(57)【要約】本発明は、組成物をインキュベートすることにより成熟フォン・ヴィルブランド因子（ｍａｔ−ＶＷＦ）をフォン・ヴィルブランド因子プロペプチド（ＶＷＦ−ＰＰ）から分離する方法に関し、前記方法は、非共有結合的に会合しているｍａｔ−ＶＷＦとＶＷＦ−ＰＰを分断することによりｍａｔ−ＶＷＦとＶＷＦ−ＰＰの解離を誘導する工程であって、前記解離を、（ｉ）少なくとも１つのキレート剤を添加することまたは（ｉｉ）ｐＨを少なくともｐＨ７に上昇させることによって誘導する、工程と、次いで前記ｍａｔ−ＶＷＦを回収して、プロペプチドを枯渇させた高純度成熟ＶＷＦ（ｍａｔ−ＶＷＦ）を取得する工程とを含む。2021519280.tif 000019
2021519280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、プロペプチドを枯渇させた高純度成熟組換えｒＶＷＦ（ｍａｔ−ｒＶＷＦ）を含む組成物を取得するための方法：
（ａ）ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及びｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含む溶液を提供する工程；
（ｂ）（ａ）の前記溶液中の前記ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体の、ｍａｔ−ｒＶＷＦ及びｒＶＷＦ−ＰＰへの解離を誘導する工程であって、前記解離を、非共有結合的に会合したｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰの分断によって生じさせ、前記解離を、
（ｉ）少なくとも１つのキレート剤を添加すること、または
（ｉｉ）ｐＨを少なくともｐＨ７に上昇させること
によって誘導する、工程；ならびに
（ｃ）前記ｍａｔ−ｒＶＷＦを回収し、少なくとも９５％の成熟ｒＶＷＦと５％未満のｒＶＷＦ−ＰＰとを含む高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物を取得する工程。
【請求項２】
前記高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物が、少なくとも９６％のｍａｔ−ｒＶＷＦと４％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、少なくとも９７％のｍａｔ−ｒＶＷＦと３％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、少なくとも９８％のｍａｔ−ｒＶＷＦと２％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、少なくとも９９％のｍａｔ−ｒＶＷＦと１％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、または少なくとも９９．５％のｍａｔ−ｒＶＷＦと０．５％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、または９９．９％のｍａｔ−ｒＶＷＦと０．１％未満のｒＶＷＦ−ＰＰを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液が、細胞培養培地、抗体カラムフロースルー溶液、及び緩衝溶液からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記溶液が、工程（ａ）の前にフューリンで処理されている、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記溶液が、抗体カラムフロースルー溶液である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのキレート剤が、二価陽イオンキレート剤である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記二価陽イオンキレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ、及びクエン酸塩からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｐＨを、少なくとも７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０に上昇させる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｐＨを、少なくとも約７．２〜約７．８に上昇させる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｐＨを、少なくとも約７．６に上昇させる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｐＨを、塩基性アミノ酸、トリス、ＮａＯＨ、トリシン、またはエタノールアミンの添加によって上昇させる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の工程（ｂ）での前記回収が、１つ以上のタンパク質分離方法を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上のタンパク質分離方法が、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、膜技術による物理的サイズ分離、及びアフィニティークロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質分離方法が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上のタンパク質分離方法が、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）が、陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）が、陰イオン交換クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーの組み合わせである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上のタンパク質分離方法が、緩衝系を含み、前記緩衝系が、１つ以上の緩衝液を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上の緩衝液が、洗浄緩衝液を含み、前記１つ以上の洗浄緩衝液が、１、２、３、４、及び／または５つの洗浄緩衝液を含み、前記１つ以上の緩衝液が５つの洗浄緩衝液を含む場合、前記第１、第２、第３、及び／または第５の洗浄緩衝液が、前記第４の洗浄緩衝液よりも高いｐＨを有し、前記１つ以上の緩衝液が４つの洗浄緩衝液を含む場合、前記第１、第２、及び／または第４の洗浄緩衝液は、前記第３の洗浄緩衝液よりも高いｐＨを有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の洗浄緩衝液の後にウイルス不活化処理工程をさらに含み、場合により、前記ウイルス不活化処理工程のｐＨが、前記第３及び／または第４の洗浄緩衝液よりも高いｐＨである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の緩衝液が、前記１つ以上のキレート剤を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上の緩衝液が、少なくともｐＨ７を示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上のタンパク質分離方法が、緩衝系を含み、前記緩衝系が、１つ以上のローディング緩衝液を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つ以上のローディング緩衝液が、前記１つ以上のキレート剤を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記１つ以上のローディング緩衝液が、少なくともｐＨ７を示す、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記１つ以上のタンパク質分離方法が、緩衝系を含み、前記緩衝系が、１つ以上のローディング緩衝液、洗浄緩衝液、及び／または溶出緩衝液を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つ以上のローディング緩衝液、洗浄緩衝液、及び／または溶出緩衝液が、前記１つ以上のキレート剤を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記１つ以上のローディング緩衝液、洗浄緩衝液、及び／または溶出緩衝液が、少なくともｐＨ７を示す、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記１つ以上のローディング緩衝液、洗浄緩衝液、及び／または溶出緩衝液が、前記１つ以上のキレート剤を含みかつ少なくともｐＨ７を示す、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記緩衝系が、グリシンＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、トリスＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）、ヒスチジン、イミダゾール、酢酸クエン酸塩、ＭＥＳ、及び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸からなる群から選択される、請求項１８〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記緩衝液が、１つ以上の一価陽イオンをさらに含む、請求項１８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記１つ以上の一価陽イオンが、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、及びＣｓ＋からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記一価陽イオンがＮａ＋である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記緩衝液が、１つ以上の一価、二価及び／または三価陰イオンをさらに含む、請求項１８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つ以上の一価、二価及び／または三価陰イオンが、Ｃｌ−、酢酸−、ＳＯ４２−、Ｂｒ−、及びクエン酸３−からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記緩衝系が、２５℃で≧０．５ｍＳ／ｃｍの導電性を示す少なくとも１つの緩衝液を含む、請求項１８〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記緩衝系が、２５℃で１５．０±０．２ｍＳ／ｃｍの導電性を示す少なくとも１つの緩衝液を含む、請求項１８〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記緩衝液が、１つ以上の非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１８〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記非イオン性界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０、及びＴｗｅｅｎ２０からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記緩衝液が、非還元糖、糖アルコール、及びポリオールからなる群から選択される１つ以上の追加の物質をさらに含む、請求項１８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物が、≦２．０％の宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルを有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物が、≦０．６％の宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルを有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及びｒＶＷＦ−ＰＰを含む前記溶液が、ｒＶＷＦの捕捉工程から得られる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及びｒＶＷＦ−ＰＰを含む前記溶液が、ＦＶＩＩＩ免疫親和性工程及び陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含む方法に由来する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
以下の工程を含む、プロペプチドを枯渇させた高純度成熟組換えｒＶＷＦ（高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ）を含む組成物を取得するための方法：
（ａ）プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含む溶液を陰イオン交換カラムにロードし、前記プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを、前記陰イオン交換カラムに結合させる工程；
（ｂ）前記結合したプロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを含有する（ａ）の前記陰イオン交換カラムを１つ以上の洗浄緩衝液で洗浄する工程；
（ｃ）前記結合したプロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを含む（ｂ）の前記カラムをフューリンで処理する工程であって、前記フューリンが前記プロｒＶＷＦをｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰに切断する、工程；
（ｄ）前記結合したプロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを（ｃ）の前記カラムから溶出緩衝液で溶出する工程であって、前記溶出緩衝液が、前記ｒＶＷＦ−ＰＰと非共有結合的に会合しているｍａｔ−ｒＶＷＦからの前記ｒＶＷＦ−ＰＰの解離を誘導し、前記解離を、
（ｉ）少なくとも１つのキレート剤を前記溶出緩衝液に添加すること、または
（ｉｉ）前記溶出緩衝液のｐＨを少なくともｐＨ７に上昇させること
によって誘導する、工程；ならびに
（ｅ）前記ｍａｔ−ｒＶＷＦを前記ｒＶＷＦ−ＰＰから分離させて回収し、高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物を取得する工程であって、前記高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物が、少なくとも９５％の成熟ｒＶＷＦと５％未満のｒＶＷＦ−ＰＰを含む、工程。
【請求項４６】
前記１つ以上の緩衝液が、洗浄緩衝液を含み、前記１つ以上の洗浄緩衝液が、１、２、３、４、及び／または５つの洗浄緩衝液を含み、前記１つ以上の緩衝液が５つの洗浄緩衝液を含む場合、前記第１、第２、第３、及び／または第５の洗浄緩衝液が、前記第４の洗浄緩衝液よりも高いｐＨを有し、前記１つ以上の緩衝液が４つの洗浄緩衝液を含む場合、前記第１、第２、及び／または第４の洗浄緩衝液は、前記第３の洗浄緩衝液よりも高いｐＨを有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１の洗浄緩衝液の後にウイルス不活化処理工程をさらに含み、場合により、前記ウイルス不活化処理工程のｐＨが、前記第３及び／または第４の洗浄緩衝液よりも高いｐＨである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
（ａ）及び（ｂ）を単一の工程で同時に行う、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
（ａ）の前記溶液が、モノクローナル抗体カラム由来のフロースルーを含み、前記モノクローナル抗体が、ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体である、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
（ａ）の前記溶液が、細胞培養培地、抗体カラムフロースルー溶液、及び緩衝溶液からなる群から選択される、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記少なくとも１つのキレート剤が、二価陽イオンキレート剤である、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記二価陽イオンキレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ、及びクエン酸塩からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｐＨを、少なくとも７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０に上昇させる、請求項４５〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ｐＨを、少なくとも約７．２〜約７．８に上昇させる、請求項４５〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ｐＨを、少なくとも約７．６に上昇させる、請求項４５〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ｐＨを、塩基性アミノ酸の添加により上昇させる、請求項４５〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
（ｂ）の前記１つ以上の洗浄緩衝液が、前記１つ以上のキレート剤を含む、請求項４５〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
（ｂ）の前記１つ以上の洗浄緩衝液が、少なくともｐＨ７を示す、請求項４５〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
（ｂ）の前記１つ以上の洗浄緩衝液が、前記１つ以上のキレート剤を含みかつ少なくともｐＨ７を示す、請求項４５〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
ウイルス不活化工程をさらに含み、前記ウイルス不活化を、洗浄工程及び／または溶出工程の前に、後に、または同時に、ただし回収の工程の前に実施する、請求項４５〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ウイルス不活化処理が、脂質エンベロープウイルスを不活化する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ウイルス不活化処理が、Ｓ／Ｄ処理である、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記１つ以上の緩衝液が、グリシンＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、トリスＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）、ヒスチジン、イミダゾール、酢酸クエン酸塩、ＭＥＳ、及び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸からなる群から選択される緩衝液を含む、請求項４５〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記１つ以上の緩衝液が、１つ以上の一価陽イオンをさらに含む、請求項４５〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記１つ以上の一価陽イオンが、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、及びＣｓ＋からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記一価陽イオンがＮａ＋である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記１つ以上の緩衝液が、１つ以上の一価、二価、及び／または三価陰イオンをさらに含む、請求項４５〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記１つ以上の一価、二価及び／または三価陰イオンが、Ｃｌ−、酢酸−、ＳＯ４２−、Ｂｒ−、及びクエン酸３−からなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記１つ以上の緩衝液が、２５℃で≧０．５ｍＳ／ｃｍの導電性を示す少なくとも１つの緩衝液を含む、請求項４５〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記１つ以上の緩衝液が、２５℃で１５．０±０．２ｍＳ／ｃｍの導電性を示す少なくとも１つの緩衝液を含む、請求項４５〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記１つ以上の緩衝液が、１つ以上の非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項４５〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記非イオン性界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０、及びＴｗｅｅｎ２０からなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記１つ以上の緩衝液が、非還元糖、糖アルコール、及びポリオールからなる群から選択される１つ以上の追加の物質をさらに含む、請求項４５〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物が、≦２．０％の宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルを有する、請求項４５〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物が、≦０．６％の宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルを有する、請求項４５〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物を、医薬組成物の製造に用いる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
先行請求項のいずれか一項に記載の方法により生成される高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦと薬学的に許容される緩衝液とを含む、医薬組成物。
【請求項７８】
５０ｍＭグリシン、１０ｍＭタウリン、５％（ｗ／ｗ）スクロース、５％（ｗ／ｗ）Ｄ−マンニトール、０．１％ポリソルベート８０、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含み、約ｐＨ７．４のｐＨを有する、請求項７７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月２１日に出願された米国仮出願第６２／６４６，１０９号に対する優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、フォン・ヴィルブランド因子プロペプチド（ＶＷＦ−ＰＰ）から成熟フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
細胞内でのタンパク質の成熟の過程で、タンパク質は、翻訳後修飾を受けて成熟する。これらの修飾には、とりわけ、アセチル化、メチル化、グリコシル化、及びタンパク質分解切断が含まれる。これらの修飾は、多くの場合、タンパク質の機能及び活性に必要であり、タンパク質、特に酵素の効率にも影響を与える可能性がある。
【０００４】
プロタンパク質またはタンパク質前駆体は、これらの翻訳後修飾の１つ以上によって、特にプロタンパク質からのプロペプチドの切断によって活性型に変化する不活性タンパク質である。
【０００５】
これらのタンパク質の活性型は、有用な治療及び／または診断タンパク質であり得る。しかしながら、活性タンパク質は、通常、生体内で非常に少量しか利用可能ではない。したがって、活性タンパク質は、それらを組換え活性化酵素（例えば、プロテアーゼ）と接触させることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで好ましくは活性化されるそれらのプロタンパク質から組換え産生される。
【０００６】
フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）は、約５００〜２０，０００ｋＤのサイズの一連の多量体として血漿中を循環する糖タンパク質である。ＶＷＦのｃＤＮＡの全長がクローン化されており；プロポリペプチドは、全長プレプロＶＷＦのアミノ酸残基２３〜７６４に対応する（Ｅｉｋｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１，７７−９０（非特許文献1））。ＶＷＦの多量体型は、ジスルフィド結合によって互いに連結した２５０ｋＤのポリペプチドサブユニットからなる。ＶＷＦは、損傷した血管壁の内皮下層への初期の血小板接着を媒介し、より大きな多量体は高い止血活性を示す。多量体化したＶＷＦは、ＶＷＦのＡ１ドメインでの相互作用を介して血小板表面糖タンパク質Ｇｐ１ｂαに結合し、血小板の接着を促進する。ＶＷＦの他の部位は、血管壁への結合を媒介する。したがって、ＶＷＦは、血小板と血管壁の間に架橋を形成し、これは、高剪断応力条件下での血小板の接着及び一次止血に不可欠である。通常、内皮細胞は高分子型のＶＷＦを分泌し、低分子量のＶＷＦ型はタンパク質分解による切断から生じる。超高分子量の多量体は、内皮細胞のバイベル−パラーデ小体に貯蔵され、トロンビン及びヒスタミンなどのアゴニストによる刺激で遊離する。
【０００７】
工業的には、ＶＷＦ、特に組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）を、遺伝子改変型の細胞株、例えば、遺伝子改変型ＣＨＯ細胞株において、ｒＦＶＩＩＩと一緒に合成し、発現させる。共発現させるｒＶＷＦの機能は、細胞培養プロセスにおいてｒＦＶＩＩＩを安定化させることである。ｒＶＷＦは、成熟ＶＷＦ（ｍａｔＶＷＦ）サブユニットのＮ末端に結合した高分子プロペプチド（ＶＷＦ−ＰＰ）を含む、プレプロペプチドＶＷＦ（ｐｒｅｐｒｏ−ＶＷＦ）として細胞内で合成される。小胞体及びゴルジ体で成熟すると、ＶＷＦ−ＰＰは細胞内プロテアーゼフューリンの作用によって切断され、発現タンパク質の二量体からなる同一サブユニットのホモポリマーとして分泌される。いくつかの場合では、フューリン切断により、ＶＷＦプロペプチドと非共有結合した成熟ＶＷＦを含むヘテロ二量体複合体を生成する。
【０００８】
フューリンまたはフューリン様プロテアーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理により、ＶＷＦ−ＰＰを成熟ＶＷＦから分離することができる（Ｓｃｈｌｏｋａｔ  Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：２５７−２６７（非特許文献2）；Ｐｒｅｉｎｉｎｇｅｒ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０：１−１５（非特許文献3））。フューリンは、プロタンパク質コンバターゼのファミリーに属し、Ｃａ２＋依存性である。この酵素は、特定の配列内のアルギニンのＣ末端ペプチド結合を特異的に切断し、位置−１及び−４にアルギニンを含む。この配列は多くのヒトタンパク質に認められ、フューリンが多くのヒトプロペプチド−タンパク質の成熟に主要な役割を果たしていることを示している。本発明の方法で使用されるフューリンは、好ましくは組換え起源のものである。組換え産生されるプロテアーゼは、大量に産生可能であるため、有用である。いくつかの実施形態では、フューリンは、前記プロテアーゼまたは細胞抽出物を分泌する細胞株の粗細胞培養上清から得られる。
【０００９】
現在の従来法は、プレプロペプチドＶＷＦをプロテアーゼとともに液相でインキュベートし、それによって成熟自体（例えば、プロタンパク質からのプロペプチドの切断）を遊離溶液中で非結合状態で生じさせるか、または例えばＷＯ２０００／０４９０４７（特許文献1）に記載されているように、プロテアーゼを固体担体に固定化し、ＶＷＦ−ＰＰを含む調製物と接触させ、インキュベートする（例えば、ＷＯ２０００／０４９０４７（特許文献1）を参照のこと）ことによって成熟ＶＷＦを生成する。ＶＷＦは、内皮細胞及び巨核球によって、大部分が反復ドメインからなるプレプロペプチドＶＷＦ（「プレプロＶＷＦ」）として合成される。シグナルペプチドが切断されると、プレプロ−ＶＷＦは小胞体のカルボキシ末端領域のジスルフィド結合を介して二量体化する。追加のジスルフィド結合がサブユニットのアミノ末端近傍に形成され、ゴルジ体で多量体を形成する。多量体への集合に続いて、プロペプチドプロセシングプロテアーゼであるフューリンによるＶＷＦプロペプチドのタンパク質分解切断が生じる。切断後、ＶＷＦプロペプチドは、ＶＷＦ多量体と非共有結合したまま、成熟ＶＷＦ／ＶＷＦ−ＰＰ複合体を形成する。刺激を受けると、複合体は血中に分泌され、ＶＷＦプロペプチドはＶＷＦ多量体から解離する。治療上有効な成熟ＶＷＦ多量体は、哺乳類細胞株でプロＶＷＦを組換え発現させ、一連のｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断及び精製工程を通じて、プロＶＷＦタンパク質をプロセシングして成熟ＶＷＦにすることにより産生することができる。しかしながら、当技術分野では、高純度で治療効果のある成熟ＶＷＦ多量体製剤（ｍａｔ−ｒＶＷＦ）を製造することが今なお必要とされており、本発明は、例えば、フューリン成熟後、精製プロセス中にキレート剤の添加及び／またはｐＨを少なくともｐＨ７に上昇させ、ｍａｔ−ｒＶＷＦからのＶＷＦ−プロペプチドの分離を促進することを含む、高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ製剤の取得方法を提供することによってこの必要性を満たす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２０００／０４９０４７
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｅｉｋｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１，７７−９０
【非特許文献２】Ｓｃｈｌｏｋａｔ  Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：２５７−２６７
【非特許文献３】Ｐｒｅｉｎｉｎｇｅｒ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０：１−１５
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、プロペプチドを枯渇させた高純度成熟組換えｒＶＷＦ（ｍａｔ−ｒＶＷＦ）を含む組成物を取得するための方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：
ａ）ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及びｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含む溶液を提供する工程；
ｂ）ａ）の前記溶液中の前記ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体の、ｍａｔ−ｒＶＷＦ及びｒＶＷＦ−ＰＰへの解離を誘導する工程であって、前記解離を、非共有結合的に会合したｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰの分断によって生じさせ、前記解離を、
ｉ．少なくとも１つのキレート剤を添加すること、または
ｉｉ．ｐＨを少なくともｐＨ７に上昇させること
によって誘導する、工程；ならびに
ｃ）前記ｍａｔ−ｒＶＷＦを回収し、少なくとも９５％の成熟ｒＶＷＦと５％未満のｒＶＷＦ−ＰＰとを含む高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物を取得する工程。
【００１３】
いくつかの実施形態では、高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物には、少なくとも９６％のｍａｔ−ｒＶＷＦと４％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、少なくとも９７％のｍａｔ−ｒＶＷＦと３％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、少なくとも９８％のｍａｔ−ｒＶＷＦと２％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、少なくとも９９％のｍａｔ−ｒＶＷＦと１％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、または少なくとも９９．５％のｍａｔ−ｒＶＷＦと０．５％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、または９９．９％のｍａｔ−ｒＶＷＦと０．１％未満のｒＶＷＦ−ＰＰが含まれる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、溶液は、細胞培養培地、抗体カラムフロースルー溶液、及び緩衝溶液からなる群から選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、溶液は、工程ａ）の前にフューリンで処理されている。
【００１６】
いくつかの実施形態では、溶液は、抗体カラムフロースルー溶液である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのキレート剤は、二価陽イオンキレート剤である。いくつかの実施形態では、二価陽イオンキレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ、及びクエン酸塩からなる群から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ｐＨを、少なくとも７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０に上昇させる。いくつかの実施形態では、ｐＨを、少なくとも約７．２〜約７．８に上昇させる。いくつかの実施形態では、ｐＨを、少なくとも約７．６に上昇させる。いくつかの実施形態では、ｐＨを、塩基性アミノ酸、トリス、ＮａＯＨ、トリシン、またはエタノールアミンの添加によって上昇させる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法の工程ｂ）における回収には、１つ以上のタンパク質分離方法が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のタンパク質分離方法は、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、膜技術による物理的サイズ分離、及びアフィニティークロマトグラフィーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、タンパク質分離方法は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。いくつかの実施形態では、１つ以上のタンパク質分離方法は、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）である。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）は、陽イオン交換クロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）は、陰イオン交換クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーの組み合わせである。
【００２０】
いくつかの実施形態では、１つ以上のタンパク質分離方法は、緩衝系を含み、前記緩衝系は、１つ以上の緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、前記１つ以上の緩衝液は、洗浄緩衝液を含み、前記１つ以上の洗浄緩衝液は、１、２、３、４、及び／または５つの洗浄緩衝液を含み、前記１つ以上の緩衝液が５つの洗浄緩衝液を含む場合、第１、第２、第３、及び／または第５の洗浄緩衝液は、第４の洗浄緩衝液よりも高いｐＨを有し、前記１つ以上の緩衝液が４つの洗浄緩衝液を含む場合、第１、第２、及び／または第４の洗浄緩衝液は、第３の洗浄緩衝液よりも高いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、方法は、第１の洗浄緩衝液の後にウイルス不活化処理工程をさらに含み、場合により、ウイルス不活化処理工程のｐＨは、前記第３及び／または第４の洗浄緩衝液よりも高いｐＨである。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、前記１つ以上のキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、少なくともｐＨ７を示す。
【００２１】
いくつかの実施形態では、１つ以上のタンパク質分離方法は、緩衝系を含み、前記緩衝系は、１つ以上のローディング緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のローディング緩衝液は、前記１つ以上のキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のローディング緩衝液は、少なくともｐＨ７を示す。
【００２２】
いくつかの実施形態では、１つ以上のタンパク質分離方法は、緩衝系を含み、前記緩衝系は、１つ以上のローディング緩衝液、洗浄緩衝液、及び／または溶出緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のローディング緩衝液、洗浄緩衝液、及び／または溶出緩衝液は、前記１つ以上のキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のローディング緩衝液、洗浄緩衝液、及び／または溶出緩衝液は、少なくともｐＨ７を示す。いくつかの実施形態では、１つ以上のローディング緩衝液、洗浄緩衝液、及び／または溶出緩衝液は、前記１つ以上のキレート剤を含み、また、少なくともｐＨ７を示す。
【００２３】
いくつかの実施形態では、緩衝系は、グリシンＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、トリスＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）、ヒスチジン、イミダゾール、酢酸クエン酸塩、ＭＥＳ、及び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸からなる群から選択される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、１つ以上の一価陽イオンをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の一価陽イオンは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、及びＣｓ＋からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、一価陽イオンは、Ｎａ＋である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、１つ以上の一価、二価、及び／または三価陰イオンをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の一価、二価及び／または三価の陰イオンは、Ｃｌ−、酢酸−、ＳＯ４２−、Ｂｒ−、及びクエン酸３−からなる群から選択される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、緩衝系は、２５℃で≧０．５ｍＳ／ｃｍの導電性を示す少なくとも１つの緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、２５℃で１５．０±０．２ｍＳ／ｃｍの導電性を示す少なくとも１つの緩衝液を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、１つ以上の非イオン性界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０、及びＴｗｅｅｎ２０からなる群から選択される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、非還元糖、糖アルコール、及びポリオールからなる群から選択される１つ以上の追加の物質をさらに含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物は、≦２．０％の宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルを有する。いくつかの実施形態では、高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物は、≦０．６％の宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルを有する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及びｒＶＷＦ−ＰＰを含む溶液は、ｒＶＷＦの捕捉工程から得られる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及びｒＶＷＦ−ＰＰを含む溶液は、ＦＶＩＩＩ免疫親和性工程及び陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含む方法に由来する。
【００３２】
本発明はまた、プロペプチドを枯渇させた高純度成熟組換えｒＶＷＦ（高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ）を含む組成物を取得するための方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：
ａ）プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含む溶液を陰イオン交換カラムにロードし、前記プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを、前記陰イオン交換カラムに結合させる工程；
ｂ）前記結合したプロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを含有するａ）の前記陰イオン交換カラムを１つ以上の洗浄緩衝液で洗浄する工程；
ｃ）前記結合したプロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを含むｂ）の前記カラムをフューリンで処理する工程であって、前記フューリンが、前記プロｒＶＷＦをｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰに切断する、工程；
ｄ）前記結合したプロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦをｃ）の前記カラムから溶出緩衝液で溶出する工程であって、前記溶出緩衝液が、前記ｒＶＷＦ−ＰＰと非共有結合的に会合しているｍａｔ−ｒＶＷＦからの前記ｒＶＷＦ−ＰＰの解離を誘導し、前記解離を、
ｉ．少なくとも１つのキレート剤を前記溶出緩衝液に添加すること、または
ｉｉ．前記溶出緩衝液のｐＨを少なくともｐＨ７に上昇させること
によって誘導する、工程；ならびに
ｅ）前記ｍａｔ−ｒＶＷＦを前記ｒＶＷＦ−ＰＰから分離させて回収し、高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物を取得する工程であって、前記高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物が、少なくとも９５％の成熟ｒＶＷＦと５％未満のｒＶＷＦ−ＰＰを含む、工程。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ａ）及びｂ）を、単一工程で同時に生じさせる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、前記１つ以上の緩衝液は、洗浄緩衝液を含み、前記１つ以上の洗浄緩衝液は、１、２、３、４、及び／または５つの洗浄緩衝液を含み、前記１つ以上の緩衝液が５つの洗浄緩衝液を含む場合、第１、第２、第３、及び／または第５の洗浄緩衝液は、第４の洗浄緩衝液よりも高いｐＨを有し、前記１つ以上の緩衝液が４つの洗浄緩衝液を含む場合、第１、第２、及び／または第４の洗浄緩衝液は、第３の洗浄緩衝液よりも高いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、方法は、第１の洗浄緩衝液の後にウイルス不活化処理工程をさらに含み、場合により、ウイルス不活化処理工程のｐＨは、前記第３及び／または第４の洗浄緩衝液よりも高いｐＨである。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ａ）の溶液は、モノクローナル抗体カラム由来のフロースルーを含み、前記モノクローナル抗体は、ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ａ）の溶液は、細胞培養培地、抗体カラムフロースルー溶液、及び緩衝溶液からなる群から選択される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのキレート剤は、二価陽イオンキレート剤である。いくつかの実施形態では、二価陽イオンキレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ、及びクエン酸塩からなる群から選択される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ｐＨを、少なくとも７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０に上昇させる。いくつかの実施形態では、ｐＨを、少なくとも約７．２〜約７．８に上昇させる。いくつかの実施形態では、ｐＨを、少なくとも約７．６に上昇させる。いくつかの実施形態では、ｐＨを、塩基性アミノ酸の添加によって上昇させる。いくつかの実施形態では、ｂ）の１つ以上の洗浄緩衝液は、前記１つ以上のキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、ｂ）の１つ以上の洗浄緩衝液は、少なくともｐＨ７を示す。いくつかの実施形態では、ｂ）の１つ以上の洗浄緩衝液は、前記１つ以上のキレート剤を含み、また、少なくともｐＨ７を示す。
【００３９】
いくつかの実施形態では、方法は、ウイルス不活化工程をさらに含み、前記ウイルス不活化を、洗浄工程及び／または溶出工程の前に、後に、または同時に、ただし回収の工程の前に実施する。いくつかの実施形態では、ウイルス不活化処理は、脂質エンベロープウイルスを不活化する。いくつかの実施形態では、ウイルス不活化処理は、溶媒及び界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、グリシンＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、トリスＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）、ヒスチジン、イミダゾール、酢酸クエン酸塩、ＭＥＳ、及び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸からなる群から選択される緩衝液を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、１つ以上の一価陽イオンをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の一価陽イオンは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、及びＣｓ＋からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、一価陽イオンは、Ｎａ＋である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、１つ以上の一価、二価、及び／または三価陰イオンをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の一価、二価及び／または三価の陰イオンは、Ｃｌ−、酢酸−、ＳＯ４２−、Ｂｒ−、及びクエン酸３−からなる群から選択される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、２５℃で≧０．５ｍＳ／ｃｍの導電性を示す少なくとも１つの緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、２５℃で１５．０±０．２ｍＳ／ｃｍの導電性を示す少なくとも１つの緩衝液を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、１つ以上の非イオン性界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０、及びＴｗｅｅｎ２０からなる群から選択される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、前記１つ以上の緩衝液は、非還元糖、糖アルコール、及びポリオールからなる群から選択される１つ以上の追加の物質をさらに含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物は、≦２．０％の宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルを有する。いくつかの実施形態では、高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物は、≦０．６％の宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルを有する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物を、医薬組成物の製造に用いる。
【００４８】
本発明はさらに、先行請求項のいずれかに記載の方法により生成される高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦと薬学的に許容される緩衝液とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、５０ｍＭグリシン、１０ｍＭタウリン、５％（ｗ／ｗ）スクロース、５％（ｗ／ｗ）Ｄ−マンニトール、０．１％ポリソルベート８０、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含み、前記組成物のｐＨは、約ｐＨ７．４である。
【００４９】
本発明の他の目的、利点、及び実施形態は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】実施例１に示す陽イオン交換体上の成熟ｒＶＷＦの精製を示す。
【図２】精製結果の表を示す。
【図３】実施例１の方法によるｍａｔ−ＶＷＦとｒ−ＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）の分離を示す銀染色タンパク質ゲル及びウェスタンブロットを示す。
【図４】実施例２及び３に対する実験セットアップのフローチャートを示す。
【図５】実施例２のクロマトグラムならびに実施例２及び３に用いるクロマトグラフィースキームを示す。
【図６】実施例２で使用する試薬の表及び結果の表を示す。
【図７】実施例２の別のクロマトグラム、及び実施例３の結果の表を示す。
【図８】実施例２及び実施例３の方法によるｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）の分離を示す銀染色タンパク質ゲルを示す。
【図９】実施例２及び実施例３の方法によるｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチドの分離を示すウェスタンブロットを示す。
【図１０】実施例４のクロマトグラム、クロマトグラフィースキーム、及び緩衝組成物を示す。
【図１１】実施例４の結果の表を示す。
【図１２】実施例４の方法によるｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）の分離を示す銀染色タンパク質ゲル及びウェスタンブロットを示す。
【図１３】実施例５のクロマトグラム、クロマトグラフィースキーム、及び緩衝液組成を示す。
【図１４】実施例５の結果の表を示す。
【図１５】実施例６のクロマトグラム、クロマトグラフィースキーム、及び緩衝液組成を示す。
【図１６】実施例６の結果の表を示す。
【図１７】実施例７のクロマトグラム、クロマトグラフィースキーム、及び緩衝液組成を示す。
【図１８】実施例７の結果の表を示す。
【図１９】実施例８のクロマトグラム、クロマトグラフィースキーム、及び緩衝液組成を示す。
【図２０】実施例８の結果の表を示す。
【図２１】実施例８の方法によるｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）の分離を示す銀染色タンパク質ゲルを示す。
【図２２】実施例８の方法によるｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチドの分離を示すウェスタンブロットを示す。１％アガロースゲルは、生成物の多量体パターンを示す。
【図２３】実施例８の方法によるｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）の分離を示すウェスタンブロットを示す。
【図２４】実施例９のクロマトグラム、クロマトグラフィースキーム、及び緩衝液組成を示す。
【図２５】実施例９の結果の表を示す。
【図２６】実施例９の生成物の表を示す。
【図２７】実施例９の方法によるｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチドの分離を示す銀染色タンパク質ゲルを示す。
【図２８】実施例９の方法によるｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチドの分離を示すウェスタンブロットを示す。１％アガロースゲルは、生成物の多量体パターンを示す。
【図２９】実施例９の方法によるｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチドの分離を示すウェスタンブロットを示す。
【図３０】実施例１、２、３、６、８、及び９に用いる強化型陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）で得られる、生成物を含有する画分の純度を示す。
【図３１】実施例１、２、３、６、８、及び９の生成物関連不純物の枯渇係数を示す。
【図３２】実施例４及び５に用いる強化型サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で得られる、生成物を含有する画分の純度を示す。
【図３３】実施例４及び５の生成物関連不純物の枯渇係数を示す。
【図３４】ＴＭＡＥ分離法で用いる緩衝製剤及び材料を示す。
【図３５】フューリン処理した成熟ＶＷＦ／ＶＷＦプロペプチド複合体のロード条件を示す。
【図３６】クロマトグラフィー法の緩衝液、条件、パラメータ、及び流速の詳細を示す。
【図３７】フューリン処理した成熟ＶＷＦ／ＶＷＦプロペプチド複合体の、成熟ＶＷＦ及びＶＷＦ−プロペプチド（ＶＷＦ−ＰＰ）への解離のクロマトグラムを示す。この図は、成熟ＶＷＦを含有する画分からのＶＷＦ−ＰＰの枯渇を示す。
【図３８】成熟ＶＷＦとＶＷＦ−プロペプチド（ＶＷＦ−ＰＰ）の分離の別のクロマトグラムを示す。この図は、成熟ＶＷＦを含有する画分からのＶＷＦ−ＰＰの枯渇を示す。
【図３９】図３９Ａ及び図３９Ｂは、成熟ＶＷＦとＶＷＦ−ＰＰの分離を含む、成熟ＶＷＦの例示的な精製方法の概略図を示す。
【図４０】本明細書に記載の陽イオン交換クロマトグラフィー法の利点のいくつかを強調した表を示す。
【図４１】クエン酸を含有するＳＱＡランニング緩衝液またはＳＱＣランニング緩衝液のいずれかを使用する、本明細書に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを用いたｒＶＷＦプロペプチドの分離を示す２つのクロマトグラムの概略を示す。ＳＥＣパラメータ（ＳＥＣ緩衝液）を変更することにより、残留ＶＷＦ−ＰＰの除去／分離が高まるとともに、成熟ＶＷＦの精製には変化がなかった。
【図４２】最適化されたＳＥＣ緩衝液（ＳＱＣ緩衝液）の利点のいくつかを強調する表を示す。ＳＱＣ緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含み、精製した成熟ＶＷＦ画分におけるＶＷＦ−ＰＰの量を減少させることが示された。
【図４３Ａ】ｒＶＷＦ用の下流の処理プロトコールのフローチャートを示す。図４３Ａは、現在使用されているプロセスを示す。
【図４３Ｂ】ｒＶＷＦ用の下流の処理プロトコールのフローチャートを示す。図４３Ｂは、改善されたＣＡＴ（ＵＮＯ＿Ｓ）工程を含む本明細書に記載のプロセスを示す。
【図４４】第１世代（Ｇｅｎ１）プロセス及び第２世代（Ｇｅｎ２）プロセスにおける工程ＣＡＴのクロマトグラフィーハードウェアの表を示す。
【図４５】Ｇｅｎ２プロセスの洗浄及び溶出条件の表を示す。
【図４６】ＵＮＯ＿Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ（工程ＣＡＴ）における第１世代及び第２世代のｒＶＷＦ小規模研磨工程の比較表を示す。
【図４７】ＵＮＯ＿Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓカラムの洗浄及び消毒手順の表を示す。
【図４８】ＣＡＴ研磨工程用の緩衝液の組成の表を示す。
【図４９】図４９Ａ及び図４９Ｂは、実行ＶＷ＿ＵＳＳ＿０５のクロマトグラムを示す。図４９Ａは、ＣＩＰ手順を含むクロマトグラム全体を示す。図４９Ｂは、３６％緩衝液Ｂ洗浄及び勾配溶出相を示す。紫外線吸収を、青色（２８０ｎｍ）及びマゼンタ（２５４ｎｍ）で示す。
【図５０】実行ＶＷ＿ＵＵＳ＿０５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色ゲル及びウェスタンブロットを示す。
【図５１】実行ＶＷ＿ＵＵＳ＿０５の多量体アガロースゲルを示す。
【図５２】本研究の異なる実行のｒＶＷＦ：Ａｇデータを示す。
【図５３】本研究の異なる実行のｒＶＷＦ  Ｒｉｓｔｏ  Ｃｏ活性データを示す。
【図５４】本研究の異なる実行のプロペプチド濃度（プロペプチド（μｇ／ｍｇ  ｒＶＷＦ：Ａｇ））データを示す。
【図５５】本研究の異なる実行のプロペプチド濃度（プロペプチド（μｇ  ＰＰ／１０００Ｕ  Ｒｉｓｔｏ））のデータを示す。
【図５６】本研究の異なる実行の溶出物プールにおける主要な分析結果を示す。
【図５７】手法開発を成功させるための目標となるＣＡＴ−Ｅ基準を示す。
【図５８】ｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰの分離における陰イオン交換、陽イオン交換、及びサイズ排除クロマトグラフィー法の例示的な実施形態を示す。
【図５９】様々なＶＷＦ形態：プロＶＷＦ（プロｒＶＷＦとも呼ばれる）、ｍａｔＶＷＦ／ＶＷＦ−ＰＰ複合体（ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ＶＷＦ−ＰＰ複合体とも呼ばれる）、ｍａｔＶＷＦ（ｍａｔ−ｒＶＷＦとも呼ばれる）、及びＶＷＦ−ＰＰ（ｒＶＷＦ−ＰＰとも呼ばれる）を示す。
【図６０−１】ＶＷＦの核酸配列及びアミノ酸配列を示す。
【図６０−２】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−３】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−４】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−５】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−６】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−７】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−８】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−９】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−１０】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−１１】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−１２】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−１３】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−１４】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−１５】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−１６】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−１７】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−１８】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６１】分析用のＤＦ３３３８／０４２ウェスタンブロット及び生データを示す。
【図６２】分析用のＤＦ３３６２／０２３ウェスタンブロット及び生データを示す。
【図６３】図６１と図６２のデータの比較を示す。
【図６４−１】代表的なＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示し、活性ＦＶＩＩＩがＶＷＦモチーフに埋め込まれている（ＶＷＦ７６４〜１３３６−ＦＶＩＩＩ重鎖２４〜７６０−ＶＷＦ２２１８〜２５９３−ＦＶＩＩＩ軽鎖１３３３〜２３５１−ＶＷＦ２６２０〜２８１３）。
【図６４−２】図６４−１の説明を参照のこと。
【図６４−３】図６４−１の説明を参照のこと。
【図６５−１】例示的なＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示し、ＦＶＩＩＩ−Ｂドメインがｎ−グリコシル化リッチドメインに置換されている（ＦＶＩＩＩ重鎖１９〜７６０−ｖＷＦ２２１８〜２５９３−ＦＶＩＩＩ軽鎖１３３３〜２３５１）。
【図６５−２】図６５−１の説明を参照のこと。
【図６５−３】図６５−１の説明を参照のこと。
【図６６】実施例１４に記載するバリアント型ｖＷＦの精製プロセスで用いる緩衝液及び組成物の表を示す。
【図６７】実行ＶＷ＿ＵＳＳ＿０７のクロマトグラム及びクロマトグラムスキームを示す。
【図６８】実行の主要な分析結果を示す。
【図６９】代表的な実行のＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色ゲルを示す。洗浄工程Ｗａｓｈ１、ＷＳＤ、及びＷａｓｈ２の間にｒｖＷＦ−プロペプチドの枯渇が観察された。
【図７０】実施例１５に記載するバリアント型ｖＷＦの精製プロセスで用いる緩衝液及び組成物の表を示す。本実施例は、さらなるシアリル化を試験するために、フューリン切断後のｒ−ＶＷＦポリペプチドからｒ−ｖＷＦプロペプチドを分離するための代替のバリアント型の実施形態を提供する。
【図７１】実行ＶＷ＿ＵＳＳ＿０６のクロマトグラム及びクロマトグラムスキームを示す。
【図７２】実行の主要な分析結果を示す。
【図７３】代表的な実行のＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色ゲルを示す。
【図７４】実施例１６に記載するバリアント型ｖＷＦの精製プロセスで用いる緩衝液及び組成物の表を示す。
【図７５】実行ＶＷ＿ＵＳＳ＿０８のクロマトグラム及びクロマトグラムスキームを示す。
【図７６】シアリル化の収量を含む、実行の主要な分析結果を示す。
【図７７】代表的な実行のＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色ゲルＤＦＭ０７２４７を示す。
【図７８】ＶＷ＿ＵＳＳ＿０６及びＶＷ＿ＵＳＳ＿０８の実行由来の溶出物のシアリル化特性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
発明の詳細な説明
Ｉ．序文
本明細書に記載の方法は、成熟ＶＷＦとＶＷＦプロペプチドを含む非共有結合的に結合したヘテロ二量体複合体から解離した成熟ＶＷＦとＶＷＦプロペプチドを分離させる。タンパク質分離法に対して、少なくとも１つのキレート剤を加えることによって、及び／または成熟ＶＷＦとＶＷＦプロペプチドを含む溶液のｐＨを少なくとも７．０まで上昇させることによって、この分離を促進する（誘導する）。本明細書に記載のすべての強化陰イオン交換（ＡＥＸ）、陽イオン交換（ＣＥＸ）及び／またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法を、あらゆるバリエーションで組み合わせて、特性が改善されたｒ−ｖＷＦを得ることができる。
【００５２】
ＩＩ．定義の選択
用語「組換え」とは、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクターに対して用いる場合、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくは異種タンパク質の導入または天然核酸もしくは天然タンパク質の変更によって改変されているか、あるいは細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、その細胞の天然（非組換え）型には認められない遺伝子を発現するか、または天然遺伝子を異常に発現するか、発現が少ないか、もしくはまったく発現しない。
【００５３】
本明細書中で使用する場合、「組換えＶＷＦ」または「ｒＶＷＦ」には、組換えＤＮＡ技術を介して得られたＶＷＦが含まれる。特定の実施形態では、本発明のｒＶＷＦタンパク質は、例えば、組換えＶＷＦの製造方法に関して参照により本明細書に援用されるＵＳ８，５９７，９１０に記載されているような構築物を含み得る。本発明におけるＶＷＦは、単量体及び多量体形態を含むすべての潜在的形態を含み得る。また、本発明は、組み合わせて使用するＶＷＦの異なる形態を包含することを理解すべきである。例えば、本発明のＶＷＦには、異なる多量体、異なる誘導体、ならびに生物学的に活性な誘導体及び生物学的に活性ではない誘導体の両方が含まれ得る。
【００５４】
本発明に関して、組換えＶＷＦは、例えば、霊長類、ヒト、サル、ウサギ、ブタ、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、イヌ、ネコなどの哺乳類由来のＶＷＦファミリーのいずれかのメンバー、及び生物学的に活性なその誘導体を包含する。活性を有する変異型及びバリアント型ＶＷＦタンパク質もまた、ＶＷＦタンパク質の機能的断片及び融合タンパク質と同様に、包含される。さらに、本発明のＶＷＦはさらに、精製、検出、またはその両方を促進するタグを有していてもよい。本明細書に記載のＶＷＦは、さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの治療的部分またはイメージングに適した部分で修飾されていてもよい。
【００５５】
用語「ＶＷＦ多量体」とは、少なくとも１０個のサブユニット、または１２、１４、もしくは１６個のサブユニット〜約２０、２２、２４もしくは２６個以上のサブユニットを含むＶＷＦを指す。用語「サブユニット」とは、ＶＷＦの多量体を指す。当技術分野で公知のように、重合してより高次の多量体を形成するのは、一般的に、ＶＷＦの二量体である。（例えば、すべての目的のために、特にＶＷＦの多量体分析に関するすべての教示のために、その全体を参照により本明細書に援用するＴｕｒｅｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．，２０１０，３６（５）：５１０−５２１を参照のこと）。
【００５６】
用語「プレプロペプチドＶＷＦ」、「プレプロＶＷＦ」または「プロＶＷＦ」とは、約２２アミノ酸残基のシグナルペプチド、約７４１アミノ酸残基のＶＷＦプロペプチド、及び約２０５０アミノ酸残基の成熟ＶＷＦサブユニットを含む非成熟ＶＷＦポリペプチドを指す。プロＶＷＦサブユニットは、小胞体のカルボキシル末端付近のジスルフィド結合を通じて二量体化し、ｔａｉｌ−ｔｏ  ｔａｉｌ型の二量体を形成することができ、次いでこれがゴルジ体に輸送される。ゴルジ体では、サブユニットのアミノ末端の近位に追加のｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ型のジスルフィド結合が形成され、それにより多量体が形成される。プロセシングプロテアーゼであるフューリンを介してＶＷＦプロペプチドのタンパク質分解性切断が生じ、そのようにして成熟ＶＷＦ／ＶＷＦ−ＰＰ複合体が生成する。ＶＷＦの名称の前に「ｒ」が含まれる場合、それは組換え型のバージョンであることを指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を、組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）に適用する。
【００５７】
用語「ＶＷＦ複合体」または「ｍａｔ−ＶＷＦ／ＶＷＦ−ＰＰ複合体」とは、成熟ＶＷＦサブユニットとＶＷＦプロペプチドを含む非共有結合ヘテロ二量体構造を指す。ＶＷＦ複合体は、プレプロペプチドＶＷＦのプロペプチド部分と成熟ＶＷＦ部分との間のフューリン切断の産物として生成し得る。ＶＷＦの名称の前に「ｒ」が含まれる場合、それは組換え型のバージョンであることを指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を、組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）に適用する。
【００５８】
用語「成熟ＶＷＦ」または「ｍａｔ−ＶＷＦ」とは、約２０５０アミノ酸残基の成熟ＶＷＦサブユニットを指す。成熟ＶＷＦサブユニットは、プレプロペプチドＶＷＦまたはＶＷＦ複合体の一部であり得る。成熟ＶＷＦは、ＶＷＦプロペプチドからの分離（単離）時に「遊離ＶＷＦ」と呼ばれ得る。ＶＷＦの名称の前に「ｒ」が含まれる場合、それは組換え型のバージョンであることを指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を、組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）に適用する。
【００５９】
用語「ＶＷＦプロペプチド」または「ＶＷＦ−ＰＰ」とは、約７４１アミノ酸残基のＶＷＦプロペプチドを指す。ＶＷＦプロペプチドは、プレプロペプチドＶＷＦまたはＶＷＦ複合体の一部であり得る。例えば、ＶＷＦ複合体において、ＶＷＦプロペプチドは、成熟ＶＷＦサブユニットと非共有結合的に会合している。ＶＷＦプロペプチドは、成熟ＶＷＦからの分離（単離）時に「遊離ＶＷＦプロペプチド」と呼ばれ得る。ＶＷＦの名称の前に「ｒ」が含まれる場合、それは組換え型のバージョンであることを指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を、組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）に適用する。
【００６０】
用語「単離した」、「精製した」、または「生物学的に純粋な」とは、その天然状態において通常は付随する成分を実質的または本質的に含まない物質を指す。純度及び均質性は、一般的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して測定する。ＶＷＦは、実質的に精製された調製物中に存在する主要な種である。いくつかの実施形態における用語「精製された」とは、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲル中で本質的に１つのバンドを生じさせることを示す。他の実施形態では、この用語は、核酸またはタンパク質が少なくとも５０％純粋であり、より好ましくは少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上純粋であることを意味する。他の実施形態における「精製する」または「精製」とは、精製する組成物から少なくとも１つの汚染物質を除去することを意味する。この意味では、精製は、精製される化合物が均質であること、例えば、１００％純粋であることを必要としない。
【００６１】
本明細書中で使用する場合、用語「約」とは、指定の値から±１０％の近似範囲を示す。例えば、語句「約２０％」は、１８〜２２％の範囲を包含する。
【００６２】
ＩＩＩ．実施形態の詳細な説明
本発明は、遊離成熟組換えフォン・ヴィルブランド因子（ｒＶＷＦ）を含有する高純度組成物を取得するための方法に関し、前記方法は以下の工程を含む：少なくとも１つのキレート剤を含むかまたは少なくともｐＨ７を有する溶液（例えば、解離溶液）を用いてｒＶＷＦプロペプチドから成熟ｒＶＷＦを解離する工程；ｒＶＷＦプロペプチドから遊離成熟ｒＶＷＦを分離する工程；及び、少なくとも９５％の遊離成熟ｒＶＷＦと５％未満のｒＶＷＦプロペプチドとを含む遊離成熟ｒＶＷＦ組成物を回収する工程。
【００６３】
本発明の方法は、成熟ＶＷＦを、そのＶＷＦプロペプチドからｉｎ  ｖｉｔｒｏで分離することに特に適している。いくつかの実施形態では、成熟ＶＷＦ及びＶＷＦ−ＰＰを含む溶液に１つ以上のキレート剤を添加するか、溶液のｐＨを少なくとも７．０に上昇させるか、またはそれらの組み合わせによって、分離を誘導する。いくつかの実施形態では、ｐＨを、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の範囲に上昇させる。
【００６４】
分離方法には、成熟ＶＷＦをＶＷＦ−ＰＰから単離するための１つ以上のタンパク質分離方法、例えば、クロマトグラフィー法の使用が含まれ得るが、これらに限定されない。この方法は、高純度の遊離の成熟ｒＶＷＦ組成物を産生することができる。いくつかの実施形態では、遊離の成熟ｒＶＷＦ組成物は、少なくとも９５％の遊離の成熟ｒＶＷＦ及び５％未満の遊離のｒＶＷＦ−ＰＰ及び／またはｍａｔＶＷＦ／ＶＷＦ−ＰＰ複合体を含む。いくつかの場合では、遊離の成熟ｒＶＷＦ組成物は、少なくとも９６％の遊離の成熟ｒＶＷＦ及び４％未満の遊離のｒＶＷＦ−ＰＰ及び／またはｍａｔＶＷＦ／ＶＷＦ−ＰＰ複合体、少なくとも９７％の遊離の成熟ｒＶＷＦ及び３％未満の遊離のｒＶＷＦ−ＰＰ及び／またはｍａｔＶＷＦ／ＶＷＦ−ＰＰ複合体、少なくとも９８％の遊離の成熟ｒＶＷＦ及び２％未満の遊離のｒＶＷＦ−ＰＰ及び／またはｍａｔＶＷＦ／ＶＷＦ−ＰＰ複合体、少なくとも９９％の遊離の成熟ｒＶＷＦ−ＰＰ及び１％未満の遊離のｒＶＷＦ−ＰＰ及び／またはｍａｔＶＷＦ／ＶＷＦ−ＰＰ複合体、少なくとも９９．５％の遊離の成熟ｒＶＷＦ及び０．５％未満の遊離のｒＶＷＦ−ＰＰ／ＰＰ及び／またはｍａｔＶＷＦ／ＶＷＦ−ＰＰ複合体を含む。
【００６５】
ａ．陰イオン交換クロマトグラフィー精製
本方法の一態様では、成熟ｒＶＷＦ（ｍａｔ−ｒＶＷＦ）を、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーを用いてｒＶＷＦ−ＰＰから分離する。いくつかの場合では、残存する、ＣＨＯ宿主細胞タンパク質などの宿主細胞由来不純物、組換えフューリンや低分子量ウイルス不活化試薬などのプロセス関連不純物、ダイズペプトンなどの培地化合物、及び他の生成物関連不純物を、成熟ＶＷＦから除去する。
【００６６】
本方法の別の態様では、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、ｒＶＷＦ−ＰＰ、例えば、残留ｒＶＷＦ−ＰＰまたは遊離ｒＶＷＦ−ＰＰから成熟ｒＶＷＦを分離する。分離のために、開始組成物、ローディング溶液、またはローディング組成物には、低ｐＨ及び少なくとも１つのキレート剤を含ませることができる。ローディング組成物は、フロースルーモードで動作する陰イオン交換体に添加することができる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液は、プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含む。いくつかの実施形態では、陰イオン交換体を結合モードで動作させ、成熟ＶＷＦとＶＷＦ−ＰＰを、少なくとも１つのキレート剤を含む濃度勾配溶出緩衝液を使用して分離する。他の実施形態では、濃度勾配溶出緩衝液は、中性〜高ｐＨ、例えば、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。別の実施形態では、濃度勾配溶出緩衝液は、１つ以上のキレート剤を含み、ｐＨ７．０以上、例えば、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０を有する。例えば、濃度勾配溶出緩衝液には、ＥＤＴＡを含ませることができ、ｐＨを８．５とすることができる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明は、プロペプチドを枯渇させた高純度成熟組換えｒＶＷＦ（高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ）を含む組成物を取得するための方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：（ａ）プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含む溶液を陰イオン交換カラムにロードし、前記プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを前記陰イオン交換カラムに結合させる工程；（ｂ）前記結合したプロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを含有するａ）の前記陰イオン交換カラムを１つ以上の洗浄緩衝液で洗浄する工程；（ｃ）前記結合したプロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを含むｂ）の前記カラムをフューリンで処理する工程であって、前記フューリンが前記プロｒＶＷＦをｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰに切断する、工程；（ｄ）前記結合したプロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦをｃ）の前記カラムから溶出緩衝液で溶出する工程であって、前記溶出緩衝液が、前記ｒＶＷＦ−ＰＰと非共有結合的に会合しているｍａｔ−ｒＶＷＦからの前記ｒＶＷＦ−ＰＰの解離を誘導し、前記解離を、（ｉ）少なくとも１つのキレート剤を前記溶出緩衝液に添加することまたは（ｉｉ）前記溶出緩衝液のｐＨを少なくともｐＨ７に上昇させることによって誘導する、工程；ならびに（ｅ）前記ｍａｔ−ｒＶＷＦを前記ｒＶＷＦ−ＰＰから分離させて回収し、高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物を取得する工程であって、前記高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物が、少なくとも９５％の成熟ｒＶＷＦと５％未満のｒＶＷＦ−ＰＰを含む、工程。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ａ）及びｂ）を、単一工程で同時に行う。いくつかの実施形態では、ａ）の溶液は、免疫親和性精製法由来のフロースルーを含む。いくつかの実施形態では、ａ）の溶液は、モノクローナル抗体カラム由来のフロースルーを含み、前記モノクローナル抗体は、ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ａ）の溶液は、細胞培養培地、抗体カラムフロースルー溶液、及び緩衝溶液からなる群から選択される。
【００６９】
工程（ｂ）のいくつかの実施形態では、前記結合したプロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを含むａ）の前記陰イオン交換カラムの洗浄は、１つ以上の洗浄緩衝液による洗浄を用い、その場合、１つ以上の洗浄緩衝液には、１つ、２つ、３つ、４つ、及び／または５つの洗浄緩衝液が含まれる。いくつかの実施形態では、第２の洗浄緩衝液は、ウイルス不活化用の成分を含む。いくつかの実施形態では、４つまたは５つの洗浄緩衝液を用いる場合、第２の洗浄緩衝液は、ウイルス不活化用の成分を含む。いくつかの実施形態では、４つまたは５つの洗浄緩衝液を用いる場合、第２または第３の洗浄緩衝液は、ウイルス不活化処理用の成分を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス不活化処理は、溶媒及び界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理である。いくつかの実施形態では、５つの洗浄緩衝液を用いる場合、第１、第２、第３、及び／または第５の洗浄緩衝液は、第４の洗浄緩衝液よりも高いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、５つの洗浄緩衝液を用いる場合、第１、第２、第３、及び第５の洗浄緩衝液は約ｐＨ７〜ｐＨ８のｐＨを有し、第４の洗浄緩衝液は約ｐＨ５〜６のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、５つの洗浄緩衝液を用いる場合、第１、第２、第３、及び／または第５の洗浄緩衝液は、ｐＨ７．４〜ｐＨ７．５前後のｐＨを有し、第４の洗浄緩衝液は、約ｐＨ５．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ウイルス不活化処理工程を、第４の洗浄緩衝液よりも高いｐＨを有する緩衝液で行う。いくつかの実施形態では、４つの洗浄緩衝液を用いる場合、ウイルス不活化処理工程を、第１の洗浄緩衝液の後に用いる。いくつかの実施形態では、４つの洗浄緩衝液を用いる場合、第１、第２、及び第４の洗浄緩衝液は、第３の洗浄緩衝液よりも高いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ウイルス不活化処理工程を、第３の洗浄緩衝液よりも高いｐＨを有する緩衝液で行う。いくつかの実施形態では、ウイルス不活化工程を、第１、第２、及び／または第４の洗浄緩衝液と同じｐＨを有する緩衝液で行う。いくつかの実施形態では、４つの洗浄緩衝液を用いる場合、第１、第２、及び第４の洗浄緩衝液は、約ｐＨ７〜約ｐＨ８のｐＨを有し、第３の洗浄緩衝液は、約ｐＨ５〜約ｐＨ６のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、４つの洗浄緩衝液を用いる場合、第１、第２、及び第４の洗浄緩衝液は、約ｐＨ７．４〜ｐＨ７．５のｐＨを有し、第３の洗浄緩衝液は、約ｐＨ５．５のｐＨを有する。
【００７０】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、当業者によって認識されるように実施することができる。いくつかの実施形態では、陰イオン交換体として、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ  Ｑ  ＸＬ（商標）、ＰＯＲＯＳ  ５０  ＰＩ（商標）、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、Ｅｍｐｈａｓｅ（商標）ＡＥＸ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ、Ｎｕｖｉａ  Ｑ、ＰＯＲＯＳ  ５０  ＨＱ、Ｃａｐｔｏ  Ｑ、Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ｉｍｐｒｅｓｓ、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｑ、Ｑ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨＹＰＥＲＤ（登録商標）Ｆ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）Ｑ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）Ｓｕｐｅｒ  Ｑ、混合モードＡＥＸ樹脂（例えば、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ  ｉｍｐｒｅｓｓ、またはＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌｌ）、ならびに任意のＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、第三級もしくは第四級アミン、またはＰＥＩ系樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、陰イオン交換体は、膜陰イオン交換体である。いくつかの実施形態では、膜陰イオン交換体として、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ（登録商標）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ（登録商標）ＰＡ、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ（登録商標）、またはＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、陰イオン交換体は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥカラム（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはその等価体である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、プロＶＷＦのローディング濃度は、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ樹脂、例えば、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１１０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１２０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１４０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１１０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１２０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１４０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１１０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１２０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１４０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約１００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約１５０ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約２００ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、または約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ樹脂である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、陰イオン交換法は、緩衝系を含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、１つ以上の溶出緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、１つ以上の洗浄緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、少なくとも１つの溶出緩衝液及び少なくとも１つの洗浄緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、少なくとも２つの溶出緩衝液及び少なくとも２つの洗浄緩衝液を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ローディング濃度は、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ樹脂、例えば、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１１０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１２０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１４０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１１０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１２０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１４０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１１０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１２０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１４０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約１００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約１５０ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約２００ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、または約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ樹脂である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含む開始組成物、ローディング溶液、またはローディング組成物のｐＨは、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、例えば、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．３〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．０、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ７．６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．８、ｐＨ７．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９、またはｐＨ９．０である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含む開始組成物、ローディング溶液、またはローディング組成物の導電性は、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約３０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、または約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍである。
【００７６】
いくつかの実施形態では、プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含む開始組成物、ローディング溶液、またはローディング組成物を、クエン酸ナトリウム、例えば、限定されないが、１０ｍＭ〜８０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜８０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ〜８０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、４０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０ｍＭクエン酸ナトリウム、６５ｍＭクエン酸ナトリウム、７０ｍＭクエン酸ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、８０ｍＭクエン酸ナトリウムなどを含む緩衝液で希釈する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、第１の洗浄緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含み、場合によりｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の洗浄緩衝液は、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有し、場合により、少なくとも１つのキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄緩衝液は、ｐＨ６．０〜ｐＨ６．９の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第２の洗浄緩衝液は、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の洗浄緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含むことができ、ｐＨ６．０〜ｐＨ６．９の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶出緩衝液は、ｐＨ７未満を有する。一実施形態では、第２の洗浄緩衝液は、ｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの洗浄緩衝液を用いる場合、第１の洗浄緩衝液はｐＨ７未満を有し、第２の洗浄緩衝液はｐＨ７超を有する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の洗浄緩衝液は、１２０ｍＭ〜２００ｍＭ、１３０ｍＭ〜２００ｍＭ、１４０ｍＭ〜２００ｍＭ、１５０ｍＭ〜２００ｍＭ、１２０ｍＭ〜１９０ｍＭ、１３０ｍＭ〜１９０ｍＭ、１４０ｍＭ〜１９０ｍＭ、１５０ｍＭ〜１９０ｍＭ、１２０ｍＭ〜１８０ｍＭ、１３０ｍＭ〜１８０ｍＭ、１４０ｍＭ〜１８０ｍＭ、１５０ｍＭ〜１８０ｍＭ、１２０ｍＭ、１２５ｍＭ、１３０ｍＭ、１３５ｍＭ、１４０ｍＭ、１４５ｍＭ、１５０ｍＭ、１５５ｍＭ、１６０ｍＭ、１６５ｍＭ、１７０ｍＭ、１７５ｍＭ、１８０ｍＭ、１８５ｍＭ、１９０ｍＭ、１９５ｍＭ、または２００ｍＭのＮａＣｌ濃度を有する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、成熟ＶＷＦ及びＶＷＦ−ＰＰを含む開始組成物、ローディング溶液、またはローディング組成物を、少なくとも１つのキレート剤を含む緩衝液と接触させ、場合により緩衝液はｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、開始組成物、ローディング溶液、またはローディング組成物を、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する緩衝液と接触させ、場合により緩衝液は少なくとも１つのキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝液は洗浄緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液は溶出緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ｐＨ６．０〜６．９を有する洗浄緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ｐＨ７．０〜９．０を有する溶出緩衝液である。いくつかの実施形態では、成熟ＶＷＦ及びＶＷＦ−ＰＰを含む開始組成物、ローディング溶液、またはローディング組成物を、第１にｐＨ６．０〜６．９を有する洗浄緩衝液と、第２にｐＨ７．０〜９．０を有する少なくとも１つの溶出緩衝液と接触させる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、成熟ＶＷＦを、１つの溶出緩衝液を用いて陰イオン交換クロマトグラフィー工程で溶出する。いくつかの実施形態では、成熟ＶＷＦを、複数の溶出緩衝液を含む濃度勾配溶出法を用いて陰イオン交換クロマトグラフィー工程で溶出する。例えば、２つの溶出緩衝液、例えば第１の溶出緩衝液及び第２の溶出緩衝液を用いて溶出を実施することができる。いくつかの実施形態では、第１の溶出緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含み、場合によりｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の溶出緩衝液は、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有し、場合により少なくとも１つのキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、第１の溶出緩衝液は、ｐＨ６．０〜ｐＨ６．９の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第２の溶出緩衝液は、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の溶出緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含むことができ、ｐＨ６．０〜ｐＨ６．９の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の溶出緩衝液は、ｐＨ７未満を有する。一実施形態では、第２の溶出緩衝液は、ｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの溶出緩衝液を用いる場合、第１の溶出緩衝液はｐＨ７未満を有し、第２の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー工程用の洗浄緩衝液のｐＨは、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、例えば、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．３〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．０、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ７．６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．８、ｐＨ７．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９、ｐＨ９．０である。いくつかの実施形態では、それは、２つの溶出緩衝液が存在する場合、例えば第１及び第２の溶出緩衝液を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー工程用の溶出緩衝液のｐＨは、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、例えば、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．３〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．０、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ７．６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．８、ｐＨ７．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９、ｐＨ９．０である。いくつかの実施形態では、それは、２つの溶出緩衝液が存在する場合、例えば第１及び第２の溶出緩衝液を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨを、工程ａ）の開始溶液に比べて上昇させ、２つの溶出緩衝液を用いる場合には第１の溶出緩衝液に比べて上昇させ、及び／または洗浄緩衝液を用いる場合には洗浄緩衝液に比べて上昇させる。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液及び溶出緩衝液を用いる場合、洗浄緩衝液はｐＨ７未満を有し、溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの溶出緩衝液を用いる場合、一方の溶出緩衝液はｐＨ７未満を有し、他方の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液及び２つの溶出緩衝液を用いる場合、洗浄緩衝液はｐＨ７未満を有し、両方の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液及び２つの溶出緩衝液を用いる場合、洗浄緩衝液及び第１の溶出緩衝液はｐＨ７未満を有し、第２の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの洗浄緩衝液及び２つの溶出緩衝液を用いる場合、洗浄緩衝液及び第１の溶出緩衝液はｐＨ７未満を有し、第２の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの洗浄緩衝液及び２つの溶出緩衝液を用いる場合、両方の洗浄緩衝液はｐＨ７未満を有し、両方の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの洗浄緩衝液及び２つの溶出緩衝液を用いる場合、第１の洗浄緩衝液はｐＨ７未満を有し、第２の洗浄緩衝液及び両方の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、方法の工程（ａ）に記載のように、プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含むローディング溶液に比べて、１つ以上の洗浄緩衝液及び／または溶出緩衝液のｐＨを少なくとも７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０に上昇させる。いくつかの実施形態では、方法の工程（ａ）の溶液中のｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体からｍａｔ−ｒＶＷＦ及びｒＶＷＦ−ＰＰへの解離を誘導するために、緩衝液のｐＨを、少なくとも７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０に上昇させ、その場合、前記解離は、非共有結合的に会合したｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰが分断されることにより生じる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液のｐＨを、少なくとも約７．２〜約７．８に上昇させる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液のｐＨを、少なくとも約７．６に上昇させる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液のｐＨを、塩基性アミノ酸の添加によって上昇させる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液のｐＨを少なくとも７に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の洗浄緩衝液のｐＨを少なくとも約７．２〜約７．８に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の洗浄緩衝液のｐＨを、少なくとも約７．６に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の洗浄緩衝液のｐＨを、塩基性アミノ酸の添加によって上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の洗浄緩衝液は、少なくともｐＨ７を示す。いくつかの実施形態では、１つ以上の溶出緩衝液のｐＨを、少なくとも約７．２〜約７．８に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の溶出緩衝液のｐＨを、少なくとも約７．６に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の溶出緩衝液のｐＨを、塩基性アミノ酸の添加によって上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の溶出緩衝液は、少なくともｐＨ７を示す。
【００８５】
いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液（洗浄緩衝液、及び／または溶出緩衝液を含む）は、１つ以上のキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含む。キレート剤は、二価陽イオンキレート剤とすることができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのキレート剤は、二価陽イオンキレート剤である。いくつかの実施形態では、二価陽イオンキレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ、及びクエン酸塩からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、二価陽イオンキレート剤は、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＳ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ、及びクエン酸塩からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キレート剤はＮＴＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＤＴＰＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＥＤＤＳである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＥＧＴＡである。いくつかの実施形態ではキレート剤はＣＤＴＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はクエン酸塩である。いくつかの実施形態では、ｂ）の１つ以上の洗浄緩衝液は、前記１つ以上のキレート剤を含み、少なくともｐＨ７を示す。
【００８６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液（洗浄及び／または溶出緩衝液を含む）は、１０ｍＭ〜８０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜８０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ〜８０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、４０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０ｍＭクエン酸ナトリウム、６５ｍＭクエン酸ナトリウム、７０ｍＭクエン酸ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、８０ｍｍクエン酸ナトリウムなどを含むがこれらに限定されない範囲のクエン酸ナトリウムを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、第１の溶出緩衝液は、１０ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ〜５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜５０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、４０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、６０ｍＭクエン酸ナトリウムなどを含むがこれらに限定されない範囲のクエン酸ナトリウムをさらに含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、第２の溶出緩衝液は、例えば、１０ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ〜５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜５０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、４０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、６０ｍＭクエン酸ナトリウムなどであるがこれらに限定されないクエン酸ナトリウムをさらに含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー工程の溶出緩衝液Ａ及び／または溶出緩衝液Ｂは、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、例えば、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約２ｍＭ〜約２０ｍＭ、約３ｍＭ〜約２０ｍＭ、約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、約５ｍＭ、約０．５ｍｍｍ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭなどを含む。
【００９０】
いくつかの実施形態では、クエン酸塩は、陰イオン交換法を用いてｒＶＷＦプロペプチドを除去した後の溶出物中に見出すことができる。いくつかの実施形態では、クエン酸塩は、段階的陰イオン交換溶出法を用いてｒＶＷＦプロペプチドを除去した後の溶出物中に見出すことができる。いくつかの実施形態では、クエン酸塩は、濃度勾配陰イオン交換溶出法を用いてｒＶＷＦプロペプチドを除去した後の溶出物中に見出すことができる。いくつかの実施形態では、陰イオン交換の対イオンはクエン酸３−である。
【００９１】
本明細書に記載の緩衝液（緩衝系）のいずれも、グリシン、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、トリスＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）、ヒスチジン、イミダゾール、酢酸クエン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、リン酸塩、トリスＨＣｌ、ビス−トリス、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニンＨＣｌ、リジンＨＣｌ、及び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸からなる群から、単一の緩衝液として、または２つ以上の緩衝液の組み合わせとして選択することができる。いくつかの実施形態では、緩衝液は、グリシンを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、トリスＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ヒスチジンを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、イミダゾールを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、酢酸クエン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、クエン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、酢酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＭＥＳを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、トリスＨＣｌを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ビス−トリスを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ヒスチジンを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、イミダゾールを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、アルギニンＨＣｌを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、リジンＨＣｌを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、本明細書に記載の緩衝液のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、グリシンＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、トリスＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）、ヒスチジン、イミダゾール、酢酸クエン酸塩、ＭＥＳ、及び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸からなる群から選択される。
【００９３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、２５℃で≧０．５ｍＳ／ｃｍの導電性を示す少なくとも１つの緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、２５℃で２０．０±０．２ｍＳ／ｃｍの導電性を示す少なくとも１つの緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、２５℃で１７．０±０．２ｍＳ／ｃｍの導電性を示す少なくとも１つの緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、２５℃で１５．０±０．２ｍＳ／ｃｍの導電性を示す少なくとも１つの緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、２５℃で１２．０±０．２ｍＳ／ｃｍの導電性を示す少なくとも１つの緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、２５℃で１０．０±０．２ｍＳ／ｃｍの導電性を示す少なくとも１つの緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、２５℃で５．０±０．２ｍＳ／ｃｍの導電性を示す少なくとも１つの緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、２５℃で２．０±０．２ｍＳ／ｃｍの導電性を示す少なくとも１つの緩衝液を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本方法の１つ以上の洗浄工程の流速は、約１０ｃｍ／時間〜約２００ｃｍ／時間、例えば、約１０ｃｍ／時間、約１５ｃｍ／時間、約２０ｃｍ／時間、約２５ｃｍ／時間、約３０ｃｍ／時間、約３５ｃｍ／時間、約４０ｃｍ／時間、約４５ｃｍ／時間、約５０ｃｍ／時間、約５５ｃｍ／時間、約６０ｃｍ／時間、約６５ｃｍ／時間、約７０ｃｍ／時間、約７５ｃｍ／時間、約８０ｃｍ／時間、約８５ｃｍ／時間、約９０ｃｍ／時間、約９５ｃｍ／時間、約１００ｃｍ／時間、約１０５ｃｍ／時間、約１１０ｃｍ／時間、約１１５ｃｍ／時間、約１２０ｃｍ／時間、約１２５ｃｍ／時間、約１３０ｃｍ／時間、約１３５ｃｍ／時間、約１４０ｃｍ／時間、約１４５ｃｍ／時間、約１５０ｃｍ／時間、約１５５ｃｍ／時間、約１６０ｃｍ／時間、約１６５ｃｍ／時間、約１７０ｃｍ／時間、約１７５ｃｍ／時間、約１８０ｃｍ／時間、約１８５ｃｍ／時間、約１９０ｃｍ／時間、約１９５ｃｍ／時間、または約２００ｃｍ／時間である。樹脂に応じて、いくつかの実施形態では流速を最大６００ｃｍ／時間とすることができる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本方法の１つ以上の溶出工程の流速は、約１０ｃｍ／時間〜約２００ｃｍ／時間、例えば、約１０ｃｍ／時間、約１５ｃｍ／時間、約２０ｃｍ／時間、約２５ｃｍ／時間、約３０ｃｍ／時間、約３５ｃｍ／時間、約４０ｃｍ／時間、約４５ｃｍ／時間、約５０ｃｍ／時間、約５５ｃｍ／時間、約６０ｃｍ／時間、約６５ｃｍ／時間、約７０ｃｍ／時間、約７５ｃｍ／時間、約８０ｃｍ／時間、約８５ｃｍ／時間、約９０ｃｍ／時間、約９５ｃｍ／時間、約１００ｃｍ／時間、約１０５ｃｍ／時間、約１１０ｃｍ／時間、約１１５ｃｍ／時間、約１２０ｃｍ／時間、約１２５ｃｍ／時間、約１３０ｃｍ／時間、約１３５ｃｍ／時間、約１４０ｃｍ／時間、約１４５ｃｍ／時間、約１５０ｃｍ／時間、約１５５ｃｍ／時間、約１６０ｃｍ／時間、約１６５ｃｍ／時間、約１７０ｃｍ／時間、約１７５ｃｍ／時間、約１８０ｃｍ／時間、約１８５ｃｍ／時間、約１９０ｃｍ／時間、約１９５ｃｍ／時間、または約２００ｃｍ／時間である。樹脂に応じて、いくつかの実施形態では流速を最大６００ｃｍ／時間とすることができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、１つ以上の非イオン性界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０、及びＴｗｅｅｎ２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０である。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ２０である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、前記１つ以上の緩衝液は、非還元糖、糖アルコール、及びポリオールからなる群から選択される１つ以上の追加の物質をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、１つ以上の非還元糖をさらに含む。いくつかの実施形態では、非還元糖として、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、及び／またはキシリトールを挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、１つ以上の糖アルコールをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、１つ以上のポリオールをさらに含む。いくつかの実施形態では、糖アルコールまたはポリオールとして、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、及び／またはグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、緩衝液は、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、１，２，３−プロパントリオール）、メソエリスリトール、及び／またはエリスリトール（メソ−１，２，３，４−ブタンテロール）をさらに含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、１つ以上の一価陽イオンを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の一価陽イオンは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、Ｃｓ＋、及びＮＨ４＋からなる群から選択される。例えば、一価の陽イオンを、Ｎａ＋とすることができる。他の実施形態では、緩衝液は、１つ以上の一価、二価、及び／または三価陰イオンを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の一価、二価及び／または三価陰イオンは、Ｃｌ−、酢酸−、ＳＯ４２−、Ｂｒ−、クエン酸３−、ＰＯ４３−、及びＢＯ３３−からなる群から選択することができる。いくつかの実施形態では、緩衝液は、非還元糖、及び糖アルコールからなる群から選択される１つ以上の追加の物質を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、１つ以上の一価陽イオンをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の一価陽イオンは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、及びＣｓ＋からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、一価陽イオンは、Ｎａ＋である。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、１つ以上の一価、二価、及び／または三価陰イオンをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の一価、二価及び／または三価陰イオンは、Ｃｌ−、酢酸−、ＳＯ４２−、Ｂｒ−、及びクエン酸３−からなる群から選択される。
【００９９】
いずれの緩衝液のｐＨも、アミノ酸、トリス、ＮａＯＨ、エタノールアミンなどを添加することによって調整する（上昇させる）ことができる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、陰イオン交換法の緩衝液とキレート剤の組み合わせは、クエン酸塩、リンゴ酸塩（リンゴ酸）、酒石酸塩（酒石酸）を含む。
【０１０１】
ｂ．陽イオン交換クロマトグラフィー精製
本方法の一態様では、成熟ＶＷＦ（ｍａｔＶＷＦ）を、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーを用いてＶＷＦ−ＰＰから分離する。いくつかの場合では、残存する、ＣＨＯ宿主細胞タンパク質などの宿主細胞由来不純物、組換えフューリン及び低分子量ウイルス不活化試薬などのプロセス関連不純物、ダイズペプトンなどの培地化合物、及び他の生成物関連不純物を、成熟ＶＷＦから除去する。
【０１０２】
本方法の別の態様では、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて残留ＶＷＦ−ＰＰまたは遊離ＶＷＦ−ＰＰなどのＶＷＦ−ＰＰから成熟ＶＷＦを分離する。分離のために、開始組成物、ローディング溶液、またはローディング組成物には、低ｐＨ及び少なくとも１つのキレート剤を含ませることができる。いくつかの実施形態では、開始組成物、ローディング溶液、またはローディング組成物は、プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含む。いくつかの実施形態では、陽イオン交換体を結合モードで動作させ、成熟ＶＷＦとＶＷＦ−ＰＰを、少なくとも１つのキレート剤を含む濃度勾配溶出緩衝液を使用して分離する。他の実施形態では、濃度勾配溶出緩衝液は、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨのような中性から高いｐＨを有する。別の実施形態では、濃度勾配溶出緩衝液は、１つ以上のキレート剤を含み、ｐＨ７．０以上、例えば、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０を有する。例えば、濃度勾配溶出緩衝液には、ＥＤＴＡを含ませることができ、ｐＨを８．５とすることができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本発明は、プロペプチドを枯渇させた高純度成熟組換えｒＶＷＦ（高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ）を含む組成物を取得するための方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：（ａ）プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含む溶液を陽イオン交換カラムにロードし、前記プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを前記陽イオン交換カラムに結合させる工程；（ｂ）前記結合したプロ−ｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを含有するａ）の前記陽イオン交換カラムを１つ以上の洗浄緩衝液で洗浄する工程；（ｃ）前記結合したプロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを含むｂ）の前記カラムをフューリンで処理する工程であって、前記フューリンが前記プロｒＶＷＦをｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰに切断する、工程；（ｄ）前記結合したプロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦをｃ）の前記カラムから溶出緩衝液で溶出する工程であって、前記溶出緩衝液が、前記ｒＶＷＦ−ＰＰと非共有結合的に会合しているｍａｔ−ｒＶＷＦからの前記ｒＶＷＦ−ＰＰの解離を誘導し、前記解離を、（ｉ）少なくとも１つのキレート剤を前記溶出緩衝液に添加することまたは（ｉｉ）前記溶出緩衝液のｐＨを少なくともｐＨ７に上昇させることによって誘導する、工程；ならびに（ｅ）前記ｍａｔ−ｒＶＷＦを前記ｒＶＷＦ−ＰＰから分離させて回収し、高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物を取得する工程であって、前記高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物が、少なくとも９５％の成熟ｒＶＷＦと５％未満のｒＶＷＦ−ＰＰを含む、工程。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ａ）及びｂ）を、単一工程で同時に行う。いくつかの実施形態では、ａ）の溶液は、免疫親和性精製法由来のフロースルーを含む。いくつかの実施形態では、ａ）の溶液は、モノクローナル抗体カラム由来のフロースルーを含み、前記モノクローナル抗体は、ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ａ）の溶液は、細胞培養培地、抗体カラムフロースルー溶液、及び緩衝溶液からなる群から選択される。
【０１０５】
陽イオン交換体を、結合モードで動作させて、成熟ＶＷＦとＶＷＦ−ＰＰを分離することができる。陽イオン交換クロマトグラフィーは、当業者によって認識されるように実施することができる。いくつかの実施形態では、陽イオン交換体として、ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（ＣＩＭ（登録商標）；ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｇｉｇａｃａｐ  Ｓ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｇｉｇａｃａｐ  ＣＭ（Ｔｏｓｏｈ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ（Ｔｏｓｏｈａ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭ（Ｔｏｓｏｈ）、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｓ（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＳ（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、ＭａｃｒｏｐｒｅｐＣＭ（（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３（Ｍｅｒｃｋ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＣＯＯ（Ｍｅｒｃｋ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ（Ｍｅｒｃｋ）、セルフィン硫酸塩（ＪＮＣ）、ＣＭ及びＳＰ  Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（Ｐａｌｌ）、ＣＭ及びＳ  ＨｙｐｅｒＤ（Ｐａｌｌ）、Ｓ及びＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓ及びＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓ及びＣＭ  ＣＡＰＴＯ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＭｏｎｏＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｎｕｖｉａ  Ｓ（Ｍｅｒｃｋ）、またはセルフィンリン酸塩（ＪＮＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、陽イオン交換体は膜陽イオン交換体である。いくつかの実施形態では、膜イオン交換体には、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｓ（Ｐａｌｌ）またはＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｓが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、陽イオン交換体は、ＵＮＯ＿Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）またはその均等物である。
【０１０６】
工程（ｂ）のいくつかの実施形態では、前記結合したプロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを含むａ）の前記陽イオン交換カラムの洗浄は、１つ以上の洗浄緩衝液による洗浄を用い、その場合、１つ以上の洗浄緩衝液には、１つ、２つ、３つ、４つ、及び／または５つの洗浄緩衝液が含まれる。いくつかの実施形態では、第２の洗浄緩衝液は、ウイルス不活化用の成分を含む。いくつかの実施形態では、４つまたは５つの洗浄緩衝液を用いる場合、第２の洗浄緩衝液は、ウイルス不活化用の成分を含む。いくつかの実施形態では、４つまたは５つの洗浄緩衝液を用いる場合、第２または第３の洗浄緩衝液は、ウイルス不活化処理用の成分を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス不活化処理は、溶媒及び界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理である。いくつかの実施形態では、５つの洗浄緩衝液を用いる場合、第１、第２、第３、及び／または第５の洗浄緩衝液は、第４の洗浄緩衝液よりも高いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、５つの洗浄緩衝液を用いる場合、第１、第２、第３、及び第５の洗浄緩衝液は約ｐＨ７〜ｐＨ８のｐＨを有し、第４の洗浄緩衝液は約ｐＨ５〜６のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、５つの洗浄緩衝液を用いる場合、第１、第２、第３、及び／または第５の洗浄緩衝液は、ｐＨ７．４〜ｐＨ７．５前後のｐＨを有し、第４の洗浄緩衝液は、約ｐＨ５．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ウイルス不活化処理工程を、第４の洗浄緩衝液よりも高いｐＨを有する緩衝液で行う。いくつかの実施形態では、４つの洗浄緩衝液を用いる場合、ウイルス不活化処理工程を、第１の洗浄緩衝液の後に用いる。いくつかの実施形態では、４つの洗浄緩衝液を用いる場合、第１、第２、及び第４の洗浄緩衝液は、第３の洗浄緩衝液よりも高いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ウイルス不活化処理工程を、第３の洗浄緩衝液よりも高いｐＨを有する緩衝液で行う。いくつかの実施形態では、ウイルス不活化工程を、第１、第２、及び／または第４の洗浄緩衝液と同じｐＨを有する緩衝液で行う。いくつかの実施形態では、４つの洗浄緩衝液を用いる場合、第１、第２、及び第４の洗浄緩衝液は、約ｐＨ７〜約ｐＨ８のｐＨを有し、第３の洗浄緩衝液は、約ｐＨ５〜約ｐＨ６のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、４つの洗浄緩衝液を用いる場合、第１、第２、及び第４の洗浄緩衝液は、約ｐＨ７．４〜ｐＨ７．５のｐＨを有し、第３の洗浄緩衝液は、約ｐＨ５．５のｐＨを有する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、プロＶＷＦのローディング濃度は、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ樹脂、例えば、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１１０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１２０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１４０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１１０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１２０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１４０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１１０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１２０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１４０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約１００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約１５０ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約２００ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、または約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ樹脂である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、陽イオン交換法は、緩衝系を含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、１つ以上の溶出緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、１つ以上の洗浄緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、少なくとも１つの溶出緩衝液及び少なくとも１つの洗浄緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、少なくとも２つの溶出緩衝液及び少なくとも２つの洗浄緩衝液を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、第１の洗浄緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含み、場合によりｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の洗浄緩衝液は、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有し、場合により、少なくとも１つのキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄緩衝液は、ｐＨ６．０〜ｐＨ６．９の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第２の洗浄緩衝液は、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の洗浄緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含むことができ、ｐＨ６．０〜ｐＨ６．９の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶出緩衝液は、ｐＨ７未満を有する。一実施形態では、第２の洗浄緩衝液は、ｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの洗浄緩衝液を用いる場合、第１の洗浄緩衝液はｐＨ７未満を有し、第２の洗浄緩衝液はｐＨ７超を有する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の洗浄緩衝液は、１２０ｍＭ〜２００ｍＭ、１３０ｍＭ〜２００ｍＭ、１４０ｍＭ〜２００ｍＭ、１５０ｍＭ〜２００ｍＭ、１２０ｍＭ〜１９０ｍＭ、１３０ｍＭ〜１９０ｍＭ、１４０ｍＭ〜１９０ｍＭ、１５０ｍＭ〜１９０ｍＭ、１２０ｍＭ〜１８０ｍＭ、１３０ｍＭ〜１８０ｍＭ、１４０ｍＭ〜１８０ｍＭ、１５０ｍＭ〜１８０ｍＭ、１２０ｍＭ、１２５ｍＭ、１３０ｍＭ、１３５ｍＭ、１４０ｍＭ、１４５ｍＭ、１５０ｍＭ、１５５ｍＭ、１６０ｍＭ、１６５ｍＭ、１７０ｍＭ、１７５ｍＭ、１８０ｍＭ、１８５ｍＭ、１９０ｍＭ、１９５ｍＭ、または２００ｍＭのＮａＣｌ濃度を有する。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、成熟ＶＷＦ及びＶＷＦ−ＰＰを含む開始組成物、ローディング溶液、またはローディング組成物を、少なくとも１つのキレート剤を含む緩衝液と接触させ、場合により緩衝液はｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、開始組成物、ローディング溶液、またはローディング組成物を、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する緩衝液と接触させ、場合により緩衝液は少なくとも１つのキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝液は洗浄緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液は溶出緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ｐＨ６．０〜６．９を有する洗浄緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ｐＨ７．０〜９．０を有する溶出緩衝液である。いくつかの実施形態では、成熟ＶＷＦ及びＶＷＦ−ＰＰを含む開始組成物、ローディング溶液、またはローディング組成物を、第１にｐＨ６．０〜６．９を有する洗浄緩衝液と、第２にｐＨ７．０〜９．０を有する少なくとも１つの溶出緩衝液と接触させる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、成熟ＶＷＦを、１つの溶出緩衝液を用いて陰イオン交換クロマトグラフィー工程で溶出する。いくつかの実施形態では、成熟ＶＷＦを、複数の溶出緩衝液を含む濃度勾配溶出法を用いて陰イオン交換クロマトグラフィー工程で溶出する。例えば、２つの溶出緩衝液、例えば第１の溶出緩衝液及び第２の溶出緩衝液を用いて溶出を実施することができる。いくつかの実施形態では、第１の溶出緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含み、場合によりｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の溶出緩衝液は、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有し、場合により少なくとも１つのキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、第１の溶出緩衝液は、ｐＨ６．０〜ｐＨ６．９の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第２の溶出緩衝液は、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の溶出緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含むことができ、ｐＨ６．０〜ｐＨ６．９の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の溶出緩衝液は、ｐＨ７未満を有する。一実施形態では、第２の溶出緩衝液は、ｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの溶出緩衝液を用いる場合、第１の溶出緩衝液はｐＨ７未満を有し、第２の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー工程用の洗浄緩衝液のｐＨは、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、例えば、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．３〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．０、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ７．６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．８、ｐＨ７．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９、ｐＨ９．０である。いくつかの実施形態では、それは、２つの溶出緩衝液が存在する場合、例えば第１及び第２の溶出緩衝液を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー工程用の溶出緩衝液のｐＨは、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、例えば、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．３〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．０、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ７．６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．８、ｐＨ７．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９、ｐＨ９．０である。いくつかの実施形態では、それは、２つの溶出緩衝液が存在する場合、例えば第１及び第２の溶出緩衝液を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨを、工程ａ）の開始溶液に比べて上昇させ、２つの溶出緩衝液を用いる場合には第１の溶出緩衝液に比べて上昇させ、及び／または洗浄緩衝液を用いる場合には洗浄緩衝液に比べて上昇させる。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液及び溶出緩衝液を用いる場合、洗浄緩衝液はｐＨ７未満を有し、溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの溶出緩衝液を用いる場合、一方の溶出緩衝液はｐＨ７未満を有し、他方の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液及び２つの溶出緩衝液を用いる場合、洗浄緩衝液はｐＨ７未満を有し、両方の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液及び２つの溶出緩衝液を用いる場合、洗浄緩衝液及び第１の溶出緩衝液はｐＨ７未満を有し、第２の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの洗浄緩衝液及び２つの溶出緩衝液を用いる場合、洗浄緩衝液及び第１の溶出緩衝液はｐＨ７未満を有し、第２の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの洗浄緩衝液及び２つの溶出緩衝液を用いる場合、両方の洗浄緩衝液はｐＨ７未満を有し、両方の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの洗浄緩衝液及び２つの溶出緩衝液を用いる場合、第１の洗浄緩衝液はｐＨ７未満を有し、第２の洗浄緩衝液及び両方の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、方法の工程（ａ）に記載のように、プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含むローディング溶液に比べて、１つ以上の洗浄緩衝液及び／または溶出緩衝液のｐＨを少なくとも７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０に上昇させる。いくつかの実施形態では、方法の工程（ａ）の溶液中のｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体からｍａｔ−ｒＶＷＦ及びｒＶＷＦ−ＰＰへの解離を誘導するために、緩衝液のｐＨを、少なくとも７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０に上昇させ、その場合、前記解離は、非共有結合的に会合したｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰが分断されることにより生じる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液のｐＨを、少なくとも約７．２〜約７．８に上昇させる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液のｐＨを、少なくとも約７．６に上昇させる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液のｐＨを、塩基性アミノ酸の添加によって上昇させる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液のｐＨを少なくとも７に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の洗浄緩衝液のｐＨを少なくとも約７．２〜約７．８に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の洗浄緩衝液のｐＨを、少なくとも約７．６に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の洗浄緩衝液のｐＨを、塩基性アミノ酸の添加によって上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の洗浄緩衝液は、少なくともｐＨ７を示す。いくつかの実施形態では、１つ以上の溶出緩衝液のｐＨを、少なくとも約７．２〜約７．８に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の溶出緩衝液のｐＨを、少なくとも約７．６に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の溶出緩衝液のｐＨを、塩基性アミノ酸の添加によって上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の溶出緩衝液は、少なくともｐＨ７を示す。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含むローディング溶液のｐＨは、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、例えば、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．３〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．０、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ７．６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．８、ｐＨ７．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９、またはｐＨ９．０である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含む開始組成物、ローディング溶液、またはローディング組成物の導電性は、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約３０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、または約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍである。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含むローディング溶液を、クエン酸ナトリウム、例えば、限定されないが、１０ｍＭ〜８０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜８０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ〜８０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、４０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０ｍＭクエン酸ナトリウム、６５ｍＭクエン酸ナトリウム、７０ｍＭクエン酸ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、８０ｍＭクエン酸ナトリウムなどを含む緩衝液で希釈する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー工程用の洗浄緩衝液のｐＨは、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、例えば、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．３〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．０、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ７．６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．８、ｐＨ７．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９、またはｐＨ９．０である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー工程用の溶出緩衝液のｐＨは、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、例えば、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．３〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．０、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ７．６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．８、ｐＨ７．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９、またはｐＨ９．０である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨを、工程ａ）の開始溶液に比べて上昇させ、２つの溶出緩衝液を用いる場合には第１の溶出緩衝液に比べて上昇させ、及び／または洗浄緩衝液を用いる場合には洗浄緩衝液に比べて上昇させる。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液及び溶出緩衝液を用いる場合、洗浄緩衝液はｐＨ７未満を有し、溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの溶出緩衝液を用いる場合、一方の溶出緩衝液はｐＨ７未満を有し、他方の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液及び２つの溶出緩衝液を用いる場合、洗浄緩衝液はｐＨ７未満を有し、両方の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液及び２つの溶出緩衝液を用いる場合、洗浄緩衝液及び第１の溶出緩衝液はｐＨ７未満を有し、第２の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの洗浄緩衝液及び２つの溶出緩衝液を用いる場合、洗浄緩衝液及び第１の溶出緩衝液はｐＨ７未満を有し、第２の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの洗浄緩衝液及び２つの溶出緩衝液を用いる場合、両方の洗浄緩衝液はｐＨ７未満を有し、両方の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの洗浄緩衝液及び２つの溶出緩衝液を用いる場合、第１の洗浄緩衝液はｐＨ７未満を有し、第２の洗浄緩衝液及び両方の溶出緩衝液はｐＨ７超を有する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、方法の工程（ａ）に記載のように、プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含むローディング溶液に比べて、１つ以上の洗浄緩衝液及び／または溶出緩衝液のｐＨを少なくとも７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０に上昇させる。いくつかの実施形態では、方法の工程（ａ）の溶液中のｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体からｍａｔ−ｒＶＷＦ及びｒＶＷＦ−ＰＰへの解離を誘導するために、緩衝液のｐＨを、少なくとも７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０に上昇させ、その場合、前記解離は、非共有結合的に会合したｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰが分断されることにより生じる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液のｐＨを、少なくとも約７．２〜約７．８に上昇させる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液のｐＨを、少なくとも約７．６に上昇させる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液のｐＨを、塩基性アミノ酸の添加によって上昇させる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液のｐＨを少なくとも７に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の洗浄緩衝液のｐＨを少なくとも約７．２〜約７．８に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の洗浄緩衝液のｐＨを、少なくとも約７．６に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の洗浄緩衝液のｐＨを、塩基性アミノ酸の添加によって上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の洗浄緩衝液は、少なくともｐＨ７を示す。いくつかの実施形態では、１つ以上の溶出緩衝液のｐＨを、少なくとも約７．２〜約７．８に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の溶出緩衝液のｐＨを、少なくとも約７．６に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の溶出緩衝液のｐＨを、塩基性アミノ酸の添加によって上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の溶出緩衝液は、少なくともｐＨ７を示す。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液（洗浄緩衝液、及び／または溶出緩衝液を含む）は、１つ以上のキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含む。キレート剤は、二価陽イオンキレート剤とすることができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのキレート剤は、二価陽イオンキレート剤である。いくつかの実施形態では、二価陽イオンキレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ、及びクエン酸塩からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、二価陽イオンキレート剤は、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＳ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ、及びクエン酸塩からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、二価陽イオンキレート剤は、クエン酸塩、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＮＴＡ、及びＥＤＤＳからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キレート剤はＮＴＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＤＴＰＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＥＤＤＳである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＥＧＴＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＣＤＴＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はクエン酸塩である。いくつかの実施形態では、ｂ）の１つ以上の洗浄緩衝液は、前記１つ以上のキレート剤を含み、少なくともｐＨ７を示す。
【０１２５】
本明細書に記載の緩衝液（緩衝系）のいずれも、グリシン、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、トリスＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）、ヒスチジン、イミダゾール、酢酸クエン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、リン酸塩、トリスＨＣｌ、ビス−トリス、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニンＨＣｌ、リジンＨＣｌ、及び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸からなる群から、単一の緩衝液として、または２つ以上の緩衝液の組み合わせとして選択することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、グリシンＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、トリスＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）、ヒスチジン、イミダゾール、酢酸クエン酸塩、ＭＥＳ、及び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、クエン酸塩、酢酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、トリスＣｌ、及び／またはビス−トリスを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、グリシンを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、トリスＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ヒスチジンを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、イミダゾールを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、酢酸クエン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、クエン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、酢酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＭＥＳを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＨＥＰＥＳを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、トリスＨＣｌを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ビス−トリスを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ヒスチジンを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、イミダゾールを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、アルギニンＨＣｌを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、リジンＨＣｌを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、本明細書に記載の緩衝液のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液（洗浄及び／または溶出緩衝液を含む）は、１０ｍＭ〜８０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜８０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ〜８０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、４０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０ｍＭクエン酸ナトリウム、６５ｍＭクエン酸ナトリウム、７０ｍＭクエン酸ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、８０ｍｍクエン酸ナトリウムなどを含むがこれらに限定されない範囲のクエン酸ナトリウムを含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、第１の溶出緩衝液は、１０ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ〜５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜５０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、４０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、６０ｍＭクエン酸ナトリウムなどを含むがこれらに限定されない範囲のクエン酸ナトリウムをさらに含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、第２の溶出緩衝液は、例えば、１０ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ〜５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜５０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ〜６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、４０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、６０ｍＭクエン酸ナトリウムなどであるがこれらに限定されないクエン酸ナトリウムをさらに含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー工程の１つ以上の緩衝液（洗浄緩衝液及び／または溶出緩衝液を含む）は、所望のｒＶＷＦ種が陽イオン交換樹脂に結合したままである限り、ＥＤＴＡを含む。いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー工程の１つ以上の緩衝液（洗浄緩衝液及び／または溶出緩衝液を含む）は、所望のｒＶＷＦ種が陽イオン交換樹脂に結合したままである限り、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、例えば、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約２ｍＭ〜約２０ｍＭ、約３ｍＭ〜約２０ｍＭ、約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、約５ｍＭ、約０．５ｍｍｍ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭなどを含む。いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡを含む緩衝液を、段階的陽イオン交換溶出の一部として用いる。いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡを含む緩衝液を、濃度勾配陽イオン交換溶出の一部として用いる。いくつかの実施形態では、段階的陽イオン交換溶出で使用する緩衝液の一部としてＥＤＴＡを用いる場合、対イオンはＮａ＋である。いくつかの実施形態では、濃度勾配陽イオン交換溶出で使用する緩衝液の一部としてＥＤＴＡを用いる場合、対イオンはＮａ＋である。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、陽イオン交換法を用いてｒＶＷＦプロペプチドを除去した後の溶出物にクエン酸塩を見出すことができる。いくつかの実施形態では、段階的陽イオン交換溶出法を用いてｒＶＷＦプロペプチドを除去した後の溶出物にクエン酸塩を見出すことができる。いくつかの実施形態では、濃度勾配陽イオン交換溶出法を用いてｒＶＷＦプロペプチドを除去した後の溶出物にクエン酸塩を見出すことができる。いくつかの実施形態では、陽イオン交換での対イオンはＮａ＋である。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、緩衝液（洗浄緩衝液及び／または溶出緩衝液を含む）の導電性は、５ｍＳ／ｃｍ〜４０ｍＳ／ｃｍ、例えば、５ｍＳ／ｃｍ〜４０ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ〜４０ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ〜４０ｍＳ／ｃｍ、２０ｍＳ／ｃｍ〜４０ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ〜１５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ〜２５ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ〜３０ｍＳ／ｃｍ、２０ｍＳ／ｃｍ〜３０ｍＳ／ｃｍ、または３０ｍＳ／ｃｍ〜４０ｍＳ／ｃｍの範囲である。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄緩衝液の導電性は、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約３０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約１８ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、または約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍである。他の実施形態では、２つ以上の洗浄緩衝液の導電性は、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約３０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約１８ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、または約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍである。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出緩衝液の導電性は、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約３０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約１８ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、または約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍである。他の実施形態では、２つ以上の洗浄緩衝液の導電性は、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約３０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約１８ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、または約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍである。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、例えば、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．３〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．０、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ７．６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．８、ｐＨ７．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９、ｐＨ９．０である。
【０１３５】
一態様では、本明細書に記載の方法は、濃度勾配溶出工程を含む。濃度勾配溶出工程は、生成物の不純物及びプロセス関連不純物を除去して成熟ＶＷＦの収率を最適化することができる。いくつかの場合では、濃度勾配溶出工程は、従来法に比べて、成熟ＶＷＦからＶＷＦプロペプチドを、より高い割合で分離する。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の溶出緩衝液の導電性は、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約３０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約１８ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、または約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍである。他の実施形態では、２つ以上の洗浄緩衝液の導電性は、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約３０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約１８ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、または約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍである。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本方法の１つ以上の洗浄工程の流速は、約１０ｃｍ／時間〜約２００ｃｍ／時間、例えば、約１０ｃｍ／時間、約１５ｃｍ／時間、約２０ｃｍ／時間、約２５ｃｍ／時間、約３０ｃｍ／時間、約３５ｃｍ／時間、約４０ｃｍ／時間、約４５ｃｍ／時間、約５０ｃｍ／時間、約５５ｃｍ／時間、約６０ｃｍ／時間、約６５ｃｍ／時間、約７０ｃｍ／時間、約７５ｃｍ／時間、約８０ｃｍ／時間、約８５ｃｍ／時間、約９０ｃｍ／時間、約９５ｃｍ／時間、約１００ｃｍ／時間、約１０５ｃｍ／時間、約１１０ｃｍ／時間、約１１５ｃｍ／時間、約１２０ｃｍ／時間、約１２５ｃｍ／時間、約１３０ｃｍ／時間、約１３５ｃｍ／時間、約１４０ｃｍ／時間、約１４５ｃｍ／時間、約１５０ｃｍ／時間、約１５５ｃｍ／時間、約１６０ｃｍ／時間、約１６５ｃｍ／時間、約１７０ｃｍ／時間、約１７５ｃｍ／時間、約１８０ｃｍ／時間、約１８５ｃｍ／時間、約１９０ｃｍ／時間、約１９５ｃｍ／時間、または約２００ｃｍ／時間である。樹脂に応じて、いくつかの実施形態では流速を最大６００ｃｍ／時間とすることができる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本方法の１つ以上の溶出工程の流速は、約１０ｃｍ／時間〜約２００ｃｍ／時間、例えば、約１０ｃｍ／時間、約１５ｃｍ／時間、約２０ｃｍ／時間、約２５ｃｍ／時間、約３０ｃｍ／時間、約３５ｃｍ／時間、約４０ｃｍ／時間、約４５ｃｍ／時間、約５０ｃｍ／時間、約５５ｃｍ／時間、約６０ｃｍ／時間、約６５ｃｍ／時間、約７０ｃｍ／時間、約７５ｃｍ／時間、約８０ｃｍ／時間、約８５ｃｍ／時間、約９０ｃｍ／時間、約９５ｃｍ／時間、約１００ｃｍ／時間、約１０５ｃｍ／時間、約１１０ｃｍ／時間、約１１５ｃｍ／時間、約１２０ｃｍ／時間、約１２５ｃｍ／時間、約１３０ｃｍ／時間、約１３５ｃｍ／時間、約１４０ｃｍ／時間、約１４５ｃｍ／時間、約１５０ｃｍ／時間、約１５５ｃｍ／時間、約１６０ｃｍ／時間、約１６５ｃｍ／時間、約１７０ｃｍ／時間、約１７５ｃｍ／時間、約１８０ｃｍ／時間、約１８５ｃｍ／時間、約１９０ｃｍ／時間、約１９５ｃｍ／時間、または約２００ｃｍ／時間である。樹脂に応じて、いくつかの実施形態では流速を最大６００ｃｍ／時間とすることができる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、１つ以上の非イオン性界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０、及びＴｗｅｅｎ２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０である。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ２０である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、前記１つ以上の緩衝液は、非還元糖、糖アルコール、及びポリオールからなる群から選択される１つ以上の追加の物質をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、１つ以上の非還元糖をさらに含む。いくつかの実施形態では、非還元糖として、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、及び／またはキシリトールを挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、１つ以上の糖アルコールをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、１つ以上のポリオールをさらに含む。いくつかの実施形態では、糖アルコールまたはポリオールとして、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、及び／またはグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、スクロース、トレハロース、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、１，２，３−プロパントリオール、メソエリスリトール、及び／またはエリスリトール（メソ−１，２，３，４−ブタンテロール）をさらに含む。
【０１４１】
いずれの緩衝液のｐＨも、アミノ酸、トリス、ＮａＯＨ、エタノールアミンなどを添加することによって調整する（上昇させる）ことができる。
【０１４２】
本明細書に記載の緩衝液（緩衝系）のいずれも、単一の緩衝液として、または２つ以上の緩衝液の組み合わせとして、クエン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、トリスＣｌ、ビス−トリスからなる群から選択することができる。いくつかの実施形態では、緩衝液は、グリシンを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、クエン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、酢酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＭＥＳを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＨＥＰＥＳを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、トリスＨＣｌを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ビス−トリスを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、本明細書に記載の緩衝液のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、陽イオン交換法の緩衝液とキレート剤の組み合わせは、クエン酸塩、リンゴ酸塩（リンゴ酸）、酒石酸塩（酒石酸）を含む。
【０１４４】
ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー精製
本発明の一態様では、成熟ＶＷＦ及びＶＷＦ−ＰＰを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分離する。いくつかの場合では、残存する、ＣＨＯ宿主細胞タンパク質などの宿主細胞由来不純物、組換えフューリン及び低分子量ウイルス不活化試薬などのプロセス関連不純物、ダイズペプトンなどの培地化合物、及び他の生成物関連不純物を、成熟ＶＷＦから除去する。
【０１４５】
本方法の別の態様では、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて残留ＶＷＦ−ＰＰまたは遊離ＶＷＦ−ＰＰなどのＶＷＦ−ＰＰから成熟ＶＷＦを分離する。分離のために、開始組成物またはローディング組成物には、低ｐＨ及び少なくとも１つのキレート剤を含ませることができる。他の実施形態では、濃度勾配溶出緩衝液は、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨのような中性から高いｐＨを有する。別の実施形態では、濃度勾配溶出緩衝液は、１つ以上のキレート剤を含み、ｐＨ７．０以上、例えば、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０を有する。例えば、濃度勾配溶出緩衝液には、ＥＤＴＡを含ませることができ、ｐＨを８．５とすることができる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本発明は、プロペプチドを枯渇させた高純度成熟組換えｒＶＷＦ（高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ）を含む組成物を取得するための方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：（ａ）プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含む溶液をサイズ排除カラムにロードし、前記プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを前記サイズ排除カラムに結合させる工程；（ｂ）前記結合したプロ−ｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを含有するａ）の前記サイズ排除カラムを１つ以上の洗浄緩衝液で洗浄する工程；（ｃ）前記結合したプロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦを含むｂ）の前記カラムをフューリンで処理する工程であって、前記フューリンが前記プロｒＶＷＦをｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰに切断する、工程；（ｄ）前記結合したプロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、及びｍａｔ−ｒＶＷＦをｃ）の前記カラムから溶出緩衝液で溶出する工程であって、前記溶出緩衝液が、前記ｒＶＷＦ−ＰＰと非共有結合的に会合しているｍａｔ−ｒＶＷＦからの前記ｒＶＷＦ−ＰＰの解離を誘導し、前記解離を、（ｉ）少なくとも１つのキレート剤を前記溶出緩衝液に添加することまたは（ｉｉ）前記溶出緩衝液のｐＨを少なくともｐＨ７に上昇させることによって誘導する、工程；ならびに（ｅ）前記ｍａｔ−ｒＶＷＦを前記ｒＶＷＦ−ＰＰから分離させて回収し、高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物を取得する工程であって、前記高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物が、少なくとも９５％の成熟ｒＶＷＦと５％未満のｒＶＷＦ−ＰＰを含む、工程。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、ａ）及びｂ）を、単一工程で同時に行う。いくつかの実施形態では、ａ）の溶液は、免疫親和性精製法由来のフロースルーを含む。いくつかの実施形態では、ａ）の溶液は、モノクローナル抗体カラム由来のフロースルーを含み、前記モノクローナル抗体は、ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ａ）の溶液は、細胞培養培地、抗体カラムフロースルー溶液、及び緩衝溶液からなる群から選択される。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、分離緩衝液は、中性〜高ｐＨを有する。他の実施形態では、緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含み、中性〜高ｐＨを有する。例えば、分離緩衝液は、キレート剤を含有し、ｐＨ６．０以上、またはいくつかの場合ではｐＨ７．０以上を有し得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、プロＶＷＦのローディング濃度は、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ樹脂、例えば、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１１０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１２０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１４０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１１０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１２０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１４０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１１０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１２０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１３０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１４０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約９０ＩＵ／ｍｌ〜約１００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約１５０ＩＵ／ｍｌ、約１５０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約２００ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌ、または約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約２７０ＩＵ／ｍｌ樹脂である。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含む開始組成物、ローディング溶液、またはローディング組成物のｐＨは、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、例えば、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．３〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．０、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ７．６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．８、ｐＨ７．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９、またはｐＨ９．０である。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、サイズ排除法は、緩衝系を含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、１つ以上の分離緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、少なくとも１つの分離緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、少なくとも２つの分離緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、少なくとも第１の分離緩衝液及び少なくとも第２の分離緩衝液を含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、第１の分離緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含み、場合によりｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、分離洗浄緩衝液は、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有し、場合により少なくとも１つのキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、第１の分離緩衝液は、ｐＨ６．０〜ｐＨ６．９の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第２の分離緩衝液は、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の分離緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含むことができ、ｐＨ６．０〜ｐＨ６．９の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の分離緩衝液は、ｐＨ７未満を有する。いくつかの実施形態では、第２の分離緩衝液は、ｐＨ７超を有する。いくつかの実施形態では、２つの分離緩衝液を用いる場合、第１の分離緩衝液はｐＨ７未満を有し、第２の分離緩衝液はｐＨ７超を有する。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、成熟ｒＶＷＦ及びｒＶＷＦ−ＰＰを含む開始溶液を、少なくとも１つのキレート剤を含む分離緩衝液と接触させ、また、場合により緩衝液はｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、開始溶液をｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する緩衝液と接触させ、また、場合により緩衝液は少なくとも１つのキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ｐＨ６．０〜６．９を有する第１の分離緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ｐＨ７．０〜９．０を有する第２の分離緩衝液である。いくつかの実施形態では、成熟ｒＶＷＦ及びｒＶＷＦ−ＰＰを含む開始溶液を、最初にｐＨ６．０〜６．９を有する第１の緩衝液及びｐＨ７．０〜９．０を有する第２の分離緩衝液と接触させる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の分離緩衝液のｐＨは、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、例えば、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．３〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．０、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ７．６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．８、ｐＨ７．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９、ｐＨ９．０である。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨを、工程ａ）の開始溶液に比べて上昇させ、２つの分離緩衝液を用いる場合には第１の分離緩衝液に比べて上昇させ、及び／または第２の分離緩衝液を用いる場合には第１の分離緩衝液に比べて上昇させる。いくつかの実施形態では、第１の分離緩衝液及び第２の分離緩衝液を用いる場合、第１の分離緩衝液はｐＨ７未満を有し、第２の分離緩衝液はｐＨ７超を有する。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、方法の工程（ａ）に記載のように、プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含むローディング溶液に比べて、１つ以上の分離緩衝液のｐＨを少なくとも７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０に上昇させる。いくつかの実施形態では、方法の工程（ａ）の溶液中のｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体からｍａｔ−ｒＶＷＦ及びｒＶＷＦ−ＰＰへの解離を誘導するために、緩衝液のｐＨを、少なくとも７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０に上昇させ、その場合、前記解離は、非共有結合的に会合したｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰが分断されることにより生じる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液のｐＨを、少なくとも約７．２〜約７．８に上昇させる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液のｐＨを、少なくとも約７．６に上昇させる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液のｐＨを、塩基性アミノ酸の添加によって上昇させる。いくつかの実施形態では、ローディング溶液のｐＨを少なくとも７に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の洗浄緩衝液のｐＨを少なくとも約７．２〜約７．８に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の洗浄緩衝液のｐＨを、少なくとも約７．６に上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の分離緩衝液のｐＨを、塩基性アミノ酸の添加によって上昇させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の分離緩衝液は、少なくともｐＨ７を示す。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の分離緩衝液は、１つ以上のキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含む。キレート剤は、二価陽イオンキレート剤とすることができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのキレート剤は、二価陽イオンキレート剤である。いくつかの実施形態では、二価陽イオンキレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ、及びクエン酸塩からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、二価陽イオンキレート剤は、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＳ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ、及びクエン酸塩からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キレート剤はＮＴＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＤＴＰＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＥＤＤＳである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＥＧＴＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＣＤＴＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はクエン酸塩である。いくつかの実施形態では、ｂ）の１つ以上の洗浄緩衝液は、前記１つ以上のキレート剤を含み、少なくともｐＨ７を示す。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の分離緩衝液は、少なくとも１つのキレート剤を含む。キレート剤は、二価陽イオンキレート剤とすることができる。いくつかの実施形態では、二価陽イオンキレート剤は、ニトリロ−２，２’，２’’−トリ酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸；ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ、及びクエン酸塩からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、二価陽イオンキレート剤は、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＳ、ＥＤＴＡ、及びクエン酸塩からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キレート剤はＮＴＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＤＴＰＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＥＤＤＳである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＥＧＴＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はＣＤＴＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤はクエン酸塩である。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー工程の溶出緩衝液Ａ及び／または溶出緩衝液Ｂは、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、例えば、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約２ｍＭ〜約２０ｍＭ、約３ｍＭ〜約２０ｍＭ、約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、約５ｍＭ、約０．５ｍｍｍ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭなどを含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の分離緩衝液は、１０ｍＭ〜５００ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜４００ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ〜４００ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜３５０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ〜３５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、４０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０ｍＭクエン酸ナトリウム、６５ｍＭクエン酸ナトリウム、７０ｍＭクエン酸ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、８０ｍＭクエン酸ナトリウム、９０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、１１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１３０ｍＭクエン酸ナトリウム、１４０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１７０ｍＭクエン酸ナトリウム、１８０ｍＭクエン酸ナトリウム、１９０ｍＭクエン酸ナトリウム、２００ｍＭクエン酸ナトリウム、２１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２３０ｍＭクエン酸ナトリウム、２４０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭクエン酸ナトリウム、２６０ｍＭクエン酸ナトリウム、２７０ｍＭクエン酸ナトリウム、２８０ｍＭクエン酸ナトリウム、２９０ｍＭクエン酸ナトリウム、３００ｍＭクエン酸ナトリウム、３１０ｍＭクエン酸ナトリウム、３２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３３０ｍＭクエン酸ナトリウム、３４０ｍＭクエン酸ナトリウム、３５０ｍＭクエン酸ナトリウム、３６０ｍＭクエン酸ナトリウム、３７０ｍＭクエン酸ナトリウム、３８０ｍＭクエン酸ナトリウム、３９０ｍＭクエン酸ナトリウム、４００ｍＭクエン酸ナトリウム、４１０ｍＭクエン酸ナトリウム、４２０ｍＭクエン酸ナトリウム、４３０ｍＭクエン酸ナトリウム、４４０ｍＭクエン酸ナトリウム、４５０ｍＭクエン酸ナトリウム、４６０ｍＭクエン酸ナトリウム、４７０ｍＭクエン酸ナトリウム、４８０ｍＭクエン酸ナトリウム、４９０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭクエン酸ナトリウム、５１０ｍＭクエン酸ナトリウム、５２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５３０ｍＭクエン酸ナトリウム、５４０ｍＭクエン酸ナトリウム、５５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５６０ｍＭクエン酸ナトリウム、５７０ｍＭクエン酸ナトリウム、５８０ｍＭクエン酸ナトリウム、５９０ｍＭクエン酸ナトリウム、または６００ｍＭクエン酸ナトリウムなどを含むがこれらに限定されない範囲のクエン酸ナトリウムを含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、１つ以上の分離緩衝液は、１０ｍＭ〜５００ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜４００ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ〜４００ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜３５０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ〜３５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、４０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０ｍＭクエン酸ナトリウム、６５ｍＭクエン酸ナトリウム、７０ｍＭクエン酸ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、８０ｍＭクエン酸ナトリウム、９０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、１１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１３０ｍＭクエン酸ナトリウム、１４０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１７０ｍＭクエン酸ナトリウム、１８０ｍＭクエン酸ナトリウム、１９０ｍＭクエン酸ナトリウム、２００ｍＭクエン酸ナトリウム、２１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２３０ｍＭクエン酸ナトリウム、２４０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭクエン酸ナトリウム、２６０ｍＭクエン酸ナトリウム、２７０ｍＭクエン酸ナトリウム、２８０ｍＭクエン酸ナトリウム、２９０ｍＭクエン酸ナトリウム、３００ｍＭクエン酸ナトリウム、３１０ｍＭクエン酸ナトリウム、３２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３３０ｍＭクエン酸ナトリウム、３４０ｍＭクエン酸ナトリウム、３５０ｍＭクエン酸ナトリウム、３６０ｍＭクエン酸ナトリウム、３７０ｍＭクエン酸ナトリウム、３８０ｍＭクエン酸ナトリウム、３９０ｍＭクエン酸ナトリウム、４００ｍＭクエン酸ナトリウム、４１０ｍＭクエン酸ナトリウム、４２０ｍＭクエン酸ナトリウム、４３０ｍＭクエン酸ナトリウム、４４０ｍＭクエン酸ナトリウム、４５０ｍＭクエン酸ナトリウム、４６０ｍＭクエン酸ナトリウム、４７０ｍＭクエン酸ナトリウム、４８０ｍＭクエン酸ナトリウム、４９０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭクエン酸ナトリウム、５１０ｍＭクエン酸ナトリウム、５２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５３０ｍＭクエン酸ナトリウム、５４０ｍＭクエン酸ナトリウム、５５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５６０ｍＭクエン酸ナトリウム、５７０ｍＭクエン酸ナトリウム、５８０ｍＭクエン酸ナトリウム、５９０ｍＭクエン酸ナトリウム、または６００ｍＭクエン酸ナトリウムなどを含むがこれらに限定されない範囲のクエン酸ナトリウムをさらに含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の分離緩衝液は、クエン酸ナトリウム、例えば、限定されないが、１０ｍＭ〜５００ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜４００ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ〜４００ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ〜３５０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ〜３５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、４０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０ｍＭクエン酸ナトリウム、６５ｍＭクエン酸ナトリウム、７０ｍＭクエン酸ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、８０ｍＭクエン酸ナトリウム、９０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、１１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１３０ｍＭクエン酸ナトリウム、１４０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１７０ｍＭクエン酸ナトリウム、１８０ｍＭクエン酸ナトリウム、１９０ｍＭクエン酸ナトリウム、２００ｍＭクエン酸ナトリウム、２１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２３０ｍＭクエン酸ナトリウム、２４０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭクエン酸ナトリウム、２６０ｍＭクエン酸ナトリウム、２７０ｍＭクエン酸ナトリウム、２８０ｍＭクエン酸ナトリウム、２９０ｍＭクエン酸ナトリウム、３００ｍＭクエン酸ナトリウム、３１０ｍＭクエン酸ナトリウム、３２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３３０ｍＭクエン酸ナトリウム、３４０ｍＭクエン酸ナトリウム、３５０ｍＭクエン酸ナトリウム、３６０ｍＭクエン酸ナトリウム、３７０ｍＭクエン酸ナトリウム、３８０ｍＭクエン酸ナトリウム、３９０ｍＭクエン酸ナトリウム、４００ｍＭクエン酸ナトリウム、４１０ｍＭクエン酸ナトリウム、４２０ｍＭクエン酸ナトリウム、４３０ｍＭクエン酸ナトリウム、４４０ｍＭクエン酸ナトリウム、４５０ｍＭクエン酸ナトリウム、４６０ｍＭクエン酸ナトリウム、４７０ｍＭクエン酸ナトリウム、４８０ｍＭクエン酸ナトリウム、４９０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭクエン酸ナトリウム、５１０ｍＭクエン酸ナトリウム、５２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５３０ｍＭクエン酸ナトリウム、５４０ｍＭクエン酸ナトリウム、５５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５６０ｍＭクエン酸ナトリウム、５７０ｍＭクエン酸ナトリウム、５８０ｍＭクエン酸ナトリウム、５９０ｍＭクエン酸ナトリウム、または６００ｍＭクエン酸ナトリウムなどをさらに含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、分離緩衝液の導電性は、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約２５ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約３０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約１８ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍ、または約２０ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍである。
【０１６４】
本明細書に記載の緩衝液（緩衝系）のいずれも、単一の緩衝液として、または２つ以上の緩衝液の組み合わせとして、クエン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、トリスＨＣｌ、ビス−トリス、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニンＨＣｌ、リジンＨＣｌ、グリシン、グリシルグリシン、ホウ酸塩、ＭＯＰＳ、ビシン、トリシン、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、及びＰＩＰＥＳからなる群から選択することができる。いくつかの実施形態では、緩衝液は、グリシンを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、クエン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、トリスＨＣｌ、ビス−トリス、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニンＨＣｌ、リジンＨＣｌ、グリシン、グリシルグリシン、ホウ酸塩、ＭＯＰＳ、ビシン、トリシン、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、及び／またはＰＩＰＥＳを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、クエン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、酢酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＭＥＳを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＨＥＰＥＳを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、トリスＨＣｌを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ビス−トリスを含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、ヒスチジンを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、イミダゾールを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、アルギニンＨＣｌを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、リジンＨＣｌを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、グリシンを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、グリシルグリシンを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ホウ酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＭＯＰＳを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ビシンを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、トリシンを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＴＡＰＳを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＴＡＰＳＯを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＰＩＰＥＳを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、本明細書に記載の緩衝液のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の分離緩衝液は、１つ以上の非イオン性界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０、及びＴｗｅｅｎ２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０である。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ２０である。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本方法の１つ以上の分離緩衝液工程の間の流速の使用は、約１０ｃｍ／時間〜約２００ｃｍ／時間、例えば、約１０ｃｍ／時間、約１５ｃｍ／時間、約２０ｃｍ／時間、約２５ｃｍ／時間、約３０ｃｍ／時間、約３５ｃｍ／時間、約４０ｃｍ／時間、約４５ｃｍ／時間、約５０ｃｍ／時間、約５５ｃｍ／時間、約６０ｃｍ／時間、約６５ｃｍ／時間、約７０ｃｍ／時間、約７５ｃｍ／時間、約８０ｃｍ／時間、約８５ｃｍ／時間、約９０ｃｍ／時間、約９５ｃｍ／時間、約１００ｃｍ／時間、約１０５ｃｍ／時間、約１１０ｃｍ／時間、約１１５ｃｍ／時間、約１２０ｃｍ／時間、約１２５ｃｍ／時間、約１３０ｃｍ／時間、約１３５ｃｍ／時間、約１４０ｃｍ／時間、約１４５ｃｍ／時間、約１５０ｃｍ／時間、約１５５ｃｍ／時間、約１６０ｃｍ／時間、約１６５ｃｍ／時間、約１７０ｃｍ／時間、約１７５ｃｍ／時間、約１８０ｃｍ／時間、約１８５ｃｍ／時間、約１９０ｃｍ／時間、約１９５ｃｍ／時間、または約２００ｃｍ／時間である。樹脂に応じて、いくつかの実施形態では流速を最大６００ｃｍ／時間とすることができる。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、本方法の１つ以上の分離緩衝液工程の間の流速の使用は、約１０ｃｍ／時間〜約２００ｃｍ／時間、例えば、約１０ｃｍ／時間、約１５ｃｍ／時間、約２０ｃｍ／時間、約２５ｃｍ／時間、約３０ｃｍ／時間、約３５ｃｍ／時間、約４０ｃｍ／時間、約４５ｃｍ／時間、約５０ｃｍ／時間、約５５ｃｍ／時間、約６０ｃｍ／時間、約６５ｃｍ／時間、約７０ｃｍ／時間、約７５ｃｍ／時間、約８０ｃｍ／時間、約８５ｃｍ／時間、約９０ｃｍ／時間、約９５ｃｍ／時間、約１００ｃｍ／時間、約１０５ｃｍ／時間、約１１０ｃｍ／時間、約１１５ｃｍ／時間、約１２０ｃｍ／時間、約１２５ｃｍ／時間、約１３０ｃｍ／時間、約１３５ｃｍ／時間、約１４０ｃｍ／時間、約１４５ｃｍ／時間、約１５０ｃｍ／時間、約１５５ｃｍ／時間、約１６０ｃｍ／時間、約１６５ｃｍ／時間、約１７０ｃｍ／時間、約１７５ｃｍ／時間、約１８０ｃｍ／時間、約１８５ｃｍ／時間、約１９０ｃｍ／時間、約１９５ｃｍ／時間、または約２００ｃｍ／時間である。樹脂に応じて、いくつかの実施形態では流速を最大６００ｃｍ／時間とすることができる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、前記１つ以上の緩衝液は、非還元糖、糖アルコール、及びポリオールからなる群から選択される１つ以上の追加の物質をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、１つ以上の非還元糖をさらに含む。いくつかの実施形態では、非還元糖として、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、及び／またはキシリトールを挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、１つ以上の糖アルコールをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝液は、１つ以上のポリオールをさらに含む。いくつかの実施形態では、糖アルコールまたはポリオールとして、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、及び／またはグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、スクロース、トレハロース、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、１，２，３−プロパントリオール、メソエリスリトール、及び／またはエリスリトール（メソ−１，２，３，４−ブタンテロール）をさらに含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー法の緩衝液とキレート剤の組み合わせは、クエン酸塩、リンゴ酸塩（リンゴ酸）、酒石酸塩（酒石酸）を含む。
【０１７１】
Ｄ．免疫親和性精製
いくつかの実施形態では、プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含む溶液を、例えば、モノクローナル抗体カラムを含む免疫親和性精製法により取得する。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体カラムは、ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体カラムは、ＶＷＦモノクローナル抗体を含む。そのようなカラム及び方法は、当技術分野で公知であり、また記載されている。例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第４，３６１，５０９号；あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される）を参照されたく、この文献は、第ＶＩＩＩ因子の精製方法を記載しており、第ＶＩＩＩ因子／ＶＷＦ複合体をモノクローナル抗ＶＷＦ抗体に結合させ、ＣａＣｌ２イオンによって第ＶＩＩＩ因子を複合体から解離させる。ｖＷＦをなお吸着している免疫親和性担体を、カオトロピック剤、特にＮａＳＣＮによって、すなわちｖＷＦ／ＮａＳＣＮ溶液を副産物として生じさせ、廃棄することによって再生させる。
【０１７２】
他の方法として、その全体を参照により本明細書に援用される米国特許第６，５７９，７２３号に記載されている方法が挙げられ、この文献は、免疫親和性クロマトグラフィー法を用いて高純度ｖＷＦまたは第ＶＩＩＩ因子／ｖＷＦ複合体を回収する方法を記載している。そのような方法は、双性イオン種を含有する溶離剤を用いて、免疫親和性吸着剤からＶＷＦを回収する。双性イオン種が存在することにより、調製中に穏やかな条件を使用することができ、追加の安定剤や保存剤を必要とせずに、分子完全性、活性の保持、及び回収したタンパク質の医薬製剤への組み込みが促進される。
そのような方法は、プロｒＶＷＦ、ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ複合体、ｍａｔ−ｒＶＷＦ、及び／またはｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）を含む溶液を得るために、現在の精製方法とともに用いることができる。いくつかの実施形態では、免疫親和性精製は、場合により、陽イオン交換、陰イオン交換、及び／またはサイズ排除クロマトグラフィー手順に基づいた手順を含む、本明細書に記載のいずれかの精製手順において、工程（ａ）の前に行う。
【０１７３】
Ｅ．遊離の成熟ＶＷＦ
いくつかの実施形態では、本明細書に提供する組成物の宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルは、２．０ｐｐｍ以下、例えば、２．０ｐｐｍ、１．９ｐｐｍ、１．８ｐｐｍ、１．７ｐｐｍ、１．６ｐｐｍ、１．５ｐｐｍ、１．４ｐｐｍ、．３ｐｐｍ、１．２ｐｐｍ、１．１ｐｐｍ、１．０ｐｐｍ、０．９ｐｐｍ、０．８ｐｐｍ、０．７ｐｐｍ、０．６ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、０．４ｐｐｍ、０．３ｐｐｍ、０．２ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、０．０９ｐｐｍ、０．０８ｐｐｍ、０．０７ｐｐｍ、０．０６ｐｐｍ、０．０５ｐｐｍ、０．０４ｐｐｍ、０．０３ｐｐｍ、０．０２ｐｐｍ、０．０１ｐｍ以下である。他の実施形態では、本明細書に提供する組成物の宿主細胞不純物レベルは、０．６ｐｐｍ以下、例えば、０．６ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、０．４ｐｐｍ、０．３ｐｐｍ、０．２ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、０．０９ｐｐｍ、０．０８ｐｐｍ、０．０７ｐｐｍ、０．０６ｐｐｍ、０．０５ｐｐｍ、０．０４ｐｐｍ、０．０３ｐｐｍ、０．０２ｐｍ、０．０１ｐｍ以下である。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供する組成物の宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルは、５．０％以下（例えば、≦５．０％）である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する組成物の宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルは、４．０％以下（例えば、≦４．０％）である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する組成物の宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルは、３．０％以下（例えば、≦３．０％）である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する組成物の宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルは、２．０％以下（例えば、≦１．０％）である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する組成物の宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルは、２．０％以下（例えば、≦１．０％）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルは、０．９％以下（例えば、≦０．９％）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルは、０．８％以下（例えば、≦０．８％）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルは、０．７％以下（例えば、≦０．７％）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルは、０．６％以下（例えば、≦０．６％）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルは、０．５％以下（例えば、≦０．５％）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルは、０．４％以下（例えば、≦０．４％）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルは、０．３％以下（例えば、≦０．３％）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルは、０．２％以下（例えば、≦０．２％）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞（ＨＣ）不純物レベルは、０．１％以下（例えば、≦０．１％）である。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦ−ＰＰ不純物は、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、または０．０５％未満である。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦ−ＰＰ不純物は１５％未満である。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦ−ＰＰ不純物は１０％未満である。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦ−ＰＰ不純物は５％未満である。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦ−ＰＰ不純物は４％未満である。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦ−ＰＰ不純物は３％未満である。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦ−ＰＰ不純物は２％未満である。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦ−ＰＰ不純物は１％未満である。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦ−ＰＰ不純物は０．５％未満である。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦ−ＰＰ不純物は０．４％未満である。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦ−ＰＰ不純物は０．３％未満である。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦ−ＰＰ不純物は０．２％未満である。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦ−ＰＰ不純物は０．１％未満である。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦ−ＰＰ不純物は０．０５％未満である。
【０１７６】
（表１）例示的なＶＷＦ−ＰＰの除去能力
2021519280.tif 000003
*:ロード前に事前に成熟させるか、またはカラム上でのin vitro成熟(現在プロセス中で、及び別の特許の請求項の一部で行われている)によって成熟を完了させる
【０１７７】
Ｆ．組換え型ＶＷＦ産生
本発明の遊離の成熟組換えフォン・ヴィルブランド因子（ｒＶＷＦ）は、組換えで産生することができる。当業者であれば、宿主細胞内で組換えタンパク質を発現するための有用な方法を認識している。いくつかの例では、方法は、ＣＨＯ細胞などの宿主細胞でｒＶＷＦをコードする核酸配列を発現させ、得られた宿主細胞を特定の条件下で培養してｒＶＷＦ、プレプロＶＷＦ、プロＶＷＦなどを産生することを含む。
【０１７８】
特定の実施形態では、ＶＷＦ用の配列コードを含む核酸配列は、発現ベクターであり得る。ベクターは、ウイルスによって送達し得るか、またはプラスミドであり得る。タンパク質をコードする核酸配列は、特定の遺伝子またはその生物学的機能部分であり得る。一実施形態では、タンパク質は、ＶＷＦの少なくとも生物学的に活性な部分である。核酸配列は、一般的に当業者に公知のプロモーター配列、エンハンサー、ＴＡＴＡボックス、転写開始部位、ポリリンカー、制限酵素部位、ポリＡ配列、タンパク質プロセシング配列、選択マーカーなどのタンパク質の制御発現に適した他の配列をさらに含み得る。
【０１７９】
ＶＷＦの発現には多種多様なベクターを用いることができ、真核生物発現ベクターから選択することができる。真核生物発現用のベクターの例として：（ｉ）酵母での発現については、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１などのプロモーターを使用するｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴなどのベクター；（ｉｉ）昆虫細胞での発現については、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈなどのプロモーターを使用するｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣなどのベクター；（ｉｉｉ）哺乳類細胞での発現については、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶなどのベクター、ならびにＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、及びβ−アクチンなどのプロモーターを使用する、例えば、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどのウイルス系由来ベクターが挙げられる。
【０１８０】
いくつかの態様では、本発明の方法で使用するｒＶＷＦを、当技術分野で公知の方法を用いて哺乳類細胞培養物中で発現させることによって産生する。特定の実施形態では、哺乳類培養物は、ＣＨＯ細胞を含む。さらなる実施形態では、ｒＶＷＦを、同じ培養物中で組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）と共発現させる。そのような実施形態では、ｒＶＷＦとｒＦＶＩＩＩを、一緒に精製する（共精製する）か、または当技術分野で公知の方法を用いて別々に精製する。他の実施形態では、ｒＶＷＦを、ｒＦＶＩＩＩを含まない培養物中で発現させる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦを、適切な真核生物宿主系で発現させ、単離する。真核細胞の例として、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、及びＨｅｐＧ２などの哺乳類細胞；例えば、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、Ｓ２細胞、及びＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞などの昆虫細胞；ならびに例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞などの酵母細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ＶＷＦは、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞などで発現させることができる。例えば、ヒト細胞株、ハムスター細胞株、またはマウス細胞株において発現させることができる。特定の一実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、またはＨＥＫ細胞株である。一般的には、哺乳類細胞、例えば、連続細胞株由来のＣＨＯ細胞を使用して、本発明のＶＷＦを発現させることができる。特定の例では、ＶＷＦタンパク質を、発現させ、ＣＨＯ細胞発現系から単離する。
【０１８２】
ＶＷＦは、細胞培養系で、または当業者が認識する任意の細胞培養法に従って産生することができる。いくつかの実施形態では、細胞培養を、高い容量特異的培養表面積を提供するのに適した条件下で大規模なバイオリアクターで実施して、高い細胞密度及びタンパク質発現を達成することができる。そのような増殖条件を提供するための１つの手段は、撹拌槽型バイオリアクターでの細胞培養にマイクロキャリアを使用することである。マイクロキャリアにおける細胞増殖の概念は、最初にｖａｎ  Ｗｅｚｅｌ（ｖａｎ  Ｗｅｚｅｌ，Ａ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９６７，２１６：６４−５）によって記載され、増殖培地に懸濁させた小さな固体粒子の表面への細胞接着を可能にする。これらの方法は、高い表面対体積比を提供し、したがって、効率的に栄養素を利用することができる。さらに、真核細胞系における分泌タンパク質の発現に関しては、表面対体積比の増加により、より高いレベルの分泌が可能となり、培養上清中のタンパク質収量が高まる。最後に、これらの方法では、真核生物発現培養物を容易にスケールアップすることができる。
【０１８３】
ＶＷＦを発現する細胞は、細胞培養増殖中に球状または多孔性マイクロキャリアに結合することができる。マイクロキャリアは、Ｂｕｔｌｅｒ（１９８８．Ｉｎ：Ｓｐｉｅｒ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：２８３−３０３）に記載されているように、デキストラン、コラーゲン、プラスチック、ゼラチン及びセルロースなどに基づいてマイクロキャリアの群から選択されるマイクロキャリアであり得る。また、球状マイクロキャリア上で細胞をバイオマスまで増殖させ、細胞が最終的な発酵槽バイオマスに到達したとき、及び発現させるタンパク質を多孔性マイクロキャリア上で産生する前に、細胞を継代培養することができ、またはその逆も可能である。適切な球状マイクロキャリアとして、Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）１、Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）２、及びＣｙｔｏｄｅｘ（商標）３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの滑面マイクロキャリア、ならびにＣｙｔｏｐｏｒｅ（商標）１、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（商標）２、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（商標）１、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（商標）２（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの多孔性マイクロキャリアが挙げられ得る。
【０１８４】
さらなる実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでプロＶＷＦをフューリンに曝露し、非成熟型ＶＷＦからＶＷＦプロペプチドを切り離す。いくつかの実施形態では、プロペプチド切断に使用するフューリンは組換えフューリンである。
【０１８５】
特定の実施形態では、高分子量ｒＶＷＦを産生する細胞培養培地で培養した細胞でｒＶＷＦを発現させる。用語「細胞培養液」、「細胞培養培地または培地」、及び「細胞培養上清」とは、当技術分野で一般的に周知の細胞培養プロセスの態様を指す。本発明に関して、細胞培養液には、細胞培養培地及び細胞培養上清が含まれ得る。細胞培養培地を、場合によりサプリメントとともに、細胞培養液に外来的に添加して、ＶＷＦ発現細胞を培養するための栄養素及び他の成分を提供する。細胞培養上清とは、細胞培養培地由来の栄養素及び他の成分ならびに培養中に細胞から放出、代謝、及び／または排泄される産物を含む細胞培養液を指す。さらなる実施形態では、培地は、動物性タンパク質フリーであり、化学的に定義することができる。動物性タンパク質フリー及び化学的に定義された培養培地の調製方法は、例えばＵＳ２００６／００９４１０４、ＵＳ２００７／０２１２７７０、及びＵＳ２００８／０００９０４０において当技術分野で公知であり、これらは、あらゆる目的のために、特に細胞培養培地に関連するすべての教示のために本明細書に援用される。「タンパク質フリー」及び関連用語は、培養物中の外来性または細胞以外の供給源に由来するタンパク質を指し、天然では増殖中にタンパク質は取り除かれる。別の実施形態では、培養培地はポリペプチドフリーである。別の実施形態では、培養培地は血清フリーである。別の実施形態では、培養培地は動物性タンパク質フリーである。別の実施形態では、培養培地は動物成分フリーである。別の実施形態では、培養培地は、タンパク質、例えば、ウシ胎仔血清などの血清由来動物性タンパク質を含有する。別の実施形態では、培養物は、外来的に添加された組換えタンパク質を含む。別の実施形態では、タンパク質は、認定病原体フリー動物由来である。本明細書中で使用する用語「化学的に定義された」とは、培地が、例えば、動物成分、器官、腺、植物、または酵母の抽出物のような未定義のサプリメントを含まないことを意味する。したがって、化学的に定義された培地の各成分は正確に定義される。好ましい実施形態では、培地は、動物成分フリーであるとともにタンパク質フリーである。
【０１８６】
特定の実施形態では、ＶＷＦ発現細胞の培養を、少なくとも約７日間、または少なくとも約１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも約５週間、６週間、７週間、または少なくとも約２か月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８か月以上維持することができる。組換えＶＷＦタンパク質の産生のために細胞培養を維持する細胞密度は、タンパク質発現に使用する培養条件及び培地に依存する。当業者であれば、ＶＷＦを産生する細胞培養物にとって最適な細胞密度を容易に決定することができる。一実施形態では、培養物を、長期間にわたって約０．５ｘ１０６〜４ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞密度で維持する。他の実施形態では、細胞密度を、長期間にわたって約１．０ｘ１０６〜約１．０ｘ１０７細胞／ｍｌの濃度で維持する。他の実施形態では、細胞密度を、長期間にわたって約１．０ｘ１０６〜約４．０ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で維持する。他の実施形態では、細胞密度を、長期間にわたって約１．０ｘ１０６〜約４．０ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で維持する。さらに他の実施形態では、細胞密度を、約２．０ｘ１０６〜約４．０ｘ１０６、または約１．０ｘ１０６〜約２．５ｘ１０６、または約１．５ｘ１０６〜約３．５ｘ１０６、または他の任意の同様の範囲の濃度で長期間維持し得る。細胞培養における適切な時間の後、当技術分野で公知の方法を用いてｒＶＷＦを発現系から単離することができる。
【０１８７】
特定の実施形態では、ｒＶＷＦ産生のための連続細胞培養の細胞密度を、長期間にわたって２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下の濃度で維持する。他の特定の実施形態では、細胞密度を、２．０ｘ１０６細胞／ｍＬ、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ、１．０ｘ１０６細胞／ｍＬ、０．５ｘ１０６細胞／ｍＬ以下で維持する。一実施形態では、細胞密度を、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ〜２．５ｘ１０６細胞／ｍＬで維持する。
【０１８８】
上記の細胞培養物の一実施形態では、細胞培養液は、銅を含む培地サプリメントを含む。そのような細胞培養液は、例えば米国特許第８，８５２，８８８号及び米国特許第９，４０９，９７１号に記載されており、これは、あらゆる目的のために、特に組換えＶＷＦを産生するための細胞培養法及び組成物に関連するすべての教示のために、その全体を参照により本明細書に援用される。
【０１８９】
プレプロＶＷＦのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に記載されており、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００５５２（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）ｍＲＮＡ）及びＮＰ＿０００５４３でそれぞれ入手可能である。成熟ＶＷＦタンパク質に対応するアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（全長プレプロＶＷＦアミノ酸配列のアミノ酸７６４〜２８１３に対応する）に記載されている。いくつかの実施形態では、ＶＷＦは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を示す。いくつかの実施形態では、本発明のｍａｔ−ｒＶＷＦは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を示す。例えば、米国特許第８，５９７，９１０号、米国特許公開第２０１６／０１２９０９０号、及び図６０を参照のこと。
【０１９０】
有用なｒＶＷＦの一形態は、少なくともｉｎ  ｖｉｖｏ安定化の特性、例えば、少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子の結合及び場合により薬理学的に許容されるグリコシル化パターンを有する。その具体例として、Ａ２ドメインを含まず、したがってタンパク質分解に対して耐性を有するＶＷＦ（Ｌａｎｋｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：１００８−１０１３，１９９７）、ならびに糖タンパク質ｌｂ結合ドメインと、コラーゲン及びヘパリン結合部位とを含むＶａｌ４４９〜Ａｓｎ７３０のＶＷＦ断片（Ｐｉｅｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６４：１３３９−１３４７，１９８９）が挙げられる。少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子を安定化させるＶＷＦの能力の判定は、一態様では、当技術分野で公知の方法に従ってＶＷＦ欠損哺乳類において実施する。
【０１９１】
本発明のｒＶＷＦは、当技術分野で公知の任意の方法によって産生することができる。特定の一例は、１９８６年１０月２３日に公開されたＷＯ８６／０６０９６及び１９９０年７月２３日に出願された米国特許出願第０７／５５９，５０９号に開示されており、組換えＶＷＦの産生方法に関して参照により本明細書に援用される。したがって、（ｉ）例えば、ＲＮＡ逆転写及び／またはＤＮＡ増幅による遺伝子改変によって組換えＤＮＡを産生し、（ｉｉ）組換えＤＮＡを、例えば電気穿孔法またはマイクロインジェクションによる形質移入によって原核細胞または真核細胞に導入し、（ｉｉｉ）形質転換細胞を、例えば連続方式またはバッチ方式で培養し、（ｉｖ）例えば構成的に、または誘導時にＶＷＦを発現させ、そして（ｖ）例えば、培養培地から、または形質転換した細胞を回収することによってＶＷＦを単離して、（ｖｉ）例えば陰イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーを介して精製ｒＶＷＦを取得するための方法は、当技術分野で公知である。一態様では、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術を用いて形質転換した宿主細胞において組換えＶＷＦを作製する。例えば、ポリペプチドのコード配列を、適切な制限酵素を用いてＤＮＡから切除することができる。あるいは、別の態様では、ＤＮＡ分子をホスホロアミド酸法のような化学合成技術を用いて合成する。また、さらに別の態様では、これらの技術の組み合わせを用いる。
【０１９２】
また、本発明は、適切な宿主において本発明のポリペプチドをコードするベクターを提供する。ベクターは、適切な発現制御配列に作動的に連結されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドをベクターに挿入する前または後のいずれかに、この作動的な連結を達成する方法は周知である。発現制御配列として、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、終止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルが挙げられる。得られるベクターは、内部にポリヌクレオチドを有し、適切な宿主を形質転換するために使用される。この形質転換を、当技術分野で周知の方法を用いて実施してもよい。
【０１９３】
多数の利用可能な周知の宿主細胞のいずれかを、本発明の実施に用いる。特定の宿主の選択は、例えば、選択した発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によってコードされるペプチドの毒性、形質転換率、ペプチドの回収の容易さ、発現特性、生物安全性及びコストを含む、当技術分野で認識される多くの因子に依存する。すべての宿主細胞が特定のＤＮＡ配列の発現に等しく有効であるわけではないということを理解したうえで、これらの因子のバランスを決定しなければならない。これらの一般的なガイドラインの範囲内で、有用な微生物宿主細胞には、限定されないが、培養中の細菌、酵母及び他の真菌、昆虫、植物、哺乳類（ヒトを含む）細胞、または当技術分野で公知の他の宿主が含まれる。
【０１９４】
形質転換した宿主細胞を、所望の化合物が発現するように、従来の発酵条件下で培養する。そのような発酵条件は当技術分野で周知である。最後に、ポリペプチドを、当技術分野で周知の方法により、培養培地または宿主細胞自体から精製する。
【０１９５】
本発明の化合物を発現するために利用する宿主細胞に応じて、場合により、タンパク質中のグリコシル化部位であることが知られている部位に炭水化物（オリゴ糖）基を結合させる。一般的に、Ｏ−結合型オリゴ糖はセリン（Ｓｅｒ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）残基に結合し、Ｎ−結合型オリゴ糖はアスパラギン（Ａｓｎ）残基に、それが配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの一部である場合に結合し、式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る。Ｘは、好ましくは、プロリンをカウントしない１９種の天然アミノ酸のうちの１つである。Ｎ−結合型及びＯ−結合型オリゴ糖の構造、及び各タイプに認められる糖残基は異なる。Ｎ−結合型及びＯ−結合型オリゴ糖の両方に一般的に認められる糖の１つのタイプは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と呼ばれる）である。シアル酸は、通常、Ｎ−結合型及びＯ−結合型オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷により、一態様では、グリコシル化化合物に酸性特性を付与する。そのような部位（複数可）は、本発明の化合物のリンカーに組み込まれていてもよいし、好ましくは、ポリペプチド化合物の組換え産生中に細胞によってグリコシル化される（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳなどの哺乳類細胞において）。他の態様では、そのような部位は、当技術分野で公知の合成または半合成手順によってグリコシル化される。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、シアル化（シアリル化とも呼ばれる）を、本明細書に記載の精製手順（陰イオン交換、陽イオン交換、サイズ排除、及び／または免疫親和法を含む）の一部としてカラム上で実施することができる。いくつかの実施形態では、シアリル化は、シアリル化を受けていないｒＶＷＦに比べて、ｒＶＷＦの安定性を増加させる。いくつかの実施形態では、シアリル化は、シアリル化を受けていないｒＶＷＦに比べて、血液循環中のｒＶＷＦの安定性を増加させる（例えば、対象への投与後の）。いくつかの実施形態では、唾液ｒＶＷＦの安定性の増加により、シアリル化を受けていないｒＶＷＦに比べて、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、シアリル化は、シアリル化を受けていないｒＶＷＦに比べて、ｒＶＷＦの半減期を増加させる。いくつかの実施形態では、シアリル化は、シアリル化を受けていないｒＶＷＦに比べて、血液循環中のｒＶＷＦの半減期を増加させる（例えば、対象への投与後の）。いくつかの実施形態では、シアリル化ｒＶＷＦの半減期の増加により、シアリル化を受けていないｒＶＷＦに比べて、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、シアリル化ｒＶＷＦの半減期の増加により、シアリル化を受けていないｒＶＷＦに比べて、血液循環中で、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間以上（例えば、対象に投与後）安定なｒＶＷＦがもたらされる。いくつかの実施形態では、シアリル化により、２，３シアリル化及び／または２，６シアリル化の数が増加する。いくつかの実施形態では、シアリル化を、追加の緩衝工程として２，３シアリルトランスフェラーゼ及び／または２，６シアリルトランスフェラーゼ及びＣＭＰ−ＮＡＮＡ（シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ナトリウム塩）を添加することによって増加させる。いくつかの実施形態では、シアリル化を、追加の緩衝工程として２，３シアリルトランスフェラーゼ及びＣＭＰ−ＮＡＮＡ（シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ナトリウム塩）を添加することによって増加させる。いくつかの実施形態では、２，３シアリル化を、追加の緩衝工程として２，３シアリルトランスフェラーゼ及びＣＭＰ−ＮＡＮＡ（シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ナトリウム塩）を添加することによって増加させる。いくつかの実施形態では、シアリル化を増加させるために、結合タンパク質（例えば、結合ｒＶＷＦ）をシアリダーゼ（例えば、ノイラミニダーゼ）で処理して２，３シアリル化を除去し、次いで洗浄工程を適用してシアリダーゼを除去し、２，６シアリル化を導入する。いくつかの実施形態では、２，６シアリルトランスフェラーゼ及びＣＭＰ−ＮＡＮＡの添加により、２，６シアリル化を導入する。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、２，６シアリル化を、追加の緩衝工程として２，６シアリルトランスフェラーゼ及びＣＭＰ−ＮＡＮＡ（シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ナトリウム塩）を添加することによって増加させる。いくつかの実施形態では、２，３シアリル化及び／または２，６シアリル化を、追加の緩衝工程として２，３シアリルトランスフェラーゼ及び／または２，６シアリルトランスフェラーゼ及びＣＭＰ−ＮＡＮＡ（シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ナトリウム塩）を添加することによって増加させる。いくつかの実施形態では、ＣＭＰ−ＮＡＮＡを、化学的または酵素的に修飾し、修飾シアル酸を電位のない部位に移す。いくつかの実施形態では、樹脂にｒＶＷＦをローディングし、本明細書に記載の１つ以上の緩衝液で洗浄して望ましくない不純物を枯渇させ、シアリルトランスフェラーゼ及びＣＭＰ−ＮＡＮＡを含有する１つ以上の緩衝液をさらなるシアリル化を可能にする条件で添加し、１つ以上の緩衝液で洗浄して余剰のシアリル化試薬を枯渇させ、１つ以上の緩衝液で強化型ｒＶＷＦ（例えば、シアリル化を増加させたｒＶＷＦ）を溶出することにより、シアリル化を実施する。いくつかの実施形態では、シアリル化プロセスは、本明細書に記載するように、陽イオン交換法、陰イオン交換法、サイズ排除法、または免疫親和精製法の一部として実施する。
【０１９８】
あるいは、例えば、固相合成技術を用いた合成法によって化合物を作製する。適切な技術は、当技術分野で周知であり、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７３），Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐｐ．３３５−６１（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｐａｎａｙｏｔｉｓ  ｅｄｓ．）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｄａｖｉｓｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４−４１４；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ（１９６９），Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第３，９４１，７６３号；Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６），Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ．）２：１０５−２５３；及びＥｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６），Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ．）２：２５７−５２７’に記載されている技術が挙げられる。固相合成は、低分子ペプチドを作製するには最も費用対効果の高い方法であるため、個々のペプチドを作製する技術として好ましい。
【０１９９】
ＶＷＦの断片、バリアント及び類似体は、当技術分野で周知の方法に従って産生することができる。ポリペプチドの断片を、限定されないが、酵素的切断（例えば、トリプシン、キモトリプシン）、及び組み換え手段を用いて調製して、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を生成することができる。特定の活性を有するタンパク質の領域、例えば、多量体化ドメインまたは当技術分野で公知の他の任意の識別可能なＶＷＦドメインを含むポリペプチド断片を生成してもよい。
【０２００】
ポリペプチド類似体の作製方法もまた、周知である。ポリペプチドのアミノ酸配列類似体は、置換型、挿入型、付加型または欠失型類似体とすることができる。ポリペプチドの断片を含む、欠失型類似体は、機能または免疫原性活性に必須ではない天然タンパク質の１つ以上の残基を欠いている。挿入型類似体は、例えば、ポリペプチド中の非末端部位におけるアミノ酸（複数可）の付加を有する。この類似体は、例えば、限定されないが、免疫反応性エピトープまたは単に単一残基の挿入を含み得る。ポリペプチドの断片を含む、付加型類似体は、タンパク質の一方または両方の末端において１つ以上のアミノ酸の付加を有し、これには、例えば、融合タンパク質が含まれる。前述の類似体の組み合わせも企図される。
【０２０１】
置換型類似体は、一般的には、タンパク質内の１つ以上の部位において野生型の１つのアミノ酸から別のアミノ酸への交換を有し、ポリペプチドの１つ以上の特性を、他の機能または特性を完全に失わせることなく調節するように設計してもよい。一態様では、置換は保存的置換である。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸から、側鎖または類似の化学的特徴を有するアミノ酸への置換である。保存的置換を行うための同様のアミノ酸として、酸性側鎖（グルタミン酸、アスパラギン酸）；塩基性側鎖（アルギニン、リジン、ヒスチジン）；極性アミド側鎖（グルタミン、アスパラギン）；疎水性の脂肪族側鎖（ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン）；芳香族側鎖（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）；小さな側鎖（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン）；または脂肪族ヒドロキシル側鎖（セリン、スレオニン）を有するアミノ酸が挙げられる。
【０２０２】
一態様では、類似体は、それらが由来する組換えＶＷＦと実質的に相同であるか、または実質的に同一である。類似体には、野生型ポリペプチドの少なくともいくつかの生物学的活性、例えば血液凝固活性を保持するものが含まれる。
【０２０３】
企図されるポリペプチドバリアントには、限定されないが、ユビキチン化、ポリシアル化（またはポリシアリル化）を含むグリコシル化、治療剤または診断剤との複合体化、標識、ペグ化などの共有ポリマー結合（ポリエチレングリコールによる誘導体化）、非加水分解結合の導入、及びヒトタンパク質において通常生じないオルニチンなどのアミノ酸の化学合成による挿入または置換などの技術によって化学的に修飾されたポリペプチドが含まれる。バリアントは、本発明の非修飾分子と同じ、または本質的に同じ結合特性を保持している。そのような化学修飾は、ＶＷＦポリペプチドへの薬剤の直接的または間接的な（例えば、リンカーを介して）結合を含み得る。間接的な結合の場合、リンカーは加水分解可能であっても、非加水分解性であってもよいと考えられる。
【０２０４】
ペグ化ポリペプチド類似体の調製は、一態様では、（ａ）結合構築物のポリペプチドが１つ以上のＰＥＧ基に結合するようなる条件下で、ポリペプチドをポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）と反応させる工程、及び（ｂ）反応生成物（複数可）を取得する工程を含む。一般的に、アシル化反応に最適な反応条件は、既知のパラメータと所望の結果に基づいて決定する。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比率が大きいほど、ポリペグ化産物の割合は大きくなる。いくつかの実施形態では、結合構築物は、Ｎ末端で単一のＰＥＧ部分を有する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、血液凝固因子に結合して、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでより長い半減期を提供し得る。ＰＥＧ基は、任意の都合のよい分子量のものであってよく、直鎖状であるか、または分岐している。ＰＥＧの平均分子量は、約２キロダルトン（「ｋＤ」）〜約１００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、または約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲である。特定の態様では、ＰＥＧ基は、ＰＥＧ部分上の天然または改変型の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）を介して、血液凝固因子上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）へのアシル化または還元アルキル化によって、あるいは当技術分野で公知の任意の他の技術によって、血液凝固因子に結合する。
【０２０５】
ポリシアリル化ポリペプチドの調製方法は、米国特許公開２００６０１６０９４８，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ｅｔ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３４１：２６−３４，１９９７、及びＳａｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １２：４２−５１，２００６に記載されている。簡潔に述べると、０．１Ｍ  ＮａＩＯ４を含有するコロミン酸（ＣＡ）の溶液を、暗所において室温で撹拌し、ＣＡを酸化させる。活性化したＣＡ溶液を、暗所において、例えば、０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７．２に対して透析し、この溶液を、ｒＶＷＦ溶液に添加し、穏やかな攪拌下で暗所において室温で１８時間インキュベートした。場合により、遊離試薬を、例えば、限外濾過／ダイアフィルトレーションによってｒＶＷＦ−ポリシアリル酸複合体から分離する。ｒＶＷＦとポリシアリル酸の複合体化は、架橋試薬としてグルタルアルデヒドを用いて達成する（Ｍｉｇｎｅａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３７：７９０−７９６，２００４）。
【０２０６】
別の態様では、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドである第２の薬剤との融合タンパク質であることがさらに企図される。一実施形態では、ポリペプチドである第２の薬剤は、限定されないが、酵素、増殖因子、抗体、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体、細胞表面受容体の細胞外ドメイン、細胞接着分子、または上記のタンパク質の断片または活性ドメインである。関連する実施形態では、第２の薬剤は、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、及び／または第ＩＸ因子などの血液凝固因子である。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は融合タンパク質である。企図される融合タンパク質は、当技術分野で周知の化学的または組換え技術によって作製する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質であり、その場合、活性ＦＶＩＩＩがＶＷＦモチーフに埋め込まれている。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質であり、その場合、ＶＷＦが完全長であるように、活性ＦＶＩＩＩがＶＷＦモチーフに埋め込まれている。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質であり、その場合、活性ＦＶＩＩＩがＶＷＦモチーフに埋め込まれ、ＶＷＦ配列の一部が削除され、ＦＶＩＩＩ配列で置換されている。ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質のいくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは、Ｂドメインを削除したＦＶＩＩＩである。ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質のいくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ−ＢドメインをＮ−グリコシル化リッチドメインに置換する。ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質のいくつかの実施形態では、ｖＷＦ−Ｎグリコシル化リッチドメインを、完全長ＦＶＩＩＩ及び／またはそのトランケート型に融合させる。
【０２０７】
ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、以下を含む：
ＶＷＦペプチドの７６４〜１３３６位を含むＶＷＦペプチド、
ＦＶＩＩＩ重鎖ペプチドの２４〜７６０位を含むＦＶＩＩＩペプチド、
ＶＷＦペプチドの２２１８〜２５９３位を含むＶＷＦペプチド、
ＦＶＩＩＩ軽鎖ペプチドの１３３３〜２３５１位を含むＦＶＩＩＩペプチド、及び
ＶＷＦペプチドの２６２０〜２８１３位を含むＶＷＦペプチド。
ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質のこの実施形態では、アミノ酸の位置は、Ｐｒｏ及び／またはシグナルペプチドを含む第１の位置からカウントする。ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質のこの実施形態では、ＶＷＦにおける７６４位は成熟ｒＶＷＦ（ｍａｔ−ｒＶＷＦ）の１位に対応し、ＦＶＩＩＩの２０位は成熟ＦＶＩＩＩペプチドの１位に対応する。ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質の配列を図６４に示す。
【０２０８】
ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、以下を含む：
ＦＶＩＩＩ重鎖ペプチドのＦＶＩＩＩ重鎖１９〜７６０位を含むＦＶＩＩＩペプチド、
ＶＷＦペプチドの２２１８〜２５９３位を含むＶＷＦペプチド、及び
ＦＶＩＩＩ軽鎖ペプチドの１３３３〜２３５１位を含むＦＶＩＩＩペプチド。
ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質のこの実施形態では、アミノ酸の位置は、Ｐｒｏ及び／またはシグナルペプチドを含む第１の位置からカウントする。ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質のこの実施形態では、ＶＷＦにおける７６４位は成熟ｒＶＷＦ（ｍａｔ−ｒＶＷＦ）の１位に対応し、ＦＶＩＩＩの２０位は成熟ＦＶＩＩＩペプチドの１位に対応する。ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質の配列を図６５に示す。
【０２０９】
別の態様では、プレプロＶＷＦ及びプロＶＷＦポリペプチドが、本発明の製剤において治療効果を提供することも企図されている。例えば、米国特許第７，００５，５０２号は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでトロンビン生成を誘導する相当量のプロＶＷＦを含む医薬品製剤を記載している。組換え、生物学的活性断片、バリアント、または天然の成熟ＶＷＦの他の類似体に加えて、本発明は、本明細書に記載の製剤におけるプレプロＶＷＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に記載）またはプロＶＷＦポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸残基２３〜７６４）の組換え生物学的活性断片、バリアント、または類似体の使用を企図する。
【０２１０】
断片、バリアント及び類似体をコードするポリヌクレオチドは、天然分子と同じまたは同様の生物学的活性を有する天然分子の生物学的活性断片、バリアント、または類似体をコードする技術者によって容易に生成され得る。様々な態様では、これらのポリヌクレオチドを、ＰＣＲ技術、ＤＮＡコード分子の消化／ライゲーションなどを用いて調製する。したがって、当業者は、部位特異的変異誘発を含むがこれに限定されない当技術分野で公知の任意の方法を使用して、ＤＮＡ鎖に一塩基の変化を生成して、コドン変化及びミスセンス変異をもたらすことができる。本明細書中で使用する場合、語句「適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、例えば、５０％ホルムアミド中、４２℃でハイブリダイゼーションし、０．１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中、６０℃で洗浄することを意味する。当業者であれば、ハイブリダイズさせる配列の長さ及びＧＣヌクレオチド塩基含量に基づいて、これらの条件に変動が生じることは理解している。当技術分野における標準式は、正確なハイブリダイゼーション条件を決定するのに適している。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，９．４７−９．５１  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照のこと。
【０２１１】
Ｇ．ウイルスの不活性化
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ウイルス不活化の工程をさらに含む。ウイルス不活化工程は、前記ウイルス不活化を、洗浄工程及び／または溶出工程の前に、後に、または同時に、ただし回収工程の前に実施することができる。ウイルス不活化処理は、脂質エンベロープウイルスを不活化することができる。いくつかの実施形態では、ウイルス不活化処理は、溶媒及び界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理である。いくつかの実施形態では、ウイルス不活化処理は、エチレングリコール、セクションアルコール中のプロピレングリオール及び／または１つ以上の有機溶媒（複数可）の使用を含む。
【０２１２】
本明細書中で使用する場合、用語「ウイルス不活性化」または「ウイルス不活化」とは、ウイルスがもはや細胞に感染し、複製し、及び増殖することができず、本質的にウイルスが除去されるプロセスを指す。このように、用語「ウイルス不活化」とは、一般的に、感染性ウイルス汚染物質を完全に含まない本明細書に開示の流体を作製するプロセスを指す。本明細書に開示の方法を用いた任意の程度のウイルス不活化が望ましい。しかしながら、医薬品に対する厳格な安全ガイドラインを満たすために必要なウイルス不活化の程度を達成することが望ましい。これらのガイドラインはＷＨＯによって定められており、当業者には周知である。
【０２１３】
本明細書に開示の方法は、インキュベーション後に混合物からウイルスを除去する工程をさらに含み得る。本明細書中で使用する場合、用語「ウイルスを除去する」または「ウイルス除去」とは、本明細書に開示の混合物からウイルスを枯渇させ、それによりウイルス粒子を混合物から効果的に抽出するプロセスを指す。ウイルスは、生存ウイルスまたは不活化ウイルスであり得る。除去は、一般的には、サイズ排除クロマトグラフィーまたは陽性吸着クロマトグラフィーによって達成され、その場合、目的のタンパク質が、例えば、本明細書に記載する陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂を含む、クロマトグラフィー樹脂に結合する。除去後、ウイルスの残存量は、例えばヒトを含め、その必要としている対象に投与する場合に実質的に長期または永久的な有害な影響を及ぼさない量である。
【０２１４】
一実施形態では、ウイルス除去後の混合物は、本質的にウイルスを含まない。本明細書中で使用する場合、用語「本質的にウイルスを含まない」とは、ウイルスの存在または活性を検出または確認するために使用する機器またはプロセスによって、微量のウイルスのみを検出または確認することができ、そのような微量のウイルスではヒトの健康に害を及ぼすには不十分であることを意味する。この実施形態の一態様では、ウイルス除去後の混合物は、完全にウイルスを含まない。本明細書中で使用する場合、用語「完全にウイルスを含まない」とは、ウイルスの存在または活性を検出または確認するために使用する機器またはプロセスの検出範囲内でウイルスの存在を検出または確認することができないことを意味する。ウイルスがヒトの健康に害を及ぼすには不十分であることから、本質的にウイルスを含まないか、または完全にウイルスを含まない混合物中に含まれるタンパク質を使用して、ヒトに安全に投与できる医薬組成物を作製することができる。
【０２１５】
この実施形態の他の態様では、ウイルス除去後の混合物は、１０ＰＦＵ／ｍＬ未満のウイルス、例えば、１ＰＦＵ／ｍＬ未満のウイルス、１×１０−１ＰＦＵ／ｍＬ未満のウイルス、１×１０−２ＰＦＵ／ｍＬのウイルス、または１×１０−３ＰＦＵ／ｍＬのウイルスを含む。
【０２１６】
この実施形態のさらに他の態様では、ウイルス除去後の混合物は、ＩＤ５０未満のウイルス、例えば、ＩＤ５０の最大１／１０未満のウイルス、ＩＤ５０の最大１／１００未満のウイルス、ＩＤ５０の最大１／２００未満のウイルス、ＩＤ５０の最大１／３００未満のウイルス、ＩＤ５０の最大１／４００未満のウイルス、ＩＤ５０の最大１／５００未満のウイルス、ＩＤ５０の最大１／６００未満のウイルス、ＩＤ５０の最大１／７００未満のウイルス、ＩＤ５０の最大１／８００未満のウイルス、ＩＤ５０の最大１／９００未満のウイルス、またはＩＤ５０の最大１／１０００未満のウイルスを含む。
【０２１７】
ウイルス不活化は、タンパク質精製と組み合わせて実施してもしなくてもよい。いくつかの実施形態では、方法は、タンパク質を支持体上に固定化すること；及び固定化したタンパク質を、非イオン性界面活性剤と有機溶媒を含む界面活性剤−溶媒混合物で処理することを含む。いくつかの実施形態では、支持体はクロマトグラフィー樹脂である。特定の実施形態では、界面活性剤−溶媒混合物は、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．３％リン酸トリ−Ｎ−ブチル、及び０．３％ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を含む。タンパク質がクロマトグラフィー樹脂、例えば陽イオン交換樹脂に固定化されたままである限り、溶媒−界面活性剤混合物処理を、長期間、例えば、３０分〜１時間継続することができ；及び／または溶媒−界面活性剤処理を２℃〜１０℃で行ってもよい。ウイルス不活化へのこのアプローチは、驚くべきことに、タンパク質が溶液中で固定化されていない状態での溶媒−界面活性剤混合物での処理に比べて、界面活性剤−溶媒混合物での処理中のタンパク質凝集体の形成をかなりの量、例えば５０％超、減らすことができる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、脂質コーティングを有するウイルスの不活化方法は、以下の工程を含む：ｉ）活性を有するタンパク質を含む流体を提供する工程；ｉｉ）有機溶媒と界面活性剤を流体と混合し、それによって混合物を作製する工程；そしてｉｉｉ）混合物を約１２０分以内でインキュベートする工程；その場合、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の両方を、約２０℃以下の温度で実施し；インキュベーション後の混合物は、脂質コーティングを有する生存ウイルスを本質的に含まず；その場合、インキュベーション後のタンパク質は、工程（ｉ）で提供される活性の少なくとも２５％の活性を有する。
【０２１９】
他の実施形態では、脂質コーティングを有するウイルスを本質的に含まないタンパク質は、以下の工程を含む方法から取得することができる：ｉ）活性を有するタンパク質を含む流体を提供する工程；ｉｉ）有機溶媒と界面活性剤を流体と混合し、それによって混合物を作製する工程；ｉｉｉ）混合物を約１２０分以内でインキュベートする工程；その場合、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の両方を、約２０℃以下の温度で実施し；インキュベーション後の混合物は、脂質コーティングを有する生存ウイルスを本質的に含まず；その場合、インキュベーション後のタンパク質は、工程（ａ）で提供される活性の少なくとも２５％の活性を有する。
【０２２０】
別の実施形態では、脂質コーティングを有するウイルスの不活化方法は、以下の工程を含む：ｉ）活性を有する血液凝固タンパク質（例えば、ＶＷＦ）を含む流体を提供する工程；ｉｉ）有機溶媒と界面活性剤を流体と混合し、それによって混合物を作製する工程；ｉｉｉ）混合物を約１２０分以内でインキュベートする工程；その場合、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の両方を、約２０℃以下の温度で実施し；インキュベーション後の混合物は、脂質コーティングを有する生存ウイルスを本質的に含まず；その場合、インキュベーション後の第ＶＩＩＩ因子は、工程（ｉ）で提供される活性の少なくとも２５％の活性を有する。
【０２２１】
いくつかの場合では、有機溶媒は、エーテル、アルコール、ジアルキルホスフェートまたはトリアルキルホスフェートである。特定の実施形態では、エーテルは、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、エチルプロピルエーテル、メチルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、及び／またはメチルイソブチルエーテルから選択される。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｎ−ペンタノール、及び／またはイソペンタノールから選択される。いくつかの実施形態では、ジアルキルホスフェートは、ジ−（ｎ−ブチル）ホスフェート、ジ−（ｔ−ブチル）ホスフェート、ジ−（ｎ−ヘキシル）ホスフェート、ジ−（２−エチルヘキシル）ホスフェート、ジ−（ｎ−デシル）ホスフェート、及び／またはエチルジ（ｎ−ブチル）ホスフェートから選択される。いくつかの実施形態では、トリアルキルホスフェートは、トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート、トリ−（ｔ−ブチル）ホスフェート、トリ−（ｎ−ヘキシル）ホスフェート、トリ−（２−エチルヘキシル）ホスフェート、及び／またはトリ−（ｎ−デシル）ホスフェートから選択される。
【０２２３】
いくつかの場合では、有機溶媒の終濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約５．０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約１．０％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）〜約０．５％（ｖ／ｖ）、または約０．２％（ｖ／ｖ）〜約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）である。
【０２２４】
いくつかの場合では、界面活性剤は、イオン性界面活性剤、双性イオン性（両性）界面活性剤、及び／または非イオン性界面活性剤から選択される。イオン性界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤または陽イオン性界面活性剤であり得る。
【０２２５】
特定の実施形態では、陰イオン性界面活性剤は、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホン酸フッ素系界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、カルボン酸アルキル、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、及び／またはカルボン酸フッ素系界面活性剤から選択される。いくつかの実施形態では、アルキル硫酸塩は、ラウリル硫酸アンモニウムまたはラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）から選択される。他の実施形態では、アルキルエーテル硫酸塩は、ラウレス硫酸ナトリウム及び／またはミレス硫酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、ドキュセートは、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムである。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、スルホン酸フッ素系界面活性剤は、パーフルオロオクタンスルホン酸塩（ＰＦＯＳ）及び／またはパーフルオロブタンスルホン酸塩から選択される。いくつかの実施形態では、カルボン酸アルキルは、脂肪酸塩及び／またはステアリン酸ナトリウムから選択される。いくつかの実施形態では、カルボン酸フッ素系界面活性剤は、パーフルオロノナン酸塩及びパーフルオロオクタン酸塩である。いくつかの実施形態では、陽イオン性界面活性剤は、アルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ポリエトキシル化獣脂アミン（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＯＤＡＢ）、ｐＨ依存性第一級アミン、ｐＨ依存性第二級アミン、及び／またはｐＨ依存性第三級アミンから選択される。いくつかの実施形態では、アルキルトリメチルアンモニウム塩は、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）及び／またはセチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）から選択される。いくつかの実施形態では、第一級アミンがｐＨ＜１０で正荷電となるか、または第二級アミンがｐＨ＜４で荷電するようになる。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、陽イオン性界面活性剤は、オクテニジン二塩酸塩である。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、双性イオン性界面活性剤は、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、スルタイン、ベタイン、及び／またはレシチンから選択される。いくつかの実施形態では、スルタインは、コカミドプロピルヒドロキシスルタインである。いくつかの実施形態では、ベタインは、コカミドプロピルベタインである。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ポロキサマー、アルキルフェノールポリグリコールエーテル、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル、２−ドデコキシエタノール（ＬＵＢＲＯＬ（登録商標）−ＰＸ）、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル、フェノキシポリエトキシルエタノール、グルコシドアルキルエーテル、マルトシドアルキルエーテル、チオグルコシドアルキルエーテル、ジギトニン、グリセロールアルキルエステル、アルキルアリールポリエーテルサルフェート、アルコールスルホネート、ソルビタンアルキルエステル、コカミドエタノールアミン、一ラウリン酸スクロース、ドデシルジメチルアミンオキシド、及び／またはコール酸ナトリウムから選択される。いくつかの実施形態では、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステルは、ポリソルベート２０ソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）、ポリソルベート４０ソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０）、ポリソルベート６０ソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０）、ポリソルベート６１ソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６１）、ポリソルベート６５ソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６５）、ポリソルベート８０ソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、及び／またはポリソルベート８１ソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８１）から選択される。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー１２４（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｌ４４）、ポロキサマー１８１（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｌ６１）、ポロキサマー１８２（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｌ６２）、ポロキサマー１８４（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｌ６４）、ポロキサマー１８８（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８）、ポロキサマー２３７（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ８７）、ポロキサマー３３８（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｌ１０８）、及び／またはポロキサマー４０７（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ１２７）から選択される。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテルは、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ＢＲＩＪ（登録商標）３０、及び／またはＢＲＩＪ（登録商標）３５から選択される。
【０２３２】
いくつかの場合では、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテルは、ポリオキシエチレン（４−５）ｐ−ｔ−オクチルフェノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−４５）、及び／またはポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）から選択される。いくつかの実施形態では、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテルは、ノノキシノール−９である。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、フェノキシポリエトキシルエタノールは、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール及び／またはオクチルフェノキシポリエトキシルエタノールから選択される。
いくつかの実施形態では、グルコシドアルキルエーテルは、オクチルグルコピラノシドである。いくつかの実施形態では、マルトシドアルキルエーテルは、ドデシルマルトピラノシドである。いくつかの実施形態では、チオグルコシドアルキルエーテルは、ヘプチルチオグルコピラノシドである。いくつかの実施形態では、グリセロールアルキルエステルは、グリセリルラウレートである。いくつかの実施形態では、コカミドエタノールアミンは、コカミドモノエタノールアミン及び／またはコカミドジエタノールアミンから選択される。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、界面活性剤の終濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約１０．０％（ｖ／ｖ）、または約０．５％（ｖ／ｖ）〜約５．０％（ｖ／ｖ）である。いくつかの場合では、界面活性剤は複数の界面活性剤である。
【０２３５】
ウイルス不活化のための有用な方法は、例えば、米国特許第６，１９０，６０９号及び第９，３１５，５６０号、ならびに米国特許公開第２０１７／０３２７５５９号に記載されており、その開示は、その全体を参照により本明細書に援用される。
【０２３６】
ウイルスの不活化は、当業者によって認識されるように実施することができる。例えば、溶媒トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）及びポリソルベート８０及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などであるがこれらに限定されない界面活性剤は、脂質エンベロープウイルスを不活化するのに効果的である。ウイルスの不活化は、１４℃〜約２５℃などの室温で約１時間以上行うことができる。いくつかの場合では、インキュベーション時間は２時間以内である。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、クエン酸ナトリウム緩衝液を含む緩衝液をウイルス不活化物質に添加することによって、ウイルス不活化処理を停止させる。いくつかの場合では、クエン酸ナトリウム緩衝液は、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、例えば、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、または約１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。
【０２３８】
Ｈ．ＶＷＦ成熟
フューリンは、ＳＰＣ（スブチリシン様プロタンパク質コンバターゼ）、ＰＣ（プロタンパク質コンバターゼ）、またはいくつかの場合ではＰＡＣＥ（対形成塩基性アミノ酸切断酵素）と呼ばれるタンパク質ファミリーの一部である。フューリンタンパク質ファミリーのメンバーには、フューリン、Ｋｅｘ２、ＰＣ２、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＡＣＥ４、ＰＣ４、ＰＣ５及び／またはＰＣ７が含まれるが、これらに限定されない。本発明の一部として、方法は、フューリンで処理することにより、プロＶＷＦ（プロｒＶＷＦ）をｍａｔ−ＶＷＦ／ＶＷＦ−ＰＰ（ｍａｔ−ｒＶＷＦ／ｒＶＷＦ−ＰＰ）複合体に成熟させるための方法を提供する。これらのフューリンファミリーメンバーのいずれも、ＶＷＦ成熟の方法において使用することができる。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、プロＶＷＦを、陰イオン交換カラムまたは樹脂上で、陽イオン交換カラムまたは樹脂上で、またはサイズ分離クロマトグラフィー法の一部として、フューリン成熟させる。いくつかの実施形態では、プロＶＷＦを、陰イオン交換カラムまたは樹脂上で、及び／または陰イオン交換クロマトグラフィー手順の一部として、フューリン成熟させる。いくつかの実施形態では、プロＶＷＦを、陽イオン交換カラムまたは樹脂上で、及び／または陽イオン交換クロマトグラフィー手順の一部として、フューリン成熟させる。いくつかの実施形態では、プロＶＷＦを、サイズ排除クロマトグラフィー手順の一部としてフューリン成熟させる。そのような方法は、例えば、あらゆる目的のためにその全体を参照により本明細書に援用される米国特許第８，０５８，４１１号に記載されている。
【０２４０】
成熟プロセスを容易にし、高濃度で樹脂上に固定化されたプロＶＷＦを提供するために、本発明のいくつかの実施形態では、クロマトグラフィー樹脂を、クロマトグラフィーカラムに充填する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟の過程でのプロＶＷＦの濃度は成熟効率に影響を及ぼすことから、クロマトグラフィー樹脂をカラムに充填することは有利である。さらに、クロマトグラフィーカラムを使用することにより、より再現性の高い方法で成熟のパラメータを効率的に制御でき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＶＷＦの成熟をより容易に実施することができる。いくつかの実施形態では、フューリン濃度は、ＩＵのＶＷＦ：Ａｇ（１０μｇのプロｒＶＷＦ）あたり約１、約２、約３、または約４ユニットの組換え活性フューリンである。いくつかの実施形態では、フューリン濃度は、ＩＵのＶＷＦ：Ａｇ（１０μｇのプロｒＶＷＦ）あたり約２〜３ユニットの組換え活性フューリンである。いくつかの実施形態では、フューリン濃度は、ＩＵのＶＷＦ：Ａｇ（１０μｇのプロｒＶＷＦ）あたり約１〜２ユニットの組換え活性フューリンである。いくつかの実施形態では、フューリン濃度は、ＩＵのＶＷＦ：Ａｇ（１０μｇのプロｒＶＷＦ）あたり約２ユニットの組換え活性フューリンである。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、プロＶＷＦを陰イオン交換樹脂上に固定化し、プロＶＷＦコンバターゼ活性を示す溶液と共にインキュベートする場合、２５℃で測定される導電性は、２５ｍＳ／ｃｍ未満である。いくつかの実施形態では、プロＶＷＦを陰イオン交換樹脂上に固定化し、プロＶＷＦコンバターゼ活性を示す溶液と共にインキュベートする場合、２５℃で測定される導電性は、２０ｍＳ／ｃｍ未満である。いくつかの実施形態では、プロＶＷＦを陰イオン交換樹脂上に固定化し、プロＶＷＦコンバターゼ活性を示す溶液と共にインキュベートする場合、２５℃で測定される導電性は、１６ｍＳ／ｃｍ未満である。いくつかの実施形態では、プロＶＷＦを陰イオン交換樹脂上に固定化し、プロＶＷＦコンバターゼ活性を示す溶液と共にインキュベートする場合、２５℃で測定される導電性は、１６ｍＳ／ｃｍ〜２５ｍＳ／ｃｍである。いくつかの実施形態では、プロＶＷＦを陰イオン交換樹脂上に固定化し、プロＶＷＦコンバターゼ活性を示す溶液と共にインキュベートする場合、２５℃で測定される導電性は、２０ｍＳ／ｃｍ〜２５ｍＳ／ｃｍである。プロｒＶＷＦ及びｍａｔ−ｒＶＷＦは、これらの導電性レベルで陰イオン交換樹脂に効率的に固定化することができる。したがって、本方法の過程で添加する緩衝液は、導電性レベルを維持するように対応して適合させるべきである。いくつかの実施形態では、導電性は、フューリン及び／またはＰＡＣＥ酵素が活性形態であり、完全にまたは部分的に移動相に存在するような導電性である。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦは、２５℃で測定する場合の導電性が少なくとも４０ｍＳ／ｃｍで、陰イオン交換樹脂から溶出される。いくつかの実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦは、２５℃で測定する場合の導電性が少なくとも６０ｍＳ／ｃｍで、陰イオン交換樹脂から溶出される。いくつかの実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦは、２５℃で測定する場合の導電性が少なくとも８０ｍＳ／ｃｍで、陰イオン交換樹脂から溶出される。いくつかの実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦは、２５℃で測定する場合の導電性が４０ｍＳ／ｃｍ〜８０ｍＳ／ｃｍで、陰イオン交換樹脂から溶出される。いくつかの実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦは、２５℃で測定する場合の導電性が６０ｍＳ／ｃｍ〜８０ｍＳ／ｃｍで、陰イオン交換樹脂から溶出される。いくつかの実施形態では、所望のｒＶＷＦ種は、陰イオン交換樹脂を用いて（例えば、ＴＭＡＥを用いて）、約１２〜１６ｍＳ／ｃｍ／２５℃の導電性で溶出し始める。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦの所望の種の主量（バルク）は、陰イオン交換樹脂を用いて約５５〜６０ｍＳ／ｃｍ／２５℃で溶出された。いくつかの実施形態では、所望のｒＶＷＦ種は、陽イオン交換樹脂を用いて、約１８〜２４ｍＳ／ｃｍ／２５℃の導電性で溶出し始める。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦの所望の種の主量（バルク）は、陽イオン交換樹脂を用いて約３６〜４２ｍＳ／ｃｍ／２５℃で溶出された。いくつかの実施形態では、所望のｒＶＷＦは、成熟ｒＶＷＦ（例えば、ｍａｔ−ｒＶＷＦ）である。いくつかの実施形態では、主量（バルク）には、溶出する所望の種の総量の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上が含まれる。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦを陰イオン交換樹脂から溶出する前に、さらなる洗浄工程を用いる。いくつかの実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦを陽イオン交換樹脂から溶出する前に、さらなる洗浄工程を用いる。
【０２４４】
多くのプロテアーゼは、それらのタンパク質分解活性のために、二価金属イオンなどの補因子を必要とする。フューリン及びフューリンタンパク質ファミリーのメンバーは、活性のためにカルシウムイオンを必要とする。したがって、フューリンを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでプロｒＶＷＦを成熟させる場合、カルシウム塩を使用する。いくつかの実施形態では、カルシウム塩は可溶性カルシウム塩である。いくつかの実施形態では、カルシウム塩は塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）である。いくつかの実施形態では、カルシウム塩は酢酸カルシウムである。いくつかの実施形態では、例えば、Ｂｅ２＋、Ｂａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｓｒ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｄ２＋、及び／またはＣｕ２＋を含むがこれらに限定されない他の二価金属イオンを使用する。いくつかの実施形態では、２つ以上の二価陽イオンの組み合わせを使用する。いくつかの実施形態では、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、カルシウム塩は、可溶性マグネシウム塩である。いくつかの実施形態では、マグネシウム塩は塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）である。いくつかの実施形態では、成熟に使用するためのフューリンタンパク質ファミリー製剤は、０．０１〜１０ｍＭの濃度の可溶性カルシウム塩を含む。いくつかの実施形態では、成熟に使用するためのフューリンタンパク質ファミリー製剤は、０．０１〜１０ｍＭの濃度の可溶性マグネシウム塩を含む。いくつかの実施形態では、成熟に使用するためのフューリンタンパク質ファミリー製剤は、０．０１〜１０ｍＭの濃度のＣａＣｌ２を含む。いくつかの実施形態では、成熟に使用するためのフューリンタンパク質ファミリー製剤は、０．０１〜１０ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む。いくつかの実施形態では、成熟に使用するためのフューリンタンパク質ファミリー製剤は、０．１〜５ｍＭの濃度のＣａＣｌ２を含む。いくつかの実施形態では、成熟に使用するためのフューリンタンパク質ファミリー製剤は、０．１〜５ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む。いくつかの実施形態では、成熟に使用するためのフューリンタンパク質ファミリー製剤は、０．２〜２ｍＭの濃度のＣａＣｌ２を含む。いくつかの実施形態では、成熟に使用するためのフューリンタンパク質ファミリー製剤は、０．２〜２ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む。いくつかの実施形態では、成熟に使用するためのフューリンタンパク質ファミリー製剤は、フューリンを含む。いくつかの実施形態では、フューリン濃度は、ＩＵのＶＷＦ：Ａｇ（１０μｇのプロｒＶＷＦ）あたり約１、約２、約３、または約４ユニットの組換え活性フューリンである。いくつかの実施形態では、フューリン濃度は、ＩＵのＶＷＦ：Ａｇ（１０μｇのプロｒＶＷＦ）あたり約２〜３ユニットの組換え活性フューリンである。いくつかの実施形態では、フューリン濃度は、ＩＵのＶＷＦ：Ａｇ（１０μｇのプロｒＶＷＦ）あたり約１〜２ユニットの組換え活性フューリンである。いくつかの実施形態では、フューリン濃度は、ＩＵのＶＷＦ：Ａｇ（１０μｇのプロｒＶＷＦ）あたり約２ユニットの組換え活性フューリンである。
【０２４５】
固定化されたプロｒＶＷＦとのフューリンのインキュベーション時間は、使用する系に応じて様々に異なり得る。温度、緩衝液などの要因もまた、成熟プロセスの効率に影響を及ぼす。一般的に、成熟プロセスは４８時間以内に終了する。いくつかの実施形態では、成熟プロセスは、１分未満で起こり得る。いくつかの実施形態では、成熟プロセスは、４０時間未満、３６時間、３０時間、２４時間、２０時間、１６時間、１０時間、５時間、２時間、１時間以下で起こり得る。いくつかの実施形態では、プロｒＶＷＦ成熟のためのインキュベーションを、１分未満〜４８時間、実施する。いくつかの実施形態では、プロｒＶＷＦ成熟のためのインキュベーションを、１０分〜４２時間、実施する。いくつかの実施形態では、プロｒＶＷＦ成熟のためのインキュベーションを、２０分〜３６時間、実施する。いくつかの実施形態では、プロｒＶＷＦ成熟のためのインキュベーションを、３０分〜２４時間、実施する。いくつかの実施形態では、フューリンの高い特異性のために、長時間のインキュベーション後でもＶＷＦの「過剰活性化」（さらなるタンパク質分解）は起こらない。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、成熟プロセスは、インキュベーションの過程で選択する温度にも依存する。フューリンの最適な酵素活性は温度によって様々に異なる。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、プロｒＶＷＦ成熟のためのインキュベーションを、２℃〜４０℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、プロｒＶＷＦ成熟のためのインキュベーションを、４℃〜３７℃の温度で実施する。いくつかの実施形態では、プロｒＶＷＦ成熟のためのインキュベーションを、低温、例えば、２℃で実施する。いくつかの実施形態では、タンパク質分解を回避及び／または防止するために、使用する最高温度は５０℃よりも低い。いくつかの実施形態では、タンパク質分解を回避及び／または防止するために、使用する最高温度は４５℃よりも低い。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、プロＶＷＦ（またはプロｒＶＷＦ）を、上記のように、フューリンまたはフューリンファミリーメンバーでの処理によって、ｍａｔ−ＶＷＦ（またはｍａｔ−ｒＶＷＦ）に変換する。いくつかの実施形態では、フューリン処理により、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％のプロｒＶＷＦが、ｍａｔ−ｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰへ変換される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのキレート剤の添加の存在下でサイズ分離し、及び／またはｐＨを少なくともｐＨ７に上昇させた後、溶出物中に５％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、４％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、３％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、２％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、１％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、０．５％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、０．４％未満のｒＶＷＦ−ＰＰ、０．１％未満のｒＶＷＦ、または０．０５％未満のｒＶＷＦ−ＰＰが存在する。
【０２４９】
（表２）例示的なプロＶＷＦ除去（フューリン処理に基づく）
2021519280.tif 000004
【０２５０】
Ｉ．ＶＷＦ多量体
ｒＶＷＦ多量体の数及び割合の評価は、例えば、あらゆる目的のために、特にＶＷＦ多量体の評価に関連するすべての教示のためにその全体を参照により本明細書に援用されるＣｕｍｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．，１９９３  Ｍａｙ；４６（５）：４７０−４７３）によって論じられているように、電気泳動及びサイズ排除クロマトグラフィー法を使用してＶＷＦ多量体をサイズによって分離する方法を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の方法を使用して実施することができる。そのような技術は、ゲルをＶＷＦに対する放射性標識抗体で免疫ブロッティングし、続いて化学発光検出する免疫ブロッティング技術（ウェスタンブロットなど）をさらに含み得る（例えば、あらゆる目的のために、特にＶＷＦ多量体の評価に関連するすべての教示のためにその全体を参照により本明細書に援用されるＷｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．，１９９３，７：３１７−３２３を参照のこと）。ＶＷＦに対するさらなるアッセイとして、ＶＷＦ：抗原（ＶＷＦ：Ａｇ）、ＶＷＦ：リストセチンコファクター（ＶＷＦ：ＲＣｏｆ）、及びＶＷＦ：コラーゲン結合活性アッセイ（ＶＷＦ：ＣＢＡ）が挙げられ、これらはフォン・ヴィルブランド病の診断と分類によく使用される（例えば、あらゆる目的のために、特にＶＷＦのアッセイに関連するすべての教示のためにその全体を参照により本明細書に援用されるＦａｖａｌｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９７，２９（４）：３４１−４５６；Ｓａｄｌｅｒ，ＪＥ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９８，６７：３９５−４２４；及びＴｕｒｅｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ，２０１０，３６：５１０−５２１を参照のこと）。いくつかの実施形態では、本方法を使用して得られるｍａｔ−ｒＶＷＦは、ｒＶＷＦのローディング試料に存在する任意の多量体パターンを含む。いくつかの実施形態では、本方法を使用して得られるｍａｔ−ｒＶＷＦは、生理学的に発生する多量体パターンならびに超大型ＶＷＦ−多量体パターンを含む。
【０２５１】
Ｊ．ＶＷＦアッセイ
一次止血において、ＶＷＦは、血小板と、コラーゲンなどの細胞外マトリックスの特定の成分との間の橋渡しとして機能する。このプロセスにおけるＶＷＦの生物学的活性は、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで測定することができる（Ｔｕｒｅｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ，２０１０，３６：５１０−５２１）。
【０２５２】
ＶＷＦ：リストセチンコファクター（ＶＷＦ：ＲＣｏｆ）アッセイは、ＶＷＦの存在下で抗生物質リストセチンによって誘導される新鮮なまたはホルマリン固定血小板の凝集に基づく。血小板凝集の程度は、ＶＷＦ濃度に依存し、比濁法、例えば、血小板凝集計を使用して測定することができる（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９７３，５２：２７０８−２７１６；Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ．，１９７５，３４：３０６−３０８）。本明細書で提供するように、本発明のＶＷＦ（ＶＷＦ：ＲＣｏ）の特定のリストセチンコファクター活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して測定する場合、一般的に、ｍＵ／μｇのＶＷＦに関して記載する。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製するｍａｔ−ｒＶＷＦは、少なくとも約２０、２２．５、２５、２７、５、３０、３２．５、３５、３７．５、４０、４２．５、４５、４７．５、５０、５２．５、５５、５７．５、６０、６２．５、６５、６７．５、７０、７２．５、７５、７７．５、８０、８２．５、８５、８７．５、９０、９２．５、９５、９７．５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０またはそれ以上のｍＵ／μｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するｍａｔ−ｒＶＷＦは、２０ｍＵ／μｇ〜１５０ｍＵ／μｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦは、３０ｍＵ／μｇ〜１２０ｍＵ／μｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦは、４０ｍＵ／μｇ〜９０ｍＵ／μｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦは、以下の表３に認められるバリエーション１〜１３３から選択される比活性を有する。
【０２５４】
（表３）組成物中に見出され、本明細書で提供する方法において使用するｒＶＷＦの比活性の例示的な実施形態。
2021519280.tif 000005
Ｖａｒ．＝バリエーション
【０２５５】
本発明のｍａｔ−ｒＶＷＦは、約１０〜約４０のサブユニットを含む、高度に多量体である。さらなる実施形態では、本発明の方法を使用して生成する多量体ｒＶＷＦは、約１０〜３０、１２〜２８、１４〜２６、１６〜２４、１８〜２２、２０〜２１のサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦは、二量体から４０を超えるサブユニット（＞１０００万ダルトン）の多量体までサイズが様々に異なる多量体として存在する。最大の多量体は、血小板受容体と損傷の内皮下マトリックス部位の両方と相互作用することができる複数の結合部位を提供し、ＶＷＦの最も止血活性の高い形態である。いくつかの実施形態では、本発明のｍａｔ−ｒＶＷＦには、超大型多量体（ＵＬＭ）が含まれる。一般的に、高分子型及び超大型多量体は止血に関して最も効果的であると考えられている（例えば、Ｔｕｒｅｃｅｋ，Ｐ．，Ｈａｍｏｓｔａｓｅｏｌｏｇｉｅ，（Ｖｏｌ．３７）：Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，ｐａｇｅｓ  Ｓ１５−Ｓ２５（２０１７）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦは、５００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、任意の所望の多量体パターンは、記載する方法を使用して得ることができる。いくつかの実施形態では、陰イオン交換法及び／または陽イオン交換法を使用する場合、１つ以上の洗浄工程（複数可）または勾配緩衝液中の緩衝液のｐＨ、導電性、及び／または対イオン濃度を操作して、所望の多量体パターンを得ることができる。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー法を使用し、回収基準を使用して、所望の多量体パターンを得ることができる。いくつかの実施形態では、記載する多量体パターンには、超大型多量体が含まれる。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、少なくとも１０，０００ｋＤａ、少なくとも１１，０００ｋＤａ、少なくとも１２，０００ｋＤａ、少なくとも１３，０００ｋＤａ、少なくとも１４，０００ｋＤａ、少なくとも１５，０００ｋＤａ、少なくとも１６，０００ｋＤａ、少なくとも１７，０００ｋＤａ、少なくとも１８，０００ｋＤａ、少なくとも１９，０００ｋＤａ、少なくとも２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１０，０００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１１，０００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１２，０００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１３，０００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１４，０００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１５，０００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１６，０００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１７，０００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１８，０００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１９，０００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａ��ある。いくつかの実施形態では、本方法を使用して得られるｍａｔ−ｒＶＷＦには、ｒＶＷＦのローディング試料に存在する任意の多量体パターンが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法を使用して得られるｍａｔ−ｒＶＷＦには、生理学的に生じる多量体パターン及び超大型ＶＷＦ多量体パターンが含まれる。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の精製方法によって調製するｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物は、ｒＶＷＦオリゴマーの９５％が６サブユニット〜２０サブユニットを有することを特徴とするｒＶＷＦオリゴマー分布を有する。いくつかの実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物は、ｒＶＷＦオリゴマーの９５％が４に認められるバリエーション４５８〜６４１から選択されるサブユニットの範囲を有することを特徴とするｒＶＷＦオリゴマー分布を有する。
【０２５７】
（表４）組成物中に認められ、本明細書で提供する方法において使用するｒＶＷＦオリゴマー分布の例示的な実施形態。
2021519280.tif 000006
2021519280.tif 000007
Ｖａｒ．＝バリエーション
【０２５８】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法によって調製するｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物は、特定のより高次のｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体またはより大きな多量体に存在するｍａｔ−ｒＶＷＦ分子の割合に従って特徴付けることができる。例えば、一実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物中の少なくとも２０％のｍａｔ−ｒＶＷＦ分子が、少なくとも１０個のサブユニットのオリゴマー複合体中に存在する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物中の少なくとも２０％のｍａｔ−ｒＶＷＦ分子が、少なくとも１２個のサブユニットのオリゴマー複合体中に存在する。さらに他の実施形態では、本明細書で提供する方法において使用するｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物は、表５〜表７に認められるバリエーション１３４〜４５７のいずれか１つによる、特定の高次ｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体またはより大きな多量体（例えば、少なくともＹサブユニットの多量体）中に存在するｍａｔ−ｒＶＷＦ分子の最小の割合を有する（例えば、少なくともＸ％を有する）。
【０２５９】
（表５）組成物中に認められ、本明細書で提供する方法において使用する特定の高次のｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体またはより大きな多量体中に存在するｍａｔ−ｒＶＷＦ分子の割合の例示的な実施形態。
2021519280.tif 000008
Ｖａｒ．＝バリエーション
【０２６０】
（表６）組成物中に認められ、本明細書で提供する方法において使用する、特定のより高次のｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体またはより大きな多量体中に存在するｍａｔ−ｒＶＷＦ分子の割合の例示的な実施形態。
2021519280.tif 000009
Ｖａｒ．＝バリエーション
【０２６１】
（表７）組成物中に認められ、本明細書で提供する方法において使用する特定の高次のｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体またはより大きな多量体中に存在するｍａｔ−ｒＶＷＦ分子の割合の例示的な実施形態。
2021519280.tif 000010
Ｖａｒ．＝バリエーション
【０２６２】
上記によれば、ｍａｔ−ｒＶＷＦは、かなりの割合の高分子量（ＨＭＷ）ｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体を含む。さらなる実施形態では、ＨＭＷ  ｒＶＷＦ多量体組成物は、少なくとも１０％〜８０％のｍａｔ−ｒＶＷＦ十量体またはより高次の多量体を含む。さらなる実施形態では、組成物は、約１０〜９５％、２０〜９０％、３０〜８５％、４０〜８０％、５０〜７５％、６０〜７０％十量体またはより高次の多量体を含む。さらなる実施形態では、ＨＭＷ  ｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体組成物は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の十量体またはより高次の多量体を含む。
【０２６３】
例えば、Ｃｕｍｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ（あらゆる目的のために、特にｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体の評価に関連するすべての教示のために、その全体を参照により本明細書に援用されるＪ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９３  Ｍａｙ；４６（５）：４７０−４７３）によって議論されたように、電気泳動及びサイズ排除クロマトグラフィー法を使用してサイズ別にｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体を分離する方法を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の方法を用いて、ｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体の数と割合の評価を実施することができる。そのような技術はさらに、ＶＷＦに対する放射性標識抗体でゲルを免疫標識した後、化学発光検出する免疫ブロット法（ウェスタンブロットなど）を含むことができる（例えば、あらゆる目的のために、特にｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体の評価に関連するすべての教示のために、その全体を参照により本明細書に援用されるＷｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．，７：３１７−３２３を参照のこと）。ＶＷＦのさらなるアッセイには、ＶＷＦ：抗原（ＶＷＦ：Ａｇ）、ＶＷＦ：リストセチンコファクター（ＶＷＦ：ＲＣｏｆ）、及びＶＷＦ：コラーゲン結合活性アッセイ（ＶＷＦ：ＣＢＡ）が含まれ、これらはフォン・ヴィルブランド病の診断及び分類によく使用される。（例えば、あらゆる目的のために、特にＶＷＦに対するアッセイに関連するすべての教示のために、その全体を参照により本明細書に援用されるＦａｖａｌｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９７，２９（４）：３４１−４５６を参照のこと）。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、ｒＦＶＩＩＩ向凝固活性（ＩＵ  ｒＦＶＩＩＩ：Ｃ）とｒＶＷＦリトセチンコファクター活性（ＩＵ  ｒＶＷＦ：ＲＣｏ）の比率は、本発明の方法に従って調製したｍａｔ−ｒＶＷＦに対して３：１〜１：５である。さらなる実施形態では、比率は、２：１〜１：４でる。さらにさらなる実施形態では、比率は、５：２〜１：４である。さらなる実施形態では、比率は、３：２〜１：３である。さらにさらなる実施形態では、比率は、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、２：１、２：３、２：４、２：５、３：１、３：２、３：４、または３：５である。さらなる実施形態では、比率は、１：１〜１：２である。さらにさらなる実施形態では、比率は、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、または２：１である。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に有用な組成物中でのｒＦＶＩＩＩ向凝固活性（ＩＵ  ｒＦＶＩＩＩ：Ｃ）とｒＶＷＦリトセチンコファクター活性（ＩＵ  ｒＶＷＦ：ＲＣｏ）の比率は、表８に認められるバリエーション１９８８〜２１４０から選択される。
【０２６５】
（表８）本明細書に提供する組成物中の、及び方法で使用するｒＦＶＩＩＩ向凝固活性（ＩＵ  ｒＦＶＩＩＩ：Ｃ）とｒＶＷＦリトセチンコファクター活性（ＩＵ  ｒＶＷＦ：ＲＣｏ）の比率に関する例示的な実施形態。
2021519280.tif 000011
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Ｖａｒ．＝バリエーション
【０２６６】
さらなる実施形態では、本発明のより高次のｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体は、投与後約１〜約９０時間安定である。さらにさらなる実施形態では、より高次のｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体は、投与後約５〜８０、１０〜７０、１５〜６０、２０〜５０、２５〜４０、３０〜３５時間安定である。さらにさらなる実施形態では、より高次のｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体は、投与後、少なくとも３、６、１２、１８、２４、３６、４８、７２時間安定である。特定の実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体の安定性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価する。
【０２６７】
一実施形態では、本明細書に提供する組成物及び方法において使用する高次ｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体は、投与後少なくとも１２時間の半減期を有する。別の実施形態では、より高次のｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体は、投与後少なくとも２４時間の半減期を有する。さらに他の実施形態では、より高次のｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体は、表９に認められるバリエーション６４２〜１０４５から選択される半減期を有する。
【０２６８】
（表９）本明細書に提供する方法によって調製する組成物に認められる高次ｍａｔ−ｒＶＷＦ多量体の半減期に関する例示的な実施形態。
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Ｖａｒ．＝バリエーション
【０２６９】
いくつかの実施形態では、本発明に従って精製したプロＶＷＦ及び／または精製ｍａｔ−ｒＶＷＦを、いずれの複合体化、翻訳後修飾または共有結合修飾によっても修飾しない。特定の実施形態では、本発明のプロＶＷＦ及び／または精製ｍａｔ−ｒＶＷＦを、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、ポリシアル酸、ヒドロキシルエチルデンプン、ポリ炭水化物部分などを含む水溶性ポリマーで修飾しない。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、本発明に従って精製したプロＶＷＦ及び／または精製ｍａｔ−ｒＶＷＦを、Ｎ−またはＣ−末端残基の修飾ならびに選択された側鎖、例えば、遊離スルフヒドリル基、第一級アミン、及びヒドロキシル基における修飾を含む、複合体化、翻訳後修飾、または共有結合修飾を介して、修飾する。一実施形態では、水溶性ポリマーを、リジン基または他の第一級アミンによってタンパク質に連結する（直接またはリンカーを介して）。いくつかの実施形態では、本発明のプロＶＷＦ及び／または精製ｍａｔ−ｒＶＷＦを、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、ポリシアリン酸、ヒドロキシルエチルデンプン、ポリ炭水化物部分などを含む水溶性ポリマーの複合体化によって修飾してもよい。
【０２７１】
プロＶＷＦ及び／または精製ｍａｔ−ｒＶＷＦを改変するために使用し得る水溶性ポリマーには、直鎖構造及び分岐構造が含まれる。複合体化したポリマーは、本発明の凝固タンパク質に直接結合させてもよく、あるいは、連結部分を介して結合させてもよい。水溶性ポリマーによるタンパク質複合体化の非限定的な例は、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号、及び第４，１７９，３３７号、ならびにＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ“Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ，”Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｅｄｓ．，ｐｐ．３６７  ３８３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１）、及びＨｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．２００８において見出すことができる。
【０２７２】
タンパク質複合体化は、当技術分野における多数の周知技術によって実施してもよく、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．２００８を参照のこと。例として、凝固タンパク質または水溶性ポリマー部分の一方のカルボキシル基と、他方のアミン基との間のペプチド結合を介した連結、または一方のカルボキシル基と他方のヒドロキシル基との間のエステル結合が挙げられる。本発明の凝固タンパク質を水溶性ポリマー化合物に複合体化させることができる別の連結は、過ヨウ素酸酸化によってポリマーの非還元末端に形成されるアルデヒド基と反応するポリマー部分上の遊離アミノ基との間のシッフ塩基を介した連結である（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ  ａｎｄ  Ｌｕｇｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８１；１２７：１０１１−８；Ｆｅｍａｎｄｅｓ  ａｎｄ  Ｇｒｅｇｏｎｒａｄｉｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９７；１３４１；２６−３４）。生成されるシッフ塩基は、ＮａＣＮＢＨ３を用いた特異的還元により安定化して、二次アミンを形成することができる。別のアプローチは、従来の酸化後における、ＮＨ４Ｃｌとの還元的アミノ化によるポリマー上の末端遊離アミノ基の生成である。二官能試薬は、２個のアミノ基または２個のヒドロキシル基を連結するために使用することができる。例えば、アミノ基を含むポリマーを、ＢＳ３（ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート／Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）のような試薬を用いて凝固タンパク質のアミノ基にカップリングすることができる。さらに、例えば、スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル／Ｐｉｅｒｃｅ）のようなヘテロ二官能性架橋試薬を使用して、アミン基とチオール基を連結することができる。他の実施形態では、アルデヒド反応性基、例えば、ＰＥＧアルコキシドとブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；ＰＥＧとＤＭＳＯ及び無水酢酸、及びＰＥＧ塩化物と４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、スクシンイミジル活性エステル、活性化ジチオカーボネートＰＥＧ、２，４，５−トリクロフェニルクロロ炭酸塩ならびにＰ−ニトロフェニルクロロ炭酸塩活性化ＰＥＧを凝固タンパク質の複合体化に使用してもよい。
【０２７３】
ＶＷＦの生物学的活性を測定する別の方法は、ＥＬＩＳＡ技術に基づくコラーゲン結合アッセイである（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｂｏｓａｋ，  Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，  １９８６，  ４３：３０３−３１１；Ｆａｖａｌｏｒｏ，  Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，  ２０００，  ８３  １２７−１３５）。マイクロタイタープレートを、Ｉ型またはＩＩＩ型コラーゲンでコーティングする。次いで、ＶＷＦをコラーゲン表面に結合させ、その後酵素標識ポリクローナル抗体で検出する。最後の工程は、ＥＬＩＳＡリーダーで測光法によりモニタリングすることができる基質反応である。
【０２７４】
フォン・ヴィルブランド因子の免疫学的アッセイ（ＶＷＦ：Ａｇ）は、血漿中のＶＷＦタンパク質の濃度を測定する免疫アッセイである。これらはＶＷＦ機能に関して何も示さない。ＶＷＦ：Ａｇを測定するための多くの方法が存在し、これらには酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または自動ラテックス免疫アッセイ（ＬＩＡ）の両方が含まれる。多くの研究所は現在、完全に自動化されたラテックス免疫測定を使用している。歴史的に研究所は、ローレル電気免疫測定法「ローレルロケッツ」を含む様々な技術を使用したが、これらは今日のほとんどのラボではほとんど使用されていない。
【０２７５】
Ｋ．ＶＷＦ製剤／投与
本方法はまた、本明細書に提供する精製方法によって得られるＶＷＦからの製剤の調製を提供する。いくつかの実施形態では、高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ組成物を、医薬組成物の製造に用いる。いくつかの実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦは凍結乾燥製剤に製剤化することができる。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、本発明のＶＷＦポリペプチドを含む製剤を、精製後及び対象への投与前に凍結乾燥させる。凍結乾燥は、当技術分野で一般的な技術を用いて実施し、開発中の組成物に最適化すべきである（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２１：１９１−２００，（２００４）及びＣｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１３：２４３−９（１９９６））。
【０２７７】
凍結乾燥サイクルは、一態様では、凍結、一次乾燥、及び二次乾燥の３工程からなる（Ａ．Ｐ．Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，Ｐｈｉｌ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄｏｎ，Ｓｅｒ  Ｂ，Ｂｉｏｌ  ２７８：１６７（１９７７））。凍結段階では、溶液を冷却して氷の形成を開始する。さらに、この工程は増量剤の結晶化を誘導する。一次乾燥段階の氷の昇華は、減圧吸引を用いてチャンバー圧力を氷の蒸気圧未満に低下させ、昇華を促進するために熱を導入することによって行う。最後に、吸着または結合した水を、二次乾燥段階において、低下させたチャンバー圧力下、高い棚温度で除去する。このプロセスは、凍結乾燥ケーキとして知られる物質を生成する。その後、ケーキを、滅菌水または注射用の適切な希釈剤のいずれかで再構成することができる。
【０２７８】
凍結乾燥サイクルは、賦形剤の最終的な物理的状態を決定するだけでなく、再構成時間、外観、安定性及び最終的な水分含有量などの他のパラメータにも影響を与える。凍結状態の組成構造は、特定の温度で発生するいくつかの遷移（例えば、ガラス転移、湿潤、及び結晶化）を経て進行し、その構造は、凍結乾燥プロセスを理解し、最適化するために使用してもよい。ガラス転移温度（Ｔｇ及び／またはＴｇ’）は、溶質の物理的状態に関する情報を提供することができ、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定することができる。Ｔｇ及びＴｇ’は、凍結乾燥サイクルを設計する際に考慮しなければならない重要なパラメータである。例えば、Ｔｇ’は一次乾燥のために重要である。さらに、乾燥状態では、ガラス転移温度は最終製品の保存温度に関する情報を提供する。
【０２７９】
ｉ．一般的な医薬製剤及び賦形剤
賦形剤は、製剤（例えば、タンパク質）の安定性及び送達を付与または増強する添加剤である。その包含の理由にかかわらず、賦形剤は製剤の不可欠な成分であり、したがって、安全かつ患者に十分に許容される必要がある。タンパク質薬剤の場合、賦形剤の選択は、薬物の有効性と免疫原性の両方に影響を及ぼす可能性があるため、特に重要である。したがって、タンパク質製剤は、適切な安定性、安全性、及び市場性を提供する賦形剤を適切に選択しつつ、開発していく必要がある。
【０２８０】
凍結乾燥製剤は、一態様では、１つ以上の緩衝液、増量剤、及び安定剤から少なくともなる。この態様では、凍結乾燥工程中または再構成中に凝集が問題となる場合に、界面活性剤の有用性を評価し、選択する。適切な緩衝剤を含ませて、凍結乾燥中のｐＨの安定したゾーン内に製剤を維持する。液体及び凍結乾燥タンパク質製剤を想定した賦形剤成分の比較を表１０に提供する。
【０２８１】
（表１０）凍結乾燥タンパク質製剤の賦形剤成分
2021519280.tif 000017
【０２８２】
タンパク質製剤を開発する際の主な課題は、製造、出荷、及び保管のストレスに対して製品を安定化させることである。製剤賦形剤の役割は、これらのストレスに対して安定化を提供することにある。賦形剤はまた、それらの送達を可能にし、患者の利便性を高めるために、高濃度タンパク質製剤の粘度を低下させるために使用される。一般的に、賦形剤は、様々な化学的及び物理的ストレスに対してタンパク質を安定化させるメカニズムに基づいて分類することができる。いくつかの賦形剤を、特定のタンパク質の特定のストレスの影響を軽減するために、または特定の感受性を調節するために使用する。他の賦形剤は、タンパク質の物理的及び共有結合の安定性に対して、より一般的な影響を及ぼす。本明細書に記載の賦形剤は、製剤におけるそれらの化学的タイプまたはそれらの機能的役割によって編成される。各賦形剤タイプについて論じる際、安定化のモードの簡単な説明を提供する。
【０２８３】
本明細書に提供する教示及びガイダンスを考慮して、当業者であれば、本発明のバイオ医薬品製剤を達成するために、任意の特定の製剤に含めることができ、バイオ医薬品（例えば、タンパク質）の安定性の保持を促進する賦形剤の量または範囲を知るであろう。例えば、本発明のバイオ医薬品製剤に含ませる塩の量及びタイプを、最終溶液の所望の浸透性（例えば、等張性、低張性または高張性）ならびに製剤に含まれる他の成分の量及び浸透性に基づいて選択する。
【０２８４】
例えば、約５％ソルビトールを含めることによって等張性を達成することができ、一方、等張性を達成するために約９％のスクロース賦形剤が必要である。本発明のバイオ医薬品製剤中に含めることができる１つ以上の賦形剤の濃度の量または範囲の選択は、塩、ポリオール及び糖類を参照することにより上記に例示されている。しかしながら、当業者であれば、本明細書に記載し、さらに特定の賦形剤を参照して例示する考慮事項が、例えば、塩、アミノ酸、他の等張剤、界面活性剤、安定剤、増量剤、抗凍結剤、凍結乾燥保護剤、抗酸化剤、金属イオン、キレート剤及び／または保護剤を含む、賦形剤のすべてのタイプ及び組み合わせに対して同様に適用可能であることを理解するであろう。
【０２８５】
さらに、特定の賦形剤をモル濃度で報告する場合、当業者であれば、溶液の当量（％）ｗ／ｖ（例えば、（溶液試料中の物質グラム／ｍＬ溶液）×１００％）も想定されることを認識するであろう。
【０２８６】
当然のことながら、当業者であれば、本明細書に記載の賦形剤の濃度が特定の製剤内の相互依存性を共有することを認識するであろう。例えば、増量剤の濃度は、例えば高いタンパク質濃度の場合、または例えば高い安定化剤濃度の場合には、低下させてもよい。さらに、当業者であれば、増量剤がない特定の製剤の等張性を維持するために、それに応じて安定化剤の濃度を調整する（例えば、安定剤の「等張化」量を使用するであろう）ことを認識するであろう。一般的な賦形剤は、当技術分野で公知であり、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｉｒ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９８），ＰＤＡ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５２：２３８−３１１に見出し得る。
【０２８７】
ｉｉ．医薬緩衝液及び緩衝剤
薬理学的に活性なタンパク質製剤の安定性は、通常、狭いｐＨ範囲で最大であることが観察される。この最適な安定性のｐＨ範囲は、予備製剤化の研究の間に早期に同定する必要がある。加速安定性研究及び熱量測定スクリーニング研究などのいくつかのアプローチは、この取り組みに有用である（Ｒｅｍｍｅｌｅ  Ｒ．Ｌ．Ｊｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８（１６）：５２４１−７（１９９９））。製剤が確定したら、タンパク質を製造し、貯蔵寿命を通して維持しなければならない。したがって、緩衝剤は、製剤中のｐＨを制御するためにほとんどの場合使用される。
【０２８８】
緩衝種の緩衝能はｐＫａに等しいｐＨで最大であり、ｐＨがこの値から離れるにつれて減少する。緩衝能の９０％は、そのｐＫａの１つのｐＨ単位内に存在する。緩衝濃度の増加に比例して、緩衝能も増加する。
【０２８９】
緩衝液を選択する際には、いくつかの要因を考慮する必要がある。まず第一に、緩衝種及びその濃度を、そのｐＫａ及び所望の製剤ｐＨに基づいて定義する必要がある。同様に、緩衝液がタンパク質及び他の製剤賦形剤と互換性があり、分解反応を触媒しないことを保証することが重要である。考慮すべき第３の重要な態様は、投与時に緩衝液が誘発し得る刺痛及び刺激の感覚である。例えば、クエン酸は注射時に刺痛を引き起こすことが知られている（Ｌａｕｒｓｅｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，９８（２）：２１８−２１（２００６））。刺痛及び刺激の可能性は、皮下（ＳＣ）または筋肉内（ＩＭ）経路を介して投与する薬物でより大きく、投与時に製剤が血液中に急速に希釈されるＩＶ経路によって投与する場合よりも、薬物溶液が比較的長い期間、その場に残る。直接ＩＶ注入によって投与する製剤の場合、緩衝液の総量（及び他の製剤成分）をモニタリングする必要がある。患者に心血管系作用を誘発し得るリン酸カリウム緩衝液の形態で投与するカリウムイオンについて特に注意する必要がある（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ．，７３（２）：２８３−９０  （２００６））。
【０２９０】
凍結乾燥製剤用の緩衝液は、追加の検討が必要である。リン酸ナトリウムのようないくつかの緩衝液は、凍結中にタンパク質非晶質相から結晶化し、ｐＨのシフトをもたらす。酢酸及びイミダゾールなどの他の一般的な緩衝液は、凍結乾燥プロセス中に昇華または蒸発し、それによって凍結乾燥中または再構成後に製剤のｐＨをシフトさせ得る。
【０２９１】
組成物中に存在する緩衝系は、生理的に適合性であり、医薬製剤の所望のｐＨを維持するように選択される。一実施形態では、溶液のｐＨはｐＨ２．０〜ｐＨ１２．０である。例えば、溶液のｐＨは、２．０、２．３、２．５、２．７、３．０、３．３、３．５、３．７、４．０、４．３、４．５、４．７、５．０、５．３、５．５、５．７、６．０、６．３、６．５、６．７、７．０、７．３、７．５、７．７、８．０、８．３、８．５、８．７、９．０、９．３、９．５、９．７、１０．０、１０．３、１０．５、１０．７、１１．０、１１．３、１１．５、１１．７、または１２．０であってもよい。
【０２９２】
ｐＨ緩衝化合物は、製剤のｐＨを所定のレベルで維持するのに適した任意の量で存在させてもよい。一実施形態では、ｐＨ緩衝濃度は、０．１ｍＭ〜５００ｍＭ（１Ｍ）である。例えば、ｐＨ緩衝剤は、少なくとも０．１、０．５、０．７、０．８  ０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、または５００ｍＭであることが意図される。
【０２９３】
本明細書中に記載の製剤を緩衝するために用いる例示的なｐＨ緩衝剤として、限定されないが、有機酸、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、トリス、ＨＥＰＥＳ、ならびにアスパラギン酸塩、ヒスチジン、及びグリシンを含むがこれらに限定されないアミノ酸またはアミノ酸の混合物が挙げられる。本発明の一実施形態では、緩衝剤はクエン酸塩である。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、製剤は、５０ｍＭグリシン、１０ｍＭタウリン、５％（ｗ／ｗ）スクロース、５％（ｗ／ｗ）Ｄ−マンニトール、０．１％ポリソルベート８０、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含み、ｐＨ７．４を有する。いくつかの実施形態では、製剤は、高純度ｍａｔ−ｒＶＷＦ、５０ｍＭグリシン、１０ｍＭタウリン、５％（ｗ／ｗ）スクロース、５％（ｗ／ｗ）Ｄ−マンニトール、０．１％ポリソルベート８０、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含み、ｐＨ７．４を有する。いくつかの実施形態では、製剤は、ｖＷＦ及び／またはｒ−ｖＷＦ／ｒＦＶＩＩＩ及び５０ｍＭグリシン、１０ｍＭタウリン、５％（ｗ／ｗ）スクロース、５％（ｗ／ｗ）Ｄ−マンニトール、０．１％ポリソルベート８０、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含み、ｐＨ７．４を有する。
【０２９５】
ｉｉｉ．医薬安定剤及び増量剤
本医薬製剤の一態様では、安定剤（または安定剤の組合せ）を添加して、貯蔵誘導凝集及び化学的分解を防止または低減する。再構成時のかすんだ溶液または濁った溶液は、タンパク質が沈殿したか、少なくとも凝集したことを示す。用語「安定剤」とは、水性状態での化学的分解（例えば、自己分解、脱アミド化、酸化など）を含む凝集または物理的劣化を防止することができる賦形剤を意味する。想定される安定剤として、限定されないが、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、アラビノース、グルコサミン、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、グリシン、アルギニンＨＣＬ、デキストラン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、シクロデキストリン、Ｎ−メチルピロリジン、セルロース、及びヒアルロン酸ナトリウムなどの多糖類を含むポリヒドロキシ化合物が挙げられる（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ  ７４：２２５，（１９９１））。本製剤では、安定剤を、約０．１、０．５、０．７、０．８  ０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、７００、９００、または１０００ｍＭの濃度で含有させる。本発明の一実施形態では、マンニトール及びトレハロースを安定剤として用いる。
【０２９６】
所望により、製剤にはまた、適切な量の増量剤及び浸透圧調節剤を含ませる。増量剤として、例えば、限定されないが、マンニトール、グリシン、スクロース、重合体、例えば、デキストラン、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ラクトース、ソルビトール、トレハロース、またはキシリトールが挙げられる。一実施形態では、増量剤はマンニトールである。増量剤を、約０．１、０．５、０．７、０．８  ０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、７００、９００、または１０００ｍＭの濃度で含有させる。
【０２９７】
ｉｖ．医薬用界面活性剤
タンパク質は表面と相互作用する傾向が高いため、空気−液体、バイアル−液体、及び液体−液体（シリコーンオイル）界面で吸着及び変性を受けやすくなる。この分解経路は、タンパク質濃度に反比例し、溶解性及び不溶性タンパク質凝集体の形成または表面への吸着による溶液からのタンパク質の損失に起因することが観察されている。容器表面吸着に加えて、表面に起因する劣化は、製品の出荷及び取り扱い中に経験するであろう物理的な攪拌によって悪化する。
【０２９８】
界面活性剤は、表面に起因する分解を防ぐためにタンパク質製剤に一般的に使用される。界面活性剤は、界面位置に対してタンパク質と競合する能力を有する両親媒性分子である。界面活性剤分子の疎水性部分は、界面位置（例えば空気／液体）を占め、一方、分子の親水性部分はバルク溶媒に配向したままである。十分な濃度（通常、界面活性剤の臨界ミセル濃度付近）では、界面活性剤分子の表面層は、タンパク質分子が界面で吸着するのを防ぐ役割を果たす。これにより、表面に起因する劣化が最小限に抑えられる。本明細書で意図される界面活性剤には、限定されないが、ソルビタンポリエトキシレートの脂肪酸エステル、例えば、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０が含まれる。これら２つは、疎水性の特徴を分子に与える脂肪族鎖の長さのみが、それぞれＣ−１２及びＣ−１８で異なっている。したがって、ポリソルベート−８０は、ポリソルベート−２０よりも界面活性が高く、臨界ミセル濃度が低い。
【０２９９】
界面活性剤はまた、タンパク質の熱力学的立体構造の安定性に影響を与え得る。ここでも、所与の界面活性賦形剤の効果は、タンパク質特異的である。例えば、ポリソルベートは、いくつかのタンパク質の安定性を低下させ、他のタンパク質の安定性を高めることが示されている。界面活性剤によるタンパク質の不安定化は、部分的または全体的に折り畳まれていないタンパク質状態との特異的結合に関与できる界面活性剤分子の疎水性尾部の観点から合理化することができる。これらのタイプの相互作用は、より拡大したタンパク質状態に向かって、立体構造的な平衡にシフトを引き起こし得る（例えば、結合ポリソルベートを相補するタンパク質分子の疎水性部分の露出を増加させる）。あるいは、タンパク質の天然状態が何らかの疎水性表面を呈する場合、天然状態に結合する界面活性剤はその立体構造を安定化し得る。
【０３００】
ポリソルベートの別の態様は、それらが本質的に酸化分解の影響を受けやすいということである。多くの場合、原料として、それらは、タンパク質残基側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすのに十分な量の過酸化物を含有する。安定剤の添加に起因した酸化的損傷の可能性があることから、最も低い有効濃度の賦形剤を製剤に使用すべきであるという点が強調される。界面活性剤に関して、所与のタンパク質に対する有効濃度は安定化のメカニズムに依存する。
【０３０１】
また、凍結及び乾燥中の表面関連凝集現象を防止するためにも、界面活性剤を適切な量で添加する（Ｃｈａｎｇ，Ｂ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８５：１３２５，（１９９６））。したがって、例示的な界面活性剤には、限定されないが、天然アミノ酸由来の界面活性剤を含む、陰イオン性、陽イオン性、非イオン性、双性イオン性、及び両性界面活性剤が含まれる。陰イオン性界面活性剤として、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウム、ケノデオキシコール酸、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、コール酸ナトリウム水和物、デオキシコール酸ナトリウム、ならびにグリコデオキシコール酸ナトリウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。陽イオン性界面活性剤として、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム一水和物、及びヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化物が挙げられるが、これらに限定されない。双性イオン性界面活性剤として、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＢ３−１０、及びＳＢ３−１２が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤として、ジギトニン、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＴＷＥＥＮ−２０、及びＴＷＥＥＮ−８０が挙げられるが、これらに限定されない。界面活性剤としてはまた、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、４０、５０及び６０、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート４０、６０、６５及び８０、ダイズレシチン、及び他のリン脂質、例えば、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、及び（ジオレイルホスファチジルグリセロール）ＤＯＰＧ；ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、これらの界面活性剤を個別に、または異なる比率の混合物として含む組成物を、さらに提供する。本発明の一実施形態では、界面活性剤はＴＷＥＥＮ−８０である。本製剤において、界面活性剤を約０．０１〜約０．５ｇ／Ｌの濃度で含有させる。提供する製剤では、界面活性剤濃度は、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｇ／Ｌである。
【０３０２】
ｖ．医薬用塩
塩は、多くの場合、製剤のイオン強度を高めるために加えられ、これは、タンパク質の溶解性、物理的安定性、及び等張性に重要であり得る。塩は、様々な方法で、タンパク質の物理的安定性に影響を及ぼし得る。イオンは、タンパク質表面上の荷電残基に結合することによって、タンパク質の天然状態を安定化させることができる。あるいは、塩は、タンパク質骨格（−ＣＯＮＨ−）に沿ってペプチド基に結合することによって変性状態を安定化させることができる。塩はまた、タンパク質分子内の残基間の反発的な静電相互作用を遮蔽することによって、タンパク質の天然の立体構造を安定化させることができる。タンパク質製剤中の塩はまた、タンパク質凝集及び不溶性につながり得るタンパク質分子間の引力静電相互作用を遮蔽することができる。提供する製剤において、塩濃度は、０．１、１、１０、２０、３０、４０、５０、８０、１００、１２０、１５０、２００、３００から５００ｍＭの間である。
【０３０３】
ｖｉ．他の一般的な賦形剤成分：医薬アミノ酸
アミノ酸は、緩衝液、増量剤、安定剤、及び抗酸化剤として、タンパク質製剤に多用途に用いられている。したがって、一態様では、ヒスチジン及びグルタミン酸を、それぞれ５．５〜６．５及び４．０〜５．５のｐＨ範囲でタンパク質製剤を緩衝するために用いる。ヒスチジンのイミダゾール基はｐＫａ＝６．０を有し、グルタミン酸側鎖のカルボキシル基はｐＫａ４．３を有し、これにより、これらのアミノ酸はそれぞれのｐＨ範囲での緩衝に適したものになる。グルタミン酸は、そのような場合において、特に有用である。ヒスチジンは、市販のタンパク質製剤中に一般的に認められ、このアミノ酸は、注射時の刺痛で知られる緩衝液であるクエン酸塩の代替となるものである。興味深いことに、ヒスチジンは、液体及び凍結乾燥でのプレゼンテーションの両方において、高濃度で使用した場合の凝集に関して安定化効果を有することも報告されている（Ｃｈｅｎ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．，２０（１２）：１９５２−６０（２００３））。他の報告により、ヒスチジンは、高タンパク質濃度製剤の粘度を低下させることも観察された。しかしながら、同研究で、著者らは、ステンレス鋼容器中での抗体の凍結融解研究中に、ヒスチジンを含有する製剤の凝集及び変色の増加を観察した。ヒスチジンに関するもう１つの注意点は、金属イオンの存在下で光酸化を受けることである（Ｔｏｍｉｔａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８（１２）：５１４９−６０（１９６９））。製剤中での抗酸化物質としてのメチオニンの使用は有望と考えられ；多くの酸化ストレスに対して有効であることが観察されている（Ｌａｍ  ＸＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ＳｃＬ，８６（１１）：１２５０−５（１９９７））。
【０３０４】
様々な態様では、優先的排除（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）のメカニズムによってタンパク質を安定化することが示されているグリシン、プロリン、セリン、アルギニン及びアラニンのうちの１つ以上のアミノ酸を含む製剤を提供する。グリシンはまた、凍結乾燥製剤で一般的に使用される増量剤でもある。アルギニンは、凝集を阻害する際に有効な薬剤であることが示されており、液体及び凍結乾燥製剤の両方で使用されている。
【０３０５】
提供する製剤において、アミノ酸濃度は、０．１、１、１０、２０、３０、４０、５０、８０、１００、１２０、１５０、２００、３００から５００ｍＭの間である。本発明の一実施形態では、アミノ酸はグリシンである。
【０３０６】
ｖｉｉ．他の一般的な賦形剤成分：医薬抗酸化剤
タンパク質残基の酸化は、多くの異なる供給源から生じる。特定の抗酸化剤の添加に加えて、酸化タンパク質の損傷の防止には、大気中の酸素、温度、露光、及び化学汚染など、製品の製造プロセス及び保管全体にわたる多くの要因を注意深く制御することが含まれる。したがって、本発明は、還元剤、酸素／フリーラジカルスカベンジャー、またはキレート剤を含むがこれらに限定されない医薬抗酸化剤の使用を企図する。治療用タンパク質製剤中の抗酸化剤は、一態様では、水溶性であり、製品貯蔵期間全体にわたって活性を維持する。還元剤及び酸素／フリーラジカルスカベンジャーは、溶液中の活性酸素種を除去することによって作用する。ＥＤＴＡなどのキレート剤は、フリーラジカル形成を促進する微量金属汚染物質を結合することによって効果を有する。例えば、酸性線維芽細胞増殖因子の液体製剤にＥＤＴＡを利用して、システイン残基の金属イオン触媒酸化を阻害した。
【０３０７】
タンパク質の酸化を防ぐための様々な賦形剤の有効性に加えて、抗酸化剤自体がタンパク質に他の共有結合の、または物理的な変化を誘導する可能性が懸念される。例えば、還元剤は、ジスルフィド結合の分子内崩壊を引き起こし、ジスルフィドシャッフリングを引き起こし得る。遷移金属イオンの存在下で、アスコルビン酸及びＥＤＴＡは、多くのタンパク質及びペプチドにおけるメチオニン酸化を促進することが示されている（Ａｋｅｒｓ  ＭＪ，ａｎｄ  Ｄｅｆｅｌｉｐｐｉｓ  ＭＲ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．  Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｖｅｎ  Ｆｒｏｋｊａｅｒ，Ｌａｒｓ  Ｈｏｖｇａａｒｄ，ｅｄｉｔｏｒｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ，ＵＫ（１９９９））；Ｆｒａｎｓｓｏｎ  Ｊ．Ｒ．，／．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６（９）：４０４６−１０５０（１９９７）；Ｙｉｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．，２１（１２）：２３７７−８３（２００４））。チオ硫酸ナトリウムは、ｒｈｕＭａｂ  ＨＥＲ２における光及び温度誘導メチオニン酸化のレベルを低下させると報告されているが；しかしながら、この研究ではチオ硫酸−タンパク質付加物の形成も報告された（Ｌａｍ  ＸＭ，Ｙａｎｇ  ＪＹ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．８６（１１）：１２５０−５（１９９７））。適切な抗酸化剤の選択は、タンパク質の特定のストレス及び感受性に従って行う。特定の態様で想定される抗酸化物質として、限定されないが、還元剤及び酸素／フリーラジカルスカベンジャー、ＥＤＴＡ、及びチオ硫酸ナトリウムが挙げられる。
【０３０８】
ｖｉｉｉ．他の一般的な賦形剤成分：医薬金属イオン
一般的に、遷移金属イオンは、タンパク質中の物理的及び化学的分解反応を触媒し得るため、タンパク質製剤では望ましくない。しかしながら、特定の金属イオンは、それらがタンパク質の補因子である場合、製剤中に、及びそれらが配位錯体を形成する場合、タンパク質の懸濁製剤（例えば、インスリンの亜鉛懸濁液）中に含ませる。近年、マグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）を使用して、アスパラギン酸からイソアスパラギン酸への異性化を阻害することが提唱されている（ＷＯ２００４０３９３３７）。
【０３０９】
金属イオンがタンパク質の安定性を与えるかまたは活性を高める２つの例は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼ（ｒｈＤＮａｓｅ，Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標））、及び第ＶＩＩＩ因子である。ｒｈＤＮａｓｅの場合、Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、特異的結合部位を介して酵素の安定性を増加させた（Ｃｈｅｎ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，／Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．，８８（４）：４７７−８２（１９９９））。実際、ＥＧＴＡを用いた溶液からのカルシウムイオンの除去は、脱アミド化及び凝集の増加を引き起こした。しかしながら、この効果は、Ｃａ＋２イオンでのみ観察され；他の二価陽イオンＭｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化することが観察された。同様の効果は第ＶＩＩＩ因子でも観察された。Ｃａ＋２及びＳｒ＋２イオンはタンパク質を安定化させ、一方、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２及びＦｅ＋２のような他のイオンは、酵素を不安定化させた（Ｆａｔｏｕｒｏｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１５５，１２１−１３１（１９９７）。第ＶＩＩＩ因子を用いた別の研究では、Ａｌ＋３イオンの存在下で凝集率の有意な増加が観察された（Ｄｅｒｒｉｃｋ  ＴＳ，ｅｔ  ａｌ．，／．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，９３（１０）：２５４９−５７（２００４））。著者らは、緩衝塩のような他の賦形剤がＡｌ＋３イオンで汚染されることが多いことを指摘しており、製剤化した製品において適切な品質の賦形剤を使用する必要性が示されている。
【０３１０】
ｉｘ．他の一般的な賦形剤成分：医薬保存剤
同じ容器からの複数の抽出を伴う多用途非経口製剤を開発する場合、保存剤が必要である。これらの主な機能は、微生物の増殖を阻害し、医薬品の貯蔵寿命または使用期間を通じて製品の無菌性を確保することである。一般的に使用される保存剤として、限定されないが、ベンジルアルコール、フェノール及びｍ−クレゾールが挙げられる。保存剤は長い間使用されてきたが、保存剤を含むタンパク質製剤の開発は困難になり得る。保存剤は、ほとんどの場合、タンパク質に対して不安定な効果（凝集）を有しており、これは、複数回投与タンパク質製剤での使用を制限する主要な要因となっている（Ｒｏｙ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ＳｃＬ，９４（２）：３８２−９６（２００５））。
【０３１１】
現在まで、ほとんどのタンパク質医薬品は、単回使用に対してのみ、製剤化されている。しかしながら、複数回投与製剤が可能な場合、それらは患者の利便性を可能にし、市場性を高める追加の利点を有する。良い例は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のものであり、保存製剤の開発は、より便利で多用途の注射ペンプレゼンテーションの商業化につながっている。ｈＧＨの保存製剤を含む少なくとも４つのそのようなペン装置は、現在市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（登録商標）（液体，Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ（登録商標）（液体，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）  ＆  Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥−デュアルチャンバーカートリッジ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ）はフェノールを含有し、一方、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（登録商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）はｍ−クレゾ−ルで製剤化する。
【０３１２】
保存された剤形の製剤開発中に、いくつかの態様を考慮する必要がある。医薬品の効果的な保存剤濃度を最適化しなければならない。これには、タンパク質の安定性を損なうことなく抗菌効果を与える濃度範囲を有する剤形で所与の保存剤を試験する必要がある。例えば、インターロイキン−１受容体（Ｉ型）の液体製剤の開発において、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）を用いて３つの保存剤のスクリーニングに成功した。保存剤を、市販品に一般的に用いる濃度での安定性への影響に基づいてランク付した（Ｒｅｍｍｅｌｅ  ＲＬ  Ｊｒ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰｈａｒｍＲｅｓ．，１５（２）：２００−８（１９９８））。
【０３１３】
保存剤を含有する液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤よりも困難である。凍結乾燥製品は、保存剤なしで凍結乾燥し、使用時に保存剤を含有する希釈剤で再構成することができる。これにより、保存剤がタンパク質に接触する時間が有意に短縮され、関連する安定性リスクが最小限に抑えられる。液体製剤では、保存剤の有効性及び安定性を、製品の貯蔵期間全体にわたって維持する必要がある（１８〜２４か月）。注意すべき重要な点は、活性薬物及びすべての賦形剤成分を含有する最終製剤において保存剤の有効性が実証されなければならないということである。
【０３１４】
いくつかの保存剤は、注射部位反応を引き起こす可能性があり、これは保存剤を選択する際に考慮する必要がある別の因子である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎの保存剤及び緩衝液の評価に焦点を当てた臨床試験では、疼痛知覚は、ｍ−クレゾールを含有する製剤に比べて、フェノール及びベンジルアルコールを含有する製剤において、低いことが観察された（Ｋａｐｐｅｌｇａａｒｄ  Ａ．Ｍ．，Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ．６２  Ｓｕｐｐｌ  ３：９８−１０３（２００４））。興味深いことに、一般的に使用される保存剤の中で、ベンジルアルコールは麻酔特性を有する（Ｍｉｎｏｇｕｅ  ＳＣ，ａｎｄ  Ｓｕｎ  ＤＡ．，ＡｎｅｓｔｈＡｎａｌｇ．，１００（３）：６８３−６（２００５））。様々な態様において、保存剤の使用は、任意の副作用を上回る利点を提供する。
【０３１５】
ｘ．医薬製剤の調製方法
本発明は、医薬品製剤の調製方法をさらに企図する。
【０３１６】
本方法はさらに、以下の工程の１つ以上を含む：凍結乾燥する前に前記混合物に本明細書に記載の安定剤を添加する工程、それぞれ、本明細書中に記載される増量剤、浸透圧調節剤、及び界面活性剤から選択される少なくとも１種の薬剤を、凍結乾燥前に前記混合物に添加する工程。
【０３１７】
凍結乾燥した物質の標準的な再構成の実施は、ある量（通常は凍結乾燥中に除去する容量に相当）の注射用の純水または滅菌水（ＷＦＩ）を添加することであるが、抗菌剤の希釈溶液を非経口投与用の医薬品の製造に使用することもある（Ｃｈｅｎ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１８：１３１１−１３５４（１９９２））。したがって、本発明の凍結乾燥ｒＶＷＦ組成物に希釈剤を添加する工程を含む再構成ｒＶＷＦ組成物の調製方法を提供する。
【０３１８】
凍結乾燥した物質を、水溶液として再構成してもよい。様々な水性担体、例えば、注射用の滅菌水、複数回投与での使用のための保存剤を含む水、または適切な量の界面活性剤を含む水（例えば、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合して活性化合物を含有する水性懸濁液）。様々な態様では、そのような賦形剤は、懸濁剤、例えば、限定されないが、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム及びアカシアガム；分散剤もしくは湿潤剤は、天然ホスファチド、例えば、限定されないが、レシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合産物、例えば、限定されないが、ポリオキシエチレンステアレート、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合産物、例えば、限定されないが、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール由来部分エステルとの縮合産物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物由来部分エステルとの縮合産物、例えば、限定されないが、ポリエチレンソルビタンモノオレエートである。様々な態様において、水性懸濁液はまた、１つ以上の保存剤を含み、例えば、限定されないが、エチル、またはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸を含有する。
【０３１９】
ｘｉ．投与用の例示的なｍａｔ−ｒＶＷＦ製剤
いくつかの実施形態では、本方法は、治療薬の量を減らすために、最終生成物が、高い効力（高いｍａｔ−ｒＶＷＦ濃度及び増強された長期安定性）を有し得る増強された製剤を提供する（１００ＩＵ／ｍｌ〜１００００ＩＵ／ｍｌ）。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｍａｔ−ｒＶＷＦ濃度は、約１００ＩＵ／ｍｌ〜１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｍａｔ−ｒＶＷＦ濃度は、約５００ＩＵ／ｍｌ〜１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｍａｔ−ｒＶＷＦ濃度は、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｍａｔ−ｒＶＷＦ濃度は、約２０００ＩＵ／ｍｌ〜１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｍａｔ−ｒＶＷＦ濃度は、約３０００ＩＵ／ｍｌ〜１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｍａｔ−ｒＶＷＦ濃度は、約４０００ＩＵ／ｍｌ〜１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｍａｔ−ｒＶＷＦ濃度は、約５０００ＩＵ／ｍｌ〜１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｍａｔ−ｒＶＷＦ濃度は、約６０００ＩＵ／ｍｌ〜１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｍａｔ−ｒＶＷＦ濃度は、約７０００ＩＵ／ｍｌ〜１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｍａｔ−ｒＶＷＦ濃度は、約８０００ＩＵ／ｍｌ〜１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｍａｔ−ｒＶＷＦ濃度は、約９０００ＩＵ／ｍｌ〜１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、ｍａｔ−ｒＶＷＦを、組換え凝固第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）と共に製剤化する。いくつかの実施形態では、ｒＦＶＩＩＩは完全長ＦＶＩＩＩである。いくつかの実施形態では、ｒＦＶＩＩＩは、完全長であり、化学的に修飾されている。いくつかの実施形態では、ｒＦＶＩＩＩには、Ｂドメインの代わりにＦＩＸ活性化ペプチドを有するＦＶＩＩＩ融合タンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、ｒＦＶＩＩＩは、トランケート型グリコシル化リッチＢドメインを有するＦＶＩＩＩハイブリッドである。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩ  Ｂドメイン欠失型バリアントである。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩ  Ｂドメイン欠失型バリアントの化学的に修飾されたバリアントである。いくつかの実施形態では、凍結乾燥工程または充填終了工程の前に、ｍａｔ−ｒＶＷＦをｒＦＶＩＩＩと共に製剤化し、その成分を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは「オンカラム」手順において混合する（例えば、精製方法の実施中にＦＶＩＩＩを添加する）ことによって保存する。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、例えば、ヒスチジン、グリシン、アルギニンのようなアミノ酸を含む１つ以上の双性イオン性化合物を含む。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、例えば、ポリソルベート８０、オクチルピラノシド、ジペプチド、及び／または両親媒性ペプチドを含む、最低でも１つの疎水性基及び１つの親水性基を有する両親媒性特性を有する成分を含む。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、例えば、ソルビトール、マンニトール、スクロース、またはトレハロースを含む、非還元糖または糖アルコールまたは二糖を含む。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、例えば、塩化ナトリウムを含む、生理学的浸透圧をもたらす非毒性水溶性塩を含む。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、６．０〜８．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、約６．０、約６．５、約７、約７．５または約８．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋及び／またはそれらの組み合わせを含む、ｒＶＷＦを安定化させる１つ以上の二価陽イオンを含む。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭグリシン、約１ｍＭ〜約５０ｍＭヒスチジン、約０〜約３００ｍＭの塩化ナトリウム（例えば、３００ｍＭ未満のナトリウム）、約０．０１％〜約０．０５％ポリソルベート２０（またはポリソルベート８０）、及び約０．５％〜約２０％（ｗ／ｗ）スクロースを含み、投与時点でｐＨ約７．０かつ生理学的浸透圧を有する。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、投与用の製剤を、凍結乾燥することができる。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は安定であり、約２℃〜約８℃、及び約１８℃〜約２５℃で液体状態で保存することができる。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は安定であり、約２℃〜約８℃で液体状態で保存することができる。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は安定であり、約１８℃〜約２５℃で液体状態で保存することができる。
【０３２２】
ｘｉｉ．投与
ヒトまたは被験動物に組成物を投与するために、一態様では、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体を含む。語句「薬学的に」または「薬理学的に」許容されるとは、安定しており、凝集産物及び切断産物などのタンパク質分解を阻害し、さらに、以下に述べるように、当技術分野で周知の経路を用いて投与した場合にアレルギー、または他の有害反応を生じさせることがない分子実体及び組成物を指す。「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性の、臨床的に有用なあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌薬剤、等張剤及び吸収遅延剤など、例えば上記の開示される薬剤が含まれる。
【０３２３】
医薬製剤は、経口、局所、経皮、非経口、吸入スプレー、経膣、経直腸、または頭蓋内注射によって投与する。本明細書中で使用する用語「非経口的」には、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内の注射または注入の技術が含まれる。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、球後、肺内注射、及びまたは特定部位への外科的移植による投与もまた企図される。一般的に、組成物は、本質的にパイロジェン及びレシピエントに有害であり得る他の不純物を含まない。
【０３２４】
組成物の単一または複数の投与を、治療医によって選択されている用量レベル及びパターンで行う。疾患の予防または治療に関して、適切な用量は、上記で定義したような治療すべき疾患の種類、疾患の重症度及び経過、薬物を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療、患者の病歴及び薬物への応答、ならびに主治医の裁量に依存する。
【０３２５】
ｘｉｉｉ．キット
さらなる態様として、本発明は、対象への投与のためのそれらの使用を容易にする方法でパッケージされた１つ以上の凍結乾燥組成物を含むキットを含む。一実施形態では、そのようなキットは、容器、例えば、密封されたボトルまたは容器にパッケージされた本明細書に記載の医薬製剤（例えば、治療用タンパク質またはペプチドを含む組成物）を、容器に貼付されるか、またはパッケージに含まれている、方法を実施する上での化合物または組成物の使用を記載するラベルとともに含む。一実施形態では、医薬製剤を、容器内のヘッドスペースの量（例えば、液体製剤と容器の上部との間の空気量）が非常に少なくなるように、容器にパッケージする。好ましくは、ヘッドスペースの量はごくわずかである（例えば、ほとんどない）。一実施形態では、キットは、治療用タンパク質またはペプチド組成物を有する第１の容器と、その組成物に対して生理学的に許容可能な再構成溶液を有する第２の容器を含む。一態様では、医薬製剤を、単位剤形でパッケージする。キットは、特定の投与経路に従って医薬製剤を投与するのに適した装置をさらに含み得る。好ましくは、キットは、医薬製剤の使用を記載するラベルを含む。
【０３２６】
ｘｉｖ．用量
本明細書に記載の病態の治療方法に関する投与計画は、薬物の作用を変更する様々な要因、例えば、患者の年齢、病態、体重、性別及び食事、感染症の重症度、投与時間及び他の臨床的要因を考慮して、主治医が決定する。例えば、本発明の組換えＶＷＦの一般的な用量は、およそ５０Ｕ／ｋｇであり、これは５００μｇ／ｋｇに等しい。
【０３２７】
一態様では、本発明の製剤を、最初のボーラスとそれに続く持続注入によって投与して、製剤の治療的循環レベルを維持する。別の例として、本発明の化合物を、１回の用量として投与する。当業者であれば、良好な医療行為及び個々の患者の臨床状態によって決定される、有効な用量及び投与計画を容易に最適化するであろう。投与頻度は、薬剤の薬物動態学的パラメータ及び投与経路に依存する。最適な医薬製剤は、投与経路及び所望の用量に応じて当業者が決定する。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．（１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １８０４２）ｐａｇｅｓ  １４３５−１７１２を参照のこと（本文書の開示は参照により本明細書に援用される）。そのような製剤は、投与する薬剤の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、及びｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与える。投与経路に応じて、体重、体表面積または臓器サイズに従って適切な用量を計算する。適切な用量反応データと併せて用量の血中濃度を測定するための確立されたアッセイを使用することにより、適切な用量を確認してもよい。最終的な投与計画は、薬の作用を変更する様々な要因、例えば、薬物の比活性、患者の損傷の重症度及び応答性、患者の年齢、病態、体重、性別及び食事、感染の重症度、投与時間ならびに他の臨床的要因を考慮して主治医が決定する。研究が行われるにつれて、様々な疾患及び病態の適切な用量レベル及び治療期間に関するさらなる情報が明らかとなるであろう。
【実施例】
【０３２８】
以下の非限定的な実施例は、代表的な実施形態のより完全な理解を容易にするためにのみ、例示の目的で提供される。
【０３２９】
これらの実施例は、後天性及び遺伝性フォン・ヴィルブランド病の治療方法に関するものを含む本明細書に記載のいかなる実施形態も制限するものと解釈すべきではない。
【０３３０】
実施例１：ｃＶＷＦプロペプチドを成熟ｒＶＷＦから分離するための陽イオン交換体上での成熟ｒＶＷＦの精製。
実施例１は、陽イオン交換体（陽イオン交換（ＣＥＸ）樹脂）上での成熟ｒＶＷＦの精製を表す。ｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）は、フューリン成熟後もｒＶＷＦに結合したままであり、ＣＥＸ樹脂にローディングする前に中性ｐＨでクエン酸ナトリウムをキレート剤として用いて解離させた。ｒＶＷＦプロペプチドの大部分が、陽イオン交換樹脂を通過した。そして、残りのｒＶＷＦプロペプチドを、洗浄工程後に枯渇させた。クエン酸ナトリウムを、緩衝物質の成分として、及びキレート剤として使用した。
【０３３１】
工業的には、ＶＷＦ、特に組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）を、遺伝子改変型ＣＨＯ細胞株において、ｒＦＶＩＩＩと一緒に合成し、発現させる。共発現させるｒＶＷＦの機能は、細胞培養プロセスにおいてｒＦＶＩＩＩを安定化させることである。ｒＶＷＦを、Ｎ末端に高分子プロペプチドを結合させたプロ形態として細胞内で合成する。小胞体及びゴルジ体で成熟すると、ｒＶＷＦ−ＰＰは、細胞内プロテアーゼであるフューリンの作用によって切断され、発現タンパク質の二量体からなる同一サブユニットのホモポリマーとして分泌される。しかしながら、成熟は不完全であり、ｒＶＷＦ−ＰＰと成熟ＶＷＦの混合物を含む生成物が生じる。
【０３３２】
組換え因子ＶＩＩＩを捕捉するモノクローナル抗体工程の後、ｒＶＷＦを含有するフロースルー（モノクローナル抗体廃液とも呼ばれる）を陰イオン交換体（陰イオン交換（ＡＥＸ）樹脂）にロードした。ｒＶＷＦを陰イオン交換体に結合させ、カルシウム存在下でフューリンにより成熟させた。ｒＶＷＦは、導電性の増加とともに陰イオン交換体から溶出された。溶出物を含む生成物を、６０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６を用いた１：２希釈で、導電性１３．３９ｍＳ／ｃｍ及びｐＨ７．３９に調整した。調整後の水性希釈液を、内径１５ｍｍ、ベッド高さ１４．０ｃｍ、容量２４．７４ｍｌを有するＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，カタログ番号１５６−０１１５）陽イオン交換体カラム上に流速１００ｃｍ／時間でロードし、続いて５ＣＶの１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２で洗浄して宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及びｒＶＷＦ−ＰＰを除去した。ｒＶＷＦを、６ＣＶの１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２の緩衝液中、流速６０ｃｍ／時間で線形濃度勾配によって導電性を増加させることによって溶出した。主要な溶出ピークを２つの部分に分割し、低分子量ｒＶＷＦ多量体と高分子量ｒＶＷＦ多量体を分離した。
【０３３３】
図１は、実施例１に示す陽イオン交換体上の成熟ｒＶＷＦの精製を示す。
【０３３４】
図２は、精製結果の表を示す。
【０３３５】
図３は、実施例１に記載の方法によるｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰの分離を示す銀染色タンパク質ゲル及びウェスタンブロットを示す。
【０３３６】
実施例２及び３：ｒＶＷＦの商業的製造のための実施例１に記載の最適化方法。
実施例２及び３は、ｒＶＷＦの商業的製造のための実施例１に記載の最適化方法を表す。
【０３３７】
実施例２及び３について、ｒＶＷＦ及びｒＦＶＩＩＩの発酵のための実験セットアップを確立した。この方法を、生化学的特性評価のための高純度ｒＶＷＦを得るための簡易的精製法に用いた。
【０３３８】
捕捉工程を、アフィニティークロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーを単一のプロセス工程に組み合わせたタンデムクロマトグラフィーによって実施した。ｒＦＶＩＩＩを、免疫アフィニティークロマトグラフィー技術に基づいて、２〜８℃の温度で抗ＦＶＩＩＩ−ｍＡｂカラムに結合させた。この工程で、ｒＦＶＩＩＩをｒＶＷＦから分離することができる。ｒＶＷＦを含むフロースルーを、同じクロマトグラフィーシステム内で、精製水でオンライン希釈し、ＡＥＸカラムに直接ロードした。２８℃まで＋１５℃昇温した後、ＡＥＸカラム上で組換えフューリン成熟を実施した。フューリン成熟させたｒＶＷＦを、導電性を増加させることにより、段階溶出で溶出した。研磨工程も実施した。ｒＶＷＦを含むＡＥＸ溶出物を、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７．６で希釈し、内径１５ｍｍ、ベッド高さ１４．０ｃｍ、及びカラム容量２５±０．５ｍｌを有するＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，カタログ番号１５６−０１１５）陽イオン交換体カラムに、流速１００ｃｍ／時間で添加した。１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，２ｍＭクエン酸，ｐＨ７．６±０．２を用いた洗浄工程の後、ｒＶＷＦを、６ＣＶの１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２の緩衝液中、流速６５ｃｍ／時間で線形濃度勾配を用いて導電性を増加させながら溶出した。主要な溶出ピークを分析目的のために溶出物（プールした溶出物）として回収した。
【０３３９】
最終的な実験計画では、ピークの最後の３０〜４０％を回収し、最も高い比活性を有するｒＶＷＦを取得した。
【０３４０】
図４は、実施例２及び３に対する実験セットアップのフローチャートを示す。
【０３４１】
図５は、実施例２のクロマトグラムならびに実施例２及び３に用いるクロマトグラフィースキームを示す。
【０３４２】
図６は、実施例２で使用する試薬の表及び結果の表を示す。
【０３４３】
図７は、実施例２の別のクロマトグラム、及び実施例３の結果の表を示す。
【０３４４】
図８は、実施例２及び実施例３の方法によるｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチドの分離を示す銀染色タンパク質ゲルを示す。
【０３４５】
図９は、実施例２及び実施例３の方法によるｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチドの分離を示すウェスタンブロットを示す。
【０３４６】
実施例４：サイズ排除クロマトグラフィーによるｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰの分離によるｒＶＷＦの商業的製造方法
実施例４は、ｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）をサイズ排除クロマトグラフィーを介して分離することによってｒＶＷＦの商業的製造に最適化した方法を表す。ＳＥＣ実行緩衝液にクエン酸ナトリウムを添加して、ｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰを効率的に分割する。
【０３４７】
ｒＶＷＦを含む限外濾過後のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ溶出物を、２つのＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ  ＳＥＣカラムの直列アレイに直接ロードし（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号２８−９９１３−１６）、いずれもそれぞれ内径１６ｍｍ、ベッド高さ８２．０ｃｍ（２×４１ｃｍ）を有し、両方のカラム容量はおよそ１６５ｍｌであった。ロードは、７ｃｍ／時間の速度で適用した。実行緩衝液は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ遊離酸，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸二水和物  ｐＨ７．５±０．２であった。サイズ排除クロマトグラフィーは、線形流速１２ｃｍ／時間で等張条件を用いて実施した。
【０３４８】
図１０は、実施例４のクロマトグラム、クロマトグラフィースキーム、及び緩衝液組成を示す。
【０３４９】
図１１は、実施例４の結果の表を示す。
【０３５０】
図１２は、実施例４の方法によるｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチドの分離を示す銀染色タンパク質ゲル及びウェスタンブロットを示す。
【０３５１】
実施例５：サイズ排除クロマトグラフィーによるｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰの分離による成熟ｒＶＷＦの商業的製造のための最適化方法。
実施例５は、ｐＨ調整したｒＶＷＦを含む開始物質をサイズ排除クロマトグラフィー上に添加することによる、サイズ排除クロマトグラフィーによるｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰの分離方法を表す。
【０３５２】
ｒＶＷＦを含む限外濾過後のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ−溶出物を、カラムにローディングする前に１Ｍグリシン  ｐＨ９．０でｐＨ７．５±０．２に調整した。この溶液を、２つのＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ  ＳＥＣカラムの直列アレイにロードし（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号２８−９９１３−１６）、いずれもそれぞれ内径１６ｍｍ、ベッド高さ８２．０ｃｍ（２×４１ｃｍ）を有し、両方のカラム容量はおよそ１６５ｍｌであった。ロードは、７ｃｍ／時間の流速で適用した。ＳＥＣ実行緩衝液は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ遊離酸及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５±０．２を含んでいた。サイズ排除クロマトグラフィーは、線形流速１２ｃｍ／時間で等張条件を用いて実施した。
【０３５３】
図１３は、実施例５のクロマトグラム、クロマトグラフィースキーム、及び緩衝液組成を示す。
【０３５４】
図１４は、実施例５の結果の表を示す。
【０３５５】
実施例６：ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ上でキレート剤を補充せずにｒＶＷＦプロペプチドからｒＶＷＦを精製するためのＣＥＸ法
実施例６は、限外濾過したＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ上にキレート剤を補充しないＣＥＸ法を表す。この方法は、ｒＶＷＦプロペプチドから成熟ｒＶＷＦを精製するための従来法の代表である。方法は、キレート剤を含む緩衝液及び／またはｐＨ７．０以上を有する緩衝液を利用しない。
【０３５６】
組換え第ＶＩＩＩ因子を捕捉するモノクローナル抗体工程の後、ｒＶＷＦを含むフロースルーを陰イオン交換体にロードした。ｒＶＷＦを陰イオン交換体に結合させ、カルシウム存在下でフューリンにより成熟させた。ｒＶＷＦは、導電性の増加とともに陰イオン交換体から溶出された。次いで、生成物を含む溶出物を、内径１５ｍｍ、ベッド高さ１４．２ｃｍ、及び容量２５．０９ｍｌを有するＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，カタログ番号１５６−０１１５）陽イオン交換体カラムに、流速１００ｃｍ／時間でロードし、続いて１０ＣＶの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１００ｍＭ酢酸ナトリウム，８５ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ６．５±０．２で洗浄し、ＨＣＰ及びｒＶＷＦプロペプチドを除去した。ｒＶＷＦを、１００ｍＭ酢酸ナトリウム，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，１００ｍＭグリシン，３ｍＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．５±０．２を流速６５ｃｍ／時間で添加することにより、単一工程で溶出した。主要な溶出ピークを、生成物を含む画分として回収した。
【０３５７】
図１５は、実施例６のクロマトグラム、クロマトグラフィースキーム、及び緩衝液組成及び緩衝条件を示す。
【０３５８】
図１６は、実施例６の結果の表を示す。
【０３５９】
実施例７：事前のキレート剤補充またはｐＨ上昇を伴わずにｒＶＷＦプロペプチドからｒＶＷＦを精製するためのＳＥＣ法
実施例７は、事前のキレート剤補充またはｐＨ上昇を伴わないＳＥＣ法を表す。この方法は、ｒＶＷＦプロペプチドから成熟ｒＶＷＦを精製するための従来法の代表である。ＳＥＣ法は、ｒＶＷＦ及び残留ｒＶＷＦプロペプチドを含む開始画分（物質）を調整するために使用するキレート剤を含む緩衝液及び／またはｐＨ７．０以上を有する緩衝液を含まない。
【０３６０】
組換えＶＷＦを含む限外濾過後のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ−溶出物を、２つのＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ  ＳＥＣカラムの直列アレイに直接ロードし（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号２８−９９１３−１６）、いずれもそれぞれ内径１６ｍｍ、ベッド高さ８２．０ｃｍ（２×４１ｃｍ）を有し、両方のカラム容量はおよそ１６５ｍｌであった。ロードは、７ｃｍ／時間の流速で添加した。実行緩衝液は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ遊離酸，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５±０．２であった。サイズ排除クロマトグラフィーは、線形流速１２ｃｍ／時間で等張条件を用いて実施した。
【０３６１】
図１７は、実施例７のクロマトグラム、クロマトグラフィースキーム、及び緩衝液組成を示す。
【０３６２】
図１８は、実施例７の結果の表を示す。
【０３６３】
実施例８：陰イオン交換クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーによるｒＶＷＦプロペプチドからのｒＶＷＦの分離。
実施例８は、陽イオン交換体上での成熟ｒＶＷＦの精製を表す。ＡＥＸ  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ工程の後に現在のｒＶＷＦ製造工程から開始物質を取得した。ＡＥＸ  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ工程由来のｒＶＷＦを含むフロースルーを、ＳＤ／ＶＩ処理し、キレート剤を含む緩衝液で希釈してｒＶＷＦ／ｒＶＷＦプロペプチド複合体を解離させた。希釈した物質をＣＥＸ樹脂（Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓ）に添加した。ｒＶＷＦ−ＰＰ、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及び低分子量ｒＶＷＦ多量体の大部分は、陽イオン交換樹脂を通過する。残りのｒＶＷＦ−ＰＰを洗浄工程後に枯渇させた。その後、結合した高分子量ｒＶＷＦ多量体を、ナトリウムイオンによって引き起こされる導電性の増加によって溶出した。
【０３６４】
工業的には、ＶＷＦ、特に組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）を、遺伝子改変型ＣＨＯ細胞株において、ｒＦＶＩＩＩと一緒に合成し、発現させる。共発現させるｒＶＷＦの機能は、細胞培養プロセスにおいてｒＦＶＩＩＩを安定化させることである。ｒＶＷＦを、Ｎ末端に高分子プロペプチドを結合させたプロ形態として細胞内で合成する。小胞体及びゴルジ体で成熟すると、プロペプチドは、細胞内プロテアーゼであるフューリンの作用によって切断され、発現タンパク質の二量体からなる同一サブユニットのホモポリマーとして分泌される。しかしながら、成熟は不完全であり、プロペプチドと成熟ＶＷＦの混合物を含む生成物が生じる。
【０３６５】
組換え第ＶＩＩＩ因子を捕捉するモノクローナル抗体工程の後、ｒＶＷＦを含むフロースルーをＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ陰イオン交換体にロードした。ｒＶＷＦを陰イオン交換体に結合させ、カルシウム存在下でフューリンにより成熟させた。ｒＶＷＦは、導電性の増加とともに陰イオン交換体から溶出された。ＴＭＡＥ−溶出物をＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ（ＭＵＱ）フィルタユニットを介して濾過し、フィルター膜に結合するＣＨＯ−ＤＮＡ及び不純物を除去した。ＣＥＸ工程のローディング物質は、溶媒及び界面活性剤で処理して脂質エンベロープウイルスを不活化するＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾過工程（ＭＵＱ）の廃液である。ウイルスを不活化するために、ＭＵＱ廃液を、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（１％）及びポリソルベート８０（０．３％）などの２つの界面活性剤の混合物及び有機溶媒であるリン酸トリ−ｎ−ブチル（０．３％）とともに室温で１時間インキュベートする。生成物を含むＭＵＱ＿フロースルーを、６０ｍＭクエン酸ナトリウム  ｐＨ７．６で１：２希釈して、導電性２１．９ｍＳ／ｃｍ及びｐＨ７．１６に調整した。ｒＶＷＦプロペプチド（ｒＶＷＦ−ＰＰ）及び低分子量ｒＶＷＦ多量体を確実に除去するために高導電性を選択し、所望の高分子量ｒＶＷＦ多量体に対する樹脂の容量を利用した。調整した希釈液を、内径１０ｍｍ，ベッド高さ１４．３ｃｍ及び容量１１．２３ｍｌを有するＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，カタログ番号１５６−０１１５）陽イオン交換体カラムに流速１００ｃｍ／時間でロードした。ローディング後、５ＣＶの１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２を用いて第１の洗浄（再平衡化）を行い、弱く結合したＨＣＰ及びｒＶＷＦプロペプチドを除去した。
【０３６６】
強く結合したＨＣＰ及びｒＶＷＦプロペプチドを枯渇させる２回目の洗浄を、１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２中の４０％５００ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２の工程で実施した（洗浄２）。
【０３６７】
溶出は２つの段階で実施した：（１）第１段階は、１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２中の４５％５００ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２（溶出物１すなわちＥ１）の工程を含み、（２）第２段階は、６カラム容量中に１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２中の４５％〜１００％の５００ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２（溶出物２すなわちＥ２）の線形濃度勾配を含んでいた。洗浄２から濃度勾配の終点までを、６５ｃｍ／時間の流速で実施した。
【０３６８】
図１９は、実施例８のクロマトグラム、クロマトグラフィースキーム、及び緩衝液組成を示す。
【０３６９】
図２０は、実施例８の結果の表を示す。
【０３７０】
図２１は、実施例８の方法によるｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチドの分離を示す銀染色タンパク質ゲルを示す。
【０３７１】
図２２は、実施例８の方法によるｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチドの分離を示すウェスタンブロットを示す。１％アガロースゲルは、生成物の多量体パターンを示す。
【０３７２】
図２３は、実施例８の方法によるｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチドの分離を示すウェスタンブロットを示す。
【０３７３】
実施例９：陰イオン交換クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーによるｒＶＷＦプロペプチドからのｒＶＷＦの分離。
実施例９は、陽イオン交換体上での成熟ｒＶＷＦの最適化された精製を表す。ＡＥＸ  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ工程の後に現在のｒ−ＶＷＦ製造工程から開始物質を取得した。ＡＥＸ  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ工程由来のｒＶＷＦを含むフロースルーを、ＳＤ／ＶＩ処理し、キレート剤を含む緩衝液で希釈してｒＶＷＦ／ｒＶＷＦプロペプチド複合体を解離させた。希釈した物質をＣＥＸ樹脂に添加した（Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓ）。ｒＶＷＦ−ＰＰ、宿主細胞タンパク質及び低分子量ｒＶＷＦ多量体の大部分は、陽イオン交換樹脂を通過する。残りのｒＶＷＦ−ＰＰを洗浄工程後に枯渇させた。結合した高分子量ｒＶＷＦ多量体を、ナトリウムイオンによって引き起こされる導電性の増加の濃度勾配によって溶出した。
【０３７４】
工業的には、ＶＷＦ、特に組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）を、遺伝子改変型ＣＨＯ細胞株において、ｒＦＶＩＩＩと一緒に合成し、発現させる。共発現させるｒＶＷＦの機能は、細胞培養プロセスにおいてｒＦＶＩＩＩを安定化させることである。ｒＶＷＦを、Ｎ末端に高分子プロペプチドを結合させたプロ形態として細胞内で合成する。小胞体及びゴルジ体で成熟すると、プロペプチドは、細胞内プロテアーゼであるフューリンの作用によって切断され、発現タンパク質の二量体からなる同一サブユニットのホモポリマーとして分泌される。しかしながら、成熟は不完全であり、プロペプチドと成熟ＶＷＦの混合物を含む生成物が生じる。
【０３７５】
組換え第ＶＩＩＩ因子を捕捉するモノクローナル抗体工程の後、ｒ−ＶＷＦを含むフロースルーをＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ陰イオン交換体にロードした。ｒＶＷＦを陰イオン交換体に結合させ、カルシウム存在下でフューリンにより成熟させた。ｒＶＷＦは、導電性の増加とともに陰イオン交換体から溶出された。ＴＭＡＥ−溶出物をＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ（ＭＵＱ）フィルタユニットを介して濾過し、フィルター膜に結合するＣＨＯ−ＤＮＡ及び不純物を除去した。ＣＥＸ工程のローディング物質は、溶媒及び界面活性剤で処理して脂質エンベロープウイルスを不活化するＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾過工程（ＭＵＱ）の廃液である。
【０３７６】
ウイルスを不活化するために、ＭＵＱ廃液を、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（１％）及びポリソルベート８０（０．３％）の２つの界面活性剤の混合物及び有機溶媒であるリン酸トリ−ｎ−ブチル（０．３％）とともに室温で１時間インキュベートする。生成物を含むＭＵＱ＿フロースルーを、６０ｍＭクエン酸ナトリウム  ｐＨ７．６で１：２希釈して、導電性２１．９ｍＳ／ｃｍ及びｐＨ７．１６に調整した。ｒＶＷＦプロペプチド及び低分子量ｒＶＷＦを確実に除去するために高導電性を選択し、所望の高分子量ｒ−ＶＷＦに対する樹脂の容量を利用する。調整した希釈液を、内径１０ｍｍ，ベッド高さ１４．３ｃｍ及び容量１１．２３ｍｌを有するＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，カタログ番号１５６−０１１５）陽イオン交換体カラムに流速１００ｃｍ／時間でロードし、続いて５ＣＶの１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２で第１の洗浄（再平衡化）を行い、弱く結合したＨＣＰ及びｒＶＷＦプロペプチドを除去した。
【０３７７】
強く結合したＨＣＰ及びｒＶＷＦプロペプチドを枯渇させる第２の洗浄（洗浄２）を、５カラム容量中の１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２中の３６％５００ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２の工程で行った。
【０３７８】
溶出は、８カラム容量中の１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２中の３６％  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２〜１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２中の１００％  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２の濃度勾配で実施した。所望の生成物に相当する溶出物は、開始時１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２中の＞５０％の５００ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２〜１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２中の７６％  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．６±０．２の画分のプールを含む。洗浄及び溶出は、流速５０ｃｍ／時間で実施した。
【０３７９】
図２４は、実施例９のクロマトグラム、クロマトグラフィースキーム、及び緩衝液組成を示す。
【０３８０】
図２５は、実施例９の結果の表を示す。
【０３８１】
図２６は、実施例９の生成物の表を示す。
【０３８２】
図２７は、実施例９の方法によるｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチドの分離を示す銀染色タンパク質ゲルを示す。
【０３８３】
図２８は、実施例９の方法によるｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチドの分離を示すウェスタンブロットを示す。１％アガロースゲルは、生成物の多量体パターンを示す。
【０３８４】
図２９は、実施例９の方法によるｒＶＷＦとｒＶＷＦプロペプチドの分離を示すウェスタンブロットを示す。
【０３８５】
キレート剤及び／またはｐＨ上昇の存在下でのｒＶＷＦ精製工程は、ｒ−ＶＷＦプロペプチド及び宿主細胞タンパク質の高い枯渇率を示した。陽イオン交換体上のｒ−ＶＷＦプロペプチドの枯渇は、キレート剤及び／またはｐＨ上昇が存在する条件下でｒＶＷＦ−ＰＰが陽イオン交換体に結合しないという事実に基づいている。サイズ排除クロマトグラフィー上のｒＶＷＦプロペプチドの枯渇は、キレート剤及び／またはｐＨ上昇の存在下で、効率的にサイズ分離がなされるという事実に基づいていた。
【０３８６】
図３０は、実施例１、２、３、６、８、及び９に用いる強化型陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）で得られる、生成物を含有する画分の純度を示す。
【０３８７】
図３１は、実施例１、２、３、６、８、及び９の生成物関連不純物の枯渇係数を示す。
【０３８８】
図３２は、実施例４及び５に用いる強化型サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で得られる、生成物を含有する画分の純度を示す。
図３３は、実施例４及び５の生成物関連不純物の枯渇係数を示す。
【０３８９】
参考文献
米国特許第８，０５８，４１１号；Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｍａｔｕｒｅ  ＶＷＦ  ｆｒｏｍ  ＶＷＦ  ｐｒｏ−ｐｅｐｔｉｄｅ．  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｓ：  Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｍｕｎｄｔ，  Ａｒｔｕｒ  Ｍｉｔｔｅｒｅｒ，  Ｍｅｉｎｈａｒｄ  Ｈａｓｓｌａｃｈｅｒ，  Ｃｈｒｉｓｔａ  Ｍａｙｅｒ．
【０３９０】
米国特許第６，４６５，６２４号；Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｙ  ｃａｔｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｓ：  Ｂｅｒｎｈａｒｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｏｙｖｉｎｄ  Ｌ．  Ｓｃｈｏｎｂｅｒｇｅｒ，  Ａｒｔｕｒ  Ｍｉｔｔｅｒｅｒ，  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｆｉｅｄｌｅｒ，  Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  Ｄｏｒｎｅｒ，  Ｊｏｈａｎｎ  Ｅｉｂｌ．
【０３９１】
実施例１０：陰イオン交換クロマトグラフィーによるｒＶＷＦプロペプチドからのｒＶＷＦの分離。
本研究は、フューリン処理した成熟ＶＷＦ／ＶＷＦ−ＰＰ複合体を、陰イオン交換クロマトグラフィーと、高いｐＨ（例えば、ｐＨ８．５）を有し、キレート剤（ＥＤＴＡ）を含む溶出緩衝液を使用して、成熟ＶＷＦとＶＷＦ−ＰＰに解離（分離）させることを示す。分離は、陰イオン交換体（ＡＥＸ）、特にＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ６５０（Ｍ）上で実施した。ウイルス不活化のための溶媒−界面活性剤処理もまた、約１時間、カラム上で実施した。クロマトグラフィー実験の詳細を、図３４〜３６に示す。
【０３９２】
図３４は、ＴＭＡＥ分離法で用いる緩衝製剤及び材料を示す。
【０３９３】
図３５は、フューリン処理した成熟ＶＷＦ／ＶＷＦプロペプチド複合体のロード条件を示す。
【０３９４】
図３６は、クロマトグラフィー法の緩衝液、条件、パラメータ、及び流速の詳細を示す。
【０３９５】
図３７は、フューリン処理した成熟ＶＷＦ／ＶＷＦプロペプチド複合体の、成熟ＶＷＦ及びＶＷＦ−プロペプチド（ＶＷＦ−ＰＰ）への解離のクロマトグラムを示す。この図は、成熟ＶＷＦを含有する画分からのＶＷＦ−ＰＰの枯渇を示す。
【０３９６】
図３８は、成熟ＶＷＦとＶＷＦ−プロペプチド（ＶＷＦ−ＰＰ）の分離の別のクロマトグラムを示す。この図は、成熟ＶＷＦを含有する画分からのＶＷＦ−ＰＰの枯渇を示す。
【０３９７】
実施例１１：成熟ＶＷＦ（ｍａｔＶＷＦ）及びＶＷＦプロペプチド（ＶＷＦ−ＰＰ）の分離のための異なるクロマトグラフィー法の改良。
第１の研究では、組換え成熟ＶＷＦを精製するための２つの方法を比較した。
【０３９８】
図３９は、成熟ＶＷＦを単離するための２つの方法の概略を示す。例えば、ｍＡｂ廃液（ＭＡＢＥｆｆｌ）を得た後の下流処理工程の１つの方法では、ＴＭＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィーの捕捉工程及びオンカラム成熟（ＴＭＣ）、ならびにＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ陰性陰イオン交換クロマトグラフィー工程（ＭＵＱ）には、ウイルス不活化のための溶媒−界面活性剤処理（ＳＤＴ）、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＡＴ）、限外濾過濃縮（ＵＦＡ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、及び透析−限外濾過濃縮（ＤＵＦ）が含まれ、バルク原薬（成熟ＶＷＦ）が製造される。他の方法では、下流処理工程には、バルク原薬を製造するための改良型陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＡＴ）工程とそれに続く透析−限外濾過（ＤＵＦ）濃縮工程が含まれ、ＳＥＣが含まれない。
【０３９９】
図４０は、本明細書に記載され、図３９に示す改良型陽イオン交換クロマトグラフィー法（ＣＡＴ２．０）の利点のいくつかを強調した表を示す。改良型ＣＡＴ法は：１０００超の減少係数で宿主細胞不純物を、２０００超の減少係数でＶＷＦ−ＰＰを、及び１０未満の減少係数で残留ＦＶＩＩＩを除去することができる。ＣＡＴ法を使用して、ＶＷＦ多量体を分離し、プールすることができる。さらに、この方法は、ＶＷＦの活性画分を分離し、残存する宿主細胞由来不純物及びＶＷＦ−ＰＰを除去するための研磨工程として、サイズ排除クロマトグラフィーを代替することができる。
【０４００】
第２の研究では、ＳＥＣプロセスの条件を変化させ、成熟ＶＷＦとＶＷＦ−ＰＰの分離を向上させた。言い換えれば、ＳＥＣ用に改変した緩衝液は、ＶＷＦ−ＰＰの量を低下させることによって成熟ＶＷＦの純度を高めることができたと判断された。
【０４０１】
図４１は、標準型ＳＥＣ緩衝液（ＳＱＡ緩衝液）または改変型ＳＥＣ緩衝液（ＳＱＣ緩衝液）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを使用したｒ−ＶＷＦプロペプチドの分離を示す２つのクロマトグラムの概略を示す。図４２は、ＳＱＣ緩衝液を用いる利点のいくつかを強調した表を示す。例えば、ＳＱＣ緩衝液を使用する方法は、宿主細胞不純物を約１００超の減少係数で、残留ＦＶＩＩＩを１０未満の減少係数で除去することができる。驚くべきことに、この方法は、不純物レベルが２μｇ／１０００ユニット未満になるようにＶＷＦ−ＰＰを除去することができる。
【０４０２】
このように、本実施例では、ＶＷＦ−ＰＰからの成熟ＶＷＦの分離を改善する方法を記載する。
【０４０３】
実施例１２：改良型ＣＡＴ（ＵＮＯ＿Ｓ）工程の開発。
モノクローナル抗体（ＭＡＢ）フロースルーから始まる第１世代の組換えフォン・ヴィルブランド因子（ｒＶＷＦ）の下流プロセスは、ＵＮＯ＿Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ（ＵＮＯ＿Ｓ）樹脂上での陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＡＴ）による研磨工程を含む。その後、ＵＮＯ＿Ｓ溶出物を限外濾過によって濃縮し、さらにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって処理し、高分子量及び低分子量ｒＶＷＦ多量体を分離し、下流プロセスの過程で生成される生成物関連不純物である遊離ｒＶＷＦプロペプチドを除去する。高分子量ｒＶＷＦ細画分は、最終的な製剤（ＦＤＰ）を得るために最終的に製剤化されるバルク原薬（ＢＤＳ）に相当する。
【０４０４】
第２世代ｒＶＷＦの下流プロセスでは、改良型陽イオン交換クロマトグラフィー法によってＳＥＣ工程を代替し、代替の陽イオン交換（ＣＡＴ）溶出手順（段階溶出の代わりに濃度勾配溶出）によって高分子量及び低分子量ｒＶＷＦ多量体及びｒＶＷＦプロペプチドを分離することが提案された。本実施例では、第２世代ｒＶＷＦ研磨精製工程ＣＡＴの実験について概説する。ＣＡＴローディングｐＨ及び導電性、カラム洗浄工程の導電性及び長さ、ならびに溶出物プール基準などの新規プロセスパラメータを小スケールで検討し、スケーラブルでロバストなプロセス下流ユニット操作工程を得た。
【０４０５】
１．目的
第１世代ｒＶＷＦ（ＶＯＮＶＥＮＤＩ（登録商標））の下流プロセスは、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）ＭＡＢフロースルーをフィードとして用いたＴＭＡＥセファローズの捕捉工程（ＴＭＣ工程）から始まり、続いてＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾過工程を経てＣＨＯ宿主細胞ＤＮＡを除去する。次いで、溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）工程を実施して、潜在的な脂質エンベロープウイルスを不活化し、続いて弱陽イオン交換体であるＵＮＯ＿ＳｐｈｅｒｅＳ（ＵＮＯ＿Ｓ）樹脂上での研磨工程（ＣＡＴ工程）を実施する。ＣＡＴ工程は、ウイルス不活化工程の間に導入されたＳ／Ｄ化学物質を除去することを目的とする。その後、ＵＮＯ＿Ｓ溶出物を限外濾過によって濃縮し、さらにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって処理し、高分子量及び低分子量ｒＶＷＦ多量体を分離し、下流プロセスの過程で生成される生成物関連不純物である遊離ｒＶＷＦプロペプチドを除去する。高分子量ｒＶＷＦ細画分は、ＦＤＰを得るために最終的に製剤化されるＢＤＳに相当する。
【０４０６】
第２世代ｒＶＷＦの下流プロセスについては、ＳＥＣ工程を省き、改良型陽イオン交換クロマトグラフィー法によってそれを代替することが提案された。
【０４０７】
一連の５つの実験では、低分子量ｒＶＷＦ多量体からの高分子量ｒＶＷＦ多量体の分離及びｒＶＷＦプロペプチドの除去を、濃度勾配ＣＡＴ溶出手順によって達成した。新規の濃度勾配溶出モードは、第１世代の下流プロセスで適用される段階溶出手順を代替することができた。本実施例では、第２世代ｒＶＷＦ研磨精製工程ＣＡＴに対する５つの実験について詳細に概説する。すべての実験は、本明細書に記載の研究計画に従って実施した。
【０４０８】
２．序論及び背景
現在のレポートは、第１世代（Ｇｅｎ１）手順で現在適用されている２つのＶＷＦ下流ユニット操作工程ＣＡＴとＳＥＣを組み合わせることによる、第２世代（Ｇｅｎ２）Ｔプロセスの開発について記載する。一連の実験では、リスク評価において同定され、クロマトグラフィー工程ＣＡＴの性能にとって重要と考えられたプロセスパラメータを検討した。現在の研究は、現在のｒＶＷＦ製造プロセスからのスケールダウンモデルに基づいた。このプロセスを、臨床第ＩＩＩ相物質の製造のためにＯｒｔｈで確立し、商業的生産のために製造（ＭＦＧ）スケールに移行した（図４３Ａ）。本レポートに記載のＣＡＴユニット操作工程で導入した変更を理解しやすくするために、現在使用している第１世代ｒＶＷＦ下流ユニット操作工程Ｓ／Ｄ、ＣＡＴ及びＳＥＣの簡単なプロセスの説明を以下に示す。
【０４０９】
Ｇｅｎ１プロセスで使用する場合、ｒＶＷＦ研磨工程ＣＡＴは、「強力な」スルホン酸陽イオン交換配位子を備えたマクロポーラスアクリルアミドベースの媒体であるＵＮＯ＿Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ上でのクロマトグラフィーによる陽イオン交換プロセスである。研磨工程用のローディング物質は、陰イオン交換濾過工程ＭＵＱの廃液であり、これを、脂質エンベロープウイルスを不活化するために溶媒及び界面活性剤で処理する。ウイルスを不活化するため、ＭＵＱ廃液を２つの界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（１％）及びポリソルベート８０（０．３％）ならびに有機溶媒トリｎ−ブチルリン酸（０．３％）の混合物とともに室温で１時間インキュベートする。処理前に、生成物の溶液を０．２°μｍメンブレンフィルターで濾過し、存在する可能性のある粒子を除去する。ウイルス不活化後、生成物の溶液をおよそ１容量の水で希釈して、Ｓ／Ｄ試薬の濃度を下げ、ＣＡＴカラムへのローディング工程のために導電性を調整する。ｐＨは調整しない。ＣＡＴクロマトグラフィー工程は、Ｓ／Ｄ試薬を除去し、ダイズペプトンなどの培地成分ならびにｒフューリン、ｒＦＶＩＩＩポリペプチドならびにＣＨＯ由来のタンパク質及びＤＮＡなどの他の不純物を含むプロセス関連不純物をさらに低減させることを主な目的とする。ユニット操作工程ＣＡＴに続いて、得られた生成物の画分（ＣＡＴ−Ｅ）を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６樹脂上でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりさらに処理する。研磨工程ＳＥＣのローディング物質は、ＵＮＯ＿ＳｐｈｅｒｅＳ上での陽イオン交換研磨工程ＣＡＴの溶出物プールである。妥当な分解能を達成するためにＳＥＣカラムのローディング容量が制限されるため、ＣＡＴ溶出物プールを、３０°ｋＤａのカットオフを有するセルロース系メンブレンカセットを用いて、限外濾過によりおよそ１５倍に濃縮する（工程ＵＦＡ）。臨床第ＩＩＩ相生産スケールでは、限外濾過濃度（ＵＦＡ）濃縮物を２つの画分に分割し、ＳＥＣカラムで別々に処理する。この措置は、ＳＥＣカラムの容量とカラムの直径を低く抑えるために実施した。緩衝マトリックスならびにローディング物質の導電性及びｐＨは、ＣＡＴ溶出物プールに対応し、ＳＥＣカラムにロードする前の濃縮工程ＵＦＡの後に調整を行わない。工程ＳＥＣの目的は、ＣＨＯ宿主細胞タンパク質の最終的な不純物除去であり、ＴＭＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上での初期の捕捉工程（ＴＭＣ工程）で生成される生成物関連不純物であるｒＶＷＦプロペプチドの主要な除去工程として機能する。さらに、工程ＳＥＣは、サイズに基づいてｒＶＷＦ多量体を分離し、生成物のリストセチンコファクター活性に寄与する高分子量ｒＶＷＦ多量体を濃縮するためのプーリングスキームを可能にする。
【０４１０】
本レポートは、ＭＦＧ（図４３Ａ）スケールで実行される現在のユニット操作工程から、改良型ＣＡＴ（ＵＮＯ＿Ｓ）工程（図４３Ｂ）への置き換えを記載している。ＣＡＴ工程の改良について、小スケールで調べた。ＣＡＴ工程に続くＵＤＦ（濃縮／透析）工程も最適化する必要があり得る。
【０４１１】
３．材料及び方法
材料及び方法、ならびにサンプリング計画について本明細書に記載する。
【０４１２】
３．１  ｒＶＷＦロード物質
すべての実験について、凍結ＭＵＱ−Ｅ生成物を使用した。材料を１３０°ｍＬアリコートで≦−６０℃で凍結保存し、必要に応じて＋２〜＋８℃の範囲で一晩解凍した。ＭＵＱ−溶出物が解凍されたら、Ｓ／Ｄ試薬を添加し、混合物をＰａｌｌ製の０．２μｍフィルターＫＡ０２ＥＡＶＰ２Ｓ（登録商標）により濾過した。その後、濾過した物質を、室温（約＋２５℃）で６０分間、適度な攪拌下でインキュベートし、潜在的な脂質エンベロープウイルスを不活化／溶解させた。Ｓ／Ｄ反応を、６０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７．５で１：２希釈して停止させた。希釈した物質を、以下のＣＡＴ工程用のフィードとして用いた。
【０４１３】
３．２  クロマトグラフィーハードウェア
現在のレポートに記載の実験では、小スケールクロマトグラフィーシステムであるＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。このシステムには、紫外線吸収、導電性、圧力、温度及びｐＨを、電子記録とともにオンラインでモニタリングするためのプローブが装備されていた。Ｕｎｉｃｏｒｎ  ７．０で動作するソフトウェアによって、システムを制御した。すべての実験は、周囲室温で実施した。
【０４１４】
ＡＫＴＡシステムチューブはＰＥＥＫであったが、これはステンレス製の配管を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅプロセスシステムが用いられる大スケールとは異なっている。ハードウェア部品はすべて認定された研究開発機器である。
【０４１５】
５つの実験すべてに使用した実験室スケールのカラムには、１０μｍのＰＰフリットが装備されており；ＵＮＯ＿Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ樹脂の粒径は、直径約８０μｍであった。大スケールでは、２０μｍのメッシュサイズを有するステンレス鋼のフリットを使用する。すべてのカラムは、研究開発目的のために設計された認定品である。
【０４１６】
ＮＥにおける現在のＧＥＮ１  ＭＧＦ機器と現在の研究で使用する小スケールのＧＥＮ２機器とのハードウェア比較を図４４に示す。
【０４１７】
３．３  緩衝液
小スケールでの精製の実行に使用した緩衝液は、実験室エリアで作製したか、または製造エリアから受け取った。緩衝液の調製のために認定された化学物質を使用したが、これらをパイロットスケールの臨床生産用の緩衝液の生産にも使用した。緩衝液を、使用前に０．２°μｍ濾過し、室温で袋またはガラス瓶に保管した。緩衝液組成の説明を、図４８に示す。
【０４１８】
３．４  分析方法
実施するｒＶＷＦ生化学的特性評価、効力及び不純物アッセイとして、ＶＷＦ：ＲｉｓｔｏＣｏ活性、ＶＷＦ抗原、ＶＷＦプロペプチド抗原含有量、ＦＶＩＩＩ活性発色法、ＵＶ吸収特性（２８０ｎｍ，２５４ｎｍ）、ポリペプチドパターン、例えば、分解、多量体パターン、及びＣＨＯ  ＨＣＰ含有量を分析するものが挙げられる。いくつかの場合では、他の分析試験を実施して、例えば、限定されないが、プロＶＷＦ抗原含有量、ＦＶＩＩＩ抗原含有量、フューリン活性、フューリン抗原、総タンパク質（ＢＣＡ）、遊離スルフヒドリル、ＣＨＯ  ＢＩＰ  ＷＢ、ＣＨＯ  ＤＮＡ、マウスモノクローナル抗体、ダイズペプトン、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ポリソルベート８０、トリ−ｎ−ブチルリン酸、動的光散乱（ＤＬＳ）（流体力学的半径）、シアル酸、ｎ−グリカン含有量、ＶＷＦコラーゲン結合、及びＶＷＦ酸化を測定することができる。
【０４１９】
４  ＣＡＴプロセスｒＶＷＦ第２世代（ＧＥＮ２）における変更
第２世代ｒＶＷＦ下流プロセスにおけるＳＥＣ工程を置き換えるために、以下に示すパラメータを検討した。導入する変更のほとんどは、研究開発の実現可能性試験に基づいている。クロマトグラフィー樹脂タイプ（ＢｉｏＲａｄによるＵＮＯ＿Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓ樹脂）及び添加する緩衝液の組成（ｐＨではない）は変更しなかった。第２世代のＣＡＴプロセスには：Ｓ／Ｄ処理、ローディング濃度及び流速、ならびに洗浄工程及び溶出工程の変更が含まれていた。
【０４２０】
４．１  Ｓ／Ｄ処理
６０°ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を用いてウイルス不活化物質を１：２希釈することによってＳ／Ｄ不活化を停止させ、この希釈により、ＣＡＴフィードを７．５〜８．０の好ましいｐＨ（ｐＨ試験範囲６．０〜９．０）及び＋２５℃での１０〜３０°ｍＳ／ｃｍ２の好ましい導電性（＋２５℃での導電性試験範囲５〜４０°ｍＳ／ｃｍ２）に設定したことを除けば、Ｓ／Ｄ処理は、ＧＥＮ１プロセスと同様に行った。実施したＧＥＮ１  ｒＶＷＦ  ＣＡＴ工程では、ＣＡＴロードをｐＨ８．９〜９．２に設定した。ＧＥＮ２のセットアップでは、導電性及びｐＨを、マトリックスに対するＣＨＯ−ＨＣＰ、ＣＨＯ−ＤＮＡ及びｒＶＷＦプロペプチドの結合が最小化される点に設定した。同様に、低分子量（ＬＭＷ）ｒＶＷＦ分子がカラムマトリックスに結合することが妨げられ、一方、高分子量（ＨＭＷ）ｒＶＷＦ分子のみが捕捉されたほうが好ましい。本研究の目的の１つは、ローディング段階での導電性を高め、できるだけ多くのＬＭＷ  ｒＶＷＦ、ＣＨＯ−ＨＣＰ、ＣＨＯ−ＤＮＡ及びｒＶＷＦプロペプチドをフィードから枯渇させることであった。
【０４２１】
４．２  ローディング濃度及び流速
研究中にローディング濃度（ＲＵ  ｒＶＷＦ／ｍＬ樹脂）を増加させ、カラム容量を増加させることなく、より多くの生成物をロードできるようにした。製造スケール（ＭＦＧ）では６０〜１４０ＲＵ／ｍｌ樹脂のローディング濃度が一般的に適用されるが、それとは対照的に、現在の小スケール研究では、９０〜２７０ＩＵ／ｍｌ樹脂をロードした。第２世代ＣＡＴ手順の平衡化、ローディング及び再平衡化の流速は、第１世代プロセス（１００ｃｍ／時間）と同じであった。洗浄及び溶出の流速は、図４５に示すように変更した。
【０４２２】
４．３  ローディング濃度及び流速
溶出段階に先行する洗浄工程を変更して、プロセス及び生成物関連不純物の除去を最適化した。第１世代プロセスで適用されていた段階溶出を、濃度勾配溶出に変更した。濃度勾配の長さを、研究中に模索した。溶出手順の変更は、低分子量ｒＶＷＦ分子が初期の濃度勾配画分で溶出され、高分子量ｒＶＷＦ分子が後期の濃度勾配画分で溶出されるという観察に基づいていた（例えば、ＵＳ６，４６５，６２４を参照のこと）。
【０４２３】
５．ＣＡＴのＧｅｎ１プロセスとＧｅｎ２プロセスの比較
両方の手順において、ＣＡＴプロセスは、以下の手順を含む：カラム活性化（陽イオン性対イオンであるナトリウムを有する陰イオン配位子のローディング）及び平衡化（安定ｐＨ及び導電性（カラム出口でモニタリングする）の観点からカラムをローディング用に準備する）、それに続いて、Ｓ／Ｄ処理して希釈したＭＵＱ溶出物の生成物ローディング。
【０４２４】
ＭＦＧスケールでのローディング中に、溶出物を０．２°μｍフィルターを介してオンラインで濾過し、Ｓ／Ｄ処理中に形成された可能性のある粒子状物質からカラムを保護した。小スケールプロセスでは、この工程は省略した。生成物を含有する溶液をカラムにポンプ輸送した後、ローディングを完了し、ポンプでカラム上に送られた低分子量のＳ／Ｄ試薬を除去する洗浄工程を適用することにより、緩やかに結合した不純物を除去した。洗浄工程のｐＨ及び導電性は、平衡化工程及びローディング工程のパラメータに対応する。洗浄後、高い導電性及び対イオン濃度を有する溶出緩衝液を用いて段階溶出を適用することにより、結合したタンパク質をカラムから溶出させた。≦３．６°ＣＶの生成物プールを回収した。
【０４２５】
小スケールでのＧｅｎ２プロセスにおいて、代替の濃度勾配溶出手順を用いて、ｒＶＷＦプロペプチド、低分子量ｒＶＷＦ分子及び高分子量分子をカラムから除去した（図４５）。溶出前の洗浄工程を、濃度勾配溶出の開始時点と同じｐＨ及び導電性で段階洗浄として実施した。４つの洗浄シナリオを試験した：０％Ｂ（１０ＣＶ）、５５％Ｂ（１０ＣＶ）、４０％Ｂ（５ＣＶ）と４５％Ｂ（５ＣＶ）及び３６％Ｂ（５ＣＶ）。対応する濃度勾配溶出工程は、０〜１００％Ｂ（１２ＣＶ）、５５〜１００％Ｂ（６ＣＶ）、４５〜１００％Ｂ（６ＣＶ）及び３６〜１００％Ｂ（６ＣＶ）であった。１００％Ｂを用いた２〜３ＣＶでの洗浄によって溶出を完了した。
【０４２６】
生成物関連不純物及び生成物の副成分を溶出することにより、溶出物をプールした。生成物の溶出後、カラムを洗浄し、塩基性及び酸性溶液で消毒した。この研磨工程の主な目的は、ＣＨＯ宿主細胞タンパク質、ヒトｒフューリン、ダイズペプトンなどの培地化合物）、生成物関連不純物（ｒＶＷＦプロペプチド）及び低分子量Ｓ／Ｄ試薬を含むプロセス関連不純物のさらなる除去であった。ｒＦＶＩＩＩの除去は、わずかな寄与しか期待されなかった。改良型ＣＡＴ（ＵＮＯ＿Ｓ）工程に続いて、タンパク質濃縮及び緩衝液交換工程（限外濾過／ダイアフィルトレーション）が必要とされ得る。しかしながら、この限外濾過／ダイアフィルトレーション工程は、本明細書に記載の研究の一部ではなかった。第１世代ＭＦＧスケールプロセスと第２世代小スケールプロセスのクロマトグラフィー手順の違いを、図４６〜４８に概説する。
【０４２７】
６．結果
以下の節では、現在の研究結果を提示する。小スケールで実施した５つの実験は、改変型ＵＮＯ（ＣＡＴ）手順を導入することにより、ＳＥＣユニット操作工程とそれ以前の限外濾過（緩衝液交換）工程を置き換えることができることを明確に示している。
【０４２８】
６．１  クロマトグラム
上記で概説したように、異なる洗浄手順及び濃度勾配溶出手順を用いた５つの実験を実施した。ＵＮＯ  Ｓ工程の目的は、生成物及びプロセス関連不純物を除去するための最適な方法を見出す一方で、ＶＷＦ  Ａｇ及び活性の点で最適な収率を達成することであった。図４９は、最終（第５）実行ＶＷ＿ＵＳＳ＿０５の２つのクロマトグラムを示す。図４９の上部パネルは、カラム活性化、ローディング段階（フィードに含まれるＳ／Ｄ化学物質によって高ＵＶ２８０ｎｍ吸収が引き起こされる）、再平衡化、洗浄、濃度勾配溶出、２Ｍ  ＮａＣｌ洗浄及びＣＩＰ手順を含む全実行を示す。クロマトグラムは、ｘ軸のスケールを説明する２つの結果ファイルを融合したものである（結果ファイル１：ロードが終了するまでの活性化；結果ファイル２：再平衡化の開始、３６％Ｂ洗浄、濃度勾配溶出、ＣＩＰ）。図４９の下部パネルは、溶出段階を詳細に示している（段階洗浄〜３６％溶出緩衝液Ｂ、続いて３６％Ｂ〜１００％Ｂの濃度勾配溶出及び１００％溶出緩衝液Ｂの段階）。
【０４２９】
６．２  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
クロマトグラフィー条件の変更及び最適化（例えば、洗浄の導電性、濃度勾配溶出の開始）の適用により、プロペプチドと成熟ｒＶＷＦの分離が洗練された。さらに、プロセス関連不純物の除去と成熟ｒＶＷＦ  Ａｇの収率及び活性が向上した。一連の実験における最後（第５）の実行のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果（銀染色及び抗ｒＶＷＦウェスタンブロット）を図５０に示す。
【０４３０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、還元条件下、３〜８％トリス酢酸ゲルで実施した。分離したポリペプチドを、銀染色（上部）及びウェスタンブロット（下部）により可視化した。ローディングする前に、試料をＤＴＴで還元し、その後、遊離スルフヒドリル基をヨードアセトアミドでブロックした。ウェスタンブロットについては、一次抗体はポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体（Ｄａｋｏ製；注文番号Ａ００８２；１：１０００希釈）、二次抗体はポリクローナルＡＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ製；注文番号Ａ−８０２５；１：２０００希釈）であった。ｒＶＷＦのバンドは２５０ｋＤａ超で泳動され；ＶＷＦプロペプチドは約９０ｋＤａで泳動される。プロペプチドは、ウェスタンブロッティングに使用する抗体では検出されない。
【０４３１】
実行ＶＷＦ＿ＵＳＳ＿０５の結果は、プロペプチドと成熟ｒＶＷＦの明確な分離を示す。溶出物試料（レーン１６）と、第１世代の手順に従って精製した参照試料（レーン１８）は、非常に類似している。
【０４３２】
６．３  多量体分析
高分子量及び低分子量のｒＶＷＦ副生成物の分布を評価するために、アガロースゲル及びウェスタンブロットによる多量体分析を実施した。ロード、フロースルー（ＦＴ）、洗浄、溶出、及び高塩洗浄由来の試料を試験した（図５１）。ＬＭＷ  ｒＶＷＦ副生成物は、フロースルー（ＦＴ；廃液画分）（レーン８）及び洗浄／溶出前（レーン９及び１０）に含有されている。溶出及び溶出後プール（レーン１１及び１２）は、参照試料ＳＥＣ−Ｆ（レーン１５）と類似のバンドパターンを示す。参照試料は、第１世代（Ｇｅｎ１）プロセスに従って精製したが、ＳＥＣ溶出物プールの上昇ピークにほぼ対応している。高塩洗浄（レーン１３）は、レーンの上部領域にスメアで認められる超大型ｒＶＷＦ分子を含有している。
【０４３３】
多量体分析は、標準プロトコールに従って１％アガロースゲルで実施した。レーンあたりおよそ５０ｎｇのｒＶＷＦを適用し、尿素存在下、非還元条件下で分離した。分離したポリペプチドを、ウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体（Ｄａｋｏ）を一次抗体（１：１０００希釈）として、ＡＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として用いて、ウェスタンブロットにより可視化した（希釈１：２０００）。
【０４３４】
ＵＮＯ＿Ｓ（Ｇｅｎ２）とＳＥＣ（Ｇｅｎ１）実行のｒＶＷＦ多量体分布を比較すると、逆分離効果を明確に認めることができる。ＳＥＣ手順では、超大分子及び大型分子が最初に溶出され（ボイドボリューム）、続いて標的分子及びプロペプチドが溶出される。Ｇｅｎ２では、分離の順序は正反対である（小型〜大型）。しかしながら、どちらの方法でも、溶出物プール内で同じｒＶＷＦ多量体分布が生じる。ＵＮＯ＿Ｓ工程に続いて、標的分子を濃縮し、それを製剤緩衝液に移すためにＵＤＦ（濃縮／透析）ユニット操作が必要であった。
【０４３５】
６．４  分析結果
分析結果の概要を、図５２〜図５５に示す。各表は、１つの特定の分析アッセイの結果を示し、研究中に実施した５つの実行のデータを含む。溶出物の結果の比較概要も図５６に示す。ｒＶＷＦ：Ａｇ及びＲｉｓｔｏ  Ｃｏ活性の溶出物の収率の割合に加えて、表は、異なる実行セットアップを直接比較できるようにするための計算された比率を含む。
【０４３６】
６．５  分析データと成功基準の一致
改変型ＣＡＴ（ＵＮＯ＿Ｓ）ユニット操作工程から生じる溶出物（生成物画分）の標的パラメータは、選択されたＢＤＳ製品仕様に部分的に準拠している。ＢＤＳ物質を得るためにＣＡＴ−Ｅ生成物プールを濃縮し、透析する必要があるため、開発目標（図５７）は、主に、絶対パラメータ濃度に依存しない（計算された）比率である。
【０４３７】
開発目標のほとんどが達成されたか、または到達に近かったという事実は、本明細書に記載の提案手順の実現可能性を示している。すべての分析アッセイを実施したわけではないが、それでも、ｒＶＷＦ：Ａｇ及びＲｉｓｔｏ収率、ＣＨＯ  ＨＣＰ及びプロペプチド不純物の除去、ならびにｒＶＷＦ多量体の分布などの主要な結果は、提案した新規ＣＡＴ手順と以前に適用したＵＮＯ＿Ｓ／ＳＥＣの組み合わせの性能が類似していることを示している。
【０４３８】
７．考察
本研究中に、５つのＵＮＯ＿Ｓ実行を実施し、第２世代ＣＡＴ手順を調べた。最適化された（最後の）実行の結果は、Ｇｅｎ１手順（例えば、段階溶出モードでのＵＮＯ＿Ｓ＋ＳＥＣ工程）で達成された結果に類似する、低分子量ｒＶＷＦ多量体からの高分子量ｒＶＷＦ多量体の分離ならびに標的タンパク質からのｒＶＷＦプロペプチド及びＣＨＯ−ＨＣＰ不純物の除去を示す。約２４ｍＳ／ｃｍ（３６％溶出緩衝液Ｂ）の導電性を有する洗浄工程と、それに続く約５０ｍＳ／ｃｍ（１００％溶出緩衝液Ｂ）までの濃度勾配溶出工程を導入したことにより、以前に得られたＧｅｎ１  ＳＥＣ  Ｆプールと類似の品質のＣＡＴ溶出物プールが得られた。ＣＡＴ溶出物を濃縮及び透析するための追加のＵＤＦ工程を使用してもよいが、本明細書に記載のＧｅｎ２  ＣＡＴ手順は、ＢＤＳ物質を取得するためにＧｅｎ１下流プロセスで適用するＵＤＦ及びＳＥＣユニット操作工程を置き換える大きな可能性を示している。
【０４３９】
実施例１３：ＤＦ３３３８／０４２及びＤＦ３３６２／０２３ウェスタンブロット抗ＶＷＦの多量体の評価
本方法から得られたｍａｔ−ｒＶＷＦを、多量体含有量について分析した。記載の陽イオン抽出（ＣＥＸ）法の利点として、以下が挙げられる：
ユニット操作の削減−現在のプロセスの３ユニット操作を、ＣＥＸ１つに置き換える。
ｒ−ｖＷＦプロペプチドの枯渇及び宿主細胞タンパク質の枯渇は、親和性工程と類似している。
陽イオン交換体上での「オンカラム」でのＳＤ処理を含めることにより、４ユニット操作を１工程に含める。
陽イオン交換体上での「オンカラム」でのＳＤ処理及びフューリン成熟を含めることにより、５ユニット操作を１工程に含める。
血栓性ｒＶＷＦの生成リスクを低減するせん断応力の低減（ユニット操作、濾過の減少、及び保持時間の有意な短縮に起因する）。
【０４４０】
この分析では、ウェスタンブロットを実行した。ウェスタンブロット画像をＣｏｒｅｌ  Ｐｈｏｔｏ  Ｐａｉｎｔソフトウェアにインポートし、１６ビットのグレースケール画像に変換した。１６ビットのグレースケールフォーマットは、評価の要件である。Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  １Ｄソフトウェアで評価を実施した。
【０４４１】
評価を簡略化するために画像を垂直反転させた（レーン番号は同じままである）。
バンド１〜６＝低分子量
バンド７〜１２＝中程度の分子量
バンド＞１２＝高分子量
【０４４２】
３ユニット操作プロセスから得られた生成物と比較した、本明細書に記載の強化型ＣＥＸから得られた生成物のｖＷＦ多量体のデンシトメトリー評価。
【０４４３】
（表１１）デンシトメトリー評価の概要。
2021519280.tif 000018
【０４４４】
多量体の割合を示す生データを図６１〜６３に示す。
【０４４５】
実施例１４：バリアント型ｖＷＦ精製プロセス
Ｉ．背景技術
ｒ−ｖＷＦプロペプチドは、ＣＨＯ細胞由来ｒ−ＶＷＦ生成物の生成物関連不純物である。産生細胞株は、プロ−ｒ−ｖＷＦを約６０％含むｒ−ＶＷＦを生成する。ｒ−ＶＷＦプロペプチドを、ペプチドアミド結合による共有結合で、さらに二価陽イオンによる非共有結合でｒ−ｖＷＦポリペプチドに結合する。共有結合であるペプチドアミド結合を、ｒフューリンとのｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションによって切断する。しかしながら、切断されたｒ−ＶＷＦプロペプチドはＶＷＦ分子に結合したままであり、これら２つのポリペプチドの分離方法を本実施例に記載する。ｒｖＷＦ／ｒｖＷＦ＿ＰＰ複合体は、二価陽イオン及び低ｐＨによって安定化することが判明した。適切な分離法と組み合わせて二価陽イオンのキレート剤または高ｐＨを適用することにより、２つの分子を高効率かつロバストな方法で分離することができる。洗浄手順として陽イオン交換樹脂に添加した場合、またはサイズ排除クロマトグラフィーで分離緩衝液に添加した場合に、キレート剤としての低濃度ＥＤＴＡまたはクエン酸塩が効果的であることがわかり、ｐＨ７以上のｐＨも効果的であることがわかった。同じ原理が、樹脂またはメンブレン技術によるイオン交換またはサイズ分離を含むすべての分離技術に適用できるはずである。ｒＶＷＦの現在の製造プロセスでは、ｒＶＷＦとｒＶＷＦ−ＰＰの分離をサポートするためにクエン酸塩を含有する実行緩衝液を使用して工程ＳＥＣを実行する。
１．実施例の適用範囲の記載−ＶＷ＿ＵＳＳ＿０７
１．ｒ−ｖＷＦプロペプチドの枯渇
２．代替「カラム上のＳＤ＿ＶＩ」処理の実施例
３．「オンカラム」でのｒＦＶＩＩＩ／ｒ−ｖＷＦ複合体の生成
４．代替製剤緩衝系におけるｒＦＶＩＩＩ／ｒ−ｖＷＦ複合体の溶出中のオンカラム予備製剤化
【０４４６】
プロセスの詳細：
組換え第ＶＩＩＩ因子を捕捉するモノクローナル抗体工程の後、ｒ−ｖＷＦを含むフロースルーをＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ陰イオン交換体にロードした。ｒ−ｖＷＦを陰イオン交換体に結合させ、カルシウム存在下でフューリンにより成熟させた。ｒ−ｖＷＦは、導電性の増加とともに陰イオン交換体から溶出された。ＴＭＡＥ−溶出物をＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ（Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ，Ｐａｌｌ部品番号ＸＴ５０００ＭＳＴＧＱＰ１）フィルタユニットを介して濾過し、フィルター膜に結合するＣＨＯ−ＤＮＡ及び不純物を除去した。生成物を含むＭＵＱ＿フロースルーを、［６０ｍＭクエン酸ナトリウム  ｐＨ７．６］で１：２希釈して、導電性２１．９ｍＳ／ｃｍ及びｐＨ７．１６に調整した。ｒ−ｖＷＦプロペプチド及び低分子量ｒ−ｖＷＦを確実に除去するために高導電性を選択し、所望の高分子量ｒ−ｖＷＦに対する樹脂の容量を利用した。調整したロードを、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，物品番号１５６−０１１５）内径＝１０ｍｍ  ベッド高さ８．８ｃｍ  容量６．９１ｍｌに流速１００ｃｍ／時間でロードし、続いて、強く結合したＨＣＰ及びｒ−ｖＷＦプロペプチドを枯渇させるための２ＣＶの［３０ｍＭクエン酸ナトリウム，１８０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５］による第１の洗浄（再平衡化）を行った。
【０４４７】
１２カラム容量の［１８．０ｇポリソルベート８０，３．５ｇジメチルスルホキシドすなわちＤＭＳＯ，３．５ｇ  ＴｎＢＰの２５ｇ／Ｋｇ混合物を含有する３０ｍＭクエン酸ナトリウム，１８０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ  ７．５］及び脂質エンベロープウイルスを不活化するための約１時間の接触時間を用いて、潜在的な「オンカラム処理」（ＷＳＤ）を実施した。「オンカラム処理」の成分を、洗浄２により、１０カラム容量の［３０ｍＭクエン酸ナトリウム，１８０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５］中で洗い流した。洗浄３を適用することにより、緩衝液を、クエン酸ナトリウム緩衝系から、［５０ｍＭグリシン，１０ｍＭタウリン，１０％スクロース，０．１％ポリソルベート８０，ｐＨ５．５］を４カラム容量で添加することにより、グリシン／タウリン系に変更した。工程「ＦＶＩＩＩ−Ｃｏｎ」において、結合したｒ−ｖＷＦ上に、ＡＤＶＡＴＥプロセスに由来する組換えヒト凝固因子ＶＩＩＩを１０カラム容量でロードした。
【０４４８】
ＦＶＩＩＩ−Ｃｏｎ−緩衝液は、［２１８．６７ｇの５０ｍＭグリシン，１０ｍＭタウリン，５％（ｗ／ｗ）スクロース，５％（ｗ／ｗ）Ｄ−マンニトール，０．１％ポリソルベート８０，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，及びｐＨ７．４に希釈した１．５７ｇ  ｒＦＶＩＩＩ  Ｓ２  ＡＤＶ  Ｓ１７Ｂ０１０９０１Ｂ２］からなる。洗浄４を適用して、非結合ｒＦＶＩＩＩを洗い流し、５カラム容量の［５０ｍＭグリシン，１０ｍＭタウリン，５％（ｗ／ｗ）スクロース，５％（ｗ／ｗ）Ｄ−マンニトール，０．１％ポリソルベート８０，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４］を添加することにより、予備製剤化用の緩衝マトリックスを調製した。カラムからｒ−ｖＷＦとｒＦＶＩＩＩの両方を［５０ｍＭグリシン，１０ｍＭタウリン，５％（ｗ／ｗ）スクロース，５％（ｗ／ｗ）Ｄ−マンニトール，０．１％ポリソルベート８０，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，６００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４±０．２］で溶出して溶出物を形成した。［５０ｍＭグリシン，１０ｍＭタウリン，５％（ｗ／ｗ）スクロース，５％（ｗ／ｗ）Ｄ−マンニトール，０．１％ポリソルベート８０，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．４］で溶出物を希釈して、塩化ナトリウム含有量を約１５０ｍＭ  ＮａＣｌに調整した。
【０４４９】
プロセスシーケンス：
本実施例の主要な工程のシーケンスは、以下の工程からなる（クロマトグラフィースキームに関して、図６７の下部も参照のこと）。
１．Ｍａｂ  ＦＶＩＩＩの捕捉（ＦＴは、ｒ−ｖＷＦを含有する画分である）
２．Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ捕捉＋成熟
３．ＦＴモードでのＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ
４．記載のＣＥＸ（ＶＷ＿ＵＳＳ＿０７）
【０４５０】
結果：
４点すべてで実験は成功した：
１．洗浄１、ＷＳＤ（（Ｗ）ａｓｈ  ｗｉｔｈ  （Ｓ）ｏｌｖｅｎｔ  （Ｄ）ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）及び洗浄２の洗浄工程の間にｒ−ｖＷＦプロペプチドの枯渇が生じた（図６７、６８、及び６９を参照のこと）
２．工程ＷＳＤにおける代替の「ＳＤ＿ＶＩオンカラム処理」の実施例。
３．「オンカラム」でのｒＦＶＩＩＩ／ｒ−ｖＷＦ複合体の生成−工程ＦＶＩＩＩ−Ｃｏｎ。
４．代替の製剤緩衝系におけるｒＦＶＩＩＩ／ｒ−ｖＷＦ複合体の溶出中のオンカラム予備製剤化（図６６、最終行を参照のこと）。
【０４５１】
実施例１５：バリアント型ｖＷＦ＿精製プロセス−シアル化の試験
Ｉ．背景技術
ｒ−ｖＷＦプロペプチドは、ＣＨＯ細胞由来ｒ−ＶＷＦ生成物の生成物関連不純物である。産生細胞株は、プロ−ｒ−ｖＷＦを約６０％含むｒ−ＶＷＦを生成する。ｒ−ｖＷＦプロペプチドを、ペプチドアミド結合による共有結合で、さらに二価陽イオンによる非共有結合でｒ−ＶＷＦポリペプチドに結合する。共有結合であるペプチドアミド結合を、ｒフューリンとのｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションによって切断する。しかしながら、切断されたｒ−ＶＷＦプロペプチドはＶＷＦ分子に結合したままであり、これら２つのポリペプチドの分離方法を本実施例に記載する。本実施例は、さらなるシアリル化を試験するために、フューリン切断後のｒ−ＶＷＦポリペプチドからｒ−ｖＷＦプロペプチドを分離するための代替のバリアント型の実施形態を提供する。精製プロセスの追加の詳細及び結果を、図７０〜７３及び７８に示す。
１．実験番号：ＶＷ＿ＵＳＳ＿０６
１．ｒ−ｖＷＦプロペプチドの枯渇
２．ｒ−ｖＷＦの追加のオンカラム２，６シアル化を生成する
【０４５２】
２．実験番号：ＶＷ＿ＵＳＳ＿０６
組換え第ＶＩＩＩ因子を捕捉するモノクローナル抗体工程の後、ｒ−ｖＷＦを含むフロースルーをＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ陰イオン交換体にロードした。ｒ−ｖＷＦを陰イオン交換体に結合させ、カルシウム存在下でフューリンにより成熟させた。ｒ−ｖＷＦを陰イオン交換体から導電性の増加とともに溶出した。ＴＭＡＥ−溶出物をＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ（Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ，Ｐａｌｌ部品番号ＸＴ５０００ＭＳＴＧＱＰ１）フィルタユニットを介して濾過し、フィルター膜に結合するＣＨＯ−ＤＮＡ及び不純物を除去した。生成物を含むＭＵＱ＿フロースルーを、［６０ｍＭクエン酸ナトリウム  ｐＨ７．６］で１：２希釈して、導電性１８．３９ｍＳ／ｃｍ及びｐＨ７．３３に調整した。ｒ−ｖＷＦプロペプチド及び低分子量ｒ−ｖＷＦを確実に除去するために高導電性を選択し、所望の高分子量ｒ−ｖＷＦに対する樹脂の容量を利用した。調整したロードを、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，物品番号１５６−０１１５）内径＝１０ｍｍ  ベッド高さ８．８ｃｍ  容量６．９１ｍｌ上に流速１００ｃｍ／時間でロードし、続いて、強く結合したＨＣＰ及びｒ−ｖＷＦプロペプチドを枯渇させるための［３０ｍＭクエン酸ナトリウム，１８０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５］による２ＣＶの第１の洗浄（再平衡化）を行った。追加の２，６シアル化を導入するために、［３０ｍＭクエン酸ナトリウム，１８０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５］に基づく５０％（ｖ／ｖ）ＣＭＰ−ＮＡＮＡ溶液及び［３０ｍＭクエン酸ナトリウム，１８０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５］に基づく５０％（ｖ／ｖ）のα２，６シアリルトランスフェラーゼの混合物を、オンライン混合により、１０カラム容量、流速２５ｃｍ／時間でカラム上に添加した。ＣＭＰ−ＮＡＮＡ溶液の組成は、１５４．２９ｇの［３０ｍＭクエン酸ナトリウム，１８０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５］に溶解させた１１ｍｇのＣＭＰ＿ＮＡＮＡ  Ｃ８２７１−２５ｍｇのロット番号ＳＬＢＶ７７７７であった。α２，６シアルリトランスフェラーゼ緩衝液の組成は、１ｍｌの精製水に溶解したＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｄａｍｓｅｌａ由来のα２，６シアリルトランスフェラーゼＳ２０７６−１ＵＮ  ＳＩＧＭＡ，ロット番号ＳＬＢＶ０５５２であり−溶解したα２，６シアリルトランスフェラーゼ０．５ｇを１５２．１０ｇの［３０ｍＭクエン酸ナトリウム，１８０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５］で希釈した。２カラム容量の［３０ｍＭクエン酸ナトリウム，１８０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５］によるさらなる洗浄を適用して、過剰なＣＭＰ＿ＮＡＮＡ及びα２，６シアリルトランスファーザーゼを除去した。４カラム容量の［５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０］を添加することにより、緩衝液交換を提供した。４カラム容量の［５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５］で溶出を行った。
【０４５３】
３．完全な精製シーケンスＶＷ＿ＵＳＳ＿０６
本実施例の主要な工程のシーケンスは、以下の工程からなる：
１．Ｍａｂ  ＦＶＩＩＩの捕捉（ＦＴは、ｒ−ｖＷＦを含有する画分である）
２．Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ捕捉＋成熟
３．ＦＴモードでのＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ
４．記載のＣＥＸ（ＶＷ＿ＵＳＳ＿０６）
【０４５４】
結果
本実施例において、この方法を用いて追加の２，６シアリル化は検出されない。しかしながら、ｒ−ｖＷＦの通常のシアリル化パターンである２，３シアリル化が認められた。
【０４５５】
実施例１６：バリアント型ｖＷＦ＿精製プロセス−シアリル化の試験
Ｉ．背景技術
ｒ−ｖＷＦプロペプチドは、ＣＨＯ細胞由来ｒ−ＶＷＦ生成物の生成物関連不純物である。産生細胞株は、プロ−ｒ−ｖＷＦを約６０％含むｒ−ＶＷＦを生成する。ｒ−ｖＷＦプロペプチドを、ペプチドアミド結合による共有結合で、さらに二価陽イオンによる非共有結合でｒ−ＶＷＦポリペプチドに結合する。共有結合であるペプチドアミド結合を、ｒフューリンとのｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションによって切断する。しかしながら、切断されたｒ−ＶＷＦプロペプチドはＶＷＦ分子に結合したままであり、これら２つのポリペプチドの分離方法を本実施例に記載する。本実施例は、さらなるシアリル化を試験するために、フューリン切断後のｒ−ＶＷＦポリペプチドからｒ−ｖＷＦプロペプチドを分離するための代替のバリアント型の実施形態を提供する。精製プロセスの追加の詳細及び結果を、図７４〜７８に示す。
１．実験番号：ＶＷ＿ＵＳＳ＿０８
１．ｒ−ｖＷＦプロペプチドの枯渇
２．ｒ−ｖＷＦの追加のオンカラム２，６シアル化を生成する
【０４５６】
２．実験番号：ＶＷ＿ＵＳＳ＿０８
組換え第ＶＩＩＩ因子を捕捉するモノクローナル抗体工程の後、ｒ−ｖＷＦを含むフロースルーをＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ陰イオン交換体にロードした。ｒ−ｖＷＦを陰イオン交換体に結合させ、カルシウム存在下でフューリンにより成熟させた。ｒ−ｖＷＦを陰イオン交換体から導電性の増加とともに溶出した。ＴＭＡＥ−溶出物をＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ（Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ，Ｐａｌｌ部品番号ＸＴ５０００ＭＳＴＧＱＰ１）フィルタユニットを介して濾過し、フィルター膜に結合するＣＨＯ−ＤＮＡ及び不純物を除去した。生成物を含むＭＵＱ＿フロースルーを、［６０ｍＭクエン酸ナトリウム  ｐＨ７．６］で１：２希釈して、導電性１９．９７ｍＳ／ｃｍ及びｐＨ７．３３に調整した。ｒ−ｖＷＦプロペプチド及び低分子量ｒ−ｖＷＦを確実に除去するために高導電性を選択し、所望の高分子量ｒ−ｖＷＦに対する樹脂の容量を利用した。調整したロードを、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，物品番号１５６−０１１５）内径＝１０ｍｍ  ベッド高さ８．８ｃｍ  容量６．９１ｍｌに流速１００ｃｍ／時間でロードし、続いて、強く結合したＨＣＰ及びｒ−ｖＷＦプロペプチドを枯渇させるための２ＣＶの［３０ｍＭクエン酸ナトリウム，１８０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５］による第１の洗浄（再平衡化）を行った。追加の２，６シアル化を導入するために、［３０ｍＭクエン酸ナトリウム，１８０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５］に基づく５０％（ｖ／ｖ）ＣＭＰ−ＮＡＮＡ溶液及び［３０ｍＭクエン酸ナトリウム，１８０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５］に基づく５０％（ｖ／ｖ）のα２，６シアリルトランスフェラーゼの混合物を、オンライン混合により、１０カラム容量、流速２５ｃｍ／時間でカラム上に添加した。ＣＭＰ−ＮＡＮＡ溶液の組成は、１２１，５７ｇの［３０ｍＭクエン酸ナトリウム，１８０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５］に溶解した１４ｍｇのＣＭＰ＿ＮＡＮＡ  Ｃ８２７１−２５ｍｇのロット番号ＳＬＢＶ７７７７であった。α２，６シアルリトランスフェラーゼ緩衝液の組成は、１２１．１０ｇの［３０ｍＭクエン酸ナトリウム，１８０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５］に溶解したＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｄａｍｓｅｌａ由来のα２，６シアリルトランスフェラーゼＳ２０７６−１ＵＮ  ＳＩＧＭＡ，ロット番号ＳＬＢＶ０５５２であった。２カラム容量の［３０ｍＭクエン酸ナトリウム，１８０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５］によるさらなる洗浄を適用して、過剰なＣＭＰ＿ＮＡＮＡ及びα２，６シアリルトランスファーザーゼを除去した。４カラム容量の［５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０］を添加することにより、緩衝液交換を提供した。４カラム容量の［５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５］で溶出を行った。
【０４５７】
３．完全な精製シーケンスＶＷ＿ＵＳＳ＿０８
本実施例の主要な工程のシーケンスは、以下の工程からなる：
１．Ｍａｂ  ＦＶＩＩＩの捕捉（ＦＴは、ｒ−ｖＷＦを含有する画分である）
２．Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ捕捉＋成熟
３．ＦＴモードでのＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ
４．記載のＣＥＸ（ＶＷ＿ＵＳＳ＿０８）
【０４５８】
結果：
本実施例において、この方法を用いて追加の２，６シアリル化は検出されない。しかしながら、ｒ−ｖＷＦの通常のシアリル化パターンである２，３シアリル化が認められた。
【０４５９】
上記の実施例は、当業者に対して、本発明の組成物、システム及び方法の実施形態の作製方法及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために提示されており、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定することを意図しない。当業者に明らかな、本発明を実施するための上記のモードの修正は、添付の特許請求の範囲内にあることを意図している。本明細書で言及するすべての特許及び刊行物は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示す。本開示で引用されるすべての参考文献は、あたかも各参考文献がその全体が個別に参照により援用されるかのように、参照により援用される。
【０４６０】
すべての見出し及び節の指定は、明確化と参照の目的でのみ使用されており、いかなる方法でも制限と見なされるべきではない。例えば、当業者であれば、本明細書に記載の発明の趣旨及び範囲に従って、異なる見出し及び節から様々な態様を適宜組み合わせることの有用性を理解するであろう。
【０４６１】
本明細書において引用されるすべての参考文献は、あたかも個々の刊行物または特許もしくは特許出願があらゆる目的のためにその全体が参照により援用されることが具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される。
【０４６２】
当業者には明らかであるように、本出願の多くの修正及び変形を、その趣旨及び範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載の特定の実施形態及び実施例は、単に例示としてのみ提供するものであり、出願は、特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲の文言によってのみ制限されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021519280.tif 000026
【図８】
2021519280.tif 000027
【図９】
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【図１０】
2021519280.tif 000029
【図１１】
2021519280.tif 000030
【図１２】
2021519280.tif 000031
【図１３】
2021519280.tif 000032
【図１４】
2021519280.tif 000033
【図１５】
2021519280.tif 000034
【図１６】
2021519280.tif 000035
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
2021519280.tif 000051
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０−１】
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【図６０−２】
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【図６０−３】
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【図６０−４】
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【図６０−５】
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【図６０−６】
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【図６０−７】
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【図６０−８】
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【図６０−９】
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【図６０−１０】
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【図６０−１１】
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【図６０−１２】
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【図６０−１３】
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【図６０−１４】
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【図６０−１５】
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【図６０−１６】
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【図６０−１７】
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【図６０−１８】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４−１】
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【図６４−２】
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【図６４−３】
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【図６５−１】
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【図６５−２】
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【図６５−３】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年11月25日(2020.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021519280000001.app
【国際調査報告】
2021519280.tif 000120
2021519280.tif 000121
2021519280.tif 000122