(57)【要約】  本明細書に開示されている主題は、関心対象の糖タンパク質、例えば抗体のグリコシル化パターン、例えばフコシル化および／またはガラクトシル化パターンを調節するための細胞培養培地および細胞培養戦略ならびにこのような培地および／または戦略を用いて調製された糖タンパク質組成物に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物中の関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節するための方法であって、
単独でまたは任意の組み合わせで、細胞培養培地中のおよび／または細胞培養環境中の以下のパラメータ：
ａ．高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）条件における約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度；
ｂ．低ｐＣＯ２条件における約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度；
ｃ．約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２；
ｄ．約２５℃〜３９℃の温度での約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；
ｅ．約０日〜約１５０日の細胞培養期間；
ｆ．約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；
ｇ．約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；
ｈ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；
ｉ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および
ｊ．約２９℃〜約３９℃の培養温度；
を調節することを含む方法。
【請求項２】
前記細胞培養環境が、細胞ありまたはなしのバイオリアクター中である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記低ｐＣＯ２条件が約１０〜約１００ｍｍＨｇであり、前記高ｐＣＯ２条件が約２０〜約２５０ｍｍＨｇである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｐＣＯ２調節の期間が、前記細胞培養期間の少なくとも最初の半分を包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記関心対象の糖タンパク質が組換えタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記組換えタンパク質が、抗体または抗体断片、ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）、ＢｓＤｂ（二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＤｂ（一本鎖二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＴａＦｖ（一本鎖二重特異性タンデム可変ドメイン）、ＤＮＬ−（Ｆａｂ）３（ドック・アンド・ロック三価Ｆａｂ）、ｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）およびＢｓｓｄＡｂ（二重特異性単一ドメイン抗体）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が抗ＣＤ２０抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗ＣＤ２０抗体がオクレリズマブである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法
【請求項１０】
前記抗体または前記抗体断片が、
ｉ）約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の％Ｇ０−Ｆ（パーセントフコシル化欠損糖タンパク質）；もしくは約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の標準化された％Ｇ０−Ｆ；および／または
ｉｉ）約４０％〜約９０％；約５０％〜約９０％；約５５％〜約８５％；もしくは約６０％〜約８０％の％Ｇ０（パーセントガラクトシル化欠損糖タンパク質）；
を示す、請求項６〜８に記載の方法。
【請求項１１】
前記グリコシル化が、
ａ．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０（フコシル化された、ガラクトシル化欠損Ｇ０））を減少させながら、増加されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０））を達成するために；または
ｂ．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を増加させながら、減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために；または
ｃ．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために；または
ｄ．フコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を達成するために；
調節される、請求項６〜９に記載の方法。
【請求項１２】
関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節する工程が、低ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度を調節すること、または高ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度、ならびに、単独でまたは任意の組み合わせで、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータ：
ａ．約２５℃〜３９℃の温度での約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；
ｂ．約０日〜約１５０日の細胞培養期間；
ｃ．約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；
ｄ．約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；
ｅ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；
ｆ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および
ｇ．約２９℃〜約３９℃の培養温度；
を調節することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、低ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度を調節すること、または高ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度、ならびに、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータ：
ａ．約２５℃〜３９℃の温度での約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；および
ｂ．約０日〜約１５０日の細胞培養期間；
を調節することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、低ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度を調節すること、または高ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度、ならびに、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータ：
ａ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；および／または
ｂ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；
を調節することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、播種前細胞培養培地保持期間、ならびに、単独でまたは任意の組み合わせで、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータ：
ａ．高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）条件における約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度；
ｂ．低ｐＣＯ２条件における約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度；
ｃ．約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２；
ｄ．約０日〜約１５０日の細胞培養期間；
ｅ．約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；
ｆ．約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；
ｇ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；
ｈ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および
ｉ．約２９℃〜約３９℃の培養温度；
を調節することを含み、
前記細胞培養培地保持期間が、約２５℃〜３９℃の温度で約０時間〜約１２０時間である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、播種前細胞培養培地保持期間、ならびに細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータ：
ａ．高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）条件における約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度または低ｐＣＯ２条件における約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度；
ｂ．約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２；および
ｃ．約０日〜約１５０日の細胞培養期間；
を調節することを含み、
前記細胞培養培地保持期間が、約２５℃〜３９℃の温度で約０時間〜約１２０時間である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記関心対象の糖タンパク質が抗体またはその抗体断片である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体または前記その抗体断片が抗ＣＤ２０抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗ＣＤ２０抗体がオクレリズマブである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、細胞培養期間、ならびに、単独でまたは任意の組み合わせで、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータのいずれか：
ａ．約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；
ｂ．約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；
ｃ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；
ｄ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および
ｅ．約２９℃〜約３９℃の培養温度；
を調節することを含み、
前記細胞培養期間が約０日〜約１５０日である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、約０ｎＭ〜約３００ｎＭのＮａ＋濃度、ならびに、単独でまたは任意の組み合わせで、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータのいずれか：
ａ．約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；
ｂ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；
ｃ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および
ｄ．約２９℃〜約３９℃の培養温度；
を調節することを含み、
Ｎａ＋濃度が約０ｍＭ〜約３００ｍＭである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、Ｎａ＋濃度および約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２を調節することを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、浸透圧、ならびに、単独でまたは任意の組み合わせで、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータのいずれか：
ａ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；
ｂ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および
ｃ．約２９℃〜約３９℃の培養温度；
を調節することを含み、
前記浸透圧が、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、
ａ．低ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度を調節すること、または高ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度を調節すること、
ｂ．約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度を調節すること、および
ｃ．約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間を調節すること、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧および約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２を調節することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、
ａ．約２９℃〜約３９℃の培養温度、および
ｂ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；および／または
約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；
を調節することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２および約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度を調節することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度および約２９℃〜約３９℃の培養温度を調節することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、ｐＣＯ２濃度、ならびに、単独でまたは任意の組み合わせで、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータのいずれか：
ａ．高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）条件における約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度；
ｂ．低ｐＣＯ２条件における約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度；
ｃ．約２５℃〜３９℃の温度での約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；
ｄ．約０日〜約１５０日の細胞培養期間；
ｅ．約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；
ｆ．約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；
ｇ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；
ｈ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および
ｉ．約２９℃〜約３９℃の培養温度；
を調節することを含み、
前記ｐＣＯ２濃度が約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｍｎ濃度が、高ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭ；高ｐＣＯ２培養物中で、約１ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約４０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭ；高ｐＣＯ２培養物中で、約１ｎＭ〜約５００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２０，０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｍｎ濃度が、低ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり；低ｐＣＯ２培養物中で、約１ｎＭ〜約２００００ｎＭ；約１ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約４０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭ；約１ｎＭ〜約５００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約５００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約５０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２００００ｎＭまたは約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｍｎ濃度の調節が、細胞培養原材料中のＭｎ含有量を決定すること、およびＭｎ濃度を調節するために原材料ロットを選択することを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｍｎ濃度の調節が、前記Ｍｎ濃度を調節するために、（ｉ）細胞培養培地もしくは細胞培養と接触している材料を調節すること；または（ｉｉ）細胞培養培地中にもしくは細胞培養の間に浸出されたＭｎの濃度を考慮すること；または（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記浸出されたＭｎが、（ｉ）フィルタ；（ｉｉ）培地調製物、保持もしくは培養容器；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせとの、細胞培養物および／または細胞培養培地の接触によって生成される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記フィルタが、デプスフィルタ、カラム、膜および円板を含むがこれらに限定されない、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
フィルタ材料が、珪藻土、中空繊維または樹脂を含むがこれらに限定されない、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞培養培地が、基本培地、再構成された培地、流加培地、加水分解産物、補助剤、血清または添加物である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞培養培地が、細胞培養の生成段階の間に補充される、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞培養培地が、細胞培養の生成段階の前に補充される、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞培養培地が、Ｍｎ、フコース、ガラクトースおよび／またはＮａ＋の１つまたは複数を含み、前記補充が、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づく、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｍｎ、フコース、ガラクトースおよびＮａ＋の１つまたは複数が、大量瞬時投与として、断続的な補充として、継続的な補充として、半継続的な補充として、フィードバックループをベースとする補充として、またはこれらの１つもしくは複数の組み合わせとして補充される、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞培養培地が、ｉ）Ｍｎ；ｉｉ）フコース；ｉｉｉ）ガラクトース；および／またはｉｖ）Ｎａ＋の１つまたは複数から実質的になる、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｍｎ濃度の調節が、高温短時間（ＨＴＳＴ）熱処理前に、約６．１〜約７．３；または約６．３〜約７．３の細胞培養培地ｐＨを利用することを含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記ｐＣＯ２を調節することを含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞培養物または前記細胞培養培地がバイオリアクター中にあり、ｐＣＯ２の調節が、バイオリアクター作動体積；バイオリアクター気体散布戦略；バイオリアクター撹拌戦略；バイオリアクター培地交換戦略、バイオリアクター灌流戦略、バイオリアクター供給戦略またはこれらの任意の組み合わせを調節することによって達成される、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ｐＣＯ２調節が、高ｐＣＯ２培養物を確立することを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ｐＣＯ２が約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約１５０ｍｍＨｇ、または約３０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ｐＣＯ２調節が、低ｐＣＯ２培養物を確立することを含む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約１００ｍｍＨｇ、１０ｍｍＨｇ〜約８０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約７０ｍｍＨｇ、または約３０ｍｍＨｇ〜約６０ｍｍＨｇである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ｐＣＯ２調節が培養の０日に起きる、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ｐＣＯ２調節が、細胞培養のおおむね大半；最初の約５日間；最初の約７日間；または最初の約１０日間起きる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ｐＣＯ２調節が、生産培養のおおむね大半；最初の約５日間；最初の約７日間；または最初の約１０日間起きる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含み、前記播種前細胞培養培地保持期間が、約０時間〜約１２０時間、約０時間〜約７２時間：約０時間〜約４８時間、または約０時間〜約２４時間である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記播種前細胞培養培地保持の間の前記培地の温度が、約２５℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３５℃〜約３９℃、または約３６℃〜約３９℃である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記細胞培養期間を調節することを含み、前記細胞培養期間が、約０日〜約１５０日、約０日〜約１５日、約０日〜約１２日、０日〜約７日、または約０日〜約５日である、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記Ｎａ＋濃度を調節することを含み、前記Ｎａ＋濃度が、約０ｍＭ〜約３００ｍＭであり；約２０ｍＭ〜約２０ｍＭ；約３０ｍＭ〜約１５０ｍＭ；または約４０ｍＭ〜約１３０ｍＭである、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記Ｎａ＋濃度の調節が、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＮａＯＨ、ＮａＣｌまたはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないＮａ化合物を細胞培養物に補充することを含む、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記浸透圧を調節することを含み、前記浸透圧が、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ；約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ；または約３２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４２５ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記浸透圧の調節が、細胞培養物に浸透圧調節培地成分を補充することを含む、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記浸透圧調節培地成分が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ソルビトール、浸透圧保護剤またはこれらの組み合わせである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記浸透圧調節培地成分が、大量瞬時投与として、断続的な補充として、継続的な補充として、半継続的な補充として、フィードバックループをベースとする補充として、またはこれらの１つもしくは複数の組み合わせとして補充される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記ガラクトース濃度を調節することを含み、前記ガラクトース濃度が、約０ｍＭ〜約６０ｍＭまたは約０ｍＭ〜約５０ｍＭである、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記フコース濃度を調節することを含み、前記フコース濃度が、約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり；０ｍＭ〜約４０ｍＭ；約０ｍＭ〜約２０ｍＭ；または約０ｍＭ〜約１０ｍＭである、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記細胞培養温度を調節することを含み、前記細胞培養温度は、約２９℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３１℃〜約３８℃、または約３４℃〜約３８℃である、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞培養温度が、細胞培養物の生成段階の間に調節される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞培養温度が、細胞培養物の生成段階の前に調節される、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞培養温度が、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づいて調節される、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞培養物が真核細胞を含む、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記真核細胞が、昆虫、鳥、真菌、植物または哺乳動物細胞である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記菌細胞が、酵母、ピキアまたは任意の糸状真菌細胞である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記酵母細胞がエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記細胞培養物が、使い捨て技術（ＳＵＴ）袋もしくはバイオリアクター；ＷＡＶＥバイオリアクター；ステンレス鋼バイオリアクター；フラスコ；チューブおよびチャンバーを含むがこれらに限定されないバイオリアクター中にある、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞培養物の体積が１ｍＬ〜３５，０００Ｌである、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞培養物の体積が、１ｍＬ〜１０ｍｌ、１ｍＬ〜５０ｍｌ、１ｍＬ〜１００ｍｌ、１ｍＬ〜２００ｍｌ、１ｍＬ〜３００ｍｌ、１ｍＬ〜５００ｍｌ、１ｍＬ〜１０００ｍｌ、１ｍＬ〜２０００ｍｌ、１ｍＬ〜３０００ｍｌ、１ｍＬ〜４０００ｍｌ、１ｍＬ〜５０００ｍｌ、１ｍＬ〜１Ｌ、１ｍＬ〜２Ｌ、１ｍＬ〜３Ｌ、１ｍＬ〜４Ｌ、１ｍＬ〜５Ｌ、１ｍＬ〜６Ｌ、１ｍＬ〜１０Ｌ、１ｍＬ〜２０Ｌ、１ｍＬ〜３０Ｌ、１ｍＬ〜４０Ｌ、１ｍＬ〜５０Ｌ、１ｍＬ〜６０Ｌ、１ｍＬ〜７０Ｌ、１ｍＬ〜１００Ｌ、１ｍＬ〜２００Ｌ、１ｍＬ〜３００Ｌ、１ｍＬ〜４００Ｌ、１ｍＬ〜５００Ｌ、１ｍＬ〜１０００Ｌ、１ｍＬ〜２０００Ｌ、１ｍＬ〜３０００Ｌ、１ｍＬ〜４０００Ｌ、１ｍＬ〜５０００Ｌ、１ｍＬ〜１０，０００Ｌ、１ｍＬ〜２０，０００Ｌ、１ｍＬ〜３０，０００Ｌ、１ｍＬ〜３０，０００Ｌ、１ｍＬ〜３５，０００Ｌである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
ａ．約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の％Ｇ０−Ｆ（パーセントフコシル化欠損糖タンパク質）；または約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の標準化された％Ｇ０−Ｆ；および／または
ｂ．約４０％〜約９０％；約５０％〜約９０％；約５５％〜約８５％；もしくは約６０％〜約８０％の％Ｇ０（パーセントガラクトシル化欠損糖タンパク質）；
を示す関心対象の糖タンパク質を取得するための、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項７７】
前記グリコシル化が、
ａ．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０（フコシル化された、ガラクトシル化欠損Ｇ０））を減少させながら、増加されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０））を達成するために；または
ｂ．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を増加させながら、減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために；または
ｃ．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために；または
ｄ．フコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を達成するために；
調節される、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項７８】
細胞培養培地、流加培地、加水分解産物または添加物を調製するための方法であって、
ａ．高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）培養物中の約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度；
ｂ．低ｐＣＯ２培養物中の約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度；
ｃ．約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２；
ｄ．約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；
ｅ．約０日〜約１５０日の細胞培養期間；
ｆ．約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；
ｇ．約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；
ｈ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；
ｉ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および
ｊ．約２９℃〜約３９℃の培養温度；
を調節する１つまたは複数の工程を含み、
前記細胞培養培地、流加培地、加水分解産物または添加物が、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する、方法。
【請求項７９】
前記関心対象の糖タンパク質が抗体または抗体断片である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記抗体または前記抗体断片が、約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の％Ｇ０−Ｆ；または約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％もしくは約１％〜約８％の標準化された％Ｇ０−Ｆ；および／または約４０％〜約９０％；約５０％〜約９０％；約５５％〜約８５％；もしくは約６０％〜約８０％の％Ｇ０を示す、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記抗体または前記抗体断片のグリコシル化が、
ａ．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０（フコシル化された、ガラクトシル化欠損Ｇ０））を減少させながら、増加されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０））を達成するために；または
ｂ．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を増加させながら、減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために；または
ｃ．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために；または
ｄ．フコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を達成するために；
調節される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの前記Ｍｎ濃度および約０時間〜約１２０時間の前記播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含む、請求項７８〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇの前記ｐＣＯ２、約０ｍＭ〜約３００ｍＭの前記Ｎａ＋濃度および約０時間〜約１２０時間の前記播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含む、請求項７８〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの前記Ｍｎ濃度、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇの前記ｐＣＯ２および約０ｍＭ〜約３００ｍＭの前記Ｎａ＋濃度を調節することを含む、請求項７８〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの前記Ｍｎ濃度、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇの前記ｐＣＯ２、約０ｍＭ〜約３００ｍＭの前記Ｎａ＋濃度および約０時間〜約７２時間の前記播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含む、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇの前記ｐＣＯ２および約０ｍＭ〜約３００ｍＭの前記Ｎａ＋濃度を調節することを含む、請求項７８〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの前記浸透圧および約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇの前記ｐＣＯ２を調節することを含む、請求項７８〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇの前記ｐＣＯ２、約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの前記Ｍｎ濃度、約０日〜約１５０日の前記細胞培養期間および約０時間〜約１２０時間の前記播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含む、請求項７８〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの前記Ｍｎ濃度および約０ｍＭ〜約６０ｍＭの前記ガラクトース濃度を調節することを含む、請求項７８〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
約０ｍＭ〜約６０ｍＭの前記フコース濃度および約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの前記Ｍｎ濃度を調節することを含む、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
約０ｍＭ〜約６０ｍＭの前記フコース濃度および約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇの前記ｐＣＯ２を調節することを含む、請求項７８〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
約０ｍＭ〜約６０ｍＭの前記フコース濃度、約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの前記Ｍｎ濃度および約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇの前記ｐＣＯ２を調節することを含む、請求項７８〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
約０ｍＭ〜約６０ｍＭの前記フコース濃度を調節することを含み、前記細胞培養温度が約２９℃〜約３９℃である、請求項７８〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
約０ｍＭ〜約６０ｍＭの前記フコース濃度および約０日〜約１５０日の前記細胞培養期間を調節することを含む、請求項７８〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記Ｍｎ濃度が、高ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭ；高ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約１０００ｎＭ；高ｐＣＯ２培養物中で約２０ｎＭ〜約３００ｎＭ；または高ｐＣＯ２培養物中で約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである、請求項７８〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記Ｍｎ濃度が、低ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭ；低ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約３０００ｎＭ；低ｐＣＯ２培養物中で約２０ｎＭ〜約３００ｎＭ；または低ｐＣＯ２培養物中で約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである、請求項７８〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記Ｍｎ濃度の調節が、細胞培養原材料中のＭｎ含有量を決定すること、およびＭｎ濃度を調節するために原材料ロットを選択することを含む、請求項９５または請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記Ｍｎ濃度の調節が、前記Ｍｎ濃度を調節するために、ｉ）細胞培養培地もしくは細胞培養物と接触している材料を調節すること；または（ｉｉ）細胞培養培地中にもしくは細胞培養の間に浸出されたＭｎの濃度を考慮すること；または（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む、請求項９５または請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記浸出されたＭｎが、（ｉ）フィルタ；（ｉｉ）培地調製物、保持もしくは培養容器；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせとの前記細胞培養物および／または細胞培養培地の接触によって生成される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記フィルタが、デプスフィルタ、カラム、膜および円板を含むがこれらに限定されない、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
フィルタ材料が、珪藻土、中空繊維または樹脂を含むがこれらに限定されない、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記Ｍｎ濃度の調節が、ＨＴＳＴ処理前に、約６．１〜約７．３；または約６．３〜約７．３の細胞培養培地ｐＨを利用することを含む、請求項９５または請求項９６に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ｐＣＯ２が調節される、請求項７８〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記細胞培養培地がバイオリアクター中にあり、ｐＣＯ２の調節が、バイオリアクター作動体積；バイオリアクター気体散布戦略；バイオリアクター撹拌戦略；バイオリアクター供給戦略；バイオリアクター灌流戦略；バイオリアクター培地交換戦略またはこれらの任意の組み合わせを調節することによって達成される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ｐＣＯ２調節が、高ｐＣＯ２培養物を確立することを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ｐＣＯ２が、約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約１５０ｍｍＨｇまたは約３０ｍｍＨｇ〜約１５０ｍｍＨｇである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ｐＣＯ２調節が、低ｐＣＯ２培養物を確立することを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ｐＣＯ２が、約１０ｍｍＨｇ〜約１００ｍｍＨｇ、１０ｍｍＨｇ〜約８０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約７０ｍｍＨｇまたは約３０ｍｍＨｇ〜約６０ｍｍＨｇである、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ｐＣＯ２調節が培養の０日に起きる、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ｐＣＯ２調節が、細胞培養のおおむね大半；最初の約５日間；最初の約７日間；または最初の約１０日間起きる、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ｐＣＯ２調節が、生産培養のおおむね大半；最初の約５日間；最初の約７日間；または最初の約１０日間起きる、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１２】
前記播種前細胞培養培地保持期間が、約０時間〜約１２０時間、０時間〜約７２時間、約０時間〜約４８時間または約０時間〜約２４時間である、請求項７８〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記播種前細胞培養培地保持の間の前記培地の温度が、約２５℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３５℃〜約３９℃または約３６℃〜約３９℃である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記細胞培養期間が、約０日〜約１５０日、約０日〜約１５日、約０日〜約１２日、０日〜約７日または約０日〜約５日である、請求項７８〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記Ｎａ＋濃度が、約０ｍＭ〜約３００ｍＭであり、約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１５０ｍＭまたは約４０ｍＭ〜約１３０ｍＭである、請求項７８〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記Ｎａ＋濃度の調節が、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＮａＯＨ、ＮａＣｌまたはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないＮａ化合物を前記細胞培養物に補充することを含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
の浸透圧が、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇまたは約３２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４２５ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項７８〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記浸透圧の調節が、細胞培養物に浸透圧調節培地成分を補充することを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記浸透圧調節培地成分が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ソルビトール、浸透圧保護剤またはこれらの組み合わせである、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ガラクトース濃度が、約０ｍＭ〜約６０ｍＭまたは約０ｍＭ〜約５０ｍＭである、請求項７８７〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記フコース濃度が、約０ｍＭ〜約６０ｍＭ、０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約０ｍＭ〜約２０ｍＭまたは約０ｍＭ〜約１０ｍＭである、請求項７８〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記細胞培養温度が、約２９℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３１℃〜約３８℃または約３４℃〜約３８℃である、請求項７８〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
組換えタンパク質の作製のための真核細胞発酵過程における、請求項７８〜１２１のいずれか一項に記載の培地の使用。
【請求項１２４】
前記組換えタンパク質が、抗体または抗体断片、ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）、ＢｓＤｂ（二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＤｂ（一本鎖二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＴａＦｖ（一本鎖二重特異性タンデム可変ドメイン）、ＤＮＬ−（Ｆａｂ）３（ドック・アンド・ロック三価Ｆａｂ）、ｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）およびＢｓｓｄＡｂ（二重特異性単一ドメイン抗体）である、請求項１２３に記載の培地の使用。
【請求項１２５】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１２４に記載の培地の使用。
【請求項１２６】
前記抗体が抗ＣＤ２０抗体である、請求項１２４に記載の培地の使用。
【請求項１２７】
前記抗ＣＤ２０抗体がオクレリズマブである、請求項１２４に記載の培地の使用。
【請求項１２８】
前記抗体または前記抗体断片が、約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の％Ｇ０−Ｆ（パーセントフコシル化欠損糖タンパク質）；約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％もしくは約１％〜約８％の標準化された％Ｇ０−Ｆ；および／または約４０％〜約９０％；約５０％〜約９０％；約５５％〜約８５％；もしくは約６０％〜約８０％の％Ｇ０（パーセントガラクトシル化欠損糖タンパク質）を示す、請求項１２４に記載の培地の使用。
【請求項１２９】
前記真核細胞が、昆虫、鳥、真菌、植物または哺乳動物細胞である、請求項１２４に記載の培地の使用。
【請求項１３０】
前記真菌細胞が、酵母、ピキアまたは任意の糸状真菌細胞である、請求項１２９に記載の培地の使用。
【請求項１３１】
前記酵母細胞がエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である、請求項１３０に記載の培地の使用。
【請求項１３２】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１２９に記載の培地の使用。
【請求項１３３】
前記細胞培養物が、使い捨て技術（ＳＵＴ）袋もしくはバイオリアクター；ＷＡＶＥバイオリアクター；ステンレス鋼バイオリアクター；フラスコ；チューブおよびチャンバーを含むがこれらに限定されないバイオリアクター中にある、請求項１２３〜１３２のいずれか一項に記載の培地の使用。
【請求項１３４】
前記細胞培養物の体積が１ｍＬ〜３５，０００Ｌである、請求項１２３〜１３３のいずれか一項に記載の培地の使用。
【請求項１３５】
前記細胞培養物の体積が、１ｍＬ〜１０ｍｌ、１ｍＬ〜５０ｍｌ、１ｍＬ〜１００ｍｌ、１ｍＬ〜２００ｍｌ、１ｍＬ〜３００ｍｌ、１ｍＬ〜５００ｍｌ、１ｍＬ〜１０００ｍｌ、１ｍＬ〜２０００ｍｌ、１ｍＬ〜３０００ｍｌ、１ｍＬ〜４０００ｍｌ、１ｍＬ〜５０００ｍｌ、１ｍＬ〜１Ｌ、１ｍＬ〜２Ｌ、１ｍＬ〜３Ｌ、１ｍＬ〜４Ｌ、１ｍＬ〜５Ｌ、１ｍＬ〜６Ｌ、１ｍＬ〜１０Ｌ、１ｍＬ〜２０Ｌ、１ｍＬ〜３０Ｌ、１ｍＬ〜４０Ｌ、１ｍＬ〜５０Ｌ、１ｍＬ〜６０Ｌ、１ｍＬ〜７０Ｌ、１ｍＬ〜１００Ｌ、１ｍＬ〜２００Ｌ、１ｍＬ〜３００Ｌ、１ｍＬ〜４００Ｌ、１ｍＬ〜５００Ｌ、１ｍＬ〜１０００Ｌ、１ｍＬ〜２０００Ｌ、１ｍＬ〜３０００Ｌ、１ｍＬ〜４０００Ｌ、１ｍＬ〜５０００Ｌ、１ｍＬ〜１０，０００Ｌ、１ｍＬ〜２０，０００Ｌ、１ｍＬ〜３０，０００Ｌ、１ｍＬ〜３０，０００Ｌ、１ｍＬ〜３５，０００Ｌである、請求項１３４に記載の培地の使用。
【請求項１３６】
ａ．関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と；
ｂ．
ｉ．高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）培養物中の約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度；
ｉｉ．低ｐＣＯ２培養物中の約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度；
ｉｉｉ．約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２；
ｉｖ．約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；
ｖ．約０日〜約１５０日の細胞培養期間；
ｖｉ．約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；
ｖｉｉ．約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；
ｖｉｉｉ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；
ｉｘ．約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および
ｘ．約２９℃〜約３９℃の培養温度；
から選択される１つまたは複数の所定のパラメータを目標とするように調節された細胞培養物および／または細胞培養培地と、を含む、細胞培養組成物。
【請求項１３７】
前記細胞培養環境がバイオリアクター内である、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１３８】
前記関心対象の糖タンパク質が抗体または抗体断片である、請求項１３６〜１３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３９】
前記抗体または前記抗体断片が、
ａ．約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の％Ｇ０−Ｆ（パーセントフコシル化欠損糖タンパク質）；または約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の標準化された％Ｇ０−Ｆ；および／または
ｂ．約４０％〜約９０％；約５０％〜約９０％；約５５％〜約８５％；もしくは約６０％〜約８０％の％Ｇ０（パーセントガラクトシル化欠損糖タンパク質）；
を示す、請求項１３８に記載の組成物。
【請求項１４０】
前記抗体または前記抗体断片のグリコシル化が、
ａ．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０（フコシル化された、ガラクトシル化欠損Ｇ０））を減少させながら、増加されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０））を達成するために；または
ｂ．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を増加させながら、減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために；または
ｃ．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために；または
ｄ．フコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を達成するために；
調節される、請求項１３８に記載の組成物。
【請求項１４１】
前記Ｍｎ濃度が約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり、前記播種前細胞培養培地保持期間が約０時間〜約１２０時間である、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４２】
前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇであり、前記Ｎａ＋濃度が約０ｍＭ〜約３００ｍＭ、前記播種前細胞培養培地保持期間が約０時間〜約１２０時間である、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４３】
前記Ｍｎ濃度が約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり、前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇであり、前記Ｎａ＋濃度が約０ｍＭ〜約３００ｍＭである、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４４】
前記Ｍｎ濃度が約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり、前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇであり、前記Ｎａ＋濃度が約０ｍＭ〜約３００ｍＭであり、前記播種前細胞培養培地保持期間が約０時間〜約１２０時間である、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４５】
前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇであり、前記Ｎａ＋濃度が約０ｍＭ〜約３００ｍＭである、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４６】
前記浸透圧が約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇである、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４７】
前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇであり、前記Ｍｎ濃度が約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり、前記細胞培養期間が約０日〜約１５０日であり、前記播種前細胞培養培地保持期間が約０時間〜約１２０時間である、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４８】
前記Ｍｎ濃度が約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり、前記ガラクトース濃度が約０ｍＭ〜約６０ｍＭである、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４９】
前記フコース濃度が約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり、前記Ｍｎ濃度が約１ｎＭ〜約３００００ｎＭである、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１５０】
前記フコース濃度が約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり、前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇである、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１５１】
前記フコース濃度が約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり、前記Ｍｎ濃度が約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり、前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇである、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１５２】
前記フコース濃度が約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり、前記細胞培養温度が約２９℃〜約３９℃である、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１５３】
前記フコース濃度が約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり、前記細胞培養期間が約０日〜約１５０日である、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１５４】
Ｍｎ濃度が、高ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭ；高ｐＣＯ２培養物中で、約１ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約４０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭ；高ｐＣＯ２培養物中で、約１ｎＭ〜約５００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２０，０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである、請求項１３６〜１５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５５】
前記Ｍｎ濃度が、低ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭ；低ｐＣＯ２培養物中で、約１ｎＭ〜約２００００ｎＭ；約１ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約４０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭ；約１ｎＭ〜約５００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約５００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約５０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２００００ｎＭまたは約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである、請求項１３６〜１５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記Ｍｎ濃度の調節が、細胞培養原材料中のＭｎ含有量を決定すること、およびＭｎ濃度を調節するために原材料ロットを選択することを含む、請求項１５４または請求項１５５に記載の組成物。
【請求項１５７】
前記Ｍｎ濃度の調節が、前記Ｍｎ濃度を調節するために、（ｉ）細胞培養培地もしくは細胞培養物と接触している材料を調節すること；または（ｉｉ）細胞培養培地中にもしくは細胞培養の間に浸出されたＭｎの濃度を考慮すること；または（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む、請求項１５４または請求項１５５に記載の組成物。
【請求項１５８】
前記浸出されたＭｎが、（ｉ）フィルタ；（ｉｉ）培地調製物、保持もしくは培養容器；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせとの、前記細胞培養物および／または細胞培養培地の接触によって生成される、請求項１５７に記載の組成物。
【請求項１５９】
前記フィルタが、デプスフィルタ、カラム、膜および円板を含むがこれらに限定されない、請求項１５８に記載の組成物。
【請求項１６０】
フィルタ材料が、珪藻土、中空繊維または樹脂を含むがこれらに限定されない、請求項１５８に記載の組成物。
【請求項１６１】
Ｍｎが、細胞培養培地の成分として補充される、請求項１５４または請求項１５５に記載の組成物。
【請求項１６２】
前記細胞培養培地が、流加培地、加水分解産物または添加物である、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１６３】
前記流加培地、前記加水分解産物または前記添加物がＭｎを含む、請求項１６２に記載の組成物。
【請求項１６４】
前記流加培地または前記添加物が、Ｍｎから実質的になる、請求項１６２に記載の組成物。
【請求項１６５】
前記Ｍｎが、細胞培養物の生成段階の間に補充される、請求項１５４または請求項１５５に記載の組成物。
【請求項１６６】
前記Ｍｎが、細胞培養物の生成段階の前に補充される、請求項１５４または請求項１５５に記載の組成物。
【請求項１６７】
前記Ｍｎが、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づいて補充される、請求項１５４または請求項１５５に記載の組成物。
【請求項１６８】
前記Ｍｎが、大量瞬時投与として、断続的な補充として、継続的な補充として、半継続的な補充として、フィードバックループをベースとする補充として、またはこれらの１つもしくは複数の組み合わせとして補充される、請求項１５４または請求項１５５に記載の組成物。
【請求項１６９】
前記Ｍｎ濃度の調節が、ＨＴＳＴ熱処理前に、約６．１〜約７．３；または約６．３〜約７．３の細胞培養培地ｐＨを利用することを含む、請求項１５４または請求項１５５に記載の組成物。
【請求項１７０】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記ｐＣＯ２を調節することを含む、請求項１３６〜１５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７１】
前記細胞培養物または細胞培養培地がバイオリアクター中にあり、ｐＣＯ２の調節が、バイオリアクター作動体積；バイオリアクター気体散布戦略；バイオリアクター撹拌戦略；バイオリアクター供給戦略、バイオリアクター灌流戦略、バイオリアクター培地交換戦略またはこれらの任意の組み合わせを調節することによって達成される、請求項１７０に記載の組成物。
【請求項１７２】
前記ｐＣＯ２調節が、高ｐＣＯ２培養物を確立することを含む、請求項１７０に記載の組成物。
【請求項１７３】
前記ｐＣＯ２が約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約１５０ｍｍＨｇまたは約３０ｍｍＨｇ〜約１５０ｍｍＨｇである、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７４】
前記ｐＣＯ２調節が、低ｐＣＯ２培養物を確立することを含む、請求項１７０に記載の組成物。
【請求項１７５】
前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約１００ｍｍＨｇ、１０ｍｍＨｇ〜約８０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約７０ｍｍＨｇまたは約３０ｍｍＨｇ〜約６０ｍｍＨｇである、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１７６】
前記ｐＣＯ２調節が培養の０日に起きる、請求項１７０に記載の組成物。
【請求項１７７】
前記ｐＣＯ２調節が、細胞培養のおおむね大半；最初の約５日間；最初の約７日間；または最初の約１０日間起きる、請求項１７０に記載の組成物。
【請求項１７８】
前記ｐＣＯ２調節が、生産培養のおおむね大半；最初の約５日間；最初の約７日間；または最初の約１０日間起きる、請求項１７０に記載の組成物。
【請求項１７９】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含み、前記播種前細胞培養培地保持期間が、約０時間〜約１２０時間、０時間〜約７２時間：約０時間〜約４８時間または約０時間〜約２４時間である、請求項１１３６〜１５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８０】
前記播種前細胞培養培地保持の間の前記培地の温度が、約２５℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３５℃〜約３９℃、または約３６℃〜約３９℃である、請求項１７９に記載の組成物。
【請求項１８１】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記細胞培養期間を調節することを含み、前記細胞培養期間が、約０日〜約１５０日、約０日〜約１５日、約０日〜約１２日、０日〜約７日または約０日〜約５日である、請求項１３６〜１５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８２】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記Ｎａ＋濃度を調節することを含み、前記Ｎａ＋濃度が、約０ｍＭ〜約３００ｍＭであり；約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約３０ｍＭ〜約１５０ｍＭ；または約４０ｍＭ〜約１３０ｍＭである、請求項１３６〜１５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８３】
前記Ｎａ＋濃度の調節が、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＮａＯＨ、ＮａＣｌまたはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないＮａ化合物を前記細胞培養物に補充することを含む、請求項１８２に記載の組成物。
【請求項１８４】
Ｎａ＋が、細胞培養物の生成段階の間に補充される、請求項１８２に記載の組成物。
【請求項１８５】
Ｎａ＋が、細胞培養物の生成段階の前に補充される、請求項１８２に記載の組成物。
【請求項１８６】
Ｎａ＋が、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づいて補充される、請求項１８２に記載の組成物。
【請求項１８７】
Ｎａ＋が、大量瞬時投与として、断続的な補充として、継続的な補充として、半継続的な補充として、フィードバックループをベースとする補充として、またはこれらの１つもしくは複数の組み合わせとして補充される、請求項１８２に記載の組成物。
【請求項１８８】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記浸透圧を調節することを含み、前記浸透圧が、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ；約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ；または約３２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４２５ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項１３６〜１５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８９】
前記浸透圧の調節が、細胞培養物に浸透圧調節培地成分を補充することを含む、請求項１８８に記載の組成物。
【請求項１９０】
前記浸透圧調節培地成分が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ソルビトール、浸透圧保護剤またはこれらの組み合わせである、請求項１８９に記載の組成物。
【請求項１９１】
前記浸透圧調節培地成分が、細胞培養物の生成段階の間に補充される、請求項１８９に記載の組成物。
【請求項１９２】
前記浸透圧調節培地成分が、細胞培養物の生成段階の前に補充される、請求項１８９に記載の組成物。
【請求項１９３】
前記浸透圧調節培地成分が、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づいて補充される、請求項１８９に記載の組成物。
【請求項１９４】
前記浸透圧調節培地成分が、大量瞬時投与として、断続的な補充として、継続的な補充として、半継続的な補充として、フィードバックループをベースとする補充として、またはこれらの１つもしくは複数の組み合わせとして補充される、請求項１８９に記載の組成物。
【請求項１９５】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記ガラクトース濃度を調節することを含み、前記ガラクトース濃度が、約０ｍＭ〜約６０ｍＭまたは約０ｍＭ〜約５０ｍＭである、請求項１３６〜１５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９６】
ガラクトースが、細胞培養培地の成分として補充される、請求項１９５に記載の組成物。
【請求項１９７】
前記細胞培養培地が、流加培地、加水分解産物または添加物である、請求項１９６に記載の組成物。
【請求項１９８】
前記流加培地、前記加水分解産物または前記添加物がガラクトースを含む、請求項１９７に記載の組成物。
【請求項１９９】
前記流加培地または前記添加物が、ガラクトースから実質的になる、請求項１９７に記載の組成物。
【請求項２００】
前記ガラクトースが、細胞培養物の生成段階の間に補充される、請求項１９６に記載の組成物。
【請求項２０１】
前記ガラクトースが、細胞培養物の生成段階の前に補充される、請求項１９６に記載の組成物。
【請求項２０２】
前記ガラクトースが、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づいて補充される、請求項１９６に記載の組成物。
【請求項２０３】
前記ガラクトースが、大量瞬時投与として、断続的な補充として、継続的な補充として、半継続的な補充として、フィードバックループをベースとする補充として、またはこれらの１つもしくは複数の組み合わせとして補充される、請求項１９６に記載の組成物。
【請求項２０４】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記フコース濃度を調節することを含み、前記フコース濃度が、約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり；０ｍＭ〜約４０ｍＭ；約０ｍＭ〜約２０ｍＭ；または約０ｍＭ〜約１０ｍＭである、請求項１３６〜１５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０５】
フコースが、細胞培養培地の成分として補充される、請求項２０４に記載の組成物。
【請求項２０６】
前記細胞培養培地が、流加培地、加水分解産物または添加物である、請求項２０５に記載の組成物。
【請求項２０７】
前記流加培地、前記加水分解産物または前記添加物がフコースを含む、請求項２０６に記載の組成物。
【請求項２０８】
前記流加培地または前記添加物が、フコースから実質的になる、請求項２０６に記載の組成物。
【請求項２０９】
前記フコースが、細胞培養物の生成段階の間に補充される、請求項２０５に記載の組成物。
【請求項２１０】
前記フコースが、細胞培養物の生成段階の前に補充される、請求項２０５に記載の組成物。
【請求項２１１】
前記フコースが、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づいて補充される、請求項２０５に記載の組成物。
【請求項２１２】
前記フコースが、大量瞬時投与として、断続的な補充として、継続的な補充として、半継続的な補充として、フィードバックループをベースとする補充として、またはこれらの１つもしくは複数の組み合わせとして補充される、請求項２０５に記載の組成物。
【請求項２１３】
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記細胞培養温度を調節することを含み、前記細胞培養温度が、約２９℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３１℃〜約３８℃または約３４℃〜約３８℃である、請求項１３６〜１５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１４】
前記細胞培養温度が、細胞培養物の生成段階の間に調節される、請求項２１３に記載の組成物。
【請求項２１５】
前記細胞培養温度が、細胞培養物の生成段階の前に調節される、請求項２１３に記載の組成物。
【請求項２１６】
前記細胞培養温度が、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づいて調節される、請求項２１３に記載の組成物。
【請求項２１７】
前記細胞培養物が真核細胞を含む、請求項１３６〜１５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１８】
前記真核細胞が真菌細胞または哺乳動物細胞である、請求項２１７に記載の組成物。
【請求項２１９】
前記真菌細胞が酵母細胞である、請求項２１８に記載の組成物。
【請求項２２０】
前記酵母細胞がエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である、請求項２１９に記載の組成物。
【請求項２２１】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２１８に記載の組成物。
【請求項２２２】
前記細胞培養物が、使い捨て技術（ＳＵＴ）袋もしくはバイオリアクター；ＷＡＶＥバイオリアクター；ステンレス鋼バイオリアクター；フラスコ；チューブおよびチャンバーを含むがこれらに限定されないバイオリアクター中にある、請求項１３６〜２２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２３】
前記細胞培養物の体積が１ｍＬ〜３５，０００Ｌである、請求項１３６〜２２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２４】
細胞培養物中で関心対象の糖タンパク質を作製するための方法であって、
ａ．真核細胞を培養するのに適した細胞培養培地を、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の方法に供すること、
ｂ．前記調節された細胞培養培地に、組換えタンパク質を発現する真核細胞を播種すること、
ｃ．前記組換えタンパク質が発現されるように、前記真核細胞を培養すること、
を含む、方法。
【請求項２２５】
前記細胞培養物がバイオリアクター中にある、請求項２２４に記載の細胞培養物中で関心対象の糖タンパク質を作製するための方法。
【請求項２２６】
前記低ｐＣＯ２条件が約１０〜約１００ｍｍＨｇであり、前記高ｐＣＯ２条件が約２０〜約２５０ｍｍＨｇである、請求項２２４に記載の細胞培養物中で関心対象の糖タンパク質を作製するための方法。
【請求項２２７】
ｐＣＯ２調節の期間が、前記細胞培養期間の少なくとも最初の半分を包含する、請求項３に記載の細胞培養物中で関心対象の糖タンパク質を作製するための方法。
【請求項２２８】
前記関心対象の糖タンパク質が組換えタンパク質である、請求項２２４〜２２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２９】
前記組換えタンパク質が、抗体または抗体断片、ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）、ＢｓＤｂ（二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＤｂ（一本鎖二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＴａＦｖ（一本鎖二重特異性タンデム可変ドメイン）、ＤＮＬ−（Ｆａｂ）３（ドック・アンド・ロック三価Ｆａｂ）、ｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）およびＢｓｓｄＡｂ（二重特異性単一ドメイン抗体）である、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３０】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３１】
前記抗体が抗ＣＤ２０抗体である、請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３２】
前記抗ＣＤ２０抗体がオクレリズマブである、請求項２３１に記載の方法。
【請求項２３３】
前記抗体または前記抗体断片が、
ｉ）約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の％Ｇ０−Ｆ（パーセントフコシル化欠損糖タンパク質）；または約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の標準化された％Ｇ０−Ｆ；および／または
ｉｉ）約４０％〜約９０％；約５０％〜約９０％；約５５％〜約８５％；もしくは約６０％〜約８０％の％Ｇ０（パーセントガラクトシル化欠損糖タンパク質）；
を示す、請求項２２４〜２３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３４】
前記グリコシル化が、
ａ．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０（フコシル化された、ガラクトシル化欠損Ｇ０））を減少させながら、増加されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０））を達成するために；または
ｂ．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を増加させながら、減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために；または
ｃ．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために；または
ｄ．フコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を達成するために；
調節される、請求項２２４〜２３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３５】
関心対象の糖タンパク質のグリコシル化を調節する方法であって、
ａ．細胞培養培地のマンガン濃度が目標とされた範囲内に属するかどうかを判定するために細胞培養培地をアッセイすること、および
ｂ．前記目標とされた範囲内に属している細胞培養培地中で、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞を培養することを含み、
マンガン濃度の前記目標とされた範囲外に属する培養培地中での、宿主細胞によって発現された関心対象の糖タンパク質のグリコシル化と比較して、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化が調節されている、方法。
【請求項２３６】
前記関心対象の糖タンパク質が抗体である、請求項２３５に記載の方法。
【請求項２３７】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２３６に記載の方法。
【請求項２３８】
前記抗体が抗ＣＤ２０抗体である、請求項２３６〜２３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３９】
前記抗ＣＤ２０抗体がオクレリズマブである、請求項２９７〜２９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４０】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２３５に記載の方法。
【請求項２４１】
前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項２３９〜２４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４２】
前記マンガン濃度の目標範囲が、約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである、請求項２３５に記載の方法。
【請求項２４３】
細胞培養培地のアッセイが、細胞培養培地の成分のマンガン濃度をアッセイすることを含む、請求項２３５に記載の方法。
【請求項２４４】
細胞培養培地の成分が、加水分解産物または血清である、請求項２４３に記載の方法。
【請求項２４５】
Ｇ０（フコシル化されたＧ０）を減少させながら、増加されたＧ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０）を達成するために、グリコシル化が調節される、請求項２３５〜２４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４６】
細胞培養組成物であって、
ａ．細胞培養培地のマンガン濃度が目標とされた範囲内に属するかどうかを判定するためにアッセイされた細胞培養培地と、
ｂ．関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、
を含む、細胞培養組成物。
【請求項２４７】
組成物が、前記関心対象の糖タンパク質をさらに含む、請求項２４６に記載の細胞培養組成物。
【請求項２４８】
前記糖タンパク質が抗体である、請求項２４７に記載の細胞培養組成物。
【請求項２４９】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２４８に記載の細胞培養組成物。
【請求項２５０】
前記抗体が抗ＣＤ２０抗体である、請求項２４８〜２４９のいずれか一項に記載の細胞培養組成物。
【請求項２５１】
前記抗ＣＤ２０抗体がオクレリズマブである、請求項２４８〜２４９のいずれか一項に記載の細胞培養組成物。
【請求項２５２】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２４６に記載の細胞培養組成物。
【請求項２５３】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２５２のいずれか一項に記載の細胞培養組成物。
【請求項２５４】
前記マンガン濃度の目標範囲が、約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである、請求項２４６に記載の細胞培養組成物。
【請求項２５５】
関心対象の糖タンパク質を含む組成物であって、調製物が、
ａ．細胞培養培地のマンガン濃度が目標とされた範囲内に属するかどうかを判定するためにアッセイされた細胞培養培地と、
ｂ．関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、
ｃ．関心対象の糖タンパク質と、
を含む、組成物。
【請求項２５６】
前記糖タンパク質が抗体である、請求項２５５に記載の組成物。
【請求項２５７】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２５６に記載の組成物。
【請求項２５８】
前記抗体が抗ＣＤ２０抗体である、請求項２５６〜２５７のいずれか１項に記載の細胞培養組成物。
【請求項２５９】
前記抗ＣＤ２０抗体がオクレリズマブである、請求項２５６〜２５７のいずれか一項に記載の細胞培養組成物。
【請求項２６０】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２５５に記載の細胞培養組成物。
【請求項２６１】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２６０に記載の細胞培養組成物。
【請求項２６２】
関心対象の糖タンパク質のグリコシル化を調節する方法であって、
ａ．関心対象の糖タンパク質を発現する宿主細胞の培養において使用される細胞培養培地に、高ＣＯ２条件下で約１０ｎＭ〜約２０００ｎＭのマンガンを補充すること、または
ｂ．関心対象の糖タンパク質を発現する宿主細胞の培養において使用される細胞培養培地に、低ＣＯ２条件下で約１０ｎＭ〜約３０００ｎＭのマンガンを補充することを含み、
関心対象の糖タンパク質のグリコシル化が、このように補充されなかった培養培地中で宿主細胞によって発現される関心対象の糖タンパク質のグリコシル化と比較して調節されている、方法。
【請求項２６３】
前記関心対象の糖タンパク質が抗体である、請求項２６２に記載の方法。
【請求項２６４】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２６３に記載の方法。
【請求項２６５】
前記抗体がオクレリズマブである、請求項２６３〜２６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６６】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２６２に記載の方法。
【請求項２６７】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２６６に記載の方法。
【請求項２６８】
Ｇ０（フコシル化されたＧ０）を減少させながら、増加されたＧ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０）を達成するために、グリコシル化が調節される、請求項２６２〜２６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６９】
細胞培養組成物であって、
ａ．
ｉ．高ＣＯ２条件下での約１０ｎＭ〜約２０００ｎＭマンガンまたは
ｉｉ．低ＣＯ２条件下での約１０ｎＭ〜約３０００ｎＭマンガン
が補充された細胞培養培地と、
ｂ．関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、
を含む、細胞培養組成物。
【請求項２７０】
組成物が、関心対象の糖タンパク質をさらに含む、請求項２６９に記載の細胞培養組成物。
【請求項２７１】
前記糖タンパク質が抗体である、請求項２６９に記載の細胞培養組成物。
【請求項２７２】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２７１に記載の細胞培養組成物。
【請求項２７３】
前記抗体がオクレリズマブである、請求項２７１〜２７２のいずれか１項に記載の細胞培養組成物。
【請求項２７４】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２６９に記載の細胞培養組成物。
【請求項２７５】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２７４に記載の細胞培養組成物。
【請求項２７６】
関心対象の糖タンパク質を含む組成物であって、調製物が、
ａ．マンガンが補充された細胞培養培地であって、
ｉ．培養物に、高ＣＯ２条件下での約１０ｎＭ〜約２０００ｎＭマンガンまたは
ｉｉ．低ＣＯ２条件下での約１０ｎＭ〜約３０００ｎＭマンガンが補充された細胞培養培地と、
ｂ．関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、
ｃ．関心対象の糖タンパク質と、
を含む、組成物。
【請求項２７７】
前記糖タンパク質が抗体である、請求項２７６に記載の組成物。
【請求項２７８】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２７７に記載の組成物。
【請求項２７９】
前記抗体がオクレリズマブである、請求項２７６〜２７７のいずれか１項に記載の細胞培養組成物。
【請求項２８０】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２７６に記載の細胞培養組成物。
【請求項２８１】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２８０に記載の細胞培養組成物。
【請求項２８２】
関心対象の糖タンパク質のグリコシル化を調節する方法であって、
ａ．６．３０〜７．２５のｐＨ目標を含む細胞培養培地を高温短時間（ＨＴＳＴ）熱処理に曝露すること、および
ｂ．細胞培養培地中で関心対象の糖タンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含み、
前ＨＴＳＴ熱処理ｐＨ目標がｐＨ７．２５より大きい培養培地中で宿主細胞によって発現された関心対象の糖タンパク質のグリコシル化と比較して、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化が調節される、方法。
【請求項２８３】
前記関心対象の糖タンパク質が抗体である、請求項２８２に記載の方法。
【請求項２８４】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２８３に記載の方法。
【請求項２８５】
前記抗体がオクレリズマブである、請求項２８３〜２８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８６】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２８２に記載の方法。
【請求項２８７】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２８６に記載の方法。
【請求項２８８】
Ｇ０（フコシル化されたＧ０）を減少させながら、増加されたＧ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０）を達成するために、グリコシル化が調節される、請求項２８２〜２８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８９】
細胞培養組成物であって、
ａ．ＨＴＳＴ熱処理に曝露された約６．３０〜約７．２５のｐＨ目標を含む細胞培養培地と、
ｂ．関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、
を含む、細胞培養組成物。
【請求項２９０】
組成物が、関心対象の糖タンパク質をさらに含む、請求項２８９に記載の細胞培養組成物。
【請求項２９１】
前記糖タンパク質が抗体である、請求項２９０に記載の細胞培養組成物。
【請求項２９２】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２９１に記載の細胞培養組成物。
【請求項２９３】
前記抗体がオクレリズマブである、請求項２９１〜２９２のいずれか１項に記載の細胞培養組成物。
【請求項２９４】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２９３に記載の細胞培養組成物。
【請求項２９５】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２９４に記載の細胞培養組成物。
【請求項２９６】
関心対象の糖タンパク質を含む組成物であって、調製物が、
ａ．ＨＴＳＴ熱処理に曝露された約６．３０〜約７．２５のｐＨ目標を含む細胞培養培地と、
ｂ．関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、
ｃ．前記関心対象の糖タンパク質と、
を含む、組成物。
【請求項２９７】
前記糖タンパク質が抗体である、請求項２９６に記載の組成物。
【請求項２９８】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２９７に記載の組成物。
【請求項２９９】
前記抗体がオクレリズマブである、請求項２９７〜２９８のいずれか１項に記載の細胞培養組成物。
【請求項３００】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２９６に記載の細胞培養組成物。
【請求項３０１】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３００に記載の細胞培養組成物。
【請求項３０２】
関心対象の糖タンパク質のグリコシル化を調節する方法であって、
ａ．細胞培養培地中で前記関心対象の糖タンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含み、
ｉ．前記細胞培養が高ｐＣＯ２に曝露され、
ｉｉ．前記細胞培養が延長された培地保持時間に曝露され、および／または
ｉｉｉ．前記細胞培養が増加されたＮａ＋濃度を含み；
前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化が、低ｐＣＯ２、短縮された培地保持時間および／または低下したＮａ＋濃度に曝露された細胞培地中の宿主細胞によって発現された関心対象の糖タンパク質の調製物のフコシル化と比較して調節されている、方法。
【請求項３０３】
前記関心対象の糖タンパク質が抗体である、請求項３０２に記載の方法。
【請求項３０４】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項３０３に記載の方法。
【請求項３０５】
前記抗体がオクレリズマブである、請求項３０３〜３０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０６】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項３０２に記載の方法。
【請求項３０７】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３０６に記載の方法。
【請求項３０８】
Ｇ０（フコシル化されたＧ０）を減少させながら、増加されたＧ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０）を達成するために、グリコシル化が調節される、請求項３０２〜３０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０９】
細胞培養組成物であって、
ａ．高ｐＣＯ２、延長された培地保持時間および／または増加されたＮａ＋濃度を含む細胞培養培地と；
ｂ．関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、
を含む細胞培養組成物。
【請求項３１０】
組成物が、関心対象の糖タンパク質をさらに含む、請求項３０９に記載の細胞培養組成物。
【請求項３１１】
前記糖タンパク質が抗体である、請求項３１０に記載の細胞培養組成物。
【請求項３１２】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項３１１に記載の細胞培養組成物。
【請求項３１３】
前記抗体がオクレリズマブである、請求項３１１〜３１２のいずれか１項に記載の細胞培養組成物。
【請求項３１４】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項３０９に記載の細胞培養組成物。
【請求項３１５】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３１４のいずれか一項に記載の細胞培養組成物。
【請求項３１６】
関心対象の糖タンパク質を含む組成物であって、調製物が、
ａ．高ｐＣＯ２、延長された培地保持時間および／または増加されたＮａ＋濃度を含む細胞培養培地と；
ｂ．関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、
ｃ．関心対象の糖タンパク質と、
を含む、組成物。
【請求項３１７】
前記糖タンパク質が抗体である、請求項３１６に記載の組成物。
【請求項３１８】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項３１７に記載の組成物。
【請求項３１９】
前記抗体がオクレリズマブである、請求項３１７〜３１８のいずれか１項に記載の細胞培養組成物。
【請求項３２０】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項３１６に記載の細胞培養組成物。
【請求項３２１】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３２０に記載の細胞培養組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／７１７，７５１号に対する優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本明細書に開示されている主題は、関心対象の糖タンパク質、例えば抗体のグリコシル化パターン、例えばフコシル化および／またはガラクトシル化パターンを調節するための細胞培養培地および細胞培養戦略ならびにこのような培地および／または戦略を用いて調製された細胞培養および糖タンパク質組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｎ結合型グリコシル化は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む組換え糖タンパク質の生理化学的特性に影響を与えることができる。これらの特性には、タンパク質の折り畳み、溶解度、結合、安定性、免疫原性および薬物動態が含まれる（Ｖａｒｋｉ  Ａ．（１９９３），Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，３（２），９７−１３０）。治療用ｍＡｂに対する作用機序に応じて、ｍＡｂの効力は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性および／または抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性に依存し得る。いくつかの研究において、Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）への末端ガラクトース残基の付加を表す末端ガラクトシル化が増加したｍＡｂは、より高いＣＤＣ活性を有する（Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３２，１３１１−１３１８；Ｈｏｄｏｎｉｃｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１，１６４４−１６５２；Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，１６，２８５−２９０）。したがって、ガラクトシル化の最適かつ一貫したレベルは、作用機序としてＣＤＣを有するｍＡｂ産物に対して極めて望ましいことがあり得る。他の研究では、オリゴ糖コアへのフコース残基の付加を表すコアフコシル化が低下したｍＡｂは、より高いＡＤＣＣ活性を有する（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０８，１２６６９-１２６７４；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，２６７３３-２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，３４６６-３４７３；Ｔｈｏｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７３，６０−７５）。したがって、フコシル化欠損の最適かつ一貫したレベル（すなわち、Ｎ結合型グリカン上のコアフコースの欠如）は、作用機序としてＡＤＣＣを有するｍＡｂ生成物に対して極めて望ましいことがあり得る。細胞培養過程におけるｍＡｂグリコシル化（例えば、ガラクトシル化および／またはフコシル化）を調節するための戦略は、一般に、以下の４つのカテゴリーのうちの１つに属する。（１）組換え細胞株の遺伝子操作（Ｌｏｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１１４（３），６３２−６４４；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，８７（５），６１４−６２２）；（２）酵素阻害剤の添加（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６），ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，１１（１０），２７３４−２７４３；Ｏｋｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３），ＰＮＡＳ，１１０（１４），５４０４−５４０９）；（３）別の糖の補充を含む、グリコシル化のための補因子および基質のレベルを修飾すること（Ｈｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，３０（６），１４１９−１４３１；Ｈｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１７），ｍＡｂｓ，９（４），７１５−７３４）；および（４）培養過程パラメータの微調整（Ｋｏｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０��２），Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６４，２４９−２６５）。多くの細胞培養過程パラメータがガラクトシル化に影響を与えることが知られているが（Ｈｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９），Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９（９），９３６−９４９）、フコシル化を調節するために特定されているものはより少ない。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書に開示されている主題は、関心対象の組換え糖タンパク質のグリコシル化パターン（例えば、ガラクトシル化および／またはフコシル化パターン）を調節することに関する。例えば、ただし、限定を目的とするものではなく、本明細書に記載されている実施形態は、所望の糖タンパク質グリコシル化パターン（例えば、ガラクトシル化および／またはフコシル化パターン）を達成または維持するためにグリコシル化を調節することに関する。本開示にしたがってグリコシル化を調節することができる方法には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない。（１）例えば、原材料のＭｎ濃度分析、細胞培養培地へのおよび／または細胞培養中のＭｎ補充、および／または
【０００５】
培地の高温短時間（ＨＴＳＴ）熱処理前に、培地ｐＨ調整に対して低下したｐＨ目標もしくは設定点を確立することによって、細胞培養からのＭｎ喪失を最小化することに関する、細胞培養培地および／または細胞培養マンガン（Ｍｎ）濃度の調節；（２）細胞培養中の過程パラメータ、例えば、ｐＣＯ２、培地保持期間、培養期間、培養温度および浸透圧／Ｎａ＋を調節すること；ならびに（３）細胞培養培地および／または細胞培養ガラクトースおよび／もしくはフコース濃度の調節。本開示の主題は、このような過程パラメータが本明細書に記載されているとおりに調節されたときに調製される細胞培養および糖タンパク質組成物も対象とする。
【０００６】
ある実施形態において、本開示は、細胞培養物中の関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節するための方法であって、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータ：高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）条件における約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度；低ｐＣＯ２条件における約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度；約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２；約２５℃〜３９℃の温度での、約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；約０日〜約１５０日の細胞培養期間；約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度を、単独でまたは任意の組み合わせで調節することを含む、方法を対象とする。
【０００７】
ある実施形態において、細胞培養環境は、細胞ありまたはなしのバイオリアクター中である。ある実施形態において、低ｐＣＯ２条件は約１０〜約１００ｍｍＨｇであり、高ｐＣＯ２条件は約２０〜約２５０ｍｍＨｇである。
【０００８】
ある実施形態において、ｐＣＯ２調節の期間は、細胞培養期間の少なくとも最初の半分を包含する。
【０００９】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質は組換えタンパク質である。ある実施形態において、組換えタンパク質は、抗体または抗体断片、ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）、ＢｓＤｂ（二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＤｂ（一本鎖二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＴａＦｖ（一本鎖二重特異性タンデム可変ドメイン）、ＤＮＬ−（Ｆａｂ）３（ドック・アンド・ロック（ｄｏｃｋ−ａｎｄ−ｌｏｃｋ）三価Ｆａｂ）、ｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）およびＢｓｓｄＡｂ（二重特異性単一ドメイン抗体）である。ある実施形態において、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。ある実施形態において、抗体は、抗ＣＤ２０抗体である。ある実施形態において、抗ＣＤ２０抗体は、オクレリズマブである。ある実施形態において、抗体または抗体断片は、約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の％Ｇ０−Ｆ（パーセントフコシル化欠損糖タンパク質）；または約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％もしくは約１％〜約８％の標準化された％Ｇ０−Ｆ；および／または約４０％〜約９０％；約５０％〜約９０％；約５５％〜約８５％；もしくは約６０％〜約８０％の％Ｇ０（パーセントガラクトシル化欠損糖タンパク質）を示す。
【００１０】
ある実施形態において、ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０（フコシル化されたガラクトシル化欠損Ｇ０））を減少させながら、増加されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０））を達成するために、またはガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を増加させながら、減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために、またはガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために、またはフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を達成するために、グリコシル化が調節される。
【００１１】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程は、低ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度を調節すること、または高ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度、ならびに単独でのまたは任意の組み合わせでの、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータ：約２５℃〜３９℃の温度での、約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；約０日〜約１５０日の細胞培養期間；約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度を調節することを含む。
【００１２】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程は、低ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度を調節すること、または高ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度、ならびに、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータ：約２５℃〜３９℃の温度での、約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；および約０日〜約１５０日の細胞培養期間を調節することを含む。
【００１３】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程は、低ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度を調節すること、または高ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度、ならびに、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータ：約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；および／または約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度を調節することを含む。
【００１４】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程は、播種前細胞培養培地保持期間ならびに単独でのまたは任意の組み合わせでの、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータのいずれか：高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）条件における約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度；低ｐＣＯ２条件における約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度；約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２；約０日〜約１５０日の細胞培養期間；約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度を調節することを含み、前記細胞培養培地保持期間は、約２５℃〜３９℃の温度で、約０時間〜約１２０時間である。
【００１５】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程は、播種前細胞培養培地保持期間ならびに細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータ：高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）条件における約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度、または低ｐＣＯ２条件における約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度；約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２；および約０日〜約１５０日の細胞培養期間を調節することを含み、細胞培養培地保持期間は、約２５℃〜３９℃の温度で約０時間〜約１２０時間である。
【００１６】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程は、細胞培養期間ならびに単独でのまたは任意の組み合わせでの、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータのいずれか：約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度を調節することを含み、細胞培養期間は約０日〜約１５０日である。
【００１７】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程は、約０ｎＭ〜約３００ｎＭのＮａ＋濃度ならびに単独でのまたは任意の組み合わせでの、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータのいずれか：約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度を調節することを含み、約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度。
【００１８】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程は、Ｎａ＋濃度および約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２を調節することを含む。
【００１９】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程は、浸透圧ならびに単独でのまたは任意の組み合わせでの、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータのいずれか：約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度を調節することを含み、浸透圧は約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【００２０】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程は、低ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度を調節すること、または高ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度を調節すること、約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度を調節すること、および約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含む。
【００２１】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節は、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧および約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２を調節することを含む。
【００２２】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節は、約２９℃〜約３９℃の培養温度および約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度および／または約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度を調節することを含む。
【００２３】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節は、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２および約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度を調節することを含む。
【００２４】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度および約２９℃および約３９℃の培養温度を調節することを含む。
【００２５】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節は、ｐＣＯ２濃度ならびに単独でのまたは任意の組み合わせでの、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータのいずれか：高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）条件における約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度；低ｐＣＯ２条件における約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度；約２５℃〜３９℃の温度での約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；約０日〜約１５０日の細胞培養期間；約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度を調節することを含み、ｐＣＯ２濃度は、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇである。
【００２６】
ある実施形態において、Ｍｎ濃度は、高ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭ；高ｐＣＯ２培養物中で、約１ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約４０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭ；高ｐＣＯ２培養物中で、約１ｎＭ〜約５００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２０，０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである。
【００２７】
ある実施形態において、Ｍｎ濃度は、低ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり；低ｐＣＯ２培養物中で、約１ｎＭ〜約２００００ｎＭ；約１ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約４０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭ；約１ｎＭ〜約５００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約５００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約５０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２００００ｎＭまたは約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである。
【００２８】
ある実施形態において、Ｍｎ濃度の調節は、細胞培養原材料中のＭｎ含有量を決定すること、およびＭｎ濃度を調節するために原材料ロットを選択することを含む。
【００２９】
ある実施形態において、Ｍｎ濃度の調節は、Ｍｎ濃度を調節するために、（ｉ）細胞培養培地もしくは細胞培養と接触している材料を調節すること；または（ｉｉ）細胞培養培地中にもしくは細胞培養の間に浸出されたＭｎの濃度を考慮すること；または（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む。ある実施形態において、浸出されたＭｎは、（ｉ）フィルタ；（ｉｉ）培地調製物、保持もしくは培養容器；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせとの、細胞培養物および／または細胞培養培地の接触によって生成される。ある実施形態において、フィルタとしては、デプスフィルタ、カラム、膜および円板が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、フィルタ材料としては、珪藻土、中空の繊維または樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
ある実施形態において、細胞培養培地は、基本培地、再構成された培地、流加培地、加水分解産物、補助剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、血清または添加物である。
【００３１】
ある実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養物の生成段階の間に補充される。
【００３２】
ある実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養物の生成段階の前に補充される。
【００３３】
ある実施形態において、細胞培養培地は、Ｍｎ、フコース、ガラクトースおよび／またはＮａ＋の１つまたは複数を含み、補充は、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づく。
【００３４】
ある実施形態において、Ｍｎ、フコース、ガラクトースおよびＮａ＋の１つまたは複数は、大量瞬時投与として、断続的な補充として、継続的な補充として、半継続的な補充として、フィードバックループをベースとする補充として、またはこれらの１つもしくは複数の組み合わせとして補充される。
【００３５】
ある実施形態において、細胞培養培地は、ｉ）Ｍｎ；ｉｉ）フコース；ｉｉｉ）ガラクトース；および／またはｉｖ）Ｎａ＋の１つまたは複数から実質的になる。
【００３６】
ある実施形態において、Ｍｎ濃度の調節は、高温短時間（ＨＴＳＴ）熱処理前に、約６．１〜約７．３；または約６．３〜約７．３の細胞培養培地ｐＨを利用することを含む。
【００３７】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節は、ｐＣＯ２を調節することを含む。
【００３８】
ある実施形態において、細胞培養物または細胞培養培地はバイオリアクター中にあり、ｐＣＯ２の調節は、バイオリアクター作動体積；バイオリアクター気体散布戦略；バイオリアクター撹拌戦略；バイオリアクター培地交換戦略、バイオリアクター灌流戦略、バイオリアクター供給戦略またはこれらの任意の組み合わせを調節することによって達成される。
【００３９】
ある実施形態において、ｐＣＯ２調節は、高ｐＣＯ２培養物を確立することを含む。ある実施形態において、ｐＣＯ２は、約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約１５０ｍｍＨｇ、または約３０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇである。
【００４０】
ある実施形態において、ｐＣＯ２調節は、低ｐＣＯ２培養物を確立することを含む。ある実施形態において、ｐＣＯ２は、約１０ｍｍＨｇ〜約１００ｍｍＨｇ、１０ｍｍＨｇ〜約８０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約７０ｍｍＨｇまたは約３０ｍｍＨｇ〜約６０ｍｍＨｇである。
【００４１】
ある実施形態において、ｐＣＯ２調節は、培養の０日で起こる。
【００４２】
ある実施形態において、ｐＣＯ２調節は、細胞培養のおおむね大半；最初の約５日間；最初の約７日間；または最初の約１０日間起こる。
【００４３】
ある実施形態において、ｐＣＯ２調節は、生産培養（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）のおおむね大半；最初の約５日間；最初の約７日間；または最初の約１０日間起こる。
【００４４】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節は、播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含み、播種前細胞培養培地保持期間は、約０時間〜約１２０時間、約０時間〜約７２時間：約０時間〜約４８時間、または約０時間〜約２４時間である。
【００４５】
ある実施形態において、播種前細胞培養培地保持の間の培地の温度は、約２５℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３５℃〜約３９℃または約３６℃〜約３９℃である。
【００４６】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節は、細胞培養期間を調節することを含み、細胞培養期間は、約０日〜約１５０日、約０日〜約１５日、約０日〜約１２日、０日〜約７日または約０日〜約５日である。
【００４７】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節は、Ｎａ＋濃度を調節することを含み、Ｎａ＋濃度は、約０ｍＭ〜約３００ｍＭであり；約２０ｍＭ〜約２０ｍＭ；約３０ｍＭ〜約１５０ｍＭ；または約４０ｍＭ〜約１３０ｍＭである。
【００４８】
ある実施形態において、Ｎａ＋濃度の調節は、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＮａＯＨ、ＮａＣｌまたはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないＮａ化合物を細胞培養物に補充することを含む。
【００４９】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節は、浸透圧を調節することを含み、浸透圧は、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ；約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ；または約３２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４２５ｍＯｓｍ／ｋｇである。ある実施形態において、浸透圧の調節は、細胞培養物に浸透圧調節培地成分を補充することを含む。ある実施形態において、浸透圧調節培地成分は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ソルビトール、浸透圧保護剤またはこれらの組み合わせである。ある実施形態において、浸透圧調節培地成分は、大量瞬時投与として、断続的な補充として、継続的な補充として、半継続的な補充として、フィードバックループをベースとする補充として、またはこれらの１つもしくは複数の組み合わせとして補充される。
【００５０】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節は、ガラクトース濃度を調節することを含み、ガラクトース濃度は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭまたは約０ｍＭ〜約５０ｍＭである。
【００５１】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節は、フコース濃度を調節することを含み、フコース濃度は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり；０ｍＭ〜約４０ｍＭ；約０ｍＭ〜約２０ｍＭ；または約０ｍＭ〜約１０ｍＭである。
【００５２】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節は、細胞培養温度を調節することを含み、細胞培養温度は、約２９℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３１℃〜約３８℃、または約３４℃〜約３８℃である。
【００５３】
ある実施形態において、細胞培養温度は、細胞培養物の生成段階の間に調節される。
【００５４】
ある実施形態において、細胞培養温度は、細胞培養物の生産段階の前に調節される。
【００５５】
ある実施形態において、細胞培養温度は、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づいて調節される。
【００５６】
ある実施形態において、細胞培養物は真核細胞を含む。ある実施形態において、真核細胞は、昆虫、鳥、真菌、植物または哺乳動物細胞である。ある実施形態において、真菌細胞は、酵母、ピキアまたは任意の糸状真菌細胞である。ある実施形態において、酵母細胞は、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である。ある実施形態において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。
【００５７】
ある実施形態において、細胞培養物は、使い捨て技術（ＳＵＴ）袋もしくはバイオリアクター；ＷＡＶＥバイオリアクター；ステンレス鋼バイオリアクター；フラスコ；チューブおよびチャンバーを含むがこれらに限定されないバイオリアクター中にある。
【００５８】
ある実施形態において、細胞培養物の体積は、１ｍＬ〜３５，０００Ｌである。ある実施形態において、細胞培養物の体積は、１ｍＬ〜１０ｍｌ、１ｍＬ〜５０ｍｌ、１ｍＬ〜１００ｍｌ、１ｍＬ〜２００ｍｌ、１ｍＬ〜３００ｍｌ、１ｍＬ〜５００ｍｌ、１ｍＬ〜１０００ｍｌ、１ｍＬ〜２０００ｍｌ、１ｍＬ〜３０００ｍｌ、１ｍＬ〜４０００ｍｌ、１ｍＬ〜５０００ｍｌ、１ｍＬ〜１Ｌ、１ｍＬ〜２Ｌ、１ｍＬ〜３Ｌ、１ｍＬ〜４Ｌ、１ｍＬ〜５Ｌ、１ｍＬ〜６Ｌ、１ｍＬ〜１０Ｌ、１ｍＬ〜２０Ｌ、１ｍＬ〜３０Ｌ、１ｍＬ〜４０Ｌ、１ｍＬ〜５０Ｌ、１ｍＬ〜６０Ｌ、１ｍＬ〜７０Ｌ、１ｍＬ〜１００Ｌ、１ｍＬ〜２００Ｌ、１ｍＬ〜３００Ｌ、１ｍＬ〜４００Ｌ、１ｍＬ〜５００Ｌ、１ｍＬ〜１０００Ｌ、１ｍＬ〜２０００Ｌ、１ｍＬ〜３０００Ｌ、１ｍＬ〜４０００Ｌ、１ｍＬ〜５０００Ｌ、１ｍＬ〜１０，０００Ｌ、１ｍＬ〜２０，０００Ｌ、１ｍＬ〜３０，０００Ｌ、１ｍＬ〜３０，０００Ｌ、１ｍＬ〜３５，０００Ｌである。
【００５９】
ある実施形態において、本開示は、細胞培養培地、流加培地、加水分解産物または添加物を調製するための方法であって、約１ｎＭ〜約２００００ｎＭの高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）培養物におけるＭｎ濃度；約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの低ｐＣＯ２培養物におけるＭｎ濃度；約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２；約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；約０日〜約１５０日の細胞培養期間；約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度を調節する１つまたは複数の工程を含み、細胞培養培地、流加培地、加水分解産物または添加物が関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する方法を対象とする。
【００６０】
ある実施形態において、これらの方法は、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２、約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度および約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含む。
【００６１】
ある実施形態において、これらの方法は、約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２および約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度を調節することを含む。
【００６２】
ある実施形態において、これらの方法は、約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２、約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度および約０時間〜約７２時間の播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含む。
【００６３】
ある実施形態において、これらの方法は、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２および約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度を調節することを含む。
【００６４】
ある実施形態において、これらの方法は、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧および約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２を調節することを含む。
【００６５】
ある実施形態において、これらの方法は、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２、約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度、約０日〜約１５０日の細胞培養期間および約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含む。
【００６６】
ある実施形態において、これらの方法は、約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度および約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度を調節することを含む。
【００６７】
ある実施形態において、これらの方法は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度および約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度を調節することを含む。
【００６８】
ある実施形態において、これらの方法は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度および約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２を調節することを含む。
【００６９】
ある実施形態において、これらの方法は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度、約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度および約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２を調節することを含む。
【００７０】
ある実施形態において、これらの方法は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度を調節することを含み、細胞培養温度は約２９℃〜約３９℃である。
【００７１】
ある実施形態において、これらの方法は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度および約０日〜約１５０日の細胞培養期間を調節することを含む。
【００７２】
ある実施形態において、Ｍｎ濃度は、高ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭ；高ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約１０００ｎＭ；高ｐＣＯ２培養物中で約２０ｎＭ〜約３００ｎＭ；または高ｐＣＯ２培養物中で約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである。
【００７３】
ある実施形態において、Ｍｎ濃度は、低ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭ；低ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約３０００ｎＭ；低ｐＣＯ２培養物中で約２０ｎＭ〜約３００ｎＭ；または低ｐＣＯ２培養物中で約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである。
【００７４】
ある実施形態において、Ｍｎ濃度の調節は、細胞培養原材料中のＭｎ含有量を決定すること、およびＭｎ濃度を調節するために原材料ロットを選択することを含む。
【００７５】
ある実施形態において、Ｍｎ濃度の調節は、Ｍｎ濃度を調節するために、ｉ）細胞培養培地もしくは細胞培養と接触している材料を調節すること；または（ｉｉ）細胞培養培地中にもしくは細胞培養の間に浸出されたＭｎの濃度を考慮すること；または（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む。
【００７６】
ある実施形態において、浸出されたＭｎは、（ｉ）フィルタ；（ｉｉ）培地調製物、保持もしくは培養容器；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせとの、細胞培養物および／または細胞培養培地の接触によって生成される。ある実施形態において、フィルタとしては、デプスフィルタ、カラム、膜および円板が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、フィルタ材料としては、珪藻土、中空の繊維または樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
ある実施形態において、Ｍｎ濃度の調節は、ＨＴＳＴ処理前に、約６．１〜約７．３；または約６．３〜約７．３の細胞培養培地ｐＨを利用することを含む。
【００７８】
ある実施形態において、ｐＣＯ２が調節される。ある実施形態において、細胞培養培地はバイオリアクター中にあり、ｐＣＯ２の調節は、バイオリアクター作動体積；バイオリアクター気体散布戦略；バイオリアクター撹拌戦略；バイオリアクター供給戦略、バイオリアクター灌流戦略、バイオリアクター培地交換戦略またはこれらの任意の組み合わせを調節することによって達成される。ある実施形態において、ｐＣＯ２調節は、高ｐＣＯ２培養物を確立することを含む。ある実施形態において、ｐＣＯ２は、約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約１５０ｍｍＨｇまたは約３０ｍｍＨｇ〜約１５０ｍｍＨｇである。
【００７９】
ある実施形態において、ｐＣＯ２調節は、低ｐＣＯ２培養物を確立することを含む。ある実施形態において、ｐＣＯ２は、約１０ｍｍＨｇ〜約１００ｍｍＨｇ、１０ｍｍＨｇ〜約８０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約７０ｍｍＨｇまたは約３０ｍｍＨｇ〜約６０ｍｍＨｇである。ある実施形態において、ｐＣＯ２調節は、培養の０日で起こる。ある実施形態において、ｐＣＯ２調節は、細胞培養のおおむね大半；最初の約５日間；最初の約７日間；または最初の約１０日間起こる。ある実施形態において、ｐＣＯ２調節は、生産培養のおおむね大半；最初の約５日間；最初の約７日間；または最初の約１０日間起こる。
【００８０】
ある実施形態において、播種前細胞培養培地保持期間は、約０時間〜約１２０時間、０時間〜約７２時間、約０時間〜約４８時間または約０時間〜約２４時間である。ある実施形態において、播種前細胞培養培地保持の間の培地の温度は、約２５℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３５℃〜約３９℃または約３６℃〜約３９℃である。
【００８１】
ある実施形態において、細胞培養期間は、約０日〜約１５０日、約０日〜約１５日、約０日〜約１２日、０日〜約７日または約０日〜約５日である。
【００８２】
ある実施形態において、Ｎａ＋濃度は、約０ｍＭ〜約３００ｍＭであり、約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１５０ｍＭまたは約４０ｍＭ〜約１３０ｍＭである。ある実施形態において、Ｎａ＋濃度の調節は、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＮａＯＨ、ＮａＣｌまたはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないＮａ化合物を細胞培養物に補充することを含む。
【００８３】
ある実施形態において、の浸透圧は、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇまたは約３２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４２５ｍＯｓｍ／ｋｇである。ある実施形態において、浸透圧の調節は、細胞培養物に浸透圧調節培地成分を補充することを含む。ある実施形態において、浸透圧調節培地成分は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ソルビトール、浸透圧保護剤またはこれらの組み合わせである。
【００８４】
ある実施形態において、ガラクトース濃度は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭまたは約０ｍＭ〜約５０ｍＭである。
【００８５】
ある実施形態において、フコース濃度は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭ、０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約０ｍＭ〜約２０ｍＭまたは約０ｍＭ〜約１０ｍＭである。
【００８６】
ある実施形態において、細胞培養温度は、約２９℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３１℃〜約３８℃または約３４℃〜約３８℃である。
【００８７】
ある実施形態において、本開示は、組換えタンパク質の作製のための真核細胞発酵過程を対象とする。ある実施形態において、組換えタンパク質は、抗体または抗体断片、ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）、ＢｓＤｂ（二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＤｂ（一本鎖二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＴａＦｖ（一本鎖二重特異性タンデム可変ドメイン）、ＤＮＬ−（Ｆａｂ）３（ドック・アンド・ロック（ｄｏｃｋ−ａｎｄ−ｌｏｃｋ）三価Ｆａｂ）、ｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）およびＢｓｓｄＡｂ（二重特異性単一ドメイン抗体）である。ある実施形態において、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。ある実施形態において、抗体は、抗ＣＤ２０抗体である。ある実施形態において、抗ＣＤ２０抗体は、オクレリズマブである。ある実施形態において、抗体または抗体断片は、約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の％Ｇ０−Ｆ（パーセントフコシル化欠損糖タンパク質）；約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％もしくは約１％〜約８％の標準化された％Ｇ０−Ｆ；および／または約４０％〜約９０％；約５０％〜約９０％；約５５％〜約８５％；もしくは約６０％〜約８０％の％Ｇ０（パーセントガラクトシル化欠損糖タンパク質）を示す。ある実施形態において、真核細胞は、昆虫、鳥、真菌、植物または哺乳動物細胞である。ある実施形態において、真菌細胞は、酵母、ピキアまたは任意の糸状真菌細胞である。ある実施形態において、酵母細胞は、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である。ある実施形態において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。
【００８８】
ある実施形態において、本開示は、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、約１ｎＭ〜約２００００ｎＭの高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）培養物中のＭｎ濃度；約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの低ｐＣＯ２培養物中のＭｎ濃度；約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２；約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；約０日〜約１５０日の細胞培養期間；約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度から選択される１つまたは複数の所定のパラメータを目標とするように調節された細胞培養物および／または細胞培養培地とを含む細胞培養組成物を対象とする。
【００８９】
ある実施形態において、Ｍｎ濃度は約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり、播種前細胞培養培地保持期間は約０時間〜約１２０時間である。
【００９０】
ある実施形態において、ｐＣＯ２は約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇであり、Ｎａ＋濃度は約０ｍＭ〜約３００ｍＭ、播種前細胞培養培地保持期間は約０時間〜約１２０時間である。
【００９１】
ある実施形態において、Ｍｎ濃度は、約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり、ｐＣＯ２は、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇであり、Ｎａ＋濃度は、約０ｍＭ〜約３００ｍＭである。
【００９２】
ある実施形態において、Ｍｎ濃度は、約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり、ｐＣＯ２は、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇであり、Ｎａ＋濃度は、約０ｍＭ〜約３００ｍＭであり、播種前細胞培養培地保持期間は、約０時間〜約１２０時間である。
【００９３】
ある実施形態において、ｐＣＯ２は、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇであり、Ｎａ＋濃度は、約０ｍＭ〜約３００ｍＭである。
【００９４】
ある実施形態において、浸透圧は、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、ｐＣＯ２は、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇである。
【００９５】
ある実施形態において、ｐＣＯ２は、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇであり、Ｍｎ濃度は、約１ｎＭ〜約３００００ｎＭ、細胞培養期間は、約０日〜約１５０日であり、播種前細胞培養培地保持期間は、約０時間〜約１２０時間である。
【００９６】
ある実施形態において、Ｍｎ濃度は、約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり、ガラクトース濃度は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭである。ある実施形態において、フコース濃度は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり、Ｍｎ濃度は、約１ｎＭ〜約３００００ｎＭである。
【００９７】
ある実施形態において、フコース濃度は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり、ｐＣＯ２は、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇである。ある実施形態において、フコース濃度は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり、Ｍｎ濃度は、約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり、ｐＣＯ２は、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇである。ある実施形態において、フコース濃度は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり、細胞培養温度は、約２９℃〜約３９℃である。ある実施形態において、フコース濃度は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり、細胞培養期間は、約０日〜約１５０日である。
【００９８】
ある実施形態において、本開示は、細胞培養物中に関心対象の糖タンパク質を作製する方法であって、本明細書に開示されている実施形態のいずれか１つに係る方法に、真核細胞を培養するのに適した細胞培養培地を供すること、調節された細胞培養培地に組換えタンパク質を発現する真核細胞を播種すること、組換えタンパク質が発現されるように、前記真核細胞を培養すること、を含む方法を対象とする。
【００９９】
ある実施形態において、本開示は、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化を調節する方法であって、細胞培養培地のマンガン濃度が目標とされた範囲内に属するかどうかを判定するために細胞培養培地をアッセイすること、前記目標とされた範囲内に属している細胞培養培地中で、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞を培養することを含み、マンガン濃度の目標とされた範囲外に属する培養培地中での、宿主細胞によって発現された関心対象の糖タンパク質のグリコシル化と比較して、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化が調節されている、方法を対象とする。
【０１００】
ある実施形態において、本開示は、関心対象の糖タンパク質を含む組成物であって、調製物が、細胞培養培地のマンガン濃度が目標とされた範囲内に属するかどうかを判定するためにアッセイされた細胞培養培地と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、関心対象の糖タンパク質とを含む、組成物を対象とする。
【０１０１】
ある実施形態において、本開示は、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化を調節する方法であって、関心対象の糖タンパク質を発現する宿主細胞の培養において使用されている細胞培養培地に、高ＣＯ２条件下で約１０ｎＭ〜約２０００ｎＭのマンガンを補充すること、または関心対象の糖タンパク質を発現する宿主細胞の培養において使用されている細胞培養培地に、低ＣＯ２条件下で約１０ｎＭ〜約３０００ｎＭのマンガンを補充することを含み、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化が、このように補充されなかった培養培地中で宿主細胞によって発現される関心対象の糖タンパク質のグリコシル化と比較して調節されている、方法を対象とする。
【０１０２】
ある実施形態において、本開示は、細胞培養組成物であって、高ＣＯ２条件下での約１０ｎＭ〜約２０００ｎＭマンガンまたは低ＣＯ２条件下での約１０ｎＭ〜約３０００ｎＭマンガンが補充された細胞培養培地と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞とを含む細胞培養組成物を対象とする。
【０１０３】
ある実施形態において、本開示は、関心対象の糖タンパク質を含む組成物であって、調製物が、マンガンが補充された細胞培養培地であって、培養物に、高ＣＯ２条件下での約１０ｎＭ〜約２０００ｎＭのマンガンまたは低ＣＯ２条件下での約１０ｎＭ〜約３０００ｎＭのマンガンが補充されている細胞培養培地と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、関心対象の糖タンパク質とを含む、組成物を対象とする。
【０１０４】
ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化を調節する方法は、細胞培養培地および／または細胞培養物のマンガン濃度が目標とされた範囲内に属するかどうかを判定するために、細胞培養培地および／または細胞培養物をアッセイすること、ならびに目標とされた範囲内に属する細胞培養培地中で関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞を培養することを含む。ある実施形態において、マンガン濃度の目標とされた範囲外に属する培養培地および／または細胞培養物中で宿主細胞によって発現される関心対象の糖タンパク質のグリコシル化と比較して、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化は調節されている。いくつかの実施形態において、マンガン濃度目標範囲は、２０ｎＭ〜２００ｎＭである。非限定的な実施形態において、マンガン濃度目標範囲は、約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである。
【０１０５】
ある実施形態において、開示された関心対象の糖タンパク質は抗体である。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。非限定的な実施形態において、抗体は、オクレリズマブである。
【０１０６】
ある実施形態において、開示された宿主細胞は、哺乳動物細胞である。宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり得る。
【０１０７】
ある実施形態において、開示されている細胞培養培地のアッセイは、細胞培養培地の成分のマンガン濃度をアッセイすることを含む。ある実施形態において、開示されている細胞培養物のアッセイは、細胞培養物の成分のマンガン濃度をアッセイすることを含む。細胞培養培地の成分は、加水分解産物または血清である。細胞培養培地の成分は、複数の成分の複雑な混合物でもあり得る。
【０１０８】
ある実施形態において、グリコシル化は、ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０（フコシル化された、ガラクトシル化欠損Ｇ０））を減少させながら、増加されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０））を達成するために調節される。ある実施形態において、グリコシル化は、ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を増加させながら、減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために調節される。
【０１０９】
ある実施形態において、グリコシル化は、ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）に影響を与えずに、増加されたまたは減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために調節される。ある実施形態において、グリコシル化は、フコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）に影響を与えずに、増加されたまたは減少されたガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を達成するために調節される。
【０１１０】
ある実施形態において、本明細書に開示されている主題は、細胞培養組成物であって、細胞培養培地および／または細胞培養物のマンガン濃度が目標とされた範囲内に属するかどうかを判定するためにアッセイされた細胞培養培地および／または細胞培養物と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞とを含む細胞培養組成物を対象とする。ある実施形態において、マンガン濃度は、培養培地および／または細胞培養物と接触しており、マンガンを浸出することができる原材料（例えば、デプスフィルタおよび／または培地フィルタ（ｍｅｄｉａ  ｆｉｌｔｅｒ）、培地調製および／または保持容器ならびにバイオリアクター）の選択または回避を通じて調節される。ある実施形態において、細胞培養組成物は、関心対象の糖タンパク質をさらに含む。ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質は抗体である。ある実施形態において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。ある実施形態において、抗体はオクレリズマブである。ある実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。
【０１１１】
ある実施形態において、本明細書に開示されている主題は、関心対象の糖タンパク質を含む調製物であって、調製物が、細胞培養培地のマンガン濃度が目標とされた範囲内に属するかどうかを判定するためにアッセイされた細胞培養培地と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、関心対象の糖タンパク質とを含む、調製物を対象とする。ある実施形態において、マンガン濃度は、所望のレベルでマンガンを含有する原材料の選択を通じて調節される。ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質は抗体である。ある実施形態において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。ある実施形態において、抗体はオクレリズマブである。ある実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。
【０１１２】
ある実施形態において、本明細書に開示されている主題は、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化を調節する方法であって、関心対象の糖タンパク質を発現する宿主細胞の培養において使用されている細胞培養培地に、高ＣＯ２条件下で約１０ｎＭ〜約２０００ｎＭマンガンを補充すること、または関心対象の糖タンパク質を発現する宿主細胞の培養において使用されている細胞培養培地に、低ＣＯ２条件下で約１０ｎＭ〜約３０００ｎＭマンガンを補充することを含み、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化が、このように補充されなかった培養培地中で宿主細胞によって発現される関心対象の糖タンパク質のグリコシル化と比較して調節されている、方法を対象とする。ある実施形態において、マンガンは、細胞培養物に直接補充される。ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質は抗体である。ある実施形態において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。ある実施形態において、抗体はオクレリズマブである。ある実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。ある実施形態において、グリコシル化は、ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０（フコシル化されたＧ０））を減少させながら、増加されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０））を達成するために調節される。ある実施形態において、グリコシル化は、ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を増加させながら、減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために調節される。
【０１１３】
ある実施形態において、本明細書に開示されている主題は、細胞培養組成物であって、高ＣＯ２条件下での約１０ｎＭ〜約２０００ｎＭマンガンまたは低ＣＯ２条件下での約１０ｎＭ〜約３０００ｎＭマンガンが補充された細胞培養培地および／または細胞培養物と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞とを含む細胞培養組成物を対象とする。ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質は抗体である。ある実施形態において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。ある実施形態において、抗体はオクレリズマブである。ある実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。
【０１１４】
ある実施形態において、本明細書に開示されている主題は、関心対象の糖タンパク質を含む組成物であって、調製物が、マンガンが補充された細胞培養培地であって、培養物に、高ＣＯ２条件下での約１０ｎＭ〜約２０００ｎＭのマンガンまたは低ＣＯ２条件下での約１０ｎＭ〜約３０００ｎＭのマンガンが補充されている細胞培養培地と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、関心対象の糖タンパク質とを含む、組成物を対象とする。ある実施形態において、マンガンは、培養培地および／または細胞培養物と接触している間にマンガンを浸出する原材料（例えば、デプスフィルタおよび／または培地フィルタ、培地調製および／または保持容器ならびにバイオリアクター）を使用することによって補充される。ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質は抗体である。ある実施形態において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。ある実施形態において、抗体はオクレリズマブである。ある実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。
【０１１５】
ある実施形態において、本明細書に開示されている主題は、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化を調節する方法であって、約６．１０〜約７．２５のｐＨ目標を含む細胞培養培地を高温短時間（ＨＴＳＴ）熱処理に曝露すること、および細胞培養培地中で関心対象の糖タンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含み、前ＨＴＳＴ熱処理ｐＨ目標がｐＨ７．２５より大きい培養培地中で宿主細胞によって発現された関心対象の糖タンパク質のグリコシル化と比較して、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化が調節されている、方法を対象とする。ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質は抗体である。ある実施形態において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。ある実施形態において、抗体はオクレリズマブである。ある実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。ある実施形態において、Ｇ０（フコシル化されたＧ０）を減少させながら、増加されたＧ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０）を達成するために、グリコシル化が調節される。
【０１１６】
ある実施形態において、本明細書に開示されている主題は、細胞培養培地および／または細胞培養物中のＭｎレベルを調節する方法であって、高温短時間（ＨＴＳＴ）熱処理前に、約６．１〜約７．３の細胞培養培地ｐＨを使用すること、および細胞培養培地中で関心対象の糖タンパク質を発現する宿主細胞を培養することから構成される方法を対象とする。ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質は抗体である。ある実施形態において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。ある実施形態において、抗体はオクレリズマブである。ある実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。ある実施形態において、Ｇ０（フコシル化されたＧ０）を減少させながら、増加されたＧ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０）を達成するために、グリコシル化が調節される。
【０１１７】
ある実施形態において、本明細書に開示されている主題は、ＨＴＳＴ熱処理に曝露された約６．３０〜約７．２５のｐＨ目標を含む細胞培養培地と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞とを含む細胞培養組成物を対象とする。ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質は抗体である。ある実施形態において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。ある実施形態において、抗体はオクレリズマブである。ある実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。
【０１１８】
ある実施形態において、本明細書に開示されている主題は、ＨＴＳＴ熱処理への曝露前に約６．３〜約７．３のｐＨ目標を含む細胞培養培地と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞とを含む細胞培養組成物を対象とする。ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質は抗体である。ある実施形態において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。ある実施形態において、抗体はオクレリズマブである。ある実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。
【０１１９】
ある実施形態において、本明細書に開示されている主題は、関心対象の糖タンパク質を含む組成物であって、調製物が、ＨＴＳＴ熱処理に曝露された約６．１０〜約７．２５のｐＨ目標を含む細胞培養培地と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、関心対象の糖タンパク質とを含む組成物を対象とする。ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質は抗体である。ある実施形態において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。ある実施形態において、抗体はオクレリズマブである。ある実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。
【０１２０】
ある実施形態において、本明細書に開示されている主題は、関心対象の糖タンパク質を含む組成物であって、調製物が、ＨＴＳＴ熱処理への曝露前に約６．１〜約７．３のｐＨ目標を含む細胞培養培地と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、関心対象の糖タンパク質とを含む組成物を対象とする。
【０１２１】
ある実施形態において、本明細書に開示されている主題は、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化を調節する方法であって、細胞培養培地中で関心対象の糖タンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含み、細胞培養物が、より高いもしくはより低いレベルのマンガン、ガラクトースおよび／もしくはフコースが補充されており（または補充なし）、高いもしくは低いｐＣＯ２に曝露され、細胞培養物が延長もしくは短縮された培地保持時間および／もしくは培養期間に曝露され、培養物はより高いもしくはより低い培養温度に維持され、より高いもしくはより低い浸透圧に維持され、および／もしくは細胞培養物が、増加したもしくは減少したＮａ＋濃度ならびに／またはこれらの任意の組み合わせを含み、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化が、低ｐＣＯ２、短縮された培地保持時間および／または低下したＮａ＋濃度に曝露された細胞培地中で宿主細胞によって発現された関心対象の糖タンパク質の調製物のフコシル化および／またはガラクトシル化と比較して調節されている方法を対象とする。ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質は抗体である。ある実施形態において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。ある実施形態において、抗体はオクレリズマブである。ある実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。ある実施形態において、グリコシル化は、Ｇ０（フコシル化されたＧ０）または減少されたＧ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０）を減少させながら、Ｇ０（フコシル化されたＧ０）を増加させながら、増加されたＧ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０）を達成するために調節される。ある実施形態において、グリコシル化は、ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）に影響を与えずに、増加されたまたは減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために調節される。ある実施形態において、グリコシル化は、フコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）に影響を与えずに、増加されたまたは減少されたガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を達成するために調節される。
【０１２２】
ある実施形態において、本明細書に開示されている主題は、細胞培養組成物であって、マンガン、ガラクトースおよび／もしくはフコース補充（または補充なし）、高いもしくは低いｐＣＯ２、延長されたもしくは短縮された培地保持時間、延長されたもしくは短縮された培養期間、より高いもしくはより低い培養温度、より高いもしくはより低い浸透圧および／もしくは増加したもしくは減少したＮａ＋濃度ならびに／またはこれらの任意の組み合わせを含む細胞培養培地および／または細胞培養物と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞とを含む細胞培養組成物を対象とする。ある実施形態において、細胞培養組成物は、関心対象の糖タンパク質をさらに含む。ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質は抗体である。ある実施形態において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。ある実施形態において、抗体はオクレリズマブである。ある実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。
【０１２３】
ある実施形態において、本明細書に開示されている主題は、関心対象の糖タンパク質を含む組成物であって、調製物が、マンガン、ガラクトースおよび／もしくはフコース補充（または補充なし）、高いもしくは低いｐＣＯ２、延長されたもしくは短縮された培地保持時間、延長されたもしくは短縮された培養期間、より高いもしくはより低い培養温度、より高いもしくはより低い浸透圧および／もしくは増加されたもしくは減少されたＮａ＋濃度ならびに／またはこれらの任意の組み合わせを含む細胞培養培地および／または細胞培養物と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、関心対象の糖タンパク質とを含む、組成物を対象とする。ある実施形態において、関心対象の糖タンパク質は抗体である。ある実施形態において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。ある実施形態において、抗体はオクレリズマブである。ある実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、生産培養物の０日におけるＭｎレベルの変動が、ガラクトシル化欠損、％Ｇ０（フコシル化されたＧ０、下）およびフコシル化欠損、標準化された％Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損、上）抗体種の変動と相関することを図示する。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、オクレリズマブ細胞培養過程におけるｍＡｂ生成物のガラクトシル化およびフコシル化に対する０日のマンガン濃度の効果を図示する。０日のＭｎ濃度（ｎＭ）に対するＧ０のプロットが図２Ａに図示されている。０日のＭｎ濃度（ｎＭ）に対する標準化されたＧ０−Ｆのプロットが図２Ｂに図示されている。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、オクレリズマブ細胞培養過程におけるｍＡｂ生成物のガラクトシル化およびフコシル化に対する０日の補充されたＭｎの効果を図示する。補充されたＭｎ濃度（ｎＭ）に対するＧ０のプロットが図３Ａに図示されている。補充されたＭｎ濃度（ｎＭ）に対するＧ０−Ｆのプロットが図３Ｂに図示されている。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、様々なレベルの細胞培養規模でのオクレリズマブ細胞培養過程におけるｍＡｂ生成物のガラクトシル化およびフコシル化に対する０日のＭｎ濃度の効果を図示する。０日のＭｎ濃度（ｎＭ）に対する標準化されたＧ０−Ｆのプロットが図４Ａに図示されている。０日のＭｎ濃度（ｎＭ）に対するＧ０のプロットが図４Ｂに図示されている。２Ｌ規模依存性因子（２Ｌ  ｓｃａｌｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）は、バイオリアクター中での高ｐＣＯ２環境の使用を表す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、様々なレベルの細胞培養規模でのオクレリズマブ細胞培養過程におけるｍＡｂ生成物のガラクトシル化およびフコシル化に対する補充されたＭｎの効果を図示する。補充されたＭｎ濃度（ｎＭ）に対する標準化されたＧ０−Ｆのプロットが図５Ａに図示されている。補充されたＭｎ濃度（ｎＭ）に対するＧ０のプロットが図５Ｂに図示されている。２Ｌ規模依存性因子は、バイオリアクター中での高ｐＣＯ２環境の使用を表す。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、抗体Ｉ細胞培養過程に対する補充されたＭｎの効果を図示する。Ｍｎ補充が総フコシル化欠損（Ｇ０）を増加させることを示すプロットが図６Ａに図示されている。Ｍｎ補充がガラクトシル化欠損（％Ｇ０Ｆ）を減少させることを示すプロットが図６Ｂに図示されている。
【図７】図７は、抗体ＩＩ細胞培養過程に対する補充されたＭｎの効果を図示する。Ｍｎ補充は、％Ｇ０−Ｆ（上）を増加させ、％Ｇ０（下）を減少させる。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、抗体ＩＩＩ細胞培養過程に対する補充されたＭｎの効果を図示する。Ｍｎ補充が％Ｇ０−Ｆを増加させることを示すプロットが図８Ａに図示されている。Ｍｎ補充が％Ｇ０を減少させることを示すプロットが図８Ｂに図示されている。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、抗体ＩＶ細胞培養過程に対する補充されたＭｎの効果を図示する。Ｍｎ補充が％Ｇ０−Ｆを増加させることを示すプロットが図９Ａに図示されている。Ｍｎ補充が％Ｇ０を減少させることを示すプロットが図９Ｂに図示されている。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、抗体Ｖ細胞培養過程に対する補充されたＭｎの効果を図示する。Ｍｎ補充が％Ｇ０−Ｆを増加させることを示すプロットが図１０Ａに図示されている。Ｍｎ補充が％Ｇ０を減少させることを示すプロットが図１０Ｂに図示されている。
【図１１】図１１は、グリコシル化に対するＭｎ添加タイミングの効果を図示する（上：％Ｇ０−Ｆおよび下：％Ｇ０）。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、グリコシル化（図１２Ａ）および標準化されたＧ０−Ｆ（図１２Ｂ）に対する、生産培養中のＭｎ添加タイミングの効果を図示する。
【図１３】図１３は、オクレリズマブＨＴＳＴ熱処理の間に観察された例示的な典型的および非典型的高温短時間（ＨＴＳＴ）圧力（上）および流速プロファイル（下）を図示する。
【図１４】図１４は、濁りの変化（左）およびＭｎ喪失（右）対サンドバス（Ｓａｎｄ  Ｂａｔｈ）ＨＴＳＴスクリーニング中の培地の前ＨＴＳＴ  ｐＨ調整を図示する。
【図１５】図１５は、２Ｌ細胞培養性能に対する前ＨＴＳＴ  ｐＨ調整の影響を図示する。主要な性能指標（％最終生存率（上）、ＩＶＰＣＶ（中央）および最終力価（下））が示されている。
【図１６】図１６は、２Ｌ細胞培養性能に対する前ＨＴＳＴ  ｐＨ調整の影響を図示する。電荷関連変異形（％軽度保護された酸性領域（上）、％主要ＩＥ−ＨＰＬＣ（中央）および％塩基性領域（下））が示されている。
【図１７】図１７は、２Ｌ細胞培養性能に対する前ＨＴＳＴ  ｐＨ調整の影響を図示する。サイズ関連変異形（％ＨＭＷＳ（上）、主ピークＳＥ−ＨＰＬＣ（中央）および％Ｆａｂ（下））が示されている。
【図１８】図１８は、２Ｌバイオリアクターからのグリカンに対する前ＨＴＳＴ  ｐＨ調整の影響を図示する。％Ｇ０、％Ｇ０−Ｆ、％標準化されたＧ０−Ｆ、％Ｇ２＋ＮＡＮＡ、％Ｍａｎ５、％Ｇ１／Ｇ１’、％Ｇ２が示されている。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｈは、抗体ＩＩＩとのＨＴＳＴ熱処理前の培地に対するｐＨ調整目標の効果を図示する。実験のデザインを示す模式図が、図１９Ａに図示されている。ＨＴＳＴ熱処理前の培地ｐＨ目標に対するマンガン濃度の変動性チャートが、図１９Ｂに図示されている。最終生存率（上）およびＩＶＰＣＶ（下）の変動性チャートが、図１９Ｃに図示されている。１３日（左）および１４日（右）力価の変動性チャートが図１９Ｄに図示されている。１３日（左）および１４日％Ｇ０−Ｆ（右）の変動性チャートが図１９Ｅに図示されている。１３日（左）および１４日％Ｇ０（右）の変動性チャートが図１９Ｆに図示されている。１３日（左列）および１４日サイズ変異形（右列）の変動性チャートが図１９Ｇに図示されており、サイズ関連変異形には、％ＨＭＷＳ、％主ピークおよび％ＬＭＷＳが含まれる。１３日（左列）および１４日電荷関連変異形（右列）の変動性チャートが図１９Ｈに図示されており、電荷関連変異形には、％軽度保護された酸性領域、％主ピークＩＥ−ＨＰＬＣおよび％塩基性領域が含まれる。
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂは、例示的なバイオリアクターの模式図を図示する。二酸化炭素（ｐＣＯ２）モデルの高分圧（上）および高ｐＣＯ２モデル中で一定の溶解された酸素を維持するための通気戦略を示すプロット（下）が図２０Ａに図示されている。低ｐＣＯ２モデルおよび低ｐＣＯ２モデル中で一定の溶解された酸素を維持するための通気戦略を示すプロット（下）が図２０Ｂに図示されている。
【図２１】図２１Ａおよび２１Ｂは、採集の時点における（１２日）ｍＡｂのフコシル化欠損（標準化されたＧ０−Ｆとして計算された）に対するｐＣＯ２モデル、培地保持およびＭｎ補充ならびにこれらの組み合わせの効果および培養物に対するｐＣＯ２プロファイルを図示する。０日のＭｎレベルが、補充されていない培養物と比較して、Ｍｎ補充された培養物中でおよそ５倍高いことを示すプロットが図２１Ａに図示されている。低および高ｐＣＯ２モデルにおいて維持された培養物に対するｐＣＯ２プロファイルを示すプロットが、図２１Ｂに図示されている。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｄは、ＣＨＯ細胞に対するｐＣＯ２および培地保持の効果を図示する。（０日での）増加するレベルのＭｎ補充による、採集の時点（１２日）におけるｍＡｂのフコシル化欠損（標準化されたＧ０−Ｆとして計算される）を示すプロットが図２２Ａに図示されている。細胞培養中のｐＣＯ２プロファイルを示すプロットが、図２２Ｂに図示されている。細胞（ｃａｌｌ）培養中の浸透圧プロファイルを示すプロットが、図２２Ｃに図示されている。細胞培養中のＮａ＋プロファイルを示すプロットが、図２２Ｄに図示されている。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｄは、ＣＨＯ細胞に対する浸透圧、ｐＣＯ２モデルおよび浸透圧滴定剤の種類の効果を図示する。採集の時点（１２日）におけるｍＡｂのフコシル化欠損（標準化されたＧ０−Ｆとして計算される）を示すプロットが図２３Ａに図示されている。細胞培養中のＮａ＋プロファイルを示すプロットが、図２３Ｂに図示されている。細胞培養中のｐＣＯ２プロファイルを示すプロットが、図２３Ｃに図示されている。細胞（ｃａｌｌ）培養中の浸透圧プロファイルを示すプロットが、図２３Ｄに図示されている。
【図２４】図２４Ａおよび２４Ｂは、ＣＨＯ細胞中で測定された細胞内ｐＨ（ｐＨｉ）に対するｐＣＯ２および浸透圧の効果を図示する。類似の浸透圧（４０６〜４１３ｍＯｓｍ／ｋｇ）およびＮａ＋（８３〜８７ｍＭ）レベルを維持しながら、異なるｐＣＯ２レベルを示すプロットが図２４Ａに図示されている。類似のｐＣＯ２レベル（２３〜２８ｍｍＨｇ）を維持しながら、異なる浸透圧レベル（浸透圧滴定剤としてＮａＣｌ；４６〜１５２ｍＭ  Ｎａ＋を使用）を示すプロットが、図２４Ｂに図示されている。
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、３−Ｌバイオリアクター中で生産されたｍＡｂのフコシル化欠損（標準化されたＧ０−Ｆとして計算された）に対する異なる培養条件および培養期間の効果を図示する。培養条件の差を示すチャートが、図２５Ａに例示されている。７日および採集の時点（１２日）におけるフコシル化欠損レベルを示すプロットが、図２５Ｂに図示されている。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｄは、グローバルプロテオーム分析を図示する。実験のデザインおよび作業の流れを示す模式図が、図２６Ａに図示されている。日（ＰＣ１）および細胞培養処理（ＰＣ２）による主成分分析（ＰＣＡ）分離された試料を示すプロットが、図２６Ｂに図示されている。全ての事例に対するカノニカルパスウェイのインジェニュイティ・パスウェイ解析（ＩＰＡ）が、図２６Ｃに図示されている。事例（ｃａｓｅ）と比較した各処理および日に対する解糖系酵素の発現が、図２６Ｄに図示されている。
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｃは、より高いｍＡｂフコシル化欠損を生じた細胞培養条件において、ＧＤＰ−フコースが影響を受けるという可能性を評価する結果を図示する。ＧＤＰ−フコースの合成に対するデノボおよびサルベージ経路が、図２７Ａに図示されている。ＧＤＰ−フコース合成経路中の鍵となる酵素のヒートマップが、図２７Ｂに図示されている。採集の時点（１２日）におけるフコシル化欠損レベル（標準化されたＧ０−Ｆとして計算される）に対するＬ−フコース添加（０日）の効果を示すプロットが図２７Ｃに図示されている。
【図２８】図２８Ａおよび２８Ｂは、３−Ｌバイオリアクター中の異なる培養条件下での、グリコシル化経路中の鍵となるタンパク質の差次的発現を決定するためのプロテオーム解析を図示する。３−Ｌバイオリアクター中で試験された４つの事例（ｉ〜ｉｖ）および得られるフコシル化欠損レベルの記載が、図２５Ａに提供されている。フコシル化欠損に関連するグリコシル化変異形（Ｍａｎ５−Ｇ２）のみを示すゴルジ中のグリコシル化経路の図が、図２８Ａに図示されている。生産培養の７日および１２日における、選択されたグリコシル化酵素（ＦＵＴ８、ＭＡＮ  Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、ＧａｌＴ３、ＧａｌＴ４、ＧａｌＴ７）、細胞内およびゴルジｐＨ制御因子（それぞれ、ＮＨＥ１およびＧＰＲ８９）およびＭｎレベル指示薬タンパク質（ＡＴＰ２Ａ１、ＧＰＰ１３）のヒートマップが、図２８Ｂに図示されている。
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｅは、高および低いｐＣＯ２モデルを用いて３−Ｌバイオリアクター中で培養された組換えＣＨＯ細胞の性能を図示する。血中血球容積（ＰＣＶ）によって表される増殖が、図２９Ａに図示されている。組換えＣＨＯ細胞の生存率を表すプロットが、図２９Ｂに図示されている。ｍＡｂ力価を表すプロットが、図２９Ｃに図示されている。電荷変異形を表すプロット（１２日）が、図２９Ｄに図示されている。サイズ変異形を表すプロット（１２日）が、図２９Ｅに図示されている。ＨＷＭＳは高分子量種を表し、ＬＷＭＳは低分子量種を表す。
【図３０】図３０は、採集の時点（１２日）でのｍＡｂのＧ０に対するｐＣＯ２モデル、培地保持およびＭｎ補充の効果を図示する。プロットは、各因子単独のおよび他の因子と組み合わせたＧ０に対する効果を示す。
【図３１】図３１は、採集の時点（１２日）での３−Ｌバイオリアクター中で生産されたｍＡｂのＧ０に対する、Ｌ−フコース添加（０日）およびマンガン添加（０日）の効果を図示する。プロットは、フコースおよびマンガン補充単独ならびにこれらの組み合わせた影響のＧ０に対する効果を示す。
【図３２】図３２は、ＰＰ３およびＧＥＭ中のマンガン含量の変動を図示する。
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｄは、培地保持、Ｍｎ補充およびこれらの組み合わせのＧ０およびＧ０−Ｆに対する効果を図示する。図３３Ａ〜３３Ｂは、ガラクトシル化欠損、Ｇ０（図３４Ａ）およびフコシル化欠損、標準化されたＧ０−Ｆ（図３３Ｂ）に対する、上昇した温度（３８℃）での培地保持時間の効果を図示する。図３３Ｃは、抗体ＩＩＩへのフコシル化欠損（％Ｇ０−Ｆ）に対する培地保持の累積的効果を図示する。図３３Ｄは、抗体ＩＩＩへのフコシル化欠損（％Ｇ０−Ｆ）に対する、培地保持、Ｍｎ補充およびこれらの組み合わせの効果を図示する。
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｂは、研究１から得たガラクトシル化欠損、Ｇ０（図３４Ａ）およびフコシル化欠損、標準化されたＧ０−Ｆ（図３４Ｂ）に対する、ガラクトースおよび補充されたＭｎおよびこれらの相互作用の効果を図示する。
【図３５】図３５Ａ〜３５Ｂは、研究２から得たガラクトシル化欠損、Ｇ０（図３５Ａ）およびフコシル化欠損、標準化されたＧ０−Ｆ（図３５Ｂ）に対する、ガラクトースおよびＭｎならびにこれらの相互作用の効果を図示する。
【図３６】図３６Ａ〜３６Ｂは、研究３から得たガラクトシル化欠損、Ｇ０（図３６Ａ）およびフコシル化欠損、標準化されたＧ０−Ｆ（図３６Ｂ）に対するガラクトースの効果を図示する。
【図３７】図３７Ａ〜３７Ｂは、フコシル化欠損、Ｇ０−Ｆ（図３７Ａ）およびガラクトシル化欠損、Ｇ０（図３７Ｂ）に対するフコース補充の効果を図示する。
【図３８】図３８Ａ〜３８Ｂは、フコシル化欠損、Ｇ０−Ｆ（図３８Ａ）およびガラクトシル化欠損、Ｇ０（図３８Ｂ）に対するフコース添加タイミングの効果を図示する。
【図３９】図３９Ａ〜３９Ｂは、フコシル化欠損、Ｇ０−Ｆ（図３９Ａ）およびガラクトシル化欠損、Ｇ０（図３９Ｂ）に対する、フコース濃度および温度ならびにこれらの相互作用の効果を図示する。
【発明を実施するための形態】
【０１２５】
本明細書に開示されている主題は、関心対象の組換え糖タンパク質が望ましい品質特性範囲内に属するように、関心対象の組換え糖タンパク質、例えば、ｍＡｂのグリコシル化（例えば、ガラクトシル化および／またはフコシル化）を調節することに関する。例えば、限定を意図するものではないが、本明細書に開示されている主題は、従来の細胞培養培地、培地調製戦略および／または細胞培養戦略を用いて達成されるよりも狭い品質特性範囲のバンド内に属するように、ｍＡｂのグリコシル化プロファイルを修飾することに適用可能である。本開示にしたがってグリコシル化を調節することができる方法には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない。（１）例えば、原材料のＭｎ濃度分析、細胞培養の間のＭｎ補充に関する細胞培養培地のマンガン（Ｍｎ）濃度の調節および／または培地の高温短時間（ＨＴＳＴ）熱処理前に、培地ｐＨ調整に対して低下したｐＨ設定点を確立すること；ならびに（２）細胞培養の間に過程パラメータ、例えば、ｐＣＯ２、培地保持期間および浸透圧／Ｎａ＋を調節すること。本開示の主題は、このような過程パラメータが本明細書に記載されているとおりに調節されたときに調製される細胞培養および糖タンパク質組成物も対象とする。
【０１２６】
本開示を明確にするために、限定を意図するものではなく、詳細な説明は、以下の小区分に分割される。
【０１２７】
１．定義
２．グリコシル化を調節するための原材料の調節
３．グリコシル化を調節するためのマンガン補充
４．ＨＴＳＴ中のマンガン喪失を最小限に抑えることによる、グリコシル化を調節するための高温短時間（ＨＴＳＴ）処理前における培地の修飾されたｐＨ目標
５．グリコシル化を調節するための、ｐＣＯ２、マンガン、培地保持、培養期間、培養温度および浸透圧／Ｎａ＋
６．グリコシル化を調節するためのガラクトース
７．グリコシル化を調節するためのフコースおよび培養温度ならびにこれらの組み合わせ
８．細胞培養および糖タンパク質組成物
【０１２８】
１．定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含む本文書が優先する。ある種の方法および材料が以下に記載されているが、
本明細書に開示されている主題の実施または試験において、本明細書に記載されているものと類似のまたは均等な方法および材料を使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。本明細書に開示されている材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【０１２９】
本明細書で使用する場合、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）／ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「を有する（ｈａｖｉｎｇ／ｈａｓ）」、「することができる」、「を含有する」およびこれらの変形は、追加の作用または構造物の可能性を排除しない、非限定的な移行句、用語または単語であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本開示はまた、明示的に記載されているかいないかに関わらず、本明細書にて提示される実施形態または要素「を含む」、「からなる」および「から実質的になる」他の実施形態を想定する。
【０１３０】
本明細書における数的範囲の表記については、同じ精度を有するその間に介在するそれぞれの数字が明示的に想定される。例えば、６〜９の範囲については、６および９に加えて、数字７および８が想定され、６．０〜７．０の範囲については、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０が明示的に想定される。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、用語「約」または「およそ」とは、当業者によって決定される値の許容できる誤差範囲内を意味し、これは、その値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野での慣行によって、３標準偏差以内または３標準偏差を超えることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、さらにより好ましくは１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたは過程に関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。
【０１３２】
「補充」という用語は、最も広い意味で使用され、標的分子、材料、対象またはこれらの組み合わせを加えるための様々な種類、技術または方法を包含する。大量瞬時の、完全に継続的な、半継続的な、断続的な、時間ベースの（ｔｉｍｅ−ｂａｓｅｄ）、フィードバックループベースの添加は、補充の例である。
【０１３３】
本明細書において、「調節する」という用語は、各属性の増加または減少を表すために使用される。
【０１３４】
用語「抗体」は、本明細書では最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、半抗体および抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
【０１３５】
本明細書において使用される「抗体断片」という用語は、完全な状態の抗体が結合する抗原を結合する完全な状態の抗体の一部を含む完全な状態の抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
本明細書において使用される「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体を抗原に結合させることに関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＬ）は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照。）抗原結合特異性を与えるために、単一のＶＨまたはＶＬドメインで十分な場合がある。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原を結合する抗体のＶＨまたはＶＬドメインを使用して、それぞれ、相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングすることで単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい。
【０１３７】
本明細書において使用される「相同な配列」という用語は、配列の整列化によって決定された場合に著しい配列類似性を共有する配列を表す。例えば、２つの配列は、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％または約９９．９％相同であり得る。整列化は、配列を比較し、配列長、配列同一性および類似性ならびに配列ミスマッチおよびギャップの存在および長さなどの因子に基づいて、合致の統計的有意性を計算するＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＨＭＭＥを含むがこれらに限定されないアルゴリズムおよびコンピュータプログラムによって実施される。相同な配列は、ＤＮＡとタンパク質配列の両方を指すことができる。
【０１３８】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で同義に使用される。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語はまた、自然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化もしくは任意の他の操作または修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションにより修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の１つ以上の類似体を含有するポリペプチドおよび当該技術分野で公知の他の修飾もこの定義に含まれる。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、本明細書で使用される場合、抗体を具体的に包含する。
【０１３９】
「糖タンパク質」という用語は、アミノ酸残基、例えば、セリンもしくはスレオニン残基（「Ｏ結合型」）またはアスパラギン残基（「Ｎ結合型」）の酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してタンパク質に付着されている少なくとも１つの炭水化物部分、例えば、多糖またはオリゴ糖に結合されたポリペプチドまたはタンパク質を指す。「グリカン」という用語は、多糖またはオリゴ糖、例えば、単糖から構成されるポリマーを表す。グリカンは、単糖残基のホモポリマーまたはヘテロポリマーであり得、直鎖状または分岐状であり得る。
【０１４０】
本明細書において使用される、関心対象の組換え糖タンパク質の「グリコシル化パターン」および「グリコシル化プロファイル」は、例えば、存在する様々な単糖の量および質、分岐の程度ならびに／または付着（例えば、Ｎ結合型またはＯ結合型）など、糖タンパク質の多糖またはオリゴ糖の様々な物理的特徴を指す。
【０１４１】
「フコシル化」は、多糖およびオリゴ糖、例えば、Ｎ−グリカン、Ｏ−グリカンおよび糖脂質上のフコース残基の程度および分布を指す。「フコシル化欠損（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」は、多糖およびオリゴ糖上のフコース残基の欠如を指す。Ｇ０グリカンは、末端のガラクトース残基を欠如するグリカンを指す。当技術分野は、フコシル化／フコシル化欠損Ｇ０グリカンを特定するために、２つの異なる命名法を特定した。
（１）フコシル化欠損Ｇ０グリカンを表すために「Ｇ０−Ｆ」（すなわち、「Ｇ０「マイナス」Ｆ）が使用され、フコシル化されたＧ０グリカンを表すために「Ｇ０」が使用される、および
【０１４２】
（２）フコシル化欠損Ｇ０グリカンを表すために「Ｇ０」が使用され、フコシル化されたＧ０グリカンを表すために「Ｇ０Ｆ」が使用される。
【０１４３】
特定の文脈においていずれの慣例が使用されているかの特定には、Ｇ０の使用およびＧ０−ＦまたはＧ０Ｆのいずれかの使用を分析することが含まれる。非フコシル化されたまたは「フコシル欠損」Ｎ−グリカンを有する治療的糖タンパク質、例えば、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗原結合能の検出可能な変化なしに、ＦｃγＲＩＩＩａ結合能の強化のために、強化された抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示す。ある状況、例えば癌処置においては、腫瘍細胞に対して高い細胞傷害性を誘導し、ＦｃγＲＩＩＩａとの強化された相互作用を介してＮＫ細胞中で高いエフェクター機能を引き起こしながら、低用量で治療効果を達成することができるので、非フコシル化または「フコシル化欠損」抗体が望ましい。他の状況、例えば、炎症性または自己免疫疾患の処置においては、強化されたＡＤＣＣおよびＦｃγＲＩＩＩａ結合は望ましくなく、したがって、そのＮ−グリカン中により高いレベルのフコース残基を有する治療的糖タンパク質が好ましいことがあり得る。本明細書において使用される「％フコース」または「％フコシル化欠損」という用語は、関心対象の組換え糖タンパク質上に存在する非フコシル化Ｎ−グリカンの百分率を指す。％フコース欠損または％フコシル化欠損がより高いほど非フコシル化Ｎ−グリカンの数がより多いことを表し、％フコース欠損または％フコシル化欠損が低いほど、フコシル化されたＮ−グリカンの数が多いことを表す。フコシル化欠損は、時々、％標準化されたＧ０−Ｆと表されることがあり、以下によって計算される。
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【０１４４】
本発明の文脈において使用される「ガラクトシル化」という用語は、糖タンパク質上のオリゴ糖鎖へのガラクトース単位の付加を指す。「ガラクトシル化欠損」という用語は、糖タンパク質上のオリゴ糖鎖上におけるガラクトース単位の欠如を指す。本明細書において使用される「ガラクトシル化された」抗体という用語は、抗体のＮ結合型グリカンが少なくとも１つのガラクトース残基を含む（例えば、Ｇ１およびＧ２グリカン）抗体を指す。本明細書において使用される「ガラクトシル化欠損」抗体という用語は、抗体のＮ結合型グリカンがガラクトース残基を欠く（例えば、Ｇ０およびＧ０Ｆグリカン）抗体を指す。
【０１４５】
本明細書において使用される「発現」という用語は、転写および／または翻訳を指す。ある実施形態において、所望の生成物の転写のレベルは、存在する対応するｍＲＮＡの量に基づいて決定することができる。例えば、関心対象の配列から転写されたｍＲＮＡは、ＰＣＲによってまたはノーザンハイブリダイゼーションによって定量することができる。ある実施形態において、関心対象の配列よってコードされるタンパク質は、様々な方法によって、例えば、ＥＬＩＳＡによって、当該タンパク質の生物活性をアッセイすることによって、または当該タンパク質を認識し、結合する抗体を使用する、このような活性とは無関係なアッセイ、例えば、ウェスタンブロッティングまたはラジオイムノアッセイを利用することによって定量することができる。
【０１４６】
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」とは、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。本用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、およびベクターがその中に導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。ある実施形態において、ベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示する。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
【０１４７】
「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、ある特定の細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合された分泌Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞に特異的に結合して、続いて細胞毒を用いて標的細胞を死滅させることができるようにする細胞傷害性の形態を指す。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現し、造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁、表３にまとめられている。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されるようなインビトロＡＤＣＣアッセイを行ってもよい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。これに代えてまたはこれに加えて、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるものなどの動物モデルにおいて評価されてもよい。
【０１４８】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）の（適切なサブクラスの）抗体への結合から始まり、これらの抗体は、それらの同族抗原に結合されている。補体活性化を評価するために、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０２：１６３（１９９６）に記載されるＣＤＣアッセイを実施してもよい。改変されたＦｃ領域アミノ酸配列を有する（変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチド）および増加または減少したＣ１ｑ結合能力を有するポリペプチド変異形は、例えば、米国特許第６，１９４，５５１  Ｂ１号および国際公開第１９９９／５１６４２号に記載されている。例えば、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）も参照。
【０１４９】
細胞を「培養すること」とは、細胞の生存および／または成長および／または細胞の増殖に好適な条件下にて、細胞を細胞培養培地と接触させることを表す。細胞培養は、バッチ、流加、連続、灌流過程を含むがこれらに限定されない様々な条件下で行うことができる。細胞培養期間は、過程に応じて変動し得る。例えば、限定を意図するものではないが、流加過程は、より少ない日数、例えば、０〜２０日間実行することができるのに対して、典型的な灌流過程は、最大１５０日間またはそれより長い日数の間、実行することができる。
【０１５０】
「バッチ培養物」とは、培養過程の開始時に、細胞培養のための全ての構成成分（細胞および全ての培養栄養素を含む）が、培養容器に供給されている培養物を意味する。
【０１５１】
本明細書で使用する場合、用語「流加細胞培養物」とは、細胞と培養培地が培養容器に最初に供給され、追加の培養栄養素が、培養プロセス中に培養物に連続して、または個別に増加して供給され、培養終了前に、周期的に細胞および／または生成物が採集されるまたはされない、バッチ培養物を意味する。
【０１５２】
「バイオリアクター撹拌戦略」という用語は、バイオリアクター中の培養物および／または培養培地の撹拌速度および／または物理的操作を表す。
【０１５３】
「バイオリアクター培地交換戦略」という用語は、バイオリアクターおよび／または培養物の細胞に接触している培地の変化が起こる任意の過程を表し、バイオリアクターから採取された細胞培養試料から細胞が遠心沈殿され、当初細胞を成長させるために使用された元の細胞培養培地とは異なり得る新しい培地中に再懸濁される過程を含むが、これに限定されない。
【０１５４】
「灌流培養物」とは、細胞が、例えば、ろ過、封入、マイクロ担体への固着などにより培養物中に保持され、培養培地が連続的にまたは断続的に導入され、培養容器から取り除かれる培養物である。
【０１５５】
「培養する容器」、「培養容器」および「バイオリアクター」は、細胞を培養するために使用される容器を表す。培養する容器は、細胞の培養に有用である限り、任意のサイズであり得る。ある実施形態において、本明細書に開示されている方法において使用するためのバイオリアクターは、ステンレス鋼容器である。ある実施形態において、本明細書に開示されている方法において使用するためのバイオリアクターは、ロッカーバッグ（ｒｏｃｋｅｒ  ｂａｇ）である。ある実施形態において、本明細書に開示されている方法において使用するためのバイオリアクターは、使い捨てバイオリアクターである。
【０１５６】
「培地」および「細胞培養培地」という用語は、細胞を成長または維持するために使用される栄養源を表す。当業者によって理解されるとおり、栄養源は、成長および／もしくは生存のために細胞によって必要とされる成分を含有し得、または細胞増殖および／もしくは生存を補助する成分を含有し得る。細胞培養培地は、細胞を成長または維持するための任意の液体上清も表す。培地成分は、任意の培養段階で、任意の時点で、または任意の形態で、細胞培養物または細胞培養培地に添加することができる任意の成分を表す。培地成分は、細胞培養培地用の原材料から得られる成分も表す。ビタミン、必須または非必須アミノ酸および微量元素は、培地成分の例である。本明細書を通じて「１つの培地（ｍｅｄｉｕｍ）」および「複数の培地（ｍｅｄｉａ）」は同義に使用されることが理解されるべきである。
【０１５７】
「化学的に確定された細胞培養培地」または「ＣＤＭ」は、動物の血清およびペプトンなど、動物由来のまたは非確定の生成物が存在しない特定された組成を有する培地である。当業者によって理解されるように、ＣＤＭは、細胞がＣＤＭと接触され、ＣＤＭ中にポリペプチドを分泌するポリペプチド生産の過程において使用され得る。したがって、組成は、ＣＤＭとポリペプチド生成物を含有し得ること、ポリペプチド生成物の存在が、ＣＤＭを化学的に非確定とはしないことが理解される。
【０１５８】
「化学的に確定されていない細胞培養培地」とは、その化学的組成を特定することができず、動物血清およびペプトンなど、１または複数の動物由来のまたは非確定の生成物を含有し得る培地を表す。当業者によって理解されるように、化学的に確定されていない細胞培養培地は、栄養源として動物由来の生成物を含有し得る。
【０１５９】
「培地保持」とは、細胞の培養において使用する前に、培養容器（例えば、バイオリアクター、使い捨て袋）または培地調製もしくは培地保存のために使用される容器（例えば、ステンレス鋼タンク、使い捨て容器）中に細胞培養培地を保持するという細胞培養の実行を表す。細胞培養操作において、培養培地は、加温され、バイオリアクター中に細胞を播種するために培地を使用する前の培養温度にまたはその近くに保つことができる。「培地保持期間」または「培地保持時間」は、バイオリアクター中に細胞を播種するために培地が使用される前に、（例えば、周囲より高い温度で）培地が保持される時間の程度を表す。本明細書を通じて「培地保持」、「培地保持期間」および「培地保持時間」は同義に使用されることが理解される。
【０１６０】
「ＨＴＳＴ」は、細胞培養培地の「高温短時間」処理を表す。細胞培養培地のこのＨＴＳＴ処理は、偶発的な因子に対してさらなる安全性障壁を与えることができる。（Ｆｌｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１８）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０２（１３）：５４９５−５５０４；Ｐｏｈｌｓｃｈｅｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９８（７）：２９６５−７１。細胞培養培地のＨＴＳＴ処理の間に、沈殿が形成することがあり得、ＨＴＳＴ装置が汚れることがあり得、培地成分が溶液から外に出ることがあり得る。ＨＴＳＴ処理から培地中に沈殿が形成するのを低下させまたは抑制するために、特定の培養培地パラメータの調整を行い得る。
【０１６１】
本明細書において使用される「低ｐＣＯ２」という用語は、比較的狭い二酸化炭素範囲での操作を記載し、ＣＯ２の上限は、「高ｐＣＯ２」操作において使用されるＣＯ２の上限より低い。低ｐＣＯ２は、約１０ｍｍＨｇ〜約１００ｍｍＨｇ、約１０ｍｍＨｇ〜約８０ｍｍＨｇ、約１０ｍｍＨｇ〜約７０ｍｍＨｇまたは約１０ｍｍＨｇ〜約６０ｍｍＨｇであり得る。これに対して、「高ｐＣＯ２」は、本明細書において、より広い二酸化炭素範囲を表すために使用され、ｐＣＯ２の上限は、低ｐＣＯ２操作において使用されるｐＣＯ２の上限より高い。高ｐＣＯ２は、約２０〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約２００ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約１５０ｍｍＨｇまたは約３０ｍｍＨｇ〜約１５０ｍｍＨｇであり得る。本明細書に記載されているｐＣＯ２調節は、細胞培養期間の少なくとも最初の半分の間、起こり得る。例えば、限定を意図するものではないが、２０日の培養については、ｐＣＯ２調節は、少なくとも最初の１０日間起こり得る。変動する細胞培養期間に応じて、ｐＣＯ２調節もその結果変動し得る。
【０１６２】
２．グリコシル化を調節するための原材料の調節
複数の細胞培養因子が、糖タンパク質、例えば、ｍＡｂのグリコシル化に影響を与える可能性を有することが知られている。これらの因子には、過程パラメータおよび特に、ガラクトースおよび微量金属などの培地成分が含まれる。個別の培地成分のレベルの変動は、複雑な原材料の使用を介してｍＡｂ細胞培養過程中に導入することができる。例えば、限定を意図するものではないが、細胞培養培地、例えば、基本培地または流加培地（およびこれらの各成分、例えば、加水分解産物または様々な種類の血清）は、ｍＡｂグリコシル化に影響を与え得るロット間変動を示し得る。したがって、ある実施形態において、本開示は、ｍＡｂのグリコシル化（例えば、ガラクトシル化および／またはフコシル化）を調節するために細胞培養培地の変動性を低減することを目的とした組成物および方法を対象とする。例えば、限定を意図するものではないが、Ｍｎ補充は、不純物としてＭｎを含有する培地成分または細胞培養培地もしくは細胞培養物にＭｎを放出することができる原材料（例えば、デプスフィルタ、ステンレス鋼またはガラス容器）を使用することによって達成することができる。
【０１６３】
ある実施形態において、本開示は、ｍＡｂグリコシル化（例えば、ガラクトシル化および／またはフコシル化）を調節するために、細胞培養培地および／またはその個別の成分をスクリーニングするための戦略を対象とする。非限定的な実施形態において、個別の成分の特異的な目標量、例えば、Ｍｎ濃度、ガラクトース濃度に適合した細胞培養培地をスクリーニングすることができる。例えば、限定を意図するものではないが、細胞培養培地は、約１ｎＭ〜約１０μＭ、約１ｎＭ〜約１μＭ、約２０ｎＭ〜約３００ｎＭまたは約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭのＭｎ濃度目標範囲に基づいてスクリーニングし、選択することができる（このような目標範囲の外にある培地は、ｍＡｂの細胞培養に関して利用されない）。ある実施形態において、細胞培養培地には、最大１０ｇ／Ｌ（例えば、約０ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌまたは約１０ｇ／Ｌ）のガラクトースをさらに補充することができる。ある実施形態において、細胞培養培地には、最大約６ｇ／Ｌのガラクトースを補誦することができる。
【０１６４】
本明細書において記載されているある実施形態は、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンを達成または保持するために、開示されているＭｎ濃度目標範囲に基づいて細胞培養培地および／または細胞培養物をスクリーニングすることによって、グリコシル化（例えば、フコシル化欠損および／またはガラクトシル化）を調節することに関する。ある非限定的否実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損および／またはガラクトシル化の調節であり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、フコシル化欠損Ｇ０の目標範囲（％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆ）は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得る。％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約０．５％、１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節することができる。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化の減少または増加であり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、フコシル化されたガラクトシル化欠損Ｇ０の目標範囲（％Ｇ０）は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節することができる。
【０１６５】
ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損とガラクトシル化の調節の組み合わせであり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆの目標範囲は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得、％Ｇ０の目標範囲は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５５％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節され得、％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節され得る。
【０１６６】
３．グリコシル化を調節するためのマンガン補充
上に記載されているように、細胞培養培地のＭｎ濃度は、グリコシル化、例えば、ｍＡｂガラクトシル化および／またはフコシル化に影響を与えることができる。同じく本明細書に記載されているように、細胞培養物のＭｎ濃度は、グリコシル化、例えば、ｍＡｂガラクトシル化および／またはフコシル化に影響を与えることができる。したがって、ある実施形態において、ｍＡｂグリコシル化は、上に記載されているように、細胞培養培地原材料中に存在するＭｎの量を調節することによってのみならず、細胞培養培地にＭｎを補充することによっても調節することができる。ある実施形態において、Ｍｎ濃度の増加は、（Ｇ０−Ｆ、Ｇ０のフコシル化欠損形態のレベルを増加させることによって）フコシル化欠損を増加させることができ、および／または（Ｇ０、ガラクトシル化欠損およびフコシル化グリカン種の減少をもたらす）ガラクトシル化を増加させることができる。
【０１６７】
図５〜１０に概説されているように、細胞培養培地および／または細胞培養物中のＭｎ濃度の増加は、一般に、増加したＧ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０）および減少したＧ０（フコシル化Ｇ０）をもたらすことができるが、６つの異なるｍＡｂにわたる傾向、フコシル化欠損（したがって、Ｇ０−Ｆ種）が増加し、ガラクトシル化欠損（したがって、Ｇ０種）が減少する程度を特定することは、特異的なＭｎ補充作用目標を確立することによって精緻化することができる。例えば、ある実施形態において、補充されるべきＭｎの濃度は、得られるｍＡｂを所望の生成物品質規格外にしないようにしながら、Ｇ０−Ｆを増加し、Ｇ０を減少するのに十分とすべきである。ある実施形態において、Ｍｎは、細胞培養培地および／または細胞培養物中の選択された範囲を達成するために補充される。ある実施形態において、Ｍｎ補充の濃度は、約１０μＭ未満（例えば、約１０ｎＭ、約４０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約５００ｎＭ、約７００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約１０００ｎＭ、約１５００ｎＭ、約２０００ｎＭ、約３０００ｎＭ、約５０００ｎＭ，約８０００ｎＭまたは約１０μＭ、開示された範囲内に属する濃度を含む）であるように選択される。ある実施形態において、Ｍｎ補充の濃度は約２０ｎＭ〜約３００ｎＭであり得る。非限定的な実施形態において、Ｍｎ補充の濃度は約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭであり得る。Ｍｎ補充が高ＣＯ２に曝露された細胞培養培地中で起きる実施形態を含むある実施形態において、Ｍｎ補充の濃度は、３０００ｎＭ未満（例えば、約５ｎＭ、１０ｎＭ、約３０ｎＭ、４０ｎＭ、約５０ｎＭ、１００ｎＭ、約２００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約５００ｎＭ、約１０００ｎＭ、約２０００ｎＭ、約３０００ｎＭ、開示されている範囲内に属する濃度を含む）であるように選択される。本明細書に概説されているように、このような濃度は、得られるｍＡｂを所望の生成物品質規格外にしないようにしながら、フコシル化欠損（したがって、Ｇ０−Ｆグリカン）を増加させ、ガラクトシル化欠損（したがって、Ｇ０グリカン）を減少させる予期せぬ能力を有する。
【０１６８】
ある実施形態において、培養物へのＭｎ補充のタイミングは、グリコシル化（例えば、ガラクトシル化およびフコシル化欠損）にも影響を与えることができる。Ｍｎ補充は、生産前の拡大培養段階の間におよび／または生産培養段階の間に添加することができる。ある実施形態において、Ｍｎ補充は、細胞培養培地および／または細胞培養物と接触している材料（例えば、デプスまたは培地フィルタ、培養容器、培地保持容器）からのＭｎの浸出から生じ得る。非限定的実施形態において、Ｍｎ補充は、培地調製をフィルタにかける過程の間に、Ｍｎおよびその他の微量金属を浸出し、これにより培養物を補充する、珪藻土を含有するデプスフィルタを使用することによって達成することができる。
【０１６９】
ある実施形態において、ｍＡｂは、Ｍｎ補充後に採集することができる。例えば、限定を目的とするものではないが、ｍＡｂは、培養の約２日〜培養の約２５日（例えば、細胞培養の約２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日または２５日）に採集することができる。非限定的な実施形態において、ｍＡｂは、細胞培養の約７日〜約１５日に採集することができる。いくつかの実施形態において、ｍＡｂは、細胞培養の約５日〜約２０日に採集することができる）。
【０１７０】
ある実施形態において、本明細書に開示されている培地組成物および細胞培養過程は、以下のもの：フコース、アンモニア、ナトリウム、ウリジン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、カドミウム、リポ酸、Ｖ２＋、Ｃｒ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋などの二価の金属イオンおよびキフネンシンからなる群の１つまたは複数の追加的および／または代替的グリコシル化調節濃度と組み合わせることができる。
【０１７１】
４．グリコシル化を調節するための、高温短時間（ＨＴＳＴ）処理前における培地の修飾されたｐＨ目標
本明細書において開示されているとおり、Ｍｎの細胞培養培地濃度は、糖タンパク質、例えば、ｍＡｂのグリコシル化を調節することができる。したがって、本開示は、ある実施形態において、グリコシル化、例えば、ｍＡｂのガラクトシル化および／またはフコシル化を調節するために、細胞培養培地Ｍｎ濃度を調節する方法を対象とする。本開示は、ある実施形態において、グリコシル化、例えば、ｍＡｂのガラクトシル化および／またはフコシル化を調節するために、細胞培養物Ｍｎ濃度を調節する方法も対象とする。例えば、限定を目的とするものではないが、本開示は、約７．０より大きい前ＨＴＳＴ培地ｐＨ調整目標を用いて培地のＨＴＳＴ処理を行うことは、ＨＴＳＴ処理後の細胞培養培地Ｍｎ濃度の減少をもたらすことができることに注目する。したがって、ある実施形態において、本開示は、約７．２５未満（例えば、約６．１〜約７．２）のｐＨ目標に調製された培地を用いてＨＴＳＴを行うことを対象とする。ある実施形態において、本開示は、約７．３未満（例えば、約６．１〜約７．３）のｐＨ目標に調製された培地を用いてＨＴＳＴを行うことを対象とする。ある実施形態において、ＨＴＳＴのために調製された培地に対するｐＨ目標は、約６．１、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．１、約７．２または約７．３であり得る。
【０１７２】
５．グリコシル化を調節するための、ｐＣＯ２、マンガン、培地保持、培養期間、培養温度およびＮａ＋／浸透圧
本明細書に開示されているとおり、細胞培養培地および／または細胞培養物のｐＣＯ２、培地保持期間、培養期間、培養温度、マンガン濃度、浸透圧／Ｎａ＋濃度および／またはこれらの組み合わせを調節することは、このような培地中で培養された糖タンパク質、例えば、ｍＡｂのフコシル化されたおよび／またはフコシル欠損Ｇ０グリカンの調節をもたらすことができる。ある実施形態において、本開示は、ｐＣＯ２、マンガン濃度、培地保持期間、培養期間、培養温度、Ｎａ＋濃度、浸透圧またはこれらの組み合わせが本明細書に概説されているとおりに調節された培地または細胞培養物を利用する細胞培養の方法を対象とする。
【０１７３】
５．１培地保持
本明細書に記載されているとおりに、特定の温度または温度範囲での培地保持期間は、グリコシル化（例えば、ガラクトシル化および／またはフコシル化欠損）に影響を与えることができる。ある実施形態において、上昇した培地保持温度は、約２５℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３５℃〜約３９℃または約３６℃〜約３９℃であり得る。ある実施形態において、特定の温度または温度範囲での培地保持期間は、約０時間〜約１２時間、約０時間〜約２４時間、約０時間〜約３６時間、約０時間〜約４８時間、約０時間〜約６０時間、約０時間〜約７２時間、約０時間〜約９６時間またはそれより長い範囲である。ある非限定的な実施形態において、細胞培養培地は、グリコシル化（例えば、フコシル化欠損および／またはガラクトシル化）を調節するために、約０時間〜約７２時間の期間、約２５℃〜約３９℃の温度に保持される。ある実施形態において、このように保持された細胞培養培地は、生産培養、増殖培養または両方において利用される。
【０１７４】
本明細書に記載されているある実施形態は、所望の糖タンパク質グリコシル化パターンを達成または保持するために、特定の温度または温度範囲で開示された培地保持時間を適用することによって、グリコシル化（例えば、フコシル化欠損および／またはガラクトシル化）を調節することに関する。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損の調節であり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、フコシル化欠損Ｇ０の目標範囲（％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆ）は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節することができる。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のガラクトシル化の調節であり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、ガラクトシル化欠損の目標範囲（例えば、％Ｇ０）は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５５％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節することができる。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損とガラクトシル化の調節の組み合わせであり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆの目標範囲は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得、％Ｇ０の目標範囲は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５５％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節され得、％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節され得る。
【０１７５】
５．２  二酸化炭素の分圧（ｐＣＯ２）
ある実施形態において、本開示は、ｍＡｂグリコシル化（例えば、ガラクトシル化および／またはフコシル化）を調節するために、細胞培養物中の二酸化炭素の分圧（ｐＣＯ２）を調整するための戦略を対象とする。非限定的実施形態において、ｐＣＯ２のレベルは、０ｍｍＨｇ〜２５０ｍｍＨｇであり得る。高ｐＣＯ２モデルは、０日から始まる培養期間の大半に対して、約０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約２００ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約１５０ｍｍＨｇまたは約３０ｍｍＨｇ〜１５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２範囲を有することができる。低ｐＣＯ２モデルは、０日から始まる培養期間の大半に対して、約１０ｍｍＨｇ〜約１００ｍｍＨｇ、約１０ｍｍＨｇ〜約８０ｍｍＨｇ、約１０ｍｍＨｇ〜約７０ｍｍＨｇまたは約１０ｍｍＨｇ〜約６０ｍｍＨｇのｐＣＯ２範囲を有することができる。本明細書において記載されているある実施形態は、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンを達成または保持するために、目標範囲にｐＣＯ２のレベルを調整することによってグリコシル化を調節することに関する。例えば、ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損の調節であり得る。ある実施形態において、フコシル化欠損Ｇ０の目標範囲（％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆ）は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節することができる。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のガラクトシル化の調節であり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、ガラクトシル化欠損の目標範囲（％Ｇ０）は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節することができる。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損とガラクトシル化の調節の組み合わせであり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆの目標範囲は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得、％Ｇ０の目標範囲は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節され得、％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節され得る。
【０１７６】
５．３  ナトリウム（Ｎａ＋）濃度
ある実施形態において、本開示は、ｍＡｂグリコシル化（例えば、ガラクトシル化および／またはフコシル化）を調節するために、細胞培養培地および／または細胞培養物中のナトリウム（Ｎａ＋）の濃度を調整するための戦略を対象とする。例えば、限定を目的とするものではないが、約０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、２０ｍＭ〜約２００ｍＭ、３０ｍＭ〜約１５０ｍＭまたは４０ｍＭ〜約１３０ｍＭのＮａ＋濃度目標範囲を達成するために、細胞培養培地に、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＮａＣｌ、ＮａＯＨおよび／もしくはＮａ＋化合物（例えば、ｐＨ調節のため）またはこれらの組み合わせを補充することができる。
【０１７７】
本明細書において記載されているある実施形態は、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンを達成または保持するために、細胞培養培地および／または細胞培養物中のＮａ＋濃度を指定された目標範囲に調整することによってグリコシル化を調節することに関する。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損の調節であり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、フコシル化欠損の目標範囲（％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆ）は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得る。％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節することができる。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のガラクトシル化の調節であり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、ガラクトシル化欠損の目標範囲（％Ｇ０）は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節することができる。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損とガラクトシル化の調節の組み合わせであり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆの目標範囲は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得、％Ｇ０の目標範囲は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％または約６０％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節され得、％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節され得る。
【０１７８】
５．４  浸透圧
ある実施形態において、本開示は、ｍＡｂグリコシル化（例えば、ガラクトシル化および／またはフコシル化）を調節するために、培養培地の浸透圧を調整するための戦略を対象とする。例えば、限定を目的とするものではないが、細胞培養培地の浸透圧は、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４５０ｍＯｓｍ／ｋｇまたは約３２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４２５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧目標範囲を達成するために、ソルビトール、ＫＣｌ、浸透圧保護剤（例えば、ベタイン）および／またはＮａＣｌを添加することによって調整することができる。
【０１７９】
本明細書において記載されているある実施形態は、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンを達成または保持するために、培養培地および／または細胞培養物の浸透圧レベルを目標範囲に調整することによってグリコシル化を調節することに関する。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損の調節であり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、フコシル化欠損の目標範囲（％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆ）は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節することができる。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のガラクトシル化の調節であり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、ガラクトシル化欠損の目標範囲（％Ｇ０）は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節することができる。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損とガラクトシル化の調節の組み合わせであり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆの目標範囲は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得、％Ｇ０の目標範囲は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節され得、％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節され得る。
【０１８０】
５．５  補充されるマンガン
上記節２および３に記載されているように、細胞培養培地および／または細胞培養物中のＭｎ濃度は、グリコシル化、例えば、ｍＡｂガラクトシル化および／またはフコシル化に影響を与えることができる。したがって、ある実施形態において、ｍＡｂグリコシル化は、
１つまたは複数の他のパラメータと組み合わせることを含み、本節に概説されているとおりに特定のＭｎ濃度目標または目標範囲を達成するために、上記されているように、細胞培養培地原材料中に存在するＭｎの量を調節することによってのみならず、細胞培養培地および／または細胞培養物にＭｎを補充することによっても調節することができる。ある実施形態において、Ｍｎ補充の濃度は、１０μＭ未満（例えば、約１０ｎＭ、４０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、１０００ｎＭ、１５００ｎＭ、２０００ｎＭ、３０００ｎＭ、５０００ｎＭ、８０００ｎＭまたは１０μＭ、開示されている範囲内に属する濃度を含む）の最終目標濃度または濃度範囲を達成するために選択される。
【０１８１】
本明細書において記載されているある実施形態は、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンを達成または保持するために、細胞培養培地および／または細胞培養物中にＭｎの開示された濃度を補充することによってグリコシル化を調節することに関する。非限定的な実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損の調節であり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、フコシル化欠損Ｇ０の目標範囲（％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆ）は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得る。％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節することができる。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のガラクトシル化の調節であり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、ガラクトシル化欠損の目標範囲（％Ｇ０）は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節することができる。
【０１８２】
ある実施形態において、Ｍｎ補充によって達成される所望の糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損の調節とフコシル化の調節の組み合わせであり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆの目標範囲は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約５％であり得、％Ｇ０の目標範囲は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節され得、％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節され得る。
【０１８３】
５．６  ｐＣＯ２、培地保持、培養期間、補充されるＭｎ、浸透圧およびＮａ＋濃度の組み合わせ
ある実施形態において、糖タンパク質のグリコシル化（例えば、フコシル化欠損および／またはガラクトシル化）を調節するための開示された技術の組み合わせを使用することができる。例えば、限定を目的とするものではないが、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンを達成または保持するために、ｐＣＯ２、培地保持、培養期間、補充されるＭｎ、浸透圧および／またはＮａ＋濃度の開示された条件の組み合わせを細胞培養培地および／または細胞培養物中で利用することができる。非限定的な実施形態において、補充されるＭｎ（例えば、約１ｎＭ〜約３００００ｎＭ）、ｐＣＯ２レベル（例えば、約０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ）、培養期間（例えば、約０日〜約２５日）、Ｎａ＋濃度（例えば、約０ｍＭ〜２５０ｍＭ）および浸透圧（例えば、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ）と組み合わせて、規定された温度または温度範囲（例えば約２５℃〜約３９℃）での開示された培地保持時間（例えば、約０時間〜約７２時間）を培養培地に適用することができる。
【０１８４】
ある実施形態において、ｐＣＯ２、培地保持、培養期間、補充されるＭｎ、浸透圧およびＮａ＋濃度の開示された条件の組み合わせは、糖タンパク質のフコシル化欠損および／またはガラクトシル化プロファイルに関して組み合わせまたは相乗効果を誘導することができる。例えば、限定を目的とするものではないが、ｐＣＯ２、培地保持、培養期間、補充されるＭｎ、浸透圧およびＮａ＋濃度の開示された条件の組み合わせが利用されると、糖タンパク質の％Ｇ０−Ｆの相乗的調節（例えば、増加または減少）が起こり得る。さらに、非限定的な実施形態において、ｐＣＯ２、培地保持、培養期間、補充されるＭｎ、浸透圧およびＮａ＋濃度の開示された条件の組み合わせが利用されると、糖タンパク質の％Ｇ０の相乗的調節（例えば、増加または減少）が起こり得る。さらに、ある実施形態において、ｐＣＯ２、培地保持、培養期間、補充されるＭｎ、浸透圧およびＮａ＋濃度の開示された条件の組み合わせが利用されると、％Ｇ０−Ｆの相乗的調節が起こり得る。
【０１８５】
本明細書において記載されているある実施形態は、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンを達成または保持するために、開示された条件（例えば、ｐＣＯ２、培地保持、培養期間、補充されるＭｎ、浸透圧およびＮａ＋濃度）の組み合わせを修飾することによって、グリコシル化を調節することに関する。ある非限定的な実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損の増加または減少であり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、フコシル化欠損Ｇ０の目標範囲（％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆ）は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節することができる。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のガラクトシル化の調節であり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、ガラクトシル化の目標範囲（例えば、％Ｇ０）は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節することができる。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損とガラクトシル化の調節の組み合わせであり得る。ある実施形態において、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆの目標範囲は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得、％Ｇ０の目標範囲は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節され得、％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節され得る。
【０１８６】
６．グリコシル化を調節するためのガラクトース
ある実施形態において、細胞培養培地および／または細胞培養物中のガラクトース、Ｍｎまたはこれらの組み合わせは、グリコシル化（例えば、ガラクトシル化およびフコシル化欠損）に影響を与えることができる。したがって、ｍＡｂグリコシル化は、ガラクトース、Ｍｎまたはこれらの組み合わせを補充することによって調節することができる。例えば、限定を目的とするものではないが、ガラクトースの濃度は、合計約１０ｇ／Ｌ（例えば、約０ｇ／Ｌ、約１．２ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌまたは約１０ｇ／Ｌ）であり得る。非限定的な実施形態において、ガラクトースの濃度は、合計約１００ｍＭであり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、ガラクトースの濃度は、約０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約０ｍＭ〜約４５ｍＭ、約０ｍＭ〜約２０ｍＭまたは約０ｍＭ〜約１０ｍＭであり得る。細胞培養物は、約１０ｎＭ、約４０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約５００ｎＭ、約７００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約１０００ｎＭ、約１５００ｎＭ、約２０００ｎＭ、約３０００ｎＭ、約５０００ｎＭ、約８０００ｎＭまたは約１０μＭのＭｎ濃度を達成するためにさらに補充することができる。ガラクトースおよびＭｎの目標濃度範囲は、記載されている範囲内に属する濃度を含むことができる。ガラクトースおよびＭｎ添加の非限定的な例としては、生産培養および／または生産培養段階にいたるまでの増殖培養への添加を挙げることができる。
【０１８７】
本明細書において記載されているある実施形態は、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンを達成または保持するために、培養培地中に、Ｍｎの開示された濃度あり／なしで、ガラクトースの開示された濃度を補充することによってグリコシル化を調節することに関する。非限定的な実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損の調節であり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、フコシル化欠損Ｇ０の目標範囲（％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆ）は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節することができる。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のガラクトシル化の調節であり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、ガラクトシル化欠損の目標範囲（％Ｇ０）は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節することができる。ある実施形態において、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損とガラクトシル化の調節の組み合わせであり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆの目標範囲は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得、％Ｇ０の目標範囲は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節され得、％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節され得る。
【０１８８】
７．グリコシル化を調節するためのフコースおよび培養温度ならびにこれらの組み合わせ
ある実施形態において、細胞培養培地および／または細胞培養物へのＬ−フコース（フコース）の添加も、グリコシル化（例えば、ガラクトシル化およびフコシル化欠損）に影響を与えることができる。したがって、ある実施形態において、ｍＡｂグリコシル化は、細胞培養培地にフコースを補充することによって調節することができる。フコースの添加はフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）の調節をもたらし、フコシル化欠損が調節する程度は、フコース濃度および／またはフコース添加のタイミングによって精緻化することができる。ある非限定的な実施形態において、添加されるフコースの濃度は、約０ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ（例えば、約０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ、約０．２５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ、約０．７５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌまたは約５ｇ／Ｌ）であり得る。ある実施形態において、フコースの濃度は、合計約１００ｍＭであり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、フコースの濃度は、約０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約０ｍＭ〜約１０ｍＭまたは約０ｍＭ〜約５ｍＭであり得る。ある実施形態において、フコース添加のタイミングは、異なるフコース濃度（例えば、約０．１ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ、開示されている範囲内に属する濃度を含む）での生産培養の播種後約０日〜生産培養の最後（例えば、約０日、約５日、約７日、約１０日、約１２日、約１５日または約２５日）であり得る。ある実施形態において、約０ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌの範囲内のレベルでのフコース添加は、約２５℃〜約３９℃の範囲内の培養温度と組み合わせて行うことができる。ある実施形態において、培養温度は、約２５℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３５℃〜約３９℃または約３６℃〜約３９℃であり得る。ある実施形態において、約０ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌまたは約０ｍＭ〜約６０ｍＭのレベルのフコース添加は、低ｐＣＯ２または高ｐＣＯ２背景での約０ｎＭ〜２００００ｎＭのレベルでＭｎ補充と組み合わせて行うことができる。フコース添加の非限定的な例としては、生産培養および／または生産培養段階にいたるまでの増殖培養への添加が挙げられる。
【０１８９】
本明細書において記載されているある実施形態は、所望される糖タンパク質グリコシル化パターンを達成または保持するために、培養培地中に、開示された条件（例えば、ｐＣＯ２、補充されるＭｎなど）下で開示された濃度のフコースを補充することによってグリコシル化を調節することに関する。非限定的な実施形態において、フコース濃度を増加させることによって達成することができる所望の糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損の調節（例えば、増加または減少）である。例えば、限定を目的とするものではないが、フコシル化欠損Ｇ０の目標範囲（％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆ）は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節することができる。ある実施形態において、フコース濃度を増加させることによって達成される所望の糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のガラクトシル化の調節であり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、フコシル化されたＧ０の目標範囲（％Ｇ０）は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節することができる。ある実施形態において、増加されたフコース濃度によって達成される所望の糖タンパク質グリコシル化パターンは、糖タンパク質のフコシル化欠損の調節とガラクトシル化の調節の組み合わせであり得る。例えば、限定を目的とするものではないが、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆの目標範囲は、約０％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％または約１％〜約８％であり得、％Ｇ０の目標範囲は、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％または約６０％〜約８０％であり得る。ある実施形態において、％Ｇ０−Ｆまたは％標準化されたＧ０−Ｆは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％または約２０％調節され得、％Ｇ０は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％または約５０％調節され得る。
【０１９０】
８．細胞培養および糖タンパク質組成物
ある実施形態において、本開示は、本明細書に概説されている細胞培養戦略の使用を介して得られた糖タンパク質、例えば、ｍＡｂの組成物に関する。このような組成物は、細胞培養培地、宿主細胞および発現されている糖タンパク質の性質によって規定される特異的な細胞培養組成物を含むことができる。例えば、限定を目的とするものではないが、本開示の組成物は、特定のグリコシル化プロファイル、例えば、特定量のフコシル化および／またはガラクトシル化されたＧ０グリカンを示す関心対象の糖タンパク質、例えば、ｍＡｂの組成物を対象とする。ある実施形態において、本開示の組成物は、有利なＭｎ濃度を含有するまたは含有するように補充されている細胞培養培地の組成物を対象とする。ある実施形態において、本開示は、このような細胞培養培地と特定のグリコシル化プロファイルを示すこのような関心対象の糖タンパク質との組み合わせを対象とすることができる。
【０１９１】
ある実施形態において、本開示は、特定の作用目標との適合性に関して細胞培養培地をスクリーニングおよび選択することによって、またはその他細胞培養培地成分変動に関して調節することによって得られた糖タンパク質、例えば、ｍＡｂの組成物に関する。例えば、限定を目的とするものではないが、本開示は、ｍＡｂ組成物であって、組成物が、細胞培養培地Ｍｎ濃度が３０ｎＭ〜１１０ｎＭの範囲内に属する細胞培養物から得られ、Ｍｎ濃度のこのような範囲外に属する培地がｍＡｂを生産する細胞培養に関連して利用されないｍＡｂ組成物を対象とする。本開示は、ｍＡｂ組成物であって、組成物が、細胞培養Ｍｎ濃度が３０ｎＭ〜１１０ｎＭの範囲内に属する細胞培養物から得られ、Ｍｎ濃度のこのような範囲外に属する細胞培養物がｍＡｂを生産する細胞培養に関連して利用されないｍＡｂ組成物も対象とする。ある実施形態において、本開示の組成物は、原材料のＭｎ濃度がスクリーニングおよび／または選択されている細胞培養培地の組成物を対象とする。ある実施形態において、本開示は、このような細胞培養培地と特定のグリコシル化プロファイルを示すこのような関心対象の糖タンパク質との組み合わせを対象とすることができる。
【０１９２】
ある実施形態において、本開示は、約７．３未満または約７．０未満の前ＨＴＳＴ  ｐＨ調整目標を用いて、培地のＨＴＳＴ処理を実施することを介して細胞培養培地中のＭｎの濃度を調節することによって得られた、特定のグリコシル化プロファイル、例えば、特定の量のフコシル化および／またはガラクトシル化されたＧ０グリカン、を示す糖タンパク質、例えば、ｍＡｂの組成物に関する。例えば、限定を目的とするものではないが、培地に対する前ＨＴＳＴ  ｐＨ調整目標は、約６．１、約６．３、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２または約７．３であり得る。ある実施形態において、本開示の組成物は、ＨＴＳＴ処理工程が本明細書に開示されているとおりの前ＨＴＳＴ  ｐＨ調整目標を用いて実施された細胞培養培地の組成物を対象とする。ある実施形態において、本開示は、このような細胞培養培地と特定のグリコシル化プロファイルを示すこのような関心対象の糖タンパク質との組み合わせを対象とすることができる。
【０１９３】
ある実施形態において、本開示は、本明細書に概説されているとおりに、細胞培養過程中のｐＣＯ２、培地保持期間、培養期間、培養温度、マンガン、ガラクトース、フコースおよび／もしくは浸透圧／Ｎａ＋濃度またはこれらの組み合わせを調節することによって得られた、特定のグリコシル化プロファイル、例えば、特定の量のフコシル化および／またはガラクトシル化されたＧ０グリカンを示す糖タンパク質、例えば、ｍＡｂの組成物に関する。ある実施形態において、本開示の組成物は、ｐＣＯ２、培地保持期間、培養期間、培養温度、マンガン、ガラクトース、フコースおよび／もしくは浸透圧／Ｎａ＋濃度またはこれらの組み合わせが、本明細書に概説されているとおりに調節されている細胞培養培地の組成物を対象とする。ある実施形態において、本開示は、このような細胞培養培地と特定のグリコシル化プロファイルを示すこのような関心対象の糖タンパク質との組み合わせを対象とすることができる。
【０１９４】
ある実施形態において、様々なバイオリアクターの形態を細胞培養培地の組成物に対して使用することができる。例えば、限定を目的とするものではないが、バイオリアクターの体積は、約１Ｌ〜約２０，０００Ｌ（例えば、約１Ｌ、約１．５Ｌ、約２Ｌ、約５Ｌ、約１０Ｌ、約５０Ｌ、約１００Ｌ、約２５０Ｌ、約５００Ｌ、約１０００Ｌ、約２０００Ｌ、約３０００Ｌ、約４０００Ｌ、約５０００Ｌ、約６０００Ｌ、約７０００Ｌ、約８０００Ｌ、約９０００Ｌ、約１０，０００Ｌ、約１１，０００Ｌ、約１２，０００Ｌ、約１３，０００Ｌ、約１４，０００Ｌ、約１５，０００Ｌ、約１６，０００Ｌ、約１７，０００Ｌ、約１８，０００Ｌ、約１９，０００Ｌまたは約２０，０００Ｌ）であり得る。非限定的な実施形態において、バイオリアクターの形態は、ｐＣＯ２、培地保持期間、浸透圧、Ｎａ＋、Ｍｎ、温度、ｐＨ、フコース、ガラクトースまたはこれらの組み合わせのレベルを調整するために変更することができる。
【０１９５】
描写され、特許請求される様々な実施形態に加えて、本開示の主題は、本明細書に開示され、特許請求される特徴の他の組合せを有する他の実施形態も対象とする。したがって、本明細書に提示される特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組合せを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組み合わせられてもよい。本開示の主題の特定の実施形態の前述の説明は、例証及び説明目的のために提示されている。網羅的であるようにも、本開示の主題を開示される実施形態に限定するようにも意図されていない。
【０１９６】
本開示の主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、本開示の主題の組成物及び方法に様々な修正及び変形を加えることができることは、当業者には明らかである。したがって、本開示の主題が添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内の修正及び変形を含むよう意図されている。様々な刊行物、特許および特許出願が本明細書に引用されており、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９７】
本開示の実施形態
以下は、本開示の非限定的な実施形態である。
【０１９８】
１．細胞培養物中の関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節するための方法であって、単独でまたは任意の組み合わせで、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータ：高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）条件における約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度；低ｐＣＯ２条件における約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度；約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２；約２５℃〜３９℃の温度での、約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；約０日〜約１５０日の細胞培養期間；約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度を、調節することを含む、方法。
【０１９９】
２．前記細胞培養環境が、細胞ありまたはなしのバイオリアクター中である、実施形態１に記載の方法。
【０２００】
３．前記低ｐＣＯ２条件が約１０〜約１００ｍｍＨｇであり、前記高ｐＣＯ２条件が約２０〜約２５０ｍｍＨｇである、実施形態１または実施形態２に記載の方法。
【０２０１】
４．ｐＣＯ２調節の期間が、前記細胞培養期間の少なくとも最初の半分を包含する、実施形態３に記載の方法。
【０２０２】
５．前記関心対象の糖タンパク質が組換えタンパク質である、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【０２０３】
６．前記組換えタンパク質が、抗体または抗体断片、ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）、ＢｓＤｂ（二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＤｂ（一本鎖二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＴａＦｖ（一本鎖二重特異性タンデム可変ドメイン）、ＤＮＬ−（Ｆａｂ）３（ドック・アンド・ロック三価Ｆａｂ）、ｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）およびＢｓｓｄＡｂ（二重特異性単一ドメイン抗体）である、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０２０４】
７．前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【０２０５】
８．前記抗体が抗ＣＤ２０抗体である、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【０２０６】
９．前記抗ＣＤ２０抗体がオクレリズマブである、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【０２０７】
１０．前記抗体または前記抗体断片が、約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の％Ｇ０−Ｆ（パーセントフコシル化欠損糖タンパク質）；または約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％もしくは約１％〜約８％の標準化された％Ｇ０−Ｆ；および／または約４０％〜約９０％；約５０％〜約９０％；約５５％〜約８５％；もしくは約６０％〜約８０％の％Ｇ０（パーセントガラクトシル化欠損糖タンパク質）を示す、実施形態６〜８に記載の方法。
【０２０８】
１１．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０（フコシル化されたガラクトシル化欠損Ｇ０））を減少させながら、増加されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０））を達成するために、またはガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を増加させながら、減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために、またはガラクトシル化欠損（例えばＧ０）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために、またはフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を達成するために、グリコシル化が調節される、実施形態６〜９に記載の方法。
【０２０９】
１２．関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、低ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度を調節すること、または高ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度、ならびに単独でのまたは任意の組み合わせでの、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータ：約２５℃〜３９℃の温度での、約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；約０日〜約１５０日の細胞培養期間；約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度を調節することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【０２１０】
１３．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、低ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度を調節すること、または高ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度、ならびに、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータ：約２５℃〜３９℃の温度での、約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；および約０日〜約１５０日の細胞培養期間を調節することを含む、実施形態１２に記載の方法。
【０２１１】
１４．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、低ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度を調節すること、または高ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度、ならびに、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータ：約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；および／または約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度を調節することを含む、実施形態１２に記載の方法。
【０２１２】
１５．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、播種前細胞培養培地保持期間ならびに単独でのまたは任意の組み合わせでの、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータのいずれか：高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）条件における約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度；低ｐＣＯ２条件における約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度；約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２；約０日〜約１５０日の細胞培養期間；約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度を調節することを含み、前記細胞培養培地保持期間が、約２５℃〜３９℃の温度で、約０時間〜約１２０時間である、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【０２１３】
１６．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、播種前細胞培養培地保持期間ならびに細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータ：高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）条件における約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度または低ｐＣＯ２条件における約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度；約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２；および約０日〜約１５０日の細胞培養期間を調節することを含み、
前記細胞培養培地保持期間が、約２５℃〜３９℃の温度で約０時間〜約１２０時間である、実施形態１５に記載の方法。
【０２１４】
１７．前記関心対象の糖タンパク質が抗体またはその抗体断片である、実施形態１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【０２１５】
１８．前記抗体または前記その抗体断片が抗ＣＤ２０抗体である、実施形態１７に記載の方法。
【０２１６】
１９．前記抗ＣＤ２０抗体がオクレリズマブである、実施形態１８に記載の方法。
【０２１７】
２０．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、細胞培養期間ならびに単独でのまたは任意の組み合わせでの、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータのいずれか：約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度を調節することを含み、細胞培養期間は約０日〜約１５０日である、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【０２１８】
２１．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、約０ｎＭ〜約３００ｎＭのＮａ＋濃度ならびに単独でのまたは任意の組み合わせでの、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータのいずれか：約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度を調節することを含み、前記Ｎａ＋濃度が約０ｍＭ〜約３００ｍＭの、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０２１９】
２２．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、Ｎａ＋濃度および約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２を調節することを含む、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【０２２０】
２３．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、浸透圧ならびに単独でのまたは任意の組み合わせでの、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータのいずれか：約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度を調節することを含み、前記浸透圧が約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇである、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０２２１】
２４．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する工程が、低ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度を調節すること、または高ｐＣＯ２条件下で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度を調節すること、約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度を調節すること、および約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含む、実施形態１に記載の方法。
【０２２２】
２５．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧および約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２を調節することを含む、実施形態１に記載の方法。
【０２２３】
２６．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、約２９℃〜約３９℃の培養温度および約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度および／または約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度を調節することを含む、実施形態１に記載の方法。
【０２２４】
２７．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２および約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度を調節することを含む、実施形態１に記載の方法。
【０２２５】
２８．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度および約２９℃〜約３９℃の培養温度を調節することを含む、実施形態１に記載の方法。
【０２２６】
２９．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、ｐＣＯ２濃度ならびに単独でのまたは任意の組み合わせでの、細胞培養培地中および／または細胞培養環境中の以下のパラメータのいずれか：高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）条件における約１ｎＭ〜約２００００ｎＭのＭｎ濃度；低ｐＣＯ２条件における約１ｎＭ〜約３００００ｎＭのＭｎ濃度；約２５℃〜３９℃の温度での約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；約０日〜約１５０日の細胞培養期間；約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度を調節することを含み、前記ｐＣＯ２濃度が、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇである、実施形態１に記載の方法。
【０２２７】
３０．前記Ｍｎ濃度が、高ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭ；高ｐＣＯ２培養物中で、約１ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約４０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭ；高ｐＣＯ２培養物中で、約１ｎＭ〜約５００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２０，０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである、実施形態１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０２２８】
３１．前記Ｍｎ濃度が、低ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり；低ｐＣＯ２培養物中で、約１ｎＭ〜約２００００ｎＭ；約１ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約４０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭ；約１ｎＭ〜約５００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約５００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約５０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２００００ｎＭまたは約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【０２２９】
３２．前記Ｍｎ濃度の調節が、細胞培養原材料中のＭｎ含有量を決定すること、およびＭｎ濃度を調節するために原材料ロットを選択することを含む、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【０２３０】
３３．前記Ｍｎ濃度の調節が、前記Ｍｎ濃度を調節するために、（ｉ）細胞培養培地もしくは細胞培養と接触している材料を調節すること；または（ｉｉ）細胞培養培地中にもしくは細胞培養の間に浸出されたＭｎの濃度を考慮すること；または（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【０２３１】
３４．前記浸出されたＭｎが、（ｉ）フィルタ；（ｉｉ）培地調製物、保持もしくは培養容器；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせとの、細胞培養物および／または細胞培養培地の接触によって生成される、実施形態３３に記載の方法。
【０２３２】
３５．前記フィルタが、デプスフィルタ、カラム、膜および円板を含むがこれらに限定されない、実施形態３４に記載の方法。
【０２３３】
３６．フィルタ材料が、珪藻土、中空繊維または樹脂を含むがこれらに限定されない、実施形態３４に記載の方法。
【０２３４】
３７．前記細胞培養培地が、基本培地、再構成された培地、流加培地、加水分解産物、補助剤、血清または添加物である、実施形態１〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【０２３５】
３８．前記細胞培養培地が、細胞培養物の生成段階の間に補充される、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【０２３６】
３９．前記細胞培養培地が、細胞培養物の生成段階の前に補充される、実施形態１〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【０２３７】
４０．前記細胞培養培地が、Ｍｎ、フコース、ガラクトースおよび／またはＮａ＋の１つまたは複数を含み、前記補充が、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づく、実施形態１〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【０２３８】
４１．前記Ｍｎ、フコース、ガラクトースおよびＮａ＋の１つまたは複数が、大量瞬時投与として、断続的な補充として、継続的な補充として、半継続的な補充として、フィードバックループをベースとする補充として、またはこれらの１つもしくは複数の組み合わせとして補充される、実施形態１〜４０のいずれか１つに記載の方法。
【０２３９】
４２．前記細胞培養培地が、ｉ）Ｍｎ；ｉｉ）フコース；ｉｉｉ）ガラクトース；および／またはｉｖ）Ｎａ＋の１つまたは複数から実質的になる、実施形態１〜４１のいずれか１つに記載の方法。
【０２４０】
４３．前記Ｍｎ濃度の調節が、高温短時間（ＨＴＳＴ）熱処理前に、約６．１〜約７．３；または約６．３〜約７．３の細胞培養培地ｐＨを利用することを含む、実施形態１〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【０２４１】
４４．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記ｐＣＯ２を調節することを含む、実施形態１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
【０２４２】
４５．前記細胞培養物または前記細胞培養培地がバイオリアクター中にあり、ｐＣＯ２の調節が、バイオリアクター作動体積；バイオリアクター気体散布戦略；バイオリアクター撹拌戦略；バイオリアクター培地交換戦略、バイオリアクター灌流戦略、バイオリアクター供給戦略またはこれらの任意の組み合わせを調節することによって達成される、実施形態１〜４４のいずれか１つに記載の方法。
【０２４３】
４６．前記ｐＣＯ２調節が、高ｐＣＯ２培養物を確立することを含む、実施形態４４に記載の方法。
【０２４４】
４７．前記ｐＣＯ２が約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約１５０ｍｍＨｇまたは約３０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇである、実施形態４６に記載の方法。
【０２４５】
４８．前記ｐＣＯ２調節が、低ｐＣＯ２培養物を確立することを含む、実施形態１〜４７の１つに記載の方法。
【０２４６】
４９．前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約１００ｍｍＨｇ、１０ｍｍＨｇ〜約８０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約７０ｍｍＨｇまたは約３０ｍｍＨｇ〜約６０ｍｍＨｇである、実施形態４８に記載の方法。
【０２４７】
５０．前記ｐＣＯ２調節が、培養の０日に起こる、実施形態１〜４９のいずれか１つに記載の方法。
【０２４８】
５１．前記ｐＣＯ２調節が、細胞培養のおおむね大半；最初の約５日間；最初の約７日間；または最初の約１０日間起こる、実施形態５０に記載の方法。
【０２４９】
５２．前記ｐＣＯ２調節が、生産培養のおおむね大半；最初の約５日間；最初の約７日間；または最初の約１０日間起こる、実施形態５０に記載の方法。
【０２５０】
５３．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含み、播種前細胞培養培地保持期間が、約０時間〜約１２０時間、約０時間〜約７２時間、約０時間〜約４８時間または約０時間〜約２４時間である、実施形態５２に記載の方法。
【０２５１】
５４．前記播種前細胞培養培地保持の間の前記培地の温度が、約２５℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３５℃〜約３９℃または約３６℃〜約３９℃である、実施形態５３に記載の方法。
【０２５２】
５５．関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、細胞培養期間を調節することを含み、細胞培養期間は、約０日〜約１５０日、約０日〜約１５日、約０日〜約１２日、０日〜約７日または約０日〜約５日である、実施形態１〜５４のいずれか１つに記載の方法。
【０２５３】
５６．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記Ｎａ＋濃度を調節することを含み、前記Ｎａ＋濃度が、約０ｍＭ〜約３００ｍＭであり；約２０ｍＭ〜約２０ｍＭ；約３０ｍＭ〜約１５０ｍＭ；または約４０ｍＭ〜約１３０ｍＭである、実施形態１〜５５のいずれか１つに記載の方法。
【０２５４】
５７．前記Ｎａ＋濃度の調節が、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＮａＯＨ、ＮａＣｌまたはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないＮａ化合物を前記細胞培養物に補充することを含む、実施形態１〜５６のいずれか１つに記載の方法。
【０２５５】
５８．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記浸透圧を調節することを含み、前記浸透圧が、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ；約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ；または約３２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４２５ｍＯｓｍ／ｋｇである、実施形態１〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【０２５６】
５９．浸透圧の調節が、細胞培養物に浸透圧調節培地成分を補充することを含む、実施形態１〜５８のいずれか１つに記載の方法。
【０２５７】
６０．前記浸透圧調節培地成分が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ソルビトール、浸透圧保護剤またはこれらの組み合わせである、実施形態５９に記載の方法。
【０２５８】
６１．前記浸透圧調節培地成分が、大量瞬時投与として、断続的な補充として、継続的な補充として、半継続的な補充として、フィードバックループをベースとする補充として、またはこれらの１つもしくは複数の組み合わせとして補充される、実施形態５９に記載の方法。
【０２５９】
６２．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記ガラクトース濃度を調節することを含み、前記ガラクトース濃度が、約０ｍＭ〜約６０ｍＭまたは約０ｍＭ〜約５０ｍＭである、実施形態１〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【０２６０】
６３．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記フコース濃度を調節することを含み、前記フコース濃度が、約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり；０ｍＭ〜約４０ｍＭ；約０ｍＭ〜約２０ｍＭ；または約０ｍＭ〜約１０ｍＭである、実施形態１〜６２のいずれか１つに記載の方法。
【０２６１】
６４．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記細胞培養温度を調節することを含み、前記細胞培養温度が、約２９℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３１℃〜約３８℃または約３４℃〜約３８℃である、実施形態１〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【０２６２】
６５．前記細胞培養温度が、細胞培養物の生成段階の間に調節される、実施形態６４に記載の方法。
【０２６３】
６６．前記細胞培養温度が、細胞培養物の生成段階の前に調節される、実施形態１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【０２６４】
６７．前記細胞培養温度が、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づいて調節される、実施形態１〜６６のいずれか１つに記載の方法。
【０２６５】
６８．前記細胞培養物が真核細胞を含む、実施形態１〜６７のいずれか１つに記載の方法。
【０２６６】
６９．前記真核細胞が、昆虫、鳥、真菌、植物または哺乳動物細胞である、実施形態６８に記載の方法。
【０２６７】
７０．前記真菌細胞が酵母、ピキアまたは任意の糸状真菌細胞である、実施形態６９に記載の方法。
【０２６８】
７１．前記酵母細胞がエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である、実施形態７０に記載の方法。
【０２６９】
７２．前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態６９に記載の方法。
【０２７０】
７３．前記細胞培養物が、使い捨て技術（ＳＵＴ）袋もしくはバイオリアクター；ＷＡＶＥバイオリアクター；ステンレス鋼バイオリアクター；フラスコ；チューブおよびチャンバーを含むがこれらに限定されないバイオリアクター中にある、実施形態１〜７２のいずれか１つに記載の方法。
【０２７１】
７４．前記細胞培養物の体積が１ｍＬ〜３５，０００Ｌである、実施形態１〜７３のいずれか１つに記載の方法。
【０２７２】
７５．前記細胞培養物の体積が、１ｍＬ〜１０ｍｌ、１ｍＬ〜５０ｍｌ、１ｍＬ〜１００ｍｌ、１ｍＬ〜２００ｍｌ、１ｍＬ〜３００ｍｌ、１ｍＬ〜５００ｍｌ、１ｍＬ〜１０００ｍｌ、１ｍＬ〜２０００ｍｌ、１ｍＬ〜３０００ｍｌ、１ｍＬ〜４０００ｍｌ、１ｍＬ〜５０００ｍｌ、１ｍＬ〜１Ｌ、１ｍＬ〜２Ｌ、１ｍＬ〜３Ｌ、１ｍＬ〜４Ｌ、１ｍＬ〜５Ｌ、１ｍＬ〜６Ｌ、１ｍＬ〜１０Ｌ、１ｍＬ〜２０Ｌ、１ｍＬ〜３０Ｌ、１ｍＬ〜４０Ｌ、１ｍＬ〜５０Ｌ、１ｍＬ〜６０Ｌ、１ｍＬ〜７０Ｌ、１ｍＬ〜１００Ｌ、１ｍＬ〜２００Ｌ、１ｍＬ〜３００Ｌ、１ｍＬ〜４００Ｌ、１ｍＬ〜５００Ｌ、１ｍＬ〜１０００Ｌ、１ｍＬ〜２０００Ｌ、１ｍＬ〜３０００Ｌ、１ｍＬ〜４０００Ｌ、１ｍＬ〜５０００Ｌ、１ｍＬ〜１０，０００Ｌ、１ｍＬ〜２０，０００Ｌ、１ｍＬ〜３０，０００Ｌ、１ｍＬ〜３０，０００Ｌ、１ｍＬ〜３５，０００Ｌである、実施形態７４に記載の方法。
【０２７３】
７６．約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の％Ｇ０−Ｆ（パーセントフコシル化欠損糖タンパク質）；または約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％もしくは約１％〜約８％の標準化された％Ｇ０−Ｆ；および／または約４０％〜約９０％；約５０％〜約９０％；約５５％〜約８５％；もしくは約６０％〜約８０％の％Ｇ０（パーセントガラクトシル化欠損糖タンパク質）を示す関心対象の糖タンパク質を取得するための、実施形態１〜７５のいずれか１つに記載の方法の使用。
【０２７４】
７７．ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０（フコシル化されたガラクトシル化欠損Ｇ０））を減少させながら、増加されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０））を達成するために、またはガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を増加させながら、減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために、またはガラクトシル化欠損（例えばＧ０）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために、またはフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を達成するために、グリコシル化が調節される、実施形態１〜７５のいずれか１つに記載の方法の使用。
【０２７５】
７８．細胞培養培地、流加培地、加水分解産物または添加物を調製するための方法であって、約１ｎＭ〜約２００００ｎＭの高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）培養物におけるＭｎ濃度；約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの低ｐＣＯ２培養物におけるＭｎ濃度；約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２；約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；約０日〜約１５０日の細胞培養期間；約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度を調節する１つまたは複数の工程を含み、前記細胞培養培地、流加培地、加水分解産物または添加物が関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンを調節する、方法。
【０２７６】
７９．前記関心対象の糖タンパク質が抗体または抗体断片である、実施形態７８に記載の方法。
【０２７７】
８０．前記抗体または前記抗体断片が、約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の％Ｇ０−Ｆ；または約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％もしくは約１％〜約８％の標準化された％Ｇ０−Ｆ；および／または約４０％〜約９０％；約５０％〜約９０％；約５５％〜約８５％；もしくは約６０％〜約８０％の％Ｇ０を示す、実施形態７９に記載の方法。
【０２７８】
８１．前記抗体または前抗体断片のグリコシル化が、ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０（フコシル化されたガラクトシル化欠損Ｇ０））を減少させながら、増加されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０））を達成するために、またはガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を増加させながら、減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために、またはガラクトシル化欠損（例えばＧ０）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために、またはフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を達成するために、調節される、実施形態７９に記載の方法。
【０２７９】
８２．約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの前記Ｍｎ濃度および約０時間〜約１２０時間の前記播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含む、実施形態７８〜８１のいずれか１つに記載の方法。
【０２８０】
８３．約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇの前記ｐＣＯ２、約０ｍＭ〜約３００ｍＭの前記Ｎａ＋濃度および約０時間〜約１２０時間の前記播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含む、実施形態７８〜８２のいずれか１つに記載の方法。
【０２８１】
８４．約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの前記Ｍｎ濃度、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇの前記ｐＣＯ２および約０ｍＭ〜約３００ｍＭの前記Ｎａ＋濃度を調節することを含む、実施形態７８〜８３のいずれか１つに記載の方法。
【０２８２】
８５．約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの前記Ｍｎ濃度、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇの前記ｐＣＯ２、約０ｍＭ〜約３００ｍＭの前記Ｎａ＋濃度および約０時間〜約７２時間の前記播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含む、実施形態７８〜８４のいずれか１つに記載の方法。
【０２８３】
８６．約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇの前記ｐＣＯ２および約０ｍＭ〜約３００ｍＭの前記Ｎａ＋濃度を調節することを含む、実施形態７８〜８５のいずれか１つに記載の方法。
【０２８４】
８７．約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの前記浸透圧および約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇの前記ｐＣＯ２を調節することを含む、実施形態７８〜８６のいずれか１つに記載の方法。
【０２８５】
８８．約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇの前記ｐＣＯ２、約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの前記Ｍｎ濃度、約０日〜約１５０日の前記細胞培養期間および０時間〜約１２０時間の前記播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含む、実施形態７８〜８７のいずれか１つに記載の方法。
【０２８６】
８９．約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの前記Ｍｎ濃度および約０ｍＭ〜約６０ｍＭの前記ガラクトース濃度を調節することを含む、実施形態７８〜８８のいずれか１つに記載の方法。
【０２８７】
９０．約０ｍＭ〜約６０ｍＭの前記フコース濃度および約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの前記Ｍｎ濃度を調節することを含む、実施形態７８〜８９のいずれか１つに記載の方法。
【０２８８】
９１．約０ｍＭ〜約６０ｍＭの前記フコース濃度および約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇの前記ｐＣＯ２を調節することを含む、実施形態７８〜９０のいずれか１つに記載の方法。
【０２８９】
９２．約０ｍＭ〜約６０ｍＭの前記フコース濃度、約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの前記Ｍｎ濃度、約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇの前記ｐＣＯ２を調節することを含む、実施形態７８〜９１のいずれか１つに記載の方法。
【０２９０】
９３．約０ｍＭ〜約６０ｍＭの前記フコース濃度を調節することを含み、前記細胞培養温度が約２９℃〜約３９℃である、実施形態７８〜９２のいずれか１つに記載の方法。
【０２９１】
９４．約０ｍＭ〜約６０ｍＭの前記フコース濃度および約０日〜約１５０日の前記細胞培養期間を調節することを含む、実施形態７８〜９３のいずれか１つに記載の方法。
【０２９２】
９５．前記Ｍｎ濃度が、高ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭ；高ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約１０００ｎＭ；高ｐＣＯ２培養物中で約２０ｎＭ〜約３００ｎＭ；または高ｐＣＯ２培養物中で約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである、実施形態７８〜９４のいずれか１つに記載の方法。
【０２９３】
９６．前記Ｍｎ濃度が、低ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭ；低ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約３０００ｎＭ；低ｐＣＯ２培養物中で約２０ｎＭ〜約３００ｎＭ；または低ｐＣＯ２培養物中で約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである、実施形態７８〜９５のいずれか１つに記載の方法。
【０２９４】
９７．前記Ｍｎ濃度の調節が、細胞培養原材料中のＭｎ含有量を決定すること、およびＭｎ濃度を調節するために原材料ロットを選択することを含む、実施形態９５または実施形態９６に記載の方法。
【０２９５】
９８．前記Ｍｎ濃度の調節が、前記Ｍｎ濃度を調節するために、ｉ）細胞培養培地もしくは細胞培養と接触している材料を調節すること；または（ｉｉ）細胞培養培地中にもしくは細胞培養の間に浸出されたＭｎの濃度を考慮すること；または（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む、実施形態９５または実施形態９６に記載の方法。
【０２９６】
９９．前記浸出されたＭｎが、（ｉ）フィルタ；（ｉｉ）培地調製物、保持もしくは培養容器；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせとの、細胞培養物および／または細胞培養培地の接触によって生成される、実施形態９８に記載の方法。
【０２９７】
１００．前記フィルタが、デプスフィルタ、カラム、膜および円板を含むがこれらに限定されない、実施形態９９に記載の方法。
【０２９８】
１０１．フィルタ材料が、珪藻土、中空繊維または樹脂を含むがこれらに限定されない、実施形態９９に記載の方法。
【０２９９】
１０２．前記Ｍｎ濃度の調節が、ＨＴＳＴ処理前に、約６．１〜約７．３；または約６．３〜約７．３の細胞培養培地ｐＨを利用することを含む、実施形態９５または実施形態９６に記載の方法。
【０３００】
１０３．前記ｐＣＯ２が調節されている、実施形態７８〜１０２のいずれか１つに記載の方法。
【０３０１】
１０４．前記細胞培養培地がバイオリアクター中にあり、ｐＣＯ２の調節が、バイオリアクター作動体積；バイオリアクター気体散布戦略；バイオリアクター撹拌戦略；バイオリアクター供給戦略；バイオリアクター灌流戦略；バイオリアクター培地交換戦略またはこれらの任意の組み合わせを調節することによって達成される、実施形態１０３に記載の方法。
【０３０２】
１０５．前記ｐＣＯ２調節が、高ｐＣＯ２培養物を確立することを含む、実施形態１０３に記載の方法。
【０３０３】
１０６．前記ｐＣＯ２が約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約１５０ｍｍＨｇまたは約３０ｍｍＨｇ〜約１５０ｍｍＨｇである、実施形態１０５に記載の方法。
【０３０４】
１０７．前記ｐＣＯ２調節が、低ｐＣＯ２培養物を確立することを含む、実施形態１０３に記載の方法。
【０３０５】
１０８．前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約１００ｍｍＨｇ、１０ｍｍＨｇ〜約８０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約７０ｍｍＨｇまたは約３０ｍｍＨｇ〜約６０ｍｍＨｇである、実施形態１０７に記載の方法。
【０３０６】
１０９．前記ｐＣＯ２調節が培養の０日に起きる、実施形態１０３に記載の方法。
【０３０７】
１１０．前記ｐＣＯ２調節が、細胞培養のおおむね大半；最初の約５日間；最初の約７日間；または最初の約１０日間起きる、実施形態１０３に記載の方法。
【０３０８】
１１１．前記ｐＣＯ２調節が、生産培養のおおむね大半；最初の約５日間；最初の約７日間；または最初の約１０日間起きる、実施形態１０３に記載の方法。
【０３０９】
１１２．前記播種前細胞培養培地保持期間が、約０時間〜約１２０時間、０時間〜約７２時間、約０時間〜約４８時間、または約０時間〜約２４時間である、実施形態７８〜１１１のいずれか１つに記載の方法。
【０３１０】
１１３．前記播種前細胞培養培地保持の間の前記培地の温度が、約２５℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３５℃〜約３９℃または約３６℃〜約３９℃である、実施形態１１２に記載の方法。
【０３１１】
１１４．前記細胞培養期間が、約０日〜約１５０日、約０日〜約１５日、約０日〜約１２日、０日〜約７日または約０日〜約５日である、実施形態７８〜１１３のいずれか１つに記載の方法。
【０３１２】
１１５．前記Ｎａ＋濃度が、約０ｍＭ〜約３００ｍＭであり、約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１５０ｍＭまたは約４０ｍＭ〜約１３０ｍＭである、実施形態７８〜１１４のいずれか１つに記載の方法。
【０３１３】
１１６．前記Ｎａ＋濃度の調節が、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＮａＯＨ、ＮａＣｌまたはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないＮａ化合物を前記細胞培養物に補充することを含む、実施形態１１５に記載の方法。
【０３１４】
１１７．の浸透圧が、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇまたは約３２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４２５ｍＯｓｍ／ｋｇである、実施形態７８〜１１６のいずれか１つに記載の方法。
【０３１５】
１１８．前記浸透圧の調節が、細胞培養物に浸透圧調節培地成分を補充することを含む、実施形態１１７に記載の方法。
【０３１６】
１１９．前記浸透圧調節培地成分が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ソルビトール、浸透圧保護剤またはこれらの組み合わせである、実施形態１１８に記載の方法。
【０３１７】
１２０．前記ガラクトース濃度が、約０ｍＭ〜約６０ｍＭまたは約０ｍＭ〜約５０ｍＭである、実施形態７８７〜１１９のいずれか１つに記載の方法。
【０３１８】
１２１．前記フコース濃度が、約０ｍＭ〜約６０ｍＭ、０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約０ｍＭ〜約２０ｍＭまたは約０ｍＭ〜約１０ｍＭである、実施形態７８〜１１９のいずれか１つに記載の方法。
【０３１９】
１２２．前記細胞培養温度が、約２９℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３１℃〜約３８℃または約３４℃〜約３８℃である、実施形態７８〜１１９のいずれか１つに記載の方法。
【０３２０】
１２３．組換えタンパク質の作製のための真核細胞発酵過程における、実施形態７８〜１２１のいずれか１つに記載の培地の使用。
【０３２１】
１２４．前記組換えタンパク質が、抗体または抗体断片、ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）、ＢｓＤｂ（二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＤｂ（一本鎖二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＴａＦｖ（一本鎖二重特異性タンデム可変ドメイン）、ＤＮＬ−（Ｆａｂ）３（ドック・アンド・ロック三価Ｆａｂ）、ｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）およびＢｓｓｄＡｂ（二重特異性単一ドメイン抗体）である、実施形態１２３に記載の培地の使用。
【０３２２】
１２５．前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、実施形態１２４に記載の培地の使用。
【０３２３】
１２６．前記抗体が抗ＣＤ２０抗体である、実施形態１２４に記載の培地の使用。
【０３２４】
１２７．前記抗ＣＤ２０抗体がオクレリズマブである、実施形態１２４に記載の培地の使用。
【０３２５】
１２８．前記抗体または前記抗体断片が、約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の％Ｇ０−Ｆ（パーセントフコシル化欠損糖タンパク質）；約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％もしくは約１％〜約８％の標準化された％Ｇ０−Ｆ；および／または約４０％〜約９０％；約５０％〜約９０％；約５５％〜約８５％；もしくは約６０％〜約８０％の％Ｇ０（パーセントガラクトシル化欠損糖タンパク質）を示す、実施形態１２４に記載の培地の使用。
【０３２６】
１２９．前記真核細胞が、昆虫、鳥、真菌、植物または哺乳動物細胞である、実施形態１２４に記載の培地の使用。
【０３２７】
１３０．前記真菌細胞が、酵母、ピキアまたは任意の糸状真菌細胞である、実施形態１２９に記載の培地の使用。
【０３２８】
１３１．前記酵母細胞がエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である、実施形態１３０に記載の培地の使用。
【０３２９】
１３２．前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態１２９に記載の培地の使用。
【０３３０】
１３３．前記細胞培養物が、使い捨て技術（ＳＵＴ）袋もしくはバイオリアクター；ＷＡＶＥバイオリアクター；ステンレス鋼バイオリアクター；フラスコ；チューブおよびチャンバーを含むがこれらに限定されないバイオリアクター中にある、実施形態１２３〜１３２のいずれか１つに記載の培地の使用。
【０３３１】
１３４．前記細胞培養物の体積が１ｍＬ〜３５，０００Ｌである、実施形態１２３〜１３３のいずれか１つに記載の培地の使用。
【０３３２】
１３５．前記細胞培養物の体積が、１ｍＬ〜１０ｍｌ、１ｍＬ〜５０ｍｌ、１ｍＬ〜１００ｍｌ、１ｍＬ〜２００ｍｌ、１ｍＬ〜３００ｍｌ、１ｍＬ〜５００ｍｌ、１ｍＬ〜１０００ｍｌ、１ｍＬ〜２０００ｍｌ、１ｍＬ〜３０００ｍｌ、１ｍＬ〜４０００ｍｌ、１ｍＬ〜５０００ｍｌ、１ｍＬ〜１Ｌ、１ｍＬ〜２Ｌ、１ｍＬ〜３Ｌ、１ｍＬ〜４Ｌ、１ｍＬ〜５Ｌ、１ｍＬ〜６Ｌ、１ｍＬ〜１０Ｌ、１ｍＬ〜２０Ｌ、１ｍＬ〜３０Ｌ、１ｍＬ〜４０Ｌ、１ｍＬ〜５０Ｌ、１ｍＬ〜６０Ｌ、１ｍＬ〜７０Ｌ、１ｍＬ〜１００Ｌ、１ｍＬ〜２００Ｌ、１ｍＬ〜３００Ｌ、１ｍＬ〜４００Ｌ、１ｍＬ〜５００Ｌ、１ｍＬ〜１０００Ｌ、１ｍＬ〜２０００Ｌ、１ｍＬ〜３０００Ｌ、１ｍＬ〜４０００Ｌ、１ｍＬ〜５０００Ｌ、１ｍＬ〜１０，０００Ｌ、１ｍＬ〜２０，０００Ｌ、１ｍＬ〜３０，０００Ｌ、１ｍＬ〜３０，０００Ｌ、１ｍＬ〜３５，０００Ｌである、実施形態１３４に記載の培地の使用。
【０３３３】
１３６．関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、約１ｎＭ〜約２００００ｎＭの高分圧ＣＯ２（ｐＣＯ２）培養物中のＭｎ濃度；約１ｎＭ〜約３００００ｎＭの低ｐＣＯ２培養物中のＭｎ濃度；約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇのｐＣＯ２；約０時間〜約１２０時間の播種前細胞培養培地保持期間；約０日〜約１５０日の細胞培養期間；約０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ＋濃度；約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのガラクトース濃度；約０ｍＭ〜約６０ｍＭのフコース濃度；および約２９℃〜約３９℃の培養温度から選択される１つまたは複数の所定のパラメータを目標とするように調節された細胞培養物および／または細胞培養培地とを含む細胞培養組成物。
【０３３４】
１３７．前記細胞培養環境がバイオリアクター内である、実施形態１３６に記載の組成物。
【０３３５】
１３８．前記関心対象の糖タンパク質が抗体または抗体断片である、実施形態１３６〜１３７のいずれか１つに記載の組成物。
【０３３６】
１３９．前記抗体または前記抗体断片が、約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％；もしくは約１％〜約８％の％Ｇ０−Ｆ（パーセントフコシル化欠損糖タンパク質）；または約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％もしくは約１％〜約８％の標準化された％Ｇ０−Ｆ；および／または約４０％〜約９０％；約５０％〜約９０％；約５５％〜約８５％；もしくは約６０％〜約８０％の％Ｇ０（パーセントガラクトシル化欠損糖タンパク質）を示す、実施形態１３８に記載の組成物。
【０３３７】
１４０．前記抗体または前記抗体断片のグリコシル化が、ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０（フコシル化されたガラクトシル化欠損Ｇ０））を減少させながら、増加されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０））を達成するために、またはガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を増加させながら、減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために、またはガラクトシル化欠損（例えばＧ０）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために、またはフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を達成するために、調節される、実施形態１３８に記載の組成物。
【０３３８】
１４１．前記Ｍｎ濃度が約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり、前記播種前細胞培養培地保持期間が約０時間〜約１２０時間である、実施形態１３６に記載の組成物。
【０３３９】
１４２．前記ｐＣＯ２が１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇであり、前記Ｎａ＋濃度が約０ｍＭ〜約３００ｍＭ、前記播種前細胞培養培地保持期間が約０時間〜約１２０時間である、実施形態１３６に記載の組成物。
【０３４０】
１４３．前記Ｍｎ濃度が約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり、前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇであり、前記Ｎａ＋濃度が約０ｍＭ〜約３００ｍＭである、実施形態１３６に記載の組成物。
【０３４１】
１４４．前記Ｍｎ濃度が約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり、前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇであり、前記Ｎａ＋濃度が約０ｍＭ〜約３００ｍＭであり、前記播種前細胞培養培地保持期間が約０時間〜約１２０時間である、実施形態１３６に記載の組成物。
【０３４２】
１４５．前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇであり、前記Ｎａ＋濃度が約０ｍＭ〜約３００ｍＭである、実施形態１３６に記載の組成物。
【０３４３】
１４６．前記浸透圧が約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇである、実施形態１３６に記載の組成物。
【０３４４】
１４７．前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇであり、前記Ｍｎ濃度が約１ｎＭ〜約３００００ｎＭでああり、前記細胞培養期間が約０日〜約１５０日であり、前記播種前細胞培養培地保持期間が約０時間〜約１２０時間である、実施形態１３６に記載の組成物。
【０３４５】
１４８．前記Ｍｎ濃度が約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり、前記ガラクトース濃度が約０ｍＭ〜約６０ｍＭである、実施形態１３６に記載の組成物。
【０３４６】
１４９．前記フコース濃度が、約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり、前記Ｍｎ濃度が約１ｎＭ〜約３００００ｎＭである、実施形態１３６に記載の組成物。
【０３４７】
１５０．前記フコース濃度が約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり、前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇである、実施形態１３６に記載の組成物。
【０３４８】
１５１．前記フコース濃度が約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり、前記Ｍｎ濃度が約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり、前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇである、実施形態１３６に記載の組成物。
【０３４９】
１５２．前記フコース濃度が約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり、前記細胞培養温度が約２９℃〜約３９℃である、実施形態１３６に記載の組成物。
【０３５０】
１５３．前記フコース濃度が約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり、細胞培養期間が約０日〜約１５０日である、実施形態１３６に記載の組成物。
【０３５１】
１５４．Ｍｎ濃度が、高ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約２００００ｎＭ；高ｐＣＯ２培養物中で、約１ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約４０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭ；高ｐＣＯ２培養物中で、約１ｎＭ〜約５００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２０，０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである、実施形態１３６〜１５３のいずれか１つに記載の組成物。
【０３５２】
１５５．前記Ｍｎ濃度が、低ｐＣＯ２培養物中で約１ｎＭ〜約３００００ｎＭであり；低ｐＣＯ２培養物中で、約１ｎＭ〜約２００００ｎＭ；約１ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約４０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭ；約１ｎＭ〜約５００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約５００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約５０００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１００００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２００００ｎＭまたは約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである、実施形態１３６〜１５３のいずれか１つに記載の方法。
【０３５３】
１５６．前記Ｍｎ濃度の調節が、細胞培養原材料中のＭｎ含有量を決定すること、およびＭｎ濃度を調節するために原材料ロットを選択することを含む、実施形態１５４または実施形態１５５に記載の組成物。
【０３５４】
１５７．前記Ｍｎ濃度の調節が、前記Ｍｎ濃度を調節するために、（ｉ）細胞培養培地もしくは細胞培養と接触している材料を調節すること；または（ｉｉ）細胞培養培地中にもしくは細胞培養の間に浸出されたＭｎの濃度を考慮すること；または（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む、実施形態１５４または実施形態１５５に記載の組成物。
【０３５５】
１５８．前記浸出されたＭｎが、（ｉ）フィルタ；（ｉｉ）培地調製物、保持もしくは培養容器；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせとの、前記細胞培養物および／または細胞培養培地の接触によって生成される、実施形態１５７に記載の組成物。
【０３５６】
１５９．前記フィルタが、デプスフィルタ、カラム、膜および円板を含むがこれらに限定されない、実施形態１５８に記載の組成物。
【０３５７】
１６０．フィルタ材料が、珪藻土、中空繊維または樹脂を含むがこれらに限定されない、実施形態１５８に記載の組成物。
【０３５８】
１６１．Ｍｎが、細胞培養培地の成分として補充される、実施形態１５４または実施形態１５５に記載の組成物。
【０３５９】
１６２．前記細胞培養培地が、流加培地、加水分解産物または添加物である、実施形態１６１に記載の組成物。
【０３６０】
１６３．前記流加培地、前記加水分解産物または前記添加物がＭｎを含む、実施形態１６２に記載の組成物。
【０３６１】
１６４．前記流加培地または前記添加物が、Ｍｎから実質的になる、実施形態１６２に記載の組成物。
【０３６２】
１６５．前記Ｍｎが、細胞培養物の生成段階の間に補充される、実施形態１５４または実施形態１５５に記載の組成物。
【０３６３】
１６６．前記Ｍｎが、細胞培養物の生成段階の前に補充される、実施形態１５４または実施形態１５５に記載の組成物。
【０３６４】
１６７．前記Ｍｎが、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づいて補充される、実施形態１５４または実施形態１５５に記載の組成物。
【０３６５】
１６８．前記Ｍｎが、大量瞬時投与として、断続的な補充として、継続的な補充として、半継続的な補充として、フィードバックループをベースとする補充として、またはこれらの１つもしくは複数の組み合わせとして補充される、実施形態１５４または実施形態１５５に記載の組成物。
【０３６６】
１６９．前記Ｍｎ濃度の調節が、ＨＴＳＴ熱処理前に、約６．１〜約７．３；または約６．３〜約７．３の細胞培養培地ｐＨを利用することを含む、実施形態１５４または実施形態１５５に記載の組成物。
【０３６７】
１７０．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記ｐＣＯ２を調節することを含む、実施形態１３６〜１５３のいずれか１つに記載の組成物。
【０３６８】
１７１．前記細胞培養物または細胞培養培地がバイオリアクター中にあり、ｐＣＯ２の調節が、バイオリアクター作動体積；バイオリアクター気体散布戦略；バイオリアクター撹拌戦略；バイオリアクター供給戦略；バイオリアクター灌流戦略；バイオリアクター培地交換戦略またはこれらの任意の組み合わせを調節することによって達成される、実施形態１７０に記載の組成物。
【０３６９】
１７２．前記ｐＣＯ２調節が、高ｐＣＯ２培養物を確立することを含む、実施形態１７０に記載の組成物。
【０３７０】
１７３．前記ｐＣＯ２が約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約２５０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約１５０ｍｍＨｇまたは約３０ｍｍＨｇ〜約１５０ｍｍＨｇである、実施形態１７２に記載の組成物。
【０３７１】
１７４．前記ｐＣＯ２調節が、低ｐＣＯ２培養物を確立することを含む、実施形態１７０に記載の組成物。
【０３７２】
１７５．前記ｐＣＯ２が約１０ｍｍＨｇ〜約１００ｍｍＨｇ、１０ｍｍＨｇ〜約８０ｍｍＨｇ、約２０ｍｍＨｇ〜約７０ｍｍＨｇまたは約３０ｍｍＨｇ〜約６０ｍｍＨｇである、実施形態１７４に記載の組成物。
【０３７３】
１７６．前記ｐＣＯ２調節が培養の０日に起きる、実施形態１７０に記載の組成物。
【０３７４】
１７７．前記ｐＣＯ２調節が、細胞培養のおおむね大半；最初の約５日間；最初の約７日間；または最初の約１０日間起きる、実施形態１７０に記載の組成物。
【０３７５】
１７８．前記ｐＣＯ２調節が、生産培養のおおむね大半；最初の約５日間；最初の約７日間；または最初の約１０日間起きる、実施形態１７０に記載の組成物。
【０３７６】
１７９．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記播種前細胞培養培地保持期間を調節することを含み、前記播種前細胞培養培地保持期間が、約０時間〜約１２０時間、０時間〜約７２時間：約０時間〜約４８時間または約０時間〜約２４時間である、実施形態１１３６〜１５３のいずれか１つに記載の組成物。
【０３７７】
１８０．前記播種前細胞培養培地保持の間の前記培地の温度が、約２５℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３５℃〜約３９℃または約３６℃〜約３９℃である、実施形態１７９に記載の組成物。
【０３７８】
１８１．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記細胞培養期間を調節することを含み、前記細胞培養期間が、約０日〜約１５０日、約０日〜約１５日、約０日〜約１２日、０日〜約７日または約０日〜約５日である、実施形態１３６〜１５３のいずれか１つに記載の組成物。
【０３７９】
１８２．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記Ｎａ＋濃度を調節することを含み、前記Ｎａ＋濃度が、約０ｍＭ〜約３００ｍＭであり；約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約３０ｍＭ〜約１５０ｍＭ；または約４０ｍＭ〜約１３０ｍＭである、実施形態１３６〜１５３のいずれか一項に記載の組成物。
【０３８０】
１８３．前記Ｎａ＋濃度の調節が、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＮａＯＨ、ＮａＣｌまたはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないＮａ化合物を前記細胞培養物に補充することを含む、実施形態１８２に記載の組成物。
【０３８１】
１８４．Ｎａ＋が、細胞培養物の生成段階の間に補充される、実施形態１８２に記載の組成物。
【０３８２】
１８５．前記Ｎａ＋が、細胞培養物の生成段階の前に補充される、実施形態１８２に記載の組成物。
【０３８３】
１８６．前記Ｎａ＋が、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づいて補充される、実施形態１８２に記載の組成物。
【０３８４】
１８７．前記Ｎａ＋が、大量瞬時投与として、断続的な補充として、継続的な補充として、半継続的な補充として、フィードバックループをベースとする補充として、またはこれらの１つもしくは複数の組み合わせとして補充される、実施形態１８２に記載の組成物。
【０３８５】
１８８．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記浸透圧を調節することを含み、前記浸透圧が、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ；約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ；または約３２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４２５ｍＯｓｍ／ｋｇである、実施形態１３６〜１５３のいずれか一項に記載の組成物。
【０３８６】
１８９．前記浸透圧の調節が、細胞培養物に浸透圧調節培地成分を補充することを含む、実施形態１８８に記載の組成物。
【０３８７】
１９０．前記浸透圧調節培地成分が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ソルビトール、浸透圧保護剤またはこれらの組み合わせである、実施形態１８９に記載の組成物。
【０３８８】
１９１．前記浸透圧調節培地成分が、細胞培養物の生成段階の間に補充される、実施形態１８９に記載の組成物。
【０３８９】
１９２．前記浸透圧調節培地成分が、細胞培養物の生成段階の前に補充される、実施形態１８９に記載の組成物。
【０３９０】
１９３．前記浸透圧調節培地成分が、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づいて補充される、実施形態１８９に記載の組成物。
【０３９１】
１９４．前記浸透圧調節培地成分が、大量瞬時投与として、断続的な補充として、継続的な補充として、半継続的な補充として、フィードバックループをベースとする補充として、またはこれらの１つもしくは複数の組み合わせとして補充される、実施形態１８９に記載の組成物。
【０３９２】
１９５．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記ガラクトース濃度を調節することを含み、前記ガラクトース濃度が、約０ｍＭ〜約６０ｍＭまたは約０ｍＭ〜約５０ｍＭである、実施形態１３６〜１５３のいずれか１つに記載の組成物。
【０３９３】
１９６．ガラクトースが、細胞培養培地の成分として補充される、実施形態１９５に記載の組成物。
【０３９４】
１９７．前記細胞培養培地が、流加培地、加水分解産物または添加物である、実施形態１９６に記載の組成物。
【０３９５】
１９８．前記流加培地、前記加水分解産物または前記添加物がガラクトースを含む、実施形態１９７に記載の組成物。
【０３９６】
１９９．前記流加培地または前記添加物が、ガラクトースから実質的になる、実施形態１９７に記載の組成物。
【０３９７】
２００．前記ガラクトースが、細胞培養物の生成段階の間に補充される、実施形態１９６に記載の組成物。
【０３９８】
２０１．前記ガラクトースが、細胞培養物の生成段階の前に補充される、実施形態１９６に記載の組成物。
【０３９９】
２０２．前記ガラクトースが、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づいて補充される、実施形態１９６に記載の組成物。
【０４００】
２０３．前記ガラクトースが、大量瞬時投与として、断続的な補充として、継続的な補充として、半継続的な補充として、フィードバックループをベースとする補充として、またはこれらの１つもしくは複数の組み合わせとして補充される、実施形態１９６に記載の組成物。
【０４０１】
２０４．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記フコース濃度を調節することを含み、前記フコース濃度が、約０ｍＭ〜約６０ｍＭであり；０ｍＭ〜約４０ｍＭ；約０ｍＭ〜約２０ｍＭ；または約０ｍＭ〜約１０ｍＭである、実施形態１３６〜１５３のいずれか一項に記載の組成物。
【０４０２】
２０５．フコースが、細胞培養培地の成分として補充される、実施形態２０４に記載の組成物。
【０４０３】
２０６．前記細胞培養培地が、流加培地、加水分解産物または添加物である、実施形態２０５に記載の組成物。
【０４０４】
２０７．前記流加培地、前記加水分解産物または前記添加物がフコースを含む、実施形態２０６に記載の組成物。
【０４０５】
２０８．前記流加培地または前記添加物が、フコースから実質的になる、実施形態２０６に記載の組成物。
【０４０６】
２０９．前記フコースが、細胞培養物の生成段階の間に補充される、実施形態２０５に記載の組成物。
【０４０７】
２１０．前記フコースが、細胞培養物の生成段階の前に補充される、実施形態２０５に記載の組成物。
【０４０８】
２１１．前記フコースが、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づいて補充される、実施形態２０５に記載の組成物。
【０４０９】
２１２．前記フコースが、大量瞬時投与として、断続的な補充として、継続的な補充として、半継続的な補充として、フィードバックループをベースとする補充として、またはこれらの１つもしくは複数の組み合わせとして補充される、実施形態２０５に記載の組成物。
【０４１０】
２１３．前記関心対象の糖タンパク質のグリコシル化パターンの調節が、前記細胞培養温度を調節することを含み、前記細胞培養温度が、約２９℃〜約３９℃、約３０℃〜約３９℃、約３１℃〜約３８℃または約３４℃〜約３８℃である、実施形態１３６〜１５３のいずれか１つに記載の組成物。
【０４１１】
２１４．前記細胞培養温度が、細胞培養物の生成段階の間に調節される、実施形態２１３に記載の組成物。
【０４１２】
２１５．前記細胞培養温度が、細胞培養物の生成段階の前に調節される、実施形態２１３に記載の組成物。
【０４１３】
２１６．前記細胞培養温度が、予め規定されたスケジュールまたは基準に基づいて調節される、実施形態２１３に記載の組成物。
【０４１４】
２１７．前記細胞培養物が真核細胞を含む、実施形態１３６〜１５３のいずれか１つに記載の組成物。
【０４１５】
２１８．前記真核細胞が真菌細胞または哺乳動物細胞である、実施形態２１７に記載の組成物。
【０４１６】
２１９．前記真菌細胞が酵母細胞である、実施形態２１８に記載の組成物。
【０４１７】
２２０．前記酵母細胞がエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である、実施形態２１９に記載の組成物。
【０４１８】
２２１．前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態２１８に記載の組成物。
【０４１９】
２２２．前記細胞培養物が、使い捨て技術（ＳＵＴ）袋もしくはバイオリアクター；ＷＡＶＥバイオリアクター；ステンレス鋼バイオリアクター；フラスコ；チューブおよびチャンバーを含むがこれらに限定されないバイオリアクター中にある、実施形態１３６〜２２１のいずれか１つに記載の組成物。
【０４２０】
２２３．前記細胞培養物の体積が１ｍＬ〜３５，０００Ｌである、実施形態１３６〜２２２のいずれか１つに記載の組成物。
【０４２１】
２２４．細胞培養物中で関心対象の糖タンパク質を作製するための方法であって、実施形態１〜７５のいずれか１つに記載の方法に、真核細胞を培養するのに適した細胞培養培地を供すること、調節された細胞培養培地に組換えタンパク質を発現する真核細胞を播種すること、組換えタンパク質が発現されるように、前記真核細胞を培養すること、を含む方法。
【０４２２】
２２５．前記細胞培養物がバイオリアクター中にある、実施形態２２４に記載の細胞培養物中で関心対象の糖タンパク質を作製するための方法。
【０４２３】
２２６．前記低ｐＣＯ２条件が約１０〜約１００ｍｍＨｇであり、前記高ｐＣＯ２条件が約２０〜約２５０ｍｍＨｇである、実施形態２２４に記載の細胞培養物中で関心対象の糖タンパク質を作製するための方法。
【０４２４】
２２７．ｐＣＯ２調節の期間が、前記細胞培養期間の少なくとも最初の半分を包含する、実施形態３に記載の細胞培養物中で関心対象の糖タンパク質を作製するための方法。
【０４２５】
２２８．前記関心対象の糖タンパク質が組換えタンパク質である、実施形態２２４〜２２７のいずれかに記載の方法。
【０４２６】
２２９．前記組換えタンパク質が、抗体または抗体断片、ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）、ＢｓＤｂ（二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＤｂ（一本鎖二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＴａＦｖ（一本鎖二重特異性タンデム可変ドメイン）、ＤＮＬ−（Ｆａｂ）３（ドック・アンド・ロック三価Ｆａｂ）、ｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）およびＢｓｓｄＡｂ（二重特異性単一ドメイン抗体）である、実施形態２２８に記載の方法。
【０４２７】
２３０．前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、実施形態２２９に記載の方法。
【０４２８】
２３１．前記抗体が抗ＣＤ２０抗体である、実施形態２２９に記載の方法。
【０４２９】
２３２．前記抗ＣＤ２０抗体がオクレリズマブである、実施形態２３１に記載の方法。
【０４３０】
２３３．前記抗体または前記抗体断片が、約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％もしくは約１％〜約８％の％Ｇ０−Ｆ（パーセントフコシル化欠損糖タンパク質）；または約０％〜約２０％；約１％〜約１５％；約１％〜約１０％もしくは約１％〜約８％の標準化された％Ｇ０−Ｆ；および／または約４０％〜約９０％；約５０％〜約９０％；約５５％〜約８５％もしくは約６０％〜約８０％の％Ｇ０（パーセントガラクトシル化欠損糖タンパク質）を示す、実施形態２２４〜２３２のいずれか１つに記載の方法。
【０４３１】
２３４．前記グリコシル化が、ガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０（フコシル化されたガラクトシル化欠損Ｇ０））を減少させながら、増加されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０））を達成するために、またはガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を増加させながら、減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために、またはガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）を達成するために、またはフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）に影響を与えずに、増加されたもしくは減少されたガラクトシル化欠損（例えば、Ｇ０）を達成するために、調節される、実施形態２２４〜２３３のいずれか１つに記載の方法。
【０４３２】
２３５．関心対象の糖タンパク質のグリコシル化を調節する方法であって、細胞培養培地のマンガン濃度が目標とされた範囲内に属するかどうかを判定するために細胞培養培地をアッセイすること、前記目標とされた範囲内に属している細胞培養培地中で、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞を培養することを含み、マンガン濃度の目標とされた範囲外に属する培養培地中での、前記宿主細胞によって発現された関心対象の糖タンパク質のグリコシル化と比較して、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化が調節されている、方法。
【０４３３】
２３６．前記関心対象の糖タンパク質が抗体である、実施形態２３５に記載の方法。
【０４３４】
２３７．前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、実施形態２３６に記載の方法。
【０４３５】
２３８．前記抗体が抗ＣＤ２０抗体である、実施形態２３６〜２３７のいずれか１つに記載の方法。
【０４３６】
２３９．前記抗ＣＤ２０抗体がオクレリズマブである、実施形態２９７〜２９８のいずれか１つに記載の方法。
【０４３７】
２４０．前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態２３５に記載の方法。
【０４３８】
２４１．前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、実施形態２３９〜２４０のいずれか１つに記載の方法。
【０４３９】
２４２．前記マンガン濃度の目標範囲が、約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである、実施形態２３５に記載の方法。
【０４４０】
２４３．前記細胞培養培地のアッセイが、前記細胞培養培地の成分の前記マンガン濃度をアッセイすることを含む、実施形態２３５に記載の方法。
【０４４１】
２４４．前記細胞培養培地の成分が、加水分解産物または血清である、実施形態２４３に記載の方法。
【０４４２】
２４５．Ｇ０（フコシル化されたＧ０）を減少させながら、増加されたＧ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０）を達成するために、グリコシル化が調節される、実施形態２３５〜２４４のいずれか１つに記載の方法。
【０４４３】
２４６．細胞培養組成物であって、細胞培養培地のマンガン濃度が目標とされた範囲内に属するかどうかを判定するためにアッセイされた細胞培養培地と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞とを含む細胞培養組成物。
【０４４４】
２４７．組成物が、前記関心対象の糖タンパク質をさらに含む、実施形態２４６に記載の細胞培養組成物。
【０４４５】
２４８．前記糖タンパク質が抗体である、実施形態２４７に記載の細胞培養組成物。
【０４４６】
２４９．前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、実施形態２４８に記載の細胞培養組成物。
【０４４７】
２５０．前記抗体が抗ＣＤ２０抗体である、実施形態２４８〜２４９のいずれか１つに記載の細胞培養組成物。
【０４４８】
２５１．前記抗ＣＤ２０抗体がオクレリズマブである、実施形態２４８〜２４９のいずれか１つに記載の細胞培養組成物。
【０４４９】
２５２．前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態２４６に記載の細胞培養組成物。
【０４５０】
２５３．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態２５２のいずれか１つに記載の細胞培養組成物。
【０４５１】
２５４．前記マンガン濃度の目標範囲が、約３０ｎＭ〜約１１０ｎＭである、実施形態２４６に記載の細胞培養組成物。
【０４５２】
２５５．関心対象の糖タンパク質を含む組成物であって、調製物が、細胞培養培地のマンガン濃度が目標とされた範囲内に属するかどうかを判定するためにアッセイされた細胞培養培地と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、関心対象の糖タンパク質とを含む、組成物。
【０４５３】
２５６．前記糖タンパク質が抗体である、実施形態２５５に記載の組成物。
【０４５４】
２５７．前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、実施形態２５６に記載の組成物。
【０４５５】
２５８．前記抗体が抗ＣＤ２０抗体である、実施形態２５６〜２５７のいずれか１つに記載の細胞培養組成物。
【０４５６】
２５９．前記抗ＣＤ２０抗体がオクレリズマブである、実施形態２５６〜２５７のいずれか１つに記載の細胞培養組成物。
【０４５７】
２６０．前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態２５５に記載の細胞培養組成物。
【０４５８】
２６１．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態２６０に記載の細胞培養組成物。
【０４５９】
２６２．関心対象の糖タンパク質のグリコシル化を調節する方法であって、関心対象の糖タンパク質を発現する宿主細胞の培養において使用されている細胞培養培地に、高ＣＯ２条件下で約１０ｎＭ〜約２０００ｎＭのマンガンを補充すること、または関心対象の糖タンパク質を発現する宿主細胞の培養において使用されている細胞培養培地に、低ＣＯ２条件下で約１０ｎＭ〜約３０００ｎＭのマンガンを補充することを含み、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化が、このように補充されなかった培養培地中で宿主細胞によって発現される関心対象の糖タンパク質のグリコシル化と比較して調節されている、方法。
【０４６０】
２６３．前記関心対象の糖タンパク質が抗体である、実施形態２６２に記載の方法。
【０４６１】
２６４．前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、実施形態２６３に記載の方法。
【０４６２】
２６５．前記抗体がオクレリズマブである、実施形態２６３〜２６４のいずれか１つに記載の方法。
【０４６３】
２６６．前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態２６２に記載の方法。
【０４６４】
２６７．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態２６６に記載の方法。
【０４６５】
２６８．Ｇ０（フコシル化されたＧ０）を減少させながら、増加されたＧ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０）を達成するために、グリコシル化が調節される、実施形態２６２〜２６７のいずれか１つに記載の方法。
【０４６６】
２６９．細胞培養組成物であって、高ＣＯ２条件下での約１０ｎＭ〜約２０００ｎＭマンガンまたは低ＣＯ２条件下での約１０ｎＭ〜約３０００ｎＭマンガンが補充された細胞培養培地と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、を含む細胞培養組成物。
【０４６７】
２７０．組成物が、関心対象の糖タンパク質をさらに含む、実施形態２６９に記載の細胞培養組成物。
【０４６８】
２７１．前記糖タンパク質が抗体である、実施形態２６９に記載の細胞培養組成物。
【０４６９】
２７２．前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、実施形態２７１に記載の細胞培養組成物。
【０４７０】
２７３．前記抗体がオクレリズマブである、実施形態２７１〜２７２のいずれか１つに記載の細胞培養組成物。
【０４７１】
２７４．前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態２６９に記載の細胞培養組成物。
【０４７２】
２７５．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態２７４に記載の細胞培養組成物。
【０４７３】
２７６．関心対象の糖タンパク質を含む組成物であって、調製物が、マンガンが補充された細胞培養培地であって、培養物に、高ＣＯ２条件下での約１０ｎＭ〜約２０００ｎＭのマンガンまたは低ＣＯ２条件下での約１０ｎＭ〜約３０００ｎＭのマンガンが補充されている細胞培養培地と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、関心対象の糖タンパク質とを含む、組成物。
【０４７４】
２７７．前記糖タンパク質が抗体である、実施形態２７６に記載の組成物。
【０４７５】
２７８．前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、実施形態２７７に記載の組成物。
【０４７６】
２７９．前記抗体がオクレリズマブである、実施形態２７６〜２７７のいずれか１つに記載の細胞培養組成物。
【０４７７】
２８０．前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態２７６に記載の細胞培養組成物。
【０４７８】
２８１．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態２８０に記載の細胞培養組成物。
【０４７９】
２８２．関心対象の糖タンパク質のグリコシル化を調節する方法であって、６．３０〜７．２５のｐＨ目標を含む細胞培養培地を高温短時間（ＨＴＳＴ）熱処理に曝露すること、および細胞培養培地中で関心対象の糖タンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含み、前ＨＴＳＴ熱処理ｐＨ目標がｐＨ７．２５より大きい培養培地中で前記宿主細胞によって発現された関心対象の糖タンパク質のグリコシル化と比較して、関心対象の糖タンパク質のグリコシル化が調節される、方法。
【０４８０】
２８３．前記関心対象の糖タンパク質が抗体である、実施形態２８２に記載の方法。
【０４８１】
２８４．前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、実施形態２８３に記載の方法。
【０４８２】
２８５．前記抗体がオクレリズマブである、実施形態２８３〜２８４のいずれか１つに記載の方法。
【０４８３】
２８６．前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態２８２に記載の方法。
【０４８４】
２８７．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態２８６に記載の方法。
【０４８５】
２８８．Ｇ０（フコシル化されたＧ０）を減少させながら、増加されたＧ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０）を達成するために、グリコシル化が調節される、実施形態２８２〜２８７のいずれか１つに記載の方法。
【０４８６】
２８９．ＨＴＳＴ熱処理に曝露された約６．３０〜約７．２５のｐＨ目標を含む細胞培養培地と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞とを含む細胞培養組成物。
【０４８７】
２９０．組成物が、関心対象の糖タンパク質をさらに含む、実施形態２８９に記載の細胞培養組成物。
【０４８８】
２９１．前記糖タンパク質が抗体である、実施形態２９０に記載の細胞培養組成物。
【０４８９】
２９２．前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、実施形態２９１に記載の細胞培養組成物。
【０４９０】
２９３．前記抗体がオクレリズマブである、実施形態２９１〜２９２のいずれか１つに記載の細胞培養組成物。
【０４９１】
２９４．前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態２９３に記載の細胞培養組成物。
【０４９２】
２９５．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態２９４に記載の細胞培養組成物。
【０４９３】
２９６．関心対象の糖タンパク質を含む組成物であって、調製物が、ＨＴＳＴ熱処理に曝露された約６．３０〜約７．２５のｐＨ目標を含む細胞培養培地と、関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、関心対象の糖タンパク質とを含む組成物。
【０４９４】
２９７．前記糖タンパク質が抗体である、実施形態２９６に記載の組成物。
【０４９５】
２９８．前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、実施形態２９７に記載の組成物。
【０４９６】
２９９．前記抗体がオクレリズマブである、実施形態２９７〜２９８のいずれか１つに記載の細胞培養組成物。
【０４９７】
３００．前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態２９６に記載の細胞培養組成物。
【０４９８】
３０１．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態３００に記載の細胞培養組成物。
【０４９９】
３０２．関心対象の糖タンパク質のグリコシル化を調節する方法であって、細胞培養培地中で関心対象の糖タンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含み、前記細胞培養物が高ｐＣＯ２に曝露され、前記細胞培養物が延長された培地保持時間に曝露され、および／または前記細胞培養物が増加されたＮａ＋濃度を含み；関心対象の糖タンパク質のグリコシル化が、低ｐＣＯ２、短縮された培地保持時間および／または低下したＮａ＋濃度に曝露された細胞培地中の宿主細胞によって発現された関心対象の糖タンパク質の調製物のフコシル化と比較して調節されている、方法。
【０５００】
３０３．前記関心対象の糖タンパク質が抗体である、実施形態３０２に記載の方法。
【０５０１】
３０４．前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、実施形態３０３に記載の方法。
【０５０２】
３０５．前記抗体がオクレリズマブである、実施形態３０３〜３０４のいずれか１つに記載の方法。
【０５０３】
３０６．前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態３０２に記載の方法。
【０５０４】
３０７．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態３０６に記載の方法。
【０５０５】
３０８．Ｇ０（フコシル化されたＧ０）を減少させながら、増加されたＧ０−Ｆ（フコシル化欠損Ｇ０）を達成するために、グリコシル化が調節される、実施形態３０２〜３０７のいずれか１つに記載の方法。
【０５０６】
３０９．高ｐＣＯ２、延長された培地保持時間および／または増加されたＮａ＋濃度を含む細胞培養培地と；関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞とを含む細胞培養組成物。
【０５０７】
３１０．組成物が、関心対象の糖タンパク質をさらに含む、実施形態３０９に記載の細胞培養組成物。
【０５０８】
３１１．前記糖タンパク質が抗体である、実施形態３１０に記載の細胞培養組成物。
【０５０９】
３１２．前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、実施形態３１１に記載の細胞培養組成物。
【０５１０】
３１３．前記抗体がオクレリズマブである、実施形態３１１〜３１２のいずれか１つに記載の細胞培養組成物。
【０５１１】
３１４．前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態３０９に記載の細胞培養組成物。
【０５１２】
３１５．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態３１４のいずれか１つに記載の細胞培養組成物。
【０５１３】
３１６．関心対象の糖タンパク質を含む組成物であって、前記調製物が、高ｐＣＯ２、延長された培地保持時間および／または増加されたＮａ＋濃度を含む細胞培養培地と；関心対象の糖タンパク質を発現するように改変操作された宿主細胞と、関心対象の糖タンパク質とを含む、組成物。
【０５１４】
３１７．前記糖タンパク質が抗体である、実施形態３１６に記載の組成物。
【０５１５】
３１８．前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、実施形態３１７に記載の組成物。
【０５１６】
３１９．前記抗体がオクレリズマブである、実施形態３１７〜３１８のいずれか１つに記載の細胞培養組成物。
【０５１７】
３２０．前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態３１６に記載の細胞培養組成物。
【０５１８】
３２１．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態３２０に記載の細胞培養組成物。
【実施例】
【０５１９】
以下の実施例は、本明細書にて開示する主題を単に例示するものであり、いかなる方法においても、限定とみなされるべきではない。
【０５２０】
［実施例１］グリコシル化を調節するための原材料の調節
複数の細胞培養因子が、モノクローナル抗体治療薬のグリコシル化に影響を与える可能性を有することが知られている。これらの因子には、過程パラメータ、培地処理ならびにガラクトースおよび微量金属などの培地成分が含まれる。個別の培地成分のレベルの変動は、Ｐｒｏｔｅｏｓｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  Ｎｏ．３（ＰＰ３）およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ（ＧＥＭ）粉末などの複雑な原材料の使用を介してｍＡｂ細胞培養過程中に導入され得る。原材料におけるこれらの変動源は、表１に概説されているように、生産培養の開始時（すなわち、０日）におけるＭｎ濃度の大幅な差をもたらし得る。
【表１】
2021533760.tif 000004
【０５２１】
生産培養の０日におけるＭｎレベルの変動が、％Ｇ０（フコシル化されたＧ０）および％Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損）抗体種の変動と相関する（図１）。図１において、セット１および２は、デプスフィルタから浸出するＭｎを通じて、培地デプスフィルトレーションを使用して実施された。培地デプスフィルトレーションは、生産培養培地組成物への著しい追加のＭｎに寄与することができる。０日のＭｎレベルは、ＩＣＰ−ＭＳによって測定した。セット３予想０日Ｍｎレベルは、セット１〜２および４〜６のデータを用いて得られた式Ｇ０＝１０９．５７４８７−８．３４８８６８３＊ｌｎ（Ｍｎ）に基づいている。フコシル化欠損は、標準化されたＧ０−Ｆ＝１００＊［Ｇ０−Ｆ］／（Ｇ０＋［Ｇ０−Ｆ］）によって表される。
【０５２２】
原材料からのＭｎ寄与に対する調節を改善するために、以下の戦略の一方または両方を実施することができる。（ａ）使用前に、指定されたＭｎ範囲内でＰＰ３およびＧＥＭ粉末を試験、選択し、（ｂ）確立された許容範囲内に（例えば、３０ｎＭ〜１１０ｎＭ）、生産培養播種後０日Ｍｎレベルを調節する。
【０５２３】
ＰＰ３およびＧＥＭ粉末は、表２および図３２中のＭｎ範囲に基づいて選択される。これらの範囲は、培地調製および処理中の喪失を考慮して、２０１６  ｖ１．０バッチ中の０日ＭｎならびにＰＰ３の３６ロットおよびＧＥＭ粉末の３４ロットからの歴史的データに基づいて確立した。
【表２】
2021533760.tif 000005
【０５２４】
過程の一貫性ならびに規格内でのＧ０、標準化されたＧ０−ＦおよびＣＤＣ値の調節をさらに確保するために、処置限界を＜３０ｎＭまたは＞１１０ｎＭとして、３０〜１１０ｎＭの０日播種後Ｍｎレベルというより狭い範囲へ調節することが可能である。
【０５２５】
［実施例２］グリコシル化を調節するためのマンガン補充
２．１  序
本実施例は、オクレリズマブおよびその他の抗体に対するマンガン補充の影響を要約する。マンガン補充が増加するとともに、フコシル化欠損（Ｇ０−Ｆ）の増加とフコシル化された（Ｇ０）（ガラクトシル化欠損）種の減少が観察された。
【０５２６】
２．２  オクレリズマブに対するマンガン補充の評価
オクレリズマブに対してマンガン補充実験を行った。オクレリズマブ生産培養物への播種後添加によって、試験事例中のマンガン（Ｍｎ）濃度を調整した。これらの研究において試験されたマンガンの濃度が、表３に列記されている。列記されているマンガン濃度は、播種後体積を基礎として培養物に添加された追加のマンガンの量に相当し、対照過程培地中のマンガンの存在に起因する、０日での総マンガン濃度を反映しない。マンガン添加は、０．０５ｍＭおよび０．５ｍＭ硫酸マンガン一水和物のフィルタにかけられた無菌溶液を使用して行われ、隔壁を介して添加された。対照および一部の試験事例の反復物を各研究中に含めた。
【表３】
2021533760.tif 000006
ａ評価されたマンガン濃度は、オクレリズマブ生産培養過程に追加されたマンガンに相当する。低レベルのマンガンが対照培地中に存在する；ｂこれらの事例に対して使用された０．０５ｍＭ硫酸マンガン溶液
【０５２７】
図２は、細胞培養物中の０日マンガン濃度とフコシル化欠損（標準化されたＧ０−Ｆ）およびガラクトシル化欠損（Ｇ０）の間の相関を示す。図３は、オクレリズマブフコシル化欠損（標準化されたＧ０−Ｆ）およびフコシル化されたガラクトシル化欠損（Ｇ０）種に対するマンガン補充の影響を示す。マンガンの濃度が増加するにつれて、オクレリズマブＧ０−Ｆが増加し、Ｇ０が減少する。図２および３は、バイオリアクターの規模にわたってのフコシル化欠損およびガラクトシル化欠損に対するマンガンの影響に関して同じ傾向を示し、これにより、小規模（２Ｌ）での知見を拡張できることを実証している。特に、２Ｌと１２ｋＬのバイオリアクターの規模の両方で、補充されていない培養物（Ｍｎ添加なし）と比べて、標準化されたＧ０−Ｆの増加とＧ０の減少がＭｎ補充された培養物中に観察された。
【０５２８】
２．２  オクレリズマブに対するマンガン補充およびｐＣＯ２の評価
規模依存性因子モデル（３７℃で３６時間培地保持をする高ｐＣＯ２モデル）および標準的な２Ｌモデルの両方で、０、５０、１００、１５０、２５０、３５０、５００、７５０、１０００および２０００ｎＭマンガンでのマンガン滴定を実施した。本研究用の培地は、以下のＨＴＳＴ条件で熱処理された高温短時間（ＨＴＳＴ）であった。１０２℃で１０秒保持、１５ｐｓｉｇの背圧およびＨＴＳＴ後に３７℃に冷却。全ての他の条件およびパラメータは、目標条件で（すなわち、同じ設定点を用いて）実行した。
【０５２９】
フコシル化欠損（標準化されたＧ０−Ｆ）およびフコシル化されたガラクトシル化欠損（ｇ０）の結果が、図４および５に示されている。高ｐＣＯ２レベルの存在下では、標準的な２Ｌモデル（低ｐＣＯ２）と比べて、標準化されたＧ０−ＦおよびＧ０に対してより大きな影響が観察された。本研究の傾向は、マンガン滴定研究と一致する（上記２．２参照）。図２〜５に示されているように、細胞培養培地の組成に対して、様々な体積（例えば、標準的な２Ｌ、２Ｌ規模依存性因子および１２，０００Ｌ）を有するバイオリアクターを使用することができる。細胞培養培地の条件は、バイオリアクターの体積に基づいて調整することができる。例えば、２Ｌバイオリアクター中で使用される細胞培養培地の組成は、１５，０００Ｌバイオリアクター中で使用するために、規模を拡大することができる。さらに、１５，０００Ｌバイオリアクターにおいて使用された細胞培養培地の組成は、２Ｌバイオリアクターにおいて使用するために、規模を縮小することができる。バイオリアクターの体積は、約１Ｌ〜約２０，０００Ｌ（例えば、約１Ｌ、約１．５Ｌ、約２Ｌ、約５Ｌ、約１０Ｌ、約５０Ｌ、約１００Ｌ、約２５０Ｌ、約５００Ｌ、約１０００Ｌ、約２０００Ｌ、約３０００Ｌ、約４０００Ｌ、約５０００Ｌ、約６０００Ｌ、約７０００Ｌ、約８０００Ｌ、約９０００Ｌ、約１０，０００Ｌ、約１１，０００Ｌ、約１２，０００Ｌ、約１３，０００Ｌ、約１４，０００Ｌ、約１５，０００Ｌ、約１６，０００Ｌ、約１７，０００Ｌ、約１８，０００Ｌ、約１９，０００Ｌまたは約２０，０００Ｌ）であり得る。
【０５３０】
２．３  抗体Ｉに対するマンガン濃度の評価
３つの要素、細胞齢（６６日対１５１日）、鉄濃度（２０μＭ対７５μＭ）およびマンガン濃度（４．５ｎＭ対４５０ｎＭ対４５００ｎＭ）を調べる完全実施要因実験計画法（２×２×３）を設計した。研究の目標は、グリコシル化に対するより高いマンガンレベルの影響および電荷変異形に対する鉄濃度の影響を決定することであった。研究デザインは、表４に示されている。Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損）およびＧ０（Ｇ０Ｆ）の結果が、図６に示されている。他の抗体と一致して、マンガン濃度の増加とともに、フコシル化欠損の増加およびＧ０の減少が観察された。この結果は、全ての細胞齢および鉄濃度にわたって一貫しており、マンガンの効果が他の試験されたパラメータと独立していることを示している。
【表４】
2021533760.tif 000007
【０５３１】
２．４  抗体ＩＩに対するマンガン補充の評価
本研究デザインは、３つの２レベル変数：：銅添加レベル、マンガン添加レベルおよび亜鉛添加レベルを組み合わせる完全実施要因実験計画法からなる（表５）。全ての提案された過程条件（目標レベルで補充される銅、マンガンおよび亜鉛を含有する）は、２つ組で試験される。この実験の結果が図７に示されている。マンガンは、Ｇ０およびＧ０−Ｆの両方に対して最大の効果推定値を有していた。マンガンレベルの増加に伴うＧ０およびＧ０−Ｆの傾向は、他の抗体と一致する。
【表５】
2021533760.tif 000008
【０５３２】
２．５  抗体ＩＩＩに対するマンガン補充の評価
抗体ＩＩＩに対して、マンガン滴定研究を実施した。最終作業体積に基づいて計算された、０．５ｍＭ硫酸マンガン原溶液を生産播種後に添加した。試験事例からの実際の測定されたマンガンに加えて添加された濃度が、表６に示されている。事例１に示されているように、生産培養物に添加された追加のマンガンなしに、細胞培養培地中に微量のマンガンが存在する。測定されたマンガンレベルにはいくらかの変動が存在するが、一般に、誘導結合プラズマ質量分析法を用いて測定されたレベルは、生産播種後に、マンガン原溶液の正しい量が各バイオリアクターに添加されたことを確認した。全ての対照ランは、予想内で行われた。さらなるマンガン補充は、成長および力価に対して影響を有していなかった。予想どおり、Ｍｎの増加とともに、フコシル化（Ｇ０）（ガラクトシル化欠損）が減少し、フコシル化欠損（Ｇ０−Ｆ）は増加した。結果が図８に示されている。
【表６】
2021533760.tif 000009
【０５３３】
２．６  抗体ＩＶおよび抗体Ｖに対するマンガン補充の評価
細胞培養過程の性能に対する亜鉛、マンガン、鉄および銅の影響ならびに抗体ＩＶおよび抗体Ｖの生成物品質を決定するための完全実施要因実験デザインを用いて、抗体ＩＶおよび抗体Ｖは、亜鉛、マンガン、鉄および銅を組み合わせて評価した。表７は、これらの研究のデザインを示す。抗体ＩＶに対する結果は図９に示されており、抗体Ｖに対する結果は図１０に示されている。図９および１０は、実際の測定されたマンガンを示す。基本培地中のマンガンの存在のために、これは、表７に列記されているマンガンの補充された量と比べて異なる。マンガン濃度が増加するにつれて、抗体ＩＶおよび抗体Ｖの両方で、Ｇ０−Ｆ（フコシル化欠損）は増加し、Ｇ０（フコシル化されたガラクトシル化欠損）は減少する。この効果は、亜鉛、鉄および銅濃度とは独立している。
【表７】
2021533760.tif 000010
【０５３４】
２．７  抗体ＶＩに対するマンガン補充タイミングの評価
グリコシル化に対する異なる添加タイミングの影響を評価するために、抗体ＶＩに対してＭｎ添加タイミング実験を行った。最初の研究では（図１１）、培養物には、５００ｎＭマンガンを補充し（以前の増殖継代の間、または生産培養の０日目もしくは３日目）、または補充しなかった。第二の研究では（図１２）、培養物には、８０ｎＭマンガンを補充し（０日目または生産培養の間毎日）、または補充しなかった。Ｍｎ補充のタイミングに関わらず、細胞培養物にＭｎを添加すると、Ｇ０（フコシル化されたガラクトシル化欠損）は減少し、標準化されたＧ０−Ｆ（フコシル化欠損）は増加した。
【０５３５】
前記は本開示の原理の例示に過ぎないこと、本開示の範囲および精神から逸脱することなく、当業者によって様々な変更を施すことができることが理解されるであろう。例えば、限定を目的とするものではないが、この実施例において使用されたバイオリアクターの体積は、約１Ｌ〜約２０，０００Ｌ（例えば、約１Ｌ、約１．５Ｌ、約２Ｌ、約５Ｌ、約１０Ｌ、約５０Ｌ、約１００Ｌ、約２５０Ｌ、約５００Ｌ、約１０００Ｌ、約２０００Ｌ、約３０００Ｌ、約４０００Ｌ、約５０００Ｌ、約６０００Ｌ、約７０００Ｌ、約８０００Ｌ、約９０００Ｌ、約１０，０００Ｌ、約１１，０００Ｌ、約１２，０００Ｌ、約１３，０００Ｌ、約１４，０００Ｌ、約１５，０００Ｌ、約１６，０００Ｌ、約１７，０００Ｌ、約１８，０００Ｌ、約１９，０００Ｌまたは約２０，０００Ｌ）であり得る。さらに、バイオリアクターおよびその操作は、ｐＣＯ２、培地保持期間、培養期間、浸透圧、Ｎａ＋、Ｍｎ、培養温度、フコース、ガラクトースまたはこれらの組み合わせのレベルを調整するために変更することができる。
【０５３６】
［実施例３］  前高温短時間（ＨＴＳＴ）熱処理ｐＨ目標
３．１  序
本実施例は、オクレリズマブ（ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｈ７）生産培地調製に対する、高温短時間（ＨＴＳＴ）熱処理前の培地に対するｐＨ調整目標の選択および裏付ける実験結果を要約する。前ＨＴＳＴ熱処理培地ｐＨ目標が低いほど、培地の濁り、付随する沈殿の形成、ＨＴＳＴ熱伝導表面付着物およびＨＴＳＴ操作の間のフィルタの目詰まりを低減することができる（例えば、米国特許第９，４９３，７４４号参照）。
【０５３７】
冷却器および減少する流速の前に測定された増加する圧力の傾向が、いくつかの培地調製物に対して観察された（図１３）。これらの傾向は、ＨＴＳＴおよびろ過操作にわたって、マンガン（Ｍｎ）喪失の増加に相関することが認められた（表９）。（冷却器前の）ＨＴＳＴ圧力の増加およびこれらの例におけるＨＴＳＴ流速の減少は、濁り／沈殿形成および培地フィルタ上でのその後の圧力増加（フィルタ目詰まりの増加）に起因し得る。オクレリズマブ製造ランにおけるこの非典型的なＨＴＳＴプロファイルならびにＨＴＳＴおよびろ過にわたるＭｎ喪失の減少の変動可能性を緩和するために、オクレリズマブ生産培地に対して、後ＨＴＳＴ  ｐＨ調整とともにより低い前ＨＴＳＴ  ｐＨ培地調整目標を評価し、実行した。
【表９】
2021533760.tif 000011
【０５３８】
全てのマンガン測定は、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）アッセイ法を用いて行った。
【０５３９】
３．２  ＨＴＳＴ熱処理および異なるｐＨ調整目標でのろ過からのマンガン喪失の評価
広い範囲のｐＨ目標にわたる熱処理後に、濁りの変化およびマンガン喪失を評価するために、卓上Ｓａｎｄ  Ｂａｔｈ  ＨＴＳＴ熱処理法による初期スクリーニング研究を使用した。本研究のためにオクレリズマブ生産培養培地を使用した。ＨＴＳＴ製造スキッド（ｓｋｉｄ）と比べて、１０２℃に達するために必要とされる熱処理時間が延長するために、Ｓａｎｄ  Ｂａｔｈ  ＨＴＳＴ熱処理法は、ＨＴＳＴ熱処理に対する最悪事例の条件に相当する。熱処理前および後での濁りの変化ならびに熱処理／ろ過にわたるマンガン喪失が図１４に示されている。ＨＴＳＴ前の生産培地に対する７．００のｐＨ調整目標より下では、濁りの著しい増加またはＭｎ喪失の減少は観察されなかった。ＨＴＳＴ前の生産培地に対する７．００またはそれより高いｐＨ調整目標では、濁りのより大きな増加およびＭｎ喪失が観察されなかった。これは、ＨＴＳＴ熱処理前に培地ｐＨを７．００より下の目標に調整することは、製造ＨＴＳＴ熱処理およびろ過操作にわたってＭｎ喪失を減少させると予想できることを示す。
【０５４０】
予備スケールＨＴＳＴ研究を行い、約６．３０（非ｐＨ調整培地）、６．７０および７．１０という３つの前ＨＴＳＴ  ｐＨ調整目標を評価した。本研究のためにオクレリズマブ生産培養培地を使用した。ＨＴＳＴおよびろ過にわたるＭｎ測定およびＭｎ喪失が表１０に示されている。Ｓａｎｄ  Ｂａｔｈ  ＨＴＳＴ熱処理研究と一致して、約６．３０および６．７０前ＨＴＳＴ  ｐＨ事例は、ｐＨ７．１０事例と比べて、ＨＴＳＴおよびろ過にわたってより小さなＭｎ喪失を実証し、より低い前ＨＴＳＴ  ｐＨ目標は、製造ＨＴＳＴおよびろ過操作にわたって観察されるＭｎ喪失を減少させるのに役立ち得ることを示している。
【表１０】
2021533760.tif 000012
【０５４１】
３．３  ２Ｌ細胞培養の性能および生成物の品質に対する前ＨＴＳＴ  ｐＨ調整の影響
予備スケールＨＴＳＴ研究において処理された生産培地を２つの２Ｌ実験で使用した。ＨＴＳＴ熱処理後およびろ過前に、生産培地を７．１０＋／−０．１０の最終ｐＨ目標に調整した。このｐＨ調整工程は、ＨＴＳＴおよびろ過の後に起こり、７．１５＋／−０．１０を目標とするであろう。ＨＴＳＴ熱処理なしに、同じプロテオースペプトン３（ＰＰ３）およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ基礎培地（ＧＥＭ）粉末２原材料ロットで調製された培地を用いて、各実験に対照を含めた。３６時間のＮ−１およびＮ培地保持とより高いｐＣＯ２レベルを生成するための改変された散布戦略とを含む規模依存２Ｌモデルを用いて、選択ラン（ｓｅｌｅｃｔ  ｒｕｎ）を実行した。
【０５４２】
これらの研究から得られた以下の結果を、過程性質決定および検証（ＰＣ／ＰＶ）の間に行われた２Ｌの対照ランならびに歴史的製造ラン（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｒｕｎ）と比較する。２Ｌ対照および製造生成物品質データは、各ＡＯアッセイ上での親和性プールから得られる。図１５は、ＫＰＩを示している。図１６〜１８は、生成物品質を示している。ＫＰＩ、電荷関連変異形、サイズ関連変異形およびグリカンは、約６．３０、６．７０および７．１０の間に前ＨＴＳＴ  ｐＨ目標を変動することから著しい影響を示さなかった。これらの研究は、細胞培養の性能および生成物の品質が、後ＨＴＳＴ  ｐＨ調整を７．１０＋／−０．１０にして、前ＨＴＳＴ  ｐＨ目標を６．３０〜７．１０の間で変化させることによって影響を受けないであろうことを示す。
【０５４３】
３．４  オクレリズマブ生産培地中の浸透圧に対するｐＨ調整の効果
ｐＨ調整のための炭酸ナトリウム添加からの浸透圧変化が、ｓａｎｄ  ｂａｔｈ  ＨＴＳＴおよび最初の予備スケールＨＴＳＴ研究に対して表１１および表１２に示されている。６．９０のｐＨでのＨＴＳＴ熱処理前の浸透圧および７．１０への最終ｐＨ調整後の最終浸透圧はいずれも、現在の生産培地目標浸透圧の中にあることが観察された。
【表１１】
2021533760.tif 000013
【表１２】
2021533760.tif 000014
【０５４４】
３．５  オクレリズマブ生産培地前ＨＴＳＴ  ｐＨおよび浸透圧目標および目標範囲の推奨
本実施例に要約される結果に基づいて、推奨されるオクレリズマブ生産培地前ＨＴＳＴ  ｐＨ調整目標は、浸透圧警告範囲を３２０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇで、６．９０＋／−０．１０または６．７０＋／−０．１０である。小規模研究の結果は、細胞培養の性能または生成物の品質に対する影響を示さず、６．３０〜７．１０の範囲にある前ＨＴＳＴ  ｐＨの使用を支持する。さらに、歴史的製造ランは、７．１５＋／−０．１０の前ＨＴＳＴ  ｐＨ目標を支持し、したがって、総合的な許容され得る前ＨＴＳＴ  ｐＨ目標範囲は６．３０〜７．２５である。１２，０００ＬのバイオリアクターのＨＴＳＴ熱処理、ろ過および計量の完了後に、オクレリズマブ生産培地は、７．１５＋／−０．１０の最終目標ｐＨへのｐＨ調整を必要とするであろう。１２，０００Ｌバイオリアクター内での最終ｐＨ調整の時点で、生産培養の播種前に培地が３４０＋／−２０ｍＯｓｍ／ｋｇの目標浸透圧内にあることを確認するために、浸透圧チェックをすべきである。
【０５４５】
３．６  さらなるｍＡｂに対するより低い前ＨＴＳＴ  ｐＨ設定点の使用
さらなるｍＡｂ実施例のために生産基本培地の調製物を製造する間に、抗体ＩＩＩは、オクレリズマブにおいて観察されているように、非典型的なＨＴＳＴ性能を体験した（図１３）。将来のＨＴＳＴ性能の問題を軽減するために、および非典型的なＨＴＳＴ性能故にマンガンの喪失を防ぐために、ＨＴＳＴ熱処理およびろ過前の培地ｐＨを、さらなるｍＡｂに対して評価した。７．１、６．６および６．１のｐＨ目標になるように培地を調製した。ＨＴＳＴ熱処理ありおよびなしで使用するために、各培地調製物を分割した。図１９Ｂは、培地調製物からのマンガンの結果を示す。青い記号は、ＨＴＳＴ熱処理された培地中のマンガンレベルを示す。ＨＴＳＴ熱処理後に、培地ｐＨ目標が増加し、マンガンが減少するという明瞭な傾向が存在する。これは、より高い培地ｐＨでは、ＨＴＳＴ熱処理およびろ過にわたって、より高いマンガン喪失が観察されることを示す。この結果は、オクレリズマブに対して行われた結果と一致している。
【０５４６】
細胞培養の性能および生成物の品質に対する、ＨＴＳＴ熱処理およびろ過前でのより低い培地ｐＨの影響を評価するために２Ｌ研究を行った。ＫＰＩの結果は、図１９Ｃおよび図１９Ｄに示されている。生成物品質の結果は、図１９Ｅ〜図１９Ｈに示されている。この研究は、さらなるｍＡｂに対する細胞培養の性能および生成物の品質は、前ＨＴＳＴ  ｐＨ目標を６．１０〜７．１０に変化させることによって影響を受けないであろうことを示す。
【０５４７】
本研究の結果に基づいて、さらなるｍＡｂに対する前ＨＴＳＴ熱処理およびろ過培地ｐＨ目標は、６．６に減少した。
【０５４８】
［実施例４］フコシル化を調節するためのｐＣＯ２、マンガン、培地保持、浸透圧およびＮａ＋
４．１  序
ｐＣＯ２レベルはバイオリアクターの規模にわたって変動し得るので、グリコシル化（例えば、ガラクトシル化および／またはフコシル化欠損）に対する未知の影響を有する細胞培養過程パラメータのうち、培養液中の二酸化炭素の分圧（ｐＣＯ２）は、非常に興味深く、したがって、同程度のｐＣＯ２プロファイルを維持することは、過程の規模拡大の間にしばしば遭遇する課題である。以前の研究は、ｐＣＯ２レベルが、哺乳動物細胞培養物中での細胞増殖、生産性および組換えタンパク質グリコシル化に影響を与えることができることを示している（Ｄａｒｊａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１９，９８−１０９；ｄｅＺｅｎｇｏｔｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８，２１９−２２７；Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２（１−３），６５−７８；Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ，６２，１５２−１６０；Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，１３，３１１−３１７；Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，１８，３４６−３５３；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，２１（１），７０−７７）。これらの研究は、フコシル化欠損に対するｐＣＯ２の影響を実証しなかったが、評価したｐＣＯ２プロファイルは、大規模バイオリアクター培養において遭遇されるｐＣＯ２を代表しない。
【０５４９】
バイオリアクターの規模にわたるフコシル化欠損の強固な調節をよりよく理解し、確立するために、組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株によって産生されるｍＡｂのフコシル化欠損に対してｐＣＯ２およびその他の過程手段との起こり得るその相互作用の効果を調べた。以下のアプローチを適用した。（１）他の過程パラメータを一定に保ちながら、異なるレベルのｐＣＯ２を維持することができる小規模な（３−Ｌ）バイオリアクターモデルを構築し、（２）ｐＣＯ２およびその他の過程パラメータ、例えば、マンガンおよび培地保持とのその相互作用のｍＡｂフコシル化欠損に対する効果を調べ、（３）ｍＡｂフコシル化欠損に対するｐＣＯ２およびその他の過程手段のあらゆる観察された効果の背後に存在する可能性がある機序を調べる。Ｍｎは複数のグリコシル化酵素に対する補因子であり（Ｒｏｕｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，３０（３），５７１−５８３）、ＣＨＯ細胞培養研究においてグリコシル化レベルを調節するために使用されてきたので（Ｇｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１０８（７），１５９１−１６０２；Ｓｕｒｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．，３１（２）：４６０−６４７）、フコシル化欠損に対して何らかの影響を示すことは以前に示されておらず、α１，６−フコシル転移酵素（ＦＵＴ８）に対する補因子であることは知られていないが、Ｍｎを選択した。大規模操作における播種前に、生産培地がバイオリアクター中に保持され、生成物品質の特性に対するその影響は以前には報告されていなかったので、培地保持を研究した。
【０５５０】
４．２  材料および方法
４．２．１  細胞培養
本明細書で報告されている全ての研究において、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）サブクラスのｍＡｂを発現する同一の組換えＣＨＯ細胞株を使用した。以前に記載されているとおりに（Ｙｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，３１（１），２２６−２３７）、３−Ｌガラスバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）中の生産培養物に播種するために、細胞を融解し、増殖した。バイオリアクター中の温度、ｐＨおよび溶解された酸素（ＤＯ）に対する設定点は、ＴｒｕＢｉｏ  ＤｅｌｔａＶを備えたＦｉｎｅｓｓｅ  ＳｍａｒｔＣｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって調節した。全ての生産培養物に対する温度、ｐＨおよびＤＯを、１日目には、３７℃、７．１５および（空気飽和の）３０％に、１日目と３日目の間には、３４℃、７．１５および３０％に、３日目以降には、３４℃、７．００および３０％ＤＯに維持した。播種の３日後に、１：７（ｖ／ｖ）で、濃縮された栄養素供給を生産培養物に添加した。
【０５５１】
以下のパラメータを調べた。Ｍｎ補充、Ｌ−フコース補充、培地保持、ｐＣＯ２レベルおよび浸透圧レベル（浸透圧滴定剤としてソルビトールおよびＮａＣｌを使用）。接種トレイン（ｉｎｏｃｕｌｕｍ  ｔｒａｉｎ）および生産培養物に対して使用された基本培地は、名目量のＭｎを含有し、Ｌ−フコースを含有しなかった。本研究に対して記載されているとおりに、目標０日濃度を達成するために、生産培養物に播種した直後に、補充されるＭｎおよび／またはＬ−フコースを加えた。空気散布（１０ｓｃｃｍ）、撹拌（７５ｒｐｍ）および片側（ＣＯ２のみ）ｐＨ調節をしながら、３７℃で別個の３−Ｌバイオリアクター中で、３６時間、（Ｎ−１接種トレインおよび生産培養物に対して使用される）基本培地を維持することによって培地保持を実行した。ＮａＣｌ（１００ｇ／Ｌ）またはソルビトール（１８２ｇ／Ｌ）の原溶液を添加することによって、浸透圧を調整した。
４．２．２  高および低ｐＣＯ２モデル構成
【０５５２】
異なるｐＣＯ２プロファイルを達成するために、バイオリアクター構成を改変して、高ｐＣＯ２モデル（図２０Ａ）および低ｐＣＯ２モデル（図２０Ｂ）を作製した。両モデルにおいて、ｐＨを減少させるために開放パイプ（５ｍｍ内径）を通じてＣＯ２を散布することによって、および以前に記載されているとおりに（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２），Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６４（６）：６６７−６７８）、ｐＨを増加させるためにＮａ２ＣＯ３を添加することによって、ｐＨを調節した。
【０５５３】
高ｐＣＯ２モデルに対しては（図２０Ａ）、バイオリアクターの作動体積は１．９Ｌ以上であった。ＤＯは、小型スパージャー（１５μｍ細孔径）を通して空気／Ｏ２を供給することによって調節した。ＤＯ調節装置の設定は、最小２ｓｃｃｍの出力でＤＯを調節するために空気を使用し、空気出力が１２ｓｃｃｍに達した後に、ＤＯ調節を最小２ｓｃｃｍ出力でＯ２に切り替えた。
【０５５４】
低ｐＣＯ２モデルに対しては（図２０Ｂ）、バイオリアクターの作動体積は１．５Ｌ以下であった。ＣＯ２に対して使用される同じ開放パイプを通じて空気／Ｏ２を散布することによって、ＤＯを調節した。ＤＯ調節装置の設定は、１０ｓｃｃｍの最小散布および５０ｓｃｃｍの最高散布で空気出力を使用した。空気出力が５０ｓｃｃｍに達した後、Ｏ２散布が増加し、空気散布が減少した。Ｏ２散布が５０ｓｃｃｍに達した時点で、空気を止め、必要に応じて、最高２５０ｓｃｃｍまで、Ｏ２出力が増加した。
【０５５５】
４．２．３  細胞培養分析
血中血球容積（ＰＣＶ）、生きた細胞の濃度、培養物生存率、ｐＨ、ＤＯ、ｐＣＯ２、グルコース、ラクテート、浸透圧、Ｎａ＋、アンモニウム、ｍＡｂ生成物の力価、グリコシル化変異形、電荷変異形、サイズ変異形およびＭｎ濃度（誘導結合プラズマ質量分析法によって）を、以前に記載されているように測定した（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２），Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６４（６）：６６７−６７８；Ｙｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，３１（１），２２６−２３７）。Ｎ結合型のグリコシル化された種の構造は、Ｔｈｏｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）に詳述されており、図２８Ａに図解されている。フコシル化欠損をＧ０Ｆに対して標準化し、以下のように定義した。
2021533760.tif 000015
【０５５６】
４．２．４  細胞内ｐＨ分析
ＳＮＡＲＦ−４Ｆ  ５−（および−６−）カルボン酸、アセトキシメチルエステルアセテート（ＳＮＡＲＦ−４Ｆ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｃａｔ  ＃Ｓ２３９２１，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、細胞内ｐＨ（ｐＨｉ）を測定した。ＳＮＡＲＦ−４Ｆは、カルボキシＳＮＡＲＦ−１のフッ素化された誘導体であり、約６．４のｐＫａ値を有する。ｐＨｉ測定および計算方法は、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２５，３４９−３５７）およびｄｅＺｅｎｇｏｔｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（ｄｅＺｅｎｇｏｔｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，７７（４４），３６９−３８０）に基づいた。
【０５５７】
ｐＨｉ測定に対して準備するために、最低６時間、新鮮な培地を所望の条件に予め平衡化した。ｐＣＯ２滴定事例に対しては、所望のｐＣＯ２レベルに到達するためにＣＯ２散布をしながら、３７℃および６００ｒｐｍ撹拌で調節されたＴＡＰ  ａｍｂｒ  １５システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中で培地を平衡化させた。次に、０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を用いて７．０にｐＨを調整し、１００ｇ／Ｌ  ＮａＣｌを用いて、浸透圧を約４００ｍＯｓｍ／ｋｇに調整した。浸透圧滴定事例に対しては、１００ｇ／Ｌ  ＮａＣｌを用いて、培地浸透圧を調整し、３７℃、５％ＣＯ２および５０ｒｐｍ撹拌（２．５ｃｍ軌道）で調節された恒温槽中に一晩配置した。細胞を沈降させ（５０万の細胞、２００ｇ、２分）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄した。所望の条件になるように予め平衡化された新鮮な培地中に、沈渣を素早く再懸濁し、ＳＮＡＲＦ−４Ｆを加えた（１．５μｇ／ｍＬの最終濃度）。予め平衡化された培地と同じ条件下で、細胞・色素混合物をインキュベートした（３０分）。４８８ｎｍのレーザならびに５８５ｎｍおよび６４０ｎｍでの検出を用いるＡｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ｐＨｉを直ちに測定した。Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ  ＦＬＥＸを使用して、細胞外ｐＨ、ｐＣＯ２、浸透圧およびＮａ＋を測定した。以前に記載されているように（Ｓａｌｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉ，４（４），１−８）、ナイジェリシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ  ＃Ｎ７１４３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で、既知のｐＨ緩衝液中で染色された細胞を用いて、ｐＨ較正曲線を作成した。
【０５５８】
４．２．５  プロテオミクス分析
質量分析法（ＭＳ）によるプロテオミクス分析のために、７日目および１２日目の生産培養物から得た細胞を沈降させ（１０００万細胞、２００ｇ、２分）、ＰＢＳで２回洗浄し、ドライアイス上で瞬間凍結し、分析まで−８０℃で保存した。以前に記載されているとおりに（Ｖｉｌｄｈｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１８），Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ，４６（５），６９２−６９６）、各試料からタンパク質を抽出し、ペプチドに消化し、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）で標識し、ＳＰＳ−ＭＳ３法により、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｌｕｍｏｓ質量分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて分析した（ＭｃＡｌｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４），Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，８４（１６），７１５０−７１５８）。
【０５５９】
ＭＳ／ＭＳスペクトルの帰属は、ＵｎｉＰｒｏｔ（２０１６年６月にダウンロードされた）中で、クリケツルス・グリセウス（チャイニーズハムスター）に対する全てのエントリーに対して検索するために、ＭＡＳＣＯＴ検索アルゴリズムを用いて行った。トリプシンペプチド（２つの切れ残った切断）の検索を行い、イオントラップ中で集められたＭＳ／ＭＳデータに合致するために０．８Ｄａ誤差許容度を使用しながら、候補ペプチドの数を限定するために、５０ｐｐｍの前駆的誤差許容度（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を使用した。静的修飾はペプチドのＮ末端およびリジン残基（＋２２９．１６２９３）上のＴＭＴならびにシステインアルキル化（５７．０２１５）を含んだが、可変的修飾はメチオニン酸化（１５．９９４９）およびチロシンのＴＭＴ標識（２２９．１６２９）を含んだ。以前に記載されているとおりに、タンパク質レベルで２％の偽発見率にフィルタリングする前に、線形判別分析アルゴリズムを用いてスコアが与えられる標的デコイアプローチを用いて、ペプチドスペクトル合致度（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｍａｔｃｈ）を２％の偽発見率にフィルタリングした（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３），ＰＮＡＳ，１１０（４８），１９４６２−１９４３１）。
【０５６０】
定量値を抽出し、Ｍｏｊａｖｅを用いて、同位体の不純物に対して補正した（Ｚｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３），Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ，６（２７１），１−１１）。さらに、定量値を標準化し、Ｒでカスタムスクリプトを用いて「相対的存在量」値に変換する前に、０．７（±０．２５Ｄａ）未満の前駆的純度または５０，０００未満の合計強度を有する定量的事象は廃棄した。そのタンパク質に対する総強度によって試料強度を除し、次いで、結果を１００に標準化することによって、相対的存在量の値を各タンパク質に対して計算した。データの標準化後に、Ｒでカスタムスクリプトを用いて、主成分分析（ＰＣＡ）を行った。データセット内でパスウェイエンリッチメントを決定するために、ＵｎｉＰｒｏｔ識別子を相同なマウス、ラットまたはヒト識別子に変換し、以前に記載されているとおりに、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ；ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）によって処理した（Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３０（４），５２３−５３０）。
【０５６１】
４．３  結果と考察
４．３．１  低および高ｐＣＯ２
異なるｐＣＯ２レベルを維持することができる小規模なバイオリアクターモデルを開発するために、３−Ｌバイオリアクター中でのＣＯ２ストリッピング速度を制御した（図２０）。バイオリアクター培養物中のｐＣＯ２を変化させるために、培地中のＮａＨＣＯ３濃度を調整することはできるが（Ｇｏｕｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，９６（６），１１０７−１１１７；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，２１（１），７０−７７）、撹拌および容器アスペクト比を一定に保ちながら、ＣＯ２ストリッピング（したがって、ｐＣＯ２レベル）を調節するための効果的な方法であるので、代わりに、バイオリアクター気体散布速度を制御した。
【０５６２】
酸素に対する細胞代謝の要求を支えるために十分なｋＬａを維持しながら、低い気体散布速度を達成するために、高ｐＣＯ２モデルにおけるＤＯ調節のためのフリット付き小型スパージャー（ｆｒｉｔｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｐａｒｇｅｒ）を使用した。小型スパージャーは、小さな気泡サイズをもたらし、したがって、総気体−液体表面領域界面を増加させる。ＣＯ２の滞留時間を増加させ、ＣＯ２ストリッピングをさらに減少させるために（Ｍａｔｓｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０７（４），４１９−４２４）、より高い作業体積（１．９Ｌ以上）で、高ｐＣＯ２モデルを運用した。低ｐＣＯ２モデルは、ＣＯ２ストリッピングを増加させるために、開放パイプスパージャーおよびより低い作業体積（１．５Ｌ以下）を使用した。バイオリアクター形状のこれらの差は、２つのモデルの間に、ｐＣＯ２レベルの所望の分離をもたらした（図２１Ｂ）。たとえ、高ｐＣＯ２はハイブリドーマ細胞増殖、生存率および抗体産生に影響を与えることが示されている（ｄｅＺｅｎｇｏｔｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８，２１９−２２７）としても、本研究において使用されたＣＨＯ細胞株に対しては、これらの特性および生成物の品質に対して負の効果は観察されなかった（図２９）。これは、培養培地中のＮａＨＣＯ３濃度を操作せずに、同じ小規模バイオリアクター中でのＣＨＯ培養物に対するｐＣＯ２レベルの制御を実証する初めての報告であると考えられる。
【０５６３】
４．３．２  フコシル化欠損に対するｐＣＯ２レベル、培地保持および補充されるＭｎの効果
高および低ｐＣＯ２バイオリアクターモデルを用いて、完全実施要因実験計画法（ＤＯＥ）において、フコシル化欠損に対するｐＣＯ２レベル、培地保持および補充されるＭｎの効果およびこれらの間での潜在的な相互作用を調べた。ガラクトシル化に対するＭｎの確立された影響と合致して（Ｇｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１０８（７），１５９１−１６０２）、ガラクトシル化欠損種（Ｇ０Ｆ）は、補充されるＭｎの背景で減少した（図２１）。低ｐＣＯ２背景でＭｎ補充を用いると、フコシル化欠損は約１％高かった（図  Ｍｎはフコシル化に対して影響を及ぼすことは知られていないので、この結果は予想外である。例えば、いくつかの他の二価陽イオンはＦＵＴ８活性を著しく阻害したが、Ｍｎは阻害しなかった（Ｋａｍｉｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕａｇｔｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１５，７８３−７８８）。フコシル化欠損は、補充されるＭｎの存在下での培地保持または高ｐＣＯ２で約２％高かった（図２１Ａ）。フコシル化欠損は、補充されるＭｎ、培地保持および高ｐＣＯ２の存在下で最も高く（約４％）、これら３つの因子間での相互作用を示している。
【０５６４】
この観察された相互作用は、高および低ｐＣＯ２モデルの両方を用いて、複数のＭｎ補充レベルで確認された（図２２）。フコシル化欠損の増加は、全てのＭｎレベルで、培地保持を用いた高ｐＣＯ２モデルにおいてより顕著であった（図２２Ａ）。本実施例は、フコシル化欠損を調節する上でのＭｎ、培地保持およびｐＣＯ２レベルの効果およびこれらの間での相互作用を実証する。したがって、Ｍｎ、培地保持およびｐＣＯ２レベルは、それぞれ単独でフコシル化欠損を調節することができるが、これらが組み合わされて働くと、フコシル化欠損に対するそれらの影響は拡大される。
４．３．３  フコシル化欠損に対する高ｐＣＯ２、浸透圧およびＮａ＋の効果から交絡因子を除去する
【０５６５】
低ｐＣＯ２モデルと比べて高ｐＣＯ２モデルでは、より高い培養浸透圧およびＮａ＋が観察された（図２２Ｃ〜２２Ｄ）。これは、単純化された平衡式（式１）によって示されるように、溶液中のＣＯ２は平衡化してＨ＋とＨＣＯ３−を形成するという事実によって説明することができる。
ＣＯ２＋Ｈ２Ｏ  ⇔  Ｈ＋＋ＨＣＯ３−式１
【０５６６】
ｐＨ調節された環境では、Ｈ＋を中和するために、塩基（本研究ではＮａ２ＣＯ３）がバイオリアクターに添加され、これにより、式１の右側に平衡を移動させ、培養物の浸透圧およびＨＣＯ３−濃度を増加させる（ｄｅＺｅｎｇｏｔｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，７７（４４），３６９−３８０）。Ｎａ＋レベルも、Ｎａ２ＣＯ３添加を通じて増加する。これらの観察は、ｍＡｂフコシル化欠損の増加は高ｐＣＯ２、浸透圧またはＮａ＋によって引き起こされたかどうかという問題を提起する。
【０５６７】
フコシル化欠損に対する浸透圧の効果から高ｐＣＯ２の効果を交絡要因として除去する試みは、文献において矛盾する結果を招いた。これらの観察は、増加するｐＣＯ２および／または浸透圧からのフコシル化欠損に対する最小限の影響から（Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，１３，３１１−３１７；Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，１８，３４６−３５３）浸透圧の増加に伴うフコシル化欠損の減少（Ｋｏｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２），Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６４，２４９−２６５）まで多岐にわたる。これらの以前の研究では、生産培養は高ｐＣＯ２および／または浸透圧で開始されたが、これは、ｐＣＯ２および浸透圧が当初低く、その後、生産培養の間に増加するバイオリアクター中の典型的な条件を代表していない（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２），Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６４（６）：６６７−６７８）。
【０５６８】
典型的なＣＨＯバイオリアクター培養をより代表する環境中で、ｐＣＯ２の効果を浸透圧およびＮａ＋の効果と識別するために、１．９Ｌ（最大浸透圧約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ）および２．２Ｌ（最大浸透圧約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ）で操作される高ｐＣＯ２モデル中の生産培養の時間経過浸透圧プロファイルと合致させるために、ＮａＣｌまたはソルビトールのいずれかで、低ｐＣＯ２モデルでの浸透圧を滴定した（図２３）。全ての事例で、浸透圧の増加とともにフコシル化欠損が増加した。両目標最大浸透圧レベルにおいて、ＮａＣｌ滴定（低ｐＣＯ２）事例および高ｐＣＯ２事例の間でフコシル化欠損は似通っていたのに対して、フコシル化欠損は、ソルビトール滴定（低ｐＣＯ２）事例について約１％低かった。これらの結果は、高ｐＣＯ２モデルて観察されたフコシル化欠損の増加は、高ｐＣＯ２または浸透圧単独よりむしろ、ｐＨ調節のために使用されたＮａ２ＣＯ３の添加からのＮａ＋濃度の上昇によるものである可能性が高い。
【０５６９】
４．３．４  細胞内ｐＨ変化：高ｐＣＯ２および高浸透圧／Ｎａ＋
高ｐＣＯ２および／またはＮａ＋を背景にしたより大きなフコシル化欠損の増加の背後にある機序を調べるために、異なるｐＣＯ２および浸透圧／Ｎａ＋レベルに供されたときのｐＨｉを、組換えＣＨＯ細胞株に対して測定した。ＣＯ２は、細胞膜を横切って拡散し（Ｅｎｄｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４），Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，４，１−２１）、細胞内部で式１に記載されている平衡状態になり、したがって、ｐＨｉを低下させることができる。さらに、細胞外ｐＨを調節するための塩基添加（Ｎａ２ＣＯ３）からのＮａ＋は、Ｎａ＋／Ｈ＋交換（Ｏｒｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７２（３６），２２３７３−２２３７６）および／またはＮａ＋依存性Ｃｌ−／ＨＣＯ３−交換（Ｒｅｕｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃ１４７−Ｃ１５３）を通じてｐＨｉに影響を与えることができる。ｐＨｉの変化は、酵素発現に影響を与えることができる（Ｂｕｍｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３），Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，３（５），６７５−６８８）。さらに、各酵素は、最適な活性のためのｐＨ範囲を有する。したがって、（高ｐＣＯ２および／またはＮａ＋による）ｐＨｉのシフトは、フコシル化に関与する酵素の発現および／または活性に影響を与えることができる。
【０５７０】
この仮説を試験するために、異なるレベルのｐＣＯ２および浸透圧（浸透圧を滴定するためにＮａＣｌを使用）において組換えＣＨＯ細胞株に対して、ｐＨｉを測定した。ｐＨｉはｐＣＯ２レベルの増加とともに減少し（図２４Ａ）、浸透圧／Ｎａ＋の増加とともに増加した。（図２４Ｂ）。これらのデータは、ｐＣＯ２および浸透圧／Ｎａ＋はいずれも、ｐＨｉに影響を与えることができることを示し、以前の知見と一致している（ｄｅＺｅｎｇｏｔｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，７７（４４），３６９−３８０；Ｒｅｕｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃ１４７−Ｃ１５３）。
【０５７１】
４．３．５  グローバルプロテオミクス分析
フコシル化欠損に対するＭｎ、培地保持および高ｐＣＯ２／Ｎａ＋の影響の背後に存在する機序を明らかにするために、非ターゲット型プロテオミクスを行った。様々な程度でフコシル化欠損に影響を及ぼすと予想される４つの異なる条件に、生産培養を供した（図２５Ａ）。ＰＣＡ（図２６Ｂ）は、日数（７対１２）および処理（すなわち、細胞培養条件）による試料の明確な分離を示した。ＩＰＡは、グルコースおよびアミノ酸代謝に関連する経路（解糖系、糖新生、メチオニン分解およびシステイン生合成）がＭｎ、培地保持および高ｐＣＯ２の存在下で上方制御されることを示した（図２６Ｃ）。解糖系の酵素のうち、フルクトース二リン酸アルドラーゼは、事例ｉと比較して、事例ｉｖに対して差次的発現の最も高い上方制御を示した（図２６Ｄ）。Ｎａ＋の増加は、ｐＨｉおよびフルクトース−６−リン酸（Ｆｒｕ−６−Ｐ）をフルクトース１，６−二リン酸に変換する解糖系経路中の律速酵素であるホスホフルクトキナーゼの活性を増加させることができる（Ｆｉｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２），Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２４２（１），Ｃ８７−９３）。ホスホフルクトキナーゼの増強された活性は、Ｆｒｕ−６−Ｐのフルクトース１，６−二リン酸への転換を増加させ、これにより、Ｆｒｕ−６−Ｐのレベルを低下させ、フルクトース二リン酸アルドラーゼの発現を上方制御させ得る。Ｆｒｕ−６−Ｐは、デノボ合成経路中でＧＤＰ−フコースに対する上流の前駆体であるＧＤＰ−マンノースに対する前駆体であるので（図２７Ａ）、Ｆｒｕ−６−Ｐの低下は、ＧＤＰ−マンノースおよびＧＤＰ−フコースの供給を低下させ、したがって、フコシル化欠損を増加させるであろう。
【０５７２】
４．３．６  ＧＤＰ−フコース合成経路：プロテオミクス分析およびＬ−フコース補充
より高いｍＡｂフコシル化欠損を生成した細胞培養条件（すなわち、事例ｉｉ−ｉｖ）で、ＧＤＰ−フコースが影響を受けた可能性を評価するために、デノボおよびサルベージＧＤＰ−フコース合成経路中の鍵となる酵素の差次的発現を調べた（図２７Ａ）。ＧＭＤおよびＬ−フコースキナーゼの下方制御は、フコシル化欠損レベルと正に相関し、ＧＭＤとＬ−フコースキナーゼの発現は、最高のフコシル化欠損を有する培養処理（事例ｉｖ）について最低であった（図２７Ｂ）。ＦＸの一貫した変化が、事例ｉと比較して事例ｉｉ−ｉｖに対して観察された。
【０５７３】
以前の研究では、ＣＨＯ細胞株中でのＧＭＤまたはＦＸのノックアウトは、ＧＤＰ−フコースを減少、フコシル化欠損を増加させ（Ｋａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７），Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１３０（３０），３００−３１０；Ｌｏｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１１４（３），６３２−６４４）、フコシル化欠損は、ＧＤＰ−フコースを合成するためのサルベージ経路を利用するために、Ｌ−フコース補充によって低下させることができる（Ｌｏｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１１４（３），６３２−６４４）。本明細書でのプロテオミクスおよび他の文献でのノックアウト研究から得られた観察に照らすと、高ｐＣＯ２および／または補助されるＭｎによるフコシル化欠損の上昇は、ＧＤＰ−フコースの制限が少なくとも一因であると仮定することができる。この仮説を調べるために、ｐＣＯ２、補充されるＭｎおよび補充されるＬ−フコースを試験する完全実施要因実験計画法を実施した（図２７Ｃ）。フコシル化欠損に対するＬ−フコースの効果は、以前の滴定研究では約０．３ｇ／Ｌ後に飽和したので、この評価では、１ｇ／ＬのＬ−フコース補充を選択した。高いフコシル化欠損を生成することが知られている条件中でＬ−フコースを補充することによって、Ｇ０Ｆに影響を与えることなく、フコシル化欠損をより低いレベルに回復した（図３１）。まとめると、プロテオミクスおよびＬ−フコース補充の結果はいずれも、ＧＤＰ−フコースの制限が、高ｐＣＯ２、培地保持および補充されるＭｎの組み合わせに対して観察された相対的に高いｍＡｂフコシル化欠損に寄与することを確認した。
【０５７４】
４．３．７  プロテオミクス分析：ＦＵＴ８
フコシル化欠損におけるＦＵＴ８の鍵となる役割を考慮する上で、４つの培養処理事例ｉ−ｉｖにおいてＦＵＴ８の差次的発現を分析した（図２５Ａ）。ＦＵＴ８は、下方制御され、事例ｉと比べて、事例ｉｉ−ｉｖに対して、フコシル化欠損と負に相関した（図２８Ｂ）。これは、高ｐＣＯ２、培地保持およびＣＨＯ細胞における補充されたＭｎによって、ＦＵＴ８の下方制御を実証する初めての研究であると考えられる。
【０５７５】
４．３．８  プロテオミクス分析：その他のグリコシル化酵素、ｐＨｉ、ゴルジｐＨおよびゴルジＭｎ濃度
グリコシル化経路のこのセグメント中にいずれかのさらなるボトルネックが存在するかどうかを決定するために、ＦＵＴ８の上流（Ｍａｎ  Ｉ、ＧｎＴＩＩ）および下流（ＧａｌＴ３、ＧａｌＴ４およびＧａｌＴ７）のグリコシル化酵素の差次的発現を評価した（Ｈｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９），Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９（９），９３６−９４９；Ｋｒｅｍｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ，（２０１８），Ｍｅｔａｂｏｌ  Ｅｎｇ，４７，１３４−１４２）。試験事例および培養日数にわたって、Ｍａｎ  ＩおよびＧｎＴＩＩに対しては最小限の変化が存在し、ＧａｌＴ３、ＧａｌＴ４およびＧａｌＴ７発現レベルに対して一貫しない変化が存在した（図２８Ｂ）。たとえ、これらのグリコシル化酵素は差次的発現を示さなかったとしても、プロテオミクスは酵素活性の変化を確かめることはできない。Ｍｎはいくつかの酵素の補因子であるので、これらの酵素の活性は、ｐＨｉによってまたは細胞内Ｍｎ含量の変化によって影響を受け得る（Ｒｏｕｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，３０（３），５７１−５８３；Ｇｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１０８（７），１５９１−１６０２）。以下に論述されているように、プロテオミクスデータはこれらの理論を裏付ける。
【０５７６】
ＮＨＥ１、ｐＨｉ制御に関与するＮａ＋／Ｈ＋交換体（Ｏｒｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７２（３６），２２３７３−２２３７６）およびＧＰＲ８９、ゴルジｐＨ制御因子（Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８），Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０（１０），１１３５−１１４５）は上方制御され、フコシル化欠損およびｐＣＯ２／Ｎａ＋と正に相関した（図２８Ｂ）。これらの観察は、ｐＣＯ２／Ｎａ＋によってｐＨｉおよびゴルジｐＨが影響を受けることを示し、上記ｐＨｉの知見と合致する（図２４）。
【０５７７】
ＡＴＰ２Ａ１、ゴルジ中へのＭｎのＡＴＰ依存性輸送体（Ｂａｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４），Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１７４２（１−３），１０３−１１２）は上方制御され、フコシル化欠損およびｐＣＯ２／Ｎａ＋と正に相関した（図２８Ｂ）。ＧＰＰ１３０、その分解が細胞内Ｍｎレベルに専ら依存するゴルジタンパク質（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，２１，１２８２−１２９２；Ｍａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３），Ｓｙｎａｐｓｅ，６７（５），２０５−２１５；Ｖｅｎｋａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１７），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，２８，２５６９−２５７８）は、下方制御され、フコシル化欠損およびｐＣＯ２／Ｎａ＋と負に相関した（図２８Ｂ）。これらの結果は、他の事例と比べて、事例ｉｖにおいて、細胞内Ｍｎレベルが最も高かったことを示す。細胞内Ｍｎレベルが高いほど、ＧｎＴｓおよびＧａｌＴｓの活性を増加させて、フコシル化欠損グリコフォームの方向への全体的な流れを好む可能性がある。したがって、増大されたＭｎ輸送および細胞内Ｍｎレベルは、高ｐＣＯ２／Ｎａ＋、補助されるＭｎおよび培地保持の培養条件において、より高いフコシル化欠損への方向に寄与し得る。
【０５７８】
前記は本開示の原理の例示に過ぎないこと、本開示の範囲および精神から逸脱することなく、当業者によって様々な変更を施すことができることが理解されるであろう。例えば、限定を目的とするものではないが、この実施例において使用されたバイオリアクターの体積は、約１Ｌ〜約２０，０００Ｌ（例えば、約１Ｌ、約１．５Ｌ、約２Ｌ、約５Ｌ、約１０Ｌ、約５０Ｌ、約１００Ｌ、約２５０Ｌ、約５００Ｌ、約１０００Ｌ、約２０００Ｌ、約３０００Ｌ、約４０００Ｌ、約５０００Ｌ、約６０００Ｌ、約７０００Ｌ、約８０００Ｌ、約９０００Ｌ、約１０，０００Ｌ、約１１，０００Ｌ、約１２，０００Ｌ、約１３，０００Ｌ、約１４，０００Ｌ、約１５，０００Ｌ、約１６，０００Ｌ、約１７，０００Ｌ、約１８，０００Ｌ、約１９，０００Ｌまたは約２０，０００Ｌ）であり得る。さらに、バイオリアクターの形状は、ｐＣＯ２、培地保持期間、浸透圧、Ｎａ＋、Ｍｎ、温度、ｐＨ、フコース、ガラクトースまたはこれらの組み合わせのレベルを調整するために変更することができる。
【０５７９】
［実施例５］グリコシル化を調節するための培地保持
バイオリアクター中で上昇した温度での培地保持時間を増加させてグリコシル化の変化（例えば、フコシル化欠損およびガラクトシル化）を評価するために、抗体ＶＩに対して培地保持実験を行った。培養物を播種するために使用する前に、空気の散布、撹拌およびｐＨ調節とともに、生産培養のための培地および生産前の増殖培養物を３８℃に０、３６、４８および７２時間バイオリアクター中に保持した。図３３Ａ〜３３Ｂは、グリコシル化に対する、上昇した温度（３８℃）での培地保持時間の効果を示す。培地保持時間とＧ０との間の相関が、図３３Ａに示されている。培地保持時間とフコシル化欠損（例えば、標準化されたＧ０−Ｆ）との間の相関が、図３３Ｂに示されている。さらに、フコシル化欠損は、培地保持時間の増加とともに増加した。図３３Ｂに示されているように、標準化されたＧ０−Ｆのレベルは、培地保持が細胞培養培地に対して適用されたときに、有意な培地保持時間依存性の増加を示した。（図３３Ａ）。
【０５８０】
フコシル化欠損の変化を評価するために、抗体ＩＩＩに対して培地保持実験を行った。抗体ＩＩＩのフコシル化欠損に対する培地保持の累積的効果を評価するために、２つ組のバイオリアクター中で４つの事例を試験した。上昇した温度（約３７℃）に４８時間、生産（Ｎ）および／または接種トレイン（Ｎ−１）培地を保持した。対照事例は、バイオリアクターに播種する際の使用前に、上昇された温度で保持されなかった生産および接種トレイン培地を使用することを表す。図３３Ｃに示されているように、結果は、ＮおよびＮ−１培地保持はいずれも、単独で、フコシル化欠損（ここで、％Ｇ０−Ｆによって表される）を増加させることを実証する。Ｎ培地保持がＮ−１培地保持と組み合わせて使用されたときに、フコシル化欠損の最大の増加が観察され、これにより、フコシル化欠損に対する培地保持の累積的効果を実証する。
【０５８１】
フコシル化欠損の変化を評価するために、抗体ＩＩＩに対して培地保持およびＭｎ補充実験を行った。抗体ＩＩＩのフコシル化欠損に対する、培地保持およびＭｎ補充の個別のおよび組み合わせの／相乗的な効果を評価するために、２つ組のバイオリアクター中で４つの事例を試験した。２５０ｎＭ  Ｍｎを補充して／補充せずに、生産培地を上昇した温度（約３７℃）に４８時間保持した。対照事例は、バイオリアクターに播種する際の使用前に上昇した温度で保持されなかった生産培地の使用およびＭｎ補充の欠如を表す。試験された条件については、図３３Ｄに示されているとおり、培地保持は、（％Ｇ０−Ｆによって表される）フコシル化欠損に対するＭｎ補充より大きな影響を示した。培地保持がＭｎ補充と組み合わせて使用されたときに、フコシル化欠損の最大の増加が観察された。特に、％Ｇ０−Ｆの最大の増加は、４８時間培地保持が２５０ｎＭ  Ｍｎ補充と組み合わされて使用されたときに観察された（図３３Ｄ）。４８時間の培地保持への曝露は、％Ｇ０−Ｆのレベルを増加させた。培地保持に曝された培地中に２５０ｎＭのＭｎが補充されたときに、％Ｇ０−Ｆのレベルが増加した。
【０５８２】
図２１Ａに示されているとおり、培地保持時間（３６時間の保持時間）での標準化されたＧ０−Ｆの増加は、３７℃でも観察された。培地保持時間、ｐＣＯ２およびＭｎ間の相互作用も観察された。予想されない相乗的相互作用は、各単一の要素に対して観察された標準化されたＧ０−Ｆ増加の合計より大きい、標準化されたＧ０−Ｆの増加をもたらした（図２１Ａ）。
【０５８３】
前記は本開示の原理の例示に過ぎないこと、本開示の範囲および精神から逸脱することなく、当業者によって様々な変更を施すことができることが理解されるであろう。例えば、限定を目的とするものではないが、この実施例において使用されたバイオリアクターの体積は、約１Ｌ〜約２０，０００Ｌ（例えば、約１Ｌ、約１．５Ｌ、約２Ｌ、約５Ｌ、約１０Ｌ、約５０Ｌ、約１００Ｌ、約２５０Ｌ、約５００Ｌ、約１０００Ｌ、約２０００Ｌ、約３０００Ｌ、約４０００Ｌ、約５０００Ｌ、約６０００Ｌ、約７０００Ｌ、約８０００Ｌ、約９０００Ｌ、約１０，０００Ｌ、約１１，０００Ｌ、約１２，０００Ｌ、約１３，０００Ｌ、約１４，０００Ｌ、約１５，０００Ｌ、約１６，０００Ｌ、約１７，０００Ｌ、約１８，０００Ｌ、約１９，０００Ｌまたは約２０，０００Ｌ）であり得る。さらに、バイオリアクターおよびその操作は、ｐＣＯ２、培地保持期間、培養期間、浸透圧、Ｎａ＋、Ｍｎ、培養温度、フコース、ガラクトースまたはこれらの組み合わせのレベルを調整するために変更することができる。
【０５８４】
［実施例６］グリコシル化を調節するためのガラクトース添加
抗体ＶＩのグリコシル化に対する、ガラクトース、Ｍｎおよびこれらの組み合わせの添加を評価するために、３つの研究を行った。研究１、２および３の結果は、図３４〜図３６に示されている。グリコシル化（例えば、Ｇ０および標準化されたＧ０−Ｆ）の特異的な分布を標的とするために、ガラクトースもしくはＭｎまたはこれらの組み合わせを調整することができる。ガラクトースレベルおよび／Ｍｎレベルの増加は、より低いガラクトシル化欠損（Ｇ０）およびより高いフコシル化欠損（標準化されたＧ０−Ｆ）をもたらした。さらに、より低いレベルのガラクトースでは、、Ｇ０は、より高いレベルのガラクトースと比べて、Ｍｎレベルの変化に対してより感受性が高かった。同様に、より低いレベルのＭｎでは、Ｇ０は、より高いレベルのＭｎと比べて、ガラクトースレベルの変化に対してより感受性が高かった。特に、異なる濃度のガラクトースをＭｎ補充と組み合わせて添加したときに、％Ｇ０の予想外の相乗的減少が観察された（図３４Ａおよび３５Ａ）。各ガラクトースおよびＭｎ補充は、用量依存的に、Ｇ０のレベルを減少させた。しかしながら、ガラクトースおよびＭｎを一緒に培養培地中に加えると、Ｇ０のレベルが有意にかつ相乗的に減少した。ガラクトースとＭｎの両方を培養培地中に一緒に添加すると、Ｇ０−Ｆのレベルは相対的により低い変化を示した（図３４Ｂおよび３５Ｂ）。
【０５８５】
［実施例７］グリコシル化を調節するためのフコース補充および培養温度
７．１  序
本実施例は、グリコシル化に対するフコース補充の効果を要約する。フコース補充レベルが高いほどおよび／またはフコース補充が早いほど、フコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）の減少が大きくなる。培養温度との相互作用が観察され、より低い培養温度で、フコシル化欠損に対してより大きな影響が観察された。
【０５８６】
７．２  フコース濃度の評価
３つの抗体ＶＩ研究において、グリコシル化に対するフコース添加の効果を評価した。図３７８Ａ〜３７８Ｂは、フコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）およびガラクトシル化（例えば、Ｇ０）に対するフコース濃度の影響を示す。フコースレベルの増加は、より高いフコシル化欠損（標準化されたＧ０−Ｆ）をもたらした。
【０５８７】
７．３  フコース添加タイミングの評価
抗体ＶＩを用いて、２つの異なるフコースレベルで、グリコシル化に対するフコース添加タイミングの効果を評価した。５つの異なる時点で、生産培養物への播種後添加として、フコースを添加した。図３８Ａ〜３８Ｂは、フコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）およびガラクトシル化（例えば、Ｇ０）に対するフコース添加タイミングの影響を示す。フコース添加が早いほど、Ｇ０−Ｆのより大きな減少が観察された。フコース添加タイミングによって、Ｇ０は影響を受けなかった。
【０５８８】
７．４  フコース補充および温度との相互作用の評価
フコース濃度および温度ならびにフコースと温度との相互作用の、グリコシル化に対する効果を評価するために、抗体ＶＩを用いて、中心複合計画研究を行った。生産培養の０日目に、播種後添加として、フコースを添加した。図３９Ａ〜３９Ｂは、フコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）およびガラクトシル化（例えば、Ｇ０）に対するフコースおよび温度の影響を示す。フコース濃度を増加させ、温度を減少させることは、より低いフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）レベルをもたらした。フコースと温度間の予想外の相互作用が観察され、
【０５８９】
より高い温度より、より低い温度において、フコースがフコシル化欠損（例えば、Ｇ０−Ｆ）に対してより大きな影響を有する。図３９Ａ〜３９Ｂに示されているように、同じＧ０−Ｆレベルに達するために、上昇した温度では、より多量のフコースが必要とされた。温度を減少することによって、より高いＧ０レベルがもたらされた。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図１９Ｈ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図２９Ｅ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【国際調査報告】
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