(57)【要約】  糖タンパク質の三量体形態を安定化させるフィロウイルス糖タンパク質の突然変異が提供される。フィロウイルス糖タンパク質は、糖タンパク質配列中の特定の位置で一定のアミノ酸置換を有する。本明細書に記載のフィロウイルス糖タンパク質は、１つ以上の指定アミノ酸置換を有さないフィロウイルス糖タンパク質と比較して、三量体形成のパーセンテージを向上させ、及び／又は三量体の収量を向上させる。フィロウイルス糖タンパク質をコードする核酸分子及びベクター、並びにフィロウイルス糖タンパク質、核酸及びベクターを含む組成物も又提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５８８位で非荷電アミノ酸残基を含む組換えフィロウイルス糖タンパク質であって、前記位置のナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５におけるＧＰの前記ナンバリングに従っており、前記非荷電アミノ酸残基は、システインではない、組換えフィロウイルス糖タンパク質。
【請求項２】
前記非荷電アミノ酸残基は、Ｆ、Ｉ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｗ及びＹの群から選択される疎水性アミノ酸残基である、請求項１に記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質。
【請求項３】
前記疎水性アミノ酸残基は、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ及びＹの群から選択される、請求項２に記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質。
【請求項４】
前記疎水性アミノ酸残基は、Ｆである、請求項２に記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質。
【請求項５】
５７７位及び／又は５７９位でアミノ酸残基Ｐを更に含む請求項１〜４の何れか一項に記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質であって、前記位置の前記ナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５における前記ＧＰの前記ナンバリングに従っている、組換えフィロウイルス糖タンパク質。
【請求項６】
前記フィロウイルスは、メインガ、マコナ、キクウィト、スーダングル及びマールブルグの群から選択される株由来である、請求項１〜５の何れか一項に記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質。
【請求項７】
前記フィロウイルス糖タンパク質は：
１）  配列番号２の前記アミノ酸配列を含むザイールエボラウイルスメインガ糖タンパク質、又は配列番号６の前記アミノ酸配列を含み、前記アミノ酸残基３２０〜４７６が欠失しているザイールエボラウイルスメインガ糖タンパク質；及び
２）  配列番号１０のアミノ酸配列を含むザイールエボラウイルスマコナＧＰ糖タンパク質、又は配列番号１４のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基３１４〜４７２が欠失しているザイールエボラウイルマコナＧＰ糖タンパク質；及び
３）  配列番号１９のアミノ酸配列を含むザイールエボラウイルスキクウィト糖タンパク質、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基３１４〜４７２が欠失しているザイールエボラウイルスキクウィト糖タンパク質；及び
４）  配列番号２７のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基２５５〜４２３が欠失しているマールブルグ糖タンパク質から成る群から選択され、
前記位置の前記ナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５におけるＧＰのナンバリングに従っている、請求項１〜６の何れか一項に記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか一項に記載の前記組換えフィロウイルス糖タンパク質のうち３つの非共有結合オリゴマーを含む三量体複合体。
【請求項９】
請求項１〜７の何れか一項に記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質又は請求項８に記載の三量体複合体をその表面に提示する粒子、好ましくはナノ粒子。
【請求項１０】
請求項１〜７の何れか一項に記載の前記組換えフィロウイルス糖タンパク質をコードする単離核酸分子。
【請求項１１】
プロモーターに作動可能に連結された請求項１０に記載の前記単離核酸分子を含むベクター。
【請求項１２】
前記ベクターは、アデノウイルスベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１０に記載の前記単離核酸分子又は請求項１１若しくは１２に記載の前記ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
組換えフィロウイルス糖タンパク質を産生する方法であって、前記組換えフィロウイルス糖タンパク質の産生に好適な条件下で請求項１３に記載の前記宿主細胞を増殖させる工程を含む方法。
【請求項１５】
請求項１〜７の何れか一項に記載の前記組換えフィロウイルス糖タンパク質、請求項８に記載の前記三量体複合体、請求項９に記載の前記粒子、請求項１０に記載の前記単離核酸分子、又は請求項１１若しくは１２に記載の前記ベクター及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１６】
フィロウイルス糖タンパク質の前記三量体形成を向上させる方法であって、前記糖タンパク質の５８８位の前記アミノ酸残基を非荷電アミノ酸残基と置換させる工程を含み、前記位置の前記ナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５におけるＧＰのナンバリングに従っており、及び前記非荷電アミノ酸残基は、システインではない方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記糖タンパク質の５７７位及び／又は５７９位の前記アミノ酸残基をＰ残基と置換させる工程を更に含み、前記位置の前記ナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５におけるＧＰのナンバリングに従っている方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ザイールエボラウイルス（ＥＢＯＶ）及びスーダンエボラウイルス（ＳＵＤＶ）並びに密接な関係にあるマールブルクウイルス（ＭＡＲＶ）等のエボラウイルスは、北米、欧州及びアフリカにおけるヒト及び霊長類での高度に致死的なエボラ出血熱（ＥＨＦ）の大流行と関連している。これらのウイルスはフィロウイルスであり、ヒト及び非ヒト霊長類に感染し、死を含む重篤な健康被害をもたらすことが知られている。フィロウイルス感染は、ヒトにおいて最大で９０％の症例致死率を生じさせてきた。ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ及びＭＡＲＶ感染症は、ＥＨＦを引き起こし、感染後７〜１０日以内に死に至ることが多い。ＥＨＦは、急激な発熱、嘔気、嘔吐、下痢、斑状丘疹状皮疹、倦怠感、衰弱、血管透過性が増加する全身性の徴候、凝血異常及び自然免疫応答の調節不全によって明らかとなる急性発熱性症候群として現れる。疾患の多くが、感染に対する自然免疫応答の調節不全及び血管内皮細胞におけるウイルス複製に起因して現れ、当該ウイルス複製は、宿主細胞の死及び内皮バリアーの破壊を誘導する。フィロウイルスは、微小粒子エアロゾルによってか、又はヒト若しくはＮＨＰを起源とする感染血液、感染臓器及び感染体液との直接接触によって拡散され得る。ヒトにおいてエボラ出血熱（ＥＨＦ）を引き起こすには、単一ウイルス粒子の感染で十分であることが報告されている。現在、ＥＨＦの治療又は予防を対象として承認された治療又はワクチンは存在しない。対症療法が、依然として、フィロウイルスに感染した個人を対象とする唯一の承認された医学的介入である。
【０００２】
重篤なヒト疾患を引き起こすとものとして、フィロウイルスは、自然感染源及び同時にバイオテロリズムの潜在的病原体の両方として懸念される状況が続いている。野生におけるフィロウイルスの保有宿主（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を最終的に同定するには未だ至っていない。エボラウイルスの４つの亜型、即ち、ザイール（Ｚａｉｒｅ）、スーダン（Ｓｕｄａｎ）、ブンディブギョ（Ｂｕｎｄｉｂｕｇｙｏ）及びコートジボワール（Ｉｖｏｒｙ  Ｃｏａｓｔ）での発症におけるものがＥＨＦを誘発すると報告されている（Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９６  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９３：３６０２−３６０７）。エボラウイルスのこれらの亜型は、類似する遺伝子構成を有しており、例えば、マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、直鎖状に配列された７個の遺伝子を含んでいる。構造遺伝子産物としては、例えば、２つの代替形態で存在するエンベロープ糖タンパク質である分泌可溶性糖タンパク質（ｓｓＧＰ）及びＲＮＡ編集によって生成される、ウイルスの侵入を媒介する膜貫通糖タンパク質（ＧＰ）が挙げられる（Ｓａｎｃｈｅｚ，ｅｔ  ａｌ．１９９６  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９３：３６０２−３６０７）。
【０００３】
免疫化は、エボラ感染からの保護に有用であり得ることが示唆されており、これは、他のＲＮＡウイルスと比較しても、エボラ亜型の中ではヌクレオチド多型が余り存在しないように思われるためである（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９３：３６０２−３６０７）。最近まで、フィロウイルスに対する予防的ワクチンの開発は、一部にはフィロウイルス感染に対する保護的免疫応答に対する要件が明確には理解されていないために、定まらない結果を有してきた。更に、天然保有宿主内では極めて多数のフィロウイルスが循環していることが、全種のフィロウイルスから保護するワクチンを設計するための努力を複雑なものとしている。
【０００４】
ワクチン候補は、複製能を有するベクター（例えば、水疱性口内炎（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ）ウイルス；狂犬病（Ｒａｂｉｅｓ）ウイルス；パラインフルエンザ（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ウイルス）；複製能を有さないベクター（アデノウイルス、改変ワクシニアアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）ウイルス）；細菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞中で発現するウイルス様粒子を含むサブユニットタンパク質；ＤＮＡワクチン；及び／又は生菌及び死菌弱毒化フィロウイルスを含む様々なプラットフォームテクノロジーに基づいて開発中である（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１２  Ｓｅｐ；４（９）：１６１９−５０）。ＥＢＯＶ糖タンパク質ＧＰは、同一種のＥＢＯＶによる曝露に対して保護するワクチンの必須成分である。更に、ＥＢＯＶ及びＳＵＤＶ由来のＧＰを包含する、エボラウイルスの２つの最も毒性の強い種は、ＥＢＯＶ及びＳＵＤＶ筋肉内曝露から、並びに遠縁のブンディブギョ（ＢＤＢＶ）、タイフォレストエボラウイルス（ＴＡＦＶ；以前は象牙海岸（Ｉｖｏｒｙ  Ｃｏａｓｔ若しくはＣｏｔｅ  ｄ’Ｉｖｏｉｒｅ）として公知であった）種による曝露からサルを保護することができる。同様に、ＭＡＲＶ由来のＧＰの包含は、ＭＡＲＶ筋肉内曝露及びエアロゾル曝露からサルを保護することができる。これらのウイルスに対する医学的対抗手段の開発は、特に全ての病原性フィロウイルスから保護する１つのワクチンであるＰＡＮ−フィロウイルスワクチンの開発は、特に優先度が高い。
【０００５】
エボラ糖タンパク質（ＧＰ）遺伝子は、前分泌糖タンパク質（ｐｒｅ−ｓＧＰ）、小非構造分泌糖タンパク質ｓｓＧＰ及び表面発現ＧＰをコードする。ＧＰ遺伝子の一次産物であるｓｓＧＰが分泌されるが、表面発現ＧＰとは対照的に、ウイルス中和抗ＧＰ  ｍＡｂによっては認識されない。表面発現ＧＰは、天然ジスルフィドと共に結合されているＧＰ１及びＧＰ２から成る。ＧＰ１は、グリカンキャップ及びムチン様ドメインが続くコアから成る。ＧＰ２は、膜貫通領域を含有する。図１は、ムチン様ドメイン（灰色）を含むＧＰ１頭部ドメイン（黒色）及びリフォールディング領域１（ＲＲ１）を含むＧＰ２ドメインを示している表面発現フィロウイルスＧＰ、ベースヘリックス（ＲＲ１とＲＲ２の間）、リフォールディング領域２（ＲＲ２）及び膜貫通ドメイン（ＴＭ）の構造の略図を示している。
【０００６】
他のウイルス融合タンパク質と同様に、エボラＧＰは、準安定な融合前コンフォメーションから安定した融合後コンフォメーションへの不可逆的なタンパク質リフォールディングによって膜融合を駆動する動的な融合機構である。準安定前融合コンフォメーションは、３つのＧＰ１及び３つのＧＰ２から成る三量体である。
【０００７】
多数の結晶構造及びＥＭ構造は、昆虫細胞（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１６  Ｊａｎ  １４；１６４（１−２）：２５８−２６８，Ｂｏｒｎｈｏｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．ＭＢｉｏ．２０１６  Ｆｅｂ  ２３；７（１）：ｅ０２１５４−１５，Ｐａｌｌｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１６  Ａｕｇ  ８；１（９）：１６１２８）及びＨＥＫ２９３細胞（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２００８  Ｊｕｌ  １０；４５４（７２０１）：１７７−８２）中で発現したエボラＧＰについて決定されているが、ＨＥＫ２９３細胞中で生成されたもののうちの２つは、フィイブリチン又はＧＣＮ４三量体化モチーフの何れかを含有する。三量体構造の１つだけは異種三量体化ドメインに融合しなかった（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２００８  Ｊｕｌ  １０；４５４（７２０１）：１７７−８２）。本試験における焦点は、異種三量体化ドメインを含まない、哺乳動物細胞中で発現した高品質の可溶性エボラ融合前ＧＰ三量体を得ることであった。細胞外ドメインをベースとする可溶性ＧＰは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現すると大部分の二量体及び単量体を形成する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２００８  Ｊｕｌ  １０；４５４（７２０１）：１７７−８２  補遺、図８）。
【０００８】
ワクチン開発のためには、ｂＮＡｂを誘導することができる糖タンパク質を使用することが好ましい。しかしながら、大部分のｂＮＡｂは単に、それが任意のコンフォメーション変化を起こす前の天然のＧＰのコンフォメーションを認識するに過ぎない。従って、非天然且つ従って非中和性のエピトープの提示を最小限に抑えながら、天然様のコンパクト且つ基底状態のコンフォメーションにある安定性のＧＰを開発することが、ｂＮＡｂの生成効率を向上させることができよう。安定性の糖タンパク質を生成するための以前の努力は、例えば、フィロウイルス糖タンパク質の突然変異の特定の安定化が記載されている、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７０６５４号パンフレットに開示されている。
【０００９】
しかしながら、三量体形成のパーセンテージ及び三量体の収量を向上させてきた、向上した安定性を備えるフィロウイルス糖タンパク質三量体に対する必要が依然としてある。好ましくは、フィロウイルス糖タンパク質のこのような安定化された三量体は又、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）との良好な結合及び非広域中和Ａｂ（非ｂＮＡｂ）との相対的に限定的な結合を示すであろう。本発明の目的は、三量体のパーセンテージが向上し、且つ好ましくは三量体の収量も向上したフィロウイルスＧＰを提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、過去に説明されたフィロウイルスＧＰ三量体と比較して、三量体形成のパーセンテージを向上させ、及び／又は三量体の収量を向上させてきた組換えフィロウイルス糖タンパク質に関する。糖タンパク質のフォールディングは、ＧＰ三量体が天然タンパク質の構造により近付き、且つ融合プロセスのために重要な融合前の基底状態のコンフォメーションの領域が本明細書に記載の突然変異によって安定化されるように、最適化される。これは、フィロウイルスＧＰ三量体のフォールディング及び安定性を最適化する普遍的なアプローチを提供する。結果として得られる、天然タンパク質構造に似ている安定且つ良好にフォールディングされたＧＰ三量体は、例えば、組換えフィロウイルスＧＰ三量体が投与されると、広域中和抗体を誘導し、且つ非中和抗体及び弱い中和抗体の誘導を低減する確率を向上させるために、免疫の目的にとって有用である。本発明は又、組換えフィロウイルス糖タンパク質をコードする単離核酸分子及びベクター、同一物を含む細胞並びに組換えフィロウイルス糖タンパク質、核酸分子、ベクター及び／又は細胞の組成物に関する。
【００１１】
一般的な一態様では、本発明は、三量体の形成を安定化させるＧＰ配列において同定された位置における特定のアミノ酸残基を有する、組換えフィロウイルスタンパク質に関する。
【００１２】
特定の実施形態では、本発明の組換えフィロウイルス糖タンパク質は、５８８位で非荷電アミノ酸残基を含むが、ここで位置のナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５におけるＧＰのナンバリングに従っており、非荷電アミノ酸残基は、システインではない。
【００１３】
特定の好ましい実施形態では、５８８位の指示された非荷電アミノ酸残基は、Ｆ、Ｉ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｗ及びＹの群から選択される疎水性アミノ酸残基である。
【００１４】
特定の好ましい実施形態では、５８８位の指示された非荷電アミノ酸残基は、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ及びＹの群から選択される疎水性アミノ酸残基である。
【００１５】
特に好ましい実施形態では、指示された５８８位の疎水性アミノ酸残基は、Ｆである。
【００１６】
特定の好ましい実施形態では、本発明の組換えフィロウイルス糖タンパク質は、５７７位及び／又は５７９位でアミノ酸残基Ｐを含むが、ここで位置のナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５におけるＧＰのナンバリングに従っている。
【００１７】
特定の好ましい実施形態では、本発明の組換えフィロウイルスＧＰは、メインガ（Ｍａｙｉｎｇａ）、マコナ（Ｍａｋｏｎａ）、キクウィト（ｋｉｋｗｉｔ）、スーダングル（Ｓｕｄａｎ  Ｇｕｌｕ）及びマールブルグ（Ｍａｒｂｕｒｇ）の群から選択された株である。
【００１８】
特定の実施形態では、本発明の組換えフィロウイルスＧＰは：
１）配列番号２のアミノ酸配列を含むザイールエボラウイルスメインガ糖タンパク質又は配列番号６のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基３２０〜４７６が欠失しているザイールエボラウイルスメインガ糖タンパク質；及び
２）配列番号１０のアミノ酸配列を含むザイールエボラウイルスマコナＧＰ又は配列番号１４のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基３１４〜４７２が欠失しているザイールエボラウイルマコナＧＰ糖タンパク質；及び
３）配列番号１９のアミノ酸配列を含むザイールエボラウイルスキクウィト糖タンパク質又は配列番号２３のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基３１４〜４７２が欠失しているザイールエボラウイルスキクウィト糖タンパク質；及び
４）配列番号２７のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基２５５〜４２３が欠失しているマールブルグ糖タンパク質から成る群から選択され、
ここで、位置のナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５におけるＧＰのナンバリングに従っている。
【００１９】
別の一般的態様では、本発明は、本発明の組換えフィロウイルス糖タンパク質のうち３つの非共有結合性オリゴマーを含む三量体複合体に関する。
【００２０】
別の一般的態様では、本発明は、その表面に本発明の組換えフィロウイルスＧＰ又は三量体複合体を提示する粒子、好ましくはナノ粒子、例えば、自己組織化ナノ粒子に関する。
【００２１】
別の一般的態様では、本発明は、本発明の組換えフィロウイルスＧＰをコードする単離核酸分子及びプロモーターに作動可能に連結した単離核酸分子を含むベクターに関する。一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。別の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。好ましい一実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。
【００２２】
別の一般的態様は、本発明の組換えフィロウイルスＧＰをコードする単離核酸分子若しくはベクターを含む宿主細胞に関する。このような宿主細胞は、組換えタンパク質の産生、組換えタンパク質の発現又はウイルス粒子の生成のために使用することができる。
【００２３】
別の一般的態様は、組換えフィロウイルスＧＰの産生に好適な条件下で本発明の組換えフィロウイルスＧＰをコードする単離核酸分子若しくはベクターを含む宿主細胞を増殖させる工程を含む、組換えフィロウイルスＧＰを生成する方法に関する。
【００２４】
更に別の一般的態様は、本明細書に記載のような組換えフィロウイルスＧＰ、三量体複合体、単離核酸分子、ベクター又は宿主細胞及び薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。
【００２５】
本発明の更に別の一般的態様は、フィロウイルス糖タンパク質の三量体形成を向上させる方法であって、糖タンパク質の５８８位のアミノ酸残基を非荷電アミノ酸残基と置換させる工程を含み、ここで位置のナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５におけるＧＰのナンバリングに従っており、及びここで非荷電アミノ酸残基は、システインではない。
【００２６】
好ましい実施形態では、フィロウイルス糖タンパク質の三量体形成を向上させるための方法は、５７７位及び／又は５７９位のアミノ酸残基をＰ残基と置換させる工程を更に含むが、ここでこれらの位置のナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５におけるＧＰのナンバリングに従っている。
【００２７】
上述の概要及び下記の本発明の詳細な説明は、添付した図面と共に読めばより明確に理解されるであろう。本発明は、図面に示す明確な実施形態に限定されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】全長フィロウイルスＧＰの構造を示す略図である。
【図２】マコナΔムチン様ＧＰ−Ｔ５７７Ｐ−Ｔ４２Ａ（ＦＩＬ１６１６１５）主鎖及び突然変異体を備えるＢｌｕｅ  ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥを示す図である。全レーンは、どの高さで三量体がランするのかを示している精製三量体を含有する採集レーンを除いて、細胞上清を含有している。
【図３−１】図３：様々な置換を備えるＧＰを含有する細胞培養上清に関する分析的ＳＥＣを示す図である。三量体ピークは、「三量体」と表示した破線で示されている。試験した置換は、Ｔ５７７Ｐ、Ｋ５８８Ｆ及びＴ５７７Ｐ−Ｋ５８８Ｆの組み合わせである。分析的ＳＥＣを使用して測定したタンパク質発現レベルは、各主鎖のＦｉｌｏ  ＧＰ（黒色破線）について並びにＴ５７７Ｐ（灰色の破線）、Ｋ５８８Ｆ（黒色の実線）及びＴ５７７Ｐ＋Ｋ５８８Ｆ二重置換（灰色の実線）を備える転移体について開示された。置換は、次の主鎖：Ａ）マコナＧＰ、Ｂ）マコナΔムチン様ドメインＧＰ、Ｃ）キクウィトＧＰ、Ｄ）キクウィトΔムチン様ドメインＧＰ、Ｅ）メインガＧＰ、Ｆ）メインガΔムチン様ドメインＧＰにおいて試験した。細胞培養上清中のタンパク質発現レベルは、トランスフェクション７２時間後に試験した。
【図３−２】（上記の通り。）
【図４−１】図４：分析的ＳＥＣに基づく三量体含量を示す図である。図３における分析的ＳＥＣパターンにおいて測定した三量体ピーク高さに基づく三量体含量を示している。試験した突然変異は、Ｔ５７７Ｐ、Ｋ５８８Ｆ及びＴ５７７Ｐ−Ｋ５８８Ｆである。突然変異は下記の主鎖：Ａ）マコナＧＰ、Ｂ）マコナΔムチン様ドメインＧＰ、Ｃ）キクウィトＧＰ、Ｄ）キクウィトΔムチン様ドメインＧＰ、Ｅ）メインガＧＰ、Ｆ）メインガΔムチン様ドメインＧＰ内で試験した。
【図４−２】（上記の通り。）
【図５−１】図５：抗体１００を用いたバイオレイヤー干渉分光法を示す図である。図５Ａは、結合の勾配が決定される時点での点線を示している星印を伴うオクテットで測定されるようなバイオレイヤー干渉分光法曲線の１つの例（キクウィトＧＰ）を示している。図５Ｂ〜５Ｄは、ｎｍ／分での抗体１００の結合の勾配について示す棒グラフである。野生型ＧＰ及び変異体（Ｔ５７７Ｐ、Ｋ５８８Ｆ及びＴ５７７Ｐ−Ｋ５８８Ｆ）は、Ｍａｂ１００への結合について細胞培養上清中で試験した。突然変異を下記の主鎖：Ｂ）マコナＧＰ、Ｃ）マコナΔムチン様ドメインＧＰ、Ｄ）キクウィトＧＰ、Ｅ）キクウィトΔムチン様ドメインＧＰ、Ｆ）メインガＧＰ、Ｇ）メインガΔムチン様ドメインＧＰ内において試験した。
【図５−２】（上記の通り。）
【図５−３】（上記の通り。）
【図６−１】図６：Ａ、Ｃ）分析的ＳＥＣに基づく三量体含量、Ｂ、Ｄ）数個の疎水性残基と置換されたＫ５８８についてＭａｂ１００を用いてバイオレイヤー干渉分光法を使用して測定した関連勾配は、メインガＧＰ（Ａ及びＢ）中において試験し、全ての可能性のあるアミノ酸を用いたＫ５８８置換は、メインガΔムチン様ドメインＧＰ（Ｃ及びＤ）主鎖において試験した。
【図６−２】（上記の通り。）
【図６−３】（上記の通り。）
【図７】マールブルグΔムチン様ドメインＧＰを含有する細胞培養上清に関する分析的ＳＥＣを示す図である。三量体ピークは、「三量体」と表示した破線で示されている。マールブルグΔムチン様ＧＰ主鎖（黒色破線）並びにＨ５８８Ｆ（薄灰色の実線）及びＨ５８８Ｉ（濃灰色の実線）置換を備える変異体の分析的ＳＥＣを使用して測定した発現レベルを示した。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
背景技術の項で、又本明細書全体を通して、様々な刊行物、論文及び特許が引用又は記載されているが、これらの参考文献はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文献、行為、材料、装置、物品等の議論は、本発明の文脈を提供することを目的とする。そのような議論は、これらの内容の何れか又は全てが、開示されている、又は特許請求されているあらゆる発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。
【００３０】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する分野の当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。さもなければ、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書で規定されている意味を有する。本明細書に引用されている全ての特許、公開される特許出願及び公報は、参照により完全に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書で使用する場合、及び添付した特許請求の範囲においては、単数形「１つの」及び「その」は、別途文脈が明白に規定していない限り、複数の言及を含むことに留意しなければならない。
【００３１】
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲等の任意の数値は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。従って、数値は、通常、列挙された値の±１０％を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、全ての可能な部分的範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含み、文脈に明らかに別段の指示がない限り、そのような範囲内の整数及び値の分数を含む。
【００３２】
アミノ酸は本開示の全体に渡って参照される。２０個の天然アミノ酸及び多くの非天然アミノ酸がある。天然及び非天然アミノ酸の両方を含む既知のアミノ酸の各々は、フルネーム、１文字の省略コード及び３文字の省略コードを有し、その全てが当業者によく知られている。例えば、２０個の天然アミノ酸のために使用される３文字及び１文字省略コードは、次の通りである：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。アミノ酸は、それらのフルネーム、１文字の省略コード、又は３文字の省略コードによって参照され得る。別途文脈が明白に規定していない限り、本明細書で使用するフィロウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列における位置のナンバリングは、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＳａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９６  Ａｐｒ  １６；９３（８）：３６０２−７に記載されたようにメインガ単離菌とも呼ばれるが、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５における糖タンパク質におけるナンバリングに従っている。Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５に従っているナンバリングは、フィロウイルスＧＰの分野においては、慣例的である。Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５株のＧＰは、配列番号１に示したアミノ酸配列を有する。この配列を有する対象のフィロウイルスＧＰ配列のアラインメントを使用すると、対象の配列における対応するアミノ酸のナンバリングを見出すことができる。
【００３３】
フィロウイルスＧＰにおける「対応する位置」は、少なくとも２つのフィロウイルスＧＰ配列がアラインメントされたときのアミノ酸残基の位置を指す。特に指定がない限り、これらの目的のためのアミノ酸位置のナンバリングは、当該技術分野で慣例であるように、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５単離菌（配列番号１）のＧＰにおけるナンバリングに従う。
【００３４】
本明細書で使用する「安定化突然変異」若しくは「安定化置換」は、突然変異が前記親分子中の対応するアミノ酸の置換によって導入された場合の親分子と比較して、（例えば、本明細書に記載したＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ又は分析的ＳＥＣアッセイを使用して測定できる）フィロウイルスＧＰの三量体のパーセンテージ及び／又は三量体の収量を増加させる、本明細書に記載した突然変異である。このような安定化突然変異の結果として生じるアミノ酸は、典型的には、野生型フィロウイルス単離株の糖タンパク質中では、たとえあるにせよ、希にしか見出されない。
【００３５】
用語「天然」若しくは「野生型」は、本明細書ではフィロウイルス株（又はそれに由来する糖タンパク質）を指す場合には互換的に用いられ、例えば、フィロウイルス感染患者におけるように、天然で発生するフィロウイルス株（又はそれに由来する糖タンパク質）を指す。
【００３６】
本発明は一般に、糖タンパク質の三量体形態を安定化させるＧＰ配列における指定位置で、特定のアミノ酸置換を含む組換えフィロウイルスＧＰに関する。本発明の同定されたアミノ酸置換の１つ以上をフィロウイルス糖タンパク質の配列に導入すると、三量体形成のパーセンテージの増加及び／又は三量体の収量の増加をもたらすことができる。これは、例えば、三量体特異的抗体、サイズ排除クロマトグラフィーを使用する、又は融解温度を測定することによって決定され得る。正確にフォールディングされた（安定性三量体）又は不正確にフォールディングされた（非安定性若しくは非三量体）糖タンパク質に結合する抗体への結合親和性、増加した三量体パーセンテージ及び／又は三量体の収量は、安定性の、天然、且つ正確にフォールディングされた糖タンパク質を表すと見なされる。
【００３７】
フィロウイルス科（ｆａｍｉｌｙ  Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）は、糸状ウイルス粒子（ビリオン）を形成し、一本鎖マイナスセンスＲＮＡの形態にあるそれらのゲノムをコードする数個の関連ウイルス（フィロウイルス若しくはフィロビリド）の分類学的起源である。一般に公知であるこの科の２つのメンバーは、エボラウイルスとマールブルグウイルスである。マールブルグウイルスの最初の株は、輸入されたサルと共にドイツのマールブルグに輸入された１９６７年に発見され、致死的大流行を引き起こした。エボラウイルスの最初の株は、それが最初に出現した中央アフリカの北コンゴ盆地内のエボラ川からその名称が取られた、１９７６年に発見された。基準種としては、マールブルグ型のレイク・ビクトリア・マールブルグウイルス（Ｌａｋｅ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ  ｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓ）及びエボラ型のザイールエボラウイルス（Ｚａｉｒｅ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）が挙げられる。４つの他のエボラ種：レストン（Ｒｅｓｔｏｎ）エボラウイルス、スーダンエボラウイルス、タイフォレストエボラウイルス及びブンディブギョエボラウイルスが特性解析されてきた。ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）亜型は、３度の主要な大流行を引き起こした変異体が見出されており、中央アフリカ及び西アフリカの住民にとって最も致死的であることが証明されている。１９７６年に大流行したメインガ変異体は、致死例２１８例を含む３８０例（８８％の致死率（ＣＦＲ））の原因となり、１９９５年のキクウィト変異体は２５０例の死亡を伴う３１５症例を引き起こした（８１％のＣＦＲ）。２０１３〜２０１６年の西アフリカでのエボラウイルスの大流行では、２８，６１６例が確認され、１１，３１０例の死亡例が発生した。（ｈｔｔｐ：／／ａｐｐｓ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｉｒｉｓ／ｂｉｔｓｔｒｅａｍ／ｈａｎｄｌｅ／１０６６５／２０８８８３／ｅｂｏｌａｓｉｔｒｅｐ＿１０Ｊｕｎ２０１６＿ｅｎｇ．ｐｄｆ；ｊｓｅｓｓｉｏｎｉｄ＝Ｃ２Ｃ２Ｆ２２７０２５９１Ｅ５６８６８ＣＣＥ９０２ＥＤ５６２２Ｆ？ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝１）
【００３８】
一般的な一態様では、本発明は、組換えフィロウイルスＧＰに関する。用語「組換え」は、タンパク質に関して使用される場合、組換え技術又はインビトロでの化学合成によって生成されるタンパク質を指す。本発明の実施形態によれば、「組換え」タンパク質は、それが、対応する天然に存在する配列に見出されない少なくとも１つの配列要素（例えば、アミノ酸置換、欠失、付加、配列の置換等）を含有するという点において、人工的なアミノ酸配列を有する。好ましくは、「組換え」タンパク質は、１つ以上の天然に存在するフィロウイルス株に対して免疫応答を誘導するか、又は免疫を生じさせるように最適化された天然に存在しないフィロウイルス糖タンパク質である。
【００３９】
用語「フィロウイルス糖タンパク質」、「フィロウイルスＧＰ」及び「ＧＰ」は、フィロウイルスビリオンのエンベロープ上で自然に発現し、且つフィロウイルスがフィロウイルス感染細胞の原形質膜を標的化してそれに付着することを可能にする、糖タンパク質又はその断片若しくは誘導体を指す。
【００４０】
本発明の実施形態によれば、「フィロウイルスＧＰタンパク質」は、例えば、メインガ、マコナ若しくはキクウィト変異体由来の野生型ザイールエボラウイルス糖タンパク質の細胞外ドメイン（アミノ酸１〜６４７）であり得る。野生型ザイールエボラウイルス糖タンパク質の細胞外ドメインは、ＧＰの膜貫通領域を除去するために短縮されている糖タンパク質である。細胞外ドメインは、可溶性であり、このため操作及び安定性についての試験がより容易である。
【００４１】
本発明の実施形態によれば、「フィロウイルスＧＰタンパク質」は、更に、ムチン様ドメインが欠失している野生型ザイールエボラウイルス糖タンパク質の細胞外ドメイン（アミノ酸１〜６４７）であり得る。ムチン様ドメインは、各プロモーターの側面で垂れ下がる別個のドメインを形成する。このドメインは、重度にグリコシル化されており、それに対して向けられた多数の中和抗体が存在しない。ムチン様ドメインが欠失しているエボラＧＰは、ムチン様ドメインを含有するＧＰよりも容易に分析及び特性解析できる融合前三量体を形成する。メインガΔムチンＧＰについては、ＧＰのアミノ酸３２０〜４７６が欠失していた。マコナ及びキクウィトΔムチンＧＰについては、アミノ酸３１４〜４７２が欠失していた。
【００４２】
本発明の実施形態によると、「フィロウイルスＧＰタンパク質」は、Ｈｉｓ６タグ等のＣ末端タグを有するフィロウイルスＧＰタンパク質の細胞外ドメインであり得る。
【００４３】
本発明の実施形態によれば、「フィロウイルス糖タンパク質」は、三量体若しくは単量体であり得、好ましくは三量体である。三量体は、ホモ三量体（例えば、３つの同一のポリペプチド単位を含む三量体）又はヘテロ三量体（例えば、全てが同一とは限らない３つのポリペプチド単位を含む三量体）であり得る。好ましくは、三量体は、ホモ三量体である。
【００４４】
「フィロウイルス糖タンパク質」は、可溶性タンパク質又は膜結合タンパク質であり得る。膜結合エンベロープタンパク質は、典型的には、図１Ａに示したように、膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含む全長フィロウイルス糖タンパク質における等の膜貫通ドメインを含む。膜結合タンパク質は、細胞質ドメインを有し得るが、膜結合するためには細胞質ドメインを必要としない。可溶性エンベロープタンパク質は、膜貫通ドメインの少なくとも部分的又は完全な欠失を含む。例えば、図１に示したように、全長フィロウイルス糖タンパク質のＣ末端は、それにより可溶性タンパク質を生成できるように、膜貫通ドメインを欠失させて短縮することができる。しかしながら、フィロウイルス糖タンパク質は、より短い短縮及び代替の短縮位置を有してもなお可溶性であり得る。本発明による膜結合糖タンパク質は、天然糖タンパク質と比較して、完全若しくは部分的Ｃ末端ドメインを含み得る。
【００４５】
シグナルペプチドは、典型的には、発現する時にはフィロウイルスＧＰのＮ末端に存在するが、シグナルペプチダーゼによって切断されるので、そのため、成熟タンパク質中には存在しない。シグナルペプチドは、他のシグナル配列と交換することができ、シグナルペプチドの一部の非限定的な例は、本明細書では、配列番号４４（エボラＧＰのシグナルペプチド）、及び４５（マールブルグＧＰのシグナルペプチド）として提供されている。
【００４６】
本発明の実施形態によると、フィロウイルス糖タンパク質は、例えば、メインガ、マコナ、キクウィト、スーダングル、マールブルグ等又はそれらの組み合わせの任意のエボラ若しくはマールブルグ株由来のフィロウイルス糖タンパク質配列由来であり得る。フィロウイルス糖タンパク質配列は、天然に存在する配列、コンセンサス配列、合成配列又はそれらの任意の誘導体若しくは断片であり得る。本明細書で使用する「コンセンサス配列」は、例えば、相同タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントによって決定されるような、相同タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントに基づくアミノ酸の人工的な配列を意味する。「合成配列」は、２つ以上の天然に存在するフィロウイルス株に対して免疫応答を誘導するか又は免疫を生じさせるように最適化されている、天然に存在しないフィロウイルス糖タンパク質である。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態では、フィロウイルスＧＰは、５８８位で非荷電アミノ酸残基を含む、天然に存在する糖タンパク質、コンセンサス糖タンパク質又は合成糖タンパク質であるが、ここで位置のナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５（配列番号１）におけるＧＰのナンバリングに従っており、非荷電アミノ酸残基は、システインではない。特に好ましいのは、非荷電アミノ酸残基がＦ、Ｉ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｗ及びＹの群から選択される疎水性アミノ酸残基である糖タンパク質である。一層より好ましいのは、疎水性アミノ酸残基がＦ、Ｉ、Ｖ及びＷの群から選択される糖タンパク質である。最も好ましいのは、疎水性アミノ酸残基がＦである糖タンパク質である。
【００４８】
本発明の特定の実施形態では、天然に存在する配列、コンセンサス配列、合成配列等の何れであっても、フィロウイルス糖タンパク質は、更に５７７位及び／又は５７９位でアミノ酸残基Ｐを含み、ここで位置のナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５におけるＧＰのナンバリングに従っている。
【００４９】
１つ以上の指定位置での１つ以上の所望のアミノ酸（又は指定アミノ酸）置換が導入されるフィロウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列は、「主鎖フィロウイルスＧＰ配列」又は「親フィロウイルスＧＰ配列」と称される。例えば、配列番号６の「メインガＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン」における５８８位（即ち、３２０〜４７６アミノ酸が欠失するＧＰ細胞外ドメイン）配列がＦに突然変異している場合は、「メインガＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン」配列は、「主鎖」若しくは「親」配列であると見なされる。本発明の実施形態による新規な安定化突然変異内に、単独で、又はいわゆる５７７位若しくは５７９位の突然変異等の他の突然変異と組み合わせて導入することができる「主鎖」若しくは「親」配列として、任意のフィロウイルス糖タンパク質を使用することができる。
【００５０】
主鎖として使用できようフィロウイルスＧＰの非限定的な例としては、天然フィロウイルス単離体由来のフィロウイルスＧＰ、合成フィロウイルスＧＰ又はコンセンサスフィロウイルスＧＰが挙げられ、特定の非限定的な例では、配列番号２〜４２を含むものが挙げられる。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態では、主鎖フィロウイルス糖タンパク質は：
１）  配列番号２のアミノ酸配列を含むザイールエボラウイルスメインガ糖タンパク質、又は配列番号６のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基３２０〜４７６が欠失しているザイールエボラウイルスメインガ糖タンパク質；及び
２）  配列番号１０のアミノ酸配列を含むザイールエボラウイルスマコナＧＰ、又は配列番号１４のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基３１４〜４７２が欠失しているザイールエボラウイルマコナＧＰ糖タンパク質；及び
３）  配列番号１９のアミノ酸配列を含むザイールエボラウイルスキクウィト糖タンパク質、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基３１４〜４７２が欠失しているザイールエボラウイルスキクウィト糖タンパク質；及び
４）  配列番号２７のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基２５５〜４２３が欠失しているマールブルグ糖タンパク質から成る群から選択され、
ここで、位置のナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５におけるＧＰのナンバリングに従っている。
【００５２】
本発明の実施形態によれば、組換えフィロウイルスＧＰは、５８８位における指定アミノ酸残基を有していないフィロウイルスＧＰと比較して、（ａ）三量体形成のパーセンテージの向上、及び（ｂ）三量体の収量の向上のうちの少なくとも１つを有する。
【００５３】
本明細書で使用する「三量体形成のパーセンテージの向上」は、フィロウイルス糖タンパク質の主鎖配列が本発明のアミノ酸置換の１つ以上を含有する場合に、フィロウイルスＧＰ配列の主鎖配列がこのようなアミノ酸置換を含有しない場合に形成される三量体のパーセンテージと比較して、より多いパーセンテージの三量体が形成されることを意味する。本明細書で使用する場合、「三量体の収量の向上」は、フィロウイルス糖タンパク質の主鎖配列が本発明のアミノ酸置換の１つ以上を含有する場合に、フィロウイスＧＰ配列の主鎖配列がこのようなアミノ酸置換を含有しない場合に得られるエンベロープタンパク質の三量体形態の総量と比較して、より多くのエンベロープタンパク質の三量体形態の総量が得られることを意味する。
【００５４】
三量体形成は、フィロウイルスＧＰの三量体形態に特異的に結合する抗体を用いる抗体結合アッセイによって測定することができる。三量体形態を検出するのに使用することができる三量体特異的抗体の例としては、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）：Ｍａｂ１００が挙げられるが、これには限定されない。本開示の観点において当該技術分野で知られる任意の抗体結合アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、バイオレイヤー干渉分光法等を使用すると、本発明の組換えフィロウイルスＧＰの三量体形成のパーセンテージを測定することができる。
【００５５】
特定の実施形態では、三量体形成は、バイオレイヤー干渉分光法（ＢＬＩ）「抗体１００は、９６ハーフウエル黒色平底ポリピレンマイクロプレート（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  製品番号３６９４）内の１×動力学バッファー中で１０μｇ／ｍＬ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  製品番号１８−１０９２）の濃度にある抗ｈＩｇＧ（ＡＨＣ）センサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ製品番号１８−５０６０）内で固定化した。実験は、３０℃、振動速度１，０００  ｒｐｍでＯｃｔｅｔ  ＨＴＸ機器（Ｐａｌｌ−ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上で実施した。活性化は６０秒間、抗体の固定化は６００秒間、次に１５０秒間に渡る洗浄及びその後にＥｎｖの結合６００秒間、その後に解離６０秒間、全ての振とうは１，０００ｒｐｍでであった。データ解析は、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析８．１ソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて行った。結合勾配は、ｎｍ／分で１０秒間で決定した。」によって測定される
【００５６】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡは、ドナービーズの高エネルギー放射によって生成した一重項酸素分子が、ドナービーズに対しておよそ２００ｎｍ以内の距離にあるアクセプタービーズに移動させられる、ビーズをベースとする近接アッセイである。一重項酸素分子のアクセプタービーズへの移動は、その後検出され得る、化学発光シグナルをもたらす次々と生じる一連の化学反応を開始させる（Ｅｇｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，（２００８）２５（１），２−１０）。例えば、Ｆｌａｇ−Ｈｉｓタグで表示された組換えフィロウイルス糖タンパク質は、ＧＰに同時に結合できるニッケル若しくは抗体に共役結合させられる２種のビーズと共にインキュベートすることができる。三量体特異的アッセイのためには、ドナービーズを三量体特異的Ｍａｂ１００にコンジュゲートさせ、アクセプタービーズをＨｉｓ６タグ若しくは抗Ｈｉｓ抗体に結合するニッケルにコンジュゲートさせる。ＧＰの定量のためには、ドナービーズを抗Ｆｌａｇ抗体にコンジュゲートさせ、アクセプタービーズをニッケル若しくは抗Ｈｉｓ抗体にコンジュゲートさせる。形成された三量体の量は、三量体特異性ｍＡｂに結合する抗体にコンジュゲートしたドナービーズと抗Ｈｉｓ抗体にコンジュゲートしたアクセプタービーズの対から発生される化学発光シグナルを測定することによって決定することができる。発現したフィロウイルス糖タンパク質の総量は、ニッケルにコンジュゲートしたドナービーズと抗Ｆｌａｇにコンジュゲートしたアクセプタービーズの対から発生される化学発光シグナルを測定することによって決定することができる。例えば、三量体及び発現した総エンベロープタンパク質の量は、実施例３に詳述したようなＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定され得る。三量体形成のパーセンテージは、形成された三量体の量を発現したエンベロープタンパク質の総量で割ることによって計算され得る。
【００５７】
形成された三量体の量及び発現したエンベロープタンパク質の総量は又、三量体形態をフィロウイルス糖タンパク質の他の形態、例えば、単量体形態から分離することができるクロマトグラフィー技術を用いて決定され得る。使用できるこのような技術の例としては、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）が挙げられるが、これには限定されない。特定の実施形態によれば、三量体形成のパーセンテージは、分析的ＳＥＣを用いて決定される。特定の実施形態によれば、三量体の収量は、分析的ＳＥＣを用いて決定される。
【００５８】
核酸、ベクター、及び細胞
別の一般的態様では、本発明は、本発明による組換えフィロウイルスＧＰをコードする核酸分子及びその核酸分子を含むベクターを提供する。本発明の核酸分子は、クローニングにより得られるか、又は合成的に生成されるＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得る。ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はその組み合わせを含むことができる。核酸分子及びベクターは、組換えタンパク質の産生、宿主細胞におけるタンパク質の発現又はウイルス粒子の産生のために使用され得る。
【００５９】
本発明の実施形態によれば、組換えフィロウイルス糖タンパク質をコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結しており、これは、核酸がプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、相同プロモーター（即ち、ベクターと同一の遺伝子源に由来する）又は異種プロモーター（即ち、異なるベクター若しくは遺伝子源に由来する）であり得る。好適なプロモーターの例としては、ヒトサイトメガロウイルス最初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ、又は簡潔に「ＣＭＶ」）プロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターが挙げられる。好ましくは、プロモーターは、発現カセット内部の核酸の上流に位置する。
【００６０】
本発明の実施形態によれば、ベクターは、発現ベクターであり得る。発現ベクターとしては、組換えタンパク質発現用ベクター及びウイルスベクター等の、対象の組織における発現のために対象に核酸を送達するためのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。本発明と共に使用するのに好適なウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、腸内ウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、タバコモザイクウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは又、非ウイルスベクターであり得る。非ウイルスベクターの例としては、プラスミド、細菌性人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
本発明の特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、例えば、組換えアデノウイルスベクターである。組換えアデノウイルスベクターは、例えば、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ、若しくはＡｄＨｕ）又はチンパンジー若しくはゴリラアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ若しくはＳＡｄＶ）又はアカゲザルアデノウイルス（ｒｈＡｄ）等のサルアデノウイルスに由来し得る。好ましくは、アデノウイルスベクターは、組換えヒトアデノウイルスベクター、例えば、組換えヒトアデノウイルス血清型２６又は組換えヒトアデノウイルス血清型５、４、３５、７、４８等の何れか１つである。他の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ｒｈＡｄベクター、例えば、ｒｈＡｄ５１、ｒｈＡｄ５２又はｒｈＡｄ５３である。
【００６２】
組換えアデノウイルスベクターの調製法は、当該技術分野で周知である。例えば、組換えアデノウイルス２６ベクターの調製法は、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレット及びＡｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｖｉｒｏｌ．８１（９）：４６５４−６３に記載されている。例示的なアデノウイルス２６のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＦ１５３４７４及び国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットの配列番号１の中に見出される。ｒｈＡｄ５１、ｒｈＡｄ５２及びｒｈＡｄ５３に関する例示的なゲノム配列は、米国特許出願公開第２０１５／０２９１９３５号明細書に提供されている。
【００６３】
本発明の実施形態によれば、本明細書に記載の組換えフィロウイルスＧＰは、本明細書に記載のベクターの何れかによって発現され、且つ／又はコードされ得る。遺伝暗号の縮重の観点から、当該技術分野において完全に常用される方法に従って、同じタンパク質をコードする幾つかの核酸配列が設計され得ることを当業者は十分に認識している。本発明の組換えフィロウイルスＧＰをコードする核酸は、任意選択によりコドン最適化されて、宿主細胞（例えば、細菌細胞又は哺乳動物細胞）における適切な発現を保証することができる。コドン最適化は、当該技術分野において広く適用されている技術である。
【００６４】
本発明はまた、本明細書に記載の核酸分子及びベクターの何れかを含む細胞、好ましくは、単離細胞を提供する。細胞は、例えば、組換えタンパク質の産生又はウイルス粒子の産生のために使用され得る。
【００６５】
従って、本発明の実施形態は、組換えフィロウイルスＧＰを作製する方法にも関する。この方法は、プロモーターに作動可能に連結された本発明の実施形態による組換えフィロウイルスＧＰをコードする核酸を含む発現ベクターにより宿主細胞をトランスフェクトする工程、組換えフィロウイルスＧＰの発現に好適な条件下でトランスフェクトされた細胞を増殖させる工程、任意選択的に、細胞中で発現された組換えフィロウイルスＧＰを精製又は単離する工程を含む。組換えフィロウイルスＧＰは、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等を含む当該技術分野で知られる任意の方法によって、細胞から単離又は収集され得る。組換えタンパク質発現のために用いられる手法は、本開示の観点において当業者によく知られているであろう。発現した組換えフィロウイルスＧＰは又、例えば、組換えフィロウイルスＧＰをコードする発現ベクターによりトランスフェクトされ、且つフィロウイルスＧＰの発現に好適な条件下で増殖された細胞の上清を分析することによって、発現したタンパク質を精製又は単離することなく調査することができる。
【００６６】
好ましい実施形態では、発現した組換えフィロウイルスＧＰは、安定化した三量体複合体を形成するようにタンパク質の会合を可能にする条件下で精製される。例えば、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）に作動可能に連結された組換えフィロウイルスＧＰをコードする発現ベクターによりトランスフェクトされた哺乳動物細胞は、３３〜３９℃、例えば、３７℃及び２〜１２％ＣＯ２、例えば、８％ＣＯ２で培養され得る。発現はまた、昆虫細胞又は酵母細胞等の、当該技術分野では全て従来法である代替的な発現系において実施され得る。続いて、発現したフィロウイルスＧＰは、例えば、糖タンパク質に結合するレクチン親和性クロマトグラフィーによって、細胞培養液から単離され得る。カラムに結合したフィロウイルスＧＰは、マンノピラノシドを用いて溶出させることができる。カラムから溶出したフィロウイルスＧＰは、必要に応じてサイズ排除クロマトグラフィー等の更なる精製工程にかけられ、任意の残留している夾雑物、例えば、細胞夾雑物も又除去され得る。抗体親和性クロマトグラフィー、非ｂＮＡｂによるネガティブ選択、抗タグ精製又はイオン交換クロマトグラフィー等の他のクロマトグラフィー法、及び当該技術分野で知られる他の方法を含む代替の精製方法の非限定的な例も使用して、発現したフィロウイルスＧＰを単離することができる。
【００６７】
本発明の組換えフィロウイルスＧＰをコードする核酸分子及び発現ベクターは、本開示の観点における当該技術分野で既知の任意の方法によって作製され得る。例えば、組換えフィロウイルスＧＰをコードする核酸は、例えば、部位特異的変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の当業者によく知られている遺伝子操作技術及び分子生物学的手法を用いて、主鎖フィロウイルスＧＰ配列内に指定位置でアミノ酸置換の少なくとも１つを導入することによって作製することができる。核酸分子は、続いて、同様に標準的な分子生物学的手法を使用して発現ベクターに導入又は「クローン化」され得る。続いて、組換えフィロウイルス糖タンパク質は、宿主細胞中の発現ベクターから発現され得、発現されたタンパク質は、本開示の観点における当該技術分野で既知の任意の方法によって、細胞培養液から精製され得る。
【００６８】
三量体複合体
別の一般的態様では、本発明は、本発明による組換えフィロウイルスＧＰのうち３つの非共有結合性オリゴマーを含む三量体複合体に関する。三量体複合体は、本明細書に記載の組換えフィロウイルスＧＰの何れかを含み得る。好ましくは、三量体複合体は、本発明による組換えフィロウイルスＧＰの３つの同一の単量体を含む。三量体複合体は、単量体形態等のフィロウイルス糖タンパク質の他の形態から分離され得るか、又は三量体複合体は、単量体形態等のフィロウイルス糖タンパク質の他の形態と共に存在し得る。
【００６９】
組成物及び方法
別の一般的態様では、本発明は、組換えフィロウイルスＧＰ、三量体複合体、単離核酸、ベクター又は宿主細胞及び薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。組成物は、本明細書に記載の組換えフィロウイルスＧＰ、三量体複合体、単離核酸分子、ベクター又は宿主細胞の何れかを含むことができる。
【００７０】
担体としては、結合剤、崩壊剤、膨張剤、懸濁化剤、乳化剤、湿潤剤、潤滑剤、香味剤、甘味料、防腐剤、染料、可溶化剤及びコーティング等の１種以上の薬学的に許容される賦形剤を挙げることができる。担体又は他の材料の厳密な性質は、投与経路、例えば、筋肉内、皮内、皮下、経口、静脈内、皮膚、粘膜内（例えば、腸）、鼻腔内又は腹腔内経路に依存し得る。液体の注射用製剤の場合、例えば、懸濁液及び溶液の場合、好適な担体及び添加剤としては、水、グリコール、油、アルコール、防腐剤、着色剤等が挙げられる。固体の経口製剤、例えば、粉末、カプセル、カプレット、ジェルキャップ及び錠剤の場合、好適な担体及び添加剤としては、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等が挙げられる。鼻腔用スプレー／吸入用混合物の場合、水溶液／水性懸濁液は、好適な担体及び添加剤として、水、グリコール、油、皮膚軟化薬、安定剤、湿潤剤、防腐剤、芳香剤、香味料等を含むことができる。
【００７１】
本発明の組成物は、経口（腸内）投与及び非経口注射を含むがこれらに限定されない、投与を容易にし、且つ効能を高めることができるように、対象への投与に好適な任意の成分で製剤化することができる。非経口注射としては、静脈内注射又は点滴、皮下注射、皮内注射及び筋肉内注射が挙げられる。本発明の組成物をその他の投与経路用に製剤化することもでき、その他の投与経路としては、経粘膜、眼内、直腸、持続性皮下注入、舌下投与、舌下、門脈循環をバイパスする口腔粘膜から、吸入又は鼻腔内が挙げられる。
【００７２】
本発明の実施形態はまた、組成物を作製する方法に関する。本発明の実施形態によれば、組成物を作製する方法は、本発明の組換えフィロウイルスＧＰ、三量体複合体、単離核酸、ベクター又は宿主細胞を１種以上の薬学的に許容される担体と混合する工程を含む。当業者は、このような組成物を調製するのに使用される従来技術に精通しているであろう。
【００７３】
フィロウイルス抗原（例えば、フィロウイルス糖タンパク質遺伝子産物に由来するタンパク質又はその断片）並びにウイルスベクター等のフィロウイルス抗原を発現するベクターは、フィロウイルス感染症に対して対象にワクチン接種するための、又は対象においてフィロウイルス感染症に対する免疫応答を引き起こすための免疫原性組成物及びワクチンにおいて以前から使用されてきた。本明細書で使用する「対象」は、本発明の実施形態による免疫原性組成物が投与されることになるか、又は投与されたあらゆる動物を意味しており、好ましくは哺乳動物を意味しており、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用する用語「哺乳動物」は、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒト等、好ましくはヒトが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組換えフィロウイルスＧＰは又、フィロウイルスに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導するための抗原として使用することができる。免疫応答は、エボラザイール・メインガ、キクウィト及びマコナ又はマールブルグウイルス等の１種以上のフィロウイルス変異体に対してであり得る。組成物は、組換えフィロウイルスＧＰがそれから発現するベクターを含み得る、又は組成物は、本発明の一実施形態による単離組換えフィロウイルスＧＰを含み得る。
【００７４】
例えば、組換えフィロウイルスタンパク質若しくはその三量体複合体を含む組成物は、それを必要とする対象に投与されて、対象においてフィロウイルス感染症に対する免疫応答を誘導することができる。アデノウイルスベクター等の、本発明の組換えフィロウイルスＧＰをコードするベクターを含む組成物であって、組換えフィロウイルスＧＰがベクターによって発現される組成物は又、それを必要とする対象に投与されて、対象においてフィロウイルス感染症に対する免疫応答を誘導することができる。本明細書に記載される方法は、本発明の免疫原性組成物を、好ましくは１種以上のベクター、例えば、アデノウイルスベクター又はＭＶＡベクターから発現される１種以上の追加のフィロウイルスＧＰと組み合わせて投与することを含み、更に免疫応答をプライミングし、且つブーストする方法を含む。
【００７５】
特定の実施形態では、フィロウイルスＧＰは、任意選択的に内因性及び／又は外因性のアジュバントと組み合わせられた、リポソーム、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ナノ粒子、ビロソーム又はエクソソーム等の粒子上に提示され得る。可溶性又は単量体糖タンパク質それ自体と比較されると、このような粒子は、典型的にはインビボにおいて抗原提示の有効性の亢進を提示する。
【００７６】
フィロウイルスＧＰを提示するＶＬＰの例は、例えば、フィロウイルスＧＰを自己組織化ウイルスタンパク質と共発現させることによって調製することができる。ＶＬＰはウイルスに似ているが、それらはウイルス性の遺伝物質を含有していないので非感染性である。エンベロープ若しくはキャプシド等のウイルス構造タンパク質の発現は、ＶＬＰの自己組織化をもたらすことができる。ＶＬＰは当業者には周知であり、ワクチンにおけるそれらの使用は、例えば（Ｋｕｓｈｎｉｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１２  Ｄｅｃ  １７；３１（１）：５８−８３）に記載されている。
【００７７】
特定の好ましい実施形態では、粒子はリポソームである。リポソームは、少なくとも１つの脂質二重層を有する球状小胞である。例えば、フィロウイルスＧＰ三量体タンパク質は、静電相互作用によって、例えば、ＨｉｓタグをフィロウイルスＧＰ三量体のＣ末端及びリポソームにおける誘導体化された脂質の先端基に組み込まれるＮｉ２＋又はＣｏ２＋等の二価のキレート化原子に付加することによって、このようなリポソームに非共有結合され得る。特定の非限定的且つ例示的な実施形態では、リポソームは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］のニッケル塩若しくはコバルト塩（ＤＧＳ−ＮＴＡ（Ｎｉ２＋）又はＤＧＳ−ＮＴＡ（Ｃｏ２＋））を６０：３６：４のモル比で含む。好ましい実施形態では、フィロウイルスＧＰ三量体タンパク質は、リポソーム表面に、例えば、リポソーム表面に組み込まれたマレイミド官能基を介して、共有結合的に結合される。その特定の非限定的且つ例示的な実施形態では、リポソームは、ＤＳＰＣ、コレステロール及び１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−カルボキサミド］脂質を５４：３０：１６のモル比で含む。フィロウイルスＧＰは、例えば、フィロウイルスＧＰにおいて付加されたＣ末端システインを介して、それに結合され得る。共有結合された変異体は、より安定性であり、高い抗原特異的ＩｇＧ力価を誘発し、Ｅｎｖ三量体の抗原性に関連の低い「下端」にあるエピトープが隠されている。リポソームに結合されたフィロウイルスＧＰ三量体を調製するための方法並びにそれらの特性解析は知られており、例えば、本明細書に参照により組み込まれる（Ｂａｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０１７  Ｊｕｌ  ２７；９１（１６）．ｐｉｉ：ｅ００４４３−１７）に記載されている。本発明は又、リポソームと融合され、且つ／又はリポソーム上に提示される本発明のフィロウイルスＧＰを提供する。
【００７８】
特定の実施形態では、本発明のフィロウイルスＧＰは、自己組織化粒子に融合されるか、又はナノ粒子上に提示される。抗原ナノ粒子は、抗原、例えば、本発明のフィロウイルスＧＰの複数のコピーが存在するポリペプチドの集合体であり、複数の結合部位（アビディティ）をもたらし、抗原の安定性及び免疫原性の向上をもたらすことができる。ワクチンに使用するための自己組織化タンパク質ナノ粒子の調製法及び使用は、当業者には周知であり、例えば、（Ｚｈａｏ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｖａｃｃｉｎｅ  ３２：３２７−３３７）、（Ｌｏｐｅｚ−Ｓａｇａｓｅｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｍｐｕｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．２０１５  Ｎｏｖ  ２６；１４：５８−６８）を参照されたい。非限定的な例として、自己組織化ナノ粒子は、フェリチン、バクテリオフェリチン又はＤＰＳに基づき得る。それらの表面上にタンパク質を提示するＤＰＳナノ粒子は、例えば、国際公開第２０１１／０８２０８７号パンフレットに記載されている。他の自己組織化タンパク質ナノ粒子並びにその調製法は、例えば、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第２０１４／１２４３０１号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１６／０１２２３９２号明細書に開示されている。本発明は又、自己組織化ナノ粒子と融合され、且つ／又は自己組織化ナノ粒子上に提示される本発明のフィロウイルスＧＰを提供する。本発明は又、本発明によるＶＬＰ、リポソーム又は自己組織化ナノ粒子を含む組成物を提供する。
【００７９】
特定の実施形態では、アジュバントは、本発明の組成物中に含まれるか、又は本発明の組成物と同時投与される。アジュバントの使用は任意選択であり、アジュバントの使用により、組成物がワクチン接種の目的のために使用されるときに免疫応答が更に亢進され得る。本発明による組成物に従った組成物と同時投与するため、又はその中に包含されるのに好適なアジュバントは、好ましくは、ヒトにおいて潜在的に安全であり、十分に許容され且つ効果的なものであるべきである。このようなアジュバントは当業者には周知であり、非限定的な例としては、ＱＳ−２１、Ｄｅｔｏｘ−ＰＣ、ＭＰＬ−ＳＥ、ＭｏＧＭ−ＣＳＦ、ＴｉｔｅｒＭａｘ−Ｇ、ＣＲＬ−１００５、ＧＥＲＢＵ、ＴＥＲａｍｉｄｅ、ＰＳＣ９７Ｂ、Ａｄｊｕｍｅｒ、ＰＧ−０２６、ＧＳＫ−Ｉ、ＧｃＭＡＦ、Ｂ−ａｌｅｔｈｉｎｅ、ＭＰＣ−０２６、Ａｄｊｕｖａｘ、ＣｐＧ  ＯＤＮ、Ｂｅｔａｆｅｃｔｉｎ、リン酸アルミニウム（例えば、ＡｄｊｕＰｈｏｓ）又は水酸化アルミニウム等のアルミニウム塩及びＭＦ５９が挙げられる。
【００８０】
本発明の他の態様は、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２３及び配列番号２７の群から選択されたアミノ酸配列を含む組換えフィロウイルス糖タンパク質に関する。これらのフィロウイルスＧＰは、特定の実施形態では主鎖タンパク質として使用することができるが、この場合、上記の突然変異は本発明の分子を得るために作製することができる。これらの配列をコードする単離核酸分子、プロモーターに作動可能に連結されたこれらの配列を含むベクター及びタンパク質、単離核酸分子又はベクターを含む組成物も又、本発明によって企図されている。
【００８１】
実施形態
実施形態１は、５８８位で非荷電アミノ酸残基を含む組換えフィロウイルス糖タンパク質であり、ここで位置のナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５におけるＧＰのナンバリングに従っており、非荷電アミノ酸残基は、システインではない組換えフィロウイルス糖タンパク質である。
【００８２】
実施形態２は、非荷電アミノ酸残基が、Ｆ、Ｉ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｗ及びＹの群から選択される疎水性アミノ酸残基である、実施形態１に記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質である。
【００８３】
実施形態３は、疎水性アミノ酸残基が、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ及びＹの群から選択される、実施形態２に記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質である。
【００８４】
実施形態４は、疎水性アミノ酸残基が、Ｆである、実施形態３に記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質である。
【００８５】
実施形態５は、５７７位及び／又は５７９位でアミノ酸残基Ｐを更に含む実施形態１〜４の何れか１つに記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質であり、ここで位置のナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５におけるＧＰのナンバリングに従っている組換えフィロウイルス糖タンパク質である。
【００８６】
実施形態６は、フィロウイルスが、メインガ、マコナ、キクウィト、スーダングル及びマールブルグの群から選択される株由来である、実施形態１〜５の何れか１つに記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質である。
【００８７】
実施形態７は、フィロウイルス糖タンパク質が：
１）  配列番号２のアミノ酸配列を含むザイールエボラウイルスメインガ糖タンパク質、又は配列番号６のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基３２０〜４７６が欠失しているザイールエボラウイルスメインガ糖タンパク質；及び
２）  配列番号１０のアミノ酸配列を含むザイールエボラウイルスマコナＧＰ、又は配列番号１４のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基３１４〜４７２が欠失しているザイールエボラウイルマコナＧＰ糖タンパク質；及び
３）  配列番号１９のアミノ酸配列を含むザイールエボラウイルスキクウィト糖タンパク質、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基３１４〜４７２が欠失しているザイールエボラウイルスキクウィト糖タンパク質；及び
４）  配列番号２７のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基２５５〜４２３含量マールブルグ糖タンパク質から成る群から選択され、
ここで、位置のナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５におけるＧＰのナンバリングに従っている、実施形態１〜６の何れか１つに記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質である。
【００８８】
実施形態８は、配列番号２〜４２の群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１〜７の何れか１つに記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質である。
【００８９】
実施形態９は、実施形態１〜７の何れか１つに記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質のうち３つの非共有結合のオリゴマーを含む三量体複合体である。
【００９０】
実施形態１０は、実施形態１〜７の何れか１つに記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質、又は実施形態８に記載の三量体複合体の表面上で提示する粒子、好ましくはナノ粒子である。
【００９１】
実施形態１１は、実施形態１〜７の何れかに１つに記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質をコードする単離核酸分子である。
【００９２】
実施形態１２は、プロモーターに作動可能に連結された実施形態１１に記載の単離核酸分子を含むベクターである。
【００９３】
実施形態１３は、ベクターがアデノウイルスベクターである、実施形態１２に記載のベクターである。
【００９４】
実施形態１４は、実施形態１１に記載の単離核酸分子、又は実施形態１２若しくは１３に記載のベクターを含む宿主細胞である。
【００９５】
実施形態１５は、組換えフィロウイルス糖タンパク質の産生に好適な条件下で実施形態１４に記載の宿主細胞を増殖させる工程を含む、組換えフィロウイルス糖タンパク質を産生する方法である。
【００９６】
実施形態１６は、実施形態１〜８の何れか１つに記載の組換えフィロウイルス糖タンパク質、請求項９に記載の三量体複合体、請求項１０に記載の粒子、請求項１１に記載の単離核酸分子又は請求項１２若しくは１３に記載のベクター及び薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【００９７】
実施形態１７は、フィロウイルス糖タンパク質の三量体形成を向上させる方法であって、糖タンパク質の５８８位のアミノ酸残基を非荷電アミノ酸残基と置換させる工程を含み、ここで位置のナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５におけるＧＰのナンバリングに従っており、及びここで非荷電アミノ酸残基は、システインではない方法である。
【００９８】
実施形態１８は、実施形態１７に記載の方法であって、５７７位及び／又は５７９位のアミノ酸残基をＰ残基と置換させる工程を更に含み、ここでこれらの位置のナンバリングは、Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５におけるＧＰのナンバリングに従っている方法である。
【実施例】
【００９９】
実施例１：組換えエボラ及びマールブルグ糖タンパク質（ＧＰ）の発現及び精製
組換えエボラ及びマールブルグＧＰの細胞外ドメイン（即ち、アミノ酸残基１〜６４７）は、ムチン様ドメイン含む、又は含まない可溶性タンパク質として発現させ、精製した。その後、単一突然変異（アミノ酸置換）及びそれらの組み合わせ（例えば、二重及び三重突然変異）を下記の：メインガＧＰ（配列番号２）、キクウィトＧＰ（配列番号１９）、２０１４年の大流行株のコンセンサス配列と同一である、別名がマコナであるＥＢＯＶ１４  ＧＰ（配列番号１０）、ＭＡＲＶ  ＧＰ（マールブルグ）（配列番号４１）、メインガΔムチンＧＰ（配列番号６）、キクウィトΔムチンＧＰ（配列番号２３）、ＥＢＯＶ１４ΔムチンＧＰ（配列番号１４）及びＭＡＲＶΔムチンＧＰ（配列番号２７）の様々な主鎖配列内に導入した。
【０１００】
エボラ及びマールブルグ糖タンパク質構築物及び変異体の生成及び発現
配列番号２〜４２に示した糖タンパク質（ＧＰ）をコードするＤＮＡをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ  ０８８５４）で合成し、ヒト細胞内で発現させるためにコドン最適化した。コドン最適化した配列を次にベクターｐｃＤＮＡ２００４内にクローン化してＧＰ構築物を生成し、これを更なる突然変異を導入するための主鎖配列として使用した。遺伝子は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）中で製造業者の仕様書に従って発現させた。グルコースレベルは、ＶｉＣｅｌｌ  ＭｅｔａＦｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）を使用して監視した。グルコースは、トランスフェクション後の第４日に枯渇したので、このためグルコースを１５ｍＭの濃度で添加した。トランスフェクションは、遠心分離及び無菌濾過によって、トランスフェクション後の第６日に収穫した。
【０１０１】
エボラ及びマールブルグＧＰタンパク質の精製
干渉宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）は、３００ｃｍ／時の流速及び５ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８のランニングバッファーを使用してＸＫ１６／２０カラム（ＧＥＨＣ）内で１３ｍＬのＣＨＴ  １型樹脂（Ｂｉｏｒａｄ）上に上清を適用することによって捕捉した（ｓｃａｖｅｎｇｅｄ）。結合したタンパク質は、５００ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．４を使用して溶出させた。ＨＣＰが枯渇した素通り画分は、引き続いて流速３００ｃｍ／時及び２０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４を含むランニングバッファーを使用してＨｉｓタグ付きタンパク質について選択的な親和性クロマトグラフィーカラムであるＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ  ５ｍＬ上に適用した。結合したタンパク質は、カラムを上向流及び１５、３０及び６００ｃｍ／時の流速でランさせながら、１００％の溶出バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）の段階的勾配を使用して溶出させた。１００ｍＭのイミダゾールを凝集体と一緒に適用すると、三量体画分が溶出した。この画分は、５０ＫのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、６０ｃｍ／時の流速を使用してＳｕｐｅｒｄｅｘ  １６／６００サイズ排除カラム（ＧＥＨＣ）に適用した。三量体画分は、引き続いて凝集体及び単量体から分離した。三量体ピークを含有する画分をプールし、そのピークの正体は、ウェスタンブロット及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ、並びに／又は分析的ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析を使用してＧＰタンパク質だと確認された。精製されたエボラ若しくはマールブルグＧＰの濃度は、２８０ｎｍでの光学密度を測定することによって決定し、精製されたタンパク質はその後の使用まで４℃で保存した。
【０１０２】
実施例２：可溶性エボラＧＰ三量体の向上した発現及び安定性
エボラＧＰの三量体形成に様々な突然変異が及ぼす作用について研究するための主鎖配列として、数個のエボラ糖タンパク質（ＧＰ）配列を選択した。野生型ザイールエボラウイルス糖タンパク質（メインガ、マコナ及びキクウィト）の細胞外ドメイン（Ｈｉｓ６タグを備えて伸張した、アミノ酸１〜６４７）をｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞中で発現させた。３種のＧＰ各々について、ムチン様ドメインが欠如している変異体も又作製した。ムチン様ドメインは、各プロモーター上で別個の周辺ドメインを形成する。このドメインは、より可変性であり、重度にグリコシル化されており、それに対して向けられた多数の中和抗体が存在しない。ムチン様ドメインが欠失しているエボラＧＰは、異種ムチン様ドメインを含有するＧＰよりも容易に分析及び特性解析できる融合前三量体を形成する。メインガタンパク質については：アミノ酸３２０〜４７６が欠失している。マコナ及びキクウィトについては：アミノ酸３１４〜４７２が欠失している。Δムチン様ＧＰは、結晶化しており、潜在的ワクチン候補であると見なされている。粗上清に関するＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＭＡＬＳは、生成される主要な種は単量体であるが、他方三量体であるのは小さな画分だけであることを明らかにした。三量体形成のパーセンテージが増加した、及び絶対的な高い三量体の収量を有する可溶性エボラタンパク質は、所望されない非天然のコンフォメーションにある調製物中に存在するエンベロープタンパク質の精製及び除去が余り必要とされないために製造の観点から有利である。更に、それらはより優れたベクター挿入物であろう。
【０１０３】
主鎖配列と比較して三量体形成のパーセンテージを向上させた、及び／又は三量体の収量を向上させたそれらの突然変異を同定するために、組換えＧＰタンパク質変異体を三量体形成について試験した。最初に、三量体のパーセンテージ及び三量体の収量のセミハイスループットスクリーニングは、ゲル上に細胞上清を装填してＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ分析を実施した。ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥの結果は、細胞上清を使用する分析的サイズ排除（ＳＥＣ）によって確証した。
【０１０４】
ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ分析
ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥは、４〜１６％のＮａｔｉｖｅＰａｇｅ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して製造業者のプロトコルに従って実施した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ムチン様ドメインを備えるＧＰ三量体は、約８００ｋＤａの質量でランするが、他方ムチン様ドメインを含まないＧＰは、約４２０ｋＤａの質量でランする。最初は、マコナΔムチンＧＰ−Ｔ５７７Ｐ−Ｔ４２Ａ（ＦＩＬ１６１６１５）（配列番号１６）を主鎖として使用した。Ｔ５７７Ｐは、以前に三量体の収量を増加させることが証明されており（国際公開第２０１７／０３７１９６号パンフレット）、Ｔ４２Ａは、タンパク質の結晶化を許容するためのＰＮＧＳ部位をノックアウトするために導入された（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１６  Ｊｕｌ  ７；５３５（７６１０）：１６９−１７２）。図２上のＮａｔｉｖｅＰＡＧＥは、Ｋ５８８Ｆ及びＫ５８８Ｗ置換の両方が三量体の収量を明確に増加させたが、他方試験した突然変異の大多数は三量体の収量を減少させたことを示している。
【０１０５】
メインガ、キクウィト及びマコナ中のＫ５８８Ｆ
分析的ＳＥＣ分析
更に、Ｔ４２Ａ及びＴ５７７Ｐの非存在下で、Ｋ５８８ＦがマコナΔムチン様ＧＰを安定化させるかどうか、及び更にメインガ及びキクウィトのΔムチン様ＧＰも安定させるかどうかについても試験された。Ｋ５８８Ｆの単独又はＴ５７７Ｐとの組み合わせも又、マコナ、メインガ及びキクウィトＧＰの完全細胞外ドメインにおいて試験した。ＥＢＯＶ  ＧＰ変異体を９６ウエルフォーマットの細胞培養中で発現させた。分析的ＳＥＣ実験を実施するために、高速液体クロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＯｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ屈折率検出器（Ｗｙａｔｔ）と連結したＭｉｎｉＤＡＷＮ  ＴＲＥＯＳ装置（Ｗｙａｔｔ）を使用した。浄化した上清を、ランニングバッファー（１５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中で１ｍＬ／分にて平衡化したＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に加えた。これらのデータは、Ａｓｔｒａ  ６ソフトウエアパッケージを使用して分析した。
【０１０６】
エボラＧＰ及びＫ５８８Ｆ突然変異と結合されたＴ５７７Ｐ、Ｋ５８８Ｆ若しくはＴ５７７Ｐの何れかを含有する変異体の分析的ＳＥＣクロマトグラムは、図３に示されている。ＧＰのクロマトグラムは、複数のピークを有する。全長細胞外ドメインの三量体は、およそ６．３分間で溶出し、Δムチン様変異体の三量体は、約７．５分間で溶出する。図４は、図３におけるＳＥＣクロマトグラムの三量体ピーク高さの棒グラフを示している。細胞培養上清は、エボラＧＰの三量体形態に優先的に結合する抗体１００の結合についてＯｃｔｅｔを使用するバイオレイヤー干渉分光法（ＢＬＩ）を用いて測定した（図５）。このため、抗体１００の１０秒間での結合速度（ｎｍシフト／分）は、正確にフォールディングされた三量体の存在についての良好な指標を提供する。６００秒間でのｎｍシフトは、抗体１００が溶液中の単量体によって三量体形成を誘導できることを示唆し得る１０秒間でのｎｍシフトほど多様ではない。１０秒間での結合速度は、分析的ＳＥＣを用いて見られる三量体含量についての突然変異体と極めて類似するランキングを示すので、分析的ＳＥＣの結果は、ＢＬＩデータによって立証された。
【０１０７】
バイオレイヤー干渉分光法（ＢＬＩ）
抗体１００は、９６ハーフウエル黒色平底ポリピレンマイクロプレート（ＦｏｒｔｅＢｉｏ製品番号３６９４）内の１×動力学バッファー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ製品番号１８−１０９２）中の１０μｇ／ｍＬの濃度で抗−ｈＩｇＧ（ＡＨＣ）センサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ製品番号１８−５０６０）上で固定化した。実験は、３０℃、振動速度１，０００  ｒｐｍでＯｃｔｅｔ  ＨＴＸ機器（Ｐａｌｌ−ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上で実施した。活性化を６０秒間、抗体の固定化を６００秒間、次に１５０秒間に渡る洗浄及びその後にＥｎｖの結合６００秒間、その後に解離６０秒間、全ての振盪を１，０００ｒｐｍで実施した。データ解析は、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析８．１ソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて行った。結合勾配は、ｎｍ／分で１０秒間で決定した。
【０１０８】
実施例３：５８８位の疎水性残基が三量体の収量を増加させる
５８８位でのフェニルアラニン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン及びチロシンとの置換をメインガＧＰ及びメインガΔメチンＧＰに対する抗体１００を用いて分析的ＳＥＣ及びＢＬＩ（Ｏｃｔｅｔ）を用いて試験した（図６）。フェニルアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン及びチロシンとの置換は、三量体の収量を実質的に増加させた。アラニン及びトリプトファンはメインガΔムチンＧＰにおいては三量体の収量をそれ程増加させなかった。メインガΔムチンＧＰにおいて全ての他の考えられるアミノ酸置換を試験したが、三量体の収量の増加を生じさせる追加の可能性は全く生じなかった（図６）。
【０１０９】
実施例４：三量体マールブルグＧＰの安定性
５８８位での置換はマールブルグＧＰを安定化させる
他のフィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）についての置換を安定化させる普遍性を確証するために、５８８位での置換をエボラＧＰとの同一性を約３２％しか有していないマールブルグＧＰにおいても導入した。エボラＧＰにおいて５８８位と相同である位置は、マールブルグＧＰ配列における５８９位（配列番号４３）に位置する。しかしながら、我々はメインガＧＰ（Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５）、配列番号１に従ったナンバリングを使用するので（Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９６  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９３：３６０２−３６０７）、本発明者らは、本明細書では５８８位について言及する。主鎖（ＦＩＬ１７１５９２、配列番号２７）としては、本発明者らが、それに対してマールブルグΔムチンＧＰであると言及するフリン切断を増加させる（Ｈａｓｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，２０１５  １６０，９０４−９１２，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２６）、ムチン様ドメインが欠失し、４つの突然変異、即ち、Ｆ４３８Ｌ、Ｗ４３９Ａ、Ｆ４４５Ｇ及びＦ４４７Ｎを備えるマールブルグＧＰを使用した。マールブルグΔムチンＧＰにおけるＨ５８８Ｆ及びＨ５８８Ｉ置換は、マールブルグΔムチンＧＰ三量体の天然フォールディングに極めて好ましい作用を有した。非突然変異マールブルグΔムチンＧＰは、主として凝集体を生成したが、しかしこれとは対照的に、特にＨ５８８Ｉは、はるかに少ない凝集体及び明確な生成物ピークを生成した（図７）。Ｈ５８８Ｉ／Ｆ突然変異は、マールブルグΔムチン様ドメインＧＰにおいて三量体の収量及びパーセンテージを増加させた。
【０１１０】
上記の実施例は、本発明が、融合前の閉鎖したフィロウイルスＧＰ三量体タンパク質のフォールディング及び安定性を最適化するための普遍的なアプローチを提供することを実証している。
【０１１１】
本明細書に記載の実施例及び実施形態は例示の目的のためのものに過ぎず、その広範な発明概念から逸脱することなく上記の実施形態に対する変更が可能であることは理解されよう。従って、本発明は、開示されている特定の実施形態に限定されるのではなく、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨及び範囲に含まれる変形例を包含すると意図されていることが理解されよう。
【０１１２】
配列表
置換を試験するための主鎖及び突然変異体の配列
配列番号１（ＮＰ＿０６６２４６．１  スパイク糖タンパク質［ザイールエボラウイルス］（Ｚ／Ｚａｉｒｅ／Ｙａｍｂｕｋｕ／１９７６／０５７９３５））（シグナル配列はボールドのイタリック体で記載した）
【化１】
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配列番号２（ＦＩＬ１５０２８２  メインガＧＰ−６４７）（ムチン様ドメインは下線を付した）
【化２】
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配列番号３（ＦＩＬ１８００１１  メインガＧＰ−６４７、Ｔ５７７Ｐ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化３】
2021533772.tif 000004
配列番号４（ＦＩＬ１７０４９７  メインガＧＰ−６４７、Ｋ５８８Ｆ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化４】
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配列番号５（ＦＩＬ１８００１２  メインガＧＰ−６４７−Ｔ５７７Ｐ、Ｋ５８８Ｆ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化５】
2021533772.tif 000006
配列番号６（ＦＩＬ１５０３５１  メインガＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３２０〜４７６））
【化６】
2021533772.tif 000007
配列番号７（ＦＩＬ１８００１８  メインガＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３２０〜４７６）、Ｔ５７７Ｐ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化７】
2021533772.tif 000008
配列番号８（ＦＩＬ１７０５００  メインガＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３２０〜４７６）、Ｋ５８８Ｆ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化８】
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配列番号９（ＦＩＬ１８００１９  メインガＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３２０〜４７６）、Ｔ５７７Ｐ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化９】
2021533772.tif 000010
配列番号１０（ＦＩＬ１５０３５２  マコナＧＰ−６４７）（ムチン様ドメインは下線を付した）
【化１０】
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配列番号１１（ＦＩＬ１５０４０９  マコナＧＰ−６４７、Ｔ５７７Ｐ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化１１】
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配列番号１２（ＦＩＬ１７０４９４  マコナＧＰ−６４７、Ｋ５８８Ｆ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化１２】
2021533772.tif 000013
配列番号１３（ＦＩＬ１７０４９５  マコナＧＰ−６４７、Ｔ５７７Ｐ、Ｋ５８８Ｆ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化１３】
2021533772.tif 000014
配列番号１４（ＦＩＬ１５０３９６  マコナＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３１４〜４７２））
【化１４】
2021533772.tif 000015
配列番号１５（ＦＩＬ１６１６１４  マコナＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３１４〜４７２）、Ｔ５７７Ｐ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化１５】
2021533772.tif 000016
配列番号１６（ＦＩＬ１６１６１５  マコナＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３１４〜４７２）、Ｔ５７７Ｐ、Ｔ４２Ａ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化１６】
2021533772.tif 000017
配列番号１７（ＦＩＬ１７０４９６  マコナＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３１４〜４７２）、Ｋ５８８Ｆ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化１７】
2021533772.tif 000018
配列番号１８（ＦＩＬ１８００２２  マコナＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３１４〜４７２）、Ｔ５７７Ｐ、Ｋ５８８Ｆ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化１８】
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配列番号１９（ＦＩＬ１５０３４９  キクウィトＧＰ−６４７）（ムチン様ドメインは下線を付した）
【化１９】
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配列番号２０（ＦＩＬ１８００１３  キクウィトＧＰ−６４７、Ｔ５７７Ｐ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化２０】
2021533772.tif 000021
配列番号２１（ＦＩＬ１７０４９８  キクウィトＧＰ−６４７、Ｋ５８８Ｆ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化２１】
2021533772.tif 000022
配列番号２２（ＦＩＬ１８００１４  キクウィトＧＰ−６４７、Ｔ５７７Ｐ、Ｋ５８８８Ｆ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化２２】
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配列番号２３（ＦＩＬ１５０３５０  キクウィトＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３１４〜４７２））
【化２３】
2021533772.tif 000024
配列番号２４（ＦＩＬ１８００２０  キクウィトＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３１４〜４７２）、Ｔ５７７Ｐ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化２４】
2021533772.tif 000025
配列番号２５（ＦＩＬ１７０４９９  キクウィトＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３１４〜４７２）、Ｋ５８８Ｆ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化２５】
2021533772.tif 000026
配列番号２６（ＦＩＬ１８００２１  キクウィトＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３１４〜４７２）、Ｔ５７７Ｐ、Ｋ５８８Ｆ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化２６】
2021533772.tif 000027
配列番号２７（ＦＩＬ１７１５９２  マールブルグＧＰ−６３７（ＭＡＲＶ）  Δムチン様ドメイン（Δ２５５〜４２３））
【化２７】
2021533772.tif 000028
配列番号２８（ＦＩＬ１７２５４５  メインガＧＰ−６４７、Ｋ５８８Ａ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化２８】
2021533772.tif 000029
配列番号２９（ＦＩＬ１７２５４６  メインガＧＰ−６４７、Ｋ５８８Ｖ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化２９】
2021533772.tif 000030
配列番号３０（ＦＩＬ１７２５４７  メインガＧＰ−６４７、Ｋ５８８Ｉ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化３０】
2021533772.tif 000031
配列番号３１（ＦＩＬ１７２５４８  メインガＧＰ−６４７、Ｋ５８８Ｌ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化３１】
2021533772.tif 000032
配列番号３２（ＦＩＬ１７２５４９  メインガＧＰ−６４７、Ｋ５８８Ｍ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化３２】
2021533772.tif 000033
配列番号３３（ＦＩＬ１７２５５０  メインガＧＰ−６４７、Ｋ５８８Ｙ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化３３】
2021533772.tif 000034
配列番号３４（ＦＩＬ１７２５３２  メインガＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３２０〜４７６）、Ｋ５８８Ａ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化３４】
2021533772.tif 000035
配列番号３５（ＦＩＬ１７２５３３  メインガＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３２０〜４７６）、Ｋ５８８Ｖ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化３５】
2021533772.tif 000036
配列番号３６（ＦＩＬ１７２５３４  メインガＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３２０〜４７６）、Ｋ５８８Ｉ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化３６】
2021533772.tif 000037
配列番号３７（ＦＩＬ１７２５３５  メインガＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３２０〜４７６）、Ｋ５８８Ｌ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化３７】
2021533772.tif 000038
配列番号３８（ＦＩＬ１７２５３６  メインガＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３２０〜４７６）、Ｋ５８８Ｍ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化３８】
2021533772.tif 000039
配列番号３９（ＦＩＬ１７２５３７  メインガＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３２０〜４７６）、Ｋ５８８Ｙ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化３９】
2021533772.tif 000040
配列番号４０（ＦＩＬ１８０３２７  メインガＧＰ−６４７、Δムチン様ドメイン（Δ３２０〜４７６）、Ｋ５８８Ｗ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化４０】
2021533772.tif 000041
配列番号４１（ＦＩＬ１７１５９３  マールブルグＧＰ−６３７、Δムチン様ドメイン（Δ２５５〜４２３）、Ｈ５８８Ｆ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化４１】
2021533772.tif 000042
配列番号４２（ＦＩＬ１７１５９４  マールブルグＧＰ−６３７（ＭＡＲＶ）  Δムチン様ドメイン（Δ２５５〜４２３）、Ｈ５８８Ｉ）（導入された突然変異は灰色の陰影で示した）
【化４２】
2021533772.tif 000043
配列番号４３（ＭＡＲＶ  ＧＰ（マールブルグ）（マールブルグＧＰの細胞外ドメイン、ムチン様ドメインは下線を付した）（シグナル配列はボールドのイタリック体）
【化４３】
2021533772.tif 000044
配列番号４４  エボラＧＰのシグナルペプチド
ＭＧＶＴＧＩＬＱＬＰＲＤＲＦＫＲＴＳＦＦＬＷＶＩＩＬＦＱＲＴＦＳ
配列番号４５  マールブルグＧＰのシグナルペプチド
ＭＫＴＩＹＦＬＩＳＬＩＬＩＱＳＩＫＴ
【０１１３】
参考文献
Ｓａｎｃｈｅｚ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．１９９６  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９３：３６０２−３６０７
Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１２  Ｓｅｐ；  ４（９）：１６１９−５０
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１６  Ｊａｎ  １４；  １６４（１−２）：２５８−２６８
Ｂｏｒｎｈｏｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．ＭＢｉｏ．２０１６  Ｆｅｂ  ２３；  ７（１）：ｅ０２１５４−１５
Ｐａｌｌｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１６  Ａｕｇ  ８；  １（９）：１６１２８
Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２００８  Ｊｕｌ  １０；  ４５４（７２０１）：１７７−８２
Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９６  Ａｐｒ  １６；  ９３（８）：３６０２−７
Ｅｇｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００８，２５（１）：２−１０
国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレット
Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｖｉｒｏｌ．８１（９）：  ４６５４−６３
Ｋｕｓｈｎｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１２  Ｄｅｃ  １７；  ３１（１）：５８−８３
Ｂａｌｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０１７  Ｊｕｌ  ２７；  ９１（１６）．  ｐｉｉ：  ｅ００４４３−１７
Ｚｈａｏ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ  （２０１４）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ３２：  ３２７−３３７
Ｌｏｐｅｚ−Ｓａｇａｓｅｔａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．  ２０１５  Ｎｏｖ  ２６；  １４：５８−６８
Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１６  Ｊｕｌ  ７；  ５３５（７６１０）：１６９−１７２
Ｈａｓｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，  ２０１５  Ｆｅｂ  ２６；  １６０：９０４−９１２
米国特許出願公開第２０１５／０２９１９３５号明細書
国際公開第２０１４／１２４３０１号パンフレット
米国特許出願公開第２０１６／０１２２３９２号明細書
国際公開第２０１７／０３７１９６号パンフレット
【図１】
2021533772.tif 000045
【図２】
2021533772.tif 000046
【図３−１】
2021533772.tif 000047
【図３−２】
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【図４−１】
2021533772.tif 000049
【図４−２】
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【図５−１】
2021533772.tif 000051
【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
2021533772.tif 000055
【図６−３】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2021533772.tif 000060
2021533772.tif 000061
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