(57)【要約】  例えばＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ綱の遺伝子改変細菌、およびステロイド基質の目的のステロイド生成物への生物変換におけるそのような細菌の使用。ステロイド基質を目的のステロイド生成物に変換する方法であって、その方法は、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌を培養培地に植菌することと、目標のＯＤ６００に到達するまでその細菌培養物を増殖させることと、目標のＯＤ６００に到達したその細菌培養物へステロイド基質を添加することと、そのステロイド基質がその目的のステロイド生成物に変換されるように細菌培養物を培養することと、その細菌培養物からその目的のステロイド生成物を抽出および／または精製することと、を含む。【選択図】図１
2021533823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多環式ステロイド環系の分解前のステロイド代謝経路が遮断された遺伝子改変細菌であって、前記細菌はステロイド側鎖分解経路が中断され、および前記細菌はステロイド基質を目的のステロイド生成物に変換する、遺伝子改変細菌。
【請求項２】
前記ステロイド側鎖分解経路の前記中断が第１のβ酸化のサイクルの後に起こる、請求項１に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項３】
前記ステロイド基質がステロール基質である、請求項１または２に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項４】
前記ステロール基質が、
【化１】
2021533823.tif 000094
β−シトステロール、
【化２】
2021533823.tif 000095
７−オキソ−β−シトステロールもしくは７−ヒドロキシ−β−シトステロール、
【化３】
2021533823.tif 000096
コレステロール、
【化４】
2021533823.tif 000097
７−オキソ−コレステロールもしくは７−ヒドロキシ−β−コレステロール、
【化５】
2021533823.tif 000098
カンペステロール、
【化６】
2021533823.tif 000099
スチグマステロール、
【化７】
2021533823.tif 000100
フコステロール、
７−オキソ−フィトステロール、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項５】
前記目的のステロイド生成物が完全なままの多環式環系を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項６】
前記目的のステロイド生成物が５個の炭素の骨格を有する側鎖を有するステロイド化合物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項７】
前記目的のステロイド生成物が、
【化８】
2021533823.tif 000101
３−オキソ−４−コレン酸、
【化９】
2021533823.tif 000102
コラ４，２２−ジエン−２４−酸、３−オキソ（ＣＡＳ５９６４８−７３−６、または純粋なＥ異性体についてはＣＡＳ８２６３７−２２−７）、
【化１０】
2021533823.tif 000103
３−オキソ−７−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化１１】
2021533823.tif 000104
３−オキソ−９−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化１２】
2021533823.tif 000105
３−オキソ−７，９−ジヒドロキシ−４−コレン酸、
【化１３】
2021533823.tif 000106
３−オキソ−１，４−コラジエン酸、
【化１４】
2021533823.tif 000107
３−オキソ−１１−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化１５】
2021533823.tif 000108
（式中、Ｒはヒドロキシル、オキソ、またはハロゲンであり得る）、
【化１６】
2021533823.tif 000109
（式中、Ｒはヒドロキシルまたはオキソであり得る）、
【化１７】
2021533823.tif 000110
３−オキソ−２３，２４−ビスノル−４−コレン−２２−酸（４−ＢＮＣ）、
【化１８】
2021533823.tif 000111
３−オキソ−２３，２４−ビスノル−１，４−コラジエン−２２−酸（１，４−ＢＮＣ）、またはそれらの多様体である、請求項５に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項８】
前記目的のステロイド生成物が、
【化１９】
2021533823.tif 000112
３−オキソ−４−コレン酸、
【化２０】
2021533823.tif 000113
コラ４，２２−ジエン−２４−酸、３−オキソ（ＣＡＳ５９６４８−７３−６、または純粋なＥ異性体についてはＣＡＳ８２６３７−２２−７）、
【化２１】
2021533823.tif 000114
３−オキソ−７−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化２２】
2021533823.tif 000115
３−オキソ−９−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化２３】
2021533823.tif 000116
３−オキソ−７，９−ジヒドロキシ−４−コレン酸、
【化２４】
2021533823.tif 000117
３−オキソ−１，４−コラジエン酸、
【化２５】
2021533823.tif 000118
３−オキソ−１１−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化２６】
2021533823.tif 000119
（式中、Ｒはヒドロキシル、オキソ、またはハロゲンであり得る）、
【化２７】
2021533823.tif 000120
（式中、Ｒはヒドロキシルまたはオキソであり得る）、またはそれらの多様体である、請求項５または６に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項９】
前記細菌がＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ綱またはＧａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ綱の細菌である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項１０】
前記Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ綱の前記細菌が、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｎｏｃａｒｄｉａ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、またはＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種である、請求項９に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項１１】
前記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ種がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ、好ましくはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓである、請求項１０に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項１２】
前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｏａｕｒｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、好ましくはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｏａｕｒｕｍである、請求項１０に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項１３】
前記Ｎｏｃａｒｄｉａ種が、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ、またはＮｏｃａｒｄｉａ  ｏｐａｃａである、請求項１０に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項１４】
前記Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種が、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉｍｐｌｅｘである、請求項１０に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項１５】
前記遺伝子改変が、ｋｓｈＡ１（配列番号１）、ｋｓｈＡ２（配列番号２）、ｋｓｈＡ３（配列番号３）、ｋｓｈＡ４（配列番号４）、およびｋｓｈＡ５（配列番号５）の遺伝子、またはそれらの相同体の不活性化を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項１６】
前記遺伝子改変が、配列番号５を含むｋｓｈＡ５遺伝子またはその相同体の野生型コピーの再導入をさらに含む、請求項１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項１７】
前記遺伝子改変が、ｋｓｈＡ１（配列番号１）、ｋｓｈＡ２（配列番号２）、ｋｓｈＡ３（配列番号３）、およびｋｓｈＡ４（配列番号４）の遺伝子、またはそれらの相同体の不活性化を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項１８】
前記遺伝子改変が、ｋｓｔＤ１（配列番号６）、ｋｓｔＤ２（配列番号７）、およびｋｓｔＤ３（配列番号８）の遺伝子、またはそれらの相同体の不活性化をさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項１９】
前記遺伝子改変が、ｆａｄＥ３４（配列番号９、配列番号１２）、ｆａｄＥ３４＃２（配列番号１０）の遺伝子のうちの１つ以上、またはその相同体の不活性化を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項２０】
前記遺伝子改変が、ｆａｄＥ２６（配列番号１１）の遺伝子、またはその相同体の不活性化をさらに含む、請求項１９に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項２１】
前記遺伝子の不活性化が遺伝子の欠失によるものである、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項２２】
前記相同体が、請求項１５〜２１で定義された遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項２３】
前記相同体が、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項２２に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項２４】
前記相同体が、請求項１５〜２１で定義された遺伝子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項２５】
前記相同体が、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項２４に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項２６】
ＬＭ９（寄託番号ＮＣＩＭＢ４３０５８）、ＬＭ１９（寄託番号ＮＣＩＭＢ４３０５９）、またはＬＭ３３（寄託番号ＮＣＩＭＢ４３０６０）の菌株の遺伝子改変Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ細菌。
【請求項２７】
ＮＲＲＬ  Ｂ−３８０５  Ｍｎｅｏ−ΔｆａｄＥ３４（寄託番号ＮＣＩＭＢ４３０５７）の菌株の遺伝子改変Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｏａｕｒｕｍ細菌。
【請求項２８】
ステロイド基質の目的のステロイド化合物への前記変換において使用するための、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項２９】
ステロイド基質を目的のステロイド生成物に変換する方法であって、
（ａ）請求項１〜２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌を培養培地に植菌し、目標ＯＤ６００に達するまで細菌培養物を増殖させるステップと、
（ｂ）前記目標ＯＤ６００に達したときに、ステロイド基質を前記細菌培養物に添加するステップと、
（ｃ）前記ステロイド基質が前記目的のステロイド生成物に変換されるように細菌培養物を培養するステップと、
（ｄ）前記細菌培養物から前記目的のステロイド生成物を抽出および／または精製するステップと、を含む方法。
【請求項３０】
前記培養培地がＬＢ培地または最小培地である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ａ）において前記細菌培養物が、少なくとも１．０、好ましくは少なくとも４．０、より好ましくは少なくとも４．５、最も好ましくは少なくとも５．０の目標ＯＤ６００まで増殖される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ステロイド基質がステロール基質である、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ステロール基質が、
【化２８】
2021533823.tif 000121
β−シトステロール、
【化２９】
2021533823.tif 000122
７−オキソ−β−シトステロールもしくは７−ヒドロキシ−β−シトステロール、
【化３０】
2021533823.tif 000123
コレステロール、
【化３１】
2021533823.tif 000124
７−オキソ−コレステロールもしくは７−ヒドロキシ−β−コレステロール、
【化３２】
2021533823.tif 000125
カンペステロール、
【化３３】
2021533823.tif 000126
スチグマステロール、
【化３４】
2021533823.tif 000127
フコステロール、
７−オキソ−フィトステロール、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記目的のステロイド生成物が完全なままの多環式環系を含む、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記目的のステロイド生成物が５個の炭素の骨格を有する側鎖を有するステロイド化合物である、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記目的のステロイド生成物が
【化３５】
2021533823.tif 000128
３−オキソ−４−コレン酸、
【化３６】
2021533823.tif 000129
コラ４，２２−ジエン−２４−酸、３−オキソ（ＣＡＳ５９６４８−７３−６、または純粋なＥ異性体についてはＣＡＳ８２６３７−２２−７）、
【化３７】
2021533823.tif 000130
３−オキソ−７−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化３８】
2021533823.tif 000131
３−オキソ−９−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化３９】
2021533823.tif 000132
３−オキソ−７，９−ジヒドロキシ−４−コレン酸、
【化４０】
2021533823.tif 000133
３−オキソ−１，４−コラジエン酸、
【化４１】
2021533823.tif 000134
３−オキソ−１１−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化４２】
2021533823.tif 000135
（式中、Ｒはヒドロキシル、オキソ、またはハロゲンであり得る）、
【化４３】
2021533823.tif 000136
（式中、Ｒはヒドロキシルまたはオキソであり得る）、
【化４４】
2021533823.tif 000137
３−オキソ−２３，２４−ビスノル−４−コレン−２２−酸（４−ＢＮＣ）、
【化４５】
2021533823.tif 000138
３−オキソ−２３，２４−ビスノル−１，４−コラジエン−２２−酸（１，４−ＢＮＣ）、またはそれらの多様体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記目的のステロイド生成物が、
【化４６】
2021533823.tif 000139
３−オキソ−４−コレン酸、
【化４７】
2021533823.tif 000140
コラ４，２２−ジエン−２４−酸、３−オキソ（ＣＡＳ５９６４８−７３−６、または純粋なＥ異性体についてはＣＡＳ８２６３７−２２−７）、
【化４８】
2021533823.tif 000141
３−オキソ−７−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化４９】
2021533823.tif 000142
３−オキソ−９−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化５０】
2021533823.tif 000143
３−オキソ−７，９−ジヒドロキシ−４−コレン酸、
【化５１】
2021533823.tif 000144
３−オキソ−１，４−コラジエン酸、
【化５２】
2021533823.tif 000145
３−オキソ−１１−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化５３】
2021533823.tif 000146
（式中、Ｒはヒドロキシル、オキソ、またはハロゲンであり得る）、
【化５４】
2021533823.tif 000147
（式中、Ｒはヒドロキシルまたはオキソであり得る）、またはそれらの多様体である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ｂ）において、前記ステロイド基質が、少なくとも０．１ｍＭ、少なくとも０．２ｍＭ、少なくとも０．３ｍＭ、少なくとも０．４ｍＭ、少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも０．６ｍＭ、少なくとも０．７ｍＭ、少なくとも０．８ｍＭ、少なくとも０．９ｍＭ、少なくとも１．０ｍＭ、少なくとも１．１ｍＭ、少なくとも１．２ｍＭ、少なくとも１．３ｍＭ、少なくとも１．４ｍＭ、少なくとも１．５ｍＭ、少なくとも１．６ｍＭ、少なくとも１．７ｍＭ、少なくとも１．８ｍＭ、少なくとも１．９ｍＭ、または少なくとも２．０ｍＭの濃度で添加される、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ステロイド基質が、少なくとも１ｍＭ、好ましくは少なくとも１．５ｍＭ、より好ましくは少なくとも２．０ｍＭの濃度で添加される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（ｂ）において、シクロデキストリン、好ましくはβ−シクロデキストリンまたはγ−シクロデキストリンが前記培養培地に添加される、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記シクロデキストリンがβ−シクロデキストリン、好ましくはメチル−β−シクロデキストリンまたは２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記シクロデキストリンが１ｍＭ〜２５ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜２５ｍＭの濃度で添加される、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記シクロデキストリンが、少なくとも１ｍＭ、好ましくは少なくとも５ｍＭ、より好ましくは少なくとも１２．５ｍＭ、最も好ましくは少なくとも２５ｍＭの濃度で添加される、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４４】
ステップ（ｂ）において、有機溶媒が前記培養培地に添加される、請求項２９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記有機溶媒がエタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、またはアセトン、好ましくはエタノールである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記有機溶媒が、１％〜２０％、２％〜１９％、３％〜１８％、４％〜１７％、５％〜１６％、６％〜１５％、７％〜１４％、８％〜１３％、９％〜１２％、１０％〜１１％、好ましくは５％〜２０％、より好ましくは５％〜１５％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加される、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
ステップ（ｂ）において、シクロデキストリンおよび有機溶媒が前記培地に添加される、請求項２９〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記シクロデキストリンが１ｍＭ〜２５ｍＭの濃度で添加され、前記有機溶媒が１％〜１０％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加され、より好ましくは前記シクロデキストリンが１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度で添加され、前記有機溶媒が１％〜１０％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加され、さらにより好ましくは前記シクロデキストリンが１ｍＭ〜５ｍＭの濃度で添加され、前記有機溶媒が１％〜５％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加され、最も好ましくは前記シクロデキストリンが５ｍＭの濃度で添加され、前記有機溶媒が５％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記シクロデキストリンが少なくとも１ｍＭの濃度で添加され、前記有機溶媒が少なくとも１％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加され得、好ましくは前記シクロデキストリンが少なくとも５ｍＭの濃度で添加され、前記有機溶媒が５％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加され得る、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
請求項２９〜４９のいずれか一項の方法によって生成された目的のステロイド生成物。
【請求項５１】
ステロイド基質を目的のステロイド生成物に変換するためのキットであって、前記キットが、
（ａ）請求項１〜２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌と、
（ｂ）前記キットの使用説明書と、を含む、キット。
【請求項５２】
前記キットがステロイド基質をさらに含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記ステロイド基質がステロール基質である、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記ステロール基質が、
【化５５】
2021533823.tif 000148
β−シトステロール、
【化５６】
2021533823.tif 000149
７−オキソ−β−シトステロールもしくは７−ヒドロキシ−β−シトステロール、
【化５７】
2021533823.tif 000150
コレステロール、
【化５８】
2021533823.tif 000151
７−オキソ−コレステロールもしくは７−ヒドロキシ−β−コレステロール、
【化５９】
2021533823.tif 000152
カンペステロール、
【化６０】
2021533823.tif 000153
スチグマステロール、
【化６１】
2021533823.tif 000154
フコステロール、
７−オキソ−フィトステロール、またはそれらの組み合わせを含む、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記キットが、シクロデキストリン、好ましくはβ−シクロデキストリンまたはγ−シクロデキストリンをさらに含む、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５６】
前記シクロデキストリンがβ−シクロデキストリン、好ましくはメチル−β−シクロデキストリンまたは２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンである、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
前記キットが有機溶媒をさらに含む、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
前記有機溶媒がエタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、またはアセトン、好ましくはエタノールである、請求項５７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子改変細菌および目的のステロイド化合物へのステロイド基質の生物変換におけるそのような細菌の使用に関する。その遺伝子改変細菌は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に由来し得る。
【０００２】
ステロイドは広く多様な種類の有機化合物であり、真核生物において多くの重要な機能を有している。たとえば、天然に存在するステロイドは、細胞膜の流動性の維持、男性と女性の生殖器系の機能の制御、および炎症の調節に関与している。
【０００３】
ステロイド制御経路を介したシグナル伝達は様々なプロセスで重要であるため、合成的に生成されたステロイド薬を使用してこれらの経路を調節する能力は、それらが医薬品の重要な分野であることを意味する。例えば、コルチコステロイドは喘息や関節リウマチなどの症状の治療のための抗炎症薬として使用され、合成ステロイドホルモンはホルモン避妊薬として広く使用され、ならびにアナボリックステロイドは筋肉量および運動能力を高めるために使用され得る。
【０００４】
医薬品として使用するためのステロイドの合成には、天然ステロール前駆体からの半合成またはより単純な有機分子からの全合成のいずれかを伴う。コレステロールなどのステロール前駆体からの半合成は、しばしば細菌の使用を伴う。細菌を使用してこれらの生物変換を実行する利点は、合成に伴うステップが少なく、および酵素によって実行される反応が立体特異的であり、結果として従来の化学合成で使用される保護および脱保護を必要とせずに所望の異性体の生成がもたらされることである。次に、細菌の生物変換の生成物は、医薬品として、または目的の化合物を生成するためのさらなる化学修飾の前駆体として使用され得る。
【０００５】
ステロイドは、植物、動物および真菌種の両方で自然に発生し、ならびに特定の細菌種によって生成される。それらはごく少数の細菌種でのみ自然に発生するにもかかわらず、いくつかの細菌種は成長基質としてステロール化合物を代謝し得る。ステロール化合物を分解し得る細菌の例には、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に由来する細菌を含む。
【０００６】
細菌のステロール代謝経路には、ステロール側鎖の進行性酸化および多環式環系の分解を伴う。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓにおけるステロール側鎖分解の経路は、変異体株を使用して以前に調査されており（Ｗｉｌｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ，２０１１．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７７（１３）：４４５５−４４６４）、そしてコレステロール異化経路の概要を図１に示す。多環式環系の破壊の前に分解経路を遮断して、そして得られる収量を改善するため側鎖酸化の様々な時点で目的のステロイド化合物の蓄積を可能にする遺伝子改変によってステロイド化合物の生成に細菌種を使用し得ることが今や見出された。
【０００７】
第１の態様において、本発明は、多環式ステロイド環系の分解の前にステロイド代謝経路において遮断された遺伝子改変細菌を提供し、その細菌は、ステロイド側鎖分解経路において中断され、および、その細菌は、目的のステロイド生成物にステロイド基質を変換する。
【０００８】
「ステロイド」または「ステロイドの」化合物とは、以下に示すステロイドコア構造に由来する天然または合成有機化合物の種類の意味を含む（ＩＵＰＡＣ承認の環標記および原子の番号付け）。
【化１】
2021533823.tif 000003
【０００９】
ステロイド化合物は一般に４つの縮合環（３つの６員シクロヘキサン環（上記の環Ａ、Ｂ、Ｃ）と１つの５員シクロペンタン環（上記の環Ｄ））を含み、その４環コアに結合した官能基によっておよびその環の酸化状態によって異なる。たとえば、ステロールはステロイド化合物のサブグループであり、明確な特徴の１つは、３位または上記の構造にヒドロキシ基（ＯＨ）が存在することである。上記の図において２０〜２７でラベル化された原子（２４１位および２４２位を含む）によって形成された構造は、ステロイド側鎖と呼ばれる。ステロイドの非限定的な例は、ステロール、３−オキソ−４−コレン酸、３−オキソ−コラ−４，２２−ジエン−２４−酸、３−オキソ−７−ヒドロキシ−４−コレン酸、３−オキソ−９−ヒドロキシ−４−コレン酸、３−オキソ−７，９−ジヒドロキシ−４−コレン酸、３−オキソ−２３，２４−ビスノル−４−コレン−２２−酸（４−ＢＮＣ）、３−オキソ−２３，２４−ビスノル−１，４−コラジエン−２２−酸（１，４−ＢＮＣ）、４−アンドロステン−３，１７−ジオン（ＡＤ）、１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオン（ＡＤＤ）、性ステロイド（例えば、プロゲステロン、テストステロン、エストラジオール）、コルチコステロイド（例えば、コルチゾール）、ニューロステロイド（例えば、ＤＨＥＡおよびアロプレグナノロン）、およびセコステロイド（例えば、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、およびカルシトリオール）を含む。ステロイド化合物の非限定的な例も図４に示す。
【００１０】
「ステロイド側鎖分解経路が中断されている」とは、ステロイド側鎖の正常な分解が損なわれている細菌の意味を含む。通常、ステロイド側鎖の分解は、側鎖活性化の最初のサイクルと、それに続く３つの連続するβ酸化サイクル（すなわち、β酸化の第１、第２、および第３のサイクル）を伴う。中断のない側鎖分解経路では、側鎖分解ステップの最終生成物は通常、４−アンドロステン−３，１７−ジオン（ＡＤ）である。したがって、ステロイド側鎖分解経路において中断された細菌は、ＡＤの生成の上流にあるステロイド生成物を蓄積する。ステロールコレステロールおよびβ−シトステロールの提案される側鎖分解経路をそれぞれ図２と図３に示す（Ｗｉｌｂｒｉｎｋ，２０１１．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｔｅｒｏｌ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅｓｉｓ）。
【００１１】
「多環式ステロイド環系」とは、ステロイドの定義における上記のステロイドコア構造に見られる環のＡＢＣＤ系の意味を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ステロイド側鎖分解経路の中断は、β酸化の第１のサイクルの後に起こる。
【００１３】
「β酸化の第１のサイクル」には、ステロイド側鎖分解経路におけるβ酸化の第１のサイクルの意味を含む（Ｗｉｐｐｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１４．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４９（４）：２６９−２９３）。具体的には、β酸化の第１のサイクルは、側鎖の活性化サイクルのステップの直後であり、結果として側鎖の短縮およびＣ２４ステロイド化合物の生成をもたらす。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ステロイド基質は、ステロール基質であり得る。特定の実施形態において、ステロール基質は、
【化２】
2021533823.tif 000004
β−シトステロール、
【化３】
2021533823.tif 000005
７−オキソ−β−シトステロールもしくは７−ヒドロキシ−β−シトステロール、
【化４】
2021533823.tif 000006
コレステロール、
【化５】
2021533823.tif 000007
７−オキソ−コレステロールもしくは７−ヒドロキシ−β−コレステロール、
【化６】
2021533823.tif 000008
カンペステロール、
【化７】
2021533823.tif 000009
スチグマステロール、
【化８】
2021533823.tif 000010
フコステロール、
７−オキソ−フィトステロール、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００１５】
「ステロール」とは、Ａ環の３位にヒドロキシル基を有するステロイドのサブグループである脂質の種類に属する分子の意味を含む。ステロールは以下の一般的な構造を有する
【化９】
2021533823.tif 000011
【００１６】
ステロールはステロイドアルコールとも呼ばれ、植物（植物ステロール）、動物（動物ステロール）および真菌に自然に発生し、ならびに一部の細菌によっても生成され得る。ステロールの非限定的な例は、β−シトステロール、７−オキソ−β−シトステロール、７−ヒドロキシ−β−シトステロール、コレステロール、７−オキソ−コレステロール、７−ヒドロキシ−β−コレステロール、カンペステロール、スチグマステロール、フコステロール、７−オキソ−フィトステロール、アドステロール、アテロナール、アベナステロール、アザコステロール、セレビステロール、コレストロン、シクロアルテノール、７−デヒドロコレステロール、５−デヒドロエピステロール、７−デヒドロシトステロール、２０α、２２Ｒ−ジヒドロキシコレステロール、ジノステロール、エピブラシカステロール、エピステロール、エルゴステロール、エルゴステロールペルオキシド、フェコステロール、フコステロール、フンジステロール、ガノデリオール、ガノデルマジオール、７α−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２７−ヒドロキシコレステロール、イノトジオール、ラノステロール、ラトステロール、リチェステロール、ルシダジオール、ルミステロール、オキシコレステロール、オキシステロール、パーケオール、スピナステロール、トラメテノール酸、およびザイモステロールを含む。ステロールの非限定的な例も図５に示す。
【００１７】
いくつかの実施形態において、目的のステロイド生成物は、完全なままの多環式環系を含む。
【００１８】
「完全なままの多環式環系」とは、コアステロイド構造のＡＢＣＤ環系がまだ存在する、つまり、ＡＢＣＤ環系が、環のいずれかが開環または削除されるような分解および／または酸化を受けていないステロイド分子の意味を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、目的のステロイド生成物は、５個の炭素の骨格を有する側鎖を有するステロイド化合物である。
【００２０】
「骨格」とは、５個の炭素原子の長さであるステロイド側鎖中の炭素原子の最長連続鎖の意味を含む。一般に、骨格の５つの炭素は、上記の「ステロイド」という用語の定義のステロイドコア構造の図に示されているように、２０位、２１位、２２位、２３位、および２４位にある炭素である。
【００２１】
特定の実施形態において、目的のステロイド生成物は、
【化１０】
2021533823.tif 000012
３−オキソ−４−コレン酸、
【化１１】
2021533823.tif 000013
【００２２】
コラ４，２２−ジエン−２４−酸、３−オキソ（ＣＡＳ５９６４８−７３−６、または純粋なＥ異性体についてはＣＡＳ８２６３７−２２−７）、
【化１２】
2021533823.tif 000014
３−オキソ−７−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化１３】
2021533823.tif 000015
３−オキソ−９−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化１４】
2021533823.tif 000016
３−オキソ−７，９−ジヒドロキシ−４−コレン酸、
【化１５】
2021533823.tif 000017
３−オキソ−１，４−コラジエン酸、
【化１６】
2021533823.tif 000018
３−オキソ−１１−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化１７】
2021533823.tif 000019
（式中、Ｒはヒドロキシル、オキソ、またはハロゲンであり得る）、
【化１８】
2021533823.tif 000020
（式中、Ｒはヒドロキシルまたはオキソであり得る）、
【化１９】
2021533823.tif 000021
３−オキソ−２３，２４−ビスノル−４−コレン−２２−酸（４−ＢＮＣ）、
【化２０】
2021533823.tif 000022
３−オキソ−２３，２４−ビスノル−１，４−コラジエン−２２−酸（１，４−ＢＮＣ）、またはそれらの多様体であり得る。
【００２３】
他の好ましい実施形態では、目的のステロイド生成物は、
【化２１】
2021533823.tif 000023
３−オキソ−４−コレン酸、
【化２２】
2021533823.tif 000024
【００２４】
コラ４，２２−ジエン−２４−酸、３−オキソ（ＣＡＳ５９６４８−７３−６、または純粋なＥ異性体についてはＣＡＳ８２６３７−２２−７）、
【化２３】
2021533823.tif 000025
３−オキソ−７−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化２４】
2021533823.tif 000026
３−オキソ−９−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化２５】
2021533823.tif 000027
３−オキソ−７，９−ジヒドロキシ−４−コレン酸、
【化２６】
2021533823.tif 000028
３−オキソ−１，４−コラジエン酸、
【化２７】
2021533823.tif 000029
３−オキソ−１１−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化２８】
2021533823.tif 000030
（式中、Ｒはヒドロキシル、オキソ、またはハロゲンであり得る）、
【化２９】
2021533823.tif 000031
（式中、Ｒはヒドロキシルまたはオキソであり得る）、またはそれらの多様体であり得る。
【００２５】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変細菌は、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ綱またはＧａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ綱の細菌であり得る。
【００２６】
特定の実施形態において、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ綱の遺伝子改変細菌は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｎｏｃａｒｄｉａ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、またはＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種であり得る。
【００２７】
細菌がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ種の細菌である場合、そのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ種は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ、好ましくはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓであり得る。
【００２８】
細菌がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の細菌である場合、そのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｏａｕｒｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたは  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、好ましくはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｏａｕｒｕｍであり得る。
【００２９】
細菌がＮｏｃａｒｄｉａ種の細菌である場合、そのＮｏｃａｒｄｉａ種は、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａまたはＮｏｃａｒｄｉａ  ｏｐａｃａであり得る。
【００３０】
細菌がＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種の細菌である場合、そのＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種はＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉｍｐｌｅｘであり得る。
【００３１】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された細菌は、１つ以上の遺伝子改変を含む。特定の実施形態において、遺伝子改変細菌の遺伝子改変はｋｓｈＡ１（配列番号１）、ｋｓｈＡ２（配列番号２）、ｋｓｈＡ３（配列番号３）、ｋｓｈＡ４（配列番号ＩＤ  ＮＯ：４）、ｋｓｈＡ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）の遺伝子、またはそれらの相同体の不活性化を含み得る。
【００３２】
「遺伝子改変」とは、生物に存在する遺伝物質への人工的な変更または追加の意味を含む。例えば、遺伝子改変は、遺伝子もしくはゲノム領域の対象とされた欠失、遺伝子もしくはゲノム領域の対象とされた変異誘発（例えば、ポイント変異）、生物のゲノムへの遺伝子もしくは遺伝物質の追加（例えば、融合）、または細菌の場合は、そのような細胞のプラスミドでの形質転換であり得る。
【００３３】
「相同体」とは、第１の遺伝子またはポリペプチドと同様の生物学的機能を有し、および第１の遺伝子またはポリペプチドとある程度の配列類似性をも有し得る第２の遺伝子またはポリペプチドの意味を含む。相同遺伝子は、対応する第１の遺伝子によってコードされるポリペプチドに対してある程度の配列類似性を示すポリペプチドをコードし得る。例えば、相同体は、共通の祖先遺伝子（オルソログ）に由来する異なる種の類似遺伝子であり得、または、相同体は、遺伝子重複イベント（パラログ）に由来する単一種のゲノム内の第２の類似遺伝子であり得る。相同遺伝子またはポリペプチドは、第１の遺伝子またはポリペプチドのヌクレオチドまたはアミノ酸配列とは異なるヌクレオチドまたはアミノ酸配列を有し得るが、それでも第１の遺伝子またはポリペプチドに関連する機能的特徴を維持する（例えば、相同ポリペプチドが酵素である場合、相同ポリペプチドは第１のポリペプチドと同じ反応を触媒する）。相同体のヌクレオチドまたはアミノ酸配列において起こり得る変異は、配列全体におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の違いによって、または前記配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の欠失、置換、挿入、反転または付加によって示され得る。
【００３４】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変は、配列番号５含むｋｓｈＡ５遺伝子またはその相同体の野生型コピーの再導入をさらに含む。
【００３５】
他の実施形態では、遺伝子改変は、ｋｓｈＡ１（配列番号１）、ｋｓｈＡ２（配列番号２）、ｋｓｈＡ３（配列番号３）、およびｋｓｈＡ４（配列番号４）の遺伝子、またはその相同体の不活性化を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変細菌の遺伝子改変は、ｋｓｔＤ１（配列番号６）、ｋｓｔＤ２（配列番号７）、およびｋｓｔＤ３（配列番号８）の遺伝子、またはその相同体の不活性化をさらに含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変は、ｆａｄＥ３４（配列番号９；配列番号１２）、ｆａｄＥ３４＃２（配列番号１０）の遺伝子のうちの１つ以上、またはそれらの相同体の不活性化を含む。
【００３８】
他の好ましい実施形態では、遺伝子改変細菌の遺伝子改変は、ｆａｄＥ２６（配列番号１１）の遺伝子、またはその相同体の不活性化をさらに含む。
【００３９】
遺伝子改変が遺伝子不活性化を含むいくつかの実施形態において、遺伝子活性化は遺伝子欠失によるものである。
【００４０】
「遺伝子欠失」とは、遺伝子またはゲノム領域によってコードされる機能的ポリペプチド生成物（複数可）がその生物によって生成されないように、生物のゲノムから遺伝子またはゲノム領域のすべて、または実質的にすべてを除去することの意味を含む。
【００４１】
特定の実施形態において、相同体は、第１の遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。他の実施形態では、相同体は、第１の遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、相同体は、第１のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。相同体は、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
【００４３】
「配列同一性」とは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列が類似している度合いの意味を含み、同一性の割合で測定される。最適なアラインメントは、比較ウィンドウ上で２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ内のヌクレオチドまたはアミノ酸配列のフラグメントは、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（追加または欠失を含まない）と比較して追加または欠失（例えば、ギャップまたはオーバーハング）を含み得る。割合は、両方の配列で同一のヌクレオチド塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定し、一致する位置の数を得、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を得ることによって算出される。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８）の類似性法の検索によってこれらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＢＬＡＳＴ，ＰＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、または調査によって、実施され得る。比較のために２つの配列が特定されていることを考えると、好ましくはＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴが使用されて最適なアラインメントを決定する。通常、ギャップの重みについては５．００、ギャップの重みの長さについては０．３０のデフォルト値が使用される。
【００４４】
特定の実施形態において、遺伝的改変Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ細菌は、ＬＭ９（寄託番号ＮＣＩＭＢ４３０５８）、ＬＭ１９（寄託番号ＮＣＩＭＢ４３０５９）、またはＬＭ３３（寄託番号ＮＣＩＭＢ４３０６０）の菌株であり得る。
【００４５】
特定の実施形態において、遺伝的改変Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｏａｕｒｕｍ細菌は、ＮＲＲＬ  Ｂ−３８０５  Ｍｎｅｏ−ΔｆａｄＥ３４（寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４３０５７）の菌株であり得る。
【００４６】
第２の態様では、本発明は、目的のステロイド化合物へのステロイド基質の変換においてに使用するための第１の態様による遺伝子改変細菌を提供する。
【００４７】
第３の態様では、本発明は、ステロイド基質を目的のステロイド生成物に変換する方法を提供し、
（ａ）第１または第２の態様による遺伝子改変細菌を培養培地に植菌し目標ＯＤ６００に到達するまで、その細菌培養物を増殖させるステップと
（ｂ）目標のＯＤ６００に達したときに、ステロイド基質をその細菌培養物へ添加するステップと、
（ｃ）ステロイド基質が目的のステロイド生成物に変換されるように細菌培養物を培養するステップと、
（ｄ）細菌培養物から目的のステロイド生成物を抽出および／または精製するステップを含む。
【００４８】
「培地」とは、微生物または細胞の増殖を支持するように設計された固体、液体、または半固体の培地の意味を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、培養培地は、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（１０ｇ／Ｌ  トリプトン、５ｇ／Ｌ  酵母エキス、１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）または最小培地（４．６５ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．５ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ、３ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１ｍｌ／Ｌ  Ｖｉｓｈｎｉａｃ微量元素溶液）であり得る。
【００５０】
特定の実施形態では、その方法のステップ（ａ）におけるその細菌培養物は、少なくとも０．２５、少なくとも０．５、少なくとも０．７５、少なくとも１．０、少なくとも１．５、少なくとも２．０、少なくとも２．５、少なくとも３．０、少なくとも３．５、少なくとも４．０、少なくとも４．１、少なくとも４．２、少なくとも４．３、少なくとも４．４、少なくとも４．５、少なくとも４．６、少なくとも４．７、少なくとも４．８、少なくとも４．９、または少なくとも５．０の目標ＯＤ６００まで増殖させ得る。目標のＯＤ６００は、好ましくは、少なくとも１．０、より好ましくは少なくとも４．０、さらにより好ましくは少なくとも４．５、最も好ましくは少なくとも５．０であり得る。
【００５１】
この方法のいくつかの実施形態では、ステロイド基質はステロール基質であり得る。特定の実施形態において、ステロール基質は、
【化３０】
2021533823.tif 000032
β−シトステロール、
【化３１】
2021533823.tif 000033
７−オキソ−β−シトステロールまたは７−ヒドロキシ−β−シトステロール、
【化３２】
2021533823.tif 000034
コレステロール、
【化３３】
2021533823.tif 000035
７−オキソ−コレステロールまたは７−ヒドロキシ−β−コレステロール、
【化３４】
2021533823.tif 000036
カンペステロール、
【化３５】
2021533823.tif 000037
スチグマステロール、
【化３６】
2021533823.tif 000038
フコステロール、
７−オキソ−フィトステロール、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００５２】
この方法のいくつかの実施形態では、目的のステロイド生成物は、完全なままの多環式環系を含み得る。特定の実施形態において、目的のステロイド生成物は、５個の炭素の骨格を有する側鎖を有するステロイド化合物であり得る。
【化３７】
2021533823.tif 000039
３−オキソ−４−コレン酸、
【化３８】
2021533823.tif 000040
【００５３】
コラ４，２２−ジエン−２４−酸、３−オキソ（ＣＡＳ５９６４８−７３−６、または純粋なＥ異性体についてはＣＡＳ８２６３７−２２−７）、
【化３９】
2021533823.tif 000041
３−オキソ−７−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化４０】
2021533823.tif 000042
３−オキソ−９−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化４１】
2021533823.tif 000043
３−オキソ−７，９−ジヒドロキシ−４−コレン酸、
【化４２】
2021533823.tif 000044
３−オキソ−１，４−コラジエン酸、
【化４３】
2021533823.tif 000045
３−オキソ−１１−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化４４】
2021533823.tif 000046
（式中、Ｒはヒドロキシル、オキソ、またはハロゲンであり得る）、
【化４５】
2021533823.tif 000047
（式中、Ｒはヒドロキシルまたはオキソであり得る）、
【化４６】
2021533823.tif 000048
３−オキソ−２３，２４−ビスノル−４−コレン−２２−酸（４−ＢＮＣ）、
【化４７】
2021533823.tif 000049
３−オキソ−２３，２４−ビスノル−１，４−コラジエン−２２−酸（１，４−ＢＮＣ）、またはそれらの多様体。
【００５４】
いくつかの好ましい実施形態において、目的のステロイド生成物は、
【化４８】
2021533823.tif 000050
３−オキソ−４−コレン酸、
【化４９】
2021533823.tif 000051
【００５５】
コラ４，２２−ジエン−２４−酸、３−オキソ（ＣＡＳ５９６４８−７３−６、または純粋なＥ異性体についてはＣＡＳ８２６３７−２２−７）、
【化５０】
2021533823.tif 000052
３−オキソ−７−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化５１】
2021533823.tif 000053
３−オキソ−９−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化５２】
2021533823.tif 000054
３−オキソ−７，９−ジヒドロキシ−４−コレン酸、
【化５３】
2021533823.tif 000055
３−オキソ−１，４−コラジエン酸、
【化５４】
2021533823.tif 000056
３−オキソ−１１−ヒドロキシ−４−コレン酸、
【化５５】
2021533823.tif 000057
（式中、Ｒはヒドロキシル、オキソ、またはハロゲンであり得る）、
【化５６】
2021533823.tif 000058
またはそれらの多様体であり得る。
【００５６】
いくつかの実施形態では、方法のステップ（ｂ）において、ステロイド基質は、少なくとも０．１ｍＭ、少なくとも０．２ｍＭ、少なくとも０．３ｍＭ、少なくとも０．４ｍＭ、少なくとも０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、少なくとも０．７ｍＭ、少なくとも０．８ｍＭ、少なくとも０．９ｍＭ、少なくとも１．０ｍＭ、少なくとも１．１ｍＭ、少なくとも１．２ｍＭ、少なくとも１．３ｍＭ、少なくとも１．４ｍＭ、少なくとも１．５ｍＭ、少なくとも１．６ｍＭ、少なくとも１．７ｍＭ、少なくとも１．８ｍＭ、少なくとも１．９ｍＭ、または少なくとも２．０ｍＭの濃度で添加され得る。好ましくは、ステロイド基質は、少なくとも１ｍＭ、より好ましくは少なくとも１．５ｍＭ、最も好ましくは少なくとも２．０ｍＭの濃度で添加され得る。
【００５７】
いくつかの実施形態では、方法のステップ（ｂ）において、シクロデキストリンが培養培地に添加され得る。
【００５８】
「シクロデキストリン」とは、環状に結合した糖分子で構成される化合物の意味を含み、その環は１→４に結合した５つ以上のα−Ｄ−グルコピラノシド単位で構成される。シクロデキストリンの非限定的な例は、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、および２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンを含む。
【００５９】
特定の実施形態において、シクロデキストリンは、β−シクロデキストリンまたはγ−シクロデキストリンであり得る。シクロデキストリンがβ−シクロデキストリンである場合、それはメチル−β−シクロデキストリンまたは２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンであり得る。
【００６０】
いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、１ｍＭ〜５０ｍＭ、２ｍＭ〜４５ｍＭ、３ｍＭ〜４０ｍＭ、４ｍＭ〜３５ｍＭ、５ｍＭ〜３０ｍＭ、６ｍＭ〜２９ｍＭ、７ｍＭ〜２８ｍＭ、８ｍＭ〜２７ｍＭ、９ｍＭ〜２６ｍＭ、１０ｍＭ〜２５ｍＭ、１１ｍＭ〜２４ｍＭ、１２ｍＭ〜２３ｍＭ、１３ｍＭ〜２２ｍＭ、１４ｍＭ〜２１ｍＭ、１５ｍＭ〜２１ｍＭ、１６ｍＭ〜２０ｍＭ、１７ｍＭ〜１９ｍＭ、１ｍＭ〜１８ｍＭの濃度で添加される。好ましくは、シクロデキストリンは、１ｍＭ〜２５ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ〜２５ｍＭの濃度で添加され得る。
【００６１】
他の実施形態では、シクロデキストリンは、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１１ｍＭ、少なくとも１２ｍＭ、少なくとも１３ｍＭ、少なくとも１４ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも１６ｍＭ、少なくとも１７ｍＭ、少なくとも１８ｍＭ、少なくとも１９ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも２１ｍＭ、少なくとも２２ｍＭ、少なくとも２３ｍＭ、少なくとも２４ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも３５ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも４５ｍＭ、または少なくとも５０ｍＭの濃度で添加される。好ましくは、シクロデキストリンは、少なくとも１ｍＭ、好ましくは少なくとも５ｍＭ、より好ましくは少なくとも１２．５ｍＭ、最も好ましくは少なくとも２５ｍＭの濃度で添加される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、方法のステップ（ｂ）において、有機溶媒が培養培地に添加され得る。
【００６３】
「有機溶媒」とは、他の物質を溶解できる炭素ベース溶媒の意味を含む。有機溶媒の非限定的な例は、エタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、メタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、およびトルエンを含む。
【００６４】
特定の実施形態において、有機溶媒は、エタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、またはアセトンであり得る。好ましくは、有機溶媒はエタノールであり得る。
【００６５】
いくつかの実施形態において、有機溶媒は、１％〜２０％、２％〜１９％、３％〜１８％、４％〜１７％、５％〜１６％、６％〜１５％、７％〜１４％、８％、〜１３％、９％〜１２％、１０％〜１１％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で培地に添加される。好ましくは、有機溶媒は、５％〜２０％、より好ましくは５％〜１５％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加され得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、有機溶媒は、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、または少なくとも２０％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で培地に添加される。好ましくは、有機溶媒は、少なくとも１％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加され得る。より好ましくは、有機溶媒は、少なくとも５％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加され得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、方法のステップ（ｂ）において、シクロデキストリンおよび有機溶媒が培養培地に添加される。
【００６８】
シクロデキストリンおよび有機溶媒が培地に添加される特定の実施形態において、シクロデキストリンは、１ｍＭ〜２５ｍＭ、２ｍＭ〜２４ｍＭ、３ｍＭ〜２３ｍＭ、４ｍＭ〜２２ｍＭ、５ｍＭ〜２１ｍＭ、６ｍＭ〜２０ｍＭ、７ｍＭ〜１９ｍＭ、８ｍＭ〜１８ｍＭ、９ｍＭ〜１７ｍＭ、１０ｍＭ〜１６ｍＭ、１１ｍＭ〜１５ｍＭ、１２ｍＭ〜１４ｍＭ、１ｍＭ〜１３ｍＭの濃度で添加され、有機溶媒は１％〜２０％、２％〜１９％、３％〜１８％、４％〜１７％、５％〜１６％、６％〜１５％、７％〜１４％、８％〜１３％、９％〜１２％、１０％〜１１％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加される。好ましくは、シクロデキストリンは、１ｍＭ〜２５ｍＭの濃度で添加され得、有機溶媒は、１％〜１０％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加され得る。より好ましくは、シクロデキストリンは１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度で添加され得、有機溶媒は１％〜１０％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加され得る。さらにより好ましくは、シクロデキストリンは１ｍＭ〜５ｍＭの濃度で添加され得、有機溶媒は１％〜５％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加され得る。最も好ましくは、シクロデキストリンは５ｍＭの濃度で添加され得、有機溶媒は５％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加され得る。
【００６９】
シクロデキストリンおよび有機溶媒が培養培地に添加される他の実施形態では、シクロデキストリンは、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１１ｍＭ、少なくとも１２ｍＭ、少なくとも１３ｍＭ、少なくとも１４ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも１６ｍＭ、少なくとも１７ｍＭ、少なくとも１８ｍＭ、少なくとも１９ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも２１ｍＭ、少なくとも２２ｍＭ、少なくとも２３ｍＭ、少なくとも２４ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、の濃度で添加され、
有機溶媒は、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、または少なくとも２０％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加される。好ましくは、シクロデキストリンは、少なくとも１ｍＭの濃度で添加され得、有機溶媒は、少なくとも１％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加され得る。より好ましくは、シクロデキストリンは少なくとも５ｍＭの濃度で添加され得、有機溶媒は５％の体積／体積（ｖ／ｖ）濃度で添加され得る。
【００７０】
第４の態様では、本発明は、第３の態様の方法によって生成される目的のステロイド生成物を提供する。
【００７１】
第５の態様において、本発明は、ステロイド基質を目的のステロイド生成物に変換するためのキットを提供し、このキットは、
（ａ）第１の側面による遺伝子改変細菌と、
（ｂ）キットの使用説明書とを含む。
【００７２】
そのキットは、ステロイド基質をさらに含み得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ステロイド基質は、ステロール基質であり得る。特定の実施形態において、ステロール基質は、
【化５７】
2021533823.tif 000059
β−シトステロール、
【化５８】
2021533823.tif 000060
７−オキソ−β−シトステロールもしくは７−ヒドロキシ−β−シトステロール、
【化５９】
2021533823.tif 000061
コレステロール、
【化６０】
2021533823.tif 000062
７−オキソ−コレステロールもしくは７−ヒドロキシ−β−コレステロール、
【化６１】
2021533823.tif 000063
カンペステロール、
【化６２】
2021533823.tif 000064
スチグマステロール、
【化６３】
2021533823.tif 000065
フコステロール、
７−オキソ−フィトステロール、またはそれらの組み合わせを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、キットは、β−シクロデキストリンまたはγ−シクロデキストリンなどのシクロデキストリンをさらに含み得る。好ましくは、シクロデキストリンは、β−シクロデキストリンであり、より好ましくは、メチル−β−シクロデキストリンまたは２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンである。
【００７５】
いくつかの実施形態では、キットは、有機溶媒をさらに含み得る。特定の実施形態では、その有機溶媒は、エタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、またはアセトン、好ましくはエタノールである。
【００７６】
本明細書で明らかに先に公表された文献のリストまたは議論は、その文献が最新技術の一部であるか、または共通の一般知識であることを認めるものと必ずしも解釈されるべきではない。
【００７７】
この開示で言及されている寄託物（寄託番号ＮＣＩＭＢ４３０５７、ＮＣＩＭＢ４３０５８、ＮＣＩＭＢ４３０５９、およびＮＣＩＭＢ４３０６０）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ、Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、ＡＢ２１９ＹＡ、英国に２０１８年５月２９日にＣａｍｂｒｅｘ  Ｋａｒｌｓｋｏｇａ  ＡＢによって寄託された。
【００７８】
本発明は、以下の非限定的な図および例を参照して、より詳細に次に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】コレステロール異化経路の概要。
【図２】コレステロール側鎖分解経路の概要。
【図３】β−シトステロール側鎖分解経路の概要。
【図４】ステロイド化合物の例。
【図５】ステロイド基質の例。
【図６】コレステロールが出発基質である場合に培養されたＬＭ３についてのＬＣ−ＭＳで得られた総イオンクロマトグラム。７．６７分と８．２５分のピークは、それぞれ４−アンドロステン−３，１７−ジオン（ＡＤ）および３−オキソ−２３，２４−ビスノル−４−コレン−２２−酸（４−ＢＮＣ）の蓄積を示している。ＮＬ：正規化レベル＝ベースピーク強度。
【図７】コレステロールが出発基質である場合のＬＭ９についてのＬＣ−ＭＳによって得られた生成物イオンマススペクトル。（Ａ）ｍ／ｚ３４５．２４のピークのピーク（ポジティブモード）は、コレステロールが出発基質である場合に蓄積される４−ＢＮＣに対応する。（Ｂ）ｍ／ｚ３７３．２７のピーク（ポジティブモード）は、コレステロールが出発基質である場合に蓄積される３−オキソ−４−コレン酸に対応する。ＮＬ：正規化レベル＝ベースピーク強度。
【図８】コレステロール、β−シトステロール、または７−オキソ−ステロールが出発基質である場合のＬＭ９についてのＬＣ−ＭＳによって得られた生成物イオンマススペクトル。（Ａ、上）ｍ／ｚ３８９．２７のピーク（ポジティブモード）は、７−オキソ−ステロールが出発基質である場合の３−オキソ−７−ヒドロキシ−４−コレン酸の生成に対応する。（Ｂ、中央）ｍ／ｚ３７３．２７のピーク（ポジティブモード）は、β−シトステロールが出発基質である場合の３−オキソ−４−コレン酸の生成に対応する。（Ｃ、下）ｍ／ｚ３７３．２７のピーク（ポジティブモード）は、コレステロールが出発基質である場合の３−オキソ−４−コレン酸の生成に対応する。ＮＬ：正規化レベル＝ベースピーク強度。
【図９】コレステロールまたはβ−シトステロールが出発基質である場合のＬＭ１９およびＬＭ９についてのＬＣ−ＭＳによって得られた抽出されたイオンクロマトグラム。（Ａ）菌株＝ＬＭ９、基質＝コレステロール。９．７０分のピークは、ＬＭ９による３−オキソ−４−コレン酸の生成に対応する。（Ｂ）菌株＝ＬＭ１９、基質＝コレステロール。８．０７分のピークは、ＬＭ１９による３−オキソ−９−ＯＨ−４−コレン酸の生成に対応する。（Ｃ）菌株＝ＬＭ９、基質＝β−シトステロール。９．６８分のピークは、ＬＭ９による３−オキソ−４−コレン酸の生成に対応する。（Ｄ）菌株＝ＬＭ１９；基質＝β−シトステロール。８．０９分のピークは、ＬＭ１９による３−オキソ−９−ＯＨ−４−コレン酸の生成に対応する。ＮＬ：正規化レベル＝ベースピーク強度。
【図１０】コレステロールまたはβ−シトステロールが出発基質である場合のＬＭ９およびＬＭ１９によって生成されたピークの同一性を確認するＬＣ−ＭＳで得られた生成物イオンマススペクトル。（Ａ）菌株＝ＬＭ１９、基質＝コレステロールまたはβ−シトステロール。ｍ／ｚ約３８９．２７のピーク（ポジティブモード）は、ＬＭ１９による３−オキソ−９−ＯＨ−４−コレン酸の生成に対応する。（Ｂ）菌株＝ＬＭ９、基質＝コレステロールまたはβ−シトステロール。ｍ／ｚ３７３．２７のピーク（ポジティブモード）は、ＬＭ９による３−オキソ−４−コレン酸の生成に対応する。ＮＬ：正規化レベル＝ベースピーク強度。
【図１１】７−オキソ−ステロールが出発基質である場合のＬＭ１９についてのＬＣ−ＭＳで得られた生成物イオンマススペクトル。ｍ／ｚ４０５．２６のピーク（ポジティブモード）は、ＬＭ１９による３−オキソ−７，９−ジヒドロキシ−４−コレン酸の生成に対応する。ＮＬ：正規化レベル＝ベースピーク強度。
【図１２】β−シトステロールが出発基質であり、かつ培地にメチル−β−シクロデキストリンが補充された場合のＬＭ９およびＬＭ３３によって生成されるステロイド生成物を比較するＨＰＬＣ分析。グラフの上の線はＬＭ９によって生成されたステロイド化合物についてのＨＰＬＣトレースを表し、下の線はＬＭ３３によって生成されたステロイド化合物についてのＨＰＬＣトレースを表す。
【図１３】出発基質としての３−オキソ−４−コレン酸に対するＬＭ９およびＬＭ３３の活性を比較するＨＰＬＣ分析および培地にメチル−β−シクロデキストリンが補充される。グラフの上の線は、ＬＭ９（Ｔ＝７２時間）によって生成されたステロイド化合物についてのＨＰＬＣトレースを表し、下の線は、ＬＭ３３（Ｔ＝７２時間）によって生成されたステロイド化合物についてのＨＰＬＣトレースを表す。
【図１４】β−シトステロールが出発基質であり、かつ培地に２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンが補充された場合のＬＭ９についてのＬＣ−ＭＳによる生成物イオンマススペクトル。ｍ／ｚ３７３．２７のピーク（ポジティブモード）は、ＬＭ９による３−オキソ−４−コレン酸の生成に対応する。ＮＬ：正規化レベル＝ベースピーク強度。
【図１５】ＬＭ９β−シトステロールが生成するステロイド化合物のＨＰＬＣ分析を出発基質とし、培地に２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンが補充される。（Ａ）Ｔ＝２４時間でのＬＭ９生成物、（Ｂ）Ｔ＝４８時間でのＬＭ９生成物、（Ｃ）Ｔ＝７２時間でのＬＭ９生成物、（Ｄ）３−オキソ−４−コレン酸標準（０．０２５ｍｇ／ｍＬ）。
【図１６】７−オキソステロールが出発基質であり、かつ培地に２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンが補充された場合のＬＭ９についてのＬＣ−ＭＳによる抽出されたイオンクロマトグラム。（Ａ）２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンの存在下でのＬＭ９生成物（Ｔ＝４８時間）。７．７４分のピークは、３−オキソ−７−ヒドロキシ−４−コレン酸の生成に対応する。（Ｂ）２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンの非存在下でのＬＭ９生成物（Ｔ＝４８時間）。７．７６分のピークは、３−オキソ−７−ヒドロキシ−４−コレン酸の生成に対応する。（Ｃ）基質が存在しない２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリン存在下でのＬＭ９生成物（Ｔ＝４８時間）。ＮＬ：正規化レベル＝ベースピーク強度。
【図１７】コレステロールが出発基質である場合の、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｏａｕｒｕｍ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３８０５（親株）およびＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４によって生成されるステロイド化合物のＨＰＬＣ分析。グラフの上の線は、親株（Ｔ＝７２ｈ）によって生成されたステロイド化合物についてのＨＰＬＣトレースを表し、下の線は、ＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４によって生成されたステロイド化合物についてのＨＰＬＣトレースを表す。
【図１８】β−シトステロールが出発基質である場合の、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｏａｕｒｕｍ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３８０５（親株）およびＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４によって生成されるステロイド化合物のＨＰＬＣ分析。グラフの上の線は、ＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４（Ｔ＝７２ｈ）によって生成されたステロイド化合物についてのＨＰＬＣトレースを表し、下の線は、親株によって生成されたステロイド化合物についてのＨＰＬＣトレースを表す。
【図１９】７−オキソステロールが出発基質である場合の、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｏａｕｒｕｍ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３８０５（親株）およびＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４によって生成されるステロイド化合物のＨＰＬＣ分析。グラフの上の線は、ＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４（Ｔ＝７２ｈ）によって生成されたステロイド化合物についてのＨＰＬＣトレースを表し、下の線は、親株によって生成されたステロイド化合物についてのＨＰＬＣトレースを表す。
【図２０】フィトステロールミックス（Ａｔｕｒｅｘ  ９０）が出発基質であり、かつ培地にメチル−β−シクロデキストリンが補充された場合のＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４が生成するステロイド化合物のＨＰＬＣ分析。トレースは、下から上にそれぞれＴ＝０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、および１６８時間でのＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４によって生成されたステロイド化合物に対応する。
【図２１】３−オキソ−４−コレン酸が出発基質であり、かつ培地にメチル−β−シクロデキストリンが補充された場合のＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４が生成するステロイド化合物のＨＰＬＣ分析。トレースは、下から上にそれぞれＴ＝０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、および１６８時間でのＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４によって生成されたステロイド化合物に対応する。
【図２２Ａ】ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの存在下でフィトステロール化合物で発酵させた後、ＬＭ３３によって生成されたステロイド化合物のＮＭＲ分析。（Ａ）発酵の生成物から得られた１Ｈスペクトル。
【図２２Ｂ】（Ｂ）０．６５〜２．５５ｐｐｍの領域のみのピークを示す図２２Ａのスペクトルの拡大図。
【図２２Ｃ】（Ｃ）発酵の生成物から得られた１３Ｃスペクトル。
【図２２Ｄ】（Ｄ）１１〜５８ｐｐｍの領域のみのピークを示す図２２Ｃのスペクトルの拡大図。１Ｈスペクトルおよび１３Ｃスペクトルの両方は、培養物中の３−オキソ−４−コレン酸の存在を示す。
【図２２Ｅ】（Ｅ）図２２Ａおよび２２Ｂに示される１Ｈスペクトルを得るために使用されたデータパラメータ。
【図２２Ｆ】（Ｆ）図２２Ｃおよび２２Ｄに示す１３Ｃスペクトルを得るために使用されたデータパラメータ。
【実施例】
【００８０】
例１−菌株の構築
材料および方法
ＲＧ４１株の構築
ＲＧ４１は元々、（Ｗｉｌｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ，２０１１．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７７（１３）：４４５５−４４６４）によって報告された３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ（ｋｓｈＡ１−５）の５つの相同体の無印の遺伝子欠失によって作られた親株ＲＧ３２から構築された。
【００８１】
以下に詳述するとおり、３−ケトステロイド−Δ１−デヒドロゲナーゼ（ｋｓｔＤｓ）の３つの相同体の欠失によってＲ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ株ＲＧ４１を構築するための親株としてＲＧ３２が使用された。
【００８２】
ｋｓｔＤ３の無印の欠失のための変異原性プラスミドの構築は以下のとおりに実行された。Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＤＳＭ４３２６９のゲノムライブラリーは、（Ｐｅｔｒｕｓｍａ  ｅｔ  ａｌ，２００９．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７５（１６）：５３００−５３０７））で説明されているように取得され、それはｋｓｈＡ３およびｋｓｔＤ３を保有するクローン（ｐＫＳＨ８００；Ｗｉｌｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｔ．，２０１１）の単離のために使用された。ｐＫＳＨ８００の４ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントは、ＥｃｏＲＩで消化されたｐＺＥｒＯ−２．１にライゲーションされ、続いてＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化された。次に、２．７ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントは、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢにライゲーションされ、それがＥｃｏＲＶ／ＮｒｕＩで消化され、最後に自己ライゲーションして、Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＲＧ３２株におけるｋｓｔＤ３遺伝子欠失＝＞ＲＧ３２ΔｋｓｔＤ３＝ＲＧ３５株のためプラスミドｐＫＳＨ８４１を得た（付録Ｃ）。
【００８３】
ｋｓｔＤ１の無印の欠失のための変異原性プラスミドの構築は以下のとおりに実行された。特定のｋｓｔＤ１プライマー（ｋｓｔＤ１−ＦおよびｋｓｔＤ１−Ｒ、付録Ｄ）が２．４  ｋｂのＰＣＲ産物を増幅のために使用され、そのＰＣＲ産物はＥｃｏＲＶで消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにライゲーションされ、次いでＳｔｕＩ／ＳｔｙＩで消化され、クレノウで平滑末端化され、自己ライゲーションした。次に、そのコンストラクトはＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化され、最後に１．３ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢにライゲーションされ、ＲＧ３５におけるｋｓｔＤ１遺伝子欠失＝＞ＲＧ３２ΔｋｓｔＤ１ΔｋｓｔＤ３＝ＲＧ３６株のためのプラスミドｐＫＳＨ８５２を得た（表付録Ｃ）。
【００８４】
ｋｓｔＤ２の無印の欠失のための変異原性プラスミドの構築は以下のとおりに実行された。Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＲＧ３６の染色体ＤＮＡは、ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して単離し、ＸｈｏＩによって消化され、そしてＸｈｏＩで消化されたｐＺＥｒＯ−２．１にライゲーションされた。そのライゲーション混合物でのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αの形質転換により、約１２，０００の形質転換体のゲノムライブラリーが生成された。ｋｓｔＤ２遺伝子（ｐＫＳＤ３２１）を保有するクローンは、特定のｋｓｔＤ２プライマー（ｋｓｔＤ２−ＦおよびｋｓｔＤ２−Ｒ、付録Ｄ）を使用したＰＣＲによって同定され、ＲＧ３６株のゲノムライブラリーから単離された。次に、ｐＫＳＤ３２１はＸｍｎＩで消化され、自己ライゲーションし、続いてＳｍａＩ／ＸｈｏＩで消化された。最後に、２．２ｋｂのＳｍａＩ／ＸｈｏＩはＳｍａＩ／Ｓａｌで消化されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢにライゲーションされ、ＲＧ３６におけるｋｓｔＤ２遺伝子欠失＝＞ＲＧ３２ΔｋｓｔＤ１ΔｋｓｔＤ２ΔｋｓｔＤ３＝ＲＧ４１株のためのプラスミドｐＫＳＤ３２６を得た（付録Ｃ）。
【００８５】
変異原性プラスミドは、形質転換によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１に移され、続いて、以前に記載されたように（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ  ｅｔ  ａｌ，２００１．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０５（２）：１９７−２０２））、共役によって対応するＲ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ株に動員された。すべての変異体は、特定のプライマー（付録Ｄ）を使用したＰＣＲによって検証され、標的遺伝子の欠失が確認された。
【００８６】
したがって、ＲＧ４１株はｋｓｈＡ  ｎｕｌｌ  ＋ΔｋｓｔＤ１ΔｋｓｔＤ２ΔｋｓｔＤ３変異体（８倍変異体）であり、ステロイドの側鎖分解に関与する遺伝子における欠失変異体を構築するための親株として使用された。
【００８７】
欠失変異体株の構築
単一変異体株ＬＭ３（ΔｆａｄＥ３４＃１）、ＬＭ１５（ΔｆａｄＥ３４＃２）は、親株ＲＧ４１（ｋｓｈＡ  ｎｕｌｌ＋ΔｋｓｔＤ１＋ΔｋｓｔＤ２＋ΔｋｓｔＤ３）からｆａｄＥ３４＃１またはｆａｄＥ３４＃２を欠失することによって構築された。
【００８８】
無印のインフレーム遺伝子欠失変異体は、ｓａｃＢカウンター選択マーカーを使用して構築された（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。標的遺伝子の上流および下流隣接領域のＰＣＲ増幅は、付録Ｄに列挙されているプライマーを使用して野生型Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＤＳＭ４３２６９テンプレートから実行された。得られた１．５ｋｂ  ＰＣＲ産物（ＵＰおよびＤＯＷＮと呼ばれる）をｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターに一緒にクローニングし、ｐｋ１８＿ｆａｄＥ３４−ＵＰ＋ＤＯＷＮおよびｐｋ１８＿ｆａｄＥ３４＃２−ＵＰ＋ＤＯＷＮコンストラクトを得た。以前にＷｉｌｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１によって構築されたｐＤＥＬ−ｆａｄＡ６は、ｆａｄＡ６の欠失に使用された。変異原性プラスミドは、形質転換によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１に移され、続いて、以前に記載されたように（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ  ｅｔ  ａｌ，２００１）、共役によって対応するＲ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ株に動員された。すべての変異体は、特定のプライマー（付録Ｄ）を使用したＰＣＲによって検証され、標的遺伝子の欠失が確認された。ＬＭ３およびＬＭ１５単一変異体株は、親株としてＲＧ４１を使用して、それぞれｆａｄＥ３４またはｆａｄＥ３４＃２を欠失することによって構築された。
【００８９】
例２−ＬＭ３株（ΔｆａｄＥ３４＃１）およびＬＭ１５株（ΔｆａｄＥ３４＃２）を使用した生物変換
材料および方法
変異体株は１００ｍｌのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間培養されたた。ＯＤ６００ｎｍ＝５の場合、ＬＢ前培養を１０ｍｌ培養に分割し、出発ステロール基質は２ｍＭで添加した（アセトンに溶解して最終濃度を４％とした）。
【００９０】
出発ステロール基質を添加の時間がＴ＝０時間として処理された。培養物は３０℃および２００ｒｐｍで数日間インキュベートされた。２５０μｌのアリコートが０時間、２４時間、４８時間、および７２時間で培養物から採取され、必要になるまで−２０℃で凍結された。
【００９１】
サンプルは、ＨＰＬＣおよび／またはＬＣ−ＭＳ分析用に、室温で解凍し、１ｍｌのＭｅＯＨを加え、ボルテックスして、４℃および１２，０００ｒｐｍで１０〜１５分間短時間遠心分離することにより調製された。次に、上澄みが濾過され（フィルターサイズ０．２μｍ）、ＨＰＬＣおよび／またはＬＣ−ＭＳによって分析された。
【００９２】
Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８カラム（２５０ｘ４．６ｍｍ、粒子サイズ５μｍ）を使用してＨＰＬＣが実行された。８０％ＭｅＯＨおよび０．１％ギ酸の移動相が１ｍｌ／ｍｉｎの流速および３５℃のカラム温度で使用された。２０μｌのサンプルが注入された。検出時間は３０分であり、そしてステロイド化合物は２５４ｎｍで検出された。生成されたステロイド生成物の定量化は、既知の標準から測定されたピーク面積の検量線の構築によって達成された。これを使用して、生成された生成物の量をｇ／ｌで計算し、続いて収率を逆算した。
【００９３】
ＬＣ−ＭＳ分析は、Ａｃｃｅｌｌａ１２５０（商標）ＨＰＬＣシステムおよびベンチトップＥＳＩ−ＭＳ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、サンノゼ、カリフォルニア州）を組み合わせて使用して実施された。５μｌのサンプルが、４０℃、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで動作する逆相Ｃ１８カラム（Ｓｈｉｍ  Ｐａｃｋ  Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＸＲ−ＯＤＳ  ３×７５  ｍｍ）に注入された。分析は、以下のような２％〜９５％のアセトニトリル：水（０．１％ギ酸を添加）の勾配を使用して、実行された：２分２％アセトニトリル、８分２％から９５％アセトニトリルの勾配、４分９５％アセトニトリル。カラムフルーエントは、ポジティブ／ネガティブモードを切り替えるスキャン範囲（ｍ／ｚ８０〜１６００Ｄａ）で動作するＥＳＩ−ＭＳ  Ｏｒｂｉｔｒａｐに向かう。ポジティブモードの電圧パラメーターは、４．２ｋＶスプレー、５７．５Ｖキャピラリーおよび９５Ｖチューブレンズであった。ネガティブモードの電圧パラメーターは、３ｋＶスプレー、−２５Ｖキャピラリーおよび７５Ｖチューブレンズであった。キャピラリー温度３２５℃、シースガスフロー７０、補助ガスオフ。サーモＸＣａｌｉｂｕｒ（商標）処理ソフトウェアが、データ分析に使用された。本研究で報告されたすべての生成物は、ポジティブモード（Ｍ＋Ｈ＋）で検出された。
【００９４】
結果
ＬＭ３株についてのＬＣ−ＭＳによって得られた総イオンクロマトグラムは、出発コレステロール基質からのＡＤおよび４−ＢＮＣの蓄積を示し（図６）、それはＬＭ３単一変異体株においては側鎖分解の遮断がないことを示している。ＬＭ１５単一変異体株についても同じ結果が得られた（データ未掲載）。
【００９５】
例３−ＬＭ９を使用した生物変換（ΔｆａｄＥ３４＃１／ΔｆａｄＥ３４＃２）
材料および方法
上記の例２に概説したのと同じ培養条件、サンプル調製技術、およびＨＰＬＣ／ＬＣ−ＭＳプロトコルが使用された。
【００９６】
結果
出発基質としてコレステロールを使用してＬＭ９株のＬＣ−ＭＳによって得られた総イオンクロマトグラム（図７、生成物イオンマススペクトルが示されている）は、４−ＢＮＣ（ｍ／ｚ３４５．２４のピーク、ポジティブモード）（図７Ａ、上）および３−オキソ−４−コレン酸（ｍ／ｚ３７３．２７のピーク、ポジティブモード）（図７Ｂ、下）両方の蓄積を示している。対象化合物の質量電荷比（ｍ／ｚ）のデータを抽出して生成された抽出されたイオンクロマトグラムは、コレステロールが出発物質である場合（図８Ｃ、下のトレース、ｍ／ｚ３７３．２７のピーク）またはβ−シトステロールが出発物質である場合（図８Ｂ、中央のトレース、ｍ／ｚ３７３．２７のピーク）、ＬＭ９によって３−オキソ−４−コレン酸が生成され、７−オキソ−ステロールが出発基質である場合に３−オキソ−７−ヒドロキシ−４−コレン酸が生成される（図８Ａ、上のトレース、ｍ／ｚ３８９．２７のピーク）ことを示している。これらの結果は、ＬＭ９株に側鎖分解の遮断があることを示している。
【００９７】
例４−ＬＭ１９株を使用した生物変換（ｋｓｈＡ５で補完されたΔｆａｄＥ３４＃１／ΔｆａｄＥ３４＃２）
材料および方法
ＬＭ１９株の構築
ｋｓｈＡ５遺伝子の野生型コピーおよびその隣接領域は、プライマーｋｓｈＡ５−ｃｏｍｐｌｅｍ−ＦおよびｋｓｈＡ５−ｃｏｍｐｌｅｍ−Ｒを使用したＰＣＲによって増幅された（付録Ｄ）。得られた２．２ｋｂのＰＣＲ産物はクリーンアップされ、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで制限され、続いてｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢにライゲーションされ、コンストラクトｐｋ１８＋ｋｓｈＡ５−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎを得た。このコンストラクトはＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１に形質転換され、共役によってＬＭ９株に移された。ｋｓｈＡ５の欠失されたコピーが野生型のものに置き換えられた、結果として生じた補完変異体ＬＭ１９は、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ  ｅｔ  ａｌ，２００１に記載されているとおりに、変異体株の構築に使用されたのと同じ共役プロトコルに従って得られた。
【００９８】
ＬＭ１９による生物変換
上記のように、ｋｓｈＡ５およびその隣接領域をＬＭ９株に再導入してＬＭ１９株を生成し、そこでヒドロキシラーゼ活性を回復させて、９−ヒドロキシル基を持つ多様化合物を生成した。蓄積されると予想される化合物は、３−オキソ−９−ＯＨ−４−コレン酸（β−シトステロールおよびコレステロールから）および３−オキソ−７，９−ジヒドロキシ−４−コレン酸（７−オキソ−ステロールから）であった。
【００９９】
上記の例２に概説したのと同じ培養条件、サンプル調製技術、およびＨＰＬＣ／ＬＣ−ＭＳプロトコルが使用された。
【０１００】
結果
ＬＭ９株とＬＭ１９株で生成された抽出されたイオンクロマトグラムを比較は、出発ステロールがコレステロールまたはβ−シトステロールの場合に、ＬＭ１９のみによって３−オキソ−９−ＯＨ−４−コレン酸（ピークは８．０７−８．０９分）が生成され（それぞれ図９Ａおよび９Ｃ）およびは、出発ステロールがコレステロールまたはβ−シトステロールの場合にＬＭ９のみによって３−オキソ−４−コレン酸（ピークは９．６８−９．７０分）生成される（それぞれ図９Ｂおよび９Ｄ）を示している。これらのピークは、出発ステロールがコレステロールまたはβ−シトステロールである場合にＬＭ１９によって３−オキソ−９−ＯＨ−４−コレン酸（ｍ／ｚ約３８９．２７のピーク、ポジティブモード）が生成されること（図１０Ａ）、出発ステロールがコレステロールまたはβ−シトステロールの場合にＬＭ９によって３−オキソ−４−コレン酸（ピークは３７３．２７、ポジティブモード）が生成されること（図１０Ｂ）が確認された。
【０１０１】
出発ステロールが７−オキソ−ステロールの場合、予想される生成物は３−オキソ−７，９−ジヒドロキシ−４−コレン酸である。図１１のＬＭ１９についての抽出されたイオンクロマトグラムには、３−オキソ−７，９−ジヒドロキシ−４−コレン酸に対応するピークがある（ｍ／ｚ４０５．２６のピークは、ポジティブモード）。ただし、このピークは、図１０のＬＭ１９で生成されたピークよりも強度が低くなっている。概要として、これらの結果は、９−ヒドロキシ基を持つ多様ステロイド化合物の生成におけるＬＭ１９の使用の成功を示している。
【０１０２】
例５−ＬＭ３３株を使用した生物変換（ΔｆａｄＥ３４＃１／ΔｆａｄＥ３４＃２／ΔｆａｄＥ２６）
材料および方法
追加の変異体株ΔｆａｄＥ３４＃１／ΔｆａｄＥ３４＃２／ΔｆａｄＥ２６（ＬＭ３３）は、ＬＭ９株からｆａｄＥ２６を欠失させることによって生成された。ｆａｄＥ２６はβ酸化の第１のサイクルに関与し（図２および３）、基質として３−オキソ−４−コレン酸を使用し得（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１５．ＡＣＳ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１（２）：１１０−１２５）、それによってその蓄積を制限する。したがって、ｆａｄＥ２６の欠損は、３−オキソ−４−コレン酸の不要な酸化の減少につながる可能性があると考えられていた。
【０１０３】
上記の例２に概説したのと同じ培養条件、サンプル調製技術、およびＨＰＬＣ／ＬＣ−ＭＳプロトコルが使用された。
【０１０４】
結果
２５ｍＭメチル−β−シクロデキストリン（ＭＣＤ）の存在下でのＬＭ９およびＬＭ３３株によるβ−シトステロールの生物変換の比較（以下の例７を参照）は、ＬＭ３３サンプルについてのＨＰＬＣトレースの主要なピークが３−オキソ−４−コレン酸であり、かつＡＤおよび４−ＢＮＣに対応するピークははるかに小さいのに対し、ＬＭ９についてのＨＰＬＣトレースではその逆が観察される（図１２）ことを示している。これは、ＬＭ３３のｆａｄＥ２６の追加の欠失は、３−オキソ−４−コレン酸のさらなる蓄積が可能になることを示しており、３−オキソ−４−コレン酸の不要な酸化が減少することを示唆している。
【０１０５】
さらに、２５ｍＭメチル−β−シクロデキストリン（ＭＣＤ）の存在下での出発基質としての３−オキソ−４−コレン酸に対するＬＭ９およびＬＭ３３株の活性の比較は、ＬＭ３３サンプルについてのＨＰＬＣトレースの主要なピークは３−オキソ−４−コレン酸のままであり、かつＡＤおよび４−ＢＮＣに対応するピークは非常に小さいことを示している。対照的に、ＬＭ９についてのＨＰＬＣトレース（図１３）において、３−オキソ−４−コレン酸のピークが減少し、かつＡＤおよび４−ＢＮＣのピークがはるかに顕著である。これは、ＬＭ９ではＡＤと４−ＢＮＣが形成されるにつれて３−オキソ−４−コレン酸の濃度が時間とともに減少するが、ｆａｄＥ２６も欠失されているＬＭ３３では３−オキソ−４−コレン酸のＡＤおよび４−ＢＮＣへの変換が大幅に減少することを示している。したがって、これらの結果は、ＬＭ３３では３−オキソ−４−コレン酸の不要な酸化が減少することを示唆している。
【０１０６】
例６−２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンが補充された培地におけるＬＭ９を使用した生物変換
材料および方法
培養培地への２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンの添加は、疎水性ステロール出発化合物の溶解度を改善するために試みられた。
【０１０７】
ＬＭ９株は、約４８時間後、ＯＤ６００ｎｍ＝５になるまで、例２に記載されるように培養された。その培養物は室温および４，５００ｒｐｍで１５〜２０分間遠心分離された。細胞は同量の最小培地（Ｋ２ＨＰＯ４（４．６５ｇ／ｌ）、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（１．５ｇ／ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（３ｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１ｇ／ｌ）およびＶｉｓｈｎｉａｃ微量元素溶液（１ｍｌ／ｌ））に再懸濁した。これは１０ｍｌの培養物に分割し、２５ｍＭの２−ＯＨプロピルβシクロデキストリン、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３および２ｍＭのステロールは粉末形態で添加された。
【０１０８】
上記の例２に概説したのと同じサンプル調製技術およびＨＰＬＣ／ＬＣ−ＭＳプロトコルが使用された。
【０１０９】
結果
出発基質としてβ−シトステロールを使用したＬＭ９株のＬＣ−ＭＳによって得られた抽出されたイオンクロマトグラムは、２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンの存在下で３−オキソ−４−コレン酸（ｍ／ｚ３７３．２７のピーク、ポジティブモード）がＬＭ９によって生成されることを示している。（図１４）。生成された３−オキソ−４−コレン酸の量を定量化するために、ＨＰＬＣ分析が実行され（図１５）、７２時間の時点で採取されたサンプルにおいて１１．６４％の収率が観察された（以下の表１）。
【表１】
2021533823.tif 000066
【０１１０】
出発基質として７−オキソ−ステロールを使用して同様の実験が実行され、抽出されたイオンクロマトグラムは、Ｔ＝４８時間での３−オキソ−７−ヒドロキシ−４−コレン酸の生成を示している（図１６）。２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンの存在下と非存在下でのＬＣ−ＭＳスペクトルの比較（図１６Ａおよび１６Ｂ）は、２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンの存在下でのより強い塩基ピーク（図１６のトレースのＮＬ値によって証明される）を明らかにし、これらの培養物中の３−オキソ−７−ヒドロキシ−４−コレン酸のより高い収率を示している。ただし、ＨＰＬＣ定量化に利用できる標準がないため、取得可能な収率に関するデータはない。
【０１１１】
培養物にＮａＨＣＯ３を補充しなかった同等の実験を実施した（データは示していない）。これらの実験において、図１４、図１５および図１６ならび表１に示す結果から有意な差はなく、それによって、ＮａＨＣＯ３の存在は、２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンを補充した培養物における収量に正の効果を生じるのに必要とされないことを示している。
【０１１２】
例７−メチル−β−シクロデキストリンを補充した培地におけるＬＭ９およびＬＭ３３を使用した生物変換
材料および方法
培養培地へのメチル−β−シクロデキストリンの添加は、疎水性ステロール出発化合物の溶解度をさらに改善するために試みられた。
【０１１３】
ＬＭ９株は、約４８時間後、ＯＤ６００ｎｍ＝５になるまで、例２に記載されるように培養された。例６に記載されているように、培養物は遠心分離され、その細胞は同量の最小培地に再懸濁した。これは１０ｍｌの培養物に分けられ、２５ｍＭのメチル−β−シクロデキストリンおよび２ｍＭのステロールは粉末の形状で添加された。
【０１１４】
３−オキソ−４−コレン酸の収量をさらに最大化するために、メチル−β−シクロデキストリンはＬＭ３３株に添加された（図１２を参照）。ＬＭ３３株は、約４８時間後、ＯＤ６００ｎｍ＝５になるまで、例２に記載されるようにＬＢ培地で培養された。次に、前培養物は１０ｍｌの培養物に分割され、２５ｍＭのメチル−β−シクロデキストリンおよび２ｍＭのステロールは粉末の形状で添加された。あるいは、培養物は遠心分離され、その細胞は同量の最小培地に再懸濁した。これは１０ｍｌの培養物に分けられ、２５ｍＭのメチル−β−シクロデキストリンおよび２ｍＭのステロールは粉末の形状で添加された。
【０１１５】
上記の例２に概説したのと同じサンプル調製技術およびＨＰＬＣ／ＬＣ−ＭＳプロトコルが使用された。
【０１１６】
結果
以下の表２は、出発基質としてβ−シトステロールを使用した、メチル−β−シクロデキストリンの存在下でのＬＭ９についてのＨＰＬＣ分析によって得られた３−オキソ−４−コレン酸の最大収率を要約し、それらの収量を２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンの存在で得られた収量と比較した（上記の例６を参照）。全体的な結果は、メチル−β−シクロデキストリンの存在下で収量が高いことを示している。
【表２】
2021533823.tif 000067
【０１１７】
メチル−β−シクロデキストリン（２５ｍＭ）の存在下でＬＭ９によって生成された生成物の量の定量化は、ＨＰＬＣ分析を使用して実施された。β−シトステロールが出発基質であり、分析されたサンプルは７２時間の時点で収集された。収率は、上記の例２に概説されているように計算され、以下の表３に示されている。
【表３】
2021533823.tif 000068
【０１１８】
同様に、以下の表４は、出発基質として７−オキソ−ステロールを使用したメチル−β−シクロデキストリンの存在下でのＬＭ９における生物変換を比較している。３−オキソ−７−ヒドロキシ−４−コレン酸の利用可能な標準がないため、収率として表すのではなくＨＰＬＣで得られたピーク面積を比較する。しかしながら、結果は、２−ＯＨ−プロピル−β−シクロデキストリンと比較して、メチル−β−シクロデキストリンの存在下でより大きなピーク面積が達成されることを依然として示している。
【表４】
2021533823.tif 000069
【０１１９】
以下の表５は、コレステロールおよびβ−シトステロールの両方を出発基質として使用し、メチル−β−シクロデキストリンの存在下でＬＢ培地および最小培地の両方で培養したＬＭ３３のＨＰＬＣ分析によって得られた３−オキソ−４−コレン酸の収率を要約した。上記の表３と以下の表５とのデータを比較は、メチル−β−シクロデキストリンの存在下でＬＭ３３の培養は、β−シトステロールが出発基質である場合に３−オキソ−４−コレン酸の最も高い収率をもたらすことを示している。
【表５】
2021533823.tif 000070
【０１２０】
例８−有機溶媒およびシクロデキストリンを補充した培地におけるＬＭ３３を使用した生物変換
材料および方法
ＬＭ３３株は、約４８時間後、ＯＤ６００ｎｍ＝５になるまで、例１に記載されるように培養された。培養物は室温で１５〜２０分間４，５００ｒｐｍで遠心分離された。その細胞は同量の最小培地に再懸濁され、培養物は１０ｍｌの培養物に分けた。エタノールに溶解した２ｍＭのβ−シトステロールが添加され（５％または１０％の最終容量／容量濃度）、さまざまな量のメチル−β−シクロデキストリン（５ｍＭ、１２．５ｍＭ、または２５ｍＭ）が粉末の形状で添加された。
【０１２１】
上記の例２に概説したのと同じサンプル調製技術およびＨＰＬＣ／ＬＣ−ＭＳプロトコルが使用された。
【０１２２】
結果
エタノールおよびメチル−β−シクロデキストリンのすべての濃度のＨＰＬＣデータは例２に記載のように処理され、以下の表６に示す３−オキソ−４−コレン酸の収率を得た。全体として、５％エタノールと５ｍＭメチル−β−シクロデキストリンを組み合わせの使用によって、最高の収率がもたらされた。
【表６】
2021533823.tif 000071
【０１２３】
例９−Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｏａｕｒｕｍ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３８０５ΔｆａｄＥ３４（ＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４）を使用した生物変換
材料および方法
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｏａｕｒｕｍ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３８０５  ΔｆａｄＥ３４株は、３−オキソ−４−コレン酸の酸化を防ぐことを目的として、ｆａｄＥ３４の欠失を親株ＮＲＲＬ  Ｂ−３８０５に導入することによって生成された（Ｍａｒｓｈｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ，１９７２．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３（１）：７２−７７）。これは、親株ＮＲＲＬ  Ｂ−３８０５テンプレートおよび付録Ｄに記載されているプライマーを使用して、例１で説明したのと同じストラテジーに従い、ｐｋ１８＿ｆａｄＥ３４＿Ｍｎｅｏ−ＵＰ＋ＤＯＷＮプラスミドが構築された。この変異原性プラスミドは、エレクトロポレーション（２．５ｋＶ、２５μＦ、６００Ω）によってＮＲＲＬ  Ｂ−３８０５株に移された。変異体株は、ｆａｄＥ３４の欠失を確認するために特定のプライマー（付録Ｄ）を使用したＰＣＲによって検証された。
【０１２４】
ＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４前培養は、ＯＤ６００ｎｍ＝５（３７℃で約７２時間）まで増殖させた。培養物は遠心分離され、その細胞は同量の最小培地に懸濁した。２ｍＭの出発ステロイド基質は粉末の形状で添加された。
【０１２５】
上記の例２に概説したのと同じサンプル調製技術およびＨＰＬＣ／ＬＣ−ＭＳプロトコルが使用された。
【０１２６】
結果
図１７、図１８、および図１９のＨＰＬＣトレースは、コレステロール、β−シトステロール、および７−オキソステロールがそれぞれの出発基質である場合に、Ｍｎｅｏ−親株およびＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４株によって生成された化合物を比較している。コレステロール（図１７）およびβ−シトステロール（図１８）の場合、ＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４株はＭｎｅｏ−ｐａｒｅｎｔ株よりも高レベルの３−オキソ−４−コレン酸ならびに低レベルのＡＤおよびＡＤＤを蓄積する。これらの結果は、ＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４株が３−オキソ−４−コレン酸ステップで側鎖酸化が遮断されていることを示している。Ｍｎｅｏ親株ＮＲＲＬ  Ｂ−３８０５は、ＫＳＨおよびＫｓｔＤを欠いていると説明されたが、３−オキソ−１，４−コラジエン酸の生成に対応するピークもあり、ＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４（したがって、親株ＮＲＲＬ  Ｂ−３８０５）はＫｓｔＤ活性が残っている可能性がある。
【０１２７】
７−オキソステロールが出発基質である場合（図１９）、Ｍｎｅｏ親株ＮＲＲＬ  Ｂ−３８０５およびＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４について得られたトレースは非常に類似しており、７−ＯＨ化合物を蓄積できないことを示している。
【０１２８】
例１０−メチル−β−シクロデキストリンを補充した培地におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｏａｕｒｕｍ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３８０５ΔｆａｄＥ３４を使用した生物変換（ＭｎｅｏΔｆａｄＥ３４）
材料および方法
上記の例９に概説したのと同じ菌株および培養条件が使用され、２５ｍＭメチル−β−シクロデキストリンは粉末の形状で添加された。２ｍＭフィトステロールミックス（Ａｔｕｒｅｘ  ９０）または３−オキソ−４−コレン酸が出発化合物として添加された。上記の例２に概説したのと同じサンプル調製技術およびＨＰＬＣ／ＬＣ−ＭＳプロトコルが使用された。
【０１２９】
結果
Ｍｎｅｏ−ΔｆａｄＥ３４は、これらの細胞がメチル−β−シクロデキストリンの存在下で最小培地で培養され、かつフィトステロール混合物が出発基質である場合、３−オキソ−１，４−コラジエン酸の可能なピークを蓄積する（図２０）。
【０１３０】
３−オキソ−４−コレン酸が出発基質である場合、３−オキソ−１，４−コレン酸の蓄積はなく（図２１）、３−オキソ−４−コレン酸の存在によってその生成が活性化されない可能性が高いことを示している。
【０１３１】
例１１−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンを補充した培地におけるＬＭ３３を使用した生物変換
材料および方法
生物変換は、増殖中の細胞、すなわち発酵の開始時に反応器に添加された生物変換試薬を用いて実施された。前培養は以下のように準備された：
１）５０ｍＬのＬＢ培地が１００ｍＬの三角フラスコに添加された。
２）２００μＬのＲ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＬＭ３３がグリセロールストックから植菌された。
３）培養物はオービタルシェーカー上で４００ＲＰＭ、３０℃で４８時間インキュベートされた。
４）１％（５ｍＬ）のＯＤ５培養物がバイオリアクターへ植菌された。
【０１３２】
バイオリアクターは（括弧内の最終濃度）トリプトン（１０ｇ／Ｌ）酵母エキス（１０ｇ／Ｌ）、ＮａＣＬ（０．５ｇ／Ｌ）；消泡剤ＤＲ２０４（０．０１５ｇ／Ｌ）、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（２３．３ｇ／Ｌ）、フィトステロールの既製混合物ＡＳ−７（７０ｇ／Ｌ）およびＴｗｅｅｎ−８０（１７．５ｇ／Ｌ）ならびに水が充填された。混合物は反応器内で１２１℃で３分間オートクレーブ処理された。生物変換は、３０℃、ｐＨ７．０、２００ｍＬ／分および４０％ｄＯ２設定値での表面からの曝気で実行された。
【０１３３】
酸素消費および若干ＣＯ２生成から判断されるように初期の増殖は１２時間未満続いた。実験開始から４８時間後、ＣＯ２生成はなく、生物変換は１０％（５０ｍＬ）の植菌率で新鮮な前培養から再植菌された。２回目の植菌後、最初の酸素消費段階もあり、これは６時間続き、その後再び酸素消費量が減少した。しかし、その減少後の培養は回復し、酸素を消費しはじめ、再びＣＯ２を生成し始めた。
【０１３４】
３−オキソ−４−コレン酸の形成は、１１２時間後に検出された。実験は１６０時間後に終了し、その時点で生成物濃度は６．０９ｍＭに達した。
【０１３５】
バイオマスおよび未反応のフィトステロールは、最初に２Ｍ  ＮａＯＨの添加によってして培養液のｐＨをｐＨ１０に上げ、続いて４７００ｇで１０分間、４℃で遠心分離することにより分離され、生成物を含む透明な溶液（４５３ｇ）が得られた。この溶液から、３６０ｇ（ｐＨ＝７．２）が４×１００  ｍｌ  ＭＴＢＥで抽出され、次に希釈ＨＣｌでｐＨ＝２．１に調整し、２ｘ１００ｍｌトルエンで再度抽出された。３−オキソ−４−コレン酸の大部分はＭＴＢＥ抽出物で検出され、トルエン抽出物中に少数が検出された。抽出物は蒸発乾固され、ＭＴＢＥに溶解されてプールされた。溶液は希ＨＣｌで洗浄され、ロタバップで濃縮された。得られた残留物から、一晩撹拌することにより３−オキソ−４−コレン酸が沈殿した。３−オキソ−４−コレン酸の同一性はＮＭＲによって確認された（図２２）。
【０１３６】
結果
図２２のスペクトルは、単離された生成物が３−オキソ−４−コレン酸と同一であることを裏付けている。図２２（Ａ）および（Ｂ）は、生成物から得られた１Ｈスペクトルを示し、図２２（Ｃ）および（Ｄ）は、生成物から得られた１３Ｃスペクトルを示す。ピークのラベルは、図２２（Ａ）および（Ｃ）に示す３−オキソ−４−コレン酸の式に示されている官能基に対応している。
【表７−１】
2021533823.tif 000072
【表７−２】
2021533823.tif 000073
【表７−３】
2021533823.tif 000074
【表７−４】
2021533823.tif 000075
【表７−５】
2021533823.tif 000076
【表７−６】
2021533823.tif 000077
【表７−７】
2021533823.tif 000078
【表７−８】
2021533823.tif 000079
【表７−９】
2021533823.tif 000080
【表７−１０】
2021533823.tif 000081
【表７−１１】
2021533823.tif 000082
【表７−１２】
2021533823.tif 000083
【表７−１３】
2021533823.tif 000084
【表７−１４】
2021533823.tif 000085
【表８−１】
2021533823.tif 000086
【表８−２】
2021533823.tif 000087
【表８−３】
2021533823.tif 000088
【表８−４】
2021533823.tif 000089
【表９−１】
2021533823.tif 000090
【表９−２】
2021533823.tif 000091
【表１０−１】
2021533823.tif 000092
【表１０−２】
2021533823.tif 000093
【図１】
2021533823.tif 000155
【図２】
2021533823.tif 000156
【図３】
2021533823.tif 000157
【図４】
2021533823.tif 000158
【図５】
2021533823.tif 000159
【図６】
2021533823.tif 000160
【図７】
2021533823.tif 000161
【図８】
2021533823.tif 000162
【図９】
2021533823.tif 000163
【図１０】
2021533823.tif 000164
【図１１】
2021533823.tif 000165
【図１２】
2021533823.tif 000166
【図１３】
2021533823.tif 000167
【図１４】
2021533823.tif 000168
【図１５】
2021533823.tif 000169
【図１６】
2021533823.tif 000170
【図１７】
2021533823.tif 000171
【図１８】
2021533823.tif 000172
【図１９】
2021533823.tif 000173
【図２０】
2021533823.tif 000174
【図２１】
2021533823.tif 000175
【図２２Ａ】
2021533823.tif 000176
【図２２Ｂ】
2021533823.tif 000177
【図２２Ｃ】
2021533823.tif 000178
【図２２Ｄ】
2021533823.tif 000179
【図２２Ｅ】
2021533823.tif 000180
【図２２Ｆ】
2021533823.tif 000181
【配列表】
2021533823000001.app
【国際調査報告】
2021533823.tif 000182
2021533823.tif 000183
2021533823.tif 000184
2021533823.tif 000185