(57)【要約】  本発明は、ＸＶ型コラーゲンまたはＸＶＩＩＩ型コラーゲンに由来するホモ三量体化領域に基づき、かつＴＮＦＲファミリーの共刺激受容体に特異的に結合し、その受容体を活性化可能なドメインを含有する、腫瘍標的化三量体ポリペプチド、およびにがんの処置におけるそれらの使用に関する。
2021525537.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つの単量体ポリペプチドを含む三量体ポリペプチド複合体であって、
各単量体ポリペプチドが、
ｉ．ＸＶＩＩＩ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥＸＶＩＩＩ）、ＸＶ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥＸＶ）およびそれらの機能的に等価なバリアントからなる群から選択されるホモ三量体化ドメイン、
ｉｉ．ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニスト
を含み、
少なくとも１つの単量体ポリペプチドが、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域をさらに含む、
三量体ポリペプチド複合体。
【請求項２】
前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域が、前記ホモ三量体化ドメインに対してＮ末端またはＣ末端に位置する、請求項１に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項３】
ａ．前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域が、前記ホモ三量体化ドメインに対してＮ末端に位置する場合、前記ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニストが、前記ホモ三量体化ドメインに対してＣ末端に位置するか、または
ｂ．前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域が、前記ホモ三量体化ドメインに対してＣ末端に位置する場合、前記ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニストが、前記ホモ三量体化ドメインに対してＮ末端に位置する、
請求項２に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項４】
前記ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体が、４−１ＢＢである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項５】
前記ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニストが、アゴニスト抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項６】
前記ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニスト抗体が、ｓｃＦｖ、ナノボディ、または抗体ミメティックである、請求項５に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項７】
前記腫瘍関連抗原が、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項８】
ＥＧＦＲに特異的に結合可能な分子が、抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項９】
抗ＥＧＦＲ抗体が、ｓｃＦｖ、ナノボディ、または抗体ミメティックである、請求項８に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項１０】
前記抗ＥＧＦＲ抗体が、ＥＧＡ１ナノボディである、請求項９に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項１１】
前記腫瘍関連抗原が、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項１２】
ＣＥＡに特異的に結合可能な分子が、抗ＣＥＡ抗体である、請求項１〜６、１１のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項１３】
前記抗ＣＥＡ抗体が、ｓｃＦｖ、ナノボディ、または抗体ミメティックである、請求項１２に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項１４】
前記ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニスト、前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域、および／または前記ホモ三量体化ドメインが、直接連結されてなるか、またはスペーサーを介して連結されてなるかのいずれかである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項１５】
前記スペーサーが、１〜１８残基を有するフレキシブルリンカーである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項１６】
前記ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニストが、１８残基長のリンカーを介して前記ホモ三量体化ドメインと連結されてなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項１７】
腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な分子が、１６残基長のリンカーを介してホモ三量体化ドメインと連結されてなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項１８】
前記単量体の少なくとも１つが、前記三量体ポリペプチドの検出および／または精製のために適切なタグをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項１９】
前記単量体が、三量体ポリペプチドの循環半減期を増加させる部分をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項２０】
前記三量体の循環半減期を増加させる部分が、アルブミン断片またはアルブミン結合部分である、請求項１９に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の三量体ポリペプチドの一部を形成する単量体ポリペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記ポリペプチドをコードする配列に対して５’位にあり、かつ当該配列と同じオープンリーディングフレーム内にあるシグナル配列をコードする配列をさらに含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記シグナル配列が、オンコスタチンＭのシグナル配列である、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチドを生成するための方法であって、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有し、かつ発現する宿主細胞を含む培養物から前記三量体ポリペプチドを単離する工程、および場合により前記三量体ポリペプチドをさらなるプロセシングに付す工程を含む、方法。
【請求項２７】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２８】
がんの処置における使用のための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド。
【請求項２９】
請求項２８に記載の使用のための三量体ポリペプチドであって、前記がんが、当該三量体ポリペプチド中に存在する、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な分子によって特異的に認識される当該腫瘍関連抗原に対して陽性である、三量体ポリペプチド。
【請求項３０】
前記がんが、結腸直腸がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、腎臓がん、頭頸部がん、胃がん、食道がん、婦人科がん、前立腺がん、尿路上皮がん、神経がん、および血液がんである、請求項２９に記載の使用のための三量体ポリペプチド。
【請求項３１】
婦人科がんが、卵巣がん、子宮頸がんおよび子宮内膜がんからなる群から選択され、神経がんが、多形神経膠芽腫であり、または血液がんが、急性骨髄性白血病である、請求項３０に記載の使用のための三量体ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん治療学の分野に関し、より具体的には、コラーゲンホモ三量体化ドメインによって形成される三量体ポリペプチド複合体である治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用する免疫応答の調節は、がん治療に対する前途有望なアプローチである。ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１などのチェックポイント阻害剤に対して作られるアンタゴニストｍＡｂは、臨床的に承認されており、共刺激受容体を標的にするアゴニストｍＡｂは、臨床試験中である。ＣＤ４０、ＯＸ４０および４−１ＢＢなどのＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）の共刺激受容体は、特に興味深い。これらの中でも、４−１ＢＢは、休止しているネイティブＴ細胞において構造的に発現されないが、活性化の際に獲得される。これは、処置の可能性のある有害な副作用を制限する。
【０００３】
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）は、唯一の確認されたリガンド［４−１ＢＢ−リガンド（４−１ＢＢＬ）、ＴＮＦＳＦ９］を有し、これは、マクロファージ、活性化Ｂ細胞および樹状細胞において発現する。そのリガンドまたはアンタゴニスト抗体による４−１ＢＢの会合は、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生および細胞溶解性エフェクター機能を促進し、プログラム細胞死からリンパ球を保護する。さらにまた、ＮＫ細胞における４−１ＢＢの会合は、サイトカイン放出（ＩＦＮγを含む）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増強する。実際に、４−１ＢＢアゴニストｍＡｂによるマウスの処置は、早くも１９９７年には、確立された低免疫原性腫瘍の腫瘍縮小を誘導することが見出された。それ以来、多くの蓄積された前臨床データは、単一薬剤および併用療法の両方として、がん免疫療法における４−１ＢＢシグナル伝達の誘導を裏付ける。
【０００４】
４−１ＢＢアゴニストｍＡｂの効果は、腫瘍を空間的に制限せず、したがって、末梢毒性は、４−１ＢＢ標的化治療のための治療ウィンドウを低減し得る。マウスにおいて、４−１ＢＢ  ｍＡｂは、免疫関連異常、特に、肝臓、脾臓および骨髄の機能に影響を与える、ＣＤ８＋Ｔ細胞のポリクローナル活性化および炎症性サイトカインの分泌を引き起こすことが示されている。臨床研究において、抗４−１ＢＢ  ｍＡｂ（ＢＭＳ−６６３５１３、ウレルマブ、ヒトＩｇＧ４）は、初期フェーズＩ治験において容認できる副作用を示したが、続くフェーズＩＩの治験は、２人の死亡者をもたらした、＞１０％の患者における重度の肝臓毒性を明らかにした。結果として、ウレルマブによる治験は打ち切られた。最近、単剤療法として、およびニボルマブとの併用として、ウレルマブによる用量漸増試験において、データが示された。低減された用量は、肝臓毒性を改善したが、許容される用量でのウレルマブの臨床活性は限定的であった。ウレルマブで処置された患者の総合的な安全性分析は、高トランスアミナーゼ血症とウレルマブの用量の間の強い関連を確認した。ウトミルマブ（ヒトＩｇＧ２）は、ウレルマブと比べて優れた安全性プロファイルを有する臨床試験中の別の抗４−１ＢＢ  ｍＡｂであるが、４−１ＢＢアゴニストとして効力が比較的低い。
【０００５】
別の戦略は、４−１ＢＢＬに代わる、抗４−１ＢＢオリゴヌクレオチドアプタマーの使用である。動物モデルにおいて、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）アプタマーとコンジュゲートした４−１ＢＢアゴニストアプタマーの全身送達は、ＩｇＧに基づく４−１ＢＢアゴニスト抗体と比較して、優れた治療効果をもたらした。リポソームの表面における抗４−１ＢＢ  Ｆ（ａｂ’）２断片およびＩＬ−２のアンカリングが、全身毒性なく、有効な抗腫瘍免疫を誘導することも最近報告されている。
【０００６】
現状では、４−１ＢＢアゴニストｍＡｂによる共刺激は、オフ腫瘍毒性によって阻止される別の実行可能な治療アプローチである。このため、腫瘍標的化処置について、重度の副作用なしに、有効な免疫刺激を可能にする新たな戦略を設計する必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の創作者らは、４−１ＢＢアゴニストＩｇＧを、二重特異性腫瘍標的化トリマーボディフォーマットに適合させた。この操作された抗体フォーマットは、ＸＶ型またはＸＶＩＩＩ型コラーゲンに由来する小さなホモ三量体化領域との抗体由来結合ドメインの融合に基づいており、これは、トリマーボディと呼ばれる三量体抗体を生じる。この操作された抗体は、より強力な共刺激インビトロ活性を発揮し、単一特異性の非標的化抗体に関して、インビボで、増強された腫瘍ホーミング／標的化、および抗腫瘍活性を示した。加えて、ＩｇＧに基づく抗４−１ＢＢアゴニスト抗体によるナイーブ免疫適格性マウスの処置は、肥大した炎症がある脾臓および肝臓によって評価される重度の毒性、肝臓、脾臓および膵臓における重度の炎症および線維症、ならびに全身の炎症性サイトカイン産生をもたらし、ＥＧＦＲまたはＣＥＡ標的化４−１ＢＢアゴニストトリマーボディによる処置は、これらの免疫関連副作用がなく、したがって、有効な（ａｆｆｅｃｔｉｖｅ）治療アプローチとしてそれ自身を構成する。
【０００８】
したがって、第１の態様において、本発明は、３つの単量体ポリペプチドを含む三量体ポリペプチド複合体であって、
各単量体が、
ｉ．ＸＶＩＩＩ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥＸＶＩＩＩ）、ＸＶ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥＸＶ）およびそれらの機能的に等価なバリアントからなる群から選択されるホモ三量体化ドメイン、ならびに
ｉｉ．ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニスト
を含み、
少なくとも１つの単量体ポリペプチドが、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域をさらに含む、
三量体ポリペプチド複合体に関する。
【０００９】
第２の態様において、本発明は、本発明により定義される三量体ポリペプチドの一部を形成する単量体ポリペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１０】
第３の態様において、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００１１】
第４の態様において、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。
【００１２】
第５の態様において、本発明は、本発明による三量体ポリペプチド複合体を生成するための方法であって、本発明によるポリヌクレオチドを有し、かつ発現する宿主細胞を含む培養物から前記三量体ポリペプチドを単離する工程、および場合により三量体ポリペプチドをさらなるプロセシングに付す工程を含む、方法に関する。
【００１３】
第６の態様において、本発明は、本発明による三量体ポリペプチドを含む医薬組成物に関する。
【００１４】
第８の態様において、本発明は、がんの処置における使用のための、本発明の三量体ポリペプチド複合体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】抗４−１ＢＢ  ＩｇＧのドメイン構造（Ａ）、ならびに単一特異性トリマーボディ（Ｂ）および二重特異性トリマーボディ（Ｃ）の遺伝子構造（左）およびドメイン構造（右）を示す模式図。すべての場合において、ＩＤ８抗体に由来する可変領域を濃灰色および淡灰色で表し（ＶＬおよびＶＨで指定される）、抗ＥＧＦＲ  ＶＨＨ  ＥＧａ１抗体を淡灰色で表し（ＶＨＨで示される）、構造ドメイン（ＴＩＥ、５ＴＩＥ  １８ＴＩＥまたは１８ＴＩＥ１８）を淡灰色で表し、ＴＩＥ構造ドメインを包含するリンカー領域も淡灰色で表す。１Ｄ８  ｓｃＦｖに基づくＮ末端トリマーボディ（１Ｄ８Ｎ）遺伝子コンストラクト（Ｂ）は、オンコスタチンＭに由来するシグナルペプチド（「Ｓ」により表される）を含有し、１Ｄ８  ｓｃＦｖ遺伝子（ＶＬ−ＶＨ）は、マウスＴＩＥＸＶＩＩＩドメインに、直接連結したか、またはフレキシブルリンカーを介して連結した。二重特異性１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディ（Ｃ）において、抗ヒトＥＧＦＲ  ＶＨＨは、フレキシブルリンカーを介して１Ｄ８Ｎ１８のＣ末端に融合される。矢印は転写の方向を示す。Ｈｉｓ６−ｍｙｃタグ（ＴＩＥドメインに対してＣ末端に位置するボックスにおいて「Ｔ」により表される）およびｆｌａｇ−ｓｔｒｅｐタグ（シグナルペプチドに対してＣ末端に位置するボックスにおいて「Ｔ」により表される）は免疫検出のために付加された。
【図２】抗４−１ＢＢトリマーボディの特性評価。（Ａ）バイオレイヤー干渉法によって得られた、１Ｄ８抗体についてのセンサーグラム（黒色曲線）およびフィッティング曲線。バイオセンサーをｍ４−１ＢＢで固定化し、２および４ｎＭの分析物抗体と会合させた。反復バイオセンサー（示さない）は、より高い同様の応答を示し、フィッティング曲線に寄与した。（Ｂ）ＦＡＣＳによって測定された、刺激されたマウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞の細胞表面上の４−１ＢＢへの結合。（Ｃ〜Ｅ）抗４−１ＢＢ抗体の共刺激活性。マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞を、ｍ４−１ＢＢＬ、１Ｄ８Ｎ５、１Ｄ８Ｎ１８または１Ｄ８  ＩｇＧの存在下、固定化抗ＣＤ３  ｍＡｂで刺激し、増殖（Ｃ）およびＩＦＮγの分泌（Ｄ）を４８時間後に測定し、細胞生存率（Ｅ）を７２時間後に測定した。データを、抗ＣＤ３  ｍＡｂで刺激されたＣＤ８ａ＋Ｔ細胞から得られた値に対する倍数変化として報告する。ラットＩｇＧ２ａおよびＭＦＥ−２３Ｎ１８を対照として使用した。結果は、少なくとも３つの別々の実験の１つからの平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表す。有意性を、独立Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって測定した；＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１。（Ｆ）ＲＩＣＳ分析を、１Ｄ８  ＩｇＧまたは１Ｄ８Ｎ１８の添加の際に形成されるクラスターを含有する領域、およびクラスターが存在しない領域（それぞれ、挿入およびズームイン領域ｉｉおよびｉ）で、生存ＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ−Ｓ細胞において行った。目的のＲＩＣＳ分析された領域を示す代表的な最大強度のプロジェクションマップ。ズームイン領域の値は、結合した抗体の拡散係数を示す。カラーのヒートマップは、青みがかったトーンがより低い強度、赤みがかったトーンがより高い強度を示す。（Ｇ）挿入図の右側に、統計分析を、５〜７回の独立した生細胞実験および細胞あたり３〜５個の異なる目的の領域（Ｎ−ＣＲ、非クラスター化領域；ＣＲ、クラスター化領域）から得られた箱ひげ図の形式で表す。
【図３】ＥＧＦＲ標的化４−１ＢＢアゴニストトリマーボディの特性評価。（Ａ）１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１（２および４ｎＭ）と固定化ｍ４−１ＢＢの相互作用、および１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１（０．５および１ｎＭ）と固定化ｈＥＧＦＲの相互作用について、バイオレイヤー干渉法を使用して得られた、センサーグラム（黒色曲線）および１：１モデルに対するフィッティングの結果（赤色曲線）。会合および解離を、２時間にわたってそれぞれ測定した。（Ｂ）ｍ４−１ＢＢおよびｈＥＧＦＲの両方への同時の結合は、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１について実証されたが、１Ｄ８Ｎ１８については実証されなかった。バイオセンサーを、ｍ４−１ＢＢでコーティングし、その後、４ｎＭの１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１（黒色曲線）または１Ｄ８Ｎ１８（青色曲線）を添加した。トリマーボディをｍ４−１ＢＢと１時間会合させた後、バイオセンサーを、次いで、緩衝液のみ、または１０ｎＭのｈＥＧＦＲを含有するウェルに移動させた。（Ｃ）ＦＡＣＳによって測定された、刺激されたマウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞の細胞表面上の抗４−１ＢＢ抗体のｍ４−１ＢＢへの結合。精製マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞を、固定化抗ＣＤ３  ｍＡｂ、およびｈＥＧＦＲまたはＢＳＡで被覆し、１Ｄ８Ｎ１８、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１または１Ｄ８  ＩｇＧの存在下、４８時間刺激した。増殖をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光アッセイで測定し（Ｄ）、ＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡによって決定した（Ｅ）。ＥＧＦＲ陰性の３Ｔ３細胞またはＥＧＦＲ陽性の３Ｔ３ｈＥＧＦＲ細胞を、抗−ＣＤ３  ｍＡｂ、および１Ｄ８Ｎ１８、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１または１Ｄ８  ＩｇＧの存在下、マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞と共培養し、ＩＦＮγ分泌を４８時間後に分析し（Ｆ）、細胞生存率を７２時間後に分析した（Ｇ）。データを、抗ＣＤ３  ｍＡｂで刺激された細胞から得られた値に対する倍数変化として表す。ラットＩｇＧ２ａおよびＭＦＥ−２３Ｎ１８を陰性対照として使用した。結果は、少なくとも３つの別々の実験の１つからの平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表す。有意性を、独立Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって測定した；＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【図４】ＥＧＦＲ標的化４−１ＢＢアゴニストトリマーボディの薬物動態学的性質および腫瘍イメージング。（Ａ）ＣＤ１マウスにおける１Ｄ８Ｎ１８または１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１（１ｍｇ／Ｋｇ）の単回ｉ．ｖ．投与後の薬物動態研究。血液試料を異なる時点で収集し、血清をＥＬＩＳＡによってトリマーボディ濃度について分析した。データを平均±ＳＤ（１時点あたりｎ＝３）として表す。（Ｂ）ＰＢＳ、または１００μｇのＣＦ６４７−標識化３Ｈ３  ＩｇＧ、または１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１のｉ．ｖ．注射２４時間後のＡ４３１腫瘍保持ヌードマウスのインビボの蛍光イメージング。（Ｃ）腫瘍と正常組織（Ｔ／Ｎ）比を、すべての画像について計算した。目的の領域を、腫瘍および正常組織に描いて、ステラジアンあたり、平方センチメートルあたり、秒あたりの光子（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）として蛍光強度を測定した。有意性を、独立Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって測定した；＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【図５】１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディで処置されたマウスにおける腫瘍縮小の誘導。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ｓ．ｃ．でＣＴ２６ｈＥＧＦＲ腫瘍細胞を接種した。（Ａ）マウス（ｎ＝６／群）を、３回のｉ．ｐ．用量（４ｍｇ／ｋｇ）の、ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ、１Ｄ８  ＩｇＧ、ＭＦＥ−２３Ｎ１８、１Ｄ８Ｎ１８、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１、またはＰＢＳで処置し、腫瘍成長について監視した。各処置群における個々のマウスについての腫瘍直径の成長曲線を表す。結果は、独立して行われた２回の実験の代表である。（Ｂ）マウス（ｎ＝５／群）を、ＰＢＳ、３Ｈ３  ＩｇＧまたは１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１（Ｂ）のいずれかの３回のｉ．ｐ．用量で処置した。（Ｃ）１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディ処置マウスの生存曲線。長期間の生存体に、完全な腫瘍拒絶後（Ｂ）、３Ｈ３  ＩｇＧまたは１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディのｉ．ｐ．注射の５０日後に、ＣＴ２６ｍｏｃｋ細胞（ｓ．ｃ．）で再負荷した。対照群として、腫瘍ナイーブマウスは、すべてのケースにおいて腫瘍を発生した。各処置群における個々のマウスについての腫瘍直径の成長曲線を表す。
【図６】１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１で処置されたマウスは、脾腫、肝腫大または組織炎症を発生しない。（Ａ）ＰＢＳ、３Ｈ３  ＩｇＧまたは１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１で処置されたマウス（ｎ＝５／群）からの脾臓および肝臓の重量を示す。（Ｂ）ＰＢＳ、３Ｈ３  ＩｇＧおよび１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１で処置されたマウスの脾臓、肝臓、膵臓および肺からの代表的な組織スライドのヘマトキシリンおよびエオシン染色。倍率は、４０倍（脾臓および肝臓）および２００倍（乾燥、膵臓および肺）である。スケールバーを示す。（Ｃ）ＰＢＳ（ｎ＝３）、３Ｈ３  ＩｇＧ（ｎ＝５）または１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１（ｎ＝４）で処置されたマウスの肝臓における単核細胞浸潤表面の定量化。（Ｄ）処置されたマウスからの血清を、処置の０、７および２１日目に末梢血から収集し、ＩＮＦγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−６のレベルを、ルミネックスアッセイ（１時点あたりｎ＝３）によって測定した。すべての統計値を平均±ＳＤとして表す。有意性を、独立Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって測定した；＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【図７】（Ａ）トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞から条件培地において分泌された１Ｄ８Ｎ１８、１Ｄ８Ｎ５および１Ｄ８Ｎ０トリマーボディの存在を、ウエスタンブロット分析によって実証した。分子質量マーカーの泳動を示す（ｋＤａ）。（Ｂ）分泌された１Ｄ８Ｎ１８、１Ｄ８Ｎ５、１Ｄ８Ｎ０およびＭＦＥ−２３Ｎ１８トリマーボディの機能性を、プラスチック固定化ｍ４−１ＢＢおよびヒトＣＥＡに対するＥＬＩＳＡによって実証した。
【図８】（Ａ）精製された１Ｄ８Ｎ１８、１Ｄ８Ｎ５および１Ｄ８Ｎ０、ならびに１Ｄ８  ＩｇＧの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ）ｍ４−１ＢＢ−陰性のＨＥＫ２９３細胞およびｍ４−１ＢＢ−陽性のＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ細胞におけるＦＡＣＳによる１Ｄ８Ｎ１８、１Ｄ８Ｎ５および１Ｄ８Ｎ０の機能的特性評価。１Ｄ８  ＩｇＧおよびＭＦＥ−２３Ｎ１８を対照として使用した。ｙ軸は、細胞の数を示し、ｘ軸は、対数尺度で表された蛍光の強度を表す。３つの独立した実験からの１つの代表的な実験を示す。（Ｃ）１Ｄ８  ＩｇＧは、活性化Ｔ細胞への１Ｄ８Ｎ５および１Ｄ８Ｎ１８の結合を打ち負かす。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ゲート開閉し、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）への１Ｄ８Ｎ５、１Ｄ８Ｎ１８および１Ｄ８  ＩｇＧの結合をＦＡＣＳによって決定した。１Ｄ８  ＩｇＧとのプレインキュベーションによる１Ｄ８Ｎ５および１Ｄ８Ｎ１８結合の妨害を示す。抗ＣＤ８  ｍＡｂによるＴ細胞染色も行って、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の間を区別した。
【図９】（Ａ）還元および非還元条件の両方における精製組換えマウス４−１ＢＢＬのクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ）ＦＡＣＳによるｍ４−１ＢＢＬの機能的特性評価。１Ｄ８Ｎ１８を対照として使用した。ｙ軸は、細胞の数を示し、ｘ軸は、対数尺度で表された蛍光の強度を表す。３つの独立した実験からの１つの代表的な実験を示す。（Ｃ）固定化ｍ４−１ＢＢへの１Ｄ８Ｎ１８トリマーボディの結合を遮断するｍ４−１ＢＢＬの機能的能力を、固定濃度のｍ４−１ＢＢＬおよび連続希釈の１Ｄ８Ｎ１８との競合ＥＬＩＳＡにおいて測定した。示されたデータを、全部で３つの実験からの１つの代表的な実験の平均±ＳＤとして表す。
【図１０】ＣＦ４８８Ａ標識化抗体の特性評価。（Ａ）還元条件におけるＣＦ４８８Ａ標識化１Ｄ８  ＩｇＧ、１Ｄ８Ｎ１８およびｍ４−１ＢＢＬのクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ）ＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ細胞におけるＦＡＣＳによるＣＦ４８８Ａ標識化１Ｄ８  ＩｇＧ、１Ｄ８Ｎ１８およびｍ４−１ＢＢＬの機能的特性評価。ｙ軸は、細胞の数を示し、ｘ軸は、対数尺度で表された蛍光の強度を表す。３つの独立した実験からの１つの代表的な実験を示す。
【図１１】ｍ４−１ＢＢを発現するＨＥＫ−２９３細胞のＦＡＣＳ分析。元のＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ細胞（選別前）の発現プロファイルを青線で示し、均一レベルの４−１ＢＢ  （ＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ−Ｓ）を発現する選別されたＨＥＫ２９３細胞を黒線で示す。ＰＥコンジュゲート化アイソタイプ対照抗体とともにインキュベートされた細胞を、灰色で塗りつぶされたヒストグラムとして示す。ｙ軸は、細胞の数を示し、ｘ軸は、対数尺度で表された蛍光の強度を表す。３つの独立した実験からの１つの代表的な実験を示す。
【図１２】細胞膜における受容体の拡散係数は、１Ｄ８Ｎ１８トリマーボディ結合によるクラスター形成において、非常に低い。ＲＩＣＳ分析は、１００ｎｇ／ｍｌの組換えｍ４−１ＢＢＬ（Ａ）、１Ｄ８  ＩｇＧ（Ｂ）または１Ｄ８Ｎ１８（Ｃ）のいずれかの添加の後、ＨＥＫ−２９３ｍ４−１ＢＢ−Ｓ細胞の細胞膜での分子移動度を示す。左から右へ：微分干渉コントラスト画像（ＤＩＣ）；調査された細胞膜領域の蛍光強度画像；２つの白色の四角で強調表示された領域を示す（ｉおよびｉｉ；ｉ領域は、領域ｉｉよりも少ないクラスター形成を示すか、クラスター形成を示さない）、全く同じ領域の平均強度の投影マップ；目的のｉおよびｉｉのズームアウト領域；２Ｄ自己相関関数マップ、およびフィッティングから得られたそれぞれの拡散係数；得られたフィッティングの３Ｄ相関のフィット表面プロット。分析は、１５０を超えるフレームで行った（約５分、フレームあたり２秒）。基準の目的のために、ピクセルサイズは、８０．４ｎｍであり、フルフレーム画像は２５６×２５６ピクセルであり、ズームイン領域は６４×６４ピクセルである。
【図１３】１Ｄ８Ｎ１８トリマーボディの構造的特性評価。（Ａ）ＳＥＣ−ＭＡＬＳ。黒線はＵＶ吸光度に相当し（左軸）、赤線は測定されたモル質量に相当する（右軸）。左から右へ、ピークは、六量体（総強度の１６％）、未知のマイナー不純物（３％）および三量体（８１％）に相当する。（Ｂ）セミ分取ＳＥＣによる、１Ｄ８Ｎ１８六量体および三量体の分離のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＭＷは分子量マーカーであり、ＩｐＴはカラムに注入された物質であり、数字はクロマトグラムの画分に相当する。（Ｃ）Ｂにおいて分析された１Ｄ８Ｎ１８のＳＥＣクロマトグラムの画分１４のＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析。左軸はＵＶ吸光度に相当し、右軸は測定されたモル質量に相当する。三量体に相当するピークは、総強度の９７％を占める。
【図１４】１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディの構造的特性評価。（Ａ）精製された１Ｄ８Ｎ１８および１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ）クロマトグラフィーピークの中央で測定された示された分子質量を有する１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１のＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析。左軸はＵＶ吸光度に相当し、右軸は測定されたモル質量に相当する。左から右へ、ピークは、六量体（総強度の１６％）および三量体（８４％）に相当する。（Ｃ）セミ分取ＳＥＣによる、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１六量体および三量体の分離のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＭＷは分子量マーカーであり、ＩｐＴはカラムに注入された物質であり、数字はクロマトグラムの画分に相当する。（Ｄ）Ｂにおいて分析された１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１のＳＥＣクロマトグラムの画分１２のＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析。左軸はＵＶ吸光度に相当し、右軸は測定されたモル質量に相当する。三量体に相当するピークは、総強度の９７％を占める。円二色性スペクトル（Ｅ）、および２１８ｎｍでの円二色性（ｄｉｃｒｏｉｓｍ）楕円率の変化によって測定された１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の（不可逆的）熱変性（Ｆ）。
【図１５】ＦＡＣＳによる１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディの機能的特性評価。１Ｄ８  ＩｇＧおよびセツキシマブを対照として使用した。ｙ軸は、細胞の相対数を示し、ｘ軸は、対数尺度で表された蛍光の強度を表す。３つの独立した実験からの１つの代表的な実験を示す。
【図１６】ＥＧＦＲ媒介シグナル伝達に対する１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディの効果。（Ａ）Ａ４３１細胞増殖の阻害。細胞を、示された用量の１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１、１Ｄ８  ＩｇＧ、セツキシマブ（陽性対照）またはリツキシマブ（陰性対照）で処置した。生存細胞を処置の７２時間後に三反復で測定し、未処置対照に対してプロットした。結果を平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表す。有意性を、独立Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって測定した；＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１（緑色のアスタリスク、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１とリツキシマブの比較；赤色のアスタリスク、セツキシマブとリツキシマブの比較）。（Ｂ）ＥＧＦＲリン酸化の阻害。細胞を、ＥＧＦまたはビヒクルによる５分間の刺激の４時間前に、５０ｎＭの各抗体とともにプレインキュベートした。ＥＧＦＲのリン酸化状態をウエスタンブロットによって評価した。
【図１７】精製された１Ｄ８Ｎ１８および１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディの血清安定性。プラスチック固定されたｍ４−１ＢＢ（Ａ）またはｈＥＧＦＲ（Ｂ）に対するＥＬＩＳＡを、ヒト血清中における３７℃での異なる時間のインキュベーションの後に行った。
【図１８】腫瘍局在化研究のための１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディ標識化。（Ａ）ＣＦ６４７標識化１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１および３Ｈ３  ＩｇＧの還元条件におけるクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。（Ｂ）ＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢおよびＡ３４１細胞におけるＦＡＣＳによるＣＦ６４７標識化１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１および３Ｈ３  ＩｇＧの機能的特性評価。ｙ軸は、細胞の数を示し、ｘ軸は、対数尺度で表された蛍光の強度を表す。３つの独立した実験からの１つの代表的な実験を示す。
【図１９】１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディのインビボ有効性研究のための腫瘍モデルの検証。（Ａ）ＣＴ２６  ＥＧＦＲ発現細胞（ＣＴ２６ｈＥＧＦＲ）および空のベクターレトロウイルスで感染させたＣＴ２６（ＣＴ２６ｍｏｃｋ）の表面への１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディ結合のＦＡＣＳ分析。１Ｄ８  ＩｇＧおよびセツキシマブを対照として使用した。ｙ軸は、細胞の数を示し、ｘ軸は、対数尺度で表された蛍光の強度を表す。３つの独立した実験からの１つの代表的な実験を示す。（Ｂ）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイによる、ＣＴ２６ｍｏｃｋ細胞に対するＣＴ２６ｈＥＧＦＲのインビトロ細胞増殖の比較分析。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＤを表し、初期値に対する倍数変化として示す。（Ｃ）３０日まで監視された、ＣＴ２６ｈＥＧＦＲに対するＣＴ２６ｍｏｃｋのインビボ腫瘍成長比較。腫瘍体積（ｃｍ３）を、１つの代表的な実験の平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表す（Ｄ）。ＣＴ２６ｈＥＧＦＲ腫瘍を３０日後に抽出し、機械的に解離させ、単一細胞懸濁液を、ＦＡＣＳによりＥＧＦＲ発現について分析した。１頭の代表動物からの結果を示す（ｎ＝５）。（Ｅ）１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディはＣＴ２６ｈＥＧＦＲ増殖の阻害剤ではない。ＣＴ２６ｈＥＧＦＲ細胞を、等モル濃度の１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１、セツキシマブおよびリツキシマブの存在下でインキュベートし、増殖に対するそれらの効果を、対照と比較したパーセンテージとして示す。データは平均±ＳＤ（ｎ＝５）を表す。
【図２０】３Ｈ３  ＩｇＧまたは１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディの全身注射後の持続性の全身免疫媒介応答。長期間の生存体に、完全な腫瘍拒絶後、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディおよび３Ｈ３  ＩｇＧのｉ．ｐ．注射の５０日後に、１．５×１０６個のＣＴ２６ｍｏｃｋ細胞（ｓ．ｃ．）で再負荷した。対照群として、腫瘍ナイーブマウスは、すべてのケースにおいて腫瘍を発生した。各処置群における個々のマウスについての腫瘍直径の成長曲線を表す。
【図２１】コラーゲン線維形成に対する１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディの効果。ＰＢＳ、３Ｈ３  ＩｇＧまたは１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１で処置されたマウスの肝臓および膵臓からの代表的な組織スライドのコラーゲン線維のシリウスレッド染色。倍率は、４０倍、および２００倍（肝臓）、ならびに１００倍（膵臓）である。スケールバーを示す。
【図２２】コラーゲン線維形成に対する１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディの効果。生理食塩水、３Ｈ３  ＩｇＧまたは１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１で処置されたマウスの肝臓および膵臓からの代表的な組織スライドのマッソントリクローム染色。倍率は、４０倍および１００倍である。スケールバーを示す。
【図２３】二重特異性１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１トリマーボディ、ならびに単一特異性の１Ｄ８Ｎ１８トリマーボディおよびＣＥＡ．１Ｎ１７トリマーボディの遺伝子構造（左）およびドメイン構造（右）を示す模式図。１Ｄ８抗体に由来する可変領域（ＶＬ−ＶＨ）を、それぞれ、暗灰色および淡灰色で表し、抗ＣＥＡ  ＶＨＨ  ＣＥＡ．１を淡灰色で表し（ＶＨＨで示される）、ＴＩＥＸＶＩＩＩドメインを淡灰色で表し、それを包含するリンカー領域も灰色で表す（５ＴＩＥ１７、１８ＴＩＥおよび１７ＴＩＥで示される）。すべてのトリマーボディは、オンコスタチンＭ（Ｓで指定される白色ボックス）に由来するシグナルペプチド、およびＨｉｓ６−ｍｙｃタグ（Ｔで指定される暗灰色ボックス）を含有する。矢印は転写の方向を示す。
【図２４】分泌された１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１トリマーボディの特性評価。（Ａ）非トランスフェクト（ｕｎｔｘ）またはトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞から条件培地において分泌されたトリマーボディの存在を、ウエスタンブロット分析によって実証した。分子質量マーカーの泳動距離を示す（ｋＤａ）。ブロットを抗ｃ−ｍｙｃ  ｍＡｂで展開し、続いて、ＩＲＤｙｅ８００コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧとのインキュベーションを行った。分泌されたトリマーボディの機能性を、プラスチック固定化ｈＣＥＡおよびｍ４−１ＢＢに対するＥＬＩＳＡによって実証した（Ｂ）。ｈＣＥＡおよびｍ４−１ＢＢへの同時結合を、ｈＣＥＡの直接固定化、続いてトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの１００μｌのニート上清、およびｍ４−１ＢＢの添加によるデュアルＥＬＩＳＡによって評価した（Ｃ）。一過性でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの１００μｌのニート上清を使用する、ＨＥＫ２９３細胞およびＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ細胞におけるフローサイトメトリー（Ｄ）。抗ＭＨＣクラスＩ  ｍＡｂを対照として使用した。
【図２５】精製された１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１トリマーボディの構造的特性評価。（Ａ）１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。試料を、ＳＥＣカラムに注入し（Ｉ、０．３ｇ／Ｌストックの５７５μＬ）、１２．４ｍＬで溶出させた（Ｅ；中心の３００μＬ画分に存在する全タンパク質をロードする前に沈殿させた）。灰色の垂線は、レーンが異なるゲルに属することを示す。（Ｂ）クロマトグラフィーピークの中央で測定された示された分子質量を有する、ＳＥＣ−ＭＡＬＳによる精製された１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１トリマーボディのオリゴマー分析。（Ｃ）１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１の円二色性スペクトル（平均残基楕円率）、および（Ｄ）２１８ｎｍでの楕円率の変化によって測定された熱変性。
【図２６】精製された１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１トリマーボディの機能的特性評価。４または２ｎＭでの固定化ｍ４−１ＢＢおよび１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１の間の相互作用からのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）由来センサーグラム。実験応答を黒色でトレースし、フィッティング曲線は灰色である（Ａ）。溶液中でｍ４−１ＢＢおよびｈＣＥＡでコーティングされたバイオセンサーに対する１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１の二重特異性を実証するＢＬＩセンサーブラム（ＢおよびＣ）。１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１、または１Ｄ８Ｎ１８（矢印で示す試料）、または動態緩衝液のみ（矢印で示す試料）のいずれかとの会合後、バイオセンサーを、５０ｎＭのＣＥＡ（黒色および赤色）、または動態緩衝液のみ（青色および緑色）に移した。１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１は両方の抗原に結合するが、１Ｄ８Ｎ１８はｍ４−１ＢＢにのみ結合し、ｈＣＥＡは、トリマーボディの非存在下で、ｍ４−１ＢＢでコーティングされたバイオセンサーと相互作用しなかった。
【図２７】１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１トリマーボディの機能的特性評価。精製された１Ｄ８Ｎ１８または１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１トリマーボディとのインキュベーション後のＨＥＫ２９３細胞（Ａ）およびＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ細胞（Ｂ）のプラスチック固定化ＢＳＡまたはＣＥＡへの接着。ＨＥＫ２９３細胞およびＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ細胞のプラスチック固定化ラミニン１１１（Ｌｍ１１１）への接着を対照として使用した（Ｃ）。データを、ＢＳＡに対する接着の倍数変化としてプロットする。抗４−１ＢＢ抗体の共刺激活性（ＤおよびＥ）。マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞を、１Ｄ８  ＩｇＧ、１Ｄ８Ｎ１８または１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１の存在下、固定化抗ＣＤ３  ｍＡｂおよびｈＣＥＡまたはＢＳＡで被覆し、増殖（Ｄ）およびＩＦＮ−γ分泌（Ｅ）を４８時間後に決定した。すべての結果は、３つの独立した実験の１つの代表である。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である、＊＊Ｐ≦０．０１、スチューデントのｔ検定。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者らは、抗腫瘍免疫応答を刺激する三量体ポリペプチド複合体を開発した。
【００１７】
三量体ポリペプチド複合体（ＴＰＣ）
第１の態様において、本発明は、３つの単量体ポリペプチドを含む三量体ポリペプチド複合体であって、
各単量体が、
ｉ．ＸＶＩＩＩ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥＸＶＩＩＩ）、ＸＶ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥＸＶ）およびそれらの機能的に等価なバリアントからなる群から選択されるホモ三量体化ドメイン、ならびに
ｉｉ．ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニスト
を含み、
少なくとも１つの単量体ポリペプチドが、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域をさらに含む、
三量体ポリペプチド複合体に関する。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「三量体ポリペプチド複合体」または「ＴＰＣ」という用語は、非共有結合的に結合した３つの単量体ポリペプチドの複合体を指す。各単量体ポリペプチドは、互いに、等しいか、または異なっていてもよい。好ましい実施形態において、ＴＰＣは、複合体の３つの単量体またはサブユニットが同一であることを意味するホモ三量体である。別の好ましい実施形態において、ＴＰＣは、複合体の３つの単量体またはサブユニットの少なくとも１つが、他の２つと異なることを意味するヘテロ三量体である。より好ましい実施形態において、ＴＰＣはホモ三量体である。
【００１９】
ホモ三量体化ドメイン
本明細書で使用される場合、「ホモ三量体化ドメイン」という用語は、単量体の間の非共有結合的三量体化に関与する領域を指す。好ましい実施形態において、ホモ三量体化ドメインは、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥＸＶＩＩＩ）、ＸＶ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥＸＶ）およびそれらの機能的に等価なバリアントからなる群から選択される。
【００２０】
本明細書に開示されるように、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンまたはＸＶ型コラーゲンの単量体は、三量体化性が、天然コラーゲン分子の三量体化性と比べて維持される限り、互いに、等しいか、または異なっていてもよい。特定の実施形態において、単量体の少なくとも１つは、他の２つと異なる。好ましい実施形態において、３つの単量体は、互いに同じであり、好ましくは、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンまたはＸＶ型コラーゲンの３つの単量体は、互いに同じである。
【００２１】
１つの実施形態において、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンホモ三量体化ドメインは、配列番号１からなるか、または配列番号１を含む。別の実施形態において、ＸＶ型コラーゲンホモ三量体化ドメインは、配列番号２からなるか、または配列番号２を含む。別の実施形態において、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンホモ三量体化ドメインは、配列番号１２からなるか、または配列番号１２を含む。
【００２２】
本明細書で使用される「それらの機能的に等価なバリアント」は、天然に存在するＸＶＩＩＩ型コラーゲンもしくはＸＶ型コラーゲンのＴＩＥＸＶＩＩＩおよび／またはＴＩＥＸＶの機能的に等価なバリアントを包含することを意図し、このバリアントは、任意の十分な程度に、天然のＸＶＩＩＩ型コラーゲン分子またはＸＶ型コラーゲン分子の三量体化性と比べて三量体化性に有害な影響を与えることなく、アミノ酸配列において修飾されている。前記修飾としては、他のアミノ酸に対する１つ以上のアミノ酸の保存的（または非保存的）置換、１つ以上のアミノ酸の挿入および／または欠失を含み、ただし、天然のＸＶＩＩＩ型コラーゲンタンパク質またはＸＶ型コラーゲンタンパク質の三量体化性は、実質的に維持され、すなわち、バリアントは、生理学的条件で同じ配列を有する他のペプチドと三量体を形成する能力（ａｂｉｌｉｔｙ）（能力（ｃａｐａｃｉｔｙ））を維持する。
【００２３】
好ましくは、、ＴＩＥＸＶＩＩＩおよび／またはＴＩＥＸＶのバリアントは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）によって置換され、かつこのような置換アミノ酸は、遺伝コードによってコードされてもよく、コードされなくてもよい、ポリペプチド、（ｉｉ）１つ以上の修飾アミノ酸残基、例えば、置換基の結合によって修飾された残基が存在するポリペプチド、（ｉｉｉ）類似のｍＲＮＡの代替プロセシングから生じるポリペプチド、ならびに／または（ｉｖ）ポリペプチド断片である。断片は、元の配列のタンパク質分解性切断（多部位タンパク質分解を含む）により作成されるポリペプチドを含む。バリアントは、翻訳後に修飾されてもよく、または化学的に修飾されてもよい。このようなバリアントは、当業者に明らかであるはずである。
【００２４】
当業者は、ヌクレオチド配列の同一性の値を、本発明のポリペプチドをコードする２つのヌクレオチド配列の対応する配列同一性を決定するために、コドン縮重、保存的アミノ酸置換およびリーディングフレームのポジショニングを考慮することによって、適切に調節することができることを認識する。
【００２５】
本発明の文脈において、「保存的アミノ酸変化」および「保存的アミノ酸置換」は、本発明において同意語として使用される。「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指し、タンパク質の機能を変えないサイレント変化をもたらす、類似の側鎖を有する別のアミノ酸による天然アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸の置換を意味する。天然アミノ酸配列内のアミノ酸についての保存的置換は、天然に存在するアミノ酸が属する群の他のメンバーから選択することができる。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられ；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群としては、セリンおよびトレオニンが挙げられ；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群としては、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられ；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群としては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられ；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群としては、リジン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられ；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群としては、システインおよびメチオニンが挙げられる。本発明のいくつかの実施形態において、好ましい保存的アミノ酸置換は、バリン−ロイシン、バリン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、アスパラギン酸−グルタミン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。したがって、本発明は、ＴＩＥＸＶＩＩＩおよび／またはＴＩＥＸＶの機能的に等価なバリアントを指し、これは、１つ以上の保存的アミノ酸置換の結果として与えられる配列とともに、１つ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。置換が、非修飾配列の機能と比べてその機能を変えない修飾ポリペプチドにおけるサイレント変化をもたらすように、ポリペプチド配列中の１つ以上のアミノ酸を、類似の電荷および極性を有する少なくとも１つの他のアミノ酸で置換することができることは、当技術分野において周知である。本発明は、前記のさらに提供されたポリペプチド配列が、ＴＩＥＸＶＩＩＩおよび／またはＴＩＥＸＶと同一または類似または同等の機能を有する限り、ＴＩＥＸＶＩＩＩおよび／またはＴＩＥＸＶによって与えられる配列と比べて、保存的置換もしくは非保存的置換の結果のいずれかとして、および／または配列の挿入もしくは欠失の結果のいずれかとして、１つ以上のアミノ酸が異なる任意のポリペプチド配列を指す。
【００２６】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなく、ヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝コードにおける相違を意味する。当業者は、所与のアミノ酸残基を特定するヌクレオチドコドンを使用する、特定の宿主細胞によって示されるコドンバイアスについて良く承知している。したがって、宿主細胞における遺伝子の異所性発現のために、そのコドン使用の頻度が、コドン使用表に記載の宿主細胞のコドン使用の頻度に近くなるような方法で、遺伝子を設計または合成することが望ましい。
【００２７】
２つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド配列の文脈における「同一性」、「同一」または「同一性パーセント」という用語は、配列同一性の部分として任意の保存的アミノ酸置換を考慮せずに、比較し、最大対応のために整列（必要により、ギャップを導入する）させた場合に、同じであるか、または同じであるアミノ酸またはヌクレオチド残基の特定のパーセンテージを有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用するか、または目視検査によって測定することができる。アミノ酸またはヌクレオチド配列の整列を得るために使用することができるさまざまなアルゴリズムおよびソフトウェアは、当技術分野において公知である。
【００２８】
配列同一性のパーセンテージは、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定してもよい。整列された配列は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列であり得る。２つの配列の最適な整列のために、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の部分は、参照配列（挿入または欠失を含まない）と比較して、挿入または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。配列同一性のパーセンテージは、同一のヌクレオチド残基または同一のアミノ酸残基が、一致した位置の数を与える両方の比較配列中に出現する位置の数を決定し、次いで、一致した位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数によって割り、結果に１００をかけることによって計算して、配列同一性のパーセンテージが得られる。２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列の間の配列同一性は、例えば、対比較のためのデフォルトパラメーターのセット（アミノ酸配列比較用：ギャップ作出ペナルティ＝８、ギャップ伸長ペナルティ＝２；ヌクレオチド配列比較用：ギャップ作出ペナルティ＝５０；ギャップ伸長ペナルティ＝３）を使用し、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３，１９７０）の方法に基づくＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．製のＷＩＳＣＯＮＳＩＮ  ＰＡＣＫＡＧＥバージョン１０．０−ＵＮＩＸにおけるギャッププログラムを使用することによって、あるいはＢＬＯＳＵＭ６２行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）および対比較のためのデフォルトパラメーターのセット（ギャップ作出コスト＝１１、ギャップ伸長コスト＝１）を使用する、ＢＬＡＳＴ  ２．２．１パッケージソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）におけるＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用することによって、決定することができる。
【００２９】
ポリペプチドの間の配列同一性のパーセンテージおよびそれらの対応する機能は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎを含む、例えば、クエリ配列をタンパク質データベースと比較することが可能な検索アルゴリズムに基づくさまざまな相同性を使用して、決定し得る。ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して、タンパク質の機能情報を提供し得る。数値は、機能割り当ての信頼性を評価するために調べられる。有用な測定値としては、「Ｅ値」（「ｈｉｔ＿ｐ」としても示される）、「同一性パーセント」、「クエリ適用範囲パーセント」および「ヒット適用範囲パーセント」が挙げられる。ＢＬＡＳＴにおいて、Ｅ値または期待値は、データベース検索で偶然に生じると予想される、生の整列スコアＳと同等またはそれよりも良好なスコアを有する異なる整列の数を表す。そのため、Ｅ値が低くなると、一致の重要性が高くなる。データベースのサイズが、Ｅ値計算における要素であるので、ＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースに対してＢＬＡＳＴ検索を行うことによって得られるＥ値は、一般に、任意の所与のクエリ／エントリーの一致について経時的に増加する。したがって、ポリペプチドの機能予測の信頼性についての設定基準において、「高い」ＢＬＡＳＴＸの一致は、１Ｅ−３０未満のトップＢＬＡＳＴＸヒットのＥ値を有すると考えられ；中程度のＢＬＡＳＴＸは、１Ｅ−３０〜１Ｅ−８のＥ値を有すると考えられ；低いＢＬＡＳＴＸは、１Ｅ−８より高いＥ値を有すると考えられる。同一性パーセントは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって整列された配列の部分の長さに沿って存在する、同一で一致したアミノ酸残基のパーセンテージを指す。ポリペプチドの機能予測の信頼性についての設定基準において、「高い」ＢＬＡＳＴＸの一致は、少なくとも７０％のトップＢＬＡＳＴＸヒットについての同一性パーセントを有すると考えられ；中程度の同一性パーセントの値は、３５〜７０％と考えられ；低い同一性パーセントは、３５％未満と考えられる。タンパク質機能の割り当てにおいて特に興味深いのは、Ｅ値、同一性パーセント、クエリ適用範囲、およびヒット適用範囲の組み合わせの使用である。クエリ適用範囲は、ＢＬＡＳＴ整列において表されるクエリ配列のパーセントを指すが、ヒット適用範囲は、ＢＬＡＳＴ整列において表されるデータベースエントリーのパーセントを指す。本発明に機能的に適用されるポリペプチドを定義する目的のために、ポリペプチドの機能は、配列番号１、配列番号２または配列番号１２などのタンパク質相同体の機能から推測され、ここで、本発明のポリペプチドは、（１）ｈｉｔ＿ｐ＜１ｅ−３０、もしくは同一性％＞３５％、ならびにクエリ適用範囲＞５０％およびヒット適用範囲＞５０％をもたらすか、または（２）ｈｉｔ＿ｐ＜１ｅ−８、ならびにクエリ適用範囲＞７０％およびヒット適用範囲＞７０％をもたらすかのいずれ一方である。
【００３０】
ＴＩＥＸＶＩＩＩの機能的に等価なバリアントはまた、配列番号１または配列番号１２の配列と、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【００３１】
ＴＩＥＸＶの機能的に等価なバリアントはまた、配列番号２の配列と、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【００３２】
三量体を形成する機能的に等価なバリアントの能力は、当業者に公知の従来に方法によって決定することができる。例えば、単純な説明のために、三量体を形成する機能的に等価なバリアントの能力は、標準的なクロマトグラフィー技法を使用することによって決定することができる。したがって、評価されるバリアントは、適切な三量体化条件に置かれ、複合体は、最終的に形成される複合体（三量体）が変わらないような非変性条件下で標準的なクロマトグラフィーアッセイに付される。バリアントが適切に三量体化されると、複合体の分子サイズは、バリアントの単一分子の分子サイズよりも三倍重くなるだろう。複合体の分子サイズは、分析遠心分離、質量分析、サイズ排除クロマトグラフィー、沈降速度などのような標準的な方法を使用することによって明らかにすることができる。
【００３３】
ＴＩＥＸＶＩＩＩおよび／またはＴＩＥＸＶは、任意の対象、好ましくは、マウス、ラット、サル、ヒトなどのような哺乳動物に由来し得る。好ましい実施形態において、ＴＩＥＸＶＩＩＩは、ヒトに由来する。別の好ましい実施形態において、ＴＩＥＸＶは、ヒトに由来する。別の好ましい実施形態において、ＴＩＥＸＶＩＩＩは、マウスＸＶＩＩＩ型コラーゲンに由来する。別の好ましい実施形態において、ＴＩＥＸＶは、マウスＸＶ型コラーゲンに由来する。より好ましい実施形態において、ＴＩＥＸＶＩＩＩは、マウスＸＶＩＩＩ型コラーゲンの小ホモ三量体化ドメインである。
【００３４】
ＴＩＥＸＶＩＩＩおよび／またはＴＩＥＸＶは、他の三量体ポリペプチド複合体（ＴＰＣ）の中で、機能的に活性な単一特異性および二重特異性の三価Ｎ末端ＴＰＣ、三価Ｃ末端ＴＰＣ、単一特異性および二重特異性の三価Ｎ／Ｃ末端ＴＰＣ；ならびに単一特異性および二重特異性の六量体単鎖Ｎ／Ｃ末端ＴＰＣを生成させるために使用することができる。加えて、これは、リガンド結合ドメインとして単一ドメイン（ＶＨＨ）抗体、または成長因子（例えば、ＶＥＧＦ）を有する、機能的に活性な単一特異性Ｃ末端ＴＰＣを生成させるために使用することができる。したがって、特異性および価数の異なる組み合わせを有する、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性、四重特異性など）の多価（例えば、三価、四価、五価または六価）組換え分子を容易に作製することができる。特定の実施形態において、ＴＩＥＸＶＩＩＩおよび／またはＴＩＥＸＶは、単一特異性ＴＰＣを生成させるために使用される。好ましい実施形態において、ＴＩＥＸＶＩＩＩおよび／またはＴＩＥＸＶは、単一特異性またな二重特異性ＴＰＣを生成させるために使用される。
【００３５】
ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニスト
本明細書で使用される場合、「ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニスト」という用語は、得られるＴＮＦＲファミリーの共刺激受容体に特異的に結合し、その刺激を誘導することができる任意の化学物質または分子を指す。
【００３６】
「特異的結合」または「特異的に結合する」または「結合する」とは、他の抗原に対するよりも高い親和性を有する、ＴＮＦＲファミリーのメンバー、または特定のＴＮＦＲファミリーメンバー内のエピトープに結合する分子を指す。典型的には、アゴニストは、結合についての平衡解離定数（ＫＤ）が、約１×１０−８Ｍ以下、例えば、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、または約１×１０−１２Ｍ以下であり、典型的には、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのそのＫＤよりも少なくとも１００倍低いＫＤを有する場合、「特異的に結合する」。ＫＤは、標準的な手順を使用して測定され得る。ＴＮＦＲファミリーの特定のメンバーまたは特定のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー内のエピトープに結合能力があるアゴニストは、しかしながら、他の関連する抗原、例えば、ヒトまたはサル、例えば、マカカ・ファシキュラリス（カニクイザル）、パン・トログロダイテス（チンパンジー）またはカリトリックス・ジャッカス（コモンマーモセット、マーモセット）などの他の種に由来する同じ抗原（ホモログ）に対する交差反応性を有し得る。単一特異性抗体は、１つの抗原または１つのエピトープのみに特異的に結合するが、二重特異性抗体は、２つの区別される抗原または２つの区別されるエピトープに特異的に結合する。
【００３７】
本発明のＴＰＣの部分を形成するＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニストは、ＴＮＦＲファミリーメンバーの天然リガンドによって誘導される、抗体が結合するＴＮＦＲファミリーメンバーの少なくとも１つの生物活性を誘導する能力を有する。例示的なアンタゴニスト活性としては、インビトロアッセイにおいてＮＦκＢ誘導プロモーターの制御下で発現する分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の産生の誘導、樹状細胞（ＤＣ）における増加したＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの表面発現によって評価されるＤＣ分化の誘導、増加したＢ細胞増殖またはＢ細胞における増加したＣＤ２３、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの表面発現によって評価されるＢ細胞の活性化、抗原に以前に曝露された患者から単離されたＰＢＭＣによるインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）の産生によって評価される抗原特異的Ｔ細胞リコール応答の誘導、ならびにＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の誘導が挙げられる。アゴニスト活性（例えば、アゴニズム）は、架橋依存性であってもよく、または抗体の架橋と独立していてもよい。
【００３８】
本明細書で使用される場合、活性化免疫細胞に関する「共刺激する」という用語は、増殖またはエフェクター機能を誘導する、第２の非活性化受容体媒介シグナルまたは共刺激シグナルを提供する共刺激分子の能力を含む。例えば、共刺激シグナルは、例えば、Ｔ細胞受容体媒介シグナルを受信したＴ細胞において、サイトカイン分泌をもたらし得る。
【００３９】
「ＴＮＦＲファミリーメンバー」には、ＴＮＦＲファミリーに属する受容体を含む。ＴＮＦＲファミリーメンバーおよびそれらの対応するリガンドの典型的な例を表１に示す。
【００４０】
【表１】
2021525537.tif 000003
【００４１】
この用語は、ＴＮＦＲの天然に存在するバリアントを含む、表１に示される受容体を含む。ＴＮＦＲは、典型的には、Ｉ型膜貫通タンパク質として発現し、それらの細胞外ドメインに１〜６つのシステインリッチドメインを含有する。シグナル伝達は、ＴＮＦＲ三量体として起こる。
【００４２】
ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニストは、ＴＰＣの、単量体ポリペプチドの１つ、単量体ポリペプチドの２つ、または３つの単量体ポリペプチドに存在し得る。好ましい実施形態において、３つの単量体ポリペプチドは、共刺激受容体のアゴニストを含む。
【００４３】
好ましい実施形態において、単量体ポリペプチドの１つは、他の２つと異なる共刺激受容体のアゴニストを含む。別の好ましい実施形態において、３つの単量体ポリペプチドは、同じ共刺激受容体の異なるアゴニストを含む。より好ましい実施形態において、３つの単量体ポリペプチドは、共刺激受容体の同じアゴニストを含む。
【００４４】
１つの実施形態において、ＴＮＦＲファミリーメンバーのアゴニストは、アゴニスト抗体である。
【００４５】
「抗体」は、広範な意味を意味し、マウス、ヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗体断片、二重特異性また多特異性抗体、二量体、三量体または多量体抗体、一本鎖抗体、シングルドメイン抗体、抗体ミメティック、および必要な特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾構造を含む、免疫グロブリン分子を含む。「全長抗体分子」は、ジスルフィド結合によって相互連結された２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）で構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインで構成される）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノからカルボキシル末端に以下の順序で配列された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲセグメントで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。
【００４６】
「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗体中の「抗原結合部位」である。ＣＤＲは、種々の用語を使用して定義され得る：（ｉ）ＶＨ中に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、およびＶＬ中に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の多様性に基づく（Ｗｕら（１９７０）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １３２：２１１−５０）（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）；（ｉｉ）ＶＨ中に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬ中に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の「超可変領域」、「ＨＶＲ」または「ＨＶ」は、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−１７）によって定義される、構造中で超可変性である抗体可変ドメインの領域を指す。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位の標準的な番号付けおよび定義を提供する。ＣＤＲ、ＨＶおよびＩＭＧＴの記述間の対応は、（Ｌｅｆｒａｎｃら（２００３）  Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：５５−７７）に記載されている。本明細書で使用される「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」および「ＬＣＤＲ３」という用語は、本明細書に明示的に記載されていない限り、上記のＫａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＩＭＧＴに記載の方法にずれかによって定義されるＣＤＲを含む。
【００４７】
免疫グロブリンは、重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの５つの主要なクラスに割り当てることができる。ＩｇＡおよびＩｇＧは、さらに、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４として下位分類される。任意の脊椎動物種の抗体の軽鎖は、それらの定常領域のアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に区別される種類、すなわち、カッパ（κ）およびラムダ（λ）の１つに割り当てることができる。
【００４８】
「抗体断片」は、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２および３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２および３、重鎖可変領域（ＶＨ）もしくは軽鎖可変領域（ＶＬ）などの重鎖ならびに／または軽鎖抗原結合部位を維持した、免疫グロブリン分子の部分を指す。抗体断片としては、周知のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびＦｖ断片、ならびに１つのＶＨドメインまたは１つのＶＬドメインからなるシングルドメイン抗体（ｄＡｂ）が挙げられる。ＶＨおよびＶＬドメインは、合成リンカーを介して一緒に連結して、ＶＨおよびＶＬドメインが別々の一本鎖抗体コンストラクトによって発現される場合において、ＶＨ／ＶＬドメインが分子内または分子間で対形成して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）またはダイアボディなどの一価の抗原結合部位を形成する、さまざまな種類の一本鎖抗体設計を形成することができる。
【００４９】
「モノクローナル抗体」は、抗体重鎖からのＣ末端リジンの除去などの可能性がある周知の変化、あるいはメチオニン酸化またはアスパラギンもしくはグルタミンアミド分解などのアミノ酸の翻訳後修飾（複数可）に起因する変化を除いて、各重鎖および各軽鎖における単一のアミノ酸組成を有する抗体集団を指す。モノクローナル抗体は、２つ以上の区別される抗原エピトープに特異的に結合する二重特異性または多重特異性モノクローナル抗体を除いて、典型的には、１つの抗原エピトープに特異的に結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団内に異種グリコシル化を有していてもよい。モノクローナル抗体は、単一特異性もしくは多重特異性、または一価、二価もしくは多価であり得る。二重特異性抗体は、モノクローナル抗体という用語に含まれる。
【００５０】
「ヒト化抗体」は、抗原結合部位が非ヒト種に由来し、可変領域フレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワークが、発現されたヒト免疫グロブリンまたはヒト免疫グロブリン生殖細胞系列の遺伝子配列の正確なコピーでなくてもよいように、フレームワーク中に置換を含んでいてもよい。
【００５１】
「ヒト抗体」は、フレームワークおよび抗原結合部位の両方が、ヒト起源の配列に由来し、ヒト対象に投与される場合に最小の免疫応答を有するように最適化された、重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体を指す。抗体が、定常領域または定常領域の部分を含有する場合、定常領域もヒト起源の配列に由来する。
【００５２】
ヒト抗体は、抗体の可変領域が、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンまたは再配列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合、ヒト起源の配列に「由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含む。このような例示的な系は、ファージ上に提示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリー、および本明細書に記載のヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスまたはラットなどの遺伝子組換え非ヒト動物である。「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンまたは再配列免疫グロブリン遺伝子と比較した場合に、抗体およびヒト免疫グロブリン遺伝子座、体細胞変異の導入、あるいはフレームワークもしくは抗原結合部位または両方への置換の意図的な導入を得るために使用される系の間の相違に起因して、異なるアミノ酸を含有していてもよい。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンまたは再配列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において、少なくとも約８０パーセント、８１パーセント、８２パーセント、８３パーセント、８４パーセント、８５パーセント、８６パーセント、８７パーセント、８８パーセント、８９パーセント、９０パーセント、９１パーセント、９２パーセント、９３パーセント、９４パーセント、９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセント、９９パーセント、または１００ーセント同一である。一部の場合において、「ヒト抗体」は、ヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列、またはファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーに組み込まれる合成ＨＣＤＲ３を含有していてもよい。
【００５３】
本発明によれば、共刺激受容体は、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーの受容体である。特定の実施形態において、共刺激受容体は、休止しているネイティブＴ細胞において構造的に発現されないが、活性化の際に獲得される受容体である。そのような非限定的な例としては、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲおよび４−１ＢＢが挙げられる。好ましい実施形態において、各単量体ポリペプチド中の共刺激受容体は、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲおよび４−１ＢＢから選択される。より好ましい実施形態において、共刺激受容体は４−１ＢＢである。
【００５４】
実施形態において、ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニストは、アゴニスト抗体である。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変領域、例えば、免疫グロブリン可変ドメインを提供するアミノ酸配列、または免疫グロブリン可変ドメインの配列を含むタンパク質を指す。抗体は、例えば、可変重鎖（Ｈ）領域（本明細書において、ＶＨと略す）および可変軽鎖（Ｌ）領域（本明細書において、ＶＬと略す）を含み得る。典型的には、抗体は、２つの可変重鎖領域および２つの可変軽鎖領域を含む。「抗体」という用語は、抗原結合抗体断片（例えば、一本鎖抗体、ナノボディ（ＶＨＨ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片およびｄＡｂ断片）、ならびに全抗体、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（およびこれらのサブタイプ）のインタクトおよび／または全長免疫グロブリンを包含する。可変重鎖領域および可変軽鎖領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と称されるより保存的な領域と一緒に混合された、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と称される超可変領域にさらに細分化することができる。ＦＲおよびＣＤＲの伸長は、正確に定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、アメリカ合衆国保健福祉省、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２；およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照されたい）。Ｋａｂａｔの定義を本文書において使用する。各可変重鎖領域および可変軽鎖領域は、典型的には、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシル末端へ以下の順序で構築される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。抗体のＶＨまたはＶＬ鎖は、さらに、重鎖もしくは軽鎖定常領域のすべてまたは部分を含んで、それにより、それぞれ、重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリンをそれぞれ形成することができる。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、ジスルフィド架橋によって結合することができる。重鎖定常領域は、典型的には、３つの定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、典型的には、ＣＬドメインを含む。可変重鎖領域および可変軽鎖領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系（例えば、エフェクター細胞）のさまざまな細胞および従来の補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）含む、宿主の組織または因子への抗体の結合を媒介する。抗体という用語は、重鎖および軽鎖によって形成される抗体、ならびに一本鎖抗体の両方を包含する。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「重鎖」または「ＨＣ」という用語は、全長重鎖およびその断片の両方を包含する。全長重鎖は、可変領域ドメインのＶＨ、ならびに３つの定常領域ドメインのＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端側終端にあり、ＣＨ３ドメインは、カルボキシル末端側終端にある。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「軽鎖」という用語は、全長軽鎖およびその断片を包含する。全長軽鎖は、可変領域のドメインＶＬ、および３つの定常領域ドメインのＣＬを含む。重鎖と同様に、可変軽鎖領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端側終端にある。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「一本鎖抗体」という用語は、遺伝的に融合した一本鎖分子として形成された、適切なペプチドリンカーの手段によって結合した可変軽鎖領域および可変重鎖領域を含有する遺伝子操作の手段によって改変された分子を指す。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「ナノボディ」という用語は、単一の単量体の可変抗体ドメインからなる抗体断片である、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を指す。全抗体と同様に、これは、特異的抗原に選択的に結合することが可能である。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「抗体ミメティック」という用語は、抗体のように、抗原に特異的に結合することができるが、必ずしも抗体に構造的に関連しない、任意の化合物を指す。「ミメティック」の化合物は、機能活性に必要な化合物の化学構造が、化合物の構造を模倣する他の化学構造と置き換えられた化合物を含む。ミメティックの例としては、ペプチド主鎖が、１つ以上のベンゾジアゼピン分子で置換されたペプチド化合物（例えば、Ｊａｍｅｓ，Ｇ．Ｌ．ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１９３７−１９４２を参照されたい）、または鎖の伸長もしくはヘテロ原子の組み込みを含む、天然のペプチド主鎖のアミド結合アイソスターおよび／もしくは修飾の使用によるペプチド二次構造を模倣するオリゴマーが挙げられ；その例としては、アザペプチド、オリゴカルバメート、オリゴ尿素、ベータ−ペプチド、ガンマ−ペプチド、オリゴ（フェニレンエチニレン）、ビニル性スルホノペプチド、ポリ−Ｎ−置換グリシン（ペプトイド）などが挙げられる。ペプチドミメティック化合物を調製するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，１７．２章，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に詳述されている。
【００６０】
本明細書で使用される場合、抗体という用語は、異なる分子の性質、トポロジーまたはスキャフォールドに基づく免疫グロブリン以外の結合剤としての「非免疫グロブリン剤」も指す。スキャフォールドという用語は、通常、特定の標的に結合するために、タンパク質バリアントに異なる機能を付与する変化したアミノ酸または配列の挿入を有し得るタンパク質フレームワークを記載することを意味する。このような非免疫グロブリン剤の例は、当技術分野において周知であり、限定されないが、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー、アフィボディ分子、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメインペプチドモノボディなどが挙げられ、他のタンパク質スキャフォールドは、Ｂｉｎｚら，２００５（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１２５７−６８）に概説されており、参照によって本明細書に含まれる。「ペプチドアプタマー」という用語は、タンパク質のスキャフォールドに両端で付着し、特異的な標的分子に結合する、短い可変ペプチドドメインを指す。可変ループの長さは、典型的には、１０〜２０アミノ酸で構成され、スキャフォールドは、良好な溶解度および緻密性を有する任意のタンパク質であってもよい。「核酸アプタマー」または「ＤＮＡアプタマー」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の分子標的に結合するための繰り返される選択のラウンドによって操作されたＤＮＡの短いストランドを指す。
【００６１】
本発明によれば、抗体は、「ヒト化」されて、ヒト個体における免疫原性を低減することができる。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体療法の安全性および有効性を改善する。ヒト化の１つの一般的な方法は、任意の適切な動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター）においてモノクローナル抗体を産生させること、およびヒト定常領域を有する定常領域と置き換えることであり、この方法で操作された抗体は「キメラ」と称される。別の一般的な方法は、非ヒトＶ−ＦＲをヒトＶ−ＦＲで置き換える「ＣＤＲグラフト化」である。ＣＤＲグラフト化法において、ＣＤＲ領域を除くすべての残基は、ヒト起源のものである。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体はヒト化されている。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体はキメラである。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体はＣＤＲグラフト化されている。ヒト化は、抗体の全体的な親和性を低下させ得るか、もしくはわずかに影響し得るか、またはヒト化後のそれらの標的に対する親和性も改善し得る。ある特定の実施形態において、ヒト化は、抗体に対する親和性を１０％増加させる。ある特定の実施形態において、ヒト化は、抗体に対する親和性を２５％増加させる。ある特定の実施形態において、ヒト化は、抗体に対する親和性を３５％増加させる。ある特定の実施形態において、ヒト化は、抗体に対する親和性を５０％増加させる。ある特定の実施形態において、ヒト化は、抗体に対する親和性を６０％増加させる。ある特定の実施形態において、ヒト化は、抗体に対する親和性を７５％増加させる。ある特定の実施形態において、ヒト化は、抗体に対する親和性を１００％増加させる。親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して適切に測定される。
【００６２】
好ましい実施形態において、共刺激受容体のアゴニスト抗体は、ｓｃＦｖ、ナノボディまたは抗体ミメティックである。
【００６３】
腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域
本発明によるＴＰＣは、単一特異性であり得、すなわち、それらは、ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体に対する結合部位を含有するが、好ましくは、それらは、腫瘍細胞の表面に存在する腫瘍関連抗原に結合可能な１つ以上の分子も含有し得る。これは、ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体に結合し、これに対するアゴニスト効果を示す領域、および腫瘍関連抗原に結合する領域を含有する二重特異性抗体をもたらす。腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域を含有するＴＰＣ内の単量体の数は、１つ、２つ、または３つであり得ることが理解される。好ましい実施形態において、単量体ポリペプチドの１つは、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な分子を含む。別の好ましい実施形態において、単量体ポリペプチドの２つは、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な分子を含む。別の好ましい実施形態において、３つの単量体ポリペプチドは、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な分子を含む。
【００６４】
「特異的に結合する」という用語は、ＴＮＦＲファミリーメンバーのアゴニストに関して、上記で詳細に定義されており、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域に同様に適用される。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」という用語は、患者のがんの状態または種類を適切な免疫療法製品またはレジメンと一致させることができる任意の抗原を意味する。ＴＡＡは、がん細胞それ自身によって発現され得るか、またはそれらは、腫瘍関連の新生血管もしくは他の間質などの腫瘍の非がん性成分と関連し得る。腫瘍細胞によって発現され、免疫エフェクター機構の標的として作用することが可能な腫瘍抗原の中には、タンパク質、一般的に、糖タンパク質、ペプチド、炭水化物および糖脂質が含まれる。腫瘍関連抗原の非限定的な例としては、ＡＦＰ（アルファ（α）−フェトタンパク質）、ＡＩＭ−２（黒色腫に存在しないインターフェロン−誘導タンパク質２）、ＡＲＴ−４（Ｔ細胞によって認識される腺癌抗原４）、ＢＡＧＥ（Ｂ抗原）、ＢＣＭＡ、ＣＡＭＥＬ（黒色腫上のＣＴＬ−認識抗原）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＤＡＭ（分化抗原黒色腫）、Ｅｐ−ＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＥｒＢ３、ＦＡＰ、ｇｐＡ３３、Ｈｅｒ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＭＡＧＥ（黒色腫抗原）、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ（Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１／黒色腫抗原Ａ）、ＭＣ１Ｒ（メラノコルチン１受容体）、ＭＥＴ、ＭＵＣ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ニューヨーク食道１）、ＯＡ１（眼白子症１型タンパク質）、Ｐ−カセリン、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＳＡＲＴ−１、−２、−３（扁平上皮抗原拒絶腫瘍１、２、３）、サバイビン−２Ｂ（イントロン２−関連生存）、ＴＲＰ（チロシナーゼ関連タンパク質）が挙げられる。抗原は、腫瘍細胞の表面で発現されてもよく、または抗原は、分泌され得る。好ましい実施形態において、抗原は細胞表面抗原である。可能性がある腫瘍抗原に対する患者における血清抗体の存在は、例えば、ＳＥＲＥＸ（組換え発現クローニングによる抗原の血清学的特定）を使用して、当業者によって決定することができ、それにより、標的抗原は、血清を腫瘍細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーと反応させることによって、特定される。
【００６６】
１つの実施形態において、ＴＡＡはＥＧＦＲである。
【００６７】
別の実施形態において、ＴＡＡはＣＥＡである。
【００６８】
１つの実施形態において、ＴＡＡに特異的に結合可能な領域は、前記ＴＡＡに対するアゴニスト能力を有さない。
【００６９】
１つの実施形態において、ＴＡＡに特異的に結合可能な領域は、抗体であり、より好ましくは、「一本鎖抗体」、ナノボディまたは「非免疫グロブリン剤」である。この用語は、ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニストの文脈において上記で定義されており、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域に同様に適用可能である。
【００７０】
好ましい実施形態において、ＴＡＡに特異的に結合可能な分子は、ホモ三量体化ドメインに対してＮ末端またはＣ末端に位置する。
【００７１】
好ましい実施形態において、ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体に特異的に結合可能な分子が、ホモ三量体化ドメインに対してＮ末端に位置する場合、その結果として、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な分子は、ホモ三量体化ドメインに対してＣ末端に位置する。別の好ましい実施形態において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な分子が、ホモ三量体化ドメインに対してＣ末端に位置する場合、その結果として、抗原のＴＮＦＲファミリー共刺激受容体に特異的に結合可能な分子は、ホモ三量体化ドメインに対してＮ末端に位置する。
【００７２】
好ましい実施形態において、腫瘍関連抗原は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）である。本明細書で使用される場合、「上皮成長因子受容体」または「ＥＧＦＲ」という用語は、上皮成長因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）の細胞外タンパク質リガンドのメンバーに対する受容体である膜貫通タンパク質である。これは、シグナル伝達経路、ならびに細胞の成長および生存を調節し、ＥＧＦ分子に対する親和性を示す、チロシンキナーゼを指す。受容体のＥｒｂＢファミリーは、４つの密接に関連するサブタイプ：ＥｒｂＢ１（上皮成長因子受容体［ＥＧＦＲ］）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）、およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）、ならびにそれらのバリアント（例えば、Ｈｕｍｐｈｒｅｙら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０、８７：４２０７−４２１１）におけるような欠失変異体ＥＧＦＲ）からなる。ＥＧＦＲに結合することが可能な分子の非限定的な例としては、天然リガンドの上皮成長因子（ＥＧＦ）、ベータセルリン（ＢＴＣ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンフィレグリン（ＡＲ）、エピレギュリン（ＥＰＲ）、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）およびエピジェン（ＥＰＧ）が挙げられる。１つの実施形態において、ＥＧＦＲに特異的に結合可能な分子は、アゴニスト能力を有さない。好ましい実施形態において、ＥＧＦＲはヒトである。
【００７３】
好ましい実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、ｓｃＦｖ、ナノボディまたは抗体ミメティックである。
【００７４】
別の好ましい実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＡ１ナノボディである。より好ましい実施形態において、Ｅｇａ１（ＶＨＨ）ヌクレオチド配列は、配列番号３である。より好ましい実施形態において、Ｅｇａ１（ＶＨＨ）アミノ酸配列は、配列番号４である。より好ましい実施形態において、Ｅｇａ１  ＣＤＲ配列は、ＣＤＲ１（配列番号５）、ＣＤＲ２（配列番号６）およびＣＤＲ３（配列番号７）である。
【００７５】
別の好ましい実施形態において、腫瘍関連抗原は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。本明細書で使用される場合、ＣＥＡＣＡＭ１、ＢＧＰ１、ＢＧＰＩ、ＣＤ６６ａ、ＢＧＰとしても公知の「癌胎児性抗原」または「ＣＥＡ」という用語は、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１を指す。前記タンパク質が分類されたヒト遺伝子は、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースにおいて、受入番号ＥＮＳＧ００００００７９３８５で示される。
【００７６】
ホモ三量体化ドメイン、ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニスト、および腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な最適な領域の間のリンカー領域
本発明によるＴＰＣを形成する単量体ポリペプチドの異なるエレメントは、互いに直接連結されていてもよく、またはアミノ酸スペーサーもしくはリンカーを介して接続されていてもよい。
【００７７】
１つの実施形態において、ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニスト、およびホモ三量体化体は、直接接続される。１つの実施形態において、ホモ三量体化体、および腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域は、直接接続される。別の実施形態において、ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニストは、ホモ三量体化体に直接接続され、ホモ三量体化ドメインは、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域に直接接続される。
【００７８】
別の実施形態において、ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニスト、およびホモ三量体化ドメインは、アミノ酸リンカーまたはスペーサーにより接続される。１つの実施形態において、ホモ三量体化ドメイン、および腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域は、アミノ酸リンカーまたはスペーサーにより接続される。別の実施形態において、ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニストは、ホモ三量体化ドメインにアミノ酸リンカーを介して接続され、ホモ三量体化ドメインは、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域にアミノ酸リンカーによって接続される。
【００７９】
本明細書に開示される場合、スペーサーは、適切な長さおよび特徴のペプチドを接続または連結する挿入物である。一般に、前記スペーサーは、前記ドメインの間のヒンジ領域としての機能を果たし、それらが、個々のドメインの三次元形式を維持しながら、互いに独立して動くことを可能にする。この意味において、好ましいスペーサーは、この動きを可能にする構造の延性または柔軟性によって特徴付けられるヒンジ領域であろう。スペーサーの長さは、変えることができ、典型的には、スペーサー中のアミノ酸の数は、１００個以下のアミノ酸、好ましくは、５０個以下のアミノ酸、より好ましくは、４０個以下のアミノ酸、さらにより好ましくは、３０個以下のアミノ酸、さらにいっそう好ましくは、２０個以下のアミノ酸である。
【００８０】
あるいは、適切なスペーサーは、マウスＩｇＧの上部ヒンジ領域の１０アミノ酸残基の配列に基づくことができ、これは、コイルドコイルの手段による二量体化抗体の生成のために使用されており（Ｐａｃｋ  Ｐ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１５７９−１５８４）、本発明によればスペーサーペプチドとして有用であり得る。これはまた、ヒトＩｇＧ、または他のヒトＩｇサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＭおよびＩｇＡ）の上部ヒンジ領域の対応する配列であり得る。ヒトＩｇの配列は、人間において免疫原性であると予想されない。本発明において使用することができる追加のスペーサーは、アミノ酸配列ＧＡＰ、ＡＡＡのペプチドを含む。
【００８１】
特定の実施形態において、前記スペーサーは、構造柔軟性（すなわち、柔軟な連結ペプチドまたは「フレキシブルリンカー」）を有するペプチドであり、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択される２つ以上のアミノ酸を含む。別の特定の実施形態において、スペーサーは、アミノ酸残基、特に、ＧｌｙおよびＳｅｒの繰り返し、またはアミノ酸残基の任意の他の適切な繰り返しを含有するペプチドである。実際上、任意のフレキシブルリンカーを、本発明によるスペーサーとして使用することができる。
【００８２】
好ましい実施形態において、スペーサーは、フレキシブルリンカーである。より好ましい実施形態において、フレキシブルリンカーは、１〜１８残基の間である。さらにより好ましい実施形態において、フレキシブルリンカーは、５、１７または１８残基、好ましくは、１８残基である。
【００８３】
好ましい実施形態において、ホモ三量体化ドメイン、およびＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニストは、直接連結される。別の好ましい実施形態において、ホモ三量体化ドメイン、およびＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニストは、フレキシブルリンカーを介して連結されてなる。より好ましい実施形態において、フレキシブルリンカーは、少なくとも１残基、少なくとも２残基、少なくとも３残基、少なくとも４残基、少なくとも５残基、少なくとも６残基、少なくとも７残基、少なくとも８残基、少なくとも９残基、少なくとも１０残基、少なくとも１１残基、少なくとも１２残基、少なくとも１３残基、少なくとも１４残基、少なくとも１５残基、少なくとも１６残基、少なくとも１７残基、または少なくとも１８残基である。さらにより好ましい実施形態において、フレキシブルリンカーは、１８残基長である。
【００８４】
好ましい実施形態において、ホモ三量体化ドメイン、および腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域は、直接連結される。別の好ましい実施形態において、ホモ三量体化ドメイン、および腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域は、フレキシブルリンカーを介して連結されてなる。より好ましい実施形態において、フレキシブルリンカーは、少なくとも１残基、少なくとも２残基、少なくとも３残基、少なくとも４残基、少なくとも５残基、少なくとも６残基、少なくとも７残基、少なくとも８残基、少なくとも９残基、少なくとも１０残基、少なくとも１１残基、少なくとも１２残基、少なくとも１３残基、少なくとも１４残基、少なくとも１５残基、少なくとも１６残基、少なくとも１７残基、または少なくとも１８残基である。さらにより好ましい実施形態において、フレキシブルリンカーは、１６残基長である。
【００８５】
好ましい実施形態において、ホモ三量体化ドメインは、ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニスト、または腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域のいずれかに直接連結されてなる。別の好ましい実施形態において、ホモ三量体化ドメインは、ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニスト、および腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域に直接連結されてなる。好ましい実施形態において、ホモ三量体化ドメインは、フレキシブルリンカーを介して、ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニスト、または腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域のいずれかに直接連結されてなる。別の好ましい実施形態において、ホモ三量体化ドメインは、フレキシブルリンカーを介して、ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニスト、および腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域に直接連結されてなる。
【００８６】
より好ましい実施形態において、フレキシブルリンカーは、少なくとも１残基、少なくとも２残基、少なくとも３残基、少なくとも４残基、少なくとも５残基、少なくとも６残基、少なくとも７残基、少なくとも８残基、少なくとも９残基、少なくとも１０残基、少なくとも１１残基、少なくとも１２残基、少なくとも１３残基、少なくとも１４残基、少なくとも１５残基、少なくとも１６残基、少なくとも１７残基、または少なくとも１８残基である。より好ましい実施形態において、フレキシブルリンカーは、１７および／または１８残基長である。さらにより好ましい実施形態において、ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニストは、１８残基長のリンカーを介して、ホモ三量体化ドメインに連結されてなり、および／または腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域は、１６残基長のリンカーを介して、ホモ三量体化ドメインに連結されてなる。
【００８７】
好ましい実施形態において、１８残基長のリンカーは、配列番号１０である。別の好ましい実施形態において、１６残基長のリンカーは、配列番号１１である。
【００８８】
好ましい実施形態において、ＴＰＣの少なくとも１つの単量体は、三量体ポリペプチドの検出および／または精製のために適切なタグをさらに含む。タグの非限定的な例としては、タグペプチドなどのアフィニティー精製タグが挙げられ；実例として、前記タグの非限定的な例としては、ポリヒスチジン［ポリ（Ｈｉｓ）］配列、得られた融合タンパク質を免疫アフィニティークロマトグラフィーによって精製するために使用され得る抗体によって認識される能力があるペプチド配列、例えば、熱ウイルスのヘマグルチニンに由来するエピトープ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｓｔｒｅｐタグなどが挙げられる。別の好ましい実施形態において、ＴＰＣの単量体は、三量体ポリペプチドの検出および／または精製のために適切なタグをさらに含む。
【００８９】
特定の実施形態において、３つの単量体ポリペプチドのそれぞれ１つは、１つのアフィニティー精製タグを含み、前記タグは、互いに異なり（例えば、アフィニティー精製タグ「ａ」、「ｂ」および「ｃ」、ここで、タグ「ａ」は物質Ａに結合することによって認識され、タグ「ｂ」は物質Ｂに結合することによって認識され、タグ「ｃ」は物質Ｃに結合することによって認識される）、これは、対応する物質（Ａ、ＢおよびＣ）に対して親和性を示す本発明のそのようなＴＰＣのみの選択的回収を可能にするように設計された３工程のアフィニティー精製手順に付されされる。前記アフィニティー精製タグは、直列で直接融合することができ、あるいは、切断可能リンカー、すなわち、酵素的または化学的手段によって特異的に切断可能なアミノ酸配列を含有するペプチドセグメント（すなわち、認識／切断部位）を介して単量体ポリペプチドに融合することができる。特定の実施形態において、前記切断可能リンカーは、エンテロキナーゼ、Ａｒｇ  Ｃエンドプロテアーゼ、Ｇｌｕ  Ｃエンドプロテアーゼ、Ｌｙｓ  Ｃエンドプロテアーゼなどのプロテアーゼ、第Ｘａ因子などによって切断可能なアミノ酸配列を含み、あるいは、別の特定の実施形態において、前記切断可能リンカーは、例えば、メチオニン残基を切断する臭化シアン、または任意の他の適切な化学試薬などの化学試薬によって切断可能なアミノ酸配列を含む。切断可能リンカーは、その後にアフィニティー精製タグの除去が望ましい場合に有用である。
【００９０】
好ましい実施形態において、３つの単量体ポリペプチドは、同じアフィニティー精製タグを含む。タグは、単量体の任意の位置、特に、ホモ三量体化ドメインに対してＣ末端またはＮ末端に位置し得る。より好ましい実施形態において、タグは、ＴＮＦＲファミリー共刺激受容体のアゴニストのＮ末端にある。より好ましい実施形態において、タグは、Ｈｉｓ６−ｍｙｃタグまたはｓｔｒｅｐ−Ｆｌａｇタグである。より好ましい実施形態において、タグは、配列番号８のｆｌａｐタグ、および／または配列番号９のＳｔｒｅｐＩＩタグである。
【００９１】
別の好ましい実施形態において、単量体は、三量体ポリペプチドの循環半減期を増加させる部分をさらに含む。本発明によれば、「半減期」は、身体中の化合物の濃度または量が、所与の濃度または量の半分に低減するために必要な期間である。所与の濃度または量は、半減期が「開始点」として選択された濃度または量から完全に独立しているので、観察された時間の間に観察された最大値、または投与の開始時に存在する濃度または量である必要はない。
【００９２】
当業者に公知の治療的投薬について最適ではない半減期プロファイルを増加させるための非限定的な例としては、薬理学的に活性なペプチドまたはタンパク質の、生来長い半減期のタンパク質またはタンパク質ドメインとの遺伝子融合（例えば、Ｆｃ融合、トランスフェリン融合、またはアルブミン融合）；薬理学的に活性なペプチドまたはタンパク質の、不活性なポリペプチド、例えば、ＸＴＥＮ（組換えＰＥＧまたは「ｒＰＥＧ」としても公知）、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ；ＨＡＰ化）、プロリン−アラニン−セリンポリマー（ＰＡＳ；ＰＡＳ化）またはエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ；ＥＬＰ化）との遺伝子融合；薬理学的に活性なペプチドまたはタンパク質の、繰り返し化学部分、例えば、ＰＥＧ（ＰＥＧ化）またはヒアルロン酸の化学コンジュゲーションにより、流体力学的半径を増加させること；ポリシアル化により、薬理学的に活性なペプチドまたはタンパク質を融合する負電荷を著しく増加させること；あるいは、ヒトＧＧ  βサブユニットなどの天然タンパク質の半減期を延長することが公知の、負に荷電し、高シアル化されたペプチド（例えば、カルボキシ末端ペプチド［ＣＴＰ；絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）β鎖のもの］）を目的の分子と融合すること；ペプチドまたはタンパク質結合ドメインの、生物活性タンパク質、ＨＳＡ、ヒトＩｇＧまたはトランスフェリンなどの通常長い半減期のタンパク質への付着を介して、非共有結合的に結合させること；ペプチドまたは低分子の、ヒトＩｇＧ、Ｆｃ部分またはＨＳＡなどの長い半減期のタンパク質への化学的コンジュゲーションが挙げられる。
【００９３】
好ましい実施形態において、半減期は、ＴＰＣ循環半減期を増加させる任意の部分なしの三量体ポリペプチドと比べて、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加され得る。
【００９４】
ＴＰＣの循環半減期を増加させる役割を果たす部分は、ＴＰＣの単量体の１つ、ＴＰＣの単量体の２つ、または３つのＴＰＣ単量体に存在し得る。また、ＴＰＣの循環半減期を増加させる役割を果たす部分は、単量体のＮ末端、単量体のＣ末端、ホモ三量体化ドメインに対してＮ末端、またはホモ三量体化ドメインに対してＣ末端に存在し得る。
【００９５】
別の好ましい実施形態において、三量体ポリペプチドの循環半減期を増加させる部分は、アルブミン断片またはアルブミン結合部分である。
【００９６】
「結合部分」という用語は、異なるエピトープまたは抗原結合ドメインと独立して、抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインを指す。結合部分は、ドメイン抗体（ｄＡｂ）であってもよく、または非免疫グロブリンタンパク質スキャフォールド、例えば、ＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＳｐＡ、アドネクチン、アフィボディ、アビマー、ＧｒｏＥｌ、トランスフェリン、ＧｒｏＥＳおよびフィブロネクチンからなる群から選択されるスキャフォールドの誘導体であるドメインであってもよく、これは、天然リガンド以外のリガンドに結合する。好ましい実施形態において、部分は、血清アルブミンに結合する。
【００９７】
ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
第２の態様において、本発明は、本発明による三量体ポリペプチドの一部を形成する単量体ポリペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド塩基を有する一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド塩基を有する。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基を有する。より好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、本発明による三量体ポリペプチドの一部を形成する単量体ポリペプチドの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つをコードする。
【００９９】
好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする配列に対して５’位にあり、かつ当該配列と同じオープンリーディングフレーム内にあるシグナル配列をコードする配列をさらに含む。本明細書で使用される場合、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」という用語は、細胞中で合成されたタンパク質を分泌経路に向かわせる、比較的短い長さ、一般に、５〜３０アミノ酸残基の間のペプチドを指す。シグナルペプチドは、通常、二次アルファヘリックス構造を採用する一連の疎水性アミノ酸を含有する。加えて、多くのペプチドは、タンパク質がその輸送のための適切なトポロジーを採用するのに寄与し得る、正に荷電した一連のアミノ酸を含む。シグナルペプチドは、そのカルボキシル末端にペプチダーゼによる認識のためのモチーフを有する傾向があり、これは、シグナルペプチドを加水分解して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質の増加を与える能力がある。シグナルペプチドは、目的のタンパク質が適切な位置に達すると、切断され得る。任意のシグナルペプチドを本発明において使用することができる。好ましい実施形態において、シグナル配列は、オンコスタチンＭのシグナル配列である。
【０１００】
前に記載のすべての用語および実施形態は、本発明のこの態様に同様に適用可能である。
【０１０１】
第３の態様において、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、細胞、好ましくは、真核細胞において、少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現するために使用される複製ＤＮＡコンストラクトを指す。発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存する。各種の発現宿主／ベクターの組み合わせを用いることができる。真核宿主のために有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主のために有用な発現ベクターとしては、ｐＣＲ  １、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体を含む大腸菌に由来するプラスミド、Ｍ１３およびフィラメント状一本鎖ＤＮＡファージなどの幅広い宿主範囲のプラスミドなどの公知の細菌プラスミドが挙げられる。これらのベクターは、形質転換プロトコールの間に外因性ＤＮＡが組み込まれたクローンを最初に選択するために使用される選択マーカーを発現するための追加の独立したカセットを含有していてもよい。発現ベクターは、好ましくは、複製開始点を含有する。発現ベクターは、１つ以上の複数のクローニング部位を含有することもできる。
【０１０３】
発現ベクターはまた、細菌におけるベクター伝播のために必要な、原核生物における複製開始点を含有していてもよい。加えて、発現ベクターは、細菌のための選択遺伝子、例えば、抗生物質、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどに対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含有することもできる。発現ベクターは、１つ以上の複数のクローニング部位を含有することもできる。複数のクローニング部位は、１つ以上の固有の制限酵素部位を含むポリヌクレオチド配列である。制限酵素部位の非限定的な例としては、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｖａＩ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１０４】
本発明のベクターだけでなく、本発明の発現ベクターを調製するために必要なＲＮＡまたはＤＮＡコンストラクトにおいて発現するポリヌクレオチドもしくは複数のポリヌクレオチドは、一般的な実験マニュアル、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｄａｖｉｄ  Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌ編，２００１，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク）または「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．ＳｅｉｄｍａｎおよびＫ．Ｓｔｒｕｈｌ編，第２巻，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク，Ｎ．Ｙ．，２００６年９月にアップデート）に含まれる従来の分子生物学の方法の手段によって得ることができる。
【０１０５】
前に記載のすべての用語および実施形態は、本発明のこの態様に同様に適用可能である。
【０１０６】
別の態様において、本発明は、前に記載のベクターを含む宿主細胞に関する。
【０１０７】
「宿主細胞」という用語は、それが、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または将来の子孫を指すように使用される。ある特定の改変は、変異または環境的影響のいずれかに起因して後続の世代において生じ得るので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一でなくてもよいが、依然として本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。宿主細胞は、任意の原核細胞（例えば、大腸菌）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫または植物細胞）であり得、これは、本発明の核酸を適切な発現ベクターに挿入すること、適切な宿主細胞をベクターで形質転換すること、および本発明のＴＰＣを構成する単量体ポリペプチドのポリペプチド部分の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することを含む、従来の遺伝子工学技法によって調製することができる。本発明の核酸は、誘導プロモーターまたは構成的プロモーターであり得る適切なプロモーターの制御下に置かれ得る。発現系に応じて、ポリペプチドは、宿主細胞の、細胞外相、ペリプラズム、または細胞質から回収され得る。
【０１０８】
適切なベクター系および宿主細胞は、当業者に利用可能な大量の文献および材料によって証拠付けられるように、当技術分野において周知である。本発明は、ベクターの構築および宿主細胞における本発明の核酸の使用にも関するので、以下に、本発明のこの態様を実施する際のそのような使用および特定の考慮事項に関する一般的な議論を提供する。
【０１０９】
一般に、原核動物は、本発明の核酸の最初のクローニング、および本発明のベクターの構築のために好ましい。例えば、下記のより具体的な開示で言及される特定の株に加えて、例として、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ番号３１４４６）、大腸菌Ｂ、および大腸菌Ｘ  １７７６（ＡＴＣＣ番号３１５３７）などの株に言及し得る。当然ながら、これらの例は、限定するよりもむしろ、説明すること意図する。
【０１１０】
原核生物は、効率の良い精製およびタンパク質の再フォールディング戦略が利用可能であるので、発現のために利用することもできる。前述の株、ならびに大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ−、ラムダ−、原栄養株、ＡＴＣＣ番号２７３３２５）、バチルス・サブチルスなどの桿菌、またはサルモネラ・ティフィムリウムもしくはセラチア・マルセッセンスなどの他の腸内細菌、およびさまざまなシュードモナス種を使用し得る。
【０１１１】
一般に、レプリコン、および宿主細胞に適合する種に由来する制御配列を含有するプラスミドベクターは、これらの宿主との関連において使用される。ベクターは、通常、複製部位、および形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を運ぶ。例えば、大腸菌は、典型的には、大腸菌種に由来するプラスミドのｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２プラスミドは、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含有し、これにより、形質転換細胞を特定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２プラスミド、または他の微生物プラスミドもしくはファージもまた、発現のために微生物によって使用され得るプロモーターを含有しなければならないか、または含有するように改変されなければならない。
【０１１２】
組換えＤＮＡ構築において最も一般的に使用されるこれらのプロモーターとしては、Ｂ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系、ならびにトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ＥＰ３６７７６）が挙げられる。これらは最も一般的に使用されるが、他の微生物プロモーターが発見および利用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細は公開されており、当業者であれば、それらをプラスミドベクターと機能的にライゲートすることが可能である。原核生物に由来するある特定の遺伝子は、それら自身のプロモーター配列から大腸菌において効率良く発現することができ、人工的な手段による別のプロモーターの追加についての必要性を排除する。
【０１１３】
原核生物に加えて、酵母培養物などの真核微生物を使用することもできる。真核微生物の中で、サッカロミセス・セレビシアエ、または一般的なパン酵母が、最も一般的に使用されるが、多くの他の株も一般に利用可能である。サッカロミセスにおける発現のために、例えば、プラスミドＹＲｐ７が、一般的に使用される。このプラスミドは、既にｔｒｐ１遺伝子を含有しており、これは、トリプトファン中で成長する能力が欠如した酵母の突然変異株、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、１９７７、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５：２３−３３）のための選択マーカーを提供する。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてｔｒｐ１の損傷の存在は、その結果、トリプトファンの非存在下での成長により形質転換体を検出するための有効な環境を提供する。
【０１１４】
酵母ベクターにおける適切なプロモーティング配列は、３−ホスホグリセレートキナーゼ、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の糖分解酵素のためのプロモーターを含む。適切な発現プラスミドの構築において、これらの遺伝子に関連する終止配列はまた、発現する所望の配列の発現ベクターの３’とライゲートさせて、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終止を提供する。
【０１１５】
成長条件によって制御される転写の追加の利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ−２、イソチトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、および前述のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびラクトースの利用に関与する酵素のためのプロモーター領域である。酵母と適合するプロモーター、複製開始点および終止配列を含有する任意のプラスミドベクターが適切である。
【０１１６】
微生物に加えて、多細胞生物に由来する細胞の培養物を宿主として使用することもできる。原則として、任意のそのような細胞培養は、脊椎動物または無脊椎動物の培養物に由来するかにかかわらず、実行可能である。しかしながら、脊椎動物細胞における関心が最も高く、培養（組織培養）における脊椎動物の増殖は、近年、日常的な手順になっている。そのような有用な宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ならびにＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３、およびＭＤＣＫ細胞株である。加えて、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系は、組換えタンパク質および抗体を産生するために広く使用される。
【０１１７】
このような細胞のための発現ベクターは、通常、（必要により）複製開始点、発現する遺伝子の前方に位置するプロモーターを、任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列とともに含む。
【０１１８】
哺乳動物細胞における使用のために、発現ベクターにおける制御機能は、しばしば、ウイルス性材料によって提供され、例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、および最も頻繁にはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期のプロモーターは、両方とも、ＳＶ４０ウイルスの複製開始点も含有する断片としてウイルスから容易に得られるので、特に有用である。ＨｉｎｄＩＩＩ部位からウイルスの複製開始点に位置するＢｇｌＩ部位に向かって伸長したおよそ２５０ｂｐの配列が含まれるならば、より小さいか、またはより大きいＳＶ４０断片を使用することもできる。さらに、そのような制御配列が宿主細胞系に適合するならば、所望の遺伝子配列に通常関連するプロモーターまたは制御配列を利用することも可能であり、しばしば望ましい。
【０１１９】
複製開始点は、例えば、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノなど）に由来し得る外因性の起源を含むベクターの構築によって提供されてもよく、または宿主細胞の染色体複製機構によって提供されてもよい。ベクターが宿主細胞の染色体に統合される場合、後者は、多くの場合、十分である。
【０１２０】
本発明のＴＰＣを構築する単量体ポリペプチドの生成の際に、例えば、ポリペプチドに非タンパク質性機能を導入することによって、材料を適切な再フォールディング条件に付すことによって（例えば、国際公開第９４／１８２２７号において示唆された一般に適用可能な戦略を使用することによって）、または単量体の望ましくないペプチド部分（例えば、最終製品中で望ましくない発現増強ペプチド断片）を切断することによって、ポリペプチドをさらに処理する必要がある場合がある。
【０１２１】
上記の議論の観点で、本発明の前記ＴＰＣ、または本発明のＴＰＣを構築する前記単量体ポリペプチドを組換え的に生成するための方法は、宿主細胞または細胞株において本発明の核酸を有し、および／または複製可能なベクターであるので、本発明の一部でもある。本発明によれば、発現ベクターは、例えば、ウイルス、プラスミド、コスミド、ミニ染色体またはファージであり得る。
【０１２２】
本発明の別の態様は、本発明の核酸を有し、かつ複製可能な、上記に記載の方法において有用な形質転換細胞（すなわち、本発明の宿主細胞）であり、宿主細胞は、細菌、酵母、もしくは原生動物などの微生物、または真菌、昆虫細胞、植物細胞、もしくは哺乳動物細胞などの多細胞生物に由来する細胞であり得る。細胞はまた、トランスフェクトされていてもよい。
【０１２３】
本発明のさらに別の態様は、本発明のＴＰＣまたはそのポリペプチド部分を構築する単量体ポリペプチドを産生する安定な細胞株、好ましくは、本発明の核酸を有し、かつ発現する細胞株に関する。特に、哺乳動物細胞株のＨＥＫおよびＣＨＯに由来する細胞が興味深い。
【０１２４】
前に記載のすべての用語および実施形態は、本発明のこの態様に同様に適用可能である。
【０１２５】
三量体ポリペプチドを生成するための方法
別の態様において、本発明は、本発明による三量体ポリペプチドを生成するための方法であって、本発明によるポリヌクレオチドを有し、かつ発現する宿主細胞を含む培養物から前記三量体ポリペプチドを単離する工程、および場合により三量体ポリペプチドをさらなるプロセシングに付す工程を含む、方法に関する。
【０１２６】
本発明のＴＰＣは、例えば、組換えタンパク質産生の技法に基づく、当技術分野において一般的に公知の方法によって調製され得る。そのため、本発明は、本発明のＴＰＣを調製する方法であって、本発明のＴＰＣの少なくとも１つの単量体ポリペプチドをコードする核酸断片を有し、かつ発現する宿主細胞を含む培養物から本発明のＴＰＣを単離する工程、および場合により本発明のＴＰＣをさらなるプロセシングに付す工程を含む、方法にも関する。
【０１２７】
本発明のＴＰＣがホモ三量体である場合、前記ホモ三量体を組換え的に生成するための方法は、本発明の核酸を適切な発現ベクターに挿入すること、適切な宿主細胞をベクターで形質転換すること、および本発明による単量体ポリペプチドおよびその三量化体の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することを含む。本発明のＴＰＣがヘテロ三量体である場合、前記ヘテロ三量体は、（ｉ）他の２つの単量体ポリペプチドと異なる１つの単量体ポリペプチドのみであって、この２つの単量体ポリペプチドは互いに同一である、あるいは（ｉｉ）３つの異なる単量体ポリペプチドを含み得る。
【０１２８】
前に記載のすべての用語および実施形態は、本発明のこの態様に同様に適用可能である。
【０１２９】
医薬組成物
別の態様において、本発明は、本発明による三量体ポリペプチドを含む医薬組成物に関する。
【０１３０】
本発明によるＴＰＣは、ＴＰＣがその目的に対して適切な医薬剤形で対象に投与され、少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルを含むように、対象へのその投与のために適切なビヒクルを含有する医薬組成物の一部であり得る。したがって、特定の実施形態において、ＴＰＣは、有効成分としてのＴＰＣに加えて、少なくとも１つのビヒクル、好ましくは、薬学的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物の一部である。「ビヒクル」という用語は、一般に、有効成分が投与される、任意の希釈剤または賦形剤を含む。好ましくは、前記ビヒクルは、対象へのそれらの投与のための薬学的に許容されるビヒクルであり、すなわち、これは、規制機関、例えば、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などによって承認されたビヒクル（例えば、賦形剤）であるか、または動物、より特に、人間における使用のために一般に認められた薬局方（例えば、欧州薬局方、米国薬局方など）に含まれている。
【０１３１】
ＴＰＣは、投与のために、任意の適切な媒体に溶解することができる。有効成分が溶解、懸濁され得るか、またはそれらがエマルジョンを形成し得る、媒体の非限定的な実例としては、水、エタノール、水−エタノールまたは水−プロピレングリコール混合物など、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などのような、石油由来油、動物油、植物油、または合成油を含む油、アセトン、メチルアルコール、エチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジエチルエステル、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、四塩化炭素、クロロホルム、塩化メチレン、トリクロロエチレン、パークロロエチレン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの有機溶媒が挙げられる。
【０１３２】
同様に、使用の直前に、経口または非経口投与用の液体形態の調製物に変換されることを意図する医薬組成物の固体形態の調製物が含まれる。この種類の液体形態としては、溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。有効成分の異なる医薬剤形、使用されるビヒクル、およびその製造方法の概説は、例えば、Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ，Ｃ．Ｆａｕｌｉ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ，Ｌｕｚａｎ  ５，Ｓ．Ａ．ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ，１９９３およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編）、第２０版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，ＵＳＡ（２０００）において見出すことができる。
【０１３３】
非限定的な様式において、ＴＰＣための投与経路としては、とりわけ、経口、胃腸、経鼻または舌下経路などの非侵襲的な薬理学的投与経路、および非経口経路などの侵襲的な投与経路が挙げられる。特定の実施形態において、ＴＰＣは、非経口経路（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、髄腔内など）により、医薬剤形で投与される。「非経口経路による投与」は、注射による目的の化合物の投与からなる投与経路として理解され、したがって、注射器および針の使用を必要とする。針が到達する組織により、異なる種類の非経口穿刺：筋肉内（化合物は筋肉組織に注射される）、静脈内（化合物は静脈に注射される）、皮下（皮下に注射される）、および皮内（皮膚の層間に注射される）がある。髄腔内経路は、薬物が脊髄の周囲の空間（髄腔内空間）に投与されるように、血液脳関門を十分に透過しない薬物を中枢神経系に投与するために使用される。好ましい実施形態において、投与は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下または髄腔内投与である。
【０１３４】
ＴＰＣの治療的使用
別の態様において、本発明によるＴＰＣは、がんの処置のために使用される。本明細書で使用される場合、「処置」という用語は、患ったがんに対する感受性を、終わらせる、改善する、または低減する目的を有する任意の種類の治療を指す。したがって、「処置」、「処置する」およびそれらの同等の用語は、薬理学的または生理学的に望ましい効果を得ることを指し、人間を含む哺乳動物におけるがんの任意の処置を包含する。効果は、障害および／またはそれに帰する有害作用の完全または部分的な予防を提供するという点で、予防的であり得る。言い換えれば、「処置」には、（１）疾患を阻害すること、例えば、その進行を止めること、（２）患者がもはや疾患もしくはその症状に苦しむことなく、例えば、失われた、非存在、もしくは欠陥のある機能の回復または修復により、疾患またはその症状の退行を引き起こすように、または効果がないプロセスを刺激するように、障害、または少なくともそれらに関連する症状を妨げること、または終わらせること、あるいは（３）疾患またはそれらに関連する症状を軽減、緩和、または改善することであって、軽減が、独立して、炎症、疼痛、呼吸困難、もしくは運動不能などのパラメーターまたは症状の大きさにおける少なくとも低減を指す広い意味で使用される、を含む。
【０１３５】
本明細書に開示されるように、「がん」および「腫瘍」という用語は、未調節の細胞成長によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態に関する。がんの例としては、限定されるものではないが、副腎、骨、脳、乳房、気管支、結腸および／または直腸、胆嚢、消化管、頭頸部、腎臓、喉頭、肝臓、肺、神経組織、膵臓、前立腺、副甲状腺、皮膚、胃、および甲状腺のがんが挙げられる。がんの他の例としては、腺がん、腺腫、基底細胞がん、子宮頸部異形成および上皮内がん、ユーイング肉腫、扁平上皮がん、巨細胞腫、多形神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍａ）、毛様細胞腫瘍、腸神経節神経腫、過形成性角膜神経腫瘍、膵島細胞がん、カポジ肉腫、平滑筋腫、白血病、リンパ腫、悪性カルチノイド、悪性黒色腫、悪性高カルシウム血症、マルファン体質腫瘍、髄様がん、転移性皮膚がん、粘膜神経腫、骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｉｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、骨髄腫、菌状息肉腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、骨原性および他の肉腫、卵巣腫瘍、褐色細胞腫、真性赤血球増加症（ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｒｍｉａ  ｖｅｒａ）、原発性脳腫瘍、小細胞肺腫瘍、潰瘍性および乳頭型の両方の扁平上皮がん、セミノーマ、軟部肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、腎細胞腫瘍または腎細胞がん、細網肉腫（ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ）およびウィルムス腫瘍が挙げられる。がんの例としては、星状細胞腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、神経膠腫または神経膠芽腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）および膵臓神経内分泌がんも挙げられる。
【０１３６】
本発明による三量体ポリペプチド複合体は、限定されないが、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部、頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣および肝臓の腫瘍などの任意のがんまたは腫瘍の処置のために有用である。
【０１３７】
さまざまな実施形態において、処置される患者のがんは、転移性がん、あるいはファーストライン、セカンドラインもしくはサードライン処置に対して難治性である難治性および／または再発性がんである。別の実施形態において、処置は、ファーストライン、セカンドラインもしくはサードライン処置である。本明細書で使用される場合、「ファーストライン」または「セカンドライン」または「サードライン」という語句は、患者が受ける処置の順序を指す。ファーストライン処置レジメンは、最初に与えられる処置であるが、セカンドラインまたはサードライン処置は、それぞれ、ファーストライン治療後、またはセカンドライン処置後に与えられる。したがって、ファーストライン処置は、疾患または状態に対する最初の処置である。がんを有する患者において、一次処置は、手術、化学療法、放射線療法、またはこれらの治療の組み合わせであり得る。ファーストライン処置はまた、当業者に、一次治療または一次処置と称される。典型的には、患者は、患者がファーストライン治療に対して、陽性の臨床応答を示さなかったか、もしくは亜臨床応答のみを示したか、またはファーストライン処置を停止したので、その後、化学療法レジメンが与えられる。この文脈において、「化学療法」は、古典的な細胞傷害性化学療法だけでなく、分子標的療法および免疫療法も包含するその最も広い意味で使用される。
【０１３８】
好ましい実施形態において、がんは、三量体ポリペプチド中に存在する、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な分子によって特異的に認識される腫瘍関連抗原に対して陽性である。より好ましい実施形態において、がんは、ＥＧＦＲ陽性である。
【０１３９】
「陽性」という用語は、ＴＡＡを指すために本明細書で使用される場合、腫瘍またはがん中のＴＡＡの「量」もしくは「レベル」が、非陽性腫瘍または正常細胞において観察されるものよりも高いことを示す。発現レベルは、当業者に公知の方法によって、また本明細書に開示の方法によって、測定することができる。「発現のレベル」または「発現レベル」という用語は、一般に、生体試料中のバイオマーカーの量を指す。「発現」は、一般に、情報（例えば、遺伝子がコードする情報および／またはエピジェネティックな情報）が、細胞中に存在し、作動する構造に変換されるプロセスを指す。したがって、本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドへの転写、ポリペプチドへの翻訳、またはさらなるポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドの修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）を指し得る。転写されたポリペプチド、翻訳されたポリペプチド、またはポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチド修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）の断片も、それらが選択的スプライシングまたは分解された転写物によって生じた転写物が起源であるか、または、例えば、タンパク質分解によるポリペプチドの翻訳後プロセシングが起源であるかに関わらず、発現していると見なされるべきである。「発現遺伝子」には、ｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドに転写され、次いで、ポリペプチドに翻訳されるもの、およびＲＮＡに転写されるが、ポリペプチドに翻訳されないもの（例えば、トランスファーＲＮＡおよびリボソームＲＮＡ）も含む。
【０１４０】
「増加した発現」、「増加した発現レベル」、「増加したレベル」、「上昇した発現」、「上昇した発現レベル」または「上昇したレベル」は、対照、例えば、疾患もしくは障害（例えば、がん）、内部対照（例えば、ハウスキーピングバイオマーカー）、または患者の群／集団からの試料中のバイオマーカーの発現レベルの中央値を有さない個体もしくは複数の個体と比べて、個体におけるバイオマーカーの増加した発現または増加したレベルを指すために互換可能に使用される。
【０１４１】
より好ましい実施形態において、がんは、結腸直腸がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、腎臓がん、頭頸部がん、胃がん、食道がん、婦人科がん、前立腺がん、尿路上皮がん、神経がん、および血液がんである。別の好ましい実施形態において、婦人科がんは、卵巣がん、子宮頸がんおよび／または子宮内膜がんであり、神経がんは、多形神経膠芽腫であり、血液がんは、急性骨髄性白血病である。
【０１４２】
前に記載のすべての用語および実施形態は、本発明のこの態様に同様に適用可能である。
【０１４３】
本発明は、単なる例示と見なされるべき以下の実施例によって記載し、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１４４】
材料および方法
抗体および試薬
使用したモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は以下を含んでいた。マウスＩｇＧ１抗ｃ−ｍｙｃ（クローン９Ｅ１０、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ；英国）、マウスＩｇＧ１抗ＦＬＡＧ（クローンＭ２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、米国）、マウスＩｇＧ１抗Ｈｉｓ６（クローンＢＭＧ−Ｈｉｓ−１、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ペンツベルク、ドイツ）、マウスＩｇＧ１抗Ｓｔｒｅｐ（クローンＳｔｒｅｐタグＩＩ）（ＩＢＡ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、ゲッティンゲン、ドイツ）、ハムスターＩｇＧ１抗マウスＣＤ３（クローン１４５−２Ｃ１１、Ｉｍｍｕｎｏｓｔｅｐ、サラマンカ、スペイン）、ビオチンコンジュゲート化ハムスターＩｇＧ１抗マウスＣＤ３（クローン１４５−２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、ＣＡ、米国）、ラットＩｇＧ２ａ抗マウス４−１ＢＢ（クローン３Ｈ３、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、ＮＨ、米国）、ラットＩｇＧ２ａ抗マウス４−１ＢＢ（クローン１Ｄ８）およびラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照はＭ．Ｊｕｒｅ−Ｋｕｎｋｅｌ博士（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ、ＮＪ、米国）から快く提供された、ウサギＩｇＧ抗ヒト蛍光体−ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）（クローンＤ７Ａ５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、ライデン、オランダ）、ウサギＩｇＧ抗ｃ−ｍｙｃ（クローンＡ−１４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダラス、ＴＸ、米国）、ならびにマウスＩｇＧ１抗β−アクチン（クローン８２２６、Ａｂｃａｍ）。キメラマウス／ヒトＩｇＧ１抗ヒトＥＧＦＲのセツキシマブは、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ（ダルムシュタット、ドイツ）から、マウス／ヒトＩｇＧ１抗ヒトＣＤ２０のリツキシマブは、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｌｔｄ．（バーゼル、スイス）から購入した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート化ラットＩｇＧ２ａ抗マウスＣＤ８（クローン５３−６．７）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート化ラットＩｇＧ抗マウスＣＤ４（クローンＧＫ１．５）は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ、米国）からであった。使用したフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート化ｍＡｂｓは、ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎからのラットＩｇＧ２ａ抗マウスＣＤ４（クローンＲＭ４−５）、およびＢｉｏｌｅｇｅｎｄからのハムスターＩｇＧ２抗マウスＣＤ１３７（クローン１７Ｂ５）であった。使用したポリクローナル抗体は以下を含んでいた：西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＥコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｆｃ特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｅｌｙ、英国）、ＰＥコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｈ＆Ｌ）、およびＰＥコンジュゲート化ヤギ抗ラットＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｈ＆Ｌ）（Ａｂｃａｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ８００コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、リメリック、ＰＡ、米国���、ＩＲＤｙｅ８００コンジュゲート化ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）、およびＩＲＤｙｅ７００コンジュゲート化ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカン、ＮＥ、米国）。Ａｌｅｘａ  ６４７コンジュゲート化ロバ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、およびロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ、米国）からであった。組換えマウスＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢＬ）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄからであり、マウス４−１ＢＢ：ｈＦｃキメラ（ｍ４−１ＢＢ）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ＭＮ、米国）からであり、ヒトＥＧＦＲ：ｈＦｃキメラ（ｈＥＧＦＲ）は、Ａｂｃａｍからであった。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからであった。
【０１４５】
細胞および培養条件
ＨＥＫ２９３（ヒト胚腎臓上皮細胞、ＣＲＬ−１５７３）、ＮＩＨ／３Ｔ３（マウス胚線維芽細胞、ＣＲＬ−１６５８）、およびＡ４３１（ヒト扁平上皮がん、ＣＲＬ−１５５５）細胞は、ＤＭＥＭ完全培地（ＤＣＭ）と称する、１０％の熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｌｏｎｚａ、ウォーカーズビル、ＭＤ、米国）中で成長させた。すべての細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ロックビル、ＭＤ、米国）から入手した。ｍ４−１ＢＢを発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２３９ｍ４−１ＢＢ）は、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補充されたＤＣＭ中で培養した。ヒトＥＧＦＲを発現するマウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞（３Ｔ３ｈＥＧＦＲ）は、Ａ．Ｖｉｌｌａｌｏｂｏ博士（ＩＩＢｍ、ＣＳＩＣ−ＵＡＭ、マドリード、スペイン）により快く提供された。ヒトＥＧＦＲを発現するｐ−ＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−ｈＥＧＦＲに感染したか（ＣＴ２６ｈＥＧＦＲ）、または空のベクターレトロウイルスに感染した（ＣＴ２６ｍｏｃｋ）、マウスＣＴ２６細胞（結腸がん細胞、ＣＲＬ−２６３８）は、Ｍ．Ｒｅｓｃｉｇｎｏ博士（実験腫瘍学部、欧州腫瘍学研究所、ミラノ、イタリア）により快く提供された。すべての細胞株はＤＣＭ中で培養した。細胞株は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｐｌｕｓ  ＴＭプライマーセット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、シーダークリーク、ＴＸ、米国）を使用するＰＣＲによって、マイコプラズマ混入の非存在について、日常的にスクリーニングした。
【０１４６】
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｈｓｄ：ＩＣＲ（ＣＤ−１）およびＨｓｄ：ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１  ｎｕ雌性マウスは、Ｈａｒｌａｎ  Ｉｂｅｒｉｃａ（Ｅｎｖｉｇｏ、バルセロナ、スペイン）から購入した。動物は、必要な場合、２０〜２２℃の一定温度、相対湿度（４５〜６５％）で、明／暗の一日のサイクル（１２時間）の下、無菌条件下で飼育した。触診を、必要な場合、層流フード内で行い、滅菌水および餌を自由に摂取させた。動物のプロトコールは、参加機関のそれぞれの動物実験の倫理委員会によって承認された：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ  Ｓａｎｉｔａｒｉａ  Ｐｕｅｒｔａ  ｄｅ  Ｈｉｅｒｒｏ−Ｓｅｇｏｖｉａ  ｄｅ  Ａｒａｎａ（Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ  Ｐｕｅｒｔａ  ｄｅ  Ｈｉｅｒｒｏ  Ｍａｊａｄａｈｏｎｄａ、マドリード、スペイン）、Ｉｎｔｉｔｕｔｏ  ｄｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎｅｓ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｓ「Ａｌｂｅｒｔｏ  Ｓｏｌｓ」（ＩＩＢｍ）（ＣＳＩＣ−ＵＡＭ、マドリード）およびＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｐａｒｃ  Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、バルセロナ、スペイン）。手順は、マドリード自治政府環境問題評議会の動物福祉課（ＰＲＯＥＸ番号６６／１４、４３０／１５、２６４／１６）によって、およびカタロニア当局の倫理委員会（手順番号９９１２）によって、さらに承認された。
【０１４７】
発現ベクターの構築
１Ｄ８  ｓｃＦｖ５をコードするＤＮＡ断片を、プライマーＳｆｉＩ−１Ｄ８−ＦｗおよびＮｏｔＩ−１Ｄ８−Ｒｖを用いてＰＣＲ増幅し、ＣｌａＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素部位を合成的に導入した。ＣｌａＩ／ＮｏｔＩ  ＰＣＲ断片を、ＣｌａＩ／ＮｏｔＩの消化された主鎖ｐＣＲ３．１−Ｌ３６−ＮＣ１にライゲートして、ｐＣＲ３．１−１Ｄ８−ＴＩＥ発現ベクターをもたらした。プラスミドｓｐＣＲ３．１−１Ｄ８−ＴＩＥ０およびｐＣＲ３．１−１Ｄ８−ＴＩＥ５を得るために、直接、または５量体のフレキシブルリンカーによって、マウスＴＩＥＸＶＩＩＩドメインのＮ末端に融合された、１Ｄ８ｓｃＦｖ遺伝子をコードする２つの合成遺伝子を、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（レーゲンスブルク、ドイツ）により合成し、ＰｓｔＩ／ＸｂａＩとして、ベクターｐＣＲ３．１−１Ｄ８−ＴＩＥ１８にサブクローニングした。二重特異性トリマーボディ発現ベクターを作成するために、プラスミドｐＣＲ３．１−ＥＧａ１−ＴＩＥ７からの抗ＥＧＦＲ  ＥＧａ１  ＶＨＨ遺伝子を含有するＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ  ＤＮＡ断片を、プラスミドｐＣＲ３．１−１Ｄ８−ＴＩＥ１８のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩの消化された主鎖にライゲートして、ｐＣＲ３．１−１Ｄ８Ｎ１８−ＴＩＥ−Ｃ１８ＥＧａ１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ発現ベクターを得た。Ｎ−末端Ｆｌａｇ−ＳｔｒｅｐＩＩタグを前に記載されたプラスミドに導入するために、ｐＣＲ３．１−ＦＬＡＧ−ＳｔｒｅｐＩＩ−１Ｄ８−ＴＩＥ１８−ｉＲＧＤからのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ切断ＤＮＡ断片を、プラスミドｐＣＲ３．１−１Ｄ８Ｎ１８−ＴＩＥ−Ｃ１８ＥＧａ１−ｍｙｃ／ＨｉｓのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩの消化された主鎖にライゲートして、ｐＣＲ３．１−ＦＬＡＧ−ＳｔｒｅｐＩＩ−１Ｄ８Ｎ１８／Ｃ１８ＥＧａ１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ発現ベクターを得た。Ｃ−末端ｍｙｃ／Ｈｉｓタグ配列を、プライマーＬＥＧＡ−１およびＳｔｏｐ−ＸｂａＩ−Ｒｅｖの対を用いるＰＣＲによって除去して、最終ベクターのｐＣＲ３．１−ＦＬＡＧ−ＳｔｒｅｐＩＩ−１Ｄ８Ｎ１８／Ｃ１８ＥＧａ１を作成した。配列を、プライマーＦｗ−ＣＭＶおよびＲｖ−ＢＧＨを使用して、検証した。
【０１４８】
プラスミドｐＣＲ３．１−１Ｄ８Ｎ５ＴＩＥＣ１８ＣＥＡ．１を構築するために、ヒトＴＩＥＸＶＩＩＩドメインのＮ末端に５量体リンカーによって、ＣＥＡ特異的ＣＥＡ．１  ＶＨＨ遺伝子に１８量体リンカーによって、融合された１Ｄ８ｓｃＦｖ遺伝子のＣ末端部分をコードする合成遺伝子を、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（レーゲンスブルク、ドイツ）により合成し、ＰｓｔＩ／ＸｂａＩとして、ベクターｐＣＲ３．１−１Ｄ８Ｎ１８にサブクローニングした。ＣＥＡ特異的ＣＥＡ．１  ＶＨＨに基づくＮ末端トリマーボディＣＥＡ．１Ｎ１７をコードするベクターｐＣＲ３．１−ＣＥＡ．１−ＴＩＥＮ１７は前に記載されている。配列を、プライマーＦｗＣＭＶ（５’−ＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧ−３’）（配列番号３）およびＲｖＢＧＨ（５’−ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧ−３）（配列番号１４）を使用して、検証した。
【０１４９】
組換え抗体の発現および精製
ＨＥＫ２９３細胞を、リン酸カルシウム沈殿法によって、適切な発現ベクターでトランスフェクトし、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を有するＤＣＭ中で選択して、安定な細胞株のＨＥＫ２９３−１Ｄ８Ｎ０、ＨＥＫ２９３−１Ｄ８Ｎ５、ＨＥＫ２９３−１Ｄ８Ｎ１８およびＨＥＫ２９３−１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１を作成した。トランスフェクトされた細胞の上清を、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットによって、タンパク質発現について分析した。安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３−１Ｄ８Ｎ０、ＨＥＫ２９３−１Ｄ８Ｎ５およびＨＥＫ２９３−１Ｄ８Ｎ１８細胞からの条件培地を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析し、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ  プラスシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰの１ｍＬのカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）にロードした。別法では、ＨＥＫ２９３−１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１細胞からの条件培地を収集し、（Ｔｗｉｎ−）Ｓｔｒｅｐタグ精製システム（ＩＢＡ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。精製抗体を、ＰＢＳ＋１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）に対して４℃で終夜透析し、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、４℃で保管した。精製抗体を、製造者の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って、Ｐｉｅｒｃｅ’ｓリムルスアメボサイト溶解物（ＬＡＬ）発色エンドトキシン定量キットによって、エンドトキシンレベルについて試験した。
【０１５０】
ウエスタンブロッティング
タンパク質試料を、１０〜２０％のトリス−グリシンゲルにおいて、還元条件下で分離し、ニトロセルロース膜（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に移し、抗ｃ−ｍｙｃまたは抗ＦＬＡＧ  ｍＡｂのいずれかを用いて探索し、続いて、ＤｙＬｉｇｈｔ８００コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧとともにインキュベーションした。タンパク質バンドの可視化および定量分析を、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）赤外イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカン、ＮＥ、米国）を用いて行った。
【０１５１】
ＥＬＩＳＡ
ｍ４−１ＢＢ（３μｇ／ｍｌ）またはｈＥＧＦＲ（５μｇ／ｍｌ）の両方を、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ  Ｂｒａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ロスキレ、デンマーク）上に、４℃で終夜固定化した。洗浄、および２００μｇのＰＢＳ−５％のＢＳＡによるブロッキングの後、１００μｌの条件培地、または１μｇ／ｍｌの精製タンパク質溶液を添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳ０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、１００μｌの抗ｃ−ｍｙｃ  ｍＡｂまたは抗ＦＬＡＧ  ｍＡｂを、室温での１時間のインキュベーションのために添加した。プレートを上記に記載のようにして洗浄し、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧを各ウェルに添加した。その後、プレートを、洗浄し、ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して展開した。競合ＥＬＩＳＡのために、ｍ４−１ＢＢ（３μｇ／ｍｌ）を、４℃で終夜固定化した。洗浄およびブロッキングの後、組換えｍ４−１ＢＢＬを、所望の濃度で、ウェルに１時間添加した。その後、精製抗体溶液を、ブロッキング緩衝液に連続希釈し、ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。標準的な洗浄工程の後、抗ＦＬＡＧ  ｍＡｂ溶液を１時間添加した。洗浄の後、ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧを、添加し、ＯＰＤを使用して展開した。
【０１５２】
フローサイトメトリー
ｍ４−１ＢＢ（ＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ）またはｈＥＧＦＲ（３Ｔ３ｈＥＧＦＲおよびＣＴ２６ｈＥＧＦＲ）を発現する細胞へのｍ４−１ＢＢＬ、１Ｄ８Ｎ０、１Ｄ８Ｎ５、１Ｄ８Ｎ１８、および１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の結合をフローサイトメトリーによって分析した。簡潔には、２．５×１０５個の細胞を、精製抗体とともに氷上で１時間インキュベートし、洗浄し、抗Ｈｉｓ、抗ｃ−ｍｙｃまたは抗ＦＬＡＧ  ｍＡｂとともに氷上で３０分間インキュベートし、ＰＥコンジュゲート化ヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した。１Ｄ８  ＩｇＧおよびセツキシマブを、適切な希釈のＰＥコンジュゲート化ヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧおよびＰＥコンジュゲート化ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧをそれぞれ使用するＦＡＣＳ研究において、対照として使用した。野生型ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞およびＣＴ２６ｍｏｃｋ細胞を、陰性対照として使用した。試料を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、ベルギッシュグラートバハ、ドイツ）を用いて分析し、データを、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖ３ソフトウェア（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、グレンデール、ＣＡ、米国）を使用して評価した。マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞を、脾臓から単離し、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（グルノーブル、フランス）からのＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞単離キットを使用して精製した。マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞を、５μｇ／ｍｌのコンカナバリン−Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により、４８時間活性化した。その後、単一細胞懸濁液を、５０μｇ／ｍＬのヒトγ−グロブリン（Ｇｒｉｆｏｌｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、バルセロナ、スペイン）とともに１０分間プレインキュベートし、１０５個細胞のアリコートを、異なる表面マーカーに特異的な抗マウスＡＰＣコンジュゲート化抗体、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗体およびＰＥコンジュゲート化抗体の組み合わせとともに２０分間インキュベートした。比較研究（１Ｄ８  ＩｇＧ対１Ｄ８Ｎ５または１Ｄ８Ｎ１８）のために、コンカナバリン−Ａ活性化マウスＴ細胞（２×１０５個細胞／条件）をヒトγ−グロブリンを用いて５分間ブロッキングした。次いで、試料を、１０μｇ／ｍｌの１Ｄ８  ＩｇＧとともに氷上で２０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄した一方、他の試料は氷上で未処理のままにした。次いで、細胞を、２μｇ／ｍｌの１Ｄ８  ＩｇＧ、１Ｄ８Ｎ１８、１Ｄ８Ｎ５またはラットＩｇＧ２ａいずれかとともに氷上で２０分間インキュベートし、洗浄した。次に、ｍｙｃタグ化１Ｄ８Ｎ１８または１Ｄ８Ｎ５とともにインキュベートされた細胞、および１つの未処理対照試料を、ウサギＩｇＧ抗ｃ−ｍｙｃ  ｍＡｂとともに氷上で２０分間インキュベートし、その後、洗浄した。最後に、細胞を、ＦＩＴＣコンジュゲート化ラットＩｇＧ２ａ抗マウスＣＤ８  ｍＡｂと一緒に、Ａｌｅｘａ  ６４７−標識化ロバ抗ラットＩｇＧまたはロバ抗ウサギＩｇＧのいずれかとともに氷上で２０分間インキュベートした。試料を、ＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩおよびＦＡＣＳｏｒｔフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。高レベルの４−１ＢＢを均質に発現するＨＥＫ細胞（ＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ−Ｓ）の集団を作成するために、ＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ細胞を、ＰＥ抗マウスＣＤ１３７  ｎＡｂで染色し、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して選別した。
【０１５３】
質量分析
２μｌのタンパク質試料を、ＺｉｐＴｉｐ（登録商標）Ｃ４マイクロカラム（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビルリカ、ＭＡ、米国）を使用して脱塩し、ＧｒｏｕｎｄＳｔｅｅｌ  ｍａｓｓｉｖｅ  ３８４標的（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ビルリカ、ＭＡ、米国）上の０．５μｌのＳＡ（シナピン酸、［７０：３０］アセトニトリル：トリフルオロ酢酸０．１％中１０ｍｇ／ｍｌ）マトリックスで溶出させた。Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を、線形モードで、以下の設定で使用した：５０００−４００００Ｔｈウィンドウ、線形ポジティブモード、イオン源１：２０ｋＶ、イオン源２：１８．５ｋＶ、レンズ：９ｋＶ、１２０ｎ秒のパルスイオン抽出、最大で１０００Ｍｒまでの高ゲーティングイオン抑制。質量の較正を、タンパク質１標準較正混合物（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて、外部で実施した。データ取得、ピークのピーキングおよびその後のスペクトル分析を、ＦｌｅｘＣｏｎｔｒｏｌ  ３．０およびＦｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ  ３．０ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使用して行った。
【０１５４】
サイズ排除クロマトグラフィー−マルチアングルレーザー光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）
静的光散乱実験を、ＤＡＷＮ−ＨＥＬＥＯＳ光散乱検出器、およびＯｐｔｉｌａｂ  ｒＥＸ示差屈折率検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サンタバーバラ、ＣＡ、米国）にインラインで接続されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、室温で行った。カラムは、８．６ｍＬの排除体積を有し、吸光度（凝集タンパク質なし）は、いずれの注入においても観察されなかった。カラムを、ランニング緩衝液（ＰＢＳ＋１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１μｍでろ過）を用いて平衡化し、ＳＥＣ−ＭＡＬＳシステムを、同じ緩衝液中の１ｇ／ＬのＢＳＡの試料を用いて較正した。次いで、ランニング緩衝液中１ｇ／Ｌの２つの抗体１Ｄ８Ｎ１８および１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の１００μＬの試料を、０．５ｍＬ／分の流速で、カラムに注入した。データの取得および分析を、ＡＳＴＲＡ  ソフトウェア（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して行った。報告されたモル質量は、クロマトグラフィーピークの中央に相当する。ＳＥＣによる単量体種の分離後、ＳＥＣ−ＭＡＬＳシステムにおける２回目の注入を、０．２６ｇ／Ｌで行った。同じまたは同様の条件下での１ｇ／ＬでのＢＳＡ試料における多数の測定値に基づいて、モル質量における実験誤差は、およそ５％であると推定した。
【０１５５】
円偏光二色性
円偏光二色性測定を、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計（ＪＡＳＣＯ、東京、日本）を用いて行った。スペクトルを、０．２ｃｍ光路長の石英キュベットを使用して、ＰＢＳ中０．２ｇ／Ｌのタンパク質試料について、２５℃で記録した。１０〜９５℃の熱変性曲線を、同じタンパク質試料およびキュベットにおいて、１℃／分の速度で温度を上昇させ、２１８ｎｍでの楕円率の変化を測定することによって、記録した。
【０１５６】
小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）
ＳＡＸＳ実験を、ｂｅａｍｌｉｎｅ  Ｂ２１のダイヤモンド光源（ジドコット、英国）で行った。タンパク質を、濃縮し、データ収集前に４℃で調製した。３および６ｍｇ／ｍＬの濃度の１Ｄ８Ｎ１８および１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の４０μｌの試料を、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５＋１５０ｍＭのＮａＣｌで構成されたランニング緩衝液を使用して、インラインのＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステムを介して、Ｓｈｏｄｅｘ  Ｋｗ−４０３カラムに、４℃で送った。連続的に溶出する試料を、１ÅのＸ線波長、および３．９ｍの試料と検出器（Ｐｉｌａｔｕｓ  ２Ｍ）の距離を使用して、１０秒の取得ブロック中で３００秒間、曝露した。データは、０．０３２＜ｑ＜３．６９５Å−１の運動量移動範囲をカバーした。試料の溶出直前に記録されたフレームを、タンパク質散乱プロファイルから減算した。Ｓｃａｔｔｅｒソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｓｉｓ．ｎｅｔ）を使用して、データ、緩衝液の減算、拡大縮小、統合、および試料の可能性がある放射線障害のチェックを分析した。３ｍｇ／ｍＬの１Ｄ８Ｎ１８に対応するデータセットは、凝集に起因して、さらに分析できなかった。Ｒｇ値を、非常に小さい角度のｑ＜１．３／Ｒｇと仮定するギニエ近似を用いて計算した。最大粒子分布Ｄｍａｘ、および距離分布を、ＧＮＯＭによる散乱パターンから計算し、形状の推定を、ＤＡＭＭＩＦ／ＤＡＭＭＩＮを用いて行い、すべてのこれらのプログラムは、ＡＴＳＡＳパッケージに含まれていた。インタラクティブで作成されたＰＤＢに基づくモデルを、プログラムＲａｐｔｏｒＸ（２２８１４３９０）を用いて得たテンプレートに基づいて、２つの抗体について作製した。このモデルの実空間の散乱プロファイルを、プログラムＦｏＸＳを用いてコンピューターで計算した。
【０１５７】
バイオレイヤー干渉法を使用する動態測定
固定化ｍ４−１ＢＢ、ならびに分析物の１Ｄ８  ＩｇＧ、１Ｄ８Ｎ１８、１Ｄ８Ｎ５および１Ｄ８Ｎ０の間の相互作用のアビディティーを、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６システム（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、メンローパーク、ＣＡ、米国）で調べた。マウス４−１ＢＢを、ＡＲ２Ｇバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）上に、従来のアミン反応性カップリングによって固定化した。固定化を、ｐＨ６の１０ｍＭの酢酸緩衝液中の１０μｇ／ｍＬのｍ４−１ＢＢを使用して、２０分にわたって、１．８±０．４ｎｍのシグナルまで行った。各抗体の動態実験は、４つの非再生ｍ４−１ＢＢでコーティングされたバイオセンサーを使用し、この２つは、動態緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０）中の４ｎＭの抗体と会合させ、２つは、２ｎＭで会合させた。会合を１時間行い、続いて、分析物を含まない動態緩衝液中で３時間解離させた。取得したセンサーグラムを、Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ分析ソフトウェアを使用して、１：１モデルに包括的にフィットさせた。動態実験を、１０００ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で行った。固定化ｈＥＧＦＲおよび分析物の１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の間の相互作用のアビディティーを同様に調べた。ｈＥＧＦＲを、ｐＨ５の１０ｍＭの酢酸緩衝液中の３μｇ／ｍＬのｈＥＧＦＲを使用して、アミン反応性カップリングによって固定化した。会合および解離を、両方とも、２時間測定した。タンデムでその抗原の両方に結合する１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の能力を実証するために、ｍ４−１ＢＢを、先に記載したようにしてＡＲ２Ｇバイオセンサー上に固定化し、次いで、４ｎＭの１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１または１Ｄ８Ｎ１８を、それぞれ２つのバイオセンサーと、１時間会合させた。バイオセンサーを、一時的に、動態緩衝液に１０分間移動させ、その後、各抗体をロードした１つのバイオセンサーを、１０ｎＭのｈＥＧＦＲに１時間移動させた一方、他のバイオセンサーは、動態緩衝液中のままであった。最後に、すべてのバイオセンサーを、動態緩衝液に１時間移動させた。
【０１５８】
溶液中のバイオセンサー固定化ｍ４−１ＢＢおよびｈＣＥＡに同時に結合する１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１の能力を、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６システム（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、メンローパーク、ＣＡ、米国）において、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して調べた。ＡＲ２Ｇバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を、ｓ−ＮＨＳおよびＥＤＣを使用して活性化し、次いで、ｐＨ６の１０ｍＭの酢酸ナトリウム中の１０μｇ／ｍＬのｍ４−１ＢＢを用いて２０分間コーティングし、続いて、エタノールアミンでクエンチした。動態緩衝液（０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ）中での１０分の平衡化後、コーティングされたバイオセンサーを、４ｎＭの１Ｄ８Ｎ１８、１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１を含有する動態緩衝液中、または動態緩衝液のみ中で、１時間インキュベートした。次いで、バイオセンサーを、動態緩衝液中の５０ｎＭのｈＣＥＡの溶液、または動態緩衝液に２時間移し、続いて、動態緩衝液中で１時間最終インキュベーションした。生センサーデータをエクスポートし、Ｓａｖｉｔｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタリングによって整えた。同様に、ｍ４−１ＢＢおよびトリマーボディの間の相互作用の動態を、ｍ４−１ＢＢコーティングバイオセンサーを使用し、動態緩衝液中の２または４ｎＭの１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１とともに１時間インキュベートし、次いで、動態緩衝液中での解離を３時間監視することによって調べた。データは、Ｏｃｔｅｔ分析ソフトウェアを使用して、１：１結合モデルにフィットさせた。
【０１５９】
細胞接着アッセイ
９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、米国）を、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス腫瘍（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から抽出された（２μｇ／ｗウェル）ｈＣＥＡまたは（１μｇ／ウェル）ラミニン−１１１（Ｌｍ１１１）を用いて、４℃で終夜コーティングした。洗浄、および２００μｇの３％のＰＢＳ−ＤＭＥＭによる３７℃で１時間のブロッキングの後、適切な希釈の精製１Ｄ８Ｎ１８または１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１を、４℃で１時間添加した。洗浄の後、５×１０４個のＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２３９ｍ４−１ＢＢ細胞を、ウェルごとに、無血清培地にロードし、加湿された５％ＣＯ２雰囲気において、３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄の後、１００μｌの基質のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ、米国）をウェルごとに添加し、生物発光を、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００プレート読み取り発光光度計（Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．、チューリッヒ、スイス）を使用して測定した。結果は、少なくとも３つの別々の実験の１つからの平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表す。データを、ＢＳＡに対する接着の倍数変化として報告する。
【０１６０】
血清安定性
精製１Ｄ８Ｎ１８および１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１を、ヒト血清中、３７℃で少なくとも７日間インキュベートした。０時間での試料の結合活性を、結合活性の減衰パーセンテージに対応する時間を計算するために、１００％として設定した。
【０１６１】
Ｔ細胞共刺激アッセイ
ヤギ抗ハムスターＩｇＧを、９６ウェルプレート（５μｇ／ｍｌ）に終夜プレコーティングし、ＲＰＭＩ完全培地（ＲＣＭ）と称する、熱不活性化１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび５０μＭの２−２−メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補充された２００μｌのＲＰＭＩ（Ｌｏｎｚａ）を用いてブロッキングした後、抗マウスＣＤ３  ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ＲＣＭ中の精製マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞（２．５×１０５個／ウェル）、および示された濃度の精製抗体を添加した。対照として、精製マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞を単独で、固定化抗ＣＤ３  ｍＡｂとともに培養した。４８時間後、上清を収集し、サイトカイン放出（ＩＦＮγ）について、製造者の指示（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、ブザンソン、フランス）により行ったＥＬＩＳＡによってアッセイした。細胞増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、米国）を使用して、４８時間後に評価した。生物発光を、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００プレート読み取り発光光度計（Ｔｅｃａｎ  Ｔｒａｄｉｎｇ  ＡＧ、スイス）を使用して測定した。結果は、少なくとも３つの別々の実験の１つからの平均±ＳＤとして表す。データを、抗ＣＤ３で刺激された細胞から得られた値に対するｘ倍の変化の共刺激として報告する。
【０１６２】
抗原特異的Ｔ細胞共刺激アッセイ
精製ｈＥＧＦＲを用いる研究のために、９６ウェルプレートを、ヤギ抗ハムスターＩｇＧ（５μｇ／ｍｌ）およびｈＥＧＦＲ（５μｇ／ウェル）を用いて４℃で終夜プレコーティングした。２００μｌのＲＣＭによるブロッキングの後、抗マウスＣＤ３  ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、精製マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞（２．５×１０５個／ウェル）および精製共刺激抗体を指示された濃度で添加した。対照として、ＣＤ８ａ＋Ｔ細胞を単独で、共刺激抗体の非存在下で培養した。細胞を用いる共刺激研究のために、野生型ＮＩＨ／３Ｔ３または３Ｔ３ｈＥＧＦＲ標的細胞を、９６ウェルプレートに終夜播種した（２．５×１０４個／ウェル）。翌日、標的細胞を、指示された濃度の精製抗体とともに氷上で３０分間プレインキュベートした。精製マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞を、ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で架橋され、１０：１のエフェクター／ターゲット比（Ｅ／Ｔ）で添加された、ビオチンコンジュゲート化抗マウスＣＤ３  ｍＡｂ（１００ｎｇ／ｍｌ）（１：５モル比）で活性化した。対照として、マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞を単独で、プラスチック固定化抗ＣＤ３  ｍＡｂとともに培養した。両方のアッセイを、ＩＦＮγ分泌および細胞増殖について、前に記載されたようにして、４８時間後に分析した。結果は、少なくとも３つの別々の実験の１つからの平均±ＳＤとして表す。
【０１６３】
ヤギ抗ハムスターＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびｈＣＥＡを、９６ウェルプレートに、４℃で終夜プレコーティングした（５μｇ／ｍｌ）。ブロッキングの後、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ｅ  ｍＡｂ（クローン１４５−２Ｃ１１；Ｉｍｍｕｎｏｓｔｅｐ、サラマンカ、スペイン）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓由来の精製ＣＤ８ａ＋Ｔ細胞（ＣＤ８ａ＋Ｔ細胞単離キット、マウス、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，ＧｍｂＨ）を、６．６７ｎＭで精製抗体を有する、完全ＲＰＭＩ＋５０μＭの２−メルカプトエタノールに添加した（２×１０５個ウェル）。対照として、精製マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞を単独で、固定化抗ＣＤ３ｅ  ｍＡｂとともに培養した。７２時間後、細胞増殖を、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００プレート読み取り発光光度計を使用して、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で評価し、上清を収集し、ＥＬＩＳＡ（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、ブザンソン、フランス）によって、ＩＦＮγ分泌についてアッセイした。結果は、少なくとも３つの別々の実験の１つからの平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表す。データを、抗ＣＤ３ｅで刺激された細胞から得られた値に対する倍数変化の共刺激として報告する。
【０１６４】
生存率アッセイ
生存率アッセイのために、精製マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞（１０５個／ウェル）を、上記に記載のようにして、異なる刺激を伴なって、９６ウェルプレートで培養した。２４、４８および７２時間で、細胞を収集し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、アネキシンＶ結合緩衝液（Ｉｍｍｕｎｏｓｔｅｐ）に再懸濁させ、ＦＩＴＣコンジュゲート化アネキシンＶ（Ｉｍｍｕｎｏｓｔｅｐ）および７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに室温で、１５分間、暗所でインキュベートした。次いで、試料を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０フローサイトメーターで分析した。データは、少なくとも３つの独立した実験の代表であり、値は、平均±ＳＤとして表す。
【０１６５】
ＥＧＦＲ媒介細胞増殖の阻害
Ａ４３１細胞（２×１０３個／ウェル）を、９６ウェルプレートにおいて、ＤＣＭに播種した。２４時間後、培地を、等モル濃度（０．１９〜５０ｎＭ）の精製抗体：セツキシマブ、リツキシマブ、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１または１Ｄ８  ＩｇＧを含有する、１％のＦＣＳで補充されたＤＭＥＭによって交換した。次いで、細胞を７２時間インキュベートし、生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光アッセイを使用して評価した。生物発光を、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００プレート読み取り発光光度計を使用して測定した。実験を三反復で行った。
【０１６６】
ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害
Ａ４３１細胞を、抗体処理の前に、２４時間、ＤＣＭ中で維持し、細胞を、１％のＦＣＳで補充されたＤＭＥＭ中、終夜欠乏させた。成長因子の刺激の前に、細胞を、等モル濃度（０．１μＭ）のセツキシマブ、リツキシマブ、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１または１Ｄ８  ＩｇＧの存在下、無血清ＤＭＥＭ中で４時間インキュベートし、続いて、２５ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）とともに５分間インキュベーションした。刺激後、細胞を、氷上で１０分間、Ｌａｅｍｍｌｉ溶解緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ヘラクレス、ＣＡ、米国）に溶解し、擦過することにより収集した。試料を、４〜１２％のトリス−グリシンゲル上で、還元条件下で分離し、ｉＢｌｏｔドライブロッティングシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ニトロセルロース膜に移した。膜を、ウサギ抗ヒト蛍光体−ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）ｍＡｂ（クローンＤ７Ａ５）とともに終夜インキュベートし、続いて、ＩＲＤｙｅ８００コンジュゲート化ロバ抗ウサギ抗体とともにインキュベーションした。同時に、抗β−アクチンマウスｍＡｂを、ローディング対照として添加し、続いて、ＩＲＤｙｅ７００コンジュゲート化ロバ抗マウスＩｇＧを添加した。タンパク質バンドの可視化および定量分析を、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外イメージングシステムを用いて行った。
【０１６７】
抗体標識化
製造者の推奨に従って（Ｂｉｏｔｉｕｍ、フリーモント、ＣＡ、米国）、精製１Ｄ８  ＩｇＧ、１Ｄ８Ｎ１８および４−１ＢＢＬを、Ｍｉｘ−ｎ−Ｓｔａｉｎ  ＣＦ４８８Ａ抗体標識キットを用いて標識し、精製３Ｈ３  ＩｇＧおよび１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１を、Ｍｉｘ−ｎ−Ｓｔａｉｎ  ＣＦ６４７抗体標識キットを用いて標識した。標識の程度（ＤＯＬ）を、標識化抗体の吸収スペクトルから決定した（それぞれ、ＣＦ４８８ＡおよびＣＦ６４７で標識されたタンパク質の場合において、１．５／１および２．７／１の色素／タンパク質）（Ｉｍｐｌｅｎ  ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ミュンヘン、ドイツ）。ＣＦ４８８ＡおよびＣＦ６４７で標識された抗体の機能性を、フローサイトメトリーによって検証し、構造的完全性を、非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１６８】
生細胞受容体クラスター形成イメージングおよび分子拡散定量化
ＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ−Ｓ細胞を、３５ｍｍのポリ−Ｌ−リジンのプレコーティングされたディッシュに、５０％コンフルエンスで蒔き、終夜培養した後、ディッシュを、６００μｌのＤＣＭを有する、直径３５ｍｍのチャンバー（Ｉｂｉｄｉ  ＧｍｂＨ、マーチンズビル、ドイツ）に組み立て、３７℃および５％ＣＯ２条件下、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ８  ３Ｘ  ＳＭＤ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ウェッツラー、ドイツ）上にセットした。使用した励起波長は、２〜５％の非常に低い出力で、白色光レーザー（ＮＫＴ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ａ／Ｓ、ビアケレズ、デンマーク）からの４８８ｎｍであり、検出は、５００〜５５０ｎｍであった。ＣＦ４８８Ａ標識化１Ｄ８  ＩｇＧ、１Ｄ８Ｎ１８または４−１ＢＢＬを、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で細胞に即座に添加し、ラスターイメージング相関分光法（ＲＩＣＳ）を行った。顕微鏡の点広がり関数、すなわち、蛍光色素が内外に拡散する焦点体積の特性評価を、記載されているようにして、２μｇ／ｍＬの可溶性精製ＥＧＦＰ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、ミルピタス、ＣＡ、米国）を用いて行った。ＲＩＣＳについて記録された一連の画像は、８０ｎｍのピクセルサイズを有する２５６×２５６ピクセルであり、２μ秒のドウェル時間を用いた。ＲＩＣＳ分析および拡散係数の定量化を、ＳＩＭ  ＦＣＳ  ４ソフトウェア（Ｇ−ＳＯＦＴ  Ｉｎｃ．、シャンペーン、ＩＬ、米国）を用いて行った。時系列からのすべての時間の追跡を、著しい光退色に起因する可能性がある不自然な結果を回避するために注意深く観察し、これは、そうしなければ拡散係数の定量化に影響を与えるだろう。これらの手段によって、分析にバイアスをかける場合があるトレンド除去アルゴリズムの利用を回避した。ＲＩＣＳ分析を、１０の移動平均（バックグラウンド減算）を使用して行って、細胞の動きおよび通過する動きの遅い粒子から生じる、可能性のある不自然な結果を廃棄した。得られた２Ｄ自己相関マップをフィッティングさせて、３Ｄで表される拡散表面マップを得た。同じ細胞内の目的の異なる領域（ＲＯＩ）の分析のために、対応する領域を、６４×６４ピクセルの正方形の領域を用いて描いた。選択した領域を、受容体のクラスター形成の存在または非存在の場所として定義した。統計学的目的のために、各条件を、最低５つの異なる細胞において研究し、各細胞において、最低３つの異なるＲＯＩを分析した。蛍光の明度およびコントラスト、ならびに微分干渉コントラストを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて最適化した（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）。拡散値は、ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ、ノーサンプトン、ＭＡ、米国）を使用して、箱ひげ図で表した。
【０１６９】
薬物動態研究
雌性ＣＤ−１マウス（ｎ＝２４／群）は、１Ｄ８Ｎ１８または１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１（１ｍｇ／ｋｇ）の単回静脈内（ｉ．ｖ．）用量を受けた。群あたり３頭のマウスからの血液試料を、投与後の異なる時点（５、１５、３０分および１、３、６、２４、４８時間）で収集した。血清を、遠心分離（５０００ｒｐｍ、４℃で１０分）後に得、−２０℃で保管した。血清を、上記に記載のようにして、固定化ｍ４−１ＢＢに対するＥＬＩＳＡによって、抗体濃度について分析した。薬物動態パラメーターを、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、ＣＡ、米国）を使用して計算した。
【０１７０】
腫瘍保持マウスにおける分子イメージング
ヒトＥＧＦＲ発現Ａ４３１細胞（１×１０６個）を、６週齢の雌性Ｈｓｄ：ａｔｈｙｍｉｃＮｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスの背側腔に、１０５μｌのＤＭＥＭ＋４２％のマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、皮下（ｓ．ｃ．）に移植した。腫瘍成長を、キャリパーを用いて腫瘍の直径を測定することによって、週に２回監視し、腫瘍体積を、式：体積＝（Ｄ×ｄ２／２）（式中、Ｄは腫瘍の長軸であり、ｄは扁長楕円の最短である）により計算した。動物の体重を、アッセイに沿って監視した。腫瘍体積が約０．１８０ｃｍ３に達した時に、マウスを、異なる処置群（ｎ＝３／群）に無作為に割り当て、１００μｌのＰＢＳまたは、１００μｌのＰＢＳ中のＣＦ６４７標識化抗体溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を、尾静脈に注射した。マウスを、麻酔（２．５％のイソフルレン）下、２４時間で、ＩＶＩＳスペクトルＣＴインビボイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）（ウォルサム、ＭＡ、米国）の下で指示された波長で撮像し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ３．２ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用して分析した。蛍光画像を、腫瘍内の代表的な区域から、および周囲の領域（正常組織）から、３つのＲＯＩを特定することによって分析した。腫瘍と正常組織（Ｔ／Ｎ）比を、特定されたＲＯＩの平均値で割ることによって計算した。すべての画像の蛍光強度は、ステラジアンあたり、平方センチメートルあたり、秒あたりの光子（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）として報告する。
【０１７１】
治療研究
ＣＴ２６ｈＥＧＦＲ腫瘍細胞（動物あたり１．５×１０６個）を、６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの背側腔に、１００μｌのＰＢＳ＋３０％のマトリゲル中、ｓ．ｃ．移植した。腫瘍成長を、週に３回のキャリパー測定によって監視し、腫瘍がおよそ０．４ｃｍの直径に達した時に（通常、７〜１０日）、マウスを、異なる処置群（ｎ＝５または６／群）に無作為に割り当て、ＰＢＳ、抗４−１ＢＢ抗体（１Ｄ８  ＩｇＧ、３Ｈ３  ＩｇＧ、１Ｄ８Ｎ１８、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１）または対照抗体（ラットＩｇＧ２ａアイソタイプのＭＦＥ−２３Ｎ１８）を４ｍｇ／Ｋｇで、１日おきに３回のｉ．ｐ．注射で処置した。腫瘍サイズが１．５ｃｍの任意の寸法の直径に達した時、腫瘍が潰瘍化した時、またはマウスの苦痛の任意の兆候があった時に、マウスを安楽死させた。持続性の全身免疫媒介応答を研究するために、生存マウス（ｎ＝５）を、３Ｈ３ＩｇＧまたは１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１による処置の５０日後に、反対側の左脇腹にＣＴ２６ｍｏｃｋ細胞（１．５×１０６個）で再負荷した。腫瘍成長を、週に３回のキャリパー測定によって監視した。治癒マウスおよびナイーブマウスを、原発腫瘍または再負荷腫瘍のいずれかが任意の寸法で１．５ｃｍの直径に達するか、または潰瘍化した後に、マウスを安楽死させない限り、再接種後さらに８５日間追跡した。
【０１７２】
毒性研究
肝臓毒性の分析のために、３月齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、３週間、３Ｈ３  ＩｇＧまたは１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１（６ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．用量を毎週受けた。マウスを、麻酔し、０、７、１４および２１日目に出血させた。マウス血清を得るために、血液を、ＢＤ  ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴチューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中でインキュベートし、続いて遠心分離した。血清を、使用まで−２０℃で保管した。抗体の最後の用量の１週間後に、マウスを安楽死させ、肝臓、脾臓、肺および膵臓を、外科的に取り出し、重量測定し、１０％のパラホルムアルデヒドで４８時間固定した。次いで、固定組織を洗浄し、パラフィンに包埋した。組織切片（５μｍ）を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、またはコラーゲン染色のためのシリウスレッド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、染色した。肝臓中のリンパ球浸潤を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。
【０１７３】
ルミネックスアッセイ
血液を、指示された日に、眼窩後出血を介して処置されたマウスから収集し、血清試料中の炎症性サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＴＮＦα）のレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ磁気ビーズキット（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビルリカ、ＭＡ、米国）を使用するルミネックスアッセイによって決定した。
【０１７４】
統計分析
すべての実験は、三反復で行い、統計分析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して行った。有意差（Ｐ値）を、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１を有する正規分布と仮定する、両側の独立Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を適用することによって識別した。値は、平均±ＳＤとして示す。生存曲線を、カプランマイヤーの方法を使用して作出し、２つ以上の生存曲線を、ログランク検定を使用して分析した。
【０１７５】
結果
４−１ＢＢアゴニストトリマーボディの設計
ラットＩｇＧ２ａに由来するｓｃＦｖの抗４−１ＢＢ  １Ｄ８  ｍＡｂ（Ｓｈｕｆｏｒｄ  ＷＷ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７；１８６：４７−５５）（図１Ａ）を使用して、１Ｄ８  ｓｃＦｖに基づくＮ末端トリマーボディ（１Ｄ８Ｎ）のパネルを設計した。３つの候補は、１Ｄ８  ｓｃＦｖを、１Ｄ８Ｎ０は、リンカーを有さないが、１Ｄ８Ｎ５および１Ｄ８Ｎ１８は、それぞれ、５残基長および１８残基長のリンカーを有する、マウスＸＶＩＩＩ型コラーゲン由来ホモ三量体化（ＴＩＥＸＶＩＩＩ）ドメインに連結する可変の長さのフレキシブルリンカーを用いて作成した（図１Ｂ）。すべての３つのコンストラクトを、抗ＣＥＡ  ＭＦＥ−２３ｓｃＦｖに基づいて、ベンチマークのＮ末端トリマーボディであるＭＦＥ−２３Ｎ１８と同様のレベルで、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞によって発現させた（Ｃｕｅｓｔａ  ＡＭら，ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ．２００９；４：ｅ５３８１）。還元条件下のウエスタンブロット分析において、１Ｄ８Ｎトリマーボディは、それらのアミノ酸配列から計算された分子量（リンカー長の増加の順序で、３４．４、３４．７および３６．８ｋＤａ）と一致した移動パターンを有する一本鎖型分子であった（図７Ａ）。加えて、それらは、ＥＬＩＳＡによって決定されるように、プラスチック上に固定化されたヒトＦｃ（ｍ４−１ＢＢ）との融合において、マウス４−１ＢＢを特異的に認識した（図７Ｂ）。
【０１７６】
３つの４−１ＢＢ特異的トリマーボディを、安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において産生させ、およそ１ｍｇ／Ｌの条件培地の収率で、ＩＭＡＣによって精製した（図８Ａ）。次いで、それらの結合動態を、ＢＬＩを使用して研究した。すべての１Ｄ８抗体は、バイオセンサー上に固定化されたｍ４−１ＢＢに対して、低ピコモル範囲のＫＤを示したが、１Ｄ８Ｎトリマーボディは、親の１Ｄ８  ｍＡｂの速度のおよそ半分の速度で解離することを見出した（図２Ａ）。これは、１Ｄ８Ｎトリマーボディが、実際は、機能的に三価であり、したがって、二価１Ｄ８  ＩｇＧよりも高い機能的親和性を有することを示す。さらに、１Ｄ８Ｎ１８、１Ｄ８Ｎ５および１Ｄ８Ｎ０は、極めて類似する動態速度定数を示し、リンカーの長さの変動が、１Ｄ８  ｓｃＦｖを構造的に損なわないか、または抗原へのそのアクセスを立体的に妨げないことを示す。細胞状況において４−１ＢＢを検出する１Ｄ８Ｎトリマーボディの能力を、フローサイトメトリーによって研究した。すべての１Ｄ８Ｎトリマーボディは、それらの細胞表面でマウス４−１ＢＢを発現するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ）に結合したが、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞に結合しなかった（図８Ｂ）。１Ｄ８Ｎ０のＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ細胞への結合は、１Ｄ８Ｎ５および１Ｄ８Ｎ１８の結合よりも効率が低かった（図８Ｂ）。１Ｄ８Ｎ５、１Ｄ８Ｎ１８および１Ｄ８  ＩｇＧはすべて、活性化されたマウスＣＤ８＋Ｔ細胞に結合したが、未刺激のＴ細胞に結合しなかった（図２Ｂ）。１Ｄ８Ｎ５および１Ｄ８Ｎ１８の結合は、１Ｄ８  ＩｇＧによって競合的に阻害された（図８Ｃ）。これらの結果は、１Ｄ８Ｎトリマーボディが、内因性マウス４−１ＢＢに結合する能力を維持していることを示す。
【０１７７】
次に、１Ｄ８Ｎトリマーボディの共刺激能力を、最適以下の用量の抗ＣＤ３  ｍＡｂの存在下におけるマウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞の増殖、ＩＦＮγ分泌および生存率に対するそれらの効果を試験することによって、調べた。１Ｄ８  ＩｇＧおよび１Ｄ８Ｎ１８は、増殖およびＩＦＮγを互いに同様に増加させ、１Ｄ８Ｎ５および１Ｄ８Ｎ０よりも有意に強力であった（図２ＣおよびＤ）。７２時間後、１Ｄ８  ＩｇＧおよび１Ｄ８Ｎ１８で刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞の統計学的に有意に増加した生存率が観察された。さらに、１Ｄ８Ｎ１８は、１Ｄ８  ＩｇＧよりも有意に強力であった（図２Ｅ）。組換え可溶性マウス４−１ＢＢＬ（ｍ４−１ＢＢＬ）は、本質的に不活性であった（図２Ｃ〜２Ｅ）。ｍ４−１ＢＢＬは、還元条件においておよそ４０ｋＤａで、非還元条件においておよそ７０ｋＤａで移動し、三量体に対応する（図９Ａ）。細胞表面上で発現したｍ４−１ＢＢへの結合は、１Ｄ８Ｎ１８よりも効率が低く（図９Ｂ）、競合ＥＬＩＳＡは、ｍ４−１ＢＢＬおよび１Ｄ８Ｎ１８がｍ４−１ＢＢの異なる領域を認識することを実証した（図９Ｃ）。次に、受容体の同種の発現を示す生存ＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ−Ｓ細胞において、細胞表面ｍ４−１ＢＢおよびＣＦ４８８Ａ標識化ｍ４−１ＢＢＬ、１Ｄ８  ＩｇＧまたは１Ｄ８Ｎ１８（図１０）の間の相互作用の時空間分布および動力学を調べた（図１１）。ＲＩＣＳを用いて、受容体のクラスター形成、および結合の際のその分子移動度を観察し、定量化した。ｍ４−１ＢＢＬが受容体のクラスター形成を誘導しないが、むしろ受容体の細胞質への内部移行（≒７０μｍ２／秒）を誘導することが観察された（図１２Ａ）。対照的に、１Ｄ８  ＩｇＧおよび１Ｄ８Ｎ１８は両方ともクラスター形成を誘導し、結合の際に細胞膜での横方向の移動度を、それぞれ≒１．５〜０．３５、および≒１．０〜０．１５μｍ２／秒に著しく低減する（図２Ｆ、ならびに１２ＢおよびＣ）。１Ｄ８Ｎ１８は、より大きく、より多数の膜クラスターを形成し、これは、その結果、横方向の拡散をより高い程度で妨げ、これは、より効果的で広範囲の架橋を示す（図２Ｇ）。
【０１７８】
１Ｄ８Ｎ１８は、１Ｄ８  ＩｇＧ、１Ｄ８Ｎ５および１Ｄ８Ｎ０よりもインビトロでのＴ細胞の共刺激において優れていたので、その後の研究においてそれに重点を置くことを選択した。ＳＥＣ−ＭＡＬＳを使用して、１Ｄ８Ｎ１８のオリゴマー状態を調べた。それは、シグナル配列なしの１Ｄ８Ｎ１８の予測された１１０．１ｋＤａに近い、１１２ｋＤａの質量を有する主要な対称のピークとして溶出した（図１３Ａ）（ＭＡＬＤＩによる質量分析はその非存在を確認した）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって見られるように、２つの少量のピークも検出され、最も小さいものはタンパク質不純物であった（図１３Ｂ）。他のピークは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて１Ｄ８Ｎ１８として移動するが、２４４ｋＤａのネイティブ質量を有し、おそらく三量体−二量体に相当する。２つの種は、ＳＥＣによって分離することができるが、主要なピークの再注入は、別の少量の三量体−二量体ピークを与え（図１３Ｃ）、三量体種が優勢である平衡を示す（１．０および０．２６  ｇ／Ｌで、それぞれ、８５および９７％）。
【０１７９】
ＥＧＦＲ標的化４−１ＢＢアゴニストトリマーボディの設計
その後、二重特異性トリマーボディを、抗ヒトＥＧＦＲシングルドメイン抗体（ＶＨＨ；クローンＥＧａ１）（Ｓｃｈｍｉｔｚ  ＫＲら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１３；２１：１２１４−１２２４）を１７残基長のリンカーを介して１Ｄ８Ｎ１８のＣ末端に融合させることによって作製し、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディを与えた（図１Ｃ）。コンストラクトは、１Ｄ８  ｓｃＦｖのＮ末端でｓｔｒｅｐ−Ｆｌａｇタグを用いて設計した。１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１を、安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（５ｍｇ／Ｌ）において産生させ、続いてＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎアフィニティークロマトグラフィーを行った。精製タンパク質の還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、そのアミノ酸配列から計算されたものと一致する５５．６ｋＤａの分子質量を有する単一バンドを明らかにした（シグナル配列なしで５２．９ｋＤａ；図１４Ａ）。精製１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１のオリゴマー状態を、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定によって調べた。試料は、シグナル配列なしの三量体の計算された質量（１５８．７ｋＤａ）に近い、１６０ｋＤａの質量を有する主要な対称のピーク、および３０９ｋＤａの質量を有する少量のピークとして溶出し（図１４Ｂ）、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１から区別できない（図１４Ｃ）。これらの結果は、再び、１Ｄ８Ｎ１８について見られるように、三量体の二量体の少量の集団の形成を示す。２つのオリゴマー種は、ＳＥＣによって分離することができ、三量体の単離された主要なピークの再注入は、三量体−二量体の溶出体積で非常に小さなピークのみを与える（図１４Ｄ）。１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１は、ＣＤおよび共同熱変性研究において、１Ｄ８Ｎ１８と非常に類似して行った（図１４Ｅ〜Ｆ）。ＳＡＸＳは、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１が、１Ｄ８Ｎ１８について見られる、同じ三量体化ＴＩＥＸＶＩＩＩのコアを含有することを示した。
【０１８０】
１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の機能性をＢＬＩによって実証した。１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディは、固定化ｍ４−１ＢＢとのその相互作用において、１Ｄ８Ｎトリマーボディと非常に類似した動態速度定数を有する（図３Ａ）。固定化ヒトＥＧＦＲ−Ｆｃキメラ（ｈＥＧＦＲ）への１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の結合動態もＢＬＩによって調べ、相互作用が、低ピコモルのＫＤを有することも見出した（図３Ａ）。ＥＧａ１ＶＨＨおよびＥＧａ１由来のＮ−トリマーボディ（ＥＧａ１Ｎ）の動態の以前の比較は、ＥＧａ１  ＶＨＨについての低ナノモルのＫＤ、およびＥＧａ１Ｎについての低ピコモルのＫＤを示した。これらの動態は、容易に区別でき、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１は、ＥＧａ１Ｎと同等の動態を示し、それが三価でｈＥＧＦＲに結合することを示す。１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１が、固定化ｍ４−１ＢＢおよびｈＥＧＦＲと同時に結合可能であることを見出した（図３Ｂ）。これは、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の二重特異性をさらに実証し、ｈＥＧＦＲおよびｍ−４−１ＢＢとの相互作用の間の立体障害の欠如を示す。細胞表面タンパク質としてその抗原を検出する１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の能力を、フローサイトメトリーによって研究した。１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディは、ＨＥＫ２９３（ＥＧＦＲ＋）、ＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ細胞、およびヒトＥＧＦＲを発現するマウス３Ｔ３細胞（３Ｔ３ｈＥＧＦＲ）に結合したが、野生型３Ｔ３細胞に結合しなかった（図１５）。さらに、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１は、１Ｄ８Ｎ１８と同程度に効率良く、活性化されたマウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞に結合した（図３Ｃ）。１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の多価結合をさらに評価するために、Ａ４３１細胞における増殖およびＥＧＦＲリン酸化を阻害するその能力を研究した。１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１およびＥＧＦ競合阻害剤のセツキシマブは、用量依存的な様式で、Ａ４３１の増殖（図１６Ａ）およびＥＧＦＲリン酸化（図１６Ｂ）を阻害したが、抗ヒトＣＤ２０のリツキシマブも１Ｄ８  ＩｇＧも阻害しなかった。
【０１８１】
次に、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１が、１Ｄ８Ｎ１８について見られるベースライン共刺激能力を維持しているか否か、およびこれが、ＥＧａ１のＥＧＦＲへの結合によって提供される架橋によって改善されたか否かを決定した。ＣＤ８ａ＋Ｔ細胞を、プラスチック固定化ｈＥＧＦＲの存在または非存在下、溶液中で、固定化抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび共刺激剤のパネルで刺激した。１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１は、ｈＥＧＦＲの非存在下で１Ｄ８Ｎ１８と同様の共刺激効果を有していたが、これは、ｈＥＧＦＲが含まれている場合に、大幅に増強された（図３ＤおよびＥ）。次いで、この効果を、ＥＧＦＲ陰性およびＥＧＦＲ陽性の標的細胞を使用する共培養アッセイによって確認した。ＩＦＮγレベルは、非標的化１Ｄ８分子と比較して、ＣＤ８ａ＋Ｔ細胞が１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の存在下で３Ｔ３ｈＥＧＦＲとともに培養された場合に、有意に高かった（図３Ｆ）。次に、細胞生存率に対するＥＧＦＲ標的化４−１ＢＢ共刺激の効果を調べた（図３Ｇ）。７２時間後、１Ｄ８  ＩｇＧおよび１Ｄ８Ｎ１８で共刺激された細胞と比較して、プラスチック固定化ｈＥＧＦＲの存在下、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１で共刺激されたＣＤ８ａ＋Ｔ細胞の統計学的に有意に増加した生存率が観察された（図３Ｇ）。
【０１８２】
インビボでＥＧＦＲ陽性腫瘍において選択的に蓄積されたＥＧＦＲ標的化４−１ＢＢアゴニストトリマーボディ
最初に、１Ｄ８Ｎ１８および１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の血清安定性を研究し、４−１ＢＢまたはＥＧＦＲ結合活性の有意な喪失は、３７℃で、マウス血清中で７日後に検出されなかった（図１７ＡおよびＢ）。次いで、薬物動態研究を、１Ｄ８Ｎ１８または１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の単回静脈内注射を受けたＣＤ１マウスにおいて行った。活性タンパク質の血漿中濃度を、固定化ｍ４−１ＢＢを用いるＥＬＩＳＡによって決定した。１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１は、１Ｄ８Ｎ１８と比較して、１．３時間に対して１６．１５時間の循環半減期で、延長された循環を示した（図４Ａ）。インビボイメージングのために、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１および抗４−１ＢＢ３Ｈ３  ｍＡｂ（Ｓｈｕｆｏｒｄ  ＷＷら）をＣＦ６４７で標識した。ＣＦ６４７標識化抗体は、非コンジュゲート化抗体と同様の移動パターンを実証し、同族の抗原を発現する細胞に特異的に結合した（図１８ＡおよびＢ）。右脇腹に皮下移植されたＡ４３１ヒト腫瘍異種移植片を保持する胸腺欠損ヌードマウスに、ＣＦ６４７標識化抗体を尾静脈に静脈内注射し、２４時間後に撮像した（図４Ｂ）。１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１は、３Ｈ３  ＩｇＧ（１．２９３±０．０５８１２）のものと比較して、４．８５±０．１２６６の腫瘍と正常組織（Ｔ／Ｎ）比で高い腫瘍局在を示し、これは、特定の腫瘍の蓄積がほとんどないことに対応する（図４Ｃ）。
【０１８３】
ＥＧＦＲ標的化４−１ＢＢアゴニストトリマーボディはＩｇＧに基づく４−１ＢＢアゴニストと同様の抗腫瘍活性を実証した
免疫適合マウスにおけるＥＧＦＲ標的化４−１ＢＢアゴニストトリマーボディの抗腫瘍効果を研究するために、ヒトＥＧＦＲをコードするレトロウイルスに感染させたマウスＣＴ２６結腸直腸がん（Ｈ−２ｄ）細胞（ＣＴ２６ｈＥＧＦＲ）を使用した（図１９Ａ）。ＣＴ２６ｈＥＧＦＲ細胞および空のベクターレトロウイルスに感染させたＣＴ２６ｍｏｃｋ細胞のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるインビトロの細胞増殖速度、およびインビボの取り込み速度、および成長曲線は類似しており（図１９ＢおよびＣ）、ｈＥＧＦＲの発現が、ＣＴ２６腫瘍細胞の低い免疫原性を有意に変えなかったことを示唆する。さらに、３週齢の皮下腫瘍からエクスビボで単離されたＣＴ２６ｈＥＧＦＲ細胞は、有意なレベルの表面ｈＥＧＦＲを発現した（図１９Ｄ）。ＣＴ２６ｈＥＧＦＲ細胞におけるＥＧＦＲ経路の機能性を解明するために、それらの増殖を阻害するセツキシマブおよび１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の能力を研究した。図１９Ｅに示すように、セツキシマブも１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１も、ＣＴ２６ｈＥＧＦＲ増殖に対して有意な効果を有さなかった。したがって、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の可能性がある治療効果は、ＥＧａ１媒介抗増殖効果に寄与しない。
【０１８４】
確立されたＣＴ２６ｈＥＧＦＲ腫瘍（平均直径０．４ｃｍ）を保持するマウスにおける精製１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の腹腔内注射（２日間隔で３回）は、２つの別々の実験において、１０頭のマウスのうち８頭のマウス（８０％）において腫瘍縮小を誘導した（図５ＡおよびＢ）。ＩｇＧに基づく４−１ＢＢアゴニスト抗体の１Ｄ８（図５Ａ）または３Ｈ３（図５Ｂ）による処置は、ＣＴ２６ｈＥＧＦＲ腫瘍を保持する１１頭のマウスのうち１０頭のマウス（９１％）において、完全縮小をもたらした。ＰＢＳ、対照抗体（アイソタイプのラットＩｇＧ２ａおよびＭＦＥ−２３Ｎ１８）および１Ｄ８Ｎ１８で処置されたすべてのマウスを、腫瘍細胞移植後４〜５週間以内に犠牲にした（図５ＡおよびＢ）。ＩｇＧに基づく４−１ＢＢアゴニストｍＡｂ処置によって治癒したマウスが、持続性の腫瘍特異的免疫を有することが十分に確立される。ＥＧＦＲ標的化４−１ＢＢアゴニストトリマーボディが同様の効果を生じ得るか否かを調べるために、３Ｈ３  ＩｇＧまたは１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１（図５Ｂ）での処置により移植されたＣＴ２６ｈＥＧＦＲ腫瘍を拒絶したマウスに、ＣＴ２６ｍｏｃｋ細胞で３か月後に再負荷した。３Ｈ３  ＩｇＧおよび１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１治癒マウスは、ＣＴ２６ｍｏｃｋ腫瘍細胞による再負荷に対して耐性であったが、年齢を一致させたナイーブマウスでは耐性ではなく（図５Ｃおよび２０）、トリマーボディ媒介ＥＧＦＲ標的化４−１ＢＢ共刺激が、ｈＥＧＦＲを発現しないＣＴ２６腫瘍に対する長期間の防御免疫記憶を誘導することができることを示す。
【０１８５】
ＥＧＦＲ標的化４−１ＢＢアゴニストトリマーボディで処置されたマウスはＩｇＧに基づく４−１ＢＢアゴニストで観察された免疫学的障害を欠く
同様の条件下、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１の毒性プロファイルを３Ｈ３  ＩｇＧと直接比較した。マウスに、週に１回、３週間、ＰＢＳ、３Ｈ３  ＩｇＧまたは１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１（６ｍｇ／ｋｇ）でｉ．ｐ．注射し、１週間後に安楽死させた。図６Ａに示すように、３Ｈ３  ＩｇＧによる処置は、重量によって実証されるように、脾臓および肝臓の全体的な肥大をもたらした。対照的に、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１による処置は、脾腫または肝腫大をもたらさなかった（図６Ａ）。３Ｈ３  ＩｇＧで処置されたマウスの脾臓の組織学的研究は、前に記載されているように（Ｎｉｕ  Ｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１７８：４１９４−４２１３）、未定義のゾーンを有する拡大した卵胞、および髄外造血の明確な証拠を伴なう構造の変化を明らかにした（図６Ｂ）。対照的に、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１で処置されたマウスの脾臓は、正常の組織学を示した（図６Ｂ）。また、前の結果（Ｎｉｕ  Ｌら）を確認すると、３Ｈ３  ＩｇＧによる処置は、肝臓において有意な単核細胞浸潤を引き起こし、中膜の肥厚を伴なう門脈周囲の腱板を形成し、微小血管系に関連する浸潤病巣も形成したが、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１で処置されたマウスにおいて、有意な浸潤は観察されなかった（図６Ｂ）。実際に、浸潤した単核細胞の表面は、３Ｈ３  ＩｇＧで処置されたマウスの肝臓の８％を占めたが、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１で処置されマウスでは０．６％、ＰＢＳで処置されたマウスでは０．２５％しか示さなかった（図６Ｃ）。加えて、シリウスレッド（図２１）またはマッソントリクローム（図２２）によるコラーゲン線維の染色は、３Ｈ３ＩｇＧ処置が、線維症の初期段階を示す、門脈コラーゲン線維の沈着および混乱を引き起こしたが、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１では引き起こさなかったことを示した。単核細胞浸潤は、肺においても見られ、３Ｈ３  ＩｇＧで処置されたマウスの膵臓において、門脈周囲の腱板を形成した。膵臓浸潤は、脈管構造から放射状に伸び、隣接する介在導管まで伸びていた（図６Ｂ）。３Ｈ３  ＩｇＧで処置されたマウスの膵臓の浸潤領域に突出したコラーゲン沈着が観察され、線維症を示す。対照的に、これらの特徴は、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１で処置されたマウスにおいて観察されなかった（図２１および２２）。次いで、血清中の炎症誘導性サイトカインのレベルに対する３Ｈ３ＩｇＧおよび１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１による処置の効果を比較した。図６Ｄに示すように、３Ｈ３  ＩｇＧ処置は、特に２１日目に明らかな、ＩＮＦγ、ＴＮＦαおよびＩＬ６の有意な上昇を引き起こした。対照的に、１Ｄ８Ｎ／ＣＥＧａ１は、ＰＢＳ処置動物と同等の、最小限または検出不能のレベルの炎症性サイトカインを誘導した。
【０１８６】
ＣＥＡ標的化４−１ＢＢアゴニストトリマーボディの設計および発現
ＣＥＡ標的化４−１ＢＢ−アゴニストトリマーボディを作成するために、抗ヒトＣＥＡシングルドメイン抗体（ＶＨＨ；ＣＥＡ．１）を、１７残基長のリンカーを介して、１Ｄ８Ｎ５のＣ末端に融合して、１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１トリマーボディを与えた（図２３ａ）。
【０１８７】
１Ｄ８Ｎ５は、１Ｄ８  ｓｃＦｖが、５残基長のリンカーによってマウスＸＶＩＩＩ型コラーゲン由来ホモ三量化（ＴＩＥＸＶＩＩＩ）ドメインに連結されたコンパクトなｓｃＦｖに基づくＮ末端トリマーボディである。コンストラクトを、ＣＥＡ．１  ＶＨＨのＣ末端でｃ−ｍｙｃおよびＨｉｓタグを用いて設計した。コンストラクトは、１Ｄ８Ｎ１８と同様のレベルで、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞によって分泌されたが、ＶＨＨに基づくＮ末端トリマーボディＣＥＡ．１Ｎ１７よりも低レベルであった（図２４ａ）。１Ｄ８Ｎ１８は、１８残基長のリンカーを有するｓｃＦｖに基づくＮ末端トリマーボディであり（図２３ｂ）、ＣＥＡ．１Ｎ１７は、１７残基長のリンカーを有するＶＨＨに基づくＮ末端トリマーボディである（図２３ｃ）。ＥＬＩＳＡ分析は、１Ｄ８Ｎ１８が、ヒトＦｃ（ｍ４−１ＢＢ）を有する融合体においてマウス４−１ＢＢを特異的に認識し、ＣＥＡ．１Ｎ１７が、ヒトＣＥＡ（ｈＣＥＡ）を特異的に認識した一方、１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１が、両方の抗原との特異的な結合を示したことを実証した（図２４ｂ）。さらに、１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの条件培地をｈＣＥＡでコーティングされたウェルに添加した場合、洗浄の後、ＣＥＡ結合トリマーボディは、可溶性ｍ４−１ＢＢを捕捉することが可能であった（図２４ｃ）。細胞状況においてｍ４−１ＢＢを検出する能力を、フローサイトメトリーによって研究した。１Ｄ８Ｎ１８および１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１は、それらの細胞表面でマウス４−１ＢＢを発現するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ）に結合したが、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞に結合しなかった。ＣＥＡ．１Ｎ１７について、結合は検出されなかった（図２４ｄ）。
【０１８８】
ＣＥＡ標的化４−１ＢＢアゴニストトリマーボディの構造的特性評価
１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１を、安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において産生させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって条件培地から精製し、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された高純度でタンパク質を得た（図２５ａ）。質量分析は、５０．４ｋＤａの分子量を示し、これは、シグナル配列のプロセシング後のプロモーターについて予想される重量である（データは示さない）。ＳＥＣ−ＭＡＬＳクロマトグラム（図２５ｂ）は、ピークの中央で１４３ｋＤａのモル質量を有する１２．６ｍＬで溶出する主要なピークを示し、これは、溶液中の三量体の形成を示す（１５１．２ｋＤａの計算質量を有する）。クロマトグラフィーは、カラムの排除体積である８．７ｍＬで溶出する凝集物質のわずかな割合も示す。２１８ｎｍに最小値を有する円偏光二色性スペクトルは、主にβシートの二次構造と一致し、これは、およそ５０℃まで安定である（図２５ｃ〜ｄ）。熱変性は、大きなペレットがキュベット中で観察されたので、不可逆的である。
【０１８９】
ＣＥＡ標的化４−１ＢＢアゴニストトリマーボディの機能的特性評価
二重特異性１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１の結合動態は、ｍ４−１ＢＢでコーティングされたバイオセンサーを使用して、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって調べた（図２５ａ）。図２６ａに示すように、１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１は、低ナノモル濃度でのｍ４−１ＢＢへの飽和結合、および極めて遅い解離（５％未満の解離が３時間にわたって観察されたので、相互作用半減期＞４０時間を有する）を示し、これは、ｍ４−１ＢＢ結合トリマーボディについて前に報告された結合挙動と一致した。我々はまた、ＢＬＩを使用して、ｍ４−１ＢＢおよびｈＣＥＡの両方への１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１の同時結合を実証した。１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１および１Ｄ８Ｎ１８は両方とも、センサー固定化ｍ４−１ＢＢと会合することが可能であり、１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１は、溶液中でｈＣＥＡへのその後の結合を示した（図２６ｂおよびｃ）。重要なことには、これは、いずれかの抗原への結合が、他の抗原への結合を立体的に阻害しないことを示し、これは、１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１がＴ細胞および腫瘍細胞の架橋に関与するのを防ぐだろう。
【０１９０】
１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１トリマーボディの多価および多重特異性をさらに評価するために、細胞接着アッセイ（図２７ａおよびｂ）を行った。図２７ｂに示すように、ＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ細胞を、１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１とのインキュベーション後に、ＣＥＡでコーティングされたウェルに接着させた。また、１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１は、４−１ＢＢ陽性細胞の接着を支持するにあたり、ラミニンよりも効率的であった（図２７ｃ）。ＨＥＫ２９３ｍ４−１ＢＢ細胞の接着は、ＢＳＡおよびＣＥＡでコーティングされたウェルへの野生型ＨＥＫ２９３細胞の接着が検出されなかったので、特異的であった（図２７ａ）。さらに、１Ｄ８Ｎ１８とプレインキュベートされた、ＢＳＡおよびＣＥＡでコーティングされたウェルは、４−１ＢＢ陽性および４−１ＢＢ陰性細胞の任意の有意な細胞接着を支持しなかった（図２７ａおよびｂ）。
【０１９１】
次いで、１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１が、１Ｄ８Ｎ１８について見られるベースライン共刺激能力を維持しているか否か、およびこれが、ＣＥＡ．１のｈＣＥＡへの結合によって提供される架橋によって改善されたか否かを決定した。マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞を、プラスチック固定化ｈＥＧＦＲの存在または非存在下、溶液中で、固定化抗ＣＤ３  ｍＡｂ、ならびに共刺激抗体の１Ｄ８  ＩｇＧ、１Ｄ８Ｎ１８および１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１で刺激した。１Ｄ８Ｎ／ＣＣＥＡ．１は、ｈＣＥＡの非存在下で１Ｄ８Ｎ１８と同様の共刺激効果を有していたが、ｈＣＥＡを含む場合、増殖（Ｐ＝０．００３）およびＩＦＮγレベル（Ｐ＝０．０９０）が大幅に増強された（図２７ｃおよびｄ）。
【図１】
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【図２】
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【図３ＡＢＣ】
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【図３ＤＥＦＧ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ＡＢ】
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【図６ＣＤ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４ＡＢＣ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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