(57)【要約】  有機酸の工業規模での生産に適した微生物細胞株並びにそのような細胞株を作製及び単離する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸を産生する微生物細胞株を作製及び単離する方法であって、正常な微生物細胞増殖を阻害するのに十分な量の有機酸が添加された培地における親細胞株の非固定化培養での連続継代を含み、培地のｐＨは、有機酸のｐＫａ値を上回る値に制御され、単離された微生物細胞株は、親細胞株と比較して有機酸を過剰産生する、前記方法。
【請求項２】
培地が固化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
有機酸が、連続継代の逐次反復において漸増量で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
有機酸が、連続継代の逐次反復において同一量で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
培地のｐＨが約５．５〜７．５の範囲内の値に制御される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
培地のｐＨが約６．０〜７．０の範囲内の値に制御される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
培地のｐＨが約７．０に制御される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
親細胞株が野生型である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
微生物細胞株が単細胞微生物に由来する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
微生物細胞株が、プロピオニバクテリウム属、ラクトバチルス属、アセトバクター属、グルコノバクター属、又はクロストリジウム属に由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
微生物細胞株がプロピオン酸菌に由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
有機酸が、プロピオン酸、乳酸、酢酸、又は酪酸である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
培地に約１．０％〜３．０％のプロピオン酸が添加されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
培地に約３．０％のプロピオン酸が添加されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法に従って産生される、微生物細胞株。
【請求項１６】
表３に同定される少なくとも２つの変異を有する微生物細胞株であって、好ましくはプロピオニバクテリウム属、ラクトバチルス属、アセトバクター属、グルコノバクター属、又はクロストリジウム属に由来する、前記微生物細胞株。
【請求項１７】
表３に同定される変異の全てを有する、請求項１６に記載の微生物細胞株。
【請求項１８】
表３に同定されるタンパク質又はそれらの相同体をコードする少なくとも２つの遺伝子において機能喪失型変異を有する、微生物細胞株。
【請求項１９】
表３に同定されるタンパク質又はそれらの相同体をコードする全ての遺伝子において機能喪失型変異を有する、請求項１８に記載の微生物細胞株。
【請求項２０】
（１）Ｏ抗原リガーゼドメイン含有タンパク質、（２）Ｍ１８ファミリーのアミノペプチダーゼ、（３）アミノ酸パーミアーゼ、及び（４）アデニングリコシラーゼから成る群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子において少なくとも１つの機能喪失型変異を有する、微生物細胞株。
【請求項２１】
少なくとも１つの機能喪失型変異が、Ｏ抗原リガーゼドメイン含有タンパク質をコードする遺伝子にある、請求項２０に記載の微生物細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本願は、２０１８年６月１８日提出の米国特許出願第６２／６８６４６３号に対する優先権を主張するものであり、その内容全体を本明細書に援用する。
技術分野
本開示は一般に、有機酸を過剰産生する微生物細胞株及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機酸は、酸性特性を有する炭素含有化合物を表す。有機酸の例としては、とりわけ、酢酸、クエン酸、グルコン酸、乳酸、プロピオン酸が挙げられる。有機酸は十分な分解性を示すため、生分解性ポリマーの生産に用いることができる。それらは、食品添加物などを含めた他の重要な商業的用途も有する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、有機酸の工業規模での生産に適した微生物細胞株並びにそのような細胞株を作製及び単離する方法を提供する。
１つの観点では、微生物細胞株を作製及び単離する方法を提供するものであり、単離された微生物細胞株は、親微生物細胞株と比較して有機酸を過剰産生する。該方法では、有機酸が添加されたｐＨ制御培地における親株の、好ましくは非固定化培養での連続継代が用いられ、ｐＨは、有機酸のｐＫａ値を上回る値に制御される。いくつかの態様では、ｐＨは、好ましくは約５．５〜約７．５の範囲、より好ましくは中性又はその付近である約６．０〜約７．０、最も好ましくは約７．０である。いくつかの態様では、培地は固化されている。いくつかの態様では、培地は、例えば倍加速度又は増殖速度が、例えば少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又はそれより多く低下するように、正常な微生物細胞増殖を阻害するのに十分な量の有機酸が添加されている。いくつかの態様では、有機酸は、連続継代の逐次反復において漸増量で添加される。いくつかの態様では、有機酸は、連続継代の逐次反復において同一量で添加される。いくつかの態様では、有機酸は、プロピオン酸、乳酸、酢酸、又は酪酸である。いくつかの態様では、有機酸はプロピオン酸であり、例えば、培地には、約１．０％〜３．０％のプロピオン酸、例えば約３．０％のプロピオン酸が添加される。いくつかの態様では、親細胞株は野生型生物である。いくつかの態様では、親細胞株は、単細胞微生物に由来する微生物細胞株である。
【０００４】
他の観点では、有機酸を過剰産生する微生物細胞株を提供するものであり、該微生物細胞株は、有機酸が添加されたｐＨ制御培地における連続継代を用いて作製及び単離され、該ｐＨは、有機酸のｐＫａ値を上回る値、好ましくは約５．５〜約７．５の範囲、より好ましくは中性又はその付近である約６．０〜約７．０、最も好ましくは約７．０に制御される。
【０００５】
他の観点では、有機酸を過剰産生する微生物細胞株を提供するものであり、該微生物細胞株は、主に、細胞エンベロープの構造、組成、及び／又は機能を直接的又は間接的に改変する変異を有する。好ましくは、微生物細胞株は、表３に同定される少なくとも２つのゲノム変異又は類似の変異を包含する。より好ましくは、微生物細胞株は、表３に同定されるゲノム変異又は相同変異の全てを包含する。１つの態様では、微生物細胞株は、表３に同定される少なくとも２つの遺伝子における変異又はそれに類似する変異を包含する。他の態様では、微生物細胞株は、表３に同定される遺伝子又はその相同体（例えば、本明細書に記載する他の種における相同遺伝子）の全てにおける変異を包含する。他の態様では、微生物細胞株は、Ｏ抗原リガーゼドメイン含有タンパク質における変異を包含する。他の態様では、微生物細胞株は、Ｍ１８ファミリーのアミノペプチダーゼにおける変異を包含する。他の態様では、微生物細胞株は、アミノ酸パーミアーゼにおける変異を包含する。他の態様では、微生物細胞株は、アデニングリコシラーゼにおける変異を包含する。
【０００６】
微生物は、有機酸を産生する任意の微生物であることができる。１つの態様では、微生物は、プロピオニバクテリウム（アシディプロピオニバクテリウム）属、より好ましくはプロピオン酸菌種に由来する。他の態様では、微生物は、ラクトバチルス属、より好ましくはラクトバチルス・アシドフィルス種に由来する。他の態様では、微生物はアセトバクター属に由来する。他の態様では、微生物はグルコノバクター属に由来する。他の態様では、微生物は、クロストリジウム属、より好ましくはクロストリジウム・ブチリカム種に由来する。いくつかの態様では、有機酸はプロピオン酸である。いくつかの態様では、有機酸は乳酸である。いくつかの態様では、有機酸は酢酸である。いくつかの態様では、有機酸は酪酸である。
【０００７】
本明細書には、本明細書に記載する方法及び微生物を用いた有機酸の産生方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、１．０％ＰＡを添加したか又は添加していない固体緩衝化培地での野生型及び変異型プロピオン酸菌の増殖を示し、菌株３−１の表現型を示している。
【図２】図２は、漂白Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｅａｕｔｙ薄力粉（ＷＦＭ、ボーラスとして）を用いたバイオリアクターにおけるプロピオン酸菌変異株（菌株３−１）によるＰＡ産生を、野生型と比較して示している。１：２００の接種、１Ｌの培養、５％（Ｗ／Ｖ）グルコース相当のＷＦＭ、３０℃、ｐＨ７（ＮａＯＨ、５Ｍ）。
【発明の詳細な説明】
【０００９】
最も一般的な有機酸はカルボン酸であり、その酸度はカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）に関連する。それらは一般に弱酸で、ｐＫａ値は約４〜５である。例えば、プロピオン酸（「ＰＡ」）は、化学式Ｃ２Ｈ５ＣＯＯＨ又はＣ３Ｈ６Ｏ２を有するカルボン酸である。それは無色、油状で、刺激性（スイスチーズ及び汗を思わせる）の液体であり、より小さなカルボン酸であるギ酸及び酢酸と、より大きな脂肪酸との間の物理的特性を有する。分子量は約７４．１ｇ／ｍｏｌであり、ｐＫａは約４．９であり、これは溶液ではｐＨ約４．９であることを意味し、ＰＡの半分は、プロトン化した（又は解離していない）非荷電状態（Ｃ２Ｈ５ＣＯＯＨ）にある一方、残りの半分は、脱プロトン化（又は解離）した負荷電状態（Ｃ２Ｈ５ＣＯＯ−）にあり、これはプロピオネートイオン又はプロパノエートイオンとして知られ、塩又はエステル化合物を形成することができる。ｐＨが低下する（より酸性になる）につれて、より多くのＰＡがプロトン化した非荷電状態になり；ｐＨが上昇する（より塩基性になる）と、より多くのＰＡが脱プロトン化した負荷電状態になる。
【００１０】
ＰＡは糸状菌及び一部の細菌の増殖を０．１〜１％（Ｗ／Ｖ）のレベルで阻害するため、ＰＡ及びその塩は動物飼料及びヒト用食物（焼き菓子など）に防腐剤として用いられる。米国では、ＰＡは、食品添加物として用いられる場合、食品医薬品局によって「一般に安全と認められる」又はＧＲＡＳとされている。オーストラリア、ニュージーランド、及びＥＵでも、食品添加物としての使用が認可されている。加えて、ＰＡは、セルロースから誘導されるプラスチック、殺虫剤、果実フレーバー、香水基剤、及び医薬品などの他の化学物質の合成における重要な中間体である。
【００１１】
それらは自然界に広く分布しているが、化学合成の方が経済的に競争力があるため、有機酸の商業生産は一般に化学合成に依存している。例えば、ＰＡは、現在、ほぼ例外なく石油化学的プロセスにより商業生産されている。バイオテクノロジー分野の迅速な発展と同時に、原油及び石油化学製品の価格が上昇しているため、化学合成によるＰＡの製造コストと微生物発酵によるＰＡの製造コストとの経済的差は小さくなっている。エネルギー不足及び環境汚染に関する懸念の増大と相まって、再生可能な供給源からのＰＡなどの有機酸の工業規模での生合成に対する関心は高まっている。
【００１２】
有機酸の微生物による発酵生産は公知であり、何世紀にもわたって用いられてきた。例えば、クロコウジカビ及びヤロウィア・リポリティカはクエン酸の生産に用いられ；ラクトバチルスは乳酸の生産に用いられ；クロストリジウムは酢酸の生産に用いられ；クロコウジカビ及びグルコノバクターはグルコン酸の生産に用いられてきた。
【００１３】
プロピオニバクテリウムは、ＰＡ（並びにビタミンＢ１２及びスイスチーズ）の生産に最も多く用いられる微生物である。プロピオニバクテリウムは、グラム陽性で、非運動性で、非胞子形成性で、杆菌様で、嫌気性の細菌属であり、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ種、Ｐ．ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ種、Ｐ．ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｉｃｕｍ種、Ｐ．ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｅ種、プロピオン酸菌種、Ｐ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ種、Ｐ．ｔｈｏｅｎｉｉ種、Ｐ．ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ種、Ｐ．ｏｌｉｖａｅ種、Ｐ．ｄａｍｎｏｓｕｍ種、Ｐ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ種、アクネ菌種、プロピオニバクテリウム・アビダム種、プロピオニバクテリウム・グラニュローサム種、Ｐ．ｈｕｍｅｒｕｓｉｉ種及びＰ．ｌｙｍｐｈｏｐｈｉｌｕｍ種を包含する。工業的ＰＡ生産で最も一般的に用いられる菌株はプロピオン酸菌である。（プロピオニバクテリウム属内の種を３つの新規属：アシディプロピオニバクテリウム、キューティバクテリウム、及びシュードプロピオニバクテリウムに再分類することが提案されている（Ｓｃｈｏｌｚ及びＫｉｌｉａｎ、２０１６）。しかしながら、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｃｉ及びＡｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉは、依然としていくぶん互換的に用いられている）。プロピオニバクテリウム細胞増殖に最適なｐＨ及び温度は、それぞれ約６．０〜７．０及び約３０〜３７℃である（Ａｈｍａｄｉら、２０１７）。細胞増殖は約５．０未満のｐＨでは阻害されるが、中性ｐＨで開始される発酵槽はｐＨ４．４に達する可能性がある（Ｒｅｈｂｅｒｇｅｒ及びＧｌａｔｚ、１９９８）。Ａｈｍａｄｉらは、文献（Ａｈｍａｄｉら、２０１７）に報告されているように、いくつかの炭素源でのさまざまなプロピオニバクテリウムの種によるＰＡ生産の概説を提供しており、この文献は本明細書に援用される。
【００１４】
ＰＡは、アネロビブリオ、バクテロイデス、クロストリジウム、フソバクテリウム、メガスファエラ、プロピオニスピラ、セレノモナス、及びベイロネラの特定種のような他の嫌気性細菌によって生産することもできる。
【００１５】
一連の酵素反応を介して炭素源をＰＡに変換する発酵経路はいくつか存在する。特にプロピオニバクテリウムでの、ＰＡ産生に関与する主要な発酵経路は、ウッド−ワークマンサイクルとして知られ、このサイクルは、解糖からの最終産生物であるピルビン酸塩からプロピオン酸塩を産生し、オキサロ酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、スクシニル−ＣｏＡ、メチルマロニル−ＣｏＡ、及びプロピオニル−ＣｏＡを含めた多くの中間体と、オキサロ酢酸トランスカルボキシラーゼ、ビオチン依存性カルボキシトランスフェラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマル酸ヒドロラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、補酵素Ｂ１２依存性メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、及びコハク酸デヒドロゲナーゼを含めた多くの酵素とを包含する。
【００１６】
ほとんどのピルビン酸塩は発酵中にＰＡ／プロピオン酸塩に変換されるが、一部は酢酸塩に変換される。酢酸塩形成経路には、中間体のアセチルＣｏＡ及びアセチルホスフェートと、酵素のピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、ホスホトランスアセチラーゼ、及び酢酸キナーゼが関与する。
【００１７】
グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、キシロース、ラクトース、グリセロール、乳酸塩、穀粉加水分解産物、糖蜜、乳清、及びそれらの組合せを含めたいくつかの炭素源が、微生物によるＰＡ生産に用いられている。バッチ発酵、流加発酵、及び連続発酵などのいくつかの培養系が用いられている。
【００１８】
しかしながら、工業規模での微生物による有機酸の生産を経済的に実行可能にするためには、発酵プロセスは、炭素源を高収率（炭素源からの有機酸の産生量、典型的にはｇ／ｇで測定される）及び高生産性（有機酸の産生率、典型的にはｇ／Ｌ．ｈで測定される）で変換できなければならない。
【００１９】
有機酸の生産収率を向上させるために、流加発酵、連続培養発酵、多段階発酵、細胞固定化発酵、及び抽出発酵システムを含めたさまざまな発酵技術が探索されてきた。しかしながら、しばしば見られる収率及び生産性における小幅な上昇は、生産コストの著しい上昇によって相殺されてしまう。
【００２０】
例えば、乳清を供給原料として用いてＰＡを生産するために、共培養法が用いられている（ＷＯ８５／０４９０１号；ＥＰ０１４１６４２ Ａ１）。ＷＯ８５／０４９０１号には、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｃｒｉｃｅｔｉｄの存在下でラクトバチルス・カゼイ亜種ラムノサスを用いて、２段発酵プロセスにより乳酸塩をプロピオン酸塩に相互変換することが記載されている。第１段階では炭水化物がラクトバチルス・カゼイによって乳酸に変換され；第２段階では乳酸がＶ．ｃｒｉｃｅｔｉｄによって発酵されてＰＡになる。（ラクトバチルス属及びベイロネラ属は両方ともファーミキューテス門に属するが、プロピオニバクテリウム属はアクチノバクテリア門に属する。）また、ＥＰ０１４１６４２号は、乳酸産生細菌（ラクトバチルス・カゼイ）及びＰＡ産生細菌（プロピオニバクテリウム・シェルマニ）の混合培養を用いて、発酵収率を最大にすることが記載されている。ＷＯ８５／０４９０１号及びＥＰ０１４１６４２号の共培養系は、ラクトースからのＰＡ産生に関して非常に生産性が高く、最終収率は２０〜１００ｇ／Ｌであることが報告されている。しかしながら、このような共培養系は、プロセスパラメーターに関し考慮すべき点が示唆される。例えば、それらは、培養系の各メンバーの増殖及び代謝活性に対する制御が不十分であるという問題を有し、これにより、いずれかのメンバーの増殖又は望ましい産物の形成への寄与が不十分になる可能性がある。再現性の欠如は共培養系でよく見られる。
【００２１】
微生物による有機酸の生産に関連した主要な問題の１つは、細胞増殖及び発酵プロセスに対する最終生成物の強い阻害作用であり、低い生産収率及び生産性の原因となる。酸許容性は、ＰＡ産生株の収率及び生産性の改善に極めて重要であると推測された（Ｒｅｈｂｅｒｇｅｒ及びＧｌａｔｚ、１９９８）。ｐＨ４．５〜５．０におけるＰＡの阻害作用は乳酸と比較して高く、これは、このｐＨ範囲において、ＰＡ（ｐＫａは約４．９）の約半分は、解離しておらず、プロトン化した非荷電形態で存在する一方、乳酸（ｐＫａは約３．１）は、ほとんどが、解離して脱プロトン化した荷電形態にあるという事実によるものであった。非解離酸はより容易に細胞壁及び細胞膜に浸透する可能性があるので、乳酸より多くのＰＡが細胞内に入り、阻害作用を発揮し得ると推測された。このように、酸許容性の向上は、最終生成物による阻害を軽減してＰＡ産生を改善するのに有効な戦略であると考えられた。したがって、高ＰＡ、及び非制御又は低ｐＨのいずれかの条件下で、プロピオニバクテリウムの「酸許容性」変異体を作り出すことを試みた。
【００２２】
例えば、酸許容性が改善された変異体プロピオン酸菌を得るために、連続継代による適応進化が用いられてきた（Ｗｏｓｋｏｗ及びＧｌａｔｚ、１９９１；Ｚｈｕら、２０１０）。連続継代は、実験室で作り出されることが多い人工的環境において２回以上反復して細菌などの微生物を増殖させる方法であり、実験用に設計された１以上の新しい環境条件に適応するように実験中に進化する際に、微生物に自然変異を生じさせる。例えば、微生物を極度の酸性条件に繰り返し供すると、微生物に自然変異がもたらされ、そのような条件に適応するか又はそのような条件を許容するのを可能にする。
【００２３】
以前の研究では、酸許容性をもたらす変異を作り出すために、変異体プロピオン酸菌株を、漸増量のＰＡ（０．５％〜５％（Ｗｏｓｋｏｗ及びＧｌａｔｚ、１９９１）又は１．５ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ（Ｚｈｕら、２０１０））を含有する選択培地において１年以上の期間にわたって繰り返し連続植え継ぎすることにより、漸増ＰＡ濃度に適応させている。おそらく、細胞増殖及びＰＡ産生に対する阻害作用はＰＡの酸度に起因すると推測されるため、これらの実験において漸増量のＰＡを有する選択培地のｐＨが制御されなかったことは重要である。
【００２４】
ＰＡ産生が増強されたプロピオン酸菌変異体は、繊維床バイオリアクターにおける固定化及び適応によっても得られている（Ｓｕｗａｎｎａｋｈａｍ及びＹａｎｇ、２００５；Ｓｕｗａｎｎａｋｈａｍ、２００５）。繊維床バイオリアクターで酸許容性変異体を得る能力は、バイオリアクターで維持される高い細胞密度及び生存能力と、固定化細胞が互いに及び固体表面と直接接触した結果としての固定化細胞の明確な生理及び生存性によるものと考えられた。より多くのＰＡ産生は、変異体におけるオキサロ酢酸トランスカルボキシラーゼ及びＣｏＡトランスフェラーゼのより高い活性レベルに部分的に起因すると考えられた。より高いＰＡ収率であるにもかかわらず、細胞密度が高い繊維床バイオリアクターでは、細胞増殖は限定的である。さらに、繊維床バイオリアクターは高価であり、拡大縮小することができず、それらの使用は小〜中規模生産に限定される。
【００２５】
最近になって、ゲノムシャッフリングのようなランダム変異誘発法が、対象とする微生物進化を増進させるために用いられている。例えば、Ｇｕａｎらは、酸許容性変異体プロピオン酸菌株を発生させるためのゲノムシャッフリングの使用について報告している（Ｇｕａｎら、２０１２）。菌株を得るために、プロトプラスト融合により連続４回のゲノムシャッフリングを実施し、漸増量のＰＡ（５〜２０ｇ／Ｌ）を添加した培地を用いて酸許容性株を選択した。ここでも、おそらく、細胞増殖及びＰＡ産生に対する阻害作用はＰＡの酸度に起因すると推測されたため、漸増量のＰＡを有する選択培地のｐＨは制御されなかった。
【００２６】
その後の分析で、親株とシャッフル後の菌株との間で顕著に異なる２４のタンパク質が同定された（Ｇｕａｎら、２０１４）。検出されたタンパク質は、大きく４つの機能クラス：細胞内代謝及びエネルギー産生；ＤＮＡ複製、ＲＮＡ合成、及び翻訳；翻訳後修飾、タンパク質フォールディング、及びシャペロン；並びに機能不明の仮想タンパク質、に分類されると報告された。
【００２７】
他の研究では、ゲノムシャッフリングを用いて、酸許容性変異体プロピオン酸菌、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ、及びＰ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ株を生じさせている（ＷＯ２０１７／０５５９３２ Ａ２）。各菌株のセットで連続３回のゲノムシャッフリングを実施した後、５ｇ／ＬのＰＡを添加したｐＨ３又はｐＨ６．５の寒天培地を用いて調製した酸性（ｐＨ３）側のｐＨ／ＰＡ濃度勾配プレートからコロニーを選択した。最終的な個々の組換え体を培地プレートでの連続希釈後にランダムに選択し、ｐＨ５の１００μＬの培地及び２５ｇ／ＬのＰＡを含有する９６ウェルプレートでスクリーニングした。変異株は、天然のプロピオニバクテリウム及び他の公知の誘導株と比較して向上したＰＡ収率を有すると報告された。変異体プロピオン酸菌株の１つのゲノム解析により、ＡＢＣ極性アミノ酸輸送体、シトクロムＣ生合成タンパク質、ＡＢＣ多重（multiple）糖輸送体、リボソームＲＮＡの大きなサブユニット、長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼ、及びカチオン拡散促進物質をコードするものを含めたいくつかの修飾遺伝子を同定した。加えて、全リボソームＲＮＡ遺伝子の余分なコピー及び点変異を有するアルギニンデイミナーゼレギュロン（ＡｒｇＲ）の余分なコピーが、変異株に見いだされた。
【００２８】
プロピオニバクテリウムの標的代謝工学も、ＰＡ産生を増加させるために用いられている。これらの研究は一般に、例えば酢酸塩形成経路を阻害するか又はＰＡ形成経路を増強するためのピルビン酸塩代謝経路に関与する酵素を標的とする。例えば、Ｙａｎｇ及びＳｕｗａｎｎａｋｈａｍは、酢酸塩形成を排除又は減少させ、それによりＰＡ産生を増大させることを目的として、酢酸キナーゼ（アセチルホスフェートから酢酸塩への変換を触媒する）及び／又はホスホトランスアセチラーゼ（アセチルＣｏＡからアセチルホスフェートへの変換を触媒する）をコードする遺伝子をノックアウトさせた、遺伝子操作されたプロピオン酸菌株を作り出した（ＵＳ２０１１／０１５１５２９ Ａ１；Ｓｕｗａｎｎａｋｈａｍ、２００５）。
【００２９】
Ｙａｎｇらは、プロピオニル−ＣｏＡ遺伝子：コハク酸ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子で形質転換した、遺伝子操作されたプロピオン酸菌及びＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ亜種ｓｈｅｒｍａｎｉｉ株を作り出し、プロピオニルＣｏＡからプロピオン酸塩への変換を触媒するプロピオニル−ＣｏＡ：コハク酸ＣｏＡトランスフェラーゼの過剰発現によってＰＡ産生を増加させた（ＷＯ２０１２／０６４８８３ Ａ２）。得られた菌株は、ＰＡ産生の増加及びＰＡに対する耐性のほか、概して酸性ｐＨに対する耐性を有すると報告された。向上したＣｏＡトランスフェラーゼ活性は、酢酸塩形成経路よりもＰＡ形成経路を通る炭素フラックスを増加させると考えられる。
【００３０】
以下の表に、組換えＤＮＡを用いて操作された遺伝子のリストを記載する。これらの遺伝子は、調節変異がＰＡ収率を上昇させると予想し得る従来の遺伝子標的を構成する。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
しかしながら、プロピオニバクテリウムにおける標的遺伝子工学は難易度が高い。最初の問題として、細菌の生理に対する酸変性及び酸ストレスの影響は複雑で、十分に理解されていないため、特定遺伝子の操作により有機酸に対する許容性を改善することは難しい。実際、プロピオニバクテリウムにおいてＰＡを形成するウッド−ワークマン経路における中間体及び酵素の素性に関する知識があるにもかかわらず、この経路における遺伝子の操作はＰＡ収率を有意な範囲まで上昇させていない。
【００３３】
さらに、プロピオニバクテリウムはＧＣ含量が高いため、ゲノムにおける個々の遺伝子及び全てのコード領域の局在を同定することが難しく、遺伝子操作は複雑になる。加えて、組換えＤＮＡをプロピオニバクテリウム細胞に導入するために利用可能なクローニングベクターはほんの少数しかなく、形質転換効率が低いことが知られている。形質転換の選択は、プロピオニバクテリウムが抗生物質マーカーに対する自然耐性を迅速に発現する能力によっても複雑化される。
【００３４】
これらの難題に加え、微生物細胞株を産生するための組換えＤＮＡの使用は、ＰＡなどの有機食品成分の開発に適合しない。少なくとも米国では、遺伝子操作された微生物によって産生されるＰＡ又は他の有機酸は、「有機」又は「天然保存料」とラベル付けすることができず、これは食品業界において特に重要である。したがって、有機酸の工業規模での生産に適した新規微生物株並びにそのような菌株の作製及び単離方法が、依然として必要とされている。
【００３５】
微生物に対する有機酸の毒性は、有機酸産生に発酵を使用する食品業界及び化学業界に関連があるにもかかわらず、十分に理解されていない。プロピオニバクテリウムにおいてＰＡを形成するウッド−ワークマン経路における中間体及び酵素の素性に関する知識があるにもかかわらず、この経路における遺伝子の操作はＰＡ収率を有意な範囲まで上昇させていない。原因の１つは、これらの遺伝子がＰＡ形成を制限しないことであるかもしれない。したがって、それらの配列又は発現を改変してもＰＡレベルは変化しないであろう。その代わりに、ここでは、他の細胞内標的がＰＡ収率を制御すると論じられているが、それらの素性は現在の知識に基づき予測することができない。未知のプロセスは、ＰＡ形成を制限するものである。このプロセスは知られていないため、このプロセスに関与する遺伝子は予測することができない。
【００３６】
連続継代又はゲノムシャッフリングによりＰＡ耐性細菌を作り出すこれまでの試みでは一般に、漸増量のＰＡを含むが、ｐＨが制御されていないか又はｐＨがＰＡのｐＫａを著しく下回る培地が用いられてきた。これは、毒性、したがって耐性が、有機酸の濃度に起因するという考えに基づいている。しかしながら、このアプローチでは、輸送体及びそれが局在する膜又はエンベロープの性質に依存する輸送体系に関与する細胞による有機酸取り込み機構が考慮されていない。
【００３７】
有機酸は、ｐＫａ値が一般に約４〜５である弱酸である。ｐＨとｐＫａとの関係は、ヘンダーソン−ハッセルバルヒの式によって説明される：
ｐＨ ＝ ｐＫａ ＋ ｌｏｇ１０（［Ａ−］／［ＨＡ］）
［式中、［ＨＡ］は、プロトン化した解離していない非荷電弱酸の濃度であり、［Ａ−］は、脱プロトン化し、解離した負荷電共役塩基の濃度である］。典型的な発酵プロセスでは、有機酸が最大濃度に達したときの微生物培養物のｐＨは、緩衝剤の使用なしでの有機酸のｐＫａに近似する。ｐＨが約４〜５の溶液は、有機酸産生細菌の公知のｐＨ許容性と比較して酸性というわけではない。これらの細菌の大半はこの範囲のｐＨ値において増殖するが、細胞増殖に最適なｐＨは典型的には約６〜７である。
【００３８】
有機酸の細胞内輸送は、有機酸の荷電の有無に応じて、拡散によるか又は膜輸送タンパク質系の作用により達成することができる。有機酸が脱プロトン化していないか又は解離してない場合、それらは荷電していない。この状態では、それらは輸送系に依存することなく細胞膜を通して拡散することができる。しかしながら、荷電分子は常に、膜を通って移行するための輸送体系を必要とする。
【００３９】
ｐＫａ値と等しいｐＨ値では、有機酸の半分は、プロトン化した（又は解離していない）非荷電形態にある一方、残りの半分は、脱プロトン化した（又は解離した）負荷電形態にある。ｐＫａ値を下回るｐＨ値では、カルボキシル基がプロトン化されるため、有機酸はほとんど荷電しない。ｐＫａ値を上回るｐＨ値では、有機酸はほとんどプロトン化されないか解離し、したがって負に荷電する。
【００４０】
高濃度の有機酸では、ｐＨは比較的低く、有機酸はほとんど非荷電状態にあり、酸形態で細胞内に拡散することが可能である。これは、ｐＨを制御しないか又は有機酸のｐＫａを著しく下回るｐＨにおいて有機酸耐性微生物を単離するための従来の尽力の基盤である。理論上、このアプローチにより、拡散に基づく有機酸の細胞への侵入に起因する耐性をもたらす変異を有する細胞株が生じるであろう。非荷電有機酸は細胞膜を通って細胞質に拡散し、細胞内の比較的アルカリ性のｐＨに起因してプロトンを放出し；細胞内酸度の上昇は細胞増殖及び有機酸形成を阻害すると推測された。言い換えれば、非荷電状態にある有機酸は、それら自体の産生を制限すると推測された。文献及び特許が公開されているにもかかわらず、我々の経験では、このアプローチは耐性微生物を効率的に生じさせず、数年に及ぶ研究を要する可能性がある。
【００４１】
我々は、これまで他の研究者らによって推定されたような、有害なのは有機酸の酸度である、という点が正しくないと仮定した。むしろ、有毒で、自然耐性変異を回復するための選択物質としてより有効であるのは、有機酸（プロピオン酸）の脱プロトン化した負荷電形態又は中性塩であった。
【００４２】
従来の尽力とは異なり、我々は、産生すべき有機酸のｐＫａ値を上回る値、好ましくは少なくとも１単位上回る値でのｐＨ制御を使用すると、有機酸のほとんどが、荷電した脱プロトン化形態を確実に維持すると仮定した。この形態では、細胞内取り込みのために、それらは依然としてタンパク質輸送系に依存する。これにより、拡散に基づく有機酸の細胞への侵入に起因する耐性をもたらす変異が発見され得る場合、そのような変異を有する細胞株の回復は回避されるであろう。
【００４３】
具体的には、用いられるプロセスは、有機酸のｐＫａ値を上回る特定ｐＨでの連続的ｐＨ制御条件下で、正常な微生物増殖を阻害するのに十分な量（漸増量又は全ての継代で同一量のいずれか）の目的の有機酸が添加された細菌培地における、遊離細胞（すなわち、非固定化又は浮遊性）培養での出発微生物細胞株（通常は野生型であるが、必ずしも野生型ではない）の連続継代であった。ｐＨは、有機酸のｐＫａ値を上回る値、好ましくは約５．５〜約７．５の範囲、より好ましくは中性又はその付近である約６．０〜約７．０、最も好ましくは約７．０に制御される。実施例ではプロピオニバクテリウムの使用について記載しているが、有機酸を分泌する発酵性生物である他の微生物、例えば、ラクトバチルス、アセトバクター、グルコノバクター、又はクロストリジウムを用いることができる。用いる有機酸は、例えば、ＰＡ、乳酸、酢酸、又は酪酸であり得る。いくつかの態様では、微生物はプロピオニバクテリウム（アシディプロピオニバクテリウム）属、より好ましくはプロピオン酸菌種に由来し、有機酸はＰＡである。いくつかの態様では、微生物は、ラクトバチルス属、より好ましくはラクトバチルス・アシドフィルス種に由来し、有機酸は乳酸である。いくつかの態様では、微生物は、アセトバクター属又はグルコノバクター属に由来し、有機酸は酢酸である。いくつかの態様では、微生物は、クロストリジウム属、より好ましくはクロストリジウム・ブチリカム種に由来し、有機酸は酪酸である。
【００４４】
ｐＨを制御する我々の連続継代法を用いて、我々は、概して少なくとも１年かかるＷｏｓｋｏｗ及びＧｌａｔｚ、１９９１に記載された従来の連続継代法を用いるよりはるかに速い２週間未満で、親株と比較して有機酸産生が上昇した新規微生物株を作り出して単離することができた。我々の方法はまた、ゲノムシャッフリング及び繊維床バイオリアクターにおける細胞固定化又は標的遺伝子操作などの他のランダム変異誘発法よりも複雑でなく、より容易に拡大縮小可能である。ｐＨを制御した連続継代法を用いて作り出し単離された変異細胞株によって産生される有機酸は、「有機」又は「天然保存料」とラベル付けすることができ、これは食品業界において特に重要である。
【００４５】
ｐＨを制御する同じ連続継代法を用いて、限定されるものではないが、ＰＡ、乳酸、酢酸、及び酪酸を含めたいくつかの有機酸を過剰産生する、限定されるものではないが、プロピオン酸菌、乳酸菌、酢酸菌、及びクロストリジウムを含めたさまざまな微生物を作製及び単離することができる。荷電分子は全て、機能に関し、輸送系及びそれに関連する膜／エンベロープに依存している。これらの細胞内成分における改変は、プロピオン酸について本明細書に記載したものと同じ結果を、他の有機酸について達成するであろう。
【００４６】
同じ選択法（すなわち、有機酸のｐＫａ値を上回るｐＨにおける連続的ｐＨ制御条件下で、正常な微生物増殖を阻害するのに十分な量の目的の有機酸を添加した細菌培地を用いる）を用いて、有機酸の許容性及び産生が上昇した単離株について、ゲノムシャッフリング又は他のランダム変異誘発法から生じた微生物ライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００４７】
このｐＨ制御法を用いて、我々は、調節及び代謝に関与するものを含めた、輸送及び／又は予想外の細胞内標的に依存する、独特の耐性機構を標的化することができた。その後、ゲノム再配列決定を用いて、高濃度の有機酸に対する遺伝子耐性をもたらす変異変化を介して重要遺伝子を同定した。
【００４８】
得られた変異は一般に、表２に示すように細胞内エンベロープ機能に影響を及ぼした。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
これらの変異は、主として、細胞壁及び細胞膜から成る、細胞質膜を含めた細胞内エンベロープの構造及び組成及び機能を改変させた。同定された変異の完全なリストを表３に提供する。我々は、以前報告されたように（表１参照）代謝工学の標的とされ、組換えＤＮＡを用いて操作された遺伝子に変異を認めなかった。複数の遺伝子における変異が、変異体表現型（有機酸を添加した培地において増大した増殖及び／又は出発微生物細胞株と比較して過剰の有機酸産生など）をもたらすのに必要と思われる。これは、単一遺伝子を操作してＰＡ収率を変化させることを試みた従来の知識と正反対である。
【００５１】
本発明に従って、他の従来の微生物学、分子生物学、組換えＤＮＡ、及び生化学的技術を用いることができる。そのような技術は文献で十分に説明されており、当該分野の技術の範囲内である。本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これは、特許請求の範囲に記載する事項の方法及び組成物の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００５２】
実施例１
菌株３−１の単離
１０ｍＬのＭ２４＋２．０％グルコース培地にて、プロピオン酸菌（ＡＴＣＣ  ２５５６２）を高細胞密度になるまで増殖させた。その後、この培養物の連続希釈物（１００〜１０−３）を、１．０％、２．０％、及び３．０％（Ｗ／Ｖ）ＰＡを添加し、水酸化ナトリウムを用いて全てｐＨ７．０に中和した、寒天で固化した固体Ｍ２４＋２．０％グルコース培地上にプレーティングした。ＰＡを追加していない固体Ｍ２４＋２．０％グルコース培地上にも細胞をプレーティングした。
【００５３】
３０℃にて５日間の嫌気性インキュベーション後、異なるＰＡ濃度でのコロニー増殖を評価した。非希釈細胞をプレーティングした３％ＰＡプレートでは３つのコロニーが増殖し、希釈細胞をプレーティングした３％ＰＡプレートではコロニーは増殖しなかった。３つのコロニーを単離し、ＰＡなし、２．０％ＰＡ、及び３．０％ＰＡのプレート（水酸化ナトリウムを用いて全てｐＨ７．０に中和）に、新たに増殖させた野生型プロピオン酸菌細胞とともに再ストリークした。
【００５４】
３０℃にて２回目の５日間の嫌気性インキュベーション後、異なるＰＡ濃度でのコロニー増殖を再度評価した。３つの単離株は全て１．０％ＰＡプレートで増殖することができたが、野生型は増殖しなかった（図１）。単離株＃１のみが２．０％ＰＡ及び３．０％ＰＡプレートで増殖することができた。この単離株を菌株３−１と名付けた（「３」は３．０％ＰＡを意味し、「１」は単離株＃１を意味する）。単離株＃１を５ｍＬの液体Ｍ２４＋２．０％グルコース培地に接種し、高細胞密度まで増殖させ、これらの細胞を凍結保存した。
【００５５】
菌株３−１に関し、固体培地上での３．０％ＰＡ耐性の表現型を確認した後、さまざまな培地及び培養条件において、この菌株の１０ｍＬバッチ培養及び１Ｌバイオリアクター培養におけるＰＡ産生を、ＨＰＬＣにより、親プロピオン酸菌（ＡＴＣＣ  ２５５６２）細胞と比較した。
実施例２
菌株３−１及び野生型プロピオン酸菌によるＰＡ産生
野生型プロピオン酸菌（ＡＴＣＣ  ２５５５６２）及び菌株３−１を、２％グルコースを添加したＭ２４培地において、嫌気性条件下３０℃にて、凍結保存物から培養した。細胞を、１０ｍＬで開始し、次いで５０ｍＬの新鮮Ｍ２４培地に４８時間ごとに継代培養し、１Ｌバイオリアクター容器用の種として用いた。
【００５６】
小麦粉培地を調製するために、７５ｇのＡｍｅｒｉｃａｎ薄力粉を、混合しながら、滅菌した２Ｌフラスコ中の１ＬのｄｄＨ２Ｏに加えた。１ｍＬのＥｎｚｅｎｃｏ  α−アミラーゼ及び５００ｍＬの５０ｐｐｍ  ＣａＣｌ２を混合物に加え、薄力粉を加水分解した。５ｍＬの５Ｍ  ＮａＯＨを加えることによりｐＨを６．０に調整し、温度を９０℃に１時間保持した。混合物を冷却させた後、３７℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、温度を６０℃に上昇させ、２ｍＬの５Ｍ  ＮａＯＨを加えることによりｐＨを７．０に調整した。グルコースを放出させるために、１ｍＬのＥｎｚｅｎｃｏグルコアミラーゼ、０．０５ｇのプロテアーゼ、０．４ｇのＭｇＳＯ４、及び１０ｇのＯｈｌｙ  ＫＡＴ酵母エキスを、撹拌しながら混合物に加えた。混合物を６０℃にて２時間保持した。混合物を冷却させた後、ガラスジャケット付きバイオリアクター容器に加え、次いで密閉した。オートクレーブ処理を行う前にｐＨを調整した。
【００５７】
３Ｌバイオリアクター容器において、１Ｌ容量で発酵を実施した。温度を３０℃に維持し、５Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７．０に維持し、培養物を２００ｒｐｍで撹拌した。接種に先立ち、３ｍＬの濾過滅菌した微量元素溶液をバイオリアクターに加えた。グルコース濃度を、ＹＳＩ２９００分析計を用いて決定した。１Ｌの小麦粉培地に５％の接種物を播種した。ＨＰＬＣでのＰＡ分析のために、試料を２４時間ごとに取り出した。結果を図２に示す。
【００５８】
菌株３−１及び親野生型株はともに、約１２０時間後に最大ＰＡ濃度に達した。菌株３−１によってもたらされたＰＡの最大濃度は約３６ｇ／Ｌであるのに対し、親野生型株では約３０ｇ／Ｌである。
【００５９】
５〜６種の異なる条件下で追加実験をそれぞれ３〜４回実施して、菌株３−１及び野生型プロピオン酸菌によるＰＡ産生を比較した。図２に示すものと同様の結果が得られた。６０時間培養後、野生型と比較して菌株３−１によるＰＡ産生は最低限１５％上昇している。
実施例３
菌株３−１のゲノム解析
菌株３−１のゲノム再配列決定を用いて、高濃度の有機酸に対する遺伝的耐性をもたらす変異変化を介して重要遺伝子を同定した。
【００６０】
２９遺伝子において６５の機能喪失型変異を同定した。表２に示すように、変異は一般に、細胞エンベロープの機能に影響を及ぼした。これらの変異は、主として、細胞質膜を含めた細胞壁及び細胞膜から成る細胞エンベロープの構造及び組成及び機能を改変する。菌株３−１で同定された変異の完全なリストを表３に提供する。
【００６１】
【表３−１】
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【００６２】
【表３−２】
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【００６３】
【表３−３】
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【００６４】
【表３−４】
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【００６５】
【表３−５】
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【００６６】
これらの遺伝子（又は本明細書に記載する他の種におけるそれらの相同体）における変異は、膜輸送タンパク質系、及び／又は、調節及び／又は代謝に関与するこれまでに知られていない細胞内標的を改変することにより、高濃度の有機酸に対する遺伝的耐性をもたらすと思われる。
【００６７】
同一遺伝子における多重変異は、その遺伝子が形質にとって非常に重要であり、形質に寄与するには複数の変化が必要とされることを示唆している。いくつかの遺伝子が３以上の変異を有していたことは注目に値し、これは、有機酸形成の制限におけるそれらの重要な役割を示している可能性がある。それらは、以下をコードする遺伝子を包含する：Ｏ抗原リガーゼドメイン含有タンパク質（ＡＳＱ４９＿ＲＳ０２５２０に１５変異；ＡＳＱ４９＿ＲＳ０２５３５に３変異；及びＡＳＱ４９＿ＲＳ０２４７５に３変異（ＢＬＡＳＴがＯ抗原リガーゼ及び膜タンパク質に強く合致する仮想タンパク質））；Ｍ１８ファミリーのアミノペプチダーゼ（ＡＳＱ４９＿ＲＳ１５９６５に６変異）；アミノ酸パーミアーゼ（ＡＳＱ４９＿ＲＳ０５８４０に４変異）；及びアデニングリコシラーゼ（ＡＳＱ４９＿ＲＳ０７９８５に４変異）。
【００６８】
参考文献
1.  Woskow S.A., B.A. Glatz. 1991. Propionic acid production by a propionic acid-tolerant strain of Propionibacterium acidipropionici in batch and semicontinuous fermentation. Applied and Environmental Microbiology 57:2821-2828.
2.  Zhu Y., J. Li, M. Tan, L. Liu, L. Jiang, J. Sun, P. Lee, G. Du, J. Chen. 2010. Optimization and scale-up of propionic acid production by propionic acid-tolerant Propionibacterium acidipropionici with glycerol as the carbon source. Bioresource Technology 101:8902-8906.
3.  Wang Z., S.-T. Yang. 2013. Propionic acid production in glycerol/glucose co-fermentation by Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. Bioresource Technology 137:116-123.
4.  Zhuge X., L. Liu, H.-d. Shin, J. Li, G. Du, J. Chen. 2014. Improved propionic acid production from glycerol with metabolically engineered Propionibacterium jensenii by integrating fed-batch culture with a pH-shift control strategy. Bioresource Technology 152:519-525.
5.  Zhuge X., J. Li, H.-d. Shin, L. Liu, G. Du, J. Chen. 2015. Improved propionic acid production with metabolically engineered Propionibacterium jensenii by an oxidoreduction potential-shift control strategy. Bioresource Technology 175:606-612.
6.  Coral J. 2008. Propionic acid production by Propionibacteriumsp. using low-cost carbon sources in submerged fermentation. Dissertation. Federal University of Parana.
7.  Zhang A., J. Sun, Z. Wang, S.-T. Yang, H. Zhou. 2015. Effects of carbon dioxide on cell growth and propionic acid production from glycerol and glucose by Propionibacterium acidipropionici. Bioresource Technology 175:374-381.
8.  Wang Z., M. Lin, L. Wang, E. M. Ammar, S.-T. Yang. 2015. Metabolic engineering of Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii for enhanced propionic acid fermentation: Effects of overexpressing three biotin-dependent carboxylases. Process Biochemistry 50:194-204.
9.  Suwannakham S., Y. Huang, S.-T. Yang. 2006. Construction and characterization of ack knock-out mutants of Propionibacterium acidipropionici for enhanced propionic acid fermentation. Biotechnology and Bioengineering 94:383-95.
10.  Suwannakham S., S.-T. Yang. 2005. Enhanced propionic acid fermentation by Propionibacterium acidipropionici mutant obtained by adaptation in a fibrous‐bed bioreactor. Biotechnology and Bioengineering 91:325-337.
11.  Suwannakham S. 2005. Metabolic engineering for enhanced propionic acid fermentation by Propionibacterium acidipropionici. Dissertation. Ohio State University.
12.  Tufvesson P., A. Ekman, R. R. R. Sardari, K. Engdahl, L. Tufvesson. 2013. Economic and environmental assessment of propionic acid production by fermentation using different renewable raw materials. Bioresource Technology 149:556-564.
13.  Thierry A., S.-M. Deutsch, H. Falentin, M. Dalmasso, F. J. Cousin, G. Jan. 2011. New insights into physiology and metabolism of Propionibacterium freudenreichii. International Journal of Food Microbiology 149:19-27.
14.  Scholz C.F.P., M. Kilian. 2016. The natural history of cutaneous propionibacteria, and reclassification of selected species within the genus Propionibacteriumto the proposed novel genera Acidipropionibacteriumgen. nov., Cutibacterium gen. nov. and Pseudopropionibacterium gen. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 66:4422-4432.
15.  Rehberger J.L., B.A. Glatz. 1998. Response of cultures of Propionibacterium to acid and low pH: tolerance and inhibition. Journal of Food Production 61:211-216.
16.  Ahmadi N., K. Khosravi-Darani, A.M. Mortazavian.2017. An overview of biotechnological production of propionic acid: From upstream to downstream processes. Electronic Journal of Biotechnology 28:67-75.
17.  Guan N., L. Liu, X. Zhug, Q. Xu, J. Li, G. Du, J. Chen. 2012. Genome-shuffling improves acid tolerance of Propionibacterium acidipropionici and propionic acid production. Advances in Chemistry Research 15:143-152.
18.  Guan N., H. Shin, R. R. Chen, J. Li, L. Liu, G. Du, J. Chen. 2014. Understanding of how Propionibacterium acidipropionici respond to propionic acid stress at the level of proteomics. Scientific Reports 4:6951.
19.  Guan N., H.D. Shin, G. Du, J. Chen, L. Liu. 2016. Metabolic engineering of acid resistance elements to improve acid resistance and propionic acid production of Propionibacterium jensenii. Biotechnology and Bioengineering 113:1294-304.
20.  Jiang L., H. Cui, L. Zhu, Y. Hu, X. Xu, S. Li, H. Huang. 2015. Enhanced propionic acid production from whey lactose with immobilized Propionibacterium acidipropionici and the role of trehalose synthesis in acid tolerance. Green Chemistry 15:250-259.
21.  EP 0141642
22.  WO 85/04901
23.  US 2011/0151529 A1
24.  WO 2012/064883 A2
25.  WO 2017/055932 A2
【図１】
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【図２】
2021529515.tif 000010
【国際調査報告】
2021529515.tif 000011
2021529515.tif 000012
2021529515.tif 000013