(57)【要約】カルボン酸基質を、カルボン酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有する異種シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）タンパク質と反応させることを含む、ガンマラクトンを作製する方法が本明細書で提供される。上記タンパク質は、カルボン酸基質のカルボニル炭素に対してガンマに位置する炭素原子で特異的にヒドロキシラーゼ活性を有し、それによって、４−ヒドロキシカルボン酸を生成し、これが、酸性にすると、自発的にガンマラクトンに変換することができるという発見に基づく。
2021530996.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを生成する方法であって、
カルボン酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有する組換えＣＹＰ４５０タンパク質およびＣ４〜Ｃ２０カルボン酸基質を含む反応混合物を提供して、４−ヒドロキシＣ４〜Ｃ２０カルボン酸を提供することと；
前記４−ヒドロキシＣ４〜Ｃ２０カルボン酸を酸性条件に供して、前記Ｃ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを生成することと
を含み、
前記組換えＣＹＰ４５０タンパク質は、配列番号１、配列番号３または配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
方法。
【請求項２】
前記組換えＣＹＰ４５０タンパク質が、前記反応混合物中の形質転換宿主細胞によって発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記形質転換宿主細胞が細菌細胞および酵母細胞から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組換えＣＹＰ４５０タンパク質が、（ａ）配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；（ｃ）配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記組換えＣＹＰ４５０タンパク質が、（ａ）配列番号３と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；（ｂ）配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；（ｃ）配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記組換えＣＹＰ４５０タンパク質が、（ａ）配列番号５と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；（ｂ）配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；（ｃ）配列番号５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸基質が、Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸：Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸の塩；Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸のエステル；Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸のモノ−、ジ−もしくはトリグリセリド；またはこれらの組み合わせを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸が、直鎖Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸、分岐Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸、飽和Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸、不飽和Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸基質が、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、およびテトラデカン酸から選択される、γ−ヘプタラクトン、γ−オクタラクトン、γ−ノナラクトン、γ−デカラクトン、γ−ウンデカラクトン、γ−ドデカラクトン、γ−トリデカラクトン、およびγ−テトラデカラクトンから選択されるＣ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを生成するための請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸基質がウンデカン酸およびウンデセン酸から選択される、γ−ウンデカラクトンおよびγ−ウンデセノラクトンから選択されるＣ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを生成するための請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸酸基質が、ヘキサン酸、ヘプタン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、およびテトラデカン酸から選択される、γ−ヘキサラクトン、γ−ヘプタラクトン、γ−デカラクトン、γ−ウンデカラクトン、γ−ドデカラクトン、γ−トリデカラクトン、およびγ−テトラデカラクトンから選択されるＣ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを生成するための請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
Ｃ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを生成する方法であって、
カルボン酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有するＣＹＰ４５０タンパク質をコードする配列を含む形質転換宿主細胞をＣ４〜Ｃ２０カルボン酸基質と共にインキュベートして、４−ヒドロキシＣ４〜Ｃ２０カルボン酸を提供することと；
前記４−ヒドロキシＣ４〜Ｃ２０カルボン酸を酸性条件に供して、前記Ｃ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを生成することと
を含み、
前記ＣＹＰ４５０タンパク質をコードする前記配列は、配列番号２、配列番号４または配列番号６と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
方法。
【請求項１３】
前記形質転換宿主細胞が細菌細胞または酵母細胞から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヌクレオチド配列が配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有し、前記ＣＹＰ４５０タンパク質が、（ａ）配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；（ｃ）配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヌクレオチド配列が配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有し、前記ＣＹＰ４５０タンパク質が、（ａ）配列番号３と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；（ｂ）配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；（ｃ）配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヌクレオチド配列が配列番号６と少なくとも８０％の同一性を有し、前記ＣＹＰ４５０タンパク質が、（ａ）配列番号５と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；（ｂ）配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；（ｃ）配列番号５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸基質が、Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸：Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸の塩；Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸のエステル；Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸のモノ−、ジ−もしくはトリグリセリド；またはこれらの組み合わせを含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸が、直鎖Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸、分岐Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸、飽和Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸、不飽和Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸基質が、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、およびテトラデカン酸から選択される、γ−ヘプタラクトン、γ−オクタラクトン、γ−ノナラクトン、γ−デカラクトン、γ−ウンデカラクトン、γ−ドデカラクトン、γ−トリデカラクトン、およびγ−テトラデカラクトンから選択されるＣ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを生成するための請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸基質がウンデカン酸およびウンデセン酸から選択される、γ−ウンデカラクトンおよびγ−ウンデセノラクトンから選択されるＣ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを生成するための請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸酸基質が、ヘキサン酸、ヘプタン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、およびテトラデカン酸から選択される、γ−ヘキサラクトン、γ−ヘプタラクトン、γ−デカラクトン、γ−ウンデカラクトン、γ−ドデカラクトン、γ−トリデカラクトン、およびγ−テトラデカラクトンから選択されるＣ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを生成するための請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記形質転換宿主細胞が増殖細胞である、請求項１２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記形質転換宿主細胞が休止細胞である、請求項１２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、各々の開示がこれにより全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年７月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／６９９，３７４号、および２０１８年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６２／７５８，０１９号に基づく優先権および利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野は、組換えタンパク質および／またはこのような組換えタンパク質を発現するように改変された微生物培養物を介してガンマラクトンを生成するための方法およびプロセスに関する。より具体的には、本開示は、酵素的変換を介した対応するカルボン酸基質からのＣ４〜Ｃ２０ガンマラクトンの生産に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
心地よい味および匂いを有する食品、フレグランスおよび化粧品に対する普遍的な欲求が存在する。多くの場合、これらの心地よい匂いおよび味の特性は、望ましい芳香および香味の特徴を有するさまざまなガンマラクトンを含むさまざまなラクトン化合物を通して提供される。ラクトン化合物の現在の需要は、主に化学合成または植物からの抽出プロセスのいずれかによって対処されている。植物抽出ベースの生産には、目的の化合物の強度および存在量に対する天候の影響、植物病害および／または不作のリスク、化合物の安定性、生産増加の環境への影響、ならびに貿易制限などの重大な欠点がある。工業生産は環境に損害を与えるおそれがあり、危険な前駆体を使用する可能性があり、重要な基質のコストのためにそれ自体がコストの増加にさらされる可能性がある。
【０００４】
したがって、当技術分野では、植物抽出および化学合成によってもたらされる制限なしに、経済的かつ確実にガンマラクトンを生成するための新規な方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
本発明によると、ガンマラクトンは、細菌および／または酵母などの微生物を使用する遺伝子改変および発酵技術によって、高収率で確実に生産され得る。これらの微生物は、新規に、または脂肪酸の生体内変換によってラクトンを合成して、商業的に有意な収量を提供することができる。したがって、ガンマラクトン生産のコストを削減し、これらのラクトン化合物を抽出できる天然資源の大規模な培養および処理の環境への影響を軽減するための新しい生産方法が本明細書で提供される。
【０００６】
より具体的には、本開示は、異種シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）タンパク質を発現する細胞系を含む微生物発酵によってガンマラクトンを生成するための方法および組成物を包含する。
【０００７】
本開示は、一部は、特定のＣＹＰ４５０タンパク質およびその機能的変異体が、カルボン酸基質のカルボニル炭素に対してガンマに位置する炭素原子で特異的にヒドロキシラーゼ活性を有し、それによって、４−ヒドロキシカルボン酸を生成し、これが、酸性にすると、自発的にガンマラクトンに変換することができるという発見に基づく。改変された微生物系でこれらのＣＹＰ４５０タンパク質を過剰発現させ、これに適切なカルボン酸基質を供給することによって、さまざまなガンマラクトンを高力価で生産することができる。したがって、本開示は、化学合成または植物抽出に関連する欠点なしに、カルボン酸（例えば、さまざまな市販の脂肪酸）からガンマラクトンを作製するための経済的で確実な方法を提供する。
【０００８】
したがって、本開示の一態様は、Ｃ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを生成する方法であって、（ａ）Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸基質を含む培地中で異種ＣＹＰ４５０タンパク質を発現する細胞系をインキュベートして、４−ヒドロキシＣ４〜Ｃ２０カルボン酸を提供することと、（ｂ）４−ヒドロキシＣ４〜Ｃ２０カルボン酸を酸性条件に供して、Ｃ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを提供することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、４−ヒドロキシカルボン酸を、酸性化の前に細胞系から単離することができる。
【０００９】
さまざまな実施形態では、細胞系が、異種ＣＹＰ４５０タンパク質をコードする配列を含む形質転換宿主細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞系が、細菌細胞、酵母細胞、目的のラクトンを自然に産生しない植物細胞、藻類細胞、および／または本明細書に記載される特定の真菌ＣＹＰ４５０タンパク質を自然にコードしない真菌細胞を含むことができる。特定の実施形態では、細胞系が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ；Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ；Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ；Ｍｕｃｏｒ；Ｐｉｃｈｉａ；Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ；Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｌｙｓ；Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ；Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ；Ｍｕｃｏｒ；Ｐａｎｔｏｅａ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍからなる群から選択される形質転換細菌および／または酵母細胞を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞系が、増殖細胞を含むことができる。他の実施形態では、細胞系が、休止細胞（例えば、凍結され、次いで、再懸濁された凍結乾燥細胞）を含むことができる。
【００１０】
本開示はまた、Ｃ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを生成する方法であって、本明細書に記載される組換えＣＹＰ４５０タンパク質およびＣ４〜Ｃ２０カルボン酸基質を含む反応混合物を提供して、４−ヒドロキシＣ４〜Ｃ２０カルボン酸を提供することと、４−ヒドロキシＣ４〜Ｃ２０カルボン酸を酸性条件に供して、Ｃ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを生成することとを含む方法を包含する。いくつかの実施形態では、組換えＣＹＰ４５０タンパク質が、反応混合物中の形質転換宿主細胞によって発現され得る。他の実施形態では、組換えＣＹＰ４５０タンパク質を、単離し、次いで、反応混合物に提供することができる。
【００１１】
本開示によるＣ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを生成する方法のさまざまな実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、カルボン酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有するＭｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｏｕｓ  ＣＹＰ４５０タンパク質またはその機能的変異体であり得る。例えば、ＣＹＰ４５０タンパク質は、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。特定の実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列からなることができる。したがって、このようなＣＹＰ４５０タンパク質またはその変異体を発現するように形質転換された形質転換宿主細胞は、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１２】
いくつかの他の実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、カルボン酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有するＢａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｍｅｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｓ  ＣＹＰ４５０タンパク質またはその機能的変異体であり得る。例えば、ＣＹＰ４５０タンパク質は、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。特定の実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列からなることができる。したがって、このようなＣＹＰ４５０タンパク質またはその変異体を発現するように形質転換された形質転換宿主細胞は、配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１３】
さらに他の実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、カルボン酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有するＵｍｂｅｌｏｐｓｉｓ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎｅ  ＣＹＰ４５０タンパク質またはその機能的変異体であり得る。例えば、ＣＹＰ４５０タンパク質は、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。特定の実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号５のアミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号５のアミノ酸配列からなることができる。したがって、このようなＣＹＰ４５０タンパク質またはその変異体を発現するように形質転換された形質転換宿主細胞は、配列番号６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸基質が、Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸：Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸の塩；Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸のエステル；Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸のモノ−、ジ−もしくはトリグリセリド；またはこれらの組み合わせを含むことができる。特定の実施形態では、Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸基質がＣ４〜Ｃ２０カルボン酸またはその塩であり得る。Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸は、直鎖Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸、分岐Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸、飽和Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸、または不飽和Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸であり得る。Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸は、任意の置換が、カルボン酸のカルボニル炭素に対してアルファ、ベータ、またはガンマに位置する炭素原子にないという条件で、ヒドロキシル基およびアミノ基から選択される１またはそれを超える官能基で必要に応じて置換され得る（図１参照）。特定の実施形態では、Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸が直鎖完全飽和カルボン酸であり得る。特定の実施形態では、Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸基質が、ヘキサン酸、ヘキセン酸、ヘプタン酸、１−ヘプテン酸、２−ヘプテン酸、オクタン酸、１−オクテン酸、２−オクテン酸、３−オクテン酸、ノナン酸、１−ノネン酸、２−ノネン酸、３−ノネン酸、デカン酸、１−デセン酸、２−デセン酸、３−デセン酸、ウンデカン酸、１−ウンデセン酸、２−ウンデセン酸、３−ウンデセン酸、ドデカン酸、１−ドデセン酸、２−ドデセン酸、３−ドデセン酸、トリデカン酸、１−トリデセン酸、２−トリデセン酸、３−トリデセン酸、テトラデカン酸、１−テトラデセン酸、２−テトラデセン酸、および３−テトラデセン酸から選択され得る。
【００１５】
Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸基質の素生に応じて、本方法によって生産されるガンマラクトンが、γ−ヘキサラクトン、γ−ヘキセノラクトン、γ−ヘプタラクトン、γ−ヘプテノラクトン、γ−オクタラクトン、γ−オクテノラクトン、γ−ノナラクトン、γ−ノネノラクトン、γ−デカラクトン、γ−デカセノラクトン、γ−ウンデカラクトン、γ−ウンデセノラクトン、γ−ドデカラクトン、γ−ドデセノラクトン、γ−トリデカラクトン、γ−トリデセノラクトン、γ−テトラデカラクトン、およびγ−テトラデセノラクトンから選択されるＣ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを含むことができる。
【００１６】
本明細書に記載される任意の方法は、細胞系からガンマラクトンを単離して、粗生成物を提供することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、このような単離ステップから得られる粗生成物が、少なくとも７０％純粋であるラクトン内容物を含むことができる。いくつかの実施形態では、方法が、ガンマラクトンを含む粗生成物を精製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記粗生成物がカラムクロマトグラフィーによって精製される。いくつかの実施形態では、前記粗生成物が酸塩基抽出によって精製される。いくつかの実施形態では、前記粗生成物が真空蒸留によって精製される。いくつかの実施形態では、方法が、セミ分取ＨＰＬＣを使用して前記ラクトンを精製することをさらに含む。
【００１７】
本明細書に記載される方法によって生産されるガンマラクトンは、単独で使用する、または他のラクトン、香味、または香気と混合して、さまざまな消費者製品または食品で使用するための所望の組成物を得ることができる。例えば、本明細書に記載されるガンマラクトンは、食品（飲料、清涼飲料、アイスクリーム、乳製品、菓子類、シリアル、チューインガム、焼き菓子等など）、栄養補助食品、医学的栄養、ならびに所望の香味または芳香特性を与える医薬品に含まれ得る。いくつかの実施形態では、本開示は、特定の香味条件、配合またはレシピで使用するための、上記の方法のいずれか１つによって生産される、または本明細書の他の場所に記載される香味量または香気量のラクトンを含む消耗品を提供する。いくつかの実施形態では、消耗品が食品、飲料、香水または化粧品であり得る。いくつかの実施形態では、組成物が飲料、菓子類、ベーカリー製品、クッキー、およびチューインガムから選択され得る。特定の実施形態では、組成物が、モモ、アンズ、ナシ、カエデ、ココナツ、バニラ、バタースコッチ、グレナディンおよび／またはナツメヤシのような味または匂いに設計された香味または芳香プロファイルを有する食品、飲料、香水または化粧品であり得る。
【００１８】
本開示は、さまざまな修正および代替形態の影響を受けやすいが、その特定の実施形態を、例として図面に示し、本明細書で詳細に説明する。しかしながら、本明細書に提示される図面および詳細な説明は、本開示を開示される特定の実施形態に限定することを意図するものではなく、逆に、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神および範囲に入る全ての修正、同等物および代替物を網羅することを意図していることを理解すべきである。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面を参照して、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明で明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれ、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１またはそれを超えるものを参照することによってよりよく理解することができる。
【００２１】
【図１】図１は、カルボン酸基質からのガンマラクトンの生産について４−ヒドロキシラーゼ経路をβ酸化経路と比較している。具体的には、γ−デカラクトン（ＧＣ１０）の生産が、２つの経路を説明するための例として使用される。
【００２２】
【図２ａ−２ｃ】図２は、Ｍｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｕｓ  Ｐ４５０を過剰発現するように形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を使用したさまざまなγ−ラクトンの生産を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示している。具体的には、図２ａは、エナント酸（ヘプタン酸、Ｃ７）からのγ−ヘプタラクトン（ＧＣ７）の生産を示している。図２ｂは、カプリル酸（オクタン酸、Ｃ８）からのγ−オクタラクトン（ＧＣ８）の生産を示している。図２ｃは、ペラルゴン酸（ノナン酸、Ｃ９）からのγ−ノナラクトン（ＧＣ９）の生産を示している。図２ｄは、カプリン酸（デカン酸、Ｃ１０）からのγ−デカラクトン（ＧＣ１０）の生産を示している。図２ｅは、ウンデシル酸（ウンデカン酸、Ｃ１１）からのγ−ウンデカラクトン（ＧＣ１１）の生産を示している。図２ｆは、ラウリン酸（ドデカン酸、Ｃ１２）からのγ−ドデカラクトン（ＧＣ１２）の生産を示している。図２ｇは、トリデシル酸（トリデカン酸、Ｃ１３）からのγ−トリデカラクトン（ＧＣ１３）の生産を示している。図２ｈは、ミリスチン酸（テトラデカン酸、Ｃ１４）からのγ−テトラデカラクトン（ＧＣ１４）の生産を示している。
【図２ｄ−２ｆ】図２は、Ｍｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｕｓ  Ｐ４５０を過剰発現するように形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を使用したさまざまなγ−ラクトンの生産を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示している。具体的には、図２ａは、エナント酸（ヘプタン酸、Ｃ７）からのγ−ヘプタラクトン（ＧＣ７）の生産を示している。図２ｂは、カプリル酸（オクタン酸、Ｃ８）からのγ−オクタラクトン（ＧＣ８）の生産を示している。図２ｃは、ペラルゴン酸（ノナン酸、Ｃ９）からのγ−ノナラクトン（ＧＣ９）の生産を示している。図２ｄは、カプリン酸（デカン酸、Ｃ１０）からのγ−デカラクトン（ＧＣ１０）の生産を示している。図２ｅは、ウンデシル酸（ウンデカン酸、Ｃ１１）からのγ−ウンデカラクトン（ＧＣ１１）の生産を示している。図２ｆは、ラウリン酸（ドデカン酸、Ｃ１２）からのγ−ドデカラクトン（ＧＣ１２）の生産を示している。図２ｇは、トリデシル酸（トリデカン酸、Ｃ１３）からのγ−トリデカラクトン（ＧＣ１３）の生産を示している。図２ｈは、ミリスチン酸（テトラデカン酸、Ｃ１４）からのγ−テトラデカラクトン（ＧＣ１４）の生産を示している。
【図２ｇ−２ｈ】図２は、Ｍｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｕｓ  Ｐ４５０を過剰発現するように形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を使用したさまざまなγ−ラクトンの生産を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示している。具体的には、図２ａは、エナント酸（ヘプタン酸、Ｃ７）からのγ−ヘプタラクトン（ＧＣ７）の生産を示している。図２ｂは、カプリル酸（オクタン酸、Ｃ８）からのγ−オクタラクトン（ＧＣ８）の生産を示している。図２ｃは、ペラルゴン酸（ノナン酸、Ｃ９）からのγ−ノナラクトン（ＧＣ９）の生産を示している。図２ｄは、カプリン酸（デカン酸、Ｃ１０）からのγ−デカラクトン（ＧＣ１０）の生産を示している。図２ｅは、ウンデシル酸（ウンデカン酸、Ｃ１１）からのγ−ウンデカラクトン（ＧＣ１１）の生産を示している。図２ｆは、ラウリン酸（ドデカン酸、Ｃ１２）からのγ−ドデカラクトン（ＧＣ１２）の生産を示している。図２ｇは、トリデシル酸（トリデカン酸、Ｃ１３）からのγ−トリデカラクトン（ＧＣ１３）の生産を示している。図２ｈは、ミリスチン酸（テトラデカン酸、Ｃ１４）からのγ−テトラデカラクトン（ＧＣ１４）の生産を示している。
【００２３】
【図３】図３は、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｍｅｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｓ  Ｐ４５０を過剰発現するように形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を使用したγ−ラクトン生産を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示している。具体的には、上のパネルは、ウンデシル酸（ウンデカン酸、Ｃ１１）からのγ−ウンデカラクトン（ＧＣ１１）の生産を示している。下のパネルは、ウンデシレン酸（ウンデセン酸、Ｃ１１：１）からのγ−ウンデセノラクトン（ＧＣ１１’）の生産を示している。
【００２４】
【図４ａ−４ｃ】図４は、Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ  Ｐ４５０を過剰発現するように形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を使用したさまざまなγ−ラクトンの生産を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示している。具体的には、図４ａは、ヘキサン酸（Ｃ６）からのγ−ヘキサラクトン（ＧＣ６）の生産を示している。図４ｂは、エナント酸（ヘプタン酸、Ｃ７）からのγ−ヘプタラクトン（ＧＣ７）の生産を示している。図４ｃは、カプリン酸（デカン酸、Ｃ１０）からのγ−デカラクトン（ＧＣ１０）の生産を示している。図４ｄは、ウンデシル酸（ウンデカン酸、Ｃ１１）からのγ−ウンデカラクトン（ＧＣ１１）の生産を示している。図４ｅは、ラウリン酸（ドデカン酸、Ｃ１２）からのγ−ドデカラクトン（ＧＣ１２）の生産を示している。図４ｆは、トリデシル酸（トリデカン酸、Ｃ１３）からのγ−トリデカラクトン（ＧＣ１３）の生産を示している。図４ｇは、ミリスチン酸（テトラデカン酸、Ｃ１４）からのγ−テトラデカラクトン（ＧＣ１４）の生産を示している。
【図４ｄ−４ｅ】図４は、Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ  Ｐ４５０を過剰発現するように形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を使用したさまざまなγ−ラクトンの生産を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示している。具体的には、図４ａは、ヘキサン酸（Ｃ６）からのγ−ヘキサラクトン（ＧＣ６）の生産を示している。図４ｂは、エナント酸（ヘプタン酸、Ｃ７）からのγ−ヘプタラクトン（ＧＣ７）の生産を示している。図４ｃは、カプリン酸（デカン酸、Ｃ１０）からのγ−デカラクトン（ＧＣ１０）の生産を示している。図４ｄは、ウンデシル酸（ウンデカン酸、Ｃ１１）からのγ−ウンデカラクトン（ＧＣ１１）の生産を示している。図４ｅは、ラウリン酸（ドデカン酸、Ｃ１２）からのγ−ドデカラクトン（ＧＣ１２）の生産を示している。図４ｆは、トリデシル酸（トリデカン酸、Ｃ１３）からのγ−トリデカラクトン（ＧＣ１３）の生産を示している。図４ｇは、ミリスチン酸（テトラデカン酸、Ｃ１４）からのγ−テトラデカラクトン（ＧＣ１４）の生産を示している。
【図４ｆ−４ｇ】図４は、Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ  Ｐ４５０を過剰発現するように形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を使用したさまざまなγ−ラクトンの生産を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示している。具体的には、図４ａは、ヘキサン酸（Ｃ６）からのγ−ヘキサラクトン（ＧＣ６）の生産を示している。図４ｂは、エナント酸（ヘプタン酸、Ｃ７）からのγ−ヘプタラクトン（ＧＣ７）の生産を示している。図４ｃは、カプリン酸（デカン酸、Ｃ１０）からのγ−デカラクトン（ＧＣ１０）の生産を示している。図４ｄは、ウンデシル酸（ウンデカン酸、Ｃ１１）からのγ−ウンデカラクトン（ＧＣ１１）の生産を示している。図４ｅは、ラウリン酸（ドデカン酸、Ｃ１２）からのγ−ドデカラクトン（ＧＣ１２）の生産を示している。図４ｆは、トリデシル酸（トリデカン酸、Ｃ１３）からのγ−トリデカラクトン（ＧＣ１３）の生産を示している。図４ｇは、ミリスチン酸（テトラデカン酸、Ｃ１４）からのγ−テトラデカラクトン（ＧＣ１４）の生産を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
図１を参照すると、脂肪酸からのガンマラクトンの生合成生産は、少なくとも２つの異なる経路を介して実施することができる。β酸化経路によると、オメガ炭素（例えば、ω−１、ω−２、ω−３、ω−４、ω−５、ω−６等）に近いヒドロキシル基を有する中鎖（Ｃ６〜Ｃ１２）または長鎖脂肪酸（Ｃ１３〜Ｃ２１）を、酵母とインキュベートして、各β酸化サイクルがヒドロキシル化炭素原子とカルボニル炭素原子との間の炭化水素骨格フラグメントからＣ２残基を除去する複数のβ酸化サイクルを引き起こすことができる（ステップａ１）。このような炭化水素骨格フラグメント内に奇数の炭素原子があるか偶数の炭素原子があるかに応じて、４−ヒドロキシ（ガンマ−ヒドロキシ）または５−ヒドロキシ（デルタ−ヒドロキシ）脂肪酸が生じることができ、酸性条件下でのラクトン化（ステップａ２）で、ガンマラクトンまたはデルタラクトンのいずれかが生産される。
【００２６】
比較すると、本方法は、４−ヒドロキシラーゼ活性で特異的に同定されたシトクロムＰ４５０タンパク質を利用する。カルボン酸またはその誘導体は、このようなシトクロムＰ４５０タンパク質によって４−ヒドロキシカルボン酸に生物変換され（ステップｂ１）、酸性にすると（ステップｂ２）、対応するガンマラクトンを生成する。したがって、本方法は、商業的スケールアップ生産に適したガンマラクトンを生成するための経済的で確実なアプローチを提供する。
【００２７】
ラクトンを生産する方法
本明細書に記載される方法は、いくつかの実施形態で、Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸基質からのＣ４〜Ｃ２０ガンマラクトンの生産を提供する。いくつかの実施形態では、このようなガンマラクトンを生成する方法が、（ａ）異種シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）タンパク質を発現する細胞系をＣ４〜Ｃ２０カルボン酸基質と共にインキュベートして、４−ヒドロキシＣ４〜Ｃ２０カルボン酸を提供することと、（ｂ）４−ヒドロキシカルボン酸を酸性条件に接触させるまたは供して、Ｃ４〜Ｃ２０ガンマラクトンを生成することとを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、異種ＣＹＰ４５０タンパク質を発現する細胞系から収穫された細胞ペレットをカルボン酸基質と共にインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、細胞系から収穫された再懸濁された細胞ペレットをカルボン酸基質と共にインキュベートすることを含む。
【００２９】
本明細書に記載されるガンマラクトンを生成する方法は、任意の比率でカルボン酸基質を含む培地中で異種ＣＹＰ４５０タンパク質を発現する細胞系をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ガンマラクトンを生成する方法が、培地１リットル当たり１グラムの細胞〜１リットル当たり２００グラムの細胞（１ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ）を含む細胞系をインキュベートすることを含む。培地は、１リットル当たり１グラムのカルボン酸基質〜１リットル当たり２０グラムの脂肪酸（１ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、１リットル当たり１グラムのカルボン酸基質（１ｇ／Ｌ）を含む培地中で、１リットル当たり１００グラムの細胞（１００ｇ／Ｌ）を含む細胞系をインキュベートすることを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、４−ヒドロキシカルボン酸の形成に十分な適切な期間、細胞系をカルボン酸基質を含む培地と共にインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、細胞培養物中のガンマラクトンの形成に十分な適切な期間、４−ヒドロキシカルボン酸を細胞培養物と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、細胞培養物との接触前に、４−ヒドロキシカルボン酸を単離することを含む。いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、細胞培養物を含む培地中で４−ヒドロキシカルボン酸をインキュベートすることを含む。
【００３１】
本明細書に記載されるラクトンを生産する方法は、ある時間インキュベートすること（例えば、異種ＣＹＰ４５０タンパク質を発現する細胞系を適切なカルボン酸基質を含む培地と共にインキュベートすること）を包含する。いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、０．５時間〜９６時間の時間インキュベートすることを含む。
【００３２】
本明細書に記載されるラクトンを生産する方法は、ある温度でインキュベートすること（例えば、異種ＣＹＰ４５０タンパク質を発現する細胞系を適切なカルボン酸基質を含む培地と共にインキュベートすること）を包含する。いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、１６℃〜４０℃の温度でインキュベートすることを含む。
【００３３】
シトクロムＰ４５０
シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）タンパク質は、一般に、基質の酸化を触媒する酵素である。ＣＹＰ４５０タンパク質は、ヘムタンパク質スーパーファミリーのメンバーであり、補因子としてヘムを含む。ＣＹＰ４５０酵素は、それだけに限らないが、動物、植物、真菌、細菌、古細菌およびウイルスを含む多くの生物で同定されている。しかしながら、本発明者らの知識の限りでは、本発明以前は、特異的なカルボン酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有するＣＹＰ４５０酵素は報告されていなかった。
【００３４】
カルボン酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有する真菌シトクロムＰ４５０酵素の候補遺伝子の大規模なライブラリーの厳密なハイスループットスクリーニングを実施した後、本発明者らは、高いカルボン酸４−ヒドロキシラーゼ活性を示す特定のＣＹＰ４５０遺伝子を同定した。
【００３５】
本方法で使用するのに適したＣＹＰ４５０タンパク質は、カルボン酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有するＭｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｏｕｓ  ＣＹＰ４５０タンパク質またはその機能的変異体であり得る。具体的には、ＣＹＰ４５０タンパク質は、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。特定の実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列からなることができる。したがって、このような異種ＣＹＰ４５０タンパク質を発現するために使用される細胞系は、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する宿主細胞を含むことができる。
【００３６】
いくつかの他の実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、カルボン酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有するＢａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｍｅｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｓ  ＣＹＰ４５０タンパク質またはその機能的変異体であり得る。例えば、ＣＹＰ４５０タンパク質は、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。特定の実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列からなることができる。したがって、このような異種ＣＹＰ４５０タンパク質を発現するために使用される細胞系は、配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する宿主細胞を含むことができる。
【００３７】
さらに他の実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、カルボン酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有するＵｍｂｅｌｏｐｓｉｓ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎｅ  ＣＹＰ４５０タンパク質またはその機能的変異体であり得る。例えば、ＣＹＰ４５０タンパク質は、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。特定の実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号５のアミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号５のアミノ酸配列からなることができる。したがって、このような異種ＣＹＰ４５０タンパク質を発現するために使用される細胞系は、配列番号６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する宿主細胞を含むことができる。
【００３８】
カルボン酸基質
本明細書に記載される方法によると、Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸基質は、４−ヒドロキシカルボン酸に変換され得る。カルボン酸基質はカルボン酸および／またはその誘導体であり得る。例えば、Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸基質は、Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸：Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸の塩；Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸のエステル；Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸のモノ−、ジ−もしくはトリグリセリド；またはこれらの組み合わせを含むことができる。本明細書で使用される場合、Ｃ４〜Ｃ２０は、４〜２０個の炭素原子を有する有機化合物を示す。Ｃ４〜Ｃ２０によって表される範囲は、それだけに限らないが、Ｃ５〜Ｃ２０、Ｃ６〜Ｃ２０、Ｃ７〜Ｃ２０、Ｃ８〜Ｃ２０、Ｃ９〜Ｃ２０、Ｃ１０〜Ｃ２０、Ｃ６〜Ｃ１４、Ｃ７〜Ｃ１４、Ｃ８〜Ｃ１４、Ｃ９〜Ｃ１４、Ｃ１０〜Ｃ１４等を含む、その中の任意の範囲を伝えることを意図している。したがって、本明細書に記載されるカルボン酸基質は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の炭素原子を有するカルボン酸またはその誘導体を含むことができる。特定の実施形態では、Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸基質がＣ４〜Ｃ２０カルボン酸またはその塩であり得る。限定されないが、基質酸は、そのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩などの形態であり得る。
【００３９】
Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸は、直鎖Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸、分岐Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸、飽和Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸、または不飽和Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸であり得る。Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸は、任意の置換が、カルボン酸のカルボニル炭素に対してアルファ、ベータ、またはガンマに位置する炭素原子にないという条件で、ヒドロキシル基およびアミノ基から選択される１またはそれを超える官能基で必要に応じて置換され得る（図１参照）。特定の実施形態では、Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸が直鎖完全飽和カルボン酸であり得る。
【００４０】
Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸の例としては、それだけに限らないが、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸、ノナデカン酸、エイコサン酸、ヘンエイコサン酸、ドコサン酸、トリコサン酸、テトラコサン酸、ペンタコサン酸、ヘキサコサン酸、ヘプタコサン酸、オクタコサン酸、ノナコサン酸、トリアコンタン酸、ヘントリアコンタン酸（ｈｅｎａｔｒｉａｃｏｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ドトリアコンタン酸、トリトリアコンタン酸、テトラトリアコンタン酸、ペンタトリアコンタン酸、ヘキサトリアコンタン酸、ヘプタトリアコンタン酸、オクタトリアコンタン酸、ノナトリアコンタン酸、およびテトラコンタン酸が挙げられる。表１は、例示的な脂肪酸の一般名、構造式および脂質数を提供する。
【００４１】
【表１】
2021530996.tif 000003
【００４２】
不飽和Ｃ４〜Ｃ２０カルボン酸の例としては、ヘキセン酸、１−ヘプテン酸、２−ヘプテン酸、１−オクテン酸、２−オクテン酸、３−オクテン酸、１−ノネン酸、２−ノネン酸、３−ノネン酸、１−デセン酸、２−デセン酸、３−デセン酸、１−ウンデセン酸、２−ウンデセン酸、３−ウンデセン酸、１−ドデセン酸、２−ドデセン酸、３−ドデセン酸、１−トリデセン酸、２−トリデセン酸、３−トリデセン酸、１−テトラデセン酸、２−テトラデセン酸、および３−テトラデセン酸が挙げられる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、カルボン酸基質を含む培地が緩衝液を含む。緩衝液の例としては、限定されないが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ヒスチジン緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ビストリス緩衝液、およびエタノールアミン緩衝液が挙げられる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、カルボン酸基質を含む培地が、基質の分散を助けるための界面活性剤を含む。界面活性剤の非限定的な例としては、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０）、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、エチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＥＴＭＡＢ）、ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド（ＬＴＡＢ）、およびラウリルトリメチルアンモニウムクロリド（ＬＴＡＣ）が挙げられる。
【００４５】
カルボン酸基質を含む培地は、任意の濃度のカルボン酸基質を含み得る。いくつかの実施形態では、カルボン酸基質を含む培地が、０．５ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌのカルボン酸基質、例えば、１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌのカルボン酸基質を含むことができる。いくつかの実施形態では、カルボン酸基質を含む培地が、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌまたは１００ｇ／Ｌのカルボン酸基質を含むことができる。
【００４６】
ラクトン
本明細書に記載される方法によると、カルボン酸基質が、本明細書に記載されるＣＹＰ４５０タンパク質の存在下で４−ヒドロキシカルボン酸に変換される。酸性にすると、４−ヒドロキシカルボン酸は対応するガンマラクトンに変換され得る。酸性化は、塩酸、酢酸などの酸で行うことができる。本開示によると、本明細書で提供される方法は、４−ヒドロキシカルボン酸を、限定されないが、γ−ヘキサラクトン、γ−ヘキセノラクトン、γ−ヘプタラクトン、γ−ヘプテノラクトン、γ−オクタラクトン、γ−オクテノラクトン、γ−ノナラクトン、γ−ノネノラクトン、γ−デカラクトン、γ−デカセノラクトン、γ−ウンデカラクトン、γ−ウンデセノラクトン、γ−ドデカラクトン、γ−ドデセノラクトン、γ−トリデカラクトン、γ−トリデセノラクトン、γ−テトラデカラクトン、およびγ−テトラデセノラクトンを含むさまざまなγ−ラクトンに変換することができる。
【００４７】
本明細書に記載される方法に従って生産されたガンマラクトンは、当技術分野で知られている任意の方法を使用して、細胞培養物から単離または精製することができる。例えば、ガンマラクトンは、溶媒抽出、蒸留、クロマトグラフィー分離、高圧液体クロマトグラフィーなどによって細胞培養物から単離または精製することができる。単離または精製されたラクトンは、製品、例えば、食品、飲料、香水または化粧品に組み込むことができる。
【００４８】
細胞系
本明細書で言及されるように、本方法による細胞系は、本明細書に記載されるＣＹＰ４５０タンパク質の発現を提供する任意の細胞を含むことができる。このような細胞系には、それだけに限らないが、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞が含まれ得る。いくつかの実施形態では、細胞系が細菌細胞、酵母細胞またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞系が原核細胞、真核細胞およびこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞系がリボソームなどの細胞成分に基づくタンパク質のインビトロ発現を含む。
【００４９】
本開示の細菌細胞には、限定されないが、以下が含まれる：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐｐ．、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ  ｓｐｐ．、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｐｐ．およびＶｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ。
【００５０】
本開示の酵母細胞には、限定されないが、操作されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉおよびＰｉｃｈｉａが含まれる。本開示によると、本明細書で請求される酵母は、菌界のメンバーとして分類される真核生物の単細胞微生物である。酵母は、多細胞の祖先から進化した単細胞生物であるが、本開示に有用ないくつかの種は、仮性菌糸または偽菌糸として知られる接続された出芽細胞のストリングを形成することによって多細胞特性を発達させる能力を有するものである。
【００５１】
いくつかの実施形態では、細胞ペレットが、ＣＹＰ４５０を発現する細胞系から収穫される。いくつかの実施形態では、細胞ペレットが、さまざまな濃度で再懸濁され得る。いくつかの実施形態では、細胞ペレットが、１ｇ／Ｌ〜２５０ｇ／Ｌの濃度で再懸濁される。いくつかの実施形態では、細胞系から収穫された細胞ペレットが、１ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１７５ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２５  ｇ／Ｌまたは２５０ｇ／Ｌの濃度で再懸濁される。
【００５２】
細胞培養物
細胞培養物は、培養物中の任意の細胞を指す。培養またはインキュベートは、細胞を制御された条件下で、典型的にはその天然環境の外で増殖させるプロセスである。例えば、酵母細胞などの細胞は、液体栄養ブロス中の細胞懸濁液として増殖させられ得る。細胞培養物には、それだけに限らないが、細菌細胞培養物、酵母細胞培養物、植物細胞培養物および動物細胞培養物が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞培養物が細菌細胞、酵母細胞またはこれらの組み合わせを含む。
【００５３】
本開示の細菌細胞培養物は、それだけに限らないが、以下を含む細菌細胞を含む：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐｐ．、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ  ｓｐｐ．、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｐｐおよびＶｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ。
【００５４】
本開示の酵母細胞培養物は、それだけに限らないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉおよびＰｉｃｈｉａを含む酵母細胞を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞培養物が、当技術分野で知られている１またはそれを超える栄養物質を含む水性培地であり得る。このような液体培地は、１またはそれを超える炭素源、窒素源、無機塩および／または成長因子を含むことができる。適切な炭素源には、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびコーンシロップが含まれ得る。適切な窒素源の例としては、ペプトン、コーンスティープリカー、ミーンエキストラクト（ｍｅａｎ  ｅｘｔｒａｃｔ）、イーストエキストラクト、カゼイン、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩、硝酸塩およびこれらの混合物などの有機および無機窒素含有物質が挙げられ得る。無機塩の例としては、リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、ナトリウム、カルシウムおよびカリウム塩が挙げられ得る。液体培地はまた、１またはそれを超えるビタミンおよび／またはミネラルを含むことができる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、細胞が１６℃〜４０℃の温度で培養される。例えば、細胞は、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃または４０℃の温度で培養され得る。
【００５７】
いくつかの実施形態では、細胞が、約３〜約９のｐＨ範囲、好ましくは約４〜約８の範囲で培養される。ｐＨは、塩酸、酢酸、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニアなどの無機もしくは有機酸または塩基の添加によって、あるいはリン酸、フタル酸またはＴｒｉｓ（登録商標）などの緩衝液の添加によって調整することができる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、細胞が、０．５時間〜９６時間、またはそれを超えた期間培養される。例えば、細胞は、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６または７２時間の期間培養され得る。典型的には、細菌細胞などの細胞が１２〜２４時間の期間培養される。いくつかの実施形態では、細胞が３７℃の温度で１２〜２４時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞が１６℃の温度で１２〜２４時間培養される。
【００５９】
いくつかの実施形態では、細胞が、１×１０８（ＯＤ６００＜１）〜２×１０１１（ＯＤ約２００）の生細胞／ｍｌ細胞培養培地の密度まで培養される。いくつかの実施形態では、細胞が、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２ｘ１０９、３ｘ１０９、４ｘ１０９、５ｘ１０９、６ｘ１０９、７ｘ１０９、８ｘ１０９、９ｘ１０９、１ｘ１０１０、２ｘ１０１０、３ｘ１０１０、４ｘ１０１０、５ｘ１０１０、６ｘ１０１０、７ｘ１０１０、８ｘ１０１０、９ｘ１０１０、１ｘ１０１１または２ｘ１０１１生細胞／ｍｌの密度まで培養される。（換算係数：ＯＤ  １＝８ｘ１０８細胞／ｍｌ）。
【００６０】
合成生物学
ここで使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当技術分野で周知であり、例えば、各々の全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８４；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによって出版、１９８７によって記載されている。
【００６１】
細菌生産系
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを用いて細菌宿主細胞で行われる。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的には、以下の３つの目的にかなう：１）組換えタンパク質の発現を増加させる；２）組換えタンパク質の溶解度を増加させる；および３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって、組換えタンパク質の精製を助ける。通常、タンパク質分解切断部位を融合部分と組換えタンパク質の接合部で導入して、融合タンパク質の精製に続いて融合部分から組換えタンパク質を分離できるようにする。このようなベクターは、本開示の範囲内にある。
【００６２】
ある実施形態では、発現ベクターが、細菌細胞における組換えポリペプチドの発現のためにそれらの遺伝子要素を含む。細菌細胞における転写および翻訳のための要素は、プロモーター、タンパク質複合体のコード領域および転写ターミネーターを含むことができる。
【００６３】
当業者は、発現ベクターの調製に利用可能な分子生物学技術を知っているだろう。本明細書に記載される、本技術の発現ベクターへの組み込みに使用されるポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの日常的な技術によって調製することができる。
【００６４】
相補的付着末端を介してＤＮＡをベクターに作動可能に連結するために、いくつかの分子生物学技術が開発されてきた。一実施形態では、相補的ホモポリマー区域を、ベクターＤＮＡに挿入される核酸分子に付加することができる。次いで、ベクターと核酸分子を、相補的ホモポリマーテール間の水素結合によって結合して、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【００６５】
代替実施形態では、提供される１つまたは複数の制限部位を含む合成リンカーを使用して、本技術のポリヌクレオチドを発現ベクターに作動可能に連結する。ある実施形態では、ポリヌクレオチドを、制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成する。ある実施形態では、核酸分子を、３’−５’−エキソヌクレアーゼ活性を有する突出３’一本鎖末端を除去し、重合活性を有する陥凹３’末端を埋めて、それによって平滑末端ＤＮＡセグメントを生成する酵素であるバクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩで処理する。次いで、平滑末端セグメントを、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡリガーゼなどの平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒することができる酵素の存在下で、大モル過剰のリンカー分子と共にインキュベートする。したがって、反応の生成物は、その末端にポリマーリンカー配列を有するポリヌクレオチドである。次いで、これらのポリヌクレオチドを、適切な制限酵素で切断し、ポリヌクレオチドの末端と適合性の末端を生成する酵素で切断された発現ベクターに連結する。
【００６６】
あるいは、ライゲーション非依存クローニング（ＬＩＣ）部位を有するベクターを使用することができる。その場合、必要なＰＣＲ増幅ポリヌクレオチドを制限消化もライゲーションもなしでＬＩＣベクターにクローニングすることができる（本明細書と矛盾のない程度に参照により本明細書に組み込まれる、Ａｓｌａｎｉｄｉｓおよびｄｅ  Ｊｏｎｇ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８  ６０６９−７４、（１９９０）、Ｈａｕｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３、５１５−１８（１９９２））。
【００６７】
ある実施形態では、選択されたプラスミドへの挿入のために目的のポリヌクレオチドを単離および／または改変するために、ＰＣＲを使用することが適切である。配列のＰＣＲ調製に使用するための適切なプライマーは、核酸分子の必要なコード領域を単離し、制限エンドヌクレアーゼまたはＬＩＣ部位を付加し、コード領域を所望のリーディングフレームに配置するように設計することができる。
【００６８】
ある実施形態では、本技術の発現ベクターに組み込むためのポリヌクレオチドを、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲを使用することによって調製する。コード領域が増幅され、プライマー自体は増幅された配列産物に組み込まれる。ある実施形態では、増幅プライマーが、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、これにより、増幅された配列産物を適切なベクターにクローニングすることが可能になる。
【００６９】
発現ベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって植物または微生物宿主細胞に導入することができる。本技術の発現ベクターによる適切な細胞の形質転換は、当技術分野で知られている方法によって達成され、典型的には、ベクターと細胞の両方のタイプに依存する。適切な技術には、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、リポフェクション、ケモポレーション（ｃｈｅｍｏｐｏｒａｔｉｏｎ）またはエレクトロポレーションが含まれる。
【００７０】
首尾よく形質転換された細胞、すなわち、発現ベクターを含む細胞は、当技術分野で周知の技術によって同定することができる。例えば、本技術の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を培養して、本明細書に記載されるポリペプチドを生産することができる。当技術分野で周知の技術によって、発現ベクターＤＮＡの存在について細胞を調べることができる。
【００７１】
宿主細胞は、前記の発現ベクターの単一コピー、あるいは、発現ベクターの複数のコピーを含むことができる。
いくつかの実施形態では、形質転換細胞が、細菌細胞、酵母細胞、藻類細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞が、カノーラ植物細胞、菜種植物細胞、ヤシ植物細胞、ヒマワリ植物細胞、ワタ植物細胞、トウモロコシ植物細胞、落花生植物細胞、亜麻植物細胞、ゴマ植物細胞、大豆植物細胞、およびペチュニア植物細胞からなる群から選択される植物細胞である。
【００７２】
外来タンパク質の高レベルの発現を指示する調節配列を含む微生物宿主細胞発現系および発現ベクターは、当業者に周知である。これらのいずれかを使用して、微生物宿主細胞における本技術の組換えポリペプチドの発現のためのベクターを構築することができる。次いで、これらのベクターを、形質転換を介して適切な微生物に導入して、本技術の組換えポリペプチドの高レベルの発現を可能にすることができる。
【００７３】
適切な微生物宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当技術分野で周知である。典型的には、ベクターまたはカセットは、関連するポリヌクレオチドの転写および翻訳を指示する配列、選択マーカー、ならびに自律複製または染色体組込みを可能にする配列を含む。適切なベクターは、転写開始制御を有するポリヌクレオチドの領域５’および転写終結を制御するＤＮＡフラグメントの領域３’を含む。両制御領域が、形質転換宿主細胞に相同な遺伝子に由来することが好ましいが、このような制御領域が、宿主として選択された特定の種に固有の遺伝子に由来する必要はないことが理解されるべきである。
【００７４】
所望の微生物宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者によく知られている。それだけに限らないが、ＣＹＣＩ、ＨＩＳ３、ＧＡＬＩ、ＧＡＬＩＯ、ＡＤＨＩ、ＰＧＫ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣＩ、ＴＲＰＩ、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓでの発現に有用）；ＡＯＸＩ（Ｐｉｃｈｉａでの発現に有用）；ならびにｌａｃ、ｔｒｐ、ＪＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃおよびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での発現に有用）を含む、これらの遺伝子を駆動することができる事実上いずれのプロモーターも本技術に適している。
【００７５】
終結制御領域はまた、微生物宿主に固有のさまざまな遺伝子に由来し得る。終結部位を必要に応じて本明細書に記載される微生物宿主のために含めることができる。
【００７６】
植物細胞では、本技術の発現ベクターが、発達の所望の段階で、所望の組織で、本技術の組換えポリペプチドの発現を指示することができるプロモーターに作動可能に連結されたコード領域を含むことができる。便宜上、発現されるポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドに由来するプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含み得る。転写終結シグナルをコードする３’非コード配列も存在すべきである。発現ベクターはまた、ポリヌクレオチド発現を促進するために、１またはそれを超えるイントロンを含み得る。
【００７７】
植物宿主細胞の場合、コード領域の発現を誘導することができる任意のプロモーターと任意のターミネーターの任意の組み合わせを、本技術のベクター配列で使用することができる。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの適切な例としては、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子からのものが挙げられる。使用され得る効率的な植物プロモーターの１つのタイプは、高レベル植物プロモーターである。このようなプロモーターは、本技術の発現ベクターと作動可能に連結して、ベクターの発現を促進することができるはずである。本技術で使用され得る高レベル植物プロモーターには、例えば大豆由来のリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットのプロモーター（本明細書と矛盾のない程度に全体がこれにより本明細書に組み込まれる、Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐ．Ｇｅｎ．、１：４８３−９８（１９８２）、およびクロロフィル結合タンパク質のプロモーターが含まれる。これらの２つのプロモーターは、植物細胞で光誘導されることが知られている（例えば、本明細書と矛盾のない程度に各々がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，ａｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎ．Ｙ．（１９８３）、２９〜３８頁；Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５８：１３９９（１９８３）およびＤｕｎｓｍｕｉｒ，Ｐ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２：２８５（１９８３）参照）。
【００７８】
同一性スコアリングを使用した配列類似性の分析
本明細書で使用される場合、「配列同一性」は、２つの最適に整列されたポリヌクレオチドまたはペプチド配列が、成分、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸のアラインメントのウィンドウ全体にわたって不変である程度を指す。試験配列と参照配列の整列されたセグメントの「同一性の割合（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）」は、２つの整列された配列によって共有される同一の成分の数を、参照配列セグメント内の成分の総数、すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さな規定の部分で割ったものである。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「パーセント配列同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」または「パーセント同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、（比較窓全体で参照配列の合計２０パーセント未満の適切なヌクレオチドの挿入、欠失またはギャップにより）２つの配列を最適に整列させた場合の、試験（「本」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）と比較した参照（「クエリ」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）の線形ポリヌクレオチド配列中の同一ヌクレオチドのパーセンテージを指す。比較窓を整列させるための配列の最適なアラインメントは、当業者に周知であり、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局地的相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性の検索方法などのツールによって、好ましくはＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州バーリントン）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡなどのこれらのアルゴリズムのコンピューター化された実装によって行われ得る。試験配列と参照配列の整列されたセグメントの「同一性の割合（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）」は、２つの整列された配列によって共有される同一の成分の数を、参照配列セグメント内の成分の総数、すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さな規定の部分で割ったものである。パーセント配列同一性は、同一性の割合に１００を掛けたものとして表される。１またはそれを超えるポリヌクレオチド配列の比較は、完全長ポリヌクレオチド配列もしくはその一部、またはより長いポリヌクレオチド配列に対するものであり得る。本開示の目的のために、「パーセント同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」はまた、翻訳されたヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＸバージョン２．０、ポリヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定され得る。
【００８０】
配列同一性のパーセントは、好ましくは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（商標）（バージョン１０；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マディソン）の「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」または「Ｇａｐ」プログラムを使用して決定される。「Ｇａｐ」は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４８：４４３−５３、１９７０）を利用して、一致数を最大化し、ギャップ数を最小化する２つの配列のアラインメントを見出す。「ＢｅｓｔＦｉｔ」は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局地的相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間の類似性の最良のセグメントの最適なアラインメントを実施し、ギャップを挿入して一致数を最大化する（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、２：４８２−４８９、１９８１、Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：２２０５−２２２０、１９８３）。パーセント同一性は、最も好ましくは「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」プログラムを使用して決定される。
【００８１】
配列同一性を決定するための有用な方法は、２０８９４メリーランド州ベセスダにある国立衛生研究所の国立医学図書館のアメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から公的に入手可能なＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラム；ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢＩ、ＮＬＭ、ＮＩＨ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０）参照にも開示されており；ＢＬＡＳＴプログラムのバージョン２．０またはそれを超えるバージョンは、ギャップ（欠失および挿入）のアラインメントへの導入を可能にし；ペプチド配列については、ＢＬＡＳＴＸを使用して配列同一性を決定することができ；ポリヌクレオチド配列については、ＢＬＡＳＴＮを使用して配列同一性を決定することができる。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「実質的なパーセント配列同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、またはさらに大きな配列同一性、例えば約９８％または約９９％の配列同一性のパーセント配列同一性を指す。したがって、本開示の一実施形態は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、またはさらに大きな配列同一性、例えば約９８％または約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド分子である。本開示のシトクロムＰ４５０遺伝子の活性を有するポリヌクレオチド分子は、さまざまなγ−およびデルタ−ラクトンの生産を指示することができ、このようなポリヌクレオチド分子は、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列と実質的なパーセント配列同一性を有することができ、本開示の範囲内に包含される。
【００８３】
同一性および類似性
同一性は、配列のアラインメント後の配列のペア間で同じであるアミノ酸の割合であり（これは、配列情報または構造情報またはいくらかの他の情報のみを使用して行うことができるが、通常は配列情報のみに基づく）、類似性は、ある類似性マトリックスを使用したアラインメントに基づいて割り当てられたスコアである。類似性指数は、以下のＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０もしくはＧＯＮＮＥＴのいずれか１つ、またはタンパク質の配列アラインメントのために当業者によって使用される任意のマトリックスであり得る。
【００８４】
同一性は、２つの部分配列間の対応の程度である（配列間にギャップはない）。２５％またはそれを超える同一性は機能の類似性を意味し、１８〜２５％は構造または機能の類似性を意味する。２つの完全に無関係またはランダムな配列（１００残基を超える）が、２０％を超える同一性を有する可能性があることに留意されたい。類似性は、２つの配列を比較した場合の類似度である。これはその同一性に依存する。
【００８５】
本明細書で使用される用語の説明：
本明細書で使用される場合、単数形「ａ、ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の言及を含む。
【００８６】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」などの用語が明細書または特許請求の範囲で使用される限り、このような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」が請求項の移行語として使用される場合に解釈されるように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語と同様の方法で包括的であることを意図している。
【００８７】
「例示的（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」という単語は、本明細書では、「例、実例または例示として役立つ」ことを意味するために使用される。本明細書で「例示的（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」として記載される任意の実施形態は、必ずしも他の実施形態よりも好ましいまたは有利であると解釈されるべきではない。
【００８８】
「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」という用語は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を説明するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本技術には、添付の配列表に報告されている完全な配列に相補的な単離された核酸フラグメント、ならびに実質的に類似の核酸配列も含まれる。
【００８９】
「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」および「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖もしくは二本鎖形態のポリマーを指すために使用される。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的改変または縮重変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明示的に示された配列も暗黙的に包含する。
【００９０】
「コード配列（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指すために使用される。
【００９１】
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、単離された核酸または単離されたポリペプチドの文脈で使用される場合、限定されないが、人の手によって、その天然の環境から離れて存在し、したがって天然の産物ではない核酸またはポリペプチドを指すために使用される。単離された核酸またはポリペプチドは、精製形態で存在することができる、または、例えば、トランスジェニック宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。
【００９２】
本明細書で使用される「インキュベートする（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）」および「インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）」という用語は、２またはそれを超える化学的または生物学的実体（化合物および酵素など）を混合し、所望の生成物を生成するのに好ましい条件下でこれらが相互作用することを可能にするプロセスを意味する。
【００９３】
「縮重変異体（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、１またはそれを超える縮重コドン置換によって参照核酸配列とは異なる残基配列を有する核酸配列を指す。縮重コドン置換は、１またはそれを超える選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成することができる。核酸配列とその縮重変異体の全ては、同じアミノ酸またはポリペプチドを発現する。
【００９４】
「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」、および「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、３つの用語は時々互換的に使用され、限定されないが、そのサイズまたは機能に関係なく、アミノ酸またはアミノ酸類似体のポリマーを指すために使用される。「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」は通常、比較的大きなポリペプチドに関して使用され、「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」は通常、小さなポリペプチドに関して使用されるが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は重複し、変化する。本明細書で使用される「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、特に注記しない限り、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を指す。「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」、「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、および「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、ポリヌクレオチド産物を指す場合、本明細書では互換的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドには、ポリヌクレオチド産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、フラグメントおよび他の同等物、変異体、ならびに前記の類似体が含まれる。
【００９５】
参照ポリペプチドに関して使用される場合、「ポリペプチドフラグメント（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」および「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」という用語は、当業者にそれらの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、アミノ酸残基が参照ポリペプチド自体と比較して欠失しているが、残りのアミノ酸配列が参照ポリペプチド中の対応する位置と通常同一であるポリペプチドを指すために使用される。このような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端、またはその両方で起こり得る。
【００９６】
ポリペプチドまたはタンパク質の「機能的フラグメント（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」という用語は、完全長ポリペプチドまたはタンパク質の一部であり、実質的に同じ生物学的活性を有する、または完全長ポリペプチドもしくはタンパク質と実質的に同じ機能を実行する（例えば、同じ酵素反応を実行する）ペプチドフラグメントを指す。
【００９７】
互換的に使用される「変異体ポリペプチド（ｖａｒｉａｎｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、「改変アミノ酸配列（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「改変ポリペプチド（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、１またはそれを超えるアミノ酸、例えば１またはそれを超えるアミノ酸置換、欠失および／または付加によって参照ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を指す。ある態様では、変異体が、参照ポリペプチドの能力の一部または全てを保持する「機能的変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ）」である。
【００９８】
「機能的変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、保守的に置換された変異体をさらに含む。「保存的に置換された変異体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、１またはそれを超える保存的アミノ酸置換によって参照ペプチドとは異なり、参照ペプチドの活性の一部または全てを維持するアミノ酸配列を有するペプチドを指す。「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、アミノ酸残基の機能的に類似した残基による置換である。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンなどのある非極性（疎水性）残基の別の残基への置換；アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、スレオニンとセリンの間など、ある荷電もしくは極性（親水性）残基の別の残基への置換；リジンもしくはアルギニンなどのある塩基性残基の別の残基への置換；またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのある酸性残基の別の残基への置換；またはフェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンなどのある芳香族残基の別の残基への置換が挙げられる。このような置換は、タンパク質またはポリペプチドの見かけの分子量にも等電点にもほとんどまたは全く影響を及ぼさないと予想される。「保存的に置換された変異体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ）」という句はまた、得られるペプチドが本明細書に記載される参照ペプチドの活性の一部または全てを維持する限り、残基が化学的に誘導体化された残基で置き換えられているペプチドを含む。
【００９９】
本技術のポリペプチドに関連する「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、さらには１００％同一であるアミノ酸配列を有する機能的に活性なポリペプチドをさらに含む。
【０１００】
本技術の変異体ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ（％）ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、配列を整列させ、必要に応じて、最大パーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指し、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない。
【０１０１】
パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当業者の技能の範囲内のさまざまな方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。例えば、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２を使用して決定され得る。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードされ得る。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ２は、いくつかの検索パラメータを使用し、これらの検索パラメータの全てが、例えば、アンマスク（ｕｎｍａｓｋ）はい（ｙｅｓ）、鎖＝全て、予想される発生１０、最小低複雑性長＝１５／５、マルチパスｅ値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５およびスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含むデフォルト値に設定される。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２がアミノ酸配列の比較に使用される状況では、所与のアミノ酸配列Ａの所与のアミノ酸配列Ｂへの、これとの、またはこれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへ、これと、またはこれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することができる）が、以下の通り計算される：分数Ｘ／Ｙの１００倍（式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２によって、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一マッチとしてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢのアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢへの％アミノ酸配列同一性が、ＢのＡへの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解されるだろう。
【０１０２】
この意味で、アミノ酸配列の「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」を決定するための技術は当技術分野で周知である。一般に、「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」は、アミノ酸が同一である、あるいは電荷または疎水性などの類似の化学的および／または物理的特性を有する適切な場所での２またはそれを超えるポリペプチドの正確なアミノ酸対アミノ酸の比較を指す。そのため、いわゆる「パーセント類似性（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」を、比較されるポリペプチド配列間で決定することができる。核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術も当技術分野で周知であり、これらはその遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定し（通常はｃＤＮＡ中間体を介して）、そこにコードされるアミノ酸配列を決定し、これを第２のアミノ酸配列と比較することを含む。一般に、「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。２またはそれを超えるアミノ酸配列がそうであるように、２またはそれを超えるポリヌクレオチド配列を、それらの「パーセント同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」を決定することによって比較することができる。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州マディソンから入手可能）で利用可能なプログラム、例えばＧＡＰプログラムは、それぞれ、２つのポリヌクレオチド間の同一性と、２つのポリペプチド配列間の同一性および類似性の両方を計算することができる。配列間の同一性または類似性を計算するための他のプログラムは当業者に知られている。
【０１０３】
参照位置に「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ）」アミノ酸位置は、アミノ酸配列を整列させることによって特定される、参照配列と整列する位置を指す。このようなアラインメントは、手動で、またはＣｌｕｓｔａｌＷ２、Ｂｌａｓｔ  ２等などの周知の配列アラインメントプログラムを使用して行うことができる。
【０１０４】
特に明記しない限り、２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列のパーセント同一性は、２つの配列のうち短い方の全長にわたる同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージを指す。
【０１０５】
全ての文法形態および綴りのバリエーションにおける「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」という用語は、スーパーファミリーからのポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なる種からの相同ポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む、「共通の進化的起源（ｃｏｍｍｏｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｏｒｉｇｉｎ）」を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の関係を指す（Ｒｅｅｃｋら、Ｃｅｌｌ  ５０：６６７、１９８７）。このようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、パーセント同一性または保存された位置での特定のアミノ酸もしくはモチーフの存在に関して、それらの配列類似性によって反映される配列相同性を有する。例えば、２つの相同ポリペプチドは、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９００、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、さらには１００％同一であるアミノ酸配列を有することができる。
【０１０６】
「適切な調節配列（ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指すために使用される。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列が含まれ得る。
【０１０７】
「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指すために使用される。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’に位置している。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、または天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素で構成されていてもよく、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発達段階において、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることが当業者によって理解される。ほとんどの場合、ほとんどの細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に定義されていないため、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有する可能性があることがさらに認識されている。
【０１０８】
「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、一方の機能が他方によって影響を受けるような、単一核酸フラグメント上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コード配列と作動可能に連結している。コード配列を、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結することができる。
【０１０９】
本明細書で使用される「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という用語は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、本技術の核酸フラグメントに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指すために使用される。「過剰発現（ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、正常な生物または非形質転換生物における産生のレベルを超える、トランスジェニックまたは組換え生物における遺伝子産物の産生を指す。
【０１１０】
「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、その細胞によるさらなる発現のための標的細胞へのポリヌクレオチドの導入を指すために使用される。導入されたポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムまたは染色体ＤＮＡに組み込まれ、遺伝的に安定な遺伝をもたらす、または宿主染色体とは無関係に複製することができる。形質転換核酸フラグメントを含む宿主生物は、「トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」または「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」または「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」生物と呼ばれる。
【０１１１】
「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」、「トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」、および「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」という用語は、本明細書で宿主細胞に関連して使用される場合、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、異種核酸分子が導入された、植物または微生物細胞などの宿主生物の細胞を指すために使用される。核酸分子は宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれ得る、または核酸分子は染色体外分子として存在し得る。このような染色体外分子は自己複製することができる。形質転換細胞、組織、または対象は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、そのトランスジェニック子孫も包含すると理解される。
【０１１２】
本明細書でポリヌクレオチドに関連して使用される場合、「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」、「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」および「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」という用語は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、特定の宿主細胞に対して外来の供給源に由来する、または同じ供給源に由来する場合、元の形態から改変されているポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列または遺伝子）を指すために使用される。したがって、宿主細胞における異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内因性であるが、例えば、部位特異的突然変異誘発または他の組換え技術の使用によって改変された遺伝子を含む。この用語はまた、天然に存在するＤＮＡ配列の天然に存在しない複数のコピーも含む。したがって、これらの用語は、細胞に対して外来もしくは異種である、または細胞に対して相同であるが、要素が通常は見られない宿主細胞内の位置もしくは形態にあるＤＮＡセグメントを指す。
【０１１３】
同様に、「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」、「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」、および「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」という用語は、本明細書でポリペプチドまたはアミノ酸配列に関連して使用される場合、特定の宿主細胞に対して外来の供給源に由来する、または同じ供給源に由来する場合、元の形態から改変されているポリペプチドまたはアミノ酸配列を意味する。したがって、組換えＤＮＡセグメントを宿主細胞で発現させて、組換えポリペプチドを生産することができる。
【０１１４】
「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」、および「カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）」という用語は、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、細胞の中央代謝の一部ではないが、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である遺伝子を通常有する染色体外要素を指すために使用される。このような要素は、いくつかのヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のためのプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入することができる独自の構築物に結合されたまたは組み換えられた、任意の供給源に由来する一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの線形または環状の自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であり得る。「形質転換カセット（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて、外来宿主におけるその遺伝子の発現の増強を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。
【０１１５】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、好ましい材料および方法を以下に説明する。
【０１１６】
以下の非限定的な実施例を検討すると、本開示はより完全に理解されるだろう。これらの実施例は、本技術の好ましい実施形態を示しているが、単なる例示として与えられていることを理解すべきである。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者であれば、本技術の本質的な特徴を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本技術をさまざまな用途および条件に適合させるためにさまざまな変更および修正を行うことができる。
【実施例】
【０１１７】
実施例１：脂肪酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有する真菌シトクロムＰ４５０酵素の候補遺伝子の同定
シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素は、多種多様な有機基質（脂肪酸を含む）の酸化を触媒して、さまざまなヒドロキシル化化合物（ヒドロキシ脂肪酸を含む）を生成することができる。ただし、炭化水素骨格に沿ってヒドロキシル化が起こる炭素原子の位置が重要となり得る。例えば、さまざまなＰ４５０の中で、細菌および真菌Ｐ４５０  ＢＭ３酵素が、ω−１〜ω−３ヒドロキシ脂肪酸の形成を触媒することが報告されている。例えば、Ｍｉｕｒａ，Ｙ．およびＦｕｌｃｏ，Ａ．Ｊ．、「ω−１，ω−２  ａｎｄ  ω−３  Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｃｈａｉｎ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ，Ａｍｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｃｏｈｏｌｓ  ｂｙ  ａ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｙｅｒｉｕｍ」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ‐Ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、３８８（３）：３０５−３１７（１９７５）；ならびにＫｉｔａｚｕｍｅ，Ｔ．ら、「Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｆａｔｔｙ−ａｃｉｄ  Ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＣＹＰ５０５）Ｉｓ  ａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０ＢＭ３」、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２７５：３９７３４−３９７４０（２０００）を参照されたい。
【０１１８】
図１を参照すると、さまざまな脂肪酸からガンマラクトンへの効率的な合成経路は、ガンマに位置する炭素原子を脂肪酸基質のカルボニル炭素にヒドロキシル化し、それによって４−ヒドロキシ脂肪酸を生成することを含む（４−ヒドロキシラーゼ経路）。その後、４−ヒドロキシ脂肪酸を酸性条件下でガンマ−ラクトンに変換することができる。
【０１１９】
Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅおよびＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａなどのいくつかの糸状菌が、対応するカルボン酸からさまざまなガンマラクトンまたはデルタラクトンを生成できることが報告されている。米国特許第５，０３２，５１３号および米国特許第７，８６３，０２３号を参照されたい。それにもかかわらず、これらの生物変換活性の分子機序はほとんど知られていない。さらに、このような糸状菌の複雑な形態が、これらのプロセスのスケールアップを大きな課題にしている。
【０１２０】
本発明者らの知識の限りでは、本発明以前は、特異的な脂肪酸４−ヒドロキシラーゼ遺伝子も酵素も同定されていなかった。脂肪酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有する真菌シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ、Ｐ４５０またはＣＹＰ４５０）酵素の候補遺伝子の大規模ライブラリーの厳密なハイスループットスクリーニングを実施した後、本発明者らは以下の候補遺伝子を同定した：Ｍｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｕｓ由来のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＡＮ０３０９４．１）、前記Ｍｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｕｓ  ＣＹＰのアミノ酸配列は配列番号１として提供される；Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｍｅｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｓ由来のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＯＲＸ８５４４８．１）、前記Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｍｅｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｓ  ＣＹＰのアミノ酸配列は配列番号３として提供される；およびＵｍｂｅｌｏｐｓｉｓ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ由来のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＯＲＸ８５４４８．１）、前記Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ  ＣＹＰのアミノ酸配列は配列番号５として提供される。
【０１２１】
実施例２：ガンマラクトンを生成するための高収量株の作製およびシトクロムＰ４５０の過剰発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのタンパク質発現を促進するために、候補遺伝子の各々を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムに対してコドン最適化し、Ｇｅｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｎｃ．（Ｎｅｗａｒｋ、ドイツ）によって合成した。
【０１２２】
コドン最適化されたＭｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｕｓ  Ｐ４５０遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位を通してｐＥＴ１７ｂベクター（ＡＭＰ＋、Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。構築物を、発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。典型的な実験では、一晩培養物を使用して、１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含有する液体ＬＢ培地（２％）に接種した。培養物を最初に３７℃でＯＤ６００が０．６になるまで増殖させ、２５℃に冷却した。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、タンパク質発現を誘導した。２５℃で３時間インキュベートした後、γ−ラクトン生産のために脂肪酸基質を１ｇ／Ｌで添加した。
【０１２３】
コドン最適化されたＢａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｍｅｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｓ  Ｐ４５０およびＵｍｂｅｌｏｐｓｉｓ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ  Ｐ４５０遺伝子の各々を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位を通してｐＥＴ−３２ａ−（＋）ベクター（ＡＭＰ＋、Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。構築物を、発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。典型的な実験では、一晩培養物を使用して、１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含有する液体ＬＢ培地（２％）に接種した。培養物を最初に３７℃でＯＤ６００が０．８になるまで増殖させ、１６℃に冷却した。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、タンパク質発現を誘導した。１６℃で５時間インキュベートした後、温度を３０℃に上げ、γ−ラクトン生産のために脂肪酸基質を１ｇ／Ｌで添加した。
【０１２４】
実施例３：ガンマラクトン生産の分析
γ−ラクトン生産を分析するために、０．５ｍｌの実施例２に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を取り、１０μｌの２Ｎ  ＨＣｌで酸性化し、次いで、室温で６０分間振盪しながら０．５ｍｌの酢酸エチルで抽出した。１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、酢酸エチル相をＧＣ／ＭＳまたはＧＣ／ＦＩＤ分析に使用した。
【０１２５】
ＧＣ／ＭＳ分析は、ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０Ｓ検出器と連結したＳｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−２０１０システムで行った。分析カラムはＳＨＲＸＩ−５ＭＳ（厚さ０．２５μｍ；長さ３０ｍ；直径０．２５ｍｍ）とし、注入温度は分割モード下で２６５℃とする。温度勾配は０〜３分８０℃；３〜８．７分１２０℃〜２６３℃、２５の勾配；８．７〜１０．７分、２６３℃である。
【０１２６】
ＧＣ／ＦＩＤ分析はＳｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−２０１４システムで行った。分析カラムはＲｅｓｔｅｋ  ＲＸｉ−５ｍｓ（厚さ０．２５μｍ；長さ３０ｍ；直径０．２５ｍｍ）とし、注入温度は分割モードで２４０℃とする。温度勾配は０〜３分、１００℃；３〜９分１００℃〜２８０℃、３０の勾配；９〜１２分、２８０℃である。
【０１２７】
実施例４：Ｍｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｕｓ  Ｐ４５０を過剰発現する高収量株を使用したガンマラクトン生産
実施例２に記載される手順を、Ｍｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｕｓ  Ｐ４５０を過剰発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を使用して実施した。具体的には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物の試料を採取し、脂肪酸基質を添加した２日後または１６時間後に酸性化した。図２は、対応するカルボン酸からのさまざまなガンマラクトンの生産を示している：（ａ）エナント酸（ヘプタン酸、Ｃ７）からのγ−ヘプタラクトン（ＧＣ７）、（ｂ）カプリル酸（オクタン酸、Ｃ８）からのγ−オクタラクトン（ＧＣ８）、（ｃ）ペラルゴン酸（ノナン酸、Ｃ９）からのγ−ノナラクトン（ＧＣ９）、（ｄ）カプリン酸（デカン酸、Ｃ１０）からのγ−デカラクトン（ＧＣ１０）、（ｅ）ウンデシル酸（ウンデカン酸、Ｃ１１）からのγ−ウンデカラクトン（ＧＣ１１）、（ｆ）ラウリン酸（ドデカン酸、Ｃ１２）からのγ−ドデカラクトン（ＧＣ１２）、（ｇ）トリデシル酸（トリデカン酸、Ｃ１３）からのγ−トリデカラクトン（ＧＣ１３）、および（ｈ）ミリスチン酸（テトラデカン酸、Ｃ１４）からのγ−テトラデカラクトン（ＧＣ１４）。
【０１２８】
図２ａ〜図２ｈに示されるように、ＧＣ７〜ＧＣ１４γ−ラクトンは、Ｍｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｕｓシトクロムＰ４５０（配列番号１）を過剰発現する異種系において、対応するＣ７〜Ｃ１４カルボン酸から有効に産生された。特に、ＧＣ７〜ＧＣ１２のピークは、保持時間と質量スペクトルの両方の点で、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）の対応する標準と一致している。γ−トリデカラクトン（ＧＣ１３）およびγ−テトラデカラクトン（ＧＣ１４）の標準は市販されていない。それにもかかわらず、推定上のＧＣ１３およびＧＣ１４のピークはＧＣ１２よりも長い保持時間を有することが注目された。
【０１２９】
実施例５：Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｍｅｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｓ  Ｐ４５０を過剰発現する高収量株を使用したガンマラクトン生産
実施例２に記載される手順を、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｍｅｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｓ  Ｐ４５０を過剰発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を使用して実施した。具体的には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物の試料を採取し、脂肪酸基質を添加した１７時間後に酸性化した。図３は、対応するカルボン酸からのさまざまなガンマラクトンの生産を示している：（ａ）ウンデシル酸（ウンデカン酸、Ｃ１１）からのγ−ウンデカラクトン（ＧＣ１１）、および（ｂ）ウンデシレン酸（ウンデセン酸、Ｃ１１：１）からのγ−ウンデセノラクトン（ＧＣ１１’）。
【０１３０】
図３に示されるように、ＧＣ１１およびＧＣ１１’γ−ラクトンは、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｍｅｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｓシトクロムＰ４５０（配列番号３）を過剰発現する異種系において、対応するＣ１１およびＣ１１：１カルボン酸から有効に産生された。特に、Ｃ１１、ＧＣ１１およびＣ１１：１のピークは、保持時間と質量スペクトルの両方の点で、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）の対応する標準と一致している。ＧＣ１１’の標準は市販されていない。それにもかかわらず、推定上のＧＣ１１’ピークはＧＣ１１と同様の保持時間を示すことが注目された。
【０１３１】
記載された反応条件下で、約６９ｍｇ／ＬのＧＣ１１および約１８ｍｇ／ＬのＧＣ１１’が、それぞれ１ｇ／ＬのＣ１１またはＣ１１：１を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）増殖細胞培養物に添加した１７時間後に産生された。
【０１３２】
増殖細胞に加えて、休止細胞も、脂肪酸のガンマラクトンへの生物変換におけるその潜在的な使用について調査した。この実験では、一晩培養物を使用して、１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含有する液体ＳＯＣ培地（３％）に接種した。培養物を最初に３７℃でＯＤ６００が０．８になるまで増殖させ、１６℃に冷却した。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、タンパク質発現を誘導した。１６℃で１６時間培養した後、培養物を収穫し、遠心分離によって細胞ペレットを回収し、使用するまで−８０℃で保管した。
【０１３３】
典型的な生物変換実験では、凍結細胞を１００ｍＭ  Ｋ−Ｐｉ緩衝液、ｐＨ７に１００ｇ／Ｌ新鮮重量の細胞濃度で再懸濁した。次いで、１ｇ／ＬのＣ１１またはＣ１１：１を、０．１％のＴｗｅｅｎ  ４０および１０ｍＭのＮＡＤＰＨと共に添加した。その後、混合物を２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。試料を３時間後に採取した。ＧＣ１１およびＧＣ１１’の力価はそれぞれ４１９ｍｇ／Ｌおよび１８５ｍｇ／Ｌであった。
【０１３４】
実施例６：Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ  Ｐ４５０を過剰発現する高収量株を使用したガンマラクトン生産
実施例２に記載される手順を、Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ  Ｐ４５０を過剰発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を使用して実施した。具体的には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物の試料を採取し、脂肪酸基質を添加した２５時間後に酸性化した。図４は、保持時間分で、対応するカルボン酸からのさまざまなガンマラクトンの生産を示している：（ａ）ウンデシル酸（ウンデカン酸、Ｃ１１）からのγ−ウンデカラクトン（ＧＣ１１）、および（ｂ）ウンデシレン酸（ウンデセン酸、Ｃ１１：１）からのγ−ウンデセノラクトン（ＧＣ１１’）。
【０１３５】
図４は、対応するカルボン酸からのさまざまなガンマラクトンの生産を示している：（ａ）ヘキサン酸（Ｃ６）からのγ−ヘキサラクトン（ＧＣ６）、（ｂ）エナント酸（ヘプタン酸、Ｃ７）からのγ−ヘプタラクトン（ＧＣ７）、（ｃ）カプリン酸（デカン酸、Ｃ１０）からのγ−デカラクトン（ＧＣ１０）、（ｄ）ウンデシル酸（ウンデカン酸、Ｃ１１）からのγ−ウンデカラクトン（ＧＣ１１）、（ｅ）ラウリン酸（ドデカン酸、Ｃ１２）からのγ−ドデカラクトン（ＧＣ１２）、（ｆ）トリデシル酸（トリデカン酸、Ｃ１３）からのγ−トリデカラクトン（ＧＣ１３）、および（ｇ）ミリスチン酸（テトラデカン酸、Ｃ１４）からのγ−テトラデカラクトン（ＧＣ１４）。
【０１３６】
図４ａ〜図４ｇに示されるように、ＧＣ６、ＧＣ７、ＧＣ１０、ＧＣ１１、ＧＣ１２、ＧＣ１３およびＧＣ１４  γ−ラクトンは、Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａシトクロムＰ４５０（配列番号５）を過剰発現する異種系において、対応するＣ６、Ｃ７、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３およびＣ１４カルボン酸から有効に産生された。特に、ＧＣ６、ＧＣ７、ＧＣ１０、ＧＣ１１およびＧＣ１２のピークは、保持時間と質量スペクトルの両方の点で、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）の対応する標準と一致している。γ−トリデカラクトン（ＧＣ１３）およびγ−テトラデカラクトン（ＧＣ１４）の標準は市販されていない。それにもかかわらず、推定上のＧＣ１３およびＧＣ１４のピークはＧＣ１２よりも長い保持時間を有することが注目された。
【０１３７】
記載された反応条件下で、約４２ｍｇ／ＬのＧＣ６が、１ｇ／ＬのＣ６を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）増殖細胞培養物に添加した２５時間後に産生された。
【０１３８】
増殖細胞に加えて、休止細胞も、脂肪酸のガンマラクトンへの生物変換におけるその潜在的な使用について調査した。この実験では、一晩培養物を使用して、１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含有する液体ＳＯＣ培地（３％）に接種した。培養物を最初に３７℃でＯＤ６００が０．８になるまで増殖させ、１６℃に冷却した。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、タンパク質発現を誘導した。１６℃で１６時間培養した後、培養物を収穫し、遠心分離によって細胞ペレットを回収し、使用するまで−８０℃で保管した。
【０１３９】
典型的な生物変換実験では、凍結細胞を１００ｍＭ  Ｋ−Ｐｉ緩衝液、ｐＨ７に１００ｇ／Ｌ新鮮重量の細胞濃度で再懸濁した。次いで、１ｇ／ＬのＣ６を添加し、混合物を２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。試料を３時間後に採取した。ＧＣ６の力価は１９８ｍｇ／Ｌであった。
【０１４０】
目的の配列
Ｍｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｕｓシトクロムＰ４５０
ＧＡＮ０３０９４．１遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１）：
MTKYAHDQIPGPEPHYLLGNVPDIFPDSLGNLIKLHDKYGPIVHLSMGGHELLSVDDPAVLETICEDNEYFTKEIESVYSDLAILNGRGLVTTSTADPDWQLGHKLIMNAFSARAMKAYHYKMGESISELCEIMDSFAKSGEDFDVSRWFIALALESIGKIGFDYDFDLLKDPNAPRHPFTVALAYVQSMIMKRASTLSWLKWYQTTTNVRFHRDLQTLRGTVEEVLKDRREHPHTEADQSDLLDFMIKAESKEGEKLNDSLIRDNIITFLSAGHNTTSAFLSWTMLELCKHPEVVENIKQEIANCGIKAGEVPTPEQVKECKYLDLVIKESLRIHPPITSILKYCKKDATVKASNGDEYDIKAGQLLQVNINALHHNPKVWEDPDVFNPDRFSGDTDNLPNTAWLTFSTGPRACIGRQFALQEGKLALVMILSRFHFKMDDPSQKIGYAVVVSTKPVGFFAKIESSQLPEPTEEIVVTKRRESKAVPQEKVKPAEFPLPPVTFLFGTQTNTSEEYARKLSGQAKEMGFKEVTVQDLDDWKLVKGEAIAKAQHDADAPSSEDDVKVSELVVVVTATYNGFPPDDANEFAKWLDERTKDSEATKNNMLSGMLYAVFGCGNRDWTSTFQKFPKKVDSGFELLGGERLLPAGEGDASDDIDGDFSLWSASFWTALMQRYGQSSSGKNADIMSNNGPAADPSQDFTLEFINIVKEKVKTEQAALNCNQLETVATIVENRELQHTEKSHRSTRHIQVQFDKSVDGKPLYEAGDHLEVVPVNEDRLVEIIATNLGLVLDSVFEVKDLDIKNLSPRSVAANIKGPCTIRNALKYYADLTGPPTRFSLSILSKQLKDSRPDIAERLQKALQPGKETERLKEFLASHRTLIDIIQAFKIKELNFKEFISSVNCIVPRKYSISSGPLEHPFDPSISVGVVDTVGGPDGNTHYFGLASGYLSHQEPGTKINAQIKACKSTFRLPDDPSTPVIFIAAGTGFSPFRGFLQERHAKGLKSSKKNSNGESSECYMFFGCRHPDQDFIYKEEFDAYLEDGTITELYTTFSRSGEVVKYVQHALLKHANLLYKLMEESNAKVYICGSAGSMAKDVKRTWERLLVQMSGVSESEAAEQIQAWVDEGKYNEDVWGT
【０１４１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム用にコドン最適化されたＧＡＮ０３０９４．１のヌクレオチド配列（配列番号２）：
ATGACCAAATATGCCCATGATCAGATTCCGGGTCCTGAACCGCATTATCTGCTGGGTAATGTTCCGGATATTTTTCCGGATAGCCTGGGCAATCTGATTAAACTGCATGATAAATATGGTCCGATTGTGCATCTGAGCATGGGTGGTCATGAACTGCTGAGCGTTGATGATCCGGCAGTTCTGGAAACCATTTGTGAAGATAATGAATATTTCACCAAAGAAATCGAAAGCGTGTATAGCGATCTGGCAATTCTGAATGGTCGTGGTCTGGTTACCACCAGTACCGCAGATCCGGATTGGCAGCTGGGTCATAAACTGATTATGAATGCATTTAGCGCACGTGCCATGAAAGCCTATCACTATAAAATGGGTGAAAGCATTAGCGAACTGTGCGAAATTATGGATAGCTTTGCAAAAAGCGGTGAGGATTTTGATGTTAGCCGTTGGTTTATTGCACTGGCACTGGAAAGCATTGGTAAAATCGGTTTCGATTATGATTTCGACCTGCTGAAAGATCCGAATGCACCGCGTCATCCGTTTACCGTTGCGCTGGCCTATGTTCAGAGTATGATCATGAAACGTGCAAGCACCCTGAGCTGGCTGAAATGGTATCAGACCACCACCAATGTTCGTTTTCATCGTGATCTGCAGACCCTGCGTGGCACCGTTGAAGAAGTTCTGAAAGACCGTCGTGAACATCCGCATACCGAAGCAGATCAGAGCGATCTGCTGGATTTTATGATTAAAGCCGAAAGCAAAGAAGGCGAGAAACTGAACGATAGCCTGATTCGTGATAACATCATTACCTTTCTGAGCGCAGGTCATAATACCACCTCAGCATTTCTGAGCTGGACCATGCTGGAACTGTGTAAACATCCGGAAGTTGTCGAAAACATCAAACAAGAAATTGCCAACTGCGGTATTAAAGCGGGTGAAGTTCCGACACCGGAACAGGTTAAAGAATGTAAATATCTGGACCTGGTGATCAAAGAAAGCCTGCGTATTCATCCGCCTATTACCAGCATTCTGAAATACTGTAAAAAAGACGCAACCGTGAAAGCCAGCAATGGTGATGAATATGATATTAAAGCAGGTCAGCTGCTGCAGGTTAACATTAATGCACTGCATCATAACCCGAAAGTTTGGGAAGATCCTGATGTTTTTAACCCGGATCGTTTTAGCGGTGATACCGATAATCTGCCGAATACCGCATGGCTGACCTTTAGCACCGGTCCGCGTGCATGTATTGGTCGTCAGTTTGCACTGCAAGAAGGTAAACTGGCCCTGGTTATGATTCTGAGCCGTTTTCATTTCAAAATGGATGATCCGAGCCAGAAAATTGGTTATGCAGTTGTTGTTAGCACCAAACCGGTTGGTTTTTTTGCCAAAATTGAAAGCAGCCAGCTGCCGGAACCGACCGAAGAAATTGTTGTTACCAAACGTCGTGAAAGTAAAGCAGTTCCGCAAGAAAAAGTTAAACCGGCAGAATTTCCGCTGCCTCCGGTGACCTTTCTGTTTGGCACCCAGACCAATACCAGCGAAGAATATGCACGTAAACTGAGCGGTCAGGCAAAAGAAATGGGTTTTAAAGAAGTTACCGTCCAGGATCTGGATGATTGGAAACTGGTTAAAGGTGAAGCAATTGCAAAAGCACAGCATGATGCCGATGCACCGAGCAGCGAAGATGATGTTAAAGTGAGCGAACTGGTTGTTGTTGTGACCGCAACCTATAATGGTTTTCCGCCTGATGATGCAAACGAATTTGCAAAATGGCTGGATGAACGTACCAAAGATAGCGAAGCAACCAAAAATAACATGCTGAGCGGTATGCTGTATGCAGTGTTTGGTTGTGGTAATCGTGATTGGACCAGCACCTTTCAGAAATTCCCGAAAAAAGTTGATAGCGGCTTTGAACTGTTAGGTGGTGAACGTCTGCTGCCAGCCGGTGAAGGTGATGCAAGTGATGATATTGATGGTGATTTTAGCCTGTGGTCTGCCAGCTTTTGGACCGCACTGATGCAGCGTTATGGTCAGAGCAGCAGCGGTAAAAATGCAGATATTATGAGCAATAATGGTCCGGCAGCAGATCCGAGTCAGGATTTTACCCTGGAATTTATCAACATCGTGAAAGAGAAGGTCAAAACCGAACAGGCAGCACTGAATTGTAATCAGCTGGAAACCGTTGCAACCATTGTTGAAAATCGCGAACTGCAGCATACAGAAAAAAGCCATCGTAGCACCCGTCATATTCAGGTTCAGTTTGATAAAAGCGTGGATGGTAAACCGCTGTATGAAGCCGGTGATCATCTGGAAGTGGTTCCGGTTAATGAAGATCGTCTGGTTGAAATTATTGCCACCAATCTGGGTTTAGTTCTGGATAGCGTTTTTGAGGTGAAAGACCTGGATATTAAGAATCTGAGTCCGCGTAGCGTTGCAGCAAACATTAAAGGTCCGTGTACCATTCGTAATGCCCTGAAATATTACGCAGATCTGACCGGTCCTCCGACACGTTTTAGTCTGAGCATTCTGTCAAAACAGCTGAAAGACAGCCGTCCTGATATTGCAGAACGCCTGCAGAAAGCACTGCAGCCTGGTAAAGAAACCGAACGTCTGAAAGAATTTCTGGCAAGTCATCGTACCCTGATCGATATTATTCAGGCCTTCAAAATCAAAGAACTGAACTTCAAAGAGTTTATCAGCAGCGTTAATTGCATCGTTCCGCGTAAATATAGCATTAGCAGTGGTCCGCTGGAACATCCGTTTGATCCGAGTATTAGCGTTGGTGTTGTTGATACCGTTGGTGGTCCGGATGGTAATACCCATTATTTTGGTCTGGCAAGCGGTTATCTGAGCCATCAAGAACCGGGTACAAAAATCAATGCACAGATTAAAGCATGCAAGAGTACCTTTCGTCTGCCGGATGATCCTAGCACACCGGTTATCTTTATTGCAGCAGGCACCGGTTTTAGCCCGTTTCGTGGTTTTCTGCAAGAACGTCATGCAAAAGGTCTGAAAAGCAGCAAAAAAAACAGCAATGGCGAAAGCAGCGAGTGCTATATGTTTTTTGGCTGTCGTCATCCGGATCAGGATTTCATCTATAAAGAAGAATTTGACGCCTACCTGGAAGATGGCACCATTACAGAACTGTATACCACCTTTAGCCGTAGCGGTGAAGTTGTTAAATATGTTCAGCACGCACTGCTGAAACATGCAAATCTGCTGTACAAACTGATGGAAGAAAGCAACGCCAAAGTGTATATTTGTGGTAGCGCAGGTAGCATGGCAAAAGATGTTAAACGTACCTGGGAGCGCCTGCTGGTTCAGATGAGCGGTGTTAGCGAAAGCGAAGCAGCAGAGCAGATTCAGGCATGGGTTGATGAAGGCAAATATAACGAAGATGTTTGGGGCACCTAA
【０１４２】
Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｍｅｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｓシトクロムＰ４５０
ＯＲＸ８５４４８．１遺伝子のアミノ酸配列（配列番号３）：
MSSQSDEIPGPKPHILLGNVQDIIPDTIGNHRRLHDEYGPVMRLYLGGHDFVSICDPEVIQSITGEGDFTKEIYSAYEDLAILSGRGLVTTATKDPDWILAHKLLMPAFSARAMKAYHDIMGKCILDLLKIMESYQECGEAIDMSRWMISLALESIGVIGFGYNFNLLDDKDSERHPFSVALNYVQSMIMKRTNSVTWTKWLQTTANVRFRRDLATLRDTVDDVLKQRRLNPPSEDARRDLLDFMLAAESKQGEKLDDNLIRDEIITFLSAGHNTTSSFLSWTFFELARNPDVEQKILQEIVNAGIKPGEIPSTEQVAKCKYIDMVIKESLRFHSPIPLVIKYCQNDCTIKTSEGKEYEIKRGQLAQIQISAVHKDPKLWENPNVFDPERFNPEKEADRHPCAWIPFSDGPRACIGRQFSLQEGKLALIMLLCKFRFRLLDETKEVGYQIIVSLKPVDLIMKVLPAELPSPNAGSDTSSVKDTVKPQLKPKENEVLEHARFPLPPVTFLYGTQTGTSEEYARKLSGQAKEFGFTDIAVAELDDWEVVKNNRIPSNKGQSSPSDEDGTKVSQLAVIVTATYNGYPPDNALKFDSWLTDITKDQKNQLEGLLYAVFGCGNKQWQSTFQAFPKKVDASIELLGAERLVPAGAGNADQDIDGDFTNWSASFWAALMQKYGRGASDKDADLMTTSGPVADPSNDFTLEFLPLGGDQAAMEAALGNRNSDPGAQVAILENKELQDVEKSGRSTRHIVVECPPASPGSGKKASYRAGDHLEIKPYNDDQLVENIAIGFGYVLDSVFQIKDCKITNLSPRSLAANIIGPCTVRNALTYFADLSGPPTRYTLTVMAKQLEKTRPDVAERLLHALQPGKETPRLREFLSTHRTILDIQRAFKIKELSFKEFLSSVNVIVPRRYSISSGPLEHPNEVSVTVGVVKDIGGADNNTDYYGLASGYLMRCPIGSKIDAKIKPCKNNFRLPENEQTPVIFICAGTGFAPFRGFLQERHAKGWKSKEKGGSSDAYLFFGCRHPDHDFIYQKELEEYLEDGTLTKLYTTFSRYNQTKKYVQHLLLTHAQLLFNLIMNENANIYVCGAGRGMAHDVRRTFERLAVQVAGMSEPEAVDAISHMVDAERYNEDVWG
【０１４３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム用にコドン最適化されたＯＲＸ８５４４８．１のヌクレオチド配列（配列番号４）：
ATGAGCAGCCAGAGCGATGAAATTCCGGGCCCGAAACCGCATATTCTGCTGGGTAATGTTCAGGATATTATTCCGGATACCATTGGCAATCATCGCCGTCTGCATGATGAATATGGCCCGGTTATGCGTCTGTATCTGGGTGGTCATGATTTTGTGAGCATTTGTGATCCGGAAGTGATTCAGAGCATTACCGGCGAAGGCGATTTTACCAAAGAAATCTATAGCGCATACGAAGATCTGGCAATTCTGAGCGGCCGTGGCCTGGTTACCACCGCAACCAAAGATCCGGATTGGATTCTGGCCCATAAACTGCTGATGCCGGCCTTTAGTGCCCGCGCAATGAAAGCCTATCATGATATTATGGGTAAATGTATTCTGGATCTGCTGAAAATTATGGAAAGCTATCAGGAATGTGGTGAAGCCATTGATATGAGCCGTTGGATGATTAGCCTGGCACTGGAAAGTATTGGCGTTATTGGTTTTGGCTATAATTTTAATCTGCTGGATGATAAAGACAGCGAACGCCATCCGTTTAGCGTTGCACTGAATTATGTGCAGAGTATGATTATGAAACGCACCAATAGCGTTACCTGGACCAAATGGCTGCAGACCACCGCCAATGTGCGTTTTCGTCGCGATCTGGCCACCCTGCGCGATACCGTGGATGATGTGCTGAAACAGCGTCGTCTGAATCCGCCGAGCGAAGATGCCCGCCGCGATCTGCTGGATTTTATGCTGGCCGCCGAAAGCAAACAGGGCGAAAAACTGGATGATAATCTGATTCGCGATGAAATTATTACCTTTCTGAGTGCAGGCCATAATACCACCAGTAGTTTTCTGAGTTGGACCTTTTTCGAACTGGCCCGCAATCCGGATGTGGAACAGAAAATTCTGCAGGAAATTGTGAATGCCGGCATTAAGCCGGGTGAAATTCCGAGTACCGAACAGGTGGCCAAATGTAAATATATTGATATGGTTATCAAGGAGAGCCTGCGCTTTCATAGCCCGATTCCGCTGGTTATTAAGTATTGTCAGAATGATTGCACCATTAAGACCAGTGAAGGTAAAGAATATGAAATTAAGCGCGGCCAGCTGGCCCAGATTCAGATTAGCGCCGTGCATAAAGATCCGAAACTGTGGGAAAATCCGAATGTGTTTGATCCGGAACGCTTTAATCCGGAAAAAGAAGCAGATCGTCATCCGTGTGCATGGATTCCGTTTAGCGATGGTCCGCGTGCCTGCATTGGTCGCCAGTTTAGCCTGCAGGAAGGTAAACTGGCCCTGATTATGCTGCTGTGCAAATTTCGTTTTCGTCTGCTGGATGAAACCAAAGAAGTGGGTTATCAGATTATTGTGAGCCTGAAACCGGTGGATCTGATTATGAAAGTGCTGCCGGCAGAACTGCCGAGTCCGAATGCCGGCAGCGATACCAGTAGTGTGAAAGATACCGTTAAACCGCAGCTGAAACCGAAAGAAAATGAAGTGCTGGAACATGCCCGTTTTCCGCTGCCGCCGGTTACCTTTCTGTATGGTACCCAGACCGGCACCAGTGAAGAATATGCACGCAAACTGAGTGGTCAGGCAAAAGAATTTGGCTTTACCGATATTGCCGTGGCAGAACTGGATGATTGGGAAGTTGTTAAAAATAATCGTATCCCGAGTAATAAGGGTCAGAGTAGTCCGAGCGATGAAGATGGCACCAAAGTGAGCCAGCTGGCTGTTATTGTTACCGCAACCTATAATGGTTATCCGCCGGATAATGCACTGAAATTTGATAGCTGGCTGACCGATATTACCAAAGATCAGAAAAATCAGCTGGAAGGTCTGCTGTATGCCGTGTTTGGTTGTGGCAATAAGCAGTGGCAGAGCACCTTTCAGGCATTTCCGAAAAAAGTGGATGCCAGTATTGAACTGCTGGGCGCAGAACGTCTGGTGCCGGCAGGCGCAGGCAATGCCGATCAGGATATTGATGGTGACTTTACCAATTGGAGTGCCAGCTTTTGGGCCGCACTGATGCAGAAATATGGCCGCGGCGCCAGTGATAAAGATGCCGATCTGATGACCACCAGTGGCCCGGTGGCCGATCCGAGTAATGATTTTACCCTGGAATTTCTGCCGCTGGGTGGTGACCAGGCAGCAATGGAAGCAGCCCTGGGTAATCGTAATAGCGATCCGGGCGCACAGGTGGCCATTCTGGAAAATAAGGAACTGCAGGATGTTGAAAAAAGTGGCCGTAGTACCCGCCATATTGTTGTTGAATGCCCGCCGGCCAGCCCGGGCAGTGGTAAAAAAGCAAGTTATCGCGCCGGTGACCATCTGGAAATTAAGCCGTATAATGATGATCAGCTGGTGGAAAATATTGCCATTGGCTTTGGCTATGTTCTGGATAGTGTTTTTCAGATTAAGGATTGCAAAATCACCAATCTGAGTCCGCGCAGTCTGGCCGCCAATATTATTGGTCCGTGCACCGTTCGCAATGCCCTGACCTATTTTGCCGATCTGAGTGGTCCGCCGACCCGCTATACCCTGACCGTGATGGCAAAACAGCTGGAAAAAACCCGCCCGGATGTGGCAGAACGTTTACTGCATGCACTGCAGCCGGGCAAAGAAACCCCGCGCCTGCGCGAATTTCTGAGTACCCATCGTACCATTCTGGATATTCAGCGCGCCTTTAAAATTAAGGAACTGAGCTTTAAAGAGTTCCTGAGCAGTGTTAATGTTATTGTTCCGCGCCGCTATAGTATTAGCAGCGGCCCGCTGGAACATCCGAATGAAGTGAGTGTGACCGTGGGTGTTGTTAAAGATATTGGCGGTGCAGATAATAATACCGATTATTATGGTCTGGCCAGTGGTTATCTGATGCGCTGCCCGATTGGTAGTAAAATTGATGCCAAAATTAAGCCGTGCAAAAATAATTTTCGCCTGCCGGAAAATGAACAGACCCCGGTTATTTTTATTTGCGCCGGCACCGGCTTTGCCCCGTTTCGTGGTTTTCTGCAGGAACGCCATGCCAAAGGTTGGAAAAGTAAAGAAAAAGGCGGTAGTAGCGATGCATATCTGTTTTTCGGCTGTCGTCATCCGGATCATGATTTTATCTATCAGAAAGAACTGGAAGAATACCTGGAAGATGGTACCCTGACCAAACTGTATACCACCTTTAGCCGCTATAATCAGACCAAAAAATATGTGCAGCATCTGCTGCTGACCCATGCCCAGCTGCTGTTTAATCTGATTATGAATGAAAACGCAAACATCTATGTGTGTGGTGCAGGCCGTGGCATGGCCCATGATGTGCGCCGCACCTTTGAACGCCTGGCAGTTCAGGTTGCAGGCATGAGCGAACCGGAAGCCGTGGATGCCATTAGTCACATGGTTGATGCCGAACGCTATAATGAAGATGTTTGGGGTTAA
【０１４４】
Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａシトクロムＰ４５０
アミノ酸配列（配列番号５）：
MTVYESDKIPGPEPRVLLGNIPDVYPDFVGNITQLHEKYGPVMRLYLGGHDYVSVCDPDCLQTTHKDGEYFTKEIQSTYEDLAILNGRGLVTTATKDPDWILGHKLLMPAFSARAMKAYHYKMGDTIKDLLNIIESFQKSGEDFDVSRWMIALALESIGNIGFDYDFNLLKDPNAERHPFTVALSYVQSMIMKRSASVSWMKWMKTSANARFQRDLGTLRNTLDSVLKERHEHPHSEDQQSDLLDFMISASTKEGDKLDDKIIRDNVMTFLSAGHNTTSSFLSWTILELCRHPEVAATIRQELANAGVQPGEIPTPEQVNACKYLDLVIKESLRMHPPIVAVLKYCKKDCTIKAGTTGDEYKIKAGQLLQSNINALHHSTKVWDEPMVFNPDRFADAELHPNAWMPFSDGPRACIGRQFSLQEGKLALVMMLSKFNFSMEDPSQKIGYEIIVAIKPVGLMVKVTPAELPEPTEEIVVTQRRESKAEPQESLKPAEFPLPPVTILYGTQTNTSEEYAKKLSGQAKEFGFKTIKVDDLDNWKLLNGGKLTKLNKDQSAPSSGDDVKVSELVVVVTATYNGNPPDNAMKFDEWLSKKTESIEDTKSNELEGILYAVFGCGNRDWSSTFQKFPTAVDTGLELLGGERLLPAGVGDASDDIDGDFSEWSANFWSTLMQRYGQSSSGKNADIMTSTAPLADPSKDFNLEFLPVHKNKELVTQANENRNQRGKTVTIKENRELQNIEKSHRSTKHIEVQFDKSEDGKPLYIAGDHLEITPVNKEELVELVAVNLGLVLDSVFQIQMNEVDISHLSPRSLAANIKGPCTIRNALKYYADLTGPPTRYTLSVLGKQLEKTRPEIAKRLQEALQPGKETPRLKEFLSTHRTFVDIMKAFNIKELNFKEFLSSVNCIVPRKYSISSGPTEHPFDPSVSIGIVRDIGGPDGKTEYRGLASGYLDTLKPGSQVNAQIKDCKSTFRLPDDGSTPVIFICAGTGMSPFRGFLQERHAQGLKSSKKGGSSEAYMFFGCRHPDQDFIYKDELQSYVEDGTLTELYTTFSRSNQVVKYVQHSLLQHAQMLYELMVDHNAKVYVCGSAGSMAKDVKRTWERITVQMSGMSEPEAEDLLKEWSDKGKYNEDVWGT
【０１４５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム用にコドン最適化されたヌクレオチド配列（配列番号６）：
ATGACCGTGTATGAAAGCGATAAAATTCCGGGTCCGGAACCGCGCGTTCTGCTGGGTAATATTCCGGATGTTTATCCGGATTTTGTTGGCAATATTACCCAGCTGCATGAAAAATATGGTCCGGTTATGCGTCTGTATCTGGGCGGCCATGATTATGTGAGTGTTTGTGATCCGGATTGTCTGCAGACCACCCATAAAGATGGTGAATATTTTACCAAAGAGATCCAGAGCACCTATGAAGATCTGGCCATTCTGAATGGCCGTGGCCTGGTGACCACCGCCACCAAAGATCCGGATTGGATTCTGGGCCATAAACTGCTGATGCCGGCATTTTCAGCCCGCGCCATGAAAGCCTATCATTATAAAATGGGTGACACCATTAAGGATCTGCTGAATATTATTGAAAGTTTTCAGAAGTCCGGTGAAGATTTTGATGTTAGCCGTTGGATGATTGCCCTGGCACTGGAAAGCATTGGCAATATTGGTTTTGATTATGATTTCAACCTGCTGAAAGATCCGAATGCCGAACGTCATCCGTTTACCGTTGCCCTGAGTTATGTTCAGAGTATGATTATGAAACGCAGTGCAAGCGTTAGCTGGATGAAATGGATGAAAACCAGTGCCAATGCCCGCTTTCAGCGTGATCTGGGTACCCTGCGCAATACCCTGGATAGTGTGCTGAAAGAACGCCATGAACATCCGCATAGCGAAGATCAGCAGAGCGATCTGCTGGATTTTATGATTAGTGCCAGTACCAAAGAAGGCGATAAACTGGATGATAAAATTATTCGCGATAACGTTATGACCTTTCTGAGCGCAGGTCATAATACCACCAGCAGTTTTCTGAGTTGGACCATTCTGGAACTGTGCCGTCATCCGGAAGTTGCCGCAACCATTCGTCAGGAACTGGCAAATGCCGGTGTGCAGCCGGGTGAAATTCCGACCCCGGAACAGGTGAATGCCTGTAAATATCTGGATCTGGTTATTAAGGAAAGCCTGCGTATGCATCCGCCGATTGTGGCAGTTCTGAAATATTGTAAAAAGGATTGTACCATCAAGGCCGGTACCACCGGTGACGAATATAAAATTAAGGCAGGCCAGCTGCTGCAGAGCAATATTAATGCACTGCATCATAGCACCAAAGTTTGGGATGAACCGATGGTTTTTAATCCGGATCGTTTTGCCGATGCAGAACTGCATCCGAATGCCTGGATGCCGTTTAGTGATGGTCCGCGTGCCTGTATTGGCCGTCAGTTTAGCCTGCAGGAAGGCAAACTGGCACTGGTTATGATGCTGAGCAAATTCAATTTTAGCATGGAAGATCCGAGCCAGAAAATTGGCTATGAAATTATTGTGGCCATTAAGCCGGTGGGCCTGATGGTGAAAGTGACCCCGGCCGAACTGCCGGAACCGACCGAAGAAATTGTTGTTACCCAGCGCCGTGAAAGTAAAGCAGAACCGCAGGAAAGTCTGAAACCGGCCGAATTTCCGCTGCCGCCGGTTACCATTCTGTATGGCACCCAGACCAATACCAGCGAAGAATATGCAAAAAAGCTGAGCGGCCAGGCCAAAGAATTTGGTTTTAAAACCATTAAGGTGGATGATCTGGATAATTGGAAACTGCTGAATGGCGGTAAACTGACCAAACTGAATAAGGATCAGAGTGCACCGAGTAGTGGTGACGATGTGAAAGTGAGTGAACTGGTGGTGGTTGTTACCGCAACCTATAATGGCAATCCGCCGGATAATGCAATGAAATTTGATGAATGGCTGAGTAAAAAGACCGAAAGCATTGAAGATACCAAAAGCAATGAACTGGAAGGCATTCTGTATGCAGTTTTTGGCTGCGGCAATCGTGATTGGAGCAGTACCTTTCAGAAATTTCCGACCGCAGTGGATACCGGTCTGGAACTGCTGGGCGGCGAACGTCTGCTGCCGGCAGGCGTTGGCGATGCCAGTGATGATATTGATGGCGATTTTAGCGAATGGAGCGCAAATTTTTGGAGTACCCTGATGCAGCGTTATGGTCAGAGCAGTAGCGGCAAAAATGCAGATATTATGACCAGCACCGCACCGCTGGCAGATCCGAGTAAAGATTTTAATCTGGAATTTCTGCCGGTGCATAAAAATAAGGAACTGGTGACCCAGGCAAATGAAAATCGCAATCAGCGCGGTAAAACCGTGACCATTAAGGAAAATCGCGAACTGCAGAATATTGAAAAAAGCCATCGTAGTACCAAACATATTGAAGTTCAGTTTGATAAGAGCGAAGATGGTAAACCGCTGTATATTGCCGGTGACCATCTGGAAATTACCCCGGTTAATAAGGAAGAACTGGTTGAACTGGTGGCCGTTAATCTGGGTCTGGTGCTGGATAGCGTGTTTCAGATTCAGATGAATGAAGTTGATATTAGTCACCTGAGCCCGCGCAGTCTGGCAGCAAATATTAAGGGCCCGTGCACCATTCGCAATGCACTGAAATATTATGCAGATCTGACCGGTCCGCCGACCCGTTATACCCTGAGTGTGCTGGGTAAACAGCTGGAAAAAACCCGTCCGGAAATTGCCAAACGTCTGCAGGAAGCCCTGCAGCCGGGCAAAGAAACCCCGCGCCTGAAAGAATTTCTGAGTACCCATCGTACCTTTGTTGATATTATGAAAGCATTCAATATCAAGGAGCTGAATTTTAAAGAGTTCCTGAGCAGTGTGAATTGTATTGTGCCGCGCAAATATAGCATTAGTAGTGGTCCGACCGAACATCCGTTTGATCCGAGCGTGAGCATTGGTATTGTTCGCGATATTGGTGGTCCGGATGGCAAAACCGAATATCGCGGTCTGGCAAGCGGCTATCTGGATACCCTGAAACCGGGTAGTCAGGTGAATGCGCAGATTAAGGATTGTAAAAGTACCTTTCGCCTGCCGGATGATGGTAGCACCCCGGTTATTTTTATTTGCGCCGGTACCGGCATGAGCCCGTTTCGTGGCTTTCTGCAGGAACGCCATGCCCAGGGTCTGAAAAGCAGTAAAAAAGGTGGCAGTAGTGAAGCATATATGTTTTTCGGTTGCCGCCATCCGGATCAGGATTTTATCTATAAAGATGAACTGCAGAGTTACGTTGAAGATGGTACCCTGACCGAACTGTATACCACCTTTAGTCGTAGTAATCAGGTGGTTAAATATGTGCAGCATAGCCTGCTGCAGCATGCACAGATGCTGTATGAACTGATGGTGGATCATAATGCAAAAGTTTATGTTTGTGGCAGCGCCGGTAGCATGGCAAAAGATGTTAAACGCACCTGGGAACGCATTACCGTTCAGATGAGTGGCATGAGCGAACCGGAAGCCGAAGATCTGCTGAAAGAATGGAGCGATAAAGGCAAATATAATGAAGATGTGTGGGGCACCTAA
【図１】
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【図２ａ−２ｃ】
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【図２ｄ−２ｆ】
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【図２ｇ−２ｈ】
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【図３】
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【図４ａ−４ｃ】
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【図４ｄ−４ｅ】
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【図４ｆ−４ｇ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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