(57)【要約】本発明は、（Ｒ）−Ｎ−（５−（（４−エチルピペラジン−１−イル）メチル）ピリジン−２−イル）−５−フルオロ−４−（６−フルオロ−１−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロベンゾ［４，５］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−８−イル）ピリミジン−２−アミン（化合物Ｉ）の塩または結晶形に関するものであり、また、本発明は化合物Ｉの塩及び／またはその結晶形の調製方法、前記塩及び／または結晶形を含有する医薬組成物、並びに疾患、病症または症候を治療するための医薬の製造におけるこれらの使用、または疾患、病症または症候を治療する方法に関するものである。【化１】2021529175.tif 000027
2021529175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式Ｉで示される化合物の塩または前記塩の結晶形。
【化１】
2021529175.tif 000023
【請求項２】
前記塩が酒石酸塩であり、且つ前記酒石酸塩がＬ−酒石酸塩であることを特徴とする、請求項１に記載の塩または前記塩の結晶形。
【請求項３】
前記酒石酸塩は、構造式ＩＩで示される構造を有することを特徴とする、請求項２に記載の塩または前記塩の結晶形。
【化２】
2021529175.tif 000024
【請求項４】
構造式ＩＩで示される化合物の結晶形。
【請求項５】
前記結晶形の粉末Ｘ線回折パターンは、回折角２θが４．４±０．２°、２３．６±０．２°及び２６．９±０．２°である特徴ピークを有することを特徴とする、請求項４に記載の結晶形。
【請求項６】
前記結晶形の粉末Ｘ線回折パターンは、回折角２θが４．４±０．２°、８．７±０．２°、１０．８±０．２°、１８．４±０．２°、２３．６±０．２°及び２６．９±０．２°の特徴ピークを有することを特徴とする、請求項５に記載の結晶形。
【請求項７】
前記結晶形の粉末Ｘ線回折パターンは、回折角２θが４．４±０．２°、８．７±０．２°、１０．８±０．２°、１５．９±０．２°、１８．４±０．２°、２３．６±０．２°及び２６．９±０．２°である特徴ピークを有することを特徴とする、請求項６に記載の結晶形。
【請求項８】
前記結晶形が図１に示す粉末Ｘ−線回折パターンを概略的に有することを特徴とする、請求項４に記載の結晶形。
【請求項９】
前記結晶形が図１２に示す粉末Ｘ−線回折パターンを概略的に有することを特徴とする、請求項４に記載の結晶形。
【請求項１０】
前記結晶形は、
１）（Ｒ）−Ｎ−（５−（（４−エチルピペラジン−１−イル）メチル）ピリジン−２−イル）−５−フルオロ−４−（６−フルオロ−１−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロベンゾ［４，５］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−８−イル）ピリミジン−２−アミン（化合物Ｉ）を、水及び／または水溶性有機溶媒に懸濁させ、懸濁物が得られ；
２）前記懸濁物を５０℃以上に加熱し；
３）５０℃以上に保持される温度条件で、前記懸濁物にＬ−酒石酸を加え、酸化処理を行い、透明な溶液が得られ；
４）室温まで温度を下げた後、撹拌してろ過し、濾過ケーキを乾燥させた後、請求項４の結晶形を得ることにより、調製されてなるものであることを特徴とする、請求項４に記載の結晶形。
【請求項１１】
前記結晶形は、５０−７０℃条件で、メタノールに化合物Ｉの透明な溶液を形成して、Ｌ−酒石酸をメタノールに溶解させ、Ｌ−酒石酸のメタノール溶液を化合物Ｉのメタノール溶液に滴下し、撹拌してからろ過し、濾過ケーキを４０−７０℃で乾燥させ、請求項４−１０のいずれか一項に記載の結晶形を得ることにより、調製されてなるものであることを特徴とする、請求項４−１０のいずれか一項に記載の結晶形。
【請求項１２】
前記結晶形は、図３に示す粉末Ｘ−線回折パターンを概略的に有することを特徴とする、構造式Ｉで示される化合物のＬ−酒石酸塩の結晶形。
【請求項１３】
構造式ＩＩＩで示される化合物またはその結晶形。
【化３】
2021529175.tif 000025
【請求項１４】
前記結晶形は、
１）（Ｒ）−Ｎ−（５−（（４−エチルピペラジン−１−イル）メチル）ピリジン−２−イル）−５−フルオロ−４−（６−フルオロ−１−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロベンゾ［４，５］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−８−イル）ピリミジン−２−アミン（化合物Ｉ）を、水及び／または水溶性有機溶媒に懸濁させ、懸濁物が得られ；
２）前記懸濁物を５０℃以上に加熱し；
３）５０℃以上に保持される温度条件で、前記懸濁物にメタンスルホン酸を加え、酸化処理を行い、透明な溶液が得られ；
４）室温まで温度を下げた後、撹拌してろ過し、濾過ケーキを乾燥させた後、請求項１３の結晶形を得ることにより、調製されてなるものであることを特徴とする、請求項１３に記載の結晶形。
【請求項１５】
前記結晶形が図５に示す粉末Ｘ−線回折パターンを概略的に有することを特徴とする、請求項１３に記載の結晶形。
【請求項１６】
前記結晶形が図６に示す粉末Ｘ−線回折パターンを概略的に有することを特徴とする、請求項１３に記載の結晶形。
【請求項１７】
前記結晶形が図７に示す粉末Ｘ−線回折パターンを概略的に有することを特徴とする、請求項１３に記載の結晶形。
【請求項１８】
前記結晶形が図８に示す粉末Ｘ−線回折パターンを概略的に有することを特徴とする、請求項１３に記載の結晶形。
【請求項１９】
下記のステップを含むことを特徴とする、
【化４】
2021529175.tif 000026
（Ｒ）−Ｎ−（５−（（４−エチルピペラジン−１−イル）メチル）ピリジン−２−イル）−５−フルオロ−４−（６−フルオロ−１−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロベンゾ［４，５］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−８−イル）ピリミジン−２−アミンのＬ−酒石酸塩（化合物ＩＩ）の調製方法。
【請求項２０】
治療有効量の請求項４−１２のいずれか一項に記載の結晶形、並びに薬学的に許容される賦形剤、補助剤及び／または担体を含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２１】
治療有効量の請求項１３−１８のいずれか一項に記載の化合物及び／または結晶形、並びに薬学的に許容される賦形剤、補助剤及び／または担体を含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２２】
例えばＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６のようなＣＤＫにより媒介される患者の疾患、病症または症候を治療するための医薬の製造における、請求項１−１８のいずれか一項に記載の塩及び／または結晶形、或いは請求項２０−２１のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２３】
前記疾患、病症または症候は、がん及び／または増殖性疾患である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記疾患、病症または症候は、乳がん、肺がん、黒色腫、結腸がん、肝臓がん、膵臓がん、脳がん、腎臓がん、卵巣がん、胃がん、皮膚がん、骨がん、神経膠腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、肝細胞がん、乳頭状腎細胞がんおよび／または頭頸部の扁平上皮がんである、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２５】
治療対象に、請求項１−１８のいずれか一項に記載の塩及び／または結晶形、或いは請求項２０−２１のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを特徴とする、例えばＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６のようなＣＤＫにより媒介される疾患の治療方法。
【請求項２６】
前記疾患は、がん及び／または増殖性疾患である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記疾患は、乳がん、肺がん、黒色腫、結腸がん、肝臓がん、膵臓がん、脳がん、腎臓がん、卵巣がん、胃がん、皮膚がん、骨がん、神経膠腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、肝細胞がん、乳頭状腎細胞がんおよび／または頭頸部の扁平上皮がんであることを特徴とする、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記治療対象はヒトであることを特徴とする、請求項２５−２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物（Ｒ）−Ｎ−（５−（（４−エチルピペラジン−１−イル）メチル）ピリジン−２−イル）−５−フルオロ−４−（６−フルオロ−１−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロベンゾ［４，５］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−８−イル）ピリミジン−２−アミンの塩及びその結晶形に関する。本発明は、前記化合物と結晶形の調製方法及び関連の中間体化合物、前記化合物を含有する医薬組成物、並びにＣＤＫ４／６活性を阻害する際これらの使用にも関する。また、本発明は上述の少なくとも一つの化合物または結晶形、並びに医薬組成物を使用してＣＤＫ４／６調節に関連する疾患、病症または症候を治療する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ，ＣＤＫｓ）はセリン／スレオニンプロテインキナーゼに属し、細胞周期、転写開始、及びある特定な代謝カスケード反応制御等の過程中の調節に関与する。異なったＣＤＫはサイクリン（ｃｙｃｌｉｎ）とＣＤＫ−ｃｙｃｌｉｎ複合体を形成する。ＣＤＫ活性が調節できなければ、細胞増殖の暴走、ゲノムの不安定（ＤＮＡ変異の増加、染色体の欠失など）、及び染色体の不安定（染色体の数の変化）などを直接にまたは間接的にもたらす。
【０００３】
現在、ＣＤＫｓファミリーには、既に２０種以上のサブタイプが確認される。ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６などは細胞周期の調節に関与し、ＣＤＫ７、ＣＤＫ８、ＣＤＫ９、ＣＤＫ１１等は転写調節に関与し、及び他のキナーゼとしてＣＤＫ３、ＣＤＫ５等が含まれている。そのうち、ＣＤＫ４／６（サイクリン依存性キナーゼ４と６）は細胞周期を調節する重要な因子である。癌関連の細胞周期突然変異は、主にＧ１期及びＧ１／Ｓ期の転換過程に存在し、ＣＤＫ４／６はＣｙｃｌｉｎＤと結合し、キナーゼ活性を有する複合体を形成し、癌抑制遺伝子Ｒｂの産物であるｐＲｂをリン酸化することにより、結合してなる転写因子Ｅ２Ｆが放出され、Ｓ期に関わる遺伝子転写を開始させ、細胞がチェックポイントを通過することを促進することで、Ｇ１期からＳ期へ転移する。ＣＤＫ４／６の特異的な活性化はある腫瘍の増殖と密接に関連し、およそ８０％のヒト腫瘍において、ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ−ＣＤＫ４／６−ＩＮＫ４−Ｒｂ経路の異常がある。ＣＤＫ４／６阻害剤は、細胞周期をＧ１期まで停止させることで、腫瘍増殖を抑制する機能を果たす。
【０００４】
分子標的ＣＤＫ４／６キナーゼ薬物の開発は重要な分野であり、その抗腫瘍標的のメリットは次の２点である。（１）大多数の増殖する細胞はＣＤＫ２またはＣＤＫ４／６に依存して増殖するが、ＣＤＫ４／６阻害剤は例えば骨髄抑制及び腸反応のような「ｐａｎ−ＣＤＫ阻害剤」の細胞毒性を示さない。（２）前臨床試験により、細胞ｃｙｃｌｉｎ  Ｄレベルが上昇し、またはＰ１６ＩＮＫ４ａが非活性化すれば、細胞の薬物に対する感度が増加することが証明され、腫瘍細胞は正常細胞に比べて上述現象があるから、ある程度で薬物の分子標的性が増えている。
【０００５】
ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／１１７９５０には、ＣＤＫ４／６プロテインキナーゼ阻害剤として用いられる１群のベンズイミダゾール誘導体を報告し、それらの化合物のほとんどは、ＣＤＫ４とＣＤＫ６を効果的に抑制できる。しかしながら、キナーゼにより媒介された疾患を治療するという点で、依然として、患者のニーズを満たしていない場合があるから、本発明者は、患者の医療ニーズを満たすために、ベンズイミダゾール誘導体の塩及びその結晶形のスクリーニングを更に行う。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、下記の構造式Ｉで示される化合物（Ｒ）−Ｎ−（５−（（４−エチルピペラジン−１−イル）メチル）ピリジン−２−イル）−５−フルオロ−４−（６−フルオロ−１−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロベンゾ［４，５］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−８−イル）ピリミジン−２−アミンの塩及びその結晶形を提供することである。
【化１】
2021529175.tif 000003
構造式Ｉの塩
【０００７】
ある実施形態において、一種の酸と化合物Ｉが対応する塩を形成する。これらの塩化合物は様々な物理的形態で存在しうる。例えば、溶液、懸濁液または固体形態であってもよい。ある実施形態において、塩化合物は固体形態である。塩化合物は固体形態である場合に、前記化合物はアモルファス体、結晶体またはそれらの混合物であってもよい。以下、化合物Ｉと二種類の酸から形成される塩を例示的に挙げる。当該二種類の酸は、それぞれ、酒石酸塩化合物、及びメタンスルホン酸塩化合物である。ある実施形態において、前記酒石酸塩とは、Ｌ−酒石酸塩である。化合物ＩのＬ−酒石酸塩とメタンスルホン酸塩の構造は下記の構造式ＩＩと構造式ＩＩＩで示される。
化合物ＩのＬ−酒石酸塩（構造式ＩＩで示される化合物、化合物ＩＩ）
【化２】
2021529175.tif 000004
化合物Ｉのメタンスルホン酸塩（構造式ＩＩＩで示される化合物、化合物ＩＩＩ）
【化３】
2021529175.tif 000005
【０００８】
本発明は、上述化合物ＩＩと化合物ＩＩＩの多種類の結晶形を更に提供している。
例えば、
化合物ＩＩの結晶形Ａ
本発明は化合物ＩＩの結晶形Ａを提供している。
【０００９】
ある実施形態において、化合物ＩＩの結晶形Ａは粉末Ｘ線回折により同定することができる。ある実施形態において、化合物ＩＩの結晶形Ａの粉末Ｘ線回折パターンは、回折角２θが４．４±０．２°、２３．６±０．２°及び２６．９±０．２°である特徴ピークを有する。便宜上、本発明において、これを結晶形Ａと称する。
【００１０】
ある実施形態において、上述結晶形Ａの粉末Ｘ線回折パターンは、回折角２θが４．４±０．２°、８．７±０．２°、１０．８±０．２°、１８．４±０．２°、２３．６±０．２°及び２６．９±０．２°の特徴ピークを有する。
【００１１】
ある実施形態において、上述結晶形Ａの粉末Ｘ線回折パターンは、回折角２θが４．４±０．２°、８．７±０．２°、１０．８±０．２°、１５．９±０．２°、１８．４±０．２°、２３．６±０．２°及び２６．９±０．２°である特徴ピークを有する。
【００１２】
ある実施形態において、本発明の前記化合物ＩＩの結晶形Ａは、示差走査量熱分析により同定することができる。ある実施形態において、結晶形Ａは図１１に示す示差走査量熱分析曲線を有する。ＤＳＣパターンにおいて、結晶形Ａの吸熱ピークは約２３０．１〜２３３．１℃にある。示差走査量熱分析は、ＮＥＴＺＳＣＨ社のＤＳＣ  ２００Ｆ３  ２４０−２０−０９５４−Ｌ（パージガス：窒素ガス；流速：６０ｍＬ／ｍｉｎ；昇温速度：１０℃／分、測定範囲：３０℃−３００℃）により測定した。
【００１３】
ある実施形態において、本発明の前記化合物ＩＩの結晶形Ａはイオンクロマトグラフィー、導電率検出器を利用し、外部標準法を採用して主成分の含有量を計算し得、測定されたＬ−酒石酸の含有量は約１２．０１％−１３．２７％である。
【００１４】
ある実施形態において、本発明の前記化合物ＩＩの結晶形Ａは１ＨＮＭＲを利用して同定し得、１ＨＮＭＲのデータは下記の通りであり：１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１．０１−１．０４（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３，Ｊ＝５．３Ｈｚ），１．５０−１．５２（ｄ，３Ｈ，ＣＨ３，Ｊ＝６．５Ｈｚ），１．９３−１．９５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），２．０３−２．０６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２），２．１６−２．１９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２），２．５０（ｓ，８Ｈ，ＣＨ２），２．５７（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．９３−３．０９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．４７（ｓ，１Ｈ，ＣＨ２），４．０２（ｓ，１Ｈ，ＣＨ），４．７９（ｓ，１Ｈ，ＣＨ），７．６８−７．７０（ｄ，１Ｈ，ＣＨ，Ｊ＝１０．５），７．７１−７．７３（ｄ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ，Ｊ＝１２．５），８．１２（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），８．２０（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），８．２１（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），８．６８−８．６９（ｄ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ，Ｊ＝３．５），１０．０３（ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）。
【００１５】
好ましくは、この結晶形Ａが純度≧８５％である。
【００１６】
好ましくは、この結晶形Ａが純度≧９５％である。
【００１７】
好ましくは、この結晶形Ａが純度≧９９％である。
【００１８】
好ましくは、この結晶形Ａが純度≧９９．５％である。
【００１９】
好ましくは、この結晶形Ａが無水物である。
【００２０】
本発明が提供する化合物ＩＩの結晶形Ａは、結晶化度が良く、吸湿性が弱く、安定性が良いという特性を有し、且つ許容できる経口生物学的利用能を備える。
化合物ＩＩの結晶形Ｂ
【００２１】
本発明は、化合物ＩＩの他の結晶形を提供し、便宜上、本発明では、これを結晶形Ｂと称する。この結晶形Ｂの粉末Ｘ線回折パターンは、図２に示す粉末Ｘ−線回折パターンを概略的に有する。
【００２２】
好ましくは、この結晶形Ｂが純度≧８５％である。
【００２３】
好ましくは、この結晶形Ｂが純度≧９５％である。
【００２４】
好ましくは、この結晶形Ｂが純度≧９９％である。
【００２５】
好ましくは、この結晶形Ｂが純度≧９９．５％である。
【００２６】
好ましくは、この結晶形Ｂが無水物である。
化合物ＩＩの結晶形Ｃ
【００２７】
本発明は、化合物ＩＩの他の結晶形を更に提供し、便宜上、本発明では、これを、結晶形Ｃと称する。この結晶形Ｃの粉末Ｘ線回折パターンは、図３に示す粉末Ｘ−線回折パターンを概略的に有する。
【００２８】
好ましくは、この結晶形Ｃが純度≧８５％である。
【００２９】
好ましくは、この結晶形Ｃが純度≧９５％である。
【００３０】
好ましくは、この結晶形Ｃが純度≧９９％である。
【００３１】
好ましくは、この結晶形Ｃが純度≧９９．５％である。
【００３２】
本発明は、化合物ＩＩまたはその溶媒和物のアモルファス体を更に提供する。このアモルファス体は、図４に示す粉末Ｘ−線回折パターンを概略的に有する。
【００３３】
本発明は、治療有効量の化合物ＩＩの結晶形Ａ、結晶形Ｂ及び／または結晶形Ｃを含有する医薬組成物を更に提供する。
本発明は、上記医薬組成物の好適な実施形態を提供する。
【００３４】
好ましくは、前記医薬組成物が治療有効量の化合物ＩＩの結晶形Ａ、結晶形Ｂ及び／または結晶形Ｃ、並びに薬学的に許容される賦形剤、補助剤または担体を含有する。
【００３５】
好ましくは、前記医薬組成物が治療有効量の化合物ＩＩの結晶形Ａ、並びに薬学的に許容される賦形剤、補助剤または担体を含有する。
【００３６】
好ましくは、前記医薬組成物が治療有効量の化合物ＩＩの結晶形Ａ、結晶形Ｂ及び／または結晶形Ｃを含有しつつ、少なくとも一種の他の有効成分を併用する。
【００３７】
好ましくは、前記医薬組成物が治療有効量の化合物ＩＩの結晶形Ａを含有しつつ、少なくとも一種の他の有効成分を併用する。
【００３８】
好ましくは、前記医薬組成物が経口剤である。
【００３９】
好ましくは、前記医薬組成物が錠剤またはカプセルである。
【００４０】
本発明は、ＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６のようなＣＤＫにより媒介される患者の病患、病症または症候を治療するための医薬の製造における、前記化合物ＩＩの結晶形Ａ、結晶形Ｂ及び／または結晶形Ｃの使用を更に提供する。
【００４１】
本発明は、前記化合物ＩＩの結晶形Ａ、結晶形Ｂ及び／または結晶形Ｃの上記用途における好適な実施形態を更に提供する。
【００４２】
好ましくは、前記疾患、病症または症候ががん及び／または増殖性疾患である。
【００４３】
好ましくは、前記の疾患、病症または症候が結腸がん、直腸がん、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、乳がん、前立腺がん、膠芽腫、扁平上皮食道がん、脂肪肉腫、Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、膵臓がん、脳腫瘍または肺がんである。
【００４４】
好ましくは、前記疾患、病症または症候が乳がんである。
【００４５】
本発明は、患者に、化合物ＩＩの結晶形Ａ、結晶形Ｂ及び／または結晶形Ｃを投与する患者の疾患、病症または症候の治療方法を更に提供する。
【００４６】
本発明は、上記化合物ＩＩの結晶形Ａ、結晶形Ｂ及び／または結晶形Ｃを利用して患者の疾患、病症または症候を治療する方法の好適な実施形態を更に提供する。
好ましくは、前記の疾患、病症または症候がＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６のようなＣＤＫにより媒介される。
【００４７】
好ましくは、前記の疾患、病症または症候ががん及び／または増殖性疾患である。
【００４８】
好ましくは、前記の疾患、病症または症候が結腸がん、直腸がん、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、乳がん、前立腺がん、膠芽腫、扁平上皮食道がん、脂肪肉腫、Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、膵臓がん、脳腫瘍または肺がんである。
【００４９】
好ましくは、前記疾患、病症または症候が乳がんである。
【００５０】
化合物ＩＩＩの結晶形Ｄ
【００５１】
本発明は、化合物ＩＩＩ及び／またはその溶媒和物の一つの結晶形を提供し、便宜上、本発明では、これを結晶形Ｄと称する。この結晶形Ｄは図５に示す粉末Ｘ−線回折パターンを概略的に有する。
【００５２】
好ましくは、この結晶形Ｄが純度≧８５％である。
【００５３】
好ましくは、この結晶形Ｄが純度≧９５％である。
【００５４】
好ましくは、この結晶形Ｄが純度≧９９％である。
【００５５】
好ましくは、この結晶形Ｄが純度≧９９．５％である。
【００５６】
好ましくは、この結晶形Ｄが無水物である。
化合物ＩＩＩの結晶形Ｅ
【００５７】
本発明は、化合物ＩＩＩ及び／またはその溶媒和物の一つの結晶形を提供し、便宜上、本発明では、これを結晶形Ｅと称する。この結晶形Ｅは図６に示す粉末Ｘ−線回折パターンを概略的に有する。
【００５８】
好ましくは、この結晶形Ｅが純度≧８５％である。
【００５９】
好ましくは、この結晶形Ｅが純度≧９５％である。
【００６０】
好ましくは、この結晶形Ｅが純度≧９９％である。
【００６１】
好ましくは、この結晶形Ｅが純度≧９９．５％である。
【００６２】
好ましくは、この結晶形Ｅが二水和物である。
化合物ＩＩＩの結晶形Ｆ
【００６３】
本発明は、化合物ＩＩＩ及び／またはその溶媒和物の一つの結晶形を提供し、便宜上、本発明では、これを結晶形Ｆと称する。この結晶形Ｆは図７に示す粉末Ｘ−線回折パターンを概略的に有する。
【００６４】
好ましくは、この結晶形Ｆが純度≧８５％である。
【００６５】
好ましくは、この結晶形Ｆが純度≧９５％である。
【００６６】
好ましくは、この結晶形Ｆが純度≧９９％である。
【００６７】
好ましくは、この結晶形Ｆが純度≧９９．５％である。
【００６８】
好ましくは、この結晶形Ｆが１．５水和物である。
化合物ＩＩＩの結晶形Ｇ
【００６９】
本発明は、まず、化合物ＩＩＩ及び／またはその溶媒和物の一つの結晶形を提供し、便宜上、本発明では、これを結晶形Ｇと称する。この結晶形Ｇは図８に示す粉末Ｘ−線回折パターンを概略的に有する。
【００７０】
好ましくは、この結晶形Ｇが純度≧８５％である。
【００７１】
好ましくは、この結晶形Ｇが純度≧９５％である。
【００７２】
好ましくは、この結晶形Ｇが純度≧９９％である。
【００７３】
好ましくは、この結晶形Ｇが純度≧９９．５％である。
【００７４】
好ましくは、この結晶形Ｇが２．５水和物である。
【００７５】
本発明は、化合物ＩＩＩ及び／またはその溶媒和物のアモルファス体を更に提供する。このアモルファス体は、図９に示すＸ−線粉末回折パターンを概略的に有する。
【００７６】
本発明は、治療有効量の化合物ＩＩＩの結晶形Ｄ、結晶形Ｅ、結晶形Ｆ及び／または結晶形Ｇを含有する医薬組成物を更に提供する。
本発明は、上記医薬組成物の好適な実施形態を更に提供する。
【００７７】
好ましくは、前記医薬組成物が治療有効量の化合物ＩＩＩの結晶形Ｄ、結晶形Ｅ、結晶形Ｆ及び結晶形Ｇ、並びに薬学的に許容される賦形剤、補助剤または担体を含有する。
【００７８】
好ましくは、前記医薬組成物が治療有効量の化合物ＩＩＩの結晶形Ｄ、結晶形Ｅ、結晶形Ｆ及び結晶形Ｇを含有しつつ、少なくとも一種の他の有効成分を併用する。
【００７９】
好ましくは、前記医薬組成物が経口製剤である。
【００８０】
好ましくは、前記医薬組成物が錠剤またはカプセルである。
【００８１】
本発明は、ＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６のようなＣＤＫにより媒介される患者の疾患、病症または症候を治療するための医薬の製造における、化合物ＩＩＩの結晶形Ｄ、結晶形Ｅ、結晶形Ｆ及び／または結晶形Ｇの使用を更に提供する。
本発明は、化合物ＩＩＩの結晶形Ｄ、結晶形Ｅ、結晶形Ｆ及び／または結晶形Ｇの上記用途における好適な実施形態を更に提供する。
【００８２】
好ましくは、前記疾患、病症または症候ががん及び／または増殖性疾患である。
【００８３】
好ましくは、前記疾患、病症または症候が結腸がん、直腸がん、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、乳がん、前立腺がん、膠芽腫、扁平上皮食道がん、脂肪肉腫、Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、膵臓がん、脳腫瘍または肺がんである。
【００８４】
好ましくは、前記疾患、病症または症候が乳がんである。
【００８５】
本発明は、患者に、化合物ＩＩＩの結晶形Ｄ、結晶形Ｅ、結晶形Ｆ及び／または結晶形Ｇを投与する患者の疾患、病症または症候の治療方法を更に提供する。
【００８６】
本発明は、上記化合物ＩＩＩの結晶形Ｄ、結晶形Ｅ、結晶形Ｆ及び／または結晶形Ｇを利用して患者の疾患、病症または症候を治療する方法の好適な実施形態を更に提供する。
【００８７】
好ましくは、前記の疾患、病症または症候がＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６のようなＣＤＫにより媒介される。
【００８８】
好ましくは、前記の疾患、病症または症候ががん及び／または増殖性疾患である。
【００８９】
好ましくは、前記の疾患、病症または症候が結腸がん、直腸がん、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、乳がん、前立腺がん、膠芽腫、扁平上皮食道がん、脂肪肉腫、Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、膵臓がん、脳腫瘍または肺がんである。
【００９０】
好ましくは、前記疾患、病症または症候が乳がんである。
【００９１】
ある実施形態において、本発明は、化合物Ｉの塩の結晶形を提供する。前記結晶形は下記の方法により調製されてなるものであり：
１）（Ｒ）−Ｎ−（５−（（４−エチルピペラジン−１−イル）メチル）ピリジン−２−イル）−５−フルオロ−４−（６−フルオロ−１−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロベンゾ［４，５］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−８−イル）ピリミジン−２−アミン（化合物Ｉ）を、水及び／または水溶性有機溶媒に懸濁させ、懸濁物が得られ；
２）上記懸濁物を５０℃以上までに加熱し；
３）５０℃以上に保持される温度条件で、上記懸濁物に対応する酸を加え、酸化処理を行い、透明な溶液が得られ；
４）室温まで温度を下げた後、撹拌してろ過し、濾過ケーキを乾燥させた後、化合物Ｉの塩の結晶形を得る。
【００９２】
例えば、上記ステップ３）で加えられた酸がＬ−酒石酸であれば、ステップ４）で得られたのは化合物ＩのＬ−酒石酸塩の結晶形である。
【００９３】
また、例えば上記ステップ３）で加えられた酸がメタンスルホン酸であれば、ステップ４）で得られたのは化合物Ｉのメタンスルホン酸塩の結晶形である。
【００９４】
ある実施形態において、化合物ＩＩの結晶形Ａの調製方法は下記の通りである：
５０−７０℃条件下、メタノールに化合物Ｉの透明な溶液を形成して、Ｌ−酒石酸をメタノールに溶解させ、Ｌ−酒石酸のメタノール溶液を化合物Ｉのメタノール溶液に滴下し、撹拌してからろ過し、濾過ケーキを４０−７０℃で乾燥させ、化合物ＩＩの結晶形Ａを得る。
【００９５】
ある実施形態において、化合物ＩＩの結晶形Ｂの調製方法は下記の通りである：
化合物ＩＩの結晶形Ａに対して、水とアセトンを加えて透明になるまで溶かし、ろ過して撹拌し、０−２０℃で更に撹拌し、固体を析出させ、遠心分離した後乾燥させて、化合物ＩＩの結晶形Ｂを得る。
【００９６】
ある実施形態において、化合物ＩＩの結晶形Ｃの調製方法は下記の通りである：
攪拌下で、１−０３（１００ｇ）、無水メタノール（１Ｌ）を、この順に２Ｌ反応釜に加え、６５℃に加熱し、反応系が透明になった０．５時間後、滴下時間が４５から６０分に制御するようにＬ−酒石酸のメタノール溶液（酒石酸３０．０９ｇが無水メタノール１００ｍＬに溶けてなるもの）を滴下し、滴下完了後、６５℃で保温して４時間反応させ、続いて、滴下時間が３０から４５分に制御するようにＬ−酒石酸のメタノール溶液（酒石酸７．４８ｇが無水メタノール１００ｍＬに溶けてなるもの）を滴下し、滴下完了後、６５℃で保温して１．５時間反応させ、続いて滴下時間が３０から４５分に制御するようにＬ−酒石酸のメタノール溶液（（酒石酸８．５５ｇが無水メタノール１００ｍＬに溶けてなるもの）を滴下し、滴下完了後、６５℃で保温して１．５時間反応させ、加熱を止め、１０℃以下に温度をさげ、ろ過し、濾過ケーキをメタノール（１００ｍＬ×２）でリンスし、４５℃に３６時間真空乾燥し、化合物ＩＩのＬ−酒石酸塩である淡黄色結晶性粉末１０９．４ｇを得た。粉末Ｘ線回折により同定したところ、この結晶形は化合物ＩＩのＬ−酒石酸塩の結晶形Ｃである。
【００９７】
ある実施形態において、化合物ＩＩのアモルファス体の調製方法は下記の通りである：
化合物ＩＩの結晶形Ａに対して、トリフルオロエタノールを加えて透明になるまで溶かし、減圧濃縮し、化合物ＩＩのアモルファス体を得る。
【００９８】
化合物ＩＩのアモルファス体が室温環境においては、水分の影響により、化合物ＩＩの結晶形Ｂに形成しやすい。
【００９９】
本発明は、下記のステップを含む、（Ｒ）−Ｎ−（５−（（４−エチルピペラジン−１−イル）メチル）ピリジン−２−イル）−５−フルオロ−４−（６−フルオロ−１−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロベンゾ［４，５］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−８−イル）ピリミジン−２−アミンのＬ−酒石酸塩（化合物ＩＩ）の調製方法を例示的に挙げられる。
【化４】
2021529175.tif 000006
ある実施形態において、化合物ＩＩＩの結晶形Ｄの調製方法は下記の通りである：
５０−７０℃条件で化合物Ｉをメタノールに透明になるまで溶かし、メタンスルホン酸をメタノールに溶解させ、メタンスルホン酸のメタノール溶液を化合物Ｉのメタノール溶液に滴下し、撹拌した後イソプロピルエーテルを滴下し、徐々に固体を析出させ、撹拌した後ろ過し、濾過ケーキを４０−７０℃で乾燥させ、固体を得る。母液にイソプロピルエーテルを更に滴下し、撹拌した後ろ過し、濾過ケーキを４０−７０℃で乾燥させ、固体を得る。得られた固体を続いて乾燥させた後、化合物ＩＩＩの結晶形Ｄを得た。
【０１００】
ある実施形態において、化合物ＩＩＩの結晶形Ｅの調製方法は下記の通りである：
化合物ＩＩＩの結晶形Ｄを、室温、５２％ＲＨの湿度条件で１−４日放置し、化合物ＩＩＩの結晶形Ｅを得る。
【０１０１】
ある実施形態において、化合物ＩＩＩの結晶形Ｆの調製方法は下記の通りである：
化合物ＩＩＩの結晶形Ｅを、室温、４４％ＲＨの湿度で１−１４日放置し、化合物ＩＩＩの結晶形Ｆを得る。
【０１０２】
ある実施形態において、化合物ＩＩＩの結晶形Ｇの調製方法は下記の通りである：
化合物ＩＩＩの結晶形Ｄを、室温、９７％ＲＨの条件で容器を開放して１−４日放置し、化合物ＩＩＩの結晶形Ｇを得る。
【０１０３】
ある実施形態において、化合物ＩＩＩのアモルファス体の調製方法は下記の通りである：
化合物ＩＩＩの結晶形Ｄに対して、水を加えて、透明になるまで溶かし、粘稠な固体になるまで減圧濃縮し乾燥させ、化合物ＩＩＩのアモルファス体を得る。
【０１０４】
化合物ＩＩＩのアモルファス体は５０ｍｇ以上のスケールでは不安定になり、結晶態になる。
【０１０５】
本発明の結晶形のいずれも基本的に純粋である。
【０１０６】
本発明に用いる「基本的に純粋である」という用語は、少なくとも８５重量％、好ましくは少なくとも９５重量％、より好ましくは少なくとも９９重量％、最も好ましくは少なくとも９９．５重量％の構造式Ｉで示される化合物が本発明の結晶形に、中でも結晶形Ａ、結晶形Ｂ及び／または結晶形Ｃに存在する、という意味である。
【０１０７】
本願が述べたように、新たな結晶形は粉末Ｘ−線回折パターンにより同定することができる。しかしながら、当業者にとって分かるように、粉末Ｘ−線回折のピーク強度及び／またはピークの状況は、例えば異なった回折測定条件及び／または優先方位などの実験条件により異なる可能性があり、また、異なる設備の精度も異なるから、測定された２θ値にも約±０．２°の誤差がある。しかしならが、ピークの相対的強度値はピークの位置よりも測定されたサンプルのある性質、例えばサンプルにおける結晶のサイズ、結晶の配向と分析される材料の純度に依存することが既知であるから、表示されるピーク強度の偏差が±２０％程度またはこれよりも大きい範囲に現れることも可能である。ただし、試験誤差、設備誤差及び優先方位などが存在するものの、当業者はまだ本願の提供するＸＲＤデータから、結晶形を同定することに充分な情報を得られる。
【０１０８】
本発明において、「図１に示す粉末Ｘ−線回折パターンを概略的に有する」または「図２に示す粉末Ｘ−線回折パターンを概略的に有する」は、粉末Ｘ−線回折パターンに示す主なピークが図１または図２に示すことを指し、このうち、主なピークは、図１またはお図２の一番高いピーク（その相対的強度を１００％とする）と比べて、相対的強度値が１０％超え、好ましくは３０％超えのピークを指す。
【０１０９】
本発明において、結晶形の調製方法に係る「メタノール／アセトンを加える」というのは、その調製方法で、まずメタノールを加えて、次にアセトンを加えることを指す。類似的に、「エタノール／水」はまずエタノールを加えて、次に水を加えることを指し；「トリフルオロエタノール／酢酸エチル」は、まずトリフルオロエタノールを加えて、次に酢酸エチルを加えることを指す。同じく、類似的な「溶媒１／溶媒２」というのは、まず溶媒１を加えて、次に溶媒２を加えることを指し；「溶媒２／溶媒１」というのは、まず溶媒２を加えて、次に溶媒１を加えることを指す。
【０１１０】
本発明において、用語「治療有効量」とは、ある化合物／結晶形が治療対象に用いられる際に、一種の疾患、或いは一種の疾患または病症の少なくとも一つの臨床症候を治療する時に、疾患、病症または症候に影響を与えることに充分な治療の量を指す。「治療有効量」は、化合物、疾患、病症及び／または疾患或いは病症の症候、疾患、病症及び／または疾患或いは病症の症候の重症度、治療される患者の年齢及び／または治療される患者の体重などによって変化する。任意の特定の状況では、適切な量は、当業者にとって自明なものであってもよく、通常の実験により確定されるものであってもよい。併用療法の場合、「治療有効量」は疾患、病症または症候を有効に治療するための併用されるものの全量を指す。
【０１１１】
本発明の医薬組成物の全ての剤形は薬学分野の常法により調製しうる。例えば、活性成分を一つまたは複数の賦形剤と混合し、そして希望される剤形とする。
【０１１２】
「薬学的に許容される担体」は所望の医薬製剤に相応しい通常の薬用担体を指し、例えば水、各種の有機溶媒等の希釈剤、賦形剤；澱粉、蔗糖などの充填剤；セルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のような粘着剤；グリセリンのような濡れ剤；カンテン、炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウムのような崩壊剤；第４アンモニウム化合物のような吸収促進剤；セチルアルコールのような界面活性剤；カオリン及びベントナイトのような吸収担体；タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム及びポリエチレングリコールなどの潤滑剤。なお、医薬組成物には、その他の薬学的に許容される、例えば分散剤、安定剤、増粘剤、錯化剤、緩衝剤、浸透促進剤、ポリマー、香料、甘味料及び染料という賦形剤を加えてもよい。好ましくは、所望の剤形と所望の投与方式に相応しい賦形剤を使用する。
【０１１３】
用語「疾患」、「病症」または「症候」は任意の疾患、不快感、病気、症状または適応症を指す。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は、化合物ＩＩの結晶形Ａ（小型サンプル、バッチ番号１０７２Ｐ０４−Ａ１４Ｓ０１）のＸＲＤパターンである。
【図２】図２は、化合物ＩＩの結晶形ＢのＸＲＤパターンである。
【図３】図３は、化合物ＩＩの結晶形ＣのＸＲＤパターンである。
【図４】図４は、化合物ＩＩのアモルファス体のＸＲＤパターンである。
【図５】図５は、化合物ＩＩＩの結晶形ＤのＸＲＤパターンである。
【図６】図６は、化合物ＩＩＩの結晶形ＥのＸＲＤパターンである。
【図７】図７は、化合物ＩＩＩの結晶形ＦのＸＲＤパターンである。
【図８】図８は、化合物ＩＩＩの結晶形ＧのＸＲＤパターンである。
【図９】図９は、化合物ＩＩＩのアモルファス体のＸＲＤパターンである。
【図１０】図１０は、化合物ＩＩの結晶形Ａ（小型サンプル、バッチ番号：１０７２Ｐ０４−Ａ１４Ｓ０１）が異なる安定性条件でのＸＲＤパターンである。下から上まで、曲線(1)から曲線(4)はそれぞれ下記の意味を表し：        ・  化合物ＩＩの結晶形Ａを０日にＸＲＤ測定を行って得られたＸＲＤパターンであり；（2）化合物ＩＩの結晶形Ａを温度２５℃、湿度６０％の条件で１０日放置した後、ＸＲＤ測定を行って得られたＸＲＤパターンであり；（3）化合物ＩＩの結晶形Ａを温度４０℃、湿度７５％の条件で１０日放置した後、ＸＲＤ測定を行って得られたＸＲＤパターンであり；（4）化合物ＩＩの結晶形Ａを温度８０℃、乾燥した条件で２４時間放置した後、ＸＲＤ測定を行って得られたＸＲＤパターンである。
【図１１】図１１は、化合物ＩＩの結晶形ＡのＤＳＣパターンである。横軸（Ｘ−軸）は温度を表し、単位：℃；縦軸（Ｙ−軸）は熱流を表し、単位：ワット／グラム。
【図１２】図１２は、化合物ＩＩの結晶形Ａ（中型サンプル、バッチ番号：２０１７０９０３）のＸＲＤパターンである。
【０１１５】
上記図１−図１０及び図１２において、横軸（Ｘ−軸）はいずれも回折角２θを表し、単位は「°」であり；縦軸（Ｙ−軸）はいずれも回折強度を表し、単位は「ｃｏｕｎｔｓ」である。
【発明を実施するための形態】
【０１１６】
以下、実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明の保護請求する範囲は、以下の実施例に限定されない。本発明の具体的な実施例において、特に断らない限り、技術または方法は本分野での通常の技術または方法などである。
【０１１７】
略語：
Ｃｂｚ−Ｃｌ：クロロギ酸ベンジル；
ＤＣＭ：ジクロロメタン；
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；
ＤＳＣ：示差走査熱量測定法；
ＤＶＳ：動的蒸気吸着；
ＥｔＯＨ：エタノール；
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル；
ＫＯＡｃ：酢酸カリウム；
ＫＯ−ｔ−Ｂｕ：カリウムｔ−ブトキシド；
ＭｅＯＨ：メタノール；
Ｐ（Ｃｙ）３：トリシクロヘキシルホスフィン；
Ｐｄ（ＯＡｃ）２：酢酸パラジウム；
Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２：［１，１´−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］二塩化パラジウム；
ＲＴ：室温；
ＲＨ：相対湿度；
ＴＧＡ：熱重量分析；
ＴＥＡ：トリエタノールアミン；
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；
Ｘａｎｔｐｈｏｓ：４，５−ビス（ジフェニルホスフィン）−９，９−ジメチルキサンテン；
ＸＲＤ：粉末Ｘ−線回折パターン。
【０１１８】
実施例１  化合物ＩＩの結晶形Ａの合成
【化５】
2021529175.tif 000007
１−Ａ１−０１の合成（ステップ一）
５０Ｌ反応釜に、ジクロロメタン（ＤＣＭ）２０Ｌ、１−Ａ１−Ｓ１（３００ｇ）、トリエチルアミン（３９０ｇ）を加え、攪拌下で−５℃以下までに温度を下げ、５時間かけてクロロギ酸ベンジル／Ｃｂｚ−Ｃｌ（５７０ｇ）を滴下し、室温まで自然昇温し、ＴＬＣ（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：３）で、反応終了までモニターした。水（１．５Ｌ）を加え、徐々に濃塩酸（８０ｍＬ）を滴下し、ｐＨを１−２に制御し、放置して分液させ、有機相を１５Ｌの水で洗い、無水硫酸ナトリウムで０．５時間乾燥した後、ろ過して乾燥剤を除去し、ろ液を集めて濃縮し、１−Ａ１−０１の粗生成物である淡黄色オイル状の液体７３０ｇを得た。収率は９５．４％であった。
【０１１９】
１−Ａ１−０２の合成（ステップ二）
２０Ｌ反応瓶に７２０ｍＬのＤＣＭ、Ｎ，Ｎ−ジメチルスルホキシド（９０ｇ）を加えて、窒素ガスで保護し、攪拌下で−６５℃以下までに温度を下げ、２時間にわたって塩化オキサリル（１０６ｇ）を滴下し、保温して２０分撹拌した。４０分にわたって１−Ａ１−０１のジクロロメタン溶液（１４３ｇ／５００ｍＬ  ＤＣＭ）を滴下し、保温して１５分反応させた。この温度に制御し、２時間にわたってＴＥＡを滴下し、−２０℃まで自然昇温し、反応系に２５０Ｌの水を加え、塩酸で反応系のｐＨを１−２に調整し、放置して分液させ、有機層を水（１Ｌ×２）で洗浄し、無水ナトリウムで乾燥し、ろ過して乾燥剤を除去し、ろ液を集めて濃縮し、製品１−Ａ１−０２の粗生成物である黄色オイル状の液体４３２ｇを得て、そのまま次の反応に用いる。
【０１２０】
１−Ａ１−０３の合成（ステップ三）
攪拌下で、１Ｌ反応釜に、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）４００ｍＬ、カリウムｔ−ブトキシド（２１５ｇ）をこの順に加え、５−１５℃までに温度を下げ、５０分にわたってホスホノ酢酸トリエチル（４３０ｇ）を滴下した。温度を１５℃に制御し、１時間にわたって１−Ａ１−０２のテトラヒドロフラン溶液（４３１ｇ／１００ｍＬ  ＴＨＦ）を滴下し、ＴＬＣ（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：３）で反応終了までモニターし、反応系に飽和食塩水（１．５Ｌ）を加え、放置して分液させ、テトラヒドロフランの相を集めた。水相をジクロロメタン（２Ｌ）で抽出し、有機層を合わせた後、無水硫酸ナトリウムで０．５時間乾燥し、ろ過して乾燥剤を除去し、ろ液を集めて濃縮し、濃縮物をカラムクロマトグラフィーで精製した後、製品１−Ａ１−０３である淡黄色オイル状液体３９０ｇを得た。
【０１２１】
１−Ａ１−０４１の合成（ステップ四）
５Ｌ反応釜に、水酸化ナトリウムの水溶液（３０１ｇ／１．５Ｌ水）を１−Ａ１−０３のテトラヒドロフラン溶液（６０１ｇ／２．３Ｌ  ＴＨＦ）に加え、還流加熱して３−４時間反応させ、反応を止めた。４０−５０℃までに温度を下げ、放置して分層させ、有機相（ＴＨＦ）を集めた後、大量の固体が現れるまで濃縮した；固体に対して水（２０Ｌ）に加えて溶解させ、水相をメチルｔ−ブチルエーテル（２Ｌ）、酢酸エチル（２Ｌ）、メチルｔ−ブチルエーテル（２Ｌ）でこの順に洗浄した；水相のｐＨを濃塩酸で１−２に調整し、酢酸エチル（１．５Ｌ、３Ｌ）で二回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで０．５時間乾燥した；ろ過して乾燥剤を除去し、ろ液を集めて、大量の固体が現れるまで濃縮し、固体に対してイソプロピルエーテル（３Ｌ）に加え２時間パルプ化し、濾過し、固体を集めて、イソプロピルエーテル（１Ｌ）でリンスした。固体を５０℃で３−４時間エアブラスト乾燥し、製品１−Ａ１−０４１である薄い黄色固体３３１ｇを得た。収率は５２．７％であった。
【０１２２】
１−０５１の合成（ステップ五）
攪拌下で、１−Ａ１−０４１（６００ｇ）、メタノール（２５Ｌ）、濃硫酸をこの順に５０Ｌ反応釜に加え、還流加熱して３−４時間反応させ、反応終了後、室温まで温度を下げた。反応系を溶媒が留出されないまで濃縮し、濃縮物に対してジクロロメタン（１５Ｌ）を加え、炭酸カリウムの水溶液でｐＨ＝９−１０に調整し、撹拌して、放置して分液させ、有機相を集め、無水硫酸ナトリウムで０．５時間乾燥し、ろ過して乾燥剤を除去し、ろ液を集めて濃縮し、製品１−Ａ１−０５１であるオフホワイト固体６．３７ｋｇを得た。収率は９７．３％であった。
【０１２３】
１−Ａ１の合成（ステップ六）
２Ｌ水素添加釜に、１−Ａ１−０５１（５００ｇ）、メタノール（１．８Ｌ）、パラジウム炭素をそれぞれに加え、反応系を窒素ガスで３回、水素ガスで３回この順に置換した。反応系を水素ガス雰囲気に保って、８５℃に昇温し、圧力３．０Ｍｐａで３時間反応させ、反応を止めた。室温まで温度を下げ、パラジウム炭素を濾過し除去し、有機相を集めて大量の薄い黄色固体が現れるまで濃縮し、イソプロピルエーテル（３Ｌ）を加え、1時間凍結（−２０℃）して結晶化し、固体の生成物を濾過して集め、固体をイソプロピルエーテル（５００ｍＬ）でリンスし、製品１−Ａ１である薄い黄色固体２３４ｇを得た。収率は９０．５％であった。
【０１２４】
１−Ａ２の合成（ステップ七）
攪拌下で、１−Ａ１（２００ｇ）、４−ブロモ−２，６−ジフルオロアニリン（４１０ｇ）、トルエン（１．２Ｌ）をこの順に５０Ｌ反応釜に加え、１時間にわたって反応系に塩化ホスホリル（４１３ｇ）を滴下した。氷浴で、１時間にわたってトリエチルアミンを滴下した。１１０℃に昇温し、１時間反応させた。反応系を２−１０℃までに温度を下げ、１Ｌの水を加え、飽和炭酸カリウム水溶液でｐＨ＝９−１０に調整し、酢酸エチル（１．５Ｌ、１Ｌ）で二回抽出し、有機層を合わせた後、２Ｌの飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで０．５時間乾燥し、ろ過して乾燥剤を除去し、ろ液を集めて固体生成物が現れるまで濃縮し、固体に対してイソプロピルエーテル（１Ｌ）を加えて１０分パルプ化し、濾過し、製品１−Ａ２である黄色固体４６０ｇを集めた。
【０１２５】
１−Ａ３の合成（ステップ八）
攪拌下で、１−Ａ２（４５０ｇ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２Ｌ）、炭酸セシウム（７００ｇ）をこの順に反応釜に加え、１１０℃に加熱し、保温して２４時間反応させ、反応終了までＴＬＣで検出し、反応系に酢酸エチル（３Ｌ）を加え、固体不純物を濾過し除去し、ろ液を飽和食塩水（１Ｌ×５）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで０．５時間乾燥し、大量の固体が現れるまで濃縮し、メチルｔ−ブチルエーテル（１Ｌ×２）で３０分パルプ化し、ろ過して、１−Ａ３である淡黄色固体３８２ｇを得た。収率は９０．１０％であった。
【０１２６】
１−０１の合成（ステップ九）
攪拌下で、１−Ａ３（３８０ｇ）、ビス(ピナコラート)ジボロン（４００ｇ）、酢酸カリウム（３４０ｇ）、酢酸パラジウム（６ｇ）、トリシクロヘキシルリン（７ｇ）、１，４−ジオキサンをこの順に反応釜に加え、窒素ガスで保護し、９０℃に昇温し、２時間反応させた。ＴＬＣで反応終了までモニターした。室温まで温度を下げ、濾過し、大量の１，４−ジオキサンを除去するまでろ液を濃縮して、濃縮物をｎ−ヘキサンとジクロロメタンのカラムクロマトグラフィーで精製し、ｎ−ヘキサン（１．２Ｌ）で１時間パルプ化し、１−０１である灰色固体３３４ｇを得た。収率は７０．１０％であった。
【０１２７】
１−０２の合成（ステップ十）
攪拌下で、１−０１（１２８ｇ）、１，４−ジオキサン（１Ｌ）、１−Ｓ３（８５ｇ）、炭酸カリウム（１１０ｇ）、精製水をこの順に２Ｌの三つ口瓶に加え、窒素ガスで保護し、［１，１´−ビス（ジフェニルホスフィン）フェロセン］二塩化パラジウムジクロロメタン錯体（Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２・ＤＣＭ）を加えた。加熱して６０℃に昇温した。４時間反応させた後、完全に反応した。反応液を室温に冷却し、大部分の１，４−ジオキサンを除去するまで減圧濃縮し、ジクロロメタン（１．５Ｌ）と精製水（１．１Ｌ）を加え、撹拌し、放置して分層させ、分液させて、水相をジクロロメタン（１０Ｌ）で抽出し、有機層を合わせ、０．５％の希塩酸（１Ｌ×２）で洗浄し、飽和食塩水（１Ｌ）で洗浄し、分液した。有機層を無水硫酸ナトリウム（５００ｇ）で乾燥し、濾過し、乾燥剤を除去し、ろ液を減圧濃縮した。濃縮物に対して酢酸エチルを（０．５Ｌ）加え、３０分撹拌し、固体を析出させ、濾過した後、得られた固体を酢酸エチル（０．５Ｌ）でリンスし、４５℃で３時間真空乾燥し、１２０ｇの黄色固体を得た。
【０１２８】
１−０３の合成（ステップ十一）
攪拌下で、１−０２（１００ｇ）、１，４−ジオキサン（１Ｌ）、１−Ｃ２（８０ｇ）、炭酸セシウム（１６３ｇ）をこの順で２Ｌの三つ口瓶に加え、窒素ガスで保護し、酢酸パラジウム（２ｇ）と４，５−ビスジフェニルホスフィン−９，９−ジメチルキサンテン（Ｘａｎｔｐｈｏｓ）（４ｇ）を加え、反応終了まで８５℃に加熱した。反応液を室温まで冷却し、濾過して固体生成物を得て、固体を酢酸エチルでリンスした後、ジクロロメタン（１．５Ｌ）と精製水（１．１Ｌ）の混合系に加え、攪拌し、放置して、分層させた。水相をジクロロメタン（７００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、精製水（７００ｍＬ×２）で洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウム（７００ｇ）を加えて乾燥し、濾過し、乾燥剤を除去し、ろ液を濃縮し、メタノール（０．５Ｌ）を加え、５５〜６５℃に加熱し、０．５時間攪拌し、室温まで温度を下げ、濾過して固体生成物を得、酢酸エチル５００ｍＬでリンスした。固体を４５℃、真空で８時間乾燥し、合計１１１．７９ｇの淡黄色固体を得た。
【０１２９】
化合物ＩＩの合成（ステップ十二）
攪拌下で、１−０３（５００ｇ）、無水メタノール（３．８Ｌ）を、この順に１０Ｌの反応釜に加え、６５℃に加熱し、反応系が透明になった０．５時間後、滴下時間が４５から６０分に制御するようにＬ−酒石酸のメタノール溶液（酒石酸１５０．８９ｇが無水メタノール５００ｍＬに溶けてなるもの）を滴下し、滴下完了後、６５℃で保温して４時間反応させ、続いて滴下時間が３０から４５分に制御するようにＬ−酒石酸のメタノール溶液（酒石酸３５．５８ｇが無水メタノール２５０ｍＬに溶けてなるもの）を滴下し、滴下完了後、６５℃で保温して１時間反応させ、続いて滴下時間が３０から４５分に制御するようにＬ−酒石酸のメタノール溶液（酒石酸３６．５５ｇが無水メタノール２５０ｍＬに溶けてなるもの）を滴下し、滴下完了後、６５℃で保温して１．５時間反応させ、加熱を止め、２０−３０℃まで自然に温度を下げ、ろ過し、濾過ケーキをメタノール（４００ｍＬ×２）でリンスし、４５℃で３６時間真空乾燥し、化合物ＩＩである淡黄色結晶性粉末５３０．６４ｇを得る。粉末Ｘ線回折により同定したところ、この結晶形は化合物ＩＩの結晶形Ａであった。
【０１３０】
実施例２  ＸＲＤ分析結果
実施例１の合成方法に従って、それぞれ、化合物ＩＩの小型サンプル（バッチ番号：１０７２Ｐ０４−Ａ１４Ｓ０１）と化合物ＩＩの中型サンプル（バッチ番号：２０１７０９０３）を調製して得られた後、ＸＲＤを用いて解析した。
【０１３１】
本発明の一つの具体的な実施形態において、小型サンプル（バッチ番号：１０７２Ｐ０４−Ａ１４Ｓ０１）はＨａｎｇｚｈｏｕ  Ｓｏｌｉｐｈａｒｍａ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．にてＢｒｕｋｅｒ  Ｄ８  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒを用いてＸＲＤ分析を行い、使用した装置と検出パラメーターを表１、ＸＲＤパターン解析データを表２に示す。
【０１３２】
小型サンプルのＸＲＤ分析装置と検出方法のパラメーター
【表１】
2021529175.tif 000008
【０１３３】
小型サンプルのＸＲＤパターン解析データ
【表２】
2021529175.tif 000009
【０１３４】
本発明の他の具体的な実施形態において、中型サンプル（バッチ番号：２０１７０９０３）は、BEIJING  CENTER  FOR  PHYSICAL＆CHEMICAL  ANALYSISにてＤ８−Ａｄｖａｎｃｅ型Ｘ−線回折計を用いてＸＲＤ分析を行い、参照した方法はＪＹ／Ｔ  ００９−１９９６「Ｘ線多結晶回折測定の一般規則」である。使用した装置と検出パラメーターを表３、ＸＲＤパターン解析データを表４に示す。
【０１３５】
中型サンプルＸＲＤ分析装置と測定方法のパラメーター
【表３】
2021529175.tif 000010
【０１３６】
中型サンプルのＸＲＤパターン解析データ
【表４】
2021529175.tif 000011
【０１３７】
当業者が理解できるように、ＸＲＤパターンを獲得する中で、誤差を減らすために、関連するデータを、例えばベースライン校正などの科学処理を適宜に行なってもよい。当業者も理解できるように、異なった実験場所の条件で施すれば、得られたＸＲＤパターンの２θ角または解像度などは少々差別が存在する。本発明が提供する化合物ＩＩの結晶形ＡのＸＲＤパターンは、図１または図１２に示す粉末Ｘ線回折パターンに限定されなく、図１または図１２に示す粉末Ｘ線回折パターンと基本的に同じのものを有する結晶は、いずれも本発明の保護範囲内にあることが理解できる。
【０１３８】
実施例３  結晶形安定性の測定
本発明の粉末Ｘ−線回折パターン検出装置と方法を表１に示す。化合物ＩＩの結晶形Ａ、化合物ＩＩＩの結晶形Ｄ、及び化合物ＩＩＩの結晶形Ｆのサンプルを８０℃で２４時間乾燥放置し、２５℃、６０％ＲＨで１０日放置し、４０℃、７５％ＲＨで１０日放置し、測定したＸＲＤパターンを図１０、結果を表５に示す。
【表５】
2021529175.tif 000012
化合物ＩＩの様々な結晶形の安定性試験結果
【０１３９】
化合物ＩＩの結晶形Ａが異なる安定性条件でのＸＲＤの対比を図１０に示し、図から分かるように、化合物ＩＩの結晶形Ａのサンプルが８０℃で２４時間乾燥放置しても、２５℃、６０％ＲＨで１０日放置しても、４０℃、７５％ＲＨで１０日放置しても、結晶形が変わらなく、化合物ＩＩの結晶形Ａの安定性が良好である。
【０１４０】
また、化合物ＩＩの結晶形Ｂは準安定結晶形であり、結晶状態が劣り、且つ１８０℃に昇温すれば結晶形Ａになっている。
実施例４  結晶形の長期安定性の測定
【０１４１】
化合物Ｉと化合物ＩＩの結晶形Ａのサンプルをそれぞれ温度２５℃±２℃、相対湿度６０％±１０％条件で１８ヶ月放置し、また、それぞれ、０ヶ月、３ヶ月及び１８ヶ月に試料を採取し、ＨＰＬＣ測定を行い、検出結果を表６に示す。
【０１４２】
化合物Ｉと化合物ＩＩの結晶形Ａの０ヶ月、３ヶ月及び１８ヶ月でのＨＰＬＣ検出結果
【表６】
2021529175.tif 000013
【０１４３】
表６のデータから分かるように、１８ヶ月後で、化合物Ｉの最大単一不純物の含有量と総不純物含有量は、いずれも化合物ＩＩの結晶形Ａの３倍以上であり、化合物ＩＩの結晶形Ａは、１８ヶ月放置した後、含有量が０．１％超える不純物を生じなく、一方、化合物Ｉは、含有量が０．１％超える四つの不純物を生じた。化合物Ｉと比べると、化合物ＩＩの結晶形Ａの安定性は顕著に向上した。
実施例５  動的水分吸着（ＤＶＳ）測定
【０１４４】
本発明の動的水分吸着検出装置と方法を表７に、動的水分吸着の測定結果を表８に示す。
【０１４５】
動的水分吸着検出装置と方法データ  
【表７】
2021529175.tif 000014
【０１４６】
動的水分吸着の測定結果
【表８】
2021529175.tif 000015
【０１４７】
化合物ＩＩの結晶形Ａと結晶形Ｂについては、０％ＲＨから８０％ＲＨまでの範囲内で、それぞれの重量変化が約５．３％及び約５．５％であり、一方、化合物ＩＩＩの結晶形Ｄと結晶形Ｆについては、０％ＲＨから８０％ＲＨまでの範囲内で、それぞれの重量変化が約１７．２％及び約１６．６％である。これで分かるように、化合物ＩＩＩの結晶形と比べて、化合物ＩＩの結晶性は、吸湿性が弱く、固体製剤の調製により適切に用いられる。
【０１４８】
実施例６  溶解度測定
化合物ＩＩの結晶形Ａと、化合物ＩＩＩの結晶形Ｄと、化合物Ｉとの溶解度を測定した。室温で、水への溶解度の結果を表９に示す。これで分かるように、化合物ＩＩの結晶形は異なれば、その溶解度を改良する程度も異なり、化合物ＩＩの結晶形Ａは優れた溶解性能を示す。
【０１４９】
化合物ＩＩの様々な結晶形の溶解度の測定結果
【表９】
2021529175.tif 000016
注：溶解度レベル基準は「２０１５年版中国薬局方」第四部の通則の規定に従う。
【０１５０】
実施例７  薬物動態の測定
ＳＤラット１２匹を二つの群に分けて、各群が６匹であり、各群において、雌雄が各々３匹である。それぞれ、化合物ＩＩの結晶形Ａと化合物Ｉを３０ｍｇ／ｋｇで単回強制経口投与した。それぞれ、所定の時点に眼底静脈叢を介して採血し、血漿を分離し、−８０℃の冷蔵庫に保管した。
【０１５１】
アセチルニトリルで上述血漿サンプルのタンパク質を沈澱させ、上澄みを水で３倍希釈し、５μＬを取ってＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定し、試験データを表１０に示す。
【０１５２】
薬物動態の測定結果
【表１０】
2021529175.tif 000017
【０１５３】
以上の結果から、化合物Ｉと比べて、化合物ＩＩの結晶形Ａは、生体内での吸収がより良好であることが分かる。
【０１５４】
実施例８  ＣＤＫ４／６に対する化合物Ｉの活性阻害の測定
化合物がＣＤＫキナーゼ（ＣＤＫ４／ＣｙｃＤ３，ＣＤＫ６／ｃｙｃＤ３）に対する親和力を示すことを証明するために、ＣＤＫキナーゼの測定を行った。
【０１５５】
反応バッファーは以下のように調製された。
ＣＤＫ６のキナーゼ塩基性バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５；０．００１５％Ｂｒｉｊ−３５；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２ｍＭ  ＤＴＴ）；ＣＤＫ４のキナーゼ塩基性バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５；０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２ｍＭ  ＤＴＴ）；ストップバッファー（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５；０．０１５％Ｂｒｉｊ−３５；０．２％コーティング試薬＃３；５０ｍＭ  ＥＤＴＡ）
【０１５６】
酵素反応計画：
１）１００％ＤＭＳＯを用いて、化合物を反応に必要な最高濃度の５０倍まで希釈した。上記化合物の希釈液１００μＬを９６ウェルプレートのウェルに移した。そして、次のウェルに、上述希釈液３０μＬを１００％ＤＭＳＯ６０μＬで希釈するように、化合物を逐次に１０個の濃度に希釈した。同じ９６ウェルプレート上で、１００％ＤＭＳＯ溶液１００μＬを二つの空のウェルに入れ、化合物なしの対照と酵素なしの対照とした。当該ウェルプレートをソースプレートとした。
２）各濃度の化合物１０μＬを、それぞれ、ソースプレートからキナーゼバッファー９０μＬを含む別の９６ウェルプレートに移し、中間プレートを調製した。
３）中間プレートとしての９６ウェルプレートにおける対応するウェルから、化合物溶液５μＬを、対応する３８４ウェルプレートに移した。
４）２．５×酵素溶液１０μＬを３８４ウェルプレートの全てのウェルに入れた。
５）室温で１０分インキュベートした。
６）２．５×基質溶液１０μｌを入れた。上記基質溶液は、キナーゼバッファーに蛍光色素標識ペプチドとＡＴＰを加えることで調製されてなるものである。
酵素と基質の反応濃度を下記の表（表１１）に示す。
【０１５７】
酵素と基質の反応濃度
【表１１】
2021529175.tif 000018
７）２８℃で特定の時間にインキュベートした。
８）ストップバッファー２５μＬを入れ、反応を停止した。
９）Ｃａｌｉｐｅｒでのデータをまとめた。そして、転化値を阻害値に換算した。
【０１５８】
「最大値」はＤＭＳＯ対照値であり、「最小値」はキナーゼなしの対照ウェルの値である。
【０１５９】
１０）ＸＬＦｉｔの最適化バージョン４．３．１の百分率阻害曲線でフィッティングし、ＩＣ５０値を得た。方程式：Ｙ＝底＋（高さ−底）／（１＋（ＩＣ５０／Ｘ）＾傾き）
結果をＩＣ５０で表し、表１２に示す。
【０１６０】
ＣＤＫ４／６に対する活性阻害の測定結果
【表１２】
2021529175.tif 000019
【０１６１】
実施例９  分子レベルでＣＤＫキナーゼの他のサブタイプに対する活性阻害及び選択性試験
化合物Ｉを試験化合物とし、分子レベルでＣＤＫキナーゼに対する活性阻害及び選択特異性について、陽性対照薬であるＬＹ２８３５２１９（Ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ）と比較した。
【０１６２】
本方法のメカニズムは式（ＩＶ）に示すように、キナーゼは、タンパク質基質を触媒してリン酸化させ、反応系におけるラジオアイソトープ３３Ｐに標識されたＡＴＰ（γ− ３３Ｐ−ＡＴＰ）の３３Ｐをタンパク質基質に標識させ、反応系をＰ８１イオン交換ろ過膜に滴下し、０．７５％リン酸バッファーでろ過膜を十分に洗浄し、放射性を有するリン酸化された基質がろ過膜に残ることがあり、基質タンパク質の放射性標識の強度を記録することで、キナーゼの活性が反映される。
【数１】
2021529175.tif 000020
【０１６３】
Ｐｒｉｓｍ４  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いてデータを処理し、曲線フィッティング式は下述式であり：
Ｙ＝最小阻害率＋（最大阻害率−最小阻害率）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０−Ｘ）＊傾き））；
ここで、Ｙは阻害百分率を表し（％）；Ｘは測定する化合物の濃度の対数を表す。
【０１６４】
結果：多種類のＣＤＫキナーゼをスクリーニングしたところ、化合物ＩがＣＤＫ１／２／７／９を阻害するＩＣ５０は０．４μＭ超えであり、ＣＤＫ４／６の数十倍乃至千倍以上であることが見出す（表１３参照）。
【０１６５】
ＣＤＫキナーゼに対する活性阻害
【表１３】
2021529175.tif 000021
【０１６６】
結論：分子レベルで、本発明の化合物ＩがＣＤＫ４／６に対して非常に強い阻害作用を示し、一方、ＣＤＫ１／２／７／９に対して阻害作用が極めて弱く、これで分かるように、化合物Ｉは極めて優れた選択性を有するＣＤＫ４／６キナーゼ阻害剤である。また、ＣＤＫ１／２／９とＣＤＫ４／６との間の化合物Ｉの選択性はＬＹ２８３５２１９（Ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ）の選択性よりも顕著に高い。
【０１６７】
実施例１０  ＪｅＫｏ−１異種移植腫瘍動物モデルの腫瘍抑制実験
２０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培養液に、ＪｅＫｏ−１細胞を培養した。対数増殖期のＪｅＫｏ−１細胞を集めて、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス皮下腫瘍接種に適した濃度までＰＢＳで再懸濁した。７０匹の雌マウスの右側に、ＰＢＳとｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）に再懸濁しているＪｅＫｏ−１細胞５×１０６個を皮下接種した。腫瘍の平均体積が１３４ｍｍ３になると、腫瘍のサイズに応じて無作為に群に分け、投与を開始した。そのうちの４８匹を実験群とし、残りの２２匹は群に分けた後の残りのマウスである。腫瘍体積の計算式：長径×短径２／２。実験において、溶媒対照群、試験薬の代表的な化合物Ｉ（１０ｍｇ／ｋｇ）、試験薬の代表的な化合物Ｉ（２５ｍｇ／ｋｇ）、試験薬の代表的な化合物Ｉ（５０ｍｇ／ｋｇ）、試験薬の代表的な化合物Ｉ（１００ｍｇ／ｋｇ）の合計６群に分けてから、各群８匹のマウスに毎日一回で強制経口投与し、連続に１９日投与した。相対的腫瘍増殖阻害率ＴＧＩに基づき、治療効果の評価を行い、結果を表１４に示された。
計算式：ＴＧＩ（％）＝（Ｃ−Ｔ）／Ｃ×１００％（ＣとＴは、それぞれ溶媒対照群の平均腫瘍重量と治療群の平均腫瘍重量を表す）。ＴＧＩ（％）が大きいほど、薬効がよいことを示し、逆も同様である。
【０１６８】
結果：化合物Ｉは良好な抗腫瘍活性を示した。
【０１６９】
ＪｅＫｏ−１異種移植腫瘍モデルに対する代表的な化合物Ｉの抗腫瘍薬効の評価
【表１４】
2021529175.tif 000022
注：ａ：ｐ値は、治療群と溶媒対照群の腫瘍の体積の比較分析結果である。
【図１】
2021529175.tif 000028
【図２】
2021529175.tif 000029
【図３】
2021529175.tif 000030
【図４】
2021529175.tif 000031
【図５】
2021529175.tif 000032
【図６】
2021529175.tif 000033
【図７】
2021529175.tif 000034
【図８】
2021529175.tif 000035
【図９】
2021529175.tif 000036
【図１０】
2021529175.tif 000037
【図１１】
2021529175.tif 000038
【図１２】
2021529175.tif 000039
【国際調査報告】
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2021529175.tif 000043
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