(57)【要約】  ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ、ＣＤ１６及びＩＬ２の組合せを発現するＮＫ−９２（商標）細胞の組成物、並びにそれらの細胞を使用して腫瘍細胞及び腫瘍微小環境中の細胞（例えば、ＭＤＳＣ又はＴＡＭ）を低減させ、癌を治療する方法が本明細書に提供される。
2021519602.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ及びＦｃ受容体を発現する組換えＮＫ−９２細胞。
【請求項２】
マルチシストロン性構築物を含み、前記マルチシストロン性構築物は、前記ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ及び前記Ｆｃ受容体をコードする、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項３】
前記Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６である、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項４】
前記Ｆｃ受容体は、配列番号２を含む、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項５】
前記マルチシストロン性導入遺伝子は、ＩＬ−２若しくはそのバリアント又はＩＬ−１５若しくはそのバリアントをコードする配列をさらに含む、請求項２に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項６】
前記ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ、前記Ｆｃ受容体、及び／又は前記ＩＬ２は、コドン最適化核酸配列によりコードされる、請求項２〜５のいずれか一項に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項７】
前記ＩＬ−２バリアントは、ｅｒＩＬ−２であり、又は前記ＩＬ−１５バリアントは、ｅｒＩＬ−１５である、請求項５に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項８】
前記ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ、前記Ｆｃ受容体、前記ｅｒＩＬ−１５、又はｅｒＩＬ−２の１つ以上の前記コード配列は、ヒト系中での発現のためにコドン最適化されている、請求項７に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項９】
ＰＤ−Ｌ１発現細胞を殺傷し得る、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１０】
前記ＰＤ−Ｌ１発現細胞は、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、又は腫瘍細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１１】
前記ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲは、ｓｃＦｖ抗体断片を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１２】
前記ｓｃＦｖ抗体断片は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１３】
前記マルチシストロン性構築物は、配列番号１１の配列を含み、前記配列は、前記ｓｃＦｖ抗体断片をコードする、請求項２に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１４】
自己開裂ペプチドをコードする配列を含み、前記配列は、前記ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲとＣＤ１６との間に位置し、前記配列は、前記ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ及び前記ＦｃＲの等モル発現を可能とする、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１５】
ＣＤ１６をコードする配列と、ＩＬ−２若しくはそのバリアントをコードする配列又はＩＬ−１５若しくはそのバリアントをコードする配列との間の内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１６】
ＰＤ−Ｌ１発現細胞に対する前記ＮＫ−９２（登録商標）細胞の直接細胞毒性は、エフェクターと標的との比が１０である場合、４０〜１００％である、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１７】
ＰＤ−Ｌ１発現細胞に対する前記ＮＫ−９２（登録商標）細胞の直接細胞毒性は、ａＮＫ（登録商標）細胞のものよりも高い、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１８】
前記ＮＫ−９２細胞のＡＤＣＣ活性は、エフェクターと標的との比が１０である場合、２０％〜６０％である、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１９】
前記ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲは、配列番号１０と少なくとも９０％の同一性を共有する配列を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項２０】
前記ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲは、細胞質シグナリングドメインを含む、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項２１】
前記細胞質シグナリングドメインは、Ｆｃイプシロン受容体ガンマ（ＦｃεＲＩγ）及び／又はＣＤ３ゼータシグナリングドメインである、請求項２０に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＮＫ−９２細胞を含む医薬組成物を含むキット。
【請求項２３】
ＮＫ−９２細胞を生成する方法であって、
ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ及びＣＤ１６をコードするベクターを提供すること、
並びに
前記ベクターを前記ＮＫ−９２細胞中に導入して前記ＮＫ−９２細胞を生成すること
を含む方法。
【請求項２４】
前記ベクターは、ＩＬ−２又はＩＬ−１５をコードする配列をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ベクターは、自己開裂ペプチドをコードする配列を含み、前記配列は、ＣＡＲとＣＤ１６との間に位置し、前記配列は、ＣＡＲ及びＣＤ１６の等モル発現を可能とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ベクターは、ＣＤ１６コード配列と、ＩＬ−２又はＩＬ−１５コード配列との間の内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＤ−Ｌ１発現細胞を殺傷する方法であって、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ、又は腫瘍細胞を請求項１〜１７のいずれか一項に記載の複数のＮＫ−９２細胞とインキュベートし、それにより前記ＭＤＳＣ、前記ＴＡＭ、又は前記腫瘍細胞を殺傷することを含む方法。
【請求項２８】
前記ＰＤ−Ｌ１発現細胞は、腫瘍細胞又は腫瘍微小環境中の細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記腫瘍微小環境中の細胞は、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）又は腫瘍関連マクロファージである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＭＤＳＣ細胞は、ＣＤ１４又はＣＤ１５を発現する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＴＡＭは、ＣＤ６８及びＣＤ２０６、ＣＤ２０４、又はＣＤ１６３の１つ以上を発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
対象における骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ、又は腫瘍細胞を殺傷する方法であって、治療有効量の組成物を前記対象に投与することを含み、前記組成物は、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の複数のＮＫ−９２細胞を含む方法。
【請求項３３】
前記対象の体表面積１ｍ２当たり約１×１０８〜約１×１０１１個の改変細胞を、前記対象に投与する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
対象における癌を治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の組成物を前記対象に投与することを含み、前記組成物は、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の複数のＮＫ−９２細胞を含む方法。
【請求項３５】
前記癌は、黒色腫、乳癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、扁平上皮癌、頭頸部癌、結腸癌、膵臓癌、子宮癌、腎細胞癌、膠芽腫、髄芽腫、肉腫、及び肺癌からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞を、静脈内投与する、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記複数のＮＫ−９２細胞を、腫瘍内投与する、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
対象における骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）又は腫瘍細胞を殺傷する方法であって、治療有効量の第１の組成物及び第２の組成物を前記対象に投与することを含み、前記第１の組成物は、複数のＮＫ−９２細胞を含み、前記第２の組成物は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む方法。
【請求項３９】
前記ＮＫ−９２細胞は、Ｆｃ受容体を発現する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＮＫ−９２細胞は、ｈａＮＫ（登録商標）細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記第２の組成物は、アベルマブである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ＮＫ細胞を個体に投与する方法であって、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲを発現するＮＫ細胞を含む第１の組成物及び初代ＮＫ細胞を含む第２の組成物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年１０月３１日に出願され、参照により本明細書に組み込まれる、本発明者らの同時係属中の米国仮特許出願第６２／７５３，７４０号の優先権を主張する。
【０００２】
配列表
４０ｋｂサイズの１０４０７７．０００６ＰＣＴ＿ＳＴ２５＿ＲＥＶ００６という名称の配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、２０１９年７月２６日に作成され、本出願とともにＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されており、参照により全体として組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
固形腫瘍中の癌細胞は、それらの周囲に腫瘍微小環境を形成して癌細胞の成長及び転移を支持し得る。腫瘍微小環境は、周囲血管、免疫細胞、線維芽細胞、他の細胞、可溶性因子、シグナリング分子、細胞外マトリックス、並びに腫瘍性形質転換を促進し、腫瘍成長及び侵入を支持し、腫瘍を宿主免疫から保護し、治療耐性を増強し、潜伏転移の生育のためのニッチを提供し得るメカニカルキューを含む、腫瘍が存在する細胞環境である。腫瘍及びその周囲微小環境は密接に関連し、常に相互作用する。腫瘍は、細胞外シグナルを放出し、腫瘍血管新生を促進し、末梢免疫寛容を誘導することによりそれらの微小環境に影響を与え得る一方、微小環境中の免疫細胞は、癌性細胞の成長及び進化に影響し得る。Ｓｗａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．“Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，ｖｏｌ．，７２，ｐａｇｅｓ  ２４７３−２４８０，２０１２を参照されたい。
【０００４】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の主成分を構成する細胞毒性リンパ球である。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、一般に、循環リンパ球の約１０〜１５％を占め、抗原に関して非特異的に且つ事前の免疫感作なしで標的細胞、例として、ウイルス感染細胞及び多くの悪性腫瘍細胞に結合し、それを殺傷する。Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１４：２４（１９８１）。標的細胞の殺傷は、細胞溶解の誘導により生じる。この目的に使用されるＮＫ細胞は、対象からの血液の末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）画分から単離し、細胞培養物中で拡大して十分数の細胞を得、次いで対象中に再注入する。このような自己ＮＫ細胞は、エクスビボ療法及びインビボ治療の両方においていくらかの有効性を示している。しかしながら、このような治療法はオートロガスの状況に制限され、全てのＮＫ細胞が細胞溶解性ではないという事実によりさらに複雑になる。
【０００５】
現在、ＣＡＲ−Ｔ療法が腫瘍微小環境中の免疫細胞を標的化する一般的な治療法になっている。しかしながら、標的抗原の多くは正常前駆体細胞上でも発現されるため、それらのＣＡＲ−Ｔ療法はインビボモデルにおいて血球減少及び骨髄前駆体の低減を引き起こすことが多く、永久的に発現される腫瘍抗原特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が患者についての許容不可能な毒性を有することを示唆している。さらに、ＣＡＲ−Ｔ技術は自己Ｔ細胞の遺伝子操作に依存し、そのことは有意な患者間変動、及びＴ細胞を拡大することができない多数の患者の排除をもたらす。したがって、腫瘍細胞及び腫瘍微小環境中の細胞の両方を標的化する有効な癌治療法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一部の実施形態において、本開示は、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ及びＦｃ受容体を発現する改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞を提供する。一部の実施形態において、改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、マルチシストロン性構築物を含み、マルチシストロン性構築物は、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ及びＦｃ受容体をコードする。一部の実施形態において、Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６である。一部の実施形態において、Ｆｃ受容体は、配列番号２を含む。一部の実施形態において、マルチシストロン性導入遺伝子は、ＩＬ−２又はそのバリアントをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ、Ｆｃ受容体、及び／又はＩＬ２は、コドン最適化核酸配列によりコードされる。一部の実施形態において、ＩＬ−２バリアントは、ｅｒＩＬ−２である。
【０００７】
一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ、Ｆｃ受容体、又はｅｒＩＬ−２の１つ以上のコード配列は、ヒト系中での発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ＰＤ−Ｌ１発現細胞を殺傷し得る。一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１発現細胞は、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、又は腫瘍細胞である。一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲは、ｓｃＦｖ抗体断片を含む。一部の実施形態において、改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、自己開裂ペプチドをコードする配列を含み、その配列は、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲとＣＤ１６との間に位置し、その配列は、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ及びＦｃＲの等モル発現を可能とする。一部の実施形態において、改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ＣＤ１６をコードする配列と、ＩＬ−２又はそのバリアントをコードする配列との間の内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）を含む。
【０００８】
一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１発現細胞に対する改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞の直接細胞毒性は、エフェクターと標的との比が１０である場合、４０〜１００％である。一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１発現細胞に対する改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞の直接細胞毒性は、ａＮＫ（登録商標）細胞のものよりも高い。一部の実施形態において、改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞のＡＤＣＣ活性は、エフェクターと標的との比が１０である場合、２０％〜６０％である。一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲは、配列番号１０と（特に、配列番号１０内のＣＤＲ配列と）少なくとも９０％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態において、本開示は、上記開示の改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞を含む医薬組成物を含むキットを提供する。一部の実施形態において、本開示は、改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞を生成する方法であって、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ及びＣＤ１６をコードするベクターを提供すること、並びにベクターをＮＫ−９２（登録商標）細胞中に導入して改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞を生成することを含む方法を提供する。
【０００９】
一部の実施形態において、ベクターは、ＩＬ−２をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態において、ベクターは、自己開裂ペプチドをコードする配列を含み、その配列は、ＣＡＲとＣＤ１６との間に位置し、その配列は、ＣＡＲ及びＣＤ１６の等モル発現を可能とする。一部の実施形態において、ベクターは、ＣＤ１６コード配列と、ＩＬ−２コード配列との間の内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）を含む。一部の実施形態において、本開示は、ＰＤ−Ｌ１発現細胞を殺傷する方法であって、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、又は腫瘍細胞を請求項１〜１７のいずれか一項に記載の複数の改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞とインキュベートし、それによりＭＤＳＣ、ＴＡＭ、又は腫瘍細胞を殺傷することを含む方法を提供する。
【００１０】
一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１発現細胞は、腫瘍細胞又は腫瘍微小環境中の細胞である。一部の実施形態において、微小環境中の細胞は、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）又は腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）である。一部の実施形態において、ＭＤＳＣ細胞は、ＣＤ１４又はＣＤ１５を発現する。一部の実施形態において、ＴＡＭは、ＣＤ６８及びＣＤ２０６、ＣＤ２０４、又はＣＤ１６３の１つ以上を発現する。一部の実施形態において、本開示は、対象における骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ、又は腫瘍細胞を殺傷する方法であって、治療有効量の組成物を対象に投与することを含み、組成物は、上記の複数の改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞を含む方法を提供する。
【００１１】
一部の実施形態において、対象の体表面積１ｍ２当たり約１×１０８〜約１×１０１１個の改変細胞を、対象に投与する。一部の実施形態において、本開示は、対象における癌を治療する方法であって、対象に、治療有効量の組成物を対象に投与することを含み、組成物は、上記の複数の改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞のいずれかを含む方法を提供する。一部の実施形態において、癌は、黒色腫、乳癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、扁平上皮癌、頭頸部癌、結腸癌、膵臓癌、子宮癌、腎細胞癌、膠芽腫、髄芽腫、肉腫、及び肺癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、細胞は、静脈内投与する。一部の実施形態において、細胞は、腫瘍内投与する。
【００１２】
一部の実施形態において、本開示は、対象における骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）又は腫瘍細胞を殺傷する方法であって、治療有効量の第１の組成物及び第２の組成物を対象に投与することを含み、第１の組成物は、複数のＮＫ−９２（登録商標）細胞を含み、第２の組成物は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む方法を提供する。
【００１３】
一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、Ｆｃ受容体を発現する。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ｈａＮＫ（登録商標）細胞である。一部の実施形態において、第２の組成物は、アベルマブである。
【００１４】
上記の一般的な説明及び以下の詳細な説明は、例示的及び説明的なものであり、本開示のさらなる説明を提供するものとする。他の目的、利点及び新規特徴部は、当業者に容易に明らかである。
【００１５】
目的、特徴部及び利点は、添付の図面とともに考慮される場合、以下の開示の参照時により容易に認識される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】第１、第２、及び第３世代のＣＡＲの構造ドメインの模式的表示である。
【図２】ＣＡＲコード配列、Ｐ２Ａ配列、ＣＤ１６コード配列、及びｅｒＩＬ−２コード配列を含むトリシストロン性プラスミドの構成成分を示す。
【図３】改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞上のＰＤ−Ｌ１−ＣＡＲの発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図４】ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞に対するＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞毒性効果を示す。親ａＮＫ（商標）細胞を、対照細胞として使用した。
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａは、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）に対するＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞毒性効果を示す。図５Ｂは、ａＮＫ（商標）耐性、ＰＤ−Ｌ１陽性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系に対するＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞毒性効果を示す。ＸＬ−４８及びＸＬ−４９は、２つの異なる抗ＰＤ−Ｌ１抗体に由来する２つの異なるｓｃＦｖドメインを含むＣＡＲを発現する２つのＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ集団である。図５Ｃは、遺伝子操作ＳＵＰ−Ｂ１５細胞に対する、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブと組み合わせた場合のＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞の抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性を示す。これらの遺伝子操作ＳＵＰ−Ｂ１５細胞は、ＣＤ２０を発現するが、ＣＤ１９を発現しない。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎを対照抗体として使用した。
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａは、ｉ．ｖ．投与を使用してビヒクル及びＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞により処理されたマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来腫瘍のインビボ腫瘍成長を示し；図６Ｂは、ビヒクル及びＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞により処理されたマウスにおけるＨＣＣ８２７由来腫瘍のインビボ腫瘍成長を示す。
【図７】ｉ．ｔ．投与を使用してビヒクル及びＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞により処理されたマウスにおけるＨＣＣ８２７由来腫瘍のインビボ腫瘍成長を示す。
【図８】ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞と、ｈａＮＫ（登録商標）細胞との間の例示的な差を示す。
【図９】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞及びｈａＮＫ（登録商標）細胞の細胞毒性を比較する例示的データを示す。
【図１０】種々の腫瘍細胞に対するＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞毒性を比較する例示的データを示す。
【図１１】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＰＤ−Ｌ１ノックアウトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から樹立された腫瘍へのＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞の追跡を比較する例示的データを示す。
【図１２】ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞により処理された動物におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＰＤ−Ｌ１ノックアウトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの腫瘍成長を比較する例示的データを示す。
【図１３】ＭＤＳＣに対するＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞毒性を実証する例示的データを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
概要
本開示は、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ、Ｆｃ受容体、及びＩＬ２の組合せを発現するＮＫ−９２（商標）細胞を提供する。これらの細胞は、腫瘍細胞及び腫瘍微小環境中の細胞の両方を標的化し得、癌を有効に治療する。
【００１８】
用語
別途規定のない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００１９】
本明細書において、及び以下の特許請求の範囲において、以下の意味を有することが定義される多数の用語が参照される。
【００２０】
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのものであるにすぎず、限定的なものではない。本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明示しない限り、複数形も含むものとする。したがって、例えば、「ナチュラルキラー細胞」の言及には、複数のナチュラルキラー細胞が含まれる。
【００２１】
全ての数値指定、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、量、及び分子量は、範囲を含め、適宜０．１又は１．０刻みだけ（＋）又は（−）に変動する近似値である。常に明示されるわけではないが、全ての数値指定の前に、用語「約」が先行し得ることを理解すべきである。
【００２２】
本明細書において使用される「＋」は、特定の細胞マーカーの存在を示すために使用される場合、その細胞マーカーが蛍光活性化細胞選別においてアイソタイプ対照に対して検出可能に存在し；又は定量的若しくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいてバックグラウンドを超えて検出可能であることを意味する。
【００２３】
本明細書において使用される「−」は、特定の細胞マーカーの存在を示すために使用される場合、その細胞マーカーが蛍光活性化細胞選別においてアイソタイプ対照に対して検出可能に存在せず；又は定量的若しくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいてバックグラウンドを超えて検出可能でないことを意味する。
【００２４】
当業者により理解されるとおり、任意の及び全ての目的のため、特に書面による説明の提供に関して、本明細書に開示される全ての範囲は、任意の及び全ての考えられる下位範囲及びその下位範囲の組合せも包含する。任意の列記範囲は、同一の範囲が少なくとも等しい２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分割されることを十分に説明し、それを可能とすると容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書に開示されるそれぞれの範囲は、下位３分の１、中位３分の１及び上位３分の１などに容易に分けることができる。同様に当業者により理解されるとおり、全ての言語、例えば、「最大」、「少なくとも」、「よりも大きい」、「未満」などは、引用される数を含み、続いて上記の下位範囲に分けることができる範囲を指す。最後に、当業者により理解されるとおり、範囲は、それぞれの個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１〜３個の細胞を有する群は、１、２、又は３個の細胞を有する群を指す。同様に、１〜５個の細胞を有する群は、１、２、３、４、又は５個の細胞を有する群を指し、以下同様である。
【００２５】
本明細書において使用される用語「実質的に同一」は、用語「同等」、又は「実質的に類似」と互換的に使用され、ＮＫ−９２（商標）細胞のある定量可能な特性、例えば、細胞毒性、生存率又は細胞倍化時間などを指す場合、それらの特性の２つの計測値が互いに１５％以下異なり、１０％以下、８％以下、又は５％以下異なることを指す。
【００２６】
常に明示されるわけではないが、本明細書に記載の試薬は単に例示であること及びそのようなものの等価物が当該技術分野において公知であることも理解すべきである。
【００２７】
本発明の目的のため、及び別途示されない限り、用語「ＮＫ−９２（商標）」は、元のＮＫ−９２（商標）細胞系並びにＮＫ−９２（商標）細胞系、ＮＫ−９２（商標）細胞のクローン、及び（例えば、外因性遺伝子の導入により）改変されたＮＫ−９２（商標）細胞を指すものとする。ＮＫ−９２（商標）細胞並びに例示的及びその非限定的な改変は、全てが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，６１８，８１７号明細書；同第８，０３４，３３２号明細書；同第８，３１３，９４３号明細書；同第９，１８１，３２２号明細書；同第９，１５０，６３６号明細書；及び米国特許出願公開第１０／００８，９５５号明細書に記載されており、それとしては、野生型ＮＫ−９２（商標）、ＮＫ−９２（商標）−ＣＤ１６、ＮＫ−９２（商標）−ＣＤ１６−γ、ＮＫ−９２（商標）−ＣＤ１６−ζ、ＮＫ−９２（商標）−ＣＤ１６（Ｆ１７６Ｖ）、ＮＫ−９２（商標）ＭＩ、及びＮＫ−９２（商標）ＣＩが挙げられる。ＮＫ−９２（商標）細胞は当業者に公知であり、そのような細胞はＮａｎｔＫｗｅｓｔ，Ｉｎｃ．から容易に入手可能である。
【００２８】
本明細書において使用される用語「ＮＫ−９２（商標）細胞」は、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｐｒ；８（４）：６５２−８（１９９４））に記載の高度に強力なユニーク細胞系に由来するナチュラルキラー細胞を指し、その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔにより保有される（以下、「ＮＫ−９２（商標）細胞」）。
【００２９】
本明細書において使用される用語「ａＮＫ（商標）細胞」は、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｐｒ；８（４）：６５２−８（１９９４））に記載の高度に強力なユニーク細胞系に由来する未改変ナチュラルキラー細胞を指し、その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔにより保有される（以下、「ａＮＫ（商標）細胞」）。
【００３０】
本明細書において使用される用語「ｈａＮＫ（登録商標）細胞」は、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｐｒ；８（４）：６５２−８（１９９４））に記載の高度に強力なユニーク細胞系に由来するナチュラルキラー細胞を指し、その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔにより保有され、細胞表面上でＣＤ１６を発現するように改変されている（以下、「ＣＤ１６＋ＮＫ−９２（商標）細胞」又は「ｈａＮＫ（登録商標）細胞」）。
【００３１】
本明細書において使用される用語「ｔａＮＫ（登録商標）細胞」は、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｐｒ；８（４）：６５２−８（１９９４））に記載の高度に強力なユニーク細胞系に由来するナチュラルキラー細胞を指し、その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔにより保有され、キメラ抗原受容体を発現するように改変されている（以下、「ＣＡＲ改変ＮＫ−９２（商標）細胞」又は「ｔａＮＫ（登録商標）細胞」）。
【００３２】
本明細書において使用される用語「ｔ−ｈａＮＫ（商標）」細胞は、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｐｒ；８（４）：６５２−８（１９９４））に記載の高度に強力なユニーク細胞系に由来するナチュラルキラー細胞を指し、それはＮａｎｔｋＷｅｓｔにより保有され、細胞表面上でＣＤ１６を発現し、キメラ抗原受容体を発現するように改変されている（以下、「ＣＡＲ改変ＣＤ１６＋ＮＫ−９２（商標）細胞」又は「ｔ−ｈａＮＫ細胞」）。一部の実施形態において、腫瘍特異的抗原は、ＰＤ−Ｌ１であり、それらのＮＫ−９２（商標）細胞は、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞と称される。
【００３３】
本明細書において使用される用語「マルチシストロン性構築物」は、単一ｍＲＮＡ分子に転写され得る組換えＤＮＡ構築物を指し、単一ｍＲＮＡ分子は、２つ以上の導入遺伝子をコードする。マルチシストロン性構築物は、それが２つの導入遺伝子をコードする場合はバイシストロン性構築物と称され、それが３つの遺伝子をコードする場合はトリシストロン性構築物と称され、それが４つの遺伝子をコードする場合はクアドロシストロン性構築物と称され、以下同様である。
【００３４】
本明細書において使用される用語「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）は、細胞内シグナリングドメインと融合している細胞外抗原結合ドメインを指す。ＣＡＲは、Ｔ細胞又はＮＫ細胞中で発現させて細胞毒性を増加させることができる。一般に、細胞外抗原結合ドメインは、目的細胞上に見出される抗原に特異的なｓｃＦｖである。ＣＡＲ発現ＮＫ−９２（商標）細胞は、ｓｃＦｖドメインの特異性に基づき、ある抗原を細胞表面上で発現する細胞に標的化される。ｓｃＦｖドメインは、任意の抗原、例として、腫瘍特異的抗原及びウイルス特異的抗原を認識するように遺伝子操作することができる。例えば、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲは、一部の癌により発現される細胞表面マーカーのＰＤ−Ｌ１を認識する。
【００３５】
本明細書において使用される用語「腫瘍特異的抗原」は、癌又は新生物細胞上に存在するが、癌細胞と同一の組織又は系統に由来する正常細胞上では検出可能でない抗原を指す。本明細書において使用される腫瘍特異的抗原は、腫瘍関連抗原、すなわち、癌細胞と同一の組織又は系統に由来する正常細胞と比較して高いレベルにおいて癌細胞上で発現される抗原も指す。
【００３６】
本明細書において使用される用語「標的」は、腫瘍の標的化を指す場合、腫瘍細胞（すなわち、標的細胞）を認識し、殺傷するＮＫ−９２（商標）細胞の能力を指す。この文脈における用語「標的化される」は、例えば、腫瘍により発現される細胞表面抗原を認識し、それに結合するＮＫ−９２（商標）細胞により発現されるＣＡＲの能力を指す。
【００３７】
用語「抗体」は、任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリン、又は標的抗原への特異的結合についてインタクト抗体と競合し得るその断片を指し、それとしては、キメラ、ヒト化、完全ヒト、及び二重特異的抗体が挙げられる。インタクト抗体は、一般に、少なくとも２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含むが、一部の例において、より少ない鎖を含み得、例えば、ラクダにおいて天然に発生する抗体は、重鎖のみを含み得る。抗体は、もっぱら単一資源に由来し得、又は抗体の異なる部分が２つの異なる抗体に由来するような「キメラ」であり得る。抗原結合タンパク質、抗体、又は結合断片は、ハイブリドーマ中で組換えＤＮＡ技術により、又はインタクト抗体の酵素的若しくは化学的開裂により産生することができる。別途示されない限り、用語「抗体」は、２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含む抗体に加え、それらの誘導体、バリアント、断片、及びムテインを含む。さらに、明示的に排除されない限り、抗体としては、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書において「抗体模倣物」と称されることがある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物（本明細書において「抗体コンジュゲート」と称されることがある）、及びそれらの断片がそれぞれ挙げられる。一部の実施形態において、この用語は、ペプチボディも含む。
【００３８】
用語「対象」は、非ヒト動物、例として、哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、及びヤギ、並びにヒトを指す。対象という用語は、本明細書に記載の疾患のための治療が必要とされる患者も指す。
【００３９】
「任意選択」又は「場合により」は、続いて記載されるイベント又は状況が生じても生じなくてもよいこと、並びに記載がイベント又は状況が生じる例及び生じない例を含むことを意味する。
【００４０】
用語「含む」は、組成物及び方法が記載された要素を含むが、他の要素を排除するものでないことを意味するものとする。「から本質的になる」は、組成物及び方法を定義するために使用される場合、その組合せに対して任意の本質的に重要な他の要素を排除することを意味するものとする。例えば、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求の範囲の基本的且つ新規の特徴に実質的に影響を与えない他の要素を排除しない。「からなる」は、微量を上回る量の他の成分及び実質的な方法ステップを排除することを意味する。これらの移行語のそれぞれにより定義される実施態様は、本開示の範囲内である。
【００４１】
本明細書において使用される用語「細胞毒性」及び「細胞溶解性」は、エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞の活性を記載するために使用される場合、同義であるものとする。一般に、細胞毒性活性は、種々の生物学的、生化学的、又は生物物理学的機序のいずれかによる標的細胞の殺傷に関する。細胞溶解は、より具体的には、エフェクターが標的細胞の原形質膜を溶解し、それによりその物理的統合性を破壊する活性を指す。これは、標的細胞の殺傷をもたらす。理論による拘束を望むものではないが、ＮＫ細胞の細胞毒性効果は細胞溶解に起因すると考えられる。
【００４２】
細胞／細胞集団に関する用語「殺傷する」は、その細胞／細胞集団の死滅をもたらす任意のタイプの操作を含むものとする。
【００４３】
用語「サイトカイン」は、免疫系の細胞に影響を与える生物分子の一般的クラスを指す。例示的なサイトカインとしては、限定されるものではないが、ＦＬＴ３リガンド、インターフェロン及びインターロイキン（ＩＬ）、特にＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２１が挙げられる。
【００４４】
用語「患者」、「対象」、「個体」などは、本明細書では互換的に用いられ、本明細書に記載の方法に適する任意の動物、又はインビトロ若しくはインサイチューにかかわらずその細胞を指す。ある非限定的な実施形態において、患者、対象、又は個体はヒトである。
【００４５】
用語「治療する」又は「治療」は、対象、例えば、ヒトにおける本明細書に記載の疾患又は障害の治療を包含し、（ｉ）疾患若しくは障害を阻害すること、すなわち、その発生を停止させること；（ｉｉ）疾患若しくは障害を緩和すること、すなわち、障害の退縮を引き起こすこと；（ｉｉｉ）障害の進行を減速させること；及び／又は（ｉｖ）疾患若しくは障害の１つ以上の症状を阻害し、緩和し、若しくはその進行を減速させることを含む。対象にモノクローナル抗体又はナチュラルキラー細胞を「投与する」又は対象へのそれらの「投与」という用語は、目的の機能を果たすために抗体又は細胞を導入又は送達する任意の経路を含む。投与は、細胞又はモノクローナル抗体の送達に好適な任意の経路により実施することができる。したがって、送達経路としては、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下送達を挙げることができる。一部の実施形態において、改変ＮＫ−９２（商標）細胞は、例えば腫瘍中への注射により腫瘍に直接投与する。一部の実施形態において、本明細書に記載の改変ＮＫ−９２（商標）細胞は、例えば、注射、注入又は移植（皮下、静脈内、筋肉内、小胞内、又は腹腔内）により非経口投与する。
【００４６】
用語「発現」は、遺伝子産物の産生を指す。
【００４７】
本明細書において使用される用語「細胞毒性」は、エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞の活性を記載するために使用される場合、種々の生物学的、生化学的、又は生物物理学的機序のいずれかによる標的細胞の殺傷に関する。
【００４８】
用語「減少させる」、「低減された」、「低減」及び「減少」は全て、参照レベルと比較して少なくとも１０％だけの減少、例えば、少なくとも約２０％、若しくは少なくとも約３０％、若しくは少なくとも約４０％、若しくは少なくとも約５０％、若しくは少なくとも約６０％、若しくは少なくとも約７０％、若しくは少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％だけの減少若しくは１００％を含む最大１００％の減少（すなわち、参照サンプルと比較して不存在のレベル）、又は参照レベルと比較して１０〜１００％の任意の減少を指すために本明細書において使用される。
【００４９】
用語「癌」は、哺乳動物中に見出される全てのタイプの癌、新生物、又は悪性腫瘍、例として、白血病、癌腫及び肉腫を指す。例示的な癌としては、脳、乳房、子宮頸部、結腸、頭頸部、肝臓、腎臓、肺、非小細胞肺、黒色腫、中皮腫、卵巣、肉腫、胃、子宮及び髄芽腫の癌が挙げられる。追加の例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、癌、悪性膵インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽腫、食道癌、泌尿生殖器癌、悪性高カルシウム血症、子宮内膜癌、副腎皮質癌、膵内分泌部及び膵外分泌部の新生物、並びに前立腺癌が挙げられる。
【００５０】
用語「治療有効量」又は「有効量」は、非治療患者に対して疾患の症状を改善するために要求される量を指す。疾患の治療的処置のために本開示を実施するために使用される有効量の活性化合物は、投与方式、対象の年齢、体重、及び全身健康状態に応じて変動する。最終的には、主治医又は獣医師は、適切量及び投与量レジメンを決定する。このような量は、「有効」量と称される。
【００５１】
用語「腫瘍微小環境」は、周囲血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症細胞、シグナリング分子及び細胞外マトリックスを含む、腫瘍が存在する細胞環境を指す。腫瘍微小環境中の例示的なタイプの細胞としては、限定されるものではないが、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が挙げられる。
【００５２】
用語「免疫細胞」は、抗原の特異的認識に関与する造血系由来の細胞を指す。免疫細胞としては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、樹状細胞又はマクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、骨髄細胞、例えば、単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球が挙げられる。
【００５３】
表題又は副題は読者の簡便性のために本明細書において使用することができ、それらは本開示の範囲に影響を与えるものではない。さらに、本明細書において使用される一部の用語は以下により具体的に定義される。
【００５４】
ＭＤＳＣ
骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）は、腫瘍微小環境中の主な免疫抑制細胞の１つである。腫瘍の微小環境は、免疫活性細胞、例えば、ＮＫ細胞が腫瘍細胞と相互作用し、それらを攻撃及び殺傷するのを妨害する。これらの負の麻痺効果は、腫瘍微小環境中に存在する免疫抑制細胞の代謝産物及び分泌産物により媒介され得る。
【００５５】
ＭＤＳＣは、癌及び他の病理学的状態、例えば、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）における免疫応答の調節因子である（例えば、Ｂｒｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，６  Ｊｕｌ  ２０１６，７：１２１５０，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１２１５０；Ｅｋｓｉｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｌｏｗ  ｒｉｓｋ  ＭＤＳ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｅ  Ｆｃ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＣＤ３３  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＢＩ  ８３６８５８，”Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１７  Ｏｃｔｏｂｅｒ；３１（１０）：２１７２−２１８０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１７．２１を参照されたい）。骨髄由来免疫抑制細胞は、骨髄系統からの免疫細胞の不均一グループ、例えば、異なる分化の段階における早期骨髄前駆体、未成熟顆粒球、マクロファージ及び樹状細胞である。骨髄由来免疫抑制細胞は、病理学的状況、例えば、慢性感染及び癌において、変更された造血の結果として強力に拡大する（例えば、Ｅｋｓｉｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｌｏｗ  ｒｉｓｋ  ＭＤＳ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｅ  Ｆｃ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＣＤ３３  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＢＩ  ８３６８５８，”Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１７  Ｏｃｔｏｂｅｒ；３１（１０）：２１７２−２１８０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１７．２１を参照されたい）。
【００５６】
骨髄由来免疫抑制細胞は、免疫賦活特性ではなく強力な免疫抑制活性を保有する点で他の骨髄細胞タイプから区別される。他の骨髄細胞と同様に、骨髄由来免疫抑制細胞は、他の免疫細胞タイプ、例として、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、及びナチュラルキラー細胞と相互作用してそれらの機能を調節する。骨髄由来免疫抑制細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＮＫＴ細胞の細胞毒性活性、並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される適応免疫応答の両方を抑制し得る。これらの作用機序は十分理解されているわけではないが、臨床及び実験証拠は、骨髄由来免疫抑制細胞の高い浸潤性を有する癌組織が不良の患者予後及び治療法に対する耐性と関連することを示している。
【００５７】
末梢循環中のＭＤＳＣの蓄積は病期と関連しており、ステージと相関する。ＭＤＳＣは、主に、抗腫瘍免疫の抑制による腫瘍成長の促進に関与している。ＭＤＳＣが血管新生及び転移拡散にも関与する説得力のある証拠も存在する。
【００５８】
ＭＤＳＣの２つの主なサブセットが癌患者において同定されている：ＣＤ１４の発現により特徴付けられる単球サブセット、及びＣＤ１５の発現により特徴付けられる顆粒球サブセット。ＭＤＳＣの両方のサブセットは、種々の機序、例えば、反応性酸素種及びアルギナーゼの産生を介して宿主免疫を活性的に抑制する。ヒトと同様、単球及び顆粒球ＭＤＳＣの蓄積は、腫瘍担持マウスの骨髄、脾臓、末梢循環、及び腫瘍中に指摘されてきた。マウスにおけるＭＤＳＣの良好な標的化は、免疫応答の改善、腫瘍成長の遅延、生存率の改善、及びワクチン療法の効力の増加と関連する。腫瘍において単球由来ＭＤＳＣは、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）に急速に分化する。
【００５９】
腫瘍関連マクロファージ
腫瘍は、マクロファージが濃縮される反応性間質の一部として免疫浸潤と関連することが多い。典型的には、マクロファージは、腫瘍成長に対して逆の効果を有するＭ１及びＭ２マクロファージに分類される：Ｍ１マクロファージは腫瘍細胞成長を阻害する一方、Ｍ２マクロファージは腫瘍発生を促進する。腫瘍細胞は、ケモカイン及び極性化サイトカインを介してマクロファージをＭ２様表現型に導き、破壊からのそれらの回避を補助し、それらの発生を促進する。これらのＭ２マクロファージは、一般に、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）と称される。ＴＡＭは、腫瘍微小環境中で滞留し、新血管形成及びマトリックス分解の促進による腫瘍成長の容易化における重要な役割を担う。結果的に、多数のＴＡＭの有する多くの腫瘍は、増加した腫瘍成長速度、局所増殖及び遠位転移を有する。
【００６０】
ＴＡＭは、ＣＤ６８並びに他のマーカーを発現し、例えば、一部のＴＡＭは、以下のマーカーＣＤ２０６、ＣＤ２０４、又はＣＤ１６３の１つ以上を発現する。
【００６１】
ＮＫ−９２（商標）細胞
ＮＫ−９２（商標）は、非ホジキンリンパ腫を罹患する対象の血液中で発見され、次いでインビトロで不死化された細胞溶解癌細胞系である。ＮＫ−９２（商標）細胞はＮＫ細胞に由来するが、正常ＮＫ細胞によりディスプレイされる主要な阻害受容体を欠く一方、活性化受容体の大多数を保持する。しかしながら、ＮＫ−９２（商標）細胞は正常細胞を攻撃することもなく、それらはヒトにおいて許容不可能な免疫拒絶応答を誘発することもない。ＮＫ−９２（商標）細胞系の特徴付けは、国際公開第１９９８／０４９２６８号パンフレット及び米国特許出願公開第２００２−００６８０４４号明細書に開示されている。ＮＫ−９２（商標）細胞は、ある癌の治療における治療剤として評価されている。
【００６２】
ベクター
本明細書に記載の改変細胞を産生するために細胞を形質移入するためのベクターが、本明細書に記載される。一実施形態において、本明細書に記載のベクターは、一過的発現ベクターである。このようなベクターを使用して導入される外因性導入遺伝子は細胞の核ゲノム中にインテグレートされず；したがって、ベクター複製の不存在下で外来導入遺伝子は分解され、又は経時的に希釈される。
【００６３】
一実施形態において、本明細書に記載のベクターは、細胞の安定的形質移入を可能とする。一実施形態において、ベクターは、細胞のゲノム中への導入遺伝子の取り込みを可能とする。一実施形態において、ベクターは、陽性選択マーカーを有する。陽性選択マーカーとしては、任意の遺伝子を発現しない細胞を殺傷する条件下で細胞が成長するのを可能とする任意の遺伝子が挙げられる。非限定的な例としては、抗生物質耐性、例えば、ジェネティシン（Ｔｎ５からのＮｅｏ遺伝子）が挙げられる。
【００６４】
一実施形態において、ベクターは、プラスミドベクターである。一実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。当業者により理解されるとおり、任意の好適なベクターを使用することができる。好適なベクターは、当該技術分野において周知である。
【００６５】
一部の実施形態において、細胞は、目的タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードするｍＲＮＡにより形質移入される。ｍＲＮＡの形質移入は、タンパク質の一過的発現をもたらす。一実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞中へのｍＲＮＡの形質移入は、細胞の投与直前に実施される。一実施形態において、細胞の投与「直前」は、投与の約１５分〜約４８時間前を指す。好ましくは、ｍＲＮＡ形質移入は、投与の約５時間〜約２４時間前に実施される。
【００６６】
ＰＤ−Ｌ１
プログラム化細胞死リガンド（ＰＤ−Ｌ１）は、ＰＤ−１に結合してＴ細胞活性化を抑制する阻害リガンドである。ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍細胞中で構成的に発現され、誘導される。ＰＤ−Ｌ１は、ＭＤＳＣ中でも発現される。無腫瘍マウスと比較して腫瘍担持マウスにおいてＰＤ−Ｌ１発現ＭＤＳＣの数が有意に増加したこと、及びリンパ器官と比較して腫瘍浸潤ＭＤＳＣ中でＰＤ−Ｌ１発現が有意に高いことが報告されている。Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｍａｙ  １，２０１７，１９８  （１  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）１２４．９を参照されたい。ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）中でも発現され、ＰＤ−Ｌ１のそのＴＡＭ発現はその受容体結合後にＴ細胞アポトーシスを直接誘導し得る。Ｋｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００９；２０６：１３２７−１３３７。
【００６７】
ＣＡＲ
腫瘍細胞をその同一組織に由来する正常細胞から区別する表現型変化は、特異的遺伝子産物の発現の１つ以上の変化、例として、正常細胞表面構成成分の損失又は他の細胞表面構成成分（すなわち、対応する正常、非癌性組織中で検出可能でない抗原）の獲得と関連することが多い。新生物若しくは腫瘍細胞中で発現されるが、正常細胞中では発現されない抗原、又は正常細胞中で見出されるレベルを実質的に上回るレベルにおいて新生物細胞中で発現される抗原は、「腫瘍特異的抗原」又は「腫瘍関連抗原」と称されている。腫瘍特異的抗原は、癌免疫療法のための標的として使用されている。１つのこのような治療法は、免疫細胞、例として、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の表面上で発現されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を利用して癌細胞に対する細胞毒性を改善する。ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞内シグナリングドメインに結合している単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは、標的細胞（例えば、癌細胞）上の抗原を認識し、それに結合し、エフェクター細胞活性化をトリガーする。シグナリングドメインは、受容体による細胞内シグナリングに重要である免疫受容体チロシンベース活性化ドメイン（ＩＴＡＭ）を含有する。
【００６８】
本開示は、細胞表面上で少なくともキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作されたＮＫ−９２（商標）細胞を提供する。ＣＡＲは、細胞外抗原認識部分（通常、特異的抗体の可変ドメインに由来する、と、特異的抗原が認識されると細胞溶解応答をトリガーし得る細胞内シグナリングドメイン（単一又は追加の共刺激エレメントを有する）とを組み合わせる。複数のタイプのＣＡＲが存在し、それら全てを本出願において使用することができる。第１世代のＣＡＲは、１つの細胞質シグナリングドメインを含有する。シグナリングドメインは、例えば、１つのＩＴＡＭを含有するＦｃイプシロン受容体ガンマ（ＦｃεＲＩγ）に、又は３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３ζに由来し得る。ＣＤ３ζ  ＣＡＲは、腫瘍根絶においてＦｃεＲＩγ  ＣＡＲよりも効率的であることが考えられる。例えば、Ｈａｙｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６６：１８２−１８７；Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ，ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｖｏｌ．２０１０，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ９５６３０４を参照されたい。第２及び第３世代ＣＡＲは、複数のシグナリングドメイン、例えば、ＣＤ３ζの細胞質シグナリングドメイン及び共刺激シグナリングドメイン、例えば、ＣＤ２８／ＣＤ１３４／ＣＤ１３７／ＩＣＯＳ及びＣＤ２８／ＣＤ１３４と、単一ＣＡＲとを組み合わせてＮＫ−９２（商標）細胞の活性化及び増殖を促進する。したがって、一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞により発現されるＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲは、ＣＤ８からのヒンジ領域、及び／又はＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲは、ＦｃεＲＩγの細胞質シグナリングドメインを含む。一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲは、ＣＤ３ζの細胞質シグナリングドメインを含む。ヒンジ領域、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン及びＦｃεＲＩγ又はＣＤ３ζの細胞質シグナリングドメインの例は、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６２／６７４，９３６号明細書に開示されている。従来の刊行物、例えば、Ｈａｙｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６６：１８２−１８７及びＣａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ，ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｖｏｌ．２０１０，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ９５６３０４は、ＣＤ３ζ  ＣＡＲが腫瘍根絶においてＦｃεＲＩγ  ＣＡＲよりも有効であり得ることを開示している一方、本件で、本発明者らは、驚くべきことに、且つ予想外に、そのようなものは、本明細書に開示の細胞、組成物、及び方法について当てはまらないことを見出した。実際、本発明者らは、１つのみのＩＴＡＭドメインを有するＦｃεＲＩγからの細胞内ドメインを含む第１世代ＣＡＲを含有するＮＫ−９２細胞が、３つのＩＴＡＭドメインを他のシグナリングドメインと組み合わせた場合（すなわち、第２又は第３世代ＣＡＲ；ここではデータ示さず）でも、３つのＩＴＡＭドメインを有するＣＤ３ζシグナリングドメインを有するＣＡＲを発現するＮＫ−９２細胞と、ＣＡＲにより認識される抗原を発現する癌細胞に対する同等以上の細胞毒性活性を有する��とを見出した。例示的なＣＡＲを図１に模式的に説明する。特に、ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）は、その天然状況において、ジスルフィド結合を介して互いに結合している２つのガンマ鎖を含み、通常、好酸球、好塩基球、及び上皮ランゲルハンス細胞中でのみ発現される。本発明者らはまた、ＦｃεＲＩγからの細胞内ドメインを含むＣＡＲが他のＣＡＲ、特に、ＣＤ３ζシグナリングドメインを含むものよりも高いレベルにおいてＮＫ−９２細胞の表面上で発現されるという予想外の発見をした。
【００６９】
場合により、ＣＡＲはＰＤ−Ｌ１に特異的である。一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１は、ヒトＰＤ−Ｌ１である。一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲは、配列番号１４のアミノ酸配列を有する。
【００７０】
一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲポリペプチドは、配列番号１０又は配列番号１０内のＣＤＲ配列部分と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態において、エピトープタグペプチド、例えば、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ポリヒスチジン、又はＶ５をポリペプチドのアミノ末端ドメインに付加して抗エピトープタグペプチドモノクローナル又はポリクローナル抗体の使用による細胞表面検出を支援することができる。
【００７１】
例において、当該技術分野において公知の方法、例えば、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発を使用してバリアントポリペプチドを作製する。部位特異的突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ，１９８６；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９８７）、カセット突然変異誘発、制限選択突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）又は他の公知の技術をクローニングされたＤＮＡに対して実施してＣＤ１６バリアントを産生する（Ａｕｓｕｂｅｌ，２００２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１）。
【００７２】
一部の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを突然変異させてＣＡＲの機能を変更せずにＣＡＲをコードするアミノ酸配列を変更する。例えば、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすポリヌクレオチド置換を、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲのｓｃＦｖ部分をコードするコドン最適化配列である配列番号９中で作製することができる。
【００７３】
１つのクラスのアミノ酸を同一クラスの別のアミノ酸により置き換える配列番号９中の保存的置換は、その置換がポリペプチドの活性を実質的に変更しない限り、開示されるバリアントの範囲内に収まる。保存的置換は、当業者に周知である。（１）ポリペプチド骨格の構造、例えば、β−シート又はα−ヘリカル立体構造、（２）電荷、（３）疎水性、又は（４）標的部位の側鎖のかさ高さに影響を与える非保存的置換は、ポリペプチド機能又は免疫学的アイデンティティを改変し得る。非保存的置換は、それらのクラスの１つのメンバーと、別のクラスとの交換を伴う。置換は、保存的置換部位又はより好ましくは、非保存部位中に導入することができる。
【００７４】
例において、当該技術分野において公知の方法、例えば、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発を使用してバリアントポリペプチドを産生する。部位特異的突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ，１９８６；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９８７）、カセット突然変異誘発、制限選択突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）又は他の公知の技術をクローニングされたＤＮＡに対して実施してバリアントを産生することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ，２００２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１）。
【００７５】
場合により、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞を使用して癌、特に、ＰＤ−Ｌ１を発現する癌を治療することができる。場合により、癌は、白血病（例として、急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（例として、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤白血病））及び慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ性白血病）、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、例として、限定されるものではないが、肉腫及び癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫からなる群から選択される。
【００７６】
Ｆｃ受容体
一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、少なくとも１つのＦｃ受容体を発現するように改変されており、その結果、少なくとも１つのＦｃ受容体は、ＮＫ−９２（商標）細胞の細胞表面上でディスプレイされる。Ｆｃ受容体は、抗体のＦｃ部分に結合する。いくつかのＦｃ受容体は公知であり、それらの好ましいリガンド、親和性、発現、及び抗体への結合後の効果により異なる。
【００７７】
【表１】
2021519602.tif 000003
【００７８】
【表２】
2021519602.tif 000004
【００７９】
一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、細胞表面上でＦｃ受容体タンパク質を発現するように改変されている。
【００８０】
一部の実施形態において、Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６である。本開示の目的のため、ＣＤ１６の特異的アミノ酸残基は、配列番号２、又は配列番号２に対して１つの位置において異なる配列番号１を参照して指定される。したがって、ＣＤ１６ポリペプチドの「１５８位における」アミノ酸残基は、ＣＤ１６ポリペプチド及び配列番号２が最大でアラインされる場合、配列番号２（又は配列番号１）の１５８位に対応するアミノ酸残基である。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、タンパク質の成熟形態、例えば、配列番号１の１５８位におけるフェニルアラニンを有するヒトＣＤ１６を発現するように改変されている。典型的な実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、タンパク質の成熟形態、例えば、配列番号２の１５８位におけるバリンを有するヒトＣＤ１６の高親和性形態を発現するように改変されている。成熟タンパク質の１５８位は、天然シグナルペプチドを含むＣＤ１６配列の１７６位に対応する。一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリペプチドは、配列番号３又は配列番号４の前駆体（すなわち、天然シグナルペプチドを有する）ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドによりコードされる。したがって、一実施形態において、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩ−Ａ（ＣＤ１６）を含む。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、配列番号１（ＦｃγＲＩＩＩ−Ａ又は１５８位におけるフェニルアラニン（Ｆ−１５８）を有するＣＤ１６と少なくとも９０％の配列同一性；又は配列番号２（１５８位におけるバリン（Ｆ１５８Ｖ）を有するＣＤ１６、より高親和性の形態）と少なくとも９０％の同一性を有するＦｃ受容体コードポリペプチドを発現するように遺伝子改変されている。
【００８１】
一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、全長ＣＤ１６の１７６位（成熟ＣＤ１６タンパク質の１５８位に対応する）におけるフェニルアラニンを有するシグナルペプチドを含む全長天然発生ＣＤ１６をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性を有する。一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１７６位（成熟タンパク質の１５８位に対応する）におけるバリンを有するシグナルペプチドを含む全長天然発生ＣＤ１６をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性を有する。一部の実施形態において、ＣＤ１６をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有し、シグナルペプチドを含む全長ＣＤ１６ポリペプチドの１７６位をコードするポリヌクレオチドの位置におけるバリンをコードするコドンを含む。一部の実施形態において、ＣＤ１６をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５を含むが、全長ＣＤ１６の１７６位におけるバリンをコードするコドンを有する。
【００８２】
一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリヌクレオチドは、配列番号１又は配列番号２と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有するポリペプチドをコードし、配列番号２を参照して決定される１５８位におけるバリンを含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２をコードする。一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリヌクレオチドは、シグナル配列を有し若しくは有さないＣＤ１６の細胞外ドメイン、又は全長ＣＤ１６の任意の他の断片、又は別のタンパク質のアミノ酸配列に融合しているＣＤ１６の少なくとも部分配列を包含するキメラ受容体をコードする。他の実施形態において、エピトープタグペプチド、例えば、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ポリヒスチジン、又はＶ５を成熟ポリペプチドのアミノ末端ドメインに付加して抗エピトープタグペプチドモノクローナル又はポリクローナル抗体の使用による細胞表面検出を支援することができる。
【００８３】
一部の実施形態において、相同性ＣＤ１６ポリヌクレオチドは、約１５０〜約７００、約７５０、又は約８００個のポリヌクレオチド長さであり得るが、７００〜８００個超のポリヌクレオチドを有するＣＤ１６バリアントは本開示の範囲内である。
【００８４】
相同性ポリヌクレオチド配列としては、ＣＤ１６のバリアントをコードするポリペプチド配列をコードするものが挙げられる。相同性ポリヌクレオチド配列としては、配列番号１に関する天然発生アレルバリエーションも挙げられる。配列番号１若しくは配列番号２のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、その天然発生バリアント、又は配列番号１若しくは配列番号２と少なくとも７０％同一、若しくは少なくとも８０％、９０％、若しくは９５％同一である配列をコードする任意のポリヌクレオチドによるＮＫ−９２（商標）細胞の形質移入は、本開示の範囲内である。一部の実施形態において、相同性ポリヌクレオチド配列は、配列番号１又は配列番号２中の保存的アミノ酸置換をコードする。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、天然ポリヌクレオチド配列と異なるが、同一のポリペプチドをコードする縮重相同性ＣＤ１６ポリヌクレオチド配列を使用して形質移入される。
【００８５】
他の例において、ＣＤ１６アミノ酸配列を変化させる多型を有するｃＤＮＡ配列、例えば、ＣＤ１６遺伝子中の遺伝子多型を示す個体間のアレルバリエーションなどを使用して、ＮＫ−９２（商標）細胞を改変する。他の例において、配列番号１の配列と異なるポリヌクレオチド配列を有する他の種からのＣＤ１６遺伝子を使用してＮＫ−９２（商標）細胞を改変する。
【００８６】
バリアントポリペプチドは、当該技術分野において公知の方法、例えば、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発を使用して作製することができる。部位特異的突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ，１９８６；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９８７）、カセット突然変異誘発、制限選択突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）又は他の公知の技術をクローニングされたＤＮＡに対して実施してＣＤ１６バリアントを産生することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ，２００２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１）。
【００８７】
一部の実施形態において、ＣＤ１６をコードするポリヌクレオチドを突然変異させてＣＤ１６の機能を変更せずにＣＤ１６をコードするアミノ酸配列を変更する。例えば、例えば、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすポリヌクレオチド置換を、配列番号１又は配列番号２中で作製することができる。
【００８８】
１つのクラスのアミノ酸を同一クラスの別のアミノ酸により置き換える配列番号１又は配列番号２中の保存的置換は、その置換がポリペプチドの活性を実質的に変更しない限り、開示されるＣＤ１６バリアントの範囲内に収まる。保存的置換は、当業者に周知である。（１）ポリペプチド骨格の構造、例えば、β−シート又はα−ヘリカル立体構造、（２）電荷、（３）疎水性、又は（４）標的部位の側鎖のかさ高さに影響を与える非保存的置換は、ＣＤ１６ポリペプチド機能又は免疫学的アイデンティティを改変し得る。非保存的置換は、それらのクラスの１つのメンバーと、別のクラスとの交換を伴う。置換は、保存的置換部位又はより好ましくは、非保存部位中に導入することができる。
【００８９】
一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリペプチドバリアントは、少なくとも２００個のアミノ酸長さであり、配列番号１又は配列番号２と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリペプチドバリアントは、少なくとも２２５個のアミノ酸長さであり、配列番号１又は配列番号２と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリペプチドバリアントは、配列番号２を参照して決定される１５８位におけるバリンを有する。
【００９０】
一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリペプチドをコードする核酸は、ＣＤ１６融合タンパク質をコードし得る。ＣＤ１６融合ポリペプチドとしては、非ＣＤ１６ポリペプチドと融合しているＣＤ１６の任意の部分又はＣＤ１６全体が挙げられる。融合ポリペプチドは、組換え方法を使用して簡便に作出される。例えば、ＣＤ１６ポリペプチド、例えば、配列番号１又は配列番号２をコードするポリヌクレオチドは、非ＣＤ１６コードポリヌクレオチド（例えば、異種タンパク質のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）とインフレームで融合される。一部の実施形態において、異種ポリペプチド配列がＣＤ１６のＣ末端に融合しており、又はＣＤ１６中に内部的に位置する融合ポリペプチドを作出することができる。典型的には、ＣＤ１６細胞質ドメインの最大約３０％を置き換えることができる。このような改変は、発現を向上させ、又は細胞毒性（例えば、ＡＤＣＣ応答性）を向上させ得る。他の例において、キメラタンパク質、例えば、他のリンパ球活性化受容体、例として、限定されるものではないが、Ｉｇ−ａ、Ｉｇ−Ｂ、ＣＤ３−ｅ、ＣＤ３−ｄ、ＤＡＰ−１２及びＤＡＰ−１０からのドメインが、ＣＤ１６細胞質ドメインの一部と置き換わる。
【００９１】
融合遺伝子は、慣用の技術、例として、自動化ＤＮＡ合成装置及び２つの連続する遺伝子断片（続いてこれをアニールし、再増幅させてキメラ遺伝子配列を生成することができる）間の相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用するＰＣＲ増幅により合成することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ，２００２）。融合部分へのインフレームでのＣＤ１６のサブクローニングを容易にする多くのベクターが市販されている。
【００９２】
サイトカイン
ＮＫ−９２細胞の細胞毒性は、サイトカイン（例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２））の存在に依存的である。市販スケール培養でＮＫ−９２細胞を維持し、拡大するために必要とされる外因的に添加されるＩＬ−２を使用するコストは、かなりのものである。ＮＫ９２細胞の活性化を継続するために十分な量のＩＬ−２のヒト対象への投与は、有害副作用を引き起こす。
【００９３】
一実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、少なくとも１つのサイトカインを発現するように改変されている。特に、少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ−２（配列番号６）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、又はそのバリアントである。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−２又はそのバリアントである。ある実施形態において、ＩＬ−２は、小胞体に標的化されるバリアントである。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−１５又はそのバリアントである。ある実施形態において、ＩＬ−１５は、小胞体に標的化されるバリアントである。
【００９４】
一実施形態において、ＩＬ−２は、ＩＬ−２を小胞体に指向するシグナル配列とともにクローニング及び発現される（ｅｒＩＬ−２）（配列番号７）。これは、ＩＬ−２を細胞外に放出させずにオートクリン活性化に十分なレベルにおけるＩＬ−２の発現を可能とする。Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＩＬ−２  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｏｎｆｉｎｅｓ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ＮＫ−９２ＴＭｃｅｌｌｓ”Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００５  Ｆｅｂ；３３（２）：１５９−６４を参照されたい。ＦｃＲ発現ＮＫ−９２細胞の継続的活性化は、例えば、自殺遺伝子の存在により防止することができる。
【００９５】
自殺遺伝子
用語「自殺遺伝子」は、自殺遺伝子を発現する細胞の陰性選択を可能とする導入遺伝子を指す。自殺遺伝子は、その遺伝子を発現する細胞を選択剤の導入により殺傷することができる安全系として使用される。これは、組換え遺伝子が制御不能な細胞成長をもたらす突然変異を引き起こす場合、又は細胞自体がそのような成長をし得る場合に望ましい。多数の自殺遺伝子系、例として、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｇｐｔ遺伝子、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｄｅｏ遺伝子が同定されている。典型的には、自殺遺伝子は、細胞に対する悪影響を有さないが、規定の化合物の存在下でその細胞を殺傷するタンパク質をコードする。したがって、自殺遺伝子は、典型的には、系の一部である。
【００９６】
一実施形態において、自殺遺伝子は、ＮＫ−９２（商標）細胞中で活性である。一実施形態において、自殺遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子である。ＴＫ遺伝子は、野生型又は突然変異ＴＫ遺伝子（例えば、ｔｋ３０、ｔｋ７５、ｓｒ３９ｔｋ）であり得る。ＴＫタンパク質を発現する細胞は、ガンシクロビルを使用して殺傷することができる。
【００９７】
別の実施形態において、自殺遺伝子は、５−フルオロシトシンの存在下で細胞に毒性であるシトシンデアミナーゼである。Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ５−ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｄｕｃｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  １  ｍｉｌｌｉｏｎ−ｆｏｌｄ  ｗｈｅｎ  ｔｈｅｙ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｕｒｇｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．”Ｂｌｏｏｄ．１９９８  Ｊｕｌ  １５；９２（２）：６７２−８２。
【００９８】
別の実施形態において、自殺遺伝子は、イホスファミド又はシクロホスファミドの存在下で毒性であるシトクロムＰ４５０である。例えば、Ｔｏｕａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．“Ａ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｔｕｍｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．”Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１４；１４（３）：２３６−４６を参照されたい。
【００９９】
別の実施形態において、自殺遺伝子は、ｉＣａｓｐ９である。Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ，（２０１１）“Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｓａｆｅｔｙ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５：１６７３−１６８３。Ｍｏｒｇａｎ，“Ｌｉｖｅ  ａｎｄ  Ｌｅｔ  Ｄｉｅ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｕｉｃｉｄｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｏｖｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）；２０：１１−１３も参照されたい。ｉＣａｓｐ９は、低分子ＡＰ１９０３の存在下でアポトーシスを誘導する。ＡＰ１９０３は生物学的に不活性な低分子であり、臨床試験において良好に忍容性であることが示されており、養子細胞療法の状況において使用されている。
【０１００】
コドン最適化
一部の実施形態において、ａＮＫ細胞を形質転換するために使用される構築物の配列は、ヒト系中でのＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ、ＣＤ１６、及び／又はｅｒＩＬ−２の発現効率を最大化するようにコドン最適化されている。コドン最適化は、典型的には、天然配列のコドンの少なくとも１つ、２つ以上、又はかなりの数を、発現系の遺伝子においてより高頻度に又は最も高頻度に使用されるコドンにより置き換えることにより核酸配列を改変することにより実施される。コドン最適化を翻訳速度に使用し、又はそれを使用して所望の特性、例えば、非最適化配列を使用して産生される転写産物と比較して長い半減期を有する組換えＲＮＡ転写産物を産生することができる。コドン最適化の方法は容易に利用可能であり、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）からのＧｅｎｅＡｒｔ（商標）；ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲにおいて無料でアクセス可能なＯｐｔｉｍｉｚｅｒ、及びＤＮＡ  ２．０（Ｎｅｗａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からのＧｅｎｅＧＰＳ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙである。特定の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲのコード配列はコドン最適化されており、配列番号１０のタンパク質配列をコードする配列番号９に記載の配列（ｓｃＦｖ部分）を含む。一部の実施形態において、コドン最適化ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲコード配列は、配列番号１５のタンパク質配列をコードする配列番号１４に記載の配列である。
【０１０１】
導入遺伝子発現
導入遺伝子は、当業者に公知の任意の機序により発現ベクター中に遺伝子操作することができる。複数の導入遺伝子を細胞中に挿入すべき場合、導入遺伝子は、同一の発現ベクター又は異なる発現ベクター中に遺伝子操作することができる。
【０１０２】
一部の実施形態において、細胞は、発現させるべきトランスジェニックタンパク質をコードするｍＲＮＡにより形質移入される。
【０１０３】
導入遺伝子及びｍＲＮＡは、当該技術分野において公知の任意の形質移入法、例として、非限定的な例として、感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、ヌクレオフェクション、又は「遺伝子銃」を使用してＮＫ−９２（商標）細胞中に導入することができる。
【０１０４】
ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲを発現するＮＫ−９２（商標）細胞
本開示は、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ及びＦｃＲを発現する改変ＮＫ−９２（商標）細胞を提供する。場合により、改変ＮＫ−９２（商標）細胞は、ＩＬ−２をさらに発現する。
【０１０５】
一部の実施形態において、改変ＮＫ−９２（商標）細胞は、マルチシストロン性導入遺伝子を含み、マルチシストロン性導入遺伝子は、キメラ抗原受容体及びＦｃ受容体、並びに場合によりＩＬ−２をコードする。
【０１０６】
一部の実施形態において、ＦｃＲは、ＣＤ１６である。一部の実施形態において、ＣＤ１６は、配列番号２を含み、又はそれからなる高親和性ＣＤ１６である。一部の実施形態において、ＩＬ−２は、配列番号７を含み、又はそれからなるｅｒＩＬ−２である。
【０１０７】
一部の実施形態において、ＣＡＲコード配列及びＣＤ１６コード配列は、Ｐ２Ａ配列（配列番号８ｇｇａａｇｃｇｇａｇｃｔａｃｔａａｃｔｔｃａｇｃｃｔｇｃｔｇａａｇｃａｇｇｃｔｇｇａｇａｃｇｔｇｇａｇｇａｇａａｃｃｃｔｇｇａｃｃｔ）により離隔している。この構成は、単一ｍＲＮＡからのＣＡＲ及びＣＤ１６の等モル発現を可能とする。
【０１０８】
一部の実施形態において、ＣＤ１６コード配列及びｅｒＩＬ−２コード配列は、内部翻訳開始を可能とする内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）により離隔している。
【０１０９】
一部の実施形態において、改変ＮＫ−９２（商標）細胞は、単一ｍＲＮＡからＣＡＲ、高親和性ＣＤ１６、及びｅｒＩＬ−２を発現するトリシストロン性構築物を含む。一部の実施形態において、トリシストロン性構築物は、配列番号１１に記載の配列を含む。ＣＡＲのインテグレーションは、エフェクター細胞が、ＣＡＲにより認識される標的を発現する標的細胞に特異的にエンゲージし、それを殺傷するのを可能とし；ＣＤ１６のインテグレーションは、治療モノクローナル抗体と組み合わせた場合にＡＤＣＣを可能とし；ｅｒＩＬ２は外因性ＩＬ−２の不存在下で細胞拡大を可能とし、導入遺伝子発現についての選択圧を維持する。１つの実例的なトリシストロン性構築物を図２に示し、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ及びＣＤ１６融合タンパク質についての例示的タンパク質配列を配列番号１２に示す。
【０１１０】
ＣＡＲ及びＣＤ１６（例えば、高親和性ＣＤ１６）、並びにｅｒＩＬ−２を発現する改変ＮＫ−９２（商標）細胞を産生するため、マルチシストロン性プラスミドを、例えば、エレクトロポレーションによりａＮＫ（商標）細胞中に導入する。形質転換ＮＫ−９２（商標）細胞は、ＩＬ−２を有さない培地中で成長させ、個々のクローンを形質転換ＮＫ−９２（商標）細胞から、限定希釈クローニングにより選択し、基準、例として、例えば、高レベルのＣＡＲ及びＣＤ１６発現、細胞毒性、ＡＤＣＣ、成長速度、及び／又はＩＬ−２分泌に基づき特徴付けすることができる。好適なクローンは、表面マーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／又はＮＫｐ３０も、ａＮＫ（商標）細胞のものと実質的に類似するレベルにおいて発現し得る。場合により、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）を実施して導入遺伝子インテグレーション部位を決定する。これらの基準の１つ以上を満たすクローンをさらなる開発のために選択し、それを使用して診療所において患者を治療することができる。
【０１１１】
発現
ＩＬ−２の発現は、ＩＬ−２不含条件における改変ＮＫ−９２（商標）細胞の能力により確認することができる。ＣＡＲ及びＣＤ１６の発現は、フローサイトメトリーにより計測することができる。ＣＡＲ、ＣＤ１６、及びＩＬ−２（例えば、ｅｒＩＬ−２、配列番号１３）のコード配列を含むトリシストロン性構築物により形質転換されたＮＫ−９２（商標）細胞について、典型的には、ＩＬ−２不含条件で成長し得る形質転換細胞の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％が、ＣＡＲ及びＣＤ１６の両方の高い発現レベルも示す。
【０１１２】
場合により、形質転換ＮＫ−９２（商標）細胞のＩＬ−２分泌レベルは、種々の時点において当該技術分野において周知の方法を使用して、例えば、ＥＬＩＳＡにより計測することができる。
【０１１３】
一部の実施形態において、培養上清中のＩＬ−２レベルを計測して細胞培養培地に放出されるＩＬ−２のレベルを決定する。一部の実施形態において、細胞ペレット中のＩＬ−２レベルを計測してＩＬ−２の総細胞内レベルを評価する。一部の実施形態において、上清中のＩＬ−２量及び細胞ペレット中のＩＬ−２量の両方を計測して形質転換ＮＫ−９２（商標）細胞により産生されるＩＬ−２の総量を決定する。
【０１１４】
場合により、形質転換ＮＫ−９２（商標）細胞の他の表面マーカーは、フローサイトメトリーにより計測することができる。これらのマーカーとしては、限定されるものではないが、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、及びＣＤ３が挙げられる。好適なクローンは、同一の成長条件下でａＮＫ（商標）細胞とそれらのマーカーの実質的に類似する発現レベルを実証したものである。
【０１１５】
細胞毒性
場合により、トリシストロン性プラスミドにより形質転換されたＮＫ−９２（商標）細胞の細胞毒性も、当該技術分野において周知の方法を使用して試験することができる。ＮＫ−９２（商標）細胞の細胞毒性は、それらの直接細胞毒性又はＡＤＣＣ活性により反映することができる。産生されたＮＫ−９２（商標）細胞の直接細胞毒性、異常細胞、例えば、腫瘍細胞を標的化し、殺傷する能力は、当該技術分野において周知の方法、例えば、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３３：３９５−３９７（１９９１））により記載された手順を使用する５１Ｃｒ放出アッセイ（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｐｒ；８（４）：６５２−８（１９９４））により評価することができる。一部の実施形態において、標的細胞は、ｔ−ｈａＮＫ細胞の表面上で発現されるＣＡＲにより認識され得る抗原を発現する。簡潔に述べると、５１Ｃｒ標識標的細胞をＮＫ−９２（商標）細胞と混合し、溶解させる。特異的細胞毒性の割合は、放出される５１Ｃｒの量に基づき計算することができる。米国特許出願公開第２００２００６８０４４号明細書を参照されたい。
【０１１６】
場合により、トリシストロン性プラスミドにより形質転換されたＮＫ−９２（登録商標）細胞の細胞毒性は、フローベース細胞毒性アッセイにおいて使用して評価することができる。エフェクター細胞（ＮＫ−９２（登録商標）細胞）及びフルオロフォア標識標的細胞、例えば、腫瘍細胞を異なるエフェクターと標的との比において混合する。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を細胞に添加することができ、試料をフローサイトメーターにより分析することができる。好ましくは、標的細胞を標識するために使用されるフルオロフォアは、フローサイトメーター中でＰＩと区別することができる。一部の実施形態において、フルオロフォアは、ＣＦＳＥである。一部の実施形態において、フルオロフォアは、ＰＫＨＧＬ６７である。細胞毒性は、フルオロフォア陽性標的集団内のＰＩ陽性細胞の％により決定することができる。
【０１１７】
或いは、産生されるＮＫ−９２（商標）細胞の直接細胞毒性は、カルセイン放出アッセイを使用して評価することもできる。例えば、ＮＫ−９２（商標）細胞（アッセイにおいてエフェクターと称される）をカルセイン負荷標的細胞（アッセイにおいて標的と称される）と、ある比において混合することができる。一定時間のインキュベーション後、標的細胞から放出されたカルセインを、例えば、蛍光プレートリーダーにより評価することができる。アッセイにおいて使用されるエフェクターと標的との比は変動し得、場合により、エフェクター：標的比は、２０：１、１５：１、１０：１、８：１、又は５：１であり得；好ましくは、エフェクター：標的比は、１０：１である。標的細胞は、ＮＫ−９２（商標）細胞（ｔ−ｈａＮＫ細胞）上のＣＡＲにより認識され得る抗原分子を発現する任意の細胞であり得る。例えば、ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞はＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲにより認識され得、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞についての標的細胞である。ＮＫ−９２（商標）細胞の細胞毒性の値は、使用される標的細胞のタイプ及びエフェクター：標的比に応じて変動し得る。一般に、本明細書に記載の方法を使用して産生されるＮＫ−９２（商標）細胞は、６０〜１００％、例えば、７０〜１００％又は８０〜１００％の細胞毒性を有し得る。一部の場合、ＮＫ−９２（商標）細胞は、カルセイン放出アッセイにより１：１０のエフェクター：標的比を使用した場合、８０〜１００％、例えば、８２〜１００％、８５〜１００％、８７〜１００％、８８〜１００％、又は８９〜１００％の細胞毒性を有し得る。
【０１１８】
場合により、評価されるＮＫ−９２（商標）細胞、例えば、ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞毒性は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）である。ＮＫ−９２（商標）細胞のＡＤＣＣ活性を計測する方法は、標的細胞を認識し得る抗体も添加することを除き上記の直接細胞毒性を計測する方法と類似する。ＮＫ細胞のＦｃ受容体は細胞結合抗体を認識し、細胞溶解反応をトリガーし、標的細胞を殺傷する。１つの実例的な例において、ｔ−ｈａＮＫ細胞は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（抗Ｈｅｒ２抗体）及びＳＫＢｒ３（標的細胞）とインキュベートすることができ、ＳＫＢｒ３細胞の殺傷は、上記の標的細胞の内部構成成分、例えば、５１Ｃｒ又はカルセインの放出により計測することができる。
【０１１９】
倍化時間
ＮＫ−９２（商標）細胞、例えば、ｔ−ｈａＮＫ細胞の成長速度は、細胞倍化時間、すなわち、細胞が初期の細胞数の２倍に到達するまで増殖するのに要する時間を使用して評価することができる。倍化時間は、ＮＫ−９２（商標）細胞の成長速度と反比例し；倍化時間が長いほど、成長速度は遅い。
【０１２０】
ＷＧＳ
場合により、改変ＮＫ−９２（商標）細胞の全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）を実施してマルチシストロン性構築物の挿入部位を同定する。
【０１２１】
治療用途
本開示はまた、疾患の任意の病期における対象における任意のタイプの癌を治療する方法を提供する。好適な癌の非限定的な例としては、癌腫、黒色腫、又は肉腫が挙げられる。一部の実施形態において、本発明を使用して造血系由来の癌、例えば、白血病又はリンパ腫を治療する。一部の実施形態において、癌は、固形腫瘍である。
【０１２２】
一部の実施形態において、対象における任意のタイプの癌を治療する方法は、患者に治療有効量の上記のＮＫ−９２（商標）細胞を投与し、それにより癌を治療することを含む。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、Ｆｃ受容体、例えば、配列番号２に記載の配列を有する高親和性Ｆｃ受容体を発現する。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ、Ｆｃ受容体及びＩＬ−２を発現する。一部の実施形態において、改変ＮＫ−９２（商標）細胞は、マルチシストロン性構築物を含み、マルチシストロン性構築物は、キメラ抗原受容体及びＦｃ受容体をコードする。
【０１２３】
治療が必要とされる対象を、本明細書に記載の改変ＮＫ−９２（商標）細胞により治療する方法も提供される。一部の実施形態において、対象又は患者は、癌又は感染性疾患、例えば、ウイルス感染を罹患する。
【０１２４】
改変ＮＫ−９２（商標）細胞は、個体に絶対数の細胞だけ投与することができ、例えば、前記個体に、約１０００個の細胞／注射〜最大約１００億個の細胞／注射、例えば、１注射当たり約、少なくとも約、又は多くとも約１×１０８、１×１０７、５×１０７、１×１０６、５×１０６、１×１０５、５×１０５、１×１０４、５×１０４、１×１０３、５×１０３個（など）のＮＫ−９２（商標）細胞、又はいずれか２つの数字間の任意の範囲（端点を含む）を投与することができる。したがって、本開示はまた、複数のＮＫ−９２（商標）細胞を含む組成物であって、細胞の数は、１×１０８、１×１０７、５×１０７、１×１０６、５×１０６、１×１０５、５×１０５、１×１０４、５×１０４、１×１０３、又は５×１０３個（など）である組成物を提供する。
【０１２５】
他の実施形態において、前記個体に、約１０００個の細胞／注射／ｍ２〜最大約１００億個の細胞／注射／ｍ２、例えば、１注射当たり約、少なくとも約、又は多くとも約１×１０８個／ｍ２、１×１０７個／ｍ２、５×１０７個／ｍ２、１×１０６個／ｍ２、５×１０６個／ｍ２、１×１０５個／ｍ２、５×１０５個／ｍ２、１×１０４個／ｍ２、５×１０４個／ｍ２、１×１０３個／ｍ２、５×１０３個／ｍ２（など）のＮＫ−９２（商標）細胞、又はいずれか２つの数字間の任意の範囲（端点を含む）を投与することができる。
【０１２６】
他の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、そのような個体に相対数の細胞だけ投与することができ、例えば、前記個体に、個体１キログラム当たり約１０００個の細胞〜最大約１００億個の細胞、例えば、個体１キログラム当たり約、少なくとも約、又は多くても約１×１０８、１×１０７、５×１０７、１×１０６、５×１０６、１×１０５、５×１０５、１×１０４、５×１０４、１×１０３、又は５×１０３個（など）のＮＫ−９２細胞、又はいずれか２つの数字間の任意の範囲（端点を含む）を投与することができる。
【０１２７】
他の実施形態において、総用量は体表面積のｍ２により算出することができ、それとしては、１ｍ２当たり約１×１０１１、１×１０１０、１×１０９、１×１０８、１×１０７個、又はいずれか２つの数字間の任意の範囲（端点を含む）が挙げられる。平均的な人間は、約１．６ｍ２〜約１．８ｍ２である。好ましい実施形態において、約１０億〜約３０億個のＮＫ−９２（商標）細胞が患者に投与される。他の実施形態において、１用量当たり注射されるＮＫ−９２（商標）細胞の量は体表面積のｍ２により算出することができ、それとしては、１ｍ２当たり１×１０１１、１×１０１０、１×１０９、１×１０８、１×１０７個が挙げられる。人間についての平均体表面積は１．６〜１．８ｍ２である。
【０１２８】
他の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、そのような個体に相対数の細胞だけ投与することができ、例えば、前記個体に、個体１キログラム当たり約１０００個の細胞〜最大約１００億個の細胞、例えば、約、少なくとも約、又は多くとも約１×１０８、１×１０７、５×１０７、１×１０６、５×１０６、１×１０５、５×１０５、１×１０４、５×１０４、１×１０３、又は５×１０３個（など）のＮＫ−９２（商標）細胞、又はいずれか２つの数字間の任意の範囲（端点を含む）を投与することができる。
【０１２９】
ＮＫ−９２（商標）細胞は、癌を有する患者に１回投与することができ、又はそれらは複数回、例えば、治療の間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２若しくは２３時間ごとに１回、又は１、２、３、４、５、６若しくは７日ごとに１回、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週若しくはそれを超える週ごとに１回、又はいずれか２つの数字間の任意の範囲（端点を含む）ごとに１回、投与することができる。
【０１３０】
一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、ＮＫ−９２（商標）細胞及び媒体、例えばヒト血清又はその同等物を含む組成物中で投与される。一部の実施形態において、媒体はヒト血清アルブミンを含む。一部の実施形態において、媒体はヒト血漿を含む。一部の実施形態において、媒体は、約１％〜約１５％のヒト血清又はヒト血清同等物を含む。一部の実施形態において、媒体は、約１％〜約１０％のヒト血清又はヒト血清同等物を含む。一部の実施形態において、媒体は、約１％〜約５％のヒト血清又はヒト血清同等物を含む。好ましい実施態様において、媒体は、約２．５％のヒト血清又はヒト血清同等物を含む。一部の実施形態において、血清は、ヒトＡＢ血清である。一部の実施形態において、ヒト治療における使用に許容可能な血清代用物がヒト血清の代わりに使用される。このような血清代用物は、当該技術分野において公知であり、又は今後開発され得る。１５％を超える濃度のヒト血清を使用することができるが、約５％を上回る濃度は費用が高すぎることが企図される。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、ＮＫ−９２（商標）細胞と細胞生存を支持する等張液とを含む組成物中で投与される。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、凍結保存試料から再構成させた組成物中で投与される。
【０１３１】
ＮＫ−９２（商標）細胞を含む薬学的に許容可能な組成物は、種々の担体及び賦形剤を含み得る。種々の水性担体、例えば、緩衝生理食塩水などを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に不所望な物質を有さない。好適な担体及び賦形剤並びにそれらの配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。薬学的に許容可能な担体は、生物学的にもその他でも不所望でない材料を意味し、すなわち、その材料は、不所望な生物学的効果を引き起こすこともなく、それが含有される医薬組成物の他の構成成分と有害な形で相互作用することもなく、対象に投与される。対象に投与される場合、担体は、場合により、活性成分の分解を最小化するように、及び対象における有害副作用を最小化するように選択される。本明細書において使用される、薬学的に許容可能という用語は、生理学的に許容可能及び薬理学的に許容可能と同義的に使用される。医薬組成物は一般に、緩衝及び貯蔵時の保存性のための薬剤を含み、投与経路に応じた適切な送達のための緩衝剤及び担体を含み得る。
【０１３２】
インビボ又はインビトロでの使用のためのこれらの組成物は、細胞に用いられる滅菌技術により滅菌することができる。組成物は、適切な生理学的状態に要求される許容可能な補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、並びに毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの配合物中の細胞及び／又は他の薬剤の濃度は変動し得、主に、選択される特定の投与方式及び対象の要求に従って液体量、粘性、及び体重など基づき選択される。
【０１３３】
一実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、治療される癌のための１つ以上の他の治療又は薬剤と併用して患者に投与される。一部の実施形態において、治療される癌のための１つ以上の他の治療としては、例えば、抗体、放射線照射、化学療法、幹細胞移植、又はホルモン療法が挙げられる。
【０１３４】
一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞及び他の癌薬剤／治療は、同時に又はほぼ同時に（例えば、互いに約１、５、１０、１５、２０、又は３０分以内）投与される。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞及び他の癌薬剤／治療は、連続的に投与される。一部の実施形態において、他の癌治療／薬剤は、ＮＫ−９２（商標）細胞の投与の１、２、又は３日後に投与される。
【０１３５】
一実施形態において、他の癌薬剤は、抗体である。一実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、疾患細胞を標的化する抗体と併用して投与される。一実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞及び抗体は、患者に一緒に投与され、例えば、同一の配合物中で；別個に、例えば、別個の配合物中で、併用して；又は別個に、例えば、異なる投与スケジュールで若しくはその日の異なる時間に投与することができる。別個に投与される場合、抗体は、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は腫瘍内注射を介して投与することができる。
【０１３６】
一部の実施形態において、本開示のＮＫ−９２（商標）細胞は、治療抗体及び／又は他の抗癌剤との組合せで使用される。治療抗体を使用して癌関連又は腫瘍関連マーカーを発現する細胞を標的化することができる。癌治療モノクローナル抗体の例を、表４に示す。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、Ｆｃ受容体、例えば、配列番号２に記載の配列を有する高親和性Ｆｃ受容体を発現する。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、ｈａＮＫ（登録商標）細胞である。一実施形態において、治療抗体は、アベルマブである。
【０１３７】
【表３】
2021519602.tif 000005
【０１３８】
【表４】
2021519602.tif 000006
【０１３９】
このようなＮＫ−９２（商標）細胞の投与は、モノクローナル抗体の投与と同時に、又は連続様式で実施することができる。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、対象がモノクローナル抗体により治療された後に対象に投与される。或いは、ＮＫ−９２（商標）細胞は、同時に、例えば、モノクローナル抗体の２４時間以内に投与することができる。
【０１４０】
一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、静脈内投与される。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、骨髄中に直接注入される。
【０１４１】
したがって、本開示は、癌又はウイルス感染の治療が必要とされる患者における癌又はウイルス感染を治療する方法であって、患者に治療有効量の本明細書に開示のＮＫ−９２（商標）細胞を投与し、それにより癌を治療することを含む方法を提供する。
【０１４２】
キット
本明細書に記載の複数のＮＫ−９２（商標）細胞を含む組成物を使用する癌又は感染性疾患の治療のためのキットも開示される。一部の実施形態において、本開示のキットは、少なくとも１つのモノクローナル抗体も含み得る。キット中に含まれるＮＫ−９２（商標）細胞は、ＣＡＲ及びＦｃ受容体を発現する。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、ＩＬ−２、例えば、ｅｒＩＬ−２、又はＩＬ−１５、例えば、ｅｒＩＬ−１５をさらに発現する。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（商標）細胞は、マルチシストロン性構築物を含み、マルチシストロン性構築物は、キメラ抗原受容体、Ｆｃ受容体、及び場合によりＩＬ−２又はＩＬ−１５をコードする。
【０１４３】
ある実施形態において、キットは、ＮＫ−９２（商標）細胞の投与前、投与と同時、又は投与後に投与すべき追加の化合物、例えば、治療有効化合物又は薬物を含有し得る。このような化合物の例としては、抗体、ビタミン、ミネラル、フルドロコルチゾン、イブプロフェン、リドカイン、キニジン、化学療法薬などが挙げられる。
【０１４４】
種々の実施形態において、キットの使用説明書は、癌又は感染性疾患の治療においてキット構成成分を使用するための指示を含む。説明書は、ＮＫ−９２（商標）細胞の取扱方法に関する情報（例えば、解凍及び／又は培養）をさらに含有し得る。説明書は、投与量及び投与頻度に関する指針をさらに含み得る。
【０１４５】
ある実施形態において、キットは、本明細書に記載の１つ以上の組成物、例えば、本明細書に記載のＮＫ−９２（商標）細胞を含む組成物が充填された１つ以上の容器をさらに含む。場合により、キットが癌、例えば、本明細書に記載のものを治療するためのものであることを示すラベルが、このような容器に伴うことがある。場合により、ラベルは、医薬又は生物製品の製造、使用又は販売を規制する当局により処方される形態の通知も含み、その通知は、ヒト投与についての製造、使用又は販売の当局による承認を反映する。
【０１４６】
本開示の方法及び組成物に使用することができ、それらと併用して使用することができ、それらの調製において使用することができ、又はそれらの産物である材料、組成物、及び構成成分が開示される。これら及び他の材料は本明細書において開示され、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、グループなどが記載される場合、これらの化合物のそれぞれの種々の個々の及び集合的な組合せ及び順列の具体的な言及が明示されていないことがあるが、それぞれが本明細書において具体的に企図及び記載されることが理解される。例えば、方法が開示及び考察され、その方法を含む多数の分子に対して行うことができる多数の改変が考察される場合、方法のそれぞれの及びあらゆる組合せ及び順列、並びに考えられる改変は、そうでないことが具体的に示されない限り、具体的に企図される。同様に、これらの任意のサブセット又は組合せも具体的に企図及び開示される。この概念は、本開示の全ての態様、例として、限定されるものではないが、開示の組成物を使用する方法におけるステップに適用される。したがって、実施することができる種々の追加のステップが存在する場合、それらの追加のステップのそれぞれを、任意の規定の方法ステップ又は開示の方法の方法ステップの組合せにより実施することができること、及びそれぞれのそのような組合せ又は組合せのサブセットが具体的に企図され、開示されているとみなすべきことが理解される。
【実施例】
【０１４７】
以下の実施例は、実例的な目的のためのものにすぎず、限定として解釈すべきではない。以下の実施例を良好に実施することを同様に可能とする、当業者が利用可能な種々の代替技術及び手順が存在する。
【０１４８】
実施例１：ＰＤ−１  ＣＡＲ改変ＮＫ−９２（商標）細胞の産生
ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲを、ＣＤ１６及びｅｒＩＬ−２導入遺伝子も含有するバイシストロン性プラスミドｐＮＥＵＫｖ１  ＦｃＲ＿ＩＬ−２ベクター中にクローニングした。トリシストロン性プラスミドを、ａＮＫ（商標）細胞中にエレクトロポレーションした。ＩＬ−２依存的である未形質転換ａＮＫ（商標）細胞はＩＬ−２枯渇培地中で生存し得なかったため、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ発現ＮＫ−９２（商標）細胞をＩＬ−２枯渇培地により選択した。
【０１４９】
限定希釈クローニング
ポリクローナルＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫプール培養物のアリコートを、ＩＬ−２補給なしの成長培地中で１．５個の細胞／ｍｌの密度に希釈した。この細胞懸濁液を９６ウェルプレート中でウェル当たり２００μｌの容量においてアリコート化し、それはウェル当たり平均０．３個の細胞に対応した。プレートを３７℃において１０日間インキュベートし、次いで細胞成長について目視により確認した。目下、クローンと命名される成長培養物をピックし、さらなる拡大及び特徴付けのために大型容器に移した。
【０１５０】
実施例２：改変ＮＫ−９２（商標）細胞の表現型
ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞中でのＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲの発現をフローサイトメトリーにより計測し、結果は、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ系からの細胞の８６．４％超が安定的ＣＡＲ発現を有することを示した。図３。
【０１５１】
実施例３：標的細胞系に対するＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞毒性
ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞毒性を、それぞれの標的細胞とインキュベートすることにより分析した。ＰＤ−Ｌ１を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞についての標的細胞として使用した。結果は、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞がそれらのそれぞれの標的細胞を有効に殺傷したことを示す。図４を参照されたい。
【０１５２】
ＭＤＳＣに対するＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞毒性も、ＭＤＳＣに対して試験した。この実験において使用されるＭＤＳＣは、血液から得られ、Ｆｉｃｏｌｌ勾配上で分離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から生成した。ＭＤＳＣをＣＤ１１ｂについての陽性磁気選択によりさらに濃縮し、組換えＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−６が補給された培養培地中で数を拡大させた（Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，Ｖｏｌ．１１，ｉｓｓｕｅ  ６，２０１１）。次いで、ＭＤＳＣをＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞に種々のエフェクターと標的との比（Ｅ：Ｔ比）において曝露させた。
【０１５３】
図５Ａに示されるとおり、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞はＭＤＳＣを有効に溶解させ（殺傷し）た。ＰＤ−Ｌ１−ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞毒性は、親ａＮＫ（商標）細胞のものよりも少なくとも５０％高く；有意に高い割合（少なくとも５０％高い）の標的細胞が、いずれのｔ−ｈａＮＫ細胞系によっても殺傷された。ＭＤＳＣは腫瘍微小環境中の主な免疫抑制細胞の１つであるため、この結果は、それらのＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞を使用して固形腫瘍を有効に治療することができることを示す。これらの結果は、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞が、最初にＣＡＲ媒介細胞毒性を介して腫瘍微小環境からＭＤＳＣを排除し、次いでｔ−ｈａＮＫ細胞自体により、又は他の免疫細胞若しくは特異的腫瘍標的療法により腫瘍細胞を殺傷することにより機能することも示唆する。
【０１５４】
図５Ｂは、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞がａＮＫ（商標）耐性、ＰＤ−Ｌ１陽性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系の特異的殺傷を向上させたことを示す。ＸＬ−４８及びＸＬ−４９は、２つの異なる抗ＰＤ−Ｌ１抗体に由来する２つの異なるｓｃＦｖドメインを含むＣＡＲを発現する２つのＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ集団である。図５Ｃは、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞が、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブと組み合わせた場合、遺伝子操作ＳＵＰ−Ｂ１５細胞（ＣＤ１９−、ＣＤ２０＋）に対する抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性を有し、そのＡＤＣＣ活性は、ＣＤ１６（１５８Ｖ）受容体のみを発現するｈａＮＫ（登録商標）細胞のものと同等であったことを示す。抗Ｈｅｒ２抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎをこの実験において対照抗体として使用した。
【０１５５】
本発明者らは、いくつかのインビボ実験においてＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞の活性をさらに調査した。さらに特定すると、雌、９〜１０週齢のＮＳＧマウス（ＪＡＸ）を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデル（新鮮細胞を使用する２４匹の動物）及びＨＣＣ８２７モデル（新鮮細胞を使用する２４匹の動物及び凍結保存細胞を使用する６匹の動物）に使用した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルはヒト乳房腺癌モデルであった一方、ＨＣＣ８２７はヒト肺腺癌モデルであった。マウスに両脇腹上で皮下接種し、処理開始時の平均腫瘍負荷は１００ｍｍ３（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）及び７５〜８０ｍｍ３（ＨＣＣ８２７）であった。新鮮調製され、放射線照射された抗ＰＤＬ１  ｔ−ｈａＮＫを、５Ｅ７個の細胞／ｍＬの濃度において与えた一方、凍結保存され、放射線照射された抗ＰＤＬ１  ｔ−ｈａＮＫを、２Ｅ７個の細胞／ｍＬの濃度において与えた。ビヒクル対照は、成長培地単独であった。投与は、ｉ．ｖ．であり、腫瘍内であった。ＩＶについての投与量：新鮮調製された細胞：２００μＬ中の１Ｅ７個の細胞／用量、及び凍結保存細胞：２００μＬ中の４Ｅ６個の細胞／用量。腫瘍内投与は、５０μＬ中で２．５Ｅ６個の細胞／腫瘍／用量であった。投与頻度は、４週間連続にわたり週２回であった。投与の初日を１日目と定めた。
【０１５６】
特に、図６Ａ及び図６Ｂに示されるとおり、新鮮調製されたＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞（１Ｅ７個の細胞／用量）は、静脈内投与した場合、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＨＣＣ８２７モデルの両方で顕著且つ長期持続の腫瘍成長阻害をもたらした。ここで、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１については腫瘍停滞が観察され、１６日目のＴＧＩは８４％（ピーク）であり、２６日目のＴＧＩは７９％（最終計測）であった。ＨＣＣ８２７については腫瘍退縮が観察され、１６日目のＴＧＩは１２０％（ピーク）であり、２９日目のＴＧＩは８４％（試験終了）であった。凍結保存ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞（４Ｅ６個の細胞／用量）も、ビヒクル対照と比較して腫瘍成長の抑制における統計的に有意な効力を示した。ここで、２６日目のＴＧＩは６０％（ピーク）であり、２９日目のＴＧＩは４０％（試験終了）であった。
【０１５７】
さらに、新鮮調製されたＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞（１Ｅ７個の細胞／用量）は、ビヒクルと比較してＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルにおいて転移性疾患負荷の有意な低減ももたらした。対照の全ての動物の１００％が転移性疾患を発症した一方、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞により処理された動物の５０％のみが転移を発症した（全て単一器官の所見）。以下の表を参照されたい。
【０１５８】
【表５】
2021519602.tif 000007
【０１５９】
腫瘍内投与した場合、有意な腫瘍成長阻害はＨＣＣ８２７モデルにおいても観察されたが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルにおいては観察されなかった。ここで、図７に示されるとおり、ＨＣＣ８２７についてのＴＧＩは２０日目で７０％（ピーク）であり、２９日目で４９％（試験終了）であった。
【０１６０】
したがって、ＰＤＬ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞が２つの皮下腫瘍モデルにおいて顕著な効力を実証したことに留意すべきである。具体的には、４週間にわたる週２回の１Ｅ７個の細胞／用量の投与レベルにおける新鮮調製されたＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞のＩＶ投与は、試験された皮下ゼノグラフトモデルの両方で顕著な抗腫瘍効力を示した。処理は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍担持マウスにおいて腫瘍停滞をもたらし、ピークＴＧＩは１６日目で８４％であり、試験終了時ＴＧＩは７９％であり（２元ＡＮＯＶＡとその後のテューキー検定による多重比較による両方の時点についてＰ＜０．０００１）、ＨＣＣ８２７モデルにおいては腫瘍退縮をもたらし、ピークＴＧＩは１６日目で１２０％であり、試験終了時ＴＧＩは８４％であった（Ｐ＜０．０００１）。４週間にわたる週２回の４Ｅ６個の細胞／用量の投与レベルにおける凍結保存ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞のＩＶ投与もＨＣＣ８２７腫瘍モデルにおいて有意な治療効力を示し、６０％（Ｐ＜０．０００１）のピークＴＧＩ、及び４０％（Ｐ＜０．０１）の試験終了時ＴＧＩに達した。
【０１６１】
４週間にわたる週２回の２．５Ｅ６個の細胞／用量／腫瘍の投与レベルにおける新鮮調製されたＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞のＩＴ投与は、ＨＣＣ８２７腫瘍の成長を有効に抑制し、２０日目に７０％のピークＴＧＩ及び４９％の試験終了時ＴＧＩをもたらした（Ｐ＜０．００１）。しかしながら、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍は、腫瘍内投与されたＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞に感受性でなかった。
【０１６２】
いっそうさらなる実施形態において、本発明者らは、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞対ｈａＮＫ細胞における種々のマーカーの発現を比較し、選択結果を図８に示す。容易に明らかなとおり、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞は、極めて多量のＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲを発現した一方、かなりの量のＣＤ１６も発現した。さらに特定すると、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞は、パーフォリン及びグランザイムＢの増加した発現を有し、そのことは図９に示されるとおりＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞毒性の向上に寄与する可能性が高い。ここで、高ＰＤ−Ｌ１細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）において、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫはｈａＮＫよりも優れており、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫによる抗ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ媒介殺傷は、ｈａＮＫを用いる抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ媒介ＡＤＣＣよりも優れていた。さらに、殺傷はパーフォリン／グランザイムに依存的であり（殺傷活性は、コンカナマイシン−ａ（パーフォリン／グランザイム不活性化物質）により有意に停止した）、殺傷は抗ＣＤ１６により影響を受けないことが観察された。
【０１６３】
本発明者らは、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞がインビトロの種々の腫瘍細胞に対しても細胞毒性であるか否かをいっそうさらに調査した。図１０は、放射線照射されたＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫを様々な腫瘍、例として、乳房（ｎ＝４）、肺（ｎ＝３）、結腸（ｎ＝２）、泌尿生殖器（ｎ＝２）、脊索腫及び卵巣細胞系と同時培養した例示的な結果を示す。殺傷度の変動がそれぞれの細胞系について観察され、Ｅ：Ｔ比が減少するにつれて殺傷能力の縮小が観察された。特に、１３個／１３個の細胞系がＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫにより殺傷された。
【０１６４】
いっそうさらなる実験において、本発明者らは、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞がインビボ腫瘍中に輸送されるか否かを調査した。図１１の結果から把握することができるとおり、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞は、ＰＤ−Ｌ１発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＴＮＢＣ腫瘍を追跡した（ＰＤ−Ｌ１ヌルに対して有意）。さらに、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞のＩＰ投与経路は、ＩＶ投与細胞よりも有意に大きいレベルのＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞蓄積を媒介した。ここで、マウスにＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＰＤ−Ｌ１ノックアウトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を接種した。ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞のフローを両方の細胞系について２４及び７２時間後にモニタリングした。明らかに、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞は、ＰＤ−Ｌ１発現を有する腫瘍を追跡した。さらなる結果はエクスビボで２１日後に示され、再びＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞はＰＤ−Ｌ１発現を有する腫瘍を追跡した。
【０１６５】
同一モデルを使用して腫瘍成長曲線をインビボで計測し、例示的な結果を図１２に示す。特に、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞は１回のみの注射後の有意な抗腫瘍活性を媒介し、それは維持された。ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＰＤ−Ｌ１  ＫＯ細胞に対する有意な抗腫瘍活性も媒介した（３６日目）。
【０１６６】
ヒトＭＤＳＣも、細胞毒性ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞に対する感受性について試験した。この目的のため、ＰＢＭＣをＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＰＧＥ２、ＴＧＦｂ１、ＴＮＦａ、ＶＥＧＦ、及びＧＭ−ＣＳＦの存在下で７日間培養し、拡大させた細胞をＣＤ３３選択を使用して選択した。ＭＤＳＣ表現型（ＣＤ１１ｂ＋、ＨＬＡ−ＤＲ陰性、ＣＤ３３）の確認後、機能的細胞毒性アッセイを実施し、例示的な結果を図１３に示す。図から把握することができるとおり、ＭＤＳＣも、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞により有効に殺傷される。この状況において、Ｍ２マクロファージも、ＰＤ−Ｌ１  ｔ−ｈａＮＫ細胞媒介細胞殺傷についての好適な標的と考えられることに留意すべきである。それというのも、Ｍ２マクロファージもＰＤ−Ｌ１を発現するためである（例えば、ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ（２０１５）１５：５７７  ＤＯＩ  １０．１１８６／ｓ１２８８５−０１５−１５４６−９を参照されたい）。
【図１】
2021519602.tif 000008
【図２】
2021519602.tif 000009
【図３】
2021519602.tif 000010
【図４】
2021519602.tif 000011
【図５Ａ】
2021519602.tif 000012
【図５Ｂ−５Ｃ】
2021519602.tif 000013
【図６Ａ−６Ｂ】
2021519602.tif 000014
【図７】
2021519602.tif 000015
【図８】
2021519602.tif 000016
【図９】
2021519602.tif 000017
【図１０−１】
2021519602.tif 000018
【図１０−２】
2021519602.tif 000019
【図１１】
2021519602.tif 000020
【図１２】
2021519602.tif 000021
【図１３】
2021519602.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】令和2年12月10日(2020.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021519602000001.app
【国際調査報告】
2021519602.tif 000023
2021519602.tif 000024
2021519602.tif 000025
2021519602.tif 000026
2021519602.tif 000027
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