(57)【要約】抗ＲＯＲ抗体構築物、前記構築物を含む医薬組成物、およびそれらの使用方法が提示される。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ＲＯＲ１である。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ＲＯＲ２である。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ＲＯＲ１およびＲＯＲ２である。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ＲＯＲ１  Ｆｒｉｚｚｌｅドメイン、ＲＯＲ２  Ｆｒｉｚｚｌｅドメイン、ＲＯＲ１  Ｉｇ様ドメイン、ＲＯＲ２  Ｉｇ様ドメイン、ＲＯＲ１  ＫｒｉｎｇｌｅドメインおよびＲＯＲ２  Ｋｒｉｎｇｌｅドメインからなる群から選択されるドメインである。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ヒトＲＯＲ抗原を含む。
2021522162.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ）結合分子であって、前記ＲＯＲ抗原結合分子が、
ＲＯＲ抗原に特異的な第１の抗原結合部位
を含み、前記第１の抗原結合部位が、
Ａ）特定のＲＯＲ抗原結合部位由来の特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列が表６から選択される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
Ｂ）前記特定のＲＯＲ抗原結合部位由来の特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列が表６から選択される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列
を含み、
前記第１の抗原結合部位が、ＲＯＲ１およびＲＯＲ２に特異的である、ＲＯＲ結合分子。
【請求項２】
チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ）結合分子であって、前記ＲＯＲ抗原結合分子が、
ＲＯＲ抗原に特異的な第１の抗原結合部位
を含み、前記第１の抗原結合部位が、
Ａ）特定のＲＯＲ抗原結合部位由来の特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列が表６から選択される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
Ｂ）前記特定のＲＯＲ抗原結合部位由来の特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列が表６から選択される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列
を含み、
前記第１の抗原結合部位が、ＲＯＲ１に特異的である、ＲＯＲ結合分子。
【請求項３】
チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ）結合分子であって、前記ＲＯＲ抗原結合分子が、
ＲＯＲ抗原に特異的な第１の抗原結合部位
を含み、前記第１の抗原結合部位が、
Ａ）特定のＲＯＲ抗原結合部位由来の特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列が表６から選択される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
Ｂ）前記特定のＲＯＲ抗原結合部位由来の特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列が表６から選択される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列
を含み、
前記第１の抗原結合部位が、ＲＯＲ２に特異的である、ＲＯＲ結合分子。
【請求項４】
前記ＲＯＲ抗原が、ＲＯＲ１  Ｆｒｉｚｚｌｅドメイン、ＲＯＲ２  Ｆｒｉｚｚｌｅドメイン、ＲＯＲ１  Ｉｇ様ドメイン、ＲＯＲ２  Ｉｇ様ドメイン、ＲＯＲ１  ＫｒｉｎｇｌｅドメインおよびＲＯＲ２  Ｋｒｉｎｇｌｅドメインからなる群から選択されるドメインである、請求項１から３のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項５】
前記ＲＯＲ抗原が、ヒトＲＯＲ抗原を含む、請求項１から４のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項６】
前記第１の抗原結合部位が、表６のＩ２Ａ−１、Ｉ２Ａ−１０、Ｉ２Ａ−１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ、Ｉ２Ａ−１１、Ｉ２Ａ−１３、Ｉ２Ａ−１４、Ｉ２Ａ−１６、Ｉ２Ａ−１８、Ｉ２Ａ−１９、Ｉ２Ａ−２２、Ｉ２Ａ−２４、Ｉ２Ａ−２６、Ｉ２Ａ−３４、Ｉ２Ａ−３６、Ｉ２Ｃ−１、Ｉ２Ｃ−２、Ｉ２Ｃ−４、Ｉ２Ｃ−６、Ｉ２Ｃ−８、Ｉ２Ｃ−９、Ｉ２Ｃ−１０、Ｉ２Ｃ−１１、Ｉ２Ｃ−１２、Ｉ２Ｃ−１３、Ｉ２Ｃ−１４、Ｉ２Ｃ−１５、Ｉ２Ｃ−１６、Ｉ２Ｃ−１７、Ｉ２Ｃ−１８、Ｉ２Ｃ−１−２０、Ｉ２Ｃ−２２、Ｉ２Ｃ−２３またはＩ２Ｃ−２４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列を含む、請求項１、４および５のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項７】
前記第１の抗原結合部位が、表６のＩ２Ａ−３、Ｉ２Ａ−４、Ｉ２Ａ−６、Ｉ２Ａ−８、Ｉ２Ａ−１２、Ｉ２Ａ−２０、Ｉ２Ａ−２５、Ｉ２Ａ−２６、Ｉ２Ａ−２７、Ｉ２Ａ−３０、Ｉ２Ａ−３２、Ｉ２Ａ−３３またはＩ２Ａ３７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列を含む、請求項２、４および５のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項８】
前記第１の抗原結合部位が、表６のＩ２Ｃ−３、Ｉ２Ｃ−５、Ｉ２Ｃ−７、Ｉ２Ｃ−１９、Ｉ２Ｃ−２１、Ｉ２Ｃ−２５またはＩ２Ｃ−２６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列を含む、請求項３、４および５のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項９】
第２の抗原結合部位をさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１０】
前記第２の抗原結合部位が、前記第１の抗原結合部位と同じである、請求項９に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１１】
前記第２の抗原結合部位が、表６のＩ２Ａ−１、Ｉ２Ａ−１０、Ｉ２Ａ−１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ、Ｉ２Ａ−１１、Ｉ２Ａ−１３、Ｉ２Ａ−１４、Ｉ２Ａ−１６、Ｉ２Ａ−１８、Ｉ２Ａ−１９、Ｉ２Ａ−２２、Ｉ２Ａ−２４、Ｉ２Ａ−２６、Ｉ２Ａ−３４、Ｉ２Ａ−３６、Ｉ２Ｃ−１、Ｉ２Ｃ−２、Ｉ２Ｃ−４、Ｉ２Ｃ−６、Ｉ２Ｃ−８、Ｉ２Ｃ−９、Ｉ２Ｃ−１０、Ｉ２Ｃ−１１、Ｉ２Ｃ−１２、Ｉ２Ｃ−１３、Ｉ２Ｃ−１４、Ｉ２Ｃ−１５、Ｉ２Ｃ−１６、Ｉ２Ｃ−１７、Ｉ２Ｃ−１８、Ｉ２Ｃ−１−２０、Ｉ２Ｃ−２２、Ｉ２Ｃ−２３またはＩ２Ｃ−２４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列を含む、請求項９に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１２】
前記第２の抗原結合部位が、表６のＩ２Ａ−３、Ｉ２Ａ−４、Ｉ２Ａ−６、Ｉ２Ａ−８、Ｉ２Ａ−１２、Ｉ２Ａ−２０、Ｉ２Ａ−２５、Ｉ２Ａ−２６、Ｉ２Ａ−２７、Ｉ２Ａ−３０、Ｉ２Ａ−３２、Ｉ２Ａ−３３またはＩ２Ａ３７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列を含む、請求項９に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１３】
前記第２の抗原結合部位が、表６のＩ２Ｃ−３、Ｉ２Ｃ−５、Ｉ２Ｃ−７、Ｉ２Ｃ−１９、Ｉ２Ｃ−２１、Ｉ２Ｃ−２５またはＩ２Ｃ−２６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列を含む、請求項９に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１４】
前記第２の抗原結合部位が、前記ＲＯＲ抗原と異なる第２の抗原に特異的である、請求項９に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１５】
前記第２の抗原が、ＣＤ３抗原である、請求項１４に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１６】
前記抗原結合部位が、前記ＣＤ３抗原のあるエピトープに特異的である、請求項１５に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１７】
前記第２の抗原結合部位が、
Ａ）配列番号６９および配列番号７３からなる群から選択される特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列；ならびに
Ｂ）配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２からなる群から選択される特定の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列
を含む、請求項１５に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１８】
前記第２の抗原結合部位が、
Ａ）配列番号６９および配列番号７３からなる群から選択される特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列；ならびに
Ｂ）配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２からなる群から選択される特定の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列
を含む、請求項１５に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１９】
全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｓｃダイアボディ、ＤＡＲＴ、ｔａｎｄＡｂおよびミニボディからなる群から選択される抗体フォーマットを含む、請求項１から１８のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項２０】
１つまたは複数の定常領域の配列を含む、請求項１から１９のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項２１】
前記定常領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＬ定常領域である、請求項２０に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項２２】
前記定常領域の配列が、（ｉ）配列番号２３、配列番号１１３、配列番号１３１もしくは配列番号１４９であるＣＨ１定常領域配列；（ｉｉ）配列番号１４、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号１０２、配列番号１１０、配列番号１２０、配列番号１２８、配列番号１３８もしくは配列番号１４６であるＣＨ２定常領域配列；（ｉｉｉ）配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４７、配列番号５２、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１１１、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、もしくは配列番号１４７であるＣＨ３定常領域配列；および／または（ｉｖ）配列番号１９、配列番号４２、配列番号５０、配列番号１０９、配列番号１２７もしくは配列番号１４５であるＣＬ定常領域配列のうち１つまたは複数を含む、請求項２０から２１のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項２３】
第１および第２のポリペプチド鎖を含み、
（ａ）前記第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、
ドメインＡは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、
ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｂ）前記第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、
ドメインＦは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＧは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、
（ｃ）前記第１および前記第２のポリペプチドは、前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用および前記Ｂドメインと前記Ｇドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ＲＯＲ抗原結合分子を形成し、前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用は、前記第１の抗原結合部位を形成する、請求項１から２２のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項２４】
第３および第４のポリペプチド鎖をさらに含み、
（ａ）前記第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、
ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩ、ＪおよびＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｂ）前記第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、
ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域アミノ酸配列を有し；
（ｃ）前記第３および前記第４のポリペプチドは、前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用および前記Ｉドメインと前記Ｍドメインとの間の相互作用を介して会合し；
（ｄ）前記第１および前記第３のポリペプチドは、前記Ｄドメインと前記Ｊドメインとの間の相互作用および前記Ｅドメインと前記Ｋドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ＲＯＲ抗原結合分子を形成し、前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用は、第２の抗原結合部位を形成する、請求項２３に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項２５】
前記第１の抗原結合部位が、ＲＯＲ１およびＲＯＲ２に、ＲＯＲ１に、またはＲＯＲ２に特異的である、請求項２３または２４に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項２６】
前記第１の抗原結合部位が、表６のＩ２Ａ−１、Ｉ２Ａ−１０、Ｉ２Ａ−１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ、Ｉ２Ａ−１１、Ｉ２Ａ−１３、Ｉ２Ａ−１４、Ｉ２Ａ−１６、Ｉ２Ａ−１８、Ｉ２Ａ−１９、Ｉ２Ａ−２２、Ｉ２Ａ−２４、Ｉ２Ａ−２６、Ｉ２Ａ−３４、Ｉ２Ａ−３６、Ｉ２Ｃ−１、Ｉ２Ｃ−２、Ｉ２Ｃ−４、Ｉ２Ｃ−６、Ｉ２Ｃ−８、Ｉ２Ｃ−９、Ｉ２Ｃ−１０、Ｉ２Ｃ−１１、Ｉ２Ｃ−１２、Ｉ２Ｃ−１３、Ｉ２Ｃ−１４、Ｉ２Ｃ−１５、Ｉ２Ｃ−１６、Ｉ２Ｃ−１７、Ｉ２Ｃ−１８、Ｉ２Ｃ−１−２０、Ｉ２Ｃ−２２、Ｉ２Ｃ−２３またはＩ２Ｃ−２４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列を含む、請求項２５に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項２７】
前記第１の抗原結合部位が、表６のＩ２Ａ−３、Ｉ２Ａ−４、Ｉ２Ａ−６、Ｉ２Ａ−８、Ｉ２Ａ−１２、Ｉ２Ａ−２０、Ｉ２Ａ−２５、Ｉ２Ａ−２６、Ｉ２Ａ−２７、Ｉ２Ａ−３０、Ｉ２Ａ−３２、Ｉ２Ａ−３３またはＩ２Ａ３７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列を含む、請求項２５に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項２８】
前記第１の抗原結合部位が、表６のＩ２Ｃ−３、Ｉ２Ｃ−５、Ｉ２Ｃ−７、Ｉ２Ｃ−１９、Ｉ２Ｃ−２１、Ｉ２Ｃ−２５またはＩ２Ｃ−２６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列を含む、請求項２５に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項２９】
前記第２の抗原結合部位が、ＣＤ３に特異的である、請求項２４から２８のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項３０】
ドメインＢおよびドメインＧが、ＣＨ３アミノ酸配列を有する、請求項２３から２８のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項３１】
前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインのアミノ酸配列が同一であり、前記配列は内在性ＣＨ３配列である、請求項３０に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項３２】
前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインのアミノ酸配列が異なり、それぞれ別個に直交型修飾を内在性ＣＨ３配列に含み、前記Ｂドメインは前記Ｇドメインと相互作用し、前記Ｂドメインと前記Ｇドメインのどちらも、前記直交型修飾を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない、請求項３０に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項３３】
前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインの前記直交型修飾が、前記Ｂドメインと前記Ｇドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む、請求項３２に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項３４】
操作されたジスルフィド架橋を生成する前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインの前記変異が、前記ＢドメインとＧドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、および他方のドメインにおける３４９Ｃである、請求項３３に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項３５】
前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインの前記直交型修飾が、ノブ・イン・ホール変異を含む、請求項３２から３４のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項３６】
前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインの前記ノブ・イン・ホール変異が、前記ＢドメインとＧドメインの一方におけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに他方のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である、請求項３５に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項３７】
前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインの前記直交型修飾が、電荷対変異を含む、請求項３２から３６のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項３８】
前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインの前記電荷対変異が、前記ＢドメインとＧドメインの一方におけるＴ３６６Ｋ変異、および他方のドメインにおけるＬ３５１Ｄ変異である、請求項３７に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項３９】
ドメインＢおよびドメインＧが、ＩｇＭ  ＣＨ２アミノ酸配列またはＩｇＥ  ＣＨ２アミノ酸配列を有する、請求項２３から３８のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項４０】
前記ＩｇＭ  ＣＨ２アミノ酸配列または前記ＩｇＥ  ＣＨ２アミノ酸配列が、直交型修飾を含む、請求項３９に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項４１】
ドメインＩがＣＬ配列を有し、ドメインＭがＣＨ１配列を有する、請求項２４から４０のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項４２】
ドメインＩがＣＨ１配列を有し、ドメインＭがＣＬ配列を有する、請求項２４から４０のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項４３】
前記ＣＨ１配列および前記ＣＬ配列がそれぞれ、１つまたは複数の直交型修飾を含み、前記ＣＨ１配列を有するドメインが、前記直交型修飾を欠くＣＬ配列を有するドメインと有意に相互作用しない、請求項４１または４２に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項４４】
前記直交型修飾が、少なくとも１つのＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含み、前記変異が、前記ＣＨ１配列の１３８位および前記ＣＬ配列の１１６位における操作されたシステイン；前記ＣＨ１配列の１２８位および前記ＣＬ配列の１１９位における操作されたシステイン、ならびに前記ＣＨ１配列の１２９位および前記ＣＬ配列の２１０位における操作されたシステインからなる群から選択される、請求項４３に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項４５】
前記直交型修飾が、少なくとも１つのＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含み、前記変異が、前記ＣＨ１配列の１２８位およびＣＬカッパ配列の１１８位における操作されたシステインを含む、請求項４３に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項４６】
前記直交型修飾が、少なくとも１つのＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含み、前記変異が、前記ＣＬ配列におけるＦ１１８Ｃ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｃ；前記ＣＬ配列におけるＦ１１８Ｃ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＬ１２８Ｃ；および前記ＣＬ配列におけるＳ１６２Ｃ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＰ１７１Ｃ変異からなる群から選択される、請求項４３に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項４７】
前記直交型修飾が、少なくとも１つのＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の電荷対変異を含み、前記電荷対変異が、前記ＣＬ配列におけるＦ１１８Ｓ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｌ；前記ＣＬ配列におけるＦ１１８Ａ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｌ；前記ＣＬ配列におけるＦ１１８Ｖ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｌ；および前記ＣＬ配列におけるＴ１２９Ｒ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＫ１４７Ｄからなる群から選択される、請求項４３から４６のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項４８】
前記直交型修飾が、少なくとも１つのＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の電荷対変異を含み、前記電荷対変異が、前記ＣＬ配列におけるＮ１３８Ｋ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＧ１６６Ｄ、および前記ＣＬ配列におけるＮ１３８Ｄ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＧ１６６Ｋからなる群から選択される、請求項４３から４６のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項４９】
ドメインＡがＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＦがＶＨアミノ酸配列を有する、請求項２３から４８のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項５０】
ドメインＡがＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＦがＶＬアミノ酸配列を有する、請求項２３から４８のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項５１】
ドメインＨがＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＬがＶＨアミノ酸配列を有する、請求項２４から４５のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項５２】
ドメインＨがＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＬがＶＬアミノ酸配列を有する、請求項２４から４５のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項５３】
ドメインＤおよびドメインＪが、ＣＨ２アミノ酸配列を有する、請求項２４のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項５４】
前記Ｅドメインが、ＣＨ３アミノ酸配列を有する、請求項２３から５３のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項５５】
前記Ｅドメインおよび前記Ｋドメインのアミノ酸配列が同一であり、前記配列は内在性ＣＨ３配列である、請求項２４から５４のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項５６】
前記Ｅドメインおよび前記Ｋドメインのアミノ酸配列が異なる、請求項２４から５４のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項５７】
前記異なる配列が、それぞれ別個に直交型修飾を内在性ＣＨ３配列に含み、前記Ｅドメインは前記Ｋドメインと相互作用し、前記Ｅドメインと前記Ｋドメインのどちらも、前記直交型修飾を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない、請求項５６に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項５８】
前記直交型修飾が、前記Ｅドメインと前記Ｋドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む、請求項５７に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項５９】
操作されたジスルフィド架橋を生成する前記変異が、前記Ｅドメインと前記Ｋドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、および他方のドメインにおける３４９Ｃである、請求項５８に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項６０】
前記Ｅドメインおよび前記Ｋドメインにおける前記直交型修飾が、ノブ・イン・ホール変異を含む、請求項５７から５９のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項６１】
前記ノブ・イン・ホール変異が、前記Ｅドメインまたは前記Ｋドメインの一方におけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに他方のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である、請求項６０に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項６２】
前記Ｅドメインおよび前記Ｋドメインにおける前記直交型修飾が、電荷対変異を含む、請求項５７から６１のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項６３】
前記電荷対変異が、前記Ｅドメインまたは前記Ｋドメインの一方におけるＴ３６６Ｋ変異、および他方のドメインにおける対応するＬ３５１Ｄ変異である、請求項６２に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項６４】
前記Ｅドメインおよび前記Ｋドメインのアミノ酸配列が、前記第１のポリペプチドと前記第３のポリペプチドとの間の特異的会合を促進する特異的相互作用を有するように選択された２つの異なる抗体ドメインの内在性配列である、請求項５６に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項６５】
前記２つの異なるアミノ酸配列が、ＣＨ１配列およびＣＬ配列である、請求項６４に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項６６】
第３の抗原結合部位をさらに含む、請求項１から６５のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項６７】
前記第３の抗原結合部位が、ＲＯＲ１およびＲＯＲ２に、ＲＯＲ１に、またはＲＯＲ２に特異的である、請求項５４に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項６８】
前記第３の抗原結合部位が、前記第１の抗原結合部位と同じである、請求項６７に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項６９】
前記第３の抗原結合部位が、表６のＩ２Ａ−１、Ｉ２Ａ−１０、Ｉ２Ａ−１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ、Ｉ２Ａ−１１、Ｉ２Ａ−１３、Ｉ２Ａ−１４、Ｉ２Ａ−１６、Ｉ２Ａ−１８、Ｉ２Ａ−１９、Ｉ２Ａ−２２、Ｉ２Ａ−２４、Ｉ２Ａ−２６、Ｉ２Ａ−３４、Ｉ２Ａ−３６、Ｉ２Ｃ−１、Ｉ２Ｃ−２、Ｉ２Ｃ−４、Ｉ２Ｃ−６、Ｉ２Ｃ−８、Ｉ２Ｃ−９、Ｉ２Ｃ−１０、Ｉ２Ｃ−１１、Ｉ２Ｃ−１２、Ｉ２Ｃ−１３、Ｉ２Ｃ−１４、Ｉ２Ｃ−１５、Ｉ２Ｃ−１６、Ｉ２Ｃ−１７、Ｉ２Ｃ−１８、Ｉ２Ｃ−１−２０、Ｉ２Ｃ−２２、Ｉ２Ｃ−２３またはＩ２Ｃ−２４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列を含む、請求項６７または６８に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項７０】
前記第３の抗原結合部位が、表６のＩ２Ａ−３、Ｉ２Ａ−４、Ｉ２Ａ−６、Ｉ２Ａ−８、Ｉ２Ａ−１２、Ｉ２Ａ−２０、Ｉ２Ａ−２５、Ｉ２Ａ−２６、Ｉ２Ａ−２７、Ｉ２Ａ−３０、Ｉ２Ａ−３２、Ｉ２Ａ−３３またはＩ２Ａ３７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列を含む、請求項６７または６８に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項７１】
前記第３の抗原結合部位が、表６のＩ２Ｃ−３、Ｉ２Ｃ−５、Ｉ２Ｃ−７、Ｉ２Ｃ−１９、Ｉ２Ｃ−２１、Ｉ２Ｃ−２５またはＩ２Ｃ−２６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列を含む、請求項６７または６８に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項７２】
第５のポリペプチド鎖を含み、
（ａ）前記第１のポリペプチド鎖はドメインＮおよびドメインＯをさらに含み、ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、
ドメインＮは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＯは定常領域アミノ酸配列を有し；
（ｂ）前記第５のポリペプチド鎖はドメインＰおよびドメインＱを含み、ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、
ドメインＰは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＱは定常領域アミノ酸配列を有し；
（ｃ）前記第１および前記第５のポリペプチドは、前記Ｎドメインと前記Ｐドメインとの間の相互作用および前記Ｏドメインと前記Ｑドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ＲＯＲ抗原結合分子を形成する、請求項６６から７１のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項７３】
（ａ）ドメインＮおよびドメインＡのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＨのアミノ酸配列がドメインＮおよびドメインＡの配列と異なり、
ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＩのアミノ酸配列がドメインＯおよびドメインＢの配列と異なり、
ドメインＰおよびドメインＦのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＬのアミノ酸配列がドメインＰおよびドメインＦの配列と異なり、
ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＭのアミノ酸配列がドメインＱおよびドメインＧの配列と異なり；
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、前記Ｎドメインと前記Ｐドメインとの間の相互作用が、前記第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、請求項７２に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項７４】
前記第１の抗原が、ＲＯＲ抗原である、請求項７３に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項７５】
前記第２の抗原が、ＣＤ３抗原である、請求項７３または７４に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項７６】
（ａ）ドメインＮ、ドメインＡおよびドメインＨのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＯ、ドメインＢおよびドメインＩのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＰ、ドメインＦおよびドメインＬのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＱ、ドメインＧおよびドメインＭのアミノ酸配列が異なり；
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、
前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、
前記Ｎドメインと前記Ｐドメインとの間の相互作用が、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、請求項５８に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項７７】
第５のポリペプチド鎖を含み、
（ａ）前記第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、
ドメインＲは可変領域アミノ酸配列を有し、ドメインＳは定常ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｂ）前記第５のポリペプチド鎖はドメインＴおよびドメインＵを含み：
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、
ドメインＴは可変領域アミノ酸配列を有し、ドメインＵは定常ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｃ）前記第３および前記第５のポリペプチドは、前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用および前記Ｓドメインと前記Ｕドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ＲＯＲ抗原結合分子を形成する、請求項６６から６９のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項７８】
（ａ）ドメインＲおよびドメインＡのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＨのアミノ酸配列がドメインＲおよびドメインＡの配列と異なり、
ドメインＳおよびドメインＢのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＩのアミノ酸配列がドメインＳおよびドメインＢの配列と異なり、
ドメインＴおよびドメインＦのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＬのアミノ酸配列がドメインＴおよびドメインＦの配列と異なり、
ドメインＵおよびドメインＧのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＭのアミノ酸配列がドメインＵおよびドメインＧの配列と異なり；
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、
前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、
前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用が、前記第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、請求項７７に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項７９】
前記第１の抗原が、ＲＯＲ抗原である、請求項７８に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項８０】
前記第２の抗原が、ＣＤ３抗原である、請求項７８または７９に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項８１】
前記分子が、５つのポリペプチド鎖を含み、鎖１が配列番号９６を含み、鎖２が配列番号９７を含み、鎖３が配列番号９８を含み、鎖４が配列番号９９を含み、鎖５が配列番号９７を含む、請求項７７から８０のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項８２】
前記分子が、５つのポリペプチド鎖を含み、鎖１が配列番号１１４を含み、鎖２が配列番号１１５を含み、鎖３が配列番号１１６を含み、鎖４が配列番号１１７を含み、鎖５が配列番号１１５を含む、請求項７７から８０のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項８３】
前記分子が、５つのポリペプチド鎖を含み、鎖１が配列番号１３２を含み、鎖２が配列番号１３３を含み、鎖３が配列番号１３４を含み、鎖４が配列番号１３５を含み、鎖５が配列番号１３３を含む、請求項７７から８０のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項８４】
（ａ）ドメインＲおよびドメインＨのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＡのアミノ酸配列が、ドメインＲおよびドメインＨの配列と異なり、
ドメインＳおよびドメインＩのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＢのアミノ酸配列が、ドメインＳおよびドメインＩの配列と異なり、
ドメインＴおよびドメインＬのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＦのアミノ酸配列が、ドメインＴおよびドメインＬの配列と異なり、
ドメインＵおよびドメインＭのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＧのアミノ酸配列が、ドメインＵおよびドメインＭの配列と異なり、
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、
前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、
前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用が、前記第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、請求項７７に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項８５】
前記第２の抗原が、ＲＯＲ抗原である、請求項８４に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項８６】
前記第１の抗原が、ＣＤ３抗原である、請求項８５に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項８７】
（ａ）ドメインＲ、ドメインＡおよびドメインＨのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＳ、ドメインＢおよびドメインＩのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＴ、ドメインＦおよびドメインＬのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＵ、ドメインＧおよびドメインＭのアミノ酸配列が異なり；
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、
前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、
前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用が、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、請求項７７に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項８８】
第１および第２のポリペプチド鎖を含むチロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ）抗原結合分子であって、
（ａ）前記第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、
ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢはＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｂ）前記第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、
ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＣＨ３アミノ酸配列を有し；
（ｃ）前記第１および前記第２のポリペプチドは、前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用および前記Ｂドメインと前記Ｇドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ＲＯＲ抗原結合分子を形成し、前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用は、ＲＯＲ抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成する、ＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項８９】
第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を含むチロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ）抗原結合分子であって、
（ａ）前記第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、
ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢはＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｂ）前記第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、
ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＣＨ３アミノ酸配列を有し；
（ｃ）前記第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、
ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、Ｋは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｄ）前記第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、
ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｅ）前記第１および前記第２のポリペプチドは、前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用および前記Ｂドメインと前記Ｇドメインとの間の相互作用を介して会合し；
（ｆ）前記第３および前記第４のポリペプチドは、前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用および前記Ｉドメインと前記Ｍドメインとの間の相互作用を介して会合し；
（ｇ）前記第１および前記第３のポリペプチドは、前記Ｄドメインと前記Ｊドメインとの間の相互作用および前記Ｅドメインと前記Ｋドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ＲＯＲ抗原結合分子を形成し、
前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用は、第１の抗原結合部位を形成し、前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用は、第２の抗原結合部位を形成し、
前記第１の抗原結合部位、前記第２の抗原結合部位、または前記第１および前記第２の抗原結合部位は、ＲＯＲ抗原に特異的である、ＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項９０】
前記第１の抗原結合部位が、ＲＯＲ抗原に特異的である、請求項８９に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項９１】
前記第２の抗原結合部位が、ＲＯＲ抗原に特異的である、請求項８９または９０に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項９２】
前記第１および前記第２の抗原結合部位が、ＲＯＲ抗原に特異的である、請求項８９に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項９３】
前記ＲＯＲ抗原が、ＲＯＲ１である、請求項８８から９２のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項９４】
前記ＲＯＲ抗原が、ＲＯＲ２である、請求項８８から９２のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項９５】
前記ＲＯＲ抗原が、ＲＯＲ１およびＲＯＲ２である、請求項８８から９２のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項９６】
前記ＲＯＲ抗原が、ＲＯＲ１  Ｆｒｉｚｚｌｅドメイン、ＲＯＲ２  Ｆｒｉｚｚｌｅドメイン、ＲＯＲ１  Ｉｇ様ドメイン、ＲＯＲ２  Ｉｇ様ドメイン、ＲＯＲ１  ＫｒｉｎｇｌｅドメインおよびＲＯＲ２  Ｋｒｉｎｇｌｅドメインからなる群から選択されるドメインである、請求項８８から９２のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項９７】
前記ＲＯＲ抗原が、ヒトＲＯＲ抗原を含む、請求項９３から９６のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項９８】
ドメインＡが、特定のＲＯＲ抗原結合部位由来の特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列が表６から選択され、
ドメインＦが、前記特定のＲＯＲ抗原結合部位由来の特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列が表６から選択される、請求項８８から９７のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項９９】
前記特定のＲＯＲ抗原結合部位が、Ｉ２Ａ−１０またはＩ２Ａ−２７である、請求項９８に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１００】
前記第２の抗原結合部位が、
Ａ）前記第３のポリペプチド鎖内の、配列番号６９および配列番号７３からなる群から選択される特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列；ならびに
Ｂ）前記第４のポリペプチド鎖内の、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２からなる群から選択される特定の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列
を含む、請求項８９から９９のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１０１】
前記第２の抗原結合部位が、
Ａ）前記第４のポリペプチド鎖内の、配列番号６９および配列番号７３からなる群から選択される特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列；ならびに
Ｂ）前記第３のポリペプチド鎖内の、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２からなる群から選択される特定の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列
を含む、請求項８９から９９のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１０２】
前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインのアミノ酸配列が同一であり、前記配列は内在性ＣＨ３配列である、請求項８８から１００のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１０３】
前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインのアミノ酸配列が異なり、それぞれ別個に直交型修飾を内在性ＣＨ３配列に含み、前記Ｂドメインは前記Ｇドメインと相互作用し、前記Ｂドメインと前記Ｇドメインのどちらも、前記直交型修飾を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない、請求項８８から１００のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１０４】
前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインの前記直交型修飾が、前記Ｂドメインと前記Ｇドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む、請求項１０３に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１０５】
操作されたジスルフィド架橋を生成する前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインの前記変異が、前記ＢドメインとＧドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、および他方のドメインにおける３４９Ｃである、請求項１０４に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１０６】
前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインの前記直交型修飾が、ノブ・イン・ホール変異を含む、請求項１０３から１０５のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１０７】
前記ノブ・イン・ホール変異が、前記ＢドメインとＧドメインの一方におけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに他方のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である、請求項１０６に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１０８】
前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインの前記直交型修飾が、電荷対変異を含む、請求項１０３から１０７のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１０９】
前記電荷対変異が、前記ＢドメインとＧドメインの一方におけるＴ３６６Ｋ変異、および他方のドメインにおけるＬ３５１Ｄ変異である、請求項１０８に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１１０】
前記Ｅドメインが、ＣＨ３アミノ酸配列を有する、請求項８８から１０９のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１１１】
前記Ｅドメインおよび前記Ｋドメインのアミノ酸配列が同一であり、前記配列は内在性ＣＨ３配列である、請求項８８から１１０のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１１２】
前記Ｅドメインおよび前記Ｋドメインのアミノ酸配列が異なる、請求項８８から１１０のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１１３】
前記異なる配列が、それぞれ別個に直交型修飾を内在性ＣＨ３配列に含み、前記Ｅドメインは前記Ｋドメインと相互作用し、前記Ｅドメインと前記Ｋドメインのどちらも、前記直交型修飾を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない、請求項１１２に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１１４】
前記直交型修飾が、前記Ｅドメインと前記Ｋドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む、請求項１１３に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１１５】
操作されたジスルフィド架橋を生成する前記変異が、前記Ｅドメインと前記Ｋドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、および他方のドメインにおける３４９Ｃである、請求項１１４に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１１６】
前記Ｅドメインおよび前記Ｋドメインにおける前記直交型修飾が、ノブ・イン・ホール変異を含む、請求項１１３から１１５のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１１７】
前記ノブ・イン・ホール変異が、前記Ｅドメインまたは前記Ｋドメインの一方におけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに他方のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である、請求項１１６に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１１８】
前記Ｅドメインおよび前記Ｋドメインにおける前記直交型修飾が、電荷対変異を含む、請求項１１３から１１７のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１１９】
前記電荷対変異が、前記Ｅドメインまたは前記Ｋドメインの一方におけるＴ３６６Ｋ変異、および他方のドメインにおける対応するＬ３５１Ｄ変異である、請求項１１８に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１２０】
前記Ｅドメインおよび前記Ｋドメインのアミノ酸配列が、前記第１のポリペプチドと前記第３のポリペプチドとの間の特異的会合を促進する特異的相互作用を有するように選択された２つの異なる抗体ドメインの内在性配列である、請求項１１２に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１２１】
前記２つの異なるアミノ酸配列が、ＣＨ１配列およびＣＬ配列である、請求項１２０に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１２２】
ドメインＩがＣＬ配列を有し、ドメインＭがＣＨ１配列を有する、請求項８９から１２１のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１２３】
ドメインＨがＶＬ配列を有し、ドメインＬがＶＨ配列を有する、請求項８９から１２２のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１２４】
ドメインＨがＶＬアミノ酸配列を有し；
ドメインＩがＣＬアミノ酸配列を有し；
ドメインＫがＣＨ３アミノ酸配列を有し；
ドメインＬがＶＨアミノ酸配列を有し；
ドメインＭがＣＨ１アミノ酸配列を有する、
請求項８９から１２３のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１２５】
第５のポリペプチド鎖をさらに含むＲＯＲ抗原結合分子であって、
（ａ）前記第１のポリペプチド鎖はドメインＮおよびドメインＯをさらに含み、ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、
ドメインＮは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＯは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｂ）前記ＲＯＲ抗原結合分子は、ドメインＰおよびドメインＱを含む第５のポリペプチド鎖をさらに含み：
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、
ドメインＰは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＱは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｃ）前記第１および前記第５のポリペプチドは、前記Ｎドメインと前記Ｐドメインとの間の相互作用および前記Ｏドメインと前記Ｑドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ＲＯＲ抗原結合分子を形成する、請求項８９〜１２４のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１２６】
（ａ）ドメインＮおよびドメインＡのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＨのアミノ酸配列が、ドメインＮおよびドメインＡの配列と異なり、
ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＩのアミノ酸配列が、ドメインＯおよびドメインＢの配列と異なり、
ドメインＰおよびドメインＦのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＬのアミノ酸配列が、ドメインＰおよびドメインＦの配列と異なり、
ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＭのアミノ酸配列が、ドメインＱおよびドメインＧの配列と異なり；
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、前記Ｎドメインと前記Ｐドメインとの間の相互作用が、前記第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、請求項１２５に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１２７】
前記第１の抗原が、ＲＯＲ抗原である、請求項１２６に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１２８】
前記第２の抗原が、ＣＤ３抗原である、請求項１２６または１２７に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１２９】
（ａ）ドメインＮ、ドメインＡおよびドメインＨのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＯ、ドメインＢおよびドメインＩのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＰ、ドメインＦおよびドメインＬのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＱ、ドメインＧおよびドメインＭのアミノ酸配列が異なり；
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、
前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、
前記ドメインＮおよびドメインＰが、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、
（ｃ）前記第１、前記第２または前記第３の抗原が、ＲＯＲ抗原である、請求項１２５に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１３０】
第５のポリペプチド鎖をさらに含むＲＯＲ抗原結合分子であって、
（ａ）前記第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、
ドメインＲは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＳは定常ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｂ）前記ＲＯＲ抗原結合分子は、ドメインＴおよびドメインＵを含む第５のポリペプチド鎖をさらに含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、
ドメインＴは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＵは定常ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｃ）前記第３および前記第５のポリペプチドは、前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用および前記Ｓドメインと前記Ｕドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ＲＯＲ抗原結合分子を形成する、請求項８９から１２４のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１３１】
（ａ）ドメインＲおよびドメインＡのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＨのアミノ酸配列が、ドメインＲおよびドメインＡの配列と異なり、
ドメインＳおよびドメインＢのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＩのアミノ酸配列が、ドメインＳおよびドメインＢの配列と異なり、
ドメインＴおよびドメインＦのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＬのアミノ酸配列が、ドメインＴおよびドメインＦの配列と異なり、
ドメインＵおよびドメインＧのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＭのアミノ酸配列が、ドメインＵおよびドメインＧの配列と異なり、
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、
前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し；
前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用が、前記第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、請求項１３０に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１３２】
前記第１の抗原が、ＲＯＲ抗原である、請求項１３１に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１３３】
前記第２の抗原が、ＣＤ３抗原である、請求項１３１または１３２に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１３４】
（ａ）ドメインＲおよびドメインＨのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＡのアミノ酸配列が、ドメインＲおよびドメインＨの配列と異なり、
ドメインＳおよびドメインＩのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＢのアミノ酸配列が、ドメインＳおよびドメインＩの配列と異なり、
ドメインＴおよびドメインＬのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＦのアミノ酸配列が、ドメインＴおよびドメインＬの配列と異なり、
ドメインＵおよびドメインＭのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＧのアミノ酸配列が、ドメインＵおよびドメインＭの配列と異なり、
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、
前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、
前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用が、前記第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、請求項１３０に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１３５】
前記第２の抗原が、ＲＯＲ抗原である、請求項１３４に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１３６】
前記第１の抗原が、ＣＤ３抗原である、請求項１３４または１３５に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１３７】
（ａ）ドメインＲ、ドメインＡおよびドメインＨのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＳ、ドメインＢおよびドメインＩのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＴ、ドメインＦおよびドメインＬのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＵ、ドメインＧおよびドメインＭのアミノ酸配列が異なり；
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、
前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、
前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用が、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し；
（ｃ）前記第１、前記第２または前記第３の抗原が、ＲＯＲ抗原である、請求項１３０に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１３８】
第５および第６のポリペプチド鎖をさらに含むＲＯＲ抗原結合分子であって、
（ａ）前記第１のポリペプチド鎖はドメインＮおよびドメインＯをさらに含み、ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され；
（ｂ）前記第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され；
（ｃ）前記ＲＯＲ抗原結合分子は、第５および第６のポリペプチド鎖をさらに含み：
前記第５のポリペプチド鎖は、ドメインＰおよびドメインＱを含み、ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、
前記第６のポリペプチド鎖は、ドメインＴおよびドメインＵを含み、ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され；
（ｄ）前記第１および前記第５のポリペプチドは、前記Ｎドメインと前記Ｐドメインとの間の相互作用および前記Ｏドメインと前記Ｑドメインとの間の相互作用を介して会合し、
前記第３および前記第６のポリペプチドは、前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用および前記Ｓドメインと前記Ｕドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ＲＯＲ抗原結合分子を形成する、請求項８９から１２４のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１３９】
（ａ）ドメインＮおよびドメインＡのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＨおよびドメインＲのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＩおよびドメインＳのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＰおよびドメインＦのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＬおよびドメインＴのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＭおよびドメインＵのアミノ酸配列が同一であり；
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、前記ドメインＮおよびドメインＰが、前記第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用が、前記第２の抗原に特異的な第４の抗原結合部位を形成する、請求項１３８に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１４０】
（ａ）ドメインＨおよびドメインＡのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＮおよびドメインＲのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＩおよびドメインＢのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＯおよびドメインＳのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＬおよびドメインＦのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＰおよびドメインＴのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＭおよびドメインＧのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＱおよびドメインＵのアミノ酸配列が同一であり；
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、前記ドメインＮおよびドメインＰが、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、前記第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用が、前記第２の抗原に特異的な第４の抗原結合部位を形成する、請求項１３８に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１４１】
前記Ａドメインと前記Ｂドメインとの間のジャンクションを形成する配列が、ＩＫＲＴＰＲＥＰまたはＩＫＲＴＶＲＥＰである、上記請求項のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１４２】
前記Ｆドメインと前記Ｇドメインとの間のジャンクションを形成する配列が、ＳＳＡＳＰＲＥＰである、上記請求項のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１４３】
少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列が、前記ＣＨ３アミノ酸配列とヒンジアミノ酸配列とを連結するＣ末端トリペプチド挿入を有し、ここで前記トリペプチド挿入は、ＰＧＫ、ＫＳＣおよびＧＥＣからなる群から選択される、上記請求項のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１４４】
前記配列が、ヒトの配列である、上記請求項のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１４５】
少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列が、ＩｇＧ配列である、上記請求項のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１４６】
前記ＩｇＧ配列がＩｇＧ１配列である、請求項１４５に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１４７】
少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列が、１つまたは複数のイソアロタイプ変異を有する、上記請求項のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１４８】
前記イソアロタイプ変異がＤ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍである、請求項１４７に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１４９】
前記ＣＬアミノ酸配列がＣカッパ配列である、上記請求項のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１５０】
前記ＣＨ２配列が、Ｆｃエフェクター機能を低減させる１つまたは複数の操作された変異を有する、上述の請求項のいずれかに記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１５１】
前記１つまたは複数の操作された変異が、Ｌ２３４、Ｌ２３５およびＰ３２９位に存在する、請求項１５０に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１５２】
前記１つまたは複数の操作された変異が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇである、請求項１５１に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１５３】
前記１つまたは複数の操作された変異が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｋである、請求項１５１に記載のＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１５４】
請求項１から１５３のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子を含む、精製されたＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１５５】
ＣＨ１親和性精製ステップを含む精製方法によって精製された、請求項１５４に記載の精製されたＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１５６】
前記精製方法が、単一ステップの精製方法である、請求項１５４または１５５に記載の精製されたＲＯＲ抗原結合分子。
【請求項１５７】
請求項１から１５６のいずれか一項に記載のＲＯＲ抗原結合分子と、薬学的に許容される希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１５８】
がんを有する対象を処置するための方法であって、治療有効量の請求項１５７に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１５９】
前記がんが、ＲＯＲ抗原発現がんである、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
前記がんが、ＲＯＲ１抗原を発現する、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記がんが、ＲＯＲ２抗原を発現する、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６２】
前記がんが、ＲＯＲ１抗原およびＲＯＲ２抗原を発現する、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６３】
前記がんが、膵がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、胃がん、黒色腫、ユーイング肉腫、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、Ｂ−ＡＬＬ、血液学的がん、前立腺がん、結腸がん、腎がん、甲状腺がん、肝臓がん、尿路上皮癌、黒色腫、子宮内膜がん、腎明細胞癌、明細胞癌および子宮がんからなる群から選択される、請求項１５８から１６２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６４】
前記医薬組成物が、追加的な治療と組み合わせて投与される、請求項１５８から１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記追加的な治療が、外科手術、放射線療法、内分泌療法、免疫療法または化学療法である、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記免疫療法が、免疫療法剤である、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記免疫療法剤が、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
前記免疫療法剤が、ワクチンである、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６９】
前記化学療法が、細胞傷害剤または化学療法剤である、請求項１６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年４月１８日に出願された米国特許仮出願第６２／６５９，６３５号の利益を主張する。
２．配列表
【０００２】
本出願は、本出願と共にＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された配列表を参照により本明細書に組み込み、前記ＡＳＣＩＩテキストファイルは、１４５２９−００１−２２８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔという表題であり、２０１９年４月１５日に作成され、３３６，６２７バイトの大きさである。
【背景技術】
【０００３】
３．背景
複数の標的を認識するように操作された抗体由来のタンパク質である多重特異性抗体の設計および治療的使用は、集中的な研究分野である。多重特異性抗体は、単一特異性モノクローナル抗体によってルーチンに提供される治療的制御よりも優れた治療的制御の将来的見込みを提供する。例えば、多重特異性抗体は、単一特異性抗体よりも優れた標的特異性を提供し、多くの抗体療法、特に抗体に基づく免疫療法に付随するオフターゲット効果を低減させるように操作することができる。多重特異性抗体は、特に免疫療法において、複数の細胞受容体の相乗的ターゲティングなどの単一特異性抗体では不可能な治療戦略の将来的見込みも提供する。このような免疫療法の１つは、Ｔ細胞マーカーおよび腫瘍細胞マーカーの二特異性係合を介して、Ｔ細胞をリクルートし再び方向付け、特定の腫瘍細胞集団を標的化し死滅させるための、二特異性抗体の使用である。例えば、ＣＤ３ｘＣＤ１９  ＢｉＴＥブリナツモマブ（ビーリンサイト（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ））などによる、ＣＤ３ｘＣＤ１９二特異性抗体を使用したＢ細胞リンパ腫のターゲティングは、米国特許出願公開第２００６／０１９３８５２号に記載されている。
【０００４】
したがって、増加された親和性もしくはアビディティ、低減されたオフターゲット結合、および／または低減された意図されない免疫活性化を含む改善を有する、腫瘍細胞集団を含む別個の細胞集団に特異的に結合する改善された多重特異性抗体が必要とされている。
【０００５】
それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｎｔｉｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；  ７１（８）  Ａｐｒｉｌ  １５，  ２０１１）、Ｒｅｂａｇａｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｆｒｏｎｔ．  Ｏｎｃｏｌ．，  １８  Ａｐｒｉｌ  ２０１２）、Ｚｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １８１，  Ｎｏ．  ６，  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１２）、Ｈｅｎｒｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，  Ｖｏｌ．  ６，  Ｎｏ．  ３７  ２０１５）、Ｚｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（３）：  ｅ３１１２７．）およびＢａｉｎｂｒｉｄｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（７）：  ｅ１０２６９５．）にさらに詳細に記載される通り、様々な腫瘍が、チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ）抗原の細胞表面発現を実証することができる。加えて、その全体が本明細書に組み込まれるＢａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１７  Ｊｕｎ  １５；  ２３（１２）：  ３０６１−３０７１）に記載されている通り、ＲＯＲ発現は、正常、すなわち、非がん性組織において発現されないまたは限定的な発現のみを実証することができる。よって、ＲＯＲ抗原は、ある特定の腫瘍において腫瘍特異的マーカーとして使用することができる。実証されたＲＯＲ発現を有する腫瘍およびがんの例としては、その全体が本明細書に組み込まれるＧｏｈｉｌ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０１７；  ６（７）：  ｅ１３２６４３７．）に記載されている通り、膵がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、胃がん、黒色腫、ユーイング肉腫、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫およびＢ−ＡＬＬが挙げられるがこれらに限定されない。他のがんとしては、血液学的がん、前立腺がん、結腸がん、腎がんおよび子宮がんが挙げられるがこれらに限定されない。腫瘍を標的化するための様々な抗体プラットフォームにおいてフォーマットされたＲＯＲ多重特異性抗体の使用は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｈｉｌ，  ｅｔ  ａｌ．、国際出願ＷＯ２０１７／０５３４６９、国際出願ＷＯ２０１４／１６７０２２、米国特許出願公開第２０１７／０１９８０４５号、国際出願ＷＯ２０１６／０９４８７３、国際出願ＷＯ２０１７／１２７４９９および国際出願ＷＯ２０１６／１４２７６８に記載されている。
よって、ＲＯＲ抗原結合分子は、がんの処置における治療潜在力を有する。ＲＯＲ抗原に加えてＴ細胞表面抗原に結合する多重特異性ＲＯＲ結合分子は、ＲＯＲを発現するがん細胞の、Ｔ細胞に再び方向付けられた死滅を提供する潜在力を有する。
したがって、多重特異性ＲＯＲ抗原結合分子を含むＲＯＲ抗原結合分子が必要とされている。増加された親和性もしくはアビディティ、低減されたオフターゲット結合、および／または低減された意図されない免疫活性化を含む改善を有するＲＯＲ抗原結合分子も必要とされている。改善された製造可能性を有し、容易に精製される、多重特異性ＲＯＲ抗原結合分子が特に必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】Ｇｅｎｔｉｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；  ７１（８）  Ａｐｒｉｌ  １５，  ２０１１）
【特許文献２】Ｒｅｂａｇａｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｆｒｏｎｔ．  Ｏｎｃｏｌ．，  １８  Ａｐｒｉｌ  ２０１２）
【特許文献３】Ｚｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １８１，  Ｎｏ．  ６，  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１２）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】国際出願第２０１７／０５３４６９号
【非特許文献２】国際出願第２０１４／１６７０２２号
【非特許文献３】米国特許出願公開第２０１７／０１９８０４５号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
４．概要
第１の態様では、抗原結合分子が提供される。全ての実施形態では、抗原結合分子は、ＲＯＲ抗原に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含み、したがって、結合分子は、ＲＯＲ抗原結合分子と命名される。
【０００９】
Ａ）チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ）抗原結合部位由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列が表６から選択される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびにＢ）ＲＯＲ抗原結合部位由来の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列が表６から選択される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＲＯＲ抗原結合分子であって、第１の抗原結合部位であり、（ｉ）ＲＯＲ１およびＲＯＲ２、（ｉｉ）ＲＯＲ１、または（ｉｉｉ）ＲＯＲ２に特異的である、ＲＯＲ抗原結合部位が本明細書に記載されている。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原結合分子は、第２の抗原結合部位をさらに含む。ある特定の態様では、第２の抗原結合部位は、第１の抗原結合部位と同じである。ある特定の態様では、第２の抗原結合部位は、第１の抗原結合部位のＲＯＲ抗原と異なる第２の抗原に特異的である。ある特定の態様では、第２の抗原は、ＣＤ３抗原である。
【００１０】
第１および第２のポリペプチド鎖を含むチロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ）抗原結合分子であって、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢはＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ抗原結合分子を形成し、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、ＲＯＲ抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成する、ＲＯＲ抗原結合分子が本明細書に記載されている。
【００１１】
ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ＲＯＲ１である。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ＲＯＲ２である。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ＲＯＲ１およびＲＯＲ２である。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ＲＯＲ１  Ｆｒｉｚｚｌｅドメイン、ＲＯＲ２  Ｆｒｉｚｚｌｅドメイン、ＲＯＲ１  Ｉｇ様ドメイン、ＲＯＲ２  Ｉｇ様ドメイン、ＲＯＲ１  ＫｒｉｎｇｌｅドメインおよびＲＯＲ２  Ｋｒｉｎｇｌｅドメインからなる群から選択されるドメインである。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ヒトＲＯＲ抗原を含む。
【００１２】
ある特定の態様では、ドメインＡは、特定のＲＯＲ抗原結合部位由来の特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列は表６から選択され、ドメインＦは、特定のＲＯＲ抗原結合部位由来の特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列は表６から選択される。ある特定の態様では、特定のＲＯＲ抗原結合部位は、表６のＩ２Ａ−１０、Ｉ２Ａ−１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５ＱまたはＩ２Ａ−２７である。
【００１３】
ある特定の態様では、ドメインＡは、表６における抗体のＶＬ配列と比較して１つまたは２つのアミノ酸変異を有するＶＬを含み、１つまたは２つのアミノ酸変異は、ＶＬにおける１つまたは複数のＣＤＲ領域に存在する。ある特定の態様では、ドメインＦは、表６における抗体のＶＨ配列と比較して１つまたは２つのアミノ酸変異を有するＶＨを含み、１つまたは２つのアミノ酸変異は、ＶＨにおける１つまたは複数のＣＤＲ領域に存在する。ある特定の態様では、ドメインＡは、１つまたは複数のＣＤＲ領域における１つまたは複数の変異を有するＩ２Ａ−１０のＶＬ配列を有するＶＬを含む。ある特定の態様では、ドメインＡは、１つまたは複数のＣＤＲ領域における１つまたは複数の変異を有するＩ２Ａ−２７のＶＬ配列を有するＶＬを含む。ある特定の態様では、ドメインＦは、１つまたは複数のＣＤＲ領域における１つまたは複数の変異を有するＩ２Ａ−１０のＶＬ配列を有するＶＬを含む。ある特定の態様では、ドメインＦは、１つまたは複数のＣＤＲ領域における１つまたは複数の変異を有するＩ２Ａ−２７のＶＬ配列を有するＶＬを含む。
【００１４】
ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインのアミノ酸配列は同一であり、ここで配列は内在性ＣＨ３配列である。
【００１５】
ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインのアミノ酸配列は異なり、それぞれ別個に直交型修飾を内在性ＣＨ３配列に含み、ここでＢドメインはＧドメインと相互作用し、ＢドメインとＧドメインのどちらも、直交型修飾を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない。
【００１６】
ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインの直交型修飾は、ＢドメインとＧドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。ある特定の態様では、操作されたジスルフィド架橋を生成するＢドメインおよびＧドメインの変異は、ＢドメインとＧドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、ならびに他方のドメインにおける３４９Ｃである。
【００１７】
ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインの直交型修飾はノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）変異を含む。ある特定の態様では、ノブ・イン・ホール変異は、ＢドメインとＧドメインの一方におけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに他方のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である。
【００１８】
ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインの直交型修飾は、電荷対変異を含む。ある特定の態様では、電荷対変異は、ＢドメインとＧドメインの一方におけるＴ３６６Ｋ変異、ならびに他方のドメインにおけるＬ３５１Ｄ変異である。
【００１９】
ある特定の態様では、ＥドメインはＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【００２０】
ある特定の態様では、ＥドメインおよびＫドメインのアミノ酸配列は同一であり、ここで配列は内在性ＣＨ３配列である。
【００２１】
ある特定の態様では、ＥドメインおよびＫドメインのアミノ酸配列は異なる。ある特定の態様では、異なる配列が、それぞれ別個に直交型修飾を内在性ＣＨ３配列に含み、ここでＥドメインはＫドメインと相互作用し、ＥドメインとＫドメインのどちらも、直交型修飾を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない。
【００２２】
ある特定の態様では、直交型修飾は、ＥドメインとＫドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。ある特定の態様では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、ＥドメインとＫドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、ならびに他方のドメインにおける３４９Ｃである。
【００２３】
ある特定の態様では、ＥドメインとＫドメインにおける直交型修飾はノブ・イン・ホール変異を含む。ある特定の態様では、ノブ・イン・ホール変異は、ＥドメインとＫドメインの一方におけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに他方のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である。
【００２４】
ある特定の態様では、ＥドメインとＫドメインにおける直交型修飾は、電荷対変異を含む。ある特定の態様では、電荷対変異は、ＥドメインまたはＫドメインの一方におけるＴ３６６Ｋ変異、ならびに他方のドメインにおける対応するＬ３５１Ｄ変異である。
【００２５】
ある特定の態様では、ＥドメインおよびＫドメインのアミノ酸配列が、第１のポリペプチドと第３のポリペプチドとの間の特異的会合を促進する特異的相互作用を有するように選択された２つの異なる抗体ドメインの内在性配列である。ある特定の態様では、２つの異なるアミノ酸配列は、ＣＨ１配列およびＣＬ配列である。
【００２６】
ある特定の態様では、ＡドメインとＢドメインとの間のジャンクションを形成する配列は、ＩＫＲＴＰＲＥＰまたはＩＫＲＴＶＲＥＰである。
【００２７】
ある特定の態様では、ＦドメインとＧドメインとの間のジャンクションを形成する配列は、ＳＳＡＳＰＲＥＰである。
【００２８】
ある特定の態様では、少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列は、ＣＨ３アミノ酸配列をヒンジアミノ酸配列に接続するＣ末端トリペプチド挿入を有し、トリペプチド挿入は、ＰＧＫ、ＫＳＣおよびＧＥＣからなる群から選択される。
【００２９】
ある特定の態様では、配列は、ヒト配列である。
【００３０】
ある特定の態様では、少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列は、ＩｇＧ配列である。ある特定の態様では、ＩｇＧ配列は、ＩｇＧ１配列である。
【００３１】
ある特定の態様では、少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列は、１つまたは複数のイソアロタイプ変異を有する。ある特定の態様では、イソアロタイプ変異は、Ｄ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍである。
【００３２】
ある特定の態様では、ＣＬアミノ酸配列は、Ｃカッパ配列である。
【００３３】
ある特定の態様では、ＣＨ２配列は、Ｆｃエフェクター機能を低減させる１つまたは複数の操作された変異を有する。ある特定の態様では、１つまたは複数の操作された変異は、Ｌ２３４、Ｌ２３５およびＰ３２９位に存在する。ある特定の態様では、１つまたは複数の操作された変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇである。ある特定の態様では、１つまたは複数の操作された変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｋである。
【００３４】
第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を含むチロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ）抗原結合分子であって、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢはＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、Ｋは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ抗原結合分子を形成し、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は、第２の抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部位、第２の抗原結合部位、または第１および第２の抗原結合部位は、ＲＯＲ抗原に特異的である、ＲＯＲ抗原結合分子も本明細書に記載されている。
【００３５】
ある特定の態様では、第１の抗原結合部位は、ＲＯＲ抗原に特異的である。ある特定の態様では、第２の抗原結合部位は、ＲＯＲ抗原に特異的である。ある特定の態様では、第１および第２の抗原結合部位は、ＲＯＲ抗原に特異的である。
【００３６】
ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ＲＯＲ１である。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ＲＯＲ２である。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ＲＯＲ１およびＲＯＲ２である。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ＲＯＲ１  Ｆｒｉｚｚｌｅドメイン、ＲＯＲ２  Ｆｒｉｚｚｌｅドメイン、ＲＯＲ１  Ｉｇ様ドメイン、ＲＯＲ２  Ｉｇ様ドメイン、ＲＯＲ１  ＫｒｉｎｇｌｅドメインおよびＲＯＲ２  Ｋｒｉｎｇｌｅドメインからなる群から選択されるドメインである。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ヒトＲＯＲ抗原を含む。
【００３７】
ある特定の態様では、ドメインＡは、特定のＲＯＲ抗原結合部位由来の特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列は表６から選択され、ドメインＦは、特定のＲＯＲ抗原結合部位由来の特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列は表６から選択される。ある特定の態様では、特定のＲＯＲ抗原結合部位は、表６のＩ２Ａ−１０、Ｉ２Ａ−１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５ＱまたはＩ２Ａ−２７である。
【００３８】
ある特定の態様では、ドメインＡは、表６における抗体のＶＬ配列と比較して１つまたは２つのアミノ酸変異を有するＶＬを含み、１つまたは２つのアミノ酸変異は、ＶＬにおける１つまたは複数のＣＤＲ領域に存在する。ある特定の態様では、ドメインＦは、表６における抗体のＶＨ配列と比較して１つまたは２つのアミノ酸変異を有するＶＨを含み、１つまたは２つのアミノ酸変異は、ＶＨにおける１つまたは複数のＣＤＲ領域に存在する。ある特定の態様では、ドメインＡは、１つまたは複数のＣＤＲ領域における１つまたは複数の変異を有するＩ２Ａ−１０のＶＬ配列を有するＶＬを含む。ある特定の態様では、ドメインＡは、１つまたは複数のＣＤＲ領域における１つまたは複数の変異を有するＩ２Ａ−２７のＶＬ配列を有するＶＬを含む。ある特定の態様では、ドメインＦは、１つまたは複数のＣＤＲ領域における１つまたは複数の変異を有するＩ２Ａ−１０のＶＬ配列を有するＶＬを含む。ある特定の態様では、ドメインＦは、１つまたは複数のＣＤＲ領域における１つまたは複数の変異を有するＩ２Ａ−２７のＶＬ配列を有するＶＬを含む。
【００３９】
ある特定の態様では、第２の抗原結合部位は、Ａ）第３のポリペプチド鎖内の、配列番号６９および配列番号７３からなる群から選択される特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列；ならびにＢ）第４のポリペプチド鎖内の、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２からなる群から選択される特定の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列を含む。
【００４０】
ある特定の態様では、第２の抗原結合部位は、Ａ）第４のポリペプチド鎖内の、配列番号６９および配列番号７３からなる群から選択される特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列；ならびにＢ）第３のポリペプチド鎖内の、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２からなる群から選択される特定の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列を含む。
【００４１】
ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインのアミノ酸配列が同一であり、配列は内在性ＣＨ３配列である。
【００４２】
ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインのアミノ酸配列は、異なり、それぞれ別個に直交型修飾を内在性ＣＨ３配列に含み、ＢドメインはＧドメインと相互作用し、ＢドメインとＧドメインのどちらも、直交型修飾を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない。
【００４３】
ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインの直交型修飾は、ＢドメインとＧドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。ある特定の態様では、操作されたジスルフィド架橋を生成するＢドメインおよびＧドメインの変異は、ＢドメインとＧドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、および他方のドメインにおける３４９Ｃである。
【００４４】
ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインの直交型修飾は、ノブ・イン・ホール変異を含む。ある特定の態様では、ノブ・イン・ホール変異は、ＢドメインとＧドメインの一方におけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに他方のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である。
【００４５】
ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインの直交型修飾は、電荷対変異を含む。ある特定の態様では、電荷対変異は、ＢドメインとＧドメインの一方におけるＴ３６６Ｋ変異、および他方のドメインにおけるＬ３５１Ｄ変異である。
【００４６】
ある特定の態様では、Ｅドメインは、ＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【００４７】
ある特定の態様では、ＥドメインおよびＫドメインのアミノ酸配列は同一であり、配列は内在性ＣＨ３配列である。
【００４８】
ある特定の態様では、ＥドメインおよびＫドメインのアミノ酸配列は、異なる。ある特定の態様では、異なる配列は、それぞれ別個に直交型修飾を内在性ＣＨ３配列に含み、ＥドメインはＫドメインと相互作用し、ＥドメインとＫドメインのどちらも、直交型修飾を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない。
【００４９】
ある特定の態様では、直交型修飾は、ＥドメインとＫドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。ある特定の態様では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、ＥドメインとＫドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、および他方のドメインにおける３４９Ｃである。
【００５０】
ある特定の態様では、ＥドメインおよびＫドメインにおける直交型修飾は、ノブ・イン・ホール変異を含む。ある特定の態様では、ノブ・イン・ホール変異は、ＥドメインまたはＫドメインの一方におけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに他方のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である。
【００５１】
ある特定の態様では、ＥドメインおよびＫドメインにおける直交型修飾は、電荷対変異を含む。ある特定の態様では、電荷対変異は、ＥドメインまたはＫドメインの一方におけるＴ３６６Ｋ変異、および他方のドメインにおける対応するＬ３５１Ｄ変異である。
【００５２】
ある特定の態様では、ＥドメインおよびＫドメインのアミノ酸配列は、第１のポリペプチドと第３のポリペプチドとの間の特異的会合を促進する特異的相互作用を有するように選択された２つの異なる抗体ドメインの内在性配列である。ある特定の態様では、２つの異なるアミノ酸配列は、ＣＨ１配列およびＣＬ配列である。
【００５３】
ある特定の態様では、ドメインＩはＣＬ配列を有し、ドメインＭはＣＨ１配列を有する。
【００５４】
ある特定の態様では、ドメインＨはＶＬ配列を有し、ドメインＬはＶＨ配列を有する。
【００５５】
ある特定の態様では、ドメインＨはＶＬアミノ酸配列を有し；ドメインＩはＣＬアミノ酸配列を有し；ドメインＫはＣＨ３アミノ酸配列を有し；ドメインＬはＶＨアミノ酸配列を有し；ドメインＭはＣＨ１アミノ酸配列を有する。
【００５６】
ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原結合分子は、第５のポリペプチド鎖をさらに含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＮおよびドメインＯをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＮは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＯは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＲＯＲ抗原結合分子は、ドメインＰおよびドメインＱを含む第５のポリペプチド鎖をさらに含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、ドメインＰは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＱは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｃ）第１および第５のポリペプチドは、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用およびＯドメインとＱドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ抗原結合分子を形成する。
【００５７】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＮおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＨのアミノ酸配列は、ドメインＮおよびドメインＡの配列と異なり、ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩのアミノ酸配列は、ドメインＯおよびドメインＢの配列と異なり、ドメインＰおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬのアミノ酸配列は、ドメインＰおよびドメインＦの配列と異なり、ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭのアミノ酸配列は、ドメインＱおよびドメインＧの配列と異なり；（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。ある特定の態様では、第１の抗原は、ＲＯＲ抗原である。ある特定の態様では、第２の抗原は、ＣＤ３抗原である。
【００５８】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＮ、ドメインＡおよびドメインＨのアミノ酸配列は異なり、ドメインＯ、ドメインＢおよびドメインＩのアミノ酸配列は異なり、ドメインＰ、ドメインＦおよびドメインＬのアミノ酸配列は異なり、ドメインＱ、ドメインＧおよびドメインＭのアミノ酸配列は異なり；（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰは、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、（ｃ）第１、第２または第３の抗原は、ＲＯＲ抗原である。
【００５９】
ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原結合分子は、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、（ａ）第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＲは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＳは定常ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＲＯＲ抗原結合分子は、ドメインＴおよびドメインＵを含む第６のポリペプチド鎖をさらに含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、ドメインＴは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＵは定常ドメインアミノ酸配列を有し；（ｃ）第３および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ抗原結合分子を形成する。
【００６０】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＲおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＨのアミノ酸配列は、ドメインＲおよびドメインＡの配列と異なり、ドメインＳおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩのアミノ酸配列は、ドメインＳおよびドメインＢの配列と異なり、ドメインＴおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬのアミノ酸配列は、ドメインＴおよびドメインＦの配列と異なり、ドメインＵおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭのアミノ酸配列は、ドメインＵおよびドメインＧの配列と異なり、（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し；ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。ある特定の態様では、第１の抗原は、ＲＯＲ抗原である。ある特定の態様では、第２の抗原は、ＣＤ３抗原である。
【００６１】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＲおよびドメインＨのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＡのアミノ酸配列は、ドメインＲおよびドメインＨの配列と異なり、ドメインＳおよびドメインＩのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＢのアミノ酸配列は、ドメインＳおよびドメインＩの配列と異なり、ドメインＴおよびドメインＬのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＦのアミノ酸配列は、ドメインＴおよびドメインＬの配列と異なり、ドメインＵおよびドメインＭのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＧのアミノ酸配列は、ドメインＵおよびドメインＭの配列と異なり、（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。ある特定の態様では、第２の抗原は、ＲＯＲ抗原である。ある特定の態様では、第１の抗原は、ＣＤ３抗原である。
【００６２】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＲ、ドメインＡおよびドメインＨのアミノ酸配列は異なり、ドメインＳ、ドメインＢおよびドメインＩのアミノ酸配列は異なり、ドメインＴ、ドメインＦおよびドメインＬのアミノ酸配列は異なり、ドメインＵ、ドメインＧおよびドメインＭのアミノ酸配列は異なり；（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用は、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し；（ｃ）第１、第２または第３の抗原は、ＲＯＲ抗原である。
【００６３】
ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原結合分子は、さらに第５および第６のポリペプチド鎖を含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖はさらにドメインＮおよびドメインＯを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され；（ｂ）第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され；（ｃ）ＲＯＲ抗原結合分子はさらに第５および第６ポリペプチド鎖を含み、第５ポリペプチド鎖はドメインＰおよびドメインＱを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、第６ポリペプチド鎖はドメインＴおよびドメインＵを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され；（ｄ）第１および第５のポリペプチドは、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用およびＯドメインとＱドメインとの間の相互作用を介して会合し、第３および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ抗原結合分子を形成する。
【００６４】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＮおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＨおよびドメインＲのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩおよびドメインＳのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＰおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬおよびドメインＴのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭおよびドメインＵのアミノ酸配列は同一であり；（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第４の抗原結合部位を形成する。
【００６５】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＨおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＮおよびドメインＲのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＯおよびドメインＳのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＰおよびドメインＴのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＱおよびドメインＵのアミノ酸配列は同一であり；（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第４の抗原結合部位を形成する。
【００６６】
ある特定の態様では、ＡドメインとＢドメインとの間のジャンクションを形成する配列は、ＩＫＲＴＰＲＥＰまたはＩＫＲＴＶＲＥＰである。
【００６７】
ある特定の態様では、ＦドメインとＧドメインとの間のジャンクションを形成する配列は、ＳＳＡＳＰＲＥＰである。
【００６８】
ある特定の態様では、少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列は、ＣＨ３アミノ酸配列をヒンジアミノ酸配列に連結するＣ末端トリペプチド挿入を有し、ここでトリペプチド挿入は、ＰＧＫ、ＫＳＣおよびＧＥＣからなる群から選択される。
【００６９】
ある特定の態様では、配列はヒト配列である。
【００７０】
ある特定の態様では、少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列は、ＩｇＧ配列である。ある特定の態様では、ＩｇＧ配列は、ＩｇＧ１配列である。
【００７１】
ある特定の態様では、少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列は、１つまたは複数のイソアロタイプ変異を有する。ある特定の態様では、イソアロタイプ変異は、Ｄ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍである。
【００７２】
ある特定の態様では、ＣＬアミノ酸配列は、Ｃカッパ配列である。
【００７３】
ある特定の態様では、ＣＨ２配列は、Ｆｃエフェクター機能を低減させる１つまたは複数の操作された変異を有する。ある特定の態様では、１つまたは複数の操作された変異は、Ｌ２３４、Ｌ２３５およびＰ３２９位に存在する。ある特定の態様では、１つまたは複数の操作された変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇである。ある特定の態様では、１つまたは複数の操作された変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｋである。
【００７４】
ＲＯＲ抗原に特異的な第１の抗原結合部位を含むチロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ）抗原結合分子であって、第１の抗原結合部位が、Ａ）特定のＲＯＲ抗原結合部位由来の特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＬ配列が表６から選択される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびにＢ）特定のＲＯＲ抗原結合部位由来の特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３  ＶＨ配列が表６から選択される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＲＯＲ抗原結合分子も本明細書に記載されている。
【００７５】
ある特定の態様では、第１の抗原結合部位は、表６における抗体のＶＬ配列と比較して１つまたは２つのアミノ酸変異を有するＶＬを含み、１つまたは２つのアミノ酸変異は、ＶＬにおける１つまたは複数のＣＤＲ領域に存在する。ある特定の態様では、第１の抗原結合部位は、表６における抗体のＶＨ配列と比較して１つまたは２つのアミノ酸変異を有するＶＨを含み、１つまたは２つのアミノ酸変異は、ＶＨにおける１つまたは複数のＣＤＲ領域に存在する。
【００７６】
ある特定の態様では、第１の抗原結合部位は、ＲＯＲ１に特異的である。ある特定の態様では、第１の抗原結合部位は、ＲＯＲ２に特異的である。ある特定の態様では、第１の抗原結合部位は、ＲＯＲ１およびＲＯＲ２に特異的である。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ＲＯＲ１  Ｆｒｉｚｚｌｅドメイン、ＲＯＲ２  Ｆｒｉｚｚｌｅドメイン、ＲＯＲ１  Ｉｇ様ドメイン、ＲＯＲ２  Ｉｇ様ドメイン、ＲＯＲ１  ＫｒｉｎｇｌｅドメインおよびＲＯＲ２  Ｋｒｉｎｇｌｅドメインからなる群から選択されるドメインである。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原は、ヒトＲＯＲ抗原を含む。
【００７７】
ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原結合分子は、第２の抗原結合部位をさらに含む。ある特定の態様では、第２の抗原結合部位は、ＲＯＲ抗原に特異的である。ある特定の態様では、第２の抗原結合部位は、ＲＯＲ抗原と異なる第２の抗原に特異的である。ある特定の態様では、第２の抗原は、ＣＤ３抗原である。ある特定の態様では、抗原結合部位は、ＣＤ３抗原のあるエピトープに特異的である。ある特定の態様では、第２の抗原結合部位は、Ａ）配列番号６９および配列番号７３からなる群から選択される特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列；ならびにＢ）配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２からなる群から選択される特定の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、第２の抗原結合部位は、Ａ）配列番号６９および配列番号７３からなる群から選択される特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列；ならびにＢ）配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２からなる群から選択される特定の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列を含む。
【００７８】
ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原結合分子は、全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ｓｃダイアボディ、ＤＡＲＴ、ｔａｎｄＡｂおよびミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）からなる群から選択される抗体フォーマットを含む。ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原結合分子は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＧは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ｃ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ抗原結合分子を形成し、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、第１の抗原結合部位を形成する。
【００７９】
ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原結合分子は、第３および第４のポリペプチド鎖をさらに含み、（ａ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩ、ＪおよびＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｄ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ抗原結合分子を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は、第２の抗原結合部位を形成する。ある特定の態様では、第１の抗原結合部位は、ＲＯＲ抗原に特異的である。ある特定の態様では、第２の抗原結合部位は、ＣＤ３に特異的である。
【００８０】
ある特定の態様では、ドメインＢおよびドメインＧは、ＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【００８１】
ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインのアミノ酸配列は同一であり、配列は内在性ＣＨ３配列である。
【００８２】
ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインのアミノ酸配列は、異なり、それぞれ別個に直交型修飾を内在性ＣＨ３配列に含み、ＢドメインはＧドメインと相互作用し、ＢドメインとＧドメインのどちらも、直交型修飾を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない。
【００８３】
ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインの直交型修飾は、ＢドメインとＧドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。ある特定の態様では、操作されたジスルフィド架橋を生成するＢドメインおよびＧドメインの変異は、ＢドメインとＧドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、および他方のドメインにおける３４９Ｃである。
【００８４】
ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインの直交型修飾は、ノブ・イン・ホール変異を含む。ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインのノブ・イン・ホール変異は、ＢドメインとＧドメインの一方におけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに他方のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である。
【００８５】
ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインの直交型修飾は、電荷対変異を含む。ある特定の態様では、ＢドメインおよびＧドメインの電荷対変異は、ＢドメインとＧドメインの一方におけるＴ３６６Ｋ変異、および他方のドメインにおけるＬ３５１Ｄ変異である。
【００８６】
ある特定の態様では、ドメインＢおよびドメインＧは、ＩｇＭ  ＣＨ２アミノ酸配列またはＩｇＥ  ＣＨ２アミノ酸配列を有する。ある特定の態様では、ＩｇＭ  ＣＨ２アミノ酸配列またはＩｇＥ  ＣＨ２アミノ酸配列は、直交型修飾を含む。
【００８７】
ある特定の態様では、ドメインＩはＣＬ配列を有し、ドメインＭはＣＨ１配列を有する。ある特定の態様では、ドメインＩはＣＨ１配列を有し、ドメインＭはＣＬ配列を有する。ある特定の態様では、ＣＨ１配列およびＣＬ配列はそれぞれ、１つまたは複数の直交型修飾を含み、ＣＨ１配列を有するドメインは、直交型修飾を欠くＣＬ配列を有するドメインと有意に相互作用しない。
【００８８】
ある特定の態様では、直交型修飾は、少なくとも１つのＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含み、変異は、ＣＨ１配列の１３８位およびＣＬ配列の１１６位における操作されたシステイン；ＣＨ１配列の１２８位およびＣＬ配列の１１９位における操作されたシステイン、ならびにＣＨ１配列の１２９位およびＣＬ配列の２１０位における操作されたシステインからなる群から選択される。
【００８９】
ある特定の態様では、直交型修飾は、少なくとも１つのＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含み、変異は、ＣＨ１配列の１２８位およびＣＬカッパ配列の１１８位における操作されたシステインを含む。
【００９０】
ある特定の態様では、直交型修飾は、少なくとも１つのＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含み、変異は、ＣＬ配列におけるＦ１１８Ｃ変異と対応するＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｃ；ＣＬ配列におけるＦ１１８Ｃ変異と対応するＣＨ１配列におけるＬ１２８Ｃ；およびＣＬ配列におけるＳ１６２Ｃ変異と対応するＣＨ１配列におけるＰ１７１Ｃ変異からなる群から選択される。
【００９１】
ある特定の態様では、直交型修飾は、少なくとも１つのＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の電荷対変異を含み、電荷対変異は、ＣＬ配列におけるＦ１１８Ｓ変異と対応するＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｌ；ＣＬ配列におけるＦ１１８Ａ変異と対応するＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｌ；ＣＬ配列におけるＦ１１８Ｖ変異と対応するＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｌ；およびＣＬ配列におけるＴ１２９Ｒ変異と対応するＣＨ１配列におけるＫ１４７Ｄからなる群から選択される。
【００９２】
ある特定の態様では、直交型修飾は、少なくとも１つのＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の電荷対変異を含み、電荷対変異は、ＣＬ配列におけるＮ１３８Ｋ変異と対応するＣＨ１配列におけるＧ１６６Ｄ、およびＣＬ配列におけるＮ１３８Ｄ変異と対応するＣＨ１配列におけるＧ１６６Ｋからなる群から選択される。
【００９３】
ある特定の態様では、ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を有する。ある特定の態様では、ドメインＡはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＦはＶＬアミノ酸配列を有する。
【００９４】
ある特定の態様では、ドメインＨはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＬはＶＨアミノ酸配列を有する。ある特定の態様では、ドメインＨはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＬはＶＬアミノ酸配列を有する。
【００９５】
ある特定の態様では、ドメインＤおよびドメインＪは、ＣＨ２アミノ酸配列を有する。
【００９６】
ある特定の態様では、Ｅドメインは、ＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【００９７】
ある特定の態様では、ＥドメインおよびＫドメインのアミノ酸配列は同一であり、配列は内在性ＣＨ３配列である。
【００９８】
ある特定の態様では、ＥドメインおよびＫドメインのアミノ酸配列は異なる。ある特定の態様では、異なる配列は、それぞれ別個に直交型修飾を内在性ＣＨ３配列に含み、ＥドメインはＫドメインと相互作用し、ＥドメインとＫドメインのどちらも、直交型修飾を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない。
【００９９】
ある特定の態様では、直交型修飾は、ＥドメインとＫドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。ある特定の態様では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、ＥドメインとＫドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、および他方のドメインにおける３４９Ｃである。ある特定の態様では、ＥドメインおよびＫドメインにおける直交型修飾は、ノブ・イン・ホール変異を含む。ある特定の態様では、ノブ・イン・ホール変異は、ＥドメインまたはＫドメインの一方におけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに他方のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である。ある特定の態様では、ＥドメインおよびＫドメインにおける直交型修飾は、電荷対変異を含む。ある特定の態様では、電荷対変異は、ＥドメインまたはＫドメインの一方におけるＴ３６６Ｋ変異、および他方のドメインにおける対応するＬ３５１Ｄ変異である。
【０１００】
ある特定の態様では、ＥドメインおよびＫドメインのアミノ酸配列は、第１のポリペプチドと第３のポリペプチドとの間の特異的会合を促進する特異的相互作用を有するように選択された２つの異なる抗体ドメインの内在性配列である。ある特定の態様では、２つの異なるアミノ酸配列は、ＣＨ１配列およびＣＬ配列である。
【０１０１】
ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原結合分子は、第３の抗原結合部位をさらに含む。ある特定の態様では、第３の抗原結合部位は、ＲＯＲ抗原に特異的である。ある特定の態様では、第１の抗原結合部位および第３の抗原結合部位は、同じＲＯＲ抗原に特異的である。ある特定の態様では、第１の抗原結合部位および第３の抗原結合部位は、異なるＲＯＲ抗原に特異的である。
【０１０２】
ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原結合分子は、第５のポリペプチド鎖を含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＮおよびドメインＯをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＮは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＯは定常領域アミノ酸配列を有し；（ｂ）第５のポリペプチド鎖はドメインＰおよびドメインＱを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、ドメインＰは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＱは定常領域アミノ酸配列を有し；（ｃ）第１および第５のポリペプチドは、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用およびＯドメインとＱドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ抗原結合分子を形成する。
【０１０３】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＮおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＨのアミノ酸配列は、ドメインＮおよびドメインＡの配列と異なり、ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩのアミノ酸配列は、ドメインＯおよびドメインＢの配列と異なり、ドメインＰおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬのアミノ酸配列は、ドメインＰおよびドメインＦの配列と異なり、ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭのアミノ酸配列は、ドメインＱおよびドメインＧの配列と異なり；（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。ある特定の態様では、第１の抗原は、ＲＯＲ抗原である。ある特定の態様では、第２の抗原は、ＣＤ３抗原である。
【０１０４】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＮ、ドメインＡおよびドメインＨのアミノ酸配列は異なり、ドメインＯ、ドメインＢおよびドメインＩのアミノ酸配列は異なり、ドメインＰ、ドメインＦおよびドメインＬのアミノ酸配列は異なり、ドメインＱ、ドメインＧおよびドメインＭのアミノ酸配列は異なり；（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用は、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【０１０５】
ある特定の態様では、ＲＯＲ抗原結合分子は、第６のポリペプチド鎖を含み、（ａ）第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＲは可変領域アミノ酸配列を有し、ドメインＳは定常ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第６のポリペプチド鎖はドメインＴおよびドメインＵを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、ドメインＴは可変領域アミノ酸配列を有し、ドメインＵは定常ドメインアミノ酸配列を有し；（ｃ）第３および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ抗原結合分子を形成する。
【０１０６】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＲおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＨのアミノ酸配列は、ドメインＲおよびドメインＡの配列と異なり、ドメインＳおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩのアミノ酸配列は、ドメインＳおよびドメインＢの配列と異なり、ドメインＴおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬのアミノ酸配列は、ドメインＴおよびドメインＦの配列と異なり、ドメインＵおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭのアミノ酸配列は、ドメインＵおよびドメインＧの配列と異なり、（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し；ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。ある特定の態様では、第１の抗原は、ＲＯＲ抗原である。ある特定の態様では、第２の抗原は、ＣＤ３抗原である。
【０１０７】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＲおよびドメインＨのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＡのアミノ酸配列は、ドメインＲおよびドメインＨの配列と異なり、ドメインＳおよびドメインＩのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＢのアミノ酸配列は、ドメインＳおよびドメインＩの配列と異なり、ドメインＴおよびドメインＬのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＦのアミノ酸配列は、ドメインＴおよびドメインＬの配列と異なり、ドメインＵおよびドメインＭのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＧのアミノ酸配列は、ドメインＵおよびドメインＭの配列と異なり、（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。ある特定の態様では、第２の抗原は、ＲＯＲ抗原である。ある特定の態様では、第１の抗原は、ＣＤ３抗原である。
【０１０８】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＲ、ドメインＡおよびドメインＨのアミノ酸配列は異なり、ドメインＳ、ドメインＢおよびドメインＩのアミノ酸配列は異なり、ドメインＴ、ドメインＦおよびドメインＬのアミノ酸配列は異なり、ドメインＵ、ドメインＧおよびドメインＭのアミノ酸配列は異なり；（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用は、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【０１０９】
本明細書に記載されているＲＯＲ抗原結合分子のいずれかを含む、精製されたＲＯＲ抗原結合分子も本明細書に記載されている。ある特定の態様では、精製されたＲＯＲ抗原結合分子は、ＣＨ１親和性精製ステップを含む精製方法によって精製される。ある特定の態様では、精製方法は、単一ステップの精製方法である。
【０１１０】
本明細書に記載されているＲＯＲ抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤とを含む医薬組成物も本明細書に記載されている。
【０１１１】
がんを有する対象を処置するための方法であって、本明細書に記載されている医薬組成物のいずれかの治療有効量を投与するステップを含む方法も本明細書に記載されている。ある特定の態様では、がんは、膵がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、胃がん、黒色腫、ユーイング肉腫、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、Ｂ−ＡＬＬ、血液学的がん、前立腺がん、結腸がん、腎がんおよび子宮がんからなる群から選択される。
５．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１は、ＣＨ１−ＣＬと対になったＣＨ３−ＣＨ３  ＩｇＧ１二量体対のアラインメントを示す。四次構造は、約１．６Å２のＲＭＳＤで整列している。
【０１１３】
【図２】図２は、本明細書に記載の様々な結合分子（抗体構築物とも称される）について、それぞれの命名規則と共に、構成の概略図を示す。
【０１１４】
【図３】図３は、本明細書に記載の二価１×１抗体構築物について、それぞれの命名規則と共に、ポリペプチド鎖とそれらのドメインのより高解像度の概略図を示す。
【０１１５】
【図４】図４は、例示的な二価の単一特異性構築物の構成を示す。
【０１１６】
【図５】図５は、実施例１に記載のバイオレイヤー干渉（ｂｉｏｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、ＢＬＩ）実験からのデータを示し、ここでは、図４に示した構成を有する二価の単一特異性結合分子［ポリペプチド１：ＶＬ−ＣＨ３（ノブ）−ＣＨ２−ＣＨ３／ポリペプチド２：ＶＨ−ＣＨ３（ホール）］がアッセイされた。抗原結合部位は、ＴＮＦαに対して特異的であった。結合分子固定化および固定化された構築物へのＴＮＦα結合からのＢＬＩ応答は、抗原への頑強で特異的な二価結合を示す。データは、分子が、ポリペプチド１とポリペプチド２との意図された対形成を高いパーセンテージで有していることと一致する。
【０１１７】
【図６】図６は、例示的な二価の１×１二重特異性結合分子「ＢＣ１」の特徴を示す。
【０１１８】
【図７】図７Ａは、単一ステップのＣＨ１親和性精製ステップ（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂）により、ゲル濾過を介して、＞９８％が非凝集二価タンパク質である単一の単分散ピークが得られることを実証する、「ＢＣ１」のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）解析を示す。図７Ｂは、ＣｒｏｓｓＭａｂ二価抗体構築物のＳＥＣ解析の比較文献データ［Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，  ２０１１  Ｊｕｌ  ５；１０８（２７）：１１１８７−９２）からのデータ］を示す。
【０１１９】
【図８】図８Ａは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の「ＢＣ１」の陽イオン交換クロマトグラフィ溶出プロファイルであって、単一のタイトなピークが示されている。図８Ｂは、標準プロテインＡ精製を使用して精製した後の「ＢＣ１」の陽イオン交換クロマトグラフィの溶出プロファイルである。
【０１２０】
【図９】図９は、様々な精製段階での「ＢＣ１」の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１２１】
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、非還元および還元条件下の両方での単一ステップのＣＨ１−親和性精製後の「ＢＣ１」のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図１０Ａ）を、参照文献で公開されている非還元および還元条件下のＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図１０Ｂ）と比較した図である。
【０１２２】
【図１１−１】図１１Ａおよび１１Ｂは、還元条件下の２つの別個の重鎖（図１１Ａ）、および２つの別個の軽鎖（図１１Ｂ）を実証する「ＢＣ１」の質量分析の解析を示す。
【図１１−２】同上。
【０１２３】
【図１２】図１２は、精製後の不完全な対形成の非存在を確認する、非還元条件下で精製された「ＢＣ１」の質量分析の解析を示す。
【０１２４】
【図１３】図１３は、２つのＩｇＧ対照抗体と比較した、「ＢＣ１」の４０℃で８週間にわたる安定性を実証する、加速安定性試験データを示す。
【０１２５】
【図１４】図１４は、実施例３でさらに説明されている、例示的な二価１×１二重特異性結合分子「ＢＣ６」の特徴を示す。
【０１２６】
【図１５】図１５Ａは、単一ステップのＣＨ１親和性精製によって単一の単分散ピークが得られることと非共有結合凝集体が存在しないことを実証する、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用したワンステップ精製後の「ＢＣ６」のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）解析を示す。図１５Ｂは、非還元条件下での「ＢＣ６」のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１２７】
【図１６】図１６は、実施例４でさらに説明されている、例示的な二価の二重特異性結合分子「ＢＣ２８」の特徴を示す。
【０１２８】
【図１７】図１７は、「ＢＣ２８」、「ＢＣ２９」、「ＢＣ３０」、「ＢＣ３１」および「ＢＣ３２」の単一ステップのＣＨ１親和性精製後の非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。
【０１２９】
【図１８】図１８は、それぞれ、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用したワンステップ精製後の「ＢＣ２８」および「ＢＣ３０」のＳＥＣ解析を示す。
【０１３０】
【図１９】図１９は、実施例５でさらに説明されている、例示的な二価の二重特異性結合分子「ＢＣ４４」の特徴を示す。
【０１３１】
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂは、それぞれ加速安定性試験条件下での、２つの二価結合分子「ＢＣ１５」および「ＢＣ１６」のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）データを示す。「ＢＣ１５」および「ＢＣ１６」は、異なる可変領域−ＣＨ３ジャンクションを有する。
【０１３２】
【図２１】図２１は、本明細書に記載の三価２×１抗体構築物について、それぞれの命名規則と共に、５つのポリペプチド鎖とそれらのドメインの概略図を示し、ここで、命名規則に従って、鎖５は概略図で「第５のポリペプチド鎖」と命名されている。
【０１３３】
【図２２】図２２は、実施例７でさらに説明されている、例示的な三価２×１二重特異性結合分子「ＢＣ１−２×１」の特徴を示す。
【０１３４】
【図２３】図２３は、様々な精製段階で、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｅｘｐｉ２９３一過性トランスフェクション系を使用して発現された「ＢＣ１」および「ＢＣ１−２×１」タンパク質の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【０１３５】
【図２４】図２４は、Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）バイオレイヤー干渉解析を使用して、二価１×１構築物「ＢＣ１」のアビディティを、三価２×１構築物「ＢＣ１−２×１」のアビディティと比較したものである。
【０１３６】
【図２５】図２５は、三価２×１構築物「ＴＢ１１１」の顕著な特徴を示す。
【０１３７】
【図２６】図２６は、本明細書に記載の三価１×２抗体構築物について、それぞれの命名規則と共に、５つのポリペプチド鎖とそれらのドメインの概略図を示し、ここで、命名規則に従って、鎖５は概略図で「第６のポリペプチド鎖」と命名されている。
【０１３８】
【図２７】図２７は、実施例１０にさらに説明されている、例示的な三価１×２構築物「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」の特徴を示す。
【０１３９】
【図２８】図２８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、ここで非還元（「−ＤＴＴ」）および還元（「＋ＤＴＴ」）条件下の三価１×２構築物「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」構築物を示すレーンを枠で囲っている。
【０１４０】
【図２９】図２９は、２つの抗体：二価１×１構築物「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」および三価１×２構築物「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」の間の抗原結合の比較を示す。「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」は、ＣＴＬＡ４に一価的に結合する一方、「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」は、ＣＴＬＡ４に二価的に結合する。
【０１４１】
【図３０】図３０は、実施例１１にさらに説明されている、例示的な三価１×２三重特異性構築物「ＢＣ２８−１×１×１ａ」の特徴を示す。
【０１４２】
【図３１】図３１は、単一の明確に確定されるピークを示す、一過性発現および単一ステップのＣＨ１親和性樹脂精製後の「ＢＣ２８−１×１×１ａ」のサイズ排除クロマトグラフィを示す。
【０１４３】
【図３２】図３２は、実施例１２でさらに説明されるように、それぞれ一過性発現およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の二価および三価構築物の、非還元および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【０１４４】
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｃは、３つの抗原：ＰＤ１、抗原「Ａ」およびＣＴＬＡ４へのＯｃｔｅｔ結合分析を示す。実施例１３でさらに説明されるように、図３３Ａは、「ＢＣ１」の、ＰＤ１および抗原「Ａ」への結合を示し；図３３Ｂは、二価二重特異性構築物「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」の、ＣＴＬＡ４、抗原「Ａ」およびＰＤ１への結合を示し；図３３Ｃは、三価三重特異性「ＢＣ２８−１×１×１ａ」の、ＰＤ１、抗原「Ａ」およびＣＴＬＡ４への結合を示す。
【０１４５】
【図３４】図３４は、本明細書に記載の特定の四価２×２構築物について、それぞれの命名規則と共に、６つのポリペプチド鎖とそれらのドメインの概略図を示す。
【０１４６】
【図３５】図３５は、実施例１４にさらに説明されている、例示的な四価２×２構築物「ＢＣ２２−２×２」の特定の顕著な特徴を示す。
【０１４７】
【図３６】図３６は、様々な精製段階で、２×２四価「ＢＣ２２−２×２」構築物を、１×２三価構築物「ＢＣ１２−１×２」および２×１三価構築物「ＢＣ２１−２×１」と比較する、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【０１４８】
【図３７】図３７は、例示的な四価２×２構築物の構成を示す。
【０１４９】
【図３８】図３８は、本明細書に記載の特定の四価構築物について、それぞれの命名規則と共に、６つのポリペプチド鎖とそれらのドメインの概略図を示し、ここで、命名規則に従って、鎖５は概略図で「第７のポリペプチド鎖」と命名されており、鎖６は「第８のポリペプチド鎖」と命名されている。
【０１５０】
【図３９】図３９は、二重特異性四価構築物の例示的な構成を示す。
【０１５１】
【図４０】図４０は、共通軽鎖ストラテジーを利用した三重特異性四価構築物についての例示的な構成を示す。
【０１５２】
【図４１】図４１は、図３９に概略化された四価構築物による二重特異性抗原係合を示し、この構築物が同時係合できたことを実証する。Ｂ−Ｂｏｄｙ固定化および固定化された構築物へのＴＮＦα結合からのバイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）応答は、分子が、意図された鎖の対形成を高いパーセンテージで有していることと一致する。
【０１５３】
【図４２】図４２は、Ｂ−Ｂｏｄｙの細胞表面抗原への結合のフローサイトメトリー解析を示す。網掛けで示すシグナルは、抗原なしの細胞を示し；ドットで示すシグナルは、表面抗原で一過性にトランスフェクトされた細胞を示す。
【０１５４】
【図４３】図４３は、三価構築物の例示的な構成を示す。
【０１５５】
【図４４】図４４は、三価構築物の例示的な構成を示す。
【０１５６】
【図４５】図４５は、実施例１７でさらに説明されているように、それぞれ一過性発現およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の二価および三価構築物の、非還元および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【０１５７】
【図４６】図４６は、ジャンクションバリアントの対形成安定性を評価するために測定された「ＢＣ２４ｊｖ」、「ＢＣ２６ｊｖ」および「ＢＣ２８ｊｖ」の熱転移の差異を示す。
【０１５８】
【図４７】図４７は、変異誘発されていないＳＰ３４−８９一価Ｂ−ｂｏｄｙについてのＣＤ３への結合親和性を決定するために使用される２倍段階希釈（２００〜１２．５ｎＭ）のＯｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）バイオレイヤー干渉解析を示す。
【０１５９】
【図４８−１】図４８Ａ〜４８Ｂは、２つのＲＯＲ抗原結合部位候補（図４８ＡのクローンＩ２−Ａ１０；図４８ＢのクローンＩ２−Ａ２７）についてのＲＯＲ１への結合親和性を決定するために使用される２倍段階希釈（２００〜１２．５ｎＭ）のＯｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）バイオレイヤー干渉解析を示す。
【図４８−２】同上。
【０１６０】
【図４９】図４９は、ＲＯＲ×ＣＤ３二重特異性１×１および１×２  Ｂ−ｂｏｄｙが、ＲＯＲ１発現腫瘍株（ＨＯＰ−９２）と混合した場合にレポーターＴ細胞の活性化をもたらしたが、ＲＯＲ１を発現しない腫瘍株（Ｂ１６）と混合した場合には活性化をもたらさなかったことを示す。
【０１６１】
【図５０】図５０は、ＲＯＲ×ＣＤ３二重特異性Ｉ２Ａ−１０  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙが、ＲＯＲ１発現腫瘍株（ＭＤＡ−ＭＤ−２３１）と混合した場合に細胞傷害性Ｔ細胞媒介性殺傷をもたらしたが、無関係の腫瘍ＡＢＳ（例えば、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１で発現されない腫瘍抗原）を有するＣＤ３二重特異性Ｂ−ｂｏｄｙが混合物に添加された場合には細胞傷害性をもたらさなかったことを示す。
【０１６２】
【図５１−１】図５１Ａ〜５１Ｅは、ＲＯＲ×ＣＤ３二重特異性Ｉ２Ａ−３  １×１および１×２  Ｂ−ｂｏｄｙが、ＲＯＲ１発現腫瘍株のＨＯＰ−９２（図５１Ａ）、Ａ５４９（図５１Ｂ）、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１（図５１Ｃ）、ＪｅＫｏ−１（図５１Ｄ）およびＲＰＭＩ−８２２６（図５１Ｅ）と混合した場合にレポーターＴ細胞の活性化をもたらしたが、ＲＯＲ１を発現しない腫瘍株（Ｂ１６）と混合した場合には活性化をもたらさなかったことを示す。
【図５１−２】同上。
【図５１−３】同上。
【図５１−４】同上。
【図５１−５】同上。
【０１６３】
【図５２】図５２は、ＲＯＲ×ＣＤ３二重特異性１×２  Ｂ−ｂｏｄｙのＩ２Ａ−１、Ｉ２Ａ−３、Ｉ２Ａ−１０、Ｉ２Ａ−１４、Ｉ２Ａ−２２およびＩ２Ａ−２７が、ＲＯＲ１発現腫瘍株（ＭＤＡ−ＭＤ−２３１）と混合した場合には細胞傷害性Ｔ細胞媒介性殺傷をもたらしたが、１×２  Ｂ−ｂｏｄｙのＩ２Ａ−１６およびＩ２Ａ−２２は強い細胞傷害性をもたらさなかったことを示す。
【０１６４】
【図５３−１】図５３Ａは、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１およびＲＰＭＩ−８２２６腫瘍株について公表されたＲＯＲ１発現データを示す。図５３Ｂおよび図５３Ｃは、細胞傷害性効果がＭＤＡ−ＭＤ−２３１およびＲＰＭＩ−８２２６腫瘍細胞系のＲＯＲ１と相関することを示す。
【図５３−２】同上。
【０１６５】
【図５４−１】図５４Ａ〜５４Ｆは、ＣＤ２５（図５４Ａ）、ＣＤ６９（図５４Ｃ）、およびＣＤ２５とＣＤ６９の両方（図５４Ｅ）を定量化することによって判定した場合にＩ２Ａ−１０およびＩ２Ａ−２７のＢ−ｂｏｄｙがＰＢＭＣ集団におけるＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化したこと、ならびにＣＤ２５（図５４Ｂ）、ＣＤ６９（図５４Ｄ）、およびＣＤ２５とＣＤ６９の両方（図５４Ｆ）を定量化することによって判定した場合にＰＢＭＣ集団におけるＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化したことを示す。
【図５４−２】同上。
【図５４−３】同上。
【０１６６】
【図５５】図５５は、候補のＩ２Ａ−１０（上パネル）およびＩ２Ａ−２７（下パネル）のそれぞれ２６％および３６％が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞との２時間インキュベーション後に内部移行したことを示す。
【０１６７】
【図５６】図５６は、単一ステップのＣＨ１親和性精製ステップにより、ゲル濾過を介して、単一の単分散ピークが得られることを実証する、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）解析を示し、ここでは、１×２  Ｂ−ｂｏｄｙ候補のＩ２Ａ−１０（上パネル）およびＩ２Ａ−２７（下パネル）の非凝集タンパク質が９８％を超えている。
【０１６８】
【図５７】図５７Ａは、完全にアセンブルされた構築物の主要なバンド（高移動性２５０ｋＤａバンド）を実証する、１×２  Ｂ−ｂｏｄｙ候補のＩ２Ａ−１０（左パネル）およびＩ２Ａ−２７（右パネル）の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１６９】
図５７Ｂは、完全にアセンブルされた構築物の主要なバンドを実証する、１×２  Ｂ−ｂｏｄｙ候補のＩ２Ａ−１０およびＩ２Ａ−２７の非還元試料のＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）解析を示す。
【０１７０】
【図５８】図５８は、単一ステップのＣＨ１親和性精製ステップ（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂）を使用して精製された二重特異性抗体のＦｃ部分内の天然位置で確認された、ＣＨ３ドメインに導入された標準ノブ・ホール直交型変異を含む二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。
【０１７１】
【図５９】図５９Ａ〜５９Ｂは、トラスツズマブへのＦｃγＲＩａ結合（図５９Ａ「ＷＴ  ＩｇＧ１」）を実証し、ｓＦｃ１０への結合はない（図５９Ｂ）ことを実証するＯｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）バイオレイヤー干渉解析を示す。
【０１７２】
【図６０】図６０は、ＡＤＣＣアッセイにおけるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、「ＷＴ−ＩｇＧ１」）による殺傷を示すが、ｓＦｃ７またはｓＦｃ１０による殺傷は示さない。
【０１７３】
【図６１】図６１は、Ｃ１ｑ  ＥＬＩＳＡにおけるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、「ＷＴ−ＩｇＧ１」）によるＣ１ｑ結合を示すが、ｓＦｃ１、ｓＦｃ７またはｓＦｃ１０による結合は示さない。
【０１７４】
【図６２】図６２Ａ〜６２Ｃは、腫瘍細胞を移植し、ＰＢＭＣでヒト化し（左実線矢印）、その後続いてＰＢＳ（図６２Ａ）、１×２  Ｂ−ｂｏｄｙ候補Ｉ２−Ａ１０（図６２Ｂ）、または１×２  Ｂ−ｂｏｄｙ候補Ｉ２−Ａ２７（図６２Ｃ）でＩＶを処置（右破線矢印）したマウスについてモニターした腫瘍体積を示す。
【０１７５】
【図６３】図６３は、各マウスの研究の終了時の腫瘍体積を示し、各群の平均および標準偏差を示している。Ｉ２−Ａ２７群の白色四角形は、ＰＭＢＣによる非ヒト化の可能性があるため、解析から除いた。
【０１７６】
【図６４】図６４Ａは、ＳＰ３４−８９のＪｕｒｋａｔ細胞およびカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）Ｔ細胞への結合を示す。図６４Ｂは、Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二重特異性抗体のカニクイザルＣＤ３デルタおよびイプシロンヘテロ二量体への結合を示す。
【０１７７】
【図６５−１】図６５Ａは、一価結合アッセイにおけるＩ２−Ａ２７  ＩｇＧ抗体のＲＯＲ１への結合を示す。図６５Ｂは、Ｉ２−Ａ２７  ＩｇＧ抗体のＲＯＲ２への最小結合を示す。図６５Ｃは、一価結合アッセイにおけるＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のＲＯＲ１への結合を示す。図６５Ｄは、Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のＲＯＲ２への最小結合を示す。図６５Ｅは、二価結合アッセイにおけるＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のＲＯＲ１への結合を示す。
【図６５−２】同上。
【図６５−３】同上。
【０１７８】
【図６６−１】図６６Ａは、Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のＳＥＣ解析を示す。図６６Ｂは、Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のＳＭＡＣ解析を示す。図６６Ｃは、Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のＨＩＣ解析を示す。
【図６６−２】同上。
【０１７９】
【図６７−１】図６７Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＲＯＲ１発現）細胞を用いたＪｕｒｋａｔアッセイにおけるＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の活性を示す。図６７Ｂは、ＲＰＭＩ−８２２６（ＲＯＲ１およびＲＯＲ２発現）細胞を用いたＪｕｒｋａｔアッセイにおけるＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の活性を示す。図６７Ｃは、Ｋ５６２（ＲＯＲ２発現）細胞を用いたＪｕｒｋａｔアッセイにおけるＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の不活性を示す。図６７Ｄは、標的細胞系の非存在下でのＪｕｒｋａｔアッセイにおけるＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の不活性を示す。
【図６７−２】同上。
【０１８０】
【図６８−１】図６８Ａは、様々な濃度のＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるＣＤ６９発現を示す。図６８Ｂは、様々な濃度のＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＲＰＭＩ−８２２６細胞によるＣＤ６９発現を示す。図６８Ｃは、様々な濃度のＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるＣＤ２５発現を示す。図６８Ｄは、様々な濃度のＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＲＰＭＩ−８２２６細胞によるＣＤ２５発現を示す。
【図６８−２】同上。
【０１８１】
【図６９】図６９Ａは、様々な濃度のＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるＬＤＨ放出を示す。図６９Ｂは、様々な濃度のＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＲＰＭＩ−８２２６細胞によるＬＤＨ放出を示す。
【０１８２】
【図７０−１】図７０Ａは、様々な濃度のＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるグランザイムＢを示す。図７０Ｂは、様々な濃度のＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＲＰＭＩ−８２２６細胞によるグランザイムＢを示す。図７０Ｃは、様々な濃度のＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるＴＮＦα分泌を示す。図７０Ｄは、様々な濃度のＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＲＰＭＩ−８２２６細胞によるＴＮＦα分泌を示す。図７０Ｅは、様々な濃度のＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるＩＦＮγ放出を示す。図７０Ｆは、様々な濃度のＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＲＰＭＩ−８２２６細胞によるＩＦＮγ放出を示す。
【図７０−２】同上。
【図７０−３】同上。
【０１８３】
【図７１】図７１Ａは、４℃または３７℃で１週間、ヒト血清に保存されたＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）試料の活性を示す。図７１Ｂは、ＲＯＲ１発現細胞の非存在下でのＪｕｒｋａｔアッセイにおける試料の不活性を示す。
【０１８４】
【図７２】図７２は、加速条件下でのＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）試料の安定性アッセイを示す。
【０１８５】
【図７３】図７３は、リアルタイム条件下でのＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）試料の安定性アッセイを示す。
【０１８６】
【図７４】図７４は、Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の酸安定性アッセイを示す。
【０１８７】
【図７５】図７５は、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のカニクイザルＣＤ３デルタおよびイプシロンヘテロ二量体への結合を示す。
【０１８８】
【図７６−１】図７６Ａは、一価結合アッセイにおけるＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  ＩｇＧ抗体のＲＯＲ１への結合を示す。図７６Ｂは、一価結合アッセイにおけるＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  ＩｇＧのＲＯＲ２への結合を示す。図７６Ｃは、一価結合アッセイにおけるＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のＲＯＲ１への結合を示す。図７６Ｄは、一価結合アッセイにおけるＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のＲＯＲ２への結合を示す。図７６Ｅは、二価結合アッセイにおけるＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のＲＯＲ１への結合を示す。図７６Ｆは、二価結合アッセイにおけるＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のＲＯＲ２への結合を示す。
【図７６−２】同上。
【図７６−３】同上。
【０１８９】
【図７７】図７７は、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の、ＲＯＲ１のＩｇ様ドメインへの結合を示す。
【０１９０】
【図７８−１】図７８Ａは、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のＳＥＣ解析を示す。図７８Ｂは、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のＳＭＡＣ解析を示す。図７８Ｃは、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のＨＩＣ解析を示す。
【図７８−２】同上。
【０１９１】
【図７９−１】図７９Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＲＯＲ１発現）細胞を用いたＪｕｒｋａｔアッセイにおけるＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の活性を示す。図７９Ｂは、ＲＰＭＩ−８２２６（ＲＯＲ１およびＲＯＲ２発現）細胞を用いたＪｕｒｋａｔアッセイにおけるＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の活性を示す。図７９Ｃは、Ｋ５６２（ＲＯＲ２発現）細胞を用いたＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の活性を示す。図７９Ｄは、標的細胞系の非存在下でのＪｕｒｋａｔアッセイにおけるＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の不活性を示す。
【図７９−２】同上。
【０１９２】
【図８０−１】図８０Ａは、様々な濃度のＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるＣＤ６９発現を示す。図８０Ｂは、様々な濃度のＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）ならびにＲＯＲ１およびＲＯＲ２発現ＲＰＭＩ−８２２６細胞によるＣＤ６９発現を示す。図８０Ｃは、様々な濃度のＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるＣＤ２５発現を示す。図８０Ｄは、様々な濃度のＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）ならびにＲＯＲ１およびＲＯＲ２発現ＲＰＭＩ−８２２６細胞によるＣＤ２５発現を示す。
【図８０−２】同上。
【０１９３】
【図８１】図８１Ａは、様々な濃度のＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるＬＤＨ放出を示す。図８１Ｂは、様々な濃度のＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）ならびにＲＯＲ１およびＲＯＲ２発現ＲＰＭＩ−８２２６細胞によるＬＤＨ放出を示す。
【０１９４】
【図８２−１】図８２Ａは、様々な濃度のＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるグランザイムＢを示す。図８２Ｂは、様々な濃度のＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）ならびにＲＯＲ１およびＲＯＲ２発現ＲＰＭＩ−８２２６細胞によるグランザイムＢを示す。図８２Ｃは、様々な濃度のＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙおよびＲＯＲ１発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるＴＮＦα分泌を示す。図８２Ｄは、様々な濃度のＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）ならびにＲＯＲ１およびＲＯＲ２発現ＲＰＭＩ−８２２６細胞によるＴＮＦα分泌を示す。図８２Ｅは、様々な濃度のＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるＩＦＮγ分泌を示す。図８２Ｆは、様々な濃度のＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）ならびにＲＯＲ１およびＲＯＲ２発現ＲＰＭＩ−８２２６細胞によるＩＦＮγ分泌を示す。
【図８２−２】同上。
【図８２−３】同上。
【０１９５】
【図８３】図８３Ａは、４℃または３７℃で１週間、ヒト血清に保存されたＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）試料の活性を示す。図８３Ｂは、ＲＯＲ１発現細胞の非存在下でのＪｕｒｋａｔアッセイにおける試料の不活性を示す。
【０１９６】
【図８４】図８４は、加速条件下でのＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）試料の安定性アッセイを示す。
【０１９７】
【図８５】図８５は、リアルタイム条件下でのＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）試料の安定性アッセイを示す。
【０１９８】
【図８６】図８６は、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の酸安定性アッセイを示す。
【０１９９】
【図８７】図８７は、Ｉ２−２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）が、がんのマウスモデルの腫瘍体積（ｍｍ３）を減少させるｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を示す。
【０２００】
【図８８】図８８は、Ｉ２−２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の複数回投与が、がんのマウスモデルの腫瘍体積（ｍｍ３）を減少させるｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を示す。
【発明を実施するための形態】
【０２０１】
図面は、例示の目的のためのみに、本発明の様々な実施形態を示している。当業者は、本明細書に例示された構造および方法の代替的実施形態が、本明細書に記載の本発明の原理から逸脱することなく利用しうることを以下の説明から容易に認識する。
６．詳細な説明
６．１．定義
【０２０２】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解されている意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、下記で与えられる意味を有する。
【０２０３】
「抗原結合部位」は、所与の抗原またはエピトープを特異的に認識するまたはそれに特異的に結合するＲＯＲ結合分子の領域を意味する。
【０２０４】
「Ｂ−ｂｏｄｙ」は、本明細書で使用される場合、また、図３を参照すると、第１および第２のポリペプチド鎖の特色を含む結合分子であって、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢはＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する、結合分子を指す。Ｂ−ｂｏｄｙは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５７２６８により詳細に記載されている。
【０２０５】
本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置」という用語は、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指し、ここで目的は、多発性硬化症、関節炎またはがんの進行などの望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速（軽減）することである。有益または望ましい臨床結果としては、検出可能であろうとまたは検出不能であろうと、症状の緩和、疾患の範囲の縮減、疾患の安定した（つまり、悪化していない）状態、疾患の進行の遅延または減速、疾患の状態の回復または緩和、および寛解（部分的寛解または完全寛解）が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けない場合の予測生存期間と比較した生存期間の延長も意味しうる。処置を必要とする対象には、すでに状態もしくは障害に罹患している対象、ならびに状態もしくは障害を有する傾向にある対象、または状態もしくは障害を予防すべき状態にある対象が含まれる。
【０２０６】
「対象」、「個体」、「動物」、「患者」または「哺乳動物」は、診断、予防または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家庭用動物、農業用動物、ならびに動物園、スポーツまたはペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛などが含まれる。
【０２０７】
「十分な量」という用語は、所望の効果を生じさせるために十分な量、例えば、細胞内のタンパク質凝集を調節するために十分な量を意味する。
【０２０８】
「治療有効量」は、疾患の症状を改善するために有効な量である。予防が治療と考えることができるように、治療有効量は「予防有効量」であることができる。
６．２．その他の解釈上の規則
【０２０９】
別途指定しない限り、本明細書における配列に対する全ての参照は、アミノ酸配列に対するものである。
【０２１０】
別途指定しない限り、抗体定常領域残基ナンバリングは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ＃ｒｅｆｓ（２０１７年８月２２日にアクセス）およびＥｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ＵＳＡ，  ６３：７８−８５  （１９６９）に記載のＥｕインデックスに従い、本明細書に記載されるＲＯＲ結合分子の鎖内の残基の物理的な位置にかかわらず、内在性定常領域配列におけるその位置にしたがって残基を識別する。「内在性配列」または「天然配列」は、生物、組織、または細胞に由来し、人工的に修飾または変異されていない、核酸およびアミノ酸配列の両方を含む任意の配列を意味する。
【０２１１】
ポリペプチド鎖番号（例えば、「第１の」ポリペプチド鎖、「第２の」ポリペプチド鎖等、またはポリペプチド「鎖１」、「鎖２」等）は、結合分子を形成する特定のポリペプチド鎖に特有の識別子として本明細書で使用され、結合分子内の異なるポリペプチド鎖の順序または含量の暗示を意図するものではない。
【０２１２】
この開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその言語的変化形は、米国特許法でそれらが帰する意味を有し、明示的に列挙されている成分以外のさらなる成分の存在を許容する。
【０２１３】
本明細書で提供される範囲は、列挙される端点を含む範囲内の全ての値についての省略表現と理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０からなる群からの任意の数、数の組合せ、または部分範囲を含むと理解される。
【０２１４】
特に明記されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される「または」という用語は、包括的であると理解される。特に明記されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語は、単数または複数であると理解される。
【０２１５】
特に明記されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される「約」という用語は、当技術分野で通常許容される範囲内、例えば、平均の２標準偏差以内と理解される。約は、示された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％以内と理解することができる。文脈から明らかでない限り、本明細書で提供される全ての数値は、約という用語によって修飾されている。
６．３．ＲＯＲ抗原結合分子
【０２１６】
第１の態様では、抗原結合分子が提供される。全ての実施形態では、抗原結合分子は、ＲＯＲ抗原に特異的な少なくとも第１の抗原結合部位を含む；したがって、結合分子は、ＲＯＲ抗原結合分子と命名される。
【０２１７】
本明細書に記載されているＲＯＲ結合分子は、ＲＯＲ抗原に特異的に結合する。
【０２１８】
本明細書で使用される場合、「ＲＯＲ抗原」は、メンバーＲＯＲ１およびＲＯＲ２を含む、チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ）ファミリーのメンバーを指す。ある特定の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、ＲＯＲ１のみに特異的に結合する抗原結合部位を有する。他の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、ＲＯＲ２のみに特異的に結合する抗原結合部位を有する。さらに他の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、交差反応性があり、ＲＯＲ１およびＲＯＲ２の両方に特異的に結合する、抗原結合部位を有する。
【０２１９】
ＲＯＲ１およびＲＯＲ２タンパク質は典型的に、少なくとも４つのタンパク質ドメインからなる：３つの細胞外ドメイン（Ｉｇ様、ＦＺおよびＫｒｉｎｇｌｅドメイン）と共に細胞内タンパク質キナーゼドメイン。一部の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、ＲＯＲ抗原の細胞外部分に特異的に結合する抗原結合部位を有する。ある特定の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、Ｉｇ様ドメインに特異的に結合する抗原結合部位を有する。他の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、ＦＺドメインに特異的に結合する抗原結合部位を有する。さらに他の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、Ｋｒｉｎｇｌｅドメインに特異的に結合する抗原結合部位を有する。特定の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、単一のＲＯＲドメインの少なくとも一部分に特異的に結合する抗原結合部位を有する。特定の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、第１および第２のＲＯＲドメインの間のジャンクションなど、２つ以上のＲＯＲドメインの少なくとも一部分に特異的に結合する抗原結合部位を有する。ＲＯＲドメインは、ＲＯＲ１ドメインまたはＲＯＲ２ドメインを指すことができる。
【０２２０】
特定の実施形態では、ＲＯＲ抗原は、ヒトである。ＵｎｉＰｒｏｔ受託＃Ｑ０１９７３は、その配列およびドメイン特色を含む正準ヒトＲＯＲ１タンパク質を表し、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列番号９４は、全長ＲＯＲ１タンパク質配列を提供する。全長配列をＮ末端からＣ末端へと参照すると、Ｉｇ様ドメインはとアミノ酸４２〜１４７として、ＦＺドメインはアミノ酸１６５〜２９９として、Ｋｒｉｎｇｌｅドメインはアミノ酸３１２〜３９１として定義される。ＵｎｉＰｒｏｔ受託＃Ｑ０１９７４は、その配列およびドメイン特色を含む正準ヒトＲＯＲ２タンパク質を表し、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列番号９５は、全長ＲＯＲ２タンパク質配列を提供する。全長配列をＮ末端からＣ末端へと参照すると、Ｉｇ様ドメインはアミノ酸５５〜１４５として、ＦＺドメインはアミノ酸１６９〜３０３として、Ｋｒｉｎｇｌｅドメインはアミノ酸３１６〜３９４として定義される。
【０２２１】
それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｎｔｉｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；  ７１（８）  Ａｐｒｉｌ  １５，  ２０１１）、Ｒｅｂａｇａｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｆｒｏｎｔ．  Ｏｎｃｏｌ．，  １８  Ａｐｒｉｌ  ２０１２）、Ｚｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １８１，  Ｎｏ．  ６，  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１２）、Ｈｅｎｒｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，  Ｖｏｌ．  ６，  Ｎｏ．  ３７  ２０１５）、Ｚｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（３）：  ｅ３１１２７．）およびＢａｉｎｂｒｉｄｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（７）：  ｅ１０２６９５．）にさらに詳細に記載される通り、様々な腫瘍が、ＲＯＲ抗原の細胞表面発現を実証することができる。加えて、その全体が本明細書に組み込まれるＢａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１７  Ｊｕｎ  １５；  ２３（１２）：  ３０６１−３０７１）に記載されている通り、ＲＯＲ発現は、正常、すなわち、非がん性組織において発現されないまたは限定的な発現のみを実証することができる。よって、ＲＯＲ抗原は、ある特定の腫瘍において腫瘍特異的マーカーとして使用することができる。実証されたＲＯＲ発現を有する腫瘍およびがんの例としては、その全体が本明細書に組み込まれるＧｏｈｉｌ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０１７；  ６（７）：  ｅ１３２６４３７．）に記載されている通り、膵がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、胃がん、黒色腫、ユーイング肉腫、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫およびＢ−ＡＬＬが挙げられるがこれらに限定されない。他のがんとしては、血液学的がん、前立腺がん、結腸がん、腎がんおよび子宮がんが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２２２】
様々な実施形態では、ＲＯＲ結合分子はその上、ＲＯＲ抗原に追加して少なくとも１つの抗原に特異的に結合する。
【０２２３】
特定の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、二特異性二価分子である。別の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、二特異性三価分子である。特定の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、ＲＯＲ抗原およびＴ細胞表面に発現される分子に特異的に結合する抗原結合部位を有する。特定の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、ＲＯＲ抗原およびＴ細胞表面に発現されるタンパク質ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を有する。理論に制約されることは望まないが、ＲＯＲ抗原およびＴ細胞表面に発現される分子（すなわち、ＣＤ３）に特異的に結合するＲＯＲ結合分子は、Ｔ細胞をＲＯＲ発現細胞（すなわち、標的細胞）に再び方向付けることにより、ＲＯＲ抗原を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅（細胞傷害性）を方向付けることができる。二特異性抗ＣＤ３分子を使用したＴ細胞媒介性死滅は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０１９３８５２号に詳細に記載されている。一部の実施形態では、Ｔ細胞表面に発現される分子は、Ｔ細胞を標的細胞に再び方向付けることができるいずれかの分子から選択される。
【０２２４】
図３を参照すると、一連の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み：（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＧは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩはＣＬアミノ酸配列を有し、ドメインＪおよびＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチド鎖はＣＨ１ドメインを含み、ドメインＭはＣＨ１ドメインまたはその部分であり；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ結合分子を形成する。
【０２２５】
一連の実施形態では、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＧは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、第３のポリペプチド鎖はＣＨ１ドメインを含み、ドメインＩはＣＨ１ドメインまたはその部分であり、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪおよびＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭはＣＬアミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ結合分子を形成する。
６．３．１．ドメインＡ（可変領域）
【０２２６】
ＲＯＲ結合分子において、ドメインＡは可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。本明細書に記載されている可変領域ドメインアミノ酸配列は、ＶＬおよびＶＨ抗体ドメイン配列を含む抗体の可変領域ドメインアミノ酸配列である。ＶＬおよびＶＨ配列は、それぞれセクション６．３．１．１および６．３．１．４でさらになお詳細に後述される。好まれる実施形態では、ドメインＡはＶＬ抗体ドメイン配列を有し、ドメインＦはＶＨ抗体ドメイン配列を有する。
６．３．１．１．ＶＬ領域
【０２２７】
本明細書に記載のＲＯＲ結合分子において有用なＶＬアミノ酸配列は、抗体軽鎖可変ドメイン配列である。本明細書に記載の天然抗体および抗体構築物の両方における典型的な配列では、特定のＶＬアミノ酸配列が、特定のＶＨアミノ酸配列と会合して、抗原結合部位を形成する。様々な実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、下記セクション６．３．１．２および６．３．１．３においてさらに詳細に記載されているように、ヒト配列、合成配列、または、ヒト配列、非ヒト哺乳動物配列、哺乳動物配列および／もしくは合成配列の組合せを含む、哺乳動物配列である。
【０２２８】
様々な実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、天然に存在する配列の変異配列である。ある特定の実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、ラムダ（λ）軽鎖可変ドメイン配列である。ある特定の実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、カッパ（κ）軽鎖可変ドメイン配列である。好ましい実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、カッパ（κ）軽鎖可変ドメイン配列である。
【０２２９】
本明細書に記載のＲＯＲ結合分子では、ドメインＡのＣ末端は、ドメインＢのＮ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、ドメインＡは、下記セクション６．３．１９．１および実施例６においてさらに詳細に記載されているように、ドメインＡとドメインＢとの間のジャンクションにおいてそのＣ末端で変異しているＶＬアミノ酸配列を有する。
６．３．１．２．相補性決定領域
【０２３０】
ＶＬアミノ酸配列は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と称される高度に可変性の配列、典型的に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤ２、およびＣＤＲ３）を含む。様々な実施形態では、ＣＤＲは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＤＲは、ヒト配列である。様々な実施形態では、ＣＤＲは、天然に存在する配列である。様々な実施形態では、ＣＤＲは、特定の抗原またはエピトープに対して抗原結合部位の結合親和性を変化させるように変異された天然に存在する配列である。ある特定の実施形態では、天然に存在するＣＤＲは、親和性成熟および体細胞超変異を介してｉｎ  ｖｉｖｏ宿主で変異されている。ある特定の実施形態では、ＣＤＲは、ＰＣＲ突然変異誘発および化学的突然変異誘発を含むがこれらに限定されない方法を介してｉｎ  ｖｉｔｒｏで変異されている。様々な実施形態では、ＣＤＲは、ランダム配列ＣＤＲライブラリおよび合理的に設計されたＣＤＲライブラリから得られたＣＤＲを含むがこれらに限定されない、合成配列である。
６．３．１．３．フレームワーク領域およびＣＤＲグラフト化
【０２３１】
ＶＬアミノ酸配列は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）配列を含む。ＦＲは、一般的に、散在されたＣＤＲの足場として作用する保存配列領域（セクション６．３．１．２．参照）であり、典型的には、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４配置（Ｎ末端からＣ末端へ）である。様々な実施形態では、ＦＲは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＦＲは、ヒト配列である。様々な実施形態では、ＦＲは、天然に存在する配列である。様々な実施形態では、ＦＲは、合理的に設計された配列を含むがそれに限定されない、合成配列である。
【０２３２】
様々な実施形態では、ＦＲおよびＣＤＲは両方が、同じ天然に存在する可変ドメイン配列に由来する。様々な実施形態では、ＦＲおよびＣＤＲは、異なる可変ドメイン配列に由来し、ここでＣＤＲはＦＲ足場にグラフト化され、ＣＤＲが特定の抗原に対する特異性を提供している。ある特定の実施形態では、グラフト化されたＣＤＲは全て、同じ天然に存在する可変ドメイン配列に由来する。ある特定の実施形態では、グラフト化されたＣＤＲは、異なる可変ドメイン配列に由来する。ある特定の実施形態では、グラフト化されたＣＤＲは、ランダム配列ＣＤＲライブラリおよび合理的に設計されたＣＤＲライブラリから得られたＣＤＲを含むがこれらに限定されない、合成配列である。ある特定の実施形態では、グラフト化されたＣＤＲおよびＦＲは、同じ種に由来する。ある特定の実施形態では、グラフト化されたＣＤＲおよびＦＲは、異なる種に由来する。好ましいグラフト化されたＣＤＲ実施形態では、抗体は「ヒト化」されており、ここで、グラフト化されたＣＤＲは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバおよびヤギ配列を含むがこれらに限定されない非ヒト哺乳動物配列であり、ＦＲはヒト配列である。ヒト化抗体は、教示する全てについてその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４０７，２１３号においてより詳細に議論されている。様々な実施形態では、ある種に由来するＦＲの部分または特定の配列は、別の種のＦＲの部分または特定の配列を置き換えるために使用される。
６．３．１．４．ＶＨ領域
【０２３３】
本明細書に記載されているＲＯＲ結合分子におけるＶＨアミノ酸配列は、抗体重鎖可変ドメイン配列である。天然のおよび本明細書に記載されているＲＯＲ結合分子の両方の典型的な抗体配置において、特定のＶＨアミノ酸配列は、特定のＶＬアミノ酸配列と会合して、抗原結合部位を形成する。様々な実施形態では、セクション６．３．１．２および６．３．１．３にさらに詳細に上述されている通り、ＶＨアミノ酸配列は、ヒト配列を含む哺乳動物配列、合成配列、または非ヒト哺乳動物、哺乳動物および／または合成配列の組合せである。様々な実施形態では、ＶＨアミノ酸配列は、天然に存在する配列の変異した配列である。
６．３．２．ドメインＢ（定常領域）
【０２３４】
ＲＯＲ結合分子において、ドメインＢは定常領域ドメイン配列を有する。本明細書に記載されている定常領域ドメインアミノ酸配列は、抗体の定常領域ドメインの配列である。
【０２３５】
様々な実施形態では、定常領域配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、定常領域配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、定常領域配列は、抗体軽鎖由来である。特定の実施形態では、定常領域配列は、ラムダまたはカッパ軽鎖由来である。ある特定の実施形態では、定常領域配列は、抗体重鎖由来である。特定の実施形態では、定常領域配列は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＭアイソタイプである抗体重鎖配列である。特定の実施形態では、定常領域配列は、ＩｇＧアイソタイプに由来する。好まれる実施形態では、定常領域配列は、ＩｇＧ１アイソタイプに由来する。好まれる特定の実施形態では、定常領域配列は、ＣＨ３配列である。ＣＨ３配列は、セクション６．３．２．１でさらになお詳細に後述される。他の好まれる実施形態では、定常領域配列は、オルソロガスＣＨ２配列である。オルソロガスＣＨ２配列は、セクション６．３．２．２でさらになお詳細に後述される。
【０２３６】
特定の実施形態では、定常領域配列は、１つまたは複数の直交型変異を含むように変異された。好まれる実施形態では、ドメインＢは、セクション６．３．１４．２でさらになお詳細に後述される通り、ノブ・ホール（ｋｎｏｂ−ｈｏｌｅ）（同義的に「ノブ・イン・ホール」、「ＫＩＨ」）直交型変異、およびセクション６．３．１４．１にさらになお詳細に後述されている通り、直交型変異を含有するＣＨ３ドメインと操作されたジスルフィド架橋を形成するＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃ変異のいずれかを含むＣＨ３配列である定常領域配列を有する。一部の好まれる実施形態では、ノブ・ホール直交型変異は、Ｔ３６６Ｗ変異である。
６．３．２．１．ＣＨ３領域
【０２３７】
ＣＨ３アミノ酸配列は、本明細書に記載されるように、抗体重鎖のＣ末端ドメインの配列である。
【０２３８】
様々な実施形態では、ＣＨ３配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＨ３配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４アイソタイプに由来し、またはＩｇＥもしくはＩｇＭアイソタイプ由来のＣＨ４配列である。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、ＩｇＧアイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、ＣＨ３配列は、ＩｇＧ１アイソタイプに由来する。
【０２３９】
ある特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、内在性配列である。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７アミノ酸２２４−３３０である。様々な実施形態では、ＣＨ３配列は、内在性ＣＨ３配列のセグメントである。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、Ｎ末端アミノ酸Ｇ２２４およびＱ２２５を欠く内在性ＣＨ３配列を有する。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、Ｃ末端アミノ酸Ｐ３２８、Ｇ３２９およびＫ３３０を欠く内在性ＣＨ３配列を有する。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、Ｎ末端アミノ酸Ｇ２２４およびＱ２２５ならびにＣ末端アミノ酸Ｐ３２８、Ｇ３２９およびＫ３３０を欠く内在性ＣＨ３配列を有する。好ましい実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、ＣＨ３配列を有する複数のドメインを有し、ここで、ＣＨ３配列は、全長内在性ＣＨ３配列、ならびにＮ末端アミノ酸、Ｃ末端アミノ酸、またはその両方を欠くＣＨ３配列の両方を指すことができる。
【０２４０】
ある特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、１つまたは複数の変異を有する内在性配列である。特定の実施形態では、変異は、下記セクション６．３．１４．１−６．３．１４．３においてさらに詳細に記載されているように、内在性ＣＨ３配列に導入されて特定のＣＨ３配列の特定の対形成をガイドする、１つまたは複数の直交型変異である。
【０２４１】
ある特定の実施形態では、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるＳｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．  ２０１１  Ａｐｒ；  １２（３）：  ２１３−２２１）においてより詳細に記載されているように、ＣＨ３配列は、本明細書でイソアロタイプ変異と称される、あるアロタイプの特定のアミノ酸を別のアロタイプのアミノ酸に置き換えることによって、抗体の免疫原性を低減するように操作されている。特定の実施形態では、Ｇ１ｍ１アロタイプの特定のアミノ酸が置き換えられている。好ましい実施形態では、ＣＨ３配列において、イソアロタイプ変異Ｄ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍがなされている。
【０２４２】
好ましい実施形態では、ドメインＢは、以下の変異変化Ｐ３４３Ｖ；Ｙ３４９Ｃ；およびトリペプチド挿入４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有する。他の好ましい実施形態では、ドメインＢは、以下の変異変化：Ｔ３６６Ｋ；およびトリペプチド挿入４４５Ｋ、４４６Ｓ、４４７Ｃを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３配列を有する。さらなる他の好ましい実施形態では、ドメインＢは、以下の変異変化：Ｙ３４９Ｃおよびトリペプチド挿入４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３配列を有する。
【０２４３】
ある特定の実施形態では、ドメインＢは、それらと異なって、内在性ＣＨ３配列に組み込まれた４４７Ｃ変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３配列を有する。
【０２４４】
本明細書に記載されるＲＯＲ結合分子では、ドメインＢのＮ末端が、ドメインＡのＣ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、ドメインＢは、下記セクション６．３．１９．１および実施例６においてさらに詳細に記載されているように、ドメインＡとドメインＢとの間のジャンクションにおいてそのＮ末端で変異しているＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【０２４５】
ＲＯＲ結合分子では、ドメインＢのＣ末端は、ドメインＤのＮ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、ドメインＢは、下記セクション６．３．１９．３においてさらに詳細に記載されているように、ドメインＢとドメインＤとの間のジャンクションにＣ末端で伸長されているＣＨ３アミノ酸配列を有する。
６．３．２．２．オルソロガスＣＨ２領域
【０２４６】
本明細書に記載されているＣＨ２アミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端へと参照した場合の、抗体重鎖の第３のドメインの配列である。ＣＨ２アミノ酸配列は、全般に、セクション６．３．３により詳細に後述される。一連の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、ＣＨ２配列を有するＣＨ２ドメインの２つ以上の対セットを有し、第１のセットは、第１のアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列、および別のアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列の１つまたは複数のオルソロガスセットを有する。本明細書に記載されているオルソロガスＣＨ２アミノ酸配列は、共有されるアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列と相互作用することができるが、ＲＯＲ結合分子に存在する別のアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列とは有意に相互作用しない。特定の実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列の全セットが、同じ種に由来する。好まれる実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列の全セットが、ヒトＣＨ２アミノ酸配列である。他の実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列のセットは、異なる種に由来する。特定の実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列の第１のセットは、ＲＯＲ結合分子における他の非ＣＨ２ドメインと同じアイソタイプに由来する。特定の実施形態では、第１のセットは、ＩｇＧアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列を有し、１つまたは複数のオルソロガスセットは、ＩｇＭまたはＩｇＥアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列のセットのうち１つまたは複数は、内在性ＣＨ２配列である。他の実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列のセットのうち１つまたは複数は、１つまたは複数の変異を有する内在性ＣＨ２配列である。特定の実施形態では、１つまたは複数の変異は、直交型ノブ・ホール変異、直交型電荷対変異または直交型疎水性変異である。ＲＯＲ結合分子に有用なオルソロガスＣＨ２アミノ酸配列は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際ＰＣＴ出願ＷＯ２０１７／０１１３４２およびＷＯ２０１７／１０６４６２により詳細に記載されている。
６．３．３．ドメインＤ（定常領域）
【０２４７】
本明細書に記載されているＲＯＲ結合分子において、ドメインＤは、定常領域アミノ酸配列を有する。定常領域アミノ酸配列は、セクション６．３．２により詳細に記載されている。
【０２４８】
好まれる一連の実施形態では、ドメインＤは、ＣＨ２アミノ酸配列を有する。ＣＨ２アミノ酸配列は、本明細書に記載されるように、Ｎ末端からＣ末端へ参照して天然抗体重鎖の第３のドメインのＣＨ２アミノ酸配列である。様々な実施形態では、ＣＨ２配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＨ２配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、ＣＨ２配列は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＭアイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、ＣＨ２配列は、ＩｇＧ１アイソタイプに由来する。
【０２４９】
ある特定の実施形態では、ＣＨ２配列は、内在性配列である。特定の実施形態では、配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７アミノ酸１１１−２２３である。好ましい実施形態では、ＣＨ２配列は、下記セクション６．３．１９．３においてより詳細が議論されているように、Ｎ末端可変ドメイン−定常ドメインセグメントを、ＣＨ２ドメインへ連結するＮ末端ヒンジ領域ペプチドを有する。
【０２５０】
ＲＯＲ結合分子では、ドメインＤのＮ末端が、ドメインＢのＣ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、ドメインＢは、下記セクション６．３．１９．３においてさらに詳細に記載されているように、ドメインＤとドメインＢとの間のジャンクションにおいてＣ末端で伸長されているＣＨ３アミノ酸配列を有する。
６．３．４．ドメインＥ（定常領域）
【０２５１】
ＲＯＲ結合分子において、ドメインＥは、定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。定常領域アミノ酸配列は、セクション６．３．２により詳細に記載されている。
【０２５２】
ある特定の実施形態では、定常領域配列は、ＣＨ３配列である。ＣＨ３配列は、上記セクション６．３．２．１においてさらに詳細に記載されている。特定の実施形態では、定常領域配列は、１つまたは複数の直交型変異を含むように変異されている。好ましい実施形態では、ドメインＥは、下記セクション６．３．１４．２においてより詳細に記載されているように、ノブ−ホール（同義的に「ノブ・イン・ホール」、「ＫＩＨ」）直交型変異、ならびに下記セクション６．３．１４．１においてより詳細に記載されているように、直交型変異を含有するＣＨ３ドメインと操作されたジスルフィド架橋を形成するＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃ変異のいずれかを含むＣＨ３配列である定常領域配列を有する。一部の好ましい実施形態では、ノブ−ホール直交型変異は、Ｔ３６６Ｗ変異である。
【０２５３】
ある特定の実施形態では、定常領域ドメイン配列は、ＣＨ１配列である。特定の実施形態では、ドメインＥのＣＨ１アミノ酸配列は、ＲＯＲ結合分子における唯一のＣＨ１アミノ酸配列である。ある特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインのＮ末端は、下記で６．３．１９．５においてさらに詳細に記載されているように、ＣＨ２ドメインのＣ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、定常領域配列は、ＣＬ配列である。ある特定の実施形態では、下記で６．３．１９．５においてさらに詳細に記載されているように、ＣＬドメインのＮ末端は、ＣＨ２ドメインのＣ末端に連結されている。ＣＨ１およびＣＬ配列は、セクション６．３．８．１にさらに詳細に記載されている。
６．３．５．ドメインＦ（可変領域）
【０２５４】
ＲＯＲ結合分子において、ドメインＦは、可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。セクション６．３．１にさらになお詳細に記述されている可変領域ドメインアミノ酸配列は、ＶＬおよびＶＨ抗体ドメイン配列を含む抗体の可変領域ドメインアミノ酸配列である。ＶＬおよびＶＨ配列は、それぞれセクション６．３．１．１および６．３．１．４にさらになお詳細に上述されている。好まれる実施形態では、ドメインＦは、ＶＨ抗体ドメイン配列を有する。
６．３．６．ドメインＧ（定常領域）
【０２５５】
ＲＯＲ結合分子において、ドメインＧは、定常領域アミノ酸配列を有する。定常領域アミノ酸配列は、セクション６．３．２により詳細に記載されている。
【０２５６】
好まれる特定の実施形態では、定常領域配列は、ＣＨ３配列である。ＣＨ３配列は、セクション６．３．２．１でさらになお詳細に後述される。他の好まれる実施形態では、定常領域配列は、オルソロガスＣＨ２配列である。オルソロガスＣＨ２配列は、セクション６．３．２．２でさらになお詳細に後述される。
【０２５７】
ある特定の好ましい実施形態では、ドメインＧは、以下の変異変化：Ｓ３５４Ｃ；およびトリペプチド挿入４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３配列を有する。一部の好ましい実施形態では、ドメインＧは、以下の変異変化：Ｓ３５４Ｃ；および４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋトリペプチド挿入を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３配列を有する。一部の好ましい実施形態では、ドメインＧは、以下の変化：Ｌ３５１Ｄ；および４４５Ｇ、４４６Ｅ、４４７Ｃトリペプチド挿入を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３配列を有する。
６．３．７．ドメインＨ（可変領域）
【０２５８】
ＲＯＲ結合分子において、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。セクション６．３．１にさらになお詳細に記述されている可変領域ドメインアミノ酸配列は、ＶＬおよびＶＨ抗体ドメイン配列を含む抗体の可変領域ドメインアミノ酸配列である。ＶＬおよびＶＨ配列は、それぞれセクション６．３．１．１および６．３．１．４にさらになお詳細に上述されている。好まれる実施形態では、ドメインＨはＶＬ抗体ドメイン配列を有する。
６．３．８．ドメインＩ（定常領域）
【０２５９】
ＲＯＲ結合分子において、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。定常領域ドメインアミノ酸配列は、セクション６．３．２にさらになお詳細に上述されている。ＲＯＲ結合分子の一連の好まれる実施形態では、ドメインＩはＣＬアミノ酸配列を有する。別の一連の実施形態では、ドメインＩはＣＨ１アミノ酸配列を有する。ＣＨ１およびＣＬアミノ酸配列は、セクション６．３．８．１にさらに詳細に記載されている。
６．３．８．１．ＣＨ１およびＣＬ領域
【０２６０】
ＣＨ１アミノ酸配列は、本明細書に記載される場合、Ｎ末端からＣ末端へ参照して抗体重鎖の第２のドメインの配列である。ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列は、内在性配列である。様々な実施形態では、ＣＨ１配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＨ１配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＭアイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、ＣＨ１配列は、ＩｇＧ１アイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、ＣＨ１配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７アミノ酸１−９８である。
【０２６１】
本明細書に記載されるＲＯＲ結合分子において有用なＣＬアミノ酸配列は、抗体軽鎖定常ドメイン配列である。ある特定の実施形態では、ＣＬ配列は、内在性配列である。様々な実施形態では、ＣＬ配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＬ配列は、ヒト配列である。
【０２６２】
ある特定の実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、ラムダ（λ）軽鎖定常ドメイン配列である。特定の実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、ヒトラムダ軽鎖定常ドメイン配列である。好ましい実施形態では、ラムダ（λ）軽鎖配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＣＧ０４である。
【０２６３】
ある特定の実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、カッパ（κ）軽鎖定常ドメイン配列である。好ましい実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、ヒトカッパ（κ）軽鎖定常ドメイン配列である。好ましい実施形態では、カッパ軽鎖配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８３４である。
【０２６４】
ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列およびＣＬ配列は両者共に内在性配列である。ある特定の実施形態では、下のセクション６．３．８．２にさらになお詳細に記述される通り、ＣＨ１配列およびＣＬ配列は別個に、それぞれ直交型修飾を内在性ＣＨ１およびＣＬ配列に含む。ＣＨ１配列における直交型変異が、ＣＨ１結合試薬とＣＨ１ドメインとの間の特異的結合相互作用を排除しないことを理解されたい。しかし、一部の実施形態では、直交型変異は、特異的結合相互作用を排除しないとしても、低減させる場合がある。ＣＨ１配列またはその部分を有するドメインが、ＣＨ１配列またはその部分を有するドメインと会合することができるように、ＣＨ１およびＣＬ配列は、内在性または修飾配列のいずれかの、その部分となることもできる。さらに、上述のＣＨ１配列の一部分を有するＲＯＲ結合分子は、ＣＨ１結合試薬に結合され得る。
【０２６５】
理論に制約されることは望まないが、ＣＨ１ドメインは、また、そのフォールディングが典型的にＩｇＧの分泌における律速ステップであるという点において、特有である（Ｆｅｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ２００９  Ｊｕｎ  １２；３４（５）：５６９−７９；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。よって、ＣＨ１を含むポリペプチド鎖の律速成分に基づくＲＯＲ結合分子の精製は、不完全鎖から完全複合体を精製する手段、例えば、１つまたは複数の非ＣＨ１を含む鎖のみを有する複合体からの律速ＣＨ１ドメインを有する複合体の精製を提供することができる。
【０２６６】
記述された通り、ＣＨ１律速発現は、一部の態様では利益となる場合があるが、ＣＨ１は、完全ＲＯＲ結合分子の全体的な発現を限定する可能性がある。よって、ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列（複数可）を含むポリペプチド鎖の発現は、完全複合体を形成するＲＯＲ結合分子の効率を改善するように調整される。説明目的の例では、ＣＨ１配列（複数可）を含むポリペプチド鎖を発現するように構築されたプラスミドベクターの比は、他のポリペプチド鎖を発現するように構築されたプラスミドベクターと比べて増加させることができる。別の説明目的の例では、ＣＬ配列（複数可）を含むポリペプチド鎖と比較した場合、ＣＨ１配列（複数可）を含むポリペプチド鎖は、２つのポリペプチド鎖のうち小さい方となることができる。別の特定の実施形態では、ＣＨ１配列（複数可）を含むポリペプチド鎖の発現は、いずれのポリペプチド鎖がＣＨ１配列（複数可）を有するか制御することにより調整することができる。例えば、ＣＨ１ドメインが、４ドメインポリペプチド鎖（例えば、本明細書に記載されている第３のポリペプチド鎖）におけるＣＨ１配列のネイティブ位置の代わりに、２ドメインポリペプチド鎖（例えば、本明細書に記載されている第４のポリペプチド鎖）に存在するように、ＲＯＲ結合分子を操作することは、ＣＨ１配列（複数可）を含むポリペプチド鎖の発現の制御に使用することができる。しかし、他の態様では、他の鎖と比較して高すぎるＣＨ１含有鎖の相対的発現レベルは、ＣＨ１鎖を有するが他の鎖のそれぞれがない不完全複合体をもたらし得る。よって、ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列（複数可）を含むポリペプチド鎖の発現は、ＣＨ１含有鎖がない不完全複合体の形成を低減させ、かつ、ＣＨ１含有鎖があるが完全複合体に存在する他の鎖がない不完全複合体の形成を低減させるように調整される。
６．３．８．２．ＣＨ１およびＣＬ直交型修飾
【０２６７】
ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列およびＣＬ配列は別個に、それぞれ直交型修飾を内在性ＣＨ１およびＣＬ配列に含む。直交型変異は全般に、下のセクション６．３．１４．１〜６．３．１４．３により詳細に記載されている。
【０２６８】
特定の実施形態では、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，０５３，５６２号および米国特許第９，５２７，９２７号においてナンバリングされ、より詳細が議論されているように、内在性ＣＨ１およびＣＬ配列における直交型修飾は、ＣＨ１配列における１３８位およびＣＬ配列における１１６位、ＣＨ１配列における１２８位およびＣＬ配列における１１９位、またはＣＨ１配列における１２９位およびＣＬ配列における２１０位の操作されたシステインから選択される、操作されたジスルフィド架橋である。好ましい実施形態では、操作されたシステインは、ＥｕインデックスによってナンバリングされるＣＨ１配列における１２８位およびＣＬカッパ配列における１１８位である。
【０２６９】
一連の好まれる実施形態では、非内在性システインアミノ酸をもたらす変異は、Ｅｕ指標によりナンバリングされた、ＣＬ配列におけるＦ１１８Ｃ変異と対応するＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｃ、またはＣＬ配列におけるＦ１１８Ｃ変異と対応するＣＨ１配列におけるＬ１２８Ｃ、またはＣＬ配列におけるＳ１６２Ｃ変異と対応するＣＨ１配列におけるＰ１７１Ｃ変異である。
【０２７０】
様々な実施形態では、ＣＬ配列およびＣＨ１配列における直交型変異は、電荷対変異である。特定の実施形態では、電荷対変異は、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるＢｏｎｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ２０１７，  ｐｐ．１−１２）においてさらに詳細に記載されているように、ＥｕインデックスによってナンバリングされるＣＬ配列におけるＦ１１８Ｓ、Ｆ１１８ＡまたはＦ１１８Ｖ変異と対応するＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｌ、またはＣＬ配列におけるＴ１２９Ｒ変異と対応するＣＨ１配列におけるＫ１４７Ｄである。一連の好ましい実施形態では、電荷対変異は、ＥｕインデックスによってナンバリングされるＣＬ配列におけるＮ１３８Ｋ変異と対応するＣＨ１配列におけるＧ１６６Ｄ、またはＣＬ配列におけるＮ１３８Ｄ変異と対応するＣＨ１配列におけるＧ１６６Ｋである。
６．３．９．ドメインＪ（ＣＨ２）
【０２７１】
ＲＯＲ結合分子では、ドメインＪは、ＣＨ２アミノ酸配列を有する。ＣＨ２アミノ酸配列は、上記セクション６．３．３でさらに詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列は、下記セクション６．３．１９．４においてより詳細に記載されているように、ドメインＪをドメインＩへ連結するＮ末端ヒンジ領域を有する。
【０２７２】
ＲＯＲ結合分子では、ドメインＪのＣ末端は、ドメインＫのＮ末端に連結されている。特定の実施形態では、ドメインＪは、下記セクション６．３．１９．５においてさらに詳細に記載されているように、ＣＨ１アミノ酸配列またはＣＬアミノ酸配列を有するドメインＫのＮ末端に連結されている。
６．３．１０．ドメインＫ（定常領域）
【０２７３】
ＲＯＲ結合分子では、ドメインＫは、定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。定常領域ドメインアミノ酸配列は、上記セクション６．３．２においてさらに詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ドメインＫは、下記セクション６．３．１４．２でさらに詳細に記載されているノブ−ホール直交型変異；上記６．３．２．１においてより詳細に記載されているイソアロタイプ変異；ならびに下記セクション６．３．１４．１においてより詳細に記載されている直交型変異を含有するＣＨ３ドメインと操作されたジスルフィド架橋を形成するＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃ変異のいずれかを含むＣＨ３配列である定常領域配列を有する。一部の好ましい実施形態では、イソアロタイプ変異と組み合わされたノブ−ホール直交型変異は、以下の変異変化：Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖである。
【０２７４】
ある特定の実施形態では、定常領域ドメイン配列は、ＣＨ１配列である。特定の実施形態では、ドメインＫのＣＨ１アミノ酸配列は、ＲＯＲ結合分子における唯一のＣＨ１アミノ酸配列である。ある特定の実施形態では、６．３．１９．５でさらになお詳細に後述される通り、ＣＨ１ドメインのＮ末端は、ＣＨ２ドメインのＣ末端に接続される。ある特定の実施形態では、定常領域配列は、ＣＬ配列である。ある特定の実施形態では、６．３．１９．５でさらになお詳細に後述される通り、ＣＬドメインのＮ末端は、ＣＨ２ドメインのＣ末端に接続される。ＣＨ１およびＣＬ配列は、セクション６．３．８．１にさらに詳細に記載されている。
６．３．１１．ドメインＬ（可変領域）
【０２７５】
ＲＯＲ結合分子では、ドメインＬは、可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。セクション６．３．１にさらになお詳細に記述されている可変領域ドメインアミノ酸配列は、ＶＬおよびＶＨ抗体ドメイン配列を含む抗体の可変領域ドメインアミノ酸配列である。ＶＬおよびＶＨ配列は、それぞれ上記セクション６．３．１．１および６．３．１．４においてさらに詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ドメインＬは、ＶＨ抗体ドメイン配列を有する。
６．３．１２．ドメインＭ（定常領域）
【０２７６】
ＲＯＲ結合分子では、ドメインＭは、定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。定常領域ドメインアミノ酸配列は、上記セクション６．３．２においてさらに詳細に記載されている。ＲＯＲ結合分子の一連の好まれる実施形態では、ドメインＩはＣＨ１アミノ酸配列を有する。別の一連の好まれる実施形態では、ドメインＩはＣＬアミノ酸配列を有する。ＣＨ１およびＣＬアミノ酸配列は、セクション６．３．８．１にさらに詳細に記載されている。
６．３．１３．ドメインＡおよびＦの対形成
【０２７７】
ＲＯＲ結合分子では、ドメインＡ  ＶＬまたはＶＨアミノ酸配列およびコグネートドメインＦ  ＶＬまたはＶＨアミノ酸配列は会合して、抗原結合部位（ＡＢＳ）を形成する。Ａ：Ｆ抗原結合部位（ＡＢＳ）は、抗原のエピトープに特異的に結合することができる。ＡＢＳによる抗原結合は、下記セクション６．３．１３．１においてさらに詳細に記載されている。
【０２７８】
様々な多価の実施形態では、ドメインＡおよびＦ（Ａ：Ｆ）によって形成されるＡＢＳは、ＲＯＲ結合分子内の１つまたは複数の他のＡＢＳと配列が同一であり、したがって、ＲＯＲ結合分子内の１つまたは複数の他の配列同一ＡＢＳと同じ認識特異性を有する。
【０２７９】
様々な多価の実施形態では、Ａ：Ｆ  ＡＢＳは、ＲＯＲ結合分子内の１つまたは複数の他のＡＢＳと配列が非同一である。ある特定の実施形態では、Ａ：Ｆ  ＡＢＳは、ＲＯＲ結合分子における１つまたは複数の他の配列非同一ＡＢＳと異なる認識特異性を有する。特定の実施形態では、Ａ：Ｆ  ＡＢＳは、ＲＯＲ結合分子における少なくとも１つの他の配列非同一ＡＢＳによって認識される抗原と異なる抗原を認識する。特定の実施形態では、Ａ：Ｆ  ＡＢＳは、ＲＯＲ結合分子における少なくとも１つの他の配列非同一ＡＢＳによっても認識される抗原の、異なるエピトープを認識する。この実施形態では、ドメインＡおよびＦによって形成されるＡＢＳは、抗原のエピトープを認識し、ここで、ＲＯＲ結合分子内の１つまたは複数の他のＡＢＳは、同じ抗原を認識するが、同じエピトープは認識しない。
６．３．１３．１．ＡＢＳによる抗原の結合
【０２８０】
ＡＢＳおよびそのようなＡＢＳを含むＲＯＲ結合分子は、ＡＢＳが特異的に結合するエピトープ（またはより全体的には抗原）を「認識する」と言われ、エピトープ（またはより全体的には抗原）は、ＡＢＳの「認識特異性」または「結合特異性」と言われる。
【０２８１】
ＡＢＳは、特定の親和性で、その特定の抗原またはエピトープに結合すると言われる。本明細書で記載される場合、「親和性」は、１個の分子と別の分子との間の非共有結合性分子間力相互作用の強度を指す。親和性、つまり相互作用の強度は、解離平衡定数（ＫＤ）として表すことができ、ここでＫＤ値は低いほど、分子間の相互作用が強力であることを示す。抗体構築物のＫＤ値は、当技術分野で周知の方法によって測定することができ、例えば、バイオレイヤー干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ／ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標））、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））、および細胞結合アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の目的のために、親和性は、Ｏｃｔｅｔ／ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標）を使用してバイオレイヤー干渉法によって測定された解離平衡定数である。
【０２８２】
「特異的結合」は、本明細書で使用される場合、ＡＢＳとそのコグネート抗原またはエピトープとの間の親和性を指し、ここでＫＤ値は、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満である。
【０２８３】
図２に概略化されるように、本明細書に記載されるＲＯＲ結合分子におけるＡＢＳの数は、ＲＯＲ結合分子の「価」を定義する。単一のＡＢＳを有するＲＯＲ結合分子は「一価」である。複数のＡＢＳを有するＲＯＲ結合分子は、「多価」であると言われる。２つのＡＢＳを有する多価ＲＯＲ結合分子は「二価」である。３つのＡＢＳを有する多価ＲＯＲ結合分子は「三価」である。４つのＡＢＳを有する多価ＲＯＲ結合分子は「四価」である。
【０２８４】
様々な多価の実施形態では、複数のＡＢＳは全て同じ認識特異性を有する。図２に概略化されているように、そのようなＲＯＲ結合分子は、「単一特異性」「多価」結合構築物である。他の多価の実施形態では、複数のＡＢＳの少なくとも２つが、異なる認識特異性を有する。そのようなＲＯＲ結合分子は、多価および「多重特異性」である。ＡＢＳが集約的に２つの認識特異性を有する多価の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は「二重特異性」である。ＡＢＳが集約的に３つの認識特異性を有する多価の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は「三重特異性」である。
【０２８５】
ＡＢＳが、集約的に、同じ抗原に存在する異なるエピトープに対して複数の認識特異性を有する多価の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、「多重パラトピック（ｍｕｌｔｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）」である。ＡＢＳが、集約的に、同じ抗原の２つのエピトープを認識する多価の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、「二重パラトピック（ｂｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）」である。
【０２８６】
様々な多価の実施形態では、ＲＯＲ結合分子の多価性は、特定の標的に対するＲＯＲ結合分子のアビディティを向上させる。本明細書で記載される場合、「アビディティ」は、２つまたはそれより多くの分子、例えば特定の標的に対する多価ＲＯＲ結合分子間の全体的な相互作用の強度を指し、ここで、アビディティは、複数のＡＢＳの親和性によって与えられる相互作用の累積強度である。アビディティは、上記で説明されているような、親和性を決定するために使用される方法と同じ方法によって測定することができる。ある特定の実施形態では、特定の標的に対するＲＯＲ結合分子のアビディティは、相互作用が特異的結合相互作用であり、ここで２つの分子間のアビディティは、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満のＫＤ値を有する。ある特定の実施形態では、特定の標的に対するＲＯＲ結合分子のアビディティが、相互作用が特異的結合相互作用であるＫＤ値であり、ここで個々のＡＢＳの１つまたは複数の親和性は、それらの各抗原またはエピトープ自体への特異的結合として十分なＫＤ値を有していない。ある特定の実施形態では、アビディティは、共通の特定の標的または複合体の別個の抗原、例えば個々の細胞で見出される別個の抗原に対する複数のＡＢＳの親和性によって与えられる相互作用の累積強度である。ある特定の実施形態では、アビディティは、共通の個々の抗原の別個のエピトープに対する複数のＡＢＳの親和性によって与えられる相互作用の累積強度である。
６．３．１４．ドメインＢおよびＧの対形成
【０２８７】
本明細書に記載されているＲＯＲ結合分子において、ドメインＢ定常領域アミノ酸配列およびドメインＧ定常領域アミノ酸配列が会合する。定常領域ドメインアミノ酸配列は、セクション６．３．２にさらになお詳細に上述されている。
【０２８８】
一連の好まれる実施形態では、ドメインＢおよびドメインＧは、ＣＨ３アミノ酸配列を有する。ＣＨ３配列は、セクション６．３．２．１にさらになお詳細に上述されている。様々な実施形態では、ＢおよびＧドメインのアミノ酸配列は、同一である。これらの実施形態のいくつかでは、配列は、内在性ＣＨ３配列である。
【０２８９】
様々な実施形態では、ＢおよびＧドメインのアミノ酸配列は異なっており、それぞれ別個に直交型修飾を内在性ＣＨ３配列に含み、ここでＢドメインはＧドメインと相互作用し、ＢドメインとＧドメインのどちらも、直交型修飾を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない。
【０２９０】
本明細書に記載される「直交型修飾」または同義的に「直交型変異」は、直交型修飾を有する第１のドメインの、相補的な直交型修飾を有する第２のドメインに対する結合の親和性を増加させる抗体ドメインのアミノ酸配列における１つまたは複数の操作された変異である。ある特定の実施形態では、直交型修飾は、直交型修飾を有するドメインの、相補的な直交型修飾を欠くドメインに対する親和性を減少させる。ある特定の実施形態では、直交型修飾は、内在性抗体ドメイン配列における変異である。様々な実施形態では、直交型修飾は、アミノ酸の付加または欠失を含むがこれらに限定されない、内在性抗体ドメイン配列のＮ末端またはＣ末端の修飾である。特定の実施形態では、直交型修飾には、下記セクション６．３．１４．１−６．３．１４．３においてさらに詳細に記載されている操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異および電荷対変異が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、直交型修飾には、限定されないが、操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異および電荷対変異から選択される直交型修飾の組合せが含まれる。特定の実施形態では、直交型修飾は、上記セクション６．３．２．１においてさらに詳細に記載されているイソアロタイプ変異などの免疫原性を減少させるアミノ酸置換と組み合わせることができる。
６．３．１４．１．直交型操作されたジスルフィド架橋
【０２９１】
様々な実施形態では、直交型修飾は、第１のドメインと第２のドメインとの間の操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。本明細書に記載される場合、「操作されたジスルフィド架橋」は、２つまたはそれより多いドメインが会合するとき非天然ジスルフィド結合を形成するように、２つまたはそれより多いドメインに非内在性システインアミノ酸を提供する変異である。操作されたジスルフィド架橋は、教示する全てについて参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  （１９９８）  １６：６７７−６８１）においてより詳細に記載されている。ある特定の実施形態では、操作されたジスルフィド架橋は、特定のドメイン間の直交型会合を改善させる。特定の実施形態では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、第１または第２のＣＨ３ドメインの一方におけるＫ３９２Ｃ変異、ならびに他方のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｃである。好ましい実施形態では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、第１または第２のＣＨ３ドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、ならびに他方のＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃである。別の好ましい実施形態では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、ＫＳＣトリペプチド配列を組み込んだＣＨ３ドメインのＣ末端の伸長によって提供される第１および第２のＣＨ３ドメインの両方における４４７Ｃ変異である。
６．３．１４．２．直交型ノブ−ホール変異
【０２９２】
様々な実施形態では、直交型修飾は、ノブ−ホール（同義的にノブ・イン・ホール）変異を含む。本明細書で記載される場合、ノブ−ホール変異は、第１のドメインが、相補的立体変異のないドメインとの会合と比較して、相補的立体変異を有する第２のドメインと優先的に会合するように、第１のドメインの表面の立体的特徴を変化させる変異である。ノブ−ホール変異は、それぞれその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号および米国特許第８，２１６，８０５号において、より詳細に記載されている。様々な実施形態では、ノブ−ホール変異は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  （１９９８）  １６：６７７−６８１））においてさらに詳細に記載されているように、操作されたジスルフィド架橋と組み合わされる。様々な実施形態では、ノブ−ホール変異、イソアロタイプ変異、および操作されたジスルフィド変異が組み合わされる。
【０２９３】
ある特定の実施形態では、ノブ・イン・ホール変異は、第１のドメインにおけるＴ３６６Ｙ変異、ならびに第２のドメインにおけるＹ４０７Ｔ変異である。ある特定の実施形態では、ノブ・イン・ホール変異は、第１のドメインにおけるＦ４０５Ａ、ならびに第２のドメインにおけるＴ３９４Ｗである。ある特定の実施形態では、ノブ・イン・ホール変異は、第１のドメインにおけるＴ３６６Ｙ変異およびＦ４０５Ａであり、第２のドメインにおけるＴ３９４ＷおよびＹ４０７Ｔである。ある特定の実施形態では、ノブ・イン・ホール変異は、第１のドメインにおけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに第２のドメインにおけるＹ４０７Ａである。ある特定の実施形態では、組み合わされたノブ・イン・ホール変異および操作されたジスルフィド変異は、第１のドメインにおけるＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異、ならびに第２のドメインにおけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である。好ましい実施形態では、組み合わされたノブ・イン・ホール変異、イソアロタイプ変異、および操作されたジスルフィド変異は、第１のドメインにおけるＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異、ならびに第２のドメインにおけるＹ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である。
６．３．１４．３．直交型電荷対変異
【０２９４】
様々な実施形態では、直交型修飾は、電荷対変異である。本明細書で使用される場合、電荷対変異は、ドメインが、相補的電荷対変異のないドメインとの会合と比較して、相補的電荷対変異を有する第２のドメインと優先的に会合するように、ドメインの表面のアミノ酸の電荷に影響を与える変異である。ある特定の実施形態では、電荷対変異は、特定のドメイン間の直交型会合を改善させる。電荷対変異は、それぞれ教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５９２，５６２号、米国特許第９，２４８，１８２号、および米国特許第９，３５８，２８６号においてより詳細に記載されている。ある特定の実施形態では、電荷対変異は、特定のドメイン間の安定性を改善させる。好ましい実施形態では、電荷対変異は、第１のドメインにおけるＴ３６６Ｋ変異、および他のドメインにおけるＬ３５１Ｄ変異である。
６．３．１５．ドメインＥおよびＫの対形成
【０２９５】
様々な実施形態では、Ｅドメインは、ＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【０２９６】
様々な実施形態では、Ｋドメインは、ＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【０２９７】
様々な実施形態では、ＥおよびＫドメインのアミノ酸配列は同一であり、配列は、内在性ＣＨ３配列である。
【０２９８】
様々な実施形態では、ＥドメインとＫドメインの配列は異なる。様々な実施形態では、異なる配列が、それぞれ別個に直交型修飾を内在性ＣＨ３配列に含み、ここでＥドメインはＫドメインと相互作用し、ＥドメインとＫドメインのどちらも、直交型修飾を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない。ある特定の実施形態では、直交型修飾には、上記セクション６．３．１４．１−６．３．１４．３においてさらに詳細に記載されているように、操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異および電荷対変異が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、直交型修飾には、限定されないが、操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異、および電荷対変異から選択される直交型修飾の組合せが含まれる。特定の実施形態では、直交型修飾は、イソアロタイプ変異などの免疫原性を減少させるアミノ酸置換と組み合わせることができる。
６．３．１６．ドメインＩおよびＭならびにドメインＨおよびＬの対形成
【０２９９】
様々な実施形態では、ドメインＩは、ＣＬ配列を有し、ドメインＭは、ＣＨ１配列を有する。様々な実施形態では、ドメインＨは、ＶＬ配列を有し、ドメインＬは、ＶＨ配列を有する。好ましい実施形態では、ドメインＨは、ＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩは、ＣＬアミノ酸配列を有し、ドメインＬは、ＶＨアミノ酸配列を有し、およびドメインＭは、ＣＨ１アミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、ドメインＨは、ＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩは、ＣＬアミノ酸配列を有し、ドメインＬは、ＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭは、ＣＨ１アミノ酸配列を有し、ドメインＫは、ＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【０３００】
様々な実施形態では、ＩドメインおよびＭドメインのアミノ酸配列は、それぞれ別個に直交型修飾を内在性配列に含み、ここでＩドメインはＭドメインと相互作用し、ＩドメインとＭドメインのどちらも、直交型修飾を欠くドメインと有意に相互作用しない。一連の実施形態では、Ｉドメインにおける直交型変異はＣＬ配列にあり、Ｍドメインにおける直交型変異はＣＨ１配列にある。ＣＨ１およびＣＬ配列に存在する直交型変異は、上のセクション６．３．８．２により詳細に記載されている。
【０３０１】
様々な実施形態では、ＨドメインおよびＬドメインのアミノ酸配列は、それぞれ別個に直交型修飾を内在性配列に含み、ここでＨドメインはＬドメインと相互作用し、ＨドメインとＬドメインのどちらも、直交型修飾を欠くドメインと有意に相互作用しない。一連の実施形態では、Ｈドメインにおける直交型変異はＶＬ配列にあり、Ｌドメインにおける直交型変異はＶＨ配列にある。特定の実施形態では、直交型変異は、ＶＨ／ＶＬ境界での電荷対変異である。好ましい実施形態では、ＶＨ／ＶＬ境界での電荷対変異は、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるＩｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．，  ２０１０，  ｖｏｌ．  ２３，  ６６７−６７７）においてより詳細に記載されているように、ＶＨにおけるＱ３９Ｅと対応するＶＬにおけるＱ３８Ｋ、またはＶＨにおけるＱ３９Ｋと対応するＶＬにおけるＱ３８Ｅである。
【０３０２】
ある特定の実施形態では、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。ある特定の実施形態では、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
６．３．１７．三価ＲＯＲ結合分子
【０３０３】
別の一連の実施形態において、ＲＯＲ結合分子は、３つの抗原結合部位を有し、したがって「三価」と称される。
【０３０４】
図２１を参照して、様々な三価の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、第５のポリペプチド鎖をさらに含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＮおよびドメインＯをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＮはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＯは定常領域アミノ酸配列を有し；（ｂ）ＲＯＲ結合分子は、第５のポリペプチド鎖をさらに含み、第５のポリペプチド鎖が、ドメインＰおよびドメインＱを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、ドメインＰはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＱは定常アミノ酸配列を有し；（ｃ）第１および第５のポリペプチドは、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用およびＯドメインとＱドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ結合分子を形成する。図２に概略化されているように、これらの三価の実施形態は、「２×１」三価構築物と称される。
【０３０５】
図２６を参照して、さらなる一連の三価の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、（ａ）第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＲはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＳは定常ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＲＯＲ結合分子は、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、第６のポリペプチド鎖が、ドメインＴおよびドメインＵを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、ドメインＴはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＵは定常ドメインアミノ酸配列を有し；（ｃ）第３および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ結合分子を形成する。図２に概略化されているように、これらの三価の実施形態は、「１×２」三価構築物と称される。
【０３０６】
様々な実施形態では、ドメインＯは、ペプチドリンカーを介してドメインＡに連結される。様々な実施形態では、ドメインＳは、ペプチドリンカーを介してドメインＨに連結される。好ましい実施形態では、ドメインＯをドメインＡに連結するかまたはドメインＳをドメインＨに連結するペプチドリンカーは、セクション６．３．１９．６においてより詳細に記載されている６アミノ酸ＧＳＧＳＧＳペプチド配列である。
６．３．１７．１．三価２×１二重特異性構築物［２（Ａ−Ａ）×１（Ｂ）］
【０３０７】
図２１を参照して、様々な実施形態では、ドメインＮおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＨのアミノ酸配列はドメインＮおよびＡのアミノ酸配列と異なり、ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩのアミノ酸配列はドメインＯおよびＢのアミノ酸配列と異なり、ドメインＰおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬのアミノ酸配列はドメインＰおよびＦのアミノ酸配列と異なり、ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭのアミノ酸配列はドメインＱおよびＧのアミノ酸配列と異なり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
６．３．１７．２．三価２×１二重特異性構築物［２（Ａ−Ｂ）×１（Ａ）］
【０３０８】
図２１を参照して、様々な実施形態では、ドメインＮおよびドメインＨのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＡのアミノ酸配列はドメインＮおよびＨのアミノ酸配列と異なり、ドメインＯおよびドメインＩのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＢのアミノ酸配列はドメインＯおよびＩのアミノ酸配列と異なり、ドメインＰおよびドメインＬのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＦのアミノ酸配列はドメインＰおよびＬのアミノ酸配列と異なり、ドメインＱおよびドメインＭのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＧのアミノ酸配列はドメインＱおよびＭのアミノ酸配列と異なり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
６．３．１７．３．三価２×１三重特異性構築物［２（Ａ−Ｂ）×１（Ｃ）］
【０３０９】
図２１を参照して、様々な実施形態では、ドメインＮ、ドメインＡ、およびドメインＨのアミノ酸配列は異なり、ドメインＯ、ドメインＢ、およびドメインＩのアミノ酸配列は異なり、ドメインＰ、ドメインＦ、およびドメインＬのアミノ酸配列は異なり、ドメインＱ、ドメインＧ、およびドメインＭのアミノ酸配列は異なり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【０３１０】
ある特定の実施形態では、セクション６．３．８．１においてより詳細に記載されているように、ドメインＯは、カッパ軽鎖由来のＣＬである定常領域配列を有し、ドメインＱは、ＩｇＧ１アイソタイプ由来のＣＨ１である定常領域配列を有する。好ましい実施形態では、上記セクション６．３．１４においてより詳細が議論されているように、ドメインＯおよびドメインＱは、互いに特異的に会合するようにＣＨ３配列を有する。
６．３．１７．４．三価１×２二重特異性構築物［１（Ａ）×２（Ｂ−Ａ）］
【０３１１】
図２６を参照して、様々な実施形態では、ドメインＲおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＨのアミノ酸配列はドメインＲおよびＡのアミノ酸配列と異なり、ドメインＳおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩのアミノ酸配列はドメインＳおよびＢのアミノ酸配列と異なり、ドメインＴおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬのアミノ酸配列はドメインＴおよびＦのアミノ酸配列と異なり、ドメインＵおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭのアミノ酸配列はドメインＵおよびＧのアミノ酸配列と異なり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＲおよびドメインＴが、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
６．３．１７．５．三価１×２二重特異性構築物［１（Ａ）×２（Ｂ−Ｂ）］
【０３１２】
種々の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、第２のＣＨ１ドメインまたはその部分をさらに含む。図２６を参照して、特定の実施形態では、ドメインＲおよびドメインＨのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＡのアミノ酸配列はドメインＲおよびＨのアミノ酸配列と異なり、ドメインＳおよびドメインＩのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＢのアミノ酸配列はドメインＳおよびＩのアミノ酸配列と異なり、ドメインＴおよびドメインＬのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＦのアミノ酸配列はドメインＴおよびＬのアミノ酸配列と異なり、ドメインＵおよびドメインＭのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＧのアミノ酸配列はドメインＵおよびＭのアミノ酸配列と異なり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＲおよびドメインＴが、第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【０３１３】
特定の実施形態では、ドメインＳおよびドメインＩのアミノ酸配列は、ＣＨ１配列である。特定の実施形態では、ドメインＵおよびドメインＭのアミノ酸配列は、ＣＨ１配列である。
６．３．１７．６．三価１×２三重特異性構築物［１（Ａ）×２（Ｂ−Ｃ）］
【０３１４】
図２６を参照して、様々な実施形態では、ドメインＲ、ドメインＡ、およびドメインＨのアミノ酸配列は異なり、ドメインＳ、ドメインＢ、およびドメインＩのアミノ酸配列は異なり、ドメインＴ、ドメインＦ、およびドメインＬのアミノ酸配列は異なり、ドメインＵ、ドメインＧ、およびドメインＭのアミノ酸配列は異なり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＲおよびドメインＴが、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【０３１５】
特定の実施形態では、セクション６．３．８．１により詳細に記述される通り、ドメインＳは、カッパ軽鎖由来のＣＬである定常領域配列を有し、ドメインＵは、ＩｇＧ１アイソタイプ由来のＣＨ１である定常領域配列を有する。好まれる実施形態では、セクション６．３．１４により詳細に上述されている通り、ドメインＳおよびドメインＵは、互いと特異的に会合するようなＣＨ３配列を有する。
【０３１６】
ある特定の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、第２のＣＨ１ドメインまたはその部分をさらに含む。特定の実施形態では、ドメインＳおよびドメインＩのアミノ酸配列は、ＣＨ１配列である。特定の実施形態では、ドメインＵおよびドメインＭのアミノ酸配列は、ＣＨ１配列である。
６．３．１８．四価２×２  ＲＯＲ結合分子
【０３１７】
様々な実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、４つの抗原結合部位を有し、したがって「四価」と称される。
【０３１８】
図３４を参照して、さらなる一連の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、さらに第５および第６のポリペプチド鎖を含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖はさらにドメインＮおよびドメインＯを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され；（ｂ）第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され；（ｃ）ＲＯＲ結合分子はさらに第５および第６ポリペプチド鎖を含み、第５ポリペプチド鎖はドメインＰおよびドメインＱを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、第６ポリペプチド鎖はドメインＴおよびドメインＵを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され；（ｄ）第１および第５のポリペプチドは、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用およびＯドメインとＱドメインとの間の相互作用を介して会合し、第３および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ結合分子を形成する。
【０３１９】
様々な実施形態では、ドメインＯは、ペプチドリンカーを介してドメインＡに連結され、ドメインＳは、ペプチドリンカーを介してドメインＨに連結される。好ましい実施形態では、ドメインＯをドメインＡに連結し、ドメインＳをドメインＨに連結するペプチドリンカーは、セクション６．３．１９．６においてより詳細に記載されているように、６アミノ酸ＧＳＧＳＧＳペプチド配列である。
６．３．１８．１．四価２×２二重特異性構築物
【０３２０】
図３４を参照して、一連の四価２×２二重特異性ＲＯＲ結合分子では、ドメインＮおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＨおよびドメインＲのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩおよびドメインＳのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＰおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬおよびドメインＴのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭおよびドメインＵのアミノ酸配列は同一であり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第４の抗原結合部位を形成する。
【０３２１】
図３４を参照して、別の一連の四価２×２二重特異性ＲＯＲ結合分子では、ドメインＨおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＮおよびドメインＲのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＯおよびドメインＳのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＰおよびドメインＴのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＱおよびドメインＵのアミノ酸配列は同一であり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第４の抗原結合部位を形成する。
６．３．１９．ドメインジャンクション
６．３．１９．１．ＶＬとＣＨ３ドメインとを連結するジャンクション
【０３２２】
様々な実施形態では、ＶＬドメインのＣ末端とＣＨ３ドメインのＮ末端との間のジャンクションを形成するアミノ酸配列は、操作された配列である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸は、ＶＬドメインのＣ末端で欠失または付加されている。ある特定の実施形態では、ＶＬドメインのＣ末端とＣＨ３ドメインのＮ末端とを連結しているジャンクションは、下記のセクション６．１３．７の表２に記載されている配列の１つである。特定の実施形態では、Ａ１１１が、ＶＬドメインのＣ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸が、ＣＨ３ドメインのＮ末端で、欠失または付加されている。特定の実施形態では、Ｐ３４３は、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。特定の実施形態では、Ｐ３４３およびＲ３４４は、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸が、ＶＬドメインのＣ末端およびＣＨ３ドメインのＮ末端の両方で欠失または付加されている。特定の実施形態では、Ａ１１１が、ＶＬドメインのＣ末端で欠失されており、Ｐ３４３が、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。好ましい実施形態では、Ａ１１１およびＶ１１０が、ＶＬドメインのＣ末端で欠失されている。別の好ましい実施形態では、Ａ１１１およびＶ１１０が、ＶＬドメインのＣ末端で欠失され、ＣＨ３ドメインのＮ末端が、Ｐ３４３Ｖ変異を有する。
６．３．１９．２．ＶＨとＣＨ３ドメインとを連結するジャンクション
【０３２３】
様々な実施形態では、ＶＨドメインのＣ末端とＣＨ３ドメインのＮ末端との間のジャンクションを形成するアミノ酸配列は、操作された配列である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸が、ＶＨドメインのＣ末端で欠失または付加されている。ある特定の実施形態では、ＶＨドメインのＣ末端とＣＨ３ドメインのＮ末端を連結するジャンクションは、下記のセクション６．１３．７の表３に記載されている配列の１つである。特定の実施形態では、Ｋ１１７およびＧ１１８が、ＶＨドメインのＣ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸が、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失または付加されている。ある特定の実施形態では、Ｐ３４３は、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、Ｐ３４３およびＲ３４４は、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、Ｐ３４３、Ｒ３４４およびＥ３４５が、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸が、ＶＨドメインのＣ末端およびＣＨ３ドメインのＮ末端の両方で欠失または付加されている。好ましい実施形態では、Ｔ１１６、Ｋ１１７およびＧ１１８が、ＶＨドメインのＣ末端で欠失されている。
６．３．１９．３．ＣＨ３のＣ末端をＣＨ２のＮ末端に連結しているジャンクション（ヒンジ）
【０３２４】
本明細書に記載のＲＯＲ結合分子では、ＣＨ２ドメインのＮ末端は、「ヒンジ」領域アミノ酸配列を有する。本明細書で使用される場合、ヒンジ領域は、抗体のＮ末端可変ドメイン−定常ドメインセグメントと抗体のＣＨ２ドメインとを連結している抗体重鎖の配列である。加えて、ヒンジ領域は、典型的に、Ｎ末端可変ドメイン−定常ドメインセグメントとＣＨ２ドメインとの間のフレキシビリティ、ならびに重鎖間のジスルフィド架橋を形成するアミノ酸配列モチーフ（例えば、第１および第３のポリペプチド鎖）の両方を提供する。本明細書で使用される場合、ヒンジ領域アミノ酸配列は、配列番号５６である。
【０３２５】
様々な実施形態では、ＣＨ３アミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインのＣ末端とＣＨ２ドメインのＮ末端との間のジャンクションにおいてＣ末端で伸長されている。ある特定の実施形態では、ＣＨ３アミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインのＣ末端とヒンジ領域との間のジャンクションにおいてＣ末端で伸長され、次いでＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されている。好ましい実施形態では、ＣＨ３アミノ酸配列は、ＰＧＫトリペプチド配列の挿入、続いてＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフの挿入によって伸長されている。
【０３２６】
特定の実施形態では、ＣＨ３ドメインのＣ末端における伸長は、別のＣＨ３ドメインの直交型Ｃ末端伸長とジスルフィド結合を形成することができるアミノ酸配列を組み込んでいる。好ましい実施形態では、ＣＨ３ドメインのＣ末端における伸長は、ＫＳＣトリペプチド配列とそれに続くＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフを組み込んでおり、ＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフは、カッパ軽鎖のＧＥＣモチーフを組み込んでいる別のＣＨ３ドメインの直交型Ｃ末端伸長とジスルフィド結合を形成する。
６．３．１９．４．ＣＬのＣ末端とＣＨ２のＮ末端とを連結するジャンクション（ヒンジ）
【０３２７】
様々な実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、そのＣ末端を介してヒンジ領域に連結され、次いで、ＣＨ２ドメインのＮ末端に連結される。ヒンジ領域配列は、上記セクション６．３．１９．３においてより詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ヒンジ領域アミノ酸配列は、配列番号５６である。
６．３．１９．５．ＣＨ２のＣ末端を定常領域ドメインに連結するジャンクション
【０３２８】
様々な実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列は、そのＣ末端を介して、定常領域ドメインのＮ末端に連結されている。定常領域は、上記セクション６．３．４においてより詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ＣＨ２配列は、その内在性配列を介してＣＨ３配列に連結されている。他の実施形態では、ＣＨ２配列は、ＣＨ１またはＣＬ配列に連結されている。ＣＨ２配列のＣＨ１またはＣＬ配列への連結を議論する例が、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，２４２，２４７号においてより詳細に記載されている。
６．３．１９．６．三価および四価分子においてドメインＯをドメインＡにまたはドメインＳをドメインＨに連結するジャンクション
【０３２９】
様々な実施形態では、抗体の重鎖（例えば、第１および第３のポリペプチド鎖）が、追加のＡＢＳを提供する追加のドメインを含むようにそのＮ末端で伸長される。図２１、図２６および図３４を参照して、ある特定の実施形態では、ドメインＯおよび／またはドメインＳの定常領域ドメインアミノ酸配列のＣ末端は、それぞれ、ドメインＡおよび／またはドメインＨの可変領域ドメインアミノ酸配列のＮ末端に連結されている。一部の好ましい実施形態では、定常領域ドメインは、ＣＨ３アミノ酸配列であり、可変領域ドメインは、ＶＬアミノ酸配列である。一部の好ましい実施形態では、定常領域ドメインは、ＣＬアミノ酸配列であり、可変領域ドメインは、ＶＬアミノ酸配列である。ある特定の実施形態では、定常領域ドメインは、ペプチドリンカーを介して可変領域ドメインに連結されている。好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは、６アミノ酸ＧＳＧＳＧＳペプチド配列である。
【０３３０】
様々な実施形態では、抗体の軽鎖（例えば、第２および第４のポリペプチド鎖）が、抗体の追加の可変ドメイン−定常ドメインセグメントを含むようにそのＮ末端で伸長される。ある特定の実施形態では、定常領域ドメインは、ＣＨ１アミノ酸配列であり、可変領域ドメインは、ＶＨアミノ酸配列である。
６．４．特定の二価ＲＯＲ結合分子
【０３３１】
さらなる態様では、二価ＲＯＲ結合分子が提供される。
【０３３２】
図３を参照して、一連の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を含み、ここで（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢはＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ結合分子を形成する。
【０３３３】
好ましい実施形態では、ドメインＥは、ＣＨ３アミノ酸配列を有し；ドメインＨは、ＶＬアミノ酸配列を有し；ドメインＩは、ＣＬアミノ酸配列を有し、ドメインＫは、ＣＨ３アミノ酸配列を有し；ドメインＬは、ＶＨアミノ酸配列を有し；ドメインＭは、ＣＨ１アミノ酸配列を有する。
【０３３４】
ある特定の実施形態では、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＲＯＲ結合分子は、二重特異性二価ＲＯＲ結合分子である。ある特定の実施形態では、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＲＯＲ結合分子は、単一特異性二価ＲＯＲ結合分子である。
６．４．１．二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ１」
【０３３５】
図３および図６を参照して、一連の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を有し、ここで（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、Ｔ３６６Ｋ変異およびＫＳＣトリペプチド配列とそれに続くＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはヒトＩｇＧ１  ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥはＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＬ３５１Ｄ変異およびＧＥＣアミノ酸ジスルフィドモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩはヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪはヒトＩｇＧ１  ＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫはＹ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭはヒトＩｇＧ１  ＣＨ１アミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ結合分子を形成し；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
【０３３６】
好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号８の配列を有し、第２のポリペプチド鎖は、配列番号９の配列を有し、第３のポリペプチド鎖は、配列番号１０の配列を有し、および第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１の配列を有する。
６．４．２．二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ６」
【０３３７】
図３および図１４を参照して、一連の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を有し、ここで（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、ＫＳＣトリペプチド配列とそれに続くＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはヒトＩｇＧ１  ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥはＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＧＥＣアミノ酸ジスルフィドモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩはヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪはヒトＩｇＧ１  ＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫはＹ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭはヒトＩｇＧ１アミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ結合分子を形成し；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
６．４．３．二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ２８」
【０３３８】
図３および図１６を参照して、一連の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を有し、ここで（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、Ｙ３４９Ｃ変異およびＰＧＫトリペプチド配列とそれに続くＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはヒトＩｇＧ１  ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥはＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＳ３５４Ｃ変異およびＰＧＫトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩはヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪはヒトＩｇＧ１  ＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫはＹ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭはヒトＩｇＧ１  ＣＨ１アミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ結合分子を形成し；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
【０３３９】
好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４の配列を有し、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２５の配列を有し、第３のポリペプチド鎖は、配列番号１０の配列を有し、および第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１の配列を有する。
６．４．４．二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ４４」
【０３４０】
図３および図１９を参照して、一連の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を有し、ここで（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、Ｙ３４９Ｃ変異、Ｐ３４３Ｖ変異、およびＰＧＫトリペプチド配列とそれに続くＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはヒトＩｇＧ１  ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥはＳ３５４Ｃ変異およびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＳ３５４Ｃ変異およびＰＧＫトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩはヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪはヒトＩｇＧ１  ＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫはＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭはヒトＩｇＧ１アミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ結合分子を形成し；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
【０３４１】
好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号３２の配列を有し、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２５の配列を有し、第３のポリペプチド鎖は、配列番号１０の配列を有し、および第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１の配列を有する。
６．５．特定の三価ＲＯＲ結合分子
６．５．１．三価１×２二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ２８−１×２」
【０３４２】
セクション６．４．３および図２６を参照して、一連の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、ここで（ａ）第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＲは第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＳは、Ｙ３４９Ｃ変異、およびＰＧＫトリペプチド配列とそれに続くドメインＳをドメインＨに連結するＧＳＧＳＧＳリンカーペプチドを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｂ）ＲＯＲ結合分子が、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、第６のポリペプチド鎖が、ドメインＴおよびドメインＵを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、ドメインＴは第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＵはＳ３５４Ｃ変異およびＰＧＫトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ結合分子を形成し；（ｄ）ドメインＲおよびドメインＴが第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【０３４３】
好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４の配列を有し、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２５の配列を有し、第３のポリペプチド鎖は、配列番号３７の配列を有し、第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１の配列を有し、および第６のポリペプチド鎖は、配列番号２５の配列を有する。
６．５．２．三価１×２三重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ２８−１×１×１ａ」
【０３４４】
セクション６．４．３ならびに図２６および図３０を参照して、一連の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、ここで（ａ）第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＲは第３のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＳは、Ｔ３６６Ｋ変異およびＫＳＣトリペプチド配列とそれに続くドメインＳをドメインＨに連結するＧＳＧＳＧＳリンカーペプチドを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｂ）ＲＯＲ結合分子が、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、第６のポリペプチド鎖が、ドメインＴおよびドメインＵを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、ドメインＴは第３のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＵはＬ３５１Ｄ変異およびＧＥＣアミノ酸ジスルフィドモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、ＲＯＲ結合分子を形成し；（ｄ）ドメインＲおよびドメインＴが第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【０３４５】
好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４の配列を有し、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２５の配列を有し、第３のポリペプチド鎖は、配列番号４５の配列を有し、第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１の配列を有し、および第６のポリペプチド鎖は、配列番号５３の配列を有する。
６．６．他のＲＯＲ結合分子プラットフォーム
【０３４６】
上述の様々な抗体プラットフォームは、限定的なものではない。特定のＣＤＲサブセットを含む本明細書に記載されている抗原結合部位は、全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｓｃダイアボディ、ＤＡＲＴ、ｔａｎｄＡｂ、ミニボディ、ラクダ類ＶＨＨ、および当業者に公知の他の抗体断片またはフォーマットを含むがこれらに限定されない、いずれかの結合分子プラットフォームへとフォーマットすることができる。例示的な抗体および抗体断片フォーマットは、それが教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ＭＡＢＳ，  ２０１７，  Ｖｏｌ．  ９，  Ｎｏ．  ２，  １８２−２１２）に詳細に記載されている。
６．７．抗原特異性
【０３４７】
ＲＯＲ抗原に加えて本明細書に記載されているＲＯＲ結合分子が特異的に結合することができる他の抗原は、多種多様な分子標的から選択することができる。例えば、抗原結合部位（単数または複数）は、Ｅ−Ｃａｄ、ＣＬＤＮ７、ＦＧＦＲ２ｂ、Ｎ−Ｃａｄ、Ｃａｄ−１１、ＦＧＦＲ２ｃ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＦＧＦＲ１、ＦＯＬＲ１、ＩＧＦ−Ｉｒａ、ＧＬＰ１Ｒ、ＰＤＧＦＲａ、ＰＤＧＦＲｂ、ＥＰＨＢ６、ＡＢＣＧ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、インテグリン−ａｖｂ３、ＳＰＡＲＣ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、アネキシン、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＴＮＦα、ＣＤ１３７、アンジオポエチン２、アンジオポエチン３、ＢＡＦＦ、ベータアミロイド、Ｃ５、ＣＡ−１２５、ＣＤ１４７、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＥＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＬＡ−２、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＨＥＲ３、ＧＤ２ガングリオシド、ＧＤＦ−８、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＤ２２２１、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、インテグリン、ＣＤ１１ａ、ＭＵＣ１、Ｎｏｔｃｈ、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦβ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦｃ、ヘマトポエチン（４ヘリックスバンドル）（ＥＰＯ（エリスロポエチン）、ＩＬ−２（Ｔ細胞増殖因子）、ＩＬ−３（マルチコロニーＣＳＦ）、ＩＬ−４（ＢＣＧＦ−１、ＢＳＦ−１）、ＩＬ−５（ＢＣＧＦ−２）、ＩＬ−６  ＩＬ−４（ＩＦＮ−β２、ＢＳＦ−２、ＢＣＤＦ）、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３（Ｐ６００）、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１５（Ｔ細胞増殖因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＯＳＭ（ＯＭ、オンコスタチンＭ）、およびＬＩＦ（白血病阻止因子）など）；インターフェロン（ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βなど）；免疫グロブリンスーパーファミリー（Ｂ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（Ｂ７０、ＣＤ８６）など）；ＴＮＦファミリー（ＴＮＦ−α（カケクチン）、ＴＮＦ−β（リンホトキシン、ＬＴ、ＬＴ−α）、ＬＴ−β、Ｆａｓ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、および４−１ＢＢＬなど）；ならびに特定のファミリーに分類されないもの（ＴＧＦ−β、ＩＬ  １α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１  ＲＡ、ＩＬ−１０（サイトカイン合成阻害因子Ｆ）、ＩＬ−１２（ＮＫ細胞刺激因子）、ＭＩＦ、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７（ｍＣＴＬＡ−８）、および／またはＩＬ−１８（ＩＧＩＦ、インターフェロン−γ誘導因子）など）に特異的に結合しうる；二重特異性抗体に関する実施形態では、抗体は、例えば、これらの標的のうちの２つに結合しうる。さらに、標的マスト細胞および好塩基球を標的とするためのＩｇＥ抗体のＦｃ部分の使用など、Ｆｃ受容体発現細胞を標的とするために、抗体の重鎖のＦｃ部分を使用してもよい。
【０３４８】
ＲＯＲ抗原に加えて本明細書に記載されているＲＯＲ結合分子が特異的に結合することができる他の抗原を選ぶことができ、これは、ＴＮＦＲ１（ＣＤ１２０ａおよびＴＮＦＲＳＦ１Ａとしても公知）、ＴＮＦＲ２（ＣＤ１２０ｂおよびＴＮＦＲＳＦ１Ｂとしても公知）、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴβＲとしても公知）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０およびＣＤ１３４としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ６（ＦＡＳおよびＣＤ９５としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤＣＲ３としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ９（４−１ＢＢとしても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＴＲＡＩＬＲ１、ＤＲ４およびＣＤ２６としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬＲ２、ＤＲ５およびＣＤ２６２としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＴＲＡＩＬＲ３、ＤＣＲ１、ＣＤ２６３としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（ＴＲＡＩＬＲ４、ＤＣＲ２およびＣＤ２６４としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫおよびＣＤ２６５としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＯＰＧとしても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（ＦＮ１４、ＴＷＥＡＫＲおよびＣＤ２６６としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩおよびＣＤ２６７としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦＲ、ＢＲ３およびＣＤ２６８としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭおよびＣＤ２７０としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１６（ＮＧＦＲ、ｐ７５ＮＴＲおよびＣＤ２７１としても公知）またはＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡおよびＣＤ２６９としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲおよびＣＤ３５７としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ、ＴＡＪおよびＴＲＡＤＥとしても公知）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＣＤ３５８としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ２５（Ａｐｏ−３、ＴＲＡＭＰ、ＬＡＲＤまたはＷＳ−１としても公知）、ＥＤＡ２Ｒ（ＸＥＤＡＲとしても公知）を含むがこれらに限定されない、受容体のＴＮＦファミリーに特異的に結合する。
【０３４９】
ＲＯＲ抗原に加えて本明細書に記載されているＲＯＲ結合分子が特異的に結合することができる他の抗原は、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＢＹ５５およびＣＧＥＮ−１５０４９などのチェックポイント阻害剤標的を含むがこれらに限定されない、免疫腫瘍学（ｉｍｍｕｎｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ）標的から選択することができる。
６．８．さらに別の修飾
【０３５０】
さらなる一連の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は追加的修飾を有する。
６．８．１．抗体−薬物コンジュゲート
【０３５１】
様々な実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、治療剤（例えば、薬物）にコンジュゲートされて、ＲＯＲ結合分子−薬物コンジュゲートを形成する。治療剤には、化学治療剤、画像化剤（例えば、放射性同位体）、免疫調節剤（例えば、サイトカイン、ケモカイン、またはチェックポイント阻害剤）、および毒素（例えば、細胞毒性剤）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、治療剤は、下記セクション６．８．３においてより詳細に議論されているように、リンカーペプチドを介してＲＯＲ結合分子に連結されている。
【０３５２】
薬物を本明細書に開示されるＲＯＲ結合分子にコンジュゲートするために適合しうる抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の調製方法は、例えば、それぞれ教示する全てについて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，６２４，００３号（ポット法）、米国特許第８，１６３，８８８号（ワンステップ法）、米国特許第５，２０８，０２０号（ツーステップ法）、米国特許第８，３３７，８５６号、米国特許第５，７７３，００１号、米国特許第７，８２９，５３１号、米国特許第５，２０８，０２０号、米国特許第７，７４５，３９４号、ＷＯ２０１７／１３６６２３、ＷＯ２０１７／０１５５０２、ＷＯ２０１７／０１５４９６、ＷＯ２０１７／０１５４９５、ＷＯ２００４／０１０９５７、ＷＯ２００５／０７７０９０、ＷＯ２００５／０８２０２３、ＷＯ２００６／０６５５３３、ＷＯ２００７／０３０６４２、ＷＯ２００７／１０３２８８、ＷＯ２０１３／１７３３３７、ＷＯ２０１５／０５７６９９、ＷＯ２０１５／０９５７５５、ＷＯ２０１５／１２３６７９、ＷＯ２０１５／１５７２８６、ＷＯ２０１７／１６５８５１、ＷＯ２００９／０７３４４５、ＷＯ２０１０／０６８７５９、ＷＯ２０１０／１３８７１９、ＷＯ２０１２／１７１０２０、ＷＯ２０１４／００８３７５、ＷＯ２０１４／０９３３９４、ＷＯ２０１４／０９３６４０、ＷＯ２０１４／１６０３６０、ＷＯ２０１５／０５４６５９、ＷＯ２０１５／１９５９２５、ＷＯ２０１７／１６０７５４、Ｓｔｏｒｚ  （ＭＡｂｓ．  ２０１５  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；  ７（６）：  ９８９−１００９）、Ｌａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （Ａｄｖ  Ｔｈｅｒ，  ２０１７  ３４：  １０１５）、Ｄｉａｍａｎｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２０１６，  １１４，  ３６２−３６７）、Ｃａｒｒｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，  ２００７．  ３：  ３２１−２）、Ｗｅ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ２００９．  １０６：  ３０００−５）、Ｒａｂｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．，  ２０１１  １４：  ７９０−６）、Ｈｕｄａｋ  ｅｔ  ａｌ．  （Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．，  ２０１２：  ４１６１−５）、Ｒａｂｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．，  ２０１２  ７：１０５２−６７）、Ａｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，  ２０１３，  １１０：  ４６−５１）、Ａｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ２０１３，  ２４：  ８４６−８５１）、Ｂａｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  ａｎｄ  Ｄ．，  ２０１４，  １４：３４−４１）、Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ２０１４，  ２５：１３３１−４１）、Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．，  ２０１４，  １３６：１０８５０−３）、Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．，  ２０１５，  ２８：１７４−８０）およびＹｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．  （ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２０１６，  １６（１）：２３）に記載さ��ている。
６．８．２．さらなる結合部分構造
【０３５３】
様々な実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、１つまたは複数の追加の結合部分構造を含む修飾を有する。ある特定の実施形態では、結合部分構造は、例えば、全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｓｃダイアボディ、ＤＡＲＴ、ｔａｎｄＡｂ、ミニボディ、カメリドＶＨＨ、および当業者に公知の他の抗体断片もしくはフォーマットを含むがこれらに限定されない抗体断片または抗体フォーマットである。例示的な抗体および抗体断片フォーマットは、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるＢｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ＭＡＢＳ，  ２０１７，  Ｖｏｌ．  ９，  Ｎｏ．  ２，  １８２−２１２）において詳細に記載されている。
【０３５４】
特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、第１または第３のポリペプチド鎖のＣ末端に連結されている。特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、第１および第３のポリペプチド鎖の両方のＣ末端に連結されている。特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、第１および第３のポリペプチド鎖の両方のＣ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造の個々の部分が、官能性結合部分構造を形成するように、第１および第３のポリペプチド鎖のＣ末端に別個に連結されている。
【０３５５】
特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、ポリペプチド鎖のいずれか（例えば、第１、第２、第３、第４、第５、または第６のポリペプチド鎖）のＮ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、追加の結合部分構造の個々の部分が、官能性結合部分構造を形成するように、異なるポリペプチド鎖のＮ末端に別個に連結されている。
【０３５６】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、ＲＯＲ結合分子内のＡＢＳの異なる抗原またはエピトープに特異的である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、ＲＯＲ結合分子内のＡＢＳの同じ抗原またはエピトープに特異的である。修飾が２つまたはそれより多い追加の結合部分構造である特定の実施形態では、追加の結合部分構造は、同じ抗原またはエピトープに特異的である。修飾が２つまたはそれより多い追加の結合部分構造である特定の実施形態では、追加の結合部分構造は、異なる抗原またはエピトープに特異的である。
【０３５７】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、下記セクション６．８．３においてより詳細が議論されているように、例えば、反応性化学および親和性タグシステムを含むがこれらに限定されないｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を使用してＲＯＲ結合分子に連結される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、Ｆｃ媒介結合（例えば、プロテインＡ／Ｇ）を介してＲＯＲ結合分子に連結される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、例えば、ＲＯＲ結合分子と追加の結合部分構造との融合産物のヌクレオチド配列を同じ発現ベクター（例えば、プラスミド）にコード化するなどの組換えＤＮＡ技術を使用して、ＲＯＲ結合分子に連結される。
６．８．３．官能基／反応基
【０３５８】
様々な実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、例えば追加の部分構造（例えば、上記セクション６．８．１および６．８．２においてより詳細が議論されている薬物コンジュゲートおよび追加の結合部分構造）の連結などの下流プロセスおよび下流精製プロセスにおいて使用することができる、官能基または化学的反応性基を含む修飾を有する。
【０３５９】
ある特定の実施形態では、修飾は、例えば、反応性チオール（例えば、マレイミド系反応性基）、反応性アミン（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド系反応性基）、「クリック化学」基（例えば、反応性アルキン基）、およびホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）を保持するアルデヒド類を含むがこれらに限定されない化学的反応性基である。ある特定の実施形態では、修飾は、親和性ペプチド配列（例えば、ＨＡ、ＨＩＳ、ＦＬＡＧ、ＧＳＴ、ＭＢＰおよびＳｔｒｅｐシステムなど）を含むがこれらに限定されない官能基である。ある特定の実施形態では、官能基または化学的反応性基は、開裂可能なペプチド配列を有する。特定の実施形態では、開裂可能なペプチドは、光開裂、化学開裂、プロテアーゼ開裂、還元条件、およびｐＨ条件を含むがこれらに限定されない手段によって開裂される。特定の実施形態では、プロテアーゼ開裂は、細胞内プロテアーゼによって実施される。特定の実施形態では、プロテアーゼ開裂は、細胞外または膜会合プロテアーゼによって実施される。プロテアーゼ開裂を採用するＡＤＣ治療は、教示する全てについて参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，  ２０１２；  ２（２）：  １５６−１７８．）においてより詳細に記載されている。
６．８．４．低減されたエフェクター機能
【０３６０】
ある特定の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、抗体結合に天然では関連するエフェクター機能を低減させる抗体ドメインのアミノ酸配列における１つまたは複数の操作された変異を有する。エフェクター機能としては、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ、これは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害とも称される）、補体固定（例えば、Ｃ１ｑ結合）、抗体依存性細胞媒介性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）およびオプソニン化など、抗体のＦｃ部分へのＦｃ受容体結合に起因する細胞機能が挙げられるがこれらに限定されない。エフェクター機能を低減させる操作された変異は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７／０１３７５３０号、Ａｒｍｏｕｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９（８）  （１９９９）  ２６１３−２６２４）、Ｓｈｉｅｌｄｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６（９）  （２００１）  ６５９１−６６０４）およびＯｇａｎｅｓｙａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ａｃｔａ  Ｃｒｉｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｄ６４  （２００８）  ７００−７０４）  により詳細に記載されている。
【０３６１】
特定の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、ＦｃＲ受容体によるＲＯＲ結合分子のＦｃ部分の結合を低減させる抗体ドメインのアミノ酸配列における１つまたは複数の操作された変異を有する。一部の実施形態では、ＦｃＲ受容体は、ＦｃＲγ受容体である。特定の実施形態では、ＦｃＲ受容体は、ＦｃγＲＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡ受容体である。
【０３６２】
特定の実施形態では、エフェクター機能を低減させる１つまたは複数の操作された変異は、抗体のＣＨ２ドメインにおける変異である。様々な実施形態では、１つまたは複数の操作された変異は、ＣＨ２ドメインのＬ２３４およびＬ２３５位に存在する。特定の実施形態では、１つまたは複数の操作された変異は、ＣＨ２ドメインのＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。他の実施形態では、１つまたは複数の操作された変異は、ＣＨ２ドメインのＬ２３４、Ｌ２３５およびＰ３２９位に存在する。特定の実施形態では、１つまたは複数の操作された変異は、ＣＨ２ドメインのＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇである。好まれる実施形態では、１つまたは複数の操作された変異は、ＣＨ２ドメインのＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｋである。
６．９．精製方法
【０３６３】
Ｂ−ｂｏｄｙプラットフォームを含むＲＯＲ結合分子を精製する方法が本明細書に提供される。
【０３６４】
一連の実施形態では、方法は、ｉ）ＲＯＲ結合分子を含む試料をＣＨ１結合試薬と接触させるステップであって、ＲＯＲ結合分子が、複合体において会合した少なくとも第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を含み、複合体が、少なくとも１つのＣＨ１ドメインまたはその部分を含み、複合体におけるＣＨ１ドメインの数が、複合体の価数（ｖａｌｅｎｃｙ）よりも少なくとも１つ少なく、接触が、ＣＨ１結合試薬がＣＨ１ドメインまたはその部分に結合するのに十分な条件下で行われる、ステップと；ｉｉ）１つまたは複数の不完全複合体から複合体を精製するステップであって、不完全複合体が、第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を含まない、ステップとを含む。
【０３６５】
典型的な天然に存在する抗体において、Ｎ末端からＣ末端へナンバリングされた第２のドメインとしてＣＨ１ドメインをそれぞれ有する、２つの重鎖が会合する。よって、典型的な抗体は、２つのＣＨ１ドメインを有する。ＣＨ１ドメインは、セクション６．３．８．１により詳細に記載されている。本明細書に記載されている種々のＲＯＲ結合分子において、タンパク質におけるＣＨ１ドメインの数が有効に低減されるように、タンパク質に典型的に見出されるＣＨ１ドメインは、別のドメインに置換されている。非限定的な説明目的の例では、典型的な抗体のＣＨ１ドメインをＣＨ３ドメインに置換し、単一のＣＨ１ドメインのみを有する抗原結合タンパク質を生成することができる。
【０３６６】
ＲＯＲ結合分子は、典型的な抗体アーキテクチャをもはや保有しないように操作された抗体アーキテクチャに基づく分子を指すこともできる。例えば、抗体は、そのＮまたはＣ末端において拡張して、抗原結合タンパク質の価数（セクション６．３．１３．１により詳細に記載されている）を増加させることができ、ある特定の実例では、ＣＨ１ドメインの数も、典型的な２つのＣＨ１ドメインを越えて増加される。このような分子は、タンパク質におけるＣＨ１ドメインの数が、抗原結合タンパク質の価数よりも少なくとも１つ少なくなるように、そのＣＨ１ドメインのうち１つまたは複数を置換させることもできる。一部の実施形態では、他のドメインによって置換されるＣＨ１ドメインの数は、単一のＣＨ１ドメインのみを有するＲＯＲ結合分子を生成する。他の実施形態では、別のドメインによって置換されるＣＨ１ドメインの数は、２つまたはそれよりも多いが、抗原結合タンパク質の価数よりも少なくとも１つ少ないＣＨ１ドメインを有するＲＯＲ結合分子を生成する。特定の実施形態では、ＲＯＲ結合分子が２つまたはそれよりも多いＣＨ１ドメインを有する場合、複数のＣＨ１ドメインは全て、同じポリペプチド鎖に存在することができる。他の特定の実施形態では、ＲＯＲ結合分子が２つまたはそれよりも多いＣＨ１ドメインを有する場合、複数のＣＨ１ドメインは、完全複合体に存在する同じポリペプチド鎖の複数コピーにおける単一のＣＨ１ドメインとなることができる。
６．９．１．ＣＨ１結合試薬
【０３６７】
ＲＯＲ結合分子を精製する例示的で非限定的な方法において、ＲＯＲ結合分子を含む試料は、ＣＨ１結合試薬と接触される。本明細書に記載されているＣＨ１結合試薬は、ＣＨ１エピトープに特異的に結合するいずれかの分子となることができる。ＣＨ１エピトープをもたらす様々なＣＨ１配列は、セクション６．３．８．１により詳細に記載されており、特異的結合は、セクション６．３．１３．１により詳細に記載されている。
【０３６８】
一部の実施形態では、ＣＨ１結合試薬は、免疫グロブリンタンパク質に由来し、ＣＨ１エピトープに特異的に結合する抗原結合部位（ＡＢＳ）を有する。特定の実施形態では、ＣＨ１結合試薬は、「抗ＣＨ１抗体」とも称される抗体である。抗ＣＨ１抗体は、種々の種に由来することができる。特定の実施形態では、抗ＣＨ１抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト抗体を含むがこれらに限定されない、哺乳動物抗体である。特定の実施形態では、抗ＣＨ１抗体は、単一ドメイン抗体である。本明細書に記載されている単一ドメイン抗体は、ＡＢＳを形成し、ＣＨ１エピトープに特異的に結合する単一の可変ドメインを有する。例示的な単一ドメイン抗体としては、それが教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれる、国際出願ＷＯ２００９／０１１５７２により詳細に記載されているラクダおよびサメに由来する重鎖抗体が挙げられるがこれらに限定されない。好まれる実施形態では、抗ＣＨ１抗体は、ラクダ由来の抗体（「ラクダ類抗体」とも称される）である。例示的なラクダ類抗体としては、ヒトＩｇＧ−ＣＨ１  ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１９４３２００１０）およびヒトＩｇＡ−ＣＨ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１９４３１１０１０）が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、抗ＣＨ１抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は典型的に、培養されている抗体産生細胞系から産生される。他の実施形態では、抗ＣＨ１抗体は、ポリクローナル抗体、すなわち、それぞれがＣＨ１エピトープを認識する異なる抗ＣＨ１抗体の集合体である。ポリクローナル抗体は典型的に、目的の抗原またはその断片、この場合はＣＨ１で免疫化した動物の抗体含有血清を収集することにより産生される。
【０３６９】
一部の実施形態では、ＣＨ１結合試薬は、免疫グロブリンタンパク質に由来しない分子である。このような分子の例としては、Ｐｅｒｒｅｔ  ａｎｄ  Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ  （Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，  Ｆｅｂ．  ２０１８，  Ｖｏｌ  １４５：９８−１１２）により詳細に記載されている通り、アプタマー、ペプトイドおよびアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）が挙げられるがこれらに限定されない。
６．９．２．固体支持体
【０３７０】
ＲＯＲ結合分子を精製する例示的で非限定的な方法において、ＣＨ１結合試薬は、本発明の様々な実施形態では、固体支持体に取り付けることができる。本明細書に記載されている固体支持体は、他の実体、例えば、ＣＨ１結合試薬を取り付けるまたは固定化することができる材料を指す。「担体」とも称される固体支持体は、国際出願ＷＯ２００９／０１１５７２により詳細に記載されている。
【０３７１】
特定の実施形態では、固体支持体は、ビーズまたはナノ粒子を含む。ビーズおよびナノ粒子の例としては、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、磁気ナノ粒子（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ポリマー（例えば、デキストラン）、合成ポリマー（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標））、またはＣＨ１結合試薬の取付けに適した他のいずれかの材料が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、固体支持体は、ＣＨ１結合試薬の取付けを可能にするように修飾される。固体支持体修飾の例としては、タンパク質と共有結合を形成する化学修飾（例えば、活性化されたアルデヒド基）、およびＣＨ１結合試薬のコグネート修飾と特異的に対形成する修飾（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン対、ジスルフィド連結、ポリヒスチジン−ニッケル、またはアジド−アルキニル対などの「クリックケミストリー」修飾）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３７２】
ある特定の実施形態では、ＲＯＲ結合分子へのＣＨ１結合試薬接触に先立ち、ＣＨ１結合試薬は、固体支持体に取り付けられ、「抗ＣＨ１樹脂」とも本明細書で称される。一部の実施形態では、抗ＣＨ１樹脂は、溶液中に分散される。他の実施形態では、抗ＣＨ１樹脂は、カラム内に「充填される」。次に、抗ＣＨ１樹脂は、ＲＯＲ結合分子と接触され、ＣＨ１結合試薬は、ＲＯＲ結合分子に特異的に結合する。
【０３７３】
他の実施形態では、ＣＨ１結合試薬がＲＯＲ結合分子に接触した後に、ＣＨ１結合試薬は、固体支持体に取り付けられる。非限定的な例証として、ビオチン修飾を有するＣＨ１結合試薬は、ＲＯＲ結合分子と接触させることができ、その後、ＣＨ１結合試薬／ＲＯＲ結合分子混合物は、ストレプトアビジン修飾固体支持体と接触させて、ＲＯＲ結合分子に特異的に結合されたＣＨ１結合試薬を含むＣＨ１結合試薬を固体支持体に取り付けることができる。
【０３７４】
ＣＨ１結合試薬が固体支持体に取り付けられる方法において、種々の実施形態では、結合されたＲＯＲ結合分子は、固体支持体から放出または「溶出」され、ＲＯＲ結合分子を有する溶出液を形成する。一部の実施形態では、対形成した修飾を反転させる（例えば、ジスルフィド連結の還元）、ＲＯＲ結合分子と競合して外すための試薬を添加する（例えば、ニッケルへの結合に関してポリヒスチジンと競合するイミダゾールの添加）、ＲＯＲ結合分子を切断して外す（例えば、修飾に切断可能部分が含まれていてよい）、またはＲＯＲ結合分子に対するＣＨ１結合試薬の特異的結合に他の仕方で干渉することにより、結合されたＲＯＲ結合分子が放出される。特異的結合に干渉する方法としては、ＣＨ１結合試薬に結合されたＲＯＲ結合分子と低ｐＨ溶液との接触が挙げられるがこれに限定されない。好まれる実施形態では、低ｐＨ溶液は、０．１Ｍ酢酸、ｐＨ４．０を含む。他の実施形態では、結合されたＲＯＲ結合分子は、ある範囲の低ｐＨ溶液、すなわち、「勾配」と接触させることができる。
６．９．３．さらなる精製
【０３７５】
例示的で非限定的な方法の一部の実施形態では、ＲＯＲ結合分子をＣＨ１結合試薬と接触させ、続いてＲＯＲ結合分子を溶出するステップを使用した方法の単一の反復が使用されて、１つまたは複数の不完全複合体からＲＯＲ結合分子を精製する。特定の実施形態では、他の精製ステップは行われない。他の実施形態では、１つまたは複数の追加的な精製ステップが行われて、１つまたは複数の不完全複合体からＲＯＲ結合分子をさらに精製する。１つまたは複数の追加的な精製ステップとしては、サイズ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィ）、電荷（例えば、イオン交換クロマトグラフィ）または疎水性（例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィ）などの他のタンパク質特徴に基づくＲＯＲ結合分子の精製が挙げられるがこれらに限定されない。好まれる実施形態では、追加的な陽イオン交換クロマトグラフィが行われる。その上、上述のＣＨ１結合試薬とＲＯＲ結合分子との接触を繰り返すと共に、反復間のＣＨ１精製方法を修飾して、例えば、第１の反復のための溶出ステップおよびその後の溶出のための勾配溶出を使用して、ＲＯＲ結合分子は、さらに精製することができる。
６．９．４．複合体のアセンブリおよび純度
【０３７６】
本発明の実施形態では、少なくとも４つの別個のポリペプチド鎖が、一体に会合して、完全複合体、例えば、ＲＯＲ結合分子を形成する。しかし、少なくとも４つの別個のポリペプチド鎖を含有しない不完全複合体を形成する場合もある。例えば、ポリペプチド鎖のうち１、２または３つのみを有する不完全複合体を形成し得る。他の例では、不完全複合体は、４つ以上のポリペプチド鎖を含有することができるが、少なくとも４つの別個のポリペプチド鎖を含有しない、例えば、不完全複合体は、別個のポリペプチド鎖の２つ以上のコピーと不適切に会合する。本発明の方法は、不完全複合体から複合体、例えば、完全にアセンブルしたＲＯＲ結合分子を精製する。
【０３７７】
精製ステップの有効性および効率を評価するための方法は、当業者にとって周知であり、そのようなものとしては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィおよび質量分析が挙げられるがこれらに限定されない。純度は、種々の判断基準に従って評価することもできる。判断基準の例としては、１）完全にアセンブルされたＲＯＲ結合分子によって提供される溶出液における総タンパク質のパーセンテージの評価、２）所望の産物を精製するための方法の倍数濃縮またはパーセント増加の評価、例えば、溶出液における完全にアセンブルされたＲＯＲ結合分子によって提供される総タンパク質の、出発試料におけるものとの比較、３）特定の望まれない産物（例えば、会合していない単一のポリペプチド鎖、ポリペプチド鎖のいずれかの組合せの二量体、またはポリペプチド鎖のいずれかの組合せの三量体）のパーセントまたはパーセント減少の決定を含む、望まれない産物、例えば、上述の不完全複合体の総タンパク質のパーセンテージ、またはパーセント減少の評価が挙げられるがこれらに限定されない。純度は、本明細書に記載されている方法のいずれかの組合せの後に評価することができる。例えば、純度は、本明細書に記載されている通り、抗ＣＨ１結合試薬を使用した単一の反復の後に、またはセクション６．９．３により詳細に記載されている通り、追加的な精製ステップの後に評価することができる。精製ステップの有効性および効率を使用して、抗ＣＨ１結合試薬を使用して記載されている方法を、プロテインＡ精製などの当業者にとって公知の他の精製方法と比較することもできる。
６．１０．製造方法
【０３７８】
本明細書に記載されているＲＯＲ結合分子は、抗体製造のために現在使用されている、標準無細胞翻訳、一過性トランスフェクションおよび安定したトランスフェクションアプローチを使用した発現により容易に製造することができる。特定の実施形態では、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅなどのＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのプロトコールおよび試薬、またはそれが教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるＦａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  Ｏｎｌｉｎｅ，  ２０１７，  １９：１１）に詳細に記載されているポリエチレンイミンなどの当業者にとって公知の他の試薬を使用して、Ｅｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をＲＯＲ結合分子の産生のために使用することができる。
【０３７９】
後述する実施例にさらに記載されている通り、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＣＨ１樹脂などのＣＨ１親和性樹脂およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから提供されたプロトコールを使用して、発現されたタンパク質は、望まれないタンパク質およびタンパク質複合体から容易に分離することができる。他の精製戦略としては、プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＡ／Ｇ試薬の使用が挙げられるがこれらに限定されない。当技術分野でルーチンに使用される通り、イオン交換クロマトグラフィを使用して、さらなる精製をもたらす（ａｆｆｅｃｔ）ことができる。
６．１１．医薬組成物
【０３８０】
別の態様では、本明細書に記載されるＲＯＲ結合分子と、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物が提供される。典型的な実施形態では、医薬組成物は滅菌される。
【０３８１】
様々な実施形態では、医薬組成物は、ＲＯＲ結合分子を０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、ＲＯＲ結合分子を、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、ＲＯＲ結合分子を、１０ｍｇ／ｍｌを超える濃度で含む。ある特定の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、またはさらには５０ｍｇ／ｍｌもしくはそれより高い濃度で存在する。特定の実施形態では、ＲＯＲ結合分子は、５０ｍｇ／ｍｌを超える濃度で存在する。
【０３８２】
様々な実施形態では、医薬組成物は、それぞれその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，９６１，９６４号、米国特許第８，９４５，８６５号、米国特許第８，４２０，０８１号、米国特許第６，６８５，９４０号、米国特許第６，１７１，５８６号、米国特許第８，８２１，８６５号、米国特許第９，２１６，２１９号、米国特許出願第１０／８１３，４８３号、ＷＯ２０１４／０６６４６８、ＷＯ２０１１／１０４３８１およびＷＯ２０１６／１８０９４１においてより詳細に記載されている。
６．１２．処置方法
【０３８３】
別の態様では、処置方法であって、対象の処置に有効な量で、本明細書に記載されているＲＯＲ結合分子（例えば、抗体）を対象に投与するステップを含む方法が提供される。このようなＲＯＲ抗原結合分子は、ＲＯＲ１抗原を発現するがん、ＲＯＲ２抗原を発現するがん、および／またはＲＯＲ１抗原とＲＯＲ２抗原の両方を発現するがんを含む、ＲＯＲ発現がんの処置において有用である。
【０３８４】
一部の実施形態では、本開示の抗体は、様々ながんを処置するために使用されうる。がんは、膀胱、血液（骨髄球性白血病［急性および慢性］、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、骨、骨髄、脳（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形性神経膠芽細胞腫、乏突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、乳房、結腸、食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃腸管、歯肉、頭部、腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽腫］、リンパ腫、白血病、腎細胞癌）、肝臓、肺、上咽頭、頸部、卵巣、前立腺（腺癌、肉腫、去勢抵抗性前立腺がん）、皮膚、胃（癌、リンパ腫、平滑筋肉腫）、精巣（セミノーマ、テラトーマ、胎児性癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）、舌または子宮由来のがんとなることができる。一部の実施形態では、がんは、新生物、悪性疾患；癌腫；未分化癌腫；巨細胞紡錘形細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ腫；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管癌；肝細胞癌；混合型肝細胞癌・胆管細胞癌；小柱腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープの腺癌；腺腫性家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド悪性腫瘍；細気管支肺胞腺癌（ｂｒａｎｃｈｉｏｌｏ−ａｌｖｅｏｌａｒ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌（ａｃｉｄｏｐｈｉｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；好酸性腺癌；好塩基球腫；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭状・濾胞腺癌；非被包性硬化性癌（ｎｏｎｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；副腎皮質癌；子宮内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌；ダクト癌浸潤；髄様癌；小葉癌；炎症性腫；乳腺パジェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生随伴腺癌；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫瘍；悪性莢膜細胞腫；悪性顆粒細胞腫瘍；悪性男性細胞腫；セルトリ細胞癌；悪性ライディッヒ細胞腫瘍；悪性脂質細胞腫瘍；悪性傍神経節腫；悪性エキストラ乳腺傍神経節腫；褐色細胞腫；糸球体肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏メラノーマ；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑の悪性黒色腫（ｍａｌｉｇ  ｍｅｌａｎｏｍａ）；類上皮細胞メラノーマ；悪性青色母斑；肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；肺胞横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー管混合腫瘍；腎芽；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胎児性癌；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛癌；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管周囲細胞腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉系軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮歯牙肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル上皮線維肉腫��悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星細胞腫；原形質性星細胞腫；線維性星細胞腫；星芽腫；神経膠芽腫；乏突起；乏突起膠芽腫；原始神経外胚葉；小脳肉腫；神経節；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅覚神経原性腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫瘍；悪性リンパ腫（細網細胞肉腫）；ホジキン病；ホジキン；側肉芽腫；悪性小リンパ球性リンパ腫；悪性びまん性大細胞型リンパ腫；悪性濾胞性リンパ腫；菌状息肉症；他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；顆粒球肉腫；ヘアリー細胞白血病；粘液腫；横紋筋腫；線維腫；頭頸部の扁平上皮癌；喉頭および下咽頭がん；鼻腔および副鼻腔がん；鼻咽頭がん；唾液腺がん；口腔；中咽頭（ｏｒｐｐｈａｒｙｎｇｅａｌ）がん；気管支原性癌（扁平上皮、未分化型小細胞、未分化型大細胞、腺癌、非小細胞肺がん）；肺胞（細気管支）癌；気管支腺腫；軟骨性過誤腫；結腸直腸がん；消化管間質腫瘍；カルチノイド；ターコット症候群；胃がん；食道胃接合部腺癌；膵（腺管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）；小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ（Ｋａｒｐｏｓｉ）肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）；大腸（腺癌、管状アデノーマ、絨毛アデノーマ、過誤腫、平滑筋腫）；転移性乳がん；腺管癌ｉｎ  ｓｉｔｕ；浸潤性腺管癌；管状癌；粘液性癌；小葉癌ｉｎ  ｓｉｔｕ；三種陰性乳がん；膀胱および尿道（扁平上皮癌、移行細胞癌、腺癌、尿路上皮癌）；明細胞癌；ヘパトーマ（肝細胞癌）；血管肉腫；肝細胞アデノーマ；血管腫；骨原性肉腫（骨肉腫）；悪性線維性組織球腫；悪性巨細胞腫瘍脊索腫；骨軟骨腫（ｏｓｔｅｏｃｈｒｏｎｄｒｏｍａ）（骨軟外骨腫（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｉｌａｇｉｎｏｕｓ  ｅｘｏｓｔｏｓｅｓ））；良性軟骨腫；軟骨粘液線維腫（ｃｈｏｎｄｒｏｍｙｘｏｆｉｂｒｏｍａ）；類骨腫；巨細胞腫瘍；髄様甲状腺がん；分化型甲状腺がん；乳頭状甲状腺がん；濾胞性甲状腺がん；ハースル細胞がん；退形成甲状腺がん；頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）；髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫（ｍｅｎｉｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、神経膠腫症）；脊髄（神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；子宮（明細胞（ｃｌｅａｒ））；子宮頸部（子宮頸部癌、前（ｐｒｅ）腫瘍子宮頸部異形成）；卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、未分類癌］、顆粒膜包膜細胞腫瘍、セルトリ・ライディッヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、悪性テラトーマ）；外陰部（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）；腟（明細胞癌、扁平上皮癌）；ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）；ファロピウス管（癌）；非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；カポジ（Ｋａｒｐｏｓｉ）肉腫；異形成母斑黒子（ｍｏｌｅｓ  ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｎｅｖｉ）；血管腫；皮膚線維腫；ケロイド；乾癬；神経芽細胞腫；副腎皮質癌；褐色細胞腫；傍神経節腫；メルケ���細胞癌；膵神経内分泌およびカルチノイド腫瘍；神経内分泌腫瘍；カルチノイド腫瘍；膵がん；胃食道；腎明細胞癌；ならびに原発性腹膜がんでありうる。
【０３８５】
本開示の抗体は、例えば、がん、自己免疫、移植拒絶反応、外傷後の免疫応答、移植片対宿主病、虚血、脳卒中、および感染症の処置のために（例えば、ＨＩＶのｇｐ１２０などのウイルス抗原を標的とすることにより）、それ自体または医薬組成物の形態で、対象に投与することができる。
【０３８６】
別の態様では、本明細書に記載されているＲＯＲ結合分子（例えば、抗体）は、１つまたは複数の追加的な治療と組み合わせて、がんを有する対象を処置する方法において使用することができる。本明細書に記載されているＲＯＲ抗原結合分子（例えば、抗体）と組み合わせて使用することができる追加的な治療としては、（ｉ）外科手術；（ｉｉ）放射線療法；（ｉｉｉ）内分泌療法；（ｉｖ）免疫療法（ＣＡＲ  Ｔ細胞療法など、アジュバント療法および細胞療法を含む）；ならびに（ｖ）細胞傷害剤および化学療法剤を含む化学療法が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３８７】
がんに対する活性を有するいずれかの治療法は、本明細書に提供されるＲＯＲ抗原結合分子（例えば、抗体）と組み合わせて使用することができる。がん処置のためのこのような薬剤の例は、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ａｂｏｕｔ−ｃａｎｃｅｒ／ｔｒｅａｔｍｅｎｔ／ｄｒｕｇｓ（最終アクセス２０１９年１月２２日）、およびＣａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｖ．  Ｔ．  Ｄｅｖｉｔａ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈｅｌｌｍａｎ  （ｅｄｉｔｏｒｓ），  １１ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （２０１８），  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓなどの公開ソースに見出すことができる。当業者であれば、薬物の特定の特徴および関与するがんの型に基づき、薬剤のいずれの組合せが有用となるか識別することができよう。
【０３８８】
ある特定の実施形態では、追加的な治療は、例えば、ガンマ線照射、中性子ビーム放射線療法、電子ビーム放射線療法、陽子線療法、ブラキセラピーおよび全身性放射性同位元素を含む放射線療法である。放射線療法は、照射、または放射性医薬品の関連する投与を含むことができる。線源は、処置されている対象の外部または内部のいずれかとなることができる（照射処置は、例えば、外照射療法（ＥＢＲＴ）またはブラキセラピー（ＢＴ）の形態となることができる）。例示的な放射性元素は、例えば、ラジウム、セシウム−１３７、イリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、金−１９８、コバルト−５７、銅−６７、テクネチウム−９９、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１およびインジウム−１１１を含む。
【０３８９】
ある特定の実施形態では、追加的な治療は、免疫療法である。免疫療法（生体応答修飾物質療法、生物学的療法、生物療法、免疫治療または生物学治療とも呼ばれる）は、疾患と戦うために免疫系の一部を使用する処置である。免疫療法は、免疫系ががん細胞を認識するのを助けることができる、またはがん細胞に対する応答を増強することができる。免疫療法は、能動および受動免疫療法を含む。免疫療法剤を含む能動免疫療法は、身体自身の免疫系を刺激する（例えば、ワクチン）一方、免疫療法剤を含む受動免疫療法は一般に、身体の外側で作成された免疫系成分（例えば、抗体）、薬物、毒素または放射性核種とコンジュゲートされた抗体、および標的化治療薬を使用する。
【０３９０】
例示的な免疫療法剤は、免疫チェックポイント阻害剤を含む。一部の実施形態では、処置方法において使用される免疫チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞活性化または機能を調節する１つまたは複数のチェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に低減させる、これを阻害する、これに干渉するまたはこれを調節することができる。ＣＴＬＡ−４とそのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６；ならびにＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−ＬｌおよびＰＤ−Ｌ２など、多数のチェックポイントタンパク質が公知である（Ｐａｒｄｏｌｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２０１２，  １２，  ２５２−２６４）。免疫チェックポイント阻害剤は、抗体を含む、または抗体に由来する。
【０３９１】
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）アゴニストである。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＯＸ４０抗体である。一部の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、抗ＯＸ−４０である。一部の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ＭＥＤＩ６４６９である。
【０３９２】
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＤ４０アゴニストである。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＣＤ４０抗体である。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、ＣＦ−８７０，８９３である。
【０３９３】
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４阻害剤である。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体である。抗ＣＴＬＡ４抗体の例としては、米国特許第５，８１１，０９７号；同第５，８１１，０９７号；同第５，８５５，８８７号；同第６，０５１，２２７号；同第６，２０７，１５７号；同第６，６８２，７３６号；同第６，９８４，７２０号；および同第７，６０５，２３８号に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、トレメリムマブ（チシリムマブ（ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）またはＣＰ−６７５，２０６としても公知）である。一部の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０またはＭＤＸ−１０１としても公知）である。イピリムマブは、ＣＴＬＡ−４に結合する完全にヒトモノクローナルＩｇＧ抗体である。イピリムマブは、Ｙｅｒｖｏｙ（商標）の商品名で市販されている。
【０３９４】
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害剤である。ＰＤ−ｌ／ＰＤ−Ｌ１阻害剤の例としては、米国特許第７，４８８，８０２号；同第７，９４３，７４３号；同第８，００８，４４９号；同第８，１６８，７５７号；同第８，２１７，１４９号、ならびにＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２００３０４２４０２、ＷＯ２００８１５６７１２、ＷＯ２０１００８９４１１、ＷＯ２０１００３６９５９、ＷＯ２０１１０６６３４２、ＷＯ２０１１１５９８７７、ＷＯ２０１１０８２４００およびＷＯ２０１１１６１６９９に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３９５】
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤である。一部の実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体である。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＢＧＢ−Ａ３１７、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８、ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６としても公知）またはペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５、ＳＣＨ９００４７５またはランブロリズマブとしても公知）である。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブである。ニボルマブは、ヒトＩｇＧ４  抗ＰＤ−１モノクローナル抗体であり、Ｏｐｄｉｖｏ（商標）の商品名で市販されている。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブである。ペンブロリズマブは、ヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体であり、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標）の商品名で市販されている。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ヒト化抗体であるＣＴ−０１１である。単独で投与されたＣＴ−０１１は、再発時に急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）の処置において応答を示すことができなかった。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、融合タンパク質であるＡＭＰ−２２４である。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体は、ＢＧＢ−Ａ３１７である。ＢＧＢ−Ａ３１７は、Ｆｃガンマ受容体Ｉに結合する能力が排除されるように特異的に操作されたモノクローナル抗体であり、高い親和性および優れた標的特異性でのＰＤ−１に対する特有の結合シグネチャーを有する。
【０３９６】
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤である。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。一部の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）である。一部の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５−０１としても公知）である。一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０ＡおよびＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）としても公知）である。
【０３９７】
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ２阻害剤である。一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２阻害剤は、抗ＰＤ−Ｌ２抗体である。一部の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ２抗体は、ｒＨＩｇＭ１２Ｂ７Ａである。
【０３９８】
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）阻害剤である。一部の実施形態では、ＬＡＧ−３阻害剤は、可溶性Ｉｇ融合タンパク質であるＩＭＰ３２１である（Ｂｒｉｇｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００７，  １７９，  ４２０２−４２１１）。一部の実施形態では、ＬＡＧ−３阻害剤は、ＢＭＳ−９８６０１６である。
【０３９９】
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、Ｂ７阻害剤である。一部の実施形態では、Ｂ７阻害剤は、Ｂ７−Ｈ３阻害剤またはＢ７−Ｈ４阻害剤である。一部の実施形態では、Ｂ７−Ｈ３阻害剤は、抗Ｂ７−Ｈ３抗体であるＭＧＡ２７１である（Ｌｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２０１２，  ３８３４）。
【０４００】
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３）阻害剤である（Ｆｏｕｒｃａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  ２０１０，  ２０７，  ２１７５−８６；Ｓａｋｕｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  ２０１０，  ２０７，  ２１８７−９４）。
【０４０１】
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＧＩＴＲアゴニストである。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＧＩＴＲ抗体である。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＴＲＸ５１８である。
【０４０２】
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＤ１３７アゴニストである。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＣＤ１３７抗体である。一部の実施形態では、抗ＣＤ１３７抗体は、ウレルマブである。一部の実施形態では、抗ＣＤ１３７抗体は、ＰＦ−０５０８２５６６である。
【０４０３】
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、組換えヒトインターロイキン−１５（ｒｈＩＬ−１５）である。
【０４０４】
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＩＤＯ阻害剤である。一部の実施形態では、ＩＤＯ阻害剤は、ＩＮＣＢ０２４３６０である。一部の実施形態では、ＩＤＯ阻害剤は、インドキシモド（ｉｎｄｏｘｉｍｏｄ）である。
【０４０５】
他の例示的な免疫療法は、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキンまたはリンホカインなどの免疫療法剤を含むアジュバント療法を含む。例としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１−アルファ、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１およびＩＬ−２７を含む）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−アルファを含む）およびインターフェロン（ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータおよびＩＦＮ−ガンマを含む）などのサイトカイン；水酸化アルミニウム（アラム（ａｌｕｍ））；カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）；キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）；不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；ＱＳ−２１；ＤＥＴＯＸ；レバミソール；ならびにジニトロフェニル（ＤＮＰ）、ならびに例えば、インターロイキン、例えば、ＩＬ−２と、ＩＦＮ−アルファなどの他のサイトカインの組合せなどのこれらの組合せが挙げられる。
【０４０６】
他の例示的な免疫療法は、細胞療法、例えば、目的の抗原に結合する受容体を含む（例えば、これを発現する）白血球（有核白血球細胞）などの免疫細胞の集団を含む。本開示の白血球は、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球または単球となることができる。一部の実施形態では、白血球は、リンパ球である。リンパ球の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＮＫＴ細胞が挙げられる。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔｈ（Ｔヘルパー）細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、γδＴ細胞または調節性（サプレッサー）Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、樹状細胞である。一部の実施形態では、細胞療法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法である。一部の実施形態では、二特異性ＣＡＲは、単一のトランスジェニック受容体においてタンデムで存在する２つの別個の抗原認識ドメインで構成される（ＴａｎＣＡＲと称される；例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｒａｄａ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２０１３；  ２：ｅ１０５を参照）。よって、方法は、一部の実施形態では、ＲＯＲ抗原結合分子（例えば、抗体）および免疫療法剤を含む組合せを腫瘍に送達するステップであって、免疫療法剤が、抗原をコードする操作された核酸であるステップを含む、または自己抗原の発現を誘導する操作された核酸を腫瘍に送達するステップと、２つの抗原に結合する二特異性ＣＡＲを発現する免疫細胞を腫瘍に送達するステップであって、２つの抗原のうち１つが、操作された核酸によってコードされる、ステップとを含む。
【０４０７】
他の例示的な免疫療法は、がん抗原に対する対象における免疫応答の誘発（ｉｌｌｉｃｉｔ）に使用することができる、がんワクチンなどの免疫療法剤を含む。例示的な方法は、ＲＯＲ抗原結合分子（例えば、抗体）の投与と組み合わせて、同じ組成物において、または同時に投与されるもしくは逐次に投薬される別々の組成物のいずれかにおいて、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチンを対象に投与し、これにより、対象において、抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を誘導するステップが関与し、がんに対する伝統的ワクチンの予防的有効用量をワクチン接種した対象における抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比べて、対象における抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後に増加される。
【０４０８】
ある特定の実施形態では、追加的な治療は、１つもしくは複数の細胞傷害剤または１つもしくは複数の化学療法剤などの化学療法を含む。細胞傷害剤は、細胞機能を阻害もしくは防止することができる、および／または細胞の死もしくは破壊を引き起こす。細胞傷害剤としては、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位元素）；化学療法剤；成長阻害性薬剤；核酸分解酵素などの酵素およびその断片；ならびにその断片および／またはバリアントを含む、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素活性がある毒素などの毒素が挙げられるがこれらに限定されない。
【０４０９】
ある特定の実施形態では、追加的な治療は、１つまたは複数の化学療法剤を含む。化学療法剤は、がんの処置において有用な化合物を含む。化学療法剤は、（ｉ）抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーターなど、腫瘍におけるホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤；（ｉｉ）副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；（ｉｉｉ）抗アンドロゲン薬；（ｉｖ）タンパク質キナーゼ阻害剤；（ｖ）脂質キナーゼ阻害剤；（ｖｉ）異常細胞増殖に関係付けられるシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するものを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド；（ｖｉｉｉ）遺伝子療法ワクチンなどのワクチンを含む。化学療法剤は、抗体を含むこともできる。
【０４１０】
例示的なキナーゼ阻害剤は、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標））、ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ（登録商標））、クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標））、ルキソリチニブ（Ｊａｋａｆｉ（登録商標））、ベムラフェニブ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標））、バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ（登録商標））、パゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標））、アファチニブ、アリセルチブ、アムバチニブ（ａｍｕｖａｔｉｎｉｂ）、アキシチニブ、バリシチニブ、ボスチニブ、ブリバニブ、カネルチニブ、カボザンチニブ（Ｃａｂｏｍｅｔｙｘ（登録商標））、セジラニブ、セリチニブ、クレノラニブ、ダブラフェニブ、ダコミチニブ、ダヌセルチブ（ｄａｎｕｓｅｒｔｉｂ）、ドビチニブ、フォレチニブ（ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ）、ガネテスピブ（ｇａｎｅｔｅｓｐｉｂ）、イブルチニブ、イデラリシブ、イマチニブ、イニパリブ、ラパチニブ、レンバチニブ、リニファニブ、リンシチニブ（ｌｉｎｓｉｔｉｎｉｂ）、マシチニブ（ｍａｓｉｔｉｎｉｂ）、モメロチニブ、モテサニブ、ネラチニブ、ニンテダニブ、ニラパリブ、オプロゾミブ（ｏｐｒｏｚｏｍｉｂ）、オラパリブ、パルボシクリブ、ピクチリシブ、ピルフェニドン、ポナチニブ、キザルチニブ、レゴラフェニブ、リゴサチブ、ルカパリブ、サラカチニブ（ｓａｒａｃａｔｉｎｉｂ）、サリデジブ（ｓａｒｉｄｅｇｉｂ）、ソラフェニブ、スニチニブ、タンズチニブ（ｔａｎｄｕｔｉｎｉｂ）、タソシチニブ（ｔａｓｏｃｉｔｉｎｉｂ）、テラチニブ（ｔｅｌａｔｉｎｉｂ）、チバンチニブ、チボザニブ、トファシチニブ、トラメチニブ、ベリパリブ、ビスモデギブ、ボラセルチブ、コビメチニブ（Ｃｏｔｅｌｌｉｃ（登録商標））、ＸＬ−１４７、ＸＬ−７６５、ＸＬ−４９９、ＸＬ−８８０、およびその他を含む。一部の実施形態では、ＲＯＲ抗原結合分子（例えば、抗体）は、がんの処置のために、ＨＳＰ９０阻害剤（例えば、ＸＬ８８８）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）モジュレーター、レチノイド関連オーファン受容体ガンマ（ＲＯＲｙ）モジュレーター、ＣＫ１阻害剤（ｉｎｈｂｉｔｏｒ）、ＣＫ１−α阻害剤、Ｗｎｔ経路阻害剤（例えば、ＳＳＴ−２１５）またはミネラロコルチコイド受容体阻害剤（例えば、エサキセレノンまたはＸＬ−５５０）と組み合わせて使用することができる。
【０４１１】
キナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲ阻害剤などのチロシンキナーゼ阻害剤；ムブリトニブ（Ｍｕｂｒｉｔｏｎｉｂ）（ＴＡＫ１６５、Ｔａｋｅｄａ）などの小分子ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤；ＣＰ−７２４．７１４（Ａｘｏｎ  Ｍｅｄｃｈｅｍ  ＢＶ、ＥｒｂＢ２受容体チロシンキナーゼの経口選択的阻害剤）；ＥＧＦＲに優先的に結合するが、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲ過剰発現細胞の両方を阻害するＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈから入手可）などのデュアルＨＥＲ阻害剤；ラパチニブ（ＧＳＫ５７２０１６；Ｇｌａｘｏ−ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから入手可）、経口ＨＥＲ２およびＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤；ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓから入手可）；カネルチニブ（ＣＩ−１０３３；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などの汎（ｐａｎ）ＨＥＲ阻害剤；Ｒａｆ−１シグナル伝達を阻害する、ＩＳＩＳ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから入手可なアンチセンス剤ＩＳＩＳ−５１３２などのＲａｆ−１阻害剤；イマチニブメシル酸塩（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｇｌａｘｏ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから入手可）などの非ＨＥＲ標的化ＴＫ阻害剤；スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒから入手可）などの多重標的化チロシンキナーゼ阻害剤；バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧから入手可）などのＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤；ＭＡＰＫ細胞外調節キナーゼ１阻害剤ＣＩ−１０４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可）；ＰＤ  １５３０３５，４−（３−クロロアニリノ）キナゾリンなどのキナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；ＣＧＰ  ５９３２６、ＣＧＰ  ６０２６１およびＣＧＰ  ６２７０６などのピロロピリミジン；ピラゾロピリミジン、４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン；クルクミン（ジフェルロイルメタン，４，５−ビス（４−フルオロアニリノ）フタルイミド）；ニトロチオフェン部分を含有するチロホスチン；アンチセンス分子（例えば、ＨＥＲコード核酸に結合するアンチセンス分子）；キノキサリン（米国特許第５，８０４，３９６号）；チロホスチン（ｔｒｙｐｈｏｓｔｉｎ）（米国特許第５，８０４，３９６号）；Ａｆｆｉｎｉｔａｃ（ＩＳＩＳ  ３５２１；Ｉｓｉｓ／Ｌｉｌｌｙ）；ＰＫＩ１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；セマキシニブ（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＩＮＣ−１Ｃ１１（Ｉｍｃｌｏｎｅ）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））；または次の特許公開のいずれかに記載されているもの：米国特許第５，８０４，３９６号；ＷＯ１９９９／０９０１６（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ）；ＷＯ１９９８／４３９６０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ）；ＷＯ１９９７／３８９８３（Ｗａｒｎｅｒ  Ｌａｍｂｅｒｔ）；ＷＯ１９９９／０６３７８（Ｗａｒｎｅｒ  Ｌａｍｂｅｒｔ）；ＷＯ１９９９／０６３９６（Ｗａｒｎｅｒ  Ｌａｍｂｅｒｔ）；ＷＯ１９９６／３０３４７（Ｐｆｉｚｅｒ，  Ｉｎｃ）；ＷＯ１９９６／３３９７８（Ｚｅｎｅｃａ）；ＷＯ１９９６／３３９７（Ｚｅｎｅｃａ）およびＷＯ１９９６／３３９８０（Ｚｅｎｅｃａ）となることができる。
【０４１２】
本明細書に提供されるＲＯＲ抗原結合分子（例えば、抗体）および治療剤などの追加的な治療による併用処置は、いずれかの順序での、同時、別々または逐次のものとなることができる。ＲＯＲ抗原結合提供分子などの治療剤、および免疫療法剤または化学療法剤などの別の治療剤の組合せ、同時投与のため、治療剤は、適宜、１つの組成物または別々の組成物として投与することができる。
６．１３．
【実施例】
【０４１３】
以下の実施例は、例示として提供されるものであり、限定するものではない。
６．１３．１．方法
【０４１４】
様々な抗原結合タンパク質の精製のための非限定的な説明目的の方法、および様々なアッセイにおけるそれらの使用は、下により詳細に記載されている。
６．１３．１．１．Ｅｘｐｉ２９３発現
【０４１５】
製造業者の使用説明書に従ってＥｘｐｉ２９３一過性トランスフェクション系を使用して、検査されている様々な抗原結合タンパク質を発現させた。簡潔に説明すると、４つの個々の鎖をコードする４つのプラスミドを、他に記述がなければ１：１：１：１質量比で混合し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３トランスフェクションキットを用いてＥｘｐｉ  ２９３細胞へとトランスフェクトした。細胞を３７℃で、８％ＣＯ２、１００％湿度にて、１２５ｒｐｍで振盪しつつ培養した。トランスフェクトした細胞に、トランスフェクションの１６〜１８時間後に１回栄養供給した。２０００ｇで１０分間の遠心分離により、５日目に細胞を回収した。親和性クロマトグラフィ精製のために上清を収集した。
６．１３．１．２．プロテインＡおよび抗ＣＨ１精製
【０４１６】
様々な抗原結合タンパク質を含有する清澄化された上清を、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ＦＰＬＣにおいてプロテインＡ（ＰｒｏｔＡ）樹脂または抗ＣＨ１樹脂のいずれかを使用して分離した。直接（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）比較が行われた例において、様々な抗原結合タンパク質を含有する上清を、２つの等しい試料へと分割した。ＰｒｏｔＡ精製のため、１ｍＬプロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＰＢＳ（５ｍＭリン酸ナトリウム・リン酸カリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で平衡化した。５ｍｌ／分にて試料をカラムにロードした。０．１Ｍ酢酸ｐＨ４．０を使用して試料を溶出した。２８０ｎｍの吸光度により溶出をモニターし、解析のために溶出ピークをプールした。抗ＣＨ１精製のため、１ｍＬ  ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＸＬカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をＰＢＳで平衡化した。５ｍｌ／分にて試料をカラムにロードした。０．１Ｍ酢酸ｐＨ４．０を使用して試料を溶出した。２８０ｎｍの吸光度により溶出をモニターし、解析のために溶出ピークをプールした。
６．１３．１．３．ＳＤＳ−Ｐａｇｅ解析
【０４１７】
様々な分離された抗原結合タンパク質を含有する試料は、完全産物、不完全産物の存在および全体的な純度に関して、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。２μｇの各試料を、１５μＬ  ＳＤＳローディング緩衝剤に添加した。還元試料は、１０ｍＭ還元剤の存在下で７５℃にて１０分間インキュベートした。非還元試料は、還元剤なしで９５℃にて５分間インキュベートした。還元および非還元試料を、ランニング緩衝剤により４〜１５％勾配ＴＧＸゲル（ＢｉｏＲａｄ）にロードし、３０分間２５０ボルトでランを行った。ランの完了後に、ゲルをＤＩ水で洗浄し、ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して染色した。解析に先立ちゲルをＤＩ水で脱染した。脱染したゲルのスキャンした画像のデンシトメトリー解析を、標準画像解析ソフトウェアを使用して行って、各試料におけるバンドの相対的存在量を計算した。
６．１３．１．４．ＩＥＸクロマトグラフィ
【０４１８】
様々な分離された抗原結合タンパク質を含有する試料は、完全産物の不完全産物および不純物に対する比に関して陽イオン交換クロマトグラフィにより解析した。清澄化された上清は、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ＦＰＬＣにおける５ｍｌ  ＭｏｎｏＳ（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）により解析した。ＭｏｎｏＳカラムを緩衝剤Ａ、１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０で平衡化した。２ｍｌ／分にて試料をカラムにロードした。６ＣＶにわたる緩衝剤Ｂ（１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０、１Ｍ塩化ナトリウム）による０〜３０％勾配を使用して試料を溶出した。２８０ｎｍの吸光度により溶出をモニターし、ピーク積分により試料の純度を計算して、単量体ピークおよび夾雑物ピークの存在量を同定した。単量体ピークおよび夾雑物ピークは、上述のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析のために別々にプールした。
６．１３．１．５．分析的ＳＥＣクロマトグラフィ
【０４１９】
様々な分離された抗原結合タンパク質を含有する試料は、単量体の高分子量産物および不純物に対する比に関して分析的サイズ排除クロマトグラフィにより解析した。清澄化された上清は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣにおける業界標準ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により解析した。ＴＳＫカラムをＰＢＳで平衡化した。１ｍｇ／ｍＬの各試料２５μＬを、１ｍｌ／分にてカラムにロードした。１．５ＣＶのＰＢＳの均一濃度の流れを使用して試料を溶出した。２８０ｎｍの吸光度により溶出をモニターし、ピーク積分により溶出ピークを解析した。
６．１３．１．６．質量分析
【０４２０】
様々な分離された抗原結合タンパク質を含有する試料を、質量分析により解析して、分子量により正確な種を確認した。全解析は、第三者研究機関により行われた。簡潔に説明すると、試料は、酵素のカクテルで処置して、グリコシル化を除去した。試料は両者共に還元フォーマットで検査して、分子量により各鎖を特異的に同定した。試料は全て、非還元条件下で検査して、試料における全ての複合体の分子量を同定した。質量スペクトル解析を使用して、分子量に基づき特有の産物の数を同定した。
６．１３．１．７．ファージディスプレイによる抗体発見
【０４２１】
ヒトＦａｂライブラリのファージディスプレイは、標準プロトコールを使用して実行した。ヒトＲＯＲ１およびＲＯＲ２タンパク質のビオチン化細胞外ドメインは、Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入し、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号２０２１７）でビオチン化した。標準プロトコールを使用したファージＥＬＩＳＡにより、ＲＯＲ１（Ａｃｒｏカタログ番号ＲＯ１−Ｈ５２２ｙ）およびＲＯＲ２（Ａｃｒｏカタログ番号ＲＯ２−Ｈ５２Ｅ５）の細胞外ドメインに結合する能力に関してファージクローンをスクリーニングした。簡潔に説明すると、ファージにおける複製および発現が可能な発現ベクター（ファージミドとも称される）を使用して、Ｆａｂフォーマットされたファージライブラリを構築した。重鎖および軽鎖の両方が、同じ発現ベクターにおいてコードされており、重鎖は、ファージコートタンパク質ｐＩＩＩのトランケートバリアントに融合された。軽鎖および重鎖−ｐＩＩＩ融合体は、別々のポリペプチドとして発現され、細菌周辺質においてアセンブルし、そこで、レドックス潜在力が、ジスルフィド結合形成を可能にして、候補ＡＢＳを含有するファージディスプレイ抗体を形成する。
【０４２２】
特定のヒト重鎖可変ドメイン（ＶＨ３−２３）および特定のヒト軽鎖可変ドメイン（Ｖｋ−１）に由来する配列を使用して、ライブラリを作成した。スクリーニングされたライブラリ内の軽鎖可変ドメインは、ＶＬ  ＣＤＲ３（Ｌ３）に多様性を導入しつつ生成し、軽鎖ＶＬ  ＣＤＲ１（Ｌ１）およびＣＤＲ２（Ｌ２）は、ヒト生殖系列配列のままであった。スクリーニングされたライブラリに関して、ＶＨドメインの全３種のＣＤＲは、ヒト抗体レパートリーに見出されるＣＤＲの長さによる位置的アミノ酸頻度にマッチするように多様化された。ライブラリにおいて使用されるファージディスプレイ重鎖（配列番号７４）および軽鎖（配列番号７５）足場は、下に収載されており、それによると、小文字「ｘ」は、ライブラリを作成するために変動されたＣＤＲアミノ酸を表し、太字イタリック体は、一定であったＣＤＲ配列を表す。
【０４２３】
その全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｕｎｋｅｌ，  ＴＡ  （ＰＮＡＳ  Ｊａｎｕａｒｙ  １，  １９８５．  ８２  （２）  ４８８−４９２）により詳細に記載されている通り、天然抗体レパートリーに見出される多様性を模倣するようにＶＬ  ＣＤＲ３ならびにＶＨ  ＣＤＲ１（Ｈ１）、ＣＤＲ２（Ｈ２）およびＣＤＲ３（Ｈ３）に多様性を導入するためにプライマーを使用したＫｕｎｋｅｌ変異誘発により、多様性を作成した。簡潔に説明すると、標準手順を使用して、単離されたファージから一本鎖ＤＮＡを調製し、Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発を実行した。次に、化学合成されたＤＮＡを電気穿孔してＴＧ１細胞に入れ、続いて回収した。回収された細胞を継代培養し、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージに感染させて、ファージライブラリを産生した。
【０４２４】
標準手順を使用してファージパニングを行った。簡潔に説明すると、ファージパニングの第１のラウンドは、ＰＢＳＴ−２％ＢＳＡにおける１ｍＬの体積で、調製されたライブラリ由来の約５×１０１２個のファージに晒した、ストレプトアビジン磁気ビーズに固定化された標的により行った。１時間インキュベーション後に、ビーズに結合したファージを、磁気スタンドを使用して上清から分離した。ビーズを３回洗浄して、非特異的に結合したファージを除去し、次いでこれを、ＯＤ６００約０．６のＥＲ２７３８細胞（５ｍＬ）に添加した。２０分後に、感染した細胞を、２５ｍＬ  ２×ＹＴ＋アンピシリンおよびＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージにおいて継代培養し、激しく振盪しつつ一晩３７℃で育成した。翌日、ＰＥＧ沈殿による標準手順を使用してファージを調製した。ＳＡＶコーティングされたビーズに特異的なファージのプレクリアランス（Ｐｒｅ−ｃｌｅａｒａｎｃｅ）をパニングに先立ち行った。標準手順を使用した１００ｎＭビーズ固定化抗原によるＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ磁気ビーズハンドラーを使用して、パニングの第２のラウンドを行った。総計して、３〜４ラウンドのファージパニングを行って、標的抗原に特異的なＦａｂをディスプレイするファージを濃縮した。標的特異的濃縮は、ポリクローナルおよびモノクローナルファージＥＬＩＳＡを使用して確認した。ＤＮＡ配列決定を使用して、候補ＡＢＳを含有する単離されたＦａｂクローンを決定した。
【０４２５】
ＲＯＲ結合剤発見キャンペーンにおいて結合親和性を測定するために、上述のファージスクリーニングにおいて同定されたＶＬおよびＶＨドメインを、二価単一特異性ネイティブヒト全長ＩｇＧ１アーキテクチャへとフォーマットし、Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）バイオレイヤー（ｂｉｏｌａｙｅｒ）干渉計におけるバイオセンサーに固定化した。次に、ＲＯＲ１（Ａｃｒｏカタログ番号ＲＯ１−Ｈ５２２ｙ）およびＲＯＲ２（Ａｃｒｏカタログ番号ＲＯ２−Ｈ５２Ｅ５）の細胞外ドメイン、ならびに個々のＲＯＲ１  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ａｃｒｏカタログ番号ＲＯ１−Ｈ５２２２）、Ｉｇ様（Ａｃｒｏカタログ番号ＲＯ１−Ｈ５２２１）およびＫｒｉｎｇｌｅ（Ａｃｒｏカタログ番号ＲＯ１−Ｈ５２２３）ドメインを含む可溶性ＲＯＲ抗原を系に添加し、結合を測定した。
【０４２６】
Ｂ−ｂｏｄｙフォーマットを使用して行われる実験のため、下に示す通り、また、図３を参照する通り、個々のクローンのＶＬ可変領域を二価１×１  Ｂ−ｂｏｄｙ「ＢＣ１」足場のドメインＡおよび／またはＨへとフォーマットし、ＶＨ領域をそのドメインＦおよび／またはＬへとフォーマットした。
【０４２７】
「ＢＣ１」足場：
第１のポリペプチド鎖（配列番号７８）
ドメインＡ＝抗原１  Ｂ−ｂｏｄｙドメインＡ／Ｈ足場（配列番号７６）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ；４４５Ｋ、４４６Ｓ、４４７Ｃトリペプチド挿入）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｗ、Ｓ３５４Ｃ）
第２のポリペプチド鎖（配列番号７９）：
ドメインＦ＝抗原１  Ｂ−ｂｏｄｙドメインＦ／Ｌ足場（配列番号７７）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ；４４５Ｇ、４４６Ｅ、４４７Ｃトリペプチド挿入）
第３のポリペプチド鎖（配列番号８０）：
ドメインＨ＝抗原２  Ｂ−ｂｏｄｙドメインＡ／Ｈ足場（配列番号７６）
ドメインＩ＝ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第４のポリペプチド鎖（配列番号８１）：
ドメインＬ＝抗原２  Ｂ−ｂｏｄｙドメインＦ／Ｌ足場（配列番号７７）
ドメインＭ＝ＣＨ１。
【０４２８】
抗ＣＤ３  ＳＰ３４−８９を有する二価二特異性１×１フォーマットへとフォーマットされたＲＯＲ  ＡＢＳ候補のため、ドメインＨは、配列番号６９のアミノ酸配列を有し、ドメインＬは、配列番号６８のアミノ酸配列を有する一方、ドメインＡは、候補ＲＯＲ  ＶＬ配列を有し、ドメインＦは、候補ＲＯＲ  ＶＨ配列を有する。
【０４２９】
ＢＣ１  １×２フォーマットのため、図２６を参照するセクション６．３．１７．４に記載されている１（Ａ）×２（Ｂ−Ａ）フォーマットへと可変ドメインをフォーマットした。図２６は、本明細書に記載されている三価１×２抗体構築物のためのそれぞれの命名規則により、５つのポリペプチド鎖およびそれらのドメインの概略図を提示し、命名規則に従って、鎖５は、概略図において「第６のポリペプチド鎖」と命名されている。他に指定がなければ、ＲＯＲ抗原結合部位（ＡＢＳ）は、二価結合剤（「Ａ」特異性）であり、ＣＤ３は、一価結合剤（「Ｂ」特異性）である。ＳＰ３４−８９  １×２鎖３足場は、配列番号８２の配列を有し、ドメインＳとドメインＨとの間のジャンクションは、他に記述がなければ、配列ＴＡＳＳＧＧＳＳＳＧ（配列番号８３）を有する１０アミノ酸リンカーである。ポリペプチド鎖２および鎖５は、１（Ａ）×２（Ｂ−Ａ）フォーマットにおいて同一である（例えば、図２６を参照、命名規則に従って、鎖５は、この概略図において「第６のポリペプチド鎖」と命名される）。
６．１３．１．８．ＮＦκＢ  ＧＦＰ  Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞刺激アッセイ
【０４３０】
ＮＦκＢ／Ｊｕｒｋａｔ／ＧＦＰ転写レポーター細胞系は、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｔ＃ＴＲ８５０−１）から購入した。同時刺激に使用された抗ＣＤ２８抗体は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｃａｔ  ５５５７２５）から購入した。溶液Ｃバックグラウンド抑制色素は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｋ１０３７）から購入した。簡潔に説明すると、９６ウェルの黒色の壁と透明な底のプレートにおいて、Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）抗体の希釈系列および１ｕｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体の存在下、Ｊｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞、Ｅ）を腫瘍細胞（Ｔ）と２：１〜４：１のＥ：Ｔ比で混合した。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で６時間インキュベートし、その後、溶液Ｃバックグラウンドサプレッサーの６×溶液をプレートに添加し、プレートリーダーにおいてＧＦＰ蛍光を読み出した。最大半量応答を生じる抗体の濃度を指すＥＣ５０値を、希釈系列から決定した。
６．１３．１．９．初代Ｔ細胞細胞傷害性アッセイ
【０４３１】
標的腫瘍抗原を発現する細胞（Ｔ）およびエフェクター細胞（Ｅ）を３：１〜１０：１に及ぶＥ：Ｔ比で混合した。使用されたエフェクター細胞は、ＰＢＭＣまたは単離された細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。候補の再び方向付けるＴ細胞抗体は、希釈系列で細胞に添加した。対照は、培地のみ対照、腫瘍細胞のみ対照、および無処置Ｅ：Ｔ細胞対照を含んだ。混合した細胞および対照条件を３７℃／５％ＣＯ２で４０〜５０時間インキュベートした。Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｐｌｕｓ（ＬＤＨ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｃａｔ  ４７４４９３４００１）から購入し、製造業者の指示に従った。簡潔に説明すると、腫瘍細胞に添加した溶解溶液は、１００％細胞傷害性対照とし、無処置Ｅ：Ｔ細胞は、０％細胞傷害性対照とした。各試料における乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）のレベルは、４９０ｎｍの吸光度により決定し、１００％および０％対照に対して正規化した。最大半量応答を生じる抗体の濃度を指すＥＣ５０値を、希釈系列から決定した。
６．１３．２．
（実施例１）
二価単一特異性構築物および二価の二重特異性構築物
【０４３２】
ＴＮＦαを認識する二価単一特異性Ｂ−Ｂｏｄｙを、標準的な分子生物学的手法を使用して、以下の構成（ＶＬ（セルトリズマブ）−ＣＨ３（ノブ）−ＣＨ２−ＣＨ３／ＶＨ（セルトリズマブ）−ＣＨ３（ホール））で構築した。この構築物において、
第１のポリペプチド鎖（配列番号１）
ドメインＡ＝ＶＬ（セルトリズマブ）
ドメインＢ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１）（ノブ：Ｓ３５４Ｃ＋Ｔ３６６Ｗ）
ドメインＤ＝ＣＨ２（ＩｇＧ１）
ドメインＥ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１）
第２のポリペプチド鎖（配列番号２）
ドメインＦ＝ＶＨ（セルトリズマブ）
ドメインＧ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１）（ホール：Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第３のポリペプチド鎖：
第１のポリペプチド鎖と同一
第４のポリペプチド鎖：
第２のポリペプチド鎖と同一。
【０４３３】
ドメインおよびポリペプチド鎖の参照は、図３に従う。構築物の全体の構成を図４に示す。「（ＶＬ）」と略記して特定されているドメインＡを有する第１のポリペプチド鎖の配列は、配列番号１で提供される。「（ＶＨ）」と略記して特定されているドメインＦを有する第２のポリペプチド鎖の配列は、配列番号２で提供される。
【０４３４】
全長構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ無細胞タンパク質合成発現系で、約１８時間、２６℃で穏やかに撹拌しながら発現させた。発現後、無細胞抽出物を遠心分離して、不溶性物質をペレット化し、上清を、１０×カイネティックバッファー（Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ）で２倍希釈して、バイオレイヤー干渉のための検体として使用した。
【０４３５】
ビオチン化ＴＮＦαを、ストレプトアビジンセンサーに固定化し、約１．５ｎｍのウェーブシフト応答に付した。１０×カイネティックバッファーでベースラインを確立した後、センサーを、抗体構築物検体溶液中に浸漬した。構築物は、セルトリズマブの従来のＩｇＧフォーマットに匹敵する約３ｎｍの応答を与え、機能性の全長抗体へと組み立てられる二価単一特異性構築物の能力を実証した。結果を図５に示す。
【０４３６】
本発明者らはまた、以下のドメイン構成を有する二価の二重特異性抗体を構築した：
第１のポリペプチド鎖：ＶＬ−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３（ノブ）
第２のポリペプチド鎖：ＶＨ−ＣＨ３
第３のポリペプチド鎖：ＶＬ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３（ホール）
第４のポリペプチド鎖  ＶＨ−ＣＨ１。
【０４３７】
配列（可変領域配列を除く）を、配列番号３（第１のポリペプチド鎖）、配列番号４（第２のポリペプチド鎖）、配列番号５（第３のポリペプチド鎖）、配列番号６（第４のポリペプチド鎖）でそれぞれ示す。
６．１３．３．
（実施例２）
二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ１」
【０４３８】
本発明者らは、ＰＤ１および第２の抗原「抗原Ａ」に特異的な「ＢＣ１」と称する二価の二重特異性構築物を構築した。「ＢＣ１」構成の顕著な特徴を、図６に示す。
【０４３９】
さらに詳細に、図３に従ってドメインおよびポリペプチド鎖の参照を示し、天然の配列からの修飾を括弧内に示すと、構成は、以下の通りであった：
第１のポリペプチド鎖（配列番号８）
ドメインＡ＝ＶＬ（「抗原Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ；４４５Ｋ、４４６Ｓ、４４７Ｃトリペプチド挿入）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｗ、Ｓ３５４Ｃ）
第２のポリペプチド鎖（配列番号９）：
ドメインＦ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ；４４５Ｇ、４４６Ｅ、４４７Ｃトリペプチド挿入）
第３のポリペプチド鎖（配列番号１０）：
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第４のポリペプチド鎖（配列番号１１）：
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１。
【０４４０】
Ａドメイン（配列番号１２）およびＦドメイン（配列番号１６）は、「抗原Ａ」に特異的な抗原結合部位（Ａ：Ｆ）を形成する。Ｈドメインは、ニボルマブ由来のＶＨ配列を有し、Ｌドメインは、ニボルマブ由来のＶＬ配列を有し；ＨおよびＬは会合して、ヒトＰＤ１に特異的な抗原結合部位（Ｈ：Ｌ）を形成する。
【０４４１】
Ｂドメイン（配列番号１３）は、いくつかの変異、つまりＴ３６６Ｋ、４４５Ｋ、４４６Ｓおよび４４７Ｃ挿入を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３の配列を有する。Ｔ３６６Ｋ変異は、ドメインＧにおけるＬ３５１Ｄ残基の電荷対コグネートである。ドメインＢにおける「４４７Ｃ」残基は、Ｃ末端ＫＳＣトリペプチド挿入に由来するものである。
【０４４２】
ドメインＤ（配列番号１４）は、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２の配列を有する。
【０４４３】
ドメインＥ（配列番号１５）は、変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３の配列を有する。３６６Ｗは、「ノブ」変異である。３５４Ｃは、ドメインＫにおけるコグネート３４９Ｃ変異とジスルフィド結合を形成することができるシステインを導入する。
【０４４４】
ドメインＧ（配列番号１７）は、以下の変異：Ｌ３５１Ｄ、および４４５Ｇ、４４６Ｅ、４４７Ｃトリペプチド挿入を有する、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３の配列を有する。Ｌ３５１Ｄ変異は、ドメインＢ  Ｔ３６６Ｋ変異に対する電荷対コグネートを導入する。ドメインＧの「４４７Ｃ」残基は、Ｃ末端ＧＥＣトリペプチド挿入に由来する。
【０４４５】
ドメインＩ（配列番号１９）は、ヒトＣカッパ軽鎖（Ｃκ）の配列を有する。
【０４４６】
ドメインＪ［配列番号２０］は、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインの配列を有し、ドメインＤの配列と同一である。
【０４４７】
ドメインＫ［配列番号２１］は、以下の変化：Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３の配列を有する。３４９Ｃ変異は、ドメインＥのコグネート３５４Ｃ変異とジスルフィド結合を形成することができるシステインを導入する。３５６ＥおよびＬ３５８Ｍは、免疫原性を減少させるイソアロタイプアミノ酸を導入する。３６６Ｓ、３６８Ａおよび４０７Ｖは、「ホール」変異である。
【０４４８】
ドメインＭ［配列番号２３］は、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１領域の配列を有する。
【０４４９】
「ＢＣ１」は、哺乳動物発現を使用して１００μｇ／ｍｌを超える濃度で、高レベルで容易に発現することができる。
【０４５０】
本発明者らは、二価の二重特異性「ＢＣ１」タンパク質が、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＣＨ１特異的ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）親和性樹脂を使用して単一ステップで容易に精製することができることを見出した。
【０４５１】
図７Ａに示すように、ＳＥＣ解析は、単一ステップのＣＨ１親和性精製ステップにより、ゲル濾過を介して、＞９８％がモノマーである単一の単分散ピークが得られることを実証する。図７Ｂは、ＣｒｏｓｓＭａｂ二価抗体構築物のＳＥＣ解析の比較文献データを示す。
【０４５２】
図８Ａは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の「ＢＣ１」の陽イオン交換クロマトグラフィ溶出プロファイルであって、単一のタイトなピークが示されている。図８Ｂは、標準的なプロテインＡ精製を使用して精製した後の「ＢＣ１」の陽イオン交換クロマトグラフィ溶出プロファイルであり、不完全な組み立て産物の同時精製と一致する追加的な溶出ピークを示す。
【０４５３】
図９は、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン３でみられるように、ＣＨ１親和性樹脂を用いた「ＢＣ１」の単一ステップの精製により、ほぼ均一な単一バンドが得られる。レーン４は、続いて陽イオン交換仕上げ工程で最小の追加的な精製を行ったものを示す。レーン７は、比較による、標準的なプロテインＡ精製を使用した軽度の精製を示し、レーン８〜１０は、陽イオン交換クロマトグラフィを使用した、プロテインＡ精製物質のさらなる精製を示す。
【０４５４】
図１０は、非還元および還元条件下の両方での単一ステップのＣＨ１−親和性精製後の「ＢＣ１」のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（パネルＡ）を、参照文献で公開されている非還元および還元条件下のＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（パネルＢ）と比較した図である。
【０４５５】
図１１は、還元条件下の２つの別個の重鎖（図１１Ａ）、および２つの別個の軽鎖（図１１Ｂ）を実証する「ＢＣ１」の質量分析の解析を示す。図１２における質量分析データは、精製後の不完全対形成の非存在を確認する。
【０４５６】
加速安定性試験を実行して、「ＢＣ１」Ｂ−Ｂｏｄｙ設計の長期安定性を評価した。精製されたＢ−ＢｏｄｙをＰＢＳバッファー中８．６ｍｇ／ｍｌに濃縮して４０℃でインキュベートした。構造的完全性をＳｈｏｄｅｘ  ＫＷ−８０３カラムを備えた分析的サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用して毎週測定した。構造的完全性を、凝集物の形成と関連させて、無傷のモノマーのパーセンテージ（％モノマー）を測定することによって決定した。データを図１３に示す。ＩｇＧ対照１は、良好な安定性特性を有する陽性対照である。ＩｇＧ対照２は、インキュベーション条件下で凝集することが公知の陰性対照である。「ＢＣ１」Ｂ−Ｂｏｄｙは、分析的ＳＥＣで決定されるように、構造的完全性を何ら失うことなく、８週間、インキュベートされた。
【０４５７】
また、二価構築物のＴＭは約７２℃であり、本発明者らは、「ＢＣ１」が高い耐熱性を有すると決定した。
【０４５８】
表１は、重要な開発性特徴について、「ＢＣ１」とＣｒｏｓｓＭａｂとを比較する。
【表１】
2021522162.tif 000003
＊Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２０１１  Ｊｕｌ  ５；１０８（２７）：１１１８７−９２）からのデータ
６．１３．４．
（実施例３）
二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ６」
【０４５９】
本発明者らは、「ＢＣ６」と称する二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙを構築した。「ＢＣ６」は、「ＢＣ１」と同様であるが、ドメインＢの残基３６６およびドメインＧの残基３５１で野生型残基を保持していることを除いてＢＣ１と同一であった。したがって「ＢＣ６」は、「ＢＣ１」のドメインＢとドメインＧにおける正しい対形成を容易にするように設計された電荷対コグネートＴ３６６ＫおよびＬ３５１Ｄを欠く。「ＢＣ６」構成の顕著な特徴を図１４に示す。
【０４６０】
「ＢＣ１」に存在する電荷対残基の非存在にもかかわらず、ＣＨ１親和性樹脂を使用した「ＢＣ６」の単一ステップの精製は、高度に均質な試料をもたらすことが分かった。図１５Ａは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用したワンステップ精製後の「ＢＣ６」のＳＥＣ解析を示す。データは、単一のステップＣＨ１親和性精製によって、「ＢＣ１」での観察と同様に、単一の単分散ピークが得られることを実証し、ポリペプチド鎖１とポリペプチド鎖２との間およびポリペプチド鎖３とポリペプチド鎖４との間のジスルフィド結合が無傷のままであることを実証する。またクロマトグラムは、非共有結合性の凝集物が存在しないことも示す。
【０４６１】
図１５Ｂは、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、レーン１は単一ステップのＣＨ１親和性精製後の「ＢＣ６」の第１のロットをローディングしたものであり、レーン２は、単一ステップのＣＨ１親和性精製後の「ＢＣ６」の第２のロットをローディングしたものである。レーン３および４は、ＣＨ１親和性精製に続けてイオン交換クロマトグラフィを用いて達成しうるさらなる精製を実証する。
６．１３．５．
（実施例４）
二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ２８」、「ＢＣ２９」、「ＢＣ３０」、「ＢＣ３１」
【０４６２】
本発明者らは、ドメインＢおよびＧのＣＨ３境界内の操作されたジスルフィドを「ＢＣ１」および「ＢＣ６」に存在するＣ末端ジスルフィドに対する代替的Ｓ−Ｓ連結として有する二価１×１二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ２８」、「ＢＣ２９」、「ＢＣ３０」および「ＢＣ３１」を構築した。文献は、ＣＨ３境界のジスルフィド結合が、Ｆｃ  ＣＨ３ドメインの状況で直交性を行使するには不十分であることを示している。これらのＢ−Ｂｏｄｙ構築物の全体の構成を図１６に概略化し、「ＢＣ２８」の顕著な特徴を下記に示す：
ポリペプチド鎖１：「ＢＣ２８」鎖１（配列番号２４）
ドメインＡ＝ＶＬ（抗原「Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）
ポリペプチド鎖２：「ＢＣ２８」鎖２（配列番号２５）
ドメインＦ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
ポリペプチド鎖３：「ＢＣ１」鎖３（配列番号１０）
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
ポリペプチド鎖４：「ＢＣ１」鎖４（配列番号１１）
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１。
【０４６３】
「ＢＣ２８」Ａ：Ｆ抗原結合部位は、「抗原Ａ」に特異的である。「ＢＣ２８」Ｈ：Ｌ抗原結合部位は、ＰＤ１（ニボルマブ配列）に特異的である。「ＢＣ２８」ドメインＢは、野生型ＣＨ３と比較して以下の変化：Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入を有する。「ＢＣ２８」ドメインＥは、野生型ＣＨ３と比較して以下の変化：Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有する。「ＢＣ２８」ドメインＧは、野生型と比較して以下の変化：Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入を有する。
【０４６４】
したがって、「ＢＣ２８」は、ドメインＢの残基３４９Ｃに操作されたシステイン、およびドメインＧの残基３５４Ｃに操作されたシステインを有する（「３４９Ｃ−３５４Ｃ」）。
【０４６５】
「ＢＣ２９」は、ドメインＢの残基３５１ＣおよびドメインＧの３５１Ｃに、操作されたシステインを有する（「３５１Ｃ−３５１Ｃ」）。「ＢＣ３０」は、ドメインＢの残基３５４ＣおよびドメインＧの３４９Ｃに操作されたシステインを有する（「３５４Ｃ−３４９Ｃ」）。ＢＣ３１は、残基３９４Ｃに操作されたシステイン、およびドメインＧの３９４Ｃに操作されたシステイン（「３９４Ｃ−３９４Ｃ」）を有する。ＢＣ３２は、ドメインＢの残基４０７ＣおよびドメインＧの４０７Ｃに操作されたシステインを有する（「４０７Ｃ−４０７Ｃ」）。
【０４６６】
図１７は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン１および３は、無傷の「ＢＣ２８」（レーン１）および「ＢＣ３０」（レーン３）の高レベルの発現および実質的な均一性を示す。レーン２は、ＢＣ２９のオリゴマー化を示す。レーン４および５は、ＢＣ３１およびＢＣ３２の乏しい発現をそれぞれ示し、ＢＣ３２の連結が不十分であることを示す。別の構築物ＢＣ９（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって報告された、ドメインＢの残基３９２およびドメインＧの３９９に導入されたシステインを有し（「３９２Ｃ−３９９Ｃ」）、ジスルフィド対を形成する構築物）は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥでオリゴマー化を示した（データは示さず）。
【０４６７】
図１８は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用したワンステップ精製後の「ＢＣ２８」および「ＢＣ３０」のＳＥＣ解析を示す。さらに本発明者らは、「ＢＣ２８」が、プロテインＡ樹脂を使用した単一ステップの精製を使用して容易に精製することができることを実証した（結果は示さず）。
６．１３．６．
（実施例５）
二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ４４」
【０４６８】
図１９は、本発明者らの現行の好ましい二価の二重特異性１×１構築物である二価の二重特異性１×１Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ４４」の一般的構成を示す。
第１のポリペプチド鎖（「ＢＣ４４」鎖１）（配列番号３２）
ドメインＡ＝ＶＬ（抗原「Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｐ３４３Ｖ；Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
ドメインＥ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）
第２のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」ポリペプチド鎖２）（配列番号２５）
ドメインＦ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
第３のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」ポリペプチド鎖３）（配列番号１０）
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第４のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」ポリペプチド鎖４）（配列番号１１）
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１
６．１３．７．
（実施例６）
可変−ＣＨ３ジャンクション操作
【０４６９】
本発明者らは、ドメインＡとＢとの間のＶＬ−ＣＨ３ジャンクション、ならびにドメインＦとＧとの間のＶＨ−ＣＨ３ジャンクションを変異させた一連のバリアントを作製し、二価１×１  Ｂ−Ｂｏｄｙ構築物の発現レベル、組み立て、および安定性を評価した。多くの解決策がありうるが、本発明者らは、Ｔ細胞エピトープの導入を減少させるために、ＶＬ、ＶＨおよびＣＨ３ドメイン内で天然に見出される残基のみを使用することを選択した。ドメイン構成の構造的評価は、好ましい配列組合せをさらに限定する。下記表２および表３は、「ＢＣ１」および他の二価構築物に基づくいくつかのジャンクションバリアントについてのジャンクションを示す。
【表２】
2021522162.tif 000004
【表３】
2021522162.tif 000005
【０４７０】
図２０は、４０℃での加速安定性試験プロトコールにおける示された週数での「ＢＣ１５」および「ＢＣ１６」試料のサイズ排除クロマトグラフィを示す。「ＢＣ１５」は安定なままであった；「ＢＣ１６」は、経時的に不安定となることが分かった。
６．１３．８．
（実施例７）
三価２×１二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ構築物（「ＢＣ１−２×１」）
【０４７１】
本発明者らは、「ＢＣ１」に基づいて三価２×１二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ１−２×１」を構築した。構成の顕著な特徴を図２２に示す。
【０４７２】
より詳細には、図２１に要約されているドメインおよびポリペプチド鎖の参照を使用して、
第１のポリペプチド鎖
ドメインＮ＝ＶＬ（「抗原Ａ」）
ドメインＯ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ、４４７Ｃ）
ドメインＡ＝ＶＬ（「抗原Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ、４４７Ｃ）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（ノブ、３５４Ｃ）
第５のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖２）
ドメインＰ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＱ＝ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ、４４７Ｃ）
第２のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖２）
ドメインＦ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ、４４７Ｃ）
第３のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖３）
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（ホール、３４９Ｃ）
第４のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖４）
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１
【０４７３】
図２３は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｅｘｐｉ２９３一過性トランスフェクション系を使用して発現されたタンパク質の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【０４７４】
レーン１は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の三価２×１「ＢＣ１−２×１」タンパク質の溶離液を示す。レーン２は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の、より分子量が低く、移動が速い、二価「ＢＣ１」タンパク質を示す。レーン３〜５は、プロテインＡを使用した「ＢＣ１−２×１」の精製を示す。レーン６および７は、ＣＨ１親和性樹脂を使用した「ＢＣ１−２×１」の精製を示す。
【０４７５】
図２４は、Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）解析を使用して、二価「ＢＣ１」構築物のアビディティを、三価２×１「ＢＣ１−２×１」構築物のアビディティと比較したものである。ビオチン化抗原「Ａ」を表面に固定化し、その表面上を、結合解析のために、抗体構築物に通過させる。
６．１３．９．
（実施例８）
三価２×１三重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ構築物（「ＴＢ１１１」）
【０４７６】
本発明者らは、図２５に概略化された構成を有する三価２×１三重特異性分子「ＴＢ１１１」を設計した。図２１に示すドメイン命名規則を参照して、ＴＢ１１１は、以下の構成を有する（「Ａｄａ」は、アダリムマブ由来のＶ領域を示す）：
ポリペプチド鎖１
ドメインＮ：ＶＨ（「Ａｄａ」）
ドメインＯ：ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ、３９４Ｃ）
ドメインＡ：ＶＬ（「抗原Ａ」）
ドメインＢ：ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ、３４９Ｃ）
ドメインＤ：ＣＨ２
ドメインＥ：ＣＨ３（ノブ、３５４Ｃ）
ポリペプチド鎖５
ドメインＰ：ＶＬ（「Ａｄａ」）
ドメインＱ：ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ、３９４Ｃ）
ポリペプチド鎖２
ドメインＦ：ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＧ：ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ、３５１Ｃ）
ポリペプチド鎖３
ドメインＨ：ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ：ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ：ＣＨ２
ドメインＫ：ＣＨ３（ホール、３４９Ｃ）
ポリペプチド鎖４（＝「ＢＣ１」鎖４）
ドメインＬ：ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ：ＣＨ１
この構築物は、発現しなかった。
６．１３．１０．
（実施例９）
三価１×２二重特異性構築物（「ＢＣ２８−１×２」）
【０４７７】
本出願人らは、図２６に表記されているドメインおよび鎖命名法を参照した、次のドメインおよび鎖構造を有する三価１×２二特異性Ｂ−ｂｏｄｙを構築した：
第１のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」鎖１）（配列番号２４）
ドメインＡ＝ＶＬ（抗原「Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）
第２のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」鎖２）（配列番号２５）
ドメインＦ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
第３のポリペプチド鎖（配列番号３７）
ドメインＲ＝ＶＬ（抗原「Ａ」）
ドメインＳ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
リンカー＝ＧＳＧＳＧＳ
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第４のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖４）（配列番号１１）：
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１
第６のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」鎖２）（配列番号２５）
ドメインＴ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＵ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）。
【０４７８】
Ｈ：Ｌ結合抗原結合部位と同様に、Ａ：Ｆ抗原結合部位は「抗原Ａ」に特異的である。Ｒ：Ｔ抗原結合部位は、ＰＤに対して特異的である。この構築物の特異性は、したがって抗原「Ａ」×（ＰＤ１−抗原「Ａ」）である。
６．１３．１１．
（実施例１０）
三価１×２二重特異性構築物（「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」）
【０４７９】
本発明者らは、図２７に概略化した一般構造を有する、三価１×２二重特異性分子（「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」）を構築した。ドメインの命名法を図２６に示す。
【０４８０】
図２８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、ここで非還元および還元条件下の「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」構築物を示すレーンを枠で囲っている。
【０４８１】
図２９は、２つの抗体「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」および「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」の抗原結合を比較している。「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」は、ＣＴＬＡ４に一価的に結合する一方、「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」は、ＣＴＬＡ４に二価的に結合する。
６．１３．１２．
（実施例１１）
三価１×２三重特異性構築物「ＢＣ２８−１×１×１ａ」
【０４８２】
本発明者らは、図３０に概略化した一般構造を有する三価１×２三重特異性分子を構築した。図２６に示すドメインおよび鎖の命名法を参照して、
第１のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」鎖１）［配列番号２４］
ドメインＡ＝ＶＬ（抗原「Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）
第２のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」鎖２）（配列番号２５）
ドメインＦ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
第３のポリペプチド鎖（配列番号４５）
ドメインＲ＝ＶＬ（ＣＴＬＡ４−４）
ドメインＳ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ；４４５Ｋ、４４６Ｓ、４４７Ｃ挿入）
リンカー＝ＧＳＧＳＧＳ
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第４のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖４）（配列番号１１）
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１。
第６のポリペプチド鎖（＝ｈＣＴＬＡ４−４鎖２）（配列番号５３）
ドメインＴ＝ＶＨ（ＣＴＬＡ４）
ドメインＵ＝ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ、４４５Ｇ、４４６Ｅ、４４７Ｃ挿入）
【０４８３】
この三重特異性構築物の抗原結合部位は、以下の通りであった：
抗原結合部位Ａ：Ｆは、「抗原Ａ」に特異的であった；
抗原結合部位Ｈ：Ｌは、ＰＤ１（ニボルマブ配列）に特異的であった；
抗原結合部位Ｒ：Ｔは、ＣＴＬＡ４に特異的であった。
【０４８４】
図３１は、単一の明確に確定されるピークを示す、一過性発現およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の「ＢＣ２８−１×１×１ａ」のサイズ排除クロマトグラフィを示す。
６．１３．１３．
（実施例１２）
二価および三価構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
【０４８５】
図３２は、それぞれ一過性発現およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の様々な構築物の、非還元および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０４８６】
レーン１（非還元条件）およびレーン２（還元条件、＋ＤＴＴ）は、二価１×１二重特異性構築物「ＢＣ１」である。レーン３（非還元）およびレーン４（還元）は、三価の二重特異性２×１構築物「ＢＣ１−２×１」である（実施例７参照）。レーン５（非還元）およびレーン６（還元）は、三価１×２二重特異性構築物「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」である（実施例１０参照）。レーン７（非還元）およびレーン８（還元）は、実施例１１に記載の三価１×２三重特異性「ＢＣ２８−１×１×１ａ」構築物である。
【０４８７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、各構築物の完全なアセンブリを実証しており、各構築物について、非還元ゲルの主要なバンドが、予測される分子量で示されている。
６．１３．１４．
（実施例１３）
結合解析
【０４８８】
図３３は、３つの抗原：ＰＤ１、抗原「Ａ」およびＣＴＬＡ−４へのＯｃｔｅｔ結合解析を示す。それぞれの場合において、抗原が固定化され、Ｂ−Ｂｏｄｙが検体である。参照のために、１×１二重特異性の「ＢＣ１」と「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」も比較すると、１×１  Ｂ−Ｂｏｄｙが、抗原結合部位が選択される抗原のみに特異的に結合することが実証された。
【０４８９】
図３３Ａは、「ＢＣ１」がＰＤ１および抗原「Ａ」に結合するが、ＣＴＬＡ４に結合しないことを示す。図３３Ｂは、二価の二重特異性１×１構築物「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」がＣＴＬＡ４に結合するが、抗原「Ａ」またはＰＤ１に結合しないことを示す。図３３Ｃは、三価三重特異性１×２構築物「ＢＣ２８−１×１×１ａ」がＰＤ１、抗原「Ａ」およびＣＴＬＡ４に結合することを示す。
６．１３．１５．
（実施例１４）
四価構築物
【０４９０】
図３５は、２×２四価二重特異性構築物「ＢＣ２２−２×２」の全体の構成を示す。２×２四価二重特異性は、それぞれの可変ドメイン−定常ドメインセグメントを複製することによって「ＢＣ１」足場で構築した。ドメインの命名法を図３４に概略化する。
【０４９１】
図３６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。レーン７〜９は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後（「ＣＨ１溶離液」）、およびさらにイオン交換クロマトグラフィ精製した後（レーン８、「ＩＥＸ後のｐｋ１」；レーン９、「ＩＥＸ後のｐｋ２」）の「ＢＣ２２−２×２」四価構築物をそれぞれ示す。レーン１〜３は、ＣＨ１親和性精製した後（レーン１）、レーン２および３はさらにイオン交換クロマトグラフィした後の三価２×１構築物「ＢＣ２１−２×１」である。レーン４〜６は、１×２三価構築物「ＢＣ１２−１×２」である。
【０４９２】
図３７は、２×２四価構築物全体の構成を示す。
【０４９３】
図３９および４０は、代替的な構成を有する四価構築物の概略図である。ドメインの命名法を図３８に示す。
６．１３．１６．
（実施例１５）
Ｂ−Ｂｏｄｙによる二重特異性抗原係合
【０４９４】
四価二重特異性２×２  Ｂ−Ｂｏｄｙ「Ｂ−Ｂｏｄｙ−ＩｇＧ  ２×２」を構築した。より詳細には、図３８にまとめたドメインおよびポリペプチド鎖の命名法の参照を使用して、
第１のポリペプチド鎖
ドメインＡ＝ＶＬ（セルトリズマブ）
ドメインＢ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１、ノブ）
ドメインＤ＝ＣＨ２（ＩｇＧ１）
ドメインＥ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１）
ドメインＷ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＸ＝ＣＨ１（ＩｇＧ１）
第３のポリペプチド鎖（第１のポリペプチド鎖と同一）
ドメインＨ＝ＶＬ（セルトリズマブ）
ドメインＩ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１、ノブ）
ドメインＪ＝ＣＨ２（ＩｇＧ１）
ドメインＫ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１）
ドメインＷＷ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＸＸ＝ＣＨ１（ＩｇＧ１）
第２のポリペプチド鎖
ドメインＦ＝ＶＨ（セルトリズマブ）
ドメインＧ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１、ホール）
第４のポリペプチド鎖（第３のポリペプチド鎖と同一）
ドメインＦ＝ＶＨ（セルトリズマブ）
ドメインＧ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１、ホール）
第７のポリペプチド鎖
ドメインＹ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＺ＝ＣＬカッパ
第８のポリペプチド鎖（第７のポリペプチド鎖と同一）
ドメインＹＹ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＺＺ＝ＣＬカッパ。
【０４９５】
これを、実施例１に記載されるようにクローニングし、発現させた。ここで、ＢＬＩ実験は、ビオチン化抗原「Ａ」のストレプトアビジンセンサー上への固定化、その後の１０×カイネティックバッファーを用いたベースラインの確立で構成した。次いで、センサーを、無細胞発現された「Ｂ−Ｂｏｄｙ−ＩｇＧ  ２×２」中に浸漬し、次いで、新たなベースラインを確立した。最終的に、センサーを、第２の結合事象が観察された１００ｎＭ  ＴＮＦαに浸漬し、単一の「Ｂ−Ｂｏｄｙ−ＩｇＧ  ２×２」構築物による両方の抗原の二重特異性結合を確認した。結果を図４１に示す。
６．１３．１７．
（実施例１６）
「ＢＢ−ＩｇＧ  ２×２」の抗原特異的細胞結合
【０４９６】
Ｅｘｐｉ−２９３細胞を、Ｅｘｐｉ−２９３トランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｍｏｃｋトランスフェクトするかまたは抗原「Ｂ」で一過性トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、Ｅｘｐｉ−２９３細胞を回収し、４％パラホルムアルデヒド中で１５分間、室温で固定化した。細胞を、ＰＢＳ中で２回洗浄した。２００，０００抗原ＢまたはＭｏｃｋトランスフェクトされたＥｘｐｉ−２９３細胞を、Ｖ底９６ウェルプレート内の１００μＬのＰＢＳ中に入れた。細胞を、３ｕｇ／ｍＬの濃度の「Ｂ−Ｂｏｄｙ−ＩｇＧ  ２×２」と１．５時間、室温でインキュベートした。細胞を、３００×Ｇで７分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、８μｇ／ｍＬの濃度の１００μＬのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒト第２抗体と室温で１時間インキュベートした。細胞を３００×Ｇで７分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、細胞結合をＧｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅを使用してフローサイトメトリーによって確認した。結果を図４２に示す。
６．１３．１８．
（実施例１７）
二価および三価構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
【０４９７】
図４５は、それぞれ一過性発現およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の様々な構築物の、非還元および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０４９８】
レーン１（非還元条件）およびレーン２（還元条件、＋ＤＴＴ）は、二価１×１二重特異性構築物「ＢＣ１」である。レーン３（非還元）およびレーン４（還元）は、二価１×１二重特異性構築物「ＢＣ２８」である（実施例４参照）。レーン５（非還元）およびレーン６（還元）は、二価１×１二重特異性構築物「ＢＣ４４」である（実施例５参照）。レーン７（非還元）およびレーン８（還元）は、三価１×２二重特異性「ＢＣ２８−１×２」構築物である（実施例９参照）。レーン９（非還元）およびレーン１０（還元）は、実施例１１に記載の三価１×２三重特異性「ＢＣ２８−１×１×１ａ」構築物である。
【０４９９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、各構築物の完全なアセンブリを実証しており、各構築物について、非還元ゲルの主要なバンドが、予測される分子量で示されている。
６．１３．１９．
（実施例１８）
可変−ＣＨ３ジャンクション操作の安定性解析
【０５００】
様々なジャンクションバリアントの組合せ間の対形成安定性を評価した。示差走査蛍光定量を行って、鎖１のＶＬ−ＣＨ３ポリペプチド（ドメインＡおよびＢ）と鎖２のＶＨ−ＣＨ３ポリペプチド（ドメインＦおよびＧ）との間の様々なジャンクションバリアント対形成の融点を決定した。ジャンクションバリアント「ＢＣ６ｊｖ」、「ＢＣ２８ｊｖ」、「ＢＣ３０ｊｖ」、「ＢＣ４４ｊｖ」および「ＢＣ４５ｊｖ」（それぞれ、上記表２および表３でみられる「ＢＣ６」、「ＢＣ２８」、「ＢＣ３０」、「ＢＣ４４」および「ＢＣ４５」の対応するジャンクション配列を有する）は、７６〜７７度の範囲のＴｍを有し、対形成安定性の増加を実証する（表４参照）。図４６は、「ＢＣ２４ｊｖ」、「ＢＣ２６ｊｖ」および「ＢＣ２８ｊｖ」の熱転移の差異を示し、「ＢＣ２８ｊｖ」が３つの中で安定性が最も大きいことを実証している。図のｘ軸は温度であり、ｙ軸は温度変化で割った蛍光変化（−ｄＦｌｕｏｒ／ｄＴｅｍｐ）である。実験は、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるＮｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  （２００７）  ２，  ２２１２  −  ２２２１）に記載されているように行った。
【表４】
2021522162.tif 000006
６．１３．２０．
（実施例１９）
ＲＯＲ×ＣＤ３候補結合分子
【０５０１】
後述する通り、様々なＲＯＲ×ＣＤ３抗体を構築し検査した。
６．１３．２０．１．ＣＤ３結合アーム
【０５０２】
ＳＰ３４抗ＣＤ３抗体（ＳＰ３４−８９、配列番号６８および６９）のヒト化バージョンに基づく一連のＣＤ３結合アームバリアントを、ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列（配列番号７０〜７３）のいずれかにおける点変異により操作した。表５に記載されている通り、様々なＶＨおよびＶＬ配列を一体に対形成させた。
【表５】
2021522162.tif 000007
【０５０３】
ＶＬおよびＶＨバリアントは、１×１  ＢＣ１  Ｂ−ｂｏｄｙの一方のアームへとクローニングし、一方、他方のアームは、無関係抗原結合部位を含有した。図４７は、Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）バイオレイヤーインターフェロメトリー解析によって決定された、非変異誘発ＳＰ３４−８９一価Ｂ−ｂｏｄｙの結合親和性を実証する。構築物の２倍系列希釈（２００〜１２．５ｎＭ）を使用して、ＳＰ３４−８９に対する２３ｎＭの結合親和性を決定し（ｋｏｎ＝３×１０５Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝７．１×１０−３ｓ−１）、これは、文献における他のＳＰ３４バリアントに対する親和性にマッチする。動態親和性も、平衡結合親和性にマッチした。
６．１３．２０．２．ＲＯＲ結合アーム
【０５０４】
Ｆａｂ  ＣＤＲに多様性が導入された化学合成Ｆａｂファージライブラリを、モノクローナルファージＥＬＩＳＡフォーマットを使用してＲＯＲ抗原に対してスクリーニングし、それによると、プレート固定化されたＲＯＲバリアントが、上述の通りファージへの結合に関して評価された。抗原を認識したＦａｂを発現するファージクローンを配列決定した。ＲＯＲ１への結合に関する第１のスクリーニングキャンペーンは、表６における「Ｉ２Ａ」と名付けられた抗原結合部位（ＡＢＳ）クローンを同定し、ＲＯＲ２への結合に関する第２のスクリーニングキャンペーンは、表６における「Ｉ２Ｃ」と名付けられたＡＢＳクローンを同定した。
【表６−１】
2021522162.tif 000008
【表６−２】
2021522162.tif 000009
【表６−３】
2021522162.tif 000010
「Ｉ２Ａ」、ＲＯＲ１に対するスクリーニング；「Ｉ２Ｃ」、ＲＯＲ２に対するスクリーニング；＊は、配列未決定を表す；太字は、潜在的な異性化部位（後述を参照）を表す
【０５０５】
上述のＶＨおよびＶＬ配列を、二価単一特異性ネイティブヒト全長ＩｇＧ１アーキテクチャへとフォーマットした。図４８Ａ〜図４８Ｂは、２種のＲＯＲ結合候補に対する２倍系列希釈（２００〜１２．５ｎＭ）のＯｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）バイオレイヤーインターフェロメトリー解析を実証する（図４８Ａ、クローンＩ２−Ａ１０；図４８Ｂ、クローンＩ２−Ａ２７）。結合親和性および動態を系列希釈から決定し、表７に示す。
【表７】
2021522162.tif 000011
【０５０６】
二価単一特異性ネイティブヒト全長ＩｇＧ１アーキテクチャへとフォーマットされたＲＯＲ結合候補を、ＲＯＲ１および／またはＲＯＲ２への結合に関してさらに特徴付けた。表８は、ＲＯＲ１のみに特異的に結合した候補、ＲＯＲ２のみに特異的に結合した候補、ならびにＲＯＲ１およびＲＯＲ２の両方に対し交差反応性であった候補を提示する。ＲＯＲ結合候補はまた、特定のＲＯＲ１ドメインへのその結合に関して特徴付けた。表９は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｉｇ様およびＫｒｉｎｇｌｅドメインに特異的に結合した候補を提示する。
【表８】
2021522162.tif 000012
【表９】
2021522162.tif 000013
【０５０７】
選択されたＲＯＲ結合候補を、安定性、変異性および免疫原性など、臨床開発に関連する抗体特性に有害に影響し得る配列モチーフに関してさらに解析した。Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ  （Ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ，  ２０１６）に従って計算的解析を行った。解析結果は、表１０に提示され、限られた数の有害配列モチーフが、収載されているクローンに存在することを実証し、さらなる臨床開発のための潜在力を説明する。
【表１０】
2021522162.tif 000014
＊ハーセプチンに見出される予測Ｔ細胞エピトープは、これらの分子に存在する
６．１３．２１．
（実施例２０）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＯＲ×ＣＤ３二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ有効性
【０５０８】
候補ＲＯＲおよびＣＤ３抗原結合部位は、Ｂ−ｂｏｄｙ  ＢＣ１  １×１および１×２フォーマットへとフォーマットし、一連の腫瘍有効性モデルにおいて検査した。
６．１３．２１．１．二特異性Ｂ−ｂｏｄｙフォーマット比較
【０５０９】
ＲＯＲ抗原結合部位（ＡＢＳ）候補Ｉ２Ａ−３およびＣＤ３  ＡＢＳ候補ＳＰ３４−８９は、二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ「ＢＣ１」１×１および１×２フォーマットへとフォーマットした。図３および図２６を参照すると、ＲＯＲ  ＡＢＳ候補は、Ａ：ＦおよびＲ：Ｔ結合部位を形成する一方、ＣＤ３  ＡＢＳ候補は、Ｈ：Ｌ結合部位を形成する。図２６を参照すると、ＳドメインとＨドメインとの間に１０アミノ酸ジャンクションまたは１６アミノ酸ジャンクションのいずれかを有する、２つの１×２フォーマットを構築した。異なる構築物を、本明細書に記載されているＮＦκＢ  ＧＦＰ  Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞刺激アッセイにおいて検査した。簡潔に説明すると、レポーターＴ細胞（エフェクター細胞）を、ＲＯＲ１抗原を発現する非小細胞肺がん標的腫瘍細胞系ＨＯＰ−９２、またはＲＯＲ１を発現しないＢ１６黒色腫標的腫瘍細胞系のいずれかと混合した。次に、異なるＢ−ｂｏｄｙ構築物の希釈系列を、エフェクター：標的混合物と共にインキュベートした。
【０５１０】
図４９に示し、表１１に提示する通り、ＲＯＲ×ＣＤ３二特異性１×１および１×２  Ｂ−ｂｏｄｙは、ＲＯＲ１発現腫瘍系統（ＨＯＰ−９２）と混合した場合に、レポーターＴ細胞の活性化をもたらしたが、ＲＯＲ×ＣＤ３二特異性１×１および１×２  Ｂ−ｂｏｄｙを、ＲＯＲ１を発現しない腫瘍系統（Ｂ１６）と混合した場合に、活性化は観察されなかった。加えて、ＲＯＲ１に対する二価特異性を保有する１×２  Ｂ−ｂｏｄｙフォーマットは、１×１  Ｂ−ｂｏｄｙフォーマットよりも強力であり、ジャンクションの長さの変動は、最小限の効力差をもたらした。
【表１１】
2021522162.tif 000015
６．１３．２１．２．ＣＤ３結合単独は、Ｔ細胞を活性化しない
【０５１１】
ＲＯＲ  ＡＢＳ候補Ｉ２Ａ−１０およびＣＤ３  ＡＢＳ候補ＳＰ３４−８９は、二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ「ＢＣ１」１×２フォーマットへとフォーマットした（「Ｉ２−Ａ１０  １×２」）。別々の構築物において、ＲＯＲ１以外の腫瘍抗原に対する対照アームも、ＣＤ３  ＡＢＳ候補ＳＰ３４−８９と共に、二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ「ＢＣ１」１×２フォーマットへとフォーマットした（「Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌ」）。図３および図２６を参照すると、ＲＯＲ候補ＡＢＳおよび「Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌ」アームＡＢＳは、Ａ：ＦおよびＲ：Ｔ結合部位を形成する一方、ＣＤ３  ＡＢＳ候補は、Ｈ：Ｌ結合部位を形成する。異なる構築物を、Ｔ細胞細胞傷害性アッセイにおいて検査した。簡潔に説明すると、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクター細胞）を、ＲＯＲ１抗原を発現する三種陰性乳がん腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＤ−２３１（標的細胞）と混合した。次に、異なるＢ−ｂｏｄｙ構築物の希釈系列を、エフェクター：標的混合物と共にインキュベートした。
【０５１２】
図５０に示す通り、ＲＯＲ×ＣＤ３三価二特異性１×２  Ｂ−ｂｏｄｙは、ＲＯＲ１発現腫瘍系統（ＭＤＡ−ＭＤ−２３１）と混合した場合に、細胞傷害性Ｔ細胞媒介性死滅をもたらしたが、無関係腫瘍ＡＢＳ（例えば、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１において発現されない腫瘍抗原）を有するＣＤ３二特異性Ｂ−ｂｏｄｙが混合物に添加された場合には、細胞傷害性をもたらさなかった。
６．１３．２１．３．複数の腫瘍モデルにおけるＲＯＲ×ＣＤ３二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ有効性
【０５１３】
ＲＯＲ  ＡＢＳ候補Ｉ２Ａ−３およびＣＤ３  ＡＢＳ候補ＳＰ３４−８９は、上述の二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ「ＢＣ１」１×１および１×２フォーマットへとフォーマットし、１×２フォーマットは、ＳドメインとＨドメインとの間に１０アミノ酸ジャンクションを有した。異なる構築物を、本明細書に記載されているＮＦκＢ  ＧＦＰ  Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞刺激アッセイにおいて検査した。簡潔に説明すると、レポーターＴ細胞（エフェクター細胞）を、ＲＯＲ１発現腫瘍細胞系、ＨＯＰ−９２（非小細胞肺がん１）、Ａ５４９（非小細胞肺がん２）、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１（三種陰性乳がん）、ＪｅＫｏ−１（マントル細胞リンパ腫）およびＲＰＭＩ−８２２６（多発性骨髄腫）と混合した。構築物は、また、ＲＯＲ１を発現しないＢ１６黒色腫腫瘍細胞系（標的細胞）と混合した。次に、異なるＢ−ｂｏｄｙ構築物の希釈系列を、エフェクター：標的混合物と共にインキュベートした。
【０５１４】
図５１Ａ〜図５１Ｅに示し、表１２に提示する通り、ＲＯＲ×ＣＤ３二特異性１×１および１×２  Ｂ−ｂｏｄｙは、ＲＯＲ１発現腫瘍系統、ＨＯＰ−９２（図５１Ａ）、Ａ５４９（図５１Ｂ）、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１（図５１Ｃ）、ＪｅＫｏ−１（図５１Ｄ）およびＲＰＭＩ−８２２６（図５１Ｅ）と混合した場合に、レポーターＴ細胞の活性化をもたらしたが、このような構築物を、ＲＯＲ１を発現しない腫瘍系統（Ｂ１６）と混合した場合に、活性化は生じなかった。ＲＯＲ１に対する二価特異性を保有する１×２  Ｂ−ｂｏｄｙフォーマットは、検査した全腫瘍系統において１×１  Ｂ−ｂｏｄｙフォーマットよりも強力であった。よって、ＲＯＲ×ＣＤ３二特異性１×１および１×２  Ｂ−ｂｏｄｙは、ある範囲の腫瘍モデルに及ぶ有効性を実証した。
【表１２】
2021522162.tif 000016
６．１３．２１．４．Ｔ細胞活性化に関するＲＯＲ  ＡＢＳ候補スクリーニング
【０５１５】
ＲＯＲ  ＡＢＳ候補Ｉ２Ａ−１、Ｉ２Ａ−３、Ｉ２Ａ−１０、Ｉ２Ａ−１４、Ｉ２Ａ−１６、Ｉ２Ａ−２０、Ｉ２Ａ−２２およびＩ２Ａ−２７は、ＣＤ３  ＡＢＳ候補ＳＰ３４−８９と共に、上述の二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ「ＢＣ１」１×２フォーマットへとフォーマットし、１×２フォーマットは、ＳドメインとＨドメインとの間に１０アミノ酸ジャンクションを有した。異なる構築物を、上述のＴ細胞細胞傷害性アッセイにおいて検査した。簡潔に説明すると、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクター細胞）を、ＲＯＲ１抗原を発現する三種陰性乳がん腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＤ−２３１（標的細胞）と６：１のＥ：Ｔ比で混合した。次に、異なるＢ−ｂｏｄｙ構築物の希釈系列を、エフェクター：標的混合物と共にインキュベートした。
【０５１６】
図５２に示し、表１３に提示する通り、ＲＯＲ×ＣＤ３二特異性１×２  Ｂ−ｂｏｄｙ  Ｉ２Ａ−１、Ｉ２Ａ−３、Ｉ２Ａ−１０、Ｉ２Ａ−１４、Ｉ２Ａ−２２およびＩ２Ａ−２７は、ＲＯＲ１発現腫瘍系統（ＭＤＡ−ＭＤ−２３１）と混合した場合に、細胞傷害性Ｔ細胞媒介性死滅をもたらしたが、１×２  Ｂ−ｂｏｄｙ  Ｉ２Ａ−１６およびＩ２Ａ−２０は、強力な細胞傷害性をもたらさなかった。加えて、Ｉ２Ａ−２２は、変則的な用量応答曲線をもたらした。よって、ＲＯＲ  ＡＢＳ候補Ｉ２Ａ−１、Ｉ２Ａ−３、Ｉ２Ａ−１０、Ｉ２Ａ−１４およびＩ２Ａ−１７は、有効なＴ細胞媒介性死滅をもたらした。
【表１３】
2021522162.tif 000017
６．１３．２１．５．細胞傷害性死滅は、ＲＯＲ１発現と相関する
【０５１７】
ＲＯＲ  ＡＢＳ候補Ｉ２Ａ−１０およびＣＤ３  ＡＢＳ候補ＳＰ３４−８９は、上述の二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ「ＢＣ１」１×２フォーマットへとフォーマットし、１×２フォーマットは、ＳドメインとＨドメインとの間に１０アミノ酸ジャンクションを有した。Ｉ２Ａ−１０候補を、記載されているＴ細胞細胞傷害性アッセイにおいて検査した。簡潔に説明すると、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクター細胞）を、ＲＯＲ１発現腫瘍細胞系、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１（三種陰性乳がん）およびＲＰＭＩ−８２２６（多発性骨髄腫）と４：１のＥ：Ｔ比で混合した。候補の希釈系列を、エフェクター：標的混合物と共にインキュベートした。
【０５１８】
図５３Ａは、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１およびＲＰＭＩ−８２２６腫瘍系統に関する発表されたＲＯＲ１発現データを説明する。図５３Ｂおよび図５３Ｃは、本出願人らの実験において観察された細胞傷害性有効性が、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１およびＲＰＭＩ−８２２６腫瘍細胞系においてＲＯＲ１と相関することを実証する。
６．１３．２１．６．ＲＯＲ  ＡＢＳ候補Ｉ２Ａ−１０およびＩ２Ａ−２７による初代Ｔ細胞活性化
【０５１９】
ＲＯＲ  ＡＢＳ候補Ｉ２Ａ−１０およびＩ２Ａ−２７は、ＣＤ３  ＡＢＳ候補ＳＰ３４−８９と共に、上述の二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ「ＢＣ１」１×２フォーマットへとフォーマットし、１×２フォーマットは、ＳドメインとＨドメインとの間に１０アミノ酸ジャンクションを有した。Ｉ２Ａ−１０  ＢＣ１  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙを形成する４つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号８４、８５、８７および８８に収載されている。Ｉ２Ａ−２７  ＢＣ１  １×２を形成する４つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号８９、９０、９２および９３に収載されている。
【０５２０】
異なる構築物を、フローサイトメトリーによって定量化されるＴ細胞活性化アッセイにおいて検査した。簡潔に説明すると、単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、エフェクター細胞）を、ＲＯＲ１抗原をそれぞれ発現する三種陰性乳がん腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＤ−２３１および膵癌腫瘍細胞系ＰＡＮＣ１（標的細胞）と７：１のＥ：Ｔ比で混合した。次に、異なるＢ−ｂｏｄｙ構築物の希釈系列を、エフェクター：標的混合物と共にインキュベートし、４４時間一緒にインキュベートした。次に、Ｔ細胞マーカーＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８ならびに活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９に関して細胞を染色し、フローサイトメトリーによって解析した。
【０５２１】
図５４Ａ〜図５４Ｆに示す通り、Ｉ２Ａ−１０およびＩ２Ａ−２７  Ｂ−ｂｏｄｙは、ＣＤ２５（図５４Ａ）、ＣＤ６９（図５４Ｃ）、ＣＤ２５およびＣＤ６９の両方（図５４Ｅ）の発現によって決定される通り、ＰＢＭＣ集団におけるＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、ＣＤ２５（図５４Ｂ）、ＣＤ６９（図５４Ｄ）、ＣＤ２５およびＣＤ６９の両方（図５４Ｆ）によって決定される通り、ＰＢＭＣ集団におけるＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化した。よって、ＲＯＲ  ＡＢＳ候補は、初代Ｔ細胞を活性化することができる。
６．１３．２１．７．ＲＯＲ  ＡＢＳ候補Ｉ２Ａ−１０およびＩ２Ａ−２７の内部移行
【０５２２】
ＲＯＲ  ＡＢＳ候補Ｉ２Ａ−１０およびＩ２Ａ−２７は、ＣＤ３  ＡＢＳ候補ＳＰ３４−８９と共に、上述の二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ「ＢＣ１」１×２フォーマットへとフォーマットし、１×２フォーマットは、ＳドメインとＨドメインとの間に１０アミノ酸ジャンクションを有した。異なる構築物を、フローサイトメトリーによって定量化される通り、腫瘍細胞系により内部移行に関して検査した。簡潔に説明すると、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、Ｉ２−Ａ１０、Ｉ２−Ａ２７またはアイソタイプ対照と共に２時間３７℃または４℃でインキュベートした。２時間後に、標識された二次抗体を、４℃で３０分間添加し、次いでフローサイトメトリーによって解析した。パーセント内部移行は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づき、アイソタイプ対照（０％）および４℃対照（１００％）の間で正規化することにより計算した。
【０５２３】
図５５に示す通り、候補Ｉ２Ａ−１０（上パネル）およびＩ２Ａ−２７（下パネル）の２６％および３６％が、それぞれ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞との２時間インキュベーション後に内部移行した。腫瘍細胞による内部移行は、ＲＯＲ抗原を発現する腫瘍細胞を死滅させるための様々な抗体−薬物コンジュゲート戦略を可能にする。
６．１３．２２．
（実施例２１）
ＲＯＲ×ＣＤ３二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ単一ステップの精製
【０５２４】
ＲＯＲ  ＡＢＳ候補Ｉ２Ａ−１０およびＩ２Ａ−２７は、ＣＤ３  ＡＢＳ候補ＳＰ３４−８９と共に、上述の二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ「ＢＣ１」三価１×２フォーマットへとフォーマットし、１×２フォーマットは、ＳドメインとＨドメインとの間に１０アミノ酸ジャンクションを有した。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用した１ステップ精製を使用して、構築物を精製した。
【０５２５】
図５６は、単一ステップＣＨ１親和性精製ステップが、ゲル濾過により単一の単分散ピークを生じたことを実証する、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）解析を示し、それによると、＞９８％が、１×２  Ｂ−ｂｏｄｙ候補Ｉ２Ａ−１０（上パネル）およびＩ２Ａ−２７（下パネル）の、凝集していないタンパク質である。
【０５２６】
図５７Ａは、完全にアセンブルした構築物の主要バンド（高い位置の移動度の２５０ｋＤａバンド）を実証する、１×２  Ｂ−ｂｏｄｙ候補Ｉ２Ａ−１０（左パネル）およびＩ２Ａ−２７（右パネル）の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図５７Ｂは、完全にアセンブルした構築物の主要バンドを実証する、１×２  Ｂ−ｂｏｄｙ候補Ｉ２Ａ−１０およびＩ２Ａ−２７に関する非還元試料のＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）解析を示す。
【０５２７】
二特異性抗体の抗ＣＨ１精製効率も、二特異性抗体のＦｃ部分内のそのネイティブ位置に見出されるＣＨ３ドメインに導入された標準ノブ・ホール直交型変異のみを有し、他のドメイン修飾がないＲＯＲ結合分子に関して検査した。したがって、検査した２種の抗体ＫＬ２７−６およびＫＬ２７−７はそれぞれ、抗体の各アームに１つが存在する、２つのＣＨ１ドメインを含有した。セクション６．１３．１により詳細に記載されている通り、各二特異性抗体を発現させ、抗ＣＨ１カラムにおいて望まれないタンパク質産物から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいてランを行った。図５８に示す通り、不完全二特異性抗体を表す７５ｋＤａの有意なバンドが存在し、これは、図３を参照すると、（ｉ）第１および第２の、または（ｉｉ）第３および第４のポリペプチド鎖のみを含有する複合体として解釈される。よって、抗ＣＨ１を使用して、各アームにＣＨ１ドメインを有する完全二特異性分子を精製する方法は、不完全抗体複合体によるバックグラウンドコンタミネーションをもたらした。
６．１３．２３．
（実施例２２）
エフェクター機能を低減させるＦｃ変異
【０５２８】
一連の操作されたＦｃバリアントを、モノクローナルＩｇＧ１抗体トラスツズマブ（ハーセプチン、「ＷＴ−ＩｇＧ１」）において生成し、これは、ＣＨ２ドメインのＬ２３４、Ｌ２３５およびＰ３２９位に変異を有する。検査したバリアントの特定の変異は、下の表１４に記載されており、ｓＦｃ１（ＰＡＬＡＬＡ）、ｓＦｃ７（ＰＧＬＡＬＡ）およびｓＦｃ１０（ＰＫＬＡＬＡ）を含む。全バリアントは、融解温度（表１４、ＴＭ１およびＴＭ２）によって決定される通り、同様の安定性を示した。
【０５２９】
ＷＴ−ＩｇＧ１およびＦｃバリアントをＯｃｔｅｔバイオセンサーに固定化し、可溶性ＦｃγＲＩａを系に添加して、結合を決定した。図５９Ａ〜図５９Ｂは、トラスツズマブへのＦｃγＲＩａ結合を実証する（図５９Ａ「ＷＴ  ＩｇＧ１」）が、ｓＦｃ１０への結合を実証しない（図５９Ｂ）、Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）バイオレイヤーインターフェロメトリー解析を示す。ＦｃγＲＩａの添加後に、トラスツズマブについてシグナルの増加が見られたが、ｓＦｃ１０について観察可能なシグナル増加は検出されず、ＦｃγＲＩａが、操作された変異を有する抗体にもはや結合しなくなったことを実証する。検査したバリアントの結合概要を表１４に提示する。加えて、全バリアントが、ＨＥＲ２への強い結合を保持した（図示せず）。
【表１４】
2021522162.tif 000018
【０５３０】
ＷＴ−ＩｇＧ１およびＦｃバリアントを、ＦｃγＲ結合、特にＦｃγＲＩＩＩａの別の尺度として、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイにおいて検査した。図６０に示す通り、トラスツズマブ（ハーセプチン、「ＷＴ−ＩｇＧ１」）は、死滅を実証したが、ｓＦｃ７とｓＦｃ１０のいずれも、検出可能レベルの死滅をもたらさなかった。ＷＴ−ＩｇＧ１およびＦｃバリアントは、ＥＬＩＳＡにより補体成分Ｃ１ｑ結合に関しても検査した。図６１に示す通り、トラスツズマブ（ハーセプチン、「ＷＴ−ＩｇＧ１」）は、Ｃ１ｑ結合を実証したが、ｓＦｃ１とｓＦｃ７とｓＦｃ１０のいずれも、検出可能なＣ１ｑ結合をもたらさなかった。よって、結果は、検査したＦｃバリアントが、低減したレベルのＦｃエフェクター機能を有することを実証する。
６．１３．２４．
（実施例２３）
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＯＲ×ＣＤ３二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ有効性
【０５３１】
ヒト化マウスにおける異種移植試験を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を測定した。簡潔に説明すると、５×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞を、ＮＯＤ  Ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）の後部側腹部の皮下に生着させ、およそ１２０〜１５０ｍｍ３まで成長させた。次に、単一のドナー由来の１×１０７個のヒトＰＢＭＣの静脈内（ＩＶ）注射によりマウスをヒト化させた。ヒト化ＮＳＧマウスを、８匹の３群へとランダム化し、ＰＢＭＣ生着３日後に、ＰＢＳ、０．５ｍｇ／Ｋｇの、ＣＤ３  ＡＢＳ候補ＳＰ３４−８９と共に１×２  Ｂ−ｂｏｄｙアーキテクチャへとフォーマットしたＲＯＲ  ＡＢＳ候補Ｉ２−Ａ１０（「Ｉ２−Ａ１０」）または０．５ｍｇ／Ｋｇの、ＣＤ３  ＡＢＳ候補ＳＰ３４−８９と共に１×２  Ｂ−ｂｏｄｙアーキテクチャへとフォーマットしたＲＯＲ  ＡＢＳ候補Ｉ２−Ａ２７（「Ｉ２−Ａ２７」）をＩＶ投薬した。週に２回の投薬を３週間続けた。腫瘍成長、体重および全体的な健康に関して動物をモニターした。試験完了後に、解析のために動物を屠殺した。標準技法を使用してフローサイトメトリー解析を行って、ＮＳＧマウスのヒト化状態を決定した。
【０５３２】
腫瘍を収集し、標準免疫組織化学技法を使用して解析して、処置に応答した腫瘍へのヒトＴ細胞の浸潤をモニターする。ＩＨＣは、標準技法を使用して実行される。簡潔に説明すると、ＦＦＰＥ試料は、脱パラフィンし、６０℃でベーキングして１００％キシレン溶液に置くことにより脱水（ｒｅｈｙｄｒａｔｅ）し、次いで、エタノール系列洗浄（１００％エタノール、９５％エタノール、７０％エタノール、５０％エタノール、ＰＢＳ）により再度水分補給する。１０ｍＭクエン酸Ｎａ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ６．０緩衝剤においてスライドを９５℃で１０分間インキュベートすることにより、抗原修復を実行する。ＡｂＣａｍ  Ｍｏｕｓｅ  ｏｎ  Ｍｏｕｓｅ  ＩＨＣキット（Ｃａｔ．Ａｂ１２７０５５）は、染色のための製造業者の指示に従って使用する。簡潔に説明すると、内在性ペルオキシダーゼ活性は、過酸化水素溶液により遮断され、内在性非特異的相互作用は、Ｒｏｄｅｎｔ  Ｂｌｏｃｋ溶液により遮断される。スライドを、製造業者の推奨（一般に、２時間室温または一晩４℃）に従って一次抗体と共にインキュベートし、次いで、ＡｂＣａｍキットのｍｏｕｓｅ  ｏｎ  ｍｏｕｓｅ  ＨＲＰポリマーで染色する。ＤＡＢ色素原（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）染色とヘマトキシリン（ｈｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ）対比染色を可視化のために使用する。
６．１３．２４．１．ＲＯＲ×ＣＤ３三価二特異性Ｂ−ｂｏｄｙは、腫瘍成長低減をもたらす
【０５３３】
図６２Ａ〜図６２Ｃに示す通り、腫瘍細胞を生着した、ＰＢＭＣでヒト化し（左の実線矢印）、次いで、ＰＢＳ（図６２Ａ）、１×２  Ｂ−ｂｏｄｙ候補Ｉ２−Ａ１０（図６２Ｂ）または１×２  Ｂ−ｂｏｄｙ候補Ｉ２−Ａ２７（図６２Ｃ）でその後ＩＶ処置した（右の破線矢印）マウスの、腫瘍体積をモニターした。図６３は、マウスのそれぞれの、試験結論時の腫瘍体積を示し、群毎の平均および標準偏差を示す。Ｉ２−Ａ２７群の白い四角は、ＰＭＢＣによる非ヒト化がほぼ確実なため、解析から除去した。結果は、Ｉ２−Ａ２７処置は、およそ４０％の腫瘍成長の有意低減をもたらしたことを実証する。
【０５３４】
試験におけるＮＳＧマウスのヒト化状態は、フローサイトメトリー解析により確認した。表１５に示す通り、解析した全マウスは、ヒトＣＤ４５（％ｈｕ  ＣＤ４５＋）の染色によって決定される通り、ヒトリンパ球によるヒト化に成功した。試料０３＿Ｂ１０（ｂ）は解析しなかった。解析した全マウスにおけるヒト化リンパ球集団はまた、ヒトＣＤ３（ｈｕＣＤ４５＋リンパ球においてゲーティングした％ＣＤ３、およびヒトＣＤ３＋Ｔ細胞においてゲーティングした％ＣＤ４＋／ＣＤ８＋）の染色によって決定される通り、ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞を含むヒトＴ細胞を有した。
【０５３５】
腫瘍試料において免疫組織化学検査を行い、処置に応答した腫瘍へのヒトＴ細胞の浸潤を確認する。
表１５：  ＮＳＧマウスのヒト化
【表１５】
2021522162.tif 000019
６．１３．２５．
（実施例２４）
ＲＯＲ１×ＣＤ３二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）有効性
【０５３６】
表６に示すＩ２Ａ−２７の６個のＣＤＲを含む追加的なＲＯＲ抗原結合分子を調製し、実験を行って、ＲＯＲ１×ＣＤ３二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）フォーマットにおける三価二特異性構築物としてのその有効性を検査した。
６．１３．２５．１．Ｉ２−Ａ２７に基づく追加的なＲＯＲ１×ＣＤ３  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体の生成
【０５３７】
ＲＯＲ  ＡＢＳ候補Ｉ２Ａ−２７は、ＣＤ３  ＡＢＳ候補ＳＰ３４−８９と共に、上述の二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ「ＢＣ１」１×２フォーマットへとフォーマットし、１×２フォーマットは、ＳドメインとＨドメインとの間に１０アミノ酸ジャンクションを有した（例えば、ドメインの概略図については図２６を参照）。例示的なＩ２Ａ−２７  ＢＣ１  １×２三価二特異性ＲＯＲ抗原結合分子を形成する５つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号９６（鎖１）、配列番号９７（鎖２）、配列番号９８（鎖３）、配列番号９９（鎖４）および配列番号９７（鎖５）として収載する。
【０５３８】
本実施例における次の記載では、用語「Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）」または「Ｉ２−Ａ２７」または「Ａ２７」は、配列番号９６の鎖１、配列番号９７の鎖２、配列番号９８の鎖３、配列番号９９の鎖４および配列番号９７の鎖５を有するこのＲＯＲ１×ＣＤ３  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）を指す。
６．１３．２５．２．ＣＤ３およびＲＯＲ１へのＲＯＲ１×ＣＤ３  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体の結合
【０５３９】
上の実施例１９に記載されている通り、ＳＰ３４−８９は、ヒトＣＤ３デルタおよびイプシロンヘテロ二量体に対する２３ｎＭの一価Ｋｄを示した（図４７を参照）。
【０５４０】
本実施例において、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３への結合は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ３ノックアウト細胞系またはカニクイザルＴ細胞系への細胞結合を評価することによりさらに特徴付けた。具体的には、ヒトＪｕｒｋａｔおよびカニクイザルＴ細胞へのＳＰ３４−８９ヒト化抗体の結合をフローサイトメトリーにより決定した。ＳＰ３４−８９は、表示の濃度で表示の細胞系と共にインキュベートし、続いて、蛍光標識された二次抗体による標識を行った。平均蛍光強度を、ＳＰ３４−８９の濃度に対してプロットした。図６４Ａに示す通り、ＳＰ３４−８９は、ＪｕｒｋａｔおよびカニクイザルＴ細胞の両方への強い結合を示したが、Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ３ノックアウト細胞系への有意な結合を示さず、ヒトおよびカニクイザル交差反応性および細胞結合が維持されたことを検証する。
【０５４１】
加えて、カニクイザルＣＤ３デルタおよびイプシロンヘテロ二量体に対する、セクション６．１３．２５．１に記載されているその結果得られるＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体の結合親和性を、バイオレイヤーインターフェロメトリー（ＢＬＩ）結合評価により決定した。
【０５４２】
より具体的には、Ｆｃバイオセンサーを使用したＯｃｔｅｔＱＫ３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、一価結合親和性解析を行った。およそ１ｎｍ応答を生じる濃度（典型的には１０〜５０ｎＭタンパク質）で、未標識Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）を先ずＦｃバイオセンサーに結合させる。次に、バイオセンサーを１０×動態緩衝剤（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）において平衡化して、ベースラインを確立する。各抗原のタグが付いていない単量体を、５０ｎｍ〜０．７５ｎＭに及ぶ濃度で、抗体コーティングされたセンサーと接触させる。会合応答および解離をモニターし記録した。その結果得られるＫｏｎおよびＫｏｆｆは、Ｏｃｔｅｔ解析ソフトウェアを使用してフィットさせた。図６４Ｂに示す通り、二特異性抗体は、カニクイザルＣＤ３デルタおよびイプシロンヘテロ二量体に対する３ｎＭの一価Ｋｄを示した。
【０５４３】
次に、ＲＯＲ１への結合を評価した。上の６．１３．２０．２に記載されているデータ（例えば、図４８Ｂを参照）と一貫して、ＶＨおよびＶＬ配列が、二価単一特異性ＩｇＧアーキテクチャへとフォーマットされる場合、Ｉ２−Ａ２７  ＩｇＧ抗体は、ＲＯＲ１に対し２．８ｎＭの一価結合を示し、ＲＯＲ２に対し最小の結合を示した（図６５Ａおよび図６５Ｂ）。
【０５４４】
次に、ＲＯＲ１およびＲＯＲ２へのＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体の一価および二価結合を、ＢＬＩを使用して解析した。
【０５４５】
上述の通りに一価結合解析を行い、抗体をＦｃセンサーにより捕捉し、緩衝剤のみにおいて会合相に続く解離相のために表示の抗原と接触させた。
【０５４６】
ストレプトアビジンバイオセンサーを使用したＯｃｔｅｔＱＫ３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、二価結合解析を行った。およそ１ｎｍ応答を生じる濃度（典型的には１０〜５０ｎＭビオチン化タンパク質）で、ビオチン化抗原を先ずストレプトアビジンバイオセンサーに結合させた。次に、バイオセンサーを１０×動態緩衝剤（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）において平衡化して、ベースラインを確立した。５０ｎｍ〜０．７５ｎＭに及ぶ濃度で、１×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）を抗原コーティングされたセンサーと接触させた。会合応答および解離をモニターし記録した。その結果得られるＫｏｎおよびＫｏｆｆは、Ｏｃｔｅｔ解析ソフトウェアを使用してフィットさせた。
【０５４７】
図６５Ｃ、図６５Ｄおよび図６５Ｅに示す通り、Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）フォーマットは、ＲＯＲ１に対し３．８ｎＭの一価結合および０．７１ｎＭの二価結合を示し、ＲＯＲ２に対し最小の結合を示した。
６．１３．２５．３．ＲＯＲ１×ＣＤ３  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体のさらなる特徴付け
【０５４８】
Ｅｘｐｉ−ＣＨＯ細胞におけるポリペプチド鎖１〜４（ポリペプチド鎖５は、ポリペプチド鎖２と同じである）をコードするＤＮＡの一過性トランスフェクションにより、セクション６．１３．２５．１に記載されているＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体を産生した。５鎖抗体をＣＨ１親和性樹脂により精製し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４へと緩衝液交換した。
【０５４９】
その結果得られるＢ−ｂｏｄｙ（商標）のアセンブリおよび純度を非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。
【０５５０】
約０．２〜１ｍｇ／ｍＬに及ぶ２μｇの抗体を使用して、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。最大１０μＬの試料を、２００μＬ  ＰＣＲ管において４μＬの２×レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）試料緩衝剤（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と混合した。別々の管に、４μＬの分子量ラダー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加した。サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）を使用して、ＰＣＲ管を５５℃で１０分間インキュベートし、４℃に冷却した。管を遠心分離し、各管の全体積を、４〜１５％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の個々のウェルにロードした。外部電源を使用して定電圧（２２０Ｖ）で操作した、Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳランニング緩衝剤（１０×から１×に希釈）によるＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  Ｔｅｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、３０分間かけて試料を電気泳動した。ゲルを脱イオン水で洗浄し、クーマシー色素（ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で最小１５分間染色した。ゲルをその後、脱イオン水で最小３０分間脱染し、撮像した。
【０５５１】
約０．３〜１．５ｍｇ／ｍＬに及ぶ３μｇの抗体を使用して還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。最大１０μＬの試料を、２００μＬ  ＰＣＲ管において４μＬの２×レムリ試料緩衝剤（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）および５μＬの５Ｍジチオスレイトールと混合した。別々の管に、４μＬ分子量ラダー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加した。ＰＣＲ管を室温で３０分間インキュベートした。次に、サーモサイクラーを使用して、試料を５５℃で１０分間インキュベートし、４℃に冷却した。管を遠心分離し、最大１４μＬの試料を、４〜１５％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の個々のウェルにロードした。外部電源を使用して定電圧（２２０Ｖ）で操作した、Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳランニング緩衝剤（１０×から１×に希釈）によるＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  Ｔｅｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、３０分間かけて試料を電気泳動した。ゲルを脱イオン水で洗浄し、クーマシー色素（ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で最小１５分間染色した。ゲルをその後、脱イオン水で最小３０分間脱染し、撮像した。
【０５５２】
１×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）は、非還元フォーマットにおいて２００ｋＤの予想される分子量付近に泳動された（本明細書にデータ図示せず）。還元フォーマットにおいて、予想される３本のバンドが分離された（１つの鎖は７５ｋＤに、１つの鎖は５０ｋＤに、２つの鎖は２５ｋＤに）（本明細書にデータ図示せず）。
【０５５３】
タンパク質はその後、還元および非還元フォーマットにおいてキャピラリー電気泳動によって解析した。
【０５５４】
製造業者の使用説明書に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにおいてキャピラリー電気泳動のランを行った。簡潔に説明すると、試料を、標識緩衝剤において標識色素と共に氷上で暗所にて３０分間インキュベートした。次に、エタノールアミンを添加し、試料を氷上で暗所にて１０分間インキュベートして、取り込まれなかった色素をクエンチした。還元試料のため、１Ｍ  ＤＴＴを試料緩衝剤に添加した。試料を９８℃で５分間インキュベートして、ＮａｎｏＦｌｕｉｄｉｃチップにおけるローディングに先立ち試料を変性した。還元試料における３本の主要バンドから、９５．５４％であるとパーセント純度を計算した（本明細書にデータ図示せず）。
【０５５５】
次に、カラムのセットにより抗体タンパク質を解析して、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により均一性を、スタンドアップ単層吸着クロマトグラフィ（ＳＭＡＣ）により凝集傾向を、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）により疎水性を評価した。
【０５５６】
Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣにおける７．８ｍｍ  ＩＤ×３０ｃｍ  ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ、ＰＮ  ０８５４１）を使用して、ＳＥＣ解析を行った。抗体をｄＰＢＳ（ｐＨ７．４）における１ｍｇ／ｍＬ濃度に対して正規化し、遠心分離により清澄化して、微粒子をペレットにした。移動相緩衝剤は、ｄＰＢＳ（ｐＨ７．４、カルシウムおよびマグネシウム不含）であった。試料毎に、１０μＬをロードし、２０分間にわたる１．０ｍｌ／分にて均一濃度で溶出した。２８０ｎｍにおける吸光度をモニターした。クロマトグラフィピークを積分して、％均一性および保持時間を決定した。
【０５５７】
Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣにおける４．６ｍｍ  ＩＤ×３００ｍｍ  Ｚｅｎｉｘ  ＳＥＣ  ３００カラム（Ｓｅｐａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＰＮ  ２１３３００Ｐ−４６３０）を使用して、ＳＭＡＣ解析を行った。抗体をｄＰＢＳ（ｐＨ７．４）における１ｍｇ／ｍＬ濃度に対して正規化し、遠心分離により清澄化して、微粒子をペレットにした。移動相緩衝剤は、ｄＰＢＳ（ｐＨ７．４、カルシウムおよびマグネシウム不含）であった。試料毎に、１０μＬをロードし、３２分間にわたる０．２５ｍＬ／分にて均一濃度で溶出した。２８０ｎｍにおける吸光度をモニターした。試料保持時間を計算し、標準対照のセットと比較して、増加した保持時間（増加した凝集形成傾向）を有する抗体を同定した。
【０５５８】
Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣにおける４．６ｍｍ  ＩＤ×３．５ｃｍ  ＴＳＫゲルＢｕｔｙｌ−ＮＰＲカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ、ＰＮ  １４９４７）を使用して、ＨＩＣ解析を行った。抗体をｄＰＢＳ（ｐＨ７．４）における２ｍｇ／ｍＬ濃度に対して正規化し、次いで、１ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度となるように等しい体積の移動相緩衝剤Ｂで希釈した。１ｍＬ／分の流速における１００％移動相緩衝剤Ｂ（２Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）でカラムを平衡化した。試料毎に、１０μＬをロードし、１５分間にわたる１．０ｍＬ／分における１００％移動相緩衝剤Ｂから１００％移動相緩衝剤Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）への勾配を使用して溶出し、１００％Ａで３分間維持してカラムを洗浄し、平衡化のために１００％Ｂに２分間戻した。２８０ｎｍにおける吸光度をモニターした。試料保持時間を計算し、標準対照のセットと比較して、増加した保持時間（増加した疎水性）を有する抗体を同定した。
【０５５９】
これらの解析の結果を図６６Ａ、図６６Ｂおよび図６６Ｃに示す。図示する通り、タンパク質は、ＳＥＣにより＞９９％均質であると思われ、他の開発可能な抗体に観察された範囲内に収まるＳＭＡＣおよびＨＩＣの両方による単一のピークをもたらし、許容される凝集および疎水性プロファイルを示唆する。
【０５６０】
次に、動的光散乱（ＤＬＳ）、静的光散乱（ＳＬＳ）および蛍光を使用してＴｍ、ＰＤＩおよび流体力学直径を測定することができるＵＮｃｌｅ分析機器により、タンパク質を解析した。抗体をｄＰＢＳ（ｐＨ７．４）における１ｍｇ／ｍＬ濃度に対して正規化し、遠心分離により清澄化して、微粒子をペレットにした。試料をＵＮｃｌｅの９μＬ石英キャピラリーキュベットデバイス（Ｕｎｉ）へと等分し、封着した。１５℃でＤＬＳによりＰＤＩおよび流体力学直径を測定した。０．５℃／分で１５℃から９５℃へと温度を一定速度で増加させ、その間に、自家蛍光によりＴｍを測定した。ＵＮｃｌｅ解析ソフトウェアｖ３．１を使用してデータを解析した。
【０５６１】
タンパク質は、６７．４℃および７３．７℃の融解温度を示した。３回の測定から得られるＰＤＩ中央値は、０．１９であり、これは単分散試料を示し（ＰＤＩ＜０．２５は、単分散と考慮される）、流体力学直径は１４．４ｎｍであった（下の表１６を参照）。
表１６．  ＵＮｃｌｅ分析機器による融点、多分散指標および流体力学直径の結果
【表１６】
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６．１３．２５．４．ＲＯＲ１×ＣＤ３  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能評価
【０５６２】
Ｔ細胞およびＲＯＲ１発現がん細胞の細胞共培養アッセイにおけるＩ２−Ａ２７  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の機能性能を解析した。ＲＯＲ１および／またはＲＯＲ２を発現するがん細胞系を評価した。
【０５６３】
ＲＯＲ１特異的抗体（Ｉ２−Ａ２７）およびＲＯＲ２特異的抗体（Ｉ２−Ｃ２１）を使用したフローサイトメトリーにより、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＲＰＭＩ−８２２６およびＫ５６２を、表面発現されたＲＯＲ１および近縁のＲＯＲ２タンパク質のコピーの数に関して評価した。コピー数評価に使用する抗体の特異性をＢＬＩにより決定したところ、Ｉ２−Ａ２７がＲＯＲ１に選択的に結合し、Ｉ２−Ｃ２１がＲＯＲ２に選択的に結合することが確認された。表１７に示す通り、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系は、ＲＯＲ１を主に発現することが決定され、ＲＰＭＩ−８２２６細胞系は、ＲＯＲ１およびＲＯＲ２の両方を発現することが決定され、Ｋ５６２細胞系は、主にＲＯＲ２を発現することが決定された。
表１７．  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＲＰＭＩ−８２２６およびＫ５６２細胞におけるＲＯＲ１およびＲＯＲ２の表面タンパク質コピー数
【表１７】
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【０５６４】
Ｉ２−Ａ２７  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）が、ＲＯＲ１またはＲＯＲ２発現がん細胞の存在下でＴ細胞を活性化することができるか評価するために、ＮＦｋＢ  Ｊｕｒｋａｔ共培養レポーター遺伝子アッセイを利用した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の活性化は、ＮＦｋＢ応答エレメントの活性化およびｅＧＦＰの産生をもたらす。具体的には、ハーフエリア（ｈａｌｆ  ａｒｅａ）の黒色の壁と透明な底の９６ウェルプレートにおいて、アッセイ当日にＲＰＭＩ−８２２６もしくはＫ５６２細胞を蒔いた（３５，０００細胞／ウェル）、またはアッセイ前日にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を蒔いた（２５，０００細胞／ウェル）。アッセイ当日に、１μｇ／ｍＬ抗ＣＤ２８抗体の存在下で、表示される濃度の抗体の希釈物を添加した。ＮＦｋＢ−ＧＦＰ  Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞をウェルに７５，０００細胞／ウェルで添加した。プレートを６時間３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。バックグラウンド抑制色素を添加し、Ｓａｆｉｒｅプレートリーダーを使用して、５２０ｎｍにおける蛍光を決定した。
【０５６５】
図６７Ａ、図６７Ｂ、図６７Ｃおよび図６７Ｄに示す通り、Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＲＯＲ１発現）またはＲＰＭＩ−８２２６（ＲＯＲ１およびＲＯＲ２発現）細胞の存在下、ｐＭ範囲でＪｕｒｋａｔレポーター細胞系を活性化することができるが、Ｋ５６２（ＲＯＲ２発現）細胞の存在下でまたは標的細胞系の非存在下では活性化できなかったことが示された。
【０５６６】
次に、初期Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９および後期Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５の発現レベル増加によって評価される通り、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するＩ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体の機能を、ＲＯＲ１発現細胞系の存在下で試験した。具体的には、Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞またはＲＰＭＩ−８２２６細胞ありまたはなしで、６：１のＥ：Ｔ比で、４８時間インキュベートした。次に、細胞をＰＥ−Ｃｙ７  ＣＤ６９抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５６１９２８）およびＢＢ５１５  ＣＤ２５抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５６４４６７）で１時間４℃にて標識した。標識後に、ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ  ＩＱｕｅ  ｓｃｒｅｅｎｅｒにおけるフローサイトメトリーによる解析に先立ち、試料を３００×ｇで遠心分離し、生細胞イメージング溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に再懸濁した。
【０５６７】
図６８Ａ〜図６８Ｄに示す通り、Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体は、ＲＯＲ１発現細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＲＰＭＩ−８２２６）の存在下の場合、ＣＤ６９およびＣＤ２５の発現の用量依存性増加をもたらしたが、これらの細胞の非存在下では用量依存性増加をもたらさなかった。
【０５６８】
活性化されたＴ細胞がその後、ＲＯＲ１発現細胞系を死滅させることができるかについて、標的細胞からのＬＤＨ放出、ならびにＣＤ８＋エフェクター細胞によるグランザイムＢ、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの分泌によって評価した。
【０５６９】
標的細胞からのＬＤＨ放出を次の通りに解析した：ハーフエリアの黒色の壁と透明な底の９６ウェルプレートにおいて、アッセイ当日にＲＰＭＩ−８２２６細胞を蒔いた、またはアッセイ前日にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を蒔いた。ＣＤ８＋細胞を６：１のエフェクター対標的細胞比で添加した。アッセイ培地は、ＲＰＭＩ＋２％熱失活ＦＢＳであった。細胞を３７℃／５％ＣＯ２で２日間インキュベートした。各ウェル由来のアッセイ培地を使用して、製造業者のプロトコールに従って乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイ（Ｒｏｃｈｅ）を行った。ＣＤ８＋なし対照（０％細胞傷害性）および洗剤死滅対照（１００％細胞傷害性）に対してデータを正規化した。
【０５７０】
図６９Ａおよび図６９Ｂに示す通り、Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下でＲＯＲ１発現細胞の用量依存性細胞傷害性をもたらしたが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の非存在下では用量依存性細胞傷害性をもたらさなかった。
【０５７１】
ＣＤ８＋エフェクター細胞によるグランザイムＢ、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの分泌を次の通りに解析した：ＭｕｌｔｉＣｙｔ  ＱＢｅａｄｓ  ＰｌｅｘＳｃｒｅｅｎ分泌タンパク質アッセイキット（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ）を使用して、製造業者のプロトコールに従って分泌されたＴＮＦα、ＩＦＮγおよびグランザイムＢのレベルを決定した。簡潔に説明すると、分析物毎の捕捉ビーズを５０×濃縮物として用意する。使用に先立ち、ビーズを一緒に組み合わせ、２×濃縮物に希釈する。１０μＬの上清をＶ字底プレートに移し、１０μＬの調製されたビーズを試料に添加し、プレート振盪機においてプレートを混合し、プレートを室温で１時間インキュベートする。インキュベーション後に、１０μＬの検出試薬を各ウェルに添加し、プレート振盪機においてプレートを混合し、プレートを室温で２時間インキュベートする。インキュベーション後に、５０μＬの洗浄緩衝剤を各ウェルに添加し、プレートを５分間１１００×ｇで遠心分離し、上清を吸引し、１０μＬの洗浄緩衝剤を各ウェルに添加することにより試料を再懸濁する。ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ  ＩＱｕｅ  Ｓｃｒｅｅｎｅｒフローサイトメーターにおいてデータを取得する。
【０５７２】
ＣＤ８＋Ｔ細胞によって放出されるグランザイムＢ、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの用量依存性増加は、Ｉ２−Ａ２７およびＲＯＲ１発現細胞の存在下で観察された；このような増加は、図７０Ａ〜図７０Ｆに示す通り、ＲＯＲ１発現細胞の非存在下では観察されなかった。
６．１３．２５．５．ＲＯＲ１×ＣＤ３  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体の血清安定性評価
【０５７３】
Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体の血清安定性を解析した。Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体を、ＰＢＳにおける２．５ｍｇ／ｍＬから、ヒト血清（約９３％最終血清濃度）またはＰＢＳにおける１７０μｇ／ｍＬへと希釈した。次に、試料を３７℃または４℃で１週間インキュベートした。１週間に及ぶインキュベーション後に、ヒト血清またはＰＢＳ対照において貯蔵した試料においてＪｕｒｋａｔ活性アッセイを実行した。１週間４℃または３７℃でヒト血清において貯蔵した試料に、活性の損失がないことが判明した（図７１Ａを参照）。血清における１週間に及ぶインキュベーション中に材料が凝集した場合、Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）は、ＣＤ３受容体の直接的活性化により、ＲＯＲ１発現細胞の非存在下でシグナルの増加をもたらすと予想することができる。ＲＯＲ１発現細胞の非存在下でアッセイのランを行った場合、活性増加は検出されなかった（図７１Ｂを参照）。
【０５７４】
次に、ＰＢＳにおける２．５ｍｇ／ｍＬにて４℃または４０℃で抗体を貯蔵し、毎週ＳＥＣおよびＰＤＩにより試料の均一性を評価することにより、Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体の安定性を評価した。加速された安定性アッセイのため、ＰＢＳにおける２．５ｍｇ／ｍＬの抗体を４０℃で最大４週間貯蔵した。抗体は、加速された安定性条件下で安定していると思われた（図７２を参照）。リアルタイムアッセイのため、ＰＢＳにおける２．５ｍｇ／ｍＬの抗体を４℃で最大１２週間貯蔵した。抗体はまた、リアルタイム条件下で安定していると思われた（図７３を参照）。
【０５７５】
加速されたリアルタイム安定性試料毎のＰＤＩおよびＺ平均（ａｖｅ）直径を、ＵＮｃｌｅ分析機器を使用して決定し、結果を下の表１８に示す。
表１８．  ＵＮｃｌｅ分析機器を使用して決定された、加速されたリアルタイム安定性試料毎のＰＤＩおよびＺ平均直径
【表１８】
2021522162.tif 000022
【０５７６】
次に、酸における抗体の安定性を評価した。１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５を使用した溶出によりＣＨ１親和性樹脂に結合することにより、Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）を、上に概要を述べる精製手順に付した。Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）を酸に０、３０、６０または１２０分間放置し、その後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤で中和した。次に、ＳＥＣにより解析する前に、タンパク質の緩衝液をＰＢＳに交換した。図７４に示す通り、Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体は、酸において最大２時間安定していた。
６．１３．２５．６．ＲＯＲ１×ＣＤ３  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二特異性抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
【０５７７】
乳がんのＰＢＭＣヒト化ＮＳＧ（商標）マウスモデルにおいて、例示的なＲＯＲ１×ＣＤ３二特異性Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）、Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を試験した。
【０５７８】
より具体的には、６〜８週齢のＮＳＭ（商標）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、系統番号００５５５７、これは、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒガンマｎｕｌｌ、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒｇｎｕｌｌ、ＮＳＧ、ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマとしても公知である）雌マウスに、ＭａｔｒｉｇｅｌとＰＢＳまたは無血清培地の１：１混合物に再懸濁した５×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、乳房脂肪体において同所性に接種した。体重および臨床観察を１週間に１回〜２回記録した。腫瘍が触知可能になったら、デジタルノギス測定を開始して、腫瘍体積を１週間に１回〜２回決定した。腫瘍体積が約６０〜８０ｍｍ３に達したら、腫瘍体積に基づきマウスをランダム化した（試験−１日目または試験０日目）。試験０日目に、マウスにＰＢＭＣを注射した。ＰＢＭＣの注射の後に、第１相検証の結果に基づき投薬を始めた。マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで投薬した。体重、臨床観察およびデジタルノギス測定を、用量開始後に１週間に２回記録した。≦２のボディ・コンディション・スコア、≧２０％の体重減少または腫瘍体積＞２０００ｍｍ３に達した動物は、試験終点前に安楽死させた。潰瘍化した腫瘍を有する動物は、試験終点前に安楽死させた。死亡しているのが見つかった動物からは組織を収集しなかった。試験３０日目に、ＣＯ２窒息により全動物を安楽死させ、組織を収集した。次に、腫瘍を収集し、断片へと分離した。１つの断片は、フローサイトメトリー解析のために培地に置いた。次のマーカーを検査した：ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４および７ＡＡＤ。１つの断片は、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）のために１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）において固定した。１つの断片は瞬間（ｆｌａｓｈ）凍結した。試験の終わりに全血を収集した。フローサイトメトリー解析のために約５０μＬの全血を得た。次のマーカーを検査した：ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４および７ＡＡＤ。
【０５７９】
結果を図８７（上部パネル）および図８８に示す。図示する通り、Ｉ２−Ａ２７  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）は、用量０．５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇにおいて、腫瘍成長の低減におけるｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を実証した。
６．１３．２６．
（実施例２５）
ＲＯＲ１／ＲＯＲ２×ＣＤ３二重特異性Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の有効性
【０５８０】
表６に示すＩ２Ａ−１０の６つのＣＤＲおよび様々なＣＤＲ変異体を含むさらなるＲＯＲ抗原結合分子を調製し、実験を実施してＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）フォーマットの三価二重特異性構築物としてのそれらの有効性を試験した。
６．１３．２６．１．
Ｉ２−Ａ１０に基づくさらなるＲＯＲ１／ＲＯＲ２×ＣＤ３  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二重特異性抗体の生成
【０５８１】
Ｉ２−Ａ１０抗体ならびにＩｇＧ、１×１  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）および１×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）フォーマットの抗体構築物のＣＤＲ領域の選択的変異を作製し、試験した。
【０５８２】
例えば、Ｉ２Ａ−１０と命名されたＲＯＲ  ＡＢＳ候補は、上記で説明されているように、ＣＤ３  ＡＢＳ候補ＳＰ３４−８９と二重特異性Ｂ−ｂｏｄｙ「ＢＣ１」１×２フォーマットへとフォーマットされ、その１×２フォーマットはＳドメインとＨドメインとの間に１０アミノ酸ジャンクションを有する（例えば、ドメインの概略図については図２６を参照）。例示的なＩ２Ａ−１０  ＢＣ１  １×２三価二重特異性ＲＯＲ抗原結合分子を形成する５つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１１４（鎖１）、配列番号１１５（鎖２）、配列番号１１６（鎖３）、配列番号１１７（鎖４）、および配列番号１１５（鎖５）として挙げられている。
【０５８３】
この実施例における以下の説明において、「Ｉ２−Ａ１０  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）」または「Ｉ２−Ａ１０」または「Ａ１０」という用語は、配列番号１１４の鎖１、配列番号１１５の鎖２、配列番号１１６の鎖３、配列番号１１７の鎖４、および配列番号１１５の鎖５を有するこのＲＯＲ１／ＲＯＲ２×ＣＤ３  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）を指す。
【０５８４】
変異を有するＩ２−Ａ１０抗体構築物には、Ｉ２−Ａ１０  Ｒ６６Ｇ、Ｉ２−Ａ１０  Ｒ６６Ｋ、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｇ、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ、Ｉ２−Ａ１０  Ｙ５５Ｅ、Ｉ２−Ａ１０  Ｙ５５Ｑ、Ｉ２−Ａ１０  Ｙ５６Ｓ、Ｉ２−Ａ１０  Ｙ９３ＳＹ９４ＳおよびＩ２−Ａ１０  Ａ３２Ｙが含まれる。
【０５８５】
これらの抗体構築物の発現力価および収量を表１９に示すように解析した。
表１９．発現力価および収量
【表１９】
2021522162.tif 000023
【０５８６】
次いで、これらの抗体構築物のＲＯＲ１への結合を試験したところ、不十分な結合を示したＡ３２ＹおよびＹ９３／９４Ｓ構築物を除き、それぞれが陽性の結合を示した。
【０５８７】
次いで、これらの抗体構築物を本明細書に記載のＪｕｒｋａｔ機能アッセイにおいて試験した（例えば６．１３．１．８を参照）。結果を表２０に示す。
表２０．変異を有するＩ２−Ａ１０構築物のＪｕｒｋａｔ機能アッセイ
【表２０】
2021522162.tif 000024
【０５８８】
これらのバリアントは細胞殺傷アッセイにおいても試験した。結果を表２１に示す。
表２１．  Ｉ２−Ａ１０バリアントの細胞殺傷アッセイ
【表２１】
2021522162.tif 000025
【０５８９】
次いで、抗体構築物を解析し、ＳＥＣでの均一性、ＳＭＡＣでの凝集傾向、およびＨＩＣでの疎水性を評価した。ＳＥＣ、ＳＭＡＣおよびＨＩＣアッセイは、実施例２４で説明されているように実施した。Ｄ５４Ｇは、ＳＥＣアッセイによると許容されなかった。Ｙ５５Ｑ（およびＹ５５Ｅ）は、Ｉ２−Ａ１０親よりも改善されたＨＩＣ値を示した。示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）も抗体構築物の試験に使用した。
【０５９０】
上記のアッセイおよび解析に基づき、Ｄ５４ＥおよびＹ５５Ｑ変異を、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑと命名した新規Ａ１０関連抗体の調製に選択した。潜在的異性化部位を修正するＤ５４Ｅ変異は、予期せず、Ｉ２−Ａ１０親抗体の活性よりも良好な活性（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイ）を有する抗体をもたらした。レア残基を生殖細胞系列に逆戻りさせるＹ５５Ｑ変異は、予期せず、Ｉ２−Ａ１０親抗体と比較して、改善されたＨＩＣ値を有する抗体をもたらした。
【０５９１】
次いで、さらなるＲＯＲ１／ＲＯＲ２×ＣＤ３  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）がＤ５４ＥおよびＹ５５Ｑ変異を組み込んで生成された。Ｙ５５Ｑは、表６に示すようにＲＯＲ１およびＲＯＲ２についての抗原結合部位のＶＬのＣＤＲ２領域における変異であり、以下に示すように鎖１および鎖３に導入された。Ｄ５４Ｅは、表６に示すようにＲＯＲ１およびＲＯＲ２についての抗原結合部位のＶＨのＣＤＲ２領域における変異であり、以下に示すように鎖２および鎖５に導入された。さらに、ノブ・アンド・ホール（ｋｎｏｂ−ａｎｄ−ｈｏｌｅ）配置を生成する変異は、鎖１（ホール）および鎖３（ノブ）の第２のＣＨ３ドメインに含まれていた。
【０５９２】
Ｉ２Ａ−１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑと命名されたＲＯＲ  ＡＢＳ候補は、上記で説明されているように、ＣＤ３  ＡＢＳ候補ＳＰ３４−８９と二重特異性Ｂ−ｂｏｄｙ「ＢＣ１」１×２フォーマットへとフォーマットされ、その１×２フォーマットはＳドメインとＨドメインとの間に１０アミノ酸ジャンクションを有している（例えば、ドメインの概略図については図２６を参照）。例示的なＩ２Ａ−１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  ＢＣ１  １×２三価二重特異性ＲＯＲ抗原結合分子を形成する５つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１３２（鎖１）、配列番号１３３（鎖２）、配列番号１３４（鎖３）、配列番号１３５（鎖４）、および配列番号１３３（鎖５）として挙げられている。
【０５９３】
この実施例における以下の説明において、「Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）」または「Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ」という用語は、配列番号１３２の鎖１、配列番号１３３の鎖２、配列番号１３４の鎖３、配列番号１３５の鎖４および配列番号１３３の鎖５を有するこのＲＯＲ１／ＲＯＲ２×ＣＤ３  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）を指す。
６．１３．２６．２．
ＲＯＲ１／ＲＯＲ２×ＣＤ３  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二重特異性抗体のＣＤ３およびＲＯＲ１への結合
【０５９４】
Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のカニクイザルＣＤ３デルタおよびイプシロンヘテロ二量体への結合親和性は、上記の実施例２４で説明した一価ＢＬＩ結合評価によって決定した。図７５に示すように、二重特異性抗体は、カニクイザルＣＤ３デルタおよびイプシロンヘテロ二量体に対して３．５ｎＭの一価Ｋｄを示した。
【０５９５】
次に、抗体のＲＯＲ１およびＲＯＲ２への結合を、実施例２４で説明されているように一価および二価のＢＬＩ結合評価を使用して評価した。図７６Ａ〜７６Ｂに示すように、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  ＩｇＧ抗体は、ＲＯＲ１に対して０．７ｎＭ、ＲＯＲ２に対して１ｐＭ未満の一価結合を示した。Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）は、ＲＯＲ１に対して０．４６ｎＭおよびＲＯＲ２に対して１ｐＭ未満の一価結合、ならびにＲＯＲ１に対して２１ｐＭおよびＲＯＲ２に対して３ｐＭの二価結合を示した（図７６Ｃ〜７６Ｆを参照）。
【０５９６】
次いで、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  ＩｇＧのＩｇ様ドメイン、  ＦｒｉｚｚｌｅｄドメインおよびＫｒｉｎｇｌｅドメインへの結合をＢＬＩによって決定した。図７７に示すように、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  ＩｇＧは、ＲＯＲ１のＩｇ様ドメインに結合する。
６．１３．２６．３．
ＲＯＲ１／ＲＯＲ２×ＣＤ３  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のさらなる特徴付け
【０５９７】
Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）は、Ｅｘｐｉ−ＣＨＯ細胞におけるポリペプチド鎖１〜４（ポリペプチド鎖５はポリペプチド鎖２と同じである）をコードするＤＮＡの一過性トランスフェクションによって生成された。５つの鎖抗体をＣＨ１親和性樹脂で精製し、バッファーをＰＢＳ、ｐＨ７．４に交換した。
【０５９８】
得られたＢ−ｂｏｄｙ（商標）のアセンブリおよび純度は、実施例２４で説明されているように非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。２×１  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）は、非還元フォーマットにおいて予想される分子量の２００ｋＤ近くで泳動した。還元フォーマットでは、予想される３つのバンド（７５ｋＤに１つの鎖、５０ｋＤに１つの鎖、および２５ｋＤに２つの鎖）が分離された（ここではデータは示さず）。続いて、タンパク質を、実施例２４で説明されているように還元および非還元フォーマットでキャピラリー電気泳動によって解析し、そのパーセント純度を還元試料の３つの主要なバンドから計算したところ９６．２５％であった。
【０５９９】
次いで、抗体タンパク質を１セットのカラムによって解析し、ＳＥＣでの均一性、ＳＭＡＣでの凝集傾向、およびＨＩＣでの疎水性を評価した。ＳＥＣ、ＳＭＡＣおよびＨＩＣアッセイは、実施例２４で説明されているように実施した。
【０６００】
これらの解析の結果を図７８Ａ〜７８Ｃに示す。示したように、タンパク質はＳＥＣによって＞９９％均一に見え、ＳＭＡＣとＨＩＣの両方で単一ピークがもたらされ、他の開発可能な抗体に対して観察された範囲内にあり、このことは許容可能な凝集および疎水性プロファイルを示唆している。
【０６０１】
次にタンパク質を、実施例２４で説明されているようにＵＮｃｌｅ分析機器を用いて解析した。抗体は、６８．５℃および７７．４℃の融解温度を示した。３回の測定からのＰＤＩ中央値は０．２１であり、流体力学的直径が１２．６ｎｍの単分散試料（ＰＤＩ＜０．２５が単分散と考えられる）を示している（下記の表２２を参照）。
表２２．  ＵＮｃｌｅ分析機器からの融解温度、多分散指数および流体力学的直径の結果
【表２２】
2021522162.tif 000026
６．１３．２６．４．
ＲＯＲ１／ＲＯＲ２×ＣＤ３  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能評価
【０６０２】
Ｔ細胞およびＲＯＲ１発現がん細胞の細胞共培養アッセイにおけるＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の機能的能力を解析した。ＲＯＲ１および／またはＲＯＲ２を発現したがん細胞系を評価した。
【０６０３】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＲＰＭＩ−８２２６、およびＫ５６２の細胞を、この研究において、実施例２４に示したように使用し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系は主としてＲＯＲ１を発現すると決定され、ＲＰＭＩ−８２２６細胞系はＲＯＲ１とＲＯＲ２の両方を発現すると決定され、Ｋ５６２細胞系は主としてＲＯＲ２を発現すると決定された。
【０６０４】
Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）がＲＯＲ１またはＲＯＲ２発現がん細胞の存在下でＴ細胞を活性化することができるかどうかを評価するため、実施例２４で説明されているようにＮＦｋＢ  Ｊｕｒｋａｔ共培養レポーター遺伝子アッセイを利用した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の活性化は、ＮＦｋＢ応答エレメントの活性化とｅＧＦＰの生成をもたらす。図７９Ａ〜７９Ｄに示すように、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＲＯＲ１発現）、ＲＰＭＩ−８２２６（ＲＯＲ１およびＲＯＲ２発現）ならびにＫ５６２（ＲＯＲ２発現）細胞の存在下で、ｐＭ範囲のＪｕｒｋａｔレポーター細胞系を活性化することができたが、ＲＯＲ１またはＲＯＲ２発現細胞系の非存在下では活性化することはできなかった。
【０６０５】
次に、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するＩ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の機能を研究した。この機能アッセイは、初期Ｔ細胞活性化マーカーのＣＤ６９、および後期Ｔ細胞活性化マーカーのＣＤ２５の発現レベルの増加により評価する場合、ＲＯＲ１発現細胞系の存在下で、上記の実施例２４に説明されている通りである。
【０６０６】
図８０Ａ〜８０Ｄに示すように、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）は、ＲＯＲ１発現細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＲＰＭＩ−８２２６）の存在下である場合、ＣＤ６９およびＣＤ２５の発現における用量依存的増加をもたらしたが、これらの細胞が非存在の場合には増加はなかった。
【０６０７】
活性化Ｔ細胞が続いてＲＯＲ１発現細胞系を殺傷させることができるかどうかは、標的細胞からのＬＤＨ放出、ならびにＣＤ８＋エフェクター細胞によるグランザイムＢ、ＴＮＦα、およびＩＦＮγの分泌によって評価した。
【０６０８】
標的細胞からのＬＤＨ放出は、実施例２４で説明されているように解析した。図８１Ａおよび８１Ｂに示すように、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下でＲＯＲ１発現細胞の用量依存的細胞傷害性をもたらしたが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の非存在下ではもたらされなかった。
【０６０９】
ＣＤ８＋エフェクター細胞によるグランザイムＢ、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの分泌は、実施例２４で説明されているように解析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞によって放出されたグランザイムＢ、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの用量依存的増加は、図８２Ａ〜８２Ｆに示すように、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）およびＲＯＲ１発現細胞の存在下で観察された；しかしそのような増加は、ＲＯＲ１発現細胞の非存在下では観察されなかった。
６．１３．２６．５．
ＲＯＲ１×ＣＤ３  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二重特異性抗体の血清安定性評価
【０６１０】
Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の血清安定性を解析した。二重特異性抗体は、ＰＢＳ中２．５ｍｇ／ｍＬからヒト血清（約９３％最終血清濃度）またはＰＢＳ中１７０μｇ／ｍＬに希釈した。次いで、試料を１週間３７℃または４℃でインキュベートした。１週間のインキュベーション後、Ｊｕｒｋａｔ活性アッセイをヒト血清に保存された試料またはＰＢＳ対照に対して実施した。ヒト血清中に、４℃または３７℃で１週間保存した試料については、活性に損失がないことがわかった（図８３Ａを参照）。物質が血清中で１週間のインキュベーション中に凝集した場合には、Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）は、ＣＤ３受容体の直接的活性化により、ＲＯＲ１発現細胞の非存在下でシグナルの増加をもたらすことが予想され得る。このアッセイがＲＯＲ１発現細胞の非存在下で実施された場合、活性の増加は検出されなかった（図８３Ｂを参照）。
【０６１１】
次いで、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）の安定性について、抗体を４℃または４０℃でＰＢＳ中２．５ｍｇ／ｍＬで保存し、ＳＥＣおよびＰＤＩによって試料の均一性を毎週評価することによって評価した。加速安定性アッセイについては、抗体をＰＢＳ中２．５ｍｇ／ｍＬで４０℃にて最大４週間保存した。抗体は、加速安定性条件下で安定しているように思われた（図８４を参照）。リアルタイムアッセイにおいては、抗体をＰＢＳ中２．５ｍｇ／ｍＬで４℃にて最大１２週間保存した。抗体はまた、リアルタイム条件下でも安定しているように思われた（図８５を参照）。
【０６１２】
各加速安定性試料およびリアルタイム安定性試料のＰＤＩおよびＺ−ａｖｅ直径は、ＵＮｃｌｅ分析機器を使用して決定し、結果を表２３に示す。
表２３．  ＵＮｃｌｅ分析機器を使用して決定された各加速安定性試料およびリアルタイム安定性試料のＰＤＩおよびＺ−ａｖｅ直径
【表２３】
2021522162.tif 000027
【０６１３】
次に、酸での抗体の安定性を評価した。Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）は、ＣＨ１親和性樹脂に結合させ、１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５を使用して溶出させることにより上記の精製手順に供した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーで中和する前に、二重特異性抗体を０、３０、６０、または１２０分間、酸中に放置した。次いで、ＳＥＣで解析する前に、タンパク質をＰＢＳにバッファー交換した。図８６に示すように、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）は、酸中で最大２時間安定していた。
６．１３．２６．６．
ＲＯＲ１／ＲＯＲ２×ＣＤ３  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）二重特異性抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の研究
【０６１４】
例示的なＲＯＲ１／ＲＯＲ２×ＣＤ３二重特異性Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性は、乳がんのＰＢＭＣヒト化ＮＳＧ（商標）マウスモデルで研究した。この研究は、上記の実施例２４で説明されているように実施した。
【０６１５】
結果を図８７（下パネル）および図８８に示す。示すように、Ｉ２−Ａ１０  Ｄ５４Ｅ  Ｙ５５Ｑ  １×２  Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）は、用量０．５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇで腫瘍成長を減少させるｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を実証した。
６．１４．配列
【化１】
2021522162.tif 000028
【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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他の配列：
【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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【化３２】
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【化３３】
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【化３４】
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【化３５】
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【化３６】
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【化３７】
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【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
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【化４１】
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【化４２】
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【化４３】
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【化４４】
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７．参照による組み込み
【０６１６】
本出願で引用された全ての公開文献、特許、特許出願および他の文献は、あたかも個別の公開文献、特許、特許出願または他の文献が、あらゆる目的のために参照により個別に示されて組み込まれているのと同程度に、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
８．均等物
【０６１７】
様々な特定の実施形態を例証および記載してきたが、上記明細書は限定的なものではない。様々な変更が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行われうることが理解される。多くの変形が、本明細書を検討すると、当業者には明らかになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
2021522162.tif 000082
【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2021522162.tif 000090
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2021522162.tif 000102
【図３１】
2021522162.tif 000103
【図３２】
2021522162.tif 000104
【図３３】
2021522162.tif 000105
【図３４】
2021522162.tif 000106
【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８−１】
2021522162.tif 000120
【図４８−２】
2021522162.tif 000121
【図４９】
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【図５０】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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【図５１−３】
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【図５１−４】
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【図５１−５】
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【図５２】
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【図５３−１】
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【図５３−２】
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【図５４−１】
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【図５４−２】
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【図５４−３】
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【図５５】
2021522162.tif 000135
【図５６】
2021522162.tif 000136
【図５７】
2021522162.tif 000137
【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
2021522162.tif 000140
【図６１】
2021522162.tif 000141
【図６２】
2021522162.tif 000142
【図６３】
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【図６４】
2021522162.tif 000144
【図６５−１】
2021522162.tif 000145
【図６５−２】
2021522162.tif 000146
【図６５−３】
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【図６６−１】
2021522162.tif 000148
【図６６−２】
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【図６７−１】
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【図６７−２】
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【図６８−１】
2021522162.tif 000152
【図６８−２】
2021522162.tif 000153
【図６９】
2021522162.tif 000154
【図７０−１】
2021522162.tif 000155
【図７０−２】
2021522162.tif 000156
【図７０−３】
2021522162.tif 000157
【図７１】
2021522162.tif 000158
【図７２】
2021522162.tif 000159
【図７３】
2021522162.tif 000160
【図７４】
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【図７５】
2021522162.tif 000162
【図７６−１】
2021522162.tif 000163
【図７６−２】
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【図７６−３】
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【図７７】
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【図７８−１】
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【図７８−２】
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【図７９−１】
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【図７９−２】
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【図８０−１】
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【図８０−２】
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【図８１】
2021522162.tif 000173
【図８２−１】
2021522162.tif 000174
【図８２−２】
2021522162.tif 000175
【図８２−３】
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【図８３】
2021522162.tif 000177
【図８４】
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【図８５】
2021522162.tif 000179
【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
2021522162.tif 000182
【配列表】
2021522162000001.app
【国際調査報告】
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2021522162.tif 000184
2021522162.tif 000185
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