(57)【要約】本開示は、概して、ＨＩＶの処置または防止のための免疫化および免疫療法に関する。特に、本方法は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を供給源から精製するステップと、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドでＰＢＭＣを刺激するステップと、少なくとも１サブセットの細胞をＰＢＭＣから枯渇させるステップであって、少なくとも１サブセットの細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ制御性細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含むステップと、枯渇させたＰＢＭＣに、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムで形質導入するステップと、少なくとも１日間にわたって、形質導入されたＰＢＭＣを培養するステップと、培養されたＰＢＭＣを採取するステップとを含む。
2021519069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を供給源から精製するステップと、
前記ＰＢＭＣを少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドで刺激するステップと、
少なくとも１サブセットの細胞を前記ＰＢＭＣから枯渇させるステップであって、前記少なくとも１サブセットの細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ制御性細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含む、ステップと、
枯渇させた前記ＰＢＭＣに、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムで形質導入するステップと、
少なくとも１日間にわたって、形質導入された前記ＰＢＭＣを培養するステップと、
培養された前記ＰＢＭＣを採取するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記培養が、静置培養システムまたは半静置培養システムで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドが、合成の重複ペプチドのプールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記合成の重複ペプチドのプールが、ＨＩＶ  Ｇａｇポリタンパク質を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記枯渇させるステップが、前記少なくとも１サブセットの細胞を、枯渇させた前記ＰＢＭＣから分離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記分離することが、磁気ビーズ分離を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡ、またはＨＩＶ  ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＩＶ  ＲＮＡ配列が、ＨＩＶ  Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ  Ｔａｔ配列、またはそれらのバリアントを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号３０の少なくとも１つと、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するマイクロＲＮＡを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＩＶに感染した被験体を処置するための遺伝子改変リンパ球であって、
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記被験体から精製するステップであって、前記ＰＢＭＣが少なくとも１つのリンパ球を含む、ステップと、
前記少なくとも１つのリンパ球を、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドで刺激するステップと、
少なくとも１サブセットの細胞を前記ＰＢＭＣから枯渇させるステップであって、前記少なくとも１サブセットの細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ制御性細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含む、ステップと、
前記少なくとも１つのリンパ球に、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムで形質導入するステップと、
少なくとも１日間にわたって、前記ＰＢＭＣを培養するステップと、
培養された前記ＰＢＭＣを採取するステップと
を含むプロセスによって調製される、遺伝子改変リンパ球。
【請求項１２】
予防用または治療用ＨＩＶワクチンで免疫した被験体を処置するための遺伝子改変リンパ球であって、
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記被験体から精製するステップであって、前記ＰＢＭＣが少なくとも１つのリンパ球を含む、ステップと、
前記少なくとも１つのリンパ球を、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドで刺激するステップと、
少なくとも１サブセットの細胞を前記ＰＢＭＣから枯渇させるステップであって、前記少なくとも１サブセットの細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ制御性細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含む、ステップと、
前記少なくとも１つのリンパ球に、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムで形質導入するステップと、
少なくとも１日間にわたって、前記ＰＢＭＣを培養するステップと、
培養された前記ＰＢＭＣを採取するステップと
を含むプロセスによって調製される、遺伝子改変リンパ球。
【請求項１３】
ＨＩＶに曝露されたが感染していない被験体を処置するための遺伝子改変リンパ球であって、
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記被験体から精製するステップであって、前記ＰＢＭＣが少なくとも１つのリンパ球を含む、ステップと、
前記ＰＢＭＣを少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドで刺激するステップと、
少なくとも１サブセットの細胞を前記ＰＢＭＣから枯渇させるステップであって、前記少なくとも１サブセットの細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ制御性細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含む、ステップと、
前記少なくとも１つのリンパ球に、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムで形質導入するステップと、
少なくとも１日間にわたって、前記ＰＢＭＣを培養するステップと、
培養された前記ＰＢＭＣを採取するステップと
を含むプロセスによって調製される、遺伝子改変リンパ球。
【請求項１４】
ＰＢＭＣを少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドで刺激するステップと、
少なくとも１サブセットの細胞を前記ＰＢＭＣから枯渇させるステップであって、前記少なくとも１サブセットの細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ制御性細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含むステップと、
枯渇させた前記ＰＢＭＣに、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムで形質導入するステップと
を含む、方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドが、ＨＩＶ  ｇａｇペプチドを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡ、またはＨＩＶ  ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＨＩＶ  ＲＮＡ配列が、ＨＩＶ  Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ  Ｔａｔ配列、またはそれらのバリアントを含む、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ  ＧＥＮＥＴＩＣＡＬＬＹ−ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＬＹＭＰＨＯＣＹＴＥＳ」との表題の２０１８年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／６４８，８０４号（この開示は、参考として本明細書に援用される）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
分野
本発明は、概して、ＨＩＶの処置および防止のための免疫化および免疫療法の分野に関する。特に、開示されている方法は、そのようなＨＩＶ＋の個体に注入するのに好適な細胞産物を調製するために、非標的細胞を枯渇させるステップを含む、治癒を求めるＨＩＶ＋の個体から白血球を得るステップと、処理するステップと、増殖させるステップとに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
抗レトロウイルス薬併用療法（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ）（ｃＡＲＴ）（高活性抗レトロウイルス薬療法（Ｈｉｇｈｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ）またはＨＡＡＲＴとしても公知）は、ＨＩＶ−１の複製を制限し、疾患進行を遅延させるが、薬物の毒性および薬物耐性ウイルスの出現が、ＨＩＶ感染者の長期制御における課題である。さらに、伝統的な抗レトロウイルス薬療法は、ＡＩＤＳ発症または死の遅延には成功しているものの、治癒をもたらすには至っていない。代替的な処置戦略が必要である。
【０００４】
免疫系がＨＩＶ複製の制限において通常は不十分であるとはいえ主要な役割を果たすことを示すデータの出現により、ＨＩＶ感染のための免疫療法には強い関心が寄せられている。いくつかの研究においてＨＩＶに対するワクチンが試験されたが、今日まで十分な成功を収めていない。さらに、遺伝子療法技術を利用することによるＨＩＶ免疫療法の強化に関心が示されているが、他の免疫療法のアプローチと同じく、十分な成功を収めていない。
【０００５】
遺伝子療法は、ウイルスベクターの使用を伴い得る新しい治療薬を作り出す可能性のある、生物医学研究の中で最も成熟した分野のうちの１つである。療法に利用可能な多種多様な可能性のある遺伝子を考慮すると、感染性および非感染性疾患を処置する手段としての遺伝子療法の期待に応えるためには、これらの遺伝子を送達する効率的な手段が必要である。マウスのレトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（アデノ随伴ウイルス）、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスを含むいくつかのウイルスシステムが、治療用の遺伝子移入ベクターとして提唱されてきた。しかし、ウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｖｏでの適用は、ウイルス構造タンパク質および／または形質導入された遺伝子産物に対する宿主免疫応答によって限定されることが多い。
【０００６】
レンチウイルスベクターは概して細胞傷害を誘導せず、強力な宿主免疫応答を誘発しないものの、いくつかの免疫刺激性遺伝子産物をコードするＨＩＶ−１などの一部のレンチウイルスは、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞傷害をもたらし、強力な免疫応答を誘導する可能性を有する。レンチウイルスベクターの使用に関する別の重要な問題は、ある特定の細胞傷害性ウイルスタンパク質に曝露された際のＴ細胞の細胞変性または機能的無応答性の可能性の問題である。同様に、多くの場合、組換えにより、複製可能な毒性レンチウイルスが発生する可能性が懸念される。遺伝子療法技法を使用したＨＩＶ免疫療法では、保護的な遺伝子改変を有する十分な数のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を得られないことにより、典型的には、抗レトロウイルス療法を中止した際にＨＩＶの迅速な再出現がもたらされる。
【０００７】
ＨＩＶの治癒を達成しようとするこれまでの努力は、とりわけ、こうした理由で十分ではない。したがって、改善されたＨＩＶ処置が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
要旨
一態様では、方法が提供される。本方法は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を供給源から精製するステップと、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドでＰＢＭＣを刺激するステップと、少なくとも１サブセットの細胞をＰＢＭＣから枯渇させるステップであって、少なくとも１サブセットの細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ制御性細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含む、ステップと、枯渇させたＰＢＭＣに、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムで形質導入するステップと、少なくとも１日間にわたって、形質導入されたＰＢＭＣを培養するステップと、培養されたＰＢＭＣを採取するステップとを含む。複数の実施形態では、少なくとも１サブセットの細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、好塩基球、好酸球、肥満細胞、樹状細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含む。
【０００９】
複数の実施形態では、培養は、静置培養システムまたは半静置培養システムで行われる。複数の実施形態では、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドは、合成の重複ペプチドのプールを含む。複数の実施形態では、合成の重複ペプチドのプールは、ＨＩＶ  Ｇａｇポリタンパク質を含む。複数の実施形態では、枯渇は、枯渇させたＰＢＭＣから少なくとも１サブセットの細胞を分離することを含む。複数の実施形態では、分離は、磁気ビーズ分離を含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡ、またはＨＩＶ  ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含む。複数の実施形態では、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ  Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ  Ｔａｔ配列、またはそれらのバリアントを含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号３０の少なくとも１つと、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。
【００１０】
別の態様では、ＨＩＶに感染した被験体を処置するための遺伝子改変リンパ球が提供される。遺伝子改変リンパ球は、少なくとも１つのリンパ球を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を被験体から精製するステップと、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドで少なくとも１つリンパ球を刺激するステップと、少なくとも１サブセットの細胞をＰＢＭＣから枯渇させるステップであって、少なくとも１サブセットの細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ制御性細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含む、ステップと、少なくとも１つのリンパ球に、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムで形質導入するステップと、少なくとも１日間にわたって、ＰＢＭＣを培養するステップと、培養されたＰＢＭＣを採取するステップとを含むプロセスによって調製される。
【００１１】
別の態様では、予防用または治療用ＨＩＶワクチンで免疫された被験体を処置するための遺伝子改変リンパ球が提供される。遺伝子改変リンパ球は、少なくとも１つのリンパ球を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を被験体から精製するステップと、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドで少なくとも１つリンパ球を刺激するステップと、少なくとも１サブセットの細胞をＰＢＭＣからの枯渇させるステップであって、少なくとも１サブセットの細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ制御性細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含む、ステップと、少なくとも１つのリンパ球に、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムで形質導入するステップと、少なくとも１日間にわたって、ＰＢＭＣを培養するステップと、培養されたＰＢＭＣを採取するステップとを含むプロセスによって調製される。
【００１２】
別の態様では、ＨＩＶに曝露されたが感染してない被験体を処置するための遺伝子改変リンパ球が提供される。遺伝子改変リンパ球は、少なくとも１つのリンパ球を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を被験体から精製するステップと、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドで少なくとも１つリンパ球を刺激するステップと、少なくとも１サブセットの細胞をＰＢＭＣからの枯渇させるステップであって、少なくとも１サブセットの細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ制御性細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含む、ステップと、少なくとも１つのリンパ球に、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムで形質導入するステップと、少なくとも１日間にわたって、ＰＢＭＣを培養するステップと、培養されたＰＢＭＣを採取するステップとを含むプロセスによって調製される。
【００１３】
別の態様では、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドでＰＢＭＣを刺激するステップと、少なくとも１サブセットの細胞をＰＢＭＣからの枯渇させるステップであって、少なくとも１サブセットの細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ制御性細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含む、ステップと、枯渇させたＰＢＭＣに、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムで形質導入するステップとを含む方法が提供される。複数の実施形態では、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドは、ＨＩＶ  ｇａｇペプチドを含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡ、またはＨＩＶ  ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含む。複数の実施形態では、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ  Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ  Ｔａｔ配列、またはそれらのバリアントを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本開示のｅｘ  ｖｉｖｏ処置方法のフロー図を示す。
【００１５】
【図２】図２は、本開示に従うＣＤ４＋Ｔ細胞の変更および新しい感染の防止を示す。
【００１６】
【図３】図３は、治療用ベクター、ヘルパープラスミド、およびエンベローププラスミドからなる、例示的なレンチウイルスベクターシステムを示す。ここで示されている治療用ベクターは、本明細書においてＡＧＴ１０３とも呼ばれる好ましい治療用ベクターであり、ｍｉＲ３０ＣＣＲ５−ｍｉＲ２１Ｖｉｆ−ｍｉＲ１８５−Ｔａｔを含有する。
【００１７】
【図４】図４は、環状化形態の例示的な３ベクターのレンチウイルスベクターシステムを示す。
【００１８】
【図５】図５は、環状化形態の例示的な４ベクターのレンチウイルスベクターシステムを示す。
【００１９】
【図６】図６は、環状化形態の、さらなる例示的な３ベクターのレンチウイルスベクターシステムを示す。
【００２０】
【図７】図７は、例示的なベクター配列を示す。ＣＣＲ５向性ＨＩＶ株の伝播を阻害するためのプロモーターおよびｍｉＲクラスターのプラス（すなわち、ゲノム）鎖配列を開発した。上段の配列（配列番号８６）は、その３’末端に制限認識部位を含むＥＦ−１アルファプロモーターである。下段の３つの配列は、制限認識部位を含むｍｉＲ３０  ＣＣＲ５（配列番号８７）、ｍｉＲ２１  Ｖｉｆ（配列番号８８）、およびｍｉＲ１８５  Ｔａｔ（配列番号８９）配列である。下線のない配列の部分は、制限認識部位を表わす。
【００２１】
【図８】図８は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させるステップを含む、ＣＤ４＋Ｔ細胞を産生するための例示的な方法のフロー図を示す。
【００２２】
【図９】図９は、Ｇａｇペプチド刺激細胞からＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇させた場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞が実質的に増加することを実証するデータを示す。
【００２３】
【図１０】図１０は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた場合、ＣＤ４＋細胞が増加し、Ｖδ１細胞が増大することを実証するデータを示す。
【００２４】
【図１１】図１１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇が、標的細胞の収量をおよそ６倍増加させたことを実証するデータを示す。
【００２５】
【図１２】図１２は、Ｇａｇペプチド刺激細胞からＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞が３倍増加することを実証するデータを示す。
【００２６】
【図１３】図１３は、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇が、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の拡大増殖をもたらしたことを実証するデータを示す。
【００２７】
【図１４】図１４は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、およびγδ細胞を枯渇させるステップを含む、ＣＤ４＋Ｔ細胞を産生する例示的な方法のフロー図を示す。
【００２８】
【図１５】図１５は、（ｉ）枯渇無し、（ｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇；（ｉｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇およびγδ細胞枯渇；ならびに（ｉｖ）ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇、γδ細胞枯渇、およびＢ細胞枯渇を含む様々な細胞枯渇戦略を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞収量に対する効果を実証するデータを示す。
【００２９】
【図１６】図１６は、（ｉ）枯渇無し、（ｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇；ならびに（ｉｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇、ＣＤ５６＋細胞枯渇、γδ細胞枯渇、およびＢ細胞枯渇を含む様々な細胞枯渇戦略を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞収量に対する効果を実証するデータを示す。
【００３０】
【図１７】図１７は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、およびγδ細胞を枯渇させる４種細胞枯渇ステップを含む、ＣＤ４＋Ｔ細胞を産生する例示的な方法のフロー図を示す。
【００３１】
【図１８】図１８は、４種細胞枯渇プロセスを使用したＣＤ４＋Ｔ細胞発現の結果を実証するデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な説明
概説
本明細書では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）疾患を処置および／または防止して機能的治癒を達成するための方法および組成物が開示される。本方法および組成物は、後述するように、組み込みレンチウイルス、非組み込みレンチウイルス、および関連するウイルスベクター技術を含む。
【００３３】
本明細書では、治療用ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、免疫療法、およびＨＩＶ感染を処置するためにそれらを使用する方法が開示される。複数の実施形態では、ＨＩＶ感染の機能的治癒を達成するための方法および組成物が提供される。本明細書の図１に示されるように、本開示の様々な態様および実施形態は、第１の刺激事象、例えば、ＨＩＶ感染患者において、例えばＨＡＡＲＴの毎日の投与によるウイルス血症の安定な抑制と共に、ＨＩＶに対する強力な免疫応答をもたらすことを意図するワクチンを用いた、第１の治療的免疫化を含み得る。複数の実施形態では、白血球画分が、アフェレーシス産物から精製される。これに続いて、（１）精製された白血球を、免疫原性ＨＩＶタンパク質である少なくとも１つの合成ペプチドで刺激すること、（２）物理的分離方法により不必要な細胞を枯渇させること、（３）刺激および枯渇された白血球集団を治療用レンチウイルスベクターで形質導入すること、（４）形質導入された細胞を、少なくとも１日間にわたって成長させるために静置培養ベッセルに移すこと、（５）静置培養ベッセルから細胞を採取すること、（６）成長培地を、注入用の凍結保存溶液および凍結細胞と置換すること、ならびに（７）元の患者に再注入して戻すことが続く。
【００３４】
様々な方法および組成物を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞などの注入された細胞が、ＨＩＶ感染を有する個人の体内に再び存在してもＨＩＶに感染することを防止することができる。例えば、図２に解説されているように、注入された細胞が感染するのを防止するためには、ＣＣＲ５発現をモジュレートしてウイルスの侵入を防止することができる。さらに、残存するあらゆる感染性ウイルスＲＮＡの破壊をターゲティングすることもできる。前出のことに関し、また本明細書の図２を参照すると、ＣＣＲ５の非存在下でさえＨＩＶに感染した細胞、または形質導入前に既に感染しており、感染性ウイルスの放出を防止することが必要である細胞におけるＨＩＶウイルスのサイクルを止める組成物および方法が提供される。ＨＩＶウイルスのサイクルを止めるためには、潜伏感染ＣＤ４＋Ｔ細胞などの潜伏感染細胞によって産生されるウイルスＲＮＡをターゲティングする。
【００３５】
ＨＩＶの治癒を達成しようとするこれまでの試みは、とりわけ、保護的な遺伝子改変を有するＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞が十分な数だけ得られなかったことが原因で不成功に終わっている。この数が臨界閾値を下回っていると、本明細書に記載される治癒は達成されない。例えば、抗レトロウイルス薬療法が終了すると、通常、ＨＩＶの再出現が続いて起こる。その後、患者は多くの場合、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の急速な破壊を経験し、過去の遺伝子療法にもかかわらず、疾患進行の再開が続く。本明細書に記載される組成物および方法に従うＨＩＶ特異的Ｔ細胞の選択的濃縮を用いることにより、様々な実施形態において治癒を含む、新しいＨＩＶ処置レジメンが開発された。
【００３６】
定義および解釈
本明細書で別途定義されない限り、本開示との関連で使用される科学および技術用語は、当業者により一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈により別途必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。概して、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学、およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、ならびにこれらの技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されているものである。特記なき限り、本開示の方法および技術は概して、当技術分野で周知であり、かつ本明細書随所で引用され、論じられる様々な一般的参考文献およびより具体的な参考文献に記載されている、従来の方法に従って行われる。例えば、Sambrook  J.およびRussell  D.  Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual、第３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.（２０００年）、Ausubelら、Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Wiley,  John  &  Sons,  Inc.（２００２年）、HarlowおよびLane  Using  Antibodies:  A  Laboratory  Manual;  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.（１９９８年）、およびColiganら、Short  Protocols  in  Protein  Science、Wiley,John  &  Sons,  Inc.（２００３年）を参照されたい。任意の酵素反応または精製技術は、製造元の仕様に従って、当技術分野で一般的に実行されるように、または本明細書に記載されるように行われる。本明細書に記載される、分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品および製薬化学に関連して使用される命名法、ならびにこれらの検査手技および技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されているものである。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者には理解され、この用語が使用される文脈に応じてある程度異なるであろう。「約」という用語が使用される文脈を考慮して、その用語の使用が当業者にとって明確でない場合、「約」は、特定の用語の最大プラス１０％またはマイナス１０％を意味する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、活性剤「の投与」または「を投与すること」という用語は、処置を必要とする被験体に、この個体の身体に治療上有用な形態および治療有効量で導入され得る形態で、本開示の活性剤を提供することを意味する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「ＡＧＴ１０３」という用語は、本明細書で詳述される、ｍｉＲ３０−ＣＣＲ５／ｍｉＲ２１−Ｖｉｆ／ｍｉＲ１８５−ＴａｔマイクロＲＮＡクラスター配列を含有するレンチウイルスベクターの特定の実施形態を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「ＡＧＴ１０３−Ｔ」という用語は、ＡＧＴ１０３レンチウイルスベクターを含有するレンチウイルスが形質導入された細胞を指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「ＣＣＲ５」という用語は、Ｃ−Ｃケモカイン受容体５を指す。本明細書における「ＣＣＲ５デルタ３２」への言及は、ＣＣＲ５遺伝子における変異体遺伝子型への言及である。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ」という用語は、特定の表面抗原分類タンパク質を指す。本明細書で使用されるこの用語の非限定的な例は、ＣＤ４タンパク質発現である。このようなタンパク質の例としては、ＣＤ４が挙げられるが、これに限定されない。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ｃＡＲＴ」という用語は、抗レトロウイルス薬併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ）を指す。「ｃＡＲＴ」という用語は、ＨＡＡＲＴ（高活性抗レトロウイルス薬療法）と同義的に使用される場合がある。
【００４４】
本明細書で使用される場合、語句「コード配列」は、転写または逆転写され得る任意のウイルスベクター配列を記述する。「コード配列」は、限定されるものないが、転写または逆転写され得る外因性配列（例えば、細胞に形質導入またはトランスフェクトされているベクターにある配列）を含む。
【００４５】
本明細書で使用される場合、組成物および方法を規定するために使用される際の移行句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、組成物および方法が、記載されている要素を含むが、他のものを除外しないことを意味する。本明細書で使用される場合、組成物および方法を規定するために使用される際の「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、組成物および方法が、組成物の微量要素よりも多くの他の成分および実質的な方法ステップを除外することを意味する。こうした移行句の各々によって規定される複数の実施形態は、本開示の範囲内にある。例えば、方法および組成物が、追加のステップおよび成分を含んでいてもよく（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ））、またはその代わりに重要ではないステップおよび組成物を含む（から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ））、またはその代わりに表記の方法ステップもしくは組成物のみを意図する（からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ））ことが意図される。さらに、本明細書で使用される場合、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」という用語は、限定することなく含むことを意味する。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「生着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）」という用語は、細胞供給源の注入後の被験体における持続的生着の定量的レベルを決定することが当業者にとって可能であることを指す（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３２３巻：５７０〜５７８頁（１９９０年）、Ｄｕｄｌｅｙら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２４巻：３６３〜３７３頁（２００１年）、Ｙｅｅら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻：１４１〜１４６頁（２００１年）、Ｒｏｏｎｅｙら、Ｂｌｏｏｄ、９２巻：１５４９〜１５５５頁（１９９８年）を参照されたい）。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「発現」、「発現される」、または「コードする」という用語は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシング、または他の形態の転写後修飾もしくは翻訳後修飾を含む場合がある。
【００４８】
本明細書で使用される場合、上記および本明細書に言及した、また本明細書でさらに定義される「機能的治癒」という用語は、ｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴなどの継続的なＨＩＶ療法を過去に必要としたＨＩＶ＋の個体が、そのようなＨＩＶ療法のより低い用量、断続的な用量、交代的な薬物の組合せまたは単剤を使用するか、またはその投薬を中止した場合に、ウイルス複製が低いかまたは検出不可能な状態で生存し得るような状況または状態を指す。個体は、低レベルのウイルス複製を維持し、疾患進行を減速または終結させるために補助療法が未だ必要であっても「機能的に治癒した」と言われる場合がある。機能的治癒の起こり得る転帰は、特定される時間枠、例えば１か月間、３か月間、６か月間、１年間、３年間、および５年間、ならびに定義され得るその他すべての時間枠内に再発が検出されないような、ＨＩＶのすべてまたは実質的にすべての最終的な根絶である。
【００４９】
本明細書で使用される場合、語句「ＨＩＶ特異的ペプチド」は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含むＴ細胞において抗ＨＩＶ応答を生成することができるか、またはそうでなければ、限定されるものではないが任意のＧＡＧペプチドを含む、ＨＩＶに関するか、もしくは発現されるか、もしくはコードされる任意のペプチドを指す。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「ＨＩＶワクチン」という用語は、ＨＩＶ特異的免疫応答を誘発することを意図する、免疫原と、ビヒクルと、アジュバントを包含する。「ＨＩＶワクチン」という用語は、本明細書に記載される「刺激剤」という用語の意味に含まれる。「ＨＩＶワクチン」は、ＨＩＶであり得る精製された不活化ウイルス粒子もしくは不活化ウイルス粒子全体、または、特異的免疫を誘発することができるＨＩＶタンパク質、糖タンパク質もしくはタンパク質断片を産生するように細胞を指向することができる組換え細菌ベクター、プラスミドＤＮＡもしくはＲＮＡに加えて、ＨＩＶタンパク質、タンパク質断片もしくはペプチド、糖タンパク質断片もしくはグリコペプチドを発現することができる組換えウイルスベクターを含み得る。代わりに、形質導入の前にＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を濃縮する目的で、またはレンチウイルスを形質導入したＣＤ４  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのために、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、Ｔ細胞受容体特異的抗体、マイトジェン、スーパー抗原、サイトカイン、および他の化学的または生物学的刺激をはじめとする免疫刺激のための特定の方法を使用して、樹状細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞を活性化してもよい。活性化物質は、可溶性であってもよく、ポリマー集合体であってもよく、リポソームもしくはエンドソームベースであってもよく、またはビーズに連結していてもよい。刺激に対する細胞の応答を改善し、かつ／または培養および形質導入の間のＣＤ４  Ｔ細胞の生存を改善するために、インターロイキン２、６、７、１２、１５、２３、またはその他を含むサイトカインを付加してよい。前出のいずれも限定するものではないが、代わりに、「ＨＩＶワクチン」という用語は、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンならびにそのバリアントおよび類似体を包含する。ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンは、公知の高度に弱毒化した二重組換えＭＶＡワクチンである。ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンは、公知のＭＶＡベクターにＨＩＶ−１  ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ配列を挿入することによって構築された（例えば、Ｇｏｅｐｆｅｒｔら（２０１４年）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．、２１０巻（１号）：９９〜１１０頁を参照されたい。また、ＷＯ２００６０２６６６７も参照されたい。これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれている）。「ＨＩＶワクチン」という用語には、以下の表１、および優先権書類（そのすべてはその全体が本明細書に組み込まれている）に含まれる任意の同様の表に提供される、任意の１つまたは複数のワクチンも含まれる。
【表１−１】
2021519069.tif 000003
【表１−２】
2021519069.tif 000004
【表１−３】
2021519069.tif 000005
【表１−４】
2021519069.tif 000006
【表１−５】
2021519069.tif 000007
【表１−６】
2021519069.tif 000008
【００５１】
本明細書で使用される場合、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、生きている生物において起こるプロセスを指す。「ｅｘ  ｖｉｖｏ」という用語は、生きている生物の外側で起こるプロセスを指す。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ処置とは、患者の体内で起こる処置を指し、一方でｅｘ  ｖｉｖｏ処置とは、患者の体外で起こるが、それでもその患者由来の組織を使用するか、その組織に接近するか、またはその組織と相互作用する処置である。ｅｘ  ｖｉｖｏ処置ステップはその後、後続のｉｎ  ｖｉｖｏ処置ステップを含んでもよい。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ」という用語はマイクロＲＮＡを指し、本明細書では「ｍｉＲ」と呼ばれる場合もある。「マイクロＲＮＡクラスター」という用語は、ベクター上で互いの近傍に位置し、かつ共発現する、少なくとも２つのマイクロＲＮＡを指す。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞株」という用語は、レンチウイルス粒子を発現させるために使用され得る任意の細胞株を指す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「ＰＢＭＣ」という用語は末梢血単核細胞を指す。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「パーセント同一性」という用語は、２つまたはそれよりも多い核酸またはポリペプチド配列の文脈では、後述の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ、または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用して、または目視検査により測定して、最大の一致のために比較およびアラインメントしたとき、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する、２つまたはそれよりも多い配列またはサブ配列を指す。適用に応じて、「パーセント同一性」は、比較されている配列の領域にわたって、例えば機能的ドメインにわたって存在する場合もあれば、または代替的に、比較される２つの配列の全長にわたって存在する場合もある。配列比較では、典型的には１つの配列が参照配列としての機能を果たし、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
【００５６】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、SmithおよびWaterman、Adv.Appl.  Math.、２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch、J.  Mol.  Biol.、４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズム、PearsonおよびLipman、Proc.Nat'l.  Acad.  Sci.  USA、８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索方法、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実装、または目視検査（Ausubelら、下記を全体的に参照されたい）によって実施することができる。
【００５７】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの一例は、Altschulら、J.  Mol.  Biol.、２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトから公的に利用可能である。
【００５８】
２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性はＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comにて利用可能）のＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスと、４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重みと、１、２、３、４、５、または６の長さ重みとを使用して決定することができる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（CABIOS、４巻：１１〜１７頁（１９８９年））を使用し、ＰＡＭ１２０残基重み表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長さペナルティ、および４のギャップペナルティを使用して決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comにて利用可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J.  Mol.  Biol.（４８巻）：４４４〜４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みと、１、２、３、４、５、または６の長さ重みとを使用して決定することができる。
【００５９】
本開示の核酸およびタンパク質配列は、公開データベースに対する検索を行うための「クエリー配列」としてさらに使用して、例えば、関連する配列を特定することができる。このような検索は、Altschulら（１９９０年）、J.  Mol.  Biol.、２１５巻：４０３〜１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いてＢＬＡＳＴのヌクレオチド検索を行うと、本開示の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いてＢＬＡＳＴのタンパク質検索を行うと、本開示のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップありアラインメントを得るためには、Altschulら（１９９７年）、Nucleic  Acids  Res.、２５巻（１７号）：３３８９〜３４０２頁に記載されているＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する際は、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用してよい。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激作用、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織、臓器、および／または体液と接触させて使用するのに好適な化合物、物質、組成物、および／または剤形を指す。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、生理学的に適合性のある、ありとあらゆる溶剤、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを指し、これらを含む。本組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を含み得る（例えば、Bergeら（１９７７年）、J  Pharm  Sci、６６巻：１〜１９頁を参照されたい）。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「物理的選択方法」という用語は、細胞のより大きな混合物（例えばＰＢＭＣ）中の細胞型を陽性選択または陰性選択するために使用され得る任意の物理的方法を指す。物理的選択方法の非限定的な例は、磁性ビーズによるソーティングである。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）」という用語は、「配列番号（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＩＤ  Ｎｏ）」という用語と同義である。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「低分子ＲＮＡ」という用語は、概して約２００ヌクレオチドまたはそれ未満よりも短い長さであり、サイレンシングまたは干渉機能を有する非コードＲＮＡを指す。他の実施形態では、低分子ＲＮＡは、約１７５ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１５０ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１２５ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１００ヌクレオチドもしくはそれ未満、または約７５ヌクレオチドもしくはそれ未満の長さである。このようなＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。本開示の「低分子ＲＮＡ」は、標的遺伝子の遺伝子発現を、例えば標的遺伝子のｍＲＮＡの破壊をもたらす経路によって阻害またはノックダウンすることができなければならない。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「静置培養」は、細胞培養期間の継続期間にわたって、物理的に撹拌、揺動されないか、またはそうでなければ意図的な運動に供されない細胞培養環境を指す。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「半静置培養」は、細胞培養期間の継続期間にわたって、最小限の意図的な運動、揺動、または物理的撹拌に供される細胞培養環境を指す。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「刺激剤」という用語は、免疫応答を刺激することができるあらゆる外因性因子を指し、限定されるものではないが、ワクチン、ＨＩＶワクチン、およびＨＩＶまたはＨＩＶ関連ペプチドを含む。刺激剤は、好ましくは、Ｔ細胞応答を刺激することができる。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、ヒト患者を含むが、他の哺乳動物も含む。「被験体」、「個体」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用される場合がある。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「Ｔ制御性細胞」は、骨髄中の前駆細胞に由来し、胸腺中で成熟する免疫抑制性Ｔ細胞の部分集団を指す。Ｔ制御性細胞は、マーカーＣＤ４、ＣＤ２５、および／またはＦＯＸＰ３の発現によって特定することができる。
【００７０】
本明細書で使用される場合、語句「標的配列」は、制御因子によってターゲティングされ得る任意のヌクレオチド配列を含む。標的配列の例としては、ｍＲＮＡが挙げられるが、これに限定されない。制御因子の例としては、これらに限定されないが、マイクロＲＮＡおよびｓｈＲＮＡなど、任意の制御性ＲＮＡが挙げられる。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「Ｔａｔ」という用語は、ＨＩＶ  ｔａｔ遺伝子およびその遺伝子産物、ならびにそれらのバリアントを指す。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「「治療有効量」という用語は、所与の病気、傷害、疾患、または状態を患う患者に見られる合併症の症状、進行、または発症を処置または防止するために十分な、好適な組成物および好適な剤形における本開示の活性剤の分量を指す。治療有効量は、患者の状態またはその重症度、および処置される被験体の年齢、体重などの状態に応じて異なる。治療有効量は、例えば、投与経路、被験体の状態、ならびに当業者に理解される他の要素を含む、いくつかの要素のうちのいずれかに応じて異なり得る。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「治療用ベクター」という用語は、ＡＧＴ１０３ベクターなどのレンチウイルスベクターと同義である。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「処置」または「処置すること」という用語は、概して、処置されている被験体の自然経過を変更することを試みる介入を指し、予防のために行われてもよいし、または臨床病理過程中に行われてもよい。望ましい効果としては、疾患の発症または再発を防止すること、症状を緩和すること、疾患の何らかの直接的もしくは間接的な病理学的帰結を抑制、減少、または阻害すること、病状を回復または軽減させること、および寛解または改善された予後を引き起こすことが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「ワクチン」という用語は、「治療用ワクチン」という用語と交換可能に使用され、個体において免疫応答を誘発することができる外因性因子を指し、限定されるものではないが、精製タンパク質、不活化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質（ｖｉｒａｌｌｙ  ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、細菌ベクター化タンパク質（ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ  ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ペプチドもしくはペプチド断片、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む。
【００７６】
本明細書で使用される場合、用語「バリアント」は、参照配列と比較して、一塩基多型、単一塩基変異、転換、反転、複製、欠失、または置換の少なくとも１つを含むヌクレオチド配列を指す。「バリアント」は、「バリアント」ヌクレオチド配列ならびにそれに関する転写後修飾および翻訳後修飾に由来するアミノ酸配列を含む。
【００７７】
「Ｖｉｆ」という用語は、ＨＩＶ  ｖｉｆ遺伝子およびその遺伝子産物、ならびにそれらのバリアントを指す。
【００７８】
本開示の複数の態様の説明
本明細書で詳述されるように、一態様では、ＨＩＶに感染した細胞を処置する方法が提供される。本方法は、概して、ｅｘ  ｖｉｖｏで行われる、ＨＩＶに感染した被験体から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を治療有効量の刺激剤と接触させるステップと、非標的細胞集団を枯渇させるステップと、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムをＰＢＭＣにｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入するステップと、そのような形質導入を達成するために十分な期間にわたって、形質導入されたＰＢＭＣを培養するステップとを含む。複数の実施形態では、形質導入されたＰＢＭＣは約１〜約３５日間培養される。複数の実施形態では、本方法は、形質導入されたＰＢＭＣを被験体に注入するステップをさらに含む。複数の実施形態では、被験体はヒトである。複数の実施形態では、刺激剤は、ペプチドまたはペプチドの混合物であり、また複数の実施形態では、ｇａｇペプチドを含む。さらなる実施形態では、刺激剤はワクチンを含む。複数の実施形態では、ワクチンはＨＩＶワクチンであり、さらなる実施形態では、ＨＩＶワクチンは、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンまたはそのバリアントまたは類似体である。複数の実施形態では、ウイルス送達システムはレンチウイルス粒子を含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡを含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含む。他の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡと、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡとを含む。複数の実施形態では、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ感染を予防するかまたは既に感染している細胞でのウイルス発現を低減するＨＩＶ  Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ  Ｔａｔ配列、それらのバリアント、または他のＨＩＶ遺伝子に由来するＲＮＡ配列を含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのうちの少なくとも１つを含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡクラスターを含む。
【００７９】
複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号１と８０％未満の配列同一性を有する。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号１と９５％よりも大きな配列同一性を有する。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号１を含む。
【００８０】
複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、もしくはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号２と８０％未満の配列同一性を有する。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号２と９５％よりも大きな配列同一性を有する。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号２を含む。
【００８１】
複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、もしくはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号３と８０％未満の配列同一性を有する。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号３と９５％よりも大きな配列同一性を有する。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号３を含む。
【００８２】
複数の実施態様では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３０と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高いパーセント同一性を有する配列を含む。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３０と８０％未満の配列同一性を有する。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３０と９５％よりも大きな配列同一性を有する。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは配列番号３０を含む。
【００８３】
別の態様では、ＨＩＶ＋個体から末梢血を得るステップと；血液を分画してＰＢＭＣ集団を得るステップと；ＰＢＭＣ集団を、精製された抗原提示細胞またはＨＩＶの成分を代表するペプチドもしくはタンパク質と接触させるステップと；接触させたＰＢＭＣ集団を約１〜約１２日間培養して抗原特異的集団を拡大増殖させるステップと；１つもしくは複数の非標的細胞集団を枯渇させて、ペプチド刺激に応答する細胞が濃縮された画分を生成するステップと；本明細書で詳述されるウイルス送達システムを、濃縮された細胞画分にｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入するステップと；適度な細胞増殖を確実にするために十分な期間にわたって、形質導入された細胞画分を培養するステップと；形質導入された細胞を採取するステップとを含む方法が開示される。
【００８４】
複数の実施形態では、ＰＢＭＣ集団をさらに精製して、ＰＢＭＣの精製画分を生成する。複数の実施形態では、ＰＢＭＣのさらに精製した画分を、ＨＩＶの成分を代表するペプチドまたはタンパク質と接触させる。
【００８５】
別の態様では、リンパ球を少なくとも１つのＨＩＶペプチドと接触させるステップと、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムをリンパ球に形質導入するステップとを含む方法が開示される。
【００８６】
複数の実施形態では、接触させるリンパ球は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞のいずれか１つまたは複数を含む。複数の実施形態では、接触させるリンパ球はＴ細胞のみを含む。複数の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびγδ細胞のいずれか１つまたは複数を含む。複数の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞のみを含む。
【００８７】
複数の実施形態では、接触させるリンパ球はＰＢＭＣに由来する。複数の実施形態では、本方法は、ＰＢＭＣ中の少なくとも１サブセットの細胞を枯渇させるステップをさらに含む。複数の実施形態では、枯渇させる少なくとも１サブセットの細胞は、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびγδ細胞のいずれか１つまたは複数を含む。
【００８８】
複数の実施形態では、接触させるリンパ球は、白血球の集団に由来する。複数の実施形態では、本方法は、白血球中の少なくとも１サブセットの細胞を枯渇させるステップをさらに含む。複数の実施形態では、枯渇させる少なくとも１サブセットの細胞は、好中球、好酸球、好塩基球、単球、ならびにＮＫ細胞、Ｂ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびγδ細胞のいずれか１つまたは複数を含むある特定のリンパ球のいずれか１つまたは複数を含む。
【００８９】
複数の実施形態では、接触させるリンパ球は、細胞の集団に由来する。複数の実施形態では、本方法は、細胞の集団から少なくとも１サブセットの細胞を枯渇させるステップをさらに含む。複数の実施形態では、枯渇させる少なくとも１サブセットの細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、好塩基球、肥満細胞、単球、樹状細胞、Ｔ制御性細胞、ＮＫＴ細胞、および赤血球のいずれか１つまたは複数を含む。複数の実施形態では、枯渇させる少なくとも１サブセットの細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞ではない任意の細胞型のいずれか１つまたは複数を含む。
【００９０】
複数の実施形態では、ウイルス送達システムはレンチウイルス粒子を含む。複数の実施形態では、レンチウイルス粒子は、本明細書に記載の任意のレンチウイルス粒子である。
【００９１】
別の態様では、被験体においてＨＩＶ感染を処置するための細胞産物を製造する方法が開示される。本方法は、概して、血中白血球を得るステップと、被験体から白血球を取り出すステップと、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＰＢＭＣの画定画分を精製するステップとを含む。複数の実施形態では、本方法は、ＰＢＭＣまたはＰＢＭＣの精製画分を治療有効量の刺激剤とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させるステップと；抗原特異的Ｔ細胞の割合を増加させるために、１つまたは複数の非標的集団を枯渇させるステップと；少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムをＰＢＭＣまたはＰＢＭＣの精製画分にｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入するステップと；改変細胞集団の形質導入および成長を達成するために十分な期間にわたって、形質導入されたＰＢＭＣまたはＰＢＭＣの精製画分を培養するステップと；形質導入されたＰＢＭＣまたはＰＢＭＣの精製画分を採取するステップとをさらに含む。複数の実施形態では、形質導入されたＰＢＭＣまたはＰＢＭＣの精製画分は、約１〜約３５日間培養される。複数の実施形態では、本方法は、形質導入されたＰＢＭＣまたはＰＢＭＣの精製画分を被験体に注入するステップをさらに含む。複数の実施形態では、被験体はヒトである。複数の実施形態では、第１の刺激剤の少なくとも１つは、ペプチドまたはペプチドの混合物を含み、ＨＩＶゲノムによってコードされるタンパク質の１つ、２つ、３つ、またはそれよりも多くを代表し、処置が意図されている国または地域に由来する公知のＨＩＶ分離株間の配列変異を代表するか、または特定の患者集団の組織適合性遺伝子間のまれな変異を含む個々のペプチドの複数の例を含む。複数の実施形態では、第１の刺激剤の少なくとも１つは、ｇａｇペプチドを含む。複数の実施形態では、第１の刺激剤の少なくとも１つは、ワクチンを含む。複数の実施形態では、ワクチンはＨＩＶワクチンであり、さらなる実施形態では、ＨＩＶワクチンは、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンまたはそのバリアントもしくは類似体である。複数の実施形態では、第１の刺激剤は、ｇａｇペプチドの混合物である。
【００９２】
複数の実施形態では、ウイルス送達システムはレンチウイルス粒子を含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡを含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡと、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡとを含む。複数の実施形態では、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ  Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ  Ｔａｔ配列、またはそれらのバリアントを含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、またはそれらのクラスターを含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、合成マイクロＲＮＡクラスターを含む。
【００９３】
複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号１と８０％未満の配列同一性を有する。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号１と９５％よりも大きな配列同一性を有する。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号１を含む。
【００９４】
複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号２と８０％未満の配列同一性を有する。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号２と９５％よりも大きな配列同一性を有する。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは配列番号２を含む。
【００９５】
複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号３と８０％未満の配列同一性を有する。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号３と９５％よりも大きな配列同一性を有する。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは配列番号３を含む。
【００９６】
複数の実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３０と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高いパーセント同一性を有する配列を含む。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３０と８０％未満の配列同一性を有する。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３０と９５％よりも大きな配列同一性を有する。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３０を含む。
【００９７】
別の態様では、被験体においてＨＩＶを処置するための細胞産物を製造する方法が開示される。複数の実施形態では、本方法は、ＰＢＭＣまたはＰＢＭＣの精製画分を少なくとも１つの抗原と接触させるステップと、ＰＢＭＣ中の１つまたは複数の非標的細胞集団を枯渇させるステップとを含む。複数の実施形態では、１つまたは複数の非標的細胞集団は、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびγδ細胞のいずれか１つまたは複数を含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの抗原は、ＨＩＶゲノムによってコードされるペプチドまたはペプチドの混合物である。複数の実施形態では、ペプチドは、ｇａｇペプチドであるか、またはペプチドの混合物はｇａｇペプチドを含む。
【００９８】
別の態様では、被験体においてＨＩＶを処置するための細胞産物を製造する方法が開示される。複数の実施形態では、本方法は、白血球または白血球の精製画分を少なくとも１つの抗原と接触させるステップと、白血球中の１つまたは複数の非標的細胞集団を枯渇させるステップとを含む。複数の実施形態では、１つまたは複数の非標的細胞集団は、好中球、好塩基球、好酸球および単球のいずれか１つまたは複数を含む。複数の実施形態では、１つまたは複数の非標的細胞集団は、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれか１つまたは複数を含む特定のリンパ球をさらに含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの抗原は、ＨＩＶゲノムによってコードされるペプチドまたはペプチドの混合物である。複数の実施形態では、ペプチドはｇａｇペプチドであるか、またはペプチドの混合物はｇａｇペプチドを含む。
【００９９】
別の態様では、レンチウイルスベクターが開示される。このレンチウイルスベクターは、少なくとも１つのコードされた遺伝子エレメントを含み、少なくとも１つのコードされた遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡ、またはＨＩＶ  ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含む。
【０１００】
別の態様では、少なくとも１つのコードされた遺伝子エレメントが、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡと、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡとを含むレンチウイルスベクターが開示される。ＨＩＶ  ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ  Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ  Ｔａｔ配列、ＨＩＶゲノムの別の部分に由来する配列、またはそれらのバリアントを含み得る。少なくとも１つのコードされた遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含み得る。少なくとも１つのコードされた遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡクラスターを含み得る。
【０１０１】
複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号１と８０％未満の配列同一性を有する。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号１と９５％よりも大きな配列同一性を有する。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは配列番号１を含む。
【０１０２】
複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号２と８０％未満の配列同一性を有する。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号２と９５％よりも大きな配列同一性を有する。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは配列番号２を含む。
【０１０３】
複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号３と８０％未満の配列同一性を有する。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号３と９５％よりも大きな配列同一性を有する。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは配列番号３を含む。
【０１０４】
複数の実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３０と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高いパーセント同一性を有する配列を含む。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３０と８０％未満の配列同一性を有する。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３０と９５％よりも大きな配列同一性を有する。複数の実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは配列番号３０を含む。
【０１０５】
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクターシステムが提供される。このシステムは、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターと；好ましくは細胞に感染するように最適化されたエンベロープタンパク質を発現させるための少なくとも１つのエンベローププラスミドと；目的の遺伝子、例えばｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子のいずれかを発現させるための少なくとも１つのヘルパープラスミドとを含み、レンチウイルスベクター、少なくとも１つのエンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞にトランスフェクトされると、レンチウイルス粒子がパッケージング細胞によって産生され、このレンチウイルス粒子は、目的の標的配列の調整、例えばケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生の阻害、またはＨＩＶ  ＲＮＡ配列のターゲティングが可能である。
【０１０６】
複数の実施形態では、エンベロープタンパク質は、細胞内区画に感染するように最適化されている。複数の実施形態では、エンベロープタンパク質は、本明細書に記載のエンベロープタンパク質のいずれかである。
【０１０７】
別の態様では、細胞に感染することができるレンチウイルス粒子が開示される。レンチウイルス粒子は、好ましくは細胞に感染するように最適化された少なくとも１つのエンベロープタンパク質と、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターとを含む。エンベロープタンパク質は、Ｔ細胞に感染するように最適化されていてよい。複数の実施形態では、エンベロープタンパク質は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染するように最適化されている。
【０１０８】
複数の実施形態では、粒子は、シュードタイプ化粒子である。複数の実施形態では、シュードタイプ化粒子は、本明細書に記載の任意のシュードタイプ化粒子である。複数の実施形態では、シュードタイプ化粒子は、レンチウイルスではないウイルスに由来するエンベロープタンパク質を含む。複数の実施形態では、エンベロープタンパク質が由来するウイルスは、本明細書に記載の任意のウイルスである。
【０１０９】
別の態様では、改変細胞が開示される。複数の実施形態では、改変細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。複数の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、本明細書に記載されるレンチウイルス粒子に感染している。複数の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞はまた、刺激剤による過去の免疫化に基づいてＨＩＶ抗原を認識するように選択されたものである。さらなる実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞により認識されるＨＩＶ抗原は、ｇａｇ抗原を含む。さらなる実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、レンチウイルス粒子に感染した後に低下したレベルのＣＣＲ５を発現する。
【０１１０】
別の態様では、改変細胞が開示される。複数の実施形態では、改変細胞は、レンチウイルス粒子および外因性抗原に感染しているＣＤ４＋Ｔ細胞である。複数の実施形態では、レンチウイルス粒子は、本明細書に記載の任意のレンチウイルス粒子である。複数の実施形態では、外因性抗原は、ＨＩＶに由来する抗原である。複数の実施形態では、ＨＩＶに由来する抗原は、本明細書に記載の任意のＨＩＶ抗原である。
【０１１１】
別の態様では、治療処置レジメンのための被験体を選択する方法が開示される。本方法は、概して、有効量の第１の刺激剤で被験体を免疫化するステップと；被験体から白血球を取り出し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製し、ＰＢＭＣに関連する少なくとも１つの因子に関連付けられる第１の定量化可能な測定値を決定するステップと；ＰＢＭＣを治療有効量の第２の刺激剤とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させ、ＰＢＭＣに関連する少なくとも１つの因子に関連付けられる第２の測定値を決定するステップとを含み、ここで、第２の定量化可能な測定値が第１の定量化可能な測定値と異なる（例えば、より高い）場合、被験体が処置レジメンのために選択される。少なくとも１つの因子は、Ｔ細胞の増殖またはＩＦＮガンマ産生であり得る。
【０１１２】
別の態様では、方法が開示される。本方法は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を供給源から精製するステップと、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドでＰＢＭＣを刺激するステップと、少なくとも１サブセットの細胞をＰＢＭＣから枯渇させるステップであって、少なくとも１サブセットの細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ制御性細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含む、ステップと、枯渇させたＰＢＭＣに、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムで形質導入するステップと、少なくとも１日間にわたって、形質導入されたＰＢＭＣを培養するステップと、培養されたＰＢＭＣを採取するステップとを含む。
【０１１３】
複数の実施形態では、ＰＢＭＣの精製は、残留赤血球細胞、残留血小板、および残留炎症細胞のいずれか１つまたは複数を除去することを含む。複数の実施形態では、精製は、細胞密度に基づいて、残留赤血球細胞、残留血小板、および残留炎症細胞のいずれか１つまたは複数を分離することを含む。複数の実施形態では、細胞密度に基づく分離は、分画遠心分離を含む。しかしながら、ＰＢＭＣを精製および／または分離する任意の好適な方法が企図される。
【０１１４】
複数の実施形態では、精製は、磁気ビーズ分離を使用して、残留赤血球細胞、残留血小板、および残留炎症細胞のいずれか１つまたは複数を分離することを含む。複数の実施形態では、精製は、磁気ビーズ分離を使用してＰＢＭＣから他の夾雑物を分離することを含む。複数の実施形態では、磁気ビーズ分離は、白血球の陽性選択を助けるために抗体を使用することを含む。複数の実施形態では、磁気ビーズ分離は、残留赤血球細胞、残留血小板、残留炎症細胞、および／または他の夾雑物の陰性選択を助けるために抗体を使用することを含む。複数の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。複数の実施形態では、ＰＢＭＣの精製は、自動化システムを使用することを含む。
【０１１５】
複数の実施形態では、形質導入されたＰＢＭＣは、１日間よりも長期間にわたって、例えば、２４時間よりも長期間にわたって、３０時間よりも長期間にわたって、３６時間よりも長期間にわたって、４２時間よりも長期間にわたって、４８時間よりも長期間にわたって、４８時間よりも長期間にわたって、５４時間よりも長期間にわたって、６０時間よりも長期間にわたって、６６時間よりも長期間にわたって、７２時間よりも長期間にわたって、７８時間よりも長期間にわたって、８４時間よりも長期間にわたって、９０時間よりも長期間にわたって、または９６時間よりも長期間にわたって培養される。
【０１１６】
複数の実施形態では、培養は、静置培養システムで行われる。複数の実施形態では、培養は、半静置培養システムで行われる。複数の実施形態では、培養細胞は、培養皿またはフラスコに付着する。複数の実施形態では、培養細胞は、懸濁される。複数の実施形態では、培養細胞の一部は、培養皿またはフラスコに付着し、一部の細胞は懸濁される。
【０１１７】
複数の実施形態では、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドは、合成ペプチドのプールを含む。複数の実施形態では、合成ペプチドのプールの合成ペプチドは、重複している。複数の実施形態では、合成ペプチドのプールの合成ペプチドは、重複していない。複数の実施形態では、合成ペプチドのプールは、およそ１５０個の個々のペプチドを含む。複数の実施形態では、ペプチドのプールは、特定の領域または部分集団に見出される流行性ＨＩＶ配列と一致するように、または主要組織適合遺伝子クラスター中の特定のハプロタイプによって決定されるペプチド結合およびＴ細胞受容体認識の要件とより良好に一致するように含まれる個々のペプチドの配列バリアントを含んでいてもよい。複数の実施形態では、合成ペプチドのプールは、１５０個未満の個々のペプチド、例えば、１４０個未満の個々のペプチド、１３０個未満の個々のペプチド、１２０個未満の個々のペプチド、１１０個未満の個々のペプチド、１００個未満の個々のペプチド、９０個未満の個々のペプチド、８０個未満の個々のペプチド、７０個未満の個々のペプチド、６０個未満の個々のペプチド、または５０個未満の個々のペプチドを含む。複数の実施形態では、合成ペプチドのプールは、１５０個よりも多くの個々のペプチド、例えば、１６０個よりも多くの個々のペプチド、１７０個よりも多くの個々のペプチド、１８０個よりも多くの個々のペプチド、１９０個よりも多くの個々のペプチド、２００個よりも多くの個々のペプチド、２１０個よりも多くの個々のペプチド、２２０個よりも多くの個々のペプチド、２３０個よりも多くの個々のペプチド、２４０個よりも多くの個々のペプチド、または２５０個よりも多くの個々のペプチドを含む。
【０１１８】
複数の実施形態では、合成ペプチドのプールは、ＨＩＶ  Ｇａｇポリタンパク質である。しかしながら、合成ペプチドのプールは、任意のＨＩＶ特異的ペプチドであってもよい。
【０１１９】
複数の実施形態では、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドによるＰＢＭＣの刺激は、組換えワクシニアをＰＢＭＣに感染させることを含む。複数の実施形態では、ワクシニアは、Ｇａｇタンパク質を発現する。複数の実施形態では、ワクシニアは、Ｇａｇタンパク質、Ｐｏｌタンパク質、およびＥｎｖタンパク質のいずれか１つまたは複数を含む。複数の実施形態では、ワクシニアは、白血球細胞をターゲティングする。複数の実施形態では、ワクシニアは、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、および単球のいずれか１つまたは複数をターゲティングする。複数の実施形態では、ワクシニアは、マクロファージをターゲティングする。複数の実施形態では、ワクシニアは、任意の抗原提示細胞をターゲティングする。複数の実施形態では、抗原提示細胞はＢ細胞である。複数の実施形態では、抗原提示細胞は樹状細胞である。
【０１２０】
複数の実施形態では、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドによるＰＢＭＣの刺激は、精製Ｇａｇタンパク質をＰＢＭＣ培養物に直接添加することを含む。複数の実施形態では、精製Ｇａｇタンパク質はワクチンを含む。複数の実施形態では、精製Ｇａｇタンパク質は、Ｇａｇ  ｐ２４タンパク質ワクチンを含む。複数の実施形態では、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドによるＰＢＭＣの刺激は、精製Ｅｎｖタンパク質をＰＢＭＣ培養物に直接添加することを含む。複数の実施形態では、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドによるＰＢＭＣの刺激は、精製Ｐｏｌタンパク質をＰＢＭＣ培養物に直接添加することを含む。
【０１２１】
複数の実施形態では、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドによるＰＢＭＣの刺激は、公知のＨＩＶ配列の様々な配列変異を含む、カスタマイズされたペプチドを添加することを含む。複数の実施形態では、カスタマイズされたペプチドは、ペプチドのアレイを含む。
【０１２２】
複数の実施形態では、枯渇は、枯渇させたＰＢＭＣから少なくとも１サブセットの細胞を分離することを含む。複数の実施形態では、少なくとも１サブセットの細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。複数の実施形態では、少なくとも１サブセットの細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、Ｂ細胞、およびγδ細胞を含む。複数の実施形態では、少なくとも１サブセットの細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびγδ細胞を含む。複数の実施形態では、少なくとも１サブセットの細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδ細胞、およびＢ細胞を含む。しかしながら、少なくとも１サブセットの細胞は、限定されるものではないが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ制御性細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含む、ＰＢＭＣ中に存在する任意のサブセットの細胞を含んでいてもよい。
【０１２３】
複数の実施形態では、分離は、磁気ビーズ分離を含む。複数の実施形態では、枯渇は、細胞表面マーカーに対する鉄標識抗体を使用して、任意の不要なサブセットの細胞を特定する方法を含む。複数の実施形態では、本方法は、それらを磁気カラムに保持させることによって不要なサブセットの細胞を除去するステップをさらに含む。
【０１２４】
複数の実施形態では、枯渇は、インターフェロン−ガンマを分泌しているＧａｇ応答細胞の陽性選択を含む。複数の実施形態では、Ｇａｇ応答細胞は、マクロファージ、Ｂリンパ球、および／またはＴリンパ球である。複数の実施形態では、Ｇａｇ応答細胞は、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、またはインターフェロン−カッパなどの他のタイプのインターフェロンを分泌する。
【０１２５】
複数の実施形態では、枯渇は、不要な細胞型を特定する未標識抗体を利用することを含む。複数の実施形態では、本方法は、抗体結合細胞をカラムに保持するステップをさらに含む。複数の実施形態では、カラムは、プロテインＡでコーディングされている。複数の実施形態では、カラムはプロテインＧでコーティングされている。複数の実施形態では、カラムは、抗免疫グロブリン、またはターゲティング抗体と結合した細胞を効果的に除去する化合物と結合する別の免疫グロブリンでコーティングされている。
【０１２６】
複数の実施形態では、枯渇は、密度に基づいて標的細胞を精製することを含む。複数の実施形態では、枯渇は、密度勾配遠心分離を使用することを含む。
【０１２７】
複数の実施形態では、枯渇は、不要な白血球を一次抗体で標識すること、およびモノクローナル抗体の定常領域と結合する二次抗体で細胞を死滅させることを含む。複数の実施形態では、二次抗体は、毒素と化学的に連結されている。複数の実施形態では、毒素は、ジフテリア毒素である。複数の実施形態では、抗体は、モノクローナルである。複数の実施形態では、抗体は、ポリクローナルである。
【０１２８】
複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡ、またはＨＩＶ  ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含む。複数の実施形態では、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ  Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ  Ｔａｔ配列、またはそれらのバリアントを含む。
【０１２９】
複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、非コードＲＮＡを含む。複数の実施形態では、非コードＲＮＡは、マイクロＲＮＡである。複数の実施形態では、非コードＲＮＡは、ｓｉＲＮＡである。複数の実施形態では、非コードＲＮＡは、ｐｉＲＮＡである。複数の実施形態では、非コードＲＮＡは、ｓｎｏＲＮＡである。複数の実施形態では、非コードＲＮＡは、ｓｎＲＮＡである。複数の実施形態では、非コードＲＮＡは、ｅｘＲＮＡである。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。
【０１３０】
複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号３０の少なくとも１つと、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号３０の少なくとも１つと、８０％未満の同一性、例えば、７５％同一性、７０％同一性、６５％同一性、６０％同一性、５５％同一性、または５０％同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。
【０１３１】
別の態様では、ＨＩＶに感染した被験体を処置するための遺伝子改変リンパ球が開示される。遺伝子改変リンパ球は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を被験体から精製するステップと、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドでＰＢＭＣを刺激するステップと、少なくとも１サブセットの細胞をＰＢＭＣからの枯渇させるステップであって、少なくとも１サブセットの細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ制御性細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含む、ステップと、枯渇させたＰＢＭＣに、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムで形質導入するステップと、少なくとも１日間にわたって、形質導入されたＰＢＭＣを培養するステップと、培養されたＰＢＭＣを採取するステップとを含むプロセスによって調製される。
【０１３２】
複数の実施形態では、ＨＩＶに感染した被験体は、ＨＩＶ感染の潜伏期にある。複数の実施形態では、ＨＩＶに感染した被験体は、ＨＩＶ感染の臨床症状をほとんどまたは全く経験していない。複数の実施形態では、ＨＩＶに感染した被験体は、ＨＩＶ感染の急性期にある。複数の実施形態では、ＨＩＶに感染した被験体は、ＨＩＶ感染の慢性期にある。複数の実施形態では、ＨＩＶに感染した被験体は、ＨＩＶが血流に進入したウイルス血症を経験したことがある。複数の実施形態では、ＨＩＶに感染した被験体は、ＨＩＶ感染の結果として、ＣＤ４＋Ｔ細胞が枯渇されている。複数の実施形態では、ＨＩＶに感染した被験体は、末梢血、胃腸管、リンパ節、およびリンパ組織のいずれか１つまたは複数においてＣＤ４＋細胞が枯渇されている。複数の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、胃腸管で優先的に枯渇される。複数の実施形態では、ＨＩＶに感染した被験体は、末梢血、胃腸管、リンパ節、およびリンパ組織のいずれか１つまたは複数においてＣＣＲ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が枯渇されている。
【０１３３】
別の態様では、予防用または治療用ＨＩＶワクチンで免疫された被験体を処置するための遺伝子改変リンパ球が開示される。遺伝子改変リンパ球は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を被験体から精製するステップと、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドでＰＢＭＣを刺激するステップと、少なくとも１サブセットの細胞をＰＢＭＣから枯渇させるステップであって、少なくとも１サブセットの細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、Ｔ制御性細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含む、ステップと、枯渇させたＰＢＭＣに、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムで形質導入するステップと、少なくとも１日間にわたって、形質導入されたＰＢＭＣを培養するステップと、培養されたＰＢＭＣを採取するステップとを含むプロセスによって調製される。
【０１３４】
複数の実施形態では、予防用または治療用ワクチンで免疫された被験体は、生物全体を含むワクチンで免疫されている。複数の実施形態では、予防用または治療用ワクチンで免疫された被験体は、生弱毒化生物を含むワクチンで免疫されている。複数の実施形態では、予防用または治療用ワクチンで免疫された被験体は、抗レトロウイルス剤を含むワクチンで免疫されている。複数の実施形態では、予防用または治療用ワクチンで免疫された被験体は、抗体を含むワクチンで免疫されている。複数の実施形態では、予防用または治療用ワクチンで免疫された被験体は、Ｔ細胞免疫の刺激を引き起こすワクチンで免疫されている。複数の実施形態では、予防用または治療用ワクチンで免疫された被験体は、内在性抗体を刺激するワクチンで免疫されている。複数の実施形態では、予防用または治療用ＨＩＶワクチンで免疫されている被験体は、ＲＶ１４４プライムおよびブーストワクチンで免疫されている。
【０１３５】
別の態様では、ＨＩＶに曝露されたが感染してない被験体または予防用ワクチン接種によりＨＩＶに対して免疫された被験体を処置するための遺伝子改変リンパ球が開示される。これらの個体は、特に生殖流体との接触により感染性ＨＩＶに１回または複数回曝露されており、その後ＨＩＶに対する免疫応答を発生させ得るが、血漿ウイルスＲＮＡのアッセイまたはＰＢＭＣからの感染性ウイルスの単離を含む診断基準では感染していない。これらの個体は、単一または複数用量の１つまたは複数のＨＩＶ予防ワクチンを受けている場合がある。これらの個体は検出可能なＨＩＶ免疫を有するため、ＡＧＴ１０３−Ｔ製品を製造し、遺伝子改変リンパ球を注入することにより、ＨＩＶ免疫のレベルを増加させ、ＨＩＶ免疫のレベルを、感染性ＨＩＶへのその後の曝露に耐えるのに十分な程度に耐久性にすることが可能である。複数の実施形態では、遺伝子改変リンパ球は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を被験体から精製するステップと、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドでＰＢＭＣを刺激するステップと、少なくとも１サブセットの細胞をＰＢＭＣからの枯渇させるステップであって、少なくとも１サブセットの細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ制御性細胞、およびＮＫＴ細胞のいずれか１つまたは複数を含む、ステップと、枯渇させたＰＢＭＣに、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムで形質導入するステップと、少なくとも１日間にわたって、形質導入されたＰＢＭＣを培養するステップと、培養されたＰＢＭＣを採取するステップとを含むプロセスによって調製される。
【０１３６】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
一般的に「ＨＩＶ」とも呼ばれるヒト免疫不全ウイルスは、ヒトにおいて後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすレトロウイルスである。ＡＩＤＳとは、免疫系の進行性不全が、生命を脅かす日和見感染およびがんを蔓延させる状態である。処置しなければ、ＨＩＶ感染後の平均生存期間は、ＨＩＶサブタイプおよび宿主集団の遺伝的特質に応じて９〜１１年と推定される。ＨＩＶによる感染は、血液、精液、膣液、尿道球腺液（ｐｒｅ−ｅｊａｃｕｌａｔｅ）、唾液、涙、リンパ液もしくは脳脊髄液、または母乳を含むがこれらに限定されない体液の移入、あるいは汚染された血液または組織産物の使用によって起こる。ＨＩＶは、感染した個体において遊離ウイルス粒子として存在する場合もあれば、感染した免疫細胞内に存在する場合もある。
【０１３７】
ＨＩＶは、ヘルパーＴ細胞などのヒト免疫系に不可欠な細胞に感染するが、向性はＨＩＶサブタイプ間で異なり得る。ＨＩＶ感染に対して特に感受性であり得る免疫細胞としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、および樹状細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＩＶ感染は、感染していないバイスタンダー細胞のアポトーシス、感染細胞の直接的なウイルスによる殺傷、および感染細胞を認識する細胞傷害性リンパ球による感染ＣＤ４＋Ｔ細胞の殺傷を含むがこれらに限定されないいくつかの機構により、低レベルのＣＤ４＋Ｔ細胞をもたらす。ＣＤ４＋Ｔ細胞数が臨界レベル未満に低下すると、細胞媒介性免疫が失われ、日和見感染およびがんに対して身体が、次第により感受性になる。
【０１３８】
ＨＩＶは構造的に多くの他のレトロウイルスと異なる。ＲＮＡゲノムは、少なくとも７つの構造的目印（ＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、およびＩＮＳ）、および１９種のタンパク質をコードする少なくとも９つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ならびに場合によってはｔａｔ、ｅｎｖおよびｒｅｖの融合物である１０番目のｔｅｖ）からなる。これらの遺伝子のうちの３つ、すなわちｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖは、新しいウイルス粒子のための構造タンパク質を作るのに必要な情報を含有する。
【０１３９】
ＨＩＶは主にＣＤ４  Ｔ細胞において複製し、細胞の破壊または調節不全を引き起こして宿主免疫を低下させる。ＨＩＶは、組み込まれたプロウイルスとして感染を確立し、特定の細胞におけるウイルス発現がこの細胞に影響する細胞病理または宿主免疫系による検出に必要とされるレベル未満に減少する潜伏状態に入る場合があるため、ＨＩＶは処置が困難であり、長期間の抗レトロウイルス薬併用療法（ｃＡＲＴ）の後でさえも根絶されていない。ほとんどの場合、ｃＡＲＴによって生存が延長され得るとはいえ、ＨＩＶ感染は致命的疾患を引き起こす。
【０１４０】
ＨＩＶとの闘いの主な目標は、疾患を治癒するための戦略を展開することである。長期のｃＡＲＴはこの目標を遂げていないため、研究者らは代替的手技に目を向けている。治療的免疫化（感染が起こった後のワクチンの使用）により宿主免疫を改善しようとする初期の取り組みによる影響は、僅かまたは皆無であった。同様に、処置強化による影響は、中程度または皆無であった。
【０１４１】
遺伝子療法の使用により多少の進歩があったが、前向きな結果は散発的であり、宿主細胞へのウイルスの侵入において決定的な役割を果たす、ＣＣＲ５をコードする遺伝子の一方または両方の対立遺伝子に欠損を有する稀なヒトの間でしか見出されていない。しかしながら、多くの研究者は、遺伝子療法がＨＩＶの治癒をいずれ達成する見込みが最も高いと楽観している。
【０１４２】
本開示の方法および組成物は、すべてのＨＩＶの身体からの完全な根絶を含む場合も含まない場合もある治癒を達成することができる。上記に言及したように、治癒は、ｃＡＲＴを過去に必要としたＨＩＶ＋の個体が、ｃＡＲＴをより低い用量もしくは断続的な用量で使用した場合に、ウイルス複製が低いかもしくは検出不可能な状態で生存し得るか、またはｃＡＲＴを完全に中止できる可能性があるような状況または状態として定義される。本明細書で使用される場合、治癒は、低レベルのウイルス複製を維持し、疾患進行を減速または終結させるために補助療法が未だ必要である可能性があり得る。治癒の起こり得る転帰は、再発の可能性のすべてを防止するような、ＨＩＶの最終的な根絶である。
【０１４３】
治癒の達成における主な障害は、ＨＩＶ自体の基礎生物学にある。ウイルス感染は、ほぼすべての免疫機能に重要なＣＤ４  Ｔ細胞を欠失させる。最も重要なことには、ＨＩＶ感染およびＣＤ４  Ｔ細胞の枯渇は、個々の細胞の活性化を必要とする。活性化は、再編成されたＴ細胞受容体を使用して病原体または他の分子を認識する、個々のＣＤ４  Ｔ細胞クローンの特異的な機構である。
【０１４４】
ＨＩＶの場合、感染により、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の集団が活性化されて感染し、結果として、ウイルスに対してさほど特異的でない他のＴ細胞より先に枯渇するため、ウイルスに対する免疫系の防御が効果的に損なわれる。ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の応答能は長期ｃＡＲＴ中に復元されるが、ｃＡＲＴが中断されると、ウイルス感染のリバウンドによってこのプロセスが繰り返され、ウイルス特異的細胞が再度欠失させ、疾患進行の時間軸が元に戻る。
【０１４５】
治癒は、ｃＡＲＴが中断されたら宿主の自然免疫がＨＩＶに対抗してこれを制御できるよう、十分なＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞が保護されている場合に可能である。一実施形態では、本開示は、遺伝子療法の有効性を改善してＨＩＶ疾患の治癒をもたらすための方法および組成物を提供する。別の実施形態では、本開示は、ＨＩＶに対する宿主免疫を増強して治癒をもたらすための方法および組成物を提供する。さらに別の実施形態では、本開示は、患者においてＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を濃縮して治癒を達成するための方法および組成物を提供する。
【０１４６】
複数の実施形態では、処置は、被験体のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、または約１０００％濃縮する。
【０１４７】
遺伝子療法
ウイルスベクターは、疾患を治療または防止する目的で遺伝子構築物を宿主細胞に送達するために使用される。
【０１４８】
遺伝子構築物は、既存の欠損を補正または補完する機能性遺伝子または遺伝子の一部分、調節タンパク質をコードするＤＮＡ配列、アンチセンス、短鎖相同ＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡなどを含む調節ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列、および病状を変更するのに重要な細胞因子について競合するようにデザインされたＲＮＡまたはタンパク質のいずれかをコードするデコイ配列を含み得るが、これらに限定されない。遺伝子療法は、これらの治療用遺伝子構築物を標的細胞に送達して、特定の疾患の処置または緩和をもたらすことを伴う。
【０１４９】
ＨＩＶ疾患の処置において遺伝子療法を利用する複数の取り組みが進行中であるが、これまでの結果は不十分である。ＣＣＲ５遺伝子（ＣＣＲ５デルタ３２として公知の対立遺伝子）の自発的な欠失を有する稀なＨＩＶ患者においては、少数の処置成功例が得られた。
【０１５０】
ＣＣＲ５の全体的な発現を低下させ、かつ／またはＨＩＶ複製の低下に役立てるため、レンチウイルスにより送達されるヌクレアーゼまたは遺伝子欠失／改変の他の機構を使用することができる。少なくとも１つの研究は、ＣＣＲ５デルタ３２の遺伝的バックグラウンドを有する患者にレンチウイルスが投与されたとき、疾患の処置が成功したと報告している。しかしながら、これは唯一の成功例であり、ＣＣＲ５デルタ３２の遺伝子型を有しない多くの他の患者は処置に成功していない。結果として、個々のウイルスベクター構築物の性能、および機能的なＨＩＶの治癒を達成するための戦略を通じたベクターの使用の改善の両方の点から、ＨＩＶに対するウイルス遺伝子療法の性能を改善させる実質的な必要性が存在する。
【０１５１】
例えば、一部の既存の療法は、細胞をＨＩＶ感染に耐性にする試みにおいて、ＣＣＲ５の一部分を欠失させるジンクフィンガーヌクレアーゼに依拠する。しかしながら、最適な処置の後でさえ、Ｔ細胞の３０％しかヌクレアーゼによって改変されておらず、改変されたもののうち、ＨＩＶ感染を防止するように改変されていたのは、ＣＤ４  Ｔ細胞集団全体の１０％のみであった。対照的に、開示されている方法では、実質的にすべての細胞が、ＨＩＶ感染を可能にするために必要なレベル未満にＣＣＲ５発現が低減しているレンチウイルス導入遺伝子を有することになる。
【０１５２】
開示されている方法の目的では、遺伝子療法は、親和性増強Ｔ細胞受容体、ＣＤ４  Ｔ細胞上（または代替的にはＣＤ８  Ｔ細胞上）のキメラ抗原受容体、ウイルスタンパク質に起因する細胞死を回避するためのシグナル伝達経路の改変、ＴＲＥＸ、ＳＡＭＨＤ１、ＭｘＡまたはＭｘＢタンパク質、ＡＰＯＢＥＣ複合体、ＴＲＩＭ５アルファ複合体、テザリン（ＢＳＴ２）、および哺乳動物細胞においてＨＩＶ複製を低減させることができると特定された同様のタンパク質を含むＨＩＶ制限エレメントの発現増加を含み得るが、これらに限定されない。
【０１５３】
免疫療法
歴史的に、ワクチンは、天然痘、ポリオ、麻疹、および黄熱病をはじめとする致命的な感染性疾患に対する対抗手段の主力であった。残念ながら、現在認可されているＨＩＶ用ワクチンはない。ＨＩＶウイルスは、免疫系から逃れる独特の方法を有し、ヒトの身体は、これに対して有効な免疫応答を確立することができないと思われる。結果として、科学者らは、ＨＩＶからの保護を提供するために何が必要かを明確に把握していない。
【０１５４】
しかしながら、免疫療法は、従来のワクチンのアプローチによってこれまで対処されなかった解決策を提供し得る。生物学的療法とも呼ばれる免疫療法は、感染またはがんと闘うために身体の自然防御能を後押しするようにデザインされた処置の一種である。免疫療法は、免疫系機能の改善、ターゲティング、または復旧のために、身体または実験室のいずれかで作られる材料を使用する。
【０１５５】
複数の実施形態では、宿主の抗ＨＩＶ免疫を増加させる目的でＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞集団を濃縮するために、免疫療法のアプローチが使用され得る。複数の実施形態では、宿主の抗ＨＩＶ免疫を増加させる目的で宿主の免疫細胞に形質導入するために、組み込み型または非組み込み型のレンチウイルスベクターが使用され得る。複数の実施形態では、宿主の免疫応答を増加させるために好適なビヒクルおよび／または生物学的もしくは化学的アジュバントと組み合わせた、死滅粒子、ウイルス様粒子、ＨＩＶペプチドまたはペプチド断片、組換えウイルスベクター、組換え細菌ベクター、精製されたサブユニットまたはプラスミドＤＮＡを含むがこれらに限定されない、ＨＩＶタンパク質を含むワクチンが、ウイルス特異的Ｔ細胞または抗体の集団を濃縮するために使用される場合があり、これらの方法は、レンチウイルスまたは他のウイルスベクターを使用したＨＩＶにターゲティングされた遺伝子療法の使用により、さらに増強することができる。
【０１５６】
方法
一態様では、本開示は、ウイルスベクターを使用してＨＩＶ疾患の治癒を達成するための方法を提供する。本方法は、概して、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の割合を増やすための免疫療法と、その後に必要に応じてＨＩＶならびにＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４の阻害剤を送達するためのレンチウイルス形質導入とを含む。
【０１５７】
一実施形態では、本方法は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の割合を増やすための第１の刺激事象を含む。第１の刺激は、ワクチンを含むがこれに限定されない、患者のＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮するために好適な任意の薬剤のうちの１つまたは複数の投与を含み得る。
【０１５８】
治療用ワクチンは、処置が行われている地理的領域の優勢なウイルス型を代表するタンパク質配列を有する１つまたは複数のＨＩＶタンパク質を含み得る。治療用ワクチンは、精製タンパク質、不活化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質、細菌ベクター化タンパク質、ペプチドまたはペプチド断片、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、サイトカインおよび／またはケモカインを含む生物学的または化学的アジュバント、ビヒクル、ならびに免疫化の方法を含む。ワクチン接種は、当技術分野で公知の標準的方法に従って施してよく、ＨＩＶ患者は、免疫化とその後のレンチウイルス形質導入を含むｅｘ  ｖｉｖｏでのリンパ球の培養との間の中間期（ｉｎｔｅｒｖａｌ）中に抗レトロウイルス薬療法を継続してよい。
【０１５９】
一部の実施形態では、ＨＩＶ＋患者をＨＩＶワクチンで免疫化すると、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度が、約２、約２５、約２５０、約５００、約７５０、約１０００、約１２５０、または約１５００倍（またはこれらの値の間の任意の量）だけ増加する。ワクチンは、開示されているレンチウイルスベクター、他のウイルスベクター、またはワクチン送達システムとして使用される他の細菌ベクターを含む、いずれの臨床的に利用されるまたは実験用のＨＩＶワクチンであってもよい。別の実施形態では、ベクターは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）をコードして、より高力価の中和抗体を誘導する。別の実施形態では、ベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびｔｅｖ、ならびにＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、およびＩＮＳを含むがこれらに限定されない、ＨＩＶに関するペプチドまたはペプチド断片をコードする。代替的に、開示されている方法で使用されるＨＩＶワクチンは、精製タンパク質、不活化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質（ＨＩＶ特異的抗体または抗体様分子またはＣＤ４様分子を含む）、細菌ベクター化タンパク質、ペプチドもしくはペプチド断片、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、またはサイトカインおよび／もしくはケモカインを含む生物学的もしくは化学的アジュバントを含み得る。
【０１６０】
一実施形態では、本方法は、精製タンパク質、不活化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質、細菌ベクター化タンパク質、サイトカインおよび／またはケモカインを含む生物学的または化学的アジュバント、ビヒクル、ならびに再刺激の方法を使用した、治療用ワクチン接種により過去に免疫化された個人または患者由来のＣＤ４  Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの再刺激を含む。ｅｘ  ｖｉｖｏでの再刺激は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫化に使用されたものと同じワクチンもしくは免疫刺激性の化合物を使用して行われてもよく、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫化に使用されたものとは異なるワクチンもしくは免疫刺激性の化合物を使用して行われてもよい。さらに一部の実施形態では、患者は、この個体がＨＩＶタンパク質に対して十分に高い抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答を有していれば、治療用ワクチン接種またはＣＤ４  Ｔ細胞の再刺激を事前に必要としない。これらの実施形態では、そのような患者は、ウイルス抗原、ワクチン、またはペプチドでＣＤ４  Ｔ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏにて刺激した後、刺激への応答に基づいてＨＩＶ特異的Ｔ細胞を選択することのみを必要とする場合がある。濃縮細胞調製物は、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれよりも多くのＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を含んでよく、ＨＩＶ媒介性枯渇から保護することができる遺伝子のレンチウイルス形質導入のために使用される。ポリクローナルマイトジェンとサイトカインによる刺激は、濃縮された形質導入Ｔ細胞の数を、元の患者に注入し戻すのに適切なレベルに達するまで増加させる。
【０１６１】
複数の実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が白血球除去によって得られ、ｅｘ  ｖｉｖｏで処置されて、約１×１０９個のＣＤ４  Ｔ細胞が得られ、このうち約０．１％、約１％、約５％、または約１０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％が、抗原応答という点でＨＩＶ特異的であり、また、開示されているレンチウイルスベクターにより送達された治療用導入遺伝子を有することからＨＩＶ耐性でもある。代替的には、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、または約１×１０１２個のＣＤ４  Ｔ細胞が再刺激のために単離され得る。ｅｘ  ｖｉｖｏでの再刺激のためには、任意の好適な量のＣＤ４  Ｔ細胞が単離される。
【０１６２】
単離されたＣＤ４  Ｔ細胞は、過去の治療用ワクチン接種に存在した抗原を含み得るＨＩＶワクチン抗原による再刺激の間中、適切な培地において培養され得る。長期のｅｘ  ｖｉｖｏ培養中のウイルスの再出現を防止するため、逆転写酵素、プロテアーゼ、またはインテグラーゼの阻害剤を含む抗レトロウイルス治療薬を添加してもよい。ＣＤ４  Ｔ細胞の再刺激は、培養物中のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の割合を増やすために使用され得る。同じ手順は、精製により得られた末梢血単核細胞を含むより少ない血液量を使用してＨＩＶ特異的Ｔ細胞を特定し、この亜集団の頻度を測定する、分析目的で使用することもできる。培養物中のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の割合は、１つまたは複数の他の細胞サブセットを枯渇させることにより濃縮または増加させることができる。
【０１６３】
ＰＢＭＣ画分は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞について、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化のために過去に使用されたワクチンの成分と一致するかまたはこれを補完するＨＩＶタンパク質とこれらの細胞を接触させることによって濃縮することができる。ｅｘ  ｖｉｖｏでの再刺激は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の相対的な頻度を約２、約５、約１０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、または約２００倍増加させ得る。本方法は、ＣＤ４  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの治療的免疫化およびｅｘ  ｖｉｖｏでの再刺激を、ｅｘ  ｖｉｖｏでのレンチウイルス形質導入および培養と組み合わせるステップをさらに含み得る。
【０１６４】
よって、一実施形態では、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞が濃縮されている再刺激したＰＢＭＣまたはＰＢＭＣの画分は、１、２、３、４、５、または最大１２、２０、もしくは３０日間培養した後、ポリクローナルマイトジェンまたは他の植物もしくは真菌ベースのアグルチニン、または、細胞表面ＣＤ３およびＣＤ２８を認識してこれらの分子を架橋し、ポリクローナルＴ細胞活性化を引き起こすことができる他の試薬を用いて、再度活性化させることができる。ポリクローナル刺激後、細胞は、治療用抗ＨＩＶレンチウイルスまたは他のベクターで形質導入され、そのような形質導入のために十分な期間、例えば約１〜約２１日間、最大約３５日間などにわたって培養下に維持され得る。代替的に、これらの細胞は、約１〜約１８日間、約１〜約１５日間、約１〜約１２日間、約１〜約９日間、または約３〜約７日間にわたって培養されてもよい。よって、形質導入された細胞は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、または約３５日間にわたって培養され得る。ポリクローナルマイトジェンを用いた活性化は、細胞産物製造プロセスに含まれる場合もあれば、含まれない場合もある。
【０１６５】
さらなる実施形態では、形質導入された細胞が十分な期間にわたって培養されたら、形質導入されたＣＤ４  Ｔ細胞は、元の患者に注入し戻される。注入は、当技術分野で公知の様々なデバイスおよび方法を使用して行うことができる。一部の実施形態では、注入には、再生着の効率を上昇させるためにシクロホスファミドまたは同様の化合物による前処
置が付随する場合がある。
【０１６６】
一部の実施形態では、処置プロセスの間中継続された被験体の抗レトロウイルス薬療法レジメンに、ＣＣＲ５にターゲティングされた療法が付加され得る。ＣＣＲ５にターゲティングされた療法の例としては、マラビロク（ＣＣＲ５アンタゴニスト）またはラパマイシン（ＣＣＲ５を低下させる免疫抑制剤）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、抗レトロウイルス薬療法が停止される場合があり、被験体がウイルスのリバウンドについて試験される場合がある。リバウンドが起こらなければ、アジュバント療法を除去してもよく、被験体をウイルスのリバウンドについて再度試験することができる。
【０１６７】
様々な実施形態では、ｃＡＲＴもしくはＨＡＡＲＴを含む抗レトロウイルス薬療法を低減した場合またはこれを使用しない場合、かつアジュバント療法を低減した場合またはこれを使用しない場合に、約２６週間にわたってウイルス抑制が持続すれば、ＨＩＶの機能的治癒とみなすことができる。治癒の他の定義は本明細書に記載されている。
【０１６８】
開示されている方法で使用されるレンチウイルスベクターおよび他のベクターは、目的の、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、もしくは少なくとも５種の遺伝子、または少なくとも６種の遺伝子、または少なくとも７種の遺伝子、または少なくとも８種の遺伝子、または少なくとも９種の遺伝子、または少なくとも１０種の遺伝子、または少なくとも１１種の遺伝子、または少なくとも１２種の遺伝子をコードし得る。ＨＩＶにターゲティングされた遺伝子療法の多用途性および治療可能性を考慮すると、本開示のウイルスベクターは、（ｉ）感染性疾患に関連する抗原または感染性病原体によって産生される毒素に対する抗体、（ｉｉ）免疫細胞の成長または機能に必要とされ、かつＨＩＶおよび他の慢性または急性のヒトウイルスまたは細菌病原体において遭遇される免疫調節不全に対する治療薬であり得る、インターロイキンを含むサイトカイン、（ｉｉｉ）ＣＤ８抑制因子を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏでＨＩＶの成長を抑制する因子、（ｉｖ）ケモカイン受容体ＣＣＲ５の変異もしくは欠失、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４の変異もしくは欠失、またはケモカイン受容体ＣＸＣＲ５の変異もしくは欠失、（ｖ）ＨＩＶに関連する特定の受容体もしくはペプチドまたはＨＩＶに関連する宿主タンパク質に対するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、（ｖｉ）ＨＩＶに関連する特定の受容体もしくはペプチドまたはＨＩＶに関連する宿主タンパク質に対する低分子干渉ＲＮＡ、あるいは（ｖｉｉ）ＨＩＶまたはＡＩＤＳを処置するために使用され得る多様な他の治療上有用な配列を含むがこれらに限定されない、遺伝子または核酸配列をコードし得る。
【０１６９】
開示されている方法で使用され得るＨＩＶにターゲティングされた遺伝子療法のさらなる例としては、親和性増強Ｔ細胞受容体、ＣＤ４  Ｔ細胞上（または代替的にはＣＤ８  Ｔ細胞上）のキメラ抗原受容体、ウイルスタンパク質に起因する細胞死を回避するためのシグナル伝達経路の改変、ＴＲＥＸ、ＳＡＭＨＤ１、ＭｘＡまたはＭｘＢタンパク質、ＡＰＯＢＥＣ複合体、ＴＲＩＭ５アルファ複合体、テザリン（ＢＳＴ２）、および哺乳動物細胞においてＨＩＶ複製を低減させることができると特定された同様のタンパク質を含むＨＩＶ制限エレメントの発現増加が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
一部の実施形態では、患者は、本開示の方法に従う処置を受けると同時にｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを受けていてもよい。他の実施形態では、患者は、本開示の方法に従って処置される前または処置された後にｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを受けてもよい。一部の実施形態では、ｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴは、本開示の方法に従う処置の間中維持され、患者は、血液中のＨＩＶウイルス負荷および血液中のレンチウイルスを形質導入したＣＤ４  Ｔ細胞の頻度についてモニタリングされ得る。好ましくは、本開示の方法に従って処置される前にｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを受けた患者は、本開示の方法に従う処置の後にｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを中止または低減することができる。
【０１７１】
有効度の目的上、形質導入されたＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度は、遺伝子療法の効果の新規の代替マーカーであり、本明細書においてより詳細に論じられるように決定することができる。
【０１７２】
組成物
様々な態様では、本開示は、感受性細胞へのＨＩＶの侵入を阻害する遺伝子構築物を送達することができるレンチウイルスベクターを提供する。例として、本明細書による１つの作用機構は、感受性細胞へのウイルス進入速度を低減させるため、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４ケモカイン受容体に対するｍＲＮＡレベルを低下させることである。
【０１７３】
代替的に、開示されているレンチウイルスベクターは、入ってくるＨＩＶゲノムＲＮＡの安定性を低減させることによってＨＩＶ感染細胞の形成を阻害することができる。また、さらに別の実施形態では、開示されているレンチウイルスベクターは、潜伏感染細胞からのＨＩＶ産生を防止することができ、その作用機構は、短鎖相同ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、または他の調節ＲＮＡ種を含む阻害性ＲＮＡの作用により、ウイルスＲＮＡ配列の不安定性を引き起こすことである。
【０１７４】
開示されている治療用レンチウイルスは概して、２種類の遺伝子カーゴのうち少なくとも１種を含む。第１に、このレンチウイルスは、感受性細胞へのＨＩＶの侵入に重要なケモカイン受容体ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡの発現を指向する遺伝子エレメントをコードし得る。第２の種類の遺伝子カーゴは、逆転写、ＲＮＡスプライシング、タンパク質を産生するＲＮＡ翻訳、または粒子を産生し感染を伝播するウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングを防止する目的で、ＨＩＶのＲＮＡ配列をターゲティングする低分子ＲＮＡ分子を発現することができる構築物を含む。例示的な構造が図３に図示されている。
【０１７５】
図３（上パネル）に示されるように、例示的な構築物は、多数のセクションまたは成分を含み得る。例えば、一実施形態では、例示的なＬＶ構築物は、以下のセクションまたは成分を含み得る。
・  ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス末端反復配列（long  terminal  repeat））、
・  ５’ＬＴＲ（染色体組み込み後にベクターの複製を防止するために切り詰めることができるＨＩＶ末端反復配列の一部分）、
・  Ｐｓｉ（パッケージング中のウイルス粒子へのベクターＲＮＡゲノムの組み込みを可能にするパッケージングシグナル）、
・  ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメントを付加すると、ＲＮＡを細胞の核から細胞質に動員することによって導入遺伝子からの発現を改善することができる）、
・  ｃＰＰＴ（宿主細胞染色体への導入遺伝子の組み込みの前に第二鎖ＤＮＡ合成を促進するポリプリントラクト（poly  purine  tract））、
・  プロモーター（プロモーターは、組み込まれた導入遺伝子からのＲＮＡ転写を開始してマイクロＲＮＡクラスター（または構築物の他の遺伝子エレメント）を発現し、一部の実施形態では、ベクターはＥＦ−１プロモーターを使用し得る）、
・  抗ＣＣＲ５（宿主細胞因子ＣＣＲ５のメッセンジャーＲＮＡをターゲティングして細胞表面上のその発現を低減させるマイクロＲＮＡ）、
・  抗Ｒｅｖ／Ｔａｔ（ＨＩＶのＲｅｖコード領域とＴａｔコード領域との間の接合部におけるＨＩＶのゲノムＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡをターゲティングするマイクロＲＮＡ。本出願では、ｍｉＲＮＡ  Ｔａｔと呼称されるか、または同様の説明が与えられる場合がある）、
・  抗Ｖｉｆ（Ｖｉｆコード領域内のＨＩＶのゲノムＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ
をターゲティングするマイクロＲＮＡ）、
・  ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントは、核のＲＮＡ輸送を促進するために使用され得るさらなるベクター成分である）、および
・  デルタＵ３  ３’ＬＴＲ（ベクターの安全性を改善するためにＵ３領域の一部分を欠失させた、ＨＩＶの３’末端反復配列の改変バージョン）。
【０１７６】
上記の成分は単なる例であること、また、構築物がＨＩＶ遺伝子の発現を防止し、感染の伝播を減少させることができる限り、このような成分を再編成したり、他のエレメントと置換したり、または別様に変更したりしてよいことは、当業者には認識されよう。
【０１７７】
本開示のベクターは、上記のいずれかまたは両方の種類の遺伝子カーゴ（すなわち、遺伝子の発現を指向する遺伝子エレメント、または翻訳もしくは転写を防止することができるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡなどの低分子ＲＮＡ）を含んでよく、本開示のベクターは、ＨＩＶの処置または診断の目的でさらに有用な産物をコードしてもよい。例として、一部の実施形態では、これらのベクターは、遺伝子改変細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで選択的に維持する目的でベクターまたは抗生物質耐性遺伝子を追跡することを目的として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または切り詰められ生物学的に不活化された細胞表面分子をコードしてもよい。
【０１７８】
開示されているベクターに組み込まれる遺伝子エレメントの組み合わせは、特に限定されない。例えば、本明細書におけるベクターは、単一の低分子ＲＮＡ、２個の低分子ＲＮＡ、３個の低分子ＲＮＡ、４個の低分子ＲＮＡ、５個の低分子ＲＮＡ、６個の低分子ＲＮＡ、７個の低分子ＲＮＡ、８個の低分子ＲＮＡ、９個の低分子ＲＮＡ、または１０個の低分子ＲＮＡ、または１１個の低分子ＲＮＡ、または１２個の低分子ＲＮＡをコードしてよい。このようなベクターは、低分子ＲＮＡと共働して機能してＨＩＶの発現および感染を防止するように他の遺伝子エレメントをさらにコードしてもよい。
【０１７９】
治療用レンチウイルスが、プロモーター領域、調節ＲＮＡのターゲティング、および調節ＲＮＡの種類の代わりに代替配列を使用し得ることは、当業者には理解されよう。さらに、本開示の治療用レンチウイルスは、レンチウイルス粒子をパッケージングするために使用されるプラスミドの変化を含む場合があり、これらの変化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生レベルを上昇させるために必要とされる。
【０１８０】
レンチウイルスベクターシステム
本明細書の様々な態様および実施形態に従うレンチウイルスビリオン（粒子）は、ビリオン（ウイルス粒子）を産生するために必要なウイルスタンパク質をコードするベクターシステムによって発現される。様々な実施形態では、逆転写および組み込みのための、プロモーターに作動可能に連結した、レンチウイルスｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を含有する１つのベクターが提供される。別の実施形態では、ｐｏｌタンパク質は、複数のベクターによって発現される。他の実施形態では、ウイルスカプシドを形成するための、プロモーターに作動可能に連結した、レンチウイルスＧａｇタンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターが提供される。複数の実施形態では、このｇａｇ核酸配列は、ｐｏｌ核酸配列の少なくとも一部とは別個のベクター上にある。他の実施形態では、ｇａｇ核酸は、ｐｏｌタンパク質をコードする全てのｐｏｌ核酸配列とは別個のベクター上にある。
【０１８１】
本明細書のベクターには多数の改変を行ってよく、これらを使用して粒子を作り出すと、野生型復帰変異体を得る機会がさらに最小限に抑えられる。これらは、ＬＴＲのＵ３領域の欠失、ｔａｔ欠失、およびマトリクス（ＭＡ）欠失を含むが、これらに限定されない。複数の実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖベクターは、レンチウイルスパッケージング配列と呼ばれる、レンチウイルスＲＮＡをパッケージングするレンチウイルスゲノム由来のヌクレオチドを含有しない。
【０１８２】
粒子を形成するベクターは、好ましくは、エンベロープタンパク質を発現するレンチウイルスゲノム由来の核酸配列を含有しない。好ましくは、プロモーターに作動可能に連結したエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含有する別個のベクターが使用される。このｅｎｖベクターも、レンチウイルスパッケージング配列を含有しない。一実施形態では、ｅｎｖ核酸配列は、レンチウイルスエンベロープタンパク質をコードする。
【０１８３】
別の実施形態では、エンベロープタンパク質は、レンチウイルスに由来しないが、異なるウイルスに由来する。結果として得られる粒子は、シュードタイプ化粒子と呼ばれる。エンベロープの適切な選択により、実質的に任意の細胞に「感染」することができる。例えば、細胞内区画をターゲティングするエンベロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子を使用することができる。そのようなｅｎｖ遺伝子およびエンベロープタンパク質が由来し得るウイルスの例としては、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルス、インフルエンザＤ型ウイルス、イサウイルス、クアランジャウイルス、およびトゴトウイルス）、ベシクロウイルス（例えば、インディアナベシクロウイルス）、アルファウイルス（例えば、とりわけ、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、アウラウイルス、バーマ森林ウイルス、ベバルウイルス、カバソウウイルス（Ｃａｂａｓｓｏｕ  ｖｉｒｕｓ）、ゲタウイルス、ハイランドＪウイルス（Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ  Ｊ  ｖｉｒｕｓ）、トロカラウイルス（Ｔｒｏｃａｒａ  ｖｉｒｕｓ）、ウナウイルス、ヌドゥムウイルス、およびミドレブルグウイルス）、アレナウイルス（例えば、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、マチュポウイルス、フニンウイルス、およびラッサ熱ウイルス）、フラビウイルス（例えば、とりわけ、ダニ媒介性脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＧＢウイルス、アポイウイルス、バガザウイルス（Ｂａｇａｚａ  ｖｉｒｕｓ）、エッジヒルウイルス、ジュグラウイルス（Ｊｕｇｒａ  ｖｉｒｕｓ）、カダムウイルス、ダカールコウモリウイルス、モドックウイルス、ポワサンウイルス、ウスツウイルス（Ｕｓｕｔｕ  ｖｉｒｕｓ）、およびサルヴィエヤウイルス（Ｓａｌ  Ｖｉｅｊａ  ｖｉｒｕｓ））、ラブドウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、耳下腺炎または麻疹）、およびオルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）が挙げられる。
【０１８４】
好ましくは使用することができる他のｅｎｖ遺伝子エンベロープタンパク質としては、内在性レトロウイルス（例えば、ネコ科動物内在性レトロウイルスおよびヒヒ内在性レトロウイルス）および密接に関連するガンマレトロウイルス（例えば、とりわけ、モロニー白血病ウイルス、ＭＬＶ−Ｅ、ＭＬＶ−Ａ、ギボン類人猿白血病ウイルス、ＧＡＬＶ、ネコ白血病ウイルス、コアラレトロウイルス、トレーガーアヒル脾臓壊死ウイルス、毒蛇レトロウイルス、ひよこ合胞体ウイルス、ガードナー−アーンシュタインネコ肉腫ウイルス、およびブタＣ型オンコウイルス）に由来するものが挙げられる。これらのガンマレトロウイルスは、初代細胞をターゲティングするためのｅｎｖ遺伝子およびエンベロープタンパク質の供給源として使用することができる。ガンマレトロウイルスは、宿主細胞が初代細胞である場合に特に好ましい。
【０１８５】
エンベロープタンパク質を選択して、特定の所望の宿主細胞をターゲティングすることができる。例えば、脳への送達には、ドーパミン受容体などの特定の受容体のターゲティングを使用することができる。別の標的は血管内皮であり得る。これらの細胞は、フィロウイルス科（例えば、クエバウイルス（Ｃｕｅｖａｖｉｒｕｓ）、ディアンロウイルス（Ｄｉａｎｌｏｖｉｒｕｓ）、エボラウイルス、およびマールブルグウイルス）の任意のウイルスに由来するエンベロープタンパク質を使用してターゲティングすることができる。エボラウイルスの種としては、タイ森林エボラウイルス、ザイールエボラウイルス、スーダンエボラウイルス、ブンディブギョエボラウイルス、およびレストンエボラウイルスが挙げられる。
【０１８６】
加えて、複数の実施形態では、糖タンパク質は、転写後修飾を受ける場合がある。例えば、実施形態では、エボラのＧＰは、翻訳後に修飾されて、ＧＰ１およびＧＰ２糖タンパク質になり得る。別の実施形態では、シュードタイプ化エンベロープ（例えば、ＦＩＶまたはＳＨＩＶ［米国特許第５，６５４，１９５号］）を有する異なるレンチウイルスカプシドを使用することができる。ＳＨＩＶシュードタイプ化ベクターは、サルなどの動物モデルにおいて容易に使用することができる。
【０１８７】
本明細書に提供されるレンチウイルスベクターシステムは、典型的には、ｇａｇ、ｐｏｌ、またはｒｅｖ遺伝子のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子は、それぞれが個々のプラスミドで提供される場合もあれば、１つまたは複数の遺伝子が同じプラスミドで一緒に提供される場合もある。一実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子は、同じプラスミドで提供される（例えば図４）。別の実施形態では、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子が第１のプラスミドで提供され、ｒｅｖ遺伝子が第２のプラスミドで提供される（例えば図５）。したがって、３ベクターシステム（例えば図４および６）および４ベクターシステム（例えば図５）はいずれも、本明細書に記載されるレンチウイルスを産生するために使用され得る。複数の実施形態では、治療用ベクター、少なくとも１つのエンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドは、パッケージング細胞、例えばパッケージング細胞株にトランスフェクトされる。パッケージング細胞株の非限定的な例は、２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞株である。治療用ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株にトランスフェクトされると、最終的にレンチウイルス粒子が産生される。
【０１８８】
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクターシステムが開示される。このシステムは、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターと；細胞に感染するように最適化されたエンベロープタンパク質を発現させるためのエンベローププラスミドと；ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子を発現させるための少なくとも１つのヘルパープラスミドとを含み、レンチウイルスベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株にトランスフェクトされると、レンチウイルス粒子がパッケージング細胞株によって産生され、このレンチウイルス粒子は、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生の阻害、またはＨＩＶ  ＲＮＡ配列のターゲティングが可能である。
【０１８９】
別の態様では、本明細書では治療用ベクターとも呼ばれるレンチウイルスベクターは、次のエレメント：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号３３〜３４）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号３５）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号３６）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）（配列番号３７）、ＥＦ−１αプロモーター（配列番号４）、ｍｉＲ３０ＣＣＲ５（配列番号１）、ｍｉＲ２１Ｖｉｆ（配列番号２）、ｍｉＲ１８５Ｔａｔ（配列番号３）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３１または６７）、およびΔＵ３  ３’ＬＴＲ（配列番号３８）を含む。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化を使用して、本明細書で参照される配列を改変することができる。
【０１９０】
別の態様では、ヘルパープラスミドは、次のエレメント：ＣＡＧプロモーター（配列番号４０）、ＨＩＶ成分ｇａｇ（配列番号４２）、ＨＩＶ成分ｐｏｌ（配列番号４３）、ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号４４）、ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号４５）、およびＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号４６）を含む。別の態様では、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を発現させるための第１のヘルパープラスミドと、ｒｅｖ遺伝子を発現させるための第２の別個のプラスミドとを含むように、ヘルパープラスミドを改変してよい。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化を使用して、本明細書で参照される配列を改変することができる。
【０１９１】
別の態様では、エンベローププラスミドは、次のエレメント：ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（ＣＭＶ）（配列番号４９）および水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（配列番号５１）を含む。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化を使用して、本明細書で参照される配列を改変することができる。
【０１９２】
様々な態様では、レンチウイルスパッケージングに使用されるプラスミドは、ベクターの機能を損失することなく、様々なエレメントの置換、付加、除去、または変異によって改変される。例えば、限定されるものではないが、次のエレメントは、パッケージング系を構成するプラスミドにおいて同様のエレメントに取って代わることができる：伸長因子１（ＥＦ−１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターは、ＣＭＶまたはＣＡＧプロモーターに取って代わることができる。ＳＶ４０ポリＡおよびｂＧＨポリＡは、ウサギベータグロビンポリＡに取って代わることができる。
【０１９３】
別の態様では、ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶ株またはクレードから構築されていてよい。例えば、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質は、ガンマレトロウイルス（例えば、とりわけ、テナガザル類人猿白血病ウイルス、ＧＡＬＶ、マウス白血病ウイルス１０Ａ１、ＭＬＶ、コアラレトロウイルス、トレーガーアヒル脾臓壊死ウイルス、毒蛇レトロウイルス、ひよこ合胞体ウイルス、ガードナー−アーンシュタインネコ肉腫ウイルス、およびブタＣ型オンコウイルス）、内在性レトロウイルス（例えば、とりわけ、ネコ科動物内在性ウイルス（ＲＤ１１４）、ＨＥＲＶ−Ｗなどのヒト内在性レトロウイルス、およびヒヒ内在性レトロウイルス、ＢａＥＶ）、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス、ＦＵＧ）、マンマレナウイルス（ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）（例えば、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、ＬＣＭＶ、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＡ型家禽ペストウイルス、ＦＰＶ、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルス、インフルエンザＤ型ウイルスなどのインフルエンザウイルス、イサウイルス、クアランジャウイルス、およびトゴトウイルス）、アルファウイルス（例えば、ロスリバーアルファウイルス、ＲＲＶ、またはスーダンエボラウイルス、タイ森林エボラウイルス、ザイールエボラウイルス、ブンディブギョエボラウイルス、およびレストンエボラウイルスなどのエボラウイルス、ＥｂｏＶ）に由来する膜糖タンパク質で置換され得る。
【０１９４】
様々なレンチウイルスパッケージング系を商業的に取得することができ（例えば、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤのＬｅｎｔｉ−ｖｐａｋパッケージングキット）、本明細書に記載されるようにデザインすることもできる。さらに、レンチウイルス粒子の産生効率を含め、任意の数の関連要素を改善するためにレンチウイルスパッケージング系の諸態様を置換または改変することは、当業者の技能の範囲内である。
【０１９５】
バイオアッセイ
様々な態様では、本開示は、機能的治癒の達成するためのＨＩＶ処置の成功を決定するためのバイオアッセイを含む。これらのアッセイは、患者における形質導入されたＨＩＶ特異的なＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を測定することにより、開示されている免疫化および処置の方法の有効度を測定するための方法を提供する。ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞が認識可能である。なぜなら、とりわけ、これらが増殖し、細胞表面マーカーの組成を変更し、リン酸化を含むシグナル伝達経路を誘導し、かつ／あるいは、サイトカイン、ケモカイン、カスパーゼ、リン酸化シグナル伝達分子、または他の細胞質および／もしくは核成分であり得る特定のマーカータンパク質を発現するからである。特定の応答するＣＤ４  Ｔ細胞は、例えば、フローサイトメトリーソーティング、磁性ビーズ分離、または抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の単離の他の認識されている方法を使用したＨＩＶ特異的細胞のソーティングを可能にする、標識されたモノクローナル抗体またはｍＲＮＡ配列の特異的なｉｎ  ｓｉｔｕ増幅を使用して認識される。単離されたＣＤ４  Ｔ細胞を試験すると、組み込まれた治療用レンチウイルスを有する細胞の頻度が決定される。質量分析、ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡまたは抗体染色と併せた個々の細胞のマイクロ流体分離を含む単一細胞試験法を使用して、ＨＩＶに対する応答性および組み込まれた治療用レンチウイルスの存在を確認することもできる。
【０１９６】
よって、様々な実施形態では、本開示による処置の適用（例えば、（ａ）免疫化、（ｂ）ｅｘ  ｖｉｖｏでの白血球／リンパ球の培養および／または非標的細胞の枯渇、（ｃ）精製タンパク質、不活化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質、細菌ベクター化タンパク質、サイトカインおよび／またはケモカインを含む生物学的または化学的アジュバント、ビヒクルによる再刺激、（ｄ）濃縮されたＴ細胞へのウイルス送達システムの形質導入、ならびに（ｅ）濃縮され形質導入されたＴ細胞の注入）に続いて、その後患者をアッセイすることで、処置の有効度を決定することができる。体内の標的Ｔ細胞の閾値は、所定値における、例えば、治療用レンチウイルスからの遺伝子改変を有する約１×１０８個のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞における機能的治癒を測定するように確立してよい。代替的に、この閾値は、患者の体内で約１×１０５、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、または約１×１０１０個のＣＤ４  Ｔ細胞であってもよい。
【０１９７】
治療用レンチウイルスによる遺伝子改変を有するＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞は、フローサイトメトリー、セルソーティング、ＦＡＣＳ分析、ＤＮＡクローニング、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲもしくはＱ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ＦＩＳＨ、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、ハイスループットシーケンシング、ＲＮＡシーケンシング、オリゴヌクレオチドプライマー伸長、または当技術分野で公知の他の方法などであるがこれらに限定されない、任意の好適な方法を使用して決定することができる。
【０１９８】
遺伝子改変を有する抗原特異的Ｔ細胞を定義するための方法は当技術分野で公知であるが、このような方法を利用し、有効度の標準的な尺度として組み込み型または非組み込み型の遺伝子療法の構築物を含むＨＩＶ特異的Ｔ細胞を特定することを組み合わせることは、本明細書において様々に記載されるように、ＨＩＶ処置の分野において新規の概念である。
【０１９９】
用量および剤形
開示されている方法および組成物は、ＨＩＶ＋患者をその疾患の様々な段階で処置するために使用され得る。したがって、投薬レジメンは、患者の状態および投与方法に基づいて異なり得る。
【０２００】
様々な実施形態では、初回のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化のためのＨＩＶ特異的ワクチンは、必要とする被験体に様々な用量で投与される。一般に、筋肉内注射により送達されるワクチンは、不活化ウイルス粒子から調製された全ウイルスタンパク質、ウイルス様粒子、または組換え系から精製されたウイルスタンパク質もしくはウイルス調製物から精製されたもののいずれかのＨＩＶタンパク質を、約１０μｇ〜約３００μｇ、約２５μｇ〜約２７５μｇ、約５０μｇ〜約２５０μｇ、約７５μｇ〜約２２５μｇ、または約１００μｇ〜約２００μｇ含む。組換えウイルスベクターまたは細菌ベクターは、記載されるありとあらゆる経路によって投与されてもよい。筋肉内ワクチンは、約１μｇ〜約１００μｇ、約１０μｇ〜約９０μｇ、約２０μｇ〜約８０μｇ、約３０μｇ〜約７０μｇ、約４０μｇ〜約６０μｇ、または約５０μｇの好適なアジュバント分子を含み、注射１用量あたり０．１〜５ｍｌの体積の油、食塩水、緩衝液、または水に懸濁され、可溶性調製物であってもエマルジョン調製物であってもよい。一部のウイルスベクター化もしくは細菌ベクター化ワクチン、融合タンパク質、リポソーム製剤、または同様の調製物を含む、経口的、直腸、口腔、性器粘膜、または鼻腔内に送達されるワクチンは、より高い量のウイルスタンパク質およびアジュバントを含有してもよい。真皮、真皮下（ｓｕｂ−ｄｅｒｍａｌ）、または皮下のワクチンは、経口的、直腸、または鼻腔内に送達されるワクチンにより似ている量のタンパク質およびアジュバントを利用する。初回免疫化に対する応答に応じて、ワクチン接種は、同じかまたは代替の送達経路を使用して１〜５回繰り返され得る。間隔は、免疫化の間で２〜２４週間であり得る。ワクチン接種に対する免疫応答は、ＥＬＩＳＡまたは同様の方法論を使用して、血清、血漿、膣分泌物、直腸分泌物、唾液、または気管支肺胞洗浄液中のＨＩＶ特異的抗体を試験することによって測定される。細胞性免疫応答は、ワクチン抗原によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に続いて、細胞内のサイトカインの蓄積について染色を行った後、フローサイトメトリーまたはリンパ球増殖、リン酸化シグナル伝達タンパク質の発現、もしくは細胞表面活性化マーカーの変化を含む同様の方法によって試験される。投薬の上限は個々の患者に基づいて決定してよく、各個々の製品または製品ロットに関する毒性／安全性プロファイルに依存する。
【０２０１】
免疫化は、１回、２回、３回、または繰り返し行ってよい。例として、ＨＩＶ免疫化のための薬剤は、必要とする被験体に、１週間に１回、１週間おきに１回、３週間ごとに１回、１か月に１回、１か月おきに、３か月ごとに、６か月ごとに、９か月ごとに、１年に１回、１８か月ごとに、２年ごとに、３６か月ごとに、または３年ごとに投与してよい。
【０２０２】
免疫化は概して、ＣＤ４  Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大増殖および濃縮前に少なくとも１回行われ、免疫化は、ｅｘ  ｖｉｖｏでの白血球／リンパ球の培養／再刺激および注入後に１回、２回、３回、またはそれよりも多く行われ得る。
【０２０３】
一実施形態では、免疫化のためのＨＩＶワクチンは、医薬組成物として投与される。一実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物は、臨床適用のための多様な経鼻、肺、経口、外用、または非経口剤形で製剤化される。剤形はそれぞれ、様々な崩壊剤、界面活性剤、充填剤、増粘剤(thickener)、結合剤、希釈剤、例えば湿潤剤、または他の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物は、注射用に製剤化されてもよい。
【０２０４】
免疫化を目的とするＨＩＶワクチン組成物は、任意の薬学的に許容される方法、例えば、鼻腔内投与、口腔投与、舌下投与、経口投与、直腸投与、眼投与、非経口投与（静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、大槽内投与、腹腔内）投与、肺投与、膣内投与、局所投与、外用投与、乱切後の外用投与、粘膜投与、エアロゾルによる、または口腔もしくは経鼻スプレー製剤による投与を使用して投与することができる。
【０２０５】
さらに、ＨＩＶワクチン組成物は、固体剤形、錠剤、丸剤、ロゼンジ、カプセル、液体分散物、ゲル、エアロゾル、肺エアロゾル、経鼻エアロゾル、軟膏、クリーム、半固体剤形、および懸濁物など、任意の薬学的に許容される剤形に製剤化することができる。さらに、本組成物は、制御放出製剤、持続放出製剤、即時放出製剤、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。さらに、本組成物は、経皮送達システムであってもよい。
【０２０６】
別の実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物は、経口投与のための固体剤形で製剤化され、この固体剤形は、粉末、顆粒、カプセル、錠剤、または丸剤であり得る。さらに別の実施形態では、固体剤形は、炭酸カルシウム、デンプン、スクロース、ラクトース、微結晶性セルロース、またはゼラチンなどの１つまたは複数の賦形剤を含む。さらに、固体剤形は、賦形剤に加えて、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含み得る。一部の実施形態では、経口剤形は、即時放出形態または改変放出形態である。改変放出剤形は、制御放出または延長放出、腸内放出などを含む。改変放出剤形に使用される賦形剤は、一般的に当業者に公知である。
【０２０７】
さらなる実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物は、舌下または口腔剤形として製剤化される。このような剤形は、舌下に投与される舌下錠剤または溶液組成物、および頬と歯肉との間に配置される口腔錠剤を含む。
【０２０８】
なおもさらなる実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物は、経鼻剤形として製剤化される。このような本開示の剤形は、経鼻送達のための溶液、懸濁物、およびゲル組成物を含む。
【０２０９】
一実施形態では、医薬組成物は、懸濁物、エマルジョン、またはシロップなど、経口投与のための液体剤形で製剤化される。他の実施形態では、液体剤形は、水および流動パラフィンなどの一般的に使用されている単純な希釈剤に加えて、保水剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、甘味料、芳香族化合物、または保存料などの様々な賦形剤を含み得る。特定の実施形態では、ＨＩＶワクチンまたはその薬学的に許容される塩を含む組成物は、小児患者への投与に好適であるように製剤化される。
【０２１０】
一実施形態では、医薬組成物は、滅菌水溶液、懸濁物、エマルジョン、非水性溶液、または坐薬など、非経口投与のための剤形で製剤化される。他の実施形態では、非水性溶液または懸濁物は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、またはオレイン酸エチルなどの注射可能なエステルを含む。坐薬の基剤としては、ウィテップゾール（witepsol）、マクロゴール、ｔｗｅｅｎ（登録商標）６１、カカオ脂、ラウリン油、またはグリセリンゼラチンが使用され得る。
【０２１１】
医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、投与時間および方式、排出速度、ならびに疾患の重症度に応じて異なり得る。
【０２１２】
再刺激の目的では、概して、リンパ球、ＰＢＭＣ、および／またはＣＤ４  Ｔ細胞を患者から取り出し、再刺激および培養のために単離する。単離した細胞は、免疫化に使用したものと同じＨＩＶワクチンもしくは活性化剤と接触させても、または異なるＨＩＶワクチンもしくは活性化剤と接触させてもよい。一実施形態では、単離した細胞は、培養物中の約１０６個の細胞あたり約１０ｎｇ〜５μｇ（または任意の他の好適な量）のＨＩＶワクチンまたは活性化剤と接触させる。より具体的には、単離した細胞は、培養物中の約１０６個の細胞あたり約５０ｎｇ、約１００ｎｇ、約２００ｎｇ、約３００ｎｇ、約４００ｎｇ、約５００ｎｇ、約６００ｎｇ、約７００ｎｇ、約８００ｎｇ、約９００ｎｇ、約１μｇ、約１．５μｇ、約２μｇ、約２．５μｇ、約３μｇ、約３．５μｇ、約４μｇ、約４．５μｇ、または約５μｇのＨＩＶワクチンまたは活性化剤と接触させてもよい。
【０２１３】
活性化剤またはワクチンは、概して、各ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養で１回使用されるが、約１５〜約３５日の間隔の後に繰り返されてもよい。例えば、繰り返しの投薬は、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、また
は約３５日目に行われ得る。
【０２１４】
濃縮され再刺激した細胞の形質導入では、例えば図４または図６に開示されているレンチウイルスベクターまたは他の公知のベクターシステムを細胞に形質導入してよい。形質導入される細胞は、培養物中の標的細胞あたり約１〜１，０００個（または任意の他の好適な量）のウイルスゲノム（レンチウイルスベクターを含有する培養液のＲＴ−ＰＣＲアッセイにより測定）と接触させてよい。レンチウイルス形質導入は、培養物中の標的細胞あたり１〜１，０００個という同じ範囲のウイルスゲノムを使用し、１〜５回繰り返してよい。
【０２１５】
細胞の濃縮
様々な実施形態では、Ｔ細胞などの細胞がＨＩＶ感染患者から得られ、培養される。培養は、マルチウェルプレートにて馴化培地（「ＣＭ」）を含む培養培地中で行われ得る。上清ｐ２４ｇａｇのレベル（「ｐ２４」）およびウイルスＲＮＡレベルが標準的手段によって評価され得る。ＣＭ培養細胞が１ｎｇ／ｍｌ未満の上清ｐ２４レベルのピークを有する患者は、さらなる抗ウイルス剤の使用ありまたはなしのＣＭにおける大規模なＴ細胞の拡大増殖に好適な患者であり得る。さらに、異なる薬物または目的の薬物の組み合わせを異なるウェルに加えてよく、試料中のウイルスレベルに対する影響を標準的手段によって評価することができる。適度なウイルス抑制をもたらす薬物の組み合わせは、治療上有用な組み合わせである。特定の被験体に関する適度なウイルス抑制を構成するものが何かを決定することは、適格な技師の能力の範囲内である。ウイルスの拡大増殖を制限することにおける目的の薬物の有効性を試験するために、抗ＣＤ３抗体などのさらなる因子を培養物に添加してウイルス産生を刺激してもよい。当技術分野で公知のＨＩＶ感染細胞試料の培養方法とは異なり、ＣＭでは２か月超の期間にわたるＴ細胞の培養が可能であり、これにより、長期の薬物有効性をアッセイする有効な系がもたらされる。
【０２１６】
好ましい実施形態では、ＨＩＶ感染細胞は、感受性の転写媒介性タンパク質配列および感受性のＨＩＶ調節エレメント配列を有する被験体から得られる。より好ましい実施形態では、ＨＩＶ感染細胞は、野生型の転写媒介性タンパク質配列および野生型のＨＩＶ調節配列を有する被験体から得られる。
【０２１７】
造血系および／または造血幹細胞の初代細胞の安定な形質導入は、細胞の表面をレンチウイルスベクターと、細胞表面に結合する少なくとも１つの分子との両方とｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることによって得ることができる。これらの細胞は、成長および／または増殖を促す条件下で、２つまたはそれよりも多くの層を備える通気された容器において培養してよい。一部の実施形態では、このアプローチは、非ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇および／または広いポリクローナルな拡大増殖と併せて使用され得る。
【０２１８】
Ｔ細胞を濃縮する別のアプローチでは、ＰＢＭＣをペプチドで刺激し、インターフェロンガンマなどのサイトカインを分泌する細胞を濃縮する。このアプローチは、概して、Ｔ細胞を含有する細胞の混合物を抗原で刺激し、抗原で刺激した細胞の分離を、これらが産物で標識されている程度に従って行うことを伴う。抗原刺激は、少なくとも１つのＴ細胞の抗原特異的な刺激を誘発するのに有効な条件下で、細胞を少なくとも１つの抗原に曝露することによって達成される。産物による標識は、少なくとも１つの捕捉部分を含有するように細胞の表面を改変し、産物が分泌され、放出され、前記捕捉部分に特異的に結合する（「捕捉される(captured)」または「封入される（entrapped）」）条件下で細胞を培養すること、および捕捉された産物を標識部分で標識することによって達成され、標識された細胞は、標識手順の一環としても分離手順の一環としても溶解されない。捕捉部分は、濃縮ステップを洗練し、概して抗原特異的Ｔ細胞の、特にＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を増加させるために、細胞表面糖タンパク質ＣＤ３またはＣＤ４の検出を組み込む場合がある。
【０２１９】
以下の実施例は、本開示の諸態様を解説するために提示するものである。しかしながら、本開示はこれらの実施例に記載される特定の条件または詳細に限定されないことを理解されたい。本明細書で言及される刊行物はすべて、参照により明示的に組み込まれている。
【実施例】
【０２２０】
（実施例１：レンチウイルスベクターシステムの開発）
図３（直鎖形態）および図４（環状化形態）にまとめたようにレンチウイルスベクターシステムを開発した。まず図３の上部を参照すると、左から右に、次のエレメント：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号３３〜３４）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号３５）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号３６）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）（配列番号３７）、ＥＦ−１αプロモーター（配列番号４）、ｍｉＲ３０ＣＣＲ５（配列番号１）、ｍｉＲ２１Ｖｉｆ（配列番号２）、ｍｉＲ１８５Ｔａｔ（配列番号３）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３１または６７）、およびΔＵ３  ３’ＬＴＲ（配列番号３８）を有する代表的な治療用ベクターをデザインし産生した。図３で詳述されている治療用ベクターは、本明細書ではＡＧＴ１０３とも呼ばれる。
【０２２１】
次に図３の中央部を参照すると、左から右に、次のエレメント：ＣＡＧプロモーター（配列番号４０）、ＨＩＶ成分ｇａｇ（配列番号４２）、ＨＩＶ成分ｐｏｌ（配列番号４３）、ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号４４）、ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号４５）、およびＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号４６）を有するヘルパープラスミドをデザインし産生した。
【０２２２】
次に図３の下部を参照すると、左から右に、次のエレメント：ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（ＣＭＶ）（配列番号４９）および水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（配列番号５１）を有するエンベローププラスミドをデザインし産生した。
【０２２３】
２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入）において、治療用ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミド（図３に示したもの）をトランスフェクションした後、レンチウイルス粒子を産生した。機能的なウイルス粒子を産生した２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞のトランスフェクションでは、プラスミドＤＮＡの取り込み効率を上昇させるために試薬ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を用いた。プラスミドおよびＤＮＡは最初に、血清を含まない培養培地に３：１の比（ＰＥＩのＤＮＡに対する質量比）で別々に添加した。２〜３日後、細胞培地を収集し、高速遠心分離および／または濾過の後にアニオン交換クロマトグラフィーを行うことにより、レンチウイルス粒子を精製した。レンチウイルス粒子の濃度は、形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）の点から表すことができる。ＴＵの決定は、培養液中のＨＩＶ  ｐ２４レベルを測定し（ｐ２４タンパク質がレンチウイルス粒子に組み込まれている）、定量的ＰＣＲにより、または細胞を感染させ光を使用することにより（ベクターがルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質マーカーをコードする場合）、細胞あたりのウイルスＤＮＡコピー数を測定することによって達成した。
【０２２４】
上記に言及したように、レンチウイルス粒子の産生のための３ベクターシステム（すなわち、２ベクターレンチウイルスパッケージング系）をデザインした。この３ベクターシステムの概略は図４に示されている。図４の概略は、これまでに図３に記載した直鎖系の環状化バージョンである。図４を参照しながら簡潔に述べると、最上部のベクターは、この場合はＲｅｖを含むヘルパープラスミドである。図４の中央にあるベクターは、エンベローププラスミドである。最下部のベクターは、これまでに記載した治療用ベクターである。
【０２２５】
より具体的に図４を参照すると、ヘルパー＋Ｒｅｖプラスミドは、ＣＡＧエンハンサー（配列番号３９）、ＣＡＧプロモーター（配列番号４０）、ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号４１）、ＨＩＶ  ｇａｇ（配列番号４２）、ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号４３）、ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号４４）、ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号４５）、ＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号４６）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号４７）を含む。
【０２２６】
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号４９）、ベータグロビンイントロン（配列番号５０）、ＶＳＶ−Ｇ（配列番号５１）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号５６）を含む。
【０２２７】
代替のベクターシステムにおいて、また図６に関して、本明細書においてベクター配列は配列番号８１〜８３として提供される。
【０２２８】
ヘルパー（＋Ｒｅｖ）およびエンベローププラスミドを含む２ベクターレンチウイルスパッケージング系の合成。
【０２２９】
材料および方法：
【０２３０】
ヘルパープラスミドの構築：Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ遺伝子を含有するｐＮＬ４−３  ＨＩＶプラスミド（ＮＩＨ  Ａｉｄｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）からのＤＮＡ断片の初回ＰＣＲ増幅によってヘルパープラスミドを構築した。ｐＣＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の同じ部位に挿入するために使用され得る、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位を有する断片を増幅するためのプライマーをデザインした。フォワードプライマーは（５’−ＴＡＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴ−３’）（配列番号６８）であり、リバースプライマーは（５’−ＣＣＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＣＡＣＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＡＴ−３’）（配列番号６９）であった。Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ断片の配列は次の通りであった：
【０２３１】
ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＡＡＴＧＡＴＡＧＧＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＧＧＴＴＴＴＡＴＣＡＡＡＧＴＡＡＧＡＣＡＧＴＡＴＧＡＴＣＡＧＡＴＡＣＴＣＡＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＡＣＡＴＡＡＡＧＣＴＡＴＡＧＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＡＡＴＴＧＧＡＡＧＡＡＡＴＣＴＧＴＴＧＡＣＴＣＡＧＡＴＴＧＧＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＴＴＡＧＴＣＣＴＡＴＴＧＡＧＡＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＡＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＣＣＡＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣＣＡＴＴＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＡＴＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＴＧＧＧＣＣＴＧＡＡＡＡＴＣＣＡＴＡＣＡＡＴＡＣＴＣＣＡＧＴＡＴＴＴＧＣＣＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＴＡＣＴＡＡＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＴＡＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＣＴＴＡＡＴＡＡＧＡＧＡＡＣＴＣＡＡＧＡＴＴＴＣＴＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＡＧＧＡＡＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＴＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＴＡＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＧＣＧＡＴＧＣＡＴＡＴＴＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＴＡＧＡＴＡＡＡＧＡＣＴＴＣＡＧＧＡＡＧＴＡＴＡＣＴＧＣＡＴＴＴＡＣＣＡＴＡＣＣＴＡＧＴＡＴＡＡＡＣＡＡＴＧＡＧＡＣＡＣＣＡＧＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＧＴＧＣＴＴＣＣＡＣＡＧＧＧＡＴＧＧＡＡＡＧＧＡＴＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＣＣＡＧＴＧＴＡＧＣＡＴＧＡＣＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＴＴＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＡＧＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＡＴＡＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣＴＴＡＧＡＡＡＴＡＧＧＧＣＡＧＣＡＴＡＧＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＧＡＧＧＡＡＣＴＧＡＧＡＣＡＡＣＡＴＣＴＧＴＴＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＴＴＡＣＣＡＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＡＡＣＣＴＣＣＡＴＴＣＣＴＴＴＧＧＡＴＧＧＧＴＴＡＴＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＧＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＴＡＴＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＣＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＴＣＡＡＴＧＡＣＡＴＡＣＡＧＡＡＡＴＴＡＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＴＴＴＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＴＡＡＡＧＴＡＡＧＧＣＡＡＴＴＡＴＧＴＡＡＡＣＴＴＣＴＴＡＧＧＧＧＡＡＣＣＡＡＡＧＣＡＣＴＡＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＴＡＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＴＡＡＡＡＧＡＡＣＣＧＧＴＡＣＡＴＧＧＡＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＡＣＣＣＡＴＣＡＡＡＡＧＡＣＴＴＡＡＴＡＧＣＡＧＡＡＡＴＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＴＧＧＡＣＡＴＡＴＣＡＡＡＴＴＴＡＴＣＡＡＧＡＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＡＧＴＡＴＧＣＡＡＧＡＡＴＧＡＡＧＧＧＴＧＣＣＣＡＣＡＣＴＡＡＴＧＡＴＧＴＧＡＡＡＣＡＡＴＴＡＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＴＡＧＣＣＡＣＡＧＡＡＡＧＣＡＴＡＧＴＡＡＴＡＴＧＧＧＧＡＡＡＧＡＣＴＣＣＴＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＴＡＣＣＣＡＴＡＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＴＧＧＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＣＴＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＣＡＡＴＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴＡＧＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＴＴＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＣＣＣＡＴＡＡＴＡＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣＴＡＴＧＴＡＧＡＴＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＡＡＣＴＡＡＡＴＴＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＧＧＡＴＡＴＧＴＡＡＣＴＧＡＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡＡＡＡＧＴＴＧＴＣＣＣＣＣＴＡＡＣＧＧＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＴＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＡＧＴＴＡＣＡＡＧＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＡＧＣＴＴＴＧＣＡＧＧＡＴＴＣＧＧＧＡＴＴＡＧＡＡＧＴＡＡＡＣＡＴＡＧＴＧＡＣＡＧＡＣＴＣＡＣＡＡＴＡＴＧＣＡＴＴＧＧＧＡＡＴＣＡＴＴＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣＣＡＧＡＴＡＡＧＡＧＴＧＡＡＴＣＡＧＡＧＴＴＡＧＴＣＡＧＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＴＣＴＡＣＣＴＧＧＣＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＡＡＴＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＡＧＴＡＣＴＡＴＴＴＴＴＡＧＡＴＧＧＡＡＴＡＧＡＴＡＡＧＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＴＡＴＣＡＣＡＧＴＡＡＴＴＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴＴＡＡＣＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＴＡＧＴＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＡＧＣＣＡＧＣＴＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧＴＣＡＧＣＴＡＡＡＡＧＧＧＧＡＡＧＣＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＧＧＡＡＴＡＴＧＧＣＡＧＣＴＡＧＡＴＴＧＴＡＣＡＣＡＴＴＴＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＴＴＡＴＣＴＴＧＧＴＡＧＣＡＧＴＴＣＡＴＧＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＴＡＴＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＡＡＡＡＴＴＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＡＧＴＡＡＡＡＡＣＡＧＴＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣＡＡＴＧＧＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＡＧＴＡＣＴＡＣＡＧＴＴＡＡＧＧＣＣＧＣＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＴＣＡＡＧＣＡＧＧＡＡＴＴＴＧＧＣＡＴＴＣＣＣＴＡＣＡＡＴＣＣＣＣＡＡＡＧＴＣＡＡＧＧＡＧＴＡＡＴＡＧＡＡＴＣＴＡＴＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＡＴＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＡＧＡＧＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＡＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＴＴＧＧＧＧＧＧＴＡＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＡＴＡＧＴＡＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＣＡＡＣＡＧＡＣＡＴＡＣＡＡＡＣＴＡＡＡＧＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＴＴＴＣＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＣＡＧＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＧＡＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＧＧＣＡＧＴＡＧＴＡＡＴＡＣＡＡＧＡＴＡＡＴＡＧＴＧＡＣＡＴＡＡＡＡＧＴＡＧＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＴＣＡＴＣＡＧＧＧＡＴＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＴＧＴＧＴＧＧＣＡＡＧＴＡＧＡＣＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＡ（配列番号７０）
【０２３２】
次に、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ隣接制限部位を有する、Ｒｅｖ、ＲＲＥ、およびウサギベータグロビンポリＡ配列を含有するＤＮＡ断片を、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。次いでこのＤＮＡ断片を、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてプラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は次の通りであった：
【０２３３】
ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＣＴＣＡＴＣＡＧＡＡＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＣＣＡＴＴＣＧＡＴＴＡＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＣＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＡＴＣＴＧＧＧＡＣＧＡＴＣＴＧＣＧＧＡＧＣＣＴＧＴＧＣＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＣＴＴＧＡＧＡＧＡＣＴＴＡＣＴＣＴＴＧＡＴＴＧＴＡＡＣＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＧＡＣＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＡＡＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＴＣＣＴＡＣＡＡＴＡＴＴＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＧＣＴＡＡＡＧＡＡＴＡＧＡＧＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＧＴＴＣＴＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＴＡＴＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＣＴＧＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＴＴＡＴＴＧＴＣＴＧＧＴＡＴＡＧＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＴＴＴＧＣＴＧＡＧＧＧＣＴＡＴＴＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣＡＡＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＡＴＡＣＣＴＡＡＡＧＧＡＴＣＡＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＧＧＣＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＡＧＡＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＴＴＧＧＣＡＡＣＡＴＡＴＧＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＴＡＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴＣＡＧＴＡＴＡＴＧＡＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣＡＴＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＧＡＣＴＴＧＡＧＧＴＴＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣＣＣＴＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＧＣＣＡＧＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧ（配列番号７１）
【０２３４】
最後に、ｐＣＤＮＡ３．１のＣＭＶプロモーターを、ＣＡＧエンハンサー／プロモーター＋ニワトリベータアクチンイントロン配列に置き換えた。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ隣接制限部位を有する、ＣＡＧエンハンサー／プロモーター／イントロン配列を含有するＤＮＡ断片を、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。次いでこのＤＮＡ断片を、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位においてプラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は次の通りであった：
【０２３５】
ＡＣＧＣＧＴＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＧＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＧＡＡＴＴＣ（配列番号７２）
【０２３６】
ＶＳＶ−Ｇエンベローププラスミドの構築：
【０２３７】
隣接するＥｃｏＲＩ制限部位を有する水疱性口内炎Ｉｎｄｉａｎａウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）配列を、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。次いでこのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ制限部位においてｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ＣＭＶ特異的なプライマーを使用したシーケンシングによって正しい方向を決定した。ＤＮＡ配列は次の通りであった。
【０２３８】
ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＴＴＴＴＡＴＴＣＡＴＴＧＧＧＧＴＧＡＡＴＴＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＣＡＴＡＧＴＴＴＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＣＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＣＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡＣＣＡＴＴＡＴＴＧＣＣＣＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＣＡＴＡＡＴＧＡＣＴＴＡＡＴＡＧＧＣＡＣＡＧＣＣＴＴＡＣＡＡＧＴＣＡＡＡＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＧＴＣＡＣＡＡＧＧＣＴＡＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＧＧＴＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＡＴＧＣＴＴＣＣＡＡＡＴＧＧＧＴＣＡＣＴＡＣＴＴＧＴＧＡＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＴＡＴＧＧＡＣＣＧＡＡＧＴＡＴＡＴＡＡＣＡＣＡＴＴＣＣＡＴＣＣＧＡＴＣＣＴＴＣＡＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＡＧＡＡＣＡＡＴＧＣＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴＧＡＡＣＡＡＡＣＧＡＡＡＣＡＡＧＧＡＡＣＴＴＧＧＣＴＧＡＡＴＣＣＡＧＧＣＴＴＣＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＧＴＴＧＴＧＧＡＴＡＴＧＣＡＡＣＴＧＴＧＡＣＧＧＡＴＧＣＣＧＡＡＧＣＡＧＴＧＡＴＴＧＴＣＣＡＧＧＴＧＡＣＴＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＴＧＣＴＧＧＴＴＧＡＴＧＡＡＴＡＣＡＣＡＧＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＡＴＴＣＡＣＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＣＧＧＡＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＴＴＡＣＡＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＡＴＡＡＣＴＣＴＡＣＡＡＣＣＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＴＡＴＡＡＧＧＴＣＡＡＡＧＧＧＣＴＡＴＧＴＧＡＴＴＣＴＡＡＣＣＴＣＡＴＴＴＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＧＡＧＧＡＣＧＧＡＧＡＧＣＴＡＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧＴＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＣＴＡＣＴＴＴＧＣＴＴＡＴＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＣＡＡＡＡＴＧＣＡＡＴＡＣＴＧＣＡＡＧＣＡＴＴＧＧＧＧＡＧＴＣＡＧＡＣＴＣＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＴＣＴＧＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＴＧＡＴＡＡＧＧＡＴＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＴＣＣＣＴＧＡＡＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＧＴＣＡＡＧＴＡＴＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＡＡＧＴＣＴＡＡＴＴＣＡＧＧＡＣＧＴＴＧＡＧＡＧＧＡＴＣＴＴＧＧＡＴＴＡＴＴＣＣＣＴＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＣＴＴＧＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＣＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＧＴＣＣＴＧＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＡＡＡＴＡＣＴＴＴＧＡＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＡＧＡＧＴＣＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＣＴＣＴＣＡＡＧＡＡＴＧＧＴＣＧＧＡＡＴＧＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＧＡＡＡＧＧＧＡＡＣＴＧＴＧＧＧＡＴＧＡＣＴＧＧＧＣＡＣＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＣＧＴＧＧＡＡＡＴＴＧＧＡＣＣＣＡＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＴＴＣＡＧＧＡＴＡＴＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＡＴＡＣＡＴＧＡＴＴＧＧＡＣＡＴＧＧＴＡＴＧＴＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＡＧＣＴＣＡＡＡＧＧＣＴＣＡＧＧＴＧＴＴＣＧＡＡＣＡＴＣＣＴＣＡＣＡＴＴＣＡＡＧＡＣＧＣＴＧＣＴＴＣＧＣＡＡＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＧＧＧＣＴＡＴＣＣＡＡＡＡＡＴＣＣＡＡＴＣＧＡＧＣＴＴＧＴＡＧＡＡＧＧＴＴＧＧＴＴＣＡＧＴＡＧＴＴＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＴＡＴＴＧＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＴＣＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＴＧＧＡＣＴＡＴＴＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＣＧＡＧＴＴＧＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴＧＣＡＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＡＣＡＧＡＴＴＴＡＴＡＣＡＧＡＣＡＴＡＧＡＧＡＴＧＡＧＡＡＴＴＣ（配列番号７３）
【０２３９】
本明細書に記載される方法および材料を使用し、４ベクターシステム（すなわち、３ベクターレンチウイルスパッケージング系）もデザインし、産生した。この４ベクターシステムの概略は図５に示されている。図５を参照しながら簡潔に述べると、最上部のベクターは、この場合はＲｅｖを含まないヘルパープラスミドである。上から２番目のベクターは、別個のＲｅｖプラスミドである。下から２番目のベクターは、エンベローププラスミドである。最下部のベクターは、これまでに記載した治療用ベクターである。
【０２４０】
図５を部分的に参照すると、ヘルパープラスミドは、ＣＡＧエンハンサー（配列番号３９）、ＣＡＧプロモーター（配列番号４０）、ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号４１）、ＨＩＶ  ｇａｇ（配列番号４２）、ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号４３）、ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号４４）、ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号４５）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号４７）を含む。
【０２４１】
Ｒｅｖプラスミドは、ＲＳＶプロモーターおよびＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号７５）、ならびにウサギベータグロビンポリＡ（配列番号６０）を含む。
【０２４２】
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号４９）、ベータグロビンイントロン（配列番号５０）、ＶＳＶ−Ｇ（配列番号５１）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号５６）を含む。
【０２４３】
ヘルパー、Ｒｅｖ、およびエンベローププラスミドを含む３ベクターレンチウイルスパッケージング系の合成。
【０２４４】
材料および方法：
【０２４５】
Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドの構築：
【０２４６】
ＲＲＥおよびウサギベータグロビンポリＡ配列を含有するＤＮＡ断片を挿入することにより、Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドを構築した。隣接するＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位を有するこの配列は、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。次いでこのＲＲＥ／ウサギポリＡベータグロビン配列を、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてヘルパープラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は次の通りである：
【０２４７】
ＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＧＴＴＣＴＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＴＡＴＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＣＴＧＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＴＴＡＴＴＧＴＣＴＧＧＴＡＴＡＧＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＴＴＴＧＣＴＧＡＧＧＧＣＴＡＴＴＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣＡＡＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＡＴＡＣＣＴＡＡＡＧＧＡＴＣＡＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＧＧＣＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＡＧＡＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＴＴＧＧＣＡＡＣＡＴＡＴＧＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＴＡＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴＣＡＧＴＡＴＡＴＧＡＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣＡＴＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＧＡＣＴＴＧＡＧＧＴＴＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣＣＣＴＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＧＣＣＡＧＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＣＣＣＧＧＧ（配列番号７４）
【０２４８】
Ｒｅｖプラスミドの構築：
【０２４９】
隣接するＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位を有するＲＳＶプロモーターおよびＨＩＶ  Ｒｅｖ配列を、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎにより、単一のＤＮＡ断片として合成した。次いでこのＤＮＡ断片を、ＣＭＶプロモーターが、ＲＳＶプロモーターに置き換えられているＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位においてｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。ＤＮＡ配列は次の通りであった：
【０２５０】
ＣＡＡＴＴＧＣＧＡＴＧＴＡＣＧＧＧＣＣＡＧＡＴＡＴＡＣＧＣＧＴＡＴＣＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＡＧＧＧＴＧＴＧＴＴＴＡＧＧＣＧＡＡＡＡＧＣＧＧＧＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴＡＣＧＣＧＧＴＴＡＧＧＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＧＧＡＴＡＴＡＧＴＡＧＴＴＴＣＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＡＡＡＴＧＴＡＧＴＣＴＴＡＴＧＣＡＡＴＡＣＡＣＴＴＧＴＡＧＴＣＴＴＧＣＡＡＣＡＴＧＧＴＡＡＣＧＡＴＧＡＧＴＴＡＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＴＴＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＴＧＣＡＴＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＡＡＧＧＴＧＧＴＡＣＧＡＴＣＧＴＧＣＣＴＴＡＴＴＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＴＴＧＧＡＣＧＡＡＣＣＡＣＴＧＡＡＴＴＣＣＧＣＡＴＴＧＣＡＧＡＧＡＴＡＡＴＴＧＴＡＴＴＴＡＡＧＴＧＣＣＴＡＧＣＴＣＧＡＴＡＣＡＡＴＡＡＡＣＧＣＣＡＴＴＴＧＡＣＣＡＴＴＣＡＣＣＡＣＡＴＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＴＣＧＡＡＧＣＴＡＧＣＧＡＴＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＴＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＣＣＡＴＴＣＧＡＴＴＡＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＣＴＴＡＴＣＴＧＧＧＡＣＧＡＴＣＴＧＣＧＧＡＧＣＣＴＧＴＧＣＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＣＴＴＧＡＧＡＧＡＣＴＴＡＣＴＣＴＴＧＡＴＴＧＴＡＡＣＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＧＡＣＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＡＡＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＴＣＣＴＡＣＡＡＴＡＴＴＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＧＣＴＡＡＡＧＡＡＴＡＧＴＣＴＡＧＡ（配列番号７５）
【０２５１】
２ベクターおよび３ベクターのパッケージング系のためのプラスミドは、同様のエレメントで改変することができ、イントロン配列は、ベクターの機能を損失することなく除去できる可能性があった。例えば、以下のエレメントは、２ベクターおよび３ベクターのパッケージング系において同様のエレメントに取って代わることができた。
【０２５２】
プロモーター：伸長因子１（ＥＦ−１）（配列番号４）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）（配列番号５２）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）（配列番号５３）は、ＣＭＶ（配列番号４９）またはＣＡＧプロモーター（配列番号８０）に取って代わることができる。これらの配列は、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
【０２５３】
ポリＡ配列：ＳＶ４０ポリＡ（配列番号５４）およびｂＧＨポリＡ（配列番号５５）は、ウサギベータグロビンポリＡ（配列番号４７）に取って代わることができる。これらの配列は、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
【０２５４】
ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ配列：ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶ株またはクレードから構築されていてよい。例えば、Ｂａｌ株由来のＨＩＶ  Ｇａｇ（配列番号５６）、ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号５７）、およびＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号５８）は、本明細書に概説されるヘルパー／ヘルパー＋Ｒｅｖプラスミドに含有されるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｉｎｔ配列と交換することができる。これらの配列は、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
【０２５５】
エンベロープ：ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質は、ネコ内在性ウイルス（ＲＤ１１４）（配列番号５９）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）（配列番号６０）、狂犬病（ＦＵＧ）（配列番号６１）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）（配列番号６２）、インフルエンザＡ家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）（配列番号６３）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）（配列番号６４）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）（配列番号６５）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）（配列番号６６）由来の膜糖タンパク質で置換され得る。これらのエンベロープの配列は、本明細書の配列の部分において特定される。さらに、これらの配列は、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
【０２５６】
まとめると、３ベクターシステム対４ベクターシステムは、部分的には次のように比較および対比することができる。３ベクターのレンチウイルスベクターシステムは、１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ、およびＲｅｖ／Ｔａｔ；２．エンベローププラスミド：ＶＳＶ−Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；ならびに３．治療用ベクター：ＲＳＶ  ５’ＬＴＲ、Ｐｓｉパッケージングシグナル、Ｇａｇ断片、ＲＲＥ、Ｅｎｖ断片、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥ、および３’デルタＬＴＲを含有する。４ベクターのレンチウイルスベクターシステムは、１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ；２．Ｒｅｖプラスミド：Ｒｅｖ；３．エンベローププラスミド：ＶＳＶ−Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；ならびに４．治療用ベクター：ＲＳＶ  ５’ＬＴＲ、Ｐｓｉパッケージングシグナル、Ｇａｇ断片、ＲＲＥ、Ｅｎｖ断片、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥ、および３’デルタＬＴＲを含有する。上記のエレメントに対応する配列は、本明細書の配列表の部分において特定される。
【０２５７】
（実施例２：抗ＨＩＶレンチウイルスベクターの開発）
この実施例の目的は、抗ＨＩＶレンチウイルスベクターを開発することであった。
【０２５８】
阻害性ＲＮＡのデザイン。Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓケモカインＣ−Ｃモチーフ受容体５（ＣＣＲ５）（ＧＣ０３Ｐ０４６３７７）のｍＲＮＡ配列を使用して、ヒト細胞においてＣＣＲ５レベルをノックダウンする潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を検索した。Ｂｒｏａｄ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのプログラムまたはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉ  ＤｅｓｉｇｎｅｒなどのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡデザインプログラムによって選択された候補から、潜在的なＲＮＡ干渉配列を選択した。選択された個々のｓｈＲＮＡ配列を、レンチウイルスベクターのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばＨ１、Ｕ６、または７ＳＫのすぐ３’側に挿入して、ｓｈＲＮＡ発現を調節した。これらのレンチウイルス−ｓｈＲＮＡ構築物を使用して細胞の形質導入を行い、特異的なｍＲＮＡレベルの変化を測定した。ｍＲＮＡレベルを低下させるために最も強力なｓｈＲＮＡをマイクロＲＮＡ骨格内に個々に包埋して、ＣＭＶまたはＥＦ−１アルファＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターのいずれかによる発現を可能にした。マイクロＲＮＡ骨格は、mirbase.orgから選択した。ＲＮＡ配列を合成ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとしても合成し、レンチウイルスベクターを使用せずに細胞に直接導入した。
【０２５９】
ヒト免疫不全ウイルス１型のＢａｌ株（ＨＩＶ−１  ８５ＵＳ＿ＢａＬ、受託番号ＡＹ７１３４０９）のゲノム配列を使用して、ヒト細胞におけるＨＩＶ複製レベルをノックダウンする潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を検索した。配列相同性および経験に基づいて、この検索ではＨＩＶのＴａｔおよびＶｉｆ遺伝子の領域に焦点を合わせたが、当業者には、これらの領域の使用は非限定的であり、他の潜在的な標的が選択され得ることは理解されよう。重要なことに、ｇａｇまたはｐｏｌ遺伝子の高度に保存された領域は、ベクターの製造に必要なパッケージング系補完プラスミドにこれらと同じ配列が存在したため、ｓｈＲＮＡによってターゲティングすることができなかった。ＣＣＲ５（ＮＭ  ０００５７９．３、ＮＭ  ００１１００１６８．１特異的）ＲＮＡと同様に、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが主催しているＧｅｎｅ−Ｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（broadinstitute.org/mai/public）またはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（rnadesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setOption.do?designOption=shrna&pid=6712627360706061801）などのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡデザインプログラムによって選択された候補から、潜在的なＨＩＶ特異的ＲＮＡ干渉配列を選択した。選択された個々のｓｈＲＮＡ配列を、レンチウイルスベクターのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばＨ１、Ｕ６、または７ＳＫのすぐ３’側に挿入して、ｓｈＲＮＡ発現を調節した。これらのレンチウイルス−ｓｈＲＮＡ構築物を使用して細胞の形質導入を行い、特異的なｍＲＮＡレベルの変化を測定した。ｍＲＮＡレベルを低下させるために最も強力なｓｈＲＮＡをマイクロＲＮＡ骨格内に個々に包埋して、ＣＭＶまたはＥＦ−１アルファＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターのいずれかによる発現を可能にした。
【０２６０】
ベクターの構築。ＣＣＲ５、Ｔａｔ、またはＶｉｆのｓｈＲＮＡについて、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有するオリゴヌクレオチド配列を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ，ＬＬＣによって合成した。重複するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を混合し、セ氏７０度から室温に冷却中にアニールした。レンチウイルスベクターを、セ氏３７度で１時間にわたり、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。消化されたレンチウイルスベクターをアガロースゲル電気泳動によって精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を決定し、ベクターとオリゴ（３：１比）を混合し、アニールさせ、ライゲートした。ライゲーション反応は、室温で３０分間Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて行った。２．５マイクロリットルのライゲーションミックスを、２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に添加した。セ氏４２度での熱ショック後に形質転換が達成された。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を広げ、薬物耐性コロニー（アンピシリン耐性プラスミドの存在を示す）を回収し、精製し、ＬＢブロスにおいて拡大増殖させた。オリゴ配列の挿入を調べるために、採取した細胞培養物からＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡミニプレップキットを用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。ｓｈＲＮＡ発現を調節するために使用したプロモーターに特異的なプライマーを使用したＤＮＡシーケンシングにより、レンチウイルスベクターにおけるｓｈＲＮＡ配列の挿入を検証した。ＨＩＶ複製を制限することが決定された例示的なベクター配列は図７に見出すことができる。ＣＣＲ５、Ｔａｔ、およびＶｉｆ遺伝子発現に対する最も高い活性を有するｓｈＲＮＡ配列を、ｍｉＲ３０、ｍｉＲ２１、およびｍｉＲ１８５骨格にアッセンブルした。これは、ｍｉＲ３０  ＣＣＲ５（配列番号８７）、ｍｉＲ２１  Ｖｉｆ（配列番号８８）、およびｍｉＲ１８５  Ｔａｔ（配列番号８９）配列に帰着した。配列番号８７、８８、および８９の下線のある配列は、ｓｈＲＮＡ配列を有する骨格を表わす。配列番号８７、８８、８９の下線のない配列は、制限認識配列を表わす。
【０２６１】
ベクターの開発
【０２６２】
これらの実験のために開発したベクターのすべてが必ずしも予想され得た通りに機能したとは限らないことに留意されたい。より具体的には、ＨＩＶに対するレンチウイルスベクターは、１）標的細胞表面上のＨＩＶ結合タンパク質（受容体）のレベルを低下させて初期のウイルスの付着および侵入を遮断する阻害性ＲＮＡ、２）ウイルスＴａｔタンパク質を隔離し、ウイルス遺伝子発現をトランス活性化するその能力を減少させる、ＨＩＶ  ＴＡＲ配列の過剰発現、および３）ＨＩＶゲノム内の重要な保存配列を攻撃する阻害性ＲＮＡという、３つの主要な成分を含み得る。
【０２６３】
上記の第１の点に関して、重要な細胞表面ＨＩＶ結合タンパク質は、ケモカイン受容体ＣＣＲ５である。ＨＩＶ粒子は、ＣＤ４およびＣＣＲ５細胞表面タンパク質に結合することにより、感受性Ｔ細胞に付着する。ＣＤ４は、Ｔ細胞の免疫学的機能に重要な細胞表面上の必須の糖タンパク質であるため、その発現レベルを操作するための標的として、これは選択しなかった。しかしながら、ＣＣＲ５遺伝子のヌル変異のホモ接合体として生まれ、受容体発現が完全に欠如している人々は、いくつかの感染性疾患に対する感受性の増強および稀な自己免疫が発生する可能性を除いては通常の生活を送る。よって、ＣＣＲ５の調整は比較的安全なアプローチであると決定され、抗ＨＩＶレンチウイルスベクターの開発における主要な標的であった。
【０２６４】
上記の第２の点に関して、ウイルスＴＡＲ配列は、ウイルスＴａｔタンパク質と密に結合するＨＩＶゲノムＲＮＡの高度に構造化された領域である。Ｔａｔ：ＴＡＲ複合体は、ウイルスＲＮＡの効率的な生成に重要である。ＴＡＲ領域の過剰発現は、Ｔａｔタンパク質を隔離し、ウイルスＲＮＡのレベルを低下させる、デコイ分子として想定された。しかしながら、ＴＡＲは、レンチウイルス粒子の製造に使用された細胞を含め、ほとんどの哺乳動物細胞に対して毒性があることが証明された。さらにＴＡＲは、他の実験室においてウイルス遺伝子発現を阻害するのに非効率的であり、ＨＩＶ遺伝子療法において実行可能な成分としては却下された。
【０２６５】
様々な実施形態では、ｉ）一連のＨＩＶ単離物にわたり合理的に保存されている配列が、目的の地理的領域における流行を代表すること；ｉｉ）ウイルスベクター中の阻害性ＲＮＡの活性に起因するＲＮＡレベルの低下により、対応するタンパク質レベルが、ＨＩＶ複製を有意に低減させるのに十分な量だけ低下すること；およびｉｉｉ）阻害性ＲＮＡによりターゲティングされるウイルス遺伝子配列が、製造中にウイルスベクター粒子のパッケージングおよびアセンブリに必要とされる遺伝子に存在しないことという、３つの基準を満たすウイルス遺伝子配列が特定された。様々な実施形態では、ＨＩＶ  ＴａｔおよびＲｅｖ遺伝子の接合部における配列、ならびにＨＩＶ  Ｖｉｆ遺伝子内の第２の配列が、阻害性ＲＮＡによってターゲティングされた。Ｔａｔ／Ｒｅｖのターゲティングは、この領域はＨＩＶゲノム内のエンベロープ遺伝子と重複するため、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質の発現を低減させるというさらなる利益を有する。
【０２６６】
ベクターの開発および試験のための様々な方法は、まず好適な標的（本明細書に記載されている）を特定した後、細胞モデルで試験するための個々または複数の阻害性ＲＮＡ種を発現するプラスミドＤＮＡを構築し、最後に、抗ＨＩＶ機能が証明された阻害性ＲＮＡを含有するレンチウイルスベクターを構築することに依拠する。レンチウイルスベクターは、毒性、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生中の収量、およびＣＣＲ５発現レベルの低下またはウイルス遺伝子産物の低減によるウイルス複製の阻害という点でのＨＩＶに対する有効性について試験される。
【０２６７】
以下の表２は、複数のバージョンの阻害性構築物を通して臨床候補に到達するまでの進行を実証する。最初にｓｈＲＮＡ（短鎖相同ＲＮＡ）分子をデザインし、プラスミドＤＮＡ構築物から発現させた。
【０２６８】
以下の表２で詳述するプラスミド１〜４は、ＨＩＶのＧａｇ、Ｐｏｌ、およびＲＴ遺伝子に対するｓｈＲＮＡ配列を試験した。各ｓｈＲＮＡは細胞モデルにおいてウイルスタンパク質発現を抑制するのに活性であったが、さらなる開発を妨げた２つの重要な問題があった。第１に、これらの配列は、北米および欧州で現在循環しているクレードＢ  ＨＩＶ株を代表するものではないＨＩＶの実験室単離物に対してターゲティングされた。第２に、これらのｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクターパッケージング系において重要な成分をターゲティングし、製造中のベクター収量を大きく低減させることになる。表２で詳述するプラスミド５は、ＣＣＲ５をターゲティングするために選択され、リード候補配列をもたらした。表２で詳述するプラスミド６、７、８、９、１０、および１１は、ＴＡＲ配列を組み込んだものであり、レンチウイルスベクター製造に使用された細胞を含む哺乳動物細胞に対して許容されない毒性をもたらしたことが分かった。表２で詳述するプラスミド２は、Ｔａｔ  ＲＮＡ発現を低減させることができるリードｓｈＲＮＡ配列を特定した。表２で詳述するプラスミド１２は、レンチウイルスベクターにおいてマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）として発現されるｓｈＣＣＲ５の有効性を実証し、これが最終産物に存在するはずであることを裏付けた。表２で詳述するプラスミド１３は、レンチウイルスベクターにおいてマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）として発現されるｓｈＶｉｆの有効性を実証し、これが最終産物に存在するはずであることを裏付けた。表２で詳述するプラスミド１４は、レンチウイルスベクターにおいてマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）として発現されるｓｈＴａｔの有効性を実証し、これが最終産物に存在するはずであることを裏付けた。表２で詳述するプラスミド１５は、単一のプロモーターから発現されたｍｉＲクラスターの形態で、ｍｉＲ  ＣＣＲ５、ｍｉＲ  ＴａｔおよびｍｉＲ  Ｖｉｆを含有した。これらのｍｉＲは、レンチウイルスベクターパッケージング系において重要な成分をターゲティングせず、哺乳動物細胞に対して無視できる毒性を有することが証明された。クラスター内のｍｉＲは、以前に試験された個々のｍｉＲに対して等しく有効であり、全体的な影響は、ＣＣＲ５向性ＨＩＶ  ＢａＬ株の複製の実質的な低減であった。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【０２６９】
機能アッセイ。ＣＣＲ５、Ｔａｔ、またはＶｉｆ  ｓｈＲＮＡコード配列（例えば、配列番号１、２および３）を含有する個々のレンチウイルスベクター、ならびに、実験の目的で、ＣＭＶ最初期プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現し、ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰと呼称されるレンチウイルスベクターを、ＣＣＲ５、Ｔａｔ、またはＶｉｆの発現をノックダウンする能力について試験した。ポリブレンの存在下または非存在下のいずれかで、哺乳動物細胞にレンチウイルス粒子を形質導入した。２〜４日後に細胞を収集し、タンパク質およびＲＮＡをＣＣＲ５、Ｔａｔ、またはＶｉｆの発現について分析した。ウェスタンブロットアッセイまたは特異的な蛍光抗体による細胞の標識（ＣＣＲ５アッセイ）後、ＣＣＲ５特異的抗体またはアイソタイプ対照抗体のいずれかを使用し、改変および非改変細胞の蛍光を比較する分析的フローサイトメトリーによって、タンパク質レベルを試験した。
【０２７０】
レンチウイルス試験の開始。１０％  ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０を使用してＴ細胞培養培地を作った。ＩＬ−２  １０，０００単位／ｍｌ、ＩＬ−１２  １μｇ／ｍｌ、ＩＬ−７  １μｇ／ｍｌ、ＩＬ−１５  １μｇ／ｍｌのサイトカインストックも事前に調製した。
【０２７１】
レンチウイルスを形質導入する前に、感染性ウイルス力価を決定し、適切な感染多重度（ＭＯＩ）になるように添加するためのウイルスの量を算出した。
【０２７２】
０〜１２日目：抗原特異的濃縮。０日目、凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、１０分間１２００ｒｐｍにて１０ｍｌの３７℃培地で洗浄し、２×１０６／ｍｌの濃度で３７℃培地に再懸濁した。この細胞を、２４ウェルプレート中０．５ｍｌ／ウェルにて、３７℃、５％  ＣＯ２で培養した。最適な刺激条件を定義するために、以下の表３に列挙した試薬の組み合わせで細胞を刺激した。
【表３】
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【０２７３】
最終濃度：ＩＬ−２＝２０単位／ｍｌ、ＩＬ−１２＝１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−７＝１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−１５＝１０ｎｇ／ｍｌ、ペプチド＝５μｇ／ｍｌの個々のペプチド、ＭＶＡ  ＭＯＩ＝１。
【０２７４】
４日目および８日目、０．５ｍｌの新鮮培地およびサイトカインを列挙した濃度で（濃度はすべて培養物中の最終濃度を示す）、刺激した細胞に添加した。
【０２７５】
１２〜２４日目：非特異的拡大増殖およびレンチウイルス形質導入。１２日目、刺激した細胞をピペット操作によりプレートから取り出し、新鮮なＴ細胞培養培地に１×１０６／ｍｌの濃度で再懸濁した。再懸濁した細胞をＴ２５培養フラスコに移し、製造元の説明に従い、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８と、それに加えて上記に列挙したサイトカインで刺激した。フラスコを垂直姿勢でインキュベートした。
【０２７６】
１４日目、ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰをＭＯＩ２０で添加し、培養物を２日間インキュベーターに戻した。このとき、細胞をピペット操作により回収し、１３００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって収集し、同じ体積の新鮮培地に再懸濁し、再び遠心分離して緩い細胞ペレットを形成した。この細胞ペレットを、先行ステップで使用したものと同じサイトカインを含む新鮮培地に、１ｍｌあたりの生存細胞０．５×１０６個の細胞で再懸濁した。
【０２７７】
１４〜２３日目にかけて、細胞の数を２日ごとに評価し、細胞を新鮮培地で０．５×１０６／ｍｌに希釈した。サイトカインは毎回添加した。
【０２７８】
２４日目に細胞を収集し、細胞からビーズを除去した。ビーズを除去するため、２分間にわたり、選別用磁石に入れた好適な管に細胞を移した。細胞を含有する上清を新しい管に移した。次いで細胞を新鮮培地中１×１０６／ｍｌで１日間培養した。アッセイを行い、抗原特異的Ｔ細胞およびレンチウイルスを形質導入した細胞の頻度を決定した。
【０２７９】
可能性のあるウイルス増大を防止するため、アンプレナビル（０．５ｎｇ／ｍｌ）を刺激の第１日目および培養中１日おきに培養物に添加した。
【０２８０】
ＩＦＮガンマの細胞内サイトカイン染色により抗原特異的Ｔ細胞を調査する。ペプチド刺激後または１×１０６細胞／ｍｌでのレンチウイルス形質導入後の培養細胞を、培地単独（陰性対照）、Ｇａｇペプチド（５μｇ／ｍｌの個々のペプチド）、またはＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ、陽性対照）で刺激した。４時間後、ＢＤ  ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（１：１０００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加してゴルジ輸送を遮断した。８時間後、細胞を洗浄し、製造元の説明に従ってＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キットを用い、細胞外抗体（ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および細胞内抗体（ＩＦＮガンマ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで試料を分析した。適切なアイソタイプ適合抗体で標識した対照試料を各実験に含めた。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用してデータを分析した。
【０２８１】
レンチウイルス形質導入率をＧＦＰ＋細胞の頻度によって決定した。形質導入された抗原特異的Ｔ細胞をＣＤ３＋ＣＤ４＋ＧＦＰ＋ＩＦＮガンマ＋細胞の頻度によって決定する。ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＧＦＰ＋ＩＦＮガンマ＋細胞の試験は対照として含まれている。
【０２８２】
これらの結果は、ＨＩＶ特異的タンパク質の発現を特異的にノックダウンするようにデザインされたレンチウイルスを標的Ｔ細胞集団のＣＤ４  Ｔ細胞に形質導入することにより、ウイルスに対して免疫があるＴ細胞の拡大増殖可能な集団が産生され得ることを示す。この実施例は、開示されているレンチウイルス構築物をワクチン接種と組み合わせて使用するとＨＩＶ患者の機能的治癒がもたらされ得ることを示す概念の証拠として機能する。
【０２８３】
（実施例３：ＨＩＶの処置のための臨床研究）
ＡＧＴ１０３−Ｔは、ＡＧＴ１０３レンチウイルスベクターも形質導入されている、＞１×１０７個のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を含有する、遺伝子改変された自己ＰＢＭＣである。
【０２８４】
第Ｉ相臨床治験では、ｃＡＲＴを受けている間に、ＨＩＶ感染、血液１ｍｍ３あたりＣＤ４＋Ｔ細胞数＞５００個の細胞、および血漿１ｍｌあたり２００個未満のコピーの安定なウイルス抑制が確認された、成人の研究参加者に、ｅｘ  ｖｉｖｏで改変された自己ＣＤ４  Ｔ細胞（ＡＧＴ１０３−Ｔ）を注入することの安全性および実現可能性を試験する。研究参加者はすべて、第Ｉ相臨床治験の間、各自の標準的な抗レトロウイルス薬物適用を継続して受けることになる。最大４０名の研究参加者が、ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖタンパク質を発現する組換え改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ｒＭＶＡ）の筋肉内注射による２用量を８週間おいて受ける。第２の免疫化の７〜１０日後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のために血液試料を収集し、ＨＩＶ−１  Ｇａｇポリタンパク質を代表する重複する合成ペプチドのプールによる刺激に応答するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を測定する。Ｇａｇ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度の測定に基づき、ワクチン応答者のうち上位半数の被験体を遺伝子療法アームに登録し、応答者のうち下位半数の被験体は研究を継続しない。上位の応答者のカットオフは、全ＣＤ４  Ｔ細胞のうち≧０．０６５％のＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度であることが予測される。本発明者らの治験の遺伝子療法アームに登録された被験体に白血球除去を施し、これに続いて、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養し、ＨＩＶ  Ｇａｇペプチドとインターロイキン２およびインターロイキン１２で１２日間刺激し、次いでＣＤ３／ＣＤ２８二重特異性抗体で修飾されたビーズで再度刺激した、ＰＢＭＣの精製を行う（Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離または抗体による陰性選択を使用する）。ｅｘ  ｖｉｖｏ培養中の自己ＨＩＶの出現を防止するため、抗レトロウイルス薬のサキナビルを１００ｎＭで含める。ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の１日後、１から１０の間の感染多重度でＡＧＴ１０３を細胞に形質導入する。形質導入された細胞をさらに７〜１４日間培養し、この間それらはポリクローナル増殖によって拡大増殖する。培養期間は、細胞を採取および洗浄し、効力および安全性リリースアッセイのためにアリコートを取っておき、残りの細胞を凍結保存培地に再懸濁することによって終了する。単回用量は、≦１×１０１０個の自己ＰＢＭＣである。効力アッセイは、インターフェロンガンマを発現することによりペプチド刺激に応答するＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を測定する。他のリリース基準としては、ＨＩＶ特異的でありＡＧＴ１０３も形質導入されているＣＤ４  Ｔ細胞が０．５×１０７個以上生成物に含まれていなければならないことが挙げられる。別のリリース基準は、細胞あたりのＡＧＴ１０３ゲノムコピー数が３を超えてはならないことである。ＡＧＴ１０３−Ｔ注入の５日前、被験体は、１用量のブスルフラム（busulfuram）（またはＣｙｔｏｘａｎ）の馴化レジメンの後、遺伝子改変されたＣＤ４  Ｔ細胞を含有する≦１×１０１０個のＰＢＭＣの注入を受ける。
【０２８５】
第ＩＩ相研究では、ＡＧＴ１０３−Ｔ細胞療法の有効度を評価する。第ＩＩ相研究の参加者には、本発明者らの第Ｉ相研究に既に登録しており、遺伝子改変された自己のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の成功裏かつ安定な生着を有し、有効度評価（１．３．）に記載されるようにモニタリングされるパラメータの肯定的な変化として定義される臨床応答を有すると判断された個体が含まれる。研究参加者は、各自の既存の抗レトロウイルス薬物適用のレジメンにマラビロクを加えるよう求められる。マラビロクは、ＣＣＲ５レベルの低下を目的とする遺伝子療法の有効性を増強するＣＣＲ５アンタゴニストである。マラビロクレジメンが実施されたら、被験体は、それまでの抗レトロウイルス薬物適用のレジメンを中止し、２８日間にわたり、または２回の連続した毎週の採血時の血漿中ウイルスＲＮＡレベルが１ｍｌあたり１０，０００を超えるまで、マラビロク単独療法のみを維持するよう求められる。ウイルス血症が持続的に高い場合、参加者は、各自のＨＩＶケアの医師の推奨に従ってマラビロクありまたはなしで、各自の元の抗レトロウイルス薬物レジメンに戻るよう要請される。
【０２８６】
マラビロク単独療法中に＞２８日間にわたって参加者のＨＩＶが抑制されたままである場合（血漿１ｍｌあたり２，０００未満のｖＲＮＡコピー）、４週間にわたってマラビロクの投薬を徐々に低減させるよう求められ、その後さらに２８日間にわたって集中的なモニタリングが行われる。マラビロク単独療法によるＨＩＶの抑制が維持された被験体は、機能的治癒を有するとみなされる。マラビロク退薬後でさえＨＩＶの抑制が維持される被験体も、機能的治癒を有する。６か月にわたって毎月モニタリングし、その後はさほど集中的でないモニタリングにより、機能的治癒の耐久性が確立される。
【０２８７】
患者の選択
【０２８８】
組み入れ基準：
・  年齢１８〜６０歳。
・  研究登録前に記録されたＨＩＶ感染。
・  研究期間中に抗レトロウイルス薬物レジメンを変更しないこと（医療上の指示がある場合を除く）を含め、研究により強制される評価に従う意志がなければならない。
・  １立方ミリメートルあたりＣＤ４＋Ｔ細胞数＞５００個の細胞（細胞／ｍｍ３）
・  ＞４００個の細胞／ｍｍ３のＣＤ４＋Ｔ細胞最下点
・  ＨＩＶウイルス量＜１，０００コピー／ミリリットル（ｍＬ）
除外基準：
・  何らかのウイルス肝炎
・  急性ＨＩＶ感染
・  ＨＩＶウイルス量＞１，０００コピー／ｍＬ
・  活発または最近（過去６か月）のＡＩＤＳを定義する合併症
・  研究登録から１２週間以内におけるＨＩＶ薬物適用の何らかの変化
・  処置に成功した皮膚の基底細胞癌を除く、少なくとも５年間にわたって寛解していないがんまたは悪性疾患
・  ＮＹＨＡグレード３もしくは４のうっ血性心不全または制御不良の狭心症もしくは不整脈の現在の診断
・  出血障害歴
・  過去３０日間の慢性的なステロイドの使用
・  妊娠中または授乳中
・  能動的な薬物またはアルコールの乱用
・  過去３０日間の深刻な病気
・  別の臨床治験に現在参加しているか、または何らかの以前の遺伝子療法
【０２８９】
安全性評価
・  急性注入反応
・  注入後安全性追跡調査
【０２９０】
有効度評価  −  第Ｉ相
・  改変ＣＤ４  Ｔ細胞の数および頻度。
・  改変ＣＤ４  Ｔ細胞の耐久性。
・  メモリーＴ細胞機能の尺度としてのＧａｇペプチド再刺激に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答（ＩＣＳアッセイ）。
・  ワクチン接種前および後の時点と比較した多機能性の抗ＨＩＶ  ＣＤ８  Ｔ細胞応答。
・  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後に二重スプライシングされたＨＩＶ  ｍＲＮＡを作るＣＤ４  Ｔ細胞の頻度。
【０２９１】
有効度評価  −  第ＩＩ相
・  遺伝子改変ＣＤ４  Ｔ細胞の数および頻度。
・  マラビロク単独療法によるウイルス抑制の維持（１ｍｌあたり＜２，０００個のｖＲＮＡコピー、ただし２回連続した毎週の採血で１ｍｌあたりのｖＲＮＡコピーが５×１０４を超えない場合は許容される）。
・  マラビロク投与中および退薬後のウイルス抑制の持続。
・  安定なＣＤ４  Ｔ細胞数。
【０２９２】
ＡＧＴ１０３−Ｔは、≧１×１０７個のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を含有し、ＡＧＴ１０３レンチウイルスベクターも形質導入されている、最大１×１０１０個の遺伝子改変された自己ＣＤ４＋Ｔ細胞からなる。第Ｉ相臨床治験では、ｃＡＲＴを受けている間に、ＨＩＶ感染、血液１ｍｍ３あたりＣＤ４＋Ｔ細胞数＞５００個の細胞、および血漿１ｍｌあたり２００個未満のコピーの安定なウイルス抑制が確認された、成人の研究参加者において、ｅｘ  ｖｉｖｏで改変された自己ＣＤ４  Ｔ細胞（ＡＧＴ１０３−Ｔ）を注入することの安全性および実現可能性を試験する。最大４０名の研究参加者が、ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖタンパク質を発現する組換え改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ｒＭＶＡ）の筋肉内注射による２回の用量を８週間おいて受ける。第２の免疫化の７〜１０日後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のために血液試料を収集し、ＨＩＶ−１  Ｇａｇポリタンパク質を代表する重複する合成ペプチドのプールによる刺激に応答するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を測定する。Ｇａｇ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度の測定に基づき、ワクチン応答者のうち上位半数の被験体を遺伝子療法アームに登録し、応答者のうち下位半数の被験体は研究を継続しない。上位の応答者のカットオフは、全ＣＤ４  Ｔ細胞のうち≧０．０６５％のＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度であることが予測される。本発明者らの治験の遺伝子療法アームに登録された被験体に白血球除去を施し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を陰性選択によって濃縮する。濃縮されたＣＤ４サブセットをＣＤ４陰性サブセットの細胞数の１０％と混合して、供給源および抗原提示細胞を提供する。濃縮されたＣＤ４  Ｔ細胞をＨＩＶ  Ｇａｇペプチドとインターロイキン２およびインターロイキン１２で１２日間刺激し、次いで、ＣＤ３／ＣＤ２８二重特異性抗体で修飾されたビーズで再度刺激する。ｅｘ  ｖｉｖｏ培養中の自己ＨＩＶの出現を防止するため、抗レトロウイルス薬のサキナビルを１００ｎＭで含める。ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の１日後、１から１０の間の感染多重度でＡＧＴ１０３を細胞に形質導入する。形質導入された細胞をさらに７〜１４日間培養し、この間それらはポリクローナル増殖によって拡大増殖する。培養期間は、細胞を採取および洗浄し、効力および安全性リリースアッセイのためにアリコートを取っておき、残りの細胞を凍結保存培地に再懸濁することによって終了する。単回用量は、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットが濃縮された≦１×１０１０個の自己細胞である。効力アッセイは、インターフェロンガンマを発現することによりペプチド刺激に応答するＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を測定する。他のリリース基準としては、ＨＩＶ特異的でありＡＧＴ１０３も形質導入されているＣＤ４  Ｔ細胞が０．５×１０７個以上生成物に含まれていなければならないことが挙げられる。別のリリース基準は、細胞あたりのＡＧＴ１０３ゲノムコピー数が３を超えてはならないことである。ＡＧＴ１０３−Ｔ注入の５日前、被験体は、１用量のブスルフラム（またはＣｙｔｏｘａｎ）の馴化レジメンの後、≦１×１０１０個の濃縮され遺伝子改変されたＣＤ４  Ｔ細胞の注入を受ける。
【０２９３】
第ＩＩ相研究では、ＡＧＴ１０３−Ｔ細胞療法の有効度を評価する。第ＩＩ相研究の参加者には、本発明者らの第Ｉ相研究に既に登録しており、遺伝子改変された自己のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の成功裏かつ安定な生着を有し、有効度評価（１．３．）に記載されるようにモニタリングされるパラメータの肯定的な変化として定義される臨床応答を有すると判断された個体が含まれる。研究参加者は、各自の既存の抗レトロウイルス薬物適用のレジメンにマラビロクを加えるよう求められる。マラビロクは、ＣＣＲ５レベルの低下を目的とする遺伝子療法の有効性を増強するＣＣＲ５アンタゴニストである。マラビロクレジメンが実施されたら、被験体は、それまでの抗レトロウイルス薬物レジメンを中止し、２８日間にわたり、または２回の連続した毎週の採血時の血漿中ウイルスＲＮＡレベルが１ｍｌあたり１０，０００を超えるまで、マラビロク単独療法のみを維持するよう求められる。ウイルス血症が持続的に高い場合、参加者は、各自のＨＩＶケアの医師の推奨に従ってマラビロクありまたはなしで、各自の元の抗レトロウイルス薬物レジメンに戻るよう要請される。
【０２９４】
マラビロク単独療法中に＞２８日間にわたって参加者のＨＩＶが抑制されたままである場合（血漿１ｍｌあたり２，０００未満のｖＲＮＡコピー）、４週間にわたってマラビロクの投薬を徐々に低減させるよう求められ、その後さらに２８日間にわたって集中的なモニタリングが行われる。マラビロク単独療法によるＨＩＶの抑制が維持された被験体は、機能的治癒を有するとみなされる。マラビロク退薬後でさえＨＩＶの抑制が維持される被験体も、機能的治癒を有する。６か月にわたって毎月モニタリングし、その後はさほど集中的でないモニタリングにより、機能的治癒の耐久性が確立される。
【０２９５】
（実施例４：ペプチド刺激前のＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇によるＣＤ４＋Ｔ細胞集団の生成）
ＣＤ８＋Ｔ細胞過剰成長は、標的ＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大増殖に著しい影響を及ぼしたため、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、細胞拡大増殖の始めに枯渇させて、それがＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大増殖を改善させることになるか否かを決定した。現行のＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇法では、細胞を磁気カラムに通すことが必要である。その手順が抗原提示細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞に及ぼす可能性のある影響を回避するために、ペプチド刺激後かつレンチウイルス形質導入前の、細胞が機械的ストレスにより良好に耐えることができる時点に、細胞枯渇を実施した。目的は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の最終収量を増加させること、また標的細胞（ＡＧＴ１０３レンチウイルスベクターも形質導入したＨＩＶ  ｇａｇタンパク質ＣＤ４＋Ｔ細胞）の収量を増加させることであった。図８は、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇プロトコールの模式図を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させるために使用される方法は、実施例８に記載されている。
【０２９６】
図９、１１、および１２に示されているように、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇されなかった対照処置と比べて、Ｇａｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージの実質的な増加をもたらした。Ｇａｇ特異的細胞は、インターフェロン−γを発現し、標的細胞は、インターフェロン−γ＋およびＣＤ４＋である（右上象限）。ＰＴＩＤ：０１−００６の場合、ＣＤ８＋枯渇後、値は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇されなかった対照処置での０．６９％と比較して、全Ｔ細胞の１．７％であった（図９、１５日目ＧａｇＰｅｐＭｉｘの右上象限）。図９を参照して、０日目では、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、ペプチド刺激培養（１日）の４４．２％、５５．３％、０．４８％、および０．０５３％と比較して、それぞれ４４．５％、５５．５％、０．０３２％、および０％の蛍光強度を有していた。１５日目では、ＣＤ８を枯渇させない場合、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、７９．８％、２０．１％、０．１２％、および０．０１８％の蛍光強度を有していた。１５日目では、ＣＤ８を枯渇させない場合、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、５８．９％、１９．２％、２１．２％、および０．６９％の蛍光強度を有していた。１５日目では、ＣＤ８を枯渇させた場合、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、６４．４％、３５．０％、０．４４％、および０．１４％の蛍光強度を有していた。１５日目では、ＣＤ８を枯渇させた場合、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、６１．９％、３２．９％、３．４７％、および１．７０％の蛍光強度を有していた。ＣＤ８を枯渇させない場合のＣＤ４＋Ｔ細胞の割合は、ＣＤ８  Ｔ細胞を枯渇させた場合の３５．１％（１５日目の対照、右上および右下象限の合計）と比較して、２０．１％であった（１５日目の対照、右上および右下象限の合計）。本発明者らは、最終産物に存在するＣＤ３＋／ＣＤ４陰性／ＣＤ８陰性細胞の大きな集団がサブクラスＶδ１のγδＴ細胞であると特定した（図１０）。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇に加えて、γδＴ細胞も欠失させることが必要であり得る。
【０２９７】
ＰＴＩＤ：０１−００７では、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇は、標的細胞の収量を、ＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇されなかった対照処置細胞と比べておよそ６倍増加させた（図１１）。図１１を参照して、０日目では、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、３３．６％、６６．４％、５．９Ｅ−４％、および１．７８Ｅ−３％の蛍光強度を有していた。０日目では（Ｇａｇペプチドに曝露された１６時間後）、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、３３．７％、６６．３％、０．０１１％、および０．０１６％の蛍光強度を有していた。１５日目では、ＣＤ８を枯渇させない場合、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、７８．４％、２１．２％、０．３０％、および０．０１８％の蛍光強度を有していた。１５日目では、ＣＤ８を枯渇させない場合、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、７６．３％、２０．２％、２．９５％、および０．６１％の蛍光強度を有していた。１５日目では、ＣＤ８を枯渇させた場合、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、５０．９％、４８．７％、０．３６％、および０．１０％の蛍光強度を有していた。１５日目では、ＣＤ８を枯渇させた場合、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、５１．６％、４４．４％、０．４３％、および３．６０％の蛍光強度を有していた。
【０２９８】
ＰＴＩＤ：０１−００８では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇は、標的細胞の収量を、ＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇されなかった対照処置細胞と比較しておよそ３倍増加させた（図１２）。図１２を参照して、０日目では、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、６５．４％、３４．５％、０．０９６％、および７．７１Ｅ−４％の蛍光強度を有していた。０日目では、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、６５．４％、３４．３％、０．２０％、および０．１０％の蛍光強度を有していた。１５日目では、ＣＤ８を枯渇させない場合、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、８７．９％、１２．１％、０．０２８％、および６．２４Ｅ−３％の蛍光強度を有していた。１５日目では、ＣＤ８を枯渇させない場合、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、８２．３％、１２．１％、５．３８％、および０．２３％の蛍光強度を有していた。１６日目では、ＣＤ８を枯渇させた場合、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、８７．８％、１２．０％、０．２２％、および０．０１３％の蛍光強度を有していた。１６日目では、ＣＤ８を枯渇させた場合、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、８７．８％、１１．１％、０．３０％、および０．７８％の蛍光強度を有していた。ＰＴＩＤ：０１−００８では、プロセスの終了時に存在する夾雑細胞は、ＣＤ３＋／ＣＤ４陰性／ＣＤ５６＋であると特定された。これは、それらがＮＫ細胞である可能性が最も高いことを意味する（図１３）。
【０２９９】
まとめると、これらのデータは、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇が、ＨＩＶ＋患者ＰＢＭＣ試料中のＧａｇ応答性ＣＤ４＋Ｔ細胞を増加させる一貫した効果を有していたことを示す。
【０３００】
（実施例５：ＣＤ８細胞枯渇は、Ｇａｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを増加させたが、Ｖδ１細胞およびＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増大は、標的細胞集団の成長を妨害した）
ＰＴＩＤ：０１−００６では、実施例８に記載のプロトコールを使用したＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇は、５０％未満のＣＤ４＋Ｔ細胞であり、Ｖδ１＋γδＴ細胞の増大を含んでいた最終産物をもたらした（図１０）。この結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＶδ１＋Ｔ細胞の両方の枯渇が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の収量を増加させることができ、標的細胞の収量も増加させることができることを示唆する。リンパ球のゲート制御データは、７７．６％の蛍光強度を示した（図１０の最も左側のグラフ）。ＣＤ３発現のパラメーターを使用すると、蛍光強度は７５．３％であった（図１０の中央左側のグラフ）。ＣＤ４発現のパラメーターを使用して、４つ別々の象限の蛍光を測定した（図１０の中央グラフ）。左下象限は、４５．３％（上限値）および４５．５％（下限値）の蛍光強度を示した。右下象限は、４４．９％の蛍光強度を示した。左上象限は、９．２６％の蛍光強度を示した。左下象限は、０．３５％の蛍光強度を示した。ＰＡＮγδのパラメーターを使用すると、蛍光強度は７３．８％であった（図１０の中央右側のグラフ）。Ｖδ１のパラメーターを使用して、４つ別々の象限の蛍光を測定した。左下象限は、１６．９％の蛍光強度を示した。右下象限は、８２．８％の蛍光強度を示した。左上象限は、０．１４％の蛍光強度を示した。右上象限は、０．１２％の蛍光強度を示した。
【０３０１】
ＰＴＩＤ：０１−００８では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の低収量をもたらした。それは、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の拡大増殖による可能性が高かった（図１３）。ＣＤ３およびＣＤ４を変数として使用した左側グラフの蛍光強度は、８３．１％の細胞がＣＤ３発現およびＣＤ４発現の両方に陰性であり、ＮＫ細胞である可能性が最も高いと画定した。ＣＤ５６を変数として使用した右側グラフの蛍光強度は、６５．７％であった。それらの拡大増殖により、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞は、培養培地にてＣＤ４＋Ｔ細胞と競合した。この結果は、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の日常的な枯渇が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の製造における別の重要なステップであり得ることを示唆する。
【０３０２】
（実施例６：様々な枯渇プロトコールを使用したＣＤ４＋Ｔ細胞の集団の生成）
ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇は単独でＶδ１およびＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増大をもたらしたため、様々な枯渇プロトコールを開発した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ５６  ＮＫ細胞、ＣＤ１９  Ｂ細胞、およびγδ細胞を全て枯渇させた枯渇プロトコールを開発した。このスキームのフロー図は図１４に示されている。
【０３０３】
図１５は、「未枯渇」対照；ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇；ＣＤ８＋Ｔ細胞およびγδＴ細胞枯渇；ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＢ細胞枯渇を含む、様々な細胞枯渇戦略の比較を示す。標的細胞は、インターフェロン−ガンマのその後の細胞内蓄積によるペプチド再刺激に対するそれらの応答により特定した。ｅｘ  ｖｉｖｏ試料は、ＣＤ４＋であり、ＨＩＶ  ｇａｇペプチドに対する応答に特異的であった全Ｔ細胞の０．０５５％を含んでいた。実施例８の細胞枯渇のプロトコールを使用して、異なるファクターの細胞を枯渇させた。手短に述べれば、細胞をＰＢＭＣ＋Ｇａｇペプチドと共に１８時間培養し、続いて細胞枯渇を行った（または「未枯渇」対照）。細胞枯渇後、細胞をさらに１２日間培養し、その間細胞には、ＩＬ−７およびＩＬ−１５サイトカインを定期的に給送して補完した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＣＤ１９＋Ｂ細胞の枯渇は、標的細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびインターフェロン−ガンマ＋細胞）の最も高い収量をもたらした（図１５）。
【０３０４】
図１５を参照して、０日目では、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、５６．４％、４３．５％、０．０３４％、および７．４４Ｅ−４％の蛍光強度を有していた。０日目では、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、５４．８％、４４．８％、０．３０％、および０．０５５％の蛍光強度を有していた。１８時間後では、枯渇させなかった場合、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、８３．９％、１６．０％、０．０６１％、および０．０２７％の蛍光強度を有していた。１８時間後では、枯渇させなかった場合、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、７７．６％、１５．４％、６．３９％、および０．５４％の蛍光強度を有していた。１８時間後では、ＣＤ８を枯渇させた場合、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、４１．９％、５７．９％、０．０９４％、および０．０９９％の蛍光強度を有していた。１８時間後では、ＣＤ８を枯渇させた場合、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、４３．３％、５０．７％、３．００％、および２．９８％の蛍光強度を有していた。１８時間後では、ＣＤ８およびγδを枯渇させた場合、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、４０．４％、５９．３％、０．１２％、および０．１３％の蛍光強度を有していた。１８時間後では、ＣＤ８およびγδを枯渇させた場合、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、３８．３％、５４．７％、３．１４％、および３．８６％の蛍光強度を有していた。１８時間後では、ＣＤ８、γδ、およびＢを枯渇させた場合、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、４６．２％、５３．６％、０．１３％、および０．０８０％の蛍光強度を有していた。１８時間後では、ＣＤ８、γδ、およびＢを枯渇させた場合、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、４２．１％、４８．５％、４．２８％、および５．０６％の蛍光強度を有していた。
【０３０５】
図１６は、「未枯渇」対照；ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇；ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、γδＴ細胞、およびＢ細胞を含む４細胞型の枯渇を含む、様々な細胞枯渇戦略の比較を示す。４細胞型の枯渇後、ＣＤ４＋Ｔ細胞／インターフェロン−ガンマ＋標的細胞の収量の実質的な増加が観察された。
【０３０６】
図１６を参照して、０日目では、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、４２．６％、５７．４％、２．７１Ｅ−３％、および０．０％の蛍光強度を有していた。０日目では、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、４２．５％、５７．４％、０．０３１％、および０．０４８％の蛍光強度を有していた。１８時間後では、枯渇させなかった場合、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、７９．５％、２０．５％、０．０１７％、および９．７３Ｅ−３％の蛍光強度を有していた。１８時間後では、枯渇させなかった場合、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、７８．９％、１９．５％、０．９３％、および０．６５％の蛍光強度を有していた。１８時間後では、ＣＤ８を枯渇させた場合、対照の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、５１．４％、４８．４％、０．１１％、および０．０６３％の蛍光強度を有していた。１８時間後では、ＣＤ８を枯渇させた場合、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、５１．７％、４３．０％、０．２２％、および５．０３％の蛍光強度を有していた。１８時間後では、ＣＤ８、ＣＤ５６、γδ、およびＢを枯渇させた場合、刺激しなかった細胞の左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、１２．８％、８７．０％、０．１４％、および０．１０％の蛍光強度を有していた。１８時間後では、ＣＤ８、ＣＤ５６、γδ、およびＢを枯渇させた場合、ＧａｇＰｅｐＭｉｘの左下象限、右下象限、左上象限、および右上象限は、それぞれ、１３．２％、７９．４％、０．２７％、および７．１７％の蛍光強度を有していた。
【０３０７】
（実施例７：４種細胞枯渇プロトコールを使用したＣＤ４＋Ｔ細胞の集団の生成）
図１７は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、およびγδＴ細胞を枯渇させる、４種細胞枯渇を使用した実験のためのフロー図を示す。ＬＶ−ＧＦＰ代用ウイルスベクターを使用して、細胞で形質導入する。このベクターは、ＡＧＴ１０３に対して同一の細胞向性を有するが、形質導入効率を容易に評価することができるように、緑色蛍光タンパク質マーカーを発現する。Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激して、形質導入効率を増加させた。インターフェロン−ガンマ発現を測定するアッセイを使用して、複数の細胞サブセットでの形質導入効率を測定した。
【０３０８】
図１８に示されているように、効率的なレンチウイルス形質導入には、ペプチド刺激のみを行い、続いて競合する細胞を枯渇させることのみで十分であり、効率は、ＣＤ４＋／Ｇａｇ特異的標的細胞が最も高かった。この典型的な結果では、標的細胞の６８％には、ＬＶ−ＧＦＰベクターが形質導入されていた。図１８を参照すると、中央のグラフでは、右下象限（６８．６％蛍光）および右上象限（１２．６％蛍光）は、それぞれ４１．５％（右下グラフ）および６７．８％（右上グラフ）のＧＦＰ形質導入効率を有していた。これは、それぞれ３５．６％（左下グラフ）および４３．３％（左上グラフ）のＧＦＰ形質導入効率を有していた中央グラフの左下象限（９．７５％蛍光）および左上象限（２．４６％蛍光）とは対照的である。
【０３０９】
（実施例８：細胞枯渇の実験室プロトコール）
０日目：ＨＩＶ陽性参加者の静脈血に由来するおよそ１×１０７個の生存可能な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、２４ウェルプレート中に５％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ７／ＩＬ１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）、および１００ｎＭサキナビル（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を含む１ｍＬのＴｅｘＭＡＣＳ  ＧＭＰ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）で培養した。細胞を、３７℃で１６〜１８時間１μｇ／ｍＬ  ＰｅｐＭｉｘ  ＨＩＶ−１（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａ（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にインキュベートした。１μｇ／ｍＬは、最終刺激条件での各々の個々のペプチドの濃度であった。
【０３１０】
１日目：１６〜１８時間のインキュベーション後、製造元の説明に従って、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１９、および／またはγδ細胞を、ＰＥ抗ヒトＣＤ８  Ａｂクローンｓｋ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＰＥ抗ヒトＣＤ５６  Ａｂクローン５．１Ｈ１１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＰＥ抗ヒトＣＤ１９  ＡｂクローンＨＩＢ１９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、およびＰＥ抗ヒトＴＣＲγδＡｂクローンＢ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、および抗ＰＥマイクロビーズ（例えば、抗ＰＥマイクロビーズＵｌｔｒｏＰｕｒｅ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）で枯渇させた。細胞を、氷上にて１０分間ＰＥコンジュゲート抗体で染色した。標識細胞を、抗ＰＥマイクロビーズで１５分間氷上にて洗浄およびインキュベートし、次いで磁場で分離した。この場合、標的表面タンパク質を発現する細胞はカラムに保持され、未標識（陰性選択された）細胞は通過して、収集された。およそ１×１０６個の生存可能な陰性選択されたＰＢＭＣを、５％ヒト血清、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ７／ＩＬ１５、および１００ｎＭサキナビルを含む０．５ｍＬのＴｅｘＭＡＣＳ  ＧＭＰ培地に播種した。
【０３１１】
２日目：細胞に、ＧＦＰを有するレンチウイルスベクターを５〜１０のＭＯＩで形質導入した。
【０３１２】
４日目：細胞に、５％ヒト血清、２０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ７／ＩＬ１５（最終１０ｎｇ／ｍＬ）、および２００ｎＭサキナビル（最終１００ｎＭ）を含む０．５ｍＬのＴｅｘＭＡＣＳ  ＧＭＰ培地を給送した。
【０３１３】
７日目：細胞に、５％ヒト血清、２０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ７／ＩＬ１５（最終１０ｎｇ／ｍＬ）、および２００ｎＭサキナビル（最終１００ｎＭ）を含む１ｍＬのＴｅｘＭＡＣＳ  ＧＭＰ培地を給送した。
【０３１４】
１０日目：ウェルの底部にある細胞塊を含む細胞をよく混合した。混合後、細胞の容積全体を１２ウェルプレートに移した。次いで、細胞に、５％ヒト血清、２０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ７／ＩＬ１５（最終１０ｎｇ／ｍＬ）、および２００ｎＭサキナビル（最終１００ｎＭ）を含む２ｍＬのＴｅｘＭＡＣＳ  ＧＭＰ培地を給送した。
【０３１５】
１４〜１６日目：細胞計数を実施し、細胞をペプチド刺激アッセイで刺激した。１×１０６個の拡大増殖された細胞を、９６ウェルプレート中で４時間にわたって、１μｇ／ｍＬ  ＰｅｐＭｉｘ  ＨＩＶ−１（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａを用いずにまたは用いて刺激した。
【０３１６】
細胞内ＩＦＮ−γを検出するために、タンパク質輸送阻害剤ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ブレフェルジンＡを含む）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を添加した。細胞を、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３  ＡｂクローンＯＫＴ３、ＰＥ抗ヒトＣＤ４  ＡｂクローンＯＫＴ４、およびＰｅｒＣＰ抗ヒトＣＤ８  ＡｂクローンＳＫ１で染色した。染色後、細胞を固定し、透過処理し、ＡＰＣ抗ヒトＩＦＮ−γクローンＢ２７を用いて４５分間４℃にてインキュベートした。細胞内染色溶液は、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から得た。
【０３１７】
ＧＦＰ発現を分析して、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の形質導入効率を決定した。ＩＦＮ−γ分泌アッセイ細胞濃縮および検出キット（ＰＥ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を製造元の説明に従って使用して、ＩＦＮ−γ分泌細胞を検出した。細胞を、ＩＦＮ−γ捕捉試薬で５分間氷上にて標識した。標識細胞を、ゆっくりと連続的に回転させながら４５分間３７℃にて閉管中でインキュベートし、次いでＰＥ抗ＩＦＮ−γ検出Ａｂ、ＰｅｒＣＰ抗ヒトＣＤ３  ＡｂクローンＯＫＴ３、およびＡＰＣ抗ヒトＣＤ４  ＡｂクローンＯＫＴ４で染色した。
【０３１８】
データは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して、各試料に由来する少なくとも１×１０５リンパ球について取得した（前方および側方散乱プロファイルに基づいてゲート制御した）。試料は全て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ  １０．１ｒ１、Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）を使用して分析した。
【０３１９】
（実施例９：細胞枯渇の商業的プロトコール）
ＡＧＴ１０３−Ｔを製造するための商業型のプロトコールでは、ＰＢＭＣ精製、ペプチド刺激、および細胞枯渇を上記に記載のように実施し、２日間培養してから、総培養液（２００ｍｌ）を、ＩＬ−７およびＩＬ−１５サイトカインを含むおよそ５リットルの培養培地を含むＧＲＥＸ  ５００Ｍ静置培養フラスコまたは撹拌がないかもしくは最小限である細胞培養用の類似の容器に移した。充填したフラスコを３７℃にて５％ＣＯ２で７日間撹拌せずにインキュベートし、次いで全量を収集し、細胞を洗浄し、１ｍＬ当たりおよそ１×１０８個の総有核細胞で凍結保存溶液に再懸濁し、次いで凍結させ、液体Ｎ２の気相に保管した。静的相培養を含めることにより、標的細胞の収量がさらに増加する。これは、この細胞サブセットが壊れやすく、非静的培養システムの機械的収集および／または培養撹拌中に枯渇しやすいことが、実験室研究で実証されているためである。
配列
本明細書では、以下の配列が参照される。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【表４−１３】
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【表４−１４】
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【表４−１５】
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【表４−１６】
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【表４−１７】
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【表４−１８】
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【表４−１９】
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【表４−２０】
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【表４−２１】
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【表４−２２】
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【表４−２３】
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【表４−２４】
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【表４−２５】
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【表４−２６】
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【表４−２７】
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【表４−２８】
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【表４−２９】
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【表４−３０】
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【表４−３１】
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【表４−３２】
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【０３２０】
本開示の好ましい実施形態のうちのいくつかを記載し、上記で具体的に例示したが、本開示がこのような実施形態に限定されることは意図していない。本開示の範囲および趣旨から逸脱することなく、これに様々な改変を行ってよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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