(57)【要約】本開示は、遺伝子改変齧歯類動物およびヒト疾患の齧歯類モデルに関する。より具体的には、本開示は、そのゲノムがヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子（ＩＬ−３６Ｒタンパク質のＩＬ１ｒｌ２サブユニットをコードする）、ならびにヒトＩＬ−３６、およびリガンド遺伝子に関する。本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類は、それぞれ乾癬およびＩＢＤの前臨床モデルとして皮膚および腸の炎症における増強を呈し、ヒトＤＩＴＲＡ疾患の齧歯類モデルとして役立つ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変齧歯類であって、そのゲノムが、
（１）内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子であって、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含むヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードする、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子と、
（２）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ６座位のヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子と、
（３）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ８座位のヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子と、
（４）内因性齧歯類ＩＬ１Ｆ９座位のヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子と、を含む、遺伝子改変齧歯類。
【請求項２】
前記ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質が、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通型細胞質配列と実質的に同一な膜貫通型細胞質配列を含む、請求項１に記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項３】
前記ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質が、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質のシグナルペプチドと実質的に同一なシグナルペプチドを含む、請求項１または２に記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項４】
前記ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質が、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項５】
前記ヒトＩｌ１ｒｌ２タンパク質の外部ドメインが、配列番号７に記載されるアミノ酸２２〜３３７を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項６】
前記ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質が、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項７】
前記ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子が、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位で前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２プロモーターに動作可能に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項８】
前記ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子が、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位の前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム断片を、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列と置換することから生じる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項９】
前記ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列が、前記ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の前記外部ドメインを実質的にコードする前記ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のゲノム断片である、請求項８に記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項１０】
前記ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子の前記ゲノム断片が、前記ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のエクソン３〜８を含む、請求項９に記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項１１】
前記置換後に残っている前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子の前記ゲノム配列が、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン８の下流にある前記エクソンを含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項１２】
前記置換後に残っている前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子の前記ゲノム配列が、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン１〜２を含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項１３】
前記ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子が、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン１〜２、前記ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のエクソン３〜８、および前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン８の下流の残っているエクソンを含む、請求項８に記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項１４】
前記ヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子が、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ６座位で前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ６遺伝子を置換する、請求項１〜１３のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項１５】
前記ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子が、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ８座位で前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ８遺伝子を置換する、請求項１〜１４のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項１６】
前記ヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子が、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ９座位で前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ９遺伝子を置換する、請求項１〜１５のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項１７】
前記齧歯類が、前記ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子、ヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子、ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子およびヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子の各々に対してホモ接合性である、請求項１〜１６のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項１８】
前記齧歯類が、野生型齧歯類と比較して短縮した結腸を呈する、請求項２０に記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項１９】
前記齧歯類が、マウスまたはラットである、請求項１〜１８のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類。
【請求項２０】
遺伝子改変齧歯類を作製する方法であって、
齧歯類ゲノムを、
（１）内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子であって、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含むヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードする、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子と、
（２）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ６座位のヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子と、
（３）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ８座位のヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子と、
（４）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ９座位のヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子と、を含むように改変すること、および
前記改変ゲノムを含む齧歯類を作製すること、を含む、方法。
【請求項２１】
前記齧歯類ゲノムが、
（ｉ）前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位で前記ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を含む第一の齧歯類を作製することと、
（ｉｉ）前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ６座位に前記ヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ８座位に前記ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子、および前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ９座位に前記ヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子を含む、第二の齧歯類を作製することと、
（ｉｉｉ）前記第一の齧歯類を前記第二の齧歯類と交配させて前記改変齧歯類ゲノムを得ることと、を含むプロセスによって改変される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位に前記ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を含む前記齧歯類が、
齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞を提供することと、
ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列を前記齧歯類ＥＳ細胞の前記齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位に挿入して、前記齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位に前記ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を形成し、それによって前記ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を含む齧歯類ＥＳ細胞を得ることと、
前記ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を含む前記齧歯類ＥＳ細胞を使用して齧歯類を作製することと、により作製される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列が、前記齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位で前記齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム断片を置換する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列が、前記ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の前記外部ドメインを実質的にコードする前記ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のゲノム断片である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子の前記ゲノム断片が、前記ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のエクソン３〜８を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記置換後に残っている前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子の前記ゲノム配列が、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン８の下流の前記エクソンを含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記置換後に残っている前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子の前記ゲノム配列が、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン１〜２を含む、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子が、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン１〜２、前記ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のエクソン３〜８、および前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン８の下流の前記残っているエクソンを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子、前記ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子、および前記ヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子を含む前記第二の齧歯類が、
齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞を提供することと、
（ｉ）前記ヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子を前記齧歯類ＥＳ細胞の前記齧歯類Ｉｌ１ｆ６座位に、
（ｉｉ）前記ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子を前記齧歯類ＥＳ細胞の前記齧歯類Ｉｌ１ｆ８座位に、および
（ｉｉｉ）前記ヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子を前記齧歯類ＥＳ細胞の前記齧歯類Ｉｌ１ｆ９座位に挿入することと、
それによって、前記ヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子、前記ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子、および前記ヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子を含む齧歯類ＥＳ細胞を得ることと、
前記ヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子、前記ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子、および前記ヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子を含む前記齧歯類ＥＳ細胞を使用して前記第二の齧歯類を作製することと、によって作製される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子、前記ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子、および前記ヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子が、連続核酸分子で提供される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子が、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ６座位で前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ６遺伝子を置換する、請求項２０〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子が、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ８座位で前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ８遺伝子を置換する、請求項２０〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記ヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子が、前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ９座位で前記内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ９遺伝子を置換する、請求項２０〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の齧歯類の、単離された細胞または組織。
【請求項３５】
齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞であって、
（１）内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子であって、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含むヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードする、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子と、
（２）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ６座位のヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子と、
（３）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ８座位のヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子と、
（４）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ９座位のヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子と、を含む、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞。
【請求項３６】
齧歯類を作製することにおける、請求項３５に記載の齧歯類ＥＳ細胞の使用。
【請求項３７】
脱制御ＩＬ−３６シグナル伝達に関連する疾患の齧歯類モデルとしての、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の齧歯類の使用。
【請求項３８】
脱制御ＩＬ−３６シグナル伝達に関連する疾患を治療するための候補化合物の治療有効性を評価する方法であって、
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の齧歯類を提供すること、
前記齧歯類に薬剤を投与して炎症を誘発すること、
候補化合物を前記齧歯類に投与すること、および
前記候補化合物が誘発された炎症を阻害するかどうかを判定すること、を含む、方法。
【請求項３９】
前記薬剤がＤＳＳまたはオキサゾロンであり、腸炎症が前記齧歯類で誘発される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記薬剤がＩＭＱであり、皮膚炎症が前記齧歯類で誘発される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記候補化合物が、前記薬剤の投与前、間、または後に前記齧歯類に投与される、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記候補化合物が、小分子化合物、核酸阻害剤、または抗体である、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記候補化合物が抗体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
標的核酸構築物であって、
相同組み換えを介在し、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列を齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位に組み込んでヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を形成することができる、５’および３’齧歯類ヌクレオチド配列と隣接する、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含むヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードする、標的核酸構築物。
【請求項４５】
標的核酸構築物であって、
ヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子、ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子、およびヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子を含む連続核酸配列を含み、
前記連続核酸配列は、相同組み換えを介在し、前記齧歯類Ｉｌ１ｆ６遺伝子、前記齧歯類Ｉｌ１ｆ８遺伝子、および前記齧歯類Ｉｌ１ｆ９遺伝子を包含する前記齧歯類座位に前記連続核酸配列を組み込むことができる、５’および３’齧歯類ヌクレオチド配列に隣接する、標的核酸構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月１６日出願の米国仮特許出願第６２／６９８，４５９号、および２０１９年６月２７日出願の米国仮特許出願第６２／８６７，４７７号の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、遺伝子改変齧歯類動物およびヒト疾患の齧歯類モデルに関する。より具体的には、本開示は、そのゲノムがヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子（ＩＬ−３６ＲのＩＬ１ｒｌ２サブユニットをコードする）ならびにヒトＩＬ−３６α、β、およびγリガンド遺伝子を含む遺伝子改変齧歯類に関する。本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類は、それぞれ、乾癬および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の前臨床モデルにおいて皮膚および腸の炎症の増強を示し、ヒトＩＬ−３６受容体阻害因子欠損症（ＤＩＴＲＡ）の齧歯類モデルとして役立ち得る。
【０００３】
参照による配列表の援用
２０１９年７月９日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介し米国特許商標庁に提出された、３５９５０＿１０４０４ＵＳ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の６５ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表が、参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００４】
インターロイキン（ＩＬ）−３６サブファミリーは、三つのアゴニスト（ＩＬ−３６α、βおよびγ、以前はそれぞれＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ８およびＩＬ１Ｆ９と称されていた）、ならびに、ヘテロ二量体受容体（ＩＬ−３６Ｒ）を介したシグナルにより、核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼの（ＭＡＰＫ）の活性化をもたらす、一つのアンタゴニスト（ＩＬ３６Ｒａ）からなる。古典的ＩＬ−１ファミリーメンバーと同様に、ＩＬ−３６サイトカインは免疫応答の開始および調節に関与している。ＩＬ−３６ファミリーのメンバーは、扁平上皮組織、特に乾癬性皮膚病変において主に発現することがまず実証された。ＩＬ−３６Ｒと上皮介在性疾患との間の関連性は、ＩＬ−３６Ｒａの機能喪失突然変異に基づいてヒトで確認され、汎発性膿疱性乾癬（「ＧＰＰ」と省略される）の診断につながったが、これは現在、ヒトＩＬ−３６受容体阻害因子欠損症（ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３６Ｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）（「ＤIＴＲＡ」と省略される）と呼ばれるＧＰＰの種であると理解されている。ＧＰＰ、掌蹠膿疱症（ＰＰＰＰ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、リウマチ性および乾癬性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、慢性腎臓病、ならびに魚鱗癬において、ＩＬ−３６発現の増加が報告された。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書において、ヒトＩＬ１ＲＬ２外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを有するＩｌ１ｒｌ２タンパク質をコードするヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子、ならびにヒトＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ８、およびＩＬ１Ｆ９をそれぞれコードするヒトＩｌ１ｆ６、Ｉｌ１ｆ８およびＩｌ１ｆ９遺伝子を含むように遺伝子改変された齧歯類の一部の実施形態が開示される。Ｉｌ１ｒｌ２はヘテロ二量体ＩＬ−３６Ｒタンパク質のサブユニットであり、三つのアゴニスト：ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ８およびＩＬ１Ｆ９（それぞれＩＬ−３６α、βおよびγとしても知られる）に結合する。本明細書に開示される齧歯類は、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を含み、三つのヒトアゴニストリガンド遺伝子を発現する一方、内因性ＩＬ−３６Ｒａアンタゴニストを保持し、内因性ＩＬ−３６Ｒａは、ヒトＩＬ−３６Ｒシグナル伝達の阻害における効力は約２０分の１である。そのような四重ヒト化齧歯類（例えば、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２およびヒトＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ８およびＩＬ１Ｆ９）は、ＩＬ−３６Ｒａの突然変異が強化されたＩＬ−３６Ｒシグナル伝達をもたらすＤＩＴＲＡ患者の症状を示すことが本明細書に示されている。したがって、遺伝子改変齧歯類、かかる齧歯類を作製するための組成物および方法、ならびにかかる齧歯類を、治療薬をスクリーニングおよび開発するためのモデルとして使用する方法が、本明細書に提供される。
【０００６】
一部の実施形態では、本明細書に、そのゲノムが、（１）内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位におけるヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子であって、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含むヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードする、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子；（２）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ６座位におけるヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子；（３）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ８座位におけるヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子；および（４）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ９座位におけるヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子を含む、遺伝子改変齧歯類が開示される。
【０００７】
一部の実施形態では、齧歯類中のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通型細胞質配列と実質的に同一な膜貫通型細胞質配列を含むヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、齧歯類中のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質のシグナルペプチドと実質的に同一なシグナルペプチドを含むヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードする。
【０００８】
一部の実施形態では、齧歯類中のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含むヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードし、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、齧歯類中のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、外部ドメインを含むヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードし、外部ドメインは、配列番号７に記載されるアミノ酸２２〜３３７を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、齧歯類中のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードする。
【００１１】
一部の実施形態では、齧歯類中のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位で内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２プロモーターに動作可能に結合される。
【００１２】
一部の実施形態では、齧歯類中のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位の内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム断片を、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列で置換することによって生じる。
【００１３】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインを実質的にコードするヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のゲノム断片である。一部の実施形態では、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のゲノム断片は、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のエクソン３〜８を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、ヒト化置換後に残存する内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン８の下流のエクソンを含む。一部の実施形態では、ヒト化置換後に残存する内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン１〜２を含む。
【００１５】
特定の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類中のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン１〜２、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のエクソン３〜８、および内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン８の下流の残りのエクソンを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類中のヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ６座位の内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ６遺伝子を置換する。
【００１７】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類中のヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ８座位の内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ８遺伝子を置換する。
【００１８】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類中のヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ９座位の内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ９遺伝子を置換する。
【００１９】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、四つのヒト化遺伝子および／またはヒト遺伝子のうちの一つまたは複数に対してホモ接合性である。一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、四つのヒト化遺伝子および／またはヒト遺伝子のそれぞれに対してホモ接合性である。
【００２０】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、野生型齧歯類と比較して短縮した結腸を呈する。一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、野生型齧歯類と比較して、実験的に誘発された炎症モデルにおいて、炎症の増強を呈する。一部の実施形態では、実験的に誘発された炎症モデルは、イミキモド（ＩＭＱ）によって誘発された皮膚炎症モデルである。一部の実施形態では、実験的に誘発された炎症モデルは、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）またはオキサゾロンによって誘発された腸炎症モデルである。
【００２１】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類はマウスまたはラットである。
【００２２】
さらに、本明細書に記載される齧歯類からの単離された細胞または組織が本明細書に開示される。
【００２３】
一部の実施形態のさらなる態様では、本明細書には遺伝子改変齧歯類を作製する方法が開示され、方法は、齧歯類のゲノムを、（１）内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位におけるヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子であって、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含むヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードする、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子；（２）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ６座位におけるヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子；（３）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ８座位におけるヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子；および（４）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ９座位におけるヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子を含むように改変すること、ならびに改変されたゲノムを含む齧歯類を作製することを含む。
【００２４】
一部の実施形態では、齧歯類ゲノムは、（ｉ）内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位にヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を含む第一の齧歯類を作製すること、（ｉｉ）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ６座位にヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子を、内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ８座位にヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子を、および内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ９座位にヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子を含む第二の齧歯類を作製すること、ならびに（ｉｉｉ）第一の齧歯類を第二の齧歯類とクロスさせて、改変された齧歯類ゲノムを得ることを含むプロセスによって改変される。
【００２５】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位にヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を含む齧歯類は、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞を提供すること、齧歯類ＥＳ細胞の齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位にヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列を挿入して、齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位にヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を形成すること、それによって、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を含む齧歯類ＥＳ細胞を得ること、およびヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を含む齧歯類ＥＳ細胞を使用して齧歯類を作製することによって作製される。
【００２６】
一部の実施形態では、挿入されるヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列は、齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位において齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム断片を置換する。一部の実施形態では、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインを実質的にコードするヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のゲノム断片である。一部の実施形態では、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のゲノム断片は、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のエクソン３〜８を含む。一部の実施形態では、置換後に残存する内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン８の下流のエクソンを含む。一部の実施形態では、ヒト化置換後に残存する内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン１〜２を含む。一部の実施形態では、ヒト化置換の結果として形成されたヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン１〜２、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のエクソン３〜８、および内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン８の下流の残りのエクソンを含む。
【００２７】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子、ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子、およびヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子を含む齧歯類は、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞を提供すること、ヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子を齧歯類ＥＳ細胞の齧歯類Ｉｌ１ｆ６座位に、ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子を齧歯類ＥＳ細胞の齧歯類Ｉｌ１ｆ８座位に、およびヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子を齧歯類ＥＳ細胞の齧歯類Ｉｌ１ｆ９座位に挿入し、それによって、ヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子、ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子、およびヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子を含む齧歯類ＥＳ細胞を得ること、ならびにヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子、ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子、およびヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子を含む齧歯類ＥＳ細胞を使用して齧歯類を作製することによって作製される。
【００２８】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子、ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子、およびヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子が、連続した核酸分子中に提供される。
【００２９】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ６座位の内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ６遺伝子を置換する。
【００３０】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ８座位の内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ８遺伝子を置換する。
【００３１】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ９座位の内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ９遺伝子を置換する。
【００３２】
一部の実施形態の別の態様では、本明細書に、（１）内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位におけるヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子であって、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含むヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードする、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子；（２）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ６座位におけるヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子；（３）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ８座位におけるヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子；および（４）内因性齧歯類Ｉｌ１ｆ９座位におけるヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子を含む、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞が開示される。一部の実施形態では、かかるＥＳ細胞は、本明細書に開示される方法によって作製され得る。一部の実施形態では、齧歯類を作製するためのかかるＥＳ細胞の使用も開示される。
【００３３】
一部の実施形態のさらに別の態様では、齧歯類ゲノム（例えば、齧歯類ＥＳ細胞）を改変して改変齧歯類を作製するのに有用な核酸構築物を標的化することが本明細書に開示される。
【００３４】
一部の実施形態では、本明細書において、相同組み換えならびにヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列を齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位に組み込んでヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を形成することができる５’および３’齧歯類ヌクレオチド配列に隣接した、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列を含む標的核酸構築物が開示され、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子が、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含むヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードする。
【００３５】
一部の実施形態では、本明細書において、ヒトＩＬ１Ｆ６遺伝子、ヒトＩＬ１Ｆ８遺伝子、およびヒトＩＬ１Ｆ９遺伝子を含む連続核酸配列を含む、標的化核酸構築物が開示され、連続核酸配列は、齧歯類Ｉｌ１ｆ６遺伝子、齧歯類Ｉｌ１ｆ８遺伝子、および齧歯類Ｉｌ１ｆ９を包含している齧歯類座位への連続核酸配列の相同組み換えおよび組み込みを媒介することができる５’および３’齧歯類ヌクレオチド配列に隣接している。
【００３６】
一部の実施形態のさらなる態様では、ＩＬ−３６シグナル伝達の脱制御に関連するヒト疾患の齧歯類モデルとして本明細書に開示される齧歯類の使用が本明細書に開示される。本明細書に開示される実施形態の非限定的な例として、齧歯類は、脱制御ＩＬ−３６シグナル伝達（例えば、限定するものではないが、ＤＩＴＲＡなど）に関連するヒト疾患の病態および分子的基盤を研究するために、またはそのような疾患の治療に有用な治療化合物をスクリーニング、試験および開発するために使用することができる。
【００３７】
さらに、一部の実施形態のさらなる態様では、脱制御ＩＬ−３６シグナル伝達に関連する疾患を治療するための候補化合物の治療有効性を評価する方法が本明細書に開示され、本明細書に開示された齧歯類に薬剤を投与して炎症を誘発し、候補化合物を齧歯類に投与し、候補化合物が誘発された炎症を阻害および／または低減させるかどうかを判定することを含む。
【００３８】
一部の実施形態では、炎症を誘発するために投与される薬剤は、ＤＳＳまたはオキサゾロンであり、これは齧歯類において腸炎症を誘発する。一部の実施形態では、炎症を誘発するために投与される薬剤は、ＩＭＱであり、これは齧歯類において皮膚炎症を誘発する。
【００３９】
一部の実施形態では、候補化合物は、炎症を誘発する薬剤の投与前、投与中、または投与後に齧歯類に投与される。一部の実施形態では、候補化合物は、低分子化合物、核酸阻害剤、または抗体などの抗原結合タンパク質とし得る。一部の実施形態では、候補化合物は、ヒトＩＬ−３６Ｒに特異的に結合する抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
本特許のファイルは、カラーで制作された少なくとも一つの図面を含む。カラー図面を含む本特許のコピーは、要請時及び必要料金の支払時に特許商標庁から提供されることになる。
【００４１】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｄは、マウスＩｌ１ｒｌ２のヒト化のための例示的戦略の実施形態を示す。図１Ａは、マウスＩｌ１ｒｌ２およびヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のゲノム構造の、正確な縮尺ではない図を示す。エクソンは、ゲノム配列にわたって配置された細いバーで表される。削除される約２５，３２４ｂｐのマウスゲノム断片と、挿入される約３２，３８９ｂｐのヒトゲノム断片が示される。実施例１に記述されるアッセイにおいて用いられたプローブの位置が示されている。図１Ｂは、正確な縮尺ではないが、底部（配列番号２６〜２８）の接合部配列を伴う、内因性マウスＩｌ１ｒｌ２遺伝子のヒト化のための例示的な改変ＢＡＣベクターを示し、（ｉ）マウスＩｌ１ｒｌ２エクソン３〜８と介在イントロン、および３’１５５ｂｐのマウスイントロン２と５’６４２ｂｐのマウスイントロン８を、ヒトＩＬ１ＲＬ２エクソン３〜８と介在イントロン、ならびに３’３４６ｂｐのヒトイントロン２および５’１１０１ｂｐのヒトイントロン８の置換、および（ｉｉ）イントロン８のヒトゲノム断片の挿入の下流のｌｏｘＰ−ｈＵｂ１−ｅｍ７−Ｎｅｏ−ｐＡ−ｍＰｒｍ１−Ｃｒｅｉ−ｌｏｘＰカセット（４９９６ｂｐ）の挿入を達成させる。図１Ｃは、正確な縮尺ではないが、ネオマイシンカセットが削除された後のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２アレルを、底部の接合部配列（配列番号２６および２９）とともに示す。図１Ｄは、マウスＩｌ１ｒｌ２タンパク質（配列番号４）、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質（配列番号２）、およびヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質（配列番号７）の配列アライメントを記載している。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図１Ｄ】同上。
【００４２】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｄは、マウスＩｌ１ｆ８、Ｉｌ１ｆ９、およびＩｌ１ｆ６をヒトＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、およびＩＬ１Ｆ６で置換するための例示的戦略の実施形態を示す。図２Ａは、正確な縮尺ではないが、マウスＩｌ１ｆ８、Ｉｌ１ｆ９、およびＩｌ１ｆ６遺伝子ならびにヒトＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、およびＩＬ１Ｆ６遺伝子のゲノム構成の図を示す。エクソンは、ゲノム配列にわたって配置された細いバーで表される。削除される約７６，５４８ｂｐのマウスゲノム断片と、挿入される約８８，８６８ｂｐのヒトゲノム断片が示されている。実施例１に記述されるアッセイにおいて用いられたプローブの位置が示されている。図２Ｂは、正確な縮尺ではないが、底部の接合部配列（配列番号３０〜３２）とともに、内因性マウスＩｌ１ｆ８、Ｉｌ１ｆ９、およびＩｌ１ｆ６遺伝子の置換のための例示的改変ＢＡＣベクターを示し、（ｉ）コード配列と非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びにマウスＩｌ１ｆ８、Ｉｌ１ｆ９、およびＩｌ１ｆ６と対応するヒト配列ＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、およびＩＬ１Ｆ６の置換、並びに（ｉｉ）ヒトゲノム断片の挿入下流のｌｏｘＰ−ｈＵｂ１−ｅｍ７−Ｈｙｇｒｏ−ｐＡ−ｍＰｒｍ１−Ｃｒｅｉ−ｌｏｘＰカセット』（５，２１８ｂｐ）の挿入を達成する。図２Ｃは、正確な縮尺ではないが、ネオマイシンカセットが削除された後のヒト化座位を、底部の接合部配列（配列番号３０および３３）とともに示す。図２Ｄは、マウスＩｌ１ｆ６（配列番号１１）およびヒトＩＬ１Ｆ６（配列番号９）タンパク質の配列アラインメント、マウスＩｌ１ｆ８（配列番号１７）およびヒトＩＬ１Ｆ８（配列番号１５）タンパク質の配列アライメント、並びにマウスＩｌ１ｆ９（配列番号２３）およびヒトＩＬ１Ｆ９（配列番号２１）タンパク質の配列アライメントを示す。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【図２Ｄ−１】同上。
【図２Ｄ−２】同上。
【００４３】
【図３Ａ−Ｃ】図３Ａ〜３Ｅは、本発明の実施形態を示し、ヒト化ＤＩＴＲＡ様マウスにおける強化されたＩＭＱ誘発性皮膚炎症を示す。ＤＩＴＲＡ様（本明細書の図では「ＤＩＴＲＡ」とも略される））および野生型（ＷＴ）マウスを、４日間連続で、ＩＭＱの局所適用により処置した。５日目に、次の病理組織学的評価およびｑＲＴ−ＰＣＲのために背部皮膚サンプルを採取した。（３Ａ）ヴァセリン（「Ｖａｓ」、対照）またはＩＭＱ含有クリーム（アルダラ）で４日間連続で局所処置された５日目のＤＩＴＲＡ様マウスおよびＷＴマウスの代表的な皮膚外観である。（３Ｂ）ＤＩＴＲＡ様およびＷＴマウスのヴァセリンおよびＩＭＱで処置された皮膚の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン（「Ｈ＆Ｅ」）染色である。（３Ｃ）ヴァセリンまたはＩＭＱ含有クリームで毎日処置したＤＩＴＲＡおよびＷＴマウスの皮膚における炎症促進性分子のｍＲＮＡ発現である（各群ｎ＝１０）。ＩＭＱを４日間連続局所適用した後、５日目に、その後の病理組織学的評価およびｑＲＴ−ＰＣＲのために、背部皮膚サンプルを、Ｉｌ１ｒｌ２単一ヒト化マウス（「１Ｈ」）、ＤＩＴＲＡ様マウス、および野生型マウスから採取した。各バーの群は、左から右に：ＷＴ  Ｖａｓ、ＤＩＴＲＡ  Ｖａｓ、ＷＴ  ＩＭＱ、およびＤＩＴＲＡ  ＩＭＱである。（３Ｄ）ヴァセリン（対照）またはＩＭＱ含有クリーム（アルダラ）で４日間連続で局所処置された５日目の１Ｈ、ＤＩＴＲＡ様マウスおよびＷＴマウスの代表的な皮膚外観である。（３Ｅ）ヴァセリンまたはＩＭＱ含有クリームで毎日処置した１Ｈ、ＤＩＴＲＡおよびＷＴマウスの皮膚における炎症促進性分子のｍＲＮＡ発現である（各群ｎ＝１０）。各バーの群は、左から右に：ＷＴ  Ｖａｓ、１Ｈ  Ｖａｓ、ＤＩＴＲＡ様Ｖａｓ、ＷＴ  ＩＭＱ、１Ｈ  ＩＭＱ、およびＤＩＴＲＡ様ＩＭＱである。
【図３Ｄ−Ｅ】同上。
【００４４】
【図４】図４Ａ〜４Ｂ。一部の実施形態では、ＤＩＴＲＡ様マウスは、定常状態で短縮した結腸を呈する。（４Ａ）ＤＩＴＲＡ様マウス並びにそれらと共に収容されたＩＬ−３６ＲおよびＷＴ同腹仔の３ヶ月および１０ヶ月の代表的写真である。（４Ｂ）その共に収容されたＩＬ−３６Ｒ  ＫＯおよびＷＴ同腹仔と比較した、３ヶ月齢および１０ヶ月齢のＤＩＴＲＡ様マウスの定量化された大腸長である（各群ｎ＝６）。エラーバーは平均±ＳＤを示す。
【００４５】
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａ〜５Ｅ。一部の実施形態では、ＤＩＴＲＡ様マウスは、ＤＳＳ誘発性慢性大腸炎において粘膜治癒に欠陥を示す。ＤＩＴＲＡ様マウス（ｎ＝１６）およびその共に収容されたＷＴ同腹仔対照（ｎ＝１４）は、２．５％ＤＳＳを７日間、次いで水を１１日間、１．５％ＤＳＳを４日間、水を５日間、合計２７日間の投与により、慢性ＤＳＳ誘発大腸炎に供された。対照マウス（ｎ＝５）に通常の水を投与した。（５Ａ）ＤＩＴＲＡ様マウスおよびそのＷＴ共収容同腹仔対照における体重減少は、元の体重と任意の特定の日の実際の体重とのパーセント差として計算される。（５Ｂ）水およびＤＳＳ処理したＤＩＴＲＡ様マウスおよびＷＴマウスにおける結腸長である。（５Ｃ）水およびＤＳＳ処理したＤＩＴＲＡ様およびＷＴマウスの結腸のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色および病理スコアである。（５Ｄ）水およびＤＳＳ処理したＤＩＴＲＡ様およびＷＴマウスの結腸ホモジネートにおけるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性である。（５Ｅ）水およびＤＳＳ処理したＤＩＴＲＡ様マウスおよびＷＴマウスの結腸ホモジネートにおける炎症促進性サイトカインのレベルである。データは、少なくとも三つの独立した実験の代表である。エラーバーは平均±ＳＤを示す。各バーの群は、左から右に：ＷＴ／水、ＤＩＴＲＡ／水、ＷＴ／ＤＳＳ、およびＤＩＴＲＡ／ＤＳＳである。
【図５Ｄ−Ｅ】同上。
【００４６】
【図６】図６Ａ〜６Ｂ。一部の実施形態では、ＲＥＧＮ抗ヒトＩＬ−３６Ｒ抗体を用いたヒトＩＬ−３６Ｒアンタゴニズムは、予防的投与時にＤＩＴＲＡ様マウスにおけるＩＭＱ誘発性皮膚炎症を改善する。ＤＩＴＲＡ様マウスの背部皮膚を、ＩＭＱ適用開始３日前に剃り、ヴァセリン（対照）またはＩＭＱ含有クリーム（アルダラ）により４日間連続で局所処置した。ＰＢＳ、αｈＩＬ−３６Ｒ  ｍＡｂ、およびｈＩｇＧ４アイソタイプ対照を、−３日目および１日目に１０ｍｇ／ｍＬで皮下注射した（各治療群につきｎ＝９）。（６Ａ）５日目にＤＩＴＲＡ様マウスから単離した背部皮膚のＨ＆Ｅ組織切片および病理スコアである。（６Ｂ）ＩＭＱの毎日適用および−３日目および１日目のＰＢＳ、αＩＬ−３６Ｒ  ｍＡｂおよびアイソタイプ対照の注射で処置した５日目のＤＩＴＲＡ様マウスの皮膚ホモジネートにおける炎症促進性サイトカインのレベルである。データは、三つの独立した実験のうちの代表を示す。エラーバーは平均±ＳＤを示す。各バーの群は、左から右に：ＰＢＳ、αｈＩＬ−３６Ｒ  ｍＡｂ、およびｈＩｇＧ４アイソタイプ対照である。
【００４７】
【図７】図７Ａ〜７Ｃ。一部の実施形態では、抗ヒトＩＬ−３６Ｒ抗体の治療的投与は、ＤＩＴＲＡ様マウスにおける慢性ＩＭＱ誘発性皮膚炎症を改善する。ＤＩＴＲＡ様マウスの背部皮膚を投与開始３日前に剃り、ヴァセリン（対照）またはＩＭＱ含有クリーム（アルダラ）で二回（第一回として５日間連続適用後、２日間適用せず、その後、第二回として４日間連続適用の合計１１日間適用）局所処置した。ＰＢＳ、抗ヒトＩＬ−３６Ｒ抗体、およびｈＩｇＧ４アイソタイプ対照を、５日目および９日目に１０ｍｇ／ｍＬで皮下注射した（各治療群につきｎ＝１０）。（７Ａ）皮膚の厚さを、ＤＩＴＲＡ様マウスにおいて１２日目に測定した。厚さはμｍで示す。（７Ｂ）１２日目にＤＩＴＲＡ様マウスからの背部皮膚のＨ＆Ｅ組織切片および病理スコアである。（７Ｃ）炎症促進性サイトカインのレベルを、ＤＩＴＲＡ様マウスの皮膚ホモジネートで１２日目に測定した。データは、二つの独立した実験のうちの代表を示す。エラーバーは平均±ＳＤを示す。各バーの群は、左から右に：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、αｈＩＬ−３６Ｒ  ｍＡｂ、およびｈＩｇＧ４アイソタイプ対照である。
【００４８】
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａ〜８Ｅ。一部の実施形態では、抗ヒトＩＬ−３６Ｒ抗体の治療的投与は、ＩＬ−１２ｐ４０遮断と同様に、ＤＩＴＲＡ様マウスにおけるＤＳＳ誘発性慢性炎症を改善し、ＤＳＳ誘発性粘膜損傷からの治癒不能を救済する。ＤＩＴＲＡ様マウス（ｎ＝４５）を、３％のＤＳＳを７日間、２％のＤＳＳを１３日間、次いで水を投与すること、合計３０日間により、慢性ＤＳＳ誘発性大腸炎に供した。対照マウス（ｎ＝５）に通常の水を投与した。ＰＢＳ（ｎ＝１１）、αＩＬ−３６Ｒ  ｍＡｂ（ｎ＝１１）、ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照（ｎ＝６）、αｍＩＬ−１２ｐ４０（ＢｉｏｘＣｅｌｌ）（ｎ＝１１）、およびラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（ｎ＝６）に、７、１０、１４、１７、２１、および２４日目に、１０ｍｇ／ｍＬで腹腔内注射した。（８Ａ）ＤＩＴＲＡ様マウスにおける体重減少は、元の体重と任意の特定の日の実際の体重とのパーセント差として計算される。（８Ｂ）ＤＩＴＲＡ様マウスにおける糞便リポカリン−２（Ｌｃｎ２）のレベルは、慢性大腸炎を通して０、７、１７、２３、３０日目に測定された。（８Ｃ）３０日目のＤＩＴＲＡ様マウスにおける結腸長である。（８Ｄ）ＤＩＴＲＡ様マウスの結腸ホモジネートにおける３０日目のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性である。（８Ｅ）ＤＩＴＲＡ様マウスの結腸ホモジネートの３０日目の炎症促進性サイトカインのレベルである。データは、二つの独立した実験のうちの代表を示す。エラーバーは平均±ＳＤを示す。各バーの群は、左から右に：ＰＢＳ／水、ＰＢＳ／ＤＳＳ、αｈＩＬ−３６Ｒ／ＤＳＳ、ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照／ＤＳＳ、αｍＩＬ−１２ｐ４０／ＤＳＳ、およびラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照／ＤＳＳである。
【図８Ｃ−Ｅ】同上。
【００４９】
【図９】図９Ａ〜９Ｃ。ヒトＩＬ−３６Ｒアンタゴニズムは、ＤＩＴＲＡ様マウスにおけるオキサゾロン誘発性大腸炎を改善する。ＤＩＴＲＡ様マウスを、１００％エタノールに溶解した３％オキサゾロン溶液で予め感作し、５、６および７日目に１．５％オキサゾロンおよびビヒクル（５０％エタノール）を直腸内投与した。前感作後２、５および７日目にマウスにＰＢＳ、抗ヒトＩＬ−３６Ｒ  ｍＡｂおよびｈＩｇＧ４アイソタイプ対照を腹腔内注射した。（Ａ）オキサゾロン投与中のＰＢＳ−、抗ヒトＩＬ−３６Ｒ  ｍＡｂ−およびｈＩｇＧ４対照処置済みＤＩＴＲＡ様マウスの体重である。＊ｐ＜０．０５  ＰＢＳ処置群から。（Ｂ）８日目のＤＩＴＲＡ様マウスで測定された結腸長である。（Ｃ）ＰＢＳ、抗ヒトＩＬ−３６Ｒ  ｍＡｂ、およびｈＩｇＧ４アイソタイプ対照を注射したオキサゾロン、およびビヒクル処置ＤＩＴＲＡ様マウスの結腸ホモジネートにおける炎症促進性サイトカインのレベルである。＊−ＰＢＳ処置群からの有意差、＃−アイソタイプ処置群からの有意差を表す。データは、各群５匹のマウスでの二つの独立した実験のうちの代表を示す。エラーバーは平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
ヒトＩＬ−３６Ｒシグナル伝達の阻害において２０分の１と低い効力であるＩＬ−３６Ｒａアンタゴニスト内因性を保持しながら、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子（ヒトＩＬ１ＲＬ２外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを有するヒト化ＩＬ１ＲＬ２タンパク質をコードする）、およびヒトＩＬ−３６αリガンドをコードするヒト遺伝子を含むように遺伝子改変された齧歯類（マウスなどであるが、これに限定されない）が本明細書に開示される。本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類は、ＩＬ−３６Ｒａの突然変異がＩＬ−３６Ｒシグナル伝達の増強をもたらすＤＩＴＲＡ患者の症状を呈することが示されている。したがって、本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類は、ＤＩＴＲＡおよびその関連障害を治療するための候補治療剤を試験するのに好適なＤＩＴＲＡの新規な機能モデルとして役立ち得る。様々な実施形態が以下にさらに記載される。
【００５１】
遺伝子改変齧歯類：四重ヒト化
一部の実施形態の一態様では、本開示は、そのゲノムに、ヒト化ＩＬ１ＲＬ２タンパク質（ＩＬ−３６Ｒのサブユニット）をコードするヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子、およびヒトＩＬ−３６α、β、およびγリガンドをコードするヒト遺伝子を含む齧歯類動物を提供する。かかる齧歯類は、本明細書では四重ヒト化齧歯類（すなわち、４ＨまたはＤＩＴＲＡ様）とも称される。
【００５２】
用語「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」は、核酸またはタンパク質の文脈において使用される場合、その構造（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列）が全体的または部分的に改変され、対応するヒトの核酸またはタンパク質に見られる構造を含む齧歯類の核酸またはタンパク質を含む。ヒト化遺伝子を含有する齧歯類またはヒト化タンパク質を発現する齧歯類は、「ヒト化」齧歯類である。
【００５３】
一部の実施形態では、本開示の齧歯類は、非限定的な例として、マウス、ラット、およびハムスターを含む。一部の実施形態では、本開示の齧歯類は、非限定的な例として、マウスおよびラットを含む。一部の実施形態では、齧歯類はネズミ上科から選択される。一部の実施形態では、本開示の齧歯類は、ヨルマウス科（例えば、マウス様のハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄラットおよびマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノボリマウス、ロックマウス、オジロラット、マダガスカルラットおよびマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、およびメクラネズミ科（例えば、メクラネズミ、タケネズミ、および高原モグラネズミ）から選択された科由来の動物である。一部の実施形態では、本開示の齧歯類は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。一部の実施形態では、本開示のマウスは、ネズミ科のメンバー由来のものである。
ＩＬ−１ＲＬ２ヒト化
【００５４】
ＩＬ−３６Ｒはインターロイキン１受容体ファミリーのメンバーであり、ＩＬ１ＲＬ２（ＩＬ−１Ｒｒｐ２としても知られる）と名付けられた受容体サブユニットと、共受容体サブユニットインターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質ＩＬ−１ＲＡｃＰからなる、ヘテロ二量体である（参照によりその全体が援用される、Ｇａｒｌａｎｄａ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３９，１００３−１０１８（２０１３）；Ｔｏｗｎｅ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，１３６７７−１３６８８（２００４））。受容体（ＩＬ−３６Ｒ）は、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、ＩＬ−３６γ（ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ８、およびＩＬ１Ｆ９としても知られる）の三つの異なるアゴニストを認識して結合し、炎症性サイトカインの発現、ならびにＩＬ−３６Ｒに結合し、炎症性サイトカインの発現を低減させるアンタゴニストであるＩＬ−３６Ｒａを誘導することができる。
【００５５】
ＩＬ１ＲＬ２は、シグナルペプチド、細胞外ドメイン（「ＥＣＤ」または「エクトドメイン」）、膜貫通ドメイン、および細胞内または細胞質ドメインを含有する。例えば、図１Ｄを参照のこと。ヒト、マウス、ラット、およびヒト化されたＩｌ１ｒｌ２核酸ならびにタンパク質配列を含む例示的ＩＬ１ＲＬ２配列が、配列表に開示され、また以下の表に要約されている。
【表１】
2021530970.tif 000002
【００５６】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、そのゲノムに、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のヌクレオチド配列およびヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列を含む、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を含む。本明細書において使用される場合、「遺伝子のヌクレオチド配列」は、ゲノム配列、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列の、その遺伝子全体または一部を含む。非限定的な例として、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のすべてまたは一部のゲノム配列、ｍＲＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列を含む。内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のヌクレオチド配列およびヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列は、齧歯類ゲノム中のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子がＩｌ１ｒｌ２タンパク質、すなわち、Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質構造（外部ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインからなる）を有する、およびＩｌ１ｒｌ２機能（例えば、インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ；１Ｌ−１ＲａｃＰ）とヘテロ二量体を形成し、三つのリガンド：ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γを認識する）を実施するタンパク質などの、タンパク質をコードするように、互いに動作可能に結合している。
【００５７】
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、そのゲノム中にヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を含有しており、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードし、このヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質は、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインを含有している。一部の実施形態では、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一である外部ドメインは、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと同じ機能性（例えば、リガンド結合特性）を呈する。「ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一な」外部ドメインまたはポリペプチドとは、一部の実施形態では、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列が同一であるポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個以下のアミノ酸が、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと異なるポリペプチドを意味する。また一部の実施形態では、例えば、アミノ酸の追加、欠失、または置換により、外部ドメインのＮまたはＣ末端部分でのみ、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと異なるが、ＮまたはＣ末端部分のアミノ酸、５個、４個、３個、２個、１個以下であるポリペプチドを意味する。「外部ドメインのＮまたはＣ末端部分」とは、外部ドメインのＮまたはＣ末端から５〜１０個のアミノ酸を意味する。一部の実施形態では、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一（たとえば少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％同一）なアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含み、その外部ドメインは、配列番号２のアミノ酸２０〜３３５から成る。一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、配列番号２に記載されるヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメイン、すなわち、配列番号２のアミノ酸２０〜３３５と実質的に同一な外部ドメインを含むヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、配列番号７のアミノ酸２２〜３３７を含む外部ドメインを含有するヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードする。
【００５８】
一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通型細胞質配列と実質的に同一な、膜貫通型細胞質配列（すなわち、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの両方を含む配列）を含有するヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通型細胞質配列と実質的に同一な膜貫通型細胞質配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通型細胞質配列と同じ機能性（例えば、シグナル伝達および／または細胞内分子との相互作用）を呈する。「内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通型細胞質配列と実質的に同一な」膜貫通型細胞質配列またはペプチドとは、一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通型細胞質配列と、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列が同一であるポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個以下のアミノ酸が、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通型細胞質配列と異なるポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、たとえばアミノ酸の追加、欠失、置換により、ＮまたはＣ末端でのみ内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通型細胞質配列と異なるが、膜貫通型細胞質配列のＮまたはＣ末端で５個、４個、３個、２個、１個以下である、ポリペプチドを意味する。「膜貫通型細胞質配列のＮまたはＣ末端部分」とは、膜貫通ドメインのＮ末端から５〜１０個のアミノ酸内、または細胞質ドメインのＣ末端から５〜１０個のアミノ酸内を意味する。一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質は、例えば、配列番号４と実質的に同一（少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％同一）なマウスＩｌ１ｒｌ２タンパク質などのマウスＩｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通型細胞質配列、または例えば、配列番号６と実質的に同一（少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％同一）なラットＩｌ１ｒｌ２タンパク質などのラットＩｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通型細胞質配列と実質的に同一な、膜貫通型細胞質配列を含有する。
【００５９】
一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質のシグナルペプチドと実質的に同一なシグナルペプチドを含有するヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質をコードする。「内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質のシグナルペプチドと実質的に同一」であるシグナルペプチドとは、一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質のシグナルペプチドと少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％配列が同一なポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質のシグナルペプチドと、３個、２個、または１個以下のアミノ酸が異なるポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、例えば、アミノ酸の追加、欠失または置換によって、ＮまたはＣ末端のみで内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質のシグナルペプチドと異なるが、シグナルペプチドのＮまたはＣ末端部分の、３個、２個、または１個のアミノ酸に留まる、ポリペプチドを意味する。「シグナルペプチドのＮまたはＣ末端部分」とは、シグナルペプチドのＮまたはＣ末端から５個のアミノ酸内を意味する。一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質は、例えば、配列番号４と実質的に同一（少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％同一）なマウスＩｌ１ｒｌ２タンパク質などのマウスＩｌ１ｒｌ２タンパク質のシグナルペプチド、または例えば、配列番号６と実質的に同一（少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％同一）なラットＩｌ１ｒｌ２タンパク質などのラットＩｌ１ｒｌ２タンパク質のシグナルペプチドと実質的に同一な、シグナルペプチドを含む。
【００６０】
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類のゲノム中のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列（または「ヒトＩＬ１ＲＬ２ヌクレオチド配列」）および内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のヌクレオチド配列（または「内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２ヌクレオチド配列」）を含み、ヒトＩＬ１ＲＬ２ヌクレオチド配列は、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子によってコードされたヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと実質的に同一なポリペプチドをコードする。そのようなヒトＩＬ１ＲＬ２ヌクレオチド配列は、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインを実質的にコードするとも称される。一部の実施形態では、ヒトＩＬ１ＲＬ２ヌクレオチド配列は、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のゲノム断片である。一部の実施形態では、ヒトＩＬ１ＲＬ２ヌクレオチド配列は、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のエクソン３〜８から構成される。一部の実施形態では、ヒトＩＬ１ＲＬ２ヌクレオチド配列は、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のイントロン２の３’部分、エクソン３〜８、およびイントロン８の５’部分から構成される。一部の実施形態では、ヒトＩＬ１ＲＬ２ヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列である。
【００６１】
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類のゲノム中のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２ヌクレオチド配列およびヒトＩｌ１ｒｌ２ヌクレオチド配列を含み、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２ヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通型細胞質配列と実質的に同一なポリペプチドをコードする。そのような齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２ヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通型細胞質配列を実質的にコードするとも称される。一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子中に存在する内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２ヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通型細胞質配列をコードする。一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子中に存在する内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２ヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン８の下流に残存するエクソンを含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子中に存在する内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２ヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン８の下流にイントロン８の３’部分と残存するエクソンを含む。
【００６２】
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類のゲノム中のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、ヒトＩＬ１ＲＬ２ヌクレオチド配列の上流（５’）に内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２ヌクレオチド配列を含み、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２ヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質のシグナルペプチドと実質的に同一なポリペプチドをコードする。そのような齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２ヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質のシグナルペプチドを実質的にコードするとも称される。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質のシグナルペプチドと実質的に同一なポリペプチドをコードする内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２ヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン１〜２を含み、一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２ヌクレオチド配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン１〜２とイントロン２の５’部分を含む。
【００６３】
一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２制御配列、例えばプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの５’転写制御配列に、例えばヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子の発現が齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２  ５’制御配列の制御下におかれるなど、動作可能に連結される。
【００６４】
一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位にある。一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、例えば、ランダムな組み込みの結果として、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子座以外の座位にある。ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子が内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位以外の座位にある一部の実施形態では、齧歯類は、例えば、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子の不活性化（例えば、全体または部分的な欠失）の結果として、齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質を発現することができない。
【００６５】
ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子が内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位にある一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子が内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位でヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列に置換された結果生じる。
【００６６】
一部の実施形態では、置換される内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位の内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のヌクレオチド配列は、齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の外部ドメインを実質的にコードする内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム断片である。一部の実施形態では、置換される齧歯類ゲノム断片は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン３〜８を含む。
【００６７】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位で齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム断片を置換するヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位で齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム断片を置換するヒトＩＬ１ＲＬ２ヌクレオチド配列は、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のゲノム断片である。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位で齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム断片を置換するヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のゲノム断片は、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインを実質的にコードする、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のエクソン全部または一部を含む。一部の実施形態では、ヒトゲノム断片は、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のエクソン３〜８を含む。
【００６８】
一部の実施形態では、ヒト化置換後に内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位に残り、挿入されたヒトＩＬ１ＲＬ２ヌクレオチド配列に動作可能に結合する内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通型細胞質配列を実質的にコードする。一部の実施形態では、ヒト化置換後、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位に残る内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン８の下流のエクソンを含む。
【００６９】
一部の実施形態では、ヒト化置換後に内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位に残り、挿入されたヒトＩＬ１ＲＬ２ヌクレオチド配列に動作可能に結合する内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質のシグナルペプチドを実質的にコードする。一部の実施形態では、ヒト化置換後、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位に残る内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム配列は、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン１〜２を含む。
【００７０】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質とヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質が、膜貫通ドメインと外部ドメインの間の接合部近辺に共通したアミノ酸を共有している場合において、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインを厳密にコードするヒトＩＬ１ＲＬ２ヌクレオチド配列を挿入する必要はない場合がある。ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインを実質的にコードし、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通ドメイン（および細胞質ドメイン）を実質的にコードする内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のゲノム配列に動作可能に結合された、若干長い、または短いヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列を挿入することが可能であり、それにより得られたヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子によってコードされるヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質は、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメインと同一な外部ドメイン、および内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の膜貫通ドメインと同一な膜貫通ドメインを含む。
【００７１】
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位の内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン３〜８を含むゲノム断片は、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のエクソン３〜８を含むゲノム断片で置換されている。結果として、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子が、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２座位で形成され、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン１〜２、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のエクソン３〜８、および内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン８の下流の残りのエクソンを含む。
【００７２】
一部の実施形態では、本明細書に提供される齧歯類は、そのゲノムにおいて、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子に対しヘテロ接合性である。一部の実施形態では、本明細書に提供される齧歯類は、そのゲノムにおいて、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子に対しホモ接合性である。
【００７３】
一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子は、齧歯類においてコードされたヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質の発現を生じさせる。一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質は、対照齧歯類（たとえば、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を有しない齧歯類）中の対応する齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質と同等のパターンで、または実質的に同一なパターンで発現される。一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質は、対照齧歯類（たとえば、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を有しない齧歯類）中の対応する齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質と同等のレベルで、または実質的に同一なレベルで発現される。一部の実施形態では、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質は、細胞表面、例えば、限定するものではないが、特にケラチノサイト、単球、マクロファージ、好中球、気管支および腸管上皮細胞などの細胞表面などで発現および検出される。ヒト化齧歯類のヒト化遺伝子またはタンパク質を、対照齧歯類の内因性齧歯類遺伝子またはタンパク質と比較する文脈において、「比較可能（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）」という用語は、比較される分子またはレベルが互いに同一ではない場合があるが、観察される差異または類似性に基づいて合理的に結論を導き出すことができるように、それらの間の比較を可能にするのに十分な類似性があることを意味する。一部の実施形態では、「実質的に同じ」という用語は、発現レベルに関して、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％を超えて互いに異なることのない比較されるレベルを含む。
【００７４】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、例えば、内因性齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子の不活性化（例えば、全体または部分的な欠失）または置換（全体または部分的な）の結果として、齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２タンパク質を発現することができない。
【００７５】
ＩＬ−３６リガンドのヒト化
本明細書に開示される齧歯類は、ヒトＩＬ−３６α、βおよびγリガンドをコードする生殖系遺伝子を含む。
【表２】
2021530970.tif 000003
【００７６】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、ヒトＩＬ−３６αタンパク質をコードするヒトＩＬ−３６α遺伝子を含むゲノムを有する。「ヒトＩＬ−３６α遺伝子」への言及は、ヒトＩＬ−３６αタンパク質をコードするヒトゲノムＤＮＡを含み、ヒトＩＬ−３６αプロモーターを含む。ヒトＩＬ−３６αタンパク質は、ヒトＩＬ−３６αタンパク質の成熟型または前駆体型であり得る。一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６αタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【００７７】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６α遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ−３６α座位にある。一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６α遺伝子は、例えば、ランダム組み込みの結果として、内因性齧歯類Ｉｌ−３６α座位以外の座位にある。ヒトＩＬ−３６α遺伝子が内因性齧歯類Ｉｌ−３６α座位以外の座位にある一部の実施形態では、齧歯類は、例えば、内因性齧歯類Ｉｌ−３６α遺伝子の不活性化（例えば、全体または部分的な欠失）の結果として、齧歯類Ｉｌ−３６αタンパク質を発現することができない。
【００７８】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６α遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ−３６α座位の内因性齧歯類Ｉｌ−３６α遺伝子を置換する。
【００７９】
一部の実施形態では、本明細書に提供される齧歯類は、そのゲノムにおいて、ヒトＩＬ−３６α遺伝子に対しヘテロ接合性である。他の実施形態では、本明細書に提供される齧歯類は、そのゲノムにおいて、ヒトＩＬ−３６α遺伝子に対しホモ接合性である。
【００８０】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６α遺伝子は、血清、例えば皮膚、腸上皮、肺などの粘膜部位、および免疫系の様々なタイプの細胞（例えば、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、樹状細胞）など、齧歯類おいて、コードされたヒトＩＬ−３６αタンパク質の発現をもたらす。一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６αタンパク質は、対照齧歯類（たとえば、ヒトＩＬ−３６α遺伝子を有しない齧歯類）中の対応する齧歯類Ｉｌ−３６αタンパク質と同等のパターンで、または実質的に同一なパターンで発現される。一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６αタンパク質は、例えば、血清中、粘膜部位（例えば、皮膚、腸上皮、肺など）、および／または免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、樹状細胞）において、対照齧歯類（例えば、ヒトＩＬ−３６α遺伝子を有しない齧歯類）の対応する齧歯類Ｉｌ−３６αタンパク質と同等の、または実質的に同じレベルで発現する。
【００８１】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、例えば、内因性齧歯類Ｉｌ−３６α遺伝子の不活性化（例えば、全体または部分的な欠失）または置換（全体または部分的な）の結果として、齧歯類Ｉｌ−３６αタンパク質を発現することができない。
【表３】
2021530970.tif 000004
【００８２】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、ヒトＩＬ−３６βタンパク質をコードするヒトＩＬ−３６β遺伝子を含むゲノムを有する。「ヒトＩＬ−３６β遺伝子」への言及は、ヒトＩＬ−３６βタンパク質をコードするヒトゲノムＤＮＡを含み、ヒトＩＬ−３６βプロモーターを含む。ヒトＩＬ−３６βタンパク質は、ヒトＩＬ−３６βタンパク質の成熟型または前駆体型であり得る。一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６βタンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【００８３】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６β遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ−３６β座位にある。一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６β遺伝子は、例えば、ランダム組み込みの結果として、内因性齧歯類Ｉｌ−３６β座位以外の座位にある。ヒトＩＬ−３６β遺伝子が内因性齧歯類Ｉｌ−３６β座位以外の座位にある一部の実施形態では、齧歯類は、例えば、内因性齧歯類Ｉｌ−３６β遺伝子の不活性化（例えば、全体または部分的な欠失）の結果として、齧歯類Ｉｌ−３６βタンパク質を発現することができない。
【００８４】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６β遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ−３６β座位の内因性齧歯類Ｉｌ−３６αβ遺伝子を置換する。
【００８５】
一部の実施形態では、本明細書に提供される齧歯類は、そのゲノムにおいて、ヒトＩＬ−３６β遺伝子に対しヘテロ接合性である。他の実施形態では、本明細書に提供される齧歯類は、そのゲノムにおいて、ヒトＩＬ−３６β遺伝子に対しホモ接合性である。
【００８６】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６β遺伝子は、血清、例えば皮膚、腸上皮、肺などの粘膜部位、および／または免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、樹状細胞）など、齧歯類おいて、コードされたヒトＩＬ−３６βタンパク質の発現をもたらす。一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６βタンパク質は、対照齧歯類（たとえば、ヒトＩＬ−３６β遺伝子を有しない齧歯類）中の対応する齧歯類ＩＬ−３６βタンパク質と同等のパターンで、または実質的に同一なパターンで発現される。一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６βタンパク質は、例えば、血清中、粘膜部位、例えば、皮膚、腸上皮、肺など、および免疫系の様々なタイプの細胞（例えば、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、樹状細胞など）において、対照齧歯類（例えば、ヒトＩＬ−３６β遺伝子を有しない齧歯類）の対応する齧歯類Ｉｌ−３６βタンパク質と同等の、または実質的に同じレベルで発現する。
【００８７】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、例えば、内因性齧歯類Ｉｌ−３６β遺伝子の不活性化（例えば、全体または部分的な欠失）または置換（全体または部分的な）の結果として、齧歯類Ｉｌ−３６βタンパク質を発現することができない。
【表４】
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【００８８】
一部の実施形態では、本発明は、そのゲノムがヒトＩＬ−３６γタンパク質をコードするヒトＩＬ−３６γ遺伝子を含有する齧歯類を提供する。「ヒトＩＬ−３６γ遺伝子」への言及は、ヒトＩＬ−３６γタンパク質をコードするヒトゲノムＤＮＡを含み、ヒトＩＬ−３６γプロモーターを含む。一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６γタンパク質は、ヒトＩＬ−３６γタンパク質の成熟型または前駆体型であり得る。一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６γタンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【００８９】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６γ遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ−３６γ座位にある。一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６γ遺伝子は、例えば、ランダム組み込みの結果として、内因性齧歯類Ｉｌ−３６γ座位以外の座位にある。ヒトＩＬ−３６γ遺伝子が内因性齧歯類Ｉｌ−３６γ座位以外の座位にある一部の実施形態では、齧歯類は、例えば、内因性齧歯類Ｉｌ−３６γ遺伝子の不活性化（例えば、全体または部分的な欠失）の結果として、齧歯類Ｉｌ−３６γタンパク質を発現することができない。
【００９０】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６γ遺伝子は、内因性齧歯類Ｉｌ−３６γ座位の内因性齧歯類Ｉｌ−３６γ遺伝子を置換する。
【００９１】
一部の実施形態では、本明細書に提供される齧歯類は、そのゲノムにおいて、ヒトＩＬ−３６γ遺伝子に対しヘテロ接合性である。他の実施形態では、本明細書に提供される齧歯類は、そのゲノムにおいて、ヒトＩＬ−３６γ遺伝子に対しホモ接合性である。
【００９２】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６γ遺伝子は、血清、例えば皮膚、腸上皮、肺などの粘膜部位、および免疫系の様々なタイプの細胞（例えば、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、樹状細胞）など、齧歯類おいて、コードされたヒトＩＬ−３６γタンパク質（ヒトＩＬ−３６γタンパク質と同一のタンパク質など）の発現をもたらす。一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６γタンパク質は、対照齧歯類（たとえば、ヒトＩＬ−３６γ遺伝子を有しない齧歯類）中の対応する齧歯類ＩＬ−３６γタンパク質と同等のパターンで、または実質的に同一なパターンで発現される。一部の実施形態では、ヒトＩＬ−３６γタンパク質は、例えば、血清中、粘膜部位（例えば、皮膚、腸上皮、肺など）、および／または免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、樹状細胞）において、対照齧歯類（例えば、ヒトＩＬ−３６γ遺伝子を有しない齧歯類）の対応する齧歯類Ｉｌ−３６γタンパク質と同等の、または実質的に同じレベルで発現する。
【００９３】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、例えば、内因性齧歯類Ｉｌ−３６γ遺伝子の不活性化（例えば、全体または部分的な欠失）または置換（全体または部分的な）の結果として、齧歯類Ｉｌ−３６γタンパク質を発現することができない。
【００９４】
一部の実施形態では、そのゲノムが、内因性座位における、全ての三つのＩｌ−３６リガンドに対するコード配列を包含する連続ゲノム断片のそれぞれヒトＩＬ−３６α、β、およびγと実質的に同一である三つのリガンドに対するコード配列を含む連続核酸との置換を含む齧歯類が提供される。一部の実施形態では、結果として生じる座位は、５’から３’に、（ｉ）ヒトＩＬ−３６γ遺伝子、（ｉｉ）ヒトＩＬ−３６γ遺伝子、および（ｉｉｉ）ヒトＩＬ−３６γ遺伝子の逆鎖を含む。
【００９５】
四重ヒト化齧歯類の表現型
本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類は、定常状態ではいかなる自然発生的疾患も発生しないが、これらの齧歯類は、定常状態および疾患状態（例えば、ＤＳＳまたはＩＭＱ処置後）の両方で、ヒト化なしの年齢一致の対照齧歯類と比較して、短縮した結腸および皮膚における炎症促進性メディエーターの発現の増加を呈する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、定常状態または疾患状態において、対照齧歯類よりも少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％短い結腸長を呈する。
【００９６】
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、定常状態において、対照齧歯類よりも１０％〜１５％（±５％）短い結腸長を呈する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、定常状態において、対照齧歯類よりも１５％〜２０％（±５％）短い結腸長を呈する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、定常状態において、対照齧歯類よりも１０％〜２０％（±５％）短い結腸長を呈する。
【００９７】
他の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、疾患状態（例えば、ＤＳＳまたはオキサゾロン処置後）において、対照齧歯類よりも２０％〜４０％（±５％）短い結腸長を呈する。他の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、疾患状態（例えば、ＤＳＳまたはオキサゾロン処置後）において、対照齧歯類よりも３０％〜４０％（±５％）短い結腸長を呈する。他の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、疾患状態（例えば、ＤＳＳまたはオキサゾロン処置後）において、対照齧歯類よりも２０％〜３０％（±５％）短い結腸長を呈する。他の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、疾患状態（例えば、ＤＳＳまたはオキサゾロン処置後）において、対照齧歯類よりも２５％〜３５％（±５％）短い結腸長を呈する。
【００９８】
本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類は、定常状態では自然発生的疾患を発症しないが、実験的に誘発された皮膚炎症および腸炎症モデル（例えば、それぞれ、乾癬およびＩＢＤの前臨床モデル）において、皮膚炎症および腸炎症の増強を呈することが示されている。
【００９９】
一部の実施形態では、ＤＳＳは、慢性大腸炎を誘発するために使用される。一部の実施形態では、ＤＳＳは、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２．５％の飲料水を通して齧歯類に投与される。一部の実施形態では、ＤＳＳは、１０％、９％、８％、７％、６％、または５％以下の飲料水を通して齧歯類に投与される。一部の実施形態では、１．５％〜３％のＤＳＳを含有する飲料水が齧歯類に与えられる。一部の実施形態では、０．５％〜３％のＤＳＳを含有する飲料水が齧歯類に与えられる。一部の実施形態では、１％〜３％のＤＳＳを含有する飲料水が齧歯類に与えられる。一部の実施形態では、２％〜３％のＤＳＳを含有する飲料水が齧歯類に与えられる。一部の実施形態では、２．５％〜３％のＤＳＳを含有する飲料水が齧歯類に与えられる。一部の実施形態では、０．５％〜２．５％のＤＳＳを含有する飲料水が齧歯類に与えられる。一部の実施形態では、０．５％〜２％のＤＳＳを含有する飲料水が齧歯類に与えられる。一部の実施形態では、０．５％〜１．５％のＤＳＳを含有する飲料水が齧歯類に与えられる。一部の実施形態では、０．５％〜１％のＤＳＳを含有する飲料水が齧歯類に与えられる。一部の実施形態では、１％〜２．５％のＤＳＳを含有する飲料水が齧歯類に与えられる。一部の実施形態では、１．５％〜２％のＤＳＳを含有する飲料水が齧歯類に与えられる。
【０１００】
一部の実施形態では、ＤＳＳの投与は、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、またはそれ以上の期間にわたって実施することができ、連続であっても、ＤＳＳの投与なしの中断を挟むこともできる。一部の実施形態では、齧歯類に、２．５％  ＤＳＳを含有する飲料水を７日間、次いで１．５％  ＤＳＳを５日間、次いで分析の２７〜３０日前まで蒸留水を与える。一部の実施形態では、齧歯類に、３％  ＤＳＳを含有する飲料水を７日間、次いで２％  ＤＳＳを１３日間、次いで分析の２７〜３０日前まで蒸留水を与える。一部の実施形態では、ＤＳＳ  は全期間にわたって与えられない。一部の実施形態では、齧歯類に、２．５％  ＤＳＳを含有する飲料水を７日間、次いで蒸留水を１１日間、次いで１．５％  ＤＳＳを４日間、次いで蒸留水を５日間、分析前の合計２７日間、与える。一部の実施形態では、齧歯類に、３％  ＤＳＳを含有する飲料水を７日間、次いで水を１３日間、次いで２％  ＤＳＳを４日間、次いで蒸留水を６日間、分析前３０日まで与える。
【０１０１】
一部の実施形態では、オキサゾロンは、大腸炎を誘発するために使用される。一部の実施形態では、オキサゾロンは、大腸炎を誘発するために、齧歯類に直腸内投与される。一部の実施形態では、オキサゾロンは、大腸炎を誘発するために、齧歯類の直腸内に三回投与される。一部の実施形態では、オキサゾロンは、直腸内投与の前に、前感作のために齧歯類に局所適用される。一部の実施形態では、オキサゾロンは、剃いだ皮膚上にオキサゾロン溶液（例えば、１００％エタノールに溶解したオキサゾロン３％溶液）を局所適用することによって前感作のために齧歯類に投与され、その後、オキサゾロンの溶液（例えば、５０％エタノールに溶解した１．０〜２．０％  オキサゾロン）の直腸内投与を三回実施する。一部の実施形態では、前感作は、１００％エタノールに溶解した１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、または４．０％のオキサゾロン溶液を用いる。一部の実施形態では、直腸内投与は、５０％エタノールに溶解されたオキサゾロンの１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％または２．０％溶液を用いる。一部の実施形態では、直腸内投与は、前感作の３、４、５、６または７日後など、数日後に実施される。一部の実施形態では、オキサゾロンは、剃いだ皮膚上にオキサゾロン溶液（例えば、１００％エタノールに溶解したオキサゾロン３．０％溶液で局所適用することによって齧歯類に投与され、その後、５０％エタノールに溶解した１．０〜２．０％  オキサゾロン溶液の三回の直腸内投与を５日、６日、および７日目に実施する。
【０１０２】
一部の実施形態では、大腸炎の程度は、以下の特徴を採点することによって評価される：炎症（重症度および程度）、上皮変化（びらん／潰瘍）、陰窩の変化（陰窩欠損、陰窩炎／陰窩膿瘍、再生／過形成、杯細胞欠損）、粘膜下浮腫、およびスライド上の全組織面積に対する病理を有する組織面積の割合。０〜４のスコアリングスケールが使用される：０〜０−正常範囲内、１−最小限、２−軽度、３−中等度、４−重度。総病理スコアを、個々の病理組織学的特徴スコアを加算して、各齧歯類について計算する。一部の実施形態では、大腸炎は、糞便試料中のリポカリン−２（Ｌｃｎ２）のレベルを測定することによって評価される。一部の実施形態では、大腸炎は、結腸ホモジネート中のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性のレベルを測定することによって測定される。一部の実施形態では、大腸炎は、結腸ホモジネート中の炎症性サイトカインのレベルを測定することによって評価される。
【０１０３】
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、同じＤＳＳ投与を受けた野生型対照齧歯類と比較して、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％以上の腸病理スコアの増加を呈する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、同じＤＳＳ投与を受けた野生型対照齧歯類と比較して、例えば、５０％〜４００％、５０％〜３００％、５０％〜２００％、５０％〜１００％、１００％〜４００％、１００％〜３００％、１００％〜２００％、または２００％〜４００％、腸病理スコアの増加を呈する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、同じＤＳＳ投与を受けた野生型対照齧歯類と比較して、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％以上、結腸ホモジネートにおけるミエロペルオキシダーゼ（「ＭＰＯ」）レベルの増加を呈する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、同じＤＳＳ投与を受けた野生型対照齧歯類と比較して、例えば、５０％〜４００％、５０％〜３００％、５０％〜２００％、５０％〜１００％、１００％〜４００％、１００％〜３００％、１００％〜２００％、または２００％〜４００％、結腸ホモジネートにおけるＭＰＯレベルの増加を呈する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、同じＤＳＳ投与を受けた野生型対照齧歯類と比較して、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％以上、糞便Ｌｃｎのレベルの増加を呈する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、同じＤＳＳ投与を受けた野生型対照齧歯類と比較して、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％以上、結腸ホモジネートにおける一つ以上の炎症促進性メディエーター（例えば、ＫＣ−ＧＲＯ、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１７ｆ、ＩＬ−１７ａ、およびＩＬ−１７ｃ）のｍＲＮＡ発現の増加および／またはタンパク質レベルの増加を呈する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、例えば、２０％〜９００％、２０％〜８００％、２０％〜７００％、２０％〜６００％、２０％〜５００％、２０％〜４００％、２０％〜３００％、２０％〜２００％、または２０％〜１００％など、結腸ホモジネートにおける一つ以上の炎症促進性メディエーターのｍＲＮＡ発現および／またはタンパク質レベルの増加を呈する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、例えば、３０％〜９００％、３０％〜８００％、３０％〜７００％、３０％〜６００％、３０％〜５００％、３０％〜４００％、３０％〜３００％、３０％〜２００％、または３０％〜１００％など、結腸ホモジネートにおける一つ以上の炎症促進性メディエーターのｍＲＮＡ発現および／またはタンパク質レベルの増加を呈する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、例えば、４０％〜９００％、４０％〜８００％、４０％〜７００％、４０％〜６００％、４０％〜５００％、４０％〜４００％、４０％〜３００％、４０％〜２０��％、または４０％〜１００％など、結腸ホモジネートにおける一つ以上の炎症促進性メディエーターのｍＲＮＡ発現および／またはタンパク質レベルの増加を呈する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、例えば、５０％〜９００％、５０％〜８００％、５０％〜７００％、５０％〜６００％、５０％〜５００％、５０％〜４００％、５０％〜３００％、５０％〜２００％、または５０％〜１００％など、結腸ホモジネートにおける一つ以上の炎症促進性メディエーターのｍＲＮＡ発現および／またはタンパク質レベルの増加を呈する。
【０１０４】
一部の実施形態では、ＩＭＱは、皮膚炎症を誘発するために齧歯類の皮膚に局所的に適用される。一部の実施形態では、ＩＭＱは、局所適用に適した担体、例えば、クリーム、ゲル、市販のＩＭＱクリーム（例えば、アルダラからのもの）などで提供される。一部の実施形態では、皮膚炎症を誘発するために、ＩＭＱは、１〜５ｍｇ、２〜４ｍｇ、または３〜３．５ｍｇの１日用量で、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日以上、齧歯類の皮膚に毎日適用される。一部の実施形態では、約３．１２５ｍｇの１日用量による４日間の毎日の局所適用は、急性皮膚炎症を誘発するのに好適であり、約３．１２５ｍｇの１日用量による９日間の毎日の局所適用は、慢性皮膚炎症を誘発するのに好適である。一部の実施形態では、ＩＭＱは、分析またはアッセイが実施される前、４〜５日連続のＩＭＱ適用、その後各回につき２日間のＩＭＱ不適用により、複数回（例えば、２、３または４回）にわたって局所的に適用される。特定の実施形態では、ＩＭＱは、分析前、５日連続のＩＭＱ適用、次いで第一回について２日間のＩＭＱ不適用、その後第二回について４日連続のＩＭＱ適用により、二回局所的に適用される（図７Ａ〜７Ｃを参照）。一部の実施形態では、炎症の重症度は、（ｉ）紅斑、落屑および皮膚の肥厚の測定に基づいて臨床Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  Ａｒｅａ  ａｎｄ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ（ＰＡＳＩ）の適合版を用いること；（ｉｉ）例えば、錯角化症、正常角化、マンロー微小膿瘍、アカントーシス、皮膚潰瘍形成、真皮および皮下組織の炎症、真皮と皮下組織における血管うっ血、毛包角化症および上皮過形成を評価するため、ならびに総病理スコアを判定するための皮膚組織の病理組織学的分析；（ｉｉｉ）例えば、特にＣｘｃｌ１、ＩＬ−１７ｆ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２３ａ、Ｓ１００Ａ８およびＤｅｆｂ４のｍＲＮＡ発現および／またはタンパク質レベルを含む、皮膚ホモジネートにおける炎症促進性メディエーターのｍＲＮＡ発現および／またはタンパク質レベルを測定すること；ならびに（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の組み合わせにより、評価され得る。
【０１０５】
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、同じＩＭＱ投与を受けた野生型対照齧歯類と比較して、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％以上など、皮膚病理スコアの増加を呈する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、同じＩＭＱ投与を受けた野生型対照齧歯類と比較して、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％以上など、皮膚ホモジネートにおける一つ以上の炎症促進性メディエーター（例えば、限定するものではないが、Ｃｘｃｌ１、ＩＬ−１７ｆ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２３ａ、Ｓ１００Ａ８およびＤｅｆｂ４）のｍＲＮＡ発現および／またはタンパク質レベルの増加を呈する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は定常状態で、定常状態の野生型対照齧歯類と比較して、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％以上など、皮膚ホモジネートにおける一つ以上の炎症促進性メディエーター（例えば、限定するものではないが、Ｃｘｃｌ１、ＩＬ−１７ｆ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２３ａ、Ｓ１００Ａ８およびＤｅｆｂ４）のｍＲＮＡ発現および／またはタンパク質レベルの増加を呈する。
【０１０６】
ＩＭＱ誘発性皮膚炎症については、一匹のＩｌ１ｒｌ２ヒト化マウスは、皮膚における炎症促進性分子の組織病理およびＲＮＡ発現に反映されるように、野生型齧歯類と同様の表現型を呈した（図３Ｄおよび３Ｅ）。一方、ＤＩＴＲＡ様マウス（すなわち、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２およびヒトＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ８、およびＩＬ１Ｆ９を含む四重ヒト化マウス）は、ＩＭＱ適用後、ＷＴマウスおよび１Ｈマウスの両方と比較して、皮膚炎症が増加した（図３Ｄおよび３Ｅ）。
【０１０７】
遺伝子改変齧歯類の組織および細胞
一部の実施形態では、本明細書に記載される齧歯類動物からの単離された細胞または組織が本明細書に開示される。一部の実施形態では、細胞は、樹状細胞、リンパ球（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞）、マクロファージ、および単球から選択される。一部の実施形態では、組織は、脂肪、膀胱、脳、乳房、骨髄、目、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、膵臓、血漿、血清、皮膚、脾臓、胃、胸腺、精巣、卵子、およびこれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態では、単離された細胞または組織は、そのゲノムに、本明細書に記載の四重ヒト化特徴を含む。
【０１０８】
四重ヒト化齧歯類を作製するための組成物および方法
本開示のさらなる態様は、上述の遺伝子改変齧歯類を作製するための方法、ならびに遺伝子改変齧歯類の作製における使用に適した核酸ベクターおよび齧歯類胚性幹細胞を目的としている。
【０１０９】
四重ヒト化齧歯類、すなわちヒト化Ｉｌ１ｒｌ２およびヒトＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ８、およびＩＬ１Ｆ９遺伝子を含む齧歯類は、単一のＩｌ１ｒｌ２ヒト化齧歯類系統、およびＩｌ１ｆ６、Ｉｌ１ｆ８、およびＩｌ１ｆ９の三重ヒト齧歯類系統を作製し、次いで、単一ヒト化齧歯類系統と三重ヒト齧歯類系統を繁殖させて、四重ヒト化齧歯類を得ることによって作製することができる。「繁殖する（ｂｒｅｅｄｉｎｇ）」または「交配する（ｃｒｏｓｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で齧歯類に関連して使用される場合、齧歯類を交尾させて子孫を作ることを指す。当業者であれば、ホモ接合性を達成するために、複数の交配が必要な場合があることを理解するであろう。
【０１１０】
一部の実施形態では、齧歯類座位に組み込まれることが望ましいヒトヌクレオチド配列を含む標的ベクターが本明細書に開示される。一部の実施形態では、ヒトヌクレオチド配列は、ヒトＩＬ１ＲＬ２の外部ドメインと実質的に同一な外部ドメインをコードするヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のヌクレオチド配列、例えば、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のエクソン３〜８を含むヌクレオチド配列であり得る。一部の実施形態では、ヒトヌクレオチド配列は、ヒトＩＬ−３６αのコード配列、ヒトＩｌ−３６βのコード配列、およびヒトＩＬ−３６γのコード配列の相補鎖を包含するヌクレオチド配列であり得る。標的化ベクターはまた、相同アームとしても知られる、組み込まれるヒトヌクレオチド配列に隣接する５’および３’齧歯類配列を含み、相同アームは、相同組み換えならびにヒトヌクレオチド配列の標的齧歯類座位（例えば、Ｉｌ１ｒｌ２座位、または齧歯類Ｉｌ１ｆ６、Ｉｌ１ｆ８、およびＩｌ１ｆ９遺伝子が位置する座位）への組み込みを介在する。一部の実施形態では、５’および３’の隣接齧歯類配列は、ヒトヌクレオチド配列によって置換される標的齧歯類座位において、対応する齧歯類ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列である。例えば、齧歯類の外部ドメインをコードするヌクレオチド配列（例えば、齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン３〜８）が、ヒト外部ドメインをコードする配列（例えば、ヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子のエクソン３〜８）で置換される実施形態では、５’隣接配列は、齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン１〜２を含むことができ、３’隣接配列は、齧歯類Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子のエクソン８の下流の残りのエクソンを含むことができる。三つ全てのＩＬ−３６リガンドをコードする齧歯類ヌクレオチド配列がヒトヌクレオチド配列で置換される一部の実施形態では、５’隣接配列は、Ｉｌ１ｆ６遺伝子のコード配列の上流の齧歯類ヌクレオチド配列を含むことができ、３’隣接配列は、Ｉｌ１ｆ９遺伝子のコード配列の上流の齧歯類ヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１１１】
一部の実施形態では、標的化ベクターは選択マーカー遺伝子を含む。一部の実施形態では、標的化ベクターは一つ以上の部位特異的組み換え部位を含む。一部の実施形態では、標的化ベクターは、部位特異的組み換え部位に隣接した選択マーカー遺伝子を含み、その結果、選択マーカー遺伝子は、部位間の組み換えの結果として削除され得る。
【０１１２】
例示的な実施形態では、齧歯類ゲノム断片を担持する細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンは、細菌相同組み換えおよびＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、参照により本明細書にその全体が援用される、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２−６５９を参照）を使用して改変され得る。結果として、齧歯類ゲノム配列は、元のＢＡＣクローンから削除され、ヒトヌクレオチド配列が挿入され、５’および３’齧歯類相同アームに隣接したヒトヌクレオチド配列を担持する改変ＢＡＣクローンが得られる。一部の実施形態では、ヒトヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列または（ｉ）ヒトＩＬ１ＲＬ２の全部または一部（例えば、ヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質の外部ドメイン）、または（ｉｉ）ヒトＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ８、およびＩＬ１Ｆ９の三つすべてをコードするヒトゲノムＤＮＡであり得る。改変ＢＡＣクローンは、直線化されると、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞に導入することができる。
【０１１３】
一部の実施形態では、本発明は、改変齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞を作るための本明細書に記述された標的化ベクターの利用法を提供する。例えば、標的化ベクターは、例えばエレクトロポレーションによって齧歯類ＥＳ細胞に導入することができる。マウスＥＳ細胞及びラットＥＳ細胞は共に当技術分野で説明されている。例えば、マウスＥＳ細胞および遺伝子改変マウスを作製するＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法について記載する、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、及びＵＳ２００８−００７８０００Ａ１（これらの全てが参照により本明細書に援用される）；ラットＥＳ細胞および遺伝子改変ラットを作製するための方法を記載し、これを改変齧歯類胚作製に使用することができ、齧歯類動物を作製するのに使用することができる、ＵＳ２０１４／０２３５９３３Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．），ＵＳ２０１４／０３１０８２８Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．），Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  ４６７：２１１−２１５およびＴｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．６（６）：ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１１．３３８（その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【０１１４】
一部の実施形態において、ゲノムに組み込まれたヒトヌクレオチド配列を有するＥＳ細胞を選択することができる。一部の実施形態では、ＥＳ細胞は、齧歯類アレルの喪失および／またはヒトアレルの獲得アッセイに基づいて選択される。一部の実施形態では、次いで選択されたＥＳ細胞を、ドナーＥＳ細胞として、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、それら全体が参照により援用される、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、およびＵＳ２００８−００７８０００Ａ１を参照）、または、両方のそれら全体が参照により援用される、ＵＳ２０１４／０２３５９３３Ａ１およびＵＳ２０１４／０３１０８２８Ａ１に記載の方法を使用することにより、桑実期以前の胚（例えば、８細胞期胚）への注入に使用する。一部の実施形態では、ドナーＥＳ細胞を含む胚は胚盤胞期までインキュベートし、次に代理母に移植して、完全にドナーＥＳ細胞に由来するＦ０齧歯類を産生する。ヒトヌクレオチド配列を保有する齧歯類の仔は、齧歯類アレルの消失および／またはヒトアレルの獲得のアッセイを使用した、尾部断片から単離されたＤＮＡの遺伝子型決定により特定することができる。
【０１１５】
一部の実施形態では、ヒト化遺伝子に対してヘテロ接合性の齧歯類を交配させ、ホモ接合性齧歯類を作製することができる。
【０１１６】
四重ヒト化齧歯類を用いる方法
本明細書に開示される齧歯類は、脱制御ＩＬ−３６シグナル伝達に関連する疾患または状態の治療に有用な化合物を特定および試験するための有用なｉｎ  ｖｉｖｏシステムおよび生体材料の供給源を提供する。
【０１１７】
「脱制御ＩＬ−３６シグナル伝達に関連する疾患」とは、ＩＬ−３６シグナル伝達の異常が発現する疾患を意味し、疾患を直接的または間接的に引き起こすか、疾患の症状を悪化させる可能性がある。脱制御ＩＬ−３６シグナル伝達に関連する疾患の非限定的な例としては、汎発性膿疱性乾癬（ＧＰＰまたはＤＩＴＲＡ）（それらの全体が参照により本明細書に援用される、Ｍａｒｒａｋｃｈｉ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：６２０−６２８（２０１１）およびＯｎｏｕｆｒｉａｄｉｓ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ８９：４３２−４３７（２０１１））、掌蹠膿疱症（ＰＰＰＰ）（その全体が参照により本明細書に援用される、Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １１：ｅ０１５５２１５（２０１６））、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（それらの全体が参照により本明細書に援用される、Ｍｅｄｉｎａ−Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９６：３４−３８（２０１６；Ｎｉｓｈｉｄａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ  ２２：３０３−３１４（２０１６）およびＲｕｓｓｅｌｌ  ＳＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１１９３−１２０４（２０１６））、関節リウマチおよび乾癬性関節炎（その全体が参照により本明細書に援用される、Ｆｒｅｙ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ７２：１５６９−１５７４（２０１３））、喘息、慢性閉塞性肺疾患（その全体が参照により本明細書に援用される、Ｃｈｅｎ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ７５：２８３５−２８４３（２０１２））、慢性腎臓病（その全体が参照により本明細書に援用される、Ｓｈａｉｋ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２６：２７−３６（２０１３））、および魚鱗癬（その全体が参照により本明細書に援用される、Ｐａｌｌｅｒ  ＡＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３９：１５２−１６５（２０１７））を含む。
【０１１８】
一部の実施形態では、開示された齧歯類を使用して評価され得る化合物は、たとえば、限定するものではないが、小分子阻害剤、核酸系阻害物質（たとえば、ｓｉＮＲＡ、リボザイム、アンチセンス構築物など）、抗原結合タンパク質（たとえば、抗体またはその抗原結合断片）、またはブロッキングペプチド／ペプチド阻害剤などのＩＬ−３６シグナル伝達の候補阻害剤を含む。
【０１１９】
一部の実施形態では、候補阻害剤は、抗体またはその抗体結合断片である。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方が、本明細書に開示される齧歯類で試験されるのに好適である。一部の実施形態では、抗体は、ヒトＩＬ−３６Ｒタンパク質に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体は、ヒトＩＬ−３６Ｒタンパク質のＩＬ１ＲＬ２サブユニットに特異的に結合する。
【０１２０】
候補化合物は、本明細書に開示される齧歯類において、例えば、ＩＭＱ誘発性皮膚炎症またはＤＳＳ誘発性腸炎症などの炎症を誘発し、候補化合物が誘発性炎症を治療または阻害することができるかどうかを判定することによって評価することができる。「治療する」または「阻害する」という用語は、重症度の改善、進行の緩和、誘発された炎症および症状の発生の排除、遅延または防止、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、齧歯類は、炎症を誘発する薬剤の投与前、投与時、または投与後に、候補化合物を投与される。候補化合物は、非経口および非経口でない投与経路を含む任意の所望の投与経路を介して投与することができる。非経口経路には、例えば、静脈内、動脈内、門脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、髄腔内、くも膜下腔内、側脳室内、頭蓋内、胸腔内または注入のその他の経路を含む。非注射経路は、例えば、経口、経鼻、経皮、肺、直腸、口腔、膣、眼を含む。投与は、連続注入、局所投与、インプラント（ゲル、膜など）からの持続放出、および／または静脈内注射による場合もある。
【０１２２】
一部の実施形態では、適切な対照齧歯類は、例えば、誘発された炎症に供されていないヒト化齧歯類、化合物または治療有効性を有するとは予想されない対照化合物（例えば、アイソタイプ対照抗体など）なしに誘発された炎症に供されたヒト化齧歯類、ならびに誘発された炎症および治療有効性があると知られている化合物に供されたヒト化齧歯類を含み得る。
【０１２３】
皮膚炎症に対する候補化合物の有効性を評価するために、化合物は、ＩＭＱ処置の前、間、または後に齧歯類に投与し得る。特定の実施形態では、候補化合物は、ＩＭＱが適用される皮膚領域またはその近くで皮下投与される。化合物は、その化合物を投与されない対照齧歯類と比較して、皮膚炎症を阻害する場合、有効であると考えられる。たとえば、化合物は、総病理スコアが１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少した場合（例えば、２０％〜９０％、２０％〜８０％、２０％〜７０％、２０％〜６０％、２０％〜５０％、２０％〜４０％、３０％〜９０％、３０％〜８０％、３０％〜７０％、３０％〜６０％、３０％〜５０％、または３０％〜４０％減少）；または一つ以上の炎症促進性メディエーターの濃度が１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少した場合（例えば、２０％〜９０％、２０％〜８０％、２０％〜７０％、２０％〜６０％、２０％〜５０％、２０％〜４０％、３０％〜９０％、３０％〜８０％、３０％〜７０％、３０％〜６０％、３０％〜５０％、または３０％〜４０％減少）、有効と考えられる。
【０１２４】
大腸炎症に対する候補化合物の有効性を評価するために、化合物を、オキサゾロン処置の前、間、または後に齧歯類に投与し得る。一部の実施形態では、候補化合物は、ＤＳＳ処置の開始後、数日間（例えば、５、６、７、８、または９日間）腹腔内投与される。一部の実施形態では、候補化合物は、オキサゾロン処置の間に複数回、例えば、オキサゾロンの局所適用の２〜３日後、オキサゾロンの一回以上の直腸内投与時（例えば、オキサゾロンの初回直腸内投与時、およびオキサゾロンの三回目の直腸内投与時）に、腹腔内投与される。化合物は、その化合物を投与されない対照ＤＩＴＲＡ齧歯類と比較して、大腸炎を阻害する場合、有効であると考えられる。たとえば、化合物は、総病理スコアが１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少したとき（例えば、２０％〜９０％、２０％〜８０％、２０％〜７０％、２０％〜６０％、２０％〜５０％、２０％〜４０％、３０％〜９０％、３０％〜８０％、３０％〜７０％、３０％〜６０％、３０％〜５０％、または３０％〜４０％減少）；一つ以上の炎症促進性メディエーターの濃度が１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少したとき（例えば、２０％〜９０％、２０％〜８０％、２０％〜７０％、２０％〜６０％、２０％〜５０％、２０％〜４０％、３０％〜９０％、３０％〜８０％、３０％〜７０％、３０％〜６０％、３０％〜５０％、または３０％〜４０％減少）；糞便中Ｌｃｎ２が１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少したとき（例えば、２０％〜９０％、２０％〜８０％、２０％〜７０％、２０％〜６０％、２０％〜５０％、２０％〜４０％、３０％〜９０％、３０％〜８０％、３０％〜７０％、３０％〜６０％、３０％〜５０％、または３０％〜４０％減少）；結腸ホモジネートにおけるＭＰＯ活性が１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少したとき（例えば、２０％〜９０％、２０％〜８０％、２０％〜７０％、２０％〜６０％、２０％〜５０％、２０％〜４０％、３０％〜９０％、３０％〜８０％、３０％〜７０％、３０％〜６０％、３０％〜５０％、または３０％〜４０％減少）；結腸長が１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上延長したとき（例えば、２０％〜９０％、２０％〜８０％、２０％〜７０％、２０％〜６０％、２０％〜５０％、２０％〜４０％、３０％〜９０％、３０％〜８０％、３０％〜７０％、３０％〜６０％、３０％〜５０％、または３０％〜４０％短縮）；またはそれらの組み合わせのとき、有効であると考えられる。
【０１２５】
本明細書は、限定するものとして解釈すべきではない以下の実施例により、さらに例示される。全ての引用参考文献（本出願全体で引用される文献参照、発行特許、及び公表された特許出願を含む）は、それらの全体が参照により本明細書に明確に援用される。
【実施例】
【０１２６】
実施例１．四重ヒト化マウス系統の作製
二つの遺伝子操作されたマウス系統：Ｉｌ１ｒｌ２単一ヒト化マウス系統、およびＩｌ１ｆ６、Ｉｌ１ｆ８、Ｉｌ１ｆ９三重ヒト化マウス系統が、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）技術（それらの全体が参照により本明細書に援用される、Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７  Ｊａｎ；２５（１）：９１−９；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００３  Ｊｕｎ；２１：６５２−５９）を用いて作製された。単一ヒト化系統および三重ヒト化系統を交配することによって、「四重ヒト化」系統が作製された。
単一ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２マウス系統の作製
【０１２７】
「単一ヒト化」系統は、マウスＩｌ１ｒｌ２の細胞外ドメインをコードするマウスＩｌ１ｒｌ２遺伝子（インターロイキン−１受容体様２タンパク質）の一部分を、ヒトＩＬ１ＲＬ２の対応する細胞外ドメインをコードするヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子の断片（それぞれ、介在イントロンおよび隣接イントロンの部分を有する、Ｉｌ１ｒｌ２／ＩＬ１ＲＬ２エクソン３〜８）で置換した（図１Ａ）。得られたヒト化遺伝子は、マウスの細胞内シグナル伝達特異性を維持するキメラ受容体をコードし、一方で細胞外ドメインをヒト化させ、それぞれ、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ８、およびＩＬ１Ｆ９（ＩＬ３６Ａ、Ｂ、およびＧとも呼ばれる）に結合することができるようにする。ホモ接合性のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２マウスは、Ｉｌ１ｒｌ２ｈｕ／ｈｕと称される。
【０１２８】
さらに具体的には、マウスＩｌ１ｒｌ２遺伝子を含有するマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンＲＰ２３−２３５Ｌ２２を使用して、以下のように改変し、標的ベクターを提供した。ＤＮＡ断片は、５’マウス相同ヌクレオチド配列、約３２，３８９ｂｐのヒトＩＬ１ＲＬ２ゲノムＤＮＡ（イントロン２の３’３４６ｂｐ、全ての介在イントロンを有するエクソン３〜８、およびイントロン８の５’  １１０１ｂｐを含有する）、約４，９９６ｂｐの自動削除ネオマイシンカセット、および３’マウス相同配列を含むよう作製された（図１Ｂ）。このＤＮＡ断片を使用し、細菌細胞中での相同組み換えを介してＢＡＣクローンＲＰ２３−２３５Ｌ２２を改変した。結果として、ＢＡＣクローン中の外部ドメインをコードするマウスＩｌ１ｒｌ２ゲノム断片（約２５，３２４ｂｐ、マウスイントロン２の３’  １５５ｂｐ、すべての介在イントロンを有するエクソン３〜８、およびマウスイントロン８の５’６４２ｂｐを含む）が、その後自己削除ネオマイシンカセットに続く、ヒトＩＬ１ＲＬ２ゲノムＤＮＡにより置換された（図１Ｂ）。得られた改変ＢＡＣクローンは、５’から３’に、（ｉ）マウスゲノムＤＮＡ約１１２．２ｋｂ、マウスＩｌ１ｒｌ２エクソン１〜２およびイントロン２の５’部分を含有する５’マウス相同アーム；（ｉｉ）イントロン２の３’部分、エクソン３〜８、およびイントロン８の５’部分を含むヒトＩＬ１ＲＬ２ゲノム断片；（ｉｉｉ）約４，９９６ｂｐの自己削除ネオマイシンカセット、次いで（ｉｖ）エクソン８の下流の残っているマウスＩｌ１ｒｌ２エクソン、全ての介在イントロンおよび３’ＵＴＲを含む３１．３ｋｂの３’マウス相同アームを含んでいた。図１Ｂを参照。接合部配列もまた図１Ｂの下部に記載される。
【０１２９】
上述のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を含有する改変ＢＡＣクローンを標的ベクターとして使用して、マウスＦ１Ｈ４胚性幹細胞をエレクトロポレーションし（５０％  Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ／５０％１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ）、ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を含む改変ＥＳ細胞を作製した。ヒト化Ｉｌ１ｒｌ２遺伝子を含む明確に標的化されたＥＳ細胞が、ヒトＩＬ１ＲＬ２配列の存在を検出するアッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）によって特定され、マウスＩｌ１ｒｌ２配列の喪失および／または保持を確認した。上述のヒト化を確認するために使用されたプライマーおよびプローブは図５に記載された。正しく標的化されたＥＳ細胞クローンが選択されると、ネオマイシン選択カセットは削除することができる。カセット削除後のヒト化Ｉｌ１ｒｌ２座位を図１Ｃに示し、接合部配列もまた図１Ｃに示す。
【表５】
2021530970.tif 000006
【０１３０】
選択したＥＳ細胞クローンを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒアルビノマウス由来の８細胞胚に顕微注入し、１００％標的細胞由来のＦ０  ＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（登録商標）を得た（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２００７、上記参照）。ヒト化座位を保有するマウスを、ヒト遺伝子配列の存在を検出するアレルアッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）の改良法を使用した、尾部断片から単離されたＤＮＡの遺伝子型同定によって再度確認し、同定した。ヒト化座位に対してホモ接合性の動物が、ヘテロ接合性動物の交配により作製された。
【０１３１】
結果として生じるヒト化／キメラＩｌ１ｒｌ２受容体（配列番号７）、マウスＩｌ１ｒｌ２タンパク質（配列番号４）、およびヒトＩＬ１ＲＬ２タンパク質（配列番号２）のアミノ酸配列のアライメントが図１Ｄに提供される。
【０１３２】
三重ヒト化マウス系統の作製
マウスＩｌ１ｆ６、Ｉｌ１ｆ８、およびＩｌ１ｆ９遺伝子のそれぞれの完全なコード配列を、それぞれ、ヒトＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ８、およびＩＬ１Ｆ９遺伝子の完全なコード配列と置換した「三重ヒト化」系統を作製した。この戦略は、キメラＩｌ１ｒｌ２受容体のヒト細胞外ドメインに結合することができるヒトリガンドをコードするヒト化遺伝子をもたらした。ホモ接合性ヒト化Ｉｌ１ｆ６、Ｉｌ１ｆ８、Ｉｌ１ｆ９マウスは、Ｉｌ１ｆ６ｈｕ／ｈｕ、Ｉｌ１ｆ８ｈｕ／ｈｕ、Ｉｌ１ｆ９ｈｕ／ｈｕと称される。
【０１３３】
さらに具体的には、マウスＩｌ１ｆ８、Ｉｌ１ｆ９、およびＩｌ１ｆ６遺伝子を含有するマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンＲＰ２３−９０Ｇ２３および遺伝子間配列を使用して、以下のように改変し、標的ベクターを提供した。ＤＮＡ断片は、５’マウス相同ヌクレオチド配列、約８８，８６８ｂｐのヒトゲノムＤＮＡ（プロモーター、非翻訳領域、およびヒトＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、およびＩＬ１Ｆ６のコード配列を含有）、約５，２１８ｂｐの自己削除ハイグロマイシンカセット、および３’マウス相同配列を含むように作製された（図２Ｂ）。このＤＮＡ断片を使用し、細菌細胞中での相同組み換えを介してＢＡＣクローンＲＰ２３−９０Ｇ２３を改変した。結果として、ＢＡＣクローン中の約７６，５４８ｂｐのゲノム断片が、ヒトゲノムＤＮＡで置換され、自己削除カセットがその後に続いた（図２Ａ〜２Ｂ）。得られた改変ＢＡＣクローンは、５’から３’の方向に、（ｉ）約５．７ｋｂのマウスゲノムＤＮＡを含有する５’マウス相同アーム、（ｉｉ）約８８，８６８ｂｐのヒトゲノム断片（プロモーター、非翻訳領域、およびヒトＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、およびＩＬ１Ｆ６のコード配列を含有する）、（ｉｉｉ）約５，２１８ｂｐの自己削除ハイグロマイシンカセット、および約２９．７ｂｐの３’マウス相同配列を含んでいた。図２Ｂを参照。接合部配列もまた図２Ｂの下部に記載される。
【０１３４】
上述のヒトＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、およびＩＬ１Ｆ６遺伝子配列を含有する改変ＢＡＣクローンを標的ベクターとして使用して、マウスＦ１Ｈ４胚性幹細胞をエレクトロポレーションし（５０％  Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ／５０％１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ）、ヒトＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、およびＩＬ１Ｆ６遺伝子配列を含む改変ＥＳ細胞を作製した。ヒトＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、およびＩＬ１Ｆ６遺伝子配列を含む明確に標的化されたＥＳ細胞が、ヒト配列の存在を検出するアッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）によって特定され、マウス配列の喪失および／または保持を確認した。上述のヒト化を確認するために使用されたプライマーおよびプローブは図６に記載された。正しく標的化されたＥＳ細胞クローンが選択されると、ハイドロマイシン（ｈｙｄｒｏｍｙｃｉｎ）選択カセットは削除することができる。カセット削除後のヒト化座位を図２Ｃに示し、接合部配列もまた図２Ｃに示す。
【表６】
2021530970.tif 000007
【０１３５】
選択したＥＳ細胞クローンを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒアルビノマウス由来の８細胞胚に顕微注入し、１００％標的細胞由来のＦ０  ＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（登録商標）を得た（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２００７、上記参照）。ヒト化座位を保有するマウスを、ヒト遺伝子配列の存在を検出するアレルアッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）の改良法を使用した、尾部断片から単離されたＤＮＡの遺伝子型同定によって再度確認し、同定した。ヒト化座位に対してホモ接合性の動物が、ヘテロ接合性動物の交配により作製された。
三重ヒト化マウス系統の作製
【０１３６】
「三重ヒト化」系統を、１００％  Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃバックグラウンドで両座位に対するホモ接合性に繁殖された、単一ヒト化系統と三重ヒト化系統を交配させることによって作製した。ホモ接合性三重ヒト化系統は、Ｉｌ１ｒｌ２ｈｕ／ｈｕ  Ｉｌ１ｆ６ｈｕ／ｈｕ  Ｉｌ１ｆ８ｈｕ／ｈｕ  Ｉｌ１ｆ９ｈｕ／ｈｕ、または「ＤＩＴＲＡ様」マウスと称される。Ｆ０生殖細胞系において、自己削除技術により、Ｎｅｏカセットおよびｈｙｇｒｏカセットが削除された。
【０１３７】
実施例２．ＤＩＴＲＡマウスの特徴解析
材料および方法
ＤＩＴＲＡ様マウスにおける急性および慢性ＩＭＱ誘発性皮膚炎症誘発および抗体治療−皮膚炎症を誘発するために、８〜１０週齢のヒト化ＤＩＴＲＡ様メスマウスは、ＩＭＱクリーム適用の三日前に、マウスヘアトリマー（Ｏｓｔｅｒ、ＭｉｎｉＭａｘ、Ｃａｔ＃  ７８０４９−１００）を使用して背部毛を剃り、０．５ｇのＶｅｅｔ毛髪除去ゲルで皮膚を脱毛した。市販のＩＭＱクリーム（５％）（アルダラ、ＧＭ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＮＤＣ  ９９２０７−２０６−１２、ロット＃  ＱＪ０４４Ａ）またはヴァセリン（ＣＶＳ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、ＮＤＣ  ５９７７９−９０２−８８）一日の局所用量６２．５ｇを、マウスの剃った背部皮膚に、急性疾患誘発には四日間連続で、慢性疾患誘発には九日間適用した。アルダラ６２．５ｍｇの一日局所用量は、活性化合物３．１２５ｍｇの一日用量に換算される。急性ＩＭＱ誘発性皮膚炎症では、抗ヒトＩＬ−３６Ｒ抗体を、ＩＭＱ適用開始の３日前および１日後に１０ｍｇ／ｋｇで背部皮膚に皮下投与した。対照群は、ＰＢＳおよび１０ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ４アイソタイプ対照注射を受けた。急性ＩＭＱ誘発性皮膚炎症では、同じ抗ヒトＩＬ−３６Ｒ抗体を、ＩＭＱ適用開始の４日前および８日後に１０ｍｇ／ｋｇで背部皮膚に治療的に皮下投与した。処置から二または三日後に、マウスの背部皮膚は紅斑、落屑及び肥厚の徴候を呈した。炎症の重症度を、臨床Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  Ａｒｅａ  ａｎｄ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ（ＰＡＳＩ）の適合版を用いて毎日測定した。紅斑、落屑および肥厚を独立して０〜４のスケール：０，なし、１，軽度、２，中等度、３，高度、および４，極めて高度、で採点した（参照によりその全体が本明細書に援用される、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｆｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９，１８２：５８３６−５８４５）。急性ＩＭＱ誘発性皮膚炎症の４日目および慢性ＩＭＱ誘発性皮膚炎症の１１日目に、キャリパー（Ｋａｅｆｅｒ）を使用して皮膚の厚さを測定した。
【０１３８】
組織病理学−マウスの背部からの直径６ｍｍの皮膚組織を１０％緩衝ホルマリンで固定し、４〜５μｍのパラフィン包埋された切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。皮膚切片について、錯角化症、正常角化、マンロー微小膿瘍、アカントーシス、皮膚潰瘍形成、真皮および皮下組織の炎症、真皮および皮下組織の血管うっ血、毛孔性角化症および上皮過形成の有無について盲検的に評価した。０〜４のスコアリングスケールを使用した：０−正常範囲内、１−最小限、２−軽度、３−中等度、および４−重度（その全体が参照により本明細書に援用される、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｆｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９，１８２：５８３６−５８４５）。個々の病理組織学的特徴スコアを加算することにより、総病理スコアをマウスごとに計算した。データ解析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを用いて実施した。
【０１３９】
皮膚ホモジネートにおけるサイトカインの測定−マウスの背部から直径６ｍｍの全層皮膚組織を採取し、Ｔ−ｐｅｒ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃３７８５１０、ロット＃ＲＦ２３６２１７）、１×Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃８７７８６、ロット＃ＱＧ２２１７６３）および５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ３  ７８４２９）を含む１５ｍＬの試験管に入れた。皮膚組織を、ポリトロン（ＰＴ１０−３５  ＧＴ−Ｄ、Ｃａｔ＃９１５８１５８）を使用して１分間、２８０００ｒｐｍで破壊し、氷上に置いた。作製された皮膚ホモジネートを、４℃で８分間、１５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を９６ウェルプレートに回収した。皮膚ホモジネートを、タンパク質アッセイ色素ダイ（ＢｉｏＲａｄ，Ｃａｔ＃  ５００−０００６，ロット＃  ２１０００８１４９）を使用してＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイに供し、総タンパク質含有量を定量した。皮膚ホモジネートにおけるサイトカイン濃度を、Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｐａｎｅｌ  １（マウス）マルチプレックスイムノアッセイキット（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｃａｔ＃  Ｋ１５０４８Ｄ）を用いて、製造業者の指示に従って測定した。簡潔に述べると、５０μＬ／ウェルのキャリブレータおよび試料（Ｄｉｌｕｅｎｔ  ４１で希釈）を、捕捉抗体で予めコーティングされたプレートに加え、７００ｒｐｍで２時間振とうしながら室温でインキュベートした。次いで、プレートを０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳで３回洗浄し、続いてＤｉｌｕｅｎｔ  ４５で希釈した２５μＬの検出抗体溶液を加えた。振とうしながら室温で２時間インキュベーションした後、プレートを３回洗浄し、各ウェルに１５０μＬの２×Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒを加えた。電気化学発光は、ＭＳＤ  Ｓｐｅｃｔｏｒ（登録商標）機器で直ちに読み取られた。データ解析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを用いて実施した。サイトカインレベルは、総タンパク質含有量に対して正規化された。
【０１４０】
ＤＩＴＲＡ様マウスにおける慢性大腸炎のＤＳＳ誘発性モデルの誘導と抗体処置−ＤＳＳ媒介性大腸炎を誘発するために、１２〜２０週齢で平均体重２３ｇ超の雌のＤＩＴＲＡ様マウスに、飲料水中１．５〜３％のＤＳＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ＃  ８７７８６，ロット＃  ＰＪ２０３９６６Ｂ）を７日間与え、次いで１１〜１３日間蒸留水を与えた。第二サイクルのＤＳＳ処置（４日間）、続いて水（５〜６日間）を２７〜３０日目まで実施した。対照群は、試験期間中、蒸留水を与えられた。抗ヒトＩＬ−３６Ｒ抗体およびｍＩＬ−１２ｐ４０（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ  Ｃａｔ＃ＢＥ００５１、クローンＣ１７．８）抗体を、７日目から週一回、１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。対照群は、ＰＢＳならびにそれぞれのｈＩｇＧ４およびｒａｔＩｇＧ２ａ（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ  Ｃａｔ＃ＢＥ００８９、クローン２Ａ３）アイソタイプ対照注射を１０ｍｇ／ｋｇで投与した。マウスは毎日計量し、大腸炎の臨床徴候（例えば、便の硬さおよび便血）を監視した。２７〜３０日目にマウスを安楽死させ、結腸長を測定した。ＤＳＳ大腸炎を評価するため、以下の特徴を採点した：炎症（重症度および程度）、上皮変化（びらん／潰瘍）、陰窩の変化（陰窩欠損、陰窩炎／陰窩膿瘍、再生／過形成、杯細胞欠損）、粘膜下浮腫、およびスライド上の全組織面積に対する病理を有する組織面積の割合。０〜４のスコアリングスケールが使用された：０〜０−正常範囲内、１−最小限、２−軽度、３−中等度、４−重度。個々の病理組織学的特徴スコアを加算することにより、総病理スコアをマウスごとに計算した。
【０１４１】
糞便試料中のＬｃｎ−２の測定−試験を通して腸炎症を監視するために、個々のＤＩＴＲＡ様マウスからの糞便を２ｍＬのディープウェルプレートに毎週採取し、−８０℃で保存した。試験終了時、異なる日に採取した糞便をホモジナイズした。簡潔に述べると、糞便試料を、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１ｍＬのＰＢＳ、１×Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ＃  ８７７８６，ロット＃  ＱＧ２２１７６３）、および５ＭのＥＤＴＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ３  ７８４２９）を用いて再構成した。２つのタングステン３ｍｍカーバイドビーズをウェル（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ＃  ６９９９７）に追加した後、プレートを、４℃で一晩、最高速度でシェーカー上に置いた。均質な糞便懸濁液を、４℃で１０分間にわたり１２００ｒｐｍで遠心分離し、上清を９６ウェルプレートに回収した。糞便リポカリン‐２（Ｌｃｎ２）レベルを、マウスＤｕｏｓｅｔリポカリン−２／ＮＧＡＬ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃  ＤＹ１８５７，ロット＃  Ｐ１１６３５９）を用いて、製造業者の指示に従って測定した。データ解析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを用いて実施した。
【０１４２】
結腸ホモジネートにおけるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性の測定−結腸の遠位部の断片を、Ｔ−ｐｅｒ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ＃  ３７８５１０，ロット＃  ＲＦ２３６２１７）、１×  Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ＃  ８７７８６，ロット＃  ＱＧ２２１７６３）および５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ＃  ７８４２９）を含有する２つのタングステン３ｍｍカーバイドビーズ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ＃  ６９９９７）を含む２ｍＬ微小遠心管に取り込んだ。Ｑｉａｇｅｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｅｒ  ＩＩを用いて、２７．５ｓ−１の頻度で１０分間、結腸組織を破壊した。管を、４℃で８分間にわたり１５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を９６ウェルプレートに回収した。結腸ホモジネートを、タンパク質アッセイダイ（ＢｉｏＲａｄ，Ｃａｔ＃  ５００−０００６，ロット＃  ２１０００８１４９）を使用してＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイに供し、総タンパク質含有量を定量した。結腸ホモジネート中のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を、マウスＭＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（ＨＨｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ＃  ＨＫ２１０−０２，ロット＃  ２１０２２ＫＯ６１７−Ｙ）を用いて、製造業者の指示に従って測定した。データ解析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを用いて実施した。ＭＰＯレベルは、総タンパク質含有量量に対して正規化された。
【０１４３】
結腸ホモジネートにおけるサイトカインの測定−結腸ホモジネート中のサイトカイン濃度を、Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｐａｎｅｌ  １（マウス）マルチプレックスイムノアッセイキット（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｃａｔ＃  Ｋ１５０４８Ｄ）を用いて、製造業者の指示に従って測定した。簡潔に述べると、５０μＬ／ウェルのキャリブレータおよび試料（Ｄｉｌｕｅｎｔ  ４１で希釈）を、捕捉抗体で予めコーティングされたプレートに加え、７００ｒｐｍで２時間振とうしながら室温でインキュベートした。次いで、プレートを０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳで３回洗浄し、続いてＤｉｌｕｅｎｔ  ４５で希釈した２５μＬの検出抗体溶液を加えた。振とうしながら室温で２時間インキュベーションした後、プレートを３回洗浄し、各ウェルに１５０μＬの２×Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒを加えた。電気化学発光は、ＭＳＤ  Ｓｐｅｃｔｏｒ（登録商標）機器で直ちに読み取られた。データ解析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを用いて実施した。サイトカインレベルは、総タンパク質含有量に対して正規化された。
【０１４４】
統計解析−テューキーの多重比較事後検定（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．００５，＊＊＊ｐ＜０．０００５，＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）を用いて、一方向ＡＮＯＶＡ法により群内の統計的有意差を判定した（＊−ＰＢＳ処置群からの統計的有意差、および＃−対応するアイソタイプ処置群からの統計的有意差の両方について同じ）。
【０１４５】
結果
ヒト化ＤＩＴＲＡ様マウスは、乾癬のＩＭＱ誘発性モデルにおいて皮膚炎症の増強を呈する
【０１４６】
ＧＰＰまたはＤＩＴＲＡ（「インターロイキン  ３６  受容体拮抗因子欠乏症」）患者に類似した脱制御ＩＬ−３６Ｒシグナル伝達の役割を調べるために、実施例１に記載されるように、マウスはヒト化ＩＬ−３６Ｒ（例えば、Ｉｌ１ｒｌ２）およびヒトＩＬ−３６α、β、γリガンドを有すが、ＩＬ−３６Ｒａアンタゴニストは有さないように作製された。得られたｈＩＬ−３６Ｒ／ｈＩＬ−３６α、β、γマウスは、ＤＩＴＲＡ患者に似た増強されたＩＬ−３６Ｒシグナル伝達をもたらす、ヒトＩＬ−３６Ｒに対するマウスＩＬ３６Ｒａの親和性が２０分の１に減少したことにより、ＤＩＴＲＡ様マウスと称された（ＤＩＴＲＡ患者のより詳細な検討については、例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される、Ｍａｒｒａｋｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１１，３６５：６２０−６２８を参照のこと）。
【０１４７】
無負荷状態では、ＤＩＴＲＡ様マウスは何の自然発生性疾患も発症しなかった。対照的に、表現型および組織学的特徴の点でヒト乾癬病変に非常に類似したＩＭＱ誘発性乾癬様皮膚炎の前臨床モデルにおいて（乾癬様皮膚炎の特性に関するより詳細な考察については、それらの全体が参照により本明細書に援用される、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｆｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９，１８２：５８３６−５８４５；Ｓｗｉｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１１，６：ｅ１８２６６を参照のこと）、ＤＩＴＲＡ様マウスは、そのＷＴ同腹仔と比較して皮膚炎症の増強を呈した（図３Ａ〜３Ｂ）。簡潔に述べると、ＤＩＴＲＡ様マウスおよびＷＴマウスの剃った背部皮膚に、ＩＭＱを四日間連続で毎日適用した。５日目に、後の病理組織学的評価、タンパク質およびＲＮＡ単離のために皮膚を採取した。ＩＭＱ処置済みＤＩＴＲＡ様マウスは、ＷＴ同腹仔と比較して、落屑、紅斑および皮膚肥厚などのより重度の乾癬病変を発症した（図３Ａ）。臨床的特徴と一致して、皮膚の病理組織学的評価により、ＤＩＴＲＡ様マウスにおいて、より増強されたアカントーシス、錯角化症、およびケラチノサイト分化の乱れが明らかになった（図３Ｂ）。ＩＭＱ処置済みＤＩＴＲＡ様マウスもまた、ＧＰＰ患者と同様に、マンロー膿瘍または膿疱の数の顕著な増加を呈した。さらに、ＩＭＱの適用は、ＷＴ同腹仔と比較して、ＤＩＴＲＡ様マウスの皮膚における乾癬（例えば、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−１７ｆ、ＩＬ−２３ａ、Ｓ１００Ａ８、Ｄｅｆｂ４を含む炎症促進性分子）において脱制御された炎症促進性分子レベルの増加をもたらした（図３Ｃ）。さらに、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γｍＲＮＡの発現は、ＩＭＱ処置済ＤＩＴＲＡ様マウスおよびＩＭＱ処置済野生型マウスにおいて、ヴァセリン処置済ＤＩＴＲＡ様マウスおよびヴァセリン済処置野生型マウスと比較して等しく増加したが、ＩＬ−３６αおよびＩＬ−３６βサイトカインのタンパク質レベルは、ＤＩＴＲＡ様マウスの炎症皮膚において、野生型マウスの炎症皮膚におけるレベルと比較して、２倍高い濃度で検出された。
【０１４８】
ヒト化ＤＩＴＲＡ様マウスは、ＤＳＳ誘発性の慢性大腸炎モデルにおいて粘膜治癒に欠陥を示す−近年、患者のサブセットにおけるいくつかの研究において、ＩＢＤにおけるＩＬ−３６軸の脱制御発現とその腸炎症への寄与の可能性が示された。ＩＬ−３６αおよびＩＬ−３６βの発現は、潰瘍性大腸炎患者の炎症粘膜において上昇することが示された（それらの全てが参照により本明細書に援用される、Ｍｅｄｉｎａ−Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１６，１９６：３４−３８；Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ  ２０１６，２２：３０３−３１４，およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１６，９：１１９３−１２０４を参照のこと）。前臨床モデルでは、ＩＬ−３６Ｒ欠損症はＤＳＳ誘発性大腸炎およびオキサゾロン誘発性大腸炎から保護される（それらの全体が参照により本明細書に援用される、Ｍｅｄｉｎａ−Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１６，１９６：３４−３８；Ｈａｒｕｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１７，１０：１４５５−１４６７を参照のこと）。定常状態で、ＤＩＴＲＡ様マウスは、自発性回腸炎／大腸炎を発症しなかったが、幼齢（３ヶ月および１０ヶ月齢）で有意に短縮した結腸を呈した（図４Ａおよび４Ｂ）。また、定常状態および野生型マウスと比較して、ＤＩＴＲＡ様マウスはＩＬ−３６サイトカインのレベルの上昇を示し、ならびにＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−１７Ａのレベルの上昇傾向、および結腸におけるＩＬ−２１レベルの低下を示した。
【０１４９】
腸炎症におけるＩＬ−３６軸の役割を評価するため、結腸上皮を損傷し（それらの全体が参照により本明細書に援用される、Ｏｋａｙａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９０，９８：６９４−７０２，ｈｅｒｅｉｎ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｅｎｔｉｒｅｔｙ）および強力な炎症反応をトリガーする（Ｒａｋｏｆｆ−Ｎａｈｏｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００４，１１８：２２９−２４１）ＤＳＳの経口投与により、化学的に誘発された腸管損傷モデルを用い、特に潰瘍性大腸炎においてＩＢＤの主要な特徴を示している。ＤＩＴＲＡ様マウスおよびその共収容されたＷＴ同腹仔を、２．５％  ＤＳＳの７日間投与、その後の１１日間の水（一回目）投与および１．５％  ＤＳＳの４日間投与、その後の５日間の水（二回目）投与により、ＤＳＳ誘発性慢性大腸炎レジメンに供した。疾患の急性期において、ＤＩＴＲＡ様マウスは、共収容されたＷＴ同腹仔と類似した腸炎症を発症した（図５Ａ）。興味深いことに、疾患の回復期において、ＤＩＴＲＡ様マウスは、持続的な体重減少（図５Ａ）、結腸長の有意な短縮（図５Ｂ）、より重度の病理スコア（より重度の潰瘍形成、広範な上皮びらんおよび好中球浸潤に関連）（図５Ｃ）、糞便リポカリン−２（Ｌｃｎ２）レベルおよびミエロペルオキシダーゼ活性の有意な上昇（図５Ｄ）、ＫＣ−ＧＲＯ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６などの炎症促進性サイトカインのアップレギュレーション、および結腸におけるＩＬ−２２レベルの低下（図５Ｅ）に反映されたＤＳＳ誘発性粘膜損傷からの回復不能を示した。さらに、ＤＩＴＲＡ様マウスは、約６２．５％の死亡率を示した（データは示さず）。対照的に、ＷＴマウスは大腸炎の回復期に回復し、死亡率は２５％であった。また、腸上皮の完全性を、ＤＩＴＲＡ様マウスおよび野生型マウスをフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）−デキストランを用いて経口的に強制投与することによって調査した。ＦＩＴＣ−デキトランレベルの有意な増加が、ＤＳＳ処置の１４日目にＤＩＴＲＡ様マウスの血清中で観察され、腸損傷中の腸透過性の制御にＩＬ−３６経路が関与していることが示唆された。したがって、ＤＩＴＲＡ様マウスにおけるＩＬ−３６シグナル伝達の亢進は、腸炎症の増悪および粘膜修復の欠陥をもたらし、腸組織リモデリングに関与する機構の制御におけるＩＬ−３６の役割を示唆する。
【０１５０】
抗ヒトＩＬ−３６Ｒモノクローナル抗体は、予防的投与時にＤＩＴＲＡ様マウスの急性皮膚炎症を阻害する−皮膚炎症におけるＩＬ−３６Ｒの役割を調べるために、乾癬様皮膚炎のＩＭＱ誘発性モデルにおいて抗ヒトＩＬ−３６Ｒモノクローナル抗体を試験した。ＤＩＴＲＡ様マウスの剃った背部皮膚に、ＩＭＱを四日間連続で毎日適用した。抗ヒトＩＬ−３６Ｒモノクローナル抗体を、ＩＭＱ適用を開始する３日前（−３ｄ）および１日後（ｄ１）に１０ｍｇ／ｋｇで投与した。対照群は、ＰＢＳおよび１０ｍｇ／ｋｇでｈＩｇＧ４アイソタイプ対照注射を受けた。５日目に、後の病理組織学的評価およびタンパク質単離のために皮膚を採取した。抗ヒトＩＬ−３６Ｒモノクローナル抗体は、ＰＢＳ処置群およびアイソタイプ対照処置群と比較して、錯角化症およびマンロー微小膿瘍を含むＩＭＱ誘発性総病理スコアを有意に減少させた（図６Ａ）。また、ヒトＩＬ−３６Ｒ遮断は、ＫＣ−ＧＲＯ、ＩＬ−６、およびＴＮＦαにおける６６〜９３％の減少をもたらした（図６Ｂ）。重要なことに、抗ヒトＩＬ−３６Ｒ抗体処置は、乾癬（例えば、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１７ｆ、およびＩＬ−１７ａ）において脱制御された炎症促進性サイトカインのレベルを大幅に減少させ（図６Ｂ）、これらのサイトカイン経路間で厳密に制御された相互作用を示唆している。急性ＩＭＱ誘発性皮膚炎症の抑制における抗ヒトＩＬ−３６Ｒモノクローナル抗体の観察された有効性は用量依存的であり、１０ｍｇ／ｋｇの用量では、１ｍｇ／ｋｇの用量と比較して、皮膚ホモジネートの病理スコア、皮膚の厚さ、および炎症促進性サイトカインのレベルに基づいて決定される皮膚炎症のより強力な阻害をもたらした（データは示していない）。
【０１５１】
抗ヒトＩＬ−３６Ｒモノクローナル抗体は、治療的投与で慢性皮膚炎症を阻害する−ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトＩＬ−３６Ｒアンタゴニズムの治療有効性をさらに検討するために、同じ抗ヒトＩＬ−３６Ｒモノクローナル抗体を慢性ＩＭＱ誘発性皮膚炎症モデルで試験した。二週間にわたり、ＤＩＴＲＡ様マウスの剃った背部皮膚に、九日間を二回、間に無処置の二日間を挟んでＩＭＱを適用した。抗ヒトＩＬ−３６Ｒモノクローナル抗体を、ＩＭＱ適用の開始５日目および９日後に１０ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。対照群は、ＰＢＳおよび１０ｍｇ／ｋｇでｈＩｇＧ４アイソタイプ対照注射を受けた。１２日目に、皮膚の厚さを測り、後続の病理組織学的評価およびタンパク質単離のために組織を採取した。急性ＩＭＱ誘発性炎症と同様、長期のＩＭＱ適用は、ＤＩＴＲＡ様マウスの皮膚における炎症促進性メディエーターのアップレギュレーションをもたらした（データは示さず）。抗ヒトＩＬ−３６Ｒモノクローナル抗体は、ＤＩＴＲＡ様マウスにおけるＩＭＱ誘発性皮膚厚および病理病変スコアの低下において有意な有効性を示した（それぞれ図７Ａおよび７Ｂ）。さらに、抗ヒトＩＬ−３６Ｒモノクローナル抗体の投与は、ＤＩＴＲＡ様マウスの皮膚における炎症促進性サイトカインのＩＭＱ誘発性産生の有意な阻害をもたらした（図７Ｃ）。
【０１５２】
全体として、データは、インビボでの急性および慢性ＩＭＱ誘発性皮膚炎症の改善における抗ヒトＩＬ−３６Ｒ抗体の予防的および治療的有効性を示した。
【０１５３】
抗ヒトＩＬ−３６Ｒモノクローナル抗体は、治療的投与において、ＤＩＴＲＡ様マウスのＤＳＳ誘発性慢性大腸炎を改善する−ＤＩＴＲＡ様マウスにおいて、ＩＬ−３６シグナル伝達の増強の結果として粘膜治癒の欠陥を示し、ＩＬ−３６遮断が観察された表現型を救済するかどうかをさらに調査した。ＤＩＴＲＡ様マウスを、３％  ＤＳＳを７日間、次いで水を１３日間、二サイクル投与することにより、慢性ＤＳＳ誘発性大腸炎に供した。同じ抗ヒトＩＬ−３６Ｒモノクローナル抗体および抗ｍＩＬ−１２ｐ４０モノクローナル抗体（クローン病の治療に承認されているウステキヌマブのマウスサロゲート）を、１０ｍｇ／ｋｇでの隔週投与を７日目から開始した。対照群は、ＰＢＳおよび対応するｈＩｇＧ４およびラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照注射を１０ｍｇ／ｋｇで受けた。抗ヒトＩＬ−３６Ｒモノクローナル抗体を用いた処置は、ＤＩＴＲＡ様マウスがＤＳＳ誘発性粘膜損傷から回復できるように救済し、ＤＩＴＲＡ様マウスにおけるＰＢＳおよびアイソタイプ対照処置と比較して疾患重症度を低下させた（図８Ａ）。疾患の異なるステージの腸炎症を監視するために、個々のマウスの糞便を毎週収集し、腸損傷における炎症の非侵襲的バイオマーカーである糞便リポカリン−２（Ｌｃｎ２）タンパク質を測定した（例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｔｈｏｒｓｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２０１７，３２：１２８−１３５）。図８Ｂに示す通り、ＰＢＳ処置群、ｈＩｇＧ４処置群、およびラットＩｇＧ２ａ処置群は、水のみの群と比較して１７、２３、および３０日目に糞便Ｌｃｎ２レベルの有意なアップレギュレーションを呈した。驚くべきことに、抗ヒトＩＬ−３６Ｒモノクローナル抗体の投与は、ＰＢＳ処置群およびアイソタイプ処置群と比較して、Ｌｃｎ２レベルの有意な低下をもたらした。糞便Ｌｃｎ２レベルの持続的な低下が、抗ヒトＩＬ−３６抗体処置群において、１７、２３、および３０日目に観察された（図８Ｂ）。
【０１５４】
さらに、抗ヒトＩＬ−３６Ｒモノクローナル抗体を用いたｈＩＬ−３６Ｒ遮断は、ＤＳＳ処置済ＤＩＴＲＡ様マウスの結腸において、結腸長の延長（図８Ｃ）およびミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性の低下（図８Ｄ）および炎症促進性サイトカインの６１〜９５％の減少（図８Ｅ）をもたらした。抗ヒトＩＬ−３６Ｒモノクローナルは、ＤＳＳ誘発性慢性大腸炎の改善においてＩＬ−１２ｐ４０遮断と同程度の有効性を示し、同様に、ＤＩＴＲＡ様マウスの結腸における、糞便Ｌｃｎ２、ＭＰＯ活性および炎症促進性サイトカインの減少にも反映された（図８Ａ−８Ｅ）。
【０１５５】
オキサゾロン誘発性大腸炎におけるＩＬ−３６Ｒ遮断−ＩＬ−３６Ｒ遮断の有効性は、ヒト潰瘍性大腸炎と組織学的に類似したＩＢＤの別の前臨床モデルであるオキサゾロン誘発性大腸炎で試験された（その全体が参照により援用される、Ｈｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７，６２９−６３８（２００２））。抗ヒトＩＬ−３６Ｒ抗体の予防的投与は、平均体重および平均結腸長の減少に反映されるように、ＤＩＴＲＡ様マウスにおけるオキサゾロン誘発性疾患重症度を、ＰＢＳおよびアイソタイプ対照処置群と比較して有意に低下させた（図９Ａ〜９Ｂ）。さらに、ＩＬ−３６Ｒアンタゴニズムは、オキサゾロン処置済ＤＩＴＲＡ様マウスの結腸におけるＩＬ−４およびＴＮＦ−αのレベルの有意な低下をもたらした（図９Ｃ）。
【０１５６】
特許、特許出願、公開特許出願、アクセッション番号、技術論文および学術論文を含む様々な公表文献が、本明細書に引用される。これら引用された各公表文献は、本明細書においてその全体で、すべての目的に対し、参照により援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ−１】
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【図２Ｄ−２】
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【図３Ａ−Ｃ】
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【図３Ｄ−Ｅ】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｃ】
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【図５Ｄ−Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図８Ｃ−Ｅ】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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