(57)【要約】  本発明は、ＴＧＦβ／Ｓｍａｄ３／ＳＭＯ分子メカニズムに対する癌細胞における影響を糾明し、ＳＭＯの高い発現が癌患者の生存率全般に関連することを明らかにしたところ、ＳＭＯが癌の潜在的な予後指標であることを確認した。したがって、本発明は、ＳＭＯが抗原として認識されるようにするＳＭＯのエピトープを特定し、これに特異的に結合する抗体又はその断片に関し、本発明における抗体は、ＳＭＯと関連した癌に対する治療剤として有用に用いられ得る。
2021530250.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表示されるＳＭＯタンパク質のアミノ酸位置１０６〜４８５番目から選ばれる１〜１０個のアミノ酸を含むエピトープ。
【請求項２】
前記エピトープはＳＭＯタンパク質のアミノ酸位置１０６〜１１５番目、１２５〜１３３番目、１５９〜１６６番目、２１６〜２２４番目、２９９〜３０７番目、３９１〜３９９番目及び４７７〜４８５番目から選ばれる１〜１０個のアミノ酸であることを特徴とする、請求項１に記載のエピトープ。
【請求項３】
配列番号２〜１５のいずれか一つで表示されるＳＭＯエピトープを抗原として認識してそれに特異的に結合する抗体であり、該抗体は配列番号１６のＨＣＤＲ１、配列番号１７のＨＣＤＲ２、配列番号１８のＨＣＤＲ３、配列番号１９のＬＣＤＲ１、配列番号２０のＬＣＤＲ２、配列番号２１のＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする抗体又はその断片。
【請求項４】
配列番号２〜１５のいずれか一つで表示されるＳＭＯエピトープを抗原として認識してそれに特異的に結合する抗体であり、該抗体は、配列番号１６のＨＣＤＲ１、配列番号１７のＨＣＤＲ２、配列番号１８のＨＣＤＲ３、配列番号１９のＬＣＤＲ１、配列番号２０のＬＣＤＲ２、配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む基準抗体と前記ＳＭＯタンパク質エピトープとの結合において相互競合できる抗体又はその断片。
【請求項５】
前記抗体は（１）配列番号２２を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２７を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（２）配列番号２３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（３）配列番号２４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（４）配列番号２５を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は（５）配列番号２６を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；を含む、請求項４に記載の抗体又はその断片。
【請求項６】
請求項３又は４の単一クローン抗体又はその断片をコードする核酸分子。
【請求項７】
請求項８の核酸分子を含むベクター。
【請求項８】
請求項９のベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
配列番号１で表示されるＳＭＯタンパク質の１０６〜４８５番アミノ酸残基から選択される１〜１０個のアミノ酸を含むエピトープ、これをコードする核酸分子又はこれを含むベクターを含む癌の予防又は治療用ワクチン組成物。
【請求項１０】
前記癌は、脳腫瘍、黒色腫、骨髄腫、非小細胞性肺癌、口腔癌、肝癌、胃癌、結腸癌、乳癌、肺癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、子宮頸癌、卵巣癌、大腸癌、小腸癌、直膓癌、ラッパ管癌腫、肛門付近癌、子宮内膜癌腫、膣癌腫、陰門癌腫、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、食道癌、リンパ腺癌、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性又は急性白血病、リンパ球リンパ腫、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、中枢神経系腫瘍、一次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺腫、リンパ腫、白血病及び多発性骨髄腫からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項９に記載の癌の予防又は治療用ワクチン組成物。
【請求項１１】
前記癌は、耐性癌、再発癌又は転移癌であることを特徴とする、請求項９に記載の癌の予防又は治療用ワクチン組成物。
【請求項１２】
前記耐性癌は、癌治療用薬物に対する耐性を有する癌であることを特徴とする、請求項１１に記載の癌の予防又は治療用ワクチン組成物。
【請求項１３】
請求項３又は４の単一クローン抗体又はその断片、請求項６の核酸分子、請求項７のベクター又はＳＭＯ遺伝子の発現を抑制する抑制剤のいずれか一つ以上を有効成分として含む癌の予防又は治療用薬剤学的組成物。
【請求項１４】
前記ＳＭＯ遺伝子の発現を抑制する抑制剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＰＮＡ）及びアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項１３に記載の癌の予防又は治療用薬剤学的組成物。
【請求項１５】
請求項３又は４の単一クローン抗体又はその断片、請求項６の核酸分子、請求項７のベクター又はＳＭＯ遺伝子の発現を抑制する抑制剤のいずれか一つ以上を有効成分として含む癌転移抑制用の薬剤学的組成物。
【請求項１６】
請求項１３の組成物を投与する段階を含む癌の予防又は治療方法。
【請求項１７】
請求項１４の組成物を投与する段階を含む癌転移の予防又は治療方法。
【請求項１８】
請求項３又は４の単一クローン抗体又はその断片を、被検者から体外に分離されたサンプルに処理する段階を含む、サンプル中に含まれたＳＭＯタンパク質の定量方法。
【請求項１９】
次の段階を含む、ＳＭＯタンパク質の過発現による耐性癌疾患の診断のための情報を提供する方法：（ａ）被検者から体外に分離されたサンプルを取得する段階；（ｂ）請求項３又は４の単一クローン抗体若しくはその断片又はこれをコードする核酸分子を前記サンプルに処理する段階；及び（ｃ）前記被検者のサンプル中に含まれたＳＭＯタンパク質の発現量が、正常群サンプル中に含まれたＳＭＯタンパク質の発現量よりも高いか否かを確認する段階。
【請求項２０】
前記ＳＭＯタンパク質の過発現による疾患は癌であることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項３又は４の単一クローン抗体若しくはその断片又はこれをコードする核酸分子を含むＳＭＯタンパク質定量キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＭＯタンパク質の癌特異的エピトープ及びこれに特異的に結合する単一クローン抗体に関し、特に、本発明のエピトープ及びこれに特異的に結合する抗体は、ヘッジホッグ信号伝達経路に関与するＳＭＯタンパク質と結合し、ヘッジホッグ伝達機転を遮断することによって、癌だけでなく、抗癌剤に耐性を有する耐性癌に対する標的治療用途に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
癌は、韓国人の死亡原因の1位を占めている。その中でも、発生率と死亡率が最も高いのは大腸癌である。最近になって韓国では大腸癌の発生率と死亡率が非常に急増している。韓国では、大腸内視鏡を用いた大腸癌の早期検診プログラムにより、手術が可能な時点で診断され、初期治療を受ける場合が多い。にもかかわらず、4〜5人の1人は、診断当時にすでに別の臓器に癌が転移している事例が発生し、手術し難い4期として診断されている。癌の治療方法又は治療剤が多岐に開発されているが、通常、手術、抗癌化学療法、放射線治療を、病期に応じて適宜併用したり、単独で用いている。病期別の癌の治療方法は、おおよそ次のとおりである。癌1期（大腸癌）では、根治的手術（施術）後に経過観察する。癌2期（大腸癌）では、根治的手術後、抗癌化学療法を行う。癌4期（大腸癌）では、患者の遂行能力にしたがって抗癌化学療法を行う。勿論、癌4期においても、必要な場合には、姑息手術や放射線治療の追加を検討したり、併用して進行する場合もある。
【０００３】
すなわち、一般的な癌患者の治療は、生存期間を延長し、症状を緩和することが主な目標であるため、開発された治療方法も、過去に比べて生存期間を延長したり、症状を緩和することには優れているかもしれないが、癌の完治に関連した抗癌効果はまだ満足できない状況にある。
【０００４】
一方、治療剤としては、ベバシズマブ（商品名：アバスチン）、セツキシマブ（商品名：アービタックス）のような様々な標的治療剤が開発されている。具体的には、ベバシズマブは、癌細胞とVEGF（血管内皮細胞成長因子）との相互作用を把握し、VEGF経路を遮断することにより、血管新生を抑制し、癌細胞の成長と転移を阻害する抗癌剤であり、これは、他の抗癌剤と併用投与して治療効果を増進させるために主に用いられている。このようなベバシズマブなどのVEGF標的治療剤は、効果が予め予測できる予測指標が明らかにされておらず、現在、特定の遺伝子検査などの診断無しで用いられている。
【０００５】
また、セツキシマブ（商品名：アービタックス）は、癌細胞の信号伝達体系を遮断し、癌の成長を阻害する効果を有する抗癌剤であり、大腸癌の代表的な標的治療剤である。これは、上皮成長因子受容体に対する抗体で、成長因子が細胞内に信号を伝えて細胞が分裂することを防ぎ、癌細胞の成長を抑制する効果を有する。
【０００６】
その他にも、一般癌だけでなく、抗癌剤に対する耐性癌又は癌の再発にも効果的な方法と薬物を開発するための様々な研究が全世界で活発に行われている。しかし、癌治療の殆どは、癌のサイズを減らすことに重点を置いており、抗癌剤に対する耐性を有する癌や癌の再発に関する研究はわずかな現状である。特に、癌の病期を決定するうえで重要なのは、癌のサイズではなく、癌が組織に浸透した程度であるので、癌の成長、転移、耐性癌などの癌症状の全般に関連している生体分子を究明し、これを目標として、癌の成長及び転移、耐性癌の成長及び転移を両方とも制御できる新しい癌標的治療の生物指標の発掘に対する必要性が台頭している状況である。
【０００７】
上記の背景技術として説明された事項は、本発明の背景に関する理解を高めるためのものに過ぎず、この技術の分野における通常の知識を有する者に既に知られた従来技術に該当することを認めるものとして理解してはならないだろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ヘッジホッグ信号伝達機転を用いて癌／耐性癌の成長及び転移を抑制するＳＭＯエピトープの新規用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ，Ｈｈ）信号伝達経路において、ＳＭＯタンパク質が、一般癌だけでなく、抗癌剤耐性癌の成長及び転移にも関連することを確認し、これを標的にして癌／耐性癌の成長及び転移を制御できる新規癌標的治療生物指標を発掘しようと鋭意努力した結果、ヘッジホッグ信号伝達機転を用いて癌／耐性癌の成長及び転移を抑制するＳＭＯエピトープを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、配列番号１で表示されるＳＭＯタンパク質のアミノ酸位置１０６〜４８５番目から選ばれる１〜１０個のアミノ酸を含むエピトープを提供することにある。
【００１１】
本発明の目的は、配列番号２〜１５のいずれか一つで表示されるＳＭＯエピトープを抗原として認識してそれに特異的に結合する抗体であり、該抗体は、配列番号１６のＨＣＤＲ１、配列番号１７のＨＣＤＲ２、配列番号１８のＨＣＤＲ３、配列番号１９のＬＣＤＲ１、配列番号２０のＬＣＤＲ２、配列番号２１のＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする抗体又はその断片を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、配列番号２〜１５のいずれか一つで表示されるＳＭＯエピトープを抗原として認識してそれに特異的に結合する抗体であり、該抗体は、配列番号１６のＨＣＤＲ１、配列番号１７のＨＣＤＲ２、配列番号１８のＨＣＤＲ３、配列番号１９のＬＣＤＲ１、配列番号２０のＬＣＤＲ２、配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む基準抗体と前記ＳＭＯタンパク質エピトープとの結合において相互競合できる抗体又はその断片を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記単一クローン抗体又はその断片をコードする核酸分子を提供することにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、前記核酸分子を含むベクターを提供することにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、配列番号１で表示されるＳＭＯタンパク質のアミノ酸位置１０６〜４８５番目から選ばれる１〜１０個のアミノ酸を含むエピトープ及び担体を含む癌の予防又は治療用ワクチン組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、前記単一クローン抗体、核酸分子又はベクターを含む組成物を提供することにある。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、癌の予防又は治療、癌転移の予防又は治療のための前記単一クローン抗体、核酸分子又はベクターを含む組成物の新規用途を提供することにある。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、前記組成物を投与する段階を含む癌又は癌転移の予防又は治療方法を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである。
【００２０】
（ｉ）本発明は、ＳＭＯタンパク質を抗原として認識してそれに特異的に結合する単一クローン抗体若しくはその断片又はこれをコードする核酸分子を提供する。
【００２１】
（ｉｉ）本発明は、ＳＭＯタンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体発掘に活用でき、この方法によって発掘した抗体は、ヘッジホッグ信号伝達過程を抑制し、ＳＭＯタンパク質機能を阻害し、この機能を用いてＳＭＯタンパク質及びヘッジホッグ信号伝達経路が関与する一般癌、耐性癌、再発癌又は転移癌に対するワクチン又は治療剤として有用に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＳＭＯ活性の主要機作であるオキシステロール（Ｏｘｙｓｔｅｒｏｌ）−ＳＭＯ結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）をコンピュータシミュレーションし、ＳＭＯエピトープシーケンスを確保したものであり、ＳＭＯ受容体−オキシステロール結合部位のα１、α２、α３ペプチド位置を示すＳＭＯタンパク質構造である。
【図２】α１、α２、α３ペプチドから製造されたマウス抗体の構造を示す図である。
【図３】正常組織と大腸癌組織を免疫組織学的染色法で分析して光学顕微鏡で撮影した写真とグラフであり、図３の写真は、大腸癌組織及び正常組織から任意に選択されたいずれか一つの染色標本である。
【図４】実施例１から得た大腸癌組織２０６例の、ＳＭＯ発現程度によるＳＭＯ発現の低い群（ＳＭＯ  ｗｅａｋ）と高い群（ＳＭＯ  ｓｔｒｏｎｇ）の生存曲線である。
【図５】大腸及び大腸癌組織をウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で分析した結果写真である。
【図６】図５の相対的なＳＭＯ発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ＳＭＯ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を定量化して示すグラフである。
【図７】ヘッジホッグ信号伝達要素であるＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３、ＳＨＨ、ＳＭＯ、ＰＴＣＨ１、ＳＵＦＵタンパク質の発現量を分析するための、１４個の大腸癌細胞株のウェスタンブロット結果である。
【図８】大腸癌細胞ＨＣＴ１１６において製造例１（２１番抗体）と製造例２（２８３番抗体）の結合能を確認するために、流細胞分析で測定した結果グラフである。下段のグラフは、流細胞分析機で測定されたＨＣＴ１１６細胞における平均蛍光強度を示している。
【図９】大腸癌細胞ＨＣＴ１１６において製造例３（３２４番抗体）、製造例４（４０１番抗体）及び製造例５（４０８番抗体）の結合能を確認するために、流細胞分析で測定した結果グラフである。下段のグラフは、流細胞分析機で測定されたＨＣＴ１１６細胞における平均蛍光強度を示している。
【図１０】図１０Ａは、ＳＷ６２０  ｃｏｎ  ｓｈＲＮＡ及びＳＷ６２０  ＳＭＯ  ｓｈＲＮＡ細胞に対するウェスタンブロット結果であり、図１０Ｂは、ＳＷ６２０  ｃｏｎ  ｓｈＲＮＡ及びＳＷ６２０  ＳＭＯ  ｓｈＲＮＡ細胞において製造例１（２１番抗体）と製造例２（２８３番抗体）の結合能を確認するために、流細胞分析で測定した結果グラフであり、図１０Ｃは、図１０Ｂの流細胞分析機によって測定されたＨＣＴ１１６細胞における平均蛍光強度を示すグラフである。
【図１１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上でＳＭＯ抗体の競合的結合能を分析するために、ＢＯＤＩＰＹ−シクロパミン（ＢＯＤＩＰＹ−シクロパミン,ＢＣ）と本発明のＳＭＯ抗体を同時に処理した後、共焦点顕微鏡で撮影した写真である。
【図１２】ＮＩＨ３Ｔ３−ＧＬＩ細胞においてＧｉｌ１レポーター活性（Ｇｉｌ１  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）（％）を分析して示すグラフである。
【図１３】正常細胞と大腸癌細胞に、製造例１の２１番抗体又は製造例２の２８３番抗体を処理したとき、ＳＭＯ発現量を測定したウェスタンブロット（Ａ）と、細胞生存力（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）をＷＳＴ−１分析で測定して示すグラフ（Ｂ）である。
【図１４】大腸癌細胞に、製造例３の３２４番抗体、製造例４の４０１番抗体又は製造例５の４０８番抗体を処理したとき、細胞生存力（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）をＷＳＴ−１分析で測定して示すグラフである。
【図１５】ＨＣＴ１１６細胞に製造例１〜５のＳＭＯ抗体をそれぞれ処理し、その細胞成長抑制能を３次元培養システム（３Ｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ）で確認した写真である。
【図１６】異なる大腸癌細胞のそれぞれに、製造例１〜５のＳＭＯ抗体をそれぞれ処理し、その細胞成長抑制能をＷＳＴ−１アッセイ分析で確認したグラフである。
【図１７】細胞死に関連するＰＡＲＰ、ｃａｓｐａｓｅ９の切断形（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｆｏｒｍ）の発現量を分析するための、様々な濃度のＳＭＯ抗体で処理されたＨＣＴ１１６大腸癌細胞株のウェスタンブロット結果である。
【図１８】様々な濃度の製造例１によるＳＭＯ抗体を、オキサリプラチン、セツキシマブに対して耐性を有する大腸癌細胞株（ＤＬＤ−１Ｒ  ｏｘａ、ＳＷ４８Ｒ  ｃｅｔ）に処理したとき、細胞成長抑制能をＷＳＴ−１アッセイ分析で確認したグラフである。
【図１９】図１９Ａは、製造例１のＳＭＯ抗体を０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ投与した異種移植動物モデルを蛍光顕微鏡で撮影した写真である。図１９Ｂは、製造例１のＳＭＯ抗体を０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ投与した異種移植動物モデルを光学顕微鏡で撮影した写真である。図１９Ｃは、製造例１のＳＭＯ抗体を０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ投与し、約１ヶ月後に異種移植動物モデルから摘出された腫瘍組織を撮影した写真である。図１９Ｄは、時間による各異種移植動物モデルにおける腫瘍の大きさを測定して示すグラフである。
【図２０】ＮＩＨ３Ｔ３−ＧＬＩ細胞においてヒト化ＳＭＯ抗体のＧＬＩレポーター活性（％）を分析して示すグラフである。
【図２１】ＨＣＴ１１６細胞株をウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で分析した結果写真である。
【図２２】図２２（ａ）は、正常細胞と大腸癌細胞にヒト化ＳＭＯ  ７番抗体を処理したとき、細胞増殖力（ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）をＷＳＴ−１分析で測定して示すグラフである。図２２（ｂ）は、正常細胞と大腸癌細胞にヒト化ＳＭＯ  １５番抗体を処理したとき、細胞増殖力（ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）をＷＳＴ−１分析で測定して示すグラフである。図２２（ｃ）は、正常細胞と大腸癌細胞にヒト化ＳＭＯ  １６番抗体を処理したとき、細胞増殖力（ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）をＷＳＴ−１分析で測定して示すグラフである。図２２（ｄ）は、正常細胞と大腸癌細胞にヒト化ＳＭＯ  ７番抗体を処理したとき、細胞増殖力（ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）をＷＳＴ−１分析で測定して示すグラフである。
【図２３Ａ】ＨＣＴ１１６細胞株にヒト化ＳＭＯ  ７、１５、１６、１７番抗体をそれぞれ処理したとき、細胞移動力（ｃｅｌｌ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を測定して示すグラフである。
【図２３Ｂ】ＨＣＴ１１６細胞株にヒト化ＳＭＯ  ７、１５、１６、１７番抗体をそれぞれ処理したとき、細胞移動力（ｃｅｌｌ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を測定するために細胞を固定して染色した後、光学顕微鏡で撮影した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【００２４】
本発明の一態様によれば、本発明は、配列番号１で表示されるＳＭＯタンパク質のアミノ酸位置１０６〜４８５番目から選ばれる１〜１０個のアミノ酸を含むエピトープを提供する。
【００２５】
ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ，Ｈｈ）は、胚発生過程で主要に作用するタンパク質で、細胞増殖、移動及び分化調節により、胚パターン形成に該当する背部と腹部の軸形成、神経系、筋骨格系などを含む様々な臓器発生に関与する。成体におけるヘッジホッグは、幹細胞の維持に関与し、ヘッジホッグの成体組織内での異常な過剰活性は、基底細胞癌、脳癌などのような様々な癌を誘発することが知られている。そこで、発生過程後のヘッジホッグ信号伝達活性は、成体では一部の特定組織でのみ活性が維持され、大部分の体細胞では減少する。これに対し、体細胞段階においてヘッジホッグ信号伝達遺伝子（Ｐｔｃｈ、Ｓｍｏ、Ｓｕｆｕ、Ｇｌｉなど）突然変異によって過度な信号伝達活性が発生する場合、癌発生を誘発することが知られている。
【００２６】
ヘッジホッグ信号伝達経路は、細胞膜にある１２−膜貫通型受容体であるＰａｔｃｈｅｄ  １（Ｐｔｃｈ１）にソニックヘッジホッグ（Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）が結合することから始まり、Ｐｔｃｈ１は、７−膜貫通型のＧｌｉタンパク質結合受容体であるＳＭＯを抑制する作用があるが、Ｐｔｃｈ１にソニックヘッジホッグが結合すると、Ｐｔｃｈ１はＳＭＯを阻害する作用を失うことになる。その結果、ＳＭＯが活性化され、活性化されたＳＭＯによって転写因子であるＧｌｉが活性化され、ヘッジホッグ標的遺伝子の発現が活性化される。すなわち、リガンドとして作用するヘッジホッグが、細胞膜に存在するＰｔｃｈ１受容体に結合し、Ｐｈｃｈ１によって活性が抑制されている他のＧＰＣＲ様膜通過タンパク質であるＳＭＯの一次繊毛への移動を促進し、ヘッジホッグ信号伝達を担う最終役割者であるＧｌｉ転写因子の活性を促進させる。
【００２７】
ＳＭＯがＧｌｉ転写因子活性を調節する方式は、ヘッジホッグによって一次繊毛に移動したＳＭＯが、下位信号段階でＧｌｉ転写因子が核へ移動することを抑制するＳｕｆｕを調節したり或いは一次繊毛内でＧｌｉタンパク質の安定性を増加させ、非活性状態であるＧｌｉを転写活性を持つ状態へと転換を誘発して、Ｇｌｉ転写因子によってヘッジホッグの作用を受ける遺伝子発現増加を誘導し、細胞の移動、増殖及び分化過程に進むようにする。
【００２８】
そこで、本発明者らは、癌を制御できる新しい抗原を発掘しようと努力した結果、ヘッジホッグ信号伝達経路（Ｓｏｎｉｃ（ＳＨＨ））／ＰＡＴＣＨＥＤ／（ＰＴＣＨ１）／ＳＭＯＯＴＨＥＮＥＤ（ＳＭＯ））において様々な癌と関連があるＳＭＯタンパク質をターゲットとし、抗原に特異的に結合し、免疫学的に認知できるＳＭＯタンパク質のエピトープを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２９】
本明細書において、用語“エピトープ”とは、抗体又はその断片が特異的に結合できる抗原の局所化された（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）部位を意味する。エピトープは、おおよそ、アミノ酸又は糖側鎖のような分子の表面基からなり、通常、特異的な３次元構造特性及び特異的電荷特性を有する。立体形態的及び非立体形態的エピトープは、変性溶媒の存在下で立体形態的エピトープに対する結合は損失されるが、非立体形態的エピトープに対しては損失されない点で区別される。エピトープは結合に直接関連するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる。）及び結合に直接関連しないその他アミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸残基が特異的抗原結合ペプチドのフットプリント（ｆｏｏｔ  ｐｒｉｎｔ）内に存在する。）を含むことができる。
【００３０】
本発明において、前記エピトープは、ＳＭＯタンパク質のアミノ酸位置１０６〜１１５番目、１２５〜１３３番目、１５９〜１６６番目、２１６〜２２４番目、２９９〜３０７番目、３９１〜３９９番目及び４７７〜４８５番目から選ばれる１〜１０個のアミノ酸を含むことができる。
【００３１】
前記位置のアミノ酸を含むエピトープは、その構造を維持するために、ワクチンや組成物として利用されるとき、担体と結合した形態で用いることができる。本発明に係る担体は生体に適合し、本発明で目的とする効果が得られるものであれば、特に次に制限されないが、好ましくは、ペプチド、血清アルブミン、免疫グロブリン、ヘモシアニン及び多糖体などから選択され得る。
【００３２】
具体的に、本発明において、前記エピトープは、図１Ａに示すように、ＳＭＯ（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）タンパク質のシステインリーチドメイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎ，ＣＲＤ）又はポケット位置（ＳＭＯ−７ＴＭ）に存在するアミノ酸残基の一部又は全部であり、１０６〜１１５番目アミノ酸残基はＬＶＬＷＳＧＬＲＮＡ（配列番号２）であり、１２５〜１３３番目アミノ酸残基はＬＬＣＡＶＹＭＰＫ（配列番号３）であり、１５９〜１６６番目アミノ酸残基はＲＥＲＧＷＰＤＦ（配列番号４）であり、２１６〜２２４番目アミノ酸残基はＱＣＱＮＰＬＦＴＥ（配列番号５）であり、２９９〜３０７番目アミノ酸残基はＧＴＭＲＬＧＥＰＴ（配列番号６）であり、３９１〜３９９番目アミノ酸残基はＦＶＧＹＫＮＹＲＹ（配列番号７）であり、４７７〜４８５番目アミノ酸残基はＱＡＥＷＥＲＳＦＲ（配列番号８）であり、好ましくは、前記アミノ酸残基内の１個又は一部（連続又は不連続）のアミノ酸を含んだり、或いは残基内の全アミノ酸を含むものであり得、それぞれのアミノ酸残基の一部が交差選択されてもよい。
【００３３】
本発明において、前記ＳＭＯタンパク質は、配列番号１で表示でき、ＧｅｎＢａｎｋから配列情報が確認できる。
【００３４】
ＳＭＯ（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）は、７−膜貫通型のＧｌｉタンパク質結合受容体であり、ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）信号伝達経路の最終役割者であるＧｌｉ転写因子の活性を調節するものと知られている。しかし、現在、ヘッジホッグ信号伝達過剰活性によって発病する癌を抑制するためにヘッジホッグ信号伝達経路のＰｔｃｈ１又はヘッジホッグタンパク質の活性をターゲットとしたり、ＳＭＯ阻害活性を抑制するために新規化合物が開発されているだけである。その場合、ヘッジホッグ信号伝達経路を完壁に阻害し難い問題があり、ＳＭＯ突然変異による抗癌剤耐性癌細胞には適用し難いという問題点がある。したがって、前述したように、様々な癌（一般癌、耐性癌、再発癌など）に対して効果的な治療効果を示すＳＭＯ抑制剤の開発が至急である。
【００３５】
本発明の他の態様によれば、本発明は、配列番号２〜１５のいずれか一つで表示されるＳＭＯエピトープを抗原として認識してそれに特異的に結合する抗体であり、該抗体は、配列番号１６のＨＣＤＲ１、配列番号１７のＨＣＤＲ２、配列番号１８のＨＣＤＲ３、配列番号１９のＬＣＤＲ１、配列番号２０のＬＣＤＲ２、配列番号２１のＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする抗体又はその断片を提供する。
【００３６】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、配列番号２〜１５のいずれか一つで表示されるＳＭＯエピトープを抗原として認識してそれに特異的に結合する抗体であり、該抗体は、配列番号１６のＨＣＤＲ１、配列番号１７のＨＣＤＲ２、配列番号１８のＨＣＤＲ３、配列番号１９のＬＣＤＲ１、配列番号２０のＬＣＤＲ２、配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む基準抗体と前記ＳＭＯタンパク質エピトープとの結合において相互競合できる抗体又はその断片を提供する。
【００３７】
ヘッジホッグの成体組織における異常過剰活性は、基底細胞癌、脳癌などのような様々な癌を誘発すると知られたことがある。哺乳類のヘッジホッグは、ソニックヘッジホッグ（Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）、インディアンヘッジホッグ（Ｉｎｄｉａｎ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）、デザートヘッジホッグ（Ｄｅｓｅｒｔ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）の３種類があり、中でも最も多く研究されているのは、全身に発現が見られるソニックヘッジホッグ（Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ，ＳＨＨ）信号経路である。
【００３８】
ソニックヘッジホッグ信号経路（Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）は、細胞膜にある１２−膜貫通型受容体であるＰａｔｃｈｅｄ１（Ｐｔｃｈ１）にソニックヘッジホッグが結合することから始まり、Ｐｔｃｈ１は、７−膜貫通型のＧｌｉタンパク質結合受容体であるＳＭＯを抑制する作用があるが、Ｐｔｃｈ１にソニックヘッジホッグが結合すると、Ｐｔｃｈ１はＳＭＯを阻害する作用を失うことになる。その結果、ＳＭＯが活性化され、活性化されたＳＭＯによって転写因子であるＧｌｉが活性化され、ヘッジホッグ標的遺伝子の発現が活性化される。すなわち、リガンドとして作用するヘッジホッグが、細胞膜に存在するＰｔｃｈ１受容体に結合し、Ｐｈｃｈ１によって活性が抑制されている他のＧＰＣＲ様膜通過タンパク質であるＳＭＯの一次繊毛への移動を促進し、ヘッジホッグ信号伝達の最終役割者であるＧｌｉ転写因子の活性を促進させる。ＳＭＯタンパク質の活性化が癌細胞で高く現れ、高いＳＭＯタンパク質の発現又は活性化が癌患者又は癌細胞の低い生存率と関連があることを、後述する実験例から確認した。
【００３９】
本発明において、ＳＭＯタンパク質の高い発現が大腸癌患者の低い生存率と関連があるということを確認し、大腸癌細胞株においてＳＭＯタンパク質発現が正常細胞に比べて増加したことを確認し、また、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ１５、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＷＩＤＲ、ＳＷ４８、ＳＮＵＣ２Ａ、ｃｏｌｏ２０５、ＳＮＵ２８３、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＨＣＴ８、ＳＮＵＣ１、ＬＳ１７４Ｔ大腸癌細胞株において、ヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）信号伝達要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）のうち、ＳＭＯ、ＧＬＩ１タンパク質の発現が増加したことを確認した。すなわち、ヘッジホッグ最終信号役割者であるＧｉｌタンパク質は、ＳＭＯタンパク質の活性化によって調節されていることが分かる。ＳＭＯタンパク質に特異的に結合してＳＭＯタンパク質の活性化を阻害又は抑制するエピトープ部位を発見し完成した。
【００４０】
本発明の好ましい具現例によれば、前記抗原結合タンパク質は、配列番号１で表示されるＳＭＯタンパク質に特異的に結合し、ＳＭＯタンパク質を抑制したり阻害するものであり、配列番号１で表示されるＳＭＯタンパク質又はその一部（エピトープ）を抗原として用いて製造されたものであれば、特にそれに制限されない。
【００４１】
本明細書において、用語“エピトープ”とは、抗体又はその断片が特異的に結合できる抗原の局所化された（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）部位を意味する。例えば、抗原であるポリペプチド中の連続したアミノ酸がエピトープになり得、ポリペプチドで３次構造上フォルディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）によって不連続する２又はそれ以上の部位が共にエピトープになってもよい。エピトープは、抗原の独特の３次元構造において、連続又は不連続のアミノ酸を少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個含むことができる。本発明の抗体又はその断片は、ＳＭＯを抗原として認識してそれに特異的に結合するが、ＳＭＯタンパク質の１０６〜４８５番目アミノ酸残基から選択される１〜１０個のアミノ酸をエピトープとして特異的に結合でき、前記エピトープは１又はそれ以上のアミノ酸を含むことができる。
【００４２】
与えられた抗体が結合するエピトープを決定する方法（例えば、エピトープマッピング）は、抗体に対する反応性テストを用いる免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）及び免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）試験など、様々な方法がある。エピトープの３次元空間構造を決定する方法は、ｘ−レイ結晶学（ｘ−ｒａｙ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）、２次元核磁気共鳴法（２−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）及びＨＤＸ−ＭＳなど、様々な方法を用いて行うことができる（Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６））。
【００４３】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその断片が結合できるエピトープは、ＮＭＲ分光学、Ｘ−ｒａｙ回折結晶学、ＥＬＩＳＡ分析、ＨＤＸ−ＭＳ（ｈｙｄｒｏｇｅｎ／ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、アレイ基盤オリゴ−ペプチドスキャニング（ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ）、及び／又は突然変異誘発マッピング（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｍａｐｐｉｎｇ）によって決定することができる（Ｇｉｅｇｅ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５０（Ｐｔ４）：３３９−３５０；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ａ（１９９０）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １８９：１−２３；Ｃｈａｙｅｎ  ＮＥ（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：１２６９−１２７４；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ａ（１９７６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５１：６３００−６３０３）。
【００４４】
本明細書において、用語“抗体”は、免疫グロブリン分子のいずれか一類型の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＹ）であり得、いずれか下位類型の抗体（例えば、ヒトにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４；及びマウスにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３）であってもよい。免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）は、様々なアロタイプ（ａｌｌｏｔｙｐｅ）が存在でき、本明細書において用語“抗体”は、通常知られたアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）及びアロタイプ（ａｌｌｏｔｙｐｅ）を含む。また、本明細書において用語“抗体”は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４であるか、そのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）類型であり得る（例えば、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のハイブリッド）。
【００４５】
本明細書において、用語“単一クローン抗体”又は“ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ”は、特定エピトープに対する単一結合特異性（ｓｉｎｇｌｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）及び親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を示す抗体を意味する。
【００４６】
本発明の単一クローン抗体は、例えば、文献［Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５（１９７５）］で初めて説明されたハイブリドーマ方法によって生産されてもよく、組換えＤＮＡ方法によって生産されてもよい。単一クローン抗体はまた、例えば、文献［Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，６２４−６２８（１９９１）］及び［Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７（１９９１）］に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。単一クローン抗体は、任意の適合な供給源から入手できるが、本発明における単一クローン抗体は、ＳＭＯ抗原を発現する細胞又はＳＭＯ抗原をコードする核酸形態の関心抗原で免疫化させたマウスから得た細胞から製造したハイブリドーマから入手できる。単一クローン抗体はまた、免疫化されたヒト又は非ヒト哺乳動物、例えば、ラット、イヌ、霊長類などの抗体発現細胞から由来したハイブリドーマから入手できる。
【００４７】
本明細書において、前記単一クローン抗体はその断片を含む意味で使われ、前記断片は、好ましくは抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を意味する。前記断片は、当業界に知られた様々な方法を用いて製造できる。例えば、パパイン（Ｆａｂ断片の生産）又はペブシン（Ｆ（ａｂ’）２）のような酵素を用いて免疫グロブリン分子のタンパク質分解性切断（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ）によってＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を製造できる。
【００４８】
本明細書において、用語“断片”は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦＶ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、又はモノマーのＶＨ又はＶＬドメインを含むｓｄＡｂであってもよく、前記断片については当業界によく知られている。
【００４９】
本発明の単一クローン抗体又はその断片は、配列番号１で表示されるＳＭＯタンパク質のエピトープに結合する抗原結合タンパク質を含み、これは、ＳＭＯによって媒介される癌の成長と転移に関連した生理学的効果を抑制する。具体的に、癌においてヘッジホッグ伝達機転の活性化によって最終役割者なるＧｌｉタンパク質の発現が増加する。この過程にはヘッジホッグによるＳＭＯ発現が関与する。ＳＭＯタンパク質の活性化又は発現によって、ヘッジホッグ伝達経路によるＧｌｉタンパク質が増加し、癌が誘発される。すなわち、ヘッジホッグ伝達機転によって増加又は活性化されたＳＭＯタンパク質は癌の成長と発生に影響を与えるものであり、上述した抗原結合タンパク質を含む単一クローン抗体又はその断片を処理し、ＳＭＯタンパク質の発現又は活性を有用に抑制し阻害する。
【００５０】
本発明において、“成長を抑制する”ことは、本発明の単一クローン抗体又はその断片と接触していない同一細胞の成長に比較して、単一クローン抗体又はその断片と接触した時に細胞成長の任意の測定可能な減少（例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の細胞培養液の成長抑制を含む。）を含むように意図され、前記細胞成長の減少は、様々なメカニズムによって発生できる。
【００５１】
前記抗原結合タンパク質は、一つ以上のＣＤＲ（例えば、１、２、３、４、５、又は６個のＣＤＲ）を含む。前記抗原結合タンパク質はＳＭＯを抗原とし、それに結合するようにするものであり、本願で説明される一つ以上の相補性決定区域（ＣＤＲ）を含むポリペプチドである。前記抗原結合タンパク質において、ＣＤＲは、適合な抗原結合特性が達成されるようにＣＤＲを配向させる。本願で提供される抗原結合タンパク質は、ＳＭＯの発現又は活性化を阻害、遮断、減少又は調整することができる。すなわち、これによって、対象内に存在するＳＭＯを阻害し、ヘッジホッグ伝達経路によって媒介される癌の発生、成長及び転移を抑制することができる。
【００５２】
また、前記ヘッジホッグ信号伝達経路の調節障害は、化学療法及び放射線療法による耐性癌又は再発癌又は転移癌の発生にも寄与することが知られている。耐性の根本的なメカニズムが明らかにされたことはないが、従来抗癌剤によって耐性となった癌細胞に、本発明のＳＭＯ抗体を投与した結果、癌細胞の成長が顕著に抑制されたことを確認した。すなわち、本発明の単一クローン抗体又はその断片は、一般癌だけでなく、耐性癌、再発癌及び転移癌にも優れた治療効果を持つことが分かる。
【００５３】
ＶＨドメイン、又は一つ又はそれ以上のＣＤＲは、重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）を形成するために定常ドメインに連結され得る。また、ＶＬドメイン、又は一つ又はそれ以上のＣＤＲは、軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）を形成するために定常ドメインに連結され得る。全長（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）重鎖及び全長軽鎖が結合して全長抗体を構成する。
【００５４】
本発明において、抗原結合タンパク質は、前述した通り、配列番号１で表示されるＳＭＯタンパク質の１０６〜４８５番目アミノ酸残基から選択される１〜１０個のアミノ酸を含むエピトープに結合するものであり、配列番号１で表示されるＳＭＯに特異的に結合することによってヘッジホッグ信号伝達経路及びＳＭＯタンパク質発現と活性化を抑制、遮断及び阻害する効果を示す。
【００５５】
好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、配列番号２〜１５で表示されるアミノ酸残基の全部又は一部に対して相補的な配列を有するものであり、これによって、ＳＭＯタンパク質に特異的に又は選択的に結合できる。
【００５６】
前記抗原結合タンパク質は、治療用途に用いることができるが、前記ＳＭＯの一つ以上の生物学的活性を抑制、阻害又は調整することができ、ＳＭＯタンパク質に特異的に結合し、後述する実験例におけるように、試験管内競合的結合によって実質的にＳＭＯを抑制する。
【００５７】
免疫グロブリン鎖の可変区域は、一般に、３個の超可変区域（通常、“相補性決定区域”、すなわち、ＣＤＲと呼ばれる。）によって連結された比較的保持されたフレームワーク区域（ＦＲ）を含む、同一の全体構造を表す。前記言及されたそれぞれの重鎖／軽鎖対における２個の鎖からのＣＤＲは、通常、フレームワーク区域によって整列され、標的タンパク質（例えば、ＰＣＳＫ９）上の特異的エピトープと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端へと、天然発生軽鎖及び重鎖可変区域はいずれも一般的に次の順序のこれら要素と一致する：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４。それぞれのこれらドメイン内の位置を占めるアミノ酸に数字を配分するためのナンバリングシステムが考案された。前記ナンバリングシステムは、文献（［Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７  ａｎｄ  １９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）］、又は［Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７］；［Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３］）に定義されている。
【００５８】
様々な重鎖及び軽鎖可変区域を本願によって提供でき、前述したように、それぞれのそれら可変区域は、前記重鎖及び軽鎖定常区域に付着してそれぞれ完全な抗体重鎖及び軽鎖を形成できる。また、それぞれの形成された重鎖及び軽鎖配列は組み合わせられて完全な抗体構造を形成できる。
【００５９】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその断片は、ＳＭＯエピトープとの結合において本明細書に開示のＣＤＲ又は可変領域を含むＳＭＯ抗体であり、特定具体例において、前記抗体又はその断片は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１６、１７、１８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１９、２０のアミノ酸配列を含む。
【００６０】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその断片は、ＳＭＯエピトープとの結合において、本明細書に開示のＣＤＲ又は可変領域を含むＳＭＯ抗体と相互競合する（又は、結合を阻害する）。特定具体例において、前記抗体又はその断片は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む基準抗体の結合を阻害し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１６、１７、１８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１９、２０のアミノ酸配列を含む。
【００６１】
一部の具体例において、基準抗体は、（１）配列番号２２を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２７を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（２）配列番号２３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（３）配列番号２４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（４）配列番号２５を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は（５）配列番号２６を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；を含む。
【００６２】
好ましくは、前記基準抗体は、（２）配列番号２３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（３）配列番号２４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（４）配列番号２５を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は（５）配列番号２６を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；でよく、最も好ましくは、（４）配列番号２５を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は（５）配列番号２６を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むものであり得る。
【００６３】
特定の具体例において、前記抗体又はその断片は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％だけＳＭＯタンパク質への当該基準抗体の結合を阻害する。競合する抗体は、同一のエピトープ、重複エピトープ又は隣接エピトープに（例えば、立体障害によって証明された通りに）結合する。両抗体が標的への結合に対して互いに競合するか否かは、ＲＩＡ及びＥＩＡのような当業界に公知の競合実験を用いて決定できる。
【００６４】
本発明の抗体又はその断片は、例えば、ヒトＳＭＯタンパク質の断片に抗体の結合によって決定されたとき、ヒトＳＭＯタンパク質の少なくとも一つのエピトープに結合できる。一部の具体例において、前記抗体又はその断片は、配列番号１で表示されるＳＭＯタンパク質の１０６〜４８５番目アミノ酸残基から選択される１〜１０個のアミノ酸を含む少なくとも一つのエピトープに結合する。一部の具体例において、前記抗体及びその断片は、配列番号２〜１５で表示されるアミノ酸残基の全部又は一部に結合する。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体は、配列番号９〜１３である、少なくとも一つのＳＭＯエピトープに結合するものであり得る。一部の具体例において、少なくとも一つのエピトープは、配列番号９〜１３と少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％同じアミノ酸配列を有する。
【００６５】
本明細書に提示されたＶＨドメイン又はその一つ以上のＣＤＲは、重鎖、例えば、全長重鎖を形成するために定常ドメインに連結され得る。同様に、本明細書に提示されたＶＬドメイン又はその一つ以上のＣＤＲは、軽鎖、例えば全長軽鎖を形成するために定常ドメインに連結され得る。全長重鎖と全長軽鎖は組み合わせられて全長抗体を形成できる。
【００６６】
本発明の好ましい具現例によれば、前記抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体又はヒト化抗体である。
【００６７】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター又は前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００６８】
本発明の核酸分子は、単離したもの、又は組み換えられたものであり得、単一鎖及び二重鎖形態のＤＮＡ及びＲＮＡの他にも、対応する相補性配列が含まれる。“単離した核酸”は、天然生成源泉から単離した核酸の場合、核酸が単離した個体のゲノムに存在する周辺遺伝配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的に又は化学的に合成された核酸、例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドの場合、このような手順で生成された核酸が、単離した核酸分子として理解されてもよい。単離した核酸分子は、別個断片の形態又はより大きい核酸構築物の成分としての核酸分子を表す。核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置されるときに“作動可能に連結”される。例えば、前配列又は分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）のＤＮＡは、ポリペプチドが分泌される前の形態である前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現するときにポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーは、ポリペプチド配列の転写に影響を与えるときにコーディング配列に作動可能に連結され、又はリポソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されるときにコーディング配列に作動可能に連結される。一般に、“作動可能に連結された”とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接して位置することを意味し、分泌リーダーの場合、隣接して同一リーディングフレーム内に存在することを意味する。
【００６９】
しかし、エンハンサーは隣接して位置する必要はない。連結は、便利な制限酵素部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを通常の方法で使用する。
【００７０】
本明細書において、用語“ベクター”とは、核酸配列を複製できる細胞への導入のために核酸配列を挿入できる伝達体を意味する。核酸配列は、外生（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であり得る。ベクターとしては、プラスミド、コスミド及びウイルス（例えば、バクテリオファージ）を挙げることができるが、これに制限されない。当業者は、標準的な組換え技術によってベクターを構築できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ＮＹ，１９９４など）。
【００７１】
本明細書において、用語“発現ベクター”とは、転写される遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むベクターを意味する。一部の場合には、その後、ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。発現ベクターには様々な調節配列を含むことができる。転写及び翻訳を調節する調節配列と共に、ベクター及び発現ベクターには、別の機能を提供する核酸配列も含み得る。
【００７２】
本明細書において、用語“宿主細胞”とは、真核生物及び原核生物を含み、前記ベクターを複製できる、又はベクターによってコードされる遺伝子を発現できる任意の形質転換可能な生物を意味する。宿主細胞は、前記ベクターによって形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）又は形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）され得るが、これは、外生の核酸分子が宿主細胞内に伝達されたり導入される過程を意味する。
【００７３】
本発明の宿主細胞は、好ましくは、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などを挙げることができるが、それらに制限されない。
【００７４】
本発明の他の態様によれば、本発明は、配列番号１で表示されるＳＭＯタンパク質のアミノ酸位置１０６〜４８５番目アミノ酸残基から選択される１〜１０個のアミノ酸を含むエピトープ、これをコードする核酸分子又はこれを含むベクターを含む癌の予防又は治療用ワクチン組成物を提供する。
【００７５】
本発明の核酸分子は、単離したもの、又は組み換えられたものであり得、単一鎖及び二重鎖形態のＤＮＡ及びＲＮＡの他に、対応する相補性配列も含まれる。“単離した核酸”は、天然生成源泉から単離した核酸の場合、核酸が単離した個体のゲノムに存在する周辺遺伝配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的に又は化学的に合成された核酸、例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドの場合、このような手順で生成された核酸が、単離した核酸分子として理解されてもよい。単離した核酸分子は、個別断片の形態又はより大きい核酸構築物の成分としての核酸分子を表す。核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置されるときに“作動可能に連結”される。例えば、前配列又は分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）のＤＮＡは、ポリペプチドが分泌される前の形態である前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現するときにポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーは、ポリペプチド配列の転写に影響を与えるときにコーディング配列に作動可能に連結され、又はリポソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されるときにコーディング配列に作動可能に連結される。一般に、“作動可能に連結された”とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接して位置することを意味し、分泌リーダーの場合、隣接して同一リーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接して位置する必要はない。連結は、便利な制限酵素部位においてライゲーションよって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを通常の方法で使用する。
【００７６】
本明細書において、用語“ベクター”とは、核酸配列を複製できる細胞への導入のために核酸配列を挿入できる伝達体を意味する。核酸配列は、外生（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であり得る。ベクターとしては、プラスミド、コスミド及びウイルス（例えば、バクテリオファージ）を挙げることができるが、それらに制限されない。当業者は、標準的な組換え技術によってベクターを構築できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ＮＹ，１９９４など）。
【００７７】
本明細書において、用語“発現ベクター”とは、転写される遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むベクターを意味する。一部の場合には、その後、ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。発現ベクターには様々な調節配列を含むことができる。転写及び翻訳を調節する調節配列と共に、ベクター及び発現ベクターには、別の機能を提供する核酸配列も含み得る。
【００７８】
本明細書において、用語“宿主細胞”とは、真核生物及び原核生物を含み、前記ベクターを複製できる、又はベクターによってコードされる遺伝子を発現できる任意の形質転換可能な生物を意味する。宿主細胞は、前記ベクターによって形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）又は形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）され得るが、これは、外生の核酸分子が宿主細胞内に伝達又は導入される過程を意味する。
【００７９】
本発明の宿主細胞は、好ましくは、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などを挙げることができるが、それらに制限されない。
【００８０】
前記ワクチンは、生ワクチン、弱毒化ワクチン又は不活化ワクチンであり得る。
【００８１】
本発明のワクチン組成物は、能動免疫によって、ＳＭＯタンパク質に対して免疫反応の他に全身免疫反応も誘導でき、癌を予防又は治療でき、能動免疫とは、病源体が侵入した時、生体が自ら自分の身体中に抗体を生成させて兔役されることを意味する。
【００８２】
また、本発明は、前記ワクチン組成物を個体に投与し、癌の予防又は治療に用いることができる。
【００８３】
前記癌は、脳腫瘍、黒色腫、骨髄腫、非小細胞性肺癌、口腔癌、肝癌、胃癌、結腸癌、乳癌、肺癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、子宮頸癌、卵巣癌、大腸癌、小腸癌、直膓癌、ラッパ管癌腫、肛門付近癌、子宮内膜癌腫、膣癌腫、陰門癌腫、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、食道癌、リンパ腺癌、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性又は急性白血病、リンパ球リンパ腫、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、中枢神経系腫瘍、一次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺腫、リンパ腫、白血病及び多発性骨髄腫からなる群から選ばれるいずれか一つでよく、前記癌は、進行性癌、耐性癌、再発癌又は転移癌であり得る。特に、前記耐性癌は、癌治療用薬物に対する耐性を有する癌であり、癌治療用薬物には、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、エルロチニブ、ネラチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、ニロチニブ、セマクサニブ、ボスチニブ、アキシチニブ、セジラニブ、レスタウルチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、ソラフェニブ、ベバシズマブ、シスプラチン、セツキシマブ、ビスカムアルバム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラムスチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、ヘプタプラチン、アミノレブリン酸メチル、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガフール、カペシタビン、ギメラシル、オテラシル、アザシチジン、メトトレキサート、ウラシル、シタラビン、フルオロウラシル、フルダラビン、エノシタビン、フルタミド、デシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモフール、ラルチトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テニポシド、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ペプロマイシン、テムシロリムス、テモゾロミド、ブスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、ロイコボリン、トレチノイン、エキセメスタン、アミノグルテチミド、アナグレリド、ナベルビン、ファドロゾール、タモキシフェン、トレミフェン、テストラクトン、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール、ビカルタミド、ロムスチン、ボリノスタット、エンチノスタット、５ＦＵ及びカルムスチンなどがあるが、特にそれらに制限されず、好ましくは、オキサリプラチン又はセツキシマブに対する耐性がある癌であり得る。
【００８４】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記単一クローン抗体又はその断片、前記核酸分子又は前記ベクター又はＳＭＯ遺伝子の発現を抑制する抑制剤を含む組成物を提供する。
【００８５】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組成物は、癌を予防又は治療したり、癌の転移を抑制したり、或いは耐性癌、再発癌又は転移癌を予防又は治療する薬剤学的組成物である。
【００８６】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、癌を予防又は治療したり、癌の転移を抑制したり、或いは耐性癌、再発癌又は転移癌予防又は治療用医薬製造のための前記単一クローン抗体又はその断片、前記核酸分子又は前記ベクター又はＳＭＯ遺伝子の発現を抑制する抑制剤の新規用途を提供する。
【００８７】
前記癌は、脳腫瘍、黒色腫、骨髄腫、非小細胞性肺癌、口腔癌、肝癌、胃癌、結腸癌、乳癌、肺癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、子宮頸癌、卵巣癌、大腸癌、小腸癌、直膓癌、ラッパ管癌腫、肛門付近癌、子宮内膜癌腫、膣癌腫、陰門癌腫、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、食道癌、リンパ腺癌、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性又は急性白血病、リンパ球リンパ腫、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、中枢神経系腫瘍、一次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺腫、リンパ腫、白血病及び多発性骨髄腫からなる群から選ばれるいずれか一つでよく、前記癌は、進行性癌、耐性癌、再発癌又は転移癌であり得る。特に、前記耐性癌は、癌治療用薬物に対する耐性を有する癌であり、癌治療用薬物には、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、エルロチニブ、ネラチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、ニロチニブ、セマクサニブ、ボスチニブ、アキシチニブ、セジラニブ、レスタウルチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、ソラフェニブ、ベバシズマブ、シスプラチン、セツキシマブ、ビスカムアルバム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラムスチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、ヘプタプラチン、アミノレブリン酸メチル、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガフール、カペシタビン、ギメラシル、オテラシル、アザシチジン、メトトレキサート、ウラシル、シタラビン、フルオロウラシル、フルダラビン、エノシタビン、フルタミド、デシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモフール、ラルチトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テニポシド、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ペプロマイシン、テムシロリムス、テモゾロミド、ブスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、ロイコボリン、トレチノイン、エキセメスタン、アミノグルテチミド、アナグレリド、ナベルビン、ファドロゾール、タモキシフェン、トレミフェン、テストラクトン、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール、ビカルタミド、ロムスチン、ボリノスタット、エンチノスタット、５ＦＵ及びカルムスチンなどがあるが、特にそれらに制限されず、好ましくは、オキサリプラチン又はセツキシマブに対する耐性がある癌であり得る。
【００８８】
本発明の薬剤学的組成物は、（ａ）前記抗体又はその断片、前記核酸分子、又は前記核酸分子を含むベクター又はＳＭＯ遺伝子の発現を抑制する抑制剤；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含むことができる。
【００８９】
本発明の前記癌は、ＳＭＯ遺伝子及びそのタンパク質発現レベルを測定した場合、ＳＭＯ遺伝子又はタンパク質の発現レベルが過発現したもので、ＳＭＯ遺伝子はＧｅｎｅ  Ｂａｎｋから確認できる。
【００９０】
本発明のＳＭＯタンパク質が過剰発現した癌を表現するために用いられている“過発現”は、適切な発現分析法でＳＭＯ発現レベルを測定した場合において、比較対象細胞（例えば、該当器官である正常大腸細胞）のＳＭＯ発現レベルに比べて１．１倍以上、好ましくは２倍以上であることを意味する。
【００９１】
本発明の組成物の最大の特徴は、ＳＭＯ遺伝子或いはタンパク質をターゲットとし、前記ＳＭＯ遺伝子の発現レベル又は前記ＳＭＯタンパク質の発現又は活性を抑制し、癌を治療又は転移を抑制したり、或いは耐性癌、再発癌又は転移癌を治療するということである。
【００９２】
前記抑制剤は、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる１種以上であり得るが、好ましくは、前記遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するｓｈＲＮＡ（Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ  ｏｒ  ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）である。前記抑制剤は、ＳＭＯ遺伝子発現を抑制するものであり得る。
【００９３】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記薬剤学的組成物を投与する段階を含む癌の予防又は治療方法を提供する。また、本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記薬剤学的組成物を投与する段階を含む癌転移の予防又は治療方法を提供する。
【００９４】
本発明が予防又は治療しようとする癌の種類は制限されないが、脳腫瘍、黒色腫、骨髄腫、非小細胞性肺癌、口腔癌、肝癌、胃癌、結腸癌、乳癌、肺癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、子宮頸癌、卵巣癌、大腸癌、小腸癌、直膓癌、ラッパ管癌腫、肛門付近癌、子宮内膜癌腫、膣癌腫、陰門癌腫、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、食道癌、リンパ腺癌、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性又は急性白血病、リンパ球リンパ腫、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、中枢神経系腫瘍、一次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺腫、リンパ腫、白血病及び多発性骨髄腫からなる群から選ばれるいずれか一つのような成人の通常の固形腫瘍（ｃｏｍｍｏｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ）を含めて多数の癌を治療するように投与され得る。
【００９５】
また、前記癌は、進行性癌、耐性癌、再発癌又は転移癌にも治療効果を有することができ、特に、前記耐性癌は、癌治療用薬物に対する耐性を有する癌であり、癌治療用薬物には、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、エルロチニブ、ネラチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、ニロチニブ、セマクサニブ、ボスチニブ、アキシチニブ、セジラニブ、レスタウルチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、ソラフェニブ、ベバシズマブ、シスプラチン、セツキシマブ、ビスカムアルバム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラムスチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、ヘプタプラチン、アミノレブリン酸メチル、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガフール、カペシタビン、ギメラシル、オテラシル、アザシチジン、メトトレキサート、ウラシル、シタラビン、フルオロウラシル、フルダラビン、エノシタビン、フルタミド、デシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモフール、ラルチトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テニポシド、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ペプロマイシン、テムシロリムス、テモゾロミド、ブスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、ロイコボリン、トレチノイン、エキセメスタン、アミノグルテチミド、アナグレリド、ナベルビン、ファドロゾール、タモキシフェン、トレミフェン、テストラクトン、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール、ビカルタミド、ロムスチン、ボリノスタット、エンチノスタット、５ＦＵ及びカルムスチンなどがあるが、特にそれらに制限されるものではなく、好ましくは、オキサリプラチン又はセツキシマブに対する耐性がある癌であり得る。
【００９６】
本発明のワクチン組成物及び薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、それらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分に加えて、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適切な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【００９７】
本発明のワクチン組成物及び薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、好ましくは、非経口投与であり、例えば、静脈内注入、局所注入及び腹腔注入などで投与できる。
【００９８】
本発明のワクチン組成物及び薬剤学的組成物の適正な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、普通の熟練した医師は、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明のワクチン組成物及び薬剤学的組成物の１日投与量は、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【００９９】
本発明のワクチン組成物及び薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されたり、又は多回容量容器内に内入して製造され得る。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【０１００】
本発明のワクチン組成物及び薬剤学的組成物は、単独の療法で用いられてもよいが、他の通常の化学療法又は放射療法と共に用いられてもよく、このような併用療法によれば、より効果的に癌治療ができる。本発明の組成物と共に利用可能な化学療法剤は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ブスルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、トランスプラチン（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）及びメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）などを含む。本発明の組成物と共に利用できる放射療法は、Ｘ線照射及びγ−線照射などである。
【０１０１】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、単一クローン抗体又はその断片を、被検者から体外に分離されたサンプルに処理する段階を含む、サンプル中に含まれたＳＭＯタンパク質の定量方法を提供する。
【０１０２】
本発明の単一クローン抗体又はその断片は、ＳＭＯタンパク質に特異的に結合するが、これを用いると、サンプル中に含まれたＳＭＯタンパク質の発現量を正確に測定できる。しかも、癌治療用薬物による耐性癌、再発癌又は転移癌に関連した様々なＳＭＯタンパク質の発現量も測定できる。
【０１０３】
本発明のさらに他の態様によれば、下記の段階を含むＳＭＯタンパク質の過発現による疾患の診断のための情報を提供する方法を提供する：
（ａ）被検者から体外に分離されたサンプルを取得する段階；
（ｂ）前記単一クローン抗体若しくはその断片又はこれをコードする核酸分子を、前記サンプルに処理する段階；及び
（ｃ）前記被検者のサンプル中に含まれたＳＭＯの発現量が、正常群サンプル中に含まれたＳＭＯの発現量よりも高いか否か確認する段階。
【０１０４】
前記ＳＭＯの過発現による疾患の診断のための情報を提供する方法であって、
ＳＭＯタンパク質は、ヘッジホッグ信号伝達経路に関与し、最終役割者なるＧｌｉの、転写活性を持つ状態への転換を誘発し、細胞移動、増殖及び分化過程を増加させる役割を担うものであり、膀胱癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、横紋筋肉腫、膠芽細胞腫などの様々な癌、又は癌治療用薬物による耐性癌、転移癌、又は再発癌で過発現して、癌細胞の増殖、移動、侵入、転移などの主要癌進行過程に直接関与するため、前記ヘッジホッグ信号伝達経路におけるＳＭＯタンパク質の発現量を正常人と比較することによって、ＳＭＯタンパク質の過発現による疾患の診断のための情報を提供することができる。
【０１０５】
本発明の好ましい具現例によれば、前記ＳＭＯタンパク質の過発現による疾患は、癌である。
【０１０６】
前記癌は、脳腫瘍、黒色腫、骨髄腫、非小細胞性肺癌、口腔癌、肝癌、胃癌、結腸癌、乳癌、肺癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、子宮頸癌、卵巣癌、大腸癌、小腸癌、直膓癌、ラッパ管癌腫、肛門付近癌、子宮内膜癌腫、膣癌腫、陰門癌腫、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、食道癌、リンパ腺癌、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性又は急性白血病、リンパ球リンパ腫、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、中枢神経系腫瘍、一次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺腫、リンパ腫、白血病及び多発性骨髄腫からなる群から選ばれるいずれか一つでよく、前記癌は、進行性癌、耐性癌、再発癌又は転移癌であり得る。特に、前記耐性癌は、癌治療用薬物に対する耐性を有する癌であり、癌治療用薬物には、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、エルロチニブ、ネラチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、ニロチニブ、セマクサニブ、ボスチニブ、アキシチニブ、セジラニブ、レスタウルチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、ソラフェニブ、ベバシズマブ、シスプラチン、セツキシマブ、ビスカムアルバム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラムスチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、ヘプタプラチン、アミノレブリン酸メチル、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガフール、カペシタビン、ギメラシル、オテラシル、アザシチジン、メトトレキサート、ウラシル、シタラビン、フルオロウラシル、フルダラビン、エノシタビン、フルタミド、デシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモフール、ラルチトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テニポシド、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ペプロマイシン、テムシロリムス、テモゾロミド、ブスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、ロイコボリン、トレチノイン、エキセメスタン、アミノグルテチミド、アナグレリド、ナベルビン、ファドロゾール、タモキシフェン、トレミフェン、テストラクトン、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール、ビカルタミド、ロムスチン、ボリノスタット、エンチノスタット、５ＦＵ及びカルムスチンなどがあるが、特にそれらに制限されるものではなく、好ましくは、オキサリプラチン又はセツキシマブに対する耐性がある癌であり得る。
【０１０７】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記単一クローン抗体若しくはその断片又はこれをコードする核酸分子を含むＳＭＯタンパク質定量キットを提供する。
【０１０８】
本発明の定量キットは、抗原抗体結合反応によって前記抗体に対する抗原を分析することによってＳＭＯタンパク質量を定量でき、前記抗原抗体結合反応は、通常のＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｎｏａｓｓａｙ）、サンドウィッチ測定法（Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ａｓｓａｙ）、ポリアクリルアミドゲル上のウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ）、免疫ブロット分析（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）及び免疫組織化学染色方法（Ｉｍｍｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）からなる群から選ばれることが好ましいが、これに制限されない。
【０１０９】
抗原−抗体結合反応のための固定体には、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、ポリビニル（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）樹脂又はポリスチレン（Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂で合成されたウェルプレート（Ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）、及びガラスからなるスライドガラス（Ｓｌｉｄｅ  ｇｌａｓｓ）からなる群から選ばれるいずれかを用いることができるが、それらに制限されない。
【０１１０】
前記２次抗体は、発色反応をする通常の発色剤で標識することが好ましく、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリ性リン酸分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（Ｃｏｌｏｉｄ  ｇｏｌｄ）、ＦＩＴＣ（Ｐｏｌｙ  Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＲＩＴＣ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｂ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）などの蛍光物質（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及び色素（Ｄｙｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つの標識体を用いることができる。発色を誘導する基質は、発色反応をする標識体に応じて使用することが好ましく、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ［２，２’−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）］及びＯＰＤ（ｏｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つを使用することが好ましいが、それらに制限されない。
【実施例】
【０１１１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【０１１２】
＜製造例１〜５．ＳＭＯ抗体製造＞
本実験例における抗体は、配列番号１で表示されるＳＭＯタンパク質のうち、１５ｍｅｒ前後のアミノ酸残基を抗原としてマウスに免疫処理して製造され、これはバイオワンに依頼して得た。
【０１１３】
１）マウスの免疫化及びハイブリドーマ細胞作製
単一クローン抗体はＳＭＯタンパク質抗原１００〜１１５番目アミノ酸残基（配列番号９；２１番、２８３番ＳＭＯ抗体）、２１４〜２２８番目アミノ酸残基（配列番号１０；３２４、４０１、４０８番ＳＭＯ抗体）、１２４〜１３８番目アミノ酸残基（配列番号１１）、１５５〜１６９番目アミノ酸残基（配列番号１２）及び４７５〜４８８番目アミノ酸残基（配列番号１３）、３８９〜４０３番目アミノ酸残基（配列番号１４）及び２９７〜３１０番目アミノ酸残基（配列番号１５）を用いてＳＭＯ抗体を製造した。効率的な抗体の製造のために配列番号９〜１５をそれぞれ抗体作製ターゲットペプチドとして選択した。
【０１１４】
前記抗体作製ターゲットペプチド（配列番号９〜１５）を各マウスに注射した後、抗原に対する抗体を生産する細胞を生成し、マウスの脾臓から得た抗体生産細胞（Ｂ細胞、Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を骨髄腫細胞（Ｍｙｅｌｏｍａ）と融合し、ハイブリドーマ細胞を得た。ハイブリドーマ細胞しか生存できないＨＡＴ培地で培養した後、抗体の活性をＥＬＩＳＡ実験を用いて確認した。
【０１１５】
２）選別及び確保
前記ハイブリドーマ細胞の中から、ＳＭＯタンパク質を特異的に認識する単一クローンハイブリドーマ細胞を選定した後、ネズミの腹腔内に前記選ばれた単一クローンハイブリドーマ細胞を注入した後、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）から得た。腹水から回収した本発明の単一クローン抗体は、タンパク質Ａとタンパク質Ｇカラムなどを用いて精製した。その後、前記抗体は、ＳＭＯ構造物とｓｉＲＮＡを用い、ウェスタンブロットと免疫蛍光法により、ＳＭＯを特異的に認識する単一クローン抗体（ＳＭＯ  ｍＡｂ）を選別及び確認した。
【０１１６】
ＳＭＯタンパク質抗原１００〜１１５番目アミノ酸残基（配列番号９）から２１番、２８３番ＳＭＯ抗体（製造例１、２）、及び２１４〜２２９番目アミノ酸残基（配列番号１０）から３２４、４０１、４０８番ＳＭＯ抗体（製造例３、４、５）が選別及び確認された。
【０１１７】
＜製造例６〜１０．ヒト化ＳＭＯ  ５，７、１５、１６、１７番抗体製造＞
本実験例における抗体は、配列番号１で表示されるＳＭＯタンパク質のうち、１５ｍｅｒ前後のアミノ酸残基を抗原としてマウスに免疫処理して製造され、これはバイオワンに依頼して得た。
【０１１８】
１）免疫化及びハイブリドーマ細胞作製
単一クローン抗体は、ＳＭＯタンパク質抗原２１４〜２２８番目アミノ酸残基（配列番号１０）をそれぞれ抗体作製ターゲットペプチドとして選択した。
【０１１９】
前記抗体作製ターゲットペプチドを各マウスに注射した後、抗原に対する抗体を生産する細胞を生成し、マウスの脾臓から得た抗体生産細胞（Ｂ細胞、Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を骨髄腫細胞（Ｍｙｅｌｏｍａ）と融合してハイブリドーマ細胞を得た。ハイブリドーマ細胞しか生存できないＨＡＴ培地で培養した後、抗体の活性をＥＬＩＳＡ実験を用いて確認した。
【０１２０】
２）選別及びハイブリドーマ配列分析
５×１０６個のハイブリドーマ細胞から抗ＳＭＯ抗体の全ＲＮＡを抽出し、製造者の指示に従って、ｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて全ＲＮＡから相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を製造した。ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いたＰＣＲによってＶＨ（重鎖の可変領域）及びＶＬ（軽鎖の可変領域）コーディング領域を増幅させた。当該ＰＣＲ産物をＴベクター（プロメガ）にクローニングし、配列分析を行った。抗体配列を分析し、これを下記の表１に示した。ＣＤＲ配列は、文献［Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］にしたがって規定する。
【０１２１】
【表１】
2021530250.tif 000003
【０１２２】
３）ヒト化抗体への変換
ヒト化抗体の製造のために、前記で得たマウスＳＭＯ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、ＩＭＧＴデータベースのヒト抗体アミノ酸配列と比較分析し、最も類似性の高いヒト抗体可変領域の重鎖遺伝子ＩＧＨＶ１−３＊０１、ＩＧＨＶ１−４６＊０１、ＩＧＨＶ１−６９−２＊０１と軽鎖遺伝子ＩＧＫＶ２−３０＊２０、ＩＧＫＶ２Ｄ−２８＊０１、ＩＧＫＶ１−３９＊０１を選別した。マウスＳＭＯ抗体をヒト化するために、マウスＳＭＯ抗体のＣＤＲを前記ヒト抗体可変領域の遺伝子に移植させて、ヒト化ＦＲのアミノ酸残基をマウス抗体のものに置換し、ヒト化抗体を製造した。その全配列を表２に示す。
【０１２３】
【表２】
2021530250.tif 000004
【０１２４】
下線表示：前記配列においてＣＤＲ１、２、３配列を下線を引いて表示した。
【０１２５】
実施例
＜実施例１＞大腸癌組織においてＳＭＯタンパク質発現の有無
１．対象
２００５年から２００９年まで手術した大腸癌患者から摘出した大腸癌組織２０６例、及び対照群として、腫瘍から０．５ｃｍ以上離れた部分から得た大腸組織（正常組織）２７例を対象にした。
【０１２６】
２．組織マイクロアレイ（Ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）作製
前記正常組織と大腸癌組織をホルマリンに固定した後、パラフィン包埋された組織から３μｍ厚の連続切片をそれぞれ４枚ずつ切り、３−アミノ−プロピルトリエトキシシランで処理したスライドに付着した。そのいずれか１枚は１０％マイヤーヘマトキシリン（Ｍａｙｅｒ’ｓ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅ）染色をし、残りの３枚は、ＳＭＯ抗原に対する免疫組織化学的染色を施した。対象症例のヘマトキシリン染色スライドで組織学的所見を確認して代表部位を表示し、パラフィンブロックでそれに相応する部位を選定した。組織マイクロアレイブロック作製機構（ＭＩＣＲＯＭ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて選定された部位を２ｍｍサイズにパンチした。あらかじめ準備した受取（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）ブロックに、直径２ｍｍ、深さ２ｍｍの微細穴（ｍｉｃｒｏｈｏｌｅ）を開け、各症例ブロックでパンチした組織切片を合計２３３個の微細穴に植えた。断面をならすために、作製された組織マイクロアレイブロックを５０℃に３０分間放置した。
【０１２７】
３．免疫組織学的染色法（ＩＨＣ）
前記作製された組織マイクロアレイを、抗原回復のために、クエン酸緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）にスライドを漬した後、マイクロウェーブオーブンを用いて１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ，ｐＨ６．０）に５分ずつ３回処理した。その後、３％の過酸化水素を投与し、さらにＰＢＳに１０分間洗浄した後、１０％ヒツジ血清で処理して非特異的結合を抑制した後、一次抗体を処理した。抗ＳＭＯ抗体（ａｂｃａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）（１：５０）を室温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄し、２次抗体（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＵＳＡ）と室温で１時間反応させた後にＰＢＳで３回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＵＳＡ）で１０分間反応させた。
【０１２８】
その後、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で発色させた後、１０％マイヤーヘマトキシリン（ヘマトキシリン）で対照染色し、流れる水に洗浄した後に封入し、光学顕微鏡で観察した。
【０１２９】
４．結論
図３は、正常組織と大腸癌組織を免疫組織学的染色法で分析し、光学顕微鏡で撮影した写真及びグラフであり、図３の写真は、大腸癌組織と正常組織から任意に選択されたいずれか一つの染色標本である。図３に見られるように、正常組織に比して大腸癌組織においてＳＭＯタンパク質発現量がより高いことが分かる。特に、ＳＭＯ発現に対する染色強度は、統計学的に大腸癌組織で非常に有意に高かった（ｐ＜０．０００１）。
【０１３０】
＜実施例２＞大腸癌組織においてＳＭＯ発現程度による生存率確認
実施例１から得た大腸癌組織２０６例を対象に、ＳＭＯ発現程度によって生存率を分析した。実施例１から得た大腸癌組織２０６例を、ＳＭＯ発現程度によって、ＳＭＯ発現の低い群（ＳＭＯ  ｗｅａｋ、青色線）と高い群（ＳＭＯ  ｓｔｒｏｎｇ、緑色線）に分け、両群間の生存曲線を比較した。このとき、生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）の生存曲線は、統計プログラムであるＳＰＳＳを用いて分析した。
【０１３１】
図４は、実施例１から得た大腸癌組織２０６例を、ＳＭＯ発現程度によって区別した、ＳＭＯ発現の低い群（ＳＭＯ  ｗｅａｋ）と高い群（ＳＭＯ  ｓｔｒｏｎｇ）の生存曲線である。
【０１３２】
図４に示すように、ＳＭＯ発現の高い群（ＳＭＯ  ｓｔｒｏｎｇ）における予後が、ＳＭＯ発現の低い群（ＳＭＯ  ｗｅｅｋ）に比べてよくないことを確認した。さらに、両群の全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）に統計学的有意性（ｐ＝０．０５）があることを確認した。
【０１３３】
＜実施例３＞正常組織及び大腸癌組織に対するウェスタンブロット分析
１．対象
実施例１の大腸癌組織２０６例と大腸組織（正常組織）２７例から最終研究対象１６例をそれぞれ（大腸癌組織１６例、正常組織１６例）選別した（＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃１０、＃２１、＃２２、＃２７、＃２８、＃３０）。採取した組織は直ちに液体窒素に浸して急速冷凍させた後、−８０℃冷凍庫に保管しておき、実験前に解凍してタンパク質を分離した。
【０１３４】
２．タンパク質の分離
組織を、プロテアーゼが添加された溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（７Ｍウレア、２Ｍチオウレア、４％  ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＤＴＴ）中で機械的な組織粉砕（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）と超音波分解（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を併用して破砕した後、４℃で３０分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄液中のタンパク質はブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いてＥＬＩＳＡ法で測定して定量した。
【０１３５】
３．ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）
採取した組織から分離されたタンパク質３０μｇで電気泳動を行い、ＰＶＤＦ膜に移した後、抗ＳＭＯ抗体（ａｂｃａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を１次抗体として用い、ＨＲＰ結合抗ウサギ抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を２次抗体として用いて標識し、化学発光染色方法で確認した。ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）法により、各ＳＭＯタンパク質発現量は、アクチンを基準１にして相対的なＳＭＯ発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ＳＭＯ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）で示した。
【０１３６】
このとき、＃数字は、試料の番号であり、各試料番号において正常組織（ｎｏｒｍａｌ）はＮと表記し、大腸癌組織（Ｔｕｍｏｒ）はＴと表記した。
【０１３７】
４．結論
図５は、大腸及び大腸癌組織をウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で分析した結果写真であり、図６は、図５の相対的なＳＭＯ発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ＳＭＯ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を定量化して示すグラフである。
【０１３８】
図５及び図６に示すように、大部分の正常組織（Ｎｏｒｍａｌ:Ｎ）に比べて大腸癌組織（Ｔｕｍｏｒ:Ｔ）においてＳＭＯタンパク質発現量が増加することを確認した。正常組織と大腸癌組織においてＳＭＯ発現程度は統計的に有意な差を示した（Ｐ＜０．０１）。
【０１３９】
＜実施例４＞様々な大腸癌細胞株においてヘッジホッグ及びＳＭＯ信号伝達発現分析
１．大腸癌細胞株培養
ＤＬＤ−１、ＨＣＴ１５、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＷＩＤＲ、ＳＷ４８、ＳＮＵＣ２Ａ、ｃｏｌｏ２０５、ＳＮＵ２８３、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＨＣＴ８、ＳＮＵＣ１、ＬＳ１７４Ｔ大腸癌細胞株は、韓国細胞株銀行から購入した。それぞれを３回継代培養した後、各大腸癌細胞株を１×１０５／ｃｍ２の細胞濃度で６０ｍｍサイズの培養容器（Ｆａｌｃｏｎ）に培養し、３日ごとに培養液の半分を入れ換えた。細胞毒性検査のためには９６ウェル培養容器（Ｆａｌｃｏｎ）を使用した。培養液は、ＲＰＭＩ１６４０にペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を添加し、１０％のウシ胎児血清を添加し、５％  ＣＯ２、加湿状態の細胞培養器（Ｆｏｒｍａ，ＵＳＡ）で培養した。
【０１４０】
２．ウェスタンブロット
ヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）信号伝達要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）であるＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３、ＳＨＨ、ＳＭＯ、ＰＴＣＨ１、ＳＵＦＵタンパク質の発現量を調べるために、前記それぞれの大腸癌細胞株を、ＰＲＯ−ＰＲＥＰタンパク質抽出溶液（Ｉｎｔｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）に溶解して抽出した後、ＢＣＡ定量（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）して使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を用いてタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）膜に移した後、５％脱脂乳でブロッキングした。その後、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３、ＳＨＨ、ＳＭＯ、ＰＴＣＨ１、ＳＵＦＵ抗体とβ−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）を４℃で一晩付着し、翌日、ＴＢＳＴで洗浄後に常温で１時間ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）抗体を付けた。ＥＣＬ（Ｂｉｏｎｏｔｅ，Ｈｗａｓｅｏｎｇ，Ｋｏｒｅａ）検出試薬（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）を用いてタンパク質発現程度を確認した。
【０１４１】
３．結論
図７は、ヘッジホッグ信号伝達要素であるＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３、ＳＨＨ、ＳＭＯ、ＰＴＣＨ１、ＳＵＦＵタンパク質の発現量を分析するための、１４個の大腸癌細胞株のウェスタンブロット結果であり、これによれば、大腸癌細胞ごとにタンパク質発現様相が異なることを確認した。ただし、この中でも、ＳＭＯ、ＧＬＩ１タンパク質は、ＨＣＴ１１６、ＳＮＵ２８３、ＳＷ６２０細胞では高い発現様相を示し、ＤＬＤ−１は、低いことを確認した。
【０１４２】
＜実施例５＞大腸癌細胞株ＧＣＴ１１６においてＳＭＯ抗体結合能分析
１．ＨＣＴ１１６大腸癌細胞株培養
ＨＣＴ１１６大腸癌細胞株は、韓国細胞株銀行から購入した。３回継代培養した後、ＨＣＴ１１６大腸癌細胞株を１×１０５／ｃｍ２の細胞濃度で６０ｍｍサイズの培養容器（Ｆａｌｃｏｎ）に培養し、３日ごとに培養液の半分を入れ換えた。この時、９６ウェル培養容器（Ｆａｌｃｏｎ）を使用した。培養液は、ＲＰＭＩ１６４０にペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を添加し、１０％のウシ胎児血清を添加し、５％  ＣＯ２、加湿状態の細胞培養器（Ｆｏｒｍａ，ＵＳＡ）で培養した。本実験例では２４時間培養した。
【０１４３】
２．流細胞分析
前記細胞の培養が完了すると、数分間０．０５％トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）で細胞を分離し、それを集めてＰＢＳで２回洗浄した。洗浄した細胞は、３．７％ホルムアルデヒドで固定した後、１次抗体であるＳＭＯマウス抗体及びＡｂｃａｍ  ＳＭＯ抗体（陽性対照群）を入れ、４℃で一晩（Ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔ）静置させた。その後、ＰＢＳで３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ−５９４が結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）した２次抗体を付けて染色した後、流細胞分析機（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した。
【０１４４】
３．結論
図８は、大腸癌細胞ＨＣＴ１１６において製造例１（２１番抗体）と製造例２（２８３番抗体）の結合能を確認するために、流細胞分析で測定した結果グラフである。下段のグラフは、流細胞分析機によって測定されたＨＣＴ１１６細胞における平均蛍光強度を示す。
【０１４５】
図９は、大腸癌細胞ＨＣＴ１１６において製造例３（３２４番抗体）、製造例４（４０１番抗体）及び製造例５（４０８番抗体）の結合能を確認するために、流細胞分析で測定した結果グラフである。下段のグラフは、流細胞分析機によって測定されたＨＣＴ１１６細胞における平均蛍光強度を示す。
【０１４６】
図８及び図９に示すように、ＳＭＯ、ＧＬＩ１の発現が相対的に高いＨＣＴ１１６細胞株においてＳＭＯ抗体の結合能を分析した結果、２１番抗体（製造例１）、２８３番抗体（製造例２）が細胞株のＳＭＯタンパク質に特異的に結合を形成することを確認した。具体的に、２１番抗体（製造例１）は、２８３番抗体（製造例２）に比べてＳＭＯタンパク質に結合する能力がより優れていることを確認した。
【０１４７】
一方、３２４番抗体（製造例３）、４０１番抗体（製造例４）、４０８番抗体（製造例５）も同様、ＨＣＴ１１６の発現したＳＭＯタンパク質に特異的に効率よく結合していることを確認した。
【０１４８】
＜実施例６＞大腸癌細胞株ＳＷ６２０  ｃｏｎ  ｓｈＲＮＡ、ＳＷ６２０  ＳＭＯ  ｓｈＲＮＡにおいてＳＭＯマウス抗体結合能確認
１．ＳＷ６２０  ｃｏｎ  ｓｈＲＮＡ（Ｃｏｎ  ｓｈＲＮＡ）作製及び培養
ｃｏｎ  ｓｈＲＮＡ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ｓａｎｔａｃｒｕｚ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてＳＷ６２０細胞に感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させた後、１００ｍｍ皿に１０００個接種した後、１週間以上培養した。このとき、ｓｈＲＮＡｓ発現が安定となった細胞は、ピューロマイシン二塩酸塩（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いてコロニー選択（ｃｏｌｏｎｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）によってＳＭＯ  ｓｈＲＮＡ安定細胞（ｓｔａｂｅｌ  ｃｅｌｌ）を得た後、ウェスタンブロッティングで確認した。
【０１４９】
本実験例では２４時間培養した。
【０１５０】
２．ＳＷ６２０  ＳＭＯ  ｓｈＲＮＡ作製（ＳＭＯ  ｓｈＲＮＡ）及び培養
ＳＭＯ  ｓｈＲＮＡ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ｓａｎｔａｃｒｕｚ，ＬＳ−４０１６１−Ｖ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてＳＷ６２０細胞に感染させた後、１００ｍｍ皿に１０００個接種した後、１週間以上培養した。このとき、ｓｈＲＮＡｓ発現が安定となった細胞は、ピューロマイシン二塩酸塩を用いてコロニー選択によってＳＭＯ  ｓｈＲＮＡ安定細胞を得た後、ウェスタンブロッティングで確認し、ノックダウンしたコロニーを選択して使用した。
【０１５１】
本実験例では２４時間培養した。
【０１５２】
３．流細胞分析
前記細胞の培養が完了すると（２４時間）、数分間０．０５％トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）で細胞を分離し、それを集めてＰＢＳで２回洗浄した。洗浄した細胞は、３．７％ホルムアルデヒドで固定した後、１次抗体であるＳＭＯマウス抗体及びＡｂｃａｍ  ＳＭＯ抗体（陽性対照群）を入れ、４℃で一晩（Ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔ）静置させた。その後、ＰＢＳで３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ−５９４が結合した２次抗体を付けて染色した後、流細胞分析機（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した。
【０１５３】
４．結論
図１０Ａは、ＳＷ６２０  ｃｏｎ  ｓｈＲＮＡ及びＳＷ６２０  ＳＭＯ  ｓｈＲＮＡ細胞に対するウェスタンブロット結果であり、図１０Ｂは、ＳＷ６２０  ｃｏｎ  ｓｈＲＮＡ及びＳＷ６２０  ＳＭＯ  ｓｈＲＮＡ細胞において製造例１（２１番抗体）と製造例２（２８３番抗体）の結合能を確認するために、流細胞分析で測定した結果グラフ（Ｂ）であり、図１０Ｃは、図１０Ｂの流細胞分析機によって測定されたＨＣＴ１１６細胞における平均蛍光強度を示すものである。
【０１５４】
ＳＭＯが発現する大腸癌細胞株ＳＷ６２０にｓｈＲＮＡを処理し、ＳＭＯの発現を減少させた細胞を製造し、ここに製造例１及び２の抗体を処理することによって、本発明のＳＭＯ抗体が細胞内でＳＭＯタンパク質と結合を形成するかを確認しようとした。図１０に示すように、ＳＭＯタンパク質の発現が減少されたＳＭＯ  ｓｈＲＮＡ細胞に、２１番抗体（製造例１）、２８３番抗体（製造例２）を処理する場合、抗体とＳＭＯタンパク質の結合が確認されなかっが、Ｃｏｎ  ｓｈＲＮＡでは抗体とＳＭＯタンパク質結合が増加したことが確認されたところ、本発明のＳＭＯ抗体はいずれもＳＭＯタンパク質に対して特異的結合能を有することを検証した。
【０１５５】
＜実施例７＞大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６においてＢＯＤＩＰＹ−シクロパミン（ＢＯＤＩＰＹ−ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ）を用いた競合的ＳＭＯ結合能確認
１．ＨＣＴ１１６大腸癌細胞株培養
ＨＣＴ１１６大腸癌細胞株は、韓国細胞株銀行から購入した。３回継代培養した後、ＨＣＴ１１６大腸癌細胞株を１×１０５／ｃｍ２の細胞濃度で６０ｍｍサイズの培養容器（Ｆａｌｃｏｎ）に培養し、３日ごとに培養液の半分を入れ換えた。この時、９６ウェル培養容器（Ｆａｌｃｏｎ）を使用した。培養液は、ＲＰＭＩ１６４０にペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を添加し、１０％のウシ胎児血清を添加し、５％  ＣＯ２、加湿状態の細胞培養器（Ｆｏｒｍａ，ＵＳＡ）で培養した。本実験例では２４時間培養した。
【０１５６】
２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上でＢｏｄｉｐｙ−シクロパミン（ＢＣ）と本発明のＳＭＯ抗体の競合
実験はＲｏｕｄａｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７９：４５３−４６０，２０１１で述べたプロトコルに従って実施した。具体的に、細胞は、２時間ＢＣ（１０ｎＭ）の存在又は不在下で、本発明のＳＭＯ抗体（製造例１又は製造例２）と共に２４時間培養した。培養を終了し、３．７％ホルムアルデヒドで細胞を固定した後、細胞核を青色で可視化（ｖｉｓｕａｌｉｚｅ）可能にするＤＡＰＩで染色した（ｓｔａｉｎｅｄ）。その後、マウンティング過程で固定させ、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で活性酸素の発生を確認した。
【０１５７】
本発明のＳＭＯ抗体（製造例１又は製造例２）によるＢｏｄｉｐｙ−シクロパミン（ＢＣ）の結合抑制は、蛍光写真（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｅｄ）の減少で測定し、ＰＣＩ  ６．２ソフトウェア（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて量を示し、その後、写真から、細胞核の存在する表面面積を調べた。
【０１５８】
３．結論
図１１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上でＳＭＯ抗体の競合的結合能を分析するために、Ｂｏｄｉｐｙ−シクロパミン（ＢＣ）と本発明のＳＭＯ抗体を同時に処理した後、共焦点顕微鏡で撮影した写真である。
【０１５９】
大腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６）においてＳＭＯタンパク質に結合するＢＯＤＩＰＹ−シクロパミン（緑色）を、本発明の２１番抗体（製造例１）、２８３番抗体（製造例２）と同時に処理し、本発明のＳＭＯ抗体がＯＤＩＰＹ−シクロパミン（緑色）の結合と競合できる否かを分析した。
【０１６０】
図１１に示すように、本発明のＳＭＯ抗体が処理されていないＨＣＴ１１６細胞にＢＯＤＩＰＹ−シクロパミンが単独で処理される場合、ＢＯＤＩＰＹ−シクロパミンは、細胞のＳＭＯタンパク質によくバインディングして緑色が増加していることを確認した。これに対し、前記ＢＯＤＩＰＹ−シクロパミンが２１番抗体又は２８３番抗体と同時に細胞に処理される場合には、本発明のＳＭＯ抗体（製造例１又は製造例２）によるＢｏｄｉｐｙ−シクロパミン（ＢＣ）の結合が抑制（緑色蛍光程度が低くなる）されることを確認した。すなわち、本発明の２１番抗体、２８３番抗体は、細胞内でＳＭＯタンパク質に対する強力な親和性を有することが分かった。
【０１６１】
＜実施例８＞ＳＭＯマウス抗体のＧＬＩ抑制能確認
１．ＮＩＨ３Ｔ３−ＧＬＩ細胞株培養
Ｇｌｉレポーター−ＮＩＨ３Ｔ３細胞株は、ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＡ，ＵＳＡ）から購入して使用した。
【０１６２】
２．ＮＩＨ３Ｔ３−ＧＬＩレポーターアッセイ
ＧＬＩ転写活性を持つＮＩＨ３Ｔ３−ＧＬＩ細胞を９６ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２細胞濃度で分注した後、２４時間経過後に、ソニックヘッジホッグペプチド（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を３０分間処理した。次いで、前記細胞に２１番抗体又は２８３番抗体を２４時間処理した後、レポーターアッセイキット（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）によりＧＬＩ１レポーター活性（％）測定した。この時、陽性対照群として、本発明のＳＭＯ抗体の代わりにＳＭＯ低分子抑制剤であるビスモデギブ（Ｖｉｓｍｏｄｉｇｉｂ）又はエリスモデギブ（Ｅｒｉｓｍｏｄｅｇｉｂ）を用いた以外は同一にして製造及び測定した。
【０１６３】
３．結論
図１２は、ＮＩＨ３Ｔ３−ＧＬＩ細胞においてＧｉｌ１レポーター活性（％）を分析して示すグラフである。具体的に、ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）信号伝達において、ＧＬＩは下位信号伝達要素であり、前記ＧＬＩの転写調節能力を確認するために、互いに異なる物質が処理されたＮＩＨ３Ｔ３−ＧＬＩ細胞からＧｉｌ１レポーター活性を分析した。その結果、ビスモデギブ又はエリスモデギブを処理した陽性対照群に比べて、本発明の抗体（２１番抗体、２８３番抗体）を使用したものが、ＧＬＩの転写活性を顕著に抑制させていることが分かる。これは、数値的に陰性対照群（ＩｇＧ）に比べて２倍以上低く、従来ＳＭＯ低分子抑制剤に比べて１．５倍低い又は類似するレベルであることを確認した。
【０１６４】
本発明のＳＭＯ抗体が、ＳＨＨによって誘導されたＧＬＩ転写活性を効果的に抑制していることを確認し、このことから、ＳＭＯ発現が増加した細胞株においてＳＭＯ抗体の処理によって細胞成長を抑制できることが分かった。すなわち、本発明のＳＭＯ抗体を用いてカスタマイズ治療が可能であると予測できる。
【０１６５】
＜実施例９＞大腸癌細胞株においてＳＭＯマウス抗体の細胞成長抑制能確認
１．正常大腸細胞と大腸癌細胞株培養
ＣＣＤ−１８Ｃｏ（正常大腸細胞）、ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ１６、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ６２０細胞は、韓国細胞株銀行から購入した。３回継代培養した後、各細胞株を１×１０５／ｃｍ２の細胞濃度で６０ｍｍサイズの培養容器（Ｆａｌｃｏｎ）に培養し、３日ごとに培養液の半分を入れ換えた。この時、９６ウェル培養容器（Ｆａｌｃｏｎ）を使用した。培養液は、ＲＰＭＩ１６４０にペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を添加し、１０％のウシ胎児血清を添加し、５％  ＣＯ２、加湿状態の細胞培養器（Ｆｏｒｍａ，ＵＳＡ）で培養した。本実験例では２４時間培養した。
【０１６６】
２．ＳＷ６２０（ｃｏｎｓｈＲＮＡ）、ＳＷ６２０（ＳＭＯｓｈＲＮＡ）細胞製造及び培養
ＳＷ６２０（ｃｏｎｓｈＲＮＡ）は、次のように製造及び培養した。ｃｏｎ  ｓｈＲＮＡ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ｓａｎｔａｃｒｕｚ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてＳＷ６２０細胞に感染させた後、１００ｍｍ皿に１０００個接種した後、１週間以上培養した。このとき、ｓｈＲＮＡｓ発現が安定となった細胞は、ピューロマイシン二塩酸塩を用いてコロニー選択によってＳＭＯ  ｓｈＲＮＡ安定細胞を得た後、ウェスタンブロッティングで確認した。本実験例では２４時間培養した。
【０１６７】
ＳＷ６２０（ＳＭＯｓｈＲＮＡ）は、次のように製造及び培養した。ＳＭＯ  ｓｈＲＮＡ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ｓａｎｔａｃｒｕｚ，ＬＳ−４０１６１−Ｖ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてＳＷ６２０細胞に感染させた後、１００ｍｍ皿に１０００個接種した後、１週間以上培養した。このとき、ｓｈＲＮＡｓ発現が安定となった細胞は、ピューロマイシン二塩酸塩を用いてコロニー選択によってＳＭＯ  ｓｈＲＮＡ安定細胞を得た後、ウェスタンブロッティングで確認し、ノックダウンしたコロニーを選択して使用した。本実験例では２４時間培養した。
【０１６８】
３．ウェスタンブロット
前記それぞれの細胞株をＰＲＯ−ＰＲＥＰタンパク質抽出溶液（Ｉｎｔｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）に溶解して抽出した後、ＢＣＡ定量（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）して使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を用いてタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）膜に移した後、５％脱脂乳でブロッキングした。その後、ＳＭＯ抗体とβ−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）を４℃で一晩付着し、翌日、ＴＢＳＴで洗浄後に常温で１時間ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）抗体を付けた。ＥＣＬ（Ｂｉｏｎｏｔｅ，Ｈｗａｓｅｏｎｇ，Ｋｏｒｅａ）検出試薬を用いてタンパク質発現程度を確認した。
【０１６９】
４．ＷＳＴ−１分析法
前記大腸癌細胞と正常細胞を９６ウェルに分注した後、２４時間経過後に、製造例１の２１番抗体、製造例２の２８３番抗体をそれぞれ濃度別（０、１０ｕｇ／ｍｌ）に投与した。２４時間経過後に、ＷＳＴ−１溶液を使用し、４時間反応させ、４５０ｎｍで吸光度を測定し、細胞生存力（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を確認した。
【０１７０】
５．結論
図１３は、正常細胞と大腸癌細胞に、製造例１の２１番抗体又は製造例２の２８３番抗体を処理したとき、ＳＭＯ発現量を測定したウェスタンブロット（Ａ）、及び細胞生存力（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）をＷＳＴ−１分析で測定して示すグラフ（Ｂ）である。
【０１７１】
図１３に示すように、本発明のＳＭＯ抗体存在の有無に関係なく、正常大腸細胞ＣＣＤ−１８Ｃｏの細胞成長は変化が殆どなかった。これに対し、ＳＭＯタンパク質が発現するＨＣＴ１１６、ＳＷ６２０  ｃｏｎ  ｓｈＲＮＡ細胞では、２１番抗体、２８３番抗体を処理したとき、細胞成長が抑制されたことを確認した。すなわち、ＳＭＯタンパク質の発現が相対的に低いＤＬＤ−１、ＳＷ６２０  ＳＭＯ  ｓｈＲＮＡ細胞では、ＳＭＯ抗体存在の有無によって、細胞成長の変化があまり観察されなかった。すなわち、本発明のＳＭＯ抗体は、大腸癌細胞に対して特異的細胞成長抑制能を有していることが分かる。
【０１７２】
図１４は、大腸癌細胞に、製造例３の３２４番抗体、製造例４の４０１番抗体又は製造例５の４０８番抗体を処理したとき、細胞生存力（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）をＷＳＴ−１分析で測定して示すグラフである。これによれば、大腸癌細胞株ＨＣＴ１６、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ６２０細胞に、製造例３〜５のＳＭＯ抗体を添加する場合、細胞成長が抑制されていることを確認した。具体的に、製造例３のＳＭＯ抗体に比べて製造例４又は５のＳＭＯ抗体が顕著な細胞成長抑制効果を示していることを検証した。
【０１７３】
＜実施例１０＞大腸癌細胞株において３次元培養を用いたＳＭＯマウス抗体の細胞成長抑制能確認
１．３次元培養を用いるＳＭＯ抗体の役割分析
Ｃｏｌｏ２０５、ＨＣＴ１１６及びＳＷ６２０大腸癌細胞をそれぞれ９６ウェル３次元培養（３Ｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）専用プレート（ｐｌａｔｅ）に１×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２分注した後に７２時間培養し、それぞれに、実施例１〜５から選択されるいずれか一つのＳＭＯ抗体１０ｕｇ／ｍｌを処理した。３〜４日培養した後、ＷＳＴ−１溶液を入れ、４時間反応した後、４５０ｎｍで吸光度を測定し、細胞生存力（ｓｕｒｖｉｖａｌ（％））を分析した。
【０１７４】
２．結論
図１５は、ＨＣＴ１１６細胞に、製造例１〜５のＳＭＯ抗体をそれぞれ処理し、その細胞成長抑制能を３次元培養システム（３Ｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ）で確認した写真であり、図１６は、異なる大腸癌細胞のそれぞれに、製造例１〜５のＳＭＯ抗体をそれぞれ処理し、その細胞成長抑制能をＷＳＴ−１アッセイ分析で確認したグラフである。
【０１７５】
図１５及び図１６に示すように、３次元培養システム（３Ｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ６２０細胞に対する製造例１〜５から製造されたＳＭＯ抗体の細胞成長抑制効果を確認した。具体的に、製造例１〜５から製造されたＳＭＯ抗体を、それぞれの大腸癌細胞に処理したとき、細胞群から出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）が形成され、細胞の外側から形状が崩れることを確認した。これに対し、対照群（ＩｇＧ）の場合、原形の細胞形状を保持していることが分かる。すなわち、本発明のＳＭＯ抗体を癌細胞に処理する場合、正常細胞に対しては影響を及ぼさず、癌細胞に対してのみ優れた細胞成長抑制効果を示していることを確認した。
【０１７６】
＜実施例１１＞本発明のＳＭＯ抗体による大腸癌細胞における細胞死タンパク質発現様相分析
１．大腸癌細胞株培養
ＨＣＴ１１６大腸癌細胞株は、韓国細胞株銀行から購入した。前記細胞を３回継代培養した後、前記大腸癌細胞株を１×１０５／ｃｍ２の細胞濃度で６０ｍｍサイズの培養容器（Ｆａｌｃｏｎ）に培養し、３日ごとに培養液の半分を入れ換えた。細胞毒性検査のためには９６ウェル培養容器（Ｆａｌｃｏｎ）を使用した。培養液は、ＲＰＭＩ１６４０にペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を添加し、１０％のウシ胎児血清を添加し、５％  ＣＯ２、加湿状態の細胞培養器（Ｆｏｒｍａ，ＵＳＡ）で培養した。
【０１７７】
２．ウェスタンブロット
ＳＭＯ抗体の添加によって、癌細胞の死滅が増加するかを確認しようとした。そのために、細胞死と関連するマーカータンパク質であるＰＡＲＰ、ｃａｓｐａｓｅ９の切断形（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｆｏｒｍ）を分析しようとした。
【０１７８】
まず、前記２４時間培養が完了した大腸癌細胞株のそれぞれに、製造例１又は製造例２のＳＭＯ抗体を様々な濃度（０、５、１０、２０μｇ）で処理した。２４時間経過後に、細胞をそれぞれ収穫し、溶解（ｌｙｓｉｓ）を用いてタンパク質を抽出した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分離し、ＰＶＤＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）膜に移した後、５％脱脂乳でブロッキングした。その後、ｃ−ＰＡＲＰ（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ｃ−ｃａｓｐａｓｅ９抗体（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ＭＡ，ＵＳＡ）とβ−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）を４℃で一晩付着し、翌日、ＴＢＳＴで洗浄後に常温で１時間ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）抗体を付けた。ＥＣＬ（Ｂｉｏｎｏｔｅ，Ｈｗａｓｅｏｎｇ，Ｋｏｒｅａ）検出試薬を用いてタンパク質発現程度を確認した。
【０１７９】
３．結論
図１７は、細胞死と関連するＰＡＲＰ、ｃａｓｐａｓｅ９の切断形（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｆｏｒｍ）の発現量を分析するための、様々な濃度のＳＭＯ抗体で処理されたＨＣＴ１１６大腸癌細胞株のウェスタンブロット結果であり、これによれば、２１番抗体と２８３番抗体が処理された大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６において、ＳＭＯ抗体の濃度が増加するにつれて細胞死タンパク質の発現量も増加することを確認した。すなわち、本発明のＳＭＯ抗体は、癌細胞の死滅も誘導することが分かる。
【０１８０】
＜実施例１２＞オキサリプラチン、セツキシマブに耐性を有する大腸癌細胞株に対する製造例１のＳＭＯ抗体の抗癌効果分析
１．オキサリプラチン、セツキシマブに耐性を有する大腸癌細胞株培養
オキサリプラチン耐性大腸癌細胞株（ＤＬＤ−１Ｒ  ｏｘａ）及びセツキシマブ耐性大腸癌細胞（ＳＷ４８Ｒ  ｃｅｔ）は、各抗癌剤を低い濃度から高い濃度まで処理して耐性細胞株を獲得して培養した。
【０１８１】
２．抗癌効果分析（ＷＳＴ−１アッセイ）
前記オキサリプラチン、セツキシマブに対して耐性を有する大腸癌細胞株を９６ウェルに分注した後、２４時間培養し、様々な濃度（０，１０ｕｇ／ｍｌ）で製造例１のＳＭＯ抗体（２１番抗体）を処理した。２４時間経過後に、前記それぞれの細胞にＷＳＴ−１溶液を入れ、４時間反応後に４５０ｎｍで吸光度を測定し、細胞生存力を確認した。
【０１８２】
３．結論
図１８は、様々な濃度の製造例１によるＳＭＯ抗体を、オキサリプラチン、セツキシマブに対して耐性を有する大腸癌細胞株（ＤＬＤ−１Ｒ  ｏｘａ、ＳＷ４８Ｒ  ｃｅｔ）に処理したとき、細胞成長抑制能をＷＳＴ−１アッセイ分析で確認したグラフであり、これによれば、本発明の２１番抗体を処理したとき、オキサリプラチン、セツキシマブに対して耐性を有する大腸癌細胞株の生存力が、４０〜６０％に大きく低下することを確認した。
【０１８３】
すなわち、本発明のＳＭＯ抗体は、既存抗癌剤に耐性を有する癌細胞に対しても優れた抗癌効果を有するとが分かる。
【０１８４】
＜実施例１３＞大腸癌細胞株ＨＣ１１６−Ｌｕｃを用いた異種移植動物モデル（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ）における腫瘍抑制能分析。
【０１８５】
１．異種移植動物モデル
実験動物は、６週齢ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ雌マウスを用いて行った。前記マウスに、１×１０６個のＨＣＴ１１６−Ｌｕｃ細胞を皮下脂肪に注射（ｎ＝６）して異種移植腫瘍動物モデルを作製し、１週後、腫瘍の大きさが２５０〜３００ｍｍ３になった時に実験を行った。
【０１８６】
２．実験方法
まず、異種移植動物モデルの腫瘍の大きさが２５０〜３００ｍｍ３となった時、腫瘍組織に製造例１のＳＭＯ抗体を、０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇを直接注入した。これは、１日に１回ずつ、６日間投与し、３日ごと腫瘍の大きさを測定した。約１ヶ月後にルシフェラ−ゼ活性（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）をｉｎ  ｖｉｖｏイメージング装備で測定し、各動物モデルを犠牲させて腫瘍組織を摘出した。
【０１８７】
３．結論
図１９Ａは、製造例１のＳＭＯ抗体を０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ投与した異種移植動物モデルを蛍光顕微鏡で撮影した写真であり、図１９Ｂは、製造例１のＳＭＯ抗体を０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ投与した異種移植動物モデルを光学顕微鏡で撮影した写真であり、図１９Ｃは、製造例１のＳＭＯ抗体を０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ投与し、約１ヶ月後に異種移植動物モデルから摘出された腫瘍組織を撮影した写真であり、図１９Ｄは、時間による各異種移植動物モデルにおける腫瘍の大きさを測定して示すグラフである。
【０１８８】
図１９に示すように、製造例１のＳＭＯ抗体を１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ投与した異種移植動物モデルの場合、腫瘍の大きさが対照群に比べて半分以下に抑制されたことが確認できる。すなわち、本発明のＳＭＯ抗体は、実質的に腫瘍に対して成長及び転移抑制効果があることを確認した。
【０１８９】
＜実施例１４＞ヒト化ＳＭＯ抗体のＧＬＩ抑制能確認
１．ＮＩＨ３Ｔ３−ＧＬＩ細胞株培養
ＧＬＩレポーター−ＮＩＨ３Ｔ３細胞株は、ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＡ，ＵＳＡ）から購入して使用した。
【０１９０】
２．ＮＩＨ３Ｔ３−ＧＬＩレポーターアッセイ
ＧＬＩ転写活性を持つＮＩＨ３Ｔ３−ＧＬＩ細胞を、９６ウェルプレートに１．５×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２細胞濃度で分注した後、ソニックヘッジホッグペプチド（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を２％  ＢＣＳに処理した。１５時間後、ヒト化ＳＭＯ抗体５、７、１５、１６、１７番抗体（製造例６〜１０）をそれぞれ１０、２０ｕｇ／ｍｌで、６時間処理した後、レポーターアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）によってＧＬＩレポーター活性（％）を測定した。このとき、陽性対照群として本発明のＳＭＯ抗体の代わりに、ＳＭＯ低分子抑制剤であるビスモデギブ又はエリスモデギブを使用した以外は同一にして製造及び測定した。
【０１９１】
３．結論
図２０は、ＮＩＨ３Ｔ３−ＧＬＩ細胞においてヒト化ＳＭＯ抗体のＧＬＩレポーター活性（％）を分析して示すグラフである。図２０では、ヒト化ＳＭＯ抗体の番号及び濃度を表記しており、例えば、‘ＳＭＯ  ５−１０’は、ヒト化ＳＭＯ  ５番抗体を１０ｕｇ／ｍｌ処理したものを示す。
【０１９２】
具体的に、ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）信号伝達において、ＧＬＩは下位信号伝達要素であり、前記ＧＬＩの転写調節能力を確認するために、異なる物質が処理されたＮＩＨ３Ｔ３−ＧＬＩ細胞からＧＬＩレポーター活性を分析した。その結果、ビスモデギブ又はエリスモデギブを処理した陽性対照群ほどではないが、本発明のヒト化ＳＭＯ抗体５番を除けば、ヒト化ＳＭＯ  ７、１５、１６、１７番抗体を用いたものが、ＧＬＩの転写活性を顕著に抑制させていることが分かる。これは、数値的にキメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体及びマウス（ｍｏｕｓｅ）抗体に類似するレベルであることを確認した。このとき、マウス抗体は、製造例６でヒト化抗体に変換する前のハイブリドーマ細胞から回収したマウス抗体を用いた。
【０１９３】
本発明のヒト化ＳＭＯ抗体（ＳＭＯ  ５、７、１５、１６、１７番抗体）が、ＳＨＨによって誘導されたＧＬＩ転写活性を効果的に抑制していることを確認し、このことから、ヒト化ＳＭＯ発現が増加した細胞株においてヒト化ＳＭＯ  ５、７、１５、１６、１７番抗体を処理することによって、細胞成長を抑制できることが分かる、すなわち、本発明のヒト化ＳＭＯ  ５、７、１５、１６、１７番抗体を用いてカスタマイズ治療が可能である。
【０１９４】
＜実施例１５＞ヘッジホッグが過発現する細胞株においてヒト化ＳＭＯ抗体によるＧＬＩ１抑制
１．ＨＣＴ１１６細胞株培養及び抗体処理
ＨＣＴ１１６細胞株は、韓国細胞株銀行から購入して使用した。１００Ｖパイプレートに５×１０５ｃｅｌｌ／ｃｍ２細胞濃度で分注した後、２４時間後、ヒト化ＳＭＯ  ５、７、１５、１６及び１７番抗体をそれぞれ１０、２０ｕｇ／ｍｌ濃度で、無血清培地（ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉａ）で処理した。
【０１９５】
２．タンパク質の分離
細胞をプロテアーゼが添加された溶解緩衝液（７Ｍウレア、２Ｍチオウレア、４％  ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＤＴＴ）中で機械的な組織粉砕（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）と超音波分解（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を併用して破砕した後、４℃で２０分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄液中のタンパク質は、ＢＣＡ（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）アッセイを用いてナノドロップ（ｎａｎｏ  ｄｒｏｐ）で測定して定量した。
【０１９６】
３．ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）
採取した組織から分離されたタンパク質３０μｇで電気泳動を行い、ＰＶＤＦ膜に移した後、抗ＧＬＩ１抗体（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ＭＡ，ＵＳＡ）、抗ＳＭＯ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）、抗β−アクチン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）を１次抗体として用い、ＨＲＰ結合抗ウサギ抗体を２次抗体として用いて標識し、化学発光染色方法によって確認した。ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）法でそれぞれのＧＬＩ１、各ＳＭＯタンパク質発現量を測定した。
【０１９７】
４．結論
図２１は、ＨＣＴ１１６細胞株をウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で分析した結果であり、これによれば、ヒト化ＳＭＯ  ７、１５、１６、１７番抗体を処理したとき、ＧＬＩ１、ＳＭＯタンパク質発現量が減少することを確認した。
【０１９８】
＜実施例１６＞大腸癌細胞株においてヒト化ＳＭＯ抗体による細胞増殖測定
１．ＷＳＴ−１分析法
前記大腸癌細胞と正常細胞を９６ウェルに分注し、２４時間経過後に、ヒト化ＳＭＯ  ７、１５、１６、１７番抗体をそれぞれ濃度別（０、１０、２０ｕｇ／ｍｌ）に投与した。２４時間経過後に、ＷＳＴ−１溶液を用いて４時間反応させ、５００ｎｍで吸光度を測定し、細胞生存力（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を確認した。
【０１９９】
２．結論
図２２は、正常細胞と大腸癌細胞にヒト化ＳＭＯ  ７番（ａ）、１５番（ｂ）、１６番（ｃ）、１７番（ｄ）抗体をそれぞれ処理したとき、細胞増殖力（ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）をＷＳＴ−１分析で測定して示すグラフである。
【０２００】
これによれば、ヒト化ＳＭＯ抗体存在の有無に関係なく、正常大腸細胞（ＣＣＤ−１８Ｃｏ）、大腸癌細胞（ＤＬＤ−１，ＨＣＴ１１６）における細胞成長は、殆ど変化がなかった。すなわち、本発明のヒト化ＳＭＯ抗体は、大腸癌細胞において細胞増殖に影響を及ぼさないことが分かった。
【０２０１】
＜実施例１７＞ＨＣＴ１１６細胞株においてヒト化ＳＭＯ抗体による細胞移動力（Ｍｏｔｉｌｉｔｙ）測定
１．トランスウェル遊走アッセイ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
ＨＣＴ１１６細胞株をトランスウェルに分注した後、ヒト化ＳＭＯ  ７、１５、１６、１７番抗体をそれぞれ（１０ｕｇ／ｍｌ）投与した。４８時間経過後に、Ｄｉｆｆ  Ｑｉｃｋ  ｋｉｔを用いて細胞移動力（ｃｅｌｌ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を確認した。
【０２０２】
２．結論
図２３Ａは、ＨＣＴ１１６細胞株にヒト化ＳＭＯ  ７、１５、１６、１７番抗体をそれぞれ処理したとき、細胞移動力（ｃｅｌｌ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を測定して示すグラフであり、図２３Ｂは、ＨＣＴ１１６細胞株にヒト化ＳＭＯ  ７、１５、１６、１７番抗体をそれぞれ処理したとき、細胞移動力（ｃｅｌｌ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を測定するために細胞を固定して染色した後、光学顕微鏡で撮影した写真である。これによれば、ビスモデギブ又はエリスモデギブを処理した陽性対照群に比べて、本発明の抗体（１６、１７番）を使用したものが、細胞移動力を顕著に抑制させていることが分かる。すなわち、この結果は、ヒト化ＳＭＯ  ７、１５、１６、１７番抗体によって細胞のＧＬＩ１とＳＭＯタンパク質発現を抑制し、これによって、細胞移動力を減少させることが分かる。このことから、本発明に係るヒト化ＳＭＯ抗体が癌転移を効果的に抑制できることが分かる。
【０２０３】
特に、ヒト化ＳＭＯ抗体のうち、ヒト化ＳＭＯ  １６、１７番抗体が、抑制されたＧＬＩ１によって細胞移動力を減少させる活性が最も高いことを確認し、癌転移抑制活性に最も優れていることが確認ができた。
【０２０４】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい具現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されるない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とその等価物によって定義されるべきであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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