(57)【要約】本明細書では、１種または複数種のグルコース輸入ポリペプチド、及び任意選択的に、キメラ受容体ポリペプチド、例えば、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチドまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、を発現する、遺伝子改変免疫細胞を開示する。本明細書ではまた、単独、または標的抗原に結合するＦｃ含有治療薬（例えば、抗体）との組み合わせのいずれかで用いられる、治療を必要とする対象における標的抗原を発現する細胞を阻害するための、このような遺伝子改変免疫細胞の使用を開示する。【選択図】図４Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一タイプの野生型免疫細胞と比較して向上したグルコース取り込み活性を示す遺伝子改変免疫細胞。
【請求項２】
（ｉ）グルコース輸入ポリペプチド
を発現または過剰発現する、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項３】
前記グルコース輸入ポリペプチドはグルコース輸送体（ＧＬＵＴ）またはナトリウム−グルコース共輸送体（ＳＧＬＴ）である、請求項２に記載の免疫細胞。
【請求項４】
前記グルコース輸入ポリペプチドは、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ１  Ｓ２２６Ｄ、ＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ８  Ｌ１２Ａ  Ｌ１３Ａ、ＧＬＵＴ１１、ＧＬＵＴ７、及びＧＬＵＴ４、からなる群から選択される、請求項２または請求項３に記載の免疫細胞。
【請求項５】
（ｉｉ）キメラ受容体ポリペプチドを更に発現し、
前記キメラ受容体ポリペプチドは、
（ａ）細胞外標的結合ドメイン、
（ｂ）膜貫通ドメイン、及び、
（ｃ）細胞質シグナル伝達ドメイン、
を含む、
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項６】
前記キメラ受容体ポリペプチドは、（ａ）が細胞外Ｆｃ結合ドメインである抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチドである、請求項５に記載の免疫細胞。
【請求項７】
前記キメラ受容体ポリペプチドは、（ａ）が細胞外抗原結合ドメインであるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドである、請求項５に記載の免疫細胞。
【請求項８】
前記キメラ受容体ポリペプチドは少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを更に含む、請求項５から請求項７のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項９】
任意選択的にＡＣＴＲポリペプチドである前記キメラ受容体ポリペプチドは、共刺激シグナル伝達ドメインを含まない、請求項５から請求項７のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項１０】
前記細胞質シグナル伝達ドメインは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項５から請求項９のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項１１】
前記細胞質シグナル伝達ドメイン（ｃ）は、前記キメラ受容体ポリペプチドのＣ末端に位置している、請求項５から請求項１０のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項１２】
前記キメラ受容体ポリペプチドは、（ａ）のＣ末端かつ（ｂ）のＮ末端に位置するヒンジドメインを更に含む、請求項５から請求項１１のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項１３】
前記キメラ受容体ポリペプチドは、前記キメラ受容体ポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチドを更に含む、請求項５から請求項１２のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項１４】
前記（ａ）のＦｃ結合ドメインは、
（Ａ）Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、
（Ｂ）免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する抗体フラグメント、
（Ｃ）免疫グロブリンのＦｃ部分またはそのＦｃ結合フラグメントに結合する天然タンパク質、及び、
（Ｄ）免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する合成ポリペプチド、
からなる群から選択される、請求項６から請求項１３のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項１５】
前記Ｆｃ結合ドメインは、Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃアルファ受容体、またはＦｃイプシロン受容体の細胞外リガンド結合ドメインである（Ａ）である、請求項１４に記載の免疫細胞。
【請求項１６】
前記Ｆｃ結合ドメインは、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ３２Ａ、またはＣＤ６４Ａの細胞外リガンド結合ドメインである、請求項１５に記載の免疫細胞。
【請求項１７】
前記Ｆｃ結合ドメインは、Ｆ１５８  ＣＤ１６ＡまたはＶ１５８  ＣＤ１６Ａの細胞外リガンド結合ドメインである、請求項１６に記載の免疫細胞。
【請求項１８】
前記Ｆｃ結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）、ドメイン抗体、またはナノボディである（Ｂ）である、請求項１４に記載の免疫細胞。
【請求項１９】
前記Ｆｃ結合ドメインは、プロテインＡもしくはプロテインＧ、またはそのＦｃ結合フラグメントである（Ｃ）である、請求項１４に記載の免疫細胞。
【請求項２０】
前記Ｆｃ結合ドメインは、Ｋｕｎｉｔｚペプチド、ＳＭＩＰ、アビマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、またはアンチカリンである（Ｄ）である、請求項１４に記載の免疫細胞。
【請求項２１】
前記（ｂ）の膜貫通ドメインは、１回貫通型膜タンパク質のものである、請求項５から請求項２０のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項２２】
前記（ａ）の細胞外抗原結合ドメインは、腫瘍抗原、病原体抗原、または自己抗原に特異的な免疫細胞に結合する一本鎖抗体フラグメントである、請求項７から請求項１３のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項２３】
前記腫瘍抗原は血液腫瘍と関連している、請求項２２に記載の免疫細胞。
【請求項２４】
前記腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ鎖、ＣＤ３０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＬｅＹ、ＣＤ１３８、ＣＤ５、ＢＣＭＡ、ＣＤ７、ＣＤ４０、及びＩＬ−１ＲＡＰ、からなる群から選択される、請求項２３に記載の免疫細胞。
【請求項２５】
前記腫瘍抗原は固形腫瘍と関連している、請求項２３に記載の免疫細胞。
【請求項２６】
前記腫瘍抗原は、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＦＯＬＲ、ＨＥＲ２、ＥｐｈＡ２、ＥＦＧＲＶＩＩＩ、ＩＬ１３ＲＡ２、ＶＥＧＦＲ２、ＲＯＲ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＤ１７１、ＣＤ１３３、ＰＳＣＡ、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＦＡＰ、ＣＤ７０、ＭＵＣ１６、Ｌ１−ＣＡＭ、及びＣＡＩＸ、からなる群から選択される、請求項２５に記載の免疫細胞。
【請求項２７】
前記病原体抗原は、細菌抗原、ウイルス抗原、または真菌抗原である、請求項２２に記載の免疫細胞。
【請求項２８】
前記（ｂ）の膜貫通ドメインは、１回貫通型膜タンパク質のものである、請求項５から請求項２７のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項２９】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６Ａ、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、及びＦＧＦＲ２Ｂ、からなる群から選択される膜タンパク質のものである、請求項２８に記載の免疫細胞。
【請求項３０】
前記（ｂ）の膜貫通ドメインは非天然疎水性タンパク質セグメントである、請求項５から請求項２７のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、及びＣＤ２、からなる群から選択される共刺激分子のものである、請求項５から請求項８、及び請求項１０から請求項３０のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインまたは４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインである、請求項３１に記載の免疫細胞。
【請求項３３】
前記ＡＣＴＲポリペプチドは２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項５から請求項８、及び請求項１０から請求項３２のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項３４】
前記２つの共刺激ドメインは、
（ｉ）ＣＤ２８及び４−１ＢＢ、または、
（ｉｉ）ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント及び４−１ＢＢ
である、請求項３３に記載の免疫細胞。
【請求項３５】
前記共刺激シグナル伝達ドメインのうちの一方はＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインであり、もう一方の共刺激ドメインは、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達ドメイン、からなる群から選択される、請求項３３に記載の免疫細胞。
【請求項３６】
前記（ｃ）の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲ１γの細胞質ドメインである、請求項５から請求項２８のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項３７】
前記ヒンジドメインは１〜６０アミノ酸長である、請求項１２から請求項３６のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項３８】
前記ヒンジドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ８α、またはＩｇＧのものである、請求項１２から請求項３７のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項３９】
前記ヒンジドメインは非天然ペプチドである、請求項１２から請求項３８のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項４０】
前記ヒンジドメインは、延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎポリペプチドであり、ｎは３〜１２（３及び１２を含む）の整数である、請求項３９に記載の免疫細胞。
【請求項４１】
前記キメラ受容体ポリペプチドはヒンジドメインを何ら含まない、請求項５から請求項１１、及び請求項１３から請求項３６のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項４２】
前記キメラ受容体ポリペプチドは、任意の非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含まない、ＡＣＴＲポリペプチドである、請求項４１に記載の免疫細胞。
【請求項４３】
前記ＡＣＴＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン、及び（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、またはこれらの組み合わせ、を含む、請求項６に記載の免疫細胞。
【請求項４４】
前記ＡＣＴＲポリペプチドは、表３に示す構成要素（ａ）〜（ｅ）を含む、請求項６に記載の免疫細胞。
【請求項４５】
前記ＡＣＴＲポリペプチドは、配列番号：１〜８０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の免疫細胞。
【請求項４６】
前記キメラ受容体ポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、もしくはこれらの組み合わせと組み合わされたＣＤ２８共刺激ドメイン、または（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、もしくはこれらの組み合わせと組み合わされた４−１ＢＢ共刺激ドメイン、を含む、ＣＡＲポリペプチドである、請求項７に記載の免疫細胞。
【請求項４７】
前記ＣＡＲポリペプチドは配列番号：１０４または１０５のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の免疫細胞。
【請求項４８】
ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、またはＴ細胞である、請求項１から請求項４７のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項４９】
内在性Ｔ細胞受容体、内在性主要組織適合遺伝子複合体、内在性ベータ２−ミクログロブリン、またはこれらの組み合わせの発現が阻害または除去されているＴ細胞である、請求項４８に記載の免疫細胞。
【請求項５０】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、請求項１から請求項４９のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項５１】
（Ａ）前記グルコース輸入ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、及び任意選択的に、
（Ｂ）前記キメラ受容体ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列、
を集合的に含む、核酸または核酸セットを含む、請求項１から請求項５０のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項５２】
前記核酸または前記核酸セットはＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子のセットである、請求項５１に記載の免疫細胞。
【請求項５３】
前記第１のヌクレオチド配列と前記第２のヌクレオチド配列の両方を含む、前記核酸を含む、請求項５１または請求項５２に記載の免疫細胞。
【請求項５４】
前記核酸は、前記第１のヌクレオチド配列と前記第２のヌクレオチド配列の間に位置する第３のヌクレオチド配列を更に含み、前記第３のヌクレオチド配列は、リボソームスキッピング部位、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、または第２のプロモーターをコードする、請求項５３に記載の免疫細胞。
【請求項５５】
前記第３のヌクレオチド配列は、Ｐ２Ａペプチドであるリボソームスキッピング部位をコードする、請求項５４に記載の免疫細胞。
【請求項５６】
前記核酸または前記核酸セットは、ベクターまたはベクターのセットの内部に含まれる、請求項５１から請求項５５のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項５７】
前記ベクターまたは前記ベクターのセットは、発現ベクターまたは発現ベクターのセットである、請求項５６に記載の免疫細胞。
【請求項５８】
前記ベクターまたは前記ベクターのセットは、１つまたは複数のウイルスベクターを含む、請求項５６または請求項５７に記載の免疫細胞。
【請求項５９】
前記１つまたは複数のウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項５８に記載の免疫細胞。
【請求項６０】
請求項１から請求項５９のいずれか１項に記載の免疫細胞、及び薬学的に許容される担体、を含む医薬組成物。
【請求項６１】
前記免疫細胞は、ＡＣＴＲポリペプチドであるキメラ受容体ポリペプチドを更に発現し、前記組成物はＦｃ含有治療薬を更に含む、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
前記Ｆｃ含有治療薬は治療抗体またはＦｃ融合タンパク質である、請求項６１に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
前記Ｆｃ含有治療薬は、任意選択的に、腫瘍抗原、病原体抗原、または自己抗原に特異的な免疫細胞である、標的抗原に結合する、請求項６１または請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記病原体抗原は、細菌抗原、ウイルス抗原、または真菌抗原である、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記Ｆｃ含有治療薬は、アダリムマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、ムロモナブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、トシツモマブ、ウステキヌマブ、モガムリズマブ、及びベドリズマブ、からなる群から選択される治療抗体である、請求項６４に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
ＡＣＴＲポリペプチドを発現する請求項５から請求項５９のいずれか１項に記載の免疫細胞、及び薬学的に許容される担体、を含む第１の医薬組成物、ならびに、
Ｆｃ含有治療薬及び薬学的に許容される担体を含む第２の医薬組成物、
を含む、キット。
【請求項６７】
前記Ｆｃ含有治療薬はＦｃ融合タンパク質または治療抗体である、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
前記Ｆｃ含有治療薬は、任意選択的に、腫瘍抗原、病原体抗原、または自己抗原に特異的な免疫細胞である、標的抗原に結合する、請求項６６または請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
前記治療抗体は、アダリムマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、ムロモナブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、トシツモマブ、ウステキヌマブ、モガムリズマブ、及びベドリズマブ、からなる群から選択される、請求項６７に記載のキット。
【請求項７０】
対象における標的抗原を発現する細胞を阻害するための方法であって、請求項５から請求項５９のいずれか１項に記載の免疫細胞の集団を必要とする対象にそれを投与することを含む、前記方法。
【請求項７１】
前記免疫細胞はＡＣＴＲポリペプチドを発現し、前記対象は、前記標的抗原に特異的なＦｃ含有治療薬を用いた治療を受けたことがあるまたは受けている、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記免疫細胞は、前記標的抗原に特異的な細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドを発現する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記標的抗原は、腫瘍抗原、病原体抗原、または自己抗原に特異的な免疫細胞である、請求項７１または請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記病原体抗原は、細菌抗原、ウイルス抗原、または真菌抗原である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記標的抗原を発現する前記細胞のうちの少なくとも一部は、低グルコース環境に置かれている、請求項７０から請求項７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記免疫細胞は自家である、請求項７０から請求項７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記免疫細胞は同種異系である、請求項７０から請求項７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記免疫細胞はｅｘ  ｖｉｖｏで活性化されている、増殖されている、またはその両方を実施されている、請求項７０から請求項７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記Ｆｃ含有治療薬は治療抗体またはＦｃ融合タンパク質である、請求項７０、請求項７１、及び請求項７３から請求項７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記Ｆｃ含有治療薬は、アダリムマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、ムロモナブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、及びベドリズマブ、からなる群から選択される治療抗体である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記対象は、がんを患うヒト患者であり、前記標的抗原は腫瘍抗原である、請求項７０から請求項８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記がんは、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び白血病、からなる群から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記がんは、Ｂ細胞由来のがん、乳癌、胃癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺癌、皮膚癌、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓癌、頭頸部癌、網膜芽細胞腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、肝臓癌、及び甲状腺癌、からなる群から選択される、請求項８１または請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記Ｂ細胞由来のがんは、Ｂ細胞系急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、及びＢ細胞性非ホジキンリンパ腫、からなる群から選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記免疫細胞は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、フィトヘマグルチニン、及び改変人工刺激細胞または粒子、のうちの１種または複数種の存在下で活性化されるＴ細胞を含む、請求項７０から請求項８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記免疫細胞は、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、及びＫ５６２細胞、ならびに改変人工刺激細胞または粒子、のうちの１種または複数種の存在下で活性化されるナチュラルキラー細胞を含む、請求項７０から請求項８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
（Ａ）請求項５から請求項４７のいずれか１項に記載のキメラ受容体ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、及び、
（Ｂ）請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のグルコース輸入ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列、
を集合的に含む核酸または核酸セット。
【請求項８８】
ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子のセットである、請求項８７に記載の核酸または核酸セット。
【請求項８９】
前記核酸は、前記第１のヌクレオチド配列と前記第２のヌクレオチド配列の両方を含み、前記核酸は、前記第１のヌクレオチド配列と前記第２のヌクレオチド配列の間に位置する第３のヌクレオチド配列を更に含み、前記第３のヌクレオチド配列は、リボソームスキッピング部位、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、または第２のプロモーターをコードする、請求項８７または請求項８８に記載の核酸または核酸セット。
【請求項９０】
前記リボソームスキッピング部位はＰ２Ａペプチドである、請求項８９に記載の核酸または核酸セット。
【請求項９１】
ベクターまたはベクターのセットの内部に含まれる、請求項８７から請求項９０のいずれか１項に記載の核酸または核酸セット。
【請求項９２】
前記ベクターまたは前記ベクターのセットは、発現ベクターまたは発現ベクターのセットである、請求項９１に記載の核酸または核酸セット。
【請求項９３】
前記ベクターまたは前記ベクターのセットは、１つまたは複数のウイルスベクターを含む、請求項９１または請求項９２に記載の核酸または核酸セット。
【請求項９４】
前記１つまたは複数のウイルスベクターは、任意選択的に、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、レトロウイルスベクターである、請求項９３に記載の核酸または核酸セット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月３日に出願された米国仮出願第６２／６９３，６６８号、２０１８年１１月７日に出願された米国仮出願第６２／７５６，６６４号、２０１８年７月３日に出願された米国仮出願第６２／６９３，６７７号、２０１８年８月１日に出願された米国仮出願第６２／７１３，３６９号、及び２０１８年１１月７日に出願された米国仮出願第６２／７５６，６９８号、の出願日の利益を主張する。先出願のそれぞれの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
腫瘍細胞を攻撃しつつ正常組織を温存する免疫応答を誘発するために、細胞ベース療法を含むがん免疫療法が用いられている。がん免疫療法は、薬剤耐性の遺伝子及び細胞メカニズムを回避して、腫瘍細胞を標的としつつ正常組織を温存するその潜在能力ゆえに、様々なタイプのがんを治療するための有望な選択肢となっている。
【０００３】
細胞ベース療法は、がん細胞に偏った反応を示す細胞傷害性Ｔ細胞を含んでいてもよい。Ｅｓｈｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．；１９９３；９０（２）：７２０−７２４；Ｇｅｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１６２（１０）：５９３１−５９３９；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００３；９（３）：２７９−２８６；Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１（４）：１６３７−１６４４；及びＩｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００４；１８：６７６−６８４。１つのアプローチは、１つまたは複数のＴ細胞活性化シグナル伝達ドメインに融合した抗原結合ドメインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させることである。抗原結合ドメインを介してがん抗原が結合すると、Ｔ細胞の活性化がもたらされ、細胞傷害が誘発される。Ｂ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療におけるキメラ抗原受容体発現自家Ｔリンパ球の効果については、臨床試験において実証されている。Ｐｕｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００８；１４（１１）：１２６４−１２７０；Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ；２０１１；２５；３６５（８）：７２５−７３３；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１８（１８）：４８１７−４８２８；Ｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（１７）：３９４０−３９５０；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（１２）：２７０９−２７２０；及びＢｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１３；５（１７７）：１７７ｒａ１３８。
【０００４】
別のアプローチは、ＮＫ細胞またはＴ細胞などの免疫細胞において、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）タンパク質を発現させることであり、ＡＣＴＲタンパク質は細胞外Ｆｃ結合ドメインを含有している。ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞（「ＡＣＴＲ  Ｔ細胞」とも呼ばれる）を抗がん抗体と共に対象に投与すると、それらは、抗体のＦｃドメインへのがん細胞の結合により、抗体が標的とするがん細胞に対する毒性を増強し得る。Ｋｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１４）７４：９３−１０３。
【０００５】
細胞ベース免疫療法は、有望であるとはいえ、悪性腫瘍細胞と非形質転換細胞の間の相互作用により生じた細胞環境である腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の特定の特性が引き起こす課題に直面している。それゆえ、ＴＭＥの見地から、細胞ベース免疫療法の効果を向上させるための戦略を開発することが極めて重要である。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、細胞ベース免疫療法に使用する、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチドまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などのキメラ受容体ポリペプチドを発現する免疫細胞を含む、免疫細胞によるグルコース取り込みを向上させる戦略の開発に基づいている。グルコース取り込みの向上は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞）において、１種または複数種のグルコース輸入ポリペプチド、例えば、本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチドなどを発現（例えば、過剰発現）させることによって達成され得る。このような遺伝子改変免疫細胞は、例えば、低グルコース環境において（例えば、腫瘍微小環境において）、高いグルコース取り込みを示すと予測される。それゆえ、１種または複数種のグルコース輸入ポリペプチド及びキメラ受容体ポリペプチドを共発現する免疫細胞は、優れた生理活性（例えば、任意選択的に治療抗体の存在下、低グルコース条件などの腫瘍微小環境下で）、例えば、細胞増殖、活性化（例えば、サイトカイン産生、例えば、ＩＬ−２またはＩＦＮγの産生の増加）、細胞傷害性、及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性、を示し得る。
【０００７】
それゆえ、本明細書では、同一タイプの野生型免疫細胞と比較して向上したグルコース取り込み活性を示す、改変（遺伝子改変）免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞）を提供する。一部の例では、改変免疫細胞は、グルコース輸入ポリペプチドを発現または過剰発現し得る。グルコース輸入ポリペプチドはグルコース輸送体（ＧＬＵＴ）またはナトリウム依存性グルコース共輸送体（ＳＧＬＴ）であってもよい。例示的なグルコース輸入ポリペプチドとしては、グルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１、例えば、ＧＬＵＴ１  Ｓ２２６Ｄ）、グルコース輸送体３（ＧＬＵＴ３）、グルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）、グルコース輸送体７（ＧＬＵＴ７）、グルコース輸送体８（ＧＬＵＴ８、例えば、ＧＬＵＴ８  Ｌ１２Ａ  Ｌ１３Ａ）、グルコース輸送体１１（ＧＬＵＴ１１）、ナトリウム依存性グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ１）、及びナトリウム依存性グルコース共輸送体（ＳＧＬＴ２）、が挙げられるがこれらに限定されない。
【０００８】
改変免疫細胞はキメラ受容体ポリペプチドを更に発現していてもよく、キメラ受容体ポリペプチドは、（ａ）細胞外標的結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞質ドメイン）、を含んでいてもよい。一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、細胞外Ｆｃ結合ドメイン（ａ）を含む抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）である。その他の実施形態では、キメラ受容体は、細胞外抗原結合ドメイン（ａ）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。一部の例では、（ｃ）はキメラ受容体ポリペプチドのＣ末端に位置している。一部の例では、キメラポリペプチドは少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを更に含んでいてもよい。その他の例では、キメラ受容体ポリペプチドは共刺激シグナル伝達ドメインを含んでいなくてもよい。
【０００９】
本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチドまたはＣＡＲポリペプチド）のいずれかは、（ａ）のＣ末端かつ（ｂ）のＮ末端に位置するヒンジドメインを更に含んでいてもよい。その他の例では、キメラ受容体ポリペプチドはヒンジドメインを何ら含んでいなくてもよい。キメラ受容体がＡＣＴＲポリペプチドである場合、そのキメラ受容体は、任意の非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含んでいなくてもよい。代替的にまたは加えて、キメラ受容体ポリペプチドはそのＮ末端にシグナルペプチドを更に含む。
【００１０】
一部の実施形態では、本明細書で開示するキメラ受容体ポリペプチドは、Ｆｃ結合ドメイン（ａ）を含むＡＣＴＲポリペプチドであってもよい。一部の例では、（ａ）のＦｃ結合ドメインは、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、例えば、Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃアルファ受容体、またはＦｃイプシロン受容体の細胞外リガンド結合ドメインであってもよい。特定の例では、Ｆｃ結合ドメインは、ＣＤ１６Ａ（例えば、Ｆ１５８  ＣＤ１６ＡまたはＶ１５８  ＣＤ１６Ａ）、ＣＤ３２Ａ、またはＣＤ６４Ａの細胞外リガンド結合ドメインである。その他の例では、（ａ）のＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する抗体フラグメントであってもよい。例えば、抗体フラグメントは、一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、またはナノボディであってもよい。加えて、（ａ）のＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分またはそのＦｃ結合フラグメントに結合する天然タンパク質であってもよい。例えば、Ｆｃ結合ドメインは、プロテインＡもしくはプロテインＧ、またはそのＦｃ結合フラグメントであってもよい。更なる例では、（ａ）のＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する合成ポリペプチドであってもよい。例としては、Ｋｕｎｉｔｚペプチド、ＳＭＩＰ、アビマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、またはアンチカリン、が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１１】
一部の実施形態では、本明細書で開示するキメラ受容体ポリペプチドは、細胞外抗原結合ドメイン（ａ）を含むＣＡＲポリペプチドであってもよい。一部の例では、（ａ）の細胞外抗原結合ドメインは、腫瘍抗原、病原体抗原、または自己抗原に特異的な免疫細胞に結合する一本鎖抗体フラグメントである。特定の例では、腫瘍抗原は血液腫瘍と関連している。例としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ鎖、ＣＤ３０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＬｅＹ、ＣＤ１３８、ＣＤ５、ＢＣＭＡ、ＣＤ７、ＣＤ４０、及びＩＬ−１ＲＡＰ、が挙げられるがこれらに限定されない。特定の例では、腫瘍抗原は固形腫瘍と関連している。例としては、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＦＯＬＲ（例えば、ＦＯＬＲ１またはＦＯＬＲ２）、ＨＥＲ２、ＥｐｈＡ２、ＥＦＧＲＶＩＩＩ、ＩＬ１３ＲＡ２、ＶＥＧＦＲ２、ＲＯＲ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＤ１７１、ＣＤ１３３、ＰＳＣＡ、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＦＡＰ、ＣＤ７０、ＭＵＣ１６、Ｌ１−ＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、及びＣＡＩＸ、が挙げられるがこれらに限定されない。特定の例では、病原体抗原は、細菌抗原、ウイルス抗原、または真菌抗原、例えば、本明細書に記載のものである。
【００１２】
一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチドまたはＣＡＲポリペプチド）のいずれかにおける（ｂ）の膜貫通ドメインは、１回貫通型膜タンパク質、例えば、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６Ａ、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、及びＦＧＦＲ２Ｂ、のものであってもよい。代替的に、（ｂ）の膜貫通ドメインは非天然疎水性タンパク質セグメントであってもよい。
【００１３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチドまたはＣＡＲポリペプチド）の少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインは、使用可能な場合、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、及びＣＤ２、であり得る共刺激分子のものであってもよい。一部の例では、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインまたは４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインである。一部の例では、ＡＣＴＲポリペプチドは２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。一部の例では、共刺激シグナル伝達ドメインのうちの一方はＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインであり、もう一方の共刺激ドメインは、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７共刺激シグナル伝達ドメイン、またはＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達ドメイン、であってもよい。具体例としては、ＣＤ２８及び４−１ＢＢ、または、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント及び４−１ＢＢ、が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチドまたはＣＡＲポリペプチド）のいずれかにおける（ｃ）の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲ１γの細胞質ドメインであってもよい。
【００１５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のキメラポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチドまたはＣＡＲポリペプチド）のいずれかのヒンジドメインは、使用可能な場合、ＣＤ２８、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ８α、またはＩｇＧのものであってもよい。その他の例では、ヒンジドメインは非天然ペプチドである。例えば、非天然ペプチドは、延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎポリペプチド（ｎは３〜１２（３及び１２を含む）の整数である）であってもよい。一部の例では、ヒンジドメインは、最大６０アミノ酸残基を含有していてもよい短いセグメントである。
【００１６】
特定の例では、本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン、及び（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、またはこれらの組み合わせ、を含んでいてもよい。例えば、ＡＣＴＲポリペプチドは、表３に示す構成要素（ａ）〜（ｅ）を含む。特定の例では、ＡＣＴＲポリペプチドは、配列番号：１〜８０から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
特定の例では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメインまたは４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及び（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、またはこれらの組み合わせ、を含んでいてもよい。更なる特定の例では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメインまたは４−１ＢＢ共刺激ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、またはこれらの組み合わせ、を含んでいてもよい。例えば、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号：１０４及び１０５から選択されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００１８】
グルコース輸入ポリペプチド及び任意選択的にＡＣＴＲポリペプチドを発現する本明細書に記載の免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、またはＴ細胞であってもよい。免疫細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来していてもよい。一部の例では、免疫細胞は、内在性Ｔ細胞受容体、内在性主要組織適合遺伝子複合体、内在性ベータ２−ミクログロブリン、またはこれらの組み合わせの発現が阻害または除去されているＴ細胞である。
【００１９】
本明細書に記載の免疫細胞のいずれかは、（ａ）グルコース輸入ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、及び任意選択的に、（ｂ）キメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチドまたはＣＡＲポリペプチド）をコードする第２のヌクレオチド配列、を集合的に含む、核酸または核酸セットを含んでいてもよい。核酸または核酸セットはＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子のセットである。一部の例では、免疫細胞は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の両方を含む、核酸を含む。このような核酸は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の間に位置する第３のヌクレオチド配列を更に含んでいてもよく、第３のヌクレオチド配列は、リボソームスキッピング部位（例えば、Ｐ２Ａペプチド）、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、または第２のプロモーターをコードする。
【００２０】
一部の例では、核酸または核酸セットは、発現ベクターまたは発現ベクターのセット（例えば、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクター）であってもよいベクターまたはベクターのセットの内部に含まれている。核酸セットまたはベクターセットとは、目的のポリペプチド（すなわち、グルコース輸入ポリペプチド及びキメラ受容体ポリペプチド）のうちの１つをそれぞれがコードする、２つまたはそれ以上の核酸分子の群、または２つまたはそれ以上のベクターの群のことを意味する。本明細書に記載の核酸のいずれかはまた、本開示の範囲内である。
【００２１】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の免疫細胞のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。免疫細胞がＡＣＴＲポリペプチドを発現する場合、医薬組成物は、治療抗体またはＦｃ融合タンパク質であってもよいＦｃ含有治療薬を更に含んでいてもよい。Ｆｃ含有治療薬は、腫瘍抗原、病原体抗原、または自己抗原に特異的な免疫細胞であってもよい標的抗原に結合してもよい。病原体抗原は、細菌抗原、ウイルス抗原、または真菌抗原であってもよい。
【００２２】
一部の例では、Ｆｃ含有治療薬は、アダリムマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、ムロモナブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、トシツモマブ、ウステキヌマブ、モガムリズマブ、及びベドリズマブ、を含むがこれらに限定されない治療抗体であってもよい。
【００２３】
更に、本開示は、（ｉ）グルコース輸入ポリペプチドとＡＣＴＲポリペプチドの両方を発現する本明細書に記載の免疫細胞のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む第１の医薬組成物、ならびに（ｉｉ）本明細書に記載のＦｃ含有治療薬及び薬学的に許容される担体、を含むキットを提供する。
【００２４】
更に、本明細書では、対象における標的抗原を発現する細胞を阻害する（例えば、このような細胞の数を減少させる、細胞増殖を阻害する、及び／または細胞の活性を抑制する）ための方法を提供し、方法は、グルコース輸入ポリペプチド及びキメラ受容体ポリペプチドを共発現していてもよい本明細書に記載の免疫細胞の集団を必要とする対象にそれを投与することを含む。キメラ受容体ポリペプチドがＡＣＴＲポリペプチドである場合、対象（例えば、ヒト患者、例えば、がんを患うヒト患者など）は、標的抗原、例えば、腫瘍抗原もしくは病原体抗原（例えば、細菌抗原、ウイルス抗原、または真菌抗原）または自己抗原に特異的な免疫細胞に特異的なＦｃ含有治療薬を用いた治療を受けたことがあってもよい、または受けていてもよい。一部の例では、標的抗原を発現する細胞のうちの少なくとも一部は、低グルコース環境に置かれている。
【００２５】
一部の例では、免疫細胞は自家である。その他の例では、免疫細胞は同種異系である。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、免疫細胞は、必要な場合、ｅｘ  ｖｉｖｏで活性化されていてもよい、増殖されていてもよい、またはその両方を実施されていてもよい。一部の例では、免疫細胞は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、フィトヘマグルチニン、及び改変人工刺激細胞または粒子、のうちの１種または複数種の存在下で活性化されるＴ細胞を含む。その他の例では、免疫細胞は、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、Ｋ５６２細胞、及び改変人工刺激細胞または粒子、のうちの１種または複数種の存在下で活性化されるナチュラルキラー細胞を含む。
【００２６】
一部の例では、本明細書に記載の方法により治療される対象は、がん、例えば、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び白血病を患うヒト患者であってもよい。更なる例示的な標的がんとしては、Ｂ細胞由来のがん、乳癌、胃癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺癌、皮膚癌、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓癌、頭頸部癌、網膜芽細胞腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、肝臓癌、及び甲状腺癌、が挙げられるがこれらに限定されない。例示的なＢ細胞由来のがんは、Ｂ細胞系急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、及びＢ細胞性非ホジキンリンパ腫、からなる群から選択される。
【００２７】
がんまたは感染性障害などの標的疾患または障害を治療することに加えて、目的の医学的治療用の医薬品を製造するための、グルコース輸入ポリペプチド及びキメラ受容体ポリペプチドを共発現する本明細書に記載の免疫細胞の使用もまた本開示の範囲内である。免疫細胞がＡＣＴＲポリペプチドを発現する場合、その免疫細胞は、本明細書においてもまた開示するＦｃ含有治療薬のいずれか、例えば、治療抗体などと共に使用されてもよい。
【００２８】
本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細については、以下の説明において記載する。本開示のその他の特徴または利点は、いくつかの実施形態の詳細な記載により、また添付の特許請求の範囲によってもまた、明らかとなるであろう。
【００２９】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様を更に説明するために含まれるが、本明細書で提供する特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれら図面のうちの１つまたは複数を参照することにより、本開示の特定の態様をより適切に理解することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】免疫細胞が発現する輸送体を過剰発現させることを含む、細胞によるグルコース取り込みを調節するための例示的な戦略の模式図である。
【図１Ｂ】非免疫細胞が発現する輸送体を発現させることを含む、細胞によるグルコース取り込みを調節するための例示的な戦略の模式図である。
【図１Ｃ】活性が向上した変異輸送体を発現させることを含む、細胞によるグルコース取り込みを調節するための例示的な戦略の模式図である。
【図１Ｄ】細胞内輸送体の細胞表面への輸送を調節することを含む、細胞によるグルコース取り込みを調節するための例示的な戦略の模式図である。
【図１Ｅ】細胞表面への輸送が向上した変異輸送体を発現させることを含む、細胞によるグルコース取り込みを調節するための例示的な戦略の模式図である。
【図２】ＡＣＴＲ（配列番号：５７）を単独で発現するまたはＧＬＵＴ１（配列番号：８１）と組み合わせてＡＣＴＲを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＧＬＵＴ１の発現上昇を示すフローサイトメトリーヒストグラムのパネルである。ＡＣＴＲ導入細胞はＣＤ１６＋であり、非形質導入細胞はＣＤ１６−である。
【図３】固定ＪＨＨ７標的細胞及び抗ＧＰＣ３抗体、固定ＨｅｐＧ２標的細胞及び抗ＧＰＣ３抗体、または固定ＩＧＲＯＶ−１標的細胞及び抗ＦＯＬＲα抗体を用いた、活性化の前（活性化前）または活性化の４日後における、ＡＣＴＲ（親、配列番号：５７）を単独で発現するＴ細胞と比較した、ＡＣＴＲ（配列番号：５７）及びＧＬＵＴ１（配列番号：８１）を共発現するＴ細胞の２−デオキシ−グルコース（２ＤＧ）取り込みを示すグラフである。
【図４】Ａは、異なる比率のＡＣＴＲ  Ｔ細胞及び制御性Ｔ細胞の存在下の、ＡＣＴＲ（親、配列番号：５７）を単独で発現するＴ細胞からのＩＦＮ−ガンマ産生に対する、制御性Ｔ細胞の阻害効果を示すグラフのパネルである。Ｂは、ＩＦＮ−ガンマ産生によって示される、抑制性制御性Ｔ細胞の存在下の、ＡＣＴＲ  Ｔ細胞単独と比較した、ＧＬＵＴ１と組み合わせたＡＣＴＲ  Ｔ細胞の高い効果を示すグラフのパネルである。
【図５】ＧＰＣ３発現ＪＨＨ７標的細胞またはＧＰＣ３発現Ｈｅｐ３Ｂ標的細胞及び様々な濃度のグルコースの存在下の６日間の共培養後に存在する、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド（配列番号：１０４）を発現するＴ細胞または模擬非形質導入Ｔ細胞の数を示すグラフである。
【図６】Ａは、ＧＰＣ３発現ＪＨＨ７標的細胞及び１．２５ｍＭのグルコースの存在下の６日間の共培養後に存在する、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド（配列番号：１０４）を発現するＴ細胞またはＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド及びＧＬＵＴ１ポリペプチド（配列番号：８１）を共発現するＴ細胞の数を示すグラフである。Ｂは、ＧＰＣ３発現ＪＨＨ７標的細胞及び１０ｍＭのグルコースの存在下の６日間の共培養後に存在する、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド（配列番号：１０４）を発現するＴ細胞またはＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド及びＧＬＵＴ１ポリペプチド（配列番号：８１）を共発現するＴ細胞の数を示すグラフである。
【図７】Ａは、ＧＰＣ３発現ＪＨＨ７標的細胞及び１．２５ｍＭのグルコースの存在下の６日間の共培養後に存在する、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド（配列番号：１０３）を発現するＴ細胞またはＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド及びＧＬＵＴ３ポリペプチド（配列番号：８３）を共発現するＴ細胞の数を示すグラフである。Ｂは、ＧＰＣ３発現ＪＨＨ７標的細胞及び１０ｍＭのグルコースの存在下の６日間の共培養後に存在する、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド（配列番号：１０３）を発現するＴ細胞またはＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド及びＧＬＵＴ３ポリペプチド（配列番号：８３）を共発現するＴ細胞の数を示すグラフである。
【図８】Ａは、ＧＰＣ３発現ＪＨＨ７標的細胞及び１．２５ｍＭのグルコースの存在下の６日間の共培養後に存在する、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド（配列番号：１０４）を発現するＴ細胞またはＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド及びＧＬＵＴ１  Ｓ２２６Ｄ変異（配列番号：８２）を共発現するＴ細胞の数を示すグラフである。Ｂは、ＧＰＣ３発現ＪＨＨ７標的細胞及び１０ｍＭのグルコースの存在下の６日間の共培養後に存在する、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド（配列番号：１０４）を発現するＴ細胞またはＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド及びＧＬＵＴ１  Ｓ２２６Ｄ変異（配列番号：８２）を共発現するＴ細胞の数を示すグラフである。
【図９】ｉｎ  ｖｉｖｏマウスＪＨＨ７異種移植モデルの腫瘍増殖曲線データを示すグラフである。治療なし、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ（配列番号：１０４）を発現するＴ細胞で治療したマウス、ならびにＧＰＣ３標的化ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１（配列番号：８１）を共発現するＴ細胞で治療したマウスの結果を示す。
【図１０】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ固形腫瘍細胞株のＴ細胞増殖を示すグラフである。ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ（配列番号：１０４）を発現するＴ細胞、ならびにＧＰＣ３標的化ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１（配列番号：８１）を共発現するＴ細胞の結果を示す。
【図１１】ｉｎ  ｖｉｖｏマウスＪＨＨ７異種移植モデル（肝細胞癌）の腫瘍増殖曲線データを示すグラフである。治療なし、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ（配列番号：１０４）を発現するＴ細胞で治療したマウス、ならびにＧＰＣ３標的化ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１（配列番号：８１）を共発現するＴ細胞で治療したマウスの結果を示す。
【図１２】ｉｎ  ｖｉｖｏマウスＨｅｐ３Ｂ異種移植モデル（肝細胞癌）の腫瘍増殖曲線データを示すグラフである。治療なし、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ（配列番号：１０４）を発現するＴ細胞で治療したマウス、ならびにＧＰＣ３標的化ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１（配列番号：８１）を共発現するＴ細胞で治療したマウスの結果を示す。
【図１３】ｉｎ  ｖｉｖｏ異種移植マウスモデルにおける、全身血中グルコースと比較した、腫瘍間質液中の低グルコースレベルを示すグラフである。
【図１４】抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ（配列番号：１０４）を単独で発現するまたはＧＬＵＴ１（配列番号：８１）と組み合わせて抗ＧＰＣ３  ＣＡＲを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＧＬＵＴ１の発現を示すフローサイトメトリーヒストグラムのパネルである。
【図１５】固定ＪＨＨ７標的細胞または固定ＨｅｐＧ２標的細胞を用いた、活性化の前（活性化前）または活性化の４日後における、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ（親、配列番号：１０４）を単独で発現するＴ細胞と比較した、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１（配列番号：８１）を共発現するＴ細胞の２−デオキシ−グルコース（２ＤＧ）取り込みを示すグラフである。
【図１６】抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ（ＣＡＲ親、配列番号：１０４）を単独で発現するＴ細胞、ならびに抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１（配列番号：８１）を共発現するＴ細胞を用いた治療を行ったＨｅｐ３Ｂ腫瘍保有ＮＳＧマウスから採取した血液試料の血液１μＬあたりのＣＡＲＴ細胞の数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
腫瘍微小環境には低グルコースレベルなどの特定の特徴があり、その一部は、エフェクターＴ細胞などのエフェクター免疫細胞の活性を抑制する場合がある。本開示は少なくとも部分的に、腫瘍微小環境におけるエフェクター免疫細胞の活性を向上させるための戦略の開発に基づいている。とりわけ、本開示は、エフェクター免疫細胞によるグルコース取り込みを向上させることにより、それらエフェクター免疫細胞の増殖及び生理活性を向上させるための方法を特徴とする。グルコース輸入は、グルコース輸送体の発現レベル、このような輸送体の活性化状態、及び／または輸送体の輸送、を含む様々な因子により調節され得る。本開示は、免疫細胞のグルコース取り込みを向上させるための様々なアプローチを提供する。一部の例については、免疫細胞が発現する輸送体を過剰発現させること（Ａ）、非免疫細胞が発現する輸送体を発現させること（Ｂ）、活性が向上した変異輸送体を発現させること（Ｃ）、細胞内輸送体の細胞表面への輸送を調節すること（Ｄ）、または、細胞表面への輸送が向上した変異輸送体を発現させること（Ｅ）、を含む図１に図示されている。代替的に、グルコース輸入に関与するタンパク質をコードする内在性遺伝子の発現を制御する、及び／または、このようなタンパク質の細胞輸送もしくは活性を制御することにより、免疫細胞のグルコース取り込み能を向上させることができる。
【００３２】
ＧＬＵＴ１を共発現するＡＣＴＲ−Ｔ細胞において、高いグルコース取り込みが認められた。更に、ＧＬＵＴ１を共発現するＡＣＴＲ−Ｔ細胞の活性は、抑制性制御性（Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞の存在下で向上した。これらの結果は、ＡＣＴＲ−Ｔ細胞におけるＧＬＵＴ１の共発現が、例えば、低グルコース条件下で、ＡＣＴＲ−Ｔ細胞を向上させると予測され得るということを示している。同様に、Ｔ細胞における抗ＧＰＣ３  ＣＡＲポリペプチド及びＧＬＵＴ１ポリペプチドの共発現はＴ細胞増殖を向上させ、とりわけ低グルコース条件下で、Ｔ細胞におけるグルコース取り込みを向上させ、ＣＡＲを単独で発現するＴ細胞と比較して、マウスモデルにおいて、ＣＡＲ−Ｔ細胞のより高い生存レベル及び高い抗腫瘍活性が認められた。腫瘍微小環境が一般的に低グルコースレベルを示すことから、ＡＣＴＲ−Ｔ細胞と、グルコース輸入を向上させる分子（例えば、ＧＬＵＴ１）の組み合わせは、高い抗腫瘍活性を示すと予測され得る。
【００３３】
それゆえ、本開示は、高いグルコース取り込み活性を有する改変（例えば、遺伝子改変）免疫細胞を提供する。一部の実施形態では、このような改変免疫細胞は、１種または複数種のグルコース輸入ポリペプチド、例えば、本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチドなどを発現して、その天然同等物と比較してグルコース取り込みを向上させていてもよい。このような遺伝子改変免疫細胞は、キメラ受容体ポリペプチド、例えば、本明細書で開示するＡＣＴＲポリペプチドまたはＣＡＲポリペプチドなどを更に発現していてもよい。本明細書ではまた、免疫細胞増殖を向上させる、及び／または、例えば、ＡＤＣＣを介して、対象（例えば、ヒトがん患者）における標的細胞（例えば、標的がん細胞）の阻害もしくは抑制を向上させるために、必要な場合（例えば、免疫細胞がＡＣＴＲポリペプチドを発現する場合）、Ｆｃ含有薬と任意選択的に組み合わせた、遺伝子改変免疫細胞の使用を提供する。本開示はまた、記載する遺伝子改変免疫細胞を含む、医薬組成物及びキットを提供する。
【００３４】
グルコース輸入ポリペプチドを発現（例えば、過剰発現）する本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞は、少なくとも以下の利点を付与し得る。グルコース輸入ポリペプチドの発現は、それを発現する免疫細胞のグルコース取り込み能を向上させ得る。それゆえ、遺伝子改変免疫細胞は、グルコース輸入ポリペプチドを発現しない（または過剰発現しない）免疫細胞と比較して、より良好に増殖する、より多くのサイトカインを産生する、より優れた抗腫瘍細胞傷害を示す、及び／または低グルコース環境（例えば、低グルコース腫瘍微小環境）におけるより高いＴ細胞生存率を示し、高いサイトカイン産生、生存率、細胞傷害、及び／または抗腫瘍活性をもたらし得る。
【００３５】
Ｉ．グルコース輸入ポリペプチド
本明細書で使用する場合、グルコース輸入ポリペプチドとは、細胞の原形質膜を横断するグルコース取り込みを媒介する（すなわち、グルコース輸入を向上させる）ポリペプチドのことを意味する。このようなグルコース輸入ポリペプチドは、任意のメカニズムを介してグルコース取り込みを向上させ得る。図１で例示するように、グルコース輸入ポリペプチドは、細胞膜間のグルコースの輸送を促進する細胞膜タンパク質であるグルコース輸送体であってもよい。グルコース輸送体は、３つの独立したクラス、クラスＩ（ＧＬＵＴ１〜ＧＬＵＴ４）輸送体、クラスＩＩ（ＧＬＵＴ５、ＧＬＵＴ７、ＧＬＵＴ９、及びＧＬＵＴ１１）輸送体、及びクラスＩＩＩ（ＧＬＵＴ６、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ１０、ＧＬＵＴ１２、及びＧＬＵＴ１３）輸送体へと分類され得る。任意の好適な種（例えば、ヒトなどの哺乳動物）の輸送体であり得る任意のこのような輸送体は、本明細書に記載の組成物及び方法との使用用に検討され得る。
【００３６】
代替的に、グルコース輸入ポリペプチドは、活性化グルコース輸入ポリペプチドを模倣するように変異した分子（例えば、リン酸化模倣体）、または、グルコース輸入ポリペプチド活性が向上するように、その細胞内輸送（例えば、細胞表面への輸送）に影響を及ぼすように変異した分子であってもよい。代替的に、内在性グルコース輸入ポリペプチドの発現は、例えば、転写因子もしくはマイクロＲＮＡを発現させることにより、または、ポリペプチドの安定性もしくは分解性を調節すること、例えば、その分解を媒介する因子、例えば、ユビキチン／プロテアソーム経路の一部であるＥ３リガーゼを調節することにより、調節され得る。加えて、内在性グルコース輸入ポリペプチドの輸送は、例えば、細胞表面へのその輸送を向上させるポリペプチドを発現させることにより調節され得る。
【００３７】
例示的なグルコース輸入ポリペプチドとしては、ＧＬＵＴ１（例えば、ＧＬＵＴ１  Ｓ２２６Ｄ）、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ８（例えば、ＧＬＵＴ８  Ｌ１２Ａ  Ｌ１３Ａ）、ＧＬＵＴ１１、ＧＬＵＴ７、及びＧＬＵＴ４などのグルコース輸送体、ならびにナトリウム／グルコース共輸送体（例えば、ＳＧＬＴ１及びＳＧＬＴ２）、を挙げることができるがこれらに限定されない。代表的なグルコース輸入ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する。
ＧＬＵＴ１（配列番号：８１）
【化１】
2021529559.tif 000003
ＧＬＵＴ１  Ｓ２２６Ｄ（配列番号：８２、Ｓ２２６Ｄを太字で示す）
【化２】
2021529559.tif 000004
ＧＬＵＴ３（配列番号：８３）
【化３】
2021529559.tif 000005
ＧＬＵＴ４（配列番号：８４）
【化４】
2021529559.tif 000006
ＧＬＵＴ７（配列番号：８５）
【化５】
2021529559.tif 000007
ＧＬＵＴ８（配列番号：８６）
【化６】
2021529559.tif 000008
ＧＬＵＴ８  Ｌ１２Ａ  Ｌ１３Ａ（配列番号：８７、変異を太字で示す）
【化７】
2021529559.tif 000009
ＧＬＵＴ１１（配列番号：８８）
【化８】
2021529559.tif 000010
ＳＧＬＴ１（配列番号：８９）
【化９】
2021529559.tif 000011
ＳＧＬＴ２（配列番号：９０）
【化１０】
2021529559.tif 000012
【００３８】
グルコース輸入ポリペプチドは、好適な種に由来する天然ポリペプチド、例えば、哺乳動物グルコース輸入ポリペプチド、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類に由来するグルコース輸入ポリペプチドなどであってもよい。このような天然ポリペプチドは当該技術分野において周知であり、例えば、一般に利用可能な遺伝子データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋを検索するためのクエリとして、上記アミノ酸配列のいずれかを使用することにより、得ることができる。本開示に用いるグルコース輸入ポリペプチドは、上記の例示的なタンパク質のいずれかと、少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を共有していてもよい。
【００３９】
２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７，１９９３において一部変更された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８，１９９０のアルゴリズムを用いて測定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得てもよい。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２，１９９７に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用してもよい。ＢＬＡＳＴプログラム及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用してもよい。
【００４０】
代替的に、グルコース輸入ポリペプチドは、天然同等物の機能的バリアントであってもよい。このような機能的バリアントは、天然同等物の機能的ドメイン（複数可）の外側に１つまたは複数の変異を含有していてもよい。天然グルコース輸入ポリペプチドの機能的ドメインは、当該技術分野において周知であってもよく、または、そのアミノ酸配列に基づいて予測されてもよい。機能的ドメイン（複数可）の外側の変異は、タンパク質の生物学的活性に実質的に影響を及ぼすとは予測され得ない。一部の例では、機能的バリアントは、天然同等物と比較して、グルコース取り込みにおける高い活性を示し得る。代替的に、機能的バリアントは、天然同等物と比較して、グルコース取り込みにおける低い活性を示し得る。加えて、機能的バリアントは、細胞表面への向上した輸送を示し得る。代替的に、機能的バリアントは、細胞表面への低下した輸送を示し得る。
【００４１】
代替的にまたは加えて、機能的バリアントは、天然同等物における１つまたは複数の位置（例えば、最大２０の位置、最大１５の位置、最大１０の位置、最大５、４、３、２、１の位置（複数可））に、保存的変異（複数可）を含有していてもよい。本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸置換が生じたタンパク質における相対的な電荷またはサイズの特徴を変化させないアミノ酸置換のことを意味する。当業者に周知のポリペプチド配列を変化させるための方法、例えば、このような方法を集めた参照文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９，またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている方法などに従って、バリアントを調製してもよい。アミノ酸の保存的置換としては、以下のグループ、（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ、（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ、（ｄ）Ａ、Ｇ、（ｅ）Ｓ、Ｔ、（ｆ）Ｑ、Ｎ、及び（ｇ）Ｅ、Ｄの中のアミノ酸内で生じた置換が挙げられる。
【００４２】
ＩＩ．キメラ受容体ポリペプチド
本明細書で使用する場合、キメラ受容体ポリペプチドとは、宿主細胞の表面上に発現させることができる非天然分子のことを意味する。キメラ受容体ポリペプチドは、目的の抗原（例えば、がんなどの疾患と関連する抗原、または病原体と関連する抗原；本明細書の記述を参照のこと）を標的とすることができる細胞外標的結合ドメインを含む。細胞外標的結合ドメインは、目的の抗原に直接結合することができる（例えば、本明細書で開示するＣＡＲポリペプチドにおける細胞外抗原結合ドメイン）。代替的に、細胞外標的結合ドメインは、中間物、例えば、抗体などのＦｃ含有薬を介して、目的の抗原に結合することができる。キメラ受容体ポリペプチドは、膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン、細胞質シグナル伝達ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、細胞質シグナル伝達ドメイン、またはこれらの組み合わせ、を更に含んでいてもよい。一部の例では、キメラ受容体ポリペプチドは共刺激ドメインを含んでいなくてもよい。キメラ受容体ポリペプチドは、宿主細胞上で発現する際に、標的抗原に直接または間接的に結合するために、細胞外標的結合ドメインが細胞外に位置するように構成されている。任意選択的な共刺激シグナル伝達ドメインは、活性化及び／またはエフェクターシグナル伝達を誘発するために、細胞質内に位置していてもよい。
【００４３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、細胞外標的結合ドメインのＣ末端かつ膜貫通ドメインのＮ末端に位置し得るヒンジドメインを更に含んでいてもよい。ヒンジは任意の好適な長さのものであってもよい。その他の実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、ヒンジドメインを全く有していなくてもよい。更にその他の実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、短いヒンジドメイン（例えば、最大２５アミノ酸残基を含む）を有していてもよい。
【００４４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、細胞外標的結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメイン、を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、細胞外標的結合ドメイン、膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメイン、を含む。その他の実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、細胞外標的結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質シグナル伝達ドメイン、及び少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、を含む。
【００４５】
一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチドであってもよい。本明細書で使用する場合、ＡＣＴＲポリペプチド（別名、ＡＣＴＲ構築物）とは、宿主細胞の表面上に発現させることができる非天然分子のことを意味し、免疫グロブリンのＦｃ部分との結合親和性及びそれに対する特異性を有する細胞外ドメイン（「Ｆｃ結合部」または「Ｆｃ結合ドメイン」）、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメイン、を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドは少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを更に含んでいてもよい。
【００４６】
その他の実施形態では、本明細書で開示するキメラ受容体ポリペプチドはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであってもよい。本明細書で使用する場合、ＣＡＲポリペプチド（別名、ＣＡＲ構築物）とは、宿主細胞の表面上に発現させることができる非天然分子のことを意味し、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメイン、を含む。本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを更に含んでいてもよい。
【００４７】
細胞外抗原結合ドメインは、医学的症状（例えば、疾患）と関連する天然抗原を含む標的抗原に特異的に結合する任意のペプチドもしくはポリペプチド、または疾患関連抗原を標的とする治療薬にコンジュゲートした抗原部分に特異的に結合する任意のペプチドもしくはポリペプチド、であってもよい。
【００４８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを更に含んでいてもよい。ＣＡＲポリペプチドは、宿主細胞上で発現する際に、標的分子及び細胞質シグナル伝達ドメインに結合するために、細胞外抗原結合ドメインが細胞外に位置するように構成されている。任意選択的な共刺激シグナル伝達ドメインは、活性化及び／またはエフェクターシグナル伝達を誘発するために、細胞質内に位置していてもよい。
【００４９】
本明細書で使用する場合、語句「タンパク質Ｘ膜貫通ドメイン」（例えば、ＣＤ８膜貫通ドメイン）とは、任意のタンパク質の任意の部分、すなわち、膜内において熱力学的に安定な膜貫通タンパク質Ｘのことを意味する。
【００５０】
本明細書で使用する場合、語句「タンパク質Ｘ細胞質シグナル伝達ドメイン」、例えば、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインとは、細胞の内部すなわち細胞小器官と相互作用し、当該技術分野において周知の一次シグナルを中継することにより免疫細胞の増殖及び／または活性化をもたらすことのできる、タンパク質（タンパク質Ｘ）の任意の部分のことを意味する。本明細書に記載の細胞質シグナル伝達ドメインは、免疫細胞を完全に活性化させるための二次シグナルを中継する共刺激シグナル伝達ドメインとは異なる。
【００５１】
本明細書で使用する場合、語句「タンパク質Ｘ共刺激シグナル伝達ドメイン」、例えば、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインとは、共刺激シグナル（二次シグナル）を免疫細胞（例えば、Ｔ細胞など）に伝達することにより免疫細胞の完全な活性化をもたらすことのできる、任意の共刺激タンパク質（タンパク質Ｘ、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、またはＩＣＯＳなど）の部分のことを意味する。
【００５２】
Ａ．細胞外標的結合ドメイン
本明細書で開示するキメラ受容体ポリペプチドは、直接結合または間接結合（抗体などの中間物を介して）のいずれかにより目的の抗原（例えば、本明細書に記載の抗原）を標的とする細胞外ドメインを含む。キメラ受容体ポリペプチドは、Ｆｃ結合ドメインを含むＡＣＴＲポリペプチドであってもよい。代替的に、キメラ受容体ポリペプチドは、細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドであってもよい。
【００５３】
Ｆｃ結合ドメイン
本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドは、Ｆｃ結合ドメインである、すなわち、好適な哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、またはサル）の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ）のＦｃ部分に結合することができる、細胞外ドメイン、を含む。好適なＦｃ結合ドメインは、哺乳動物Ｆｃ受容体などの天然タンパク質、またはある特定の細菌タンパク質（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ）に由来していてもよい。加えて、Ｆｃ結合ドメインは、本明細書に記載の抗体のいずれかのＦｃ部分に、高い親和性及び特異性で特異的に結合するように改変された合成ポリペプチドであってもよい。例えば、このようなＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであってもよい。例としては、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体、またはナノボディ、が挙げられるがこれらに限定されない。代替的に、Ｆｃ結合ドメインは、Ｆｃに対する結合活性でペプチド組み合わせライブラリをスクリーニングすることにより同定され得る、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、小モジュール免疫治療薬（ＳＭＩＰ）、アドネクチン、アビマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、またはアンチカリンなどのＦｃ部分に特異的に結合する合成ペプチドであってもよい。
【００５４】
一部の実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、哺乳動物Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。本明細書で使用する場合、「Ｆｃ受容体」は、多くの免疫細胞（Ｂ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、肥満細胞、及び好酸球を含む）の表面上に発現し、抗体のＦｃドメインに対する結合特異性を示す、細胞表面結合受容体である。Ｆｃ受容体は通常、抗体のＦｃ（結晶性フラグメント）部分に対する結合特異性を有する少なくとも２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインで構成される。一部の例では、抗体のＦｃ部分へとＦｃ受容体が結合すると、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）作用が誘発され得る。本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドを構築するのに用いられるＦｃ受容体は、野生型同等物と比較してＦｃに対する高いまたは低い親和性を有し得る、天然の遺伝子多型バリアント（例えば、ＣＤ１６  Ｖ１５８バリアント）であってもよい。代替的に、Ｆｃ受容体は、Ｉｇ分子のＦｃ部分に対する結合親和性を変化させる１つまたは複数の変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の変異を含む最大１０アミノ酸残基置換）を有する、野生型同等物の機能的バリアントであってもよい。一部の例では、変異は、Ｆｃ受容体のグリコシル化パターンを変化させることによりＦｃに対する結合親和性を変化させ得る。
【００５５】
本明細書に記載の方法または構築物のいずれかに用いることができる、Ｆｃ受容体細胞外ドメイン（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．５３：１−９，２００１を参照のこと）における多くの例示的な遺伝子多型を、以下の表に列挙する。
【表１】
2021529559.tif 000013
【００５６】
Ｆｃ受容体は、それが結合可能な抗体のアイソタイプに基づいて分類される。例えば、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は通常、ＩｇＧ抗体、例えば、１種または複数種のそのサブタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）などに結合し、Ｆｃアルファ受容体（ＦｃαＲ）は通常、ＩｇＡ抗体に結合し、Ｆｃイプシロン受容体（ＦｃεＲ）は通常、ＩｇＥ抗体に結合する。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃアルファ受容体、またはＦｃイプシロン受容体、である。Ｆｃガンマ受容体の例としては、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、ＣＤ６４Ｃ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６Ａ、及びＣＤ１６Ｂ、が挙げられるがこれらに限定されない。Ｆｃアルファ受容体の例はＦｃαＲ１／ＣＤ８９である。Ｆｃイプシロン受容体の例としてはＦｃεＲＩ及びＦｃεＲＩＩ／ＣＤ２３が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドを構築するのに用いる例示的なＦｃ受容体、及び対応するＦｃドメインに対するそれらの結合活性を以下の表に列挙する。
【表２】
2021529559.tif 000014
【００５７】
本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドに用いるＦｃ受容体のリガンド結合ドメインの選択は当業者に明らかである。例えば、選択は、Ｆｃ受容体の結合が望まれる抗体のアイソタイプ、及び結合相互作用の所望の親和性などの因子に依存し得る。
【００５８】
一部の例では、Ｆｃ結合ドメインは、Ｆｃに対する親和性を調節し得る天然の遺伝子多型を導入していてもよい、ＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインである。一部の例では、Ｆｃ結合ドメインは、１５８位に遺伝子多型（例えば、バリンまたはフェニルアラニン）を導入したＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインである。一部の実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、そのグリコシル化状態及びＦｃに対するその親和性を変化させる条件下で作製される。
【００５９】
Ｆ１５８残基及びＶ１５８残基を太字及び下線（シグナルペプチドはイタリック体）で強調表示して、ヒトＣＤ１６Ａ  Ｆ１５８バリアント及びヒトＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８バリアントのアミノ酸配列を以下に記載する。
ＣＤ１６Ａ  Ｆ１５８（配列番号：９１）：
【化１１】
2021529559.tif 000015
ＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８（配列番号：９２）：
【化１２】
2021529559.tif 000016
【００６０】
一部の実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、ＩｇＧ抗体のサブセットに対してＡＣＴＲポリペプチドを特異的にする修飾を導入したＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインである。例えば、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１）に対する親和性を高めるまたは低下させる変異を導入してもよい。
【００６１】
本明細書に記載のＦｃ結合ドメインのいずれかは、治療抗体のＦｃ部分に対する好適な結合親和性を有していてもよい。本明細書で使用する場合、「結合親和性」とは、見かけの結合定数すなわちＫＡのことを意味する。ＫＡは、解離定数であるＫＤの逆数である。本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドのＦｃ受容体ドメインの細胞外リガンド結合ドメインは、抗体のＦｃ部分に対する少なくとも１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０Ｍ、またはそれ以下の結合親和性Ｋｄを有していてもよい。一部の実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、別の抗体、抗体のアイソタイプ（複数可）、またはそのサブタイプ（複数可）に対するＦｃ結合ドメインの結合親和性と比較して、抗体、抗体のアイソタイプ（複数可）、またはそのサブタイプ（複数可）に対する高い結合親和性を有する。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、別の抗体、抗体のアイソタイプ（複数可）、またはそのサブタイプ（複数可）に対するＦｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインの結合性と比較して、抗体、抗体のアイソタイプ（複数可）、またはそのサブタイプ（複数可）に対する特異性を有する。
【００６２】
当該技術分野において周知のその他のＦｃ結合ドメインはまた、本明細書に記載のＡＣＴＲ構築物に用いることができ、それらとしては、例えば、ＷＯ２０１５０５８０１８Ａ１及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１５９９９号（そのそれぞれの関連開示は、本明細書で参照する用途及び主題で参照により組み込まれる）に記載のものが挙げられる。
【００６３】
細胞外抗原結合ドメイン
本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、ＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞の特異性をリダイレクトする細胞外抗原結合ドメインを含む。本明細書で使用する場合、「細胞外抗原結合ドメイン」とは、医学的症状（例えば、疾患）と関連する天然抗原であり得る目的の標的抗原に対する結合特異性を有するペプチドもしくはポリペプチド、または疾患関連抗原を標的とする治療薬にコンジュゲートした抗原部分に対する結合特異性を有するペプチドもしくはポリペプチド、のことを意味する。本明細書に記載の細胞外抗原結合ドメインは、Ｆｃ受容体の細胞外ドメインを含まず、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合し得ない。Ｆｃフラグメントに結合しない細胞外ドメインとは、二者間の結合活性が通常のアッセイを用いて検出可能ではない、または、バックグラウンドのみもしくは生物学的に有意ではない結合活性が通常のアッセイを用いて検出されることを意味する。
【００６４】
一部の例では、本明細書に記載の任意のＣＡＲポリペプチドの細胞外抗原結合ドメインは、細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）に結合することができるペプチドもしくはポリペプチド、または、主要組織適合遺伝子複合体と複合体を形成して抗原提示細胞の細胞表面上に提示される抗原（またはそのフラグメント）に結合することができるペプチドもしくはポリペプチド、である。このような細胞外抗原結合ドメインは、標的細胞表面抗原に高い結合親和性で結合する抗体に由来し得る一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）であってもよい。例示的な細胞表面標的抗原及びそれらに結合する例示的な抗体を以下の表３に列挙する。
【表３−１】
2021529559.tif 000017
【表３−２】
2021529559.tif 000018
【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
2021529559.tif 000027
【００６５】
細胞外抗原結合ドメインは、目的の標的抗原に応じて、表１に列挙した抗体のいずれかに由来する抗原結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）を含んでいてもよい。
【００６６】
その他の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのいずれかの細胞外抗原結合ドメインは、細菌抗原、ウイルス抗原、または真菌抗原などの病原体抗原に特異的であってもよい。一部の例を以下、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、ヘマグルチニン、もしくはＭ２タンパク質、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ糖タンパク質もしくはＧ糖タンパク質、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、もしくはｇＥ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ＭＯＭＰもしくはＰｏｒＢタンパク質、デング熱ウイルスコアタンパク質、マトリックスタンパク質、もしくは糖タンパク質Ｅ、麻疹ウイルスヘマグルチニン、単純ヘルペスウイルスＩＩ型糖タンパク質ｇＢ、ポリオウイルスＩ  ＶＰ１、ＨＩＶ  １のエンベロープ糖タンパク質、Ｂ型肝炎コア抗原もしくは表面抗原、ジフテリア毒素、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ２４Ｍ  エピトープ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃａｌ  ｐｉｌｉｎ、仮性狂犬病ウイルスｇ５０（ｇｐＤ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩ（ｇｐＢ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩＩ（ｇｐＣ）、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、伝染性胃腸炎糖タンパク質１９５、伝染性胃腸炎マトリックスタンパク質、または、ヒトＣ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｅ１もしくはＥ２、に記載する。
【００６７】
加えて、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドの細胞外抗原結合ドメインは、疾患または障害と関連する抗原（例えば、本明細書に記載の腫瘍抗原または病原体抗原）を標的とする治療薬にコンジュゲートしたタグに特異的であってもよい。一部の例では、治療薬にコンジュゲートしたタグは抗原性であってもよく、ＣＡＲポリペプチドの細胞外抗原結合ドメインは、抗原性タグに対する高い結合親和性及び／または特異性を有する抗体の抗原結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）であってもよい。例示的な抗原性タグとしては、ビオチン、アビジン、蛍光分子（例えば、ＧＦＰ、ＹＲＰ、ルシフェラーゼ、またはＲＦＰ）、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ、Ｈｉｓ（例えば、６×ＨｉｓなどのポリＨｉｓ）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ＧＳＴ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、ｔｒｘ、Ｔ７、ＨＳＶ、ＶＳＶ（例えば、ＶＳＶ−Ｇ）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｖ５、ｅタグ、Ｓタグ、ＫＴ３、Ｅ２、Ａｕ１、Ａｕ５、及び／またはチオレドキシン、が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６８】
その他の例では、治療薬にコンジュゲートしたタグは、リガンド−受容体ペアのメンバーであり、細胞外抗原結合ドメインは、タグに結合するリガンド−受容体ペアのその他のメンバーまたはそのフラグメントを含む。例えば、治療薬にコンジュゲートしたタグはビオチンであってもよく、ＣＡＲポリペプチドの細胞外抗原結合ドメインは、アビジンのビオチン結合フラグメントを含んでいてもよい。例えば、Ｕｒｂａｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｌｏｈｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８を参照されたい。その他の例としては、細胞外抗原結合ドメインが、タンパク質タグ、例えば、ＦＩＴＣ（Ｔａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；及びＭａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、ＰＮＥ（Ｒｏｄｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、Ｌａ−ＳＳ−Ｂ（Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、ビオチン（Ｌｏｈｍｕｌｌｕｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）、及びロイシン−ジッパー（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）などに特異的なｓｃＦｖフラグメントである、抗タグＣＡＲが挙げられる。本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドに用いる抗原結合ドメインの選択は当業者に明らかである。例えば、選択は、標的抗原のタイプ、及び結合相互作用の所望の親和性などの因子に依存し得る。
【００６９】
本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのいずれかの細胞外抗原結合ドメインは、標的抗原（例えば、本明細書に記載の標的のうちのいずれか１つ）またはその抗原性エピトープに対する好適な結合親和性を有していてもよい。本明細書で使用する場合、「結合親和性」とは、見かけの結合定数すなわちＫＡのことを意味する。ＫＡは、解離定数（ＫＤ）の逆数である。本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドに用いる細胞外抗原結合ドメインは、標的抗原または抗原性エピトープに対する少なくとも１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０Ｍ、またはそれ以下の結合親和性（ＫＤ）を有していてもよい。高い結合親和性は低いＫＤに対応している。第２の抗原と比較した、第１の抗原に対する細胞外抗原結合ドメインのより高い親和性の結合は、第２の抗原に結合するためのＫＡ（または数値のＫＤ）と比較した、第１の抗原に結合するためのより高いＫＡ（またはより小さな数値のＫＤ）によって示され得る。このような場合、細胞外抗原結合ドメインは、第２の抗原（例えば、二次構造の同一の第１のタンパク質またはその模倣体）と比較した、第１の抗原（例えば、一次構造の第１のタンパク質もしくはその模倣体、または第２のタンパク質）に対する特異性を有する。結合親和性の差異（例えば、特異性またはその他の比較の）は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、１０，０００、または１０５倍であってもよい。
【００７０】
結合親和性（または結合特異性）は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法（例えば、蛍光アッセイを用いた）、を含む様々な方法を用いて測定することができる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＨＢＳ−Ｐバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）中である。これらの技術を使用して、標的タンパク質濃度に応じた、結合した結合タンパク質の濃度を測定することができる。結合した結合タンパク質の濃度（［結合した］）は通常、以下の方程式、
［結合した］＝［遊離］／（Ｋｄ＋［遊離］）
により、遊離標的タンパク質の濃度（［遊離］）と関連している。
【００７１】
しかし、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ解析などの方法を用いて測定した親和性の定量的測定値（ＫＡに比例する）を得ることが時に十分であり、それにより、比較用、例えば、より高い親和性が、例えば、２倍より高いかどうかを測定することに利用して、例えば、機能アッセイ、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおける活性を用いて、親和性の定性的な測定値を得ること、または親和性の推定を得ることが可能であることから、ＫＡの正確な測定を実施することが常に必要というわけではない。
【００７２】
Ｂ．膜貫通ドメイン
本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチドまたはＣＡＲポリペプチド）の膜貫通ドメインは、当該技術分野において周知の任意の形態であってもよい。本明細書で使用する場合、「膜貫通ドメイン」とは、細胞膜内、好ましくは真核細胞膜内において熱力学的に安定な任意のタンパク質構造のことを意味する。本明細書で使用するキメラ受容体ポリペプチドに相性よく用いられる膜貫通ドメインは、天然タンパク質から得てもよい。代替的に、膜貫通ドメインは、合成の非天然タンパク質セグメント、例えば、細胞膜内において熱力学的に安定な疎水性タンパク質セグメントであってもよい。
【００７３】
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインの三次元構造に基づいて分類される。例えば、膜貫通ドメインは、アルファへリックス、２つ以上のアルファへリックスの複合体、ベータバレル、または、細胞のリン脂質二重層を貫通する任意のその他の安定構造、を形成していてもよい。更に、膜貫通ドメインは、更にまたは代替的に、膜貫通ドメインが膜を貫通する貫通の回数、及びタンパク質の配向を含む、膜貫通ドメインのトポロジーに基づいて分類され得る。例えば、１回貫通型膜タンパク質は細胞膜を１回貫通し、複数回貫通型膜タンパク質は細胞膜を少なくとも２回（例えば、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上の回数）貫通する。
【００７４】
膜タンパク質は、その末端のトポロジー、及び細胞の内外に対する膜貫通セグメント（複数可）のトポロジーに応じて、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型と定義され得る。Ｉ型膜タンパク質は、１回膜貫通領域を有し、タンパク質のＮ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側上に存在し、かつタンパク質のＣ末端が細胞質側上に存在するように配向している。ＩＩ型膜タンパク質はまた、１回膜貫通領域を有するが、タンパク質のＣ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側上に存在し、かつタンパク質のＮ末端が細胞質側上に存在するように配向している。ＩＩＩ型膜タンパク質は、複数の膜貫通セグメントを有し、膜貫通セグメントの数、ならびにＮ末端及びＣ末端の位置に基づいて、更に分類され得る。
【００７５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドの膜貫通ドメインは、Ｉ型１回貫通型膜タンパク質に由来する。１回貫通型膜タンパク質としては、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、及びＦＧＦＲ２Ｂ、が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、以下、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、及びＦＧＦＲ２Ｂ、から選択される膜タンパク質に由来する。一部の例では、膜貫通ドメインはＣＤ８のものである（例えば、膜貫通ドメインはＣＤ８αのものである）。一部の例では、膜貫通ドメインは４−１ＢＢ／ＣＤ１３７のものである。その他の例では、膜貫通ドメインはＣＤ２８のものである。一部の例では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、任意の非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含んでいなくてもよい。一部の例では、このようなキメラ受容体ポリペプチドはヒンジドメインを何ら含んでいなくてもよい。その他の例では、膜貫通ドメインはＣＤ３４のものである。更にその他の例では、膜貫通ドメインはヒトＣＤ８αに由来しない。一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドの膜貫通ドメインは１回貫通型アルファへリックスである。
【００７６】
複数回貫通型膜タンパク質に由来する膜貫通ドメインはまた、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドに相性よく用いられてもよい。複数回貫通型膜タンパク質は、複合アルファへリックス構造（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のアルファへリックス）またはベータシート構造を含んでいてもよい。複数回貫通型膜タンパク質のＮ末端及びＣ末端は脂質二重層の相対する側上に存在することが好ましく、例えば、タンパク質のＮ末端は脂質二重層の細胞質側上に存在し、タンパク質のＣ末端は細胞外側上に存在する。複数回貫通型膜タンパク質に由来する１つのへリックス貫通部または複数のへリックス貫通部のいずれかを、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドを構築するのに使用してもよい。
【００７７】
本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドに用いる膜貫通ドメインはまた、合成の非天然タンパク質セグメントの少なくとも一部を含んでいてもよい。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、合成の非天然アルファへリックスまたはベータシートである。一部の実施形態では、タンパク質セグメントは、少なくとも約２０アミノ酸、例えば、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のアミノ酸である。合成膜貫通ドメインの例は、当該技術分野、例えば、米国特許第７，０５２，９０６Ｂ１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０００／０３２７７６Ａ２号（そのそれぞれの関連開示は参照により本明細書に組み込まれる）において周知である。
【００７８】
一部の実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列はシステイン残基を含まない。一部の実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は１つのシステイン残基を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は２つのシステイン残基を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は３つ以上のシステイン残基（例えば、３、４、５、またはそれ以上の）を含む。
【００７９】
膜貫通ドメインは、膜貫通領域、及び、膜貫通ドメインのＣ末端側に位置する細胞質領域、を含んでいてもよい。膜貫通ドメインの細胞質領域は、３つまたはそれ以上のアミノ酸を含んでいてもよく、一部の実施形態では、脂質二重層内において膜貫通ドメインが配向するのを補助する。一部の実施形態では、１つまたは複数のシステイン残基は、膜貫通ドメインの膜貫通領域内に存在している。一部の実施形態では、１つまたは複数のシステイン残基は、膜貫通ドメインの細胞質領域内に存在している。一部の実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は正に荷電したアミノ酸を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、アミノ酸アルギニン、セリン、及びリジンを含む。
【００８０】
一部の実施形態では、膜貫通ドメインの膜貫通領域は疎水性アミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、膜貫通領域は、主として、疎水性アミノ酸残基、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはバリンなどを含む。一部の実施形態では、膜貫通領域は疎水性である。一部の実施形態では、膜貫通領域はポリ−ロイシン−アラニン配列を含む。
【００８１】
タンパク質またはタンパク質セグメントの疎水性指標、疎水特性、または親水特性は、例えば、Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性指標解析を含む、当該技術分野において周知の任意の方法を用いて評価することができる。
【００８２】
Ｃ．共刺激シグナル伝達ドメイン
多くの免疫細胞は、細胞の増殖、分化、及び生存を促進するために加えて、細胞のエフェクター機能を活性化するために、抗原特異的シグナルの刺激に加えて共刺激を必要としている。一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチド、例えば、本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドまたはＣＡＲポリペプチドなどは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、キメラポリペプチドはＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインまたは４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激シグナル伝達ドメインを含有していてもよい。用語「共刺激シグナル伝達ドメイン」とは、本明細書で使用する場合、細胞内でシグナル伝達を媒介してエフェクター機能などの免疫応答（二次シグナル）を誘導する共刺激シグナル伝達タンパク質の少なくとも１つのフラグメントのことを意味する。当該技術分野において周知のとおり、Ｔ細胞などの免疫細胞の活性化は、２種のシグナル、（１）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び抗原提示細胞が提示する抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体の結合により誘発される抗原特異的シグナル（一次シグナル）（通常、ＴＣＲ複合体の構成要素としてのＣＤ３ζにより駆動される）、ならびに（ｉｉ）共刺激受容体とそのリガンドの間の相互作用により誘発される共刺激シグナル（二次シグナル）、を必要とすることが多い。共刺激受容体は、ＴＣＲ誘発シグナル伝達に加えたものとして共刺激シグナル（二次シグナル）を伝達して、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球などの免疫細胞が介在する反応を調節する。
【００８３】
宿主細胞（例えば、免疫細胞）における共刺激シグナル伝達ドメインの活性化は、細胞に、サイトカインの産生及び分泌、貪食性、増殖、分化、生存、及び／または細胞傷害を向上または抑制させ得る。任意の共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載のキメラポリペプチドに相性よく用いられてもよい。共刺激シグナル伝達ドメインのタイプ（複数可）は、キメラポリペプチドが発現し得る免疫細胞のタイプ（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球）、及び所望の免疫エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）などの因子に基づいて選択される。キメラポリペプチドに用いる共刺激シグナル伝達ドメインの例は、限定するわけではないが、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ、及びＰＤＣＤ６）、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９／ＣＤ１３７、４−１ＢＢ  リガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７  リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０  リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０  リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲ  リガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンフォトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０  リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ−アルファ、及びＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＳＬＡＭファミリーのメンバー（例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、及びＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、ならびに、任意のその他の共刺激分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ−１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ−１、ＬＡＧ−３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン−１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ−４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ  Ｒ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、及びＮＫＧ２Ｃなど、を含む、共刺激タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインであってもよい。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１（ＣＤ１１ａ）、もしくはＣＤ２、またはその任意のバリアントのものである。
【００８４】
本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメインのいずれかのバリアントもまた本開示の範囲内であり、その結果、共刺激シグナル伝達ドメインは免疫細胞の免疫応答を調節することができる。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、野生型同等物と比較して、最大１０アミノ酸残基の変異（例えば、１、２、３、４、５、または８）、例えば、アミノ酸置換、欠失、または付加などを含む。１つまたは複数のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換、欠失、または付加）を含むこのような共刺激シグナル伝達ドメインはバリアントと呼ばれることもある。
【００８５】
共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達の向上及び免疫応答の刺激向上をもたらし得る。共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達の抑制及び免疫応答の刺激抑制をもたらし得る。例えば、天然ＣＤ２８アミノ酸配列の残基１８６及び１８７の変異は、ＡＣＴＲポリペプチドの共刺激ドメインによる共刺激活性の向上及び免疫応答の誘導をもたらし得る。一部の実施形態では、変異は、ＣＤ２８共刺激ドメインのグリシン残基を用いた１８６位及び１８７位のそれぞれにおけるリジンの置換であり、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアントと呼ばれる。ドメインの共刺激活性を向上または抑制し得る、共刺激シグナル伝達ドメイン内において生成可能な別の変異は、当業者には明白である。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、またはＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアントのものである。
【００８６】
一部の実施形態では、キメラポリペプチドは、単一の共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２７共刺激ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、ＩＣＯＳ共刺激ドメイン、またはＯＸ４０共刺激ドメインなどを含有していてもよい。
【００８７】
一部の実施形態では、キメラポリペプチドは２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、２、３、またはそれ以上の）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、キメラポリペプチドは、２つまたはそれ以上の同一の共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインの２つの複製を含む。一部の実施形態では、キメラポリペプチドは、異なる共刺激タンパク質に由来する２つまたはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、任意の２つまたはそれ以上の本明細書に記載の共刺激タンパク質などを含む。共刺激シグナル伝達ドメインのタイプ（複数可）の選択は、キメラ受容体ポリペプチドと共に用いる宿主細胞のタイプ（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）、及び所望の免疫エフェクター機能などの因子に基づいていてもよい。一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、２つの共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインの２つの複製を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、異なる共刺激受容体に由来する２つまたはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、任意の２つまたはそれ以上の本明細書に記載の共刺激受容体など、例えば、ＣＤ２８及び４−１ＢＢ、ＣＤ２８及びＣＤ２７、ＣＤ２８及びＩＣＯＳ、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント及び４−１ＢＢ、ＣＤ２８及びＯＸ４０、またはＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント及びＯＸ４０を含んでいてもよい。一部の実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２８及び４−１ＢＢである。一部の実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント及び４−１ＢＢである。一部の実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２８及びＯＸ４０である。一部の実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント及びＯＸ４０である。一部の実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、ＣＤ２８とＩＣＯＳＬの組み合わせを含有していてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは、ＣＤ２８とＣＤ２７の組み合わせを含有していてもよい。特定の実施形態では、４−１ＢＢ共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインまたはＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端側に位置している。
【００８８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドは共刺激シグナル伝達ドメインを含まない。
【００８９】
Ｄ．細胞質シグナル伝達ドメイン
任意の細胞質シグナル伝達ドメインを使用して、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチドまたはＣＡＲポリペプチド）を作製してもよい。このような細胞質ドメインは、免疫細胞の増殖及び／または活性化をもたらす細胞シグナル伝達（一次シグナル伝達）の誘発に関与する任意のシグナル伝達ドメインであってもよい。本明細書に記載の細胞質シグナル伝達ドメインは、免疫細胞を完全に活性化させるための共刺激または二次シグナルを中継することが当該技術分野において周知である共刺激シグナル伝達ドメインではない。
【００９０】
本明細書に記載の細胞質ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）ドメインを含んでいてもよく、または、ＩＴＡＭを含んでいなくてもよい。「ＩＴＡＭ」は、本明細書で使用する場合、多くの免疫細胞で発現するシグナル伝達分子の尾部に通常は存在している保存タンパク質モチーフである。モチーフは、６〜８アミノ酸により隔てられたアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの２つのリピートを含んでいてもよく、式中、それぞれのｘは独立して任意のアミノ酸であり、保存モチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ（６〜８）ＹｘｘＬ／Ｉがもたらされる。シグナル伝達分子内のＩＴＡＭは、シグナル伝達分子の活性化に続くＩＴＡＭ内のチロシン残基のリン酸化が少なくとも部分的に介在する細胞内のシグナル伝達において重要である。ＩＴＡＭはまた、シグナル伝達経路に含まれるその他のタンパク質用のドッキング部位として機能し得る。
【００９１】
一部の例では、細胞質シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζまたはＦｃεＲ１γのものである。その他の例では、細胞質シグナル伝達ドメインはヒトＣＤ３ζに由来しない。更にその他の例では、細胞質シグナル伝達ドメインは、同一キメラ受容体ポリペプチドの細胞外Ｆｃ結合ドメインがＣＤ１６Ａに由来する場合、Ｆｃ受容体に由来しない。
【００９２】
１つの特定の実施形態では、相加効果または相乗効果用に、いくつかのシグナル伝達ドメインを共に融合させてもよい。有用な別のシグナル伝達ドメインの非限定例としては、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩｙ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ２Ｒ−ベータ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２Ｒ−ガンマ／ＣＤ１３２、及びＣＤ４０、のうちの１つまたは複数の一部または全てが挙げられる。
【００９３】
その他の実施形態では、本明細書に記載の細胞質シグナル伝達ドメインはＩＴＡＭモチーフを含まない。例としては、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ、Ｔｏｌｌ−インターロイキン受容体（ＴＩＲ）、及びチロシンキナーゼの、細胞質シグナル伝達ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９４】
Ｅ．ヒンジドメイン
一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチド、例えば、本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドまたはＣＡＲポリペプチドなどは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置するヒンジドメインを更に含む。ヒンジドメインは、タンパク質の２つのドメイン間に通常は存在するアミノ酸セグメントであり、タンパク質を柔軟にしてドメインの一方または両方の互いに対する移動を可能とし得る。キメラ受容体ポリペプチドの膜貫通ドメインに対する、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのこのような柔軟性及び移動をもたらす任意のアミノ酸配列を使用してもよい。
【００９５】
ヒンジドメインを含ませるための当該技術分野において周知の任意のタンパク質のヒンジドメインは、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドに相性よく用いられる。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、天然タンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部であり、キメラ受容体ポリペプチドに柔軟性を付与する。一部の実施形態では、ヒンジドメインはＣＤ８である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８のヒンジドメインの一部、例えば、ＣＤ８のヒンジドメインの少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、３５、または４０）連続アミノ酸を含有するフラグメントである。ヒンジドメイン及び／または膜貫通ドメインは、Ｎ末端部分、Ｃ末端部分、またはその両方において、別のアミノ酸（例えば、１５ａａ、１０−ａａ、８−ａａ、６−ａａ、または４−ａａ）に連結していてもよい。例えば、Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２５（６）：９４７−９５３（２０１９）にそれらの例を見出すことができる。
【００９６】
一部の実施形態では、ヒンジドメインはＣＤ２８である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ２８のヒンジドメインの一部、例えば、ＣＤ２８のヒンジドメインの少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、３５、または４０）連続アミノ酸を含有するフラグメントである。
【００９７】
一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ１６Ａ受容体のもの、例えば、ＣＤ１６Ａ受容体の最大４０（例えば、２０、２５、３０、３５、または４０）連続アミノ酸から構成され得る、ＣＤ１６Ａ受容体の全ヒンジドメインまたはその一部である。このようなキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチド）は、異なる受容体（非ＣＤ１６Ａ受容体）に由来するヒンジドメインを含有していなくてもよい。
【００９８】
抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体などのヒンジドメインはまた、本明細書に記載のキメラポリペプチドに相性よく用いられる。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１及びＣＨ２を連結させているヒンジドメインである。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のものであり、抗体のヒンジドメイン及び抗体の１つまたは複数の定常領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメイン及び抗体のＣＨ３定常領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインならびに抗体のＣＨ２定常領域及びＣＨ３定常領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体である。一部の実施形態では、抗体はＩｇＧ抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域ならびにＣＨ２定常領域及びＣＨ３定常領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域及びＣＨ３定常領域を含む。
【００９９】
非天然ペプチドはまた、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチド用のヒンジドメインとして使用することができる。一部の実施形態では、細胞外標的結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端の間のヒンジドメインは、ペプチドリンカー、例えば、（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎリンカーなどであり、式中、ｘ及びｎは独立して、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上を含む、３〜１２の整数であってもよい。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号：９３）であり、式中、ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０を含む、３〜６０の整数であってもよい。特定の実施形態では、ｎは６０超の整数であってもよい。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号：９４）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６（配列番号：９５）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）９（配列番号：９６）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１２（配列番号：９７）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１５（配列番号：９８）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３０（配列番号：９９）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４５（配列番号：１００）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６０（配列番号：１０１）である。
【０１００】
その他の実施形態では、ヒンジドメインは、様々な長さの親水性残基（例えば、１０〜８０アミノ酸残基）で構成される非構造的なポリペプチドである延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）である。ＸＴＥＮペプチドのアミノ酸配列は、当業者に明白であり、例えば、米国特許第８，６７３，８６０号（その関連開示は参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、６０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、３０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、４５アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、１５アミノ酸を含む。
【０１０１】
本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドを作製するために用いられるヒンジドメインのいずれかは、最大２５０アミノ酸残基を含有していてもよい。一部の例では、キメラ受容体ポリペプチドは、例えば、１５０〜２５０アミノ酸残基（例えば、１５０〜１８０アミノ酸残基、１８０〜２００アミノ酸残基、または２００〜２５０アミノ酸残基）を含有する、比較的長いヒンジドメインを含有していてもよい。その他の例では、キメラ受容体ポリペプチドは、６０〜１５０アミノ酸残基（例えば、６０〜８０、８０〜１００、１００〜１２０、または１２０〜１５０アミノ酸残基）を含有していてもよい、中程度のサイズのヒンジドメインを含有していてもよい。代替的に、キメラ受容体ポリペプチドは、６０未満のアミノ酸残基（例えば、１〜３０アミノ酸、または３１〜６０アミノ酸）を含有していてもよい、短いヒンジドメインを含有していてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチド）は、ヒンジドメインを含有しない、または、非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含有しない。
【０１０２】
Ｆ．シグナルペプチド
一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチドまたはＣＡＲポリペプチド）はまた、ポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチド（シグナル配列としても周知）を含んでいてもよい。一般的に、シグナル配列は、ポリペプチドを細胞内の所望の部位へと向けるペプチド配列である。一部の実施形態では、シグナル配列は、キメラ受容体ポリペプチドを細胞の分泌経路へと向けて、キメラ受容体ポリペプチドの脂質二重層への組み込み及びアンカリングを可能とする。本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドに相性よく用いられる天然タンパク質のシグナル配列または合成の非天然シグナル配列を含むシグナル配列は、当業者に明白である。一部の実施形態では、シグナル配列はＣＤ８αに由来する。一部の実施形態では、シグナル配列はＣＤ２８に由来する。その他の実施形態では、シグナル配列はマウスカッパ鎖に由来する。更にその他の実施形態では、シグナル配列はＣＤ１６に由来する。
【０１０３】
Ｇ．ＡＣＴＲポリペプチドの例
本明細書に記載の方法及び組成物と共に用いるための例示的なＡＣＴＲ構築物は、例えば、本明細書及び図面に見出され得る、または、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１６０４０４４１Ａ１号、第ＷＯ２０１７／１６１３３３号、及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１５９９９号（そのそれぞれはこの目的のために参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドは、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に対する結合親和性及び特異性を有するＣＤ１６Ａ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＡＣＴＲポリペプチドは、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを更に含んでいてもよく、そのうちの１つは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインまたは４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインであってもよい。ＡＣＴＲポリペプチドは、宿主細胞上で発現する際に、標的分子及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインに結合するために、細胞外リガンド結合ドメインが細胞外に位置するように構成されている。共刺激シグナル伝達ドメインは、活性化及び／またはエフェクターシグナル伝達を誘発するために、細胞質内に位置していてもよい。
【０１０４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｆｃ結合ドメイン、例えば、ＣＤ１６Ａ細胞外ドメインなど、膜貫通ドメイン、任意選択的な１つまたは複数の共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７共刺激シグナル伝達ドメイン、またはＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達ドメイン）、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、を含んでいてもよい。
【０１０５】
代替的にまたは加えて、本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドは、互いに連結していてもよい、または細胞質シグナル伝達ドメインにより隔てられていてもよい、２つまたはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含有していてもよい。ＡＣＴＲポリペプチド内における、細胞外Ｆｃ結合部、膜貫通ドメイン、任意選択的な共刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）、及び細胞質シグナル伝達ドメインは、直接またはペプチドリンカーを介して、互いに連結していてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドのいずれかは、Ｎ末端にシグナル配列を含んでいてもよい。
【０１０６】
本明細書に記載の例示的なＡＣＴＲポリペプチドを表４に記載する。これらの例示的な構築物は、任意選択的な共刺激ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメインの位置を交換可能ではあるが、Ｎ末端からＣ末端の順に、シグナル配列、Ｆｃ結合ドメイン（例えば、Ｆｃ受容体の細胞外ドメイン）、ヒンジドメイン、及び膜貫通部、を有する。
【表４−１】
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【表４−２】
2021529559.tif 000029
【表４−３】
2021529559.tif 000030
【表４−４】
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【表４−５】
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【０１０７】
例示的なＡＣＴＲポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する（シグナル配列はイタリック体）。
配列番号：１：
【化１３】
2021529559.tif 000033
配列番号：２：
【化１４】
2021529559.tif 000034
配列番号：３：
【化１５】
2021529559.tif 000035
配列番号：４：
【化１６】
2021529559.tif 000036
配列番号：５：
【化１７】
2021529559.tif 000037
配列番号：６：
【化１８】
2021529559.tif 000038
配列番号：７：
【化１９】
2021529559.tif 000039
配列番号：８：
【化２０】
2021529559.tif 000040
配列番号：９：
【化２１】
2021529559.tif 000041
配列番号：１０：
【化２２】
2021529559.tif 000042
配列番号：１１：
【化２３】
2021529559.tif 000043
配列番号：１２：
【化２４】
2021529559.tif 000044
配列番号：１３：
【化２５】
2021529559.tif 000045
配列番号：１４：
【化２６】
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配列番号：１５：
【化２７】
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配列番号：１６：
【化２８】
2021529559.tif 000048
配列番号：１７：
【化２９】
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配列番号：１８：
【化３０】
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配列番号：１９：
【化３１】
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配列番号：２０：
【化３２】
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配列番号：２１：
【化３３】
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配列番号：２２：
【化３４】
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配列番号：２３：
【化３５】
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配列番号：２４：
【化３６】
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配列番号：２５：
【化３７】
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配列番号：２６：
【化３８】
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配列番号：２７：
【化３９】
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配列番号：２８：
【化４０】
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配列番号：２９：
【化４１】
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配列番号：３０：
【化４２】
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配列番号：３１：
【化４３】
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配列番号：３２：
【化４４】
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配列番号：３３：
【化４５】
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配列番号：３４：
【化４６】
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配列番号：３５：
【化４７】
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配列番号：３６：
【化４８】
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配列番号：３７：
【化４９】
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配列番号：３８：
【化５０】
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配列番号：３９：
【化５１】
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配列番号：４０：
【化５２】
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配列番号：４１：
【化５３】
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配列番号：４２：
【化５４】
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配列番号：４３：
【化５５】
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配列番号：４４：
【化５６】
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配列番号：４５：
【化５７】
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配列番号：４６：
【化５８】
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配列番号：４７：
【化５９】
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配列番号：４８：
【化６０】
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配列番号：４９：
【化６１】
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配列番号：５０：
【化６２】
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配列番号：５１：
【化６３】
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配列番号：５２：
【化６４】
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配列番号：５３：
【化６５】
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配列番号：５４：
【化６６】
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配列番号：５５：
【化６７】
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配列番号：５６：
【化６８】
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配列番号：５７：
【化６９】
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配列番号：５８：
【化７０】
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配列番号：５９：
【化７１】
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配列番号：６０：
【化７２】
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配列番号：６１：
【化７３】
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配列番号：６２：
【化７４】
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配列番号：６３：
【化７５】
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配列番号：６４：
【化７６】
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配列番号：６５：
【化７７】
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配列番号：６６：
【化７８】
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配列番号：６７：
【化７９】
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配列番号：６８：
【化８０】
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配列番号：６９：
【化８１】
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配列番号：７０：
【化８２】
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配列番号：７１：
【化８３】
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配列番号：７２：
【化８４】
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配列番号：７３：
【化８５】
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配列番号：７４：
【化８６】
2021529559.tif 000106
配列番号：７５：
【化８７】
2021529559.tif 000107
配列番号：７６：
【化８８】
2021529559.tif 000108
配列番号：７７：
【化８９】
2021529559.tif 000109
配列番号：７８：
【化９０】
2021529559.tif 000110
配列番号：７９：
【化９１】
2021529559.tif 000111
配列番号：８０：
【化９２】
2021529559.tif 000112
【０１０８】
Ｈ．ＣＡＲポリペプチドの例
本明細書に記載の方法及び組成物と共に用いるための例示的なＣＡＲポリペプチドは、例えば、本明細書及び図面に見出され得る、または、当該技術分野において周知のＣＡＲポリペプチドである。本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、目的の抗原（例えば、上の表３に列挙した抗原）に対する結合親和性及び特異性を有する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを更に含んでいてもよく、そのうちの１つは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインまたは４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインであってもよい。ＣＡＲポリペプチドは、宿主細胞上で発現する際に、標的分子及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインに結合するために、細胞外抗原結合ドメインが細胞外に位置するように構成されている。共刺激シグナル伝達ドメインは、活性化及び／またはエフェクターシグナル伝達を誘発するために、細胞質内に位置していてもよい。
【０１０９】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、任意選択的な１つまたは複数の共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７共刺激シグナル伝達ドメイン、またはＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達ドメイン）、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、を含んでいてもよい。
【０１１０】
代替的にまたは加えて、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、互いに連結していてもよい、または細胞質シグナル伝達ドメインにより隔てられていてもよい、２つまたはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含有していてもよい。ＣＡＲポリペプチド内における、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、任意選択的な共刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）、及び細胞質シグナル伝達ドメインは、直接またはペプチドリンカーを介して、互いに連結していてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのいずれかは、Ｎ末端にシグナル配列を含んでいてもよい。
【０１１１】
本明細書に記載の例示的なＣＡＲポリペプチドを表５に記載する。これらの例示的な構築物は、任意選択的な共刺激ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメインの位置を交換可能ではあるが、Ｎ末端からＣ末端の順に、シグナル配列、抗原結合ドメイン（例えば、腫瘍抗原または病原体抗原などの抗原を標的とするｓｃＦｖフラグメント）、ヒンジドメイン、及び膜貫通部、を有する。
【表５】
2021529559.tif 000113
【０１１２】
例示的なＣＡＲポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する（シグナル配列はイタリック体）。
配列番号：１０４：
【化９３】
2021529559.tif 000114
配列番号：１０５：
【化９４】
2021529559.tif 000115
【０１１３】
ＩＩＩ．グルコース輸入ポリペプチド及び任意選択的にキメラ受容体ポリペプチドを発現する免疫細胞
本明細書では、本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチドのうちの１種または複数種を発現する遺伝子改変宿主細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞）を提供する。遺伝子改変宿主細胞は、本明細書においてもまた記載されているとおりに、キメラ受容体ポリペプチドを更に発現していてもよい（例えば、ＡＣＴＲ発現細胞、例えば、ＡＣＴＲ  Ｔ細胞、またはＣＡＲ発現Ｔ細胞）。
【０１１４】
代替的に、本明細書で開示する遺伝子改変宿主細胞はキメラ受容体ポリペプチドを何ら発現していなくてもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示する１種または複数種のグルコース輸入ポリペプチドを過剰発現していてもよい遺伝子改変免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来していてもよい。グルコース輸入ポリペプチドの過剰発現は、腫瘍微小環境において、抗腫瘍活性またはＴＩＬを向上させ得る。代替的にまたは加えて、遺伝子改変免疫細胞は、遺伝子改変Ｔ細胞受容体を更に有していてもよいＴ細胞であってもよい。ＴＩＬ及び／または遺伝子改変ＴＣＲはペプチド−ＭＨＣ複合体を標的としていてもよく、ペプチドは、病原体、腫瘍抗原、または自己抗原に由来していてもよい。一部の例を以下の表６に記載する。
【０１１５】
ＡＣＴＲ  Ｔ細胞と共に用いる本明細書で開示するＣＡＲ構築物または抗体のいずれかはまた、このようなペプチド／ＭＨＣ複合体内のペプチドのいずれかを標的としていてもよい。
【表６】
2021529559.tif 000116
【０１１６】
一部の実施形態では、宿主細胞は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などである。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。例えば、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ヘルパー細胞もしくはＣＤ８＋細胞傷害性細胞またはこれらの組み合わせであってもよい。代替的にまたは加えて、Ｔ細胞は、抑制性Ｔ細胞、例えば、Ｔｒｅｇ細胞などであってもよい。一部の実施形態では、免疫細胞はＮＫ細胞である。その他の実施形態では、免疫細胞は、樹立細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞であってもよい。一部の例では、免疫細胞は、異なるタイプの当該技術分野において周知のＴ細胞及び／またはＮＫ細胞の混合物であってもよい。例えば、免疫細胞は、好適なドナー（例えば、ヒト患者）から単離した免疫細胞の集団であってもよい。以下の開示内容を参照されたい。
【０１１７】
一部の例では、宿主細胞に導入するグルコース輸入ポリペプチドは、宿主細胞の内在性タンパク質と同一である。グルコース輸入ポリペプチドのコード配列の別の複製を宿主細胞に導入することにより、天然同等物と比較して、ポリペプチドの発現レベルが向上（すなわち、過剰発現）し得る。一部の例では、宿主細胞に導入するグルコース輸入ポリペプチドは、宿主細胞に対して異種、すなわち、宿主細胞には存在しない、または、宿主細胞においては発現しない。このような異種グルコース輸入ポリペプチドは、宿主細胞において本来発現しない天然タンパク質（例えば、異なる種に由来する）であってもよい。代替的に、異種グルコース輸入ポリペプチドは、天然タンパク質のバリアント、例えば、本明細書に記載の天然タンパク質のバリアントなどであってもよい。一部の例では、外来（すなわち、宿主細胞に内在していない）複製のコード核酸は染色体外に存在していてもよい。その他の例では、外来複製のコード配列は、宿主細胞の染色体に組み込まれていてもよく、内在性遺伝子の天然の遺伝子座とは異なる位置に配置されていてもよい。
【０１１８】
このような遺伝子改変宿主細胞は、環境、例えば、低グルコース環境からグルコースを取り込む高い能力を有し、それにより、低グルコース条件下においてより優れた増殖及び／または生理活性を示す。遺伝子改変細胞は、本明細書で開示するキメラ受容体ポリペプチドを発現する場合、直接（例えば、ＣＡＲ発現免疫細胞により）、または、Ｆｃ含有治療薬、例えば、抗腫瘍抗体（例えば、ＡＣＴＲ発現免疫細胞により）などを介してのいずれかで、標的細胞を認識してそれらを阻害することができる。低グルコース環境において想定されるその高い増殖率、生物活性、及び／または生存率を考慮すると、Ｔ細胞及びＮＫ細胞などの遺伝子改変細胞は、グルコース輸入ポリペプチドを発現しない、またはより低レベルもしくはより活性の低い形態のグルコース輸入ポリペプチドを発現する、ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞またはＣＡＲ発現Ｔ細胞と比較して、より高い治療効果を示すと予測され得る。
【０１１９】
免疫細胞の集団は、任意の供給源、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、骨髄、または、脾臓、リンパ節、胸腺、幹細胞、もしくは腫瘍組織などの組織などから得ることができる。代替的に、免疫細胞集団は、幹細胞、例えば、造血幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来していてもよい。望ましいタイプの宿主細胞を得るのに好適な供給源は、当業者には明白であろう。一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、本明細書に記載の治療を必要とする患者（例えば、ヒト患者）から採取してもよいＰＢＭＣに由来する。細胞を刺激分子と共培養することにより得られた細胞の集団内で、望ましいタイプの宿主細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＴ細胞及びＮＫ細胞）を増殖させてもよい。非限定例として、Ｔ細胞を増殖させるために抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用してもよい。
【０１２０】
本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチドのいずれか及び任意選択的にキメラ受容体ポリペプチドを発現する免疫細胞を構築するために、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドを安定発現または一過性発現させるための発現ベクターを本明細書に記載の通常の方法を用いて作製してから、免疫宿主細胞に導入してもよい。例えば、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸を、１種または２種の好適な発現ベクター、例えば、好適なプロモーターと機能的に連結したウイルスベクターなどにクローニングしてもよい。一部の例では、キメラ受容体ポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチド用のコード配列のそれぞれは、２種の別々の核酸分子上にあり、２種の別々のベクターにクローニングすることができ、それらのベクターを同時または連続的に好適な宿主細胞に導入してもよい。代替的に、キメラ受容体ポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチド用のコード配列は、１種の核酸分子上にあり、１種のベクターにクローニングしてもよい。キメラ受容体ポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチドのコード配列は、２種のポリペプチドの発現が異なるプロモーターによって制御されるように、２種の異なるプロモーターと機能的に連結していてもよい。代替的に、キメラ受容体ポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチドのコード配列は、２種のポリペプチドの発現が単一のプロモーターによって制御されるように、１種のプロモーターと機能的に連結していてもよい。２種の別々のポリペプチドが単一のｍＲＮＡ分子から翻訳され得るように、２種のポリペプチドのコード配列間に好適な配列を挿入してもよい。このような配列、例えば、ＩＲＥＳまたはリボソームスキッピング部位は当該技術分野において周知である。更なる説明については以下に記載する。
【０１２１】
適切な条件下で核酸及びベクター（複数可）を制限酵素と接触させて、互いに対をなすことによりリガーゼと連結可能となるそれぞれの分子上に相補末端を生成してもよい。代替的に、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸の末端に、合成核酸リンカーをライゲートしてもよい。合成リンカーは、ベクター内における特定の制限部位に対応する核酸配列を含有していてもよい。発現ベクター／プラスミド／ウイルスベクターの選択は、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドを発現させるための宿主細胞のタイプに依存し得るが、真核細胞における導入及び複製に好適である必要がある。
【０１２２】
本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドを発現させるために、限定するわけではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間初期プロモーター、ウイルスＬＴＲ、例えば、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１  ＬＴＲなど、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ヒトＥＦ１−アルファプロモーター、または単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーター、を含む、様々なプロモーターを使用してもよい。グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドを発現させるための更なるプロモーターとしては、免疫細胞内における任意の構成的に活性なプロモーターが挙げられる。代替的に、免疫細胞内においてその発現が調節され得るように、任意の調節性プロモーターを使用してもよい。
【０１２３】
加えて、ベクターは、例えば、以下、宿主細胞内の安定または一過性トランスフェクタントを選択するための選択マーカー遺伝子、例えば、ネオマイシン遺伝子またはカナマイシン遺伝子など、高レベルの転写を行うためのヒトＣＭＶの前初期遺伝子に由来するエンハンサー／プロモーター配列、ヒトＥＦ１−アルファ遺伝子のイントロン配列、ｍＲＮＡを安定させるためのＳＶ４０に由来する転写終了シグナル及びＲＮＡプロセシングシグナル、適切なエピソーム複製を行うためのＳＶ４０ポリオーマウイルス複製起点及びＣｏｌＥ１、配列内リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、汎用性のあるマルチクローニング部位、センス及びアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写を行うためのＴ７及びＳＰ６  ＲＮＡプロモーター、誘発時にベクターを有する細胞の死滅を引き起こす「自殺スイッチ」または「自殺遺伝子」（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ、または誘導性カスパーゼ、例えば、ｉＣａｓｐ９など）、ならびに、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドの発現を評価するためのレポーター遺伝子、の一部または全てを含有していてもよい。
【０１２４】
１つの特定の実施形態では、このようなベクターはまた自殺遺伝子を含む。本明細書で使用する場合、用語「自殺遺伝子」とは、その自殺遺伝子を発現する細胞の死滅を引き起こす遺伝子のことを意味する。自殺遺伝子は、細胞がその遺伝子を発現する際に、薬剤、例えば、薬物への感受性を付与する遺伝子であってもよく、細胞が薬剤と接触するまたは薬剤に曝露されると、細胞の死滅が引き起こされる。自殺遺伝子は、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｓｕｉｃｉｄｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃａｒｏｌｉｎｅ  Ｊ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｕｔｔｏｎ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００４を参照されたい）、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ニトロレダクターゼ、及びカスパーゼ、例えば、カスパーゼ８など、が挙げられる。好適なベクター、及び導入遺伝子を含有するベクターを作製するための方法は、当該技術分野において周知かつ利用可能である。グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドを発現させるためのベクターの調製の例は、例えば、ＵＳ２０１４／０１０６４４９（その全体は参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
【０１２５】
本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターのいずれかはまた、本開示の範囲内である。このようなベクター、または、その中に含まれるグルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドをコードする配列を、任意の好適な方法によって、宿主細胞、例えば、宿主免疫細胞などに導入してもよい。ベクターを免疫細胞に導入するための方法は、当該技術分野において周知であり、ＤＮＡエレクトロポレーション、ＲＮＡエレクトロポレーション、リポソームなどの試薬を用いたトランスフェクション、またはウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入などのレトロウイルス形質導入）、を挙げることができる。
【０１２６】
一部の実施形態では、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドを発現させるためのベクターは、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入などのレトロウイルス形質導入）により、宿主細胞に導入される。導入を行うための例示的なウイルス法としては、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０７９３６号、第ＷＯ９４／０３６２２号、第ＷＯ９３／２５６９８号、第ＷＯ９３／２５２３４号、第ＷＯ９３／１１２３０号、第ＷＯ９３／１０２１８号、及び第ＷＯ９１／０２８０５号、米国特許第５，２１９，７４０号及び第４，７７７，１２７号、英国特許第２，２００，６５１号、ならびに欧州特許第０３４５２４２号を参照のこと）、アルファウイルスベースのベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号、第ＷＯ９３／０３７６９号、第ＷＯ９３／１９１９１号、第ＷＯ９４／２８９３８号、第ＷＯ９５／１１９８４号、及び第ＷＯ９５／００６５５号を参照のこと）、が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドを発現させるためのベクターはレトロウイルスである。一部の実施形態では、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドを発現させるためのベクターはレンチウイルスである。
【０１２７】
レトロウイルス形質導入について記載している参照文献の例としては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，３９９，３４６号、Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３３：１５３（１９８３）、Ｔｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，６５０，７６４号、Ｔｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，９８０，２８９号、Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１１２０（１９８８）、Ｔｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第号５，１２４，２６３、１９９５年３月１６日に公開されたＤｏｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．による国際特許公開第ＷＯ９５／０７３５８号、及びＫｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８２：８４５（１９９３）、が挙げられる。国際特許公開第ＷＯ９５／０７３５８号は、初代Ｂリンパ球の高効率形質導入について記載している。ＷＯ２０１６／０４０４４１Ａ１（本明細書で参照する用途及び主題で参照により本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい。
【０１２８】
ウイルスベクターを用いて、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドをコードするベクターを宿主細胞に導入する例では、免疫細胞を感染させてベクターを担持することができるウイルス粒子は、当該技術分野において周知の任意の方法を用いて作製してもよく、例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ１９９１／００２８０５Ａ２号、第ＷＯ１９９８／００９２７１Ａ１号、及び米国特許６，１９４，１９１に見出すことができる。ウイルス粒子を細胞培養上清から回収して、単離及び／または精製してから、そのウイルス粒子を免疫細胞と接触させてもよい。
【０１２９】
一部の実施形態では、本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドのいずれかをコードするＲＮＡ分子を通常の方法（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写）で調製してから、周知の方法、例えば、Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７：１０２７−１０３５により、好適な宿主細胞、例えば、本明細書に記載の宿主細胞に導入してもよい。
【０１３０】
一部の例では、グルコース輸入ポリペプチドをコードする核酸及び好適なキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸を別々の発現ベクターにクローニングしてもよく、それらの発現ベクターを同時または連続的に好適な宿主細胞に導入してもよい。例えば、グルコース輸入ポリペプチドを発現させるための発現ベクター（またはＲＮＡ分子）を宿主細胞に最初に導入してもよく、グルコース輸入ポリペプチドを発現するトランスフェクション済み宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで単離及び培養してもよい。次に、好適なキメラ受容体ポリペプチドを発現させるための発現ベクター（またはＲＮＡ分子）を、グルコース輸入ポリペプチドを発現する宿主細胞に導入してもよく、両方のポリペプチドを発現するトランスフェクション済み細胞を単離してもよい。別の例では、それぞれグルコース輸入ポリペプチド及びキメラ受容体ポリペプチドを発現させるための発現ベクター（またはＲＮＡ分子）を宿主細胞に同時に導入してもよく、両方のポリペプチドを発現するトランスフェクション済み宿主細胞を通常の方法で単離してもよい。
【０１３１】
その他の例では、グルコース輸入ポリペプチドをコードする核酸及びキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸を同一の発現ベクターにクローニングしてもよい。キメラ受容体ポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチドを発現させるためのポリヌクレオチド（このようなポリヌクレオチドが少なくとも１つの調節エレメントと機能的に連結しているベクターを含む）はまた、本開示の範囲内である。本開示の有用なベクターの非限定例としては、ウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）、及びレンチウイルスベクターを含む、レトロウイルスベクター、などが挙げられる。
【０１３２】
一部の例では、トランスポゾンを用いて、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸（複数可）を宿主細胞に導入してもよい。一部の例では、遺伝子編集により、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはメガヌクレアーゼを用いて、コード核酸（複数可）を宿主細胞に導入してもよい。
【０１３３】
一部の例では、本明細書に記載の核酸は２種のコード配列を含んでいてもよく、一方は本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチドをコードし、もう一方はグルコース輸入を向上させることができるポリペプチドをコードする（すなわち、グルコース輸入ポリペプチド）。本明細書に記載の２種のコード配列を含む核酸は、２種のコード配列によりコードされるポリペプチドが独立した（かつ物理的に離れている）ポリペプチドとして発現可能となるように構成されていてもよい。この目的を達成するために、本明細書に記載の核酸は、第１のコード配列と第２のコード配列の間に位置する第３のヌクレオチド配列を含有していてもよい。この第３のヌクレオチド配列は、例えば、リボソームスキッピング部位をコードしていてもよい。リボソームスキッピング部位は、正常なペプチド結合形成を阻害する配列である。このメカニズムにより、１つのメッセンジャーＲＮＡに由来する別のオープンリーディングフレームの翻訳がもたらされる。この第３のヌクレオチド配列は、例えば、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、またはＦ２Ａペプチドをコードしていてもよい（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１；６（４）：ｅ１８５５６を参照されたい）。非限定例として、例示的なＰ２Ａペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ  配列番号：１０２のアミノ酸配列を有していてもよい。
【０１３４】
別の実施形態では、第３のヌクレオチド配列は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードしていてもよい。ＩＲＥＳは、末端非依存的な翻訳開始を可能とし、１つのメッセンジャーＲＮＡに由来する別のオープンリーディングフレームの翻訳もまた可能とするＲＮＡエレメントである。代替的に、第３のヌクレオチド配列は、第２のポリペプチドの発現を制御する第２のプロモーターをコードしていてもよい。第３のヌクレオチド配列はまた、２種以上の、リボソームスキッピング配列、ＩＲＥＳ配列、別のプロモーター配列、またはこれらの組み合わせをコードしていてもよい。
【０１３５】
核酸はまた、別のコード配列（第４のコード配列及び第５のコード配列を含むがこれらに限定されない）を含んでいてもよく、別のコード配列によりコードされるポリペプチドが更に独立かつ物理的に離れているポリペプチドとして発現するように構成されていてもよい。この目的のために、別のコード配列は、１つまたは複数の、リボソームスキッピング配列、ＩＲＥＳ配列、または別のプロモーター配列をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列により、その他のコード配列から離れていてもよい。
【０１３６】
一部の例では、核酸（例えば、本明細書に記載の発現ベクターまたはＲＮＡ分子）は、グルコース輸入ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチド）と好適なＡＣＴＲポリペプチドの両方のためのコード配列を含んでいてもよく、それら２種のコード配列は、任意の順番で、Ｐ２Ａペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列（例えば、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、配列番号：１０２）により隔てられている。その結果、このような核酸から、２種の別々のポリペプチド、グルコース輸入ポリペプチド及びＡＣＴＲが生成され得、Ｐ２Ａ部分ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ（配列番号：１０３）は上流のポリペプチド（上流のコード配列によりコードされる）に連結し、Ｐ２Ａペプチドに由来する残基Ｐは下流のポリペプチド（下流のコード配列によりコードされる）に連結している。一部の例では、ＡＣＴＲポリペプチドは上流のポリペプチドであり、グルコース輸入ポリペプチドは下流のポリペプチドである。その他の例では、グルコース輸入ポリペプチドは上流のポリペプチドであり、ＡＣＴＲポリペプチドは下流のポリペプチドである。
【０１３７】
一部の例では、上記の核酸は、２セグメントのコード配列間、例えば、上流のポリペプチドとＰ２Ａペプチドの間のリンカー（例えば、ＧＳＧリンカー）を更にコードしていてもよい。
【０１３８】
特定の例では、本明細書に記載の核酸は、核酸をトランスフェクションする宿主細胞内で２種の別々のポリペプチド、（ｉ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、好適なＡＣＴＲ（例えば、本明細書に記載の配列番号：１〜８０のいずれか、例えば、配列番号：１または配列番号：５７）、ペプチドリンカー（例えば、ＧＳＧリンカー）、及びＰ２Ａペプチドに由来するＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ（配列番号：１０３）セグメント、を含有する第１のポリペプチド、ならびに（ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｐ２Ａペプチドに由来するＰ残基、及びグルコース輸入ポリペプチド（例えば、配列番号：８１〜９０のいずれか）、を含有する第２のポリペプチド、を発現するように構成されている。
【０１３９】
その他の特定の例では、本明細書に記載の核酸は、核酸をトランスフェクションする宿主細胞内で２種の別々のポリペプチド、（ｉ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、好適なＣＡＲ（例えば、本明細書に記載の配列番号：１０４〜１０５のいずれか、例えば、配列番号：１０４または配列番号：１０５）、ペプチドリンカー（例えば、ＧＳＧリンカー）、及びＰ２Ａペプチドに由来するＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ（配列番号：１０３）セグメント、を含有する第１のポリペプチド、ならびに（ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｐ２Ａペプチドに由来するＰ残基、及びグルコース輸入ポリペプチド（例えば、配列番号：８１〜９０のいずれか）、を含有する第２のポリペプチド、を発現するように構成されている。
【０１４０】
一部の例では、別の目的のポリペプチドはまた、宿主免疫細胞に導入されていてもよい。
【０１４１】
本明細書で提供するグルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドのいずれかをコードするベクター、または、キメラ受容体及び／またはグルコース輸入ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ分子）を、宿主細胞に導入した後、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドの発現が可能となる条件下で、それらの細胞を培養してもよい。グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸が調節性プロモーターによって調節される例では、調節性プロモーターが活性化する条件下で、宿主細胞を培養してもよい。一部の実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターであり、免疫細胞は、誘導性分子の存在下、または誘導性分子が生成される条件下で、培養される。グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドが発現しているかどうかを確認することは当業者に明白であり、任意の周知の方法、例えば、定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いた、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの検出、または、ウェスタンブロット法、蛍光顕微鏡、及びフローサイトメトリーを含む方法を用いた、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドの検出により、評価することができる。
【０１４２】
代替的に、免疫細胞を対象に投与した後に、キメラポリペプチドの発現をｉｎ  ｖｉｖｏで生じさせてもよい。本明細書で使用する場合、用語「対象」とは、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、サル、マウス、ウサギ、または家畜哺乳動物などのことを意味する。例えば、対象は霊長類であってもよい。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【０１４３】
代替的に、本明細書で開示する免疫細胞のいずれかにおけるグルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドの発現は、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドをコードするＲＮＡ分子を導入することにより達成することができる。このようなＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写または化学合成により調製することができる。その後、例えば、エレクトロポレーションを用いて、好適な宿主細胞、例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＴ細胞とＮＫ細胞の両方）などに、それらＲＮＡ分子を導入してもよい。例えば、Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７：１０２７−１０３５及びＷＯＷＯ２０１３／０４０５５７に記載されている方法に従い、ＲＮＡ分子を合成してから宿主免疫細胞に導入してもよい。
【０１４４】
特定の実施形態では、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドを含むベクター（複数可）またはＲＮＡ分子（複数可）を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、宿主細胞または免疫細胞に導入してもよい。非限定例として、本明細書に記載の１種または複数種のグルコース輸入ポリペプチド及び／または１種または複数種のキメラ受容体ポリペプチドをコードするベクターまたはＲＮＡ分子を、対象に直接投与（例えば、静脈内投与により）して、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドを含む宿主細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで作製することにより、この導入を達成してもよい。
【０１４５】
本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドのいずれかを発現する宿主細胞を調製するための方法はまた、宿主細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで活性化させることを含んでいてもよい。宿主細胞を活性化させるとは、宿主細胞を刺激して、その細胞がエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣなどの細胞傷害）を発揮可能となり得る活性化状態にさせることを意味する。宿主細胞を活性化させるための方法は、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドを発現させるために用いる宿主細胞のタイプに依存する。例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、フィトヘマグルチニン、改変人工刺激細胞もしくは粒子、またはこれらの組み合わせ、を含むがこれらに限定されない１種または複数種の分子の存在下で、Ｔ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで活性化させてもよい。改変人工刺激細胞は、当該技術分野において周知の人工抗原提示細胞であってもよい。例えば、Ｎｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．２０１７，２（１）：６８−７９及びＴｕｒｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．２０１０，１６（４）：３７４−３８１（そのそれぞれの関連開示は、本明細書で参照する用途及び主題で参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１４６】
その他の例では、１種または複数種の分子、例えば、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２、ＩＬ１２、ＩＬ−２１、Ｋ５６２細胞、及び／または改変人工刺激細胞または粒子などの存在下で、ＮＫ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで活性化させてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドのいずれかを発現する宿主細胞（ＡＣＴＲ／ＣＡＲ及び／またはグルコース輸入ポリペプチドを発現する細胞）をｅｘ  ｖｉｖｏで活性化させてから、対象に投与する。宿主細胞が活性化しているかどうかを確認することは当業者に明白であり、細胞の活性化、サイトカインの発現または分泌、及び細胞の形態と関連する１種または複数種の細胞表面マーカーの発現を評価することを含んでいてもよい。
【０１４７】
本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドのいずれかを発現する宿主細胞を調製するための方法は、宿主細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させることを含んでいてもよい。宿主細胞を増殖させることは、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドを発現する細胞の数の増加をもたらす、例えば、宿主細胞を増殖させるまたは宿主細胞を刺激して増殖させる、任意の方法を含んでいてもよい。宿主細胞の増殖を刺激するための方法は、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドを発現させるために用いる宿主細胞のタイプに依存し、当業者に明白である。一部の実施形態では、本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドのいずれかを発現する宿主細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させてから、対象に投与する。
【０１４８】
一部の実施形態では、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドを発現する宿主細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖及び活性化させてから、それらの細胞を対象に投与する。宿主細胞の活性化及び増殖を用いて、ウイルスベクターをゲノムに導入して、本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させてもよい。ｍＲＮＡエレクトロポレーションを使用する場合、活性化細胞に対して実施する際にエレクトロポレーションがより効果的となり得るが、活性化及び／または増殖は必須でなくてもよい。一部の例では、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドは、好適な宿主細胞において一過的（例えば、３〜５日間）に発現する。一過性発現は、潜在的な毒性がある場合に有利であり得、臨床試験の初期段階で発生し得る副作用に有用となるはずである。
【０１４９】
グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチドを発現する宿主細胞のいずれかを医薬的に許容される担体と混合して医薬組成物を形成してもよく、その医薬組成物はまた、本開示の範囲内である。
【０１５０】
本開示の組成物と共に用いられる語句「薬学的に許容される」とは、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与する際に、生理学的に忍容性があり、通常は、有害反応を引き起こさない、このような組成物の分子要素及びその他の成分のことを意味する。好ましくは、本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される」とは、連邦政府または州政府の監督機関により承認されていること、または、哺乳動物、より詳細には、ヒトにおける使用用に米国薬局方またはその他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「許容される」とは、担体が、組成物の活性成分（例えば、核酸、ベクター、細胞、または治療抗体）と相性がよく、組成物（複数可）を投与する対象にマイナスの影響を及ぼさないということを意味する。本方法に用いる医薬組成物のいずれかは、凍結乾燥組成物または水溶液の形態の、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤、を含んでいてもよい。
【０１５１】
緩衝剤を含む薬学的に許容される担体は当該技術分野において周知であり、リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど；アミノ酸；疎水性ポリマー；単糖；二糖；ならびに、その他の炭水化物；金属錯体；及び／または非イオン性界面活性剤、を含んでいてもよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒを参照されたい。
【０１５２】
本開示の医薬組成物はまた、治療する特定の適応症用及び／またはＡＤＣＣの増強用に、必要に応じて、１種または複数種の別の活性化合物を含有していてもよく、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する活性化合物であることが好ましい。考えられる別の活性化合物の非限定例としては、例えば、ＩＬ−２に加えて、当分野において周知かつ以下の組み合わせ治療の記述に列挙されている様々な因子が挙げられる。
【０１５３】
ＩＶ．遺伝子改変免疫細胞の治療用途
本明細書で開示する遺伝子改変免疫細胞は、様々な障害、例えば、がん、感染性疾患、及び自己免疫疾患に対する免疫療法に使用することができる。
【０１５４】
（ａ）ＡＣＴＲポリペプチドを発現する遺伝子改変免疫細胞及びＦｃ含有治療薬の組み合わせ免疫療法
本開示の例示的なＡＣＴＲポリペプチドは、Ｔリンパ球に抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）能を付与し、ＮＫ細胞におけるＡＤＣＣを増強する。細胞に結合した抗体が受容体に結合すると、その受容体は、Ｔ細胞の活性化、持続的な増殖、及び結合細胞に対する特異的な細胞傷害を誘発する。
【０１５５】
ＩｇのＦｃ部分に対するＣＤ１６の親和性の度合いはＡＤＣＣの重要な決定因子であり、それゆえ、抗体免疫療法に対する臨床効果の重要な決定因子である。Ｉｇに対する高い結合親和性を示し、優れたＡＤＣＣを介在する、Ｖ１５８遺伝子多型を有するＣＤ１６を一例として選択した。Ｆ１５８受容体は、Ｖ１５８受容体と比較してＴ細胞増殖及びＡＤＣＣの誘導におけるより低い潜在能を示すが、Ｆ１５８受容体がＶ１５８受容体と比較してより低いｉｎ  ｖｉｖｏ毒性を示し得ることから、一部の臨床状況において有用なものとなっている。
【０１５６】
免疫細胞においてＡＣＴＲポリペプチドと共発現させるグルコース輸入ポリペプチドは、低グルコース環境で細胞を効果的に増殖及び／または機能させることにより、細胞ベース免疫療法、例えば、Ｔ細胞療法またはＮＫ細胞療法などに役立ち得る。抗体誘導細胞傷害は、抗体投与を単に停止することにより、必要な場合はいつでも停止させることができる。ｍＲＮＡエレクトロポレーションを用いて、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはＡＣＴＲポリペプチドを一過的に発現させて、任意の潜在的な自己免疫反応を制限することにより、臨床的安全性は更に向上し得る。
【０１５７】
それゆえ、一実施形態では、本開示は、がんの抗体ベース免疫療法を必要とする対象におけるその効果を向上させるための方法を提供し、対象は、抗原発現細胞に結合可能な治療抗体などのＦｃ含有治療薬を用いた治療を受けている。Ｆｃ含有治療薬は、Ｆｃ部分、例えば、改変免疫細胞上に発現したＡＣＴＲのＦｃ結合部分（例えば、ヒトＣＤ１６Ａの細胞外ドメイン）が認識して結合し得る、ヒトまたはヒト化Ｆｃ部分を含有している。
【０１５８】
本明細書に記載の方法は、治療有効量の抗体、及び、治療有効量の遺伝子改変宿主細胞、例えば、本開示のグルコース輸入ポリペプチド及びＡＣＴＲポリペプチドを共発現する免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞）などを対象に導入することを含んでいてもよい。対象（例えば、ヒト患者、例えば、ヒトがん患者など）は、標的抗原に特異的なＦｃ含有治療薬を用いた治療を受けたことがあってもよい、または受けていてもよい。標的抗原は、限定するわけではないが、腫瘍抗原、病原体抗原（例えば、細菌またはウイルスの）、または疾患細胞上の抗原、例えば、本明細書に記載のもの、を含む、疾患または症状と関連する任意の分子であってもよい。
【０１５９】
本明細書で列挙する疾患症状のいずれかと関連する範囲の本開示の文脈において、用語「治療する」、「治療」などとは、このような症状と関連する少なくとも１種の症候を軽減もしくは改善すること、または、このような症状の進行を遅延もしくは逆転させることを意味する。本開示の趣旨の範囲内において、用語「治療する」とはまた、発症（すなわち、疾患の臨床発現前の段階）を阻止、遅延させること、及び／または、疾患が進行もしくは悪化するリスクを低下させることを意味する。例えば、がんに関連し、用語「治療する」とは、患者の腫瘍負荷を除去もしくは低下させること、または、転移を予防、遅延、もしくは阻害することなどを意味し得る。
【０１６０】
本明細書で使用する場合、用量または量に適用される用語「治療的に有効」とは、化合物または医薬組成物を必要とする対象にそれを投与する際に、所望の活性をもたらすのに十分な化合物または医薬組成物の量のことを意味する。活性成分の組み合わせを投与する場合（例えば、抗体を含む第１の医薬組成物、及び、グルコース輸入ポリペプチド及び／または抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）構築物を発現するＴリンパ球またはＮＫ細胞の集団を含む第２の医薬組成物）、組み合わせの有効量が、個別に投与する場合に有効となり得るそれぞれの成分の量を含んでいてもいなくてもよいということに留意されたい。本開示の文脈の範囲内において、用語「治療的に有効」とは、本開示の方法で治療する障害の少なくとも１種の症候の発現を遅延させる、本開示の方法で治療する障害の少なくとも１種の症候の進行を阻止する、本開示の方法で治療する障害の少なくとも１種の症候を軽減または緩和するのに十分な、化合物または医薬組成物の量のことを意味する。
【０１６１】
本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチド及びＡＣＴＲポリペプチドを発現する宿主細胞（例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞など）は、対象におけるＡＤＣＣを増強するのに、及び／または、抗体ベース免疫療法の効果を向上させるのに、及び／または、低グルコース環境における免疫細胞の成長及び／または増殖を向上させるのに有用である。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、サル、マウス、ウサギ、または家畜哺乳動物などである。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象はヒトがん患者である。一部の実施形態では、対象は、本明細書に記載の治療抗体のいずれかを用いた治療を受けたことがあるまたは受けている。
【０１６２】
本明細書に記載の方法を実施するために、本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチド及びＡＣＴＲポリペプチドのいずれかを発現する有効量の免疫細胞（ＮＫ細胞及び／またはＴリンパ球）、及び有効量の抗体、またはその組成物を、好適な経路、例えば、静脈内投与などで、治療を必要とする対象に投与してもよい。本明細書で使用する場合、有効量とは、投与すると対象に治療効果を付与する、それぞれの因子（例えば、グルコース輸入ポリペプチド、ＡＣＴＲポリペプチドを発現するＮＫ細胞及び／またはＴリンパ球、抗体、またはその組成物）の量のことを意味する。本明細書に記載の細胞または組成物の量が治療効果を達成するかどうかを確認することは、当業者には明白であろう。有効量は、当業者が認識しているとおり、治療する個々の症状、症状の重症度、個々の患者の特性（年齢、身体的な状態、サイズ、ジェンダー、性別、及び体重を含む）、治療期間、併用療法（ある場合）の性質、個々の投与経路、ならびに、医療従事者の知見及び専門知識の範囲内の類似因子、によって様々である。一部の実施形態では、有効量は、対象における症候を緩和、軽減、改善、向上、抑制する、または、対象における任意の疾患または障害の進行を遅延させる。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、治療を必要とする対象はヒトがん患者である。一部の実施形態では、治療を必要とする対象は、１種または複数種の病原性感染症（例えば、ウイルス感染症、細菌感染症、及び／または真菌感染症）を患っている。
【０１６３】
任意のがんまたは任意の病原体を治療するために、本開示の方法を使用してもよい。本開示の方法を用いて治療することができるがんの具体的な非限定例としては、例えば、リンパ腫、乳癌、胃癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺癌、皮膚癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓癌、頭頸部癌、網膜芽細胞腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、甲状腺癌、肝細胞癌、食道癌、及び子宮頸癌、が挙げられる。特定の実施形態では、がんは固形腫瘍であってもよい。
【０１６４】
本開示の方法はまた、細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染によって引き起こされ得る感染性疾患を治療するために使用してもよい。このような例においては、病原体抗原（例えば、感染症を引き起こす細菌、ウイルス、または真菌と関連する抗原）を標的とするＦｃ含有治療薬（例えば、抗体）と共に、遺伝子改変免疫細胞を使用してもよい。病原体抗原の具体的な非限定例としては、細菌抗原、ウイルス抗原、及び／または真菌抗原、が挙げられるがこれらに限定されない。一部の例を以下、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、ヘマグルチニン、もしくはＭ２タンパク質、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ糖タンパク質もしくはＧ糖タンパク質、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、もしくはｇＥ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ＭＯＭＰもしくはＰｏｒＢタンパク質、デング熱ウイルスコアタンパク質、マトリックスタンパク質、もしくは糖タンパク質Ｅ、麻疹ウイルスヘマグルチニン、単純ヘルペスウイルスＩＩ型糖タンパク質ｇＢ、ポリオウイルスＩ  ＶＰ１、ＨＩＶ  １のエンベロープ糖タンパク質、Ｂ型肝炎コア抗原もしくは表面抗原、ジフテリア毒素、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ２４Ｍ  エピトープ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃａｌ  ｐｉｌｉｎ、仮性狂犬病ウイルスｇ５０（ｇｐＤ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩ（ｇｐＢ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩＩ（ｇｐＣ）、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、伝染性胃腸炎糖タンパク質１９５、伝染性胃腸炎マトリックスタンパク質、または、ヒトＣ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｅ１もしくはＥ２、に記載する。
【０１６５】
一部の実施形態では、ＡＤＣＣ活性を少なくとも２０％及び／または少なくとも２倍増強させる、例えば、ＡＤＣＣを５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍またはそれ以上増強させるのに有効な量で、免疫細胞を対象に投与する。
【０１６６】
Ｆｃ含有治療薬が結合する抗原を発現する細胞を標的とするために、免疫細胞を、治療抗体などのＦｃ含有治療薬と共に同時投与する。一部の実施形態では、２種以上のＦｃ含有治療薬、例えば、２種以上の抗体などを、免疫細胞と共に使用してもよい。抗体ベース免疫療法を用いて、免疫療法が有効と考えられる対象における任意の疾患または障害の症候を治療、緩和または抑制してもよい。
【０１６７】
抗体（複数形で同義で用いられる）は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１種の抗原認識部位を介して、標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、インタクト（すなわち、全長）なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、Ｆｃ領域、その変異体を含むその抗原結合フラグメント、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ディアボディ、ナノボディ、直鎖状抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ならびに、所定の特異性の抗原認識部位及びＦｃ領域を含む免疫グロブリン分子の任意のその他の修飾形態（抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、及び共有結合修飾抗体を含む）もまた包含する。抗体としては、任意のクラスの抗体、例えば、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などが挙げられ、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。抗体の重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスへと割り当てることができる。５種の主なクラスの免疫グロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在しており、これらのうちの数種を、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２へと更に分類することができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれている。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構造は周知である。本開示で使用する抗体は、共に使用するＡＣＴＲ及び／またはグルコース輸入ポリペプチド発現免疫細胞が認識可能なＦｃ領域を含有している。Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域またはヒト化Ｆｃ領域であってもよい。
【０１６８】
本明細書に記載の抗体のいずれかは、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであってもよい。「モノクローナル抗体」とは均質な抗体集団のことを意味し、「ポリクローナル抗体」とは不均質な抗体集団のことを意味する。これら２つの用語は、抗体の供給源または抗体を作製する方法を限定しない。
【０１６９】
１つの例では、本明細書に記載の方法に用いる抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその抗原結合フラグメントである、非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態のことを意味する。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性、及び性能を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも導入したＣＤＲ配列またはフレームワーク配列にも存在していないが、抗体性能を更に改良及び最適化するために含ませる残基を含んでいてもよい。一般的に、ヒト化抗体は、全てまたはほぼ全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全てまたはほぼ全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である、少なくとも１つの、通常は２つの可変ドメインのほぼ全てを含む。ヒト化抗体はまた、最適に、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）、通常は、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。抗体は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されているように修飾されたＦｃ領域を有していてもよい。本明細書で用いる抗体は、グリコシル化（例えば、フコシル化）またはアフコシル化されていてもよい。ヒト化抗体のその他の形態は、元の抗体を基準として変化させた１つまたは複数のＣＤＲ（１、２、３、４、５、６）を有し、それらはまた、元の抗体の１つまたは複数のＣＤＲ「に由来する」１つまたは複数のＣＤＲと呼ばれる。ヒト化抗体はまた、親和性成熟を伴っていてもよい。
【０１７０】
別の例では、本明細書に記載の抗体は、ヒト抗体に由来する重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含んでいてもよいキメラ抗体である。キメラ抗体とは、第１の種に由来する可変領域または可変領域の一部、及び第２の種に由来する定常領域を有する抗体のことを意味する。一般的に、これらのキメラ抗体においては、軽鎖と重鎖の両方の可変領域は、１種の哺乳動物（例えば、非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ウサギ、及びラットなど）に由来する抗体の可変領域を模倣している一方で、定常部分は、別の哺乳動物、例えば、ヒトなどに由来する抗体の配列に相同である。一部の実施形態では、可変領域及び／または定常領域において、アミノ酸修飾を行ってもよい。
【０１７１】
本明細書で開示するグルコース輸入ポリペプチド及び／またはＡＣＴＲポリペプチドのいずれかを発現する免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球及び／またはＮＫ細胞）を、Ｆｃ含有抗体を用いた治療を受けたことがあるまたは受けている対象に投与してもよい。例えば、免疫細胞を、抗体と同時にヒト対象に投与してもよい。代替的に、免疫細胞を、抗体ベース免疫療法中にヒト対象に投与してもよい。一部の例では、免疫細胞及び抗体を、少なくとも４時間の間隔をあけて、例えば、少なくとも１２時間の間隔をあけて、少なくとも１日間の間隔をあけて、少なくとも３日間の間隔をあけて、少なくとも１週間の間隔をあけて、少なくとも２週間の間隔をあけて、または少なくとも１ヶ月間の間隔をあけて、ヒト対象に投与してもよい。
【０１７２】
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、対応する標的抗原またはそのエピトープに特異的に結合する。抗原またはエピトープに「特異的に結合する」抗体は、当該技術分野において十分に理解されている用語である。分子が、別の標的との反応と比較して、より頻繁に、より速やかに、より長い期間で、及び／またはより強い親和性で、特定の標的抗原と反応する場合、その分子は「特異的結合」を示すと言われる。抗体が、その他の物質との結合と比較して、より強い親和性で、結合力で、より速やかに、及び／またはより長い期間で、結合する場合、その抗体は標的抗原またはエピトープに「特異的に結合する」。例えば、抗原またはその中の抗原性エピトープに特異的に（または優先的に）結合する抗体は、その他の抗原またはその同一抗原の中のその他のエピトープとの結合と比較して、より強い親和性で、親和力で、より速やかに、及び／またはより長い期間で、この標的抗原と結合する抗体である。例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体が第２の標的抗原に特異的または優先的に結合してもしなくてもよいということもまた、この定義により理解される。それゆえ、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも排他的結合を必要とするものではない（含んでいてもよいが）。一部の例では、標的抗原またはそのエピトープに「特異的に結合する」抗体は、その他の抗原またはその同一抗原の中のその他のエピトープに結合しなくてもよい。
【０１７３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、本明細書で開示する標的抗原（例えば、本明細書に記載の標的のうちのいずれか１つ）またはその抗原性エピトープに対する好適な結合親和性を有する。
【０１７４】
本明細書に記載の免疫療法の方法に用いる抗体は、目的の標的抗原、またはその中の特定の領域もしくは抗原性エピトープに結合（例えば、特異的に結合）してもよい。例示的な目的の標的抗原及びそれら目的の標的抗原に特異的な例示的な抗体を上の表５に記載する。
【０１７５】
抗体ベース免疫療法の効果は、当該技術分野において周知の任意の方法を用いて評価することができ、熟練した医療従事者には明白であろう。例えば、抗体ベース免疫療法の効果は、対象の生存率、あるいは、対象または組織もしくはその試料における腫瘍負荷量またはがん負荷量により評価することができる。一部の実施形態では、免疫細胞は、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはＡＣＴＲポリペプチド及び／または抗体を発現する免疫細胞の不在下における効果と比較して、抗体ベース免疫療法の効果を少なくとも２０％及び／または少なくとも２倍向上させるのに、例えば、抗体ベース免疫療法の効果を５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上向上させるのに有効な量で、治療を必要とする対象に投与される。
【０１７６】
本明細書に記載の組成物または方法のいずれかにおいて、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞及び／またはＴ細胞）は、対象に対して自家であってもよく、すなわち、免疫細胞は、治療を必要とする対象から採取してもよく、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはＡＣＴＲポリペプチドを発現するように遺伝子改変してから、同一対象に投与する。１つの特定の実施形態では、対象に再導入する前に、自家免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞）をｅｘ  ｖｉｖｏで活性化及び／または増殖させる。対象への自家細胞の投与は、非自家細胞の投与と比較して、宿主細胞の拒絶反応の抑制をもたらし得る。代替的に、宿主細胞は同種異系細胞である、すなわち、細胞は第１の対象から採取され、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはＡＣＴＲポリペプチドを発現するように遺伝子改変されて、第１の対象とは異なるが同一種の第２の対象に投与される。例えば、同種異系免疫細胞はヒトドナーに由来していてもよく、ドナーとは異なるヒトレシピエントに投与される。特定の一実施形態では、Ｔリンパ球は、内在性Ｔ細胞受容体の発現が阻害または除去されている同種異系Ｔリンパ球である。１つの特定の実施形態では、対象に導入する前に、同種異系Ｔリンパ球をｅｘ  ｖｉｖｏで活性化及び／または増殖させる。例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ−２、フィトヘマグルチニン、改変人工刺激細胞もしくは粒子、またはこれらの組み合わせ、の存在下で、当該技術分野において周知の任意の方法を用いて、Ｔリンパ球を活性化させてもよい。
【０１７７】
例えば、ＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ−１５タンパク質、ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２タンパク質、ＩＬ−１２タンパク質、ＩＬ−２１タンパク質、Ｋ５６２細胞株、及び／または改変人工刺激細胞または粒子、からなる群から選択される１種または複数種の因子の存在下で、当該技術分野において周知の方法を用いて、ＮＫ細胞を活性化させてもよい。ＮＫ細胞を増殖させるための有効な方法の記載については、例えば、米国特許第７，４３５，５９６号及び第８，０２６，０９７号を参照されたい。例えば、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ及び／またはＩＩ分子を欠いているまたは不十分に発現しており、かつ膜結合ＩＬ−１５及び４−１ＢＢリガンド（ＣＤＩ３７Ｌ）を発現するように遺伝子改変されている、細胞に曝露することにより、本開示の組成物または方法に用いるＮＫ細胞を優先的に増殖させてもよい。このような細胞株としては、Ｋ５６２［ＡＴＣＣ，ＣＣＬ  ２４３；Ｌｏｚｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ４５（３）：３２１−３３４（１９７５）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １８：４２１−４３１（１９７６）］、及びウィルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ（Ｆｅｈｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０（３−４）：５０３−５３４（２００１）；Ｈａｒａｄａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３２（７）：６１４−６２１（２００４））、子宮内膜腫瘍細胞株ＨＨＵＡ、黒色腫細胞株ＨＭＶ−ＩＩ、肝芽細胞腫細胞株ＨｕＨ−６、肺小細胞癌細胞株Ｌｕ−１３０及びＬｕ−１３４−Ａ、神経芽細胞腫細胞株ＮＢ  １９及びＮ１３６９、精巣に由来する胎児性がん細胞株ＮＥＣ  １４、子宮頸部癌細胞株ＴＣＯ−２、ならびに、骨髄に転移した神経芽細胞腫細胞株ＴＮＢ  １［Ｈａｒａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９３：３１３−３１９（２００２）］、が挙げられるが必ずしもこれらに限定されるものではない。用いる細胞株は、ＭＨＣＩ分子とＭＨＣＩＩ分子の両方を欠いているまたは不十分に発現していることが好ましく、例えば、Ｋ５６２細胞株及びＨＦＷＴ細胞株などである。細胞株の代わりに固体支持体を使用してもよい。このような支持体は、好ましくは、その表面上に、ＮＫ細胞に結合して、一次活性化イベント及び／または増殖性応答を誘導することができる少なくとも１種の分子、または、このような影響を有する分子に結合することにより足場として機能することができる少なくとも１種の分子を結合させてある必要がある。支持体は、その表面に、ＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ−１５タンパク質、またはＩＬ−１５受容体抗体を結合させてあってもよい。支持体は、その表面上に結合したＩＬ−１５受容体抗体及びＣＤ１３７抗体を有していることが好ましい。
【０１７８】
記載する組成物または方法の一実施形態では、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、またはＴリンパ球及びＮＫ細胞の対象への導入（または再導入）に続いて、治療有効量のＩＬ−２の対象への投与を行う。
【０１７９】
本開示によれば、治療有効用量の免疫細胞、例えば、本開示のグルコース輸入ポリペプチド及び／またはＡＣＴＲポリペプチドを体重１キログラムあたり約１０５〜１０１０またはそれ以上の細胞（細胞／Ｋｇ）の範囲で含む、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞などを注入することにより、患者を治療することができる。患者が耐えることができるほど頻繁かつ多くの回数で、所望の応答が得られるまで注入を繰り返してもよい。適切な注入用量及びスケジュールは患者毎に様々であるが、個々の患者用に、治療を行う医師が決定することができる。一般的に、初期用量の約１０６細胞／Ｋｇを注入してから、１０８またはそれ以上の細胞／Ｋｇに漸増する。注入細胞を増殖させるためにＩＬ−２を同時投与してもよい。ＩＬ−２の量は、体表面の平方メートルあたり約１〜５×１０６国際単位であってもよい。
【０１８０】
一部の実施形態では、約１００〜５００ｍｇ、５００〜１０００ｍｇ、１０００〜１５００ｍｇ、または１５００〜２０００ｍｇの１回または複数回の用量で、抗体を対象に投与する。一部の実施形態では、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、または約９００ｍｇの１回または複数回の用量で、抗体を対象に投与する。一部の実施形態では、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１７００ｍｇ、または約１８００ｍｇの１回または複数回の用量で、抗体を対象に投与する。一部の実施形態では、約１６００ｍｇの１回または複数回の用量で、抗体を対象に投与する。
【０１８１】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」とは、当業者が測定した個々の値の許容される誤差の範囲内であることを意味し、その値がどのように測定または決定されたか、すなわち、測定システムの制約にある程度依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野における実施あたり、許容される標準偏差内であることを意味し得る。代替的に、「約」とは、任意の値の最大±２０％、好ましくは最大±１０％、より好ましくは最大±５％、及び更により好ましくは最大±１％の範囲のことを意味し得る。代替的に、とりわけ生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の桁内、好ましくは２倍内であることを意味し得る。本出願書及び特許請求の範囲において個々の値を記載する場合、特に明記しない限り、用語「約」とは、暗に及びこの文脈で、個々の値の許容される誤差の範囲内であることを意味する。
【０１８２】
本明細書に記載の方法で用いる個々の用量レジメン、すなわち、用量、タイミング、及び繰り返しは、個々の対象、及びその対象の病歴に依存する。用いる抗体の適切な用量は、治療するがんのタイプ、疾患の重症度及び経過、これまでの治療、患者の病歴及び抗体に対する反応、ならびに主治医の裁量、に依存する。一度に、または一連の治療にわたり、抗体を患者に投与してもよい。本開示の治療の進行は、通常の技術及びアッセイを用いることにより、容易にモニターすることができる。
【０１８３】
全身投与に加えて、疾患の部位への（例えば、腫瘍への）直接投与を含む任意の好適な経路を用いて、抗体の投与を実施してもよい。
【０１８４】
一部の実施形態では、方法は、抗体を１回用量で対象に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、抗体を複数回用量（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、または８回の用量）で対象に投与することを含む。一部の実施形態では、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞の投与の１、２、３、４、５、６、または７日前に第１の用量の抗体を対象に投与して、抗体を複数回用量で対象に投与する。一部の実施形態では、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞の投与の約２４〜４８時間前に、第１の用量の抗体を対象に投与する。
【０１８５】
一部の実施形態では、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞の投与の前に、抗体を対象に投与し、その後、それに続き約２週間に１回投与する。一部の実施形態では、第１の２回の用量の抗体を約１週間（例えば、約６、７、８、または９日間）の間隔をあけて投与する。特定の実施形態では、第３及びそれに続く用量を約２週間に１回投与する。
【０１８６】
本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、抗体の投与のタイミングは、おおよそであり、指定日の３日前及び３日後を含む（例えば、３週間に１回の投与は、１８日目、１９日目、２０日目、２１日目、２２日目、２３日目、または２４日目の投与を包含する）。
【０１８７】
本明細書に記載の組成物または方法の効果は、当該技術分野において周知の任意の方法を用いて評価することができ、熟練した医療従事者には明白であろう。例えば、抗体ベース免疫療法の効果は、対象の生存率、あるいは、対象または組織もしくはその試料におけるがん負荷量により評価することができる。一部の実施形態では、抗体ベース免疫療法は、その療法（例えば、抗体、及びグルコース輸入ポリペプチド及び／またはＡＣＴＲポリペプチドを発現する免疫細胞の投与）の対象における安全性または毒性に基づいて、例えば、対象の総合的な健康状態、及び／または有害事象または重度の有害事象の存在により、評価される。
【０１８８】
（ｂ）ＣＡＲポリペプチドを発現する遺伝子改変免疫細胞を用いた免疫療法
グルコース輸入ポリペプチド及びＣＡＲポリペプチドを共発現する本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞を、免疫療法、例えば、ＣＡＲポリペプチドが直接または間接的に標的とする（例えば、ＣＡＲポリペプチドが結合するタグにコンジュゲートした治療薬を介して）抗原を発現する疾患細胞を阻害するためのＴ細胞療法またはＮＫ細胞療法などに使用してもよい。免疫細胞においてＣＡＲポリペプチドと共発現したグルコース輸入ポリペプチドは、例えば、腫瘍微小環境、例えば、低グルコース環境などで細胞を効果的に増殖及び／または機能させることにより、細胞ベース免疫療法に役立ち得る。ｍＲＮＡエレクトロポレーションを用いて、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはＣＡＲポリペプチドを一過的に発現させて、任意の潜在的な非腫瘍特異的反応を制限することにより、臨床的安全性は更に向上し得る。
【０１８９】
本明細書に記載の方法は、治療有効量の遺伝子改変宿主細胞、例えば、本開示のグルコース輸入ポリペプチド及びＣＡＲポリペプチドを共発現する免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞）などを対象に導入することを含んでいてもよい。対象（例えば、ヒト患者、例えば、ヒトがん患者など）は更に、抗がん治療薬または抗感染症薬を含むがこれらに限定されない抗がん療法または抗感染症療法を用いた治療を受けたことがあってもよい、または受けていてもよい。ＣＡＲは、任意の標的抗原に結合可能な抗原結合ドメインを有する。このような標的抗原は、限定するわけではないが、腫瘍抗原、病原体抗原（例えば、細菌、真菌、またはウイルスの）、または疾患細胞上の抗原、例えば、本明細書に記載のもの、を含む、疾患または症状と関連する任意の分子であってもよい。
【０１９０】
本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチド及びＣＡＲポリペプチドを発現する宿主細胞（例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及びを発現する細胞など）は、標的抗原を発現する細胞を阻害するのに、及び／または、低グルコース環境における免疫細胞の成長及び／または増殖を向上させるのに有用である。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、サル、マウス、ウサギ、または家畜哺乳動物などである。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象はヒトがん患者である。一部の実施形態では、対象は更に、本明細書に記載の治療抗体のいずれかを用いた治療を受けたことがあるまたは受けている。
【０１９１】
本明細書に記載の方法を実施するために、本明細書に記載のグルコース輸入ポリペプチド及びＣＡＲポリペプチドのいずれかを発現する有効量の免疫細胞（ＮＫ細胞及び／またはＴリンパ球）、またはその組成物を、好適な経路、例えば、静脈内投与などで、治療を必要とする対象に投与してもよい。本明細書で使用する場合、有効量とは、投与すると対象に治療効果を付与する、それぞれの因子（例えば、グルコース輸入ポリペプチド、ＣＡＲポリペプチドを発現するＮＫ細胞及び／またはＴリンパ球、またはその組成物）の量のことを意味する。本明細書に記載の細胞または組成物の量が治療効果を達成するかどうかを確認することは、当業者には明白であろう。有効量は、当業者が認識しているとおり、治療する個々の症状、症状の重症度、個々の患者の特性（年齢、身体的な状態、サイズ、ジェンダー、性別、及び体重を含む）、治療期間、併用療法（ある場合）の性質、個々の投与経路、ならびに、医療従事者の知見及び専門知識の範囲内の類似因子、によって様々である。一部の実施形態では、有効量は、対象における症候を緩和、軽減、改善、向上、抑制する、または、対象における任意の疾患または障害の進行を遅延させる。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、治療を必要とする対象はヒトがん患者である。一部の実施形態では、治療を必要とする対象は、１種または複数種の病原性感染症（例えば、ウイルス感染症、細菌感染症、及び／または真菌感染症）を患っている。
【０１９２】
任意のがんまたは任意の病原体を治療するために、本開示の方法を使用してもよい。がんの特定の非限定例を本明細書において提供する（例えば、上のセクションＩＶの開示内容を参照のこと）。
【０１９３】
本開示の方法はまた、細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染によって引き起こされ得る感染性疾患を治療するために使用してもよい。このような例においては、病原体抗原（例えば、感染症を引き起こす細菌、ウイルス、または真菌と関連する抗原）に特異的なＣＡＲポリペプチドを発現する遺伝子改変免疫細胞を使用して、感染細胞を除去してもよい。病原体抗原の具体的な非限定例としては、細菌抗原、ウイルス抗原、及び／または真菌抗原、が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１９４】
一部の実施形態では、標的抗原を発現する細胞を少なくとも２０％及び／または少なくとも２倍阻害する、例えば、標的抗原を発現する細胞を５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍またはそれ以上阻害するのに有効な量で、免疫細胞を対象に投与する。
【０１９５】
別の治療薬（例えば、抗体ベース免疫療法薬）を用いて、治療薬が有効と考えられる対象における任意の疾患または障害の症候を治療、緩和または抑制してもよい。
【０１９６】
本明細書に記載の細胞ベース免疫療法の効果は、当該技術分野において周知の任意の方法を用いて評価することができ、熟練した医療従事者には明白であろう。例えば、細胞ベース免疫療法の効果は、対象の生存率、あるいは、対象または組織もしくはその試料における腫瘍負荷量またはがん負荷量により評価することができる。一部の実施形態では、免疫細胞は、グルコース輸入ポリペプチドを発現しない同一タイプの免疫細胞を用いた効果と比較して、細胞ベース免疫療法の効果を少なくとも２０％及び／または少なくとも２倍向上させるのに、例えば、免疫療法の効果を５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上向上させるのに有効な量で、治療を必要とする対象に投与される。
【０１９７】
本明細書に記載の組成物または方法のいずれかにおいて、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞及び／またはＴ細胞）は、対象に対して自家であってもよく、すなわち、免疫細胞は、治療を必要とする対象から採取してもよく、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはＣＡＲポリペプチドを発現するように遺伝子改変してから、同一対象に投与する。代替的に、宿主細胞は同種異系細胞である、すなわち、細胞は第１の対象から採取され、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはＣＡＲポリペプチドを発現するように遺伝子改変されて、第１の対象とは異なるが同一種の第２の対象に投与される。対象に導入する前に、自家免疫細胞または同種異系免疫細胞のいずれかをｅｘ  ｖｉｖｏで活性化及び／または増殖させてもよい。上のセクションＩＶの記載を参照されたい。
【０１９８】
本開示によれば、治療有効用量の免疫細胞、例えば、本開示のグルコース輸入ポリペプチド及び／またはＣＡＲポリペプチドを体重１キログラムあたり約１０５〜１０１０またはそれ以上の細胞（細胞／Ｋｇ）の範囲で含む、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞などを注入することにより、患者を治療することができる。患者が耐えることができるほど頻繁かつ多くの回数で、所望の応答が得られるまで注入を繰り返してもよい。適切な注入用量及びスケジュールは患者毎に様々であるが、個々の患者用に、治療を行う医師が決定することができる。一般的に、初期用量の約１０６細胞／Ｋｇを注入してから、１０８またはそれ以上の細胞／Ｋｇに漸増する。注入細胞を増殖させるためにＩＬ−２を同時投与してもよい。ＩＬ−２の量は、体表面の平方メートルあたり約１〜５×１０６国際単位であってもよい。
【０１９９】
本明細書に記載の組成物または方法の効果は、当該技術分野において周知の任意の方法を用いて評価することができ、熟練した医療従事者には明白であろう。例えば、本明細書に記載の組成物または方法の効果は、対象の生存率、あるいは、対象または組織もしくはその試料におけるがん負荷量または病原体負荷量により評価することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、その療法（例えば、グルコース輸入ポリペプチド及びＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞の投与）の対象における安全性または毒性に基づいて、例えば、対象の総合的な健康状態、及び／または有害事象または重度の有害事象の存在により、評価することができる。
【０２００】
（ｃ）その他の免疫療法
一部の実施形態では、グルコース輸入ポリペプチドのうちの１種または複数種を発現する遺伝子改変免疫細胞は、疾患細胞（例えば、がん細胞または病原体感染細胞）に特異的な天然免疫細胞に由来していてもよい。このような遺伝子改変免疫細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球すなわちＴＩＬ）は、キメラ受容体ポリペプチドを何ら共発現していなくてもよく、標的疾患細胞、例えば、がん細胞を破壊するために用いられ得る。１種または複数種のグルコース輸入ポリペプチドを発現するがキメラ受容体を発現しない遺伝子改変ＴＩＬを、標的腫瘍細胞及びＴＩＬに結合することができる二重特異性抗体（ＢｉＴＥ）と共に使用してもよい。
【０２０１】
Ｖ．組み合わせ治療
本開示に記載の組成物及び方法を、がんのその他のタイプの治療法、例えば、化学療法、外科手術、放射線、遺伝子療法など、または抗感染症療法などと共に使用してもよい。本開示の免疫療法と共にこのような治療法を同時または連続的に（任意の順番で）実施してもよい。
【０２０２】
別の治療薬と同時投与する場合、相加効果または相乗効果により、それぞれの薬剤の好適な治療有効用量を減少させてもよい。
【０２０３】
本開示の治療薬は、その他の免疫調節治療薬、例えば、治療ワクチン（ＧＶＡＸ、ＤＣ系ワクチンなどを含むがこれらに限定されない）、チェックポイント阻害薬（ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３などを阻害する薬剤を含むがこれらに限定されない）、または活性化因子（４１ＢＢ、ＯＸ４０などを増強する薬剤を含むがこれらに限定されない）、などと組み合わせることができる。
【０２０４】
本開示の免疫療法薬と組み合わせるのに有用なその他の治療薬の非限定例としては、（ｉ）抗血管新生薬（例えば、ＴＮＰ−４７０、血小板第４因子、トロンボスポンジン−１、メタロプロテアーゼの組織阻害因子（ＴＩＭＰ１及びＴＩＭＰ２）、プロラクチン（１６Ｋｄのフラグメント）、アンジオスタチン（プラスミノーゲンの３８Ｋｄのフラグメント）、エンドスタチン、ｂＦＧＦ可溶性受容体、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インターフェロンアルファ、可溶性ＫＤＲ受容体及びＦＬＴ−１受容体、胎盤プロリフェリン関連タンパク質、ならびにＣａｒｍｅｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｊａｉｎ（２０００）に列挙されているもの）、（ｉｉ）ＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを阻害することができる抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦ受容体フラグメント、アプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤、及びこれらの任意の組み合わせなど、ならびに（ｉｉｉ）化学療法化合物、例えば、ピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン、及びシタラビン）、プリン類似体、葉酸アンタゴニスト及び関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；ビンカアルカロイドなどの天然物を含む抗増殖／有糸分裂阻害剤（ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビノレルビン）、微小管破壊剤、例えば、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン、及びナベルビンなど、エピジポドフィロトキシン（エトポシド及びテニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、サイトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホラミド、及びエトポシド（ＶＰ１６））；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、及びマイトマイシンなど；酵素（Ｌ−アスパラギンを組織的に代謝して細胞自体のアスパラギンを合成する能力を有さない細胞を除去するＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板薬；抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド及び類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミン及びメチルメラミン（ヘキサメチルメラミン及びチオテパ）、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）及び類似体、ストレプトゾシン）、トラゼネス−ダカルバジン（ＤＴＩＣ）など；��増殖／抗有糸分裂代謝拮抗薬、例えば、葉酸類似体（メトトレキサート）など；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）、及びアロマターゼ阻害薬（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固薬（ヘパリン、合成ヘパリン塩、及びトロンビンのその他の阻害剤）；線維素溶解薬（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、及びウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；抗分泌薬（ブレフェルディン）；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（例えば、ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン、ベバシズマブ）及び増殖因子阻害剤（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断薬；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤及び分化誘導因子（トレチノイン）；ＡＫＴ阻害剤（例えば、ＭＫ−２２０６  ２ＨＣｌ、ペリフォシン（ＫＲＸ−０４０１）、ＧＳＫ６９０６９３、イパタセルチブ（ＧＤＣ−００６８）、ＡＺＤ５３６３、ユプロセルチブ、アフレセルチブ、またはトリシリビンなど）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、及びイリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、及びプレドニゾロン）；増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導因子及びカスパーゼ活性化因子；及びクロマチン破壊剤、など、が挙げられる。
【０２０５】
別の有用な薬剤の例については、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５９．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００５），Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｐ  Ｄ  Ｒ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ  Ｎ．Ｊ．；Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２０００），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｍｄ．；Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１），ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，ＮＹ；Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９９２），Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｈｗａｙ  Ｎ．Ｊ．もまた参照されたい。
【０２０６】
本明細書に記載の方法の効果は、当該技術分野において周知の任意の方法を用いて評価することができ、熟練した医療従事者には明白であろう。例えば、抗体ベース免疫療法の効果は、対象の生存率、あるいは、対象または組織もしくはその試料におけるがん負荷量により評価することができる。一部の実施形態では、抗体ベース免疫療法は、その療法の対象における安全性または毒性に基づいて、例えば、対象の総合的な健康状態、及び／または有害事象または重度の有害事象の存在により、評価される。
【０２０７】
ＶＩＩ．治療用途用のキット
本開示はまた、本明細書に記載の組成物を使用するためのキットを提供する。例えば、本開示はまた、抗体、ならびに、細胞介在性細胞傷害を向上させる（直接または抗体を介するのいずれか）、抗体ベース免疫療法を向上させる、及び／または、低グルコース環境における免疫細胞の成長及び／または増殖を向上させる、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチド、例えば、ＡＣＴＲポリペプチドまたはＣＡＲポリペプチドなどを発現する免疫細胞の集団（例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞）を使用するためのキットを提供する。このようなキットは、グルコース輸入ポリペプチド及び／またはキメラ受容体ポリペプチド、例えば、本明細書に記載のものなどを発現するＴリンパ球及び／またはＮＫ細胞（免疫細胞）の集団を含む第１の医薬組成物、ならびに、抗体及び薬学的に許容される担体を含む第２の医薬組成物、を含む、１つまたは複数の容器を含んでいてもよい。
【０２０８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のキットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖されたグルコース輸入ポリペプチド発現及び／またはキメラ受容体発現免疫細胞、ならびに、活性化Ｔ細胞上に存在する細胞表面抗体に特異的な抗体、例えば、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ３８抗体、または抗ＣＤ７抗体、を含む。グルコース輸入ポリペプチド発現及び／またはキメラ受容体発現免疫細胞は、当該技術分野において周知または本明細書で開示するキメラ受容体ポリペプチドのいずれかを発現していてもよい。
【０２０９】
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかに使用するための取扱説明書を更に含んでいてもよい。含まれている取扱説明書は、目的の作用を得るために、例えば、ＡＤＣＣ活性を増強する、及び／または、対象における抗体ベース免疫療法の効果を向上させる、及び／または、低グルコース環境（例えば、対象における低グルコース腫瘍微小環境）における免疫細胞の成長及び／または増殖を向上させるために、第１及び第２の医薬組成物を対象に投与するための説明を含んでいてもよい。キットは、対象が治療を必要とするかどうかを判定することに基づく、治療に適した対象を選択するための説明、を更に含んでいてもよい。一部の実施形態では、取扱説明書は、治療を必要とする対象に第１及び第２の医薬組成物を投与するための説明を含む。
【０２１０】
本明細書に記載の第１及び第２の医薬組成物の使用に関する取扱説明書は通常、目的の治療のための用量、投与スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数回用量パッケージ）、または単位未満用量であってもよい。本開示のキットにおいて提供される取扱説明書は通常、ラベルまたは添付文書上に記載された取扱説明書である。ラベルまたは添付文書は、医薬組成物が、対象における疾患または障害を治療する、疾患または障害の発症を遅らせる、及び／または、疾患または障害を緩和するために使用されることを示す。
【０２１１】
本明細書で提供するキットは好適なパッケージに入れられている。好適なパッケージとしては、バイアル、ボトル、瓶、柔軟なパッケージなど、が挙げられるがこれらに限定されない。特定の器具、例えば、吸入用器具、経鼻投与用器具、または注入用器具などと組み合わせて使用するためのパッケージもまた考えられる。キットは滅菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針で貫通可能な栓を有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。容器はまた、滅菌アクセスポートを有していてもよい。第２の医薬組成物内の少なくとも１種の活性剤は、本明細書に記載の抗体である。第１の医薬組成物内の少なくとも１種の活性剤は、本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチド及び／またはグルコース輸入ポリペプチドを発現する免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞）の集団である。
【０２１２】
キットは、任意選択的に、別の構成要素、例えば、緩衝剤及び説明情報などを提供してもよい。通常、キットは、容器、及び、容器上または容器に結合したラベルまたは添付文書（複数可）を含む。一部の実施形態では、本開示は、上で記載したキットの内容物を含む製造物品を提供する。
【０２１３】
一般的な技術
本開示の実施においては、特に明記しない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来技術を用いるが、それらは当業者の知るところである。このような技術については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８５＞＞；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４＞＞；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６＞＞；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６＞＞；及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）などの文献において十分に説明されている。
【０２１４】
当業者であれば、更に工夫を凝らすことなく、上の記載に基づいて本開示を最大限利用できるものと考えられる。それゆえ、以下の特定の実施形態は単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる意味においても残りの開示を限定するものではない。本明細書で引用する全ての刊行物は、本明細書で参照する用途及び主題で参照により組み込まれる。
【実施例】
【０２１５】
実施例１：より低いグルコース環境においてグルコース輸入ポリペプチドを発現させることのＴ細胞機能への影響。
グルコース輸入ポリペプチド導入遺伝子を、同一Ｔ細胞においてＡＣＴＲポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ１  Ｓ２２６Ｄバリアント、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ８  Ｌ１２Ａ  Ｌ１３Ａバリアント、ＧＬＵＴ１１、ＧＬＵＴ７、ＧＬＵＴ４、ＳＧＬＴ１、またはＳＧＬＴ２（例えば、配列番号：８１〜９０）である。例えば、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられたＡＣＴＲポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチドをコードするウイルスをＴ細胞に導入する。Ｔ細胞を、ＩＧＲＯＶ−１細胞などの腫瘍標的細胞、及び抗ＦＯＬＲ１抗体などの腫瘍標的化抗体と、任意のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率で混合する。その後、反応液を、異なる開始濃度のグルコース（例えば、０〜２０ｍＭ）で、５％ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で一定期間（例えば、６〜８日間）培養する。次に、例えば、サイトカイン産生アッセイまたはＴ細胞増殖アッセイを用いて、Ｔ細胞機能を評価する。反応上清からサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２及び／またはＩＦＮ−ガンマ）を測定する。増殖実験用に、共培養物を回収してから、抗ＣＤ３抗体及び生死細胞染料で染色する。フローサイトメトリーを用いて、生ＣＤ３陽性細胞の数をＴ細胞増殖の指標として評価する。ＡＣＴＲポリペプチドに加えてグルコース輸入ポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＡＣＴＲを単独で発現するＴ細胞と比較して、例えば、高いサイトカイン産生または高い増殖を含む高いＴ細胞機能を示す。この高い機能は、より低いグルコース濃度においてより顕著であり得る。これらの実験は、Ｔ細胞においてグルコース輸入ポリペプチドを発現させることがＴ細胞活性にプラスの影響を及ぼすことを示している。
【０２１６】
実施例２：より高い可溶性阻害剤濃度の環境においてグルコース輸入ポリペプチド遺伝子を発現させることのＴ細胞機能への影響。
グルコース輸入ポリペプチド導入遺伝子を、同一Ｔ細胞においてＡＣＴＲポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ１  Ｓ２２６Ｄバリアント、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ８  Ｌ１２Ａ  Ｌ１３Ａバリアント、ＧＬＵＴ１１、ＧＬＵＴ７、ＧＬＵＴ４、ＳＧＬＴ１、またはＳＧＬＴ２（例えば、配列番号：８１〜９０）である。例えば、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられたＡＣＴＲポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチドをコードするウイルスをＴ細胞に導入する。形質導入Ｔ細胞を、腫瘍微小環境中に存在する異なる濃度の可溶性阻害剤（例えば、ＴＧＦベータ、ＰＧＥ２、及び／またはアデノシン）を含有する培地中で、ＩＧＲＯＶ−１細胞などの腫瘍標的細胞、及び抗ＦＯＬＲ１抗体などの腫瘍標的化抗体と、任意のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率で混合する。その後、反応液を、５％ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で一定期間（例えば、６〜８日間）培養する。次に、例えば、サイトカイン産生アッセイまたはＴ細胞増殖アッセイを用いて、Ｔ細胞機能を評価する。反応上清からサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２及び／またはＩＦＮ−ガンマ）を測定する。増殖実験用に、共培養物を回収してから、抗ＣＤ３抗体及び生死細胞染料で染色する。フローサイトメトリーを用いて、生ＣＤ３陽性細胞の数をＴ細胞増殖の指標として評価する。ＡＣＴＲポリペプチドに加えてグルコース輸入ポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＡＣＴＲを単独で発現するＴ細胞と比較して、例えば、高いサイトカイン産生または高い増殖を含む高いＴ細胞機能を示す。この高い機能は、より高い可溶性阻害剤濃度において達成され得る。これらの実験は、Ｔ細胞においてグルコース輸入ポリペプチドを発現させることがＴ細胞活性にプラスの影響を及ぼすことを示している。
【０２１７】
実施例３：より多い免疫抑制細胞が存在する環境においてグルコース輸入ポリペプチドを発現させることのＴ細胞機能への影響。
グルコース輸入ポリペプチド導入遺伝子を、同一Ｔ細胞においてＡＣＴＲポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ１  Ｓ２２６Ｄバリアント、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ８  Ｌ１２Ａ  Ｌ１３Ａバリアント、ＧＬＵＴ１１、ＧＬＵＴ７、ＧＬＵＴ４、ＳＧＬＴ１、またはＳＧＬＴ２（例えば、配列番号：８１〜９０）である。例えば、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられたＡＣＴＲポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチドをコードするウイルスをＴ細胞に導入する。形質導入Ｔ細胞を、免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来の抑制細胞及び／または制御性Ｔ細胞）の存在下で、ＩＧＲＯＶ−１細胞などの腫瘍標的細胞、及び抗ＦＯＬＲ１抗体などの腫瘍標的化抗体と、任意のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率で混合する。その後、反応液を、５％ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で一定期間（例えば、３〜１０日間）培養する。次に、例えば、サイトカイン産生アッセイまたはＴ細胞増殖アッセイを用いて、Ｔ細胞機能を評価する。反応上清からサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２及び／またはＩＦＮ−ガンマ）を測定する。増殖実験用に、共培養物を回収してから、抗ＣＤ３抗体及び生死細胞染料で染色する。フローサイトメトリーを用いて、生ＣＤ３陽性細胞の数をＴ細胞増殖の指標として評価する。ＡＣＴＲポリペプチドに加えてグルコース輸入ポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＡＣＴＲを単独で発現するＴ細胞と比較して、例えば、高いサイトカイン産生または高い増殖を含む高いＴ細胞機能を示す。この高い機能は、多い量（例えば、より多い数またはより高いパーセンテージ）の免疫抑制細胞の存在下で達成され得る。これらの実験は、Ｔ細胞においてグルコース輸入ポリペプチドを発現させることがＴ細胞活性にプラスの影響を及ぼすことを示している。
【０２１８】
実施例４：腫瘍モデルにおいてグルコース輸入ポリペプチドを発現させることのＴ細胞機能への影響。
グルコース輸入ポリペプチド導入遺伝子を、同一Ｔ細胞においてＡＣＴＲポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ１  Ｓ２２６Ｄバリアント、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ８  Ｌ１２Ａ  Ｌ１３Ａバリアント、ＧＬＵＴ１１、ＧＬＵＴ７、ＧＬＵＴ４、ＳＧＬＴ１、またはＳＧＬＴ２（例えば、配列番号：８１〜９０）である。例えば、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられたＡＣＴＲポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチドをコードするウイルスをＴ細胞に導入する。マウス腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性について形質導入Ｔ細胞を評価する。これらの実験用に、腫瘍細胞株、例えば、ＩＧＲＯＶ−１を、ＮＳＧ（商標）（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスに接種する。続いて、腫瘍標的化抗体、ならびにＡＣＴＲを単独で発現するまたはＡＣＴＲ及びグルコース輸入ポリペプチドを発現するＴ細胞を、腫瘍保有マウスに投与する。実験期間中にわたり腫瘍の増殖をモニターする。腫瘍標的化抗体と組み合わせると、ＡＣＴＲポリペプチドに加えてグルコース輸入ポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＡＣＴＲポリペプチドを単独で発現するＴ細胞と比較して、高い抗腫瘍活性を示す。加えて、腫瘍標的化抗体と組み合わせると、ＡＣＴＲポリペプチドに加えてグルコース輸入ポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＡＣＴＲポリペプチドを単独で発現するＴ細胞と比較して、例えば、高い増殖、向上したＴ細胞持続性、及び／または高いサイトカイン産生を含む高いＴ細胞活性を示し得る。これらの実験は、ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞においてグルコース輸入ポリペプチドを発現させることがｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞機能にプラスの影響を及ぼすことを示している。
【０２１９】
実施例５．Ｔ細胞におけるＡＣＴＲ及びＧＬＵＴ１の共発現はＧＬＵＴ１発現を向上させた
本実施例は、ＡＣＴＲポリペプチド及びＧＬＵＴ１をコードするウイルスを形質導入したＴ細胞においてグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）発現が上昇していることを示している。これらの実験では、ＡＣＴＲポリペプチド（配列番号：５７）を単独でコードするまたはＰ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられたＡＣＴＲ及びＧＬＵＴ１（配列番号：８１）をコードするウイルスをＴ細胞に形質導入した。フローサイトメトリーを用いてＧＬＵＴ１発現を評価した。Ｔ細胞をｅＦｌｕｏｒ７８０  ｆｉｘａｂｌｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色してから、抗ＣＤ１６抗体で染色して、ＡＣＴＲ発現ならびに抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を検出した。細胞を洗浄してから、Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて固定及び透過処理を行った。次に、抗ＧＬＵＴ１抗体で細胞を染色し、洗浄してから、フローサイトメトリーを用いて解析した。
【０２２０】
フローサイトメトリーデータのヒストグラムを図２に示す。生細胞集団をＣＤ１６発現でゲーティングして、非形質導入（ＣＤ１６−）集団及びＡＣＴＲ（ＣＤ１６＋）集団を生じさせた。これらの細胞集団をまた、ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞としてゲーティングした。認められたＧＬＵＴ１発現は、ＡＣＴＲ単独Ｔ細胞及びＡＣＴＲ＋ＧＬＵＴ１Ｔ細胞内の非形質導入細胞集団内において、ＣＤ４＋細胞と比較して、ＣＤ８＋細胞においてより高かった。認められたＧＬＵＴ１発現は、ＡＣＴＲを単独で発現するＴ細胞と比較して、ＡＣＴＲ及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞において、ＣＤ１６＋集団のＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞の両方でより高かった。これらの実験は、Ｔ細胞におけるＡＣＴＲ及びＧＬＵＴ１の共発現が、ＡＣＴＲ陽性Ｔ細胞におけるＧＬＵＴ１の発現上昇をもたらすことを示している。
【０２２１】
実施例６．ＡＣＴＲ及びＧＬＵＴ１の共発現はＴ細胞におけるグルコース取り込みを向上させた
本実施例は、ＡＣＴＲポリペプチド及びＧＬＵＴ１をコードするウイルスを形質導入したＴ細胞においてグルコース取り込みが増加していることを示している。これらの実験では、ＡＣＴＲポリペプチド（配列番号：５７）を単独でコードするまたはＰ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられたＡＣＴＲ及びＧＬＵＴ１（配列番号：８１）をコードするウイルスをＴ細胞に形質導入した。
【０２２２】
活性化前の実験用に、Ｔ細胞を、ＣＯ２（５％）インキュベータ内、１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中、３７℃で一晩静置した。細胞を回収して、カルシウムとマグネシウムを含むＰＢＳ中に再懸濁した。製造業者のプロトコルに従いＧｌｕｃｏｓｅ  Ｕｐｔａｋｅ−Ｇｌｏ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞の２−デオキシ−グルコース（２ＤＧ）取り込み能を評価することにより、グルコース取り込みを測定した。それぞれの実験用に、Ｔ細胞（５０，０００）を２ＤＧ（１ｍＭ）と共に２０分間培養してから試料の処理を行い、全ての測定を３回実施した。
【０２２３】
４日目の活性化の実験用に、Ｔ細胞を、ＣＯ２（５％）インキュベータ内、１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中、３７℃で一晩静置した。細胞を回収して、５０％ＲＰＭＩ  １６４０及び５０％グルコースフリーＲＰＭＩ  １６４０中に再懸濁して、５ｍＭ終濃度のグルコースを得て、培地に１０％ウシ胎児血清を補足した。Ｔ細胞を、その両方がＧＰＣ３を発現する固定ＪＨＨ７細胞もしくは固定ＨｅｐＧ２細胞、及び抗ＧＰＣ３抗体（０．５μｇ／ｍＬ）と、または、ＦＯＬＲαを発現する固定ＩＧＲＯＶ−１細胞、抗ＦＯＬＲα抗体（１μｇ／ｍＬ）と、３．２：１のＥ：Ｔ比率で混合した。反応液を、ＣＯ２（５％）インキュベータ内、３７℃で４日間培養した。細胞を回収して、カルシウムとマグネシウムを含むＰＢＳ中に再懸濁した。製造業者のプロトコルに従いＧｌｕｃｏｓｅ  Ｕｐｔａｋｅ−Ｇｌｏ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞の２−デオキシ−グルコース（２ＤＧ）取り込み能を評価することにより、グルコース取り込みを測定した。それぞれの実験用に、Ｔ細胞（５０，０００）を２ＤＧ（１ｍＭ）と共に２０分間培養してから試料の処理を行い、全ての測定を３回実施した。
【０２２４】
複数の標的−抗体ペアにおける、複数のドナーに由来する複数種のＴ細胞試料の、活性化前及び４日目の活性化の実験における、ＡＣＴＲを単独で発現するＴ細胞に対する、ＡＣＴＲ及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞における２ＤＧ取り込みの倍率変化をプロットした（図３）。それぞれのしるしは３回の測定の平均値を表す。まとめると、これらのデータは、活性化の前及び活性化の４日後において、ＡＣＴＲ及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞が、ＡＣＴＲを単独で発現するＴ細胞と比較して、より多くのグルコースを取り込んでいることを示している。
【０２２５】
実施例７．ＡＣＴＲ及びＧＬＵＴ１の共発現はＡＣＴＲ−Ｔ細胞活性を向上させた
本実施例は、Ｔ細胞において、抑制性制御性Ｔ細胞の存在下、ＡＣＴＲと組み合わせてグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）を発現させることが、ＡＣＴＲ単独の場合と比較して、Ｔ細胞の活性を向上させることを示している。誘導性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）をＰＢＭＣから単離して増殖させた。簡潔に説明すると、製造業者のプロトコルに従いＲｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、ＣＤ４＋ＣＤ１２７−／ｄｉｍ細胞をＰＢＭＣから単離した。４〜６日間に１回Ｈｕｍａｎ  Ｔｒｅｇ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）で刺激してから、ヒトＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍＬ）、ヒトＴＧＦ−ベータ（１０ｎｇ／ｍＬ）、及びラパマイシン（１００ｎＭ）の存在下、１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養することにより、単離細胞を増殖させた。増殖中、１ｍＬあたり約０．５×１０６細胞に細胞を維持した。抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ１２７抗体、及び抗ＦｏｘＰ３抗体を用いたフローサイトメトリーにより、細胞の表現型をモニターした。活性化した誘導性Ｔｒｅｇを、＞１０μｍの直径及び＞９５％ＣＤ４＋／ＣＤ２５ｈｉｇｈ／ＦｏｘＰ３＋／ＣＤ１２７ｄｉｍの表現型を有する細胞集団として定義した。活性化した誘導性Ｔｒｅｇをそれに続く実験に使用した。これらの実験では、ＡＣＴＲポリペプチド（配列番号：５７）を単独でコードするまたはＰ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられたＡＣＴＲポリペプチド及びＧＬＵＴ１（配列番号：８１）をコードするウイルスをＴ細胞に形質導入した。形質導入Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中で、ＦＯＬＲαを発現する生ＩＧＲＯＶ−１標的細胞、抗ＦＯＬＲα抗体（１μｇ／ｍＬ）と、１：１のＥ：Ｔ比率で培養した。Ｔ細胞に対する様々な比率の同一ドナーの誘導性Ｔｒｅｇ（Ｔ細胞：Ｔｒｅｇ＝１：０、４：１、２：１、または１：１）の不在下または存在下で、反応を実施した。反応液を、ＣＯ２（５％）インキュベータ内、３７℃で７日間培養した。４日後、それぞれの反応液から上清を除去し、Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ  ｇａｍｍａ  Ｋｉｔ（Ｃｉｓｂｉｏ）を用いてＩＦＮ−ガンマレベルを測定した。
【０２２６】
２つの異なるドナーから調製したＡＣＴＲ  Ｔ細胞（配列番号：５７）用の条件に応じた、ＩＦＮ−ガンマの量をプロットする（図４、パネルＡ）。これらのデータは、量を増加させていく誘導性Ｔｒｅｇの存在下における、ＩＦＮ−ガンマの用量依存的阻害を示している。誘導性Ｔｒｅｇ不在下の同一反応と比較した、産生ＩＦＮ−ガンマ量により求められる最大ＩＦＮ−ガンマのパーセンテージを、Ｔ細胞においてＡＣＴＲと共発現させたＴＮＦスーパーファミリーポリペプチドに応じてプロットする（図４、パネルＢ）。ドナー１の実験を４：１のＴ細胞：Ｔｒｅｇ比率で実施し、ドナー２の実験を１：１のＴ細胞：Ｔｒｅｇ比率で実施した。両方のドナーにおける、ＡＣＴＲ（親）を単独で発現するＴ細胞からのＩＦＮ−ガンマ産生は、Ｔｒｅｇの存在下で、Ｔｒｅｇの不在下における細胞のＩＦＮ−ガンマ産生の３０〜４０％のレベルにまで抑制される。ドナー１における両方において、ＡＣＴＲ及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞で同様の結果が認められた。ＡＣＴＲ及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞は、ドナー２におけるより多い相対ＩＦＮ−ガンマ産生によって明らかなように、ＡＣＴＲを単独で発現するＴ細胞と比較して、Ｔｒｅｇの抑制に対するより強い耐性を示す。
【０２２７】
これらの実験は、ＡＣＴＲもまた発現しているＴ細胞においてＧＬＵＴ１を共発現させることが、固形腫瘍微小環境中に存在することが知られているＴｒｅｇによる抑制に対するより強い耐性をそれらＴ細胞に示させることにより、Ｔ細胞活性を向上させ得ることを示している。
【０２２８】
実施例８：低いグルコース濃度のＴ細胞機能への影響。
例示的なＧＰＣ３標的化ＣＡＲ構築物（配列番号：１０４）をコードするガンマレトロウイルスベクターを組換え技術により作製し、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチドを細胞表面上に発現する細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞を感染させるのに用いた。次に、６日間フローベース増殖アッセイを使用して、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ発現細胞の機能を試験した。具体的には、２００，０００の非形質導入模擬Ｔ細胞またはＧＰＣ３標的化ＣＡＲ構築物を発現するＴ細胞を、５０，０００のＧＰＣ３＋肝細胞癌ＪＨＨ７腫瘍細胞またはＨｅｐ３Ｂ腫瘍細胞のいずれかと共に、４：１（エフェクター細胞／ＣＡＲ発現Ｔ細胞：標的細胞）の比率で培養した。共培養物を、異なる濃度のグルコースの存在下、５％ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で６日間培養した。６日間の最後に、共培養物を回収して、抗ＣＤ３抗体で染色した。フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ３陽性細胞の数をＴ細胞増殖の指標として評価した。より低いグルコース濃度でより少ないＣＡＲ−Ｔ増殖が認められた（図５）。これらの実験は、低グルコース環境がＣＡＲ−Ｔ細胞増殖にマイナスの影響を及ぼし得ることを示している。
【０２２９】
実施例９：グルコース輸送体遺伝子を発現させることの、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチドを共発現するＴ細胞への影響
例示的なＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド（配列番号：１０４）をコードするガンマレトロウイルスベクターを組換え技術により作製し、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチドをその細胞表面上に発現する細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞を感染させるのに用いた。加えて、例示的なＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチド（ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ３、またはＧＬＵＴ１  Ｓ２２６Ｄバリアント）をコードするガンマレトロウイルスベクターを組換え技術により作製し、ＧＰＣ３標的化ポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチドを発現する細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞を感染させるのに用いた。ＣＡＲポリペプチドとグルコース輸入ポリペプチドの両方をコードする構築物において、２つのポリペプチドのコード配列は、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられた。ＧＰＣ３標的化ＣＡＲとグルコース輸送体の組み合わせとしては、配列番号：１０４＋配列番号：８１（ＧＬＵＴ１）、配列番号：１＋配列番号：５（ＧＬＵＴ３）、及び配列番号：１０４＋配列番号：２（ＧＬＵＴ１  Ｓ２２６Ｄ）、が挙げられる。次に、６日間フローベース増殖アッセイを使用して、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ発現細胞の機能を試験した。具体的には、２００，０００の非形質導入模擬Ｔ細胞、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞、またはＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチド及びＧＬＵＴ１ペプチドを発現するＴ細胞を、５０，０００のＧＰＣ３＋肝細胞癌ＪＨＨ７腫瘍細胞と共に、４：１（エフェクター細胞／ＣＡＲ発現Ｔ細胞：標的細胞）の比率で培養した。共培養物を、１．２５ｍＭのグルコース（腫瘍相当）及び１０ｍＭのグルコース（ほぼ末梢血レベル）の存在下、５％ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で６日間培養した。６日間の最後に、共培養物を回収して、抗ＣＤ３抗体で染色した。フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ３陽性細胞の数をＴ細胞増殖の指標として評価した。ＣＡＲポリペプチドに加えてグルコース輸入ポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ構築物を単独で発現するＴ細胞と比較して、高いＴ細胞増殖を示した（図６〜図８）。この高い増殖はまた、腫瘍相当の低グルコース濃度で生じた。これらの実験は、Ｔ細胞においてグルコース輸送体ＧＬＵＴ１を発現させることがＣＡＲ−Ｔ細胞増殖活性にプラスの影響を及ぼすことを示している。
【０２３０】
実施例１０：より低いグルコース環境においてグルコース輸送体遺伝子を発現させることのＣＡＲ−Ｔ細胞機能への影響。
グルコース輸入導入遺伝子を、同一Ｔ細胞においてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ１  Ｓ２２６Ｄバリアント、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ８  Ｌ１２Ａ  Ｌ１３Ａバリアント、ＧＬＵＴ１１、ＧＬＵＴ７、ＧＬＵＴ４、ＳＧＬＴ１、またはＳＧＬＴ２（例えば、配列番号：８１〜９０）である。例えば、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられたＣＡＲポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチドをコードするウイルスをＴ細胞に導入する。Ｔ細胞を、ＨｅｐＧ２細胞などの腫瘍標的細胞と、任意のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率で混合する。その後、反応液を、異なる開始濃度のグルコース（例えば、０〜２０ｍＭ）で、５％ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で一定期間（例えば、６〜８日間）培養する。次に、例えば、サイトカイン産生アッセイまたはＴ細胞増殖アッセイを用いて、Ｔ細胞機能を評価する。反応上清からサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２及び／またはＩＦＮ−ガンマ）を測定する。増殖実験用に、共培養物を回収してから、抗ＣＤ３抗体及び生死細胞染料で染色する。フローサイトメトリーを用いて、生ＣＤ３陽性細胞の数をＴ細胞増殖の指標として評価する。ＣＡＲポリペプチドに加えてグルコース輸入ポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＣＡＲを単独で発現するＴ細胞と比較して、例えば、高いサイトカイン産生または高い増殖を含む高いＴ細胞機能を示す。この高い機能は、より低いグルコース濃度においてより顕著であり得る。これらの実験は、Ｔ細胞においてグルコース輸送体を発現させることがＴ細胞活性にプラスの影響を及ぼすことを示している。
【０２３１】
実施例１１：より高い可溶性阻害剤濃度の環境においてグルコース輸送体遺伝子を発現させることのＣＡＲ−Ｔ細胞機能への影響。
グルコース輸入導入遺伝子を、同一Ｔ細胞においてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ１  Ｓ２２６Ｄバリアント、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ８  Ｌ１２Ａ  Ｌ１３Ａバリアント、ＧＬＵＴ１１、ＧＬＵＴ７、ＧＬＵＴ４、ＳＧＬＴ１、またはＳＧＬＴ２（例えば、配列番号：８１〜９０）である。例えば、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられたＣＡＲポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチドをコードするウイルスをＴ細胞に導入する。形質導入Ｔ細胞を、腫瘍微小環境中に存在する異なる濃度の可溶性阻害剤（例えば、ＴＧＦベータ、ＰＧＥ２、及び／またはアデノシン）を含有する培地中で、ＨｅｐＧ２細胞などの腫瘍標的細胞と、任意のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率で混合する。その後、反応液を、５％ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で一定期間（例えば、６〜８日間）培養する。次に、例えば、サイトカイン産生アッセイまたはＴ細胞増殖アッセイを用いて、Ｔ細胞機能を評価する。反応上清からサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２及び／またはＩＦＮ−ガンマ）を測定する。増殖実験用に、共培養物を回収してから、抗ＣＤ３抗体及び生死細胞染料で染色する。フローサイトメトリーを用いて、生ＣＤ３陽性細胞の数をＴ細胞増殖の指標として評価する。ＣＡＲポリペプチドに加えてグルコース輸入ポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＣＡＲを単独で発現するＴ細胞と比較して、例えば、高いサイトカイン産生または高い増殖を含む高いＴ細胞機能を示す。この高い機能は、より高い可溶性阻害剤濃度において達成され得る。これらの実験は、Ｔ細胞においてグルコース輸送体を発現させることがＴ細胞活性にプラスの影響を及ぼすことを示している。
【０２３２】
実施例１２：より多い免疫抑制細胞が存在する環境においてグルコース輸送体遺伝子を発現させることのＣＡＲ−Ｔ細胞機能への影響。
グルコース輸入導入遺伝子を、同一Ｔ細胞においてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ１  Ｓ２２６Ｄバリアント、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ８  Ｌ１２Ａ  Ｌ１３Ａバリアント、ＧＬＵＴ１１、ＧＬＵＴ７、ＧＬＵＴ４、ＳＧＬＴ１、またはＳＧＬＴ２（例えば、配列番号：８１〜９０）である。例えば、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられたＣＡＲポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチドをコードするウイルスをＴ細胞に導入する。形質導入Ｔ細胞を、免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来の抑制細胞及び／または制御性Ｔ細胞）の存在下で、ＨｅｐＧ２細胞などの腫瘍標的細胞と、任意のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率で混合する。その後、反応液を、５％ＣＯ２インキュベータ内、３７℃で一定期間（例えば、３〜１０日間）培養する。次に、例えば、サイトカイン産生アッセイまたはＴ細胞増殖アッセイを用いて、Ｔ細胞機能を評価する。反応上清からサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２及び／またはＩＦＮ−ガンマ）を測定する。増殖実験用に、共培養物を回収してから、抗ＣＤ３抗体及び生死細胞染料で染色する。フローサイトメトリーを用いて、生ＣＤ３陽性細胞の数をＴ細胞増殖の指標として評価する。ＣＡＲポリペプチドに加えてグルコース輸入ポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＣＡＲを単独で発現するＴ細胞と比較して、例えば、高いサイトカイン産生または高い増殖を含む高いＴ細胞機能を示す。この高い機能は、多い量（例えば、より多い数またはより高いパーセンテージ）の免疫抑制細胞の存在下で達成され得る。これらの実験は、Ｔ細胞においてグルコース輸送体を発現させることがＴ細胞活性にプラスの影響を及ぼすことを示している。
【０２３３】
実施例１３：腫瘍モデルにおいてグルコース輸送体遺伝子を発現させることのＣＡＲ−Ｔ細胞機能への影響。
グルコース輸入導入遺伝子を、同一Ｔ細胞においてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ１  Ｓ２２６Ｄバリアント、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ８  Ｌ１２Ａ  Ｌ１３Ａバリアント、ＧＬＵＴ１１、ＧＬＵＴ７、ＧＬＵＴ４、ＳＧＬＴ１、またはＳＧＬＴ２（例えば、配列番号：８１〜９０）である。例えば、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられたＣＡＲポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチドをコードするウイルスをＴ細胞に導入する。マウス腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性について形質導入Ｔ細胞を評価する。これらの実験用に、腫瘍細胞株、例えば、ＨｅｒＧ２を、ＮＳＧ（商標）（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスに接種する。続いて、ＣＡＲを単独で発現するまたはＣＡＲ及びグルコース輸入ポリペプチドを発現するＴ細胞を、腫瘍保有マウスに投与する。実験期間中にわたり腫瘍の増殖をモニターする。ＣＡＲポリペプチドに加えてグルコース輸入ポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＣＡＲポリペプチドを単独で発現するＴ細胞と比較して、高い抗腫瘍活性を示す。加えて、ＣＡＲポリペプチドに加えてグルコース輸入ポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＣＡＲポリペプチドを単独で発現するＴ細胞と比較して、例えば、高い増殖、向上したＴ細胞持続性、及び／または高いサイトカイン産生を含む高いＴ細胞活性を示し得る。これらの実験は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞においてグルコース輸入ポリペプチドを発現させることがｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞機能にプラスの影響を及ぼすことを示している。
【０２３４】
実施例１４：ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ−Ｔ発現構築物を用いたマウス腫瘍モデルにおいてグルコース輸送体遺伝子を発現させることのＣＡＲ−Ｔ細胞機能への影響。
グルコース輸入導入遺伝子を、同一Ｔ細胞においてＧＰＣ３標的化ＣＡＲ−Ｔポリペプチドと共発現させた。例示的なＧＰＣ３標的化ＣＡＲ−Ｔポリペプチド（配列番号：１０４）をコードするガンマレトロウイルスベクターを組換え技術により作製し、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ−Ｔをその細胞表面上に発現する細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞を感染させるのに用いた。ＣＡＲ−Ｔポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチド（ＧＬＵＴ１、配列番号：３）をコードするウイルスをＴ細胞にまた導入したが、そのコード配列は、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列（配列番号：２２）により隔てられた。マウス腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性についてＣＡＲ形質導入Ｔ細胞及びＣＡＲ／ＧＬＵＴ１形質導入Ｔ細胞を評価した。これらの実験用に、肝細胞癌腫瘍細胞株ＪＨＨ７を、ＮＳＧ（商標）（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスに接種した。５×１０６細胞の右脇腹への皮下注射により、ＪＨＨ７ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）異種移植片を雌ＮＳＧに樹立した。腫瘍容積が約５０ｍｍ３に到達したとき（接種後８日目）、ＧＰＣ３  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を用いた治療を開始した。腫瘍容積を基準としてそれぞれ５匹のマウスの治療群にマウスを無作為化し、５×１０６のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量で、接種後８日目及び１５日目に、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞、ならびにＣＡＲポリペプチド及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞を用いた治療を行った。総Ｔ細胞用量はそれぞれの構築物のＣＡＲ形質導入効率に基づいて様々であり、総Ｔ細胞用量は、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲを発現するＴ細胞（４８．８％ＣＡＲ＋）、ならびにＧＰＣ３標的化ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞（２９．０％ＣＡＲ＋）においてそれぞれ、１．０２×１０７及び１．７２×１０７（２週間にわたり毎週）であった。実験期間中にわたり週に２〜３回、腫瘍容積及び体重を測定した。グルコース輸送体ＧＬＵＴ１を共発現するＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ構築物のみを発現するＴ細胞と比較して、高い抗腫瘍効果を示した（図９）。これらの実験は、ＣＡＲ−Ｔ細胞においてグルコース輸送体ＧＬＵＴ１を共発現させることが、肝細胞癌のマウス異種移植モデルにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果にプラスの影響を及ぼすことを示している。
【０２３５】
実施例１５：より低いグルコース環境においてグルコース輸送体遺伝子を発現させることのＣＡＲ−Ｔ細胞機能への影響。
グルコース輸入導入遺伝子を、同一Ｔ細胞においてＧＰＣ３標的化ＣＡＲ−Ｔポリペプチドと共発現させた。例示的なＧＰＣ３標的化ＣＡＲ−Ｔポリペプチド（配列番号：１０４）をコードするガンマレトロウイルスベクターを組換え技術により作製し、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ−Ｔをその細胞表面上に発現する細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞を感染させるのに用いた。ＣＡＲ−Ｔポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチド（ＧＬＵＴ１、配列番号：８１）をコードするウイルスをＴ細胞にまた導入したが、そのコード配列は、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられた。Ｔ細胞の共培養物を固形腫瘍標的細胞と混合してから回収し、抗ＣＤ３抗体及び生死細胞染料で染色した。フローサイトメトリーを用いて、生ＣＤ３陽性細胞の数をＴ細胞増殖の指標として評価した（図１０）。ＣＡＲポリペプチドに加えてグルコース輸入ポリペプチドを発現するＴ細胞は高いＴ細胞増殖を示したが、それはより低いグルコース濃度でより顕著であった。
【０２３６】
実施例１６：ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ−Ｔ発現構築物を用いたマウス腫瘍モデルにおいてグルコース輸送体遺伝子を発現させることのＣＡＲ−Ｔ細胞機能への影響。
例示的なＧＰＣ３標的化ＣＡＲ−Ｔポリペプチド（配列番号：１０４）をコードするガンマレトロウイルスベクターを組換え技術により作製し、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ−Ｔをその細胞表面上に発現する細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞を感染させるのに用いた。ＣＡＲ−Ｔポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチド（ＧＬＵＴ１、配列番号：８１）をコードするウイルスをＴ細胞にまた導入したが、そのコード配列は、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられた。マウス腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性についてＣＡＲ形質導入Ｔ細胞及びＣＡＲ／ＧＬＵＴ１形質導入Ｔ細胞を評価した。これらの実験用に、肝細胞癌腫瘍細胞株ＪＨＨ７を、ＮＳＧ（商標）（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスに接種した。５×１０６細胞の右脇腹への皮下注射により、ＪＨＨ７ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）異種移植片を雌ＮＳＧに樹立した。腫瘍容積が約５０ｍｍ３に到達したとき（接種後８日目）、ＧＰＣ３  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を用いた治療を開始した。腫瘍容積を基準としてそれぞれ５匹のマウスの治療群にマウスを無作為化し、５×１０６のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量で、接種後８日目及び１５日目に、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞、ならびにＣＡＲポリペプチド及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞を用いた治療を行った。総Ｔ細胞用量はそれぞれの構築物のＣＡＲ形質導入効率に基づいて様々であり、総Ｔ細胞用量は、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲを発現するＴ細胞（４８．８％ＣＡＲ＋）、ならびにＧＰＣ３標的化ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞（３５．５％ＣＡＲ＋）においてそれぞれ、１．０２×１０７及び１．４１×１０７（２週間にわたり毎週）であった。実験期間中にわたり週に２〜３回、腫瘍容積及び体重を測定した（図１１）。エンドポイントで未治療腫瘍を切除し、０．４５μｍのフィルター内蔵チューブに充填してから５００ｇの遠心力をかけて、間質液を除去した（Ｗｉｉｇ  ２００３  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８４：Ｈ４１６）。糖尿病血糖値測定器を用いて、血中及び腫瘍間質液中のグルコースレベルを測定した（図１３）。グルコース輸送体ＧＬＵＴ１を共発現するＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ構築物のみを発現するＴ細胞と比較して、高い抗腫瘍効果を示した。これらの実験は、ＣＡＲ−Ｔ細胞においてグルコース輸送体ＧＬＵＴ１を共発現させることが、肝細胞癌のマウス異種移植モデルにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果にプラスの影響を及ぼすことを示している。
【０２３７】
実施例１７：ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ−Ｔ発現構築物を用いたマウス腫瘍モデルにおいてグルコース輸送体遺伝子を発現させることのＣＡＲ−Ｔ細胞機能への影響
例示的なＧＰＣ３標的化ＣＡＲ−Ｔポリペプチド（配列番号：１）をコードするガンマレトロウイルスベクターを組換え技術により作製し、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ−Ｔをその細胞表面上に発現する細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞を感染させるのに用いた。ＣＡＲ−Ｔポリペプチド及びグルコース輸入ポリペプチド（ＧＬＵＴ１、配列番号：８１）をコードするウイルスをＴ細胞にまた導入したが、そのコード配列は、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられた。マウス腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性についてＣＡＲ形質導入Ｔ細胞及びＣＡＲ／ＧＬＵＴ１形質導入Ｔ細胞を評価した。これらの実験用に、肝細胞癌腫瘍細胞株Ｈｅｐ３Ｂを、ＮＳＧ（商標）（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスに接種した。５×１０６細胞の右脇腹への皮下注射により、Ｈｅｐ３Ｂヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）異種移植片を雌ＮＳＧに樹立した。腫瘍容積が約１００ｍｍ３に到達したとき（接種後２０日目）、ＧＰＣ３  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を用いた治療を開始した。腫瘍容積を基準としてそれぞれ５匹のマウスの治療群にマウスを無作為化し、１×１０６のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量で、接種後２０日目及び２７日目に、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞、ならびにＣＡＲポリペプチド及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞を用いた治療を行った。総Ｔ細胞用量はそれぞれの構築物のＣＡＲ形質導入効率に基づいて様々であり、総Ｔ細胞用量は、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲを発現するＴ細胞（４８．８％ＣＡＲ＋）、ならびにＧＰＣ３標的化ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞（３５．５％ＣＡＲ＋）においてそれぞれ、２．０５×１０６及び２．８２×１０６（２週間にわたり毎週）であった。実験期間中にわたり週に２〜３回、腫瘍容積及び体重を測定した（図１２）。エンドポイントで未治療腫瘍を切除し、０．４５μｍのフィルター内蔵チューブに充填してから５００ｇの遠心力をかけて、間質液を除去した（Ｗｉｉｇ  ２００３  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８４：Ｈ４１６）。糖尿病血糖値測定器を用いて、血中及び腫瘍間質液中のグルコースレベルを測定した（図１３）。グルコース輸送体ＧＬＵＴ１を共発現するＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ構築物のみを発現するＴ細胞と比較して、高い抗腫瘍効果を示した。これらの実験は、ＣＡＲ−Ｔ細胞においてグルコース輸送体ＧＬＵＴ１を共発現させることが、肝細胞癌のマウス異種移植モデルにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果にプラスの影響を及ぼすことを示している。
【０２３８】
実施例１８．抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１の共発現はＧＬＵＴ１発現を向上させた
本実施例は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲポリペプチド及びＧＬＵＴ１をコードするウイルスを形質導入したＴ細胞においてグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）発現が上昇していることを示している。これらの実験では、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲポリペプチド（配列番号：１０４）を単独でコードするまたはＰ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられた抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１（配列番号：８１）をコードするウイルスをＴ細胞に形質導入した。フローサイトメトリーを用いてＧＬＵＴ１発現を評価した。Ｔ細胞をｅＦｌｕｏｒ７８０  ｆｉｘａｂｌｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色してから、蛍光標識ＧＰＣ３細胞外ドメインで染色して、ＣＡＲ発現ならびに抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を検出した。細胞を洗浄してから、Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて固定及び透過処理を行った。次に、抗ＧＬＵＴ１抗体で細胞を染色し、洗浄してから、フローサイトメトリーを用いて解析した。
【０２３９】
フローサイトメトリーデータのヒストグラムを図１４に示す。ＧＰＣ３細胞外ドメイン（ＧＰＣ３  ＣＡＲ発現）で染色することにより生細胞集団をゲーティングして、非形質導入（ＣＡＲ−）集団及びＣＡＲ（ＣＡＲ＋）集団を生じさせた。これらの細胞集団をまた、ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞としてゲーティングした。認められたＧＬＵＴ１発現は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ単独Ｔ細胞及び抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ＋ＧＬＵＴ１Ｔ細胞内の非形質導入細胞集団内において、ＣＤ４＋細胞と比較して、ＣＤ８＋細胞においてより高かった。認められたＧＬＵＴ１発現は、ＣＡＲを単独で発現するＴ細胞と比較して、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞において、ＣＡＲ＋集団のＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞の両方でより高かった。これらの実験は、Ｔ細胞における抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１の共発現が、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞におけるＧＬＵＴ１の発現上昇をもたらすことを示している。
【０２４０】
実施例１９．抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１の共発現はグルコース取り込みを向上させた
本実施例は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１をコードするウイルスを形質導入したＴ細胞においてグルコース取り込みが増加していることを示している。これらの実験では、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ（配列番号：１０４）を単独でコードするまたはＰ２Ａリボソームスキップ配列により隔てられた抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１（配列番号：８１）をコードするウイルスをＴ細胞に形質導入した。
【０２４１】
活性化前の実験用に、Ｔ細胞を、ＣＯ２（５％）インキュベータ内、１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中、３７℃で一晩静置した。細胞を回収して、カルシウムとマグネシウムを含むＰＢＳ中に再懸濁した。製造業者のプロトコルに従いＧｌｕｃｏｓｅ  Ｕｐｔａｋｅ−Ｇｌｏ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞の２−デオキシ−グルコース（２ＤＧ）取り込み能を評価することにより、グルコース取り込みを測定した。それぞれの実験用に、Ｔ細胞（５０，０００）を２ＤＧ（１ｍＭ）と共に２０分間培養してから試料の処理を行い、全ての測定を３回実施した。
【０２４２】
４日目の活性化の実験用に、Ｔ細胞を、ＣＯ２（５％）インキュベータ内、１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中、３７℃で一晩静置した。細胞を回収して、５０％ＲＰＭＩ  １６４０及び５０％グルコースフリーＲＰＭＩ  １６４０中に再懸濁して、５ｍＭ終濃度のグルコースを得て、培地に１０％ウシ胎児血清を補足した。Ｔ細胞を、その両方がＧＰＣ３を発現する固定ＪＨＨ７細胞または固定ＨｅｐＧ２細胞と、２：１のＥ：Ｔ比率で混合した。反応液を、ＣＯ２（５％）インキュベータ内、３７℃で４日間培養した。細胞を回収して、カルシウムとマグネシウムを含むＰＢＳ中に再懸濁した。製造業者のプロトコルに従いＧｌｕｃｏｓｅ  Ｕｐｔａｋｅ−Ｇｌｏ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞の２−デオキシ−グルコース（２ＤＧ）取り込み能を評価することにより、グルコース取り込みを測定した。それぞれの実験用に、Ｔ細胞（５０，０００）を２ＤＧ（１ｍＭ）と共に２０分間培養してから試料の処理を行い、全ての測定を３回実施した。
【０２４３】
複数のドナーに由来する複数種のＴ細胞試料の、活性化前及び４日目の活性化の実験における、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲを単独で発現するＴ細胞に対する、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞における２ＤＧ取り込みの倍率変化をプロットした（図１５）。しるしはそれぞれの実験における３回の測定の平均値を表す。まとめると、これらのデータは、活性化の前の適度に増加したグルコース取り込みと同様に、活性化の４日後において、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞が、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲを単独で発現するＴ細胞と比較して、より多くのグルコースを取り込んでいることを示している。
【０２４４】
実施例２０．抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞は異種移植マウスにおいて高い生存率を示した
本実施例は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞が、マウス異種移植モデルにおいて増殖及び持続することを示した。これらの実験では、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ（配列番号：１０４）を発現するＴ細胞、ならびに抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１（配列番号：８１）を共発現するＴ細胞を用いた治療を行ったＨｅｐ３Ｂ腫瘍保有ＮＳＧマウスから血液試料を採取した（異種移植試験の詳細については実施例１０を参照のこと）。イソフルラン麻酔下の眼窩採血により、１５、２５、４０、及び６０日目に、全血試料（２０μＬ）を採取して、フローサイトメトリー用の処理を行うまでＢａｍＢａｎｋｅｒ凍結保護剤で凍結させた。赤血球を溶解して、生／死染料、抗ヒトＣＤ３、及び蛍光標識組換えＧＰＣ３タンパク質で試料を染色してから、フローサイトメトリーを用いて解析した。結果を血液１μＬあたりの生ＣＡＲ＋／ＣＤ３＋細胞の数で表す（図１６）。それぞれの時点は、３匹またはそれ以上のマウスを含む群の平均値を表している。抗ＧＰＣ３  ＣＡＲを単独で発現するＴ細胞で治療したマウスにおいて、１５日目に、わずかな数のＣＡＲ発現Ｔ細胞（血液１μＬあたり＜１の細胞）が検出され、この群のマウスの数は、それに続く時点において３匹未満に落ちた。抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞で治療したマウスにおけるＣＡＲ発現Ｔ細胞の数は、１５日目において、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲを単独で発現するＴ細胞で治療したマウスにおけるＣＡＲ発現Ｔ細胞の数と比較して、はるかに多く、評価を行った全ての時点において、実験期間中にわたり検出可能なままであった。これらのデータは、腫瘍保有ＮＳＧマウスにおいて、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ及びＧＬＵＴ１を共発現するＴ細胞が、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲを単独で発現するＴ細胞と比較して、優れた細胞増殖及び細胞持続性を示すことを示している。
【０２４５】
その他の実施形態
本明細書において開示する全ての特徴を任意の組み合わせで組み合わせてもよい。本明細書において開示するそれぞれの特徴を、同一、同等、または類似の目的を満たす代替の特徴で置き換えてもよい。それゆえ、特に明記しない限り、開示するそれぞれの特徴は、一般的な一連の同等または類似の特徴の例に過ぎない。
【０２４６】
上記の記載内容から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に見極めることができ、また、本開示の趣旨及び範囲を逸脱することなく本開示の様々な変更及び修正を行い、様々な用法及び条件に適合させることができる。それゆえ、その他の実施形態もまた特許請求の範囲内である。
【０２４７】
等価物
いくつかの発明の実施形態について本明細書で記載及び説明してきたが、当業者は、本明細書に記載の機能を実施するための、及び／または、本明細書に記載の結果及び／または本明細書に記載の利点のうちの１つまたは複数を得るための、様々なその他の方法及び／または構成を容易に想像し、このような変化形態及び／または修正のそれぞれは、本明細書に記載の本発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般的に言えば、本明細書に記載の全てのパラメータ、寸法、物質、及び構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、物質、及び／または構成が、本発明の教示を利用する一特定用途または複数の特定用途に依存する、ということを当業者は容易に理解するであろう。本明細書に記載の特定の発明の実施形態に対する多くの等価物について、当業者は理解する、または、通常の実験を行うだけで確認することが可能であろう。それゆえ、上記の実施形態が単なる例として提供されており、添付の特許請求の範囲及びその等価物の範囲内において、具体的に記載及び請求したもの以外の発明の実施形態を別様に実施することができる、と理解すべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載の、それぞれ個々の特徴、システム、物品、物質、キット、及び／または方法に関する。加えて、２つまたはそれ以上のこのような特徴、システム、物品、物質、キット、及び／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、物質、キット、及び／または方法が互いに矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
【０２４８】
本明細書で定義及び使用する全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文献における定義、及び／または定義する用語の通常の意味を超えて優先されるものと理解すべきである。
【０２４９】
本明細書で開示する全ての参照文献、特許、及び特許出願は、それぞれが引用される主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては、その文献の全体を包含し得る。
【０２５０】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、反対のことを明確に指し示さない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解すべきである。
【０２５１】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される語句「及び／または」は、そのように連結された要素、すなわち、一部の例では接続的に示される要素、またその他の例では離接続的に示される要素の「一方またはその両方」を意味するものと理解すべきである。「及び／または」と共に列挙される複数の要素は、同様に、すなわち、そのように連結された要素のうちの「１つまたは複数」と解釈されるべきである。具体的に示されるそれら要素と関連しているかまたは関連していないかにかかわらず、「及び／または」節が具体的に示す要素以外のその他の要素を任意選択的に示してもよい。それゆえ、非限定例として、「Ａ及び／またはＢ」への言及とは、「含む」などのオープンエンド用語と共に使用する場合、一実施形態ではＡのみ（Ｂ以外の要素を任意選択的に含む）、別の実施形態ではＢのみ（Ａ以外の要素を任意選択的に含む）、更に別の実施形態ではＡとＢの両方（その他の要素を任意選択的に含む）、などのことを意味し得る。
【０２５２】
本明細書及び特許請求の範囲において使用する場合、「または」は、上で定義した「及び／または」と同一の意味を有すると理解すべきである。例えば、一覧の要素を分ける場合、「または」または「及び／または」は、包括的、すなわち、要素の数または一覧及び任意選択的に別の列挙されていない要素のうちの少なくとも１つを含むが、それらのうちの２つ以上もまた含む、と解釈されるべきである。反対のことを明確に指し示す用語、例えば、「のうちの１つのみ」もしくは「のうちの厳密に１つ」など、または特許請求の範囲において用いられる「からなる」に限り、要素の数または一覧のうちの厳密に１つの要素を含むことを意味する。一般的に、本明細書で使用する用語「または」は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、または「のうちの厳密に１つ」などの排他性の用語が先行する場合、排他的な選択肢（すなわち、「一方またはもう一方であるが両方ではない」）を指し示すと専ら解釈されるべきである。「から本質的になる」は、特許請求の範囲において使用する場合、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するべきである。
【０２５３】
本明細書及び特許請求の範囲において使用する場合、１つまたは複数の要素の一覧に関する語句「少なくとも１つ」は、要素の一覧における要素のうちのいずれか１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するものと理解されるべきであるが、要素の一覧内に列挙される全ての要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含む必要はなく、要素の一覧内の要素の任意の組み合わせを除外するものでもない。この定義はまた、具体的に示されるそれら要素と関連しているかまたは関連していないかにかかわらず、語句「少なくとも１つ」が意味する要素の一覧内に具体的に示される要素以外の要素を任意選択的に示してもよいということを可能とする。それゆえ、非限定例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（すなわち、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、すなわち、「Ａ及び／またはＢのうちの少なくとも１つ」）とは、一実施形態では、Ｂの存在を伴わない、２つ以上を任意選択的に含む少なくとも１つのＡ（Ｂ以外の要素を任意選択的に含む）、別の実施形態では、Ａの存在を伴わない、２つ以上を任意選択的に含む少なくとも１つのＢ（Ａ以外の要素を任意選択的に含む）、更に別の実施形態では、２つ以上を任意選択的に含む少なくとも１つのＡ、及び２つ以上を任意選択的に含む少なくとも１つのＢ（その他の要素を任意選択的に含む）、などのことを意味し得る。
【０２５４】
反対のことを明確に指し示さない限り、２つ以上の工程または行為を含む本発明でクレームする任意の方法において、本方法の工程または行為の順番が、列挙される本方法の工程または行為の順番に必ずしも限定されないということもまた理解すべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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