(57)【要約】  本開示は、細胞の拡大増殖を伴わない細胞療法における使用のために、T細胞、例えば初代CD4+T細胞および/またはCD8+T細胞を遺伝子操作する方法を提供する。特定の局面において、提供される方法は、代替の操作法、例えば、細胞の拡大増殖を伴う方法と比べて短縮された時間内でキメラ抗原受容体（CAR）を発現する、操作されたT細胞の組成物、例えば操作されたT細胞の集団を含む組成物を成功裏に生成する。特定の局面において、提供される方法は、細胞を刺激または活性化するプロセスが開始されたときから4日以内に、細胞療法における使用に適した操作されたT細胞の組成物を成功裏に生成する。いくつかの局面において、結果的に得られる操作された細胞組成物は、他の手段、例えば細胞の拡大増殖を伴う方法によって生成された操作されたT細胞組成物よりも低分化であり、疲弊が少なく、強力である細胞集団で構成されている。提供される方法によって生成されたT細胞の組成物および対象を治療するためのそれらの使用もまた、提供される。2021533746.tif 000045
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、
（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、T細胞を刺激するための条件下、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬を含む刺激試薬に曝露し、それにより、刺激された集団を生成する工程であって、該刺激試薬が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインと、1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを活性化することができる、工程；
（b）該刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程；
（c）該形質転換細胞の集団を最大96時間インキュベートする工程であって、任意で、インキュベーションが約37℃の温度で実施され、該インキュベーションが、1つまたは複数の組換えサイトカインを欠く基礎培地中で実施される、工程；および
（c）該インキュベーションの後、形質転換集団のT細胞を採取し、それにより、操作された細胞の組成物を製造する工程であって、採取が、該刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間の時点（両端の値を含む）で実施される、工程
を含み、
それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法。
【請求項２】
操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、
（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、T細胞を刺激するための条件下、刺激試薬に曝露し、それにより、刺激された集団を生成する工程；
（b）該刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程；および
（c）形質転換集団のT細胞を採取する工程であって、採取が、
（i）該刺激試薬への曝露が開始された後24〜120時間の時点（両端の値を含む）で；
（ii）組み込まれたベクターがゲノム中で検出された時点で、ただし、二倍体ゲノムあたりの安定な組み込まれたベクターコピー数（iVCN）を達成する前に；
（iii）採取時の生存細胞の総数が、該刺激された集団の全生存細胞の数の3倍、2倍、もしくは約3倍、約2倍、または同じもしくはほぼ同じとなる前の時点で；かつ/または
（iv）CD27+CCR7+のパーセンテージが、該集団中の全T細胞、該集団中の全CD3+T細胞、該集団中の全CD4+T細胞、または該集団中の全CD8+T細胞もしくはその組換えタンパク質発現細胞の中で、60％よりも高いまたは約60％よりも高い時点で
実施される、工程
を含み、
それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法。
【請求項３】
インプット組成物が少なくとも300×106個の生存初代T細胞を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
刺激試薬が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインと、1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを活性化することができる、請求項2または3記載の方法。
【請求項５】
操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、
（a）少なくとも300×106個の生存初代T細胞を含むインプット組成物を、T細胞を刺激するための条件下、刺激試薬に曝露し、それにより、刺激された集団を生成する工程であって、該刺激試薬が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインと、1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを活性化することができる、工程；
（b）該刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程；および
（c）形質転換集団のT細胞を採取する工程であって、採取が、
（i）該刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間の時点（両端の値を含む）で；
（ii）組み込まれたベクターが該形質転換集団のゲノム中で検出された時点で、ただし、二倍体ゲノムあたりの安定な組み込まれたベクターコピー数（iVCN）を達成する前に；
（iii）採取時の生存細胞の総数が、該刺激された集団の全生存細胞の数の3倍、2倍もしくは約3倍、約2倍または同じもしくはほぼ同じとなる前の時点で；かつ/または
（iv）ナイーブ様T細胞のパーセンテージが、該集団中の全T細胞、該集団中の全CD3+細胞、該集団中の全CD4+T細胞、または該集団中の全CD8+T細胞もしくはその組換えタンパク質発現細胞の中で、60％よりも高いまたは約60％よりも高い時点で
実施される、工程
を含み、
それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法。
【請求項６】
採取が、組み込まれたベクターがゲノム中で検出された時点で、ただし、二倍体ゲノムあたりの安定なiVCNを達成する前に実施される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
iVCNがピークに達し、24時間よりも長い期間、変化せずに留まったとき、または許容誤差の範囲内でしか変化しなかったとき、二倍体ゲノムあたりの安定なiVCNが達成される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
形質転換細胞の集団の二倍体ゲノム中の総ベクターコピー数（VCN）に対するiVCNの分率が平均で1.0もしくは約1.0である、またはその許容誤差の範囲内であるとき、二倍体ゲノムあたりの安定なiVCNが達成される、請求項6記載の方法。
【請求項９】
採取が、形質転換細胞の集団の総VCNに対する組み込まれたベクターコピー数（iVCN）の分率が平均で0.8未満である時点で実施される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、
（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、T細胞を刺激するための条件下、刺激試薬に曝露し、それにより、刺激された集団を生成する工程であって、該刺激試薬が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインと、1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを活性化することができる、工程；
（b）該刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程；および
（c）形質転換集団のT細胞を採取する工程であって、採取が、該刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間（両端の値を含む）で実施され、採取時、該形質転換細胞の集団の組み込まれたベクターコピー数（iVCN）が平均で、二倍体ゲノムあたり0.4コピー〜2.0コピーまたは約0.4コピー〜2.0コピー（両端の値を含む）である、工程
を含み、
それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法。
【請求項１１】
採取が、形質転換細胞の集団のiVCNが平均で二倍体ゲノムあたり2.0コピー未満または約2.0コピー未満である時点で実施される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、
（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、T細胞を刺激するための条件下、刺激試薬に曝露し、それにより、刺激された集団を生成する工程であって、該刺激試薬が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインと、1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを活性化することができる、工程；
（b）該刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程；および
（c）形質転換集団のT細胞を採取する工程であって、採取が、該刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間の時点（両端の値を含む）で実施され、採取時、ナイーブ様細胞および/またはセントラルメモリーT細胞のパーセンテージが、該集団中の全T細胞、該集団中の全CD4+T細胞、または該集団中の全CD8+T細胞もしくはその組換えタンパク質発現細胞の中で、60％よりも高いまたは約60％よりも高い、工程
を含み、
それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法。
【請求項１３】
採取時、
ナイーブ様T細胞のパーセンテージが、集団中の全組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、任意で、該集団中の全組換えタンパク質発現T細胞の中で65％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い、または約65％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い；
ナイーブ様T細胞のパーセンテージが、該集団中の全組換えタンパク質発現CD4+T細胞の中で40％よりも高いまたは約40％よりも高い、任意で、該集団中の全組換えタンパク質発現CD4+細胞の中で50％、60％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い、または約50％、60％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い；または
ナイーブ様T細胞のパーセンテージが、該集団中の全組換えタンパク質発現CD8+T細胞の中で40％よりも高いまたは約40％よりも高い、任意で、該集団中の全組換えタンパク質発現CD8+細胞の中で50％、60％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い、または約50％、60％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い、
請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
採取時、
ナイーブ様T細胞および/またはセントラルメモリーT細胞のパーセンテージが、集団中の全組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、任意で、該集団中の全組換えタンパク質発現T細胞の中で65％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い、または約65％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い；
ナイーブ様T細胞および/またはセントラルメモリーT細胞のパーセンテージが、該集団中の全組換えタンパク質発現CD4+T細胞の中で40％よりも高いまたは約40％よりも高い、任意で、該集団中の全組換えタンパク質発現CD4+細胞の中で50％、60％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い、または約50％、60％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い；または
ナイーブ様T細胞および/またはセントラルメモリーT細胞のパーセンテージが、該集団中の全組換えタンパク質発現CD8+T細胞の中で40％よりも高いまたは約40％よりも高い、任意で、該集団中の全組換えタンパク質発現CD8+細胞の中で50％、60％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い、または約50％、60％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い、
請求項12または13記載の方法。
【請求項１５】
導入の後かつ採取の前に、形質転換細胞の集団を最大96時間インキュベートする工程をさらに含み、
任意で、インキュベーションが約37℃の温度で実施される、
請求項2〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
導入の後、インキュベーションが最大72時間にわたり実施される、請求項1または15記載の方法。
【請求項１７】
導入の後、インキュベーションが最大48時間にわたり実施される、請求項1または15記載の方法。
【請求項１８】
導入の後、インキュベーションが最大24時間にわたり実施される、請求項1または15記載の方法。
【請求項１９】
インキュベーションが少なくとも18時間実施される、請求項1および15〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
採取が、刺激物質への曝露が開始された後96時間以内に実施される、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
採取が、刺激物質への曝露が開始された後72時間以内に実施される、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
採取が、刺激物質への曝露が開始された後48時間以内に実施される、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
（a）における曝露および（b）における導入の一方または両方が、1つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で実施される、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
（a）における曝露および（b）における導入が、1つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で実施される、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
インキュベーションが、1つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で実施される、請求項15〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
インキュベーションが、1つまたは複数の組換えサイトカインを欠く基礎培地中で実施される、請求項15〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
ナイーブ様T細胞、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞が、CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+、またはCD62L-CCR7+である、請求項5〜9および12〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
ナイーブ様T細胞がCD27+CCR7+細胞を含む、請求項5〜9および12〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
ナイーブ様T細胞がCCR7+CD45RA+T細胞を含む、請求項5〜9および12〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、
（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、1つまたは複数の組換えサイトカインの存在を含む、T細胞を刺激するための条件下、刺激試薬に曝露し、それにより、刺激された集団を生成する工程であって、該刺激試薬が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインと、1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを活性化することができる、工程；
（b）刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程であって、導入が、1つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で実施される、工程；
（c）該形質転換細胞の集団を、最大96時間インキュベートする工程であって、任意で、インキュベーションが約37℃の温度で実施され、該インキュベーションが、1つまたは複数の組換えサイトカインを欠く基礎培地中で実施される、工程；および
（c）該インキュベーションの後、形質転換集団のT細胞を採取し、それにより、操作された細胞の組成物を製造する工程であって、採取が、該刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間の時点（両端の値を含む）で実施される、工程
を含み、
それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法。
【請求項３１】
1つまたは複数の組換えサイトカインがヒトである、請求項1および23〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
1つまたは複数の組換えサイトカインが、組換えIL-2、組換えIL-7、および組換えIL-15、任意で、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7、および/または10〜200IU/mLの組換えIL-15から選択される、請求項1および23〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
1つまたは複数の組換えサイトカインが、組換えIL-2、組換えIL-7、および組換えIL-15、任意で、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7、および10〜200IU/mLの組換えIL-15であるか、またはそれらを含む、請求項1および23〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
（a）における曝露および（b）における導入の一方または両方が、無血清培地中で実施される、請求項1〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
（a）における曝露および（b）における導入が、無血清培地中で実施される、請求項1〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
刺激試薬が、
（i）TCR複合体のメンバーに特異的に結合し、任意でCD3に特異的に結合する主剤、および
（ii）T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤
を含み、
任意で、該共刺激分子が、CD28、CD137（4-1-BB）、OX40、またはICOSから選択される、
請求項1，6〜9、11、13、14、16〜24および32〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
刺激試薬が、
（i）TCR複合体のメンバーに特異的に結合し、任意でCD3に特異的に結合する主剤、および
（ii）T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤
を含み、
任意で、該共刺激分子が、CD28、CD137（4-1-BB）、OX40、またはICOSから選択される、
請求項2〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
主剤および副剤の一方または両方が抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項36または37記載の方法。
【請求項３９】
主剤および副剤が抗体を含み、任意で、刺激試薬が抗CD3抗体および抗CD28抗体またはそれらの抗原結合断片を含む、請求項36〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
主剤および副剤が、固体支持体の表面に存在するか、またはそれに付着している、請求項37〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
固体支持体が、ビーズであるか、またはビーズを含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
ビーズと細胞の比が3：1未満である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、
（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、（i）TCR複合体のメンバーに特異的に結合し、任意でCD3に特異的に結合する主剤と、（ii）T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤とが付着しているビーズを含む刺激試薬に曝露する工程であって、ビーズと細胞の比が3：1未満であり、曝露が、T細胞を刺激するための条件下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する、工程；
（b）該刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程；および
（c）形質転換集団のT細胞を採取する工程であって、採取が、該刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間の時点（両端の値を含む）で実施される、工程
を含み、
それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法。
【請求項４４】
ビーズと細胞の比が1：1または約1：1である、請求項41〜43記載の方法。
【請求項４５】
ビーズに、抗CD3抗体および抗CD28抗体またはそれらの抗原結合断片が付着している、請求項41〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
主剤および副剤が、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬の表面に可逆的に結合している、請求項36、38または39記載の方法。
【請求項４７】
操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、
（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬を含む刺激試薬に曝露する工程であって、該オリゴマー粒子試薬に、（i）TCR複合体のメンバーに特異的に結合し、任意でCD3に特異的に結合する主剤と、（ii）T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤とが可逆的に結合しており、曝露が、T細胞を刺激するための条件下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する、工程；
（b）該刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程；および
（c）該形質転換集団のT細胞を採取する工程であって、採取が、該刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間の時点（両端の値を含む）で実施される、工程
を含み、
それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法。
【請求項４８】
（a）における曝露が、インプット組成物中、細胞106個あたり0.1μg〜20μgまたは約0.1μg〜20μgである量（両端の値を含む）の刺激試薬を用いて実施される、請求項1、46または47記載の方法。
【請求項４９】
T細胞を含むインプット組成物を、該インプット組成物中、細胞106個あたり0.1μg〜20μgまたは約0.1μg〜20μgの量（両端の値を含む）の刺激試薬に曝露する工程であって、該刺激試薬が、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬を含み、曝露が、T細胞を刺激するための条件下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する、工程
を含む、T細胞を刺激する方法。
【請求項５０】
T細胞を含むインプット組成物を、該インプット組成物中、細胞106個あたり0.1μg〜2μgまたは約0.1μg〜2μgの量（両端の値を含む）の刺激試薬に曝露する工程であって、該刺激試薬が、（i）TCR複合体のメンバーに特異的に結合し、任意でCD3に特異的に結合する主剤と、（ii）T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤とが付着している複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬を含み、曝露が、T細胞を刺激するための条件下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する、工程
を含む、T細胞を刺激する方法。
【請求項５１】
インプット組成物が初代T細胞を含む、請求項49または50記載の方法。
【請求項５２】
刺激試薬の量が、インプット組成物中、細胞106個あたり0.1μg〜2μgまたは約0.1μg〜2μg（両端の値を含む）である、請求項48、49および51記載の方法。
【請求項５３】
導入の後かつ採取の前に、形質転換細胞の集団を最大96時間インキュベートする工程をさらに含み、
任意で、インキュベーションが約37℃の温度で実施される、
請求項43〜48および52のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
導入の後、インキュベーションが最大72時間にわたり実施される、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
導入の後、インキュベーションが最大48時間にわたり実施される、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
導入の後、インキュベーションが最大24時間にわたり実施される、請求項53記載の方法。
【請求項５７】
採取が、刺激物質へのインプット組成物の曝露が開始された後96時間以内に実施される、請求項43〜48および52〜56のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
採取が、刺激物質へのインプット組成物の曝露が開始された後72時間以内に実施される、請求項43〜48および52〜57のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
採取が、刺激物質へのインプット組成物の曝露が開始された後48時間以内に実施される、請求項43〜48および52〜58のいずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
（a）における曝露および（b）における導入の一方または両方が、1つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で実施される、請求項43〜48および52〜59のいずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
（a）における曝露および（b）における導入が、1つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で実施される、請求項43〜48および52〜59のいずれか一項記載の方法。
【請求項６２】
インキュベーションが、1つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で実施される、請求項43〜48および52〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項６３】
インキュベーションが、1つまたは複数の組換えサイトカインを欠く基礎培地中で実施される、請求項43〜48および52〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項６４】
操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、
（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、（i）TCR複合体のメンバーに特異的に結合し、任意でCD3に特異的に結合する主剤と、（ii）T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤とが付着しているビーズを含む刺激試薬に曝露する工程であって、ビーズと細胞の比が3：1未満であり、曝露が、1つまたは複数の組換えサイトカインの存在を含む、T細胞を刺激するための条件下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する工程；
（b）該刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程であって、導入が1つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で実施される、工程；
（c）該形質転換細胞の集団を最大96時間インキュベートする工程であって、任意で、インキュベーションが約37℃の温度で実施され、該インキュベーションが、1つまたは複数の組換えサイトカインを欠く基礎培地中で実施される、工程；および
（d）該インキュベーションの後、形質転換集団のT細胞を採取し、それにより、操作された細胞の組成物を製造する工程であって、採取が、該刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間の時点（両端の値を含む）で実施される、工程
を含み、
それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法。
【請求項６５】
操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、
（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬を含む刺激試薬に曝露する工程であって、該オリゴマー粒子試薬に、（i）TCR複合体のメンバーに特異的に結合し、任意でCD3に特異的に結合する主剤と、（ii）T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤とが付着しており、曝露が、1つまたは複数の組換えサイトカインの存在を含む、T細胞を刺激するための条件下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する、工程；
（b）該刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程であって、導入が1つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で実施される、工程；
（c）該形質転換細胞の集団を最大96時間インキュベートする工程であって、任意で、インキュベーションが約37℃の温度で実施され、該インキュベーションが、1つまたは複数の組換えサイトカインを欠く基礎培地中で実施される、工程；および
（d）該インキュベーションの後、形質転換集団のT細胞を採取し、それにより、操作された細胞の組成物を製造する工程であって、採取が、該刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間の時点（両端の値を含む）で実施される、工程
を含み、
それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法。
【請求項６６】
刺激試薬の量が、インプット組成物中、細胞106個あたり0.4μg〜8μgまたは約0.4μg〜8μg（両端の値を含む）である、請求項48〜63および65のいずれか一項記載の方法。
【請求項６７】
刺激試薬の量が、インプット組成物中、細胞106個あたり0.8μg〜4μgまたは約0.8μg〜4μg（両端の値を含む）である、請求項48〜63、65および66のいずれか一項記載の方法。
【請求項６８】
刺激試薬の量が、インプット組成物中、細胞106個あたり0.8μgまたは約0.8μgである、請求項48〜63および65〜67のいずれか一項記載の方法。
【請求項６９】
刺激試薬の量が、細胞106個あたり1.2μgまたは約1.2μgである、請求項48〜63および65〜68のいずれか一項記載の方法。
【請求項７０】
刺激試薬の量が、細胞106個あたり1.8μgまたは約1.8μgである、請求項48〜63および65〜68のいずれか一項記載の方法。
【請求項７１】
1つまたは複数の組換えサイトカインがヒトである、請求項60〜70のいずれか一項記載の方法。
【請求項７２】
1つまたは複数の組換えサイトカインが、組換えIL-2、組換えIL-7、および/または組換えIL-15、任意で、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7、および/または10〜200IU/mLの組換えIL-15から選択される、請求項60〜71のいずれか一項記載の方法。
【請求項７３】
1つまたは複数の組換えサイトカインが、組換えIL-2、組換えIL-7、および組換えIL-15、任意で、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7、および10〜200IU/mLの組換えIL-15であるか、またはそれらを含む、請求項60〜72のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
（a）における曝露および（b）における導入の一方または両方が、無血清培地中で実施される、請求項1〜48および52〜73のいずれか一項記載の方法。
【請求項７５】
（a）における曝露および（b）における導入が、無血清培地中で実施される、請求項1〜48および52〜74のいずれか一項記載の方法。
【請求項７６】
インキュベーションが無血清培地中で実施される、請求項1、15〜48および52〜75のいずれか一項記載の方法。
【請求項７７】
ビーズと細胞の比が2：1〜0.5：1または約2:1〜0.5:1である、請求項41〜45、53〜64および71〜76のいずれか一項記載の方法。
【請求項７８】
ビーズと細胞の比が1：1または約1：1である、請求項41〜45、53〜64および71〜77のいずれか一項記載の方法。
【請求項７９】
ビーズが、3.5μmよりも大きいまたは約3.5μmよりも大きいが、約9μm以下または約8μm以下または約7μm以下または約6μm以下または約5μm以下である直径を含む、請求項41〜45、53〜64および71〜78のいずれか一項記載の方法。
【請求項８０】
ビーズが4.5μmまたは約4.5μmの直径を含む、請求項41〜45、53〜64および71〜79のいずれか一項記載の方法。
【請求項８１】
ビーズが不活性である、請求項41〜45、53〜64および71〜80のいずれか一項記載の方法。
【請求項８２】
ビーズが、ポリスチレン表面であるか、またはそれを含む、請求項41〜45、53〜64および71〜81のいずれか一項記載の方法。
【請求項８３】
ビーズが常磁性または超常磁性である、請求項41〜45、53〜64および71〜82のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
インキュベーションの後またはインキュベーションの間のいずれかに細胞を磁場に曝露し、それにより、刺激試薬を該細胞から除去する工程
を、採取の前にさらに含む、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子が、ビオチン、アビジン、ビオチン類似体もしくはムテイン、アビジン類似体もしくはムテイン、および/またはそれらの生物学的に活性な断片に結合するか、または結合することができる、請求項1、46〜63および65〜76のいずれか一項記載の方法。
【請求項８６】
複数のストレプトアビジンムテイン分子それぞれが、SEQ ID NO: 61に記載されるアミノ酸の配列中のストレプトアビジン中の位置を基準にして位置44〜47に対応する配列位置にアミノ酸配列Va144-Thr45-Ala46-Arg47またはIle44-Gly45-Ala46-Arg47を含む、請求項1、46〜63、65〜76および85のいずれか一項記載の方法。
【請求項８７】
複数のストレプトアビジンムテイン分子それぞれが、
（a）SEQ ID NO: 62、63、68、75〜77、または80〜83のいずれかに記載されるアミノ酸の配列；
（b）SEQ ID NO: 62、63、68、75〜77、もしくは80〜83のいずれかと少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはより高い配列同一性を示し、かつVa144-Thr45-Ala46-Arg47もしくはIle44-Gly45-Ala46-Arg47に対応するアミノ酸配列を含み、かつ/またはビオチン、ビオチン類似体、もしくはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、アミノ酸の配列；または
（c）ビオチン、ビオチン類似体、もしくはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、（a）または（b）の機能的断片
を含む、請求項1、46〜63、65〜76、85および86のいずれか一項記載の方法。
【請求項８８】
複数のストレプトアビジンムテイン分子が、SEQ ID NO: 63または68に記載されるアミノ酸の配列を含む、請求項1、46〜63、65〜76および85〜87のいずれか一項記載の方法。
【請求項８９】
主剤および副剤がそれぞれストレプトアビジン結合ペプチドを含む、請求項46〜63、65〜76および85〜88のいずれか一項記載の方法。
【請求項９０】
ストレプトアビジン結合ペプチドが、
2021533746.tif 000043
からなる群より選択される、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
主剤および副剤の一方または両方が、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項46〜63、65〜76および85〜90のいずれか一項記載の方法。
【請求項９２】
1つまたは複数の前記剤が、一価の抗体断片であるか、またはそれを含む、請求項91記載の方法。
【請求項９３】
主剤および副剤の一方または両方が、Fabであるか、またはそれを含む、請求項91または92記載の方法。
【請求項９４】
オリゴマー粒子試薬が、
60nmよりも大きい、70nmよりも大きい、80nmよりも大きい、もしくは90nmよりも大きい半径、
50nm〜150nm、75nm〜125nm、80nm〜115nm、もしくは90nm〜110nmの半径（両端の値を含む）；または
90nm±15nmもしくは95nm±20〜25nmの半径
を含む、請求項1、46〜63、65〜76および85〜93のいずれか一項記載の方法。
【請求項９５】
オリゴマー粒子試薬が、
少なくとも5×107g/molもしくは少なくとも1×108g/mol；および/または
5×107g/mol〜5×108g/mol、1×108g/mol〜5×108g/mol、もしくは1×108g/mol〜2×108g/mol
の分子量を含む、請求項1、46〜63、65〜76および85〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項９６】
オリゴマー粒子試薬が、
少なくとも500のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体、少なくとも1,000のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体、少なくとも1,500のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体、または少なくとも2,000のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体；および/または
1,000〜20,000のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体、1,000〜10,000のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体、または2,000〜5,000のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体
を含む、請求項1、46〜63、65〜76および85〜88のいずれか一項記載の方法。
【請求項９７】
インキュベーションの少なくとも一部分の後または間のいずれかに、物質を細胞に加える工程をさらに含み、
該物質が、刺激試薬によるT細胞の刺激を終わらせるかまたは減らす、
請求項1、46〜63、65〜76および85〜96のいずれか一項記載の方法。
【請求項９８】
インキュベーションの少なくとも一部分の後または間のいずれかに、物質を細胞に加える工程をさらに含み、
該物質が、主剤および副剤とオリゴマー粒子試薬との間の結合を解消することができる、
請求項46〜63、65〜76および85〜97のいずれか一項記載の方法。
【請求項９９】
前記物質が、フリーの結合パートナーであり、かつ/または競合試薬である、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
前記物質の存在が、T細胞中で主剤および副剤によって誘導または変調されたシグナルを終結または減少させる、請求項98または99記載の方法。
【請求項１０１】
前記物質が、ストレプトアビジン結合ペプチド、ビオチンもしくは生物学的に活性な断片、またはビオチン類似体もしくは生物学的に活性な断片であるか、またはそれを含む、請求項97〜100のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０２】
前記物質が、ストレプトアビジン結合ペプチドであるか、またはそれを含み、該ストレプトアビジン結合ペプチドが、
2021533746.tif 000044
からなる群より選択される、請求項101記載の方法。
【請求項１０３】
前記物質が、ビオチンもしくは生物学的に活性な断片またはビオチン類似体もしくは生物学的に活性な断片であるか、またはそれを含む、請求項101記載の方法。
【請求項１０４】
前記物質が、オリゴマー粒子刺激試薬への曝露が開始された後42時間〜120時間または約42時間〜120時間（両端の値を含む）で加えられる、請求項97〜103のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０５】
前記物質が、オリゴマー粒子試薬への曝露が開始された後72時間〜96時間または約72時間〜96時間で加えられる、請求項97〜104のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０６】
前記物質が、オリゴマー粒子試薬への曝露が開始された後48時間または約48時間で加えられる、請求項97〜105のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０７】
前記物質が、オリゴマー粒子試薬への曝露が開始された後72時間または約72時間で加えられる、請求項97〜106のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０８】
前記物質が、オリゴマー粒子試薬への曝露が開始された後96時間または約96時間で加えられる、請求項97〜107のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０９】
前記物質が、インキュベーションの後かつ採取の前に加えられる、請求項97〜108のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１０】
前記物質が、インキュベーションの少なくとも一部分の間に加えられ、該インキュベーションが、該物質が加えられた後も継続する、請求項97〜109のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１１】
操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、
（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬を含む、細胞106個あたり0.2μg〜8μgまたは約0.2μg〜8μgの刺激試薬に曝露する工程であって、該オリゴマー粒子試薬に、（i）CD3に特異的に結合する主剤と、（ii）CD28に特異的に結合する副剤とが付着しており、曝露が、組換えIL-2、IL-7、およびIL-15を有する無血清培地の存在下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する、工程；
（b）該刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程であって、導入が、組換えIL-2、IL-7、およびIL-15を有する無血清培地の存在下で実施される、工程；
（c）該形質転換細胞の集団を、静的条件下、24時間〜96時間インキュベートする工程であって、任意で、インキュベーションが、約37℃の温度で、かつ該インキュベーションの少なくとも一部分の間、ビオチンもしくはその生物学的に活性な断片、任意でD-ビオチンまたはビオチン類似体もしくはその生物学的に活性な断片を含む物質を添加しながら実施される、工程；および
（d）該インキュベーションの後、形質転換集団のT細胞を採取し、それにより、操作された細胞の組成物を製造する工程であって、採取が、該刺激試薬への曝露が開始された後72〜96時間の時点（両端の値を含む）で実施される、工程
を含み、
それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法。
【請求項１１２】
インプット組成物が少なくとも300×106個の生存初代T細胞を含む、請求項1〜111のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１３】
インプット組成物が600×106個または約600×106個の生存初代T細胞を含む、請求項1〜112のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１４】
インプット組成物中の細胞の少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約96％、少なくとももしくは少なくとも約97％、少なくとももしくは少なくとも約98％、少なくとももしくは少なくとも約99％、約100％または100％がCD3+T細胞である、請求項1〜113のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１５】
前記組成物中の細胞の少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約96％、少なくとももしくは少なくとも約97％、少なくとももしくは少なくとも約98％、少なくとももしくは少なくとも約99％、約100％または100％がCD4+T細胞およびCD8+T細胞である、請求項1〜114のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１６】
インプット組成物が、1.5：1〜2.0：1のCD4+細胞とCD8+細胞の比を含む、請求項1〜115のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１７】
インプット組成物が、1.2：1〜0.8：1のCD4+細胞とCD8+細胞の比、任意で1：1または約1：1のCD4+T細胞とCD8+T細胞の比を含む、請求項1〜116のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１８】
操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、
（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬を含む、細胞106個あたり0.4μg〜8μgまたは約0.4μg〜8μgの刺激試薬に曝露する工程であって、該オリゴマー粒子試薬に、（i）CD3に特異的に結合する主剤と、（ii）CD28に特異的に結合する副剤とが付着しており、
該インプット組成物が、2：1〜1：2のCD4+T細胞とCD8+T細胞の比を含み、少なくとも300×106個のCD4+およびCD8+T細胞を含み、曝露が、組換えIL-2、IL-7、およびIL-15を含む無血清培地の存在下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する、工程；
（b）該刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程であって、導入が、組換えIL-2、IL-7、およびIL-15を有する無血清培地の存在下で実施される、工程；
（c）形質転換細胞の集団を、静的条件下、24時間〜72時間また約24時間〜72時間インキュベートする工程であって、任意で、インキュベーションが、約37℃の温度で、かつ、該インキュベーションの少なくとも一部分の間、ビオチンもしくはその生物学的に活性な断片、任意でD-ビオチンまたはビオチン類似体もしくはその生物学的に活性な断片を含む物質を添加しながら実施され、添加が、該刺激試薬への曝露が開始された後48〜72時間の時点（両端の値を含む）で実施される、工程；および
（d）該インキュベーションの後、形質転換集団のT細胞を採取し、それにより、操作された細胞の組成物を製造する工程であって、採取が、該刺激試薬への曝露が開始された後72〜96時間の時点（両端の値を含む）で実施される、工程
を含み、
それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法。
【請求項１１９】
前記物質が、刺激試薬への曝露が開始された後48時間または約48時間で加えられる、請求項111〜118のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２０】
前記物質が、刺激試薬への曝露が開始された後72時間または約72時間で加えられる、請求項111〜118のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２１】
前記物質が、刺激試薬への曝露が開始された後96時間または約96時間で加えられる、請求項111〜118のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２２】
操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、
（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、常磁性ビーズを含む刺激試薬に、2：1〜0.5：1または約2：1〜0.5：1のビーズと細胞の比で曝露する工程であって、該ビーズが、ポリスチレンコーティングおよび4.5μmまたは約4.5μmの直径を含む不活性常磁性ビーズであり、該ビーズに、（i）抗CD3抗体またはその抗原結合断片および抗CD28抗体またはその抗原結合断片が付着しており、該インプット組成物が、2：1〜1：2のCD4+T細胞とCD8+T細胞の比を含み、少なくとも300×106個のCD4+およびCD8+T細胞を含み、曝露が、組換えIL-2、IL-7、およびIL-15を含む無血清培地の存在下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する、工程；
（b）該刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程であって、導入が、組換えIL-2、IL-7、およびIL-15を有する無血清培地の存在下で実施される、工程；
（c）該形質転換細胞の集団を、静的条件下、48〜72時間（両端の値を含む）インキュベートする工程であって、任意で、インキュベーションが約37℃の温度で実施される、工程；
（d）該インキュベーションの後、該細胞を磁場に曝露して該刺激試薬を該細胞から除去し、次いで該T細胞を採取し、それにより、操作された細胞の組成物を製造する工程であって、採取が、該刺激試薬への曝露が開始された後72〜96時間の時点（両端の値を含む）で実施される、工程
を含み、
それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法。
【請求項１２３】
インキュベーションの少なくとも一部分が、組換えIL-2、IL-7、およびIL-15を含む無血清培地の存在下で実行される、請求項111〜122のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２４】
インキュベーションが、組換えサイトカインを欠く基礎培地中で実施される、請求項111〜123のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２５】
インプット組成物が、450×106個または約450×106個の生存初代T細胞、500×106個もしくは約500×106個の生存初代T細胞、550×106個もしくは約550×106個の生存初代T細胞、600×106個もしくは約600×106個の生存初代T細胞、700×106個もしくは約700×106個の生存初代T細胞、800×106個もしくは約800×106個の生存初代T細胞、900×106個もしくは約900×106個の生存初代T細胞、または1,000×106個もしくは約1,000×106個の生存初代T細胞、または前記のいずれかの間の任意の値を含む、請求項1〜124のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２６】
インプット組成物が少なくとも600×106個または少なくとも約600×106個の生存初代T細胞を含む、請求項1〜125のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２７】
インプット組成物が900×106個または最大900×106個の生存初代T細胞を含む、請求項1〜126のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２８】
インプット組成物が900×106個または約900×106個の生存初代T細胞を含む、請求項1〜125のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２９】
インキュベーションが、導入の後24時間または約24時間実施される、請求項44〜59、61〜69、81〜113、115および116のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３０】
インキュベーションが、導入の後48時間または約48時間実施される、請求項1および15〜129のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３１】
インキュベーションが、導入の後72時間または約72時間実施される、請求項1および15〜130のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３２】
刺激試薬への曝露の前に、生体試料からのCD3+T細胞またはCD4+T細胞および/またはCD8+T細胞を濃縮してインプット組成物を製造する工程を含む、請求項1〜131のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３３】
刺激試薬への曝露の前に、生体試料からのCD3+T細胞を濃縮してインプット組成物を製造する工程を含む、請求項1〜132のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３４】
濃縮が免疫親和性に基づく選択による、請求項132または133記載の方法。
【請求項１３５】
免疫親和性に基づく選択が、アフィニティークロマトグラフィーマトリックス上に固定されたまたはそれに付着した抗体と、細胞を接触させることによって実施され、該抗体が、細胞表面マーカーに特異的に結合して、CD3+細胞の陽性選択を実施することができる、請求項134記載の方法。
【請求項１３６】
刺激試薬への曝露の前に、生体試料からのCD4+またはCD8+T細胞を濃縮してインプット組成物を製造する工程を含む、請求項1〜132のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３７】
濃縮が、
（a）閉鎖系中で第一の選択を実行することであって、該第一の選択が、初代ヒトT細胞を含む試料からの（i）CD4+細胞および（ii）CD8+細胞の一方の濃縮を含み、それにより、該濃縮が第一の選択集団および非選択集団を生成する、前記実行すること；および
（b）閉鎖系中で第二の選択を実行することであって、該第二の選択が、該非選択集団からの（i）CD4+細胞および（ii）CD8+細胞の他方の濃縮を含み、それにより、該濃縮が第二の選択集団を生成し、該濃縮が、CD4+T細胞およびCD8+T細胞の別々の濃縮集団を製造する、前記実行すること
を含み、
該別々の濃縮集団がそれぞれ、該第一の選択集団または該第二の選択集団の一方からの細胞を含み、
インプット組成物が、CD4+T細胞の濃縮集団およびCD8+T細胞の濃縮集団の1つまたは複数からの細胞を含む、
請求項136記載の方法。
【請求項１３８】
CD4+T細胞およびCD8+T細胞の別々の濃縮集団が混合され、それにより、インプット組成物が製造される、請求項136または137記載の方法。
【請求項１３９】
混合が閉鎖系中で実行され、任意で、該閉鎖系が自動化されている、請求項138記載の方法。
【請求項１４０】
第一および/または第二の選択における細胞の濃縮が、細胞表面マーカーの発現に基づいて陽性選択または陰性選択を実行することを含む、請求項136〜139のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４１】
第一または第二の選択における細胞の濃縮が、細胞表面マーカーまたはCD4+もしくはCD8+細胞を濃縮するためのマーカーの発現に基づいて複数の陽性または陰性選択工程を実行することを含む、請求項136〜140のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４２】
第一および/または第二の選択における細胞の濃縮が、免疫親和性に基づく選択を含む、請求項136〜141のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４３】
第一および第二の選択における細胞の濃縮が免疫親和性に基づく選択を含む、請求項142記載の方法。
【請求項１４４】
免疫親和性に基づく選択が、アフィニティークロマトグラフィーマトリックス上に固定されたまたはそれに付着した抗体と、細胞を接触させることによって実施され、該抗体が、細胞表面マーカーに特異的に結合して、CD4+またはCD8+細胞の陽性または陰性選択を実施することができる、請求項142または143記載の方法。
【請求項１４５】
抗体が、マトリックス上に固定された結合試薬と可逆性結合を形成することができる1つまたは複数の結合パートナーをさらに含み、該抗体が、接触の間にクロマトグラフィーマトリックスに可逆的に結合し；
該マトリックス上で該抗体が特異的に結合する細胞表面マーカーを発現する細胞を、該結合試薬と該結合パートナーとの間の該可逆性結合の切断によって該マトリックスから回収することができる、
請求項135または144記載の方法。
【請求項１４６】
結合パートナーが、ビオチン、ビオチン類似体、および結合試薬に結合することができるペプチドの中から選択され；かつ
該結合試薬が、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン類似体またはムテイン、アビジン、およびアビジン類似体またはムテインの中から選択される、
請求項145記載の方法。
【請求項１４７】
結合パートナーが、SEQ ID NO:64に記載されるアミノ酸の配列を含む；かつ/または
結合試薬が、SEQ ID NO: 75、80、76または63に記載されるアミノ酸の配列を含むストレプトアビジンムテインである、
請求項145または146記載の方法。
【請求項１４８】
試料中の細胞をアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに接触させた後、競合試薬を加えて結合パートナーと結合試薬との間の結合を切断し、それにより、選択された細胞を該マトリックスから回収する工程をさらに含む、請求項145〜147のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４９】
競合試薬がビオチンまたはビオチン類似体である、請求項148記載の方法。
【請求項１５０】
1つまたは複数の選択における1つまたは複数の抗体が、3×10-5sec-1よりも大きいまたは約3×10-5sec-1よりも大きい、結合および細胞表面マーカーについての解離速度定数（koff）を有する、請求項135および144〜149のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５１】
1つまたは複数の選択における1つまたは複数の抗体が、約10-3〜10-7の範囲または約10-7〜約10-10の範囲の解離定数（Kd）である、細胞表面マーカーに対する親和性を有する、請求項135および144〜150のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５２】
クロマトグラフィーマトリックスが、カラムである分離用容器に詰められている、請求項135および144〜151のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５３】
生体試料からのCD4+またはCD8+T細胞の濃縮が、
（a）CD4+細胞の濃縮が、CD4の表面発現に基づく陽性選択を含み；
（b）CD8+細胞の濃縮が、CD8の表面発現に基づく陽性選択を含み；または
（a）と（b）の両方
を含む、請求項136〜152のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５４】
刺激試薬への曝露の前に、生体試料からのCD4+またはCD8+T細胞を濃縮する工程であって、濃縮が、試料の細胞を、インキュベーション組成物中でCD4に特異的に結合する第一の免疫親和性試薬およびインキュベーション組成物中でCD8に特異的に結合する第二の免疫親和性試薬と、該免疫親和性試薬が該試料中の細胞の表面上のCD4およびCD8分子にそれぞれ特異的に結合する条件下で接触させることを含む、工程；および
該第一および/または第二の免疫親和性試薬に結合した細胞を回収し、それにより、CD4+細胞およびCD8+細胞を含む濃縮組成物を生成する工程
を含み、
インプット組成物が、CD4+細胞およびCD8+細胞を含む濃縮組成物の細胞を含む、
請求項1〜153のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５５】
免疫親和性試薬それぞれが抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項154記載の方法。
【請求項１５６】
免疫親和性試薬がビーズの外側表面に固定されている、請求項154または155記載の方法。
【請求項１５７】
ビーズが磁気ビーズである、請求項156記載の方法。
【請求項１５８】
第一または第二の免疫親和性試薬に結合した細胞の回収が、細胞を磁場に曝露することを含む、請求項157記載の方法。
【請求項１５９】
生体試料が、対象、任意でヒト対象から得られた初代T細胞を含む、請求項132〜158のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６０】
生体試料が、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（PBMC）試料、未分画T細胞試料、リンパ球試料、白血球試料、アフェレーシス産物、もしくは白血球アフェレーシス産物であるか、またはそれを含む、請求項132〜159のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６１】
生体試料が、濃縮の前に事前にクライオ凍結されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物である、請求項132〜160のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６２】
採取が、刺激試薬への曝露が開始された後96時間または約96時間で実施される、請求項1〜48および52〜161のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６３】
採取が、刺激試薬への曝露が開始された後2日もしくは約2日または3日もしくは約3日で実施される、請求項1〜48および52〜161のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６４】
採取が、刺激試薬への曝露が開始された後72時間または約72時間で実施される、請求項1〜48および52〜161のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６５】
採取が、刺激試薬への曝露が開始された後48時間または約48時間で実施される、請求項1〜48および52〜161のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６６】
採取が、組み込まれたベクターがゲノム中で検出された時点で、ただし、二倍体ゲノムあたりの安定なiVCNを達成する前に実施される、請求項1および12〜165のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６７】
採取が、形質転換細胞の集団中の総VCNに対する組み込まれたベクターコピー数（iVCN）の分率が平均で0.8未満である時点で実施される、請求項1および12〜166のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６８】
採取が、形質転換細胞の集団のiVCNが平均で二倍体ゲノムあたり2.0コピー未満または約2.0コピー未満である時点で実施される、請求項1および12〜167のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６９】
細胞の採取が、細胞をすすぐまたは洗うことによって細胞デブリを除去することを含む、請求項1〜168のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７０】
ナイーブ様細胞のパーセンテージが、集団中の全T細胞、該集団中の全CD4+T細胞、または該集団中の全CD8+T細胞もしくはその組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い時点で、細胞が採取される、請求項1および30〜169のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７１】
ナイーブ様細胞および/またはセントラルメモリーT細胞のパーセンテージが、集団中の全T細胞、該集団中の全CD4+T細胞、または該集団中の全CD8+T細胞もしくはその組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い時点で、細胞が採取される、請求項1および30〜169のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７２】
採取時、
ナイーブ様T細胞のパーセンテージが、集団中の全組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、任意で、該集団中の全組換えタンパク質発現T細胞の中で65％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い、または約65％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い；
ナイーブ様T細胞のパーセンテージが、該集団中の全組換えタンパク質発現CD4+T細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、任意で、該集団中の全組換えタンパク質発現CD4+細胞の中で65％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い、または約65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高い；または
ナイーブ様T細胞のパーセンテージが、該集団中の全組換えタンパク質発現CD8+T細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、任意で、該集団中の全組換えタンパク質発現CD8+細胞の中で65％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い、または約65％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い、
請求項170または171記載の方法。
【請求項１７３】
採取時、
ナイーブ様T細胞および/またはセントラルメモリーT細胞のパーセンテージが、集団中の全組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、任意で、該集団中の全組換えタンパク質発現T細胞の中で65％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い、または約65％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い；
ナイーブ様T細胞および/またはセントラルメモリーT細胞のパーセンテージが、該集団中の全組換えタンパク質発現CD4+T細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、任意で、該集団中の全組換えタンパク質発現CD4+細胞の中で65％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い、または約65％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い；または
ナイーブ様T細胞および/またはセントラルメモリーT細胞のパーセンテージが、該集団中の全組換えタンパク質発現CD8+T細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、任意で、該集団中の全組換えタンパク質発現CD8+細胞の中で65％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い、または約65％、70％、80％、90％、もしくは95％よりも高い、
請求項171記載の方法。
【請求項１７４】
ナイーブ様T細胞、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞が、CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+、またはCD62L-CCR7+である、請求項170〜173のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７５】
ナイーブ様T細胞がCD27+CCR7+T細胞を含む、請求項170〜174のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７６】
ナイーブ様T細胞がCCR7+CD45RA+T細胞を含む、請求項170〜175のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７７】
操作された細胞の組成物の細胞を、凍結保存および/または対象への投与のために、任意で薬学的に許容される賦形剤の存在下で製剤化する工程をさらに含む、請求項1〜176のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７８】
操作された細胞の組成物の細胞が凍結保護物質の存在下で製剤化される、請求項177記載の方法。
【請求項１７９】
凍結保護物質がDMSOを含む、請求項178記載の方法。
【請求項１８０】
操作された細胞の組成物の細胞が、容器、任意でバイアルまたはバッグの中に製剤化される、請求項177〜179のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８１】
組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターがT細胞に導入される、請求項1〜180のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８２】
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項181記載の方法。
【請求項１８３】
ウイルスベクターがレンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、請求項180または181記載の方法。
【請求項１８４】
導入が形質導入アジュバントの存在下で実施される、請求項1〜183のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８５】
形質導入アジュバントが、硫酸プロタミン、任意で1μg/ml〜50μg/mlまたは約1μg/ml〜50μg/mlの硫酸プロタミン、フィブロネクチン由来形質導入アジュバントまたはRetroNectinである、請求項184記載の方法。
【請求項１８６】
組換えタンパク質が、
疾患、障害、または病気の細胞または組織と関連する、それに特異的である、かつ/またはその上に発現する、標的抗原に結合することができる、組換え受容体
である、請求項1〜185のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８７】
疾患、障害、または病気が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである、請求項186記載の方法。
【請求項１８８】
標的抗原が腫瘍抗原である、請求項187記載の方法。
【請求項１８９】
標的抗原が、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、別名CAIXまたはG250）、がん精巣抗原、がん精巣抗原1B（CTAG、別名NY-ESO-1およびLAGE-2）、がん胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、タイプIII上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；別名Fc受容体ホモログ5またはFCRH5）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp10O）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役型受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソセリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、がん胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、トロホブラスト糖タンパク質（TPBG、別名5T4）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1、別名TYRP1またはgp75）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2、別名ドーパクロムトートメラーゼ、ドーパクロムデルタイソメラーゼまたはDCT）、血管内皮細胞増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮細胞増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグと関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBV、もしくは他の病原体によって発現される分子の中から選択される、請求項186〜188のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９０】
組換えタンパク質が、機能的非TCR抗原受容体またはTCRもしくはその抗原結合断片であるか、またはそれを含む、請求項1〜48または52〜189のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９１】
組換えタンパク質がキメラ抗原受容体（CAR）である、請求項1〜48または52〜190のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９２】
無血清培地が、
基礎培地中0.5mM〜5mMのL-グルタミンのジペプチド形態；
0.5mM〜5mMのL-グルタミン；および
少なくとも1つのタンパク質
を含み、血清を含まない、請求項34〜42または74〜191のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９３】
1つまたは複数の組換えサイトカインを欠く基礎培地が、L-グルタミンを、任意で約0.5mM〜約5mMの濃度で、任意で約2mMの濃度で含む、請求項1および26〜192のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９４】
1つまたは複数の組換えサイトカインを欠く基礎培地が血清を含まない、請求項1および26〜191および193のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９５】
基礎培地が、アルブミン、インスリン、またはトランスフェリンの1つまたは複数、任意でヒトまたは組換えアルブミン、インスリン、またはトランスフェリンの1つまたは複数から選択される少なくとも1つのタンパク質を含む、請求項1、26〜191および193〜194のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９６】
請求項1〜195のいずれか一項記載の方法によって製造された治療用T細胞組成物。
【請求項１９７】
前記方法によって製造された複数の組成物における平均で、組成物中のT細胞の総数または該組成物中の組換えタンパク質を発現するT細胞の総数の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または少なくとも約50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または約50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％が、ナイーブ様T細胞であるか、またはナイーブ様細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞である、請求項196記載の治療用T細胞組成物。
【請求項１９８】
前記方法によって製造された複数の組成物における平均で、組成物中のT細胞の総数または該組成物中の組換えタンパク質を発現するT細胞の総数の少なくとも50％または少なくとも約50％または50％または約50％が、セントラルメモリーT細胞であるか、またはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞である、請求項196記載の治療用T細胞組成物。
【請求項１９９】
平均で、組成物中のT細胞の総数または該組成物中の組換えタンパク質を発現するT細胞の総数の少なくとも50％または少なくとも約50％または50％または約50％が、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞である、請求項196記載の治療用T細胞組成物。
【請求項２００】
ナイーブ様T細胞上に発現するマーカーが、CD45RA、CD27、CD28、およびCCR7からなる群より選択される、請求項197または199記載の治療用T細胞組成物。
【請求項２０１】
ナイーブ様T細胞、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞が、CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+、またはCD62L-CCR7+である、請求項197、199および200のいずれか一項記載の治療用T細胞組成物。
【請求項２０２】
ナイーブ様T細胞、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞が、CD27+CCR7+T細胞を含み、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも70％、80％、85％、または90％がCD27+CCR7+である、請求項197および199〜201のいずれか一項記載の治療用T細胞組成物。
【請求項２０３】
ナイーブ様T細胞、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞が、CD27+CCR7+T細胞を含み、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、または90％がCD27+CCR7+である、請求項197および199〜202のいずれか一項記載の治療用T細胞組成物。
【請求項２０４】
ナイーブ様T細胞、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞がCD27+CCR7+T細胞を含み、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、または90％がCD27+CCR7+であり、該組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、または90％がCD27+CCR7+である、請求項197および199〜203のいずれか一項記載の治療用T細胞組成物。
【請求項２０５】
組換え受容体を発現するCD4+T細胞および組換え受容体を発現するCD8+T細胞を含む、治療用T細胞組成物であって、
該組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、または90％がCD27+CCR7+であり、該組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、または90％がCD27+CCR7+である、
治療用T細胞組成物。
【請求項２０６】
前記組成物中の細胞の少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約96％、少なくとももしくは少なくとも約97％、少なくとももしくは少なくとも約98％、少なくとももしくは少なくとも約99％、約100％または100％がCD3+T細胞である、請求項196〜205のいずれか一項記載の治療用T細胞組成物。
【請求項２０７】
前記組成物中の細胞の少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約96％、少なくとももしくは少なくとも約97％、少なくとももしくは少なくとも約98％、少なくとももしくは少なくとも約99％、約100％または100％がCD4+T細胞およびCD8+T細胞である、請求項196〜206のいずれか一項記載の治療用T細胞組成物。
【請求項２０８】
前記組成物中の細胞の少なくとももしくは少なくとも約90％がCD4+T細胞およびCD8+T細胞であり、該組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとももしくは少なくとも約60％がCD27+CCR7+であり、該組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとももしくは少なくとも約60％がCD27+CCR7+である、請求項205〜207のいずれか一項記載の治療用T細胞組成物。
【請求項２０９】
前記組成物中のT細胞の総数または該組成物中の組換え受容体を発現するT細胞の総数の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または少なくとも約50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または約50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％が、CD27+CCR7+である、請求項205〜208のいずれか一項記載の治療用T細胞組成物。
【請求項２１０】
前記組成物中の受容体+/CD4+T細胞と受容体+/CD8+T細胞の比が、約1：3〜約3：1である、請求項197〜209のいずれか一項記載の治療用T細胞組成物。
【請求項２１１】
前記組成物中の受容体+/CD4+T細胞と受容体+/CD8+T細胞の比が、約1：2〜約2：1である、請求項196〜210のいずれか一項記載の治療用T細胞組成物。
【請求項２１２】
前記組成物中の受容体+/CD4+T細胞と受容体+/CD8+T細胞の比が、1：1または約1：1である、請求項196〜211のいずれか一項記載の治療用T細胞組成物。
【請求項２１３】
組換えタンパク質が、
疾患、障害、または病気の細胞または組織と関連する、それに特異的である、かつ/またはその上に発現する、標的タンパク質に結合することができる、組換え受容体
であるか、またはそれを含む、請求項196〜212のいずれか一項記載の治療用組成物。
【請求項２１４】
組換えタンパク質がキメラ抗原受容体（CAR）である、請求項196〜213のいずれか一項記載の治療用組成物。
【請求項２１５】
前記組成物中の生存T細胞の数が、25×106個もしくは約25×106個から、200×106個もしくは約200×106個であり、任意で、該組成物中の生存T細胞の数が、25×106個もしくは約25×106個から、100×106個もしくは約100×106個、25×106個もしくは約25×106個から、70×106個もしくは約70×106個、25×106個もしくは約25×106個から、50×106個もしくは約50×106個、50×106個もしくは約50×106個から、200×106個もしくは約200×106個、50×106個もしくは約50×106個から、100×106個もしくは約100×106個、50×106個もしくは約50×106個から、70×106個もしくは約70×106個、70×106個もしくは約70×106個から、200×106個もしくは約200×106個、70×106個もしくは約70×106個から、100×106個もしくは約100×106個、または100×106個もしくは約100×106個から、200×106個もしくは約200×106個（それぞれ両端の値を含む）である、請求項196〜214のいずれか一項記載の治療用組成物。
【請求項２１６】
前記組成物の量が、1.0mL〜10mL（両端の値を含む）、任意で2mLもしくは約2mL、3mLもしくは約3mL、4mLもしくは約4mL、5mLもしくは約5mL、6mLもしくは約6mL、7mLもしくは約7mL、8mLもしくは約8mL、9mLもしくは約9mL、または10mLもしくは約10mL、または前記のいずれかの間の任意の値である、請求項196〜215のいずれか一項記載の治療用組成物。
【請求項２１７】
請求項196〜216のいずれか一項記載の組成物と、該組成物を対象に投与するための指示書とを含む、製造物品。
【請求項２１８】
対象が疾患または病気を有し、任意で、組換え受容体が、該疾患または病気の細胞と関連するかまたはその上に発現もしくは存在する抗原を、特異的に認識するかまたはそれに特異的に結合する、請求項217記載の製造物品。
【請求項２１９】
疾患または病気を有するかまたは有することが疑われる対象を治療する方法であって、該対象に対し、請求項196〜216のいずれか一項記載の組成物からのT細胞のある用量を投与する工程を含む、方法。
【請求項２２０】
T細胞の前記用量が、1×104個〜50×106個または約1×104個〜50×106個（両端の値を含む）のT細胞を含む、請求項219記載の方法。
【請求項２２１】
T細胞の前記用量のT細胞が、全T細胞、全生存T細胞、全生存組換え受容体発現T細胞、全生存組換え受容体発現CD4+T細胞、または全生存組換え受容体発現CD8+T細胞である、請求項219または220記載の方法。
【請求項２２２】
疾患または病気ががんである、請求項219〜221のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２３】
疾患または病気を有する対象を治療する方法における使用のための組成物であって、任意で該疾患または病気ががんである、請求項196〜216のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２２４】
疾患または病気を有する対象を治療するための医薬の製造のための使用であって、任意で該疾患または病気ががんである、請求項196〜216のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項２２５】
前記組成物の細胞が、疾患または病気の細胞と関連するかまたはその上に発現もしくは存在する抗原を特異的に認識するかまたはそれに特異的に結合する組換え受容体を発現し、任意で、該組換え受容体がキメラ抗原受容体である、請求項223の使用のための組成物または224記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2018年8月9日に出願された「Processes for Generating Engineered Cells and Compositions Thereof」と題する米国仮出願第62/716,981号；2018年10月5日に出願された「Processes for Generating Engineered Cells and Compositions Thereof」と題する米国仮出願第62/742,249号；2019年1月29日に出願された「Processes for Generating Engineered Cells and Compositions Thereof」と題する米国仮出願第62/798,433号；2019年5月2日に出願された「Processes for Generating Engineered Cells and Compositions Thereof」と題する米国仮出願第62/842,402号；および2019年6月13日に出願された「Processes for Generating Engineered Cells and Compositions Thereof」と題する米国仮出願第62/861,308号からの優先権を主張する。これらの内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表の参照による組み込み
本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は、2019年8月5日に作成された735042017440SeqList.txtと題するファイルとして提供され、そのサイズは93,105バイトである。配列表の電子形式の情報が全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
分野
本開示は、細胞の拡大増殖を伴わない細胞療法における使用のために、T細胞、例えば初代CD4+T細胞および/またはCD8+T細胞を遺伝子操作する方法を提供する。特定の局面において、提供される方法は、代替の操作法、例えば、細胞の拡大増殖を伴う方法と比べて短縮された時間内でキメラ抗原受容体（CAR）を発現する、操作されたT細胞の組成物、例えば操作されたT細胞の集団を成功裏に生成する。特定の局面において、提供される方法は、細胞を刺激または活性化するプロセスが開始されたときから4日以内に、細胞療法における使用に適した操作されたT細胞の組成物を成功裏に生成する。いくつかの局面において、結果的に得られる操作された細胞組成物は、他の手段、例えば細胞の拡大増殖を伴う方法によって生成された操作されたT細胞組成物よりも低分化であり、疲弊が少なく、強力である細胞集団で構成されている。同じく提供されるものは、提供される方法によって生成されたT細胞の組成物および対象を治療するためのそれらの使用である。
【背景技術】
【０００４】
背景
様々な細胞療法が疾患および病気の治療に利用可能である。細胞療法としては、組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体で遺伝子操作された免疫細胞、例えばT細胞を伴う方法がある。しかし、場合によっては、遺伝子操作された細胞組成物を生成するための既存の方法のいくつかは、時間を労したり、成功裏に完了するために必要な時間が異なったりすることがある。特定の場合、既存の方法のいくつかは、細胞集団がインビボで低い効能または持続性しか有しない組成物を生じさせることもある。そのような細胞療法を製造および/または操作するための改善された方法が、より効率的な方法および/または改善された細胞組成物製品を提供することを含め、必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本明細書に提供されるものは、操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、T細胞を刺激するための条件下、刺激試薬に曝露し、それにより、刺激された集団を生成する工程；（b）刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程；および（c）形質転換集団のT細胞を採取する工程であって、採取が、（i）刺激試薬への曝露が開始された後24〜120時間または1日〜5日もしくは約1日〜約5日の時点（両端の値を含む）で；（ii）組み込まれたベクターがゲノム中で検出された時点で、ただし、二倍体ゲノムあたりの安定な組み込まれたベクターコピー数（iVCN）を達成する前に；（iii）採取時の生存細胞の総数が、刺激された集団の全生存細胞の数の3倍、2倍もしくは約3倍、約2倍または同じもしくはほぼ同じである前の時点で；かつ/または（iv）CD27+CCR7+のパーセンテージが、集団中の全T細胞、集団中の全CD3+T細胞、集団中の全CD4+T細胞または集団中の全CD8+T細胞もしくはその組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い時点で実施される、工程を含み；それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法である。
【０００６】
いくつかの態様において、インプット組成物は少なくとも300×106個の生存初代T細胞を含む。特定の態様において、刺激試薬は、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインと、1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを活性化することができる。
【０００７】
本明細書に提供されるものは、操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、（a）少なくとも300×106個の生存初代T細胞を含むインプット組成物を、T細胞を刺激するための条件下、刺激試薬に曝露し、それにより、刺激された集団を生成する工程であって、刺激試薬が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインと、1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを活性化することができる、工程；（b）刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程；および（c）形質転換集団のT細胞を採取する工程であって、採取が、（i）刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間または2日〜5日もしくは約2日〜約5日の時点（両端の値を含む）で；（ii）組み込まれたベクターがゲノム中で検出された時点で、ただし、二倍体ゲノムあたりの安定な組み込まれたベクターコピー数（iVCN）を達成する前に；（iii）採取時の生存細胞の総数が、刺激された集団の全生存細胞の数の3倍、2倍もしくは約3倍、約2倍または同じもしくはほぼ同じである前の時点で；かつ/または（iv）ナイーブ様T細胞のパーセンテージが、集団中の全T細胞、集団中の全CD3+細胞、集団中の全CD4+T細胞または集団中の全CD8+T細胞もしくはその組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い時点で実施される、工程を含み；それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法である。
【０００８】
いくつかの態様において、採取は、組み込まれたベクターがゲノム中で検出された時点で、ただし、二倍体ゲノムあたりの安定なiVCNを達成する前に実施される。特定の態様において、二倍体ゲノムあたりの安定なiVCNは、iVCNがピークに達し、24時間もしくは1日よりも長い期間または約24時間もしくは約1日よりも長い期間、変化せずに留まったとき、または許容誤差の範囲内でしか変化しなかったとき、達成される。。特定の態様において、二倍体ゲノムあたりの安定なiVCNは、形質転換細胞の集団の二倍体ゲノム中の総ベクターコピー数（VCN）に対するiVCNの分率が平均で1.0もしくは約1.0である、またはその許容誤差の範囲内であるとき、達成される。いくつかの態様において、採取は、形質転換細胞の集団中の総VCNに対する組み込まれたベクターコピー数（iVCN）の分率が平均で0.8未満であるとき、実施される。
【０００９】
いくつかの態様において、T細胞は、ナイーブ様T細胞のパーセンテージが、集団中の全T細胞、集団中の全CD3+細胞、集団中の全CD4+T細胞または集団中の全CD8+T細胞もしくはその組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い時点で、採取される。特定の態様において、ナイーブ様T細胞はCD27+CCR7+T細胞を含む。
【００１０】
本明細書に提供されるものは、操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、T細胞を刺激するための条件下、刺激試薬に曝露し、それにより、刺激された集団を生成する工程であって、刺激試薬が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインと、1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを活性化することができる、工程；（b）刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程；および（c）形質転換集団のT細胞を採取する工程であって、採取が、刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間または2日〜5日もしくは約2日〜約5日の時点（両端の値を含む）で実施され、採取時、形質転換細胞の集団の組み込まれたベクターコピー数（iVCN）が平均で二倍体ゲノムあたり0.4コピー〜2.0コピーまたは二倍体ゲノムあたり約0.4コピー〜2.0コピーである、工程を含み；それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法である。
【００１１】
いくつかの態様において、採取は、形質転換細胞の集団のiVCNが平均で二倍体ゲノムあたり2.0コピー未満または約2.0コピー未満である時点で実施される。特定の態様において、採取は、形質転換細胞の集団のiVCNが平均で二倍体ゲノムあたり1.5コピー未満または約1.5コピー未満である時点で実施される。特定の態様において、採取は、形質転換細胞の集団のiVCNが平均で二倍体ゲノムあたり1.0コピー未満または約1.0コピー未満である時点で実施される。いくつかの態様において、採取は、形質転換細胞の集団のiVCNが平均で二倍体ゲノムあたり0.75コピー未満または約0.75コピー未満である時点で実施される。特定の態様において、採取は、形質転換細胞の集団のiVCNが平均で二倍体ゲノムあたり0.5コピー未満または約0.5コピー未満である時点で実施される。
【００１２】
本明細書に提供されるものは、操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、T細胞を刺激するための条件下、刺激試薬に曝露し、それにより、刺激された集団を生成する工程であって、刺激試薬が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインと、1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを活性化することができる、工程；（b）刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程；および（c）形質転換集団のT細胞を採取する工程であって、採取が、刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間（両端の値を含む）または2日〜5日もしくは約2日〜約5日の時点（両端の値を含む）で実施され、採取時、ナイーブ様細胞のパーセンテージが、集団中の全T細胞、集団中の全CD4+T細胞または集団中の全CD8+T細胞もしくはその組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、工程を含み；それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法である。
【００１３】
いくつかの態様において、提供される方法における採取時、セントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、集団中の全T細胞、集団中の全CD4+T細胞または集団中の全CD8+T細胞もしくはその組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い。特定の態様において、セントラルメモリーT細胞はCCR7+CD45RA-である。
【００１４】
本明細書に提供されるものは、操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、T細胞を刺激するための条件下、刺激試薬に曝露し、それにより、刺激された集団を生成する工程であって、刺激試薬が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインと、1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを活性化することができる、工程；（b）刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程；および（c）形質転換集団のT細胞を採取する工程であって、採取が、刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間（両端の値を含む）または2日〜5日もしくは約2日〜約5日の時点（両端の値を含む）で実施され、採取時、ナイーブ様細胞および/またはセントラルメモリー細胞のパーセンテージが、集団中の全T細胞、集団中の全CD4+T細胞または集団中の全CD8+T細胞もしくはその組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、工程を含み；それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法である。
【００１５】
いくつかの態様において、採取時、ナイーブ様T細胞のパーセンテージは、集団中の全組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、例えば、集団中の全組換えタンパク質発現T細胞の中で65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高いまたは約65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高い。いくつかの態様において、採取時、ナイーブ様T細胞のパーセンテージは、集団中の全組換えタンパク質発現CD4+T細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、例えば、集団中の全組換えタンパク質発現CD4+細胞の中で65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高いまたは約65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高い。いくつかの態様において、採取時、ナイーブ様T細胞のパーセンテージは、集団中の全組換えタンパク質発現CD8+T細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、例えば、集団中の全組換えタンパク質発現CD8+細胞の中で65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高いまたは約65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高い。いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞は、CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+、またはCD62L-CCR7+である。いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞はCCR7+CD45RA+を含む。特定の態様において、ナイーブ様T細胞はCD27+CCR7+細胞を含む。
【００１６】
いくつかの態様において、採取時、CD27+CCR7+のパーセンテージは、集団中の全組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、例えば、集団中の全組換えタンパク質発現T細胞の中で65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高いまたは約65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高い。いくつかの態様において、採取時、CD27+CCR7+のパーセンテージは、集団中の全組換えタンパク質発現CD4+T細胞の中で40％よりも高いまたは約40％よりも高い、例えば、集団中の全組換えタンパク質発現CD4+細胞の中で50％、60％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高いまたは約50％、60％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高い。いくつかの態様において、採取時、CD27+CCR7+のパーセンテージは、集団中の全組換えタンパク質発現CD8+T細胞の中で40％よりも高いまたは約40％よりも高い、例えば、集団中の全組換えタンパク質発現CD8+細胞の中で50％、60％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高いまたは約50％、60％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高い。
【００１７】
いくつかの態様において、採取時、ナイーブ様T細胞および/またはセントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、集団中の全組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、例えば、集団中の全組換えタンパク質発現T細胞の中で65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高いまたは約65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高い。いくつかの態様において、採取時、ナイーブ様T細胞および/またはセントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、集団中の全組換えタンパク質発現CD4+T細胞の中で40％よりも高いまたは約40％よりも高い、例えば、集団中の全組換えタンパク質発現CD4+細胞の中で50％、60％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高いまたは約50％、60％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高い。いくつかの態様において、採取時、ナイーブ様T細胞および/またはセントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、集団中の全組換えタンパク質発現CD8+T細胞の中で40％よりも高いまたは約40％よりも高い、例えば、集団中の全組換えタンパク質発現CD8+細胞の中で50％、60％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高いまたは約50％、60％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高い。いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞は、CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+、またはCD62L-CCR7+である。いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞はCCR7+CD45RA+を含む。特定の態様において、ナイーブ様T細胞はCD27+CCR7+細胞を含む。特定の態様において、セントラルメモリーT細胞はCCR7+CD45RA-である。
【００１８】
いくつかの態様において、導入の後かつ採取の前に、方法はさらに、形質転換細胞の集団を最大96時間または最大4日にわたりインキュベートする工程を含む。特定の態様において、インキュベーションは約37℃の温度で実施される。特定の態様において、インキュベーションは導入の後、最大72時間または最大3日にわたり実施される。特定の態様において、インキュベーションは導入の後、最大48時間または最大2日にわたり実施される。いくつかの態様において、インキュベーションは導入の後、最大24時間または最大1日にわたり実施される。特定の態様において、インキュベーションは少なくとも18時間実施される。特定の態様において、インキュベーションは静的条件下で実行される。特定の態様において、静的条件は、遠心分離、振とう、回転、揺動または灌流、例えば連続的または半連続的な培地の灌流を含まない条件である。
【００１９】
特定の態様において、採取は、刺激物質への曝露が開始された後96時間または4日以内に実施される。いくつかの態様において、採取は、刺激物質への曝露が開始された後72時間または3日以内に実施される。特定の態様において、採取は、刺激物質への曝露が開始された後48時間または2日以内に実施される。
【００２０】
特定の態様において、曝露および導入の一方または両方は1つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で実施される。いくつかの態様において、インキュベーションは1つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で実施される。特定の態様において、インキュベーションは、1つまたは複数の組換えサイトカインを欠く基礎培地中で実施される。
【００２１】
本明細書に提供されるものは、操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、1つまたは複数のサイトカインの存在を含む、T細胞を刺激するための条件下、刺激試薬に曝露し、それにより、刺激された集団を生成する工程であって、刺激試薬が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインと、1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを活性化することができる、工程；（b）刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程であって、導入が、1つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で実施される、工程；（c）形質転換細胞の集団を最大96時間または最大4日にわたりインキュベートする工程であって、インキュベーションが約37℃の温度で実施され、インキュベーションが、1つまたは複数の組換えサイトカインを欠く基礎培地中で実施される、工程；および（c）インキュベーションの後、形質転換集団のT細胞を採取し、それにより、操作された細胞の組成物を製造する工程であって、採取が、刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間または2日〜5日の時点（両端の値を含む）で実施される、工程を含み；それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法である。
【００２２】
いくつかの態様において、1つまたは複数の組換えサイトカインはヒトである。特定の態様において、1つまたは複数の組換えサイトカインは組換えIL-2、組換えIL-7および組換えIL-15から選択される。特定の態様において、1つまたは複数の組換えサイトカインは、10〜200IU/mLの組換えIL-2；100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7；および/または10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む。特定の態様において、1つまたは複数の組換えサイトカインは、組換えIL-2、組換えIL-7および組換えIL-15である、またはそれらを含む。例えば、場合によっては、1つまたは複数の組換えサイトカインは、10〜200IU/mLの組換えIL-2；100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7；および10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む。
【００２３】
いくつかの態様において、曝露および導入の一方または両方は無血清培地中で実施される。
【００２４】
特定の態様において、刺激試薬は、（i）TCRのメンバーに特異的に結合し、任意でCD3に特異的に結合する主剤と、（ii）T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤とを含み、任意で、共刺激分子はCD28、CD137（4-1-BB）、OX40またはICOSから選択される。特定の態様において、一次および副剤の一方または両方は抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、主剤および副剤は抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の態様において、刺激試薬は抗CD3抗体および抗CD28抗体を含む。
【００２５】
いくつかの態様において、主剤および副剤は、固体支持体の表面に存在する、またはそれに付着している。特定の態様において、固体支持体は、ビーズである、またはビーズを含む。特定の態様において、ビーズ：細胞の比は3：1未満である。
【００２６】
本明細書に提供されるものは、操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、（i）TCR複合体のメンバーに特異的に結合し、任意でCD3に特異的に結合する主剤と、（ii）T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤とが付着しているビーズを含む刺激試薬に曝露する工程であって、ビーズ：細胞の比が3：1未満であり、曝露が、T細胞を刺激するための条件下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する、工程；（b）刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程；および（c）形質転換集団のT細胞を採取する工程であって、採取が、刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間または2日〜5日の時点（両端の値を含む）で実施される、工程を含み；それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法である。
【００２７】
いくつかの態様において、ビーズ：細胞の比は1：1または約1：1である。特定の態様において、ビーズに、抗CD3抗体および抗CD28抗体またはそれらの抗原結合断片が付着している。
【００２８】
特定の態様において、主剤および副剤は、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬の表面に可逆的に結合している。
【００２９】
本明細書に提供されるものは、操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬を含む刺激試薬に曝露する工程であって、オリゴマー粒子試薬が、（i）TCR複合体のメンバーに特異的に結合し、任意でCD3に特異的に結合する主剤と、（ii）T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤とを可逆的に結合させて有し、曝露が、T細胞を刺激するための条件下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する、工程；（b）刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程；および（c）形質転換集団のT細胞を採取する工程であって、採取が、刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間または2日〜5日の時点（両端の値を含む）で実施される、工程を含み；それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法である。
【００３０】
いくつかの態様において、曝露は、インプット組成物中、細胞106個あたり0.1μg〜20μgまたは約0.1μg〜20μgである量（両端の値を含む）の刺激試薬、例えば複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬を用いて実施される。
【００３１】
本明細書に提供されるものは、T細胞を刺激する方法であって、T細胞を含むインプット組成物を、インプット組成物中、細胞106個あたり0.1μg〜20μgまたは約0.1μg〜20μgの量（両端の値を含む）の刺激試薬に曝露する工程であって、該刺激試薬が、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬を含み、曝露が、T細胞を刺激するための条件下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する、工程を含む方法である。いくつかの態様において、インプット組成物は初代T細胞を含む。
【００３２】
本明細書に提供されるものは、T細胞を刺激する方法であって、T細胞を含むインプット組成物を、インプット組成物中、細胞106個あたり0.1μg〜20μgまたは約0.1μg〜20μgの量（両端の値を含む）の刺激試薬に曝露する工程であって、該刺激試薬が、（i）TCR複合体のメンバーに特異的に結合し、任意でCD3に特異的に結合する主剤と、（ii）T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤とが付着している複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬を含み、曝露が、T細胞を刺激するための条件下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する、工程を含む方法である。いくつかの態様において、インプット組成物は初代T細胞を含む。
【００３３】
いくつかの態様において、導入の後かつ採取の前に、方法はさらに、形質転換細胞の集団を最大96時間または最大4日にわたりインキュベートする工程を含む。いくつかの態様において、インキュベーションは約37℃の温度で実施される。特定の態様において、インキュベーションは導入の後、最大72時間または最大3日にわたり実施される。特定の態様において、インキュベーションは導入の後、最大48時間または最大2日にわたり実施される。いくつかの態様において、インキュベーションは導入の後、最大24時間または最大1日にわたり実施される。特定の態様において、インキュベーションは静的条件下で実行される。特定の態様において、静的条件は、遠心分離、振とう、回転、揺動または灌流、例えば連続的または半連続的な培地の灌流を含まない条件である。
【００３４】
特定の態様において、採取は、刺激物質へのインプット組成物の曝露が開始された後96時間または4日以内に実施される。特定の態様において、採取は、刺激物質へのインプット組成物の曝露が開始された後72時間または3日以内に実施される。いくつかの態様において、採取は、刺激物質へのインプット組成物の曝露が開始された後48時間または2日以内に実施される。
【００３５】
特定の態様において、曝露および導入の一方または両方は1つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で実施される。
【００３６】
いくつかの態様において、インキュベーションは1つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で実施される。特定の態様において、インキュベーションは、1つまたは複数の組換えサイトカインを欠く基礎培地中で実施される。
【００３７】
本明細書に提供されるものは、操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、（i）TCR複合体のメンバーに特異的に結合し、任意でCD3に特異的に結合する主剤と、（ii）T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤とが付着しているビーズを含む刺激試薬に曝露する工程であって、ビーズ：細胞の比が3：1未満であり、曝露が、1つまたは複数の組換えサイトカインの存在を含む、T細胞を刺激するための条件下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する工程；（b）刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程であって、導入が1つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で実施される、工程；（c）形質転換細胞の集団を最大96時間または最大4日にわたりインキュベートする工程であって、任意で、インキュベーションが約37℃の温度で実施され、インキュベーションが、1つまたは複数の組換えサイトカインを欠く基礎培地中で実施される、工程；および（d）インキュベーションの後、形質転換集団のT細胞を採取し、それにより、操作された細胞の組成物を製造する工程であって、採取が、刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間または2日〜5日の時点（両端の値を含む）で実施される、工程を含み；それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法である。
【００３８】
本明細書に提供されるものは、操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬を含む刺激試薬に曝露する工程であって、オリゴマー粒子試薬に、（i）TCR複合体のメンバーに特異的に結合し、任意でCD3に特異的に結合する主剤と、（ii）T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤とが付着しており、曝露が、1つまたは複数の組換えサイトカインの存在を含む、T細胞を刺激するための条件下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する工程；（b）刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程であって、導入が1つまたは複数の組換えサイトカインの存在下で実施される、工程；（c）形質転換細胞の集団を最大96時間または最大4日にわたりインキュベートする工程であって、任意で、インキュベーションが約37℃の温度で実施され、インキュベーションが、1つまたは複数の組換えサイトカインを欠く基礎培地中で実施される、工程；および（d）インキュベーションの後、形質転換集団のT細胞を採取し、それにより、操作された細胞の組成物を製造する工程であって、採取が、刺激試薬への曝露が開始された後48〜120時間または2日〜5日の時点（両端の値を含む）で実施される、工程を含み；それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法である。
【００３９】
いくつかの態様において、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子刺激試薬への曝露は、インプット組成物中、細胞106個あたり0.4μg〜8μgまたは約0.4μg〜8μgである量（両端の値を含む）の刺激試薬を用いて実施される。特定の態様において、曝露は、インプット組成物中、細胞106個あたり0.8μg〜4μgまたは約0.8μg〜4μgである量（両端の値を含む）の刺激試薬を用いて実施される。特定の態様において、曝露は、インプット組成物中、細胞106個あたり0.8μgまたは約0.8μgである量の刺激試薬を用いて実施される。
【００４０】
いくつかの態様において、1つまたは複数の組換えサイトカインはヒトである。いくつかの態様において、1つまたは複数の組換えサイトカインは組換えIL-2、組換えIL-7および/または組換えIL-15から選択される。例えば、場合によっては、1つまたは複数の組換えサイトカインは、10〜200IU/mLの組換えIL-2；100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7；および/または10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む。特定の態様において、1つまたは複数の組換えサイトカインは、組換えIL-2、組換えIL-7および組換えIL-15である、またはそれらを含む。例えば、場合によっては、1つまたは複数の組換えサイトカインは、10〜200IU/mLの組換えIL-2；100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7；および10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む。特定の態様において、曝露および導入の一方または両方は無血清培地中で実施される。いくつかの態様において、インキュベーションは無血清培地中で実施される。
【００４１】
特定の態様において、刺激試薬は、主剤および副剤、例えば抗CD3および抗CD28抗体またはそれらの抗原結合断片が、ビーズの表面に存在する、またはそれに付着している刺激試薬である。特定の態様において、ビーズ：細胞の比は2：1〜0.5：1または約2:1〜0.5:1である。特定の態様において、ビーズ：細胞の比は1：1または約1：1である。いくつかの態様において、ビーズは、3.5μmよりも大きいまたは約3.5μmよりも大きく、かつ約9μm以下または約8μm以下または約7μm以下または約6μm以下または約5μm以下の直径を含む。特定の態様において、ビーズは4.5μmまたは約4.5μmの直径を含む。いくつかの態様において、ビーズは不活性である。特定の態様において、ビーズは、ポリスチレン表面である、またはそれを含む。いくつかの態様において、ビーズは常磁性または超常磁性である。例えば、場合によっては、ビーズは、磁場に引き寄せられるビーズである。いくつかの態様において、採取の前に、方法はさらに、インキュベーションの後または間に細胞を磁場に曝露し、それにより、刺激試薬を細胞から除去する工程を含む。
【００４２】
いくつかの態様において、刺激試薬は、主剤および副剤、例えば抗CD3および抗CD28抗体またはそれらの抗原結合断片が、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬に可逆的に結合している刺激試薬である。特定の態様において、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子は、ビオチン、アビジン、ビオチン類似体もしくはムテイン、アビジン類似体もしくはムテインおよび/またはそれらの生物学的に活性な断片に結合する、または結合することができる。特定の態様において、複数のストレプトアビジンムテイン分子それぞれは、SEQ ID NO: 61に記載されるアミノ酸の配列中のストレプトアビジン中の位置を基準にして位置44〜47に対応する配列位置にアミノ酸配列Va144-Thr45-Ala46-Arg47またはIle44-Gly45-Ala46-Arg47を含む。
【００４３】
いくつかの態様において、複数のストレプトアビジンムテイン分子それぞれは、a）SEQ ID NO: 62、63、68、75〜77または80〜83のいずれかに記載されるアミノ酸の配列；b）SEQ ID NO: 62、63、68、75〜77または80〜83のいずれかと少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはより高い配列同一性を示し、Va144-Thr45-Ala46-Arg47またはIle44-Gly45-Ala46-Arg47に対応するアミノ酸配列を含む、かつ/またはビオチン、ビオチン類似体もしくはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合するアミノ酸の配列；またはc）ビオチン、ビオチン類似体もしくはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、a）もしくはb）の機能的断片を含む。特定の態様において、複数のストレプトアビジンムテイン分子は、SEQ ID NO: 63または68に記載されるアミノ酸の配列を含む。
【００４４】
特定の態様において、オリゴマー粒子試薬の表面に可逆的に結合した主剤および副剤はそれぞれストレプトアビジン結合ペプチドを含む。いくつかの態様において、ストレプトアビジン結合ペプチドは、
2021533746.tif 000003
からなる群より選択される。
【００４５】
特定の態様において、主剤および副剤の一方または両方は抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の態様において、1つまたは複数の主/副剤は、一価の抗体断片である、またはそれを含む。いくつかの態様において、主剤および副剤の一方または両方は、Fabである、またはそれを含む。
【００４６】
いくつかの態様において、オリゴマー粒子試薬は、60nmよりも大きい、70nmよりも大きい、80nmよりも大きい、または90nmよりも大きい半径を含む。いくつかの態様において、オリゴマー粒子試薬は、50nm〜150nm、75nm〜125nm、80nm〜115nmもしくは90nm〜110nmの半径（両端の値を含む）；または90nm±15nmもしくは95nm±20〜25nmの半径を含む。
【００４７】
いくつかの態様において、オリゴマー粒子試薬は少なくとも5×107g/molもしくは少なくとも1×108g/mol；および/または5×107g/mol〜5×108g/mol、1×108g/mol〜5×108g/molもしくは1×108g/mol〜2×108g/molの分子量を含む。
【００４８】
特定の態様において、オリゴマー粒子試薬は少なくとも500のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体、少なくとも1,000のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体、少なくとも1,500のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体もしくは少なくとも2,000のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体；および/または1,000〜20,000のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体、1,000〜10,000のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体もしくは2,000〜5,000のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体を含む。
【００４９】
いくつかの態様において、方法はさらに、インキュベーションの少なくとも一部分の後または間に物質を細胞に加える工程を含み、物質は、主剤および副剤、例えば抗CD3および抗CD28抗体またはそれらの抗原結合断片とオリゴマー粒子試薬との間の結合を解消することができる。特定の態様において、物質は、フリーの結合パートナーである、かつ/または競合物質である。特定の態様において、物質の存在は、T細胞中で主剤および副剤によって誘導または変調されたシグナルを終結または減少させる。いくつかの態様において、物質は、ストレプトアビジン結合ペプチド、ビオチンもしくは生物学的に活性な断片またはビオチン類似体もしくは生物学的に活性な断片である、またはそれを含む。特定の態様において、物質は、ストレプトアビジン結合ペプチドである、またはそれを含み、ストレプトアビジン結合ペプチドは、
2021533746.tif 000004
からなる群より選択される。いくつかの態様において、物質は、ビオチンもしくは生物学的に活性な断片またはビオチン類似体もしくは生物学的に活性な断片である、またはそれを含む。
【００５０】
特定の態様において、物質は、オリゴマー粒子を含む刺激試薬への曝露が開始された後42時間〜120時間または約42時間〜120時間（両端の値を含む）で加えられる。特定の態様において、物質は、オリゴマー粒子試薬への曝露が開始された後48時間〜120時間もしくは約48時間〜120時間または2日〜5日もしくは約2日〜5日（両端の値を含む）で加えられる。特定の態様において、物質は、オリゴマー粒子試薬への曝露が開始された後72時間〜96時間もしくは約72時間〜96時間または3日〜4日もしくは約3日〜4日で加えられる。いくつかの態様において、物質は、オリゴマー粒子試薬への曝露が開始された後48時間もしくは約48時間または2日もしくは約2日で加えられる。特定の態様において、物質は、オリゴマー粒子試薬への曝露が開始された後72時間もしくは約72時間または3日もしくは約3日で加えられる。特定の態様において、物質は、オリゴマー粒子試薬への曝露が開始された後96時間もしくは約96時間または4日もしくは約4日で加えられる。
【００５１】
いくつかの態様において、物質は、インキュベーションの後かつ採取の前に加えられる。特定の態様において、物質は、インキュベーションの少なくとも一部分の間に加えられ、インキュベーションは、物質が加えられた後も継続する。特定の態様において、物質が加えられた後、インキュベーションは、組換えサイトカインを欠く基礎培地の存在下で実行される。
【００５２】
本明細書に提供されるものは、操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬を含む、細胞106個あたり0.02μg〜8μgまたは約0.02μg〜8μgの刺激試薬に曝露する工程であって、オリゴマー粒子試薬に、（i）CD3に特異的に結合する主剤と、（ii）CD28に特異的に結合する副剤とが付着しており、曝露が、組換えIL-2、IL-7およびIL-15を有する無血清培地の存在下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する、工程；（b）刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程であって、導入が、組換えIL-2、IL-7およびIL-15を有する無血清培地の存在下で実施される、工程；（c）形質転換細胞の集団を、静的条件下、24時間〜96時間または1日〜4日、インキュベートする工程であって、任意で、インキュベーションが、約37℃の温度で、かつ、インキュベーションの少なくとも一部分の間、ビオチンもしくはその生物学的に活性な断片、任意でD-ビオチンまたはビオチン類似体もしくはその生物学的に活性な断片を含む物質を添加しながら実施される、工程；および（d）インキュベーションの後、形質転換集団のT細胞を採取し、それにより、操作された細胞の組成物を製造する工程であって、採取が、刺激試薬への曝露が開始された後72〜96時間または3日〜4日の時点（両端の値を含む）で実施される、工程を含み；それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法である。
【００５３】
いくつかの態様において、インプット組成物は少なくとも300×106個の生存初代T細胞を含む。いくつかの態様において、インプット組成物中の初代T細胞の数は、450×106個もしくは約450×106個の生存初代T細胞、500×106個もしくは約500×106個の生存初代T細胞、550×106個もしくは約550×106個の生存初代T細胞、600×106個もしくは約600×106個の生存初代T細胞、700×106個もしくは約700×106個の生存初代T細胞、800×106個もしくは約800×106個の生存初代T細胞、900×106個もしくは約900×106個の生存初代T細胞または1,000×106個もしくは約1,000×106個の生存初代T細胞または前記のいずれかの間の任意の値である。特定の態様において、インプット組成物は600×106個または約600×106個の生存初代T細胞を含む。特定の態様において、インプット組成物中の初代T細胞の数は、最大900×106個の生存初代T細胞または900×106個もしくは約900×106個の生存初代T細胞である。
【００５４】
いくつかの態様において、インプット組成物中の初代T細胞は、初代CD3+T細胞を含む、または初代CD4+T細胞および/または初代CD8+T細胞を含む。いくつかの態様において、インプット組成物中の細胞は、対象由来の生体試料から選択または単離などによって濃縮される。いくつかの態様において、初代T細胞は、生体試料からCD3+T細胞のための免疫親和性に基づく選択などによって単離または選択された初代CD3+T細胞において濃縮される。いくつかの態様において、初代T細胞は、生体試料から初代CD4+T細胞のための免疫親和性に基づく選択などによって単離または選択された初代CD4+T細胞において濃縮される。いくつかの態様において、初代T細胞は、生体試料からCD8+T細胞のための免疫親和性に基づく選択などによって単離または選択された初代CD8+T細胞において濃縮される。いくつかの態様において、初代T細胞は、生体試料からCD4+T細胞およびCD8+T細胞のための免疫親和性に基づく選択などによって単離または選択された、濃縮された初代CD4+T細胞および濃縮された初代CD8+T細胞である。
【００５５】
特定の態様において、インプット組成物は、1.5：1〜2.0：1のCD4+細胞：CD8+細胞の比を含む。いくつかの態様において、インプット組成物は、1.2：1〜0.8：1のCD4+細胞：CD8+細胞の比を含む。いくつかの態様において、比は、CD4+T細胞：CD8+T細胞1：1または約1：1である。
【００５６】
本明細書に提供されるものは、操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、（a）初代T細胞を含むインプット組成物を、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬を含む、細胞106個あたり0.4μg〜8μgまたは約0.4μg〜8μgの刺激試薬に曝露する工程であって、オリゴマー粒子試薬に、（i）CD3に特異的に結合する主剤と、（ii）CD28に特異的に結合する副剤とが付着しており、インプット組成物が、2：1〜1：2のCD4+細胞：CD8+T細胞の比を含み、CD4+およびCD8+T細胞である少なくとも300×106個の初代T細胞を含み、曝露が、組換えIL-2、IL-7およびIL-15を含む無血清培地の存在下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する、工程；（b）刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程であって、導入が、組換えIL-2、IL-7およびIL-15を有する無血清培地の存在下で実施される、工程；（c）形質転換細胞の集団を、静的条件下、24時間〜72時間もしくは約24時間〜72時間、1日〜3日もしくは約1日〜3日、インキュベートする工程であって、任意で、インキュベーションが、約37℃の温度で；かつ、インキュベーションの少なくとも一部分の間、ビオチンもしくはその生物学的に活性な断片、任意でD-ビオチンまたはビオチン類似体もしくはその生物学的に活性な断片を含む物質を添加しながら実施され、添加が、刺激試薬への曝露が開始された後48〜72時間または2日〜3日の時点（両端の値を含む）で実施される、工程；および（d）インキュベーションの後、形質転換集団のT細胞を採取し、それにより、操作された細胞の組成物を製造する工程であって、採取が、刺激試薬への曝露が開始された後72〜96時間または3日〜4日の時点（両端の値を含む）で実施される、工程を含み；それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法である。いくつかの態様において、該初代T細胞は、1：1または約1：1のCD4+T細胞：CD8+T細胞の比を含む。いくつかの態様において、物質は、オリゴマー粒子試薬への曝露が開始された後48時間もしくは約48時間または2日またはもしくは約2日で加えられる。特定の態様において、物質は、オリゴマー粒子試薬への曝露が開始された後72時間もしくは約72時間または3日もしくは約3日で加えられる。特定の態様において、物質は、オリゴマー粒子試薬への曝露が開始された後96時間もしくは約96時間または4日もしくは約4日で加えられる。
【００５７】
本明細書に提供されるものは、操作されたT細胞の組成物を製造する方法であって、（a）少なくとも300×106個の初代T細胞を含むインプット組成物を、常磁性ビーズを含む刺激試薬に、2：1〜0.5：1または約2：1〜0.5：1のビーズ：細胞の比で曝露する工程であって、ビーズが、ポリスチレンコーティングおよび4.5μmまたは約4.5μmの直径を含む不活性常磁性ビーズであり、ビーズに、（i）抗CD3抗体またはその抗原結合断片および抗CD28抗体またはその抗原結合断片が付着しており、インプット組成物が、2：1〜1：2のCD4+T細胞：CD8+T細胞の比を含み、CD4+およびCD8+T細胞である少なくとも300×106個の初代T細胞を含み、曝露が、組換えIL-2、IL-7およびIL-15を含む無血清培地の存在下で実施され、それにより、刺激された集団を生成する、工程；（b）刺激された集団のT細胞に、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを導入し、それにより、形質転換細胞の集団を生成する工程であって、導入が、組換えIL-2、IL-7およびIL-15を有する無血清培地の存在下で実施される、工程；（c）形質転換細胞の集団を、静的条件下、48〜72時間または2〜3日（両端の値を含む）、インキュベートする工程であって、任意で、インキュベーションが約37℃の温度で実施される、工程；（d）インキュベーションの後、細胞を磁場に曝露して刺激試薬を細胞から除去し、次いでT細胞を採取し、それにより、操作された細胞の組成物を製造する工程であって、採取が、刺激試薬への曝露が開始された後72〜96時間または約3日〜4日の時点（両端の値を含む）で実施される、工程を含み；それにより、操作された細胞の組成物を製造する、方法である。いくつかの態様において、初代T細胞は、1：1または約1：1のCD4+T細胞：CD8+T細胞の比を含む。
【００５８】
いくつかの態様において、インプット組成物中の初代T細胞の数は、450×106個もしくは約450×106個の生存初代T細胞、500×106個もしくは約500×106個の生存初代T細胞、550×106個もしくは約550×106個の生存初代T細胞、600×106個もしくは約600×106個の生存初代T細胞、700×106個もしくは約700×106個の生存初代T細胞、800×106個もしくは約800×106個の生存初代T細胞、900×106個もしくは約900×106個の生存初代T細胞または1,000×106個もしくは約1,000×106個の生存初代T細胞または前記のいずれかの間の任意の値である。特定の態様において、インプット組成物は600×106個または約600×106個の生存初代T細胞を含む。特定の態様において、インプット組成物中の細胞の数は、最大900×106個の生存初代T細胞または900×106個もしくは約900×106個の生存初代T細胞である。
【００５９】
いくつかの態様において、インキュベーションの少なくとも一部分は、組換えIL-2、IL-7およびIL-15を含む無血清培地の存在下で実行される。特定の態様において、インキュベーションは、組換えサイトカインを欠く基礎培地中で実施される。特定の態様において、インキュベーションは導入の後24時間もしくは約24時間または1日もしくは約1日、実施される。いくつかの態様において、インキュベーションは導入の後48時間もしくは約48時間または2日もしくは約2日、実施される。特定の態様において、インキュベーションは導入の後72時間もしくは約72時間または3日もしくは約3日、実施される。
【００６０】
いくつかの態様において、刺激試薬への曝露の前に、方法は、生体試料からのCD3+T細胞を濃縮する工程であって、濃縮が、CD3+である細胞を閉鎖系中で選択し、それにより、選択集団を生成する工程を含む。場合によっては、濃縮は第一の選択であり、細胞および第一の選択は、CD3+である細胞に関してさらに選択されてその選択をさらに濃縮し、それにより、第二の選択集団を生成する。いくつかの態様において、インプット組成物は濃縮されたCD3+細胞を含む。いくつかの態様において、インプット組成物は、第一の選択からの濃縮されたCD3+細胞を含む。いくつかの態様において、インプット組成物は、第二の選択からの濃縮されたCD3+細胞を含む。
【００６１】
特定の態様において、細胞の濃縮は免疫親和性に基づく選択を含む。いくつかの態様において、免疫親和性に基づく選択は、細胞を、アフィニティークロマトグラフィーマトリックス上に固定されたまたはそれに付着した抗体と接触させることによって実施され、抗体は、細胞上の細胞表面マーカーに特異的に結合することができる。いくつかの態様において、免疫親和性に基づく選択はCD3+T細胞の陽性選択である。特定の態様において、方法はさらに、試料中の細胞をアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに接触させた後、抗体に結合した細胞を溶出させ、それにより、選択された細胞をマトリックスから回収する工程を含む。
【００６２】
いくつかの態様において、刺激試薬への曝露の前に、方法は、生体試料からのCD4+またはCD8+T細胞を濃縮する工程を含み、濃縮は、（a）閉鎖系中で第一の選択を実行することを含み、第一の選択が、初代ヒトT細胞を含む試料からの（i）CD4+細胞、および（ii）CD8+細胞の一方の濃縮を含み、それにより、第一の選択集団および非選択集団を生成し；（b）閉鎖系中で第二の選択を実行することを含み、第二の選択が、非選択集団からの（i）CD4+細胞、および（ii）CD8+細胞の他方の濃縮を含み、それにより、第二の選択集団を生成し、濃縮は、CD4+T細胞およびCD8+T細胞の別々の濃縮集団を製造し、別々の濃縮集団はそれぞれ、第一の選択集団または第二の選択集団の一方からの細胞を含み、インプット組成物は、CD4+T細胞の濃縮集団およびCD8+T細胞の濃縮集団の1つまたは複数からの細胞を含む。
【００６３】
いくつかの態様において、CD4+T細胞およびCD8+T細胞の別々の濃縮集団は混合され、それにより、インプット組成物を製造する。特定の態様において、該混合は閉鎖系中で実行され、任意で、閉鎖系は自動化されている。特定の態様において、第一および/または第二の選択における細胞の濃縮は、細胞表面マーカーの発現に基づいて陽性選択または陰性選択を実行することを含む。いくつかの態様において、第一または第二の選択における細胞の濃縮は、細胞表面マーカーまたはCD4+もしくはCD8+細胞を濃縮するためのマーカーの発現に基づいて複数の陽性または陰性選択工程を実行することを含む。
【００６４】
特定の態様において、第一および/または第二の選択における細胞の濃縮は免疫親和性に基づく選択を含む。いくつかの態様において、免疫親和性に基づく選択は、細胞を、アフィニティークロマトグラフィーマトリックス上に固定されたまたはそれに付着した抗体と接触させることによって実施され、抗体は、細胞上の細胞表面マーカーに特異的に結合して、CD4+またはCD8+細胞の陽性または陰性選択を実施することができる。特定の態様において、方法はさらに、第一の選択および/または第二の選択において試料中の細胞をアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに接触させた後、抗体に結合した細胞を溶出させ、それにより、選択された細胞をマトリックスから回収する工程を含む。特定の態様において、生体試料からCD4+またはCD8+T細胞の濃縮は、（a）CD4の表面発現に基づく陽性選択によってCD4+細胞を濃縮すること；（b）CD8の表面発現に基づく陽性選択によってCD8+細胞を濃縮することを含む。いくつかの態様において、（a）および（b）両方。
【００６５】
いくつかの態様において、アフィニティークロマトグラフィーマトリックス上での免疫親和性に基づく選択は、マトリックス上に固定された結合試薬と可逆性結合を形成することができる1つまたは複数の結合パートナーをさらに含む抗体を使用して実施され、抗体は、該接触の間に該クロマトグラフィーマトリックスに可逆的に結合する。そのような態様において、該マトリックス上で抗体が特異的に結合する細胞表面マーカーを発現する細胞は、結合試薬と結合パートナーとの間の可逆性結合の切断によってマトリックスから回収されることができる。いくつかの態様において、結合パートナーは、ビオチン、ビオチン類似体および結合試薬に結合することができるペプチドの中から選択され、結合試薬は、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン類似体またはムテイン、アビジンおよびアビジン類似体またはムテインの中から選択される。いくつかの態様において、結合パートナーは、SEQ ID NO: 64に記載されるアミノ酸の配列を含む；かつ/または、結合試薬は、SEQ ID NO: 75、80、76または63に記載されるアミノ酸の配列を含むストレプトアビジンムテインである。いくつかの態様において、試料中の細胞をアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに接触させた後、細胞を濃縮する方法は、競合試薬を加えて結合パートナーと結合試薬との間の結合を切断し、それにより、選択された細胞をマトリックスから回収する工程を含む。いくつかの態様において、競合試薬はビオチンまたはビオチン類似体である。いくつかの態様において、選択における抗体は、3×10-5sec-1または約3×10-5sec-1よりも大きい、結合および細胞表面マーカーについての解離速度定数（koff）を有する。いくつかの態様において、選択における抗体は、約10-3〜10-7の範囲または約10-7〜約10-10の範囲の解離定数（Kd）である、細胞表面マーカーに対する親和性を有する。いくつかの態様において、選択のためのクロマトグラフィーマトリックスは、カラムである分離用容器に詰められている。
【００６６】
いくつかの態様において、刺激試薬への曝露の前に、方法は、生体試料からのCD4+またはCD8+T細胞を濃縮する工程であって、濃縮が、該試料の細胞を、インキュベーション組成物中でCD4に特異的に結合する第一の免疫親和性試薬およびインキュベーション組成物中でCD8に特異的に結合する第二の免疫親和性試薬と、免疫親和性試薬が試料中の細胞の表面上のCD4およびCD8分子にそれぞれ特異的に結合する条件下で接触させることを含む、工程；および第一および/または第二の免疫親和性試薬に結合した細胞を回収し、それにより、CD4+細胞およびCD8+細胞を含む濃縮組成物を生成する工程を含み、インプット組成物は、CD4+細胞およびCD8+細胞を含む濃縮組成物の細胞を含む。いくつかの態様において、免疫親和性試薬それぞれは抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の態様において、免疫親和性試薬はビーズの外側表面に固定されている。特定の態様において、ビーズは磁気ビーズである。いくつかの態様において、第一または第二の免疫親和性試薬に結合した細胞の回収は、細胞を磁場に曝露することを含む。
【００６７】
特定の態様において、生体試料は、対象、任意でヒト対象から得られた初代T細胞を含む。特定の態様において、生体試料は、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（PBMC）試料、未分画T細胞試料、リンパ球試料、白血球試料、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物である、またはそれを含む。いくつかの態様において、生体試料は、濃縮の前に事前にクライオ凍結されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物である。
【００６８】
特定の態様において、採取は、刺激試薬への曝露が開始された後48時間もしくは約48時間または2日もしくは約2日で実施される。いくつかの態様において、採取は、刺激試薬への曝露が開始された後72時間もしくは約72時間または3日もしくは約3日で実施される。特定の態様において、採取は、刺激試薬への曝露が開始された後48時間もしくは約48時間または2日もしくは約2日で実施される。
【００６９】
特定の態様において、採取は、組み込まれたベクターがゲノム中で検出された時点で、ただし、二倍体ゲノムあたりの安定なiVCNを達成する前に実施される。いくつかの態様において、採取は、形質転換細胞の集団中の総VCNに対する組み込まれたベクターコピー数（iVCN）の分率が平均で0.8未満である時点で実施される。特定の態様において、採取は、形質転換細胞の集団のiVCNが平均で二倍体ゲノムあたり2.0コピー未満または約2.0コピー未満である時点で実施される。
【００７０】
いくつかの態様において、採取は、形質転換細胞の集団のiVCNが平均で二倍体ゲノムあたり1.5コピー未満または約1.5コピー未満である時点で実施される。特定の態様において、採取は、形質転換細胞の集団のiVCNが平均で二倍体ゲノムあたり1.0コピー未満または約1.0コピー未満である時点で実施される。特定の態様において、採取は、形質転換細胞の集団のiVCNが平均で二倍体ゲノムあたり0.75コピー未満または約0.75コピー未満である時点で実施される。いくつかの態様において、採取は、形質転換細胞の集団のiVCNが平均で二倍体ゲノムあたり0.5コピー未満または約0.5コピー未満である時点で実施される。特定の態様において、細胞の採取は、細胞をすすぐ、または洗うことによって細胞デブリを除去することを含む。特定の態様において、細胞は、ナイーブ様細胞のパーセンテージが、集団中の全T細胞、集団中の全CD4+T細胞または集団中の全CD8+T細胞もしくはその組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い時点で採取される。いくつかの態様において、細胞は、ナイーブ様T細胞および/またはセントラルメモリーT細胞のパーセンテージが、集団中の全T細胞、集団中の全CD4+T細胞または集団中の全CD8+T細胞もしくはその組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い時点で採取される。いくつかの態様において、採取時、ナイーブ様T細胞のパーセンテージは、集団中の全組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、例えば、集団中の全組換えタンパク質発現T細胞の中で65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高いまたは約65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高い。いくつかの態様において、採取時、ナイーブ様T細胞のパーセンテージは、集団中の全組換えタンパク質発現CD4+T細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、例えば、集団中の全組換えタンパク質発現CD4+細胞の中で65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高いまたは約65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高い。いくつかの態様において、採取時、ナイーブ様T細胞のパーセンテージは、集団中の全組換えタンパク質発現CD8+T細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、例えば、集団中の全組換えタンパク質発現CD8+細胞の中で65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高いまたは約65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高い。いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞は、CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+、またはCD62L-CCR7+である。いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞はCCR7+CD45RA+を含む。特定の態様において、ナイーブ様T細胞はCD27+CCR7+細胞を含む。
【００７１】
いくつかの態様において、採取時、ナイーブ様T細胞および/またはセントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、集団中の全組換えタンパク質発現細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、例えば、集団中の全組換えタンパク質発現T細胞の中で65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高いまたは約65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高い。いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞および/またはセントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、集団中の全組換えタンパク質発現CD4+T細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、例えば、集団中の全組換えタンパク質発現CD4+細胞の中で65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高いまたは約65、70％、80％、90％もしくは95％よりも高い。いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞および/またはセントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、集団中の全組換えタンパク質発現CD8+T細胞の中で60％よりも高いまたは約60％よりも高い、例えば、集団中の全組換えタンパク質発現CD8+細胞の中で65％、70％、80％、90％もしくは95％よりも高いまたは約65、70％、80％、90％もしくは95％よりも高い。いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞は、CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+、またはCD62L-CCR7+である。いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞はCCR7+CD45RA+を含む。特定の態様において、ナイーブ様T細胞はCD27+CCR7+細胞を含む。特定の態様において、セントラルメモリーT細胞はCCR7+CD45RA-である。
【００７２】
特定の態様において、方法はさらに、アウトプット組成物の細胞を凍結保存および/または対象への投与のために製剤化する工程を含む。いくつかの態様において、細胞は、薬学的に許容される賦形剤の存在下で製剤化される。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、凍結保護物質の存在下で製剤化される。いくつかの態様において、凍結保護物質はDMSOを含む。場合によっては、DMSoは、凍結プロセス中に細胞内結晶が形成するのを防ぎ得る。
【００７３】
いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、容器、任意でバイアルまたはバッグの中に製剤化される。特定の態様において、組換えタンパク質は、疾患、障害または病気の細胞または組織と関連する、それに特異的である、かつ/またはその上に発現する標的抗原に結合することができる組換え受容体である。特定の態様において、疾患、障害または病気は感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患または腫瘍もしくはがんである。
【００７４】
いくつかの特定の態様において、標的抗原は腫瘍抗原である。特定の態様において、標的抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、別名CAIXまたはG250）、がん精巣抗原、がん精巣抗原1B（CTAG、別名NY-ESO-1およびLAGE-2）、がん胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、タイプIII上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；別名Fc受容体ホモログ5またはFCRH5）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp10O）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役型受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソセリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、がん胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、トロホブラスト糖タンパク質（TPBG、別名5T4）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1、別名TYRP1またはgp75）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2、別名ドーパクロムトートメラーゼ、ドーパクロムデルタイソメラーゼまたはDCT）、血管内皮細胞増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮細胞増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異もしくは病原体発現抗原またはユニバーサルタグと関連する抗原および/またはビオチン化分子および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体によって発現される分子の中から選択される。
【００７５】
特定の態様において、組換えタンパク質は、機能的非TCR抗原受容体またはTCRもしくはその抗原結合断片である、またはそれを含む。特定の態様において、組換えタンパク質はキメラ抗原受容体（CAR）である。いくつかの態様において、組換え受容体は抗BCMA CARである。特定の態様において、組換えタンパク質は抗CD19 CARである。
【００７６】
特定の態様において、キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、スペーサーおよび/またはヒンジ領域を含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインはscFvを含む。特定の態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、T細胞中で一次活性化シグナルを誘導することができるシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメインおよび/または免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインである、またはそれらを含む。特定の態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3鎖、任意でCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分である、またはそれを含む。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達領域は、CD28、4-1BBもしくはICOSの細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含む。
【００７７】
特定の態様において、無血清培地は、基礎培地中0.5mM〜5mMのL-グルタミンのジペプチド形態；0.5mM〜5mMのL-グルタミン；および少なくとも1つのタンパク質を含み、血清を含まない。
【００７８】
いくつかの態様において、1つまたは複数の組換えサイトカインを欠く基礎培地はL-グルタミンを含む。いくつかの態様において、L-グルタミンは約0.5mM〜約5mMの濃度で存在する。いくつかの態様において、L-グルタミンは約2mMの濃度で存在する。
【００７９】
いくつかの態様において、1つまたは複数の組換えサイトカインを欠く基礎培地は血清を含まない。
【００８０】
いくつかの態様において、基礎培地はさらに、アルブミン、インスリンまたはトランスフェリンの1つまたは複数、任意でヒトまたは組換えアルブミン、インスリンまたはトランスフェリンの1つまたは複数から選択される少なくとも1つのタンパク質を含む。
【００８１】
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法はいずれも、例えば、組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを細胞、例えばT細胞に導入するために非ウイルス的遺伝子操作法を使用して実施することができる。本明細書に記載される方法の提供される態様はいずれも、細胞療法の製造のために組換えタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを初代T細胞に導入するために非ウイルス的導入法を使用して実施することができる。特定の局面において、非ウイルス法は、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドまたはその一部分の、細胞中のゲノムへの組み込みを容易にする方法である。様々な非ウイルス的導入方法を、本明細書に記載される非ウイルス的導入の任意の方法を含め、使用することができる。
【００８２】
1つの局面において、本明細書に提供されるものは、本明細書に提供される任意の方法によって製造された操作された細胞を含む組成物である。いくつかの態様において、組成物は治療用組成物である。本明細書に提供されるものは、本明細書に提供される任意の方法によって製造された治療用T細胞組成物である。
【００８３】
いくつかの態様において、組成物中のT細胞の総数または組成物中の組換えタンパク質を発現するT細胞の総数の少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または少なくとも約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞である。いくつかの態様において、組成物中のT細胞の総数または組成物中の組換えタンパク質を発現するT細胞の総数の少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または少なくとも約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％が、セントラルメモリーT細胞である、またはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞である。いくつかの態様において、組成物中のT細胞の総数または組成物中の組換えタンパク質を発現するT細胞の総数の少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または少なくとも約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％が、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞である、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞である。いくつかの態様において、組成物中のT細胞の総数または組成物中の組換えタンパク質を発現するT細胞の総数の少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または少なくとも約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％がCD27+CCR7+T細胞である。
【００８４】
いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞は、CD45RA、CD27、CD28およびCCR7からなる群より選択されるT細胞活性化マーカーに関して表面陽性である；かつ/または、CD25、CD45RO、CD56、CD62L、KLRG1からなる群より選択されるマーカーに関して表面陰性である；かつ/または低いCD95発現を有する；かつ/または低いCD95発現を有する；かつ/またはIL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10からなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現に関して陰性である。
【００８５】
いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞上に発現するマーカーは、CD45RA、CD27、CD28およびCCR7からなる群より選択される。いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞は、CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+、またはCD62L-CCR7+である。いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞は、CD27+CCR7+T細胞を含み、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも70％、80％、85％または90％がCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞は、CD27+CCR7+T細胞を含み、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％または90％がCD27+CCR7+である。
【００８６】
いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞は、CD27+CCR7+T細胞を含み、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％または90％がCD27+CCR7+であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％または90％がCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％または90％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である。
【００８７】
いくつかの態様において、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％が、セントラルメモリーT細胞である、またはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％が、セントラルメモリーT細胞である、またはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも40％、50％、60％、70％、80％または90％が、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞である、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％が、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞である、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である。
【００８８】
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法によって製造される複数のT細胞組成物中で平均で、組成物中のT細胞の総数または組成物中の組換えタンパク質を発現するT細胞の総数の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または少なくとも約50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または約50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞である。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法によって製造される複数のT細胞組成物中で平均で、組成物中のT細胞の総数または組成物中の組換えタンパク質を発現するT細胞の総数の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または少なくとも約50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または約50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％が、セントラルメモリーT細胞である、またはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞である。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法によって製造される複数のT細胞組成物中で平均で、組成物中のT細胞の総数または組成物中の組換えタンパク質を発現するT細胞の総数の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または少なくとも約50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または約50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％が、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞である、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞である。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法によって製造される複数のT細胞組成物中で平均で、組成物中のT細胞の総数または組成物中の組換えタンパク質を発現するT細胞の総数の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または少なくとも約50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または約50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％がCD27+CCR7+T細胞である。前記態様のいずれかにおいて、本明細書に開示される方法によって製造される複数のT細胞組成物中で平均で、組成物中の細胞の少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約96％、少なくとももしくは少なくとも約97％、少なくとももしくは少なくとも約98％、少なくとももしくは少なくとも約99％、約100％または100％が、CD4+T細胞およびCD8+T細胞であることができる。前記態様のいずれかにおいて、本明細書に開示される方法によって製造される複数のT細胞組成物中で平均で、組成物中の細胞の少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約96％、少なくとももしくは少なくとも約97％、少なくとももしくは少なくとも約98％、少なくとももしくは少なくとも約99％、約100％または100％が、CD3+T細胞であることができる。
【００８９】
1つの局面において、本明細書に提供されるものは、組換え受容体を発現するCD4+T細胞および組換え受容体を発現するCD8+T細胞を含む治療用T細胞組成物であって、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である、治療用T細胞組成物である。
【００９０】
いくつかの態様において、組成物中のT細胞の総数または組成物中の組換えタンパク質を発現するT細胞の総数の少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または少なくとも約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞である。いくつかの態様において、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも60％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の30％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも70％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の40％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも70％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の50％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも70％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の60％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも70％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の70％が、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である。
【００９１】
1つの局面において、本明細書に提供されるものは、組換え受容体を発現するCD4+T細胞および組換え受容体を発現するCD8+T細胞を含む治療用T細胞組成物であって、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％が、セントラルメモリーT細胞である、またはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％が、セントラルメモリーT細胞である、またはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である、治療用T細胞組成物である。
【００９２】
いくつかの態様において、組成物中のT細胞の総数または組成物中の組換えタンパク質を発現するT細胞の総数の少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または少なくとも約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％が、セントラルメモリーT細胞である、またはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞である。いくつかの態様において、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも25％が、セントラルメモリーT細胞である、またはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも60％が、セントラルメモリーT細胞である、またはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも65％が、セントラルメモリーT細胞である、またはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも60％が、セントラルメモリーT細胞である、またはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも70％が、セントラルメモリーT細胞である、またはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の65％が、セントラルメモリーT細胞である、またはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも70％が、セントラルメモリーT細胞である、またはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の70％が、セントラルメモリーT細胞である、またはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である。
【００９３】
1つの局面において、本明細書に提供されるものは、組換え受容体を発現するCD4+T細胞および組換え受容体を発現するCD8+T細胞を含む治療用T細胞組成物であって、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも40％、50％、60％、70％、80％または90％が、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞である、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％が、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞である、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である、治療用T細胞組成物である。
【００９４】
いくつかの態様において、組成物中のT細胞の総数または組成物中の組換え受容体を発現するT細胞の総数の少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または少なくとも約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％が、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞である、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であるT細胞である。いくつかの態様において、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％が、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞である、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも65％が、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞である、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも70％が、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞である、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも70％が、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞である、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも75％が、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞である、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも75％が、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞である、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である。
【００９５】
いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞は、CD45RA、CD27、CD28およびCCR7からなる群より選択されるT細胞活性化マーカーに関して表面陽性である；かつ/または、CD25、CD45RO、CD56、CD62L、KLRG1からなる群より選択されるマーカーに関して表面陰性である；かつ/または低いCD95発現を有する。いくつかの態様において、ナイーブ様T細胞上に発現するマーカーは、CD45RA、CD27、CD28およびCCR7からなる群より選択される。いくつかの態様において、受容体+/CD4+T細胞またはナイーブ様T細胞である、もしくはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である受容体+/CD4+T細胞はCCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+またはCD62L-CCR7+である。いくつかの態様において、受容体+/CD4+T細胞またはナイーブ様T細胞である、もしくはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である受容体+/CD4+T細胞はCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、受容体+/CD8+T細胞またはナイーブ様T細胞である、もしくはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である受容体+/CD8+T細胞はCCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+またはCD62L-CCR7+である。いくつかの態様において、受容体+/CD8+T細胞またはナイーブ様T細胞である、もしくはナイーブ様T細胞上に発現するマーカーに関して表面陽性である受容体+/CD8+T細胞はCD27+CCR7+である。
【００９６】
1つの局面において、本明細書に提供されるものは、組換え受容体を発現するCD4+T細胞および組換え受容体を発現するCD8+T細胞を含む治療用T細胞組成物であって、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％がCD27+CCR7+であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％がCD27+CCR7+である、治療用T細胞組成物である。
【００９７】
1つの局面において、本明細書に提供されるものは、組換え受容体を発現するCD4+T細胞および組換え受容体を発現するCD8+T細胞を含む治療用T細胞組成物であって、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％がCD27+CCR7+であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％がCD27+CCR7+である、治療用T細胞組成物である。
【００９８】
いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約96％、少なくとももしくは少なくとも約97％、少なくとももしくは少なくとも約98％、少なくとももしくは少なくとも約99％、約100％または100％がCD4+T細胞およびCD8+T細胞である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとももしくは少なくとも約90％がCD4+T細胞およびCD8+T細胞であり、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとももしくは少なくとも約60％がCD27+CCR7+であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとももしくは少なくとも約40％がCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとももしくは少なくとも約95％がCD4+T細胞およびCD8+T細胞であり、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとももしくは少なくとも約65％がCD27+CCR7+であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとももしくは少なくとも約45％がCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとももしくは少なくとも約98％がCD4+T細胞およびCD8+T細胞であり、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとももしくは少なくとも約70％、少なくとももしくは少なくとも約75％、少なくとももしくは少なくとも約80％、または少なくとももしくは少なくとも約85％がCD27+CCR7+であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとももしくは少なくとも約50％、少なくとももしくは少なくとも約55％、少なくとももしくは少なくとも約60％、または少なくとももしくは少なくとも約65％がCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとももしくは少なくとも約98％がCD4+T細胞およびCD8+T細胞であり、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとももしくは少なくとも約75％がCD27+CCR7+であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとももしくは少なくとも約55％がCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとももしくは少なくとも約98％がCD4+T細胞およびCD8+T細胞であり、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとももしくは少なくとも約80％がCD27+CCR7+であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとももしくは少なくとも約60％がCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとももしくは少なくとも約98％がCD4+T細胞およびCD8+T細胞であり、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとももしくは少なくとも約85％がCD27+CCR7+であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとももしくは少なくとも約65％がCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとももしくは少なくとも約98％がCD4+T細胞およびCD8+T細胞であり、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとももしくは少なくとも約90％がCD27+CCR7+であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとももしくは少なくとも約70％がCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも90％がCD4+T細胞およびCD8+T細胞であり、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも60％がCD27+CCR7+であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも40％がCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも90％がCD4+T細胞およびCD8+T細胞であり、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少な���とも70％がCD27+CCR7+であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％がCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも90％がCD4+T細胞およびCD8+T細胞であり、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも70％がCD27+CCR7+であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも60％がCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも95％がCD4+T細胞およびCD8+T細胞であり、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも70％がCD27+CCR7+であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも70％がCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも95％がCD4+T細胞およびCD8+T細胞であり、組成物中の全受容体+/CD8+細胞の少なくとも80％がCD27+CCR7+であり、組成物中の全受容体+/CD4+細胞の少なくとも80％がCD27+CCR7+である。
【００９９】
いくつかの態様において、組成物中のT細胞の総数または組成物中の組換え受容体を発現するT細胞の総数の少なくとももしくは少なくとも約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％、または約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％がCD27+CCR7+である。
【０１００】
いくつかの態様において、組成物中の受容体+/CD4+T細胞：受容体+/CD8+T細胞の比は約1：3〜約3：1である。いくつかの態様において、組成物中の受容体+/CD4+T細胞：受容体+/CD8+T細胞の比は約1：2〜約2：1である。いくつかの態様において、組成物中の受容体+/CD4+T細胞：受容体+/CD8+T細胞の比は1：1または約1：1である。
【０１０１】
いくつかの態様において、組成物は細胞の1つまたは複数の単位用量を含む。いくつかの態様において、単位用量は1×104〜50×106個または約1×104〜50×106個のT細胞を含む。
【０１０２】
いくつかの態様において、組換えタンパク質は、キメラ受容体および/または組換え抗原受容体である、またはそれらを含む。いくつかの態様において、組換え受容体は、疾患、障害または病気の細胞または組織と関連する、それに特異的である、かつ/またはその上に発現する標的タンパク質に結合することができる。いくつかの態様において、疾患、障害、または病気は、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである。いくつかの態様において、標的抗原は腫瘍抗原である。いくつかの態様において、標的抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、別名CAIXまたはG250）、がん精巣抗原、がん精巣抗原1B（CTAG、別名NY-ESO-1およびLAGE-2）、がん胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、タイプIII上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；別名Fc受容体ホモログ5またはFCRH5）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp10O）、Gタンパク質共役型受容体5D（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メソセリン、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、がん胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、トロホブラスト糖タンパク質（TPBG、別名5T4）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、血管内皮細胞増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮細胞増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異抗原もしくはユニバーサルタグと関連する抗原および/またはビオチン化分子および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体によって発現される分子の中から選択される。
【０１０３】
いくつかの態様において、組換え受容体は、機能的非TCR抗原受容体またはTCRもしくはその抗原結合断片である、またはそれを含む。
【０１０４】
いくつかの態様において、組換えタンパク質は、抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、抗体またはその抗体断片であり、またはそれを含み、その抗体断片は、いくつかの態様において、一本鎖断片である。いくつかの態様において、断片は、柔軟なリンカーによって結合された抗体可変領域を含む。いくつかの態様において、断片はscFvを含む。
【０１０５】
いくつかの態様において、組換えタンパク質は細胞内シグナル伝達領域を含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、T細胞中で一次活性化シグナルを誘導することができるシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメインおよび/または免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインである、またはそれらを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3鎖の細胞内シグナル伝達ドメインである、またはそれを含む。いくつかの態様において、CD3鎖はCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖またはそのシグナル伝達部分である。
【０１０６】
いくつかの態様において、組換えタンパク質はさらに、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達領域との間に位置する膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域はさらに共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含む。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28、4-1BBもしくはICOSの細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含む。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間にある。
【０１０７】
いくつかの態様において、T細胞は、対象から得られた初代T細胞である。いくつかの態様において、T細胞は対象の自己細胞である。いくつかの態様において、T細胞は対象の同種異系細胞である。
【０１０８】
いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。特定の態様において、組成物はさらに、薬学的に許容される担体を含む。特定の態様において、組成物はさらに凍結保護物質を含む。いくつかの態様において、凍結保護物質はDMSOである。
【０１０９】
特定の態様において、組成物の全T細胞、全CD4+T細胞または全CD8+T細胞もしくはその組換えタンパク質発現細胞の少なくとも60％がCD27+CCR7+である。組成物の全組換えタンパク質発現細胞の少なくとも65％、70％、80％、90％または95％がCD27+CCR7+である、組成物の組換えタンパク質発現CD4+T細胞の少なくとも65％、70％、80％、90％または95％がCD27+CCR7+である、または組成物の組換えタンパク質発現CD8+T細胞の少なくとも65％、70％、80％、90％または95％がCD27+CCR7+である。
【０１１０】
1つの局面において、本明細書に提供されるものは、本明細書に提供される方法または組成物の組成物と、アウトプット組成物を対象に投与するための指示書とを含む製造物品である。
【０１１１】
特定の態様において、対象は疾患または病気を有する。いくつかの態様において、組換え受容体は、疾患または病気の細胞と関連する、またはその上に発現もしくは存在する抗原を特異的に認識する、またはそれに特異的に結合する。
【０１１２】
1つの局面において、本明細書に提供されるものは、疾患または病気を有する、または有することが疑われる対象を治療する方法であって、対象に対し、本明細書に提供される任意の組成物からのT細胞の用量を投与する工程を含む方法である。
【０１１３】
特定の態様において、T細胞の用量は、単回用量として対象に投与される、または2週、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、1年もしくはより長い期間内に一回だけ投与される。いくつかの態様において、T細胞の用量は、1×104〜50×106個または約1×104〜50×106個（両端の値を含む）のT細胞を含む。特定の態様において、T細胞の用量は、50×106個未満のT細胞、10×106個未満のT細胞、5×106個未満のT細胞、1×106個未満のT細胞、0.5×106個未満のT細胞または1×105個未満のT細胞を含む。特定の態様において、T細胞の用量は20×106個または約20×106個のT細胞を含む。いくつかの態様において、T細胞の用量は10×106個または約10×106個のT細胞を含む。
【０１１４】
特定の態様において、T細胞の用量は2×106個または約2×106個のT細胞を含む。特定の態様において、T細胞の用量は1×106個または約1×106個のT細胞を含む。
【０１１５】
いくつかの態様において、T細胞の用量のT細胞は、全T細胞、全生存T細胞、全生存組換え受容体発現T細胞、全生存組換え受容体発現CD4+T細胞または全生存組換え受容体発現CD8+T細胞である。特定の態様において、疾患または病気はがんである。特定の態様において、疾患または病気は骨髄腫、白血病またはリンパ腫である。いくつかの態様において、疾患または病気は、B細胞悪性腫瘍である、かつ/または急性リンパ性白血病（ALL）、成人ALL、慢性リンパ性白血病（CLL）、非ホジキンリンパ腫（NHL）およびびまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）である。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図1Aおよび1Bは、異なるバッチのオリゴマー試薬上に多量体化された抗CD3/抗CD28とインキュベートさせた3人の異なるドナー由来のT細胞のWST代謝アッセイの結果を示す。図1Aは、36nmまたは101nmの平均流体力学半径を有するオリゴマー骨格上に多量体化された抗CD3/抗CD28を含有する参照バッチと比較した、すべての試験バッチ（プール）についてのWST代謝活性をまとめる。個々の試験バッチおよび参照試薬についての異なるドナー由来のT細胞間の平均WST代謝活性を図1Bに示す。
【図２】図2Aおよび2Bは、CAR+T細胞を含有するT細胞組成物を生成するための拡大増殖プロセス（Expanded）ならびにビーズ系刺激試薬（Bead）、ビーズ系刺激試薬および基礎培地中でのインキュベーション（Bead-Basal Media）またはオリゴマー刺激試薬（Oligomer）を伴う非拡大増殖プロセスから生成された細胞組成物から評価された、細胞総数（TNC)（図2A）および生存細胞の割合（生存率)（図2B）を描写する。刺激（Stim）、形質導入（Trans）、インキュベーション（Inc）、収集（Collect）、細胞製剤化（Form）および凍結保存（Cryo）工程時に収集された試料からの結果を示す。
【図３】図3は、拡大増殖プロセス（Expanded）ならびに（a）ビーズ系刺激試薬（Bead）、（b）ビーズ系刺激試薬および基礎培地中でのインキュベーション（Bead-Basal Media）または（c）オリゴマー刺激試薬（Oligomer）を伴う非拡大増殖プロセスから生成された細胞組成物を、各々、BCMAを発現する標的細胞株（RPMI-8226）とエフェクター：標的比27：1、9：1、3：1または1：1でインキュベートさせた場合に評価された、例示的な抗BCMA CAR T細胞の細胞溶解活性を表示する。
【図４】図4A〜4Dは、拡大増殖プロセスならびに（a）ビーズ系刺激試薬（Bead）、（b）ビーズ系刺激試薬および基礎培地中でのインキュベーション（Bead-Basal Media）または（c）オリゴマー刺激試薬（Oligomer）を伴う非拡大増殖プロセスから生成されたCAR+ T細胞組成物からの結果を描写する。図4Aは、CCR7とCD27の両方に対して陽性のCD4+およびCD8+ T細胞の割合を描写する。図4Bは、CD4+CAR+T細胞に対するCCR7+CD27+細胞の割合を描写する。図4Cは、CD8+CAR+T細胞に対するCCR7+CD27+細胞の割合を描写する。図4Dは、1日目の活性化（d1 AMAT）、2日目の形質導入（d2 XMAT）および培養開始後の様々な時間（d4 INOC+2、d6 INOC+4、d7 INOC+5）を含めた製造プロセス中の様々な日数での、拡大増殖プロセスからの代表的なドナーから生成されたCCR7+CD27+細胞の割合を表示する。
【図５】図5A〜5Fは、拡大増殖プロセスならびに（a）ビーズ系刺激試薬（Bead）、（c）オリゴマー刺激試薬（Oligomer）または（d）基礎培地中でインキュベートされたビーズ系刺激試薬（Bead-Basal Media）を伴う非拡大増殖プロセスによって生成された操作されたCAR-T細胞組成物での処置後のインビボマウス異種移植腫瘍モデルにおける腫瘍量を、50日の期間にわたり、腫瘍のみまたはモック形質導入対照と各々比較して描写する。図5Aは、各群当たりの腫瘍量平均を描写する。図5B〜5Fは、各々の評価された処置群における個々のマウスについての結果を表示する：図5B（対照）、図5C（拡大増殖プロセス）、図5D（非拡大増殖オリゴマープロセス）、図5E（非拡大増殖ビーズプロセス）および図5F（非拡大増殖ビーズプロセス、基礎培地）。
【図６】図6A〜6Eは、モック形質導入対照（図6A）または拡大増殖プロセス（Expanded)（図6B）ならびにオリゴマー刺激試薬（Oligomer)（図6C）、ビーズ系刺激試薬（Bead)（図6D）もしくは基礎培地中でインキュベートされたビーズ系刺激試薬（Bead-Basal Media)（図6E）を伴う非拡大増殖プロセスによって生成された操作されたCAR-T細胞組成物での処置後の選択日でのインビボマウス異種移植腫瘍モデルにおける腫瘍量の、各々50日の期間にわたる代表的な生物発光イメージを描写する。
【図７】図7は、拡大増殖プロセス（Expanded）ならびに（a）オリゴマー刺激試薬（Oligomer）、（b）ビーズ系刺激試薬（Bead）または（c）基礎培地中でインキュベートされたビーズ系刺激試薬（Bead-Basal Media）を伴う非拡大増殖プロセスによって生成された操作されたCAR-T細胞組成物で処置後33日の時点での異種移植腫瘍を受けたマウスから収集された血液1μL当たりのT細胞およびCAR+ T細胞の総数、ならびに総T細胞集団内のCAR+ T細胞の割合を描写する。細胞を、切断型受容体代理マーカーに特異的な試薬で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。
【図８】図8Aおよび図8Bは、抗CD19 CARをコードするレンチウイルスにより形質導入され、抗CD3/抗CD28 Fabコンジュゲートストレプトアビジンムテインオリゴマーを刺激剤として使用した拡大増殖プロセス（Expanded）または非拡大増殖プロセス（Non-expanded）のいずれかを使用して生成された抗CD19 CAR-T細胞組成物から定量された、生存総細胞の割合および細胞総数を描写する。
【図９】図9Aおよび9Bは、CD19発現細胞との共培養中の抗CD19 CAR-T細胞の生存率または総細胞数を描写する。図9Aは、拡大増殖プロセスまたは非拡大増殖プロセスを使用して生成された抗CD19 CAR-T細胞組成物からの生存細胞の割合およびCAR+ T細胞の総数を示す。図9Bは、選択後に直接刺激されたT細胞（非凍結）または刺激の前に凍結保存されたT細胞（凍結）から生成された抗CD19 CAR-T細胞組成物からの生存細胞の割合およびCAR+ T細胞の総数を示す。
【図１０】図10は、拡大増殖プロセスまたは非拡大増殖プロセスを使用して生成され、刺激の前に凍結保存された細胞を含有する抗CD19 CAR+T細胞組成物の細胞溶解活性を示す。細胞を、融解後0日目、1日目、3日目または6日目にエフェクター：標的細胞比10：1でCD19発現細胞と共培養した。
【図１１】図11Aおよび11Bは、拡大増殖プロセス（Expanded）または非拡大増殖プロセス（Non-expanded）を使用して生成され、追加の組換えサイトカインを欠く培地中でCD19を発現するように操作されたHEK細胞とエフェクター：標的細胞比5：1で共培養することを伴う長期刺激下で培養された、抗CD19 CAR-T細胞を描写する。図11Aは、長期刺激にわたる様々な時点で評価された生存抗CD19 CAR-T細胞の数を描写する。ND-検出不可。図11Bは、長期刺激培養物から11日目および19日目に収集され、CD25、CD69、PD-1、LAG-3、TIM-3、CD45RAおよびTIGITを含む表面タンパク質に対する抗体でならびにCAR発現の代理マーカーについて染色された試料由来の陽性染色細胞の割合を描写する。
【図１２】図12A〜12Cは、拡大増殖プロセス（Expanded）もしくは非拡大増殖プロセス（Non-expanded）を使用して生成された1×106個、0.5×106個または0.25×106個の抗CD19 CAR-T細胞またはPBS対照が0日目に注射されたマウスのインビボ腫瘍マウスモデルからの結果を示す。図12Aは、腫瘍関連生物発光シグナルの平均放射輝度として測定された腫瘍存在の定量、および研究中の異なる時点で収集された血液試料中の腫瘍細胞の割合を描写する。図12Bは、研究中の異なる時点で収集された血液試料中の総T細胞と総CAR-T細胞の両方の割合を描写する。図12Cは、注射後最大60日までのマウスの生存パーセントを描写する。
【図１３】図13A〜13Bは、スピノキュレートされかつ18〜30時間の静的インキュベーション下のビーズ系刺激試薬を伴う拡大増殖プロセス（アーム1）ならびにスピノキュレーションおよび基礎培地中で96時間インキュベートされたオリゴマー刺激試薬（アーム4）、スピノキュレーションおよび基礎培地中で72時間インキュベートされたビーズ系刺激試薬（アーム2）、基礎培地中で72時間インキュベートされたオリゴマー刺激試薬（アーム5）、基礎培地中で48時間インキュベートされたビーズ系刺激試薬（アーム3）を伴う非拡大増殖プロセスによって生成された操作されたT細胞（EC）組成物、ならびに刺激されていない凍結保存されたT-細胞組成物（CMAT）を描写する。図13Aは、CD4+CAR+T細胞のCCR7+CD27+細胞の割合を描写する。図13Bは、CD4+ CAR+ T細胞およびCD8+ CAR+ T細胞の割合を描写する。
【図１４】図14は、モック空ベクターを使用したプロセス（アーム6、モック）に加え、スピノキュレートされかつ18〜30時間の静的インキュベーション下のビーズ系刺激試薬を伴う拡大増殖プロセス（アーム1）ならびにスピノキュレーションおよび基礎培地中で72時間インキュベートされたビーズ系刺激試薬（アーム2）、スピノキュレーションおよび基礎培地中で48時間インキュベートされたビーズ系刺激試薬（アーム3）、スピノキュレーションおよび基礎培地中で96時間インキュベートされたオリゴマー刺激試薬（アーム4）、スピノキュレーションおよびオリゴマー刺激試薬および基礎培地中で72時間のインキュベーション（アーム5）を伴う非拡大増殖プロセスによって生成された操作されたT細胞組成物の、K562-BCMA標的細胞に対する、様々なエフェクター：標的比（E：T）での細胞溶解活性（比溶解％）を示す。細胞溶解活性を、赤色蛍光シグナルの喪失による顕微鏡検査によって評価し、48時間、72時間および96時間の期間にわたり4時間毎に各培養の開始時の細胞計数に対して正規化した。点線は、殺傷についてのEC50を示す。
【図１５】図15A〜15Cは、モック空ベクターを使用したプロセス（アーム6、モック）に加え、スピノキュレートされかつ18〜30時間の静的インキュベーション下のビーズ系刺激試薬を伴う拡大増殖プロセス（1）ならびにスピノキュレーションおよび基礎培地中で72時間インキュベートされたビーズ系刺激試薬（2）、スピノキュレーションおよび基礎培地中で48時間インキュベートされたビーズ系刺激試薬（3）、スピノキュレーションおよび基礎培地中で96時間インキュベートされたオリゴマー刺激試薬（4）、スピノキュレーションおよびオリゴマー刺激試薬および基礎培地中で72時間インキュベーション（5）を伴う非拡大増殖プロセスによって生成されたT細胞組成物の、組換えBCMA Fc融合タンパク質とコンジュゲートされた常磁性ビーズとの6日間の連続的インキュベーションを伴う長期刺激アッセイにおける活性を描写する。図15Aは、長期刺激の経過の間に観察された生細胞の総数を示す。図15Bは、インキュベーションの1日目〜6日目から測定された総生存細胞についての曲線下面積として定量された場合の異なるT細胞組成物の拡大増殖を示す。図15Cは、長期刺激の経過の間の異なる時点に観察された異なる操作プロセスから産生されたT細胞にわたる生存細胞のパーセント（生存率％）を示す。
【図１６】図16A〜16Cは、図15A〜15Cに描写されたT細胞組成物の、組換えBCMA Fc融合タンパク質とコンジュゲートされた常磁性ビーズとの6日間の連続的インキュベーションを伴う長期刺激後のサイトカインプロファイルを描写する。図16Aは、長期刺激の0日目にサイトカインTNFa、IFN-gおよびIL-2に対して陽性と染色されたCD4/CAR+ T細胞およびCD8/CAR+ T細胞のパーセントを示す。図16Bは、長期刺激の6日目にサイトカインTNFa、IFN-gおよびIL-2に対して陽性と染色されたCD4/CAR+ T細胞およびCD8/CAR+ T細胞のパーセントを示す。図16Cは、CD8+細胞で判定された場合のサイトカインの累積レベルからの多機能性スコアおよびIL-2包括的スコアを、ドナーに合わせて調整することによって正規化して示す。
【図１７Ａ】図17Aは、治療用組成物を産生するためのプロセスにおける倍加の数とCD27+に対して陽性であるCD4+CAR+細胞の割合との間の相関を示す。
【図１７Ｂ】図17Bは、治療用アウトプットT細胞組成物（例えば、薬品）中のセントラルメモリー/ナイーブ様CD4+ T細胞の割合と採取基準（スピアマンρ：-0.54；p値：<0.001）を達成する集団倍加の数との間の関係を示す。治療用アウトプットT細胞組成物（例えば、薬品）中のCD8+ T細胞について類似の結果が観察された。
【図１７Ｃ】図17Cは、産生プロセスの拡大増殖工程中の高（0.35×10^6個の細胞/mL）および低（0.05×10^6個の細胞/mL）播種密度の採取基準に達する集団倍加の数を示す。
【図１７Ｄ】図17Dは、産生プロセスの拡大増殖工程中の播種密度に応じたアウトプット治療用組成物中のCD27+CAR+CD8+ T細胞の割合を示す。
【図１７Ｅ】図17Eは、アウトプットT細胞組成物中のTCM細胞の量に対する処理持続期間の影響を示す。
【図１８】図18A〜18Dは、CAR+ T細胞組成物が投与された対象についてのカプラン-マイヤー生存曲線を、CD4+ CAR+ T細胞（無増悪生存期間について図18A、奏効期間について図18C）およびCD8+ CAR+ T細胞（無増悪生存期間について図18B、奏効期間について図18D）の中のある特定の閾値レベルを上回るまたは下回る割合のCCR7+CD27+ CAR+ T細胞を含有する組成物が投与された群に分けて示す。
【図１８Ｅ】図18Eは、CD8+/CAR+ T細胞における集団倍加数（PDL）が「高い」または「低い」の患者についての最適分割ログランク検定に基づくPFS曲線を示す。低PDLは、<6 PDLのことを指し、>6 PDLは、高PDLのことを指す。
【図１８Ｆ】図18Fは、非ホジキンリンパ腫患者に由来する濃縮されたCD4+（左パネル）およびCD8+（右パネル）インプット組成物中のCD27+CD28+ T細胞の割合を示す。
【図１８Ｇ】図18Gは、濃縮されたCD4+ インプット組成物中のエフェクターメモリーT細胞の割合と採取基準（スピアマンρ：0.43；p値：<0.001）に達するのに必要な集団倍加の数との間の関係を示す。濃縮されたCD8+インプット組成物について類似の結果が観察された。
【図１９】図19Aおよび19Bは、拡大増殖プロセスならびにビーズ系刺激試薬（Bead）またはオリゴマー刺激試薬（Oligomer）を伴う非拡大増殖プロセス（プロセスの5日目（D5；図19A）または4日目（D4；図19B）に細胞が採取された）から生成された抗BCMA CAR+ T細胞組成物の3種の異なる処置用量：高（2×106個）、中（4×105個）および低（8×104個）で処置されたマウスにおける腫瘍量を表示する。対照：腫瘍細胞のみが注射されたマウス（TXなしの腫瘍）および腫瘍細胞とモック形質導入T細胞組成物が注射されたマウス（モック）。
【図２０】図20A〜20Dは、拡大増殖（Expanded）ならびにビーズ系刺激試薬（Bead）またはオリゴマー刺激試薬（Oligomer）を伴う非拡大増殖プロセスから生成された抗BCMA CAR+ T細胞組成物の投与後の5日（図20A）、13日（図20B）、19日（図20C）または26日（図20D）の時点にマウスから収集された血液1μL当たりのT細胞およびCAR+ T細胞の総数を、腫瘍細胞のみ（TXなしの腫瘍）およびモック形質導入T細胞組成物ありの腫瘍細胞（モック）を含む対照と比較して示す。
【図２１】図21は、ドロップレットデジタルPCR（ddPCR）によって評価された場合の、高分子量DNA画分を分離する前（プレゲル；標準ベクターコピー数（VCN）アッセイ）または15kb、17.5kbもしくは20kbの閾値を上回るものをパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE)によって分離した後（組み込まれたベクターコピー数（VCN）アッセイ）のコピー数を示す。コピー数を、組み込まれた導入遺伝子配列の一部を特異的に増幅するプライマー；パッケージングプラスミド（水疱性口内炎インディアナウイルスGタンパク質（VSVg）をコードするウイルスパッケージングプラスミド）、またはゲノム対照（リボヌクレアーゼPタンパク質サブユニットp30（RRP30）をコードする遺伝子）を使用して評価した。評価を、形質導入細胞由来の試料、または非形質導入対照、すなわちスパイクされたCARプラスミドおよびVSVgプラスミドにおいて実施した。各遺伝子のコピー数を、二倍体ゲノムの数（cp/二倍体ゲノム；参照としてアルブミン遺伝子に特異的なプライマーを使用する）に対してまたはゲノムDNA 50ng当たり正規化した。
【図２２】図22A〜22Bは、CARをコードする導入遺伝子配列を含有するレンチウイルス調製物により形質導入されたJurkat T細胞（図22A）またはヒト対象から単離された初代T細胞（図22B）についての、様々な時点（形質導入前（「プレ」）、形質導入後の5分、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間および96時間の時点、または操作プロセスの完了時「完了」）における、導入遺伝子配列の標準ベクターコピー数（VCN）アッセイ（PFGEに供されなかったゲノムDNA試料、高分子量DNAと低分子量DNAの両方）および組み込まれたコピー数（PFGE後の高分子量DNA試料中の）によって評価された場合のコピー数を描写する。各遺伝子のコピー数を、二倍体ゲノムの数（cp/二倍体ゲノム；参照としてアルブミン遺伝子に特異的なプライマーを使用する）に対して正規化した。
【図２３】図23Aは、形質導入後に血清も成長因子もなしの基礎培地（「基礎」）またはIL-2、IL-5およびIL-15を含有する無血清培地（「完全」）中でインキュベートされた、（1）抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲート常磁性ビーズ（「ビーズ」）、（2）細胞106個当たり4.0μgの濃度の抗CD3/抗CD28 Fabコンジュゲートオリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬、または（3）細胞106個当たり0.8μgの濃度の抗CD3/抗CD28 Fabコンジュゲートオリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬とのインキュベーションによって刺激された2人の異なるヒト対象（ドナーAおよびドナーB）由来の初代T細胞を使用した、例示的な非拡大増殖T細胞組成物製造プロセスの3日目、4日目または5日目に評価された組み込まれたコピー数を示す。図23Bは、iVCNによって判定された場合のコピー数とCAR発現細胞の割合（フローサイトメトリーによるCD3+細胞の中のCD3+/活性化Cas3-/CAR+細胞の割合によって判定された場合の）との間の相関を描写する。
【図２４】図24A〜24Eは、表E9に示されているように異なる刺激試薬および収集時間を利用した様々な例示的な拡大増殖または非拡大増殖T細胞組成物製造プロセス中の、標準VCN（PFGEなし）およびiVCN（PFGEあり）によって評価された場合の二倍体ゲノム当たりのコピー数（図24A）、組み込まれた導入遺伝子の分率（図4B）、組み込まれなかった導入遺伝子の分率（図24C）、二倍体ゲノム当たりの組み込まれなかった導入遺伝子コピー数（図24D）ならびにCAR+細胞当たりの組み込まれたコピー数（図24E）を描写する。
【図２５】図25は、キメラ抗原受容体（CAR）を発現するように様々なドナー由来の初代T細胞を操作するための例示的な操作プロセス中の様々な時点の間の、標準VCN（PFGEなし）およびiVCN（PFGEあり）によって評価された場合の二倍体ゲノム当たりのコピー数、組み込まれなかった導入遺伝子コピー数、組み込まれなかった導入遺伝子の分率、ならびに組み込まれた導入遺伝子の分率を描写する。評価された時点は、融解原料時（TMAT；0日目）、活性化時（AMAT；1日目）、形質導入時（XMAT；2日目）または培養の開始後の様々な時間（inoc+1〜inoc+6；プロセスの3日目〜8日目を表す）を含めた拡大増殖プロセスの0日目から8日目を含む。
【図２６】図26は、操作前の単離されたCD4+およびCD8+ T細胞組成物（CMAT）ならびに操作後のCD4+およびCD8+治療用CAR+T細胞組成物のT細胞のクロナリティを示す（シャノン指数を適用）。
【図２７】図27は、異なる濃度の抗CD3/抗CD28 Fabコンジュゲートオリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬の存在下および/または異なる培地組成物の存在下での生成された細胞組成物の表現型の相違を示す。ムテイン試薬および培地組成物の様々な組み合わせでの、エフェクターメモリーCD45RA+細胞（CCR7-CD45RA+；EMRA）、ナイーブ様T細胞（CCR7+CD45RA+；NAIVE）、エフェクターメモリー（CCR7-CD45RA-；EM）およびセントラルメモリー（CCR7+CD45RA-；CM）を示していたCD8+ CAR+ T細胞の割合を示す。
【図２８】図28は、非拡大増殖プロセスおよび拡大増殖プロセスを対照して使用した、3人の異なるドナー由来の初代T細胞の操作された組成物中のCCR7とCD27の両方の染色に対して陽性のCD4+CAR+ T細胞およびCD8+CAR+ T細胞の割合を示す。
【図２９】図29は、非拡大増殖プロセスおよび拡大増殖プロセスを対照して使用した、3人の異なるドナー由来の初代T細胞の操作された組成物中のエフェクターメモリーCD45RA+細胞（CCR7-CD45RA+；EMRA）、ナイーブ様T細胞（CCR7+CD45RA+；NAIVE）、エフェクターメモリー（CCR7-CD45RA-；EM）およびセントラルメモリー（CCR7+CD45RA-；CM）を示していたCD4+CAR+ T細胞およびCD8+CAR+ T細胞の割合を示す。
【図３０】図30A〜30Dは、T細胞と抗CD3/抗CD28オリゴマー刺激試薬とを化合物63の存在下または非存在下でインキュベートすることのmTorシグナル伝達および生存率および成長動力学に対する例示的な効果を示す。図30Aは、メモリーサブセットによる生CD8+ T細胞におけるpS6発現を示す。図30Bは、示した通りの処置による総CD8 T細胞の平均蛍光強度（mfi）を示す。図30C〜30Dは、刺激の開始（「インプット」）後の培養中の経時的な（日数によって示されている；d1など）生存率および総T細胞数をそれぞれ示す。
【図３１】図31A〜31Fは、化合物63の存在下または非存在下での抗CD3/抗CD28オリゴマー刺激試薬とのインキュベーションを利用した方法を使用して生成された凍結保存されたCAR-T細胞の例示的な機能性および表現型特性を示す。図31Aは、融解時のカスパーゼの細胞内発現を示す。図31B〜31Dは、CD27および/またはCCR7のサブセット発現によるCD8 CAR-T細胞およびCD4 CAR-T細胞の表現型プロファイルをそれぞれ示す。図31C〜31Eは、抗原保有標的で刺激されたCD8 CAR-T細胞およびCD4 CAR-T細胞の中の細胞内IL-2、IFNγまたはTNF（左パネル）あるいはIL-2および/またはIFNγまたはTNFの組み合わせ（右パネル）をそれぞれ示す。図31Fは、抗CARビーズで刺激されたCAR-T細胞についての12日間にわたる拡大増殖および生存（左パネル）ならびに曲線下面積によって算出された総拡大増殖測定基準（右パネル）を示す。
【図３２】図32A〜32Cは、3人のドナーから採取された凍結保存されたアフェレーシス（CrAPH）または凍結保存されたT細胞選択材料（CMAT）を使用したプロセスについての各処理工程での、例示的な生存率（図32A）、総生存有核細胞（図32B）および累積下流収量（図32C）を示す。D5_HRPO、D5_WPRO、D5_FPROは、それぞれ、5日目に採取された細胞生成物、5日目に洗浄された細胞生成物、および5日目に製剤化された細胞生成物（例えば、製剤化された薬品）のことを指す。図32D〜32Fは、3人のドナー由来の処理された凍結保存（CrAPH）または新鮮アフェレーシス（CMAT）試料からの採取時（4日目または5日目）の細胞表現型の例示的な平均割合を示す。図32D〜32Fは、CD3+aCas3-細胞のCAR+細胞（図32D、上部パネル）、aCas3-CD4+細胞のCAR+細胞（図32D、下部左パネル）、aCas3-CD8+細胞のCAR+細胞（図32D、下部右パネル）、CD3+aCas3-細胞の採取産物（HRPO）総有核CAR+細胞（図32E）、aCas3-CD4+細胞のCAR+CD25+細胞（図32F、左パネル）、およびaCas3-CD8+細胞のCAR+CD25+細胞（図32F、右パネル）の例示的な平均割合を示す。
【図３３】図33は、刺激の開始から0時間、16時間、24時間または48時間の刺激インキュベーション時間で生成された、aCas3-CD4+CAR+細胞（上部パネル）およびaCas3-CD8+CAR+細胞（下部パネル）の例示的なメモリー表現型プロファイルを示す。
【図３４】図34A〜34Bは、異なるドナータイプ（参照、患者）を使用した拡大増殖および非拡大増殖操作プロセスについてのフローサイトメトリーによって判定された細胞表現型の例示的な定量を示す。細胞を、例示的な抗CD19 CAR（CD19）、例示的な抗BCMA CAR（BCMA）を発現するように操作したか、またはモック形質導入した（モック）。図34Aは、生CD45+細胞のCD3+CD8+およびCD3+CD4+細胞の割合（左パネル）、ならびにCD45+細胞のCD8+CAR+およびCD4+CAR+細胞の割合（右パネル）を示す。図34Bは、CD4+CAR+細胞：CD+CAR+細胞およびCD4+細胞：CD8+細胞の比を示す。
【図３５】図35は、拡大増殖または非拡大増殖操作プロセスによって生成された異なるドナータイプ（参照、患者）由来の細胞組成物の拡大増殖倍率を示す。細胞を、例示的な抗CD19 CAR（CD19）または例示的な抗BCMA CAR（BCMA）を発現するように操作した。
【図３６】図36A〜36Bは、異なるドナータイプ（参照、患者）を使用した拡大増殖および非拡大増殖操作プロセスから生じる細胞表現型の例示的な割合を示す。細胞を、例示的な抗CD19 CAR（CD19）、例示的な抗BCMA CAR（BCMA）を発現するように操作したか、またはモック形質導入した（モック）。図36A〜36Bは、aCAS-CD8+CAR+およびaCAS-CD4+CAR+細胞のCD45RA+CCR7+細胞（図36A、左上部パネル）、aCAS-CD8+CAR+およびaCas-CD4+CAR+細胞のCD45RA-CCR7+細胞（図36A、右上部パネル）、aCas-CD8+CAR+およびaCas-CD4+CAR+細胞のCD45RA-CCR7-細胞（図36A、左下部パネル）、aCAS-CD8+CAR+およびaCas-CD4+CAR+細胞のCD45RA+CCR7-細胞（図36A、右下部パネル）、ならびにaCAS-CD8+CAR+およびaCas-CD4+CAR+細胞のCD27+CCR7+細胞（図36B）の例示的な割合を示す。
【図３７】図37A〜37Bは、例示的な抗CD19 CAR（CD19 CAR T）または例示的な抗BCMA CAR（BCMA CAR T）を発現するように細胞を操作した、ドナーが一致した拡大増殖および非拡大増殖操作プロセスについてのフローサイトメトリーによる判定で示された場合の細胞表現型の例示的な定量を示す。
【図３８】図38は、抗ID抗体での長期CAR依存性刺激後の非拡大増殖プロセスまたは拡大増殖プロセスのいずれかから生成された細胞についての経時的な総生細胞の数および曲線下面積（AUC）を示す。図38は、抗CD19 CARを発現するように操作された細胞についての総生細胞計数およびAUCを示す。
【図３９】図39は、抗ID抗体での長期CAR依存性刺激後の非拡大増殖プロセスまたは拡大増殖プロセスのいずれかから生成された細胞についての経時的な総生細胞の数および曲線下面積（AUC）を示す。図39は、抗BCMA CARを発現するように操作された細胞についての総生細胞計数およびAUCを示す。
【図４０】図40A〜40Bは、異なるエフェクター：標的比での慢性刺激前（図40A）および慢性刺激後（図40B）の非拡大増殖または拡大増殖プロセスによって操作された抗CD19 CAR T細胞の細胞傷害能を示す。
【図４１】図41は、慢性刺激の前後のフローサイトメトリーによって測定されたIL-2、IFNγ、TNFおよびIL-2/IFNγ/TNFを発現する非拡大増殖または拡大増殖プロセスによって操作されたCAR+CD4+細胞およびCAR+CD8+細胞の例示的な割合を示す。
【図４２Ａ】図42A（左パネル）は、ドナーが一致した非拡大増殖および拡大増殖操作プロセスから生成された抗BCMA CAR-T細胞組成物での処置後の経時的な腫瘍量を示す。図42A（右パネル）は、各群についてのBLIの曲線下面積（AUC）から算出された-1日目（処置前）〜処置後50日目の腫瘍成長を示す。
【図４２Ｂ】図42Bは、ドナーが一致した非拡大増殖および拡大増殖操作プロセスから生成された細胞についての数日にわたる血液1μL当たりの抗BCMA CAR-T細胞の絶対数を示す。
【図４３Ａ】図43Aは、ドナーが一致した非拡大増殖および拡大増殖操作プロセスから生成されたより高い用量（上部パネル）およびより低い用量（下部パネル）の抗CD19 CAR-T細胞組成物での処置後数日にわたる腫瘍量を示す。
【図４３Ｂ】図43Bは、より高い用量（上部パネル）およびより低い用量（下部パネル）の抗CD19 CAR-T細胞で処置された各群についてのBLIの曲線下面積（AUC）から算出された-1日目（処置前）〜処置後50日目の腫瘍成長を示す。
【図４３Ｃ】図43Cは、ドナーが一致した非拡大増殖および拡大増殖操作プロセスから生成された細胞についての数日にわたる血液1μL当たりの抗CD19 CAR-T細胞の絶対数を示す。
【図４４】図44A〜44Dは、多種多様な非拡大増殖および拡大増殖操作プロセスを含む製造ランの間およびその後の総生細胞（図44A）、生存率（図44B）および表現型（図44Cおよび44D）を示す。
【図４５】図45Aは、拡大増殖プロセス（○）または非拡大増殖プロセス（●）を使用してCARを発現するように操作された異なるヒトドナー由来の初代T細胞から産生された細胞組成物における、標準VCN（PFGEなし）およびiVCN（PFGEあり）によって評価された場合の総細胞間の細胞1個当たりのコピー数の間の関係を示す。図45B〜45Cは、標準VCN（図45B）またはiVCN（図45C）によって評価された場合の細胞組成物における細胞1個当たりのコピー数と、フローサイトメトリーによって評価された生存CD45+細胞間のCAR発現CD3+細胞の割合（CD3+CAR+の％）によって示された場合のCARの表面発現との間の関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１７】
詳細な説明
本明細書において提供されるのは、組換えタンパク質、例えば、キメラ抗原受容体（CAR）または組換えT細胞受容体（TCR）などの組換え受容体を発現する、操作された細胞、例えば、操作されたT細胞の組成物を生成または産生するための方法である。いくつかの態様では、本方法は、細胞のインプット集団（本明細書においてインプット組成物とも称される）、例えば、初代T細胞の集団を刺激条件下でインキュベートする工程、次いで、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程の1つまたは複数の工程であるかそれを含む。特定の態様では、本方法は、インプット組成物中の細胞の刺激の開始後4日以内または数日以内などの一定時間内に完了するプロセスに関連して使用される。
【０１１８】
CARを発現する操作されたT細胞を生成するためのプロセスを含め、遺伝子操作されたT細胞集団を含有する組成物を生成するための様々なプロセスが利用可能である。ただし、特定の局面では、これらのプロセスのいくつかは、操作された細胞を生成するために長いまたは比較的長い期間を必要とし得る。加えて、様々な局面では、いくつかの既存のプロセスは、細胞療法に適した操作されたT細胞を首尾よく産生するのに必要な時間が変動し得るので、そのことが、細胞療法のその投与を調整することを困難にしている。ある特定の局面では、これらのプロセスのいくつかは、比較的高い割合または量の消耗した細胞、分化した細胞または低い効力を有する細胞を含む細胞の集団を産生し得る。操作されたT細胞を生成するための追加の方法が必要とされる。
【０１１９】
特定の態様では、提供される方法は、細胞療法における使用に適した操作された細胞を効率的に産生または生成するためのプロセスに関連して使用される。いくつかの態様では、操作された細胞を生成するための提供されるプロセスは、T細胞を刺激および遺伝子操作（例えば、形質転換、形質導入またはトランスフェクト）して、細胞療法のための組成物として使用するために収集または製剤化され得る操作されたT細胞の集団を産生するための1つまたは複数の工程を含有する。いくつかの局面では、本明細書において提供されるプロセスは、細胞を拡大増殖するための任意の追加の工程の必要なしに、例えば、拡大増殖単位操作なしにかつ/または細胞の拡大増殖を引き起こすことを意図した工程を含むことなしに、操作された細胞を首尾よく生成する。いくつかの局面では、提供される方法は、細胞を拡大増殖させることを伴うプロセスなどの代替プロセスから産生された操作されたT細胞組成物と比較して増強された効力を有する操作されたT細胞を生成する。
【０１２０】
特定の局面では、提供されるプロセスの期間は、インプット細胞集団またはインプット組成物の細胞、例えば、T細胞が、刺激条件（例えば、セクションI-Bなどにおける本明細書に記載されるような）に最初に接触または曝露されたときから測定することができ、これらの最初の接触または曝露は、本明細書において刺激または刺激することの開始と称され、また、本明細書において（例えば、刺激試薬に曝露させることが開始されたときなどの）刺激試薬に曝露させることとも称される。いくつかの態様では、操作された細胞を含有するアウトプット集団（本明細書においてアウトプット組成物とも、または操作された細胞、例えば、操作されたT細胞の組成物とも称される）を採取または収集するのに必要な期間は、刺激の開始から測定される。特定の態様では、プロセスの期間は、120時間、108時間、96時間、84時間、72時間、60時間、48時間、36時間もしくは30時間であるか、約120時間、108時間、96時間、84時間、72時間、60時間、48時間、36時間もしくは30時間であるか、または120時間、108時間、96時間、84時間、72時間、60時間、48時間、36時間もしくは30時間未満である。特定の態様では、プロセスの期間は、5日、4日、3日、2日もしくは1日であるか、約5日、4日、3日、2日もしくは1日であるか、または5日、4日、3日、2日もしくは1日未満である。特定の態様では、操作された細胞、例えば、アウトプット組成物または集団の細胞は、より長い時間を必要とするプロセスで操作された細胞よりも効力がある、持続的であるまたはナイーブ様である。いくつかの局面では、提供されるプロセスの期間、例えば、T細胞の操作された集団を生成または産生するのに必要な時間は、いくつかの既存のプロセスの時間よりも2日、3日、4日、5日、6日、7日もしくは7日超、約2日、3日、4日、5日、6日、7日もしくは7日超、または少なくとも2日、3日、4日、5日、6日、7日もしくは7日超短い。いくつかの態様では、提供されるプロセスの期間は、代替または既存のプロセスの75％、60％、50％、40％、30％、25％、15％もしくは10％であるか、約75％、60％、50％、40％、30％、25％、15％もしくは10％であるか、または75％、60％、50％、40％、30％、25％、15％もしくは10％未満である。
【０１２１】
ある特定の態様では、提供されるプロセスは、生体試料から単離、濃縮または選択される細胞、例えば、CD3+、CD4+および/またはCD8+ T細胞の集団に対して実施される。いくつかの局面では、提供される方法は、対象から生体試料が収集されてから他の方法またはプロセスと比較して短縮された時間内に、操作されたT細胞の組成物を産生または生成することができる。いくつかの態様では、提供される方法は、生体試料または濃縮、単離もしくは選択された細胞が凍結保存されて貯蔵される任意のまたはすべての時間を含め、対象から生体試料が収集されてから操作されたT細胞が収集、採取または製剤化（例えば、凍結保存または投与のために）されるまで、10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日もしくは2日以内または約10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日もしくは2日以内、あるいは120時間、96時間、72時間もしくは48時間以内または約120時間、96時間、72時間もしくは48時間以内に、操作されたT細胞を産生または生成することができる。
【０１２２】
ある特定の態様では、提供されるプロセスによって産生または生成された、操作されたT細胞、例えば、キメラ抗原受容体などの組換え受容体を発現するT細胞を含有するT細胞のアウトプット組成物または集団は、細胞療法のための細胞として利用されたときに特に有効または効力がある。例えば、いくつかの局面では、提供されるプロセスから生成された操作されたT細胞、例えば、CAR+ T細胞を含有するアウトプット組成物は、代替の既存プロセスによって生成または産生された操作されたT細胞よりもはるかに高度な効力および/または増殖能を有する。いくつかの局面では、提供されるプロセスによって産生された操作されたT細胞、例えば、CAR+ T細胞を含有するアウトプット組成物は、代替または既存の方法によって産生された操作されたT細胞、例えば、CAR+ T細胞よりも増強された抗腫瘍細胞活性または抗がん細胞活性を有する。
【０１２３】
特定の態様が想定していることは、提供されるプロセス、例えば、プロセスの間にT細胞の拡大増殖を含まないまたは必要としないプロセスによって産生された操作されたT細胞、例えば、CAR+ T細胞の集団が、いくつかの局面では、高度な効力または有効性の達成を成し遂げると予測されていないことである。細胞療法のためのT細胞を製造する既存の方法は、例えば、拡大増殖単位操作を含むおよび/または細胞の拡大増殖を引き起こすことを意図した工程を含むプロセスなど、細胞を拡大増殖させるためのプロセスを含むか、または例えば閾値密度までの細胞の拡大増殖を必要とする。ある特定の態様が想定していることは、拡大増殖が、操作されたT細胞への十分な量のベクター組み込みをもたらすのに必要であると予測されており、このことが、効力のあるまたは有効なCAR+ T細胞の集団を生成するために必要であると予想されていることである。ここで、実証されることは、例えば、提供されるプロセスのような、拡大増殖のための工程または条件を欠くプロセス（例えば、拡大増殖単位操作を欠くおよび/または細胞の拡大増殖を引き起こすことを意図した工程を含まないプロセス）によって、効力のあるまたは有効なCAR+ T細胞組成物を産生することができることである。いくつかの局面では、ベクター、例えば、ウイルスベクターの安定な組み込みの前に採取、収集または製剤化される操作された細胞は、効力のあるまたは有効なCAR+ T細胞の組成物を依然としてもたらす。ある特定の局面では、提供される方法によって産生されたCAR+ T細胞は、拡大増殖を含む代替プロセス（例えば、拡大増殖単位操作を含むおよび/または細胞の拡大増殖を引き起こすことを意図した工程を含むプロセス）から産生または生成されたCAR+ T細胞よりも効力がある、持続的であるまたは有効である。ある特定の態様は、ベクター組み込みが、細胞が収集、採取または製剤化されている間またはその後であっても継続して起こり得ることを想定している。
【０１２４】
また、本明細書において提供されるのは、細胞をオリゴマー刺激試薬で刺激することを含む、T細胞集団を産生または操作するためのプロセスである。外因性成長因子の非存在下または少量の外因性成長因子などインビトロでT細胞を刺激する際に使用するための既存の試薬が公知である（例えば、米国特許6,352,694 B1および欧州特許EP 0 700 430 B1を参照のこと）。一般に、そのような試薬は、様々な結合剤（例えば、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体）が固定されている直径1μmを超えるビーズ、例えば、磁気ビーズを利用し得る。しかしながら、場合によっては、そのような磁気ビーズは、例えば、臨床試験または治療目的に必要とされる条件下で細胞を刺激するための方法に組み込むことが困難である。なぜなら、拡大増殖されたT細胞を対象に投与する前にこれらの磁気ビーズが完全に除去されていることを確認しなければならないためである。いくつかの局面では、細胞を磁場に曝露させることなどによるそのような除去は、細胞療法に利用可能な生存細胞の収量を減少させる場合がある。ある特定の場合では、そのような試薬、例えば、磁気ビーズを含有する刺激試薬は、刺激試薬からの十分な量のT細胞の分離を可能にする最小限の時間、細胞とインキュベートさせなければならない。
【０１２５】
オリゴマー刺激試薬を利用する提供されるプロセスは、そのような潜在的な制限を克服する。例えば、いくつかの態様では、提供されるプロセスは、該プロセスによって生成または産生されたアウトプット細胞中の刺激試薬、例えば、磁気ビーズを含有する試薬の残留リスクを回避または低減させる。いくつかの態様では、このことはまた、最後の操作されたT細胞集団が確実にビーズ不含であるために追加の手段を講じなければならないような他の方法と比較して、GMP基準に準拠しているプロセスをより簡単に確立できることも意味している。いくつかの態様では、このことは、細胞からオリゴマー刺激試薬を、例えば、細胞を単にすすぐまたは洗浄することによって、例えば、遠心分離によって解離させる物質、例えば、競合試薬の添加によって、本態様において容易に成し遂げられ得る。したがって、いくつかの局面では、細胞からのオリゴマー刺激試薬の、例えば物質または競合試薬の添加による、除去または分離は、結果的に、ビーズ系刺激試薬の除去または分離と比較して、細胞喪失がほとんどないかまたは全くない。いくつかの局面では、オリゴマー刺激試薬の除去または分離のタイミングは、全く限定されないか、またはビーズ系刺激試薬の除去または分離よりも限定されることは少ない。したがって、いくつかの局面では、オリゴマー刺激試薬は、提供されるプロセスの間の任意の時点または段階に細胞から除去または分離されてよい。
【０１２６】
提供されるプロセスのいくつかの局面では、細胞は、基礎培地の存在下でのインキュベーション、例えば、異種または組換えタンパク質（例えば、CAR）をコードするウイルスベクターが導入されたT細胞のインキュベーションを伴うプロセスで、形質導入されるまたは形質導入に供される。ある特定の局面では、基礎培地は、追加の添加物（例えば、栄養素、ビタミンまたはアミノ酸）または任意の追加の組換えサイトカインもしくは成長因子を含有しない。ある特定の局面では、基礎培地は、組換えサイトカインまたは成長因子を含有しない。ある特定の局面では、基礎培地は、L-グルタミンなどのある特定の必須アミノ酸を含有し得るが、他のさらなる追加の添加物または組換えサイトカインを含有しない。いくつかの局面では、基礎培地の存在下でのインキュベーションは、例えば、補足培地、完全培地、血清を含有する培地または血清代替物を含有する培地の存在下でのインキュベーションと比較して、操作プロセスの間に行われ得る分化を低減させる。したがって、いくつかの局面では、基礎培地の存在下での、例えば、形質導入またはスピノキュレーション後のインキュベーションは、アウトプット組成物、例えば、CAR+ T細胞を含有する細胞の集団を含有する産生された細胞の組成物中のより分化の少ないナイーブ様細胞の部分を増加させる。
【０１２７】
中でも、本明細書において提供される知見は、T細胞を刺激するために典型的に利用される刺激試薬の量が低減されたなどの弱いまたは低減された刺激によって、より強い刺激条件またはより多くの量もしくは濃度の刺激試薬を伴うプロセスによって生成されたCAR+ T細胞と同じくらいまたはさらにより効力がある、持続的であるまたは有効である操作されたCAR+ T細胞を生成することができるという観察である。例えば、いくつかの態様では、より少ない量または比較的少ない量のオリゴマー刺激試薬で細胞を刺激することは、生じた操作された細胞集団の効力、有効性または持続性を、より多い量のオリゴマー刺激試薬を使用したプロセスと比較して増加させ得る。そのような態様は、そのような効果が、プロセスの間およびその後、活性化マーカーの発現または活性化マーカーに対して陽性の細胞の部分を低減させるのに十分に低い用量であっても持続し得ることを想定している。
【０１２８】
特定の態様では、提供される方法は、細胞を拡大増殖させないかまたは細胞を閾値量もしくは濃度まで拡大増殖させる工程を含有しない。いくつかの局面では、出発細胞集団、例えば、インプット集団から細胞の数または濃度を増加させるために細胞を拡大増殖させることに依拠しないプロトコルは、細胞集団間で変動し得るインキュベーションまたは培養を必要としない。例えば、いくつかの態様は、異なる疾患または疾患サブタイプを有する対象などの異なる対象から得られた細胞集団が異なる比率で分裂または拡大増殖し得ることを想定している。ある特定の局面では、細胞の拡大増殖を必要とする潜在的に変動可能な工程を排除することで、全プロセスの期間が厳密に管理可能となる。ある特定の態様では、プロセス期間の変動性が低減されるかまたは排除され、そのことで、いくつかの局面では、自己細胞療法を促進するための医師、患者および技術者の間の予約および処置の改善された調整が可能となり得る。
【０１２９】
本出願で言及される特許文書、科学論文およびデータベースを含むすべての刊行物は、あたかもそれぞれ個々の刊行物が参照により個別に組み入れられるのと同程度に、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み入れられる。本明細書に記載される定義が、参照により本明細書に組み入れられる特許、出願、公開された出願および他の刊行物に記載される定義と相反するか、そうでなければ矛盾する場合、本明細書に記載される定義が、参照により本明細書に組み入れられる定義よりも優先される。
【０１３０】
本明細書において用いられるセクションの見出しは、編成のみを目的としたものであり、記述されている主題を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１３１】
I．操作細胞を生成するためのプロセス
本明細書において提供されるのは、組換えタンパク質、例えば、T細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）などの組換え受容体を発現する、操作されたCD4+ TおよびCD8+ T細胞などの操作された細胞のアウトプット集団を生成するための方法である。ある特定の態様では、本明細書において提供される方法は、細胞療法の製造、生成または産生に関連して使用され、細胞の単離、分離、選択、活性化または刺激、形質導入、洗浄、懸濁、希釈、濃縮および/または製剤化のための工程などの追加の処理工程に関連して使用され得る。いくつかの態様では、操作された細胞、例えば、操作されたT細胞を生成または産生する方法は、対象から細胞を単離するための工程、細胞を刺激条件下でインキュベートするための工程、および細胞を遺伝子操作するための工程の1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、本方法は、生体試料から、インプット細胞、例えば、初代CD3+ T細胞、CD4+ T細胞および/またはCD8+ T細胞を最初に単離、例えば、選択または分離する；刺激条件下でインキュベートし、遺伝子操作して、例えば、形質導入またはトランスフェクションによって細胞に組換え受容体をコードする組換えポリヌクレオチドを導入する；次いで、容器、例えば、バッグまたはバイアルに、アウトプット集団として収集、採取または充填する順序で行われる処理工程を含む。本方法のいくつかの局面では、生体試料は、凍結保存された生体試料、例えば、凍結保存されたアフェレーシス産物であることができる。いくつかの態様では、アウトプット集団の細胞は、任意で細胞を凍結保存および貯蔵した後に、同じ対象に再導入される。いくつかの態様では、操作された細胞のアウトプット集団は、療法、例えば、自己細胞療法における使用に適する。
【０１３２】
特定の態様では、提供される方法は、細胞の初期またはインプット集団からの組換え受容体を発現する細胞のアウトプット集団の生成に関連して使用される。ある特定の態様では、インプット集団は、濃縮されたT細胞、濃縮されたCD3+ T細胞、濃縮されたCD4+ T細胞および/または濃縮されたCD8+ T細胞を含有する細胞の集団（以降、本明細書においてそれぞれ、濃縮されたT細胞の集団、濃縮されたCD3+ T細胞の集団、濃縮されたCD4+ T細胞の集団および濃縮されたCD8+ T細胞の集団とも称される）に由来するものを含めた細胞を組み合わせ、混合および/またはプールすることによって、産生、生成および/または製造される。いくつかの態様では、細胞のインプット集団は、CD3+ T細胞の集団であり、例えば、CD4+および/またはCD8+選択を伴わない。いくつかの態様では、細胞のインプット集団は、PBMCまたは白血球アフェレーシス試料などの出発試料からのCD3+ T細胞が濃縮された集団であり、ここで、出発試料は、CD4+および/またはCD8+選択に供されていない。いくつかの態様では、出発試料は、CD3+ T細胞が濃縮されたインプット集団を生成するために、CD3について選択され、別のマーカー（例えば、CD4および/またはCD8）についての任意の事前、同時または後続の選択を伴わない。いくつかの態様では、細胞のインプット集団は、CD3+ T細胞が濃縮され、そのインプット集団は、インプット集団を活性化もしくは刺激するまたは操作するなどの製造プロセスの工程に供される前に、さらなる選択、例えば、CD4+および/またはCD8+選択に供されない。いくつかの態様では、細胞のインプット集団は、組み合わせ、混合および/またはプールされたCD4+およびCD8+ T細胞の集団である。ある特定の態様では、提供される方法は、細胞、例えば、インプット集団の細胞を活性化または刺激する工程；活性化または刺激された細胞を遺伝子操作して、例えば、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを形質導入またはトランスフェクションによって導入する工程の1つまたは複数に関連して使用される。ある特定の態様では、本方法はまた、生体試料から、例えば、対象から採取、収集および/または得られた生体試料から細胞を単離または選択して、濃縮されたT細胞のインプット集団を生成することに関連して使用され得る。特定の態様では、提供される方法は、細胞がインキュベート、活性化、刺激、操作、形質導入および/または培養された後に、濃縮されたT細胞の集団を採取、収集および/または製剤化することに関連して使用され得る。
【０１３３】
ある特定の態様では、提供される方法は、細胞の拡大増殖をもたらすいかなる工程、段階または条件も含有しない。特定の態様では、インプット集団、例えば、濃縮されたCD3+ T細胞の出発集団（例えば、CD4および/またはCD8マーカーについての事前または同時選択を伴わない）、CD4+ T細胞の出発試料（例えば、実質的にCD8+ T細胞なし）、CD8+ T細胞の出発試料（例えば、実質的にCD4+ T細胞なし）、またはCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の出発集団の細胞は、操作された細胞の集団を生成するための提供される方法を受けながらも、拡大増殖しない。特定の態様では、アウトプット集団、例えば、提供されるプロセスによって遺伝子操作された細胞のアウトプット集団の細胞は、刺激条件下での培養の開始時など、インプット集団中の細胞の量と比較して、同じ、ほぼ同じ、低減されるまたは減少する。いくつかの局面では、出発細胞集団、例えば、インプット集団から細胞の数または濃度を増加させるために細胞を拡大増殖させることに依拠しないプロトコルは、細胞集団間で変動し得るインキュベーションまたは培養を必要としない。例えば、いくつかの態様は、異なる疾患または疾患サブタイプを有する対象などの異なる対象から得られた細胞集団が異なる比率で分裂または拡大増殖し得ることを想定している。ある特定の局面では、細胞の拡大増殖を必要とする潜在的に変動可能な工程を排除することで、全プロセスの期間が厳密に管理可能となる。
【０１３４】
いくつかの態様では、本方法は、細胞を刺激条件下でインキュベートすることなどによる細胞を刺激するための1つまたは複数の工程に関連して使用される。いくつかの局面では、そのような刺激条件は、細胞と刺激試薬、例えば、セクションI-B-1などにおける本明細書に記載される刺激試薬とを培養する工程であるかそれを含む。特定の態様では、設定されたまたは固定された量の細胞が、例えば、設定されたまたは固定された濃度で刺激される。ある特定の態様では、刺激する工程、例えば、細胞を刺激条件下で培養することは、2日未満の時間などの設定されたもしくは固定された時間、または18時間〜30時間の間の時間にわたり実施される。いくつかの局面では、刺激試薬で刺激する工程は、20時間±4時間または約20時間±4時間にわたり行われる。
【０１３５】
ある特定の態様では、本明細書において提供される方法は、例えば本明細書に記載される方法（例えば、セクションI-Cにおける）によって、異種または組換えポリヌクレオチドを細胞に導入すること、例えば、細胞を形質導入することまたはトランスフェクトすることに関連して実施される。特定の態様では、細胞は、細胞を遺伝子操作する間またはその後のいずれかに、例えば、組換えタンパク質をコードする異種もしくは組換えポリヌクレオチドの組み込みを可能にするまたは組換えタンパク質の発現を可能にするのに十分な時間にわたりインキュベートされる。ある特定の態様では、細胞は、設定されたまたは固定された時間、例えば18時間超または4日未満の時間、例えば、72時間±6時間インキュベートされる。提供される態様のいずれかにおいて、導入することは、細胞が刺激試薬で刺激された後に、細胞に対して行うことができる。いくつかの態様では、操作工程は、刺激することが開始または始動されたときから一定時間内に、例えば、刺激試薬が細胞に添加された、培養させたまたは接触させたときから30時間以内に開始または始動される。特定の態様では、操作工程は、刺激試薬が細胞に添加された、培養させたまたは接触させた後、18時間〜30時間の間、例えば、20時間±4時間の時点で開始または始動される。
【０１３６】
いくつかの態様では、1つまたは複数のプロセス工程は、少なくとも部分的に、無血清培地中で行われる。いくつかの態様では、無血清培地は、規定されたまたは正確に規定された細胞培養培地である。ある特定の態様では、無血清培地は、処理されている、例えば、阻害物質および/または成長因子を除去するために濾過されている、制御された培養培地である。いくつかの態様では、無血清培地は、タンパク質を含有する。ある特定の態様では、無血清培地は、血清アルブミン、加水分解物、成長因子、ホルモン、担体タンパク質および/または付着因子を含有し得る。
【０１３７】
いくつかの態様では、提供される方法は、臨床用途（例えば、養子細胞療法における）のための細胞の調製における1つ、複数またはすべての工程が細胞を非無菌状態に曝すことなく行われるように、行われる。いくつかの態様では、細胞は、いずれも閉鎖された無菌系またはデバイス内で、単離、分離または選択、形質導入、洗浄、任意で活性化または刺激および製剤化される。いくつかの態様では、工程の1つまたは複数は、閉鎖された系またはデバイスとは別に行われる。いくつかのそのような態様では、細胞は、別個の閉鎖系への無菌移送などにより、無菌条件下で閉鎖された系またはデバイスから離れて移送される。
【０１３８】
特定の態様では、濃縮されたT細胞の集団は、組換え受容体を発現する濃縮されたT細胞のアウトプット集団を生成するためのプロセスの任意の段階または工程の前、その間またはその後に、収集され、凍結保護のために製剤化され、0℃未満、-20℃未満、または-70℃もしくは-80℃または-70℃もしくは-80℃未満で、凍結され（例えば、凍結保護される）、および/または貯蔵してもよい。いくつかの態様では、細胞は、1日未満、2日未満、3日未満、4日未満、5日未満、6日未満、7日未満、8日未満、9日未満もしくは10日未満の期間にわたり、または1週間未満、2週間未満、3週間未満、4週間未満、5週間未満、6週間未満、7週間未満、8週間未満の期間にわたり、または少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間もしくは少なくとも8週間にわたり、または8週間超にわたり貯蔵され得る。貯蔵後、濃縮されたT細胞の集団を融解してもよく、プロセスの同じ時点から処理を再開してもよい。いくつかの態様では、濃縮されたT細胞のインプット集団は、さらなる処理、例えば、刺激条件下でのインキュベーションの前に、凍結保護および貯蔵される。特定の態様では、濃縮されたT細胞の培養および/または製剤化された集団は、例えば、自己細胞療法として対象に投与される前に凍結保護および貯蔵される。
【０１３９】
ある特定の態様では、本明細書において提供される方法は、細胞を刺激するための工程、次いで、組換え受容体（例えば、CAR）をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入するための工程を含むプロセスによって、操作された細胞が生成されるプロセスに関連して使用される。特定の態様では、刺激することは、18〜30時間、例えば、約24時間にわたり実施され、ポリヌクレオチドの導入がその後実施される。ある特定の態様では、細胞は、例えば、凍結保存のために製剤化されるかまたは対象に投与されるために、ポリヌクレオチドの導入が開始された後3日以内に、採取または収集される。様々な態様では、細胞は、例えば、凍結保存のために製剤化されるかまたは対象に投与されるために、刺激条件下でのインキュベーションが開始された後4日以内に、採取または収集される。
【０１４０】
特定の態様では、プロセスの任意の段階または工程で、細胞の一部がサンプリングまたは収集されてもよく、例えば、集団が閉鎖系に留まる間に、例えば、単離、インキュベーション、操作、培養および/または製剤化中に、T細胞の集団（濃縮されたT細胞の集団など）から細胞が採取されてもよい。ある特定の態様では、そのような細胞は、限定されないが生存率、アポトーシス、活性化、刺激、成長および/または消耗を含むメーカー、特徴または特性について分析されてもよい。いくつかの態様では、濃縮されたT細胞の集団が閉鎖系に留まる間に、自動化されたプロセスによって細胞がサンプリングまたは収集される。いくつかの態様では、サンプリングまたは収集された細胞の分析は自動化されている。特定の態様では、分析は、無菌条件下の閉鎖系において実施される。
【０１４１】
いくつかの態様では、提供される方法によって産生および/または処理された細胞または細胞の集団は、例示的なプロセスおよび/または代替プロセスによって処理または産生された細胞または細胞の集団と比較してもよい。ある特定の態様では、代替プロセスおよび/または例示的なプロセスは、1つまたは複数の特定の局面では異なり得るが、それ以外では、例示的なプロセスまたは代替プロセスと比較される提供される方法の態様または局面の類似または同じ特徴、局面、工程、段階、試薬または条件を含む。例えば、提供される方法によって生成された操作された細胞、例えば、非拡大増殖細胞のアウトプット集団を、細胞を拡大増殖する1つまたは複数の工程を伴うプロセスで生成された細胞と比較してもよい。いくつかの態様では、別段の指定がない限り、提供される方法と例示的なプロセスまたは代替プロセスは、単離、選択、濃縮、活性化、刺激、操作、トランスフェクション、形質導入、培養および/または製剤化のための類似または同一の工程を用いるなど、他の点では類似および/または同一であろう。いくつかの態様では、別段の指定がない限り、提供される方法と代替プロセスは、同じまたは類似のタイプの生体試料から細胞を単離、選択および/または濃縮し、かつ/あるいは、同じ細胞タイプの細胞および/またはインプット細胞を処理する。
【０１４２】
また、薬学的集団および製剤を含めた本方法によって調製された細胞および集団、ならびに方法を行うためのキット、システムおよび装置も提供される。さらに、養子細胞療法のための方法などの治療法を含めた本方法によって調製された細胞および集団の使用方法、ならびに対象に投与するための薬学的集団も提供される。
【０１４３】
A. 試料および細胞調製
特定の態様では、提供される方法は、生体試料から細胞を単離、選択または濃縮して、濃縮された細胞、例えば、T細胞の1つまたは複数のインプット集団を生成することに関連して使用される。いくつかの態様では、提供される方法は、生体試料、例えば、特定の疾患もしくは病状を有する、細胞療法を必要とするまたは細胞療法が投与される対象などの対象から得られるまたは対象に由来する生体試料からの、細胞またはその集団の単離を含む。いくつかの局面では、対象は、ヒト、例えば、細胞がそのために単離、処理および/または操作される養子細胞療法などの特定の治療的介入を必要とする患者である対象である。したがって、細胞は、いくつかの態様では、初代細胞、例えば、初代ヒト細胞である。試料は、組織、体液、および対象から直接採取された他の試料を含む。生体試料は、生物学的供給源から直接得られる試料、または処理される試料であることができる。生体試料は、限定されないが、体液、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗、組織および臓器の試料を含み、これらに由来する処理済み試料も含む。
【０１４４】
いくつかの局面では、試料は、血液もしくは血液由来試料であるか、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシス産物に由来する。例示的な試料は、全血、末梢血単核細胞（PBMC）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、大腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃腺もしくは他の臓器、および/またはそれらに由来する細胞を含む。試料は、細胞療法、例えば、養子細胞療法の状況下では、自己および同種の供給源由来の試料を含む。
【０１４５】
いくつかの例では、対象の循環血液由来の細胞は、例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。試料は、いくつかの局面では、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、および/または血小板を含むリンパ球を含有し、いくつかの局面では、赤血球細胞および血小板以外の細胞を含有する。
【０１４６】
いくつかの態様では、対象から収集された血液細胞は、例えば、血漿画分を除去するために、かつ、後続の処理工程のために細胞を適切な緩衝液または培地に入れるために、洗浄される。いくつかの態様では、細胞は、リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄される。いくつかの態様では、洗浄溶液は、カルシウムおよび/またはマグネシウムおよび/または多くのもしくはあらゆる二価カチオンを欠く。いくつかの局面では、洗浄工程は、製造業者の指示に従って、半自動化された「フロースルー」遠心分離機（例えば、Cobe 2991細胞プロセッサー、Baxter）によって達成される。いくつかの局面では、洗浄工程は、製造業者の指示に従って、接線流濾過（TFF）によって達成される。いくつかの態様では、細胞は、洗浄後、例えば、Ca++/Mg++を含まないPBSなどの多種多様な生体適合性緩衝液に再懸濁される。ある特定の態様では、血液細胞試料の成分が除去され、細胞が培養培地に直接再懸濁される。
【０１４７】
いくつかの態様では、細胞を含有する試料（例えば、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物）は、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスの間に添加されたヘパリンなどの1つまたは複数の抗凝固剤を除去するために洗浄される。
【０１４８】
いくつかの態様では、細胞を含有する試料（例えば、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（PBMC）試料、未分画T細胞試料、リンパ球試料、白血球細胞試料、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物）は、凍結保存および/または凍結保護（例えば、凍結）され、次いで、細胞の集団の単離、選択、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、インキュベーション、培養、採取、製剤化、および/または製剤化された細胞集団の対象への投与のための任意の工程の前に融解され、任意で洗浄される。
【０１４９】
いくつかの態様では、対象由来の自己末梢血単核細胞（PBMC）を含有する試料は、適切な製造品質を確保するのに適した方法において収集される。一局面では、PBMCを含有する試料は、分画された全血に由来する。いくつかの態様では、対象由来の全血は、白血球アフェレーシスによって、遠心力を使用し、細胞表現型間の密度差を利用して分画され、このとき、自己単核細胞（MNC）が優先的に濃縮される一方で、赤血球細胞などの他の細胞表現型は、収集された細胞組成物において低減される。いくつかの態様では、自己血漿がMNC収集の間に同時に収集され、それは、いくつかの局面では、白血球アフェレーシス産物の安定性の拡大を可能にすることができる。一局面では、自己血漿が白血球アフェレーシス産物に加えられ、白血球アフェレーシス産物マトリックスの緩衝能が改善される。いくつかの局面では、白血球アフェレーシス産物を生成するために処理される全血の総体積は、2L、4L、6L、8L、10L、12L、14L、16L、18Lもしくは20Lであるかまたは約2L、4L、6L、8L、10L、12L、14L、16L、18Lもしくは20Lであるか、あるいは、前述のいずれかの間の任意の値である。いくつかの態様では、収集された自己血漿の体積は、10mL、50mL、100mL、150mL、200mL、250mLもしくは300mL以上であるかまたは約10mL、50mL、100mL、150mL、200mL、250mLもしくは300mL以上であるか、あるいは、前述のいずれかの間の体積である。いくつかの態様では、白血球アフェレーシス産物は、白血球アフェレーシス収集完了の約48時間以内に、手順、例えば、プロセス内凍結保存のための洗浄および製剤化に供される。いくつかの態様では、白血球アフェレーシス産物は、例えば、白血球アフェレーシス収集完了の約2時間、6時間、12時間、18時間、24時間、36時間または48時間以内に、1つまたは複数の洗浄工程に供される。いくつかの局面では、1つまたは複数の洗浄工程は、白血球アフェレーシス収集中の抗凝固剤、白血球アフェレーシス産物中に蓄積され得る細胞廃棄物、残留血小板および/または細胞残屑を除去する。いくつかの態様では、1つまたは複数の緩衝液交換は、1つまたは複数の洗浄工程の間に実施される。
【０１５０】
特定の態様では、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物は、以下に記載されるように、凍結保存および/または凍結保護（例えば、凍結）され、次いで、細胞の選択または単離工程（例えば、T細胞の選択または単離工程）に供される前に融解される。いくつかの態様では、凍結保存および/または凍結保護されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物がT細胞の選択または単離工程に供された後、追加の凍結保存および/または凍結保護工程が、細胞の集団を活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、インキュベーション、培養、採取、製剤化、および/または製剤化された細胞集団を対象に投与する工程などのいずれかの後続の工程の最中または間に実施されることはない。例えば、融解された凍結保存および/または凍結保護されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物から選択されたT細胞は、T細胞活性化/刺激または形質導入などの下流プロセスのために融解され、任意で洗浄される前に、再び凍結保存および/または凍結保護されることはない。
【０１５１】
特定の態様では、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物は、凍結保存溶液または緩衝液中に、5×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mL、20×106個の細胞/mL、30×106個の細胞/mL、40×106個の細胞/mL、50×106個の細胞/mL、60×106個の細胞/mL、70×106個の細胞/mL、80×106個の細胞/mL、90×106個の細胞/mL、100×106個の細胞/mL、110×106個の細胞/mL、120×106個の細胞/mL、130×106個の細胞/mL、140×106個の細胞/mLもしくは150×106個の細胞/mL、約5×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mL、20×106個の細胞/mL、30×106個の細胞/mL、40×106個の細胞/mL、50×106個の細胞/mL、60×106個の細胞/mL、70×106個の細胞/mL、80×106個の細胞/mL、90×106個の細胞/mL、100×106個の細胞/mL、110×106個の細胞/mL、120×106個の細胞/mL、130×106個の細胞/mL、140×106個の細胞/mLもしくは150×106個の細胞/mL、または少なくとも5×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mL、20×106個の細胞/mL、30×106個の細胞/mL、40×106個の細胞/mL、50×106個の細胞/mL、60×106個の細胞/mL、70×106個の細胞/mL、80×106個の細胞/mL、90×106個の細胞/mL、100×106個の細胞/mL、110×106個の細胞/mL、120×106個の細胞/mL、130×106個の細胞/mL、140×106個の細胞/mLもしくは150×106個の細胞/mL、あるいは前述のいずれかの間の任意の値の密度で、凍結保存および/または凍結保護（例えば、凍結）される。いくつかの態様では、凍結保存溶液または緩衝液は、例えば、DMSO溶液（任意でヒト血清アルブミン（HSA）を含む）または他の好適な細胞凍結培地であるかそれを含有する。
【０１５２】
特定の態様では、凍結保存および/または凍結保護されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物がバンクされ（例えば、試料を凍結する前のT細胞選択を伴わない）、これにより、いくつかの局面では、後続の製造工程にさらに多くの柔軟性を与えることができる。いくつかの局面では、凍結保存および/または凍結保護されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物は、産物の処理において各々個別にまたは組み合わせて使用することができる複数の凍結保存容器（バッグなど）に分割される。例えば、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物中の生存細胞の総数が15×109個未満の細胞であるとき、凍結保存および/または凍結保護されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物は、4個の凍結保存容器（バッグなど）に分割される。いくつかの態様では、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物中の生存細胞の総数が15〜30×109個の細胞であるとき、凍結保存および/または凍結保護されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物は、8個の凍結保存容器（バッグなど）に分割される。
【０１５３】
一局面では、選択前に細胞をバンクすることにより、下流プロセスの細胞収量が増加し、細胞を早期にバンクすることは、それらの健康が向上し、製造成功基準を満たすのがさらに容易になる場合があることを意味し得る。別の局面では、一旦融解されると、凍結保存および/または凍結保護されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物は、1つまたは複数の異なる選択方法に供することができる。このアプローチの利点は、とりわけ、試料のドナーおよび/または別のレシピエントなどにおける対象の疾患または病状の治療のための細胞療法の細胞の利用可能性、有効性および/または他の側面を強化することである。
【０１５４】
いくつかの態様では、試料（例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料）は、ドナーが何らかの疾患または病状と診断された後の時点で、細胞選択の前に、または事前の細胞選択を伴わず（例えば、クロマトグラフィーによる選択などの事前のT細胞選択を伴わず）収集され、凍結保存および/または凍結保護される。いくつかの局面では、凍結保存の時期はまた、疾患もしくは病状に対する任意の初期治療、疾患もしくは病状に対する治療のために標識された任意の標的化治療もしくは任意の治療、または放射線および/または化学療法以外の任意の治療のうちの1つもしくは複数をドナーが受ける前である。いくつかの態様では、試料は、疾患の初期治療後の疾患の最初の再発の後、およびドナーまたは対象が疾患のためのその後の治療を受ける前に収集される。初期治療および/またはその後の治療は、細胞療法以外の療法であり得る。いくつかの態様では、収集された細胞は、初期治療および/またはその後の治療後の細胞療法に使用されてもよい。一局面では、事前の細胞選択を伴わず凍結保存および/または凍結保護された試料は、クロスオーバーして後に治療を必要とし得る無作為化臨床試験の非治療患者に関連するものなどの初期費用の削減に役立ち得る。
【０１５５】
いくつかの態様では、試料（例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料）は、疾患の第2選択治療後およびドナーまたは対象が疾患のためのその後の治療を受ける前の疾患の第2の再発後の時点で、細胞選択の前に、または事前の細胞選択を伴わず（例えば、クロマトグラフィーによる選択などの事前のT細胞選択を伴わず）収集され、凍結保存および/または凍結保護される。いくつかの態様では、患者は、例えば、特定の危険因子を評価することによって、第2選択治療の後に再発する可能性が高いと識別される。いくつかの態様では、危険因子は、ダブルヒットリンパ腫、原発性の難治性がん、または活性化B細胞リンパ腫などの疾患タイプおよび/または遺伝的特質に基づく。いくつかの態様では、危険因子は、第1選択治療後の早期再発、または治療後の他の予後不良指標（例えば、IPI（国際予後指数）＞2）などの臨床像に基づく。
【０１５６】
いくつかの態様では、試料（例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料）は、ドナーまたは対象が何らかの疾患と診断される前の時点で、細胞選択の前に、または事前の細胞選択を伴わず（例えば、クロマトグラフィーによる選択などの事前のT細胞選択を伴わず）収集され、凍結保存および/または凍結保護される。いくつかの局面では、ドナーまたは対象は、何らかの疾患を発症するリスクがあると判定されてもよい。いくつかの局面では、ドナーまたは対象は、健康な対象であり得る。ある特定の場合では、ドナーまたは対象は、何らかの疾患を発症するリスクまたは何らかの疾患と診断されるリスクがあると考えられることがなくても、細胞療法が人生のさらに後の段階で必要とされる場合に、細胞をバンクまたは保存することを選択してもよい。いくつかの態様では、ドナーまたは対象は、遺伝子変異、遺伝子異常、遺伝子破壊、家族歴、タンパク質異常（タンパク質産生および/またはプロセシングの欠陥など）、および何らかの疾患を発症するリスクを高め得るライフスタイルの選択などの因子に基づいて、何らかの疾患を発症するリスクがあると考えられる場合がある。いくつかの態様では、細胞は、予防薬として収集される。
【０１５７】
いくつかの態様では、細胞の凍結保存および/または凍結保護された試料（例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料）、例えば、事前の細胞選択に供されていない（例えば、クロマトグラフィーによる選択などの事前のT細胞選択を伴わない）細胞の試料は、12時間超、24時間超、36時間超もしくは48時間超または12時間、24時間、36時間もしくは48時に等しい期間、あるいは、0.5日超、1日超、1.5日超もしくは2日超または0.5日、1日、1.5日もしくは2日に等しい期間にわたり貯蔵またはバンクされる。いくつかの態様では、試料は、1週間超、2週間超、3週間超もしくは4週間超または1週間、2週間、3週間もしくは4週間に等しい期間にわたり貯蔵またはバンクされる。いくつかの態様では、試料は、長期貯蔵または長期バンクされる。いくつかの局面では、試料は、1カ月超、2カ月超、3カ月超、4カ月超、5カ月超、6カ月超、7カ月超、8カ月超、9カ月超、10カ月超、11カ月超、1年超、2年超、3年超、4年超、5年超、6年超、7年超、8年超、9年超、10年超、11年超、12年超、13年超、14年超、15年超、16年超、17年超、18年超、19年超、20年超、25年超、30年超、35年超、40年超もしくはそれ以上、または1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、7カ月、8カ月、9カ月、10カ月、11カ月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年もしくはそれ以上に等しい期間にわたり貯蔵される。
【０１５８】
いくつかの態様では、ドナーから採取されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料は、冷却環境で貯蔵施設または処理施設に輸送され、かつ/または、貯蔵施設で極低温保存されるか、処理施設で処理される。いくつかの態様では、試料は、輸送前に、例えば、CD3+ T細胞、CD4+ T細胞および/またはCD8+ T細胞などのT細胞を選択することによって処理される。いくつかの態様では、そのような処理は、試料を輸送後および極低温保存する前に実施される。いくつかの態様では、処理は、極低温保存に続いて試料を融解した後に実施される。
【０１５９】
ドナー、ひいてはその細胞が、疾患に対する広範囲な治療を受けていない段階、および/あるいは、疾患もしくは病状の発症またはその診断の前の段階で、ドナーがその細胞を貯蔵することを可能にすることによって、そのような細胞は、1回または複数回の治療の後に採取された細胞と比較して、細胞療法における使用に対して特定の利点を有し得る。例えば、1回または複数回の治療の前に採取された細胞の方が、数回の治療を受けた細胞よりも健康であり得る、高いレベルの特定の細胞活性を示し得る、迅速に増殖し得る、および/または遺伝子操作に対して受容的であり得る。本明細書に記載される態様による利点の別の例には、利便性が含まれ得る。例えば、細胞療法に必要とされる前にドナーの細胞を収集し、任意で処理し、貯蔵することにより、レシピエントが後にそれらを必要とする場合に、細胞は容易に利用可能となる。これにより、アフェレーシス検査室の容量が増加し、技術者がアフェレーシス収集プロセスの予定を決める際の柔軟性が高まる。
【０１６０】
アフェレーシス試料などの試料由来の細胞を極低温保存および処理するための例示的な方法およびシステムには、WO2018170188に記載されているものが含まれ得る。いくつかの態様では、本方法およびシステムは、患者が細胞療法を必要とする前にアフェレーシスを収集する工程、次いで、組換え受容体（例えば、CAR）を用いて細胞（例えば、T細胞）を操作するプロセスで後に使用するために、アフェレーシス試料を凍結保存する工程を伴う。場合によっては、そのようなプロセスは、本明細書に記載されるプロセスを含むことができる。いくつかの態様では、対象からアフェレーシス試料が収集され、その後のT細胞選択、細胞の集団の活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、インキュベーション、培養、採取、製剤化、および/または製剤化された細胞集団の対象への投与の前に凍結保存される。そのような例では、凍結保存されたアフェレーシス試料は、試料を本明細書に記載されるいずれかなどの1つまたは複数の選択工程に供する前に融解される。
【０１６１】
いくつかの態様では、細胞の凍結保存および/または凍結保護された試料（例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料）、例えば、事前の細胞選択に供されていない（例えば、クロマトグラフィーによる選択などの事前のT細胞選択を伴わない）細胞の試料は、細胞療法のための細胞集団、例えば、CAR+ T細胞を含有するT細胞集団を製造するための下流プロセスに使用する前に融解される。いくつかの態様では、そのような細胞の凍結保存および/または凍結保護された試料（例えば、アフェレーシス試料または白血球アフェレーシス試料）は、CAR+ T細胞療法などの操作されたT細胞療法のための、本明細書において提供されるプロセスに関連して使用される。特定の例では、採取/製剤化工程の前またはその間に、凍結保存のさらなる工程は行われない。
【０１６２】
1. T細胞選択
いくつかの態様では、細胞または集団の選択、単離または濃縮は、1つまたは複数の調製および/または非親和性ベースの細胞分離工程を含む。いくつかの例では、細胞は、洗浄、遠心分離、および/または1つもしくは複数の試薬の存在下でインキュベートして、例えば、不要な成分を除去し、所望の成分を濃縮し、特定の試薬に感受性のある細胞を溶解または除去する。いくつかの例では、密度、付着特性、サイズ、感度および/または特定の成分に対する耐性などの1つまたは複数の特性に基づいて、細胞が分離される。いくつかの態様では、本方法は、赤血球細胞を溶解することによる末梢血からの白血球細胞の調製、およびパーコール勾配またはフィコール勾配による遠心分離などの密度に基づく細胞分離法を含む。ある特定の態様では、選択、単離および濃縮のための方法、技法および試薬が、例えば、WO2013124474およびWO2015164675に記載されており、それらの特許は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１６３】
いくつかの態様では、凍結保存および/または凍結保護されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物が融解される。いくつかの態様では、融解された細胞組成物は、希釈（例えば、無血清培地による）および/または洗浄（例えば、無血清培地による）に供され、このことは、場合によっては、不要なまたは望ましくない成分を除去または低減させることができる。場合によっては、希釈および/または洗浄は、融解された試料中に含有される、別の面で細胞の生存率、収量、長期室温曝露時の回収率に負の影響を及ぼし得る、凍結保護物質、例えば、DMSOの存在を除去または低減する。いくつかの態様では、希釈および/または洗浄は、無血清培地、例えば、本明細書のセクションIIに記載されるものまたは参照により本明細書に組み入れられるPCT/US2018/064627に記載されるものへの、融解された凍結保存産物の培地交換を可能にする。
【０１６４】
いくつかの態様では、無血清培地は、1つまたは複数のサプリメントが補充された基礎培地（例えば、OpTmizer（商標）T-Cell Expansion Basal Medium（ThermoFisher））を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数のサプリメントは、無血清である。いくつかの態様では、無血清培地は、例えば追加のサプリメント（例えば、OpTmizer（商標）T-Cell Expansion Supplement（ThermoFisher））によって提供される、細胞（例えば、T細胞）の維持、拡大増殖および/または活性化のための1つまたは複数の追加の成分が補充された基礎培地を含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、血清代替サプリメント、例えば、免疫細胞血清代替物、例えば、CTS（商標）Immune Cell Serum Replacement（ThermoFisher、#A2596101）、またはSmith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31に記載されている免疫細胞血清代替物を含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、L-グルタミンなどのアミノ酸の遊離形態を含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、L-グルタミンのジペプチド形態（例えば、L-アラニル-L-グルタミン）、例えば、Glutamax（商標）（ThermoFisher）中のジペプチドを含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、1つまたは複数の組換えサイトカイン、例えば、組換えヒトIL-2、組換えヒトIL-7、および/または組換えヒトIL-15を含む。
【０１６５】
いくつかの態様では、選択工程の少なくとも一部は、細胞と選択試薬とのインキュベーションを含む。表面マーカー、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカーまたは核酸などの1つまたは複数の特異的分子の細胞内または細胞上の発現または存在に基づいて1つまたは複数の異なる細胞型を選択するための1つまたは複数の選択試薬を使用して行われ得る選択方法の一部としての単数または複数の選択試薬とのインキュベーション。いくつかの態様では、そのようなマーカーに基づく分離のための単数または複数の選択試薬を使用する任意の公知の方法が使用され得る。いくつかの態様では、単数または複数の選択試薬は、親和性または免疫親和性に基づく分離である分離をもたらす。例えば、いくつかの局面では、選択は、1つまたは複数のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞の発現または発現レベルに基づく細胞および細胞集団を分離するための単数または複数の試薬とのインキュベーションを含み、これは、例えば、抗体とのインキュベーション、またはそのようなマーカーと特異的に結合する結合パートナーとのインキュベーション、続いて、一般に洗浄工程、および抗体または結合パートナーに結合していない細胞から抗体または結合パートナーに結合した細胞を分離することによる。
【０１６６】
そのようなプロセスのいくつかの局面では、ある体積の細胞が、ある量の所望の親和性に基づく選択試薬と混合される。免疫親和性に基づく選択は、分離される細胞と、細胞上のマーカー、例えば、固体表面の抗体または他の結合パートナー、例えば、粒子に特異的に結合する分子との間の有利なエネルギー的な相互作用をもたらす任意のシステムまたは方法を使用して行うことができる。いくつかの態様では、方法は、細胞のマーカーに特異的な選択剤（例えば抗体）によってコーティングされたビーズ、例えば、磁性ビーズなどの粒子を使用して行われる。粒子（例えばビーズ）は、エネルギー的に有利な相互作用を促進するために一定の細胞密度と粒子（例えばビーズ）との比で、チューブまたはバッグなどの容器内の細胞とともに、振盪または混合しながら、インキュベートまたは混合することができる。他の場合では、方法は、選択の全部または一部が、例えば、遠心回転下で、遠心チャンバの内部キャビティ内で行われる、細胞の選択を含む。いくつかの態様では、細胞と、選択試薬、例えば、免疫親和性に基づく選択試薬とのインキュベーションは、遠心チャンバ内で行われる。特定の態様では、単離または分離は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号WO2009/072003またはUS20110003380A1に記載されているシステム、デバイスまたは装置を使用して行われる。一例では、システムは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開番号WO2016/073602に記載されているシステムである。
【０１６７】
いくつかの態様では、遠心チャンバのキャビティ内でそのような選択工程またはその一部（例えば、抗体被覆粒子、例えば、磁性ビーズとのインキュベーション）を行うことによって、使用者は、様々な溶液の体積、処理中の溶液の追加、およびそのタイミングなどの特定のパラメータを制御することができ、これは、他の利用可能な方法と比較して利点を提供することができる。例えば、インキュベーション中にキャビティ内の液体の体積を減少させる機能により、キャビティ内の細胞の総数に影響を与えることなく、選択に使用される粒子（例えばビーズ試薬）の濃度、ひいては溶液の化学ポテンシャルを増加させることができる。これにより、処理されている細胞と選択に使用される粒子との間の対の相互作用を強化することができる。いくつかの態様では、例えば、本明細書において記載されるシステム、回路および制御と関連する場合にチャンバ内でインキュベーション工程を行うことにより、使用者はインキュベーション中の所望の時間に溶液を撹拌することができ、これにより、相互作用を改善することもできる。
【０１６８】
いくつかの態様では、細胞と選択試薬とのインキュベーションを含む選択工程の少なくとも一部は、遠心チャンバ内で行われる。そのようなプロセスのいくつかの局面では、ある体積の細胞と、製造業者の指示に従って同一の数の細胞および/または体積の細胞を選択するためにチューブまたは容器内で同様の選択を行う際に通常使用される量よりもはるかに少ない量の所望の親和性に基づく選択試薬とが混合される。いくつかの態様では、製造業者の指示に従って、同一の数の細胞および/または同一の体積の細胞について、チューブまたは容器ベースのインキュベーションでの細胞の選択に使用される同一の選択試薬の量の5％以下、10％以下、15％以下、20％以下、25％以下、50％以下、60％以下、70％以下、または80％以下である単数または複数の選択試薬の量が使用される。
【０１６９】
いくつかの態様では、選択、例えば、細胞の免疫親和性に基づく選択のために、チャンバのキャビティ内で、濃縮および/または枯渇が望まれる細胞上の表面マーカーに特異的に結合するが、集団中の他の細胞上の表面マーカーには結合しない分子、例えば、ポリマーまたは表面、例えばビーズ、例えば磁性ビーズ、例えば、CD3、CD4、およびCD8に特異的なモノクローナル抗体に結合した磁性ビーズなどの足場に任意で結合した抗体などの選択試薬を含む選択緩衝液も含有する集団中で細胞がインキュベートされる。いくつかの態様では、記載されるように、振盪または回転させながらチューブ内で選択が行われる場合に、同一の数の細胞または同一の体積の細胞を選択するのとほぼ同じまたは類似の効率を達成するのに通常使用されるか、必要であろう選択試薬の量と比較して、実質的にそれよりも少ない量（例えば、その量の5％以下、10％以下、20％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下もしくは80％以下）で、チャンバのキャビティ内で細胞に選択試薬が加えられる。いくつかの態様では、インキュベーションは、細胞および選択試薬に選択緩衝液を加えることにより行われて、例えば、10mL〜200mL、例えば、少なくとも10mL、少なくとも20mL、少なくとも30mL、少なくとも40mL、少なくとも50mL、少なくとも60mL、少なくとも70mL、少なくとも80mL、少なくとも90mL、少なくとも100mL、少なくとも150mLもしくは少なくとも200mL、または少なくとも約10mL、少なくとも約20mL、少なくとも約30mL、少なくとも約40mL、少なくとも約50mL、少なくとも約60mL、少なくとも約70mL、少なくとも約80mL、少なくとも約90mL、少なくとも約100mL、少なくとも約150mLもしくは少なくとも約200mL、または約10mL、約20mL、約30mL、約40mL、約50mL、約60mL、約70mL、約80mL、約90mL、約100mL、約150mLもしくは約200mL、または10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mLもしくは200mLの試薬のインキュベーションにより標的体積を達成する。いくつかの態様では、選択緩衝液および選択試薬は、細胞に加える前に予め混合される。いくつかの態様では、選択緩衝液および選択試薬は、細胞に別個に加えられる。いくつかの態様では、選択インキュベーションは、エネルギー的に有利な相互作用を促進するのを助け、それにより、高い選択効率を達成しながら比較的少ない全体的な選択試薬の使用を可能にし得る、周期的な穏やかな混合条件により行われる。
【０１７０】
いくつかの態様では、選択試薬とのインキュベーションの総持続時間は、5分〜6時間または約5分〜6時間、例えば、30分〜3時間、例えば、少なくとも30分、少なくとも60分、少なくとも120分もしくは少なくとも180分、または少なくとも約30分、少なくとも約60分、少なくとも約120分もしくは少なくとも約180分である。
【０１７１】
いくつかの態様では、インキュベーションは、一般に、スピンの存在下などの混合条件下で、一般に、細胞をペレット化するのに使用される速度よりも遅い速度などの比較的低い力または速度で、例えば、600rpm〜1700rpmまたは約600rpm〜1700rpm（例えば、600rpm、1000rpm、もしくは1500rpmもしくは1700rpm、または約600rpm、約1000rpm、もしくは約1500rpmもしくは約1700rpm、または少なくとも600rpm、少なくとも1000rpm、もしくは少なくとも1500rpmもしくは少なくとも1700rpm）で、例えば、80g〜100gまたは約80g〜約100g（例えば、80g、85g、90g、95gもしくは100g、または約80g、約85g、約90g、約95gもしくは約100g、または少なくとも80g、少なくとも85g、少なくとも90g、少なくとも95gもしくは少なくとも100g）の試料またはチャンバもしくは他の容器の壁でのRCFで行われる。いくつかの態様では、スピンは、静止期間が後に続くこのような低速でのスピンの繰り返される間欠期を使用して、例えば、1秒間、2秒間、3秒間、4秒間、5秒間、6秒間、7秒間、8秒間、9秒間または10秒間のスピンおよび/または静止、例えば、約1秒または2秒のスピンの後に約5秒間、約6秒間、約7秒間または約8秒間静止することを使用して行われる。
【０１７２】
いくつかの態様では、そのようなプロセスは、チャンバが一体化されている完全閉鎖系内で行われる。いくつかの態様では、このプロセス（およびいくつかの局面ではまた、アフェレーシス試料などの細胞を含有する試料を洗浄する先行する洗浄工程などの1つまたは複数の追加の工程）は、自動プログラムを使用して、細胞、試薬および他の成分を適当な時間にチャンバに引き込み、押し出し、遠心分離を行って、単一の閉鎖系で洗浄および結合工程を完了するように、自動的に行われる。
【０１７３】
いくつかの態様では、細胞および選択試薬および/または試薬のインキュベーションおよび/または混合の後、インキュベートされた細胞は、特定の単数または複数の試薬の有無に基づいて細胞を選択するために分離される。いくつかの態様では、分離は、細胞と選択試薬とのインキュベーションが行われたのと同じ閉鎖系内で行われる。いくつかの態様では、選択試薬とのインキュベーション後、選択試薬が結合した細胞を含むインキュベートされた細胞は、細胞の免疫親和性に基づく分離のための系に移される。いくつかの態様では、免疫親和性に基づく分離のための系は、磁気分離カラムであるか、それを含む。
【０１７４】
そのような分離工程は、抗体または結合パートナーなどの試薬と結合した細胞がその後の使用のために保持される陽性選択、および/または抗体または結合パートナーなどの試薬に結合していない細胞が保持される陰性選択に基づくことができる。いくつかの例では、両画分がその後の使用のために保持される。いくつかの局面では、所望の集団以外の細胞が発現させるマーカーに基づいて分離が最もよく行われるように、異種集団内の細胞型を特異的に同定する陰性選択が、抗体が利用可能でない場合に特に有用であり得る。
【０１７５】
いくつかの態様では、プロセス工程は、例えば、親和性に基づく選択を行うことができる系または装置を使用する、インキュベートされた細胞の陰性選択および/または陽性選択をさらに含む。いくつかの態様では、単離は、陽性選択による特定の細胞集団の濃縮、または陰性選択による特定の細胞集団の枯渇によって行われる。いくつかの態様では、陽性選択または陰性選択は、それぞれ陽性または陰性に選択された細胞に発現した、または比較的高いレベル（マーカーhigh）で発現（マーカー＋）した1つまたは複数の表面マーカーに特異的に結合する1つもしくは複数の抗体または他の結合剤と細胞をインキュベートすることによって達成される。
【０１７６】
分離は、特定の細胞集団、または特定のマーカーを発現する細胞の100％の濃縮または除去をもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現する細胞などの特定の種類の細胞の陽性選択または濃縮は、そのような細胞の数または割合を増加させることを示すが、マーカーを発現しない細胞が完全な不在をもたらす必要はない。同様に、マーカーを発現する細胞などの特定の種類の細胞の陰性選択、除去、または枯渇は、そのような細胞の数または割合を減少させることを示すが、そのような細胞いずれもが完全に除去される必要はない。
【０１７７】
いくつかの例では、複数回の分離工程が行われ、この分離工程では、1つの工程から陽性または陰性に選択された画分が、後続の陽性選択または陰性選択などの別の分離工程に供される。いくつかの例では、単一の分離工程によって、陰性選択の標的となるマーカーにそれぞれ特異的な複数の抗体または結合パートナーとともに細胞をインキュベートすることなどによって、複数のマーカーを同時に発現する細胞を枯渇させることができる。同様に、様々な細胞型に発現された複数の抗体または結合パートナーとともに細胞をインキュベートすることによって、複数の細胞型を同時に陽性に選択することができる。特定の態様では、分離工程は繰り返され、およびまたは2回以上行われ、この分離工程では、1つの工程から陽性または陰性に選択された画分が、繰り返される陽性選択または陰性選択などの同じ分離工程に供される。いくつかの例では、例えば、選択された細胞の純度を高めるため、および/または陰性に選択された画分から陰性に選択された細胞をさらに除去する、および/または枯渇させるために、単一の分離工程が繰り返され、および/または2回以上行われる。特定の態様では、1つまたは複数の分離工程は、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、または10回超行われる。特定の態様では、1つまたは複数の選択工程は、1回〜10回、1回〜5回または3回〜5回行われ、および/または繰り返される。
【０１７８】
例えば、いくつかの局面では、T細胞、例えば、1つまたは複数の表面マーカーが陽性であるか発現レベルが高い細胞、例えば、CD28＋T細胞、CD62L＋T細胞、CCR7＋T細胞、CD27＋T細胞、CD127＋T細胞、CD3＋T細胞、CD4＋T細胞、CD8＋T細胞、CD45RA＋T細胞および/またはCD45RO＋T細胞の特定の亜集団が、陽性選択技術または陰性選択技術によって単離される。いくつかの態様では、そのような細胞は、そのようなマーカーに特異的に結合する1つまたは複数の抗体または結合パートナーとのインキュベーションによって選択される。いくつかの態様では、抗体または結合パートナーは、磁性ビーズまたは常磁性ビーズなど、選択をもたらすための固体支持体またはマトリックスに、例えば、直接または間接的にコンジュゲートすることができる。例えば、CD3＋T細胞、CD28＋T細胞は、CD3/CD28がコンジュゲートした磁性ビーズ（例えば、DYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expander、および/またはExp ACT（登録商標）ビーズ）を使用して陽性に選択することができる。
【０１７９】
いくつかの態様では、T細胞は、B細胞、単球または他の白血球細胞、例えば、CD14などの非T細胞に発現されるマーカーの陰性選択によって、PBMC試料から分離される。いくつかの局面では、PBMCまたは白血球アフェレーシス試料などの出発試料からCD3+ T細胞が濃縮された集団を生成するためにCD3+選択工程が使用され、ここで、出発試料は、CD4および/またはCD8などの別のマーカーに基づく陽性または陰性選択に供されていない。いくつかの態様では、出発試料は、CD3+ T細胞が濃縮されたインプット集団を生成するために、別のマーカー（例えば、CD4および/またはCD8）についての任意の事前、同時または後続の選択を伴わず、CD3について選択される。いくつかの態様では、細胞のインプット集団は、CD3+ T細胞が濃縮され、そのインプット集団は、インプット集団を活性化もしくは刺激するまたは操作するなどの製造プロセスの工程に供される前に、さらなる選択、例えば、CD4+および/またはCD8+選択に供されない。ある特定の態様では、CD3+ T細胞が濃縮されたインプット集団は、1：10〜10：1の間、1：5〜5：1の間、4：1〜1：4の間、1：3〜3：1の間、2：1〜1：2の間、1.5：1〜1：1.5の間、1.25：1〜1：1.25の間、1.2：1〜1：1.2の間、1.1：1〜1：1.1の間、または約1：1または1：1のCD4+ T細胞：CD8+ T細胞比を有する。
【０１８０】
いくつかの態様では、T細胞は、B細胞、単球または他の白血球細胞、例えば、CD14などの非T細胞に発現されるマーカーの陰性選択によって、PBMC試料から分離される。いくつかの局面では、CD4＋ヘルパーT細胞およびCD8＋細胞傷害性T細胞を分離するために、CD4＋またはCD8＋選択工程が使用される。そのようなCD4＋およびCD8＋集団は、1つまたは複数のナイーブ様、メモリーおよび/またはエフェクターT細胞亜集団に発現されるか比較的高度に発現されるマーカーに対する陽性選択または陰性選択によって、亜集団にさらに分類することができる。
【０１８１】
いくつかの態様では、例えば、それぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づく陽性選択または陰性選択によって、CD8＋細胞では、ナイーブ幹細胞、セントラルメモリー幹細胞、エフェクターメモリー幹細胞および/またはセントラルメモリー幹細胞がさらに濃縮または枯渇される。いくつかの態様では、セントラルメモリーT（TCM）細胞の濃縮は、投与後の長期生存、拡大増殖および/または生着を改善するなど、効果を高めるために行われ、これはいくつかの局面では、そのような亜集団において特にロバストである。Terakura et al.,（2012）Blood. 1: 72-82; Wang et al.（2012）J Immunother. 35（9）:689-701を参照されたい。いくつかの態様では、TCMに富むCD8＋T細胞とCD4＋T細胞とを組み合わせると、効果がさらに高まる。
【０１８２】
態様では、メモリーT細胞は、CD8＋末梢血リンパ球のCD62L＋およびCD62L-の両サブセットに存在する。PBMCでは、抗CD8抗体および抗CD62L抗体を使用するなどして、CD62L-CD8＋画分および/またはCD62L＋CD8＋画分を濃縮または枯渇させることができる。
【０１８３】
いくつかの態様では、セントラルメモリーT（TCM）細胞の濃縮は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3および/またはCD127の陽性発現または高い表面発現に基づき、いくつかの局面では、CD45RAおよび/またはグランザイムBを発現するか、高度に発現する細胞の陰性選択に基づく。いくつかの局面では、TCM細胞が濃縮されたCD8＋集団の単離は、CD4、CD14、CD45RAを発現する細胞の枯渇、およびCD62Lを発現する細胞の陽性選択、または濃縮によって行われる。一局面では、セントラルメモリーT（TCM）細胞の濃縮は、CD14およびCD45RAの発現に基づく陰性選択と、CD62Lに基づく陽性選択とに供される、CD4の発現に基づいて選択された細胞の陰性の画分から開始して行われる。そのような選択は、いくつかの局面では同時に行われ、他の局面ではいずれかの順序で連続して行われる。いくつかの局面では、CD8＋細胞集団または亜集団を調製するのに使用されたのと同じCD4の発現に基づく選択工程はまた、CD4に基づく分離からの陽性および陰性の画分の両方が保持され、方法の後続の工程に使用されるように、CD4＋細胞集団または亜集団を生成するために使用され、任意で、1つまたは複数の追加の陽性選択または陰性選択の工程が続く。いくつかの態様では、CD4＋細胞集団の選択およびCD8＋細胞集団の選択は同時に行われる。いくつかの態様では、CD4＋細胞集団、およびCD8＋細胞集団の選択は、いずれかの順序で連続して行われる。いくつかの態様では、細胞を選択するための方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる公開された米国特許出願第20170037369号に記載のものを含み得る。いくつかの態様では、選択されたCD4＋細胞集団および選択されたCD8＋細胞集団を選択後に組み合わせてもよい。いくつかの局面では、選択されたCD4＋細胞集団および選択されたCD8＋細胞集団は、本明細書において記載されるバイオリアクターバッグ内で組み合わされてもよい。
【０１８４】
特定の態様では、生体試料、例えば、PBMCまたは他の白血球細胞の試料は、陰性および陽性の画分の両方が保持されるCD4＋T細胞の選択に供される。特定の態様では、CD8＋T細胞は陰性の画分から選択される。いくつかの態様では、生体試料は、陰性および陽性の画分の両方が保持されるCD8＋T細胞の選択に供される。特定の態様では、CD4＋T細胞は陰性の画分から選択される。
【０１８５】
いくつかの局面では、PBMCまたは白血球アフェレーシス試料などの出発試料からCD8+ T細胞が濃縮された集団を生成するためにCD8に基づく陽性選択工程が使用され、ここで、出発試料は、CD3+および/またはCD4+などの別のマーカーに基づく選択に供されていない。いくつかの態様では、CD8陽性選択工程由来の陰性および陽性の両画分が保持され、CD8陰性画分がさらに、CD4+ T細胞が濃縮された集団を生成するためにCD4に基づく陽性選択工程に供される。いくつかの態様では、CD8+ T細胞が濃縮された集団由来の細胞およびCD4+ T細胞が濃縮された集団由来の細胞が混合、組み合わせおよび/またはプールされ、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含有するインプット集団を生成する。ある特定の態様では、CD8+ T細胞が濃縮された集団およびCD4+ T細胞が濃縮された集団が、細胞を刺激する、例えば、セクションI-Bに記載されているような細胞を刺激条件下で培養する前に、プール、混合および/または組み合わされる。ある特定の態様では、プール、混合および/または組み合わされた細胞または集団は、1：10〜10：1の間、1：5〜5：1の間、4：1〜1：4の間、1：3〜3：1の間、2：1〜1：2の間、1.5：1〜1：1.5の間、1.25：1〜1：1.25の間、1.2：1〜1：1.2の間、1.1：1〜1：1.1の間、または約1：1もしくは1：1のCD4+ T細胞：CD8+ T細胞比を有する。ある特定の態様では、細胞または集団は、プール、混合および/または組み合わされた細胞組成物中1：1または約1：1のCD4+ T細胞：CD8+ T細胞比を有するように、プール、混合および/または組み合わされる。
【０１８６】
いくつかの局面では、PBMCまたは白血球アフェレーシス試料などの出発試料からCD4+ T細胞が濃縮された集団を生成するためにCD4に基づく陽性選択工程が使用され、ここで、出発試料は、CD3+および/またはCD8+などの別のマーカーに基づく選択に供されていない。いくつかの態様では、CD4陽性選択工程由来の陰性および陽性の両画分が保持され、CD4陰性画分がさらに、CD8+ T細胞が濃縮された集団を生成するために使用されるCD8に基づく陽性選択工程に供される。いくつかの態様では、CD4+ T細胞が濃縮された集団由来の細胞およびCD8+ T細胞が濃縮された集団由来の細胞が混合、組み合わせおよび/またはプールされ、CD8+ T細胞およびCD4+ T細胞を含有するインプット集団を生成する。ある特定の態様では、CD4+ T細胞が濃縮された集団およびCD8+ T細胞が濃縮された集団が、細胞を刺激する、例えば、セクションI-Bに記載されているような細胞を刺激条件下で培養する前に、プール、混合および/または組み合わされる。ある特定の態様では、プール、混合および/または組み合わされた細胞または集団は、1：10〜10：1の間、1：5〜5：1の間、4：1〜1：4の間、1：3〜3：1の間、2：1〜1：2の間、1.5：1〜1：1.5の間、1.25：1〜1：1.25の間、1.2：1〜1：1.2の間、1.1：1〜1：1.1の間、または約1：1もしくは1：1のCD4+ T細胞：CD8+ T細胞比を有する。ある特定の態様では、細胞または集団は、プール、混合および/または組み合わされた細胞組成物中1：1または約1：1のCD4+ T細胞：CD8+ T細胞比を有するように、プール、混合および/または組み合わされる。
【０１８７】
いくつかの態様では、CD4に特異的に結合する選択剤およびCD8に特異的に結合する選択剤が、CD4+ T細胞が濃縮された集団およびCD8+ T細胞が濃縮された集団を生成するためにそれぞれ使用される。いくつかの態様では、CD4特異的選択剤およびCD8特異的選択剤の容量は、同じまたは実質的に同じであり、例えば、単位体積または単位重量の選択剤（例えば、ClinicMACS CD4選択試薬およびCD8選択試薬）を使用して、同じ数の総細胞からCD4またはCD8細胞を選択することができる。いくつかの態様では、同じまたは実質的に同じ容量を有するCD8特異的選択剤よりも多くの量のCD4特異的選択剤を使用することができる。例えば、CD4特異的選択剤およびCD8特異的選択剤の体積または重量は、約5：1、4：1、3：1、2：1、または1：5：1の比であることができる。
【０１８８】
特定の例では、PBMCの試料または他の白血球細胞試料は、陰性および陽性の画分の両方が保持されるCD4＋細胞の選択に供される。次いで、CD14およびCD45RAまたはCD19の発現に基づく陰性選択、ならびにCD62LまたはCCR7などのセントラルメモリーT細胞に特徴的なマーカーに基づく陽性選択に、陰性の画分を供し、この場合、陽性選択および陰性選択は、いずれかの順序で行われる。
【０１８９】
CD4＋Tヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞およびエフェクター細胞に分類してもよい。CD4＋リンパ球は、標準的な方法によって得ることができる。いくつかの態様では、ナイーブCD4＋Tリンパ球は、CD45RO-T細胞、CD45RA＋T細胞、CD62L＋T細胞またはCD4＋T細胞である。いくつかの態様では、セントラルメモリーCD4＋細胞は、CD62L＋およびCD45RO＋である。いくつかの態様では、エフェクターCD4＋細胞は、CD62L-およびCD45RO-である。
【０１９０】
一例では、陰性選択によってCD4＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルが、典型的にはCD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DRおよびCD8に対する抗体を含む。いくつかの態様では、抗体または結合パートナーは、磁性ビーズまたは常磁性ビーズなどの固体支持体またはマトリックスに結合して、陽性選択および/または陰性選択のための細胞分離を可能にする。例えば、いくつかの態様では、細胞および細胞集団は、免疫磁気（または親和性磁気（affinitymagnetic））分離技術を使用して、分離または単離される（Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol.2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S.A. Brooks and U. Schumacher（著作権）Humana Press Inc., Totowa, NJに概説される）。
【０１９１】
いくつかの局面では、インキュベートされる試料、または分離される細胞集団は、磁気応答性粒子または微小粒子、例えば、常磁性ビーズ（例えば、DynalbeadsまたはMACS（登録商標）ビーズ）などの小さな磁化可能材料または磁気応答性材料を含有する選択試薬とともにインキュベートされる。磁気応答性材料、例えば、粒子は、一般に、分離することが望ましい、例えば、陰性または陽性に選択することが望ましい1つの細胞、複数の細胞、または細胞集団に存在する表面マーカーなどの分子に特異的に結合する抗体などの結合パートナーに、直接または間接的に結合している。
【０１９２】
いくつかの態様では、磁性粒子または磁性ビーズは、抗体または他の結合パートナーなどの特異的結合メンバーに結合した磁気応答性材料を含む。磁気分離法に使用される多くの周知の磁気応答性材料が公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられるMoldayの米国特許第4,452,773号、および欧州特許明細書EP 452342 Bに記載の磁性粒子である。参照により本明細書に組み入れられるOwenの米国特許第4,795,698号およびLibertiらの米国特許第5,200,084号に記載されているものなどのコロイドサイズの粒子を用いてもよい。
【０１９３】
インキュベーションは、一般に、抗体もしくは結合パートナー、または分子、例えば、磁性粒子もしくは磁性ビーズに付着しているそのような抗体もしくは結合パートナーに特異的に結合する二次抗体もしくは他の試薬が、試料内の細胞に存在する場合に細胞表面分子に特異的に結合する条件下で行われる。
【０１９４】
特定の態様では、磁気応答性粒子は、一次抗体もしくは他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素またはストレプトアビジンでコーティングされる。特定の態様では、磁性粒子は、1つまたは複数のマーカーに特異的な一次抗体のコーティングを介して細胞に付着している。特定の態様では、ビーズではなく細胞を一次抗体または結合パートナーにより標識し、次いで、細胞型特異的二次抗体または他の結合パートナー（例えばストレプトアビジン）によりコーティングされた磁性粒子を加える。特定の態様では、ストレプトアビジンによりコーティングされた磁性粒子は、ビオチン化一次抗体またはビオチン化二次抗体と併せて使用される。
【０１９５】
いくつかの局面では、磁場に試料を置き、磁気応答性粒子または磁化可能粒子を付着させた細胞を磁石に引きつけて、未標識細胞から分離する手順で分離が達成される。陽性選択の場合、磁石に引きつけられる細胞が保持される。陰性選択の場合、引きつけられない細胞（未標識細胞）が保持される。いくつかの局面では、陽性選択および陰性選択の組合せは、同じ選択工程の間に行われ、ここで、陽性および陰性の画分は保持され、さらに処理されるか、追加の分離工程に供される。
【０１９６】
いくつかの態様では、親和性に基づく選択は、磁気活性化細胞選別（MACS）（Miltenyi Biotech, Auburn, CA）によるものである。磁気活性化細胞選別（MACS）、例えば、CliniMACSシステムでは、それに付着した磁化粒子を有する細胞の高純度選択が可能である。特定の態様では、MACSは、外部磁場の印加後に非標的種および標的種が連続的に溶出されるモードで動作する。すなわち、磁化粒子に付着した細胞は、付着していない種が溶出されている間、適所に保持される。次いで、この最初の溶出工程が完了した後、磁場に閉じ込められて溶出が妨げられた種は、それらを溶出し、回収することができるように何らかの方法で解放される。特定の態様では、非標的細胞は標識され、不均一な細胞集団から枯渇させられる。
【０１９７】
いくつかの態様では、親和性試薬の最適以下収量濃度とは、細胞を試薬とともにインキュベートし、試薬に結合した細胞を回収または分離することを含む、所与の選択または濃縮において結合細胞の最適または最大収量を達成するために使用または必要とされる濃度未満の濃度である（「収量」とは、例えば、試薬によって標的化されるか、それに対して試薬が特異的であるか、それに対して試薬が特異的であり、かつ結合することができるマーカーを有する、インキュベーション中の細胞の総数と比較した、そのように回収または選択された細胞の数である）。最適以下収量濃度とは、一般に、そのようなプロセスまたは工程で、試薬に結合した細胞の回収時に、結合細胞、例えば、CD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞の全部よりも少ない、例えば70％以下の収量を達成する試薬の濃度または量である。いくつかの態様では、親和性試薬の最適以下濃度によって、50％以下、45％以下、40％以下、30％以下もしくは25％以下、または約50％、約45％、約40％、約30％もしくは約25％の収量が達成される。濃度は、細胞1個当たりの粒子または表面の数または質量、および/または細胞1個当たりの作用物質（例えば、抗体断片などの抗体）の質量または分子の数に関して表され得る。特定の態様では、最適以下収量濃度は、ナイーブ様CD4＋T細胞対ナイーブ様CD8＋T細胞の固定、制御および/または規定された比を導出または達成するのに十分である。
【０１９８】
いくつかの態様では、例えば、CD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞に親和性を有する2つ以上の選択試薬のそれぞれまたは1つもしくは複数について最適以下収量濃度で操作する場合、そのような試薬のうちの1つまたは複数が、他のそのような試薬のうちの1つまたは複数よりも高い濃度で使用されて、そのような試薬によって認識される細胞型の比を、他方によって認識される細胞型と比較してバイアスする。例えば、比をバイアスすることが望まれるマーカーに特異的に結合する試薬は、比を増加させることが望まれる程度に応じて、他のものと比較して、半分、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍またはそれ以上増加した濃度（例えば、作用物質、または細胞1個当たりの質量）で含まれてもよい。
【０１９９】
いくつかの態様では、最適以下の範囲で、および/または試薬の飽和を達成するのに十分な細胞を用いて操作する場合、免疫親和性試薬の量は、濃縮細胞のおおよその収量に比例する。特定の態様では、濃縮または選択されたCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含有する生成された集団の所望の比に依存する免疫親和性試薬の適切な量または濃度は、常用的な問題として決定することができる。
【０２００】
いくつかの態様では、分離および/または単離工程は、免疫親和性試薬が、例えば、WO 2015/164675（参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）に記載されているようなストレプトアビジンムテインとのペプチドリガンド相互作用を介して、可逆的に結合している磁気ビーズを使用して行われる。そのような磁気ビーズの例は、Streptamers（登録商標）である。いくつかの態様では、分離および/または工程は、Miltenyi Biotecから市販されているものなどの磁気ビーズを使用して行われる。
【０２０１】
いくつかの態様では、試料からのCD4+およびCD8+細胞の第1の選択または濃縮は、抗体がそれぞれ固定された少なくとも第1および第2のアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを含む免疫親和性ベースの試薬を使用して実施される。いくつかの態様では、第1および/または第2の選択の一方または両方は、複数のアフィニティークロマトグラフィーマトリックスおよび/または抗体を利用することができ、それにより、同じ選択、すなわち、第1の選択または第2の選択に利用される複数のマトリックスおよび/または抗体は直列に接続される。いくつかの態様では、第1および/または第2の選択に利用される単数または複数のアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、少なくとも約50×106個の細胞/mL、100×106個の細胞/mL、200×106個の細胞/mLまたは400×106個の細胞/mLを吸着するか、選択または濃縮することが可能である。いくつかの態様では、吸着容量は、カラムの直径および/または長さに基づいて調整することができる。いくつかの態様では、選択または濃縮された集団の培養開始比は、例えば、細胞を選択するための単数または複数のカラムの吸着容量に基づいて仮定して、培養開始比を達成するのに十分な量のマトリックスおよび/または十分な相対量を選択することによって達成される。
【０２０２】
いくつかの態様では、磁気応答性粒子は、後にインキュベート、培養および/または操作されるべき細胞に付着したままである；いくつかの局面では、粒子は、患者に投与するために細胞に付着したままである。いくつかの態様では、磁化可能粒子または磁気応答性粒子は、細胞から除去される。磁化可能粒子を細胞から除去する方法は公知であり、例えば、競合する非標識抗体、磁化可能粒子、または切断可能なリンカーにコンジュゲートした抗体などの使用を含む。いくつかの態様では、磁化可能粒子は生分解性である。
【０２０３】
いくつかの態様では、単離および/または選択により、濃縮されたT細胞、例えば、CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、および/またはCD8+ T細胞の1つまたは複数の集団がもたらされる。いくつかの態様では、濃縮されたT細胞の2つ以上の別個の集団が、単一の生体試料から単離されるか、選択されるか、濃縮されるか、または得られる。いくつかの態様では、別個の集団は、同じ対象から収集され、採取され、および/または得られた別個の生体試料から単離され、選択され、濃縮され、および/または得られる。
【０２０４】
ある特定の態様では、単離および/または選択により、CD3+ T細胞を少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％含む、濃縮されたT細胞の1つまたは複数の集団がもたらされる。特定の態様では、濃縮されたT細胞の集団は、CD3+ T細胞から本質的になる。
【０２０５】
ある特定の態様では、単離および/または濃縮により、CD4+ T細胞を少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％含む、濃縮されたCD4+ T細胞の集団がもたらされる。ある特定の態様では、CD4+ T細胞のインプット集団は、CD8+ T細胞を40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、または0.01％未満含み、かつ/または、CD8+ T細胞を含有せず、かつ/または、CD8+ T細胞を含まないか実質的に含まない。いくつかの態様では、濃縮されたT細胞の集団は、CD4+ T細胞から本質的になる。
【０２０６】
ある特定の態様では、単離および/または濃縮により、CD8+ T細胞を少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％含む、濃縮されたCD8+ T細胞の集団がもたらされる。ある特定の態様では、CD8+ T細胞の集団は、CD4+ T細胞を40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、または0.01％未満含有し、かつ/または、CD4+ T細胞を含有せず、かつ/または、CD4+ T細胞を含まないか実質的に含まない。いくつかの態様では、濃縮されたT細胞の集団は、CD8+ T細胞から本質的になる。
【０２０７】
いくつかの態様では、濃縮されたT細胞の1つまたは複数の集団は、単離、選択および/または濃縮の後に、凍結、例えば、凍結保存および/または凍結保護される。特定の態様では、濃縮されたCD3+ T細胞の集団は、単離、選択および/または濃縮の後に、凍結、例えば、凍結保存および/または凍結保護される。特定の態様では、濃縮されたCD4+ T細胞の集団は、単離、選択および/または濃縮の後に、凍結、例えば、凍結保存および/または凍結保護される。ある特定の態様では、濃縮されたCD8+ T細胞の集団は、単離、選択および/または濃縮の後に、凍結、例えば、凍結保存および/または凍結保護される。いくつかの態様では、濃縮されたT細胞の1つまたは複数の集団は、細胞の集団のインキュベーション、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、培養、拡大増殖、採取および/または製剤化の任意の工程の前に、凍結、例えば、凍結保存および/または凍結保護される。特定の態様では、濃縮されたCD3+ T細胞の集団は、細胞の集団のインキュベーション、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、培養、拡大増殖、採取および/または製剤化の任意の工程の前に、凍結、例えば、凍結保存および/または凍結保護される。特定の態様では、濃縮されたCD4+ T細胞の集団は、細胞の集団のインキュベーション、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、培養、拡大増殖、採取および/または製剤化の任意の工程の前に、凍結、例えば、凍結保存および/または凍結保護される。いくつかの態様では、濃縮されたCD8+ T細胞の集団は、細胞の集団のインキュベーション、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、培養、拡大増殖、採取および/または製剤化の任意の工程の前に、凍結、例えば、凍結保存および/または凍結保護される。いくつかの態様では、濃縮されたT細胞の1つまたは複数の集団、例えば、濃縮されたCD3+ T細胞の集団は、細胞の集団の活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、インキュベーション、培養、採取および/または製剤化の任意の工程の前に、凍結、例えば、凍結保存および/または凍結保護される。いくつかの態様では、濃縮されたT細胞の1つまたは複数の集団、例えば、濃縮されたCD4+ T細胞および/または濃縮されたCD8+細胞の集団は、細胞の集団の活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、インキュベーション、培養、採取および/または製剤化の任意の工程の前に、凍結、例えば、凍結保存および/または凍結保護される。特定の態様では、1つまたは複数の凍結保護されたインプット集団は、例えば、-80℃または約-80℃で、12時間〜7日の間、24時間〜120時間の間、または2日〜5日の間にわたり貯蔵される。特定の態様では、1つまたは複数の凍結保護されたインプット集団は、-80℃または約-80℃で、10日未満、9日未満、8日未満、7日未満、6日未満、または5日未満、4日未満、3日未満、2日未満、または1日未満の時間にわたり貯蔵される。いくつかの態様では、1つまたは複数の凍結保護されたインプット集団は、-70℃もしくは約-70℃または-80℃もしくは約-80℃で、3日未満、例えば、約2日間にわたり貯蔵される。
【０２０８】
a. 選択剤または試薬
ある特定の局面では、本明細書において提供される方法は、選択剤を利用する。いくつかの態様では、剤は、選択試薬である。いくつかの態様では、選択剤は、細胞の表面上の分子、例えば、細胞表面分子に結合する。いくつかの場合に、細胞表面分子は、選択マーカーである。いくつかの態様では、選択剤は、試料中の細胞の1つまたは複数によって発現される選択マーカーに特異的に結合することが可能である。
【０２０９】
いくつかの態様では、細胞、例えば、標的細胞（例えば、T細胞）は、選択されるべき細胞が少なくとも1つの共通する特異的分子の存在によって規定されるように、細胞表面上に分子、例えば、選択マーカーを有するかまたはそれを発現する。いくつかの態様では、標的細胞を含有する試料はまた、分子（例えば、選択マーカー）を欠いている追加の細胞を含有し得る。例えば、いくつかの態様では、T細胞は、複数の細胞タイプ、例えば、赤血球細胞またはB細胞を含有する試料から選択され得る。
【０２１０】
いくつかの局面では、細胞表面分子、例えば、選択マーカーは、所望の細胞集団または亜集団、例えば、血液細胞、例えば、リンパ球（例えば、T細胞、Tヘルパー細胞、例えば、CD3+ T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ Tヘルパー細胞、B細胞またはナチュラルキラー細胞）、単球、または幹細胞、例えば、CD34陽性末梢幹細胞またはNanogもしくはOct-4発現幹細胞の集団または亜集団を規定する抗原であり得る。いくつかの態様では、選択マーカーは、T細胞またはT細胞のサブセットの表面上に発現されるマーカー、例えば、CD25、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RAおよび/またはCD45ROであることができる。T細胞の例は、CMV特異的CD8+ T-リンパ球、細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞および制御性T細胞（Treg）などの細胞を含む。Tregの実例は、CD4 CD25 CD45RA Treg細胞を含み、メモリーT細胞の実例は、CD62L CD8+特異的セントラルメモリーT細胞を含む。
【０２１１】
いくつかの態様では、選択マーカーは、CD4であってよく、選択剤は、CD4に特異的に結合する。いくつかの局面では、CD4に特異的に結合する選択剤は、抗CD4抗体、抗CD4抗体の二価抗体断片、抗CD4抗体の一価抗体断片、および抗体様結合特性を有するタンパク質性CD4結合分子からなる群より選択され得る。いくつかの態様では、抗CD4抗体、例えば、二価抗体断片または一価抗体断片（例えば、CD4 Fab断片）は、抗体13B8.2またはCD4に対する特異的結合を保持する13B8.2の機能的に活性な変異体に由来することができる。例えば、抗体13B8.2またはm13B8.2の例示的な変異体は、米国特許第7,482,000号、米国特許出願第US2014/0295458号または国際特許出願番号WO2013/124474；およびBes, C, et al. J Biol Chem 278, 14265-14273（2003）に記載されている。「ml3B8.2」と称される変異体Fab断片は、米国特許7,482,000に記載されているように、CD4結合ネズミ抗体13B8.2の可変ドメインと重鎖に対するガンマ型の定常ヒトCH1ドメインおよびカッパ型の定常ヒト軽鎖ドメインを含有する定常ドメインとを担持する。いくつかの態様では、抗CD4抗体、例えば、抗体13B8.2の変異体は、可変軽鎖中にアミノ酸置換H91A、可変軽鎖中にアミノ酸置換Y92A、可変重鎖中にアミノ酸置換H35Aおよび/または可変重鎖中にアミノ酸置換R53Aを含有する（各々、Kabatナンバリングによる）。いくつかの局面では、ml3B8.2中の13B8.2 Fab断片の可変ドメインと比較して、軽鎖の91位にあるHis残基（SEQ ID NO：102中の93位）がAlaに変異しており、重鎖の53位にあるArg残基（SEQ ID NO：101中の55位）がAlaに変異している。いくつかの態様では、抗CD4またはその断片に可逆的に結合する試薬は、市販されているかまたは市販されている試薬に由来する（例えば、カタログ番号6-8000-206または6-8000-205または6-8002-100；IBA GmbH, Gottingen, Germany）。いくつかの態様では、選択剤は、抗CD4 Fab断片を含む。いくつかの態様では、抗CD4 Fab断片は、SEQ ID NO：101によって示される配列を有する可変重鎖およびSEQ ID NO：102によって示される配列を有する可変軽鎖を含む。いくつかの態様では、抗CD4 Fab断片は、SEQ ID NO：101によって示される配列を有する可変重鎖のCDRおよびSEQ ID NO：102によって示される配列を有する可変軽鎖のCDRを含む。
【０２１２】
いくつかの態様では、選択マーカーは、CD8であってよく、選択剤は、CD8に特異的に結合する。いくつかの局面では、CD8に特異的に結合する選択剤は、抗CD8抗体、抗CD8抗体の二価抗体断片、抗CD8抗体の一価抗体断片、および抗体様結合特性を有するタンパク質性CD8結合分子からなる群より選択され得る。いくつかの態様では、抗CD8抗体、例えば、二価抗体断片または一価抗体断片（例えば、CD8 Fab断片）は、抗体OKT8（例えば、ATCC CRL-8014）またはCD8に対する特異的結合を保持するその機能的に活性な変異体に由来することができる。いくつかの態様では、抗CD8またはその断片に可逆的に結合する試薬は、市販されているかまたは市販されている試薬に由来する（例えば、カタログ番号6-8003または6-8000-201；IBA GmbH, Gottingen, Germany）。いくつかの態様では、選択剤は、抗CD8 Fab断片を含む。いくつかの態様では、抗CD8 Fab断片は、SEQ ID NO：104によって示される配列を有する可変重鎖およびSEQ ID NO：105によって示される配列を有する可変軽鎖を含む。いくつかの態様では、抗CD8 Fab断片は、SEQ ID NO：104によって示される配列を有する可変重鎖のCDRおよびSEQ ID NO：105によって示される配列を有する可変軽鎖のCDRを含む。
【０２１３】
いくつかの態様では、選択マーカーは、CD3であってよく、選択剤は、CD3に特異的に結合する。いくつかの局面では、CD3に特異的に結合する選択剤は、抗CD3抗体、抗CD3抗体の二価抗体断片、抗CD3抗体の一価抗体断片、および抗体様結合特性を有するタンパク質性CD3結合分子からなる群より選択され得る。いくつかの態様では、抗CD3抗体、例えば、二価抗体断片または一価抗体断片（例えば、CD3 Fab断片）は、抗体OKT3（例えば、ATCC CRL-8001；例えば、Stemberger et al. PLoS One. 2012；7(4): e35798を参照のこと）またはCD3に対する特異的結合を保持するその機能的に活性な変異体に由来することができる。いくつかの態様では、抗CD3またはその断片に可逆的に結合する試薬は、市販されているかまたは市販されている試薬に由来する（例えば、カタログ番号6-8000-201、6-8001-100；IBA GmbH, Gottingen, Germany）。いくつかの態様では、選択剤は、抗CD3 Fab断片を含む。いくつかの態様では、抗CD3 Fab断片は、SEQ ID NO：89によって示される配列を有する可変重鎖およびSEQ ID NO：90によって示される配列を有する可変軽鎖を含む。いくつかの態様では、抗CD3 Fab断片は、SEQ ID NO：89によって示される配列を有する可変重鎖のCDRおよびSEQ ID NO：90によって示される配列を有する可変軽鎖のCDRを含む。
【０２１４】
上記例のいずれかにおいて、二価抗体断片は、（Fab)2’-断片、または二価単鎖Fv断片であり得る一方で、一価抗体断片は、Fab断片、Fv断片、および単鎖Fv断片（scFv）からなる群より選択され得る。上記例のいずれかにおいて、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子は、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ（glubody）、アンキリン骨格に基づくタンパク質、結晶質骨格に基づくタンパク質、アドネクチン、およびアビマーであり得る。
【０２１５】
2. クロマトグラフィーによるT細胞選択
いくつかの態様では、細胞、例えば、T細胞は、アフィニティークロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーを含むカラムクロマトグラフィーなどによるクロマトグラフィー単離によって、単離、選択または濃縮される。いくつかの態様では、本方法は、標的細胞、例えば、単離、選択または濃縮されるべき細胞の表面上に位置する受容体分子に結合する受容体結合試薬を利用する。そのような方法は、（トレースレス）細胞アフィニティークロマトグラフィー技術（CATCH）として記載されていることがあり、PCT出願番号WO2013124474およびWO2015164675（参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）に記載されている方法または技法のいずれかを含み得る。
【０２１６】
いくつかの態様では、細胞、例えば、標的細胞は、単離、選択または濃縮されるべき細胞が少なくとも1つの共通する特異的受容体分子の存在によって規定されるように、細胞表面上に受容体分子を有するかまたはそれを発現する。いくつかの態様では、標的細胞を含有する試料はまた、受容体分子を欠いている追加の細胞を含有し得る。例えば、いくつかの態様では、T細胞は、複数の細胞タイプ、例えば、赤血球細胞またはB細胞を含有する試料から単離、濃縮、およびまたは選択される。
【０２１７】
いくつかの態様では、選択剤は、クロマトグラフィーカラム中に含まれ、例えば、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に直接的または間接的に結合している。いくつかの態様では、選択剤は、試料がカラムに加えられる時点でクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に存在する。いくつかの態様では、選択剤は、試薬、例えば、選択試薬を通じてクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に間接的に結合されることが可能である。いくつかの態様では、選択試薬は、カラムの固定相に共有結合または非共有結合により結合される。いくつかの態様では、選択試薬は、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に可逆的に固定される。場合によっては、選択試薬は、共有結合を介してクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に固定される。いくつかの局面では、選択試薬は、非共有結合によりクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に可逆的に固定される。
【０２１８】
いくつかの局面では、選択剤が試料に加えられる。いくつかの局面では、受容体結合試薬が試料に加えられる。ある特定の態様では、受容体結合試薬は、細胞、例えば、標的細胞の表面上の受容体分子（例えば、CD3、CD4および/またはCD8）に特異的に結合する結合部位Bを有する。いくつかの局面では、受容体結合試薬はまた、親和性試薬などの選択剤の結合部位Zに特異的かつ可逆的に結合できる結合パートナーCを含む。
【０２１９】
ある特定の局面では、親和性試薬はまた、結合パートナーCが結合することによって受容体結合試薬の多量体化をもたらすことができる、2つ以上の結合部位Zを含有し得る。したがって、本明細書において使用されるこの親和性試薬はまた、多量体化試薬を含有することができる。親和性試薬は、例えば、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジン、アビジンムテインまたはそれらの混合物であり得る。いくつかの局面では、異なるクロマトグラフィーマトリックスが、異なる親和性試薬にカップリングされ、カラム内に積層されて分離のための多成分系を形成し得る。
【０２２０】
ある特定の態様では、試料、例えば、細胞および受容体結合試薬を含有する試料は、付着または固定された親和性試薬を含有するクロマトグラフィーマトリックス上に装填するかまたはそれと接触させる。特定の局面では、親和性試薬は、受容体結合試薬の結合パートナーCに特異的に結合する複数の結合部位Zを有する。ある特定の局面では、受容体結合試薬は、結合パートナーCと結合部位Zとの間の相互作用によって親和性試薬に結合する。したがって、いくつかの態様では、細胞、例えば、標的細胞は、クロマトグラフィーマトリックス上の親和性試薬の1つまたは複数の結合部位Zと受容体結合試薬の結合パートナーCとによって形成される複合体を介して固定される。さらなる局面では、細胞、例えば、標的細胞は、クロマトグラフィーマトリックスから残留試料をすすぐ、遊離させるまたは洗浄することなどによって、試料から枯渇され得る。特定の局面では、受容体結合試薬は、細胞を含有する試料中に含まれても、付着した親和性試薬または多量体化試薬への結合のために、例えば試料がクロマトグラフィーマトリックスに加えられる前に、クロマトグラフィーマトリックスに適用または接触させてもよい。
【０２２１】
いくつかの局面では、次いで、競合試薬がクロマトグラフィーカラム上に装填される。特定の態様では、競合試薬は、親和性試薬の結合部位Zに結合可能である結合部位を有する。ある特定の態様では、競合試薬は、親和性試薬と複合体を形成し、それによって競合試薬がクロマトグラフィーマトリックス上に固定される。この競合結合の結果として、結合パートナーCと結合部位Zでの受容体結合試薬と親和性試薬との間の結合が置き換えられる。特定の態様では、親和性試薬、受容体結合試薬および細胞（例えば、標的細胞）を含有する複合体が付着したクロマトグラフィーマトリックスに、競合試薬を添加または装填することで、クロマトグラフィーマトリックスから細胞を溶出させる。いくつかの局面では、受容体結合試薬は、結合部位Bで細胞の受容体分子に対して低い親和性を有し、その結果、受容体結合試薬は、競合試薬の存在下で細胞から解離する。したがって、いくつかの態様では、細胞、例えば、標的細胞は、結合している受容体結合分子を含まずまたは本質的に含まずクロマトグラフィーマトリックスから溶出される。
【０２２２】
いくつかの態様では、選択剤は、試料がクロマトグラフィーカラム（例えば、固定相）に加えられる時点で、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に存在している、例えば、直接的に結合（例えば、共有結合または非共有結合により）していても、選択試薬を介して間接的に結合していてもよい。したがって、試料の添加時に、標的細胞に、選択剤が結合して、カラムのクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に固定することができる。あるいは、いくつかの態様では、選択剤を試料に加えることができる。このやり方では、選択剤が、試料中の標的細胞（例えば、T細胞）に結合し、次いで、その試料を、選択試薬を含むクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に加えることができる。この場合、すでに標的細胞に結合している選択剤が、選択試薬に結合し、それによって、標的細胞をクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に固定する。いくつかの態様では、選択剤は、選択剤に含まれる本明細書に記載されるような結合パートナーCを介して、本明細書に記載されるような選択試薬に結合する。
【０２２３】
いくつかの態様では、2つ以上の選択剤は、選択試薬と、例えば選択試薬上に存在する1つまたは複数の結合部位Zを介して、会合する、例えば可逆的にまたは不可逆的に結合する。場合によっては、この結果として、細胞表面分子（例えば、選択マーカー）（その少なくとも2コピー）を有する標的細胞が特定の分子（例えば、選択マーカー）に結合可能である選択剤と接触する場合にアビディティー効果が生じることができるように、選択剤が互いに密接に配置される。
【０２２４】
いくつかの態様では、同じである、すなわち、同じ選択マーカー結合特異性を有する2つ以上の異なる選択剤が、選択試薬に可逆的に結合することができる。いくつかの態様では、異なる選択マーカーに結合する少なくとも2つの異なる選択剤、場合によっては、3つまたは4つの異なる選択剤を使用することが可能である。いくつかの局面では、少なくとも2つの選択剤の各々が、異なる分子（例えば、選択マーカー）、例えば、第1の分子、第2の分子などに結合することができる。場合によっては、異なる分子（例えば、選択マーカー）、例えば細胞表面分子が、同じ標的細胞上に存在することができる。他の場合では、異なる分子（例えば、選択マーカー）、例えば細胞表面分子が、同じ細胞集団中に存在する異なる標的細胞上に存在することができる。一部の場合に、第3、第4などの選択剤が同じ試薬と会合することができ、各々がさらに異なる結合部位を含有する。
【０２２５】
いくつかの態様では、2つ以上の異なる選択剤は、同じ結合パートナーCを含有する。いくつかの態様では、2つ以上の異なる選択剤は、異なる結合パートナーを含有する。いくつかの局面では、第1の選択剤は、選択試薬上に存在する結合部位Z1に特異的に結合することができる結合パートナーC1を有することができ、第2の選択剤は、選択試薬上に存在する結合部位Z1または結合部位Z2に特異的に結合することができる結合パートナーC2を有することができる。したがって、いくつかの場合に、選択試薬によって含まれる複数の結合部位Zは、選択剤によって含まれる結合パートナーC1およびC2にそれぞれ可逆的に結合可能である、結合部位Z1およびZ2を含む。いくつかの態様では、C1およびC2は同じであり、かつ/または、Z1およびZ2は同じである。他の局面では、複数の結合部位Zの1つまたは複数は異なることができる。他の場合では、複数の結合パートナーCの1つまたは複数は異なっていてもよい。結合パートナーCの各々が結合部位Zの1つと相互作用、例えば特異的に結合可能である限りは、結合部位Zを含有する選択試薬と適合可能である異なる結合パートナーCのどんな組み合わせを選択することも、当業者の技能の範囲内である。
【０２２６】
いくつかの態様では、結合パートナーCと結合部位Zとの間で形成される可逆的結合は、競合剤および/または遊離結合剤によって破壊され得る。いくつかの態様では、競合剤および/または遊離結合剤は、結合パートナーCとの結合に関して1つまたは複数の結合部位Zと競合可能である、ビオチン、ビオチン誘導体もしくは類似体またはストレプトアビジン結合ペプチドであることができる。いくつかの態様では、結合パートナーCと競合剤および/または遊離結合剤は異なり、競合剤および/または遊離結合剤は、1つまたは複数の結合部位Zに対して、結合パートナーの親和性と比較してより高い結合親和性を示す。本明細書において提供される方法のいずれかの特定の局面では、選択試薬への選択剤の結合を破壊するためにクロマトグラフィーカラムの固定相に競合剤および/または遊離結合剤を添加することは、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）から標的細胞（例えば、T細胞）を引き離す必要はない。
【０２２７】
いくつかの態様では、試料の細胞、例えば、標的細胞は、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）から残留試料をすすぐ、遊離させるまたは洗浄することなどによって、試料から枯渇され得る。いくつかの態様では、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）から未結合細胞および残屑を除去するために、1回または複数回（例えば、2、3、4、5、6回）の洗浄工程が使用される。いくつかの態様では、試料は、1回または複数回の洗浄工程が実施される前に少なくとも5、10、16、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100もしくは120分間または約5、10、16、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100もしくは120分間マトリックスに浸透可能である。
【０２２８】
いくつかの態様では、細胞、例えば、標的細胞、競合試薬および受容体結合試薬を含む第1のクロマトグラフィーカラムの溶出液からの溶出試料が収集される。ある特定の態様では、溶出試料は、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスであり同時にゲル浸透マトリックスとして作用することもできる好適な固定相を有する第2のクロマトグラフィーカラム上に装填される。特定の態様では、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、その上に固定された親和性試薬を有する。いくつかの局面では、受容体結合試薬および競合試薬は、親和性試薬上の結合部位Zに結合し、それによって、クロマトグラフィーマトリックス上に固定される。結果として、ある特定の局面では、単離された標的細胞を含有する溶出試料は、受容体結合試薬および競合試薬が枯渇される。したがって、いくつかの局面では、いかなる反応物質も含まない標的細胞は、この時点で、さらなる使用、例えば、本明細書に記載される方法のいずれかによる処理に向けた状態にある。
【０２２９】
いくつかの態様では、1つの工程から陽性または陰性選択された画分が別の選択工程、例えば後続の陽性または陰性選択に供される、複数回の細胞選択工程が行われる。ある特定の態様では、選択、単離および濃縮のための方法、技法および試薬が、例えば、PCT出願番号WO2015164675に記載されており、この特許は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０２３０】
いくつかの態様では、試料から標的細胞（例えば、CD3+ T細胞）を単離するために、単回の選択工程を使用することができる。いくつかの態様では、単回の選択工程は、単一のクロマトグラフィーカラム上で実施することができる。いくつかの例では、単回の選択工程は、複数のマーカーを発現する細胞を同時に枯渇させることができる。同様に、複数の細胞タイプを同時に陽性選択することができる。ある特定の態様では、選択工程は、1回超繰り返され、およびまたは、実施され、この場合、1つの工程から陽性または陰性選択された画分は、同じ選択工程、例えば繰り返しの陽性または陰性選択に供される。いくつかの例では、単回の選択工程は、1回超繰り返され、および/または、実施されることで、例えば、選択された細胞の純度を増加させ、かつ/または、陰性選択された画分から陰性選択された細胞をさらに除去および/もしくは枯渇させる。ある特定の態様では、1つまたは複数の選択工程は、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、または10回超実施される。ある特定の態様では、1つまたは複数の選択工程は、1〜10回、1〜5回、または3〜5回実施および/または繰り返される。
【０２３１】
細胞選択は、1つまたは複数のクロマトグラフィーカラムを使用して実施され得る。いくつかの態様では、1つまたは複数のクロマトグラフィーカラムは、閉鎖系に含まれる。いくつかの態様では、閉鎖系は、自動化された閉鎖系であり、例えば、最低限のユーザー（例えば、ヒト）インプットを必要とするかまたは全く必要ない。いくつかの態様では、細胞選択は、連続的に実施される（例えば、連続選択技法）。いくつかの態様では、1つまたは複数のクロマトグラフィーカラムが連続的に配置される。例えば、第1のカラムは、カラムのアウトプット（例えば、溶出液）を、例えば連結管を介して、第2のクロマトグラフィーカラムに供給できるように配向され得る。いくつかの態様では、複数のクロマトグラフィーカラムが連続的に配置され得る。いくつかの態様では、細胞選択は、後続の工程が先の工程からの陰性および/または陽性画分をさらなる選択に供する、連続の陽性および陰性選択工程を行うことによって成し遂げられ得る。この場合、プロセス全体は、同じ管または管セット内で行われる。いくつかの態様では、標的細胞を含有する試料は、第1の選択がCD4+またはCD8+の一方の集団を濃縮するために達成され、第1の選択から選択されなかった細胞を第2の選択のための細胞源として使用してCD4+またはCD8+の他方の集団を濃縮する、連続選択に供される。いくつかの態様では、さらなる1回または複数回の選択を、CD4+またはCD8+の一方または両方の集団の亜集団、例えば、セントラルメモリーT（TCM）細胞、ナイーブT細胞および/または1つもしくは複数の表面マーカーに対して陽性またはそれを高レベルで発現する細胞（例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+および/またはCD45RO+）を濃縮するために達成することができる。いくつかの態様では、標的細胞を含有する試料は、第1の選択がCD3+集団を濃縮するために達成され、選択された細胞を第2の選択のための細胞源として使用してCD3+集団を濃縮する、連続選択に供される。いくつかの態様では、標的細胞を含有する試料は、第1の選択が第1の固定相（例えば、第1のクロマトグラフカラム内）上でCD3+集団を濃縮するために達成され、未結合細胞を含有するフロースルーを第2の選択のための細胞源として使用して第2の固定相（例えば、第2のクロマトグラフカラム内）上でCD3+集団を濃縮する、連続選択であって、第1の固定相と第2の固定相は連続的に配置される連続選択に供される。いくつかの態様では、選択は、CD3+ T細胞のための陽性選択（例えば、細胞表面CD3に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を使用することによる）である。いくつかの態様では、さらなる1回または複数回の選択を、CD3+集団の亜集団、例えば、セントラルメモリーT（TCM）細胞、ナイーブT細胞および/または1つもしくは複数の表面マーカーに対して陽性またはそれを高レベルで発現する細胞（例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+および/またはCD45RO+）を濃縮するために達成することができる。いくつかの態様では、標的細胞を含有する試料は、第1の選択がCD3+集団を濃縮するために達成され、選択された細胞を第2の選択のための細胞源として使用してCD4+集団を濃縮する、連続選択に供される。いくつかの態様では、さらなる1回または複数回の選択を、CD3+CD4+集団の亜集団、例えば、セントラルメモリーT（TCM）細胞、ナイーブT細胞および/または1つもしくは複数の表面マーカーに対して陽性またはそれを高レベルで発現する細胞（例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+および/またはCD45RO+）を濃縮するために達成することができる。いくつかの態様では、標的細胞を含有する試料は、第1の選択がCD3+集団を濃縮するために達成され、選択された細胞を第2の選択のための細胞源として使用してCD8+集団を濃縮する、連続選択に供される。いくつかの態様では、さらなる1回または複数回の選択を、CD3+CD8+集団の亜集団、例えば、セントラルメモリーT（TCM）細胞、ナイーブT細胞および/または1つもしくは複数の表面マーカーに対して陽性またはそれを高レベルで発現する細胞（例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+および/またはCD45RO+）を濃縮するために達成することができる。いくつかの局面では、T細胞の特定の亜集団（例えば、CD3+細胞）、例えば、1つまたは複数の表面マーカーに対して陽性またはそれを高レベルで発現する細胞（例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+および/またはCD45RO+ T細胞）が、陽性または陰性の連続選択技法によって選択されることが想定される。いくつかの態様では、細胞選択は、並行して実施される（例えば、並行選択技法）。いくつかの態様では、1つまたは複数のクロマトグラフィーカラムが並行して配置される。例えば、試料が第1のカラムを通過する必要なしに試料が各カラムに適用されることが可能となる管を介して試料が2つ以上のカラム上に同時に装填されるように、2つ以上のカラムが配置され得る。例えば、並行選択技法を使用して、細胞選択は、陽性および/または陰性選択工程を、例えば、プロセス全体が同じ管または管セット内で行われる閉鎖系で同時に行うことによって成し遂げられ得る。いくつかの態様では、標的細胞を含有する試料は、各カラムが細胞集団の選択を達成する2つ以上のクロマトグラフィーカラム上に試料が装填される、並行選択に供される。いくつかの態様では、2つ以上のクロマトグラフィーカラムが、CD3+、CD4+またはCD8+集団の選択を個別に達成する。いくつかの態様では、アフィニティークロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーを含む2つ以上のクロマトグラフィーカラムが、独立して、同じ細胞集団の選択を達成する。例えば、2つ以上のクロマトグラフィーカラムが、CD3+細胞の選択を達成してもよい。いくつかの態様では、アフィニティークロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーを含む2つ以上のクロマトグラフィーカラムが、独立して、異なる細胞集団の選択を達成する。例えば、2つ以上のクロマトグラフィーカラムが、独立して、CD3+細胞、CD4+細胞およびCD8+細胞の選択を達成してもよい。いくつかの態様では、例えば連続選択技法を使用した、さらなる1回または複数回の選択を、並行選択を介して選択された1つまたはすべての細胞集団の亜集団を濃縮するために達成することができる。例えば、選択された細胞を、セントラルメモリーT（TCM）細胞、ナイーブT細胞および/または1つもしくは複数の表面マーカーに対して陽性またはそれを高レベルで発現する細胞（例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+および/またはCD45RO+）についてさらに選択してもよい。いくつかの態様では、標的細胞を含有する試料は、2つ以上のカラム上でCD3+集団を濃縮するために達成される並行選択に供される。いくつかの態様では、さらなる1回または複数回の選択を、CD3+集団の亜集団、例えば、セントラルメモリーT（TCM）細胞、ナイーブT細胞および/または1つもしくは複数の表面マーカーに対して陽性またはそれを高レベルで発現する細胞（例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+および/またはCD45RO+）を濃縮するために達成することができる。いくつかの態様では、標的細胞を含有する試料は、選択が2つ以上のカラム上で独立してCD3+集団およびCD4+集団を濃縮するために達成される、並行選択に供される。いくつかの態様では、さらなる1回または複数回の選択を、CD3+およびCD4+集団の亜集団、例えば、セントラルメモリーT（TCM）細胞、ナイーブT細胞および/または1つもしくは複数の表面マーカーに対して陽性またはそれを高レベルで発現する細胞（例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+および/またはCD45RO+）を濃縮するために達成することができる。いくつかの態様では、標的細胞を含有する試料は、CD3+集団およびCD8+集団を濃縮するために達成される並行選択に供される。いくつかの態様では、さらなる1回または複数回の選択を、CD3+およびCD8+集団の亜集団、例えば、セントラルメモリーT（TCM）細胞、ナイーブT細胞および/または1つもしくは複数の表面マーカーに対して陽性またはそれを高レベルで発現する細胞（例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+および/またはCD45RO+）を濃縮するために達成することができる。いくつかの態様では、標的細胞を含有する試料は、CD4+集団およびCD8+集団を濃縮するために達成される並行選択に供される。いくつかの態様では、さらなる1回または複数回の選択を、CD4+およびCD8+集団の亜集団、例えば、セントラルメモリーT（TCM）細胞、ナイーブT細胞および/または1つもしくは複数の表面マーカーに対して陽性またはそれを高レベルで発現する細胞（例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+および/またはCD45RO+）を濃縮するために達成することができる。いくつかの局面では、T細胞の特定の亜集団（例えば、CD3+、CD4+、CD8+ T細胞）、例えば、1つまたは複数の表面マーカーに対して陽性またはそれを高レベルで発現する細胞（例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+および/またはCD45RO+ T細胞）が、陽性または陰性の並行選択技法によって選択されることが想定される。いくつかの態様では、連続および並行の選択技法を組み合わせて使用することができる。
【０２３２】
一般に、固定相（例えば、選択樹脂）の結合能は、一定量の標的部分、例えば、T細胞などの標的細胞を選択するためにどれほど多くの固定相が必要となるかに影響を及ぼす。結合能、例えば、固定相（例えば、選択樹脂）1mL当たり固定できる標的細胞の数を使用して、1つまたは複数のカラム上の捕捉された標的細胞の数を判定または制御することができる。1つまたは複数のクロマトグラフィーカラムを、本明細書において開示されるオンカラム細胞選択および刺激に使用することができる。複数のカラムが使用されるとき、これらを、連続的に、並行して、またはそれらを好適に組み合わせて配置することができる。したがって、固定相（例えば、選択樹脂）の結合能を使用して、単一カラムアプローチにおける試薬量または複数カラムアプローチにおけるカラム毎の試薬量を標準化することができる。
【０２３３】
いくつかの態様では、本明細書において使用される固定相の結合能は、過剰な標的細胞が固定相上に装填されたときの、所与の溶媒および細胞濃度条件で固定相に結合する標的細胞（例えば、CD3+ T細胞、CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞）の最大数である。一局面では、オンカラム細胞選択および刺激のための本明細書において使用される固定相の結合能は、静的結合能である。いくつかの態様では、本明細書において開示される固定相（例えば、選択樹脂）の静的結合能は、固定相1mL当たり標的細胞約5000万〜約1億個の範囲である。いくつかの態様では、固定相（例えば、選択樹脂）の静的結合能は、固定相1mL当たり細胞約1000万〜約2000万個、約2000万〜約3000万個、約3000万〜約4000万個、約4000万〜約5000万個、約5000万〜約6000万個、約6000万〜約7000万個、約7000万〜約8000万個、約8000万〜約9000万個、約9000万〜約1億個、約1億1000万〜約1億2000万個、約1億2000万〜約1億3000万個、約1億3000万〜約1億4000万個、約1億4000万〜約1億5000万個、約1億5000万〜約1億6000万個、約1億6000万〜約1億7000万個、約1億7000万〜約1億8000万個、約1億8000万〜約1億9000万個、または約1億9000万〜約2億個である。
【０２３４】
いくつかの態様では、本明細書において使用される固定相の結合能は、未結合標的細胞の有意な漏出（breakthrough）が生じる前の所与の流動条件下で固定相に結合する標的細胞（例えば、CD3+ T細胞、CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞）の数である。一局面では、オンカラム細胞選択および刺激のための本明細書において使用される固定相の結合能は、動的結合能、すなわち、試料適用中の充填クロマトグラフィーカラムにおける動作条件下の結合能である。いくつかの態様では、動的結合能は、公知の濃度の標的細胞を含有する試料を装填し、フロースルーをモニタリングすることによって判定され、標的細胞は、未結合標的細胞がカラムを流れる前のある特定の漏出点まで固定相に結合するだろう。いくつかの態様では、本明細書において開示される固定相（例えば、選択樹脂）の動的結合能は、固定相1mL当たり標的細胞約5000万〜約1億個の範囲である。いくつかの態様では、固定相（例えば、選択樹脂）の動的結合能は、固定相1mL当たり標的細胞約1000万〜約2000万個、約2000万〜約3000万個、約3000万〜約4000万個、約4000万〜約5000万個、約5000万〜約6000万個、約6000万〜約7000万個、約7000万〜約8000万個、約8000万〜約9000万個、約9000万〜約1億個、約1億1000万〜約1億2000万個、約1億2000万〜約1億3000万個、約1億3000万〜約1億4000万個、約1億4000万〜約1億5000万個、約1億5000万〜約1億6000万個、約1億6000万〜約1億7000万個、約1億7000万〜約1億8000万個、約1億8000万〜約1億9000万個、または約19000万〜約20000万である。
【０２３５】
一般に、クロマトグラフィー法は、流体クロマトグラフィー、典型的には、液体クロマトグラフィーである。いくつかの局面では、クロマトグラフィーは、細胞、例えば、標的細胞を含有する流体試料が、例えば、クロマトグラフィーマトリックスを含有するカラムの一端に重力流によってまたはポンプによって適用され、流体試料がカラムの他端からカラムを出る、フロースルーモードで行うことができる。加えて、クロマトグラフィーは、単離されるべき細胞を含有する流体試料が、例えば、ピペットチップ内に充填されたクロマトグラフィーマトリックスを含有するカラムの一端にピペットによって適用され、流体試料がクロマトグラフィーマトリックス/ピペットチップに入り、カラムの他端から出る、「アップ＆ダウン」モードで行うことができる。あるいは、クロマトグラフィーはまた、クロマトグラフィー材料（固定相）を、細胞を含有する試料と、例えば、振盪、回転または反復接触下でインキュベートし、流体試料を例えばピペットを用いて除去する、バッチモードで行うこともできる。
【０２３６】
いくつかの局面では、本発明の文脈におけるクロマトグラフィーマトリックスとして、細胞のクロマトグラフィー単離に適する限りはどんな材料を利用してもよい。特定の局面では、好適なクロマトグラフィー材料は、少なくとも無害または本質的に無害であり、例えば、細胞単離および/または細胞分離のための所望の条件下で充填クロマトグラフィーカラムにおいて使用されるとき、細胞生存率に有害ではない。いくつかの局面では、クロマトグラフィーマトリックスは、所定の場所に、典型的には所定の位置に留まっているが、分離されるべき試料およびその中に含まれる成分の場所は変化している。したがって、いくつかの局面では、クロマトグラフィーマトリックスは、「固定相」である。
【０２３７】
典型的には、それぞれのクロマトグラフィーマトリックスは、固相または半固相の形態を有するが、単離/分離されるべき標的細胞を含有する試料は流体相である。クロマトグラフィー分離を成し遂げるために使用される移動相は、同様に流体相である。クロマトグラフィーマトリックスは、粒子状材料（任意の好適なサイズおよび形状の）、または紙基材もしくはメンブレンを含むモノリシックなクロマトグラフィー材料であることができる（実施例セクションを参照のこと）。したがって、クロマトグラフィーは、カラムクロマトグラフィーと平面クロマトグラフィーの両方であることができる。標準的なクロマトグラフィーカラムに加えて、双方向フローを可能にするカラムまたはピペットチップを、ここに記載のようなカラムベース/フロースルーモードベースの細胞のクロマトグラフィー分離に使用することができる。いくつかの局面では、粒子状マトリックス材料が使用され、粒子状マトリックス材料は、例えば、約5μm〜約200μm、または約5μm〜約400μm、または約5μm〜約600μmの平均粒径を有し得る。いくつかの局面では、平面クロマトグラフィーが使用され、マトリックス材料は、慣用のセルロース系もしくは有機高分子系のメンブレン（例えば、紙メンブレン、ニトロセルロースメンブレンまたは二フッ化ポリビニリデン（PVDF）メンブレン）またはシリカ被覆ガラスプレートなどの平面クロマトグラフィーに適した任意の材料であり得る。
【０２３８】
いくつかの局面では、クロマトグラフィーマトリックス/固定相は、非磁性材料または非磁化可能材料である。そのような材料は、誘導体化シリカまたは架橋ゲルを含み得る。架橋ゲル（典型的にはビーズ形態で製造される）は、架橋多糖などの天然高分子系であり得る。好適な例は、アガロースゲルまたは架橋デキストランのゲルを含むが、それらに限定されない。架橋ゲルはまた、合成高分子系、すなわち、天然に存在しない高分子クラス系であり得る。通常、細胞分離のためのクロマトグラフィー固定相のベースとなるそのような合成高分子は、極性単量体単位を有する高分子であって、それゆえそれ自体極性である高分子である。
【０２３９】
好適な合成高分子の実例は、ポリアクリルアミド、スチレン-ジビニルベンゼンゲルおよびアクリラートとジオールまたはアクリルアミドとジオールの共重合体である。実例は、Fractogel（登録商標）として市販されているポリメタクリラートゲルである。さらなる例は、Toyopearl（登録商標）として市販されているエチレングリコールとメタクリラートの共重合体である。いくつかの態様では、クロマトグラフィー固定相はまた、天然および合成高分子成分、例えば、多糖とアガロースまたは多糖とN,N'-メチレンビスアクリルアミドの複合マトリックスまたは複合材料または共重合体、例えば、ポリアクリルアミド/アガロース複合材料を含み得る。デキストランとN,N'-メチレンビスアクリルアミドの共重合体の実例は、上述のSephacryl（登録商標）シリーズの材料である。誘導体化シリカは、合成高分子または天然高分子にカップリングされたシリカ粒子を含み得る。そのような態様の例は、多糖グラフトシリカ、ポリビニルピロリドングラフトシリカ、ポリエチレンオキシドグラフトシリカ、ポリ（2-ヒドロキシエチルアスパルトアミド）シリカおよびポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）グラフトシリカを含むが、それらに限定されない。
【０２４０】
本発明において利用されるクロマトグラフィーマトリックスは、いくつかの態様では、例えば、本明細書に記載されるような除去カートリッジにおいて使用されるときの、ゲル濾過（サイズ排除としても知られている）マトリックスである。ゲル濾過は、分離されるべき細胞との相互作用を少なくとも本質的に受けないように設計されるという特性を特徴とし得る。よって、ゲル濾過マトリックスは、本明細書において定義されているような細胞または他の生物学的実体の主にそれらのサイズに基づく分離を可能にする。それぞれのクロマトグラフィーマトリックスは、典型的には、上述したような粒子状多孔質材料である。クロマトグラフィーマトリックスは、ある特定の排除限界を有し得、その限界は、典型的には分子量に関して定義され、その分子量を超える分子は、細孔への侵入が完全に遮断される。サイズ排除限界を定義するそれぞれの分子量は、単離されるべき標的細胞（または生物学的実体）の重量に対応する重量を下回るように選択され得る。そのような態様では、標的細胞は、サイズ排除クロマトグラフィーマトリックスの細孔への侵入が妨げられる。同様に、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスである固定相は、選択された標的細胞のサイズよりも小さいサイズである細孔を有し得る。例証的な態様では、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスおよび/またはゲル濾過マトリックスは、0〜約500nmの平均細孔サイズを有する。
【０２４１】
受容体結合分子または競合試薬などの試料中に存在する他の成分は、細孔の排除限界を下回るサイズを有し得、これは、サイズ排除クロマトグラフィーマトリックスの細孔に侵入することができる。細孔容積に部分的にまたは完全に侵入することができるそのような成分のうち、その細孔容積によりアクセスできないより大きな分子が通常最初に溶出し、最も小さい分子が最後に溶出する。いくつかの態様では、サイズ排除クロマトグラフィーマトリックスの排除限界は、標的細胞の最大幅を下回るように選択される。よって、細孔容積にアクセス可能な成分は、通常、標的細胞よりも長く、サイズ排除クロマトグラフィーマトリックスの中に/上に残留するだろう。したがって、標的細胞は、試料の他の物質/成分から別々にクロマトグラフィーカラムの溶出液中に回収され得る。それゆえ、受容体結合試薬、またはあてはまる場合、競合試薬などの成分は、標的細胞よりも遅い時点で、ゲル濾過マトリックスから溶出する。ゲル浸透マトリックスが、結合部位、例えば、試料中に存在する受容体結合試薬および/または競合試薬などの試薬に結合可能である結合部位Zを含む親和性試薬（通常、その上に共有結合により結合されている）を含む場合、この分離の効果は、さらに高まるだろう。受容体結合試薬および/または競合試薬は、親和性試薬の結合部位Zに結合し、それにより、ゲル浸透マトリックス上に固定される。この方法は、通常、本発明おいて使用されるような除去カートリッジにおいて行われ、いくつかの態様では、本発明に係る方法、組み合わせおよびキットは、そのようなゲル濾過マトリックスを含むおよび/または利用する。それぞれの方法において、したがって、細胞は、サイズに基づいて分離される。
【０２４２】
本発明において利用されるクロマトグラフィーマトリックスはまた、磁気により誘引可能な物質、例えば、1つまたは複数の磁気により誘引可能な粒子または磁性流体を含み得る。それぞれの磁気により誘引可能な粒子は、標的細胞に結合可能である結合部位を有する多量体化試薬または親和性試薬を含み得る。磁気により誘引可能な粒子は、反磁性、強磁性、常磁性または超常磁性の材料を含有し得る。超常磁性の材料は、永久磁化を生じることなく、誘導された磁場によって磁場に反応する。酸化鉄系の磁気粒子は、例えば、Dynal BiotechからDynabeads（登録商標）として、Miltenyi Biotecから磁気MicroBeadsとして、CPG Inc.から磁気多孔性ガラスビーズとして、ならびに様々な他の供給元、例えば、少し例を挙げれば、Roche Applied Science、BIOCLON、BioSource International Inc.、micromod、AMBION、Merck、Bangs Laboratories、Polysciences、またはNovagen Inc.から市販されている。超常磁性のCoおよびFeCoならびに強磁性のCoナノ結晶系の磁性ナノ粒子は、例えば、Hutten, A. et al.（J. Biotech. (2004), 112, 47-63）によって記載されている。しかしながら、いくつかの態様では、本発明において利用されるクロマトグラフィーマトリックスは、いかなる磁気により誘引可能な物質も有しない。
【０２４３】
いくつかの態様では、細胞表面、例えば、標的細胞表面上に位置する受容体分子は、本発明に係る方法におけるクロマトグラフィー分離プロセス中に細胞表面に共有結合または非共有結合により結合されたまま残存する限り、どんな分子であってもよい。受容体分子は、受容体結合試薬に対して指向され得る分子である。いくつかの態様では、受容体は、膜受容体タンパク質などのペプチドまたはタンパク質である。いくつかの態様では 受容体は、脂質、多糖または核酸である。タンパク質である受容体は、表在性膜タンパク質または内在性膜タンパク質であり得る。それは、いくつかの態様では、膜にまたがる1つまたは複数のドメインを有し得る。ある特定の態様では、受容体分子は、免疫細胞の表面タンパク質、例えば、CD3、CD4またはCD8である。いくつかの態様では、受容体分子は、所望の細胞集団または亜集団、例えば、血液細胞の集団または亜集団、例えば、リンパ球（例えば、T細胞、CD3+ T細胞、CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞）を規定する抗原であり得る。
【０２４４】
いくつかの態様では、受容体結合試薬は、結合部位Bを有するか含有する。ある特定の態様では、結合部位Bは、一価である。いくつかの局面では、一価の結合部位Bは、一価の抗体断片もしくは免疫グロブリン様機能を有するタンパク質性結合分子、アプタマーまたはMHC分子であるかそれを含有する。一価の抗体断片の例は、Fab断片、Fv断片、および二価の単鎖Fv断片を含む単鎖Fv断片（scFv）を含むが、それらに限定されない。（組換え）抗体断片の例は、Fab断片、Fv断片、単鎖Fv断片（scFv）、二価抗体断片、例えば（Fab)2'-断片、ダイアボディ、トリアボディ（Iliades, P., et al., FEBS Lett (1997) 409, 437-441）、デカボディ（Stone, E., et al., Journal of Immunological Methods (2007) 318, 88-94）および他のドメイン抗体（Holt, L.J., et al., Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490）である。いくつかの態様では、受容体分子結合試薬の1つまたは複数の結合部位は、「デュオカリン（duocalin）」としても知られている二量体リポカリンムテインなどの二価のタンパク質性人工結合分子であり得る。いくつかの態様では、受容体結合試薬は、単一の第2結合部位を有し得、すなわち、それは、一価であり得る。一価の受容体結合試薬の例は、一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子またはMHC分子を含むが、それらに限定されない。
【０２４５】
好適なタンパク質性結合分子のなおさらなる例は、EGF様ドメイン、Kringleドメイン、フィブロネクチンI型ドメイン、フィブロネクチンII型ドメイン、フィブロネクチンIII型ドメイン、PANドメイン、G1aドメイン、SRCRドメイン、Kunitz/Bovine膵臓トリプシンインヒビタードメイン、テンダミスタット（tendamistat）、Kazal型セリンプロテアーゼインヒビタードメイン、Trefoil（P型）ドメイン、フォン・ビルブラント因子C型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、CUBドメイン、チログロブリンI型リピート、LDL-受容体クラスAドメイン、Sushiドメイン、Linkドメイン、トロンボスポンジンI型ドメイン、免疫グロブリンドメインもしくは免疫グロブリン様ドメイン（例えば、ドメイン抗体またはラクダ重鎖抗体）、C型レクチンドメイン、MAMドメイン、フォン・ビルブラント因子A型ドメイン、ソマトメジンBドメイン、WAP型4ジスルフィドコアドメイン、F5/8 C型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、SH2ドメイン、SH3ドメイン、ラミニン型EGF様ドメイン、C2ドメイン、「カッパボディ（Kappabodies）」（Ill.et al, Protein Eng. (1997) 10, 949-57を参照のこと、いわゆる「ミニボディ（minibody）」（Martin et al., EMBO J (1994) 13, 5303-5309）、ダイアボディ（Holliger et al., PNAS USA (1993) 90, 6444-6448を参照のこと）、いわゆる「Janusis」（Traunecker et al., EMBO J (1991) 10, 3655-3659、またはTraunecker et al., Int J Cancer (1992) Suppl 7, 51-52を参照のこと）、ナノボディ、マイクロボディ、アフィリン、アフィボディ、ノッチン、ユビキチン、ジンクフィンガータンパク質、自己蛍光タンパク質またはロイシンリッチリピートタンパク質である。抗体様機能を有する核酸分子の例は、アプタマーである。アプタマーは、規定の3次元モチーフに折り畳まれ、所与の標的構造に対して高親和性を示す。
【０２４６】
特定の局面では、受容体結合タンパク質は、結合パートナーCを含有する。いくつかの局面では、受容体結合試薬に含まれる結合パートナーCは、例えば、炭化水素系（高分子を含む）であり得、窒素、リン、硫黄、炭素、ハロゲン、または擬ハロゲン基を含み得る。その結合パートナーは、アルコール、有機酸、無機酸、アミン、ホスフィン、チオール、ジスルフィド、アルカン、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、糖、オリゴ糖、または多糖であり得る。さらなる例として、その結合パートナーは、カチオン、アニオン、ポリカチオン、ポリアニオン、ポリカチオン、電解質、高分子電解質、カーボンナノチューブまたはカーボンナノフォームでもあり得る。一般に、そのような結合パートナーは、多量体化試薬の結合部位に対して他の物質よりも高い親和性を有する。それぞれの結合パートナーの例は、クラウンエーテル、免疫グロブリン、その断片および抗体様機能を有するタンパク質性結合分子を含むが、それらに限定されない。
【０２４７】
いくつかの態様では、受容体結合試薬に含まれる結合パートナーCは、ビオチンを含み、親和性試薬は、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体を含む。いくつかの態様では、受容体結合試薬に含まれる結合パートナーCは、ストレプトアビジンまたはアビジンに可逆的に結合するビオチン類似体を含み、親和性試薬は、それぞれのビオチン類似体に可逆的に結合するストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体を含む。いくつかの態様では、受容体結合試薬に含まれる結合パートナーCは、ストレプトアビジンまたはアビジン結合ペプチドを含み、親和性試薬は、それぞれのストレプトアビジンまたはアビジン結合ペプチドに可逆的に結合するストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体を含む。
【０２４８】
いくつかの態様では、受容体結合試薬に含まれる結合パートナーは、ストレプトアビジン結合ペプチドを含み得る。いくつかの態様では、ペプチド配列は、一般式His-Pro-Xaa（式中、Xaaは、グルタミン、アスパラギンまたはメチオニンである）を有する配列を含有し、例えば、SEQ ID NO：78に示される配列を含有する。いくつかの態様では、ペプチド配列は、SEQ ID NO：93に示される配列を含有する。いくつかの態様では、ペプチド配列は、SEQ ID NO：79に示される、例えばSEQ ID NO：69に示される一般式を有する。一例として、ペプチド配列は、Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly（Strep-tag（登録商標）とも呼ばれる、SEQ ID NO：70に示される）である。一例として、ペプチド配列は、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（Strep-tag（登録商標）IIとも呼ばれる、SEQ ID NO：64に示される）であり、それは、米国特許6,103,493に記載されており、例えば、Strep-Tactin（登録商標）という商標で市販されている。ストレプトアビジン結合ペプチドは、例えば、単一ペプチド、例えば、米国特許5,506,121に記載されている「Strep-tag（登録商標）」など、または国際特許公報WO 02/077018もしくは米国特許7,981,632に記載されているような2つ以上の個々の結合モジュールの連続配置を有するストレプトアビジン結合ペプチドであり得る。
【０２４９】
一部の態様では、受容体結合試薬の結合パートナーCは、親和性タグとして当業者に公知の部分を含む。そのような態様では、親和性試薬は、親和性タグに結合すると知られている対応する結合パートナー、例えば、抗体または抗体断片を含む。公知の親和性タグのいくつかの実例として、受容体結合試薬に含まれる結合パートナーは、ジニトロフェノールもしくはジゴキシゲニン、オリゴヒスチジン、ポリヒスチジン、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合タンパク質、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、キチン結合タンパク質（CBP）もしくはチオレドキシン、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、FLAG’-ペプチド、HA-タグ（例えば、SEQ ID NO：94）、VSV-G-タグ（例えば、SEQ ID NO：95）、HSV-タグ（例えば、SEQ ID NO：96）、T7エピトープ（例えば、SEQ ID NO：97）、マルトース結合タンパク質（MBP）、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Dの配列のHSVエピトープ（例えば、SEQ ID NO：98）、転写因子c-mycの配列の「myc」エピトープ（例えば、SEQ ID NO：99）、V5-タグ（例えば、SEQ ID NO：100）、またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）を含み得る。そのような態様では、親和性試薬、この場合、抗体または抗体断片の1つまたは複数の結合部位と抗原との間に形成される複合体は、遊離抗原、すなわち、遊離ペプチド（エピトープタグ）または遊離タンパク質（例えば、MBPまたはCBP）を加えることによって、競合的に破壊され得る。親和性タグは、オリゴヌクレオチドタグでもあり得る。そのようなオリゴヌクレオチドタグは、例えば、親和性試薬に連結されているまたはそれに含まれている相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように使用され得る。
【０２５０】
好適な結合パートナーCのさらなる例は、レクチン、プロテインA、プロテインG、金属、金属イオン、ニトリロ三酢酸誘導体（NTA）、RGD-モチーフ、デキストラン、ポリエチレンイミン（PEI）、レドックスポリマー、糖タンパク質、アプタマー、色素、アミロース、マルトース、セルロース、キチン、グルタチオン、カルモジュリン、ゼラチン、ポリミキシン、ヘパリン、NAD、NADP、リジン、アルギニン、ベンズアミジン、ポリU、またはオリゴ-dTを含むが、それらに限定されない。Concavalin Aなどのレクチンは、多糖類およびグリコシル化されたタンパク質に結合すると知られている。色素の実例は、NADH依存性酵素に特異的に結合する、Cibacron blue F3G-A（CB）またはRed HE-3Bなどのトリアジン色素である。典型的には、Green Aは、CoAタンパク質、ヒト血清アルブミンおよびデヒドロゲナーゼに結合する。いくつかの場合に、色素である7-アミノアクチノマイシンDおよび4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドールは、DNAに結合する。一般に、Ni、Cd、Zn、CoまたはCuなどの金属のカチオンは、典型的には、ヘキサヒスチジンまたはHis-Asn-His-Arg-His-Lys-His-Gly-Gly-Gly-Cysタグ（MATタグ)（SEQ ID NO：103）を含むオリゴヒスチジン含有配列などの親和性タグ、およびN-メタクリロイル-(L)-システインメチルエステルに結合するために使用される。
【０２５１】
WO 2013/011011として公開されている国際特許出願PCT/EP2012/063969（あらゆる目的のために参照によりその内容全体が本明細書に組み入れられる）と一致して、受容体結合試薬と標的細胞上の受容体分子との間の結合の強度は、受容体結合試薬を介した親和性試薬への標的細胞の結合の可逆性にとって必須でなくてよい。むしろ、結合部位Bを介した受容体結合試薬と受容体分子との間の結合に対する解離定数（Kd）が、低親和性、例えば、約10-3〜約10-7 MのKdの範囲内であるか、または高親和性、例えば、約10-7〜約1×10-10 MのKdの範囲内であるかを意味する、結合の強度に関係なく、結合部位Bを介した受容体結合試薬と受容体分子との結合の解離が十分に速く起きる限り、標的細胞は、可逆的に染色され得る。この点において、結合部位Bを介した受容体結合試薬と受容体分子との間の結合に対する解離速度定数（koff）は、約3×10-5 sec-1以上の値を有し得る（この解離速度定数は、受容体結合試薬の結合部位Bと標的細胞の表面上の受容体分子との間に形成される複合体の解離反応を特徴付ける定数である）。受容体結合試薬の結合部位Bと標的細胞の表面上の受容体分子との間の会合反応に対する会合速度定数（kon）は、任意の値を有し得る。受容体分子と受容体結合試薬との間の十分に可逆的な結合を保証するために、約3×10-5 sec-1以上、約5×10-5 sec-1以上、例えば、1×10-4 sec-1以上もしくは約1×10-4 sec-1以上、5×10-4 sec-1以上もしくは約5×10-4 sec-1以上、1×10-3 sec-1以上もしくは約1×10-3 sec-1以上、5×10-3 sec-1以上もしくは約5×10-3 sec-1以上、1×10-2 sec-1以上もしくは約1×10-2 sec-1以上、1×10-1 sec-1以上もしくは約1×10-1 sec-1以上、または5×10-1 sec-1以上もしくは約5×10-1 sec-1以上の値を有する結合平衡のkoff値を選択することが有益である。ここで、本明細書において使用されるような動態学的および熱力学的な定数の値は、大気圧、すなわち1.013バール、および室温、すなわち25℃の条件のことを指していることに留意される。
【０２５２】
いくつかの態様では、 受容体結合試薬は、受容体分子に特異的に結合可能な単一（一価）の結合部位Bを有する。いくつかの態様では、受容体結合試薬は、受容体分子に結合可能な少なくとも2つ（すなわち、3つ、4つまたは5つの同一の結合部位Bを含む複数の結合部位B）を有する。これらの態様のいずれかにおいて、結合部位B（の各々）を介した受容体分子の結合は、約3×10-5 sec-1以上のkoff値を有し得る。したがって、受容体結合試薬は、一価分子（例えば、一価抗体断片または一価人工結合分子（タンパク質性またはその他）、例えば、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン（「Anticalin（登録商標）」としても知られている）、または二価分子、例えば抗体もしくは両方の結合部位が保持されている断片、例えばF(ab')2断片であることができる。いくつかの態様では、koff速度が3×10-5 sec-1以上であれば、受容体分子は、多価分子、例えば、五量体IgE分子であってもよい。
【０２５３】
本発明のいくつかの態様では、ここで記載される可逆的な細胞アフィニティークロマトグラフィー技術を介した生物学的材料の（トレースレス）単離を提供するのは、分子レベルでは、少なくとも結合部位Bを介した受容体結合試薬と標的細胞上の受容体分子との結合のkoff速度（3×10-5 sec-1以上の）ではない。むしろ、例えば、米国特許 7,776,562または国際特許出願WO02/054065に記載されているように、固定された親和性試薬によって媒介されるアビディティー効果を伴った、受容体分子と結合している受容体結合試薬の結合部位Bとの間の低親和性結合が、可逆的かつトレースレスな標的細胞の単離を可能にする。これらの態様では、親和性試薬の2つ以上の結合部位Zと少なくとも2つの受容体結合試薬の結合パートナーCとの間で複合体が形成され得、それにより、可逆的な固定およびその後のアフィニティークロマトグラフィーマトリックスからの標的細胞の溶出（結合パートナーCと結合部位Zとの間に形成された結合（複合体）を破壊し、標的細胞から受容体結合試薬を解離させる、競合剤の添加を介して）が可能になる。上述したように、そのような低結合親和性は、結合部位Bを介した受容体結合試薬と標的細胞表面上の受容体分子との結合に対する約1.0×10-3 M〜約1.0×10-7 Mの範囲内の解離定数（KD）を特徴とし得る。
【０２５４】
3. インプット組成物
ある特定の態様では、提供される方法は、細胞のインプット集団または組成物を産生または調製することに関連して使用される。ある特定の態様では、インプット細胞組成物は、遺伝子操作において使用するための細胞、例えば、遺伝子操作される細胞または遺伝子操作された細胞を産生するためのプロセスを受ける細胞の集団を含む。ある特定の態様では、細胞は、組換え受容体をコードする核酸で処理するか、それと接触させるか、またはそれとインキュベートさせる。ある特定の態様では、インプット組成物は、T細胞、生存T細胞、CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞および/またはそれらの亜集団を含有する。
【０２５５】
いくつかの態様では、細胞生存率は、色素取り込みアッセイ（例えば、カルセインAMアッセイ）、XTT細胞生存率アッセイおよび色素排除アッセイ（例えば、トリパンブルー、エオシンまたはプロピジウム色素排除アッセイ）を非限定的に含み得るアッセイで評価される。特定の態様では、生存細胞は、1つまたは複数のアポトーシスマーカー、例えば、アネキシンVまたは活性型カスパーゼ3の陰性発現を有する。いくつかの態様では、生存細胞は、カスパーゼまたは活性型カスパーゼ、例えば、カスパーゼ2、カスパーゼ3、カスパーゼ6、カスパーゼ7、カスパーゼ8、カスパーゼ9もしくはカスパーゼ10、Bcl-2ファミリーメンバー、例えば、Bax、BadおよびBid、アネキシンV、またはTUNEL染色を非限定的に含み得る1つまたは複数のアポトーシスマーカーの発現に対して陰性である。特定の態様では、生存細胞は、活性型カスパーゼ3陰性である。ある特定の態様では、生存細胞は、アネキシンV陰性である。
【０２５６】
いくつかの態様では、インプット組成物は、濃縮されたCD3+ T細胞、例えば、生存CD3+ T細胞の集団を含む。いくつかの態様では、インプット集団の細胞の少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％が、CD3+ T細胞、例えば、生存CD3+ T細胞である。いくつかの態様では、インプット集団は、CD3+ T細胞、例えば、生存CD3+ T細胞から本質的になる。
【０２５７】
ある特定の態様では、インプット集団は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞が濃縮された細胞、例えば、濃縮されたCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の集団である。特定の態様では、インプット集団は、CD4+またはCD8+T細胞である細胞が少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％であるかそれを含む。いくつかの態様では、インプット集団は、CD4+およびCD8+ T細胞から本質的になる。
【０２５８】
ある特定の態様では、インプット集団は、濃縮されたCD4+ T細胞の集団である。特定の態様では、インプット集団の細胞の少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％がCD4+ T細胞である。いくつかの態様では、インプット集団は、CD4+ T細胞から本質的になる。
【０２５９】
いくつかの態様では、濃縮されたCD4+ T細胞の集団由来の細胞と濃縮されたCD8+ T細胞の集団由来の細胞が混合、組み合わせおよび/またはプールされ、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含有するインプット集団を生成する。ある特定の態様では、濃縮されたCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の集団は、細胞を刺激する、例えば、セクションI-Bに記載されているような細胞を刺激条件下で培養する前に、プール、混合および/または組み合わされる。ある特定の態様では、生体試料からのCD4+およびCD8+ T細胞の単離、濃縮および/または選択に続いて、濃縮されたCD4+およびCD8+ T細胞の集団がプール、混合および/または組み合わされる。特定の態様では、濃縮されたCD4+およびCD8+ T細胞の集団の凍結、例えば、凍結保存、および融解に続いて、濃縮されたCD4+およびCD8+ T細胞の集団がプール、混合および/または組み合わされる。
【０２６０】
ある特定の態様では、インプット集団は、濃縮されたCD4+細胞の集団由来の細胞と濃縮されたCD8+細胞の集団由来の細胞との混合、プールおよび/または組み合わせによって、産生、生成または製造される。ある特定の態様では、濃縮されたCD4+ T細胞の集団は、CD4+ T細胞を少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または99.9％含有する。特定の態様では、濃縮されたCD4+ T細胞の集団は、CD4+ T細胞を100％含有するか、またはCD4+ T細胞を約100％含有する。ある特定の態様では、濃縮されたT細胞の集団は、CD8+ T細胞を20％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満もしくは0.01％未満含むか含有し、かつ/または、CD8+ T細胞を含有せず、かつ/または、CD8+ T細胞を含まないか実質的に含まない。いくつかの態様では、細胞の集団は、CD4+ T細胞から本質的になる。ある特定の態様では、濃縮されたCD8+ T細胞の集団は、CD8+ T細胞を少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％もしくは99.9％含有するか、またはCD8+ T細胞を100％含有するか約100％含有する。ある特定の態様では、濃縮されたCD8+ T細胞の集団は、CD4+ T細胞を20％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満もしくは0.01％未満含むか含有し、かつ/または、CD4+ T細胞を含有せず、かつ/または、CD4+ T細胞を含まないか実質的に含まない。いくつかの態様では、細胞の集団は、CD8+ T細胞から本質的になる。
【０２６１】
ある特定の態様では、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞は、1：10〜10：1の間、1：5〜5：1の間、4：1〜1：4の間、1：3〜3：1の間、2：1〜1：2の間、1.5：1〜1：1.5の間、1.25：1〜1：1.25の間、1.2：1〜1：1.2の間、1.1：1〜1：1.1の間、または約1：1または1：1のCD4+ T細胞：CD8+ T細胞比で、プール、混合および/または組み合わされる。特定の態様では、生存CD4+ T細胞および生存CD8+ T細胞は、1：10〜10：1の間、1：5〜5：1の間、4：1〜1：4の間、1：3〜3：1の間、2：1〜1：2の間、1.5：1〜1：1.5の間、1.25：1〜1：1.25の間、1.2：1〜1：1.2の間、1.1：1〜1：1.1の間、または約1：1または1：1のCD4+ T細胞：CD8+ T細胞比で、プール、混合および/または組み合わされる。
【０２６２】
特定の態様では、インプット組成物は、50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106、700×106、800×106、900×106、 1,000×106、1,100×106もしくは1,200×106個、約50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106、700×106、800×106、900×106、 1,000×106、1,100×106もしくは1,200×106個、または少なくとも50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106、700×106、800×106、900×106、 1,000×106、1,100×106もしくは1,200×106個の量のT細胞、例えば生存T細胞、生存CD3+ T細胞、または生存の混合CD4+およびCD8+ T細胞を有する。特定の態様では、インプット組成物は、50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106個、約50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106個、または少なくとも50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106個の量のCD4+ T細胞、例えば、生存CD4+ T細胞を有する。ある特定の態様では、インプット組成物は、50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106個、約50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106個、または少なくとも50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106個の量のCD8+ T細胞、例えば、生存CD8+ T細胞を有する。いくつかの態様では、細胞の量は、同じ組成物中に一緒にプール、混合および/または組み合わされた生存CD4+およびCD8+ T細胞の量である。そのような態様では、CD4+およびCD8+ T細胞は、1：3〜3：1の間、2：1〜1：2の間、1.5：1〜1：1.5の間、1.25：1〜1：1.25の間、1.2：1〜1：1.2の間、1.1：1〜1：1.1の間、または約1：1または1：1のCD4+ T細胞：CD8+ T細胞比で存在する。いくつかの態様では、細胞の量は、約1：1または1：1のCD4+ T細胞：CD8+ T細胞比で一緒にプール、混合および/または組み合わされた生存CD4+およびCD8+ T細胞の量である。 
【０２６３】
特定の態様では、インプット組成物は、300×106〜600×106または約300×106〜600×106個の量のT細胞、例えば、生存CD3+細胞、または混合の生存CD4+および生存CD8+細胞（例えば、1：1または約1：1比で混合された）を有する。いくつかの態様では、インプット集団は、300×106または約300×106個の量の、例えば、生存CD3+細胞、または混合の生存CD4+および生存CD8+細胞（例えば、1：1または約1：1比で混合された）を有する。いくつかの態様では、インプット集団は、400×106または約400×106個の量の、例えば、生存CD3+細胞または混合の生存CD4+および生存CD8+細胞（例えば、1：1または約1：1比で混合された）を有する。いくつかの態様では、インプット集団は、500×106または約500×106個の量の、例えば、生存CD3+細胞または混合の生存CD4+および生存CD8+細胞（例えば、1：1または約1：1比で混合された）を有する。いくつかの態様では、インプット集団は、600×106または約600×106個の量の、例えば、生存CD3+細胞または混合の生存CD4+および生存CD8+細胞（例えば、1：1または約1：1比で混合された）を有する。いくつかの態様では、インプット集団は、700×106または約700×106個の量の、例えば、生存CD3+細胞または混合の生存CD4+および生存CD8+細胞（例えば、1：1または約1：1比で混合された）を有する。いくつかの態様では、インプット集団は、800×106または約800×106個の量の、例えば、生存CD3+細胞または混合の生存CD4+および生存CD8+細胞（例えば、1：1または約1：1比で混合された）を有する。いくつかの態様では、インプット集団は、900×106または約900×106個の量の、例えば、生存CD3+細胞または混合の生存CD4+および生存CD8+細胞（例えば、1：1または約1：1比で混合された）を有する。いくつかの態様では、インプット集団は、100×107または約100×107個の量の、例えば、生存CD3+細胞または混合の生存CD4+および生存CD8+細胞（例えば、1：1または約1：1比で混合された）を有する。いくつかの態様では、インプット集団は、110×107または約110×107個の量の、例えば、生存CD3+細胞または混合の生存CD4+および生存CD8+細胞（例えば、1：1または約1：1比で混合された）を有する。いくつかの態様では、インプット集団は、120×107または約120×107個の量の、例えば、生存CD3+細胞または混合の生存CD4+および生存CD8+細胞（例えば、1：1または約1：1比で混合された）を有する。
【０２６４】
ある特定の態様では、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞は、インプット組成物が、T細胞、例えば、生存T細胞、生存CD3+ T細胞、または生存の混合CD4+およびCD8+ T細胞を最大で目標数（2n）または最大で約目標数（約2n）有するように、プール、混合および/または組み合わされる。濃縮されたCD4+ T細胞を含む組成物がCD4+ T細胞を少なくともn個含有し、濃縮されたCD8+ T細胞（例えば、CD4+ T細胞組成物と同じドナーに由来する、例えば、ドナー由来の同じアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料に由来する）を含む組成物がCD8+ T細胞を少なくともn個含有するある特定の態様では、CD4+ T細胞組成物由来のCD4+ T細胞のn個およびCD8+ T細胞組成物由来のCD8+ T細胞のn個が、プール、混合および/または組み合わされ（すなわち、CD4+：CD8+比1：1）、T細胞を目標数（2n）含有するインプット組成物を生成する。濃縮されたCD4+ T細胞を含む組成物がCD4+ T細胞をn個以下（例えば、n個よりも少ない）含有し、濃縮されたCD8+ T細胞（例えば、CD4+ T細胞組成物と同じドナーに由来する、例えば、ドナー由来の同じアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料に由来する）を含む組成物がCD8+ T細胞をn個以下（例えば、n個よりも少ない）含有するある特定の態様では、CD4+ T細胞組成物の細胞のすべておよびCD8+ T細胞組成物の細胞のすべてが、プール、混合および/または組み合わされて、インプット組成物を生成する。これらの態様では、インプット組成物は、目標数（2n）よりも少ないT細胞を含有し得る。濃縮されたCD4+ T細胞を含む組成物がn個よりも少ないCD4+ T細胞を含有し、濃縮されたCD8+ T細胞（例えば、CD4+ T細胞組成物と同じドナーに由来する、例えば、ドナー由来の同じアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料に由来する）を含む組成物がn個を超えるCD8+ T細胞を含有する（逆もまた同様）ある特定の態様では、インプット組成物がT細胞を最大で目標数（2n）含有するように、CD4+ T細胞組成物の細胞またはCD8+ T細胞組成物の細胞を使用してもう一方の細胞タイプを補う。先行の態様のいずれかにおいて、目標数2nは、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106、700×106、800×106、900×106、 1,000×106、1,100×106、または1,200×106個であることができる。
【０２６５】
ある特定の態様では、濃縮されたCD4+ T細胞を含む組成物由来の450×106個のCD4+ T細胞および濃縮されたCD8+ T細胞（例えば、CD4+ T細胞組成物と同じドナーに由来する、例えば、ドナー由来の同じアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料に由来する）を含む組成物由来の450×106個のCD8+ T細胞がプール、混合および/または組み合わされて、900×106個のCD4+およびCD8+ T細胞を含有するインプット組成物を生成する。ある特定の態様では、濃縮されたCD4+ T細胞を含む組成物が450×106個よりも少ないCD4+ T細胞を含有し、濃縮されたCD8+ T細胞（例えば、CD4+ T細胞組成物と同じドナーに由来する、例えば、ドナー由来の同じアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料に由来する）を含む組成物が450×106個よりも少ないCD8+ T細胞を含有するとき、CD4+ T細胞組成物の細胞のすべておよびCD8+ T細胞組成物の細胞のすべてが、プール、混合および/または組み合わされて、インプット組成物を生成する。ある特定の態様では、組成物のいずれか一方が450×106個よりも少ないCD4+またはCD8+細胞を含有する一方で、他方の組成物が450×106を超えるCD8+細胞またはCD4+細胞を含有するとき、最大で900×106個のCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞が組み合わされて、インプット組成物を生成する。インプット組成物中のCD4+およびCD8+ T細胞の総数は、900×106個よりも少ない場合がある。言い換えれば、刺激に供されるべきT細胞を最大で目標数（2n）、例えば、T細胞を最大で900×106個含むインプット組成物を生成するために、濃縮されたCD4+ T細胞を含む組成物の細胞を使用して、濃縮されたCD8+ T細胞を含む組成物を補ってもよい（逆もまた同様）。
【０２６６】
上記態様では、細胞の選択、単離、分離、濃縮および/または精製プロセスがインプット組成物の調製に関して考察されているが、本明細書において開示される細胞の選択、単離、分離、濃縮および/または精製プロセスを、後続の工程（例えば、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、インキュベーション、培養、採取、製剤化、および/または製剤化された細胞集団の対象への投与）の途中、その前、またはそのいずれかの間に、任意の好適な組み合わせおよび/または順序で使用できることを理解すべきである。例えば、T細胞の選択、単離、分離、濃縮および/または精製工程を、T細胞の活性化/刺激とT細胞の形質導入との間に実施することができる。別の例では、T細胞の選択、単離、分離、濃縮および/または精製工程を、T細胞の形質導入後であるが、細胞を採取する前、収集する前、および/または製剤化する前に実施することができる。特定の例では、T細胞の選択、単離、分離、濃縮および/または精製工程を、細胞を採取する直前に、精錬または清澄化工程として実施することができる。いくつかの態様では、クロマトグラフィーによるT細胞の選択工程は、T細胞の活性化/刺激とT細胞の形質導入の間に実施される。いくつかの態様では、クロマトグラフィーによるT細胞の選択工程は、T細胞の形質導入後であるが、細胞を採取する前、収集する前、および/または製剤化する前に実施される。いくつかの態様では、クロマトグラフィーによるT細胞の選択工程は、細胞を採取する直前に実施される。
【０２６７】
いくつかの態様では、インプット組成物は、細胞を刺激する、例えば、セクションI-Bに記載されているような細胞を刺激条件下で培養する前に、例えば、無血清培地を用いた、1つまたは複数の希釈および/または洗浄工程に供される。いくつかの態様では、希釈および/または洗浄工程は、無血清培地への、例えば、本明細書のセクションIIまたはPCT/US2018/064627（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている無血清培地への培地交換を可能にする。
【０２６８】
いくつかの態様では、無血清培地は、1つまたは複数のサプリメントが補充された基礎培地（例えば、OpTmizer（商標）T-Cell Expansion Basal Medium（ThermoFisher））を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数のサプリメントは、無血清である。いくつかの態様では、無血清培地は、例えば追加のサプリメント（例えば、OpTmizer（商標）T-Cell Expansion Supplement（ThermoFisher））によって提供される、細胞（例えば、T細胞）の維持、拡大増殖および/または活性化のための1つまたは複数の追加の成分が補充された基礎培地を含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、血清代替サプリメント、例えば、免疫細胞血清代替物、例えば、CTS（商標）Immune Cell Serum Replacement（ThermoFisher、#A2596101）、またはSmith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31に記載されている免疫細胞血清代替物を含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、L-グルタミンなどのアミノ酸の遊離形態を含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、L-グルタミンのジペプチド形態（例えば、L-アラニル-L-グルタミン）、例えば、Glutamax（商標）（ThermoFisher）中のジペプチドを含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、1つまたは複数の組換えサイトカイン、例えば、組換えヒトIL-2、組換えヒトIL-7、および/または組換えヒトIL-15を含む。
【０２６９】
いくつかの態様では、インプット組成物は、PBMCまたは白血球アフェレーシス試料などの出発試料から生成されたCD8+ T細胞が濃縮された集団と出発試料から生成されたCD4+ T細胞が濃縮された集団とを混合、組み合わせおよび/またはプールするによって生成される。いくつかの態様では、CD4+ T細胞が濃縮された集団は、出発試料からCD8+ T細胞が濃縮された集団を生成するプロセスの間に生成されたCD8陰性画分から生成される。特定の態様では、インプット組成物は、1：1または約1：1のCD4+ T細胞：CD8+ T細胞の比を有し、インプット組成物は、細胞を刺激する、例えば、セクションI-Bに記載されているような細胞を刺激条件下で培養する前に、例えば、本明細書のセクションIIまたはPCT/US2018/064627に記載される無血清培地を用いた、1つまたは複数の洗浄工程に供される。いくつかの態様では、1つまたは複数の洗浄工程は、アルブミンを含有するPBS/EDTA緩衝液から無血清培地（細胞の刺激においても使用される）への培地交換を可能にする。
【０２７０】
B. 刺激
いくつかの態様では、提供される方法は、細胞を刺激すること、例えば、細胞を刺激条件下で培養することに関連して使用される。いくつかの態様では、刺激条件は、TCRおよび/または共受容体から生成されたシグナルなど、細胞、例えば、CD4+またはCD8+ T細胞内のシグナルを活性化もしくは刺激する、および/または活性化もしくは刺激することが可能である条件を含む。いくつかの態様では、刺激条件は、刺激試薬、例えば、細胞内のシグナルを活性化もしくは刺激する、または活性化もしくは刺激することが可能である試薬と共にまたはその存在下で細胞を培養する1つまたは複数の工程であるかそれを含む。いくつかの態様では、刺激試薬は、TCRおよび/または共受容体を刺激および/または活性化する。特定の態様では、刺激試薬は、本明細書において提供される、例えば、セクションI-B-1に記載されているような試薬である。ある特定の態様では、細胞の集団を刺激条件下で刺激または培養することは、刺激された細胞の集団（本明細書において細胞の刺激された集団とも称される）を生成または産生する。
【０２７１】
いくつかの態様では、インプット集団、例えば、セクションI-A-3などにおける本明細書に記載のインプット集団の細胞が刺激される。ある特定の態様では、インプット集団の細胞は、異種または組換えポリヌクレオチドを細胞に導入する前に、例えば、本明細書に、例えば、セクションI-Cに記載される方法、工程または技法によって、刺激されるか刺激に供される。特定の態様では、インプット集団由来の細胞は、事前に凍結、例えば、凍結保存され、貯蔵され、そして、刺激の前に融解され、任意で洗浄される。特定の態様では、インプット集団の細胞は、凍結保存および/または凍結保護されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物から融解された組成物から選択され（例えば、セクションI-A-1およびセクションI-A-2に記載されているように）、インプット集団の細胞は、刺激の前に、凍結、例えば、凍結保存されず、貯蔵されない。
【０２７２】
特定の局面では、インプット細胞が初めて刺激条件に接触または曝露されたときに、刺激（本明細書において刺激することとも称される）の開始が起こる。いくつかの態様では、刺激は、インプット集団の細胞が初めて、TCRおよび/または共受容体から生成されるシグナルなど、細胞内のシグナルを活性化もしくは刺激する、および/または活性化もしくは刺激することが可能である条件で刺激または曝露されたときに開始されると考えられる。いくつかの態様では、刺激は、インプット細胞が初めて刺激試薬、例えば、本明細書に、例えば、セクションI-B-1に記載される刺激試薬に接触または曝露されたときに、開始される。
【０２７３】
いくつかの態様では、刺激、例えば、細胞を刺激条件下で培養することは、48時間、42時間、36時間、30時間、24時間、22時間、20時間、18時間、16時間もしくは12時間、約48時間、42時間、36時間、30時間、24時間、22時間、20時間、18時間、16時間もしくは12時間、または48時間、42時間、36時間、30時間、24時間、22時間、20時間、18時間、16時間もしくは12時間未満にわたり実施される。いくつかの態様では、刺激、例えば、細胞を刺激条件下で培養することは、20±4時間または16時間〜24時間または約16時間〜24時間にわたり実施される。特定の態様では、刺激、例えば、細胞を刺激条件下で培養することは、36時間〜12時間もしくは約36時間〜12時間、30時間〜18時間、または24時間もしくは約24時間、または22時間にわたり実施される。いくつかの態様では、刺激、例えば、細胞を刺激条件下で培養することは、2日もしくは1日、約2日もしくは1日、または2日もしくは1日未満にわたり実施される。
【０２７４】
特定の態様では、50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106、700×106、800×106、900×106もしくは1,000×106個、約50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106、700×106、800×106、900×106もしくは1,000×106個、または少なくとも50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106、700×106、800×106、900×106もしくは1,000×106個の量のインプット集団の細胞が、刺激されるか刺激に供される、例えば、刺激条件下で培養される。特定の態様では、刺激される、例えば、刺激条件下で培養されるインプット集団の量は、50×106個もしくは約50×106個の細胞、100×106個もしくは約100×106個の細胞、150×106個もしくは約150×106個の細胞、200×106個もしくは約200×106個の細胞、250×106個もしくは約250×106個の細胞、300×106個もしくは約300×106個の細胞、350×106個もしくは約350×106個の細胞、400×106個もしくは約400×106個の細胞、450×106個もしくは約450×106個の細胞、500×106個もしくは約500×106個の細胞、550×106個もしくは約550×106個の細胞、600×106個もしくは約600×106個の細胞、700×106個もしくは約700×106個の細胞、800×106個もしくは約800×106個の細胞、900×106個もしくは約900×106個の細胞、または1,000×106個もしくは約1,000×106個の細胞、または前述のいずれかの間の任意の値である。特定の態様では、900×106個または約900×106個の量のインプット集団の細胞が刺激される、例えば、刺激条件下で培養される。
【０２７５】
特定の態様では、インプット組成物は、生存CD4+ T細胞および生存CD8+ T細胞を、1：10〜10：1の間、1：5〜5：1の間、4：1〜1：4の間、1：3〜3：1の間、2：1〜1：2の間、1.5：1〜1：1.5の間、1.25：1〜1：1.25の間、1.2：1〜1：1.2の間、1.1：1〜1：1.1の間、または約1：1もしくは1：1の生存CD4+ T細胞：生存CD8+ T細胞比で含む。特定の態様では、インプット組成物は、生存CD4+ T細胞および生存CD8+ T細胞を、約1：1または1：1の生存CD4+ T細胞：生存CD8+ T細胞比で含む。特定の態様では、インプット集団の450×106個または約450×106個の量のCD4+細胞が刺激される、例えば、刺激条件下で培養される。特定の態様では、インプット集団の450×106個または約450×106個の量のCD8+細胞が刺激される、例えば、刺激条件下で培養される。特定の態様では、インプット集団の450×106個または約450×106個の量のCD4+ T細胞および450×106個または約450×106個の量のCD8+ T細胞が刺激される、例えば、刺激条件下で培養される。
【０２７６】
ある特定の態様では、細胞、例えば、インプット集団の細胞は、0.01×106個の細胞/mL、0.1×106個の細胞/mL、0.5×106個の細胞/mL、1.0×106個の細胞/mL、1.5×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mLもしくは50×106個の細胞/mL、約0.01×106個の細胞/mL、0.1×106個の細胞/mL、0.5×106個の細胞/mL、1.0×106個の細胞/mL、1.5×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mLもしくは50×106個の細胞/mL、または少なくとも0.01×106個の細胞/mL、0.1×106個の細胞/mL、0.5×106個の細胞/mL、1.0×106個の細胞/mL、1.5×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mLもしくは50×106個の細胞/mLの密度で、刺激されるか刺激に供される、例えば、刺激試薬の存在下などの刺激条件下で培養される。ある特定の態様では、細胞、例えば、インプット集団の細胞は、3.0×106個の細胞/mL、約3.0×106個の細胞/mL、または少なくとも3.0×106個の細胞/mLの密度で、刺激されるか刺激に供される、例えば、刺激試薬の存在下などの刺激条件下培養される。ある特定の態様では、インプットの細胞は、生存細胞である。
【０２７７】
いくつかの態様では、刺激および/または活性化のための条件は、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、作用物質、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオンおよび/または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、ならびに細胞を活性化するように設計された任意の他の作用物質の1つまたは複数を含むことができる。
【０２７８】
特定の態様では、刺激条件は、細胞、例えば、インプット集団由来の細胞を、1つまたは複数のサイトカインと共におよび/またはその存在下で培養することを含む。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、組換えサイトカインである。いくつかの態様では、1つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えサイトカインである。ある特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、T細胞によって発現されるおよび/またはT細胞に対して内因性である受容体に結合するおよび/または結合可能である。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、サイトカインの4-アルファ-ヘリックスバンドルファミリーのメンバーであるかそれを含む。いくつかの態様では、サイトカインの4-アルファ-ヘリックスバンドルファミリーのメンバーは、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン15（IL-15）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を含むが、それらに限定されない。いくつかの態様では、1つまたは複数のサイトカインは、IL-15であるかそれを含む。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、IL-7であるかそれを含む。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、IL-2であるかそれを含む。
【０２７９】
ある特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインの量または濃度は、国際単位（IU）を用いて測定および/または定量される。国際単位を使用して、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、ワクチン、血液製剤および類似の生物活性物質を定量してもよい。いくつかの態様では、IUは、特定の重量および強度の国際参照標準、例えば、ヒトIL-2についてのWHO第1国際標準、86/504と比較することによる生物学的調製物の効力の測定単位であるかそれを含む。国際単位は、公開されておりかつ国際的な共同研究活動から得られた生物活性単位を報告するための唯一認められている標準化された方法である。特定の態様では、サイトカインの集団、試料または供給源についてのIUは、類似のWHO標準品を用いた製品比較試験によって得てもよい。例えば、いくつかの態様では、ヒト組換えIL-2、IL-7またはIL-15の集団、試料または供給源のIU/mgは、WHO標準IL-2製品（NIBSCコード：86/500）、WHO標準IL-17製品（NIBSCコード：90/530）およびWHO標準IL-15製品（NIBSCコード：95/554）とそれぞれ比較される。
【０２８０】
いくつかの態様では、IU/mg単位の生物活性は、（ng/ml単位のED50）-1×106に等しい。特定の態様では、組換えヒトIL-2またはIL-15のED50は、CTLL-2細胞による細胞増殖の半最大刺激（XTT切断）に必要な濃度に等しい。ある特定の態様では、組換えヒトIL-7のED50は、PHA活性化ヒト末梢血リンパ球の増殖のための半最大刺激に必要な濃度に等しい。IL-2についてのIUのアッセイおよび計算に関する詳細は、Wadhwa et al., Journal of Immunological Methods (2013), 379 (1-2): 1-7；およびGearing and Thorpe, Journal of Immunological Methods (1988), 114 (1-2): 3-9において考察されており；IL-15についてのIUのアッセイおよび計算に関する詳細は、Soman et al. Journal of Immunological Methods (2009) 348 (1-2): 83-94において考察されている。
【０２８１】
いくつかの態様では、細胞、例えば、インプット細胞は、1IU/mL〜1,000IU/mLの間、10IU/mL〜50IU/mLの間、50IU/mL〜100IU/mLの間、100IU/mL〜200IU/mLの間、100IU/mL〜500IU/mLの間、250IU/mL〜500IU/mLの間、または500IU/mL〜1,000IU/mLの間の濃度のサイトカイン、例えば、組換えヒトサイトカインの存在下で、刺激されるか刺激に供される。
【０２８２】
いくつかの態様では、細胞、例えば、インプット細胞は、1IU/mL〜500IU/mLの間、10IU/mL〜250IU/mLの間、50IU/mL〜200IU/mLの間、50IU/mL〜150IU/mLの間、75IU/mL〜125IU/mLの間、100IU/mL〜200IU/mLの間、または10IU/mL〜100IU/mLの間の濃度の組換えIL-2、例えば、ヒト組換えIL-2の存在下で、刺激されるか刺激に供される。特定の態様では、細胞、例えば、インプット集団の細胞は、50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mLもしくは100IU/mL、または約50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mLもしくは100IU/mLの濃度の組換えIL-2の存在下で、刺激されるか刺激に供される。いくつかの態様では、細胞、例えば、インプット細胞は、100IU/mLまたは約100IU/mLの組換えIL-2、例えば、ヒト組換えIL-2の存在下で、刺激されるか刺激に供される。
【０２８３】
いくつかの態様では、細胞、例えば、インプット細胞は、100IU/mL〜2,000IU/mLの間、500IU/mL〜1,000IU/mLの間、100IU/mL〜500IU/mLの間、500IU/mL〜750IU/mLの間、750IU/mL〜1,000IU/mLの間、または550IU/mL〜650IU/mLの間の濃度の組換えIL-7、例えば、ヒト組換えIL-7の存在下で、刺激されるか刺激に供される。特定の態様では、細胞、例えば、インプット細胞は、50IU/mL、100IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、250IU/mL、300IU/mL、350IU/mL、400IU/mL、450IU/mL、500IU/mL、550IU/mL、600IU/mL、650IU/mL、700IU/mL、750IU/mL、800IU/mL、750IU/mL、750IU/mL、750IU/mLもしくは1,000IU/mL、または約50IU/mL、100IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、250IU/mL、300IU/mL、350IU/mL、400IU/mL、450IU/mL、500IU/mL、550IU/mL、600IU/mL、650IU/mL、700IU/mL、750IU/mL、800IU/mL、750IU/mL、750IU/mL、750IU/mLもしくは1,000IU/mLの濃度のIL-7の存在下で、刺激されるか刺激に供される。特定の態様では、細胞、例えば、インプット細胞は、600IU/mLまたは約600IU/mLの組換えIL-7、例えば、ヒト組換えIL-7の存在下で、刺激されるか刺激に供される。
【０２８４】
いくつかの態様では、細胞、例えば、インプット細胞は、1IU/mL〜500IU/mLの間、10IU/mL〜250IU/mLの間、50IU/mL〜200IU/mLの間、50IU/mL〜150IU/mLの間、75IU/mL〜125IU/mLの間、100IU/mL〜200IU/mLの間、または10IU/mL〜100IU/mLの間の濃度の組換えIL-15、例えば、ヒト組換えIL-15の存在下で、刺激されるか刺激に供される。特定の態様では、細胞、例えば、インプット集団の細胞は、50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mLもしくは200IU/mL、または約50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mLもしくは200IU/mLの濃度の組換えIL-15の存在下で、刺激されるか刺激に供される。いくつかの態様では、細胞、例えば、インプット細胞は、100IU/mLまたは約100IU/mLの組換えIL-15、例えば、ヒト組換えIL-15の存在下で、刺激されるか刺激に供される。
【０２８５】
特定の態様では、細胞、例えば、インプット集団由来の細胞は、IL-2、IL-7および/またはIL-15の存在下の刺激条件下で、刺激されるか刺激に供される。いくつかの態様では、IL-2、IL-7および/またはIL-15は、組換えである。ある特定の態様では、IL-2、IL-7および/またはIL-15は、ヒトである。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えIL-2、IL-7および/またはIL-15であるかそれを含む。ある特定の態様では、細胞は、組換えIL-2、IL-7およびIL-15の存在下の刺激条件下で、刺激されるか刺激に供される。ある特定の態様では、細胞は、100IU/mLまたは約100IU/mLの組換えIL-2、600IU/mLまたは約600IU/mLの組換えIL-7、および100IU/mLまたは約100IU/mLの組換えIL-15の存在下の刺激条件下で、刺激されるか刺激に供される。
【０２８６】
条件は、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、作用物質、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオンおよび/または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、ならびに細胞を活性化するように設計された任意の他の作用物質の1つまたは複数を含むことができる。
【０２８７】
いくつかの局面では、刺激は、Riddellらの米国特許第6,040,177号、Klebanoff et al. (2012） J Immunother. 35 (9): 651-660、Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82、および/またはWang et al. (2012) J Immunother. 35 (9):689-701に記載されているものなどの技術に従って行われる。
【０２８８】
いくつかの態様では、刺激は、無血清培地中で実施される。いくつかの態様では、無血清培地は、規定されたおよび/または正確に規定された細胞培養培地である。ある特定の態様では、無血清培地は、処理されている、例えば、阻害物質および/または成長因子を除去するために濾過されている、制御された培養培地である。いくつかの態様では、無血清培地は、タンパク質を含有する。ある特定の態様では、無血清培地は、血清アルブミン、加水分解物、成長因子、ホルモン、担体タンパク質および/または付着因子を含有し得る。
【０２８９】
いくつかの態様では、刺激は、本明細書のセクションIIまたはPCT/US2018/064627に記載される無血清培地中で実施される。いくつかの態様では、無血清培地は、1つまたは複数のサプリメントが補充された基礎培地（例えば、OpTmizer（商標）T-Cell Expansion Basal Medium（ThermoFisher））を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数のサプリメントは、無血清である。いくつかの態様では、無血清培地は、例えば追加のサプリメント（例えば、OpTmizer（商標）T-Cell Expansion Supplement（ThermoFisher））によって提供される、細胞（例えば、T細胞）の維持、拡大増殖および/または活性化のための1つまたは複数の追加の成分が補充された基礎培地を含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、血清代替サプリメント、例えば、免疫細胞血清代替物、例えば、CTS（商標）Immune Cell Serum Replacement（ThermoFisher、#A2596101）、またはSmith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31に記載されている免疫細胞血清代替物を含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、L-グルタミンなどのアミノ酸の遊離形態を含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、L-グルタミンのジペプチド形態（例えば、L-アラニル-L-グルタミン）、例えば、Glutamax（商標）（ThermoFisher）中のジペプチドを含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、1つまたは複数の組換えサイトカイン、例えば、組換えヒトIL-2、組換えヒトIL-7、および/または組換えヒトIL-15を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の刺激条件または刺激試薬の存在下での刺激の少なくとも一部は、例えば、国際公開番号WO2016/073602（参照により組み入れられる）に記載されているような遠心回転下で、遠心チャンバの内部キャビティ内で行われる。いくつかの態様では、遠心チャンバ内で実施される刺激の少なくとも一部は、刺激および/または活性化を誘導するための単数または複数の試薬と混合することを含む。いくつかの態様では、選択された細胞などの細胞は、遠心チャンバ内で刺激条件または刺激剤と混合される。そのようなプロセスのいくつかの局面では、細胞培養プレートまたは他のシステムで同様の刺激を行う際に通常利用されているよりもはるかに少ない量の1つまたは複数の刺激条件または刺激剤と一定体積の細胞が混合される。
【０２９０】
いくつかの態様では、刺激は、一般に、スピンの存在下などの混合条件下で、一般に、細胞をペレット化するのに使用される速度よりも遅い速度などの比較的低い力または速度で、例えば、600rpm〜1700rpmまたは約600rpm〜1700rpm（例えば、600rpm、1000rpm、もしくは1500rpmもしくは1700rpm、または約600rpm、1000rpm、もしくは1500rpmもしくは1700rpm、または少なくとも600rpm、1000rpm、もしくは1500rpmもしくは1700rpm）で、例えば、80g〜100gまたは約80g〜100g（例えば、80g、85g、90g、95gもしくは100g、または約80g、85g、90g、95gもしくは100g、または少なくとも80g、85g、90g、95gもしくは100g）の試料またはチャンバもしくは他の容器の壁でのRCFで行われる。いくつかの態様では、スピンは、このような低速でのスピンの後に静止期間が続く反復インターバルを使用して、例えば、1秒間、2秒間、3秒間、4秒間、5秒間、6秒間、7秒間、8秒間、9秒間または10秒間のスピンおよび/または静止、例えば、約1秒または2秒のスピンとその後の約5秒間、約6秒間、約7秒間または約8秒間の静止を使用して行われる。
【０２９１】
ある特定の態様では、刺激は、静的条件、例えば、培地の遠心分離、振盪、回転、揺動、または灌流、例えば、連続もしくは半連続灌流を伴わない条件下で実施される。いくつかの態様では、開始の前またはその直後、例えば、5分、15分または30分以内に、バッグまたはバイアルなどの容器に細胞が移送され（例えば、無菌条件下で移送され）、インキュベーター内に入れられる。特定の態様では、インキュベーターは、16℃、24℃もしくは35℃、約16℃、24℃もしくは35℃、または少なくとも16℃、24℃もしくは35℃に設定される。いくつかの態様では、インキュベーターは、37℃、約37℃、または37℃±2℃、±1℃、±0.5℃もしくは±0.1℃に設定される。特定の態様では、静的条件下での刺激は、インキュベーター内に置かれた細胞培養バッグ中で実施される。いくつかの態様では、培養バッグは、単球（存在するならば）のバッグ表面への付着を可能にするシングルウェブのポリオレフィンガス透過性フィルムから構成される。
【０２９２】
1. 刺激試薬
特定の態様では、刺激条件は、細胞を刺激試薬と共にインキュベートすること、培養すること、および/または培養することを含む。ある特定の態様では、刺激試薬は、ビーズを含有するかそれを含む。ある特定の態様では、細胞が刺激試薬とインキュベートされるかまたは接触すると刺激の開始が起こる。特定の態様では、刺激試薬は、オリゴマー試薬、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマーを含有するかそれを含む。特定の態様では、刺激試薬は、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化するおよび/または活性化可能である。
【０２９３】
いくつかの態様では、刺激条件または刺激試薬は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを刺激または活性化可能である1つまたは複数の作用物質、例えば、リガンドを含む。いくつかの態様では、本明細書において想定されるような作用物質は、RNA、DNA、タンパク質（例えば、酵素）、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、炭水化物、脂質レクチン、または所望の標的に対して親和性を有する任意の他の生体分子を含むことができるが、それらに限定されない。いくつかの態様では、所望の標的は、T細胞受容体および/またはT細胞受容体の成分である。ある特定の態様では、所望の標的は、CD3である。ある特定の態様では、所望の標的は、T細胞共刺激分子、例えば、CD28、CD137（4-1-BB）、OX40またはICOSである。当技術分野において公知であり利用可能な多種多様な方法によって、1つまたは複数の作用物質をビーズに直接または間接的に付着させてもよい。付着は、共有、非共有、静電または疎水性であり得、例えば、化学的手段、機械的手段または酵素的手段を含む多種多様な付着手段によって達成され得る。いくつかの態様では、作用物質は、抗体またはその抗原結合断片、例えばFabである。いくつかの態様では、ビーズに直接付着している別の生体分子（例えば、抗ビオチン抗体）を介して、生体分子（例えば、ビオチン化抗CD3抗体）をビーズに間接的に付着させてもよい。
【０２９４】
いくつかの態様では、刺激試薬は、ビーズ（例えば、常磁性ビーズ）に付着しておりかつ細胞（例えば、T細胞）上の以下の巨大分子の1つまたは複数に特異的に結合する1つまたは複数の作用物質（例えば、抗体）を含有する：CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54（ICAM-1）、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L（CD70）、4-1BB（CD137）、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R；IFN-ガンマR、TNF-アルファR、IL-4R、IL-10R、CD18/CDl la（LFA-1）、CD62L（L-セレクチン）、CD29/CD49d（VLA-4）、Notchリガンド（例えば、Delta様1/4、Jagged 1/2など）、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7およびCXCR3、またはこれらの巨大分子もしくはその断片に対する対応するリガンドを含むその断片。いくつかの態様では、ビーズに付着された作用物質（例えば、抗体）は、細胞（例えば、T細胞）上の以下の巨大分子の1つまたは複数に特異的に結合する：CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RAおよび/またはCD45RO。
【０２９５】
いくつかの態様では、ビーズに付着された作用物質の1つまたは複数は、抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（免疫グロブリンFc領域を有する完全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディおよび単鎖分子）、ならびに抗体断片（例えば、Fab、F(ab')2、およびFv）を含むことができる。いくつかの態様では、刺激試薬は、抗体断片（抗原結合断片を含む）、例えば、Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、または（Fab’)2断片である。IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgE定常領域を含め、本明細書において想定される抗体に、任意のアイソタイプの定常領域を使用することができ、そのような定常領域は任意のヒトまたは動物種（例えば、ネズミ種）から得ることができることが認識される。いくつかの態様では、作用物質は、T細胞受容体の1つまたは複数の成分に結合するおよび/またはそれを認識する抗体である。特定の態様では、作用物質は、抗CD3抗体である。ある特定の態様では、作用物質は、共受容体に結合するおよび/またはそれを認識する抗体である。いくつかの態様では、刺激試薬は、抗CD28抗体を含む。
【０２９６】
いくつかの態様では、細胞、例えば、インプット集団の細胞は、3：1、2.5：1、2：1、1.5：1、1.25：1、1.2：1、1.1：1、1：1、0.9：1、0.8：1、0.75：1、0.67：1、0.5：1、0.3：1もしくは0.2：1、または約3：1、2.5：1、2：1、1.5：1、1.25：1、1.2：1、1.1：1、1：1、0.9：1、0.8：1、0.75：1、0.67：1、0.5：1、0.3：1もしくは0.2：1の刺激試薬：細胞比の存在下で、刺激されるか刺激に供される。特定の態様では、刺激試薬：細胞の比は、2.5：1〜0.2：1の間、2：1〜0.5：1の間、1.5：1〜0.75：1の間、1.25：1〜0.8：1の間、1.1：1〜0.9：1の間である。特定の態様では、刺激試薬：細胞の比は、約1：1であるかまたは1：1である。
【０２９７】
いくつかの態様では、細胞は、細胞106個当たり0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.75μg、1μg、1.2μg、1.4μg、1.6μg、1.8μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μgもしくは10μg、約0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.75μg、1μg、1.2μg、1.4μg、1.6μg、1.8μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μgもしくは10μg、または少なくとも0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.75μg、1μg、1.2μg、1.4μg、1.6μg、1.8μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μgもしくは10μgの刺激試薬の存在下で、刺激されるか刺激に供される。いくつかの態様では、細胞は、細胞106個当たり4μgまたは約4μgの存在下で、刺激されるか刺激に供される。特定の態様では、細胞は、細胞106個当たり0.8μgまたは約0.8μgの存在下で、刺激されるか刺激に供される。様々な態様では、細胞は、細胞106個当たり0.8μgまたは約0.8μgの存在下で、刺激されるか刺激に供される。特定の態様では、細胞は、細胞106個当たり1.2μgまたは約1.2μgの存在下で、刺激されるか刺激に供される。特定の態様では、細胞は、細胞106個当たり1.8μgまたは約1.8μgの存在下で、刺激されるか刺激に供される。
【０２９８】
a. ビーズ試薬
ある特定の態様では、刺激試薬は、細胞（例えば、T細胞）を活性化および/または拡大増殖可能である1つまたは複数の作用物質（例えば、生体分子）にコンジュゲートまたは連結された粒子（例えば、ビーズ）を含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、ビーズに結合している。いくつかの態様では、ビーズは、生体適合性であり、すなわち、生物学的使用に適した材料から構成される。いくつかの態様では、ビーズは、培養細胞、例えば培養T細胞に対して非毒性である。いくつかの態様では、ビーズは、作用物質と細胞との間の相互作用を可能にする方法で作用物質を付着可能である任意の粒子であり得る。
【０２９９】
いくつかの態様では、刺激試薬は、ビーズと、細胞の表面上の巨大分子と直接相互作用する1つまたは複数の作用物質とを含有する。ある特定の態様では、ビーズ（例えば、常磁性ビーズ）は、細胞上の1つまたは複数の巨大分子（例えば、1つまたは複数の細胞表面タンパク質）に特異的な1つまたは複数の作用物質（例えば、抗体）を介して、細胞と相互作用する。ある特定の態様では、ビーズ（例えば、常磁性ビーズ）は、一次抗体（例えば、抗ビオチン抗体）または他の生体分子などの本明細書に記載される第1の作用物質で標識され、次いで、二次抗体（例えば、ビオチン化抗CD3抗体）または他の第2の生体分子（例えば、ストレプトアビジン）などの第2の作用物質が加えられ、それにより、二次抗体または他の第2の生体分子が、粒子上のそのような一次抗体または他の生体分子に特異的に結合する。
【０３００】
いくつかの態様では、ビーズは、約0.001μm超、約0.01μm超、約0.1μm超、約1.0μm超、約10μm超、約50μm超、約100μm超または約1000μm超かつ約1500μm以下の直径を有する。いくつかの態様では、ビーズは、約1.0μm〜約500μm、約1.0μm〜約150μm、約1.0μm〜約30μm、約1.0μm〜約10μm、約1.0μm〜約5.0μm、約2.0μm〜約5.0μm、または約3.0μm〜約5.0μmの直径を有する。いくつかの態様では、ビーズは、約3μm〜約5μmの直径を有する。いくつかの態様では、ビーズは、少なくとも0.001μm、0.01μm、0.1μm、0.5μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm、9.5μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μmもしくは20μm、または少なくとも約0.001μm、0.01μm、0.1μm、0.5μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm、9.5μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μmもしくは20μm、または約0.001μm、0.01μm、0.1μm、0.5μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm、9.5μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μmもしくは20μmの直径を有する。ある特定の態様では、ビーズは、4.5μmまたは約4.5μmの直径を有する。ある特定の態様では、ビーズは、2.8μmまたは約2.8μmの直径を有する。
【０３０１】
いくつかの態様では、ビーズは、0.001g/cm3超、0.01g/cm3超、0.05g/cm3超、0.1g/cm3超、0.5g/cm3超、0.6g/cm3超、0.7g/cm3超、0.8g/cm3超、0.9g/cm3超、1g/cm3超、1.1g/cm3超、1.2g/cm3超、1.3g/cm3超、1.4g/cm3超、1.5g/cm3超、2g/cm3超、3g/cm3超、4g/cm3超、または5g/cm3超の密度を有する。いくつかの態様では、ビーズは、約0.001g/cm3〜約100g/cm3、約0.01g/cm3〜約50g/cm3、約0.1g/cm3〜約10g/cm3、約0.1g/cm3〜約.5g/cm3、約0.5g/cm3〜約1g/cm3、約0.5g/cm3〜約1.5g/cm3、約1g/cm3〜約1.5g/cm3、約1g/cm3〜約2g/cm3、または約1g/cm3〜約5g/cm3の間の密度を有する。いくつかの態様では、ビーズは、約0.5g/cm3、約0.5g/cm3、約0.6g/cm3、約0.7g/cm3、約0.8g/cm3、約0.9g/cm3、約1.0g/cm3、約1.1g/cm3、約1.2g/cm3、約1.3g/cm3、約1.4g/cm3、約1.5g/cm3、約1.6g/cm3、約1.7g/cm3、約1.8g/cm3、約1.9g/cm3、または約2.0g/cm3の密度を有する。ある特定の態様では、ビーズは、約1.6g/cm3の密度を有する。特定の態様では、ビーズまたは粒子は、約1.5g/cm3の密度を有する。ある特定の態様では、粒子は、約1.3g/cm3の密度を有する。
【０３０２】
ある特定の態様では、複数のビーズが均一な密度を有する。ある特定の態様では、均一な密度は、平均ビーズ密度の10％未満、5％未満または1％未満の密度標準偏差を含む。
【０３０３】
いくつかの態様では、ビーズは、ビーズ表面またはその近くに、作用物質にカップリング、結合またはコンジュゲートすることができる少なくとも1つの材料を含有する。いくつかの態様では、ビーズは、表面官能化されている、すなわち、結合分子、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドと共有結合を形成することができる官能基を含む。特定の態様では、ビーズは、表面に露出したカルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、トシル基、エポキシ基および/またはクロロメチル基を含む。特定の態様では、ビーズは、表面に露出したアガロースおよび/またはセファロースを含む。特定の態様では、ビーズ表面は、結合分子を結合または付着することができる付着刺激試薬を含む。特定の態様では、生体分子はポリペプチドである。いくつかの態様では、ビーズは、表面に露出したプロテインA、プロテインGまたはビオチンを含む。
【０３０４】
いくつかの態様では、ビーズは、磁場内で反応する。いくつかの態様では、ビーズは磁性ビーズである。いくつかの態様では、磁性ビーズは常磁性である。特定の態様では、磁性ビーズは超常磁性である。特定の態様では、ビーズは、磁場に曝露されない限り、いかなる磁性特性も示さない。
【０３０５】
特定の態様では、ビーズは、磁性コア、常磁性コアまたは超常磁性コアを含む。いくつかの態様では、磁性コアは金属を含有する。いくつかの態様では、金属は、限定されることなく、鉄、ニッケル、銅、コバルト、ガドリニウム、マンガン、タンタル、亜鉛、ジルコニウムまたはそれらの任意の組合せであり得る。特定の態様では、磁性コアは、金属酸化物（例えば酸化鉄）、フェライト（例えば、マンガンフェライト、コバルトフェライト、ニッケルフェライトなど）、ヘマタイトおよび金属合金（例えばCoTaZn）を含む。いくつかの態様では、磁性コアは、フェライト、金属、金属合金、酸化鉄または二酸化クロムのうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、磁性コアは、元素状鉄またはその化合物を含む。いくつかの態様では、磁性コアは、マグネタイト（Fe3O4）、マグヘマイト（γFe2O3）またはグレイジャイト（Fe3S4）のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、内部コアは酸化鉄（例えばFe3O4）を含む。
【０３０６】
特定の態様では、ビーズは、表面官能化コートまたはコーティングによって覆われた磁性コア、常磁性コアおよび/または超常磁性コアを含有する。いくつかの態様では、コートは、限定されることなく、ポリマー、多糖、シリカ、脂肪酸、タンパク質、炭素、アガロース、セファロースまたはそれらの組合せを含むことができる材料を含有することができる。いくつかの態様では、ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）、ポリグルタルアルデヒド、ポリウレタン、ポリスチレンまたはポリビニルアルコールであり得る。特定の態様では、外側コートまたは外側コーティングはポリスチレンを含む。特定の態様では、外側コーティングは表面官能化されている。
【０３０７】
いくつかの態様では、刺激試薬は、金属酸化物コア（例えば酸化鉄コア）およびコートを含有するビーズを含み、金属酸化物コアは、少なくとも1つの多糖（例えばデキストラン）を含み、コートは、少なくとも1つの多糖（例えばアミノデキストラン）、少なくとも1つのポリマー（例えばポリウレタン）およびシリカを含む。いくつかの態様では、金属酸化物コアはコロイド状酸化鉄コアである。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、抗CD3抗体および抗CD28抗体を含む。いくつかの態様では、刺激試薬は、抗CD3抗体、抗CD28抗体および抗ビオチン抗体を含む。いくつかの態様では、刺激試薬は抗ビオチン抗体を含む。いくつかの態様では、ビーズは、約3μm〜約10μmの直径を有する。いくつかの態様では、ビーズは、約3μm〜約5μmの直径を有する。特定の態様では、ビーズは、約3.5μmの直径を有する。
【０３０８】
いくつかの態様では、刺激試薬は、金属酸化物コア（例えば酸化鉄内部コア）およびコート（例えば保護コート）を含むビーズに付着する1つまたは複数の作用物質を含み、コートはポリスチレンを含む。特定の態様では、ビーズは、常磁性（例えば超常磁性）鉄コア、例えば、マグネタイト（Fe3O4）および/またはマグヘマイト（γFe2O3）cおよびポリスチレンコートまたはコーティングを含むコアを含む単分散、常磁性（例えば超常磁性）ビーズである。いくつかの態様では、ビーズは非多孔性である。いくつかの態様では、ビーズは、1つまたは複数の作用物質が付着する官能化表面を含有する。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、表面でビーズに共有結合している。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、抗CD3抗体および抗CD28抗体を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体、および標識抗体（例えばビオチン化抗体）、例えば、標識抗CD3抗体または標識抗CD28抗体に結合することができる抗体またはその抗原断片を含む。特定の態様では、ビーズは、約1.5g/cm3の密度および約1m2/g〜約4m2/gの表面積を有する。特定の態様では、ビーズは、約4.5μmの直径および約1.5g/cm3の密度を有する単分散超常磁性ビーズである。いくつかの態様では、ビーズは、約2.8μmの平均直径および約1.3g/cm3の密度を有する単分散超常磁性ビーズである。
【０３０９】
いくつかの態様では、濃縮T細胞の集団は、ビーズ：細胞の比が3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1.25:1、1.2:1、1.1:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.75:1、0.67:1、0.5:1、0.3:1もしくは0.2:1、または約3:1、約2.5:1、約2:1、約1.5:1、約1.25:1、約1.2:1、約1.1:1、約1:1、約0.9:1、約0.8:1、約0.75:1、約0.67:1、約0.5:1、約0.3:1もしくは約0.2:1で刺激試薬とともにインキュベートされる。特定の態様では、ビーズ：細胞の比は、2.5:1〜0.2:1、2:1〜0.5:1、1.5:1〜0.75:1、1.25:1〜0.8:1、1.1:1〜0.9:1である。特定の態様では、ビーズ：細胞の比は、約1:1または1:1である。
【０３１０】
b. オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬
特定の態様では、刺激試薬は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる1つまたは複数の作用物質、例えばリガンドにコンジュゲート、結合または付着するオリゴマー試薬、例えばストレプトアビジンムテイン試薬を含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、特定の結合部位（例えば結合部位Z）でオリゴマー試薬に結合することができる付着した結合ドメインまたは結合パートナー（例えば結合パートナーC）を有する。いくつかの態様では、複数の作用物質が、オリゴマー試薬に可逆的に結合している。様々な態様では、オリゴマー試薬は、特定の態様では結合ドメイン（例えば結合パートナーC）で複数の作用物質に可逆的に結合している複数の特定の結合部位を有する。いくつかの態様では、結合した作用物質の量は、競合試薬、例えば、特定の結合部位（例えば結合部位Z）に結合することもできる試薬の存在下で低減されるか減少する。
【０３１１】
いくつかの態様では、刺激試薬は、少なくとも1つの作用物質（例えば、T細胞などの細胞内でシグナルを生成することができる作用物質）がオリゴマー試薬に会合する、例えば、可逆的に会合する可逆的な系であるか、それらを含む。いくつかの態様では、試薬は、作用物質に結合する、例えば、可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む。場合によっては、試薬は、T細胞などの細胞内でシグナルを生成することができる少なくとも1つの付着した作用物質を有するオリゴマー粒子試薬である。いくつかの態様では、作用物質は、分子のエピトープまたは領域に特異的に結合することができる少なくとも1つの結合部位、例えば結合部位Bを含み、試薬の少なくとも1つの結合部位、例えば、試薬の結合部位Zに特異的に結合する、本明細書において結合パートナーCとも呼ばれる結合パートナーも含む。いくつかの態様では、結合パートナーCと少なくとも1つの結合部位Zとの間の結合相互作用は、非共有相互作用である。場合によっては、結合パートナーCと少なくとも1つの結合部位Zとの間の結合相互作用は、共有相互作用である。いくつかの態様では、結合パートナーCと少なくとも1つの結合部位Zとの間の非共有相互作用などの結合相互作用は、可逆的である。
【０３１２】
そのような可逆的な系でオリゴマー試薬として使用され得る物質は公知であり、例えば、米国特許第5,168,049号、米国特許第5,506,121号、米国特許第6,103,493号、米国特許第7,776,562号、米国特許第7,981,632号、米国特許第8,298,782号、米国特許第8,735,540号、米国特許第9,023,604号ならびに国際公開PCT出願番号WO2013/124474および国際公開PCT出願番号WO2014/076277を参照されたい。可逆的相互作用を形成することができる試薬および結合パートナーの非限定的な例、ならびにそのような結合を逆にすることができる物質（例えば競合試薬）は、以下に記載される。
【０３１３】
いくつかの態様では、オリゴマー試薬は、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインもしくは類似体、アビジン、アビジンムテインもしくは類似体（ニュートラアビジンなど）またはそれらの混合物のオリゴマーであり、そのようなオリゴマー試薬は、作用物質の結合ドメインと可逆的に会合するための1つまたは複数の結合部位（例えば結合パートナーC）を含む。いくつかの態様では、作用物質の結合ドメインは、ビオチン、ビオチン誘導体もしくは類似体、またはストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインもしくは類似体、アビジンもしくはアビジンムテインもしくは類似体に特異的に結合することができるストレプトアビジン結合ペプチドもしくは他の分子であり得る。
【０３１４】
特定の態様では、1つまたは複数の作用物質（例えば、T細胞などの細胞内でシグナルを生成することができる作用物質）は、オリゴマー試薬上に存在する複数の特定の結合部位（例えば結合部位Z）などを介して、オリゴマー試薬と会合する、例えば可逆的に結合している。場合によっては、これにより、作用物質によって結合されるか認識される細胞表面分子（の少なくとも2コピー）を有する標的細胞が作用物質と接触する場合にアビディティー効果が生じることができるように、作用物質が互いに密接に配置される。
【０３１５】
いくつかの態様では、オリゴマー試薬は、ストレプトアビジンオリゴマー、ストレプトアビジンムテインオリゴマー、ストレプトアビジン類似体オリゴマー、アビジンオリゴマー、アビジンムテインもしくはアビジン類似体（ニュートラアビジンなど）から構成されるオリゴマー、またはそれらの混合物である。特定の態様では、オリゴマー試薬は、作用物質の結合ドメイン（例えば結合パートナーC）に結合することができる特定の結合部位を含む。いくつかの態様では、結合ドメインは、ビオチン、ビオチン誘導体もしくは類似体、またはストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインもしくは類似体、アビジンもしくはアビジンムテインもしくは類似体に特異的に結合することができるストレプトアビジン結合ペプチドもしくは他の分子であり得る。
【０３１６】
いくつかの態様では、ストレプトアビジンは、野生型ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインまたは類似体、例えばストレプトアビジン様ポリペプチドであり得る。同様に、いくつかの局面では、アビジンには、野生型アビジンまたはアビジンのムテインもしくは類似体、例えばニュートラアビジン、典型的にはさらに中性のpiを示し、天然のアビジンの代替として利用可能な修飾アルギニンを有する脱グリコシル化アビジンが含まれる。一般に、脱グリコシル化された中性形態のアビジンには、例えば、Sigma Aldrichを通じて入手可能な「Extravidin」、またはThermo ScientificもしくはInvitrogenから入手可能な「NeutrAvidin」などの市販形態が含まれる。いくつかの態様では、試薬は、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインもしくは類似体である。いくつかの態様では、野生型ストレプトアビジン（wt-ストレプトアビジン）は、Argarana et al, Nucleic Acids Res. 14（1986）1871-1882（SEQ ID NO:61）によって開示されたアミノ酸配列を有する。一般に、ストレプトアビジンは、4つの同一のサブユニットの四量体として天然に存在し、すなわち、それはホモ四量体であり、各サブユニットは、ビオチン、ビオチン誘導体または類似体またはビオチン模倣体に対する単一の結合部位を含む。ストレプトアビジンサブユニットの例示的な配列は、SEQ ID NO:61に記載のアミノ酸の配列であるが、そのような配列はまた、他のストレプトマイセス（Streptomyces）種由来のそのホモログに存在する配列を含み得る。特に、ストレプトアビジンの各サブユニットはビオチンに対して強い結合親和性を示し、その解離定数（Kd）は約10-14Mであり得る。場合によっては、ストレプトアビジンは、4つの結合部位のうちの1つのみが機能的である一価の四量体（Howarth et al.（2006）Nat.Methods,3:267-73;Zhang et al.（2015）Biochem.Biophys.Res.Commun.,463:1059-63））、4つの結合部位のうちの2つが機能的である二価の四量体（Fairhead et al.（2013）J. Mol. Biol., 426: 199-214）として存在し得るか、単量体または二量体の形態で存在し得る（Wu et al.（2005）J. Biol. Chem., 280:23225-31; Lim et al.（2010）Biochemistry, 50:8682-91）。
【０３１７】
いくつかの態様では、ストレプトアビジンは、野生型または未修飾ストレプトアビジン、例えば、ストレプトマイセス種由来のストレプトアビジン、またはビオチン、ビオチン誘導体もしくは類似体もしくはビオチン模倣体の結合部位を含む少なくとも1つの機能性サブユニットを含む、例えば、一般にSEQ ID NO:61に記載のストレプトマイセス・アビジニイ（Streptomyces avidinii）由来の野生型ストレプトアビジンの少なくとも1つの機能性サブユニットもしくはその機能的に活性な断片を含むその機能的に活性な断片などの任意の形態であり得る。例えば、いくつかの態様では、ストレプトアビジンは、N末端および/またはC末端で短縮される野生型ストレプトアビジンの断片を含むことができる。そのような最小のストレプトアビジンには、SEQ ID NO:61のアミノ酸位置10〜16の領域でN末端で始まり、SEQ ID NO:61のアミノ酸位置133〜142の領域でC末端で終わる任意のものが含まれる。いくつかの態様では、ストレプトアビジンの機能的に活性な断片は、SEQ ID NO:62に記載のアミノ酸の配列を含む。いくつかの態様では、SEQ ID NO:62に記載されるようなストレプトアビジンは、SEQ ID NO:61に記載の番号付けによりAla13に対応する位置にN末端メチオニンをさらに含むことができる。ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインにおける残基の位置への言及は、SEQ ID NO:61における残基の番号付けに関するものである。
【０３１８】
ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインの例は、例えば、WO86/02077、DE19641876 Al、US6,022,951、WO98/40396またはWO96/24606に記載されている。ストレプトアビジンムテインの例は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第5,168,049号、米国特許第5,506,121号、米国特許第6,022,951号、米国特許第6,156,493号、米国特許第6,165,750号、米国特許第6,103,493号もしくは米国特許第6,368,813号または国際公開PCT出願番号WO2014/076277を参照されたい。
【０３１９】
いくつかの態様では、ストレプトアビジンムテインは、未修飾または野生型ストレプトアビジンの一部ではないアミノ酸を含むことができるか、野生型または未修飾ストレプトアビジンの一部のみを含むことができる。いくつかの態様では、ストレプトアビジンムテインは、未修飾または野生型ストレプトアビジンのサブユニットと比較して、例えば、SEQ ID NO:61に記載の野生型ストレプトアビジンサブユニット、またはSEQ ID NO:762に記載されるようなその機能的に活性な断片と比較して、別のアミノ酸置換（substitution）（置換（replacement））を有し得る少なくとも1つのサブユニットを含む。
【０３２０】
いくつかの態様では、結合ドメインに対するストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインの解離定数（Kd）などの結合親和性は、1x10-4M未満、5x10-4M未満、1x10-5M未満、5x10-5M未満、1x10-6M未満、5x10-6M未満もしくは1x10-7M未満であるが、一般に1x10-13M超、1x10-12M超または1x10-11M超である。例えば、米国特許第5,506,121号に開示されているようなペプチド配列（例えばStrep-タグ）は、ビオチン模倣体として作用し、ストレプトアビジンに対する結合親和性、例えば、約10-4M〜約10-5MのKdを示すことができる。場合によっては、ストレプトアビジン分子内に変異を起こすことによって結合親和性をさらに改善することができ、例えば、米国特許第6,103,493号またはWO2014/076277を参照されたい。いくつかの態様では、結合親和性は、本明細書において記載されるものなど、当技術分野において公知の方法によって決定することができる。
【０３２１】
いくつかの態様では、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインなどの試薬は、ペプチドリガンド結合パートナーに対する結合親和性を示し、このペプチドリガンド結合パートナーは、作用物質（例えば、受容体結合剤または選択剤）に存在する結合パートナーCであり得る。いくつかの態様では、ペプチド配列は、一般式His-Pro-Xaaを有する配列を含み、式中、Xaaは、SEQ ID NO:78に記載の配列を含むようなグルタミン、アスパラギンまたはメチオニンである。いくつかの態様では、ペプチド配列は、SEQ ID NO:93に記載されるような配列を含有する。いくつかの態様では、ペプチド配列は、SEQ ID NO:69に記載されるような、SEQ ID NO:79に記載の一般式を有する。一例では、ペプチド配列は、Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly（Strep-tag（登録商標）とも呼ばれ、SEQ ID NO:70に記載される）である。一例では、ペプチド配列は、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（Strep-tag（登録商標）IIとも呼ばれ、SEQ ID NO:64に記載される）である。いくつかの態様では、ペプチドリガンドは、少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含み、2つのモジュール間の距離は、少なくとも0および50アミノ酸以下であり、1つの結合モジュールは、3〜8アミノ酸を有し、少なくとも配列His-Pro-Xaaを含み、式中、Xaaはグルタミン、アスパラギンまたはメチオニンであり、他の結合モジュールは、SEQ ID NO:79に記載されるような同じまたは異なるストレプトアビジンペプチドリガンドを有する（例えば、国際公開PCT出願番号WO02/077018、米国特許第7,981,632号を参照）。いくつかの態様では、ペプチドリガンドは、SEQ ID NO:71または72のいずれかに記載の式を有する配列を含む。いくつかの態様では、ペプチドリガンドは、SEQ ID NO:65〜67、73〜74のいずれかに記載のアミノ酸の配列を有する。ほとんどの場合、これらのストレプトアビジン結合ペプチドはいずれも、同じ結合部位、すなわち、ストレプトアビジンのビオチン結合部位に結合する。そのようなストレプトアビジン結合ペプチドのうちの1つまたは複数が結合パートナーC、例えば、C1およびC2として使用される場合、結合パートナーCを介して1つまたは複数の作用物質に結合した多量体化試薬および/またはオリゴマー粒子試薬は、典型的に1つまたは複数のストレプトアビジンムテインから構成される。
【０３２２】
いくつかの態様では、ストレプトアビジンムテインは、米国特許第6,103,493号に記載されるような変異体である。いくつかの態様では、ストレプトアビジンムテインは、SEQ ID NO:61に記載されるような野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列に基づいて、アミノ酸位置44〜53の領域内に少なくとも1つの変異を含む。いくつかの態様では、ストレプトアビジンムテインは、1つまたは複数の残基44、45、46および/または47に変異を含む。いくつかの態様では、ストレプトアビジンムテインは、疎水性脂肪族アミノ酸、例えば、Val、Ala、IleまたはLeu、45位の任意のアミノ酸、脂肪族アミノ酸、例えば、46位の疎水性脂肪族アミノ酸による野生型ストレプトアビジンの44位のGluの置換および/または塩基性アミノ酸、例えば、ArgまたはLys、例えば一般にArgによる47位のValの置換を含む。いくつかの態様では、Alaは46位にあり、および/またはArgは47位にあり、および/またはValまたはIleは44位にある。いくつかの態様では、ストレプトアビジン変異体は、SEQ ID NO:75またはSEQ ID NO:76もしくは77に記載のアミノ酸の配列を含む例示的なストレプトアビジンムテインに示されるような、残基Val44-Thr45-Ala46-Arg47を含む（ストレプトアビジン変異体1、SAM1としても知られる）。いくつかの態様では、ストレプトアビジンムテインは、SEQ ID NO:80、63または68に記載のアミノ酸の配列を含む例示的なストレプトアビジンムテインに示されるような、残基Ile44-Gly45-Ala46-Arg47を含む（SAM2としても知られる）。場合によっては、そのようなストレプトアビジンムテインは、例えば、米国特許第6,103,493号に記載されており、商標Strep-Tactin（登録商標）の下に市販されている。いくつかの態様では、ムテインストレプトアビジンは、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:82に記載のアミノ酸の配列を含む。特定の態様では、分子は、SEQ ID NO:62、76、63、81、83、77または68のいずれかに記載の配列を含むストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインの四量体であり、四量体としては、単量体1個当たり1個のN末端アミンおよび4個のリジンを含む20個の第一級アミンを含む分子である。
【０３２３】
いくつかの態様では、ストレプトアビジンムテインは、ペプチドリガンド（Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly; Strep-tag（登録商標）とも呼ばれ、SEQ ID NO:70に記載されている）について3.7x10-5M未満であり、および/またはペプチドリガンド（Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys; Strep-tag（登録商標）IIとも呼ばれ、SEQ ID NO:64に記載されている）について7.1x10-5M未満であり、および/またはSEQ ID NO:64、71〜74、65〜67、69、70、78、79のいずれかに記載のペプチドリガンドについて7.0x10-5M未満、5.0x10-5M未満、1.0x10-5M未満、5.0x10-6M未満、1.0x10-6M未満、5.0x10-7M未満もしくは1.0x10-7M未満であるが、一般に1x10-13M超、1x10-12M超もしくは1x10-11M超である解離定数（Kd）を特徴とする結合親和性を示す。
【０３２４】
いくつかの態様では、得られるストレプトアビジンムテインは、ペプチドリガンド（Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly; Strep-tag（登録商標）とも呼ばれ、SEQ ID NO:70に記載されている）について2.7x104M-1超であり、および/またはペプチドリガンド（Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys; Strep-tag（登録商標）IIとも呼ばれ、SEQ ID NO:64に記載されている）について1.4x104M-1超であり、および/またはSEQ ID NO:64、71〜74、65〜67、69、70、78、79のいずれかに記載のペプチドリガンドについて1.43x104M-1超、1.67x104M-1超、2x104M-1超、3.33x104M-1超、5x104M-1超、1x105M-1超、1.11x105M-1超、1.25x105M-1超、1.43x105M-1超、1.67x105M-1超、2x105M-1超、3.33x105M-1超、5x105M-1超、1x106M-1超、1.11x106M-1超、1.25x106M-1超、1.43x106M-1超、1.67x106M-1超、2x106M-1超、3.33x106M-1超、5x106M-1超、1x107M-1超であるが、一般に1x1013M-1未満、1x1012M-1未満または1x1011M-1未満である会合定数（Ka）を特徴とする結合親和性を示す。
【０３２５】
特定の態様では、本明細書において提供されるのは、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体から構成されるおよび/またはそれを含有するオリゴマー粒子試薬である。ある特定の態様では、本明細書において提供されるオリゴマー粒子試薬は、1つまたは複数の作用物質、例えば、刺激剤および/または選択剤に可逆的に結合するまたは可逆的に結合可能である複数の結合部位を含有する。いくつかの態様では、オリゴマー粒子は、70nm〜125nm（両端の値を含む）の半径、例えば、平均半径；1×107g/mol〜1×109g/mol（両端の値を含む）の分子量；および/または1,000〜5,000（両端の値を含むのストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体）を有する。いくつかの態様では、オリゴマー粒子試薬は、細胞の表面上の分子（例えば、受容体）に結合する作用物質などの1つまたは複数の作用物質に結合している、例えば、可逆的に結合している。ある特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、本明細書に、例えば、セクションI-B-1-aに記載される作用物質である。いくつかの態様では、作用物質は、抗CD3抗体および/もしくは抗CD28抗体またはその抗原結合断片、例えば、結合パートナー、例えば、ストレプトアビジン結合ペプチド、例えば、Strep-tag（登録商標）IIを含有する、抗体またはその抗原断片である。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、結合パートナー、例えば、ストレプトアビジン結合ペプチド、例えば、Strep-tag（登録商標）IIを含有する、抗CD3 Fabおよび/または抗CD28 Fabである。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、Strepタグ化抗CD3 FabおよびStrepタグ化抗CD28 Fabにコンジュゲートされたストレプトアビジン系オリゴマー、例えばストレプトアビジンムテインオリゴマーを含む。いくつかの態様では、オリゴマー粒子試薬は、WO2015/158868またはWO2018/197949に記載されているようないずれかである。
【０３２６】
いくつかの態様では、本明細書において提供されるのは、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体から構成されるおよび/またはそれを含有するオリゴマー粒子試薬である。ある特定の態様では、本明細書において提供されるオリゴマー粒子試薬は、1つまたは複数の作用物質、例えば、刺激剤および/または選択剤に可逆的に結合するまたは可逆的に結合可能である複数の結合部位を含有する。いくつかの態様では、オリゴマー粒子は、80nm〜120nm（両端の値を含む）の半径、例えば、平均半径；7.5×106g/mol〜2×108g/mol（両端の値を含む）の分子量、例えば、平均分子量；および/または500〜10,000（両端の値を含む）のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体の量、例えば、平均量を有する。いくつかの態様では、オリゴマー粒子試薬は、細胞の表面上の分子（例えば、受容体）に結合する作用物質などの1つまたは複数の作用物質に結合している、例えば、可逆的に結合している。ある特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、本明細書に、例えば、セクションI-B-1-aに記載される作用物質である。いくつかの態様では、作用物質は、抗CD3 Fabおよび/または抗CD28 Fab、例えば、結合パートナー、例えば、ストレプトアビジン結合ペプチド、例えば、Strep-tag（登録商標）IIを含有するFabである。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、結合パートナー、例えば、ストレプトアビジン結合ペプチド、例えば、Strep-tag（登録商標）IIを含有する抗CD3 Fabおよび/または抗CD28 Fabである。
【０３２７】
いくつかの態様では、細胞は、細胞106個当たり0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.75μg、1μg、1.2μg、1.4μg、1.6μg、1.8μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μgもしくは10μg、約0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.75μg、1μg、1.2μg、1.4μg、1.6μg、1.8μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μgもしくは10μg、または少なくとも0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.75μg、1μg、1.2μg、1.4μg、1.6μg、1.8μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μgもしくは10μgのオリゴマー刺激試薬（例えば、Strepタグ化抗CD3 FabおよびStrepタグ化抗CD28 Fabにコンジュゲートされたストレプトアビジン系オリゴマー、例えばストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で、刺激されるか刺激に供される。いくつかの態様では、細胞は、細胞106個当たり4μgまたは約4μgのオリゴマー刺激試薬（例えば、Strepタグ化抗CD3 FabおよびStrepタグ化抗CD28 Fabにコンジュゲートされたストレプトアビジン系オリゴマー、例えばストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で、刺激されるか刺激に供される。特定の態様では、細胞は、細胞106個当たり1.2μgまたは約1.2μgのオリゴマー刺激試薬（例えば、Strepタグ化抗CD3 FabおよびStrepタグ化抗CD28 Fabにコンジュゲートされたストレプトアビジン系オリゴマー、例えばストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で、刺激されるか刺激に供される。特定の態様では、細胞は、細胞106個当たり0.8μgまたは約0.8μgのオリゴマー刺激試薬（例えば、Strepタグ化抗CD3 FabおよびStrepタグ化抗CD28 Fabにコンジュゲートされたストレプトアビジン系オリゴマー、例えばストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で、刺激されるか刺激に供される。特定の態様では、細胞は、細胞106個当たり1.8μgまたは約1.8μgのオリゴマー刺激試薬（例えば、Strepタグ化抗CD3 FabおよびStrepタグ化抗CD28 Fabにコンジュゲートされたストレプトアビジン系オリゴマー、例えばストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で、刺激されるか刺激に供される。ある特定の局面では、オリゴマー刺激試薬内で、オリゴマー粒子と付着した作用物質との間の質量は約3：1である。ある特定の局面では、オリゴマー刺激試薬内で、オリゴマー粒子と、付着した抗CD3 Fabと、付着した抗CD28 Fabとの間の質量比は、約3：0.5：0.5である。ある特定の局面では、4μgのオリゴマー刺激試薬は、3μgのオリゴマー粒子と1μgの付着した作用物質、例えば、0.5μgの抗CD3 Fabと0.5μgの抗CD28 Fabであるかそれを含む。他の例では、細胞106個当たり1.2μgのオリゴマー刺激試薬は、細胞106個当たり、0.9μgのオリゴマー粒子と0.3μgの付着した作用物質、例えば、0.15μgの抗CD3 Fabと0.15μgの抗CD28 Fabであるかそれを含む。いくつかの態様では、オリゴマー刺激試薬が無血清培地に加えられ、刺激が、無血清培地、例えば、本明細書のセクションIIまたはPCT/US2018/064627に記載されるような無血清培地中で実施される。
【０３２８】
特定の態様では、インプット集団の900×106個または約900×106個の量のT細胞（例えば、900×106個のCD3+ T細胞、または450×106個のCD4+ T細胞および450×106個のCD8+ T細胞）が、オリゴマー刺激試薬（例えば、Strepタグ化抗CD3 FabおよびStrepタグ化抗CD28 Fabにコンジュゲートされたストレプトアビジン系オリゴマー、例えばストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で刺激に供され、例えば、刺激条件下で培養される。ある特定の態様では、細胞、例えば、インプット集団の細胞は、例えば、刺激試薬の存在下、0.01×106個の細胞/mL、0.1×106個の細胞/mL、0.5×106個の細胞/mL、1.0×106個の細胞/mL、1.5×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mLもしくは50×106個の細胞/mL、約0.01×106個の細胞/mL、0.1×106個の細胞/mL、0.5×106個の細胞/mL、1.0×106個の細胞/mL、1.5×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mLもしくは50×106個の細胞/mL、または少なくとも0.01×106個の細胞/mL、0.1×106個の細胞/mL、0.5×106個の細胞/mL、1.0×106個の細胞/mL、1.5×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mLもしくは50×106個の細胞/mLの密度で、刺激されるか刺激に供される、例えば、刺激条件下で培養される。ある特定の態様では、細胞、例えば、インプット集団の細胞は、例えば、刺激試薬の存在下、3.0×106個の細胞/mL、約3.0×106個の細胞/mL、または少なくとも3.0×106個の細胞/mLの密度で、刺激されるか刺激に供される、例えば、刺激条件下で培養される。
【０３２９】
いくつかの態様では、無血清培地は、1つまたは複数のサプリメントが補充された基礎培地（例えば、OpTmizer（商標）T-Cell Expansion Basal Medium（ThermoFisher））を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数のサプリメントは、無血清である。いくつかの態様では、無血清培地は、例えば追加のサプリメント（例えば、OpTmizer（商標）T-Cell Expansion Supplement（ThermoFisher））によって提供される、細胞（例えば、T細胞）の維持、拡大増殖および/または活性化のための1つまたは複数の追加の成分が補充された基礎培地を含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、血清代替サプリメント、例えば、免疫細胞血清代替物、例えば、CTS（商標）Immune Cell Serum Replacement（ThermoFisher、#A2596101）、またはSmith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31に記載されている免疫細胞血清代替物を含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、L-グルタミンなどのアミノ酸の遊離形態を含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、L-グルタミンのジペプチド形態（例えば、L-アラニル-L-グルタミン）、例えば、Glutamax（商標）（ThermoFisher）中のジペプチドを含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、1つまたは複数の組換えサイトカイン、例えば、組換えヒトIL-2（例えば、100IU/mL）、組換えヒトIL-7（例えば、600IU/mL）、および/または組換えヒトIL-15（例えば、100IU/mL）を含む。
【０３３０】
C. 遺伝子操作
いくつかの態様では、提供される方法は、細胞を遺伝子操作すること、例えば、組換えタンパク質をコードする異種または組換えポリヌクレオチドを導入することを含む。そのような組換えタンパク質は、組換え受容体、例えば、セクションIIIに記載されるいずれかを含み得る。ウイルスおよび非ウイルスによる遺伝子操作法を含め、T細胞などの細胞のゲノムへの組換え受容体をコードするポリヌクレオチドの組み込みをもたらすだろう、異種または組換えポリヌクレオチドを導入する任意の方法が使用され得る。組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、異種または組換えポリヌクレオチドの細胞への導入は、多数の公知のベクターのいずれかを使用して行われ得る。そのようなベクターは、レンチウイルス系およびガンマレトロウイルス系を含むウイルス系を含む。例示的な方法は、ウイルス、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスによる形質導入を介することを含む、受容体をコードする異種ポリヌクレオチドの移送のための方法を含む。いくつかの態様では、刺激された細胞の集団は、遺伝子操作され、例えば、組換え受容体をコードする異種または組換えポリヌクレオチドが導入され、それによって、形質転換された細胞の集団（本明細書において細胞の形質転換された集団とも称される）を生成する。
【０３３１】
いくつかの態様では、提供される方法は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、脂質ナノ粒子などのナノ粒子、タングステン粒子促進性微粒子銃、リン酸ストロンチウムDNA共沈殿、ならびに、例えばWO 2014055668および米国特許第7,446,190号に記載されている他のアプローチなどの非ウイルス法を使用して、細胞を遺伝子操作すること、例えば、組換えタンパク質をコードする異種または組換えポリヌクレオチドを導入することを含む。トランスポゾンに基づく系も想定される。
【０３３２】
特定の態様では、細胞が、本明細書に、例えば、セクションI-Bおいて提供される方法のいずれかなどによって刺激条件下で刺激、活性化および/またはインキュベートされた後に、細胞は、遺伝子操作され、形質転換され、または形質導入される。特定の態様では、1つまたは複数の刺激された集団は、先に凍結保護され、貯蔵されており、そして、細胞を遺伝子操作する、形質転換する、トランスフェクトする、または形質導入する前に、融解され、任意で洗浄される。
【０３３３】
特定の態様では、細胞が、刺激されたもしくは刺激に供されたまたは刺激条件下で培養された後に、細胞は、遺伝子操作される、形質転換される、または形質導入される。特定の態様では、細胞は、刺激の開始から72時間、60時間、48時間、36時間、24時間もしくは12時間、約72時間、60時間、48時間、36時間、24時間もしくは12時間、または72時間、60時間、48時間、36時間、24時間、もしくは12時間以内（各数値を含む）に、遺伝子操作される、形質転換される、または形質導入される。特定の態様では、細胞は、刺激の開始から3日、2日もしくは1日、約3日、2日もしくは1日、または3日、2日、もしくは1日以内（各数値を含む）に、遺伝子操作される、形質転換される、または形質導入される。ある特定の態様では、細胞は、刺激の開始後12時間〜48時間もしくは約12時間〜48時間、16時間〜36時間もしくは約16時間〜36時間、または18時間〜30時間もしくは約18時間〜30時間の間に遺伝子操作される、形質転換される、または形質導入される。特定の態様では、細胞は、刺激の開始後18時間〜30時間または約18時間〜30時間の間に遺伝子操作される、形質転換される、または形質導入される。特定の態様では、細胞は、刺激の開始後16時間、18時間、20時間、22時間もしくは24時間または約16時間、18時間、20時間、22時間もしくは24時間に、遺伝子操作される、形質転換される、または形質導入される。
【０３３４】
ある特定の態様では、遺伝子操作のための方法は、集団の1つまたは複数の細胞を組換えタンパク質、例えば、組換え受容体をコードする核酸分子またはポリヌクレオチドと接触させるまたはそれを導入することによって行われる。ある特定の態様では、核酸分子またはポリヌクレオチドは、細胞に対して異種である。特定の態様では、異種核酸分子または異種ポリヌクレオチドは、細胞原産ではない。ある特定の態様では、異種核酸分子または異種ポリヌクレオチドは、細胞によって天然に発現されないタンパク質、例えば、組換えタンパク質をコードする。特定の態様では、異種核酸分子またはポリヌクレオチドは、接触または導入の前に細胞内に見いだされない核酸配列であるかそれを含有する。
【０３３５】
いくつかの態様では、細胞、例えば、刺激された細胞は、形質導入アジュバントの存在下で、操作される、例えば、形質導入される。例示的な形質導入アジュバントは、ポリカチオン、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン由来断片もしくはバリアント、およびRetroNectinを含むが、それらに限定されない。ある特定の態様では、細胞は、ポリカチオン、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン由来断片もしくはバリアント、および/またはRetroNectinの存在下で操作される。特定の態様では、細胞は、ポリブレン、DEAE-デキストラン、硫酸プロタミン、ポリ-L-リジンまたはカチオン性リポソームであるポリカチオンの存在下で操作される。特定の態様では、細胞は、硫酸プロタミンの存在下で操作される。いくつかの態様では、例えば、セクションI-B-1に記載されるようなオリゴマー刺激試薬の存在は、形質導入アジュバントとして作用することができ、例えば、WO/2017/068419（参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【０３３６】
いくつかの態様では、遺伝子操作、例えば、形質導入は、例えば、本明細書のセクションIIまたはPCT/US2018/064627に記載されるような無血清培地中で行われる。いくつかの態様では、無血清培地は、規定されたまたは正確に規定された細胞培養培地である。ある特定の態様では、無血清培地は、処理されている、例えば、阻害物質および/または成長因子を除去するために濾過されている、制御された培養培地である。いくつかの態様では、無血清培地は、タンパク質を含有する。ある特定の態様では、無血清培地は、血清アルブミン、加水分解物、成長因子、ホルモン、担体タンパク質および/または付着因子を含有し得る。
【０３３７】
特定の態様では、細胞は、1つまたは複数のサイトカインの存在下で操作される。ある特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、組換えサイトカインである。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えサイトカインである。ある特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、T細胞によって発現されるおよび/またはT細胞に対して内因性である受容体に結合するおよび/または結合可能である。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、サイトカインの4-アルファ-ヘリックスバンドルファミリーのメンバーであるかそれを含む。いくつかの態様では、サイトカインの4-アルファ-ヘリックスバンドルファミリーのメンバーは、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン15（IL-15）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を含むが、それらに限定されない。いくつかの態様では、1つまたは複数のサイトカインは、IL-15であるかそれを含む。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、IL-7であるかそれを含む。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、組換えIL-2であるかそれを含む。
【０３３８】
特定の態様では、細胞、例えば、刺激された細胞は、IL-2、IL-7および/またはIL-15の存在下の刺激条件下で操作される。ある特定の態様では、IL-2、IL-7および/またはIL-15は、組換えである。ある特定の態様では、IL-2、IL-7および/またはIL-15は、ヒトである。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えIL-2、IL-7および/またはIL-15であるかそれを含む。ある特定の態様では、細胞は、組換えIL-2、IL-7およびIL-15、例えば、組換えヒトIL-2（例えば、100IU/mL）、組換えヒトIL-7（例えば、600IU/mL）、および/または組換えヒトIL-15（例えば、100IU/mL）の存在下の刺激条件下で、操作される、例えば、形質導入される。
【０３３９】
いくつかの態様では、細胞は、刺激の間に存在していたものと同じまたは類似の培地の存在下で遺伝子操作される、形質転換される、または形質導入される。いくつかの態様では、細胞は、刺激の間に存在していた培地と同じサイトカインを有する培地中で遺伝子操作される、形質転換される、または形質導入される。ある特定の態様では、細胞は、刺激の間に存在していた培地と同じサイトカインを同じ濃度で有する培地中で遺伝子操作される、形質転換される、または形質導入される。
【０３４０】
1. 形質導入
いくつかの態様では、細胞を遺伝子操作することは、ポリヌクレオチド、例えば、異種または組換えポリヌクレオチドを細胞に形質導入によって導入することであるかそれを含む。いくつかの態様では、細胞は、ウイルスベクターを用いて形質導入されるかまたは形質導入に供される。特定の態様では、細胞は、ウイルスベクターを用いて形質導入されるかまたは形質導入に供される。いくつかの態様では、ウイルスは、ガンマレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターである。レンチウイルスによる形質導入法は公知である。例示的な方法は、例えば、Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701；Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644；Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114；およびCavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505に記載されている。
【０３４１】
いくつかの態様では、形質導入は、集団の1つまたは複数の細胞を、組換えタンパク質、例えば、組換え受容体をコードする核酸分子と接触させることによって行われる。いくつかの態様では、接触させることは、遠心分離、例えばスピノキュレーション（例えば、遠心分離接種）を用いて達成することができる。そのような方法は、国際公開番号WO2016/073602に記載されているような方法のいずれかを含む。例示的な遠心チャンバは、A-200/FおよびA-200遠心チャンバを含むSepax（登録商標）およびSepax（登録商標）2システムと共に使用するための遠心チャンバ、ならびにそのようなシステムと共に使用するための様々なキットを含む、Biosafe SAによって製造および販売されている遠心チャンバを含む。例示的なチャンバ、システムならびに処理装置およびキャビネットは、例えば、米国特許第6,123,655号、米国特許第6,733,433号および公開された米国特許出願公開番号US2008/0171951、ならびに公開された国際特許出願公開番号WO00/38762に記載されている（これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。このようなシステムと共に使用するための例示的なキットは、BioSafe SAによって製品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1またはCS-900.2で販売されている使い捨てキットを含むが、それらに限定されない。
【０３４２】
特定の態様では、50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106、700×106、800×106、900×106もしくは1,000×106個、約50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106、700×106、800×106、900×106もしくは1,000×106個、または少なくとも50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106、700×106、800×106、900×106もしくは1,000×106個の量の刺激に供された、例えば、刺激条件下で培養された組成物の細胞が、遺伝子操作、例えば、形質導入に供される。特定の態様では、刺激に供された後に形質導入に供されるCD4+ T細胞とCD8+ T細胞の両方を含む細胞、例えば、生存T細胞の総数は、50×106個もしくは約50×106個の細胞、100×106個もしくは約100×106個の細胞、150×106個もしくは約150×106個の細胞、200×106個もしくは約200×106個の細胞、250×106個もしくは約250×106個の細胞、300×106個もしくは約300×106個の細胞、350×106個もしくは約350×106個の細胞、400×106個もしくは約400×106個の細胞、450×106個もしくは約450×106個の細胞、500×106個もしくは約500×106個の細胞、550×106個もしくは約550×106個の細胞、600×106個もしくは約600×106個の細胞、700×106個もしくは約700×106個の細胞、800×106個もしくは約800×106個の細胞、900×106個もしくは約900×106個の細胞、または1,000×106個もしくは約1,000×106個の細胞、または前述のいずれかの間の任意の値である。特定の態様では、最大で900×106個のインプット集団の細胞が刺激に供され、刺激に供された細胞の600×106個、約600×106個または最大で600×106個の量の細胞が、遺伝子操作、例えば、形質導入に供される。特定の態様では、遺伝子操作、例えば、形質導入に供された細胞組成物は、生存CD4+ T細胞および生存CD8+ T細胞を、1：10〜10：1の間、1：5〜5：1の間、4：1〜1：4の間、1：3〜3：1の間、2：1〜1：2の間、1.5：1〜1：1.5の間、1.25：1〜1：1.25の間、1.2：1〜1：1.2の間、1.1：1〜1：1.1の間、または約1：1もしくは1：1の生存CD4+ T細胞：生存CD8+ T細胞比で含む。
【０３４３】
いくつかの態様では、提供される方法は、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターを、刺激された細胞集団の300×106個、約300×106個または300×106個未満の細胞、例えば、生存T細胞に形質導入することに関連して使用される。ある特定の態様では、刺激された細胞集団の100×106個または約100×106個の細胞、例えば、生存T細胞が形質導入されるかまたは形質導入に供される。
【０３４４】
いくつかの態様では、提供される方法は、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターを、刺激された細胞集団の600×106個、約600×106個または600×106個未満の細胞、例えば、生存T細胞に形質導入することに関連して使用される。ある特定の態様では、刺激された細胞集団の600×106個または約600×106個の細胞、例えば、生存T細胞が形質導入されるかまたは形質導入に供される。いくつかの態様では、最大で900×106個の細胞（例えば、生存CD3+細胞または混合の生存CD4+および生存CD8+細胞（例えば、1：1または約1：1比で混合された））が刺激に供され、刺激に供された細胞の600×106個、約600×106個または最大で600×106個の量の細胞が形質導入に供される。
【０３４５】
いくつかの態様では、形質導入は、無血清培地中で実施される。いくつかの態様では、形質導入は、IL-2、IL-7およびIL-15の存在下で実施される。いくつかの態様では、形質導入のためのウイルスベクターが凍結され、使用の前に融解され、そして、融解されたウイルスベクターが無血清培地で希釈される。いくつかの態様では、ウイルスベクターを希釈するためおよび形質導入のための無血清培地は、本明細書のセクションIIまたはPCT/US2018/064627に記載されている通りである。
【０３４６】
いくつかの態様では、無血清培地は、1つまたは複数のサプリメントが補充された基礎培地（例えば、OpTmizer（商標）T-Cell Expansion Basal Medium（ThermoFisher））を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数のサプリメントは、無血清である。いくつかの態様では、無血清培地は、例えば追加のサプリメント（例えば、OpTmizer（商標）T-Cell Expansion Supplement（ThermoFisher））によって提供される、細胞（例えば、T細胞）の維持、拡大増殖および/または活性化のための1つまたは複数の追加の成分が補充された基礎培地を含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、血清代替サプリメント、例えば、免疫細胞血清代替物、例えば、CTS（商標）Immune Cell Serum Replacement（ThermoFisher、#A2596101）、またはSmith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31に記載されている免疫細胞血清代替物を含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、L-グルタミンなどのアミノ酸の遊離形態を含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、L-グルタミンのジペプチド形態（例えば、L-アラニル-L-グルタミン）、例えば、Glutamax（商標）（ThermoFisher）中のジペプチドを含む。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、1つまたは複数の組換えサイトカイン、例えば、組換えヒトIL-2、組換えヒトIL-7、および/または組換えヒトIL-15を含む。
【０３４７】
特定の態様では、細胞、例えば、刺激された細胞集団の細胞は、CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞である細胞を少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％含有する。いくつかの態様では、形質導入は、形質導入後インキュベーションを含め、24〜48時間の間、36〜12時間の間、18〜30時間の間、または24時間もしくは約24時間にわたり実施される。いくつかの態様では、形質導入は、形質導入後インキュベーションを含め、24時間、48時間もしくは72時間または約24時間、48時間もしくは72時間、または1日、2日もしくは3日または約1日、2日もしくは3日それぞれ実施される。特定の態様では、形質導入は、形質導入後インキュベーションを含め、24時間±6時間、48時間±6時間もしくは72時間±6時間、または約24時間±6時間、48時間±6時間もしくは72時間±6時間にわたり実施される。特定の態様では、形質導入は、形質導入後インキュベーションを含め、72時間もしくは約72時間、72±4時間、または3日もしくは約3日にわたり実施される。
【０３４８】
ある特定の態様では、形質導入工程は、インキュベーション、例えば、刺激条件下でのインキュベーションの始動または開始の2日以内、36時間以内、30時間以内、24時間以内、18時間以内、16時間以内、14時間以内、または12時間以内に開始される。ある特定の態様では、形質導入工程は、インキュベーション、例えば、刺激条件下でのインキュベーションの始動または開始の約20時間の時点で開始される。ある特定の態様では、形質導入工程は、インキュベーション、例えば、刺激条件下でのインキュベーションの始動または開始の20±4時間の時点で開始される。
【０３４９】
いくつかの態様では、システムには、本明細書または国際公開番号WO2016/073602に記載されているような遠心チャンバシステムと共にまたはそれに関連して行うことができる1つまたは複数の処理工程など、システム内で実施される形質導入工程および1つまたは複数の様々な他の処理工程の局面を操作、自動化、制御および/またはモニタリングするための装置を含む他の装置が含まれ、および/またはシステムは、それに関連して配置される。いくつかの態様では、この装置は、キャビネット内に含有される。いくつかの態様では、装置は、制御回路を含有するハウジング、遠心分離機、カバー、モータ、ポンプ、センサ、ディスプレイおよびユーザインターフェースを含むキャビネットを含む。例示的なデバイスは、米国特許第6,123,655号、米国特許第6,733,433号および米国特許第2008/0171951号に記載されている。
【０３５０】
いくつかの態様では、システムは、一連の容器、例えば、バッグ、チューブ、ストップコック、クランプ、コネクタおよび遠心分離チャンバを含む。いくつかの態様では、バッグなどの容器は、同じ容器または別個の容器、例えば、同じバッグまたは別個のバッグ内に、形質導入されるべき細胞とウイルスベクター粒子とを含有する、バッグなどの1つまたは複数の容器を含む。いくつかの態様では、システムはさらに、本方法の間に構成成分および/または集団を希釈、再懸濁および/または洗浄するためにチャンバおよび/または他の構成成分に引き込まれる媒体、例えば、希釈剤および/または洗浄溶液を含有する、バッグなどの1つまたは複数の容器を含む。容器は、システム内の1つまたは複数の位置、例えば、投入ライン、希釈剤ライン、洗浄ライン、廃棄物ラインおよび/または排出ラインに対応する位置に接続することができる。
【０３５１】
いくつかの態様では、チャンバは、その回転軸の周りなどでチャンバの回転を達成可能である遠心分離機と関連付けられる。回転は、細胞の形質導入に関連するインキュベーションの前、その間および/もしくはその後に、および/または他の処理工程のうちの1つもしくは複数において行われ得る。したがって、いくつかの態様では、様々な処理工程の1つまたは複数が、回転下で、例えば、特定の力で行われる。チャンバは、典型的には垂直方向またはほぼ垂直方向に回転可能であり、その結果、チャンバは遠心分離中に垂直に位置し、側壁および軸は垂直またはほぼ垂直であり、端壁は水平またはほぼ水平である。
【０３５２】
いくつかの態様では、集団をキャビティに提供する前に、細胞を含有する集団およびウイルスベクター粒子を含有する集団および任意で空気を組み合わせるか混合することができる。いくつかの態様では、細胞を含有する集団およびウイルスベクター粒子を含有する集団および任意で空気を別個に提供し、キャビティ内で組み合わせて混合する。いくつかの態様では、細胞を含有する集団、ウイルスベクター粒子を含有する集団および任意で空気を任意の順序で内部キャビティに提供することができる。そのようないくつかの態様のいずれかにおいて、細胞およびウイルスベクター粒子を含有する集団は、遠心チャンバの内部または外部で組み合わされているまたは混合されているかどうか、かつ/または、細胞およびウイルスベクター粒子が、遠心チャンバに一緒にまたは別個に、例えば同時または連続して提供されるかどうかにかかわらず、一度一緒に組み合わされるか混合されたインプット集団である。
【０３５３】
いくつかの態様では、空気などの気体の体積の取り込みは、形質導入法での回転など、細胞およびウイルスベクター粒子をインキュベートする前に行われる。いくつかの態様では、空気などの気体の体積の取り込みは、形質導入法での回転など、細胞およびウイルスベクター粒子のインキュベーションの間に行われる。
【０３５４】
いくつかの態様では、形質導入集団を構成する細胞またはウイルスベクター粒子の液体体積、および任意で空気の体積は、所定の体積であることができる。体積は、システムに関連する回路にプログラムされた体積および/またはその回路によって制御された体積であることができる。
【０３５５】
いくつかの態様では、形質導入集団、および任意で空気などの気体の取り込みは、所望または所定の体積がチャンバの内部キャビティに取り込まれるまで、手動、半自動および/または自動で制御される。いくつかの態様では、システムに関連付けられたセンサは、遠心分離チャンバに出入りする液体および/または気体を、その色、流量および/または密度などを介して検出することができ、関連する回路と通信して、そのような所望または所定の体積の取り込みが達成されるまで、必要に応じて取り込みを停止または続行させることができる。いくつかの局面では、気体（例えば、空気）ではなくシステム内の液体のみを検出するようにプログラムされているかそれが可能であるセンサを作製して、取り込みを停止することなく、空気などの気体をシステムに通過させることができる。いくつかのそのような態様では、空気などの気体の取り込みが望まれている間、非透明なチューブ片をセンサ近くのラインに配置することができる。いくつかの態様では、空気などの気体の取り込みを手動で制御することができる。
【０３５６】
提供される方法の局面では、遠心分離チャンバの内部キャビティが高速回転に供される。いくつかの態様では、回転は、液体インプット集団および任意で空気の取り込みの前に、それと同時に、それに続いて、またはそれと断続的に達成される。いくつかの態様では、回転は、液体インプット集団および任意で空気の取り込みに続いて達成される。いくつかの態様では、回転は、内部キャビティの側壁の内面でのおよび/または細胞の表面層での200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、1000g、1100g、1500、1600g、1800g、2000g、2200g、2500g、3000g、3200g、3500gもしくは4000g、または約200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、1000g、1100g、1500、1600g、1800g、2000g、2200g、2500g、3000g、3200g、3500gもしくは4000g、または少なくとも200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、1000g、1100g、1500、1600g、1800g、2000g、2200g、2500g、3000g、3200g、3500gもしくは4000g、または少なくとも約200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、1000g、1100g、1500、1600g、1800g、2000g、2200g、2500g、3000g、3200g、3500gもしくは4000gの相対遠心力での遠心チャンバの遠心分離によるものである。いくつかの態様では、回転は、1200g超もしくは約1200g超、1400g超もしくは約1400g超、1600g超もしくは約1600g超、1800g超もしくは約1800g超、2000g超もしくは約2000g超、2400g超もしくは約2400g超、2800g超もしくは約2800g超、3000g超もしくは約3000g超、または3200g超もしくは約3200g超などによる、1100g超または約1100gである力での遠心分離によるものである。特定の態様では、遠心分離による回転は、600g〜800gの間の力での回転である。特定の態様では、遠心分離による回転は、693gまたは約693gの力での回転である。いくつかの態様では、遠心分離による回転は、1600gであるまたは約1600gである力での回転である。
【０３５７】
いくつかの態様では、チャンバのキャビティ内の空気などの気体は、チャンバから排出される。いくつかの態様では、空気などの気体は、閉鎖系の一部として遠心チャンバと動作可能に連結された容器に排出される。いくつかの態様では、容器は、空いている、または空の容器である。いくつかの態様では、チャンバのキャビティ内の気体などの空気は、無菌の管路を介してチャンバの内部キャビティに動作可能に接続されたフィルターを通して排出される。いくつかの態様では、空気は、手動、半自動または自動プロセスを使用して排出される。いくつかの態様では、チャンバのキャビティから、インキュベートされた細胞およびウイルスベクター粒子を含有するアウトプット集団、例えば、形質導入が開始された細胞またはウイルスベクターにより形質導入された細胞を圧搾する前に、それと同時に、それと断続的に、またはそれに続いて、チャンバから空気が排出される。
【０３５８】
いくつかの態様では、形質導入および/または他のインキュベーションは、連続的または半連続的なプロセスとして、またはその一部として実施される。いくつかの態様では、連続的なプロセスは、インキュベーションの少なくとも一部の間、例えば遠心分離しながら、細胞およびウイルスベクター粒子、例えば形質導入組成物の連続的な取り込み（単一の既存の組成物として、または同じ容器、例えばキャビティに連続的に引き込み、それによってその部分を混合することによって）、ならびに/または、液体の連続的な圧搾もしくは排除、および任意で容器からの気体（例えば、空気）の排出を伴う。いくつかの態様では、連続的な取り込みおよび連続的な圧搾は、少なくとも部分的に同時に行われる。いくつかの態様では、連続的な取り込みは、インキュベーションの一部の間に、例えば、遠心分離の一部の間に行われ、連続的な圧搾は、インキュベーションの別の部分の間に行われる。2つは交互に行われ得る。したがって、連続的な取り込みおよび圧搾により、インキュベーションを行いながら、試料のさらに大きな全体積を処理する、例えば形質導入することができる。
【０３５９】
いくつかの態様では、インキュベーションは、連続的なプロセスの一部であり、本方法は、インキュベーションの少なくとも一部の間に、キャビティへの形質導入組成物の連続的な取り込みをチャンバの回転の間およびインキュベーションの一部の間に達成する工程、液体の連続的な圧搾を達成する工程、および任意で、チャンバの回転の間に、少なくとも1つの開口部を通じてキャビティから気体（例えば、空気）を排出する工程を含む。
【０３６０】
いくつかの態様では、半連続的なインキュベーションは、キャビティへの組成物の取り込み、インキュベーション、キャビティからの液体の圧搾、および任意で、アウトプット容器などへのキャビティからの気体（例えば、空気）の排出、次いで、さらに多くの細胞および処理のための他の試薬、例えばウイルスベクター粒子を含有する後続の（例えば、第2、第3などの）組成物の取り込み、ならびにプロセスの反復を交互に達成することによって行われる。例えば、いくつかの態様では、インキュベーションは、半連続的なプロセスの一部であり、本方法は、インキュベーションの前に、少なくとも1つの開口部を通じた形質導入組成物のキャビティへの取り込みを達成する工程、インキュベーションに続いて、キャビティからの流体の圧搾を達成する工程；細胞およびウイルスベクター粒子を含む別の形質導入組成物の内部キャビティへの取り込みを達成する工程；ならびに別の形質導入組成物中の細胞がベクターにより形質導入されるかまたは形質導入に供される条件下で、内部キャビティ内で別の形質導入組成物をインキュベートする工程を含む。このプロセスは、いくつかの追加ラウンドにわたり反復的に継続され得る。この点で、半連続的または連続的な方法は、さらに大きな体積および/または数の細胞の産生を可能にし得る。
【０３６１】
いくつかの態様では、形質導入インキュベーションの一部は、遠心チャンバ内で実施され、回転または遠心分離を含む条件下で実施される。
【０３６２】
特定の態様では、ウイルスベクターによる細胞の形質導入は、細胞およびウイルス粒子を含有する混合物のスピノキュレーション、例えば、遠心分離であるかそれを含む。いくつかの態様では、細胞およびウイルス粒子を含有する組成物は、一般に、細胞をペレット化するために使用される速度よりも遅い速度、例えば、600rpm〜1700rpmまたは約600rpm〜1700rpm（例えば、600rpm、1000rpm、もしくは1500rpmもしくは1700rpm、または約600rpm、1000rpm、もしくは1500rpmもしくは1700rpm、または少なくとも600rpm、1000rpm、もしくは1500rpmもしくは1700rpm）などの比較的低い力または速度で回転させることができる。いくつかの態様では、回転は、例えば、チャンバまたはキャビティの内壁または外壁で測定した場合、100g〜4000gまたは約100g〜4000g（例えば、100g、200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、900g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000gもしくは3500g、または約100g、200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、900g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000gもしくは3500g、または少なくとも100g、200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、900g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000gもしくは3500g、または少なくとも約100g、200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、900g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000gもしくは3500g）の力、例えば、相対遠心力で行われる。
【０３６３】
いくつかの態様では、細胞は、ウイルスベクターと共に、100g〜4000g、200g〜1,000g、500g〜1200g、1000g〜2000g、600g〜800g、1200g〜1800gもしくは1500g〜1800gまた約100g〜4000g、200g〜1,000g、500g〜1200g、1000g〜2000g、600g〜800g、1200g〜1800gもしくは1500g〜1800gの力、例えば、相対遠心力でスピノキュレートされる。ある特定の態様では、細胞は、ウイルスベクター粒子と共に、100g、200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、900g、1000g、1200g、1500g、1600g、2000g、2500g、3000g、3200gもしくは3500g、少なくとも100g、200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、900g、1000g、1200g、1500g、1600g、2000g、2500g、3000g、3200gもしくは3500g、または約100g、200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、900g、1000g、1200g、1500g、1600g、2000g、2500g、3000g、3200gもしくは3500gでスピノキュレートされる。いくつかの態様では、細胞は、ウイルスベクターにより692gもしくは693gまたは約692gもしくは693gの力で形質導入されるかまたは形質導入に供される。特定の態様では、細胞は、ウイルスベクターにより1600gまたは約1600gの力で形質導入されるかまたは形質導入に供される。いくつかの態様では、力は、内部キャビティの側壁の内面でのおよび/または細胞の表面層での力である。
【０３６４】
ある特定の態様では、細胞は、スピノキュレートされる、例えば、細胞およびウイルスベクターを含有する細胞組成物は、5分間超または約5分間、例えば、10分間超もしくは約10分間、15分間超もしくは約15分間、20分間超もしくは約20分間、30分間超もしくは約30分間、45分間超もしくは約45分間、60分間超もしくは約60分間、90分間超もしくは約90分間、または120分間超もしくは約120分間；あるいは、5分〜120分、30分〜90分、15分〜60分、15分〜45分、30分〜60分、もしくは45分〜60分、または約5分〜120分、30分〜90分、15分〜60分、15分〜45分、30分〜60分、もしくは45分〜60分（両端の値を含む）にわたり回転される。いくつかの態様では、細胞は、ウイルスベクターと共に30分間または約30分間スピノキュレートされる。ある特定の態様では、細胞は、ウイルスベクターと共に60分間または約60分間スピノキュレートされる。
【０３６５】
いくつかの態様では、形質導入の方法は、形質導入組成物および任意で空気を、遠心チャンバ内で、5分間超もしくは約5分間、例えば、10分間超もしくは約10分間、15分間超もしくは約15分間、20分間超もしくは約20分間、30分間超もしくは約30分間、45分間超もしくは約45分間、60分間超もしくは約60分間、90分間超もしくは約90分間、または120分間超もしくは約120分間にわたりスピノキュレーション、例えば、回転または遠心分離することを含む。いくつかの態様では、形質導入組成物および任意で空気は、5分を超えるが60分以下、45分以下、30分以下または15分以下にわたり遠心チャンバ内で回転または遠心分離される。特定の態様では、形質導入は、60分間または約60分間にわたり回転または遠心分離することを含む。
【０３６６】
いくつかの態様では、形質導入の方法は、形質導入組成物および任意で空気を、遠心チャンバ内で、10分〜60分、15分〜60分、15分〜45分、30分〜60分、もしくは45分〜60分、または約10分〜60分、約15分〜60分、約15分〜45分、約30分〜60分、もしくは約45分〜60分（両端の値を含む）にわたり、かつ、内部キャビティの側壁の内面でおよび/または細胞の表面層で1000g、1100g、1200g、1400g、1500g、1600g、1800g、2000g、2200g、2400g、2800g、3200gもしくは3600g、約1000g、1100g、1200g、1400g、1500g、1600g、1800g、2000g、2200g、2400g、2800g、3200gもしくは3600g、または1000g、1100g、1200g、1400g、1500g、1600g、1800g、2000g、2200g、2400g、2800g、3200gもしくは3600gの力で回転または遠心分離することを含む。特定の態様では、形質導入の方法は、形質導入組成物、例えば、細胞およびウイルスベクター粒子を、1600gまたは約1600gで60分間または約60分間にわたり回転または遠心分離することを含む。
【０３６７】
2. ウイルスベクター粒子
いくつかの態様では、組換え核酸は、組換え感染性ウイルス粒子、例えば、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するベクターを使用して細胞に移送される。いくつかの態様では、組換え核酸は、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えばガンマ-レトロウイルスベクターを使用してT細胞に移送される（例えば、Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557を参照のこと）。
【０３６８】
いくつかの態様では、レトロウイルスベクター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）、マウス胚性幹細胞ウイルス（MESV）、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）または脾フォーカス形成ウイルス（SFFV）に由来するレトロウイルスベクターは、長末端反復配列（LTR）を有する。ほとんどのレトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスに由来する。いくつかの態様では、レトロウイルスは、任意の鳥類または哺乳類の細胞源に由来するものを含む。レトロウイルスは、典型的には両種指向性であり、これは、ヒトを含む数種の宿主細胞に感染可能であることを意味する。一態様では、発現されるべき遺伝子は、レトロウイルスのgag、polおよび/またはenv配列と置き換わる。多数の例示的なレトロウイルス系が記載されている（例えば、米国特許第5,219,740号；第6,207,453号；第5,219,740号；Miller and Rosman (1989) Bio Techniques 7:980-990；Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852；Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037；およびBoris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109）。
【０３６９】
ウイルスベクターゲノムは、典型的には、パッケージング細胞株または産生細胞株にトランスフェクトできるプラスミドの形態で構築される。そのような例のいずれでも、組換え受容体などの組換えタンパク質をコードする核酸は、一般にウイルスゲノムの非必須領域などのウイルスベクターの領域に挿入または配置される。いくつかの態様では、核酸は、ある特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入されて、複製欠損であるウイルスを産生する。
【０３７０】
多種多様な公知の方法のいずれかを使用して、ゲノムがウイルスベクターゲノムのRNAコピーを含有するレトロウイルス粒子を産生することができる。いくつかの態様では、少なくとも2つの成分（第1に、構造タンパク質と、ウイルスベクター粒子を生成するのに必要な酵素とを包含するパッケージングプラスミド、第2に、ウイルスベクターそれ自体、すなわち、導入されるべき遺伝物質）がウイルスベースの遺伝子送達系の作製に関与する。これらの成分の一方または両方の設計に、バイオセーフティのためのセーフガードを導入することができる。
【０３７１】
いくつかの態様では、パッケージングプラスミドは、エンベロープタンパク質以外のHIV-1などのあらゆるレトロウイルスタンパク質を含有することができる（Naldini et al., 1998）。他の態様では、ウイルスベクターは、病原性に関連するものなどの追加のウイルス遺伝子、例えば、HIVの一次トランスアクチベーターであるvpr、vif、vpuおよびnef、ならびに/またはTatを欠損し得る。いくつかの態様では、HIVベースのレンチウイルスベクターなどのレンチウイルスベクターは、親ウイルスの3つの遺伝子、gag、polおよびrevのみを含み、これにより、組換えによる野生型ウイルスの再構成の可能性が減少するか排除される。
【０３７２】
いくつかの態様では、ウイルスベクターゲノムは、ウイルスベクターゲノムから転写されたウイルスゲノムRNAをウイルス粒子にパッケージングするのに必要なあらゆる成分を含有するパッケージング細胞株に導入される。あるいは、ウイルスベクターゲノムは、関心対象の1つまたは複数の配列、例えば組換え核酸に加えて、ウイルス成分をコードする1つまたは複数の遺伝子を含み得る。ただし、いくつかの局面では、標的細胞内でのゲノムの複製を防ぐために、複製に必要な内因性ウイルス遺伝子が除去され、パッケージング細胞株に別個に提供される。
【０３７３】
いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、粒子を生成するために必要な成分を含有する1つまたは複数のプラスミドベクターによりトランスフェクトされる。いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、LTR、シス作用パッケージング配列および関心対象の配列、すなわちCARなどの抗原受容体をコードする核酸を含む、ウイルスベクターゲノムを含有するプラスミドと；Gag、polおよび/またはrevなどのウイルスの酵素的および/または構造的成分をコードする1つまたは複数のヘルパープラスミドによりトランスフェクトされる。いくつかの態様では、レトロウイルスベクター粒子を生成する様々な遺伝的成分を分離するために複数のベクターが利用される。いくつかのそのような態様では、パッケージング細胞に別個のベクターを提供することにより、普通なら複製能力のあるウイルスを生成する可能性がある組換え事象の可能性が減少する。いくつかの態様では、あらゆるレトロウイルス成分を有する単一のプラスミドベクターを使用することができる。
【０３７４】
いくつかの態様では、レンチウイルスベクター粒子などのレトロウイルスベクター粒子は、宿主細胞の形質導入効率を高めるために偽型化される。例えば、いくつかの態様では、レンチウイルスベクター粒子などのレトロウイルスベクター粒子は、VSV-G糖タンパク質を用いて偽型化され、これにより、広い細胞宿主範囲が提供され、形質導入できる細胞タイプを拡大する。いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、例えば、シンドビスウイルスエンベロープ、GALVまたはVSV-Gなどの異種指向性、ポリトロピックまたは両種指向性のエンベロープを含むように、非天然エンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドまたはポリヌクレオチドによりトランスフェクトされる。
【０３７５】
いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムRNAをレンチウイルスベクター粒子にパッケージングするためにトランスで必要とされる、ウイルス調節タンパク質および構造タンパク質を含む成分を提供する。いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、レンチウイルスタンパク質を発現して機能的なレンチウイルスベクター粒子を産生することができる、任意の細胞株であり得る。いくつかの局面では、好適なパッケージング細胞株は、293細胞（ATCC CCL X）、293T細胞、HeLA細胞（ATCC CCL 2）、D17細胞（ATCC CCL 183）、MDCK細胞（ATCC CCL 34）、BHK細胞（ATCC CCL-10）およびCf2Th細胞（ATCC CRL 1430）を含む。
【０３７６】
いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、ウイルスタンパク質を安定に発現する。例えば、いくつかの局面では、gag、pol、revおよび/または他の構造遺伝子を含有するが、LTRおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築することができる。いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、異種タンパク質をコードする核酸分子および/またはエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸を含有するウイルスベクターゲノムと共に、1つまたは複数のウイルスタンパク質をコードする核酸分子により一過性にトランスフェクトされ得る。
【０３７７】
いくつかの態様では、ウイルスベクターおよびパッケージングプラスミドおよび/またはヘルパープラスミドは、トランスフェクションまたは感染を介してパッケージング細胞株に導入される。パッケージング細胞株は、ウイルスベクターゲノムを含有するウイルスベクター粒子を産生する。トランスフェクションまたは感染のための方法は周知である。非限定的な例は、リン酸カルシウム、DEAE-デキストランおよびリポフェクション法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションを含む。
【０３７８】
組換えプラスミドならびにレトロウイルスLTRおよびパッケージング配列を特別な細胞株に（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）導入すると、パッケージング配列は、組換えプラスミドのRNA転写物をウイルス粒子にパッケージングすることを可能にし得、その後、これが培養培地に分泌され得る。次いで、いくつかの態様では、組換えレトロウイルスを含有する培地を収集し、任意で濃縮し、遺伝子導入に使用する。例えば、いくつかの局面では、パッケージング細胞株へのパッケージングプラスミドおよび導入ベクターのコトランスフェクションの後、ウイルスベクター粒子が培養培地から回収され、当業者が使用している標準的な方法によって滴定される。
【０３７９】
いくつかの態様では、レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターは、レンチウイルス粒子の生成を可能にするプラスミドの導入により、例示的なHEK 293T細胞株などのパッケージング細胞株内で産生させることができる。いくつかの態様では、パッケージング細胞は、gagおよびpolをコードするポリヌクレオチドにより、ならびに抗原受容体（例えば、CAR）などの組換え受容体をコードするポリヌクレオチドによりトランスフェクトされ、かつ/または、前記ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、revタンパク質をコードするポリヌクレオチドにより任意でおよび/または追加でトランスフェクトされ、かつ/または、前記ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、VSV-Gなどの非天然エンベロープ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより任意でおよび/または追加でトランスフェクトされ、かつ/または、前記ポリヌクレオチドを含有する。いくつかのそのような態様では、細胞、例えばHEK 293T細胞のトランスフェクションの約2日後、細胞上清は、組換えレンチウイルスベクターを含有し、これを回収し、滴定することができる。
【０３８０】
回収および/または産生されたレトロウイルスベクター粒子を使用し、記載されるような方法を使用して標的細胞を形質導入することができる。標的細胞に入ると、ウイルスRNAは逆転写され、核に輸送され、宿主ゲノムに安定して組み込まれる。ウイルスRNAの組み込みの1日後または2日後に、組換えタンパク質、例えば、CARなどの抗原受容体の発現を検出することができる。
【０３８１】
3. 細胞のインキュベーション
特定の態様では、細胞をウイルスベクターにより形質転換する（例えば、形質導入する）などによる遺伝子操作はさらに、細胞にウイルスベクターを導入または接触させた後に細胞をインキュベートする1つまたは複数の工程を含む。いくつかの態様では、細胞、例えば、形質転換された細胞集団の細胞（「形質転換された細胞」とも呼ばれる）は、細胞を遺伝子操作、形質転換、形質導入またはトランスフェクトしてウイルスベクターを細胞に導入するためのプロセスに続いて、インキュベートされる。特定の態様では、インキュベーションは、インキュベートされた細胞の集団（本明細書においてインキュベートされ細胞集団とも称される）をもたらす。
【０３８２】
いくつかの態様では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、異種または組換えポリヌクレオチド、例えば、ウイルスベクター粒子の導入が細胞のさらなる処理なしに行われた後に、インキュベートされる。特定の態様では、インキュベートする前に、細胞を洗浄して、例えば、異種または組換えポリヌクレオチド、例えば、ウイルスベクター粒子をコードする外因性または残留ポリヌクレオチド、例えば、スピノキュレーションに続く遺伝子操作プロセス後に培地中に残留しているものを除去するかまたは実質的に除去する。
【０３８３】
いくつかのそのような態様では、さらなるインキュベーションは、1つまたは複数の細胞の宿主ゲノムへのウイルスベクターの組み込みをもたらす条件下で達成される。例えば、さらなるインキュベーションは、形質導入（例えば、スピノキュレーションを介した）後にT細胞に結合され得るウイルスベクターが関心対象の遺伝子を送達するために細胞のゲノム内に組み込まれる時間を提供する。いくつかの局面では、さらなるインキュベーションは、細胞、例えば、形質転換された細胞が休止または回復することが可能な条件下で行われ、その中で、インキュベーションの間の細胞の培養が細胞の健康を支援または維持する。特定の態様では、細胞は、静的条件、例えば、培地の遠心分離、振盪、回転、揺動、または灌流、例えば、連続もしくは半連続灌流を伴わない条件下でインキュベートされる。
【０３８４】
インキュベーションが宿主ゲノムへのウイルスベクター粒子の組み込みをもたらしたかどうかを評価または判定し、ひいてはさらなるインキュベーションの条件を経験的に判定することは、当業者のレベルの範囲内である。いくつかの態様では、宿主ゲノムへのウイルスベクターの組み込みは、インキュベーション後にウイルスベクター粒子のゲノムに含有される核酸によってコードされる異種タンパク質などの組換えタンパク質の発現レベルを測定することによって評価することができる。組換え分子の発現レベルを評価するための多数の周知の方法、例えば、親和性ベースの方法、例えば、免疫親和性ベースの方法による検出（例えば、細胞表面タンパク質の関連では、フローサイトメトリーなどによる）が使用されてもよい。いくつかの例では、発現は、形質導入マーカーおよび/またはレポーター構築物の検出によって測定される。いくつかの態様では、切断型表面タンパク質をコードする核酸がベクター内に含まれ、発現および/またはその増強のマーカーとして使用される。
【０３８５】
ある特定の態様では、インキュベーションは、静的条件、例えば、培地の遠心分離、振盪、回転、揺動、または灌流、例えば、連続もしくは半連続灌流を伴わない条件下で実施される。いくつかの態様では、インキュベーションの開始の前またはその直後、例えば、5分、15分または30分以内に、バッグまたはバイアルなどの容器に細胞が移送され（例えば、無菌条件下で移送され）、インキュベーター内に入れられる。
【０３８６】
いくつかの態様では、インキュベーションの少なくとも一部は、国際公開番号WO2016/073602に記載されているように遠心チャンバの内部キャビティ内で行われる。
【０３８７】
いくつかの態様では、異種または組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ウイルスベクターが導入された細胞が、インキュベーションのための容器に移送される。いくつかの態様では、容器は、バイアルである。特定の態様では、容器は、バッグである。いくつかの態様では、細胞、および任意で異種または組換えポリペプチドが、閉鎖または無菌条件下で容器に移送される。いくつかの態様では、次いで、容器、例えば、バイアルまたはバッグは、インキュベーションの全部または一部のためにインキュベーター内に入れられる。特定の態様では、インキュベーターは、16℃、24℃もしくは35℃、約16℃、24℃もしくは35℃、または少なくとも16℃、24℃もしくは35℃に設定される。いくつかの態様では、インキュベーターは、37℃、約37℃、または37℃±2℃、±1℃、±0.5℃もしくは±0.1℃に設定される。
【０３８８】
いくつかの局面では、インキュベーションのための条件は、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、作用物質、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオンおよび/または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、ならびに細胞を活性化するように設計された任意の他の作用物質の1つまたは複数を含むことができる。
【０３８９】
いくつかの態様では、インキュベーションは、無血清培地中で実施される。いくつかの態様では、無血清培地は、規定されたおよび/または正確に規定された細胞培養培地である。ある特定の態様では、無血清培地は、処理されている、例えば、阻害物質および/または成長因子を除去するために濾過されている、制御された培養培地である。いくつかの態様では、無血清培地は、タンパク質を含有する。ある特定の態様では、無血清培地は、血清アルブミン、加水分解物、成長因子、ホルモン、担体タンパク質および/または付着因子を含有し得る。
【０３９０】
特定の態様では、細胞は、1つまたは複数のサイトカインの存在下でインキュベートされる。ある特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、組換えサイトカインである。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えサイトカインである。ある特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、T細胞によって発現されるおよび/またはT細胞に対して内因性である受容体に結合するおよび/または結合可能である。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、サイトカインの4-アルファ-ヘリックスバンドルファミリーのメンバーであるかそれを含む。いくつかの態様では、サイトカインの4-アルファ-ヘリックスバンドルファミリーのメンバーは、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン15（IL-15）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を含むが、それらに限定されない。いくつかの態様では、1つまたは複数のサイトカインは、IL-15であるかそれを含む。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、IL-7であるかそれを含む。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、組換えIL-2であるかそれを含む。
【０３９１】
特定の態様では、細胞は、IL-2、IL-7および/またはIL-15の存在下でインキュベートされる。ある特定の態様では、IL-2、IL-7および/またはIL-15は、組換えである。ある特定の態様では、IL-2、IL-7および/またはIL-15は、ヒトである。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えIL-2、IL-7および/またはIL-15であるかそれを含む。ある特定の態様では、細胞は、組換えIL-2、IL-7およびIL-15の存在下でインキュベートされる。
【０３９２】
いくつかの態様では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、1IU/mL〜1,000IU/mLの間、10IU/mL〜50IU/mLの間、50IU/mL〜100IU/mLの間、100IU/mL〜200IU/mLの間、100IU/mL〜500IU/mLの間、250IU/mL〜500IU/mLの間、または500IU/mL〜1,000IU/mLの間の濃度のサイトカイン、例えば、組換えヒトサイトカインとインキュベートされる。
【０３９３】
いくつかの態様では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、1IU/mL〜500IU/mLの間、10IU/mL〜250IU/mLの間、50IU/mL〜200IU/mLの間、50IU/mL〜150IU/mLの間、75IU/mL〜125IU/mLの間、100IU/mL〜200IU/mLの間、または10IU/mL〜100IU/mLの間の濃度のIL-2、例えば、ヒト組換えIL-2とインキュベートされる。特定の態様では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mLもしくは100IU/mL、または約50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mLもしくは100IU/mLの濃度の組換えIL-2とインキュベートされる。いくつかの態様では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、100IU/mLまたは約100IU/mLの組換えIL-2、例えば、ヒト組換えIL-2の存在下でインキュベートされる。
【０３９４】
いくつかの態様では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、100IU/mL〜2,000IU/mLの間、500IU/mL〜1,000IU/mLの間、100IU/mL〜500IU/mLの間、500IU/mL〜750IU/mLの間、750IU/mL〜1,000IU/mLの間、または550IU/mL〜650IU/mLの間の濃度の組換えIL-7、例えば、ヒト組換えIL-7とインキュベートされる。特定の態様では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、50IU/mL、100IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、250IU/mL、300IU/mL、350IU/mL、400IU/mL、450IU/mL、500IU/mL、550IU/mL、600IU/mL、650IU/mL、700IU/mL、750IU/mL、800IU/mL、750IU/mL、750IU/mL、750IU/mLもしくは1,000IU/mL、または約50IU/mL、100IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、250IU/mL、300IU/mL、350IU/mL、400IU/mL、450IU/mL、500IU/mL、550IU/mL、600IU/mL、650IU/mL、700IU/mL、750IU/mL、800IU/mL、750IU/mL、750IU/mL、750IU/mLもしくは1,000IU/mLの濃度のIL-7とインキュベートされる。特定の態様では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、600IU/mLまたは約600IU/mLのIL-7の存在下でインキュベートされる。
【０３９５】
いくつかの態様では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、1IU/mL〜500IU/mLの間、10IU/mL〜250IU/mLの間、50IU/mL〜200IU/mLの間、50IU/mL〜150IU/mLの間、75IU/mL〜125IU/mLの間、100IU/mL〜200IU/mLの間、または10IU/mL〜100IU/mLの間の濃度の組換えIL-15、例えば、ヒト組換えIL-15とインキュベートされる。特定の態様では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mLもしくは200IU/mL、または約50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mLもしくは200IU/mLの濃度の組換えIL-15とインキュベートされる。いくつかの態様では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、100IU/mLまたは約100IU/mLの組換えIL-15、例えば、ヒト組換えIL-2の存在下でインキュベートされる。
【０３９６】
特定の態様では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、IL-2、IL-7、および/またはIL-15の存在下でインキュベートされる。いくつかの態様では、IL-2、IL-7、および/またはIL-15は、組換えである。ある特定の態様では、IL-2、IL-7、および/またはIL-15は、ヒトである。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えIL-2、IL-7、および/またはIL-15であるかそれを含む。ある特定の態様では、細胞は、組換えIL-2、IL-7、およびIL-15の存在下でインキュベートされる。
【０３９７】
いくつかの態様では、例えば、非拡大増殖プロセスのインキュベーションの全部または一部は、基礎培地（例えば、CTS OpTmizer基礎培地（Thermofisher））、グルタミン、ならびに1つまたは複数の組換えサイトカイン、例えば組換えIL-2、IL-7および/またはIL-15を含む培地中で実施される。いくつかの態様では、培地は、セクションII.Bに記載されているような1つまたは複数の追加の成分を含有することができる。いくつかの態様では、1つまたは複数の追加の成分は、L-グルタミンのジペプチド形態（例えば、L-アラニル-L-グルタミン）を含み得る。いくつかの態様では、1つまたは複数の追加の成分は、追加のサプリメント、例えば、OpTmizer（登録商標）サプリメント（Thermofisher）によって提供される。いくつかの態様では、培地は、無血清培地であり、いかなる血清成分も含有しない。いくつかの局面では、培地は、1つまたは複数の血清代替タンパク質、例えば、アルブミン、インスリンまたはトランスフェリンの1つまたは複数を含有することができる（例えば、CTS（商標）Immune Cell Serum Replacement）。例示的な無血清培地またはその成分は、セクションIIに記載される。
【０３９８】
いくつかの態様では、細胞は、上記の刺激の方法またはプロセスに関連して行われるような、細胞の刺激の間に存在していたものと同じまたは類似の培地の存在下でインキュベートされる。いくつかの態様では、細胞は、上記の刺激の方法またはプロセスに関連して行われるような、細胞の刺激の間に存在していた培地と同じサイトカインを有する培地中でインキュベートされる。ある特定の態様では、細胞は、上記の刺激の方法またはプロセスに関連して行われるような、細胞の刺激の間に存在していた培地と同じサイトカインを同じ濃度で有する培地中でインキュベートされる。いくつかの態様では、細胞は、組換えサイトカインの非存在下でインキュベートされる。いくつかの態様では、細胞は、本明細書に記載されるような1つまたは複数のサイトカインの非存在下でインキュベートされる。いくつかの態様では、細胞は、本明細書に記載されるサイトカインすべての非存在下でインキュベートされる。
【０３９９】
いくつかの局面では、さらなるインキュベーションは、細胞が休止または回復することが可能な条件下で行われ、これは、例えば、組換えサイトカインまたは他の刺激剤の形態の刺激条件の存在を含まない。例えば、インキュベートすることは、インキュベーションの間の健康な細胞の培養を支援または維持するの十分な希薄な培地の存在下で行われる。
【０４００】
いくつかの態様では、インキュベーションの全部または一部は、基礎培地、例えば、1つまたは複数の組換えサイトカインを含まないかいかなる組換えサイトカインも含まない基礎培地中で実施される。いくつかの態様では、培地は、1つまたは複数の組換えサイトカイン、例えば、組換えヒトIL-2、組換えヒトIL-7、および/または組換えヒトIL-15を含まない。いくつかの局面では、インキュベーションは、いかなる組換えサイトカインも含まずに行われる。ある特定の態様では、基礎培地に、追加の添加物が補充される。いくつかの態様では、基礎培地に、いかなる追加の添加物も補充されない。細胞培養培地への添加物は、栄養素、糖、例えばグルコース、アミノ酸、ビタミン、またはATPおよびNADHなどの添加物を含み得るが、それらに限定されない。他の添加物を加えることもできるが、一般に、具体的な添加物および量は、培地と細胞のインキュベーションが、細胞の維持を促進するが、インキュベーションの間の細胞の代謝活性を最小化する、制限するおよび/または誘導しないようなものである。
【０４０１】
特定の態様では、培地は、1つまたは複数の組換えサイトカインを含有せずかつ血清成分を含有しない基礎培地、すなわち、無血清培地であるが、セクションII.Bに記載されているような1つまたは複数の追加の成分を含有し得る。特定の態様では、そのような無血清培地の、例えば、非拡大増殖プロセスのインキュベーションの全部または一部における使用は、細胞の維持を提供するが、細胞を活性化するまたは代謝的に活性にすることによって細胞を休止もしくは静止状態であるまたはその可能性が高い状態に促進し得る特定の因子を含まない、希薄培地を提供する。いくつかの局面では、そのような無血清培地の存在下でのインキュベーションは、刺激および遺伝子操作（例えば、形質導入）後に、細胞が回復または休止するのを可能にする。いくつかの局面では、そのような無血清培地の存在下でのインキュベーションは、例えば、製造プロセスの間またはその後、および採取/製剤化された細胞が凍結保存され、次いで、使用直前に融解されたとき、生存率の損失または喪失の影響を受けにくい細胞を含有するアウトプット組成物をもたらす。いくつかの態様では、融解されたときのアウトプット組成物中の細胞は、類似の培地であるがアウトプット組成物の凍結保存時に細胞をより代謝的に活性にし得る1つまたは複数の組換えサイトカイン、血清または他の因子を含有する培地中でインキュベートされた細胞よりも低いレベルのカスパーゼまたは他のアポトーシスマーカーを有する。
【０４０２】
いくつかの態様では、基礎培地は、無機塩、糖、アミノ酸、および任意で、ビタミン、有機酸および/もしくは緩衝液または他の周知の細胞培養栄養素の混合物を含有する。栄養素に加えて、培地は、pHと浸透圧を維持するのにも役立つ。いくつかの局面では、基礎培地の試薬は、細胞の成長、増殖および/または拡大増殖を支援する。多種多様な市販の基礎培地が当業者に周知であり、これには、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、ロズウェルパーク記念研究所培地（RPMI）、イスコフ改変ダルベッコ培地およびハム培地が含まれる。いくつかの態様では、基礎培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地、RPMI-1640またはα-MEMである。
【０４０３】
いくつかの態様では、基礎培地は、平衡塩類溶液（例えば、PBS、DPBS、HBSS、EBSS）である。いくつかの態様では、基礎培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、最小必須培地（MEM）、イーグル基礎培地（BME）、F-10、F-12、RPMI 1640、グラスゴー最小必須培地（GMEM）、アルファ最小必須培地（アルファMEM）、イスコフ改変ダルベッコ培地、およびM199から選択される。いくつかの態様では、基礎培地は、複合培地（例えば、RPMI-1640、IMDM）である。いくつかの態様では、基礎培地は、OpTmizer（商標）CTS（商標）T-Cell Expansion Basal Medium（ThermoFisher）である。
【０４０４】
いくつかの態様では、基礎培地は、タンパク質を含まない。いくつかの態様では、基礎培地は、ヒトタンパク質（例えば、ヒト血清タンパク質）を含まない。いくつかの態様では、基礎培地は、無血清である。いくつかの態様では、基礎培地は、ヒトに由来する血清を含まない。いくつかの態様では、基礎培地は、組換えタンパク質を含まない。いくつかの態様では、基礎培地は、ヒトタンパク質および組換えタンパク質を含まない。いくつかの態様では、基礎培地は、本明細書に記載されるような1つまたは複数またはすべてのサイトカインを含まない。いくつかの態様では、例えば、非拡大増殖プロセスのインキュベーションの全部または一部は、いかなる追加の添加物または組換えサイトカインも含まない基礎培地中で実施される。いくつかの態様では、基礎培地は、いかなる追加の添加物または組換えサイトカインも含まないCTS OpTmizer基礎培地（Thermofisher）である。
【０４０５】
いくつかの態様では、例えば、非拡大増殖プロセスのインキュベーションの全部または一部は、基礎培地およびグルタミンを含む培地、例えば、グルタミン含有のCTS OpTmizer基礎培地（Thermofisher）中で実施される。
【０４０６】
いくつかの態様では、例えば、非拡大増殖プロセスのインキュベーションの全部または一部は、1つまたは複数の組換えサイトカイン、例えば、組換えヒトIL-2、組換えヒトIL-7、および/または組換えヒトIL-15を含まない基礎培地（例えば、CTS OpTmizer基礎培地（Thermofisher））を含む培地中で実施される。いくつかの態様では、培地に、セクションII.Bに示されるような1つまたは複数の追加の非血清成分が補充される。いくつかの態様では、1つまたは複数のサプリメントは、無血清である。いくつかの態様では、無血清培地はさらに、L-グルタミンなどのアミノ酸の遊離形態を含む。いくつかの態様では、無血清培地は、血清代替サプリメントを含まない。いくつかの態様では、無血清培地は、L-グルタミンのジペプチド形態（例えば、L-アラニル-L-グルタミン）を含まない。いくつかの態様では、無血清培地は、いかなる組換えサイトカインも含まない。いくつかの態様では、無血清培地は、T細胞サプリメントおよび遊離形態のL-グルタミンが補充された基礎培地を含むが、いかなる免疫細胞血清代替物、いかなるL-グルタミンのジペプチド形態、またはいかなる組換えサイトカインも含有しない。いくつかの態様では、無血清培地は、基礎培地（例えば、OpTmizer（商標）T-Cell Expansion Basal Medium）、L-グルタミンおよび例えばサプリメント（例えば、OpTmizer（商標）T-Cell Expansion Supplement）によって提供される1つまたは複数の追加の成分を含む。
【０４０７】
特定の態様では、細胞は、無血清培地中、0.25×106個の細胞/mL、0.5×106個の細胞/mL、0.75×106個の細胞/mL、1.0×106個の細胞/mL、1.25×106個の細胞/mL、1.5×106個の細胞/mL、1.75×106個の細胞/mLもしくは2.0×106個の細胞/mL、または約0.25×106個の細胞/mL、0.5×106個の細胞/mL、0.75×106個の細胞/mL、1.0×106個の細胞/mL、1.25×106個の細胞/mL、1.5×106個の細胞/mL、1.75×106個の細胞/mLもしくは2.0×106個の細胞/mLの濃度でインキュベートされる。特定の態様では、細胞は、無血清培地中、0.75×106個の細胞/mLまたは約0.75×106個の細胞/mLの濃度でインキュベートされる。いくつかの態様では、インキュベートすることは、18時間〜30時間または約18時間〜30時間の間である。特定の態様では、インキュベートすることは、24時間もしくは約24時間、または1日もしくは約1日である。いくつかの態様では、インキュベートすることは、それぞれ、48時間もしくは72時間または約48時間もしくは72時間、または2日もしくは3日または約2日もしくは3日である。特定の態様では、インキュベートすることは、24時間±6時間、48時間±6時間もしくは72時間±6時間、または約24時間±6時間、48時間±6時間もしくは72時間±6時間である。特定の態様では、インキュベートすることは、72時間もしくは約72時間、72±4時間、または3日もしくは約3日であり、例えば、その時間の間、細胞は、無血清培地中、0.75×106個の細胞/mLまたは約0.75×106個の細胞/mLの濃度でインキュベートされる。いくつかの態様では、インキュベーションの全部または一部は、1つまたは複数の組換えサイトカイン、例えば、組換えヒトIL-2、組換えヒトIL-7、および/または組換えヒトIL-15を含まない基礎培地（例えば、CTS OpTmizer基礎培地（Thermofisher））を含む無血清培地中で実施される。いくつかの態様では、無血清培地に、L-グルタミンおよび/または1つもしくは複数の細胞サプリメント、例えば、OpTmizer（商標）T-Cell Expansion Supplementが補充されるが、いかなる免疫細胞血清代替物、いかなるL-グルタミンのジペプチド形態、またはいかなる組換えサイトカインも含有しない。
【０４０８】
特定の態様では、細胞は、サイトカインの非存在下でインキュベートされる。特定の態様では、細胞は、任意の組換えサイトカインの非存在下でインキュベートされる。特定の態様では、細胞は、1つまたは複数の組換えサイトカイン、例えば、組換えIL-2、IL-7および/またはIL-15の非存在下でインキュベートされる。
【０４０９】
いくつかの態様では、基礎培地はさらに、グルタミン、例えばL-グルタミンを含む。いくつかの局面では、グルタミンは、グルタミン、例えばL-グルタミンの遊離形態である。いくつかの態様では、基礎培地中のグルタミン、例えばL-グルタミンの濃度は、約0.5mM〜1mM、0.5mM〜1.5mM、0.5mM〜2mM、0.5mM〜2.5mM、0.5mM〜3mM、0.5mM〜3.5mM、0.5mM〜4mM、0.5mM〜4.5mM、0.5mM〜5mM、1mM〜1.5mM、1mM〜2mM、1mM〜2.5mM、1mM〜3mM、1mM〜3.5mM、1mM〜4mM、1mM〜4.5mM、1mM〜5mM、1.5mM〜2mM、1.5mM〜2.5mM、1.5mM〜3mM、1.5mM〜3.5mM、1.5mM〜4mM、1.5mM〜4.5mM、1.5mM〜5mM、2mM〜2.5mM、2mM〜3mM、2mM〜3.5mM、2mM〜4mM、2mM〜4.5mM、2mM〜5mM、2.5mM〜3mM、2.5mM〜3.5mM、2.5mM〜4mM、2.5mM〜4.5mM、2.5mM〜5mM、3mM〜3.5mM、3mM〜4mM、3mM〜4.5mM、3mM〜5mM、3.5mM〜4mM、3.5mM〜4.5mM、3.5mM〜5mM、4mM〜4.5mM、4mM〜5mMもしくは4.5mM〜5mMであるか、または約0.5mM〜1mM、0.5mM〜1.5mM、0.5mM〜2mM、0.5mM〜2.5mM、0.5mM〜3mM、0.5mM〜3.5mM、0.5mM〜4mM、0.5mM〜4.5mM、0.5mM〜5mM、1mM〜1.5mM、1mM〜2mM、1mM〜2.5mM、1mM〜3mM、1mM〜3.5mM、1mM〜4mM、1mM〜4.5mM、1mM〜5mM、1.5mM〜2mM、1.5mM〜2.5mM、1.5mM〜3mM、1.5mM〜3.5mM、1.5mM〜4mM、1.5mM〜4.5mM、1.5mM〜5mM、2mM〜2.5mM、2mM〜3mM、2mM〜3.5mM、2mM〜4mM、2mM〜4.5mM、2mM〜5mM、2.5mM〜3mM、2.5mM〜3.5mM、2.5mM〜4mM、2.5mM〜4.5mM、2.5mM〜5mM、3mM〜3.5mM、3mM〜4mM、3mM〜4.5mM、3mM〜5mM、3.5mM〜4mM、3.5mM〜4.5mM、3.5mM〜5mM、4mM〜4.5mM、4mM〜5mMもしくは4.5mM〜5mM未満（両端の値を含む）である。いくつかの態様では、基礎培地中のグルタミン、例えばL-グルタミンの濃度は、少なくとも約0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、または5mMである。いくつかの態様では、基礎培地中のグルタミン、例えばL-グルタミンの濃度は、最大約2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mMである。いくつかの態様では、基礎培地中のグルタミン、例えばL-グルタミンの濃度は、約2mMである。いくつかの態様では、基礎培地はさらに、タンパク質またはペプチドを含み得る。いくつかの態様では、少なくとも1つのタンパク質は、非哺乳動物起源のものではない。いくつかの態様では、少なくとも1つのタンパク質は、ヒトであるかまたはヒトに由来する。いくつかの態様では、少なくとも1つのタンパク質は、組換えである。いくつかの態様では、少なくとも1つのタンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、インスリン、フィブロネクチン、アプロチニンまたはフェツインを含む。いくつかの態様では、タンパク質は、アルブミン、インスリンまたはトランスフェリンの1つまたは複数、任意でヒトまたは組換えアルブミン、インスリンまたはトランスフェリンの1つまたは複数を含む。
【０４１０】
いくつかの態様では、タンパク質は、アルブミンまたはアルブミン代替物である。いくつかの態様では、アルブミンは、ヒト由来アルブミンである。いくつかの態様では、アルブミンは、組換えアルブミンである。いくつかの態様では、アルブミンは、天然ヒト血清アルブミンである。いくつかの態様では、アルブミンは、組換えヒト血清アルブミンである。いくつかの態様では、アルブミンは、非ヒト供給源由来の組換えアルブミンである。アルブミン代替物は、任意のタンパク質またはポリペプチド供給源であり得る。そのようなタンパク質またはポリペプチド試料の例は、ウシ脳下垂体抽出物、植物加水分解物（例えば、コメ加水分解物）、ウシ胎児アルブミン（フェツイン）、タマゴアルブミン、ヒト血清アルブミン（HSA）、または別の動物由来アルブミン、ニワトリ抽出物、ウシ胚抽出物、AlbuMAX（登録商標）I、およびAlbuMAX（登録商標）IIを含むが、それらに限定されない。いくつかの態様では、タンパク質またはペプチドは、トランスフェリンを含む。いくつかの態様では、タンパク質またはペプチドは、フィブロネクチンを含む。いくつかの態様では、タンパク質またはペプチドは、アプロチニンを含む。いくつかの態様では、タンパク質は、フェツインを含む。
【０４１１】
いくつかの態様では、1つまたは複数の追加のタンパク質は、基礎培地に加えられる血清代替サプリメントの一部である。血清代替サプリメントの例は、例えば、Immune Cell Serum Replacement（ThermoFisher、#A2598101）またはSmith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan;4(1):e31に記載されているものを含む。
【０４１２】
ある特定の態様では、細胞は、異種または組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、ウイルスベクターを導入した後、18時間、24時間、30時間、36時間、40時間、48時間、54時間、60時間、72時間、84時間、96時間もしくは96時間超、約18時間、24時間、30時間、36時間、40時間、48時間、54時間、60時間、72時間、84時間、96時間もしくは96時間超、または少なくとも18時間、24時間、30時間、36時間、40時間、48時間、54時間、60時間、72時間、84時間、96時間もしくは96時間超にわたりインキュベートされる。ある特定の態様では、細胞は、異種または組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、ウイルスベクターを導入した後、1日、2日、3日、4日もしくは4日超、約1日、2日、3日、4日もしくは4日超、または少なくとも1日、2日、3日、4日もしくは4日超にわたりインキュベートされる。いくつかの態様では、インキュベートすることは、遺伝子操作の前の30分間〜2時間、1時間〜8時間の間、6時間〜12時間の間、12時間〜18時間の間、16時間〜24時間の間、18時間〜30時間の間、24時間〜48時間の間、24時間〜72時間の間、42時間〜54時間の間、60時間〜120時間の間、96時間〜120時間の間、90時間の間、1日〜7日の間、3日〜8日の間、1日〜3日の間、4日〜6日の間、または4日〜5日の間の時間にわたり実施される。いくつかの態様では、インキュベートすることは、18時間〜30時間または約18時間〜30時間の間である。特定の態様では、インキュベートすることは、24時間もしくは約24時間または1日もしくは約1日である。
【０４１３】
ある特定の態様では、総インキュベーション期間は、12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、42時間、48時間、54時間、60時間、72時間、84時間、96時間、108時間もしくは120時間、約12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、42時間、48時間、54時間、60時間、72時間、84時間、96時間、108時間もしくは120時間、または少なくとも12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、42時間、48時間、54時間、60時間、72時間、84時間、96時間、108時間もしくは120時間である。ある特定の態様では、総インキュベーション期間は、1日、2日、3日、4日もしくは5日、約1日、2日、3日、4日もしくは5日、または少なくとも1日、2日、3日、4日もしくは5日である。特定の態様では、インキュベーションは、120時間、108時間、96時間、84時間、72時間、60時間、54時間、48時間、42時間、36時間、30時間、24時間、18時間もしくは12時間、約120時間、108時間、96時間、84時間、72時間、60時間、54時間、48時間、42時間、36時間、30時間、24時間、18時間もしくは12時間、または120時間、108時間、96時間、84時間、72時間、60時間、54時間、48時間、42時間、36時間、30時間、24時間、18時間もしくは12時間以内に完了する。特定の態様では、インキュベーションは、1日、2日、3日、4日もしくは5日、約1日、2日、3日、4日もしくは5日、または1日、2日、3日、4日もしくは5日以内に完了する。いくつかの態様では、総インキュベーション期間は、12時間〜120時間、18時間〜96時間、24時間〜72時間、もしくは24時間〜48時間、または約12時間〜120時間、18時間〜96時間、24時間〜72時間、もしくは24時間〜48時間（両端の値を含む）である。いくつかの態様では、総インキュベーション期間は、1時間〜48時間、4時間〜36時間、8時間〜30時間、もしくは12時間〜24時間、または約1時間〜48時間、4時間〜36時間、8時間〜30時間、もしくは12時間〜24時間（両端の値を含む）である。特定の態様では、インキュベーションは、それぞれ、24時間、48時間もしくは72時間または約24時間、48時間もしくは72時間、または1日、2日もしくは3日または約1日、2日もしくは3日にわたり実施される。特定の態様では、インキュベーションは、24時間±6時間、48時間±6時間、または72時間±6時間にわたり実施される。特定の態様では、インキュベーションは、72時間もしくは約72時間または3日もしくは約3日にわたり実施される。
【０４１４】
特定の態様では、インキュベーションは、刺激の開始後、12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、42時間、48時間、約12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、42時間、48時間、または少なくとも12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、42時間、48時間の時点で開始される。特定の態様では、インキュベーションは、刺激の開始後、0.5日、1日、1.5日もしくは2日、約0.5日、1日、1.5日もしくは2日、または少なくとも0.5日、1日、1.5日もしくは2日の時点で開始される。特定の態様では、インキュベーションは、刺激の開始の120時間、108時間、96時間、84時間、72時間、60時間、54時間、48時間、42時間、36時間、30時間、24時間、18時間もしくは12時間、約120時間、108時間、96時間、84時間、72時間、60時間、54時間、48時間、42時間、36時間、30時間、24時間、18時間もしくは12時間、または120時間、108時間、96時間、84時間、72時間、60時間、54時間、48時間、42時間、36時間、30時間、24時間、18時間もしくは12時間以内に開始される。特定の態様では、インキュベーションは、刺激の開始の5日、4日、3日、2日、1日もしくは0.5日、約5日、4日、3日、2日、1日もしくは0.5日、または5日、4日、3日、2日、1日もしくは0.5日以内に開始される。
【０４１５】
いくつかの態様では、インキュベーションは、刺激の開始後、24時間〜120時間、36時間〜108時間、48時間〜96時間、もしくは48時間〜72時間、または約24時間〜120時間、36時間〜108時間、48時間〜96時間、もしくは48時間〜72時間（両端の値を含む）に完了する。いくつかの態様では、インキュベーションは、刺激の開始から、120時間、108時間、96時間、72時間、48時間もしくは36時間、約120時間、108時間、96時間、72時間、48時間もしくは36時間、または120時間、108時間、96時間、72時間、48時間もしくは36時間以内に完了する。いくつかの態様では、インキュベーションは、刺激の開始から、5日、4.5日、4日、3日、2日もしくは1.5日、約5日、4.5日、4日、3日、2日もしくは1.5日、または5日、4.5日、4日、3日、2日もしくは1.5日以内に完了する。特定の態様では、インキュベーションは、刺激の開始後、24時間±6時間、48時間±6時間、または72時間±6時間の時間後に完了する。いくつかの態様では、インキュベーションは、72時間後もしくは約72時間後、または3日後もしくは約3日後に完了する。
【０４１６】
いくつかの態様では、インキュベーションは、異種または組換えポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれるのに十分な時間にわたり行われる。特定の態様では、インキュベーションは、少なくとも組み込まれたウイルスコピー数（iVCN）が二倍体ゲノム当たり0.1、0.5、1、2、3、4、5もしくは5超、約0.1、0.5、1、2、3、4、5もしくは5超、または少なくとも0.1、0.5、1、2、3、4、5もしくは5超であるのに十分な時間にわたり実施される。特定の態様では、インキュベーションは、少なくともiVCNが0.5もしくは1、約0.5もしくは1、または少なくとも0.5もしくは1であるのに十分な時間にわたり実施される。特定の態様では、インキュベーションは、異種または組換えポリヌクレオチドがゲノムに安定に組み込まれるのに十分な時間にわたり行われる。特定の態様では、異種または組換えポリヌクレオチドは、二倍体ゲノム当たりのiVCNが、期間、例えば、少なくとも12、24または48時間にわたり、20％、15％、10％、5％、1％または0.1％超変化しないときに安定に組み込まれたと見なされる。特定の態様では、インキュベーションは、安定な組み込みの前に完了する。
【０４１７】
ある特定の態様では、インキュベーションは、少なくとも組み込まれたベクターがゲノム中に検出されるまで実施されるか行われる。いくつかの態様では、インキュベーションは、安定な二倍体ゲノム当たりの組み込まれたベクターコピー数（iVCN）に到達する前に完了する。特定の態様では、インキュベーションは、少なくとも組み込まれたベクターがゲノム中に検出されるまでであるが安定な二倍体ゲノム当たりのiVCNに到達する前に実施されるか行われる。ある特定の態様では、安定な二倍体ゲノム当たりのiVCNは、iVCNがピークに達し、かつ/または一定時間にわたり不変のままであるか、もしくは許容誤差内で不変のままであるときに成し遂げられる。いくつかの態様では、許容誤差は、±40％、±35％、±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％、±2％、±1％もしくは±1％未満、±40％、±35％、±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％、±2％、±1％もしくは±1％未満以内、または約±40％、±35％、±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％、±2％、±1％もしくは±1％未満である。ある特定の態様では、一定時間は、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、16時間、18時間、24時間、36時間、48時間、60時間もしくは72時間、約2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、16時間、18時間、24時間、36時間、48時間、60時間もしくは72時間、または少なくとも2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、16時間、18時間、24時間、36時間、48時間、60時間もしくは72時間である。ある特定の態様では、一定時間は、1日、2日もしくは3日、約1日、2日もしくは3日、または少なくとも1日、2日もしくは3日である。ある特定の態様では、安定な二倍体ゲノム当たりのiVCNは、iVCNがピークに達し、かつ不変のままであるか、または許容誤差内で不変のままであるとき、例えば、24時間もしくは1日、約24時間もしくは1日、または少なくとも24時間もしくは1日である一定時間にわたり±25％であるときに成し遂げられる。いくつかの態様では、安定な二倍体ゲノム当たりのiVCNは、形質転換された細胞の集団の二倍体ゲノム中の総ベクターコピー数（VCN）に対するiVCNの分率が、平均で、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4もしくは1.5、少なくとも0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4もしくは1.5、または約0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4もしくは1.5であるか、あるいは、その許容誤差以内、例えば、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％もしくは±1％であるときに成し遂げられる。ある特定の態様では、安定な二倍体ゲノム当たりのiVCNは、形質転換された細胞の集団の二倍体ゲノム中の総ベクターコピー数（VCN）に対するiVCNの分率が、平均で、0.8もしくは約0.8であるか、またはその許容誤差内であるときに成し遂げられる。いくつかの態様では、安定な二倍体ゲノム当たりのiVCNは、形質転換された細胞の集団の二倍体ゲノム中の総ベクターコピー数（VCN）に対するiVCNの分率が、平均で、1.0もしくは約1.0であるかまたはその許容誤差内であるときに成し遂げられる。
【０４１８】
いくつかの態様では、インキュベーションは、iVCNが二倍体ゲノム当たり5.0、4.0、3.0、2.5、2.0、1.75、1.5、1.25、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3もしくは0.25コピーに達する、約5.0、4.0、3.0、2.5、2.0、1.75、1.5、1.25、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3もしくは0.25コピーに達する、または少なくとも5.0、4.0、3.0、2.5、2.0、1.75、1.5、1.25、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3もしくは0.25コピーに達する前に完了する。ある特定の態様では、インキュベーションは、iVCNが二倍体ゲノム当たり1.0コピーまたは約1.0コピーに達する前に完了する。特定の態様では、インキュベーションは、iVCNが二倍体ゲノム当たり0.5コピーまたは約0.5コピーに達する前に完了する。
【０４１９】
ある特定の態様では、細胞は、1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞集団の細胞倍加、例えば、インキュベートの間に行われる倍加の前に、約1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞集団の細胞倍加、例えば、インキュベートの間に行われる倍加の前に、または少なくとも1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞集団の細胞倍加、例えば、インキュベートの間に行われる倍加の前に採取される。特定の態様では、細胞倍加の量は、異なる時点、例えば、操作プロセスの異なる時間または段階で集団中の生存細胞の数を測定することによって算出され得る。特定の態様では、細胞倍加は、ある時点での生存細胞の総量を、より早い時点で存在する生存細胞の総数と比較することによって算出することができる。ある特定の態様では、インキュベーションは、1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞集団の細胞倍加、例えば、インキュベートの間に行われる倍加の前に、約1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞集団の細胞倍加、例えば、インキュベートの間に行われる倍加の前に、または少なくとも1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞集団の細胞倍加、例えば、インキュベートの間に行われる倍加の前に完了する。ある特定の局面では、細胞倍加は、インキュベーションの開始時およびインキュベーションの完了時の総有核細胞数（TNC）を決定し、次いで、完了時のTNCを開始時のTNCで割った答えの自然対数を決定し、次いで、その答えの自然対数を2の自然対数で割ることによって、算出される。
【０４２０】
いくつかの局面では、例えば、操作プロセスの間の、ある集団において行われる倍加の数は、次式を使用して決定される。
2021533746.tif 000005
【０４２１】
いくつかの局面では、例えば、操作プロセスの間の、ある集団において行われる倍加の数は、次式を使用して決定される。
2021533746.tif 000006
【０４２２】
ある特定の態様では、例えば、操作プロセスの間の、ある集団において行われる倍加の数は、次式を使用して決定される。
2021533746.tif 000007
【０４２３】
様々な態様では、例えば、操作プロセスの間の、ある集団において行われる倍加の数は、次式を使用して決定される。
2021533746.tif 000008
【０４２４】
特定の態様では、例えば、操作プロセスの間の、ある集団において行われる倍加の数は、次式を使用して決定される。
2021533746.tif 000009
【０４２５】
ある特定の態様では、インキュベーションは、総細胞数、例えば、インキュベートされた細胞またはインキュベーションを受けた細胞の総数が、インプット集団の細胞の数、例えば、刺激試薬と接触させた細胞の総数の1、2、3、4、5、6、8、10、20倍もしくは20倍より多くを超える前または約1、2、3、4、5、6、8、10、20倍もしくは20倍より多くを超える前に完了する。様々な態様では、インキュベーションは、インキュベートされた細胞の総数が、形質転換、形質導入またはスピノキュレートされた細胞の総数、例えば、ウイルスベクターと接触させた細胞の総数の1、2、3、4、5、6、8、10、20倍もしくは20倍より多くを超える前または約1、2、3、4、5、6、8、10、20倍もしくは20倍より多くを超える前に完了する。ある特定の態様では、細胞は、T細胞、生存T細胞、CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CARを発現するT細胞、または前記のいずれかの組み合わせである。いくつかの態様では、インキュベーションは、細胞の総数がインプット集団の細胞の総数を超える前に完了する。いくつかの態様では、インキュベーションは、生存CD3+ T細胞の総数がインプット集団の生存CD3+細胞の総数を超える前に完了する。ある特定の態様では、インキュベーションは、細胞の総数が、形質転換、形質導入またはスピノキュレートされた細胞の細胞総数を超える前に完了する。いくつかの態様では、インキュベーションは、生存CD3+ T細胞の総数が、形質転換、形質導入またはスピノキュレートされた細胞の生存CD3+の総数を超える前に完了する。
【０４２６】
いくつかの態様では、細胞集団の総細胞数または総生存細胞数は、インキュベーションの間、類似、同じまたは本質的に同じままである。特定の態様では、細胞集団の総細胞数または総生存細胞数は、インキュベーションの間、変化しない。いくつかの局面では、総細胞数または総生存細胞数は、インキュベーションの間、減少する。特定の局面では、総生存細胞数は、刺激の開始の前、例えば、直前、または刺激の開始時、インプット集団の総細胞数または総生存細胞数の95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％もしくは50％であるか、約95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％もしくは50％であるか、または95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％もしくは50％未満である。
【０４２７】
D. プロセス中の低分子
いくつかの態様では、本明細書において提供されるのは、操作された細胞（例えば、CAR-T細胞）を調節剤の存在下で製造または産生することを含む方法であって、それによって製造または産生された操作された細胞の持続性、消耗の欠如および/または有効性が改善される方法である。いくつかの局面では、提供される方法は、例えば細胞療法において使用するための、（i）より少ない消耗した細胞および/または消耗に関連するマーカーもしくは表現型を呈するより少ない細胞を含有する；（ii）割合が増加したメモリー様T細胞、例えば寿命の長いメモリーT細胞を含有する;（iii）あまり分化していない；（iv）改善されたまたは増強された生存、拡大増殖、持続性および/または抗腫瘍活性を示す；（v）改善された治療有効性を示す；ならびに/あるいは（vi）代替法、例えば、調節剤の存在下で行われない代替法によって産生される操作された細胞の組成物と比較して改善された臨床応答持続期間を示す、組換え受容体を発現するように操作された初代T細胞を含む細胞の組成物を産生する。いくつかの態様では、代替プロセスとの比較は、調節剤の存在下で行われないという点だけが異なる同じプロセスに対してなされる。
【０４２８】
いくつかの態様では、調節剤は、細胞を収集、採取または製剤化する前に、細胞または細胞集団と接触させる（例えば、調節剤は、細胞内にあるかまたは1つもしくは複数の細胞表面分子と相互作用する）。いくつかの態様では、調節剤は、細胞が刺激、例えば、T細胞活性化に供される前、その間またはその後に存在する。いくつかの態様では、調節剤は、刺激、例えば、セクションI-Bなどにおける本明細書に記載される刺激の前またはその間に、細胞または細胞集団と接触させる（例えば、調節剤は、細胞内にあるかまたは1つもしくは複数の細胞表面分子と相互作用する）。いくつかの態様では、調節剤は、細胞が操作、例えば、形質導入に供される前、その間またはその後に存在する。いくつかの態様では、調節剤は、操作、例えば、セクションI-Cなどにおける本明細書に記載される操作の前またはその間に、細胞または細胞集団と接触させる（例えば、調節剤は、細胞内にあるかまたは1つもしくは複数の細胞表面分子と相互作用する）。いくつかの態様では、調節剤は、インキュベーション、例えば、セクションI-C-3などにおける本明細書に記載されるインキュベーションの間またはその後に、細胞または細胞集団と接触させる（例えば、調節剤は、細胞内にあるかまたは1つもしくは複数の細胞表面分子と相互作用する）。いくつかの態様では、調節剤は、刺激（例えば、セクションI-Bなどにおける本明細書に記載される刺激）の間、操作（セクションI-Cなどにおける本明細書に記載される操作）の間、および/またはインキュベーション（例えば、セクションI-C-3などにおける本明細書に記載されるインキュベーション）の間に、細胞または細胞集団と接触させる（例えば、調節剤は、細胞内にあるかまたは1つもしくは複数の細胞表面分子と相互作用する）。ある特定の態様では、細胞または細胞集団は、インキュベーション後であるが細胞を収集、採取または製剤化するための工程の前に、調節剤の存在下でプロセス、手順、工程または技法を受ける。特定の態様では、細胞または細胞集団は、インキュベーション後に、調節剤の存在下でプロセス、手順、工程または技法を受ける。
【０４２９】
いくつかの態様では、操作される（例えば、形質導入される）べき細胞は、操作の前に、調節剤と、例えば、培養培地中で接触させる（例えば、インキュベートさせる）。いくつかの態様では、細胞は、調節剤の存在下で操作される。いくつかの態様では、1つまたは複数の操作される細胞は、調節剤と、例えば、1つまたは複数の組換えサイトカインを含まないかいかなる組換えサイトカインも含まない基礎培地などの培養培地中で接触させる（例えば、インキュベートさせる）。また、いくつかの態様では、操作された細胞の製造または産生の間に、例えば細胞に基づく治療のための、（i）調節剤と（ii）操作されるべき細胞および/または操作に供された細胞（操作された細胞を含む）、例えば初代免疫細胞（例えば、T細胞）とを含む組成物も提供される。
【０４３０】
いくつかの態様では、調節剤は、PI3K阻害剤、Akt経路、mTOR阻害剤、Ras/ERK阻害剤、NF-κΒ阻害剤、BET阻害剤、CDK阻害剤、CRACチャネル阻害剤、Cox阻害剤、ドーパミン拮抗剤、ERK5阻害剤、グルココルチコイド、IGF-1R阻害剤、IKK阻害剤、JAK阻害剤、Lck阻害剤、PDKl阻害剤、Raf阻害剤、およびSyk阻害剤からなる群より選択される。いくつかの態様では、Src阻害剤は、ダサチニブ、サラカチニブ、ボスチニブ、KX01、およびレバスチニブ（DCC-2036）を含むが、それらに限定されない。いくつかの態様では、Src阻害剤は、レバスチニブ（DCC-2036）を含む。本開示の調節剤として有用な特定の作用物質は、WO2019018603、WO2018106595およびPCT/US2018/058812に開示されており、これらの特許は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０４３１】
いくつかの態様では、調節剤は、mTORなどの標的の1つまたは複数の活性を阻害する、低減する、防止するおよび/または阻害する、低減するもしくは防止することが可能である、化合物、低分子、例えば、有機低分子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、siRNAもしくはポリペプチド、またはその断片、アイソフォーム、バリアント、類似体もしくは誘導体であるかそれを含む。特定の態様では、作用物質は、10kD未満、9kD未満、8kD未満、7kD未満、6kD未満、5kD未満、4kD未満、3kD未満、2kD未満、1kD未満、0.5kD未満または0.1kD未満の分子量を有する低分子である。
【０４３２】
いくつかの態様では、調節剤は、mTOR活性を阻害する作用物質であるかそれを含む。いくつかの態様では、操作される（例えば、形質導入される）べき細胞は、操作の前に、mTOR阻害剤と接触させる（例えば、インキュベートさせる）。いくつかの態様では、細胞は、mTOR阻害剤の存在下で操作される。いくつかの態様では、1つまたは複数の操作される細胞は、mTOR阻害剤と、例えば、1つまたは複数の組換えサイトカインを含まないかいかなる組換えサイトカインも含まない基礎培地などの培養培地中で接触させる（例えば、インキュベートさせる）。また、いくつかの態様では、操作された細胞の製造または産生の間に、（i）mTOR阻害剤と（ii）操作されるべき細胞および/または操作に供された細胞（操作された細胞を含む）とを含む組成物も提供される。
【０４３３】
いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORの少なくとも1つの活性を阻害する、低減するおよび/または減少させる、かつ/あるいは、阻害する、低減するおよび/または減少させることが可能である。特定の態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORキナーゼ活性を阻害する、低減するおよび/または減少させる、かつ/あるいは、阻害する、低減するおよび/または減少させることが可能である。いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1活性、例えば、mTORC1キナーゼ活性および/またはmTORC2活性を阻害する、低減するおよび/または減少させる、かつ/あるいは、阻害する、低減するおよび/または減少させることが可能である。いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1複合体の形成を防止するおよび/または前記複合体を不安定化させる。特定の態様では、活性を阻害する作用物質は、mTORC2複合体の形成を防止するおよび/または前記複合体を不安定化させる。
【０４３４】
特定の態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、少なくとも1つの追加のキナーゼの活性を阻害する。ある特定の態様では、少なくとも1つの追加のキナーゼは、PI3Kである。特定の態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、（i）PI3K活性を阻害しない；（ii）mTOR活性のIC50でPI3K活性を検出可能に阻害しない；および/または（iii）mTOR活性を検出可能に阻害するすべての濃度でPI3Kを検出可能に阻害しない。いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1およびmTORC2キナーゼ活性を、PI3K活性と比べて阻害する、例えば、選択的に阻害する。ある特定の態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1およびmTORC2キナーゼ活性を阻害する。特定の態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1活性、例えばmTORC1キナーゼ活性を選択的に阻害する。
【０４３５】
ある特定の態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、（i）mTORC2活性を阻害しない；（ii）mTORC1活性のIC50でmTORC2活性を検出可能に阻害しない；および/または（iii）mTORC1活性を検出可能に阻害するすべての濃度でmTORC2を検出可能に阻害しない。
【０４３６】
いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、CC214-1（Celgene）、CC214-2（Celgene）、CC0470324、GDC0980、SAR245409、VS5584、PI-103、SF1126、BGT226、XL765、PF-04691502、ダクトリシブ（NVP-BEZ235およびBEZ-235とコード名が付けられた）、ピラゾロピリミジン、トリンl（Torin l）、トルキニブ（Torkinib）（PP242）、PP30、Ku-0063794、WAY-600（Wyeth）、WAY-687（Wyeth）、WAY-354（Wyeth）、DS3078a、ラパマイシン（シロリムス）、テムシロリムス（CC1779）、エベロリムス（RAD001）、デフォロリムス（AP23573）、AZD8055（AstraZeneca）、およびOSI-027（OSI）を含むが、それらに限定されない。いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、式（I）、式（II）または式（III）に提供される式を有するかそれを含む。いくつかの態様では、作用物質は、化合物155、化合物246または化合物63である。
【０４３７】
特定の態様では、作用物質は、式（I）
2021533746.tif 000010
［式中、R1は、置換もしくは非置換のC1-8アルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のシクロアルキル、または置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルであり、R2は、置換もしくは非置換のC1-8アルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のシクロアルキル、または置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルであり、R3およびR4は、独立して、HまたはC1-8アルキルである］に示される式を含む。いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、式（I）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であるかそれを含む。いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、式（I）の化合物またはその薬学的に許容される塩であるかそれを含む。いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、2-(3-ヒドロキシフェニル)-9-(2-イソプロピルフェニル)-8-オキソ-8,9-ジヒドロ-7H-プリン-6-カルボキサミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であるかそれを含む。いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、
2021533746.tif 000011
またはその薬学的に許容される塩であるかそれを含む。
【０４３８】
いくつかの態様では、作用物質は、式（II）
2021533746.tif 000012
［式中、Lは、直接の結合、NHまたはOであり、Yは、NまたはCR3であり、式中、R1は、H、置換もしくは非置換のC1-8アルキル、置換もしくは非置換のC2-8アルケニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のシクロアルキルまたは置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルであり、R2は、H、置換もしくは非置換のC1-8アルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のシクロアルキル、または置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルであり、R3は、H、置換もしくは非置換のC1-8アルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、-NHR4または-N(R4)2であり、R4は、出現毎に、独立して、置換もしくは非置換のC1-8 アルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のシクロアルキル、または置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルである］に示される式を含む。いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、式（II）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であるかそれを含む。いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、6-(4-(2H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)フェニル)-1-(2-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)エチル)-1H-イミダゾ[4,5-b]ピラジン-2(3H)-オンまたはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であるかそれを含む。いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、
2021533746.tif 000013
またはその薬学的に許容される塩であるかそれを含む。
【０４３９】
特定の態様では、作用物質は、式（III）
2021533746.tif 000014
［式中、R1は、置換もしくは非置換のC1-8アルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクリル、または置換もしくは非置換のヘテロシクリルアルキルであり、R2は、H、置換もしくは非置換のC1-8 アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクリル、置換もしくは非置換のヘテロシクリルアルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換のシクロアルキルアルキルであり、R3は、H、または置換もしくは非置換のC1-8 アルキルである］に示される式を含む。ある特定の態様では、R1は、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のヘテロアリールである。いくつかの態様では、R1は、置換されているピリジルである。いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、式（III）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であるかそれを含む。いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、式（III）の化合物またはその薬学的に許容される塩であるかそれを含む。いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、7-(6-(2-ヒドロキシプロパン-2-イル)ピリジン-3-イル)-1-((1r,4r)-4-メトキシシクロヘキシル)-3,4-ジヒドロピラジノ[2,3-b]ピラジン-2(1H)-オンまたはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であるかそれを含む。いくつかの態様では、mTOR活性を阻害する作用物質は、
2021533746.tif 000015
またはその薬学的に許容される塩であるかそれを含む。
【０４４０】
当業者に理解されるように、本発明の範囲はまた、標的に基づいてそれぞれのクラスに機能的に分類される他の作用物質すべての類似体または誘導体も含み、その類似体または誘導体は、塩、エステル、エーテル、溶媒和物、水和物、立体異性体またはプロドラッグを含むが、それらに限定されない。
【０４４１】
E. 刺激試薬の除去
いくつかの態様では、刺激試薬は、細胞を収集、採取または製剤化する前に、細胞または細胞集団から除去または分離される。いくつかの態様では、刺激試薬は、インキュベーション、例えば、セクションI-Cなどにおける本明細書に記載されるインキュベーションの後またはその間に、細胞または細胞集団から除去または分離される。ある特定の態様では、細胞または細胞集団は、インキュベーション後であるが細胞を収集、採取または製剤化するための工程の前に、刺激試薬を除去するためのプロセス、手順、工程または技法を受ける。特定の態様では、細胞または細胞集団は、インキュベーション後に、刺激試薬を除去するためのプロセス、手順、工程または技法を受ける。いくつかの局面では、インキュベーションの間に細胞から刺激試薬が分離または除去されると、細胞は、残りのインキュベーション期間、分離または除去の前と同じインキュベーション条件に戻される。
【０４４２】
ある特定の態様では、刺激試薬は、細胞から除去および/または分離される。理論に束縛されるものではないが、特定の態様は、刺激試薬と細胞との間の結合および/または会合が、状況によって、インキュベーションの間に経時的に減少し得ることを想定している。ある特定の態様では、1つまたは複数の作用物質を加えて、刺激試薬と細胞との間の結合および/または会合を減少させてもよい。特定の態様では、細胞培養条件の変化、例えば、作用物質の添加は、刺激試薬と細胞との間の結合および/または会合を減少させ得る。したがって、いくつかの態様では、刺激試薬は、例えば、インキュベーション、細胞培養系および/または溶液から細胞を除去することなく、細胞とは別個にインキュベーション、細胞培養系および/または溶液から除去してもよい。
【０４４３】
ある特定の態様では、刺激試薬は、一定期間後に細胞から分離および/または除去される。特定の態様では、時間は、刺激の開始からの時間である。特定の態様では、インキュベーションの開始は、細胞が刺激試薬および/または刺激試薬を含有する培地もしくは溶液と接触した時点またはほぼその時点であると考えられる。特定の態様では、刺激試薬は、刺激の開始の120時間、108時間、96時間、84時間、72時間、60時間、48時間、36時間、24時間、もしくは12時間以内、または約120時間、108時間、96時間、84時間、72時間、60時間、48時間、36時間、24時間、もしくは12時間以内（各数値を含む）に細胞から除去または分離される。特定の態様では、刺激試薬は、刺激の開始の5日、4日、3日、2日、1日もしくは0.5日以内、または約5日、4日、3日、2日、1日もしくは0.5日以内（各数値を含む）に細胞から除去または分離される。特定の態様では、刺激試薬は、刺激が開始された後、48時間もしくは約48時間または2日もしくは約2日の時点で細胞から除去または分離される。ある特定の態様では、刺激試薬は、刺激が開始された後、72時間もしくは約72時間または3日もしくは約3日の時点で細胞から除去または分離される。いくつかの態様では、刺激試薬は、刺激が開始された後、96時間もしくは約96時間または4日もしくは約4日の時点で細胞から除去または分離される。
【０４４４】
1. ビーズ試薬の除去
ある特定の態様では、ビーズ刺激試薬、例えば、抗CD3/抗CD28抗体コンジュゲート常磁性ビーズは、細胞または細胞集団から分離または除去される。細胞から刺激試薬（例えば、ビーズ粒子または磁化可能粒子などの粒子であるかそれを含有する刺激試薬）を除去するための方法は公知である。いくつかの態様では、例えば、刺激試薬の一次抗体に結合し、細胞上の抗原に対する親和性を変化させる、非標識抗体などの競合する抗体を使用することができ、その使用によって穏やかな分離が可能になる。場合によっては、分離後、競合する抗体は、粒子（例えば、ビーズ粒子）と会合したままであり得る一方で、未反応抗体は洗い流されるか、洗い流され得、細胞は、単離、選択、濃縮および/または活性化抗体を含まない。そのような試薬の例は、DETACaBEAD（Friedl et al. 1995; Entschladen et al. 1997）である。いくつかの態様では、切断可能なリンカー（例えば、DNAリンカー）の存在下で粒子（例えば、ビーズ粒子）を除去することができ、それにより、粒子結合抗体がリンカー（例えば、CELLection、Dynal）にコンジュゲートされる。場合によっては、リンカー領域は、例えば、DNaseまたは他の放出緩衝液の添加によって、単離後に細胞から粒子（例えば、ビーズ粒子）を除去するための切断可能な部位を提供する。いくつかの態様では、細胞からの粒子（例えば、ビーズ粒子）の放出のために、他の酵素的方法を利用することもできる。いくつかの態様では、粒子（例えば、ビーズ粒子または磁化可能粒子）は生分解性である。
【０４４５】
いくつかの態様では、刺激試薬は、磁性、常磁性および/または超常磁性であり、かつ/あるいは、磁性、常磁性および/または超常磁性であるビーズを含有し、刺激試薬は、磁場に細胞を曝露させることによって細胞から除去してもよい。磁場を生成するための磁石を含有する好適な機器の例は、DynaMag CTS（Thermo Fisher）、Magnetic Separator（Takara）およびEasySep Magnet（Stem Cell Technologies）を含む。
【０４４６】
特定の態様では、刺激試薬は、提供される方法の完了の前に、例えば、本明細書において提供される方法によって産生された操作された細胞を採取、収集および/または製剤化する前に、細胞から除去または分離される。いくつかの態様では、刺激試薬は、細胞を操作、例えば、形質導入またはトランスフェクトした後に、細胞から除去および/または分離される。
【０４４７】
いくつかの態様では、刺激ビーズ試薬、例えば、刺激磁気ビーズ試薬は、細胞を収集、採取または製剤化する前に、細胞または細胞集団から除去または分離される。いくつかの態様では、刺激ビーズ試薬、例えば、刺激磁気ビーズ試薬は、インキュベーション、例えば、セクションI-Cなどにおける本明細書に記載されるインキュベーションの間またはその後に磁場に曝露させることによって、細胞または細胞集団から除去または分離される。ある特定の態様では、細胞または細胞集団は、インキュベーション後であるが細胞を収集、採取または製剤化するための工程の前に、刺激ビーズ試薬、例えば、刺激磁気ビーズ試薬を除去するために、磁場に曝露させる。特定の態様では、細胞または細胞集団は、インキュベーション後に、刺激ビーズ試薬、例えば、刺激磁気ビーズ試薬を除去するために、磁場への曝露を受ける。いくつかの局面では、インキュベーションの間に細胞または細胞集団から刺激ビーズ試薬が分離または除去されると、細胞または細胞集団は、残りのインキュベーション期間、磁場への曝露の前と同じインキュベーション条件に戻される。
【０４４８】
特定の態様では、刺激ビーズ試薬、例えば、刺激磁気ビーズ試薬は、例えば、刺激の開始の120時間、108時間、96時間、84時間、72時間、60時間、48時間、36時間、24時間、もしくは12時間以内、または約120時間、108時間、96時間、84時間、72時間、60時間、48時間、36時間、24時間、もしくは12時間以内（各数値を含む）に磁場に曝露させることによって、細胞から除去または分離される。特定の態様では、刺激ビーズ試薬、例えば、刺激磁気ビーズ試薬は、例えば、刺激の開始の5日、4日、3日、2日、1日、もしくは0.5日以内、または約5日、4日、3日、2日、1日、もしくは0.5日以内（各数値を含む）に磁場に曝露させることによって、細胞から除去または分離される。ある特定の態様では、刺激ビーズ試薬、例えば、刺激磁気ビーズ試薬は、例えば、刺激が開始された後72時間もしくは約72時間または3日もしくは約3日の時点で磁場に曝露させることによって、細胞から除去または分離される。ある特定の態様では、刺激ビーズ試薬、例えば、刺激磁気ビーズ試薬は、例えば、刺激が開始された後48時間もしくは約48時間または2日もしくは約2日の時点で磁場に曝露させることによって、細胞から除去または分離される。いくつかの態様では、刺激ビーズ試薬、例えば、刺激磁気ビーズ試薬は、例えば、刺激が開始された後96時間もしくは約96時間または4日もしくは約4日の時点で磁場に曝露させることによって、細胞から除去または分離される。
【０４４９】
2. オリゴマー試薬の除去
いくつかの態様では、インキュベートされたT細胞の集団は、単数または複数の刺激剤のシグナル伝達を破壊する、例えば、減少および/または停止させるためにT細胞に競合剤などの物質を加える本明細書において提供される方法のいずれかに従って、産生または生成された。いくつかの態様では、インキュベートされたT細胞の集団は、競合剤、例えば、ビオチンまたはビオチン類似体、例えば、D-ビオチンなどの物質の存在を含有する。いくつかの態様では、競合剤、例えば、ビオチンまたはビオチン類似体、例えば、D-ビオチンなどの物質は、物質がインキュベーションの間に外因的に加えられなかった培養T細胞の参照集団または調製物中の物質の量よりも少なくとも1.5倍超、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍以上多い量で存在する。いくつかの態様では、培養T細胞の集団中の競合剤、例えば、ビオチンまたはビオチン類似体、例えば、D-ビオチンなどの物質の量は、10μM〜100μM、100μM〜1mM、100μM〜500μMもしくは10μM〜100μM、または約10μM〜100μM、100μM〜1mM、100μM〜500μMもしくは10μM〜100μMである。いくつかの態様では、10μMまたは約10μMのビオチンまたはビオチン類似体、例えば、D-ビオチンを細胞または細胞集団に加えて、細胞または細胞集団からオリゴマー刺激試薬を分離または除去する。
【０４５０】
ある特定の態様では、1つまたは複数の作用物質（例えば、TCRおよび/または共受容体を刺激または活性化する作用物質）は、例えば、オリゴマー試薬上に存在する複数の特定の結合部位（例えば、結合部位Z）を介して、オリゴマー試薬と会合する、例えば可逆的に結合している。場合によっては、この結果として、作用物質が結合するか認識する細胞表面分子（その少なくとも2コピー）を有する標的細胞が作用物質と接触する場合にアビディティー効果が生じることができるように、作用物質が互いに密接に配置される。いくつかの局面では、受容体結合試薬は、結合部位Bで細胞の受容体分子に対して低い親和性を有し、その結果、受容体結合試薬は、競合試薬の存在下で細胞から解離する。したがって、いくつかの態様では、作用物質は、競合試薬の存在下で細胞から除去される。
【０４５１】
いくつかの態様では、オリゴマー刺激試薬は、可逆的に付着した抗CD3 Fabおよび抗CD28 Fabを有するストレプトアビジンムテインオリゴマーである。いくつかの態様では、付着したFabは、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマーへの可逆的付着を可能にするストレプトアビジン結合ドメインを含有する。場合によっては、抗CD3 Fabおよび抗CD28 Fabは、CD3および/またはCD28を発現するT細胞が、可逆的に付着したFabを有するオリゴマー刺激試薬と接触した場合にアビディティー効果が生じることができるように、互いに密接に配置される。いくつかの局面では、Fabは、CD3およびCD28に対して低い親和性を有し、その結果、Fabは、競合試薬、例えば、ビオチンまたはビオチンバリアントもしくは類似体の存在下で細胞から解離する。したがって、いくつかの態様では、Fabは、競合試薬、例えば、D-ビオチンの存在下で細胞から除去または解離される。
【０４５２】
いくつかの態様では、オリゴマー刺激試薬、例えば、オリゴマー刺激ストレプトアビジンムテイン試薬は、細胞を収集、採取または製剤化する前に、細胞または細胞集団から除去または分離される。いくつかの態様では、オリゴマー刺激試薬、例えば、オリゴマー刺激ストレプトアビジンムテイン試薬は、インキュベーション、例えば、セクションI-C-3などにおける本明細書に記載されるインキュベーションの後またはその間に、競合試薬、例えば、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンに接触させるか曝露させることによって、細胞または細胞集団から除去または分離される。ある特定の態様では、細胞または細胞集団は、インキュベーション後であるが細胞を収集、採取または製剤化するための工程の前に、オリゴマー刺激試薬、例えば、オリゴマー刺激ストレプトアビジンムテイン試薬を除去するために、競合試薬、例えば、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンに接触させるか曝露させる。特定の態様では、細胞または細胞集団は、インキュベーション後に、オリゴマー刺激試薬、例えば、オリゴマー刺激ストレプトアビジンムテイン試薬を除去するために、競合試薬、例えば、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンに接触させるか曝露させる。いくつかの局面では、オリゴマー刺激試薬、例えば、オリゴマー刺激ストレプトアビジンムテイン試薬が、例えば、競合試薬、例えば、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンに接触させるか曝露させることによって、インキュベーションの間に細胞から分離または除去されると、細胞は、残りのインキュベーション期間、分離または除去の前と同じインキュベーション条件に戻される。
【０４５３】
いくつかの態様では、細胞は、細胞からオリゴマー刺激試薬を除去または分離するために、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、100μM、500μM、0.01μM、1mMもしくは10mM、約0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、100μM、500μM、0.01μM、1mMもしくは10mM、または少なくとも0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、100μM、500μM、0.01μM、1mMもしくは10mMの競合試薬と接触させる。様々な態様では、細胞は、可逆的に付着した抗CD3 Fabおよび抗CD28 Fabを有する刺激ストレプトアビジンムテインオリゴマーを細胞から除去または分離するために、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、100μM、500μM、0.01μM、1mMもしくは10mM、約0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、100μM、500μM、0.01μM、1mMもしくは10mM、または少なくとも0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、100μM、500μM、0.01μM、1mMもしくは10mMのビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンと接触させる。様々な態様では、細胞は、オリゴマー刺激試薬、例えば、可逆的に付着した抗CD3 Fabおよび抗CD28 Fabを有するストレプトアビジンムテインオリゴマーを細胞から除去または分離するために、100μM〜10mMまたは約100μM〜10mM、例えば、1mMのビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンと接触させる。様々な態様では、細胞は、D-ビオチンへの接触または曝露後2時間、6時間、12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、42時間もしくは48時間、または約2時間、6時間、12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、42時間もしくは48時間にわたり、100μM〜10mMまたは約100μM〜10mM、例えば、1mMのビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンと接触させる。
【０４５４】
特定の態様では、オリゴマー刺激試薬、例えば、オリゴマー刺激ストレプトアビジンムテイン試薬は、刺激の開始の120時間、108時間、96時間、84時間、72時間、60時間、48時間、36時間、24時間、もしくは12時間以内、または約120時間、108時間、96時間、84時間、72時間、60時間、48時間、36時間、24時間、もしくは12時間以内（各数値を含む）に細胞から除去または分離される。特定の態様では、オリゴマー刺激試薬、例えば、オリゴマー刺激ストレプトアビジンムテイン試薬は、刺激の開始の5日、4日、3日、2日、1日、もしくは0.5日以内、または約5日、4日、3日、2日、1日、もしくは0.5日以内（各数値を含む）に細胞から除去または分離される。特定の態様では、オリゴマー刺激試薬、例えば、オリゴマー刺激ストレプトアビジンムテイン試薬は、刺激が開始された後48時間もしくは約48時間または2日もしくは約2日の時点で細胞から除去または分離される。ある特定の態様では、オリゴマー刺激試薬、例えば、オリゴマー刺激ストレプトアビジンムテイン試薬は、刺激が開始された後72時間もしくは約72時間または3日もしくは約3日の時点で細胞から除去または分離される。いくつかの態様では、オリゴマー刺激試薬、例えば、オリゴマー刺激ストレプトアビジンムテイン試薬は、刺激が開始された後96時間もしくは約96時間または4日もしくは約4日の時点で細胞から除去または分離される。
【０４５５】
ある特定の態様では、細胞または細胞集団は、例えば、セクションI-C-3などにおける本明細書に記載されるインキュベーションの間またはその後に、オリゴマー刺激試薬、例えば、オリゴマー刺激ストレプトアビジンムテイン試薬を除去するために、刺激が開始された後48時間もしくは約48時間または2日もしくは約2日の時点で、競合試薬、例えば、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンに接触させるか曝露させる。いくつかの局面では、オリゴマー刺激試薬、例えば、オリゴマー刺激ストレプトアビジンムテイン試薬が、例えば、競合試薬、例えば、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンに接触させるか曝露させることによって、インキュベーションの間に細胞から分離または除去されると、細胞は、残りのインキュベーション期間、分離または除去の前と同じインキュベーション条件に戻される。他の局面では、オリゴマー刺激試薬、例えば、オリゴマー刺激ストレプトアビジンムテイン試薬が、例えば、競合試薬、例えば、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンに接触させるか曝露させることによって、インキュベーション後に細胞から分離または除去されると、細胞はさらに、競合試薬への接触または曝露後2時間、6時間、12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、42時間もしくは48時間または約2時間、6時間、12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、42時間もしくは48時間にわたりインキュベートされる。いくつかの態様では、D-ビオチン処理された形質導入細胞はさらに、D-ビオチン添加後48時間または約48時間にわたりインキュベートされる。
【０４５６】
F. 細胞の採取、収集または製剤化
いくつかの態様では、細胞は、採取または収集される。特定の態様では、細胞は、インキュベーションの完了後に収集または採取される。ある特定の態様では、収集または採取された細胞は、アウトプット集団の細胞である。いくつかの態様では、アウトプット集団は、生存のCD3+、CD4+、CD8+である細胞、および/または、組換え受容体、例えば、CAR+に対して陽性である細胞を含む。特定の態様では、採取されたCD4+ T細胞および製剤化されたCD8+ T細胞は、アウトプットCD4+およびCD8+ T細胞である。特定の態様では、製剤化された細胞集団、例えば、濃縮されたCD4+およびCD8+細胞の製剤化された集団は、アウトプット細胞集団、例えば、濃縮されたCD4+およびCD8+細胞のアウトプット集団である。
【０４５７】
いくつかの態様では、採取、収集または製剤化される細胞または細胞集団は、いかなる拡大増殖も、例えば、インキュベーションまたは培養の間に生存細胞の量を増加させる条件下で細胞がインキュベートまたは培養されるいかなる条件も受けていない。例えば、いくつかの局面では、採取される細胞は、インキュベーションまたは培養の開始時の総生存細胞の数と比較してインキュベーションまたは培養の終了時に総生存細胞の量が増加するいかなるインキュベーションまたは培養も受けていない。いくつかの態様では、採取される細胞は、インキュベーションまたは培養プロセスの開始時と比較してインキュベーションまたは培養プロセスの終了時に生存細胞の総数を増加させる（例えば、拡大増殖させる）ことを明確に目的としたいかなるインキュベーションまたは培養工程も受けていない。いくつかの態様では、細胞は、拡大増殖をもたらす可能性のある条件下でインキュベートまたは培養されるが、インキュベートまたは培養条件は、細胞集団を拡大増殖させる目的で行われない。いくつかの態様では、採取される細胞は、拡大増殖工程を含まないプロセスで製造されたにもかかわらず、拡大増殖を受けている可能性がある。いくつかの態様では、拡大増殖工程を含まない製造プロセスは、非拡大増殖プロセスまたは最小拡大増殖プロセスと称される。「非拡大増殖」プロセスはまた、「最小拡大増殖」プロセスとも称される場合がある。いくつかの態様では、非拡大増殖プロセスまたは最小拡大増殖プロセスは、拡大増殖のための工程を含まないプロセスにもかかわらず、拡大増殖を受けた細胞をもたらす可能性がある。いくつかの態様では、採取される細胞は、細胞集団の拡大増殖を全体として低減、抑制、最小化または排除するように設計された培地組成物を含むインキュベーションまたは培養工程を受けている可能性がある。いくつかの態様では、収集、採取または製剤化される細胞は、バイオリアクター内であるいはインキュベーションまたは培養の全部または一部で細胞が揺動、回転、振盪または還流される条件下で実施される、インキュベーションまたは培養を過去に受けていない。
【０４５８】
いくつかの態様では、細胞の選択、単離、分離、濃縮および/または精製工程は、細胞または細胞集団が採取、収集または製剤化される前に実施される。いくつかの態様では、細胞の選択、単離、分離、濃縮および/または精製工程は、本明細書において開示されるようなクロマトグラフィーを使用して行われる。いくつかの態様では、クロマトグラフィーによるT細胞の選択工程は、T細胞の形質導入後であるが細胞を採取する前、収集する前および/または製剤化する前に実施される。いくつかの態様では、クロマトグラフィーによるT細胞の選択工程は、細胞を採取する直前に実施される。
【０４５９】
ある特定の態様では、刺激の開始から細胞を収集、採取または製剤化するまでの時間は、36時間、42時間、48時間、54時間、60時間、72時間、84時間、96時間、108時間もしくは120時間であるか、約36時間、42時間、48時間、54時間、60時間、72時間、84時間、96時間、108時間もしくは120時間であるか、または36時間、42時間、48時間、54時間、60時間、72時間、84時間、96時間、108時間もしくは120時間未満である。ある特定の態様では、刺激の開始から細胞を収集、採取または製剤化するまでの時間は、1.5日、2日、3日、4日もしくは5日であるか、約1.5日、2日、3日、4日もしくは5日であるか、または1.5日、2日、3日、4日もしくは5日未満である。いくつかの態様では、操作された細胞を生成するための刺激の開始から細胞を収集、採取または製剤化するまでの時間は、36時間〜120時間、48時間〜96時間、もしくは48時間〜72時間、または約36時間〜120時間、48時間〜96時間、もしくは48時間〜72時間（両端の値を含む）、あるいは、1.5日〜5日、2日〜4日、もしくは2日〜3日、または約1.5日〜5日、2日〜4日、もしくは2日〜3日（両端の値を含む）である。特定の態様では、インキュベーションの開始から細胞を採取、収集または製剤化するまでの時間は、48時間、72時間もしくは96時間であるか、約48時間、72時間、もしくは96時間であるか、または48時間、72時間、もしくは96時間未満である。特定の態様では、インキュベーションの開始から細胞を採取、収集または製剤化するまでの時間は、2日、3日もしくは4日であるか、約2日、3日もしくは4日であるか、または2日、3日もしくは4日未満である。特定の態様では、インキュベーションの開始から細胞を採取、収集または製剤化するまでの時間は、48時間±6時間、72時間±6時間、または96時間±6時間である。特定の態様では、インキュベーションの開始から細胞を採取、収集または製剤化するまでの時間は、96時間もしくは4日であるかまたは約96時間もしくは4日である。
【０４６０】
特定の態様では、細胞は、無血清培地、例えば、本明細書のセクションIIまたはPCT/US2018/064627（参照により本明細書に組み入れられる）に記載される無血清培地中に採取、収集または製剤化される。いくつかの態様では、細胞は、例えば、セクションI-C-3の本明細書に記載されるようなインキュベーションの間に使用されるものと同じ無血清培地中に採取、収集または製剤化される。
【０４６１】
特定の態様では、細胞は、1つまたは複数の組換えサイトカインを含有せずかつ血清成分を含有しない、すなわち、無血清培地であるが、セクションII.Bに記載されているような1つまたは複数の追加の成分を含有し得る基礎培地中に採取、収集または製剤化される。特定の態様では、そのような無血清培地の使用は、細胞の維持を提供するが、細胞を活性化するまたは代謝的に活性にすることによって細胞を休止もしくは静止状態であるまたはその可能性が高い状態に促進し得る特定の因子を含まない、希薄培地を提供する。いくつかの局面では、そのような無血清培地の存在下でのインキュベーションは、刺激および遺伝子操作（例えば、形質導入）後に、細胞が回復または休止するのを可能にする。いくつかの局面では、そのような無血清培地の存在下で細胞を採取、収集または製剤化することは、例えば、採取/製剤化された細胞が凍結保存され、次いで、使用直前に融解されたとき、生存率の損失または喪失の影響を受けにくい細胞を含有するアウトプット組成物の形成をもたらす。いくつかの態様では、融解されたときのアウトプット組成物中の細胞は、類似の培地であるがアウトプット組成物の凍結保存時に細胞をより代謝的に活性にし得る1つまたは複数の組換えサイトカイン、血清または他の因子を含有する培地中でインキュベートされた細胞よりも低いレベルのカスパーゼまたは他のアポトーシスマーカーを有する。
【０４６２】
ある特定の態様では、濃縮されたT細胞の1つまたは複数の集団が製剤化される。特定の態様では、濃縮されたT細胞の1つまたは複数の集団が操作および/または培養された後に、その1つまたは複数の集団が製剤化される。特定の態様では、1つまたは複数の集団は、インプット集団である。いくつかの態様では、1つまたは複数のインプット集団は、過去に凍結保護されて貯蔵されており、インキュベーションの前に融解される。
【０４６３】
ある特定の態様では、細胞は、少なくとも組み込まれたベクターがゲノム中に検出されたときに採取または収集される。いくつかの態様では、細胞は、安定な二倍体ゲノム当たりの組み込まれたベクターコピー数（iVCN）の前に採取または収集される。特定の態様では、細胞は、組み込まれたベクターがゲノム中に検出された後であるが安定な二倍体ゲノム当たりのiVCNが成し遂げられる前に採取または収集される。
【０４６４】
いくつかの態様では、細胞は、iVCNが二倍体ゲノム当たり5.0、4.0、3.0、2.5、2.0、1.75、1.5、1.25、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3もしくは0.25コピーに達する、約5.0、4.0、3.0、2.5、2.0、1.75、1.5、1.25、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3もしくは0.25コピーに達する、または少なくとも5.0、4.0、3.0、2.5、2.0、1.75、1.5、1.25、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3もしくは0.25コピーに達する前に採取または収集される。特定の態様では、細胞は、iVCNが二倍体ゲノム当たり1.0コピーまたは約1.0コピーに達する前に採取または収集される。いくつかの態様では、細胞は、iVCNが二倍体ゲノム当たり0.5コピーまたは約0.5コピーに達する前に収集または採取される。
【０４６５】
ある特定の態様では、細胞は、1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞集団の細胞倍加、例えば、インキュベートの間に行われる倍加の前に、約1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞集団の細胞倍加、例えば、インキュベートの間に行われる倍加の前に、または少なくとも1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞集団の細胞倍加、例えば、インキュベートの間に行われる倍加の前に採取される。
【０４６６】
特定の態様では、細胞は、細胞の総数、例えば、インキュベートされた細胞またはインキュベーションを受けた細胞の総数が、インプット集団の細胞の数、例えば、刺激試薬と接触させた細胞の総数の1、2、3、4、5、6、8、10、20倍もしくは20倍より多くを超える前または約1、2、3、4、5、6、8、10、20倍もしくは20倍より多くを超える前の時間に採取または収集される。いくつかの態様では、細胞は、インキュベートされた細胞の総数が、形質転換、形質導入またはスピノキュレートされた細胞の総数、例えば、ウイルスベクターと接触させた細胞の総数の1、2、3、4、5、6、8、10、20倍もしくは20倍より多くを超える前または約1、2、3、4、5、6、8、10、20倍もしくは20倍より多くを超える前の時間に採取または収集される。ある特定の態様では、細胞は、T細胞、生存T細胞、CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CARを発現するT細胞、または前記のいずれかの組み合わせである。特定の態様では、細胞は、細胞の総数がインプット集団の細胞の総数を超える前の時間に採取または収集される。様々な態様では、細胞は、生存CD3+ T細胞の総数がインプット集団の生存CD3+細胞の総数を超える前の時間に採取または収集される。特定の態様では、細胞は、細胞の総数が、形質転換、形質導入またはスピノキュレートされた細胞の細胞総数を超える前の時間に採取または収集される。様々な態様では、細胞は、生存CD3+ T細胞の総数が、形質転換、形質導入またはスピノキュレートされた細胞の生存CD3+細胞の総数を超える前の時間に採取または収集される。様々な態様では、細胞は、生存CD4+細胞およびCD8+細胞の総数が、インプット集団の生存CD4+細胞およびCD8+細胞の総数を超える前の時間に採取または収集される。特定の態様では、細胞は、細胞の総数が、形質転換、形質導入またはスピノキュレートされた細胞の細胞総数を超える前の時間に採取または収集される。様々な態様では、細胞は、生存CD4+細胞およびCD8+細胞の総数が、形質転換、形質導入またはスピノキュレートされた細胞の生存CD4+細胞およびCD8+細胞の総数を超える前の時間に採取または収集される。
【０４６７】
ある特定の態様では、プロセスは、採取または収集する間またはその後に、例えば、フィルター（例えば、40μmのフィルター）を使用して細胞組成物を濾過して、例えば、大きな粒子を除去する工程を含む。ある特定の態様では、濾過の工程は、細胞が採取または収集されている間に実施される。例えば、フィルターは、形質導入後にインキュベートされている細胞とSepax（登録商標）またはSepax 2（登録商標）細胞処理システムなどの採取/収集デバイスとの間で連動し得る。ある特定の態様では、細胞が採取または収集され、次いで、濾過された後、濾過された組成物は任意で洗浄される。ある特定の態様では、細胞が採取または収集され、洗浄されて、洗浄された細胞組成物が濾過される。
【０４６８】
ある特定の態様では、製剤化された細胞は、アウトプット細胞である。いくつかの態様では、濃縮されたT細胞の製剤化された集団は、濃縮されたT細胞のアウトプット集団である。特定の態様では、製剤化されたCD4+ T細胞および製剤化されたCD8+ T細胞は、アウトプットCD4+およびCD8+ T細胞である。特定の態様では、製剤化された細胞集団、例えば、濃縮されたCD4+およびCD8+細胞の製剤化された集団は、アウトプット細胞集団、例えば、濃縮されたCD4+およびCD8+細胞のアウトプット集団である。
【０４６９】
いくつかの態様では、細胞は、バッグまたはバイアルなどの容器内に製剤化することができる。
【０４７０】
いくつかの態様において、細胞は、いくつかの局面では、薬学的に許容される担体または賦形剤を含みうる薬学的に許容される緩衝液中に配合される。いくつかの態様において、処理は、対象への投与のために薬学的に許容されるかまたは望ましい媒体または配合緩衝液への媒体の交換を含む。いくつかの態様において、処理する段階は、形質導入および/または拡大増殖された細胞を洗浄して、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体または賦形剤を含みうる薬学的に許容される緩衝液の中に細胞を置き換える段階を伴うことができる。薬学的に許容される担体または賦形剤を含むそのような薬学的形態の例は、細胞および組成物を対象に投与するために許容される形態に関連して以下に記述される任意のものでありうる。いくつかの態様における薬学的組成物は、疾患または状態を処置または予防するのに有効な量、例えば治療上有効または予防上有効な量の細胞を含有する。
【０４７１】
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒性である、活性成分以外の、薬学的配合物中の成分をいう。薬学的に許容される担体は、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存料を含むが、これらに限定されることはない。
【０４７２】
いくつかの局面において、担体の選択は、一部には特定の細胞によって、および/または投与方法によって決定される。したがって、種々の適当な配合物が存在する。例えば、薬学的組成物は保存料を含みうる。適当な保存料としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムが挙げられうる。いくつかの局面において、2つまたはそれ以上の保存料の混合物が用いられる。保存料またはその混合物は、典型的には全組成物の約0.0001重量％から約2重量％の量で存在する。担体は、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)によって記述されている。薬学的に許容される担体は一般に、用いられる投与量および濃度でレシピエントに無毒性であり、以下のものが含まれるが、これらに限定されることはない: リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤; アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤; 保存料(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノールおよびm-クレゾールなど); 低分子量(約10残基未満)ポリペプチド; 血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質; ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体; グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸; 単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物; EDTAなどのキレート剤; スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖類; ナトリウムなどの塩形成対イオン; 金属錯体(例えばZn-タンパク質錯体); ならびに/またはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン界面活性剤。
【０４７３】
いくつかの局面において緩衝剤が組成物に含まれる。適当な緩衝剤としては、例えばクエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに他のさまざまな酸および塩が挙げられる。いくつかの局面において、2つまたはそれ以上の緩衝剤の混合物が用いられる。緩衝剤またはその混合物は、典型的には全組成物の約0.001重量％〜約4重量％の量で存在する。投与可能な薬学的組成物を調製するための方法は公知である。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)においてより詳細に記述されている。
【０４７４】
配合物は水溶液を含むことができる。配合物または組成物はまた、各活性が互いに悪影響を及ぼさない場合、細胞で処置される特定の適応症、疾患、または状態に有用な2つ以上の活性成分、好ましくは細胞に補完的な活性を有するものを含有しうる。そのような活性成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて適当に存在する。したがって、いくつかの態様において、薬学的組成物は、化学療法剤、例えばアスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、および/またはビンクリスチンのような他の薬学的に活性な作用物質または薬物をさらに含む。
【０４７５】
いくつかの態様において組成物は、いくつかの局面では、選択されたpHに緩衝されうる、滅菌液体調製物、例えば等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液、または粘性組成物として提供される。液体組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール)およびそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒体であることができる。滅菌注射溶液は、適当な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどとの混合物などの溶媒中に細胞を組み込むことによって調製することができる。組成物は、所望される投与経路および製剤に依存して、湿潤剤、分散剤または乳化剤(例えばメチルセルロース)、pH緩衝剤、ゲル化または増粘添加剤、保存料、香味剤、および/または着色剤のような補助物質を含有することができる。いくつかの局面において標準的なテキストを参考にして適当な調製物を調製してもよい。
【０４７６】
抗菌保存料、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝液を含む、組成物の安定性および無菌性を高めるさまざまな添加剤を添加することができる。微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸によって確実にすることができる。注射可能な薬学的形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。
【０４７７】
いくつかの態様において、配合緩衝液は凍結保存料を含有する。いくつかの態様において、細胞は、5％〜20％ DMSO溶液または5％〜10％ DMSO溶液のような、1.0％〜30％ DMSO溶液を含有する凍結保存溶液で配合される。いくつかの態様において、凍結保存溶液は、例えば、20％ DMSOおよび8％ヒト血清アルブミン(HSA)を含有するPBS、または他の適当な細胞凍結培地であるか、またはそれを含有する。いくつかの態様において、凍結保存溶液は、例えば、少なくともまたは約7.5％ DMSOであるか、またはそれを含有する。いくつかの態様において、処理段階は、形質導入および/または拡大増殖された細胞を洗浄して、凍結保存料溶液中の細胞と置き換える段階を伴うことができる。いくつかの態様において、細胞は、12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％もしくは5.0％ DMSOまたは約12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％もしくは5.0％ DMSO、あるいは1％〜15％、6％〜12％、5％〜10％または6％〜8％ DMSOの終濃度を有する培地および/または溶液の中で、凍結、例えば、凍結保護または凍結保存される。特定の態様において、細胞は、例えば、5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％もしくは0.25％ HSAまたは約5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％もしくは0.25％ HSA、あるいは0.1％〜-5％、0.25％〜4％、0.5％〜2％または1％〜2％ HSAの終濃度を有する培地および/または溶液の中で、凍結、例えば、凍結保護または凍結保存される。
【０４７８】
特定の態様において、濃縮されたT細胞、例えば、刺激され、操作され、および/または培養されたT細胞の組成物は、配合され、凍結保護され、その後にある量の時間の間、貯蔵される。ある種の態様において、配合された凍結保護細胞は、細胞が注入のために放出されるまで貯蔵される。特定の態様において、配合された凍結保護細胞は、1日〜6ヶ月、1ヶ月〜3ヶ月、1日〜14日、1日〜7日、3日〜6日、6ヶ月〜12ヶ月、または12ヶ月よりも長い間貯蔵される。いくつかの態様において、細胞は1日、2日、3日、4日、5日、6日もしくは7日間、約1日、2日、3日、4日、5日、6日もしくは7日間、または1日、2日、3日、4日、5日、6日もしくは7日未満の間、凍結保護および貯蔵される。ある種の態様において、貯蔵後に細胞は融解され、対象に投与される。ある種の態様において、細胞は5日間または約5日間貯蔵される。いくつかの態様において、配合された細胞は凍結保護されない。
【０４７９】
いくつかの態様において、配合は、培養細胞または拡大増殖細胞のような、細胞の洗浄、希釈または濃縮を含む1つまたは複数の処理段階を用いて実行される。いくつかの態様において、処理は、所与の用量またはその一部での投与のための細胞の数を含む単位用量形態組成物のような、所望の濃度または数への細胞の希釈または濃度を含むことができる。いくつかの態様において、処理段階は、容量低減を含み、それにより、必要に応じて細胞の濃度を増加させることができる。いくつかの態様において、処理段階は、容量追加を含み、それにより、必要に応じて細胞の濃度を減少させることができる。いくつかの態様において、処理は、形質導入および/または拡大増殖された細胞にある量の配合緩衝液を加えることを含む。いくつかの態様において、配合緩衝液の容量は、少なくとも50 mL、100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、もしくは1000 mL、または少なくとも約50 mL、100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、もしくは1000 mL、または約50 mL、100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、もしくは1000 mL、または50 mL、100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、もしくは1000 mLのような、10 mL〜1000 mLまたは約10 mL〜1000 mLである。
【０４８０】
いくつかの態様において、細胞組成物を配合するためのそのような処理段階は、閉鎖システムで実行される。そのような処理段階の例は、Sepax（登録商標）またはSepax 2（登録商標）細胞処理システムを伴う使用のためのものを含む、Biosafe SAによって製造され販売されている遠心分離チャンバのような、細胞処理システムに関連する1つまたは複数のシステムまたはキットと組み合わせた遠心分離チャンバを用いて実施されうる。例示的なシステムおよび方法は、国際公開WO2016/073602に記述されている。いくつかの態様において、方法は、上述の態様のいずれかにおいて、遠心分離チャンバの内部キャビティからの、薬学的に許容される緩衝液などの配合緩衝液中に配合された細胞の成果組成物である配合化組成物の取り出しを行うことを含む。いくつかの態様において、配合化組成物の取り出しは、閉鎖システムの一部として遠心分離チャンバと機能的に連結されているバッグなどの容器に対するものである。いくつかの態様において、バッグなどの容器は、アウトプットラインまたはアウトプット位置でシステムに接続されている。
【０４８１】
いくつかの態様において、遠心分離チャンバまたは細胞処理システムに関連するものなどの閉鎖システムは、チューブラインの各端部に、ポートと接続された多方向のチューブマニホールドを含む多ポートアウトプットキットを含み、配合化組成物の取り出しのために、ポートに1つまたは複数の容器を接続することができる。いくつかの局面において、所望の数または複数のアウトプット容器、例えばバッグを、少なくとも3、4、5、6、7、8つまたはそれ以上のような、1つまたは複数、一般には2つまたはそれ以上の多ポートアウトプットのポートに、滅菌して接続することができる。例えば、いくつかの態様において、1つまたは複数の容器、例えばバッグをポートに取り付けることができ、または全ポートよりも少ないポートに取り付けることができる。したがって、いくつかの態様において、システムは、アウトプット組成物の複数のアウトプットバッグ内への取り出しを行うことができる。
【０４８２】
いくつかの局面において、単回投与量の投与または複数回投与量の投与などの投与量の投与の量で、細胞は複数のアウトプットバッグの1つまたは複数に取り出されることができる。例えば、いくつかの態様において、アウトプットバッグはそれぞれ、所与の用量またはその分割量で投与するための細胞数を含有しうる。したがって、いくつかの局面において、各バッグは、投与のための単回用量を含んでいても、2つのアウトプットバッグ、または3つのアウトプットバッグのような、複数のアウトプットバッグのうちの2つ以上が、総合して投与のための1用量を構成するように、所望の用量の分割量を含有していてもよい。
【０４８３】
したがって、容器、例えばアウトプットバッグは、一般に、投与される細胞、例えばその1つまたは複数のその単位用量を含む。単位用量は、対象に投与されるべき細胞の量もしくは数、または投与されるべき細胞の数の2倍(もしくはそれ以上)でありうる。それは、対象に投与される細胞の最低の用量または最低可能用量でありうる。
【０４８４】
いくつかの態様において、容器、例えば、バッグの各々は、単位用量の細胞を個別に含む。したがって、いくつかの態様において、各容器は、同じ、またはほぼ同じ、もしくは実質的に同じ数の細胞を含む。いくつかの態様において、各単位用量は、少なくともまたは少なくとも約1×106、2×106、5×106、1×107、5×107、または1×108個の操作された細胞、全細胞、T細胞、またはPBMCを含む。いくつかの態様において、各バッグの配合化細胞組成物の容量は、10 mL〜100 mL、例えば少なくともまたは少なくとも約20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mLもしくは100 mLである。
【０４８５】
いくつかの態様において、この方法によって産生されたそのような細胞、またはそのような細胞を含む組成物は、疾患または状態を処置するために対象に投与される。
【０４８６】
G.  連続選択、平行選択、およびポリッシング
本明細書に提供される方法は、標的細胞集団(例えば、T細胞、CD3+、CD4+、CD8+ T細胞)を単離および/または濃縮するための、例えばカラムクロマトグラフィーによる複数の選択工程を可能にする。いくつかの態様において、1つまたは複数の選択工程は、アウトプット治療用細胞組成物を創出するためのプロセス、例えば、上述のIA〜F項に記述されるようなプロセスの1つもしくは複数時点で、またはその一定の工程の後に行われる。いくつかの態様において、例えばI-A項に記述されるような初期細胞選択の後に行われる選択工程は、ポリッシング工程と呼ばれる。ポリッシング工程は、細胞組成物のさらなる精製、特異的細胞サブタイプの選択(例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、および/またはCD45RO+ T細胞)、死細胞の除去(例えば、生存細胞の選択)、成功裏に操作された細胞(例えば、導入遺伝子(例えば、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受容体(TCR)などを発現している細胞)の選択、または特異的細胞タイプの比、総数、もしくは濃度の調整(例えば、CD4+に対するCD8+細胞、CAR+もしくはTCR+細胞に対するCAR-もしくはTCR-細胞、またはCD4+、CD8+、CAR+、TCR+、および/もしくは生存細胞の総数もしくは濃度)のためを含むが、それに限定されるわけではない様々な目的で行われる場合がある。いくつかの態様において、選択工程(例えば、ポリッシング工程)は、産物制御を増加させるために、および/または患者間の変動を減少させるために有用である。
【０４８７】
いくつかの態様において、選択工程(例えば、初期選択工程および/またはポリッシング工程)は、例えば、細胞組成物をさらに精製すること、特異的細胞サブタイプの選択、生存細胞の選択、操作された細胞の選択、および/または細胞の比、総数、もしくは濃度を調整することのための、複数の選択工程を含む。いくつかの態様において、選択工程(例えば、ポリッシング工程)は、インキュベーション、例えばI-C-3項に記述されるようなインキュベーションの前に行われる。いくつかの態様において、選択工程(例えば、ポリッシング工程)は、収集および回収の前に、例えばI-H項に記述されるような収集および回収の前に行われる。
【０４８８】
いくつかの局面では、そのような方法(例えば、選択工程(例えば、初期選択および/またはポリッシング工程))は、本明細書において提供されるような、サンプルからの複数の異なる細胞集団(例えば、刺激および/または操作された細胞のアウトプット組成物)が濃縮および/または単離される連続選択を用いることによって、閉鎖系の中などの単一のプロセス流れにより達成される。いくつかの局面では、分離または単離を同じ容器または容器セット、例えば、チューブセットの中で実行することは、連続する陽性および陰性選択工程、先行する工程からの陰性および/または陽性の画分をさらなる選択に供する後続の工程を実行することによって達成され、そこでは全プロセスが同じチューブまたはチューブセットの中で行われる。1つの態様において、標的細胞を含有するサンプル(例えば、刺激および/または操作された細胞のアウトプット組成物)は、第1の選択を行ってCD4+またはCD8+集団の一方について濃縮し、第1の選択から選択されなかった細胞を第2の選択のための細胞供給源として使用して、CD4+またはCD8+集団の他方について濃縮する、連続選択に供される。いくつかの態様において、さらなる1つまたは複数の選択を行って、CD4+またはCD8+集団の一方または両方のサブ集団、例えば、セントラルメモリーT(TCM)細胞またはナイーブT細胞について濃縮することができる。いくつかの態様において、1つまたは複数の表面マーカーが陽性の細胞またはそれを高レベル発現している細胞、例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、および/またはCD45RO+ T細胞などのT細胞の特異的サブ集団(例えば、CD3+、CD4+、CD8+細胞)は、選択工程(例えば、初期選択工程および/またはポリッシング工程)の間、陽性または陰性選択技法により選択される。いくつかの態様において、標的細胞を含有する細胞集団(例えば、刺激および/または操作された細胞のアウトプット組成物)は、ポリッシング工程が生存細胞について選択する連続選択に供される。いくつかの態様において、ポリッシング工程は、細胞組成物中の細胞の比または総数を制御または調整することを可能にする。
【０４８９】
1つの態様において、標的細胞を含有するサンプル(例えば、刺激および/または操作された細胞のアウトプット組成物)は、第1の選択がCD3+集団について濃縮するために行われる連続選択に供される。いくつかの態様において、さらなる1つまたは複数の選択を行って、CD3+集団のサブ集団、例えば、CD4+細胞について濃縮することができる。いくつかの態様において、さらなる1つまたは複数の選択を行って、CD3+集団のサブ集団、例えば、CD8+細胞について濃縮することができる。いくつかの態様において、さらなる1つまたは複数の選択を行って、生存細胞について濃縮することができる。いくつかの態様において、さらなる1つまたは複数の選択を行って、CD3+細胞のサブ集団、例えば生存しているCD3+CD4+および/またはCD3+CD8+細胞を濃縮することができる。いくつかの態様において、生存細胞を選択することは、細胞集団(例えば、刺激および/もしくは操作された細胞またはそれらのサブ集団のアウトプット組成物)から死細胞を除去することを含む、またはそれからなる。
【０４９０】
いくつかの態様において、本項に開示される方法(例えば、選択工程(例えば、初期選択工程および/またはポリッシング工程)を、連続選択技法を用いて行う必要はない。いくつかの態様において、本項に開示される方法(例えば、選択工程(例えば、初期選択および/またはポリッシング工程))を、平行選択技法と組み合わされた連続選択技法を用いて行うことができる。いくつかの態様において、選択工程(例えば、初期選択および/またはポリッシング工程)は、連続選択を用いない、または閉鎖系の中もしくは同じチュービングを使用する容器セットの中で行われない連続選択を用いる場合がある。いくつかの態様において、選択工程(例えば、初期選択および/またはポリッシング工程)は、単一の工程で、例えば単一のクロマトグラフィーカラムを使用して達成される。いくつかの態様において、選択工程(例えば、初期選択および/またはポリッシング工程)は、平行選択技法を用いて達成される。例えば、選択工程(例えば、初期選択および/またはポリッシング工程)は、例えば全プロセスが同じチューブまたはチューブセットの中で行われる閉鎖系において、陽性および/または陰性選択工程を同時に実行することによって達成される。いくつかの態様において、標的細胞を含有するサンプル(例えば、刺激および/または操作された細胞のアウトプット組成物)は、サンプル(例えば、刺激および/または操作された細胞のアウトプット組成物)が2つ以上のクロマトグラフィーカラム上にロードされる平行選択に供され、そこで各カラムは細胞集団の選択を行う。いくつかの態様において、2つ以上のクロマトグラフィーカラムは、CD3+、CD4+、またはCD8+集団の選択を個別に行う。いくつかの態様において、2つ以上のクロマトグラフィーカラムは、同じ細胞集団の選択を行う。例えば、2つ以上のクロマトグラフィーカラムは、CD3+細胞の選択を行う場合がある。いくつかの態様において、アフィニティークロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーを含む2つ以上のクロマトグラフィーカラムは、同じ細胞集団の選択を独立して行う。いくつかの態様において、アフィニティークロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーを含む2つ以上のクロマトグラフィーカラムは、異なる細胞集団の選択を独立して行う。いくつかの態様において、さらなる1つまたは複数の選択は、平行選択を介して選択された1つまたは全部の細胞集団のサブ集団について濃縮するように行うことができる。例えば、選択された細胞は、セントラルメモリーT(TCM)細胞またはナイーブT細胞についてさらに選択される場合がある。いくつかの態様において、標的細胞(例えば、CD3+細胞)を含有するサンプル(例えば、刺激および/または操作された細胞のアウトプット組成物)は、平行選択に供され、その際、平行選択はCD4+集団およびCD8+集団について濃縮するために行われる。いくつかの態様において、CD4+およびCD8+集団のサブ集団、例えば、セントラルメモリーT(TCM)細胞またはナイーブT細胞について濃縮するために、さらなる1つまたは複数の選択を行うことができる。いくつかの局面では、1つまたは複数の表面マーカーが陽性またはそれを高レベル発現している細胞、例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、および/またはCD45RO+ T細胞などのT細胞���特定のサブ集団(例えば、CD3+、CD4+、CD8+ T細胞)が陽性または陰性選択技法により選択されることが企図される。いくつかの態様において、標的細胞(例えば、CD3+細胞)を含有するサンプル(例えば、刺激および/または操作された細胞のアウトプット組成物)は、平行選択に供され、その際、平行選択はセントラルメモリーT(TCM)細胞またはナイーブT細胞について濃縮するために行われる。いくつかの態様において、セントラルメモリーT(TCM)細胞またはナイーブT細胞のサブ集団、例えば、CD4+、CD3+、またはCD8+細胞について濃縮するためにさらなる1つまたは複数の選択を行うことができる。いくつかの態様において、さらなる選択は、平行選択が達成された後に連続選択技法を介して行われる。
【０４９１】
いくつかの態様において、選択工程(例えば、初期選択および/またはポリッシング工程)を、本明細書において記述される選択剤により標識されたビーズを使用して行うことができ、第1の選択工程からの陽性および陰性の画分を保持し、続いて第2の選択剤により標識されたビーズを使用することによって、または陽性の画分を上記のようなカラムクロマトグラフィーに供することによって、陽性の画分の陽性選択をさらに行って、第2の選択マーカーについて濃縮することができる。いくつかの態様において、1つまたは複数のポリッシング工程は、本明細書において記述されるカラムクロマトグラフィー、例えばI-A項に記述されるようなクロマトグラフィーおよび/または上記の薬剤および試薬系を含むクロマトグラフィーを用いて行われる。いくつかの態様において、選択工程(例えば、初期選択および/またはポリッシング工程)は、ビーズ分離およびカラムクロマトグラフィーを含む1つまたは複数の方法を用いて達成される。いくつかの態様において、選択工程(例えば、初期選択および/またはポリッシング工程)は、カラムクロマトグラフィーを用いて達成される。
【０４９２】
いくつかの局面では、単一もしくは同じ単離もしくは分離容器もしくは容器セット、例えば単一のカラムもしくはカラムのセット、および/もしくは同じチューブもしくはチューブセットの中に、または同じ分離マトリックスもしくは媒体もしくは試薬、例えば、同じ磁性マトリックス、親和性標識固体支持体、もしくは抗体もしくは他の結合パートナーを使用して、複数の集団を単離することは、単離を合理化する特徴を含み、例えば、コスト、時間、複雑さ、サンプルの取り扱いの必要性、資源、試薬、または設備の使用の低減をもたらす。いくつかの局面では、そのような特徴は、それらが方法に関連するコスト、効率、時間、および/または複雑さを最小限にし、かつ/または細胞産物への潜在的な害、例えば感染、混入、および/もしくは温度変化によって起こる害を回避する点で有利である。本明細書に提供される方法は、複数の選択工程がオンカラム刺激と組み合わせた細胞選択の前または後の両方で標的集団を濃縮することを可能にする。
【０４９３】
本明細書に提供される方法は、成功裏に刺激および操作された細胞の選択および濃縮をさらに可能にする。例えば、いくつかの態様において、上記の連続選択、平行選択、または単一選択手順は、組み換え受容体(例えば、CAR、TCR)を発現している、刺激された細胞を同定するために使用される場合がある。いくつかの態様において、組み換え受容体(例えば、CAR)を発現している細胞は、サブ集団細胞、例えば、CD4+ CAR+ T細胞、CD8+ CAR+ T細胞、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD45RA+、CD45RO+ T細胞、および/または生存細胞についてさらに濃縮する(例えば、ポリッシングする)ことができる。いくつかの態様において、選択工程(例えば、初期選択および/またはポリッシング工程)は、組み換え受容体(例えば、CAR、TCR)を発現している細胞および/またはそのサブ集団の比、濃度、または総数の制御または調整を可能にする。いくつかの態様において、濃縮された(例えば、ポリッシングされた)集団は、細胞療法に使用(例えば、投与)するために配合することができる。
【０４９４】
H.  プロセスおよび/またはアウトプット集団の例示的な特徴
特定の態様において、提供される方法は、1つまたは複数のインプット集団から、例えば単一の生体サンプルから得られ、選択され、または濃縮されたインプット集団から、操作されたT細胞のアウトプット集団を産生または作製するプロセスに関連して使用される。ある種の態様において、アウトプット集団は、組み換え受容体、例えばTCRまたはCARを発現する細胞を含有する。特定の態様において、アウトプット集団の細胞は、治療、例えば自己細胞療法として対象に投与するのに適している。
【０４９５】
特定の態様において、提供される方法は、以下の工程: インプット集団からの細胞を刺激する工程; 刺激された細胞を操作、形質転換、形質導入、またはトランスフェクトして、異種または組み換えポリヌクレオチド、例えば、CARなどの組み換え受容体をコードするポリヌクレオチドを発現または含有させる工程; 細胞をインキュベート、細胞から刺激試薬を除去または分離する工程、ならびに細胞を収集および回収し、それによりいくつかの局面で、操作されたT細胞のアウトプット集団を作製する工程の一部または全部を含むプロセスのような、アウトプット細胞および/または操作されたT細胞のアウトプット集団を作製または産生するための全プロセスに関連して用いられる。
【０４９６】
いくつかの態様において、提供される方法は、以下の工程: 生体サンプルを回収するもしくは得る工程; 生体サンプルからインプット細胞を単離、選択もしくは濃縮する工程; インプット細胞を冷凍凍結および貯蔵し、次いで解凍する工程; 細胞を刺激する工程; 刺激された細胞を遺伝子操作して、組み換えポリヌクレオチド、例えば、CARのような組み換え受容体をコードするポリヌクレオチドを発現または含有させる工程; 培養細胞をアウトプット組成物中に配合する工程; ならびに細胞が対象への注入および/もしくは投与のために配布されるまで、配合されたアウトプット細胞を冷凍凍結および貯蔵する工程の一部または全部を含むプロセスのような、アウトプット細胞および/または濃縮されたT細胞のアウトプット組成物を作製または産生するための全プロセスに関連して用いられる。いくつかの態様において、提供される方法は、細胞が、例えば、インプット集団と比較して少なくとも3、4、5倍、もしくはそれ以上の細胞の量、レベル、または濃度である閾値量まで拡大増殖する条件下で細胞をバイオリアクター中で培養することなどによって、プロセス中の細胞数を拡大増殖または増加させるための工程を含まない。いくつかの態様において、細胞を遺伝子操作することは、例えば、ウイルス粒子の存在下で細胞をスピノキュレートし、次いでウイルス粒子の存在下の静的条件下で細胞をインキュベートすることによって、細胞にウイルスベクターを形質導入するための工程であるか、またはそれを含む。
【０４９７】
ある種の態様において、刺激の開始から細胞を回収、収集、または配合することまでの、操作された細胞を作製するための提供されるプロセスの総持続時間は、36時間、42時間、48時間、54時間、60時間、72時間、84時間、96時間、108時間、もしくは120時間であるか、約36時間、約42時間、約48時間、約54時間、約60時間、約72時間、約84時間、約96時間、約108時間、もしくは約120時間であるか、または36時間未満、42時間未満、48時間未満、54時間未満、60時間未満、72時間未満、84時間未満、96時間未満、108時間未満、もしくは120時間未満である。ある種の態様において、刺激の開始から細胞を回収、収集、または配合することまでの、操作された細胞を作製するための提供されるプロセスの総持続時間は、1.5日、2日、3日、4日、もしくは5日であるか、約1.5日、約2日、約3日、約4日、もしくは約5日であるか、または1.5日未満、2日未満、3日未満、4日未満、もしくは5日未満である。いくつかの態様において、刺激の開始から細胞を回収、収集、または配合することまでの、操作された細胞を作製するための提供されるプロセスの総持続時間は、36時間〜120時間もしくは約36時間〜約120時間、48時間〜96時間もしくは約48時間〜約96時間、または48時間〜72時間もしくは約48時間〜約72時間（両端の値を含む）、または、1.5日〜5日もしくは約1.5日〜約5日、2日〜4日もしくは約2日〜約4日、または2日〜3日もしくは約2日〜約3日（両端の値を含む）である。特定の態様において、インキュベーションの開始から細胞の回収、収集、または配合まで測定される場合の、提供されるプロセスを完了するための時間量は、48時間、72時間、もしくは96時間であるか、約48時間、約72時間、もしくは約96時間であるか、または48時間未満、72時間未満、もしくは96時間未満であるか、または2日、3日、もしくは4日であるか、約2日、約3日、もしくは約4日であるか、または2日未満、3日未満、もしくは4日未満である。特定の態様において、インキュベーションの開始から細胞の収集、回収、または配合まで測定される場合の、提供されるプロセスを完了するための時間量は、48時間±6時間、72時間±6時間、または96時間±6時間である。
【０４９８】
いくつかの態様において、例えばI-C-3項に開示されるように、インキュベーションは、刺激の開始後、24時間〜120時間もしくは約24時間〜約120時間、36時間〜108時間もしくは約36時間〜約108時間、48時間〜96時間もしくは約48時間〜約96時間、または48時間〜72時間もしくは約48時間〜約72時間（両端の値を含む）で完了される。いくつかの態様において、インキュベーションは、刺激の開始から120時間、約120時間、もしくは120時間以内、108時間、約108時間、もしくは108時間以内、96時間、約96時間、もしくは96時間以内、72時間、約72時間、もしくは72時間以内、48時間、約48時間、もしくは48時間以内、または36時間、約36時間、もしくは36時間以内で完了される。特定の態様において、インキュベーションは、24時間±6時間後、48時間±6時間後、または72時間±6時間後で完了される。いくつかの態様において、インキュベーションは、刺激の開始後、1日〜5日もしくは約1日〜約5日、1.5日〜4.5日もしくは約1.5日〜約4.5日、2日〜4日もしくは約2日〜約4日、または2日〜3日もしくは約2日〜約3日（両端の値を含む）で完了される。いくつかの態様において、インキュベーションは、刺激の開始から5日、約5日、もしくは5日以内、4日、約4日、もしくは4日以内、3日、約3日、もしくは3日以内、2日、約2日、もしくは2日以内、または1.5日、約1.5日、もしくは1.5日以内で完了される。
【０４９９】
いくつかの態様において、全プロセスは、濃縮されたT細胞、例えば、CD4+およびCD8+ T細胞の単一の集団を用いて行われる。ある種の態様において、プロセスは、濃縮されたT細胞(例えば、CD4およびCD8細胞)の2つ以上のインプット集団を用いて行われ、これらのインプット集団は、濃縮されたT細胞の単一のアウトプット集団を作製または産生するために、プロセス前および/またはプロセス中に組み合わされる。いくつかの態様において、濃縮されたT細胞は、操作されたT細胞、例えば、組み換え受容体を発現するように形質導入されたT細胞であるか、またはそれを含む。
【０５００】
いくつかの態様において、アウトプット集団、例えば、操作されたT細胞の集団は、(i)T細胞のインプット集団またはT細胞を含有するインプット集団を、刺激条件下で、18時間〜30時間または約18時間〜約30時間（両端の値を含む）インキュベートすること、(ii)組み換え受容体をコードする異種または組み換えポリヌクレオチドを、刺激された集団のT細胞内に導入すること、(iii)細胞をインキュベートすること、および次いで、(iv)インキュベートされた細胞を回収または収集することによって作製される。
【０５０１】
いくつかの態様において、細胞は、刺激条件下のインキュベーションを開始した後36時間〜108時間以内または1.5日〜4.5日以内に回収または収集される。特定の態様において、細胞は、形質転換された(例えば、遺伝子操作された、形質導入された、またはトランスフェクトされた)T細胞が、24〜48時間または1〜2日のスパン内で20％よりも大きく増加も減少もしない、ゲノムあたりの安定な組み込み型ベクターのコピー数(iVCN)を達成した後、48時間または2日内に回収または収集される。いくつかの態様において、細胞集団の測定されたiVCNが、該集団において測定された総ベクターコピー数(VCN)の20％、15％、10％、もしくは5％以内、または約20％、約15％、約10％、もしくは約5％以内である場合に、組み込みは安定と見なされる。特定の態様は、安定な組み込みを達成するために、ウイルスベクターが細胞と接触または細胞に導入された後、細胞を48時間、60時間、72時間、1日、2日、もしくは3日間、約48時間、約60時間、約72時間、約1日、約2日、もしくは約3日間、または少なくとも48時間、少なくとも60時間、少なくとも72時間、少なくとも1日、少なくとも2日、もしくは少なくとも3日間インキュベートしなければならないことを企図している。いくつかの態様において、安定な組み込みは、インキュベーションの72時間以内または約72時間で行われる。いくつかの態様において、細胞は、形質転換されたT細胞の総数がインプット集団の細胞の総数またはそれ未満である時点で回収または収集される。様々な態様において、細胞は、インプット集団の細胞が3、2、または1回を超えて倍加する前の時点で回収または収集される。
【０５０２】
ある種の態様において、アウトプット集団、例えば、操作されたT細胞の集団は、(i)T細胞を含むインプット集団を、刺激試薬、例えば、本明細書に、例えばI-B-1項に、記述される刺激試薬の存在下の刺激条件下で、18〜30時間（両端の値を含む）インキュベートすること、(ii)例えば、刺激されたT細胞をウイルスベクターの存在下でスピノキュレートすることによって、刺激されたT細胞に組み換え受容体をコードするウイルスベクターを形質導入すること、(iii)形質導入されたT細胞を静的条件下で、18時間〜96時間または18時間〜96時間（両端の値を含む）インキュベートすること、および(iv)形質転換された集団のT細胞を、刺激条件下のインキュベーションが開始された後36時間〜108時間または約36時間〜約108時間内に収集することによって作製される。
【０５０３】
いくつかの態様において、提供される方法に関連したプロセスは、代替プロセスと比較される。例えば、いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、細胞を拡大増殖させるための工程を含む代替プロセスと比較される。特定の態様において、代替プロセスは、1つまたは複数の特定の局面では異なり得るが、その他の点で、提供される方法に関連するプロセスと類似または同一の特徴、局面、工程、段階、試薬および/または条件を含む。いくつかの態様において、代替プロセスは、提供される方法に関連するプロセスに類似し、例えば、拡大増殖を欠如するまたは拡大増殖を含まないが、非限定的に以下のうちの1つまたは複数を含む具合が異なる: 異なる試薬および/もしくは培地配合; インキュベーション、形質導入、トランスフェクション、および/もしくは培養中の血清の存在; インプット集団の異なる細胞構成、例えば、CD4+とCD8+ T細胞の比; 異なる刺激条件および/もしくは異なる刺激試薬; 刺激試薬と細胞の異なる比; 異なるベクターおよび/もしくは形質導入方法; 細胞をインキュベート、形質導入、および/もしくはトランスフェクトするための異なるタイミングもしくは順序; インキュベーションもしくは形質導入中に存在する1つもしくは複数の組み換えサイトカインの欠如もしくは差異(例えば、異なるサイトカインもしくは異なる濃度)、または細胞を収集もしくは回収するための異なるタイミング。
【０５０４】
いくつかの態様において、生体サンプルからのインプット細胞(例えば、CD4+またはCD8+ T細胞)の単離、濃縮、および/または選択から、アウトプット細胞が回収、配合、および/または凍結保護される時間まで測定される場合の、提供されるプロセスを完了するために必要な持続時間または時間量は、48時間、72時間、96時間、120時間、2日、3日、4日、5日、7日、もしくは10日、約48時間、約72時間、約96時間、約120時間、約2日、約3日、約4日、約5日、約7日、もしくは約10日、または48時間未満、72時間未満、96時間未満、120時間未満、2日未満、3日未満、4日未満、5日未満、7日未満、もしくは10日未満である。いくつかの態様において、単離、選択、または濃縮された細胞は、刺激の前に凍結保護されず、かつインプット細胞の単離、濃縮、および/または選択から(アウトプット細胞が回収、配合、および/または凍結保護される時間まで測定される場合の、提供されるプロセスを完了するために必要な持続時間または時間量は、48時間、72時間、96時間、120時間、2日、3日、4日、もしくは5日、または約48時間、約72時間、約96時間、約120時間、約2日、約3日、約4日、もしくは約5日、または48時間未満、72時間未満、96時間未満、120時間未満、2日未満、3日未満、4日未満、もしくは5日未満である。
【０５０５】
ある種の態様において、提供されるプロセスは、生体サンプルから単離、濃縮、または選択された細胞の集団、例えば、CD4+およびCD8+ T細胞に対して行われる。いくつかの局面では、提供される方法は、生体サンプルが対象から回収されたときから、他の方法またはプロセスと比較して短い時間量内で、操作されたT細胞の組成物を産生または作製することができる。いくつかの態様において、提供される方法は、生体サンプル、または濃縮、単離、もしくは選択された細胞が刺激または形質導入のための工程の前に凍結保存および貯蔵される、任意または全部の時間を含めて、生体サンプルが対象から回収されたときから、操作されたT細胞が回収、収集、または配合されるとき(例えば、凍結保存または投与のため)まで、10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日、2日以内、もしくは約10日、約9日、約8日、約7日、約6日、約5日、約4日、約3日、約2日以内、または120時間、96時間、72時間、もしくは48時間以内もしくは約120時間、約96時間、約72時間、もしくは約48時間以内で、操作されたT細胞を産生または作製することができる。特定の態様において、提供される方法は、生体サンプル、または濃縮、単離、もしくは選択された細胞が刺激または形質導入のための工程の前に凍結保存および貯蔵される、任意または全部の時間を含めて、生体サンプルが対象から回収されたときから、操作されたT細胞が回収、収集、または配合されるときまで、6日〜8日または約6日〜8日以内で（両端の値を含む）、操作されたT細胞を産生または作製することができる。
【０５０６】
ある種の態様において、提供される方法は、アウトプット細胞および/または濃縮T細胞のアウトプット集団を作製または産生するためのプロセスに関連して用いられる。特定の態様において、アウトプット細胞および/または濃縮T細胞のアウトプット集団は、血液サンプルもしくは白血球アフェレーシスサンプルのような、生体サンプルから回収され、得られ、単離され、選択され、および/もしくは濃縮され; 刺激条件の下でインキュベートされ; 組み換えポリヌクレオチド、例えば、CARのような組み換え受容体をコードするポリヌクレオチドを発現もしくは含有するように、操作され、例えば、形質導入され; 閾値量、密度もしくは拡大増殖まで培養され; ならびに/または配合された細胞であるか、またはそれらを含む。いくつかの態様において、アウトプット集団は、例えば、プロセスの1つまたは複数の工程の間、前、および/または後に、あらかじめ凍結保護および解凍されている。いくつかの態様において、アウトプット集団は、組み換え受容体、例えば、CARを発現するT細胞、例えば、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含有する。
【０５０７】
いくつかの態様において、アウトプット集団の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％は、組み換え受容体を発現する。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくとも50％は、組み換え受容体を発現する。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％は、組み換え受容体を発現する。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくとも50％は、組み換え受容体を発現する。特定の態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも99％、または99％超は、組み換え受容体を発現する。特定の態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞の少なくとも50％は、組み換え受容体を発現する。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD8+ T細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも99％、または99％超は、組み換え受容体を発現する。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD8+ T細胞の少なくとも50％は、組み換え受容体を発現する。
【０５０８】
特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、代替プロセス、例えば、細胞を拡大増殖する1つまたは複数の工程を含むプロセスによって産生されるアウトプット細胞と比較して、組み換え受容体によって結合および/または認識される抗原を発現している細胞(例えば、標的細胞)に対して改善された細胞溶解活性を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞が抗原を発現する細胞、例えば、標的細胞に曝露された場合、アウトプット組成物の細胞は、抗原を発現する細胞の25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、もしくは100％を死滅させるか、約25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、もしくは100％を死滅させるか、または少なくとも25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、もしくは100％を死滅させる。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、類似のまたは同じ条件の下で代替プロセスによって産生されたアウトプット細胞よりも、抗原を発現する細胞、例えば標的細胞の少なくとも25％、50％、75％、100％、150％、または1倍、2倍、3倍、4倍もしくは5倍高い量を死滅させる。
【０５０９】
特定の態様において、アウトプット集団の細胞は、代替プロセス、例えば、細胞を拡大増殖する1つまたは複数の工程を含むプロセスによって産生されるアウトプット細胞と比較して、改善されたインビボ抗腫瘍活性を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞が対象、例えば、腫瘍またはがんを有する対象に投与された場合、アウトプット集団の細胞は、対象における腫瘍細胞、例えば、抗原を発現しているがん細胞または腫瘍細胞の25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、もしくは100％を死滅させるか、約25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、もしくは100％を死滅させるか、または少なくとも25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、もしくは100％を死滅させる。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、類似のまたは同じ条件の下で代替プロセスによって産生されたアウトプット細胞よりも、腫瘍細胞の少なくとも25％、50％、75％、100％、150％、または1倍、2倍、3倍、4倍、もしくは5倍高い量をインビボで死滅させる。
【０５１０】
特定の態様において、アウトプット集団の細胞の大部分は、ナイーブ様細胞、セントラルメモリー細胞、および/またはエフェクターメモリー細胞である。特定の態様において、アウトプット集団の細胞の大部分は、ナイーブ様細胞またはセントラルメモリー細胞である。いくつかの態様において、アウトプット集団の細胞の大部分は、CCR7またはCD27発現のうちの1つまたは複数について陽性である。ある種の態様において、アウトプット集団の細胞は、代替プロセス、例えば、拡大増殖を含むプロセスから作製されたアウトプット集団よりもナイーブ様またはセントラルメモリー細胞の部分が大きい。
【０５１１】
ある種の態様において、アウトプット集団の細胞は、消耗したおよび/または老化した細胞の部分および/または頻度が低い。特定の態様において、アウトプット集団の細胞は、消耗したおよび/または老化した細胞の部分および/または頻度が低い。いくつかの態様において、アウトプット集団の細胞の40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、または1％未満が消耗および/または老化している。ある種の態様において、アウトプット集団の細胞の25％未満が消耗および/または老化している。ある種の態様において、アウトプット集団の細胞の10％未満が消耗および/または老化している。特定の態様において、細胞は、低い部分を有する。
【０５１２】
いくつかの態様において、アウトプット集団の細胞は、CD27およびCCR7の発現、例えば表面発現について陰性である細胞の部分および/または頻度が低い。特定の態様において、アウトプット集団の細胞は、CD27-CCR7-細胞の部分および/または頻度が低い。いくつかの態様において、アウトプット集団の細胞の40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、または1％未満がCD27-CCR7-細胞である。ある種の態様において、アウトプット集団の細胞の25％未満がCD27-CCR7-細胞である。ある種の態様において、アウトプット集団の細胞の10％未満がCD27-CCR7-細胞である。態様において、アウトプット集団の細胞の5％未満がCD27-CCR7-細胞である。
【０５１３】
いくつかの態様において、アウトプット集団の細胞は、CD27およびCCR7の一方または両方の発現、例えば表面発現について陽性である細胞の部分および/または頻度が高い。いくつかの態様において、アウトプット集団の細胞は、CD27およびCCR7の一方または両方の発現について陽性である細胞の部分および/または頻度が高い。いくつかの態様において、アウトプット集団の細胞の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％超は、CD27およびCCR7の一方または両方について陽性である。様々な態様において、アウトプット集団のCD4+ CAR+細胞の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超は、CD27およびCCR7の一方または両方について陽性である。いくつかの態様において、アウトプット集団のCD8+ CAR+細胞の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超は、CD27およびCCR7の一方または両方について陽性である。
【０５１４】
ある種の態様において、アウトプット集団の細胞は、CD27およびCCR7の発現、例えば、表面発現について陽性である細胞の部分および/または頻度が高い。いくつかの態様において、アウトプット集団の細胞は、CD27+ CCR7+細胞の部分および/または頻度が高い。いくつかの態様において、アウトプット集団の細胞の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％超は、CD27+ CCR7+細胞である。様々な態様において、アウトプット集団のCD4+ CAR+細胞の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超はCD27+ CCR7+細胞である。いくつかの態様において、アウトプット集団のCD8+ CAR+細胞の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超はCD27+ CCR7+細胞である。
【０５１５】
ある種の態様において、アウトプット集団の細胞は、CCR7について陰性であり、CD45RAの発現、例えば、表面発現について陽性である細胞の部分および/または頻度が低い。いくつかの態様において、アウトプット集団の細胞は、CCR7-CD45RA+細胞の部分および/または頻度が低い。特定の態様において、アウトプット集団の細胞の40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、または1％未満はCCR7-CD45RA+細胞である。いくつかの態様において、アウトプット集団の細胞の25％未満はCCR7-CD45RA+細胞である。特定の態様において、アウトプット集団の細胞の10％未満はCCR7-CD45RA+細胞である。ある種の態様において、アウトプット集団の細胞の5％未満はCCR7-CD45RA+細胞である。
【０５１６】
特定の態様において、細胞集団の1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞倍加、例えば、インキュベートする間に生じる倍加の前に、約1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞倍加、例えば、インキュベートする間に生じる倍加の前に、または少なくとも1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞倍加、例えば、インキュベートする間に生じる倍加の前に、細胞が収集される。ある種の態様において、集団の任意の倍加、例えば、インキュベーションの間に行われる倍加の前に、細胞が収集される。いくつかの局面では、操作プロセス中に行われる場合がある倍加を低減することは、いくつかの態様において、ナイーブ様である操作されたT細胞の部分を増加させるであろう。いくつかの態様において、操作プロセス中の倍加を増加させることで、操作プロセス中に行われる場合があるT細胞の分化が増加する。
【０５１７】
いくつかの局面では、操作された細胞組成物を作製または産生するためのプロセスの場合、プロセス中に、例えば、インキュベーション中に行われる拡大増殖または細胞倍加を低減させることで、得られる操作された細胞組成物のナイーブ様T細胞の量または部分が増加することが企図される。特定の局面において、プロセス中に行われる拡大増殖または細胞倍加を増加させることで、得られる操作された細胞組成物の分化したT細胞の量または部分が増加する。いくつかの局面では、得られる操作された細胞組成物中のナイーブ様細胞の部分を増大または拡大する、本明細書において提供されるプロセスのようなプロセスが、操作された細胞組成物の効力、有効性、および持続性を、例えば投与後にインビボで、増加させ得ることが企図される。
【０５１８】
1.  刺激性ビーズ試薬を使用するプロセス
いくつかの態様において、アウトプット集団、例えば、操作されたT細胞の集団は: (i)T細胞のインプット集団またはT細胞を含有するインプット集団を、ビーズを含有する刺激試薬、例えば、I-B-1-a項などの本明細書において記述されるビーズに基づく刺激試薬と共に、18〜30時間または約18〜約30時間（両端の値を含む）インキュベートすること、(ii)組み換え受容体をコードする異種または組み換えポリヌクレオチドを、刺激された集団のT細胞内に導入すること、(iii)細胞を静的条件下でインキュベートすること、(iv)細胞から常磁性ビーズ試薬を除去または分離すること、および(v)インキュベートされた細胞を回収または収集すること、を含む工程によって作製される。
【０５１９】
ある種の態様において、アウトプット集団、例えば、操作されたT細胞の集団は、(i)T細胞を含むインプット集団を、抗CD3/抗CD28抗体とコンジュゲートされた常磁性ビーズの存在下で、18〜30時間（両端の値を含む）、刺激条件下でインキュベートすること、(ii)刺激されたT細胞に、組み換え受容体をコードするウイルスベクターを、例えば、ウイルスベクターの存在下で刺激されたT細胞をスピノキュレートすることによって、形質導入すること、(iii)形質導入されたT細胞を静的条件下で、42時間〜84時間または約42時間〜約84時間（両端の値を含む）インキュベートすること、および(iv)T細胞を収集または回収すること、によって作製される。
【０５２０】
いくつかの態様において、操作された細胞の集団を産生するための提供される方法は、T細胞のインプット集団を、組み換えIL-2、Il-7、およびIL-15を含有する培地中で、抗CD3および抗CD28抗体とコンジュゲートされた常磁性ビーズの存在下で、1:1の比のビーズ:細胞で、18〜30時間（両端の値を含む）刺激すること; 最初にウイルスベクターの存在下で細胞を693gの力で30分間スピノキュレートし、次いで、スピノキュレートされた細胞をウイルスベクターと共に、48時間〜96時間（両端の値を含む）インキュベートすることによって、組み換え受容体をコードするウイルスベクターを細胞に形質導入すること; 細胞を磁石に曝露して、細胞から抗CD3および抗CD28抗体とコンジュゲートされた常磁性ビーズを除去または分離すること; ならびに細胞を回収または収集すること、のうちの1つまたは複数を含む。
【０５２１】
いくつかの態様において、細胞は、刺激の開始から、54時間〜120時間または約54時間〜約120時間（両端の値を含む）で収集または回収される。様々な態様において、細胞は、刺激の開始後、60時間〜108時間または72時間〜96時間（両端の値を含む）で収集または回収される。特定の態様において、抗CD3および抗CD28抗体とコンジュゲートされた常磁性ビーズは、刺激の開始後、60時間〜108時間または72時間〜96時間（両端の値を含む）で細胞から除去または分離される。
【０５２２】
いくつかの態様において、抗CD3および抗CD28抗体とコンジュゲートされた常磁性ビーズは、刺激の開始から48時間後または約48時間後に、例えば、48時間±6時間後に細胞から除去または分離される。いくつかの態様において、抗CD3および抗CD28抗体とコンジュゲートされた常磁性ビーズは、刺激の開始から72時間後または約72時間後に、例えば、72時間±6時間後に細胞から除去または分離される。特定の態様において、抗CD3および抗CD28抗体とコンジュゲートされた常磁性ビーズは、刺激の開始から96時間後または約96時間後に、例えば、96時間±6時間後に細胞から除去または分離される。いくつかの態様において、抗CD3および抗CD28抗体とコンジュゲートされた常磁性ビーズは、インキュベーション中に細胞から除去または分離され、細胞は、磁場への曝露後にインキュベーションに戻される。特定の態様において、抗CD3および抗CD28抗体とコンジュゲートされた常磁性ビーズは、インキュベーションの後に細胞から除去または分離され、細胞は、磁場への曝露後に回収または収集される。
【０５２３】
2.  オリゴマー刺激試薬に基づくプロトコル
いくつかの態様において、アウトプット集団、例えば、操作されたT細胞の集団は: T細胞のインプット集団またはT細胞を含有するインプット集団を、オリゴマー刺激粒子試薬、例えば、I-B-1-b項などの本明細書において記述されるオリゴマーに基づく刺激試薬と共に、18〜30時間または約18〜約30時間（両端の値を含む）インキュベートすること; 組み換え受容体をコードする異種または組み換えポリヌクレオチドを、刺激された集団のT細胞内に導入すること、(iii)細胞を静的条件下でインキュベートすること、(iv)競合試薬を添加することによって細胞から刺激試薬を除去または分離すること、および(v)インキュベートされた細胞を回収または収集すること、を含む工程によって作製される。
【０５２４】
ある種の態様において、アウトプット集団、例えば、操作されたT細胞の集団は: T細胞を含むインプット集団を、抗CD3/抗CD28 Fabが可逆的に結合したストレプトアビジンムテインオリゴマーの存在下で、刺激条件下で、18〜30時間（両端の値を含む）インキュベートすること; 例えばウイルスベクターの存在下で刺激されたT細胞をスピノキュレートすることによって、刺激されたT細胞に組み換え受容体をコードするウイルスベクターを形質導入し、次いで、形質導入されたT細胞を、静的条件下で42時間〜84時間または約42時間〜約84時間（両端の値を含む）インキュベートすること; およびT細胞を収集または回収すること、を含む工程によって作製される。
【０５２５】
いくつかの態様において、操作された細胞の集団を産生するための提供される方法は、組み換えIL-2、IL-7、およびIL-15を含有する無血清培地中、T細胞のインプット集団を、細胞106個当たり0.4μg〜8μgまたは約0.4μg〜約8μg（両端の値を含む）の、例えば細胞106個当たり1.2μgの量の、抗CD3/抗CD28 Fabが可逆的に結合したオリゴマー性ストレプトアビジンムテインの存在下で、18〜30時間（両端の値を含む）刺激すること; 最初にウイルスベクターの存在下で細胞を693gの力で30分間スピノキュレートし、次いで、スピノキュレートされた細胞をウイルスベクターと共に、24時間〜96時間（両端の値を含む）インキュベートすることによって、組み換え受容体をコードするウイルスベクターを細胞に形質導入すること; 細胞にビオチン(例えば、D-ビオチン)を添加して、抗CD3/抗CD28 Fabが可逆的に結合したオリゴマー性ストレプトアビジンムテインを細胞から除去または分離すること; ならびに細胞を回収または収集すること、のうちの1つまたは複数を含む。
【０５２６】
いくつかの態様において、細胞は、刺激の開始から36時間〜96時間または約36時間〜約96時間（両端の値を含む）から収集または回収される。様々な態様において、細胞は、刺激の開始後、36時間〜108時間または48時間〜96時間（両端の値を含む）で収集または回収される。特定の態様において、抗CD3/抗CD28 Fabが可逆的に結合したオリゴマー性ストレプトアビジンムテインは、刺激の開始後36時間〜96時間または48時間〜72時間（両端の値を含む）で細胞から除去または分離される。
【０５２７】
いくつかの態様において、抗CD3/抗CD28 Fabが可逆的に結合したオリゴマー性ストレプトアビジンムテインは、刺激の開始から48時間後または約48時間後に、例えば、48時間±6時間後に細胞から除去または分離される。特定の態様において、抗CD3/抗CD28 Fabが可逆的に結合したオリゴマー性ストレプトアビジンムテインは、刺激の開始から72時間後または約72時間後に、例えば、72時間±6時間後に細胞から除去または分離される。特定の態様において、抗CD3/抗CD28 Fabが可逆的に結合したオリゴマー性ストレプトアビジンムテインは、刺激の開始から96時間後または約96時間後に、例えば、96時間±6時間後に細胞から除去または分離される。特定の態様において、抗CD3/抗CD28 Fabが可逆的に結合したオリゴマー性ストレプトアビジンムテインは、インキュベーション後に細胞から除去または分離され、細胞が、ビオチンまたはビオチン類似体の添加後に回収または収集される。ある種の態様において、抗CD3/抗CD28 Fabが可逆的に結合したオリゴマー性ストレプトアビジンムテインは、インキュベーションの間に細胞から除去または分離されることにより、細胞がビオチンまたはビオチン類似体の添加後にインキュベーションに戻される。
【０５２８】
いくつかの態様において、インキュベーションは、無血清培地中の組み換えサイトカイン(例えば、IL-2、IL-7、およびIL-15)の存在下で行われる。ある種の態様において、インキュベーションは、組み換えサイトカインの非存在下で行われる。特定の態様において、インキュベーションは、基礎培地の存在下で行われる。ある種の態様において、オリゴマー性刺激試薬で刺激された細胞が、組み換えサイトカインを含有する無血清培地の存在下でインキュベートされるプロセスと比較して、基礎培地中でのインキュベーションは、異種もしくは組み換えヌクレオチドの組み込み、例えば、安定した組み込みを増加させるか、組み換え受容体を発現している細胞の割合を増加させるか、効力を改善するか、または細胞の分化を低減させる。
【０５２９】
特定の態様において、ビオチンまたはビオチン類似体の添加などによる、オリゴマー刺激試薬、例えば、抗CD3/抗CD28 Fabが可逆的に結合したオリゴマー性ストレプトアビジンムテインの除去は、刺激試薬が細胞から分離または除去される場合に生じる可能性がある細胞損失の量を低減させる。いくつかの態様において、オリゴマー刺激試薬が細胞から分離または除去された場合、細胞の30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％未満、または約30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％未満が、細胞集団から失われるか、死滅するか、または分離される。ある種の態様において、刺激のためにオリゴマー刺激試薬を使用するプロセスから作製されたアウトプット集団は、抗体とコンジュゲートされた常磁性ビーズなどの代替的な刺激試薬を利用するプロセスから作製されたアウトプット集団よりも15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、もしくは50％多い総細胞を有するか、約15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、もしくは50％多い総細胞を有するか、または少なくとも15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、もしくは50％多い総細胞を有する。
【０５３０】
3.  ベクターのコピー数
いくつかの態様において、組み換え受容体、例えばCARをコードする導入遺伝子配列などの、導入遺伝子配列のゲノム組み込みを、細胞を操作するための提供されるプロセスのうちのいずれかに関連して産生された細胞において評価することができる。いくつかの態様において、細胞の染色体DNAまたはゲノムDNA中に組み込まれた導入遺伝子配列のコピー数である、組み込まれたコピー数が評価される。
【０５３１】
いくつかの態様において、導入遺伝子配列のゲノム組み込みを評価するための方法は、1つまたは複数の細胞から単離されたデオキシリボ核酸(DNA)から、10キロ塩基(kb)超または約10kb超であるDNA種などの、DNAの高分子量画分を分離することを含む。いくつかの局面では、そのような分離は、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)などの方法によって行うことができる。いくつかの局面では、1つまたは複数の細胞は、組み換えタンパク質をコードする導入遺伝子配列を含む少なくとも1つの操作された細胞を含有するか、または含有すると疑われる。いくつかの局面では、方法は、1つまたは複数の細胞のゲノムに組み込まれた導入遺伝子配列の存在、非存在または量を、例えば、定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、デジタルPCR(dPCR)またはドロプレットデジタルPCR(ddPCR)などの定量法によって決定することを含む。
【０５３２】
いくつかの態様において、高分子量画分は、主として染色体DNAまたはゲノムDNAなどの大きなDNA分子を含有し、プラスミド、非組み込み型のDNAフラグメント、線形相補的DNA(cDNA)、自己組み込み体(autointegrant)、長末端反復配列(LTR)の環またはゲノムに組み込まれていない他の残りの種もしくは分子などの、サイズについての閾値よりも小さな分子を低く含有するまたはほとんど含有しない。いくつかの態様において、高分子量画分中の導入遺伝子配列の量の存在、非存在または量を決定することによって、検出された導入遺伝子配列は、操作された細胞のゲノム中に組み込まれている配列を表し、非組み込み型の導入遺伝子配列の検出を最小限にする。
【０５３３】
いくつかの態様において、高分子量画分は、サイズが10キロ塩基(kb)超または約10kb超であるDNA分子を含む。いくつかの態様において、高分子量画分は、サイズが10超、11超、12超、12.5超、13超、14超、15超、16超、17超、17.5超、18超、19超、20超、25超もしくは30キロ塩基(kb)超もしくはそれ以上、または約10超、約11超、約12超、約12.5超、約13超、約14超、約15超、約16超、約17超、約17.5超、約18超、約19超、約20超、約25超もしくは約30キロ塩基(kb)超もしくはそれ以上であるDNA分子を含む。いくつかの態様において、高分子量画分は、サイズが10超、12.5超、15超、17.5超もしくは20キロ塩基(kb)超もしくはそれ以上、または約10超、12.5超、15超、17.5超もしくは20キロ塩基(kb)超もしくはそれ以上であるDNA分子を含む。いくつかの局面では、高分子量画分は、ゲノムDNAまたはゲノムDNAフラグメントを含有し、DNAサンプル中に存在することができる非組み込み型核酸種または残留核酸種を除外または分離する。いくつかの局面では、高分子量画分、例えばDNAサンプルは、約10、11、12、12.5、13、14、15、16、17、17.5、18、19、20、25もしくは30キロ塩基(kb)またはそれ以上のように、閾値よりも高い。いくつかの態様において、閾値は、10超、12.5超、15超、17.5超もしくは20キロ塩基(kb)超もしくはそれ以上、または約10超、約12.5超、約15超、約17.5超もしくは約20キロ塩基(kb)超もしくはそれ以上である。
【０５３４】
いくつかの態様において、高分子量画分は、電気泳動に基づく方法を用いて分離または単離される。いくつかの局面では、電気泳動は、電場の存在下で分離マトリックスを通過する移動度を介して生体分子を電荷および/またはサイズで分離する。いくつかの態様において、電気泳動システムを使用して、核酸分子を含む特定の分析物をサイズまたは分子量に基づき分画、分析、および回収することができる。いくつかの局面では、画分は、複数の分子のサブセットである、またはそれを含む。いくつかの局面では、画分は、サイズもしくは分子量によって定義もしくは決定することができ、またはいくつかの局面では、電場の力により本開示の緩衝組成物を通過して泳動するよう駆動された場合、該画分を他の複数の分子もしくは画分よりも速いもしくは遅い速度で泳動させる(すなわち、電気泳動移動度)、任意の物理的性質によって定義もしくは決定することができる。
【０５３５】
いくつかの態様において、高分子量画分は、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)を用いて分離または単離される。いくつかの局面では、PFGEは、染色体DNAまたはゲノムDNAなどのより大きな核酸分子の分解能を改善するために電気泳動システムに交代性の電圧勾配を導入することを含む。いくつかの局面では、電気泳動システムの電圧は、3つの方向: ゲルの中心軸を通過する1つの方向、および左右に角度60°で伸びる2つの方向の間で周期的に切り替えられる。いくつかの局面では、PFGEにより核酸分子を分離または単離するための例示的なシステムおよび方法は、例えば、US 9599590; US 2017/0240882; またはUS 2017/0254774に記述されるものを含む。
【０５３６】
いくつかの局面では、PFGEなどの電気泳動は、装置またはシステムを使用して行うことができる。いくつかの局面では、装置またはシステムは、自動化システムまたは高スループットシステムである。PFGEを行うための例示的なシステムは、例えば、US 9599590; US 2017/0240882; もしくはUS 2017/0254774に記述されるもの、またはPippin Prep、Blue PippinもしくはPippin HT(Sage Science); CHEF Mapper(登録商標)XA System、CHEF-DR(登録商標)III Variable Angle System、CHEF-DR II System(Bio-Rad); およびBiometra Rotaphor 8 System(Analytik Jena AG)のような市販の装置もしくはシステムを含む。
【０５３７】
いくつかの局面では、評価のための例示的なサンプルは、核酸、オリゴヌクレオチド、DNA分子、RNA分子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの局面では、サンプルは、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの局面では、サンプルは、養子細胞療法のために操作された細胞の溶解物のような、全細胞溶解物または細胞溶解物のDNAもしくはタンパク質画分であることができる。
【０５３８】
いくつかの態様において、サンプルからの核酸は、ゲノムDNA、二本鎖DNA(dsDNA)、一本鎖DNA(ssDNA)、コードDNA(またはcDNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、一本鎖RNA、二本鎖RNA(dsRNA)、モルホリノRNA干渉(RNAi)分子、ミトコンドリア核酸、クロロプラスト核酸、ウイルスDNA、ウイルスRNA、および別の遺伝物質を有する他のオルガネラを含むことができる。いくつかの局面では、サンプルからの核酸はまた、改変型、合成、もしくは非天然のヌクレオチドもしくは構造エレメント、またはイノシンなどの塩基類似体のような他の代替/改変された核酸化学構造を含む核酸類似体、インターカレーター(米国特許第4,835,263号)および副溝結合剤(米国特許第5,801,115号)を含むことができる。
【０５３９】
いくつかの態様において、高または低分子量画分を単離または分離する前に、サンプルは、電気泳動システムにおける評価の前に、実効負電荷を付与する、ペプチドもしくはタンパク質を変性させる、またはDNAもしくはRNA分子を消化する試薬と組み合わせることができる。いくつかの局面では、サンプルは、検出の目的でサンプルまたはその画分に蛍光、磁気、または放射特性を付与する作用物質と組み合わせることができる。いくつかの例では、dsDNAサンプルは、臭化エチジウムと混合され、電気泳動カセットに適用され、サンプルの画分がウルトラブライトグリーンLEDを用いて検出される。
【０５４０】
いくつかの局面では、電気泳動システムのような核酸サンプルを分離または単離するためのシステムは、自動化されているおよび/または高スループットであることができる。いくつかの局面では、電気泳動システムは、電気泳動カセットなどの使い捨ての消耗品または試薬を利用することができる。
【０５４１】
いくつかの局面では、導入遺伝子配列の存在、非存在または量を決定することは、核酸配列の存在、非存在または量を決定するための方法を用いて行われることができる。特に、定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)または関連方法などの、核酸配列を定量化するために使用される方法は、DNAを含有するサンプル、または特にDNAを含有するサンプルから分離または単離された高分子量画分などの特定の画分の中の導入遺伝子配列のコピー数を決定するのに用いることができる。いくつかの態様において、導入遺伝子配列の存在、非存在または量を決定することは、例えば、下記の例示的なアッセイのいずれか1つを用いてコピー数を決定して、核酸分子を定量化することを含む。
【０５４２】
いくつかの局面では、特定の配列の存在、非存在および/または量は、導入遺伝子配列の全部または一部と特異的に結合するか、またはそれを認識することができる、プローブまたはプライマーを使用して検出することができる。いくつかの態様において、コピー数は、導入遺伝子配列の一部を特異的に検出することができるプローブ、または導入遺伝子配列の一部を特異的に増幅することができるプライマー配列を使用して決定することができる。いくつかの局面では、プローブまたはプライマー配列は、導入遺伝子配列の一部を、例えば、細胞に対して異種、外因性または遺伝子導入である導入遺伝子配列の一部を、特異的に検出するか、それと結合するか、またはそれを認識することができる。いくつかの態様において、qPCRまたは他の核酸に基づく方法のために使用されるプライマーまたはプローブは、組み換えタンパク質をコードする核酸、ならびに/または調節エレメント、例えば、プロモーター、転写および/もしくは転写後調節エレメントもしくは応答エレメント、またはマーカー、例えば、代用マーカーを含む、プラスミドおよび/もしくはベクターの他の構成要素もしくはエレメントと結合すること、それを認識すること、および/またはそれを増幅することに特異的である。いくつかの局面では、プローブまたはプライマーは、導入遺伝子配列の存在、非存在および/または量を決定するための例示的な方法、例えば定量PCR(qPCR)、デジタルPCR(dPCR)またはドロプレットデジタルPCR(ddPCR)のために使用することができる。
【０５４３】
いくつかの局面では、存在、非存在または量を決定することは、1つまたは複数の細胞中または1つまたは複数の細胞を含有する生体サンプル中の導入遺伝子配列の質量、重量、濃度またはコピー数を決定することのような、導入遺伝子配列の量を決定することを含む。いくつかの局面では、核酸配列の存在、非存在もしくは量を決定すること、または導入遺伝子配列の質量、重量、濃度もしくはコピー数を評価することは、細胞の集団の一部または生体サンプルの一部において行うことができ、サンプル全体または細胞集団全体における存在、非存在または量を決定するために規準化、平均、および/または外挿することができる。
【０５４４】
いくつかの態様において、導入遺伝子配列の存在、非存在または量を決定することは、1つまたは複数の細胞中の二倍体ゲノム当たりまたは細胞当たりの導入遺伝子配列の質量、重量、濃度またはコピー数を決定することを含む。いくつかの態様において、1つまたは複数の細胞は、集団の複数の細胞が、組み換えタンパク質をコードする導入遺伝子配列を含む細胞集団を含む。いくつかの態様において、コピー数は、細胞集団の中の二倍体ゲノム当たりまたは細胞当たりの平均(average)または平均(mean)コピー数である。
【０５４５】
いくつかの局面では、コピー数を決定することは、1つまたは複数の細胞中、または生体サンプル中に存在する導入遺伝子配列のコピー数を決定することを含む。いくつかの局面では、コピー数は、平均(average)または平均(mean)コピー数として表現することができる。いくつかの局面では、特定の組み込み型導入遺伝子のコピー数は、細胞当たりの組み込み体(導入遺伝子配列を含有する)の数を含む。いくつかの局面では、特定の組み込み型導入遺伝子のコピー数は、二倍体ゲノム当たりの組み込み体(導入遺伝子配列を含有する)の数を含む。いくつかの局面では、導入遺伝子配列のコピー数は、細胞当たりの組み込み型導入遺伝子配列の数として表現される。いくつかの局面では、導入遺伝子配列のコピー数は、二倍体ゲノム当たりの組み込み型導入遺伝子配列の数として表現される。いくつかの局面では、1つまたは複数の細胞は、集団の複数の細胞が組み換えタンパク質をコードする導入遺伝子配列を含む、細胞集団を含む。いくつかの態様において、コピー数は、細胞集団の中の二倍体ゲノム当たりまたは細胞当たりの平均(average)または平均(mean)コピー数である。
【０５４６】
いくつかの態様において、導入遺伝子配列の量を決定することは、1つまたは複数の細胞当たり、任意で、CD3+、CD4+および/もしくはCD8+細胞当たり、ならびに/または組み換えタンパク質を発現している細胞当たりの、導入遺伝子配列の質量、重量、濃度またはコピー数を評価することを含む。いくつかの局面では、細胞上に発現される表面マーカーまたは表現型は、細胞に基づく方法を用いて、例えばフローサイトメトリーまたは免疫染色によって、決定することができる。いくつかの局面では、組み換えタンパク質を発現している細胞は、細胞に基づく方法を用いて、例えばフローサイトメトリーまたは免疫染色によって、例えば抗イディオタイプ抗体または代用マーカーについての染色を用いて、決定することができる。いくつかの局面では、導入遺伝子配列の量は、CD3+、CD4+および/もしくはCD8+細胞などの特定の細胞の数に対して、ならびに/または組み換えタンパク質を発現している細胞当たり、もしくは総細胞数当たり、例えばサンプル中の総細胞数当たりもしくは操作プロセスを受けている細胞の総数当たりで規準化することができる。
【０５４７】
いくつかの態様において、決定されたコピー数は、規準化された値として表現される。いくつかの態様において、決定されたコピー数は、ゲノム当たりまたは細胞当たりの導入遺伝子配列のコピー数として定量化される。いくつかの局面では、T細胞などの典型的な体細胞は二倍体ゲノムを含有するので、ゲノム当たりの値は、二倍体ゲノム当たりの導入遺伝子配列のコピーとして表現される。いくつかの局面では、決定されたコピー数は、細胞のゲノム中の公知の参照遺伝子のコピー数に対して規準化することができる。いくつかの局面では、参照遺伝子は、RRP30(リボヌクレアーゼPタンパク質サブユニットp30をコードする)、または18S rRNA(18SリボソームRNA)、28S rRNA(28SリボソームRNA)、TUBA(α-チューブリン)、ACTB(β-アクチン)、β2M(β2-ミクログロブリン)、ALB(アルブミン)、RPL32(リボソームタンパク質L32)、TBP(TATA配列結合タンパク質)、CYCC(シクロフィリンC)、EF1A(伸長因子1α)、GAPDH(グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ)、HPRT(ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ)またはRPII(RNAポリメラーゼII)である。いくつかの態様において、決定されたコピー数は、1マイクログラムのDNA当たりの導入遺伝子配列のコピーとして定量化される。
【０５４８】
いくつかの局面では、コピー数は、細胞の複数または集団、例えば操作された細胞の複数または集団からの、コピー数の平均(average)、平均(mean)、または中央値である。いくつかの局面では、コピー数は、細胞の複数または集団、例えば操作された細胞の複数または集団からの、コピー数の平均(average)または平均(mean)である。いくつかの局面では、平均(average)または平均(mean)コピー数は、細胞の複数もしくは集団、例えば、操作もしくは製造プロセスの1つもしくは複数の工程を受けている細胞の複数もしくは集団から、または対象への投与のための細胞組成物のような細胞組成物において決定される。いくつかの局面では、規準化された平均コピー数は、例えば、二倍体ゲノム中に2つのコピーとして存在する公知の遺伝子などの参照遺伝子に対して規準化された、導入遺伝子配列の平均(average)または平均(mean)コピー数として決定される。いくつかの局面では、二倍体ゲノム当たり2つのコピーとして典型的に存在する参照遺伝子に対する規準化は、二倍体細胞などの細胞中のコピー数に対応することができる。したがって、いくつかの局面では、規準化された平均(average)または平均(mean)コピー数は、細胞の、例えば、典型的には二倍体ゲノムを有するT細胞の、複数または集団の中の検出された導入遺伝子配列の平均(average)または平均(mean)コピー数に対応することができる。
【０５４９】
いくつかの態様において、導入遺伝子配列の存在、非存在または量を決定することは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって行われる。いくつかの態様において、PCRは、下記のいずれかのような定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、デジタルPCRまたはドロプレットデジタルPCRである。いくつかの態様において、導入遺伝子配列の存在、非存在または量は、ドロプレットデジタルPCRによって決定される。いくつかの態様において、PCRは、導入遺伝子配列の少なくとも一部と相補性であるか、またはそれを特異的に増幅することができる、1つまたは複数のプライマーと、場合によっては、参照遺伝子の少なくとも一部と相補性であるか、またはそれを特異的に増幅することができる、1つまたは複数のプライマーとを使用して行われる。
【０５５０】
いくつかの局面では、qPCRを使用して、各サイクルの後に産物を定量して、反応が進行するにつれ測定される増幅産物の蓄積をリアルタイムで検出することができる。したがって、いくつかの局面では、qPCRを用いて、サンプル中の特定の核酸配列の、例えば導入遺伝子配列の、コピー数を決定することができる。いくつかの局面では、qPCRは、産物DNAの量が増加するにつれ増加した蛍光をもたらす蛍光レポーター分子を、各反応ウェル中に用いる。いくつかの局面では、用いられる蛍光化学物質は、DNA結合色素および蛍光標識配列特異的プライマーまたはプローブを含む。いくつかの局面では、qPCRは、特定の波長の光を各サンプルに照射し、励起されたフルオロフォアにより放射される蛍光を検出する能力を有する専門のサーマルサイクラーを用いる。いくつかの局面では、測定される蛍光は、アンプリコンの総量に比例し; 経時的な蛍光変化は、各サイクル中に産生されたアンプリコンの量を計算するために使用される。
【０５５１】
いくつかの態様において、dPCRは、核酸を検出および定量化するための方法であって、標的核酸分子の正確な定量分析および高感度検出を可能にする。いくつかの局面では、dPCRは、一連の個別のPCR反応(または区画)へとDNAの限界希釈を行うこと含む。いくつかの局面では、限界希釈は、評価すべきテンプレート核酸の、例えば導入遺伝子配列の、ランダム分布に基づくナノ流体技術およびエマルジョン化学による分配原理ならびにポアソン統計学を採用して、所与の比率の陽性区画に関して存在するDNAの量を測定することができる。いくつかの局面では、dPCRは一般的に線形であり、鋭敏であり、非常に少量のDNAを検出または定量化することができる。いくつかの局面では、dPCRは、標準曲線なしに1分子カウント法を用いたDNAサンプルの絶対的定量化を可能にし、絶対的定量化は、ウェル1つ当たり1つの区画についてのPCRから得ることができる(Pohl et al., (2004) Expert Rev. Mol. Diagn. 4(1), 41-47を参照されたい)。
【０５５２】
dPCRのための例示的な市販の装置またはシステムは、Raindrop(商標)Digital PCR System(Raindance(商標)Technologies); QX200(商標)Droplet Digital(商標)PCR System(Bio-Rad); BioMark(商標)HD SystemおよびqdPCR 37K(商標)IFC(Fluidigm Corporation)およびQuantStudio(商標)3D Digital PCR System(Life Technologies(商標))(例えば、Huggett et al. (2013) Clinical Chemistry 59: 1691-1693; Shuga, et al. (2013) Nucleic Acids Research 41(16): e159; Whale et al. (2013) PLoS One 3: e58177を参照されたい)。
【０５５３】
いくつかの態様において、操作された細胞のゲノム中への組み込みのための導入遺伝子配列、例えば組み換えタンパク質をコードする導入遺伝子配列の存在、非存在または量は、ドロプレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応(ddPCR)を用いて決定される。ddPCRは、水-油エマルジョン化学によりPCR溶液がより小さな反応物に分割または分配されて、多数のドロプレットが作製される、デジタルPCRの一種である。いくつかの局面では、油中水型ドロプレットを作製するために特定の界面活性剤を使用することができる。(例えば、Hindson et al., (2011) Anal Chem 83(22): 8604-8610; Pinheiro et al., (2012) Anal Chem 84, 1003-1011を参照されたい)。いくつかの局面では、それぞれ個別のドロプレットが、続いて個別の反応として進行する。いくつかの局面では、PCRサンプルは、ナノリットルサイズのサンプルに分配され、油性ドロプレット中に封入される。いくつかの局面では、油性ドロプレットは、各ウェルに減圧を適用するドロプレット発生装置を使用して作られる。例示的な場合では、20μLのサンプル体積から個別の反応のための約20,000個の油性ドロプレットを作ることができる。
【０５５４】
いくつかの局面では、組み込まれたコピー数を評価する方法を様々な時点で行って、導入遺伝子配列が導入された細胞のゲノム中への導入された導入遺伝子配列の組み込みのような、遺伝子工学のタイミング、程度または進行を決定および比較することができる。いくつかの局面では、方法は、操作された細胞組成物のための操作または製造プロセス、例えば、記載されたプロセスのいずれかの様々な段階で行うことができる。例えば、提供される方法は、拡大増殖される操作プロセスまたは非拡大増殖される操作プロセスの様々な段階で行うことができる。
【０５５５】
いくつかの局面では、提供される方法によって操作された細胞は、上記のベクターコピー数についてのアッセイを使用して、組み換え受容体、例えばCARをコードするような、導入遺伝子配列のゲノム組み込みについて評価される。いくつかの態様において、方法は、細胞から単離されたデオキシリボ核酸(DNA)から10キロ塩基(kb)超または約10kb超の高分子量画分を分離する工程であって、分離する前に、細胞は、導入遺伝子配列の組み込みのための条件下で、導入遺伝子配列を含むポリヌクレオチドがウイルス形質導入などによって細胞のゲノム中に導入されている、工程; および高分子量画分中の導入遺伝子配列の存在、非存在または量を決定する工程を含む。
【０５５６】
4.  アウトプット組成物の例示的な特徴
ある種の態様において、提供される方法は、アウトプット細胞および/または濃縮されたT細胞のアウトプット組成物、例えば、治療用T細胞組成物を作製または産生するためのプロセスに関連して使用される。特定の態様において、アウトプット組成物は、CD3+ T細胞について濃縮された細胞の組成物である。いくつかの態様において、アウトプット組成物中の総細胞の少なくともまたは約60％、少なくともまたは約65％、少なくともまたは約70％、少なくともまたは約75％、少なくともまたは約80％、少なくともまたは約85％、少なくともまたは約90％、少なくともまたは約95％、少なくともまたは約98％、少なくともまたは約98.5％、少なくともまたは約99％、少なくともまたは約99.5％、少なくともまたは約99.9％、100％、または約100％は、CD3+ T細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物中の総細胞の少なくともまたは約86％、少なくともまたは約86.5％、少なくともまたは約87％、少なくともまたは約87.5％、少なくともまたは約88％、少なくともまたは約88.5％、少なくともまたは約89％、少なくともまたは約89.5％、少なくともまたは約90％、少なくともまたは約90.5％、少なくともまたは約91％、少なくともまたは約91.5％、少なくともまたは約92％、少なくともまたは約92.5％、少なくともまたは約93％、少なくともまたは約93.5％、少なくともまたは約94％、少なくともまたは約94.5％、少なくともまたは約95％、少なくともまたは約95.5％、少なくともまたは約96％、少なくともまたは約96.5％、少なくともまたは約97％、少なくともまたは約97.5％、少なくともまたは約98％、または少なくともまたは約98.5％は、CD3+ T細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物中の総細胞の約80％〜約100％、約85％〜約98％、約88％〜約96％、または約90％〜約94％は、CD3+ T細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、本質的にCD3+ T細胞からなる。いくつかの態様において、アウトプット組成物中の総細胞の少なくともまたは約90％はCD3+ T細胞であり、アウトプット組成物中の総細胞の少なくともまたは約40％は組み換え受容体(例えば、CAR)を発現する。
【０５５７】
ある種の態様において、アウトプット組成物は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞について濃縮された細胞の組成物である。特定の態様において、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞は、アウトプット組成物中の総細胞の少なくともまたは約60％、少なくともまたは約65％、少なくともまたは約70％、少なくともまたは約75％、少なくともまたは約80％、少なくともまたは約85％、少なくともまたは約90％、少なくともまたは約95％、少なくともまたは約98％、少なくともまたは約98.5％、少なくともまたは約99％、少なくともまたは約99.5％、少なくともまたは約99.9％、100％、または約100％を占める。いくつかの態様において、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞は、アウトプット組成物中の総細胞の少なくともまたは約86％、少なくともまたは約86.5％、少なくともまたは約87％、少なくともまたは約87.5％、少なくともまたは約88％、少なくともまたは約88.5％、少なくともまたは約89％、少なくともまたは約89.5％、少なくともまたは約90％、少なくともまたは約90.5％、少なくともまたは約91％、少なくともまたは約91.5％、少なくともまたは約92％、少なくともまたは約92.5％、少なくともまたは約93％、少なくともまたは約93.5％、少なくともまたは約94％、少なくともまたは約94.5％、少なくともまたは約95％、少なくともまたは約95.5％、少なくともまたは約96％、少なくともまたは約96.5％、少なくともまたは約97％、少なくともまたは約97.5％、少なくともまたは約98％、または少なくともまたは約98.5％を占める。いくつかの態様において、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞は、アウトプット組成物中の総細胞の約80％〜約100％、約85％〜約98％、約88％〜約96％、または約90％〜約94％を占める。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、本質的にCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞からなる。
【０５５８】
特定の態様において、アウトプット組成物は、10％もしくは約10％〜90％もしくは約90％、20％もしくは約20％〜80％もしくは約80％、25％もしくは約25％〜75％もしくは約75％、30％もしくは約30％〜70％もしくは約70％、35％もしくは約35％〜65％もしくは約65％、40％もしくは約40％〜60％もしくは約60％、55％もしくは約55％〜45％もしくは約45％、または約50％もしくは50％のCD4+ T細胞、および約10％または約10％〜90％もしくは約90％、20％もしくは約20％〜80％もしくは約80％、25％もしくは約25％〜75％もしくは約75％、30％もしくは約30％〜70％もしくは約70％、35％もしくは約35％〜65％もしくは約65％、40％もしくは約40％〜60％もしくは約60％、55％もしくは約55％〜45％もしくは約45％、または約50％もしくは50％のCD8+ T細胞を含有する。ある種の態様において、アウトプット組成物は、35％もしくは約35％〜65％もしくは約65％、40％もしくは約40％〜60％もしくは約60％、55％もしくは約55％〜45％もしくは約45％、または約50％もしくは50％のCD4+ T細胞、および35％もしくは約35％〜65％もしくは約65％、40％もしくは約40％〜60％もしくは約60％、55％もしくは約55％〜45％もしくは約45％、または約50％もしくは50％のCD8+ T細胞を含有する。特定の態様において、アウトプットは、35％または約35％〜65％または約65％のCD4+ T細胞および35％または約35％〜65％または約65％のCD8+ T細胞を含有する。特定の態様において、アウトプット組成物は、3:1〜1:3、2.5:1〜1:2.5、2:1〜1:2、1.5:1〜1:1.5、1.4:1〜1:1.4、1.3:1〜1:1.3、1.2:1〜1:1.2、または1.1:1〜1:1.1の比のCD4+ T細胞: CD8+ T細胞を含有する。いくつかの態様において、細胞の組成物は、3:1もしくは約3:1、2.8:1もしくは約2.8:1、2.5:1もしくは約2.5:1、2.25:1もしくは約2.25:1、2:1もしくは約2:1、1.8:1もしくは約1.8:1、1.7:1もしくは約1.7:1、1.6:1もしくは約1.6:1、1.5:1もしくは約1.5:1、1.4:1もしくは約1.4:1、1.3:1もしくは約1.3:1、1.2:1もしくは約1.2:1、1.1:1もしくは約1.1:1、1:1もしくは約1:1、1:1.1もしくは約1:1.1、1:1.2もしくは約1:1.2、1:1.3もしくは約1:1.3、1:1.4もしくは約1:1.4、1:1.5もしくは約1:1.5、1:1.6もしくは約1:1.6、1:1.7もしくは約1:1.7、1:1.8もしくは約1:1.8、1:2もしくは約1:2、1:2.25もしくは約1:2.25、1:2.5もしくは約1:2.5、1:2.8もしくは約1:2.8、または1:3もしくは約1:3の比のCD4+ T細胞: CD8+ T細胞を有する。
【０５５９】
いくつかの態様において、本明細書に提供される方法によって産生されるアウトプット組成物の少なくとも75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは約95％、少なくとも97％もしくは約97％、少なくとも98％もしくは約98％、または少なくとも99％もしくは約99％は、10:90〜90:10、20:80〜80:20、75:25〜25:75、70:30〜30:70、35:65〜65:35、40:60〜60:40、45:55〜55:45、または約50:50もしくは50:50の比のCD4+ T細胞: CD8+ T細胞を有する。特定の態様において、本明細書に提供される方法によって産生されるアウトプット組成物の少なくとも80％、少なくとも85％、または少なくとも90％は、3:1〜1:3、2.5:1〜1:2.5、2:1〜1:2、1.5:1〜1:1.5、1.4:1〜1:1.4、1.3:1〜1:1.3、1.2:1〜1:1.2、または1.1:1〜1:1.1の比のCD4+ T細胞: CD8+ T細胞を有する。ある種の態様において、本明細書に提供される方法によって産生されるアウトプット組成物の少なくとも90％は、1:2〜2:1の比のCD4+ T細胞: CD8+ T細胞を有する。特定の態様において、本明細書に提供される方法によって産生されるアウトプット組成物の少なくとも90％は、1.5:1〜1:1.5、1.25:1〜1:1.25、または1.1:1〜1:1.1の比のCD4+ T細胞: CD8+ T細胞を有する。
【０５６０】
いくつかの態様において、アウトプット組成物は、3:1〜1:3、2.5:1〜1:2.5、2:1〜1:2、1.5:1〜1:1.5、1.4:1〜1:1.4、1.3:1〜1:1.3、1.2:1〜1:1.2、または1.1:1〜1:1.1の比の、組み換え受容体、例えばCARを発現するCD4+ T細胞: 組み換え受容体、例えばCARを発現するCD8+ T細胞を含有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物中の組み換え受容体(例えば、CAR)を発現するCD4+ T細胞: 組み換え受容体(例えば、CAR)を発現するCD8+ T細胞の比は、3:1もしくは約3:1、2.8:1もしくは約2.8:1、2.5:1もしくは約2.5:1、2.25:1もしくは約2.25:1、2:1もしくは約2:1、1.8:1もしくは約1.8:1、1.7:1もしくは約1.7:1、1.6:1もしくは約1.6:1、1.5:1もしくは約1.5:1、1.4:1もしくは約1.4:1、1.3:1もしくは約1.3:1、1.2:1もしくは約1.2:1、1.1:1もしくは約1.1:1、1:1もしくは約1:1、1:1.1もしくは約1:1.1、1:1.2もしくは約1:1.2、1:1.3もしくは約1:1.3、1:1.4もしくは約1:1.4、1:1.5もしくは約1:1.5、1:1.6もしくは約1:1.6、1:1.7もしくは約1:1.7、1:1.8もしくは約1:1.8、1:2もしくは約1:2、1:2.25もしくは約1:2.25、1:2.5もしくは約1:2.5、1:2.8もしくは約1:2.8、または1:3もしくは約1:3である。
【０５６１】
特定の態様において、本明細書に提供される方法によって産生されるアウトプット組成物の少なくとも80％、少なくとも85％、または少なくとも90％は、3:1〜1:3、2.5:1〜1:2.5、2:1〜1:2、1.5:1〜1:1.5、1.4:1〜1:1.4、1.3:1〜1:1.3、1.2:1〜1:1.2、または1.1:1〜1:1.1の比の組み換え受容体、例えばCARを発現するCD4+ T細胞: 組み換え受容体、例えばCARを発現するCD8+ T細胞を有する。ある種の態様において、本明細書に提供される方法によって産生されるアウトプット組成物の少なくとも90％は、1:2〜2:1の比のCD4+ T細胞: CD8+ T細胞を有する。特定の態様において、本明細書に提供される方法によって産生されるアウトプット組成物の少なくとも90％は、1.5:1〜1:1.5、1.25:1〜1:1.25、1.1:1〜1:1.1の比のCD4+ T細胞: CD8+ T細胞を有する。
【０５６２】
いくつかの態様において、提供される方法に関連して作製または産生されたアウトプット組成物は、組み換え受容体、例えば、TCRまたはCARを発現している細胞を含有する。いくつかの態様において、組み換え受容体を発現することは、細胞膜および/もしくは細胞表面に局在する1つもしくは複数の組み換え受容体タンパク質を有すること、検出可能な量の組み換え受容体タンパク質を有すること、組み換え受容体をコードするmRNAの検出可能な量を有すること、組み換え受容体をコードする組み換えポリヌクレオチドを有することもしくは含有すること、ならびに/または組み換え受容体発現の代用マーカーであるmRNAもしくはタンパク質を有することもしくは含有することを含み得るが、それに限定されるわけではない。
【０５６３】
いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくとももしくは約5％、少なくとももしくは約10％、少なくとももしくは約20％、少なくとももしくは約30％、少なくとももしくは約40％、少なくとももしくは約45％、少なくとももしくは約50％、少なくとももしくは約55％、少なくとももしくは約60％、少なくとももしくは約65％、少なくとももしくは約70％、少なくとももしくは約75％、少なくとももしくは約80％、少なくとももしくは約85％、少なくとももしくは約90％、少なくとももしくは約95％、少なくとももしくは約97％、少なくとももしくは約99％、または99％超は、組み換え受容体を発現する。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくともまたは約50％は、組み換え受容体を発現する。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくとももしくは約5％、少なくとももしくは約10％、少なくとももしくは約20％、少なくとももしくは約30％、少なくとももしくは約40％、少なくとももしくは約45％、少なくとももしくは約50％、少なくとももしくは約55％、少なくとももしくは約60％、少なくとももしくは約65％、少なくとももしくは約70％、少なくとももしくは約75％、少なくとももしくは約80％、少なくとももしくは約85％、少なくとももしくは約90％、少なくとももしくは約95％、少なくとももしくは約97％、少なくとももしくは約99％、または99％超は、組み換え受容体を発現する。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくともまたは約50％は、組み換え受容体を発現する。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくとももしくは約5％、少なくとももしくは約10％、少なくとももしくは約20％、少なくとももしくは約30％、少なくとももしくは約40％、少なくとももしくは約45％、少なくとももしくは約50％、少なくとももしくは約55％、少なくとももしくは約60％、少なくとももしくは約65％、少なくとももしくは約70％、少なくとももしくは約75％、少なくとももしくは約80％、少なくとももしくは約85％、少なくとももしくは約90％、少なくとももしくは約95％、少なくとももしくは約97％、少なくとももしくは約99％、または99％超は、組み換え受容体を発現するCD3+ T細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくともまたは約50％は、組み換え受容体を発現するCD3+ T細胞である。
【０５６４】
特定の態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞の少なくとももしくは約30％、少なくとももしくは約40％、少なくとももしくは約45％、少なくとももしくは約50％、少なくとももしくは約55％、少なくとももしくは約60％、少なくとももしくは約65％、少なくとももしくは約70％、少なくとももしくは約75％、少なくとももしくは約80％、少なくとももしくは約85％、少なくとももしくは約90％、少なくとももしくは約95％、少なくとももしくは約97％、少なくとももしくは約99％、または99％超は、組み換え受容体を発現する。特定の態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞の少なくともまたは約50％は、組み換え受容体を発現する。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD8+ T細胞の少なくとももしくは約30％、少なくとももしくは約40％、少なくとももしくは約45％、少なくとももしくは約50％、少なくとももしくは約55％、少なくとももしくは約60％、少なくとももしくは約65％、少なくとももしくは約70％、少なくとももしくは約75％、少なくとももしくは約80％、少なくとももしくは約85％、少なくとももしくは約90％、少なくとももしくは約95％、少なくとももしくは約97％、少なくとももしくは約99％、または99％超は、組み換え受容体を発現する。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD8+ T細胞の少なくともまたは約50％は、組み換え受容体を発現する。
【０５６５】
特定の態様において、アウトプット組成物は、少なくとももしくは少なくとも約50％、少なくとももしくは少なくとも約60％、少なくとももしくは少なくとも約70％、少なくとももしくは少なくとも約75％、少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約99％、または少なくとももしくは少なくとも約99.9％の生存細胞を含有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、少なくとももしくは少なくとも約75％の生存細胞を含有する。ある種の態様において、アウトプット組成物は、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、または少なくとももしくは少なくとも約95％の生存細胞を含有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、少なくとももしくは少なくとも約50％、少なくとももしくは少なくとも約60％、少なくとももしくは少なくとも約70％、少なくとももしくは少なくとも約75％、少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約99％、または少なくとももしくは少なくとも約99.9％の生存CD3+ T細胞を含有する。特定の態様において、アウトプット組成物は、少なくとももしくは少なくとも約75％の生存CD3+ T細胞を含有する。ある種の態様において、アウトプット組成物は、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、または少なくとももしくは少なくとも約95％の生存CD3+ T細胞を含有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、少なくとももしくは少なくとも約50％、少なくとももしくは少なくとも約60％、少なくとももしくは少なくとも約70％、少なくとももしくは少なくとも約75％、少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約99％、または少なくとももしくは少なくとも約99.9％の生存CD4+ T細胞を含有する。ある種の態様において、アウトプット組成物は、少なくとももしくは少なくとも約75％の生存CD4+ T細胞を含有する。特定の態様において、アウトプット組成物は、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、または少なくとももしくは少なくとも約95％の生存CD4+ T細胞を含有する。特定の態様において、アウトプット組成物は、少なくとももしくは少なくとも約50％、少なくとももしくは少なくとも約60％、少なくとももしくは少なくとも約70％、少なくとももしくは少なくとも約75％、少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約99％、または少なくとももしくは少なくとも約99.9％の生存CD8+ T細胞を含有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、少なくとももしくは少なくとも約75％の生存CD8+ T細胞を含有する。ある種の態様において、アウトプット組成物は、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、または少なくとももしくは少なくとも約95％の生存CD8+ T細胞を含有する。
【０５６６】
特定の態様において、アウトプット細胞は、アポトーシスを起こしている、および/もしくはアポトーシス調製されている、刺激されている、ならびに/またはアポトーシスに入っている細胞の割合および/または頻度が低い。特定の態様において、アウトプット細胞は、アポトーシスマーカーに対して陽性である細胞の割合および/または頻度が低い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の40％未満もしくは約40％未満、35％未満もしくは約35％未満、30％未満もしくは約30％未満、25％未満もしくは約25％未満、20％未満もしくは約20％未満、15％未満もしくは約15％未満、10％未満もしくは約10％未満、5％未満もしくは約5％未満、または1％未満もしくは約1％未満がアポトーシスマーカーを発現し、アポトーシスマーカーを含有し、および/またはアポトーシスマーカー陽性である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の約25％未満がアポトーシスのマーカーを発現し、アポトーシスのマーカーを含有し、および/またはアポトーシスのマーカー陽性である。ある種の態様において、アウトプット組成物の10％未満または約10％未満の細胞がアポトーシスマーカーを発現し、アポトーシスマーカーを含有し、および/またはアポトーシスマーカー陽性である。
【０５６７】
特定の態様において、アウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+)細胞の少なくとももしくは少なくとも約50％、少なくとももしくは少なくとも約60％、少なくとももしくは少なくとも約70％、少なくとももしくは少なくとも約75％、少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約99％、または少なくとももしくは少なくとも約99.9％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+)細胞の少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、または少なくとももしくは少なくとも約95％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+)細胞の少なくとももしくは少なくとも約90％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくとももしくは少なくとも約50％、少なくとももしくは少なくとも約60％、少なくとももしくは少なくとも約70％、少なくとももしくは少なくとも約75％、少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約99％、または少なくとももしくは少なくとも約99.9％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、または少なくとももしくは少なくとも約95％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。特定の態様において、アウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくとももしくは少なくとも約90％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+) CD3+ T細胞の少なくとももしくは少なくとも約50％、少なくとももしくは少なくとも約60％、少なくとももしくは少なくとも約70％、少なくとももしくは少なくとも約75％、少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約99％、または少なくとももしくは少なくとも約99.9％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。特定の態様において、アウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+) CD3+ T細胞の少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、または少���くとももしくは少なくとも約95％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+) CD3+ T細胞の少なくとももしくは少なくとも約90％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。
【０５６８】
特定の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+)細胞の少なくとももしくは少なくとも約50％、少なくとももしくは少なくとも約60％、少なくとももしくは少なくとも約70％、少なくとももしくは少なくとも約75％、少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約99％、または少なくとももしくは少なくとも約99.9％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。ある種の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+)細胞の少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、または少なくとももしくは少なくとも約95％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。いくつかの態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+)細胞の少なくとももしくは少なくとも約90％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。いくつかの態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくとももしくは少なくとも約50％、少なくとももしくは少なくとも約60％、少なくとももしくは少なくとも約70％、少なくとももしくは少なくとも約75％、少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約99％、または少なくとももしくは少なくとも約99.9％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。ある種の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、または少なくとももしくは少なくとも約95％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。特定の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくとももしくは少なくとも約90％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。いくつかの態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+) CD3+ T細胞の少なくとももしくは少なくとも約50％、少なくとももしくは少なくとも約60％、少なくとももしくは少なくとも約70％、少なくとももしくは少なくとも約75％、少なくとももしくは少なくとも約80％���少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、少なくとももしくは少なくとも約99％、または少なくとももしくは少なくとも約99.9％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。特定の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+) CD3+ T細胞の少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。ある種の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+) CD3+ T細胞の少なくとも90％が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。
【０５６９】
前記の態様のいずれかでは、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物は、同じまたは異なるドナーに由来する場合がある。いくつかの局面では、複数のアウトプット組成物のうちの少なくとも2つは、異なるドナーに由来する。いくつかの局面では、複数のアウトプット組成物の各々は、いくつかの異なるドナーの1つに、例えば、約2、約5、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、または約60を超える異なるドナーに、例えば、CAR-T細胞療法などの細胞療法を必要とする患者に由来する。
【０５７０】
前記態様のいずれかでは、アウトプット組成物は、バイアルのような1つまたは複数容器中に約もしくは少なくとも約10×106、約もしくは少なくとも約20×106、約もしくは少なくとも約25×106、約もしくは少なくとも約50×106、約もしくは少なくとも約100×106、約もしくは少なくとも約200×106、約もしくは少なくとも約400×106、約もしくは少なくとも約600×106、約もしくは少なくとも約800×106、約もしくは少なくとも約1000×106、約もしくは少なくとも約1200×106、約もしくは少なくとも約1400×106、約もしくは少なくとも約1600×106、約もしくは少なくとも約1800×106、約もしくは少なくとも約2000×106、約もしくは少なくとも約2500×106、約もしくは少なくとも約3000×106、または約もしくは少なくとも約4000×106個の総細胞、例えば、総生存細胞を含むことができる。前記態様のいずれかでは、アウトプット組成物の体積は、1.0mL〜10mL（両端の値を含む）、任意で、2mLもしくは約2mL、3mLもしくは約3mL、4mLもしくは約4mL、5mLもしくは約5mL、6mLもしくは約6mL、7mLもしくは約7mL、8mLもしくは約8mL、9mLもしくは約9mL、または10mLもしくは約10mL、または前述のいずれかの間の任意の値であることができる。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、複数の容器、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上のバイアル中に含まれる。前記態様のいずれかにおいて、アウトプット組成物は、単位容器当たり、例えばバイアル当たり、約もしくは少なくとも約5×106、約もしくは少なくとも約10×106、約もしくは少なくとも約20×106、約もしくは少なくとも約25×106、約もしくは少なくとも約50×106、約もしくは少なくとも約100×106、約もしくは少なくとも約150×106、約もしくは少なくとも約200×106、約もしくは少なくとも約250×106、約もしくは少なくとも約300×106、約もしくは少なくとも約350×106、約もしくは少なくとも約400×106、約もしくは少なくとも約450×106、約もしくは少なくとも約500×106、約もしくは少なくとも約550×106、または約もしくは少なくとも約600×106個の総細胞、例えば、総生存細胞を含むことができる。いくつかの態様において、1つまたは複数の容器中のアウトプット組成物の細胞は、溶液または緩衝液中に、例えば、凍結保存溶液または緩衝液中に、5×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mL、20×106個の細胞/mL、30×106個の細胞/mL、40×106個の細胞/mL、50×106個の細胞/mL、60×106個の細胞/mL、70×106個の細胞/mL、80×106個の細胞/mL、90×106個の細胞/mL、100×106個の細胞/mL、110×106個の細胞/mL、120×106個の細胞/mL、130×106個の細胞/mL、140×106個の細胞/mL、もしくは150×106個の細胞/mL、約5×106個の細胞/mL、約10×106個の細胞/mL、約20×106個の細胞/mL、約30×106個の細胞/mL、約40×106個の細胞/mL、約50×106個の細胞/mL、約60×106個の細胞/mL、約70×106個の細胞/mL、約80×106個の細胞/mL、約90×106個の細胞/mL、約100×106個の細胞/mL、約110×106個の細胞/mL、約120×106個の細胞/mL、約130×106個の細胞/mL、約140×106個の細胞/mL、もしくは約150×106個の細胞/mL、または少なくとも5×106個の細胞/mL、少なくとも10×106個の細胞/mL、少なくとも20×106個の細胞/mL、少なくとも30×106個の細胞/mL、少なくとも40×106個の細胞/mL、少なくとも50×106個の細胞/mL、少なくとも60×106個の細胞/mL、少なくとも70×106個の細胞/mL、少なくとも80×106個の細胞/mL、少なくとも90×106個の細胞/mL、少なくとも100×106個の細胞/mL、少なくとも110��106個の細胞/mL、少なくとも120×106個の細胞/mL、少なくとも130×106個の細胞/mL、少なくとも140×106個の細胞/mL、もしくは少なくとも150×106個の細胞/mLの密度である。いくつかの態様において、約または最大約900×106個の細胞(例えば、生存CD4+ T細胞および生存CD8+ T細胞、または生存CD3+ T細胞)は、刺激された組成物の約または最大約600×106個の細胞(例えば、生存CD4+ T細胞および生存CD8+ T細胞、または生存CD3+ T細胞)が、例えばウイルスベクターを用いた、例えば形質導入による遺伝子操作に供されるか、または非ウイルス法の遺伝子操作に続く、いかなる組み換えサイトカインも有しない無血清基礎培地(例えば、1つまたは複数のサプリメントを補充されたもの)中の約72時間または約3日間のインキュベーションに供される、刺激に供される。いくつかの態様において、産生されたアウトプット組成物は、バイアルなどの1つまたは複数の容器中に約100×106〜約1400×106個の総細胞、例えば、総生存細胞を含む。
【０５７１】
特定の態様において、アウトプット組成物の細胞の大部分は、ナイーブもしくはナイーブ様細胞、セントラルメモリー細胞、および/またはエフェクターメモリー細胞である。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞の大部分は、ナイーブ様またはセントラルメモリー細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の大部分は、セントラルメモリー細胞である。いくつかの局面では、分化がより小さい細胞、例えば、セントラルメモリー細胞は、寿命がより長く、消耗の速さがより小さく、それにより持続性および耐久性が増している。いくつかの局面では、CAR-T細胞療法のような細胞療法に対する応答者は、セントラルメモリー遺伝子の発現が増加している。例えば、Fraietta et al. (2018) Nat Med. 24(5):563-571を参照されたい。
【０５７２】
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、ナイーブ様T細胞またはナイーブ様T細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞の部分および/または頻度が高い。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、拡大増殖を含むプロセス(例えば、拡大増殖の単位操作を含み、かつ/または細胞の拡大増殖を引き起こすことを意図した工程を含むプロセス)などの代替プロセスから作製されたアウトプット組成物よりもナイーブ様細胞の部分および/または頻度が高い。ある種の態様において、ナイーブ様T細胞は、様々な分化状態の細胞を含む場合があり、ある種の細胞マーカーの陽性もしくは高い発現(例えば、表面発現もしくは細胞内発現)および/または他の細胞マーカーの陰性もしくは低い発現(例えば、表面発現もしくは細胞内発現)によって特徴づけられる場合がある。いくつかの局面では、ナイーブ様T細胞は、CCR7、CD45RA、CD28、および/またはCD27の陽性または高い発現によって特徴づけられる。いくつかの局面では、ナイーブ様T細胞は、CD25、CD45RO、CD56、CD62L、および/またはKLRG1の陰性発現によって特徴づけられる。いくつかの局面では、ナイーブ様T細胞は、CD95の低い発現によって特徴づけられる。ある種の態様において、ナイーブ様T細胞またはナイーブ様T細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞はCCR7+CD45RA+であり、その際、細胞はCD27+またはCD27-である。ある種の態様において、ナイーブ様T細胞またはナイーブ様T細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞はCD27+CCR7+であり、その際、細胞はCD45RA+またはCD45RA-である。ある種の態様において、ナイーブ様T細胞またはナイーブ様T細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞はCD62L-CCR7+である。
【０５７３】
特定の態様において、アウトプット組成物の細胞はCCR7+細胞が濃縮されている。CCR7は、リンパ節内へのT細胞の進入に関与するケモカイン受容体である。特定の局面において、CCR7は、ナイーブまたはナイーブ様T細胞(例えば、CCR7+CD45RA+またはCCR7+CD27+)およびセントラルメモリーT細胞(CCR7+CD45RA-)によって発現される。いくつかの態様において、提供される方法によって産生される、操作されたT細胞の提供される組成物は、集団のT細胞の50％超もしくは約50％超、55％超もしくは約55％超、60％超もしくは約60％超、65％超もしくは約65％超、70％超もしくは約70％超、75％超もしくは約75％超、80％超もしくは約80％超、85％超もしくは約85％超、または90％超もしくは約90％超がセントラルメモリーおよびナイーブ様T細胞であるT細胞の集団を含む。いくつかの態様において、提供される方法によって産生される、操作されたT細胞の提供される組成物は、集団のT細胞の50％超もしくは約50％超、55％超もしくは約55％超、60％超もしくは約60％超、65％超もしくは約65％超、70％超もしくは約70％超、75％超もしくは約75％超、80％超もしくは約80％超、85％超もしくは約85％超、または90％超もしくは約90％超がCCR7+ T細胞であるT細胞の集団を含む。いくつかの態様において、提供される方法によって産生される、操作されたT細胞の提供される組成物は、集団のT細胞の50％超もしくは約50％超、55％超もしくは約55％超、60％超もしくは約60％超、65％超もしくは約65％超、70％超もしくは約70％超、75％超もしくは約75％超、80％超もしくは約80％超、85％超もしくは約85％超、または90％超もしくは約90％超がCCR7+CD27+であるT細胞の集団を含む。いくつかの態様において、提供される方法によって産生される、操作されたT細胞の提供される組成物は、集団のT細胞の50％超もしくは約50％超、55％超もしくは約55％超、60％超もしくは約60％超、65％超もしくは約65％超、70％超もしくは約70％超、75％超もしくは約75％超、80％超もしくは約80％超、85％超もしくは約85％超、または90％超もしくは約90％超がCCR7+CD45RA-である、T細胞の集団を含む。
【０５７４】
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、セントラルメモリーT細胞またはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞の部分および/または頻度が高い。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、拡大増殖を含むプロセス(例えば、拡大増殖の単位操作を含み、かつ/または細胞の拡大増殖を引き起こすことを意図した工程を含むプロセス)などの代替プロセスから作製されたアウトプット組成物よりも、セントラルメモリー細胞の部分および/または頻度が高い。ある種の態様において、セントラルメモリーT細胞は、様々な分化状態の細胞を含む場合があり、ある種の細胞マーカーの陽性もしくは高い発現(例えば、表面発現)および/または他の細胞マーカーの陰性もしくは低い発現(例えば、表面発現)によって特徴づけられる場合がある。いくつかの局面では、セントラルメモリーT細胞は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、および/またはCD127の陽性または高い発現によって特徴づけられる。いくつかの局面では、セントラルメモリーT細胞は、CD45RAおよび/またはグランザイムBの陰性または低い発現によって特徴づけられる。ある種の態様において、セントラルメモリーT細胞またはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞は、CCR7+CD45RA-である。
【０５７５】
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、拡大増殖を含むプロセス(例えば、拡大増殖の単位操作を含み、かつ/または細胞の拡大増殖を引き起こすことを意図した工程を含むプロセス)などの代替プロセスから作製されたアウトプット組成物よりも、ナイーブ様細胞およびセントラルメモリー細胞の部分および/または頻度が高い。
【０５７６】
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、エフェクターメモリーおよび/もしくはエフェクターメモリーRA T細胞またはエフェクターメモリーおよび/もしくはエフェクターメモリーRA T細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞の部分および/または頻度が低い。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、拡大増殖を含むプロセス(例えば、拡大増殖の単位操作を含み、かつ/または細胞の拡大増殖を引き起こすことを意図した工程を含むプロセス)などの代替プロセスから作製されたアウトプット組成物よりも、エフェクターメモリーおよび/またはエフェクターメモリーRA T細胞の部分および/または頻度が低い。ある種の態様において、エフェクターメモリーおよび/またはエフェクターメモリーRA T細胞は、様々な分化状態の細胞を含む場合があり、ある種の細胞マーカーの陽性もしくは高い発現(例えば、表面発現もしくは細胞内発現)および/または他の細胞マーカーの陰性もしくは低い発現(例えば、表面発現もしくは細胞内発現)によって特徴づけられる場合がある。ある種の態様において、エフェクターメモリーT細胞またはエフェクターメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞はCCR7-CD45RA-である。ある種の態様において、エフェクターメモリーRA T細胞またはエフェクターメモリーRA T細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞はCCR7-CD45RA+である。
【０５７７】
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、拡大増殖を含むプロセス(例えば、拡大増殖の単位操作を含み、かつ/または細胞の拡大増殖を引き起こすことを意図した工程を含むプロセス)などの代替プロセスから作製されたアウトプット組成物よりも、エフェクターメモリーT細胞の部分および/または頻度が低い。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、拡大増殖を含むプロセス(例えば、拡大増殖の単位操作を含み、かつ/または細胞の拡大増殖を引き起こすことを意図した工程を含むプロセス)などの代替プロセスから作製されたアウトプット組成物よりもエフェクターメモリーRA T細胞の部分および/または頻度が低い。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、拡大増殖を含むプロセス(例えば、拡大増殖の単位操作を含み、かつ/または細胞の拡大増殖を引き起こすことを意図した工程を含むプロセス)などの代替プロセスから作製されたアウトプット組成物よりも、ナイーブ様細胞およびセントラルメモリー細胞の部分および/または頻度が高く、かつエフェクターメモリーおよびエフェクターメモリーRA T細胞の部分および/または頻度が低い。
【０５７８】
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、ナイーブ様および/またはセントラルメモリー細胞の部分および/または頻度が高い。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、セントラルメモリー細胞の部分および/または頻度が高い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくとも30％もしくは30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは95％もしくは約95％、または95％超は、メモリー表現型であるか、ナイーブ様もしくはセントラルメモリー表現型であるか、またはナイーブ様もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはセントラルメモリーT細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも55％もしくは55％もしくは約55％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、または少なくとも65％もしくは65％もしくは約65％は、ナイーブ様もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはセントラルメモリーT細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞の少なくとも30％もしくは30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは95％もしくは約95％、または95％超は、ナイーブ様もしくはセントラルメモリーCD4+ T細胞であるか、またはセントラルメモリーCD4+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞の少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも55％もしくは55％もしくは約55％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、または少なくとも65％もしくは65％もしくは約65％は、ナイーブ様もしくはセントラルメモリーCD4+ T細胞であるか、またはセントラルメモリーCD4+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞の40％もしくは約40％〜65％もしくは約65％、40％もしくは約40％〜45％もしくは約45％、45％もしくは約45％〜50％もしくは約50％、50％もしくは約50％〜55％もしくは約55％、55％もしくは約55％〜60％もしくは約60％、または60％もしくは約60％〜65％もしくは約65％は、ナイーブ様またはセントラルメモリーCD4+ T細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD4+CAR+ T細胞の少なくとも30％もしくは30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは95％もしくは約95％、または95％超は、ナイーブ様もしくはセントラルメモリーCD4+CAR+ T細胞であるか、またはセントラルメモリーCD4+CAR+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD4+CAR+ T細胞の少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも55％もしくは55％もしくは約55％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、または少なくとも65％もしくは65％もしくは約65％は、ナイーブ様もしくはセントラルメモリーCD4+CAR+ T細胞であるか、またはセントラルメモリーCD4+CAR+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD4+CAR+ T細胞の40％もしくは約40％〜65％もしくは約65％、40％もしくは約40％〜45％もしくは約45％、45％もしくは約45％〜50％もしくは約50％、50％もしくは約50％〜55％もしくは約55％、55％もしくは約55％〜60％もしくは約60％、または60％もしくは約60％〜65％もしくは約65％は、ナイーブ様もしくはセントラルメモリーCD4+CAR+ T細胞であるか、またはセントラルメモリーCD4+CAR+ T細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD8+ T細胞の少なくとも30％もしくは30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは95％もしくは約95％、または95％超は、ナイーブ様もしくはセントラルメモリーCD8+ T細胞であるか、またはセントラルメモリーCD8+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD8+ T細胞の少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも55％もしくは55％もしくは約55％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、または少なくとも65％もしくは65％もしくは約65％は、ナイーブ様もしくはセントラルメモリーCD8+ T細胞であるか、またはセントラルメモリーCD8+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD8+ T細胞の40％もしくは約40％〜65％もしくは約65％、40％もしくは約40％〜45％もしくは約45％、45％もしくは約45％〜50％もしくは約50％、50％もしくは約50％〜55％もしくは約55％、55％もしくは約55％〜60％もしくは約60％、または60％もしくは約60％〜65％もしくは約65％は、ナイーブ様もしくはセントラルメモリーCD8+ T細胞であるか、またはセントラルメモリーCD8+ T細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD8+CAR+ T細胞の少なくとも30％もしくは30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは95％もしくは約95％、または95％超は、ナイーブ様もしくはセントラルメモリーCD8+CAR+ T細胞であるか、��たはセントラルメモリーCD8+CAR+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD8+CAR+ T細胞の少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも55％もしくは55％もしくは約55％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、または少なくとも65％もしくは65％もしくは約65％は、ナイーブ様もしくはセントラルメモリーCD8+CAR+ T細胞であるか、またはセントラルメモリーCD8+CAR+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD8+CAR+ T細胞の40％もしくは約40％〜65％もしくは約65％、40％もしくは約40％〜45％もしくは約45％、45％もしくは約45％〜50％もしくは約50％、50％もしくは約50％〜55％もしくは約55％、55％もしくは約55％〜60％もしくは約60％、または60％もしくは約60％〜65％もしくは約65％は、ナイーブ様もしくはセントラルメモリーCD8+CAR+ T細胞であるか、またはセントラルメモリーCD8+CAR+ T細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCAR+ T細胞(例えば、CD4+CAR+ T細胞およびCD8+CAR+ T細胞)の少なくとも30％もしくは30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは95％もしくは約95％、または95％超は、ナイーブ様もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはセントラルメモリーT細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCAR+ T細胞(例えば、CD4+CAR+ T細胞およびCD8+CAR+ T細胞)の少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも55％もしくは55％もしくは約55％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、または少なくとも65％もしくは65％もしくは約65％は、ナイーブ様もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはセントラルメモリーT細胞である。いくつかの態様において、組成物中のCAR+ T細胞の少なくとも30％もしくは30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは95％もしくは約95％、または95％超は、CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、グランザイムB-、および/またはCD127+である。いくつかの態様において、組成物中のCAR+ T細胞の少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも55％もしくは55％もしくは約55％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、または少なくとも65％もしくは65％もしくは約65％は、CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、グランザイムB-、および/またはCD127+である。
【０５７９】
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくとも85％または85％または約85％は、ナイーブ様もしくはセントラルメモリー表現型であるか、またはナイーブ様もしくはセントラルメモリーT細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の15％未満または15％または約15％は、エフェクターもしくはエフェクターRA表現型であるか、またはエフェクターもしくはエフェクターRA T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、消耗および/または老化している細胞の部分および/または頻度が低い。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、消耗したおよび/または老化した細胞の部分および/または頻度が低い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の40％未満もしくは約40％未満、35％未満もしくは約35％未満、30％未満もしくは約30％未満、25％未満もしくは約25％未満、20％未満もしくは約20％未満、15％未満もしくは約15％未満、10％未満もしくは約10％未満、5％未満もしくは約5％未満、または1％未満もしくは約1％未満が、消耗および/または老化している。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の25％未満もしくは約25％未満が、消耗および/または老化している。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の10％未満もしくは約10％未満が、消耗および/または老化している。
【０５８０】
いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、CD27およびCD28の発現、例えば表面発現について陰性である細胞の部分および/または頻度が低い。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、CD27-CD28-細胞の部分および/または頻度が低い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の40％未満もしくは約40％未満、35％未満もしくは約35％未満、30％未満もしくは約30％未満、25％未満もしくは約25％未満、20％未満もしくは約20％未満、15％未満もしくは約15％未満、10％未満もしくは約10％未満、5％未満もしくは約5％未満、または1％未満もしくは約1％未満がCD27-CD28-細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の25％未満もしくは約25％未満がCD27-CD28-細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の10％未満もしくは約10％未満がCD27-CD28-細胞である。態様において、アウトプット組成物の細胞の5％未満もしくは約5％未満がCD27-CD28-細胞である。
【０５８１】
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、CD27およびCD28の発現、例えば表面発現について陽性である細胞の部分および/または頻度が高い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、CD27+CD28+細胞の部分および/または頻度が高い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくとももしくは少なくとも約50％、少なくとももしくは少なくとも約60％、少なくとももしくは少なくとも約70％、少なくとももしくは少なくとも約75％、少なくとももしくは少なくとも約80％、少なくとももしくは少なくとも約85％、少なくとももしくは少なくとも約90％、少なくとももしくは少なくとも約95％、または95％超もしくは約95％超がCD27+CD28+細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の25％未満もしくは約25％未満がCD27-CD28-細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくとももしくは少なくとも約50％がCD27+CD28+細胞である。態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくとももしくは少なくとも約75％がCD27+CD28+細胞である。
【０５８２】
特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、TEMRA細胞である細胞の部分および/または頻度が低い。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、TEMRA細胞の部分および/または頻度が低い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の40％未満もしくは約40％未満、35％未満もしくは約35％未満、30％未満もしくは約30％未満、25％未満もしくは約25％未満、20％未満もしくは約20％未満、15％未満もしくは約15％未満、10％未満もしくは約10％未満、5％未満もしくは約5％未満、または1％未満もしくは約1％未満がTEMRA細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の25％未満もしくは約25％未満がTEMRA細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の10％未満もしくは約10％未満がTEMRA細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の5％未満もしくは約5％未満がTEMRA細胞である。
【０５８３】
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、CCR7発現について陰性であり、かつCD45RA発現、例えば表面発現について陽性である細胞の部分および/または頻度が低い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、CCR7-CD45RA+細胞の部分および/または頻度が低い。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞の40％未満もしくは約40％未満、35％未満もしくは約35％未満、30％未満もしくは約30％未満、25％未満もしくは約25％未満、20％未満もしくは約20％未満、15％未満もしくは約15％未満、10％未満もしくは約10％未満、5％未満もしくは約5％未満、または1％未満もしくは約1％未満がCCR7-CD45RA+細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の25％未満もしくは約25％未満がCCR7-CD45RA+細胞である。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞の10％未満もしくは約10％未満がCCR7-CD45RA+細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の5％未満もしくは約5％未満がCCR7-CD45RA+細胞である。
【０５８４】
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、分化の初期段階のT細胞、または分化の初期段階のT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞の部分および/または頻度が高い。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、拡大増殖を含むプロセス(例えば、拡大増殖の単位操作を含み、かつ/または細胞の拡大増殖を引き起こすことを意図した工程を含むプロセス)などの代替プロセスから作製されたアウトプット組成物よりも、分化の初期段階のT細胞の部分および/または頻度が高い。ある種の態様において、分化の初期段階のT細胞は、ある種の細胞マーカーの陽性もしくは高い発現(例えば、表面発現もしくは細胞内発現)および/または他の細胞マーカーの陰性もしくは低い発現(例えば、表面発現もしくは細胞内発現)によって特徴づけられる場合がある。いくつかの局面では、分化の初期段階のT細胞は、CCR7および/またはCD27の陽性または高い発現によって特徴づけられる。ある種の態様において、分化の初期段階のT細胞または分化の初期段階のT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞はCCR7+CD27+である。
【０５８５】
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、分化の中間段階のT細胞、または分化の中間段階のT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞の部分および/または頻度が低い。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、拡大増殖を含むプロセスなどの代替プロセスから作製されたアウトプット組成物よりも、分化の中間段階のT細胞の部分および/または頻度が低い。ある種の態様において、分化の中間段階のT細胞は、ある種の細胞マーカーの陽性もしくは高い発現(例えば、表面発現もしくは細胞内発現)および/または他の細胞マーカーの陰性もしくは低い発現(例えば、表面発現もしくは細胞内発現)によって特徴づけられる場合がある。ある種の態様において、分化の中間段階のT細胞または分化の中間段階のT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞はCCR7+CD27-である。ある種の態様において、分化の中間段階のT細胞または分化の中間段階のT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞はCCR7-CD27+である。ある種の態様において、分化の中間段階のT細胞または分化の中間段階のT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞は、CCR7+CD27-である細胞およびCCR7-CD27+である細胞を含む。
【０５８６】
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、高度に分化したT細胞、または高度に分化したT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞の部分および/または頻度が低い。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、拡大増殖を含むプロセスなどの代替プロセスから作製されたアウトプット組成物よりも、高度に分化したT細胞の部分および/または頻度が低い。ある種の態様において、高度に分化したT細胞は、ある種の細胞マーカーの陽性もしくは高い発現(例えば、表面発現もしくは細胞内発現)および/または他の細胞マーカーの陰性もしくは低い発現(例えば、表面発現もしくは細胞内発現)によって特徴づけられる場合がある。いくつかの局面では、高度に分化したT細胞は、CCR7および/またはCD27の陰性または低い発現によって特徴づけられる。ある種の態様において、高度に分化したT細胞または高度に分化したT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であるT細胞はCCR7-CD27-である。
【０５８７】
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、拡大増殖を含むプロセスなどの代替プロセスから作製されたアウトプット組成物よりも、分化の初期段階のT細胞(例えば、CCR7+CD27+である細胞)の部分および/または頻度が高く、分化の中間段階のT細胞(例えば、CCR7+CD27-である細胞および/またはCCR7-CD27+である細胞)の部分および/または頻度が低く、かつ高度に分化したT細胞(例えば、CCR7-CD27-である細胞)の部分および/または頻度が低い。
【０５８８】
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、拡大増殖を含むプロセスなどの代替プロセスから作製されたアウトプット組成物よりもナイーブ様細胞およびセントラルメモリー細胞の部分および/または頻度が高い。ある種の態様において、ナイーブ様細胞およびセントラルメモリー細胞は、分化の初期段階のT細胞、例えば、CCR7+CD27+である細胞を含む、様々な分化状態の細胞を含む。
【０５８９】
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、CCR7およびCD27の発現、例えば、表面発現について陽性である細胞の部分および/または頻度が高い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、CCR7+CD27+細胞の部分および/または頻度が高い。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の5％未満もしくは約5％未満、10％未満もしくは約10％未満、15％未満もしくは約15％未満、20％未満もしくは約20％未満、25％未満もしくは約25％未満、または30％未満もしくは約30％未満は、CCR7-またはCD27-細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくとも30％もしくは30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは95％もしくは約95％、少なくとも98％もしくは98％もしくは約98％、または98％超は、CCR7+CD27+である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも55％もしくは55％もしくは約55％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、または少なくとも65％もしくは65％もしくは約65％はCCR7+CD27+である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞の少なくとも30％もしくは30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは95％もしくは約95％、または95％超はCCR7+CD27+である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞の少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも55％もしくは55％もしくは約55％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、または少なくとも65％もしくは65％もしくは約65％はCCR7+CD27+である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞の40％もしくは約40％〜65％もしくは約65％、40％もしくは約40％〜45％もしくは約45％、45％もしくは約45％〜50％もしくは約50％、50％もしくは約50％〜55％もしくは約55％、55％もしくは約55％〜60％もしくは約60％、または60％もしくは約60％〜65％もしくは約65％はCCR7+CD27+である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD4+CAR+ T細胞の少なくとも30％もしくは30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは95％もしくは約95％、または95％超はCCR7+CD27+であ���。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD4+CAR+ T細胞の少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも55％もしくは55％もしくは約55％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、または少なくとも65％もしくは65％もしくは約65％はCCR7+CD27+である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD4+CAR+ T細胞の40％もしくは約40％〜65％もしくは約65％、40％もしくは約40％〜45％もしくは約45％、45％もしくは約45％〜50％もしくは約50％、50％もしくは約50％〜55％もしくは約55％、55％もしくは約55％〜60％もしくは約60％、または60％もしくは約60％〜65％もしくは約65％はCCR7+CD27+である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD8+ T細胞の少なくとも30％もしくは30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは95％もしくは約95％、または95％超はCCR7+CD27+である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD8+ T細胞の少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも55％もしくは55％もしくは約55％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、または少なくとも65％もしくは65％もしくは約65％はCCR7+CD27+である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD8+ T細胞の40％もしくは約40％〜65％もしくは約65％、40％もしくは約40％〜45％もしくは約45％、45％もしくは約45％〜50％もしくは約50％、50％もしくは約50％〜55％もしくは約55％、55％もしくは約55％〜60％もしくは約60％、または60％もしくは約60％〜65％もしくは約65％はCCR7+CD27+である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD8+CAR+ T細胞の少なくとも30％もしくは30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは95％もしくは約95％、または95％超はCCR7+CD27+である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD8+CAR+ T細胞の少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも55％もしくは55％もしくは約55％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、または少なくとも65％もしくは65％もしくは約65％はCCR7+CD27+である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD8+CAR+ T細胞の40％もしくは約40％〜65％もしくは約65％、40％もしくは約40％〜45％もしくは約45％、45％もしくは約45％〜50％もしくは約50％、50％もしくは約50％〜55％もしくは約55％、55％もしくは約55％〜60％もしくは約60％、または60％もしくは約60％〜65％もしくは約65％はCCR7+CD27+である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCAR+ T細胞(例えば、CD4+CAR+ T細胞およびCD8+CAR+ T細胞)の少なくとも30％もしくは30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは95％もしくは約95％、または95％超はCCR7+CD27+である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCAR+ T細胞(例えば、CD4+CAR+ T細胞およびCD8+CAR+ T細胞)の少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも55％もしくは55％もしくは約55％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、または少なくとも65％もしくは65％もしくは約65％はCCR7+CD27+である。いくつかの態様において、組成物中のCAR+ T細胞の少なくとも30％もしくは30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは95％もしくは約95％、または95％超は、CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、グランザイムB-、および/またはCD127+である。いくつかの態様において、組成物中のCAR+ T細胞の少なくとも50％もしくは50％もしくは約50％、少なくとも55％もしくは55％もしくは約55％、少なくとも60％もしくは60％もしくは約60％、または少なくとも65％もしくは65％もしくは約65％はCD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、グランザイムB-、および/またはCD127+である。
【０５９０】
いくつかの態様において、組み換え受容体を発現しているCD3+ T細胞を含み、および/またはそれが濃縮されている治療用T細胞組成物が本明細書において提供され、その際、組成物中の総受容体+/CD3+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％はCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも95％もしくは少なくとも約95％、少なくとも96％もしくは少なくとも約96％、少なくとも97％もしくは少なくとも約97％、少なくとも98％もしくは少なくとも約98％、少なくとも99％もしくは少なくとも約99％、約100％、または100％はCD3+ T細胞である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも90％または少なくとも約90％はCD3+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD3+細胞の少なくとも40％もしくは少なくとも約40％、少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、または少なくとも90％もしくは少なくとも約90％は、CD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも95％または少なくとも約95％はCD3+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD3+細胞の少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、または少なくとも90％もしくは少なくとも約90％はCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも98％または少なくとも約98％はCD3+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD3+細胞の少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、または少なくとも90％もしくは少なくとも約90％はCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％はCD3+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％はCD27+CCR7+であり、組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％はCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも90％はCD3+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％はCD27+CCR7+であり、組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％はCD27+CCR7+である。
【０５９１】
いくつかの態様において、組み換え受容体を発現しているCD3+ T細胞を含み、および/またはそれが濃縮されている治療用T細胞組成物が本明細書において提供され、その際、組成物中の総受容体+/CD3+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％は、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも95％もしくは少なくとも約95％、少なくとも96％もしくは少なくとも約96％、少なくとも97％もしくは少なくとも約97％、少なくとも98％もしくは少なくとも約98％、少なくとも99％もしくは少なくとも約99％、約100％、または100％はCD3+ T細胞である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも90％もしくは少なくとも約90％はCD3+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD3+細胞の少なくとも40％もしくは少なくとも約40％、少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、または少なくとも90％もしくは少なくとも約90％は、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも95％または少なくとも約95％はCD3+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD3+細胞の少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、または少なくとも90％もしくは少なくとも約90％はナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも98％または少なくとも約98％はCD3+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD3+細胞の少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、または少なくとも90％もしくは少なくとも約90％は、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、または90％はCD3+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％はナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であり、組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％は、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性である。いくつかの態���において、組成物中の細胞の少なくとも90％はCD3+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、または90％は、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であり、組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％はナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性である。
【０５９２】
いくつかの態様において、組み換え受容体を発現しているCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含み、および/またはそれが濃縮されている治療用T細胞組成物が、本明細書において提供され、その際、組成物中の総受容体+/CD4+および受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％はCD27+CCR7+である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも95％もしくは少なくとも約95％、少なくとも96％もしくは少なくとも約96％、少なくとも97％もしくは少なくとも約97％、少なくとも98％もしくは少なくとも約98％、少なくとも99％もしくは少なくとも約99％、約100％、または100％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞である。
【０５９３】
いくつかの態様において、組み換え受容体を発現しているCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含み、および/またはそれが濃縮されている治療用T細胞組成物が、本明細書において提供され、その際、組成物中の総受容体+/CD4+および受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％は、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも95％もしくは少なくとも約95％、少なくとも96％もしくは少なくとも約96％、少なくとも97％もしくは少なくとも約97％、少なくとも98％もしくは少なくとも約98％、少なくとも99％もしくは少なくとも約99％、約100％、または100％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも90％または少なくとも約90％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD4+および受容体+/CD8+細胞の少なくとも40％もしくは少なくとも約40％、少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、または少なくとも90％もしくは少なくとも約90％は、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも95％もしくは少なくとも約95％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD4+および受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、または少なくとも90％もしくは少なくとも約90％は、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも98％もしくは少なくとも約98％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD4+および受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、または少なくとも90％もしくは少なくとも約90％は、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％は、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であり、組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％は、��イーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとも90％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％は、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性であり、組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％は、ナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞であるか、またはナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性である。
【０５９４】
ある種の態様において、組み換え受容体を発現しているCD4+ T細胞および組み換え受容体を発現しているCD8+ T細胞を含む治療用T細胞組成物が本明細書において開示され、その際、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％は、CD27+CCR7+であり、組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％は、CD27+CCR7+であり、その際、組成物中の細胞の少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも95％もしくは少なくとも約95％、少なくとも96％もしくは少なくとも約96％、少なくとも97％もしくは少なくとも約97％、少なくとも98％もしくは少なくとも約98％、少なくとも99％もしくは少なくとも約99％、約100％、または100％は、CD3+ T細胞である。ある種の態様において、組み換え受容体を発現しているCD4+ T細胞および組み換え受容体を発現しているCD8+ T細胞を含む治療用T細胞組成物が本明細書において開示され、その際、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％はCD27+CCR7+であり、組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％はCD27+CCR7+であり、その際、組成物中の細胞の少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも95％もしくは少なくとも約95％、少なくとも96％もしくは少なくとも約96％、少なくとも97％もしくは少なくとも約97％、少なくとも98％もしくは少なくとも約98％、少なくとも99％もしくは少なくとも約99％、約100％、または100％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞である。いくつかの局面では、組成物中の細胞の少なくとも90％または少なくとも約90％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも60％または少なくとも約60％はCD27+CCR7+であり、治療用T細胞組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも40％もしくは少なくとも約40％はCD27+CCR7+である。いくつかの局面では、組成物中の細胞の少なくとも95％または少なくとも約95％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも65％または少なくとも約65％は、CD27+CCR7+であり、治療用T細胞組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも45％または少なくとも約45％はCD27+CCR7+である。いくつかの局面では、組成物中の細胞の少なくとも98％または少なくとも約98％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも75％もしくは少なくとも約75％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、または少なくとも85％もしくは少なくとも約85％はCD27+CCR7+であり、治療用T細胞組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも55％もしくは少なくとも約55％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、または少なくとも65％もしくは少なくとも約65％は、CD27+CCR7+である。いくつかの局面では、組成物中の細胞の少なくとも98％または少なくとも約98％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも75％または少なくとも約75％は、CD27+CCR7+であり、治療用T細胞組成物中の総受容体+/CD4+細���の少なくとも55％または少なくとも約55％は、CD27+CCR7+である。いくつかの局面では、組成物中の細胞の少なくとも98％または少なくとも約98％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも80％または少なくとも約80％は、CD27+CCR7+であり、組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも60％または少なくとも約60％は、CD27+CCR7+である。いくつかの局面では、組成物中の細胞の少なくとも98％または少なくとも約98％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも85％または少なくとも約85％は、CD27+CCR7+であり、組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも65％または少なくとも約65％は、CD27+CCR7+である。いくつかの局面では、組成物中の細胞の少なくとも98％もしくは少なくとも約98％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも90％または少なくとも約90％は、CD27+CCR7+であり、組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも70％または少なくとも約70％は、CD27+CCR7+である。いくつかの局面では、組成物中の細胞の少なくとも90％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも60％は、CD27+CCR7+であり、組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも40％は、CD27+CCR7+である。いくつかの局面では、組成物中の細胞の少なくとも90％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも70％は、CD27+CCR7+であり、組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも50％は、CD27+CCR7+である。いくつかの局面では、組成物中の細胞の少なくとも90％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも70％は、CD27+CCR7+であり、組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも60％は、CD27+CCR7+である。いくつかの局面では、組成物中の細胞の少なくとも95％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも70％は、CD27+CCR7+であり、組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも70％は、CD27+CCR7+である。いくつかの局面では、組成物中の細胞の少なくとも95％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞であり、組成物中の総受容体+/CD8+細胞の少なくとも80％は、CD27+CCR7+であり、組成物中の総受容体+/CD4+細胞の少なくとも80％は、CD27+CCR7+である。
【０５９５】
前記態様のいずれかでは、細胞集団または組成物内の1つまたは複数のマーカー(例えば、CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CCR7、またはCD45RA、その他)について陽性/陰性の細胞の割合は、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物からの割合の平均(average)、平均(mean)、または中央値であることができる。いくつかの態様において、細胞集団または組成物内のマーカーについて陽性の細胞の割合は、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物からのそのような割合の平均である。いくつかの態様において、複数のアウトプット組成物は、複数のインプット組成物から本明細書において開示される方法によって産生され、インプット組成物は、同じ生体サンプルまたは異なる生体サンプル(例えば、PBMCまたはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシスサンプル)に、例えば、同じドナーまたは異なるドナーに由来する場合がある。いくつかの局面では、平均は、本明細書において開示される方法によって産生された約5もしくは少なくとも約5、約10もしくは少なくとも約10、約15もしくは少なくとも約15、約20もしくは少なくとも約20、約25もしくは少なくとも約25、約30もしくは少なくとも約30、約35もしくは少なくとも約35、約40もしくは少なくとも約40、約45もしくは少なくとも約45、約50もしくは少なくとも約50、約55もしくは少なくとも約55、約60もしくは少なくとも約60、約100もしくは少なくとも約100、または約100個超の複数のアウトプット組成物に基づく。
【０５９６】
いくつかの態様において、方法によって産生された複数のアウトプット組成物(例えば、約5もしくは少なくとも約5つ)中に平均して、組成物中のT細胞の総数または組み換えタンパク質を発現している組成物中のT細胞の総数の少なくとも80％もしくは少なくとも約80％もしくは80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％もしくは85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％もしくは90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは少なくとも約95％もしくは95％もしくは約95％、少なくとも96％もしくは少なくとも約96％もしくは96％もしくは約96％、少なくとも97％もしくは少なくとも約97％もしくは97％もしくは約97％、少なくとも98％もしくは少なくとも約98％もしくは98％もしくは約98％、または少なくとも99％もしくは少なくとも約99％もしくは99％もしくは約99％は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞である。いくつかの態様において、方法によって産生された複数のアウトプット組成物(例えば、約5もしくは少なくとも約5つ)中に平均して、組成物中の総受容体+/CD4+および受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％は、ナイーブ様T細胞である、またはナイーブ様T細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性である(例えば、CD27+CCR7+細胞)。いくつかの態様において、本明細書において開示される方法によって産生された複数(例えば、約5もしくは少なくとも約5つ)のアウトプット組成物は、平均して、少なくとも50％、60％、70％、80％もしくは90％のナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞を含む、または組成物中の総受容体+/CD4+および受容体+/CD8+細胞のナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性である。いくつかの態様において、本明細書において開示される方法によって産生された複数(例えば、約5もしくは少なくとも約5つ)のアウトプット組成物は、平均して、組成物中の総受容体+/CD4+および受容体+/CD8+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％のCD27+CCR7+細胞を含む。いくつかの態様において、本明細書において開示される方法によって産生された複数(例えば、約5もしくは少なくとも約5つ)のアウトプット組成物は、平均して、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも95％もしくは少なくとも約95％、少なくとも96％もしくは少なくとも約96％、少なくとも97％もしくは少なくとも約97％、少なくとも98％もしくは少なくとも約98％、または少なくとも99％もしくは少なくとも約99％のCD3+ T細胞を含む。いくつかの態様において、本明細書において開示される方法によって産生された複数(例えば、約5もしくは少なくとも約5つ)のアウトプット組成物は、平均して、少なくとも50％、60％、70％、80％もしくは90％のナイーブ様T細胞を含むか、または組成物中の総受容体+/CD3+細胞のナイーブ様T細胞(例えば、CD27+CCR7+細胞)上に発現されるマーカーについて表面陽性である。いくつかの態様において、本明細書において開示される方法によって産生された複数(例えば、約5もしくは少なくとも約5つ)のアウトプット組成物は、平均して、少なくとも50％、60％、70％、80％もしくは90％のナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞を含��か、または組成物中の総受容体+/CD3+細胞のナイーブ様T細胞もしくはセントラルメモリーT細胞上に発現されるマーカーについて表面陽性である。いくつかの態様において、本明細書において開示される方法によって産生された複数(例えば、約5もしくは少なくとも約5つ)のアウトプット組成物は、平均して、組成物中の総受容体+/CD3+細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％または90％のCD27+CCR7+細胞を含む。
【０５９７】
II.  無血清培地配合物および関連構成成分
提供される方法の1つまたは複数の工程は、基礎培地中にグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含有する無血清培地の存在下で行うことができる。血清代替タンパク質のような少なくとも1つのタンパク質、または細胞の維持、成長および/もしくは拡大増殖を指示する1つもしくは複数の他の構成成分を含有する1つまたは複数のサプリメントを含む、1つまたは複数のさらなるサプリメントを添加することができる。いくつかの態様において、無血清培地は、合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)を含有する。いくつかの態様において、合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、0.5mMまたは約0.5mM〜5mMまたは約5mM(例えば2mM)である。いくつかの態様において、L-グルタミンの濃度は、0.5mMまたは約0.5mM〜5mMまたは約5mM(例えば2mM)である。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は、ヒトタンパク質または組み換えタンパク質、例えば血清代替タンパク質、例えばアルブミンである。いくつかの態様において、無血清培地は、1つまたは複数の組み換えサイトカイン(例えばIL-2、IL-7、またはIL-15)をさらに含む。いくつかの態様において、無血清培地は、1つまたは複数の組み換えサイトカイン(例えばIL-2、IL-7、またはIL-15)をさらに含まない。いくつかの態様において、無血清培地は、フェノールレッドを含まない。
【０５９８】
いくつかの態様において、提供される無血清培地は、液体基礎培地および1つまたは複数のサプリメントから生成または調製される。
【０５９９】
いくつかの態様において、無血清培地は、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミンである合成アミノ酸などの、細胞培養においてL-グルタミンに変換されることができる合成アミノ酸を含有することができる。場合によっては、合成アミノ酸は、L-グルタミンおよびタンパク質を含まない基礎培地中に提供される。いくつかの態様において、合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、0.5 mMまたは約0.5 mMから5 mMまたは約5 mM (例えば2 mM)である。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質はヒト由来タンパク質、組換えタンパク質、または両方である。いくつかの態様において、基礎培地はフェノールレッドを含まない。
【０６００】
いくつかの態様において、無血清培地を調製するためのサプリメントの中には、サプリメントが凍結されているか、またはL-グルタミンがその構成成分になった後に凍結されている、少なくとも1つのタンパク質と、グルタミンの遊離形態、例えばL-グルタミンとを含むサプリメントがある。いくつかの態様において、サプリメント中のL-グルタミンの濃度は、200 mM未満、例えば150 mM未満、100 mMまたはそれ以下、例えば20 mM〜120 mM、または40 mM〜100 mM、例えば約80 mMである。いくつかの態様において、サプリメントが基礎培地と組み合わされた後のL-グルタミンの濃度は、約0.5 mM〜約5 mM (例えば2 mM)である。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は非哺乳動物起源のものではない。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は、ヒトタンパク質もしくはヒト由来タンパク質であるか、または組換えである。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質はアルブミン、例えばヒトまたは組換えヒトアルブミンを含む。
【０６０１】
A. 基礎培地
いくつかの態様において、基礎培地は、グルコースなどの炭素原、水、1種または複数種の塩、ならびにアミノ酸および窒素の供給源を含む。
【０６０２】
いくつかの態様において、基礎培地はアミノ酸を含む。いくつかの態様において、アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、セリン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン、スレオニン、アルギニン、アラニン、チロシン、システイン、バリン、メチオニン、ノルバリン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、および/またはプロリンを含む。
【０６０３】
いくつかの態様において、基礎培地は、少なくとも1つの合成アミノ酸を含む。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、細胞を含む細胞培養物中でグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)に変換することができる。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は免疫細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作された細胞である。いくつかの態様において、細胞はT細胞である。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作されたT細胞である。いくつかの態様において、細胞は、組換え受容体(例えば、キメラ抗原受容体)を発現するように遺伝子操作されている。いくつかの態様において、細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)発現T細胞である。
【０６０４】
いくつかの態様において、合成アミノ酸は、グルタミンの安定化形態(すなわち、L-グルタミン)である。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、水溶液(例えば、基礎培地)中でグルタミン(すなわち、L-グルタミン)よりも安定である。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に有意な量のグルタミンを生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に有意な量のピロリドンカルボン酸またはアンモニアを生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に少なくとも約1、3、5、7、9、11、13、または14日間、有意な量のグルタミン(すなわち、L-グルタミン)を生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、または8週間、有意な量のグルタミン(すなわち、L-グルタミン)を生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12ヶ月間、有意な量のグルタミン(すなわち、L-グルタミン)を生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に少なくとも1、2、3、4、または5年間、有意な量のグルタミン(すなわち、L-グルタミン)を生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に少なくとも約1、3、5、7、9、11、13、または14日間、有意な量のピロリドンカルボン酸またはアンモニアを生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、または8週間、有意な量のピロリドンカルボン酸またはアンモニアを生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12ヶ月間、有意な量のピロリドンカルボン酸またはアンモニアを生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に少なくとも1、2、3、4、または5年間、有意な量のピロリドンカルボン酸またはアンモニアを生成しない。
【０６０５】
いくつかの態様において、合成アミノ酸は、水溶液(例えば、基礎培地)に可溶性である。いくつかの態様において、水溶液中の合成アミノ酸の溶解度は、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)よりも高い。
【０６０６】
いくつかの態様において、合成アミノ酸は細胞に輸送されることができ、そこで合成アミノ酸はグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)に変換されることができる。いくつかの態様において、細胞は免疫細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作された細胞である。いくつかの態様において、細胞はT細胞である。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作されたT細胞である。いくつかの態様において、細胞は、組換え受容体(例えば、キメラ抗原受容体)を発現するように遺伝子操作されている。いくつかの態様において、細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)発現T細胞である。
【０６０７】
いくつかの態様において、合成アミノ酸はジペプチドである。いくつかの態様において、合成アミノ酸はトリペプチドである。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、L-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)、例えば基礎培地中で自発的に分解しないGlutamax（商標）におけるジペプチドである。
【０６０８】
いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、約0.5 mM〜5 mMである。いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、2 mMまたは約2 mMである。いくつかの態様において、L-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、0.5 mM〜1 mM、0.5 mM〜1.5 mM、0.5 mM〜2 mM、0.5 mM〜2.5 mM、0.5 mM〜3 mM、0.5 mM〜3.5 mM、0.5 mM〜4 mM、0.5 mM〜4.5 mM、0.5 mM〜5 mM、1 mM〜1.5 mM、1 mM〜2 mM、1 mM〜2.5 mM、1 mM〜3 mM、1 mM〜3.5 mM、1 mM〜4 mM、1 mM〜4.5 mM、1 mM〜5 mM、1.5 mM〜2 mM、1.5 mM〜2.5 mM、1.5 mM〜3 mM、1.5 mM〜3.5 mM、1.5 mM〜4 mM、1.5 mM〜4.5 mM、1.5 mM〜5 mM、2 mM〜2.5 mM、2 mM〜3 mM、2 mM〜3.5 mM、2 mM〜4 mM、2 mM〜4.5 mM、2 mM〜5 mM、2.5 mM〜3 mM、2.5 mM〜3.5 mM、2.5 mM〜4 mM、2.5 mM〜4.5 mM、2.5 mM〜5 mM、3 mM〜3.5 mM、3 mM〜4 mM、3 mM〜4.5 mM、3 mM〜5 mM、3.5 mM〜4 mM、3.5 mM〜4.5 mM、3.5 mM〜5 mM、4 mM〜4.5 mM、4 mM〜5 mMもしくは4.5 mM〜5 mM、または約0.5 mM〜1 mM、約0.5 mM〜1.5 mM、約0.5 mM〜2 mM、約0.5 mM〜2.5 mM、約0.5 mM〜3 mM、約0.5 mM〜3.5 mM、約0.5 mM〜4 mM、約0.5 mM〜4.5 mM、約0.5 mM〜5 mM、約1 mM〜1.5 mM、約1 mM〜2 mM、約1 mM〜2.5 mM、約1 mM〜3 mM、約1 mM〜3.5 mM、約1 mM〜4 mM、約1 mM〜4.5 mM、約1 mM〜5 mM、約1.5 mM〜2 mM、約1.5 mM〜2.5 mM、約1.5 mM〜3 mM、約1.5 mM〜3.5 mM、約1.5 mM〜4 mM、約1.5 mM〜4.5 mM、約1.5 mM〜5 mM、約2 mM〜2.5 mM、約2 mM〜3 mM、約2 mM〜3.5 mM、約2 mM〜4 mM、約2 mM〜4.5 mM、約2 mM〜5 mM、約2.5 mM〜3 mM、約2.5 mM〜3.5 mM、約2.5 mM〜4 mM、約2.5 mM〜4.5 mM、約2.5 mM〜5 mM、約3 mM〜3.5 mM、約3 mM〜4 mM、約3 mM〜4.5 mM、約3 mM〜5 mM、約3.5 mM〜4 mM、約3.5 mM〜4.5 mM、約3.5 mM〜5 mM、約4 mM〜4.5 mM、約4 mM〜5 mMもしくは約4.5 mM〜5 mM（それぞれ両端の値を含む）である。いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、5 mM〜7.5 mM、5 mM〜10 mM、5 mM〜12.5 mM、5 mM〜15 mM、5 mM〜17.5 mM、5 mM〜20 mM、7.5 mM〜10 mM、7.5 mM〜12.5 mM、7.5 mM〜15 mM、7.5 mM〜17.5 mM、7.5 mM〜20 mM、10 mM〜12.5 mM、10 mM〜15 mM、10 mM〜17.5 mM、10 mM〜20 mM、12.5 mM〜15 mM、12.5 mM〜17.5 mM、12.5 mM〜20 mM、15 mM〜17.5 mM、15 mM〜20 mMもしくは17.5 mM〜20 mM、または約5 mM〜7.5 mM、約5 mM〜10 mM、約5 mM〜12.5 mM、約5 mM〜15 mM、約5 mM〜17.5 mM、約5 mM〜20 mM、約7.5 mM〜10 mM、約7.5 mM〜12.5 mM、約7.5 mM〜15 mM、約7.5 mM〜17.5 mM、約7.5 mM〜20 mM、約10 mM〜12.5 mM、約10 mM〜15 mM、約10 mM〜17.5 mM、約10 mM〜20 mM、約12.5 mM〜15 mM、約12.5 mM〜17.5 mM、約12.5 mM〜20 mM、約15 mM〜17.5 mM、約15 mM〜20 mMもしくは約17.5 mM〜20 mM（それぞれ両端の値を含む）である。いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、少なくとも0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mMもしくは5 mM、または少なくとも約0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mMもしくは5 mMである。いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、2 mMであるか、または約2 mMである。いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、多くても2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mM、5 mM、5.5 mM、6 mM、6.5 mM、7 mM、7.5 mM、8 mM、8.5 mM、9 mM、9.5 mM、10 mM、12.5 mM、15 mM、17.5 mMも���くは20 mM、または約2 mM、約2.5 mM、約3 mM、約3.5 mM、約4 mM、約4.5 mM、約5 mM、約5.5 mM、約6 mM、約6.5 mM、約7 mM、約7.5 mM、約8 mM、約8.5 mM、約9 mM、約9.5 mM、約10 mM、約12.5 mM、約15 mM、約17.5 mMもしくは約20 mMである。
【０６０９】
いくつかの態様において、基礎培地は、L-グルタミンを含まないか、または有意な量のL-グルタミンを含まない。
【０６１０】
いくつかの態様において、基礎培地はL-グルタミンを含む。いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンの濃度は、0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mMもしくは0.5 mMであるか、または約0.1 mM、約0.2 mM、約0.3 mM、約0.4 mMもしくは約0.5 mMであるか、または0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mMもしくは0.5 mM未満であるか、または約0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mMもしくは0.5 mM未満である。いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンの濃度は、1 mM、2 mM、3 mM、4 mMもしくは5 mMであるか、約1 mM、約2 mM、約3 mM、約4 mMもしくは約5 mMであるか、または1 mM、2 mM、3 mM、4 mMもしくは5 mM未満であるか、または約1 mM、2 mM、3 mM、4 mMもしくは5 mM未満である。いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンの濃度は、2 mMまたは約2 mMである。
【０６１１】
いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸、例えばグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)に変換されることができる少なくとも1つの合成アミノ酸、例えばL-アラニル-L-グルタミンなどの、L-グルタミンのジペプチド形態が、基礎培地中に提供される。いくつかの態様において、基礎培地は人工または合成培地である。いくつかの態様において、基礎培地は平衡塩類溶液(例えば、PBS、DPBS、HBSS、EBSS)であるか、それらを含む。いくつかの態様において、基礎培地は、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、最小必須培地(MEM)、イーグル基礎培地(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、グラスゴー最小必須培地(GMEM)、アルファ最小必須培地(アルファMEM)、イスコフ改変ダルベッコ培地およびM199から選択される。いくつかの態様において、基礎培地は複合培地(例えば、RPMI-1640、IMDM)である。いくつかの態様において、基礎培地は、OpTmizer(商標) CTS(商標) T細胞拡大増殖基礎培地(ThermoFisher)である。
【０６１２】
いくつかの態様において、基礎培地は、無機塩、糖、アミノ酸の栄養混合物を含み、ビタミン、有機酸、抗酸化剤、および/または緩衝液を任意で含有してもよい。
【０６１３】
いくつかの態様において、基礎培地は、CO32-およびHCO3-を含む。いくつかの態様において、基礎培地のCO32-/HCO3-含量は、気体CO2 (例えば、5〜10％)で平衡化され、それによって培地中の最適pHを維持する。いくつかの態様において、基礎培地は、両性イオン、例えばHEPESを含む。いくつかの態様において、基礎培地はフェノールレッドを含む。いくつかの態様において、基礎培地はフェノールレッドを含まない。
【０６１４】
いくつかの態様において、基礎培地は無機塩を含む。いくつかの態様において、無機塩は浸透圧平衡を促進する。いくつかの態様において、無機塩は、ナトリウム、カリウム、およびカルシウムイオンを提供することによって膜電位を調節する。
【０６１５】
いくつかの態様において、基礎培地は、1つまたは複数の炭水化物を含む。いくつかの態様において、炭水化物はグルコースを含む。いくつかの態様において、炭水化物はガラクトースを含む。いくつかの態様において、炭水化物はマルトースを含む。いくつかの態様において、炭水化物はフルクトースを含む。
【０６１６】
いくつかの態様において、基礎培地は脂肪酸を含む。いくつかの態様において、基礎培地は脂質を含む。いくつかの態様において、基礎培地はビタミン(例えば、ビタミンA、ビタミンB7、ビタミンB9、ビタミンB12、ビタミンC、ビタミンE)を含む。いくつかの態様において、基礎培地は微量元素を含む。いくつかの態様において、微量元素は銅を含む。いくつかの態様において、微量元素は亜鉛を含む。いくつかの態様において、微量元素はセレンを含む。いくつかの態様において、微量元素はトリカルボン酸中間体を含む。
【０６１７】
いくつかの態様において、基礎培地は、無機塩、糖、アミノ酸、および任意で、ビタミン、有機酸および/もしくは緩衝液または他の周知の細胞培養栄養素の混合物を含有する。栄養素に加えて、培地はpHと浸透圧を維持するのにも役立つ。いくつかの局面において、基礎培地の試薬は、細胞の成長、増殖および/または拡大増殖を支持する。多種多様な基礎培地が入手可能であり、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、ロズウェルパーク記念研究所培地(RPMI)、イスコフ改変ダルベッコ培地およびハム培地を含む。いくつかの態様において、基礎培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地、RPMI-1640、またはα-MEMである。
【０６１８】
いくつかの態様において、基礎培地はタンパク質を含まない。いくつかの態様において、基礎培地は、ヒトタンパク質(例えば、ヒト血清タンパク質)を含まない。いくつかの態様において、基礎培地は無血清である。いくつかの態様において、基礎培地は、ヒト由来の血清を含まない。いくつかの態様において、基礎培地は組み換えタンパク質を含まない。いくつかの態様において、基礎培地は、ヒトタンパク質および組み換えタンパク質を含まない。
【０６１９】
いくつかの態様において、基礎培地はタンパク質またはペプチドを含む。いくつかの態様において、タンパク質はアルブミンまたはアルブミン代替物である。いくつかの態様において、アルブミンはヒト由来アルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは組み換えアルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは天然のヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは組み換えヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは非ヒト供給源からの組み換えアルブミンである。アルブミン代替物は、任意のタンパク質またはポリペプチド源であり得る。そのようなタンパク質またはポリペプチドサンプルの例としては、ウシ下垂体抽出物、植物加水分解物(例えば、米加水分解物)、ウシ胎児アルブミン(フェチュイン)、卵アルブミン、ヒト血清アルブミン(HSA)、または別の動物由来アルブミン、ニワトリ抽出物、ウシ胚抽出物、AlbuMAX(登録商標)I、およびAlbuMAX(登録商標)IIが挙げられるが、それに限定されるわけではない。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドはトランスフェリンを含む。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドはフィブロネクチンを含む。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドはアプロチニンを含む。いくつかの態様において、タンパク質はフェチュインを含む。
【０６２０】
いくつかの態様において、基礎培地(例えば、OpTmizer(商標)CTS(商標)T細胞拡大増殖基礎培地)は液体配合物である。いくつかの態様において、基礎培地は、意図された使用の前に、凍結されていないか、または(例えば、そのプロトコルに従って)凍結されないように指示される。いくつかの態様において、基礎培地は、2℃〜8℃または約2℃〜8℃で貯蔵される。いくつかの態様において、基礎培地は室温で貯蔵される。いくつかの態様において、基礎培地は、2℃〜8℃で貯蔵された場合、少なくとも1、2、3、4、5もしくは6週間または約1、2、3、4、5もしくは6週間安定である。いくつかの態様において、基礎培地は、2℃〜8℃で貯蔵された場合、少なくとも1、2、3、4、5もしくは6ヶ月間、または少なくとも約1、2、3、4、5もしくは6ヶ月間安定である。
【０６２１】
B.  付加的な構成成分およびサプリメント
いくつかの態様において、無血清培地は、基礎培地と、1つまたは複数のサプリメントによって提供することができる1つまたは複数の付加的な構成成分とを含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のサプリメントは、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含む少なくとも第1のサプリメントを含む。いくつかの態様において、そのようなサプリメントは、使用および/または基礎培地への組み入れの前に凍結される。いくつかの態様において、本明細書において記述されるものなどのサプリメントは、培地サプリメント(例えば、基礎培地のための培地サプリメント)として用いられることが意図されている。いくつかの態様において、第1のサプリメントおよび/またはさらなるサプリメントは、細胞の維持を提供する。いくつかの態様において、細胞は初代細胞である。いくつかの態様において、細胞は免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞はT細胞である。いくつかの態様において、細胞はCD4 T細胞またはCD8 T細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト由来の細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト由来の免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト由来のT細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト由来の初代免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作された細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒトに由来する遺伝子操作された細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト由来の遺伝子操作されたT細胞(例えば、キメラ抗原受容体(CAR)発現T細胞)である。
【０６２２】
いくつかの態様において、第1のサプリメントは、その意図された使用の前に、-20℃〜0℃または約-20℃〜約0℃で貯蔵されるか、または貯蔵されることが推奨される。いくつかの態様において、サプリメントは、約0℃未満で貯蔵されるか、または貯蔵されることが推奨される。いくつかの態様において、サプリメントは、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)がその構成成分になった直後にまたはすぐ後に、サプリメントがその意図された用途に用いられる時まで凍結される。いくつかの態様において、サプリメントは、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)がその構成成分になった後に大部分の時間、サプリメントがその意図された用途に用いられる時まで凍結される。いくつかの態様において、サプリメントは、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)がその構成成分になった後に1、2、3、4、5、6、または7日超の間、サプリメントがその意図された用途に用いられる時まで液体として保持されない。いくつかの態様において、サプリメントは、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)がその構成成分になった後に4、8、12、16、20もしくは24時間超または約4、8、12、16、20もしくは24時間超の間、サプリメントがその意図された用途に用いられる時まで液体として保持されない。いくつかの態様において、サプリメントは、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)がその構成成分になる前と後の両方の大部分の時間、サプリメントがその意図された用途に用いられる時まで凍結される。いくつかの態様において、サプリメントは、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)がサプリメントの構成成分になる時に室温であるか、または室温未満である(例えば、サプリメントの温度は20℃、15℃、10℃、5℃もしくは0℃よりも下または約20℃、15℃、10℃、5℃もしくは0℃よりも下である)。一局面において、L-グルタミンの不安定性のせいで起こる可能性がある、無血清培地配合物中の変わりやすいグルタミン濃度および/または増加し続けるアンモニア濃度を最小限にするために、凍結したサプリメント中のL-グルタミンの存在は、基礎培地の添加前にその安定性を確実にした。
【０６２３】
いくつかの態様において、サプリメントが解凍された場合、サプリメント中の遊離形態L-グルタミンは沈殿しない。いくつかの態様において、サプリメントが液体である場合、サプリメント中の遊離形態L-グルタミンは沈殿しない。いくつかの態様において、サプリメントが室温下で解凍される場合、サプリメント中の遊離形態L-グルタミンは沈殿しない。いくつかの態様において、サプリメント中のL-グルタミンの遊離形態の濃度は、400mM、300mM、200mM、180mM、160mM、140mM、120mM、100mMもしくは80mMであるか、または約400mM、300mM、200mM、180mM、160mM、140mM、120mM、100mMもしくは80mMであるか、または400mM、300mM、200mM、180mM、160mM、140mM、120mM、100mMもしくは80mM未満であるか、または約400mM、300mM、200mM、180mM、160mM、140mM、120mM、100mMもしくは80mM未満である。いくつかの態様において、サプリメント中のL-グルタミンの濃度は約200mMである。
【０６２４】
いくつかの態様において、サプリメント中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるこものなど)と組み合わされた後に、培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度が0.5 mM〜5 mMまたは約0.5 mM〜5 mMであるようなものである。いくつかの態様において、基礎培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、2 mMまたは約2 mMである。いくつかの態様において、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、0.5 mM〜1 mM、0.5 mM〜1.5 mM、0.5 mM〜2 mM、0.5 mM〜2.5 mM、0.5 mM〜3 mM、0.5 mM〜3.5 mM、0.5 mM〜4 mM、0.5 mM〜4.5 mM、0.5 mM〜5 mM、1 mM〜1.5 mM、1 mM〜2 mM、1 mM〜2.5 mM、1 mM〜3 mM、1 mM〜3.5 mM、1 mM〜4 mM、1 mM〜4.5 mM、1 mM〜5 mM、1.5 mM〜2 mM、1.5 mM〜2.5 mM、1.5 mM〜3 mM、1.5 mM〜3.5 mM、1.5 mM〜4 mM、1.5 mM〜4.5 mM、1.5 mM〜5 mM、2 mM〜2.5 mM、2 mM〜3 mM、2 mM〜3.5 mM、2 mM〜4 mM、2 mM〜4.5 mM、2 mM〜5 mM、2.5 mM〜3 mM、2.5 mM〜3.5 mM、2.5 mM〜4 mM、2.5 mM〜4.5 mM、2.5 mM〜5 mM、3 mM〜3.5 mM、3 mM〜4 mM、3 mM〜4.5 mM、3 mM〜5 mM、3.5 mM〜4 mM、3.5 mM〜4.5 mM、3.5 mM〜5 mM、4 mM〜4.5 mM、4 mM〜5 mMもしくは4.5 mM〜5 mM、または約0.5 mM〜1 mM、約0.5 mM〜1.5 mM、約0.5 mM〜2 mM、約0.5 mM〜2.5 mM、約0.5 mM〜3 mM、約0.5 mM〜3.5 mM、約0.5 mM〜4 mM、約0.5 mM〜4.5 mM、約0.5 mM〜5 mM、約1 mM〜1.5 mM、約1 mM〜2 mM、約1 mM〜2.5 mM、約1 mM〜3 mM、約1 mM〜3.5 mM、約1 mM〜4 mM、約1 mM〜4.5 mM、約1 mM〜5 mM、約1.5 mM〜2 mM、約1.5 mM〜2.5 mM、約1.5 mM〜3 mM、約1.5 mM〜3.5 mM、約1.5 mM〜4 mM、約1.5 mM〜4.5 mM、約1.5 mM〜5 mM、約2 mM〜2.5 mM、約2 mM〜3 mM、約2 mM〜3.5 mM、約2 mM〜4 mM、約2 mM〜4.5 mM、約2 mM〜5 mM、約2.5 mM〜3 mM、約2.5 mM〜3.5 mM、約2.5 mM〜4 mM、約2.5 mM〜4.5 mM、約2.5 mM〜5 mM、約3 mM〜3.5 mM、約3 mM〜4 mM、約3 mM〜4.5 mM、約3 mM〜5 mM、約3.5 mM〜4 mM、約3.5 mM〜4.5 mM、約3.5 mM〜5 mM、約4 mM〜4.5 mM、約4 mM〜5 mMもしくは約4.5 mM〜5 mM（それぞれ両端の値を含む）である。いくつかの態様において、基礎培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、5 mM〜7.5 mM、5 mM〜10 mM、5 mM〜12.5 mM、5 mM〜15 mM、5 mM〜17.5 mM、5 mM〜20 mM、7.5 mM〜10 mM、7.5 mM〜12.5 mM、7.5 mM〜15 mM、7.5 mM〜17.5 mM、7.5 mM〜20 mM、10 mM〜12.5 mM、10 mM〜15 mM、10 mM〜17.5 mM、10 mM〜20 mM、12.5 mM〜15 mM、12.5 mM〜17.5 mM、12.5 mM〜20 mM、15 mM〜17.5 mM、15 mM〜20 mMもしくは17.5 mM〜20 mM、または約5 mM〜7.5 mM、約5 mM〜10 mM、約5 mM〜12.5 mM、約5 mM〜15 mM、約5 mM〜17.5 mM、約5 mM〜20 mM、約7.5 mM〜10 mM、約7.5 mM〜12.5 mM、約7.5 mM〜15 mM、約7.5 mM〜17.5 mM、約7.5 mM〜20 mM、約10 mM〜12.5 mM、約10 mM〜15 mM、約10 mM〜17.5 mM、約10 mM〜20 mM、約12.5 mM〜15 mM、約12.5 mM〜17.5 mM、約12.5 mM〜20 mM、約15 mM〜17.5 mM、約15 mM〜20 mMもしくは約17.5 mM〜20 mM（それぞれ両端の値を含む）である。いくつかの態様において、基礎培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、少なくとも0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mMもしくは5 mM、または少なくとも約0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mMもしくは5 mMである。いくつかの態様において、基礎培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、多くても2 mMまたは約2 mMである。
【０６２５】
いくつかの態様において、第1のサプリメントは、1つまたは複数のさらなる構成成分を含有する。いくつかの態様において、第2のサプリメントのような、さらなるサプリメントが、1つまたは複数のさらなる構成成分を提供するために提供される。いくつかの態様において、サプリメント、すなわち第1のサプリメントおよび任意で1つまたは複数のさらなるサプリメント、例えば第2のサプリメントは、基礎培地と組み合わされて、基礎培地に1つまたは複数のさらなる構成成分を提供する。
【０６２６】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、少なくとも1つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は非哺乳動物起源のものではない。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は、ヒトのものであるか、またはヒトに由来する。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は組換えである。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、インスリン、フィブロネクチン、アプロチニンまたはフェチュインを含む。いくつかの態様において、タンパク質は、アルブミン、インスリンまたはトランスフェリンの1つまたは複数、任意でヒトまたは組換えアルブミン、インスリンまたはトランスフェリンの1つまたは複数を含む。
【０６２７】
いくつかの態様において、タンパク質はアルブミンまたはアルブミン代替物である。いくつかの態様において、アルブミンはヒト由来アルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは組換えアルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは天然のヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは組換えヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは非ヒト供給源からの組換えアルブミンである。アルブミン代替物は、任意のタンパク質またはポリペプチド源であり得る。そのようなタンパク質またはポリペプチド試料の例としては、ウシ下垂体抽出物、植物加水分解物(例えば、米加水分解物)、ウシ胎児アルブミン(フェチュイン)、卵アルブミン、ヒト血清アルブミン(HSA)、または別の動物由来アルブミン、ニワトリ抽出物、ウシ胚抽出物、AlbuMAX(登録商標) I、およびAlbuMAX(登録商標) IIが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０６２８】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、アルブミンを含む。いくつかの態様において、アルブミンはヒトアルブミンであるか、またはヒトアルブミンに由来する。いくつかの態様において、アルブミンはヒト血清またはヒト血漿に由来する。いくつかの態様において、アルブミンは組換えアルブミンである。いくつかの態様において、組換えアルブミンはヒトに由来する。いくつかの態様において、組換えアルブミンはヒトに由来しない。いくつかの態様において、サプリメントは天然アルブミンを含む。いくつかの態様において、天然アルブミンはヒトに由来する。いくつかの態様において、天然アルブミンはヒトに由来しない。いくつかの態様において、サプリメント中のアルブミンの濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、培地中のアルブミンの濃度またはおおよその濃度が、0 mg/mLもしくは約0 mg/mLから、2 mg/mLもしくは約2 mg/mL、0 mg/mLもしくは約0 mg/mLから、4 mg/mLもしくは約4 mg/mL、0 mg/mLもしくは約0 mg/mLから、6 mg/mLもしくは約6 mg/mL、0 mg/mLもしくは約0 mg/mLから、8 mg/mLもしくは約8 mg/mL、0 mg/mLもしくは約0 mg/mLから、10 mg/mLもしくは約10 mg/mL、0 mg/mLもしくは約0 mg/mLから、12 mg/mLもしくは約12 mg/mL、2 mg/mLもしくは約2 mg/mLから、4 mg/mLもしくは約4 mg/mL、2 mg/mLもしくは約2 mg/mLから、6 mg/mLもしくは約6 mg/mL、2 mg/mLもしくは約2 mg/mLから、8 mg/mLもしくは約8 mg/mL、2 mg/mLもしくは約2 mg/mLから、10 mg/mLもしくは約10 mg/mL、2 mg/mLもしくは約2 mg/mLから、12 mg/mLもしくは約12 mg/mL、4 mg/mLもしくは約4 mg/mLから、6 mg/mLもしくは約6 mg/mL、4 mg/mLもしくは約4 mg/mLから、8 mg/mLもしくは約8 mg/mL、4 mg/mLもしくは約4 mg/mLから、10 mg/mLもしくは約10 mg/mL、4 mg/mLもしくは約4 mg/mLから、12 mg/mLもしくは約12 mg/mL、6 mg/mLもしくは約6 mg/mLから、8 mg/mLもしくは約8 mg/mL、6 mg/mLもしくは約6 mg/mLから、10 mg/mLもしくは約10 mg/mL、6 mg/mLもしくは約6 mg/mLから、12 mg/mLもしくは約12 mg/mL、8 mg/mLもしくは約8 mg/mLから、10 mg/mLもしくは約10 mg/mL、8 mg/mLもしくは約8 mg/mLから、12 mg/mLもしくは約12 mg/mL、10 mg/mLもしくは約10 mg/mLから、12 mg/mLもしくは約12 mg/mL、または10 mg/mLもしくは約10 mg/mLから、15 mg/mLもしくは約15 mg/mL（それぞれ両端の値を含む）であるようなものである。いくつかの態様において、培地中のアルブミンは、5 mg/mLまたは約5 mg/mLである。
【０６２９】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物を含む。いくつかの態様において、トランスフェリン代替物は、サプリメント中のトランスフェリンを置き換えて、トランスフェリンと実質的に同様の結果を与え得る化合物である。トランスフェリン代替物の例としては、任意の鉄キレート化合物が挙げられるが、これに限定されることはない。用いられ得る鉄キレート化合物は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸(EGTA)、メシル酸デフェロキサミン、ジメルカプトプロパノール、ジエチレントリアミン五酢酸(DPTA)、およびトランス-l,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N',N'-四酢酸(CDTA)の鉄キレート、ならびにクエン酸第二鉄キレートおよび硫酸第一鉄キレートを含むが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、トランスフェリンは鉄飽和トランスフェリンである。いくつかの態様において、トランスフェリンは鉄飽和ヒトトランスフェリンである。
【０６３０】
いくつかの態様において、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物は、ヒトトランスフェリンであるか、またはヒトトランスフェリンに由来する。いくつかの態様において、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物は、ヒト血清または血漿に由来する。いくつかの態様において、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物は、組換えトランスフェリンである。いくつかの態様において、トランスフェリンの濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、培地中のトランスフェリンの濃度が10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、50 mg/Lもしくは約50 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、100 mg/Lもしくは約100 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、150 mg/Lもしくは約150 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、200 mg/Lもしくは約200 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、250 mg/Lもしくは約250 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、300 mg/Lもしくは約300 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、350 mg/Lもしくは約350 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、400 mg/Lもしくは約400 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、450 mg/Lもしくは約450 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、500 mg/Lもしくは約500 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、550 mg/Lもしくは約550 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、600 mg/Lもしくは約600 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、650 mg/Lもしくは約650 mg/L、または10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、750 mg/Lもしくは約750 mg/Lである。いくつかの態様において、トランスフェリンの濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、培地中のトランスフェリンの濃度が100 mg/Lまたは約100 mg/Lであるようなものである。いくつかの態様において、トランスフェリンの濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、培地中のトランスフェリンの濃度が50 mg/Lもしくは約50 mg/Lから、150 mg/Lもしくは約150 mg/Lであるようなものである。
【０６３１】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、インスリンまたはインスリン代替物を含む。いくつかの態様において、インスリン代替物は、インスリンの代わりに用いられて、インスリンと実質的に同様の結果をもたらし得る亜鉛含有化合物である。インスリン代替物の例としては、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、臭化亜鉛、および硫酸亜鉛が挙げられるが、これらに限定されることはない。いくつかのインスリンが当業者に知られている。Gilman, A.G. et al, Eds., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press, New York, 1990, pp. 1463-1495を参照されたい。いくつかの態様において、インスリン代替物ではなく、インスリンがサプリメントおよび培地において用いられる。いくつかの態様において、インスリンは亜鉛インスリンである。いくつかの態様において、インスリンはヒト亜鉛インスリンである。
【０６３２】
いくつかの態様において、インスリンはヒトインスリンであるか、またはヒトインスリンに由来する。いくつかの態様において、インスリンは組換えインスリンである。いくつかの態様において、インスリンは組換えヒトインスリンである。いくつかの態様において、インスリン(またはインスリン代替物)の濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、培地中のインスリン(またはインスリン代替物)のおおよその濃度が約1 mg/Lから、2.5 mg/Lもしくは約2.5 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、5 mg/Lもしくは約5 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、7.5 mg/Lもしくは約7.5 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、10 mg/Lもしくは約10 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、12.5 mg/Lもしくは約12.5 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、15 mg/Lもしくは約15 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、17.5 mg/Lもしくは約17.5 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、20 mg/Lもしくは約20 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、22.5 mg/Lもしくは約22.5 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、25 mg/Lもしくは約25 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、27.5 mg/Lもしくは約27.5 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、30 mg/Lもしくは約30 mg/Lである。いくつかの態様において、培地中のインスリンまたはインスリン代替物の濃度は、10 mg/Lまたは約10 mg/Lである。いくつかの態様において、培地中のインスリンまたはインスリン代替物の濃度は、7.5 mg/Lもしくは約7.5 mg/Lから、12.5 mg/Lもしくは約12.5 mg/Lである。
【０６３３】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は成長因子を含む。いくつかの態様において、成長因子は上皮成長因子(EGF)を含む。いくつかの態様において、成長因子は線維芽細胞成長因子(FGF)を含む。いくつかの態様において、成長因子はインスリン様成長因子(IGF)を含む。いくつかの態様において、成長因子は神経成長因子(NGF)を含む。いくつかの態様において、成長因子は血小板由来成長因子(PDGF)を含む。いくつかの態様において、成長因子は形質転換成長因子(TGF)を含む。
【０６３４】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、ホルモン(例えば、成長ホルモン、インスリン、ヒドロコルチゾン、トリヨードチロニン、エストロゲン、アンドロゲン、プロゲステロン、プロラクチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン放出ペプチド)を含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、アルファグロブリンまたはベータグロブリンを含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、ペプチドまたはペプチド画分(例えば、動物、微生物または植物に由来するタンパク質加水分解物)を含む。
【０６３５】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は脂質を含む。いくつかの態様において、脂質はコレステロールを含む。いくつかの態様において、脂質はステロイドを含む。いくつかの態様において、脂質は脂肪酸(例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸)を含む。いくつかの態様において、脂質はエタノールアミンを含む。いくつかの態様において、脂質はコリンを含む。いくつかの態様において、脂質はイノシトールを含む。
【０６３６】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は遷移金属を含む。いくつかの態様において、遷移金属は鉄を含む。いくつかの態様において、遷移金属は亜鉛を含む。いくつかの態様において、遷移金属は銅を含む。いくつかの態様において、遷移金属はクロムを含む。いくつかの態様において、遷移金属はヨウ素を含む。いくつかの態様において、遷移金属はコバルトを含む。いくつかの態様において、遷移金属はセレンを含む。いくつかの態様において、遷移金属はマグネシウムを含む。いくつかの態様において、遷移金属は、モリブデンを含む。
【０６３７】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分はビタミンを含む。いくつかの態様において、ビタミンは脂溶性ビタミン(例えば、ビタミンA、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK)を含む。いくつかの態様において、ビタミンは水溶性ビタミン(例えば、B1、B2、B6、B12、C、葉酸)を含む。
【０６３８】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分はポリアミンを含む。いくつかの態様において、ポリアミンはプトレシンを含む。いくつかの態様において、ポリアミンはスペルミジンを含む。いくつかの態様において、ポリアミンはスペルミンを含む。
【０６３９】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は還元剤を含む。いくつかの態様において、還元剤は2-メルカプトエタノールを含む。いくつかの態様において、還元剤はアルファ-チオグリセロールを含む。いくつかの態様において、還元剤は還元グルタチオンを含む。
【０６４０】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は保護添加剤を含む。いくつかの態様において、保護添加剤はカルボキシメチルセルロースを含む。いくつかの態様において、保護添加剤はポリビニルピロリドンを含む。いくつかの態様において、保護添加剤はプルロニックF-68を含む。いくつかの態様において、保護添加剤はTween 80を含む。
【０６４１】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、接着因子を含む。いくつかの態様において、接着因子はフィブロネクチンを含む。いくつかの態様において、接着因子はラミニンを含む。
【０６４２】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、1つまたは複数の抗酸化剤、1つまたは複数のアルブミンまたはアルブミン代替物、1つまたは複数の脂質剤、1つまたは複数のインスリンまたはインスリン代替物、1つまたは複数のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、1つまたは複数の微量元素、および1つまたは複数のグルココルチコイドの1つまたは複数である。いくつかの態様において、抗酸化剤は、N-アセチル-L-システイン、2-メルカプトエタノールもしくはD,L-酢酸トコフェロール、またはそれらの誘導体もしくは混合物を含む。いくつかの態様において、アルブミンはヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、脂質剤は、Human Ex-Cite(登録商標)もしくはエタノールアミンまたはそれらの誘導体および混合物を含む。いくつかの態様において、インスリンはヒト亜鉛インスリンである。いくつかの態様において、トランスフェリンはヒト鉄飽和トランスフェリンである。いくつかの態様において、微量元素はSe4+である。いくつかの態様において、グルココルチコイドはヒドロコルチゾンである。いくつかの態様において、サプリメントは濃縮される。
【０６４３】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、1つまたは複数の抗酸化剤、ならびに1つまたは複数のアルブミンまたはアルブミン代替物、1つまたは複数の脂質剤、1つまたは複数のインスリンまたはインスリン代替物、1つまたは複数のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、1つまたは複数の微量元素、および1つまたは複数のグルココルチコイドからなる群より選択される1つまたは複数の成分を含む。
【０６４４】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、N-アセチル-Lシステイン、ヒト血清アルブミン、Human Ex-Cyte(登録商標)、エタノールアミン、ヒト亜鉛インスリン、ヒト鉄飽和トランスフェリン、Se4+、ヒドロコルチゾン、D,L-酢酸トコフェロール、および/または2-メルカプトエタノールの1つまたは複数を含む。
【０６４５】
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、N-アセチル-L-システイン(NAC)を含む。いくつかの態様において、NACの濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、基礎培地中のNACの濃度が10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、50 mg/Lもしくは約50 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、100 mg/Lもしくは約100 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、150 mg/Lもしくは約150 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、200 mg/Lもしくは約200 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、250 mg/Lもしくは約250 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、300 mg/Lもしくは約300 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、350 mg/Lもしくは約350 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、400 mg/Lもしくは約400 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、450 mg/Lもしくは約450 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、500 mg/Lもしくは約500 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、550 mg/Lもしくは約550 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、600 mg/Lもしくは約600 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、650 mg/Lもしくは約650 mg/L、10 mg/Lもしくは約10 mg/Lから、700 mg/Lもしくは約700 mg/Lである。
【０６４６】
いくつかの態様において、基礎培地中のNACの濃度は、0mMまたは約0mMから、1mMまたは約1mM、0mMまたは約0mMから、2mMまたは約2mM、0mMまたは約0mMから、3mMまたは約3mM、0mMまたは約0mMから、4mMまたは約4mM、0mMまたは約0mMから、5mMまたは約5mM、0mMまたは約0mMから、6mMまたは約6mM、0mMまたは約0mMから、7mMまたは約7mM、0mMまたは約0mMから、8mMまたは約8mM、0mMまたは約0mMから、9mMまたは約9mM、0mMまたは約0mMから、10mMまたは約10mM、0mMまたは約0mMから、12mMまたは約12mM、0mMまたは約0mMから、14mMまたは約14mM、0mMまたは約0mMから、16mMまたは約16mM、0mMまたは約0mMから、18mMまたは約18mM、0mMまたは約0mMから、20mMまたは約20mMである。
【０６４７】
いくつかの態様において、1つまたは複数の付加的な構成成分は、エタノールアミンを含む。いくつかの態様において、エタノールアミンの濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、基礎培地中のエタノールアミンの濃度が0mg/Lまたは約0mg/Lから、2mg/Lまたは約2mg/L、0mg/Lまたは約0mg/Lから、4mg/Lまたは約4mg/L、0mg/Lまたは約0mg/Lから、6mg/Lまたは約6mg/L、0mg/Lまたは約0mg/Lから、8mg/Lまたは約8mg/L、0mg/Lまたは約0mg/Lから、10mg/Lまたは約10mg/L、0mg/Lまたは約0mg/Lから、12mg/Lまたは約12mg/L、0mg/Lまたは約0mg/Lから、14mg/Lまたは約14mg/L、0mg/Lまたは約0mg/Lから、16mg/Lまたは約16mg/L、0mg/Lまたは約0mg/Lから、18mg/Lまたは約18mg/L、0mg/Lまたは約0mg/Lから、20mg/Lまたは約20mg/L、0mg/Lまたは約0mg/Lから、22mg/Lまたは約22mg/L、0mg/Lまたは約0mg/Lから、24mg/Lまたは約24mg/L、0mg/Lまたは約0mg/Lから、26mg/Lまたは約26mg/L、0mg/Lまたは約0mg/Lから、28mg/Lまたは約28mg/L、0mg/Lまたは約0mg/Lから、30mg/Lまたは約30mg/Lであるようなものである。
【０６４８】
いくつかの態様において、1つまたは複数の付加的な構成成分は、1つまたは複数のサプリメント、例えば第1のサプリメントおよび1つまたは複数のさらなるまたは付加的なサプリメントを基礎培地に添加することによって提供されることができる。
【０６４９】
いくつかの態様において、第1のサプリメントは、L-グルタミンを、1つまたは複数の所望の構成成分を含有する既存のサプリメントに添加するか、またはそれと混合することによって調製される。いくつかの態様において、L-グルタミンは血清代替サプリメント、例えば、免疫細胞血清代替物、例えば、ThermoFisher、#A2598101またはCTS(商標)免疫細胞血清代替物に添加されるか、またはそれと混合される。いくつかの態様において、L-グルタミンは、Smith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31に記述されている免疫細胞血清代替物を含むサプリメントに添加されるか、またはそれと混合される。
【０６５０】
いくつかの態様において、無血清培地配合物は、90％〜98.75％(v/v)または約90％〜約98.75％(v/v)の基礎培地および1.25％〜10％(v/v)または約1.25％〜約10％(v/v)の第1のサプリメントを含む。いくつかの態様において、無血清培地配合物は、90％〜97.5％(v/v)または約90％〜約97.5％(v/v)の基礎培地および1.25％〜5％(v/v)または約1.25％〜約5％(v/v)の第1のサプリメントを含む。いくつかの態様において、無血清培地配合物は、95％(v/v)または約95％(v/v)の基礎培地および2.5％±0.2％(v/v)または約2.5％±0.2％(v/v)、例えば2.5％(v/v)または約2.5％(v/v)の第1のサプリメントを含む。いくつかの態様において、1リットルの基礎培地に、25ミリリットルまたは約25ミリリットルの第1のサプリメントが補充される。
【０６５１】
いくつかの態様において、1つまたは複数の付加的な構成成分を提供するために、さらなるサプリメント、例えば第2のサプリメントが基礎培地と組み合わされる。いくつかの態様において、第2のサプリメントは、1つまたは複数の抗酸化剤、1つまたは複数のアルブミンまたはアルブミン代替物、1つまたは複数の脂質剤、1つまたは複数のインスリンまたはインスリン代替物、1つまたは複数のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、1つまたは複数の微量元素、および1つまたは複数のグルココルチコイドを含む、上記のいずれかのような1つまたは複数の付加的な構成成分を含む。第2のサプリメントの例示的な構成成分は、上に記述されている。いくつかの態様において、第2のサプリメントは、アルブミン、N-アセチルシステイン(NAC)およびエタノールアミンを含む。いくつかの態様において、第2のサプリメントは、アルブミン、N-アセチルシステイン(NAC)およびエタノールアミンを含み、ここでアルブミン、NACおよび/またはエタノールアミンの濃度は、第2のサプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、アルブミン、NACおよび/またはエタノールアミンの濃度が、本明細書において記述されるものと実質的に同じであるようなものである。いくつかの態様において、アルブミンはヒト由来のアルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは、ヒト血漿または血清からのヒト由来アルブミンである。いくつかの態様において、第2のサプリメントは液体であり、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含まないか、またはその有意な量を含まない。いくつかの態様において、第2のサプリメントは、OpTmizer(登録商標)サプリメント(Thermofisher、A1048503の一部)を含む。
【０６５２】
いくつかの態様において、第2のサプリメントは液体である。いくつかの態様において、第2のサプリメントは貯蔵のために凍結されないか、または凍結されることが推奨されない。いくつかの態様において、無血清培地配合物は、約1.25％〜約5％(v/v)、例えば2.5％±0.2％または約2.5％±0.2％、例えば2.5％もしくは2.6％または約2.5％もしくは約2.6％の第2のサプリメントを含む。いくつかの態様において、1リットルの基礎培地に、約26ミリリットルの第2のサプリメントが補充される。いくつかの態様において、無血清培地配合物は、90％〜97.5％(v/v)または約90％〜約97.5％(v/v)の基礎培地および1.25％〜5％(v/v)または約1.25％〜約5％(v/v)の第2のサプリメントを含む。いくつかの態様において、無血清培地配合物は、95％または約95％(v/v)の基礎培地および2.5％±0.2％(v/v)または約2.5％±0.2％(v/v)、例えば2.5％(v/v)もしくは2.6％(v/v)または約2.5％(v/v)もしくは約2.6％(v/v)の第2のサプリメントを含む。いくつかの態様において、1リットルの基礎培地に、25ミリリットルもしくは26ミリリットルまたは約25ミリリットルもしくは26ミリリットルの第2のサプリメントが補充される。
【０６５３】
いくつかの態様において、第1のサプリメント(例えば血清代替サプリメント、例えばCTS(商標)免疫細胞血清代替物)とさらなるサプリメント(例えばOpTmizer(登録商標)細胞サプリメント)との両方が基礎培地に添加される。いくつかの態様において、無血清培地配合物は、約90％〜97.5％(v/v)の基礎培地、約1.25％〜5％(v/v)の第1のサプリメント、および約1.25％〜5％(v/v)の第2のサプリメントを含む。いくつかの態様において、無血清培地配合物は、約95％(v/v)の基礎培地、約2.5％±0.2％(v/v)の第1のサプリメント、および約2.5％±0.2％(v/v)の第2のサプリメントを含む。
【０６５４】
いくつかの態様において、1つまたは複数のサプリメントは、2または約2倍から、100倍または約100倍濃縮される。いくつかの態様において、サプリメントは、40倍または約40倍の配合物である。いくつかの態様において、1リットルの基礎培地に、第1のサプリメントと場合によっては1つまたは複数のさらなるサプリメントとを含む少なくとも1つのサプリメントが、20〜30ミリリットルまたは約20〜30ミリリットル、例えば25±2ミリリットル、補充される。
【０６５５】
C.  無血清培地
いくつかの態様において、無血清培地は、基礎培地および合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含む。いくつかの態様において、無血清培地は、基礎培地および合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含む。いくつかの態様において、無血清培地は、例えば操作されたT細胞を作製するための証明されたプロセスの間のT細胞の維持を支援するために、少なくとも1つのタンパク質または付加的な構成成分をさらに含む。
【０６５６】
いくつかの態様において、無血清培地は、細胞を含む細胞培養物中でグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)に変換することができる合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)を含有する形態であり、ここで培地は無血清である。いくつかの態様において、合成アミノ酸は水溶液(例えば、無血清培地)に可溶性である。いくつかの態様において、水溶液中の合成アミノ酸の溶解度は、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)よりも高い。いくつかの態様において、無血清培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、0.5mM〜5mMまたは約0.5mM〜約5mMである。いくつかの態様において、無血清培地中のL-グルタミンのジペプチド形態の(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、2mMまたは約2mMである。いくつかの態様において、L-グルタミンのジペプチド形態の(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、0.5mM〜1mM、0.5mM〜1.5mM、0.5mM〜2mM、0.5mM〜2.5mM、0.5mM〜3mM、0.5mM〜3.5mM、0.5mM〜4mM、0.5mM〜4.5mM、もしくは0.5mM〜5mM、または約0.5mM〜1mM、約0.5mM〜1.5mM、約0.5mM〜2mM、約0.5mM〜2.5mM、約0.5mM〜3mM、約0.5mM〜3.5mM、約0.5mM〜4mM、約0.5mM〜4.5mM、もしくは約0.5mM〜5mM（それぞれ両端の値を含む）である。いくつかの態様において、無血清培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、少なくとも0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、もしくは5mM、または少なくとも約0.5mM、約1mM、約1.5mM、約2mM、約2.5mM、約3mM、約3.5mM、約4mM、約4.5mM、もしくは約5mMである。いくつかの態様において、無血清培地中のL-グルタミンのジペプチド形態、例えばL-アラニル-L-グルタミンの濃度は、2mMまたは約2mMであり、無血清培地中のL-グルタミンの遊離形態の濃度は、2mMまたは約2mMである。
【０６５７】
いくつかの態様において、無血清培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、約0.5mM〜約5mMである。いくつかの態様において、無血清培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、2mMまたは約2mMである。いくつかの態様において、無血清培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、0.5mM〜1mM、0.5mM〜1.5mM、0.5mM〜2mM、0.5mM〜2.5mM、0.5mM〜3mM、0.5mM〜3.5mM、0.5mM〜4mM、0.5mM〜4.5mM、もしくは0.5mM〜5mM、または約0.5mM〜1mM、約0.5mM〜1.5mM、約0.5mM〜2mM、約0.5mM〜2.5mM、約0.5mM〜3mM、約0.5mM〜3.5mM、約0.5mM〜4mM、約0.5mM〜4.5mM、もしくは約0.5mM〜5mM（それぞれ両端の値を含む）である。いくつかの態様において、培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、少なくとも0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、もしくは5mM、または少なくとも約0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、もしくは5mMである。
【０６５８】
いくつかの態様において、無血清培地は少なくとも1つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は非哺乳動物起源のものではない。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は、ヒトのものであるか、またはヒトに由来する。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は組換えである。いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、少なくとも1つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は非哺乳動物起源のものではない。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は、ヒトのものであるか、またはヒトに由来する。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は組換えである。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、インスリン、フィブロネクチン、アプロチニンまたはフェチュインを含む。いくつかの態様において、タンパク質は、アルブミン、インスリンまたはトランスフェリンの1つまたは複数、任意でヒトまたは組換えアルブミン、インスリンまたはトランスフェリンの1つまたは複数を含む。
【０６５９】
いくつかの態様において、無血清培地はアルブミンを含む。いくつかの態様において、アルブミンはヒトに由来する。いくつかの態様において、アルブミンはヒト血清またはヒト血漿に由来する。いくつかの態様において、アルブミンは組換えアルブミンである。いくつかの態様において、組換えアルブミンはヒトに由来する。いくつかの態様において、組換えアルブミンはヒトに由来しない。いくつかの態様において、サプリメントは天然アルブミンを含む。いくつかの態様において、天然アルブミンはヒトに由来する。いくつかの態様において、天然アルブミンはヒトに由来しない。いくつかの態様において、無血清培地中のアルブミンの濃度は、0 mg/mLもしくは約0 mg/mLから、2 mg/mLもしくは約2 mg/mL、0 mg/mLもしくは約0 mg/mLから、4 mg/mLもしくは約4 mg/mL、0 mg/mLもしくは約0 mg/mLから、6 mg/mLもしくは約6 mg/mL、0 mg/mLもしくは約0 mg/mLから、8 mg/mLもしくは約8 mg/mL、0 mg/mLもしくは約0 mg/mLから、10 mg/mLもしくは約10 mg/mL、0 mg/mLもしくは約0 mg/mLから、12 mg/mLもしくは約12 mg/mL、2 mg/mLもしくは約2 mg/mLから、4 mg/mLもしくは約4 mg/mL、2 mg/mLもしくは約2 mg/mLから、6 mg/mLもしくは約6 mg/mL、2 mg/mLもしくは約2 mg/mLから、8 mg/mLもしくは約8 mg/mL、2 mg/mLもしくは約2 mg/mLから、10 mg/mLもしくは約10 mg/mL、2 mg/mLもしくは約2 mg/mLから、12 mg/mLもしくは約12 mg/mL、4 mg/mLもしくは約4 mg/mLから、6 mg/mLもしくは約6 mg/mL、4 mg/mLもしくは約4 mg/mLから、8 mg/mLもしくは約8 mg/mL、4 mg/mLもしくは約4 mg/mLから、10 mg/mLもしくは約10 mg/mL、4 mg/mLもしくは約4 mg/mLから、12 mg/mLもしくは約12 mg/mL、6 mg/mLもしくは約6 mg/mLから、8 mg/mLもしくは約8 mg/mL、6 mg/mLもしくは約6 mg/mLから、10 mg/mLもしくは約10 mg/mL、6 mg/mLもしくは約6 mg/mLから、12 mg/mLもしくは約12 mg/mL、8 mg/mLもしくは約8 mg/mLから、10 mg/mLもしくは約10 mg/mL、8 mg/mLもしくは約8 mg/mLから、12 mg/mLもしくは約12 mg/mL、10 mg/mLもしくは約10 mg/mLから、12 mg/mLもしくは約12 mg/mL、または10 mg/mLもしくは約10 mg/mLから、15 mg/mLもしくは約15 mg/mL（それぞれ両端の値を含む）である。いくつかの態様において、培地中のアルブミンは5 mg/mLまたは約5 mg/mLである。
【０６６０】
いくつかの態様において、無血清培地は、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物(本明細書において記述されるものなど)を含む。いくつかの態様において、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物は、ヒトに由来する。いくつかの態様において、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物は、ヒト血清または血漿に由来する。いくつかの態様において、無血清培地中のトランスフェリンの濃度は、10mg/Lもしくは約10mg/Lから、50mg/Lもしくは約50mg/L、10mg/Lもしくは約10mg/Lから、100mg/Lもしくは約100mg/L、10mg/Lもしくは約10mg/Lから、150mg/Lもしくは約150mg/L、10mg/Lもしくは約10mg/Lから、200mg/Lもしくは約200mg/L、10mg/Lもしくは約10mg/Lから、250mg/Lもしくは約250mg/L、10mg/Lもしくは約10mg/Lから、300mg/Lもしくは約300mg/L、10mg/Lもしくは約10mg/Lから、350mg/Lもしくは約350mg/L、10mg/Lもしくは約10mg/Lから、400mg/Lもしくは約400mg/L、10mg/Lもしくは約10mg/Lから、450mg/Lもしくは約450mg/L、10mg/Lもしくは約10mg/Lから、500mg/Lもしくは約500mg/L、10mg/Lもしくは約10mg/Lから、550mg/Lもしくは約550mg/L、10mg/Lもしくは約10mg/Lから、600mg/Lもしくは約600mg/L、10mg/Lもしくは約10mg/Lから、650mg/Lもしくは約650mg/L、または10mg/Lもしくは約10mg/Lから、750mg/Lもしくは約750mg/Lである。いくつかの態様において、無血清培地中のトランスフェリンの濃度は、100mg/Lもしくは約100mg/Lである。いくつかの態様において、無血清培地中のトランスフェリンの濃度は、50 mg/Lまたは約50 mg/Lから、150 mg/Lである。
【０６６１】
いくつかの態様において、サプリメントは、インスリンまたはインスリン代替物(本明細書において記述されるものなど)を含む。いくつかの態様において、インスリンはヒトに由来する。いくつかの態様において、インスリンは組換えインスリンである。いくつかの態様において、インスリンは組換えヒトインスリンである。いくつかの態様において、無血清培地中のインスリン(またはインスリン代替物)の濃度は、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、2.5 mg/Lもしくは約2.5 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、5 mg/Lもしくは約5 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、7.5 mg/Lもしくは約7.5 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、10 mg/Lもしくは約10 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、12.5 mg/Lもしくは約12.5 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、15 mg/Lもしくは約15 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、17.5 mg/Lもしくは約17.5 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、20 mg/Lもしくは約20 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、22.5 mg/Lもしくは約22.5 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、25 mg/Lもしくは約25 mg/L、1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、27.5 mg/Lもしくは約27.5 mg/L、または1 mg/Lもしくは約1 mg/Lから、30 mg/Lもしくは約30 mg/Lである。いくつかの態様において、無血清培地中のインスリンまたはインスリン代替物の濃度は、10 mg/Lまたは約10 mg/Lである。いくつかの態様において、無血清培地中のインスリンまたはインスリン代替物の濃度は、7.5 mg/Lもしくは約7.5 mg/Lから、12.5 mg/Lもしくは約12.5 mg/Lである。
【０６６２】
いくつかの態様において、無血清培地はフェノールレッドを含まない。いくつかの態様において、無血清培地はフェノールレッドを含む。
【０６６３】
いくつかの態様において、無血清培地は、無機塩、糖、アミノ酸の栄養混合物を含み、ビタミン、有機酸、抗酸化剤、脂質、成長因子、N-アセチルシステイン、エタノールアミンおよび/または緩衝液を任意で含有してもよい。例としては、無機塩、糖、アミノ酸、ビタミン、有機酸、抗酸化剤、脂質、成長因子、N-アセチルシステイン、エタノールアミンおよび/または緩衝液を含む、上記の項におけるような、本明細書において記述されるものが挙げられる。
【０６６４】
いくつかの態様において、無血清培地は、1つまたは複数の抗酸化剤、1つまたは複数のアルブミンまたはアルブミン代替物、1つまたは複数の脂質剤、1つまたは複数のインスリンまたはインスリン代替物、1つまたは複数のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、1つまたは複数の微量元素、1つまたは複数のグルココルチコイド、1つまたは複数の無機塩、1つまたは複数のエネルギー源、1つまたは複数の緩衝剤、1つまたは複数のピルビン酸塩、1つまたは複数のpH指示薬、1つまたは複数のアミノ酸、および1つまたは複数のビタミンの1つまたは複数から選択される1つまたは複数の成分を含む。いくつかの態様において、抗酸化剤は、N-アセチル-L-システイン、2-メルカプトエタノール、およびD,L-酢酸トコフェロール、またはそれらの誘導体もしくは混合物からなる群より選択される。いくつかの態様において、アルブミンはヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、脂質剤は、Human Ex-Cyte(登録商標)およびエタノールアミンである。いくつかの態様において、インスリンはヒト亜鉛インスリンである。いくつかの態様において、トランスフェリンはヒト鉄飽和トランスフェリンである。いくつかの態様において、グルココルチコイドはヒドロコルチゾンである。いくつかの態様において、無機塩成分は、1つまたは複数のカルシウム塩、1つまたは複数のカリウム塩、1つまたは複数のマグネシウム塩、1つまたは複数のナトリウム塩、1つまたは複数の炭酸塩、および1つまたは複数のリン酸塩からなる群より選択される1つまたは複数の無機塩を含む。いくつかの態様において、エネルギー源はD-グルコースである。いくつかの態様において、緩衝剤はHEPESである。いくつかの態様において、ピルビン酸塩はピルビン酸ナトリウムである。いくつかの態様において、pH指示薬はフェノールレッドである。いくつかの態様において、アミノ酸成分は、グリシン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-リシン、L-ロイシン、L-グルタミン、L-アルギニンHCL、L-メチオニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリン、ならびにそれらの塩および誘導体からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、ビタミン成分は、ビオチン、D-パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、i-イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサルHCl、リボフラビン、チアミンHCl、ならびにビタミンB12およびその誘導体からなる群より選択される1つまたは複数のビタミンを含む。いくつかの態様において、成分は、N-アセチル-L-システイン、2-メルカプトエタノール、ヒト血清アルブミン、D,L-酢酸トコフェロール、Human Ex-Cyte(登録商標)、エタノールアミン、ヒト亜鉛インスリン、鉄飽和トランスフェリン、Se4+、ヒドロコルチゾン、Ca2+、K+、Mg2+、Na+、CO32-、PO43-、D-グルコース、HEPES、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッド、グリシン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、 L-フェニルアラニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-リシン、L-ロイシン、L-グルタミン、L-アルギニンHCL、L-メチオニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-スレオニン、L -トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリン、ビオチン、D-パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、i-イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサルHCl、リボフラビン、チアミンHCl、ならびにビタミンB12を含む。
【０６６５】
いくつかの態様において、基礎培地および少なくとも1つのサプリメントを含む無血清培地が提供される。基礎培地およびサプリメントの様々な例が、上記の項においてなど、本明細書において記述されている。
【０６６６】
いくつかの態様において、無血清培地配合物は、90％または約90％から、97.5％または約97.5％ (v/v)の基礎培地、2.5％または約2.5％から、10％または約10％ (v/v)のサプリメント、例えば第1のサプリメントおよび/または第2のサプリメントを含む。いくつかの態様において、無血清培地配合物は、90％または約90％から、97.5％または約97.5％ (v/v)の基礎培地、1.25％または約1.25％から、5％または約5％ (v/v)の第1のサプリメント、および1.25％または約1.25％から、5％または約5％ (v/v)の第2のサプリメントを含む。
【０６６７】
いくつかの態様において、無血清培地は、1つまたは複数のサプリメントを補充された基礎培地、例えばOpTmizer(商標)T細胞拡大増殖基礎培地(ThermoFisher))を含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のサプリメントは無血清である。いくつかの態様において、無血清培地は、OpTmizer(商標)T細胞拡大増殖サプリメント(ThermoFisher)のような、細胞(例えばT細胞)の維持のためのサプリメントを補充された基礎培地を含む。いくつかの態様において、無血清培地は、L-グルタミンのようなアミノ酸の遊離形態をさらに含む。いくつかの態様において、無血清培地は、1つまたは複数の組み換えヒトIL-2、組み換えヒトIL-7、および/または組み換えヒトIL-15のような組み換えサイトカインを含有しない。特定の態様において、無血清培地は、本明細書において記述されるプロセスの任意の1つまたは複数の工程、例えばI項に記述される1つまたは複数の工程に使用することができる。いくつかの態様において、そのような無血清培地は、細胞のインキュベーションおよび/または収集、回収もしくは配合の間に使用される。
【０６６８】
いくつかの態様において、無血清培地は、T細胞サプリメントおよびL-グルタミンの遊離形態を補充された基礎培地を含む。いくつかの態様において、無血清培地は、OpTmizer(商標)T細胞拡大増殖サプリメントおよびL-グルタミンを補充されたOpTmizer(商標)T細胞拡大増殖基礎培地を含む。いくつかの態様において、無血清培地は、約2.6％のOpTmizer(商標)T細胞拡大増殖サプリメント、および約1.0％のL-グルタミン(終濃度約2mM)を補充されたOpTmizer(商標)T細胞拡大増殖基礎培地を含む。いくつかの態様において、そのような無血清培地は、1つまたは複数の組み換えヒトIL-2、組み換えヒトIL-7、および/または組み換えヒトIL-15のような組み換えサイトカインを含有しない。特定の態様において、無血清培地は、本明細書において記述されるプロセスの任意の1つまたは複数の工程、例えばI項に記述される1つまたは複数の工程に使用することができる。いくつかの態様において、そのような無血清培地は、細胞のインキュベーションおよび/または収集、回収もしくは配合の間に使用される。
【０６６９】
いくつかの態様において、無血清培地は、細胞(例えば、T細胞)の維持のためのサプリメント、例えばOpTmizer(商標)T細胞拡大増殖サプリメント(ThermoFisher)を補充された基礎培地を含み、血清代替サプリメント、例えば、免疫細胞血清代替物、例えば、ThermoFisher、#A2596101、CTS(商標)免疫細胞血清代替物、またはSmith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31に記載される免疫細胞血清代替物をさらに含む。いくつかの態様において、無血清培地は、L-グルタミンのようなアミノ酸の遊離形態をさらに含む。いくつかの態様において、無血清培地は、L-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)、例えばGlutamax(商標)(ThermoFisher)中のジペプチドをさらに含む。いくつかの態様において、無血清培地は、1つまたは複数のサイトカインを含む。ある種の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、組み換えサイトカインである。ある種の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、T細胞によって発現され、かつ/またはT細胞に内因性の受容体に結合する、および/または結合することができる。特定の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、4-アルファヘリックス束ファミリーのサイトカインのメンバーである、またはそれを含む。いくつかの態様において、4-アルファヘリックス束ファミリーのサイトカインのメンバーは、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-7(IL-7)、インターロイキン-9(IL-9)、インターロイキン12(IL-12)、インターロイキン15(IL-15)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含むが、それに限定されるわけではない。いくつかの態様において、無血清培地は、1つまたは複数の組み換えヒトIL-2、組み換えヒトIL-7、および/または組み換えヒトIL-15をさらに含む。特定の態様において、無血清培地は、本明細書において記述されるプロセスの任意の1つまたは複数の工程、例えばI項に記述される1つまたは複数の工程に使用することができる。特定の態様において、無血清培地は、サンプル調製、選択、刺激および/または操作を含む任意の1つまたは複数の工程に使用することができる。
【０６７０】
いくつかの態様において、無血清培地は、T細胞サプリメント、免疫細胞血清代替物、L-グルタミンの遊離形態、L-グルタミンのジペプチド形態、組み換えIL-2、組み換えIL-7、および/または組み換えIL-15を補充された基礎培地を含む。いくつかの態様において、無血清培地は、OpTmizer(商標)T細胞拡大増殖サプリメント、CTS(商標)免疫細胞血清代替物、L-グルタミン、L-アラニル-L-グルタミン、組み換えヒトIL-2、組み換えヒトIL-7、および組み換えヒトIL-15を補充されたOpTmizer(商標)T細胞拡大増殖基礎培地を含む。いくつかの態様において、無血清培地は、約2.6％のOpTmizer(商標)T細胞拡大増殖サプリメント、約2.5％のCTS(商標)免疫細胞血清代替物、約1.0％のL-グルタミン(終濃度約2mM)、約1.0％のL-アラニル-L-グルタミン(終濃度約2mM)、約100IU/mLの組み換えヒトIL-2、約600IU/mLの組み換えヒトIL-7、および約100IU/mLの組み換えヒトIL-15を補充されたOpTmizer(商標)T細胞拡大増殖基礎培地を含む。特定の態様において、無血清培地は、本明細書において記述されるプロセスの任意の1つまたは複数の工程、例えばI項に記述される1つまたは複数の工程に使用することができる。特定の態様において、無血清培地は、サンプル調製、選択、刺激および/または操作を含む任意の1つまたは複数の工程に使用することができる。
【０６７１】
いくつかの態様において、無血清培地は濃縮培地配合物である。いくつかの態様において、無血清培地は濃縮培地配合物ではない。いくつかの態様において、無血清培地は、2倍または約2倍から、100倍または約100倍濃縮される。いくつかの態様において、無血清培地は、10倍または約10倍の配合物である。いくつかの態様において、無血清培地は、2℃または約2℃〜8℃で貯蔵することができる。
【０６７２】
III.  組み換えタンパク質
様々な態様において、1つまたは複数の組み換えタンパク質を発現する、操作、形質転換、形質導入、またはトランスフェクトされた細胞、例えば免疫細胞、例えばT細胞が提供される。特定の態様において、1つまたは複数の組み換えタンパク質のうちの少なくとも1つは、組み換え受容体、例えば、抗原受容体およびその1つまたは複数の構成成分を含む受容体である。
【０６７３】
A.  組み換え受容体
いくつかの態様において、1つまたは複数の組み換え受容体を発現する操作された細胞、例えば免疫細胞、例えばT細胞が提供される。受容体には、抗原受容体およびその1つまたは複数の構成成分を含む受容体がある。組み換え受容体には、キメラ受容体、例えばそのリガンド結合ドメインまたは結合フラグメントと細胞内シグナル伝達ドメインまたは領域とを含むもの、機能的非TCR抗原受容体、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受容体(TCR)、例えば組み換えまたはトランスジェニックTCR、キメラ自己抗体受容体(CAAR)および前述のいずれかの構成成分が含まれる場合がある。CARなどの組み換え受容体は、一般に、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達構成成分に、いくつかの局面ではリンカーおよび/または膜貫通ドメインを介して、連結された細胞外抗原(またはリガンド)結合ドメインを含む。いくつかの態様において、操作された細胞は、異なる構成成分、ドメインまたは領域を含む2つ以上の受容体を発現する。いくつかの局面では、2つ以上の受容体は、組み換え受容体の特異性、活性、抗原(またはリガンド)結合、機能および/または発現の空間的または時間的な調節または制御を可能にする。
【０６７４】
1.  キメラ抗原受容体(CAR)
いくつかの態様において、操作された細胞、例えばT細胞は、特定の抗原(またはマーカーもしくはリガンド)、例えば特定の細胞タイプの表面に発現される抗原に対する特異性を有する組み換え受容体、例えばキメラ抗原受容体(CAR)を発現する。いくつかの態様において、抗原はポリペプチドである。いくつかの態様において、抗原は、炭水化物または他の分子である。いくつかの態様において、抗原は、例えば健康な細胞または組織における、正常または非標的の細胞または組織と比較して、疾患または状態の細胞上、例えば、腫瘍または病原性細胞上に選択的に発現されるか、または過剰発現される。他の態様において、該抗原は正常細胞上に発現され、かつ/または遺伝子操作された細胞上に発現される。いくつかの局面では、組み換え受容体、例えばCARは、細胞外リガンド(例えば、抗原)結合領域またはドメイン、例えば、本明細書に記述される抗体またはフラグメントのいずれか、および細胞内シグナル伝達領域中より選択される1つまたは複数の領域またはドメインを含む。いくつかの態様において、リガンド(例えば、抗原)結合領域またはドメインは、scFvまたは単一ドメインVH抗体であるか、またはそれを含み、細胞内シグナル伝達領域またはドメインは、ITAMであるか、またはそれを含む。いくつかの局面では、細胞内シグナル伝達領域またはドメインは、CD3-ゼータ(CD3ζ)鎖のシグナル伝達ドメインまたはその一部を含む。いくつかの局面では、細胞外リガンド(例えば、抗原)結合領域またはドメインおよび細胞内シグナル伝達領域またはドメインは、1つまたは複数のリンカーおよび/または膜貫通ドメインを介して連結または接続される。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達領域との間に配置された膜貫通ドメインを含む。
【０６７５】
CARを含む例示的な抗原受容体、ならびにそのような受容体を細胞内に操作および導入するための方法は、例えば、国際特許出願公開番号WO2000/14257、WO2013/126726、WO2012/129514、WO2014/031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061、米国特許出願公開第2002131960号、同第2013287748号、同第20130149337号、米国特許第6,451,995号、同第7,446,190号、同第8,252,592号、同第8,339,645号、同第8,398,282号、同第7,446,179号、同第6,410,319号、同第7,070,995号、同第7,265,209号、同第7,354,762号、同第7,446,191号、同第8,324,353号、同第8,479,118号、および欧州特許出願番号EP2537416に記載されているもの、ならびに/またはSadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39;およびWu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75に記載されているものを含む。いくつかの局面では、抗原受容体は、米国特許第7,446,190号に記載されているようなCAR、および国際特許出願公開番号WO2014/055668に記載されているものを含む。CARの例には、前述の参照、例えばWO2014/031687、米国特許第8,339,645号、米国特許第7,446,179号、US 2013/0149337、米国特許第7,446,190号、米国特許第8,389,282号、Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701;およびBrentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)のいずれかに開示されるCARが含まれる。
【０６７６】
いくつかの態様において、組み換え受容体、例えば、抗原受容体は、抗原、リガンドおよび/またはマーカーに結合する、例えば特異的に結合する、細胞外抗原結合ドメインまたはリガンド結合ドメインを含む。抗原受容体の中には、キメラ抗原受容体(CAR)などの、機能的な非TCR抗原受容体がある。いくつかの態様において、抗原受容体は、抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含むCARである。いくつかの態様において、CARは、特定の抗原、マーカーまたはリガンド、例えば、養子療法の標的となる特定の細胞タイプに発現される抗原、例えば、がんマーカー、および/または抑制応答(dampening response)を誘発することを目的とした抗原、例えば、正常もしくは非罹患細胞タイプで発現される抗原、に対する特異性を示すように構築される。したがって、CARは典型的には、その細胞外部分に、1つまたは複数のリガンド(例えば、抗原)結合分子、例えば、1つもしくは複数の抗原結合フラグメント、ドメイン、もしくは部分、または1つもしくは複数の抗体可変ドメイン、および/または抗体分子を含む。いくつかの態様において、CARは、抗体分子の1つまたは複数の抗原結合部分、例えば、モノクローナル抗体(mAb)の可変重鎖(VH)と可変軽鎖(VL)とから誘導される一本鎖抗体フラグメント(scFv)、または単一ドメイン抗体(sdAb)、例えばsdFv、ナノボディ、VHHおよびVNARを含む。いくつかの態様において、抗原結合フラグメントは、柔軟なリンカーによって結合された抗体可変領域を含む。
【０６７７】
いくつかの態様において、CARは、細胞表面に発現される抗原またはリガンド、例えばインタクトな抗原、を特異的に認識する抗体または抗原結合フラグメント(例えばscFv)を含む。いくつかの態様において、抗原またはリガンドは、細胞表面に発現されるタンパク質である。いくつかの態様において、抗原またはリガンドはポリペプチドである。いくつかの態様において、それは炭水化物または他の分子である。いくつかの態様において、抗原またはリガンドは、正常または非標的の細胞または組織と比較して、疾患または状態の細胞上、例えば、腫瘍または病原性細胞上に選択的に発現されるか、または過剰発現される。他の態様において、該抗原は正常細胞上に発現され、かつ/または操作された細胞上に発現される。
【０６７８】
いくつかの態様において、キメラ受容体によって標的づけられる抗原の中には、養子細胞療法により標的づけられる疾患、状態、または細胞タイプの状況下で発現される抗原がある。疾患および状態の中には、例えば、血液のがん、免疫系のがん、例えば、リンパ腫、白血病、および/または骨髄腫、例えばB細胞性、T細胞性、および骨髄性白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫を含むがんおよび腫瘍を含む、増殖性、腫瘍性、および悪性の疾患および障害がある。
【０６７９】
いくつかの態様において、抗原またはリガンドは、腫瘍抗原またはがんマーカーである。いくつかの態様において、抗原またはリガンドは、以下であるか、または以下を含む:αvβ6インテグリン(avb6インテグリン)、B細胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9(CA9、別名CAIXまたはG250)、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B(CTAG、別名NY-ESO-1およびLAGE-2)、がん胎児性抗原(CEA)、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4(CSPG4)、上皮成長因子タンパク質(EGFR)、トランケート型上皮成長因子タンパク質(tEGFR)、タイプIII上皮成長因子受容体変異(EGFR vIII)、上皮糖タンパク質2(EPG-2)、上皮糖タンパク質40(EPG-40)、エフリンB2、エフリン受容体A2(EPHa2)、エストロゲン受容体、Fc受容体様5(FCRL5; 別名Fc受容体ホモログ5またはFCRH5)、胎児アセチルコリン受容体(胎児AchR)、葉酸結合タンパク質(FBP)、葉酸受容体α、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2(OGD2)、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100(gp100)、グリピカン-3(GPC3)、Gタンパク質共役受容体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受容体型チロシンキナーゼerb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原(HMW-MAA)、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1(HLA-A1)、ヒト白血球抗原A2(HLA-A2)、IL-22受容体α(IL-22Rα)、IL-13受容体α2(IL-13Rα2)、キナーゼ挿入ドメイン受容体(kdr)、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子(L1-CAM)、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A: LRRC8A)、Lewis Y、黒色腫関連抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン(MSLN)、c-Met、マウスサイトメガロウイルス(CMV)、ムチン1(MUC1)、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD(NKG2D)リガンド、メラン(melan)A(MART-1)、神経細胞接着分子(NCAM)、がん胎児抗原、メラノーマ優先発現抗原(PRAME)、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)、サバイビン、トロホブラスト(Trophoblast)糖タンパク質(TPBG、別名5T4)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72)、チロシナーゼ関連タンパク質1(TRP1、別名TYRP1またはgp75)、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2、別名ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタイソメラーゼまたはDCT)、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)、血管内皮細胞増殖因子受容体2(VEGFR2)、Wilms Tumor 1(WT-1)、病原体特異的もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体によって発現される分子。いくつかの態様における該受容体によって標的づけられる抗原には、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原、例えば、いくつかの公知のB細胞マーカーのいずれかが含まれる。いくつかの態様において、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79bまたはCD30であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、抗原は、病原体特異抗原または病原体発現抗原、例えばウイルス抗原(例えば、HIV、HCV、HBV由来のウイルス抗原)、細菌抗原、および/または寄生虫抗原であるか、またはそれを含む。
【０６８０】
いくつかの態様において、抗体は、2つの抗体ドメインまたは領域、例えば重鎖可変(VH)領域と軽鎖可変(VL)領域と、をつなぐ1つまたは複数のリンカーを含む、scFvなどの抗原結合フラグメントである。リンカーは、典型的には、ペプチドリンカー、例えば、柔軟性および/または可溶性のペプチドリンカーである。リンカーの中には、グリシンおよびセリンおよび/または場合によってはスレオニンに富むリンカーがある。いくつかの態様において、リンカーは、溶解性を改善できるリシンおよび/またはグルタミン酸などの荷電残基をさらに含む。いくつかの態様において、リンカーは、1つまたは複数のプロリンをさらに含む。いくつかの局面では、グリシンおよびセリン(および/またはスレオニン)に富むリンカーは、少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％のそのようなアミノ酸を含む。いくつかの態様において、それらは少なくとも50％、55％、60％、70％、もしくは75％、または少なくとも約50％、55％、60％、70％、もしくは75％のグリシン、セリン、および/またはスレオニンを含む。いくつかの態様において、リンカーは、実質的に完全にグリシン、セリン、および/またはスレオニンから構成される。リンカーは一般に、約5〜約50アミノ酸長、典型的には10または約10から、30または約30、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30、いくつかの例では、10〜25アミノ酸長である。例示的なリンカーには、配列GGGGS(4GS; SEQ ID NO:115)またはGGGS(3GS; SEQ ID NO:116)の様々な数の反復、例えば、そのような配列の2、3、4、および5の間の反復を有するリンカーが含まれる。例示的なリンカーとして、
2021533746.tif 000016
に示される配列を有するか、またはそれからなるものが挙げられる。
【０６８１】
いくつかの態様において、抗体または抗原結合フラグメント(例えばscFvまたはVHドメイン)は、CD19などの抗原を特異的に認識する。いくつかの態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、CD19に特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントに由来するか、またはその変異体である。
【０６８２】
いくつかの態様において、scFvおよび/またはVHドメインは、FMC63に由来する。FMC63は、一般に、ヒト起源のCD19を発現しているNalm-1細胞およびNalm-16細胞に対して産生されたマウスモノクローナルIgG1抗体を指す(Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302)。FMC63抗体は、SEQ ID NO: 38に示されるCDR H1; SEQ ID NO:39に示されるCDR H2; SEQ ID NO: 40または54に示されるCDR H3; およびSEQ ID NO: 35に示されるCDR L1; SEQ ID NO:36または55に示されるCDR L2; およびSEQ ID NO:37または56に示されるCDR L3を含む。FMC63抗体は、SEQ ID NO: 41のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)およびSEQ ID NO: 42のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)を含む。いくつかの態様において、scFvは、SEQ ID NO:35のCDR L1配列、SEQ ID NO:36のCDR L2配列、およびSEQ ID NO:37のCDR L3配列を含む可変軽鎖ならびに/もしくはSEQ ID NO:38のCDR H1配列、SEQ ID NO:39のCDR H2配列、およびSEQ ID NO:40のCDR H3配列を含む可変重鎖、またはそれと少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する前述のいずれかの変異体を含む。いくつかの態様において、scFvは、SEQ ID NO:41に示されるFMC63の可変重鎖領域およびSEQ ID NO:42に示されるFMC63の可変軽鎖領域、またはそれと少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する前述のいずれかの変異体を含む。いくつかの態様において、可変重鎖および可変軽鎖は、リンカーによって接続されている。いくつかの態様において、リンカーは、SEQ ID NO:58に示される。いくつかの態様において、scFvは、順に、VH、リンカー、およびVLを含む。いくつかの態様において、scFvは、順に、VL、リンカー、およびVHを含む。いくつかの態様において、scFvは、SEQ ID NO:57に示されるヌクレオチドの配列またはSEQ ID NO:57と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列によってコードされる。いくつかの態様において、scFvは、SEQ ID NO:43に示されるアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:43と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を含む。
【０６８３】
いくつかの態様において、scFvおよび/またはVHドメインは、SJ25C1に由来する。SJ25C1は、ヒト起源のCD19を発現しているNalm-1細胞およびNalm-16細胞に対して産生されたマウスモノクローナルIgG1抗体である(Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302)。SJ25C1抗体は、それぞれSEQ ID NO: 47〜49に示されるCDR H1、H2およびH3、ならびにそれぞれSEQ ID NO: 44〜46に示されるCDR L1、L2およびL3配列を含む。SJ25C1抗体は、SEQ ID NO: 50のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)およびSEQ ID NO: 51のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)を含む。いくつかの態様において、svFvは、SEQ ID NO:44に示されるCDR L1配列; SEQ ID NO: 45に示されるCDR L2; およびSEQ ID NO:46に示されるCDR L3を含む可変軽鎖; ならびに/もしくはSEQ ID NO:47に示されるCDR H1、SEQ ID NO:48に示されるCDR H2、およびSEQ ID NO:49に示されるCDR H3を含む可変重鎖、またはそれと少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する前述のいずれかの変異体を含む。いくつかの態様において、scFvは、SEQ ID NO:50に示されるSJ25C1の可変重鎖領域およびSEQ ID NO:51に示されるSJ25C1の可変軽鎖領域、またはそれと少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する前述のいずれかの変異体を含む。いくつかの態様において、可変重鎖および可変軽鎖は、リンカーによって接続されている。いくつかの態様において、リンカーはSEQ ID NO:52に示される。いくつかの態様において、scFvは、順に、VH、リンカー、およびVLを含む。いくつかの態様において、scFvは、順に、VL、リンカー、およびVHを含む。いくつかの態様において、scFvは、SEQ ID NO:53に示されるアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:53と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を含む。
【０６８４】
いくつかの態様において、抗体または抗原結合フラグメント(例えばscFvまたはVHドメイン)は、BCMAなどの抗原を特異的に認識する。いくつかの態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、BCMAに特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントに由来するか、またはその変異体である。
【０６８５】
いくつかの態様において、CARは、BCMAに、例えばヒトBCMAに、特異的な抗BCMA CARである。マウス抗ヒトBCMA抗体およびヒト抗ヒト抗体を含む抗BCMA抗体を含むキメラ抗原受容体、およびそのようなキメラ受容体を発現している細胞は、以前に記述されている。Carpenter et al., Clin Cancer Res., 2013, 19(8):2048-2060、WO2016/090320、WO2016090327、WO2010104949A2およびWO2017173256を参照されたい。いくつかの態様において、抗原または抗原結合ドメインはBCMAである。いくつかの態様において、scFvは、BCMAに特異的な抗体または抗体フラグメントに由来するVHおよびVLを含む。いくつかの態様において、BCMAと結合する抗体または抗体フラグメントは、国際特許出願公開番号WO2016/090327およびWO2016/090320に示される抗体または抗体フラグメント由来のVHおよびVLであるか、またはそれを含む。
【０６８６】
いくつかの態様において、抗BCMA CARは、WO2016/090320またはWO2016090327に記載される抗体に由来する可変重鎖(VH)および/または可変軽鎖(VL)領域を含む抗原結合ドメイン、例えば、scFvを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメイン、例えばscFvは、SEQ ID NO: 109に示されるVHおよびSEQ ID NO: 110に示されるVLを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメイン、例えばscFvは、SEQ ID NO: 111に示されるVHおよびSEQ ID NO: 112に示されるVLを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメイン、例えばscFvは、SEQ ID NO: 113に示されるVHおよびSEQ ID NO: 114に示されるVLを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメイン、例えばscFvは、SEQ ID NO: 106に示されるVHおよびSEQ ID NO: 107に示されるVLを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメイン、例えばscFvは、SEQ ID NO: 118に示されるVHおよびSEQ ID NO: 119に示されるVLを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメイン、例えばscFvは、SEQ ID NO: 120に示されるVHおよびSEQ ID NO: 121に示されるVLを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメイン、例えばscFvは、SEQ ID NO: 122に示されるVHおよびSEQ ID NO: 123に示されるVLを含む。いくつかの態様において、VHまたはVLは、前述のVHまたはVL配列のいずれかと少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつBCMAへの結合を保持する。いくつかの態様において、VH領域はVL領域のアミノ末端側である。いくつかの態様において、VH領域はVL領域のカルボキシ末端側である。
【０６８７】
いくつかの態様において、抗原または抗原結合ドメインはGPRC5Dである。いくつかの態様において、scFvは、GPRC5Dに特異的な抗体または抗体フラグメントに由来するVHおよびVLを含む。いくつかの態様において、GPRC5Dと結合する抗体または抗体フラグメントは、国際特許出願公開番号WO2016/090329およびWO2016/090312に示される抗体または抗体フラグメント由来のVHおよびVLであるか、またはそれを含む。
【０６８８】
いくつかの局面では、CARは、ユニバーサルタグまたはユニバーサルエピトープと結合するまたはそれを認識する、例えば、特異的に認識する、リガンド(例えば、抗原)結合ドメインを含む。いくつかの局面では、結合ドメインは、疾患または障害に関連する抗原を認識する、異なる結合分子(例えば、抗体または抗原結合フラグメント)と連結することができる分子、タグ、ポリペプチドおよび/またはエピトープと結合することができる。例示的なタグまたはエピトープは、色素(例えば、フルオレセインイソチオシアネート)またはビオチンを含む。いくつかの局面では、疾患または障害に関連する抗原、例えば、腫瘍抗原を認識する、タグに連結された結合分子(例えば、抗体または抗原結合フラグメント)は、タグに特異的なCARを発現している操作された細胞と共に、操作された細胞の細胞傷害性または他のエフェクター機能をもたらす。いくつかの局面では、疾患または障害に関連する抗原に対するCARの特異性は、タグ付き結合分子(例えば、抗体)によって提供され、異なるタグ付き結合分子を使用して異なる抗原を標的づけることができる。ユニバーサルタグまたはユニバーサルエピトープに特異的な例示的なCARは、例えば、米国特許第9,233,125号、WO2016/030414、Urbanska et al., (2012) Cancer Res 72: 1844-1852、およびTamada et al., (2012). Clin Cancer Res 18:6436-6445に記載されているものを含む。
【０６８９】
いくつかの態様において、抗原は、病原体特異抗原または病原体発現抗原であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、抗原は、ウイルス抗原(例えば、HIV、HCV、HBV、その他由来のウイルス抗原)、細菌抗原、および/または寄生虫抗原である。いくつかの態様において、CARは、主要組織適合性複合体(MHC)-ペプチド複合体として細胞表面に提示された細胞内抗原、例えば腫瘍関連抗原を特異的に認識するTCR様抗体、例えば抗体またはフラグメント(例えばscFv)を含む。いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体を認識する抗体またはその抗原結合部分は、細胞上に組み換え受容体、例えば抗原受容体の部分として発現することができる。抗原受容体の中に、機能的非T細胞受容体(TCR)抗原受容体、例えばキメラ抗原受容体(CAR)がある。いくつかの態様において、ペプチド-MHC複合体に対するTCR様特異性を示す抗体または抗原結合フラグメントを含むCARはまた、TCR様CARと呼ばれる場合がある。いくつかの態様において、CARはTCR様CARであり、抗原は、TCRのようにMHC分子に関連して細胞表面上で認識される、細胞内タンパク質のペプチド抗原などの、プロセシングされたペプチド抗原である。いくつかの態様において、TCR様CARのMHC-ペプチド複合体に特異的な細胞外抗原結合ドメインは、いくつかの局面ではリンカーおよび/または膜貫通ドメインを介して、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達構成成分と連結される。いくつかの態様において、そのような分子は、典型的には、TCRなどの天然の抗原受容体を介したシグナル、および任意で、共刺激受容体と組み合わせたそのような受容体を介したシグナルをまねたり、そのようなシグナルに近づいたりすることができる。
【０６９０】
「主要組織適合性複合体」（MHC）への言及は、ポリペプチドのペプチド抗原（細胞内機構によってプロセシングされたペプチド抗原を含む）と場合により複合体化し得る、多型ペプチド結合部位または結合溝を含むタンパク質、一般的には糖タンパク質を指す。いくつかの場合には、MHC分子は、TCRなどのT細胞上の抗原受容体またはTCR様抗体によって認識されるコンフォメーションで抗原を提示するために、例えばペプチドとの複合体、すなわちMHC-ペプチド複合体として、細胞表面にディスプレイまたは発現され得る。一般的に、MHCクラスI分子は、場合により3つのαドメインを含む膜貫通α鎖と、非共有結合したβ2ミクログロブリンを有する、ヘテロ二量体である。一般的に、MHCクラスII分子は、2つの膜貫通糖タンパク質αおよびβで構成され、両方とも通常は膜にまたがっている。MHC分子は、ペプチドを結合するための抗原結合部位（複数可）および適切な抗原受容体による認識に必要な配列を含む、MHCの有効な部分を含み得る。いくつかの態様では、MHCクラスI分子は、細胞質ゾルに由来するペプチドを細胞表面に送達する；この場合には、MHC-ペプチド複合体はT細胞、例えば一般にはCD8+ T細胞によって認識されるが、場合によってはCD4+ T細胞によって認識される。いくつかの態様では、MHCクラスII分子は、小胞系（vesicular system）に由来するペプチドを細胞表面に送達する；この場合には、それらは通常CD4+ T細胞によって認識される。一般に、MHC分子は、マウスではH-2、ヒトではヒト白血球抗原（HLA）と総称される、連鎖している遺伝子座のグループによってコードされる。それゆえ、一般的に、ヒトMHCはヒト白血球抗原（HLA）と称されることもある。
【０６９１】
用語「MHC-ペプチド複合体」または「ペプチド-MHC複合体」またはその変形は、一般に、MHC分子の結合溝または裂け目に収まったペプチドの非共有結合的相互作用などによる、ペプチド抗原とMHC分子の複合体または会合を指す。いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体は、細胞の表面上に存在するか、または提示される。いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体は、抗原受容体、例えば、TCR、TCR様CAR、またはその抗原結合部分によって特異的に認識され得る。
【０６９２】
いくつかの態様では、ポリペプチドの、ペプチド抗原またはエピトープなどのペプチドは、例えば抗原受容体による認識のために、MHC分子と会合することができる。一般に、ペプチドは、ポリペプチドまたはタンパク質などのより長い生体分子に由来するか、またはその断片に基づく。いくつかの態様では、ペプチドは、典型的には約8〜約24アミノ酸長である。いくつかの態様では、ペプチドは、MHCクラスII複合体での認識のために、9〜22または約9〜22アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様では、ペプチドは、MHCクラスI複合体での認識のために、8〜13または約8〜13アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体などの、MHC分子との関連でペプチドが認識されると、TCRまたはTCR様CARなどの抗原受容体は、T細胞応答、例えば、T細胞増殖、サイトカイン産生、細胞傷害性T細胞応答または他の応答を誘導するT細胞への活性化シグナルをもたらすか、または引き起こす。
【０６９３】
いくつかの態様では、TCR様抗体または抗原結合部分は、公知であるか、または公知の方法により作製することができる（例えば、米国特許出願公開番号US 2002/0150914; US 2003/0223994; US 2004/0191260; US 2006/0034850; US 2007/00992530; US20090226474; US20090304679; および出願公開番号WO 03/068201を参照されたい）。
【０６９４】
いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、特定のMHC-ペプチド複合体を含む有効量の免疫原で宿主を免疫することによって作製され得る。いくつかの場合では、MHC-ペプチド複合体のペプチドは、MHCに結合することができる抗原、例えば、腫瘍抗原、例えば、ユニバーサル腫瘍抗原、骨髄腫抗原、または以下に記載される他の抗原、のエピトープである。いくつかの態様では、次いで、免疫応答を誘発するために、有効量の免疫原が宿主に投与される；その場合、免疫原は、MHC分子の結合溝内のペプチドの三次元表現に対する免疫応答を引き出すのに十分な期間にわたってその三次元形態を保持する。その後、宿主から回収された血清をアッセイして、MHC分子の結合溝内のペプチドの三次元表現を認識する所望の抗体が産生されているかどうかを判定する。いくつかの態様では、産生された抗体をアッセイして、該抗体がMHC-ペプチド複合体をMHC分子単独、関心対象のペプチド単独、およびMHCと無関係のペプチドとの複合体から区別し得ることを確認することができる。その後、所望の抗体を単離することができる。
【０６９５】
いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、ファージ抗体ライブラリーなどの、抗体ライブラリーディスプレイ法を使用することによって取得することができる。いくつかの態様では、変異型Fab、scFvまたは他の抗体形態のファージディスプレイライブラリーが作製され、例えば、該ライブラリーではそのメンバーがCDR（複数可）の1つまたは複数の残基で変異している。例えば、米国特許出願公開番号US20020150914; US2014/0294841; およびCohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332を参照されたい。
【０６９６】
本明細書において「抗体」という用語は、最も広い意味において用いられ、インタクトな抗体および機能的な(抗原結合)抗体断片などのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含み、これには、抗原結合断片(Fab)断片、F(ab')2断片、Fab'断片、Fv断片、組み換えIgG (rIgG)断片、抗原に特異的に結合することができる可変重鎖(VH)領域、単鎖可変断片(scFv)などの単鎖抗体断片、および単一ドメイン抗体(例えば、sdAb、sdFv、ナノボディ、VHHまたはVNAR)断片が含まれる。この用語は、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異的、例えば二重特異的抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデムジ-scFv、タンデムトリ-scFvのような、遺伝子操作されおよび/またはそれ以外に改変された形態の免疫グロブリンを包含する。別段の言及がなければ、「抗体」という用語は、その機能的抗体断片を包含すると理解されるべきである。この用語はまた、IgGおよびそのサブクラス、IgM、IgE、IgA、ならびにIgDなどの任意のクラスまたはサブクラスの抗体などの、インタクトなまたは全長の抗体を包含する。いくつかの局面において、CARは二重特異性CARであり、例えば異なる特異性を持った2つの抗原結合ドメインを含有する。
【０６９７】
いくつかの態様では、抗原結合タンパク質、抗体およびその抗原結合断片は、完全長抗体の抗原を特異的に認識する。いくつかの態様では、抗体の重鎖および軽鎖は、完全長であるか、または抗原結合部分（Fab、F(ab')2、Fvまたは一本鎖Fv断片（scFv））であり得る。他の態様では、抗体重鎖定常領域は、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、およびIgEから選択され、特に、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4、より具体的には、IgG1（例えば、ヒトIgG1）から選択される。別の態様では、抗体軽鎖定常領域は、例えば、カッパまたはラムダ、特にカッパから選択される。
【０６９８】
提供する抗体の中には、抗体断片が含まれる。「抗体断片」は、インタクトの抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定するものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線形抗体；可変重鎖（VH）領域、一本鎖抗体分子、例えばscFvおよび単一ドメインVH単一抗体；抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。特定の態様では、抗体は、可変重鎖領域および/または可変軽鎖領域を含む一本鎖抗体断片、例えばscFvである。
【０６９９】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体が抗原に結合する際に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は一般に類似の構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域（FR）と3つのCDRを含む。例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照されたい。単一のVHまたはVLドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを用いて、それぞれ相補的なVLまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングすることにより、単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照されたい。
【０７００】
単一ドメイン抗体（sdAb）は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。特定の態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である。いくつかの態様では、CARは、抗原に特異的に結合する抗体重鎖ドメインを含む；該抗原は、腫瘍細胞、がん細胞などの、標的となる細胞または疾患のがんマーカーもしくは細胞表面抗原、例えば、本明細書に記載のまたは公知の標的抗原のいずれかである。例示的な単一ドメイン抗体は、sdFv、ナノボディ、VHH、またはVNARを含む。
【０７０１】
抗体断片は、インタクトの抗体のタンパク質分解消化および組換え宿主細胞による産生を含むがこれらに限らない、様々な技術によって作製することができる。いくつかの態様では、抗体は、組換えにより作製された断片であり、例えば、天然には存在しない配置を含む断片、例えば、ペプチドリンカーなどの合成リンカーによって連結された2つ以上の抗体領域または鎖を有するもの、および/または天然に存在するインタクトの抗体の酵素消化によっては生じないものなどである。いくつかの態様では、抗体断片はscFvである。
【０７０２】
「ヒト化」抗体は、全てまたは実質的に全てのCDRアミノ酸残基が非ヒトCDRに由来し、全てまたは実質的に全てのFRアミノ酸残基がヒトFRに由来する抗体である。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、典型的にはヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化を受けた、非ヒト抗体のバリアントを指す。いくつかの態様では、ヒト化抗体の一部のFR残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復させるかまたは改善するために、非ヒト抗体（例えば、CDR残基の由来となった抗体）からの対応する残基で置き換えられる。
【０７０３】
したがって、いくつかの態様では、TCR様CARなどのキメラ抗原受容体は、抗体または抗体断片を含む細胞外部分を含む。いくつかの態様では、その抗体または断片にはscFvが含まれる。いくつかの局面では、抗体または抗原結合フラグメントは、抗原結合フラグメントまたは分子の複数、例えばライブラリーをスクリーニングすることによって、例えば、特異的抗原またはリガンドとの結合についてscFvライブラリーをスクリーニングすることによって、得ることができる。
【０７０４】
いくつかの局面では、組み換え受容体、例えば、キメラ抗原受容体は、1つまたは複数のリガンド(例えば、抗原)結合ドメイン、例えば抗体またはそのフラグメントを含む細胞外部分、および1つまたは複数の細胞内シグナル伝達領域またはドメイン(互換的に細胞質シグナル伝達ドメインまたは領域とも呼ばれる)を含む。いくつかの局面では、組み換え受容体、例えば、CARは、スペーサーおよび/または膜貫通ドメインもしくは部分をさらに含む。いくつかの局面では、スペーサーおよび/または膜貫通ドメインは、リガンド(例えば、抗原)結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達領域またはドメインを含む細胞外部分と連結することができる。
【０７０５】
いくつかの態様において、CARなどの組み換え受容体は、スペーサーをさらに含み、該スペーサーは、免疫グロブリン定常領域またはその変異体もしくは修飾バージョンの少なくとも一部、例えば、IgG4ヒンジ領域などのヒンジ領域、および/またはCH1/CLおよび/またはFc領域の場合があり、またはそれを含む場合がある。いくつかの態様において、組み換え受容体はさらに、スペーサーおよび/またはヒンジ領域を含む。いくつかの態様において、定常領域または部分は、ヒトIgG、例えばIgG4またはIgG1、のものである。いくつかの局面では、定常領域の部分は、抗原認識成分、例えばscFvと膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域として機能する。スペーサーは、スペーサーがない場合と比較して、抗原結合後の細胞の応答性を増加させる長さであることができる。いくつかの例では、スペーサーは、12アミノ酸長もしくは約12アミノ酸長であるか、または多くて12アミノ酸長である。例示的なスペーサーには、以下が含まれる: 少なくとも約10〜229アミノ酸、約10〜200アミノ酸、約10〜175アミノ酸、約10〜150アミノ酸、約10〜125アミノ酸、約10〜100アミノ酸、約10〜75アミノ酸、約10〜50アミノ酸、約10〜40アミノ酸、約10〜30アミノ酸、約10〜20アミノ酸、または約10〜15アミノ酸を有するもの(上記範囲のいずれかの両端間の任意の整数を含む)。いくつかの態様において、スペーサー領域は、約12アミノ酸以下、約119アミノ酸以下、または約229アミノ酸以下を有する。いくつかの態様において、スペーサーは、250アミノ酸長未満、200アミノ酸長未満、150アミノ酸長未満、100アミノ酸長未満、75アミノ酸長未満、50アミノ酸長未満、25アミノ酸長未満、20アミノ酸長未満、15アミノ酸長未満、12アミノ酸長未満、または10アミノ酸長未満である。いくつかの態様において、スペーサーは、10〜250アミノ酸長、10〜150アミノ酸長、10〜100アミノ酸長、10〜50アミノ酸長、10〜25アミノ酸長、10〜15アミノ酸長、15〜250アミノ酸長、15〜150アミノ酸長、15〜100アミノ酸長、15〜50アミノ酸長、15〜25アミノ酸長、25〜250アミノ酸長、25〜100アミノ酸長、25〜50アミノ酸長、50〜250アミノ酸長、50〜150アミノ酸長、50〜100アミノ酸長、100〜250アミノ酸長、100〜150アミノ酸長、もしくは150〜250アミノ酸長、または約10〜250アミノ酸長、約10〜150アミノ酸長、約10〜100アミノ酸長、約10〜50アミノ酸長、約10〜25アミノ酸長、約10〜15アミノ酸長、約15〜250アミノ酸長、約15〜150アミノ酸長、約15〜100アミノ酸長、約15〜50アミノ酸長、約15〜25アミノ酸長、約25〜250アミノ酸長、約25〜100アミノ酸長、約25〜50アミノ酸長、約50〜250アミノ酸長、約50〜150アミノ酸長、約50〜100アミノ酸長、約100〜250アミノ酸長、約100〜150アミノ酸長、もしくは約150〜250アミノ酸長である。例示的なスペーサーは、IgG4ヒンジ単独、CH2およびCH3ドメインと連結されたIgG4ヒンジ、またはCH3ドメインと連結されたIgG4ヒンジを含む。例示的なスペーサーは、Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153、Hudecek et al. (2015) Cancer Immunol Res. 3(2): 125-135または国際特許出願公開番号WO2014031687に記載されているものを含むが、それに限定されるわけではない。
【０７０６】
いくつかの局面では、スペーサーは、IgGのヒンジ領域のみ、例えばIgG4またはIgG1のヒンジのみ、例えばSEQ ID NO:1に示され、SEQ ID NO: 2に示される配列によってコードされるヒンジのみのスペーサーを含む。他の態様において、スペーサーは、CH2および/またはCH3ドメインに連結されたIgヒンジ、例えば、IgG4ヒンジである。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO: 3に示されるような、CH2およびCH3ドメインに連結されたIgヒンジ、例えば、IgG4ヒンジである。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO: 4に示されるような、CH3ドメインのみに連結されたIgヒンジ、例えば、IgG4ヒンジである。いくつかの態様において、コードされるスペーサーは、SEQ ID NO: 108に示される配列であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、スペーサーは、グリシン-セリンリッチ配列または公知の柔軟なリンカーなどの他の柔軟なリンカーであるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、定常領域または部分は、IgDのものである。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO: 5に示される配列を有する。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO: 1、3、4および5のいずれかと少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する。
【０７０７】
いくつかの態様において、スペーサーは、全部または一部がIgG4および/またはIgG2に由来することができる。いくつかの態様において、スペーサーは、IgG4、IgG2、ならびに/またはIgG2およびIgG4に由来する1つまたは複数のヒンジ、CH2および/またはCH3配列を含むキメラポリペプチドであることができる。いくつかの態様において、スペーサーは、1つまたは複数のドメインに1つまたは複数の単一のアミノ酸変異などの変異を含むことができる。いくつかの例では、アミノ酸の改変は、IgG4のヒンジ領域におけるセリン(S)のプロリン(P)による置換である。いくつかの態様において、アミノ酸の改変は、グリコシル化の不均一性を低減させるためのアスパラギン(N)のグルタミン(Q)による置換、例えば、SEQ ID NO: 60に示されるIgG4重鎖定常領域配列のCH2領域中の177位に対応する位置(Uniprotアクセッション番号P01861; EUナンバリングによる297位およびSEQ ID NO:4に示されるヒンジ-CH2-CH3スペーサー配列の79位に対応する位置)でのNからQへの置換、またはSEQ ID NO: 59に示されるIgG2重鎖定常領域配列のCH2領域中の176位に対応する位置(Uniprotアクセッション番号P01859; EUナンバリングによる297位に対応する位置)でのNからQへの置換である。
【０７０８】
いくつかの局面では、スペーサーは、以下より選択される1つまたは複数などのポリペプチドスペーサーである: (a)免疫グロブリンヒンジもしくはその修飾バージョンの全部もしくは一部を含むもしくはそれからなる、または約15アミノ酸以下を含み、かつCD28細胞外領域もしくはCD8細胞外領域を含まない、(b)免疫グロブリンヒンジ、任意でIgG4ヒンジ、もしくはその修飾バージョンの全部もしくは一部を含むもしくはそれからなり、かつ/または約15アミノ酸以下を含み、CD28細胞外領域もしくはCD8細胞外領域を含まない、(c)12アミノ酸長もしくは約12アミノ酸長であり、かつ/または免疫グロブリンヒンジ、任意でIgG4、もしくはその修飾バージョンの全部もしくは一部を含むもしくはそれからなる; あるいは(d)SEQ ID NO: 1、3〜5もしくは27〜34に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する前述のいずれかの変異体からなる、またはそれを含む、あるいは(e)式X1PPX2P(SEQ ID NO: 31)[式中、X1は、グリシン、システインまたはアルギニンであり、X2は、システインまたはスレオニンである]を含む、またはそれからなる。
【０７０９】
いくつかの態様において、CARのリガンド(例えば、抗原)結合または認識ドメインは、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達構成成分、例えば細胞内シグナル伝達領域もしくはドメイン、および/または抗原受容体複合体、例えばTCR複合体、を経由する活性化を模倣するシグナル伝達構成成分、および/または別の細胞表面受容体を介するシグナルと連結される。したがって、いくつかの態様において、抗原結合構成成分(例えば、抗体)は、1つまたは複数の膜貫通および細胞内シグナル伝達領域またはドメインに連結される。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、細胞外ドメインと融合される。いくつかの態様において、受容体、例えば、CARにおけるドメインの1つに天然で関連する膜貫通ドメインが使用される。場合によっては、膜貫通ドメインは、アミノ酸置換により選択または改変されて、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用が最小限にされる。
【０７１０】
膜貫通ドメインは、いくつかの態様において、天然または合成起源のいずれかに由来する。起源が天然の場合、ドメインは、いくつかの局面では、任意の膜結合型または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、T細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137(4-1BB)、またはCD154に由来する(すなわち、少なくともその膜貫通領域を含む)ものを含む。あるいは、膜貫通ドメインは、いくつかの態様において合成である。いくつかの局面では、合成膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。いくつかの局面では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの3つ組が、合成膜貫通ドメインの各末端に見られるであろう。いくつかの態様において、連結は、リンカー、スペーサー、および/または膜貫通ドメインによる。いくつかの局面では、膜貫通ドメインは、CD28の膜貫通部分またはその変異体を含む。細胞外ドメインおよび膜貫通は、直接または間接的に連結することができる。いくつかの態様において、細胞外ドメインおよび膜貫通は、本明細書において記述されるいずれかなどのスペーサーによって連結される。
【０７１１】
いくつかの態様において、受容体の膜貫通ドメイン、例えば、CARの膜貫通ドメインは、ヒトCD28またはその変異体の膜貫通ドメイン、例えば、ヒトCD28の27アミノ酸の膜貫通ドメイン(アクセッション番号: P10747.1)であるか、またはSEQ ID NO: 8に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:8と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインであり; いくつかの態様において、組み換え受容体の部分を含む膜貫通ドメインは、SEQ ID NO: 9に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０７１２】
いくつかの局面では、組み換え受容体、例えば、CARは、細胞内シグナル伝達領域またはドメイン(互換的に細胞質シグナル伝達ドメインまたは領域とも呼ばれる)を含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域またはドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、T細胞において一次活性化シグナルを刺激および/もしくは誘発することができるシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体(TCR)構成成分のシグナル伝達ドメイン(例えば、CD3-ゼータ(CD3ζ)鎖もしくはその機能的変異体もしくはシグナル伝達部分の細胞内シグナル伝達ドメインもしくは領域)、ならびに/または免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を含むシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、組み換え受容体、例えば、CARは、抗体またはフラグメントおよび細胞内シグナル伝達領域またはドメインを含む細胞外部分を含む。
【０７１３】
いくつかの態様において、組み換え受容体、例えば、CARは、細胞内シグナル伝達領域またはドメインなどの少なくとも1つの細胞内シグナル伝達構成成分を含む。細胞内シグナル伝達領域の中に、天然抗原受容体を介したシグナル、共刺激受容体と組み合わせたそのような受容体を介したシグナル、および/または共刺激受容体単独を介したシグナルをまねる、またはそのようなシグナルに近づくものがある。いくつかの態様において、低分子オリゴペプチドまたはポリペプチドリンカー、例えば、2〜10アミノ酸長のリンカー、例えばグリシンおよびセリン、例えば、グリシン-セリン二つ組を含むものが、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間に存在し、それらの間の連結を形成する。
【０７１４】
いくつかの態様において、CARの連結時に、CARの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達領域は、免疫細胞、例えばCARを発現するように操作されたT細胞、の正常なエフェクター機能または応答の少なくとも1つを刺激および/または活性化する。例えば、状況によっては、CARは、細胞溶解活性またはTヘルパー活性などといったT細胞の機能、例えばサイトカインまたは他の因子の分泌などを誘導する。いくつかの態様において、例えば、抗原受容体構成成分または共刺激分子の細胞内シグナル伝達領域またはドメインの切断された部分が、エフェクター機能シグナルを伝達するのであれば、インタクトな免疫刺激鎖の代わりにそれが使用される。いくつかの態様において、例えば1つまたは複数の細胞内ドメインを含む、細胞内シグナル伝達領域は、T細胞受容体(TCR)の細胞質配列を含み、いくつかの局面では、天然状況においてそのような受容体と協調して作用して抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始させる共受容体の細胞質配列、および/またはそのような分子の任意の派生物もしくは変異体、および/または同じ機能的能力を有する任意の合成配列も含む。いくつかの態様において、例えば1つまたは複数の細胞内ドメインを含む、細胞内シグナル伝達領域は、共刺激シグナルの提供に関与する領域またはドメインの細胞質配列を含む。
【０７１５】
いくつかの態様において、受容体は、TCR複合体の細胞内構成成分、例えばT細胞活性化および細胞傷害性を媒介するTCR CD3鎖、例えばCD3ゼータ鎖、を含む。したがって、いくつかの局面では、抗原結合または抗原認識ドメインは、1つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結される。いくつかの態様において、細胞シグナル伝達モジュールは、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナル伝達ドメイン、および/または他のCD膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、受容体、例えばCARは、Fc受容体ガンマ(FcRγ)、CD8アルファ、CD8ベータ、CD4、CD25、またはCD16などの1つまたは複数の付加的な分子の一部をさらに含む。例えば、いくつかの局面において、CARは、CD3ゼータ(CD3ζ)またはFcRγと、CD8アルファ、CD8ベータ、CD4、CD25、またはCD16の1つまたは複数とのキメラ分子を含む。
【０７１６】
天然のTCRの状況において、完全な活性化は一般に、TCRを介するシグナル伝達のみならず、共刺激シグナルも必要とする。T細胞の活性化は、いくつかの局面では、以下の2つのクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると記載されている: TCRを経由して抗原依存性一次活性化を開始するもの(一次細胞質シグナル伝達領域またはドメイン)、および抗原依存的に作用して二次または共刺激シグナルを提供するもの(二次細胞質シグナル伝達領域またはドメイン)。いくつかの局面では、CARは、そのようなシグナル伝達構成成分の一方または両方を含む。
【０７１７】
いくつかの局面では、CARは、TCR複合体の一次刺激および/または活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達領域を含む。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達領域は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含む場合がある。一次細胞質シグナル伝達領域を含むITAMの例としては、TCRまたはCD3ゼータ(CD3ζ)、Fc受容体(FcR)ガンマまたはFcRベータに由来するものが挙げられる。いくつかの態様において、CARにおける細胞質シグナル伝達領域またはドメインは、細胞質シグナル伝達ドメイン、その部分、またはCD3ゼータに由来する配列を含む。いくつかの態様において、細胞内(または細胞質)シグナル伝達領域は、ヒトCD3鎖、任意で、CD3ゼータ刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的変異体、例えば、ヒトCD3ζのアイソフォーム3の112アミノ酸細胞質ドメイン(アクセッション番号: P20963.2)または米国特許第7,446,190号もしくは米国特許第8,911,993号に記載されるCD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、SEQ ID NO: 13、14もしくは15に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 13、14もしくは15に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
【０７１８】
したがって、いくつかの態様において、完全な刺激および/または活性化を促進するために、二次または共刺激シグナルを生成するための1つまたは複数の構成成分もまたCARに含まれる。他の態様において、CARは、共刺激シグナルを生成するための構成成分を含まない。いくつかの局面では、同じ細胞中で付加的なCARが発現され、二次または共刺激シグナルを生成するための構成成分を提供する。
【０７１９】
いくつかの態様において、CARは、CD28、4-1BB、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、ICOSおよび/または他の共刺激受容体などの共刺激受容体のシグナル伝達領域および/または膜貫通部分を含む。いくつかの局面では、同じCARが、一次細胞質シグナル伝達領域と共刺激シグナル伝達構成成分との両方を含む。
【０７２０】
いくつかの態様において、1つまたは複数の異なる組み換え受容体は、1つまたは複数の異なる細胞内シグナル伝達領域またはドメインを含むことができる。いくつかの態様において、一次細胞質シグナル伝達領域が1つのCAR内に含まれる一方で、共刺激構成成分は、別の受容体、例えば、別の抗原を認識する別のCAR、によって提供される。いくつかの態様において、CARは、いずれも同じ細胞上に発現される活性化または刺激CAR、および共刺激CARを含む(WO2014/055668を参照されたい)。
【０７２１】
ある特定の態様において、細胞内シグナル伝達領域は、CD3(例えば、CD3-ゼータ)細胞内ドメインに連結されたCD28膜貫通およびシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、CD3ゼータ細胞内ドメインに連結されたキメラCD28およびCD137(4-1BB、TNFRSF9)共刺激ドメインを含む。
【０７２２】
いくつかの態様において、CARは、細胞質部分において、1つまたは複数の、例えば、2つまたはそれ以上の、共刺激ドメインおよび一次細胞質シグナル伝達領域を包含する。例示的なCARは、CD3-ゼータ、CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2Dおよび/またはICOSの、細胞内シグナル伝達領域またはドメインなどの細胞内構成成分を含む。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、T細胞共刺激分子の、例えば、CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2Dおよび/またはICOS由来の、細胞内シグナル伝達領域またはドメインを、場合によっては膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達領域またはドメインとの間に含む。いくつかの局面では、T細胞共刺激分子は、CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2Dおよび/またはICOSの1つまたは複数である。
【０７２３】
いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域またはドメインは、ヒトCD28の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的変異体もしくは部分、例えば、その41アミノ酸ドメインおよび/または天然CD28タンパク質の186〜187位にLLからGGへの置換を有するそのようなドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO: 10もしくは11に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 10もしくは11に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、細胞内領域は、CD137(4-1BB)の細胞内共刺激シグナル伝達領域もしくはドメインまたはその機能的変異体もしくは部分、例えば、ヒト4-1BBの42アミノ酸細胞質ドメイン(アクセッション番号Q07011.1)またはその機能的変異体もしくは部分、例えば、SEQ ID NO: 12に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 12に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
【０７２４】
場合により、CARは、第1世代CAR、第2世代CAR、第3世代CARまたは第4世代CARと称される。いくつかの局面において、第1世代CARは、例えば、抗原結合時にCD3鎖誘導性シグナルを介して、単に一次刺激または活性化シグナル提供するものであり; いくつかの局面において、第2世代CARは、そのようなシグナルおよび共刺激シグナルを提供するもの、例えば、1つまたは複数の共刺激受容体、例えばCD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、ICOSおよび/または他の共刺激受容体由来の細胞内シグナル伝達領域またはドメインを含むものであり; いくつかの局面では、第3世代CARは、例えば、CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、ICOSおよび/または他の共刺激受容体より選択される、異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むものであり; いくつかの局面では、第4世代CARは、例えば、CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、ICOSおよび/または他の共刺激受容体より選択される、異なる共刺激受容体の3つまたはそれ以上の共刺激ドメインを含むものである。
【０７２５】
いくつかの態様において、細胞は、1つもしくは複数の付加的な分子および/もしくはポリペプチドを発現するように操作され、かつ/またはCARの機能および/もしくは活性を調節、制御もしくはモジュレートするためにコンビナトリアルアプローチおよび/もしくはマルチターゲティングアプローチが用いられる。CARおよびコンビナトリアルアプローチのために用いられる例示的なアプローチは、例えば、下記のコンビナトリアルアプローチおよびマルチターゲティングの項に記載されている。
【０７２６】
いくつかの態様において、CARは、抗体、例えば抗体フラグメント、CD28の膜貫通部分またはその機能的変異体であるかまたはそれを含む膜貫通ドメイン、およびCD28のシグナル伝達部分またはその機能的変異体とCD3ゼータのシグナル伝達部分またはその機能的変異体とを含む細胞内シグナル伝達領域を含む。いくつかの態様において、CARは、抗体、例えば抗体フラグメント、CD28の膜貫通部分またはその機能的変異体であるかまたはそれを含む膜貫通ドメイン、および4-1BBのシグナル伝達部分またはその機能的変異体とCD3ゼータのシグナル伝達部分またはその機能的変異体とを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかのそのような態様において、該受容体は、ヒトIg分子などのIg分子の一部を含むスペーサー、例えばIgG4ヒンジなどのIgヒンジを含むスペーサー、例えばヒンジのみのスペーサーをさらに含む。
【０７２７】
2.  改変されたアプローチ
いくつかの態様において、操作された細胞は、改変されたアプローチ、例えば、マルチターゲティング戦略または調節可能な受容体(regulatable receptor)を用いる細胞を含む。いくつかの態様において、改変された戦略またはアプローチは、2つ以上のポリペプチドなどの複数のポリペプチドを用いることを含む。いくつかの態様において、例示的な改変されたアプローチまたは戦略は、細胞上での2つ以上の遺伝子操作された受容体の発現を含み、これらの受容体は、各々が同じまたは異なる抗原を認識し、典型的には各々が、異なる細胞内シグナル伝達構成成分などの異なる領域またはドメインを含む。いくつかの態様において、例示的な改変されたアプローチまたは戦略は、CARの1つまたは複数のドメインまたは領域をコードする1つまたは複数のポリペプチド鎖の発現を含む。いくつかの局面では、様々なポリペプチド鎖を組み合わせて、CARの機能もしくは活性を果たし、かつ/またはCARの機能および/もしくは活性を調節、制御、もしくはモジュレートすることができる。いくつかの局面では、マルチターゲティング戦略は、二重特異性CAR、例えば、異なる特異性を有する2つの抗原結合ドメインを含むことによって、例えば、2つの抗原を標的づけるCARを含む。
【０７２８】
いくつかの態様において、改変された戦略またはアプローチは、例えば、オフターゲット上、例えば、正常細胞上には別々に存在するが、処뷧馁臣趁雧ꎂ臣龁臣뚊藦꺁듧麃룤ꮁ臣뾁룤銷臣颭鳥馁苣㊋臣꺁闧ꪁ苣鞊軥銂꣦蒚臣醁苣膀듦Ꞁ賥䎖剁臣놅裥肿䅃ꢁ臣蒵臣袐苣鮁苣ꮐ苣芀臣辁臣讁臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀菣ꮃ菣뾂菣늂菣ꎂ菣낂裦ꖕ臣膀듦Ꞁ賥䎖剁臣袂臣뮘껥Ꞁ䅃銂駧뺏臣ꚁ臣讂듧麃胣设臣낁胣뮴胦隌䅃貁胣ꎭ룥뺁臣꾁鷩립苦내菨ꢁ胣ꚇ뷧馁臣趁雧ꎂ臣龁臣뚊藦꺁듧麃臣꺁룤릖臣誸臣몙迧閁苣讂臣讂諦龎臣邵郥鞁胣뮘껥Ꞁ䅃貁胣ꎭ룥내菨뺁臣꾁蟥꺽臣鮜臣鞁臣ꪁ臣내菨ꮁ臣뾁駧뺏臣貂苣ꖈ臣鞊軥ꮁ뗧袐臣讂듧麃苣ꮐ苣芀臣辁臣讁臣肱鷩ꞁ臣膀铦覤臣貂臣Ꚉ闧뺁臣꾁苣鞃菣벃菣꾁胣뾪꿧膀菣뢂菣것菣袃胣뺁臣꾁裥ꆾ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂뗧뾁迦袁迥릮뷤膀뻤袁臣膀䅃銂郥肂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†臣辁臣讁臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀铦覤臣貂臣ꊂ菣궃菣膃臣龁臣Ꚉ闧꾁胣내菨銂鏦鲽臣ꚁ胣䎁剁臣ㆮ臣뺁臣꾁ꓨ낕臣覃菣ꒂ菣뺁臣꾁ꃩ龟苣뎂菣覃臣讂ꒁ臣龁臣螤闦꺁菣ꪃ菣鞃菣覃苣몙迧閁臣讂臣ꢁ苣ꮐ苣芀臣辁臣讁臣肱鷩ꞁ臣膀뗧뾁郥辂臣龁꟦薀臣鶃菣骃菣膃菣階臣膀䅃銂郥肂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣ㆁ臣뺁臣꾁ꓨ낕臣颻諥蒚臣覃菣ꒂ菣뺁臣꾁ꃩ龟臣膀䅃ꮁ귥ꢜ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣뎂菣鎃菣袃菣ꊂ菣ꊂ菣궃菣膃臣袂臣⾳臣龁臣麃菣膃苣벃苣蚃苣뎃苣ꊂ菣궃菣膃臣ㆮ臣뺁臣꾁ꓨ낕臣鶃菣骃菣膃菣階臣颭鳥馁苣颧胣ꪁ菣ꆃ苣뎃臣龁臣颠鿥꾁胣䎁剁臣龩菨誁苣뎁뺁臣꾁듦Ꞁ苣뾪꿧膀裥ꆾ胣뺁臣꾁菣뢂菣것菣袃臣讂臣膂臣뾽铧閁苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣趓뷤閁苣龁듧麃臣膀闧ꪁ苣讧裦邈裥膀菣ꆃ苣뎃臣龁臣颠鿥銂郥肂ꒁ믤誸臣鞏껥鎽苣몙迧馁苣芀臣辁臣讁臣肱鷩ꞁ臣膀ꒁ믤誸臣鞏껥鎽臣膀뗧뾁迦袁迥릮뷤꺁觧낕胦膀듦Ꞁ胣鞊軥⢟苣鞁臣꾁菣겂菣覃邵郥膀ꧦ붃臣袂臣⾳臣龁臣몙迧꺁ꧧ鎖髧뺁臣꾁駦鎖髧뾪꿧뺁臣꾁裥ꆾ苣꾏菨ꮁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†臣辁臣讁臣肱鷩ꞁ臣膀䅃꺁菣ꆃ苣뎃臣龁臣颠鿥銂苣벃菣馁苣ㆋ臣뺁臣꾁ꓨ낕臣鶃菣骃菣膃菣階臣膀ꒁ臣龁臣螤闦꺁諦龎臣龁臣蚈귥銂꣦蒚臣醁苣鎁臣貁臣趁苣芀뻤몤髧ꪁ菣ꮃ菣뾂菣늂菣ꎂ菣낂裦ꖕ臣膀뻤袁臣膀鯥鮚觧놨蟥颡藥讖闧랏佗〲㐱㔰㘵㠶臣龁臣䚯摥牯癯攠⁴污Ⱞ匠楣‮牔湡汳‮敍楤楣敮‬捓⁩牔湡汳䴠摥‮㈨㄰⤳㔠㈨㔱㨩ㄲ爵ㅡ㈷※慓敤慬湩‬畃牲传楰⁮浉畭潮⹬⠠〲㘱 ㄴ›㠶㜭㬶圠湡⁧瑥愠⹬⠠〲㜱 牆湯⹴䤠浭湵汯‮㨸㤱㐳※楍穲敡⁩瑥愠⹬⠠〲㜱 牆湯⹴䤠浭湵汯‮㨸㠱〵※慍楲⵮捁癥摥⁯瑥愠⹬⠠〲㠱 潊牵慮⁬景䠠浥瑡汯杯⁹愦灭※湏潣潬祧ㄠ㨱㬸䘠獥慮⁫瑥愠⹬⠠〲㘱 慎⁴敒⁶慃据牥‮㘱㤨㨩㔠㘶㔭ㄸ※臣袂臣䆳慢整䐭条⁡湡⁤慄楶慬‬㈨㄰⤶䴠汯捥汵牡吠敨慲祰ⴠ传据汯瑹捩⁳ⰳㄠ〶㐱臣風볨閁苣ꚁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†뻤袁臣膀臣辁臣讁臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀鏦鲽臣貂臣내菨꾁胣肸裨蒚臣膀곧ㆬ迥릮뷤ꮁ苣ꎁ臣趪귨閁苣讂諦龎胣设臣낁곧ㆬ諦龎臣릉闧蒚臣邵郥鞁臣鮚臣膀듧麃臣뺯臣ꚁ듦Ꞁ賥뺁臣꾁裥肿苣낂菣ꮃ苣颪냥馁苣鎁臣貁臣趁苣견蒵臣鮏臣鞏껥鎽设臣낁胣䎁剁臣龁臣咯剃銂駧뺏臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣내菨꾁胣肸裨蒚臣膀곧㊬迥릮뷤ꮁ苣ꎁ臣趪귨閁苣讂곧㊬諦龎臣릉闧蒚臣邵郥鞁臣鮚臣膀藥ꮖ듧麃臣뺯臣ꚁ藥몈뿦랂苣誃菣銂ꫨ躰臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂곧㊬뗧뾁迦袁迥릮뷤⢓뻤袁臣膀䅃뺁臣꾁䍔⥒胣设臣낁苣ꆃ菣놅裥肿迥릮뷤銂臣覂臣몙迧馁苣鎁臣貁臣趁苣芀臣辁臣讁臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧ㆬ諦龎臣견鞊軥꾁郥颁臣芁苣芀臣辁臣讁臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧ㆬ諦龎臣견鞊軥꾁闧ꪁ苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 蒁臣ꒁ臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣견誁苣뎁뺁臣꾁곧㊬뗧뾁迦袁迥릮뷤⢓뻤袁臣䎰剁臣龁臣咯剃꾁胣내菨ꮁ꿥鞁臣뮴胦隌臣龁臣몈뿦랂苣誃菣銂ꫨ躰臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣鞏껥鎽臣膀呉䵁臣龁臣䦯䅔颧菣膃菣閃苣ꮐ苣내菨薆苣낂菣ꮃ볤钁꟦邈裦蚈苣ꮐ苣芀臣辁臣讁臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧ㆬ迥릮뷤ꮁ苣ꎁ臣颪냥閁苣讂듦Ꞁ賥꾁胣超雧鲿귧꺁雩讧苣节臣覂臣膀듧麃臣誁臣讂苣낂菣ꮃ볤钁臣龁臣뾂菣醃苣ꪳ駧뺏臣覤賥膀뻤袁臣䦰䅔ꪃ菣뢅賥誁苣뎁节臣辁臣䦯䅔銪믤Ꞁ苣낂菣ꮃ볤钁苣릂苣벃菣꺁雩讧臣ꦁ胣超雧랂菣鞃苣꺁뷥邈臣袂臣⾳苣鞁臣꾁뗧袐臣龁迥릮뷤꺁뿨趂臣꺁裥邭设臣낁胣䎁㑄苣鞁臣꾁䑃覭꺁苣ꦃ苣뾂菣隌胣ㆁ꣧节臣辁臣螤闦꺨臣ꊻ蛥ꂛ귥膀뻤袁臣亰ⵆ뫎誁苣뎁节臣辁臣䆯ⵐꪁ臣꺁듦Ꞁ賥膀臣覂臣ꮁ뺁臣꾁苣ꒂ菣ꮂ苣뎃臣ꦁ臣ꂛ귥꺁臩鶼귥몙迧꺁ꫨ躰胣鞢껦膀臣袂臣⾳苣鞁臣꾁铧颭苣뒼臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 蒁臣ꒁ臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣견誁苣뎁뺁臣꾁곧㊬뗧뾁迦袁迥릮뷤꾁胣䎁㉄膀䑃㌱⠷ⴴ䈱⥂胣侁㑘⠰䑃㌱⤴胣䎁㉄膀䅄ㅐ膀䅄ㅐ膀䭎㉇膀䍉协臣袂臣⾳臣龁臣隻臣놅裥肿迥릮뷤ꪁ臣꺁藥몈뿦鞏껥鎽臣내菨薆苣낂菣ꮃ볤钁ꃩ龟臣龁臣覃菣ꒂ菣銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣견誁苣뎁곧㊬迥릮뷤꾁胣낕臣讂藥몈뿦鞏껥鎽臣내菨薆苣낂菣ꮃ볤钁菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣鎁臣貁臣趁苣芀ꒁ臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧ㆬ迥릮뷤꾁䑃㠲藥몈뿦랂苣誃菣鶼臩颠鿥銂郥뾁胣견鞏껥鎽臣㒯ㄭ䉂藥몈뿦랂苣誃菣鶼臩颠鿥銂郥뾁胣뺁臣꾁臣꺁胩ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†臣辁臣讁臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧ㆬ臣袂臣⾳臣龁臣견鞏껥鎽臣膀呉䵁臣龁臣䦯䅔颧菣膃菣閃苣ꮐ苣내菨薆苣낂菣ꮃ볤钁菣ꆃ苣뎃臣袂臣놅裥肿迥릮뷤꺁듧麃蛥랂苣誃菣鶼臩覃菣ꒂ菣꺁룤릖苣ꮐ苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 蒁臣ꒁ臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣견鞏껥鎽臣䦯䅔뺁臣꾁呉䵁꟦ꊃ菣벃菣銂郥肂듧麃蛥랂苣誃菣鶼臩覃菣ꒂ菣銂郥뾁胣견鞏껥鎽臣놅裥肿迥릮뷤꺁듧麃蛥랂苣誃菣鶼臩覃菣ꒂ菣銂郥肂胣貐臣내菨薆臣颪냥閁苣龁듦Ꞁ賥뺁臣꾁裥肿苣낂菣ꮃ臣놅裥肿苣낂菣ꮃ臣꺁뗧뾁郥辂臣꾁胣超雧鲿귧膀뻤袁臣랼諥ꞁ臣ꒁ賦骶髧ꪁ藥ꮖ뿥钭臣ꦁ胣设臣낁胣몁볤邭駧뺏臣鞢諥膀苣ꒂ菣ꮂ苣뎃臣袂臣隻臣ꂛ귥꺁裥貳胣ꪁ苣뎁臣내菨뮭믦ꪁ臣꺁내菨銪믤Ꞁ苣閃苣꾂苣벃ꧦ붃臣ꦁ苣节臣覂臣节臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†臣辁臣讁臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧ㆬ迥릮뷤꺁臣꺁胩邵臣袂臣ꚁ苣견鞏껥鎽臣뾁臣ꎀ뗧ꮁ苣ꎁ臣节胣랼諥ꪁ藥ꮖ뿥钭臣颪냥閁苣ꪁ臣芀臣辁臣讁臣肱鷩ꮁ臣蒁臣膀룤릖臣鞏껥鎽臣뾁臣ꎀ뗧閁苣龁ꃥ袐臣꾁胣내菨꾁꿥릮賥馁苣膀苣鞁臣꾁諦龎臣뺯臣ꚁ뿥钭臣ꪁ臣ꪁ苣膀臣龁臣뮘껥閁苣讂胣誁苣뎁뺁臣꾁ꋥ隮臣讂苣蚁臣膀苣鞁臣꾁鯥邭苣蚈돦馁苣袂臣ꮁ胣节臣辁臣ꢂ菣Ꞃ苣뾂菣龩菨銂껥財臣讂苣蚁臣颪냥閁苣ꪁ臣芀臣讁臣ꪁ臣覂胣蒁臣ꒁ臣꺁臣꺁苣蚁臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧ㆬ諦龎臣袂臣견鞊軥銂駧뺏臣讂듧麃臣궁臩鞁臣鮚臣ꦁ胣螤闦꺁迥릮뷤貁胩邵臣貂臣뒠郥ꮁ臣膀뻤袁臣膀꺨苣鞁臣꾁ꓨ낕꣧꺁苣ꒂ菣ꮂ苣뎃臣蚈돦膀ꋥ隮胣膌뛧膀臣袂臣⾳臣龁臣馨髧내菨꺁듧麃若뎮胦뮭믦ꪁ臣꺁藥ꮖ苣閃苣꾂苣벃ꧦ붃臣龮ꇨꮁ苣ꎁ臣몤臣貂苣袂臣ꪁ胣貮藥ꪁ藥ꮖ듦Ꞁ賥뺁臣꾁裥肿臣ꦁ臣鮜臣鞁臣鲿귧貁臩邈臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 蒁臣ꒁ臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣뮴胦隌菣ꆃ苣뎃臣膀ꒁ臣䎮剁蛥ꮁ郥뺁苣膀룤릖臣놅裥肿꟦邈裦蚈臣膀裥꺁諦龎苣趪귨鞁臣蒁苣ꖈ臣䎮剁臣袂臣ꚁ迦鮾臣貂苣芀臣辁臣讁臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀䅃꾁胣ꆸ雦ꢁ苣貐臣내菨誸臣몙迧閁苣讂듦Ꞁ賥뺁臣꾁裥肿䅃膀藥몈뿦䎀剁苣ꮐ苣⢀佗〲㐱〯㔵㘶銂迥ꞅ臣貂臣蒁芀臣辁臣讁臣肱鷩ꞁ臣膀듧麃臣膀ꒁ臣龁臣螤闦꺁裥肿苣鞁臣꾁듦Ꞁ賥䎖剁臣袂臣⾳臣龁臣놅裥肿䅃銂郥肂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†臣辁臣讁臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀뗧뾁迦袁迥릮뷤銂駧뺏臣讂듧麃臣閁苣ꮁ胣뺖苦뺁臣꾁韧뚊臣ꊖ胩馁苣鞊軥誁苣뎁뺁臣꾁臣貂臣몛鳦꺁諦龎믤隤臣鞊軥銂ꫨ颭臣讂䅃ꪁ臣꺁胣뮘껥Ꞁ䅃⡒䍩剁胣䚁摥牯癯攠⁴污Ⱞ匠楣‮牔湡汳‮敍楤楣敮‬⠵ㄲ⤵⠠〲㌱銂迥ꞅ銂郥뾁※臣貂臣袂臣ꚁ胣뺖苦馨髧隌䅃銂믤鞁臣膀臩閁苣讂듦Ꞁ賥랂苣誃菣꾁胣뮘껥Ꞁ䅃꺁臣꺁菣겂菣覃臣꺁뗧袐臣袂臣ꚁ룦醰臣龁臣醊裥閁苣ꚁ胣设臣낁胣ꪂ菣뾂菣늂菣袃諥鲞苣躽룦馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 蒁臣ꒁ臣꺁藦颧臣誁臣ꚁ胣㊁꣧麡臣鞏껥鎽臣鶁苣麁苣膀迥릮뷤꺁룤릖臣鶁臣鞊軥ꮁ뗧袐臣讂臣ꢁ臣내菨貁듦Ꞁ賥閁苣讂臣뺁臣꾁뿥钭臣颪냥閁苣讂臣膀곧㊬臣뮘껥Ꞁ迥릮뷤貁臣꺁諦龎臣邵郥馁苣鎁臣ꞁ胣鶁臣鲿귧銂諦뚈臣讂臣뺁臣꾁룦낡臣鮁苣랂苣誃菣貁ꫨ躰臣貂苣袂臣ꮁ胣내菨ꮁ꿥鞁臣뮴胦隌苣낂菣ꮃ臣袂臣뮘껥랂苣誃菣銂ꫨ躰臣讂胣设臣鞁臣膀듦Ꞁ賥䎖剁臣뮘껥Ꞁ䅃⡒䍩剁ꢁ臣蒵臣袐苣鮁臣芁苣芀뻤袁臣膀듦Ꞁ賥䎖剁臣膀雧ꎂ臣龁臣뚊藦ꮁ臣蒁臣몙迧閁苣讂臣膀귦뢸듧麃룤ꞁ苣몙迧閁苣讂諦龎臣邵郥鞁胣뮘껥Ꞁ迥릮뷤貁胣ꎭ룥내菨誸臣몙迧閁苣讂臣膀雧ꎂ臣龁臣뚊藦꺁듧麃룤ꞁ臣몙迧閁苣ꪁ臣ꖈ臣鞊軥ꮁ뗧袐臣讂諧膳臣膀苣閃苣벃苣莃菣릊黦꺁迥붃胦銂뷤鮸臣讂臣膂臣膀臣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敬⵸偈〠㐮층涼‬敍捲⁫楍汬灯牯覼臣骀臣ꚁ뿦躁臣龁胣ꆬ臣ꞁ胣뺿臩鞁臣뚺뛦銂苣ꦃ菣袼敓桰捡祲⁬ⵓ〳‰剈䠠偩敲⁰㘲㘯ⰰ䜠⁅效污桴慣敲볯ꮁꏨꮡ臣ꚁ胣䆁呋⁁硅汰牯牥苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣랂苣蚃菣袼䕇䠠慥瑬捨牡覼苣ꢔ臣讂苣ꒂ苣銎駩꾂菣麃菣낂菣閃苣벃볯厈䍅볯ꮁ믤鞁臣芀㔱〰䅭ꖻ룤꺁䅭袼業汬⁩扡潳扲湡散甠楮覼臣蚈铧銂菣벃菣鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꪂ菣뒂菣벃苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ꂃ菣ꒂ菣銂郥覜臣讂菣벃菣閁苣龁ꧨ首苣膀䡰⸶㔳臣ㆮ〰䵭菣覃菣궂苣ꮃ苣龃菣ꮁ苣誂胣꒮룦ꞁ㔱裥鎖蟥蚐臣龁胣ꚇ郧貾臣銃菣궃苣랂菣ꊂ菣뎃苣꒙軥馁苣龁苣ꮁ胣ꚩ雦銂䑐〱苣ꦃ菣ꮁꏨꮡ臣袼ꮂ菣ꂃ臣龁苣㊊㔮䱭볯膀〱洰⁍慎㉈佐膀㐱洰⁍慎汃胣ㆁ䵭䔠呄銂郥覜臣讂䡰⸷꺁럧鶡뛦㎲㔮䱭臣뚺蟥閁臣龁胣傂ㅄ뚺蟥ꦉ苣鞃菣ꮃ臣膀⸰㔴볎閃苣ꮃ苣벃胣ꆬ臣ꞁ⸰㈲볎閃苣ꮃ苣벃臣袂臣ꚁ駩貏뿦躁臣龁뻥膀ꧨ首苣趇뗧鞁胣銈〸蓢ꞁ단떔臣龁胣趇뗧꺁觥ꮁ胣ꪂ菣뒂菣벃苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ꂃ菣ꒂ菣ꚩ雨꺁鳦芵뿦ꚺ苣袨룦鞁胣ꪂ菣뒂菣벃苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ꂃ菣ꒂ菣ꚩ雨꺁苣ꒂ苣銂该蒚藥ꎕ매閳볯䒈卌볯ꮁ苣ꎁ臣겸껥鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꪂ菣뒂菣벃賥鞃菣뮂苣꺁룤ꮲ胦銂ꧨꆾ臣讂臣膂臣膀룤風雦閳苣뾽铧鞁臣膀ꒁ臣낕臣讂苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ꂃ菣ꒂ菣袼䅓覼臣궃菣袃臣覂〱臣ꪂ菣뒂菣벃苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ꂃ菣ꒂ菣ꚩ雨銂ꫨ붣臣龁胣蒐苣ꪃ苣麃菣꺁맥螝苣ꒂ苣膀迥螎볯㊈〸浮臣꺁郥覅뫥銂꣨겸臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ룦骮胣馃菣릂菣ꒂ菣鲣귦ꪁ臣覼臣袂臣뮴胦袼菣ꪂ菣뎃뗧袐볯銂ꧨꆾ臣龁胣邵黦銂ꇨ䖨ꮁꓧ馁胣邵黦꾁胣鞾苣貂臣ꪂ菣뒂菣벃苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ꂃ菣ꒂ菣ꚩ雨貁臣貂苣꺁菣ꦃ菣벃苣ꮁ臣蒁臣肸단鞁臣誁苣膀맥螝跥蒾臣㦌渷쉭ㆱ渰ꞁ臣誂胣鎃苣膃菣邵郥貁〴浮汯洯쉧㎱浮汯洯ꞁ臣ꎁ臣鎁臣銂ꓧ馁胣ં䐼噉邀볯銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†볯ꢡ볯銼볯낕臣讂菣莃菣讁苣꺁苣ꪃ苣麃菣隌呓䕒ⵐ䅔呃义臣钯볨㲃牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㌵㜳㘴琮晩㸢〲ㄲ㌵㜳㘴琮晩ꃂ〰〰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 誸꣨꺁苣蚁臣龔裦閁苣龁ꒁ臣ꪂ菣뒂菣벃苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ꂃ菣ꒂ菣ꚩ雨꺁맥螝裥邭蟩袼坍볯銂胣䢁䱐랂苣蚃菣袼䝁䱉久⁔ㄱ〰臣袂臣垳慹瑴䔠䱃偉䕓䐠䅕呌䍅볯銂噕ꓦ몇볯䶈䱁卌䐠坁⁎䕈䕌协볯垈慹瑴볯ꢁ뗧袐臣龁杁汩湥⁴噕ꓦ몇駥覼臣ꢁ苣ꮁ铧蒁臣龮ꇨ鞁臣麝꿥낧뗦貂뗦開ꃥ蚈鯩袼䙁覼돦ꮁ苣ꎁ臣袨룦鞁臣芀䙁ꮁ苣讂꣨겸臣膀苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ꂃ菣ꒂ菣鮛蟩鎽臣뎹鷥蚈귥辇苣㖒ⰲ〵朰洯汯볯㖈⸲欵慄볯ꢁ믤骮臣ꚁ胣蒐苣ꪃ苣麃菣ꚩ雨궸臣릂菣것菣袃苣鎃苣뎃菣蚃苣뎃鯥辇뷤꺁맥螝闦꺁꣨鞮苣꾏菨ꮁ臣龁볯ꢡ㍅볯芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 袼ꇨꖼ볯覼苣ꪃ苣麃菣릂菣것菣袃苣鎃苣뎃菣蚃苣뎃ꧨ겖臣떂苣몂臣袂臣蚈귥辇戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌳㐷⸶楴≦㈾㈰㔱㌳㐷⸶楴쉦゠〰㈰㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†裥肿觧ꪳ볯鞊䑃誁苣뎁䑃㠲䘠扡雦螉볯銂胣誸꣨꺁苣蚁臣龔裦閁苣龁苣ꪃ苣麃菣릂菣것菣袃苣鎃苣뎃菣蚃苣뎃ꧨ겖臣꺁迥蚀胦邵郥ꮁ苣ꎁ臣骤蟩鎽賥鞁臣芀諦䎗㍄臣袂臣鞊䑃㠲䘠扡雦螉苣膀郥䚄扡雦螉臣趞鷧鞁臣릂菣것菣袃苣鎃苣뎃菣鞃菣覃裢邵郥醃菣袃菣벃苣讻臣ꚁ苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ꂃ菣ꒂ菣ꪂ菣뒂菣벃臣꾏胩蒚臣邵郥閁臣龁胣鞊䑃″慆궖觧꾁胣较苣隃菣覃菣麃듧麃ꃦ侪呋袼呁䍃볯뮙賩蚕꣦覼剃ⵌ〸㄰볯蚕꣦覼볯뺁臣膀뇧붛觧놨곧㒬㌬ㄶ㔬㤴迥銂迥ꞅ볯讁苣ꎔ铧閁苣龁䑃邵郥ꊃ菣꾂菣벃菣ꮃ諦鎽臣놔鷦鞁胣䆁慲慫慷攠⁴污䨠‮楂捯敨⹭ㄠ〲‬㔶ⴷ㘶′ㄨ㤹⤶臣風볨閁苣ꚁ臣讂諦䎗㍄諦鎽䭏㍔臣趇軩꾏ꓥ覃菣ꒂ菣誁苣뎁믨階迥覤菣ꆃ苣뎃苣ꮐ鳦馁苣节臣ꞁ臣ꎁ臣芀臣貂苣꺁藩鞈臣厯充䤠⁄低›㤸臣袂臣㦳ꮁ臣貂臣貂꣨覼臣貂臣蒁苣芀諦䎗㉄‸慆궖觧꾁胣鞊뷤䎓㉄⸸袼郥邈룤겜軩䚖讧꿧ꦉ臣鞁臣䞦湥慂歮苣꾂苣莃苣ꞃ菣ꪕ迥䆷㑆ㄵ㜹⸴꺁룤ꞁ꿥鞨볯뺁臣膀慖桮癯⁥瑥愠⹬‬䱂住ⱄㄠ‵畊祬㈠〰ⰳ嘠汯‮〱ⰲ丠⹯㈠‬慰敧⁳㘵ⴴ㜵銂迥ꞅ볯ꮁ铧ꖝ臣膀䕓⁑䑉丠㩏㤠誁苣뎁㈹臣鶁苣麁苣風볨閁苣ꚁ臣讂諦䎗㉄鞊뷤䎓㉄⸸꺁蟩誁苣뎁믨階迥覤菣ꆃ苣뎃苣ꮐ鳦馁苣节臣ꞁ臣ꎁ臣芀慆궖觧銂胣鶁苣覂臣趇軩꺁苣ꮃ菣궂苣ꮜꯧꮁ臣蒁臣膀苣龃菣뢅臣超裥㲗牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㌵㜳㘴琮晩㸢〲ㄲ㌵㜳㘴琮晩ꃂ〰〰㌲⼼㹡⼼䥄㹖銂鳦馁苣㊋臣꺁苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣邵郥蚈귥꺁胩骶藩꺽苣ꮐ鳦馁苣릂菣것菣袃苣鎃苣뎃菣鞃菣覃뗧袐藩鞈臣讀胣ꮁ黨肝臣龁胣骃菣膃菣馨귨閁苣龁慆궖觧銂뗧鮏臣蒚臣붣胩鞁臣袼鯥鮚觧놨蟥颡藥讖闧랏佗〲㌱〯ㄱ㄰誁苣뎁佗〲㌱ㄯ㐲㜴銂迥ꞅ볯芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 꾏胩Ꞁ뗧袐苣龮雦馁苣龁苣ꮁ胣骃菣膃菣馨귨閁苣龁諦䎗㍄臣袂臣鞊䑃㠲䘠扡雦螉苣膀苣ꪃ苣麃菣릂菣것菣袃苣鎃苣뎃菣蚃苣뎃ꧨ겖臣뮁臣꒮룦ꞁ럦袐臣膀臣貂臣袂苣膀ꧨ겖룤꺁뗧袐菩趽臣꾏胩蒚臣邵郥馁苣鎁臣貁臣趁苣邵郥醃菣袃菣벃臣芁苣䚋扡雦螉룤꺁睔湩匭牴灥琭条雩꺁鯧銺뷤ꢔ苣讻臣ꚁꧨ겖臣꾏胩蒚臣邵郥閁臣龁胣뒠郥ꮁ苣ꎁ臣꾁胣骃菣膃菣馨귨閁苣龁慆궖觧銂胣ꪂ菣뒂菣벃苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ꂃ菣ꒂ菣ꚩ雨誸臣꺁鯥骮臣趉臣论觥ꮁ럦袐臣龁胣鶁苣꾁胣蒁臣ꒁ臣꺁뻤ꮁ臣蒁臣膀꟦薀臣䚪扡裥邭臣袂苣螝룤ꪁ裥ꎕ苣龔臣閁臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ꪂ菣뒂菣벃苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ꂃ菣ꒂ菣ꚩ雨뢁臣骃菣膃菣馨귨閁苣龁諦䎗㍄臣袂臣鞊䑃㠲臣邵郥꾁胣䒁鎃苣膃菣꺁럦ꂊ臣袂臣ꚁ裥궖臣龁臣ꎧ뛦馁苣鎁臣貁臣趁苣芀ⵄ菣ꪂ菣뎃臣膀苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ꂃ菣ꒂ菣誸臣邵郥醃菣袃菣벃臣꺁뗧袐苣花苣ꚁ뷤ꢔ觧ꪳ룤꺁瑓敲⵰慴ꢁꯧ袐臣膀臣貂臣袂苣膀뗧袐苣螈雦馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖龮雦设骼苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ꂃ菣ꒂ菣ꪂ菣뒂菣벃臣꾏胩蒚臣邵郥鞁臣ꪂ菣뒂菣벃賥鞊䑃誁苣뎁諦䎗㉄‸慆궖觧꺁듦Ꞁꧨꆾ戼㹲 龮雦设ꮁ꣨覼臣龁菣궃苣릂臣袂臣ꚁꇨ䖨ꮁ꣨覼臣貂臣邃菣膃臣貂臣貂臣覂臣颧胣ꪁ苣ꪃ苣麃菣릂菣것菣袃苣鎃苣뎃ꧨ겖臣꾏胩蒚臣邵郥鞁臣鞊䑃誁苣뎁諦䎗㉄‸慆궖觧銂胣咁듧麃苣몈뿦馁苣붃諥ꮁ雩鞁臣閩뻤鞁臣芀臣貂苣꺁苣ꪃ苣麃菣릂菣것菣袃苣鎃苣뎃ꧨ겖臣蒴㔹浮臣뎹鷥認뻥銂鳦鞁臣蒁臣芀迥뚺胦鮃菣麃苣뎃觨ꂴꓨ袐뷤뢁臣覮껥ꪁ菣袃菣뺂菣Ꚃ菣ꦡ南ⵔ꺁裥궖臣钯觨ꊃ菣뾂菣뎃苣ꮁ苣誂胣내菨鞢껦꺁賦馨臣鞁臣꺁듧麃臣ꎻ골뮴胦銂ꧨꆾ臣龁胣ં䐼噉邀볯銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†趐臣낕臣讂菣誃菣讁苣꺁내菨銂胣ꪂ菣뒂菣벃苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ꚩ雨ꮁ迥蚀髧ꮁ뗧袐臣龁諦䎗㍄鞊䑃㠲ꓥ辇뷤隌慆궖觧ꢁ臣节臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣뺁臣膀듧麃苣膀郥颁臣鞊䑃⼳諦䎗㉄‸慆궖觧ꮁ迥蚀髧ꮁ뗧袐臣龁胣ㆁ㄰볯薆菩몟뫦覼臣龁臣㎯渶꺁맥螝跥蒾苣覜臣讂꿥ꞅ苣ꪃ苣麃菣ꚩ雨ꢁ臣节臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃臣貾胣垁呓ㄭꧨ겖苣내菨ꮁ臩ꢔ臣膀㔴渰ꞁ臣뢐藥ꚺ苣궪蟥鞁臣鞁臣袨룦馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣ꎻ골뮴胦꺁菣馃菣銂ꧨꆾ臣龁胣邵黦銂胣ꊂ菣뮂苣뺯뇨꺁鿥誤觧궸臣내菨꺁闦ꮁ꿥鞁臣ꎭꛨ隌臣膀듧麃闦芁臣誂臣垮呓ㄭ臣钯臣鞁臣ꢡ臣龁胣ં䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†鯥ㆳꮁꓧ馁苣蚁臣膀ꧨ鎨臣貂臣ꚩ雨鶁苣麁苣ꞁ裥肿臣貂臣咟듧麃臣뎹鷥垇呓ㄭ듦Ꞁ臣릌闦鞁臣讂꣧ꚺ臣芁臣龁胣鶁臣蚁臣膀裥肿臣讨뫥꾁胣ꚩ꣩鞁臣馁臣ꚁ臣ꚩ雨ꮁ雩鞁臣貐꟦ꞁ臣誂胣貐꟦ꪁ苣ꒂ苣꺁蛥ꢃ鿥隺ꧨ겖臣릌闦鞁臣讂苣꺁臣芁臣龁볯芦臣ꚁ뇂馨뫦辁럥薆臣낕臣讂볯芀鯥ㆳ꾁胣ꚩ雨钁臣ꮁ裥薀臣螃菣뾂苧ꢁ臣ꚁ꣨閁苣讂南ⵔ뮴胦銂ꓧ馁胣뎛䄱臣袂臣뎛䈱臣膀苣誂냥閁臣㎪渶꺁苣ꪃ苣麃菣릂菣것菣袃苣鎃苣뎃菣蚃苣뎃ꧨ겖菣莃苣鲃菣뎃룤ꮁꓥ辇뷤隌臣貂臣鞊䑃⼳諦䎗㉄‸慆銂뷤ꢔ臣龁臣趁胣垁呓ㄭ듦Ꞁ臣袂臣ꚁꛨ겸臣貂苣咋듧麃臣몈뿦貁뷤膂臣芁臣龁臣ꢁ苣몤臣芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖龮雦设骼闧ꪁ苣붣胩鞃菣뮂苣鎖臣꺁내菨蒵裦ꦉ臣릉胦㲧牢ਾ†껥붖뻤ㆋ臣風볨鞁臣袂臣ꮁ铧邈臣貂臣咟듧麃뗧邈觧銂꟦薀臣ꢡ迧讞臣袂臣龩菨蒚觧뒾臣ꊖ臣ꚁꧨꆾ臣龁胣ં䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ覼铧颭軧誁苣뎁듧麃闦㲰牢ਾ†䅃⭒내菨銂郥覜臣讂내菨蒵裦ꦉ苣龔裦馁苣龁苣꺁鏦鲽菣궃苣릂臣颧胣ꪁ껦躚臣鎖臣내菨꺁럧낕臣袂臣龔귥내菨꺁菣벃苣뎃菣벃苣ꮁ雩鞁臣咦듧麃뗧邈觧銂ꧨꆾ臣龁胣鞃菣뮂苣钁臣ꮁ胣몈뿦袼瑳浩볯膀뷥ꪳ냥ꖅ볯璈慲獮볯膀苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣袼湩覼胣ꆎ迥袼潣汬捥覼胣내菨붣觥隌볯暈牯覼臣袂臣趇뗧鶿귥袼祃潲볯ꖷ꣧꺁雩讧駦ꮁ내菨蒵裦ꦉ臣覂ꧨ首苣躏鯩鞁胣蚈黦鞁臣膀뗧邈觧궸臣내菨꺁럧낕臣袂臣龔귥내菨꺁菣벃苣뎃菣벃苣銂룦骮臣龁胣邵黦貁鯥㊳誁苣뎁䈲臣風臣貂臣蒁苣芀详Ꞥꋥ隮鏦鲽菣궃苣릂苣鞏臣龁듧麃뗧邈觧꾁胣蒐鷩ꆋꓥ鞢껦鞃菣뮂苣ꞁ铧邈臣貂臣내菨蒵裦ꦉ苣誂苣颫臣辷듧麃闦誁苣뎁ꯩ蒁铧颭듧麃臣醃菣뮂菣蚃菣뢂苣몤臣龁胣鎁臣邵黦꾁胣隻臣鞃菣뮂苣ꮁ臣ꮐ臣貂臣蒁鿥誤럥讨臣내菨꺁럧낕苣鞢臣膀铧颭軧銂铦蒖臣讂苣蚁臣趃臣鎁臣ꢁ郥뒇臣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ覼듧麃뫦ꎧ듦Ꞁ戼㹲 䈠䵃몙迧馨髧내菨ꪠ볯劈䵐ⵉ㈸㘲볯銂胣龮雦设ꮁ꣨覼臣龁苣蚁臣ꆋꓥ鞢껦뺁臣꾁鷩ꆋꓥ鞢껦鞃菣뮂苣ꮁ苣ꎁ臣龔裦閁苣龁뗧邈觧讁苣꺁뻤몤髧ꪁ諦䊗䵃⁁䅃⁒내菨ꢁ臣节臣膀㜲볯㆚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