(57)【要約】  本開示は、対象において免疫応答を増進するためおよび自己反応性Ｂ細胞により媒介されるがんまたは炎症状態を治療するための免疫療法組成物および方法を提供する。一部の態様では、少なくとも１つの腫瘍抗原またはＢ系列細胞抗原ならびにＮＫｐ３０および／または別の活性化ＮＫ受容体を認識する多重特異性抗原結合性構築物が提供される。一部の態様では、少なくとも２つの腫瘍抗原またはＢ系列細胞により発現される２つの抗原、ＮＫｐ３０、および別の活性化ＮＫ受容体を認識する多重特異性抗原結合性構築物が提供される。本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物および方法は、ＣＤ１６欠損性微環境により特徴付けられる、および／または腫瘍抗原の発現の低いレベルを有する標的細胞（例えば、がん細胞）により特徴付けられるがんであったとしても、がんの治療のために使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第１の抗原結合単位が、第１の腫瘍抗原に結合することにより腫瘍細胞を特異的に標的化するか、またはＢ細胞により発現される第１の標的抗原に結合することによりＢ細胞を特異的に標的化し、第２の抗原結合単位が、ＮＫｐ３０抗原に特異的に結合する、多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項２】
第２の腫瘍抗原、Ｂ細胞により発現される第２の標的抗原、またはＮＫ受容体に結合する第３の抗原結合単位をさらに含む、請求項１に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項３】
前記第１の抗原結合単位が、第１の腫瘍抗原に結合することにより腫瘍細胞を特異的に標的化する、請求項１または２に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項４】
前記第３の抗原結合単位が第２の腫瘍抗原に結合する、請求項３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項５】
前記第３の抗原結合単位がＮＫ受容体に結合する、請求項３に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項６】
前記ＮＫ受容体がＮＫｐ３０である、請求項５に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項７】
前記ＮＫ受容体がＮＫＧ２Ｄである、請求項５に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項８】
前記ＮＫ受容体がＮＫｐ４６またはＮＫｐ４４である、請求項５に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項９】
前記第１の腫瘍抗原に結合する２つの抗原結合単位を含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１０】
前記第１の腫瘍抗原および前記第２の腫瘍抗原が同じ腫瘍抗原である、請求項２乃至９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１１】
前記第１の抗原結合単位が、Ｂ細胞により発現される第１の標的抗原に結合することによりＢ細胞を特異的に標的化する、請求項１または２に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１２】
前記Ｂ細胞により発現される前記第１の標的抗原が、自己反応性Ｂ細胞または形質細胞である、請求項１、２、または１１に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１３】
前記Ｂ細胞により発現される前記第１の標的抗原が、Ｂ細胞特異的、Ｂ細胞拘束、またはＢ細胞濃縮抗原である、請求項１、２、１１、および１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１４】
前記Ｂ細胞により発現される前記第１の標的抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＢＣＭＡからなる群から選択される、請求項１、２、および１１乃至１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１５】
前記第３の抗原結合単位が、Ｂ細胞により発現される第２の標的抗原に結合する、請求項２または１１に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１６】
Ｂ細胞により発現される前記第１の標的抗原に結合する２つの抗原結合単位を含む、請求項２および１１乃至１５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１７】
Ｂ細胞により発現される前記第１の標的抗原およびＢ細胞により発現される前記第２の標的抗原が同じ抗原である、請求項１６に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１８】
少なくとも４つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、（ｉ）第１の抗原結合単位が、第１の腫瘍抗原に結合することにより腫瘍細胞を特異的に標的化するか、またはＢ細胞により発現される第１の標的抗原に結合することによりＢ細胞を標的化し、第２の抗原結合単位が、第１のＮＫ細胞活性化受容体に特異的に結合し、第３の抗原結合単位が、第２のＮＫ細胞活性化受容体に結合し、第４の抗原結合単位が、第２の腫瘍抗原またはＢ細胞により発現される第２の標的抗原に結合し、（ｉｉ）前記第１のＮＫ受容体がＮＫｐ３０であり、前記第２のＮＫ受容体がＮＫｐ３０ではない、多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１９】
前記第１の腫瘍抗原および前記第２の腫瘍抗原が同じ腫瘍抗原である、請求項１８に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項２０】
前記第１の腫瘍抗原または前記第２の腫瘍抗原が、１ＧＨ−ＩＧＫ、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、シクロフィリンＣ会合タンパク質、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン−４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ  ７３３、ＢＡＧＥ、ＢＣＭＡ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ベータカテニン、ベータ−ＨＣＧ、ＢｒＥ３抗原、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ  １５−３＼ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、炭酸脱水酵素ＩＸ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫ４ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＯ−０２９、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１ａ、結腸特異的抗原ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、Ｇａ７３３ＶＥｐＣＡＭ、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、Ｈ４−ＲＥＴ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＨＴｇｐ−１７５、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４抗原、ＫＳＡ、ＫＳ−１抗原、ＫＳ１−４、ＬＡＧＥ−１ａ、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＭＹＬ−ＲＡＲ、ＮＢ／７０Ｋ、Ｎｍ２３Ｈ１、ＮｕＭＡ、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂ���３、ＰＡＭ４抗原、膵臓がんムチン、ＰＤ１受容体（ＰＤ−１）、ＰＤ−１受容体リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＤ−１受容体リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＰＩ５、胎盤増殖因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、Ｐｍｅｌ１７前立腺酸ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＣＡＳ１、ＲＳ５、ＲＡＧＥ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｒａｓ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＳＤＤＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ２結合タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、ＴＬＰ、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＳＰ−１８０、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、トムセン−フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、チロシナーゼ、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃ１−２、ｂｃ１−６、またはＫ−ｒａｓである、請求項１乃至１０、１８、および１９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項２１】
前記第１の腫瘍抗原および前記第２の腫瘍抗原の一方または両方がＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）またはＨＥＲ２である、請求項１乃至１０、１８、および１９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項２２】
Ｂ細胞により発現される前記第１の抗原およびＢ細胞により発現される前記第２の抗原が同じ抗原である、請求項１８に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項２３】
Ｂ細胞により発現される前記第１の抗原またはＢ細胞により発現される前記第２の抗原がＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）である、請求項１、２、５乃至８、１１乃至１８、２１、２２のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項２４】
前記抗原結合単位の１つまたは複数が抗体またはその抗原結合性部分である、請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項２５】
前記抗原結合単位のそれぞれが抗体またはその抗原結合性部分である、請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項２６】
前記第１の抗原結合単位の前記抗体またはその抗原結合性部分がモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分である、請求項２４または２５に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項２７】
前記抗原結合単位のいずれか１つの前記抗体またはその抗原結合性部分が、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、またはいずれかの抗原結合性部分である、請求項２４乃至２６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項２８】
前記抗原結合単位のいずれか１つの前記抗体またはその抗原結合性部分がｓｃＦｖまたはＦａｂ抗体断片である、請求項２４乃至２６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項２９】
前記抗原結合単位の１つまたは複数が非抗体スキャフォールドタンパク質である、請求項１乃至２４および２６乃至２８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項３０】
前記非抗体スキャフォールドタンパク質がアンチカリンである、請求項２９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項３１】
前記抗原結合単位の１つまたは複数が、ポリペプチド、小分子、またはアプタマーである、請求項１乃至２４および２６乃至３０のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項３２】
少なくとも１つの抗原結合単位が、エフェクター免疫細胞により発現される分子に特異的に結合する、請求項１乃至３１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項３３】
前記エフェクター免疫細胞により発現される前記分子が、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２ａ、ＣＤ６４、またはＣＤ８９である、請求項３２に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項３４】
１つの抗原結合単位のその標的への結合が、別の抗原結合単位のその標的への結合を遮断しない、請求項１乃至３３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項３５】
前記第１の抗原結合単位および前記第２の抗原結合単位がそれらの各々の標的に結合し、両方の抗原結合単位が同時に結合したままとなる、請求項１乃至３４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項３６】
全ての抗原結合単位がそれらの各々の標的に結合し、同時に結合したままとなる、請求項１乃至３５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項３７】
第１の抗原結合単位および１つまたは複数の追加の抗原結合単位のそれらの各々の標的への結合が、第１の細胞および腫瘍またはＢ細胞を一緒になるようにブリッジ形成させることができる、請求項１乃至３６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項３８】
前記第１の細胞および前記腫瘍またはＢ細胞の前記ブリッジ形成が、フローサイトメトリーおよび／または蛍光プレートリーダーにより決定される、請求項３７に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項３９】
前記抗原結合単位の１つまたは複数が標的抗原機能を阻害する、請求項１乃至３８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項４０】
二重特異性抗体である、請求項１乃至３９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項４１】
三重特異性または四重特異性抗体である、請求項１乃至３９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項４２】
共通の軽鎖を含む、請求項１乃至４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項４３】
四価である、請求項１乃至４２のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項４４】
少なくとも１つの腫瘍またはＢ細胞抗原について少なくとも二価である、請求項１乃至４３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項４５】
ＮＫｐ３０抗原について少なくとも二価である、請求項１乃至４３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項４６】
Ｆｃドメインを含まない、請求項１乃至４５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項４７】
１つまたは複数の抗原結合単位が、Ｆｃドメイン中の１つまたは複数の免疫グロブリンＦｃ改変を含む重鎖を含む、請求項１乃至４５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項４８】
前記重鎖の前記免疫グロブリンＦｃドメインが、前記１つまたは複数の抗原結合単位のヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む、請求項４７に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項４９】
前記突然変異が前記重鎖のＣＨ３ドメイン中に存在する、請求項４８に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項５０】
クアドローマ細胞中で製造される、請求項１乃至４９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項５１】
１つまたは複数の免疫グロブリン定常領域改変を含む、請求項１乃至５０のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項５２】
前記免疫グロブリン定常領域が、抗体のヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む、請求項５１に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項５３】
１つまたは複数の突然変異が１つの抗原結合単位の軽鎖定常領域中に存在し、１つまたは複数の突然変異が別の抗原結合単位の重鎖定常領域中に存在する、請求項５１または５２に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項５４】
前記Ｆｃドメインが増加したエフェクター機能を有する、請求項４７乃至５３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項５５】
前記Ｆｃドメインが減少したエフェクター機能を有する、請求項４７乃至５３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項５６】
前記Ｆｃドメインが前記構築物の半減期を増進する、請求項４７乃至５５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項５７】
前記多重特異性抗体が、多重特異性ＩｇＧ、多重特異性抗体断片、多重特異性融合タンパク質、付加型ＩｇＧ、および多重特異性抗体コンジュゲートからなる群から選択される、請求項４７乃至５６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項５８】
前記第１の腫瘍抗原および第２の腫瘍抗原の一方または両方が腫瘍特異抗原である、請求項１乃至１０、１８乃至２１、２４乃至５４、および５６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項５９】
前記抗原結合単位の１つまたは複数が、Ｂ細胞により発現される標的抗原に特異的に結合する、請求項１乃至２、５乃至８、１１乃至１８、２２乃至５３、５５乃至５７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項６０】
少なくとも３つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第１の抗原結合単位が、Ｂ系列細胞により発現される第１の標的抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位がＮＫｐ３０抗原に特異的に結合し、第３の抗原結合単位が、第２のＢ系列細胞により発現される第２の標的抗原またはＮＫ受容体に結合する、多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項６１】
Ｂ系列細胞により発現される前記第１の標的抗原がＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）である、請求項６０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項６２】
Ｂ系列細胞により発現される前記第２の標的抗原が、ＢＣＭＡ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ７２、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９、ＴＡＣ、ＧＰＲＣ５Ｄ（Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５メンバーＤ）、ＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１）、およびＩＬ７／３Ｒからなる群から選択される、請求項６０または６１に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項６３】
前記Ｂ系列細胞が、プロＢ細胞、プレＢ細胞、移行期Ｂ細胞、濾胞性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、胚中心Ｂ細胞、形質細胞、およびメモリーＢ細胞からなる群から選択される、請求項６０乃至６２のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項６４】
前記第１の抗原結合単位が、前記Ｂ系列細胞により発現される前記第１の標的抗原の機能を阻害する、請求項６０乃至６３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項６５】
前記第１の抗原結合単位および前記第２の抗原結合単位が少なくとも１つのアミノリンカーアミノ酸配列により連結されている、請求項１乃至６４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項６６】
前記リンカーアミノ酸配列がＧＧＧＧＳｘ（配列番号２２）（ｘは、１および６を含む１〜６の整数である）を含む、請求項６５に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項６７】
（ａ）それぞれ配列番号３８、３９、および４０において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｂ）それぞれ配列番号１１、１２、および４１において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｃ）それぞれ配列番号４４、４５、および４６において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｄ）それぞれ配列番号４７、４８、および４６において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｅ）それぞれ配列番号１１、４５、および４９において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｆ）それぞれ配列番号１１、５０、および４１において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または
（ｇ）それぞれ配列番号４４、５０、および４１において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
を含む、請求項１乃至６６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項６８】
配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つの重鎖可変領域配列または配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つの配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変配列を含む、請求項１乃至６７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項６９】
（ａ）それぞれ配列番号１５、１６、および４２において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または（ｂ）それぞれ配列番号６９、７０、および７１において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項１乃至６８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項７０】
配列番号１４、２５、もしくは７２において示される重鎖可変領域配列または配列番号１４、２５、もしくは７２において示される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変配列を含む、請求項６９に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項７１】
それぞれ配列番号１９、２０、および４３において示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項１乃至７０のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項７２】
配列番号１８において示される軽鎖可変領域配列または配列番号１８において示される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変配列を含む、請求項７１に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項７３】
配列番号９、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、および配列番号７４のいずれか１つにおいて示される重鎖配列ならびに配列番号８において示される軽鎖配列を含む、請求項１乃至７２のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項７４】
（ａ）配列番号３８（ＹＴＦＸ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４Ｈであり、Ｘ１はＴまたはＳであり、Ｘ２はＮまたはＳであり、Ｘ３はＹまたはＨであり、Ｘ４はＭまたはＶである）のＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号３９（ＧＸ５ＩＤＰＳＸ６ＧＸ７Ｘ８ＴＹＡであり、Ｘ５はＶまたはＩであり、Ｘ６はＧまたはＤであり、Ｘ７はＧ、ＹまたはＳであり、Ｘ８はＮまたはＳである）のＣＤＲＨ２、および
（ｃ）配列番号４０（ＡＲＧＲＹＤＹＸ９ＤＹＬＧＷＦＤＸ１０であり、Ｘ９はＧまたはＳであり、Ｘ１０はＰまたはＧである）のＣＤＲＨ３
を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７５】
ＣＤＲＨ１が配列番号１１であり、ＣＤＲＨ２が配列番号１２であり、ＣＤＲＨ３が配列番号４１である、請求項７４に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７６】
ＣＤＲＨ１が配列番号４４であり、ＣＤＲＨ２が配列番号４５であり、ＣＤＲＨ３が配列番号４６である、請求項７４に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７７】
ＣＤＲＨ１が配列番号４７であり、ＣＤＲＨ２が配列番号４８であり、ＣＤＲＨ３が配列番号４６である、請求項７４に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７８】
ＣＤＲＨ１が配列番号１１であり、ＣＤＲＨ２が配列番号４５であり、ＣＤＲＨ３が配列番号４９である、請求項７４に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７９】
ＣＤＲＨ１が配列番号１１であり、ＣＤＲＨ２が配列番号５０であり、ＣＤＲＨ３が配列番号４１である、請求項７４に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８０】
ＣＤＲＨ１が配列番号４４であり、ＣＤＲＨ２が配列番号５０であり、ＣＤＲＨ３が配列番号４１である、請求項７４に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８１】
配列番号１９のＣＤＲＬ１、配列番号２０のＣＤＲＬ２、および配列番号４３のＣＤＲＬ３をさらに含む、請求項７４乃至８０のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８２】
配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一の重鎖可変配列を含む、請求項７４乃至８１のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８３】
配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一の重鎖可変配列を含む、請求項７４乃至８１のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８４】
配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一の重鎖可変配列を含む、請求項７４乃至８１のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８５】
配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一の重鎖可変配列を含む、請求項７４乃至８１のいずれか１項の請求項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８６】
配列番号５５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一の重鎖可変配列を含む、請求項７４乃至８１のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８７】
配列番号５６のアミノ酸配列または配列番号５７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一の重鎖可変配列を含む、請求項７４乃至８１のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８８】
配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一の軽鎖可変配列を含む、請求項７４乃至８７のいずれか１項の請求項のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８９】
配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つから選択される重鎖可変配列ならびに配列番号１８の軽鎖可変配列を含む、請求項７４に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９０】
ヒトＢＣＭＡに結合した場合、配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つの重鎖可変領域配列ならびに配列番号１８の軽鎖可変配列を含む抗ヒトＢＣＭＡ抗体により結合されるアミノ酸残基の少なくとも１つに結合する、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９１】
（ａ）配列番号１５のＣＤＲＨ１、配列番号１６のＣＤＲＨ２、および配列番号４２のＣＤＲＨ３または（ｂ）配列番号６９のＣＤＲＨ１、配列番号７０のＣＤＲＨ２、および配列番号７１のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９２】
配列番号１９のＣＤＲＬ１、配列番号２０のＣＤＲＬ２、および配列番号４３のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項９１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９３】
配列番号１４、配列番号２５、または配列番号７２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一の重鎖可変配列を含む、請求項９１または９２に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９４】
配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一の軽鎖可変配列を含む、請求項９１乃至９３のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９５】
配列番号１４、配列番号２５、または配列番号７２の重鎖可変配列および配列番号１８の軽鎖可変配列を含む、請求項９１乃至９４のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９６】
ヒトＮＫｐ３０に結合した場合、（ａ）配列番号１４、配列番号２５、もしくは配列番号７２の重鎖可変領域配列および配列番号１８の軽鎖可変領域配列、または（ｂ）配列番号７８の重鎖可変領域配列および配列番号８０の軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトＮＫｐ３０抗体の結合を交差遮断する、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９７】
配列番号７の残基Ｉ５０、Ｓ８２、またはＬ１１３の少なくとも１つを含むヒトＮＫｐ３０上のエピトープに結合する、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項９８】
前記エピトープが配列番号７の残基Ｉ５０を含む、請求項９７に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項９９】
前記エピトープが配列番号７の残基Ｓ８２を含む、請求項９７に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１００】
前記エピトープが配列番号７の残基Ｌ１１３を含む、請求項９７に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１０１】
前記エピトープが、残基（ａ）配列番号７のＩ５０およびＳ８２、（ｂ）配列番号７のＩ５０およびＳＬ１１３、（ｃ）配列番号７のＳ８２およびＬ１１３、または（ｄ）配列番号７のＩ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３を含む、請求項９７に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１０２】
約１×１０−６またはそれ未満の親和性（ＫＤ）でＮＫｐ３０に結合する、請求項９７乃至１０１のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１０３】
前記ヒトＮＫｐ３０のリガンド結合領域に結合する、請求項９７乃至１０２のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１０４】
前記ＮＫｐ３０リガンドが、ＢＡＧ６、Ｂ７−Ｈ６、またはＧａｌ−３である、請求項１０３に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１０５】
配列番号７の残基Ｉ５０、Ｓ８２、またはＬ１１３、またはその任意の組合せのアラニンへの突然変異が、ヒトＮＫｐ３０への結合の喪失を結果としてもたらす、請求項９７乃至１０４のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１０６】
配列番号７のアミノ酸残基５０〜１１３内に位置するエピトープに結合する、請求項９７乃至１０５のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１０７】
前記エピトープが非リニアエピトープである、請求項９７乃至１０６のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１０８】
（ａ）それぞれ配列番号１５、１６、および４２において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１９、２０および４３において示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｂ）それぞれ配列番号６９、７０および７１において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１９、２０および４３において示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに
（ｃ）それぞれ配列番号７５、７６、および７７において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号８０の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
からなる群から選択される重鎖および軽鎖ＣＤＲを有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトＮＫｐ３０上の前記エピトープへの結合について競合する、請求項９７乃至１０７のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１０９】
配列番号１４、配列番号２５、もしくは配列番号７２の重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号１８の軽鎖可変領域アミノ酸配列、または配列番号７８の重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号８０の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトＮＫｐ３０上の前記エピトープへの結合について競合する、請求項９７乃至１０８のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１１０】
（ａ）配列番号１４、配列番号２５、または配列番号７２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域または（ｂ）配列番号７８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号８０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトＮＫｐ３０上の前記エピトープへの結合について競合する、請求項９７乃至１０９のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１１１】
ヒトＮＫｐ３０のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、前記エピトープが配列番号７のアミノ酸５０〜１１３内にありまたはそれとオーバーラップし、Ｉ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３における置換の１つまたは複数が前記抗体または抗原結合性部分のヒトＮＫｐ３０への結合を妨害する、抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１１２】
前記エピトープがコンホメーショナルエピトープである、請求項１１１に記載の抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１１３】
前記エピトープがリニアエピトープである、請求項１１１に記載の抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１１４】
ＮＫｐ３０抗原に特異的に結合する前記第２の抗原結合単位が配列番号７の残基Ｉ５０、Ｓ８２、またはＬ１１３の少なくとも１つを含むヒトＮＫｐ３０上のエピトープに結合する、請求項１乃至７３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１１５】
前記エピトープが配列番号７の残基Ｉ５０を含む、請求項１１４に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１１６】
前記エピトープが配列番号７の残基Ｓ８２を含む、請求項１１４に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１１７】
前記エピトープが配列番号７の残基Ｌ１１３を含む、請求項１１４に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１１８】
前記エピトープが、残基（ｉ）配列番号７のＩ５０およびＳ８２、（ｉｉ）配列番号７のＩ５０およびＳＬ１１３、（ｉｉｉ）配列番号７のＳ８２およびＬ１１３または（ｉｖ）配列番号７のＩ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３を含む、請求項１１４に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１１９】
前記第２の抗原結合単位または構築物が約１×１０−６またはそれ未満の親和性（ＫＤ）でＮＫｐ３０に結合する、請求項１１４乃至１１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１２０】
前記第２の抗原結合単位またはその構築物がヒトＮＫｐ３０のリガンド結合領域に結合する、請求項１１４乃至１１９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１２１】
前記ＮＫｐ３０リガンドが、ＢＡＧ６、Ｂ７−Ｈ６、またはＧａｌ−３である、請求項１２０に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１２２】
配列番号７の残基Ｉ５０、Ｓ８２、またはＬ１１３、またはその任意の組合せのアラニンへの突然変異が、ヒトＮＫｐ３０への結合の喪失を結果としてもたらす、請求項１１４乃至１２１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１２３】
前記エピトープが非リニアエピトープである、請求項１１４乃至１２２のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１２４】
前記第２の抗原結合単位または構築物が、
（ａ）それぞれ配列番号１５、１６、および４２において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１９、２０および４３において示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｂ）それぞれ配列番号６９、７０および７１において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１９、２０および４３において示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに
（ｃ）それぞれ配列番号７５、７６、および７７において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号８０の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
からなる群から選択される重鎖および軽鎖ＣＤＲを有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトＮＫｐ３０上の前記エピトープへの結合について競合する、請求項１１４乃至１２３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１２５】
前記第２の抗原結合単位または構築物が、配列番号１４、配列番号２５、もしくは配列番号７２の重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号１８の軽鎖可変領域アミノ酸配列、または配列番号７８の重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号８０の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトＮＫｐ３０上の前記エピトープへの結合について競合する、請求項１１４乃至１２４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１２６】
前記第２の抗原結合単位または構築物が、（ｉ）配列番号１４、配列番号２５、もしくは配列番号７２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または（ｉｉ）配列番号７８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号８０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトＮＫｐ３０上の前記エピトープへの結合について競合する、請求項１１４乃至１２５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１２７】
前記第２の抗原結合単位がヒトＮＫｐ３０のエピトープに結合し、前記エピトープが配列番号７のアミノ酸５０〜１１３内にありまたはそれとオーバーラップし、Ｉ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３における置換の１つまたは複数が前記抗体または抗原結合性部分のヒトＮＫｐ３０への結合を妨害する、請求項１乃至７３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
【請求項１２８】
前記エピトープがコンホメーショナルエピトープである、請求項１２７に記載の抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１２９】
前記エピトープがリニアエピトープである、請求項１２７に記載の抗体またはその抗原結合性部分。
【請求項１３０】
請求項１乃至１２９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片をコードする核酸。
【請求項１３１】
請求項１３０に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１３２】
１つまたは複数の発現制御配列をさらに含む、請求項１３１に記載の発現ベクター。
【請求項１３３】
請求項１３１または１３２に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項１３４】
哺乳動物細胞である、請求項１３３に記載の細胞。
【請求項１３５】
前記哺乳動物細胞が齧歯動物細胞である、請求項１３４に記載の細胞。
【請求項１３６】
前記齧歯動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１３５に記載の細胞。
【請求項１３７】
多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片を製造する方法であって、請求項１３３乃至１３６のいずれか１項に記載の細胞を前記細胞による前記発現ベクターからの前記多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片の発現のために好適な条件下で培養することを含む、方法。
【請求項１３８】
前記細胞または前記細胞が培養された培地から前記構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片を単離することをさらに含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
請求項１乃至１２６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４０】
（ａ）請求項１乃至１２９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片および
（ｂ）（ａ）の多重特異性抗原結合性構築物または単離された抗体もしくはその抗原結合性断片にコンジュゲート化した異種部分
を含む、タンパク質コンジュゲート分子。
【請求項１４１】
前記異種部分が、治療剤、毒素、薬物、または放射性部分である、請求項１４０に記載のタンパク質コンジュゲート分子。
【請求項１４２】
対象においてがん細胞に対する免疫応答を増進する方法であって、前記対象に有効量の請求項１乃至１０、１８乃至２１、２４乃至５４、５６乃至５８、６５乃至１２９、および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与し、それにより、前記対象においてがん細胞に対する免疫応答を増進することを含む、方法。
【請求項１４３】
前記免疫応答がＮＫ細胞媒介性免疫応答である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記がん細胞が、血液がん細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、白血病細胞、神経学的がん細胞、乳がん細胞、前立腺がん細胞、皮膚がん細胞、肺がん細胞、膀胱がん細胞、腎臓がん細胞、頭頸部がん細胞、胃腸がん細胞、結腸直腸がん細胞、肝臓がん細胞、膵臓がん細胞、泌尿生殖器がん細胞、骨がん細胞、および血管がん細胞である、請求項１４２または１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記がん細胞が前記第１の腫瘍抗原を発現する、請求項１４２乃至１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記がん細胞が前記第１の腫瘍抗原および前記第２の腫瘍抗原を発現する、請求項１４２乃至１４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４７】
対象においてＢ細胞に対する免疫応答を増進する方法であって、前記対象に有効量の請求項１乃至２、５乃至８、１１乃至１８、２２乃至５３、５５乃至５７、５９乃至１２９、および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与し、それにより、前記対象においてＢ細胞に対する免疫応答を増進することを含む、方法。
【請求項１４８】
前記免疫応答がＮＫ細胞媒介性免疫応答である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記Ｂ細胞が自己反応性Ｂ細胞または形質細胞である、請求項１４７または１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記Ｂ細胞が前記第１のＢ細胞抗原を発現する、請求項１４７乃至１４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５１】
前記Ｂ細胞が前記第１のＢ細胞抗原および前記第２のＢ細胞抗原を発現する、請求項１４７乃至１５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５２】
対象においてがんを治療する方法であって、前記対象に有効量の請求項１乃至１０、１８乃至２１、２４乃至５４、５６乃至５８、６５乃至１２９、および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与することを含む、方法。
【請求項１５３】
それを必要とする対象においてがんを治療しもしくはその進行を遅延させまたは腫瘍成長を低減もしくは阻害する方法であって、前記対象に有効量の請求項１乃至１０、１８乃至２１、２４乃至５４、５６乃至５８、６５乃至１２９、および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与することを含む、方法。
【請求項１５４】
前記がんが、血液がん、リンパ腫、骨髄腫、白血病、神経学的がん、乳がん、前立腺がん、皮膚がん、肺がん、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、胃腸がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、または血管がんである、請求項１５２または１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記がんが、前記第１の腫瘍抗原を発現するがん細胞を含む、請求項１５２乃至１５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記がんが、前記第１の腫瘍抗原および前記第２の腫瘍抗原を発現するがん細胞を含む、請求項１５２乃至１５５のいずれか１項の請求項に記載の方法。
【請求項１５７】
前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートが、ＮＫｐ３０機能をアゴナイズすることにより前記対象の免疫応答を増進する、請求項１５２乃至１５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５８】
前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートがナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性がん細胞溶解および／またはγδ  Ｔ細胞機能を増進する、請求項１５２乃至１５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートがγδ  Ｔ細胞媒介性細胞傷害性またはサイトカイン産生を増進する、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
抗がん療法を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１５２乃至１５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記抗がん療法が、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、細胞療法、サイトカイン療法、放射線療法、寒冷療法、または外科療法である、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記抗がん療法が、前記多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片を用いる治療の前、同時、または後に投与される、請求項１６０または１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記抗がん療法が免疫療法であり、前記対象における前記がんが、前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートを用いる治療の非存在下で前記免疫療法に対して難治性である、請求項１６０乃至１６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートが、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される、請求項１５２乃至１６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記がんがＣＤ１６欠損性腫瘍微環境を含み、または、前記がん細胞がＣＤ１６欠損性腫瘍微環境中に存在する、請求項１５２乃至１６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６６】
前記対象の前記がんにおけるＣＤ１６の発現レベルを検出することをさらに含む、請求項１５２乃至１６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６７】
前記ＣＤ１６を検出することがＣＤ１６ａまたはＣＤ１６ｂのレベルを検出することを含む、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
前記ＣＤ１６欠損性微環境が、前記対象に対する造血幹細胞移植と関連付けられる、請求項１６５乃至１６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記ＣＤ１６欠損性微環境が浸潤性ＮＫ細胞の集団を含み、前記浸潤性ＮＫ細胞が対照ＮＫ細胞と比較して５０％未満のＣＤ１６の発現を有する、請求項１６５乃至１６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７０】
前記浸潤性ＮＫ細胞が、対照ＮＫ細胞と比較して３０％未満、２０％未満、または１０％未満のＣＤ１６の発現を有する、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
前記ＣＤ１６欠損性微環境が浸潤性ＮＫ細胞の集団を含み、前記浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも１０％が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する、請求項１６５乃至１６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７２】
前記浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
前記がんが、低いレベルの腫瘍抗原を発現する細胞を含む、請求項１５２乃至１７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７４】
前記腫瘍抗原のレベルががん細胞当たり１００，０００未満の腫瘍抗原コピーである、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記腫瘍抗原のレベルが、がん細胞当たり９０，０００未満、７５，０００未満、５０，０００未満、または４０，０００未満の腫瘍抗原コピーである、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記対象の１つまたは複数のがん細胞の腫瘍抗原のレベルを検出することをさらに含む、請求項１５２乃至１７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７７】
自己免疫疾患を有する対象を治療する方法であって、前記対象に請求項１乃至２、５乃至８、１１乃至１８、２２乃至５３、５５乃至５７、５９乃至１２９、および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与することを含む、方法。
【請求項１７８】
前記自己免疫疾患が、全体的または部分的に自己反応性Ｂ細胞により媒介される、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
前記対象が、標的細胞を枯渇されており、赤芽球癆を有するまたはそのリスクがある、請求項１７７または１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
前記自己免疫疾患が、全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、１型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、原発性胆汁胆管炎、グッドパスチャー病、原発性膜性腎症、卵巣不全、および自己免疫性睾丸炎からなる群から選択される、請求項１７７乃至１７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８１】
前記多重特異性抗原結合性構築物が、ＮＫｐ３０機能をアゴナイズすることにより前記対象の免疫応答を増進する、請求項１７７乃至１８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８２】
前記多重特異性抗原結合性構築物が、Ｂ細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を増進する、請求項１７７乃至１８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８３】
剤を前記対象に投与することをさらに含み、前記剤が、コルチコステロイド、ＤＭＡＲＤ、および抗サイトカイン療法からなる群から選択される、請求項１７７乃至１８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８４】
前記抗サイトカイン療法が、抗ＴＮＦα抗体、ＴＮＦα受容体トラップ、抗ＩＬ１７抗体、または抗ＩＬ２３抗体である、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートが、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される、請求項１７７乃至１８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８６】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化させまたはその活性化を持続化させる方法であって、前記ＮＫ細胞を有効量の請求項１乃至１２９および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートと接触させることを含む、方法。
【請求項１８７】
前記接触させることがｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８８】
前記接触させることがｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８９】
対象においてナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化させまたはその活性化を持続化させる方法であって、前記ＮＫ細胞を有効量の請求項１乃至１２９および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートと接触させることを含み、前記ＮＫ細胞が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する、方法。
【請求項１９０】
前記対象ががんを有する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
前記がんが、前記構築物が特異的に結合する前記腫瘍抗原の一方または両方を発現する、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
前記接触させるＮＫ細胞が腫瘍浸潤性ＮＫ細胞である、請求項１８９乃至１９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９３】
前記ＮＫ細胞の前記活性化または持続的な活性化が腫瘍微環境中で起こる、請求項１８９乃至１９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９４】
前記ＮＫ細胞のＣＤ１６発現が前記対照ＮＫ細胞のＣＤ１６発現の５０％未満である、請求項１８９乃至１９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９５】
前記ＮＫ細胞のＣＤ１６発現が、前記対照ＮＫ細胞のＣＤ１６発現の４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満である、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９６】
前記腫瘍微環境が浸潤性ＮＫ細胞の集団を含み、前記浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも１０％が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９７】
前記浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
前記ＮＫ細胞がＣＤ１６を発現しない、請求項１８９乃至１９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９９】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による標的細胞の殺傷を増進する方法であって、前記ＮＫ細胞の存在下で前記標的細胞を請求項１乃至１２９および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートと接触させることを含む、方法。
【請求項２００】
前記接触工程がｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
前記接触工程がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０２】
前記標的細胞ががん細胞である、請求項１９９乃至２０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０３】
前記標的細胞がＢ細胞である、請求項１９９乃至２０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０４】
対象においてＮＫ細胞によるがん細胞の殺傷を増進する方法であって、前記対象に有効量の請求項１乃至１２９および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与することを含み、前記がん細胞が、前記構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片が結合する腫瘍抗原を１００，０００未満のコピー数で発現する、方法。
【請求項２０５】
前記がん細胞が、がん細胞当たり９０，０００未満の腫瘍抗原コピーのコピー数で前記腫瘍抗原を発現する、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０６】
前記がん細胞が、がん細胞当たり７５，０００未満、５０，０００未満、または４０，０００未満の腫瘍抗原コピーのコピー数で前記腫瘍抗原を発現する、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０７】
前記対象の１つまたは複数のがん細胞による前記腫瘍抗原の発現を検出することをさらに含む、請求項２０４乃至２０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０８】
自己反応性Ｂ細胞性炎症状態を有する対象を治療する方法であって、前記対象に有効量の請求項１乃至２、５乃至８、１１乃至１８、２２乃至５３、５５乃至５７、５９乃至１２９、および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与することを含む、方法。
【請求項２０９】
前記有効量の多重特異性抗原結合性構築物または医薬組成物が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡを発現する形質細胞の骨髄レベルを低減する、請求項２０８に記載の方法。
【請求項２１０】
前記自己反応性Ｂ細胞性炎症状態が、自己反応性Ｂ細胞により媒介される自己免疫疾患である、請求項２０８または２０９に記載の方法。
【請求項２１１】
前記自己反応性Ｂ細胞性炎症状態が、重症筋無力症、軽鎖アミロイドーシス、尋常性天疱瘡、および免疫性血小板減少症から選択される疾患である、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
自己反応性Ｂ細胞により媒介される前記自己免疫疾患が、全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、１型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、原発性胆汁胆管炎、グッドパスチャー病、原発性膜性腎症、卵巣不全、および自己免疫性睾丸炎からなる群から選択される、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１３】
自己反応性Ｂ細胞により媒介される前記自己免疫疾患が重症筋無力症である、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１４】
前記対象に抗炎症剤を投与することをさらに含む、請求項２０８乃至２１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１５】
前記抗炎症剤が、コルチコステロイド、ＤＭＡＲＤｓ、または抗サイトカイン剤からなる群から選択される、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２１６】
前記対象がヒトである、請求項１４２乃至１８５、１８９乃至１９８、および２０４乃至２１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１７】
対象におけるがん細胞に対する免疫応答の増進において使用するための、請求項１乃至１０、１８乃至２１、２４乃至５４、５６乃至５８、６５乃至１２９、および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート。
【請求項２１８】
前記免疫応答がＮＫ細胞媒介性免疫応答である、請求項２１７に記載の使用。
【請求項２１９】
前記がん細胞が、血液がん細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、白血病細胞、神経学的がん細胞、乳がん細胞、前立腺がん細胞、皮膚がん細胞、肺がん細胞、膀胱がん細胞、腎臓がん細胞、頭頸部がん細胞、胃腸がん細胞、結腸直腸がん細胞、肝臓がん細胞、膵臓がん細胞、泌尿生殖器がん細胞、骨がん細胞、および血管がん細胞である、請求項２１７または２１８に記載の使用。
【請求項２２０】
前記がん細胞が前記第１の腫瘍抗原を発現する、請求項２１７乃至２１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２１】
前記がん細胞が前記第１の腫瘍抗原および前記第２の腫瘍抗原を発現する、請求項２１７乃至２２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２２】
対象におけるＢ細胞に対する免疫応答の増進において使用するための、請求項１乃至２、５乃至８、１１乃至１８、２２乃至５３、５５乃至５７、５９乃至１２９、および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート。
【請求項２２３】
前記免疫応答がＮＫ細胞媒介性免疫応答である、請求項２２２に記載の使用。
【請求項２２４】
前記Ｂ細胞が自己反応性Ｂ細胞または形質細胞である、請求項２２２または２２３に記載の使用。
【請求項２２５】
前記Ｂ細胞が前記第１のＢ細胞抗原を発現する、請求項２２２乃至２２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２６】
前記Ｂ細胞が前記第１のＢ細胞抗原および前記第２のＢ細胞抗原を発現する、請求項２２２乃至２２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２７】
対象におけるがんの治療において使用するための、請求項１乃至１０、１８乃至２１、２４乃至５４、５６乃至５８、６５乃至１２９、および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート。
【請求項２２８】
それを必要とする対象におけるがんの治療もしくはその進行の遅延または腫瘍成長の低減もしくは阻害において使用するための、請求項１乃至１０、１８乃至２１、２４乃至５４、５６乃至５８、６５乃至１２９、および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート。
【請求項２２９】
前記がんが、血液がん、リンパ腫、骨髄腫、白血病、神経学的がん、乳がん、前立腺がん、皮膚がん、肺がん、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、胃腸がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、または血管がんである、請求項２２７または２２８に記載の使用。
【請求項２３０】
前記がんが、前記第１の腫瘍抗原を発現するがん細胞を含む、請求項２２７乃至２２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３１】
前記がんが、前記第１の腫瘍抗原および前記第２の腫瘍抗原を発現するがん細胞を含む、請求項２２７乃至２３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３２】
前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートが、ＮＫｐ３０機能をアゴナイズすることにより前記対象の免疫応答を増進する、請求項２２７乃至２３１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３３】
前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートがナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性がん細胞溶解および／またはγδ  Ｔ細胞機能を増進する、請求項２２７乃至２３２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３４】
前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートがγδ  Ｔ細胞媒介性細胞傷害性またはサイトカイン産生を増進する、請求項２３３に記載の使用。
【請求項２３５】
抗がん療法を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２２７乃至２３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３６】
前記抗がん療法が、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、細胞療法、サイトカイン療法、放射線療法、寒冷療法、または外科療法である、請求項２３５に記載の使用。
【請求項２３７】
前記抗がん療法が、前記多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片を用いる治療の前、同時、または後に投与される、請求項２３５または２３６に記載の使用。
【請求項２３８】
前記抗がん療法が免疫療法であり、前記対象における前記がんが、前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートを用いる治療の非存在下で前記免疫療法に対して難治性である、請求項２３５乃至２３７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３９】
前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートが、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される、請求項２２７乃至２３８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４０】
前記がんがＣＤ１６欠損性腫瘍微環境を含み、または、前記がん細胞がＣＤ１６欠損性腫瘍微環境中に存在する、請求項２２７乃至２３９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４１】
前記対象の前記がんにおけるＣＤ１６の発現レベルを検出することをさらに含む、請求項２２７乃至２４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４２】
前記ＣＤ１６を検出することがＣＤ１６ａまたはＣＤ１６ｂのレベルを検出することを含む、請求項２４１に記載の使用。
【請求項２４３】
前記ＣＤ１６欠損性微環境が、前記対象に対する造血幹細胞移植と関連付けられる、請求項２４０乃至２４２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４４】
前記ＣＤ１６欠損性微環境が浸潤性ＮＫ細胞の集団を含み、前記浸潤性ＮＫ細胞が対照ＮＫ細胞と比較して５０％未満のＣＤ１６の発現を有する、請求項２４０乃至２４３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４５】
前記浸潤性ＮＫ細胞が、対照ＮＫ細胞と比較して３０％未満、２０％未満、または１０％未満のＣＤ１６の発現を有する、請求項２４４に記載の使用。
【請求項２４６】
前記ＣＤ１６欠損性微環境が浸潤性ＮＫ細胞の集団を含み、前記浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも１０％が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する、請求項２４０乃至２４４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４７】
前記浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する、請求項２４６に記載の使用。
【請求項２４８】
前記がんが、低いレベルの腫瘍抗原を発現する細胞を含む、請求項２２７乃至２４７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４９】
前記腫瘍抗原のレベルががん細胞当たり１００，０００未満の腫瘍抗原コピーである、請求項２４８に記載の使用。
【請求項２５０】
前記腫瘍抗原のレベルが、がん細胞当たり９０，０００未満、７５，０００未満、５０，０００未満、または４０，０００未満の腫瘍抗原コピーである、請求項２４９に記載の使用。
【請求項２５１】
前記対象の１つまたは複数のがん細胞の腫瘍抗原のレベルを検出することをさらに含む、請求項２２７乃至２５０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５２】
自己免疫疾患を有する対象の治療において使用するための、請求項１乃至２、５乃至８、１１乃至１８、２２乃至５３、５５乃至５７、５９乃至１２９、および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート。
【請求項２５３】
前記自己免疫疾患が、全体的または部分的に自己反応性Ｂ細胞により媒介される、請求項２５２に記載の使用。
【請求項２５４】
前記対象が、標的細胞を枯渇されており、赤芽球癆を有するまたはそのリスクがある、請求項２５２または２５３に記載の使用。
【請求項２５５】
前記自己免疫疾患が、全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、１型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、原発性胆汁胆管炎、グッドパスチャー病、原発性膜性腎症、卵巣不全、および自己免疫性睾丸炎からなる群から選択される、請求項２５２乃至２５４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５６】
前記多重特異性抗原結合性構築物が、ＮＫｐ３０機能をアゴナイズすることにより前記対象の免疫応答を増進する、請求項２５２乃至２５５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５７】
前記多重特異性抗原結合性構築物が、Ｂ細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を増進する、請求項２５２乃至２５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５８】
剤を前記対象に投与することをさらに含み、前記剤が、コルチコステロイド、ＤＭＡＲＤ、および抗サイトカイン療法からなる群から選択される、請求項２５２乃至２５７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５９】
前記抗サイトカイン療法が、抗ＴＮＦα抗体、ＴＮＦα受容体トラップ、抗ＩＬ１７抗体、または抗ＩＬ２３抗体である、請求項２５８に記載の使用。
【請求項２６０】
前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートが、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される、請求項２５２乃至２５９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６１】
対象におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化またはその活性化の持続化において使用するための、請求項１乃至１２９および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートであって、前記ＮＫ細胞が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート。
【請求項２６２】
前記対象ががんを有する、請求項２６１に記載の使用。
【請求項２６３】
前記がんが、前記構築物が特異的に結合する前記腫瘍抗原の一方または両方を発現する、請求項２６２に記載の使用。
【請求項２６４】
前記接触させるＮＫ細胞が腫瘍浸潤性ＮＫ細胞である、請求項２６１乃至２６３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６５】
前記ＮＫ細胞の前記活性化または持続的な活性化が腫瘍微環境中で起こる、請求項２６１乃至２６４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６６】
前記ＮＫ細胞のＣＤ１６発現が前記対照ＮＫ細胞のＣＤ１６発現の５０％未満である、請求項２６１乃至２６５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６７】
前記ＮＫ細胞のＣＤ１６発現が、前記対照ＮＫ細胞のＣＤ１６発現の４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満である、請求項２６６に記載の使用。
【請求項２６８】
前記腫瘍微環境が浸潤性ＮＫ細胞の集団を含み、前記浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも１０％が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する、請求項２６５に記載の使用。
【請求項２６９】
前記浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する、請求項２６８に記載の使用。
【請求項２７０】
前記ＮＫ細胞がＣＤ１６を発現しない、請求項２６１乃至２６９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７１】
対象におけるＮＫ細胞によるがん細胞の殺傷の増進において使用するための、請求項１乃至１２９および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートであって、前記がん細胞が、前記構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片が結合する腫瘍抗原を１００，０００未満のコピー数で発現する、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート。
【請求項２７２】
前記がん細胞が、がん細胞当たり９０，０００未満の腫瘍抗原コピーのコピー数で前記腫瘍抗原を発現する、請求項２７１に記載の使用。
【請求項２７３】
前記がん細胞が、がん細胞当たり７５，０００未満、５０，０００未満、または４０，０００未満の腫瘍抗原コピーのコピー数で前記腫瘍抗原を発現する、請求項２７２に記載の使用。
【請求項２７４】
前記対象の１つまたは複数のがん細胞による前記腫瘍抗原の発現を検出することをさらに含む、請求項２７１乃至２７３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７５】
対象における自己反応性Ｂ細胞性炎症状態の治療において使用するための、請求項１乃至２、５乃至８、１１乃至１８、２２乃至５３、５５乃至５７、５９乃至１２９、および１３９乃至１４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート。
【請求項２７６】
前記有効量の多重特異性抗原結合性構築物または医薬組成物が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡを発現する形質細胞の骨髄レベルを低減する、請求項２７５に記載の使用。
【請求項２７７】
前記自己反応性Ｂ細胞性炎症状態が、自己反応性Ｂ細胞により媒介される自己免疫疾患である、請求項２７５または２７６に記載の使用。
【請求項２７８】
前記自己反応性Ｂ細胞性炎症状態が、重症筋無力症、軽鎖アミロイドーシス、尋常性天疱瘡、および免疫性血小板減少症から選択される疾患である、請求項２７７に記載の使用。
【請求項２７９】
自己反応性Ｂ細胞により媒介される前記自己免疫疾患が、全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、１型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、原発性胆汁胆管炎、グッドパスチャー病、原発性膜性腎症、卵巣不全、および自己免疫性睾丸炎からなる群から選択される、請求項２７７に記載の使用。
【請求項２８０】
自己反応性Ｂ細胞により媒介される前記自己免疫疾患が重症筋無力症である、請求項２７７に記載の使用。
【請求項２８１】
前記対象に抗炎症剤を投与することをさらに含む、請求項２７５乃至２８０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８２】
前記抗炎症剤が、コルチコステロイド、ＤＭＡＲＤｓ、または抗サイトカイン剤からなる群から選択される、請求項２８１に記載の使用。
【請求項２８３】
前記対象がヒトである、請求項２１７乃至２８２のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＮＫ細胞による標的細胞の殺傷を増進するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは主な死因の一つであり、米国癌学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；ＡＡＣＲ）の２０１７年版Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｒｅｐｏｒｔによれば、２０１５年に世界中でほぼ６分の１の死を占める。がんに関与する分子メカニズムは高度に複雑である。一部の状況では、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージなどの免疫細胞は抗腫瘍活性を呈し、腫瘍の発生および／または進行を効果的に制御することができる。免疫細胞は腫瘍抗原（腫瘍特異的または腫瘍関連抗原）を認識し、抗原を発現する細胞を排除する。しかしながら、腫瘍はまた高度に抑制性の微環境を構成し、浸潤性免疫細胞の機能を下方調節することができる。例えば、腫瘍細胞は、腫瘍特異的または腫瘍関連抗原のレベルを下方調節し、浸潤性免疫細胞による細胞死を免れることができる。結果として、患者の免疫系はがん細胞を異物として認識しないことがあり、またはがん細胞を破壊するには十分に強くないことがある。
【０００３】
がんに対する多数の治療が現在利用可能であり、これには、手術、放射線、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、標的化療法、幹細胞移植、およびプレシジョンメディシンが含まれる。具体的には、患者の内因性免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージ）を利用して腫瘍の形成および進行を阻害する免疫療法アプローチが近年開発されている。ＣＤ１６は、ある特定の免疫療法にとっての標的である。例えば、マルゲツキシマブは、多数の腫瘍細胞上に発現されるヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）を認識し、免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）上のＣＤ１６ａを標的化するＦｃ最適化モノクローナル抗体である。追加的に、免疫療法薬物をＢ細胞リンパ腫に標的化するためにＣＤ１６およびＣＤ１９を認識する二重特異性抗体断片が開発されている。開発中の別の免疫療法は、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍抗原、およびＣＤ１６に結合する多重特異性結合性タンパク質を伴う。しかしながら、ある特定の患者は、ＣＤ１６のレベルが対照ＮＫ細胞と比較してＮＫ細胞上で減少したレベルで存在するがんを有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
既存の免疫腫瘍学の療法は、患者および腫瘍の大部分にとって依然としていくぶん効果的でない。例えば、腫瘍細胞が腫瘍抗原の発現を下方調節する場合、腫瘍抗原を標的とする免疫療法は効果的でないことがある。腫瘍関連抗原を標的化するモノクローナル抗体は、低抗原発現性腫瘍に対して有効性を示さなかった。したがって、低い抗原発現レベルを有する患者はある特定の利用可能な免疫療法に対して適格ではない。
【０００５】
追加的に、炎症状態（例えば、全体的または部分的に自己反応性Ｂ細胞により媒介される炎症状態）は一般的である。Ｂ細胞（形質細胞を含む）はそのような状態において複数の役割を有し、これには、自己抗体の分泌、自己抗原の提示、炎症性サイトカインの分泌、抗原プロセシングおよび提示のモジュレーション、ならびに異所性胚中心の生成が含まれる。Ｂ細胞の枯渇が提唱されているが、大域的なＢ細胞枯渇は保護的Ｂ細胞および病原性Ｂ細胞の両方を排除する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、がん細胞に対する免疫応答を増進する（例えば、ＮＫ細胞の活性を増進する）ことができる多重特異性抗原結合性構築物の発見に少なくとも部分的に基づく。本開示はいかなる具体的な理論または作用機序によっても縛られないが、本明細書に記載の構築物は、がん細胞もしくはＢ系列細胞により発現される１つもしくは複数の腫瘍もしくはＢ系列細胞抗原、および／または１つもしくは複数の追加のＮＫ細胞受容体に結合した場合に、隣接する免疫エフェクター細胞上のＮＫｐ３０活性をアゴナイズし、それにより、構築物が結合した標的細胞に対する免疫応答を増進する（例えば、ＮＫエフェクター機能、Ｔ細胞増殖、ＩＦＮγの産生および分泌、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、ならびに／またはＴ細胞の細胞溶解活性を増加させる）ことができる。例えば、ＮＫｐ３０機能および／または１つもしくは複数の追加のＮＫ細胞受容体をアゴナイズし、１つまたは複数の腫瘍抗原（例えば、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）またはＨＥＲ２）を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を増進する多重特異性抗原結合性構築物が提供される。
【０００７】
本発明の多重特異性抗原結合性構築物は、１つまたは複数の例示的な特徴により目立つものである。本開示はいかなる具体的な理論または作用機序によっても縛られないが、第１に、１つまたは複数の腫瘍抗原またはＢ系列細胞抗原、例えば、ＢＣＭＡに結合する抗原結合単位は、標的抗原とそのコグネイトリガンドまたは受容体との相互作用を阻害することができる。一部の実施形態では、腫瘍またはＢ系列細胞抗原を介するシグナル伝達は、該抗原を発現するがん細胞の増殖および／または生存能力を増進することができる。第２に、そのような活性は記載される構築物の機能のために必要とされないが、構築物はまた、可能とされたエフェクター機能であることができ（例えば、それらは、抗体のＦｃ領域で可能とされたエフェクター機能を構成することができる）、これは抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）をサポートする。第３に、構築物は、標的細胞およびＮＫ細胞に同時に結合できるように構造化されており、第４に、構築物は、例えば腫瘍微環境中で、ＮＫｐ３０のエンゲージメントを介してＮＫ細胞活性化を誘発し、可溶性ＮＫｐ３０リガンドの効果を阻害し、ＮＫ細胞による炎症促進性サイトカインを増加させることができる他に、一部の実施形態では、１つまたは複数の追加のＮＫ細胞受容体にエンゲージメントすることができる。
【０００８】
よって、一態様では、本開示は、少なくとも２つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性、四重特異性）抗原結合性構築物であって、第１の抗原結合単位が、腫瘍またはＢ系列細胞抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位が、ＮＫｐ３０抗原に特異的に結合する、多重特異性抗原結合性構築物を提供する。
【０００９】
別の態様では、本開示は、少なくとも３つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第１の抗原結合単位が、第１の腫瘍またはＢ系列細胞抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位が、ＮＫｐ３０抗原に特異的に結合し、第３の抗原結合単位が、第２の腫瘍もしくはＢ系列細胞抗原またはＮＫ受容体（活性化ＮＫ細胞受容体）に結合する、多重特異性抗原結合性構築物を特徴とする。
【００１０】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第３の抗原結合単位は第２の腫瘍またはＢ系列細胞抗原に結合する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第３の抗原結合単位はＮＫ受容体に結合する。
【００１１】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、ＮＫ受容体はＮＫｐ３０であり、例えば、構築物はＮＫｐ３０について二価である。本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、ＮＫ受容体はＮＫＧ２Ｄである。本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、ＮＫ受容体はＮＫｐ４６またはＮＫｐ４４である。本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、ＮＫ受容体は、本明細書に記載のまたは当該技術分野において公知の任意の他のＮＫ細胞活性化受容体である。
【００１２】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、第１の腫瘍またはＢ系列細胞抗原に結合する２つの抗原結合単位を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第１の腫瘍またはＢ系列細胞抗原および第２の腫瘍またはＢ系列細胞抗原は同じ抗原である。例えば、本明細書に記載の構築物は、単一の標的抗原、例えば、ＢＣＭＡについて少なくとも二価であることができる。
【００１３】
さらに別の態様では、本開示は、少なくとも３つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第１の抗原結合単位が、第１の腫瘍またはＢ系列細胞抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位が、ＮＫｐ３０抗原に特異的に結合し、第３の抗原結合単位が、第２の腫瘍またはＢ系列細胞抗原に結合する、多重特異性抗原結合性構築物を特徴とする。
【００１４】
別の態様では、本開示は、少なくとも３つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第１の抗原結合単位が、第１の腫瘍またはＢ系列細胞抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位が、ＮＫｐ３０抗原に特異的に結合し、第３の抗原結合単位が、ＮＫ受容体に結合する、多重特異性抗原結合性構築物を特徴とする。
【００１５】
別の態様では、本開示は、少なくとも４つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、（ｉ）第１の抗原結合単位が、第１の腫瘍またはＢ系列細胞抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位が、第１のＮＫ細胞活性化受容体に特異的に結合し、第３の抗原結合単位が、第２のＮＫ細胞活性化受容体に結合し、第４の抗原結合単位が、第２の腫瘍またはＢ系列細胞抗原に結合し、（ｉｉ）第１のＮＫ受容体がＮＫｐ３０であり、第２のＮＫ受容体がＮＫｐ３０ではない、多重特異性抗原結合性構築物を提供する。例えば、第２のＮＫ受容体は、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、ＮＫ−４６、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７、またはＮＫｐ４４であることができる。
【００１６】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第１の腫瘍またはＢ系列細胞抗原および第２の腫瘍またはＢ系列細胞抗原は同じ抗原である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第１の腫瘍抗原または第２の腫瘍抗原は、１ＧＨ−ＩＧＫ、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、シクロフィリンＣ会合タンパク質（ａｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  Ｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン−４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ  ７３３、ＢＡＧＥ、ＢＣＭＡ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ベータカテニン、ベータ−ＨＣＧ、ＢｒＥ３抗原、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ  １５−３＼ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、炭酸脱水酵素ＩＸ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫ４ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＯ−０２９、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１ａ、結腸特異的抗原ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、Ｇａ７３３ＶＥｐＣＡＭ、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、Ｈ４−ＲＥＴ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＨＴｇｐ−１７５、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４抗原、ＫＳＡ、ＫＳ−１抗原、ＫＳ１−４、ＬＡＧＥ−１ａ、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＭＹＬ−ＲＡＲ、ＮＢ／７０Ｋ、Ｎｍ２３Ｈ１、ＮｕＭＡ、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ３、ＰＡＭ４抗原、膵臓がんムチン（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｕｃｉｎ）、ＰＤ１受容体（ＰＤ−１）、ＰＤ−１受容体リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＤ−１受容体リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＰＩ５、胎盤増殖因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、Ｐｍｅｌ１７前立腺酸ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＣＡＳ１、ＲＳ５、ＲＡＧＥ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｒａｓ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＳＤＤＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ２結合タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、ＴＬＰ、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＳＰ−１８０、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、トムセン−フリーデンライヒ抗原（Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）、腫瘍壊死抗原、チロシナーゼ、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃ１−２、ｂｃ１−６、またはＫ−ｒａｓである。
【００１７】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、Ｂ系列細胞により発現される第１または第２の標的抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ７２、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９、ＴＡＣからなる群から選択される。本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第１の腫瘍またはＢ系列細胞抗原および第２の腫瘍またはＢ系列細胞抗原の一方または両方はＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）である。
【００１８】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位の１つまたは複数は抗体またはその抗原結合性部分である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位のそれぞれは抗体またはその抗原結合性部分である。
【００１９】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第１の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性部分はモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位のいずれか１つの抗体またはその抗原結合性部分は、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、またはいずれかの抗原結合性部分である。
【００２０】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位のいずれか１つの抗体またはその抗原結合性部分はｓｃＦｖまたはＦａｂ抗体断片である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位の１つまたは複数は非抗体スキャフォールドタンパク質（ｎｏｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）である。
【００２１】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位の１つまたは複数は、ポリペプチド、小分子、またはアプタマーである。
一部の実施形態では、本明細書に記載の任意の構築物は、エフェクター免疫細胞により発現される分子に特異的に結合する追加の抗原結合単位をさらに含む。エフェクター免疫細胞により発現される分子は、例えば、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２ａ、ＣＤ６４、またはＣＤ８９であることができる。
【００２２】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、１つの抗原結合単位のその標的への結合は、別の抗原結合単位のその標的への結合を遮断しない。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第１の抗原結合単位および第２の抗原結合単位はそれらの各々の標的に結合し、両方の抗原結合単位は同時に結合したままとなる。
【００２３】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、全ての抗原結合単位はそれらの各々の標的に結合し、同時に結合したままとなる。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第１の抗原結合単位および１つまたは複数の追加の抗原結合単位のそれらの各々の標的への結合は、第１の細胞および腫瘍細胞またはＢ系列細胞を一緒になるようにブリッジ形成させることができる。
【００２４】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第１の細胞および腫瘍細胞またはＢ系列細胞のブリッジ形成は、フローサイトメトリーおよび／または蛍光プレートリーダーにより決定される。
【００２５】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第１の抗原結合単位および第４の抗原結合単位の一方または両方は標的抗原機能を阻害する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は多重特異性抗体である。
【００２６】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は共通の軽鎖を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は四価である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は少なくとも１つの腫瘍またはＢ系列細胞抗原について少なくとも二価である。
【００２７】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物はＦｃドメインを含まない。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原結合単位は、Ｆｃドメイン中の１つまたは複数の免疫グロブリンＦｃ改変を含む重鎖を含む。
【００２８】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、重鎖の免疫グロブリンＦｃドメインは、１つまたは複数の抗原結合単位のヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。
【００２９】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、突然変異は重鎖のＣＨ３ドメイン中に存在する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はクアドローマ細胞中で製造される。
【００３０】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は１つまたは複数の免疫グロブリン定常領域改変を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、抗体のヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。
【００３１】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は１つの抗原結合単位の軽鎖定常領域中に存在し、１つまたは複数の突然変異は別の抗原結合単位の重鎖定常領域中に存在する。
【００３２】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、Ｆｃドメインは増加したエフェクター機能を有する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、Ｆｃドメインは減少したエフェクター機能を有する。
【００３３】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、Ｆｃドメインは構築物の半減期を増進する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第１の腫瘍抗原および第２の腫瘍抗原の一方または両方は腫瘍特異抗原である。
【００３４】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第１の抗原結合単位および第２の抗原結合単位は少なくとも１つのアミノリンカーアミノ酸配列により連結されている。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、リンカーアミノ酸配列はＧＧＧＧＳｘ（配列番号２２）（ｘは、１および６を含む１〜６の整数である）を含む。
【００３５】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、それぞれ配列番号１１、１２、および１３において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。
【００３６】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、配列番号１０において示される重鎖可変領域配列を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、それぞれ配列番号１５、１６、および１７において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。
【００３７】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、配列番号１４、２５、もしくは７２において示される重鎖可変領域配列または配列番号１４、２５、もしくは７２の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変配列を含む。
【００３８】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、それぞれ配列番号１９、２０、および２１において示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。
【００３９】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、配列番号１８において示される軽鎖可変領域配列または配列番号１８の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変配列を含む。
【００４０】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、配列番号９または２４において示される重鎖配列および配列番号８において示される軽鎖配列を含む。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、それぞれ配列番号３８、３９、および４０、それぞれ配列番号１１、１２、および４１、それぞれ配列番号４４、４５、および４６、それぞれ配列番号４７、４８、および４６、それぞれ配列番号１１、４５、および４９、それぞれ配列番号１１、５０、および４１、またはそれぞれ配列番号４４、５０、および４１のいずれかにおいて示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。任意選択で、構築物は、配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つの重鎖可変領域配列または配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つの配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変配列を含む。例として、構築物は、それぞれ、（ａ）配列番号１５、１６、および４２において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、（ｂ）配列番号６９、７０、および７１において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または（ｃ）配列番号７５、７６、および７７において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含むことができる。構築物は、それぞれ配列番号１９、２０、および４３において示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含むことができる。
【００４１】
配列番号９、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、および配列番号７４のいずれか１つのアミノ酸配列を有する重鎖、ならびに配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む構築物もまた本明細書において提供される。
【００４２】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、ＮＫｐ３０抗原に特異的に結合する第２の抗原結合単位は、任意選択で、配列番号７の残基Ｉ５０、Ｓ８２、またはＬ１１３の少なくとも１つを含むヒトＮＫｐ３０上のエピトープに結合する。任意選択で、エピトープは配列番号７の残基Ｉ５０を含む。任意選択で、エピトープは配列番号７の残基Ｓ８２を含む。任意選択で、エピトープは配列番号７の残基Ｌ１１３を含む。例として、エピトープは、任意選択で、残基（ｉ）配列番号７のＩ５０およびＳ８２、（ｉｉ）配列番号７のＩ５０およびＳＬ１１３、（ｉｉｉ）配列番号７のＳ８２およびＬ１１３または（ｉｖ）配列番号７のＩ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３を含む。第２の抗原結合単位または構築物は、任意選択で、約１×１０−６またはそれ未満の親和性（ＫＤ）でＮＫｐ３０に結合する。
【００４３】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第２の抗原結合単位または構築物は、任意選択で、ヒトＮＫｐ３０のリガンド結合領域に結合する。一部の態様では、ＮＫｐ３０リガンドは、ＢＡＧ６、Ｂ７−Ｈ６、またはＧａｌ−３である。任意選択で、配列番号７の残基Ｉ５０、Ｓ８２、またはＬ１１３、またはその任意の組合せのアラニンへの突然変異は、ヒトＮＫｐ３０への結合の喪失を結果としてもたらす。エピトープは、任意選択で、非リニアエピトープである。
【００４４】
任意選択で、第２の抗原結合単位または構築物は、（ａ）それぞれ配列番号１５、１６、および４２において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１９、２０および４３において示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、（ｂ）それぞれ配列番号６９、７０および７１において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１９、２０および４３において示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに（ｃ）それぞれ配列番号７５、７６、および７７において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号８０の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列からなる群から選択される重鎖および軽鎖ＣＤＲを有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトＮＫｐ３０上のエピトープへの結合について競合する。任意選択で、第２の抗原結合単位または構築物は、配列番号１４、配列番号２５、もしくは配列番号７２の重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号１８の軽鎖可変領域アミノ酸配列、または配列番号７８の重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号８０の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトＮＫｐ３０上のエピトープへの結合について競合する。任意選択で、第２の抗原結合単位または構築物は、（ｉ）配列番号１４、配列番号２５、もしくは配列番号７２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または（ｉｉ）配列番号７８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号８０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトＮＫｐ３０上のエピトープへの結合について競合する。
【００４５】
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第２の抗原結合単位はヒトＮＫｐ３０のエピトープに結合し、エピトープは配列番号７のアミノ酸５０〜１１３内にありまたはそれとオーバーラップし、Ｉ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３における置換の１つまたは複数は抗体または抗原結合性部分のヒトＮＫｐ３０への結合を妨害する。任意選択で、エピトープはコンホメーショナルエピトープである。任意選択で、エピトープはリニアエピトープである。
【００４６】
配列番号３８（ＹＴＦＸ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４Ｈであり、Ｘ１はＴまたはＳであり、Ｘ２はＮまたはＳであり、Ｘ３はＹまたはＨであり、Ｘ４はＭまたはＶである）のＣＤＲＨ１、配列番号３９（ＧＸ５ＩＤＰＳＸ６ＧＸ７ＴＸ８ＹＡであり、Ｘ５はＶまたはＩであり、Ｘ６はＧまたはＤであり、Ｘ７はＧ、ＹまたはＳであり、Ｘ８はＮまたはＳである）のＣＤＲＨ２、および配列番号４０（ＡＲＧＲＹＤＹＸ９ＤＹＬＧＷＦＤＸ１０であり、Ｘ９はＧまたはＳであり、Ｘ１０はＰまたはＧである）のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が本明細書において提供される。単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択で、それぞれ配列番号１１、配列番号１２、および配列番号４１、それぞれ配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６、それぞれ配列番号４７、配列番号４８、および配列番号４６、それぞれ配列番号１１、配列番号４５、および配列番号４９、それぞれ配列番号１１、配列番号５０、および配列番号４１、それぞれ配列番号４４、配列番号５０、および配列番号４１のいずれかにおいて示されるようなＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含む。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１９のＣＤＲＬ１、配列番号２０のＣＤＲＬ２、および配列番号４３のＣＤＲＬ３をさらに含む。例として、記載されるような抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、または配列番号５７のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一の重鎖可変配列を含むことができる。さらなる例として、抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択で、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一の軽鎖可変配列を含む。そのため、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つから選択される重鎖可変配列、ならびに配列番号１８の軽鎖可変配列を含むことができる。
【００４７】
ヒトＢＣＭＡに結合した場合、配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つの重鎖可変領域配列、ならびに配列番号１８の軽鎖可変配列を含む抗ヒトＢＣＭＡ抗体により結合されるアミノ酸残基の少なくとも１つに結合する、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が本明細書において提供される。
【００４８】
（ａ）配列番号１５のＣＤＲＨ１、配列番号１６のＣＤＲＨ２、および配列番号４２のＣＤＲＨ３、（ｂ）配列番号６９のＣＤＲＨ１、配列番号７０のＣＤＲＨ２、および配列番号７１のＣＤＲＨ３、または（ｃ）配列番号７５のＣＤＲＨ１、配列番号７６のＣＤＲＨ２、および配列番号７７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片もまた提供される。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１９のＣＤＲＬ１、配列番号２０のＣＤＲＬ２、および配列番号４３のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１４、配列番号２５、または配列番号７２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一の重鎖可変配列を含む。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一の軽鎖可変配列を含む。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一の重鎖可変配列を含む。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号８０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一の軽鎖可変配列を含む。そのため、（ｉ）配列番号１４、配列番号２５、もしくは配列番号７２の重鎖可変領域配列、および配列番号１８の軽鎖可変領域配列、または（ｉｉ）配列番号７８の重鎖可変領域配列および配列番号８０の軽鎖可変領域配列を含む抗体またはその抗原結合性断片が本明細書において提供される。
【００４９】
ヒトＮＫｐ３０に結合した場合、（ｉ）配列番号１４、配列番号２５、もしくは配列番号７２の重鎖可変領域配列、および配列番号１８の軽鎖可変領域配列、または（ｉｉ）配列番号７８の重鎖可変領域配列および配列番号８０の軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトＮＫｐ３０抗体の結合を交差遮断する、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片がさらに提供される。
【００５０】
本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、第１および／または第２の腫瘍抗原は、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、またはその組合せと関連付けられる。任意選択で、一部の実施形態では、第１および／または第２の腫瘍抗原は、上皮がん抗原、前立腺特異的がん抗原（ＰＳＡ）もしくは前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、膀胱がん抗原、肺がん（例えば、小細胞肺）抗原、結腸がん抗原、卵巣がん抗原、脳がん抗原、胃がん抗原、腎細胞癌抗原、膵臓がん抗原、肝臓がん抗原、食道がん抗原、頭頸部がん抗原、結腸直腸がん抗原、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫もしくはホジキンリンパ腫）抗原、Ｂ細胞リンパ腫がん抗原、白血病抗原、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫もしくは形質細胞骨髄腫）抗原、急性リンパ芽球性白血病抗原、慢性骨髄性白血病抗原、または急性骨髄性白血病抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原はＢＣＭＡである。
【００５１】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物の第１の抗原結合単位は、自己反応性Ｂ細胞または形質細胞などのＢ細胞により発現される第１の抗原に結合する。任意選択で、第１の抗原は、Ｂ細胞特異的、Ｂ細胞拘束、またはＢ細胞濃縮抗原である。任意選択で、第１の抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＢＣＭＡからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物の第３の抗原結合単位は、Ｂ細胞により発現される第２の抗原に結合する。任意選択で、第３の抗原結合単位はＮＫ受容体（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、またはＮＫｐ４４）に結合する。任意選択で、構築物は、Ｂ系列細胞により発現される第１の標的抗原に結合する２つの抗原結合単位を含む。任意選択で、Ｂ細胞により発現される第１の標的抗原およびＢ細胞により発現される第２の標的抗原は同じ抗原である。
【００５２】
少なくとも３つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第１の抗原結合単位が、Ｂ系列細胞により発現される第１の標的抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位がＮＫｐ３０抗原に特異的に結合し、第３の抗原結合単位が、第２のＢ系列細胞抗原により発現される抗原またはＮＫ受容体に結合する、多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。任意選択で、Ｂ系列細胞により発現される第１の標的抗原はＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）である。任意選択で、Ｂ系列細胞により発現される第２の標的抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ７２、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９、ＴＡＣ、ＧＰＲＣ５Ｄ（Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５メンバーＤ）、ＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１）、およびＩＬ７／３Ｒからなる群から選択される。Ｂ系列細胞は、プロＢ細胞、プレＢ細胞、移行期Ｂ細胞、濾胞性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、胚中心Ｂ細胞、形質細胞、およびメモリーＢ細胞からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合単位は、Ｂ系列細胞により発現される第１の標的抗原の機能を阻害する。
【００５３】
一部の実施形態では、第１の抗原結合単位は非抗体スキャフォールドタンパク質である。ある特定の実施形態では、非抗体スキャフォールドタンパク質はアンチカリンである。他の実施形態では、第１の抗原結合単位は、ポリペプチド、小分子、またはアプタマーである。任意選択で、第１の抗原結合単位は抗体またはその抗原結合性断片である。第１の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性部分は、任意選択で、モノクローナル抗体またはその抗原結合性部分である。第１の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性部分は、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、またはいずれかの抗原結合性部分であることができる。第１の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性部分は、任意選択で、ｓｃＦｖまたはＦａｂ抗体断片である。
【００５４】
一部の実施形態では、第２の抗原結合単位は非抗体スキャフォールドタンパク質である。ある特定の実施形態では、非抗体スキャフォールドタンパク質はアンチカリンである。他の実施形態では、第２の抗原結合単位は、ポリペプチド、小分子、またはアプタマーである。任意選択で、第２の抗原結合単位は抗体またはその抗原結合性断片である。第２の抗原結合単位は、任意選択で、モノクローナル抗体またはその抗原結合性部分である。第２の抗原結合単位は、ヒト化抗体または完全ヒト抗体、またはいずれかの抗原結合性部分であることができる。第２の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性部分は、任意選択で、ｓｃＦｖまたはＦａｂ抗体断片である。
【００５５】
一部の実施形態では、第３の抗原結合単位は非抗体スキャフォールドタンパク質である。ある特定の実施形態では、非抗体スキャフォールドタンパク質はアンチカリンである。他の実施形態では、第３の抗原結合単位は、ポリペプチド、小分子、またはアプタマーである。任意選択で、第３の抗原結合単位は抗体またはその抗原結合性断片である。第３の抗原結合単位は、任意選択で、モノクローナル抗体またはその抗原結合性部分である。第３の抗原結合単位は、ヒト化抗体または完全ヒト抗体、またはいずれかの抗原結合性部分であることができる。第３の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性部分は、任意選択で、ｓｃＦｖまたはＦａｂ抗体断片である。
【００５６】
一部の実施形態では、第４の抗原結合単位は非抗体スキャフォールドタンパク質である。ある特定の実施形態では、非抗体スキャフォールドタンパク質はアンチカリンである。他の実施形態では、第４の抗原結合単位は、ポリペプチド、小分子、またはアプタマーである。任意選択で、第４の抗原結合単位は抗体またはその抗原結合性断片である。第４の抗原結合単位は、任意選択で、モノクローナル抗体またはその抗原結合性部分である。第４の抗原結合単位は、ヒト化抗体または完全ヒト抗体、またはいずれかの抗原結合性部分であることができる。第４の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性部分は、任意選択で、ｓｃＦｖまたはＦａｂ抗体断片である。抗原結合性構築物は、任意選択で、エフェクター免疫細胞により発現される分子に特異的に結合する追加の抗原結合単位をさらに含む。ある特定の実施形態では、エフェクター免疫細胞により発現される分子は、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２ａ、ＣＤ６４、またはＣＤ８９である。
【００５７】
一部の実施形態では、抗原結合性構築物は、第２の腫瘍またはＢ系列細胞抗原に特異的に結合する第３の抗原結合単位をさらに含む。
抗原結合性構築物は、第３の抗原結合単位、一部の実施形態では、ＮＫｐ３０に加えて、すなわち、ＮＫｐ３０上に見出される抗原ではない、別の活性化ＮＫ細胞受容体に特異的に結合する第３の抗原結合単位をさらに含む。そのような活性化ＮＫ細胞受容体の非限定的な例としては、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、２Ｂ４、ＣＤ２２６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３７、ＣＤ１６ａ、およびＣＤ２が挙げられる。抗原結合性構築物は、一部の実施形態では、第２の腫瘍またはＢ系列細胞抗原に結合する第３の抗原結合単位、および、ＮＫｐ３０に加えて、すなわち、ＮＫｐ３０上に見出される抗原ではない、別の活性化ＮＫ細胞受容体に特異的に結合する第４の抗原結合単位をさらに含む。そのような活性化ＮＫ細胞受容体の非限定的な例としては、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、２Ｂ４、ＣＤ２２６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３７、ＣＤ１６ａ、およびＣＤ２が挙げられる。
【００５８】
本明細書に開示される２つ以上の抗原結合単位は、同じ抗原結合性構築物内の同じまたは異なる構造であることができる。例えば、全ての抗原結合単位は抗体もしくはその抗原結合性部分であることができ、またはサブセットは抗体もしくはその抗原結合性部分であることができる。
【００５９】
一部の実施形態では、１つの抗原結合単位のその標的への結合は、他の抗原結合単位のその標的への結合を遮断しない。任意選択で、２つ以上の抗原結合単位はそれらの各々の標的に結合し、全ての抗原結合単位は同時に結合したままとなる。一部の実施形態では、それらの各々の標的への１つの抗原結合単位の結合および別の抗原結合単位の結合は、免疫細胞などの第１の細胞、および腫瘍細胞を一緒になるようにブリッジ形成させることができる。任意選択で、第１の細胞および腫瘍細胞のブリッジ形成は、フローサイトメトリーおよび／または蛍光プレートリーダーにより決定される。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合単位は腫瘍抗原機能を阻害する。
【００６０】
本開示は、一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物が、二重特異性抗体、三重特異性抗体、または四重特異性抗体であることを提供する。任意選択で、構築物は共通の軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、構築物は四価である。任意選択で、構築物は、腫瘍もしくはＢ系列細胞抗原について少なくとも二価であり、および／またはＮＫｐ３０抗原について少なくとも二価である。一部の実施形態では、構築物はＦｃドメインを含まない。他の実施形態では、第１の抗原結合単位または第２の抗原結合単位、または両方は、１つまたは複数の免疫グロブリンＦｃ改変を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、重鎖の免疫グロブリンＦｃドメインは、第１および第２の抗原結合単位のヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。任意選択で、突然変異は重鎖のＣＨ３ドメイン中に存在する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はクアドローマ細胞中で製造される。ある特定の実施形態では、構築物は１つまたは複数の免疫グロブリン定常領域改変を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、抗体のヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。任意選択で、１つまたは複数の突然変異は１つの抗原結合単位の軽鎖定常領域中に存在し、１つまたは複数の突然変異は別の抗原結合単位の重鎖定常領域中に存在する。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、二重特異性ＩｇＧ、二重特異性抗体断片、二重特異性融合タンパク質、付加型ＩｇＧ（ａｐｐｅｎｄｅｄ  ＩｇＧ）、および二重特異性抗体コンジュゲートからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、低減されたエフェクター機能を有し、または構築物の半減期を増進する。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合単位および第２の抗原結合単位は少なくとも１つのアミノリンカーアミノ酸配列により連結されている。任意選択で、リンカーアミノ酸配列はＧＧＧＧＳｘ（配列番号２２）（ｘは、１および６を含む１〜６の整数である）を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、それぞれ配列番号１１、１２、および１３において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。任意選択で、構築物は、配列番号１０において示される重鎖可変領域配列を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、それぞれ配列番号１５、１６、および１７において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。任意選択で、構築物は、配列番号１４または２５において示される重鎖可変領域配列を含む。一部の実施形態では、構築物は、それぞれ配列番号１９、２０、および２１において示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。任意選択で、構築物は、配列番号１８において示される軽鎖可変領域配列を含む。一部の実施形態では、構築物は、任意選択で、配列番号９または２４において示される重鎖配列および配列番号８において示される軽鎖配列を含む。
【００６２】
本明細書に記載の任意の構築物の実施形態では、第２の抗原結合単位は、任意選択で、ＮＫｐ３０をアゴナイズすることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、構築物が標的抗原を発現する細胞（例えば、がん細胞またはＢ系列細胞）に結合した場合に免疫エフェクター細胞により発現されるＮＫｐ３０をアゴナイズすることができる。
【００６３】
本開示は、一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は多重特異性抗体であることを提供する。任意選択で、構築物は共通の軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、構築物は四価である。一部の実施形態では、構築物は、ＮＫｐ３０抗原について二価であり、第１の腫瘍またはＢ系列細胞抗原について一価であり、第２の腫瘍またはＢ系列細胞抗原について一価である。一部の実施形態では、構築物は、ＮＫｐ３０抗原について二価であり、第２の活性化ＮＫ受容体について一価であり、腫瘍またはＢ系列細胞抗原について一価である。一部の実施形態では、構築物は、ＮＫｐ３０抗原について一価であり、第２の活性化ＮＫ受容体について一価であり、第１の腫瘍またはＢ系列細胞抗原について一価であり、第２の腫瘍またはＢ系列細胞抗原について一価である。一部の実施形態では、構築物はＦｃドメインを含まない。他の実施形態では、少なくとも１つの抗原結合単位は、１つまたは複数の免疫グロブリンＦｃ改変を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、重鎖の免疫グロブリンＦｃドメインは、抗原結合単位のヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。任意選択で、突然変異は重鎖のＣＨ３ドメイン中に存在する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はクアドローマ細胞中で製造される。ある特定の実施形態では、構築物は１つまたは複数の免疫グロブリン定常領域改変を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、抗体のヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。任意選択で、１つまたは複数の突然変異は１つの抗原結合単位の軽鎖定常領域中に存在し、１つまたは複数の突然変異は別の抗原結合単位の重鎖定常領域中に存在する。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、多重特異性ＩｇＧ、多重特異性抗体断片、多重特異性融合タンパク質、付加型ＩｇＧ、および多重特異性抗体コンジュゲートからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、低減されたエフェクター機能を有し、または構築物の半減期を増進する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の抗原結合単位は少なくとも１つのアミノリンカーアミノ酸配列により連結されている。任意選択で、リンカーアミノ酸配列はＧＧＧＧＳｘ（配列番号２２）（ｘは、１および６を含む１〜６の整数である）を含む。
【００６４】
本開示はまた、ヒトＢＣＭＡに結合した場合、配列番号１０において表される重鎖可変領域配列および配列番号１８において表される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトＢＣＭＡ抗体により結合されるアミノ酸残基の少なくとも１つに結合する、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。別の態様では、本開示は、ヒトＢＣＭＡに結合した場合、配列番号１０において表される重鎖可変領域配列および配列番号１８において表される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトＢＣＭＡ抗体の結合を交差遮断する、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を特徴とする。一部の実施形態では、それぞれ配列番号１１、１２、および１３において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合性断片が提供される。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ配列番号１９、２０、および２１において示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０において示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１８において示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０において示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１８において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００６５】
ヒトＮＫｐ３０に結合した場合、配列番号１４または２５において示される重鎖可変領域配列および配列番号１８において示される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトＮＫｐ３０抗体により結合されるアミノ酸残基の少なくとも１つに結合する、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片もまた提供される。本開示はまた、ヒトＮＫｐ３０に結合した場合、配列番号１４または２５において示される重鎖可変領域配列および配列番号１８において示される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトＮＫｐ３０抗体の結合を交差遮断する、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。一部の実施形態では、それぞれ配列番号１５、１６、および１７において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む単離された抗体、またはその抗原結合性断片が提供される。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ配列番号１９、２０、および２１において示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１４または２５において示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１８において示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１４または２５において示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１８において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００６６】
エピトープが配列番号７のアミノ酸５０〜１１３内にありまたはそれとオーバーラップし、Ｉ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３における置換の１つまたは複数が抗体または抗原結合性部分のヒトＮＫｐ３０への結合を妨害する、ヒトＮＫｐ３０のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合性部分もまた本明細書において提供される。任意選択で、エピトープはコンホメーショナルエピトープである。任意選択で、エピトープはリニアエピトープである。
【００６７】
配列番号７の残基Ｉ５０、Ｓ８２、またはＬ１１３の少なくとも１つを含むヒトＮＫｐ３０上のエピトープに結合する、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分もまた本明細書において提供される。任意選択で、エピトープは配列番号７の残基Ｉ５０を含む。任意選択で、エピトープは配列番号７の残基Ｓ８２を含む。任意選択で、エピトープは配列番号７の残基Ｌ１１３を含む。さらなる例として、エピトープは、任意選択で、残基（ｉ）配列番号７のＩ５０およびＳ８２、（ｉｉ）配列番号７のＩ５０およびＳＬ１１３、（ｉｉｉ）配列番号７のＳ８２およびＬ１１３または（ｉｖ）配列番号７のＩ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３を含む。任意選択で、抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７のアミノ酸位置５０〜１１３に対応する１つまたは複数のアミノ酸残基の配列を含むエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７のアミノ酸位置５０〜１１３に対応する３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分は、任意選択で、約１×１０−６またはそれ未満の親和性（ＫＤ）でＮＫｐ３０に結合する。
【００６８】
抗体またはその抗原結合性部分は、任意選択で、ヒトＮＫｐ３０のリガンド結合領域に結合する。一部の態様では、ＮＫｐ３０リガンドは、ＢＡＧ６、Ｂ７−Ｈ６、またはＧａｌ−３である。任意選択で、配列番号７の残基Ｉ５０、Ｓ８２、またはＬ１１３、またはその任意の組合せのアラニンへの突然変異は、突然変異の非存在下での結合と比較して、ヒトＮＫｐ３０への低減された結合を結果としてもたらす。そのような低減された結合は、検出可能な結合の完全な喪失であることができる。抗体またはその抗原結合性部分は、任意選択で、配列番号７のアミノ酸残基５０〜１１３内に位置するエピトープに結合する。エピトープは、任意選択で、非リニアエピトープである。任意選択で、抗体またはその抗原結合性部分は、（ａ）それぞれ配列番号１５、１６、および４２において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１９、２０および４３において示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、（ｂ）それぞれ配列番号６９、７０および７１において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１９、２０および４３において示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに（ｃ）それぞれ配列番号７５、７６、および７７において示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号８０の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列からなる群から選択される重鎖および軽鎖ＣＤＲを有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトＮＫｐ３０上のエピトープへの結合について競合する。任意選択で、抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１４、配列番号２５、もしくは配列番号７２の重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号１８の軽鎖可変領域アミノ酸配列、または配列番号７８の重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号８０の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトＮＫｐ３０上のエピトープへの結合について競合する。任意選択で、抗体またはその抗原結合性部分は、（ｉ）配列番号１４、配列番号２５、もしくは配列番号７２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または（ｉｉ）配列番号７８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号８０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトＮＫｐ３０上のエピトープへの結合について競合する。
【００６９】
本開示は、本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物（例えば、二重特異性抗原結合性構築物、三重特異性抗原結合性構築物、もしくは四重特異性抗原結合性構築物）または単離された抗体もしくはその抗原結合性断片および薬学的に許容される担体を含む組成物をさらに提供する。抗原結合性構築物は、任意選択で、エフェクター免疫細胞により発現される分子に特異的に結合する第３の抗原結合単位をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に開示される１つより多くの多重特異性抗原結合性構築物を含むことができる。
【００７０】
本開示はまた、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離された抗体もしくはその抗原結合性部分をコードする核酸を提供する。核酸を含むベクター（任意選択で発現制御配列を有する）およびベクターまたは核酸を含む細胞もまた提供される。そのような細胞を細胞によるベクターからの１つまたは複数のポリペプチドの発現のための条件下で培養することを含む、ポリペプチドを製造する方法が提供される。方法は、任意選択で、細胞または細胞が培養された培地から１つまたは複数のポリペプチドを単離することを含む。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離された抗体、もしくはその抗原結合性断片にコンジュゲート化した異種部分を含むタンパク質コンジュゲート分子もまた提供される。任意選択で、異種部分は、治療剤、毒素、薬物、または放射性部分である。本開示はまた、がんを有する対象に有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離された抗体、もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート分子を投与することを含む、対象においてがんを治療する方法を提供する。
【００７１】
本開示はまた、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物はＣＤ１６エンゲージメント非依存的な方式でがんまたは腫瘍に対する免疫応答を増進することができるという発見に部分的に基づく。ＣＤ１６（ＦＣγＲＩＩＩ）は、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体のＦｃ部分などのＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合する。ＣＤ１６Ａは、ＮＫ細胞上のＣＤ３ζおよびＦｃ−εＲＩ−γと共局在する膜貫通タンパク質である。そのようなＦｃ領域のＣＤ１６Ａへの結合は、ＮＫ細胞によるサイトカイン産生、およびがん細胞などの標的細胞に対するこれらの細胞の増加した細胞傷害性エフェクター活性（ＡＤＣＣ）を結果としてもたらす。多くの腫瘍指向性モノクローナル抗体療法は、その活性についてＣＤ１６Ａエンゲージメントに依拠し、それががん患者におけるその使用にとって課題を提示し得る。例えば、ヒトにおいて、ＮＫ細胞は２つの別個の集団：ＣＤ５６ｄｉｍ／ＣＤ１６ｐｏｓおよびＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ１６ｎｅｇから構成される。健常個体において、ＣＤ１６ｎｅｇ集団は総ＮＫ細胞集団の５〜１５％を表す。しかしながら、一部のがん患者においてＣＤ１６ｎｅｇ  ＮＫ細胞の割合は大きく増加している（例えば、最大５０％）。
【００７２】
追加的に、腫瘍微環境は、細胞の表面からのＣＤ１６Ａのシェディングを誘導すること（ＡＤＡＭ１７酵素により媒介される活性）によりＣＤ５６ｄｉｍ／ＣＤ１６ｐｏｓ  ＮＫ細胞の表現型に影響することが示されており、またはＴＧＦβはＣＤ１６ＡｐｏｓからＣＤ１６ｎｅｇ  ＮＫ細胞への変換を促進することができる。追加的に、ＣＤ１６Ａの多型に起因して、一部の個体は、モノクローナル抗体療法により媒介されるＡＤＣＣを劇的に損なうＣＤ１６Ａにおける突然変異を有する。そのため、ＣＤ１６Ａエンゲージメントの非存在下であっても抗腫瘍活性を維持することができる腫瘍指向性療法が強く所望され、必要とされている。ＣＤ１６Ａ欠損を克服することができる本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、その必要性を満たす。
【００７３】
本開示はまた、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、低いレベルの標的抗原（すなわち、多重特異性構築物が結合する腫瘍抗原）を発現する標的細胞に対する免疫応答（例えば、ＮＫ細胞媒介性応答）を増進することができるという発見に部分的に基づく。ハーセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）（登録商標）（ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）［米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）所在］）およびリツキサン（ＲＩＴＵＸＡＮ）（登録商標）（バイオジェン（Ｂｉｏｇｅｎ）［米国マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）所在］）などの腫瘍抗原指向性モノクローナル抗体療法は、低いレベルの腫瘍抗原を発現する腫瘍に対して低減された有効性を呈している。実際、腫瘍抗原の低いレベルの発現を有する腫瘍を持つ患者は、抗原を標的化する抗体療法を用いる治療のために不適格なことがある。腫瘍は、とりわけ、抗体療法が結合する腫瘍抗原の発現を下方調節することによりそのような抗体療法を免れることができることも確立されている（例えば、スギモトら（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．）（２００９）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３９０（１）：４８−５３；ボドガイら（Ｂｏｄｏｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７３（７）：１−１２を参照）。本開示はいかなる具体的な理論または作用機序によっても縛られないが、本明細書に記載の多重特異性構築物は、ＮＫ細胞活性化の閾値を低下させ、高い、中間の、および低いレベルの腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞のＮＫ細胞殺傷を強力に再方向付けすることにより抗体療法のこれらの制限を克服する。
【００７４】
そのため、本開示は、がんを有する対象に有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物もしくは抗体もしくはその抗原結合性部分、または本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物もしくは抗体もしくはその抗原結合性部分を含むタンパク質コンジュゲートもしくは組成物を投与する工程を含む、対象においてがんを治療する方法をさらに提供する。任意選択で、がんを治療する方法は、がんを有する対象に有効量の多重特異性抗原結合性構築物もしくは抗体もしくはその抗原結合性部分または多重特異性抗原結合性構築物もしくは抗体もしくは抗原結合性部分を含むタンパク質コンジュゲートもしくは組成物を投与することを含み、対象は、ＣＤ１６欠損性（ＣＤ１６  ｌｏｗを含む）微環境を含むがん（例えば、対照ＮＫ細胞と比較して５０％未満のＣＤ１６の発現を有する浸潤性ＮＫ細胞の集団を有するがんまたは浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも１０％が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する浸潤性ＮＫ細胞の集団を有するがん）を有する。一部の実施形態では、ＣＤ１６欠損性微環境は、対象に対する造血幹細胞移植と関連付けられる。対象はヒトまたは他の哺乳動物であることができる。多重特異性抗原結合性構築物または抗体もしくはその抗原結合性部分は、ＮＫｐ３０機能をアゴナイズすることにより対象の免疫応答を増進することができる。例えば、多重特異性抗原結合性構築物または抗体もしくはその抗原結合性部分はＮＫ細胞媒介性がん細胞溶解を増進することができる。方法は、微環境中のＣＤ１６を検出することを含むことができる。任意選択で、ＣＤ１６欠損性微環境は、（例えば、組織の生検または試料中の）ＣＤ１６ａまたはＣＤ１６ｂのレベルを検出することにより検出される。本明細書に記載の任意の方法の一部の実施形態では、対象（例えば、ヒトがん患者）のＣＤ１６Ａ遺伝子型は、多重特異性抗体を投与する前に決定することができる。例えば、ＣＤ１６Ａ  １５８多型に関して対象の遺伝子型を決定するための試験を実行することができる。例えば、シューら（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１６）  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  Ｍｏｎｉｔｏｒ．  ２２：２０８６−２０９６を参照。
【００７５】
任意選択で、がんを治療する方法は、がんを有する対象に有効量の多重特異性抗原結合性構築物または有効量の抗体もしくはその抗原結合性部分を投与することを含み、対象は、低いレベルの腫瘍抗原（例えば、がん細胞当たり約１００，０００コピー未満）を含むがんを有する。対象はヒトまたは他の哺乳動物であることができる。多重特異性抗原結合性構築物または抗体もしくはその抗原結合性部分は、ＮＫｐ３０機能をアゴナイズすることにより対象の免疫応答を増進することができる。多重特異性抗原結合性構築物または抗体もしくはその抗原結合性部分は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化の閾値を効果的に低下させ、いっそう低いレベルの腫瘍抗原を発現する標的細胞（例えば、腫瘍細胞）のＮＫ細胞殺傷を再方向付けする。多重特異性抗原結合性構築物または抗体もしくはその抗原結合性部分は、低腫瘍抗原発現細胞であってもＩＦＮγ産生およびＡＤＣＣ機能を保持する。
【００７６】
がんは、任意選択で、血液がん、神経学的がん（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、乳がん、前立腺がん、皮膚がん、肺がん、膀胱がん、腎臓がん、脳がん、頭頸部がん、胃腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、および血管がんからなる群から選択される。がんを治療する方法は、第２の抗がん療法を対象に投与する工程をさらに含むことができる。ある特定の実施形態では、抗がん療法は、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、サイトカイン療法、放射線療法、寒冷療法、または外科療法である。多重特異性抗原結合性構築物または組成物は、例えば、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される。
【００７７】
本開示はまた、対象（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物）に治療有効量の多重特異性抗原結合性構築物、有効量のもしくは本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合性部分、または開示される多重特異性抗原結合性構築物もしくは抗体もしくはその抗原結合性部分を含む有効量の組成物を投与することを含む、それを必要とする対象において免疫応答を増進する方法を提供する。増進した免疫応答は、増進したＴ細胞機能、増進したＮＫ細胞機能、増進したマクロファージ機能、サイトカイン産生、および／またはＡＤＣＣ機能の１つまたは複数を含む。多重特異性抗原結合性構築物、抗体もしくは断片、または組成物は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される。
【００７８】
対照ＮＫ細胞によるＣＤ１６の発現と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有するＮＫ細胞を活性化させまたはその活性化を持続化させる方法もまた本明細書において提供される。方法は、ＮＫ細胞を有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物、抗体もしくはその抗原結合性部分、またはいずれかを含む組成物と接触させることを含む。ＮＫ細胞を多重特異性抗原結合性構築物または抗体もしくはその抗原結合性部分と接触させることはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。一部の実施形態では、方法は、がんを有する対象においてＮＫ細胞を活性化させまたはその活性化を持続化させるために使用される。ＮＫ細胞の活性化または持続的な活性化はＣＤ１６欠損性微環境中で起こることができる。任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物が特異的に結合する腫瘍抗原はＢＣＭＡまたはＨＥＲ２である。接触させるＮＫ細胞は腫瘍浸潤性ＮＫ細胞であることができる。任意選択で、ＮＫ細胞のＣＤ１６発現は対照ＮＫ細胞のＣＤ１６発現より低い（例えば、対照ＮＫ細胞と比較して５０％未満のＣＤ１６の発現）。任意選択で、ＣＤ１６欠損性微環境は、浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも１０％が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する腫瘍浸潤性ＮＫ細胞の集団を含む。ＮＫ細胞は１５０，０００未満のＣＤ１６コピー数を有することができる。一部の実施形態では、ＮＫ細胞はＣＤ１６を発現しない。
【００７９】
ＮＫ細胞による標的細胞の殺傷を増進する方法もまた本明細書において提供される。方法は、ＮＫ細胞の存在下で標的細胞を有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物、抗体もしくはその抗原結合性部分、または組成物と接触させることを含む。任意選択で、標的細胞は低いレベルの腫瘍抗原を発現する（例えば、約１００，０００未満のコピー数）。より特には、標的細胞はがん細胞であることができ、抗原は腫瘍抗原である。任意選択で、がん細胞は対象中にあり、方法は、対象に有効量の多重特異性抗原結合性構築物、抗体もしくは断片、または組成物を投与してＮＫ細胞によるがん細胞の殺傷を増進することを含む。
【００８０】
さらに別の態様では、本開示は、対象から標的細胞を枯渇させる方法であって、それを必要とする対象に標的抗原を発現する１つまたは複数の標的細胞を枯渇させるために十分な量の本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物を投与することを含み、多重特異性結合性構築物が少なくとも２つの連結した抗原結合単位を含み、第１の抗原結合単位が、標的抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位が、ＮＫｐ３０抗原に特異的に結合する、方法を特徴とする。一部の実施形態では、多重特異性結合性構築物は第３の抗原結合単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性結合性構築物は第３の抗原結合単位および第４の抗原結合単位を含む。一部の実施形態では、標的抗原は、本明細書に記載のまたは当該技術分野において公知の任意の腫瘍抗原などの腫瘍抗原である。一部の実施形態では、標的細胞はＢ細胞、例えば、自己反応性Ｂ細胞である（そのような場合、標的抗原は、Ｂ細胞特異的、Ｂ細胞拘束、またはＢ細胞濃縮抗原、例えば、ＣＤ２０またはＢＣＭＡである）。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は自己免疫状態に罹患している。一部の実施形態では、自己免疫状態は、全体的または部分的に自己反応性Ｂ細胞により媒介される。一部の実施形態では、標的細胞を枯渇されている対象は赤芽球癆を有するまたはそのリスクがある。赤芽球癆は、例えば、同種幹細胞移植後のＡＢＯ血液群不適合に起因することができる。一部のそのような実施形態では、対象は血液群Ｏを有し、同種幹細胞移植は血液群Ａのドナーからのものであった。標的細胞を枯渇されている対象が赤芽球癆を有するまたはそのリスクがあるそれらの実施形態では、標的細胞は、例えば、標的血漿Ｂ細胞である。よって、一部の実施形態では、標的抗原は、例えば、血漿Ｂ細胞上に見出されるが他のＢ細胞上には見出されない抗原である。
【００８１】
別の態様では、本開示は、自己反応性Ｂ細胞性炎症状態を有する対象を治療する方法であって、対象に有効量の本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物もしくは抗体もしくはその抗原結合性部分またはその医薬組成物を投与することを含む、方法を特徴とする。有効量の多重特異性抗原結合性構築物、抗体もしくはその断片、またはその医薬組成物は、任意選択で、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡを発現する形質細胞の骨髄レベルを低減する。自己反応性Ｂ細胞性炎症状態としては、自己反応性Ｂ細胞により媒介される自己免疫疾患が挙げられる。自己反応性Ｂ細胞性炎症状態の例としては、重症筋無力症、軽鎖アミロイドーシス、尋常性天疱瘡、および免疫性血小板減少症が挙げられるがそれに限定されない。
【００８２】
全体的または部分的に自己反応性Ｂ細胞により媒介される炎症状態（例えば、自己免疫状態）を有する対象を治療する方法であって、対象に標的抗原を発現する１つまたは複数の自己反応性Ｂ細胞を枯渇させるために十分な量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を投与することを含み、多重特異性結合性構築物が、標的抗原に特異的に結合する第１の抗原結合単位、ＮＫｐ３０抗原に特異的に結合する第２の抗原結合単位、および第３の抗原結合単位を含む、方法もまた本明細書において提供される。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は第４の抗原結合単位を含む。一部の実施形態では、標的抗原は、Ｂ細胞特異的、Ｂ細胞拘束、またはＢ細胞濃縮抗原、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９、またはＢＣＭＡである。一部の実施形態では、全体的または部分的に自己反応性Ｂ細胞により媒介される自己免疫疾患は、全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、１型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、原発性胆汁胆管炎、グッドパスチャー病、原発性膜性腎症、卵巣不全、および自己免疫性睾丸炎からなる群から選択されるものであることができる。他のそのような自己免疫疾患は当該技術分野において公知であり、例えば、ルートヴィヒら（Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１７）  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：Ａｒｔｉｃｌｅ  ６０３およびホフマンら（Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１８）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：Ａｒｔｉｃｌｅ  ８３５に記載されている。一部の実施形態では、そのような多重特異性構築物は、炎症性障害（例えば、自己免疫疾患）に対する他の療法、例えば、コルチコステロイド、ＤＭＡＲＤｓ、または抗サイトカイン療法（例えば、抗ＴＮＦα抗体、ＴＮＦα受容体トラップ、抗ＩＬ１７抗体、もしくは抗ＩＬ２３抗体）と組み合わせることができる。
【００８３】
対象におけるがん細胞に対する免疫応答の増進において使用するための、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートもまた本明細書において提供される。免疫応答は、任意選択で、ＮＫ細胞媒介性免疫応答である。がん細胞は、任意選択で、血液がん細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、白血病細胞、神経学的がん細胞、乳がん細胞、前立腺がん細胞、皮膚がん細胞、肺がん細胞、膀胱がん細胞、腎臓がん細胞、頭頸部がん細胞、胃腸がん細胞、結腸直腸がん細胞、肝臓がん細胞、膵臓がん細胞、泌尿生殖器がん細胞、骨がん細胞、および血管がん細胞である。一部の態様では、がん細胞は第１の腫瘍抗原を発現する。一部の態様では、がん細胞は第１の腫瘍抗原および第２の腫瘍抗原を発現する。
【００８４】
本開示はまた、対象におけるＢ細胞に対する免疫応答の増進において使用するための、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを提供する。免疫応答は、任意選択で、ＮＫ細胞媒介性免疫応答である。Ｂ細胞は、任意選択で、自己反応性Ｂ細胞または形質細胞である。一部の態様では、Ｂ細胞は第１のＢ細胞抗原を発現する。一部の態様では、Ｂ細胞は第１のＢ細胞抗原および第２のＢ細胞抗原を発現する。
【００８５】
本開示は、対象におけるがんの治療において使用するための、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートをさらに提供する。
【００８６】
本開示はまた、それを必要とする対象におけるがんの治療もしくはその進行の遅延または腫瘍成長の低減もしくは阻害において使用するための、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを提供する。
【００８７】
任意選択で、がんは、血液がん、リンパ腫、骨髄腫、白血病、神経学的がん、乳がん、前立腺がん、皮膚がん、肺がん、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、胃腸がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、または血管がんである。一部の態様では、がんは、第１の腫瘍抗原を発現するがん細胞を含む。一部の態様では、がんは、第１の腫瘍抗原および第２の腫瘍抗原を発現するがん細胞を含む。
【００８８】
本明細書に記載の任意の使用の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートは、ＮＫｐ３０機能をアゴナイズすることにより対象の免疫応答を増進する。
【００８９】
本明細書に記載の任意の使用の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性がん細胞溶解および／またはγδ  Ｔ細胞機能を増進する。
【００９０】
本明細書に記載の任意の使用の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートは、γδ  Ｔ細胞媒介性細胞傷害性またはサイトカイン産生を増進する。
【００９１】
本明細書に記載の任意の使用の実施形態では、使用は、抗がん療法を対象に投与することをさらに含む。任意選択で、抗がん療法は、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、細胞療法、サイトカイン療法、放射線療法、寒冷療法、または外科療法である。抗がん療法は、任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片を用いる治療の前、同時、または後に投与される。抗がん療法は、任意選択で、免疫療法であり、対象におけるがんは、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを用いる治療の非存在下で免疫療法に対して難治性である。任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートは、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される。
【００９２】
本明細書に記載の任意の使用の一部の実施形態では、がんはＣＤ１６欠損性腫瘍微環境を含み、または、がん細胞はＣＤ１６欠損性腫瘍微環境中に存在する。任意選択で、使用は、対象のがんにおけるＣＤ１６の発現レベルを検出することをさらに含む。ＣＤ１６を検出することは、任意選択で、ＣＤ１６ａまたはＣＤ１６ｂのレベルを検出することを含む。一部の態様では、ＣＤ１６欠損性微環境は、対象に対する造血幹細胞移植と関連付けられる。任意選択で、ＣＤ１６欠損性微環境は浸潤性ＮＫ細胞の集団を含み、浸潤性ＮＫ細胞は対照ＮＫ細胞と比較して５０％未満のＣＤ１６の発現を有する。一部の態様では、浸潤性ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較して３０％未満、２０％未満、または１０％未満のＣＤ１６の発現を有する。任意選択で、ＣＤ１６欠損性微環境は浸潤性ＮＫ細胞の集団を含み、浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも１０％は対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する。一部の態様では、浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％は対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する。
【００９３】
本明細書に記載の任意の使用の一部の実施形態では、がんは、低いレベルの腫瘍抗原を発現する細胞を含む。任意選択で、腫瘍抗原のレベルはがん細胞当たり１００，０００未満の腫瘍抗原コピーである。一部の態様では、腫瘍抗原のレベルは、がん細胞当たり９０，０００未満、７５，０００未満、５０，０００未満、または４０，０００未満の腫瘍抗原コピーである。使用は、任意選択で、対象の１つまたは複数のがん細胞の腫瘍抗原のレベルを検出することをさらに含む。
【００９４】
本開示は、自己免疫疾患を有する対象の治療において使用するための、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートをさらに提供する。任意選択で、自己免疫疾患は、全体的または部分的に自己反応性Ｂ細胞により媒介される。対象は、任意選択で、標的細胞を枯渇されており、赤芽球癆を有するまたはそのリスクがある。一部の態様では、自己免疫疾患は、全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、１型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、原発性胆汁胆管炎、グッドパスチャー病、原発性膜性腎症、卵巣不全、および自己免疫性睾丸炎からなる群から選択される。
【００９５】
本明細書に記載の任意の使用の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＮＫｐ３０機能をアゴナイズすることにより対象の免疫応答を増進する。
本明細書に記載の任意の使用の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、Ｂ細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を増進する。
【００９６】
本明細書に記載の任意の使用の一部の実施形態では、使用は、剤を対象に投与することをさらに含み、剤は、コルチコステロイド、ＤＭＡＲＤ、および抗サイトカイン療法からなる群から選択される。任意選択で、抗サイトカイン療法は、抗ＴＮＦα抗体、ＴＮＦα受容体トラップ、抗ＩＬ１７抗体、または抗ＩＬ２３抗体である。
【００９７】
本明細書に記載の任意の使用の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートは、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される。
【００９８】
本開示は、対象におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化またはその活性化の持続化において使用するための、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートであって、ＮＫ細胞が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートをさらに提供する。任意選択で、対象はがんを有する。一部の態様では、がんは、構築物が特異的に結合する腫瘍抗原の一方または両方を発現する。接触させるＮＫ細胞は、任意選択で、腫瘍浸潤性ＮＫ細胞である。任意選択で、ＮＫ細胞の活性化または持続的な活性化は腫瘍微環境中で起こる。ＮＫ細胞のＣＤ１６発現は、任意選択で、対照ＮＫ細胞のＣＤ１６発現の５０％未満である。一部の態様では、ＮＫ細胞のＣＤ１６発現は、対照ＮＫ細胞のＣＤ１６発現の４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満である。任意選択で、腫瘍微環境は浸潤性ＮＫ細胞の集団を含み、浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも１０％は対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する。一部の態様では、浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％は対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する。一部の態様では、ＮＫ細胞はＣＤ１６を発現しない。
【００９９】
本開示は、対象におけるＮＫ細胞によるがん細胞の殺傷の増進において使用するための、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートであって、がん細胞が、１００，０００未満の腫瘍抗原コピー数で、構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片が結合する腫瘍抗原を発現する、多重特異性抗原結合性構築物、抗体、もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートをさらに提供する。がん細胞は、任意選択で、がん細胞当たり９０，０００未満の腫瘍抗原コピーのコピー数で腫瘍抗原を発現する。一部の態様では、がん細胞は、がん細胞当たり７５，０００未満、５０，０００未満、または４０，０００未満の腫瘍抗原コピーのコピー数で腫瘍抗原を発現する。一部の態様では、使用は、対象の１つまたは複数のがん細胞による腫瘍抗原の発現を検出することをさらに含む。
【０１００】
本開示はまた、対象における自己反応性Ｂ細胞性炎症状態の治療において使用するための、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを提供する。任意選択で、有効量の多重特異性抗原結合性構築物または医薬組成物は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡを発現する形質細胞の骨髄レベルを低減する。自己反応性Ｂ細胞性炎症状態は、任意選択で、自己反応性Ｂ細胞により媒介される自己免疫疾患である。一部の態様では、自己反応性Ｂ細胞性炎症状態は、重症筋無力症、軽鎖アミロイドーシス、尋常性天疱瘡、および免疫性血小板減少症から選択される疾患である。一部の態様では、自己反応性Ｂ細胞により媒介される自己免疫疾患は、全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、１型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、原発性胆汁胆管炎、グッドパスチャー病、原発性膜性腎症、卵巣不全、および自己免疫性睾丸炎からなる群から選択される。例えば、自己反応性Ｂ細胞により媒介される自己免疫疾患は重症筋無力症である。
【０１０１】
本明細書に記載の任意の使用の一部の実施形態では、使用は対象に抗炎症剤を投与することをさらに含む。任意選択で、抗炎症剤は、コルチコステロイド、ＤＭＡＲＤｓ、または抗サイトカイン剤からなる群から選択される。任意選択で、対象はヒトである。
【０１０２】
本出願は、以下の図を含む。これらの図は、本組成物および方法のある特定の実施形態および／または特徴を図示し、本組成物および方法の任意の記載を補足することが意図されている。これらの図は、書面による説明がそうであることを明示的に示さない限り、本組成物および方法の範囲を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】例示的な抗体フォーマットの説明図（例えば、コンターマン（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ）およびブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）（２０１５）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２０（７）：８３８−４７に記載されている）。
【図２】例示的なＢＣＭＡ−ＮＫｐ３０多重特異性構築物の存在下におけるＮＫ細胞によるＨ９２９腫瘍細胞殺傷の増進を描く折れ線グラフ。Ｘ軸は、構築物または抗体の濃度を示す。Ｙ軸は、ＮＫ細胞によるＨ９２９細胞の特異的溶解％を示す。図２Ａは、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（中黒円）および抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（網掛け円）と比較して試験した２つのグリコシル化多重特異性構築物（構築物１（四角）および構築物２（菱形）。これらは、抗ＮＫｐ３０Ｆａｂのアミノ酸配列のみが互いに異なる）による結果を示す。構築物および抗ＢＣＭＡ抗体は、ＣＤ１６ａに結合することが可能である。図２Ｂは、構築物１および構築物２のバージョンによる結果を示す。これらは、グリコシル化（Ｎ２９７Ａ突然変異）を欠如するため、ＣＤ１６ａに結合することができない。構築物１および構築物２の非グリコシル化バージョン（白抜き四角および白抜き菱形；本明細書ではそれぞれ構築物３および構築物４とも呼ばれる）を、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（白抜き円）および抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（網掛け円）の非グリコシル化バージョンと比較して試験した。
【図３】ＢＣＭＡ−ＮＫｐ３０多重特異性構築物（構築物＃１）がＣＤ１６Ａ発現の存在下でＡＤＣＣを増進したことを示す折れ線グラフ。Ｘ軸には抗体の濃度が示されており、Ｙ軸には特異的溶解のパーセンテージが示されている。図３Ａは、ＭＭ．１Ｓ腫瘍細胞を使用した結果を示し、図３Ｂは、ＲＰＭＩ−８２２６腫瘍細胞を使用した結果を示す。ＣＤ１６Ａ発現ＮＫ細胞株の細胞をエフェクター細胞として使用した場合、ＢＣＭＡ−ＮＫｐ３０多重特異性構築物（白抜き円）は、ＢＣＭＡモノクローナル抗体（網掛け円）またはＩｇＧ１アイソタイプ対照（中黒円）と比較して、ＡＤＣＣを増加させたことが実証された。
【図４】本ＢＣＭＡ−ＮＫｐ３０多重特異性構築物が、ＣＤ１６非依存的様式で腫瘍細胞殺傷を誘導したことを示す折れ線グラフ。Ｘ軸には構築物または抗体の濃度が示されており、Ｙ軸には特異的溶解のパーセンテージが示されている。図４Ａおよび図４Ｃは、腫瘍抗原ＢＣＭＡを高レベルで発現するＨ９２９腫瘍細胞を使用した結果を示し、図４Ｂは、ＢＣＭＡを低レベルで発現するＲＰＭＩ−８２２６腫瘍細胞を使用した結果を示す。ＣＤ１６Ａ陰性ＮＫ細胞株（図４Ａおよび図４ＣのＫＨＹＧ−１、図４ＢのＮＫ細胞株）をエフェクター細胞として使用した場合、ＢＣＭＡ−ＮＫｐ３０多重特異性構築物（四角および菱形）は、ＢＣＭＡモノクローナル抗体（図４Ｂおよび図４Ｃの網掛け円）、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（図４Ｂの中黒円）またはＣＤ１６Ａ−ＢＣＭＡ二重特異性構築物（図４Ｃの白抜き円）と比較して、ＣＤ１６陰性ＮＫ細胞による腫瘍細胞殺傷を誘導した。
【図５】本ＢＣＭＡ−ＮＫｐ３０多重特異性構築物が、ＮＫｐ３０およびＣＤ１６を二重標的化することにより優れた活性を呈することを示す折れ線グラフ。図５Ａ、図５Ｂ、および図５Ｃでは、構築物または抗体の濃度がＸ軸に示されている。図５Ａおよび図５Ｂでは、産生されたＩＦＮγの量（ｐｇ／ｍＬ）がＹ軸に示されており、図５Ｃでは特異的溶解のパーセンテージがＹ軸に示されている。図５Ａは、ＢＣＭＡを高レベルで発現するＨ９２９腫瘍細胞を使用した結果を示し、図５Ｂおよび図５Ｃは、ＢＣＭＡを低レベルで発現するＭＭ．１Ｓ腫瘍細胞を使用した結果を示す。ＮＫｐ３０−ＢＣＭＡ多重特異性構築物（中黒四角）は、ＮＫｐ３０−ＢＣＭＡのＦｃ−ヌル構築物（図５Ａの白抜き四角）、ＢＣＭＡモノクローナル抗体（図５Ａ、図５Ｂ、および図５Ｃの中黒円）、Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１アイソタイプ対照（図５Ａの三角形）、ＣＤ１６−ＢＣＭＡ二重特異性構築物（図５Ｂおよび図５Ｃの白抜き円）、およびＮＫｐ３０ヌル−ＢＣＭＡ  Ｆｃヌル構築物（図５Ｂおよび図５Ｃの逆三角形）よりも優れた活性を呈した。
【図６】ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０に結合する例示的なグリコシル化多重特異性構築物（構築物１（四角）および構築物２（菱形））が、高ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞に対してＮＫ細胞活性化およびＡＤＣＣ活性を増進させることを示す折れ線グラフ。これらの多重特異性構築物は、抗ＮＫｐ３０  Ｆａｂ部分のアミノ酸配列のみが異なり、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（中黒円）および抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（網掛け暗色）と比較して試験した場合、高ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞に対して優れたＡＤＣＣ活性（図６Ａ）およびＩＦＮγ産生（図６Ｂ）を呈する。Ｘ軸は、構築物または抗体の濃度を示し、Ｙ軸は、ＮＫ細胞によるＨ９２９細胞の特異的溶解％（図６Ａ）または放出されたＩＦＮγの濃度（図６Ｂ）を示す。
【図７】ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０に結合する例示的なグリコシル化多重特異性構築物（構築物１（四角）および構築物２（菱形））が、中程度ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞に対してＮＫ細胞活性化およびＡＤＣＣ活性を増進させることを示す折れ線グラフ。これらの多重特異性構築物は、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（中黒円）および抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（網掛け円）と比較して試験した場合、中程度ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞に対して優れたＡＤＣＣ活性（図７Ａ）およびＩＦＮγ産生（図７Ｂ）を呈する。Ｘ軸は、構築物または抗体の濃度を示し、Ｙ軸は、ＮＫ細胞によるＭＭ１．Ｓ細胞の特異的溶解％（図７Ａ）または放出されたＩＦＮγの濃度（図７Ｂ）を示す。
【図８】ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０に結合する例示的なグリコシル化多重特異性構築物（構築物１（四角）および構築物２（菱形））が、低ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞に対してＮＫ細胞活性化およびＡＤＣＣ活性を増進させることを示す折れ線グラフ。これらの多重特異性構築物は、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（中黒円）および抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（網掛け円）と比較して試験した場合、低ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞に対して優れたＡＤＣＣ活性（図８Ａ）およびＩＦＮγ産生（図８Ｂ）を呈する。Ｘ軸は、構築物または抗体の濃度を示し、Ｙ軸は、ＮＫ細胞によるＲＰＭＩ−８２２６細胞の特異的溶解％（図８Ａ）または放出されたＩＦＮγの濃度（図８Ｂ）を示す。
【図９】Ｈ９２９がん細胞の存在下または非存在下において、ＮＫｐ３０−ＢＣＭＡ多重特異性抗原結合構築物がＮＫ細胞活性化に及ぼす効果を描く棒グラフ。左から右に、構築物１、３Ｚ、４Ｚ、２Ｚ（構築物２Ｚは、本明細書では構築物９とも呼ばれる）、５Ｚ、および抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１の効果が示されている。Ｙ軸は、ｐｇ／ｍＬの単位で表現されているＩＦＮγ産生を表す。
【図１０】Ｈ９２９がん細胞の存在下（ＮＫ＋Ｈ９２９＋構築物１（四角）およびＮＫ＋Ｈ９２９＋構築物２（菱形））または非存在下（白抜き円はＮＫ＋構築物１を描き、網掛け円はＮＫ＋構築物２を描く）において、ＮＫｐ３０−ＢＣＭＡ多重特異性抗原結合構築物がＮＫ細胞活性化に及ぼす効果を描く折れ線グラフ。Ｙ軸は、ＣＤ６９＋ＮＫ細胞のパーセンテージを表す。
【図１１】Ｈ９２９がん細胞の存在下（ＮＫ＋Ｈ９２９＋構築物１（四角）およびＮＫ＋Ｈ９２９＋構築物２（菱形））または非存在下（白抜き円はＮＫ＋構築物１を描き、中黒円はＮＫ＋構築物２を描く）において、ＮＫｐ３０−ＢＣＭＡ多重特異性抗原結合構築物がＮＫ細胞活性化に及ぼす効果を描く折れ線グラフ。Ｙ軸は、ＣＤ１３７＋ＮＫ細胞のパーセンテージを表す。
【図１２】サイトカインＩＬ−２およびＩＬ−１５による以前の刺激の非存在下において、ＮＫｐ３０−ＢＣＭＡ多重特異性抗原結合構築物（構築物１（四角）および構築物２（菱形））がＮＫ細胞活性化に及ぼす効果を描く折れ線グラフ。比較のために、抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１（円）の効果が示されている。Ｙ軸は、ｐｇ／ｍＬの単位で表現されているＩＦＮγ産生を表す。Ｘ軸は、構築物または抗体の濃度をｎＭで表す。
【図１３】サイトカインＩＬ−２およびＩＬ−１５による以前の刺激の非存在下において、ＮＫｐ３０−ＢＣＭＡ多重特異性抗原結合構築物がＮＫ細胞活性化に及ぼす効果を描く折れ線グラフ。構築物１（四角）、構築物２（菱形）、および抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１（円）のデータが示されている。Ｙ軸は、ＣＤ６９＋ＮＫ細胞のパーセンテージを表す。Ｘ軸は、構築物または抗体の濃度をｎＭで表す。
【図１４】サイトカインＩＬ−２およびＩＬ−１５による以前の刺激の非存在下にいて、ＮＫｐ３０−ＢＣＭＡ多重特異性抗原結合構築物がＮＫ細胞活性化に及ぼす効果を描く折れ線グラフ。Ｙ軸は、ＣＤ１３７＋ＮＫ細胞のパーセンテージを表す。構築物１（四角）、構築物２（菱形）、および抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１（円）のデータが示されている。Ｘ軸は、構築物または抗体の濃度をｎＭで表す。
【図１５】ＮＫｐ３０−ＢＣＭＡ多重特異性抗原結合構築物が、エロツズマブおよびダラツムマブよりも強力な標的細胞溶解の誘導因子であることを示す図。図１５Ａは、ＭＭ．１Ｓ腫瘍細胞上での腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、およびＣＳ１の表面発現を反映する。多重特異性構築物（四角）は、抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（円）、ダラツムマブ（逆三角形）、およびエロツズマブ（菱形）と比べて試験した場合、腫瘍細胞に対してＩＦＮγ産生増加（図１５Ｂ）および優れたＡＤＣＣ活性（図１５Ｃ）を呈した。Ｘ軸は、構築物または抗体の濃度を示し、Ｙ軸は、放出されたＩＦＮγの濃度（図１５Ｂ）またはＮＫ細胞によるＭＭ．１Ｓ腫瘍細胞の特異的溶解％（図１５Ｃ）を示す。
【図１６】本明細書に記載されている多重特異性抗原結合構築物の例示的な実施形態の説明図。この構築物は、ＮＫｐ３０、第１の腫瘍抗原、第２の腫瘍抗原、およびＮＫｐ４６などの第２のＮＫ活性化受容体と特異的に結合する。
【図１７Ａ】本Ｈｅｒ２−ＮＫｐ３０多重特異性構築物は、ＮＫｐ３０およびＣＤ１６を標的化することにより優れた活性を呈することを示す折れ線グラフ。図１７Ａ、図１７Ｂ、および図１７ＣのＸ軸には構成物または抗体の濃度が示されている。図１７Ｂおよび図１７ＣのＹ軸には、産生されたＩＦＮγの量（ｐｇ／ｍＬ）が示されており、図１７ＡのＹ軸には特異的溶解のパーセンテージが示されている。図１７Ａは、Ｈｅｒ２＋ＳＫＢＲ３腫瘍細胞を使用した結果を示し、図１７Ｂおよび図１７Ｃは、それぞれＨｅｒ２を低発現レベルおよび中程度〜低発現レベルで発現するＳＷ４８０腫瘍細胞およびＴ４７Ｄ腫瘍細胞を使用した結果を示す。ＮＫｐ３０−Ｈｅｒ２多重特異性構築物（構築物Ａ（白抜き菱形）および構築物Ｂ（四角））は、モノクローナル抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ、円）またはグリコシル化を欠如した抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１抗体の変異体（中黒菱形）よりも優れた活性を呈した（ＥＣ５０値がより低いと決定された）。同様に、そのような構成物は、幾つかの抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１モノクローナル抗体と比較して、ＮＫ細胞によるＩＦＮγ発現の誘導がより強力だった（図１７Ａ）。
【図１７Ｂ】本Ｈｅｒ２−ＮＫｐ３０多重特異性構築物は、ＮＫｐ３０およびＣＤ１６を標的化することにより優れた活性を呈することを示す折れ線グラフ。図１７Ａ、図１７Ｂ、および図１７ＣのＸ軸には構成物または抗体の濃度が示されている。図１７Ｂおよび図１７ＣのＹ軸には、産生されたＩＦＮγの量（ｐｇ／ｍＬ）が示されており、図１７ＡのＹ軸には特異的溶解のパーセンテージが示されている。図１７Ａは、Ｈｅｒ２＋ＳＫＢＲ３腫瘍細胞を使用した結果を示し、図１７Ｂおよび図１７Ｃは、それぞれＨｅｒ２を低発現レベルおよび中程度〜低発現レベルで発現するＳＷ４８０腫瘍細胞およびＴ４７Ｄ腫瘍細胞を使用した結果を示す。ＮＫｐ３０−Ｈｅｒ２多重特異性構築物（構築物Ａ（白抜き菱形）および構築物Ｂ（四角））は、モノクローナル抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ、円）またはグリコシル化を欠如した抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１抗体の変異体（中黒菱形）よりも優れた活性を呈した（ＥＣ５０値がより低いと決定された）。同様に、そのような構成物は、幾つかの抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１モノクローナル抗体と比較して、ＮＫ細胞によるＩＦＮγ発現の誘導がより強力だった（図１７Ａ）。
【図１７Ｃ】本Ｈｅｒ２−ＮＫｐ３０多重特異性構築物は、ＮＫｐ３０およびＣＤ１６を標的化することにより優れた活性を呈することを示す折れ線グラフ。図１７Ａ、図１７Ｂ、および図１７ＣのＸ軸には構成物または抗体の濃度が示されている。図１７Ｂおよび図１７ＣのＹ軸には、産生されたＩＦＮγの量（ｐｇ／ｍＬ）が示されており、図１７ＡのＹ軸には特異的溶解のパーセンテージが示されている。図１７Ａは、Ｈｅｒ２＋ＳＫＢＲ３腫瘍細胞を使用した結果を示し、図１７Ｂおよび図１７Ｃは、それぞれＨｅｒ２を低発現レベルおよび中程度〜低発現レベルで発現するＳＷ４８０腫瘍細胞およびＴ４７Ｄ腫瘍細胞を使用した結果を示す。ＮＫｐ３０−Ｈｅｒ２多重特異性構築物（構築物Ａ（白抜き菱形）および構築物Ｂ（四角））は、モノクローナル抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ、円）またはグリコシル化を欠如した抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１抗体の変異体（中黒菱形）よりも優れた活性を呈した（ＥＣ５０値がより低いと決定された）。同様に、そのような構成物は、幾つかの抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１モノクローナル抗体と比較して、ＮＫ細胞によるＩＦＮγ発現の誘導がより強力だった（図１７Ａ）。
【図１８】種々の培養腫瘍細胞によるヒトＨｅｒ２発現レベルを示すフローサイトメトリープロット。
【図１９】ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物１は、カニクイザルマカクの骨髄中の形質細胞を枯渇させることを実証する図。構築物１を３０．２５ｍｇ／ｋｇで成体カニクイザル（ｎ＝２）に単回静脈内注射した。処置したサルの骨髄中の免疫グロブリン分泌細胞の数を、ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＡに特異的なアッセイを使用して経時的にＥＬＩＳＡで測定した。処置動物では両方とも、処置２週間後に骨髄形質細胞の強力な減少（＞８０％）が、続いて３週間後にリバウンドが観察された。
【図２０】ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物１が、処置したカニクイザルマカクの血漿中の血清ＩｇＭの減少を誘導することを実証する図。ＥＬＩＳＡを使用して、処置したサルの末梢血中の血漿ＩｇＭのレベルを経時的に測定した（図２０Ａ）。このアッセイは、カニクイザルＩｇＭに特異的であり、標準カニクイザルＩｇＭを使用して、処置したサルの血中ＩｇＭ濃度を算出した。処置の５週間後に、血漿ＩｇＭの強力な減少の開始が観察された（図２０Ｂ）。データは３つの独立実験の代表的なものである。サルにおけるこのレベルの血清ＩｇＭ枯渇は、ヒトにおける６回の血漿交換後（例えば、ＪＴ  グプティル（ＪＴ  Ｇｕｐｔｉｌｌ）ら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０１６）４９（７）：４７２−４７９を参照）およびヒトにおけるＦｃ／ＦｃＲｎ遮断後（例えば、ウルリヒス（Ｕｌｒｉｃｈｔｓ）、２０１７を参照）に観察されているものと同様である。
【図２１】ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物１が、処置したカニクイザルのｉｎ  ｖｉｖｏ  ＮＫ細胞拡大増殖を誘導することを実証する図。図２１Ａに示されているように、ＮＫ細胞は、処置したサルの血液中で拡大増殖し、処置の約１４日後に最大ピークを示した。ＮＫ細胞は、処置したサルの骨髄においても拡大増殖したが（図２１Ｂ）、この拡大増殖は、サルＢ６０１６の方がＡＫ７４９Ｊよりも少なかった。
【図２２】ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物１が、サルＡＫ７４９ＪにおいてＮＫ細胞活性化を誘導することを実証する図。ＣＤ６９発現により示されるように、ＮＫ細胞は、カニクイザルＡＫ７４９Ｊの血液（図２２Ａ）および骨髄（図２２Ｂ）で活性化された。サルＢ６０１６は、処置前に高いＣＤ６９発現（＞７０％）を示し、処置の経過中に高いＣＤ６９発現を維持した。
【図２３】ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物１が、典型的なＩｇＧ１様薬物動態プロファイルを表示することを実証する図。構築物１の単回ＩＶ注射後に血漿を収集し、抗原特異的ＥＬＩＳＡを使用して、処置したサルの血液中の構築物１のレベルを測定した。二相減衰モデル（ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｄｅｃａｙ  ｍｏｄｅｌ）を使用して、両サルのβ相半減期が約１６日間であると推定した。
【図２４】ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物１（四角）が、腫瘍細胞の存在下でのみ、ＮＫ細胞によるＩＦＮγ（図２４Ａ）、ＴＮＦα（図２４Ｂ）、およびランテス（図２４Ｃ）のより高い産生を促進し、ＢＣＭＡに対するＩｇＧ１モノクローナル抗体単独（円）よりも優れた活性を有することを示す折れ線グラフ。Ｘ軸は、構築物または抗体の濃度を示し、Ｙ軸は、放出された種々のサイトカインの濃度をｐｇ／ｍｌで示す。
【図２５】ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物１が、骨髄腫患者に由来する末梢ＮＫ細胞による多発性骨髄腫腫瘍細胞に対する活性化および細胞傷害性を誘導することを実証する図。図２５Ａは、健常ドナーおよび多発性骨髄腫患者が、同等レベルのＮＫｐ３０およびＣＤ１６ＡをＰＢＭＣ上に発現することを示す。図２５Ｂは、アイソタイプ対照としてのトラスツズマブまたは抗体無しの場合と比較して、多重特異性抗原結合構築物１が、多発性骨髄腫を有する患者から単離された活性化ＮＫ細胞の増加、ならびに多発性骨髄腫細胞に対する細胞傷害活性の増加に結び付くことを示す。
【図２６】ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物１が、多発性骨髄腫患者の骨髄に由来する自家骨髄腫細胞のＮＫ細胞殺傷を誘導することを実証する図。図２６Ａは、新たに診断された多発性骨髄腫患者の骨髄中の形質細胞がＢＣＭＡを発現しており、ＮＫ細胞が、高レベルのＮＫｐ３０およびＣＤ１６Ａを発現していることを示す。図２６Ｂに示されているように、構築物１、または構築物１の非グリコシル化（Ｆｃヌル）バージョンである構築物３、またはＢＣＭＡ−ＩｇＧ１  ｍＡｂの存在下で骨髄細胞を試験した場合、構築物１およびその非グリコシル化バージョンである構築物３では、ＢＣＭＡ−ＩｇＧ１モノクローナル対照と比較してより高い程度の悪性骨髄細胞の死が無抗体対照に対して観察された。
【図２７】親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体である多重特異性抗原結合構築物５が、可溶性ＢＣＭＡリガンドであるＡＰＲＩＬの存在下における結合を向上させたことを実証する図。左の折れ線グラフに示されているように、構築物１は、１００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬの存在下では、Ｈ９２９ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞に結合しない。しかしながら、親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体である多重特異性抗原結合構築物５（右の折れ線グラフに示されている）は、可溶性ＡＰＲＩＬの存在下でさえ、ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞に結合することができる。
【図２８】親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体である多重特異性抗原結合構築物５活性が、可溶性ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの存在により影響を受けないことを実証する図。初代ＮＫ細胞を、ＢＣＭＡｐｏｓ多発性骨髄腫腫瘍細胞株Ｕ２６６（図２８Ａ）またはＭＭ１Ｒ（図２８Ｂ）と共に、可溶性ＢＣＭＡリガンドであるＡｐｒｉｌおよびＢＡＦＦを用いてまたは用いずに、種々の濃度の構築物５の存在下で培養した。ＮＫ細胞により分泌されたＩＦＮγを、４８時間後に上清中で測定した。
【図２９】親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体である多重特異性抗原結合構築物５が、高レベルの可溶性ＢＣＭＡの存在下で活性を示すことを実証する図。初代ＮＫ細胞を、可溶性ＢＣＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）および種々の濃度の構築体５の非存在下（網掛け円）または存在下（白抜き円）で、Ｈ９２９がん細胞と共にインキュベートした。ＮＦ細胞によるＩＦＮγの分泌を測定した。
【図３０】親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体である多重特異性抗原結合構築物５が、ＢＣＭＡｌｏｗ標的細胞に対して活性を保持したことを実証する図。初代ＮＫ細胞を、高および低ＢＣＭＡコピー／細胞を発現するＢＣＭＡｐｏｓ腫瘍細胞株と共に、構築物５の存在下で培養した。ＮＫ細胞により放出された上清中のＩＦＮ−γを、４８時間の時点でＥＬＩＳＡにより測定した。データは、構築物５が、ＢＣＭＡ高（ｈｉｇｈ）発現腫瘍細胞に対して選択性を示し、ＢＣＭＡ低（ｌｏｗ）発現腫瘍細胞に対して活性を保持したが、２，０００ＢＣＭＡコピー／細胞未満を発現する腫瘍細胞（例えば、Ｒａｊｉ）に対しては活性を示さなかったことを示す。
【図３１】親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体である多重特異性抗原結合構築物５が、より高発現のＢＣＭＡ腫瘍細胞に対して選択性を示し、低ＢＣＭＡ発現細胞での活性を保持したことを実証する図。初代ＮＫ細胞を、高および低ＢＣＭＡコピー／細胞を発現するＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞株と共に、構築物５の存在下で培養した。ＮＫ細胞により放出された上清中のＩＦＮ−γを、４８時間の時点でＥＬＩＳＡにより測定した。構築物５は、ピコモル濃度でさえ、ＢＣＭＡ発現のレベルが様々である一連の細胞株と共に共培養したＮＫ細胞によるＩＦＮγ産生を誘導する活性を示した。
【図３２】親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体である多重特異性抗原結合構築物５（四角）が、低コピー／細胞のＢＣＭＡを発現するリンパ腫細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化するのに対し、ＢＣＭＡ−ＩｇＧ１モノクローナル（円）は活性を一切示さないことを実証する図。初代ＮＫ細胞を、種々の濃度の構築物５またはＢＣＭＡ−ＩｇＧ１の存在下で、ＪｅＫｏ−１腫瘍細胞（マントル細胞リンパ腫）と共に培養した。ＮＫ細胞により放出された上清中のＩＦＮγを、４８時間の時点でＥＬＩＳＡにより測定した。
【図３３】親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体である多重特異性抗原結合構築物５（中黒四角）により誘導された増殖シグナルが、主にＮＫｐ３０係合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）に依存することを実証する図。初代ＮＫ細胞を、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識し、ＩＬ−２、および（ｉ）構築物５、（ｉｉ）ＢＣＭＡ、ＣＤ１６（Ｆｃを介して）に結合するが、ＮＫｐ３０には結合しない二重特異性物質［ＮＫｐ３０ヌル×ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１（白抜き四角）］、または（ｉｉｉ）ＢＣＭＡに結合するが、ＣＤ１６またはＮＫｐ３０には結合しない二重特異性物質［ＮＫｐ３０ヌル×ＢＣＭＡ  Ｆｃヌル（逆三角形）］の存在下で、Ｈ９２９がん細胞と共にインキュベートした。５日後に、フローサイトメトリーによりＮＫ細胞増殖を測定し、ＣＴＶ希釈物を評価した。構築物５は、ＣＤ１６Ａに結合するがＮＫｐ３０には結合しない二重特異性物質［ＮＫｐ３０ヌル×ＢＣＭＡ（ＩｇＧ１）］またはＣＤ１６ＡおよびＮＫｐ３０に結合しない二重特異性物質［ＮＫｐ３０ヌル×ＢＣＭＡ  Ｆｃヌル］よりも高い程度にＮＫ細胞増殖を誘導し、構築物５の増殖シグナルが、主にＮＫｐ３０係合に依存することが示される。
【図３４】非フコシル化が、多重特異性抗原結合構築物１（四角）の活性を向上させることを実証する図。初代ＮＫ細胞を、種々の濃度の抗体の存在下でＨ９２９腫瘍細胞と共に培養し、ＮＫ細胞上でのＣＤ１０７発現ならびに細胞内ＩＦＮγを、フローサイトメトリーにより測定した。これらのデータは、多重特異性抗原結合構築物１の非フコシル化Ｆｃである構築物７（逆三角形）の使用が、活性を向上させることを実証する。
【図３５】ＮＫｐ３０が、多発性骨髄腫患者の骨髄中のγδＴ細胞上に発現されることを実証する図。骨髄（ＢＭ）細胞を染色し、４人の多発性骨髄腫患者のＢＭにおけるγδＴ細胞の頻度ならびにγδＴ細胞によるＮＫｐ３０の発現を、図３５Ａに示されているように、フローサイトメトリーで評価した。図３５Ｂは、各患者の骨髄穿刺液中のＴＣＲ  γδＴ細胞の頻度を示す。これらのデータも、多発性骨髄腫患者のＮＫｐ３０発現γδＴ細胞を、本明細書に記載されているＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを標的とする多重特異性抗原結合構築物を使用して活性化することができることを示す。
【図３６】親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体である多重特異性抗原結合構築物５が、１００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬおよび１ｎｇ／ｍｌのＢＡＦＦの存在下ならびにＮＫ細胞の非存在下でさえ、ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞であるＭＭ．１Ｒの増殖を阻止することを実証する図。ＭＭ．１Ｒ腫瘍細胞の増殖を、ＩＮＣＵＣＹＴＥ（登録商標）生細胞分析システム（エッセンインスルメンツ社（Ｅｓｓｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）、米国ミシガン州アナーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ）所在）を使用して蛍光イメージング法により１００時間の期間にわたってモニターした。
【図３７】親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体である多重特異性抗原結合構築物５が、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（サーモフィッシャー社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、米国マサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）所在）の希釈により測定したところ、モノクローナルＢＣＭＡ−ＩｇＧ１抗体よりも高い程度にＮＫ細胞の増殖を誘導したことを実証する図。
【図３８】親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体である多重特異性抗原結合構築物５が、１００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬおよび１ｎｇ／ｍｌのＢＡＦＦの存在下で、ＮＫ細胞によるＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞ＭＭ．１Ｒの強力な殺傷を誘導することを実証する図。ＮＫ細胞によるＭＭ．１Ｒ腫瘍細胞の殺傷は、ＩＮＣＵＣＹＴＥ（登録商標）生細胞分析システムを使用して蛍光イメージング法により４時間の期間にわたってモニターした。
【図３９】ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物１が、モノクローナルＢＣＭＡ−ＩｇＧ１抗体と比較して、広範囲の抗原発現を発現するＢＣＭＡ腫瘍細胞の強力な殺傷を誘導することを実証する図。
【図４０】多重特異性抗原結合構築物５の非グリコシル化（Ｆｃヌル）変異体である多重特異性抗原結合構築物８が、ＣＤ１６Ａ係合の非存在下でさえ活性を示すことを実証する図。
【図４１】親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体である多重特異性抗原結合構築物５が、低ＢＣＭＡ  ＪｅＫｏ−１腫瘍細胞のＮＫ細胞殺傷を誘導するが、ＢＣＭＡ陰性ＨＬ−６０腫瘍細胞のＮＫ細胞殺傷を誘導しないことを実証する図。
【図４２】Ｈｅｒ２およびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物を使用した細胞傷害性結果を示す図。Ｈｅｒ２およびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物である構築物ＣおよびＤは、抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体（トラスツズマブ）よりも優れた活性を呈した。
【図４３】拡大増殖したγδＴ細胞の表現型および機能評価を示す図。図示されているように、拡大増殖したγδＴ細胞のおよそ４０％は、ＮＫｐ３０発現に対して陽性である。
【図４４】標的Ｕ２６６細胞のγδＴ細胞特異的細胞傷害性が、構築物５の存在下では用量依存的効果を示すことを実証する図。
【図４５】１０ｐＭの構築物５の存在下では、３０分後に標的Ｕ２６６細胞が顕著に減少し、構築物５によるγδＴ細胞上のＮＫｐ３０の係合が、標的細胞殺傷を促進することを実証することを示す図。
【図４６】構築物５によるγδＴ細胞上のＮＫｐ３０の係合が、γδＴ細胞増殖を増加させることを実証する図。
【図４７Ａ】ＮＫｐ３０の部分的アミノ酸配列を有する表を示す図。ｍＡｂ８、ｍＡｂ１０、およびｍＡｂ１１が結合するエピトープを構成する残基は、太字および下線付きの文字で示されている。
【図４７Ｂ】残基Ｉ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３が球体として示されているヒトＮＫｐ３０のＸ線結晶解析画像（左パネル）、ならびに残基Ｉ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３が球体として示されている、Ｂ７−Ｈ６に結合しているヒトＮＫｐ３０のＸ線結晶解析画像（右パネル）が描かれている図。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
以下の記載は、開示される組成物および方法の様々な態様および実施形態を記述する。具体的な実施形態は、組成物および方法の範囲を定義することを意図するものではない。むしろ、実施形態は単に、開示される組成物および方法の範囲内に少なくとも含まれる非限定的な例を提供する。記載は当業者の観点から読まれるべきであり、したがって、当業者に周知の情報は必ずしも含まれない。本明細書において使用される場合、単数形ａ、およびｔｈｅは、文脈が他に明確に規定しなければ、複数の参照物を含むこともまた理解されるべきである。
【０１０５】
多重特異性抗原結合性構築物
少なくとも２つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。第１の抗原結合単位は、腫瘍抗原に結合することにより腫瘍細胞を特異的に標的化するか、またはＢ系列細胞により発現される標的抗原に結合することによりＢ系列細胞を特異的に標的化する。第２の抗原結合単位はＮＫｐ３０抗原に特異的に結合する。構築物は、がんまたは自己免疫疾患を有する対象における腫瘍細胞またはＢ細胞（形質細胞もしくは自己反応性Ｂ細胞などのＢ系列細胞を含む）の標的化および殺傷を含む様々な方法において有用である。
【０１０６】
免疫系は、腫瘍細胞を認識および排除する能力を有するが、腫瘍細胞は、免疫系を逃れる複数の戦略を使用することができる。免疫チェックポイントの遮断は、治療的な抗腫瘍免疫を活性化または再活性化させるアプローチの１つである。がんの形成または進行を阻害する別のアプローチは、様々なエフェクター分子の機能および天然の免疫応答に関与する相互作用を増進することによる。本開示は、天然の免疫応答を増進する多重特異性抗原結合性構築物を提供する。免疫応答は、対象のＮＫ細胞がＣＤ１６の低減されたレベルを呈し、および／または対象の腫瘍細胞が腫瘍抗原発現の低減されたレベルを呈する状態であっても構築物により増進される。本明細書において使用される場合、「免疫応答を増進する」は、多重特異性抗原結合性構築物の存在下で起こるがその非存在下では起こらない免疫応答の増加を指す。そのような増進は、本明細書の他の箇所において記載されるように、１つまたは複数のＮＫまたはＴ細胞機能（例えば、細胞傷害活性、サイトカイン産生）などの増加を指すことができる。
【０１０７】
本開示は、一部の態様では、少なくとも２つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性、および四重特異性）抗原結合性構築物であって、第１の抗原結合単位が、腫瘍抗原またはＢ系列細胞により発現される抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位が、ＮＫｐ３０抗原に特異的に結合する、多重特異性抗原結合性構築物およびその組成物を提供する。
【０１０８】
本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は少なくとも３つの連結した抗原結合単位を含み、第１の抗原結合単位は第１の腫瘍抗原またはＢ系列細胞により発現される抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位は第２の腫瘍抗原またはＢ系列細胞により発現される抗原に特異的に結合し、第３の抗原結合単位はＮＫｐ３０抗原に特異的に結合する。
【０１０９】
本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は少なくとも３つの連結した抗原結合単位を含み、第１の抗原結合単位は腫瘍抗原またはＢ系列細胞により発現される抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位はＮＫｐ３０抗原に特異的に結合し、第３の抗原結合単位はＮＫ受容体に特異的に結合する。一部のそのような実施形態では、第３の抗原結合単位はＮＫｐ３０にも結合する。一部のそのような実施形態では、第３の抗原結合単位は異なる活性化ＮＫ受容体に結合し、すなわち、ＮＫｐ３０に結合しない。
【０１１０】
本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は少なくとも４つの連結した抗原結合単位を含み、第１の抗原結合単位は第１の腫瘍抗原またはＢ系列細胞により発現される抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位は第２の腫瘍抗原またはＢ系列細胞により発現される抗原に特異的に結合し、第３の抗原結合単位はＮＫｐ３０抗原に特異的に結合し、第４の抗原結合単位は活性化ＮＫ受容体に特異的に結合する。一部のそのような実施形態では、第４の抗原結合単位はＮＫｐ３０にも結合する。一部のそのような実施形態では、第４の抗原結合単位は異なる活性化ＮＫ受容体に結合し、すなわち、ＮＫｐ３０に結合しない。第４の抗原結合単位が異なる活性化ＮＫ受容体に結合するそれらの実施形態では、受容体は、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、２Ｂ４、ＣＤ２２６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３７、ＣＤ１６ａ、およびＣＤ２から選択される。これらのＮＫ活性化受容体の例示的なヒトアミノ酸配列は配列番号２８〜３６として見出すことができる。
【０１１１】
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は１つまたは複数の腫瘍抗原を標的化することができ、該腫瘍抗原としては、（ｉ）腫瘍特異抗原、（ｉｉ）腫瘍関連抗原、（ｉｉｉ）腫瘍特異抗原を発現する細胞、（ｉｖ）腫瘍関連抗原を発現する細胞、（ｖ）腫瘍上の胚性抗原、（ｖｉ）自己腫瘍細胞、（ｖｉｉ）腫瘍特異的膜抗原、（ｖｉｉｉ）腫瘍関連膜抗原、（ｉｘ）増殖因子受容体、（ｘ）増殖因子リガンド、および（ｘｉ）がんと関連付けられる任意の他の種類の抗原または抗原提示細胞もしくは材料が挙げられる。
【０１１２】
一部の実施形態では、第１および／または第２の腫瘍抗原は腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）である。本明細書において使用される場合、「ＴＳＡ」は、腫瘍細胞に特有であり、身体中の他の細胞上に存在しない抗原である。一部の実施形態では、第１および／または第２の腫瘍抗原は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。「ＴＡＡ」は、本明細書において使用される場合、腫瘍細胞に特有ではなく、その代わりに抗原に対する免疫学的寛容の状態を誘導しない条件下で正常細胞上にも発現される。腫瘍上の抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能とする条件下で起こることができる。一部の実施形態では、ＴＡＡは、免疫系が未熟であり応答が不可能な胎生期発生の間に正常細胞上に発現され、または正常細胞上に極めて低いレベルで通常存在するが、腫瘍細胞上においてはるかにより高いレベルで発現される。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、ＴＡＡは、患者の腫瘍細胞をシークエンシングし、腫瘍中にのみ見出される突然変異したタンパク質を同定することにより決定される。これらの抗原は「ネオ抗原」と称される。ネオ抗原が同定されると、それに対する治療的抗体を製造し、本明細書に記載の方法において使用することができる。
【０１１４】
一部の態様では、腫瘍抗原は、上皮がん抗原、前立腺特異的がん抗原（ＰＳＡ）もしくは前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、膀胱がん抗原、肺がん抗原、結腸がん抗原、卵巣がん抗原、脳がん抗原、胃がん抗原、腎細胞癌抗原、膵臓がん抗原、肝臓がん抗原、食道がん抗原、頭頸部がん抗原、結腸直腸がん抗原、リンパ腫抗原、Ｂ細胞リンパ腫がん抗原、白血病抗原、骨髄腫抗原、急性リンパ芽球性白血病抗原、慢性骨髄性白血病抗原、または急性骨髄性白血病抗原である。
【０１１５】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、本明細書に記載の開示される多重特異性抗原結合性構築物により標的化することができる腫瘍抗原の例である。ＢＣＭＡはＴＮＦ受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体であり、成熟Ｂ細胞上に通常発現される。ＢＣＭＡは天然に様々なアイソフォームにおいて存在する。例として、ヒトＢＣＭＡは配列番号６のアミノ酸配列を含む。ＢＣＭＡはＢＣＭおよび腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）としても公知である。ＢＣＭＡはそのリガンドであるＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）に結合し、ＢＡＦＦは、ＴＮＦファミリーのメンバーであり、Ｂ細胞共刺激の目的のためにＴ細胞および樹状細胞により発現される。ＢＣＭＡは、ある特定のがん細胞、例えば、多発性骨髄腫細胞上に検出される。
【０１１６】
ヒト上皮増殖因子２（ＨＥＲ２）は、本明細書に記載の開示される多重特異性抗原結合性構築物により標的化することができる腫瘍抗原の別の例である。ＨＥＲ２は、ｅｒｂＢ２遺伝子によりコードされる膜結合型チロシンキナーゼ受容体である。ＨＥＲ２は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ２、ＣＤ３４０、およびＥＲＢＢ２としても公知である。ＨＥＲ２は、ある特定のがん細胞、例えば、乳がん細胞、卵巣がん細胞、胃がん細胞、肺がん細胞、および子宮がん細胞上に検出される。例として、ヒトＨＥＲ２アイソフォームｂは配列番号３７のアミノ酸配列を含む。
【０１１７】
開示される多重特異性抗原結合性構築物により標的化することができる追加の腫瘍抗原としては、１ＧＨ−ＩＧＫ、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、９Ｄ７、シクロフィリンＣ会合タンパク質、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン−４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ  ７３３、ＢＡＧＥ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ベータカテニン、ベータ−ＨＣＧ、ＢｒＥ３抗原、ＢＣＡ２２５、ＢＩＮＧ−４、ＢＲＣＡ１／２、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ  １５−３＼ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、カルシウム活性化クロライドチャネル２、ＣＡＧＥ、ＣＡＭ４３、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、炭酸脱水酵素ＩＸ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫ４ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＭＬ６／６、ＣＯ−０２９、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、サイクリンＢ、ＨＩＦ−１ａ、結腸特異的抗原ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、フィブロネクチン、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、Ｇａ７３３ＶＥｐＣＡＭ、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、Ｈ４−ＲＥＴ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＨＴｇｐ−１７５、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、未熟ラミニン受容体、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４抗原、ＫＳＡ、ＫＳ−１抗原、ＫＳ１−４、ＬＡＧＥ−１ａ、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＴＲＡＧ−３、ＭＣ１Ｒ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、メソテリン、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３���ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＭＹＬ−ＲＡＲ、ＮＢ／７０Ｋ、Ｎｍ２３Ｈ１、ＮｕＭＡ、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｐポリペプチド、ｐ１５、ｐ１６、ｐ５３、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ３、ＰＡＭ４抗原、膵臓がんムチン、ＰＤ１受容体（ＰＤ−１）、ＰＤ−１受容体リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＤ−１受容体リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＰＩ５、胎盤増殖因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、Ｐｍｅｌ１７前立腺酸ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＣＡＳ１、ＲＳ５、ＲＡＧＥ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｒａｓ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、ＳＡＰ−１、Ｓ１００、ＳＳＸ−２、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＳＤＤＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ２結合タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦ−βＲＩＩ、Ｉｇ  ＴＣＲ、ＴＬＰ、テロメラーゼ、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＳＰ−１８０、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、トムセン−フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、チロシナーゼ、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、ＸＡＧＥ、１７−１Ａ抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃ１−２、ｂｃ１−６、およびＫ−ｒａｓ、がん遺伝子マーカーおよびがん遺伝子産物が挙げられるがそれに限定されない（例えば、センシら（Ｓｅｎｓｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２００６）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １２：５０２３−３２；パルミアニら（Ｐａｒｍｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２００７）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７８：１９７５−７９；ノヴェッリーノら（Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．）（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ５４：１８７−２０７を参照）。
【０１１８】
一部の実施形態では、腫瘍抗原は、ヒト慢性疾患またはがん（例えば、子宮頸がん）と関連付けられるウイルスに由来するウイルス抗原である。例えば、一部の実施形態では、ウイルス抗原は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ＨＰＶ抗原Ｅ６および／もしくはＥ７、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する。
【０１１９】
顕著なことに、腫瘍抗原発現は、ＮＫ細胞、具体的には腫瘍に浸潤するＮＫ細胞による標的化を逃れるように腫瘍細胞により下方調節され得る。本発明の多重特異性抗原結合性構築物は、標的細胞が低い腫瘍抗原発現レベルを有する場合であってもＮＫ細胞による標的細胞の殺傷を増進する能力を有する。追加的に、多重特異性抗原結合性構築物は、低腫瘍抗原発現性腫瘍細胞の存在下であってもＩＦＮγ産生およびＡＤＣＣ機能を促進する能力を保持する。
【０１２０】
ＮＫｐ３０などの、本明細書において「ＮＫ活性化受容体」と称されることもある天然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）は、典型的には免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体である。そのようなＮＫ受容体を通じたシグナル伝達は強いＮＫ細胞活性化に繋がり、細胞内Ｃａ＋＋レベルの増加、細胞傷害性、およびサイトカインおよびリンホカイン放出の誘発、ならびに腫瘍細胞を含む多くの種類の標的細胞に対するＮＫ細胞傷害性の活性化を結果としてもたらす。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の実施形態において標的として使用するために想定される追加のＮＫ活性化受容体の非限定的な例としては、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、２Ｂ４、ＣＤ２２６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３７、ＣＤ１６ａ、およびＣＤ２が挙げられる。ＮＫｐ３０およびこれらの追加のＮＫ活性化受容体の例示的なヒトアミノ酸配列は、配列番号７、および２８〜３６として見出すことができる。
【０１２１】
ＮＫｐ３０（ＣＤ３３７としても公知）は、ＮＫ細胞、およびエフェクターγδ  Ｔ細胞などのＴ細胞のサブセット上に発現される。ＮＫｐ３０は、ＢＡＧ６、Ｂ７−Ｈ６（ＮＣＲ３ＬＧ１）、およびガレクチン−３（Ｇａｌ−３）を含む細胞外リガンドにより活性化され、そのようなリガンドを発現する隣接する細胞に対するＮＫ細胞細胞傷害性を刺激する。そのため、ＮＫｐ３０は腫瘍細胞に対するＮＫ細胞細胞傷害性を制御すると考えられている。ヒトＮＫｐ３０のアミノ酸配列は、例えば、配列番号７を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
【０１２２】
ＮＫｐ４６（ＣＤ３３５としても公知）は、休止ＮＫ細胞および活性化ＮＫ細胞の両方により選択的に発現される。活性化されると、ＮＫｐ４６は、そのリガンドを発現する隣接する細胞に対するＮＫ細胞細胞傷害性を刺激する。ヒトＮＫｐ４６のアミノ酸配列は、例えば、配列番号２８を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
【０１２３】
ＮＫｐ４４（ＣＤ３３６としても公知）は、活性化ＮＫ細胞およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された（すなわち、活性化）ＴＣＲｇ／ｄリンパ球細胞により選択的に発現される。ＮＫｐ４４は、混合型白血病−５（ｍｉｘｅｄ−ｌｉｎｅａｇｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ−５）タンパク質の新規のアイソフォームであるＮＫｐ４４Ｌにより活性化される。ヒトＮＫｐ４４のアミノ酸配列は、例えば、配列番号３６を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
【０１２４】
ＮＫＧ２Ｄ（ＣＤ３１４としても公知）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ８＋アルファ−ベータおよびガンマ−デルタＴ細胞中、新鮮に単離されたＰＢＭＣからの本質的に全てのＣＤ５６＋ＣＤ３−  ＮＫ細胞上、ならびにインターフェロン産生キラー樹状細胞（ＩＫＤＣ）中に発現される。ＮＫＧ２Ｄは、自己腫瘍細胞およびウイルス感染細胞の表面において提示される様々な細胞ストレス誘導性リガンドに結合することにより活性化され、レクチンなどのそのようなリガンドを発現する細胞に対するＮＫ細胞細胞傷害性を刺激する。ヒトＮＫＧ２Ｄのアミノ酸配列は、例えば、配列番号３２を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
【０１２５】
２Ｂ４（ＣＤ２４４としても公知）は、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーの異好性受容体であり、そのリガンドはＣＤ４８である。２Ｂ４は、ＮＣＲ３およびＮＣＲ１などの他のＮＫ受容体によるシグナルを増進することによりＮＫ活性化における共刺激因子として作用する。ヒト２Ｂ４４のアミノ酸配列は、例えば、配列番号２９および３０を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
【０１２６】
ＣＤ１３７（４１ＢＢとしても公知）は、活性化Ｔ細胞の他に、樹状細胞、Ｂ細胞、濾胞性樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒球および炎症の部位における血管壁の細胞上に発現され、そのリガンドはＴＮＦＳＦ９／４−１ＢＢＬである。ヒトＣＤ１３７のアミノ酸配列は、例えば、配列番号３３を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
【０１２７】
ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１としても公知）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびＴ細胞のサブセット上に発現され、そのリガンドはＣＤ１５５またはＣＤ１１２である。ヒトＣＤ２２６のアミノ酸配列は、例えば、配列番号３１を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
【０１２８】
ＣＤ１６ａ（ＦｃＲＩＩＩａとしても公知）は、ナチュラルキラー細胞、好中球多形核白血球、単球およびマクロファージ上に発現され、ＩｇのＦｃ領域の受容体であり、複合体化または凝集したＩｇＧの他に、単量体ＩｇＧに結合する。ヒトＣＤ１６ａのアミノ酸配列は、例えば、配列番号３４を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
【０１２９】
ＣＤ２（ＬＦＡ２としても公知）は、ナチュラルキラー細胞およびＴ細胞上に発現され、ＬＦＡ３／ＣＤ４８およびＣＤ４８の受容体である。ヒトＣＤ２のアミノ酸配列は、例えば、配列番号３５を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
【０１３０】
よって、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原結合単位はＮＫｐ３０に特異的に結合する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はＮＫｐ４６に特異的に結合する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はＮＫｐ４４に特異的に結合する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はＮＫＧ２Ｄに特異的に結合する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位は２Ｂ４に特異的に結合する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はＣＤ２２６に特異的に結合する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はＣＤ１３７に特異的に結合する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はＣＤ１６ａに特異的に結合する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はＣＤ２に特異的に結合する。
【０１３１】
本開示は、ある特定の免疫応答エフェクター分子および相互作用をアゴナイズすることにより免疫応答を増進するための組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、対象がＣＤ１６欠損性微環境を含むがんまたは状態を有する場合であっても、対象において免疫応答を増進するために使用することができる。ＣＤ１６は、ＮＫ細胞、好中球多形核白血球、単球、およびマクロファージ上に存在するＦｃ受容体であり、ＩｇＧ抗体上のＦｃ受容体に結合するのでＦｃγＲＩＩＩとしても公知である。ＣＤ１６は、シグナル伝達に参加するＣＤ１６ａおよびＣＤ１６ｂ  Ｆｃ受容体として同定されている。ＣＤ１６ａは、ある特定のＮＫ細胞上に存在し、サイトカイン産生および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介する細胞傷害性エフェクター活性を誘導する。ＣＤ１６ａの下方調節がサイトカイン活性化および標的細胞刺激後に起こることが示されている。
【０１３２】
ＣＤ１６発現の非存在下で腫瘍細胞殺傷を媒介することは重要である。第１に、ＮＫ細胞は２つの別個の集団：ＣＤ５６ｄｉｍ／ＣＤ１６陽性およびＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ１６陰性から構成される。健常個体において、ＣＤ１６陰性は総ＮＫ集団の５〜１５％を表す。しかしながら、一部のがん患者においてＣＤ１６陰性ＮＫ細胞の割合は大きく増加している。それらの細胞集団はフローサイトメトリーにより同定することができる。追加的に、腫瘍微環境は、細胞の表面からのＣＤ１６ａのシェディングを誘導すること（ＡＤＡＭ１７酵素により媒介される活性）または細胞の表面上のその発現を下方調節すること（ＴＧＦβおよびその他により媒介される活性）によりＣＤ５６ｄｉｍ／ＣＤ１６ｐｏｓ  ＮＫ細胞の表現型に影響することが示されている。ＮＫ細胞上のＣＤ１６ａ発現のレベルは、フローサイトメトリーを使用して測定することができる。さらに、ＣＤ１６ａの多型に起因して、一部の個体は、モノクローナル抗体により媒介されるＡＤＣＣを劇的に損なうＣＤ１６ａにおける突然変異を有する。患者を遺伝子型判定することができる。追加的に、同種造血幹細胞移植（ＨＣＳＴ）において、ＮＫ阻害受容体とＨＬＡとの間のミスマッチの存在は、ドナーＮＫ細胞がレシピエント免疫細胞を殺傷し、したがって残留悪性細胞を排除することを可能とする。最近、移植後に再構成される最初のＮＫ細胞はＮＫｐ３０＋／ＣＤ１６−表現型を示すことが示された。したがって、ＣＤ１６発現の非存在下で腫瘍細胞殺傷を媒介することは大きな重要性を有する。
【０１３３】
任意選択で、免疫応答を増進するための本発明の組成物および方法は、ＮＫ細胞が対照ＮＫ細胞と比較して５０％未満のＣＤ１６の発現を有する対象を伴う。任意選択で、対象のＣＤ１６欠損性微環境は、浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも１０％が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する腫瘍浸潤性ＮＫ細胞の集団を含む。ＮＫ細胞は１５０，０００未満のＣＤ１６コピー数を有することができる。一部の実施形態では、ＮＫ細胞はＣＤ１６を発現しない。
【０１３４】
特定の標的抗原を認識する少なくとも２つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物が提供される。そのため、「多重特異性抗原結合性構築物」という用語は、本明細書において使用される場合、二重特異性、三重特異性、四重特異性、および多重特異性抗原結合性構築物を含む。
【０１３５】
多重特異性抗原結合性構築物は、単一の多機能性ポリペプチド、小分子、もしくはアプタマーであることができ、または共有結合的もしくは非共有結合的に互いに会合した２つ以上の分子のマルチマー複合体であることができる。多重特異性抗原結合性構築物としては、別の機能分子、例えば、別のペプチド、タンパク質、および／またはアプタマーに連結されることまたはそれと共発現されることができる抗体（またはその抗原結合性断片）が挙げられる。例えば、抗体またはその断片は、第２の結合特異性を有する多重特異性抗原結合性構築物を製造するために、タンパク質またはその断片などの１つまたは複数の他の分子実体に（例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合またはその他により）機能的に連結させることができる。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、多重特異性抗原結合性構築物を製造するために、異なる結合特異性を有する１つまたは複数の抗体またはその抗原結合性断片に機能的に連結させられる。構築物の各抗体またはその抗原結合性部分は１つまたは複数の抗原結合特異性を有することができる。
【０１３６】
本明細書において使用される場合、抗原結合単位は、抗原に結合する構築物の区画を形成する多重特異性抗原結合性構築物のドメインまたは領域などを指す。第１の抗原結合単位は、構築物の第２の抗原結合単位とは別々の多重特異性抗原結合性構築物の結合区画を形成し、各単位は抗原結合の別々の領域を形成する。一般に、１つの単位（第１の単位）はその抗原結合において他の単位（第２の単位）とは別個である。例えば、構築物の１つの抗原結合単位は、腫瘍またはＢ系列細胞抗原（例えば、ＢＣＭＡ）について一価であってそれに結合する一方、構築物の他の抗原結合単位はＮＫｐ３０について一価であってそれに結合する。さらに、例として、構築物の１つの抗原結合単位は腫瘍またはＢ系列細胞抗原に結合する一方、構築物の他のアームはＮＫｐ３０または関連分子に結合する（例えば、構造の類似性に起因して、２つの抗原と交差反応する）。例えば、米国特許第９，８４５，３５６号明細書を参照。
【０１３７】
任意選択で、および一部の実施形態では、多重特異性構築物は四価である。例えば、一部の実施形態では、１つの抗原結合単位は腫瘍またはＢ系列細胞抗原について二価であり、それぞれは腫瘍またはＢ系列細胞抗原上の同じエピトープに結合する一方、他の抗原結合単位はＮＫｐ３０について二価であり、それぞれはＮＫｐ３０上の同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、多重特異性構築物は四価であり、１つの抗原結合単位は腫瘍またはＢ系列細胞抗原について二価であり、それぞれは腫瘍またはＢ系列細胞抗原上の２つの異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、多重特異性構築物は四価であり、１つの抗原結合単位はＮＫｐ３０について二価であり、それぞれはＮＫｐ３０上の２つの異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、多重特異性構築物は四価であり、１つの抗原結合単位は腫瘍またはＢ系列細胞抗原について二価であり、それぞれは腫瘍またはＢ系列細胞抗原上の２つの異なるがオーバーラップするエピトープに結合する。一部の実施形態では、多重特異性構築物は四価であり、１つの抗原結合単位はＮＫｐ３０について二価であり、それぞれはＮＫｐ３０の２つの異なるがオーバーラップするエピトープに結合する。一部の実施形態では、多重特異性構築物は四価であり、１つの抗原結合単位は第１の腫瘍抗原について一価であり、１つの抗原結合単位は第２の腫瘍またはＢ系列細胞抗原について一価であり、１つの抗原結合単位はＮＫｐ３０について二価であり、それぞれはＮＫｐ３０上の同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、多重特異性構築物は四価であり、１つの抗原結合単位は腫瘍またはＢ系列細胞抗原について一価であり、１つの抗原結合単位はＮＫｐ３０について二価であり、それぞれはＮＫｐ３０上の同じエピトープに結合し、１つの抗原結合単位は第２のＮＫ受容体について一価である。一部の実施形態では、多重特異性構築物は四価であり、１つの抗原結合単位は第１の腫瘍またはＢ系列細胞抗原について一価であり、１つの抗原結合単位は第２の腫瘍またはＢ系列細胞抗原について一価であり、１つの抗原結合単位はＮＫｐ３０について一価であり、１つの抗原結合単位は第２のＮＫ受容体について一価である。
【０１３８】
価数という用語は、抗原結合性構築物またはタンパク質を記載するために使用される場合、異なる認識または結合部位が同じエピトープに結合するかどうかにかかわらず、抗原結合性構築物またはタンパク質中の認識（結合）部位の数を指す。各認識部位は、抗原上の１つのエピトープ（結合部位）を特異的に認識し、したがってそれに結合することができる。抗原結合性タンパク質が１つより多くの認識部位を含む場合（例えば、抗原結合性タンパク質が、その可変領域中に２つの認識部位を有するＩｇＧである場合）、各認識部位は、同じ抗原上の同じエピトープ、または同じ抗原上もしくは異なる抗原上のいずれにあるにせよ異なるエピトープを特異的に認識することができる。多価性は、受容体結合単位または構築物と、関係する抗原または標的受容体との間のアビディティ、すなわち、結合の強度を増加させることができる。アビディティは、エピトープまたは抗原決定基と抗原結合単位上のその結合部位との間の親和性、および抗原結合単位上に存在する関係する結合部位の実際の数の両方に関する。
【０１３９】
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、腫瘍またはＢ系列細胞抗原に特異的に結合する第１の抗原結合単位、およびＮＫｐ３０に特異的に結合する第２の抗原結合単位を含む。抗原結合単位の標的分子への結合に関して、特異的結合、特異的に結合する、特異的、選択的に結合する、および選択的などの用語は、具体的な標的抗原もしくは分子（例えば、ポリペプチド標的）または具体的な標的抗原もしくは分子上のエピトープに関する場合、非特異的または非選択的な相互作用とは測定できる程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比較して標的分子の結合を決定することにより測定することができる。特異的結合はまた、過剰な非標識化標的などの、標的に類似した対照分子との競合により決定することができる。その場合、特異的結合は、標識化標的のプローブへの結合が過剰な非標識化標的により競合的に阻害される場合に指し示される。
【０１４０】
エピトープという用語は、本明細書において使用される場合、抗原結合性構築物または単位への特異的結合が可能な抗原の成分を意味する。エピトープは、頻繁に、表面に接近可能なアミノ酸残基および／または糖側鎖からなり、特定の三次元構造的特徴の他に、特定の電荷的特徴を有することができ、連続または非連続であり得る。コンホメーショナルおよび非コンホメーショナルエピトープは、後者への結合はそうではないが、前者への結合は変性溶剤の存在下で失われるという点で区別される。エピトープは、結合に直接的に関与するアミノ酸残基、および結合に直接的に関与しない他のアミノ酸残基を含むことができる。抗原結合性タンパク質が結合するエピトープは、例えば、異なる点突然変異を有する抗原変種への抗原結合性タンパク質の結合についての試験、例えば、「エピトープマッピング」、および／またはＸ線結晶学技術の使用などのエピトープ決定のための公知の技術を使用して決定することができる。
【０１４１】
一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原結合単位は、少なくとも１×１０−７Ｍ、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、少なくとも１×１０−１２Ｍ、または少なくとも１×１０−１３ＭのＫＤを有する。一部の実施形態では、構築物の抗原結合単位は同じまたは類似したＫＤを有する。
【０１４２】
ＫＤ（Ｍ）という用語は、本明細書において使用される場合、具体的な抗原結合単位／抗原相互作用の解離平衡定数を指す。ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ。ｋｄ（秒−１）という用語は、本明細書において使用される場合、具体的な抗原結合単位／抗原相互作用の解離速度定数を指す。この値はｋｏｆｆ値とも称される。ｋａ（Ｍ−１×秒−１）という用語は、本明細書において使用される場合、具体的な抗原結合単位／抗原相互作用の会合速度定数を指す。この値はｋｏｎ値とも称される。
【０１４３】
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物の１つの抗原結合単位（例えば、第１の抗原結合単位）のその標的への結合は、他の抗原結合単位（例えば、第２の抗原結合単位）のその標的への結合を遮断も立体的に邪魔もしない。例えば、第１の抗原結合単位の腫瘍またはＢ系列細胞抗原への結合時に、第２またはその後の抗原結合単位はＮＫｐ３０抗原に自由に結合する。そのため、一部の実施形態では、第１の抗原結合単位および第２の抗原結合単位はそれらの各々の標的に同時に結合する。
【０１４４】
一部の実施形態では、第１の抗原結合単位および第２の抗原結合単位のそれらの各々の標的への結合は免疫細胞および第２の細胞を一緒になるようにブリッジ形成させ、２つの細胞を近接させる。本明細書において使用される場合、ブリッジは、２つの細胞種（例えば、ＮＫｐ３０を発現する１つの免疫細胞および腫瘍もしくはＢ系列細胞抗原を発現する第２の細胞）を接合させることまたは２つの細胞を一緒になるように近接させることを指し、２つの細胞は物理的接触状態にある必要はない。そのため、多重特異性抗原結合性構築物は２つの細胞へのコネクター（例えば、ブリッジ）として作用し、各細胞は、ＮＫｐ３０および／もしくは第２のＮＫ活性化受容体または１つもしくは複数の腫瘍もしくはＢ系列細胞抗原のいずれかを発現する。
【０１４５】
２つの細胞が本開示の構築物によりブリッジ形成しているかどうかを決定する方法は当該技術分野において公知である。例えば、一部の実施形態では、免疫細胞および第２の細胞のブリッジ形成は、例えば、フローサイトメトリー、ＦＲＥＴ、免疫沈降、顕微鏡法、または蛍光プレートリーダーにより決定される。
【０１４６】
本明細書に記載されるように、本開示の構築物は、ＮＫｐ３０および／または第２のＮＫ活性化受容体を発現する１つまたは複数の免疫細胞ならびに１つまたは複数の腫瘍またはＢ系列細胞抗原を発現する１つまたは複数の細胞に結合することができる。免疫細胞の種類は、治療される疾患の文脈、および免疫細胞の具体的な種類に依存し、考慮している障害に依存して当業者により決定され得る。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞であり、これには、エフェクターγδ  Ｔ細胞を含むＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ４＋細胞が含まれる。一部の実施形態では、免疫細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はＢ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はマクロファージである。
【０１４７】
一部の実施形態では、構築物は、１つまたは複数の腫瘍細胞（例えば、固形または非固形腫瘍細胞）に結合することができる。本明細書において使用される場合、腫瘍細胞はがん細胞と交換可能に使用されることがあるが、正常細胞と比較して増加した増殖を呈する非悪性（非がん性）細胞も包含する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、免疫細胞および腫瘍抗原を発現する細胞（例えば、ＢＣＭＡ発現性腫瘍細胞）をブリッジ形成させながら、ＮＫｐ３０機能を増進することにより治療することができるがん細胞である。
【０１４８】
例として、腫瘍細胞は、血液がん、リンパ腫、骨髄腫、白血病、神経学的がん、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、胃腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、腎臓がん、および血管がんからなる群から選択されるがんからのものである。任意選択で、腫瘍細胞（および排他的ではないがそのような腫瘍細胞と関連付けられる特定の腫瘍抗原）は、カポジ肉腫、白血病、急性リンパ性白血病（ｅｔｖ６、ａｍｌ１、シクロフィリンｂ）、急性骨髄球性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性赤白血病（ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｓ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｅ  ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性白血病、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病（シクロフィリンｂ）、マントル細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇ−イディオタイプ）、真性多血症リンパ（Ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ  ｖｅｒａ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ホジキン病（Ｉｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、非ホジキン病、骨髄腫（ｍｙｃｌｏｍａ）（ＭＵＣファミリー、ｐ２１ｒａｓ）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫（ｃｈｒｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ）、骨原性肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸肉腫、結腸癌（ｐ２１ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＭＵＣファミリー）、膵臓がん、乳がん（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、卵巣がん、前立腺がん（前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびその抗原エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、およびＰＳＡ−３、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク質）、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、ヘパトーマ、肝細胞がん（α−フェトプロテイン）、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣腫瘍（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫（Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ）、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫（ｐ５タンパク質、ｇｐ７５、がん胎児性抗原、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ｃｄｃ２７、ＭＡＧＥ−３、ｐ２１ｒａｓ、ｇｐ１００）、神経芽腫、網膜芽腫、鼻咽頭癌（Ｉｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、食道癌、基底細胞癌、胆道がん（ｐ２１ｒａｓ）、膀胱がん（ｐ２１ｒａｓ）、骨がん、脳および中枢神経系（ＣＮＳ）がん、子宮頸癌（ｐ５３、ｐ２１ｒａｓ）、絨毛癌（ＣＥＡ）、結腸直腸がん（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−ＣＯ１７−１Ａ／ＧＡ７３３、ＡＰＣ）、結合組織���ん、消化器系のがん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、胃がん（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク質）、上皮細胞がん（シクロフィリンｂ）、上皮内新生物、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん（小細胞、大細胞）（ＣＥＡ、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１）、口腔がん（例えば、口唇、舌、口、および咽頭がん）、卵巣がん（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、膵臓がん、直腸がん、呼吸器系のがん、皮膚がん、甲状腺がん、ならびに泌尿器系のがんからなる群から選択されるがんからのものである。
【０１４９】
一部の構築物では、構築物は１つまたは複数のＢ系列細胞に結合することができる。本明細書において使用される場合、Ｂ系列細胞としては、プロＢ細胞、プレＢ細胞、移行期Ｂ細胞、濾胞性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、胚中心Ｂ細胞、形質細胞、およびメモリーＢ細胞が挙げられる。
【０１５０】
少なくとも２つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第１の抗原結合単位が、Ｂ系列細胞により発現される第１の標的抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位が、ＮＫｐ３０抗原に特異的に結合する、多重特異性抗原結合性構築物が特に提供される。例えば、第１の標的抗原はＢ系列細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）であることができる。任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物は、Ｂ系列細胞により発現される第２の標的抗原に結合する第３の抗原結合単位をさらに含む。
【０１５１】
ＢＣＭＡに加えて、Ｂ系列細胞により発現される標的抗原としては、例えば、ＣＤ１ｃ、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ７２、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９、ＴＡＣ、ＧＰＲＣ５Ｄ（Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５メンバーＤ）、ＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１）、およびＩＬ７／３Ｒが挙げられる。
【０１５２】
抗体およびその抗原結合性部分
本明細書に記載されるように、開示される多重特異性抗原結合性構築物は、二重特異性、三重特異性、四重特異性、または多重特異性の抗体またはその抗原結合性断片を含む。
【０１５３】
本明細書に記載の構築物は、様々な態様および実施形態では、１つまたは複数の抗体および／またはその抗原結合性部分を含むことができる。例えば、抗原結合単位は、ＮＫｐ３０に対する所与の抗体のまたはＢＣＭＡもしくはＨＥＲ２などの腫瘍抗原に対する所与の抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖、またはその相補性決定領域を含むことができる。よって、本明細書に記載の任意の態様の一部の実施形態では、第１の抗原結合単位、第２の抗原結合単位、第３の抗原結合単位、またはその任意の組合せは、抗体またはその抗原結合性部分を含むことができる。本明細書に記載の任意の態様の一部の実施形態では、第１の抗原結合単位、第２の抗原結合単位、第３の抗原結合単位、またはその任意の組合せは抗体またはその抗原結合性部分である。
【０１５４】
免疫グロブリンまたは抗体という用語は、本明細書において使用される場合、ポリペプチド鎖の２つのペア：軽（Ｌ）鎖の１つのペアおよび重（Ｈ）鎖の１つのペアを一般に含む構造的に関するタンパク質のクラスを指す。インタクトな免疫グロブリンにおいて、これらの鎖の４つ全てはジスルフィド結合により相互接続されている。免疫グロブリンの構造はよく特徴付けられている。例えば、ポール（Ｐａｕｌ）（２０１３）  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７ｔｈ  ｅｄ．，  Ｃｈ．  ５，  リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）［米国ペンシルベニア州フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）所在］を参照。簡潔に述べれば、各重鎖は、典型的には、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、典型的には、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、典型的には、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、典型的には、ＣＬと略記される１つのドメインを含む。
【０１５５】
抗体は、本明細書において使用される場合、インタクトな抗体（例えば、インタクトな免疫グロブリン）を指すことができる。しかしながら、抗原結合性部分および抗原結合性断片という用語は、インタクトな抗体と交換可能に使用することができる。抗原結合性断片は少なくとも１つの抗原結合性ドメインを含む。抗原結合性ドメインの１つの例は、ＶＨ−ＶＬ二量体により形成される抗原結合性ドメインである。抗体および抗原結合性断片は、それらが特異的に結合する抗原により記載することができる。例えば、ＮＫｐ３０抗体、または抗ＮＫｐ３０抗体は、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体である。
【０１５６】
ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存された領域が散在した超可変性の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる超可変領域（ＨＶＲ））にさらに分割することができる。より保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。各ＶＨおよびＶＬは、一般に、以下の順序（Ｎ末端からＣ末端へ）：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４で並べられた３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。ＣＤＲは、抗原結合に関与し、抗体に対して抗原特異性および結合親和性を付与する。（カバットら（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  ５ｔｈ  ｅｄ．，米国国立衛生研究所公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）［米国メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）所在］およびコチア、シーら（Ｃｈｏｔｉａ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．）（１９８７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７を参照；全体を参照により本願明細書に援用する。）３つの重鎖ＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と称されることがあり、３つの軽鎖ＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３と称されることがある。
【０１５７】
「カバットに従って番号付けされた」、「カバット番号付け」、「カバットの定義」、および「カバットの標識化」とも称されるカバットにより記載されたシステムは、抗体の任意の可変ドメインに対して応用可能な明瞭な残基番号付けシステムを提供し、各鎖の３つのＣＤＲを定義する精密な残基境界を提供する。（カバットら（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）［米国メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）所在］（１９８７）および（１９９１）；その内容の全体を参照により援用する）。これらのＣＤＲはカバットＣＤＲと称され、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）および８９〜９７（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（ＣＤＲ１）、５０〜６５（ＣＤＲ２）および９５〜１０２（ＣＤＲ３）を含む。ＣＤＲがカバットに従って定義される場合、軽鎖ＦＲ残基はおおよそ残基１〜２３（ＬＣＦＲ１）、３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、５７〜８８（ＬＣＦＲ３）、および９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基中のおおよそ残基１〜３０（ＨＣＦＲ１）、３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、６６〜９４（ＨＣＦＲ３）、および１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。「カバットにおけるようなＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
【０１５８】
他のＣＤＲ番号付けシステムもまた当該技術分野において使用される。コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）および共同研究者らは、カバットＣＤＲ内のある特定の下位部分は、アミノ酸配列のレベルにおいて大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格コンホメーションをとることを見出した。（コチアら（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７；およびコチアら（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３）。これらの下位部分は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３またはＨ１、Ｈ２、およびＨ３として指定され、「Ｌ」および「Ｈ」はそれぞれ軽鎖および重鎖領域を指定する。これらのＣＤＲは、「コチアＣＤＲ」、「コチア番号付け」、または「コチアに従って番号付けされた」と称されることがあり、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（ＣＤＲ１）、５２〜５６（ＣＤＲ２）および８９〜９７（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（ＣＤＲ１）、５０〜５６または５２〜５６（ＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＣＤＲ３）を含む。Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７（１９８７）。
【０１５９】
「マッカラムに従って番号付けされた」、または「マッカラム番号付け」とも称される、マッカラム（ＭａｃＣａｌｌｕｍ）により記載されたシステムは、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基３０〜３６（ＣＤＲ１）、４６〜５５（ＣＤＲ２）および８９〜９６（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の３０〜３５（ＣＤＲ１）、４７〜５８（ＣＤＲ２）および９３〜１０１（ＣＤＲ３）を含む。マッカラムら（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．）（（１９９６）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６２（５）：７３２−７４５）。
【０１６０】
「ＡｂＭに従った番号付け」、または「ＡｂＭ番号付け」とも称される、ＡｂＭにより記載されたシステムは、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）および８９〜９７（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３５（ＣＤＲ１）、５０〜５８（ＣＤＲ２）および９５〜１０２（ＣＤＲ３）を含む。
【０１６１】
可変領域のＩＭＧＴ（インターナショナル・イミュノジェネティクス・インフォメーション・システム（ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ））番号付けもまた使用することができ、これは、ルフラン、エム、ピー（Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｍ．−Ｐ．）「免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体およびＩｇ様ドメインに対するＩＭＧＴ特有の番号付け（Ｔｈｅ  ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｇ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ）」，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２−１３６（１９９９）（全体を参照により本願明細書に明示的に援用する）に記載されるようなＩＭＧＴの方法に従った免疫グロブリン可変重鎖または軽鎖中の残基の番号付けである。本明細書において使用される場合、「ＩＭＧＴ配列番号付け」または「ＩＭＴＧに従って番号付けされた」は、ＩＭＧＴに従った可変領域をコードする配列の番号付けを指す。重鎖可変ドメインについて、ＩＭＧＴに従って番号付けされた場合、超可変領域は、ＣＤＲ１についてアミノ酸位置２７〜３８、ＣＤＲ２についてアミノ酸位置５６〜６５、およびＣＤＲ３についてアミノ酸位置１０５〜１１７に及ぶ。軽鎖可変ドメインについて、ＩＭＧＴに従って番号付けされた場合、超可変領域は、ＣＤＲ１についてアミノ酸位置２７〜３８、ＣＤＲ２についてアミノ酸位置５６〜６５、およびＣＤＲ３についてアミノ酸位置１０５〜１１７に及ぶ。
【０１６２】
本明細書に記載の構築物および抗原結合単位の一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＤＲは、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（ＣＤＲ１）、４９〜５６（ＣＤＲ２）および８９〜９７（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２７〜３５（ＣＤＲ１）、４９〜６０（ＣＤＲ２）および９３〜１０２（ＣＤＲ３）を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメイン中のＣＤＲ２は、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、アミノ酸４９〜５６を含むことができる。
【０１６３】
所望の標的に対する抗体または抗体断片を生成およびスクリーニングする方法は当該技術分野において周知である。増進した特性（例えば、増進した親和性、キメラ化、ヒト化）のために抗体または抗体断片をさらに改変する他に、本明細書に記載されるような抗原結合性断片を生成する方法もまた当該技術分野において周知である。
【０１６４】
キメラ抗体または抗体断片という用語は、重鎖および／または軽鎖の成分が具体的な供給源または種に由来し、重鎖および／または軽鎖の残余が異なる供給源または種に由来する、抗体または抗体断片を指す。
【０１６５】
ヒト化形態の非ヒト抗体または抗体断片は、非ヒト抗体または抗体断片に由来する最小の配列を含有するキメラ抗体または抗体断片である。ヒト化抗体は、一般にヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、１つまたは複数のＣＤＲからの残基が非ヒト抗体（ドナー抗体）の１つまたは複数のＣＤＲからの残基により置き換えられたものである。ドナー抗体は、所望の特異性、親和性、または生物学的効果を有するマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、または非ヒト霊長動物抗体などの任意の好適な非ヒト抗体であることができる。一部の事例では、レシピエント抗体の選択されたフレームワーク領域残基は、ドナー抗体の対応するフレームワーク領域残基により置き換えられる。ヒト化抗体または抗体断片はまた、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含むことができる。そのような改変は、抗体機能をさらに精密化するために行うことができる。（ジョーンズら（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；ライヒマンら（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３−３２９；およびプレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）（１９９２）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ２：５９３−５９６を参照）。
【０１６６】
ヒト抗体または抗体断片は、ヒトもしくはヒト細胞により産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、またはヒト抗体レパートリーもしくはヒト抗体コーディング配列（例えば、ヒト供給源から得られるもしくはｄｅ  ｎｏｖｏで設計される）を利用する非ヒト供給源に由来するものである。ヒト抗体または抗体断片はヒト化抗体または抗体断片を特に除外する。
【０１６７】
一部の実施形態では、抗体分子は、ダイアボディおよび一本鎖分子の他に、抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）を含む。例えば、抗体分子は、重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（本明細書においてＶＨと略記される）、および軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（本明細書においてＶＬと略記される）を含むことができる。一部の実施形態では、抗体分子は１つの重鎖および１つの軽鎖を含むまたはからなる（半抗体と称される）。別の例では、抗体分子は２つの重鎖可変ドメイン配列および２つの軽鎖可変ドメイン配列を含み、それにより、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一可変ドメイン抗体、ダイアボディ（Ｄａｂ）（二価および二重特異性）、ならびにキメラ（例えば、ヒト化）抗体などの２つの抗原結合部位を形成し、これは全体抗体の改変により製造することができ、または組換えＤＮＡ技術を使用してｄｅ  ｎｏｖｏで合成されたものであり得る。これらの機能性抗体断片は、それらの各々の抗原と選択的に結合する能力を保持する。抗体および抗体断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが挙げられるがそれに限定されない抗体の任意のクラスから、ならびに抗体の任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）からのものであることができる。抗体分子の調製物はモノクローナルまたはポリクローナルであることができる。抗体分子はまた、ヒト、ヒト化、ＣＤＲグラフト、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成抗体であることができる。抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選ばれる重鎖定常領域を有することができる。抗体はまた、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかから選ばれる軽鎖を有することができる。
【０１６８】
抗体分子の抗原結合性断片または抗原結合性部分は当該技術分野において周知であり、例えば、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィドブリッジにより連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるダイアボディ（ｄＡｂ）断片；（ｖｉ）ラクダ科動物もしくはラクダ化可変ドメイン；（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、バードら（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；ヒューストンら（Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）；または（ｖｉｉｉ）単一ドメイン抗体を含む。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して得ることができ、断片は、インタクトな抗体と同じ方式で有用性についてスクリーニングすることができる。
【０１６９】
抗体分子はまた、単一ドメイン抗体であることができる。単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ）が単一ドメインポリペプチドの部分である抗体を含むことができる。例としては、重鎖抗体、軽鎖を天然に欠いた抗体、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体および抗体に由来するもの以外の単一ドメインスキャフォールドが挙げられるがそれに限定されない。単一ドメイン抗体は、当該技術分野において公知の任意のものまたは任意の将来的な単一ドメイン抗体であることができる。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシが挙げられるがそれに限定されない任意の種に由来することができる。単一ドメイン抗体は、例えば、国際公開第９４／０４６７８号に開示されている。明瞭性の理由から、天然に軽鎖を欠いた重鎖抗体に由来するこの可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨからそれを区別するために本明細書においてＶＨＨまたはナノボディとして知られる。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科の種（例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびグアナコ）またはラクダ科以外の種において生じた抗体に由来することができる。
【０１７０】
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、少なくとも２つの抗原に対する特異性を有するが任意選択で２つより多くの結合部位を有する、二重特異性抗体を含む。二重特異性抗体分子は、第１の抗原（例えば、ＢＣＭＡまたは他の腫瘍もしくはＢ系列細胞抗原）に対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列および第２の抗原（例えば、ＮＫｐ３０）に対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。一部の実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１の抗原に対する結合特異性を有するｓｃＦｖまたはその断片および第２の抗原に対する結合特異性を有するｓｃＦｖまたはその断片を含む（例えば、コンターマン（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ）およびブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）（２０１５）  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２０（７）：８３８−４７を参照）。
【０１７１】
様々な二重特異性抗体フォーマットが当該技術分野において公知であり、これには、例えば、本明細書に記載される、二重特異性ＩｇＧ、二重特異性抗体断片、二重特異性融合タンパク質、付加型ＩｇＧ、および二重特異性抗体コンジュゲートが含まれる。本開示の文脈において使用することができる例示的な二重特異性フォーマットとしては、例えば、ｓｃＦｖベースまたはダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合物、デュアル可変ドメイン（ＤＶＤ）−ｌｇ、クアドローマ、ノブ−イントゥー−ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）、共通の軽鎖（例えば、ノブ−イントゥー−ホールを有する共通の軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ｂｏｄｙ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ｌｇＧ１／ｌｇＧ２、二重作用性Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ｌｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性フォーマットが挙げられるがそれに限定されない（例えば、以上のフォーマットの総説について、クラインら（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１２）ｍＡｂｓ  ４：６、１−１１、およびそこで引用されている参考文献を参照；シュピースら（Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１５）Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６７：９５−１０６も参照）。二重特異性抗体はまた、ペプチド／核酸コンジュゲーションを使用して構築することができ、例えば、直交化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して部位特異的抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを生成し、それを次に、定義される組成、価数、および幾何学形状を有するマルチマー複合体に自己アセンブルさせる。（例えば、カザンら（Ｋａｚａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１３）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３５（１）：３４０−６を参照）。一部の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物は、共通の軽鎖を含む抗体を含む。本明細書に記載の構築物において使用される共通の軽鎖のアミノ酸配列の非限定的な例としては、配列番号８および配列番号８１が挙げられる。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、米国特許第７，５１７，９６６号明細書（その内容および配列の全体を参照により本願明細書に援用する）に記載の抗ＮＫｐ３０抗体といった、公知の抗体または公知のＮＫｐ３０抗体のＣＤＲを含む。任意選択で、ＮＫｐ３０抗体は、コレクシオン・ナショナル・ドゥ・キュルチュール・ドゥ・ミクロオルガニスム（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  Ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ｄｅ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）（ＣＮＣＭ）登録番号１−２５７６を有するハイブリドーマにより産生されるヒト化バージョンの抗体である。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、国際公開第２０１８１３８０３２号、国際公開第２０１７１１４６９４号、国際公開第２０１６２０７２７８号、国際公開第２０１６２０７２７３号、国際公開第２０１５１９７５９３号、国際公開第２０１５１９７５９８号、国際公開第２０１５１９７５８２号、米国特許出願公開第２０１５０３７６２７４号明細書、米国特許出願公開第２０１８０２０７２９０号明細書、および国際公開第２０１８０４７１５４号（それぞれの内容および配列の全体を参照により本願明細書に援用する）のいずれかに記載の抗ＮＫｐ４６抗体といった、公知のＮＫｐ４６抗体または公知のＮＫｐ４６抗体のＣＤＲを含む。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、国際公開第２０１８１４８４４７号、国際公開第２０１８０３５３３０号、国際公開第２０１００１７１０３号、および米国特許第９，２７３，１３６号明細書（それぞれの内容および配列の全体を参照により本願明細書に援用する）のいずれかに記載の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体といった、公知の抗体または公知のＮＫＧ２Ｄ抗体のＣＤＲを含む。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、国際公開第２０１７２０５７４５号、米国特許出願公開第２０１６０２４４５２８号明細書、国際公開第２０１６１３４３５８号、米国特許出願公開第２０１７０２２６２１５号明細書、および国際公開第２０１８１９１５０２号（それぞれの内容および配列の全体を参照により本願明細書に援用する）のいずれかに記載の抗ＣＤ１３７抗体といった、公知の抗体または公知のＣＤ１３７抗体のＣＤＲを含む。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、第１の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、腫瘍抗原に対する公知の抗体または公知の抗体のＣＤＲを含む。例として、米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）および／または欧州医薬品庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ）によりがん療法における使用のために現在承認されている例示的な腫瘍抗原標的化抗体の商標名および一般名としては以下が挙げられるがそれに限定されない：レムトラーダ（ＬＥＭＴＲＡＤＡ）（登録商標）（アレムツズマブ、サノフィジェンザイム（ＳａｎｏｆｉＧｅｎｚｙｍｅ）；例えば、キーティングら（Ｋｅａｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９（１０）：３５５６−３５６１；ヒルメンら（Ｈｉｌｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２００７）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２５（３５）：５６１６−５６２３）を参照；アバスチン（ＡＶＡＳＴＩＮ）（登録商標）（ベバシズマブ、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；例えば、フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．）（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３３３（２）：３２８−３３５）を参照；アドセトリス（ＡＤＣＥＴＲＩＳ）（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン、シアトル・ジェネティクス（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）；例えば、ユーネスら（Ｙｏｕｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１０）Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３６３（１９）：１８１２−１８２１；センターら（Ｓｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３０（７）：６３１−６３７）を参照；レモバブ（ＲＥＭＯＶＡＢ）（登録商標）（カツマキソマブ、フレゼニウスバイオテック（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）；例えば、サイメッツ（Ｓｅｉｍｅｔｚ）（２０１１）Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２：３０９−３１６）を参照；アービタックス（ＥＲＢＩＴＵＸ）（登録商標）（セツキシマブ、エリリリー（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）；例えば、ウォン（Ｗｏｎｇ）（２００５）Ｃｌｉｎ．  Ｔｈｅｒ．２７（６）：６８４−６９４）を参照；ゼヴァリン（ＺＥＶＡＬＩＮ）（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、スペクトラムファーマシューティカルズ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；例えば、ヴィジッヒら（Ｗｉｔｚｉｇ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２０（１０）：２４５３−２４６３；マーカス（Ｍａｒｃｕｓ）（２００５）Ｓｅｍｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．３２（１  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ３６−４３）を参照；ベクティビックス（ＶＥＣＴＩＢＩＸ）（登録商標）（パニツムマブ、アムジェン（Ａｍｇｅｎ）；例えば、チュー（Ｃｈｕ）（２００６）Ｃｌｉｎ．  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ６（１）：１３；ファン・クッツェムら（Ｖａｎ  Ｃｕｔｓｅｍ  ｅｔ  ａｌ．）（２００７）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２５（１３）：１６５８−１６６４）を参照；パージェタ（ＰＥＲＪＥＴＡ）（登録商標）（ペルツズマブ、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；バセルガら（Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１２）Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ��６６（２）：１０９−１１９；アグスら（Ａｇｕｓ  ｅｔ  ａｌ．）（２００５）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２３（１１）：２５３４−２５４３）を参照；リツキサン（ＲＩＴＵＸＡＮ）（登録商標）（リツキシマブ、バイオジェン（Ｂｉｏｇｅｎ）；例えば、フジエール（Ｆｅｕｇｉｅｒ）（２０１５）Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．１１（９）：１３２７−１３４２）を参照；アーゼラ（ＡＲＺＥＲＲＡ）（登録商標）（オファツムマブ、ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；例えば、ティーリングら（Ｔｅｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）（２００６）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７（１）：３６２−３７１；ティーリングら（Ｔｅｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０４（６）：１７９３−１８００）を参照；ガザイバ（ＧＡＺＶＹＡ）（登録商標）（オビヌツズマブ、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；例えば、モスネルら（Ｍｏｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１０）Ｂｌｏｏｄ  １１５（２２）：４３９３−４４０２；ゴレイら（Ｇｏｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１３）Ｂｌｏｏｄ  １２２（２０）：３４８２−３４９１；ゲーデら（Ｇｏｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１４）Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３７０（１２）：１１０１−１１１０；レディーら（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１７）Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）５６（７）：１２２７−１２３７）を参照；オクレバス（ＯＣＲＥＶＵＳ）（登録商標）（オクレリズマブ、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；例えば、ライヒェルト（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ）（２０１７）ＭＡｂｓ  ９（２）：１６７−１８１；モンタルバン（Ｍｏｎｔａｌｂａｎ）（２０１６）Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３７６（３）：２０９−２２０）を参照；ポルトラザ（ＰＯＲＴＲＡＺＺＡ）（登録商標）（ネシツムマブ、エリリリー（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）；例えば、ディーンストマン（Ｄｉｅｎｓｔｍａｎｎ）およびタベルネロ（Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ）（２０１０）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．  Ｄｒｕｇｓ  １１（１２）：１４３４−１４４１）を参照；ハーセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）（登録商標）（トラスツズマブ、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；例えば、スラモンら（Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２００１）Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４４（１１）：７８３−７９２を参照；マキシミアノら（Ｍａｘｉｍｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１６）ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ３０（２）：７５−８６）を参照；カドサイラ（ＫＡＤＣＹＬＡ）（登録商標）（アドトラスツズマブエムタンシン、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；例えば、ヴェルマら（Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１２）Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３６７（１９）：１７８３−１７９１；クロップら（Ｋｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１４）１５（７）：６８９−６９９）を参照；ダラザレックス（ＤＡＲＺＡＬＥＸ）（登録商標）（ダラツムマブ、ヤンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）；例えば、ド・ヴェーアら（ｄｅ  Ｗｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１１）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８６（３）：１８４０−１８４８；ロニアルら（Ｌｏｎｉａｌ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１６）Ｌａｎｃｅｔ  ３８７（１���０２７）：１５５１−１５６０）を参照；ユニツキシン（ＵＮＩＴＵＸＩＮ）（登録商標）（ジヌツキシマブ、ユナイテッド・セラピューティクス（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；例えば、ディロン（Ｄｈｉｌｌｏｎ）（２０１５）Ｄｒｕｇｓ  ７５（８）：９２３−９２７）を参照；およびラルトルボ（ＬＡＲＴＲＵＶＯ）（登録商標）（オララツマブ、エリリリー（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）；例えば、タップら（Ｔａｐ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１６）Ｌａｎｃｅｔ  ３８８（１００４３）：４８８−４９７；シャーリー（Ｓｈｉｒｌｅｙ）（２０１７）Ｄｒｕｇｓ  ７７（１）：１０７−１１２）を参照。
【０１７７】
追加の例示的な腫瘍抗原標的化抗体としては、Ｉ−１３１−ＢＣ８（代替的にＩｏｍａｂ−Ｂとして公知、アクチニウム・ファーマティクス（Ａｃｔｉｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、タラコツズマブ（代替的にＪＮＪ−５６０２２４７３として公知、ジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ））、バダスツキシマブ・タリリン（ｖａｄａｓｔｕｘｉｍａｂ  ｔａｌｉｒｉｎｅ）（シアトル・ジェネティクス（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ））、ウブリツキシマブ（ＴＧセラピューティクス（ＴＧ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ））、モキセツモマブ・パスドトクス（ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ  ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）（アストラゼネカ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）／メドイミュン（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ））、ＸＭＡＢ−５５７４（代替的にＭＯＲ２０８として公知、キセンコル（Ｘｅｎｃｏｒ））、オポルツズマブ・モナトクス（ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ  ｍｏｎａｔｏｘ）（ヴィヴェンティア・バイオ（Ｖｉｖｅｎｔｉａ  Ｂｉｏ））、マルゲツキシマブ（マクロジェニックス（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ））、ＭＭ−３０２（メリマック・ファーマシューティカルズ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））、サシツズマブ・ゴビテカン（イミュノディクス、インク（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，  Ｉｎｃ．））、グレムバツムマブ・ベドチン（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）（セルデックス・セラピューティクス（Ｃｅｌｌｄｅｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ））、アンデカリキシマブ（ギリアード・サイエンシズ（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））、デパツキシズマブ・マホドチン（アッヴィ（ＡｂｂＶｉｅ））、トレメリムマブ（アストラゼネカ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）／メドイミュン（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ））、ラコツモマブ（レコンビオ・エスエル（Ｒｅｃｏｍｂｉｏ  ＳＬ））、アネツマブ・ラブタンシン（バイエル（Ｂａｙｅｒ））、ミルベツキシマブ・ソラブタンシン（ｍｉｒｖｅｔｕｘｉｍａｂ  ｓｏｒｖｔａｎｓｉｎｅ）（イミュノジェン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ））、およびカロツキシマブ（トラコン・ファーマ（ＴＲＡＣＯＮ  Ｐｈａｒｍａ））が挙げられるがそれに限定されず、これらの全てはライヒェルト（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ）（２０１７）ＭＡｂｓ  ９（２）：１６７−１８１（参照により全体を本願明細書に援用する）にさらに記載されている。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、第１の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択で１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において定義されており、これには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。そのため、結合性ポリペプチド中の必須でないアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられる。ある特定の実施形態では、アミノ酸の連なりは、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成において異なる構造的に類似した連なりで置き換えることができる。代替的に、ある特定の実施形態では、飽和突然変異誘発などにより、コーディング配列の全体または部分に沿って無作為に突然変異が導入されてもよく、結果として生じる突然変異体は、本明細書に記載されるような抗原結合単位に組み込み、所望の標的に結合する能力についてスクリーニングすることができる。
【０１７９】
一部の態様では、第１の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一部の態様では、多重特異性抗原結合性構築物は、配列番号２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの重鎖を含む。ある特定の態様では、多重特異性抗原結合性構築物は、配列番号２のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの重鎖を含む。一部の態様では、多重特異性抗原結合性構築物は、配列番号１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの軽鎖を含む。任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物は、配列番号１のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの軽鎖を含む。配列に関する同一性または類似性は、配列をアライメントし、必要な場合にはギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後の、出発アミノ酸残基と同一（すなわち、同じ残基）の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。本明細書において使用される場合、少なくとも９０％の同一性は、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％同一、ならびに包括的に９０％〜１００％のあらゆるパーセンテージを含む。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、米国特許第７，５１７，９６６号明細書に記載のＮＫｐ３０抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。一部の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、米国特許第７，５１７，９６６号明細書に記載の抗体の重鎖に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖および米国特許第７，５１７，９６６号明細書に記載の抗体の軽鎖に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、国際公開第２０１８１３８０３２号、国際公開第２０１７１１４６９４号、国際公開第２０１６２０７２７８号、国際公開第２０１６２０７２７３号、国際公開第２０１５１９７５９３号、国際公開第２０１５１９７５９８号、国際公開第２０１５１９７５８２号、米国特許出願公開第２０１５０３７６２７４号明細書、米国特許出願公開第２０１８０２０７２９０号明細書、および国際公開第２０１８０４７１５４号のいずれかに記載のＮＫｐ４６抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。一部の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、国際公開第２０１８１３８０３２号、国際公開第２０１７１１４６９４号、国際公開第２０１６２０７２７８号、国際公開第２０１６２０７２７３号、国際公開第２０１５１９７５９３号、国際公開第２０１５１９７５９８号、国際公開第２０１５１９７５８２号、米国特許出願公開第２０１５０３７６２７４号明細書、米国特許出願公開第２０１８０２０７２９０号明細書、および国際公開第２０１８０４７１５４号のいずれかに記載の抗体の重鎖に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖ならびに国際公開第２０１８１３８０３２号、国際公開第２０１７１１４６９４号、国際公開第２０１６２０７２７８号、国際公開第２０１６２０７２７３号、国際公開第２０１５１９７５９３号、国際公開第２０１５１９７５９８号、国際公開第２０１５１９７５８２号、米国特許出願公開第２０１５０３７６２７４号明細書、米国特許出願公開第２０１８０２０７２９０号明細書、および国際公開第２０１８０４７１５４号のいずれかに記載の抗体の軽鎖に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、国際公開第２０１８１４８４４７号、国際公開第２０１８０３５３３０号、国際公開第２０１００１７１０３号、および米国特許第９，２７３，１３６号明細書のいずれかに記載のＮＫＧ２Ｄ抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。一部の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、国際公開第２０１８１４８４４７号、国際公開第２０１８０３５３３０号、国際公開第２０１００１７１０３号、および米国特許第９，２７３，１３６号明細書のいずれかに記載の抗体の重鎖に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖ならびに国際公開第２０１８１４８４４７号、国際公開第２０１８０３５３３０号、国際公開第２０１００１７１０３号、および米国特許第９，２７３，１３６号明細書のいずれかに記載の抗体の軽鎖に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、国際公開第２０１７２０５７４５号、米国特許出願公開第２０１６０２４４５２８号明細書、国際公開第２０１６１３４３５８号、米国特許出願公開第２０１７０２２６２１５号明細書、および国際公開第２０１８１９１５０２号のいずれかに記載のＣＤ１３７抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。一部の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、国際公開第２０１７２０５７４５号、米国特許出願公開第２０１６０２４４５２８号明細書、国際公開第２０１６１３４３５８号、米国特許出願公開第２０１７０２２６２１５号明細書、および国際公開第２０１８１９１５０２号のいずれかに記載の抗体の重鎖に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖ならびに国際公開第２０１７２０５７４５号、米国特許出願公開第２０１６０２４４５２８号明細書、国際公開第２０１６１３４３５８号、米国特許出願公開第２０１７０２２６２１５号明細書、および国際公開第２０１８１９１５０２号のいずれかに記載の抗体の軽鎖に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１８４】
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＢＣＭＡまたはＨＥＲ２などの腫瘍抗原のためのＣＤＲＨ配列の他に、ＮＫｐ３０のためのＣＤＲＨ配列の両方を含む重鎖の少なくとも１つのコピーを含む。
【０１８５】
一部の態様では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物において使用することができる新規の抗体およびその抗原結合性断片もまた本明細書において提供される。換言すれば、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の１つまたは複数の抗原結合単位は、本明細書に記載の新規の抗体のいずれかに由来するまたはそれから選択される重鎖および／もしくは軽鎖ＣＤＲ、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域、ならびに／または全長重鎖および／もしくは軽鎖を含むことができる。
【０１８６】
ＢＣＭＡ結合性抗体およびその抗原結合性部分
よって、（ｉ）配列番号３８（ＹＴＦＸ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４Ｈであり、Ｘ１はＴまたはＳであり、Ｘ２はＮまたはＳであり、Ｘ３はＹまたはＨであり、Ｘ４はＭまたはＶである）を含むＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号３９（ＧＸ５ＩＤＰＳＸ６ＧＸ７ＴＸ８ＹＡであり、Ｘ５はＶまたはＩであり、Ｘ６はＧまたはＤであり、Ｘ７はＧ、ＹまたはＳであり、Ｘ８はＮまたはＳである）を含むＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０（ＡＲＧＲＹＤＹＸ９ＤＹＬＧＷＦＤＸ１０であり、Ｘ９はＧまたはＳであり、Ｘ１０はＰまたはＧである）を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する新規の抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、（ｉ）配列番号１９を含むＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号２０を含むＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのような重鎖および軽鎖ＣＤＲを有する抗体の代表的な例は、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、ｍＡｂ６、およびｍＡｂ７である。
【０１８７】
そのため、一部の態様では、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４１の重鎖ＣＤＲ３を含むヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号４３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなＣＤＲを有する代表的な抗体はｍＡｂ１である。
【０１８８】
一部の態様では、配列番号４４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４５の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４６の重鎖ＣＤＲ３を含むヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号４３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなＣＤＲを有する代表的な抗体はｍＡｂ２である。
【０１８９】
一部の態様では、配列番号４７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４８の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４６の重鎖ＣＤＲ３を含むヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号４３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなＣＤＲを有する代表的な抗体はｍＡｂ３である。
【０１９０】
一部の態様では、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４５の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４９の重鎖ＣＤＲ３を含むヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号４３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなＣＤＲを有する代表的な抗体はｍＡｂ４である。
【０１９１】
一部の態様では、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４１の重鎖ＣＤＲ３を含むヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号４３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなＣＤＲを有する代表的な抗体はｍＡｂ５である。
【０１９２】
一部の態様では、配列番号４４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４１の重鎖ＣＤＲ３を含むヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号４３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなＣＤＲを有する代表的な抗体はｍＡｂ６およびｍＡｂ７である。
【０１９３】
本明細書に記載の構築物、抗体、およびその抗原結合性部分の一部の態様および実施形態では、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部のそのような実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つから１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１８から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０１９４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のヒトＢＣＭＡに特異的に結合する構築物、抗体、およびその抗原結合性部分のＣＤＲは、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）および８９〜９７（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２７〜３５（ＣＤＲ１）、４９〜６０（ＣＤＲ２）および９３〜１０２（ＣＤＲ３）を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメイン中のＣＤＲ２は、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、アミノ酸４９〜５６を含むことができる。
【０１９５】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つの重鎖可変領域の３つの重鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１８の軽鎖可変領域の３つの軽鎖ＣＤＲを含む、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０１９６】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つの重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１８の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がカバットに従って番号付けされたものである、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０１９７】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つの重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１８の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がコチアに従って番号付けされたものである、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０１９８】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つの重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１８の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がマッカラムに従って番号付けされたものである、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０１９９】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つの重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１８の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がＡｂＭに従って番号付けされたものである、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２００】
開示はまた、一部の実施形態では、配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つの重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１８の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がＩＭＧＴに従って番号付けされたものである、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２０１】
本明細書に記載の構築物、抗体、およびその抗原結合性部分の一部の態様および実施形態では、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号５１、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、および配列番号１０２のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖領域を含む。一部の実施形態では、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。一部のそのような実施形態では、重鎖領域は、配列番号５１、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、および配列番号１０２のいずれか１つから１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号８から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０２０２】
本開示はまた、ヒトＢＣＭＡに結合した場合、配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つにおいて表される重鎖可変領域配列、ならびに配列番号１８において表される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトＢＣＭＡ抗体により結合されるアミノ酸残基の少なくとも１つ（ａｔ  ｌａｓｔ  ｏｎｅ）に結合する、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。別の態様では、本開示は、ヒトＢＣＭＡに結合した場合、配列番号１０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７のいずれか１つにおいて表される重鎖可変領域配列、ならびに配列番号１８において表される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトＢＣＭＡ抗体の結合を交差遮断する、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を特徴とする。
【０２０３】
ＮＫｐ３０結合抗体およびその抗原結合性部分
一部の態様では、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４２の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する新規の抗体またはその抗原結合性部分もまた本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号４３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなＣＤＲを有する代表的な抗体はｍＡｂ８およびｍＡｂ９である。
【０２０４】
本明細書に記載の構築物の一部の態様および実施形態では、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１４もしくは配列番号２５に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに／または配列番号１８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部のそのような実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１４または配列番号２５から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１８から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０２０５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分のＣＤＲは、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）および８９〜９７（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２７〜３５（ＣＤＲ１）、４９〜６０（ＣＤＲ２）および９３〜１０２（ＣＤＲ３）を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメイン中のＣＤＲ２は、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、アミノ酸４９〜５６を含むことができる。
【０２０６】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号１４または２５の重鎖可変領域の３つの重鎖ＣＤＲ、および配列番号１８の軽鎖可変領域の３つの軽鎖ＣＤＲを含む、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２０７】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号１４または２５の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、および配列番号１８の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がカバットに従って番号付けされたものである、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２０８】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号１４または２５の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、および配列番号１８の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がコチアに従って番号付けされたものである、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２０９】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号１４または２５の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、および配列番号１８の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がマッカラムに従って番号付けされたものである、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２１０】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号１４または２５の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、および配列番号１８の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がＡｂＭに従って番号付けされたものである、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２１１】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号１４または２５の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、および配列番号１８の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がＩＭＧＴに従って番号付けされたものである、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２１２】
本明細書に記載の構築物、抗体、およびその抗原結合性部分の一部の態様および実施形態では、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号６４または配列番号１０１に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖領域を含む。一部の実施形態では、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。一部のそのような実施形態では、重鎖領域は、配列番号６４または配列番号１０１から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号８から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０２１３】
一部の態様では、配列番号６９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号７０の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号７１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する新規の抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号４３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなＣＤＲを有する代表的な抗体はｍＡｂ１０である。
【０２１４】
本明細書に記載の構築物の一部の態様および実施形態では、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７２に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または配列番号１８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部のそのような実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号７２から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１８から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０２１５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分のＣＤＲは、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）および８９〜９７（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２７〜３５（ＣＤＲ１）、４９〜６０（ＣＤＲ２）および９３〜１０２（ＣＤＲ３）を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメイン中のＣＤＲ２は、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、アミノ酸４９〜５６を含むことができる。
【０２１６】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号７２の重鎖可変領域の３つの重鎖ＣＤＲ、および配列番号１８の軽鎖可変領域の３つの軽鎖ＣＤＲを含む、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２１７】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号７２の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、および配列番号１８の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がカバットに従って番号付けされたものである、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２１８】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号７２の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、および配列番号１８の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がコチアに従って番号付けされたものである、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２１９】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号７２の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、および配列番号１８の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がマッカラムに従って番号付けされたものである、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２２０】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号７２の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、および配列番号１８の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がＡｂＭに従って番号付けされたものである、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２２１】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号７２の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、および配列番号１８の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がＩＭＧＴに従って番号付けされたものである、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２２２】
本明細書に記載の構築物、抗体、およびその抗原結合性部分の一部の態様および実施形態では、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７３に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖領域を含む。一部の実施形態では、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。一部のそのような実施形態では、重鎖領域は、配列番号７３から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号８から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０２２３】
ヒトＮＫｐ３０に結合した場合、配列番号７２において示される重鎖可変領域配列および配列番号１８において示される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトＮＫｐ３０抗体により結合されるアミノ酸残基の少なくとも１つに結合する、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片もまた提供される。本開示はまた、ヒトＮＫｐ３０に結合した場合、配列番号７２において示される重鎖可変領域配列および配列番号１８において示される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトＮＫｐ３０抗体の結合を交差遮断する、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。
【０２２４】
一部の態様では、配列番号７５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号７６の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号７７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する新規の抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号８０の軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなＣＤＲを有する代表的な抗体はｍＡｂ１１である。
【０２２５】
本明細書に記載の構築物の一部の態様および実施形態では、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または配列番号８０に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部のそのような実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号７８から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号８０から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０２２６】
一部の実施形態では、本明細書に記載のヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分のＣＤＲは、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）および８９〜９７（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２７〜３５（ＣＤＲ１）、４９〜６０（ＣＤＲ２）および９３〜１０２（ＣＤＲ３）を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメイン中のＣＤＲ２は、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、アミノ酸４９〜５６を含むことができる。
【０２２７】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号７８の重鎖可変領域の３つの重鎖ＣＤＲ、および配列番号８０の軽鎖可変領域の３つの軽鎖ＣＤＲを含む、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２２８】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号７８の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、および配列番号８０の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がカバットに従って番号付けされたものである、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２２９】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号７８の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、および配列番号８０の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がコチアに従って番号付けされたものである、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２３０】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号７８の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、および配列番号８０の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がマッカラムに従って番号付けされたものである、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２３１】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号７８の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、および配列番号８０の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がＡｂＭに従って番号付けされたものである、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２３２】
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号７８の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、および配列番号８０の軽鎖の軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基がＩＭＧＴに従って番号付けされたものである、ＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
【０２３３】
本明細書に記載の構築物、抗体、およびその抗原結合性部分の一部の態様および実施形態では、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７９に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖領域を含む。一部の実施形態では、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号８１に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。一部のそのような実施形態では、重鎖領域は、配列番号７９から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号８１から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０２３４】
ヒトＮＫｐ３０に結合した場合、配列番号７８において示される重鎖可変領域配列および配列番号８０において示される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトＮＫｐ３０抗体により結合されるアミノ酸残基の少なくとも１つに結合する、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片が本明細書において提供される。本開示はまた、ヒトＮＫｐ３０に結合した場合、配列番号７８において示される重鎖可変領域配列および配列番号８０において示される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトＮＫｐ３０抗体の結合を交差遮断する、ヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。
【０２３５】
ＮＫｐ３０エピトープ結合
本開示はいかなる具体的な理論または作用機序によっても縛られないが、本明細書において実証されるように、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の優れた多面的な特性は、ＮＫｐ３０に結合してそれをアゴナイズする能力に部分的に由来すると考えられる。本明細書に記載の新規の多重特異性抗原結合性構築物は、ＮＫ細胞およびγδ  Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞上のＮＫｐ３０にエンゲージメントして、例えば、腫瘍微環境において、そのような免疫エフェクター細胞の活性化および結果的な炎症性サイトカインの産生、細胞傷害活性の増進、および免疫エフェクター細胞増殖を結果としてもたらす。本明細書において使用される場合、「腫瘍微環境」（代替的に「がん微環境」；「ＴＭＥ」と略記される）という用語は、腫瘍または新生物が存在する細胞環境または状況を指し、これには、周囲血管の他に、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症細胞、およびリンパ球が挙げられるがそれに限定されない非がん性細胞が含まれる。シグナル伝達分子および細胞外マトリックスもまたＴＭＥを構成する。腫瘍および周囲微環境は密接に関連し、常に相互作用する。腫瘍は、細胞外シグナルを放出して腫瘍血管新生を促進し、末梢免疫寛容を誘導することにより微環境に影響を及ぼすことができ、微環境中の免疫細胞は腫瘍細胞の増殖および進化に影響することができる。
【０２３６】
よって、エピトープマッピング解析を行って、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および抗体のＮＫｐ３０への結合および機能的活性のために重要な残基を同定した。本明細書において使用される場合、「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、抗原結合性タンパク質（例えば、抗原結合単位、免疫グロブリン、抗体、またはその抗原結合性部分）が特異的に結合する抗原（例えば、ＮＫｐ３０）上の決定因子または部位を指す。タンパク質抗原のエピトープは「リニアエピトープ」および「コンホメーショナルエピトープ」に区分することができる。本明細書において使用される場合、「リニアエピトープ」という用語は、連結したアミノ酸の連続した直鎖状の配列から形成されるエピトープを指す。タンパク質抗原のリニアエピトープは、典型的には、化学変性剤（例えば、酸、塩基、溶媒、架橋試薬、カオトロピック剤、ジスルフィド結合還元剤）または物理変性剤（例えば、熱、放射能、もしくは機械的せん断もしくは応力）への曝露時に保持される。一部の実施形態では、エピトープは非直鎖状であり、断続的エピトープ（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ）とも称される。本明細書において使用される場合、「コンホメーショナルエピトープ」または「非リニアエピトープ」という用語は、ポリペプチドの三次フォールディングにより並置された非連続のアミノ酸から形成されるエピトープを指す。コンホメーショナルエピトープは、典型的には、変性剤を用いた処理により喪失される。エピトープは、典型的には、特有の空間的コンホメーションにおいて少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、エピトープは、特有の空間的コンホメーションにおいて２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、または３個未満のアミノ酸を含む。一般に、具体的な標的分子に特異的な抗原結合単位、抗体、またはその抗原結合性部分は、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物内の標的分子上の特定のエピトープを優先的に認識してそれに結合する。一部の実施形態では、エピトープは、ヒトＮＫｐ３０の細胞外ドメインの全てのアミノ酸を含まない。
【０２３７】
抗原結合性タンパク質、例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、免疫グロブリン、抗体またはその抗原結合性部分と接触するまたはそれにより埋没する残基を含有するドメインまたは領域は、ＮＫｐ３０（例えば、配列番号７の野生型ＮＫｐ３０）中の特定の残基を突然変異させ、抗原結合性タンパク質が、突然変異したまたは変種ＮＫｐ３０タンパク質に結合できるかどうかを決定することにより同定することができる。多数の個々の突然変異を作製することにより、結合において直接的な役割を果たすまたは突然変異が抗原結合性タンパク質と抗原との結合に影響できるように抗原結合性タンパク質に十分に密接に近接している残基を同定することができる。これらのアミノ酸の知識から、抗原結合性タンパク質と接触するまたは抗体により覆われる残基を含有する抗原のドメインまたは領域を解明することができる。そのようなドメインは抗原結合性タンパク質の結合性エピトープを含むことができる。この一般のアプローチの１つの特定の例はアラニン／アルギニンスキャニングプロトコールを利用する（例えば、ナネヴィッツ、ティーら（Ｎａｎｅｖｉｃｚ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．），１９９５，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２７０：３７，２１６１９−２１６２５およびズプニック、エーら（Ｚｕｐｎｉｃｋ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．），２００６，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２８１：２９，２０４６４−２０４７３を参照）。一般に、アルギニンは、荷電性でバルキーであり、そのため、突然変異が導入される抗原の領域において抗原結合性タンパク質と抗原との結合を妨害することがあるので、（典型的には個々に）野生型ポリペプチド中のアミノ酸の代替とされる。野生型抗原中に存在するアルギニンはアラニンで置き換えられる。様々なそのような個々の突然変異体が得られ、収集された結合結果が、いずれの残基が結合に影響するかを決定するために解析される。
【０２３８】
そのため、本明細書に記載の具体的な抗体により認識されるエピトープの全体または部分（例えば、同じもしくはオーバーラップする領域または該領域の間もしくはそれにわたる領域）を含むＮＫｐ３０上のエピトープに結合する抗原結合性タンパク質（例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、免疫グロブリン、抗体またはその抗原結合性部分）もまた本明細書に記載の組成物および方法により包含される。そのような抗原結合性タンパク質抗体は、例えば、競合結合アッセイを含む、当該技術分野において公知の慣例的な技術を使用して同定することができる。
【０２３９】
本明細書において実証されるように、ＮＫｐ３０に特異的に結合してＮＫｐ３０の機能および活性をアゴナイズし、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物において使用することができる、複数の新規のＮＫｐ３０抗体、すなわち、ｍＡｂ８、ｍＡｂ９、ｍＡｂ１０、およびｍＡｂ１１が開発された。ＮＫｐ３０内のいずれのアミノ酸残基がｍＡｂ８、ｍＡｂ１０、およびｍＡｂ１１のヒトＮＫｐ３０への結合のために不可欠であるのかを決定するために、組み合わせたアラニンおよびアルギニンスキャニング突然変異誘発分析を行って、ＮＫｐ３０への抗体結合のために重要な残基を同定した。ＮＫｐ３０突然変異体は、ＮＫｐ３０の面上の表面露出したアミノ酸残基における単一点突然変異を用いて生成した。これらのＨｉｓタグ化ＮＫｐ３０突然変異体を次に、Ｏｃｔｅｔにより測定した場合の、ｍＡｂ８、ｍＡｂ１０、およびｍＡｂ１１に結合する能力について試験した。
【０２４０】
抗原結合性タンパク質と変種ＮＫｐ３０との結合における変更（例えば、低減または増加）は、本明細書において使用される場合、（例えば、実施例において以下に記載されるように、Ｂｉａｃｏｒｅ試験もしくはＯｃｔｅｔなどの公知の方法により測定された場合の）結合親和性、ＥＣ５０における変化、および／または抗原結合性タンパク質の総結合能力における変化（例えば、低減））があることを意味する。結合における有意な変更は、突然変異した残基が抗原結合性タンパク質への結合に直接的に関与することまたは結合性タンパク質が抗原に結合した場合に結合性タンパク質に密接に近接していることを指し示す。
【０２４１】
一部の実施形態では、結合における有意な低減は、抗原結合性タンパク質と突然変異体ＮＫｐ３０抗原との間の結合親和性、ＥＣ５０、および／または能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）が、抗原結合性タンパク質と野生型ＮＫｐ３０（例えば、配列番号７において示される）との間の結合と比べて１０％より大きく、２０％より大きく、４０％より大きく、５０％より大きく、５５％より大きく、６０％より大きく、６５％より大きく、７０％より大きく、７５％より大きく、８０％より大きく、８５％より大きく、９０％より大きくまたは９５％より大きく低減されることを意味する。ある特定の実施形態では、結合は、検出可能な限界より低くまで低減される。一部の実施形態では、結合における有意な低減は、抗原結合性タンパク質の変種ＮＫｐ３０タンパク質への結合が、抗原結合性タンパク質と野生型ＮＫｐ３０タンパク質（例えば、配列番号７のタンパク質）との間で観察される結合の５０％未満（例えば、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％未満）である場合に立証される。そのような結合の測定は、当該技術分野において公知の様々な結合アッセイを使用して行うことができる。１つのそのようなアッセイの特定の例は実施例３７に記載されている。
【０２４２】
ｍＡｂ８について、Ｉ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３は、これらの残基を突然変異させることはＮＫｐ３０への結合の喪失を結果としてもたらしたので、ＮＫｐ３０への結合のために重要なアミノ酸残基として同定された。ｍＡｂ１０およびｍＡｂ１１について、Ｉ５０およびＬ１１３は、これらの残基を突然変異させることはＮＫｐ３０への結合の喪失を結果としてもたらしたので、ＮＫｐ３０への結合のために重要なアミノ酸残基として同定された。図４７Ａは、ＮＫｐ３０の面上の表面露出したアミノ酸残基を含むＮＫｐ３０の部分的なアミノ酸配列を含む表を示し、ｍＡｂ８、ｍＡｂ１０、およびｍＡｂ１１により結合されるエピトープを構成する残基は太字および下線文字で指し示される。図４７Ｂは、残基Ｉ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３を球として示したヒトＮＫｐ３０のＸ線結晶学画像（左パネル）ならびに残基Ｉ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３を球として示したＢ７−Ｈ６に結合したヒトＮＫｐ３０のＸ線結晶学画像（右パネル）を表す。これらの図は、本明細書に記載のＮＫｐ３０抗原結合性タンパク質は、ＮＫｐ３０のコンホメーショナルまたは非リニアエピトープに結合し、それにより、リガンド結合を遮断することを指し示す。
【０２４３】
そのため、ＮＫｐ３０のＮＫｐ３０リガンドへの結合を遮断する、配列番号７のアミノ酸残基Ｉ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３の少なくとも１つに特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＮＫｐ３０リガンドは、ＢＡＧ６、Ｂ７−Ｈ６、およびＧａｌ−３から選択される。本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、ＮＫｐ３０リガンドはＢ７−Ｈ６である。
【０２４４】
本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７の残基Ｉ５０を含むヒトＮＫｐ３０のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７の残基Ｓ８２を含むヒトＮＫｐ３０のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７の残基Ｌ１１３を含むヒトＮＫｐ３０のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７の残基Ｉ５０およびＬ１１３を含むヒトＮＫｐ３０のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７の残基Ｉ５０およびＳ８２を含むヒトＮＫｐ３０のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７の残基Ｓ８２およびＬ１１３を含むヒトＮＫｐ３０のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号７の残基Ｉ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３を含むヒトＮＫｐ３０のエピトープに特異的に結合する。
【０２４５】
本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、ヒトＮＫｐ３０のエピトープに結合し、ヒトＮＫｐ３０のエピトープへの結合についてｍＡｂ８と競合する。本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、ヒトＮＫｐ３０のエピトープに結合し、ヒトＮＫｐ３０のエピトープへの結合についてｍＡｂ１０と競合する。本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、ヒトＮＫｐ３０のエピトープに結合し、ヒトＮＫｐ３０のエピトープへの結合についてｍＡｂ１１と競合する。一部のそのような実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、ＮＫｐ３０に結合してそれをアゴナイズする。一部のそのような実施形態では、本開示により提供される多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、ＮＫｐ３０に結合してそれをアゴナイズし、ＮＫ細胞および／またはγδ  Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞の活性化を共刺激する。
【０２４６】
本開示は、本明細書に記載の１つまたは複数の具体的な参照抗体（例えば、ｍＡｂ８、ｍＡｂ１０、またはｍＡｂ１１）により認識されるエピトープの全体または部分を含むＮＫｐ３０上のエピトープへの結合について競合する、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分を提供する。一部の実施形態では、提供する（ｐｒｏｖｉｄｅ）多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、ヒトＮＫｐ３０のエピトープに結合し、ヒトＮＫｐ３０のエピトープへの結合について参照抗体（例えば、ｍＡｂ８、ｍＡｂ１０、またはｍＡｂ１１）と競合し、１×１０−６またはそれ未満の平衡解離定数ＫＤでヒトＮＫｐ３０に結合する。一部の実施形態では、エピトープに対する１つまたは複数の突然変異は、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分ならびに参照抗体（例えば、ｍＡｂ８、ｍＡｂ１０、またはｍＡｂ１１）の両方への結合を阻害、低減、または遮断する。一部の実施形態では、参照抗体は、本明細書に記載のｍＡｂ８抗体である。
【０２４７】
一部の実施形態では、本開示により提供される多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、ＮＫｐ３０に結合した抗体、またはその断片もしくは部分を含む結晶構造のｘ線結晶学的解析を通じて評価することができる。一部の実施形態では、本開示により提供される抗体により結合されるエピトープは、抗体パラトープ残基、例えば、ｍＡｂ８、ｍＡｂ１０、またはｍＡｂ１１の４オングストローム（Å）以内に存在または位置するヒトＮＫｐ３０抗原上の残基を決定することにより同定される。
【０２４８】
一部の実施形態では、野生型ＮＫｐ３０タンパク質（例えば、配列番号７）中の残基がアルギニンまたはアラニンで置換されている変種ＮＫｐ３０タンパク質について有意により低い結合を呈する多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分が提供される。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質（例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分）の結合は、野生型ＮＫｐ３０タンパク質（例えば、配列番号７）と比較して以下の突然変異：Ｉ５０Ｒ、Ｓ８２Ｒ、およびＬ１１３Ｒのいずれか１つまたは複数（例えば、１、２、３）を有する変種ＮＫｐ３０タンパク質について有意に低減している。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質の結合は、野生型ＮＫｐ３０タンパク質（例えば、配列番号７）と比較して、図４７Ａにおいて示されるように、以下の位置：５０、８２、および１１３において１つまたは複数（例えば、１、２、３）の置換を有する変種ＮＫｐ３０タンパク質について有意に低減している。一部の実施形態では、結合の低減は、ＥＣ５０の変化として観察される。一部の実施形態では、ＥＣ５０の変化はＥＣ５０の数値の増加（そのため結合の減少）である。一部の実施形態では、アミノ酸がＮＫｐ３０エピトープの部分であるためには、結合は少なくとも１０％低減しており、例えば、以下の量：少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の少なくともいずれかの低減は、一部の実施形態では、残基がエピトープの部分であることを指し示すことができる。
【０２４９】
一部の態様では、ヒトＮＫｐ３０のエピトープが配列番号７のアミノ酸５０〜１１３内にありまたはそれとオーバーラップし、アミノ酸残基Ｉ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３における１つまたは複数の置換が抗体または抗原結合性部分のヒトＮＫｐ３０への結合を妨害する、該エピトープに結合する多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、抗体またはその抗原結合性部分もまた本明細書において提供される。一部の実施形態では、エピトープはコンホメーショナルエピトープである。一部の実施形態では、エピトープはリニアエピトープである。
【０２５０】
列記される変種形態は、配列番号７において示される野生型配列に関して参照されるが、ＮＫｐ３０のアレル変種において指し示される位置におけるアミノ酸は異なり得ることが理解されるであろう。ＮＫｐ３０のそのようなアレル形態について有意により低い結合を示す抗原結合性タンパク質もまた想定される。よって、一部の実施形態では、上記の任意の実施形態を、配列番号７の純粋に野生型の配列ではなくアレル配列と比較することができる。
【０２５１】
上述のように、結合に直接的に関与するまたは抗原結合性タンパク質により覆われるアミノ酸残基は、スキャニングの結果から同定することができる。これらの残基は、そのため、抗原結合性タンパク質が結合する結合領域を含有する配列番号７のドメインまたは領域の表示を提供することができる。実施例３７において要約される結果から見ることができるように、一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、配列番号７のアミノ酸：５０、８２、および１１３の少なくとも１つを含有するドメインに結合する。
【０２５２】
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質（例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分）は、配列番号７のアミノ酸５０、８２、および１１３の少なくとも１つを含有する領域に結合する。一部の実施形態では、同定される残基の１つより多くは、抗原結合性タンパク質により結合される領域の部分である。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質はｍＡｂ８と競合する。
【０２５３】
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質（例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分）は、配列番号７の少なくともＩ５０を含有する領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質はｍＡｂ８、ｍｂ１０、およびｍＡｂ１１の１つまたは複数と競合する。
【０２５４】
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質（例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分）は、配列番号７の少なくともＳ８２を含有する領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質はｍＡｂ８と競合する。
【０２５５】
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質（例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分）は、配列番号７の少なくともＬ１１３を含有する領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質はｍＡｂ８、ｍｂ１０、およびｍＡｂ１１の１つまたは複数と競合する。
【０２５６】
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質（例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分）は、配列番号７の少なくともＩ５０およびＳ８２を含有する領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質はｍＡｂ８と競合する。
【０２５７】
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質（例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分）は、配列番号７の少なくともＩ５０およびＬ１１３を含有する領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質はｍＡｂ８、ｍｂ１０、およびｍＡｂ１１の１つまたは複数と競合する。
【０２５８】
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質（例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分）は、配列番号７の少なくともＳ８２およびＬ１１３を含有する領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質はｍＡｂ８と競合する。
【０２５９】
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質（例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分）は、配列番号７の少なくともＩ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３を含有する領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質はｍＡｂ８と競合する。
【０２６０】
別の態様では、ＮＫｐ３０への特異的結合について本明細書に記載のエピトープに対して例示される抗体またはその抗原結合性部分の１つと競合する抗原結合性タンパク質（例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分）が提供される。そのような抗原結合性タンパク質はまた、本明細書に例示される抗原結合性タンパク質（例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分）の１つと同じエピトープ、またはオーバーラップするエピトープに結合することができる。例示される抗原結合性タンパク質（例えば、ｍＡｂ８、ｍＡｂ１０、ｍＡｂ１１、または構築物１〜１０のいずれか１つ）と競合しまたはそれと同じＮＫｐ３０エピトープに結合する抗原結合性タンパク質は、類似した機能的特性を示すことが予期される。そのため、特定の例として、本明細書において提供される抗原結合性タンパク質としては、
（ａ）ｍＡｂ８、ｍＡｂ１０、およびｍＡｂ１１について本明細書に記載のＣＤＲの６つ全て、
（ｂ）ｍＡｂ８、ｍＡｂ１０、ｍＡｂ１１、または構築物１〜１０のいずれか１つについて本明細書に記載のＶＨおよびＶＬ、
（ｃ）ｍＡｂ８、ｍＡｂ１０、ｍＡｂ１１、または構築物１〜１０のいずれか１つについて指定されるような２つの軽鎖および２つの重鎖
を有する抗体または多重特異性抗原結合性構築物と競合するものが挙げられる。
【０２６１】
多重特異性抗原結合性構築物
一部の態様では、本明細書に記載の組成物および方法において使用するための、ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡに特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物もまた本明細書において提供される。例えば、構築物１は、ヒトＢＣＭＡおよびヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物である。構築物は、抗体の重鎖が、ポリ−ＧＧＧＳ（配列番号２２）リンカーによって抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ領域に接続された抗ＮＫｐ３０抗体（ｍＡｂ８）の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質である抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ１）を含有する。構築物の抗ＢＣＭＡ部分および抗ＮＫｐ３０部分の軽鎖は同一である。その構造が図１のイラストレーションにより表される構築物１は、配列番号９において表される重鎖配列および配列番号８において表される軽鎖配列を含む。
【０２６２】
よって、一部の態様では、（ｉ）配列番号９に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖領域および（ｉｉ）配列番号８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号９から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号８から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０２６３】
構築物２は、抗体の重鎖が、ポリ−ＧＧＧＳ（配列番号２２）リンカーによって抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ領域に接続された抗ＮＫｐ３０抗体（ｍＡｂ９）の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質である抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体を含む。構築物の抗ＢＣＭＡ部分および抗ＮＫｐ３０部分の軽鎖は同一である。その構造が図１のイラストレーションにより表される構築物２は、構築物１と同じ抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体部分、および構築物１と同じ軽鎖を含むが、構築物の抗ＮＫｐ３０抗体部分の可変領域配列（配列番号２５）により異なる。
【０２６４】
よって、一部の態様では、（ｉ）配列番号２４に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖領域および（ｉｉ）配列番号８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号２４から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号８から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０２６５】
構築物３および４は、各構築物の重鎖のＦｃ部分が（ＥＵ番号付けに従って番号付けされた）Ｎ２９７Ａアミノ酸置換を含有する構築物１および２の非グリコシル化バージョン（「構築物１アグリコ」または「構築物２アグリコ」とも称される）である。例えば、構築物３は、配列番号２６において表されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８において表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。構築物４は、配列番号２７において表されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８において表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０２６６】
よって、一部の態様では、（ｉ）配列番号２６または配列番号２７に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖領域および（ｉｉ）配列番号８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号２６または配列番号２７から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号８から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０２６７】
構築物５は、抗体の重鎖が、ポリ−ＧＧＧＳ（配列番号２２）リンカーによって抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ領域に接続された抗ＮＫｐ３０抗体（ｍＡｂ８）の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質である親和性成熟した抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ３）を含む。構築物の抗ＢＣＭＡ部分および抗ＮＫｐ３０部分の軽鎖は同一である。構築物５は、配列番号６５において表されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８において表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０２６８】
よって、一部の態様では、（ｉ）配列番号６５に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖領域および（ｉｉ）配列番号８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号６５から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号８から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０２６９】
構築物６は、抗体の重鎖が、ポリ−ＧＧＧＳ（配列番号２２）リンカーによって抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ領域に接続された抗ＮＫｐ３０抗体（ｍＡｂ８）の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質である親和性成熟した抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ２）を含む。構築物の抗ＢＣＭＡ部分および抗ＮＫｐ３０部分の軽鎖は同一である。構築物６は、配列番号６６において表されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８において表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０２７０】
よって、一部の態様では、（ｉ）配列番号６６に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖領域および（ｉｉ）配列番号８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号６６から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号８から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０２７１】
構築物７は、抗体の重鎖が、伸長されたポリ−ＧＧＧＳ（配列番号２２）リンカーによって抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ領域に接続された抗ＮＫｐ３０抗体（ｍＡｂ８）の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質である抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ１）を含む非フコシル化構築物である。構築物の抗ＢＣＭＡ部分および抗ＮＫｐ３０部分の軽鎖は同一である。構築物７は、配列番号６７において表されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８において表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０２７２】
よって、一部の態様では、（ｉ）配列番号６７に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖領域および（ｉｉ）配列番号８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号６７から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号８から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０２７３】
構築物８は、抗体の重鎖が、ポリ−ＧＧＧＳ（配列番号２２）リンカーによって抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ領域に接続された抗ＮＫｐ３０抗体（ｍＡｂ８）の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質であり、重鎖のＦｃ部分が（ＥＵ番号付けに従って番号付けされた）Ｎ２９７Ａアミノ酸置換を含有する、親和性成熟した抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ３）を含む構築物５の非グリコシル化バージョンである。構築物の抗ＢＣＭＡ部分および抗ＮＫｐ３０部分の軽鎖は同一である。構築物８は、配列番号６８において表されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８において表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０２７４】
よって、一部の態様では、（ｉ）配列番号６８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖領域および（ｉｉ）配列番号８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号６８から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号８から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０２７５】
構築物９（本明細書において構築物２Ｚと称されることもある）は、ヒトＢＣＭＡおよびヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物である。構築物は、抗体の重鎖が、ポリ−ＧＧＧＳ（配列番号２２）リンカーによって抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ領域に接続された抗ＮＫｐ３０抗体（ｍＡｂ１０）の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質である抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ１）を含有する。構築物の抗ＢＣＭＡ部分および抗ＮＫｐ３０部分の軽鎖は同一である。構築物９は、配列番号７４において表される重鎖配列および配列番号８において表される軽鎖配列を含む。
【０２７６】
よって、一部の態様では、（ｉ）配列番号７４に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖領域および（ｉｉ）配列番号８に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号７４から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号８から１５アミノ酸もしくはそれ未満、１４アミノ酸もしくはそれ未満、１３アミノ酸もしくはそれ未満、１２アミノ酸もしくはそれ未満、１１アミノ酸もしくはそれ未満、１０アミノ酸もしくはそれ未満、９アミノ酸もしくはそれ未満、８アミノ酸もしくはそれ未満、７アミノ酸もしくはそれ未満、６アミノ酸もしくはそれ未満、５アミノ酸もしくはそれ未満、４アミノ酸もしくはそれ未満、３アミノ酸もしくはそれ未満、２アミノ酸もしくはそれ未満、または１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
【０２７７】
構築物１０は、抗体の重鎖が、ポリ−ＧＧＧＳ（配列番号２２）リンカーによって抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ領域に接続された抗ＮＫｐ３０抗体（ｍＡｂ８）の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質である親和性成熟した抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ３）を含む非フコシル化構築物である。構築物の抗ＢＣＭＡ部分および抗ＮＫｐ３０部分の軽鎖は同一である。構築物１０は、配列番号６５において表されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８において表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０２７８】
非対称および対称の両方のアーキテクチャの多価および／または多重特異性抗体フォーマットなどの本明細書に記載の多価および／または多重特異性構築物を生成するために使用することができる様々なフォーマットおよび方法が当該技術分野において公知である。そのようなフォーマットの非限定的な例としては、以下が挙げられる：（ｉ）Ｆｃレス二重特異性抗体フォーマット、例えば、タンデム単鎖可変断片（ｓｃＦｖ２、ｔａＦｖ）およびトリプルボディ、例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）および二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）分子；単一ドメイン抗体を含む二重特異性単一ドメイン抗体融合タンパク質、例えば、ＶＨまたはＶＬドメイン、ＶＨＨ、ＶＮＡＲおよびナノボディ；ダイアボディおよびダイアボディ誘導体、例えば、タンデムダイアボディおよび二重親和性再標的化（ｄｕａｌ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）（ＤＡＲＴ）タンパク質；Ｆａｂ融合タンパク質；および様々なタンパク質からのヘテロ二量体化ペプチドまたはミニ抗体、例えば、コイルドコイル構造を有するロイシンジッパーの使用を通じた他のＦｃレス融合タンパク質；（ｉｉ）非対称アーキテクチャを有する二重特異性ＩｇＧ、例えば、２つの異なる抗体からの重鎖および軽鎖を有する非対称ＩｇＧ；ノブ−イントゥー−ホールアプローチ、ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避するための静電相互作用（ステアリング）、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２のヒンジ領域に電荷対を導入することによる優先的な重鎖ヘテロ二量体化、鎖交換操作ドメイン（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）（ＳＥＥＤ）ヘテロ二量体、およびＴ細胞受容体に基づく抗体による二重特異性エンゲージメント（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＢＥＡＴ）技術を使用した、非対称Ｆｃ領域を有する二重特異性ＩｇＧ；非対称ＦｃおよびＣＨ３融合タンパク質；（ｉｉｉ）対称アーキテクチャを有する二重特異性抗体、例えば、ｓｃＦｖの融合による付加型ＩｇＧ、ドメイン抗体およびスキャフォールドタンパク質の融合物、Ｆａｂアームの融合物、および追加の可変重鎖および軽鎖ドメインの融合物；改変されたＩｇＧ分子；対称ＦｃおよびＣＨ３ベース二重特異性抗体；および免疫グロブリン由来ホモ二量体化ドメインを使用した二重特異性抗体。例えば、「二重特異性抗体の製造（Ｔｈｅ  ｍａｋｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、ブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）およびコンターマン（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ）、ＭＡＢＳ  ２０１７，  Ｖｏｌ．  ９：２，  ｐｐ．  １８２−２１２（その内容の全体を参照により本願明細書に援用する）を参照。例えば、米国特許第５，７３１，１６８号明細書に記載の「ノブ・イン・ア・ホール」（ｋｎｏｂ  ｉｎ  ａ  ｈｏｌｅ）アプローチ；例えば、国際公開第０９／０８９００４号、国際公開第０６／１０６９０５号および国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されるような静電ステアリングＦｃペアリング；例えば、国際公開第０７／１１０２０５号に記載されるような鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）ヘテロ二量体形成；例えば、国際公開第０８／１１９３５３号、国際公開第２０１１／１３１７４６号、および国際公開第２０１３／０６０８６７号に記載されるようなＦａｂアーム交換；例えば、米国特許第４，４３３，０５９号明細書に記載されるような、例えば、アミン反応性基およびスルフヒドリル反応性基を有するヘテロ二官能性試薬を使用して二重特異性構造を生成するための抗体架橋による、二重抗体コンジュゲート；例えば、米国特許第４，４４４，８７８号明細書に記載されるような、２つの重鎖の間のジスルフィド結合の還元および酸化のサイクルを通じた異なる抗体からの半抗体（重鎖−軽鎖ペアまたはＦａｂ）の再結合により生成される二重特異性抗体決定因子；例えば、米国特許第５，２７３，７４３号明細書に記載されるような、三機能性抗体、例えば、スルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｄｒｙｌ）反応性基を通じて架橋された３つのＦａｂ’断片；例えば、米国特許第５，５３４，２５４号明細書に記載されるような、生合成結合性タンパク質、例えば、好ましくはジスルフィドまたはアミン反応性化学架橋を通じてＣ末端テイルを通じて架橋されたｓｃＦｖのペア；例えば、米国特許第５，５８２，９９６号明細書に記載されるような、二機能性抗体、例えば、定常ドメインを置き換えたロイシンジッパー（例えば、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ）を通じて二量体化した異なる結合特異性を有するＦａｂ断片；例えば、米国特許第５，５９１，８２８号明細書に記載されるような、二重特異性およびオリゴ特異性の一価およびオリゴ価受容体、例えば、１つの抗体のＣＨ１領域と、典型的には会合した軽鎖を有する他の抗体のＶＨ領域との間でポリペプチドスペーサーを通じて連結された２つの抗体（２つのＦａｂ断片）のＶＨ−ＣＨ１領域；例えば、米国特許第５，６３５，６０２号明細書に記載されるような、二重特異性ＤＮＡ−抗体コンジュゲート、例えば、ＤＮＡの二本鎖小片を通じた抗体またはＦａｂ断片の架橋；例えば、米国特許第５，６３７，４８１号明細書に記載されるような、二重特異性融合タンパク質、例えば、それらと全長定常領域との間に親水性ヘリカルペプチドリンカーを有する２つのｓｃＦｖを含有する発現構築物；例えば、米国特許第５，８３７，２４２号明細書に記載されるような、多価および多重特異性結合性タンパク質、例えば、一般にダイアボディと称される、Ｉｇ重鎖可変領域の結合性領域を有する第１のドメイン、およびＩｇ軽鎖可変領域の結合性領域を有する第２のドメインを有するポリペプチドの二量体（二重特異性、三重特異性、または四重特異性分子を作製するより高次構造もまた包含される）；例えば、米国特許第５，８３７，８２１号明細書に記載されるような、二量体化して二重特異性／多価分子を形成することができる、ペプチドスペーサーを用いて抗体ヒンジ領域およびＣＨ３領域にさらに接続された連結されたＶＬおよびＶＨ鎖を有するミニボディ構築物；二量体を形成して二重特異性ダイアボディを形成することができる、短いペプチドリンカー（例えば、５もしくは１０アミノ酸）を用いてまたはリンカーを全く用いずにいずれかの方向において連結されたＶＨおよびＶＬドメイン；例えば、米国特許第５，８４４，０９４号明細書に記載されるような、三量体および四量体；例えば、米国特許第５，８６４，０１９号明細書に記載されるような、一連のＦＶ（またはｓｃＦｖ）を形成するためにＶＬドメインとさらに会合したＣ末端において架橋可能な基を用いたペプチド連結により接続されたＶＨドメイン（またはファミリーメンバー中のＶＬドメイン）の連なり；ならびに、例えば、米国特許第５，８６９，６２０号明細書に記載されるような、ペプチドリンカーを通じて連結されたＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方を有する単鎖結合性ポリペプチドが非共有結合性または化学架橋を通じて多価構造に組み合わせられて、例えば、ｓｃＦＶ型またはダイアボディ型の両方のフォーマットを使用してホモ二価、ヘテロ二価、三価、および四価構造を形成したものも参照。追加の例示的な多重特異性および二重特異性分子ならびにそれを作る方法は、例えば、米国特許第５，９１０，５７３号明細書、同第５，９３２，４４８号明細書、同第５，９５９，０８３号明細書、同第５，９８９，８３０号明細書、同第６，００５，０７９号明細書、同第６，２３９，２５９号明細書、同第６，２９４，３５３号明細書、同第６，３３３，３９６号明細書、同第６，４７６，１９８号明細書、同第６，５１１，６６３号明細書、同第６，６７０，４５３号明細書、同第６，７４３，８９６号明細書、同第６，８０９，１８５号明細書、同第６，８３３，４４１号明細書、同第７，１２９，３３０号明細書、同第７，１８３，０７６号明細書、同第７，５２１，０５６号明細書、同第７，５２７，７８７号明細書、同第７，５３４，８６６号明細書、同第７，６１２，１８１号明細書、米国特許出願公開第ＵＳ２００２００４５８７号明細書、米国特許出願公開第２００２０７６４０６号明細書、米国特許出願公開第２００２１０３３４５号明細書、米国特許出願公開第２００３２０７３４６号明細書、米国特許出願公開第２００３２１１０７８号明細書、米国特許出願公開第２００４２１９６４３号明細書、米国特許出願公開第２００４２２０３８８号明細書、米国特許出願公開第２００４２４２８４７号明細書、米国特許出願公開第２００５００３４０３号明細書、米国特許出願公開第２００５００４３５２号明細書、米国特許出願公開第２００５０６９５５２号明細書、米国特許出願公開第２００５０７９１７０号明細書、米国特許出願公開第２００５１００５４３号明細書、米国特許出願公開第２００５１３６０４９号明細書、米国特許出願公開第２００５１３６０５１号明細書、米国特許出願公開第２００５１６３７８２号明細書、米国特許出願公開第２００５２６６４２５号明細書、米国特許出願公開第２００６０８３７４７号明細書、米国特許出願公開第２００６１２０９６０号明細書、米国特許出願公開第２００６２０４４９３号明細書、米国特許出願公開第２００６２６３３６７号明細書、米国特許出願公開第２００７００４９０９号明細書、米国特許出願公開第２００７０８７３８１号明細書、米国特許出願公開第２００７１２８１５０号明細書、米国特許出願公開第２００７１４１０４９号明細書、米国特許出願公開第２００７１５４９０１号明細書、米国特許出願公開第２００７２７４９８５号明細書、米国特許出願公開第２００８０５０３７０号明細書、米国特許出願公開第２００８０６９８２０号明細書、米国特許出願公開第２００８１５２６４５号明細書、米国特許出願公開第２００８１７１８５５号明細書、米国特許出願公開第２００８２４１８８４号明細書、米国特許出願公開第２００８２５４５１２号明細書、米国特許出願公開第２００８２６０７３８号明細書、米国特許出願公開第２００９１３０１０６号明細書、米国特許出願公開第２００９１４８９０５号明細書、米国特許出願公開第２００９１５５２７５号明細書、米国特許出願公開第２００９１６２３５９号明細書、米国特許出願公開第２００９１６２３６０号明細書、米国特許出願公開第２００９１７５８５１号明細書、米国特許出願公開第２００９１７５８６７号明細書、米国特許出願公開第２００９２３２８１１号明細書、米国特許出願公開第２００９２３４１０５号明細書、米国特許出願公開第２００９２６３３９２号明細書、米国特許出願公開第２００９２７４６４９号明細書、欧州特許出願公開第３４６０８７号明細書、およびＰＣＴ国際公開０００６６０５号、国際公開第０２０７２６３５号、国際公開第０４０８１０５１号、国際公開第０６０２０２５８号、国際公開第２００７０４４８８７号、国際公開第２００７０９５３３８号、国際公開第２００７１３７７６０号、国際公開第２００８１１９３５３号、国際公開第２００９０２１７５４号、国際公開第２００９０６８６３０号、国際公開第９１０３４９３号、国際公開第９３２３５３７号、国際公開第９４０９１３１号、国際公開第９４１２６２５号、国際公開第９５０９９１７号、国際公開第９６３７６２１号、国際公開第９９６４４６０号に見出される。
【０２７９】
一部の実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合性構築物は腫瘍またはＢ系列細胞抗原（例えば、ＢＣＭＡ）およびＮＫｐ３０に選択的に結合する。抗原結合単位は、本明細書に開示されるように、標準技術により生成することができる。一部の実施形態では、腫瘍もしくはＢ系列細胞抗原もしくはＮＫｐ３０に対する任意の公知の抗体を使用して本開示に従った二重特異性抗体を生成することができ、または、多重特異性抗原結合性構築物は、当該技術分野において公知の抗体を使用して生成することができる。
【０２８０】
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物（例えば、三重特異性抗原結合性構築物）は、エフェクター免疫細胞により発現される分子に特異的に結合する第３の抗原結合単位をさらに含む。任意選択で、第３の抗原結合単位は免疫グロブリンＦｃドメインである。エフェクター免疫細胞により発現される分子は、例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ６４、またはＣＤ８９であることができる。任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物は免疫グロブリンＦｃドメインを含まない。
【０２８１】
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物（例えば、三重特異性抗原結合性構築物）は、第２の腫瘍またはＢ系列細胞抗原に特異的に結合する第３の抗原結合単位をさらに含む。そのような実施形態では、三重特異性抗原結合性構築物は、第１の腫瘍またはＢ系列細胞抗原について一価であり、第２の腫瘍またはＢ系列細胞抗原について一価であり、ＮＫｐ３０について二価である。
【０２８２】
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物（例えば、三重特異性抗原結合性構築物）は、第２のＮＫ活性化受容体に特異的に結合する第３の抗原結合単位をさらに含む。一部のそのような実施形態では、三重特異性抗原結合性構築物は、腫瘍またはＢ系列細胞抗原について一価であり、ＮＫｐ３０について二価であり、第２のＮＫ活性化受容体について一価である。
【０２８３】
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物（例えば、四重特異性抗原結合性構築物）は、第２のＮＫ活性化受容体に特異的に結合する第３の抗原結合単位、および第２の腫瘍またはＢ系列細胞抗原に特異的に結合する第４の抗原結合単位をさらに含む。そのような実施形態では、四重特異性抗原結合性構築物は、腫瘍またはＢ系列細胞抗原について一価であり、第２の腫瘍またはＢ系列細胞抗原について一価であり、ＮＫｐ３０について一価であり、第２のＮＫ活性化受容体について一価である。
【０２８４】
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の実施形態において標的として使用するために想定される追加のＮＫ活性化受容体の非限定的な例としては、ＮＫｐ４６、２Ｂ４、ＣＤ２２６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３７、ＣＤ１６ａ、およびＣＤ２が挙げられる。これらのＮＫ活性化受容体の例示的なヒトアミノ酸配列は、配列番号２７〜３５として見出すことができる。
【０２８５】
よって、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はＮＫｐ４６に特異的に結合する。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位は２Ｂ４に特異的に結合する。
【０２８６】
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はＣＤ２２６に特異的に結合する。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はＮＫＧ２Ｄに特異的に結合する。
【０２８７】
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はＣＤ１３７に特異的に結合する。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はＣＤ１６ａに特異的に結合する。
【０２８８】
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はＣＤ２に特異的に結合する。
ある特定の実施形態では、第１の抗原結合単位および第２の抗原結合単位は少なくとも１つのアミノリンカーアミノ酸配列により連結されている。任意選択で、リンカーアミノ酸配列はＧＧＧＧＳｘ（配列番号２２）（ｘは、１および６を含む１〜６の整数である）を含む。
【０２８９】
第１の抗原結合単位または第２の抗原結合単位、または両方は、１つまたは複数の免疫グロブリンＦｃ改変を含む重鎖を含むことができる。同様に、第３またはその後の抗原結合単位、または両方もまた、１つまたは複数の免疫グロブリンＦｃ改変を含む重鎖を含むことができる。一部の実施形態では、重鎖の免疫グロブリンＦｃドメインは、例えば、第１および第２の抗原結合単位のヘテロ二量体化を促進し、血清半減期を促進し、および／またはエフェクター機能を改変する、１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。一部の実施形態では、突然変異は重鎖のＣＨ３ドメイン中に存在する（例えば、シューら（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１５）ｍＡｂｓ  ７（１）：２３１−４２を参照）。
【０２９０】
伝統的なＦｃ融合タンパク質および抗体はガイドされない相互作用ペアの例であるが、例えば、第１の抗原結合単位および第２の抗原結合単位のヘテロ二量体化を促進するために、様々な操作されたＦｃドメインが非対称相互作用ペアとして設計されている（シュピースら（Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７（２Ａ）：９５−１０６）。許容される収率において好ましい非対称融合タンパク質を製造するために単一細胞株中でのＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を増加させる様々な方法が当該技術分野において公知である（例えば、クラインら（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１２）ｍＡｂｓ  ４：６５３−６６３；およびシュピースら（Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７（２ＰａｒｔＡ）：９５−１０６を参照）。Ｆｃ含有ポリペプチドの所望のペア形成を得る方法としては、電荷ベースのペア形成（静電ステアリング）、「ノブ−イントゥー−ホール」立体ペア形成、ＳＥＥＤボディペア形成、およびロイシンジッパーベースのペア形成が挙げられるがそれに限定されない（例えば、リッジウェイら（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ９：６１７−６２１；マーチャントら（Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９８）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １６：６７７−６８１；デイビスら（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．２３：１９５−２０２；グナセカランら（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１０）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８５：１９６３７−１９６４６；ラニクら（Ｗｒａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１２）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８７：４３３３１−４３３３９；米国特許第５，９３２，４４８号明細書；ならびにＰＣＴ国際公開第１９９３／０１１１６２号、国際公開第２００９／０８９００４号、および国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照）。
【０２９１】
例えば、特定のポリペプチドの間の相互作用を促進することができる１つの手段は、米国特許第７，１８３，０７６号明細書および同第５，７３１，１６８号明細書、ならびにＰＣＴ国際公開第２０１６／１６４０８９号などに記載されるようにプロチュベランス−イントゥー−キャビティ（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ）（ノブ−イントゥー−ホール）相補領域を操作することによる。「プロチュベランス」（隆起）は、第１のポリペプチドの境界面（例えば、第１の相互作用ペア）からの小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることにより構築される。プロチュベランスと同一または類似のサイズの相補的な「キャビティ」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることにより第２のポリペプチドの境界面（例えば、第２の相互作用ペア）上に任意選択で作製される。好適な位置および寸法のプロチュベランスまたはキャビティが第１または第２のいずれかのポリペプチドの境界面において存在する場合、隣接する境界面において対応するそれぞれキャビティまたはプロチュベランスを操作することのみが必要である。
【０２９２】
中性ｐＨ（７．０）において、アスパラギン酸およびグルタミン酸は負に荷電し、リシン、アルギニン、およびヒスチジンは正に荷電する。これらの荷電性残基を使用して、ヘテロ二量体形成を促進し、それと同時にホモ二量体形成を邪魔することができる。反対の電荷の間で誘引性相互作用が起こり、同様の電荷の間で反発性相互作用が起こる。部分的に、本明細書に開示されるタンパク質複合体は、荷電性境界面残基の部位特異的突然変異誘発を実行することによりヘテロマルチマー形成（例えば、ヘテロ二量体形成）を促進するために誘引性相互作用を使用し、任意選択でホモ二量体形成（例えば、ホモ二量体形成）を邪魔するために反発性相互作用を使用する。
【０２９３】
例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン境界面は、ドメイン−ドメイン相互作用に関与する４つの特有の電荷残基ペア：Ａｓｐ３５６−Ｌｙｓ４３９’、Ｇｌｕ３５７−Ｌｙｓ３７０’、Ｌｙｓ３９２−Ａｓｐ３９９’、およびＡｓｐ３９９−Ｌｙｓ４０９’［第２の鎖中の残基番号付けは（’）により指し示される］を含む。ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン中の残基を指定するためにここで使用される番号付けスキームは、カバットのＥＵ番号付けスキームに従うことに留意すべきである。ＣＨ３−ＣＨ３ドメイン相互作用において存在する２回対称性に起因して、各特有の相互作用は構造中に２回現れる（例えば、Ａｓｐ−３９９−Ｌｙｓ４０９’およびＬｙｓ４０９−Ａｓｐ３９９’）。野生型配列において、Ｋ４０９−Ｄ３９９’は、ヘテロ二量体およびホモ二量体の両方の形成を好む。第１の鎖において電荷極性を切り替える単一の突然変異（例えば、Ｋ４０９Ｅ；正電荷から負電荷へ）は、第１の鎖のホモ二量体の形成にとって不都合な相互作用に繋がる。不都合な相互作用は、同じ電荷（負−負；Ｋ４０９Ｅ−Ｄ３９９’およびＤ３９９−Ｋ４０９Ｅ’）の間で起こる反発性相互作用に起因して生じる。第２の鎖において電荷極性を切り替える類似した突然変異（Ｄ３９９Ｋ’；負から正へ）は、第２の鎖のホモ二量体形成にとって不都合な相互作用（Ｋ４０９’−Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９Ｋ−Ｋ４０９’）に繋がる。しかし、同時に、これらの２つの突然変異（Ｋ４０９ＥおよびＤ３９９Ｋ’）はヘテロ二量体形成にとって好都合な相互作用（Ｋ４０９Ｅ−Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９−Ｋ４０９’）に繋がる。ヘテロ二量体の形成およびホモ二量体の支障に対する静電ステアリング効果は、例えば、Ａｒｇ３５５およびＬｙｓ３６０を含む、第２の鎖中の反対に荷電した残基とペア形成していてもよいしそうでなくてもよい追加の電荷残基の突然変異によりさらに増進することができる（例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１６／１６４０８９号を参照）。
【０２９４】
そのため、一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、免疫グロブリンの定常ドメインを含むことができる。例えば、第１の抗原結合単位は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡｌもしくはＩｇＡ２）、ＩｇＥ、またはＩｇＭ免疫グロブリンのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含むことができる。任意選択で、第２の抗原結合単位および／またはその後の抗原結合単位は、ＩｇＧ（ＩｇＧｌ、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡｌもしくはＩｇＡ２）、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含むことができる。そのような免疫グロブリンドメインは、ヘテロ二量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、欠失、付加、および／または置換）を含むことができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＩｇＧ１アイソタイプである。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＩｇＧ１アイソタイプであり、置換を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＩｇＧ２アイソタイプである。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＩｇＧ３アイソタイプである。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＩｇＧ４アイソタイプである。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はＩｇＧ４アイソタイプであり、置換を含む。一部の実施形態では、置換は、ＥＵ番号付けに従って番号付けされた場合にＳｅｒ２２８におけるものである。一部の実施形態では、Ｓｅｒ２２８における置換はＳ２２８Ｐである。一部の実施形態では、第１の抗原結合単位および第２の抗原結合単位は、同じ免疫グロブリンクラスおよびサブタイプに由来するＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、第１および第２の抗原結合単位は、異なる免疫グロブリンクラスまたはサブタイプに由来するＦｃドメインを含む。同様に、第１および／または第２の抗原結合単位（例えば、非対称ペアまたは非ガイド相互作用ペア）は、任意選択で、例えば、ヘテロ二量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、欠失、付加、および／または置換）を含む、改変された免疫グロブリンの定常ドメインを含む。１つまたは複数のその後の抗原結合単位は、任意選択で、同じクラスおよびサブタイプからのものであり、または第１および／もしくは第２の抗原結合単位とは異なる。所望のヘテロ二量体形成を有するＦｃ改変を生成する方法は当該技術分野において公知である。
【０２９５】
一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物の血清半減期を増進するように改変することができる。例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨにおいて、Ｆｃ受容体への抗体の結合を増進または減少させる１つまたは複数の突然変異を含むＦｃドメインは当該技術分野において公知である。例えば、本明細書に開示される構築物は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域中に１つまたは複数の突然変異を含むことができ、突然変異は、酸性環境中（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０に及ぶエンドソーム中）でＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。そのような突然変異は、動物に投与された場合に構築物の血清半減期の増加を結果としてもたらすことができる。増進した血清半減期などの所望の特徴のためにＦｃドメインを改変する方法は当該技術分野において公知である。
【０２９６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、その対応する変更されていない定常領域と比べて低減されたエフェクター機能を有する（またはエフェクター機能を有しない）変更された重鎖定常領域を含む。本明細書に記載の構築物の定常領域を伴うエフェクター機能は、定常またはＦｃ領域の特性を変更することによりモジュレートすることができる。変更されたエフェクター機能としては、例えば、以下の活性：ＡＤＣＣ、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、アポトーシス、１つまたは複数のＦｃ受容体への結合、および炎症促進性応答の１つまたは複数におけるモジュレーションが挙げられる。モジュレーションは、変更されていない形態の定常領域の活性と比較して変更された定常領域を含有する対象抗体またはその抗原結合性断片により呈されるエフェクター機能活性の増加、減少、または排除を指す。具体的な実施形態では、モジュレーションは、活性が消失しまたは完全に存在しない状況を含む。
【０２９７】
変更されたＦｃＲ結合親和性および／またはＡＤＣＣ活性および／または変更されたＣＤＣ活性を有する変更された定常領域は、変更されていない形態の定常領域と比較して増進または減少したＦｃＲ結合活性および／またはＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性のいずれかを有するポリペプチドである。ＦｃＲへの増加した結合を示す変更された定常領域は、変更されていないポリペプチドより高い親和性で少なくとも１つのＦｃＲに結合する。ＦｃＲへの減少した結合を示す変更された定常領域は、変更されていない形態の定常領域より低い親和性で少なくとも１つのＦｃＲに結合する。ＦｃＲへの減少した結合を示すそのような変種は、ＦｃＲへの認識できる結合をほとんどまたは全く有することができず、例えば、天然配列免疫グロブリン定常またはＦｃ領域のＦｃＲへの結合のレベルと比較して０〜５０％（例えば、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％未満）のＦｃＲへの結合である。同様に、モジュレートされたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を示す変更された定常領域は、変更されていない定常領域と比較して増加または低減されたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性のいずれかを呈することができる。例えば、一部の実施形態では、変更された定常領域を含む抗体またはその抗原結合性断片は、変更されていない形態の定常領域のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性の約０〜５０％（例えば、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％未満）を呈することができる。低減されたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを示す変化した定常領域を含む本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、低減されたＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣ活性を呈し、またはＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣ活性を全く呈しないものであることができる。
【０２９８】
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、低減されたエフェクター機能を呈し、またはエフェクター機能を呈しない。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、Ｇ２／Ｇ４ハイブリッド定常領域などのハイブリッド定常領域、またはその部分を含む（例えば、バートンら（Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９２）Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎ．５１：１−１８；キャンフィールドら（Ｃａｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９１）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７３：１４８３−１４９１；およびミュラーら（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９７）Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３４（６）：４４１−４５２を参照）。
【０２９９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、増加したエフェクター機能を呈する。免疫グロブリンＦｃ領域中で行うことができる置換を含む、エフェクター機能を増進または増加させる方法は当該技術分野において公知である。そのような置換の例は、ワンら（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｌｌ  ９（１）６３−７３（例えば、Ｔａｂｌｅ  １を参照）（内容の全体を参照により本願明細書に援用する）において見出すことができる。
【０３００】
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物のエフェクター機能をモジュレートすることは、グリコシル化における変化を含む。エフェクター機能の程度と共にヒトＩｇＧ上に見出されるオリゴ糖の重要性の要約は、ラジュ・ティー・エス（Ｒａｊｕ  Ｔ  Ｓ．），  ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｒｉｌ  ２００３．  ４４−５３に記載されている。ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）およびモリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）によれば、ヒトＩｇＧオリゴ糖の微不均一性は、ＣＤＣおよびＡＤＣＣ、様々なＦｃ受容体への結合、ならびにＣ１ｑタンパク質への結合などの生物学的機能に影響し得る。（ライト、エー（Ｗｒｉｇｈｔ  Ａ．）およびモリソン、エスエル（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ．）  ＴＩＢＴＥＣＨ  １９９７，  １５  ２６−３２）。抗体のグリコシル化パターンは、産生細胞および細胞培養条件に依存して異なり得ることもまた報告されている（ラジュ・ティー・エス（Ｒａｊｕ  Ｔ  Ｓ．），  ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｒｉｌ  ２００３．  ４４−５３）。そのような差異は、エフェクター機能および薬物動態の両方における変化に繋がり得る（イスラエルら（Ｉｓｒａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９６；８９（４）：５７３−５７８；ニューカークら（Ｎｅｗｋｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ．）  Ｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  １９９６；１０６（２）：２５９−６４）。エフェクター機能における差異は、エフェクター細胞上のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合するＩｇＧの能力に関する可能性がある。ＦｃγＲへの向上した結合を有するアミノ酸配列における変種を含むＩｇＧは、ヒトエフェクター細胞を使用して１００％までの増進したＡＤＣＣを呈することができることもまた示されている（シールズら（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．）  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００１  ２７６（９）：６５９１−６０４）。これらの変種は、結合境界面において見出されないアミノ酸における変化を含むが、糖成分の性質およびその構造パターンの両方もまた、観察される差異に寄与する。追加的に、ＩｇＧのオリゴ糖成分中のフコースの存在または非存在は、結合およびＡＤＣＣを向上させ得ることが示されている（シールズら（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．）Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００２；２７７（３０）：２６７３３−４０）。Ａｓｎ２９７に連結したフコシル化炭水化物を欠いたＩｇＧは、Ｆｃγ受容体への正常な受容体結合を呈した。対照的に、ＦｃγＲＩＩＡ受容体への結合は、特により低い抗体濃度において、５０％向上し、増進したＡＤＣＣが付随した。よって、一部の実施形態では、エフェクター機能を増進または増加させる方法は、変更されたグリコシル化（ｇｌｙｏｓｙｌａｔｉｏｎ）またはフコシル化活性を有する遺伝子操作されたＣＨＯ細胞中で本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を発現または産生させることを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物はフコシル化を欠いており、または非フコシル化されている。そのような遺伝子操作されたＣＨＯ細胞は、例えば、減少したα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有しまたはα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有しないものであることができ、それにより、結果として生じる多重特異性抗原結合性構築物は、糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンを通じてＦｃ領域に結合した複合体Ｎ−グリコシド連結糖鎖が、Ｎ−アセチルグルコサミンに結合したフコースを有する糖鎖を何ら含有しない、または低減された量の該糖鎖を含有するような、Ｆｃ領域を含む。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物と共に使用することができるそのような操作された細胞の非限定的な例としては、国際公開第００／６１７３９号、米国特許第６，９４６，２９２号明細書、米国特許第７，２１４，７７５号明細書、米国特許第７，４２５，４４６号明細書、米国特許第７，７０８，９９２号明細書、および米国特許第７，７３７，３２５号明細書（それぞれの内容の全体を参照により本願明細書に援用する）に記載されるものが挙げられる。
【０３０１】
一部の実施形態では、エフェクター機能を増進しまたは増加させる方法は、ＡＤＣＣ活性に関係があるとされるオリゴ糖をバイセクト化させる変更されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素（ＧｎｎＵ）活性を有する遺伝子操作または改変されたＣＨＯ細胞中で本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を発現または産生させることを含む。
【０３０２】
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、増進または低減された補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を呈する変更された定常領域を含有する。モジュレートされたＣＤＣ活性は、抗体のＦｃ領域中に１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、または欠失を導入することにより達成することができる。例えば、米国特許第６，１９４，５５１号明細書を参照。
【０３０３】
抗体またはその断片は、１つより多くの種に結合するためにさらに選択することができる。例えば、マウスおよびヒトの両方に結合する抗体または断片は、マウスおよびヒトの両方の標的細胞を用いるスクリーニングにより選択することができる。
【０３０４】
本明細書に記載の構築物および抗原結合単位は、部分的に、スキャフォールドドメイン、タンパク質、または部分、例えば、標的受容体結合活性を提供しないが、空間的組織化、構造的サポート、複数の受容体結合単位の連結の手段、または他の所望の特徴、例えば、向上した半減期を提供する構築物の部分またはドメインを提供することができる分子を含むことができる。様々なスキャフォールド技術および組成物は当該技術分野において公知であり、本明細書に記載の抗原結合単位に容易に連結またはコンジュゲート化させることができる。スキャフォールドドメイン、タンパク質、または部分は、抗体に由来し、または抗体に由来しないものであり得る。そのようなスキャフォールドタンパク質、およびそのドメインは、一般に、既存の抗原結合性タンパク質のコンビナトリアル化学ベースの適合を通じて得られる。
【０３０５】
非抗体タンパク質スキャフォールドは、２つの構造的カテゴリー、ドメインサイズの構築物（６〜２０ｋＤａの範囲内）、および制約されたペプチド（２〜４ｋＤａの範囲内）に入ると考えることができる。ドメインサイズの非抗体スキャフォールドとしては、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アトリマー、ＤＡＲＰｉｎ、ＦＮ３スキャフォールド（例えば、アドネクチンおよびセンチリン）、フィノマー、クニッツドメイン、プロネクチンならびにＯＢｏｄｙが挙げられるがそれに限定されない。ペプチドサイズの非抗体スキャフォールドとしては、例えば、アビマー、二環ペプチドおよびシステインノットが挙げられる。これらの非抗体スキャフォールドおよびそのベースまたは由来となる基礎タンパク質またはペプチドは、例えば、シメオン（Ｓｉｍｅｏｎ）およびチェン（Ｃｈｅｎ），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｌｌ  ９（１）：３−１４（２０１８）；バスケス−ロンバルディら（Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｌｏｍｂａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．），  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２０：１２７１−１２８３（２０１５）、およびビンツら（Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．），  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：１２５７−１２６８（２００５）（それぞれの内容の全体を参照により本願明細書に援用する）により総説されている。非抗体スキャフォールドを使用する利点としては、増加した親和性、標的中和、および安定性が挙げられる。様々な非抗体スキャフォールドはまた、例えば、組織透過、より小さいサイズ、および熱安定性の点で、抗体スキャフォールドの制限の一部を克服することができる。一部の非抗体スキャフォールドはまた、例えば、二重特異性構築物が所望される場合の軽鎖会合の問題により邪魔されることなく、より容易な構築を許容することができる。非抗体スキャフォールド上に構築物を構築する方法は当業者に公知である。正式には抗体スキャフォールド上ではないが、そのような構築物は、多くの場合に、特異的な標的結合能力を提供する単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖまたは他の抗体結合性ドメイン変種のいずれの形態にあるにせよ、抗体結合性ドメインを含む。
【０３０６】
よって、本明細書に記載の任意の態様の一部の実施形態では、構築物は非抗体スキャフォールドタンパク質を含むことができる。本明細書に記載の任意の態様の一部の実施形態では、受容体結合単位の少なくとも１つは非抗体スキャフォールドタンパク質を含むことができる。非抗体スキャフォールドタンパク質のスキャフォールド部分は、一部の実施形態では、例えば、ヒト第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）に由来するアドネクチンスキャフォールドもしくは部分；ヒトリポカリンに由来するアンチカリンスキャフォールド（例えば、例えば国際公開第２０１５／１０４４０６号に記載されるものなど）；低比重関連タンパク質（ＬＲＰ）のＡドメインおよび／もしくは超低比重リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ）に由来するアビマースキャフォールドもしくはタンパク質断片；ＦＹＮチロシンキナーゼのＳＨ３ドメインのフィノマースキャフォールドもしくは部分；ヒトトリプシン阻害剤、アプロチニン（ウシ膵臓トリプシン阻害剤）、アルツハイマーのアミロイド前駆体タンパク質、および組織因子経路阻害剤などのクニッツ型プロテアーゼ阻害剤のクニッツドメインスキャフォールドもしくは部分；Ｅ．エラテリウム（Ｅ．  ｅｌａｔｅｒｉｕｍ）からのトリプシン阻害剤に基づくものなどのノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）スキャフォールド（システインノットミニプロテイン）；アフィボディスキャフォールドもしくはＳ．アウレウス（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡのＺドメインの全体もしくは部分；β−ヘアピン模倣体スキャフォールド；設計アンキリンリピートタンパク質（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ａｎｋｙｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＤＡＲＰｉｎ）スキャフォールドもしくはアンキリンリピート（ＡＲ）タンパク質に基づく人工的なタンパク質スキャフォールド；またはヒトトランスフェリン、ヒトＣＴＬＡ−４、ヒトクリスタリン、およびヒトユビキチンに由来しもしくはそれに基づく任意のスキャフォールドを含むことができることを当業者は理解する。例えば、ヒトトランスフェリン受容体用のヒトトランスフェリンの結合部位は、その一部が異なる抗原に対する親和性を獲得しているトランスフェリン変種の多様なライブラリーを作製するために多様化させることができる。例えば、アリら（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９９）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：２４０６６−２４０７３を参照。受容体との結合に関与しないヒトトランスフェリンの部分は、変化させないままであり、変種結合部位を提示するための、抗体のフレームワーク領域のようなスキャフォールドとして働く。ライブラリーは次に、抗体ライブラリーとして、および本明細書に記載の方法に従って、標的抗原について最適な選択性および親和性を有する変種を同定するために、目的の標的抗原に対してスクリーニングされる。例えば、ヘイら（Ｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）（２００５）ＴＲＥＮＤＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３（１０）：５１４−５２２を参照。
【０３０７】
本開示はまた、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離された抗体、もしくはその抗原結合性部分をコードする核酸を提供する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離された抗体、もしくはその抗原結合性部分をコードする核酸配列の非限定的な例としては、配列番号８４〜１００が挙げられる。核酸を含む（任意選択で発現制御配列を有する）本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離された抗体、もしくはその抗原結合性断片のためのベクター、およびベクターまたは核酸を含む細胞もまた提供される。そのような細胞を細胞によるベクターからの１つまたは複数のポリペプチドの発現のための条件下で培養することを含む、ポリペプチドを製造する方法が提供される。方法は、任意選択で、細胞または細胞が培養された培地から１つまたは複数のポリペプチドを単離することを含む。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離された抗体、もしくはその抗原結合性断片にコンジュゲート化した異種部分を含むタンパク質コンジュゲート分子もまた提供される。任意選択で、異種部分は、治療剤、毒素、薬物、または放射性部分である。
【０３０８】
多重特異性抗原結合性構築物を製造する方法
本明細書に記載の任意の多重特異性抗原結合性構築物を製造する方法が本明細書において提供される。開示される構築物を製造する方法は、抗体およびその抗原結合性断片を調製する方法を含む。そのような方法は当該技術分野において周知であり、例えば、適切な免疫原を用いて対象（例えば、非ヒト哺乳動物）を免疫化することを含む。腫瘍抗原、または、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、もしくはＮＫＧ２Ｄなどの活性化ＮＫ受容体に結合する抗体を生成するために、当業者は、全長腫瘍抗原またはＮＫ活性化受容体のポリペプチドもしくはその変種もしくは断片を用いて好適な対象（例えば、ラット、マウス、アレチネズミ、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウマ、または非ヒト霊長動物などの非ヒト哺乳動物）を免疫化する。ポリペプチド（腫瘍抗原またはＮＫ活性化受容体）の抗原性断片は、ポリペプチドの既知の構造的特徴に基づいて抗体を生成するために選択することができる。例えば、当該技術分野において利用可能な受容体／リガンド境界面の情報に基づいて腫瘍抗原またはＮＫ活性化受容体内の領域を使用して、望ましい特性を有する抗体を生成するための好適な抗原性断片を設計することができる。結果として生じた抗体または抗原結合性構築物を次に所望の結合特性（例えば、腫瘍抗原およびＮＫ活性化受容体に対する結合親和性ならびに腫瘍抗原およびＮＫ活性化受容体が発現される細胞にブリッジ形成する能力）についてスクリーニングすることができる。
【０３０９】
好適な対象（例えば、非ヒト哺乳動物）は、哺乳動物による抗体の産生を誘発するために十分な回数のその後のブースター免疫化と共に適切な抗原を用いて免疫化することができる。免疫原は、アジュバントと共に対象（例えば、非ヒト哺乳動物）に投与することができる。対象における抗体の産生において有用なアジュバントとしては、タンパク質アジュバント；細菌アジュバント、例えば、細菌全体（ＢＣＧ、コリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）またはサルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ））、および、細胞壁骨格、トレハロースジミコール酸、モノホスホリルリピドＡ、結核菌（ｔｕｂｅｒｃｌｅ  ｂａｃｉｌｌｕｓ）のメタノール抽出可能残留物（ＭＥＲ）、完全または不完全フロイントアジュバントを含む細菌成分；ウイルスアジュバント；ならびに化学的アジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、およびヨード酢酸塩およびコレステリルヘミスクシネートが挙げられるがそれに限定されない。免疫応答を誘導する方法において使用することができる他のアジュバントとしては、例えば、コレラ毒素およびパラポックスウイルスタンパク質が挙げられる。（ビーグら（Ｂｉｅｇ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９９）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３１（１）：１５−２４も参照；例えば、ロドメルら（Ｌｏｄｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：１０５９−１０６６；ジョンソンら（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９９）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４２：４６４０−４６４９；バルドリッジら（Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９：１０３−１０７；およびグプタら（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ  １３（１４）：１２６３−１２７６も参照）。
【０３１０】
一部の実施形態では、方法は、免疫原に結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を調製することを含む。例えば、実験室マウスなどの好適な哺乳動物は、上記のようなポリペプチド（例えば、腫瘍抗原もしくはＮＫ活性化受容体）または抗原性断片を用いて免疫化される。免疫化された哺乳動物の抗体産生細胞（例えば、脾臓のＢ細胞）は、免疫原の少なくとも１回のブースター免疫化の２〜４日後に単離することができ、次に好適な骨髄腫細胞株の細胞との融合前に培養で短期間生育することができる。細胞は、例えば、ワクシニアウイルスまたはポリエチレングリコールなどの融合促進剤の存在下で融合させることができる。融合において得られたハイブリッド細胞はクローニングされ、所望の抗体を分泌する細胞クローンが選択される。例えば、好適な免疫原を用いて免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞は、骨髄腫細胞株ＰＡＩまたは骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４の細胞と融合させることができる。融合後、正常な骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞より過成長することを防止するために定期的な間隔において選択培地、例えばＨＡＴ培地を添加した好適な培養培地中で細胞は拡大増殖される。得られたハイブリドーマ細胞は次に、所望の抗体、例えば、所望の抗原に結合する抗体の分泌についてスクリーニングされる。
【０３１１】
一部の実施形態では、腫瘍抗原またはＮＫ活性化受容体に特異的な抗体は、例えば、米国特許第６，３００，０６４号明細書およびショーンブロートら（Ｓｃｈｏｏｎｂｒｏｏｄｔ  ｅｔ  ａｌ．）（２００５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３（９）：ｅ８１に記載されるような非免疫バイアスライブラリーから選択される。
【０３１２】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば、ファージディスプレイ技術、細菌ディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、真核ウイルスディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイ、および無細胞（例えば、リボソームディスプレイ）抗体スクリーニング技術を伴い、またはそれと組み合わせて使用することができる（例えば、エッツら（Ｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．）（２００１）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８３：６９２４−６９３５；コーネリス（Ｃｏｒｎｅｌｉｓ）（２０００）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １１：４５０−４５４；クレムら（Ｋｌｅｍｍ  ｅｔ  ａｌ．）（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６：３０２５−３０３２；キーケら（Ｋｉｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １０：１３０３−１３１０；イェンら（Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．  １８：２１２−２２０；ボーデルら（Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３２８：４３０−４４４；グラベールら（Ｇｒａｂｈｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．）（２００１）Ｃｏｍｂ．  Ｃｈｅｍ．  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ  ４：１８５−１９２；ミカエルら（Ｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２：６６０−６６８；ペレボエフら（Ｐｅｒｅｂｏｅｖ  ｅｔ  ａｌ．）（２００１）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：７１０７−７１１３；シャフィッツェルら（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９９）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１９−１３５；およびヘインズら（Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）（２０００）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８：１２８７−１２９２を参照）。
【０３１３】
様々なファージディスプレイ法を使用して抗体を同定する方法は当該技術分野において公知である。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に提示される。そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィド結合安定化Ｆｖ抗体断片などの抗体の抗原結合性ドメインを提示するために利用することができる。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、ｆｄおよびＭ１３などの糸状ファージである。抗原結合性ドメインは、ファージコートタンパク質ｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、またはｐＩＸのいずれかに対する組換え融合タンパク質として発現される。（例えば、シら（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１０）ＪＭＢ  ３９７：３８５−３９６を参照。）本明細書に記載の免疫グロブリン、またはその断片を作るために使用することができるファージディスプレイ法の例としては、ブリンクマンら（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９５）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０；エイムスら（Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９５）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６；ケトルボローら（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９４）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：９５２−９５８；ペルシッチら（Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９７）Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８；バートンら（Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９４）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０；ならびにＰＣＴ国際公開第９０／０２８０９号、国際公開第９１／１０７３７号、国際公開第９２／０１０４７号、国際公開第９２／１８６１９号、国際公開第９３／１１２３６号、国際公開第９５／１５９８２号、および国際公開第９５／２０４０１号に開示されるものが挙げられる。好適な方法はまた、例えば、米国特許第５，６９８，４２６号明細書、同第５，２２３，４０９号明細書、同第５，４０３，４８４号明細書、同第５，５８０，７１７号明細書、同第５，４２７，９０８号明細書、同第５，７５０，７５３号明細書、同第５，８２１，０４７号明細書、同第５，５７１，６９８号明細書、同第５，４２７，９０８号明細書、同第５，５１６，６３７号明細書、同第５，７８０，２２５号明細書、同第５，６５８，７２７号明細書、同第５，７３３，７４３号明細書、および同第５，９６９，１０８号明細書に記載されている。
【０３１４】
一部の実施形態では、ファージディスプレイ抗体ライブラリーは、免疫化された哺乳動物からのＢ細胞から収集されたｍＲＮＡを使用して生成することができる。例えば、Ｂ細胞を含む脾臓細胞試料を、上記のように腫瘍抗原またはＮＫｐ３０ポリペプチドを用いて免疫化されたマウスから単離することができる。標準的な分子生物学技術を使用してｍＲＮＡを細胞から単離し、ｃＤＮＡに変換することができる。（例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ４ｔｈ  Ｅｄ．，  コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク所在］；ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク所在］；ロー（Ｌｏ）（２００４）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  スプリンガー・サイエンス・アンド・ビジネス・メディア（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ）；ならびにボッレバエク（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照）。ファージディスプレイライブラリーを構築するために免疫グロブリンの重鎖および軽鎖ポリペプチドの可変領域をコードするｃＤＮＡが使用される。そのようなライブラリーを生成する方法は、例えば、メルツら（Ｍｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９５）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６２（１−２）：２１３−９；ディ・ニロら（Ｄｉ  Ｎｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．）（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３８８（Ｐｔ  ３）：８８９−８９４；およびイングバーグら（Ｅｎｇｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５１：３５５−３７６に記載されている。
【０３１５】
一部の実施形態では、例えば、ハイブリドーマ由来抗体の集団またはファージディスプレイ抗体ライブラリーから目的の抗体を同定するために選択およびスクリーニングの組合せを用いることができる。好適な方法は当該技術分野において公知であり、例えば、フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：６２−７０；ブリンクマンら（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９５）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２（１）：４１−５０．；エイムスら（Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９５）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４（２）：１７７−８６．；ケトルボローら（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９４）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４（４）：９５２−８；およびペルシッチら（Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９７）Ｇｅｎｅ  １８７（１）：９−１８に記載されている。例えば、バクテリオファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、またはｐＩＸ）および異なる抗原組合せ領域の融合タンパク質をそれぞれコードする複数のファージミドベクターが標準的な分子生物学技術を使用して製造され、次に細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））の集団に導入される。細菌中でのバクテリオファージの発現は、一部の実施形態では、ヘルパーファージの使用を必要とし得る。一部の実施形態では、ヘルパーファージは必要とされない（例えば、チャスティーンら（Ｃｈａｓｔｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３４（２１）：ｅ１４５を参照）。細菌から産生されるファージを回収し、次にそれを、例えば、（固定化された）固体支持体に結合した標的抗原に接触させる。ファージはまた、溶液中の抗原に接触させることができ、複合体をその後に固体支持体に結合させる。
【０３１６】
上記の方法を使用してスクリーニングされた抗体の亜集団は、当該技術分野において公知の任意の免疫学的または生化学ベースの方法を使用して具体的な抗原（例えば、ヒト腫瘍抗原またはＮＫ活性化受容体）に対する特異性および結合親和性について特徴付けることができる。例えば、抗体の腫瘍抗原またはＮＫ活性化受容体への特異的結合は、例えば、上記のようにＥＬＩＳＡアッセイ、ＳＰＲアッセイ、免疫沈降アッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、および平衡透析などであるがそれに限定されない免疫学的または生化学ベースの方法を使用して決定することができる。抗体の免疫特異的結合および交差反応性を解析するために使用することができるイムノアッセイとしては、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定化アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する競合および非競合アッセイ系が挙げられるがそれに限定されない。上記の方法はまた、腫瘍抗原またはＮＫ活性化受容体に対する抗体がヒト腫瘍抗原またはＮＫ活性化受容体タンパク質に結合しないかどうかを決定するために使用することができる。
【０３１７】
選択されたＣＤＲアミノ酸配列が短鎖配列（例えば、１０〜１５未満のアミノ酸の長さ）である実施形態では、ＣＤＲをコードする核酸は、例えば、シライシら（Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５１（１）：１２９−１３０および米国特許第６，９９５，２５９号明細書に記載されるように化学的に合成することができる。アクセプター抗体をコードする所与の核酸配列について、ＣＤＲをコードする核酸配列の領域は、標準的な分子生物学技術を使用して化学的に合成された核酸で置き換えることができる。化学的に合成された核酸の５’および３’末端は、ドナー抗体の可変領域をコードする核酸への核酸のクローニングにおいて使用するために付着末端制限酵素部位を含むように合成することができる。代替的に、一緒になって抗体をコードすることができる化学的に合成された核酸の断片は、当該技術分野において公知のＤＮＡアセンブリー技術（例えば、ギブソンアセンブリー）を使用して接合させることができる。
【０３１８】
選ばれた任意の抗体は、本明細書に記載されるような抗原結合性断片を生成するためにさらに改変し、および／または本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物を生成するために当該技術分野において公知の技術を使用してマニピュレートすることができる。例えば、例えば米国特許第４，４３３，０５９号明細書に記載されるように、アミン反応性基およびスルフヒドリル反応性基を有するヘテロ二官能性試薬を使用して二重特異性構造を生成するために架橋方法を使用することができ；例えば、米国特許第４，４４４，８７８号明細書に記載されるように、２つの重鎖の間のジスルフィド結合の還元および酸化のサイクルを通じて異なる抗体から半抗体（重鎖−軽鎖ペアまたはＦａｂ）を再結合することにより二重特異性抗体決定因子を生成することができ；例えば、米国特許第５，２７３，７４３号明細書に記載されるように、スルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｄｒｙｌ）反応性基を通じて三機能性抗体、例えば、３つのＦａｂ’断片を架橋することができる。多重特異性構築物を生成する方法としては、例えば、共通の軽鎖を有する多重特異性構築物を生成する方法が挙げられる。
【０３１９】
多重特異性抗原結合性構築物の発現および精製
本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物は、分子生物学およびタンパク質化学の技術分野において公知の様々な技術を使用して製造することができる。例えば、多重特異性抗原結合性構築物をコードする核酸（単一の多機能性ポリペプチドとして、またはマルチマー複合体の別々の分子として、例えば、他の抗原結合単位から別々に１つの抗原結合単位として）は、転写および翻訳調節配列を含有する発現ベクターに挿入することができ、該配列としては、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、転写ターミネーターシグナル、ポリアデニル化シグナル、ならびにエンハンサーまたは活性化因子配列が挙げられる。調節配列としては、プロモーターならびに転写開始および終止配列が挙げられる。追加的に、発現ベクターは、２つの異なる生物中、例えば、発現のために哺乳動物または昆虫細胞中ならびにクローニングおよび増幅のために原核性宿主中で維持することができるように、１つより多くの複製システムを含むことができる。
【０３２０】
哺乳動物細胞中での核酸からのクローニングされた重鎖および軽鎖ポリペプチドの発現のために幾つかの可能なベクターシステムが利用可能である。ベクターの１つのクラスは、所望の遺伝子配列の宿主細胞ゲノムへの組込みに依拠する。安定的に組み込まれたＤＮＡを有する細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｐｔ（ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）およびバーグ（Ｂｅｒｇ）（１９８１）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：２０７２）またはＴｎ５  ｎｅｏ（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）およびバーグ（Ｂｅｒｇ）（１９８２）Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １：３２７）などの薬物抵抗性遺伝子を同時に導入することにより選択することができる。選択マーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ遺伝子配列に連結させるか、または共トランスフェクションにより同じ細胞に導入するかのいずれかとすることができる（ウィグラーら（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（１９７９）Ｃｅｌｌ  １６：７７）。ベクターの第２のクラスは、染色体外プラスミドに自律複製能力を付与するＤＮＡエレメントを利用する。これらのベクターは、ウシパピローマウイルス（サーバーら（Ｓａｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８２）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７９：７１４７）、サイトメガロウイルス、ポリオーマウイルス（ディーンズら（Ｄｅａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８４）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：１２９２）、またはＳＶ４０ウイルス（ルスキー（Ｌｕｓｋｙ）およびボッチャン（Ｂｏｔｃｈａｎ）（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９３：７９）などの動物ウイルスに由来することができる。
【０３２１】
発現ベクターは、核酸のその後の発現のために好適な方式で細胞に導入することができる。導入の方法は、概ね、以下に議論される標的化される細胞種により定められる。例示的な方法としては、ＣａＰＯ４沈殿、リポソーム融合、陽イオン性リポソーム、エレクトロポレーション、ウイルス感染、デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、および直接微量注射が挙げられる。
【０３２２】
抗体またはその抗原結合性断片の発現用の適切な宿主細胞としては、酵母、細菌、昆虫、植物、および哺乳動物細胞が挙げられる。具体的に関心が持たれるものとしては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの真菌、ＳＦ９などの昆虫細胞、哺乳動物細胞株（例えば、ヒト細胞株）の他に、初代細胞株である。
【０３２３】
一部の実施形態では、抗体またはその断片は、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック哺乳動物）中で発現させ、そこから精製することができる。例えば、抗体は、例えば、ホーデビン（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ）（２００２）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １３（６）：６２５−６２９；ファン・クイク−ロメイジュンら（ｖａｎ  Ｋｕｉｋ−Ｒｏｍｅｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２０００）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  ９（２）：１５５−１５９；およびポロックら（Ｐｏｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９９）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１（１−２）：１４７−１５７に記載されるように、トランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、齧歯動物）中で産生され、ミルクから単離することができる。
【０３２４】
抗体およびその断片は、タンパク質の発現を可能とするために十分な条件下、および期間、抗体または断片をコードする核酸を含有する発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養することにより細胞から産生させることができる。タンパク質発現のためのそのような条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択と共に変動し、慣例的な実験を通じて当業者により容易に確認される。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現された抗体は、封入体から再フォールディングさせることができる（例えば、ホウら（Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １０：３１９−３０を参照）。細菌発現システムおよびその使用方法は当該技術分野において公知である（オーズベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ウィリー・アンド・サンズ（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）；ならびにグリーン（Ｇｒｅｅｎ）およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ４ｔｈ  Ｅｄ．，  コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク所在］（２００１）を参照）。コドン、好適な発現ベクターおよび好適な宿主細胞の選択は多数の要因に依存して変動し、必要に応じて容易に最適化することができる。本明細書に記載の抗体（またはその断片）は、哺乳動物細胞中または酵母、バキュロウイルス、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現システムが挙げられるがそれに限定されない他の発現システム中で発現させることができる（例えば、カスズブスカら（Ｋａｓｚｕｂｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．）（２０００）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  １８：２１３−２２０を参照）。
【０３２５】
発現後に、抗体およびその断片を単離することができる。抗体またはその断片は、どんな他の成分が試料中に存在するのかに依存して当該技術分野において公知の様々なやり方において単離または精製することができる。標準的な精製方法としては、電気泳動、分子、免疫学的、およびクロマトグラフィー技術が挙げられ、クロマトグラフィー技術としては、イオン交換、疎水性、アフィニティー、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーが挙げられる。例えば、抗体は、標準的な抗抗体カラム（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラム）を使用して精製することができる。タンパク質濃縮と組み合わせて限外濾過およびダイアフィルトレーション技術もまた有用である。例えば、スコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）［米国ニューヨーク州ニューヨーク市（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ）所在］を参照。必要な精製の程度は所望の使用に依存して変動する。一部の事例では、発現された抗体またはその断片の精製は必要でない。
【０３２６】
精製された抗体またはその断片の収率または純度を決定する方法は当該技術分野において公知であり、例えば、ブラッドフォードアッセイ、ＵＶ分光法、ビウレットタンパク質アッセイ、ローリータンパク質アッセイ、アミドブラックタンパク質アッセイ、高圧力液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、およびゲル電気泳動方法（例えば、クマシーブルーまたはコロイド銀染色剤などのタンパク質染色剤を使用する）が挙げられる。
【０３２７】
多重特異性抗原結合性構築物の修飾
多重特異性抗原結合性構築物は、単一の多機能性ポリペプチドとしてまたはマルチマー複合体の別々の分子として、例えば、他の抗原結合単位から別々に１つの抗原結合単位として、修飾することができる。修飾は、共有結合または非共有結合修飾であることができる。そのような修飾は、例えば、ポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることにより抗体または抗原結合性断片に導入することができる。修飾のために好適な部位は、例えば、抗体または断片の構造解析またはアミノ酸配列解析を含む様々な基準のいずれかを使用して選ぶことができる。
【０３２８】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、異種部分にコンジュゲート化させることができる。異種部分は、例えば、異種ポリペプチド、治療剤（例えば、毒素もしくは薬物）、または検出可能な標識であることができ、検出可能な標識は、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、重金属標識、発光標識、またはビオチンもしくはストレプトアビジンなどのアフィニティータグなどであるがそれに限定されない。好適な異種ポリペプチドとしては、例えば、抗体または断片の精製において使用するための抗原性タグ（例えば、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号３）、ポリヒスチジン（６−Ｈｉｓ；ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号４）、ヘマグルチニン（ＨＡ；ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号５）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））が挙げられる。異種ポリペプチドとしてはまた、診断用のまたは検出可能なマーカーとして有用なポリペプチド（例えば、酵素）、例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が挙げられる。好適な放射性標識としては、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および３Ｈが挙げられる。好適な蛍光標識としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）  ４８８、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ−ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）  ７００、Ｃｙ５、アロフィコシアニン、およびＣｙ７が挙げられるがそれに限定されない。発光標識としては、例えば、様々な発光性ランタニド（例えば、ユウロピウムまたはテルビウム）キレートのいずれかが挙げられる。例えば、好適なユウロピウムキレートとしては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはテトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）のユウロピウムキレートが挙げられる。酵素標識としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられる。
【０３２９】
２つのタンパク質（例えば、抗体および異種部分）は、多数の公知の化学架橋剤のいずれかを使用して架橋することができる。そのような架橋剤の例は、「ヒンダード」（ｈｉｎｄｅｒｅｄ）ジスルフィド結合を含む連結を介して２つのアミノ酸残基を連結するものである。これらの連結において、架橋単位内のジスルフィド結合は、例えば、還元されたグルタチオンまたは酵素ジスルフィドレダクターゼの作用により、還元から保護される（ジスルフィド結合のいずれかの側の基を邪魔することによる）。１つの好適な試薬、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）は、タンパク質の１つにおける末端リシンおよび他方における末端システインを利用して２つのタンパク質間にそのような連結を形成する。各タンパク質上の異なるカップリング部分により架橋するヘテロ二官能性試薬もまた使用することができる。他の有用なクロスリンカーとしては、２つのアミノ基（例えば、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド）、２つのスルフヒドリル基（例えば、１，４−ビス−マレイミドブタン）、アミノ基およびスルフヒドリル基（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、アミノ基およびカルボキシル基（例えば、４−［ｐ−アジドサリチルアミド］ブチルアミン）、ならびにアミノ基およびアルギニンの側鎖中に存在するグアニジニウム基（例えば、ｐ−アジドフェニルグリオキサール一水和物）を連結する試薬が挙げられるがそれに限定されない。
【０３３０】
一部の実施形態では、放射性標識は、抗体のアミノ酸骨格に直接的にコンジュゲート化させることができる。代替的に、放射性標識は、タンパク質骨格に結合しているより大きい分子（例えば、関係のあるタンパク質のメタ−ヨードフェニル（ｍＩＰ）誘導体を形成するために遊離アミノ基に結合するメタ−［１２５Ｉ］ヨードフェニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（［１２５Ｉ］ｍＩＰＮＨＳ中の１２５Ｉ（例えば、ロジャーズら（Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９７）Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ３８：１２２１−１２２９を参照）またはキレート（例えば、ＤＯＴＡもしくはＤＴＰＡ）の部分として含めることができる。放射性標識またはそれを含有するより大きい分子／キレートを本明細書に記載の抗体または抗原結合性断片にコンジュゲート化する方法は当該技術分野において公知である。そのような方法は、放射性標識またはキレートのタンパク質への結合を促す条件（例えば、ｐＨ、塩濃度、および／または温度）下でタンパク質を放射性標識とインキュベートすることを伴う（例えば、米国特許第６，００１，３２９号明細書を参照）。
【０３３１】
蛍光標識（フルオロフォアと称されることがある）をタンパク質（例えば、抗体）にコンジュゲート化する方法はタンパク質化学の技術分野において公知である。例えば、フルオロフォアは、フルオロフォアに取り付けられたスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルまたはテトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル部分を使用してタンパク質の（例えば、リシンの）遊離アミノ基または（例えば、システインの）スルフヒドリル基にコンジュゲート化することができる。一部の実施形態では、フルオロフォアは、スルホ−ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能性クロスリンカー部分にコンジュゲート化することができる。好適なコンジュゲーション方法は、フルオロフォアのタンパク質への結合を促す条件下で抗体タンパク質またはその断片をフルオロフォアとインキュベートすることを伴う。例えば、ウェルチ（Ｗｅｌｃｈ）およびレドバンリー（Ｒｅｄｖａｎｌｙ）（２００３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）を参照。
【０３３２】
一部の実施形態では、抗体または断片は、例えば、循環中、例えば、血液、血清、または他の組織中の抗体の安定化および／または保持を向上させる部分を用いて修飾することができる。例えば、抗体または断片は、例えば、リーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  １０（６）：９７３−８；キンストラーら（Ｋｉｎｓｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｉｅｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：４７７−４８５；およびロバーツら（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｉｅｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：４５９−４７６に記載されるようにＰＥＧ化、またはＨＥＳ化（フレゼニウス・カビ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ）、ドイツ）（例えば、パヴィシッチら（Ｐａｖｉｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１０）Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ３８７（１−２）：１１０−１１９を参照）することができる。安定化部分は、少なくとも、例えば、１．５（または少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、または５０またはより大きい）倍数だけ抗体（または断片）の安定性、または保持を向上させることができる。
【０３３３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合性断片は、グリコシル化されることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合性断片は、抗体または断片が低減されたグリコシル化を有するまたはグリコシル化を有しないように、酵素もしくは化学処理に供し、または細胞から製造することができる。低減されたグリコシル化を有する抗体を製造する方法は当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第６，９３３，３６８号明細書；ライトら（Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０（１０）：２７１７−２７２３；およびコら（Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９３）Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３０：１３６１に記載されている。
【０３３４】
医薬組成物および製剤
本開示の多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合性部分もしくは断片および薬学的に許容される担体を含む組成物もまた提供される。組成物は、本明細書に開示される方法と共に使用される希釈剤、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、および／またはアジュバントをさらに含むことができる。そのような組成物は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物から利益を得るであろう、がんまたは自己免疫障害などの他の状態を有する対象において使用することができる。
【０３３５】
ある特定の実施形態では、許容される製剤材料は、好ましくは、用いられる投与量および濃度においてレシピエントに対して非毒性である。ある特定の実施形態では、製剤材料はｓ．ｃ．および／またはＩ．Ｖ．投与用である。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、組成物の例えば、ｐＨ、重量オスモル濃度、粘度、透明性、色、等張性、匂い、無菌状態、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または透過を改変、維持または保存するための製剤材料を含有することができる。ある特定の実施形態では、好適な製剤材料としては、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン）；抗菌物質；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムもしくは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えば、ボレート、ビカルボネート、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、シトレート、ホスフェートもしくは他の有機酸）；充填剤（例えば、マンニトールもしくはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンもしくはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）；充填剤；単糖、二糖、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースもしくはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン）；着色、香味および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸もしくは過酸化水素）；溶剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールもしくはソルビトール）；懸濁化剤；界面活性剤もしくは湿潤剤（例えば、プルロニック（登録商標）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、ｔｒｉｔｏｎ、トロメタミン、レシチン、コレステロール、ｔｙｌｏｘａｐａｌ）；安定性増進剤（例えば、スクロースもしくはソルビトール）；張度増進剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは、塩化ナトリウムもしくはカリウム、マンニトール、ソルビトール）；送達溶媒；希釈剤；賦形剤ならびに／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれに限定されない。（アレン（Ａｌｌｅｎ）（２０１２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  −Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２２ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ロイド、ブイ、アレン（Ｌｌｏｙｄ  Ｖ、Ａｌｌｅｎ）編，  ザ・ファーマシューティカル・プレス（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ））。ある特定の実施形態では、製剤は、ＰＢＳ；２０ｍＭのＮａＯＡＣ、ｐＨ５．２、５０ｍＭのＮａＣｌ；および／または１０ｍＭのＮａＯＡＣ、ｐＨ５．２、９％のスクロースを含む。ある特定の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達フォーマットおよび所望の投与量に依存して当業者により決定される。例え���、アレン（Ａｌｌｅｎ）（２０１２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  −  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２２ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ロイド、ブイ、アレン（Ｌｌｏｙｄ  Ｖ、Ａｌｌｅｎ）編，  ザ・ファーマシューティカル・プレス（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ）を参照。ある特定の実施形態では、そのような組成物は、多重特異性抗原結合性構築物の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出の速度および／またはｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスの速度に影響を及ぼすことができる。
【０３３６】
ある特定の実施形態では、医薬組成物中の主要な溶媒または担体は、水性または非水性のいずれかの性質であることができる。例えば、ある特定の実施形態では、好適な溶媒または担体は、場合により非経口投与用の組成物において一般的な他の材料を添加した、注射用の水、生理食塩水溶液または人工脳脊髄液であることができる。ある特定の実施形態では、生理食塩水は等張リン酸緩衝生理食塩水を含む。ある特定の実施形態では、血清アルブミンと混合された中性の緩衝生理食塩水または生理食塩水はさらなる例示的な溶媒である。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、これらはソルビトールまたはしたがって（ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ）好適な代替物をさらに含むことができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物を含む組成物は、凍結乾燥ケーキまたは水性溶液の形態において所望の純度を有する選択された組成物を任意選択の製剤物質と混合することにより貯蔵用に調製することができる（アレン（Ａｌｌｅｎ）（２０１２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  −  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２２ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ロイド、ブイ、アレン（Ｌｌｏｙｄ  Ｖ、Ａｌｌｅｎ）編，  ザ・ファーマシューティカル・プレス（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ））。さらに、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物を含む組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化することができる。
【０３３７】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達用に選択することができる。ある特定の実施形態では、組成物は、吸入用または経口的などの消化管を通じた送達用に選択することができる。そのような薬学的に許容される組成物の調製は当業者の能力の範囲内である。
【０３３８】
ある特定の実施形態では、製剤成分は、投与の部位にとって許容される濃度において存在する。ある特定の実施形態では、生理的ｐＨまたはわずかにより低いｐＨ、典型的には、約５〜約８のｐＨ範囲内に組成物を維持するために緩衝剤が使用される。
【０３３９】
非経口投与が想定される場合のある特定の実施形態では、治療用組成物は、薬学的に許容される溶媒中に多重特異性抗原結合性構築物を含む、発熱物質非含有の非経口的に許容される水性溶液の形態であることができる。ある特定の実施形態では、非経口注射用の溶媒は、多重特異性抗原結合性構築物がその中に無菌の等張溶液として製剤化され、適切に保存される無菌の蒸留水である。ある特定の実施形態では、調製物は、次にデポー注射を介して送達することができる製造物の制御または持続放出を提供することができる、注射可能なマイクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームなどの剤を含む所望の分子の製剤を伴うことができる。ある特定の実施形態では、ヒアルロン酸もまた使用することができ、これは、循環中の持続期間を促進する効果を有することができる。ある特定の実施形態では、所望の分子を導入するために、埋込み可能な薬物送達デバイスを使用することができる。
【０３４０】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は吸入用に製剤化することができる。ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、吸入用の乾燥粉末として製剤化することができる。ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物を含む吸入溶液は、エアロゾル送達用の噴射剤を用いて製剤化することができる。ある特定の実施形態では、溶液を噴霧することができる。肺投与は、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達を記載するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号にさらに記載されている。
【０３４１】
ある特定の実施形態では、製剤は経口的に投与できることが想定される。ある特定の実施形態では、この様式において投与される多重特異性抗原結合性構築物は、錠剤およびカプセルなどの固体投与形態の配合において慣習的に使用される担体を用いてまたは用いずに製剤化することができる。ある特定の実施形態では、バイオアベイラビリティが最大化され、前全身性分解が最小化される胃腸管中の点において製剤の活性部分を放出するようにカプセルを設計することができる。ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物の吸収を促すために少なくとも１つの追加の剤を含めることができる。ある特定の実施形態では、希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた用いることができる。
【０３４２】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、錠剤の生産のために好適な非毒性の賦形剤との混合状態の有効量の多重特異性抗原結合性構築物を伴うことができる。ある特定の実施形態では、無菌水または他の適切な溶媒中に錠剤を溶解することにより、溶液を単位用量形態において調製することができる。ある特定の実施形態では、好適な賦形剤としては、炭酸カルシウム、炭酸もしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、もしくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；またはデンプン、ゼラチン、もしくはアカシアなどの結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルクなどの潤滑剤が挙げられるがそれに限定されない。
【０３４３】
追加の医薬組成物が当業者により選択されることができ、これには、持続または制御送達製剤中の多重特異性抗原結合性構築物を伴う製剤が含まれる。ある特定の実施形態では、リポソーム担体、生体内分解性マイクロ粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射などの、様々な他の持続または制御送達手段を製剤化するための技術もまた当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達用の多孔性ポリマーマイクロ粒子の制御放出を記載するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照。ある特定の実施形態では、持続放出調製物は、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスを含むことができる。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書および欧州特許出願公開第０５８，４８１号明細書）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（シドマンら（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９３）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（ランガーら（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８１）Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  １５：１６７−２７７；およびランガー（Ｌａｎｇｅｒ）（１９８２）Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．  １２：９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（ランガーら（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．））またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号明細書）を含むことができる。ある特定の実施形態では、持続放出組成物はまた、当該技術分野において公知の幾つかの方法のいずれかにより調製できるリポソームを含むことができる（例えば、エプスタインら（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８５）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２；欧州特許第０３６，６７６号明細書；欧州特許第０８８，０４６号明細書；および欧州特許第１４３，９４９号明細書を参照）。
【０３４４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用される医薬組成物は典型的には無菌である。ある特定の実施形態では、滅菌は、無菌濾過膜を通じた濾過により達成される。ある特定の実施形態では、組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかにおいて実行することができる。ある特定の実施形態では、非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態でまたは溶液中に貯蔵することができる。ある特定の実施形態では、非経口組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
【０３４５】
ある特定の実施形態では、医薬組成物が製剤化されたら、それを溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体としてまたは脱水もしくは凍結乾燥粉末として無菌バイアル中に貯蔵することができる。ある特定の実施形態では、そのような製剤は、使用準備済みの形態または投与前に再構成される（例えば、凍結乾燥された）形態のいずれかにおいて貯蔵することができる。
【０３４６】
ある特定の実施形態では、単回用量投与単位を製造するためのキットが提供される。ある特定の実施形態では、キットは、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性製剤を有する第２の容器の両方を含有することができる。ある特定の実施形態では、シングルおよびマルチチャンバー事前充填シリンジを含有するキットが含まれる。
【０３４７】
ある特定の実施形態では、治療的に用いられる多重特異性抗原結合性構築物を含む医薬組成物の有効量は、例えば、治療的な文脈および目的に依存する。ある特定の実施形態による治療用の適切な投与量レベルは、部分的には、送達される分子、多重特異性抗原結合性構築物が使用されている適応症、投与の経路、ならびに患者のサイズ（体重、身体表面もしくは臓器サイズ）および／または状態（年齢および全般的健康）に依存して変動することを当業者は理解する。臨床医は、最適な治療効果を得るために投与量を滴定し、投与の経路を改変することができる。
【０３４８】
臨床医はまた、使用される製剤中の多重特異性抗原結合性構築物の薬物動態パラメーターを考慮に入れて、投薬の頻度を選択する。ある特定の実施形態では、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に達するまで組成物を投与する。ある特定の実施形態では、組成物は、したがって、単回用量としてもしくは経時的な２つもしくはより多くの用量（同じ量の所望の分子を含有してもよく、もしくはそうでなくてもよい）として、または、例えば埋込みデバイスもしくはカテーテルを介して、連続注入として、投与することができる。適切な投与量のさらなる精密化は当業者により慣例的に為され、当業者により慣例的に行われるタスクの範囲内である。ある特定の実施形態では、適切な投与量は、適切な用量応答データの使用を通じて確認することができる。
【０３４９】
ある特定の実施形態では、医薬組成物の投与の経路は、公知の方法、例えば、経口的なもの、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳内、脳室内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、門脈内、もしくは病巣内経路による注射を通じたもの、持続放出システムによるものまたは埋込みデバイスによるものに従って為される。ある特定の実施形態では、組成物は、ボーラス注射によりまたは注入により連続的に、または埋込みデバイスにより投与することができる。ある特定の実施形態では、併用療法の個々の要素は、異なる経路により投与することができる。
【０３５０】
ある特定の実施形態では、組成物は、例えば、手術の間にまたは外用で、局所的に投与することができる。任意選択で、局所投与は、所望の分子が吸収または被包された膜、スポンジ、または別の適切な材料の埋込みを介して為される。ある特定の実施形態では、埋込みデバイスが使用される場合、デバイスは、任意の好適な組織または臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、徐放性ボーラス、または連続的な投与を介して為され得る。
【０３５１】
ある特定の実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏの方式において多重特異性抗原結合性構築物を含む医薬組成物を使用することが望ましいことがある。そのような事例では、患者から除去された細胞、組織（例えば、血液を含む）および／または臓器は、多重特異性抗原結合性構築物を含む医薬組成物に曝露され、その後に細胞、組織および／または臓器は再び患者に埋め込まれる。
【０３５２】
ある特定の実施形態では、抗原結合性構築物は、ポリペプチドを発現および分泌するように本明細書に記載の方法などの方法を使用して遺伝子操作されたある特定の細胞を埋め込むことにより送達することができる。ある特定の実施形態では、そのような細胞は動物またはヒト細胞であることができ、自己、異種由来の、または異種間のものであることができる。ある特定の実施形態では、細胞を不死化させることができる。ある特定の実施形態では、免疫学的応答の可能性を減少させるために、細胞を被包して周囲組織の浸潤を回避することができる。ある特定の実施形態では、被包材料は、典型的には、タンパク質生成物の放出を可能とするが、患者の免疫系によるまたは周囲組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する生体適合性の半透性ポリマーエンクロージャまたは膜である。
【０３５３】
多重特異性抗原結合性構築物の使用方法
本明細書に記載されるように、本開示は、それを必要とする対象において増殖性障害を治療する方法であって、対象に治療有効量の本開示の多重特異性抗原結合性構築物（例えば、二重特異性抗原結合性構築物）を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象において免疫応答を増進する（例えば、増進したＮＫおよび／またはＴ細胞機能；増進したＮＫおよび／またはＴ細胞媒介性応答；Ｔ細胞からの増加したサイトカイン、例えば、ＩＦＮγの分泌および／または産生；細胞溶解活性を含む、増進したＮＫ細胞および／またはＴ細胞機能；増進したマクロファージ機能；増進したＡＤＣＣ機能）方法であって、対象に治療有効量の本開示の多重特異性抗原結合性構築物または構築物を含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。本明細書において例示されるように、免疫応答の増進は、単一の標的を有する剤と比較して多重特異性抗原結合性構築物の投与でより大きい。一部の実施形態では、免疫応答の増進は、腫瘍もしくはＢ細胞抗原単独またはＮＫｐ３０もしくは他のＮＫ活性化受容体単独に結合する剤と比較して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはより大きく高い。これらの効果は、腫瘍抗原発現のレベルにかかわらず（すなわち、腫瘍抗原の高いレベルを有する標的細胞中の他に、腫瘍抗原の低いレベルを有する標的細胞中で）起こる。
【０３５４】
本明細書に記載の組成物は、とりわけ、対象において様々ながんまたは状態を治療し、その進行を遅延させ、または予防する方法において有用である。がんまたは状態はＣＤ１６欠損性微環境を含むことができる。任意選択で、ＣＤ１６微環境は、対象に対する造血幹細胞移植と関連付けられる。ＣＤ１６欠損性微環境は、対照ＮＫ細胞（例えば、休止ＮＫ細胞、対象からの健常ＮＫ細胞、健常個体からのＮＫ細胞）と比較して５０％未満のＣＤ１６の発現を有する浸潤性ＮＫ細胞の集団を含むことができる。任意選択で、浸潤性ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較して４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満のＣＤ１６の発現を有する。一部の対象中の浸潤性ＮＫ細胞はＣＤ１６を発現しない。他の実施形態では、ＣＤ１６欠損性微環境は、浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも１０％が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する浸潤性ＮＫ細胞の集団を含む。任意選択で、ＣＤ１６欠損性微環境は、浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する浸潤性ＮＫ細胞の集団を含む。他の実施形態では、ＮＫ細胞は１５０，０００未満のＣＤ１６コピー数を有する。任意選択で、ＮＫ細胞は、１４０，０００未満、１３０，０００未満、１２０，０００未満、１１０，０００未満、１００，０００未満、７５，０００未満、５０，０００未満、または２５，０００未満のＣＤ１６コピー数を有する。
【０３５５】
本明細書に記載の方法および使用を使用して治療されるがんまたは増殖性障害もしくは腫瘍としては、血液がん、リンパ腫、骨髄腫、白血病、神経学的がん、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、胃腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、腎臓がん、および血管がんが挙げられるがそれに限定されない。任意選択で、がんは、カポジ肉腫、白血病、急性リンパ性白血病（ｅｔｖ６、ａｍｌ１、シクロフィリンｂ）、急性骨髄球性白血病、骨髄芽球性前骨髄球性骨髄単球性単球性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病（シクロフィリンｂ）、マントル細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇ−イディオタイプ）、真性多血症リンパ、ホジキン病（Ｉｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、非ホジキン病、骨髄腫（ＭＵＣファミリー、ｐ２１ｒａｓ）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸肉腫、結腸癌（ｐ２１ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＭＵＣファミリー）、膵臓がん、乳がん（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、卵巣がん、前立腺がん（前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびその抗原エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、およびＰＳＡ−３、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク質）、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、ヘパトーマ、肝細胞がん（α−フェトプロテイン）、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣腫瘍（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫（Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ）、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫（ｐ５タンパク質、ｇｐ７５、がん胎児性抗原、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ｃｄｃ２７、ＭＡＧＥ−３、ｐ２１ｒａｓ、ｇｐ１００）、神経芽腫、網膜芽腫、鼻咽頭癌（Ｉｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、食道癌、基底細胞癌、胆道がん（ｐ２１ｒａｓ）、膀胱がん（ｐ２１ｒａｓ）、骨がん、脳および中枢神経系（ＣＮＳ）がん、子宮頸癌（ｐ５３、ｐ２１ｒａｓ）、絨毛癌（ＣＥＡ）、結腸直腸がん（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−ＣＯ１７−１Ａ／ＧＡ７３３、ＡＰＣ）、結合組織がん、消化器系のがん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、胃がん（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク質）、上皮細胞がん（シクロフィリンｂ）、上皮内新生物、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん（小細胞、大細胞）（ＣＥＡ、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１）、口腔が���（例えば、口唇、舌、口、および咽頭がん）、卵巣がん（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、膵臓がん、直腸がん、呼吸器系のがん、皮膚がん、甲状腺がん、および泌尿器系のがんからなる群から選択される。
【０３５６】
組成物は、部分的には投与の経路に依存する様々な方法を使用して対象、例えば、ヒト対象に投与することができる。経路は、例えば、静脈注射もしくは注入（ＩＶ）、皮下注射（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）注射、筋肉内注射（ＩＭ）、皮内注射（ＩＤ）、経口、頭蓋内注射、または髄腔内注射（ＩＴ）であることができる。注射は、ボーラスまたは連続注入において行うことができる。
【０３５７】
本明細書に記載されるように、ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０の両方を標的化する多重特異性抗原結合性構築物は、骨髄中の形質細胞を特異的に枯渇させることができる。これは、そのような構築物は、Ｂ細胞などの標的細胞集団の枯渇が必要とされる障害、例えば、全体的または部分的に自己反応性Ｂ細胞または抗体により媒介される障害の治療のために有用であることを指し示す。よって、さらに別の態様では、本開示は、対象から標的細胞（例えば、腫瘍細胞またはＢ系列細胞）を枯渇させる方法であって、それを必要とする対象に標的抗原を発現する１つまたは複数の標的細胞を枯渇させるために十分な量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を投与することを含み、多重特異性結合構築物が少なくとも２つの連結した抗原結合単位を含み、第１の抗原結合単位が、標的抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位が、ＮＫｐ３０抗原に特異的に結合する、方法を特徴とする。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は第３の抗原結合単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は第３の抗原結合単位および第４の抗原結合単位を含む。一部の実施形態では、標的抗原は、本明細書に記載のまたは当該技術分野において公知の任意の腫瘍抗原などの腫瘍抗原である。一部の実施形態では、標的細胞は、自己反応性Ｂ細胞などのＢ細胞であり、そのような場合、標的抗原は、Ｂ細胞特異的、Ｂ細胞拘束、またはＢ細胞濃縮抗原、例えば、ＣＤ２０またはＢＣＭＡである。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は自己免疫状態に罹患している。一部の実施形態では、自己免疫状態は、全体的または部分的に自己反応性Ｂ細胞により媒介される。一部の実施形態では、標的細胞が枯渇されている対象は赤芽球癆を有するまたはそのリスクがある。赤芽球癆は、例えば、同種幹細胞移植後のＡＢＯ血液群不適合に起因することができる。一部のそのような実施形態では、対象は血液群Ｏを有し、同種幹細胞移植は血液群Ａのドナーからのものであった。標的細胞を枯渇されている対象が赤芽球癆を有するまたはそのリスクがあるそれらの実施形態では、標的細胞は、例えば、標的血漿Ｂ細胞である。よって、一部の実施形態では、標的抗原は、例えば、血漿Ｂ細胞上に見出されるが他のＢ細胞上には見出されない抗原である。
【０３５８】
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、本明細書において提供される多重特異性構築物を用いて治療されている対象は、例えば、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、重症筋無力症、ＳＬＥ、ＡＮＣＡ関連血管炎、炎症性ミオパチー、びまん性強皮症、自己免疫性髄膜脳炎、関節リウマチ、クリオグロブリン血症、および原発性ＡＰＳなどにおける、治療的血漿交換が一次標準治療またはファーストライン補助療法（ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ  ａｄｊｕｎｃｔ）である疾患または障害を有する。ザ・アメリカン・ソサイエティ・フォー・アフェレーシス（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ）（ＡＳＦＡ）ガイドライン２０１６年版は、プラスマフェレーシスという用語を「血液の他の成分から血漿を分離する医療用デバイスに患者またはドナーの血液を通過させ、コロイド置換液を使用することなく血漿を除去する（すなわち、総血漿体積の１５％未満）手順」と定義し、ＴＰＥ（治療的血漿交換）を「血液の他の成分から血漿を分離する医療用デバイスに患者の血液を通過させる治療的手順。血漿は除去され、コロイド溶液（例えば、アルブミンおよび／もしくは血漿）またはクリスタロイド／コロイド溶液の組合せなどの置換液で置き換えられる。」と定義している。そのため、本明細書において使用される場合、ＴＰＥは、病原性自己抗体、免疫複合体、クリオグロブリン、骨髄腫軽鎖（ｍｙｅｌｏｍａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ）、エンドトキシン、およびコレステロールを含有するリポタンパク質などの高分子量物質（＞１５，０００Ｄａ）の除去のための体外血液精製技術である。よって、一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、例えば、「併発性全身性ループスエリテマトーデスおよび他の自己免疫疾患の管理としての治療的血漿交換（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｌａｓｍａ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｓ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）」、ディー・アギーレ−バレンシアら（Ｄ．  Ａｇｕｉｒｒｅ−Ｖａｌｅｎｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．），  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  （２０１９）  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ５３５０９６０（内容の全体を参照により本願明細書に援用する）の表１に列記される任意の自己免疫疾患などの、血漿からの成分を枯渇させるためにＴＰＥが使用される適応症において使用することができる。
【０３５９】
別の態様では、本開示は、全体的または部分的に自己反応性Ｂ細胞により媒介される炎症状態（例えば、自己免疫状態）を有する対象を治療する方法であって、対象に標的抗原を発現する１つまたは複数の自己反応性Ｂ細胞を枯渇させるために十分な量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を投与することを含む、方法を特徴とする。対象に有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を投与することにより自己反応性Ｂ細胞性炎症状態を有する対象を治療する方法もまた提供される。任意選択で、有効量の多重特異性抗原結合性構築物またはその医薬組成物は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡを発現する形質細胞の骨髄レベルを低減する。本明細書において使用される場合、自己反応性Ｂ細胞性炎症状態は、自己反応性Ｂ細胞により媒介される自己免疫疾患であり、例としては、自己反応性Ｂ細胞により媒介される自己免疫疾患が挙げられる。本明細書に記載の方法は、対象に抗炎症剤、例えば、炎症または自己免疫疾患もしくは状態を治療するために使用される抗炎症剤（コルチコステロイド、ＤＭＡＲＤｓ、もしくは抗サイトカイン剤）または他の剤を投与することを含むことができる。任意選択で、標的抗原は、Ｂ細胞特異的、Ｂ細胞拘束、またはＢ細胞濃縮抗原、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９、またはＢＣＭＡである。一部の実施形態では、全体的または部分的に自己反応性Ｂ細胞により媒介される自己免疫疾患は、全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、１型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、原発性胆汁胆管炎、グッドパスチャー病、原発性膜性腎症、卵巣不全、尋常性天疱瘡、および自己免疫性睾丸炎からなる群から選択されるものであることができる。他のそのような自己免疫疾患は当該技術分野において公知であり、例えば、ルートヴィヒら（Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１７）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：Ａｒｔｉｃｌｅ  ６０３およびホフマンら（Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１８）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：Ａｒｔｉｃｌｅ  ８３５に記載されている。本明細書に記載の構築物および方法を使用して治療することができる異常なＢ細胞を伴う他の適応症としては、軽鎖アミロイドーシス、尋常性天疱瘡、および免疫性血小板減少症が挙げられる。
【０３６０】
例えば、重症筋無力症は、腕および脚を含む骨格筋において虚弱を引き起こす慢性の自己免疫性神経筋疾患である。重症筋無力症において、抗体（免疫タンパク質）は、筋肉の収縮を防止する神経筋接合部におけるアセチルコリンの受容体を遮断、変更、または妨害する。この疾患の有病率は１００，０００人当たり約２０症例であり、重症筋無力症を有するほとんどの個体において、疾患は、アセチルコリン受容体自体に対する抗体により引き起こされる。しかしながら、ＭｕＳＫ（筋肉特異的キナーゼ）タンパク質などの他のタンパク質に対する抗体もまた、神経筋接合部における伝達の障害に繋がることがある。重症筋無力症を治療するために典型的に使用されるコルチコステロイドおよび免疫抑制剤は、多数の重大な副作用と関連付けられる。例えば、ソリリス（Ｓｏｌｉｒｉｓ）のみの使用は、ＡＣｈ受容体を標的とする病原性ＩｇＧによりリクルートされた補体の活性を遮断する。それは、病原性ＩｇＧによるＡｃｈ受容体の遮断にも、これらのＩｇＧによる受容体の架橋および内部移行にも対処しない。
【０３６１】
軽鎖アミロイドーシスまたはＡＬアミロイドーシスは、形質細胞の群が多過ぎる軽鎖を作り、それがミスフォールディングおよび凝集してアミロイド原線維を形成する障害である。原線維は次に臓器中に沈着する。影響される最も一般的な臓器は心臓および腎臓である。軽鎖アミロイドーシスはまた、胃、大腸、肝臓、神経および皮膚に影響することがある。軽鎖アミロイドーシスの有病率は１，０００，０００人当たり約４０症例である。最大８０％の患者が自己幹細胞移植（ＡＳＣＴ）に不適格であり、形質細胞指向性化学療法は、アミロイド沈着により引き起こされる臓器機能障害の対処に不十分であることが示されている。
【０３６２】
１００，０００人当たり約１〜１０患者の有病率を有する尋常性天疱瘡は、見かけ上は健常な皮膚および粘膜における上皮内の水疱および大規模なびらんにより特徴付けられる珍しい潜在的に致死性の自己免疫障害である。尋常性天疱瘡は、カルシウム依存性カドヘリンデスモグレイン１およびデスモグレイン３を標的とするＩｇＧ自己抗体により特徴付けられる。これらの膜貫通糖タンパク質は、上皮細胞間の細胞−細胞接着およびシグナル伝達に影響する。棘融解（結果的な上皮水疱形成を伴う細胞間接着の喪失）は、自己抗体結合によるデスモグレイン機能の直接的な阻害または細胞−細胞接着の下方調節を結果としてもたらす自己抗体誘導性細胞シグナル伝達のいずれかの結果としてもたらされる。自己抗体は、活動性疾患の間に血清および皮膚の両方に存在する。粘膜表面を含む、層状扁平上皮の任意の区画が影響され得る。コルチコステロイドおよび免疫抑制剤に応答しない患者は、ＩＶ  Ｉｇまたはリツキサンを用いて治療される。ＩＶ  Ｉｇおよびリツキサンを用いた場合でも、完全寛解には数か月要することがあり、一部の患者は応答しない。
【０３６３】
１００，０００人当たり約９．５症例の有病率を有する免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）は、自己抗体が正常な血小板に対して産生される場合に起こる。血小板は破壊され、身体から排除されて、影響された個体におけるこれらの細胞の不足が結果としてもたらされる。これらの抗体の一部はまた、血小板を産生する骨髄中の細胞（巨核球）に影響し、それが血小板産生の減少に繋がって、血液中の血小板の数をさらに低減する。ＩＴＰの治療は、典型的には、血小板の自己免疫破壊の低減、または特定の増殖因子を用いる血小板産生の直接的な刺激のいずれかに集中する。ＩＶ  Ｉｇおよびプラスマフェレーシスの使用は深刻な合併症に繋がることがあり、トロンボポエチン受容体アゴニストは血液血小板数の増加に繋がるが、血小板の基礎となる破壊に対処しない。
【０３６４】
よって、本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性構築物を用いて治療されている対象は、重症筋無力症、軽鎖アミロイドーシス、尋常性天疱瘡、および免疫性血小板減少症から選択される疾患を有する。
【０３６５】
一部の実施形態では、そのような多重特異性構築物は、コルチコステロイド、ＤＭＡＲＤｓ、または抗サイトカイン療法などの炎症性障害（例えば、自己免疫疾患）に対する他の療法と組み合わせることができる。
【０３６６】
そのため、自己反応性Ｂ細胞性炎症状態を有する対象を治療する方法であって、対象に有効量の少なくとも２つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第１の抗原結合単位が、Ｂ系列細胞により発現される第１の標的抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位が、ＮＫｐ３０抗原に特異的に結合する、多重特異性抗原結合性構築物または構築物を含む医薬組成物を投与することによるものである、方法が本明細書において提供される。自己反応性Ｂ細胞性炎症状態という用語は、部分的または全体的に自己反応性Ｂ細胞または形質細胞により駆動される状態を含む。より特には、自己反応性Ｂ細胞媒介性炎症状態としては、本明細書に記載されるような多数の自己免疫状態が挙げられる。
【０３６７】
有効量の多重特異性抗原結合性構築物または医薬組成物は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡを発現する形質細胞の骨髄レベルを低減する。方法は、任意選択で、対象に炎症性および自己免疫状態の治療において使用される抗炎症剤（例えば、コルチコステロイド、ＤＭＡＲＤｓ、もしくは抗サイトカイン剤）または他の剤を投与することをさらに含む。
【０３６８】
本明細書において使用される場合、対象という用語は哺乳動物対象を意味する。例示的な対象としては、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ラクダ、ヤギおよびヒツジが挙げられるがそれに限定されない。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は、本明細書において提供される多重特異性抗原結合性構築物を用いて治療することができる疾患または状態を有するまたは有することが疑われる。一部の実施形態では、疾患または状態はがんである。一部の実施形態では、対象は、本明細書において提供される多重特異性抗原結合性構築物を用いて治療することができるがんを有するヒトである。一部の実施形態では、対象は、本明細書において提供される多重特異性抗原結合性構築物を用いて治療することができるがんを有することが疑われるヒトである。
【０３６９】
任意の疾患または障害を治療することまたはその治療は、対象において存在する疾患または障害を寛解させることを指す。寛解という用語は、疾患状態、例えば、がんの治療における任意の治療的に有益な結果、重篤度もしくは進行の軽減、軽快もしくは軽快の継続期間の促進、またはその治癒を指す。そのため、治療することまたは治療としては、少なくとも１つの身体的パラメーターまたは症状を寛解させることが挙げられる。治療することまたは治療としては、身体的（例えば、認識可能な症状の安定化）または生理学的（例えば、身体的パラメーターの安定化）のいずれかまたは両方で、疾患または障害をモジュレートすることが挙げられる。治療することまたは治療としては、転移または進行を遅延させまたは予防することが挙げられる。
【０３７０】
本明細書において使用される場合、投与することまたは投与は、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内、皮下送達および／または本明細書に記載のもしくは当該技術分野において公知の任意の他の物理的送達方法などにより、身体の外側に存在する物質（例えば、本明細書において提供される多重特異性抗原結合性構築物）を患者の中に注射しまたは他に物理的に送達する行為を指す。疾患、またはその症状が治療されている場合、物質の投与は、典型的には、疾患またはその症状の開始後に行われる。疾患、またはその症状が予防されている場合、物質の投与は、典型的には、疾患またはその症状の開始前に行われる。
【０３７１】
投与は、例えば、外用投与、局所注入、注射、またはインプラントの手段により達成することができる。インプラントは、シラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜、または繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状材料のものであることができる。インプラントは、対象への組成物の持続的または定期的な放出のために構成することができる。例えば、米国特許出願公開第２００８０２４１２２３号明細書；米国特許第５，５０１，８５６号明細書；同第４，８６３，４５７号明細書；および同第３，７１０，７９５号明細書；ならびに欧州特許第４８８４０１号明細書および欧州特許第４３０５３９号明細書を参照。組成物は、例えば、拡散性、浸食性、または対流性システムに基づく埋込み可能なデバイス、例えば、浸透ポンプ、生分解性インプラント、電気拡散システム、電気浸透システム、蒸気圧ポンプ、電気分解ポンプ、起泡性ポンプ、圧電ポンプ、浸食ベースのシステム、または電気機械システムによって対象に送達することができる。一部の実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合性構築物は、局所投与によって対象に治療的に送達される。
【０３７２】
本明細書において使用される場合、増進したＴ細胞機能またはＴ細胞の活性化という用語は、表面上に抗原特異的Ｔ細胞受容体を発現する成熟Ｔ細胞がそのコグネイト抗原を認識して、細胞周期に入ること、サイトカインまたは溶菌酵素を分泌すること、および細胞ベースのエフェクター機能を行うことを開始させるまたはそのためにコンピテントとなることにより応答する細胞プロセスを指す。Ｔ細胞活性化は、典型的には、完全に活性化されるために少なくとも２つのシグナルを必要とする。１つ目は抗原−主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によるＴ細胞抗原特異的受容体（ＴＣＲ）のエンゲージメント後に起こり、２つ目は共刺激分子（例えば、ＣＤ２８）のその後のエンゲージメントにより起こる。これらのシグナルは核に伝達され、Ｔ細胞のクローン性拡大増殖、細胞表面上の活性化マーカーの上方調節、エフェクター細胞への分化、細胞傷害性もしくはサイトカイン分泌の誘導、アポトーシスの誘導、またはその組合せを結果としてもたらす。一部の実施形態では、増進したＴ細胞機能はまた、Ｔ細胞の増進した生存および／または増進した増殖を包含する。そのような活性を測定する方法は当該技術分野において慣例的で公知であり、例示的な方法は実施例などにおいて本明細書に記載されている。
【０３７３】
本明細書において使用される場合、Ｔ細胞媒介性応答という用語は、Ｔ細胞により媒介される任意の応答を指し、Ｔ細胞としては、エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞、エフェクターγδ  Ｔ細胞）ならびにヘルパーＴ細胞（例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、およびＴＦＨ細胞などのそのサブセットを含む、ＣＤ４＋細胞）が挙げられるがそれに限定されない。Ｔ細胞媒介性応答としては、例えば、Ｔ細胞の細胞傷害性、Ｔ細胞のサイトカイン分泌、および増殖が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物により増進されるＴ細胞媒介性応答としては、パーフォリン−グランザイム経路および／またはＴＲＡＩＬ／ＦＡＳ−Ｌ経路を通じた細胞溶解活性などの、エフェクターγδ  Ｔ細胞により媒介される応答；ＡＤＣＣ媒介性細胞溶解またはサイトカイン分泌；ならびにＴＣＲ刺激、ＮＫＧ２Ｄ刺激、および／またはＩＬ−１２もしくはＩＬ−１８誘導を通じたＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのサイトカイン分泌が挙げられる。シー、ゾウら（Ｃ．  Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．），  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．  （２０１７）８（５）：８９００−８９０９（内容の全体を参照により本願明細書に援用する）を参照。
【０３７４】
対象においてがんを治療しもしくはその進行を遅延させまたは腫瘍成長を低減もしくは阻害する方法であって、対象に有効量の本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与することによる、方法もまた本明細書において提供される。任意選択で、投与はγδ  Ｔ細胞媒介性細胞傷害性またはサイトカイン産生を増進する。
【０３７５】
本明細書において使用される場合、治療有効量または有効量という用語は、対象に投与された場合に、疾患もしくは障害を治療するためまたは別の所望の効果を達成するために効果的（例えば、ＮＫ細胞またはエフェクターγδ  Ｔ細胞などの他のＮＫｐ３０発現エフェクター細胞による標的細胞（例えば、がん細胞またはＢ系列細胞）の殺傷を増進するために効果的）な多重特異性抗原結合性構築物の量を指す。対象におけるがんを治療もしくは予防することができるまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏでＮＫ細胞による標的細胞の殺傷を増進することができる、本明細書に記載の抗体またはその断片の好適な用量は様々な要因に依存することができ、該要因としては、使用される具体的な構築物およびそれが他の治療剤と付随して使用されるかどうかが挙げられる。例えば、同じ対象を治療するために必要とされる多重特異性抗原結合性構築物の断片（例えば、単一の抗原結合単位）の用量と比較して異なる用量の多重特異性抗原結合性構築物全体ががんを有する対象を治療するために必要とされることがある。対象に投与される用量に影響する他の要因としては、例えば、がんまたは自己反応性Ｂ細胞媒介性状態の種類または重篤度が挙げられる。例えば、転移性黒色腫を有する対象は、膠芽腫を有する対象とは異なる多重特異性抗原結合性構築物の投与量の投与を必要とすることがある。同様に、重症筋無力症を有する対象は、全身性ループスエリテマトーデスを有する対象とは異なる投与量を必要とすることがある。他の要因としては、例えば、対象に同時にまたは以前に影響した他の医学的障害、対象の全般的健康、対象の遺伝学的傾向、食事、投与の時間、排出の速度、薬物の組合せ、および対象に投与される任意の他の追加の治療法を挙げることができる。任意の具体的な対象のための特定の投与量および治療レジメンは、治療施術者（例えば、医師または看護師）の判断にも依存することも理解されるべきである。治療有効量はまた、組成物の任意の毒性または有害効果を治療的に有益な効果が凌ぐものである。
【０３７６】
医薬組成物は、治療有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を含むことができる。そのような有効量は、上記のように当業者により容易に決定され得る。考慮としては、投与される多重特異性抗原結合性構築物の効果、または、１つより多くの剤が医薬組成物中でもしくはそれと共に使用される場合には、１つもしくは複数の追加の活性剤との多重特異性抗原結合性構築物の組合せの効果が挙げられる。
【０３７７】
本明細書に記載の任意の多重特異性抗原結合性構築物の好適なヒト用量は、例えば、第Ｉ相用量漸増研究においてさらに評価することができる。例えば、ファン・グルプら（ｖａｎ  Ｇｕｒｐ  ｅｔ  ａｌ．）（２００８）Ａｍ．  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８（８）：１７１１−１７１８；ハノウスカら（Ｈａｎｏｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．）（２００７）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １３（２，  ｐａｒｔ  １）：５２３−５３１；およびヘザリントンら（Ｈｅｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２００６）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５０（１０）：３４９９−３５００を参照。
【０３７８】
そのような多重特異性抗原結合性構築物の毒性および治療効果は、細胞培養物または実験動物（例えば、本明細書に記載の任意のがんの動物モデル）において公知の薬学的手順により決定することができる。これらの手順は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に効果的な用量）を決定するために使用することができる。毒性効果と治療効果との用量比は治療指数であり、それは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療指数を呈する多重特異性抗原結合性構築物が好ましい。毒性の副作用を呈する構築物が使用されてもよいが、影響された組織の部位にそのような構築物を標的化する送達システムを設計すること、および、正常細胞への潜在的な損傷を最小化し、それにより副作用を低減することに注意するべきである。
【０３７９】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲の定式化において使用することができる。本明細書に記載の抗原結合性構築物の投与量は、一般に、ほとんどまたは全く毒性を有しないＥＤ５０を含む多重特異性抗原結合性構築物の循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる投与形態および利用される投与の経路に依存してこの範囲内で変動することができる。本明細書に記載の抗原結合性構築物について、治療的に効果的な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養において決定されるようなＥＣ５０（すなわち、症状の半数最大阻害を達成する構築物、例えば、抗体の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて定式化することができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。一部の実施形態では、例えば、（例えば、目または関節への）局所投与が所望される場合、局所的な部位内で治療的に効果的な濃度を達成するために必要とされる用量を決定するために細胞培養または動物モデルを使用することができる。
【０３８０】
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、単剤療法として対象に投与することができる。代替的に、抗原結合性構築物は、がんに対する他の療法と組み合わせて投与することができる。例えば、組成物は、放射線、手術、標的化もしくは細胞傷害性化学療法、化学放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、遺伝子療法、細胞移植療法、プレシジョンメディシン、ゲノム編集療法、炎症性もしくは自己免疫疾患療法（例えば、抗炎症剤もしくは抗サイトカイン剤）または他の薬物療法と同時、その前、または後に対象に投与することができる。
【０３８１】
本開示の組成物との併用投与のために好適な化学療法剤としては、例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｎｃｉｎｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにこれらのアナログまたはホモログが挙げられる。さらなる剤としては、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンＣ、シス−ジクロルジアミン白金（ＩＩ）（ｃｙｓ−ｄｉｃｈｌｏｒｄｉａｍｉｎｅ  ｐｌａｔｉｎｕｍ  （ＩＩ））（ＤＤＰ）、プロカルバジン、アルトレタミン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、サトラプラチン、または四硝酸トリプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノムシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｃｉｎ）（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）およびテモゾロミドが挙げられる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物および１つまたは複数の追加の活性剤は同時に投与される。任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物は時間的に一番目に投与され、１つまたは複数の追加の活性剤は時間的に二番目に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加の活性剤は時間的に一番目に投与され、多重特異性抗原結合性構築物は時間的に二番目に投与される。任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物および１つまたは複数の追加の剤は同じまたは異なる経路において同時に投与される。例えば、抗原結合性構築物を含む組成物は、任意選択で、１つまたは複数の追加の剤を含有する。
【０３８２】
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性は、以前にまたは現在投与されている療法を置き換えまたは増強することができる。例えば、多重特異性抗原結合性構築物を用いて治療する場合、１つまたは複数の追加の活性剤の投与は、中止または縮小することができ、例えば、より低いレベルまたは投与量において投与することができる。一部の実施形態では、以前の療法の投与を維持することができる。一部の実施形態では、以前の療法は、多重特異性抗原結合性構築物のレベルが治療効果を提供するために十分なレベルに達するまで維持される。
【０３８３】
本明細書において定義されるようながんまたは自己反応性Ｂ細胞媒介性炎症状態の改善について対象（例えば、ヒト患者）をモニターすることは、疾患パラメーターにおける変化、例えば、腫瘍成長またはサイズの低減について対象を評価することを意味する。一部の実施形態では、評価は、投与の少なくとも１時間後、例えば、少なくとも２、４、６、８、１２、２４、もしくは４８時間、または少なくとも１日、２日、４日、１０日、１３日、２０日もしくはより多くの日数、または少なくとも１週、２週、４週、１０週、１３週、２０週、もしくはより多くの週の後に行われる。対象は、以下の期間：治療の開始前、治療中、または治療の１つもしくは複数の要素が投与された後の１つまたは複数において評価することができる。評価は、さらなる治療の必要性を評価すること、例えば、投与量、投与の頻度、または治療の継続期間を変更するべきかどうかを評価することを含むことができる。それはまた、選択された治療モダリティーを追加または削減する必要性、例えば、本明細書に記載のがんに対する任意の治療を追加または削減することを評価することを含むことができる。
【０３８４】
一部の実施形態では、本明細書に記載の治療有効量の多重特異性抗原結合性構築物、または構築物を含む組成物は、それを必要とする対象において免疫応答をモジュレートまたは増進するために対象に投与される。一部の実施形態では、増進した免疫応答は、増進したＴ細胞機能、増進したＮＫ細胞機能、または増進したマクロファージ機能の１つまたは複数を含む。ある特定の態様では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＮＫｐ３０を発現する免疫細胞を腫瘍またはＢ系列細胞抗原を発現する第２の細胞（例えば、腫瘍細胞またはＢ系列細胞）とブリッジ形成させることによりＮＫｐ３０機能をアゴナイズすることにより対象の免疫応答を増進する。
【０３８５】
対照ＮＫ細胞によるＣＤ１６の発現と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有するＮＫ細胞を活性化させまたはその活性化を持続化させる方法もまた本明細書において提供される。方法は、ＮＫ細胞を有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物と接触させることを含む。多重特異性結合構築物は、例えば、少なくとも２つの連結した抗原結合単位を含み、第１の抗原結合単位は腫瘍抗原（例えば、ＢＣＭＡまたはＨＥＲ２／ｎｅｕ）に特異的に結合し、第２の抗原結合単位はＮＫｐ３０抗原に特異的に結合する。ＮＫ細胞の多重特異性抗原結合性構築物との接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。
【０３８６】
一部の実施形態では、方法は、がんを有する対象においてＮＫ細胞を活性化させまたはその活性化を持続化させるために使用される。がん細胞は、多重特異性抗原結合性構築物が特異的に結合する標的抗原を発現してもよい。任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物が特異的に結合する腫瘍抗原はＢＣＭＡまたはＨＥＲ２である。接触させるＮＫ細胞は腫瘍浸潤性ＮＫ細胞であることができる。
【０３８７】
ＮＫ細胞の活性化または持続的な活性化は、ＮＫ細胞がＣＤ１６欠損性微環境にあるかどうかにかかわらず起こる。ＣＤ１６欠損性微環境は、対照ＮＫ細胞（例えば、休止ＮＫ細胞、対象からの健常ＮＫ細胞、健常個体からのＮＫ細胞）と比較して５０％未満のＣＤ１６の発現を有する浸潤性ＮＫ細胞の集団を含んでもよい。任意選択で、浸潤性ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較して４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満のＣＤ１６の発現を有する。一部の対象中の浸潤性ＮＫ細胞はＣＤ１６を発現しない。他の態様では、ＣＤ１６欠損性微環境は、浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも１０％が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する浸潤性ＮＫ細胞の集団を含む。任意選択で、ＣＤ１６欠損性微環境は、浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％が対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する浸潤性ＮＫ細胞の集団を含む。他の態様では、ＮＫ細胞は１５０，０００未満のＣＤ１６コピー数を有する。任意選択で、ＮＫ細胞は、１４０，０００未満、１３０，０００未満、１２０，０００未満、１１０，０００未満、１００，０００未満、７５，０００未満、５０，０００未満、または２５，０００未満のＣＤ１６コピー数を有する。
【０３８８】
本明細書において使用される場合、増進したＮＫ細胞機能またはＮＫ細胞の活性化という用語は、細胞周期に入ること（すなわち、増殖すること）、１つまたは複数の活性化マーカーの細胞表面発現を増加させること、サイトカインまたはケモカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７Ａ、およびＩＬ−２２を含む）または溶菌酵素（例えば、パーフォリンおよびグランザイム）を分泌することまたはその分泌を増加させること、および細胞ベースのエフェクター機能を行うことを開始させるまたはそのためにコンピテントとなることによりＮＫ細胞がコグネイトリガンドまたは本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物に応答する細胞プロセスを指す。そのような活性を測定する方法は当該技術分野において慣例的で公知であり、例示的な方法は実施例などにおいて本明細書に記載されている。例えば、増進したＮＫ細胞機能がＮＫ細胞による増加または増進したサイトカイン産生である実施形態では、ＥＬＩＳＡまたはサイトカインビーズアレイアッセイなどのサイトカインアッセイを使用して増加を決定することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物の存在下でのサイトカイン産生の増加は、対照または参照抗体と比較して少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、またはより高い。増進したＮＫ細胞機能が１つまたは複数の活性化マーカーの増加または増進した発現である実施形態では、アッセイは、例えばフローサイトメトリーを使用して、ＮＫ細胞上の少なくとも１つの活性化マーカーの表面発現の増加を検出することを含む。一部の実施形態では、「表面発現の増加」は、対照抗体または参照抗体の存在下での表面発現と比べて表面発現の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の増加を指す。
【０３８９】
本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物は、がんの治療のための本明細書における任意の方法において、および、任意選択で、抗がん療法を対象に投与することをさらに含む方法において記載されるように使用することができる。本明細書に記載されるようなそのような抗がん療法（例えば、免疫療法、化学療法など）は、多重特異性抗原結合性構築物を用いる治療の前、同時、または後に投与することができる。例として、抗がん療法は、多重特異性抗原結合性構築物の投与の１もしくはより多くの分、時間、日、または週だけ前に投与することができる。そのような場合、抗がん療法は、腫瘍細胞が腫瘍抗原発現を下方調節するまで単独で投与することができ、そのような時点において、多重特異性抗原結合性構築物の投与は、抗がん療法と共にまたはその代わりに開始することができる。方法のある特定の実施形態では、抗がん療法および多重特異性抗原結合性構築物は、完全または部分的にオーバーラップする期間において投与される。そのため、両方は、同じ期間の分、時間、日、週、または月の間に投与することができる。そのようなオーバーラップする時間的期間の間に、抗がん療法および多重特異性抗原結合性構築物は、（例えば、同じ組成物中でもしくは同じ投与手段により）同時にもしくはおおよそ同じ時点において投与することができ、または一方を他方の（分、時間、日などだけ）前もしくは後に投与することができる。任意選択で、抗がん療法は免疫療法であり、対象におけるがんは、少なくとも多重特異性抗原結合性構築物を用いる治療の非存在下で、免疫療法に対して難治性である。
【０３９０】
対象においてがんを治療する方法であって、がんが低いレベルの腫瘍抗原を含む、方法もまた本明細書において提供される。方法は、対象に有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を投与することを含む。多重特異性結合構築物は、例えば、少なくとも２つの連結した抗原結合単位を含み、第１の抗原結合単位は腫瘍抗原（例えば、ＢＣＭＡまたはＨＥＲ２／ｎｅｕ）に特異的に結合し、第２の抗原結合単位はＮＫｐ３０抗原に特異的に結合し、本明細書に記載の任意の多重特異性抗原結合性構築物であり得る。治療されるがんは低いレベルの腫瘍抗原を含む。本明細書において使用される場合、腫瘍抗原の低いレベルは、当業者により高いと考えられない任意のレベルである。例として、腫瘍細胞当たり約１３０，０００〜１５０，０００より多いＢＣＭＡのコピーのＢＣＭＡ発現レベルは高いと考えられる一方、約１３０，０００〜１５０，０００未満のＢＣＭＡ発現レベルは中間または低いと考えられる。そのため、ＢＣＭＡの低いレベルは、本明細書において使用される場合、腫瘍細胞当たり約１００，０００未満、約９０，０００未満、約７５，０００未満、および５０，０００未満のＢＣＭＡのコピーを含む。そのため、がんが低いレベルの腫瘍抗原を含む対象においてがんを治療する方法は、がん細胞当たり約１００，０００未満の腫瘍抗原コピー、細胞当たり１３０未満の腫瘍抗原コピー、がん細胞当たり約７５，０００未満の腫瘍抗原コピー、がん細胞当たり約６０，０００未満の腫瘍抗原コピー、がん細胞当たり５０，０００未満の腫瘍抗原コピー、がん細胞当たり４０，０００未満の腫瘍抗原コピー、細胞当たり３５，０００未満の腫瘍抗原コピー、または細胞当たりより少ない任意の数のコピーのレベルの腫瘍抗原を含む。低いレベルの腫瘍抗原発現は、経時的に下方調節されてもよく（例えば、腫瘍細胞は、ＮＫ細胞などの浸潤性免疫細胞による細胞死を免れる）、具体的な腫瘍細胞に特徴的であってもよく、または両方であってもよい。
【０３９１】
第１の抗原結合単位が特異的に結合する腫瘍抗原の低いレベルにもかかわらず、多重特異性抗原結合性構築物は、ＮＫｐ３０機能をアゴナイズすることにより対象の免疫応答を増進することができ、ＮＫ細胞媒介性がん細胞溶解を増進すること、サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）の産生を促進すること、およびＡＤＣＣ機能を増進することができる。そのため、多重特異性抗原結合性構築物は、様々ながん種の治療のための本明細書における任意の方法において、および、任意選択で、抗がん療法を対象に投与することをさらに含む方法において記載されるように使用することができる。本明細書に記載されるようなそのような抗がん療法（例えば、免疫療法）は、多重特異性抗原結合性構築物を用いる治療の前、同時、または後に投与することができる。例として、抗がん療法は、多重特異性抗原結合性構築物の投与の１もしくはより多くの分、時間、日、または週だけ前に投与することができる。そのような場合、抗がん療法は、腫瘍細胞が腫瘍抗原発現を下方調節するまで単独で投与することができ、そのような時点において、多重特異性抗原結合性構築物の投与は、抗がん療法と共にまたはその代わりに開始することができる。本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、抗がん療法および多重特異性抗原結合性構築物は、完全または部分的にオーバーラップする期間において投与される。そのため、両方は、同じ期間の分、時間、日、週、または月の間に投与することができる。そのようなオーバーラップする時間的期間の間に、抗がん療法および多重特異性抗原結合性構築物は、（例えば、同じ組成物中でもしくは同じ投与手段により）同時にもしくはおおよそ同じ時点において投与することができ、または一方を他方の（分、時間、日などだけ）前もしくは後に投与することができる。任意選択で、抗がん療法は免疫療法であり、対象におけるがんは、少なくとも多重特異性抗原結合性構築物を用いる治療の非存在下で、免疫療法に対して難治性である。
【０３９２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による標的細胞の殺傷を増進する方法もまた本明細書において提供される。方法は、ＮＫ細胞の存在下で標的細胞を有効量の（すなわち、標的細胞の殺傷を増進するために十分な）多重特異性抗原結合性構築物と接触させることを含み、標的細胞は約１００，０００未満のコピー数で腫瘍抗原を発現し、多重特異性結合構築物は少なくとも２つの連結した抗原結合単位を含み、第１の抗原結合単位は腫瘍抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位はＮＫｐ３０抗原に特異的に結合する。接触工程はｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。接触工程がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる場合、残留する生存細胞は、任意選択で、細胞が由来する対象と同じまたは異なる対象に移植される。例えば、残留生存細胞は、幹細胞、または造血細胞などであり得る。
【０３９３】
対象においてＮＫ細胞によるがんまたはＢ系列細胞の殺傷を増進する方法もまた提供される。方法は、対象に有効量（すなわち、ＮＫ細胞によるがんまたはＢ細胞の殺傷を増進するために十分な量の多重特異性抗原結合性構築物を投与することを含む。任意選択で、がん細胞は約１００，０００未満のコピー数で腫瘍抗原を発現し、多重特異性結合構築物は少なくとも２つの連結した抗原結合単位を含み、第１の抗原結合単位は腫瘍抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位はＮＫｐ３０抗原に特異的に結合する。
【０３９４】
本明細書において使用される場合、増進したＮＫ細胞機能またはＮＫ細胞の活性化という用語は、細胞周期に入ること（すなわち、増殖すること）、１つまたは複数の活性化マーカーの細胞表面発現を増加させること、サイトカインまたはケモカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７Ａ、およびＩＬ−２２を含む）または溶菌酵素（例えば、パーフォリンおよびグランザイム）を分泌することまたはその分泌を増加させること、および細胞ベースのエフェクター機能を行うことを開始させるまたはそのためにコンピテントとなることによりＮＫ細胞がコグネイトリガンドまたは本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物に応答する細胞プロセスを指す。そのような活性を測定する方法は当該技術分野において慣例的で公知であり、例示的な方法は実施例などにおいて本明細書に記載されている。例えば、増進したＮＫ細胞機能がＮＫ細胞による増加または増進したサイトカイン産生である実施形態では、ＥＬＩＳＡまたはサイトカインビーズアレイアッセイなどのサイトカインアッセイを使用して増加を決定することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物の存在下でのサイトカイン産生の増加は、対照または参照抗体と比較して少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、またはより高い。増進したＮＫ細胞機能が１つまたは複数の活性化マーカーの増加または増進した発現である実施形態では、アッセイは、例えばフローサイトメトリーを使用して、ＮＫ細胞上の少なくとも１つの活性化マーカーの表面発現の増加を検出することを含む。一部の実施形態では、「表面発現の増加」は、対照抗体または参照抗体の存在下での表面発現と比べて表面発現の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の増加を指す。
【０３９５】
一部の態様では、それを必要とする対象からの標的細胞（例えば、腫瘍細胞またはＢ系列細胞）の枯渇において使用するための多重特異性抗原結合性構築物であって、少なくとも２つの連結した抗原結合単位を含み、第１の抗原結合単位が、標的抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合単位が、ＮＫｐ３０抗原に特異的に結合する、多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は第３の抗原結合単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は第３の抗原結合単位および第４の抗原結合単位を含む。一部の実施形態では、標的抗原は、本明細書に記載のまたは当該技術分野において公知の任意の腫瘍抗原などの腫瘍抗原である。一部の実施形態では、標的細胞は、自己反応性Ｂ細胞などのＢ細胞であり、そのような場合、標的抗原は、Ｂ細胞特異的、Ｂ細胞拘束、またはＢ細胞濃縮抗原、例えば、ＣＤ２０またはＢＣＭＡである。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は自己免疫状態に罹患している。一部の実施形態では、自己免疫状態は、全体的または部分的に自己反応性Ｂ細胞により媒介される。一部の実施形態では、標的細胞を枯渇されている対象は赤芽球癆を有するまたはそのリスクがある。一部のそのような実施形態では、対象は血液群Ｏを有し、同種幹細胞移植は血液群Ａのドナーからのものであった。標的細胞を枯渇されている対象が赤芽球癆を有するまたはそのリスクがあるそれらの実施形態では、標的細胞は、例えば、標的血漿Ｂ細胞である。よって、一部の実施形態では、標的抗原は、例えば、血漿Ｂ細胞上に見出されるが他のＢ細胞上には見出されない抗原である。
【０３９６】
一部の態様では、それを必要とする対象における全体的または部分的に自己反応性Ｂ細胞により媒介される炎症状態（例えば、自己免疫状態または自己反応性Ｂ細胞性炎症状態）の治療において使用するための多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、対象は、重症筋無力症、軽鎖アミロイドーシス、尋常性天疱瘡、および免疫性血小板減少症から選択される疾患を有する。一部の実施形態では、そのような多重特異性構築物は、コルチコステロイド、ＤＭＡＲＤｓ、または抗サイトカイン療法などの炎症性障害（例えば、自己免疫疾患）に対する他の療法と組み合わせることができる。
【０３９７】
一部の態様では、それを必要とする対象におけるがん免疫応答などの免疫応答のモジュレートまたは増進において使用するための多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、増進した免疫応答は、増進したＴ細胞機能、増進したＮＫ細胞機能、または増進したマクロファージ機能の１つまたは複数を含む。ある特定の態様では、多重特異性抗原結合性構築物は、ＮＫｐ３０を発現する免疫細胞を腫瘍またはＢ系列細胞抗原を発現する第２の細胞（例えば、腫瘍細胞またはＢ系列細胞）とブリッジ形成させることによりＮＫｐ３０機能をアゴナイズすることにより対象の免疫応答を増進する。
【０３９８】
一部の態様では、対照ＮＫ細胞によるＣＤ１６の発現と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有するＮＫ細胞の活性化またはその活性化の持続化において使用するための多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の態様では、それを必要とする対象における低いレベルの腫瘍抗原を有するがんの治療またはその進行の遅延において使用するための多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の態様では、それを必要とする対象におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による標的細胞の殺傷の増加または増進において使用するための多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の態様では、対象におけるＮＫ細胞によるがんまたはＢ系列細胞の殺傷の増進において使用するための多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。
【０３９９】
開示される実施形態のために使用できる、それと組み合わせて使用できる、またはその準備において使用できる材料、組成物、および成分が開示される。これらおよび他の材料が本明細書に開示され、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの組成物の各様々な個々的および集合的組合せおよび並べ替えの特定の言及が明示的に開示されないことがあるが、それぞれは本明細書において特に想定され記載されていることが理解される。例えば、方法が開示および議論され、方法に含まれる多数の分子に対して為され得る多数の改変が議論されている場合、そうでないことが特に指し示されなければ、方法のそれぞれのおよびあらゆる組合せおよび並べ替え、ならびに可能な改変が特に想定される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せもまた特に想定され、開示される。この概念は、開示される組成物を使用する方法における工程が挙げられるがそれに限定されない本開示の全ての態様に適用される。そのため、行うことができる様々な追加の工程がある場合、これらの追加の工程のそれぞれは、開示される方法の任意の特定の方法工程または方法工程の組合せと共に行うことができること、ならびに各そのような組合せまたは組合せのサブセットが特に想定され、開示されていると考えられるべきであることが理解される。
【０４００】
本明細書において参照される刊行物およびそのためにそれらが参照される材料は、本願明細書により特に全体を参照により援用する。以下の記載は、開示される組成物および方法のさらなる非限定的な例を提供する。
【実施例】
【０４０１】
（実施例１）
ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物はＮＫエフェクター機能を増進させる
ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物がＮＫ細胞に及ぼす効果を分析するため、初代ヒトＮＫ細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５で予備刺激し、多発性骨髄腫細胞株Ｈ９２９のＢＣＭＡ発現標的細胞、および各アームがＢＣＭＡに結合し、各重鎖のＣ末端がヒトＮＫｐ３０と特異的に結合するｓｃＦｖである抗体（ＩｇＧ１）全体を含むフォーマットを有する本明細書に記載されている１０ｎＭの多重特異性抗原結合構築物と共に一晩インキュベートする（１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２の存在下で）。第１の抗原結合ドメインは、米国特許第９，２７３，１４１号明細書に記載されている例示的なＣＡ８抗体の重鎖可変領域（配列番号２）および軽鎖可変領域（配列番号１）を含む。ｓｃＦｖは、ハイブリドーマＩ−２５７６により産生される抗体（米国特許第７，５１７，９６６号明細書に詳細に記載されており、この抗体およびその配列に関連するその開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）またはそのヒト化バージョンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、対照ＢＣＭＡ抗体単独と比較して、ＮＫエフェクター機能を増進させる。
【０４０２】
追加の構築物
標準的な分子生物学技法を使用して、ヒトＢＣＭＡおよびヒトＮＫｐ３０と特異的に結合する多重特異性抗原結合構築物である構築物１を生成した。この構築物は、抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ１）を含み、この抗体の重鎖は、ポリＧＧＧＳ（配列番号２２）リンカーを介して抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ領域に接続されている抗ＮＫｐ３０抗体（ｍＡｂ８）の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質である。この構築物の抗ＢＣＭＡ部分および抗ＮＫｐ３０部分の軽鎖は同一である。その構造が図１の図解により表される構築物１は、配列番号９に示されている重鎖配列および配列番号８に示されている軽鎖配列を含む。
【０４０３】
標準的な分子生物学技法を使用して、これもヒトＢＣＭＡおよびヒトＮＫｐ３０と特異的に結合する多重特異性抗原結合構築物である構築物２を生成した。この構築物は、抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ１）を含み、この抗体の重鎖は、ポリＧＧＧＳ（配列番号２２）リンカーを介して抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ領域に接続されている抗ＮＫｐ３０抗体の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質である。この構築物の抗ＢＣＭＡ部分および抗ＮＫｐ３０部分の軽鎖は同一である。その構造が図１の図解により表される構成物２は、構築物１と同じ抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体部分および構築物１と同じ軽鎖を含むが、この構築物の抗ＮＫｐ３０抗体部分（ｍＡｂ９）の可変領域配列が異なる。構築物２は、配列番号２４に示されている重鎖配列および配列番号８に示されている軽鎖配列を含む。
【０４０４】
また、構築物１および２の非グリコシル化バージョン（「構築物１脱グリコ」／構築物３または「構築物２脱グリコ」／構築物４）を作出した。各構築物の重鎖のＦｃ部分は、Ｎ２９７Ａアミノ酸置換（ＥＵ式付番による付番）を含んでいた。例えば、構築物３は、配列番号２６に示されているアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。構築物４は、配列番号２７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０４０５】
構築物５は、親和性成熟抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ３）を含み、この抗体の重鎖は、ポリＧＧＧＳ（配列番号２２）リンカーを介して抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ領域に接続されている抗ＮＫｐ３０抗体（ｍＡｂ８）の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質である。この構築物の抗ＢＣＭＡ部分および抗ＮＫｐ３０部分の軽鎖は同一である。構築物５は、配列番号６５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０４０６】
構築物６は、親和性成熟抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ２）を含み、この抗体の重鎖は、ポリＧＧＧＳ（配列番号２２）リンカーを介して抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ領域に接続されている抗ＮＫｐ３０抗体（ｍＡｂ８）の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質である。この構築物の抗ＢＣＭＡ部分および抗ＮＫｐ３０部分の軽鎖は同一である。構築物６は、配列番号６６に示されているアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０４０７】
構築物７は、抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ１）を含む非フコシル化構築物であり、この抗体の重鎖は、伸長されたポリＧＧＧＳ（配列番号２２）リンカーを介して抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ領域に接続されている抗ＮＫｐ３０抗体（ｍＡｂ８）の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質である。この構築物の抗ＢＣＭＡ部分および抗ＮＫｐ３０部分の軽鎖は同一である。構築物６６は、配列番号６７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０４０８】
構築物８は、抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ３）を含む構築物５の非グリコシル化バージョンであり、この抗体の重鎖は、伸長されたポリＧＧＧＳ（配列番号２２）リンカーを介して抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ領域に接続されている抗ＮＫｐ３０抗体（ｍＡｂ８）の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質である。この構築物の抗ＢＣＭＡ部分および抗ＮＫｐ３０部分の軽鎖は同一である。構築物８は、配列番号６８に示されているアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０４０９】
（実施例２）
ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、ＮＫ細胞によるＣＤ１６発現の非存在下でＮＫエフェクター機能を増進させる
ＣＤ１６発現の非存在下において、ＮＫ細胞上のＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物の効果を分析するために、ＣＤ１６に結合することができない抗体を研究した（図２Ａおよび図２Ｂ）。ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０を標的とするグリコシル化多重特異性抗原結合構築物は、ＣＤ１６に結合する能力を保持するが、非グリコシル化抗体は、ＣＤ１６に結合する能力を欠如する。
【０４１０】
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト末梢血バフィコートから単離した。ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を、磁気ビーズによるネガティブ選択を使用してＰＢＭＣから単離した。単離ＮＫ細胞の純度は、典型的には９０％よりも高かった。単離ＮＫ細胞を、細胞傷害性アッセイまたはＩＦＮγ放出アッセイで使用する前に、ＩＬ−２およびＩＬ−１５で補完された培地で一晩培養した。翌日、ＮＫ細胞を、標的細胞ならびに種々の濃度の構築物１および２または抗ＢＣＭＡ抗体および対照抗体と混合した。
【０４１１】
図２Ａに示されているように、グリコシル化二重特異性抗体である構築物１および２は、親抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体単独の活性と比較して、Ｈ９２９腫瘍細胞に対して末梢血ＮＫ細胞による優れたＡＤＣＣ活性を呈する。さらに、構築物１および２は、ＣＤ１６Ａ受容体に結合しない構築物の非グリコシル化バージョンを使用して図２Ｂで実証されているように、ＮＫ細胞上のＣＤ１６Ａ受容体に対する結合が無効になった場合でも、依然として強力なＡＤＣＣを媒介することができる。こうした結果は、本多重特異性抗原結合構築物が、末梢血（ｐｂ）ＮＫ細胞によるＡＤＣＣを増進し、ＣＤ１６Ａに対する結合の非存在下でもこの活性を保持したことを示す。
【０４１２】
図３Ａおよび図３Ｂは、構築物１が、ＣＤ１６Ａ発現の存在下でＡＤＣＣを増進したことを示す。図３Ａは、腫瘍抗原ＢＣＭＡを中レベルで発現するＭＭ．１Ｓ腫瘍細胞を使用した結果を示し、図３Ｂは、ＢＣＭＡを低レベルで発現するＲＰＭＩ−８２２６腫瘍細胞を使用した結果を示す。ＣＤ１６Ａ発現ＮＫ細胞株の細胞をエフェクター細胞として使用した場合、構築物１は、ＢＣＭＡモノクローナル抗体または陰性対照と比較して、ＡＤＣＣを増加させたことが実証された。
【０４１３】
最後に、ＣＤ１６を発現しないＮＫ細胞株をエフェクター細胞として使用した。図４Ａおよび図４Ｂは、ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０を標的とする本多重特異性抗原結合構築物が、ＣＤ１６Ａ発現の非存在下でＡＤＣＣを誘導したことを示す。図４Ａおよび図４Ｃは、腫瘍抗原ＢＣＭＡを高レベルで発現するＨ９２９腫瘍細胞を使用した結果を示し、図４Ｂは、ＢＣＭＡを低レベルで発現するＲＰＭＩ−８２２６腫瘍細胞を使用した結果を示す。ＣＤ１６Ａ陰性ＮＫ細胞株（図４Ａおよび図４ＣのＫＨＹＧ−１、図４ＢのＮＫ細胞株）をエフェクター細胞として使用した場合、ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性構築物は、ＢＣＭＡモノクローナル抗体（図４Ｂおよび図４Ｃ）、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（図４Ｂ）、またはＣＤ１６Ａ−ＢＣＭＡ二重特異性構築物（図４Ｃ）と比較して、ＣＤ１６陰性ＮＫ細胞による腫瘍細胞殺傷を誘導した。
【０４１４】
（実施例３）
ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、優れた活性を呈する
ＮＫｐ３０およびＣＤ１６を両方とも標的とする、ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物の効果を分析するため、種々の構成物を研究した（図５Ａ、図５Ｂ、および図５Ｃ）。ＮＫｐ３０およびＣＤ１６を両方とも標的とする、ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、産生されたＩＦＮγの量または特異的溶解のパーセンテージにより測定して、優れた活性を呈することが示された。
【０４１５】
図５Ａは、Ｈ９２９腫瘍細胞を使用した結果を示し、図５Ｂおよび図５Ｃは、ＢＣＭＡを低レベルで発現するＭＭ．１Ｓ腫瘍細胞を使用した結果を示す。ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性構築物は、ＮＫｐ３０−ＢＣＭＡ  Ｆｃ−ヌル構築物（図４Ａ）、ＢＣＭＡモノクローナル抗体（図５Ａ、図５Ｂ、および図５Ｃ）、Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１アイソタイプ対照（図４Ａ）、ＣＤ１６−ＢＣＭＡ二重特異性構築物（図５Ｂおよび図５Ｃ）、およびＮＫｐ３０ヌル−ＢＣＭＡ  Ｆｃヌル構築物（図５Ｃ）よりも優れた活性を呈した。
【０４１６】
（実施例４）
ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、高、中、または低ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞の存在下でＩＦＮγ産生およびＡＤＣＣ機能を保持する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）をＰＢＭＣから単離した。この方法で典型的に達成された単離ＮＫ細胞の純度は、９０％よりも高かった。単離ＮＫ細胞を、細胞傷害性アッセイまたはＩＦＮγ放出アッセイで使用する前に、ＩＬ−２およびＩＬ−１５で補完された培地で一晩培養した。翌日、ＮＫ細胞を、１細胞あたり約１３０，０００〜１５０，０００コピーのＢＣＭＡを発現することがフローサイトメトリーにより決定された標的細胞Ｈ９２９（図６Ａおよび図６Ｂ）；１細胞当たり約９０，０００〜１００，０００，０００コピーのＢＣＭＡを発現することがフローサイトメトリーにより決定されたＭＭ．１Ｓ（図７Ａおよび図７Ｂ）；または１細胞当たり約３０，０００〜４０，０００コピーのＢＣＭＡを発現することがフローサイトメトリーにより決定されたＲＰＭＩ８２２６（図８Ａおよび図８Ｂ）と混合した。ＮＫ細胞および標的細胞を、５：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で使用し、抗体希釈範囲は、１０ｎＭから開始して１／５希釈した（ｎ＝８濃度）。細胞傷害性アッセイは、９６Ｕ底ウェルプレートにて４時間３７℃で実施し、ＩＦＮγアッセイは、９６Ｕ底ウェルプレートにて１８時間３７℃で実施した。
【０４１７】
インキュベーション後、標的細胞の殺傷を、ＰＩＥＲＣＥ（商標）ＬＤＨ細胞傷害性アッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国マサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）所在）を製造業者の使用説明書に従って使用して、損傷細胞から培地への乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を細胞傷害性および細胞溶解のバイオマーカーとして用いることにより測定した。全ての実験条件を三重重複で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下の通りに決定した：１００×（実験値−エフェクター細胞自発的対照−標的細胞自発的対照）／標的細胞最大対照−標的細胞自発的対照）。ＮＫ細胞により培地に放出されたＩＦＮγをＥｌｉｓａで測定した。
【０４１８】
結果は、ＮＫｐ３０に結合するドメインおよびＢＣＭＡに結合するドメインを有する多重特異性結合構築物の存在下では、ＮＫ細胞は、ＢＣＭＡモノクローナル抗体の存在下またはｈＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の存在下でのＮＫ細胞と比較して、ほとんどの濃度において、細胞溶解を引き起こし、サイトカインＩＦＮγの放出を促進する優れた能力を有することを示す。この効果は、３つのタイプの細胞：Ｈ９２９（図６Ａおよび図６Ｂ）、ＭＭ．１Ｓ（図７Ａおよび図７Ｂ）、およびＲＰＭＩ−８２２６（図８Ａおよび図８Ｂ）において示された。これらの細胞は、それぞれ、１標的細胞あたり約１３０，０００〜１５０，０００コピーのＢＣＭＡ、１標的細胞あたり約９０，０００〜１００，０００コピーのＢＣＭＡ、および１標的細胞あたり約３０，０００〜４０，０００コピーのＢＣＭＡを発現することがフローサイトメトリーを使用して決定されていた。まとめると、こうしたデータは、多重特異性結合構築物が、標的細胞上のＢＣＭＡが低レベルである場合でさえ効果的であることを示す。
【０４１９】
（実施例５）
多重特異性抗原結合構築物は、腫瘍細胞の非存在下ではＮＫ細胞を活性化しない
ＩＬ−２およびＩＬ−１５サイトカインで活性化されたＮＫ細胞（図９）または休止ＮＫ細胞（図１０および図１１）を、幾つかの多重特異性抗原結合構築物（構築物１など）または１０ｎＭ濃度の抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１モノクローナル抗体対照（図９）または種々の濃度の抗体（図１０および図１１）の存在下で、Ｈ９２９がん細胞（エフェクター：標的比１：１）と共にまたは無しで一晩インキュベートした。インキュベーション後、上清を収集し、ＩＦＮγを、Ｅｌｉｓａ（バイオレジェンド社（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））で測定した（図９）。ＮＫ細胞によるＣＤ６９（図１０）およびＣＤ１３７（図１１）の発現を、フローサイトメトリーで評価した。がん細胞の非存在下では、多重特異性抗体結合構築物は、ＩＦＮγ放出、ＣＤ６９およびＣＤ１３７発現により測定したところ、ＮＫ細胞を活性化することができなかった。
【０４２０】
（実施例６）
本明細書に記載されている多重特異性抗原結合構築物は、サイトカインによる以前の刺激がなくともＮＫ細胞を活性化する
休止ＮＫ細胞を、幾つかの多重特異性抗原結合構築物（構築物１など）の１つ、または種々の濃度の抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１モノクローナル抗体対照の存在下で、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１のＢＣＭＡ陽性標的細胞Ｈ９２９と共に３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、上清を収集し、ＩＦＮγを、Ｅｌｉｓａ（バイオレジェンド社（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））で測定した（図１２）。ＮＫ細胞によるＣＤ６９およびＣＤ１３７の発現（それぞれ、図１３および図１４）を、フローサイトメトリーで評価した。これらのデータは、ＢＣＭＡ−ＮＫｐ３０抗原結合構築物が、サイトカインによる以前の刺激がなくともＮＫ細胞を活性化することを示す。
【０４２１】
（実施例７）
本明細書に記載されている多重特異性抗原結合構築物は、標的細胞溶解を強力に誘導する
ＮＫｐ３０−ＢＣＭＡ多重特異性抗原結合構築物の効果をさらに分析するために、構築物を、現在臨床試験中のある特定の従来型抗体と比較して使用した（図１５Ａ、図１５Ｂ、および図１５Ｃ）。図１５Ａは、ＭＭ．１Ｓ腫瘍細胞上での、腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、およびＣＳ１の表面発現を反映する。多重特異性構築物は、抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体、ＣＤ３８を標的とするダラツムマブ、およびＣＳＩを標的とするエロツズマブと比べて試験した場合、腫瘍細胞に対してＩＦＮγ産生増加（図１５Ｂ）および優れたＡＤＣＣ活性（図１５Ｃ）を呈した。これらのデータは、本明細書に記載されているＮＫｐ３０−ＢＣＭＡ多重特異性抗原結合構築物が従来型抗体よりも優れた効力を有することを実証する。
【０４２２】
（実施例８）
免疫不全異種移植マウスモデルにおけるＢＣＭＡ−ＮＫｐ３０二重特異性抗体の効果
ＮＳＧ（商標）マウス（ジャクソンラボ社（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）、米国メイン州バーハーバー（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）所在）に、８×１０６個のＢＣＭＡ発現標的細胞（例えば、Ｈ９２９、ＭＭ．ｉＳ、ＲＰＭＩ−８２２６）を接種する。接種後４〜５日毎に、ＣＤ１６を発現するように遺伝子改変された放射線照射ＮＫ細胞をマウスに投与する。ＢＣＭＡ結合ドメインおよびＮＫｐ３０結合ドメインを有する多重特異性結合構築物および単一特異性結合構築物の投与後に、動物の生存、体重、および血漿をモニターする。
【０４２３】
（実施例９）
非ヒト霊長類におけるＢＣＭＡ−ＮＫｐ３０二重特異性抗体の効果
カニクイザルでは、ＢＣＭＡは、Ｂ細胞マーカーであり、ＢＣＭＡが形質細胞には存在するが末梢Ｂ細胞には存在しないヒトとは異なり、形質細胞および大部分の末梢血Ｂ細胞に存在する。したがって、ＢＣＭＡ結合構築物の効力は、末梢血中のＢ細胞および骨髄中の形質細胞の枯渇を検出することにより評価することができる。効力、ＰＫ、ＰＤ、および非ＧＬＰ毒性を評価するため、カニクイザルに、ＢＣＭＡ結合ドメインおよびＮＫｐ３０結合ドメインを有する多重特異性結合構築物またはＢＣＭＡに結合する対応する単一特異性結合構築物を５０ｍｇ／Ｋｇ〜０．１ｍｇ／Ｋｇで投与する。Ｂ細胞枯渇を、Ｂ細胞数および血清ＩｇＧレベルをモニターすることにより処置の２４時間〜７２時間後に評価する。
【０４２４】
（実施例１０）
Ｈｅｒ２およびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、優れた活性を呈する
Ｈｅｒ２およびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物の効果を分析するため、種々の構成物を研究した（図１７Ａ、図１７Ｂ、および図１７Ｃ）。標準的な分子生物学技法を使用して、各々が、ヒトＨｅｒ２およびヒトＮＫｐ３０と特異的に結合する多重特異性抗原結合構築物である構築物ＡおよびＢを生成した。構築物は、抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１抗体を含み、この抗体の重鎖は、ポリＧＧＧＳ（配列番号２２）リンカーを介して抗Ｈｅｒ２抗体のＦｃ領域に接続されている抗ＮＫｐ３０抗体の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質である。構築物の抗Ｈｅｒ２部分および抗ＮＫｐ３０部分の軽鎖は同一である。その構造が図１の図解により表される構築物Ａは、構築物１および２の抗ＮＫｐ３０抗体部分と同じ重鎖領域および軽鎖領域を含む。
【０４２５】
Ｈｅｒ２およびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、特異的溶解のパーセンテージにより測定したところ、優れた活性を呈することが示された。
図１７Ａは、ＳＫＢＲ３腫瘍細胞を使用した結果を示す。Ｈｅｒ２およびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物（構築物Ａおよび構築物Ｂ）は、抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体（トラスツズマブ、図１７Ａ）および抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体の非グリコシル化バージョン（図１７Ａ）よりも優れた活性を呈した。
【０４２６】
（実施例１１）
Ｈｅｒ２およびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、高、中、または低Ｈｅｒ２発現腫瘍細胞の存在下でＩＦＮγ産生活性を保持する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）をＰＢＭＣから単離した。この方法で典型的に達成された単離ＮＫ細胞の純度は、９０％よりも高かった。単離ＮＫ細胞を、細胞傷害性アッセイまたはＩＦＮγ放出アッセイで使用する前に、ＩＬ−２およびＩＬ−１５で補完された培地で一晩培養した。翌日、ＮＫ細胞を、標的細胞ＳＫＢＲ３（Ｈｅｒ２を高発現する）、ＳＷ４０（Ｈｅｒ２の発現レベルが低い）、またはＴ４７Ｄ（Ｈｅｒ２の発現レベルが中程度〜低い）と混合した。それらのＨｅｒ２発現レベルをフローサイトメトリーで測定した（図１８を参照）。ＮＫ細胞および標的細胞を、５：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で使用した。抗体希釈範囲は、１０ｎＭから開始して１／１０または１／５希釈した（ｎ＝８濃度）。インキュベーション後、ＮＫ細胞により培地に放出されたＩＦＮγをＥＬＩＳＡで測定した。
【０４２７】
結果は、ＮＫｐ３０に結合するドメインおよびＨｅｒ２に結合するドメインを有する多重特異性結合構築物の存在下では、ＮＫ細胞は、Ｈｅｒ２モノクローナル抗体の存在下または幾つかの抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１モノクローナル抗体のいずれか１つの存在下でのＮＫ細胞と比較して、ほとんどの濃度において、サイトカインＩＦＮγの放出を促進する優れた能力を有することを示す（図１７Ｂおよび１７Ｃ）。この効果は、上記の３つの細胞タイプ全てにおいて示される。まとめると、こうしたデータは、多重特異性結合構成物が、標的細胞上のＨｅｒ２が低レベルである場合でさえ効果的であることを示す。
【０４２８】
（実施例１２）
ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物１は、カニクイザルマカクの骨髄中の形質細胞を枯渇させる
構築物１を、３０．２５ｍｇ／ｋｇで成体カニクイザル（ｎ＝２）に単回静脈内注射した。処置したサルの骨髄中の免疫グロブリン分泌細胞の数を、ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＡに特異的なＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して経時的に測定した。骨髄中の形質細胞数の推定として、骨髄中の免疫グロブリン分泌細胞の大部分は、形質細胞であると仮定した。図１９に示されているように、処置動物では両方とも、処置２週間後に骨髄形質細胞の強力な減少（＞８０％）が、続いて３週間後にリバウンドが観察された。
【０４２９】
（実施例１３）
ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物１は、カニクイザルマカクの血漿中の血清ＩｇＭを減少させる
単回用量の構築物１を、３０．２５ｍｇ／ｋｇでカニクイザルマカクに静脈内投与した。ＥＬＩＳＡを使用して、処置したカニクイザルマカクの末梢血中の血漿ＩｇＭのレベルを経時的に測定した。このアッセイは、カニクイザルＩｇＭに特異的であり、標準カニクイザルＩｇＭを使用して、処置したサルの血中ＩｇＭ濃度を算出した。処置の５週間後に、血漿ＩｇＭの強力な減少の開始が観察された。データは３つの独立実験の代表的なものである。図２０に示されているように、ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物１は、処置したカニクイザルマカクの血漿中の血清ＩｇＭの減少を誘導する。
【０４３０】
（実施例１４）
ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物１は、処置したサルのｉｎ  ｖｉｖｏ  ＮＫ細胞拡大増殖を誘導する
フローサイトメトリーを使用して、構築物１を０日目に３０．２５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与したカニクイザルにおける絶対数計算のための細胞血球数を含む、処置したサルの末梢血中のＮＫ細胞の絶対数を経時的に測定した。カニクイザルＮＫ細胞は、死細胞を除いて、ＣＤ４５＋／ＣＤ３−／ＣＤ１４−／ＣＤ２０−細胞集団をゲート制御した。フローサイトメトリーを使用して、同じ処置サルの骨髄における白血球集団中のＮＫ細胞のパーセンテージを経時的に測定した。
【０４３１】
図２１Ａに示されているように、ＮＫ細胞は、処置したサルの血液中で拡大増殖し、処置の約１４日後に最大ピークを示した。ＮＫ細胞は、処置したサルの骨髄でも拡大増殖したが（図２１Ｂ）、この拡大増殖は、サルＢ６０１６の方がＡＫ７４９Ｊよりも少なかった。
【０４３２】
（実施例１５）
ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物１は、サルＡＫ７４９ＪにおいてＮＫ細胞活性化を誘導する
フローサイトメトリーを使用して、構築物１を０日目に３０．２５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与したカニクイザルの末梢血または骨髄中のＮＫ細胞上でのＣＤ６９発現レベルを経時的に測定した。カニクイザルＮＫ細胞は、死細胞を除いて、ＣＤ４５＋／ＣＤ３−／ＣＤ１４−／ＣＤ２０−細胞集団をゲート制御した。ＣＤ６９発現により示されるように、ＮＫ細胞は、サルＡＫ７４９Ｊの血液（図２２Ａ）および骨髄（図２２Ｂ）で活性化された。サルＢ６０１６は、処置前に高いＣＤ６９発現（＞７０％）を示し、処置の経過中に高いＣＤ６９発現を維持したことに留意されたい。
【０４３３】
（実施例１６）
ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物１は、典型的なＩｇＧ１様薬物動態プロファイルを表示する
構築物１の単回ＩＶ注射後に血漿を収集し、抗原特異的ＥＬＩＳＡを使用して、処置したサルの血液中の構築物１のレベルを測定した。二相減衰モデルを使用して、図２３に示されているように、両サルでのβ相半減期が約１６日間であると推定した。
【０４３４】
（実施例１７）
ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを標的とする多重特異性抗原結合構築物は、腫瘍細胞の存在下でのみ、ＮＫ細胞によるＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびランテスのより高い産生を促進する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）をＰＢＭＣから単離した。この方法で典型的に達成された単離ＮＫ細胞の純度は、９０％よりも高かった。新たに単離したＮＫ細胞を、１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で標的細胞Ｈ９２９と混合した。抗体希釈範囲は、１０ｎＭから開始して１／５希釈した（ｎ＝７濃度）。翌日、培養物から上清を収集し、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびランテス濃度をＥＬＩＳＡで測定した。本明細書では図２４に実証されているように、構築物１は、ＢＣＭＡ−ＩｇＧ１モノクローナルと比較して、新鮮な休止ＮＫ細胞によるサイトカインのより高い産生を促進し、腫瘍細胞の非存在下ではＮＫ細胞によるサイトカインの産生を誘導しない。
【０４３５】
（実施例１８）
ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを標的とする多重特異性抗原結合構築物１は、骨髄腫患者に由来する末梢ＮＫ細胞による、ＭＭ腫瘍細胞に対する活性化および細胞傷害性を誘導する
ＮＫｐ３０陽性（ｐｏｓ）またはＣＤ１６ｐｏｓＮＫ細胞の頻度を、健常者（ｎ＝５）または疾患状態が異なる多発性骨髄腫患者（ｎ＝５）から単離されたＰＢＭＣを使用してフローサイトメトリーで評価した（図２５Ａ）。図２５Ａで使用したものと同じＭＭ患者に由来するＰＢＭＣを、モネンシンおよびブレフェルジンＡの存在下において、１０ｎＭの構築物１、またはトラスツズマブ（アイソタイプ対照として使用）、または無抗体の存在下で、ＭＭ．１Ｓ腫瘍細胞に対して試験した。ＮＫ細胞脱顆粒およびＩＦＮγ産生を、ＮＫ（ＣＤ５６ｐｏｓ、ＣＤ３陰性（ｎｅｇ））ＣＤ１０７ｐｏｓ細胞およびＮＫ（ＣＤ５６ｐｏｓ、ＣＤ３ｎｅｇ）ＩＦＮγ陽性細胞をゲート制御することによりフローサイトメトリーを使用して測定した。図２５Ａおよび図２５Ｂに示されているように、ＭＭ患者に由来するＰＢＭＣ上でのＮＫｐ３０およびＣｄ１６Ａの発現は、健常個体と同等であり、ＭＭ患者に由来するＮＫ細胞は、構築物１に応答して高い機能性を表示する。
【０４３６】
（実施例１９）
ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを標的とする多重特異性抗原結合構築物１は、多発性骨髄腫患者の骨髄に由来する自家骨髄腫細胞のＮＫ細胞殺傷を誘導する
骨髄細胞を一団の抗体で染色して、多発性骨髄腫であると新たに診断された患者に由来する骨髄形質細胞（ＣＤ１３８ｐｏｓ）上でのＢＣＭＡ、ＣＳ１、およびＣＤ３８の発現を測定した。この患者のＢＭにおけるＮＫ細胞の頻度、ならびにＮＫ細胞上でのＮＫｐ３０、ＣＤ１６Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、およびＮＫｐ４６の発現を、図２６Ａに示されているように、リンパ球およびＣＤ５６ｐｏｓ、ＣＤ３ｎｅｇ細胞をゲート制御することによりフローサイトメトリーで評価した。図２６Ｂは、ＣＤ１３８ｐｏｓ多発性骨髄腫細胞の頻度の減少としてフローサイトメトリーで測定したところ、構築物１、構築物１の非グリコシル化（Ｆｃヌル）バージョンである構築物３、およびＢＣＭＡ−ＩｇＧ１  ｍＡｂの存在下で、自家骨髄形質細胞の死を示す。データは、抗体を含まない対照ウェルに対して正規化した。構築物１、または構築物３、またはＢＣＭＡ−ＩｇＧ１  ｍＡｂの存在下で骨髄細胞を試験した場合、構築物１およびその非グリコシル化バージョンである構築物３では、ＢＣＭＡ−ＩｇＧ１モノクローナル対照と比較してより高い程度の悪性骨髄細胞の死が、無抗体対照に対して観察された。
【０４３７】
（実施例２０）
ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物は、可溶性ＢＣＭＡリガンドであるＡＰＲＩＬの存在下で結合を向上させた
抗ＢＣＭＡ−ＩｇＧ１、構築物５（親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体）、および構築物１を、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＡＰＲＩＬと混合し、Ｈ９２９（ＢＣＭＡｐｏｓ）がん細胞と共に４５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２で１５分間染色した。結合データを、フローサイトメトリーで評価した。図２７に示されているように、親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体である多重特異性抗原結合構築物５は、可溶性ＡＰＲＩＬの存在下でさえ、ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞に結合することができる。
【０４３８】
（実施例２１）
ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物の活性は、可溶性ＢＣＭＡリガンドであるＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの存在による影響を受けない
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）をＰＢＭＣから単離した。この方法で典型的に達成された単離ＮＫ細胞の純度は、９０％よりも高かった。単離ＮＫ細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、ＩＬ−２およびＩＬ−１５で補完された培地で一晩培養した。翌日、ＮＫ細胞を、標的細胞Ｕ２６６−Ｂ１およびＭＭ１Ｒと混合した。ＮＫ細胞および標的細胞は、２：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で使用した。抗体希釈範囲は、２５ｎＭから開始して１／１０希釈した（ｎ＝３濃度）。ＩＦＮγのＥＬＩＳＡアッセイは、４８時間後に３７℃にて９６Ｕ底ウェルプレートで実施した。本明細書では図２８に実証されているように、構築物５（親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体）の活性は、両方とも多発性骨髄腫患者の血清に見出される可溶性ＡｐｒｉｌおよびＢＡＦＦ（ＢＣＭＡリガンド）の存在による影響を受けない。
【０４３９】
（実施例２２）
ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物の活性は、可溶性ＢＣＭＡの存在による影響を受けない
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）をＰＢＭＣから単離した。この方法で典型的に達成された単離ＮＫ細胞の純度は、９０％よりも高かった。単離ＮＫ細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、ＩＬ−２およびＩＬ−１５で補完された培地で一晩培養した。翌日、ＮＫ細胞を、１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で標的Ｈ９２９細胞と混合した。抗体希釈範囲は、２５ｎＭから開始して１／１０希釈し（ｎ＝８濃度）、５０ｎｇ／ｍｌの可溶性ＢＣＭＡを有するかまたは有していなかった。ＩＦＮγのＥＬＩＳＡアッセイは、４８時間後に３７℃にて９６Ｕ底ウェルプレートで実施した。図２９に示されているように、親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する構築物５は、高レベルの可溶性ＢＣＭＡの存在下で活性を示す。
【０４４０】
（実施例２３）
ＢＣＭＡｌｏｗ標的細胞に対する、ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物の活性は保持される
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）をＰＢＭＣから単離した。この方法で典型的に達成された単離ＮＫ細胞の純度は、９０％よりも高かった。単離ＮＫ細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、ＩＬ−２およびＩＬ−１５で補完された培地で一晩培養した。翌日、ＮＫ細胞を、様々なレベルのＢＣＭＡコピー／細胞を発現する標的腫瘍細胞と２：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で混合した。ＩＦＮγのＥＬＩＳＡアッセイは、４８時間後に３７℃にて９６Ｕ底ウェルプレートで実施した。データは、構築物５が、ＢＣＭＡ高（ｈｉｇｈ）発現腫瘍細胞に対して選択性を示し、ＢＣＭＡ低（ｌｏｗ）発現腫瘍細胞に対して活性を保持したが、２，０００ＢＣＭＡコピー／細胞未満を発現する腫瘍細胞（例えば、Ｒａｊｉ）に対しては活性を示さなかったことを示す。図３０に示されているように、構築物５は、ＢＣＭＡｈｉｇｈ発現腫瘍細胞に対して選択性を示し、ＢＣＭＡｌｏｗ発現腫瘍細胞に対して活性を保持したが、２，０００ＢＣＭＡコピー／細胞未満を発現する腫瘍細胞（例えば、Ｒａｊｉ）に対しては活性を示さなかった。
【０４４１】
（実施例２４）
ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物は、より高発現ＢＣＭＡ腫瘍細胞に対して選択性を示し、低ＢＣＭＡ発現細胞で活性を保持する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）をＰＢＭＣから単離した。この方法で典型的に達成された単離ＮＫ細胞の純度は、９０％よりも高かった。単離ＮＫ細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、ＩＬ−２およびＩＬ−１５で補完された培地で一晩培養した。翌日、ＮＫ細胞を、様々なレベルのＢＣＭＡコピー／細胞を発現する様々な標的腫瘍細胞と、２：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で混合した。構築物５の抗体希釈範囲は、２５ｎＭから開始して１／１０希釈した（ｎ＝３濃度）。ＩＦＮγのＥＬＩＳＡアッセイは、４８時間後に３７℃にて９６Ｕ底ウェルプレートで実施した。図３１に示されているように、構築物５は、ピコモル濃度でさえ、ＢＣＭＡ発現レベルが様々である一連の細胞株と共に共培養したＮＫ細胞によるＩＦＮγ産生を誘導する活性を示した。
【０４４２】
（実施例２５）
ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物は、低コピー／細胞のＢＣＭＡを発現するリンパ腫細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）をＰＢＭＣから単離した。この方法で典型的に達成された単離ＮＫ細胞の純度は、９０％よりも高かった。単離ＮＫ細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、ＩＬ−２およびＩＬ−１５で補完された培地で一晩培養した。翌日、ＮＫ細胞を、約５０００ＢＣＭＡコピー／細胞を発現するＪｅＫｏ−１標的リンパ腫細胞と２：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で混合した。構築物Ｘの抗体希釈範囲は、２５ｎＭから開始して１／１０希釈した（ｎ＝６濃度）。ＩＦＮγのＥＬＩＳＡアッセイは、４８時間後に３７℃にて９６Ｕ底ウェルプレートで実施した。図３２に示されているように、構築物５は、低コピー／細胞のＢＣＭＡを発現するリンパ腫細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化するが、ＢＣＭＡ−ＩｇＧ１モノクローナルは、いかなる活性も示さない。
【０４４３】
（実施例２６）
ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物により誘導される増殖シグナルは、主にＮＫｐ３０係合に依存する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）をＰＢＭＣから単離した。この方法で典型的に達成された単離ＮＫ細胞の純度は、９０％よりも高かった。単離ＮＫ細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、ＩＬ−２およびＩＬ−１５で補完された培地で一晩培養した。初代ＮＫ細胞を、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識し、ＩＬ−２、および構築物５、ＢＣＭＡ、ＣＤ１６（Ｆｃを介して）に結合するが、ＮＫｐ３０には結合しない二重特異性物質［ＮＫｐ３０ヌル×ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１］、またはＢＣＭＡに結合するが、ＣＤ１６またはＮＫｐ３０には結合しない二重特異性物質［ＮＫｐ３０ヌル×ＢＣＭＡ  Ｆｃヌル］の存在下で、Ｈ９２９がん細胞と共にインキュベートした。５日後に、フローサイトメトリーによりＮＫ細胞増殖を測定し、ＣＴＶ希釈物を評価した。図３３に示されているように、構築物５は、ＣＤ１６Ａに結合するがＮＫｐ３０には結合しない二重特異性物質［ＮＫｐ３０ヌル×ＢＣＭＡ（ＩｇＧ１）］またはＣＤ１６ＡおよびＮＫｐ３０に結合しない二重特異性物質［ＮＫｐ３０ヌル×ＢＣＭＡ  Ｆｃヌル］よりも高い程度にＮＫ細胞増殖を誘導し、構築物５の増殖シグナルが、主にＮＫｐ３０係合に依存することを示す。
【０４４４】
（実施例２７）
Ｆｃの非フコシル化は、ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを標的とする多重特異性抗原結合構築物の活性を向上させる
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）をＰＢＭＣから単離した。この方法で典型的に達成された単離ＮＫ細胞の純度は、９０％よりも高かった。単離ＮＫ細胞を、脱顆粒アッセイで使用する前に、ＩＬ−２およびＩＬ−１５で補完された培地で一晩培養した。翌日、ＮＫ細胞を、標的Ｈ９２９細胞と１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で混合した。抗体希釈範囲は、２５ｎＭから開始して１／１０希釈した（ｎ＝６濃度）。ＮＫ細胞上のＣＤ１０７発現ならびに細胞内ＩＦＮγを、フローサイトメトリーで測定し、ＣＤ１０７および細胞内ＩＦＮγを発現するＮＫ細胞のパーセンテージを決定した。図３４に示されているように、多重特異性抗原結合構築物１に非フコシル化Ｆｃを有する構築物７を使用すると、活性が向上する。
【０４４５】
（実施例２８）
ＮＫｐ３０は、多発性骨髄腫患者の骨髄中のγδＴ細胞上に発現される
骨髄細胞を一団の抗体で染色し、４人の多発性骨髄腫患者のＢＭにおけるγδＴ細胞の頻度ならびにγδＴ細胞によるＮＫｐ３０の発現を、図３５Ａに示されているように、リンパ球、ＣＤ３ｐｏｓ、ＴＣＲγδｐｏｓ細胞をゲート制御することによりフローサイトメトリーで評価した。図３５Ｂは、各患者の骨髄穿刺液中のＴＣＲ  γδＴ細胞の頻度を示す。これらのデータは、多発性骨髄腫患者のＮＫｐ３０発現γδＴ細胞も、本明細書に記載されているＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを標的とする多重特異性抗原結合構築物を使用して活性化することができることを示す。
【０４４６】
（実施例２９）
多重特異性抗原結合構築物５は、ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞の増殖を阻止する
構築物５を、ＮＫ細胞の非存在下で、１００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬおよび１０ｎｇ／ｍｌのＢＡＦＦを有するかまたは有しない、ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞であるＭＭ．１Ｒを有する培養に１０ｐＭの濃度で添加した。腫瘍細胞増殖を、ＩＮＣＵＣＹＴＥ（登録商標）生細胞分析システムを使用して蛍光イメージング法により１００時間の期間にわたってモニターした。図３６に示されているように、親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体である多重特異性抗原結合構築物５は、１００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬおよび１ｎｇ／ｍｌのＢＡＦＦの存在下ならびにＮＫ細胞の非存在下でさえ、ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞であるＭＭ．１Ｒの増殖を阻止した。
【０４４７】
（実施例３０）
多重特異性抗原結合構築物５は、ＮＫ細胞のより大きな増殖および細胞分裂を両方とも誘導する
ＮＫ細胞を、ＩＬ−２、および構築物５（１ｎＭ）、ＢＣＭＡ−ＩｇＧ１抗体（１ｎＭ）、ＩｇＧ１対照抗体（トラスツズマブ）（１ｎＭ）、または無抗体の存在下にて、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識されたＨ９２９と共に５日間培養した。増殖を、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標）Ｖｉｏｌｅｔの希釈により測定し、ＮＫ細胞が起こした細胞分裂の数を、ＦＬＯＷＪＯソフトウェア（フロージョーＬＬＣ社（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）；米国オレゴン州アッシュランド（Ａｓｈｌａｎｄ）所在）を使用して算出した。図３７に示されているように、親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体である多重特異性抗原結合構築物５は、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標）Ｖｉｏｌｅｔの希釈により測定したところ、モノクローナルＢＣＭＡ−ＩｇＧ１抗体よりも高い程度にＮＫ細胞の増殖および細胞分裂を誘導した。
【０４４８】
（実施例３１）
多重特異性抗原結合構築物５は、ＢＣＭＡリガンドであるＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの存在下でさえ、ＭＭ．１Ｒ腫瘍細胞の強力なＮＫ細胞殺傷を誘導する
初代ＮＫ細胞を、構築物５［１００ｐＭ］、ＢＣＭＡ−ＩｇＧ１  ｍＡｂ［１００ｐＭ］、または無抗体の存在下または非存在下にて、２：１のエフェクター：標的比で、レンチウイルスＮｕｃＬｉｇｈｔ  ｇｒｅｅｎを形質導入したＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞ＭＭ．１Ｒと共に共培養した。ＮＫ細胞による腫瘍細胞殺傷は、ＩＮＣＵＣＹＴＥ（登録商標）生細胞分析システムを使用して蛍光イメージング法により４時間の期間にわたってモニターした。殺傷パーセントを、標的細胞のみの対照群の数に対して正規化することにより算出した。図３８に示されているように、親和性成熟ＢＣＭＡアームを有する多重特異性抗原結合構築物１の変異体である多重特異性抗原結合構築物５は、１００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬおよび１ｎｇ／ｍｌのＢＡＦＦの存在下で、ＮＫ細胞によるＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞ＭＭ．１Ｒの強力な殺傷を誘導した。
【０４４９】
（実施例３２）
多重特異性抗原結合構築物１は、広範囲の抗原発現を発現するＢＣＭＡ腫瘍細胞の強力な殺傷を誘導する
異なるドナーに由来する初代ＮＫ細胞を、系列希釈した構築物１またはＢＣＭＡ−ＩｇＧ１モノクローナル抗体の存在下で、様々なレベルのＢＣＭＡを発現する多発性骨髄腫腫瘍細胞株と共に４時間共培養した。腫瘍細胞の殺傷を、５：１のエフェクター：標的比を使用して実施した４時間のＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）放出アッセイにより評価した。異なるドナーに由来するエフェクターＮＫ細胞を用いた、標的Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、およびＲＰＭＩ８２２６腫瘍細胞の構築物１またはＢＣＭＡ−ＩｇＧ１モノクローナル抗体誘導性溶解のＥＣ５０値が示されている。データは、構築物１が、モノクローナルＢＣＭＡ−ＩｇＧ１抗体よりもはるかにより強力であったことを示す。ＲＰＭＩ８２２６で試験したＢＣＭＡ−ＩｇＧ１のＥＣ５０値は、ＢＣＭＡ−ＩｇＧ１がＢＣＭＡに対してＮＫ細胞を活性化しなかったため、該当なし（ｎ／ａ）として示されている。図３９に示されているように、ＮＫｐ３０およびＢＣＭＡを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物１は、モノクローナルＢＣＭＡ−ＩｇＧ１抗体と比較して、広範囲の抗原発現を発現するＢＣＭＡ腫瘍細胞の強力な殺傷を誘導する。
【０４５０】
（実施例３３）
多重特異性抗原結合構築物８は、ＣＤ１６Ａ係合の非存在下で活性を示す
初代ＮＫ細胞を使用した４時間のＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）殺傷アッセイを実施した。様々な用量の抗体の存在下におけるＨ９２９腫瘍細胞の殺傷は、構築物８［構築物５のＦｃヌルバージョン］またはＢＣＭＡ−ＩｇＧ１  ｍＡｂにより誘導される、Ｈ９２９腫瘍細胞の最大溶解のパーセンテージとして示されている。図４０に示されているように、多重特異性抗原結合構築物５の非グリコシル化（Ｆｃヌル）変異体である多重特異性抗原結合構築物８は、ＣＤ１６Ａ係合の非存在下でさえ活性を示す。
【０４５１】
（実施例３４）
多重特異性抗原結合構築物５は、低ＢＣＭＡ  ＪｅＫｏ−１腫瘍細胞のＮＫ細胞殺傷を誘導するが、ＢＣＭＡ陰性ＨＬ−６０腫瘍細胞のＮＫ細胞殺傷は誘導しない
初代ＮＫ細胞を、系列希釈（５倍）された構築物５の存在下で、低ＢＣＭＡ（陽性）ＪｅＫｏ−１腫瘍細胞またはＢＣＭＡ陰性ＨＬ−６０腫瘍細胞と共に４時間共培養した。図４１に示されているように、構築物５の存在下では、ＪｅＫｏ−１腫瘍細胞の殺傷が用量依存的に観察されたが、ＢＣＭＡ陰性ＨＬ−６０腫瘍細胞の殺傷は検出されなかった。
【０４５２】
（実施例３５）
Ｈｅｒ２およびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、優れた細胞傷害活性を呈する
Ｈｅｒ２およびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物の効果を分析するため、種々の構築物を研究した（図４２）。標準的な分子生物学技法を使用して、各々が、ヒトＨｅｒ２およびヒトＮＫｐ３０に特異的に結合する多重特異性抗原結合構築物である構築物ＣおよびＤを生成した。例えば、構築物Ｄは、抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１抗体を含み、この抗体の重鎖は、ポリＧＧＧＳ（配列番号２２）リンカーを介して抗Ｈｅｒ２抗体のＦｃ領域に接続されている抗ＮＫｐ３０抗体の重鎖可変領域をそのＣ末端にさらに含む融合タンパク質である。手短に言えば、Ｈｅｒ２陽性ＳＫ−ＢＲ３細胞株を、エフェクターＫＨＹＧ−１ＮＫ細胞株と共に使用した。標的細胞およびＮＫ細胞を、１ｎＭの構築物Ｃ、構築物Ｄ、またはトラスツズマブと混合し、５％ＣＯ２インキュベーターで４時間３７℃にてインキュベートした。標的ＳＫ−ＢＲ３細胞からのＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）放出を、読出しとして測定した。Ｈｅｒ２およびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、特異的溶解のパーセンテージにより測定したところ、抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体単独、トラスツズマブ単独と比較して優れた活性を呈することが示された。
【０４５３】
（実施例３６）
ＢＣＭＡおよびＮＫｐ３０を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、γδＴ細胞による標的細胞殺傷を促進する
ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞を、新鮮なバフィコートから単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＣＤ３およびγδＴＣＲの陽性発現に従って、ＦＡＣｓＡＲＩＡを使用して選別し、合計で約２．５×１０４個の濃縮γδＴ細胞を得た。γδＴ細胞を、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３、０．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８、１００ＩＵのＩＬ−２、および１μｇ／ｍＬのＰＨＡと共に１×１０６個／ｍＬで約１２日間培養した。γδＴ細胞の最終収量は、約６×１０６個だった。
【０４５４】
拡大増殖したγδＴ細胞の表現型および機能評価は、図４３に示されている。図示されているように、拡大増殖したγδＴ細胞のおよそ４０％は、ＮＫｐ３０発現に対して陽性である。
【０４５５】
拡大増殖したγδＴ細胞のさらなる表現型および機能評価を実施した。γδＴ細胞を計数し、１０ｎＭ濃度のＣＦＳＥ  Ｆａｒ  Ｒｅｄで染色し、１ウェル当たり１００，０００細胞でＲＰ１０＋１０ＩＵのＩＬ−２に播種した。Ｕ２６６標的細胞をｃｅｌｌ  ｔｒａｃｅ  ＣＦＳＥで染色し、１ウェル当たり５０，０００標的細胞でＲＰ１０に播種し、最終２：１エフェクター：標的比をもたらした。構築物５の系列希釈物を、ＲＰ１０培地で１０ｎＭから開始して１０倍系列希釈して調製し、合計７つのデータ点を作成した。プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍでインキュベートし、緑色および赤色チャネルの画像を２時間毎に撮影した。図４４に示されているように、標的Ｕ２６６細胞のＴ細胞特異的細胞傷害性は、構築物５の存在下では用量依存的効果を示す。さらに、図４５に実証されているように、構成物５の存在下でのみ、３０分後に標的Ｕ２６６細胞の殺傷が観察された。左パネルおよび右パネルでは両方とも、標的Ｕ２６６細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  ＣＦＳＥで緑色に標識されている。３０分後、１０ｐＭの構築物５の存在下でのみ、標的Ｕ２６６細胞が顕著に減少し（右パネル）、構築物５によるγδＴ細胞上のＮＫｐ３０の係合が、標的細胞殺傷を促進することを実証する。標的Ｕ２６６細胞の減少に加えて、図４６に示されているように、γδＴ細胞が４８時間後に増加する。上部パネルおよび下部パネルでは両方とも、γδＴ細胞は、ＣＦＳＥ  Ｆａｒ  Ｒｅｄで標識されているが、１０ｐＭの構築物５の存在下でのみ（底部パネル）γδＴ細胞の数の増加が見られ、構成物５によるγδＴ細胞上のＮＫｐ３０の係合が、γδＴ細胞増殖を増加させることが実証されている。
【０４５６】
（実施例３７）
ＮＫｐ３０に対する不可欠な結合残基の識別
ＮＫｐ３０突然変異体の抗体結合を、Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ３８４システム（ポールフォーテバイオコーポレーション社（Ｐａｌｌ  Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国カリフォルニア州メンローパーク（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ）所在）で実施した。Ｈｉｓタグ付きＮＫｐ３０突然変異体を、順化培地からＨＩＳ１Ｋ  Ｏｃｔｅｔセンサーで直接的に捕捉した。次いで、センサーを１００ｎＭ試験抗体に曝露した。ＦｏｒｔｅＢｉｏのデータ分析ソフトウェア７．０を使用してデータを処理し、結合応答を表にして報告した。
【０４５７】
ＮＫｐ３０内のどのアミノ酸残基が、ヒトＮＫｐ３０に対するｍＡｂ８、ｍＡｂ１０、およびｍＡｂ１１の結合に不可欠であるかを決定するため、複合アラニンおよびアルギニンスキャニング突然変異誘発分析（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ａｌａｎｉｎｅ  ａｎｄ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施して、ＮＫｐ３０に対する抗体結合に重要な残基を識別した。ＮＫｐ３０に対するＮＫｐ３０リガンドＢ７−Ｈ６の結合に重要であることが知られている選択されたアミノ酸残基位置に単一の点突然変異を有するＮＫｐ３０突然変異体を生成した。その後、これらのＨｉｓタグ付きＮＫｐ３０突然変異体を、ｍＡｂ８、ｍＡｂ１０、およびｍＡｂ１１に結合するそれらの能力について試験した。
【０４５８】
ｍＡｂ８の場合、Ｉ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３が、ＮＫｐ３０に対する結合に重要なアミノ酸残基であると識別された。それは、これらの残基を突然変異させると、ＮＫｐ３０に対する結合の喪失がもたらされたからである。ｍＡｂ１０およびｍＡｂ１１の場合、Ｉ５０およびＬ１１３が、ＮＫｐ３０に対する結合に重要なアミノ酸残基であると識別された。それは、これらの残基を突然変異させると、ＮＫｐ３０に対する結合の喪失がもたらされたからである。図４７Ａは、ＮＫｐ３０の部分的アミノ酸配列を有する表を示す。この表では、ｍＡｂ８、ｍＡｂ１０、およびｍＡｂ１１が結合するエピトープを構成する残基は、太字で示されている。また、図４７Ｂには、残基Ｉ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３が球体として示されているヒトＮＫｐ３０のＸ線結晶解析画像（左パネル）、ならびに残基Ｉ５０、Ｓ８２、およびＬ１１３が球体として示されている、Ｂ７−Ｈ６に結合しているヒトＮＫｐ３０のＸ線結晶解析画像（右パネル）が描かれている。これらの図は、本明細書に記載されているＮＫｐ３０抗原結合性タンパク質が、ＮＫｐ３０の立体構造エピトープまたは非リニアエピトープに結合し、それによりリガンド結合を阻止することを示す。
【０４５９】
【表１−１】
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【０４６０】
【表１−２】
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【０４６１】
【表１−３】
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【０４６２】
【表１−４】
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【０４６３】
【表１−５】
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【０４６４】
【表１−６】
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【０４６５】
【表１−７】
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【０４６６】
【表１−８】
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【０４６７】
【表１−９】
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【０４６８】
【表１−１０】
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【０４６９】
【表１−１１】
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【０４７０】
【表１−１２】
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【０４７１】
【表１−１３】
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【０４７２】
【表１−１４】
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【０４７３】
【表１−１５】
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【０４７４】
【表１−１６】
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【０４７５】
【表１−１７】
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【０４７６】
【表１−１８】
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【０４７７】
【表１−１９】
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【０４７８】
【表１−２０】
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【０４７９】
【表１−２１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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