(57)【要約】  本開示は、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物を含む選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物、並びに例えば、自己免疫疾患、及び／又はエフェクターＴ細胞に対する制御性Ｔ細胞の選択的な数の増加及び活性化を提供するのに有効な治療法に応答する他の状態を治療するためにこれらの組成物を使用する方法を提供する。【選択図】図１７
2021523922.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造：
【化１】
2021523922.tif 000030
（式中、ＩＬ−２はインターロイキン−２であり、
ｎは各出現で独立して約３〜約４０００の整数である）
を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含む組成物。
【請求項２】
ＩＬ−２がアルデスロイキンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、あわせて考慮した場合に、
式
【化２】
2021523922.tif 000031
（式中、ｎ’は１、４、５又は５より大きい整数から選択される）によって包含される、ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約２０モルパーセント以下で含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、あわせて考慮した場合に、
式
【化３】
2021523922.tif 000032
（式中、ｎ’は１、４、５又は５より大きい整数から選択される）によって包含される、ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約１５モルパーセント以下で含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、あわせて考慮した場合に、式
【化４】
2021523922.tif 000033
（式中、ｎ’は１、４、５又は５より大きい整数から選択される）によって包含される、ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約１０モルパーセント以下で含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
１に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約１０モル％以下で含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
１に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約７モル％以下で含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
１に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約５モル％以下で含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
４に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約１０モル％以下で含む、請求項３〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
４に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約７モル％以下で含む、請求項３〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
４に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約５モル％以下で含む、請求項３〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、ほぼ等モル量の
【化５】
2021523922.tif 000034
を含む、請求項１に記載のＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートの混合物を含む組成物。
【請求項１３】
組前記組成物が、式
【化６】
2021523922.tif 000035
（ここで、（ＩＩ）／（ＩＩＩ）のモル比が、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３及び１：１．４からなる群から選択される）を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含む、請求項２に記載のＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートの混合物を含む組成物。
【請求項１４】
アルデスロイキンあたりの分岐ポリエチレングリコール部分、
【化７】
2021523922.tif 000036
の平均数が、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．６、２．７、２．８、２．９及び３からなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
アルデスロイキンあたりの分岐ポリエチレングリコール部分の平均数が約２．５である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
ｎの値が５〜２０００の範囲である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
ｎの値が１０〜１０００の範囲である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
ｎの値が１０〜７５０の範囲である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
ｎの値が１０〜５００の範囲である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
ｎの値が２０〜２５０の範囲である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
ｎの平均値が約２２６である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が、約２５０ダルトン〜約９００００ダルトンの範囲にある、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が、約１０００ダルトン〜約６００００ダルトンの範囲にある、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が、約５０００ダルトン〜約６００００ダルトンの範囲にある、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が、約１００００ダルトン〜約５５０００ダルトンの範囲にある、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
モルベースで、約５モル％以下のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約２８モル％〜約６０モル％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約２４モル％〜約６５モル％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約１２モル％以下のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が約２００００ダルトンである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項２７】
８０％以上の組み合わされたジ−及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを更に含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
モルベースで、約２．５〜約４．５モル％のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約３５〜約５０モル％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約３８〜約４６モル％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約３〜約１０モル％のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が約２００００ダルトンである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項２９】
あわせた合計が約８０〜約９５モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを更に含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
モルベースで、約２．８〜約３．８モル％のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４４〜約４８モル％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４１〜約４４モル％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約７〜約９モル％のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が約２００００ダルトンである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項３１】
あわせた合計が約８７〜約９０モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを更に含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
モルベースで、約２．８〜約３．８モル％のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４４〜約４８モル％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４１〜約４４モル％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約７〜約９モル％のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、前記組成物がリジンＫ７又はＫ８又はＫ３１又はＫ７５の１つに付着したＰＥＧ部分を有するモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートの混合物を含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が約２００００ダルトンである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項３３】
あわせた合計が約８７〜約９０モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを更に含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
モルベースで、約２．８〜約３．８モル％のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４４〜約４８モル％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４１〜約４４モル％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約７〜約９モル％のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、前記組成物がリジンＫ７に付着したＰＥＧ部分を有するモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が約２００００ダルトンである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項３５】
あわせた合計が約８７〜約９０モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを更に含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
薬学的に許容可能な賦形剤を更に含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
非経口投与に適した形態の、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
皮下投与に適した形態の、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
水性希釈剤を含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４０】
約５のｐＨを有する、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム及びスクロースを更に含む、請求項３９又は請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
１．５ｍｇ／ｍｌタンパク質当量、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１１０ｍＭ塩化ナトリウム、２％スクロース（重量／体積）、ｐＨ５．０を含む請求項３７記載の組成物。
【請求項４３】
請求項１〜４２のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を被験体に投与することにより、被験体における制御性Ｔ細胞対エフェクターＴ細胞の比率を増加させる方法。
【請求項４４】
制御性Ｔ細胞がＦｏｘｐ３＋細胞及びＣＤ２５＋細胞から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
エフェクターＴ細胞がＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ベースラインと比較した場合、制御性Ｔ細胞の倍増が、ｉｎ−ｖｉｖｏマウスモデルで評価した場合、少なくとも約２の値に達する、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ベースラインと比較した場合、制御性Ｔ細胞の倍増が、ｉｎ−ｖｉｖｏマウスモデルで評価した場合、少なくとも約４の値に達する、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
制御性Ｔ細胞数の増加が、投与後少なくとも３日間、ベースラインレベルを超えて持続する、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
制御性Ｔ細胞数の増加が、投与後少なくとも５日間、ベースラインレベルを超えて持続する、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１〜４２いずれか一項に記載の組成物の治療有効量を被験体に投与することを含む、自己免疫疾患を有する被験体を治療する方法。
【請求項５１】
前記投与が皮下注射によるものである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記投与が２週間に１回又は４週間に１回行われる、請求項５０〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記投与が、２週間に１回、３μｇ／ｋｇ〜２４μｇ／ｋｇの用量を含む、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
治療法に使用するための、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
自己免疫疾患の治療に使用するための、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５６】
自己免疫疾患を治療するための薬剤を製造するための、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、エフェクターＴ細胞と比較して、制御性Ｔ細胞の数及び活性化を選択的に増加させる長時間作用型インターロイキン−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）アゴニストＴｒｅｇ刺激因子組成物、並びに自己免疫疾患及び炎症性疾患、及び／又はＴｒｅｇ刺激療法に反応する他の状態の治療においてこれらのＴｒｅｇ刺激因子組成物を使用する方法に関する。特に、本出願は、選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物、並びにそれを作製する方法、それらの製剤、並びにＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物を自己免疫疾患及び炎症性障害の治療に使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、感染性微生物による侵入に対する体の主な防衛線である。正常に機能している免疫系では、自己抗原に対して免疫反応は起こらず、これは自己寛容と称される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する寛容性が失われたために身体組織がその身体自身の免疫系によって攻撃された場合に発生する（Ｄｅｊａｃｏ，Ｃ．，ら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００６；１１７（３）：２８９−３００）。自己免疫疾患を患っている被験体では、身体組織は抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞又は自己抗体によって破壊され、付随する炎症が機能障害を引き起こし、場合によっては死に至る可能性がある。自己免疫疾患は、人口のおよそ６％に影響を与える広範囲の症状を伴う不均一な疾患の集まりである（Ｓｉａｔｓｋａｓ，Ｃ．，ら，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６；６（１）：４５−５８）。自己免疫疾患の臨床的特徴は非常に異なるが、免疫介在性メカニズムは、標的抗原に対する適応免疫応答の生成と関連している（Ｋｕｂｙ，Ｊ．，１９９４：Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｐ  ４４５−４６７．ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０００３】
コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリン及びメトトレキサート等の様々な従来の治療法は、自己免疫疾患の一部の患者ではわずかに効果的であるが、均一に効果的ではなく、副作用及び毒性と関連する（Ｊａｎｔｕｎｅｎ，Ｅ．，ら，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０００；２５（４）：３５１−６）。かかる従来のアプローチでは、自己反応性免疫に関連する根本的な病理に対処することはできない。
【０００４】
自己免疫疾患の病態生理学の理解における最近の進歩に照らして、細胞又は分子標的に焦点を合わせた可能性のある新たな治療法が開発され、現在評価されている。自己免疫疾患の病因は不明であるが、遺伝的要因、不適切な免疫調節、及びホルモン要因と環境要因との間の潜在的な相互作用によって引き起こされると考えられている。自己免疫疾患の誘発には、隔離された抗原、分子擬態、ＭＨＣクラスＩＩ分子の不規則な発現、サイトカインの不均衡、イディオタイプネットワーク調節経路の機能不全、全身の制御性Ｔ細胞の欠陥、及びポリクローナルＢ細胞の活性化を含む様々なメカニズムが提案されている（Ｋｕｂｙ，１９９４、同上）。自己免疫疾患の治療のために、Ｂ細胞枯渇、抗サイトカイン療法、及び幹細胞療法を含む幾つかのアプローチが研究されてきたが、これらのアプローチには、有効性、安全性及び／又は望ましくない副作用に関して欠点がある。自己免疫疾患を治療するための従来の治療法は、免疫系全体を抑制することによって機能し、それによって感染症及び他の深刻な副作用の重大なリスクにつながる。したがって、自己免疫疾患の治療に対して有効性、安全性及び／又は忍容性の改善された組み合わせを提供するための追加の治療の必要性が残されている。
【０００５】
長年にわたり、自己免疫応答におけるＩＬ−２の役割は炎症性サイトカインとして確立されてきた。しかしながら、より最近の研究では、ＩＬ−２が特定の条件下で慢性自己免疫性炎症において保護的な役割を果たすことができるということが示唆された。特に、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）とエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）とのバランスの崩れは、様々な自己免疫疾患の共通の特徴として特定されており、かかるバランスの崩れはＩＬ−２等の恒常性サイトカインの影響を受けると考えられている。その薬物動態プロファイルにより、自己免疫療法のための未修飾ＩＬ−２の投与は、頻繁な毎日又は隔日の投与を必要とし、これはしばしば痛みのある注射部位反応を伴う。更に、頻繁な注射の必要性は、不快感及び不便さのためにしばしば患者のコンプライアンスの低下を伴う。ＩＬ−２の長期反復投与はまた、ＩＬ−２の望ましくない多面的な全身作用のリスク上昇、並びに関連するリスク及び有害作用も伴う。更に、治療域が限られているため、免疫恒常性を達成するための未修飾ＩＬ−２の使用と、望ましいＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆバランスの維持は、達成不可能ではないにしても、長期間にわたって困難であることが判明する可能性がある。更に、自己免疫疾患療法に関するその狭い治療マージンは、非常に低用量のＩＬ−２の投与を必要とすることで、その有効性に悪影響を与える。何らかの臨床的利益を得るため低用量のＩＬ−２を使用することができるが、有害事象によって用量が制限され、Ｔｒｅｇの増加は中程度で短命である。例えば、自己免疫疾患療法に対する未修飾のＩＬ−２の投与は、ＩＬ−５の望ましくない増加と、それに続く好酸球レベルの上昇を誘発し、炎症を引き起こす可能性がある。そのため、様々な自己免疫疾患において、制御性Ｔ細胞及びエフェクターＴ細胞の活性の疾患緩和バランスを促進する方法でＩＬ−２シグナル伝達を選択的に調節し得る作用物質の必要性が残されている。
【０００６】
特定の自己免疫疾患は、ＩＬ−２産生の障害及び／又は制御性Ｔ細胞の欠損を含む根本的な病因を有しており、これらは疾患の発症に先立つ免疫学的メカニズムとして関係している。自己免疫症状を効果的に軽減し、生活の質を改善し、好ましくは様々な自己免疫疾患において長期の寛解を提供するために、代替のより効果的な治療用組成物及び治療計画の必要性が残されている。本開示は、慢性自己免疫疾患を治療するための現在の選択肢の限られた利用可能性及び関連する欠点に対処する。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、選択的Ｔｒｅｇ刺激因子ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物の発見に基づいている。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物は、定義された不均一性のＩＬ−２−ＰＥＧコンジュゲート混合物である。それらの組成物は、他の免疫細胞への影響を最小限に抑えながら、Ｔｒｅｇ恒常性を選択的に回復するための低用量皮下投与を目的としている。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物は、２０ｋＤａポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に安定して共有結合的に複合化されている、組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２、特に追加のアミノ酸の変異又は置換を含まないアルデスロイキンアミノ酸配列）を含むコンジュゲートの混合物であり、ここで、混合物は、ＩＬ−２部分ごとに一定のＰＥＧ化を伴う定義された画分を有する。本開示の組成物は、主にジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２の定義された画分、並びにモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２及び／又はテトラ若しくはより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２の定義されたより少ない画分を有するＩＬ−２ＰＥＧコンジュゲートの選択された混合物を含む。特に、本開示の組成物は、選択的Ｔｒｅｇ刺激因子ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物、それを作製する方法、それらの製剤、並びにＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物を自己免疫疾患及び炎症性障害の治療に使用する方法を提供する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は、抗原特異的Ｔ制御性細胞を活性化及び拡大することにより、免疫炎症性疾患において持続的な応答を誘導する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の低用量皮下投与による自己免疫障害の治療は、従来のＴ細胞機能への影響を最小限に抑えて、Ｔｒｅｇ恒常性を選択的に回復する手段を提供し、それにより、これらの障害を軽減するための代替及び／又は改善されたアプローチを提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の一般的な組成を示す代表的な逆相ＨＰＬＣプロットであり、その調製は、実施例１及び実施例１Ａに記載されている。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の一般的な組成を示す代表的な逆相ＨＰＬＣプロットであり、その調製は、実施例１及び実施例１Ａに記載されている。ｘ軸（溶出時間、分）に沿って左から右に移動して、精製されたコンジュゲート組成物は、主にジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ｒＩＬ−２を含む。
【図２】図２は、アルデスロイキン（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現される組換え非グリコシル化インターロイキン−２である１２５−Ｌ−セリン−２−１３３インターロイキン−２）のアミノ酸配列である。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、実施例２に記載されるように、マウスにおいて単回用量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を投与した後の血液（図３Ａ）及び脾臓（図３Ｂ）におけるマウスＴｒｅｇの薬力学的分析の結果を示すプロットである。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例２に記載されるように、マウスにおいて単回用量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を投与した後の、血中のＮＫ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、及びＣＤ８  Ｔ細胞のレベルをそれぞれ示すプロットである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例２に記載されるように、マウスにおいて単回用量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を投与した後の、血中のＮＫ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、及びＣＤ８  Ｔ細胞のレベルをそれぞれ示すプロットである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、実施例２に記載されるように、マウスにおいて単回用量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を投与した後の、血中のＮＫ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、及びＣＤ８  Ｔ細胞のレベルをそれぞれ示すプロットである。
【図５Ａ】図５Ａは、実施例２に記載されるように、マウスにおいて単回用量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を投与した後のＣＤ２５及びＦｏｘｐ３の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定されるＴｒｅｇ機能及び活性のプロットである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実施例２に記載されるように、マウスにおいて単回用量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を投与した後のＣＤ２５及びＦｏｘｐ３の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定されるＴｒｅｇ機能及び活性のプロットである。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例３に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒｅｇ抑制アッセイにおいて１及び４日目にビヒクル治療マウスから単離された脾臓Ｔｒｅｇのプロットである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例３に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒｅｇ抑制アッセイにおいて１及び４日目にビヒクル治療マウスから単離された脾臓Ｔｒｅｇのプロットである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、実施例３に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒｅｇ抑制アッセイにおいて１及び４日目にビヒクル治療マウスから単離された脾臓Ｔｒｅｇのプロットである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、実施例３に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒｅｇ抑制アッセイにおいて１及び４日目にビヒクル治療マウスから単離された脾臓Ｔｒｅｇのプロットである。
【図７】図７は、実施例３に記載されるように、経時的に評定された１：２の比率でＴｃｏｎ（従来のＴ細胞）とともに培養された単離Ｔｒｅｇの相対的抑制能力を示すプロットである。
【図８Ａ】図８Ａは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物で治療したマウスにおける耳介腫脹の程度を示し、この研究を、実施例４に記載されるように、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２投与によるＴｒｅｇ誘導の遅延型過敏症（ＤＴＨ）のマウスモデルにおいてＴ細胞抗原駆動性の炎症を抑制する能力を評定するために行った。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物で治療したマウスにおける耳介腫脹の程度を示し、この研究を、実施例４に記載されるように、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２投与によるＴｒｅｇ誘導の遅延型過敏症（ＤＴＨ）のマウスモデルにおいてＴ細胞抗原駆動性の炎症を抑制する能力を評定するために行った。
【図９Ａ】図９Ａは、実施例５に記載されるように、カニクイザルにおいて単回用量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を投与した後の血中のＴｒｅｇレベル（それぞれ、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３）のプロットである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、実施例５に記載されるように、カニクイザルにおいて単回用量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を投与した後の血中のＴｒｅｇレベル（それぞれ、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３）のプロットである。
【図９Ｃ】図９Ｃは、実施例５に記載されるように、カニクイザルにおいて単回用量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を投与した後の血中のＴｒｅｇレベル（それぞれ、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３）のプロットである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、実施例７に記載されるように、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物又は未修飾ＩＬ−２（アルデスロイキン）のいずれかをマウスに投与した後のマウスＴｒｅｇの薬力学的分析の結果を示すプロットである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、実施例７に記載されるように、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物又は未修飾ＩＬ−２（アルデスロイキン）のいずれかをマウスに投与した後のマウスＴｒｅｇの薬力学的分析の結果を示すプロットである。
【図１１】図１１は、実施例８に詳述されるように、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のマウスモデルで評価した場合のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物（０．３ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウスの経時的な尿タンパクレベル（ｇ／Ｌ）のプロットである。
【図１２】図１２は、様々な投与量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の単回投与後の経時的（日）な末梢血（細胞／μｌ）サンプル中のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔＴｒｅｇの薬力学的分析の結果を示すプロットである。
【図１３】図１３は、実施例１０に記載されるように、ヒト被験体への様々な投与量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の単回投与後の経時的（日）な末梢血（細胞／μｌ）サンプル中の総ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの薬力学的分析の結果を示すプロットである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、実施例１０に記載されるように、ヒト被験体への様々な投与量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の単回投与後の経時的（日）な末梢血サンプルにおける、ＣＤ３細胞のパーセンテージとして表される、Ｔｃｏｎ細胞集団、ＣＤ４＋（図１４Ａ）及びＣＤ８＋Ｔｃｏｎ細胞（図１４Ｂ）のプロットである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、実施例１０に記載されるように、ヒト被験体への様々な投与量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の単回投与後の経時的（日）な末梢血サンプルにおける、ＣＤ３細胞のパーセンテージとして表される、Ｔｃｏｎ細胞集団、ＣＤ４＋（図１４Ａ）及びＣＤ８＋Ｔｃｏｎ細胞（図１４Ｂ）のプロットである。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、実施例１０に記載されるように、ヒト被験体への様々な投与量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の単回投与後の経時的（日）な末梢血サンプルにおける、ＣＤ３細胞のパーセンテージとして表される、Ｔｃｏｎ細胞集団、ＣＤ４＋（図１４Ａ）及びＣＤ８＋Ｔｃｏｎ細胞（図１４Ｂ）のプロットである。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、実施例１０に記載されるように、ヒト被験体への様々な投与量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の単回投与後の経時的（日）な末梢血サンプルにおける、ＣＤ３細胞のパーセンテージとして表される、Ｔｃｏｎ細胞集団、ＣＤ４＋（図１４Ａ）及びＣＤ８＋Ｔｃｏｎ細胞（図１４Ｂ）のプロットである。図１４Ｃ〜図１４Ｄは、それぞれ、実施例１０に記載されるように、ヒト被験体への様々な投与量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の単回投与後の経時的（日）な末梢血サンプルにおける、ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞／μｌ）及びＫｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８のパーセンテージとして表される）の数を示すプロットである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、フローサイトメトリーを用いて数えたＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇのプロットである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、フローサイトメトリーを用いて数えたＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇのプロットである。実施例１０に記載されるように、様々な投与量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の単回投与による治療前及び治療後の複数の時点で、ヒト被験体から全血を収集した。図１５Ａは、ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの数（細胞／μｌ）に対する各投与量のピーク効果の中央値を示し、図１５Ｂは、治療後の経時的な（日）ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの絶対数を提供する。
【図１６Ａ】図１６Ａは、それぞれ、フローサイトメトリーを用いて数えた、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のプロットである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、それぞれ、フローサイトメトリーを用いて数えた、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のプロットである。実施例１０に記載されるように、様々な投与量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の単回投与による治療前及び治療後の複数の時点で、ヒト被験体から全血を収集した。結果を、各細胞集団の割合（％）、及び治療前の値に基づいて計算された倍率変化として表す。
【図１７】図１７Ａは、Ｔｒｅｇ対Ｔｃｏｎの用量反応比（図１７Ａ）、並びにフローサイトメトリーを用いて数えたＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ及びＣＤ８＋Ｔ細胞（図１７Ｂ）のプロットである。図１７Ｂは、Ｔｒｅｇ対Ｔｃｏｎの用量反応比（図１７Ａ）、並びにフローサイトメトリーを用いて数えたＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ及びＣＤ８＋Ｔ細胞（図１７Ｂ）のプロットである。実施例１０に記載されるように、様々な投与量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の単回投与による治療前及び治療後の複数の時点で、ヒト被験体から全血を収集した。結果を、各細胞集団の割合（％）、及び治療前の値に基づいて計算された倍率変化の比として表す。Ｔｃｏｎ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示は、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物を含む、選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物を提供する。概して、本明細書で提供される化学修飾されたＩＬ−２コンジュゲート組成物は、そのアミノ基を介してＩＬ−２に安定に共有結合した特定の優勢な数の分岐ポリエチレングリコール部分を有することを特徴とする。本明細書で提供される組成物は、主にジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２の定義された画分、並びにモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２及び／又はテトラ若しくはより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２の定義されたより少ない画分を有するＩＬ−２ＰＥＧコンジュゲートの選択された混合物を含む。
【００１０】
一態様では、本開示は、構造：
【００１１】
【化１】
2021523922.tif 000003
【００１２】
（式中、ＩＬ−２はインターロイキン−２であり、
ｎは各出現で独立して約３〜約４０００の整数である）
を有するＰＥＧ化ＩＬ−２を含む組成物を提供する。
【００１３】
当該組成物の特定の実施形態では、ＩＬ−２はアルデスロイキンである。当該組成物の特定の実施形態では、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量は、約２００００ダルトンである。当該組成物の更なる特定の実施形態では、組成物のＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートは、リジン３１に付着したＰＥＧ部分を有する。
【００１４】
一態様では、本明細書で提供されるのは、式：
【００１５】
【化２】
2021523922.tif 000004
【００１６】
（ここで、ＩＬ−２はインターロイキン−２、ｎは約３〜約４０００の整数、ｎ’は２及び３である）のコンジュゲートを含む組成物である。
【００１７】
式（Ｉ）のポリマー部分は、１，３−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ１００００カルバモイル）−２−プロパノキシ）−４−ブタノイル（ＩＬ−２部分のアミノ窒素に共有結合により付着しているカルボニル基まで及びそれを含む）とも称される。式（Ｉ）による混合物の組成物は、一般に、本明細書ではＲＵＲ−ＩＬ２と称され、これは、ある範囲のＰＥＧサイズを包含する。ｎの例示的な範囲は、例えば、約３〜約４０００に加えて、約５〜２０００、又は約１０〜１０００、又は約１０〜７５０、又は約１０〜５００、又は約１０〜４００、又は約１０〜３００、又は約１０〜２５０、又は約２０〜２５０を含む。幾つかの実施形態では、ｎは平均して約２２６である。
【００１８】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、式：
【００１９】
【化３】
2021523922.tif 000005
【００２０】
（ここで、ＩＬ−２はインターロイキン−２、ｎは約３〜約４０００の整数、ｎ’は１及び２及び３である）の組成物である。
【００２１】
幾つかの実施形態では、式Ｉの選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物は、分岐ポリエチレングリコール部分と安定に共有結合したＩＬ−２Ｒを含み、ＩＬ−２部分あたりの分岐ＰＥＧ部分の数（ＰＥＧ化の程度）は、１−ｍｅｒ（モノ−ＰＥＧ化）及び４−ｍｅｒ（テトラ−ＰＥＧ化）を含む微量画分との混合物における２及び３−ｍｅｒ（ジ−及びトリ−ＰＥＧ化）の主な分布である。したがって、幾つかの実施形態では、式Ｉによる組成物中の微量画分は、ｎ’が１、４、５、又はそれより大きいが、１１以下であるコンジュゲートを含むであろう。
【００２２】
例えば、一実施形態では、選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物は、以下の構造に包含される：
【００２３】
【化４】
2021523922.tif 000006
ここで、ＩＬ−２は、ＩＬ−２のアミノ酸残基の１つであり、構造（Ｉｂ）に示される「ＮＨ」は、当該ＩＬ−２残基のアミノ基であり、「ｎ」は約３〜約４０００の整数であり、ｎ’は２及び３である。
【００２４】
幾つかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２と称される選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物及び関連組成物である。これらの組成物は、本明細書に記載されるように、合計約２０ｋＤの名目上の分子量を有する個々の共有結合性のＰＥＧの付着を有するＩＬ−２コンジュゲートを含む。好ましくは、ＩＬ−２部分はアルデスロイキンである。これらの組成物は、主にジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２の定義された画分、並びにモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２及び／又はテトラ若しくはより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２の定義されたより少ない画分を有するＩＬ−２ＰＥＧコンジュゲートの選択された混合物を更に含む。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の特定の調製物が、以下及び本出願を通して記載される。本明細書で使用される場合、式ＡのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物、式ＢのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物、式ＣのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物、式ＤのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物、及び／又は式ＥのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物は、選択的Ｔｒｅｇ刺激因子ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の特定の実施形態及び関連組成物を表し、これらの実施形態では、ＩＬ−２部分はアルデスロイキンである（本明細書に記載される）。任意に、これらの組成物は、その薬学的に許容可能な塩を含む。
【００２５】
ある実施形態では、本明細書において提供されるのは、式ＡのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物であり、組成物は、モルベースで、約５モル％以下のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約２８モル％〜約６０モル％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約２４モル％〜約６５モル％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約１２モル％以下のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量は約２００００ダルトンである。好ましくは、式ＡのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物は、８０モル％以上の組み合わされたジ−及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含む。
【００２６】
ある実施形態では、式ＢのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物が本明細書において提供され、組成物は、モルベースで、約２．５〜約４．５モル％のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約３５〜約５０モル％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約３８〜約４６モル％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約３〜約１０モル％のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量は約２００００ダルトンである。好ましくは、式ＢのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物は、あわせた合計が約８０〜約９５モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含む。
【００２７】
ある実施形態では、式ＣのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物が本明細書において提供され、組成物は、モルベースで、約２．８〜約３．８モル％のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４４〜約４８モル％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４１〜約４４モル％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約７〜約９モル％のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量は約２００００ダルトンである。好ましくは、式ＣのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は、あわせた合計が約８７〜約９０モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含む。
【００２８】
ある実施形態では、式ＤのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物が本明細書において提供され、ここで、組成物は、モルベースで、約２．８〜約３．８モル％のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４４〜約４８モル％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４１〜約４４モル％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約７〜約９モル％のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、当該組成物はリジンＫ７又はＫ８又はＫ３１又はＫ７５の１つに付着したＰＥＧ部分を有するモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートの混合物を含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量は約２００００ダルトンである。好ましくは、式ＤのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は、あわせた合計が約８７〜約９０モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含む。
【００２９】
ある実施形態では、式ＥのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物が本明細書において提供され、ここで、組成物は、モルベースで、約２．８〜約３．８モル％のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４４〜約４８モル％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４１〜約４４モル％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約７〜約９モル％のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、組成物はリジンＫ７に付着したＰＥＧ部分を有するモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量は約２００００ダルトンである。好ましくは、式ＥのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は、あわせた合計が約８７〜約９０モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含む。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物」は、式ＡのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２、及び／又は式ＢのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び／又は式ＣのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２、及び／又は式ＤのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２、及び／又は式ＥのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２、及び／又はこれらの組成物の薬学的に許容可能な塩のいずれか１つによる１つ以上の組成物を指す場合がある。実施例１及び／又は実施例１Ａの調製物は、本開示の「ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物」の非限定的な例である。
【００３１】
本明細書で提供される選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物の更なる実施形態：
本明細書で提供される組成物は、ｎが２に等しいコンジュゲート、例えば、上に示す１，３−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）１０ｋＤカルバモイル）−２−プロパノキシ）−４−ブタノイル構造をそれぞれ有する２つの分岐ポリエチレングリコールポリマーが組成物中の実質的に全てのジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートについて同じ相対位置に付着しているジ−ＰＥＧ化コンジュゲートを含み得る。或いは、ジ−ＰＥＧ化コンジュゲートは、ジ−ＰＥＧ化コンジュゲートの混合物、例えば、分岐ポリエチレングリコール部分の付着がＩＬ−２上の２つの部位で起こり、特定の付着部位が組成物に含まれる全てのジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートについて同じではない、ジ−ＰＥＧ化コンジュゲートの混合物を含み得る。したがって、かかるジ−ＰＥＧ化組成物は、ＰＥＧ化の程度、特に付着した分岐ＰＥＧ部分の数（例えば、２−ｍｅｒ）に関しては均一であるが、ＩＬ−２分子上のＰＥＧ付着の位置に関しては不均一であり、この場合、ＰＥＧ付着の位置異性体となる。
【００３２】
組成物はまた、ｎが３に等しい単一のコンジュゲート、例えば、３つの分岐ポリエチレングリコール部分が、組成物中の実質的に全てのＩＬ−２コンジュゲートについて同じ相対位置に付着しているトリ−ＰＥＧ化コンジュゲートを含み得る。或いは、トリ−ＰＥＧ化コンジュゲートは、トリ−ＰＥＧ化コンジュゲートの混合物、例えば、分岐ポリエチレングリコール部分の付着部位が組成物に含まれるコンジュゲートについてＩＬ−２上の異なる部位で生じるトリ−ＰＥＧ化コンジュゲートの混合物を含み得る。したがって、かかるトリ−ＰＥＧ化組成物は、ＰＥＧ化の程度、特に付着した分岐ＰＥＧ部分の数に関しては均一であるが、ＩＬ−２分子上のＰＥＧ付着の位置に関しては不均一であり、この場合、ＰＥＧ付着の位置異性体となる。
【００３３】
組成物はまた、ｎが１に等しい単一のコンジュゲート、例えば、１つの分岐ポリエチレングリコール部分が、組成物中の実質的に全てのＩＬ−２コンジュゲートについて同じ相対位置に付着しているモノ−ＰＥＧ化コンジュゲートを含み得る。或いは、モノ−ＰＥＧ化コンジュゲートは、モノ−ＰＥＧ化コンジュゲートの混合物、例えば、分岐ポリエチレングリコール部分の付着部位が組成物に含まれるコンジュゲートについてＩＬ−２上の異なる部位で生じるモノ−ＰＥＧ化コンジュゲートの混合物を含み得る。したがって、かかるモノ−ＰＥＧ化組成物は、ＰＥＧ化の程度、特に付着した分岐ＰＥＧ部分の数に関しては均一であるが、ＩＬ−２分子上のＰＥＧ付着の位置に関しては不均一であり、この場合、ＰＥＧ付着の位置異性体となる。
【００３４】
ＩＬ−２分子上のＰＥＧ付着の特定の位置は、本明細書に記載の組成物においてより一般的である。例えば、リジンＫ７又はＫ８又はＫ３１又はＫ７５は、通常ＰＥＧ化された部位である。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物及び関連組成物は、リジンＫ７又はＫ８又はＫ３１又はＫ７５がＰＥＧ化部位であるコンジュゲートを含み得る。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物及び関連組成物は、リジンＫ７又はＫ８又はＫ３１又はＫ７５がＰＥＧ化部位であるモノ−ＰＥＧ化コンジュゲートを含み得る。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物及び関連組成物は、リジンＫ７がＰＥＧ化部位であるモノ−ＰＥＧ化コンジュゲートを含み得る。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物及び関連組成物は、リジンＫ３１がＰＥＧ化部位であるモノ−ＰＥＧ化コンジュゲートを含み得る。
【００３５】
幾つかの実施形態では、組成物は、あわせて考慮した場合、約２０モル％以下、好ましくは約１５モル％以下のコンジュゲートを含み、式（Ｉ）（式中、ｎ’は、１、４、５、又は５より大きい整数から選択される整数である）に包含され、モルパーセンテージは総ＰＥＧ−ＩＬ−２コンジュゲートに基づいている。幾つかの実施形態では、組成物は、あわせて考慮した場合、約１０モル％以下のコンジュゲートを含み、式（Ｉ）（式中、ｎ’は、１、４、５、又は５より大きい整数から選択される整数である）に包含され、モルパーセンテージは総ＰＥＧ−ＩＬ−２コンジュゲートに基づいている。幾つかの追加の実施形態では、組成物は、約１０モル％以下の単量体、好ましくは約７モル％以下の単量体、又は約５モルパーセント以下の単量体（すなわち、ｎが１に等しい場合の構造（Ｉ）に従う）を含む。幾つかの更なる実施形態では、組成物は、約１０モル％以下の四量体、好ましくは約７モル％以下の四量体、又は約５モルパーセント以下の四量体を含む（すなわち、ｎが４に等しい場合の構造（Ｉ）に従う）を含む。特定の追加の実施形態では、組成物は、約１０モル％以下の単量体及び約１０モル％以下の四量体を含む。或いは、組成物は、約７モル％以下の単量体及び約７モル％以下の四量体を含むか、又は約５モル％以下の単量体及び約５モル％以下の四量体を含み得る。
【００３６】
幾つかの実施形態では、組成物中のＰＥＧ化ＩＬ−２に関して、組成物は、一般に、以下の特徴のうちの１つ以上を満たすであろう：組成物中のコンジュゲートの少なくとも約８０％は、ジ−ＰＥＧ化コンジュゲート及びトリ−ＰＥＧ化コンジュゲートの混合物を含み、ＩＬ−２部分に付着した上記の式（Ｉ）に示す構造を有する２個及び３個の分岐ポリマーを有するものもある；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約８５％は、ジ−ＰＥＧ化コンジュゲート及びトリ−ＰＥＧ化コンジュゲートの混合物を含み、ＩＬ−２部分に付着した上記の式（Ｉ）に示す構造を有する２個及び３個の分岐ポリマーを有するものもある；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９０％は、ジ−ＰＥＧ化コンジュゲート及びトリ−ＰＥＧ化コンジュゲートの混合物を含み、ＩＬ−２部分に付着した上記の式（Ｉ）に示す構造を有する２個及び３個の分岐ポリマーを有するものもある；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９５％は、ジ−ＰＥＧ化コンジュゲート及びトリ−ＰＥＧ化コンジュゲートの混合物を含み、ＩＬ−２部分に付着した上記の式（Ｉ）に示す構造を有する２個及び３個の分岐ポリマーを有するものもある；組成物中のコンジュゲートの約２０％以下が、ＩＬ−２部分部分に付着した上記の式（Ｉ）に示される構造を有する１個又は４個以上の分岐ポリマーを有するであろう；組成物中のコンジュゲートの約１５％以下が、ＩＬ−２部分部分に付着した上記の式（Ｉ）に示される構造を有する１個又は４個以上の分岐ポリマーを有するであろう；組成物中のコンジュゲートの約１０％以下が、ＩＬ−２部分部分に付着した上記の式（Ｉ）に示される構造を有する１個、４個以上の分岐ポリマーを有するであろう；組成物中のコンジュゲートの約７％以下が、ＩＬ−２部分部分に付着した上記の式（Ｉ）に示される構造を有する１個又は４個以上の分岐ポリマーを有するであろう。
【００３７】
幾つかの実施形態では、組成物は、あわせて考慮した場合、約２０モル％以下、好ましくは約１５モル％以下の組成物を含み、式（Ｉ）（式中、ｎ’は、１、４、５、又は５より大きい整数から選択される整数である）に包含され、モルパーセンテージは総ＰＥＧ−ＩＬ−２コンジュゲートに基づいている。幾つかの実施形態では、組成物は、あわせて考慮した場合、約１０モル％以下のコンジュゲートを含み、式（Ｉ）（式中、ｎ’は、１、４、５、又は５より大きい整数から選択される整数である）に包含され、モルパーセンテージは総ＰＥＧ−ＩＬ−２コンジュゲートに基づいている。幾つかの追加の実施形態では、組成物は、約１０モル％以下の単量体、好ましくは約７モル％以下の単量体、又は約５モルパーセント以下の単量体（すなわち、ｎが１に等しい場合の構造（Ｉ）に従う）を含む。幾つかの更なる実施形態では、組成物は、約１０モル％以下の四量体、好ましくは約７モル％以下の四量体、又は約５モルパーセント以下の四量体を含む（すなわち、ｎが４に等しい場合の構造（Ｉ）に従う）を含む。特定の追加の実施形態では、組成物は、約１０モル％以下の単量体及び約１０モル％以下の四量体を含む。或いは、組成物は、約７モル％以下の単量体及び約７モル％以下の四量体を含むか、又は約５モル％以下の単量体及び約５モル％以下の四量体を含み得る。
【００３８】
幾つかの更なる実施形態では、組成物は、ほぼ等モル量の
【００３９】
【化５】
2021523922.tif 000007
を含む。
【００４０】
例えば、例示的な組成物は、ジ−ＰＥＧ化種とトリ−ＰＥＧ化種との近似比：１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３又は１：１．４のいずれか１つ以上を含み得る。かかる組成物のＩＬ−２あたりのＰＥＧ部分の平均数は、例えば、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．６、２．７、２．８、２．９及び３から選択される。特定の実施形態では、ＩＬ−２あたりのＰＥＧ部分の平均数は、約２．５である。
【００４１】
例えば、幾つかの実施形態では、組成物は、約２０モルパーセント（モル％）以下のＩＬ−２コンジュゲートを含み、これは、あわせて考慮した場合、式
【００４２】
【化６】
2021523922.tif 000008
【００４３】
に包含され、
ｎ’は１、４、５、又は５より大きい整数から選択される。
【００４４】
しかしながら、幾つかの追加の実施形態では、組成物は、約１５モルパーセント（モル％）以下のＩＬ−２コンジュゲートを含み、これは、あわせて考慮した場合に、式
【００４５】
【化７】
2021523922.tif 000009
【００４６】
に包含され
１、４、５、又は５より大きい整数から選択されるｎ’を有する。
【００４７】
更に幾つかの更なる実施形態では、組成物は、約１０モルパーセント（モル％）以下のＩＬ−２コンジュゲートを含み、これは、あわせて考慮した場合、式
【００４８】
【化８】
2021523922.tif 000010
【００４９】
に包含され、
１、４、５、又は５より大きい整数から選択されるｎ’を有する。
【００５０】
上述の幾つかの追加の実施形態では、組成物は、ｎ’が１に等しい約１０モル％以下のＩＬ−２コンジュゲートを含む。更に幾つかの他の実施形態では、組成物は、ｎ’が１に等しい約７モル％以下のＩＬ−２コンジュゲートを含む。
【００５１】
更に幾つかの更なる実施形態では、組成物は、ｎ’が１に等しい約５モル％以下のＩＬ−２コンジュゲートを含む。更に幾つかの代替の実施形態では、組成物は、１に等しいｎ’を有する約５モル％未満のＩＬ−２コンジュゲートを含む。
【００５２】
幾つかの更なる実施形態では、上述のいずれか１つ以上の組成物に関して、組成物は４に等しいｎ’を有する約１０モル％以下のＩＬ−２コンジュゲートを含む。又は、他の幾つかの実施形態では、組成物は、ｎ’が４に等しい約７モル％以下のＩＬ−２コンジュゲートを含む。更に幾つかの更なる実施形態では、組成物は、４に等しいｎ’を有する約５モル％以下のＩＬ−２コンジュゲートを含む。
【００５３】
ほぼ等モル量の、
【００５４】
【化９】
2021523922.tif 000011
【００５５】
を含む組成物も本明細書で提供される。
【００５６】
更に追加の実施形態では、式
【００５７】
【化１０】
2021523922.tif 000012
【００５８】
（ここで、ジＰＥＧ／トリＰＥＧコンジュゲートのモル比は、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３及び１：１．４から選択される）のＩＬ−２コンジュゲートを含む組成物である。
【００５９】
更に幾つかの更なる実施形態では、組成物は、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．６、２．７、２．８、２．９及び３からなる群から選択されるＩＬ−２残基あたり（上記のような構造を有する）分岐ポリエチレングリコール部分の平均数を有する。特定の実施形態では、ＩＬ−２部分あたりの分岐ポリエチレングリコール部分（上記のような構造を有する）の平均数は約２．５である。前述の１つ以上に関連する幾つかの実施形態では、ｎの値は５〜２０００の範囲である。他の幾つかの実施形態では、ｎの値は１０〜１０００の範囲である。更に幾つかの追加の実施形態では、ｎの値は１０〜７５０の範囲である。幾つかの実施形態では、ｎの値は、１０〜５００、又は２０〜２５０の範囲である。
【００６０】
本明細書で提供される実施形態におけるｎの値は、各出現で独立して変化し得る。本明細書に記載の１つ以上の実施形態では、分岐ポリマーのポリエチレングリコールアームのそれぞれにおけるｎの値は実質的に同じである。幾つかの更なる実施形態では、分岐ポリマーを含むポリマーアームのそれぞれにおけるｎの値は、約１７０〜２８５の範囲である。更に幾つかの更なる実施形態では、分岐ポリマーを含むポリマーアームのそれぞれにおけるｎの値は、約２０４〜約２５０の範囲である。１つ以上の特定の実施形態では、分岐ポリマーを含むポリマーアームのそれぞれにおけるｎの値は、約２２６である。
【００６１】
本明細書で提供される態様又は実施形態のいずれか１つ以上に関連する１つ以上の実施形態では、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量は、約２５０ダルトン〜約９００００ダルトンの範囲である。幾つかの他の実施形態では、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量は、約１０００ダルトン〜約６００００ダルトンの範囲である。更なる実施形態では、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量は、約５０００ダルトン〜約６００００ダルトンの範囲である。幾つかの他の実施形態では、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量は、約１００００ダルトン〜約５５０００ダルトンの範囲である。
【００６２】
更に幾つかの追加の実施形態では、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量は、約１５０００ダルトン〜約２５０００ダルトンの範囲である。更に１つ以上の更なる実施形態では、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量は、約１８０００ダルトン〜約２２０００ダルトンの範囲である。更に幾つかの更なる実施形態では、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量は、約２００００ダルトンである。
【００６３】
追加の例示的な組成物は、分子の全体のポリマー部分が約２５０ダルトン〜約９００００ダルトンの範囲の名目上の平均分子量を有する、上記の式による組成物を含む。分子のポリマー部分の追加の適切な範囲には、約１０００ダルトン〜約６００００ダルトン、約５０００ダルトン〜約６００００ダルトンの範囲、約１００００ダルトン〜約５５０００ダルトン、約１５０００ダルトン〜約５００００ダルトンの範囲、及び約２００００ダルトン〜約５００００ダルトンの範囲から選択される範囲の名目上の平均分子量が含まれる。
【００６４】
ポリエチレングリコールポリマー部分の追加の例示的な重量平均分子量には、約２００ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約７５０ダルトン、約８００ダルトン、約９００、約１０００ダルトン、約１５００ダルトン、約２０００ダルトン、約２２００ダルトン、約２，５００ダルトン、約３０００ダルトン、約４０００ダルトン、約４４００ダルトン、約４５００ダルトン、約５０００ダルトン、約５５００ダルトン、約６０００ダルトン、約７０００ダルトン、約７５００ダルトン、約８０００ダルトン、約９０００ダルトン、約１００００ダルトン、約１１０００ダルトン、約１２０００ダルトン、約１３０００ダルトン、約１４０００ダルトン、約１５０００ダルトン、約２００００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約２５０００ダルトン約３００００ダルトン、約３５０００ダルトン、約４００００ダルトン、約４５０００ダルトン、約５００００ダルトン、約５５０００ダルトン、約６００００ダルトン、約６５０００ダルトン、約７００００ダルトン、及び約７５０００ダルトンが含まれる。幾つかの好ましい実施形態では、分岐ポリエチレングリコールポリマーの重量平均分子量は、約２００００ダルトンである。各分岐ＰＥＧ部分が約２００００ダルトンの名目上の分子量を有する幾つかの特定の実施形態では、組成物の結果として生じる分子量範囲は、組成物全体について特徴付けられる場合、約５５ｋＤａ〜７５ｋＤａである。
【００６５】
本明細書で提供される選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物の更なる実施形態は、その薬学的に許容可能な塩を含む。上記のように、ＩＬ−２コンジュゲート組成物は、薬学的に許容可能な塩の形態であり得る。典型的には、かかる塩は、薬学的に許容可能な酸又は酸同等物との反応によって形成される。この点での「薬学的に許容可能な塩」という用語は、一般に、比較的非毒性の、無機及び有機酸付加塩を指す。これらの塩は、投与ビヒクル又は剤形製造プロセスにおいてその場で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）、又は本明細書に記載の長時間作用型インターロイキン−２組成物を適切な有機酸若しくは無機酸と別々に反応させ、こうして形成された塩を単離することによって調製することができる。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、シュウ酸塩（ｏｘｙｌａｔｅ）、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩（ｇｌｕｃｏｈｅｐｔｏｎａｔｅ）、ラクトビオン酸塩、及びラウリルスルホン酸塩等が挙げられる。（例えば、Ｂｅｒｇｅら（１９７７）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい）。したがって、記載されている塩は、塩酸塩、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等の無機酸から誘導することができ；又は酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸等の有機酸から調製することができる。本明細書で使用される場合、本明細書に記載のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物を含む「組成物（複数の場合もある）」という用語は、ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートの任意及び／又は全ての薬学的に許容可能な塩を含む。この説明は、「又はその薬学的に許容可能な塩」という用語が組成物の説明に追加されるかどうかにかかわらず適用される。
【００６６】
使用方法の実施形態
未修飾のＩＬ−２とは対照的に、本明細書に記載のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物を含む選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物は、自己反応性免疫に関連する根底にある病理に対処し、並びに有益なＴ細胞機能をもたらす特定の機構を標的として、未修飾のＩＬ−２の投与に比べて大幅な改善を提供する。既存の自己免疫疾患療法の欠陥に対処するため、本組成物は、投与時に持続的な曝露を提供し、独特の薬理学的プロファイルを有する。本発明の組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで内因性Ｔｒｅｇを選択的に拡大及び活性化し、従来のＴ細胞及び／又はナチュラルキラー細胞の拡大を制限して、それにより自己免疫疾患の治療のための優れたアプローチを提供する。
【００６７】
より詳しくは、本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物を含み、そのアミノ基を介してＩＬ−２に安定に共有結合により連結した特定の優勢な数の分岐ポリエチレングリコール部分を有する選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物は、低用量で投与された場合に特に効果的であることが発見された。本発明の組成物は、ＩＬ−２受容体に結合及びそれを活性化して、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の細胞集団及び免疫抑制機能を優先的に増加させる一方で、Ｔエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）に対する刺激効果を最小限にするのに効果的である。げっ歯類、非ヒト霊長類研究、及びヒト臨床研究における本組成物（一般に本明細書ではＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物、又は他の例ではＲＵＲ−ＩＬ−２組成物と称される）への持続的曝露は、同等の用量の未修飾ＩＬ−２では達成できなかったＴｒｅｇ対Ｔｅｆｆ応答の大きさ、持続時間、及び特異性提供するのに効果的であった。
【００６８】
選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の単一の低漸増皮下用量（補足例に記載）のヒトへの投与は、用量規制毒性、重篤な有害事象、又は臨床的に重大な異常をもたらさなかった。予備的な薬物動態分析は、組成物がほとんどの被験体で投与後約４〜６日あたりで最大濃度に達し、投与後およそ２週間まで濃度の変化がほとんどなく、その後濃度がおよそ８〜９日の半減期で低下したことを示した。予備的な薬力学的評定により、選択的長時間作用型ＩＬ−２受容体アゴニストＴｒｅｇ刺激因子組成物の投与により、循環ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔＴｒｅｇが用量依存的に増加することが明らかになり、すなわち、循環ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔＴｒｅｇの絶対数が持続的に増加し、投与後およそ２０〜２５日までレベルがベースラインに戻らなかった。投与前と比較して、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔＴｒｅｇの数に数倍（大きさは投与量に応じて）の平均増加があった。変化の大きさはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔＴｒｅｇで観察されたものよりも小さかったものの、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの総個体数も増加した。最低用量では、治療を受けた被験体対プラセボ被験体のＴｒｅｇの数に変化はなかった。どの用量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成でもＴ細胞集団（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）の割合又は数の変化は観察されなかったことから、主な効果はＴｒｅｇで見られた。したがって、本発明の組成物及び方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏバイオアッセイ（代替の化学修飾ＩＬ−２化合物と比較した場合でも）及びヒト研究においても、以下に説明するように、下記の項目にあるその他の特徴とともに、Ｔｒｅｇの抑制能力を高めるのに驚くほど効果的である。
【００６９】
本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物を含む選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物は、（とりわけ）自己免疫疾患及び障害を治療するのに有用である。本明細書に記載のＲＵＲ−ＩＬ−２又はＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の投与によって治療することができる例示的な自己免疫疾患としては、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、全身性硬化症、強直性脊椎炎、移植片対宿主病、及び多発性筋炎等の全身状態；又は１型糖尿病、アディソン病、橋本甲状腺炎、グレーブス病、シェーグレン症候群、白斑、悪性貧血、糸球体腎炎、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、ピーナッツアレルギー、肺線維症等の臓器特異的自己免疫疾患が挙げられる。
【００７０】
幾つかの実施形態では、治療される状態は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、主に中年の女性に発症する自己免疫性炎症性疾患である。ＳＬＥの特徴としては、例えば、皮膚の発疹、関節痛、再発性胸膜炎、及び腎臓疾患が含まれる。Ｔｃｏｎと比較したＴｒｅｇの進行性恒常性不均衡は、ＳＬＥを含む多くの自己免疫疾患によって共有されている。まとめると、Ｔｒｅｇ恒常性をＳＬＥの病理に関連付ける治療仮説、ＳＬＥ患者における低用量ＩＬ−２の活性、及びＩＬ−２と比較した本明細書に記載のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物の優れたＴｒｅｇ誘導特性は、ＳＬＥ、並びに他の自己免疫疾患及び状態の治療における本発明のＲＵＲ−ＩＬ−２又はＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物の使用に対する十分な裏付けを提供する。１つ以上の更なる実施形態では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のＲＵＲ−ＩＬ−２又はＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２関連組成物を投与することによって状態を治療する方法であり、ここで、状態は、例えば、アレルギー、ＧＶＨＤ、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、１型糖尿病、多発性硬化症及び乾癬からなる群から選択される。
【００７１】
更に幾つかの更なる実施形態では、ＲＵＲ−ＩＬ−２又はＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２関連組成物は、治療有効用量で被験体に投与された場合、従来のＴ細胞及びナチュラルキラー細胞よりも制御性Ｔ細胞を優先的に拡大及び活性化するのに効果的である。
【００７２】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される治療有効量のＲＵＲ−ＩＬ−２又はＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２関連組成物を被験体に投与することによって、被験体における制御性Ｔ細胞対エフェクターＴ細胞の比率を増加させる方法である。
【００７３】
前述の方法に関連する幾つかの実施形態では、制御性Ｔ細胞は、Ｆｏｘｐ３＋細胞及びＣＤ２５＋細胞から選択される。前者の実施形態又は方法に関連する１つ以上の実施形態では、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞から選択される。
【００７４】
上記の方法又は関連する実施形態に関連する幾つかの更なる実施形態では、ベースラインと比較した場合の制御性Ｔ細胞の倍増は、ｉｎ−ｖｉｖｏマウスモデルで評価した場合、少なくとも約２、又は少なくとも約４、又は更には少なくとも約６に達する。
【００７５】
上記方法の幾つかの実施形態では、制御性Ｔ細胞数の増加は、投与後少なくとも３日間、ベースラインレベルを超えて持続する。幾つかの追加の実施形態では、制御性Ｔ細胞数の増加が、投与後少なくとも５日間、ベースラインレベルを超えて持続する。好ましくは、制御性Ｔ細胞数の増加が少なくとも７日間、ベースラインレベルを超えて持続する。
【００７６】
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、上記又は本明細書の他の場所に記載されているＲＵＲ−ＩＬ−２又はＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２関連組成物の実施形態を含む治療有効量の選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物を被験体に投与することを含む、自己免疫疾患を有する被験体を治療する方法である。
【００７７】
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ａ、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｂ、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｃ、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｄ、及びＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｅからなる群から選択される治療有効量の組成物を被験体に投与することを含む、自己免疫疾患を有する被験体を治療する方法である。
【００７８】
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ａ、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｂ、及びＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｃからなる群から選択される治療有効量の組成物を被験体に投与することを含む、自己免疫疾患を有する被験体を治療する方法である。
【００７９】
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、治療有効量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ａの組成物を被験体に投与することを含む、自己免疫疾患を有する被験体を治療する方法である。
【００８０】
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、治療有効量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｂの組成物を被験体に投与することを含む、自己免疫疾患を有する被験体を治療する方法である。
【００８１】
更なる態様では、本明細書で提供されるのは、治療有効量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｃの組成物を被験体に投与することを含む、自己免疫疾患を有する被験体を治療する方法である。
【００８２】
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ａ、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｂ、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｃ、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｄ、及びＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｅからなる群から選択される組成物の治療法における使用である。
【００８３】
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ａの組成物の治療法における使用である。
【００８４】
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｂの組成物の治療法における使用である。
【００８５】
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｃの組成物の治療法における使用である。
【００８６】
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｄの組成物の治療法における使用である。
【００８７】
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｅの組成物の治療法における使用である。
【００８８】
更なる態様では、本明細書で提供されるのは、自己免疫疾患の治療用薬剤の製造のためのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ａ、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｂ、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｃ、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｄ、及びＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２  式Ｅからなる群から選択される選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物の使用である。
【００８９】
より特定の実施形態では、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の治療は、治療有効量のＲＵＲ−ＩＬ−２又はＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２関連組成物を含む製剤の皮下投与を含む。例えば、ＳＬＥの代表的な動物モデルにおける生理学的免疫応答及び疾患進行の制御に対するＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物誘導性Ｔｒｅｇの効果を説明する実施例８に記載の結果を参照されたい。そこに記載されているように、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は、腎傷害のバイオマーカー（ＳＬＥを患う患者の特徴の１つ）を正常なマウスで観察されるのとほぼ同じレベルまで抑制するのに効果的であった。
【００９０】
本明細書に記載の治療方法を参照する実施形態では、かかる実施形態は、その治療で使用するための、或いはその治療で使用するための薬剤の製造で使用するための更なる実施形態でもある。本開示は更に、治療法に使用するための、本明細書に記載のその製剤を含む、組成物の実施形態のいずれか１つによる組成物を提供する。本開示は更に、自己免疫疾患の治療に使用するための、本明細書に記載のその製剤を含む、組成物の実施形態のいずれか１つによる組成物を提供する。
【００９１】
一態様では、本開示は、治療法で使用するための、
構造：
【００９２】
【化１１】
2021523922.tif 000013
【００９３】
（式中、ＩＬ−２はインターロイキン−２であり、
ｎは各出現で独立して約３〜約４０００の整数である）を有するＰＥＧ化ＩＬ−２を含む組成物を提供する。治療法で使用するための当該組成物の特定の実施形態では、ＩＬ−２はアルデスロイキンである。治療法で使用するための当該組成物の特定の実施形態では、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量は、約２００００ダルトンである。治療法で使用するための当該組成物の更なる特定の実施形態では、組成物のＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートは、リジン３１に付着したＰＥＧ部分を有する。治療法で使用するための当該組成物の特定の実施形態では、治療法は自己免疫疾患に使用するためのものである。
【００９４】
用語
本開示の特定の特徴を説明及び主張する際に、以下の用語は、別段の指定がない限り、以下に記載される定義に従って使用される。
【００９５】
本明細書で使用及び記載される場合、「選択的」という用語は、誘導された免疫細胞の特徴を具体化するｉｎ  ｖｉｖｏ免疫学的応答を指すか、又は幾つかの点では免疫学的シグナル応答を指すが、他の点ではそうではないことを指す。特に、Ｔｒｅｇ誘導及び／又は活性化に関する「選択的」は、ＩＣＯＳ又はＫｉ６７又はＳＴＡＴ５等の活性化の１つ以上のマーカーによって示されるように、Ｔｒｅｇ細胞数の増加（ＣＤ２５が高く、フローサイトメトリーによる合計）、及び／又はＴｒｅｇ活性化状態の増加を示す免疫応答を指し、及び／又は活性化は、下流の誘導免疫抑制応答及び／又は誘導免疫寛容応答を指し、同時に特定の他の免疫応答を欠いていることを指す。これに関して、「選択的Ｔｒｅｇ誘導」は、記載されているようにＴｒｅｇの免疫応答を指し、同時に、有意な及び／又は臨床的に重要なエフェクターＴ細胞及び関連する免疫学的活性化応答を欠いていることを指す。重要な及び／又は臨床的に重要なエフェクターＴ細胞及び関連する免疫学的活性化応答には、例えば、ＣＤ４陽性Ｔエフェクター細胞及び／又はＣＤ８陽性Ｔエフェクター細胞の増殖、及び／又はＩＣＯＳ又はＫｉ６７等の活性化のマーカー、又は他の周知のエフェクター免疫応答が含まれる。他のエフェクター免疫応答シグナルには、「サイトカイン症候群」として知られるもの等、及び／又はＩＬ−５、ＩＮＦｇａｍｍａ、ＩＬ−６、ＩＦＮａｌｐｈａ、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＬ−１９等の特定の炎症性サイトカインの上昇が含まれる場合がある。選択的Ｔｒｅｇ刺激は、平均Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比にも反映され得る。好ましくは、本明細書に記載のＲＵＲ−ＩＬ−２又はＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２関連組成物に応答して達成される平均Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比は、少なくとも５倍、好ましくは７倍、より好ましくは１０倍以上である。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「ＰＥＧ化の程度」という用語は、個々のアルデスロイキンポリペプチドのアミノ基（複数の場合もある）に共有結合により連結した安定なＰＥＧ置換基の数を指す。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、記載された数値のプラスマイナス１０％等の記載された数値の合理的な付近を意味する。好ましくは、本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ、ほぼ」は、所与の量のプラスマイナス５％以内を意味する。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「ｎは２及び３である」という用語は、ＩＬ−２コンジュゲートの混合物を指し、混合物は、本明細書に記載されるように、ジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化のコンジュゲートを含む。
【００９９】
「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」という用語は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ表現型等のＴ細胞を指す。（例えば、Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ａ．Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ａｎｄ  Ｑｉｚｈｉ  Ｔａｎｇ，Ｔｒｅｇ  ｃｅｌｌｓ−ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｆｒｏｎｔｉｅｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１８・Ｖｏｌ．３６２  Ｉｓｓｕｅ  ６４１１，ｐ１５４−１５５．を参照されたい）
「Ｔｃｏｎ」又は「従来のＴ細胞」という用語は、ａβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、並びに共受容体ＣＤ４又はＣＤ８を発現し、Ｔヘルパー細胞機能及び細胞傷害性Ｔ細胞エフェクター機能等の確立された適応免疫エフェクター機能を実行するＴリンパ球を指す。例えば、ＴｃｏｎはＣＤ４＋ＣＤ２５−ナイーブな従来のＴ細胞を指す場合がある。「エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）」は、当業者に知られているように、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞等のＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞エフェクター表現型を指す。「ナチュラルキラー細胞」、「Ｋ細胞」、又は「キラー細胞」としても知られる「ＮＫ細胞」は、リンパ球（白血球）の一種であり、自然免疫系の構成要素である。ＮＫ細胞は、腫瘍やウイルスに感染した細胞の宿主拒絶反応において主要な役割を果たす。
【０１００】
「ＩＬ−２中間体」は、ＩＬ−２ポリペプチド、特にアルデスロイキンを指す。「ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２」は、ＩＬ−２部分が本明細書に記載されるようなアルデスロイキンであり、ＰＥＧ部分が本明細書に記載されるとおりであるＩＬ−２  ＰＥＧコンジュゲートを指す。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を、一般的に化学名（１，３−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）１０ｋＤカルバモイル）−２−プロパノキシ）−４−ブタンアミド）インターロイキン−２）と呼ぶこともできるが、これは組成を完全に説明しているわけではない。本明細書で使用される場合、アルデスロイキンは、大腸菌で発現される組換え非グリコシル化インターロイキン−２である１２５−Ｌ−セリン−２−１３３インターロイキン−２）のアミノ酸配列を指す。アルデスロイキンのアミノ酸配列を図２に示す。当業者に知られている他の宿主系で発現されるアルデスロイキンもまた、本明細書で使用される用語の意味の範囲内である。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「ＩＬ−２」という用語は、ヒトＩＬ−２活性を有する部分を指す。「ＩＬ−２部分」という用語は、分岐ポリエチレングリコール部分に付着する前のＩＬ−２部分、並びに共有結合より付着した後のＩＬ−２部分を指す。元のＩＬ−２部分が、本明細書で提供される分岐ポリエチレングリコールポリマー等のポリエチレングリコールポリマーに付着される場合、ＩＬ−２部分は、ポリエチレングリコール部分への連結に関連する１つ以上の共有結合の存在のためにわずかに変化することが理解される。別の分子に付着したそのようなわずかに変化した形態のＩＬ−２部分は、本明細書では、ＩＬ−２部分の「残基」と称される。ＩＬ−２の残基に関して「残基」という用語は、本明細書の式において示されるように、１つ以上の共有結合性の付着部位で、ポリエチレングリコール等のポリマーへの共有結合による付着の後に残るＩＬ−２分子の部分を意味する。通常、付着部位は、ＩＬ−２のリジンの１１個のアミン基の１つである。
【０１０２】
未修飾のＩＬ−２がポリエチレングリコール等のポリマーに付着している場合、ポリマー（複数の場合もある）への連結に関連する１つ以上の共有結合の存在により、ＩＬ−２がわずかに変化することが理解されよう。分岐ＰＥＧ部分等の別の分子に付着したＩＬ−２のこのわずかに変化した形態は、場合によってはＩＬ−２の「残基」と称されることもあれば、単に「ＩＬ−２」等と称されることもあり、かかるポリマーコンジュゲートに含まれるＩＬ−２は、１つ以上の共有結合の存在のためにわずかに変化し、それぞれが分岐したＰＥＧ部分をＩＬ−２に連結しているということが理解される。「より高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲート」という用語は、テトラＰＥＧコンジュゲート又はペンタＰＥＧコンジュゲート又はＰＥＧ部分が最大１１個のコンジュゲートを指す。好ましくは、「より高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲート」は、テトラＰＥＧコンジュゲート又はペンタＰＥＧコンジュゲートを指す。
【０１０３】
例えば、国際特許公開第２０１２／０６５０８６号公報に記載されている配列番号１〜配列番号４のいずれか１つに対応するアミノ酸配列を有するタンパク質は、それに実質的に相同な任意のタンパク質又はポリペプチドと同様に、例示的なＩＬ−２タンパク質である。実質的に相同であるという用語は、特定の対象配列、例えば、変異配列が、１つ以上の置換、欠失又は付加によって参照配列から変化しており、その正味の効果が参照配列と対象配列との間で有害な機能的非類似性をもたらさないことを意味する。本発明の目的のため、９５パーセントを超える相同性、同等の生物学的活性（ただし、必ずしも同等の生物学的活性の強度ではない）、及び同等の発現特性を有する配列は、実質的に相同であるとみなされる。相同性を決定する目的で、成熟配列のトランケーションは無視されるべきである。本明細書で使用される場合、「ＩＬ−２」という用語は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、又は偶発的に突然変異によって改変されたかかるタンパク質を含む。これらの用語はまた、１個〜６個の追加のグリコシル化部位を有する類縁体、追加のアミノ酸（複数の場合もある）が少なくとも１つのグリコシル化部位を含むタンパク質のカルボキシ末端に少なくとも１つの追加のアミノ酸を有する類縁体、及び少なくとも１つのグリコシル化部位を含むアミノ酸配列を有する類縁体を含む。この用語には、天然部分と組換え生成部分の両方が含まれる。更に、ＩＬ−２は、ヒト由来、動物由来、及び植物由来であり得る。１つの例示的なＩＬ−２は、アルデスロイキンと称されるヒト組換えＩＬ−２である（図２を参照）。本明細書に記載の長時間作用型ＩＬ−２Ｒアゴニストへの言及は、その薬学的に許容可能な塩形態を包含することを意味する。
【０１０４】
本明細書に記載のＲＵＲ−ＩＬ−２又はＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２関連組成物は、ある意味で長時間作用型薬剤である。本明細書で提供されるＲＵＲ−ＩＬ−２又はＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２関連組成物に関して、長時間作用型は、修飾されていない同じＩＬ−２Ｒアゴニスト（例えば、修飾されていないアルデスロイキン又は他の適切なインターロイキン−２配列）の血清中の循環半減期よりも延長された循環半減期を有するかかる組成物を指す。例えば、コンパレータアゴニストは、ポリエチレングリコール部分等の１つ以上の水溶性ポリマー部分へと共有結合により付着することによって修飾されず、同じ薬物動態分析によって同じ被験体にタンパク質等価用量のＩＬ−２Ｒアゴニストを投与したものとして比較される。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「ＰＥＧ」又は「ポリエチレングリコール」は、任意の水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含することを意味する。特に明記しない限り、「ＰＥＧポリマー」又はポリエチレングリコールは、実質的に全ての（好ましくは全ての）単量体サブユニットがエチレンオキシドサブユニットであるものであるが、ポリマーは、例えば、複合化のために、別個のエンドキャッピング部分又は官能基を含んでもよい。本開示で使用するためのＰＥＧポリマーは、末端酸素（複数の場合もある）が例えば、合成変換中に変位されているかどうかに応じて、「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−」又は「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２−、」の２つの構造のうちの１つを含む。上記のように、ＰＥＧポリマーの場合、変数（ｎ）は約３〜４０００の範囲であり、末端基及び全体的なＰＥＧの構造は変化する場合がある。好ましくは、ＰＥＧは、本明細書に詳細に記載されるような特定の意味を有する。
【０１０６】
「分岐」は、ポリマーの形状又は全体的な構造に関して、分岐点又は中央の構造的特徴から延びる２つ以上のポリマー「アーム」又は「鎖」を有するポリマーを指す。一例として、例示的なＰＥＧ試薬、ｍＰＥＧ２−ブタン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１，３−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）カルバモイル）−２−プロパノキシ）−４−スクシンイミジルブタノエート）は、それぞれがカルバメート結合（〜ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ〜）を介して中央のプロピル基の１−及び３−炭素にそれぞれ共有結合により付着し、そこからオキシブタノエートスクシンイミジルエステルが伸びる２つの直鎖のＰＥＧ鎖で構成される分岐ポリエチレングリコールポリマーである。
【０１０７】
ＰＥＧ等の水溶性ポリマーとの関連での分子量は、数（名目上の）平均分子量又は重量平均分子量のいずれかとして表すことができる。特に明記しない限り、本明細書における分子量への全ての言及は、名目上の平均分子量を指す。数平均と重量平均の両方の分子量測定は、ゲル浸透クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、又は他の液体クロマトグラフィーの手法を使用して測定することができる。また、分子量の平均値を決定するための末端基分析若しくは束一的性質（凝固点降下、沸点上昇、又は浸透圧等）の測定等の使用、又は重量平均分子量を決定するための光散乱技術、超遠心分離若しくは粘度測定の使用等の分子量値を測定する他の方法を使用することもできる。ゲルろ過クロマトグラフィーは、分岐ポリマーの平均分子量を決定するために頻繁に使用される。ＰＥＧポリマーは、典型的には多分散性であり（すなわち、ポリマーの数平均分子量及び重量平均分子量は等しくない）、好ましくは約１．２未満、より好ましくは約１．１５未満、更により好ましくは約１．１０未満、更により好ましくは約１．０５未満、及び最も好ましくは約１．０３未満の低い多分散性値を有する。
【０１０８】
「安定な」連結又は結合は、水中で実質的に安定である、すなわち、生理学的条件下で長期間にわたって感知できる程度に加水分解を受けない化学結合を指す。加水分解的に安定な連結の例としては、限定されるものではないが、一般に、炭素−炭素結合（例えば、脂肪族鎖）、エーテル、アミド、アミン等が挙げられる。一般に、安定した連結とは、生理学的条件下で１日あたり約１〜２％未満の加水分解速度を示す結合である。代表的な化学結合の加水分解速度は、ほとんどの標準的な化学の教科書に記載されている。
【０１０９】
本明細書で使用する場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」には、文脈で別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象が含まれる。
【０１１０】
「実質的に」又は「本質的に」とは、別段の記述がない限り、ほぼ完全に又は完全に、例えば、所与の量の９５％以上を意味する。
【０１１１】
調製及び実施例
調製及び実施例は、限定ではなく例示として記載されており、当業者によって様々な修正を加えることができることを理解されたい。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物を含む、選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物を調製する方法は、本明細書に記載され、及び／又は当業者に知られている。試薬及び開始物質は、容易に入手可能であるか、又は当業者によって容易に合成され得る。これらの方法の工程に適した条件はよく知られており、緩衝液及び試薬の適切な置換は当業者の範囲内である。更に、当業者は、幾つかの状況では、組成物が製造される工程及び順序が変更されてもよく、これは当業者によって十分に理解されることを理解するであろう。同様に、調製物は、必要に応じて又は所望に応じて、様々な周知の手法によって単離及び／又は精製され得ることが理解されるであろう。
【０１１２】
ＩＬ−２中間体の調製：
ＩＬ−２部分は、非組換え法及び／又は組換え法から誘導することができ、本開示は、この点に関して限定されない。ＩＬ−２部分は、ヒト由来、動物由来、及び植物由来であり得る。例えば、生物学的システムからＩＬ−２を単離すること、或いは培養培地からＩＬ−２を得ることが可能である。例えば、米国特許第４，４０１，７５６号及びＰａｕｌｙら（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７５（１）：７３−８４に記載されている手順を参照されたい。
【０１１３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、並びに原核生物及び真核生物の宿主細胞において組換えポリペプチドを産生及び発現するための方法は、当業者によく知られている。例えば、米国特許第５，６１４，１８５号を参照されたい。ＩＬ−２部分を、細菌［例えば大腸菌、例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＩＬ−２ｍ．２１（３）：２９５−３１１を参照されたい］、哺乳動物［例えば、Ｋｒｏｎｍａｎら（１９９２）Ｇｅｎｅ  １２１：２９５−３０４を参照されたい］、酵母［例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、例えば、Ｍｏｒｅｌら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２８（１）：１２１−１２９を参照されたい］、及び植物［例えば、Ｍｏｒら（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（３）：２５９−２６６を参照されたい］の発現系において発現させることができる。タンパク質を調製するための組換えベースの方法は異なる場合があるが、組換え方法は通常、所望のポリペプチド又はフラグメントをコードする核酸を構築すること、核酸を発現ベクターにクローニングすること、宿主細胞（例えば、植物、細菌、酵母、トランスジェニック動物細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞若しくはベビーハムスター腎臓細胞等の哺乳動物細胞）を形質転換すること、及び核酸を発現させて、所望のポリペプチド又はフラグメントを産生することを含む。タンパク質精製の様々な方法を用いて、本開示の組成物を精製することができ、かかる方法は当技術分野で知られており、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮＹ（１９９４）に記載されている。組換えポリペプチドの同定及び精製を容易にするために、エピトープタグ又は他の親和性結合配列をコードする核酸配列を、コード配列とインフレームで挿入又は付加することができ、それにより、所望のポリペプチド及び結合に適したポリペプチドで構成される融合タンパク質を生成する。
【０１１４】
ＩＬ−２活性を有するタンパク質を発現するために使用されるシステムに応じて、ＩＬ−２部分は、非グリコシル化又はグリコシル化され得て、これらのいずれかを使用することができる。すなわち、ＩＬ−２部分は、グリコシル化されていなくてもよく、ＩＬ−２部分は、グリコシル化されていてもよく、１つ以上の好ましい実施形態では、ＩＬ−２部分は、グリコシル化されていない。ＩＬ−２部分はまた、ポリマーのアミノ酸の側鎖内の原子への容易な付着を提供するために、例えば、リジン、システイン及び／又はアルギニン等の１つ以上のアミノ酸残基を含む及び／又はそれを置換するように有利に修飾され得る。ＩＬ−２部分の置換の例は、米国特許第５，２０６，３４４号公報に記載されている。更に、ＩＬ−２部分は、天然に存在しないアミノ酸残基を含むように修飾することができる。アミノ酸残基及び天然に存在しないアミノ酸残基を付加するための手法は、当業者によく知られている。
【０１１５】
更に、ＩＬ−２部分は、有利には官能基の付着を含むように修飾することができる（官能基含有アミノ酸残基の付加による場合を除く）。例えば、ＩＬ−２部分は、チオール基を含むように修飾することができる。更に、ＩＬ−２部分はＮ末端アルファ炭素を含むように修飾することができる。更に、ＩＬ−２部分は、１つ以上の炭水化物部分を含むように改変することができる。更に、ＩＬ−２部分を修飾してアルデヒド基を含めることができる。更に、ＩＬ−２部分を修飾してケトン基を含めることができる。本開示の幾つかの実施形態では、ＩＬ−２部分は、チオール基、Ｎ末端アルファ炭素、炭水化物、アルデヒド基及びケトン基のうちの１つ以上を含むように修飾されないことが好ましい。
【０１１６】
例示的なＩＬ−２部分は、文献に記載されており、例えば、米国特許第５，１１６，９４３号、同第５，１５３，３１０号、同第５，６３５，５９７号、同第７，１０１，９６５号及び同第７，５６７，２１５号、並びに米国特許出願公開第２０１０／００３６０９７号公報及び同第２００４／０１７５３３７号公報に記載されている。好ましいＩＬ−２部分は、図２に提供されるアミノ酸配列を有し、本明細書で使用されるアルデスロイキンのアミノ酸配列を表す。
【０１１７】
場合によっては、ＩＬ−２部分は「単量体」形態であり、対応するペプチドの単一の発現が別個のユニットに組織化される。他の例では、ＩＬ−２部分は、タンパク質の２つの単量体形態が（例えば、ジスルフィド結合によって）互いに会合している「二量体」（例えば、組換えＩＬ−２の二量体）の形態である。例えば、組換えヒトＩＬ−２の二量体との関連で、二量体は、各単量体のＣｙｓ１２５残基から形成されるジスルフィド結合によって互いに会合された２つの単量体の形態であり得る。
【０１１８】
任意の所与のペプチド若しくはタンパク質部分、又は組成物について、その部分がＩＬ−２活性を有するかどうかを判断することが可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＬ−２活性を決定するための様々な方法が当技術分野及び本明細書に記載されている。例示的なアプローチは、本明細書に記載のＣＴＴＬ−２細胞増殖アッセイである。例示的なアプローチは、Ｍｏｒｅａｕら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１０４７−１０５６）にも記載されている。簡単に説明すると、非特異的結合アッセイでは、提案されるＩＬ−２部分又は組成物を、ＩＬ−２の受容体を持つ細胞株の存在下で４℃で１時間プレインキュベートさせる。その後、１２５Ｉ標識ＩＬ−２を系内で４℃で３時間インキュベートする。データは、野生型ＩＬ−２に対する提案されるＩＬ−２部分活性の％阻害能力として表される。電位測定法、分光光度法、クロマトグラフィー及び放射測定法を含む、当技術分野で知られている他の方法論もまた、ＩＬ−２機能を評定するために使用することができる。
【０１１９】
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物を含む、選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物の調製：
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の例示的な選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物は、一般に、約９の高ｐＨのビシン溶液中で、精製ＩＬ−２をモル過剰（ＩＬ−２に関してモル当量の過剰）のＰＥＧ試薬、ｍＰＥＧ２（２０ｋＤ）−ブタン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（又は他の適切に活性化されたエステル）（１，３−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ１００００カルバモイル）−２−プロパノキシ）−４−スクシンイミジルブタノエートと反応させることによって調製される。反応物を、一般に穏やかな条件下、例えば、約２０℃〜約６５℃、又は約２０℃〜約４０℃、又は周囲温度若しくは室温で約３０分〜約５時間、又は約３０分〜４時間、又は約３０分〜２時間、又は約３０分〜１時間混合する。反応は、酢酸等の適切な酸の添加による低ｐＨへの酸性化によってクエンチされる。
【０１２０】
次に、ＰＥＧ化されたｒＩＬ−２反応生成物は、イオン交換クロマトグラフィー等の適切な方法によって精製される。例えば、イオン交換クロマトグラフィーを使用する場合、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は、樹脂に結合し、次いで、塩化ナトリウム勾配等の適切な勾配で溶出される。次いで、クロマトグラフィー生成物プールを濃縮し、例えば、タンジェント流ろ過（ＴＦＦ）を使用して、適切な製剤バッファー（例えば、スクロースを含む酢酸ナトリウムバッファー）にダイアフィルトレーションする。
【０１２１】
必要に応じて、生成物プールを、適切なカラム（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又はＶｙｄａｃ等の企業から市販されているＣ１８カラム又はＣ３カラム）を使用する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用する逆相クロマトグラフィーによって、又はイオン交換カラム、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）イオン交換カラムを使用するイオン交換クロマトグラフィーによって位置異性体へと更に分離することができる。どちらのアプローチも、同じ分子量を有するポリマー活性作用物質の異性体（すなわち、位置アイソフォーム）を分離するために使用することができる。
【０１２２】
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物を含む選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物は、本明細書に記載の及び／又は分析ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ、ＬＣＭＳ、並びにＣＴＬＬ−２増殖及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＴｒｅｇ誘導等のバイオアッセイを含む当業者に既知の様々な分析及びバイオアッセイの手法によって特性評価され得る。
【０１２３】
配合：
本明細書で提供される更に１つ以上の実施形態は、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物を含む選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物であり、本明細書に記載のＩＬ−２コンジュゲート組成物、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む。
【０１２４】
「薬学的に許容可能な賦形剤」又は「薬学的に許容可能な担体」は、本明細書に記載の組成物に含めることができ、被験体に重大な有害な毒物学的影響を引き起こさない成分を指す。本開示の組成物は、好ましくは、静脈内、筋肉内又は皮下を含む非経口投与等、組成物を生物学的に利用可能にする任意の経路によって投与される医薬組成物として配合される。そかかる医薬組成物及びそれを調製するためのプロセスは、当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｄ．Ｂ．Ｔｒｏｙ，Ｅｄｉｔｏｒ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００６）を参照されたい）。任意に、本明細書で提供される組成物は薬学的に許容可能な賦形剤を更に含むことができ、例示的な賦形剤としては、限定されるものではないが、炭水化物、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、バッファー、酸、塩基、アミノ酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられる。組成物中の個々の賦形剤の量は、賦形剤の活性及び組成物の特定の必要性に応じて変化するであろう。通常、任意の個々の賦形剤の最適量は、実験、すなわち、様々な量の賦形剤（低から高までの範囲）を含む組成物を調製し、安定性及び他のパラメータを調べ、次いで、重大な有害作用を伴わずに最適な性能が得られる範囲を決定することによって決定される。糖等の炭水化物、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖、及び／又は糖ポリマー等の誘導体化糖が賦形剤として存在し得る。特定の炭水化物の賦形剤としては、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース等の単糖；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等の二糖；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖；及びマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール、シクロデキストリン等のアルジトール等が挙げられる。賦形剤はまた、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせ等の無機塩又はバッファーを含み得る。組成物はまた、微生物の増殖を防止又は抑止するための抗菌剤を含むことができる。本開示の１つ以上の実施形態に適した抗菌剤の非限定的な例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。抗酸化剤も組成物中に存在することができる。酸化防止剤は酸化を防ぐために使用され、それによってコンジュゲート又は製剤の他の成分の劣化を防ぐ。本開示の１つ以上の実施形態で使用するのに適した抗酸化剤としては、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせが挙げられる。界面活性剤は、賦形剤として存在することができる。例示的な界面活性剤としては、「Ｔｗｅｅｎ  ２０」及び「Ｔｗｅｅｎ  ８０」等のポリソルベート、並びにＦ６８及びＦ８８（これらは両方ともニュージャージー州マウントオリーブのＢＡＳＦから入手可能）等のプルロニック；ソルビタンエステル；レシチン及び他のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン（ただし、好ましくはリポソーム形態ではない）等のリン脂質、脂肪酸及び脂肪酸エステル等の脂質；コレステロール等のステロイド；並びにＥＤＴＡ等のキレート剤；亜鉛及び他のかかる適切な陽イオンが挙げられる。酸又は塩基は、組成物中の賦形剤として存在することができる。使用できる酸の非限定的な例としては、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるそれらの酸が挙げられる。適切な塩基の例としては、限定されるものではないが、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｕｍｅｒａｔｅ）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される塩基が挙げられる。１つ以上のアミノ酸は、本明細書に記載の組成物中に賦形剤として存在することができる。この点に関する例示的なアミノ酸には、アルギニン、リジン、及びグリシンが含まれる。追加の適切な薬学的に許容可能な賦形剤としては、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，７ｔｈ  ｅｄ．，Ｒｏｗｅ，Ｒ．Ｃ．，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２に記載されているものが挙げられる。本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物を含む選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物の好ましい製剤は、１．５ｍｇ／ｍｌタンパク質当量、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１１０ｍＭ塩化ナトリウム、２％スクロース（重量／体積）、ｐＨ５．０である。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を、滅菌済みで供給されすぐに使用できる、シリコンライナー付きのポリプロピレンキャップを備えた適切な容量の滅菌済みの使い捨てポリカーボネートボトルに保管することができる。
【０１２５】
投薬：
本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物を含む選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物の投薬量は、幾つかの要因に応じて変化するが、組成物が単位用量容器（例えば、バイアル）に保管される場合、治療上有効な用量であることが最適である。更に、製剤は注射器に収容することができる。治療有効用量は、自己免疫症状及び／又は免疫抑制の緩和、及び／又は寛容の誘導等の本明細書に記載の臨床的に望ましいエンドポイントをもたらす量を決定するために、本明細書に提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２実施形態及び関連組成物を含む選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物の漸増量の反復投与によって実験的に決定され得る。
【０１２６】
好ましい投与量は、被験体において従来のＴ細胞及びナチュラルキラー細胞よりも制御性Ｔ細胞を優先的に拡大及び活性化するのに有効な低投与量である。制御性Ｔ細胞の活性化を、様々なアプローチで測定することができる。例えば、ＩＬ−２依存性Ｔ細胞プロセスにおけるＳＴＡＴ５の不可欠な役割を考えると、リンパ球におけるＳＴＡＴ５の増加の検出は、Ｔｒｅｇ活性化の重要なマーカーとして利用することができる。表現型的には、Ｔｒｅｇの活性化は、細胞表面ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）の増加、及び／又はＴｒｅｇ系統の主要制御因子であるタンパク質フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）の細胞内発現の増加、及び／又は細胞増殖に関連するタンパク質Ｋｉ６７の発現増加を通じて、フローサイトメトリーによって測定することもできる。まとめると、これらのマーカーはＴｒｅｇ細胞の機能と関連しており、自己免疫疾患においてかかる細胞ではしばしば調節不全になっている。本明細書において、Ｔｒｅｇ細胞の誘導及び活性化の好ましい検出は、フローサイトメトリーによるものである。Ｔｒｅｇの機能性は、従来のＴ細胞の増殖を阻害する能力を測定するｅｘ  ｖｉｖｏ抑制アッセイによっても評定することができる。Ｔｒｅｇの動員及び活性化の結果は、抗原駆動型炎症モデルを使用してｉｎ  ｖｉｖｏで直接測定することもできる。
【０１２７】
本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２実施形態及び関連組成物の投与は、典型的には注射によるものである。肺、鼻、頬、直腸、舌下及び経皮等の他の投与様式も企図されている。本明細書で使用される場合、「非経口」という用語は、皮下、静脈内、動脈内、腫瘍内、リンパ管内、腹腔内、心臓内、髄腔内、及び筋肉内の注射、並びに点滴注入を含む。特定の実施形態では、注射は皮下である。例えば、患者への投与は、本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物と希釈剤とを含む組成物の注射によって達成することができる。可能な希釈剤に関して、希釈剤は、例えば、注射用静菌水、水中の５％デキストロース、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、乳酸リンガー溶液、生理食塩水、滅菌水、脱イオン水及びそれらの組み合わせから選択され得る。当業者は、２つの所与の薬理学的成分が所与の製剤において一緒に適合性があるかどうかを試験することによって判断することができる。患者に投与するための例示的な組成物、例えば、皮下製剤は、例えば、治療有効量の本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物、水、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム及びスクロースを含む。液体組成物は、約４．５〜７．５、又は約４．５〜６の範囲のｐＨを有する。
【０１２８】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物を含む、選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物は固体形態である。好ましい固体形態は、例えば、５重量パーセント未満の水、又は好ましくは２重量パーセント未満の水を含有する、固体の乾燥形態のものである。固体形態は、一般に、水性希釈剤での再構成に適している。好ましい固体製剤は、約０℃〜１０℃の温度で密封容器に保管された場合、少なくとも約２４ヶ月間安定である。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「患者」又は「被験体」という用語は、自己免疫疾患等、本明細書で提供される組成物の投与によって予防又は治療することができる状態に罹患している、又はその傾向がある生物を指し、ヒト及び動物の両方を含む。被験体としては、限定されるものではないが、哺乳動物（例えば、ネズミ、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等）が挙げられ、好ましくはヒトである。特定の実施形態では、患者、好ましくはヒトは、本開示の組成物の投与から利益を得るであろう、自己免疫状態等の疾患、障害又は状態を更に特徴とする。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療する、治療すること」という用語は、これらの状態の症状及び合併症と闘う又は緩和する目的で、本開示の組成物の投与が示される状態を有する患者の管理及びケアを指す。治療には、症状若しくは合併症の発症を予防するため、症状若しくは合併症を軽減するため、又は疾患、状態若しくは障害を排除するために、それを必要とする患者に本開示の組成物を投与することが含まれる。例えば、自己免疫障害。好ましくは、治療は、免疫抑制及び／又は寛容をもたらすために、それを必要とする患者に本開示の組成物を投与することを含む。治療される患者は動物であり、好ましくはヒトである。本明細書で使用される投与には、患者が組成物を消費するとき、及び／又は患者が組成物を消費するように指示されるときのいずれかが含まれる。
【０１３１】
「薬学的に有効な量」及び「薬理学的に有効な量」及び「治療有効量」及び「生理学的に有効な量」という句は、本明細書で同じ意味で使用され、血流又は標的組織内の物質の望ましいレベルを達成するのに必要とされる、本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物の量を指す。正確な量は、例えば、治療される特定の状態、意図される患者集団、個々の患者の考慮事項、投与される治療用組成物の成分及び物理的特性等の多くの要因に依存するであろう。
【０１３２】
本開示の化合物を含む医薬組成物を、かかる治療を必要とする患者に非経口的に投与することができる。非経口投与は、シリンジ、任意にペン状シリンジ又は機械的駆動注射器による皮下、筋肉内又は静脈内の注射によって実施され得る。或いは、非経口投与は、注入ポンプによって行われてもよい。本開示の実施形態は、それを必要とする患者に、治療有効量の本開示の組成物及び１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を投与することを含む、患者への投与に適した医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物を、当技術分野で周知の医薬品用の従来の賦形剤を使用する様々な手法のいずれかによって調製することができる。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ（２００６））。
【０１３３】
本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物を含む選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物の用量と並んで、方法及び組成物と関連する投与計画は、被験体の年齢、体重及び全身状態と並んで、治療されている状態の種類及び状況、医療専門家の判断、並びに投与される特定の選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物に応じて変化する。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、患者又は被験体への単回又は複数回用量の投与時に、研究者、獣医、医師若しくは他の臨床医が求めている、組織、器官、動物、哺乳動物若しくはヒトの生物学的若しくは医学的応答、又はそれらに対する所望の治療効果を誘発する本開示の組成物の量又は用量を指す。好ましくは、有効量は、患者又は被験体への単回又は複数回用量の投与時に、投与前レベルの少なくとも１０倍の選択的Ｔｒｅｇ細胞増加を誘導する、本開示の組成物の量又は用量を指す。用量は、より高い初期負荷用量、それに続くより低い用量を含み得る。１つ以上の例では、本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物を含む治療有効量の選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物は、ＩＬ−２の量で表される以下の範囲：約０．１０〜約７００μｇ／ｋｇ、約０．２０〜約６５０μｇ／ｋｇ、約０．３０〜約６００μｇ／ｋｇ、約１．０〜約５５０μｇ／ｋｇ、約２．０〜約５００μｇ／ｋｇ、約１０〜約４５０μｇ／ｋｇ、約２５〜約４００μｇ／ｋｇ、約５０〜約３５０μｇ／ｋｇ、又は約１００〜約３００μｇ／ｋｇの１つ以上に包含される量であり、前述の範囲のそれぞれ及び全てからの前述の開始値及び終了値のありとあらゆる組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、例えば、自己免疫疾患、又は被験体における従来のＴ細胞及びナチュラルキラー細胞よりも制御性Ｔ細胞の優先的な拡大及び活性化から利益を得ることができる疾患若しくは状態を治療するために、本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物を含む選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物は、用量、例えば５００μｇ／ｋｇ以下の用量で投与される。本開示の好ましい投与計画は、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物、特に式Ａ〜Ｅの組成物が、２週間に１回、３〜２４μｇ／ｋｇの用量で投与される場合である。本開示の別の好ましい用量レジメンは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物、特に式Ａ〜Ｅの組成物が、２週間に１回、３〜１８μｇ／ｋｇの用量で投与される場合である。本開示の別の好ましい投与計画は、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物、特に式Ａ〜Ｅの組成物が、２週間に１回、３〜１２μｇ／ｋｇの用量で投与される場合である。本開示の別の好ましい投与計画は、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物、特に式Ａ〜Ｅの組成物が、２週間に１回、３〜６μｇ／ｋｇの用量で投与される場合である。本開示の別の好ましい投与計画は、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物、特に式Ａ〜Ｅの組成物が、２週間に１回３μｇ／ｋｇの用量で投与される場合である。
【０１３５】
本明細書で提供される組成物は、免疫系の恒常性能力を回復するのに効果的であり、例えば、Ｔｒｅｇ機能不全が自己免疫疾患、アレルギー及び移植片拒絶等の役割を果たす疾患にプラスの影響を与える能力を有する。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２実施形態及び関連組成物を含む選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物を投与することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで内因性Ｔｒｅｇを選択的に拡大する方法である。例示的な投薬範囲としては、例えば、約１００μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、又は約１５０μｇ／ｋｇ〜約４５０μｇ／ｋｇ、又は約１７５μｇ／ｋｇ〜約４００μｇ／ｋｇ、又は更には約１７５μｇ／ｋｇ〜約３５０μｇ／ｋｇが挙げられる。好ましい用量及び投与計画は、本明細書に提供される実施例に記載されている。Ｔｅｆｆ細胞及びＮＫ細胞の刺激を最小限に抑えながら、Ｔｒｅｇ細胞を最大限に増幅するには、適切な用量が効果的であり、このようなものは、フローサイトメトリー分析のために末梢血を収集することによってモニタリングして、Ｔｒｅｇ細胞、エフェクターＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＮＫ細胞の出現率を特定することができる。これらの数値に基づいて、投与量を適切に調整することができる。
【０１３６】
投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療効果）を提供するように調整され得る。静脈内（ｉ．ｖ．）若しくは非静脈内投与、局所若しくは全身、又はそれらの組み合わせの投与スケジュールは、通常、単回ボーラス投与量又は連続注入から、１日あたり（例えば、４時間〜６時間ごと）の複数回投与までの範囲であるか、又は治療する医師及び患者の状態によって指定される。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び本明細書で提供される関連組成物を含む選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物を投与する頻度及びスケジュールに関して、当業者は、適切な投与計画を決定することができる。例えば、治療サイクルにおいて、臨床医は、単回用量として、又は一連の用量として、（例えば、数日又は数週間にわたって）、組成物を投与することを決定することができる。組成物の長時間作用性に基づいて、通常、比較的まれにしか投与されないことが好ましい（例えば、３週間に１回、２週間に１回、８日〜１０日に１回、毎週１回等）。治療過程に関連する例示的な期間としては、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間、約１５週間、約１６週間、約１７週間、約１８週間、約１９週間、約２０週間、約２１週間、約２２週間、約２３週間、約２４週間、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１３ヶ月、約１４ヶ月、約１５ヶ月、約１６ヶ月、約１７ヶ月、約１８ヶ月、約１９ヶ月、約２０ヶ月、約２１ヶ月、約２２ヶ月、約２３ヶ月、約２４ヶ月、約３０ヶ月、約３年、約４年及び約５年が挙げられる。本明細書に記載の治療方法は、通常、患者のケアを監督する臨床医が治療方法が効果的であるとみなす限り、すなわち、患者が治療に反応している限り、又は状態の関連する症状が治まるまで継続される。治療法が有効であることを示す非限定的なパラメータには、ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ及びＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ等の制御性Ｔ細胞の数の増加、及び／又はＮＫ細胞、並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクター細胞の数の減少の１つ以上が含まれる
本明細書で提供される組成物は、治療有効用量で被験体に投与された場合、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞等のエフェクターＴ細胞に対するＦｏｘＰ３＋細胞及びＣＤ２５＋細胞等の制御性Ｔ細胞の比率を増加させるのに有用である。例えば、本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物を含む選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物の投与は、ベースラインと比較され、例えば本明細書に記載されるようなｉｎ−ｖｉｖｏマウスモデルにおいて評価される場合、制御性Ｔ細胞の少なくとも２倍の増加をもたらすのに効果的であり得る。この方法はまた、幾つかの実施形態では、ベースラインと比較され、例えば本明細書に記載されるようなｉｎ−ｖｉｖｏマウスモデルにおいて評価される場合、制御性Ｔ細胞の少なくとも４倍の増加をもたらすのに有効であり得る。場合によっては、制御性Ｔ細胞数の増加は、投与後少なくとも３日間、又は更には投与後少なくとも５日間、ベースラインレベルを超えて持続する。
【０１３７】
添付の実施例に示されるように、本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物を含む選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物は、適切な投与量範囲内で投与される場合、Ｔエフェクター細胞に対して最小限の刺激効果を持ちながら、制御性Ｔ細胞の細胞集団及び免疫抑制機能を優先的に増加させるのに効果的である。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物を含む選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物は、同等のネイティブＩＬ−２の用量では達成できないＴｒｅｇ対Ｔｅｆ応答の大きさ、持続時間及び特異性を提供するための持続的曝露を達成することができる。
【実施例】
【０１３８】
前述の説明及び以下の実施例は、本明細書で提供される開示の範囲（複数の場合もある）を説明することを意図しており、限定するものではないことを理解されたい。本開示の範囲内の他の態様、利点、及び修正は、本開示が属する技術分野の当業者には明らかであろう。
【０１３９】
材料及び方法
アルデスロイキン（デス−アラニル−１、セリン−１２５ヒトインターロイキン−２、図２を参照されたい）と同一のアミノ酸配列を有する組換えヒトＩＬ−２をクローン化し、発現させ、使用して、ここではＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２と称される例示的な選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物を調製する。この配列は、天然の成熟ヒトＩＬ−２配列からアミノ酸＃１（アラニン）を除外しており、アミノ酸＃１２５にシステインからセリンへのアミノ酸変異がある。配列の第１のアミノ酸は、細菌を直接発現させるためのメチオニンである（シグナルペプチドはコードされていない）。発現すると、Ｎ末端メチオニンは宿主メチオニンアミノペプチダーゼによって除去される。単一のジスルフィド結合が、アミノ酸５８位と１０５位とのシステイン間に形成される。このタンパク質は大腸菌に由来するため、グリコシル化されていない。一部の記載において、複合化されたＩＬ−２組成物は、幾つかの点で（１，３−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）カルバモイル）−２−プロパノキシ）−４−ブタンアミド）インターロイキン−２）として記載する場合があり、この命名法はＰＥＧ化パターン又は混合物を完全に説明するものではないことに留意されたい。
【０１４０】
ポリエチレングリコール試薬、ｍＰＥＧ２（２０ｋＤ）−ブタン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１，３−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）１０ｋＤカルバモイル）−２−プロパノキシ）−４−スクシンイミジルブタノエート（本明細書ではｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ  ＮＨＳとも称される）は、米国特許第７，８８７，７８９号公報の実施例２に記載されているとおりに調製される。外観：白色から灰白色の粒状粉末；分子量（Ｍｎ）１８〜２２ｋＤａ（ポリマーの多分散性による）。１，３−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）１０ｋＤカルバモイル）−２−プロパノキシ）−４−スクシンイミジルブタノエートの構造を以下に示す。
【０１４１】
【化１２】
2021523922.tif 000014
【０１４２】
特に明記しない限り、本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の実施形態及び関連組成物を含む選択的Ｔｒｅｇ刺激因子組成物の濃度、量及び投薬レベルはタンパク質ベースで報告され、タンパク質成分が寄与する質量のみをカウントし、ＰＥＧ部分が寄与するものではない。タンパク質ベースを使用することにより、計算に使用される有効なＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成分子量は、ｒＩＬ−２タンパク質のみがカウントされるため、様々な程度のＰＥＧ化を有する複合化されたｒＩＬ−２分子の混合物でも１５．３ｋＤａである。
【０１４３】
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２関連組成物は、リジン基で共有結合した複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に複合化されたｒｈＩＬ−２（アルデスロイキン配列）からなるＰＥＧ化コンジュゲート混合組成物である。ｒｈＩＬ−２分子あたりのＰＥＧ部分の数（ＰＥＧ化の程度）は、１分子（ジ又はトリ−ＰＥＧ化）あたり主に２及び３のＰＥＧ部分の分布であり、少数種は１  ＰＥＧ（モノ−ＰＥＧ化）及び４  ＰＥＧ（テトラ−ＰＥＧ化）及び／又はより高ＰＥＧ化された分子を含み、ｒｈＩＬ−２あたり平均約２．５のＰＥＧ部分をもたらす。各ＰＥＧ部分の名目上の分子量は２０ｋＤａであり、ｒｈＩＬ−２の分子量は１５．３  ｋＤａであるため、名目上のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の分子量は６５ｋＤａになる。
【０１４４】
実施例１
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物の調製
ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ  ＮＨＳのストック溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）を２ｍＭ  ＨＣｌ中に調製する。ＩＬ−２の典型的なＰＥＧ化反応を次のように行う：ＩＬ−２（アルデスロイキン）ストック溶液（１．３ｍｇ／ｍｌ）１１５ｍＬを２５０ｍＬのプラスチックボトルに移し、０．５Ｍビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）１５ｍＬ、ｐＨ９．２及び水０．５ｍＬをＩＬ−２の溶液に加える。ＰＥＧ化を、１９．５ｍＬのｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ  ＮＨＳストック溶液をＩＬ−２含有溶液に滴下することで開始する。得られた反応混合物は、１ｍｇ／ｍｌのＩＬ−２、５０ｍＭ  ビシン、及び１０モル当量のｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ  ＮＨＳ（タンパク質に関して）を含み、ｐＨは８．７である。穏やかに攪拌しながら、反応を周囲温度で４０分間進行させる。酢酸２．２ｍＬを加えて反応物のｐＨを４．１に下げることにより、反応を停止する。
【０１４５】
得られたＩＬ−２コンジュゲート生成物を、ＳＰＦＦセファロースを使用する陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製する。コンジュゲーション反応が完了したら、反応混合物を２０倍量の１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）に対して透析する。透析したサンプルを水で１：４に希釈し、ＳＰＦＦセファロース樹脂を充填したカラムにロードする。陽イオン交換クロマトグラフィーに使用されるバッファーは次のとおりである：バッファーＡ：１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、及びバッファーＢ：１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１．０Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ４．０）。サンプルをロードする前に、樹脂をバッファーＢで洗浄し、バッファーＡで平衡化する。ロード後、樹脂を３カラム容量のバッファーＡで洗浄する。５カラム容量に０〜５０％バッファーＢ、１カラム容量に２５％〜５０％バッファーＢ、１カラム容量に５０％バッファーＢ、１カラム容量に５０％〜１００％、及び１カラム容量に１００％バッファーＢからなる４段階の勾配を用いて、２８ｃｍ／時の流速で複合化された及び複合化されていないＩＬ−２を溶出する。２及び３（すなわち、二量体及び三量体）のＰＥＧ化度（ｄＰ）を有するＩＬ−２コンジュゲートを含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって識別し、プールする。
【０１４６】
二量体及び三量体を含むプールされた画分は、撹拌限外ろ過セル（Ａｍｉｃｏｎ）及び窒素ガスを使用して濃縮する。最終生成物の組成を、移動相：Ａ、水中０．０９％ＴＦＡ、及びＢ、アセトニトリル中０．０４％ＴＦＡを使用するＲＰ−ＨＰＬＣによって決定する。Ｉｎｔｒａｄａ  ＷＰ−ＲＰ  Ｃ１８カラム（３×１５０ｍｍ）を流速０．５ｍＬ／分、カラム温度５０℃で使用する。精製されたコンジュゲート混合物は、約４．６％（モル）のモノ−ＰＥＧ化ｒＩＬ−２、約４７．７％（モル）のジ−ＰＥＧ化ｒＩＬ−２、約４２．９％（モル）のトリ−ＰＥＧ化ｒＩＬ−２、及び約４．８％（モル）のテトラＰＥＧ化ＩＬ−２を含むと決定される。溶出時間がｘ軸に示されている図１を参照されたい。最終生成物の混合物の平均ＰＥＧ化度は、２．４８（すなわち、約２．５）であると決定される。最終生成物の混合物には遊離ＩＬ−２は検出されない。この調製物は、式ＡのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の組成物の例である。
【０１４７】
実施例１−Ａ
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物の代替の調製
所望のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び関連組成物の調製は、ｒｈＩＬ−２タンパク質プロセス中間体の発酵及び精製、ｒｈＩＬ−２とＰＥＧ試薬開始物質ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ  ＮＨＳとの複合化、特定の程度のＰＥＧ化を有するＩＬ−２コンジュゲート画分の精製、並びに本明細書に記載の実施形態による所望の分布のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を生成するためのＰＥＧ化ｒｈＩＬ−２コンジュゲートの最終の製剤化からなる。
【０１４８】
所望のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は、１，３−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）１０ｋＤカルバモイル）−２−プロパノキシ）−４−スクシンイミジルブタノエート（本明細書ではｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ  ＮＨＳとも称される）をインターロイキン−２（ＩＬ−２）タンパク質（アルデスロイキン配列）のリジン残基と反応させることで調製され、ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートの分布をもたらす。この生成物は、主にジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化種を含み、モノ−ＰＥＧ化及び／又はテトラ−ＰＥＧ化種の量は少ない。
【０１４９】
凍結したＩＬ−２開始物質（−７０℃で保管した１０ｍＭ酢酸、５％トレハロース、ｐＨ４．５バッファー中の精製組換えＩＬ−２（アルデスロイキン配列））を室温まで解凍する。ＰＥＧ反応物であるｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ  ＮＨＳ（粉末）を、室温で約９０ｇ／Ｌの２ｍＭ  ＨＣｌ溶液に添加することにより可溶化し、最低１５分間攪拌する。次いで、溶液を反応容器に充填する。解凍したＩＬ−２を反応容器に加え、水で適切に希釈した後、０．７５ＭビシンｐＨ９．７バッファーを加える。反応混合物中の最終的なＩＬ−２濃度はおよそ１．０ｇ／Ｌであり、ビシン濃度は目標のｐＨ８．７に達するようにおよそ５０ｍＭである。一般に、タンパク質をＰＥＧ化するためのＰＥＧ：ｒｈＩＬ−２の質量比は、ｐＨ８．５〜９．５のビシン緩衝液中で約１０：１〜１３：１である。ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ  ＮＨＳ溶液の添加が完了してから測定する場合、反応液を２２℃で４０分間撹拌を続けながらインキュベートする。インキュベーション期間の終わりに、１Ｎ酢酸を添加して反応を停止し、ｐＨを急速に下げ、すぐに追加の１Ｎ酢酸を使用してｐＨ４．０まで更に段階的に滴定する。クエンチした反応液を水を加えて１０倍に希釈する。希釈したクエンチした反応液を０．２２μｍフィルターでろ過し、粗生成物を提供する。
【０１５０】
次に、ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ陽イオン交換クロマトグラフィーを粗生成物に対して行い、ＰＥＧ化反応画分を部分的に分離する。ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを平衡化し、フィードを室温で約５分の滞留時間でロードした後、ロードバッファーで５ＣＶ（カラム容量）で洗浄する。ＰＥＧ化ｒｈＩＬ−２は樹脂に結合するが、遊離ＰＥＧは洗い流される。次いで、生成物を、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０バッファーバックグラウンド中の０〜５００ｍＭ塩化ナトリウムによる線形勾配溶出を使用して溶出する。それぞれ０．１５ＣＶの画分を収集し、溶出を約１ＣＶから開始する。２８０ｎｍでの吸光度がピーク最大値の５％未満になったとき、画分の収集を終了する。各画分におけるＰＥＧ化画分濃度（すなわち、モノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２（単量体）、ジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２（二量体）、トリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２（三量体）、テトラ−ＰＥＧ化ＩＬ−２（四量体）等）を２８０ｎｍの波長での吸光度によって測定する。ＰＥＧ化画分の分布は、本明細書に記載されているようにＲＰ−ＨＰＬＣによって測定され、モノ−ＰＥＧ、ジ−ＰＥＧ、トリ−ＰＥＧ、及びそれ以上の成分を含む画分が特定され、必要な画分の再プールを決定するために使用されて本明細書で提供されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物、特に式Ａ〜式Ｅに記載される、標的ＰＥＧ化画分の分布プロファイルを有する組成物を生成する。特定された組成物の選択された画分のアリコート、例えば、ジ−ＰＥＧ−ＩＬ−２、及びトリ−ＰＥＧ−ＩＬ−２及び／又はモノ−ＰＥＧ以上のＰＥＧは、本明細書に提供される標的プロファイルを達成するように計算され、次いで、必要に応じて再プールして、ＰＥＧ化画分の望ましい分布を持つ生成物を有するＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を得る。或いは、精製スキームを考案することができ、それにより、溶出及び収集は、再プールする必要なしに、本明細書に記載の実施形態による所望のプロファイルを提供し得る。次いで、所望の（及び／又は再プールされた）クロマトグラフィー精製した調製物を濃縮し、タンジェント流ろ過（ＴＦＦ）を用いて１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２％重量／体積スクロース、ｐＨ５．０にダイアフィルトレーションして、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の原薬の最終目標濃度１ｍｇ／ｍｌ（タンパク質ベース）を達成する。
【０１５１】
再プールされた及び／又は標的の生成物を分析し、組成分布を、ＰＥＧ画分のプロファイルを評定するために、ＲＰ−ＨＰＬＣを含む本明細書に記載される方法によって検証する。式Ａ〜式ＥのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物に関する本明細書の仕様に従った組成物の調製物を、以下の表１に収載される１番〜４番の製品バッチの例によって示す。属性のアッセイは当業者に知られており、及び／又は実施例１−Ｂ〜実施例１−Ｉに記載されているか、そうでなければ本明細書に記載されている。適切な履歴標準サンプル組成物を確立し、後続の調製での比較に使用する。
【０１５２】
表１．ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣによるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の異なるバッチからのサンプルの実例分析の要約
【０１５３】
【表１】
2021523922.tif 000015
【０１５４】
幾つかの実施形態では、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物生成物は、モルベースで、１％未満の遊離の非結合ＩＬ−２（より好ましくは、検出可能な遊離ＩＬ−２なし）、５％以下のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２、２８％〜約６０％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２、約２４％〜約６５％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２、１２％以下のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２種、及び８０％以上の組み合わされたジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２種を含有する。
【０１５５】
幾つかの実施形態では、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物生成物は、例えば、０．５モル％未満の遊離ＩＬ−２、約２．５〜約４．５モル％のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２、約３５〜約５０モル％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２、約３８〜約４６モル％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２、約３〜約１０モル％のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２種、及びあわせた合計が約８０〜約９５モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含有する。
【０１５６】
幾つかの実施形態では、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物生成物は、例えば、モルベースで５％以下のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２と、２８％〜約６０％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２と、約２４％〜約６５％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２と、１２％以下のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２種を含有する。好ましくは、組成物は、８０％以上の組み合わされたジ−及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含む。
【０１５７】
幾つかの実施形態では、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物生成物は、例えば、約２．５〜約４．５モル％はモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含み、約３５〜約５０モル％はジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含み、約３８〜約４６モル％はトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含み、約３〜約１０モル％はより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２種を含む。好ましくは、組成物は、あわせた合計が約８０〜約９５モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含む。
【０１５８】
幾つかの実施形態では、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物生成物は、例えば、約２．８〜約３．８モル％はモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含み、約４４〜約４８モル％はジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含み、約４１〜約４４モル％はトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含み、約７〜９モル％はより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２種を含む。好ましくは、組成物は、あわせた合計が約８７〜約９０モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含む。
【０１５９】
幾つかの実施形態では、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物生成物は、例えば、約２．８〜約３．８モル％はモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含み、約４４〜約４８モル％はジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含み、約４１〜約４４モル％はトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含み、約７〜約９モル％はより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２種を含み、ここで、当該組成物は、リジンＫ７又はＫ８又はＫ３１又はＫ７５の１つに付着したＰＥＧ部分を有するモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートの混合物を含む。好ましくは、組成物は、あわせた合計が約８７〜約９０モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含む。
【０１６０】
幾つかの実施形態では、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物生成物は、例えば、約２．８〜約３．８モル％はモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含み、約４４〜約４８モル％はジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含み、約４１〜約４４モル％はトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含み、約７〜約９モル％はより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２種を含み、ここで、当該組成物は、リジンＫ７に付着したＰＥＧ部分を有するモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含む。好ましくは、組成物は、あわせた合計が約８７〜約９０モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２を含む。
【０１６１】
実施例１−Ｂ
逆相高速液体クロマトグラフィーによるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の純度及び特性評価
ダイオードアレイ検出器（２１５ｎｍのＵＶ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズ機器を用いて、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用し、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成のサンプルのクロマトグラフィー純度及び同一性を評定する。使用するカラムは、ＡＣＥ  ３  Ｐｈｅｎｙｌ−３００カラム（Ｍａｃ−Ｍｏｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）（又は他の適切なカラム）で、溶離液の流量は０．６ｍＬ／分である。ＲＰ−ＨＰＬＣは、２つの移動相：（１）移動相Ａ、０．１％ギ酸水溶液、及び（２）移動相Ｂ、０．１％ギ酸のアセトニトリル溶液の混合物を含む勾配を使用し行われる。線形勾配は、６０％移動相Ａ／４０％移動相Ｂから４０％移動相Ａ／６０％移動相Ｂ、２０％移動相Ａ／８０％移動相Ｂ、６０％移動相Ａ／４０％移動相Ｂの範囲であった。希釈剤／配合バッファーの成分は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、２００ｍＭ塩化ナトリウム、２％スクロース、ｐＨ５．０である。
【０１６２】
凍結したＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成の標準物質及びサンプルを解凍し、製剤バッファーで１．０ｍｇ／ｍｌに希釈する。製剤バッファーの少なくとも１つのブランク対照を、注入によって最初にＲＰ−ＨＰＬＣに供し、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物に関連するピークの分析に干渉しないことを確実にする。次に、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物標準物質又は対照を５回注入した。次に、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物サンプルを注入する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物標準物質／対照を、６回のサンプル注入ごとに、注入順序の最後に注入する。
【０１６３】
ジ−ＰＥＧ化（ジ−ＰＥＧ）及びトリ−ＰＥＧ化（トリ−ＰＥＧ）ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を含む最初の５つの標準物質注入の保持時間の％相対標準偏差（ＲＳＤ）は２．０％以下である。ジ−ＰＥＧ及びトリ−ＰＥＧ成分の全ての標準物質ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物注入の％ＲＳＤ面積パーセントは５．０％以下である。標準及びサンプルの注入からの全てのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物のピークが統合されている。具体的には、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の場合、０．５％の検出限界（ＬＯＤ）を超えるジ−ＰＥＧ及びトリ−ＰＥＧ  ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物種、及び０．３％ＬＯＤを超えるｒｈＩＬ−２ピークがそれぞれ統合されている。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の濃度が１．０ｍｇ／ｍｌの場合、定量限界（ＬＯＱ）はジ−ＰＥＧ及びトリ−ＰＥＧ  ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２種で１．０％、ｒｈＩＬ−２で０．５％である。分析結果を下記表２（６サンプル）及び表３（１２サンプル）に示す。
【０１６４】
表２：ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した６つのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の複製サンプルからのモノ−ＰＥＧ、ジ−ＰＥＧ、トリ−ＰＥＧ、テトラ−ＰＥＧ及びペンタ−ＰＥＧ画分の面積パーセント
【０１６５】
【表２】
2021523922.tif 000016
【０１６６】
表３：ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した１２個のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の複製サンプルからのモノ−ＰＥＧ、ジ−ＰＥＧ、トリ−ＰＥＧ、テトラ−ＰＥＧ及びペンタ−ＰＥＧ画分の面積パーセント
【０１６７】
【表３】
2021523922.tif 000017
【０１６８】
実施例１−Ｃ
サイズ排除高速液体クロマトグラフィーによるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の純度及び特性評価
ダイオードアレイ検出器（２８０ｎｍのＵＶ）及びＹａｒｒａＳＥＣ−２０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズ機器を用いて、０．２２５ｍＬ／分の溶離液流量で、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を使用し、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の純度を決定し、特性評価をすることもできる。移動相は、アセトニトリルを含む８０：２０の体積比の０．２Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．５）である。希釈剤／製剤バッファーは、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、２００ｍＭ塩化ナトリウム、２％スクロースを含み、ｐＨは５．０であった。
【０１６９】
凍結したＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成の標準物質及び分析サンプルを解凍し、製剤バッファーで１．０ｍｇ／ｍｌに希釈する。サンプルは、溶液中５℃で最大５日間安定である。
【０１７０】
手順として、製剤バッファーの少なくとも１つのブランク対照を、注入によって最初にＲＰ−ＨＰＬＣに供し、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２に関連するピークの分析に干渉しないことを確実にする。次に、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物、システム適合性溶液を注入して、凝集体又は高分子量種がテトラ−ＰＥＧ  ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２画分から確実に分離されるようにする。続いて、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の標準物質又は対照を５回注入する。次に、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物サンプルを注入する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物標準物質／対照を、６回のサンプル注入ごとに、注入順序の最後に注入する。
【０１７１】
最初の５回の標準物質注入について、ジ−ＰＥＧ及びトリ−ＰＥＧ  ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２フラクションの保持時間の％ＲＳＤは２．０％以下である。全ての標準物質の注入に対するジ−ＰＥＧ及びトリ−ＰＥＧ  ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の％ＲＳＤ面積パーセントは５．０％以下である。標準及びサンプルの注入からの全てのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２画分のピークが統合されている。具体的には、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の場合、１．０％の検出限界（ＬＯＤ）を超えるジ−ＰＥＧ及びトリ−ＰＥＧ  ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２画分が統合される。１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の場合、３．０％ＬＯＱを超えるジ−ＰＥＧ及びトリ−ＰＥＧ  ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２のみが報告された。
【０１７２】
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の複製サンプルの分析を以下の表４及び表５に示し、表中にＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物のモノ−ＰＥＧ、ジ−ＰＥＧ、トリ−ＰＥＧ、テトラ−ＰＥＧ、及びペンタ−ＰＥＧ画分のピーク面積を示す。
【０１７３】
表４：ＳＥＣ−ＨＰＬＣによるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２のモノ−ＰＥＧ、ジ−ＰＥＧ、トリ−ＰＥＧ、テトラ−ＰＥＧ、及びペンタ−ＰＥＧ成分の％ピーク面積
【０１７４】
【表４】
2021523922.tif 000018
【０１７５】
表５：ＳＥＣ−ＨＰＬＣによるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物サンプルのモノ−ＰＥＧ、ジ−ＰＥＧ、トリ−ＰＥＧ、テトラ−ＰＥＧ、及びペンタ−ＰＥＧ画分の％ピーク面積
【０１７６】
【表５】
2021523922.tif 000019
【０１７７】
ＲＰ−ＨＰＬＣとＳＥＣ−ＨＰＬＣの両方によるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の様々なサンプルの代表的な分析の要約を表１に示す。わかるように、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物調製物は、ＰＥＧ化画分の混合物（すなわち、モノ−ＰＥＧ化、ジ−ＰＥＧ化、トリ−ＰＥＧ化、テトラ−ＰＥＧ化、ペンタ−ＰＥＧ化等）に関して、良好なバッチ間の一貫性を実証する。
【０１７８】
実施例１−Ｄ
ＳＤＳ−Ｐａｇｅ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の同一性の確認に利用する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物のサンプル、分子量マーカー、及び適切なＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の標準物質を、ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにロードし、ゲル内を泳動させる。電気泳動後、ＧｅｌＣｏｄｅＴＭ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎを使用してゲルを染色する。ゲル泳動のバンドパターンを標準物質と比較し、サンプルに新たなバンドがないことを確認すると、サンプルの同一性が確認される。最も強い２つのバンドは、トリ−ＰＥＧ化画分とジ−ＰＥＧ化画分に対応する。レーンの一番上のバンドはより高ＰＥＧ化された変種に対応し、最も低いバンドはモノ−ＰＥＧ化変種に対応する。
【０１７９】
実施例１−Ｅ
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用したＩＬ−２Ｒαβに対する親和性、及びヒトＩＬ−２Ｒαβα複合体を発現するＵ−２  ＯＳ細胞における効力。
【０１８０】
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の結合親和性を、偏光検出を備えたＢｉａｃｏｒｅＸ−１００表面プラズモン共鳴を使用して決定する。この手法では、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップの表面をＮ−ヒドロキシスクシンイミド１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＮＨＳ  ＥＤＣ）の１：１複合体で活性化して、活性ＮＨＳエステルを生成する。酢酸ナトリウム中のヤギ抗ヒトＦｃ抗体、ｐＨ４．０バッファーがチップの表面に共有結合により付着している。残留ＮＨＳエステルを１Ｍエタノールアミンでクエンチする。ＩＬ−２−Ｒα−Ｆｃ（ヒトＩＬ−２Ｒα−Ｆｃキメラ；Ｓｙｍａｎｓｉｓ）とＩＬ−２Ｒβ−Ｆｃ（ヒトＩＬ−２Ｒβ−Ｆｃキメラ；Ｓｙｍａｎｓｉｓ）の１：１混合物を、０．１％ＢＳＡを含むＨＢＳ−ＥＰバッファー（１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０００５％体積／体積界面活性剤Ｐ２０）を使用してチップに捕捉する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を０．１％ＢＳＡを含むＨＢＳ−ＥＰバッファーで連続希釈し、センサーチップ上に注入する。動的結合親和性を、３分間の溶液（ｋｏｎ）、続いて３分間洗浄（ｋｏｆｆ）の適用中によって測定する。ｋｏｆｆとｋｏｎの比率を、動的結合親和性ＫＤを計算するために使用する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の２つのバッチの３回の分析の結果を表６に示す。結合親和性及び結合率は、２つの原薬ロットで一貫している。
【０１８１】
表６：ＳＰＲを使用したＩＬ−２Ｒαβに対するＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の結合親和性
【０１８２】
【表６】
2021523922.tif 000020
【０１８３】
或いは、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームは、凍結保存されたすぐに使用できる細胞アッセイ形式であり、培養細胞よりも堅牢で一貫性のある細胞応答を提供する。酵素（β−ガラクトシダーゼ）フラグメント補完アッセイ（カナダのＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォーム）を使用して、薬物／リガンド−受容体相互作用を測定する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の効力を、ヒトＩＬ−２Ｒαβα複合体を発現するＵ−２  ＯＳ細胞で測定する。アッセイの基礎は、単独では不活性である開裂酵素（ｓｐｌｉｔ  ｅｎｚｙｍｅ）のフラグメントを利用する。２つの酵素フラグメントがＩＬ−２Ｒβ又はＩＬ−２Ｒγサブユニットの細胞内ドメインに融合し、受容体とのリガンド相互作用により、受容体サブユニットが近接して酵素活性を回復する。基質を加えると、酵素が作用して発光シグナルを生成する。酵素フラグメント補完による受容体の活性化を、サンプル及び標準を細胞と約６時間インキュベートした後に測定する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は、高親和性ヘテロ三量体αβγＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）により低用量のシグナル伝達を提供する。
【０１８４】
実施例１−Ｆ
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物のＰＥＧ化部位占有率
２つのロットに由来するＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物のＰＥＧ化部位占有率を、ペプチドマッピングによるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物とｒｈＩＬ−２との直接比較によって特性評価する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２消化物において、リジン含有ペプチドはＰＥＧ化され得て、標準ｒｈＩＬ−２消化物中の同じペプチドと比較して、より少ない存在量を有する対応する天然のリジン含有ペプチドによって反映され得る。したがって、ＰＥＧ化部位の占有率は、分析されたＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２消化物中の天然ペプチドの存在量の減少に基づいて計算することができる。更に、代用物質のペプチドマッピングを、部位占有率の追加確認に使用できる。
【０１８５】
一般的に、この分析は次のように行うことができる。直接ペプチドマッピング比較研究では、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成及びｒｈＩＬ−２標準対照サンプルをＧｌｕＣ及びＧｌｕＣ／トリプシンで同時に消化した後、ＬＣ−ＵＶ／ＭＳ／ＭＳ分析を行ってペプチドの同定と存在量を提供する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成とｒｈＩＬ−２とのペプチドマッピングの比較を用いて、ＰＥＧ化部位の占有率を決定する。
【０１８６】
簡単に説明すると、リジンを含まない一般的なペプチドを、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成とｒｈＩＬ−２分析の両方で標準（複数の場合もある）として選択する。ペプチドの相対強度は、それらの標準（複数の場合もある）に対する正規化である。リジンによるネイティブペプチド（ＲＲ）の相対存在量の減少は、ペプチドの相対強度によって計算される（式１）。リジンでのＰＥＧ化部位の占有率は、リジンを含むペプチドによる平均ＲＲである。
【０１８７】
式１：
【０１８８】
【数１】
2021523922.tif 000021
【０１８９】
ペプチド相対強度（Ｐｅｐ／Ｒｅｆ）＝ＵＶピーク面積（ペプチド）／ＵＶピーク面積（標準ペプチド）
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成の代用物として使用される物質は、単分散４ｋＤ  ＰＥＧのｒｈＩＬ−２のリジンへの複合化による結合生じる生成物である。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物のＰＥＧ化プロファイルを模倣するため、代用物を同じ複合化リンカーを使用して調製し、複合化反応を、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を調製するために使用したのと同じ反応条件下で実施した。ＬＣ  ＭＳ／ＭＳベースのＧｌｕＣマッピング及び代用物のトリプシンマッピングは、ＰＥＧ化されたリジンを識別し、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２を裏付ける情報を提供する。
【０１９０】
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２（ＧＭＰロット）のＧｌｕＣマップは、ｒｈＩＬ−２の９５％の配列包括度を有する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２のＧｌｕＣマップをｒｈＩＬ−２と直接比較すると、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の１１個のリジンのうち４個の相対的定量が得られ（表７を参照されたい）、ここで、リジン７及びリジン８はペプチドマップで１つの部位としてカウントした。ＧｌｕＣマップの残りのリジンを含むペプチドは、部位差別化（ｓｉｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）のないＰＥＧ化の証拠を示している。ＧｌｕＣ／トリプシンマップでリジンを含むペプチドを更にトリプシンで切断すると、Ｋ３１、Ｋ３４、Ｋ４２及びＫ４７でＰＥＧが占有される。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及びｒｈＩＬ−２によるＧｌｕＣ／トリプシンマッピングクロマトグラムを比較すると、これらのペプチドが大幅に減少していることがわかる（表７を参照されたい）。Ｋ４８部位のＰＥＧ化占有率は、酵素による切断の誤り（ｍｉｓ−ｃｌｅａｖａｇｅ）が原因であり、トリプシン／ＧｌｕＣマップでは利用できない（Ｎ／Ａ）。
【０１９１】
４ｋ  ＰＥＧ化ｒｈＩＬ−２代用物のペプチドマッピングにより、４ｋ  ＰＥＧ標識リジンを含むペプチドが高い質量精度（５ｐｐｍ未満）で同定される。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２及び４ｋ  ＰＥＧ化ｒｈＩＬ−２代用物の直接ペプチドマッピングの結果をあわせると、Ｋ７、Ｋ３１及びＫ７５が主要なＰＥＧ化部位であることがわかる（表８を参照されたい）。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物のあまり優勢でないＰＥＧ化部位は、Ｋ８、Ｋ３４、Ｋ４２、Ｋ４７、Ｋ５３及びＫ６３である可能性がある。Ｋ４８はＰＥＧ化されている可能性があり、Ｋ９６は未定である。
【０１９２】
ＰＥＧ化部位の占有率は、２番目のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成ＧＭＰ調製物、及び開発ロットで同等である（表７を参照されたい）。ＧｌｕＣマッピングとトリプシン／ＧｌｕＣマッピングとを組み合わせたアプローチにより、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物のコンジュゲートの幾つかの主要なＰＥＧ化部位に関するロット間情報が提供される。
【０１９３】
表７．
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物におけるＰＥＧ化部位占有率：ＧＭＰロット及びＤＥＭＯロット
【０１９４】
【表７】
2021523922.tif 000022
【０１９５】
表８．ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物及び４ｋ  ＰＥＧ化ｒｈＩＬ−２代用物におけるＰＥＧ化部位占有率の要約
【０１９６】
【表８】
2021523922.tif 000023
【０１９７】
実施例１−Ｇ
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の液相安定性
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物（２％（重量／体積）スクロースを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム、２００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５中の約１ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−２当量）１．０ｍｇ／ｍｌの溶液の安定性を、室温（周囲実験室条件）、５℃（冷蔵）及び−２０℃の３つの異なる保管条件下で、前述のようにＲＰ−ＨＰＬＣによって１、３、５及び７日間の時点で評価する。
【０１９８】
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物溶液間の差異を、対照の新たに調製されたＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物サンプル溶液に対して評価する。室温、５℃及び−２０℃で最大７日間保管したＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物サンプルのジ−ＰＥＧ及びトリ−ＰＥＧ種は、名目上の−７０℃サンプル保管と比較して最大１％の相対差を示す。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の成分ＰＥＧ化種（モノ−ＰＥＧ、テトラ−ＰＥＧ、ペンタ−ＰＥＧ種）の割合が少ない場合の相対差（Ｒｅｌ．Ｄｉｆｆ．）は最大８％である。これは、これらの代表的な保管条件下で保管された溶液サンプルが安定していることを示している。
【０１９９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオアッセイ：
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、ＩＬ−２受容体複合体の代表である受容体の活性化後の生物学的活性を特性評価するための細胞ベースのアッセイを含む、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の生物学的効力の更なる測定及び生物学的特性評価に使用され得る。
【０２００】
バイオアッセイの方法論
【０２０１】
【表９】
2021523922.tif 000024
【０２０２】
３つのアッセイ全てにおいて、用量反応曲線（反応対濃度）からのデータを非線形回帰モデルを使用して評価する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物サンプルの効力を、５０％有効濃度（ＥＣ５０）比により標準物質と比較して測定する。
【０２０３】
実施例１−Ｈ
ＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイ
細胞増殖アッセイでは、サンプル及び標準を約２６時間インキュベートした後、ＣＴＬＬ−２細胞を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞増殖を測定し、ここでは細胞増殖は、発光アデノシン三リン酸ベースのアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）、ウィスコンシン州のＰｒｏｍｅｇａ）で測定される。例えば、この細胞ベースの増殖アッセイでは、ｒｈＩＬ−２タンパク質に対して用量依存的な増殖応答を示すＣＴＬＬ−２細胞株を使用する。ｒｈＩＬ−２はアッセイ対照として使用され、この方法ではＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成とは異なる濃度範囲で調製される。このアッセイを９６ウェルプレートフォーマットで行う。ＣＴＬＬ−２細胞を飢餓培地でｒｈＩＬ−２の飢餓状態にし、３７℃及び５％ＣＯ２インキュベーター内で２０±３時間一晩インキュベートする。飢餓状態の細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の希釈系列を細胞に供給し、３７℃及び５％ＣＯ２インキュベーターで更に２５±３時間インキュベートする。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成により誘導される各ウェルの細胞増殖を、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）検出キットを使用して測定する。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）は、各ウェルに存在するＡＴＰの量に比例する発光シグナルを生成し、これは、存在する生細胞に正比例する。発光シグナルをＳｐｅｃｔｒａｍａｘＭ５プレートリーダーで読み取る。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の標準物質及び各サンプルの用量反応曲線を、発光シグナル（ｙ軸）を濃度（ｘ軸）に対してプロットすることによって生成する。プロットを、４パラメータのロジスティック非線形回帰モデルに適合させる。Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｌｉｎｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＰＬＡ）ソフトウェアを使用して、回帰の有意性である勾配の差（平行度）に対する同等性試験を評定し、同じプレート内の標準物質に対するサンプルの効力比を計算する。
【０２０４】
実施例１−Ｉ
リン酸−ＳＴＡＴ５の活性化
受容体結合後のリン酸化ＳＴＡＴ５アッセイでは、下流の細胞シグナル伝達がリン酸化を介してシグナル伝達性転写因子５（ＳＴＡＴ５）を活性化し、遺伝子発現を促進して細胞増殖を誘導する。リン酸−ＳＴＡＴ５の活性化は、ＩＬ−２依存性マウスＴリンパ球細胞株であるＣＴＬＬ−２細胞において、サンプル及び標準の約１０分間の処理に応答して、リン酸−ＳＴＡＴ５／全ＳＴＡＴ５マルチプレックスアッセイ（メリーランド州のＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して測定される。
【０２０５】
実施例２
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究：マウスにおける単回用量ＰＫ／ＰＤ研究
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物によるＴｒｅｇの選択的刺激を、マウスで実証することができる。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４／群）に、０．０３、０．１及び０．３ｍｇ／ｋｇの用量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の単回皮下投与を行う。投与後、投与後１〜７日目及び１０日目に血液及び脾臓のサンプルを収集する。より具体的には、各時点で、血液及び脾臓のサンプルを収集し、サンプルをプールし、フローサイトメトリーによるリンパ球細胞集団に対する薬物作用の薬力学的分析について評定し（例えば、実施例５を参照されたい）、ビヒクル対照と比較した倍率変化として表す。細胞数の変化に加えて、機能マーカー及び活性マーカーを定量する。最後に、血漿薬物濃度も評定する。
【０２０６】
図３Ａ及び図３Ｂに示されるように、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の投与は、血液と脾臓の両方においてＣＤ４＋Ｔｒｅｇの用量依存的増加をもたらし、投与の４日後に細胞数のピーク増加をもたらす。試験した最高用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）では、Ｔｒｅｇ動員に対する持続的な効果が達成され、Ｔｒｅｇレベルは投与後７日〜１０日までベースラインレベルに戻らない。血液中では、試験した最高用量の投与後にＮＫ細胞が上昇するが、ＣＤ４Ｔ細胞への変化はわずかであり、ＣＤ８Ｔ細胞のわずかな減少が起こる（図４Ａ〜図４Ｃ）。Ｂ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞は、試験した最高用量の投与後にわずかに減少し、この用量では、ＮＫ細胞の増加も２倍未満になる。Ｔｒｅｇの機能及び活性のマーカー（図５Ａ及び図５Ｂ）は、試験した最高用量で、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の投与により、ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３の平均蛍光強度（ＭＦＩ）により測定されるＴｒｅｇ活性化が増加することを示している。Ｔｒｅｇ数は投与後４日まで最大値に達しないが、これらの活性化マーカーは投与後最初の２日で最大値に達し、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の血漿曝露に従ってゆっくりと減少する。Ｋｉ６７で測定した急速に増殖するＴｒｅｇの割合は、投与後２日で急速に上昇し、６日目まで持続してベースラインレベルに戻った。更に、細胞表面マーカー誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）を発現するＴｒｅｇの割合も増加し、これは、ＩＣＯＳの発現が自己免疫環境におけるＴｒｅｇの抑制活性の増加に関連しているという注目すべき知見である。Ｋｉ６７及びＩＣＯＳの増加は、ピークＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物濃度に比べていくらか遅れているように見えるが、ベースラインレベルへの復帰は、この前臨床マウス研究における血漿濃度の減少と一致している。
【０２０７】
実施例３
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒｅｇ抑制アッセイ
この研究の目的は、制御性Ｔ細胞の阻害機能を評定することである。皮下投与後１日〜７日及び１０日に、ナイーブ及びＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物で治療したＣ５７ＢＬ／６マウスからＴｒｅｇを磁気的に分離する。Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎを１：２〜１：５１２の範囲の比率で３日間共培養する。アッセイの最後の１６時間に３Ｈ−チミジンの取り込みによって細胞増殖を評価し、プレート対照と比較した増殖細胞の割合を計算する。
【０２０８】
簡単に言えば、脾臓を、様々な用量レベル（０．０３、０．１及び０．３ｍｇ／ｋｇ）のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物又は投薬後の指定された時間にビヒクルで処理された雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４マウス／治療群／時間）から収集する。単一細胞分離物を各脾臓に対して調製し、得られた脾細胞混合物を各時点で各用量群に対してプールする。１つの脾臓に相当するプールされたサンプルの一部を、免疫細胞プロファイリングのために分注する。残りの脾細胞調製物を、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の分離に利用する。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞分離、マウス、キット（ドイツ国ベルギッシュグラートバッハのＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を製造元の推奨に従って利用する磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によってマウス脾臓から分離する。ＣＤ４＋Ｔ細胞を陰性選択し、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞とＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇとに分離する。ナイーブな従来のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞（Ｔｃｏｎ）を、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用し、メーカーの推奨手順に従って、未治療の動物より採取したマウス脾臓からＭＡＣＳによって分離する。
【０２０９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制アッセイを、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．５μＭβ−メルカプトエタノール、及び１×抗生物質／抗真菌剤（１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び２５０ｎｇ／ｍＬアンホテリシンＢ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で行う。５×１０４Ｔｃｏｎを、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８（Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎキット、マウス、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）でコーティングされたビーズで、９６ウェル丸底プレートの１００μｌ培地において各Ｔｃｏｎに対してビーズ２個の比率で刺激する。Ｔｒｅｇｓの抑制能力を、Ｔｃｏｎに様々な比率（Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎの比率が２：１〜１：５１２）でＴｒｅｇを追加することによって評定する。各Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比を３回試験する。細胞を加湿雰囲気下で３７℃、５％ＣＯ２で７２時間共培養し、アッセイ終了の１６時間前に、０．５μＣｉ［３Ｈ］−チミジンをウェルに添加する。取り込まれなかった［３Ｈ］−チミジンを含まない細胞を洗浄した後、マイクロプレートシンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、チミジンの取り込みを１分あたりのカウント（ＣＰＭ）として測定する。個々のＣＰＭ値を、４つの最低Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ希釈で記録した平均ＣＰＭで割ることにより、最大増殖に対して正規化する。濃度応答曲線を、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）６．０３（カリフォルニア州サンディエゴのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で４パラメータ非線形回帰及び１／ｙ２重み付けを使用してグラフ化する。
【０２１０】
図６Ａ〜図６Ｄに示すように、研究開始後１日及び４日でビヒクル治療マウスから単離された脾臓Ｔｒｅｇは抑制能力を示し、最大の抑制は１：２の比率で発生する。しかしながら、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の投与後のこれらの時点で分離されたＴｒｅｇは、特に１：８を超える比率で、Ｔｃｏｎ増殖の減少によって証明されるように、大幅に増加した抑制能力を示す。１：２の比率でＴｃｏｎとともに培養された単離されたＴｒｅｇの相対的抑制能力も経時的に評定する（図７）。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２投与後、増加したＴｒｅｇ抑制活性は４日間維持された後、ビヒクル対照治療群によって示されるベースライン活性に戻る。
【０２１１】
実施例４
マウスＫＬＨ  ＤＴＨ有効性モデルにおけるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の評価
Ｔ細胞抗原による炎症を抑制するＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の投与によるＴｒｅｇ誘導の能力を評定するため、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６〜１０／群）を遅延型過敏症（ＤＴＨ）のモデルで利用する。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）及び不完全フロイントアジュバントをそれぞれ１：１：１の比率で含むエマルションに、１００μｇのキーホールリンピットヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む１００μｌの皮下注射を用いて、マウスを背部の皮下で感作する。５日後、チャレンジの前にベースラインの耳介厚を測定し、左耳に１０μｇのＫＬＨを皮内投与し、右耳は未治療のままにする。耳介厚の測定値を、全ての群でＫＬＨチャレンジの２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間後にキャリパーで測定する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を、感作時の０日目に、３日ごとに０．００３ｍｇ／ｋｇ〜０．３ｍｇ／ｋｇの範囲の皮下用量で投与する。シクロスポリン（１０ｍｇ／ｋｇ、単回用量）からなる陽性対照を０日目に投与した。
【０２１２】
図８Ａ、図８Ｂに示されるように、抗原チャレンジに続いて、耳介の腫れが誘発され、耳介厚の平均増加が４８時間で最大１４ｍｍ超に達する。ナイーブのチャレンジされていない耳介は、研究の過程で厚さの変化を示さなかった。この研究における感作及びチャレンジ期間を通してＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の投与は、ビヒクル対照と比較して各時点での炎症の減少によって証明されるように、耳介の腫れの有意な用量依存的減少をもたらす。チャレンジ後の効果をより定量的に評定するために、厚さの変化のＡＵＣを各治療群（ＡＵＣ０−９６時間）について計算する。図８Ａ及び図８Ｂに示されるように、最小有効量は０．０１ｍｇ／ｋｇ  ｑ３ｄであり、最大効果は０．３ｍｇ／ｋｇ  ｑ３ｄで達成される。ビヒクル群からの統計学的に有意なＡＵＣ値は、アスタリスクで示される（ｐ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ）。まとめると、このデータは、投与後に達成されたＴｒｅｇの動員及び活性化の増強が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原駆動性炎症機構を抑制できることを示している。
【０２１３】
実施例１のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の活性を、げっ歯類及びカニクイザルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ投与後に評定する。マウスでは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成により、Ｔｒｅｇが用量依存的に増加し、投与後４日に最大に達する。マウスにおいてＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物によって誘導されたＴｒｅｇのフローサイトメトリー分析は、ＦｏｘＰ３及びＣＤ２５平均蛍光強度（ＭＦＩ）等のＴｒｅｇ活性化のマーカーが、投与後最初の２日以内に最大値に達し、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の血漿曝露に応じて経時的に徐々に減少することを示した。活発に増殖しているＴｒｅｇの割合も、投与後２日以内に最大値に達し、６日目まで持続する。Ｔｒｅｇ機能マーカーＩＣＯＳの発現は、３日目にピークに達して、７日目までにベースラインに戻る。治療を受けたマウスの脾臓から分離されたＴｒｅｇは、投与後最初の４日間で抑制能力を大幅に増加させた後、ベースレベルの活性に戻る。実施例１のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は、３日ごとに投与された場合、遅延型過敏症（ＤＴＨ）マウスモデルにおいて抗原駆動性炎症反応を抑制した。
【０２１４】
実施例５
カニクイザルにおける単回用量研究
この研究では、雌１匹と雄１匹のカニクイザルに、２５μｇ／ｋｇのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を皮下投与する。Ｔｒｅｇ細胞数と活性化状態のフローサイトメトリーによる評定のため、治療前（−６及び−１日目）と治療後の複数の間隔で各動物から一連の血液サンプルを採取する。
【０２１５】
免疫表現型分析のため、血液サンプル（およそ１．０ｍＬ）を、次の時点で各サルから収集する：治療前（−６及び−１日目）、治療後２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目。静脈穿刺サンプルを、抗凝固剤Ｋ２ＥＤＴＡを含むチューブに収集し、チューブを移送するまで湿った氷の上に置く。全血サンプルを、以下のパネルを使用したフローサイトメトリーによって分析し、サンプルは以下について分析する：
Ｔ細胞パネル：ＣＤ４５／ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８／ＩＣＯＳ
Ｔ／Ｂ／ＮＫパネル：ＣＤ４５／ＣＤ３／ＣＤ１６／ＣＤ２０
ｐＳＴＡＴ５パネル：ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤ２５／ＣＤ１２７／ｐＳＴＡＴ５
Ｔｒｅｇパネル１：ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤ２５／ＦｏｘＰ３／Ｋｉ６７
Ｔｒｅｇパネル２：ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤ２５／ＦｏｘＰ３／Ｈｅｌｉｏｓ
コンピュータ化されたシステムを研究の実施に使用することができ、例えば、フローサイトメトリーデータの取得にはＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ／ＦＡＣＳＤｉｖａ  ＬＥＧＥＮＤＰｌｅｘデータ分析ソフトウェアを使用でき、フローサイトメトリーデータ分析にはＤｅ  Ｎｏｖｏ  ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用できる。
【０２１６】
雄及び雌の値を平均化し、変化の大きさをｄ−１値に対して示し、点線でマークする。図９に示されるように、Ｔｒｅｇ細胞数は、投与後に実質的に増加し、投与の７日後にそれらの最大レベルに達し、１４〜２１日目までにほぼｄ−１レベルに戻る。図９Ａ中、白抜きの三角形で示されているように、Ｋｉ６７で測定した場合、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物によって誘導されたほぼ全てのＴｒｅｇは増殖性である。
【０２１７】
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の投与によって刺激されたＴｒｅｇの相対的な活性化状態は、ＦｏｘＰ３及びＣＤ２５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって更に測定される。ＣＤ２５  ＭＦＩは、６日目に最大値に達し、その後１０日目までプラトーに達した後、２１日目までにほぼ投与前のレベルに戻る。ＦｏｘＰ３  ＭＦＩはまた、投与後６日目に最大に達し、その後１４日目〜２１日目で投与前のレベルにほぼ戻る。まとめると、これらのデータは、Ｔｒｅｇ活性化の増加を伴って、同様の大きさの血中Ｔｒｅｇ誘導が見られることから、マウスでの所見のカニクイザルへのトランスレータビリティ（ｔｒａｎｓｌａｔａｂｉｌｉｔｙ）を示している。しかしながら、マウスでの発見とは対照的に、カニクイザルでの影響は本質的により長くなる。
【０２１８】
実施例６
マウス、ラット及びサルにおける単回用量の薬物動態及び毒物動態
マウス、ラット、及びサルにおけるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の単回用量の薬物動態／毒物動態の結果を要約する。投与計画の詳細を表１０に示す。
【０２１９】
表１０：ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の単回用量の薬物動態及び毒物動態研究の概要
【０２２０】
【表１０】
2021523922.tif 000025
【０２２１】
マウス研究の場合、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物のビヒクルは、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、２００ｍＭ塩化ナトリウム、及び２％スクロース（ｐＨ５）である。ラット及びサルの研究では、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物のビヒクルは、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２００ｍＭ塩化ナトリウム、及び２％スクロース（ｐＨ５）である。
【０２２２】
皮下投与後、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は、マウス、ラット及びサルでそれぞれ０．３３〜１．０日、１．０〜２．３日及び２．０日のＴｍａｘでゆっくりと吸収される（表１１）。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成の血漿曝露は、マウス及びラットで多かれ少なかれ用量を比例的に増加させる。バイオアベイラビリティは、ラットで２９．８〜４６．０％の範囲、サルで８６．２％である。
【０２２３】
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の定常状態での分布容積（Ｖｓｓ）は、用量とともにラットで増加するようであり、２５．１（０．０１ｍｇ／ｋｇ）〜５２．６ｍＬ／ｋｇ  １．０ｍｇ／ｋｇ）の範囲であった（表１２）。全体として、Ｖｓｓはラット及びサルの種特異的血漿量よりもそれぞれ１倍〜２倍及び２倍〜４倍大きく、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２が主に血管空間に留まっていることを示唆している。
【０２２４】
血漿クリアランス（ＣＬ）は非常に低い（ラットで０．５６０〜１．１４ｍＬ／時／ｋｇ、サルで０．２４５ｍＬ／時／ｋｇ）（表）。静脈内又は皮下投与後、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物濃度は、マウスで１．８５〜２．２４日、ラットで１．２５〜２．４４日、及びサルで１０．４〜１２．９日の半減期を伴って単指数関数的減衰を示すようである（表１１及び１２、並びに図１０Ａ、図１０Ｂ）。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の腎排泄は、糸球体フィルターの分子量カットオフに近い平均分子量６３ｋＤａであるため、低いと予測される。
【０２２５】
表１１：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット又はカニクイザルにＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を単回皮下投与した後の平均±ＳＥ血漿薬物動態／毒物動態パラメータ
【０２２６】
【表１１】
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【０２２７】
表１２：Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット又はカニクイザルにＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を単回静脈内用量を投与した後の平均±ＳＥ血漿薬物動態パラメータ
【０２２８】
【表１２】
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【０２２９】
実施例７
マウスでの比較研究
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０．０３、０．１及び０．３ｍｇ／ｋｇのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の単回皮下用量を投与するか、又は０．０３ｍｇ／ｋｇ（ｑｄｄｘ５）、０．１ｍｇ／ｋｇ（ｑｄｘ５）及び１ｍｇ／ｋｇ（ｑｄｘ５）の投与量の未修飾ＩＬ−２（アルデスロイキン）を投与する、実施例２に記載の研究と本質的に同様の研究を実施する。投与後、血液及び脾臓のサンプルを収集し、フローサイトメトリーによるリンパ球細胞集団に対する薬力学的分析のために分析して、ビヒクル対照と比較した倍率変化として表す。結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示す（ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は「ＲＵＲ−ＩＬ−２」と表示され、アルデスロイキンは「ＩＬ−２」と表示される）。
【０２３０】
実施例８
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のマウスモデルにおけるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の有効性の調査
この研究は、この疾患の最も一般的に研究されているマウスモデルであるＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒマウスモデル（Ｐｅｒｒｙ  Ｄ．，ら，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１１：２７１６９４）を使用して、ＳＬＥの発症と進行及びそれに関連する特徴に対するＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の有効性を決定するために実施される。ＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒマウスモデルは、リンパ節腫大、ＩｇＧレベルの上昇、抗核抗体産生、タンパク尿、及び糸球体の炎症による腎不全等、ヒトＳＬＥの病態を反映する自己免疫疾患を発症する。実施例１に記載のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物のストック溶液を、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、ＵＳＰで調製；ｐＨ５．０±０．１）に調製したビヒクル（透明な液体；１０ｍＭ酢酸ナトリウム／２００ｍＭ塩化ナトリウム／２％（重量／体積）スクロース）中に供給される試験品（１．５８ｍｇ／ｍＬ）として使用する。投与日に、適切な量の試験品を取り出し、ビヒクルで希釈して、所望の投与濃度（０．０３ｍｇ／ｋｇ用量及び０．３ｍｇ／ｋｇ用量）に到達させる。投薬量は５ｍＬ／ｋｇであった。この研究に使用した動物は、ＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒマウス及びＭＲＬ／ＭｐＪナイーブの雌性マウスで、６週齢〜８週齢である。動物を無作為化に治療群に割り当てる。治療群を、以下の表１３に記載する。４５匹のＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒマウスを、実験開始前の体重及び尿中のタンパク質含有量のレベルに基づいて、３群（群２〜４でそれぞれ１５匹）に無作為化する。群２〜４の動物には、表６に記載されているように、ビヒクル又は試験品を皮下投与する。群１−ＭＲＬ／ＭｐＪマウスは陰性対照としてとしてビヒクルを受ける。
【０２３１】
８週目の初回投与から３日後、群２〜４の３匹のマウスを人道的に犠牲にし、血液サンプルを収集して処理した。体重を、研究の開始から週に２回測定し、終わりまで継続する。
【０２３２】
皮膚病変の写真を、最初に観察したとき、及びその後１週間間隔で撮影した。
【０２３３】
尿を投与の前日（ベースライン時）に採取し、その後毎週採取する。尿中のタンパク質レベルを、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｃｌｉｎｉｔｅｋ  Ｓｔａｔｕｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定する。
【０２３４】
犠牲の日（２０週目の最後の投与から３日後）に、抱水クロラール（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により全てのマウスに麻酔をかける。血液サンプルを採取し、１００００ｒ／分で１０分間遠心分離して、血清サンプルを取得する。血清を、臨床生化学検査まで−８０℃で保管する。血清サンプル（１００μｌ）をＥＬＩＳＡ（マウス抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡキット、Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号５１２０）で分析し、Ｈｉｔａｃｈｉ７０２０自動生化学分析装置を使用して血清のＢＵＮ濃度を試験する。リンパ球分析では、血液サンプルをＥＤＴＡ−Ｋチューブに収集し、フローサイトメトリーによってＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８／Ｔｒｅｇ／ＮＫ／Ｂ細胞％を試験する。結果を図１１に示す。そこに示されているように、０．３ｍｇ／ｋｇの用量でのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の投与は、腎臓損傷のバイオマーカー（すなわち、尿中のタンパク質レベル）を正常なマウスで観察されるのとほぼ同じレベルに抑制するのに効果的である。この研究は、ＳＬＥの代表的な動物モデルにおける生理学的免疫応答及び疾患進行の制御に対するＲＵＲ−ＩＬ−２誘導性Ｔｒｅｇの効果を更に解明する。
【０２３５】
表１３−治療群
【０２３６】
【表１３】
2021523922.tif 000028
【０２３７】
実施例９
抗原依存性、Ｔ細胞性、遅延型過敏症（ＤＴＨ）モデルにおけるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成の研究
この研究は、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物によるｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔｒｅｇ刺激及び増殖が、高度のアナフィラキシーが確立される食物アレルギーモデルにおいて、抗原依存的にＴ細胞性遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を下方制御する方法をモデル化している。
【０２３８】
ＤＴＨモデルを開発するため、完全及び不完全フロイントアジュバントに乳化されたモデル抗原キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の皮下投与でＢａｌｂ／ｃマウスを感作する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物（０．００３、０．０１、０．３、０．１又は０．３ｍｇ／ｋｇ、ｑ３ｄ）又はシクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｑｄ）の皮下投与を０日目に開始し、８日目まで継続し、５日目にＫＬＨの皮内チャレンジを投与して、耳介の腫れを４日間測定した。炎症を起こした耳を免疫組織化学（ＩＨＣ）に供し、ＫＬＨチャレンジ後のＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の割合を定量する。応答の特異性を、ＫＬＨ再チャレンジ、又は無関係の抗原であるオボアルブミン（ＯＶＡ）による感作及びチャレンジを行うことのいずれかによる治療をせずに、更に３週間〜４週間後に評定する。食物アレルゲンに対するＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物−拡張Ｔｒｅｇの効果を理解するため、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＯＶＡをミョウバンで腹腔内に乳化することによって週に２回感作する。２回目の感作の１０日後、マウスを隔日で８回経口的にＯＶＡでチャレンジする。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物（０．１ｍｇ／ｋｇ、ｑ３ｄ×３）又はシクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｑｄ）の皮下投与を０日目に開始し、８日目まで継続する。アレルギー反応の重症度を、８回目のチャレンジ後３０分〜４５分以内の臨床スコアによって評定する。更に、血清肥満細胞プロテアーゼ１（ＭＣＰＴ  １）及びＯＶＡ特異的ＩｇＥの力価を定量する。パーセントＴｒｅｇを、末梢血及び脾臓のフローサイトメトリーによって決定する。
【０２３９】
ＤＴＨのこのマウスモデルでは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の投与により、ＫＬＨ再チャレンジに対する炎症反応が用量依存的に抑制された。炎症を起こした耳介のＩＨＣ分析は、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の有意な浸潤を示している。炎症に対する抑制効果は、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を更に投与せず、感作後の同じ抗原及び無関係の抗原による３週間〜４週間後の再チャレンジによって例示されるとおり、永続性があり、抗原特異的である。最後に、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の投与は、モデル食品アレルゲンであるＯＶＡの反復投与によって引き起こされる高度なアナフィラキシー症状の軽減に効果的であることがわかった。アナフィラキシーの臨床スコアの低下は、ＭＣＰＴ１のレベル及び抗ＯＶＡ特異的ＩｇＥの力価の有意な低下、並びにＴｒｅｇの有意な増加と相関している。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は、抗原特異的で永続性のあるＴｒｅｇ増殖、及びこのＫＬＨ過敏症モデルのマウスにおける治療反応を示した。更に、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は、食物アレルギーモデルで有効であることがわかっている。このデータは、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の場合のように、抗原特異的炎症に対するＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の使用を支持している。
【０２４０】
本明細書で提供される前臨床証拠は、ＩＬ−２コンジュゲートＴｒｅｇ刺激因子ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物が自己免疫及び炎症性の障害の治療のために制御性Ｔ細胞の数及び抑制機能を増加させるという概念を裏付ける。ＩＬ−２産生の障害及び制御性Ｔ細胞の機能障害は、複数の自己免疫疾患の免疫学的メカニズムとして関係している。臨床的利益を得るため低用量のＩＬ−２を使用することができるが、薬物動態が不十分な場合は毎日の送達が必要であり、有害事象は用量を制限し、Ｔｒｅｇの増加は中程度で短命である。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は、従来のＴ細胞機能への影響を最小限に抑えながらＴｒｅｇ恒常性を選択的に回復する低用量皮下投与を目的としたＩＬ−２コンジュゲートＴｒｅｇ刺激因子を提供する。ここに、マウス及び非ヒト霊長類モデルにおいてＴｒｅｇの数及び活性を選択的に拡大するＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の能力を特性評価し、自己免疫のモデルにおけるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の有効性を評定するためのデータを提供する。ＩＬ−２受容体への親和性を、表面プラズモン共鳴によって評定する。ヒトＰＢＭＣの活性を、フローサイトメトリー及び飛行時間型質量分析（ＣｙＴｏＦ）を使用して、複数のリンパ球集団におけるｐＳＴＡＴ５誘導によって測定することができる。Ｃ５７ＢＬ／６マウス又はカニクイザルの皮下投与後のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を、リンパ球数の変化及びフローサイトメトリーによる活性化によって測定する。ｅｘ  ｖｉｖｏのＴｒｅｇ機能を、単離された脾臓ＴｒｅｇによるＴｃｏｎ増殖の阻害によって決定する。有効性を、ＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒマウスを使用して全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のモデルで評定する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は、ＩＬ−２Ｒα及びＩＬ−２Ｒαβ複合体と比較してヒトＩＬ−２Ｒβに対する親和性を大幅に弱め、低親和性ＩＬ−２Ｒβγを発現するＴｃｏｎよりも高親和性ＩＬ−２Ｒαβγを発現するＴｒｅｇの優先的な活性化を示唆している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＴｒｅｇはＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成刺激に対してより感受性が高く、ヒトＰＢＭＣの他のリンパ球サブセットと比較してＳＴＡＴ５リン酸化の増加を示す。マウスでは、単回投与により、Ｔｃｏｎ活性化を伴わずに、血液及び脾臓で７日間〜１０日間Ｔｒｅｇ動員が持続し、これは、Ｔｒｅｇ活性化マーカーの誘導及びｅｘ  ｖｉｖｏでの抑制能力の増加が同時に起こる効果である。カニクイザルでは、血漿曝露は、単回投与後１４日間以上、持続的なＴｒｅｇ動員及び活動により延長され、これは、５日間毎日投与されるｒｈＩＬ−２の同等の総投与量と比較して、大きさ、期間及び特異性に優れた反応である。最後に、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物はＳＬＥのマウスモデルで有効である。ＳＬＥモデルでは、１２週間にわたってＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を繰り返し投与すると、Ｔｒｅｇの上昇が持続し、血中尿素窒素が減少し、尿タンパクレベル及び腎臓の組織病理学が正常に戻る。ｃＧＶＨＤモデルでは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物を繰り返し投与すると、Ｔｒｅｇが増加し、脾臓の胚中心Ｂ細胞が減少し、肺機能障害が逆転する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は、Ｔｒｅｇの持続的���優先的な活性化をもたらし、ＳＬＥのモデル系で有効性を示す。
【０２４１】
実施例１０
健康なボランティアにおけるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の単回漸増皮下投与の安全性、忍容性、薬物動態及び薬力学を評価するための第Ｉ相、二重盲検、無作為化プラセボ対照研究
健康なボランティアにおけるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物（ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２）の単回漸増低皮下用量の安全性、忍容性、薬物動態及び薬力学を評価するために、二重盲検、無作為化、プラセボ対照研究を行う。この研究は７つのコホートに分けられ、被験者は０．３、１．０、３．０、６．０、９．０、１３．５又は２０．０μｇ／ｋｇのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２を受けた。１２人の被験者を各用量コホートに無作為化され、そのうち９人はＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の単回皮下投与を受け、３人はプラセボを受けた。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２を、０．９％塩化ナトリウム滅菌液で希釈した皮下注射用の滅菌液として配合する。医薬品を使い捨てガラスバイアルで供給し、２℃〜８℃で保管する。医薬品の各バイアルには、０．７５±０．１ｍｇのｒｈＩＬ−２（ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２に基づく）が含まれていた。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２％（重量／体積）スクロース、ｐＨ５．０中におよそ１．０ｍｇ／ｍｌタンパク質の濃度で配合する。プラセボは市販の０．９％塩化ナトリウム溶液である。０．３μｇ／ｋｇの開始用量は、最小予測生物学的影響レベル（ＭＡＢＥＬ）アプローチを使用して選択され、非臨床毒性研究からの最も感受性の高い種における無毒性量（ＮＯＡＥＬ）によって支持される。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の薬物動態及び安全性の評価を可能にするため、開始用量を０．３μｇ／ｋｇに設定する。１人はＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２を受け、もう１人はプラセボを受けた２人の被験者に二重盲検法で投薬し、研究開始前の少なくとも７日間、起こりうる副作用を監視する。
【０２４２】
この研究の主要目的は、単回皮下投与として投与されたＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の安全性及び忍容性を評価することである。この研究の副次目的は、（１）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数及び／又は活性の変化の時間経過と程度を観察すること、（２）単回皮下用量として投与したＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを特性評価すること、並びに（３）サイトカイン、Ｔ細胞、他の末梢血集団、他の血清タンパク質、遺伝子発現の変化、及び抗薬物抗体への影響を含む、血液中のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の免疫学的影響を評定することである。研究の最初の段階では、免疫マーカーを投与前から投与後２０時間まで試験する。具体的には、Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋−Ｔ細胞、ＣＤ８＋−Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、サイトカイン、可溶性ＣＤ２５及びＲＮＡを、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２受容及びプラセボ受容のコホートで試験する。その後のフェーズでは、同じ免疫マーカーを投薬後４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、１０日目、１２日目、１５日目、１８日目、２０日目、２５日目、３０日目、４０日目及び５０日目にも試験する。
【０２４３】
用量規制毒性（ＤＬＴ）、重篤な有害事象（ＳＡＥ）、死亡又は臨床上重大な異常は報告されていない。有害事象（ＡＥ）は、軽度（グレード１）の注射部位反応に限定されており、高用量のＩＬ−２に関連することが知られているＡＥの証拠は観察されなかった。
【０２４４】
予備的なＰＫ分析は、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２がほとんどの被験者で投与後４日〜６日あたりで最大濃度に達し、投与後およそ２週間まで濃度の変化がほとんどなく、その後濃度がおよそ８日〜９日の半減期で低下したことを示す。
【０２４５】
薬力学的（ＰＤ）評定は、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２が循環ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔＴｒｅｇの用量依存的な増加をもたらすことを明らかにしている。３．０、６．０、９．０、１３．５及び２０．０μｇ／ｋｇの単回用量コホートでは、循環ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔＴｒｅｇの絶対数が持続的に増加し、レベルは投与後およそ２０日〜２５日までベースラインに戻らない。それぞれ３．０、６．０、９．０、１３．５及び２０．０μｇ／ｋｇの用量では、投与前と比較して、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔＴｒｅｇの数が平均で３、３．５、４．１、５及び８．１倍増加する。３．０、６．０、９．０、１３．５及び２０．０μｇ／ｋｇの用量では、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの総数も増加するが、変化の大きさはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔＴｒｅｇで観察されたものよりも小さくなる。プラセボを受けた被験者と比較して、０．３及び１．０μｇ／ｋｇの用量でのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２治療被験者対プラセボ被験者のＴｒｅｇの数に変化はない。どの用量のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２でも、Ｔ細胞集団（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）の割合又は数に変化が見られないことから、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の主な効果はＴｒｅｇで見られる。１３．５及び２０．０μｇ／ｋｇでＮＫ細胞の割合及び絶対数がわずかに増加しているが、高用量ＩＬ−２に関連するＡＥの証拠はない。
【０２４６】
図１２に示すように、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔＴｒｅｇの用量依存的な増加をもたらした。３．０、６．０、９．０及び１３．５μｇ／ｋｇでは、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔＴｒｅｇの絶対数の持続的な増加をもたらし、投与後２０〜２５日までレベルはベースラインに戻らなかった。ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔＴｒｅｇｓの数は、３．０、６．０、９．０及び１３．５μｇ／ｋｇの用量では、プラセボと比較して、それぞれ３．０、３．５、４．１及び５．０倍の平均増加があり、最大応答は、３．０μｇ／ｋｇで８４時間のピークから、１３．５μｇ／ｋｇで７〜１２日続くより延長されたピーク応答にシフトし、２０日〜２５日目までにベースラインレベルに戻る。図１３に示すように、３．０、６．０、９．０及び１３．５μｇ／ｋｇの用量では、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの総集団も用量依存的に増加したが、変化の大きさはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ制御性Ｔ細胞で観察されたものよりも小さくなる。０．３μｇ／ｋｇ及び１μｇ／ｋｇの用量で、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２治療被験者対プラセボ被験者の合計ＣＤ４＋Ｔｒｅｇに変化は観察されなかった（図１３）。
【０２４７】
重要なことに、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２又はプラセボ治療を受けたいずれの被験者においてもＴｃｏｎ細胞集団（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）の割合の変化は観察されなかったため、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の主な効果はＴｒｅｇで見られた。しかしながら、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の被験者では、１３．５μｇ／ｋｇでＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数及びＫｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合のわずかな増加が観察された（図１４Ａ〜図１４Ｄ）。どの用量レベルでもＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数に変化はなかった。
【０２４８】
ＣＤ５６＋ＮＫ細胞集団も分析した。循環ＮＫ細胞の絶対数の増加が認められ、１３．５μｇ／ｋｇの用量レベルではこの細胞サブセットの割合が同様に増加したが、低用量レベルでは増加しなかった。また、３．０、６．０、９．０及び１３．５μｇ／ｋｇで、増殖のマーカーであり、したがって活性化のマーカーであるＫｉ６７を発現するＣＤ５６＋ＮＫ細胞の割合の用量依存的な増加が認められた。３．０、６．０及び９．０μｇ／ｋｇで、Ｋｉ６７を発現する割合は、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２投与後、それぞれ約１０％、２０〜３０％及び３０〜４０％であった。１３．５μｇ／ｋｇの用量ではＫｉ６７を発現する割合の更なる増加はなく、３０〜４０％のままであった。
【０２４９】
ＳＡＤ研究によるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２治療は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔＴｒｅｇの数の持続的な増加をもたらし、投与後２０〜２５日までレベルはベースラインに戻らなかった。変化の大きさはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔＴｒｅｇで観察されたものよりも小さかったものの、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの総個体数も増加した。ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の数の増加が１３．５μｇ／ｋｇで観察された。
【０２５０】
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の追加コホート、２０．０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１３）；プラセボ（ｎ＝３）、及びＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２、２８．０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝９）；プラセボ（ｎ＝３）も実施した。各コホートを５０日間追跡し、有害事象、バイタルサイン、及び臨床検査評価、並びにＴｒｅｇ、Ｔｃｏｎ、及びＮＫ細胞及びサブセットの数及び活性の時間経過及び程度の変化、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の薬物動態、並びにサイトカインレベル、末梢血細胞集団、血清タンパク質及び遺伝子発現等の他の免疫学的効果によって評価される、健康なボランティアにおけるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の単回漸増用量の皮下投が被験者の安全性及び忍容性に及ぼす影響を評定する。
【０２５１】
一般に、安全性の結果では、研究の中止につながる用量規制毒性、死亡又は有害事象、臨床上重要なバイタルサイン、ＥＣＧ又は身体検査の異常は見られなかった。有害事象は主に軽度又は中等度（グレード１又はグレード２）の注射部位反応に限定され、４人の被験者がグレード１の頭痛事象を経験し、１人の被験者が試験した最高用量（２８．０μｇ／ｋｇ）でサイトカインレベルの上昇に起因する軽度（グレード１）の兆候及び発熱、食欲不振、嘔吐、下痢、頻脈及び筋肉痛（全てグレード１の重症度）の症状を経験し、抗薬物抗体の誘発はなかった。
【０２５２】
一般に、ＣＤ２５−ｂｒｉｇｈｔ  Ｔｒｅｇの持続的で用量依存的な増加が、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２に応答して観察された（図１５を参照されたい）。２８μｇ／ｋｇのＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物では、投与前の値を超えるＣＤ２５−ｂｒｉｇｈｔ  Ｔｒｅｇの数の１７倍の平均ピーク増加が観察された。Ｔｒｅｇレベルは１０日目〜１２日目にピークに達し、投与後２０日〜２５日までベースラインに戻らない。Ｔｒｅｇ活性化マーカーであるＩＣＯＳ及びＣＴＬＡ４の増加は、１３．５μｇ／ｋｇ以上の用量で観察された。
【０２５３】
Ｔｃｏｎ細胞の割合に実質的な変化は観察されず、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２に応答したＣＤ５６＋ＮＫ細胞では最小限の増加が観察された（図１６を参照されたい）。（ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞も数えた。データは示されていない）。ＮＫ細胞の増加は用量依存的ではなかった。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の最高濃度でＮＫ細胞の２倍の増加が観察された。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２は、２８μｇ／ｋｇまでＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することはなく、Ｔｒｅｇの用量依存的な増加を誘導する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の投与により、２８μｇ／ｋｇのベースラインよりも平均ピークＴｒｅｇ：ＣＤ８比が１５倍に増加する。（図１７を参照されたい）。
【０２５４】
研究の目的は、皮下に単回漸増用量（ＳＣ）を投与したヒトにおけるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の安全性及び忍容性を評定した。更に、Ｔｒｅｇ、従来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、サイトカインレベルの数及び割合の変化の時間経過及び程度、並びに末梢血中のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物の薬物動態（ＰＫ）を調査した。このヒト初の二重盲検、単回漸増用量研究では、健康なボランティアに０．３〜２８μｇ／ｋｇの範囲のＳＣ用量（コホートあたり、治療薬９：プラセボ３）を投与し、被験者を５０日間追跡した。計画した８つのコホート全てが投薬を完了した。バイタルサイン、心電図又は臨床検査値には、用量規制毒性、重篤な有害事象、死亡又は臨床上重大な異常はなかった。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２に起因する有害事象は、主に軽度（グレード１）の注射部位反応に限定されていた。試験した最高用量の１人の被験者は、サイトカインレベルの上昇及びリンパ球減少症の一過性で軽度（グレード１）の症状を示したが、治療せずに解消した。他のどの用量レベルの個人にも、ＩＬ−２療法に関連することが知られている全身性の兆候又は症状はなかった。これまでに最初の６つのコホートで抗薬物抗体の検査を行ったが、いずれも検出されていない。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２は、投与後４日〜６日で最大血漿レベルに達し、約２週間はほとんど変化せず、その後、約８日〜９日の半減期で減少した。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の主な効果はＴｒｅｇで見られた。３．０〜２８．０μｇ／ｋｇの用量コホートでは、循環ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ  Ｔｒｅｇの絶対数及び割合の用量依存的で持続的な増加が観察された。上昇したレベルは１０〜１２日目にピークに達し、投与後約２０〜２５日までベースラインに戻らなかった。２８．０μｇ／ｋｇでは、これらのＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ  Ｔｒｅｇの数の平均ピーク増加はベースラインの１７倍であり、平均ピークパーセンテージは０．５％から７．４％に増加した。更に、１３．５μｇ／ｋｇ以上の用量ではＴｒｅｇ活性化マーカーが増加した。試験した最高用量では、ＮＫ細胞の割合及び数は平均３．５倍増加したが、従来のＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の割合及び数に変化は見られなかった。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は、Ｔｒｅｇを選択的に誘導し、２８．０μｇ／ｋｇ群のベースラインを超える平均ピークＴｒｅｇ：ＣＤ８比の１５倍の増加によって証明される。結論として、試験した用量範囲でのＩＬ−２コンジュゲートＴ−ｒｅｇ刺激因子ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の単回投与は、忍容性が高く安全であった。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２は、循環ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ  Ｔｒｅｇの顕著な選択的用量依存的増加をもたらし、従来のＴ細胞への影響は最小限で、ＮＫ細胞への影響は比較的小さかった。これらの臨床結果は、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の長期にわたるＴｒｅｇ選択的作用を示す以前の動物研究を拡大し、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患の新たな治療法としてＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２を試験するための強力な裏付けを提供する。
【０２５５】
ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２組成物は安全であり、この最初のヒトにおける単回漸増用量研究で十分に忍容され、循環ＣＤ２５−ｂｒｉｇｈｔＴｒｅｇ細胞の顕著な選択的用量依存的増加をもたらした。Ｔｃｏｎｓ及びＮＫ細胞への影響は最小限であり、この研究データは、自己免疫疾患及び炎症性疾患におけるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２を試験するための裏付けを提供する。
【０２５６】
実施例１１
全身性エリテマトーデス患者における皮下ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の安全性、忍容性、薬物動態及び薬力学を評価するための第Ｉ相、二重盲検、無作為化プラセボ対照漸増複数回用量研究
最小から中等度の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者の４つの用量コホートにおけるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の漸増複数回用量の安全性、忍容性、ＰＫ及び免疫学的効果を評価するための二重盲検、無作為化、プラセボ対照研究を行う。ＳＬＥ疾患活動性への影響も評価する。疾患活動性が最小から中程度の１２人のＳＬＥ患者を、４つの用量コホートのそれぞれに無作為化し、そのうち９人はＲＵＲ−ＩＬ−２−２０ｋＤの１．０ｍｇ／ｍｌ水溶液の皮下用量を複数回受け、３人はプラセボを受けた。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２薬物及びプラセボを、本明細書に記載されているように、例えば実施例１−Ａのとおりに調製する。活動性の臨床ＳＬＥ疾患活動は選択基準として必要とされない。コホート１では、３．０μｇ／ｋｇの開始用量を２週間間隔で３回投与する（１、１５及び２９日目）。この開始用量は、上記の研究で以前に決定されたＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の単一皮下用量の好ましい安全性及びＰＤプロファイルに基づいている。コホート２、３及び４のその後の用量レベルは、それぞれ、前の用量コホートの最大２倍であった。コホート１〜３の患者は、２週間間隔で合計４週間にわたって３回の治験薬の投与を受けた。研究の過程で評価される用量は、３．０μｇ／ｋｇ〜２４μｇ／ｋｇの範囲である。コホート４の患者は、１、１５、２９、４３、５７、７１及び８５日目に投与されるＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２による１２週間の治療を受ける。このコホートは、ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２治療の長期にわたる投与の安全性、並びにＰＫ及びＰＤプロファイルに関するデータを提供する。ＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２又はプラセボの最終投与を受けた後、安全性、ＰＫ、ＰＤ及び予備的有効性を評価するために患者を更に５０日間追跡する。各コホートの１２人の被験者のうち８人を、安全性の問題の可能性について、安全性審査委員会によって最終患者の３回目の投薬の２週間後に評価する。更に、安全性審査委員会によって２回、すなわち（１）最初の８人の被験者が３回目の投与を受けてから２週間後、及び（２）全ての被験者が全ての投与量の治験薬を投与されてから２週間後にコホート４の全ての患者を評価する
安全性の所見に加えて、Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋−Ｔ細胞、ＣＤ８＋−Ｔ細胞、ＮＫ細胞応答、サイトカインレベル、利用可能なＰＫデータ等の免疫学的変化を使用して、用量レベルを決定する。この研究の主要目的は、ＳＬＥ患者に複数回漸増皮下用量として投与されたＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の安全性及び忍容性を評価することであり、この研究の副次目的は、（１）ＳＬＥ患者における複数回の皮下投与後のＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２のＰＫプロファイルを特性評価すること、（２）ＳＬＥ患者におけるＴｒｅｇ及びＴｒｅｇサブセットの数及び機能、ＣＤ４＋−Ｔ細胞、ＣＤ８＋−Ｔ細胞、ＮＫ細胞、並びにサイトカインレベルを含む、ＰＤバイオマーカーの変化の時間経過及び程度に関するＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の効果を評定すること、（３）二本鎖ＤＮＡに対する抗体の存在及びレベル、並びにＳＬＥ患者の補体Ｃ３及びＣ４のレベルに対するＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の効果を評定すること、並びに（４）ＳＬＥ患者の疾患活動性に対するＲＵＲ２０ｋＤ−ＩＬ−２の効果を評定することである。漸増複数回用量研究からの予備的なＰＫデータを表す結果を、以下の表１５の単回皮下研究からのデータと比較する。
【０２５７】
表１５．単回及び複数回用量のヒト試験におけるＰＫデータ
【０２５８】
【表１４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年1月15日(2021.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2021523922.tif 000070
（式中、ＩＬ−２はインターロイキン−２であり、
ｎは各出現で独立して約３〜約４０００の整数であり、
ｎ’は１、２、または３である）
のＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含む組成物。
【請求項２】
ＩＬ−２がアルデスロイキンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、あわせて考慮した場合に、
式
【化２】
2021523922.tif 000071
（式中、ｎ’は１、４、５又は５より大きい整数から選択される）によって包含される、ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約２０モルパーセント以下で含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、あわせて考慮した場合に、
式
【化３】
2021523922.tif 000072
（式中、ｎ’は１、４、５又は５より大きい整数から選択される）によって包含される、ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約１５モルパーセント以下で含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、あわせて考慮した場合に、式
【化４】
2021523922.tif 000073
（式中、ｎ’は１、４、５又は５より大きい整数から選択される）によって包含される、ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約１０モルパーセント以下で含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
１に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約１０モルパーセント以下で含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
１に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約７モルパーセント以下で含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
１に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約５モルパーセント以下で含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
４に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約１０モルパーセント以下で含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
４に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約７モルパーセント以下で含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
４に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約５モルパーセント以下で含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、ほぼ等モル量の
【化５】
2021523922.tif 000074
を含む、請求項１に記載のＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートの混合物を含む組成物。
【請求項１３】
組前記組成物が、式
【化６】
2021523922.tif 000075
（ここで、（ＩＩ）／（ＩＩＩ）のモル比が、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、または１：１．４である）を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含む、請求項２に記載のＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートの混合物を含む組成物。
【請求項１４】
アルデスロイキンあたりの分岐ポリエチレングリコール部分、
【化７】
2021523922.tif 000076
の平均数が、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．６、２．７、２．８、２．９、または３である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
アルデスロイキンあたりの分岐ポリエチレングリコール部分の平均数が約２．５である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
ｎの値が５〜２０００の範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
ｎの値が１０〜１０００の範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
ｎの値が１０〜７５０の範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
ｎの値が１０〜５００の範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
ｎの値が２０〜２５０の範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
ｎの平均値が約２２６である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が、約２５０ダルトン〜約９００００ダルトンの範囲にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が、約１０００ダルトン〜約６００００ダルトンの範囲にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が、約５０００ダルトン〜約６００００ダルトンの範囲にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が、約１００００ダルトン〜約５５０００ダルトンの範囲にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
モルベースで、約５モルパーセント以下のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約２８モルパーセント〜約６０モルパーセントのジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約２４モルパーセント〜約６５モルパーセントのトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約１２モルパーセント以下のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が約２００００ダルトンである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項２７】
８０％以上の組み合わされたジ−及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを更に含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
モルベースで、約２．５〜約４．５モルパーセントのモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約３５〜約５０モルパーセントのジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約３８〜約４６モルパーセントのトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約３〜約１０モルパーセントのより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が約２００００ダルトンである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項２９】
あわせた合計が約８０〜約９５モルパーセントのジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを更に含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
モルベースで、約２．８〜約３．８モルパーセントのモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４４〜約４８モルパーセントのジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４１〜約４４モルパーセントのトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約７〜約９モルパーセントのより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が約２００００ダルトンである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項３１】
あわせた合計が約８７〜約９０モルパーセントのジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを更に含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
モルベースで、約２．８〜約３．８モルパーセントのモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４４〜約４８モルパーセントのジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４１〜約４４モルパーセントのトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約７〜約９モルパーセントのより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、前記組成物がリジンＫ７又はＫ８又はＫ３１又はＫ７５の１つに付着したＰＥＧ部分を有するモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートの混合物を含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が約２００００ダルトンである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項３３】
あわせた合計が約８７〜約９０モルパーセントのジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを更に含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
モルベースで、約２．８〜約３．８モルパーセントのモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４４〜約４８モルパーセントのジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４１〜約４４モルパーセントのトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約７〜約９モルパーセントのより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、前記組成物がリジンＫ７に付着したＰＥＧ部分を有するモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が約２００００ダルトンである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項３５】
あわせた合計が約８７〜約９０モルパーセントのジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを更に含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
薬学的に許容可能な賦形剤を更に含む、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
非経口投与に適した形態の、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
皮下投与に適した形態の、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
水性希釈剤を含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４０】
約５のｐＨを有する、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム及びスクロースを更に含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
１．５ｍｇ／ｍｌタンパク質当量、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１１０ｍＭ塩化ナトリウム、２％スクロース（重量／体積）、ｐＨ５．０を含む請求項３７記載の組成物。
【請求項４３】
治療法に使用するための、請求項２６〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
制御性Ｔ細胞対エフェクターＴ細胞の比率を増加させる方法に使用するための、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
制御性Ｔ細胞がＦｏｘｐ３＋細胞及びＣＤ２５＋細胞から選択される、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
エフェクターＴ細胞がＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞から選択される、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４７】
ベースラインと比較した場合、制御性Ｔ細胞の倍増が、ｉｎ−ｖｉｖｏマウスモデルで評価した場合、少なくとも約２の値に達する、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４８】
ベースラインと比較した場合、制御性Ｔ細胞の倍増が、ｉｎ−ｖｉｖｏマウスモデルで評価した場合、少なくとも約４の値に達する、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４９】
制御性Ｔ細胞数の増加が、投与後少なくとも３日間、ベースラインレベルを超えて持続する、請求項４４に記載の組成物。
【請求項５０】
制御性Ｔ細胞数の増加が、投与後少なくとも５日間、ベースラインレベルを超えて持続する、請求項４４に記載の組成物。
【請求項５１】
自己免疫疾患の治療に使用するための、請求項１〜４２いずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
皮下注射により投与される、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
２週間に１回又は４週間に１回投与される、請求項５１〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
２週間に１回、３μｇ／ｋｇ〜２４μｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスである、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５６】
前記自己免疫疾患が、アトピー性皮膚炎である、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記自己免疫疾患が、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５８】
アレルギー疾患に使用するための、請求項２６〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５８】
【表１４】
2021523922.tif 000077
なお、本発明は以下の態様を含みうる。
［１］構造：
【化１３−１】
2021523922.tif 000078
（式中、ＩＬ−２はインターロイキン−２であり、
ｎは各出現で独立して約３〜約４０００の整数である）
を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含む組成物。
［２］ＩＬ−２がアルデスロイキンである、上記［１］に記載の組成物。
［３］前記組成物が、あわせて考慮した場合に、
式
【化１３−２】
2021523922.tif 000079
（式中、ｎ’は１、４、５又は５より大きい整数から選択される）によって包含される、ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約２０モルパーセント以下で含む、上記［２］に記載の組成物。
［４］前記組成物が、あわせて考慮した場合に、
式
【化１３−３】
2021523922.tif 000080
（式中、ｎ’は１、４、５又は５より大きい整数から選択される）によって包含される、ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約１５モルパーセント以下で含む、上記［３］に記載の組成物。
［５］前記組成物が、あわせて考慮した場合に、式
【化１３−４】
2021523922.tif 000081
（式中、ｎ’は１、４、５又は５より大きい整数から選択される）によって包含される、ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約１０モルパーセント以下で含む、上記［３］に記載の組成物。
［６］１に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約１０モル％以下で含む、上記［３］〜［５］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［７］１に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約７モル％以下で含む、上記［３］〜［５］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［８］１に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約５モル％以下で含む、上記［３］〜［５］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［９］４に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約１０モル％以下で含む、上記［３］〜［８］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［１０］４に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約７モル％以下で含む、上記［３］〜［８］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［１１］４に等しいｎ’を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを約５モル％以下で含む、上記［３］〜［８］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［１２］前記組成物が、ほぼ等モル量の
【化１３−５】
2021523922.tif 000082
を含む、上記［１］に記載のＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートの混合物を含む組成物。
［１３］組前記組成物が、式
【化１３−６】
2021523922.tif 000083
（ここで、（ＩＩ）／（ＩＩＩ）のモル比が、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３及び１：１．４からなる群から選択される）を有するＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含む、上記［２］に記載のＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートの混合物を含む組成物。
［１４］アルデスロイキンあたりの分岐ポリエチレングリコール部分、
【化１３−７】
2021523922.tif 000084
の平均数が、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．６、２．７、２．８、２．９及び３からなる群から選択される、上記［１３］に記載の組成物。
［１５］アルデスロイキンあたりの分岐ポリエチレングリコール部分の平均数が約２．５である、上記［１３］に記載の組成物。
［１６］ｎの値が５〜２０００の範囲である、上記［１］〜［１５］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［１７］ｎの値が１０〜１０００の範囲である、上記［１］〜［１５］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［１８］ｎの値が１０〜７５０の範囲である、上記［１］〜［１５］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［１９］ｎの値が１０〜５００の範囲である、上記［１］〜［１５］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［２０］ｎの値が２０〜２５０の範囲である、上記［１］〜［１５］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［２１］ｎの平均値が約２２６である、上記［１］〜［１５］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［２２］各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が、約２５０ダルトン〜約９００００ダルトンの範囲にある、上記［１］〜［１５］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［２３］各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が、約１０００ダルトン〜約６００００ダルトンの範囲にある、上記［１］〜［１５］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［２４］各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が、約５０００ダルトン〜約６００００ダルトンの範囲にある、上記［１］〜［１５］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［２５］各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が、約１００００ダルトン〜約５５０００ダルトンの範囲にある、上記［１］〜［１５］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［２６］モルベースで、約５モル％以下のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約２８モル％〜約６０モル％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約２４モル％〜約６５モル％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約１２モル％以下のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が約２００００ダルトンである、上記［１］又は［２］に記載の組成物。
［２７］８０％以上の組み合わされたジ−及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを更に含む、上記［２６］に記載の組成物。
［２８］モルベースで、約２．５〜約４．５モル％のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約３５〜約５０モル％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約３８〜約４６モル％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約３〜約１０モル％のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が約２００００ダルトンである、上記［１］又は［２］に記載の組成物。
［２９］あわせた合計が約８０〜約９５モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを更に含む、上記［２８］に記載の組成物。
［３０］モルベースで、約２．８〜約３．８モル％のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４４〜約４８モル％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４１〜約４４モル％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約７〜約９モル％のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が約２００００ダルトンである、上記［１］又は［２］に記載の組成物。
［３１］あわせた合計が約８７〜約９０モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを更に含む、上記［３０］に記載の組成物。
［３２］モルベースで、約２．８〜約３．８モル％のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４４〜約４８モル％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４１〜約４４モル％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約７〜約９モル％のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、前記組成物がリジンＫ７又はＫ８又はＫ３１又はＫ７５の１つに付着したＰＥＧ部分を有するモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートの混合物を含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が約２００００ダルトンである、上記［１］又は［２］に記載の組成物。
［３３］あわせた合計が約８７〜約９０モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを更に含む、上記［３２］に記載の組成物。
［３４］モルベースで、約２．８〜約３．８モル％のモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４４〜約４８モル％のジ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約４１〜約４４モル％のトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲート、及び約７〜約９モル％のより高ＰＥＧ化されたＩＬ−２コンジュゲートを含み、前記組成物がリジンＫ７に付着したＰＥＧ部分を有するモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを含み、各分岐ポリエチレングリコール部分の名目上の平均分子量が約２００００ダルトンである、上記［１］又は［２］に記載の組成物。
［３５］あわせた合計が約８７〜約９０モル％のジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化ＩＬ−２コンジュゲートを更に含む、上記［３４］に記載の組成物。
［３６］薬学的に許容可能な賦形剤を更に含む、上記［１］〜［３５］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［３７］非経口投与に適した形態の、上記［１］〜［３５］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［３８］皮下投与に適した形態の、上記［１］〜［３５］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［３９］水性希釈剤を含む、上記［３６］に記載の組成物。
［４０］約５のｐＨを有する、上記［３９］に記載の組成物。
［４１］酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム及びスクロースを更に含む、上記［３９］又は上記［４０］に記載の組成物。
［４２］１．５ｍｇ／ｍｌタンパク質当量、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１１０ｍＭ塩化ナトリウム、２％スクロース（重量／体積）、ｐＨ５．０を含む上記［３７］記載の組成物。
［４３］上記［１］〜［４２］に記載のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を被験体に投与することにより、被験体における制御性Ｔ細胞対エフェクターＴ細胞の比率を増加させる方法。
［４４］制御性Ｔ細胞がＦｏｘｐ３＋細胞及びＣＤ２５＋細胞から選択される、上記［４３］に記載の方法。
［４５］エフェクターＴ細胞がＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞から選択される、上記［４４］に記載の方法。
［４６］ベースラインと比較した場合、制御性Ｔ細胞の倍増が、ｉｎ−ｖｉｖｏマウスモデルで評価した場合、少なくとも約２の値に達する、上記［４３］〜［４５］に記載のいずれか一項に記載の方法。
［４７］ベースラインと比較した場合、制御性Ｔ細胞の倍増が、ｉｎ−ｖｉｖｏマウスモデルで評価した場合、少なくとも約４の値に達する、上記［４３］〜［４５］に記載のいずれか一項に記載の方法。
［４８］制御性Ｔ細胞数の増加が、投与後少なくとも３日間、ベースラインレベルを超えて持続する、上記［４３］〜［４７］に記載のいずれか一項に記載の方法。
［４９］制御性Ｔ細胞数の増加が、投与後少なくとも５日間、ベースラインレベルを超えて持続する、上記［４３］に記載の方法。
［５０］上記［１］〜［４２いずれか一項］に記載の組成物の治療有効量を被験体に投与することを含む、自己免疫疾患を有する被験体を治療する方法。
［５１］前記投与が皮下注射によるものである、上記［５０］に記載の方法。
［５２］前記投与が２週間に１回又は４週間に１回行われる、上記［５０］〜［５１］に記載のいずれか一項に記載の方法。
［５３］前記投与が、２週間に１回、３μｇ／ｋｇ〜２４μｇ／ｋｇの用量を含む、上記［５０］〜［５２］に記載のいずれか一項に記載の方法。
［５４］治療法に使用するための、上記［１］〜［４２］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［５５］自己免疫疾患の治療に使用するための、上記［１］〜［４２］に記載のいずれか一項に記載の組成物。
［５６］自己免疫疾患を治療するための薬剤を製造するための、上記［１］〜［４２］に記載のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【国際調査報告】
2021523922.tif 000085
2021523922.tif 000086