(57)【要約】  本発明は、所定のヌクレオチド配列に従ってポリヌクレオチド分子を合成するための新たな方法に関する。本発明はまた、合成後の合成ポリヌクレオチドのアセンブリ方法、ならびに合成および／またはアセンブリ方法を行うためのシステムおよびキットに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法であって、前記方法が、繰り返しの合成サイクルを行うことを含み、各サイクルにおいて、
（Ａ）二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖が、リガーゼ酵素の作用によって、前記所定の配列の第１のヌクレオチドの付加により伸長され、
（Ｂ）前記第１の鎖にハイブリダイズされる二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖が、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素によって前記所定の配列の第２のヌクレオチドを加えることによって伸長され、
（Ｃ）次いで、前記二本鎖ポリヌクレオチドが、切断部位で切断され、
各サイクルの前記所定の配列の前記第１および第２のヌクレオチドが、切断後に、前記二本鎖ポリヌクレオチドにおいて保持され、前記第１のヌクレオチドおよび前記第２のヌクレオチドが、前記合成二本鎖ポリヌクレオチド中の異なるヌクレオチド対においてパートナーヌクレオチドになる、方法。
【請求項２】
前記切断部位が、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列によって定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各サイクルにおいて、前記第２の鎖の伸長の前に、前記二本鎖ポリヌクレオチド中に切断部位が作成される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リガーゼ酵素の作用による工程（Ａ）の間に、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第１の鎖に組み込まれて、前記切断部位を定義する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
所与の合成サイクルにおいて、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第２の鎖に付加される、そのサイクルの前記第２のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、前記可逆的ターミネーター基が、次のサイクルの前記第２のヌクレオチドの前記次の合成サイクルにおける前記付加の前に、そのサイクルの前記組み込まれた第２のヌクレオチドから除去される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
連結反応が、粘着末端連結反応を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のヌクレオチドおよび前記ユニバーサルヌクレオチドが、ポリヌクレオチド連結分子の構成成分であり、前記ポリヌクレオチド連結分子が、前記リガーゼ酵素の作用による工程（Ａ）の間に、前記二本鎖ポリヌクレオチドに連結され、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記二本鎖ポリヌクレオチドへの連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第１の鎖が伸長され、前記切断部位が作成される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、
（１）合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、足場ポリヌクレオチドを提供することであって、前記合成鎖が、プライマー鎖部分を含み、前記支持鎖が、前記二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖であり、前記合成鎖が、前記二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖である、提供することと、
（２）粘着末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を前記足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、連結末端が、
（ｉ）前記支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよび前記所定の配列の第１のヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第１の鎖が前記第１のヌクレオチドで伸長され、前記切断部位が、前記ユニバーサルヌクレオチドの前記第１の鎖への組み込みによって作成される、連結することと、
（３）前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込みにより、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端を伸長することであって、前記第２のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
（４）連結された足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、切断が、前記支持鎖を切断することと、前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、組み込まれた第１および第２のヌクレオチドを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
（５）前記第２のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、を含む、第１の合成サイクルを行うことを含み、
前記方法が、
（６）粘着末端連結反応における前記リガーゼ酵素の作用によって、さらなる二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を、切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、前記連結末端が、
（ｉ）前記支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよび前記さらなる合成サイクルの前記第１のヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第１の鎖が、前記さらなる合成サイクルの前記第１のヌクレオチドで伸長され、前記切断部位が、前記ユニバーサルヌクレオチドの前記第１の鎖への組み込みによって作成される、連結することと、
（７）前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなる合成サイクルの前記第２のヌクレオチドの組み込みにより、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端を伸長することであって、前記第２のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
（８）前記連結された足場ポリヌクレオチドを前記切断部位で切断することであって、切断が、前記支持鎖を切断することと、前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記第１およびさらなる合成サイクル（複数可）の組み込まれた第１および第２のヌクレオチドを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
（９）前記第２のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、
（１０）工程６〜９を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する前記二本鎖ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、さらなる合成サイクルを行うことをさらに含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、前記切断部位で前記連結された足場ポリヌクレオチドを切断する工程の前に、前記可逆的ターミネーター基が、前記第２のヌクレオチドから代替的に除去される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（１）において、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、そのサイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程（２）において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端で、前記ヘルパー鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、そのサイクルの前記第１のヌクレオチドであり、前記次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
工程（６）において、前記切断された足場ポリヌクレオチドにおいて、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記支持鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、工程（７）で組み込まれる前記さらなる合成サイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程（６）において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端で、前記ヘルパー鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記さらなる合成サイクルの前記第１のヌクレオチドであり、前記次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
第１およびさらなる合成サイクルにおいて、前記足場ポリヌクレオチド中の前記ヌクレオチド突出および前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端中の前記ヌクレオチド突出が、同じ数のヌクレオチドを含み、前記数が１以上である、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）前記第１のサイクルの連結工程（工程２）において、および全てのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
ｉ．そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合するように、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋２を占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
ｉｉｉ．前記突出が、そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドに突出する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドを含む１つのヌクレオチド突出を含むように、かつ
ｉｖ．前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置ｎは、その組み込み時にそのサイクルの前記所定の配列の前記第２のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１およびｎ＋２は、それぞれ、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記第１／次のおよび第２のヌクレオチド位置であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
（ｂ）前記第１のサイクルの伸長工程（工程３）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第２のヌクレオチドが、前記第２の鎖に組み込まれ、前記第１の鎖中のパートナーヌクレオチドと対合され、
（ｃ）前記第１のサイクルの切断工程（工程４）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ＋２と位置ｎ＋１との間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第１の鎖に付着したそのサイクルの前記第１のヌクレオチドとそのパートナーヌクレオチドと対合したそのサイクルの前記第２のヌクレオチドとを保持し、その際、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのサイクルの前記第１のヌクレオチドによって占められる位置が、前記次の合成サイクルにおけるヌクレオチド位置ｎとして定義される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）前記第１のサイクルの連結工程（工程２）において、および全てのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
ｉ．そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合するように、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋３を占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
ｉｉｉ．前記突出が、そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドに突出する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドを含む１つのヌクレオチド突出を含むように、かつ
ｉｖ．前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置ｎは、その組み込み時にそのサイクルの前記所定の配列の前記第２のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１、ｎ＋２、およびｎ＋３は、それぞれ、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における次の、第２の、および第３のヌクレオチド位置であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
（ｂ）前記第１のサイクルの伸長工程（工程３）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第２のヌクレオチドが、前記第２の鎖に組み込まれ、前記第１の鎖中のパートナーヌクレオチドと対合され、
（ｃ）前記第１のサイクルの切断工程（工程４）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ＋２と位置ｎ＋１との間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第１の鎖に付着したそのサイクルの前記第１のヌクレオチドとそのパートナーヌクレオチドと対合したそのサイクルの前記第２のヌクレオチドとを保持し、その際、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのサイクルの前記第１のヌクレオチドによって占められる位置が、次の合成サイクルにおけるヌクレオチド位置ｎとして定義される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）前記第１のサイクルの連結工程（工程２）において、および全てのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
ｉ．そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合するように、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋３＋ｘを占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
ｉｉｉ．前記突出が、そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドに突出する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドを含む１つのヌクレオチド突出を含むように、かつ
ｉｖ．前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置ｎは、その組み込み時にそのサイクルの前記所定の配列の前記第２のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋３は、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第３のヌクレオチド位置であり、ｘは、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎ＋３に対するヌクレオチド位置の数であり、前記数は、１〜１０以上の整数であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
（ｂ）前記第１のサイクルの伸長工程（工程３）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第２のヌクレオチドが、前記第２の鎖に組み込まれ、前記第１の鎖中のパートナーヌクレオチドと対合され、
（ｃ）前記第１のサイクルの切断工程（工程４）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ＋２と位置ｎ＋１との間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第１の鎖に付着したそのサイクルの前記第１のヌクレオチドとそのパートナーヌクレオチドと対合したそのサイクルの前記第２のヌクレオチドとを保持し、その際、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのサイクルの前記第１のヌクレオチドによって占められる位置は、次の合成サイクルにおけるヌクレオチド位置ｎとして定義される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
工程（１）において、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記末端が、１＋ｙヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記１＋ｙヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記突出の前記第１のヌクレオチドが、前記突出の前記末端に対して遠位にある前記突出中の位置を占め、ヌクレオチド位置ｎを占め、工程（３）において組み込まれた前記第１のサイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、位置ｎ＋１を占める前記突出の前記ヌクレオチドが、工程（７）において組み込まれた前記次の／第２の合成サイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程（２）において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端で、前記ヘルパー鎖の前記末端が、１＋ｙヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記１＋ｙヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記１＋ｙ突出ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、前記相補的連結末端の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、そのサイクルの前記第１のヌクレオチドであり、ヌクレオチド位置ｎ＋２＋ｘを占め、前記第３の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対のパートナーヌクレオチドであり、
工程（６）において、前記切断された足場ポリヌクレオチドにおいて、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記支持鎖の前記末端が、１＋ｙヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記１＋ｙヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記突出の前記第１のヌクレオチドが、前記突出の前記末端に対して遠位にある前記突出中の位置を占め、ヌクレオチド位置ｎを占め、工程（７）において組み込まれた前記さらなる合成サイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、位置ｎ＋１を占める前記突出の前記ヌクレオチドが、前記次の合成サイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程（６）において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端において、前記ヘルパー鎖の前記末端は、１＋ｙヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記１＋ｙヌクレオチドは、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記１＋ｙ突出ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、前記相補的連結末端の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記さらなる合成サイクルの前記第１のヌクレオチドであり、ヌクレオチド位置ｎ＋２＋ｘを占め、前記次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対のパートナーヌクレオチドであり、
ｉ．位置ｎは、その組み込み時にそのサイクルの前記所定の配列の前記第２のヌクレオチドとは反対になるヌクレオチド位置であり、
ｉｉ．連結後、位置ｎ＋１およびｎ＋２は、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記第１および第２のヌクレオチド位置であり、
ｉｉｉ．ｙは、１以上である整数であり、
ｉｖ．ｘは、０以上である整数であり、
ｖ．前記足場ポリヌクレオチドにおけるｙの数は、好ましくは、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端におけるｙの数と同じ数であり、ｙが異なる数である場合、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端におけるｙの数は、好ましくは、前記足場ポリヌクレオチドにおけるｙの数よりも少なく、
ｖｉ．任意の所与の一連の第１のサイクルおよびさらなるサイクルにおいて、ｘに対して選択される数は、前記足場ポリヌクレオチドにおいて、ｙに対して選択される数−１である、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
第１およびさらなるサイクルの両方において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチド連結分子および前記連結された足場ポリヌクレオチドの両方において、位置ｎ＋３＋ｘを占め、前記足場ポリヌクレオチドが、位置ｎ＋３＋ｘとｎ＋２＋ｘとの間で切断される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
第１およびさらなるサイクルの両方において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチド連結分子および前記連結された足場ポリヌクレオチドの両方において、位置ｎ＋４＋ｘを占め、前記足場ポリヌクレオチドが、位置ｎ＋３＋ｘとｎ＋２＋ｘとの間で切断される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、
（ｉ）工程（２）において、前記ポリヌクレオチド連結分子には、前記第１のサイクルの前記所定の配列の第１のヌクレオチドを含み、前記第１のサイクルの前記所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含む、相補的連結末端が提供されるように、
（ｉｉ）工程（３）において、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の前記末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記第１のサイクルの前記所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込みにより伸長され、前記プライマー鎖部分の前記末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記第１のサイクルの前記所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長され、前記第１のサイクルの前記第２およびさらなるヌクレオチドのそれぞれが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、各さらなる伸長後、前記可逆的ターミネーター基が、次のヌクレオチドの組み込みの前にヌクレオチドから除去されるように、
（ｉｉｉ）切断後の工程（４）において、前記第１のサイクルの前記所定の配列の前記第１、第２、およびさらなるヌクレオチドが、前記切断された足場ポリヌクレオチド中に保持されるように、
（ｉｖ）工程（６）において、前記ポリヌクレオチド連結分子には、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の第１のヌクレオチドを含み、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含む、相補的連結末端が提供されるように、
（ｖ）工程（６）において、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の前記末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込みにより伸長され、前記プライマー鎖部分の前記末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長され、前記さらなるサイクルの前記第２およびさらなるヌクレオチドのそれぞれが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、各さらなる伸長後、前記可逆的ターミネーター基が、前記次のヌクレオチドの前記組み込み前にヌクレオチドから除去されるように、
（ｖｉ）切断後の工程（８）において、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の前記第１、第２、およびさらなるヌクレオチドが、前記切断された足場ポリヌクレオチド中に保持されるように、修正される、請求項８〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、切断前の工程（４）および（８）において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、前記第１およびさらなるヌクレオチドの前記ヌクレオチド位置の後の、前記支持鎖中の次のヌクレオチド位置である前記支持鎖中の位置を占めるように、かつ前記支持鎖が、最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置と、前記ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置との間で切断されるように、構造化される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、切断前の工程（４）および（８）において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、前記第１およびさらなるヌクレオチドの前記ヌクレオチド位置の後の、前記支持鎖中の次＋１のヌクレオチド位置である前記支持鎖中の位置を占めるように、かつ前記支持鎖が、最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置と、前記支持鎖中の次のヌクレオチドによって占められる位置との間で切断されるように、構造化される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、前記所定の配列の第１のヌクレオチドと対合するパートナーヌクレオチドが、前記第１のヌクレオチドと相補的な、好ましくは天然に相補的なヌクレオチドである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、工程（４）および／または（８）の前に、合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、前記足場ポリヌクレオチドが提供され、前記合成鎖が、ヘルパー鎖なしで提供される、請求項８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、工程（４）および／または（８）の前に、前記合成鎖の前記ヘルパー鎖部分が、前記足場ポリヌクレオチドから除去される、請求項８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記合成鎖の前記ヘルパー鎖部分が、（ｉ）前記足場ポリヌクレオチドを約８０℃〜約９５℃の温度に加熱し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉ）前記足場ポリヌクレオチドを８Ｍ尿素などの尿素溶液で処理し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉｉ）前記足場ポリヌクレオチドを１００％ホルムアミドなどのホルムアミドまたはホルムアミド溶液で処理し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、または（ｉｖ）前記足場ポリヌクレオチドを、前記ヘルパー鎖部分の配列と相補的であるヌクレオチド配列の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子と接触させて、それにより前記ヘルパー鎖部分と前記足場ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを競合的に阻害することによって、前記足場ポリヌクレオチドから除去される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
各切断工程が、２工程切断プロセスを含み、各切断工程が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、したがって脱塩基部位を形成することを含む第１の工程と、前記支持鎖を前記脱塩基部位で切断することを含む第２の工程と、を含む、請求項１〜１０、１１、１４、１５、１７、および１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の工程が、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヌクレオチド除去酵素が、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ酵素である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヌクレオチド除去酵素が、
ｉ．ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）、または
ｉｉ．ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２の工程が、塩基である化学物質を用いて行われる、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記塩基がＮａＯＨである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の工程が、脱塩基部位切断活性を有する有機化学物質を用いて行われる、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記有機化学物質が、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２の工程が、脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われ、任意選択的に、脱塩基部位リアーゼ活性を有する前記酵素が、
（ｉ）ＡＰエンドヌクレアーゼ１、
（ｉｉ）エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎ番目）、または
（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
各切断ステップが、切断酵素を用いて前記ユニバーサルヌクレオチドを除去することを含む１工程切断プロセスを含み、前記酵素が、
（ｉ）エンドヌクレアーゼＩＩＩ、
（ｉｉ）エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、
（ｉｉｉ）ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）、または
（ｉｖ）８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＯＧＧ１）である、請求項１〜１０、１１、１４、１５、１７および１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記切断工程が、前記支持鎖を酵素で切断することを含む、請求項１〜９、１２、１４、１６、１７、および１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記酵素が、ヌクレオチド位置ｎ＋１とｎとの間の前記支持鎖を切断する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記酵素が、エンドヌクレアーゼＶである、請求項３４または請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖が、ＤＮＡ鎖である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
組み込まれたヌクレオチドが、ｄＮＴＰである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
組み込まれたヌクレオチドが、可逆的ターミネーター基を含むｄＮＴＰである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
可逆的ターミネーター基を含む前記組み込まれたヌクレオチドのうちの１つ以上が、３’−Ｏ−アリル−ｄＮＴＰである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
可逆的ターミネーター基を含む前記組み込まれたヌクレオチドのうちの１つ以上が、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖が、ＤＮＡ鎖であり、前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの他方の鎖が、ＲＮＡ鎖である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記合成鎖が、ＲＮＡ鎖であり、前記支持鎖が、ＤＮＡ鎖である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
組み込まれたヌクレオチドが、ＮＴＰである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
組み込まれたヌクレオチドが、可逆的ターミネーター基を含むＮＴＰである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドが、３’−Ｏ−アリル−ＮＴＰである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドが、３’−Ｏ−アジドメチル−ＮＴＰである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリメラーゼ酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは未修飾ポリメラーゼと比較して可逆的ターミネーター基を含むｄＮＴＰを組み込む能力が増強された修飾ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎ、好ましくは種９°Ｎ−７由来の天然ＤＮＡポリメラーゼのバリアントである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリメラーゼ酵素が、Ｔ３またはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ、任意選択的に、未修飾ポリメラーゼと比較して可逆的ターミネーター基を含むＮＴＰを組み込む能力が増強された修飾ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１〜３６および４２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記トランスフェラーゼ酵素が、末端トランスフェラーゼ活性を有し、任意選択的に、前記酵素が、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ｐｏｌラムダ、ｐｏｌマイクロ、またはΦ２９ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記第２のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去する前記工程が、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて行われる、請求項５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記リガーゼ酵素が、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼである、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、工程（１）／（６）において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、前記足場ポリヌクレオチドにおいて、ヘアピンループによって接続されている、請求項８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、工程（２）／（６）において、前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、前記ポリヌクレオチド連結分子において、前記相補的連結末端とは反対の末端でヘアピンループによって接続されている、請求項８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、
（ａ）工程（１）／（６）において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の部分とが、前記足場ポリヌクレオチドにおいて、ヘアピンループによって接続されており、
（ｂ）工程（２）／（６）において、前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の部分とが、前記ポリヌクレオチド連結分子において、前記相補的連結末端とは反対の末端でヘアピンループによって接続されている、請求項８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
工程（１）および（６）において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖および／またはそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分が、共通の表面に繋留されている、請求項８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記プライマー鎖部分および／またはそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分が、切断可能なリンカーを含み、前記リンカーが、合成後に前記表面から前記二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
工程（１）および（６）において、前記足場ポリヌクレオチド中の前記ヘアピンループが表面に繋留されている、請求項５５および５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記ヘアピンループが、切断可能なリンカーを介して表面に繋留され、前記リンカーが、合成後に前記表面から前記二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記切断可能なリンカーが、ＵＶ切断可能なリンカーである、請求項５８または請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記表面が、微粒子である、請求項５７〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記表面が、平坦な表面である、請求項５７〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記表面が、ゲルを含む、請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記表面が、約２％のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面を含み、好ましくは、前記ポリアクリルアミド表面が、ガラスなどの固体支持体に結合されている、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、１つ以上の共有結合を介して前記共通の表面に繋留されている、請求項５７〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記１つ以上の共有結合が、前記共通の表面上の官能基と足場分子上の官能基との間に形成され、前記足場分子上の前記官能基が、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記共通の表面上の前記官能基が、ブロモアセチル基であり、任意に、前記ブロモアセチル基が、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
合成サイクルが、微小流体システム内の液滴中で行われる、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングシステムである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを提供する、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドまたはその領域が、好ましくはＰＣＲによって増幅される、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
所定の配列を有するポリヌクレオチドをアセンブリする方法であって、所定の配列を有する第１のポリヌクレオチドおよび所定の配列を有する１つ以上の追加のポリヌクレオチドを合成するために、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の方法を行うことと、前記第１および１つ以上の追加のポリヌクレオチドを一緒に接合することと、を含む、方法。
【請求項７５】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、二本鎖である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、一本鎖である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、適合する末端を作成するために切断され、好ましくは連結によって一緒に接合される、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、切断部位で制限酵素によって切断される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記合成および／またはアセンブリ工程が、微小流体システム内の液滴中で実行される、請求項７０〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記アセンブリ工程が、所定の配列を有する第１の合成ポリヌクレオチドを含む第１の液滴と、所定の配列を有する追加の１つ以上の合成ポリヌクレオチドを含む第２の液滴と、を提供することを含み、前記液滴が、互いに接触し、前記合成ポリヌクレオチドが、一緒に接合され、それにより前記第１および追加の１つ以上のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをアセンブリする、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記合成工程が、各液滴が前記合成サイクルの工程に対応する反応試薬を含む、複数の液滴を提供することと、前記合成サイクルの前記工程に従って前記足場ポリヌクレオチドに前記液滴を順次送達することと、によって行われる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
液滴の送達後かつ次の液滴の送達の前に、過剰の反応試薬を除去するために洗浄工程が実施される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングシステムである、請求項８１および８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
合成工程およびアセンブリ工程が、同じシステム内で行われる、請求項８１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
請求項１〜８５のいずれか一項に記載の方法を実施するためのポリヌクレオチド合成システムであって、（ａ）各反応領域が少なくとも１つの足場ポリヌクレオチドを含む、反応領域のアレイと、（ｂ）前記反応試薬を前記反応領域に送達するための手段と、任意に（ｃ）前記足場ポリヌクレオチドからの前記合成二本鎖ポリヌクレオチドを切断するための手段と、を含む、ポリヌクレオチド合成システム。
【請求項８７】
前記反応試薬を液滴で提供するための手段と、前記合成サイクルに従って前記足場ポリヌクレオチドに前記液滴を送達するための手段と、をさらに含む、請求項８６に記載のシステム。
【請求項８８】
請求項８６または８７に記載のシステムと共に使用するため、かつ請求項１〜８５のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、前記合成サイクルの前記工程に対応する反応試薬の容量を含む、キット。
【請求項８９】
ポリヌクレオチドマイクロアレイを作成する方法であって、前記マイクロアレイが、複数の反応領域を含み、各領域が、所定の配列を有する１つ以上のポリヌクレオチドを含み、前記方法が、
（ａ）複数の反応領域を含む表面を提供することであって、各領域が１つ以上の二本鎖アンカーまたは足場ポリヌクレオチドを含む、提供することと、
（ｂ）各反応領域で請求項１〜７１のいずれか一項に記載の方法に従って合成サイクルを行い、それにより各領域で所定の配列を有する１つ以上の二本鎖ポリヌクレオチドを合成することと、を含む、方法。
【請求項９０】
合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、マイクロアレイを提供し、各領域が、所定の配列を有する１つ以上の一本鎖ポリヌクレオチドを含む、請求項８９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定のヌクレオチド配列に従ってポリヌクレオチド分子を合成するための新たな方法に関する。本発明はまた、合成後の合成ポリヌクレオチドのアセンブリ方法、ならびに合成および／またはアセンブリ方法を行うためのシステムおよびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヌクレオチド分子、特にＤＮＡの合成およびアセンブリのための２つの主な方法が存在する。
【０００３】
ホスホルアミダイト化学は、化学的に活性化されたＴ、Ｃ、Ａ、またはＧのモノマーを段階的なプロセスによって長さ約１００／１５０塩基のオリゴヌクレオチドにアセンブリする合成手法である。化学反応工程は高度に感受性であり、条件は完全に無水の（水が完全に存在しない）、水性の酸化的と酸性との間で変わる（Ｒｏｙ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１３，１８，１４２６８−１４２８４）。前の反応工程からの試薬が完全に除去されていない場合、これは将来の合成工程にとって有害となるであろう。したがって、この合成方法は、長さ約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドの生成に限定されている。
【０００４】
ポリメラーゼ合成手法は、Ｔ、Ｃ、Ａ、およびＧ三リン酸を使用してＤＮＡ鋳型に対する相補鎖を合成するためにポリメラーゼを使用する。反応条件は水性かつ温和であり、この手法は、長さが数千塩基のＤＮＡポリヌクレオチドを合成するのに使用することができる。この方法の主な欠点は、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡをこの方法ではデノボ合成することができず、それから複製が作られるＤＮＡ鋳型を必要とすることである。（Ｋｏｓｕｒｉ  ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４，１１，４９９−５０７）。
【０００５】
したがって、以前の方法は、複製される既存の鋳型分子の助けなしには二本鎖ＤＮＡをデノボ合成するために使用することができない。
【０００６】
本発明者らは、既存の鋳型分子を複製する必要なく、一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチド分子を段階的にデノボ合成することができる新たな方法論を開発した。このような方法はまた、ホスホルアミダイト化学技術に関連する極端な条件を回避し、対照的に、中性ｐＨ付近の温和な水性条件下で実施される。このような方法はまた、合成生物学の広範囲の適用可能性を提供し、完全なゲノムの＞１００ｍｅｒのヌクレオチド長を有する現在の合成方法に対する電位１０８改善による一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド分子のデノボ合成を可能にする。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法を提供し、本方法は、繰り返しの合成サイクルを行うことを含み、各サイクルにおいて、
（Ａ）二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖が、リガーゼ酵素の作用によって、所定の配列の第１のヌクレオチドの付加により伸長され、
（Ｂ）第１の鎖にハイブリダイズされる二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖が、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素によって所定の配列の第２のヌクレオチドを加えることによって伸長され、
（Ｃ）次いで、二本鎖ポリヌクレオチドが、切断部位で切断され、
各サイクルの所定の配列の第１および第２のヌクレオチドは、切断後に、二本鎖ポリヌクレオチドにおいて保持され、第１のヌクレオチドおよび第２のヌクレオチドは、合成二本鎖ポリヌクレオチド中の異なるヌクレオチド対においてパートナーヌクレオチドになる。
【０００８】
上記の方法のうちのいずれにおいても、切断部位は、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列によって定義され得る。
【０００９】
上記の方法のうちのいずれにおいても、各サイクルにおいて、切断部位は、第２の鎖の伸長前に二本鎖ポリヌクレオチド中に作成され得る。
【００１０】
上記の方法のうちのいずれにおいても、リガーゼ酵素の作用による工程（Ａ）の間に、ユニバーサルヌクレオチドが二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖に組み込まれて、切断部位を定義し得る。
【００１１】
上記の方法のうちのいずれにおいても、所与の合成サイクルにおいて、二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖に付加される、そのサイクルの第２のヌクレオチドは、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、可逆的ターミネーター基は、次のサイクルの第２のヌクレオチドの次の合成サイクルにおける付加の前に、そのサイクルの組み込まれた第２のヌクレオチドから除去される。
【００１２】
上記の方法のうちのいずれにおいても、連結反応は、粘着末端連結反応を含み得る。
【００１３】
上記の方法のうちのいずれにおいても、第１のヌクレオチドおよびユニバーサルヌクレオチドは、ポリヌクレオチド連結分子の構成成分であり、ポリヌクレオチド連結分子は、リガーゼ酵素の作用による工程（Ａ）の間に、二本鎖ポリヌクレオチドに連結され、ポリヌクレオチド連結分子の二本鎖ポリヌクレオチドへの連結時に、二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖が伸長され、切断部位が作成される。
【００１４】
上記の方法のうちのいずれかにおいて、本方法は、
（１）合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖が、プライマー鎖部分を含み、支持鎖が、二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖であり、合成鎖が、二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖である、提供することと、
（２）粘着末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を足場ポリヌクレオチドに連結することであって、ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、連結末端が、
（ｉ）支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよび所定の配列の第１のヌクレオチドと、
（ｉｉ）ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖が第１のヌクレオチドで伸長され、切断部位が、ユニバーサルヌクレオチドの第１の鎖への組み込みによって作成される、連結することと、
（３）ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込みにより、二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端を伸長することであって、第２のヌクレオチドが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
（４）連結された足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、切断が、支持鎖を切断することと、足場ポリヌクレオチドからユニバーサルヌクレオチドを除去して、組み込まれた第１および第２のヌクレオチドを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
（５）第２のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去することと、を含む、第１の合成サイクルを行うことを含んでもよく、
本方法は、
（６）粘着末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって、さらなる二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を、切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、この連結末端が、
（ｉ）支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよびさらなる合成サイクルの第１のヌクレオチドと、
（ｉｉ）ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖が、さらなる合成サイクルの第１のヌクレオチドで伸長され、切断部位が、ユニバーサルヌクレオチドの第１の鎖への組み込みによって作成される、連結することと、
（７）ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、さらなる合成サイクルの第２のヌクレオチドの組み込みにより、二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端を伸長することであって、第２のヌクレオチドが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
（８）連結された足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、切断が、支持鎖を切断することと、足場ポリヌクレオチドからユニバーサルヌクレオチドを除去して、第１およびさらなる合成サイクル（複数可）の組み込まれた第１および第２のヌクレオチドを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
（９）第２のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去することと、
（１０）工程６〜９を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、さらなる合成サイクルを行うことをさらに含む。任意のこのような方法において、１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、切断部位で連結された足場ポリヌクレオチドを切断する工程の前に、可逆的ターミネーター基は、第２のヌクレオチドから代替的に除去され得る。
【００１５】
上記の任意のこのような方法において、工程（１）において、プライマー鎖部分に対して近位にある足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端は、ヌクレオチド突出を含んでもよく、支持鎖の末端ヌクレオチドは、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出し、支持鎖の末端ヌクレオチドは、そのサイクルの第２のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、
工程（２）において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端で、ヘルパー鎖の末端は、ヌクレオチド突出を含み、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出し、支持鎖の末端ヌクレオチドは、そのサイクルの第１のヌクレオチドであり、次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
工程（６）において、切断された足場ポリヌクレオチドにおいて、プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端は、ヌクレオチド突出を含み、支持鎖の末端ヌクレオチドは、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出し、支持鎖の末端ヌクレオチドは、工程（７）で組み込まれるさらなる合成サイクルの第２のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、
工程（６）において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端で、ヘルパー鎖の末端は、ヌクレオチド突出を含み、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出し、支持鎖の末端ヌクレオチドは、さらなる合成サイクルの第１のヌクレオチドであり、次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
第１およびさらなる合成サイクルにおいて、足場ポリヌクレオチド中のヌクレオチド突出およびポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端中のヌクレオチド突出は、同じ数のヌクレオチドを含み、その数は１以上である。
【００１６】
上記のこのような方法において、
（ａ）第１のサイクルの連結工程（工程２）において、および全てのさらなるサイクルの連結工程において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、
ｉ．そのサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドであり、支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋１を占め、ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合するように、
ｉｉ．ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであり、支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋２を占め、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
ｉｉｉ．突出が、そのサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドに突出するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを含む１つのヌクレオチド突出を含むように、かつ
ｉｖ．ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化されてもよく、
位置ｎは、その組み込み時にそのサイクルの所定の配列の第２のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１およびｎ＋２は、それぞれ、相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第１／次のおよび第２のヌクレオチド位置であり、連結時に、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖の末端ヌクレオチドは、合成鎖のプライマー鎖部分に対して近位にある足場ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと合成鎖のプライマー鎖部分との間に作成され、
（ｂ）第１のサイクルの伸長工程（工程３）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの第２のヌクレオチドは、第２の鎖に組み込まれ、第１の鎖中のパートナーヌクレオチドと対合され、
（ｃ）第１のサイクルの切断工程（工程４）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、連結された足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎ＋２と位置ｎ＋１との間で切断され、それによって、足場ポリヌクレオチドからポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、切断された足場ポリヌクレオチドの第１の鎖に付着したそのサイクルの第１のヌクレオチドとそのパートナーヌクレオチドと対合したそのサイクルの第２のヌクレオチドとを保持し、その際、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のそのサイクルの第１のヌクレオチドによって占められる位置は、次の合成サイクルにおけるヌクレオチド位置ｎとして定義される。
【００１７】
代替的に、上記のこのような方法において、
（ａ）第１のサイクルの連結工程（工程２）において、および全てのさらなるサイクルの連結工程において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、
ｉ．そのサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドであり、支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋１を占め、ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合するように、
ｉｉ．ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋３を占め、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
ｉｉｉ．突出が、そのサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドに突出するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを含む１つのヌクレオチド突出を含むように、かつ
ｉｖ．ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化されてもよく、
位置ｎは、その組み込み時にそのサイクルの所定の配列の第２のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１、ｎ＋２、およびｎ＋３は、それぞれ、相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における次の、第２の、および第３のヌクレオチド位置であり、連結時に、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖の末端ヌクレオチドは、合成鎖のプライマー鎖部分に対して近位にある足場ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと合成鎖のプライマー鎖部分との間に作成され、
（ｂ）第１のサイクルの伸長工程（工程３）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの第２のヌクレオチドは、第２の鎖に組み込まれ、第１の鎖中のパートナーヌクレオチドと対合され、
（ｃ）第１のサイクルの切断工程（工程４）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、連結された足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎ＋２と位置ｎ＋１との間で切断され、それによって、足場ポリヌクレオチドからポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、切断された足場ポリヌクレオチドの第１の鎖に付着したそのサイクルの第１のヌクレオチドとそのパートナーヌクレオチドと対合したそのサイクルの第２のヌクレオチドとを保持し、その際、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のそのサイクルの第１のヌクレオチドによって占められる位置は、次の合成サイクルにおけるヌクレオチド位置ｎとして定義される。
【００１８】
代替的に、上記のこのような方法において、
（ａ）第１のサイクルの連結工程（工程２）において、および全てのさらなるサイクルの連結工程において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、
ｉ．そのサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドであり、支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋１を占め、ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合するように、
ｉｉ．ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋３＋ｘを占め、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
ｉｉｉ．突出が、そのサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドに突出するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを含む１つのヌクレオチド突出を含むように、かつ
ｉｖ．ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化されてもよく、
位置ｎは、その組み込み時にそのサイクルの所定の配列の第２のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋３は、相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第３のヌクレオチド位置であり、ｘは、相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎ＋３に対するヌクレオチド位置の数であり、数は、１〜１０以上の整数であり、連結時に、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖の末端ヌクレオチドは、合成鎖のプライマー鎖部分に対して近位にある足場ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと合成鎖のプライマー鎖部分との間に作成され、
（ｂ）第１のサイクルの伸長工程（工程３）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの第２のヌクレオチドは、第２の鎖に組み込まれ、第１の鎖中のパートナーヌクレオチドと対合され、
（ｃ）第１のサイクルの切断工程（工程４）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、連結された足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎ＋２と位置ｎ＋１との間で切断され、それによって、足場ポリヌクレオチドからポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、切断された足場ポリヌクレオチドの第１の鎖に付着したそのサイクルの第１のヌクレオチドとそのパートナーヌクレオチドと対合したそのサイクルの第２のヌクレオチドとを保持し、その際、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のそのサイクルの第１のヌクレオチドによって占められる位置は、次の合成サイクルにおけるヌクレオチド位置ｎとして定義される。
【００１９】
ある特定の方法において、工程（１）において、プライマー鎖部分に対して近位にある足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端は、１＋ｙヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含んでもよく、支持鎖の１＋ｙヌクレオチドは、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出し、突出の第１のヌクレオチドは、突出の末端に対して遠位にある突出中の位置を占め、ヌクレオチド位置ｎを占め、工程（４）において組み込まれた第１のサイクルの第２のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、位置ｎ＋１を占める突出のヌクレオチドは、工程（８）において組み込まれた次の／第２の合成サイクルの第２のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、
工程（２）において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端で、ヘルパー鎖の末端が、１＋ｙヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、ヘルパー鎖の１＋ｙヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出し、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の１＋ｙ突出ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドが、そのサイクルの第１のヌクレオチドであり、ヌクレオチド位置ｎ＋２＋ｘを占め、第３の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対のパートナーヌクレオチドであり、
工程（１）において、切断された足場ポリヌクレオチドにおいて、プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端は、１＋ｙヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、支持鎖の１＋ｙヌクレオチドは、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出し、突出の第１のヌクレオチドは、突出の末端に対して遠位にある突出中の位置を占め、ヌクレオチド位置ｎを占め、工程（７）において組み込まれたさらなる合成サイクルの第２のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、位置ｎ＋１を占める突出のヌクレオチドは、次の合成サイクルの第２のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、
工程（６）において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端において、ヘルパー鎖の末端は、１＋ｙヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、ヘルパー鎖の１＋ｙヌクレオチドは、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出し、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の１＋ｙ突出ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドは、さらなる合成サイクルの第１のヌクレオチドであり、ヌクレオチド位置ｎ＋２＋ｘを占め、次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対のパートナーヌクレオチドであり、
ｉ．位置ｎは、組み込み時にそのサイクルの所定の配列の第２のヌクレオチドとは反対になるヌクレオチド位置であり、
ｉｉ．連結後、位置ｎ＋１およびｎ＋２は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第１および第２のヌクレオチド位置であり、
ｉｉｉ．ｙは、１以上である整数であり、
ｉｖ．ｘは、０以上である整数であり、
ｖ．足場ポリヌクレオチドにおけるｙの数は、好ましくは、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端におけるｙの数と同じ数であり、ｙが異なる数である場合、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端におけるｙの数は、好ましくは、足場ポリヌクレオチドにおけるｙの数よりも少なく、
ｖｉ．任意の所与の一連の第１のサイクルおよびさらなるサイクルにおいて、ｘに対して選択される数は、足場ポリヌクレオチドにおいて、ｙに対して選択される数−１である。
【００２０】
工程（１）において、プライマー鎖部分に近位である足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端が、ヌクレオチド突出を含む、上記の方法において、第１およびさらなるサイクルの両方において、ユニバーサルヌクレオチドは、ポリヌクレオチド連結分子および連結された足場ポリヌクレオチドの両方において、位置ｎ＋３＋ｘを占め、足場ポリヌクレオチドは、位置ｎ＋３＋ｘとｎ＋２＋ｘとの間で切断される。代替的に、第１およびさらなるサイクルの両方において、ユニバーサルヌクレオチドは、ポリヌクレオチド連結分子および連結された足場ポリヌクレオチドの両方において、位置ｎ＋４＋ｘを占め、足場ポリヌクレオチドは、位置ｎ＋３＋ｘとｎ＋２＋ｘとの間で切断される。
【００２１】
上記の方法は、
（ｉ）工程（２）において、ポリヌクレオチド連結分子には、第１のサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドを含み、第１のサイクルの所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含む、相補的連結末端が提供されるように、
（ｉｉ）工程（３）において、二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端が、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、第１のサイクルの所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込みにより伸長され、プライマー鎖部分の末端が、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、第１のサイクルの所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長され、第１のサイクルの第２およびさらなるヌクレオチドのそれぞれが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、各さらなる伸長後、可逆的ターミネーター基が、次のヌクレオチドの組み込みの前にヌクレオチドから除去されるように、
（ｉｉｉ）切断後の工程（４）において、第１のサイクルの所定の配列の第１、第２、およびさらなるヌクレオチドが、切断された足場ポリヌクレオチド中に保持されるように、
（ｉｖ）工程（６）において、ポリヌクレオチド連結分子には、さらなるサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドを含み、さらなるサイクルの所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含む、相補的連結末端が提供されるように、
（ｖ）工程（６）において、二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端が、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、さらなるサイクルの所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込みにより伸長され、プライマー鎖部分の末端が、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、さらなるサイクルの所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長され、さらなるサイクルの第２およびさらなるヌクレオチドのそれぞれが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、各さらなる伸長後、可逆的ターミネーター基が、次のヌクレオチドの組み込み前にヌクレオチドから除去されるように、
（ｖｉ）切断後の工程（８）において、さらなるサイクルの所定の配列の第１、第２、およびさらなるヌクレオチドが、切断された足場ポリヌクレオチド中に保持されるように、修正されてもよい。これらの方法において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、切断前の工程（４）および（８）において、ユニバーサルヌクレオチドが、相補的連結末端に対する遠位方向において、第１およびさらなるヌクレオチドのヌクレオチド位置の後の、支持鎖中の次のヌクレオチド位置である支持鎖中の位置を占めるように、かつ支持鎖が、最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置と、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置との間で切断されるように、構造化され得る。これらの方法において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、代替的に、切断前の工程（４）および（８）において、ユニバーサルヌクレオチドが、相補的連結末端に対する遠位方向において、第１およびさらなるヌクレオチドのヌクレオチド位置の後の、支持鎖中の次のヌクレオチド位置である支持鎖中の位置を占めるように、かつ支持鎖が、最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置と、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置との間で切断されるように、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端が構造化されるように、構造化されてもよい。
【００２２】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、所定の配列の第１のヌクレオチドと対合するパートナーヌクレオチドは、第１のヌクレオチドと相補的な、好ましくは天然に相補的なヌクレオチドであり得る。
【００２３】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、工程（２）および／または（６）の前に、合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、足場ポリヌクレオチドが提供され得、合成鎖は、ヘルパー鎖なしで提供される。任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、工程（２）および／または（６）の前に、合成鎖は、足場ポリヌクレオチドから除去され得る。
【００２４】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程の後で、かつ所定のヌクレオチド配列の次のヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドの合成鎖に組み込む工程の前に、合成鎖のヘルパー鎖部分は、足場ポリヌクレオチドから除去され得る。いかなるこのような方法においても、合成鎖のヘルパー鎖部分は、（ｉ）足場ポリヌクレオチドを約８０℃〜約９５℃の温度に加熱し、足場ヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉ）足場ポリヌクレオチドを８Ｍ尿素などの尿素溶液で処理し、足場ポリヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉｉ）足場ポリヌクレオチドをホルムアミドまたは１００％ホルムアミドなどのホルムアミド溶液で処理し、足場ポリヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、または（ｉｖ）足場ポリヌクレオチドを、ヘルパー鎖部分の配列と相補的であるヌクレオチド配列の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子と接触させ、それによってヘルパー鎖部分の足場ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを競合的に阻害することによって、足場ポリヌクレオチドから除去することができる。
【００２５】
足場ポリヌクレオチドの支持鎖が、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置と、合成鎖のプライマー鎖部分に対する近接方向においてユニバーサルヌクレオチドに対する支持鎖中の次のヌクレオチドによって占められる位置との間で切断される、上記および本明細書に記載されるいかなるそのような方法においても、各切断工程は、２工程切断プロセスを含み得、各切断工程は、ユニバーサルヌクレオチドを除去し、したがって脱塩基部位を形成することを含む第１の工程と、支持鎖を脱塩基部位で切断することを含む第２の工程と、を含み得る。いかなるこのような方法においても、第１の工程は、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われ得る。ヌクレオチド除去酵素は、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ酵素であり得る。ヌクレオチド除去酵素は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）またはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）であり得る。いかなるこのような方法においても、第２の工程は、塩基である化学物質を用いて行われ得る。塩基はＮａＯＨであり得る。いかなるこのような方法においても、第２の工程は、脱塩基部位切断活性を有する有機化学物質を用いて行われ得る。有機化学物質は、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンであり得る。いかなるこのような方法においても、第２の工程は、ＡＰエンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎｔｈ）、またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩなどの脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われ得る。
【００２６】
足場ポリヌクレオチドの支持鎖が、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置と、合成鎖のプライマー鎖部分に対する近接方向においてユニバーサルヌクレオチドに対する支持鎖における次のヌクレオチドによって占められる位置との間で切断される、上記および本明細書に記載の任意のこのような方法において、各切断工程は、ユニバーサルヌクレオチドを切断酵素で除去することを含む１工程切断プロセスを含み得、酵素は、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）、または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＯＧＧ１）である。
【００２７】
足場ポリヌクレオチドの支持鎖が、プライマー鎖部分に対する近位方向においてユニバーサルヌクレオチドに対する支持鎖中の次のヌクレオチドによって占められる位置と、プライマー鎖部分に対する近位方向においてユニバーサルヌクレオチドに対する支持鎖中の第２のヌクレオチドによって占められる位置との間で切断される、上記および本明細書に記載の任意のこのような方法において、切断工程は、支持鎖を酵素で切断することを含み得る。ここのような酵素はエンドヌクレアーゼＶであり得る。
【００２８】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、合成二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖は、ＤＮＡ鎖であり得る。合成鎖および支持鎖はＤＮＡ鎖であり得る。このような場合、組み込まれたヌクレオチドは、好ましくはｄＮＴＰ、好ましくは可逆的ターミネーター基を含むｄＮＴＰである。いかなるこのような方法においても、可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上または全てが、３’−Ｏ−アリル−ｄＮＴＰまたは３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰを含み得る。
【００２９】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、合成二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖はＤＮＡ鎖であり得、合成二本鎖ポリヌクレオチドの他方の鎖はＲＮＡ鎖であり得る。合成鎖はＲＮＡ鎖であり得、支持鎖はＲＮＡまたはＤＮＡ鎖であり得る。このような場合、トランスフェラーゼ酵素またはポリメラーゼ酵素によって組み込まれたヌクレオチドは、好ましくはＮＴＰ、好ましくは可逆的ターミネーター基を含むＮＴＰである。いかなるこのような方法においても、可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上または全てが、３’−Ｏ−アリル−ＮＴＰまたは３’−Ｏ−アジドメチル−ＮＴＰであり得る。
【００３０】
ＤＮＡを含む合成鎖へのヌクレオチドの組み込み、例えば、１つ以上のｄＮＴＰの組み込みを伴う上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、酵素は、ポリメラーゼ酵素、好ましくはＤＮＡポリメラーゼ酵素、より好ましくは非修飾ポリメラーゼと比較して、可逆的ターミネーター基を含むｄＮＴＰを組み込む能力が増強された修飾ＤＮＡポリメラーゼ酵素であり得る。ポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎ、好ましくは種９°Ｎ−７由来の天然ＤＮＡポリメラーゼのバリアントであり得る。
【００３１】
ＲＮＡを含む合成鎖へのヌクレオチドの組み込み、例えば、１つ以上のＮＴＰの組み込みを伴う上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、酵素は、ポリメラーゼ酵素、好ましくはＴ３またはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ酵素、より好ましくは非修飾ポリメラーゼと比較して、可逆的ターミネーター基を含むＮＴＰを組み込む能力が増強された修飾ＲＮＡポリメラーゼ酵素であり得る。
【００３２】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、合成二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖はＤＮＡ鎖であり得、合成二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖はＲＮＡ鎖であり得る。代替的に、合成二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖はＲＮＡ鎖であり得、合成二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖はＤＮＡ鎖であり得る。
【００３３】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、酵素は、末端トランスフェラーゼ活性を有し、任意に、酵素が、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ｐｏｌラムダ、ｐｏｌマイクロ、またはΦ２９ＤＮＡポリメラーゼである。
【００３４】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、第１／隣のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去する工程は、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて行われ得る。
【００３５】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程は、好ましくはリガーゼ酵素を用いて行われる。リガーゼ酵素は、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼであり得る。
【００３６】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、工程（１）／（６）において、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、足場ポリヌクレオチドにおいて、ヘアピンループによって接続され得る。
【００３７】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、工程（２）／（６）において、ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ポリヌクレオチド連結分子において、相補的連結末端とは反対の末端でヘアピンループによって接続され得る。
【００３８】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、
（ａ）工程（１）／（６）において、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、足場ポリヌクレオチドにおいて、ヘアピンループによって接続されており、
（ｂ）工程（２）／（６）において、ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ポリヌクレオチド連結分子において、相補的連結末端とは反対の末端でヘアピンループによって接続されている。
【００３９】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、ポリヌクレオチド連結分子のうちの少なくとも１つ以上または全ては、相補的連結末端とは反対の末端で、支持鎖およびヘルパー鎖を接続するヘアピンループを含む単一分子として提供され得る。上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、各合成サイクルのポリヌクレオチド連結分子は、相補的連結末端とは反対の末端で、支持鎖およびヘルパー鎖を接続するヘアピンループをそれぞれ含む単一分子として提供され得る。
【００４０】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、工程（１）および（６）において、プライマー鎖部分を含む足場ポリヌクレオチドの合成鎖および／またはそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分は、共通の表面に繋留され得る。プライマー鎖部分を含む足場ポリヌクレオチドの合成鎖および／またはそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分は、切断可能なリンカーを含み得、リンカーは、合成後に表面から二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る。
【００４１】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、工程（１）および（６）において、合成鎖のプライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とがヘアピンループによって接続され得、ヘアピンループは、表面に繋留されている。
【００４２】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、ヘアピンループは、切断可能なリンカーを介して表面に繋留され得、リンカーは、合成後に表面から二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る。切断可能なリンカーは、ＵＶ切断可能なリンカーであり得る。
【００４３】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、ポリヌクレオチドが付着している表面は、微粒子の表面または平坦な表面であり得る。
【００４４】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、ポリヌクレオチドが付着している表面は、ゲルを含み得る。表面は、約２％のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面を含み得、好ましくは、ポリアクリルアミド表面は、ガラスなどの固体支持体に結合されている。
【００４５】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、１つ以上の共有結合を介して共通の表面に繋留され得る。１つ以上の共有結合は、共通の表面上の官能基と足場分子上の官能基との間に形成され得、足場分子上の官能基は、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基であり得る。共通の表面上の官能基は、ブロモアセチル基であり得、任意に、ブロモアセチル基は、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される。
【００４６】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、上記および本明細書に記載される合成サイクルのうちのいずれかに関する反応は、微小流体システム内の液滴中で行われ得る。微小流体システムは、エレクトロウェッティングシステムであり得る。微小流体システムは、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）であり得る。
【００４７】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、合成後、二本鎖ポリヌクレオチドの鎖を分離して、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。
【００４８】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、合成後、二本鎖ポリヌクレオチドまたはその領域は、好ましくはＰＣＲによって増幅される。
【００４９】
本発明はまた、所定の配列を有するポリヌクレオチドをアセンブリする方法を提供し、方法は、所定の配列を有する第１のポリヌクレオチドと所定の配列を有する１つ以上の追加のポリヌクレオチドとを合成するために、上記および本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを行うことと、第１および１つ以上の追加のポリヌクレオチドを一緒に接合することと、を含む。第１および１つ以上の追加のポリヌクレオチドは、好ましくは異なる所定の配列を含み得る。第１のポリヌクレオチドおよび１つ以上の追加のポリヌクレオチドは、二本鎖であり得るか、または一本鎖であり得る。第１のポリヌクレオチドおよび１つ以上の追加のポリヌクレオチドを最初に切断して、適合する末端を作成し、次に、例えば、連結によって一緒に接合することができる。第１のポリヌクレオチドおよび１つ以上の追加のポリヌクレオチドは、切断部位で制限酵素によって切断されて、適合する末端を作成することができる。
【００５０】
上記および本明細書に記載されるような所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成するための方法のうちのいずれか、ならびに／または上記および本明細書に記載されるような所定の配列を有するポリヌクレオチドをインビトロでアセンブリする方法のうちのいずれかは、微小流体システム内の液滴中で行われ得る。いかなるこのような方法においても、アセンブリ方法は、所定の配列を有する第１の合成ポリヌクレオチドを含む第１の液滴と、所定の配列を有する追加の１つ以上の合成ポリヌクレオチドを含む第２の液滴とを提供することを含むアセンブリ工程を含み得、液滴は、互いに接触し、合成ポリヌクレオチドは、一緒に接合され、それにより第１のポリヌクレオチドおよび追加の１つ以上のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをアセンブリする。いかなるこのような方法おいても、合成工程は、各液滴が合成サイクルの工程に対応する反応試薬を含む、複数の液滴を提供することと、合成サイクルの工程に従って足場ポリヌクレオチドに液滴を順次送達することと、によって行われ得る。いかなるこのような方法においても、液滴の送達後かつ次の液滴の送達前に、過剰の反応試薬を除去するために洗浄工程が実施され得る。いかなるこのような方法においても、微小流体システムは、エレクトロウェッティングシステムであり得る。いかなるこのような方法においても、微小流体システムは、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）であり得る。いかなるこのような方法においても、合成工程およびアセンブリ工程は、同じシステム内で行われ得る。
【００５１】
上記および本明細書に記載されるような所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成するための方法のうちのいずれかにおいても、ユニバーサルヌクレオチドは、イノシン、またはその類似体、バリアント、もしくは誘導体であり、ヘルパー鎖中のユニバーサルヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドはシトシンである。
【００５２】
関連する態様において、本発明は、二本鎖ポリヌクレオチドを伸長して、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法をさらに提供し、本方法は、１つ以上の合成サイクルを含み、各合成サイクルにおいて、ユニバーサルヌクレオチドおよび所定の配列の第１のヌクレオチドが、連結反応において二本鎖足場ポリヌクレオチドの第１の鎖に付加され、所定の配列の第２のヌクレオチドが、足場ポリヌクレオチドの反対の鎖に付加され、足場ポリヌクレオチドが、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で切断され、切断時に、ユニバーサルヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドから放出され、第１および第２のヌクレオチドが、足場ポリヌクレオチドに保持され、所定の配列の第１のヌクレオチドおよび所定の配列の第２のヌクレオチドが、合成された二本鎖ポリヌクレオチド中の異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドとなる。
【００５３】
関連する態様において、本発明は、二本鎖ポリヌクレオチドを伸長して、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法をさらに提供し、合成サイクルにおいて、ユニバーサルヌクレオチドが、連結反応において二本鎖足場ポリヌクレオチドに付加されて、足場ポリヌクレオチド内にポリヌクレオチド切断部位を作成し、足場ポリヌクレオチドが切断されて、所定の配列の第１のヌクレオチドおよび任意選択で１つ以上の所定の配列のさらなるヌクレオチドの次のサイクルにおける組み込みのために、足場ポリヌクレオチドの第１の鎖に部位を提供し、所定の配列の第２のヌクレオチドおよび任意選択で１つ以上の所定の配列のさらなるヌクレオチドの次のサイクルにおける組み込みのために、足場ポリヌクレオチドの反対の鎖に部位を提供し、所定の配列の第１のヌクレオチドおよび所定の配列の第２のヌクレオチドが、合成された二本鎖ポリヌクレオチド中の異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドとなる。
【００５４】
関連する態様において、本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法におけるユニバーサルヌクレオチドの使用をさらに提供し、ユニバーサルヌクレオチドは、二本鎖足場ポリヌクレオチドにおいてポリヌクレオチド切断部位を作成するための合成サイクルにおいて使用され、足場ポリヌクレオチドの切断は、所定の配列の１つ以上のヌクレオチドの組み込みのための足場ポリヌクレオチドの各鎖において部位を提供し、各合成サイクルにおいて、該使用は、合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖がプライマー鎖部分を含む、提供することと、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含む、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を提供することであって、相補的連結末端のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドを含み、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドが、所定の配列の連結可能な第１のヌクレオチドを含み、支持鎖が、ポリヌクレオチド切断部位を作成する際に使用するためのユニバーサルヌクレオチドを含む、提供することと、連結反応において、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖を足場ポリヌクレオチドの支持鎖に連結することであって、そのときに足場ポリヌクレオチドの支持鎖が、所定の配列の第１のヌクレオチドで伸長され、一本鎖切断が、ヘルパー鎖と合成鎖のプライマー鎖部分との間に作成され、次いで、任意選択的に、ヘルパー鎖を除去する、連結することと、可逆的ターミネーター基を含む所定の配列の第２のヌクレオチドを、ポリメラーゼ酵素またはトランスフェラーゼ酵素の作用によって、足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端に付加することと、足場ポリヌクレオチドの支持鎖を、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義された切断部位で切断することであって、そのときにユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド連結分子が、足場ポリヌクレオチドから除去され、所定の配列の第１および第２のヌクレオチドが、切断された足場ポリヌクレオチドにおいて保持される、切断することと、を含み、可逆的ターミネーター基は、切断工程の前または後に第２のヌクレオチドから除去され、所定の配列の第１のヌクレオチドおよび所定の配列の第２のヌクレオチドは、合成された二本鎖ポリヌクレオチド中の異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドとなる。
【００５５】
所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するいかなるこのような方法においても、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖は、所定の配列の第１のヌクレオチドの隣にある所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含んでもよく、所定の配列の第１のヌクレオチドは、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖の末端ヌクレオチドであり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに連結され、所定の配列の第２のヌクレオチドの付加の後、本方法は、可逆的ターミネーター基を含むさらなるヌクレオチドを付加し、次いで可逆的ターミネーター基を除去する１つ以上のサイクルを行うことにより、所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドを、ポリメラーゼ酵素またはトランスフェラーゼ酵素の作用によって、合成鎖のプライマー鎖部分の末端に付加することをさらに含み、切断時に、所定の配列の第１、第２、およびさらなるヌクレオチドは、切断されたポリヌクレオチドにおいて保持される。
【００５６】
所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成する方法におけるユニバーサルヌクレオチドのこのような使用は、上記および本明細書に定義および記載されたる特定の方法のうちのいずれかを使用して実施され得る。
【００５７】
関連する態様において、本発明は、同じ末端で二本鎖ポリヌクレオチド分子の各鎖を所定のヌクレオチドでインビトロで伸長する方法をさらに提供し、本方法は、合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖が、プライマー鎖部分を含む、提供することと、連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端に、所定の配列の第１のヌクレオチドを付加することであって、第１のヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖中の末端ヌクレオチドであり、支持鎖が、ユニバーサルヌクレオチドをさらに含み、第１のヌクレオチドが、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに連結され、ポリヌクレオチド連結分子の反対側／ヘルパー鎖と合成鎖のプライマー鎖部分との間に一本鎖切断が作成され、任意選択的に、ポリヌクレオチド連結分子のヘルパー鎖を除去する、付加することと、可逆的ターミネーター基を含む所定の配列の第２のヌクレオチドを、ポリメラーゼ酵素またはトランスフェラーゼ酵素の作用によって、合成鎖のプライマー鎖部分の末端に付加することをさらに含み、足場ポリヌクレオチドの支持鎖を、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義された切断部位で切断することであって、そのときにユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド連結分子が足場ポリヌクレオチドから除去され、切断後、第１のヌクレオチドが支持鎖において保持され、第２のヌクレオチドがプライマー鎖部分において保持される、切断することと、可逆的ターミネーター基を第２のヌクレオチドから除去することと、を含み、該除去は、切断の前または後に行われ、所定の配列の第１のヌクレオチドおよび所定の配列の第２のヌクレオチドは、合成された二本鎖ポリヌクレオチド中の異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドとなる。
【００５８】
二本鎖ポリヌクレオチド分子の各鎖を伸長するいかなるこのような方法においても、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖は、所定の配列の第１のヌクレオチドの隣にある所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含んでもよく、所定の配列の第１のヌクレオチドは、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖の末端ヌクレオチドであり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに連結され、所定の配列の第２のヌクレオチドの付加の後、本方法は、可逆的ターミネーター基を含むさらなるヌクレオチドを付加し、次いで可逆的ターミネーター基を除去する１つ以上のサイクルを行うことにより、所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドを、ポリメラーゼ酵素またはトランスフェラーゼ酵素の作用によって、合成鎖のプライマー鎖部分の末端に付加することをさらに含み、切断時に、所定の配列の第１、第２、およびさらなるヌクレオチドは、切断されたポリヌクレオチドにおいて保持される。
【００５９】
本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法を提供し、本方法は、前述の伸長方法による１つ以上の伸長サイクルを行うことを含む。
【００６０】
二本鎖ポリヌクレオチド分子の各鎖を所定のヌクレオチドで伸長するいかなるこのような方法においても、または所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するいかなるこのような方法においても、本方法は、上記および本明細書に定義および記載される特定の方法のうちのいずれかを使用して実施され得る。
【００６１】
関連する態様において、本発明は、同じ末端で二本鎖足場ポリヌクレオチドの各鎖を所定のヌクレオチドで伸長するサイクルの間に、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド連結分子を二本鎖足場ポリヌクレオチドにインビトロで連結する方法をさらに提供し、本方法は、支持鎖と、それにハイブリダイズされた合成鎖と、を含む、二本鎖足場ポリヌクレオチド提供することであって、合成鎖がプライマー鎖部分を含む、提供することと、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を二本鎖足場ポリヌクレオチドに連結することであって、ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、相補的連結末端のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドを含み、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドが、所定の配列の連結可能な第１のヌクレオチドを含み、支持鎖が、ポリヌクレオチド切断部位を作成する際に使用するためのユニバーサルヌクレオチドを含み、連結反応が、連結反応において、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖を二本鎖足場ポリヌクレオチドの支持鎖に連結することであって、そのときに足場ポリヌクレオチドの支持鎖が、所定の配列の第１のヌクレオチドで伸長され、一本鎖切断が、ヘルパー鎖と合成鎖のプライマー鎖部分との間に作成され、次いで、任意選択的に、ヘルパー鎖を除去する、連結することとを含み、本方法は、可逆的ターミネーター基を含む所定の配列の第２のヌクレオチドを、ポリメラーゼ酵素またはトランスフェラーゼ酵素によって、足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端に付加することと、足場ポリヌクレオチドの支持鎖を、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義された切断部位で切断することであって、そのときにユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド連結分子が、足場ポリヌクレオチドから除去され、所定の配列の第１および第２のヌクレオチドが、切断された足場ポリヌクレオチドにおいて保持される、切断することと、をさらに含み、可逆的ターミネーター基は、切断工程の前または後に第２のヌクレオチドから除去され、所定の配列の第１のヌクレオチドおよび所定の配列の第２のヌクレオチドは、合成された二本鎖ポリヌクレオチド中の異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドとなる。
【００６２】
ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド連結分子を二本鎖足場ポリヌクレオチドに連結するいかなるこのような方法においても、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖は、所定の配列の第１のヌクレオチドの隣にある所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含んでもよく、所定の配列の第１のヌクレオチドは、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖の末端ヌクレオチドであり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに連結され、所定の配列の第２のヌクレオチドの付加の後、本方法は、可逆的ターミネーター基を含むさらなるヌクレオチドを付加し、次いで可逆的ターミネーター基を除去する１つ以上のサイクルを行うことにより、所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドを、ポリメラーゼ酵素またはトランスフェラーゼ酵素の作用によって合成鎖のプライマー鎖部分の末端に付加することをさらに含み、切断時に、所定の配列の第１、第２、およびさらなるヌクレオチドは、切断されたポリヌクレオチドにおいて保持される。
【００６３】
本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法を提供し、本方法は、前述の連結方法による１つ以上の伸長サイクルを行うことを含む。
【００６４】
所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するサイクル中に、ユニバーサルヌクレオチドを含む連結ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドに連結するいかなるこのような方法においても、方法は、上記および本明細書に定義および記載される特定の方法のうちのいずれかを使用して実施され得る。
【００６５】
本発明は追加的に、上記および本明細書に記載される合成および／またはアセンブリ方法のうちのいずれかを実施するためのポリヌクレオチド合成システムを提供し、（ａ）各反応領域が少なくとも１つの足場ポリヌクレオチドを含む、反応領域のアレイと、（ｂ）反応試薬を反応領域に送達するための手段と、任意に（ｃ）足場ポリヌクレオチドからの合成二本鎖ポリヌクレオチドを切断するための手段と、を含む。このようなシステムは、反応試薬を液滴で提供するための手段と、合成サイクルに従って足場ポリヌクレオチドに液滴を送達するための手段と、をさらに含み得る。
【００６６】
本発明は、上記および本明細書に記載されるシステムのうちのいずれかと共に使用するため、ならびに上記および本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを実施するためのキットをさらに提供し、キットは、合成サイクルの工程に対応する反応試薬の容量を含む。
【００６７】
本発明はまた、ポリヌクレオチドマイクロアレイを作成する方法を提供し、マイクロアレイは、複数の反応領域を含み、各領域は、所定の配列を有する１つ以上のポリヌクレオチドを含み、方法は、
（ａ）複数の反応領域を含む表面を提供することであって、各領域が１つ以上の二本鎖アンカーまたは足場ポリヌクレオチドを含む、提供することと、
（ｂ）各反応領域で請求項１〜７１のいずれか一項に記載の方法に従って合成サイクルを行い、それにより各領域で所定の配列を有する１つ以上の二本鎖ポリヌクレオチドを合成することと、を含む。
【００６８】
このような方法では、合成後、二本鎖ポリヌクレオチドの鎖を分離して、マイクロアレイを提供することができ、各領域は、所定の配列を有する１つ以上の一本鎖ポリヌクレオチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
本明細書に提示され、以下に記載される関連図は、本発明の方法を含む方法を使用する合成サイクルの工程のうちのいくつかまたは全て、ならびにオリゴヌクレオチド、表面、表面付着化学、リンカーなどの方法の態様を行うための手段を示す。これらの図ならびにその全ての説明および全ての関連方法、試薬、およびプロトコルは、例示のみのために掲示され、限定するものとして解釈されるべきではない。
【００７０】
例えば、図７、８、９、１０、１１、１４ａ、１５ａ、１６ａなどの関連図は、ヌクレオチド（例えば、可逆的ターミネーター基を含むヌクレオチド）の組み込み、切断（例えば、足場ポリヌクレオチドを第１の部分と第２の部分とに切断し、第１の部分はユニバーサルヌクレオチドを含み、第２の部分は組み込まれたヌクレオチドを含む）、連結（例えば、一本鎖部分を含むポリヌクレオチド構築物を、組み込まれたヌクレオチドを含む切断された足場ポリヌクレオチドの第２の部分に連結し、一本鎖部分は、組み込まれたヌクレオチドに相補的なパートナーヌクレオチドを含む）、および脱保護（例えば、組み込まれたヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去）を含む合成サイクルの工程のうちのいくつかまたは全てを示す。これらの方法は、例示的な支持のためにのみ提供されており、特許請求される発明の範囲内ではない。図１〜６ならびに図５３および５４に示される方法スキームは、本発明の方法である。
【００７１】
【図１】本発明の例示的な方法のバージョン１のスキーム。  本発明の例示的な方法のバージョン１による第１の合成サイクルを示すスキーム。  本方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、ポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結、可逆的ターミネーター基またはブロッキング基を含むヌクレオチドの組み込み、脱保護、および切断のサイクルを含む。  スキームは、支持鎖（「ａ」と標識された）と、それにハイブリダイズされた合成鎖（「ｂ」と標識された）と、を含む、足場ポリヌクレオチド（１０１、１０６）の提供を示す。合成鎖はプライマー鎖部分（点線）を含む。プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドは、連結可能基、好ましくは、図に示されるような末端リン酸基を含む。「Ａ」（アデノシン）として示される、プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドは、単一ヌクレオチド突出において、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出する。プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドは、ヌクレオチド対の支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合される。対の両方のヌクレオチドは「Ｘ」として示される。これらの２つのヌクレオチドは、任意の２つのヌクレオチドまたはその類似体もしくは誘導体であり得、天然に相補的なヌクレオチド対であることに限定されない。支持鎖の突出している末端ヌクレオチドは、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。  スキームは、ポリヌクレオチド連結分子（１０２、１０７、図の右上の構造）の提供を示す。ポリヌクレオチド連結分子は、ヘルパー鎖（破線）、それにハイブリダイズされた支持鎖、および相補的連結末端を含む。相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドは、所定の配列の第１のヌクレオチドであり、「Ｇ」（グアニン）として示され、「Ｃ」（シトシン）として示されるヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合される。相補的連結末端のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、「Ｔ」（チミン）として示され、単一ヌクレオチド突出において、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドに突出する。相補的連結末端のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、連結不可能なヌクレオチドを含む。相補的連結末端は、支持鎖中にユニバーサルヌクレオチド（「Ｕｎ」として示される）を含み、これは、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合される（「Ｘ」として示される）。Ｇ、Ｃ、およびＴは、純粋に例示のために示されており、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。Ｘは、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。対合されたヌクレオチドが天然に相補的なヌクレオチドを含む必要はない。  スキームは、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖（１０２、１０７）の足場ポリヌクレオチドの支持鎖への連結、およびヘルパー鎖とプライマー鎖部分との間の合成鎖における一本鎖切断（「ニック」）の作成を示す。  スキームは、所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込み（１０３、１０８）を示す。このヌクレオチドは、可逆的ターミネーター基（三角形）を含み、純粋に例示のために「Ｔ」（チミン）として示され、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。  スキームは、所定の配列の第２のヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去を含む脱保護工程（１０４、１０９）を示す。  スキームは、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義された切断部位で支持鎖を切断する（ギザギザの矢印）ことを含む切断工程（１０５、１１０）を示す。切断は、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド連結分子を放出し、足場ポリヌクレオチドにおける第１および第２のヌクレオチドの保持をもたらす。本発明の合成方法のバージョン１において、支持鎖は、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置と、プライマー鎖部分に対する近位方向／ヘルパー鎖部分に対する遠位方向において、支持鎖における次のヌクレオチド位置を占めるヌクレオチドとの間で切断される。  本発明の合成方法のバージョン１において、切断後の各サイクルにおいて、所定の配列の第１のヌクレオチドは対合しておらず、プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドであり、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドである、所定の配列の第２のヌクレオチドに突出する単一ヌクレオチド突出において提供される。その結果、所定の配列の第１のヌクレオチドおよび所定の配列の第２のヌクレオチドは、互いとヌクレオチド対を形成しない。
【図２】本発明の例示的な方法のバージョン２のスキーム。  本発明の例示的な方法のバージョン２による第１の合成サイクルを示すスキーム。  本方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、ポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結、可逆的ターミネーター基またはブロッキング基を含むヌクレオチドの組み込み、脱保護、および切断のサイクルを含む。  スキームは、支持鎖（「ａ」と標識された）と、それにハイブリダイズされた合成鎖（「ｂ」と標識された）と、を含む、足場ポリヌクレオチド（２０１、２０６）の提供を示す。合成鎖はプライマー鎖部分（点線）を含む。プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドは、連結可能基、好ましくは、図に示されるような末端リン酸基を含む。「Ａ」（アデノシン）として示される、プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドは、単一ヌクレオチド突出において、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出する。プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドは、ヌクレオチド対の支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合される。対の両方のヌクレオチドは「Ｘ」として示される。これらの２つのヌクレオチドは、任意の２つのヌクレオチドまたはその類似体もしくは誘導体であり得、天然に相補的なヌクレオチド対であることに限定されない。支持鎖の突出している末端ヌクレオチドは、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。  スキームは、ポリヌクレオチド連結分子（２０２、２０７、図の右上の構造）の提供を示す。ポリヌクレオチド連結分子は、ヘルパー鎖（破線）、それにハイブリダイズされた支持鎖、および相補的連結末端を含む。相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドは、所定の配列の第１のヌクレオチドであり、「Ｇ」（グアニン）として示され、「Ｃ」（シトシン）として示されるヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合される。相補的連結末端のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、「Ｔ」（チミン）として示され、単一ヌクレオチド突出において、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドに突出する。相補的連結末端のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、連結不可能なヌクレオチドを含む。相補的連結末端は、支持鎖中にユニバーサルヌクレオチド（「Ｕｎ」として示される）を含み、これは、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合される（「Ｘ」として示される）。支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドは、「Ｘ」として示され、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合される。パートナーヌクレオチドは、「Ｘ」としても示される。Ｇ、Ｃ、およびＴは、純粋に例示のために示されており、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。「Ｘ」として示されるヌクレオチドは、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。対合されたヌクレオチドが天然に相補的なヌクレオチドを含む必要はない。  スキームは、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖（２０２、２０７）の足場ポリヌクレオチドの支持鎖への連結、およびヘルパー鎖とプライマー鎖部分との間の合成鎖における一本鎖切断（「ニック」）の作成を示す。  スキームは、所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込み（２０３、２０８）を示す。このヌクレオチドは、可逆的ターミネーター基（三角形）を含み、純粋に例示のために「Ｔ」（チミン）として示され、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。  スキームは、所定の配列の第２のヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去を含む脱保護工程（２０４、２０９）を示す。  スキームは、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義された切断部位で支持鎖を切断する（ギザギザの矢印）ことを含む切断工程（２０５、２１０）を示す。切断は、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド連結分子を放出し、足場ポリヌクレオチドにおける第１および第２のヌクレオチドの保持をもたらす。本発明の合成方法のバージョン２において、支持鎖は、プライマー鎖部分に対する近位方向／ヘルパー鎖部分に対する遠位方向において、ユニバーサルヌクレオチドに対する次のヌクレオチド位置を占めるヌクレオチドと、プライマー鎖部分に対する近位方向／ヘルパー鎖部分に対する遠位方向において、ユニバーサルヌクレオチドに対する第２のヌクレオチド位置を占めるヌクレオチドとの間で切断される。  本発明の合成方法のバージョン２において、切断後の各サイクルにおいて、所定の配列の第１のヌクレオチドは対合しておらず、プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドであり、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドである、所定の配列の第２のヌクレオチドに突出する単一ヌクレオチド突出において提供される。その結果、所定の配列の第１のヌクレオチドおよび所定の配列の第２のヌクレオチドは、互いとヌクレオチド対を形成しない。
【図３】本発明の例示的な方法のバージョン２の変形例を示すスキーム。  本発明の例示的な方法のバージョン２の変形例による第１の合成サイクルを示すスキーム。  本方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、ポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結、可逆的ターミネーター基またはブロッキング基を含むヌクレオチドの組み込み、脱保護、および切断のサイクルを含む。  スキームは、支持鎖（「ａ」と標識された）と、それにハイブリダイズされた合成鎖（「ｂ」と標識された）と、を含む、足場ポリヌクレオチド（３０１、３０６）の提供を示す。合成鎖はプライマー鎖部分（点線）を含む。プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドは、連結可能基、好ましくは、図に示されるような末端リン酸基を含む。「Ａ」（アデノシン）として示される、プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドは、単一ヌクレオチド突出において、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出する。プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドは、ヌクレオチド対の支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合される。対の両方のヌクレオチドは「Ｘ」として示される。これらの２つのヌクレオチドは、任意の２つのヌクレオチドまたはその類似体もしくは誘導体であり得、天然に相補的なヌクレオチド対であることに限定されない。支持鎖の突出している末端ヌクレオチドは、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。  スキームは、ポリヌクレオチド連結分子（３０２、３０７、図の右上の構造）の提供を示す。ポリヌクレオチド連結分子は、ヘルパー鎖（破線）、それにハイブリダイズされた支持鎖、および相補的連結末端を含む。相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドは、所定の配列の第１のヌクレオチドであり、「Ｇ」（グアニン）として示され、「Ｃ」（シトシン）として示されるヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合される。相補的連結末端のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、「Ｔ」（チミン）として示され、単一ヌクレオチド突出において、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドに突出する。相補的連結末端のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、連結不可能なヌクレオチドを含む。相補的連結末端は、支持鎖中にユニバーサルヌクレオチド（「Ｕｎ」として示される）を含み、これは、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合される（「Ｘ」として示される）。相補的連結末端において、「Ｘ」として示される２つのヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチドと支持鎖中の末端ヌクレオチドとの間に位置付けられ、「Ｘ」としても示される、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合される。Ｇ、Ｃ、およびＴは、純粋に例示のために示されており、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。「Ｘ」として示されるヌクレオチドは、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。対合されたヌクレオチドが天然に相補的なヌクレオチドを含む必要はない。  スキームは、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖（３０２、３０７）の足場ポリヌクレオチドの支持鎖への連結、およびヘルパー鎖とプライマー鎖部分との間の合成鎖における一本鎖切断（「ニッ��」）の作成を示す。  スキームは、所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込み（３０３、３０８）を示す。このヌクレオチドは、可逆的ターミネーター基（三角形）を含み、純粋に例示のために「Ｔ」（チミン）として示され、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。  スキームは、所定の配列の第２のヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去を含む脱保護工程（３０４、３０９）を示す。  スキームは、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義された切断部位で支持鎖を切断する（ギザギザの矢印）ことを含む切断工程（３０５、３１０）を示す。切断は、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド連結分子を放出し、足場ポリヌクレオチドにおける第１および第２のヌクレオチドの保持をもたらす。本発明の合成方法のバージョン２のこれらの変形例において、支持鎖は、所定の配列の第１のヌクレオチドによって占められる位置と、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において支持鎖中の次のヌクレオチドによって占められる位置との間で常に切断される。  本発明の合成方法のバージョン２のこれらの変形例において、切断後の各サイクルにおいて、所定の配列の第１のヌクレオチドは対合しておらず、プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドであり、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドである、所定の配列の第２のヌクレオチドに突出する単一ヌクレオチド突出において提供される。その結果、所定の配列の第１のヌクレオチドおよび所定の配列の第２のヌクレオチドは、互いとヌクレオチド対を形成しない。
【図４】本発明の例示的な方法のバージョン１のさらなる変形例を示すスキーム。  本発明の例示的な方法のバージョン１のさらなる変形例による第１の合成サイクルを示すスキーム。  本方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、ポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結、可逆的ターミネーター基またはブロッキング基を含むヌクレオチドの組み込み、脱保護、および切断のサイクルを含む。  スキームは、支持鎖（「ａ」と標識された）と、それにハイブリダイズされた合成鎖（「ｂ」と標識された）と、を含む、足場ポリヌクレオチド（４０１、４０６）の提供を示す。合成鎖はプライマー鎖部分（点線）を含む。プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドは、連結可能基、好ましくは、図に示されるような末端リン酸基を含む。プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドは、「Ｃ」（シトシン）として示される。支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドは、「Ａ」（アデノシン）として示される。支持鎖の末端および最後から２番目のヌクレオチドは、多重ヌクレオチド突出において、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出する。支持鎖は、任意選択的に、平行垂直線によって示される、１つ以上のさらなるヌクレオチドを含み得る。プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドは、ヌクレオチド対の支持鎖のパートナーヌクレオチドと対合される。対の両方のヌクレオチドは「Ｘ」として示される。これらの２つのヌクレオチドは、任意の２つのヌクレオチドまたはその類似体もしくは誘導体であり得、天然に相補的なヌクレオチド対であることに限定されない。支持鎖の突出ヌクレオチドは、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。  スキームは、ポリヌクレオチド連結分子（４０２、４０７、図の右上の構造）の提供を示す。ポリヌクレオチド連結分子は、ヘルパー鎖（破線）、それにハイブリダイズされた支持鎖、および相補的連結末端を含む。相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドは、所定の配列の第１のヌクレオチドであり、「Ｇ」（グアニン）として示され、「Ｃ」（シトシン）として示されるヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合される。相補的連結末端のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、「Ｔ」（チミン）として示される。ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドは、「Ｇ」（グアニン）として示される。ヘルパー鎖の末端および最後から２番目のヌクレオチドは、多重ヌクレオチド突出において、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドに突出する。ヘルパー鎖は、任意選択的に、平行垂直線によって示される、末端および最後から２番目のヌクレオチドの前に１つ以上のさらなるヌクレオチドを含み得る。相補的連結末端のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、連結不可能なヌクレオチドを含む。相補的連結末端は、支持鎖中にユニバーサルヌクレオチド（「Ｕｎ」として示される）を含み、これは、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合される（「Ｘ」として示される）。Ｇ、Ｃ、およびＴは、純粋に例示のために示されており、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。Ｘは、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。対���されたヌクレオチドが天然に相補的なヌクレオチドを含む必要はない。  スキームは、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖（４０２、４０７）の足場ポリヌクレオチドの支持鎖への連結、およびヘルパー鎖とプライマー鎖部分との間の合成鎖における一本鎖切断（「ニック」）の作成を示す。  スキームは、所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込み（４０３、４０８）を示す。このヌクレオチドは、可逆的ターミネーター基（三角形）を含み、純粋に例示のために「Ｔ」（チミン）として示され、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。  スキームは、所定の配列の第２のヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去を含む脱保護工程（４０４、４０９）を示す。  スキームは、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義された切断部位で支持鎖を切断する（ギザギザの矢印）ことを含む切断工程（４０５、４１０）を示す。切断は、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド連結分子を放出し、足場ポリヌクレオチドにおける第１および第２のヌクレオチドの保持をもたらす。本発明の合成方法のバージョン１のこれらの特定の変形例において、支持鎖は、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置と、プライマー鎖部分に対する近位方向／ヘルパー鎖部分に対する遠位方向において、支持鎖中の次のヌクレオチド位置を占めるヌクレオチドとの間で常に切断される。  本発明の合成方法のバージョン１のこれらの特定の変形例において、切断後の各サイクルにおいて、所定の配列の第１のヌクレオチドは対合しておらず、プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドであり、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドである、所定の配列の第２のヌクレオチドに突出する多重ヌクレオチド突出において提供される。その結果、所定の配列の第１のヌクレオチドおよび所定の配列の第２のヌクレオチドは、互いとヌクレオチド対を形成しない。
【図５】本発明の例示的な方法のバージョン２のさらなる変形例を示すスキーム。  本発明の例示的な方法のバージョン２のさらなる変形例による第１の合成サイクルを示すスキーム。  本方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、ポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結、可逆的ターミネーター基またはブロッキング基を含むヌクレオチドの組み込み、脱保護、および切断のサイクルを含む。  スキームは、支持鎖（「ａ」と標識された）と、それにハイブリダイズされた合成鎖（「ｂ」と標識された）と、を含む、足場ポリヌクレオチド（５０１、５０６）の提供を示す。合成鎖はプライマー鎖部分（点線）を含む。プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドは、連結可能基、好ましくは、図に示されるような末端リン酸基を含む。プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドは、「Ｃ」（シトシン）として示される。支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドは、「Ａ」（アデノシン）として示される。支持鎖の末端および最後から２番目のヌクレオチドは、多重ヌクレオチド突出において、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出する。支持鎖は、任意選択的に、平行垂直線によって示される、１つ以上のさらなるヌクレオチドを含み得る。プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドは、ヌクレオチド対の支持鎖のパートナーヌクレオチドと対合される。対の両方のヌクレオチドは「Ｘ」として示される。これらの２つのヌクレオチドは、任意の２つのヌクレオチドまたはその類似体もしくは誘導体であり得、天然に相補的なヌクレオチド対であることに限定されない。支持鎖の突出ヌクレオチドは、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。  スキームは、ポリヌクレオチド連結分子（５０２、５０７、図の右上の構造）の提供を示す。ポリヌクレオチド連結分子は、ヘルパー鎖（破線）、それにハイブリダイズされた支持鎖、および相補的連結末端を含む。相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドは、所定の配列の第１のヌクレオチドであり、「Ｇ」（グアニン）として示され、「Ｃ」（シトシン）として示されるヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合される。相補的連結末端のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、「Ｔ」（チミン）として示される。ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドは、「Ｇ」（グアニン）として示される。ヘルパー鎖の末端および最後から２番目のヌクレオチドは、多重ヌクレオチド突出において、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドに突出する。ヘルパー鎖は、任意選択的に、平行垂直線によって示される、末端および最後から２番目のヌクレオチドの前に１つ以上のさらなるヌクレオチドを含み得る。相補的連結末端のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、連結不可能なヌクレオチドを含む。相補的連結末端は、支持鎖中にユニバーサルヌクレオチド（「Ｕｎ」として示される）を含み、これは、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合される（「Ｘ」として示される）。さらなるヌクレオチド（「Ｘ」として示される）は、所定の配列の第１のヌクレオチドと、相補的連結末端の支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドとの間に位置付けられ、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレ���チドと対合される（「Ｘ」としても示される）。Ｇ、Ｃ、およびＴは、純粋に例示のために示されており、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。Ｘは、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。対合されたヌクレオチドが天然に相補的なヌクレオチドを含む必要はない。  スキームは、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖（５０２、５０７）の足場ポリヌクレオチドの支持鎖への連結、およびヘルパー鎖とプライマー鎖部分との間の合成鎖における一本鎖切断（「ニック」）の作成を示す。  スキームは、所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込み（５０３、５０８）を示す。このヌクレオチドは、可逆的ターミネーター基（三角形）を含み、純粋に例示のために「Ｔ」（チミン）として示され、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。  スキームは、所定の配列の第２のヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去を含む脱保護工程（５０４、５０９）を示す。  スキームは、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義された切断部位で支持鎖を切断する（ギザギザの矢印）ことを含む切断工程（５０５、５１０）を示す。切断は、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド連結分子を放出し、足場ポリヌクレオチドにおける第１および第２のヌクレオチドの保持をもたらす。本発明の合成方法のバージョン２のこれらの特定の変形例において、支持鎖は、プライマー鎖部分に対する近位方向／ヘルパー鎖部分に対する遠位方向において、ユニバーサルヌクレオチドに対する次のヌクレオチド位置を占めるヌクレオチドと、プライマー鎖部分に対する近位方向／ヘルパー鎖部分に対する遠位方向において、ユニバーサルヌクレオチドに対する第２のヌクレオチド位置を占めるヌクレオチドとの間で常に切断される。  本発明の合成方法のバージョン２のこれらの特定の変形例において、切断後の各サイクルにおいて、所定の配列の第１のヌクレオチドは対合しておらず、プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドであり、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドである、所定の配列の第２のヌクレオチドに突出する多重ヌクレオチド突出において提供される。その結果、所定の配列の第１のヌクレオチドおよび所定の配列の第２のヌクレオチドは、互いとヌクレオチド対を形成しない。
【図６】１サイクル当たり３つ以上のヌクレオチドの組み込みを伴う本発明の例示的な方法のバージョン１の変形例を示すスキーム。  連結および組み込みの両方の工程における複数のヌクレオチドの組み込みを伴う本発明の例示的な方法のバージョン１の変形例による第１の合成サイクルを示すスキーム。  本方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、ポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結、（ａ）可逆的ターミネーター基またはブロッキング基を含むヌクレオチドの組み込み、続いて（ｂ）脱保護、それから最後に切断の複数の工程のサイクルを含む。  スキームは、支持鎖（「ａ」と標識された）と、それにハイブリダイズされた合成鎖（「ｂ」と標識された）と、を含む、足場ポリヌクレオチド（６０１、６０６）の提供を示す。合成鎖はプライマー鎖部分（点線）を含む。プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドは、連結可能基、好ましくは、図に示されるような末端リン酸基を含む。「Ａ」（アデノシン）として示される、プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドは、単一ヌクレオチド突出において、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出する。プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドは、ヌクレオチド対の支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合される。対の両方のヌクレオチドは「Ｘ」として示される。これらの２つのヌクレオチドは、任意の２つのヌクレオチドまたはその類似体もしくは誘導体であり得、天然に相補的なヌクレオチド対であることに限定されない。支持鎖の突出している末端ヌクレオチドは、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。  スキームは、ポリヌクレオチド連結分子（６０２、６０７、図の右上の構造）の提供を示す。ポリヌクレオチド連結分子は、ヘルパー鎖（破線）、それにハイブリダイズされた支持鎖、および相補的連結末端を含む。相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドは、所定の配列の第１のヌクレオチドであり、「Ｇ」（グアニン）として示され、「Ｃ」（シトシン）として示されるヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合される。相補的連結末端のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、「Ｔ」（チミン）として示され、単一ヌクレオチド突出において、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドに突出する。相補的連結末端のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、連結不可能なヌクレオチドを含む。支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドは、所定の配列のさらなるヌクレオチドであり、「Ｔ」（チミン）として示され、「Ａ」（アデニン）として示されるヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合される。相補的連結末端は、支持鎖中にユニバーサルヌクレオチド（「Ｕｎ」として示される）を含み、これは、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合される（「Ｘ」として示される）。Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣは、純粋に例示のために示されており、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。Ｘは、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。対合されたヌクレオチドが天然に相補的なヌクレオチドを含む必要はない。  スキームは、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖（６０２、６０７��の足場ポリヌクレオチドの支持鎖への連結、およびヘルパー鎖とプライマー鎖部分との間の合成鎖における一本鎖切断（「ニック」）の作成を示す。  スキームは、所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込み（６０３、６０８）を示す。このヌクレオチドは、可逆的ターミネーター基（三角形）を含み、純粋に例示のために「Ｔ」（チミン）として示され、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得る。組み込み時に、第２のヌクレオチドは、第１のヌクレオチドとヌクレオチド対を形成する。  スキームは、所定の配列の第２のヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去を含む、第２のヌクレオチドの組み込みの後の脱保護工程（６０４、６０９）を示す。  スキームは、所定の配列のさらなるヌクレオチドの組み込み（６０３’、６０８’）を示す。このヌクレオチドは、可逆的ターミネーター基（三角形）を含み、「Ｃ」（シトシン）として示される。組み込み時に、さらなるヌクレオチドは、「Ｇ」（グアニン）として示される、工程（２）において、ポリヌクレオチド連結分子によって提供された所定の配列の第１のヌクレオチドとヌクレオチド対を形成する。シトシンおよびグアニンは、純粋に例示のために示されており、これらのヌクレオチドは、任意のヌクレオチド、またはその類似体もしくは誘導体であり得、天然に相補的なヌクレオチド対であることに限定されない。  スキームは、所定の配列のさらなるヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去を含む、さらなるヌクレオチドの組み込みの後の第２の脱保護工程（６０４’、６０９’）を示す。  スキームは、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義された切断部位で支持鎖を切断する（ギザギザの矢印）ことを含む切断工程（６０５、６１０）を示す。切断は、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド連結分子を放出し、足場ポリヌクレオチドにおける第１、第２、およびさらなるヌクレオチドの保持をもたらす。本発明の合成方法のバージョン１のこの特定の変形例において、支持鎖は、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置と、プライマー鎖部分に対する近位方向／ヘルパー鎖部分に対する遠位方向において、支持鎖中の次のヌクレオチド位置を占めるヌクレオチドとの間で切断される。  本発明の合成方法のバージョン１のこれらの特定の変形例の全てにおいて、切断後、工程（２）においてポリヌクレオチド連結分子によって提供された所定の配列のさらなるヌクレオチドは対合しておらず、プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端ヌクレオチドであり、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドである組み込み工程（３’）において提供された所定の配列のさらなるヌクレオチドに突出する単一ヌクレオチド突出において提供される。その結果、所定の配列の第１のヌクレオチドおよび所定の配列の第２のヌクレオチドは互いとヌクレオチド対を形成せず、工程（２）において、ポリヌクレオチド連結分子によって提供される第１のさらなるヌクレオチド、および工程（３’）において組み込まれた第１のさらなるヌクレオチドは、互いとヌクレオチド対を形成しないなどである。
【図７】例示的な方法バージョン１のスキーム。  実施例部分の例示的な方法のバージョン１による第１の合成サイクルを示すスキーム。この方法は、例示的な支持のためにのみ提供されており、特許請求される発明の範囲内ではない。方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、組み込み、切断、連結、および脱保護のサイクルを含む。スキームは、第１の合成サイクル（１０１、１０２）におけるチミンヌクレオチドの組み込み、およびパートナーアデニンヌクレオチド（１０４）と反対のその対合、ならびに次の合成サイクルで使用するための足場ポリヌクレオチド（１０６）の提供を示す。この対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。ヌクレオチドＺは、任意のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドＸは、任意の適切なヌクレオチドであり得る。図はまた、第２の合成サイクルに対応する参照符号を示す。
【図８】例示的な方法バージョン２のスキーム。  実施例部分の例示的な方法のバージョン２による第１の合成サイクルを示すスキーム。この方法は、例示的な支持のためにのみ提供されており、特許請求される発明の範囲内ではない。方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、組み込み、切断、連結、および脱保護のサイクルを含む。このスキームは、第１のサイクル（２０１、２０２）におけるチミンヌクレオチドおよびパートナーアデニンヌクレオチド（２０４）と反対のその対合の組み込み、ならびに次の合成サイクルにおいてシトシンと対合するためのグアニンを含む足場ポリヌクレオチド（２０６）の提供を示す。これらの対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。ヌクレオチドＺは、任意のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドＸは、任意の適切なヌクレオチドであり得る。図はまた、第２の合成サイクルに対応する参照符号を示す。
【図９】例示的な方法のバージョン３のスキーム。  実施例部分の例示的な方法のバージョン３による第１の合成サイクルを示すスキーム。この方法は、例示的な支持のためにのみ提供されており、特許請求される発明の範囲内ではない。方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、組み込み、切断、連結、および脱保護のサイクルを含む。スキームは、第１のサイクル（３０１、３０２）におけるチミンヌクレオチドおよびパートナーアデニンヌクレオチド（３０４）と反対のその対合の組み込み、ならびに次の合成サイクルで使用するための足場ポリヌクレオチド（３０６）の提供を示す。この対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。スキームはまた、足場ポリヌクレオチドの構成成分としてのシトシン−グアニン対を示し、これは所定の配列の一部ではない。この対はまた、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、任意の対であり得る。ヌクレオチドＺは、任意のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドＸは、任意の適切なヌクレオチドであり得る。
【図１０】例示的な方法のバージョン４のスキーム。  実施例部分の例示的な方法のバージョン４による第１の合成サイクルを示すスキーム。この方法は、例示的な支持のためにのみ提供されており、特許請求される発明の範囲内ではない。方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、組み込み、切断、連結、および脱保護のサイクルを含む。スキームは、第１のサイクル（４０１、４０２）におけるチミンヌクレオチドおよびパートナーユニバーサルヌクレオチド（４０４）と反対のその対合の組み込み、ならびに次の合成サイクルにおいてシトシンと対合するためのグアニンを含む足場ポリヌクレオチド（４０６）の提供を示す。これらの対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。ヌクレオチドＸ、Ｙ、およびＺは、任意のヌクレオチドであり得る。
【図１１】例示的な方法のバージョン５のスキーム。  実施例部分の例示的な方法のバージョン５による第１の合成サイクルを示すスキーム。この方法は、例示的な支持のためにのみ提供されており、特許請求される発明の範囲内ではない。方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、組み込み、切断、連結、および脱保護のサイクルを含む。スキームは、第１のサイクル（５０１、５０２）におけるチミンヌクレオチドおよびパートナーアデニンヌクレオチド（５０４）と反対のその対合の組み込み、ならびに次の合成サイクルにおいてシトシンと対合するためのグアニンを含む足場ポリヌクレオチド（５０６）の提供を示す。スキームはまた、足場ポリヌクレオチドの構成成分としてのシトシン−グアニン対（位置ｎ−２）を示し、これは所定の配列の一部ではない。これらの対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。ヌクレオチドＸ、Ｙ、およびＺは、任意のヌクレオチドであり得る。
【図１２】足場ポリヌクレオチドの表面固定化を示すスキーム。  スキームは、足場ポリヌクレオチドの可能な例示的なヘアピンループ構成およびそれらの表面への固定化を示す（ａ〜ｈ）。  スキーム（ｉおよびｊ）は、ポリヌクレオチドを表面に付着させるための表面化学の例を示す。実施例は、両方の鎖がヘアピンを介して接続されている二本鎖の実施形態を示しているが、非接続二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を付着させるために同じ化学を使用することができる。
【図１３】ヘルパー鎖の不在−組み込み。  ａ）破線枠で強調表示されている組み込み工程を示すスキーム。  ｂ）イノシンと反対の３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みについてのＤＮＡポリメラーゼの評価。図は、５０℃のＭｎ２＋イオンの存在下での様々なＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（エキソ）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩおよびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ）による３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを示す。レーン１：Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン２：Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：Ｄｅｅｐ  ｖｅｎｔ（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン４：Ｄｅｅｐ  ｖｅｎｔ（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン５：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン６：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン７：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン８：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。  ｃ）イノシンと反対の３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みについてのＤＮＡポリメラーゼの評価。様々なＤＮＡポリメラーゼを使用した組み込みの結果。  ｄ）Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した組み込みについての温度の評価。図は、様々な温度でＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用したＭｎ２＋イオンの存在下でのイノシンと反対の３’−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを示す。レーン１：３７℃での３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン２：３７℃での３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：５０℃での３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン４：５０℃での３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン５：６５℃での３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン６：６５℃での３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。  ｅ）Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した組み込みについての温度の評価。異なる温度で行われた組み込みの結果。  ｆ）Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した組み込みについてのＭｎ２＋の存在の評価。図は、６５℃でのイノシンと反対の３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを示す。レーンＳ：標準。レーン１：Ｍｎ２＋イオンを含まない３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン２：Ｍｎ２＋イオンを含まない３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：Ｍｎ２＋イオンの存在下での３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン４：Ｍｎ２＋イオンの存在下での３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。  ｇ）Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した組み込みについてのＭｎ２＋の��在の評価。Ｍｎ２＋イオンの存在下および不在下での組み込みの結果。  ｈ）組み込み工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図１４】ヘルパー鎖の不在−切断。  ａ）ヘルパー鎖の不在下でのハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の切断を示すスキーム。切断工程は、破線枠で強調表示されている。  ｂ）３７℃および室温２４℃でのそれぞれｈＡＡＧおよび０．２Ｍ  ＮａＯＨ（強塩基）によるオリゴヌクレオチドの切断を示すゲル。レーン１．開始オリゴヌクレオチド。両方の全長鎖を含んだ陽性対照であったレーン２は、９０％：１０％の切断対未切断ＤＮＡ比のより高い収率を示した。ヘルパー鎖によらない切断反応を含んだレーン３は、１０％：９０％の切断対未切断ＤＮＡ比の低い収率パーセンテージを示した。  ｃ）３７℃でのｈＡＡＧおよびＥｎｄｏ  ＶＩＩＩによるオリゴヌクレオチドの切断を示すゲル。両方の全長鎖を含んだ陽性対照であったレーン２は、約９０％：１０％の切断対未切断ＤＮＡ比のより高い収率を示した。ヘルパー鎖によらない切断反応を含んだレーン３は、約７％：９３％の切断対未切断ＤＮＡ比の低い収率パーセンテージを示した。  ｄ）ｈＡＡＧ／Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩおよびｈＡＡＧ／化学塩基によるオリゴヌクレオチドの切断の要約。  ｅ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図１５】ヘルパー鎖の不在−連結。  ａ）ヘルパー鎖の不在下でのハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の連結を示すスキーム。破線枠で強調表示されている連結工程。  ｂ）ヘルパー鎖の不在下で室温（２４℃）でのＱｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによるオリゴヌクレオチドの連結を示すゲル。レーン１は、３６ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴと１８ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴとの混合物を含んだ。これらのオリゴは参照バンドを提供した。  ｃ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図１６】ヘルパー鎖によるバージョン１化学−組み込み。ａ）破線枠で強調表示されている組み込み工程を示すスキーム。ｂ）組み込み工程の研究に適用可能なオリゴヌクレオチド。
【図１７】ヘルパー鎖によるバージョン１化学−切断。  ａ）ヘルパー鎖の不在下でのハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の切断を示すスキーム。切断工程は、破線枠で強調表示されている。  ｂ）３７℃および室温２４℃でのそれぞれｈＡＡＧおよび０．２Ｍ  ＮａＯＨ（強塩基）によるオリゴヌクレオチドの切断を示すゲル。レーン１．開始オリゴヌクレオチド。両方の全長鎖を含んだ陽性対照であったレーン２は、９０％：１０％の切断対未切断ＤＮＡ比のより高い収率を示した。ヘルパー鎖によらない切断反応を含んだレーン３は、１０％：９０％の切断対未切断ＤＮＡ比の低い収率パーセンテージを示した。ヘルパー鎖による切断反応を含んだレーン４は、５０％：５０％の切断対未切断ＤＮＡ比の等しい収率パーセンテージを示した。  ｃ）脱塩基部位の切断についてのエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの評価。ゲルは、３７℃でのｈＡＡＧおよびＥｎｄｏ  ＶＩＩＩによるオリゴヌクレオチドの切断を示す。両方の全長鎖を含んだ陽性対照であったレーン２は、約９０％：１０％の切断対未切断ＤＮＡ比のより高い収率を示した。ヘルパー鎖によらない切断反応を含んだレーン３は、約７％：９３％の切断対未切断ＤＮＡ比の低い収率パーセンテージを示した。ヘルパー鎖による切断反応を含んだレーン４は、１０％：９０％の切断対未切断ＤＮＡ比の低い収率パーセンテージを示した。  ｄ）脱塩基部位の切断についてのＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンの評価。ゲルは、３７℃でのｈＡＡＧおよび１００ｍＭのＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンによるオリゴヌクレオチドの切断を示す。レーン１．開始オリゴヌクレオチド。両方の全長鎖を含んだ陽性対照であるレーン２は、１００％の切断ＤＮＡを示した。ヘルパー鎖による切断反応を含んだレーン３は、９０％：１０％の切断対未切断ＤＮＡ比のより高い収率パーセンテージを示した。  ｅ）ｈＡＡＧ／Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩ、ｈＡＡＧ／化学塩基およびｈＡＡＧ／代替化学塩基によるオリゴヌクレオチドの切断の要約。  ｆ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図１８】ヘルパー鎖によるバージョン１化学−連結。  ａ）ヘルパー鎖の存在下でハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の連結を示すスキーム。破線枠で強調表示されている連結工程。  ｂ）ヘルパー鎖の存在下での室温（２４℃）でのＱｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによるオリゴヌクレオチドの連結を示すゲル。レーン１は、３６ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴと１８ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴとの混合物を含んだ。これらのオリゴは参照バンドを提供した。レーン２では、２０分後に予想されるバンドサイズ３６ｍｅｒの観察可能な連結生産物があった。  ｃ）ヘルパー鎖の存在下で一晩インキュベートした後の、室温（２４℃）でのＱｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによるオリゴヌクレオチドの連結を示すゲル。レーン１は、３６ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴと１８ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴとの混合物を含んだ。これらのオリゴは参照バンドとして機能した。レーン２では、３６ｍｅｒの予想されるバンドサイズの観察可能な完全連結生産物があった。  ｄ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図１９】ヘルパー鎖によるバージョン２化学−組み込み。  ａ）オレンジ色の破線枠で強調表示されている組み込み工程を示すスキーム  ｂ）２７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転化率５％。レーン３：２分後の組み込み、転化率１０％。レーン４：５分後の組み込み、転化率２０％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率３０％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率３５％。  ｃ）図は、３７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転化率３０％。レーン３：２分後の組み込み、転化率６０％。レーン４：５分後の組み込み、転化率９０％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率９０％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率９０％。  ｄ）４７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転化率３０％。レーン３：２分後の組み込み、転化率６５％。レーン４：５分後の組み込み、転化率９０％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率９０％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率９０％。  ｅ）２７℃でＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転換率７０％。レーン３：２分後の組み込み、転化率８５％。レーン４：５分後の組み込み、転化率９２％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率９６％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率９６％。  ｆ）３７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転化率８５％。レーン３：２分後の組み込み、転化率９５％。レーン４：５分後の組み込み、転化率９６％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率９６％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率９６％。  ｇ）４７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転化率８５％。レーン３：２分後の組み込み、転化率９０％。レーン４：５分後の組み込み、転化率９６％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率９６％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率９６％。  ｈ）様々な温度での３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込みおよびＭｎ２＋イオンの存在の要約。  ｉ）３７℃でのＭｎ２＋の存在下でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる相補的塩基と反対の３’−Ｏ−修飾−ｄＮＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：５分間の３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：５分間の３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＡＴＰの組み込み。レーン４：５分間の３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＣＴＰの組み込み。レーン５：��分間の３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＧＴＰの組み込み。  ｊ）組み込み工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図２０】ヘルパー鎖によるバージョン２化学−切断。  ａ）ヘルパー鎖の存在下でのハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の切断を示すスキーム。切断工程はオレンジ色の破線枠で強調表示されている。  ｂ）ゲルは、３７℃でのＥｎｄｏ  Ｖによるオリゴヌクレオチドの切断を示す。レーン１．開始オリゴヌクレオチド。両方の全長鎖を含んだ陽性対照であったレーン２は、８０％：２０％の切断対未切断ＤＮＡ比の収率を示した。ヘルパー鎖によらない切断反応を含むレーン３は、＞９９％の切断ＤＮＡのはるかに高い収率を示した。ヘルパー鎖による切断反応を含むレーン４も、＞９９％のＤＮＡ切断収率を示した。  ｃ）エンドヌクレアーゼＶによる切断研究の要約。  ｄ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図２１】ヘルパー鎖によるバージョン２化学−連結。  ａ）ヘルパー鎖の不在下でのハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の連結を示すスキーム。オレンジ色の破線枠で強調表示されている連結工程。  ｂ）切断工程の研究のためのオリゴヌクレオチド。
【図２２】ヘルパー鎖によるバージョン２化学−脱保護。  ａ）オレンジ色の破線枠で強調表示されている脱保護工程を示すスキーム。  ｂ）図は、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み後の５０ｍＭのＴＣＥＰによる３’−Ｏ−アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始プライマーレーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：５０ｍＭのＴＣＥＰによるレーン２の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン４の生産物の伸長。  ｃ）図は、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み後の３００ｍＭのＴＣＥＰによる３’−Ｏ−アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始プライマー。レーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：３００ｍＭのＴＣＥＰによるレーン２の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン４の生産物の伸長。  ｄ）図は、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＣＴＰの組み込み後の５０ｍＭのＴＣＥＰによる３’−Ｏ−アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始プライマー。レーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３−Ｏ−アジドメチル−ｄＣＴＰの組み込み。レーン３：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：３００ｍＭのＴＣＥＰによるレーン２の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン４の生産物の伸長。  ｅ）図は、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＣＴＰの組み込み後の３００ｍＭのＴＣＥＰによる３’−Ｏ−アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始プライマーレーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３−Ｏ−アジドメチル−ｄＣＴＰの組み込み。レーン３：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン１の生産物の伸長。レーン４：３００ｍＭのＴＣＥＰによるレーン１の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン３の生産物の伸長。  ｆ）．図は、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＡＴＰの組み込み後の３００ｍＭのＴＣＥＰによる３’−Ｏ−アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。  レーン１：開始プライマー  レーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３−Ｏ−アジドメチル−ｄＡＴＰの組み込み。レーン３：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：３００ｍＭのＴＣＥＰによるレーン２の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン４の生産物の伸長。  ｇ）図は、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＧＴＰの組み込み後の３００ｍＭのＴＣＥＰによる３’−Ｏ−アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始プライマー。  レーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３−Ｏ−アジドメチル−ｄＧＴＰの組み込み。レーン３：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：３００ｍＭのＴＣＥＰによるレーン２の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５���全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン４の生産物の伸長。  ｈ）０．２μＭのＤＮＡに対するＴＣＥＰによる脱保護の効率。  ｉ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図２３】二重ヘアピンモデルによるバージョン２化学−組み込み。  ａ）破線枠で強調表示されている組み込み工程を示すスキーム。  ｂ）その天然対応物と反対の３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みについてのＤＮＡポリメラーゼの評価。図は、３７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始材料。レーン２：天然ｄＮＴＰ混合物の組み込み。レーン３：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン４：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン３の生産物の伸長。  ｃ）その天然対応物と反対の３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みについてのＤＮＡポリメラーゼの評価。組み込み工程の研究に適用可能なオリゴヌクレオチド。
【図２４】二重ヘアピンモデルによるバージョン２化学−切断。  ａ）ヘアピンオリゴヌクレオチドの切断を示すスキーム。切断工程は破線枠で強調表示されている。  ｂ）３７℃でのＥｎｄｏ  Ｖによるヘアピンオリゴヌクレオチドの切断を示すゲル。レーン１．開始ヘアピンオリゴヌクレオチド。５分後に切断されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン２は、約９８％の割合で高収率の消化ＤＮＡを示した。１０分後に切断されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン３は、約９９％の割合で高収率の消化ＤＮＡを示した。３０分後に切断されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン４は、約９９％の割合で高収率の消化ＤＮＡを示し、１時間後に切断されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン５は、約９９％の割合で高収率の消化ＤＮＡを示した。  ｃ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図２５】二重ヘアピンモデルによるバージョン２化学−連結。  ａ）ハイブリダイズされたヘアピンの連結を示すスキーム。破線枠で強調表示されている連結工程。  ｂ）ヘルパー鎖の存在下での室温（２４℃）での平滑／ＴＡ  ＤＮＡリガーゼによるヘアピンオリゴヌクレオチドの連結を示すゲル。レーン１は開始ヘアピンオリゴヌクレオチドを含んでいた。１分後の連結されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン２は、約８５％の割合で高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。２分後の連結されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン３は、約８５％の割合で高収率の消化ＤＮＡを示した。３分後の連結されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン４は、約８５％の割合で高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。４分後の連結されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン５は、＞約８５％の割合で高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。  ｃ）連結工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図２６】バージョン２化学−二重ヘアピンモデルについての完全サイクル。  ａ）酵素的組み込み、切断、連結、および脱保護工程を伴う完全サイクルを示すスキーム。  ｂ）その天然対応物と反対の３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みについてのＤＮＡポリメラーゼの評価。図は、３７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始材料。レーン２：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：エンドヌクレアーゼＶによるレーン２の生産物の切断。レーン５：平滑ＴＡリガーゼキットによるレーン４の生産物の連結。  ｃ）組み込み工程の研究に適用可能なオリゴヌクレオチド。
【図２７】バージョン２化学−ヘルパー鎖を使用した単一ヘアピンモデルについての完全サイクル。  ａ）酵素的組み込み、切断、連結、および脱保護工程を伴う完全サイクルを示すスキーム。  ｂ）組み込み工程の研究に適用可能なオリゴヌクレオチド。
【図２８】バージョン３化学−二重ヘアピンモデルについての完全サイクル。  ａ）酵素的組み込み、切断、連結、および脱保護工程を伴う完全サイクルを示すスキーム。  ｂ）組み込み工程の研究に適用可能なオリゴヌクレオチド。
【図２９】バージョン２化学−二重ヘアピンモデルについての完全２サイクル。  ａ）酵素的組み込み、脱保護、切断、および連結工程を伴う第１の完全サイクルを示すスキーム。  ｂ）酵素的組み込み、脱保護、切断、および連結工程を伴う第１の完全サイクルに続く第２の完全サイクルを示すスキーム。  ｃ）図は、組み込み、脱保護、切断、および連結工程を含む完全２サイクル実験を示すゲルを図示する。レーン１．開始材料。レーン２．天然ｄＮＴＰによる開始材料の伸長。レーン３．Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン４．全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン３の生産物の伸長。レーン５．ＴＣＥＰによるレーン３の生産物の脱保護。レーン６．全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン５の生産物の伸長。レーン７．エンドヌクレアーゼＶによるレーン５の生産物の切断。レーン８．平滑ＴＡリガーゼキットによるレーン７の生産物の連結。レーン９．ラムダエキソヌクレアーゼによるレーン８の生産物の切断。レーン１０．第２のサイクルのための開始材料−レーン９と同じ材料。レーン１１．Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン１２．全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン１１の生産物の伸長。レーン１３．ＴＣＥＰによるレーン１１の生産物の脱保護。レーン１４．全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン１３の生産物の伸長。レーン１５．エンドヌクレアーゼＶによるレーン１３の生産物の切断。レーン１６．平滑ＴＡリガーゼキットによるレーン１５の生産物の連結。  ｄ）研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図３０】本明細書に記載される方法により合成されるような所定の配列のポリヌクレオチドの足場ヌクレオチドからの放出の機構を示す例。
【図３１】本発明によるＲＮＡの合成のための例示的な方法の概略図。例示的な方法は、ヘルパー鎖の不在下での合成を示す。
【図３２】本発明によるＲＮＡの合成のための例示的な方法の概略図。例示的な方法は、ヘルパー鎖の存在下での合成を示す。
【図３３】本発明によるＲＮＡの合成のための例示的な方法の概略図。例示的な方法は、ヘルパー鎖の存在下での合成を示す。
【図３４】組み込み工程の前にヘルパー鎖を変性する工程を伴う、単一ヘアピンモデルによる合成方法のバージョン２によるＤＮＡ合成のための例示的な方法の第１の完全サイクルの概略図。
【図３５】組み込み工程の前にヘルパー鎖を変性する工程を伴う、単一ヘアピンモデルによる合成方法のバージョン２によるＤＮＡ合成のための例示的な方法の第２の完全サイクルの概略図。
【図３６】組み込み工程の前にヘルパー鎖を変性する工程を伴う、単一ヘアピンモデルによる合成方法のバージョン２によるＤＮＡ合成のための例示的な方法の第３の完全サイクルの概略図。
【図３７】実施例９に詳述される実験に使用されるオリゴヌクレオチド。
【図３８】実施例９に詳述されるような完全３サイクル実験に対応する反応生産物を示すゲル。  図は、組み込み、脱ブロック、切断、および連結工程を含む完全３サイクル実験の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始材料。レーン２．天然ｄＮＴＰによる開始材料の伸長レーン３：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン４：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン３の生産物の伸長。レーン５：ＴＣＥＰによるレーン３の生産物の脱ブロックレーン６：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン５の生産物の伸長。レーン７：エンドヌクレアーゼＶによるレーン５の生産物の切断。レーン８：Ｔ３  ＤＮＡリガーゼによるレーン７の生産物の連結レーン９：第２のサイクルの開始材料−レーン９と同じ材料レーン１０：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン９の生産物の伸長。レーン１１：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン１２：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン１１の生産物の伸長。レーン１３：ＴＣＥＰによるレーン１１の生産物の脱ブロックレーン１４：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン１３の生産物の伸長。レーン１５：エンドヌクレアーゼＶによるレーン１３の生産物の切断レーン１６：Ｔ３  ＤＮＡリガーゼによるレーン１５の生産物の連結レーン１７：第３のサイクルのための開始材料−レーン１６と同じ材料レーン１８：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン１７の生産物の伸長。レーン１９：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン２０：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン１９の生産物の伸長。レーン２１：ＴＣＥＰによるレーン１９の生産物の脱ブロックレーン２２：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン２１の生産物の伸長。レーン２３：エンドヌクレアーゼＶによるレーン２１の生産物の切断レーン２４：Ｔ３  ＤＮＡリガーゼによるレーン２３の生産物の連結
【図３９】ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＳＨおよびＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨに曝露された異なる量のＢＲＡＰＡを添加したポリアクリルアミドゲル表面からの蛍光シグナル。
【図４０】ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＳＨおよびＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨに曝露された異なる量のＢＲＡＰＡを添加したポリアクリルアミドゲル表面上のフルオレセインチャネルから測定された蛍光シグナル。
【図４１】（ａ）異なる試料に固定化されたリンカーを有しないヘアピンＤＮＡの配列を示す。  （ｂ）異なる試料に固定化されたリンカーを有するヘアピンＤＮＡの配列を示す。
【図４２】ブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンＤＮＡオリゴマーからの蛍光シグナル。
【図４３】ブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンＤＮＡオリゴマーから測定された蛍光。
【図４４】三リン酸の組み込み後のブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンＤＮＡオリゴマーからの蛍光シグナル。
【図４５】三リン酸の組み込み後のブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンＤＮＡオリゴマーから測定された蛍光。
【図４６】（ａ）実施例１２に詳述されるような各反応工程についての実験的概観および結果。  （ｂ）実施例１２に詳述される実験に使用されるオリゴヌクレオチド。
【図４７】切断反応の前および後のヘアピンＤＮＡオリゴマーからの蛍光シグナルを示す（実施例１２）。
【図４８】切断反応の前および後のヘアピンＤＮＡオリゴマーから測定された蛍光シグナルを示す（実施例１２）。
【図４９】連結反応のためのイノシン含有鎖および相補的「ヘルパー」鎖のための配列を示す（実施例１２）。
【図５０】連結反応のモニタリングに対応するヘアピンＤＮＡオリゴマーからの蛍光シグナルに関する結果（実施例１２）。
【図５１】連結反応のモニタリングに対応するヘアピンＤＮＡオリゴマーから測定された蛍光に関する結果（実施例１２）。
【図５２】実施例１３は、本発明の方法、例えば、本発明の合成方法のバージョン１および２ならびにそれらの変形例（図１〜６および実施例１３）による組み込み工程を使用した、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ修飾−ｄＮＴＰの組み込みに関する結果。  図５２ａは、プライマー鎖（合成鎖のプライマー鎖部分；配列番号６８）およびテンプレート鎖（支持鎖；配列番号６９）の核酸配列を提供する。  図５２ｂは、３７℃のＭｎ２＋イオンの存在下でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ修飾−ｄＮＴＰの組み込みの結果を示すゲルを示す。  レーン１：開始オリゴヌクレオチド。  レーン２：３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み（効率＞９９％）  レーン３：３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＡＴＰの組み込み（効率＞９９％）。  レーン４：３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＣＴＰの組み込み（効率＞９０％）。  レーン５：３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＧＴＰの組み込み（効率＞９９％）。  付加すると、新たに付加された３’−Ｏ−修飾−ｄＮＴＰはプライマー鎖部分の位置ｎを占める。プライマー鎖部分における次のヌクレオチド位置は、ｎ−１と指定される。
【図５３】図は、実施例１４に記載されるＤＮＡ合成反応サイクルを示すスキームを示す。
【図５４】図は、実施例１４に記載されるＤＮＡ合成反応サイクルを示すスキームを示す。
【図５５】図は、実施例１４に記載される実験に使用されるオリゴヌクレオチドを示す。
【図５６】図は、実施例１４に記載されるヘアピン足場ポリヌクレオチドへの、ユニバーサルヌクレオチドとして使用された２−デオキシイノシンを含むポリヌクレオチド連結分子の連結の結果を実証するゲルの写真を示す。ゲルのレーンは以下の通りである：レーン１：開始ヘアピン足場ポリヌクレオチド。レーン２：ポリヌクレオチド連結分子に連結されたヘアピン足場ポリヌクレオチド（１塩基Ｔ突出）。レーン３：ポリヌクレオチド連結分子に連結されたヘアピン足場ポリヌクレオチド（１塩基Ｃ突出）。レーン４：開始ヘアピン足場ポリヌクレオチド。レーン５：ポリヌクレオチド連結分子に連結されたヘアピン足場ポリヌクレオチド（２塩基突出）。レーン６：ポリヌクレオチド連結分子に連結されたヘアピン足場ポリヌクレオチド（３塩基突出）。レーン７：ポリヌクレオチド連結分子に連結されたヘアピン足場ポリヌクレオチド（４塩基突出）。
【００７２】
図の解釈。
図１２、１３ａ、１４ａ、１５ａ、１６ａ、１７ａ、１８ａ、１９ａ、２０ａ、２１ａ、２２ａ、２３ａ、２４ａ、２５ａ、２６ａ、２７ａ、２８ａ、２９ａ、２９ｂ、３０、３１、３２、３３、３４、３５、および３６に示される構造は、図７、８、９、１０、および１１に示されるものと一貫して解釈されるべきである。したがって、これらの図では、二本鎖足場ポリヌクレオチド分子の各左手鎖は、支持鎖（図７〜１１の鎖「ａ」に対応する）に関し、二本鎖足場ポリヌクレオチド分子の各右手鎖は、合成鎖（図７〜１の鎖「ｂ」に対応する）に関し、全ての足場ポリヌクレオチド分子は、プライマー鎖部分（図７〜１１の鎖「ｂ」の実線および点線に対応する）を含む鎖に対応するより低い合成鎖を含み、ヘルパー鎖部分（図７〜１１の鎖「ｂ」の破線に対応する）を含む鎖に対応する上部合成鎖を有する、新たなヌクレオチドの組み込みの前のある特定の足場ポリヌクレオチド分子（例えば、図１６ａおよび２４ａ）が示され、ヘルパー鎖部分（図７〜１１の鎖「ｂ」の破線の欠如に対応する）を含まない、ある特定の足場ヌクレオチド分子（例えば、図１３ａ、１４ａ、および１５ａの）が示され、ヘルパー鎖部分（図７〜１１の鎖「ｂ」の破線に対応する）を含む鎖に対応する上部合成鎖を有する、連結工程後のある特定の足場ポリヌクレオチド分子（例えば、図３４、３５、および３６の）が示され、ヘルパー鎖部分は、次の合成サイクルにおいて新たなヌクレオチドの組み込みの前に除去される。
【００７３】
加えて、これらの図では、関連する場合、各新たなヌクレオチドは、ｒｔＮＴＰと標識され、かつ小さな円形構造（図７〜１１の小さな三角形構造に対応する）として示される、可逆的ターミネーター基と一緒に組み込まれるように示され、末端リン酸基は、「ｐ」と標識され、小さな楕円形構造として示される。
【００７４】
図１２ｃ、１２ｄ、１２ｇ、１２ｈ、２３ａ、２４ａ、２５ａ、２６ａ、２８ａ、２９ａ、２９ｂ、および３０は、ヘルパー鎖部分を含む鎖と支持鎖とがヘアピンループによって接続されている足場ポリヌクレオチド分子を示す。図１２ｂ、２３ａ、２４ａ、２５ａ、２６ａ、２７ａ、２８ａ、２９ａ、２９ｂ、３０、３４、３５、および３６は、ヘルパー鎖部分を含む鎖と支持鎖とがヘアピンループによって接続されている足場ポリヌクレオチド分子を示す。
【００７５】
図２８ａおよび２９ａなどの図は、ヘルパー鎖部分を含む鎖（右上の鎖）と支持鎖（左上の鎖）とがヘアピンループによって接続されている足場ポリヌクレオチド分子を示し、同じ分子において、プライマー鎖部分を含む鎖（右下の鎖）と支持鎖（左下の鎖）とが、ヘアピンループによって接続されている。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
本発明は、所定のヌクレオチド配列によるポリヌクレオチド分子のデノボ合成のための方法を提供する。合成されるポリヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡであり、好ましくは二本鎖ポリヌクレオチド分子である。本発明は、既存の合成方法と比較して利点を提供する。例えば、全ての反応工程を穏やかなｐＨの水性条件で行うことができ、広範囲の保護および脱保護手順は必要ではない。さらに、合成は、所定のヌクレオチド配列を含む既存の鋳型鎖の複製に依存しない。
【００７７】
本発明は、本明細書で定義されるようなユニバーサルヌクレオチドの使用が、切断および繰り返しの合成サイクルを促進する合成された領域内のポリヌクレオチド切断部位の作成を可能にすると判定した。本発明は、ポリヌクレオチドを合成するための、およびこのような合成されたポリヌクレオチドを含む大きな断片をアセンブリするための多用途の方法を提供する。
【００７８】
本発明の合成方法のある特定の実施形態は、本発明の２つの例示的な方法のバージョンおよびそれらのある特定の変形例（図１〜６）を含む例示的な方法を参照することによって、本明細書により一般的に詳細に記載される。本発明の例示的な方法のバージョンおよびそれらの変形例を含む全ての例示的な方法が、本発明を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子をインビトロで合成する方法を提供し、本方法は、合成サイクルを行うことを含み、各サイクルにおいて、第１のポリヌクレオチド鎖が、所定の配列の第１のヌクレオチドの組み込みによって伸長され、次に、第１の鎖にハイブリダイズされる第２のポリヌクレオチド鎖が、所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込みによって伸長される。好ましくは、方法は、ＤＮＡを合成するためのものである。本明細書に記載される特定の方法は、本発明の実施形態として提供される。
【００７９】
反応条件
一態様では、本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するための方法を提供する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、合成は、二本鎖ポリヌクレオチド内のヌクレオチドのハイブリダイゼーションに好適な条件下で実施される。ポリヌクレオチドは、典型的には、ヌクレオチドの相補的ヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で試薬と接触される。ハイブリダイゼーションを可能にする条件は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５））。
【００８１】
ポリヌクレオチドへのヌクレオチドの組み込みは、例えば、好適な緩衝溶液の存在下で、好適な温度（例えば、約６５℃）で修飾ヌクレオチド（例えば、３’−Ｏ−修飾−ｄＮＴＰ）を組み込むために、ポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸポリメラーゼ）または末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素またはその機能的バリアントを使用して、好適な条件下で実施され得る。一実施形態では、緩衝溶液は、２ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのＭｇＳＯ４、および０．０１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含み得る。
【００８２】
ポリヌクレオチドの切断は、例えば、好適な緩衝溶液の存在下で、酵素と適合する温度（例えば、３７℃）でポリヌクレオチド切断酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ）を使用して、好適な条件下で実施され得る。一実施形態では、緩衝溶液は、５ｍＭの酢酸カリウム、２ｍＭのトリス−酢酸、１ｍＭの酢酸マグネシウム、および０．１ｍＭのＤＴＴを含み得る。
【００８３】
ポリヌクレオチドの連結は、例えば、好適な緩衝溶液の存在下で、酵素と適合する温度（例えば、室温）でリガーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）を使用して、好適な条件下で実施され得る。一実施形態では、緩衝溶液は、４．４ｍＭのトリス−ＨＣｌ、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．７ｍＭのジチオスレイトール、０．７ｍＭのＡＴＰ、５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）を含み得る。
【００８４】
脱保護は、例えば還元剤（例えば、ＴＣＥＰ）を使用して、好適な条件下で実施され得る。例えば、脱保護は、トリス緩衝液中のＴＣＥＰを使用して（例えば、最終濃度３００ｍＭで）行われ得る。
【００８５】
アンカーポリヌクレオチドおよび足場ポリヌクレオチド
所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドは、本明細書で足場ポリヌクレオチドと呼ばれる、本明細書に記載されるような表面に付着し得るか、または付着することができる、既存のポリヌクレオチドへの所定のヌクレオチドの組み込みによる本発明の方法によって合成される。本明細書により詳細に記載されるように、足場ポリヌクレオチドは、新たに合成されたポリヌクレオチドを収容するための支持構造を形成し、本明細書の記載から明らかになるように、従来の合成方法におけるように複製される既存の鋳型鎖を含まない。足場ポリヌクレオチドが表面に付着している場合、足場ポリヌクレオチドは、アンカーポリヌクレオチドと呼ばれることがある。足場ポリヌクレオチドを表面に付着させてアンカーポリヌクレオチドを形成するための表面付着化学は、本明細書により詳細に記載されている。
【００８６】
一実施形態では、足場ポリヌクレオチドは、相補的支持鎖にハイブリダイズされた合成鎖を含む。合成鎖はプライマー鎖部分（例えば、図１〜１６を参照されたい）を含む。合成鎖は、相補的支持鎖にハイブリダイズされて提供され得る。代替的に、支持鎖および合成鎖は別々に提供され得、次いでハイブリダイズされ得る。
【００８７】
足場ポリヌクレオチドには、隣接する末端で接続されていない支持鎖および合成鎖のそれぞれが提供され得る。足場ポリヌクレオチドには、足場ヌクレオチドの両方の末端でヘアピンループなどを介して、隣接する末端で接続されている支持鎖および合成鎖の両方が提供され得る。足場ポリヌクレオチドには、足場ヌクレオチドの一方の末端または任意の他の好適なリンカーでヘアピンループなどを介して、隣接する末端で接続されている支持鎖および合成鎖の両方が提供され得る。
【００８８】
ヘアピンを有するまたは有しない足場ポリヌクレオチドは、本明細書により詳細に記載されるような固体支持体または表面に固定化され得る（図１２を参照されたい）。
【００８９】
「ヘアピン」または「ヘアピンループ」という用語は、現在の技術分野において一般的に使用されている。「ヘアピンループ」という用語は、「ステムループ」とも呼ばれることが多い。このような用語は、ポリヌクレオチド分子の一方の鎖が分子内塩基対合のために同じ鎖の別の区分にハイブリダイズしたときに形成される、不対合核酸塩基のループを含むポリヌクレオチド中の二次構造の領域を指す。したがって、ヘアピンはＵ字型の構造に似ている場合がある。このような構造の例を図１２に示す。
【００９０】
本明細書に記載されるある特定の方法において、新たな合成は、リガーゼ酵素の作用によって所定の配列の第１のヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドに組み込むことにより開始される。したがって、所定の配列の第１のヌクレオチドは、本明細書にさらに記載されるように、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに連結される。所定の配列の第１のヌクレオチドは、支持鎖、ヘルパー鎖、および相補的連結末端を含むポリヌクレオチド連結分子によって提供される。所定の配列の第１のヌクレオチドは、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドとして提供される。
【００９１】
相補的連結末端におけるヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、連結不可能なヌクレオチドであり、典型的には、リン酸基を欠いて提供される。これにより、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドのプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドと連結することを防止し、連結後にヘルパー鎖とプライマー鎖部分との間に一本鎖切断部位が作成される。一本鎖切断の作成および維持は他の手段によっても達成され得る。例えば、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドには、プライマー鎖部分との連結を防止する好適なブロッキング基が提供され得る。
【００９２】
本明細書に記載されるある特定の方法において、所定の配列の第２のヌクレオチドは、ポリメラーゼまたはトランスフェラーゼ酵素の作用によって足場ポリヌクレオチドに組み込まれる。したがって、ポリメラーゼ酵素またはトランスフェラーゼ酵素は、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドを伸長するように作用する。
【００９３】
例示的な方法の一般的な方法スキームのさらなる詳細が、本明細書にさらに提供される。
【００９４】
ヌクレオチドおよびユニバーサルヌクレオチド
本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって合成ポリヌクレオチドに組み込まれ得るヌクレオチドは、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、および修飾ヌクレオチドであり得る。
【００９５】
ヌクレオチドは、天然核酸塩基または非天然核酸塩基を含み得る。ヌクレオチドは、天然核酸塩基、糖、およびリン酸基を含み得る。天然核酸塩基は、アデノシン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）を含む。ヌクレオチドの成分のうちの１つは、さらに修飾され得る。
【００９６】
ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、もしくはリン酸、またはそれらの組み合わせのいずれかにおいて構造的に修飾され、オリゴヌクレオチド鎖への組み込みのための基質としてのポリメラーゼ酵素になお許容可能なヌクレオチドである。
【００９７】
非天然核酸塩基は、標的ポリヌクレオチド中の核酸塩基のうちの全てにある程度結合する、例えば、水素結合するものであり得る。非天然核酸塩基は、好ましくは、ヌクレオシドアデノシン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）を含むヌクレオチドにある程度結合する、例えば水素結合するものである。
【００９８】
非天然ヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびアンロックド核酸（ＵＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）またはモルホリノ、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートであり得る。
【００９９】
非天然ヌクレオチドは、修飾糖および／または修飾核酸塩基を含み得る。修飾糖としては、２’−Ｏ−メチルリボース糖が挙げられるが、これに限定されない。修飾核酸塩基としては、メチル化核酸塩基が挙げられるが、これに限定されない。核酸塩基のメチル化は、遺伝子およびマイクロＲＮＡなどの他の要素の発現を改変させる能力を有する認識された形態のエピジェネティック修飾である。核酸塩基のメチル化は、主にＣｐＧモチーフからなるジヌクレオチドである別々の遺伝子座で起こるが、ＣＨＨモチーフ（ＨはＡ、Ｃ、またはＴである）でも起こり得る。典型的には、メチル化中に、メチル基がシトシン塩基の第５の炭素に付加されてメチルシトシンを作成する。したがって、修飾核酸塩基としては、５−メチルシトシンが挙げられるが、これに限定されない。
【０１００】
所定の配列のヌクレオチドは、ヌクレオチド対を形成するために反対のパートナーヌクレオチドに組み込まれ得る。パートナーヌクレオチドは相補的ヌクレオチドであり得る。相補的ヌクレオチドは、所定の配列のヌクレオチドにある程度結合する、例えば水素結合することができるヌクレオチドである。
【０１０１】
典型的には、所定の配列のヌクレオチドは、天然に相補的なパートナー核酸塩基と反対のポリヌクレオチドに組み込まれる。したがって、アデノシンは、チミンとは反対に組み込まれ得、逆もまた同様である。グアニンは、シトシンとは反対に組み込まれ得、逆もまた同様である。代替的に、所定の配列のヌクレオチドは、それがある程度結合する、例えば水素結合する、パートナー核酸塩基とは反対に組み込まれ得る。
【０１０２】
代替的に、パートナーヌクレオチドは、非相補的ヌクレオチドであり得る。非相補的ヌクレオチドは、所定の配列のヌクレオチドに結合する、例えば水素結合することができないヌクレオチドである。したがって、合成されたポリヌクレオチドが全体として二本鎖であり、かつ第１の鎖がハイブリダイゼーションによって第２の鎖に付着しているという条件で、所定の配列のヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと反対に組み込まれて、ミスマッチを形成する場合がある。
【０１０３】
「反対の」という用語は、核酸生化学の分野におけるこの用語の通常の使用、具体的には従来のワトソン−クリック塩基対合に関するものとして理解されるべきである。したがって、配列５’−ＡＣＧＡ−３’の第１の核酸分子は、配列５’−ＴＣＧＴ−３’の第２の核酸分子と二本鎖を形成することができ、第１の分子のＧは、第２のＣと反対に位置付けられ、それと水素結合するであろう。配列５’−ＡＴＧＡ−３’の第１の核酸分子は、配列５’−ＴＣＧＴ−３’の第２の核酸分子と二本鎖を形成し得、第１の分子のＴは、第２の分子のＧとミスマッチであるが、それでもなおそれと反対に位置付けられ、パートナーヌクレオチドとして作用するであろう。この原理は、ユニバーサルヌクレオチドを含むパートナー対を含む、本明細書に開示される任意のヌクレオチドパートナー対関係に当てはまる。
【０１０４】
本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、支持鎖における位置および合成鎖における反対の位置は、位置番号「ｎ」を割り当てられる。この位置は、任意の所与の合成サイクルにおいて、そのサイクルまたはその後のサイクルの組み込み工程でのプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所与の配列の第２のまたはさらなるヌクレオチドによって占められるか、または占められることになる合成鎖中のヌクレオチド位置とは反対である足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のヌクレオチドの位置を指す。位置「ｎ」はまた、位置が、ポリヌクレオチド連結分子足場ポリヌクレオチドの連結およびポリメラーゼ酵素またはトランスフェラーゼ酵素の作用による所定の配列の第２のヌクレオチドまたはさらなるヌクレオチドの組み込み時に所定の配列の第２のヌクレオチドまたはさらなるヌクレオチドと反対になるヌクレオチド位置である、連結工程の前のポリヌクレオチド連結分子の支持鎖内の位置を指す。
【０１０５】
支持鎖における位置および合成鎖における反対の位置の両方が、ポジトンｎと呼ばれ得る。
【０１０６】
位置「ｎ」の定義に関するさらなる詳細は、図１〜６、および本明細書でより詳細に記載される本発明の例示的な合成方法のバージョンおよび変形例に関連するその説明を参照して提供される。
【０１０７】
ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体は、好ましくは、ヌクレオシド三リン酸として提供され得る。したがって、ＤＮＡポリヌクレオチドを合成するための本発明の方法のうちのいずれにおいても、ヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の作用を介して、または例えば、デオキシヌクレオチジル末端トランスフェラーゼ活性を有する酵素の作用を介して、２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−Ｏ−三リン酸（ｄＮＴＰ）から組み込まれ得る。ＲＮＡポリヌクレオチドを合成するための本発明の方法のうちのいずれにおいても、ヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ酵素の作用を介して、または例えば、ヌクレオチジル末端トランスフェラーゼ活性を有する酵素の作用を介して、リボヌクレオシド−５’−Ｏ−三リン酸（ＮＴＰ）から組み込まれ得る。三リン酸は、四リン酸または五リン酸（一般的には、オリゴリン酸）で置換することができる。これらのオリゴリン酸は、他のアルキル基またはアシル基で置換することができる。
【化１】
2021529548.tif 000002
【０１０８】
本発明の方法は、ユニバーサルヌクレオチドを使用することができる。ユニバーサルヌクレオチドを足場分子の支持鎖の構成成分として使用して、各合成サイクル中に新たに組み込まれたヌクレオチドがその所望のパートナーヌクレオチドと正しく対合されることを促進することができる。必要に応じて、ユニバーサルヌクレオチドも、所定のヌクレオチド配列の成分として合成鎖に組み込まれ得る。
【０１０９】
ユニバーサルヌクレオチドは、核酸塩基が所定の配列の任意のヌクレオチドの核酸塩基にある程度結合する、すなわち水素結合するものである。ユニバーサルヌクレオチドは、好ましくは、ヌクレオシドアデノシン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）を含むヌクレオチドにある程度結合する、例えば水素結合するものである。ユニバーサルヌクレオチドは、他のヌクレオチドよりもいくつかのヌクレオチドにより強く結合し得る。例えば、ヌクレオシド、２’−デオキシイノシンを含むユニバーサルヌクレオチド（Ｉ）は、Ｉ−Ｃ＞Ｉ−Ａ＞Ｉ−Ｇの優先的な対合順序がおよそ＝Ｉ−Ｔであることを示すであろう。
【０１１０】
可能なユニバーサルヌクレオチドの例は、イノシンまたはニトロインドールである。ユニバーサルヌクレオチドは、好ましくは、以下の核酸塩基、ヒポキサンチン、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドール、３−ニトロピロール、ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンゾイミダゾール、５−ニトロインダゾール、４−アミノベンゾイミダゾール、またはフェニル（Ｃ６芳香族環のうちの１つを含む。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、以下のヌクレオシド：２’−デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、７−デアザ−イノシン、２−アザ−デオキシイノシン、２−アザ−イノシン、４−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロインドールリボヌクレオシド、５−ニトロインドール２’デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインドールリボヌクレオシド、６−ニトロインドール２’デオキシリボヌクレオシド、６−ニトロインドールリボヌクレオシド、３−ニトロピロール２’デオキシリボヌクレオシド、３−ニトロピロールリボヌクレオシド、ヒポキサンチンの非環状糖類似体、ニトロイミダゾール２’デオキシリボヌクレオシド、ニトロイミダゾールリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾール２’デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾールリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾール２’デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾール２’デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾールリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾール２’デオキシリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、フェニルＣ−リボヌクレオシド、またはフェニルＣ−２’−デオキシリボシルヌクレオシドのうちの１つを含む。
【０１１１】
ユニバーサル塩基のいくつかの例を以下に示す。
【化２】
2021529548.tif 000003
【０１１２】
光切断可能な塩基および酵素切断可能な塩基を含む切断可能な塩基を組み込むユニバーサルヌクレオチドも使用することができ、それらのいくつかの例を以下に示す。
【０１１３】
光切断可能な塩基：
【化３】
2021529548.tif 000004
エンドヌクレアーゼＩＩＩにより切断可能な塩基類似体：
【化４】
2021529548.tif 000005
ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）によって切断可能な塩基類似体：
【化５】
2021529548.tif 000006
８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＯＧＧ１）によって切断可能な塩基類似体：
【化６】
2021529548.tif 000007
ｈＮｅｉｌ１によって切断可能な塩基類似体：
【化７】
2021529548.tif 000008
チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）によって切断可能な塩基類似体：
【化８】
2021529548.tif 000009
ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）によって切断可能な塩基類似体：
【化９】
2021529548.tif 000010
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼによって切断可能な塩基：
【化１０】
2021529548.tif 000011
ヒト一本鎖選択的単官能性ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＳＭＵＧ１）によって切断可能な塩基
【化１１】
2021529548.tif 000012
５−メチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ（ＲＯＳ１）によって切断可能な塩基：
【化１２】
2021529548.tif 000013
（Ｓ．Ｓ．Ｄａｖｉｄ，Ｓ．Ｄ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  １９９８，９８，１２２１−１２６２、およびＭ．Ｉ．Ｐｏｎｆｅｒｒａｄａ−Ｍａｒｉｎ，Ｔ．Ｒｏｌｄａｎ−Ａｒｊｏｎａ，Ｒ．Ｒ．Ａｒｉｚａ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００９，３７，４２６４−４２７４を参照されたい）。
【０１１４】
足場ポリヌクレオチドを伴う方法のうちのいずれにおいても、ユニバーサルヌクレオチドは、最も好ましくは２’−デオキシイノシンを含む。
【０１１５】
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができるエピジェネティック塩基の例には、以下のものが含まれる。
【化１３】
2021529548.tif 000014
【０１１６】
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができる修飾塩基の例には、以下のものが含まれる。
【化１４】
2021529548.tif 000015
【０１１７】
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができるハロゲン化塩基の例には、以下のものが含まれる。
【化１５】
2021529548.tif 000016
Ｒ１＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アルキル、アリール、蛍光標識、アミノプロパルギル、アミノアリルである。
【０１１８】
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができる、例えば付着／リンカー化学において有用であり得るアミノ修飾塩基の例には、以下のものが含まれる。
【化１６】
2021529548.tif 000017
塩基＝アルキンまたはアルケンリンカーを有するＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである。
【０１１９】
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができる、例えばクリック化学において有用であり得る修飾塩基の例には、以下のものが含まれる。
【化１７】
2021529548.tif 000018
【０１２０】
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができるビオチン修飾塩基の例には、以下のものが含まれる。
【化１８】
2021529548.tif 000019
塩基＝アルキンまたはアルケンリンカーを有するＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである。
【０１２１】
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができるフルオロフォアおよびクエンチャーを担持する塩基の例には、以下のものが含まれる。
【化１９】
2021529548.tif 000020
【０１２２】
ヌクレオチド組み込み酵素
ヌクレオチドの付加により、二本鎖ポリヌクレオチド分子の一本鎖ポリヌクレオチド部分を伸長することができる、かつ／または平滑末端二本鎖ポリヌクレオチド分子の一本鎖を伸長することができる酵素が利用可能である。これには、鋳型非依存性ポリメラーゼまたは鋳型非依存性トランスフェラーゼ活性など、鋳型非依存性酵素活性を有する酵素が含まれる。
【０１２３】
したがって、本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端への、所定の配列の第２のヌクレオチドおよび／または所定の配列のさらなるヌクレオチドの付加に使用される酵素は、鋳型非依存性ポリメラーゼまたは鋳型非依存性トランスフェラーゼ活性などの鋳型非依存性酵素活性を有する。
【０１２４】
本明細書に記載される方法を使用して、所定のヌクレオチドを付加するために任意の好適な酵素を用いることができる。したがって、ポリメラーゼまたはトランスフェラーゼ酵素の使用に関して本明細書に定義および記載される全ての方法において、ポリメラーゼまたはトランスフェラーゼ酵素は、本発明の方法の文脈においてポリメラーゼまたはトランスフェラーゼ酵素と同じ機能を果たすことができる別の酵素と置換され得る。
【０１２５】
ポリメラーゼ酵素を、本明細書に記載される方法に用いることができる。ポリメラーゼ酵素は、本明細書に記載されるように、修飾ヌクレオチド、具体的には、付着した可逆的ターミネーター基を有するヌクレオチドを組み込むそれらの能力に基づいて選択され得る。本明細書に記載される例示的な方法において、ＤＮＡに作用する全てのポリメラーゼは、３’〜５’のエキソヌクレアーゼ活性を有してはならない。ポリメラーゼは、鎖置換活性を有し得る。
【０１２６】
したがって、好ましくは、ポリメラーゼは、未修飾ポリメラーゼと比較して、可逆的ターミネーター基を含むヌクレオチドを組み込む能力が増強された修飾ポリメラーゼである。ポリメラーゼは、より好ましくは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎ、好ましくは種９°Ｎ−７由来の天然ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子操作されたバリアントである。修飾されたポリメラーゼの例は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓから入手可能なＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼである。この酵素は、３’−Ｏ修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が向上している。
【０１２７】
本発明の方法のうちのいずれにおいても可逆的ターミネーターｄＮＴＰの組み込みに使用することができる他のポリメラーゼの例は、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（エキソ）、Ｖｅｎｔ（エキソ）、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片（エキソ）、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびＴａｑポリメラーゼである。
【０１２８】
本発明の方法のうちのいずれにおいても可逆的ターミネーターＮＴＰの組み込みに使用することができる他のポリメラーゼの例は、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、ｐｏｌラムダ、ｐｏｌマイクロ、またはΦ２９ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１２９】
ＤＮＡを含むこのようなポリヌクレオチド合成分子の伸長のために、ＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。任意の好適なＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
【０１３０】
ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ全長、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ大（Ｋｌｅｎｏｗ）断片、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素活性を有する酵素、例えば、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素であり得る。
【０１３１】
ＤＮＡポリメラーゼは、３’〜５’のエキソヌクレアーゼ活性を欠いている場合がある。任意のこのような好適なポリメラーゼ酵素を使用することができる。このようなＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ全長、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ大断片、ＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ大（クレノウ）断片（３’→５’エキソ）、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼであり得る。
【０１３２】
ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を保有し得る。任意のこのような好適なポリメラーゼ酵素を使用することができる。このようなＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ大断片、ＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ大（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（３’→５’エキソ）、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼであり得る。
【０１３３】
ＤＮＡポリメラーゼは、３’〜５’のエキソヌクレアーゼ活性を欠いている場合があり、鎖置換活性を保有し得る。任意のこのような好適なポリメラーゼ酵素を使用することができる。このようなＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ大（Ｋｌｅｎｏｗ）断片、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素であり得る。
【０１３４】
ＤＮＡポリメラーゼは、５’〜３’のエキソヌクレアーゼ活性を欠いている場合がある。任意のこのような好適なポリメラーゼ酵素を使用することができる。このようなＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ大断片、ＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ大（Ｋｌｅｎｏｗ）断片、ＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ大（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（３’→５’エキソ）、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼであり得る。
【０１３５】
ＤＮＡポリメラーゼは、３’〜５’および５’〜３’の両方のエキソヌクレアーゼ活性を欠いている場合があり、鎖置換活性を保有し得る。任意のこのような好適なポリメラーゼ酵素を使用することができる。このようなＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ大断片、ＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ大（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（３’→５’エキソ）、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素であり得る。
【０１３６】
ＤＮＡポリメラーゼはまた、遺伝子操作されたバリアントであり得る。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、種９°Ｎ−７などのＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎ由来の天然ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子操作されたバリアントであり得る。このような修飾ポリメラーゼの一例は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓから入手可能なＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼまたはＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼである。他の操作またはバリアントＤＮＡポリメラーゼには、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（エキソ）、Ｖｅｎｔ（エキソ）、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片（エキソ）、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびＴａｑポリメラーゼが含まれる。
【０１３７】
ＲＮＡを含むこのようなポリヌクレオチド合成分子の伸長のために、任意の好適な酵素を使用することができる。例えば、ＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。任意の好適なＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。
【０１３８】
ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素であり得る。
【０１３９】
酵素は、末端トランスフェラーゼ活性を有し得、例えば、酵素は、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、または末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼであり得、ポリヌクレオチド合成分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡを含むポリヌクレオチド分子を形成するように伸長される。これらの酵素のうちのいずれも、ポリヌクレオチド合成分子の伸長が必要とされる本発明の方法で使用され得る。
【０１４０】
このような酵素の１つは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）などの末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素である（例えば、Ｍｏｔｅａ  ｅｔ  ａｌ，２０１０；Ｍｉｎｈａｚ  Ｕｄ−Ｄｅａｎ，Ｓｙｓｔ．Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，２００８，２（３−４），６７−７３を参照されたい）。ＴｄＴは、ヌクレオシド三リン酸基質（ＮＴＰまたはｄＮＴＰ）からのヌクレオチド分子（ヌクレオシド一リン酸）のポリヌクレオチド合成分子への付加を触媒することができる。ＴｄＴは、天然および非天然ヌクレオチドの付加を触媒することができる。また、ヌクレオチド類似体の付加を触媒することもできる（Ｍｏｔｅａ  ｅｔ  ａｌ，２０１０）。Φ２９ＤＮＡポリメラーゼと同様に、ＰｏｌラムダおよびＰｏｌマイクロ酵素も使用することができる（Ｒａｍａｄａｎ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００４，３３９（２），３９５−４０４）。
【０１４１】
末端トランスフェラーゼ酵素（例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ；ＴｄＴ）の作用による鋳型の非存在下での一本鎖ポリヌクレオチド分子（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方）を伸長して、人工的に合成された一本鎖ポリヌクレオチド分子を作成するための技術は、当該技術分野で広く議論されている。このような技術は、例えば、特許出願公開ＷＯ２０１６／０３４８０７、ＷＯ２０１６／１２８７３１、ＷＯ２０１６／１３９４７７、およびＷＯ２０１７／００９６６３、ならびにＵＳ２０１４／０３６３８５２、ＵＳ２０１６／００４６９７３、ＵＳ２０１６／０１０８３８２、およびＵＳ２０１６／０１６８６１１に開示されている。これらの文書は、人工的に合成された一本鎖ポリヌクレオチド分子を作成するためのＴｄＴの作用による一本鎖ポリヌクレオチド合成分子の制御された伸長を記載している。このような酵素を使用する天然および非天然／人工ヌクレオチドによる伸長は、修飾ヌクレオチド、例えば、ブロッキング基を組み込んだヌクレオチドによる伸長と同様に記載されている。これらの文書に開示されている末端トランスフェラーゼ酵素のうちのいずれも、その任意の酵素断片、誘導体、類似体、または機能的等価物と同様に、末端トランスフェラーゼ機能が酵素に保存されているという条件で、本発明の方法に適用することができる。
【０１４２】
指向進化技術、従来のスクリーニング、合理的または半合理的な工学／突然変異誘発法または任意の他の適切な方法を使用して、必要な機能を提供および／または最適化するために任意のこのような酵素を変更することができる。鋳型を使用せずに、ヌクレオチドを用いて、ＤＮＡもしくはＲＮＡを含む分子などの一本鎖ポリヌクレオチド分子部分、または平滑末端分子の１つの鎖を伸長することができる任意の他の酵素を使用することができる。
【０１４３】
したがって、本明細書で定義される方法のうちのいずれにおいても、ＤＮＡを含む一本鎖ポリヌクレオチド合成分子部分、またはＤＮＡを含む平滑末端二本鎖ポリヌクレオチドは、鋳型非依存性ポリメラーゼまたはトランスフェラーゼ活性などの鋳型非依存性酵素活性を有する酵素によって伸長され得る。酵素は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素活性、例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）などのデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素、またはその酵素断片、誘導体、類似体、もしくは機能的等価物を有し得る。このような酵素の作用によって伸長されたポリヌクレオチド合成分子は、ＤＮＡを含む。
【０１４４】
本明細書で定義される方法のうちのいずれにおいても、ＲＮＡを含むポリヌクレオチド合成分子の一本鎖部分、またはＲＮＡを含む平滑末端二本鎖ポリヌクレオチドは、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素（例えば、ＴｄＴを含む）を有する酵素、またはその酵素断片、誘導体、類似体、もしくは機能的等価物によって伸長され得る。このような酵素の作用によって伸長されたポリヌクレオチド合成分子は、ＲＮＡを含み得る。ＲＮＡを含む一本鎖ポリヌクレオチド合成分子、またはＲＮＡを含むポリヌクレオチド合成分子の一本鎖部分の合成には、任意の好適なヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を使用することができる。ポリ（Ｕ）ポリメラーゼおよびポリ（Ａ）ポリメラーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来）などのヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチド合成分子へのヌクレオシド一リン酸ユニットの鋳型非依存性付加が可能である。これらの酵素のうちのいずれも、その任意の酵素断片、誘導体、類似体、または機能的等価物と同様に、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ機能が酵素に保存されているという条件で、本発明の方法に適用することができる。指向進化技術、従来のスクリーニング、合理的または半合理的な工学／突然変異誘発法または任意の他の適切な方法を使用して、必要な機能を提供および／または最適化するために任意のこのような酵素を変更することができる。
【０１４５】
可逆的ターミネーター基
本明細書に定義および記載される本発明の合成方法のうちのいずれにおいても、ポリメラーゼ酵素またはトランスフェラーゼ酵素の作用によって合成鎖に組み込まれるヌクレオチドは、好ましくは、本明細書に記載されるような可逆的ターミネーター基とも称される、１つ以上の可逆的ブロッキング基を含むヌクレオチドとして組み込まれる。
【０１４６】
このような基は、所与の合成サイクルにおいて酵素によるさらなる伸長を防止するように作用し、その結果、所定の配列の１つのヌクレオチドのみが合成鎖を伸長させるために制御可能に使用され得、したがって非特異的ヌクレオチドの組み込みが防止される。この効果を達成する任意の機能性は、本明細書に定義および記載される方法のうちのいずれにおいても使用され得る。ヌクレオチドに付着した可逆的ブロッキング基／可逆的ターミネーター基および脱ブロッキング工程は、この効果を達成するための好ましい手段である。しかしながら、この効果は、必要に応じて代替的な手段によっても達成され得る。
【０１４７】
所与のサイクルにおけるヌクレオチドの合成鎖への組み込み後の酵素によるさらなる伸長を防止し、合成鎖への組み込みを工程当たり１つのヌクレオチドに制限するために、任意の好適な可逆的ブロッキング基をヌクレオチドに付着させることができる。本発明のうちのいずれの方法においても、可逆的ブロッキング基は、好ましくは、ポリメラーゼ酵素によるさらなる伸長を防止するように作用する可逆的ターミネーター基である。可逆的ターミネーターの例を以下に提供する。
【０１４８】
プロパルギル可逆的ターミネーター：
【化２０】
2021529548.tif 000021
アリル可逆的ターミネーター：
【化２１】
2021529548.tif 000022
シクロオクテン可逆的ターミネーター：
【化２２】
2021529548.tif 000023
シアノエチル可逆的ターミネーター：
【化２３】
2021529548.tif 000024
ニトロベンジル可逆的ターミネーター：
【化２４】
2021529548.tif 000025
ジスルフィド可逆的ターミネーター：
【化２５】
2021529548.tif 000026
アジドメチル可逆的ターミネーター：
【化２６】
2021529548.tif 000027
アミノアルコキシ可逆的ターミネーター：
【化２７】
2021529548.tif 000028
【０１４９】
塩基に付着したかさ高い基を有するヌクレオシド三リン酸は、３’−ヒドロキシ基上の可逆的ターミネーター基の代替物として機能し得、さらなる組み込みをブロックすることができる。この基は、ＴＣＥＰまたはＤＴＴ生産天然ヌクレオチドによって脱保護することができる。
【化２８】
2021529548.tif 000029
【０１５０】
本発明の方法のうちのいずれかに従ってＤＮＡポリヌクレオチドを合成するために、好ましい修飾ヌクレオシドは、３’−Ｏ−修飾−２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−Ｏ−三リン酸である。本発明の方法のうちのいずれかに従ってＲＮＡポリヌクレオチドを合成するために好ましい修飾ヌクレオシドは、３’−Ｏ−修飾リボヌクレオシド−５’−Ｏ−三リン酸である。
【０１５１】
好ましい修飾ｄＮＴＰは、３’−Ｏ−アリル−ｄＮＴＰおよび３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰである修飾ｄＮＴＰである。
【０１５２】
３’−Ｏ−アリル−ｄＮＴＰを以下に示す。
【化２９】
2021529548.tif 000030
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰを以下に示す。
【化３０】
2021529548.tif 000031
【０１５３】
本明細書に記載および定義される本発明の方法は、脱保護または脱ブロッキング工程を指す場合がある。このような工程は、任意の好適な手段による可逆的ブロッキング基（例えば、可逆的ターミネーター基）の除去、または別様に、酵素／ポリメラーゼによるさらなる伸長を阻害するためにブロッキング基／ターミネーター基の機能性を逆転させることを伴う。
【０１５４】
脱保護工程において、任意の好適な試薬を使用して可逆的ターミネーター基を除去することができる。
【０１５５】
好ましい脱保護剤は、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。ＴＣＥＰを使用して、組み込み後に（Ｐｄ０と共に）３’−Ｏ−アリル−ヌクレオチドおよび３’−Ｏ−アジドメチル−ヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去することができる。
【０１５６】
脱保護試薬の例を以下に提供する。
プロパルギル可逆的ターミネーター：
Ｐｄ触媒による処理−Ｎａ２ＰｄＣｌ４、ＰｄＣｌ２。
リガンド、例えば、トリフェニルホスフィン−３，３’，３’’−トリスルホン酸三ナトリウム塩を使用することができる。
アリル可逆的ターミネーター：
Ｐｄ触媒による処理−Ｎａ２ＰｄＣｌ４、ＰｄＣｌ２。
リガンド、例えば、トリフェニルホスフィン−３，３’，３’’−トリスルホン酸三ナトリウム塩を使用することができる。
アジドメチル可逆的ターミネーター：
チオール（メルカプトエタノールまたはジチオトレイトール）、またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−ＴＣＥＰによる処理。
シアノエチル可逆的ターミネーター：
フッ化物−フッ化アンモニウム、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）による処理。
ニトロベンジル可逆的ターミネーター：
ＵＶ光への曝露
ジスルフィド可逆的ターミネーター：
チオール（メルカプトエタノールまたはジチオトレイトール）、またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−ＴＣＥＰによる処理。
アミノアルコキシ可逆的ターミネーター：
亜硝酸塩（ＮＯ２−、ＨＮＯ２）による処理ｐＨ＝５．５
【０１５７】
可逆的ブロッキング基（例えば、可逆的ターミネーター基）は、可逆的ターミネーター基の除去後のさらなる組み込みを防止するために組み込み工程からの不要な試薬が除去されるという条件で、組み込み工程の直後に行われる工程によって除去することができる。
【０１５８】
ポリヌクレオチド連結分子
足場ポリヌクレオチドの存在および連結工程を必要とする方法において、ポリヌクレオチド連結分子の構成および構造の選択はまた、用いられる具体的な方法に依存する。ポリヌクレオチド連結分子は、一般に、本明細書に記載されるような支持鎖および本明細書に記載されるようなヘルパー鎖を含む。ポリヌクレオチド連結分子は、分子の一方の末端に相補的連結末端を含む。ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、足場ポリヌクレオチドの末端に連結される。
【０１５９】
ポリヌクレオチド連結分子の相補性連結末端には、ヘルパー鎖中に連結不可能な末端ヌクレオチド、典型的には非リン酸化末端ヌクレオチドが提供される。これにより、合成鎖のヘルパー鎖部分の合成鎖のプライマー鎖部分への連結が防止され、よって連結後に合成鎖において一本鎖切断が作成される。合成鎖における連結を防止するための代替的な手段を使用することもできる。例えば、ブロッキング部分は、ヘルパー鎖中の末端ヌクレオチドに付着し得る。さらに、本明細書にさらに記載されるように、ヘルパー鎖は、切断の前に、例えば変性によって足場分子から除去され得る。ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端には、ヘルパー鎖中の連結不可能な末端ヌクレオチドに隣接する支持鎖中に連結可能な末端ヌクレオチドが提供される。支持鎖の連結可能な末端ヌクレオチドは、リガーゼ酵素の作用によって足場分子に組み込まれる所定の配列の第１のヌクレオチドである。ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端にはまた、支持鎖においてユニバーサルヌクレオチドが提供される。支持鎖の連結可能な末端ヌクレオチドに対する支持鎖におけるユニバーサルヌクレオチドの正確な位置付けは、特定の方法のバージョンおよびそれらの変形例の説明から明らかになるように、用いられる特定の反応化学に依存する。
【０１６０】
本明細書に記載される例示的な方法および図中のそれらの描写を参照することによって、ポリヌクレオチド連結分子の適切な構造を容易に確認することができる。
【０１６１】
連結
連結工程を伴う本発明の方法において、連結は、任意の好適な手段を使用して達成され得る。好ましくは、連結工程は、リガーゼ酵素によって行われるであろう。リガーゼは、一塩基突出基質に対する活性が増強された修飾リガーゼであり得る。リガーゼは、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼであり得る。リガーゼは平滑ＴＡリガーゼであり得る。例えば、平滑ＴＡリガーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ）から入手可能である。これは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼと、連結エンハンサーと、平滑末端および一塩基突出基質の両方の連結および形質転換を改善するために特別に調製された最適化反応緩衝液との、すぐに使用できるマスターミックス溶液である。一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドを連結（接合）するための分子、酵素、化学物質、および方法は、当業者に周知である。
【０１６２】
足場ポリヌクレオチドの切断
足場ポリヌクレオチドの存在および切断工程を必要とする方法において、切断工程を行うための試薬の選択は、用いられる具体的な方法に依存する。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドの具体的な配列によって定義される。したがって、本明細書に記載される例示的な方法を参照することによって容易に明らかになるように、所望の切断部位の構成および適切な切断試薬の選択は、その方法で用いられる特定の化学に依存するであろう。
【０１６３】
修飾塩基を認識するＤＮＡ切断酵素のいくつかの例を以下の表に示す。
【表１】
2021529548.tif 000032
【０１６４】
合成鎖
限定されないが、図１〜２およびさらに本明細書に記載されるような本発明の合成方法のバージョンの１および２ならびにそれらの変形例を含む、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを合成する方法において、足場ポリヌクレオチドには、合成鎖が提供される。合成鎖はプライマー鎖部分を含む。合成サイクル中に、所定の配列の各新たな第２のヌクレオチドが、プライマー鎖部分の伸長によって合成鎖に組み込まれ、所定の配列の第１のヌクレオチドが支持鎖に組み込まれる。ポリメラーゼ酵素または末端トランスフェラーゼ活性を有する酵素などの酵素を使用して、各新たな第２のヌクレオチドの組み込み／付加を触媒することができる。所定の配列の各新たに組み込まれた第２のヌクレオチドは、次の組み込み工程におけるプライミング組み込みで使用するためのプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドとして作用する。したがって、任意の所与の合成サイクルにおいて、合成鎖のプライマー鎖部分は、適切な酵素によるプライミングを可能にするのに十分なポリヌクレオチド配列を含む。さらに本明細書に記載されるある特定の実施形態において、所与の合成サイクルにおいて、所定の配列の第２のヌクレオチドは、合成鎖に組み込まれ、続いて、１つ以上のさらなるヌクレオチドの合成鎖に組み込まれる。このような実施形態において、所定の配列の第２のヌクレオチドおよびさらなるヌクレオチドは、可逆的ターミネーター基を含み、本方法は、組み込み後、および次のヌクレオチドの組み込み前に、ヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去する工程を追加的に含む。
【０１６５】
ヌクレオチドの「組み込み」、「伸長」、および「付加」という用語は、本明細書において同じ意味を有することが意図される。
【０１６６】
ヘルパー鎖
ヘルパー鎖は、連結工程でポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結を容易にするために、ポリヌクレオチド連結分子に提供され得る。ヘルパー鎖はまた、切断工程で切断酵素（複数可）の結合を促進し得る。必要に応じて、切断工程での切断酵素（複数可）の結合を確実にし、連結工程での連結を確実にするために代替的な手段が提供されるという条件で、ヘルパー鎖が削除され得る。本発明の好ましい方法において、ポリヌクレオチド連結分子にはヘルパー鎖が提供される。
【０１６７】
ヘルパー鎖が必要に応じてリガーゼおよび切断酵素（複数可）の結合を促進するのに好適であるという条件で、ヘルパー鎖の長さ、配列、および構造のパラメーターに関する特別な要件はない。
【０１６８】
ヘルパー鎖は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体／誘導体および／または非ヌクレオチドを含み得る。
【０１６９】
好ましくは、ヘルパー鎖の配列の領域内で、支持鎖とのミスマッチは回避されるべきであり、ＧＣおよびＡＴに富む領域は回避されるべきであり、加えて、ヘアピンまたはバルジなどの二次構造の領域は回避されるべきである。
【０１７０】
ヘルパー鎖の長さは１０塩基以上であり得る。任意に、ヘルパー鎖の長さは、１５塩基以上、好ましくは３０塩基以上であり得る。しかしながら、ヘルパー鎖が切断および／または連結を促進することができるという条件で、ヘルパー鎖の長さは変化し得る。
【０１７１】
ヘルパー鎖は支持鎖の対応する領域にハイブリダイズされなければならない。ヘルパー鎖が連結工程におけるリガーゼ酵素の結合および／または切断工程における切断酵素（複数可）の結合を促進することができるという条件で、ヘルパー鎖の全体が支持鎖の対応する領域にハイブリダイズされることは必須ではない。したがって、ヘルパー鎖と支持鎖の対応する領域との間のミスマッチは許容され得る。ヘルパー鎖は支持鎖の対応する領域よりも長い場合がある。支持鎖は、プライマー鎖に対して遠位方向において、ヘルパー鎖に対応する領域を越えて伸長し得る。ヘルパー鎖は、例えばヘアピンを介して、支持鎖の対応する領域に接続され得る。
【０１７２】
ヘルパー鎖は、ニックの部位のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドがニックの部位のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに対して合成鎖中の次の逐次ヌクレオチド位置を占めるように支持鎖にハイブリダイズされ得る。したがって、この構成では、ヘルパー鎖とプライマー鎖との間にヌクレオチド位置ずれはない。それにもかかわらず、ヘルパー鎖およびプライマー鎖は、一本鎖の切断またはニックの存在のために物理的に分離されるであろう。
【０１７３】
ユニバーサルヌクレオチドと対合するヘルパー鎖中のヌクレオチドは、任意の好適なヌクレオチドであり得る。好ましくは、分子のらせん構造を歪める可能性がある対合は回避されるべきである。好ましくは、シトシンはユニバーサルヌクレオチドに対するパートナーとして作用する。特に好ましい実施形態では、ユニバーサルヌクレオチドは、イノシン、またはその類似体、バリアント、もしくは誘導体であり、ヘルパー鎖中のユニバーサルヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドはシトシンである。
【０１７４】
ヘルパー鎖の除去
本明細書に記載される本発明の合成方法のうちのいずれにおいても、所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込み工程の前に、ポリヌクレオチド連結分子によって提供されるヘルパー鎖が、足場ポリヌクレオチドから除去され得る。
【０１７５】
合成鎖のヘルパー鎖部分は、これらに限定されないが、（ｉ）足場ポリヌクレオチドを約８０℃〜約９５℃の温度に加熱し、足場ポリヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉ）足場ポリヌクレオチドを８Ｍ尿素などの尿素溶液で処理し、足場ポリヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉｉ）足場ポリヌクレオチドを１００％ホルムアミドなどのホルムアミドまたはホルムアミド溶液で処理し、足場ポリヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、または（ｉｖ）足場ポリヌクレオチドを、ヘルパー鎖部分の配列と相補的であるヌクレオチド配列の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子と接触させて、それによりヘルパー鎖部分と足場ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを競合的に阻害することを含む任意の手段によって、足場ポリヌクレオチドから除去され得る。
【０１７６】
二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程の後、および足場ポリヌクレオチドの切断の工程の前に、ヘルパー鎖部分を足場ポリヌクレオチドから除去する方法において、切断工程は、ヘルパー鎖によって提供される二本鎖領域の不在下で支持鎖を切断することを含む。本明細書に開示される任意の好適な酵素から選択されるものなど、任意の好適な酵素を、このような切断工程を行うために選択することができる。
【０１７７】
プライマー鎖
プライマー鎖部分は、ポリメラーゼ酵素または末端トランスフェラーゼ活性を有する酵素などの酵素が合成を開始できるようにする、すなわち、プライマー鎖部分の末端での新たなヌクレオチドの付加を触媒するのに好適であるべきである。
【０１７８】
プライマー鎖は、新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得る（例えば、図１〜６の各々に示される構造において点線で示されるような）配列の領域を含み得る。プライマー鎖は、新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得る配列の領域からなる場合があり、したがって、プライマー鎖の全体は、本明細書に記載されるような新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得る配列であり得る。
【０１７９】
プライマー鎖が新たなポリヌクレオチド合成を開始するのに好適であるという条件で、プライマー鎖の長さ、配列、および構造のパラメーターについて特別な要件はない。
【０１８０】
プライマー鎖は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体／誘導体および／または非ヌクレオチドを含み得る。
【０１８１】
当業者は、新たなポリヌクレオチド合成を開始することができるプライマー鎖を容易に構築することができる。したがって、新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得るプライマー鎖の配列領域内では、支持鎖とのミスマッチは回避されるべきであり、ＧＣおよびＡＴに富む領域は回避されるべきであり、加えて、ヘアピンまたはバルジなどの二次構造の領域は回避されるべきである。
【０１８２】
新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得るプライマー鎖の配列領域の長さは、好みおよび使用されるポリメラーゼ酵素に応じて当業者が選択することができる。この領域の長さは、７塩基以上、８塩基以上、９塩基以上、または１０塩基以上であり得る。任意に、この領域の長さは、１５塩基以上、好ましくは３０塩基以上であろう。
【０１８３】
プライマー鎖は支持鎖の対応する領域にハイブリダイズされなければならない。プライマー鎖が新たなポリヌクレオチド合成を開始することができるという条件で、プライマー鎖の全体が支持鎖の対応する領域にハイブリダイズされることは必須ではない。したがって、ヘルパー鎖と支持鎖の対応する領域との間のミスマッチは、ある程度許容され得る。好ましくは、新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得るプライマー鎖の配列領域は、支持鎖中の対応する核酸塩基に相補的な核酸塩基を含むべきである。
【０１８４】
ヘルパー鎖は、例えばヘアピンを介して、支持鎖の対応する領域に接続され得る。
【０１８５】
支持鎖
限定されないが、本発明の合成方法のバージョン１および２ならびにそれらの変形例を含む本発明の方法では、上記に記載されるように、足場ポリヌクレオチドには、支持鎖が提供される。支持鎖は合成鎖にハイブリダイズされる。上記に記載されるように、支持鎖がプライマー鎖部分と適合し、存在する場合、上記に記載されるように、合成鎖のヘルパー鎖部分と適合するという条件で、支持鎖の長さ、配列、および構造のパラメーターについて特別な要件はない。
【０１８６】
合成ポリヌクレオチド
本明細書に記載される方法に従って合成された所定の配列を有するポリヌクレオチドは二本鎖である。合成されたポリヌクレオチドは全体として二本鎖であり、第１の鎖は、ハイブリダイゼーションによって第２の鎖に付着している。第１の鎖が全体としてハイブリダイゼーションによって第２の鎖に付着しているという条件で、非ハイブリダイゼーションのミスマッチおよび領域は許容され得る。
【０１８７】
ハイブリダイゼーションは、中程度にストリンジェントまたはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件によって定義され得る。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、５倍塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、約５０％ホルムアミドのハイブリダイゼーション緩衝液、６倍ＳＳＣ、および５５℃のハイブリダイゼーション温度（または、約５０％ホルムアミドを含み、ハイブリダイゼーション温度が４２℃のような他の同様のハイブリダイゼーション溶液）を含む事前洗浄溶液、ならびに０．５倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、６０℃の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４５℃で、６ｘＳＳＣでハイブリダイズし、続いて６８℃で、０．１ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで１回以上洗浄する。
【０１８８】
本明細書に記載される方法に従って合成された所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドとして保持され得る。代替的に、二本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖を分離して、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖の分離（溶解）を可能にする条件は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５））。
【０１８９】
本明細書に記載される方法に従って合成された所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドは、合成後に増幅され得る。二本鎖ポリヌクレオチドのいかなる領域も増幅され得る。二本鎖ポリヌクレオチドの全体またはいかなる領域も、足場ポリヌクレオチドの全体またはいかなる領域と一緒に増幅され得る。二本鎖ポリヌクレオチドの増幅を可能にする条件は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５））。したがって、本明細書に記載される合成方法のうちのいずれも、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドまたはその任意の領域が上記に記載されるように増幅される増幅工程をさらに含み得る。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼらせん反応（ＰＳＲ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立配列複製（３ＳＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、分岐増幅法（ＲＡＭ）などの任意の好適な方法によって行われ得る。好ましくは、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる。
【０１９０】
本明細書に記載される方法に従って合成された所定の配列を有する二本鎖または一本鎖ポリヌクレオチドは、任意の長さであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも３５０個、少なくとも４００個、少なくとも４５０個、または少なくとも５００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の長さであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、約１０〜約１００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対、約１０〜約２００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対、約１０〜約３００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対、約１０〜約４００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対、および約１０〜約５００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の長さであり得る。ポリヌクレオチドは、最大１０００個以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対、最大５０００個以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さ、または約１０００００以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さであり得る。
【０１９１】
ＲＮＡ合成
ＤＮＡ合成について記載される方法はＲＮＡの合成に適応され得る。１つの適応において、本発明の合成方法のバージョン１および２ならびにそれらの変形例について記載された合成工程が適応され得る。したがって、合成方法のバージョン１および２ならびにそれらの変形例の各々において、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、上記に記載されるように、ＤＮＡ鎖である。足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分はＲＮＡ鎖である。ヘルパー鎖は、存在する場合、ＲＮＡ鎖であり得る。ヘルパー鎖は、存在する場合、ＤＮＡ鎖であり得る。
【０１９２】
ヌクレオチドは、上記に記載されるように、可逆的ターミネーター基を含むように修飾され得るリボヌクレオシド−５’−Ｏ−三リン酸（ＮＴＰ）から組み込まれ得る。好ましくは３’−Ｏ−修飾リボヌクレオシド−５’−Ｏ−三リン酸が使用される。修飾ヌクレオチドはＲＮＡポリメラーゼの作用によって組み込まれる。
【０１９３】
したがって、本発明の合成方法のバージョン１〜５に関する説明は、ＲＮＡ合成に必要な変更を加えて適用することができるが、説明されるように適応され得る。
【０１９４】
図３２および３３は、それぞれ図７および８に示されるような実施例のＤＮＡ合成法のバージョン１および２の適応であるＲＮＡ合成のための反応スキームを説明する。図１〜６に示されるように、本発明の方法のバージョン１および２ならびにそれらの変形例は、同じ方法で適応され得る。
【０１９５】
ＲＮＡ合成のために適応される方法のうちのいずれにおいても、支持鎖、プライマー鎖、ヘルパー鎖、ポリヌクレオチド連結分子、およびユニバーサルヌクレオチドの上記の説明は、必要な変更を加えて適用することができるが、説明されるように適応され得る。ユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖はＤＮＡ鎖であるため、以前に記載されるような切断工程および切断位置は、必要な変更を加えて適用することができる。好ましい実施形態では、ＳｐｌｉｎｔＲ  ＤＮＡリガーゼが連結工程において使用される。
【０１９６】
固相合成
本発明の合成方法に従って生産された合成ポリヌクレオチドは、好ましくは固相または可逆的固相技術を使用して合成することができる。様々なこのような技術が当該技術分野において知られており、また、使用され得る。所定の配列の新たな二本鎖ポリヌクレオチドの合成を開始する前に、足場ポリヌクレオチドを表面、例えば、ガラスなどの平坦な表面、ゲル系材料、またはビーズもしくは官能化量子ドットなどの微粒子の表面に固定化し得る。表面を構成する材料自体が基質に結合され得る。例えば、足場ポリヌクレオチドは、例えばポリアクリルアミドなどのゲル系材料に固定化され得、ゲル系材料は、ガラスなどの支持基質に結合されている。
【０１９７】
ポリヌクレオチドは、直接または間接的に表面に固定化または繋留され得る。例えば、それらは化学結合によって表面に直接取り付けられ得る。それらは、以下に記載されるように、例えば、ＳＰＲＩにおけるような、またはエレクトロウェッティングシステムにおけるような、微粒子もしくはビーズの表面などの中間表面を介して表面に間接的に繋留され得る。次に、新たに合成されたポリヌクレオチドを組み込んでいる足場ポリヌクレオチドが固定化されている間に、合成サイクルを開始し、完了させることができる。
【０１９８】
このような方法において、二本鎖足場ポリヌクレオチドは、所定の配列の第１のヌクレオチドの組み込みの前に表面に固定化され得る。したがって、このような固定化された二本鎖足場ポリヌクレオチドは、合成中および合成後に、所定の配列の二本鎖ポリヌクレオチドを表面に繋留するためのアンカーとして作用し得る。
【０１９９】
このような二本鎖アンカー／足場ポリヌクレオチドの一方の鎖のみが、分子の同じ末端の表面に固定化され得る。代替的に、二本鎖アンカー／足場ポリヌクレオチドの両方の鎖が、それぞれ分子の同じ末端で表面に固定化され得る。二本鎖アンカー／足場ポリヌクレオチドには、新たな合成の開始部位と反対の末端のヘアピンループなどを介して、隣接する末端で接続された各鎖が提供され得、接続された末端は、表面上に固定化され得る（例えば、図１２に概略的に示されるように）。
【０２００】
足場ポリヌクレオチドを伴う方法において、本明細書に記載されるように、足場ポリヌクレオチドは、所定の配列における第１のヌクレオチドの組み込みの前に表面に付着し得る。したがって、図１２（ａ）および（ｃ）に示されるように、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とを、両方とも別々に表面に付着させることができる。図１２（ｂ）および（ｄ）に示されるように、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ヘアピンループなどを介して、隣接する末端で、例えば、新たな合成の開始部位と反対の末端で接続され得、接続された末端は表面に繋留され得る。図１２（ｅ）〜（ｈ）に示されるように、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分との一方または他方を、別々に表面に付着させることができる。好ましくは、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが表面に付着している。
【０２０１】
平坦な表面上での固相合成
所定の配列の新たな二本鎖ポリヌクレオチドの合成を開始する前に、合成アンカー／足場ポリヌクレオチドを、本明細書に記載されるものを含む当該技術分野で既知の方法によって合成し、表面に繋留させることができる。
【０２０２】
予め形成されたポリヌクレオチドを、平坦な表面に付着した核酸マイクロアレイを作成するために一般的に用いられる方法によって表面に繋留させることができる。例えば、アンカー／足場ポリヌクレオチドを作成し、次に、平坦な表面上にスポットまたは印刷することができる。アンカー／足場ポリヌクレオチドは、接触印刷技術を使用して表面上に堆積させることができる。例えば、中実または中空のチップまたはピンを、予め形成された足場ポリヌクレオチドを含む溶液に浸漬し、平坦な表面と接触させることができる。代替的に、オリゴヌクレオチドをマイクロスタンプ上に吸着させ、次に、物理的接触によって平坦な表面に転写することができる。非接触印刷技術としては、サーマル印刷または圧電印刷が挙げられ、予め形成された足場ポリヌクレオチドを含むサブナノリットルサイズの微小液滴を、インクジェットおよびバブルジェット印刷に使用される方法と同様の方法を使用して印刷チップから射出することができる。
【０２０３】
一本鎖オリゴヌクレオチドは、マイクロアレイを作成するために用いられる、いわゆる「オンチップ」方法を使用するなど、平坦な表面上で直接合成することができる。次に、このような一本鎖オリゴヌクレオチドは、予め形成されたアンカー／足場ポリヌクレオチドを固定化するための付着部位として作用し得る。
【０２０４】
一本鎖オリゴヌクレオチドを生成するためのオンチップ技術は、保護されたヌクレオチドを選択的に活性化して、その後の新たな保護されたヌクレオチドの組み込みを可能にするためのフォトリソグラフィマスクを通して向けられるＵＶ光の使用を伴うフォトリソグラフィを含む。ＵＶ媒介脱保護および予め判定されたヌクレオチドの結合のサイクルは、所望の配列を有するオリゴヌクレオチドのインサイチュ生成を可能にする。フォトリソグラフィマスクの使用に対する代替物として、インクジェット印刷技術を使用した核酸塩基の逐次堆積、ならびに所望の配列を有するオリゴヌクレオチドを生成するための結合、酸化、および脱保護のサイクルの使用によって、オリゴヌクレオチドを平坦な表面上に作成し得る（レビューのために、Ｋｏｓｕｒｉ  ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４，１１，４９９−５０７を参照されたい）。
【０２０５】
以下に記載されるような可逆的固定化を伴う方法を含む、本明細書に記載される合成方法のうちのいずれにおいても、表面は任意の好適な材料で作成され得る。典型的には、表面は、シリコン、ガラス、またはポリマー材料を含み得る。表面は、約２％のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面、任意にＮ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面などのゲル表面を含むことができ、好ましくはポリアクリルアミド表面は、ガラスなどの固体支持体に結合されている。
【０２０６】
可逆的固定化
所定の配列を有する合成ポリヌクレオチドは、可逆的固定化を促進する、微粒子およびビーズなどの結合表面および結合構造を使用して本発明に従って合成することができる。固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）方法または改良された方法が、当該技術分野において既知であり、用いることができる（例えば、ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ  Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３（２２）：４７４２−４７４３を参照されたい）。
【０２０７】
表面は、常磁性ビーズなどの微粒子の形態で提供され得る。常磁性ビーズは磁場の影響下で凝集する場合がある。例えば、常磁性表面には、化学基、例えばカルボキシル基が提供され得、これは、以下により詳細に記載されるように、適切な付着条件下で、核酸に対する結合部分として作用するであろう。核酸は、このような表面から適切な溶出条件下で溶出され得る。微粒子およびビーズの表面には、ＵＶ感受性ポリカーボネートが提供され得る。核酸は、好適な固定化緩衝液の存在下で活性化表面に結合され得る。
【０２０８】
微粒子およびビーズを反応溶液内で自由に移動させ、次に、例えば、ビーズを表面にエッチングしたマイクロウェルまたはピット内に保持することによって可逆的に固定化することができる。ビーズは、例えば、ビーズに付着した固有の核酸「バーコード」の使用によって、または色分けの使用によって、アレイの一部として局在化され得る。
【０２０９】
したがって、所定の配列の新たな二本鎖ポリヌクレオチドの合成を開始する前に、本発明によるアンカー／足場ポリヌクレオチドを合成し、次に、このような結合表面に可逆的に固定化することができる。本発明の方法によって合成されたポリヌクレオチドは、このような結合表面に可逆的に固定化される間に合成することができる。
【０２１０】
微小流体技術およびシステム
表面は、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）であり得る。ＥＷＯＤシステムは、微小液滴の形態での非常に小さい液体容量の微小流体操作を促進する誘電体被覆表面を提供する（例えば、Ｃｈｏｕ，Ｗ−Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｓ，６：１２４９−１２７１）。液滴容量は、エレクトロウェッティング技術によってチップ上でプログラム可能に作成、移動、区分化、および組み合わせることができる。したがって、エレクトロウェッティングシステムは、合成中および合成後にポリヌクレオチドを可逆的に固定化するための代替的な手段を提供する。
【０２１１】
所定の配列を有するポリヌクレオチドは、本明細書に記載される方法によって固相で合成することができ、ポリヌクレオチドは、ＥＷＯＤ表面上に固定化され、各サイクルにおける必要な工程はエレクトロウェッティング技術によって促進される。例えば、足場ポリヌクレオチドを伴い、組み込み、切断、連結、および脱保護工程を必要とする方法において、各工程に必要な試薬、ならびに使用済みかつ不要な試薬を除去するために必要な任意の洗浄工程に必要な試薬は、エレクトロウェッティング技術を介した電場の影響下で輸送される微小液滴の形態で提供され得る。
【０２１２】
本発明の合成方法において使用され得る他の微小流体プラットフォームが利用可能である。例えば、核酸操作のために一般的に用いられているエマルジョンベースの微小液滴技術を使用することができる。このようなシステムでは、微小液滴は、２つの不混和性流体、典型的には水と油との混合によって作成されるエマルジョン中に形成される。エマルジョン微小液滴は、微小流体網内でプログラム可能に作成、移動、区分化、および組み合わせることができる。ヒドロゲル系もまた利用可能である。本明細書に記載される合成方法のうちのいずれにおいても、微小液滴は、上記に記載されるＥＷＯＤシステムおよび他の微小流体システム、例えば、エラストマー材料を含む成分に基づくアーキテクチャを含む微小流体システムなどの任意の好適な適合システムで操作することができる。
【０２１３】
微小液滴は、それらが本明細書の合成方法と適合するという条件で、任意の好適なサイズのものであり得る。微小液滴のサイズは、用いられる具体的なシステムおよびシステムの関連するアーキテクチャに応じて変化するであろう。したがって、サイズは必要に応じて適応され得る。本明細書に記載される合成方法のうちのいずれにおいても、液滴直径は、約１５０ｎｍ〜約５ｍｍの範囲であり得る。１μｍ未満の液滴直径は、例えば、Ｇａｎａｎ−Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，２００７，３，ｐｐ７３７−７４２）に記載されているような、キャピラリージェット法を伴う技術などによって、当該技術分野において既知の手段によって検証することができる。
【０２１４】
中間または最終合成生産物の配列決定。
合成もしくはアセンブリの中間生産物、または最終的なポリヌクレオチド合成生産物は、所望のポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドが正しく合成またはアセンブリされているかどうかを決定するための品質管理チェックとして配列決定され得る。目的のポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを、固相合成プラットフォームから除去し、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄによって販売されているＭｉｎＩＯＮ（商標）デバイスを使用したナノポアシーケンシングなど、いくつかの既知の市販の配列決定技術のうちのいずれか１つによって配列決定することができる。特定の実施例では、配列決定は、固相プラットフォーム自体で実施され得、ポリヌクレオチドを別の合成デバイスに移す必要がなくなる。配列決定は、合成に使用されるＥＷＯＤデバイスなどの同じエレクトロウェッティングデバイス上で都合よく実施することができ、それにより、合成デバイスは、１つ以上の測定電極対を含む。目的のポリヌクレオチドを含む液滴は、電極対の電極のうちの１つと接触することができ、液滴は、電極対の第２の電極と接触する第２の液滴と液滴界面二重層を形成し、液滴二重層界面は、両親媒性膜中にナノポアを含む。ポリヌクレオチドは、例えば、酵素制御下でナノポアを移動させることができ、ナノポアを通るイオン電流の流れは、ポリヌクレオチドがナノポアを通過する間の電極対間の電位差の下で測定することができる。経時的なイオン電流測定値を記録し、ポリヌクレオチド配列を決定するために使用することができる。配列決定の前に、ポリヌクレオチドは、特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５０１４０号に開示されるような配列決定のためにそれを最適化するために、１つ以上の試料調製工程に供され得る。好適に用いられ得る酵素、両親媒性膜、およびナノポアの例は、特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５２７６７およびＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６に開示されている。ポリヌクレオチド、ナノポア、両親媒性膜などの試料調製に必要な試薬は、試料注入口を介してＥＷＯＤデバイスに供給することができる。試料注入口は、試薬チャンバーに接続され得る。
【０２１５】
表面付着化学
オリゴヌクレオチドは典型的には化学的に付着するが、それらはまた、親和性相互作用などを介して間接的な手段によって表面に付着し得る。例えば、オリゴヌクレオチドをビオチンで官能化し、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆された表面に結合させることができる。
【０２１６】
ポリヌクレオチドを表面（例えば、平坦な表面）、微粒子、およびビーズなどに固定化するために、様々な表面付着方法および化学が利用可能である。付着を促進するために、表面を官能化または誘導体化することができる。このような官能化は、当該技術分野において知られている。例えば、表面は、ポリヒスチジンタグ（ヘキサヒスチジン−タグ、６×Ｈｉｓ−タグ、Ｈｉｓ６タグ、またはＨｉｓ−タグ（登録商標））、Ｎｉ−ＮＴＡ、ストレプトアビジン、ビオチン、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、またはＬＮＡなど）、カルボキシル基、第４級アミン基、チオール基、アジド基、アルキン基、ＤＩＢＯ、脂質、ＦＬＡＧタグ（ＦＬＡＧオクタペプチド）、ポリヌクレオチド結合タンパク質、ペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片で官能化され得る。表面は、アンカー／足場ポリヌクレオチドに特異的に結合する分子または基で官能化され得る。
【０２１７】
ポリヌクレオチドを表面に付着させるのに好適な化学のいくつかの例を、図１２ｉおよび図１２ｊに示す。
【０２１８】
本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とを含む足場ポリヌクレオチドは、１つ以上の共有結合を介して共通の表面に繋留され得る。１つ以上の共有結合は、共通の表面上の官能基と足場分子上の官能基との間に形成され得る。足場分子上の官能基は、例えば、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基であり得る。共通の表面上の官能基は、ブロモアセチル基であり得、任意に、ブロモアセチル基は、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される。
【０２１９】
本発明の方法のうちのいずれにおいても、足場ポリヌクレオチドは、リンカーを介して直接または間接的のいずれかで表面に付着し得る。生体適合性および親水性の性質を有する任意の好適なリンカーを使用することができる。
【０２２０】
リンカーは、直鎖状リンカーであってもまたは分岐状リンカーであってもよい。
【０２２１】
リンカーは炭化水素鎖を含み得る。炭化水素鎖は、２〜約２０００個以上の炭素原子を含み得る。炭化水素鎖は、アルキレン基、例えば、Ｃ２〜約２０００個以上のアルキレン基を含み得る。炭化水素鎖は、−（ＣＨ２）ｎ−の一般式を有し得、式中、ｎは２〜２０００以上である。炭化水素鎖は、１つ以上のエステル基（すなわち、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）または１つ以上のアミド基（すなわち、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−）によって任意に中断され得る。
【０２２２】
ＰＥＧ、ポリアクリルアミド、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ−２−メチル−２−オキサゾリン（ＰＭＯＸＡ）、双性イオンポリマー、例えばポリ（メタクリル酸カルボキシベタイン）（ＰＣＢＭＡ）、ポリ［Ｎ−（３−スルホプロピル）−Ｎ−メタクリロキシエチル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアンモニウムベタイン］（ＰＳＢＭＡ）、グリコポリマー、およびポリペプチドを含む群から選択される任意のリンカーを使用することができる。
【０２２３】
リンカーは、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−の一般式を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み得、式中、ｎは１〜約６００以上である。
【０２２４】
リンカーは、−［（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＰＯ２−−Ｏ］ｍ−の一般式を有するオリゴエチレングリコール−リン酸単位を含み得、式中、ｎは１〜約６００以上であり、ｍは１〜２００以上であり得る。
【０２２５】
上記に記載されるリンカーのうちのいずれも、リンカーの一末端で本明細書に記載される足場分子に付着することができ、リンカーの他方の末端で第１の官能基に付着することができ、第１の官能基は、表面に共有結合を提供し得る。第１の官能基は、本明細書にさらに記載されるように、例えば、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基であり得る。表面をさらなる官能基で官能化して、第１の官能基と共有結合を提供し得る。さらなる官能基は、本明細書にさらに記載されるように、例えば、２−ブロモアセトアミド基であり得る。任意に、ブロモアセチル基は、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される。表面上のさらなる官能基は、ブロモアセチル基であり得、任意に、ブロモアセチル基は、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供され、第１の官能基は、必要に応じて、例えば、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基であり得る。ポリヌクレオチドが付着している表面は、ゲルを含み得る。表面は、約２％のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面を含み、好ましくはポリアクリルアミド表面は、ガラスなどの固体支持体に結合されている。
【０２２６】
本発明の方法のうちのいずれにおいても、足場ポリヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドに組み込まれた分岐ヌクレオチドを介してリンカーに任意に付着し得る。任意の好適な分岐ヌクレオチドを、任意の好適な適合するリンカーと共に使用することができる。
【０２２７】
本発明の合成サイクルを開始する前に、足場ポリヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドに組み込まれた１つ以上の分岐ヌクレオチドを用いて合成することができる。１つ以上の分岐ヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドに組み込まれる正確な位置、したがってリンカーが付着し得る正確な位置は変化してもよく、所望に応じて選択され得る。位置は、例えば、支持鎖および／または合成鎖の末端にあり得るか、または例えば、ヘアピンループを含む実施形態では、支持鎖を合成鎖に接続するループ領域内にあり得る。
【０２２８】
足場ポリヌクレオチドの合成中に、１つ以上の分岐ヌクレオチドは、分岐部分の反応基をブロックするブロッキング基と共に足場ポリヌクレオチドに組み込まれ得る。次に、ブロッキング基は、リンカーの分岐部分、またはリンカーが複数の単位を含む場合はリンカーの第１の単位（分子）への結合の前に除去（脱ブロック）され得る。
【０２２９】
足場ポリヌクレオチドの合成中に、１つ以上の分岐ヌクレオチドを、その後の「クリック化学」反応において使用するのに好適な基で足場ポリヌクレオチドに組み込んで、リンカー、またはリンカーが複数の単位を含む場合にはリンカーの第１の単位を分岐部分に結合することができる。このような基の例はアセチレン基である。
【０２３０】
いくつかの非限定的で例示的な分岐ヌクレオチドを以下に示す。
【化３１】
2021529548.tif 000033
【０２３１】
リンカーは、任意に、例えば、Ｓｐ９スペーサーなどの１つ以上のスペーサー分子（単位）を含み得、第１のスペーサー単位は、分岐ヌクレオチドに付着している。
【０２３２】
リンカーは、第１のスペーサー基に付着した１つ以上のさらなるスペーサー基を含み得る。例えば、リンカーは、複数の、例えばＳｐ９スペーサー基を含み得る。第１のスペーサー基は分岐部分に付着し、次に、１つ以上のさらなるスペーサー基が、順次付加されて、それらの間にリン酸基で接続されている複数のスペーサー単位を含むスペーサー鎖を伸長させる。
【０２３３】
分岐ヌクレオチドに付着した第１のスペーサー単位、または分岐鎖に既に付着した既存のスペーサー単位に付着するさらなるスペーサー単位を含むことができるスペーサー単位（Ｓｐ３、Ｓｐ９、およびＳｐ１３）のいくつかの非限定的な例を以下に示す。
【化３２】
2021529548.tif 000034
【０２３４】
リンカーは、１つ以上のエチレングリコール単位を含み得る。
【０２３５】
リンカーは、複数の単位がヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含み得る。
【０２３６】
上記に図示される構造では、５’’という用語は、分岐部分が付着しているヌクレオチドの５’末端と示差するために使用され、５’は当該技術分野におけるその通常の意味を有する。５’’とは、そこからリンカーが伸長され得るヌクレオチド上の位置を意味することが意図される。５’’位置は異なる場合がある。５’’位置は、典型的には、ヌクレオチドの核酸塩基における位置である。核酸塩基中の５’’位置は、上記の構造に図示されるように、所望の分岐部分の性質に応じて変化し得る。
【０２３７】
マイクロアレイ
本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成方法のうちのいずれかを使用して、ポリヌクレオチドマイクロアレイを製造することができる（Ｔｒｅｖｉｎｏ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００７  １３，ｐｐ５２７−５４１）。したがって、アンカーまたは足場ポリヌクレオチドは、表面上の複数の個々にアドレス可能な反応部位に繋留され得、所定の配列を有するポリヌクレオチドは、マイクロアレイ上にインサイチュで合成され得る。
【０２３８】
合成後、各反応領域において、所定の配列のポリヌクレオチドに、固有の配列を付与することができる。アンカーまたは足場ポリヌクレオチドに、同定を促進するためのバーコード配列が提供され得る。
【０２３９】
所定の配列のポリヌクレオチドを合成する方法以外に、本明細書に記載される技術を含む、この技術分野で一般的に使用される技術を使用して、マイクロアレイ製造を行うことができる。例えば、アンカーまたは足場ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるものを含む既知の表面付着方法および化学を使用して表面に繋留され得る。
【０２４０】
所定の配列のポリヌクレオチドの合成後に、非繋留末端からあらゆる望ましくないポリヌクレオチド配列を除去するための最終切断工程が提供され得る。
【０２４１】
所定の配列のポリヌクレオチドは、二本鎖形態で反応部位に提供され得る。代替的に、合成後に、二本鎖ポリヌクレオチドを分離し、一本鎖を除去して、反応部位に一本鎖ポリヌクレオチドを残してもよい。このプロセスを促進するために、鎖の選択的繋留が提供され得る。例えば、足場ポリヌクレオチドを伴う方法において、合成鎖は表面に繋留され得、支持鎖は繋留されない場合があるか、またはその逆でもよい。合成鎖に、切断不能なリンカーが提供され得、支持鎖に、切断可能なリンカーが提供され得るか、またはその逆でもよい。鎖の分離は、熱処理などの従来の方法によって行われ得る。
【０２４２】
合成ポリヌクレオチドのアセンブリ
本明細書に記載される方法によって合成され、任意に本明細書に記載される方法によって増幅される所定の配列を有するポリヌクレオチドは、より大きな合成ポリヌクレオチドを作成するために１つ以上の他のこのようなポリヌクレオチドに接合され得る。
【０２４３】
複数のポリヌクレオチドの接合は、当該技術分野において一般的に知られている技術によって達成することができる。本明細書に記載される方法によって合成された第１のポリヌクレオチドおよび１つ以上の追加のポリヌクレオチドを切断して適合する末端を作成し、次に、ポリヌクレオチドを連結によって一緒に接合することができる。切断は任意の好適な手段によって達成することができる。典型的には、制限酵素切断部位をポリヌクレオチド中に作成し得、次に、制限酵素を使用して切断工程を行い、それにより合成されたポリヌクレオチドを任意のアンカー／足場ポリヌクレオチドから放出し得る。切断部位は、アンカー／足場ポリヌクレオチドの一部として設計され得る。代替的に、切断部位は、所定のヌクレオチド配列の一部として、新たに合成されたポリヌクレオチド内に作成され得る。
【０２４４】
ポリヌクレオチドのアセンブリは、好ましくは固相法を使用して行われる。例えば、合成後、第１のポリヌクレオチドは、表面固定化部位に対して遠位の好適な位置で単一の切断に供され得る。したがって、第１のポリヌクレオチドは表面に固定化されたままであり、単一の切断は別のポリヌクレオチドへの接合に対して適合する末端を生成するであろう。追加のポリヌクレオチドを２つの好適な位置で切断に供して、他のポリヌクレオチドに結合するための適合する末端を各末端に生成し得、同時に追加のポリヌクレオチドを表面固定化から放出し得る。追加のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドと適合的に接合され得、したがって、所定の配列を有し、さらに別の追加のポリヌクレオチドへの接合に適合する末端を有する、より大きな固定化ポリヌクレオチドを作成し得る。したがって、予め選択された切断合成ポリヌクレオチドの接合の反復サイクルが、はるかに長い合成ポリヌクレオチド分子を作成し得る。追加のポリヌクレオチドの接合の順序は、必要な所定の配列によって決定されるだろう。
【０２４５】
したがって、本発明のアセンブリ方法は、１つ以上のＭｂ程度の長さを有する合成ポリヌクレオチド分子の作成を可能にし得る。
【０２４６】
本発明のアセンブリおよび／または合成方法は、当該技術分野において知られている装置を使用して行うことができる。上記に記載されるように、非常に少量の試薬を、典型的にはエレクトロウェッティングオン誘電体（ＥＷＯＤ）などの液滴エレクトロウェッティング技術の形態で、アレイの異なる場所で他の容量と選択的に移動、区分化、および組み合わせることを可能にする技術および装置を用いることができる。液滴を操作することができる、本発明に用いられ得る好適なエレクトロウェッティング技術およびシステムは、例えば、ＵＳ８６５３８３２、ＵＳ８８２８３３６、ＵＳ２０１４／０１９７０２８、およびＵＳ２０１４／０２０２８６３に開示されている。
【０２４７】
固相からの切断は、プライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分との一方または両方で切断可能なリンカーを提供することによって達成され得る。切断可能なリンカーは、例えば、ＵＶ切断可能なリンカーであり得る。
【０２４８】
酵素的切断を伴う切断方法の例を図３０に示す。概略図は、（黒菱形構造を介して）表面に付着し、所定の配列のポリヌクレオチドを含む足場ポリヌクレオチドを示す。足場ポリヌクレオチドは上部ヘアピンおよび下部ヘアピンを含む。いずれの場合も、上部ヘアピンは、ユニバーサルヌクレオチドを利用して切断部位を定義する切断工程を使用して切断することができる。下部ヘアピンは、足場ポリヌクレオチドに操作されるか、または所定の配列の新たに合成されたポリヌクレオチドに操作される部位を介して制限エンドヌクレアーゼによって除去することができる。
【０２４９】
したがって、上記に記載されるように、所定の配列を有するポリヌクレオチドは、エレクトロウェッティング表面に固定化されながら合成され得る。合成されたポリヌクレオチドは、エレクトロウェッティング表面から切断され得、液滴の形態で電場の影響下で移動され得る。液滴は、それらが他の切断合成ポリヌクレオチドとの連結のための切断された合成ポリヌクレオチドを送達することができる表面上の特定の反応部位で組み合わせることができる。次に、ポリヌクレオチドを、例えば連結によって接合することができる。このような技術を使用して、所望の所定の配列に従って順番に異なるポリヌクレオチドの集団を合成し、付着させることができる。このようなシステムを使用して、完全自動化ポリヌクレオチド合成およびアセンブリシステムを設計することができる。このシステムは、所望の所定の配列に従って、所望の配列を受け取り、試薬を供給し、合成サイクルを行い、続いて所望のポリヌクレオチドをアセンブリするようにプログラムすることができる。
【０２５０】
システムおよびキット
本発明はまた、本明細書に記載および定義される合成方法のうちのいずれか、ならびに本明細書に記載および定義されるその後の増幅およびアセンブリ工程のうちのいずれかを実施するためのポリヌクレオチド合成システムも提供する。
【０２５１】
典型的には、合成サイクル反応は、本明細書に記載および定義される手段によって表面に繋留されている足場ポリヌクレオチド分子に所定の配列のヌクレオチドを組み込むことによって実施されるであろう。表面は、本明細書に記載および定義されるような任意の好適な表面であり得る。
【０２５２】
一実施形態では、所定の配列のヌクレオチドを足場ポリヌクレオチド分子に組み込むための反応は、反応領域内の足場ポリヌクレオチドに対して合成方法のうちのいずれかを行うことを伴う。
【０２５３】
反応領域は、足場ポリヌクレオチド分子が付着しており、合成方法を行うための試薬を送達することができる好適な基質の任意の領域である。
【０２５４】
一実施形態では、反応領域は、一本鎖足場ポリヌクレオチド分子を含む表面の単一の領域であり得、一本鎖足場ポリヌクレオチド分子は試薬でアドレス指定され得る。
【０２５５】
別の実施形態では、反応領域は、複数の足場ポリヌクレオチド分子を含む表面の単一の領域であり得、足場ポリヌクレオチド分子は、互いに単離して試薬で個別にアドレス指定することはできない。したがって、このような実施形態では、反応領域内の複数の足場ポリヌクレオチド分子は同じ試薬および条件に曝露され、したがって、同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有する合成ポリヌクレオチド分子を生じさせることができる。
【０２５６】
一実施形態では、本明細書に記載および定義される合成方法のうちのいずれかを実施するための合成システムは、複数の反応領域を含み得、各反応領域は１つ以上の付着した足場ポリヌクレオチドを含み、各反応領域は、他の反応領域のそれぞれから単離して試薬で個別にアドレス指定することができる。このようなシステムは、例えば反応領域が基質、典型的には平坦な基質上に形成される場合には、例えばアレイの形態で構成され得る。
【０２５７】
単一の反応領域を含むか、または複数の反応領域を含む基質を有するシステムは、例えば、ＥＷＯＤシステムもしくは微小流体システム内に含まれ得、システムは、試薬を反応部位に送達するように構成され得る。ＥＷＯＤおよび微小流体システムは、本明細書により詳細に記載されている。例えば、ＥＷＯＤシステムは、電気的制御下で試薬を反応部位（複数可）に送達するように構成され得る。例えばエラストマー材料もしくは同様の材料から形成される微細加工アーキテクチャを含むような微小流体システムは、流体圧力および／もしくは吸引制御下で、または機械的手段によって試薬を反応部位（複数可）に送達するように構成され得る。試薬は、例えば試薬送達用の導管として作用するカーボンナノチューブを介して、任意の好適な手段によって送達され得る。任意の好適なシステムが想定され得る。
【０２５８】
ＥＷＯＤ、微小流体システムおよび他のシステムは、合成後に足場ポリヌクレオチドから合成二本鎖ポリヌクレオチドを切断するための酵素、および／または基質から足場ポリヌクレオチド全体を放出するためにリンカーを切断するための試薬、および／または合成後のポリヌクレオチド分子またはその任意の領域もしくは部分を増幅するための試薬、および／または本発明の合成方法に従って合成されたより小さなポリヌクレオチド分子からより大きなポリヌクレオチド分子をアセンブリするための試薬などの任意の他の所望の試薬を反応部位に送達するように構成され得る。
【０２５９】
本発明はまた、本明細書に記載および定義される合成方法のうちのいずれかを実施するためのキットも提供する。キットは、本明細書に記載および定義される本発明の合成および／またはアセンブリ方法のうちのいずれかを行うための試薬の任意の所望の組み合わせを含み得る。例えば、キットは、足場ポリヌクレオチドを含む任意の１つ以上の容量（複数可）の反応試薬、本明細書に記載および定義される合成サイクルの任意の１つ以上の工程に対応する容量（複数可）の反応試薬、可逆的ブロッキング基もしくは可逆的ターミネーター基を含むヌクレオチドを含む容量（複数可）の反応試薬、合成後の１つ以上のポリヌクレオチド分子またはその任意の領域もしくは部分を増幅するための容量（複数可）の反応試薬、本発明の合成方法に従って合成されたより小さいポリヌクレオチド分子からより大きいポリヌクレオチド分子をアセンブリするための容量（複数可）の反応試薬、合成後に足場ポリヌクレオチドから合成二本鎖ポリヌクレオチドを切断するための容量（複数可）の反応試薬、および１つ以上のリンカーを切断して基質から足場ポリヌクレオチド全体を放出するための容量（複数可）の反応試薬を含み得る。
【０２６０】
例示的な方法
本発明によるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子を合成する例示的で非限定的な方法は、添付の特許請求の範囲を含む本明細書に記載されている。
【０２６１】
本発明によるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子を合成する以下の２つの非限定的で例示的な方法およびそれらの変形例において、合成方法のバージョン１および２への言及は、それぞれ図１〜６に示される反応の概略図に従って解釈されるべきであり、図７〜１１のうちのいずれかに示される反応の概略図、または実施例部分における同じ説明には従わない。図７〜１１のいずれかに示される反応の概略図および以下の実施例のセクションにおける反応の概略図の説明は、本発明の方法と比較して修正される反応スキームに基づいて、本発明の方法の例示的な支援を提供する。
【０２６２】
以下に記載される各例示的な方法において、各工程に記載される構造は、必要に応じて参照符号の助けを借りて特定の図を参照することによって参照され得る。以下の文中の参照符号は、図１〜６のものと対応している。このような参照符号は、図に示される具体的な構造に限定されることを意図しておらず、関連する構造の記載は、限定されないが、具体的に例示されているものも含めて、その全体が本明細書に提供されるようなその記載に対応している。
【０２６３】
本発明の方法のバージョン１および２として本明細書で称される、本発明の２つの非限定的で例示的な方法を以下に記載する（例えば、それぞれ、図１および２を参照されたい）。これらの例示的な方法の各々の工程（１）において、相補的支持鎖（図１および２の各々の工程１に示される構造において「ａ」と標識された鎖を参照されたい）にハイブリダイズされた合成鎖（図１および２の各々の工程１に示される構造において「ｂ」と標識された鎖を参照されたい）を含む足場ポリヌクレオチド（図１および２の各々の工程１に示される構造を参照されたい）が提供される（１０１、２０１）。
【０２６４】
足場ポリヌクレオチドは二本鎖であり、デノボ合成されるので合成ポリヌクレオチドの領域を収容するための支持構造を提供する。足場ポリヌクレオチドは、プライマー鎖部分（図１および２の各々の工程１に示される構造において「ｂ」と標識された鎖の点線部分を参照されたい）およびヘルパー鎖部分（図１および２の各々の工程１に示される構造において「ｂ」と標識された鎖の破線部分を参照されたい）を含む合成鎖を含む。プライマー鎖部分および合成鎖のヘルパー鎖部分の両方が、相補的支持鎖にハイブリダイズされて提供される。
【０２６５】
プライマー鎖部分を含む足場ポリヌクレオチドの末端は、突出末端を含み、支持鎖の末端はプライマー鎖部分の末端に突出する。
【０２６６】
方法の工程（２）において、連結工程が行われ（１０２、２０２）、ポリヌクレオチド連結分子は、二本鎖足場ポリヌクレオチドに連結される。ポリヌクレオチド連結分子は、所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチド連結分子は、支持鎖と、支持鎖にハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含む。ポリヌクレオチド連結分子は、突出を含む相補的連結末端を含み、ヘルパー鎖の末端は、支持鎖の末端に突出する。突出相補的連結末端は、二本鎖足場ポリヌクレオチドの突出末端と相補的である。ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖は、相補的連結末端に所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドを含む。所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドは、相補的連結末端におけるポリヌクレオチド連結分子の支持鎖の末端ヌクレオチドである。所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドは、連結可能なヌクレオチドであり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに連結される。粘着末端連結反応における連結時に、所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドは、二本鎖足場ポリヌクレオチドの突出末端における二本鎖足場ポリヌクレオチドの支持鎖への付着によって、二本鎖足場ポリヌクレオチドに組み込まれる。
【０２６７】
２つの方法のバージョンおよびそれらの変形例の各々において、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖はまた、切断工程における切断を促進する相補的連結末端にユニバーサルヌクレオチド（図１および２の各々に図示される構造において「Ｕｎ」と標識される）を含む。ユニバーサルヌクレオチドの役割は、以下の各方法の詳細な説明から明らかになるであろう。
【０２６８】
相補的連結末端におけるポリヌクレオチド連結分子のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、ヘルパー鎖が合成鎖のプライマー鎖部分に連結することができないように提供され、すなわち、ヘルパー鎖は、連結不可能なヌクレオチドとして提供される。これは、典型的には、リン酸基を含まないヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを提供することによって達成され、すなわち、ヌクレオシドとして提供される。代替的に、５’保護ヌクレオシド、５’−デオキシヌクレオシドもしくは５’−アミノヌクレオシドなどの５’位に連結不可能な基を有するヌクレオシド、または任意の他の好適な連結不可能なヌクレオチドもしくはヌクレオシドを使用することができる。
【０２６９】
したがって、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖の、二本鎖足場ポリヌクレオチドの支持鎖への連結時に、一本鎖切断または「ニック」が、合成鎖のプライマー鎖部分とヘルパー鎖との間の合成鎖に提供される。
【０２７０】
ポリヌクレオチド連結分子の二本鎖足場ポリヌクレオチドへの連結時に、新たに組み込まれた第１のヌクレオチド、切断ステップにおいて切断を促進する際に使用するためのユニバーサルヌクレオチド、および「ニック」を含む二本鎖足場ポリヌクレオチドが形成される。
【０２７１】
そのサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドが二本鎖足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに連結されるため、二本鎖足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドがリガーゼ酵素の基質として作用することを可能にするために、連結工程の前に、二本鎖足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドには、付着したリン酸基または他の連結可能基が提供されなければならない。
【０２７２】
本明細書により詳細に記載されるように、本明細書に記載されるバージョン１および２ならびにそれらの変形例に関するある特定の例示的な方法において、ヘルパー鎖は、例えば、変性およびそれが以前にハイブリダイズされた支持鎖からの放出によって、その合成サイクルにおいて所定の配列の第２のヌクレオチドを組み込む工程の前に除去され得る。
【０２７３】
合成の第１のサイクルの文脈において、「所定の配列の第１のヌクレオチド」という用語は、必ずしも所定の配列のまさに第１のヌクレオチドを意味すると理解されるべきではない。本明細書に記載される方法は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドの合成に関するものであり、所定の配列の一部は、第１の合成サイクルの開始前に足場ポリヌクレオチドに事前合成されて提供され得る。この文脈において、所定の配列の「１つの（ａ）」第１のヌクレオチドという用語は、所定の配列の「任意の」ヌクレオチドを意味し得る。
【０２７４】
合成鎖のプライマー鎖部分の末端は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド分子を単一ヌクレオチドで伸長する能力を有する酵素によって合成鎖に付着する／組み込まれる所定の配列の第２のヌクレオチドの付着のための部位であるプライマー部位を提供する。このような酵素は、典型的には、ヌクレオチドトランスフェラーゼ酵素またはポリメラーゼ酵素である。本明細書でさらに定義される、および／または当業者に既知の任意の好適な酵素を使用することができる。したがって、酵素は、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドを伸長するように作用するであろう。したがって、この末端ヌクレオチドは、典型的には、例えば、５’〜３’方向の伸長を触媒するポリメラーゼもしくはトランスフェラーゼ、または任意の他の酵素による伸長を可能にするために、プライマー鎖部分の３’末端を定義する。プライマー鎖部分を含む合成鎖と反対の末端は、結果的に典型的には、合成鎖の５’末端を定義し、合成鎖の５’末端に隣接する支持鎖の末端ヌクレオチドは、結果的に典型的には、支持鎖の３’末端を定義するであろう。
【０２７５】
一本鎖切断の部位に位置付けられた合成鎖のヘルパー鎖部分の末端ヌクレオチドは、典型的には、ヘルパー鎖部分の５’末端を定義し、結果的に、合成鎖のヘルパー鎖部分と反対の末端が、典型的には合成鎖の３’末端を定義するであろう。
【０２７６】
第２のヌクレオチドを組み込む工程（工程３；１０３、２０３）において、第２のヌクレオチドには、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基（図１および２の各々の工程３において組み込まれたヌクレオチドの小さい三角形として図示される）が提供される。したがって、工程（３）において、一塩基のみが組み込まれる。
【０２７７】
任意の好適な可逆的ターミネーター基を含むヌクレオチドを使用することができる。可逆的ターミネーター基を有する好ましいヌクレオチドは、本明細書でさらに記載されるような３’−Ｏ−アリル−ｄＮＴＰおよび／もしくは３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰ、または他の基である。
【０２７８】
本明細書に定義される様々な方法の説明から明らかになるように、「所定の配列の第２のヌクレオチド」という用語は、所定の配列を含む１つの鎖の直鎖状配列の第１のヌクレオチドから続く次のヌクレオチドを意味するものとして理解されるべきではなく、合成二本鎖ポリヌクレオチド全体の文脈において、所定の配列の単なる「１つの」さらなるヌクレオチドを意味するものとして理解されるべきである。本明細書に定義される本発明の特定の非限定的な方法のバージョン１および２、ならびにそのある特定の変形例の場合、１つのサイクルの各「第１のヌクレオチド」は、同じ核酸鎖内の前のサイクルの「第１のヌクレオチド」に順次連結され、それによって、第１の鎖を順次１サイクル当たり１ヌクレオチド伸長する。各サイクルにおいて、１つのサイクルの各「第２のヌクレオチド」は、同じ核酸鎖中の前のサイクルの「第２のヌクレオチド」の隣に順次組み込まれ、それによって、第２の鎖を順次１サイクル当たり１ヌクレオチド伸長する。したがって、合成サイクルが完了すると、合成二本鎖ポリヌクレオチド分子は、各サイクルの連結された第１のヌクレオチドによって定義される１つの鎖の所定の配列と、各サイクルの組み込まれた第２のヌクレオチドによって定義される反対の鎖の所定の配列と、を含む。両方の鎖の配列は必ずしも予め定義されておらず、各合成サイクルにおいてユーザによって選択された第１および第２のヌクレオチドの同一性によって決定される。本明細書に記載の方法のバージョン１および２において、各サイクルの第１および第２のヌクレオチドがそれぞれのパートナーヌクレオチドとヌクレオチド対を形成することを考慮すると、各サイクルの第１および第２のヌクレオチドが、各サイクルのそれぞれのパートナーヌクレオチドに天然に相補的であるようにユーザによって選択される場合、最終合成鎖は完全に相補的である。ある特定のサイクルの第１および第２のヌクレオチドが、それらのサイクルのそれぞれのパートナーヌクレオチドに相補的でないとユーザによって選択される場合、最終合成鎖は完全には相補的ではなくなるそれにもかかわらず、いずれの場合においても、最終合成鎖は、両方とも、合成二本鎖ポリヌクレオチド全体の文脈において所定の配列を含む。
【０２７９】
第２のヌクレオチドを組み込む工程（工程３）の後、足場ポリヌクレオチドが続いて切断される（工程４、１０４、２０４）。切断は、足場ポリヌクレオチドからのポリヌクレオチド連結分子の放出、ならびに対合されず、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に付着したそのサイクルの第１のヌクレオチドの保持、および切断された足場ポリヌクレオチドの合成鎖に付着し、パートナーヌクレオチドと対合するそのサイクルの第２のヌクレオチドの保持をもたらす。切断は、存在し、切断の直前に支持鎖にハイブリダイズされる場合、ヘルパー鎖の放出、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の放出をもたらす。切断は、こうして、切断部位に、支持鎖の切断された末端および切断前のニック部位を含んだ合成鎖のプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを適所に残し、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドは、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドとしてのそのサイクルの第２のヌクレオチドに突出する支持鎖の切断された末端の末端ヌクレオチドとしてのそのサイクルの第１のヌクレオチドを含む。突出は、単一ヌクレオチド突出であっても複数ヌクレオチド突出であってもよい。
【０２８０】
方法の工程（５）において、脱保護工程が行われて、所定のヌクレオチド配列の組み込まれた第２のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基が除去される（１０５、２０５）。代替的に、脱保護工程は、切断工程（工程４）の前に行われてもよく、この場合、脱保護工程は、工程（４）として定義され（図１および２の工程４；１０４、２０４）、切断工程は、工程（５）として定義される（図１および２の工程５；１０５、２０５）。
【０２８１】
合成ポリヌクレオチドを生成するために、上記に記載されるのと同じ工程を含む合成の反復サイクルが行われる。
【０２８２】
特定の方法を、以下でより詳細に説明する。
【０２８３】
合成方法のバージョン１
図１を参照すると、本発明の合成方法の第１の特定の非限定的で例示的なバージョンでは、二本鎖足場ポリヌクレオチドが提供される（図１の工程１；１０１）。二本鎖足場ポリヌクレオチドは、支持鎖と、それにハイブリダイズされた合成鎖と、を含む。合成鎖はプライマー鎖部分を含む。二本鎖足場ポリヌクレオチドには、少なくとも１つの突出末端が提供され、少なくとも１つの突出末端は、プライマー鎖部分の末端に突出する支持鎖の末端を含む。支持鎖の末端ヌクレオチドは、リガーゼ酵素の基質として作用することができ、好ましくはリン酸基または他の連結可能基を含む。
【０２８４】
方法の工程（２）において、ポリヌクレオチド連結分子（図１の上部の右上に示される構造を参照されたい）は、足場ポリヌクレオチドに連結される。連結は、所定の配列の第２のヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドの支持鎖に組み込む（図１の工程２；１０２）。
【０２８５】
方法の工程（３）において、所定のヌクレオチド配列の第２のヌクレオチドは、単一ヌクレオチドでオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド分子を伸長する能力を有する酵素の作用によって合成鎖のプライマー鎖部分の末端に付加される。このような酵素は、典型的には、ヌクレオチドトランスフェラーゼ酵素またはポリメラーゼ酵素である（図１の工程３；１０３）。第２のヌクレオチドには、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基が提供される。したがって、工程（３）において、一塩基のみが組み込まれる。
【０２８６】
各合成サイクルにおいて、足場ポリヌクレオチドは、次いで、支持鎖にユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で切断される（工程４、１０４）。方法のバージョン１において、切断は、プライマー鎖部分に対する近位方向／ヘルパー鎖に対する遠位方向において、ユニバーサルヌクレオチドの直後に支持鎖を切断することを含み、すなわち、支持鎖は、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置と、プライマー鎖部分に対する近位方向／ヘルパー鎖に対する遠位方向において、支持鎖中の次のヌクレオチド位置との間で切断される。足場ポリヌクレオチドの切断（工程４）は、足場ポリヌクレオチドからのポリヌクレオチド連結分子の放出、ならびに対合されず、切断された足場ポリヌクレオチドの第１の鎖に付着したそのサイクルの第１のヌクレオチドの保持、および合成鎖のプライマー鎖部分に付着し、パートナーヌクレオチドと対合するそのサイクルの第２のヌクレオチドの保持をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断（工程４）は、存在し、切断直前に支持鎖にハイブリダイズされる場合、足場ポリヌクレオチドからのヘルパー鎖の喪失、および足場ポリヌクレオチドからのユニバーサルヌクレオチドの喪失をもたらす。切断は、切断部位に、支持鎖の切断された末端および切断前のニック部位を含んだ合成鎖のプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを適所に残し、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドは、合成鎖のプライマー鎖部分の切断された末端の末端ヌクレオチドとしてのそのサイクルの第２のヌクレオチドに突出する支持鎖の切断された末端の末端ヌクレオチドとしてのそのサイクルの第１のヌクレオチドを含む。
【０２８７】
方法の工程（５）において、脱保護工程が行われ、新たに組み込まれたヌクレオチドからターミネーター基が除去される。代替的に、図１（それぞれ１０４および１０５）に示すように、脱保護工程が工程（４）として定義され、切断工程が工程（５）として定義される切断工程の前に行われてもよい。
【０２８８】
工程１−足場ポリヌクレオチドの提供
本発明の合成方法の例示的なバージョン１では、二本鎖足場ポリヌクレオチドは、工程（１）で提供される（１０１）。合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、二本鎖足場ポリヌクレオチドが提供され、合成鎖は、プライマー鎖部分を含む。支持鎖の末端ヌクレオチドは、支持鎖の末端ヌクレオチドが対合されず、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出する、単一ヌクレオチド突出を含む。支持鎖の末端ヌクレオチドは、リガーゼ酵素の基質として作用することができ、連結可能基、好ましくはリン酸基を含む。
【０２８９】
工程２−ポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結および所定の配列の第１のヌクレオチドの組み込み
方法の工程（２）において、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子は、粘着末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって足場ポリヌクレオチドに連結される（１０２）。
【０２９０】
ポリヌクレオチド連結分子は、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含む。ポリヌクレオチド連結分子は、支持鎖にユニバーサルヌクレオチドおよび所定の配列の第１のヌクレオチドを含む相補的連結末端をさらに含む。
【０２９１】
ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、支持鎖の末端ヌクレオチドが、任意の所与の合成サイクルにおいて足場ポリヌクレオチドに組み込まれる所定の配列の第１のヌクレオチドであるように構造化される。支持鎖の末端ヌクレオチドは、ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合する。相補的連結末端は、単一ヌクレオチド突出を含み、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出する。支持鎖の末端ヌクレオチド、すなわち、そのサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドは、支持鎖＋１中のヌクレオチド位置ｎ＋１を占める。位置ｎとは、第２のヌクレオチドの組み込み時にそのサイクルの所定の配列の第２のヌクレオチドとは反対になるヌクレオチド位置を意味する。位置ｎ＋１は、相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎに対する次のヌクレオチド位置である。図１では、所定の配列の第１のヌクレオチドはアデノシンとして示され、工程（３）における所定の配列の第２のヌクレオチドはチミンとして示され、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドはチミンとして示される。アデノシンおよびチミンは、純粋に例示のために示される。第１および第２のヌクレオチドならびにヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、ユーザによって選択される任意の好適なヌクレオチドであり得る。Ｘとして示されるヌクレオチドも、ユーザによって選択される任意の好適なヌクレオチドであり得る。
【０２９２】
典型的には、相補的連結末端における支持鎖の末端ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端の支持鎖の３’末端を定義する。
【０２９３】
ポリヌクレオチド連結分子のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド鎖中の別のポリヌクレオチドに連結することができないように構成される（図１の上部の右上に示される構造において純粋に例示のために「Ｔ」と標識された位置）。このヌクレオチドは、連結不可能な末端ヌクレオチドと呼ばれる。典型的には、この末端ヌクレオチドは、リン酸基を欠いており、すなわち、ヌクレオシドである。典型的には、ヘルパー鎖のこの末端ヌクレオチドは、ヘルパー鎖の５’末端を定義する。
【０２９４】
ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端では、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、それが支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであるように、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合されるように、かつ支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋２を占めるように、位置付けられ。位置ｎ＋２とは、相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖中の第２のヌクレオチド位置を意味する。
【０２９５】
突出相補的連結末端は、好適な連結条件に供されたときに、それが足場ポリヌクレオチドの突出末端と適合的に接合するように構成される。ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖と足場ポリヌクレオチドとの連結時に、第１のヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドに組み込まれる。ポリヌクレオチド連結分子のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドが連結不可能なヌクレオチドであるため、リガーゼ酵素は、ヘルパー鎖と合成鎖のプライマー鎖部分とが連結することを防止し、したがって、ヘルパー鎖と合成鎖のプライマー鎖部分との間に一本鎖切断または「ニック」を作成する。
【０２９６】
足場ポリヌクレオチドへのポリヌクレオチド連結分子の連結は、工程（１）の二本鎖足場ポリヌクレオチドの支持鎖の長さを伸長し、所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖に組み込まれる。
【０２９７】
支持鎖の連結は、任意の好適な手段によって行われ得る。連結は、典型的および好ましくは、リガーゼ活性を有する酵素によって行われ得る。例えば、連結は、本明細書でさらに記載されるＴ３  ＤＮＡリガーゼもしくはＴ４  ＤＮＡリガーゼまたはその機能的バリアントもしくは等価物を用いて行われ得る。ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、例えば、末端リン酸基がないために、または連結不可能な基が存在するために、リガーゼの基質として作用することができないように提供されるため、このような酵素の使用は、合成鎖における一本鎖切断の維持をもたらす。
【０２９８】
ポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結後、所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドは、ヌクレオチド位置ｎ＋１を占めると称され、ユニバーサルヌクレオチドは、ヌクレオチド位置ｎ＋２を占めると称され、連結前に、プライマー鎖部分に対して近位方向にある足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドであったヌクレオチドは、ヌクレオチド位置ｎを占めると称される。
【０２９９】
工程３−所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込み
方法の工程（３）において、ポリヌクレオチド連結分子の足場ヌクレオチドへの連結後、次いで、所定の配列の第２のヌクレオチドが、プライマー鎖部分の伸長によって合成鎖に組み込まれる。
【０３００】
プライマー鎖部分の伸長は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド分子を単一ヌクレオチドで伸長する能力を有する任意の好適な酵素の作用によって達成され得る。このような酵素は、典型的には、ヌクレオチドトランスフェラーゼ酵素またはポリメラーゼ酵素である。本明細書でさらに定義されるか、または当業者に既知の任意の好適な酵素を使用することができる。
【０３０１】
プライマー鎖部分の伸長の直前にヘルパー鎖が足場ポリヌクレオチド中に存在する場合、また特にポリメラーゼ酵素が使用される場合、酵素は、ヘルパー鎖に「侵入」し、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを置換するように作用し得る。その後、組み込まれた第２のヌクレオチドは、ヘルパー鎖の置換された末端ヌクレオチドによって以前に占めされた位置を占める（図１の下部の中央に示される構造を参照されたい）。ある特定の実施形態では、ヘルパー鎖は、伸長／組み込み工程（３）の前に除去されてもよく、この場合、酵素は、ヘルパー鎖またはその一部を置換する必要なく、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドにアクセスし伸長してもよい。
【０３０２】
工程（３）の間に組み込まれる所定の配列の第２のヌクレオチドは、酵素によるさらなる伸長を防止するか、または酵素によるさらなる伸長を防止する任意の他の類似の官能性を含む可逆的ターミネーター基を含む。本明細書でさらに定義されるか、または当業者に既知の任意の好適な可逆的ターミネーター基または官能基を使用することができる。
【０３０３】
足場ポリヌクレオチドのプライマー鎖部分へのその組み込み時に、そのサイクルの所定の配列の第２のヌクレオチドは、パートナーヌクレオチドと対合して、そのサイクルのヌクレオチド対を形成する。ヌクレオチド対は、本明細書にさらに定義されるような任意の好適なヌクレオチド対であり得る。
【０３０４】
工程４−切断
方法の工程（４）において、連結された足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される（１０４）。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は、足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断（工程４）は、存在し、切断の直前に支持鎖にハイブリダイズされる場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。
【０３０５】
足場ポリヌクレオチドの切断は、それにより、足場ポリヌクレオチドからポリヌクレオチド連結分子を放出するが、対合されず、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に付着するそのサイクルの第１のヌクレオチドの保持、および切断された足場ポリヌクレオチドの合成鎖に付着し、パートナーヌクレオチドと対合される、そのサイクルの第２のヌクレオチドの保持をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断は、支持鎖の末端に所定の配列の第１のヌクレオチドを、合成鎖のプライマー鎖部分の末端に所定の配列の第２のヌクレオチドを含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを定位置に残す。支持鎖の切断された末端の末端ヌクレオチドである、そのサイクルの第１のヌクレオチドは、合成鎖のプライマー鎖部分の切断された末端の末端ヌクレオチドであるそのサイクルの第２のヌクレオチドに突出する。
【０３０６】
この例示的な方法では、合成鎖にすでに一本鎖切断または「ニック」が提供されており、したがって足場ポリヌクレオチドに二本鎖切断を提供するためには支持鎖の切断のみが必要である。ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖中の位置ｎ＋２を占めるときにこのような突出する切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを得るために、支持鎖は、ユニバーサルヌクレオチドに対して特定の位置で切断される。足場ポリヌクレオチドの支持鎖がヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間で切断される場合、ポリヌクレオチド連結分子は、そのサイクルの第１のヌクレオチドが、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に付着した足場ポリヌクレオチドに保持されることを除いて、足場ポリヌクレオチドから放出される（図１の上部の左上に示される構造を参照されたい）。
【０３０７】
リン酸基は、切断部位で切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに付着され続けるべきである。これにより、次の合成サイクルの連結工程において、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖に切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖を確実に連結することができる。切断は、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドが連結可能基、好ましくは末端リン酸基を保持し、したがって、リン酸化工程が行われる必要がないように行われる。
【０３０８】
したがって、方法のバージョン１では、ユニバーサルヌクレオチドは、工程（２）、（３）、および（４）で支持鎖中の位置ｎ＋２を占め、支持鎖は、工程（４）でヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間で切断される。
【０３０９】
好ましくは、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間のホスホジエステル結合（ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖に対する近位方向において、ユニバーサルヌクレオチドの位置に対する支持鎖の第１のホスホジエステル結合）の切断によって切断される。
【０３１０】
支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間のホスホジエステル結合の一方のエステル結合の切断によって切断され得る。
【０３１１】
好ましくは、支持鎖はヌクレオチド位置ｎ＋２に対する第１のエステル結合の切断により切断される。これは、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖上の切断位置で末端リン酸基を保持する効果を有するであろう。
【０３１２】
ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎ＋２を占める場合、任意の好適な機構を用いて、ヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間の支持鎖の切断をもたらし得る。
【０３１３】
上記に記載されるようなヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間の支持鎖の切断は、酵素の作用によって行われ得る。
【０３１４】
上記に記載されるようなヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間の支持鎖の切断は、２工程切断プロセスとして行われ得る。
【０３１５】
２工程切断プロセスの第１の切断工程は、支持鎖からユニバーサルヌクレオチドを除去し、それによって位置ｎ＋２に脱塩基部位を形成することを含み得、第２の切断工程は、位置ｎ＋２とｎ＋１との間の脱塩基部位で支持鎖を切断することを含み得る。
【０３１６】
上記に概説された方法でユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で支持鎖を切断する１つの機構は、実施例２に記載されている。実施例２に記載される切断機構は例示的なものであり、上記に記載されるような突出を含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドが達成されるという条件で、他の機構を用いることができる。
【０３１７】
２工程切断プロセスの第１の切断工程では、糖−リン酸足場を無傷のままにしながら、ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖から除去される。これは、二本鎖ポリヌクレオチドから一本鎖ユニバーサルヌクレオチドを特異的に除去ことができる酵素の作用によって達成することができる。例示された切断方法では、ユニバーサルヌクレオチドは、イノシンであり、イノシンは、酵素の作用によって支持鎖から除去され、よって脱塩基部位を形成する。例示された切断方法では、酵素は、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ酵素、具体的にはヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）である。無塩基部位が形成されるという条件で、他の酵素、分子、または化学物質を使用することができる。ヌクレオチド除去酵素は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）などのポリヌクレオチドからのウラシルの放出を触媒する酵素であり得る。
【０３１８】
２工程切断プロセスの第２の切断工程では、支持鎖は、一本鎖切断を作成することによって脱塩基部位で切断される。例示された方法では、支持鎖は、ＮａＯＨなどの塩基である化学物質の作用によって切断される。代替的に、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンなどの有機化学物質を使用してもよい。あるいは、ＡＰエンドヌクレアーゼ１、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎｔｈ）、またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩなどの脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を使用してもよい。記載されるような脱塩基部位で支持鎖が切断されるという条件で、他の酵素、分子、または化学物質を使用することができる。
【０３１９】
したがって、ユニバーサルヌクレオチドが工程（１）および（２）で支持鎖の位置ｎ＋２にあり、支持鎖が位置ｎ＋２とｎ＋１との間で切断される実施形態では、第１の切断工程は、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われ得る。このような酵素の例は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）などの３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ酵素である。第２の切断工程は、ＮａＯＨなどの塩基である化学物質を用いて行われ得る。第２の工程は、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンなどの脱塩基部位切断活性を有する有機化学物質を用いて行われ得る。第２の工程は、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩまたはエンドヌクレアーゼＩＩＩなどの脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われ得る。
【０３２０】
上記に記載されるようなヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間の支持鎖の切断はまた、１工程切断プロセスとして行われ得る。任意のこのようなプロセスで使用され得る酵素の例には、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩが含まれる。任意のこのようなプロセスで使用され得る他の酵素には、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）、および８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＯＧＧ１）などの８−オキソグアノシンを切断する酵素が含まれる。
【０３２１】
工程５−脱保護
本発明のこの例示的な方法のバージョンでは、全てのバージョンと同様に、隣のヌクレオチドを次の合成サイクルに組み込むことを可能にするために、可逆的ターミネーター基を第１のヌクレオチドから除去しなければならない（脱保護工程；１０５）。これは、第１のサイクルの様々な段階で行われ得る。これは、切断工程（４）の後、本方法の工程（５）として行うことができる。しかしながら、脱保護工程は、工程（３）での第２のヌクレオチドの組み込み後、および切断工程（４）の前に行われてもよく、この場合、図１（それぞれ１０４および１０５）に示すように、脱保護工程が工程（４）として定義され、切断工程が工程（５）として定義される。脱保護工程がどの段階で行われるかにかかわらず、酵素および残りの組み込まれていない第２のヌクレオチドは、同じ合成サイクルにおける第２のヌクレオチドの多重組み込みを防止するために、工程（３）の後に最初に除去されるべきである。
【０３２２】
第１のヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去は、当業者に既知の任意の好適な手段によって行われ得る。例えば、除去は、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの化学物質の使用によって行われ得る。
【０３２３】
さらなるサイクル
第１の合成サイクルの完了後、第２およびさらなる合成サイクルは、同じ方法の工程を使用して行われ得る。
【０３２４】
前のサイクルの工程（４）および（５）の切断生産物は、次の合成サイクルのための二本鎖足場ポリヌクレオチドとして提供される（工程６において）。
【０３２５】
次のおよび各さらなる合成サイクルの工程（６）において、さらなる二本鎖ポリヌクレオチド連結分子が、前のサイクルの工程（４）および（５）の切断生産物に連結される。ポリヌクレオチド連結分子は、ポリヌクレオチド連結分子がさらなる合成サイクルの第１のヌクレオチドを含むことを除いて、前のサイクルの工程（２）について上記に記載されるのと同じ方法で構造化され得る。ポリヌクレオチド連結分子は、工程（２）について上記に記載されるのと同じ方法で、前のサイクルの工程（４）および（５）の切断生産物に連結され得る。
【０３２６】
次のおよび各さらなる合成サイクルの工程（７）において、二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端は、ヌクレオチドトランスフェラーゼ酵素、ポリメラーゼ酵素、または他の酵素の作用によるさらなる合成サイクルの第２のヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長される。さらなる合成サイクルの第２のヌクレオチドは、工程（３）について上記に記載されるのと同じ方法で組み込まれ得る。
【０３２７】
次のおよび各さらなる合成サイクルの工程（８）において、連結された足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される。切断は、足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断（工程８）は、存在し、切断の直前に支持鎖にハイブリダイズされる場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断は、それにより、足場ポリヌクレオチドからさらなるポリヌクレオチド連結分子を放出するが、対合されず、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に付着するそのさらなるサイクルの第１のヌクレオチドの保持、および切断された足場ポリヌクレオチドの合成鎖に付着し、パートナーヌクレオチドと対合される、そのさらなるサイクルの第２のヌクレオチドの保持をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断は、さらなるサイクルの第１のヌクレオチドを、足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端でさらなるサイクルの第２のヌクレオチドに突出する足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを適所に残す。工程（８）における切断は、工程（４）に関して上述されるのと同じ方法で行われ得る。
【０３２８】
工程（９）では、可逆的ターミネーター基は、さらなるサイクルの第２のヌクレオチドから除去される（脱保護工程；１０９）。第１のサイクルについて上記に記載されるように、これは様々な段階で行われ得る。これは、切断工程（８）の後、本方法の工程（９）として行うことができる。代替的に、脱保護工程は、組み込み工程（７）の後、および切断工程（８）の前の任意の工程で行われてもよく、この場合、図１（それぞれ１０９および１１０）に示すように、脱保護工程は工程（８）として定義され、切断工程は工程（９）として定義される。次のサイクルおよびさらなるサイクルにおける可逆的ターミネーター基の除去による脱保護は、第１の合成サイクルに関して上記に記載されるように行われ得る。
【０３２９】
合成サイクルは、上記に記載されるように、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するのに必要な回数だけ繰り返される。
【０３３０】
合成方法のバージョン２
図２を参照すると、本発明の合成方法の第２の特定の非限定的で例示的なバージョンでは、二本鎖足場ポリヌクレオチドが提供される（図２の工程１；２０１）。二本鎖足場ポリヌクレオチドは、支持鎖と、それにハイブリダイズされた合成鎖と、を含む。合成鎖はプライマー鎖部分を含む。二本鎖足場ポリヌクレオチドには、少なくとも１つの突出末端が提供され、少なくとも１つの突出末端は、プライマー鎖部分の末端に突出する支持鎖の末端を含む。支持鎖の末端ヌクレオチドは、リガーゼ酵素の基質として作用することができ、好ましくはリン酸基または他の連結可能基を含む。
【０３３１】
方法の工程（２）において、ポリヌクレオチド連結分子（図２の上部の右上に示される構造を参照されたい）は、足場ポリヌクレオチドに連結される。連結は、所定の配列の第２のヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドの支持鎖に組み込む（図２の工程２；２０２）。
【０３３２】
方法の工程（３）において、所定のヌクレオチド配列の第２のヌクレオチドは、単一ヌクレオチドでオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド分子を伸長する能力を有する酵素の作用によって合成鎖のプライマー鎖部分の末端に付加される。このような酵素は、典型的には、ヌクレオチドトランスフェラーゼ酵素またはポリメラーゼ酵素である（図２の工程３；２０３）。第２のヌクレオチドには、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基が提供される。したがって、工程（３）において、一塩基のみが組み込まれる。
【０３３３】
各合成サイクルにおいて、足場ポリヌクレオチドは、次いで、支持鎖にユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で切断される（工程４、２０４）。方法のバージョン２において、切断は、プライマー鎖部分に対する近位方向／ヘルパー鎖に対する遠位方向において、ユニバーサルヌクレオチドの隣のヌクレオチド位置にあるヌクレオチドの直後で支持鎖を切断することを含む。足場ポリヌクレオチドの切断（工程４）は、足場ポリヌクレオチドからのポリヌクレオチド連結分子の放出、ならびに対合されず、切断された足場ポリヌクレオチドの第１の鎖に付着したそのサイクルの第１のヌクレオチドの保持、および合成鎖のプライマー鎖部分に付着し、パートナーヌクレオチドと対合するそのサイクルの第２のヌクレオチドの保持をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断（工程４）は、存在し、切断直前に支持鎖にハイブリダイズされる場合、足場ポリヌクレオチドからのヘルパー鎖の喪失、および足場ポリヌクレオチドからのユニバーサルヌクレオチドの喪失をもたらす。切断は、切断部位に、支持鎖の切断された末端および切断前のニック部位を含んだ合成鎖のプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを適所に残し、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドは、合成鎖のプライマー鎖部分の切断された末端の末端ヌクレオチドとしてのそのサイクルの第２のヌクレオチドに突出する支持鎖の切断された末端の末端ヌクレオチドとしてのそのサイクルの第１のヌクレオチドを含む。
【０３３４】
方法の工程（５）において、脱保護工程が行われ、新たに組み込まれたヌクレオチドからターミネーター基が除去される。代替的に、図２（それぞれ２０４および２０５）に示すように、脱保護工程が工程（４）として定義され、切断工程が工程（５）として定義される切断工程の前に行われてもよい。
【０３３５】
工程１−足場ポリヌクレオチドの提供
本発明の合成方法の例示的なバージョン２では、二本鎖足場ポリヌクレオチドは、工程（１）で提供される（２０１）。合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、二本鎖足場ポリヌクレオチドが提供され、合成鎖は、プライマー鎖部分を含む。支持鎖の末端ヌクレオチドは、支持鎖の末端ヌクレオチドが対合されず、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出する、単一ヌクレオチド突出を含む。支持鎖の末端ヌクレオチドは、リガーゼ酵素の基質として作用することができ、連結可能基、好ましくはリン酸基を含む。
【０３３６】
工程２−ポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結および所定の配列の第１のヌクレオチドの組み込み
方法の工程（２）において、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子は、粘着末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって足場ポリヌクレオチドに連結される（２０２）。
【０３３７】
ポリヌクレオチド連結分子は、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含む。ポリヌクレオチド連結分子は、支持鎖にユニバーサルヌクレオチドおよび所定の配列の第１のヌクレオチドを含む相補的連結末端をさらに含む。
【０３３８】
ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、支持鎖の末端ヌクレオチドが、任意の所与の合成サイクルにおいて足場ポリヌクレオチドに組み込まれる所定の配列の第１のヌクレオチドであるように構造化される。支持鎖の末端ヌクレオチドは、ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合する。相補的連結末端は、単一ヌクレオチド突出を含み、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出する。支持鎖の末端ヌクレオチド、すなわち、そのサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドは、支持鎖＋１中のヌクレオチド位置ｎ＋１を占める。位置ｎとは、第２のヌクレオチドの組み込み時にそのサイクルの所定の配列の第２のヌクレオチドとは反対になるヌクレオチド位置を意味する。位置ｎ＋１は、相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎに対する次のヌクレオチド位置である。図２では、所定の配列の第１のヌクレオチドはアデノシンとして示され、工程（３）における所定の配列の第２のヌクレオチドはチミンとして示され、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドはチミンとして示される。アデノシンおよびチミンは、純粋に例示のために示される。第１および第２のヌクレオチドならびにヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、任意の好適なヌクレオチドであり得る。Ｘとして示されるヌクレオチドも、ユーザによって選択される任意の好適なヌクレオチドであり得る。
【０３３９】
典型的には、相補的連結末端における支持鎖の末端ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端の支持鎖の３’末端を定義する。
【０３４０】
ポリヌクレオチド連結分子のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド鎖中の別のポリヌクレオチドに連結することができないように構成される（図２の上部の右上に示される構造において純粋に例示のために「Ｔ」と標識された位置）。このヌクレオチドは、連結不可能な末端ヌクレオチドと呼ばれる。典型的には、この末端ヌクレオチドは、リン酸基を欠いており、すなわち、ヌクレオシドである。典型的には、ヘルパー鎖のこの末端ヌクレオチドは、ヘルパー鎖の５’末端を定義する。
【０３４１】
ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端では、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合されるように、かつ支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋３を占めるように、位置付けられる。位置ｎ＋３とは、相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖中の第３のヌクレオチド位置を意味する。
【０３４２】
突出相補的連結末端は、好適な連結条件に供されたときに、それが足場ポリヌクレオチドの突出末端と適合的に接合するように構成される。ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖と足場ポリヌクレオチドとの連結時に、第１のヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドに組み込まれる。ポリヌクレオチド連結分子のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドが連結不可能なヌクレオチドであるため、リガーゼ酵素は、ヘルパー鎖と合成鎖のプライマー鎖部分とが連結することを防止し、したがって、ヘルパー鎖と合成鎖のプライマー鎖部分との間に一本鎖切断または「ニック」を作成する。
【０３４３】
足場ポリヌクレオチドへのポリヌクレオチド連結分子の連結は、工程（１）の二本鎖足場ポリヌクレオチドの支持鎖の長さを伸長し、所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖に組み込まれる。
【０３４４】
支持鎖の連結は、任意の好適な手段によって行われ得る。連結は、典型的および好ましくは、リガーゼ活性を有する酵素によって行われ得る。例えば、連結は、本明細書でさらに記載されるＴ３  ＤＮＡリガーゼもしくはＴ４  ＤＮＡリガーゼまたはその機能的バリアントもしくは等価物を用いて行われ得る。ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、例えば、末端リン酸基がないために、または連結不可能な基が存在するために、リガーゼの基質として作用することができないように提供されるため、このような酵素の使用は、合成鎖における一本鎖切断の維持をもたらす。
【０３４５】
ポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結後、所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドは、ヌクレオチド位置ｎ＋１を占めると称され、ユニバーサルヌクレオチドは、ヌクレオチド位置ｎ＋３を占めると称され、連結前に、プライマー鎖部分に対して近位方向にある足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドであったヌクレオチドは、ヌクレオチド位置ｎを占めると称される。
【０３４６】
工程３−所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込み
方法の工程（３）において、ポリヌクレオチド連結分子の足場ヌクレオチドへの連結後、次いで、所定の配列の第２のヌクレオチドが、プライマー鎖部分の伸長によって合成鎖に組み込まれる。
【０３４７】
プライマー鎖部分の伸長は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド分子を単一ヌクレオチドで伸長する能力を有する任意の好適な酵素の作用によって達成され得る。このような酵素は、典型的には、ヌクレオチドトランスフェラーゼ酵素またはポリメラーゼ酵素である。本明細書でさらに定義されるか、または当業者に既知の任意の好適な酵素を使用することができる。
【０３４８】
プライマー鎖部分の伸長の直前にヘルパー鎖が足場ポリヌクレオチド中に存在する場合、また特にポリメラーゼ酵素が使用される場合、酵素は、ヘルパー鎖に「侵入」し、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを置換するように作用し得る。その後、組み込まれた第２のヌクレオチドは、ヘルパー鎖の置換された末端ヌクレオチドによって以前に占めされた位置を占める（図２の下部の中央に示される構造を参照されたい）。ある特定の実施形態では、ヘルパー鎖は、伸長／組み込み工程（３）の前に除去されてもよく、この場合、酵素は、ヘルパー鎖またはその一部を置換する必要なく、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドにアクセスし伸長してもよい。
【０３４９】
工程（３）の間に組み込まれる所定の配列の第２のヌクレオチドは、酵素によるさらなる伸長を防止するか、または酵素によるさらなる伸長を防止する任意の他の類似の官能性を含む可逆的ターミネーター基を含む。本明細書でさらに定義されるか、または当業者に既知の任意の好適な可逆的ターミネーター基または官能基を使用することができる。
【０３５０】
足場ポリヌクレオチドのプライマー鎖部分へのその組み込み時に、そのサイクルの所定の配列の第２のヌクレオチドは、パートナーヌクレオチドと対合して、そのサイクルのヌクレオチド対を形成する。ヌクレオチド対は、本明細書にさらに定義されるような任意の好適なヌクレオチド対であり得る。
【０３５１】
工程４−切断
方法の工程（４）において、連結された足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される（２０４）。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は、足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断（工程４）は、存在し、切断の直前に支持鎖にハイブリダイズされる場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。
【０３５２】
足場ポリヌクレオチドの切断は、それにより、足場ポリヌクレオチドからポリヌクレオチド連結分子を放出するが、対合されず、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に付着するそのサイクルの第１のヌクレオチドの保持、および切断された足場ポリヌクレオチドの合成鎖に付着し、パートナーヌクレオチドと対合される、そのサイクルの第２のヌクレオチドの保持をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断は、支持鎖の末端に所定の配列の第１のヌクレオチドを、合成鎖のプライマー鎖部分の末端に所定の配列の第２のヌクレオチドを含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを適所に残す。支持鎖の切断された末端の末端ヌクレオチドである、そのサイクルの第１のヌクレオチドは、合成鎖のプライマー鎖部分の切断された末端の末端ヌクレオチドであるそのサイクルの第２のヌクレオチドに突出する。
【０３５３】
この例示的な方法では、合成鎖にすでに一本鎖切断または「ニック」が提供されており、したがって足場ポリヌクレオチドに二本鎖切断を提供するためには支持鎖の切断のみが必要である。ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖中の位置ｎ＋３を占めるときにこのような突出する切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを得るために、支持鎖は、ユニバーサルヌクレオチドに対して特定の位置で切断される。足場ポリヌクレオチドの支持鎖がヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間で切断される場合、ポリヌクレオチド連結分子は、そのサイクルの第１のヌクレオチドが、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に付着した足場ポリヌクレオチドに保持されることを除いて、足場ポリヌクレオチドから放出される（図１の上部の左上に示される構造を参照されたい）。
【０３５４】
リン酸基は、切断部位で切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに付着され続けるべきである。これにより、次の合成サイクルの連結工程において、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖に切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖を確実に連結することができる。切断は、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドが連結可能基、好ましくは末端リン酸基を保持し、したがって、リン酸化工程が行われる必要がないように行われる。
【０３５５】
したがって、方法のバージョン１では、ユニバーサルヌクレオチドは、工程（２）、（３）、および（４）で支持鎖中の位置ｎ＋３を占め、支持鎖は、工程（４）でヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間で切断される。
【０３５６】
好ましくは、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間のホスホジエステル結合（ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖に対する近位方向において、ユニバーサルヌクレオチドの位置に対する支持鎖の第１のホスホジエステル結合）の切断によって切断される。
【０３５７】
支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間のホスホジエステル結合の一方のエステル結合の切断によって切断され得る。
【０３５８】
好ましくは、支持鎖はヌクレオチド位置ｎ＋２に対する第１のエステル結合の切断により切断される。これは、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖上の切断位置で末端リン酸基を保持する効果を有するであろう。
【０３５９】
ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎ＋３を占める場合、任意の好適な機構を用いて、ヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間の支持鎖の切断をもたらし得る。
【０３６０】
上記に記載されるようなヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間の支持鎖の切断は、酵素の作用によって行われ得る。
【０３６１】
上記に記載されるように、ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖中の位置ｎ＋３を占めるときの、ヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間の支持鎖の切断は、エンドヌクレアーゼＶなどの酵素の作用によって行われ得る。
【０３６２】
支持鎖中の位置ｎ＋３を占めているユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で、ヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間で支持鎖を切断する１つの機構は、実施例３に類似の方法で記載されている。記載される機構は例示的であり、上記に記載される切断配置が達成されるという条件で、他の機構を用いることができる。
【０３６３】
この例示的な機構では、エンドヌクレアーゼ酵素が用いられる。例示された方法では、酵素は、エンドヌクレアーゼＶである。ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖中の位置ｎ＋３を占めるときに支持鎖がヌクレオチド位置ｎ＋２とｎ＋１との間で切断されるという条件で、他の酵素、分子、または化学物質を使用することができる。
【０３６４】
工程５−脱保護
本発明のこの例示的な方法のバージョンでは、全てのバージョンと同様に、隣のヌクレオチドを次の合成サイクルに組み込むことを可能にするために、可逆的ターミネーター基を第１のヌクレオチドから除去しなければならない（脱保護工程；２０５）。これは、第１のサイクルの様々な段階で行われ得る。これは、切断工程（４）の後、本方法の工程（５）として行うことができる。しかしながら、脱保護工程は、工程（３）での第２のヌクレオチドの組み込み後、および切断工程（４）の前に行われてもよく、この場合、図２（それぞれ２０４および２０５）に示すように、脱保護工程が工程（４）として定義され、切断工程が工程（５）として定義される。脱保護工程がどの段階で行われるかにかかわらず、酵素および残りの組み込まれていない第２のヌクレオチドは、同じ合成サイクルにおける第２のヌクレオチドの多重組み込みを防止するために、工程（３）の後に最初に除去されるべきである。
【０３６５】
第１のヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去は、当業者に既知の任意の好適な手段によって行われ得る。例えば、除去は、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの化学物質の使用によって行われ得る。
【０３６６】
さらなるサイクル
第１の合成サイクルの完了後、第２およびさらなる合成サイクルは、同じ方法の工程を使用して行われ得る。
【０３６７】
前のサイクルの工程（４）および（５）の切断生産物は、次の合成サイクルのための二本鎖足場ポリヌクレオチドとして提供される（工程６において）。
【０３６８】
次のおよび各さらなる合成サイクルの工程（６）において、さらなる二本鎖ポリヌクレオチド連結分子が、前のサイクルの工程（４）および（５）の切断生産物に連結される。ポリヌクレオチド連結分子は、ポリヌクレオチド連結分子がさらなる合成サイクルの第１のヌクレオチドを含むことを除いて、前のサイクルの工程（２）について上記に記載されるのと同じ方法で構造化され得る。ポリヌクレオチド連結分子は、工程（２）について上記に記載されるのと同じ方法で、前のサイクルの工程（４）および（５）の切断生産物に連結され得る。
【０３６９】
次のおよび各さらなる合成サイクルの工程（７）において、二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端は、ヌクレオチドトランスフェラーゼ酵素、ポリメラーゼ酵素、または他の酵素の作用によるさらなる合成サイクルの第２のヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長される。さらなる合成サイクルの第２のヌクレオチドは、工程（３）について上記に記載されるのと同じ方法で組み込まれ得る。
【０３７０】
次のおよび各さらなる合成サイクルの工程（８）において、連結された足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される。切断は、足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断（工程８）は、存在し、切断の直前に支持鎖にハイブリダイズされる場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断は、それにより、足場ポリヌクレオチドからさらなるポリヌクレオチド連結分子を放出するが、対合されず、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に付着するそのさらなるサイクルの第１のヌクレオチドの保持、および切断された足場ポリヌクレオチドの合成鎖に付着し、パートナーヌクレオチドと対合される、そのさらなるサイクルの第２のヌクレオチドの保持をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断は、さらなるサイクルの第１のヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに含み、足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端でさらなるサイクルの第２のヌクレオチドに突出する、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを適所に残す。工程（８）における切断は、工程（４）に関して上述されるのと同じ方法で行われ得る。
【０３７１】
工程（９）では、可逆的ターミネーター基は、さらなるサイクルの第２のヌクレオチドから除去される（脱保護工程；２０９）。第１のサイクルについて上記に記載されるように、これは様々な段階で行われ得る。これは、切断工程（８）の後、本方法の工程（９）として行うことができる。代替的に、脱保護工程は、組み込み工程（７）の後、および切断工程（８）の前の任意の工程で行われてもよく、この場合、図２（それぞれ２０９および２１０）に示すように、脱保護工程は工程（８）として定義され、切断工程は工程（９）として定義される。次のサイクルおよびさらなるサイクルにおける可逆的ターミネーター基の除去による脱保護は、第１の合成サイクルに関して上記に記載されるように行われ得る。
【０３７２】
合成サイクルは、上記に記載されるように、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するのに必要な回数だけ繰り返される。
【０３７３】
合成方法のバージョン２の変形例
上記に記載される方法に加えて、合成方法のバージョン２の変形例が提供され、本方法は、以下の変形例を除いて、上記に記載される合成方法のバージョン２と同じ方法で行われる。
【０３７４】
第１のサイクルの連結工程（工程２）において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋３＋ｘを占めるように、かつ相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから除去された３＋ｘ位置であるヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合されるように、構造化され、ヌクレオチド位置ｎ＋３は、相補的連結末端に対する遠位方向において、ヌクレオチド位置ｎに対する支持鎖中の第３のヌクレオチド位置である。
【０３７５】
第１のサイクルの切断工程（工程４）において、ユニバーサルヌクレオチドは代わりに、足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋３＋ｘを占め、ヌクレオチド位置ｎ＋３は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、ヌクレオチド位置ｎに対する支持鎖中の第３のヌクレオチド位置であり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎ＋２とｎ＋１との間で切断される。
【０３７６】
第２のサイクルの連結工程（工程６）において、および全てのさらなるサイクルの連結工程において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋３＋ｘを占めるように、かつ相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから除去された３＋ｘ位置であるパートナーヌクレオチドと対合されるように、構造化され、ヌクレオチド位置ｎ＋３は、相補的連結末端に対する遠位方向において、ヌクレオチド位置ｎに対する支持鎖中の第３のヌクレオチド位置である。
【０３７７】
最後に、第２のサイクルの切断工程（工程８）において、および全てのさらなるサイクルの切断工程において、ユニバーサルヌクレオチドは代わりに、足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋３＋ｘを占め、ヌクレオチド位置ｎ＋３は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、ヌクレオチド位置ｎに対する支持鎖中の第３のヌクレオチド位置であり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎ＋２とｎ＋１との間で切断される。
【０３７８】
これらの変形例の方法の全てにおいて、ｘは、１〜１０以上の間の整数であり、ｘは、所与の一連のサイクルの工程（２）、（４）、（６）、および（８）で同じ整数である。
【０３７９】
合成方法のバージョン２と同様に、バージョン２に基づく変形例の方法では、任意の所与のサイクルにおいて、連結後、ならびに組み込みおよび切断工程の間の、支持鎖中のそのサイクルの第１のヌクレオチドによって占められるヌクレオチド位置が、ヌクレオチド位置ｎ＋１として定義され、所与の合成サイクルの完了時の、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のそのサイクルのその第１のヌクレオチドによって占められる位置が、次の合成サイクルにおいてヌクレオチド位置ｎとして定義されることに留意されたい。
【０３８０】
したがって、合成方法のバージョン２のこれらの特定の変形例において、ヌクレオチド位置ｎに対する切断部位の位置は一定に保持され、ヌクレオチド位置ｎに対するユニバーサルヌクレオチドの位置は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、ユニバーサルヌクレオチドの位置を、ｘに対して選択された数によって決定されるいくつかのヌクレオチド位置だけ移動することによって増加される。
【０３８１】
これらの変形例の方法の概略図を図３に提供し、ここでは、脱保護工程が工程（４）として示され、切断工程がステップ（５）として示される。上で考察したように、これらの工程行われ得る順序は、入れ替えることができる。
【０３８２】
合成方法のバージョン１および２のさらなる変形例
上記に記載される合成方法のバージョン２の変形方法に加えて、合成方法のバージョン１および２の変形例であるさらなる方法が提供される。これらの方法は、以下に記載される変形例を除いて、上記に記載される合成方法のバージョン１および２と同じ方法で行われる。合成方法のバージョン１および２のこれらのさらなる変形例は、すぐ下に記載される同じ一般的なフォーマットに従って行われる。合成方法のバージョン１のさらなる変形例と合成方法のバージョン２のさらなる変形例との間の相違は、ヌクレオチド位置ｎに対するユニバーサルヌクレオチドの位置付けにおけるものである。
【０３８３】
合成方法のバージョン１および２のさらなる変形例のための一般的なフォーマット。
第１のサイクルの工程（１）において、足場ポリヌクレオチドは、プライマー鎖部分に対して近位にある足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端が、１＋ｙヌクレオチドを含む多重ヌクレオチド突出を含むように提供される。ｙに対して選択される数は、１以上の整数である。したがって、突出は、２つ以上のヌクレオチドを含む。支持鎖の１＋ｙヌクレオチドは、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出する。
【０３８４】
突出の第１のヌクレオチドと称されるヌクレオチドは、突出の末端に対して遠位にある突出中の位置を占める。言い換えれば、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるヌクレオチドの隣の支持鎖中のヌクレオチド位置を占める、対合されていないヌクレオチドである。突出の第２のヌクレオチドは、突出の末端に対する近位方向において、突出の第１のヌクレオチドの隣のヌクレオチド位置を占める、対合していないヌクレオチドである。したがって、最小突出長が２つのヌクレオチドの場合、突出の第２のヌクレオチドが、突出支持鎖の末端ヌクレオチドである。突出の第１のヌクレオチドは、ヌクレオチド位置ｎを占め、工程（３）で組み込まれたその第１のサイクルの第２のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである。突出の第２のヌクレオチドは、ヌクレオチド位置ｎ＋１を占め、工程（７）で組み込まれた次の／第２の合成のサイクルの第２のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである。
【０３８５】
第１のサイクルの工程（２）において、ヘルパー鎖の末端が、１＋ｙヌクレオチドを含む多重ヌクレオチド突出も含むように、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端が提供され、ｙは、１以上である整数である。したがって、相補的連結末端中の突出も、２つ以上のヌクレオチドを含む。相補的連結末端のヘルパー鎖の１＋ｙヌクレオチドは、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出し、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の１＋ｙ突出ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである。
【０３８６】
任意の所与の合成サイクルにおいて、ｙに対して選択される数は、足場ポリヌクレオチドおよび相補的連結末端の両方の突出に関して同じ数であることが好ましい。そうである場合、ポリヌクレオチド連結分子が足場ポリヌクレオチドに連結されるとき、全ての前の突出ヌクレオチドは、対応するパートナーヌクレオチドと対を形成する。ｙに対して選択された数が、足場ポリヌクレオチドおよび相補的連結末端の両方の突出に関して異なる数である場合、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端におけるｙに対して選択される数は、足場ポリヌクレオチドにおけるｙに対して選択される数よりも少ないことが好ましい。そうである場合、ポリヌクレオチド連結分子が足場ポリヌクレオチドに連結されるとき、突出ヌクレオチドの一部が、対応するパートナーヌクレオチドと対を形成する。これは、ニック部位に隣接する足場ポリヌクレオチドの支持鎖のヌクレオチドのうちの１つ以上を対合させないままにする。これは、組み込み／伸長工程の間に、トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、または他の酵素がプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドへのアクセスを得ることを促進し得る。
【０３８７】
相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドは、そのサイクルの第１のヌクレオチドであり、ヌクレオチド位置ｎ＋２＋ｘを占め、第３の合成サイクルで形成された異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドである。ｘに対して選択される数は、０以上である整数である。
【０３８８】
ｘに対して選択される数は、足場ポリヌクレオチドに関して、ｙに対して選択される数−１である。したがって、足場ポリヌクレオチドにおける突出に関して、ｙ＝１の場合、足場ポリヌクレオチドにおける突出の長さは、２である。足場ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドは、位置ｎ＋１を占める。ｙ＝１の場合、ｘ＝０である。したがって、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチド、すなわち、そのサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドは、ヌクレオチド位置ｎ＋２を占める。足場ポリヌクレオチドにおける突出に関して、ｙ＝２の場合、足場ポリヌクレオチドにおける突出の長さは、３である。足場ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドは、位置ｎ＋２を占める。Ｙ＝２の場合、ｘ＝１である。したがって、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチド、すなわち、そのサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドは、ヌクレオチド位置ｎ＋３を占めるなどである。
【０３８９】
工程（２）と同様に、工程（６）において、足場ポリヌクレオチドは、プライマー鎖部分に対して近位にある足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端が、１＋ｙヌクレオチドを含む多重ヌクレオチド突出を含むように提供され、ｙは、１以上である整数である。したがって、突出は、２つ以上のヌクレオチドを含む。支持鎖の１＋ｙヌクレオチドは、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出する。
【０３９０】
突出の第１のヌクレオチドと称されるヌクレオチドは、突出の末端に対して遠位にある突出中の位置を占める。突出の第２のヌクレオチドは、突出の末端に対する近位方向において、突出の第１のヌクレオチドの隣のヌクレオチド位置を占める、対合していないヌクレオチドである。したがって、最小突出長が２つのヌクレオチドの場合、突出の第２のヌクレオチドが、突出支持鎖の末端ヌクレオチドである。突出の第１のヌクレオチドは、ヌクレオチド位置ｎを占め、工程（７）で組み込まれた今の／第２のサイクルの第２のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである。突出の第２のヌクレオチドは、ヌクレオチド位置ｎ＋１を占め、次の／第３の合成のサイクルの第２のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである。
【０３９１】
工程（６）において、ヘルパー鎖の末端が、１＋ｙヌクレオチドを含む多重ヌクレオチド突出も含むように、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端が提供され、ｙは、１以上である整数である。したがって、相補的連結末端中の突出も、２つ以上のヌクレオチドを含む。相補的連結末端のヘルパー鎖の１＋ｙヌクレオチドは、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出し、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の１＋ｙ突出ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである。
【０３９２】
工程（２）と同様に、任意の所与のさらなる合成サイクルにおいて、工程（６）においてｙに対して選択される数は、足場ポリヌクレオチドおよび相補的連結末端の両方の突出に関して同じ数であることが好ましい。ｙに対して選択された数が、足場ポリヌクレオチドおよび相補的連結末端の両方の突出に関して異なる数である場合、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端におけるｙに対して選択される数は、足場ポリヌクレオチドにおけるｙに対して選択される数よりも少ないことが好ましい。
【０３９３】
相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドは、そのサイクルの第１のヌクレオチドであり、ヌクレオチド位置ｎ＋２＋ｘを占め、第４の合成サイクルで形成された異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドである。ｘに対して選択される数は、０以上である整数である。
【０３９４】
先に示されるように、任意の所与のサイクルまたは一連のさらなるサイクルにおいて、ｘに対して選択される数は、足場ポリヌクレオチドに関して、ｙに対して選択される数−１である。したがって、足場ポリヌクレオチドにおける突出に関して、ｙ＝１の場合、足場ポリヌクレオチドにおける突出の長さは、２である。足場ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドは、位置ｎ＋１を占める。ｙ＝１の場合、ｘ＝０である。したがって、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチド、すなわち、そのサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドは、ヌクレオチド位置ｎ＋２を占める。足場ポリヌクレオチドにおける突出に関して、ｙ＝２の場合、足場ポリヌクレオチドにおける突出の長さは、３である。足場ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドは、位置ｎ＋２を占める。Ｙ＝２の場合、ｘ＝１である。したがって、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチド、すなわち、そのサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドは、ヌクレオチド位置ｎ＋３を占めるなどである。
【０３９５】
任意の所与のサイクルにおいて、連結後、ならびに組み込みおよび切断工程の間の、支持鎖中のそのサイクルの第１のヌクレオチドによって占められるヌクレオチド位置は、ヌクレオチド位置ｎ＋２＋ｘとして定義され、所与の合成サイクルの完了時の、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のそのサイクルの第１のヌクレオチドによって占められる位置は、足場ポリヌクレオチドの支持鎖中の二重ヌクレオチド突出の場合、次の合成サイクルにおいてヌクレオチド位置ｎ＋１として定義されるか、または足場ポリヌクレオチドの支持鎖中の三重ヌクレオチド突出の場合、次の合成サイクルにおいてヌクレオチド位置ｎ＋２として定義されるなどであることに留意されたい。
【０３９６】
したがって、合成方法のバージョン１および２のこれらの特定の変形例において、ユニバーサルヌクレオチドの位置およびヌクレオチド位置ｎに対する切断部位の位置は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、ユニバーサルヌクレオチドの位置および切断部位の位置を、ｘに対して選択された数によって決定されるいくつかのヌクレオチド位置だけ移動することによって増加される。
【０３９７】
合成方法のバージョン１のさらなる変形例のための特定のフォーマット。
【０３９８】
本発明はさらに、合成方法のバージョン１の特定のさらなる変形例を提供する。この変形例の方法は、以下の追加の特徴と共に、上記に記載される合成方法のバージョン１および２のさらなる変形例のための一般的なフォーマットに従って行われる。
【０３９９】
第１およびさらなるサイクルの両方において、ユニバーサルヌクレオチドは、ポリヌクレオチド連結分子および連結された足場ポリヌクレオチドの両方において、位置ｎ＋３＋ｘを占め、足場ポリヌクレオチドは、位置ｎ＋３＋ｘとｎ＋２＋ｘとの間で切断される。
【０４００】
これらの変形例の方法の概略図を図４に提供し、ここでは、脱保護工程が工程（４）として示され、切断工程がステップ（５）として示される。上で考察したように、これらの工程行われ得る順序は、入れ替えることができる。この図において、垂直の二重線構造の存在は、足場ポリヌクレオチドの突出支持鎖およびポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端の突出支持鎖の両方における１つ以上のさらなるヌクレオチドの存在の可能性を表す。足場ポリヌクレオチドの突出支持鎖の末端ヌクレオチドは、末端リン酸基などの末端連結可能基を有する。
【０４０１】
合成方法のバージョン２のさらなる変形例のための特定のフォーマット。
本発明はさらに、合成方法のバージョン２の特定のさらなる変形例を提供する。この変形例の方法は、以下の追加の特徴と共に、上記に記載される合成方法のバージョン１および２のさらなる変形例のための一般的なフォーマットに従って行われる。
【０４０２】
第１およびさらなるサイクルの両方において、ユニバーサルヌクレオチドは、ポリヌクレオチド連結分子および連結された足場ポリヌクレオチドの両方において、位置ｎ＋４＋ｘを占め、足場ポリヌクレオチドは、位置ｎ＋３＋ｘとｎ＋２＋ｘとの間で切断される。
【０４０３】
これらの変形例の方法の概略図を図５に提供し、ここでは、脱保護工程が工程（４）として示され、切断工程がステップ（５）として示される。上で考察したように、これらの工程行われ得る順序は、入れ替えることができる。この図において、垂直の二重線構造の存在は、足場ポリヌクレオチドの突出支持鎖およびポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端の突出支持鎖の両方における１つ以上のさらなるヌクレオチドの存在の可能性を表す。足場ポリヌクレオチドの突出支持鎖の末端ヌクレオチドは、末端リン酸基などの末端連結可能基を有する。
【０４０４】
１サイクル当たり３つ以上のヌクレオチドの組み込みを伴う合成方法のバージョン１および２の変形例
本発明はさらに、上記に記載される特定のバージョン１および２、ならびにそれらの変形例に基づくまたさらに追加の変形例の方法を含む、１サイクル当たり３つ以上のヌクレオチドが組み込まれる、またさらに追加の変形例の方法を提供する。これらのまたさらにさらなる変形例の方法のいずれかは、以下の修正が行われ得ることを除いて、上記に記載されるように行われ得る。
【０４０５】
工程（２）において、ポリヌクレオチド連結分子には、第１のサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドを含み、第１のサイクルの所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含む、相補的連結末端が提供される。次いで、ポリヌクレオチド連結分子が、足場ポリヌクレオチドに連結される。第１のサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドは、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドである。相補的連結末端は、好ましくは、第１のサイクルの所定の配列の第１およびさらなるヌクレオチドが、ヌクレオチドの直鎖状配列を含むように構造化され、配列中の各ヌクレオチドは、相補的連結末端に対する遠位方向において、支持鎖中の次のヌクレオチド位置を占める。
【０４０６】
工程（３）において、二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端は、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、第１のサイクルの所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込みにより伸長され、プライマー鎖部分の末端は、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、第１のサイクルの所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長され、第１のサイクルの第２およびさらなるヌクレオチドのそれぞれは、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、各さらなる伸長後、可逆的ターミネーター基は、次のヌクレオチドの組み込みの前の脱保護工程（工程４）において、ヌクレオチドから除去される。
【０４０７】
ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、切断前の工程（４）において、ユニバーサルヌクレオチドが、相補的連結末端に対する遠位方向において、第１およびさらなるヌクレオチドのヌクレオチド位置の後である支持鎖中の位置を占めるように構造化される。
【０４０８】
切断後の工程（４）において、第１のサイクルの所定の配列の第１、第２、およびさらなるヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチド中に保持される。
【０４０９】
工程（６）において、ポリヌクレオチド連結分子には、さらなるサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドを含み、さらなるサイクルの所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含む、相補的連結末端が提供される。工程（２）と同様に、次いで、ポリヌクレオチド連結分子が、足場ポリヌクレオチドに連結される。工程（２）と同様に、さらなるサイクルの所定の配列の第１のヌクレオチドは、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドである。相補的連結末端は、好ましくは、さらなるサイクルの所定の配列の第１およびさらなるヌクレオチドが、ヌクレオチドの直鎖状配列を含むように構造化され、配列中の各ヌクレオチドは、相補的連結末端に対する遠位方向において、支持鎖中の次のヌクレオチド位置を占める。
【０４１０】
工程（６）において、二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端は、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、さらなるサイクルの所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込みにより伸長され、プライマー鎖部分の末端は、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、さらなるサイクルの所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長され、さらなるサイクルの第２およびさらなるヌクレオチドのそれぞれは、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、各さらなる伸長後、可逆的ターミネーター基は、次のヌクレオチドの組み込み前にヌクレオチドから除去される。
【０４１１】
切断後の工程（８）において、さらなるサイクルの所定の配列の第１、第２、およびさらなるヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチド中に保持される。
【０４１２】
これらの変形例の方法では、切断は、任意の所与のサイクルに組み込まれる一番最後のさらなるヌクレオチドの可逆的ターミネーター基が、切断部位で連結された足場ポリヌクレオチドを切断するステップの後に一番最後のさらなるヌクレオチドから代替的に除去され得ることを除いて、最後の脱保護ステップ（ステップ４および８）の後に、ステップ（５）および（９）として常に行われる。
【０４１３】
任意の所与の合成サイクルにおけるこれらの変形例の方法では、切断前に、支持鎖において、所定の配列の第１のヌクレオチドによって占められる位置は、位置ｎ＋１と呼ばれ得、支持鎖において、所定の配列の第１のさらなるヌクレオチドによって占められる位置は、位置ｎ＋２と呼ばれ得、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、位置ｎ＋３＋ｘと呼ばれ得、ｘは、０〜１０以上の整数であり、ｘは、支持鎖が１つのさらなるヌクレオチドのみを含む場合は０であり、ｘは、支持鎖が２つのさらなるヌクレオチドのみを含む場合は１であるなどである。
【０４１４】
これらの変形例の方法のうちのいずれにおいても、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、切断前の工程（４）および（８）において、ユニバーサルヌクレオチドが、相補的連結末端に対する遠位方向において、第１およびさらなるヌクレオチドのヌクレオチド位置の後の、支持鎖中の次のヌクレオチド位置である支持鎖中の位置を占めるように、かつ支持鎖が、最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置と、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置との間で切断されるように、構造化される。
【０４１５】
これらの変形例の方法の概略図を図６に提供し、ここでは、脱保護工程が工程（４）として示され、切断工程がステップ（５）として示される。上で考察したように、これらの工程行われ得る順序は、組み込まれる一番最後のヌクレオチドに対して入れ替えることができる。図６に示される方法スキームは、支持鎖が最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置とユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置との間で切断される、上記の本発明の合成方法のバージョン１の適応に基づく。
【０４１６】
これらの変形例の方法のうちのいずれにおいても、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、代替的に、切断前の工程（４）および（８）において、ユニバーサルヌクレオチドが、相補的連結末端に対する遠位方向において、第１およびさらなるヌクレオチドのヌクレオチド位置の後の、支持鎖中の次＋１のヌクレオチド位置である支持鎖中の位置を占めるように、かつ支持鎖が、代替的に、最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置と、支持鎖中の次のヌクレオチドによって占められる位置との間で切断されるように、構造化される。
【０４１７】
支持鎖が最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置とユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置との間で切断される、本発明の合成方法のバージョン１の適応に基づいて図６に示される方法スキームは、支持鎖が、代替的に、支持鎖中の最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置と、ユニバーサルヌクレオチドに対して遠位である支持鎖中の次のヌクレオチドによって占められる位置との間で切断されるように、等しく適合され得る。したがって、このような適応は、上記に記載されるような本発明の合成方法のバージョン２の適応に基づく。
【０４１８】
第１およびさらなる合成サイクルの間のさらなるヌクレオチドの組み込みに対応するために、各第１および第２のヌクレオチドに加えて、ヌクレオチド位置ｎに対するユニバーサルヌクレオチドの配置の観点から、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端の構成に通例の適合を行う必要があり得ることが理解されるであろう。本明細書に記載および定義される本発明の全ての方法において、ヌクレオチド位置ｎは、必然的に、組み込まれる前にまたは組み込まれると、任意の所与のサイクルの所定の配列の第２のヌクレオチドと反対であるか、または反対になる、支持鎖中のヌクレオチド位置である。したがって、当業者は、第１およびさらなる合成サイクルのさらなるヌクレオチドの組み込みに対応するように、方法のバージョンおよびそれらの変形例のうちのいずれかを適応させるために、ユニバーサルヌクレオチドの位置付けおよびヌクレオチド位置ｎに対する切断部位の選択に対する通例の修正を容易に行うことができる。
【実施例】
【０４１９】
以下の実施例は、本発明によるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを合成するための方法、ならびにその方法において使用される例示的な構築物の支持を提供する。実施例は本発明を限定しない。
【０４２０】
実施例１３以外に、以下の実施例は、本発明による合成方法に関連するが、その範囲内にない反応スキームによる合成方法を説明する。
【０４２１】
実施例は、所定の配列のヌクレオチドの足場ポリヌクレオチドの合成鎖への付加、ユニバーサルヌクレオチドによって定義される切断部位での足場ポリヌクレオチドの切断、ならびに所定の配列の付加されたヌクレオチドのパートナーヌクレオチド、および次の合成サイクルで使用するための切断部位の作成に使用するための新たなユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド連結分子の連結の工程を伴う合成反応を行う能力を示す。本発明の方法は、これらの工程を修正された内容で組み込む。したがって、実施例１３以外に、以下の実施例は、本明細書で定義される本発明の方法の例示的な支持を提供する。実施例１３は、本発明の方法、例えば、本発明の合成方法のバージョン１および２ならびにそれらの変形例（図１〜６）による組み込み工程を使用した、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ修飾−ｄＮＴＰの組み込みに関するデータを提供する。
【０４２２】
以下の実施例および対応する図１３〜５１では、合成方法の「バージョン１、２、および３」または「バージョン１、２、または３の化学」などへの言及は、それぞれ図７、８、および９に記載される反応の概略図に従って解釈されるべきであり、図１〜６のうちのいずれかに示される反応の概略図または本明細書の同じ説明には従わない。実施例１３および図５２は、本発明の合成方法に従って解釈される。特に、本発明１および２の合成方法ならびにそれらの変形例、および図１〜６に示される関連する反応の概略図、より具体的には、このような方法の組み込み工程３による。
【０４２３】
実施例１．ヘルパー鎖の不在下での合成。
この実施例は、４つの工程：部分二本鎖ＤＮＡ上への３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンと反対で起こる。
【０４２４】
工程１：組み込み
第１の工程は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護単一ヌクレオチドの制御された付加を記載する（図１３ａ）。
【０４２５】
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
【０４２６】
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図１３ｈ）。原液を１００μＭの濃度で調製した。
【０４２７】
３．３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。しかしながら、修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
【０４２８】
２種類の可逆的ターミネーターを試験した。
【化３３】
2021529548.tif 000035
【０４２９】
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．２５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
【０４３０】
２．０．５μｌの１０μＭプライマー（合成鎖）（５ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号１、図１３ｈ）および０．７５μｌの１０μＭ鋳型（支持鎖）（６ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号２、図１３ｈ）を反応混合物に加えた。
【０４３１】
３．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
【０４３２】
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。しかしながら、修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
【０４３３】
５．反応物を６５℃で２０分間インキュベートした。
【０４３４】
６．ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
【０４３５】
７．反応物を、ＴＢＥ緩衝液を含むポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
【０４３６】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
【０４３７】
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
【０４３８】
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
【０４３９】
４．ゲルを、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０４４０】
結果
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ製のカスタマイズされて操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼは、ユニバーサルヌクレオチド、例えばノシンと反対に３’−Ｏ−修飾−ｄＮＴＰを組み込むことができる効率的なＤＮＡポリメラーゼである（図１３ｂ〜ｃ）。
【０４４１】
イノシンと反対の効率的な組み込みは、６５℃の温度で起こった（図１３ｄ〜ｅ）。
【０４４２】
イノシンと反対側の３’−Ｏ−修飾ｄＴＴＰの組み込みは、Ｍｎ２＋イオンの存在を必要とする（図１３ｆ〜ｇ）。成功した転化は、図１３ｃ、ｅ、ｇ、およびｈにおいて太字でマークされている。
【０４４３】
結論
イノシンと反対の３−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みは、Ｍｎ２＋イオンの存在下で６５℃の温度で、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ製のカスタマイズされて操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して特に高い効率で達成され得る。
【０４４４】
工程２：切断
第２の工程は、ｈＡＡＧ／Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩまたはｈＡＡＧ／化学塩基のいずれかによるポリヌクレオチドの２工程切断を記載する（図１４ａ）。
【０４４５】
材料および方法
材料
１．実施例１で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図１４（ｅ）の表を参照されたい）。
【０４４６】
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０４４７】
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、４１μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
【０４４８】
２．次に、５μｌの１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ（登録商標）反応緩衝液ＮＥＢ（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
【０４４９】
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図１４ｅ）、鋳型（配列番号３）または任意の蛍光タグ付きの長オリゴ鎖、Ｔを有するプライマー（配列番号４）、および対照（配列番号５）を全て５ｐｍｏｌで同じチューブに加えた。
【０４５０】
４．１μｌのヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）ＮＥＢ（１０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０４５１】
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０４５２】
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
【０４５３】
周囲条件下での精製試料混合物を以下に概説されたプロトコルを使用して精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
【０４５４】
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０４５５】
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０４５６】
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
【０４５７】
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
【０４５８】
６．ＤＮＡ溶出について、５０μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）をカラム膜の中央に加え、室温で１分間放置した。
【０４５９】
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために−２０℃で保存した。
【０４６０】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
【０４６１】
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
【０４６２】
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
【０４６３】
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０４６４】
生成された脱塩基部位の切断を以下の手順を使用して実施した。
１．２μｌ（１０〜１００ｎｇ／μｌ）のＤＮＡを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加えた。
【０４６５】
２．４０μｌ（０．２Ｍ）のＮａＯＨまたは１．５μｌのＥｎｄｏ  ＶＩＩＩ  ＮＥＢ（１０単位／μｌ）および５μｌの１０×反応緩衝液ＮＥＢ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、７５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２５℃でｐＨ８）も同じチューブに加え、再懸濁して１３０００ｒｐｍで５秒間遠心分離することによって穏やかに混合した。
【０４６６】
３．得られた混合物をＮａＯＨ処理試料について室温で５分間インキュベートし、その間にＥｎｄｏ  ＶＩＩＩ反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。
【０４６７】
４．インキュベーション時間が経過した後、上記に概説されるような精製プロトコルの工程１〜７を使用して、反応混合物を精製した。
【０４６８】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
【０４６９】
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
【０４７０】
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
【０４７１】
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０４７２】
結果および結論
ヘルパー鎖によらない切断反応は、切断対未切断ＤＮＡ比の約７％：９３％という低いパーセンテージ収率を示した（図１４ｂ〜ｄ）。
【０４７３】
切断結果は、この特定の実施例において、使用された特定の試薬に基づいて、陽性対照と比較して、ヘルパー鎖の不在下で低い収率の切断ＤＮＡが得られることを示した。加えて、脱塩基部位の切断のための化学塩基の使用は、ＥｎｄｏＶＩＩＩ切断と比較して時間がかからなかった。
【０４７４】
工程３：連結
第３の工程は、ヘルパー鎖の不在下でのＤＮＡリガーゼとのポリヌクレオチドの連結を記載する。概略図を図１５に示す。
【０４７５】
材料および方法
材料
１．実施例１で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図１５ｃの表を参照されたい）。
【０４７６】
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０４７７】
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、１６μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
【０４７８】
２．次に、１０μｌの２×Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液ＮＥＢ（１３２ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのジチオトレイトール、２ｍＭのＡＴＰ、１５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）および２５℃でｐＨ７．６）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
【０４７９】
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図１５ｃ）、ＴＡＭＲＡまたは任意の蛍光タグ付きリン酸鎖（配列番号７）、Ｔを有するプライマー（配列番号８）、およびイノシン鎖（配列番号９）を全て５ｐｍｏｌで同じチューブに加えた。
【０４８０】
４．１μｌのＱｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（４００単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０４８１】
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することにより穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
【０４８２】
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
【０４８３】
７．上記に記載されるような精製工程１〜７に概説されるプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０４８４】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
【０４８５】
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
【０４８６】
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅをブランクにし、次に、ブランキングの後に工程２を繰り返した。
【０４８７】
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０４８８】
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、上記に記載される工程５〜８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
【０４８９】
結果および結論
この特定の実施例において、使用される特定の試薬に基づいて、ヘルパー鎖の不在下で室温（２４℃）でのＤＮＡリガーゼ、この特定の場合はクイックＴ４  ＤＮＡリガーゼとのオリゴヌクレオチドの連結は、低減された量の連結生産物をもたらす（図１５ｂ）。
【０４９０】
実施例２．ヘルパー鎖によるバージョン１の化学。
この実施例は、４つの工程：ニック部位からの３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンと反対で起こる。方法は、連結および切断工程の効率を改善するヘルパー鎖を使用する。
【０４９１】
工程１：組み込み
第１の工程は、ＤＮＡポリメラーゼを使用した酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護単一ヌクレオチドの制御された付加を記載する（図１６ａ）。
【０４９２】
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
【０４９３】
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。原液を１００μＭの濃度で調製した。オリゴヌクレオチドを図１６ｂに示す。
【０４９４】
３．３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
【０４９５】
２種類の可逆的ターミネーターを試験した。
【化３４】
2021529548.tif 000036
【０４９６】
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４を、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１０．２５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
【０４９７】
２．０．５μｌの１０μＭプライマー（５ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号１０、図１６（ｂ）の表）、０．７５μｌの１０μＭ鋳型（６ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号１１、図１６（ｂ）の表）、２μｌの１０μＭのヘルパー鎖（配列番号１２、図１６（ｂ）の表）を反応混合物に加えた。
【０４９８】
３．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
【０４９９】
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
【０５００】
５．反応物を６５℃で２０分間インキュベートした。
【０５０１】
６．ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
【０５０２】
７．反応物をポリアクリルアミドゲル（１５％）ＴＢＥ緩衝液上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
【０５０３】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を、滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
【０５０４】
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
【０５０５】
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
【０５０６】
４．ゲルを、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０５０７】
組み込み工程は、上記に記載されるプロトコルに従って研究することができる。
【０５０８】
工程２：切断
第２の工程は、ｈＡＡＧ／Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩまたはｈＡＡＧ／化学塩基（×２）のいずれかによるポリヌクレオチドの２工程切断を記載する（図１７ａ）。
【０５０９】
材料および方法
材料
１．実施例２で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図１７ｆを参照されたい）。
【０５１０】
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０５１１】
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、４１μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
【０５１２】
２．５μｌの１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ（登録商標）反応緩衝液ＮＥＢ（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
【０５１３】
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図１７ｆ）、鋳型（配列番号１３）または任意の蛍光タグ付き長オリゴ鎖、Ｔを有するプライマー（配列番号１４）、対照（配列番号１５）、およびヘルパー鎖（配列番号１６）を全て５ｐｍｏｌで同じチューブに加えた。
【０５１４】
４．１μｌのヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）ＮＥＢ（１０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０５１５】
５．代替塩基を使用する反応では、１μｌのヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）ＮＥＢ（１００単位／μｌ）を加えた。
【０５１６】
６．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０５１７】
７．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
【０５１８】
周囲条件下での精製試料混合物を以下に概説されたプロトコルを使用して精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
【０５１９】
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０５２０】
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０５２１】
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
【０５２２】
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
【０５２３】
６．ＤＮＡ溶出のために、５０μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）をカラム膜の中央に加え、室温で１分間放置した。
【０５２４】
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために−２０℃で保存した。
【０５２５】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
【０５２６】
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
【０５２７】
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
【０５２８】
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０５２９】
以下の手順を使用して、生成された脱塩基部位の切断を実施した。
１．２μｌ（１０〜１００ｎｇ／μｌ）のＤＮＡを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加えた。
【０５３０】
２．４０μｌ（０．２Ｍ）のＮａＯＨまたは１．５μｌのＥｎｄｏ  ＶＩＩＩ  ＮＥＢ（１０単位／μｌ）および５μｌの１０×反応緩衝液ＮＥＢ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、７５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２５℃でｐＨ８）も同じチューブに加え、再懸濁して１３０００ｒｐｍで５秒間遠心分離することによって穏やかに混合した。
【０５３１】
３．得られた混合物を、０．２ＭのＮａＯＨ処理試料について室温で５分間インキュベートし、その間にＥｎｄｏ  ＶＩＩＩ反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。
【０５３２】
４．インキュベーション時間が経過した後、反応混合物を上述の精製プロトコルの工程１〜７を使用して精製した。
【０５３３】
以下の手順を使用して、代替の塩基性化学物質を使用して生成された脱塩基部位の切断を実施した。
１．１μｌ（１０〜１００ｎｇ／μｌ）のＤＮＡを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加えた。次に、酢酸溶液シグマ（９９．８％）で、室温でｐＨ７．４に緩衝化された２μｌのＮ，Ｎ’ジメチルエチレンジアミンシグマ（１００ｍＭ）を同じチューブに加えた。
【０５３４】
２．２０μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）をチューブに加え、再懸濁して１３０００ｒｐｍで５秒間の遠心分離することによって穏やかに混合した。
【０５３５】
３．得られた試料を３７℃で２０分間インキュベートした。
【０５３６】
４．インキュベーション時間が経過した後、反応混合物を上述の精製プロトコルの工程１〜７を使用して精製した。
【０５３７】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
【０５３８】
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
【０５３９】
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
【０５４０】
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０５４１】
結果
ｈＡＡＧ  ＤＮＡグリコシラーゼによるユニバーサルヌクレオチド、この場合はイノシンを含む切断部位での切断効率は、ヘルパー鎖の不在下での１０％からヘルパー鎖の存在下での５０％まで有意に増加した（図１７ｂ）。ｈＡＡＧおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩは、ｈＡＡＧおよびＮａＯＨ（５０％）よりも低い効率（１０％）でイノシンを切断する。ニックの入ったＤＮＡを使用した記載されるシステムでは、０．２ＭのＮａＯＨを使用した化学的切断が、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩよりもＡＰ部位の切断に好ましいことが示された（図１７ｃ）。中性ｐＨでの穏やかなＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンは、０．２ＭのＮａＯＨのような脱塩基部位を切断するのに高い効率を有し、それゆえ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩおよびＮａＯＨと比較して好ましい（図１７ｄ〜ｅ）。
【０５４２】
結論
イノシンを含むＤＮＡの切断について、３つの方法を評価した。１つの完全酵素法−ｈＡＡＧ／エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ならびに化学的および酵素的切断を組み合わせた２つの方法−ｈＡＡＧ／ＮａＯＨおよびｈＡＡＧ／ジメチルエチルアミンを、実施例２においてＤＮＡ切断について研究した。
【０５４３】
ｈＡＡＧ／ＮａＯＨの結果は、ヘルパー鎖の不在下（１０％）と比較して、ヘルパー鎖の存在下で切断ＤＮＡのはるかに高い収率（５０％）を示した。これらの特定の実施例では、使用される特定の試薬に基づいて、ヘルパー鎖はＤＮＡ切断の収率を増加させる。
【０５４４】
ＮａＯＨに対する代替物としてエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを使用した酵素的切断は、ヘルパー鎖の存在下でのＮａＯＨ（５０％）と比較して、効率が悪かった（１０％）。
【０５４５】
代替の穏やかな化学塩基Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンを含めると、ＮａＯＨと同じくらい効率的にＡＰ部位の高い切断効率が得られ、１０×ｈＡＡＧ酵素の付加と一緒に、切断ＤＮＡが有意に増加した（図１７ｅを参照されたい）。
【０５４６】
工程３：連結
第３の工程は、ヘルパー鎖の存在下でのポリヌクレオチドとＤＮＡリガーゼとの連結を記載する。概略図を図１８ａに示す。
【０５４７】
材料および方法
材料
１．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図１８ｄを参照されたい）。
【０５４８】
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０５４９】
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、１６μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
【０５５０】
２．次に、１０μｌの２×Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液ＮＥＢ（１３２ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのジチオトレイトール、２ｍＭのＡＴＰ、１５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）および２５℃でｐＨ７．６）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
【０５５１】
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図１８ｄ）、ＴＡＭＲＡまたは任意の蛍光タグ付きリン酸鎖（配列番号１８）、Ｔを有するプライマー（配列番号１９）およびイノシン鎖（配列番号２０）およびヘルパー鎖（配列番号２１）を全て５ｐｍｏｌで同じチューブに加えた。
【０５５２】
４．１μｌのＱｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（４００単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０５５３】
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、２０分間室温でインキュベートした。
【０５５４】
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
【０５５５】
７．上記に記載されるような精製工程１〜７に概説されるプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０５５６】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
【０５５７】
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
【０５５８】
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
【０５５９】
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０５６０】
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、上記の工程５〜８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
【０５６１】
結果および結論
この特定の実施例では、使用される特定の試薬に基づいて、ヘルパー鎖の不在下では連結活性の低下が観察され（図１８ｂ）、ヘルパー鎖の存在下では連結が高い効率で進行し（図１８ｃ）、生産物が高効率で形成された。
【０５６２】
実施例３．ヘルパー鎖によるバージョン２化学
この実施例は、４つの工程：部分二本鎖ＤＮＡ上への３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、組み込みの第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンに隣接して支持鎖中に位置付けられた天然に相補的なヌクレオチドと反対で起こる。
【０５６３】
工程１：組み込み
材料および方法
材料
第１の工程は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護単一ヌクレオチドの制御された付加を記載する（図１９ａ）。
【０５６４】
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
【０５６５】
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図１９ｊ）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
【０５６６】
３．３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
【０５６７】
全てのｄＮＴＰの３’−Ｏ−アジドメチル可逆的ターミネーターを、組み込みについて独立して試験した。
【化３５】
2021529548.tif 000037
【０５６８】
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．２５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
【０５６９】
２．０．５μｌの１０μＭプライマー（５ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号２２、図１９ｊ）および０．７５μｌの１０μＭ鋳型−Ａ／Ｇ／Ｔ／Ｃ（６ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号２３〜２６、図１９ｊ）および１μＬの１０μＭヘルパー鎖Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ（１０ｐｍｏｌ、２当量）（配列番号２７〜３０、図１９ｊ）を反応混合物に加えた。
【０５７０】
３．３’−Ｏ修飾−ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
【０５７１】
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
【０５７２】
５．反応物を６５℃で２０分間インキュベートした。
【０５７３】
６．ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
【０５７４】
７．反応物をポリアクリルアミドゲル（１５％）ＴＢＥ緩衝液上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
【０５７５】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を、滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
【０５７６】
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
【０５７７】
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
【０５７８】
４．ゲルを、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０５７９】
結果および結論
Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した３−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み時の温度の評価に関して、結果は、連結のためのヘルパー鎖の存在下での３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込みが５分後に９０％に達することを示す。３７℃および４７℃で２０分後には、１０％のプライマーが未伸長のままである。
【０５８０】
２ｍＭのＭｎ２＋イオンおよび３７℃の温度でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼは、ヘルパー鎖（前のサイクルによる連結工程からの）の存在下で高い効率でＤＮＡ中の相補的塩基と反対に３’−Ｏ−修飾−ｄＮＴＰを組み込むための良好な条件を提供する。
【０５８１】
工程２：切断
第２の工程は、エンドヌクレアーゼＶによるポリヌクレオチドの１工程切断を記載する（図２０ａ）。
【０５８２】
材料および方法
材料
１．実施例３で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図２０ｂの表を参照されたい）。
【０５８３】
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０５８４】
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、４１μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
【０５８５】
２．次に、５μｌの１０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）ＮＥＢ（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
【０５８６】
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図２０ｄ）、鋳型（配列番号３１）または任意の蛍光タグ付き長オリゴ鎖、Ｔを有するプライマー（配列番号３２）および対照（配列番号３３）およびヘルパー鎖（配列番号３４）を全て５ｐｍｏｌで同じチューブに加えた。
【０５８７】
４．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（１０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０５８８】
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０５８９】
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
【０５９０】
試料混合物を以下に概説されたプロトコルを使用して精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
【０５９１】
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０５９２】
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０５９３】
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
【０５９４】
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
【０５９５】
６．ＤＮＡ溶出のために、５０μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）をカラム膜の中央に加え、室温で１分間放置した。
【０５９６】
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために−２０℃で保存した。
【０５９７】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
【０５９８】
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
【０５９９】
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
【０６００】
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０６０１】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
【０６０２】
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
【０６０３】
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
【０６０４】
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉｄｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０６０５】
結果および結論
実施例３からの切断結果は、ヘルパー鎖の存在下または不在下でエンドヌクレアーゼＶを用いて有意に高収率の切断ＤＮＡを得ることができることを示した（図２０ｃ）。
【０６０６】
工程３：連結
第３の工程は、ヘルパー鎖の存在下でのポリヌクレオチドとＤＮＡリガーゼとの連結を記載する。概略図を図２１ａに示す。
【０６０７】
材料および方法
材料
１．実施例３で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図２１ｂの表を参照されたい）。
【０６０８】
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０６０９】
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、１６μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
【０６１０】
２．次に、１０μｌの２×Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液ＮＥＢ（１３２ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのジチオスレイトール、２ｍＭのＡＴＰ、１５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）、２５℃でｐＨ７．６）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
【０６１１】
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図２１ｂ）、ＴＡＭＲＡまたは任意の蛍光タグ付きリン酸鎖（配列番号３５）、Ｔを有するプライマー（配列番号３６）およびイノシン鎖（配列番号３７）およびヘルパー鎖（配列番号３８）を全て（５ｐｍｏｌの量を有する）同じチューブに加えた。
【０６１２】
４．１μｌのＱｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（４００単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０６１３】
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
【０６１４】
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
【０６１５】
７．上記に記載されるような精製工程１〜７に概説されるプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０６１６】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
【０６１７】
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
【０６１８】
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
【０６１９】
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０６２０】
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、上記に記載される工程５〜８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
【０６２１】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
【０６２２】
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
【０６２３】
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
【０６２４】
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０６２５】
工程４：脱保護
Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰの組み込みによってＤＮＡに導入された３’−Ｏ−アジドメチル基を担持するＤＮＡモデルについて、脱保護工程（図２２ａ）を研究した。脱保護をトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）によって実施し、全ての天然ｄＮＴＰの混合物を精製された脱保護ＤＮＡの溶液に加えたときの伸長反応によってモニタリングした。
【０６２６】
材料および方法
材料
１．実施例３で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図２２ｉを参照されたい）。
【０６２７】
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０６２８】
３．酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓから購入した。
【０６２９】
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．２５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
【０６３０】
２．１μｌの１０μＭプライマー（１０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号３９、図２２ｉ）および１．５μｌのいずれかの１０μＭ鋳型−Ａ／Ｇ／Ｔ／Ｃ（１５ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号４０〜４３、図２２ｉ）を反応混合物に加えた。
【０６３１】
３．３’−Ｏ修飾−ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
【０６３２】
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
【０６３３】
５．反応物を３７℃で５分間インキュベートした。
【０６３４】
６．４μＬの試料を取り出し、０．５μｌの５ｍＭのｄＮＴＰ混合物と混合し、制御反応のために１０分間反応させた。
【０６３５】
７．ｐＨ７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
【０６３６】
８．２０μＬの１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液によって溶出するＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
【０６３７】
９．１μＬの５ｍＭのｄＮＴＰ混合物および１μＬのＤｅｅｐＶｅｎｔ（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼを精製された反応混合物に加え、１０分間反応させた。
【０６３８】
１０．ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
【０６３９】
１１．反応物をポリアクリルアミドゲル（１５％）ＴＢＥ緩衝液上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
【０６４０】
結果および結論
５０ｍＭのＴＣＥＰは、０．２μＭのＤＮＡモデル上で３’−Ｏ−アジドメチル基を高い効率で切断するのに十分ではなかった（図２２ｈ）。対照的に、３００ｍＭのＴＣＥＰは、０．２μＭのＤＮＡモデル上で３’−Ｏ−アジドメチル基を９５％の効率で首尾よく切断した（図２２ｈ）。
【０６４１】
実施例４．二重ヘアピンモデルによるバージョン２化学
この実施例は、２つのヘアピンモデル上での４つの工程：ニック部位からの３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンに隣接する支持鎖中に位置付けられた天然に相補的なヌクレオチドと反対で起こる。
【０６４２】
工程１：組み込み
第１の工程は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護単一ヌクレオチドの制御された付加を記載する（図２３ａ）。
【０６４３】
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
【０６４４】
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図２３ｃ）。原液を１００μＭの濃度で調製した。
【０６４５】
３．３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
【０６４６】
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰを組み込みについて試験した。
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰ：
【化３６】
2021529548.tif 000038
【０６４７】
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４を、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１０．２５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
【０６４８】
２．０．５μｌの１０μＭヘアピンオリゴヌクレオチド（５ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号４４、図２３ｃ）を反応混合物に加えた。
【０６４９】
３．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
【０６５０】
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
【０６５１】
５．反応物を６５℃で２０分間インキュベートした。
【０６５２】
６．ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
【０６５３】
７．反応物をポリアクリルアミドゲル（１５％）ＴＢＥ緩衝液上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
【０６５４】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
【０６５５】
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
【０６５６】
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
【０６５７】
４．ゲルを、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０６５８】
結果
ＤＮＡポリメラーゼは、ヘアピン構築物中のその天然に相補的な塩基と反対に３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰを組み込む。
【０６５９】
工程２：切断
第２の工程は、この特定の場合におけるエンドヌクレアーゼＶによるヘアピンモデルの１工程切断を記載する（図２４ａ）。
【０６６０】
材料および方法
材料
１．実施例４で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図２４ｃを参照されたい）。
【０６６１】
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０６６２】
方法
以下の手順を使用して、ヘアピンオリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、４３μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
【０６６３】
２．次に、５μｌの１０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）ＮＥＢ（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
【０６６４】
３．５ｐｍｏｌの量を有する１μｌのヘアピンオリゴヌクレオチド（配列番号４５、図２４ｃ）を同じチューブに加えた。
【０６６５】
４．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０６６６】
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０６６７】
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
【０６６８】
試料混合物を以下に概説されたプロトコルを使用して精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
【０６６９】
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０６７０】
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０６７１】
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
【０６７２】
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
【０６７３】
６．ＤＮＡ溶出のために、５０μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）をカラム膜の中央に加え、室温で１分間放置した。
【０６７４】
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために−２０℃で保存した。
【０６７５】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
【０６７６】
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
【０６７７】
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
【０６７８】
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０６７９】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
【０６８０】
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
【０６８１】
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
【０６８２】
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０６８３】
結果および結論
実施例４からの切断結果は、エンドヌクレアーゼＶを用いて３７℃で著しく高収率の消化されたヘアピンＤＮＡが得られることを示した（図２４ｂ）。
【０６８４】
工程３：連結
第３の工程は、ヘアピンモデルとＤＮＡリガーゼとの連結を記載する。概略図を図２５ａに示す。
【０６８５】
材料および方法
材料
１．実施例４で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図２５ｃを参照されたい）。
【０６８６】
２  滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０６８７】
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、１μｌ（５ｐｍｏｌ）のＴＡＭＲＡまたは任意の蛍光タグ付きリン酸ヘアピンオリゴ（配列番号４６）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
【０６８８】
２．次に、１５μｌ（１００ｐｍｏｌ）のイノシン含有ヘアピン構築物（配列番号４７）を同じチューブに加え、ピペットで３秒間再懸濁することによって穏やかに混合した。
【０６８９】
３．４０μｌの平滑／ＴＡ  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０６９０】
４．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
【０６９１】
５．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
【０６９２】
６．上記の精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０６９３】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
【０６９４】
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
【０６９５】
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
【０６９６】
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０６９７】
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、上記に記載されるような工程５〜８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
【０６９８】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
【０６９９】
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
【０７００】
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
【０７０１】
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０７０２】
結果
ヘルパー鎖の存在下で室温（２４℃）での平滑／ＴＡ  ＤＮＡリガーゼとヘアピンオリゴヌクレオチドとの連結は、高収率の連結生産物をもたらした。１分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約８５％の比率で、高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。２分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約８５％の比率で、高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。３分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約８５％の比率で、高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。４分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約８５％超の比率で、高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した（図２５ｂ）。
【０７０３】
実施例５．バージョン２化学−二重ヘアピンモデルの完全サイクル。
この実施例は、二重ヘアピンモデル上での４つの工程：ニック部位からの３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンに隣接して支持鎖中に位置付けられた天然に相補的なヌクレオチドと反対で起こる。ヘアピンの一端は付着アンカーとして機能する。
【０７０４】
方法は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込み、その後のイノシン切断、連結、および脱保護によるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護一塩基の制御された付加によって開始する（図２６ａ）。
【０７０５】
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
【０７０６】
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図２６ｃ）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
【０７０７】
３．３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
【０７０８】
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰを組み込みについて試験した。
【化３７】
2021529548.tif 000039
【０７０９】
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
【０７１０】
２．２μｌの１０μＭの二重ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド（２０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号４８、図２６ｃ）を反応混合物に加えた。
【０７１１】
３．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
【０７１２】
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
【０７１３】
５．反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。
【０７１４】
６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物を加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
【０７１５】
７．精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０７１６】
８．２０μｌのＮＥＢ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０７１７】
９．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０７１８】
１０．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０７１９】
１１．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
【０７２０】
１２．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ＴＢＥ緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分析し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
【０７２１】
１３．上記の精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０７２２】
１４．２０μｌのＮＥＢ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０７２３】
１５．１０μｌの連結のための１００μＭの鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号４９、図２６ｃ）を反応混合物に加えた。
【０７２４】
１６．４０μｌの平滑／ＴＡ  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を精製されたＤＮＡ試料に加えた。
【０７２５】
１７．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
【０７２６】
１８．ｐＨ７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
【０７２７】
１９．２０μＬの１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液によって溶出するＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
【０７２８】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
【０７２９】
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
【０７３０】
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
【０７３１】
４．ゲルを、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０７３２】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
【０７３３】
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
【０７３４】
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
【０７３５】
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０７３６】
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、第２節の工程５〜８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
【０７３７】
以下に概説されたプロトコルを使用した各工程後に、試料混合物を精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
【０７３８】
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０７３９】
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０７４０】
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
【０７４１】
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
【０７４２】
６．ＤＮＡ溶出のために、反応のための２０μｌの適切な緩衝液をカラム膜の中心に加え、室温で１分間放置した。
【０７４３】
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために−２０℃で保存した。
【０７４４】
結果
ＤＮＡポリメラーゼは、二重ヘアピン構築物中のその天然に相補的な塩基と反対側に３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰを組み込む（図２６ｂ）。
【０７４５】
実施例６バージョン２化学−ヘルパー鎖を使用した単一ヘアピンモデルの完全サイクル
この実施例は、単一ヘアピンモデル上での４つの工程：ニック部位からの３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、天然に相補的な塩基と反対で起こる。ＤＮＡ合成は、その過程においてヘルパー鎖を使用する。
【０７４６】
方法は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込み、その後のイノシン切断、連結、および脱保護によるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護一塩基の制御された付加によって開始する（図２７ａ）。
【０７４７】
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
【０７４８】
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図２７ｂ）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
【０７４９】
３．３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
【０７５０】
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰを組み込みについて試験した。
【化３８】
2021529548.tif 000040
【０７５１】
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
【０７５２】
２．２μｌの１０μＭの単一ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド（２０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号５０、図２７ｂ）およびヘルパー鎖（３０ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号５１、図２７ｂ）を反応混合物に加えた。
【０７５３】
３．３’−Ｏ修飾−ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
【０７５４】
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
【０７５５】
５．反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。
【０７５６】
６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物を加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
【０７５７】
７．上記の精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０７５８】
８．２０μｌのＮＥＢ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０７５９】
９．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０７６０】
１０．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０７６１】
１１．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
【０７６２】
１２．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ＴＢＥ緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分析し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
【０７６３】
１３．上記の精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０７６４】
１４．２０μｌのＮＥＢ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０７６５】
１５．１０μｌの連結のための１００μＭの鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号５２、図２７ｂ）および１０μｌの連結のための１００μＭヘルパー鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号５３、図２７ｂ）を反応混合物に加えた。
【０７６６】
１６．４０μｌの平滑／ＴＡ  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０７６７】
１７．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
【０７６８】
１８．ｐＨ７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
【０７６９】
１９．２０μＬの１×ＮＥＢ  Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液によって溶出するＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
【０７７０】
２０．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
【０７７１】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を、滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
【０７７２】
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
【０７７３】
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
【０７７４】
４．ゲルを、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０７７５】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
【０７７６】
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
【０７７７】
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
【０７７８】
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０７７９】
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、工程５〜８において上記した手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
【０７８０】
以下に概説されたプロトコルを使用した各工程後に、試料混合物を精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
【０７８１】
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０７８２】
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０７８３】
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
【０７８４】
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
【０７８５】
６．ＤＮＡ溶出のために、反応のための２０μｌの適切な緩衝液をカラム膜の中央に加え、室温で１分間放置した。
【０７８６】
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために−２０℃で保存した。
【０７８７】
実施例７．バージョン３化学−二重ヘアピンモデルの完全サイクル。
この実施例は、二重ヘアピン構築物モデルについての４つの工程：ニック部位からの３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシン塩基と反対で起こる。
【０７８８】
方法は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込み、その後のイノシン切断、連結、および脱保護によるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護単一ヌクレオチドの制御された付加によって開始する（図２８ａ）。
【０７８９】
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
【０７９０】
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図２８ｂ）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
【０７９１】
３．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼは、３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力を高めた。
【０７９２】
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰを組み込みについて試験した。
【化３９】
2021529548.tif 000041
【０７９３】
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
【０７９４】
２．２μｌの１０μＭの二重ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド（２０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号５４、図２８ｂ）を反応混合物に加えた。
【０７９５】
３．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
【０７９６】
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
【０７９７】
５．反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。
【０７９８】
６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物を加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
【０７９９】
７．精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０８００】
８．２０μｌのＮＥＢ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０８０１】
９．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０８０２】
１０．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０８０３】
１１．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
【０８０４】
１２．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ＴＢＥ緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分析し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
【０８０５】
１３．上記の精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０８０６】
１４．２０μｌのＮＥＢ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０８０７】
１５．１０μｌの連結のための１００μＭの鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号５５、図２８ｂ）を反応混合物に加えた。
【０８０８】
１６．４０μｌの平滑／ＴＡ  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０８０９】
１７．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
【０８１０】
１８．ｐＨ７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
【０８１１】
１９．２０μＬの１×ＮＥＢ  Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液によって溶出するＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
【０８１２】
２０．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
【０８１３】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
【０８１４】
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
【０８１５】
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
【０８１６】
４．ゲルを、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０８１７】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
【０８１８】
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
【０８１９】
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅをブランクにした。次に、ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
【０８２０】
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０８２１】
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、第２節の工程５〜８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
【０８２２】
以下に概説されたプロトコルを使用した各工程後に、試料混合物を精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
【０８２３】
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０８２４】
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０８２５】
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
【０８２６】
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
【０８２７】
６．ＤＮＡ溶出のために、反応のための２０μｌの適切な緩衝液をカラム膜の中心に加え、室温で１分間放置した。
【０８２８】
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために−２０℃で保存した。
【０８２９】
実施例８バージョン２化学−二重ヘアピンモデルについての完全な２サイクル実験
この実施例は、二重ヘアピンモデル上で４つの工程：ニック部位からの３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、脱保護、切断、および連結を使用したポリヌクレオチドの合成のための完全な２サイクル実験を記載しており、第１の工程は、相補的塩基と反対で起こる。
【０８３０】
方法は、図２９ａに示される第１のサイクルの反応の概略図に示されるように、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込み、その後の脱保護、イノシン切断、および連結によるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護単一ヌクレオチドの制御された付加によって開始する。図２９ｂは、第２のサイクルの反応の概略図を示す。
【０８３１】
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
【０８３２】
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図２９ｄ）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
【０８３３】
３．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼは、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力を高めた。
【０８３４】
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰおよび３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＣＴＰを組み込みのために使用した。
【化４０】
2021529548.tif 000042
【０８３５】
方法
第１のサイクル：
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
【０８３６】
２．２μｌの１０μＭの二重ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド（２０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号５６、図２９ｄ）を反応混合物に加えた。
【０８３７】
３．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
【０８３８】
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
【０８３９】
５．反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。
【０８４０】
６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物を加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
【０８４１】
７．ｐＨ＝７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μｌの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
【０８４２】
８．精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０８４３】
９．２０μｌのＮＥＢ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０８４４】
１０．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０８４５】
１１．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０８４６】
１２．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
【０８４７】
１３．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ＴＢＥ緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分析し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
【０８４８】
１４．精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
【０８４９】
１５．２０μｌのＮＥＢ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０８５０】
１６．１０μｌの連結のための１００μＭの鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号５７、図２９ｄ）を反応混合物に加えた。
【０８５１】
１７．４０μｌの平滑／ＴＡ  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０８５２】
１８．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
【０８５３】
１９．精製工程１〜５に概説されたプロトコルを使用して、ストレプトアビジン磁気ビーズキットによって、反応混合物を精製した。
【０８５４】
２０．非連結オリゴヌクレオチドをラムダエキソヌクレアーゼによって消化した。
【０８５５】
２１．精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
【０８５６】
２２．２０μｌのＮＥＢ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０８５７】
第２のサイクル：
２３．３’−Ｏ−修飾−ｄＣＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
【０８５８】
２４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
【０８５９】
２５．反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。
【０８６０】
２６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物を加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
【０８６１】
２７．ｐＨ＝７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μｌの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
【０８６２】
２８．精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０８６３】
２９．２０μｌのＮＥＢ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０８６４】
３０．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０８６５】
３１．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０８６６】
３２．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
【０８６７】
３３．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ＴＢＥ緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分析し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
【０８６８】
３４．精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０８６９】
３５．２０μｌのＮＥＢ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０８７０】
３６．１０μｌの連結のための１００μＭの鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号５８、図２９ｂ）を反応混合物に加えた。
【０８７１】
３７．４０μｌの平滑／ＴＡ  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【０８７２】
３８．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で１０分間インキュベートした。
【０８７３】
３９．インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
【０８７４】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を、滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
【０８７５】
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
【０８７６】
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａを適用することによって、電気泳動に供した。
【０８７７】
４．ゲルを、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０８７８】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
【０８７９】
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
【０８８０】
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
【０８８１】
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０８８２】
以下に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、試料混合物を精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
【０８８３】
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０８８４】
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０８８５】
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
【０８８６】
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
【０８８７】
６．ＤＮＡ溶出のために、反応のための２０μｌの適切な緩衝液をカラム膜の中心に加え、室温で１分間放置した。
【０８８８】
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０８８９】
連結工程の後に、ストレプトアビジン磁気ビーズを使用して、以下に概説されたプロトコルを介して、試料混合物を精製した。
１．２００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）によって、１００μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を３回洗浄した。
【０８９０】
２．連結工程後の反応混合物を１０容量の結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）と混合し、ストレプトアビジン磁気ビーズと共に２０℃で１５分間インキュベートする。
【０８９１】
３．２００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）によって、ストレプトアビジン磁気ビーズを３回洗浄した。
【０８９２】
４．脱イオン水によって、ストレプトアビジン磁気ビーズを３回洗浄した。
【０８９３】
５．９５℃で３分間加熱することによる４０μｌの脱イオン水によって、オリゴヌクレオチドを溶出した。
【０８９４】
図２９ｃに示される結果は、本発明の例示的な方法を使用した２つの完全な合成サイクルの実行を示す。
【０８９５】
実施例９．バージョン２化学−単一ヘアピンモデル上での完全な３サイクル実験。
この実施例は、二重ヘアピンモデル上での５つの工程：ニック部位からの３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、脱保護、切断、連結、および変性工程を使用したポリヌクレオチドの合成のための完全な３サイクル実験を記載しており、第１の工程は、相補的塩基と反対で起こる。
【０８９６】
方法の例示的な概略図を、図３４、３５、および３６に示す。
【０８９７】
方法は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込み、その後の脱保護、切断、連結、およびヘルパー鎖の変性によるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護一塩基の制御された付加によって開始する。図３４は、酵素的組み込み、脱保護、切断、連結、および変性工程を伴う第１の完全サイクルを示す。この実施例では、オリゴヌクレオチドはＴヌクレオチドによって伸長される。図３５は、酵素的組み込み、脱保護、切断、連結工程、および変性工程を伴う第１のサイクルに続く第２の完全サイクルを示す。この実施例では、オリゴヌクレオチドはＴヌクレオチドによって伸長される。図３６は、酵素的組み込み、脱保護、切断、連結、および変性工程を伴う第２のサイクルに続く第３の完全サイクルを示す。この実施例では、オリゴヌクレオチドはＴヌクレオチドによって伸長される。
【０８９８】
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
【０８９９】
２．オリゴヌクレオチドを内部で設計し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た（図３７）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
【０９００】
３．３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。代替的に、任意のＤＮＡポリメラーゼまたは修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる他の酵素を使用することができる。
【０９０１】
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰを組み込みのために使用した。
【化４１】
2021529548.tif 000043
【０９０２】
方法
第１のサイクル：
１．２０μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）およびＭｎＣｌ２溶液（１０μｌの４０ｍＭ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１３９μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
【０９０３】
２．２０μｌの１００μＭの単一ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド（２ｎｍｏｌ、１当量）（配列番号５９、図３７）を反応混合物に加えた。
【０９０４】
３．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
【０９０５】
４．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（１０μｌの２ｍＭ）を加えた。
【０９０６】
５．次に、５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。しかしながら、修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる任意のＤＮＡポリメラーゼまたは他の酵素を使用することができる。
【０９０７】
６．反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。
【０９０８】
７．精製工程６６〜７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
【０９０９】
８．２００μｌのＴＥ緩衝液によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０９１０】
９．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
【０９１１】
１０．４００μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
【０９１２】
１１．精製工程６６〜７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
【０９１３】
１２．１５０μｌのＮＥＢ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０９１４】
１３．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
【０９１５】
１４．５μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を溶出液に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。任意の好適な代替エンドヌクレアーゼを使用することができる。
【０９１６】
１５．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
【０９１７】
１６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
【０９１８】
１７．精製工程６６〜７２に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
【０９１９】
１８．１００μｌのＴ３  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２倍濃縮）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０９２０】
１９．２０μｌの連結のための１００μＭのイノシン鎖（２ｎｍｏｌ）および２０μｌの連結のための１００μＭのヘルパー鎖（２ｎｍｏｌ）（配列番号６０、５１、図３７）、ならびに４０μｌの水を反応物に加えた。
【０９２１】
２０．２０μｌのＴ３  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（３０００単位／μｌ）を同じチューブに加え（これは任意のＤＮＡ連結酵素を含み得る）、室温で３０分間インキュベートした。
【０９２２】
精製工程７３〜７８に概説された変性工程を含むストレプトアビジン磁気ビーズキットのためのプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０９２３】
２１．精製工程６６〜７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットのためのプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０９２４】
２２．１００μｌのＴＥ緩衝液によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０９２５】
第２のサイクル：
２３．１５μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、ＭｎＣｌ２溶液（７．５μｌの４０ｍＭ）、および１９μｌの脱イオン水を加えた。
【０９２６】
２４．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
【０９２７】
２５．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（７．５μｌの２ｍＭ）を加えた。
【０９２８】
２６．次に、５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
【０９２９】
２７．反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。
【０９３０】
２８．精製工程６６〜７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
【０９３１】
２９．１００μｌのＴＥ緩衝液によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０９３２】
３０．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
【０９３３】
３１．２００μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
【０９３４】
３２．精製工程６６〜７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
【０９３５】
３３．１００μｌのＮＥＢ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０９３６】
３４．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
【０９３７】
３５．５μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を溶出液に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。任意の好適な代替エンドヌクレアーゼを使用することができる。
【０９３８】
３６．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
【０９３９】
３７．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
【０９４０】
３８．精製工程６６〜７２に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
【０９４１】
３９．６０μｌのＴ３  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２倍濃縮）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０９４２】
４０．２０μｌの連結のための１００μＭのイノシン鎖（２ｎｍｏｌ）および２０μｌの連結のための１００μＭのヘルパー鎖（２ｎｍｏｌ）（配列番号６０、５１、図３７）、ならびに１０μｌのイオン水を反応混合物に加えた。
【０９４３】
４１．１０μｌのＴ３  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（３０００単位／μｌ）を同じチューブに加え、室温で３０分間インキュベートした。任意の好適なＤＮＡリガーゼを使用することができる。
【０９４４】
４２．精製工程７３〜７８に概説された変性工程を含むストレプトアビジン磁気ビーズキットのためのプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０９４５】
４３．精製工程６６〜７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットのためのプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０９４６】
４４．４６μｌのＴＥ緩衝液によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０９４７】
第３のサイクル：
４５．６μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、ＭｎＣｌ２溶液（３μｌの４０ｍＭ）を加えた。
【０９４８】
４６．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
【０９４９】
４７．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（６μｌの２００μＭ）を加えた。
【０９５０】
４８．次に、３μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（３０Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる任意のＤＮＡポリメラーゼまたは他の好適な酵素を使用することができる。
【０９５１】
４９．反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。
【０９５２】
５０．精製工程６６〜７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
【０９５３】
５１．５０μｌのＴＥ緩衝液によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０９５４】
５２．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
【０９５５】
５３．１００μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
【０９５６】
５４．精製工程６６〜７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
【０９５７】
５５．４９μｌのＮＥＢ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０９５８】
５６．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
【０９５９】
５７．５μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を溶出液に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。代替的に、任意の好適なエンドヌクレアーゼを使用することができる。
【０９６０】
５８．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
【０９６１】
５９．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
【０９６２】
６０．精製工程６６〜７２に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
【０９６３】
６１．３０μｌのＴ３  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２倍濃縮）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
【０９６４】
６２．１０μｌの連結のための１００μＭのイノシン鎖（２ｎｍｏｌ）、１０μｌの連結のための１００μＭのヘルパー鎖（２ｎｍｏｌ）（配列番号６０、５１、図３７）、および５μｌの水を反応混合物に加えた。
【０９６５】
６３．５μｌのＴ３  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（３０００単位／μｌ）を同じチューブに加えた。（これは任意のＤＮＡ連結酵素を含み得）、室温で３０分間インキュベートした。
【０９６６】
６４．ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
【０９６７】
以下に概説されたプロトコルを使用した、組み込み、脱ブロック、および切断工程の後のＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによる反応混合物の精製。
６５．１０容量の緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
【０９６８】
６６．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０９６９】
６７．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０９７０】
６８．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
【０９７１】
６９．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
【０９７２】
７０．ＤＮＡ溶出のために、反応のための２０〜２００μｌの適切な緩衝液をカラム膜の中心に加え、室温で１分間放置した。
【０９７３】
７１．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０９７４】
変性工程を伴うストレプトアビジン磁気ビーズを使用した連結工程後の反応物の精製を、以下に概説されたプロトコルを介して行った。
７２．２００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）によって、１００μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を３回洗浄した。
【０９７５】
７３．連結工程後の反応混合物を１０容量の結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）と混合し、ストレプトアビジン磁気ビーズと共に２０℃で１５分間インキュベートさせた。
【０９７６】
７４．２００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）によって、ストレプトアビジン磁気ビーズを３回洗浄した。
【０９７７】
７５．ヘルパー鎖を除去するために、ストレプトアビジン磁気ビーズを２００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）中で８０℃まで加熱し、磁石にかけ、上清を迅速に廃棄した。
【０９７８】
７６．脱イオン水を用いて、ストレプトアビジン磁気ビーズを３回洗浄した。
【０９７９】
７７．９５℃で３分間加熱することによる５０〜１００μｌの脱イオン水によって、オリゴヌクレオチドを溶出した。
【０９８０】
結果および結論
図３８は、組み込み、脱ブロック、切断、および連結工程を含む完全３サイクル実験に対応する反応生産物を示すゲルを示す。示されている結果は、本発明の例示的な方法を使用した３つの完全合成サイクルの実行を実証している。
【０９８１】
実施例１０．ポリアクリルアミド表面の誘導体化およびその後の分子の固定化
この実施例は、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用したポリアクリルアミド表面上のブロモアセチル基の提示、およびその後のブロモアセチル基へのそれらの共有結合によるチオール化分子の表面固定化を記載する。
【０９８２】
材料および方法
顕微鏡用スライドガラスおよびカバーガラスを、アセトン、エタノール、および水中でそれぞれ１０分間ずつ順次超音波処理することによって洗浄し、アルゴンで乾燥させた。清浄なガラス製のカバーガラスを、ポリスチレン製ペトリ皿中で、気相でトリクロロ（１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ−ペルフルオロオクチル）シランでシラン化し、エタノール中で２回超音波処理し、Ａｒで乾燥させた（以後、「フッ素化カバーガラス」）。顕微鏡用スライドガラス上で、４％アクリルアミド／Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（１９：１）溶液を、１００μｌの１０％（ｗ／ｖ）過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、１０μｌのテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）と混合し、０、０．１、０．２、および０．３％（ｗ／ｖ）でＮ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を添加し、直径４ｍｍのゴム製ガスケットに素早く分配し、続いてアクリルアミド溶液に向かって面するフッ素化側を含むフッ素化カバーガラスで挟み、１０分間重合した。１０分後、表面を脱イオン水に浸し、合計４時間浸したままにし、その間にフッ素化カバーガラスを注意深く取り除いた。重合されたポリアクリルアミド表面をアルゴンで乾燥させた。
【０９８３】
続いてポリアクリルアミド表面を、リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８）中の陰性対照として、チオール化ポリエチレングリコール（１ｋＤａ）フルオレセイン（ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＳＨ）、およびカルボキシル化ポリエチレングリコール（１ｋＤａ）フルオレセイン（ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）に１時間曝露し、続いてリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５ＭのＮａＣｌを含む同じ緩衝液で順次洗浄して、非特異的に吸着されたチオール化およびカルボキシル化フルオロフォアを除去した。続いて表面を、フルオレセインチャネルのＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって撮像した。
【０９８４】
結果および結論
図３９は蛍光シグナルを示し、図４０は、ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＳＨおよびＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨに曝露された異なる量のＢＲＡＰＡを添加したポリアクリルアミドゲル表面からの測定された蛍光を示す。フルオレセインの固定化は、カルボキシル化フルオレセインのゼロに近い非特異的吸着を伴って、ＢＲＡＰＡおよびチオール化フルオレセインのみを添加したポリアクリルアミド表面でのみ成功した。
【０９８５】
ＢＲＡＰＡを含まないポリアクリルアミド表面（ＢＲＡＰＡ  ０％）ならびにＢＲＡＰＡおよびカルボキシル化分子（ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）を含むポリアクリルアミド表面と比較して、ＢＲＡＰＡを含むポリアクリルアミド表面（ＢＲＡＰＡ  ０．１、０．２、および０．３％）、およびチオール化分子（ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＳＨ）のみから、有意に高い陽性蛍光シグナルが得られた。結果は、表面からのブロモアセチル部分とフルオレセインタグ付き分子からのチオール部分との間に、特異的共有結合が起こったことを示す。
【０９８６】
結果は、本発明の方法で使用するための支持鎖および合成鎖を含む分子などの分子が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成反応に適合する表面基質上に容易に固定化され得ることを実証する。
【０９８７】
実施例１１．ヘアピンＤＮＡオリゴマーの表面固定化、およびその後の蛍光標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸の組み込み。
この実施例は以下を記載する。
（１）薄いポリアクリルアミド表面上にブロモアセチル基を提示する方法、
（２）チオリン酸官能化ヘアピンＤＮＡのリンカーを有するか、または有しない共有結合を介したヘアピンＤＮＡのその後の固定化、および
（３）ヘアピンＤＮＡへの２’−デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の組み込み。
【０９８８】
本方法は、実質的にあらゆる種類の材料表面（例えば、金属、ポリマーなど）と適合する。
【０９８９】
（１）：ブロモアセチル官能化された薄いポリアクリルアミド表面の加工
材料および方法
最初に、顕微鏡用スライドガラスを、純粋なＤｅｃｏｎ  ９０（３０分）、水（３０分）、１ＭのＮａＯＨ（１５分）、水（３０分）、０．１ＭのＨＣｌ（１５分）、水（３０分）中で超音波処理によって洗浄し、最後にアルゴンで乾燥させた。
【０９９０】
最初に、２％（ｗ／ｖ）のアクリルアミドモノマー溶液を、１ｇのアクリルアミドモノマーを５０ｍｌの水に溶解することによって作成した。アクリルアミドモノマー溶液をボルテックスし、アルゴン中で１５分間脱気した。Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ、８２．５ｍｇ）を、８２５μｌのＤＭＦに溶解し、アクリルアミドモノマー溶液に加え、さらにボルテックスした。最後に、１ｍｌの５％（ｗ／ｖ）過硫酸カリウム（ＫＰＳ）および１１５μｌの純粋なテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を、アクリルアミド溶液に加え、ボルテックスし、清浄な顕微鏡用スライドガラスを、このアクリルアミド重合混合物に９０分間曝露した。９０分後、表面を脱イオン水で洗浄し、アルゴンで乾燥させた。これらの表面は、この実施例では、以後「ＢＲＡＰＡ修飾表面」と呼ぶことにする。陰性対照として、ＢＲＡＰＡを含まないポリアクリルアミド表面もまた、アクリルアミドモノマー溶液へのＢＲＡＰＡ溶液の添加を除外することによって、上記に記載されるものと同様の方法で作成した。これらの表面は、この実施例では、以後「ＢＲＡＰＡ制御表面」と呼ぶことにする。
【０９９１】
（２）：ポリアクリルアミド表面へのチオリン酸官能化ヘアピンＤＮＡの共有結合
材料および方法
直径４ｍｍの円形開口部を有するゴム製ガスケットを、ＢＲＡＰＡ修飾表面およびＢＲＡＰＡ制御表面上に置いて固定した。最初に、表面をリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７）で１０分間下塗りした。続いて緩衝液を除去し、表面を、それぞれ１μＭの濃度の６個の単一のチオリン酸で修飾されたリンカーを含み、かつ含まない５’−蛍光標識された（Ａｌｅｘａ  ６４７）ヘアピンＤＮＡオリゴマーに曝露し、暗所で１時間インキュベートした。対照として、リンカーを有するおよび有しないが、チオリン酸を有しないＤＮＡオリゴマーと共に、ＢＲＡＰＡ修飾表面をインキュベートした（この実施例では、以後「オリゴマー制御表面」と呼ばれる）。インキュベーション後、リン酸ナトリウム（１００ｍＭ、ｐＨ７）、続いてトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）で表面をすすぎ、最後に水ですすいだ。任意の非特異的に吸着されたＤＮＡオリゴマーを除去するために、続いて１Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含む水で表面を洗浄し、水で洗浄し、アルゴンで乾燥させた。Ａｌｅｘａ  ６４７チャネルのＣｈｅｍｉＤｏｃ撮像装置上で表面をスキャンした。
【０９９２】
図４１ａは、リンカーが異なる試料に固定化されていないヘアピンＤＮＡの配列を示す。図４１ｂは、リンカーが異なる試料に固定化されたヘアピンＤＮＡの配列を示す。
【０９９３】
結果
結果を図４２および４３に示す。図４２は、ブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンＤＮＡオリゴマーから生じるが、ＢＲＡＰＡまたはオリゴマー対照からは生じない蛍光シグナルを示す。
【０９９４】
図４３は、ポリアクリルアミド表面へのＤＮＡ固定化の後に測定された蛍光強度を示す。この図は、様々なポリアクリルアミド表面から得られた表面蛍光シグナルを示し、ブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面へのＤＮＡの共有結合固定化の成功のために、（（２）に記載されるような）ＢＲＡＰＡおよびオリゴマー制御表面と比較して、有意に高いシグナルが、ＢＲＡＰＡ修飾表面に固定化されたヘアピンＤＮＡオリゴマーから得られたことを示す。
【０９９５】
結論
ＤＮＡからの蛍光シグナルは、ＢＲＡＰＡを添加したＢＲＡＰＡ修飾表面からのみ顕著に存在し、チオリン酸官能基を介した表面へのＤＮＡの共有結合の成功を示している。リンカーを有しないＤＮＡと比較して、リンカーを有するＤＮＡから、均一かつより高いシグナルが得られた。
【０９９６】
（３）：リンカーを有するヘアピンＤＮＡオリゴマーへの三リン酸の組み込み
材料および方法
直径９ｍｍの円形開口部を有するゴム製ガスケットを、リンカーを有するＤＮＡオリゴマーで固定化されたＢＲＡＰＡ修飾表面上に置き、組み込み緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ、６ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０５％のｔｗｅｅｎ２０、および２ｍＭのＭｎＣｌ２）で１０分間下塗りした。続いて表面を、ＤＮＡポリメラーゼ（０．５Ｕ／μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼ）および三リン酸（２０μＭのＡｌｅｘａ  ４８８標識ｄＵＴＰ）を含む組み込み緩衝液に曝露し、１時間インキュベートした（この実施例では、以後「ポリメラーゼ表面」と呼ばれる）。陰性対照として、追加の表面の組も、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼを含まない組み込み緩衝液に１時間曝露した（この実施例では、以後「陰性表面」と呼ばれる）。１時間後、両方の種類の試料を水中で洗浄し、続いて１Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含む水に曝露し、再び水で洗浄した。表面からの蛍光シグナルを、Ａｌｅｘａ  ６４７およびＡｌｅｘａ  ４８８チャネルのＣｈｅｍｉＤｏｃを使用して測定し、ヘアピンＤＮＡの存在（Ａｌｅｘａ  ６４７）およびｄＵＴＰの組み込み（Ａｌｅｘａ  ４８８）の両方をモニタリングした。
【０９９７】
結果
図４４は、Ａｌｅｘａ  ４８８標識ｄＵＴＰの組み込み前および後のＡｌｅｘａ  ６４７およびＡｌｅｘａ  ４８８チャネルから検出された蛍光シグナルを示す。組み込み前および後のＡｌｅｘａ  ６４７からの不変の陽性シグナルは、表面固定化ヘアピンＤＮＡが組み込み反応中に安定的であることを示し、Ａｌｅｘａ  ４８８からの陽性シグナルは、ポリメラーゼの存在によってのみ、ｄＵＴＰの組み込みの成功を示す、組み込み反応後のポリメラーゼ表面からのみ観察された。
【０９９８】
図４５は、（３）に記載されるようなＡｌｅｘａ  ４８８標識ｄＵＴＰの組み込み前および後の「ポリメラーゼ表面」および「陰性表面」から得られたＡｌｅｘａ  ６４７（ヘアピンＤＮＡ）およびＡｌｅｘａ  ４８８（ｄＵＴＰ）チャネルにおいて測定された測定蛍光シグナルを示す。組み込みが成功した結果、ポリメラーゼ表面からの組み込み反応後に、Ａｌｅｘａ  ４８８蛍光シグナルの有意な増加が得られたが、陰性表面からのシグナルは、ポリメラーゼの不在のために、組み込み反応後も同じままであった。Ａｌｅｘａ  ６４７チャネルの蛍光シグナルは、組み込み反応後に実質的に変化しないままであり、これは表面上のヘアピンＤＮＡの存在を示している。蛍光シグナルのわずかな減少は、２回目の露光による光退色の効果によるものと思われる。
【０９９９】
結論
結果は、本発明の方法において使用するための支持鎖および合成鎖を含む分子が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成反応と適合する表面基質上に容易に固定化され得ることを実証する。結果はさらに、このような分子が、合成鎖を伸長させるために新たなｄＮＴＰの組み込みを許容し得ると同時に、分子が安定的で、基質に付着したままであることを実証する。
【１０００】
実施例１２．リンカーおよびチオリン酸共有結合を介して誘導体化表面に固定化されたヘアピンＤＮＡオリゴマーの切断および連結。
この実施例は、リンカーを有するチオリン酸官能化ヘアピンＤＮＡの誘導体化表面への共有結合、その後の切断および連結反応を記載する。基質調製およびヘアピンＤＮＡの結合を、実施例１１に記載されるように実施した。
【１００１】
（１）：リンカーを有する固定化ヘアピンＤＮＡオリゴマーの切断
材料および方法
実施例１１に記載されるような表面ＢＲＡＰＡ修飾表面上に、ヘアピンＤＮＡを固定化した。切断および連結反応のための全ての実験対照を含む４組の三重表面を調製した。実験条件を図４６ａに記載する。図４６ｂは、異なる試料に固定化されたヘアピンＤＮＡの配列を示す。
【１００２】
ＤＮＡ固定化工程の後に、直径９ｍｍの円形開口部を有するゴム製ガスケットを、５’末端でＡｌｅｘａ  ６４７で標識されたＤＮＡで固定化された全ての表面上に置き、１×ＮＥ緩衝液４（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９）で１０分間下塗りした。試料Ｄについては、固定化ヘアピンＤＮＡはイノシンを含まず、イノシンはグアニンによって置換されることに留意されたい。続いて全ての試料を、１．５Ｕ／μｌのエンドヌクレアーゼＶを含むＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（試料Ａ、Ｂ、およびＤ）またはエンドヌクレアーゼＶを含まないＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（試料Ｃ）のいずれかに１時間曝露した。続いて全ての試料を、１×Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（６６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、７．５％のＰＥＧ６０００、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．６）、１Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０５％の（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ緩衝液で洗浄し、１×Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ緩衝液で再び洗浄し、Ａｌｅｘａ  ６４７チャネルのＣｈｅｍｉＤｏｃ撮像装置上でスキャンした。
【１００３】
結果
図４７は、切断反応前および後のヘアピンＤＮＡオリゴマーからの蛍光シグナルを示す。
【１００４】
図４８は、上記に記載されるようなＤＮＡ固定化表面から得られた切断反応の前および後に測定された蛍光シグナルを示す。切断反応の成功は、試料ＡおよびＢからのみ観察されたが、エンドヌクレアーゼＶ（試料Ｃ）または配列中のイノシン（試料Ｄ）のいずれも存在しないため、蛍光シグナル強度は、試料ＣおよびＤについて略同じままであった。
【１００５】
エンドヌクレアーゼＶの存在を伴うＤＮＡ鎖内のイノシン部位での成功した切断反応の結果として、試料ＡおよびＢから蛍光シグナルの有意な低減が観察された。試料ＣおよびＤについて、ＤＮＡ中のエンドヌクレアーゼＶの不在およびイノシンの欠如は、それぞれ蛍光シグナルをもたらし、ＤＮＡ固定化後に得られた初期シグナルとほぼ同じレベルを維持した。
【１００６】
（２）：連結反応
材料および方法
（１）に記載されるような切断反応の後、試料ＡおよびＢ（図４６ａに記載されるような）を、試料ＡについてはＴ３  ＤＮＡリガーゼ（２５０Ｕ／μｌ）を用い、試料Ｂについては陰性対照としてＴ３  ＤＮＡリガーゼを用いずに、ＭｎＣｌ２を含有する１×Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２ｍＭ）、５′末端でＡｌｅｘａ  ６４７で標識されたイノシン鎖（１６μＭ）、および相補的「ヘルパー」鎖（１６μＭ）（配列を以下の図４９に示す）に曝露した。試料を、それぞれの溶液中で１時間インキュベートした。１時間後、表面を水中で洗浄し、続いて１Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含有する水に曝露し、再び水で洗浄した。Ａｌｅｘａ  ６４７チャネルのＣｈｅｍｉＤｏｃを使用して、表面からの蛍光シグナルを測定した。図４９は、連結反応のためのイノシン含有鎖および相補的「ヘルパー」鎖についての配列を示す。
【１００７】
結果
図５０は、連結反応のモニタリングに関する結果を示す。連結反応の前および後に、Ａｌｅｘａ  ６４７チャネルから検出された蛍光シグナル。連結後のＡｌｅｘａ  ６４７チャネルにおける蛍光シグナルの増加は、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼを有する試料Ａからのみ得られたが、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼの不在のため、試料Ｂについては連結反応後、蛍光シグナルは同じレベルのままであった。
【１００８】
図５１は、連結の成功の結果として試料Ａからの連結反応後に、Ａｌｅｘａ  ６４７蛍光シグナルの有意な増加が得られたことを示し、ここで、シグナルレベルは、ＤＮＡ固定化の後、および図４８に示されるような切断反応の前に、初期シグナルレベルに回復する。試料Ｂからの蛍光シグナルは、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼの不在のため、連結反応後も同じままであった。
【１００９】
結論
この実施例の結果は、本発明の方法で使用するための支持鎖および合成鎖を含む分子が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成反応に適合する表面基質上に容易に固定化でき、同時に安定的で基質に付着したままでありながら、切断および連結に曝露され得ることを実証する。
【１０１０】
実施例１３．平滑末端ＤＮＡの３’末端への３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰの組み込み。
この実施例は、平滑末端二本鎖ＤＮＡの３’末端への３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰの組み込みを記載する。
【１０１１】
以下の工程は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込みによる平滑末端二本鎖オリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護一塩基の制御された付加を示す。工程は、図１〜６の各々に示されるように組み込み工程３に従う。
【１０１２】
材料および方法
材料
１．社内で合成された３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰ。
【１０１３】
２．３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む増強された能力を有する、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【１０１４】
３．平滑末端二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド。
【１０１５】
４種類の可逆的ターミネーターを試験した。
【化４２】
2021529548.tif 000044
【１０１６】
方法
１．５μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の３３．５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
【１０１７】
２．２μｌの２０μＭプライマー（４０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号６８、図５２ａ）および３μｌの２０μＭ鋳型（６０ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号６９、図５２ａ）を反応混合物に加えた。
【１０１８】
３．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（２．５μｌの４０ｍＭ）を加えた。
【１０１９】
４．次に、２μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（２０Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
【１０２０】
５．反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。
【１０２１】
６．ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
【１０２２】
７．反応物をポリアクリルアミドゲル（１５％）ＴＢＥ緩衝液上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
【１０２３】
結果
図５２ｂは、３７℃でＭｎ２＋イオンの存在下で、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＮＴＰの組み込みの結果を示すゲルを示す。データは、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼが、３’−Ｏ−修飾−ｄＮＴＰを平滑末端ＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端に首尾よく組み込んで単一塩基突出を作成できたことを示す。
【１０２４】
実施例１４．突出末端連結を使用したポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの例示的な連結。
この実施例は、ＤＮＡリガーゼを使用したポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結を記載する。この実施例は、図２に示されるように、本発明の合成方法のバージョン２と一致する、突出末端を有する分子の連結を伴う。
【１０２５】
図５３は、ＤＮＡ合成反応サイクルを示すスキームを提供する。スキームは、図２に示されるように、本発明の合成方法のバージョン２と一致することが意図される。したがって、図５３のスキームは、突出末端を有する足場ポリヌクレオチド（スキームの最上部パネルにおける右手ヘアピン構造）の提供を示し、左側の鎖は支持鎖に対応し、右側の鎖は合成鎖に対応する。支持鎖の末端ヌクレオチドは、純粋に例示のために「Ｔ」として示され、合成鎖の末端ヌクレオチドに突出する。支持鎖の末端ヌクレオチドは、５’末端にリン酸基を含む。サイクルの次の工程において、ポリヌクレオチド連結分子（スキームの最上部パネルの右端の構造）が提供される。ポリヌクレオチド連結分子は、支持鎖（左側の鎖）およびヘルパー鎖（右側の鎖）を有する。ポリヌクレオチド連結分子は、突出末端を有し、２−デオキシイノシン（Ｉｎ）であるユニバーサルヌクレオチドを含む相補的連結末端を有する。相補的連結末端におけるヘルパー鎖の末端は、連結不可能なヌクレオチドを含み、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出する。相補的連結末端における支持鎖の末端は、純粋に例示のために「Ｇ」として示される、所定の配列のヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結時に、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端における支持鎖の末端ヌクレオチドが、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに連結され、ポリヌクレオチド連結分子のヘルパー鎖と足場ポリヌクレオチドの合成鎖との間に一本鎖切断（「ニック」）が作成される。ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖の末端ヌクレオチドは、所定の配列のヌクレオチドを含み、位置ｎ＋１を占める。よって、ユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎ＋３を占める。次の工程において、純粋に例示のために「Ａ」として示されるさらなるヌクレオチドは、この場合、ポリメラーゼ酵素またはヌクレオチドトランスフェラーゼ酵素の作用によって、足場ポリヌクレオチドの合成鎖に組み込まれる。さらなるヌクレオチドは、可逆的ターミネーター基またはブロッキング基を含む。さらなるヌクレオチドは、この場合、純粋に例示のために「Ｔ」として示される、支持鎖中のパートナーヌクレオチドと対合し、したがってヌクレオチド対を形成する。次いで、スキームは、可逆的ターミネーター基またはブロッキング基が除去される、脱保護または脱ブロッキング工程を示す。図５３に示される反応スキームにおいて、ヘルパー鎖は、任意選択の工程として、組み込み工程の前に除去されることが示される。組み込み後、位置ｎ＋１とｎ＋２との間で支持鎖を切断することによって、ポリヌクレオチド連結分子を切断する。切断後、組み込まれる所定の配列の第１のヌクレオチド「Ｇ」は、突出末端の支持鎖の末端ヌクレオチドとして足場ポリヌクレオチドに保持される。組み込まれる所定の配列の第２のヌクレオチド「Ａ」は、合成鎖の末端ヌクレオチドとして足場ポリヌクレオチドに保持され、パートナーヌクレオチド「Ｔ」と対合する。
【１０２６】
図５４は、伸長される足場ポリヌクレオチドの末端における突出の長さを延長することを除いて、図５３に示されるものと同じ合成反応スキームを示す。連結工程中に適合性を維持するために、対応する増加をポリヌクレオチド連結分子において生じさせることになる。
【１０２７】
以下に詳述されるように、この実施例１４は、図５３および５４の破線ボックスに示されるように、ポリヌクレオチド連結分子を足場ポリヌクレオチドに連結する工程を説明する。
【１０２８】
材料および方法
材料：
１．この実施例で利用されるオリゴヌクレオチドは社内で設計され、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成された。これらを図５５に記載する。
【１０２９】
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【１０３０】
方法：
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチドを用いた連結反応を実施した。
１．１２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加えた。
【１０３１】
２．次に、３０μｌの２×Ｔ３  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液ＮＥＢ（１３２ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのジチオスレイトール、２ｍＭのＡＴＰ、１５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）および２５℃でｐＨ７．６）および２μｌの４０ｍＭの  ＭｎＣｌ２を同じエッペンドルフチューブに加えた。
【１０３２】
３．５μｌの２−デオキシイノシン（Ｉｎ）鎖（２００μｍｏｌ／ｌ）（配列番号６）および５μｌのヘルパー鎖（２００μｍｏｌ／ｌ）（配列番号７、８）および１μｌのＴＡＭＲＡ、または５’突出を有する任意の蛍光タグ付きポリヌクレオチド（２０μｍｏｌ／ｌ）（配列番号７０、７１、７２、７３、または７４）を同じチューブに加えた。
【１０３３】
４．５μｌのＴ３  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（３０００単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
【１０３４】
５．次いで、反応混合物を室温で３０分間インキュベートした。
【１０３５】
６．インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
【１０３６】
結果
結果を図５６に示す。
【１０３７】
上記の実施例では、配列番号１〜８０に提示される全てのオリゴヌクレオチドは、３’末端にヒドロキシル基を有する。配列番号１〜８０に提示される全てのオリゴヌクレオチドは、配列番号７、配列番号１８、配列番号３５、配列番号７０〜４を除いて、５’末端でリン酸基を欠いている。
【１０３８】
開示される方法および生産物の異なる適用が、当該技術分野における特定の必要性に合わせられ得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、限定的であることは意図されないことも理解されたい。
【１０３９】
さらに、この明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド連結分子」への言及は、２つ以上のこのようなポリヌクレオチドを含み、「足場ポリヌクレオチド」への言及は、２つ以上のこのような足場ポリヌクレオチドを含むなどである。
【１０４０】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１２ｉ】
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【図１２ｊ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１３ｅ】
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【図１３ｆ】
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【図１３ｇ】
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【図１３ｈ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１４ｅ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
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【図１７ｅ】
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【図１７ｆ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１８ｃ】
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【図１８ｄ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図１９ｃ】
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【図１９ｄ】
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【図１９ｅ】
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【図１９ｆ】
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【図１９ｇ】
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【図１９ｈ】
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【図１９ｉ】
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【図１９ｊ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２０ｃ】
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【図２０ｄ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２２ｃ】
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【図２２ｄ】
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【図２２ｅ】
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【図２２ｆ】
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【図２２ｇ】
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【図２２ｈ】
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【図２２ｉ】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２３ｃ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２５ｃ】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２６ｃ】
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【図２７ａ】
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【図２７ｂ】
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【図２８ａ】
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【図２８ｂ】
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【図２９ａ】
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【図２９ｂ】
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【図２９ｃ】
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【図２９ｄ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１ａ】
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【図４１ｂ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５ａ】
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【図４５ｂ】
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【図４６ａ】
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【図４６ｂ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【配列表】
2021529548000001.app
【国際調査報告】
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2021529548.tif 000163
2021529548.tif 000164