(57)【要約】  ＰＤＸ１＋内胚葉細胞集団からＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞を産生する、方法及び組成物を提供する。当該方法は、内胚葉細胞集団を、ＥＧＦ成分、ならびにタンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤と接触させて、ＰＤＸ１＋内胚葉細胞集団の少なくとも一部を、ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞に分化することを誘導することを含む。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤＸ１＋内胚葉細胞集団からＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞を産生する方法であって、当該内胚葉細胞集団を、
ＥＧＦ成分、及び
タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤と接触させて、
ＰＤＸ１＋内胚葉細胞集団の少なくとも一部を、ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞に分化することを誘導することを含む、方法。
【請求項２】
前記タンキラーゼ酵素は、ＴＮＫ１又はＴＮＫ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンキラーゼ阻害剤は、タンキラーゼ酵素のニコチンアミドサブサイトよりも、アデノシンサブサイトに対してより高い親和性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンキラーゼ阻害剤は、前記アデノシンサブサイトに選択的に結合する、請求項１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンキラーゼ阻害剤は、前記タンキラーゼ酵素のニコチンアミドサブサイトに結合しない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＰＤＸ１＋内胚葉細胞集団を、ＢＭＰ阻害剤成分と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＢＭＰ阻害剤成分は、ノギン、ドルソモルフィン、ＬＤＮ、コーディン、ＢＭＰＲ１Ａ、又はＢＭＰＲ１Ｂである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記タンキラーゼ阻害剤は、ＷＩＫＩ４、Ｇ００７−ＬＫ、ＪＷ７４、ＪＷ５５、ＣＭＰ２４、ＣＭＰ４０、もしくはＣＭＰ４、又はその塩、溶媒和物、及び／もしくは複合体である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記タンキラーゼ阻害剤は、ＷＩＫＩ４、Ｇ００７−ＬＫ、ＪＷ７４、もしくはＪＷ５５、又はその塩、溶媒和物、及び／もしくは複合体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＤＸ１＋内胚葉細胞集団を、ノギン、ＥＧＦ、ならびにＷＩＫＩ４、Ｇ００７−ＬＫ、ＪＷ７４及びＪＷ５５のうちの１つと接触させることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＤＸ１＋内胚葉細胞集団を、ノギン、ＥＧＦ、ならびにＧ００７−ＬＫ、ＪＷ７４又はＪＷ５５及びＷＩＫＩ４のうちの少なくとも１つと接触させることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
内胚葉ＰＤＸ１＋細胞集団は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等である多能性幹細胞（ＰＳＣ）から分化される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
多能性幹細胞は、ヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）又はヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＤＸ１＋内胚葉細胞集団を産生することをはじめに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＤＸ１＋内胚葉細胞集団を産生することは、
ａ．多能性幹細胞集団を
Ｉ．Ｎｏｄａｌアゴニスト、随意にＡｃｔＡ、及びｗｎｔシグナル伝達アゴニスト、随意にＷｎｔ３ａ又はＣＩＨＲ  ９９０２１、
ＩＩ．Ｎｏｄａｌアゴニスト、随意にＡｃｔＡ、ＦＧＦアゴニスト、随意にｂＦＧＦ、及び随意にｗｎｔシグナル伝達アゴニスト、随意にＷｎｔ３ａ  ＣＩＨＲ  ９９０２１、及び
ＩＩＩ．Ｎｏｄａｌアゴニスト、随意にＡｃｔＡ、及びＦＧＦアゴニスト、随意にｂＦＧＦ、の組み合わせと接触させて、
ステージ１の分化細胞を産生すること、
ｂ．前記ステージ１の分化細胞を、ＦＧＦアゴニスト、随意にＦＧＦ１０と、随意にｗｎｔシグナル伝達アゴニスト、随意にＷｎｔ３ａと、及び／又はノギンと接触させて、ステージ２の分化細胞を産生すること、ならびに
ｃ．前記ステージ２の分化細胞を、ノギン、及び随意にシクロパミン−ＫＡＡＤ（Ｃｙｃ）、ＦＧＦアゴニスト、随意にＦＧＦ１０、及び／又はＥｘｅｎｄｉｎ−４成分、随意にＥｘｅｎｄｉｎ−４と接触させて、内胚葉細胞集団を提供すること、のステップのうちの１又は複数を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞を、インスリン産生細胞集団に分化することをさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記インスリン産生細胞集団は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は最大で約９５％までの、インスリン産生細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記インスリン産生細胞集団は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は最大で約９５％の、Ｃ−ペプチド＋／ＮＫＸ６．１＋細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ＥＧＦ、タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤、及び随意にＢＭＰ阻害剤を含む、培地の添加剤組成物。
【請求項２０】
好適な基本培地、ＥＧＦ、タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤、及び随意にＢＭＰ阻害剤を含む、培地の培養組成物。
【請求項２１】
キットであって、
ＥＧＦ成分、
タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤、及び
随意にＢＭＰ阻害剤成分を含む、キット。
【請求項２２】
対象を治療する方法であって、
ａ．請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法に従ってＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞を含む細胞の集団を産生することと、
ｂ．前記細胞の集団、又は富化した及び／もしくは単離したＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞集団を、前記対象に導入することとを含む、方法。
【請求項２３】
分化の前に、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋前駆細胞集団を富化及び／又は単離することをさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法に従って産生した、富化及び／又は単離したＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞集団、ならびに／又は当該細胞集団及び好適な希釈剤を含む組成物。
【請求項２５】
少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は最大約９５％の、ＮＫＸ６−１＋細胞を含む、請求項２４に記載の富化及び／又は単離したＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞集団。
【請求項２６】
少なくとも３０％、３５％、４０％又は少なくとも５０％の、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞を含む、請求項２４に記載の富化及び／又は単離したＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞集団。
【請求項２７】
請求項１から１８のいずれか一項に規定するＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞、請求項１６から１８のいずれか一項に規定するインスリン産生細胞集団、又は請求項２４から２６のいずれか一項にかかる富化及び／もしくは単離したＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞集団、の使用であって、インスリン欠乏関連疾患の治療、創薬、膵臓関連疾患の試験、移植組織工学及び／又は疾患のモデル化に関する、使用。
【請求項２８】
前記インスリン欠乏関連疾患は、１型糖尿病又は２型糖尿病である、請求項２７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この開示は、インスリン産生ベータ様細胞を産生する、方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト多能性幹細胞（「ｈＰＳＣ」であり、ヒト胚性幹細胞「ｈＥＳＣ」及びヒト人工多能性幹細胞「ｈｉＰＳＣ」を含む）からインスリン産生ベータ様細胞を生成することは、１）糖尿病治療の将来的な選択肢としての患者への移植、２）発生及び疾患のモデル化、ならびに３）膵臓関連疾患に関する創薬及び試験といった多数の用途のための、ヒト内分泌細胞の再生可能な源となる可能性がある。これら用途を実現するためには、異なる細胞株及び実験室にわたって有効で一貫性のある分化戦略を特定する必要がある。ここでは、インスリン発現細胞を生成する高い能力をもつＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞を生成する特異的なタンキラーゼ阻害剤の使用について記述する。
【発明の概要】
【０００３】
インスリン発現細胞を生成する能力が増したＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞の生成を誘導する、タンキラーゼ１（ＴＮＫＳ１／ＰＡＲＰ−５ａ／ＡＲＴＤ５）及びタンキラーゼ２（ＴＮＫＳ２／ＰＡＲＰ−５ｂ／ＡＲＴＤ６）に結合する化合物を使用する方法を提供する。
【０００４】
一態様においては、ＰＤＸ１＋内胚葉細胞集団からＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞を産生する方法であって、内胚葉細胞集団をＥＧＦと、及びタンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤と接触させて、ＰＤＸ１＋内胚葉細胞集団の少なくとも一部をＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞に分化することを誘導することを含む、方法を提供する。
【０００５】
本開示の他の特徴及び利点は、以下の発明の詳細な説明から明らかになることとなる。しかしながら、発明の詳細な説明及び特定の実施例は、本開示の好ましい実施形態を示しつつ、例示によってのみ与えられるものであり、当業者にとっては、この開示の趣旨及び範囲内での種々の変更及び変形が、発明の詳細な説明から明らかになることとなるということを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
ここで、本開示の実施形態について、以下の図面を参照しながら記載することとする：
【０００７】
【図１】図１は、タンキラーゼ阻害剤で処理した細胞が、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞の形成を誘導する、又はＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞を生じることを示している。
【図２】図２は、特異的なタンキラーゼ阻害剤（ＩＷＲ−１及びＷＩＫＩ４）で処理した細胞が、非特異的なタンキラーゼ阻害剤（ＸＡＶ９３９及びＭＮ６４）で処理した細胞よりも、高い割合のＩＮＳＧＦＰ＋細胞を生じる（２１日目）ことを示している。分化８日目から１３日目の間に、種々のタンキラーゼ経路阻害剤で処理した細胞（ＮＥのみで処理した、又はタンキラーゼ阻害剤（ＮＥ＋ＸＡＶ９３９  １．５ｕＭ、ＮＥ＋ＩＷＲ−１−ｅｎｄｏ  ３ｕＭ、ＮＥ＋  ＭＮ６４  ３ｕＭ、ＮＥ＋ＷＩＫＩ４  ９ｕＭ）と組み合わせてＮＥで処理した、細胞）を、Ｒｅｚａｎｉａ及びＰａｇｌｉｕｃａが開発した分化プロトコール（Ｒｅｚａｎｉａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４，Ｐａｇｌｉｕｃａ  ２０１４）の改変した版を用いて、さらに１０日間分化した。分化２３日目の細胞凝集体の代表的な明視野及び蛍光の画像を示している。示した結果は、ＩＮＳＧＦＰ／Ｗレポーター株からのものである。
【図３】図３は、図２に示す結果の定量化であって、異なる化合物ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ−１、ＭＮ６４、ＷＩＫＩ４で処理した又は未処理の細胞に由来する、分化２３日目にフローサイトメトリー解析で測定したＩＮＳＵＬＩＮ（インスリン）：ＧＦＰ＋細胞の割合の定量化を示す。細胞は、異なる化合物、ＸＡＶ９３９  １．５ｕＭ、ＩＷＲ−１  ３ｕＭ、ＭＮ６４  ３ｕＭ、ＷＩＫＩ４  ９ｕＭと組み合わせて、ＮＥ（−）又はＮＥを用いて処理した。示した結果は、ＩＮＳＧＦＰ／Ｗレポーター株からのものであり、エラーバーは標準偏差を表し、ｎ＝４である。
【図４】図４は、ＷＩＫＩ４が、ＩＷＲ、ＭＮ６４及びＸＡＶと比較して、より高いレベルのＩＮＳ  ｍＲＮＡを誘導することを示している。異なるタンキラーゼ阻害剤で処理した細胞は、ＱＰＣＲで測定したところ、異なる量のインスリン転写物を発現する。分化２３日目にハウスキーピング遺伝子ＴＢＰ（ＴＡＴＡ結合タンパク質）に対して標準化したインスリン転写物の相対的発現を示しているものであって、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ−１、ＭＮ６４、ＷＩＫＩ４（ＸＡＶ９３９  １．５ｕＭ、ＩＷＲ−１  ３ｕＭ、ＭＮ６４  ３ｕＭ、ＷＩＫＩ４  ９ｕＭ）を用いて、又は用いずに、細胞を処理することによって、膵前駆細胞を生成した。成体膵臓を、陽性対照として用いた。示した結果は、ｌＮＳＧＦＰ／Ｗレポーター株からのものである。エラーバーは標準偏差を表し、ｎ＝３である。
【図５】図５は、ＷＩＫＩ４による処理（８〜１３日目）が、高い割合の、Ｈ１細胞株を用いたＣ−ペプチド＋／ＮＫＸ６−１＋インスリン発現ベータ様細胞を生成することを示している。Ｃ−ペプチド（インスリンの代替）及びＮＫＸ６．１についてのフローサイトメトリー解析を、分化２３日目に行い、高い割合のＣ−ペプチド＋／ＮＫＸ６−１＋細胞（ベータ様細胞）を示した。各四分の一区画内の数字は、集団全体のうちの相対的割合を示す。示した結果は、Ｈ１細胞株からのものである。
【図６】図６は、特異的なタンキラーゼ阻害剤が、Ｈ１細胞株を用いたＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性細胞で測定したところ、高い割合の膵臓前駆体を生成することを示している。特異的なタンキラーゼ阻害剤、すなわちＡＲＴＤ５及びＡＲＴＤ６に特異的に結合するＡＲＴＤ阻害剤（ＴＡＮＫ１及びＴＡＮＫ２）は、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性細胞で測定したところ、高い割合の膵臓前駆体を生成するが、ＡＲＴＤ１／２阻害剤（ＭＫ４８２７、タンキラーゼの触媒部位に結合しないＡＲＤＴ阻害剤）は生成しなかった。８から１２日目にＭＫ４８２７、ＪＷ７４、ＷＩＫＩ４、ＪＷ５５、Ｇ００７−ＬＫにより、未処理（−）又は処理した後の、分化１２日目におけるフローサイトメトリー解析で測定したＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋細胞の割合の定量化を示している。様々な濃度の選択的阻害剤を用いている。示した結果は、分化１２日目のＨ１細胞株からのものである。エラーバーは、ＳＥＭを表し、ｎ≧＝３である。
【図７】図７は、特異的なタンキラーゼ阻害剤が、Ｈ１細胞株を用いたＣ−ペプチド／ＮＫＸ６−１二重陽性細胞で測定したところ、高い割合のベータ様細胞を生成することを示している。特異的なタンキラーゼ阻害剤（ＷＩＫＩ４、ＪＷ７４、ＪＷ５５及びＧ００７−ＬＫ）で処理した細胞は、Ｃ−ペプチド＋／ＮＫＸ６．１＋インスリン発現ベータ様細胞の集団を生成することが可能である。８から１３日目にＷＩＫＩ４（９ｕＭ）、Ｇ００７−ＬＫ（５ｕＭ）、ＪＷ７４（１０ｕＭ）、ＪＷ５５（５ｕＭ）により処理した後の、分化２３日目におけるフローサイトメトリー解析で測定したＣ−ペプチド＋／ＮＫＸ６．１＋細胞の割合の定量化を示している。示した結果は、Ｈ１細胞株からのものである。エラーバーはＳＥＭを表し、全てに関してはｎ＝４であり、ＪＷ７４に関してはｎ＝１である。
【図８】図８は、本明細書に記載の方法に従って産生した、移植したＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性前駆細胞から分化した、インスリン産生細胞を含む、細胞の蛍光免疫染色を示している。ＷＩＫＩ４により生成した膵臓前駆体を、免疫不全マウスに、皮下に移植した。移植片を、移植３ヶ月後に解析し、またインスリン、グルカゴン、サイトケラチン１９及びトリプシンについて染色した。蛍光免疫染色により、ＷＩＫＩ４処理した細胞が、ベータ様細胞（インスリン＋）、アルファ様細胞（グルカゴン＋）、トリプシン＋及びサイトケラチン１９＋の細胞に発達する能力を有することが実証された。
【図９】図９は、本明細書に記載の方法に従って産生した、Ｃ−ペプチド／ＮＫＸ６−１二重陽性ベータ様細胞を含有する移植した培養物から分化した、インスリン産生細胞を含む、細胞の蛍光免疫染色を示している。ＷＩＫＩ４により生成したベータ様細胞は、免疫不全マウスにおいて、皮下に及び腎臓被膜下に移植した。移植片を、移植７．５週後に解析し、またインスリン、グルカゴン及びソマトスタチンについて染色した。蛍光免疫染色により、ＷＩＫＩ４処理した細胞は、ベータ様細胞（インスリン＋）、アルファ様細胞（グルカゴン＋）、デルタ様細胞（ソマトスタチン＋）に発達する能力を有することが実証された。
【図１０】図１０は、本明細書に記載する方法に従って産生したＣ−ペプチド／ＮＫＸ６−１二重陽性ベータ様細胞を含有する培養物の移植後の、血糖症の正常化を示している。ＷＩＫＩ４により生成したベータ様細胞は、免疫不全マウスにおいて、皮下に及び腎臓被膜下に移植した。ストレプトゾトシン注射により、免疫不全マウスを高血糖にさせた。血糖を毎週モニタリングして、１２週から正常血糖（インスリンペレットの不在下）が観察された。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書には、高い割合のインスリン産生ベータ様細胞を生成する能力を有する、膵前駆細胞を有効に生成する、タンキラーゼ阻害剤の用途を記載する。この開示より前に、例えばＷＩＫＩ４、ＩＷＲ−１、ＪＷ７４、ＪＷ５５及びＧ００７−ＬＫ等のタンキラーゼ阻害剤を、膵臓の分化において使用することについて記述されてこなかった。また、ＰＤＸ１発現の後にこれら化合物を添加することにより、インビトロでインスリン産生ベータ様細胞を生じることが可能であるより高い割合のＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞の形成につながる。結果として、このアプローチにより、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣの異なる株からのインスリン産生細胞の生成に関する、代替的かつ有効なプロトコールがもたらされる。
【０００９】
タンキラーゼは、ヒトにおいて１７のメンバーを含む、ジフテリア毒素様ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ（ＡＲＴＤ）酵素のスーパーファミリーに属する。それらは、標的タンパク質上で、補基質ＮＡＤ＋からのＡＤＰ−リボースの転移を触媒する。この共有結合性の翻訳後改変は、１又は複数のＡＤＰ−リボース（ＡＤＰｒ）分子の標的タンパク質への結合を導く。タンキラーゼ１（ＴＮＫＳ１／ＰＡＲＰ−５ａ／ＡＲＴＤ５）及びタンキラーゼ２（ＴＮＫＳ２／ＰＡＲＰ−５ｂ／ＡＲＴＤ６）は、この酵素ファミリー（ＡＲＴＤ１−６）のポリマー形成クラス（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｌａｓｓ）に属するが、それらを他のメンバーから分ける固有のドメイン構成を有する。これらタンキラーゼは、Ｃ末端に位置するＡＲＴＤ触媒ドメインに加えて、この触媒ドメインに隣接するステライルアルファモチーフ（ＳＡＭ）を含有するが、これはタンキラーゼの多量体化の原因となる。さらに、これらタンキラーゼは、特定のタンパク質に対する特異性を与える５つのアンキリンリピートクラスター（ＡＲＣ）を含有する。
【００１０】
タンキラーゼの触媒ドメインは、２つのドメイン、供与部位及び受容部位、を特徴とする。ＮＡＤ＋が自然に結合する場所である供与部位は、２つのサブサイト、ニコチンアミドサブサイト及びアデノシンサブサイト、に分けることができる。
【００１１】
出願人は、タンキラーゼに対して選択的活性をもち、かつ、他のＡＲＴＤ酵素への結合が最小であるか又は結合しない、特異的ＡＲＴＤ阻害剤を用いることで、最も高い割合のインスリン産生細胞が生成されることを実証する。市販のＡＲＴＤ阻害剤は、供与部位に対して異なる特異性をもって結合する可能性がある。アデノシンサブサイトのみに特異的に結合して他のＡＲＴＤ酵素とは対照的に、ＴＡＮＫ阻害に対して特異性を見せるように、阻害剤の選抜群を設計した。
【００１２】
ＰＤＸ１発現後のタンキラーゼ阻害が、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する細胞を生じて、そして公開されている分化プロトコール（Ｒｅｚａｎｉａ  ２０１４，Ｐａｇｌｉｕｃａ  ２０１４）により、インスリン発現細胞を生成する能力を有する。
【００１３】
一実施形態においては、ＰＤＸ１発現は、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣの分化７〜８日目に達成し、そしてタンキラーゼ阻害剤を６日間（１２〜１３日目）施与する。
【００１４】
一実施形態においては、インスリン発現は、先に記載したとおり（Ｒｅｚａｎｉａ  ２０１４，Ｐａｇｌｉｕｃａ  ２０１４）、チロイドホルモン、Ａｌｋ５阻害剤、レチノイン酸、ＢＭＰ阻害、ソニックヘッジホッグ阻害の存在下での１２〜１３日目の細胞を培養することによって誘導される。インスリンの発現は、１６日目以降から検出できる。
【００１５】
タンキラーゼ阻害剤を用いて生成した膵臓前駆体は、これに限定されるものではないが、臨床目的でのヒト及び他の種への移植、インビトロでの健常膵臓の発生のモデル化、患者特異的なｈｉＰＳＣのモデル疾患への利用、ならびに膵臓関連疾患の創薬及び試験に用いられ得る。
【００１６】
本開示のある態様は、ＰＤＸ１＋集団からＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞を産生する方法を含み、当該方法は、ＰＤＸ１＋細胞集団を、ＥＧＦ成分と、タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤とに接触させることを含むが、これがＰＤＸ１＋細胞集団の少なくとも一部のＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞への分化を誘導する。
【００１７】
本明細書で用いる場合、「タンキラーゼ阻害剤」は、タンキラーゼ酵素の酵素活性を阻害する分子、化合物又は組成物である。タンキラーゼ阻害剤は、タンキラーゼ酵素のニコチンアミドサブサイト及び／又はアデノシンサブサイトに結合可能である。タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤はまた、異なる程度にニコチンアミドにも結合し得る。アデノシンサブサイトに結合する一部のタンキラーゼ阻害剤は、ニコチンアミドサブサイトに対して、同等又はより高いアデノシンサブサイトへの親和性を呈する。しかしながら、アデノシンサブサイトに選択的に結合するタンキラーゼ阻害剤が好ましい。タンキラーゼ阻害剤の例としては、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ−１−ｅｎｄｏ、ＭＮ６４、ＷＩＫＩ４、Ｇ００７−ＬＫ、ＪＷ７４、又はＪＷ５５が挙げられるが、これに限定されない。タンキラーゼ阻害剤の他の例としては、例えば、Ａｎｕｍａｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）に提供されている。
【００１８】
ある実施形態においては、タンキラーゼ阻害剤は、タンキラーゼ酵素の触媒部位に結合する。本明細書において用いる場合、「タンキラーゼ酵素」の語には、これに限定するものではないが、タンキラーゼ１（ＴＮＫ１）及びタンキラーゼ２（ＴＮＫ２）が含まれる。一部の実施形態においては、タンキラーゼ阻害剤は、ＴＮＫ１及びＴＮＫ２のアデノシンサブサイトに結合する。あるタンキラーゼ酵素は当技術分野で公知であり、また例えばＲｉｆｆｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）で論じられている。
【００１９】
一部の実施形態においては、タンキラーゼ阻害剤は、タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合する。好ましい一実施形態においては、タンキラーゼ阻害剤は、ニコチンアミドサブサイトよりも、アデノシンサブサイトに対してより高い親和性を有する。別の好ましい実施形態においては、タンキラーゼ阻害剤は、アデノシンサブサイトに選択的に結合する。アデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤の例としては、ＷＩＫＩ４、ＩＷＲ−１、Ｇ００７−ＬＫ、ＪＷ５５、ＪＷ７４、ＣＭＰ２４、ＣＭＰ４０、及びＣＭＰ４が挙げられるが、これに限定されない。好ましくは、タンキラーゼ阻害剤は、ＷＩＫＩ４、ＩＷＲ−１、Ｇ００７−ＬＫ、ＪＷ５５、又はＪＷ７４である。
【００２０】
タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイト及びニコチンアミドサブサイトの両方に結合するタンキラーゼ阻害剤の例としては、ＮＶＰ−ＴＮＫＳ６５６、ＣＭＰ４ｂ、及び以下の化合物１６が挙げられるが、これに限定されない。
【化１】
2021525094.tif 000003
【００２１】
一部の実施形態においては、タンキラーゼ阻害剤は、タンキラーゼ酵素のニコチンアミドサブサイトに結合しない。
【００２２】
ある実施形態においては、この方法は、ＰＤＸ１＋内胚葉細胞集団を、ＢＭＰ阻害剤成分と接触させることをさらに含む。
【００２３】
「接触させること」（例えば、内胚葉細胞集団を、成分と接触させること）の語は、それによって細胞が、インビトロで、当該成分と一緒に培養又はインキュベートされる任意の好適な手段を指す。例えば化合物を、培養液中の細胞に加えるか、又は、化合物を含有する培地に移動させるもしくは該培地と混合する。例えば、細胞は、接着培養液中で、又は懸濁培養液中で処理され得、成分は、実質的に、時間的に同時（例えば、カクテル中で一緒に）又は順次（例えば、１つめの成分の添加から１時間以内）に加えることが可能である。細胞はまた、例えば増殖因子もしくは他の分化薬剤等の別の薬剤もしくは環境と接触させて、細胞を安定化する、又はさらに細胞を分化して、例えば多能性（及び／又は分化された）集団を培養するための当技術分野で公知の条件下で当該細胞を培養することを含むことが可能である。
【００２４】
本明細書で用いる場合、「内胚葉細胞集団」は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の、ＰＤＸ１＋細胞を含む細胞の集団を指す。例えば、内胚葉細胞は、少なくともＰＤＸ１を発現する、胚性後方前腸細胞集団が該当する。他の因子もまた、発現され得る。当該集団は、ＮＫＸ６−１陰性（ＮＫＸ６−１−）であり得るか、又は低いレベルのＮＫＸ６−１を発現することが可能である。内胚葉細胞集団は、例えば、ＰＤＸ１等の１又は複数のマーカーに関するフローサイトメトリーによる分子解析によって特定することが可能である。内胚葉細胞集団は、例えば、二次元（単一層）又は三次元（胚様体又は他の集合体形態）の形態をとり得る。
【００２５】
本明細書で用いる場合、「内胚葉」の語は、極めて初期の胚における３つの一次胚細胞層のうちの最も内側のものを指す。他の２つの胚細胞層は、外胚葉（外側）及び中胚葉（中間層）であり、内胚葉は、最内層である。内胚葉は、一部の臓器、ならびに、消化器系及び呼吸器系の上皮層を形成する。内胚葉細胞は、分化して、まず胚消化管（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｕｔ）を生じて、次いで当該消化管（食道、胃部、腸管、直腸、結腸）の管壁、咽頭嚢の誘導体（扁桃腺、甲状腺、胸腺、副甲状腺）、肺、肝臓、胆嚢、及び膵臓を生じる。
【００２６】
本明細書で用いる場合、「多能性幹細胞」の語は、分裂により自己複製して、また異なる条件下で、１以上の分化細胞型であって、例えば３種の胚細胞層の特性を示す１もしくは複数の細胞型に成長又は分化する能力を有して、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞を含む、細胞を指す。胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞は、多能性幹細胞の例である。多能性細胞は、例えばヌードマウス奇形腫形成アッセイを用いて、１以上の細胞型に分化するそれらの能力を特徴決定する。多能性はまた、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によっても証明される。
【００２７】
「前駆細胞」の語は、分化により生じることが可能であるようなある細胞と比べて、完全に分化した細胞であるよりも、発達の経路又は進行に沿ったより早期の段階にある細胞表現型を有する細胞を指す。前駆細胞は、そこで細胞が発生及び分化するような発達経路ならびに環境に応じて、複数の別個の分化細胞型を、又は単一の分化細胞型を生じ得る。
【００２８】
「膵前駆細胞」の語は、膵臓内分泌細胞（例えばグルカゴン産生アルファ細胞、インスリン産生ベータ細胞、ソマトスタチン産生デルタ細胞、グレリン産生イプシロン細胞及び膵臓ポリペプチド産生細胞等）、又は膵腺房細胞（例えば、アミラーゼ産生膵臓細胞及び／又はトリプシン産生膵臓細胞）又は膵管細胞、のうちのいずれかを形成することができる細胞を指す。例えばチロイドホルモン、ａｌｋ５ｉ、レチノイン酸、ＢＭＰ及びＳＨＨ阻害の組み合わせ等の成分を添加すること、ならびに／又は、前駆細胞が発生する環境から生じることによって、膵臓内分泌細胞、膵腺房細胞又は膵管細胞のうちの１以上の形成又は発生が誘導され得る。同様に、インビトロでのＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞の注射により、内分泌細胞、膵腺房細胞及び膵管細胞の発生がもたらされ得る。
【００２９】
本明細書で用いる場合、「機能性ベータ細胞」の語は、膵臓細胞の一種を意味するものであって、これは主として、膵臓の、インスリンを作り放出するランゲルハンス島という領域にある。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「インスリン産生ベータ様細胞」の語は、インスリンを作り、そして膵臓のランゲルハンス島という領域にある機能性ベータ細胞又は膵臓細胞のうちの少なくとも１以上の、少なくとも２以上の、又は少なくとも３以上の特性を有する、細胞を指す。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「幹細胞」の語は、特殊化した細胞に分化することが可能である未分化細胞を指す。幹細胞は、増殖し、自己複製し、及び分化したもしくは分化可能である娘細胞を後に生じることが可能である多数の母細胞を生成する能力を有する複数の幹細胞又は前駆細胞を生じることが可能である。娘細胞は、例えば、親としての発生能を伴う１又は複数の細胞も保持しつつ、１又は複数の成熟細胞型にその後分化する、子孫を増殖して産生するように誘導することが可能である。
【００３２】
細胞の文脈において、「分化した」又は「分化すること」の語は、相対語であり、「分化細胞」は、比較している細胞よりも発達経路をさらに先に進んだ細胞であり、一部の場合においては、ある「分化細胞」はより特殊化している。一部の場合においては、「分化細胞」は、１つの細胞型から別の細胞型へと変化した細胞である。すなわち、幹細胞は、経路をさらに進んだ他の種類の前駆細胞にその後に分化できるような系統制限された前駆細胞（例えば内胚葉前駆細胞等）に分化し、次いで、特定の組織型において特有の役割を果たし、さらに増殖する能力を保持するかもしれないし保持しないかもしれない、最終段階の分化細胞に分化することが可能である。
【００３３】
「胚性幹細胞」の語は、胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞をいうために用いる（例えば、米国特許第５，８４３，７８０号、第６，２００，８０６号を参照）。こうした細胞はまた、体細胞核移植に由来する胚盤胞の内部細胞塊から得ることが可能である（例えば、米国特許第５，９４５，５７７号、第５，９９４，６１９号、第６，２３５，９７０号を参照）。胚性幹細胞の際立った特徴により、胚性幹細胞表現型が規定される。したがって、ある細胞が、他の細胞と区別できるような胚性幹細胞の固有の特性のうちの１又は複数を所有するならば、その細胞は、胚性幹細胞の表現型を有する。例示的な胚性幹細胞の際立った特徴としては、限定するものではないが、遺伝子発現プロファイル、増殖能、分化能、核型、特定の培養条件に対する反応性等が挙げられる。
【００３４】
「発現」の語は、遺伝子からの情報又は核酸分子内にコードされた情報が、「発現産物」の合成において用いられるような細胞内プロセスを指す。当該プロセスは、ＲＮＡ及びタンパク質、適宜に分泌タンパク質を産生することに関与し、適用できる場合には、例えば転写、翻訳、フォールディング、修飾及びプロセッシングを含めるがこれに限定されない。「発現産物」には、遺伝子から転写されたＲＮＡ、及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳により得られたポリペプチドが含まれる。
【００３５】
本明細書で用いる場合、「ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋陽性膵前駆細胞」の語は、例えば膵臓内胚葉細胞に由来して、少なくとも例えば膵ベータ細胞等であるインスリン産生細胞へと分化する能力を有する、細胞を指す。ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆体は、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１といったマーカーを発現して、例えば、多能性幹細胞（ＰＳＣ）と比較して増加したレベルのＰＴＦ１Ａ及びＳＯＸ９を発現することができる。
【００３６】
本明細書で用いる場合、「ＮＫＸ６−１＋」の語は、「ＮＫ６ホメオボックス１」遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４８２５）のｍＲＮＡ（及び／又は随意にｃＤＮＡ）又はタンパク質産物、参照により本明細書で援用される配列であってタンパク質及びｍＲＮＡの配列（及び／又は随意にｃＤＮＡ）をはじめとする配列を指す。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「ＰＤＸ１」の語は、「膵臓及び十二指腸のホメオボックス１」遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：３６５１）のｍＲＮＡ（及び／又は随意にｃＤＮＡ）又はタンパク質の産物、参照により本明細書で援用されるものの配列であって、タンパク質及びｍＲＮＡの配列（及び／又は随意にｃＤＮＡ）を含めた配列を指す。
【００３８】
本明細書で用いる場合、「ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞集団」の語は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は最大約９５％の、ＮＫＸ６−１＋細胞を含む、細胞集団を指す。他の因子もまた、発現され得る。ＮＫＸ６−１陽性細胞集団はまた、少なくとも３０％、３５％、４０％、又は少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は最大で約９５％の、ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞を含み得る。ＮＫＸ６−１陽性細胞集団は、例えば、二次元（単一層）又は三次元（胚様体又は他の集合体形態）の形態をとり得る。
【００３９】
一部の実施形態においては、ＥＧＦと、タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤とによる処理が、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞を生じさせるが、これは、ＢＭＰ阻害剤の添加によって増大する。一部の実施形態においては、ＢＭＰ阻害剤は、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）、ドルソモルフィン、ＬＤＮ、コーディン、ＢＭＰＲ１Ａ又はＢＭＰＲ１Ｂである。一実施形態においては、ＢＭＰ阻害剤は、ノギンである。
【００４０】
本明細書において用いる場合、「ＢＭＰ阻害剤成分」の語は、実施例１０で提供する薬剤を、例えば遺伝子識別番号（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９２４１）を有するヒトノギン等であるノギン（ＮＯＧ）、及び天然の活性複合体及び活性断片を含むその活性複合体及び活性断片を；例えば遺伝子識別番号（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６５７）を有するヒトＢＭＰＲ１Ａである骨形成タンパク質受容体ＩＡ型（ＢＭＰＲ１Ａ）、及び天然の活性複合体及び活性断片を含むその活性複合体及び活性断片を；例えば遺伝子識別番号（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６５８）を有するヒトＢＭＰＲ１Ｂである骨形成タンパク質受容体ＩＢ型（ＢＭＰＲ１Ｂ）、及び天然の活性複合体及び活性断片を含むその活性複合体及び活性断片を；小分子化学阻害剤ドルソモルフィン及びその塩、溶媒和物、及び組み合わせを；「ＤＭ−３１８９」としても知られる小分子化学阻害剤ＬＤＮ  １９３１８９及び／もしくはその塩及び／もしくは溶媒和物を；及び、例えば遺伝子識別番号（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８６４６）を有するヒトコーディン（ＣＨＲＤ）であるコーディン、及び天然の活性複合体及び活性断片を含むその活性複合体及び活性断片を、ならびに／又は、例えばノギンを含む組み合わせを含む上記のうちの２以上の組み合わせ、を含むがこれに限定されない、例えばＴＧＦベータファミリーリガンドを結合することによってＴＧＦ−ベータ／ＢＭＰファミリーのシグナル伝達を阻害する、任意のポリペプチド又は化合物を意味する。それぞれ（例えば、Ｇｅｎｅ  ＩＤで識別される成分）の、タンパク質及びｍＲＮＡを含む配列は、参照により本明細書に援用される。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「ノギン」の語は、遺伝子識別番号（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９２４１）、参照により本明細書に援用される配列であってタンパク質及びｍＲＮＡの配列をはじめとする配列、を有する骨形成タンパク質アンタゴニストを指す。
【００４２】
化合物「ドルソモルフィン」には、以下の一般式の化合物：
【化２】
2021525094.tif 000004
その塩、溶媒和物、及び／又は組み合わせ、が含まれる。
【００４３】
化合物「ＬＤＮ」は、以下の一般式を有する化合物：
【化３】
2021525094.tif 000005
その塩、溶媒和物、及び／又は組み合わせ、を意味する。
【００４４】
ある実施形態においては、ノギン成分は、ノギンである。ノギンの濃度は、例えば、約１ｎｇから約５００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇから約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇから約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇから約１００ｎｇ／ｍｌの範囲にわたり得る。別の実施形態においては、ノギンの濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ、又は約５００ｎｇ／ｍｌである。
【００４５】
本明細書で用いる場合、「ＥＧＦ成分」の語は、例えば実施例１１で提供される薬剤を、例えば遺伝子識別番号（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１９５０）を有するヒトＥＧＦである上皮増殖因子（ＥＧＦ）、及び天然の活性複合体及び活性断片を含むその活性複合体及び活性断片を；例えば遺伝子識別番号（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：３７４）を有するヒトＡＲ／ＡＲＥＧであるアンフィレグリン（ＡＲ）、及び天然の活性複合体及び活性断片を含むその活性複合体及び活性断片を；例えば遺伝子識別番号（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：７０３９）を有するヒトＴＧＦαであるトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、及び天然の活性複合体及び活性断片を含むその活性複合体及び活性断片を；例えば遺伝子識別番号（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６８５）を有するヒトＢＴＣであるベタセルリン（Ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）（ＢＴＣ）、及び天然の活性複合体及び活性断片を含むその活性バリアント及び活性断片を；例えば遺伝子識別番号（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１８３９）を有するヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、及び天然の活性複合体及び活性断片を含むその活性複合体及び活性断片を；例えば遺伝子識別番号（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２０６９）を有するヒトＥＲＥＧであるエピレグリン（ＥＲＥＧ／ＥＲ）、及び天然の活性バリアント及び活性断片を含むその活性バリアント及び活性断片を；例えば遺伝子識別番号（それぞれＧｅｎｅ  ＩＤ：３０８４、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９５４２、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１０７１８、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１４５９５７）を有するヒトＮＲＧであるニューレグリン（例えばＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３  ＮＲＧ４を含む）、及び天然の活性バリアント及び活性断片を含むその活性バリアント及び活性断片を、ならびに／又は例えばヒトＥＧＦを含む組み合わせである、上記のうちの２以上の組み合わせを含むがこれに限定されないＥＧＦ受容体ファミリーメンバー（ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ−１／ＥＧＦＲ、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１９５６、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２０６４  ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ−３、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２０６５、及び／又はＥｒｂＢ４／ＨＥＲ−４、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２０６６）のうちのいずれかを活性化する任意のポリペプチド又は小分子を意味する。
【００４６】
ある実施形態においては、本明細書で用いる場合、「ＥＧＦ」の語は、例えば遺伝子識別番号（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１９５０）、ならびに天然の活性複合体及び活性断片を含むその活性複合体及び活性断片を有するヒトＥＧＦである上皮増殖（ＥＧＦ）を指す。
【００４７】
ある実施形態においては、ＥＧＦ成分はＥＧＦである。ＥＧＦの濃度は、例えば、約１ｎｇから約５００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇから約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇから約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇから約１００ｎｇ／ｍｌの範囲にわたり得る。別の実施形態においては、ＥＧＦの濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ、又は約５００ｎｇ／ｍｌである。
【００４８】
一部の実施形態においては、タンキラーゼ阻害剤は、ＷＩＫＩ４、Ｇ００７−ＬＫ、ＪＷ７４、ＪＷ５５、ＣＭＰ２４、ＣＭＰ４０、又はＣＭＰ４、又はその塩、溶媒和物、及び／又は複合体である。一実施形態においては、タンキラーゼ阻害剤は、ＷＩＫＩ４、Ｇ００７−ＬＫ、ＪＷ７４、又はＪＷ５５、又はその塩、溶媒和物、及び／又は複合体である。タンキラーゼ阻害剤の濃度は、例えば、約１μＭから約１００ｍＭ、例えば約１０μＭから約５０ｍＭ、約１ｍＭから約１００ｍＭ、又は約１ｍＭから約５０ｍＭの範囲にわたり得る。別の実施形態においては、Ｗｎｔ阻害剤の濃度は、約１ｕＭ、約２ｕＭ、約５ｕＭ、約１０ｕＭ、約１５ｕＭ、約２０ｕＭ、約３０ｕＭ、約４０ｕＭ、約５０ｕＭ、約６０ｕＭ、約７０ｕＭ、約８０ｕＭ、約９０ｕＭ、又は約１００ｕＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭである。
【００４９】
一実施形態においては、この方法は、内胚葉細胞集団を、少なくとも１のＢＭＰ阻害剤成分（例えばノギン等）；少なくとも１のＥＧＦ成分、及びタンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合する少なくとも１のタンキラーゼ阻害剤と接触させることを含む。
【００５０】
別の実施形態においては、この方法は、内胚葉細胞集団を、ＢＭＰ阻害剤成分（例えばノギン等）、ＥＧＦ成分、及びＷＩＫＩ４、Ｇ００７−ＬＫ、ＪＷ７４又はＪＷ５５を含むタンキラーゼ阻害剤と接触させることを含む。
【００５１】
別の実施形態においては、この方法は、内胚葉細胞集団を、少なくとも１のＢＭＰ阻害剤成分（例えばノギン等）、少なくとも１のＥＧＦ成分、ならびにＷＩＫＩ４、Ｇ００７−ＬＫ、ＪＷ７４及びＪＷ５５のうちの少なくとも１を含む少なくとも１のタンキラーゼ阻害剤と接触させることを含む。
【００５２】
ある実施形態においては、内胚葉細胞集団は、少なくとも１のＢＭＰ阻害剤成分、少なくとも１のＥＧＦ成分、タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合する少なくとも１のタンキラーゼ阻害剤の組み合わせと、少なくとももしくは約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、又は少なくとも約１０日間、接触させる。別の実施形態においては、内胚葉細胞集団は、当該組み合わせと、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、又は少なくとも約１５日間、接触させる。ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋陽性、及び／又はインスリン産生細胞生成能は、培養細胞中で、例えば少なくとも３０日以上持続可能であることがわかっている。
【００５３】
ある実施形態においては、本明細書に記載する方法は、内胚葉ＰＤＸ１＋細胞の集団からの約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは約９５％を超えるＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性膵前駆細胞、及び／又はＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性膵前駆細胞からの、例えば約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは約９５％を超えるインスリン産生細胞、の産生を誘導する。
【００５４】
ある実施形態においては、タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤を用いた方法は、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性膵前駆細胞からの約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は約９５％を超えるインスリン産生細胞の産生を誘導する。
【００５５】
分化は、膵臓前駆体マーカーのレベルを測定することによって検出可能である。例えばＮＫＸ６−１、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＯＸ９は、例えばＲＴ−ＰＣＲによってそのｍＲＮＡ発現を検出可能であるような、膵臓前駆体マーカーである。分化はまた、例えばＧＰ２、ＣＤ１４２及び抗−ＨＰｘ１及び抗−ＨＰｘ２に対する抗体等である、膵前駆細胞を認識する抗体を用いて検出可能である（Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｍｅｒｉ  ２０１７，Ｃｏｇｇｅｒ  ２０１７，Ｒａｍｏｎｄ  ２０１７）。
【００５６】
ある実施形態においては、内胚葉細胞集団は、例えば胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等である多能性幹細胞（ＰＳＣ）から分化される。
【００５７】
ある実施形態においては、多能性幹細胞は、例えばヒト等である哺乳動物からのものである。ある実施形態においては、多能性幹細胞は、ヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）又はヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）である。
【００５８】
本明細書において用いる場合、「ｉＰＳＣ」及び「人工多能性幹細胞」の語は、区別なく用いられて、また非多能性細胞から、典型的には成体体細胞から、例えば以下に限定されないがＳＯＸ２（Ｇｅｎｅ  ＩＤ；６６５７）、ＫＬＦ４（Ｇｅｎｅ  ＩＤ；９３１４）、ｃＭＹＣ（Ｇｅｎｅ  ＩＤ；４６０９）、ＮＡＮＯＧ（Ｇｅｎｅ  ＩＤ；７９９２３）、ＬＩＮ２８／ＬＩＮ２８Ａ（Ｇｅｎｅ  ＩＤ；７９７２７））と組み合わせた１以上の遺伝子（ＰＯＵ４Ｆ１／ＯＣＴ４（Ｇｅｎｅ  ＩＤ；５４６０）を含む）の発現を誘導することによって、人工的に生じた（例えば、誘導又は完全な逆戻り（ｒｅｖｅｒｓａｌ）によって）多能性幹細胞を指す。
【００５９】
ある実施形態においては、この方法は、内胚葉細胞集団を獲得するステップを含む。例えば、本明細書に記載するように、例えばＥＳＣ又はｉＰＳＣ等である多能性幹細胞からの内胚葉細胞への分化は、ステージ１からステージ３を含むような国際公開第２０１３／１６３７３９号の図１において特徴付けられている一連のステップを含む。ステージ１は、例えば０日目から５日目の期間に及ぶ例えば３つのサブステージであるサブステージにさらに分割可能である。ステージ２は、例えば２〜３日の期間に及び得、またステージ３は、例えば１〜４日の期間に及び得る。２０１１年のＮｏｓｔｒｏらが記載するように、ステージ１は、多能性幹細胞の集団を０日目にＡｃｔＡ（又は他のＮｏｄａｌアゴニスト）及びＷｎｔ３ａと接触させることと、当該集団を１日目にＡｃｔＡ、ｂＦＧＦ及び随意にＷｎｔ３ａと接触させることと、当該集団を２日目にＡｃｔＡ及びｂＦＧＦと接触させて、ステージ１の分化細胞を産生することとを含み得る。ステージ２は例えば、分化しようとする集団（例えば、ステージ１の分化細胞）を線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ１０）、随意にウイングレス型ＭＭＴＶ統合部位ファミリーメンバー３Ａ（Ｗｎｔ３ａ）、及び随意にドルソモルフィンと接触させて、ステージ２の分化細胞を産生することを含み得る。ステージ３は例えば、分化しようとする集団（例えば、ステージ２の分化細胞）をノギン、随意にシクロパミン−ＫＡＡＤ（Ｃｙｃ）（又はその他のヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達阻害剤）、レチノイン酸（ＲＡ）、随意にＦＧＦ１０と接触させて、内胚葉細胞集団を提供することを含み得る。ドルソモルフィンは、例えばコーディンＬＤＮ１９３１８９及びＢＭＰＲ等である他のノギン成分と置き換えることが可能であり；ＡｃｔＡは、他のＮｏｄａｌアゴニストと置き換えることが可能であり、またＷｎｔ  ３ａは、例えばＣＨＩＲ９９０２１等の他のｗｎｔ／ベータカテニンアゴニスト等である他のＷｎｔシグナル伝達アゴニストと置き換えることが可能である。同様に、ｂＦＧＦ及びＦＧＦ１０は、他のＦＧＦ、又はそれぞれｂＦＧＦもしくはＦＧＦ１０と同じ受容体を活性化する化合物と置き換えることが可能である。レチノイン酸は、例えばレチノイン酸アナログで置き換えることが可能である。このプロトコールは、例えば以前に記載されたプロトコール（Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）であり得るか、及び／又は改変（例えば、１日目にＷｎｔ３ａを、また５日目から７日目にＥｘｅｎｄｉｎ−４、Ｅｘ−４を添加）を伴い得る。例えば、プロトコールからＦＧＦ１０及び／又はＥｘｅｎｄｉｎ−４を省略すること、並びに例えばＷｎｔ３ａの代わりとしてＣＨＩＲ９９０２１（ステムジェント社（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）０４−０００４）を用いることといった変形を含める。ステージ３の細胞を生成するためのプロトコールは、米国特許第７，９８９，２０４号、第７，９９３，９１６号、第８，１２９，１８２号及び第８，１８７，８７８号に記載されており、そのそれぞれを参照により援用する。
【００６０】
ＡｃｔＡは、Ｎｏｄａｌアゴニストである。本明細書で用いる場合、「Ｎｏｄａｌアゴニスト」の語は、例えば「Ｎｏｄａｌ」（例えばＧｅｎｅ  ＩＤ：４３３８等であるヒトＮｏｄａｌ）又は「アクチビン」等であるＮｏｄａｌシグナル伝達を活性化する任意の分子を意味する。本明細書において用いる場合、「アクチビン」又は「ＡｃｔＡ」の語は、例えば、Ｎｏｄａｌシグナル伝達のみならず、天然の活性複合体及び活性断片を含むその活性複合体及び活性断片を活性化することが可能である、例えばヒトアクチビンである「アクチビンＡ」（例えばＧｅｎｅ  ＩＤ：３６２４）ならびに随意に天然の活性複合体及び活性断片を含むその活性複合体及び断片を指す。
【００６１】
Ｗｎｔ３Ａは、ｗｎｔシグナル伝達アゴニストである。本明細書で用いる場合、「ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト」の語は、肝細胞においてｗｎｔ／ベータ−カテニン受容体シグナル伝達を活性化する任意の分子を意味し、また例えばＷｎｔ３ａのみならず、ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）、ＣＨＩＲ９９０２１、ステムジェント社）、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（カタログ：１３１２３））、又はステムジェント社のＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＢＩＯ（カタログ：０４００３）等であるＧＳＫ３選択的阻害剤を含む。ＣＨＩＲ９９０２１は、ＧＳＫ３の選択的阻害剤である。期待されるＧＳＫ３選択的阻害剤は、例えばＷｎｔシグナル伝達経路におけるＧＳＫ−３α／βに対する選択的阻害剤である。
【００６２】
ＦＧＦ１０及びｂＦＧＦは、ＦＧＦ受容体シグナル伝達を活性化するＦＧＦメンバーである。
【００６３】
本明細書で用いる場合、「ＦＧＦアゴニスト」の語は、例えばＦＧＦを含むサイトカイン等である分子、又は、ＦＧＦシグナル伝達経路を活性化する、例えばＦＧＦ受容体を結合及び活性化する小分子、を意味する。本明細書で用いる場合、「ＦＧＦ」の語は、例えばヒトＦＧＦ１（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２２４６）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦとしても知られる；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２２４７）、ＦＧＦ３（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２２４８）、ＦＧＦ４（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２２４９）、ＦＧＦ５（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２２５０）、ＦＧＦ６（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２２５１）、ＦＧＦ７（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２２５２）、ＦＧＦ８（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２２５３）、ＦＧＦ９（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２２５４）及びＦＧＦ１０（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２２５５）であり、随意に天然の活性複合体及び活性断片を含むその活性複合体ならびに活性断片を含む、任意の線維芽細胞増殖因子を指す。ある実施形態においては、ＦＧＦは、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ４及び／又はＦＧＦ２である。
【００６４】
最大で３段階までに多能性幹細胞を分化するために追加される成分についての例示的な範囲は、先に記載されており（Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、ならびに／又はサイトカイン及び小分子を、以下の濃度で使用することが可能である：アクチビンＡ（Ａｃｔ１：１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３ａ（ステージ１：２５ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（ステージ１：０．１〜３μＭ）、ｂＦＧＦ（０．１〜５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ１０（５〜５００ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３ａ（ステージ２：３ｎｇ／ｍｌ）、ドルソモルフィン（ＤＭ：０．２５〜０．７５μＭ）、ノギン（ＮＯＧ：１〜５００ｎｇ／ｍｌ）、シクロパミン−ＫＡＡＤ（Ｃｙｃ：０．５〜２．５μＭ）、レチノイン酸（ＲＡ：０．０２〜２μＭ）、ＥＧＦ（１〜５００ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ阻害剤（１ｕＭ〜１００ｍＭ）。
【００６５】
細胞を分化して内胚葉細胞集団を獲得する他の方法もまた、用いることが可能である。
【００６６】
さらなる態様には、多能性幹細胞集団からＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞を産生する方法が含まれるものであって、当該方法は、ステップｄと共にステップ（又はサブステップ）ａ、ｂ及びｃのうちの１又は複数を含むものであって、当該ステップは、
ａ．多能性幹細胞集団を
Ｉ．Ｎｏｄａｌアゴニスト、随意にＡｃｔＡ、及びｗｎｔシグナル伝達アゴニスト、随意にＷｎｔ３ａ又はＣＩＨＲ  ９９０２１、
ＩＩ．Ｎｏｄａｌアゴニスト、随意にＡｃｔＡ、ＦＧＦアゴニスト、随意にｂＦＧＦ、及び随意にｗｎｔシグナル伝達アゴニスト、随意にＷｎｔ３ａ  ＣＩＨＲ  ９９０２１、ならびに
ＩＩＩ．Ｎｏｄａｌアゴニスト、随意にＡｃｔＡ、及びＦＧＦアゴニスト、随意にｂＦＧＦ、の組み合わせと接触させて、
ステージ１の分化細胞を産生すること、
ｂ．ステージＩの分化細胞をＦＧＦアゴニスト、随意にＦＧＦ１０と、随意にｗｎｔシグナル伝達アゴニスト、随意にＷｎｔ３ａと、及び／又はノギン成分、随意にドルソモルフィンと接触させて、ステージ２の分化細胞を産生すること、
ｃ．ステージ２の分化細胞を、ノギン成分、随意にノギン、レチノイン酸（ＲＡ）又はＲＡアナログと、随意にシクロパミン−ＫＡＡＤ（Ｃｙｃ）と、ＦＧＦアゴニスト、随意にＦＧＦ１０と、及び／又はＥｘｅｎｄｉｎ−４成分、随意にＥｘｅｎｄｉｎ−４と接触させて、内胚葉細胞集団を提供すること、ならびに
ｄ．ＰＤＸ１＋内胚葉細胞集団を、当該内胚葉細胞集団の少なくとも一部をＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞に分化することを誘導するのに十分な量で、ＥＧＦ成分と、タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤とに接触させること、を含む。ある実施形態においては、ステップｄ）は、ＰＤＸ１＋内胚葉細胞集団を、ＢＭＰ阻害剤成分と接触させることをさらに含む。
【００６７】
ある実施形態においては、ステージ２（随意にドルソモルフィンの代わりに）は、当該集団を少なくとも１のノギン成分と接触させることを含むか、及び／又はさらに含む。
【００６８】
ある実施形態においては、ステップは、ステップａ、ｂ及びｃのうちの２以上を含む。例えば、当業者は、ステージ２の細胞又はその均等物に適用しようとする方法が、ステップｃ）及びｄ）を含むであろうことを認識するであろう。同様に、出発細胞集団のサブステージに応じて、ａ）の１又は複数のサブステップが実施され得るか、及び／又は除外され得る。
【００６９】
本明細書において用いる場合、「ステージ１の細胞」は、例えばＮｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．,２０１１に記載されるように、二次元又は三次元の形態でのヒト多能性幹細胞（ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ）のインビトロでの分化に次いで生成される、少なくとも、ＳＲＹ−ｂｏｘ含有遺伝子１７（ＳＯＸ１７）（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６４３２１）及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４（ＣＸＣＲ４）（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：７８５２）の発現によって特徴付けられる内胚葉細胞を意味する。
【００７０】
本明細書で用いる場合、「ステージ２の細胞」は、例えばＮｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１に記載されるように、二次元又は三次元の形態でのヒト多能性幹細胞（ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ）のインビトロでの分化に次いで生成される、少なくとも、フォークヘッドボックスＡ２（ＦＯＸＡ２）（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：３１７０）の発現によって、及びＨＮＦ１ホメオボックスＢ（ＨＮＦ１Ｂ）（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６９２８）の発現によって特徴付けられる内胚葉細胞を意味する。
【００７１】
本明細書で用いる場合、「ステージ３の細胞」は、例えばＮｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１に記載されるように、二次元又は三次元の形態でのヒト多能性幹細胞（ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ）のインビトロでの分化に次いで生成される、少なくとも、ＰＤＸ１（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：３６５１）の発現によって特徴付けられる内胚葉細胞を意味する。
【００７２】
本明細書で用いる場合、「ステージ４の細胞」は、ヒト多能性幹細胞（ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ）のインビトロでの分化に次いで生成される、少なくとも、ＮＫ６ホメオボックス１（ＮＫＸ６−１）（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４８２５）の発現によって、ならびに膵臓及び十二指腸のホメオボックス１（ＰＤＸ１）（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：３６５１）の発現によって特徴付けられる内胚葉細胞を意味する。
【００７３】
ＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性前駆細胞は、例えば、インビボ及び／又はインビトロでインスリン産生細胞を生成するために用いることが可能である。
【００７４】
例えば、本明細書に記載の方法に従って産生した移植されたＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性前駆細胞が、インスリン産生細胞に分化する（図８）。
【００７５】
インスリン産生細胞の検出は、例えばフローサイトメトリーによるｃ−ペプチド陽性、ならびに／又は例えばＲＴ−ＰＣＲによる、インスリン及び／もしくはグルカゴンの発現の検出を例えば含み得る。
【００７６】
本明細書で用いる場合、「インスリン産生細胞」の語は、インスリンを分泌する、膵臓前駆体から分化した細胞を指す。インスリン産生細胞には、機能性膵ベータ細胞のみならず、恒常的なやり方もしくは誘導可能なやり方でインスリンを合成、発現又は分泌する膵ベータ様細胞が含まれる。例えば本明細書に記載の方法に従って内胚葉細胞を膵臓前駆体に分化して、その後のインスリン産生細胞への分化によって産生するインスリン産生細胞の集団は、機能性膵ベータ細胞又はベータ様細胞（例えば、内在性の機能性ベータ細胞の少なくとも２つの特性を有する細胞）とすることが可能である。例えば本明細書に開示の方法によって産生されるインスリン産生細胞の集団は、膵ベータ細胞又は膵ベータ様細胞を含み得、そしてまた非インスリン産生細胞（例えば、インスリンを産生又は分泌しない例外を伴うベータ細胞様表現型を含む細胞）を含有し得ることもまた期待される。
【００７７】
ＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性前駆細胞のインスリン産生細胞への分化は、例えば、（Ｒｅｚａｎｉａ  ２０１４、Ｐａｇｌｉｕｃａ  ２０１４）に開示の方法によって行われる。
【００７８】
本明細書で用いる場合、「Ｃ−ペプチド陽性／ＮＫＸ６−１陽性細胞」は、例えば膵臓内胚葉細胞に由来し、またＮＫＸ６−１及びＣ−ペプチドであるマーカーを発現する、細胞を指す。本明細書で用いる場合、「Ｃ−ペプチド」は、プロインスリン分子内のインスリンのＡ−鎖とインスリンのＢ鎖とを結合させる短い３１アミノ酸プリペプチド、又はこのポリペプチドのバリアント、又はこのポリペプチドの断片を指す。Ｃ−ペプチドは、インスリン産生のマーカーである。Ｃ−ペプチド陽性／ＮＫＸ６−１陽性細胞は、Ｐａｇｌｉｕｃａ  ２０１４に開示の方法を用いて、ＮＫＸ６−１陽性膵前駆細胞から分化可能である。Ｃ−ペプチド陽性／ＮＫＸ６−１陽性細胞の集団は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は最大約９５％の、Ｃ−ペプチド陽性／ＮＫＸ６−１陽性細胞を含む。
【００７９】
当該細胞は、混合細胞培養液として、収穫することが可能である（例えば、遠心沈殿させて好適な希釈液中に再懸濁させる）。
【００８０】
ある実施形態においては、当該方法は、例えばＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性膵前駆細胞及び／もしくはＣ−ペプチド／ＮＫＸ６−１二重陽性膵ベータ細胞を富化すること、ならびに／又は単離することを含む。
【００８１】
ある実施形態においては、単離するステップは、細胞の集団を、ＮＫＸ６−１陽性細胞を結合する特異的な薬剤と接触させることを含む。
【００８２】
例えば実施例４において、ＧＰ２、ＣＤ１４２、ＨＰｘ１及びＨＰｘ２に向けられる抗体を用いて、ＮＫＸ６−１陽性細胞に関して富化することが可能である、ということも実証された。
【００８３】
したがって、ある実施形態においては、当該方法は、ＮＫＸ６−１陽性細胞を含む細胞の集団を、ＨＰＸエピトープ検出抗体と接触させることを含む。
組成物及びキット
【００８４】
ＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性膵前駆細胞と、分化したインスリン産生細胞とは、単離することが可能である。したがって、さらなる態様は、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性膵前駆細胞及び／又は例えば本明細書に記載の方法に従って産生した分化したインスリン産生細胞の、富化され、精製され、又は単離された細胞集団を含む。別の態様は、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性膵前駆細胞及び／又は分化したインスリン産生細胞の、富化され、精製され、又は単離された細胞集団を含む組成物、ならびに好適な希釈剤を含む。
【００８５】
好適な希釈剤は、例えば、好適な培地、又は例えば血清、血清代替物、もしくは血清添加剤、及び／もしくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロールメチルセルロース、もしくはポリビニルピロリデン等の好適な凍結防御物質を含有する凍結培地（ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）を含む。
【００８６】
さらなる態様は、ＢＭＰ阻害剤成分を伴って又は伴わずに、ＥＧＦ成分、タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤、を含む培地添加物組成物を含むが、これは細胞培養基本培地の添加剤として用いることが可能である。添加剤にはまた、アスコルビン酸、Ｌ−グルタミン及びＢ２７（又はＮｅｕｒｏｂｒｅｗ−２１等の代替物）等の本明細書で論じる他の成分が含まれ得る。ある実施形態における添加剤は、以下の有効成分を含む：ＢＭＰ阻害剤、ＥＧＦ、タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤、ならびに随意に、アスコルビン酸、Ｌ−グルタミン及びＢ２７のうちの１又は複数。
【００８７】
ＰＤＸ１＋内胚葉細胞からＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性膵前駆細胞を分化するための成分は、例えばＤＭＥＭ（又は例えばＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、ＣＭＲＬ）等、基礎培地に添加される単一の添加剤として含めることが可能である。添加剤は、ある実施形態においては、以下の有効成分を含有することとなる：ＢＭＰ阻害剤、ＥＧＦ、タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤、アスコルビン酸、Ｌ−グルタミン、及びＢ２７。
【００８８】
さらなる態様は、１つのステージから別のステージへと細胞を分化するのに好適な培地組成物である。例えば、好適な培地組成物は、例えばＥＧＦ成分、及び／又はタンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤、随意にＢＭＰ阻害剤成分、及び／又は、さらに本明細書に記載の他の増殖因子を含み得る。
【００８９】
本明細書で言及する場合、「細胞培地」（本明細書においては「培養培地」又は「培地」とも呼ぶ）の語は、細胞生存率を維持して、増殖及び随意に分化を支持する栄養素を含有する、細胞を培養するための培地である。細胞培地は、適切な組合せで、以下のうちのいずれかを含有し得る：塩、緩衝液、アミノ酸、グルコース、又は他の糖類、抗生剤、血清又は血清代替物、及びペプチド増殖因子、ビタミン等の他の成分。特定の細胞型に通常用いられる細胞培地は、当業者にとって公知である。
【００９０】
好適な培地は、例えばＤＭＥＭ（ライフテクノロジーズ社）、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、ＣＭＲＬ及び／もしくはその他を含む好適な基本培地、又は、内胚葉細胞の増殖を支持して、例えば組成物及び随意に他の薬剤を添加することが可能である基本培地組成物を提供（例えば、好適なステージ４の培地組成物を提供）する培地を含むことが可能である。
【００９１】
培地は、例えば、ＰＤＸ１＋内胚葉細胞の集団を培養して、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性分化を誘導することが可能である。
【００９２】
したがって、さらなる態様は、細胞培養基本培地、ならびに
ｉ．ＥＧＦ成分、
ｉｉ．タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤、及び
ｉｉｉ．ＢＭＰ阻害剤成分、のうちの１又は複数、を含む培地組成物である。
【００９３】
一部の実施形態においては、培地組成物（又は基本培地）は、ペニシリン及びストレプトマイシン等である１もしくは複数の抗生剤；Ｌ−グルタミン（ライフテクノロジーズ社）等の１もしくは複数のアミノ酸、血清代替物であるＢ２７添加剤（ライフテクノロジーズ社）、ならびに／又はＬ−アスコルビン酸（シグマ社）等である１もしくは複数のビタミンをさらに含み得る。
【００９４】
添加剤中の成分の量は、例えば、培地中に希釈したとき（例えば、４５０ｍＬの基本培地中に希釈したとき）に、例えば内胚葉集団を分化することに関して本明細書に記載した濃度を結果的にもたらすような量であり得る。同様に、培地中の成分の濃度は、例えば内胚葉集団を分化することに関して本明細書に記載した濃度であり得る。
【００９５】
さらなる態様は、
ＥＧＦ成分、
タンキラーゼ酵素のアデノシンサブサイトに結合するタンキラーゼ阻害剤、及び／又は
ＢＭＰ阻害剤成分、を含むキットを含む。
【００９６】
上記に記載したように、組成物およびキットの成分は、本明細書の別の箇所に記載した成分のいずれかと、随意に使用のための指示とを含み得る。例えば、ある実施形態においては、キットは、本明細書に記載の１又は複数のステージの分化を誘導する成分等を含む添加剤（例えばステージ４の添加剤）を含む。ある実施形態においては、キットは、基本培地、随意に本明細書に記載の基本培地を含む。
使用
【００９７】
ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋  ＨＰＳＣ由来の膵臓前駆体及びそれらのベータ細胞誘導体は、複数の用途に用いることが可能である。
【００９８】
例えば、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１膵前駆細胞は、予測的な薬物毒性学及び創薬に使用することが可能である。
【００９９】
したがって、ある実施形態においては、本明細書に記載の方法により生成したＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１を発現する集団を試験化合物と接触させることと、当該試験化合物が、対照と比較して１）増殖を刺激する、２）アポトーシスの契機となる、及び／又は３）ＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１発現細胞のインスリン産生ベータ様細胞への、他のホルモン産生細胞（例えば、ソマトスタチン、グルカゴン、膵臓ポリペプチド及びグレリン）、腺房細胞又は導管細胞への分化を誘導するか否かを判断することとを含む、アッセイを提供する。当技術分野で公知のアッセイを用いて、例えば、アポトーシス及び／又は細胞増殖を評価することが可能である。ホルモン産生細胞への分化は、ホルモン産生、随意に分泌されたホルモンを測定することによって、又はｍＲＮＡレベルを評価することによって評価することが可能である。
【０１００】
ＨＰＸ抗体の使用により、試験化合物との接触のためにより均一な集団を提供することによって、化合物のスクリーニングを促進することが可能である。
【０１０１】
記載の細胞はまた、細胞移植に用いることが可能である。例えば、細胞、富化及び／もしくは単離したＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性膵前駆細胞、ならびに／又はＮＫＸ６−１陽性インスリン産生細胞の混合集団は、例えば糖尿病及び／又は前糖尿病状態を治療するためにそれを必要とする対象に導入することが可能である。
【０１０２】
したがって、ある態様は、細胞を獲得することならびに／又は本明細書に記載の方法に従って膵前駆細胞及び／もしくはインスリン産生細胞を調製することと、当該細胞を、例えば糖尿病を患う対象であるそれを必要とする対象に投与することとを含む。
【０１０３】
例えば糖尿病を患う対象に移植及び／又は治療を行うために、それを必要とする対象に移植及び／又は治療を行うための当該細胞を含む、当該細胞及び組成物の使用がまた含まれる。
【０１０４】
ある実施形態においては、糖尿病はＩ型糖尿病である。別の実施形態においては、糖尿病はＩＩ型糖尿病である。
【０１０５】
ある実施形態においては、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性膵前駆細胞及び／又はベータ細胞は、組織工学に用いられる。例えば、膵臓系統細胞の精製した集団へのアクセスは、規定された数の膵臓細胞を含めた改変コンストラクトの産生を可能にすることとなる。
【０１０６】
ある実施形態においては、当該方法は、患者の特定の疾患のｈｉＰＳＣに適用して、例えば糖尿病のモデル化に用いられる。例えば、糖尿病を患う患者から膵細胞又は他の細胞を単離し、処理して、それによりその後の培養によりＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性膵前駆細胞への分化を誘導するｈｉＰＳＣを得ることが可能である。これら細胞を用いて、例えば疾患に関与する遺伝子又は患者の免疫細胞への反応等である疾患の特性を評価することが可能である。
【０１０７】
例えば、正常細胞と、患者の特定の疾患のｈｉＰＳＣとをＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性膵臓細胞に誘導して、他の細胞型と比較することが可能である。例えば、正常の及び患者の特定のｈｉＰＳＣからの膵臓前駆体及びベータ細胞について、遺伝子的、エピジェネティック的、及びプロテオミクス的な解析を行うことが可能である。こうした詳細な解析は、シグナル伝達経路、転写調節ネットワーク、及び／又は正常ヒト膵臓の発生を調節する細胞表面マーカーのみならず疾患に関与する細胞表面マーカーの発見につながり得る。
【０１０８】
本明細書で用いる場合、「対象」又は「患者」の語は、哺乳動物を含めた動物界の全てのメンバーを含み、また好適にはヒトを指す。
【０１０９】
インビトロ細胞培養に適用する場合、「治療する、処理する」、「治療すること、処理すること」、「治療、処理」等の語は培地をあらゆる種類のプロセスもしくは条件に供すること、又は、任意の化合物を培地に添加すること、もしくは除去することを含む。単離された細胞に適用する場合には、細胞をあらゆる種類のプロセスもしくは条件に供すること、又は細胞に対してあらゆる種類の操作もしくは手順を行うことを含む。対象に適用する場合には、この語は、個体に対して、医療上又は外科的な注意、ケア、又は管理を提供することを指す。
【０１１０】
本明細書で用いる場合、対象に適用する「治療」の語は、臨床結果を含めた有益な結果又は所望の結果を得ることに向けたアプローチを指し、また糖尿病を治療するための、例えば薬剤的介入、外科手術、放射線療法及び自然療法的介入である医療処置ならびに適用のみならず試験治療を指す。有益又は所望の臨床結果には、１もしくは複数の症状もしくは状態の緩和又は改善、疾患の程度の縮小、安定化した（例えば、悪化ではない）病状、疾患の拡散の防止、疾患の進行の遅延又は減速、病状からの寛解、病状の緩和又は寛解、及び、検出可能か又は検出不可能である寛解（部分的か又は全体的）が含まれ得るが、これに限定されない。「治療」はまた、治療を受けない場合に予測される生存期間と比較して生存期間が長くなることを意味し得る。
【０１１１】
本明細書で用いる場合、「投与すること」、「導入すること」、及び「移植すること」の語は、所望の部位において導入される細胞の少なくとも部分的な局在を結果としてもたらす方法又は経路によって、細胞（例えば、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１二重陽性膵前駆細胞、又はそれらの分化した後代（例えば、膵ベータ細胞等のインスリン産生細胞）を対象に送達する文脈において区別なく用いる。細胞は、膵臓に直接移植可能であるか、あるいは移植した細胞又は細胞の成分の少なくとも一部が生存可能のままであるような対象における所望の位置への送達を結果的にもたらす任意の適切な経路によって投与することが可能である。
【０１１２】
さらに、特定の項において記載する定義及び実施形態は、当業者によって理解されることとなるのに好適である本明細書に記載の他の実施形態に適用可能であることを意図している。例えば、続く節において、本発明の異なる態様がより詳細に規定される。そのように規定された態様のそれぞれは、その反対のことを明示していない限り、任意の他の態様と組み合わせてもよい。特に、好ましい又は有利であるとして示した任意の特徴は、好ましい又は有利であると示したその他の特徴と組み合わせてもよい。
【０１１３】
上記の開示は、概して、本願を記述するものである。以下の特定の実施例を参照することにより、より完全な理解が得られうる。これら実施例は、説明の目的のためのみに記載され、本願の範囲を限定することを意図するものではない。状況が適切な手段を示唆する又は与える可能性がある場合は、形態上の変更及び均等物での置換が検討される。特定の語が本明細書で採用されているが、そうした語は、説明的な意味を意図しているものであって、限定の目的を意図しているものではない。
【実施例】
【０１１４】
以下の非限定的な実施例は、本開示の例証である：
【０１１５】
実施例１
タンキラーゼ阻害剤は、インスリン産生細胞に分化するＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵前駆細胞を誘導する
この報告においては、種々のｈＰＳＣ株からＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋内胚葉を生成する新規の方法を提示する。ＩＮＳ遺伝子座に対してＧＦＰレポーター株を用いることにより、タンキラーゼ阻害剤が同様の膵臓前駆体集団を生成したにもかかわらず、ＩＷＲ−１及びＷＩＫＩ４等の選択的タンキラーゼ阻害剤で処理した細胞は、分化２１日目に、より高い割合のインスリン：ＧＦＰ＋細胞を生成することができたということを実証した。（図１〜５を参照のこと）。
【０１１６】
実施例２
ＡＲＤＴ５及び６を標的とする特異的なＡＲＤＴ阻害剤（ＴＡＮＫ１及びＴＡＮＫ２）は、Ｈ１細胞株を用いてベータ様細胞を生成する膵前駆細胞を生じる。
試験されたＡＲＤＴ阻害剤は、タンキラーゼタンパク質のアデノシンサブサイト（ＡＲＤＴ５／６としても知られる）を標的とすることによって、タンキラーゼシグナル伝達を拮抗する。反対に、ＰＡＲＰ１／２を阻害するだけである化合物ＭＫ４８２７で処理した細胞が、ＤＭＳＯ対照と同様の集団を生成した［図５］。公開されているプロトコール（Ｒｅｚａｎｉａ  ２０１４、Ｐａｇｌｉｃａ  ２０１４）を用いてこれらタンキラーゼ阻害剤由来の膵臓前駆体を培養することによって、２３日目にｃ−ペプチド＋／ＮＫＸ６．１＋ベータ様集団を生成することができた。（図６及び７を参照のこと）。
【０１１７】
実施例３
ＷＩＫＩ４により生成された膵臓前駆体は、インビボで内分泌細胞、外分泌細胞、及び導管細胞に発達した。
それらのインビボでの発生能を評価するために、ＷＩＫＩ４により生成した膵臓前駆体を、免疫不全マウスに、皮下に移植した。移植片を、移植３ヶ月後に解析して、インスリン、ＮＫＸ６−１、グルカゴン、サイトケラチン１９及びトリプシンについて染色した。蛍光免疫染色により、ＷＩＫＩ４処理した細胞は、ベータ様細胞（インスリン＋／ＮＫＸ６−１＋）、アルファ様細胞（グルカゴン＋／インスリン−）、トリプシン＋及びサイトケラチン１９＋の細胞に発達する能力を有することが実証されたが、これは両方の内分泌細胞、腺房細胞、及び導管細胞の存在を実証する（図８を参照のこと）。
【０１１８】
実施例４
ＷＩＫＩ４により生成したベータ様細胞は、インビボで内分泌細胞に発達した。
それらのインビボでの発生能を評価するために、ＷＩＫＩ４により生成したベータ様細胞含有培養物を、免疫不全マウスに、皮下に又は腎臓被膜下に移植した。移植片を、移植７．５週後に解析して、インスリン、グルカゴン及びソマトスタチンについて染色した。蛍光免疫染色により、ＷＩＫＩ４処理した細胞は、ベータ様細胞（インスリン＋）、アルファ様細胞（グルカゴン＋）、及びデルタ様細胞（ソマトスタチン＋）によって特徴付けられる島様細胞に発達する能力を有することが実証された（図９を参照のこと）。
【０１１９】
実施例５
ＷＩＫＩ４により生成したベータ様細胞は、動物糖尿病モデルにおいて糖血症を正常化する。
それらのインビボでの機能性を評価するために、ＷＩＫＩ４により生成したベータ様細胞含有培養物を、ストレプトゾトシン注射により高血糖にさせた免疫不全マウスに、皮下に又は腎臓被膜下に移植した。血糖は、最初に、インスリンペレットによって（０〜４週及び８〜１２週に腎臓被膜で、ならびに０〜４週及び１０〜１４週に皮下に）、次いで移植細胞によって、正常化したが、これはグルコースを感知し、それに応じてインスリンを放出するというそれらの能力を実証している（図１０を参照のこと）。
【０１２０】
本願は、好ましい実施例であると現在考えられるものを参照しながら記載したが、本願は、開示の実施例に限定されないということを理解されたい。それとは反対に、本願は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれる様々な変形及び均等の措置をカバーすることを意図している。
【０１２１】
全ての公開公報、特許及び特許出願が、個々の公開公報、特許又は特許出願のそれぞれをその全体を参照により援用するように具体的に個別に示した場合と同程度に、その全体を参照により本明細書に援用する。特に、本明細書に提供した各アクセッション番号に関連する配列は、例えば表やその他に提供されるアクセッション番号及び／又はバイオマーカー配列（例えば、タンパク質及び／又は核酸）を含めて、その全体を参照により援用する。
【０１２２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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