(57)【要約】  本発明は、ハネジナマコの体腔液を抽出した後、ビテリンを遠心分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動と染色をして得られた電気泳動結果に基づいて、卵巣発育期のメスナマコ、オスナマコ、及び性腺無発育のハネジナマコを区別することが含まれる、卵巣発育期のハネジナマコのメス個体を同定するための方法である。卵巣発育期のメスナマコ個体のサンプルは、２００〜２５０ｋＤに特異的なバンドが現れ、性腺無発育の個体とオスナマコ個体のサンプルは、この特異的なバンドが現れない。ハネジナマコを損傷することなく、体腔液サンプルを抽出することにより、卵巣発育期のメスナマコ個体を同定でき、人工種苗生産おける親ナマコの選抜に適用する価値がある。【選択図】図３
2021519575.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハネジナマコの体腔液を抽出した後、ビテリンを遠心分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動と染色を行い、電気泳動の結果に基づいて、卵巣発育期のメスナマコ、オスナマコ、及び性腺無発育のハネジナマコを区別する工程が含まれることを特徴とする、卵巣発育期のハネジナマコのメス個体を同定するための方法。
【請求項２】
前記電気泳動の結果に基づいて、卵巣発育期のメスナマコ、オスナマコ、及び性腺無発育のハネジナマコを区別する工程は、２００〜２５０ｋＤａに明らかなバンドがあるものが卵巣発育期のメスナマコ個体であり、性腺無発育の個体とオス個体がこの特異的なバンドがないことに基づいて、卵巣発育期のハネジナマコのメス個体を同定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ビテリンの遠心分離は、超遠心によりビテリンを分離することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
超遠心によるビテリンの分離は、含有濃度が１ｍＭであるＰＭＳＦ、密度が１．２１５ｇ／ｍＬであるＫＢｒを含む溶液４ｍＬを超遠心管の底部に加え、ハネジナマコの体腔液１ｍＬを超遠心管の上部に加え、Ｈｉｍａｃ  ＣＰ  １００ＭＸ超遠心機にＰ１００ＡＴ−０１３２ローターを使用し、回転数１８００００ｇ、１０℃で２４時間遠心し、上部の液体、すなわちビテリンが含まれる溶液を３００μＬ取ることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記染色は、クマシーブリリアントブルーでの染色であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ハネジナマコの体腔液の抽出は、プロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦの溶液が予め加えられたシリンジを使用し、ハネジナマコの体壁を通して体腔に挿入し、体腔液を抽出することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦの溶液は、ＰＭＳＦの１００ｍＭ溶液であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海水養殖の生物技術分野に属し、具体的に卵巣発育期のハネジナマコのメス個体を同定するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ハネジナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａ）は、シロナマコ、イシナマコとも呼ばれ、棘皮動物門、ナマコ綱、樹手亜綱、楯手目、ナマコ科、ナマコ属に属するものである。西のナタール港から紅海まで、東に向かってカロリン諸島、フィジー諸島まで、北に向かって日本まで、南に向かってオーストラリア及び中国本土の広西、広東、海南などの地域に分布しており、一般的にバンク礁の周縁や、潮流が強く海草が多い砂底床に生えている。ハネジナマコは、体壁が厚く、コラーゲンが豊富で、滑らかで弾力性のある口触りがあり、栄養価値が高いだけでなく、医薬用の価値も極めて高い。ハネジナマコは、熱帯ナマコの養殖種として重要であり、輸出向けの高級水産物の一種である。ハネジナマコは、成長が速く、繁殖法が簡単且つ多様で、病害が少なく、市場ニーズが高いなどの特徴があり、中国華南の沿岸地域での養殖開発において大きな潜在力を秘めている。
【０００３】
中国の華南地域で、ハネジナマコの繁殖期は、毎年５〜９月であり、親ナマコは通常陰乾や流水による刺激法により人為繁殖が行われる。精巣が発育したオスナマコと卵巣が発育したメスナマコだけが人為繁殖に使用することができ、卵巣が発育したメスナマコは入手が難しい。卵巣が発育したメスナマコ個体の外観は、性腺無発育の個体及びオスナマコ個体の外観と同様であるため、ハネジナマコの人工繁育時の親ナマコの選抜が困難である。従って、ナマコに損傷を与えることなく、卵巣発育期のメスナマコを同定できる方法を開発することは、急務である。
【０００４】
超遠心沈降法とは、遠心力を利用し、分散系内の分散質粒子を徐々に沈降させて分離する方法を指す。溶液中の粒子に強力な遠心力が作用する場合、粒子の密度が溶剤の密度により大きければ、粒子が沈むことになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、卵巣発育期のハネジナマコのメス個体を同定するための方法を提供することにあり、本発明の方法によれば、卵巣発育期のハネジナマコのメス個体を同定でき、ハネジナマコを損傷することなく、体腔液のサンプルを抽出することにより卵巣発育期のメスナマコ個体を同定でき、人工種苗生産おける親ナマコの選抜に適用する価値がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、卵巣発育期のメスナマコの体腔液の中にビテリンが豊富で、性腺無発育の個体及びオスナマコ個体がこのタンパク質を含まないことを見出した。しかしながら、体腔液の中に分子量がビテリンに近い夾雑タンパク質も含んでいるため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのタンパク質電気泳動により体腔液中のビテリンを直接同定することが難しい。ビテリンは、アポリポタンパク質の一種であり、脂質とリポタンパク質の複合体を形成成する。本発明は、初めて超遠心法によりリポタンパク質（ビテリン）を他の非脂質結合性の夾雑タンパク質と分離でき、従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク電気泳動における分子量がビテリンに近い夾雑タンパクを除去することができる。その後、リポタンパクを取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動とクマシーブリリアントブルーでの染色を行い、電気泳動の結果に基づいて卵巣発育期のメスナマコ、オスナマコ、及び性腺無発育のハネジナマコを区別する。
【０００７】
従って、本発明の卵巣発育期のハネジナマコのメス個体を同定するための方法は、
ハネジナマコの体腔液を抽出した後、ビテリンを遠心分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動と染色を行い、電気泳動の結果に基づいて卵巣発育期のメスナマコ、オスナマコ、及び性腺無発育のハネジナマコを区別する工程が含まれる。具体的に、２００〜２５０ｋＤａに明らかなバンドがあるものは卵巣発育期のメスナマコ個体であり、性腺無発育の個体とオス個体はこの特異的なバンドがないことにより、卵巣発育期のハネジナマコのメス個体を同定する。
【０００８】
好ましくは、ビテリンの遠心分離は、超遠心によりビテリンを分離する。ハネジナマコの体腔液を高速遠心した後、ビテリンは上澄みの上部にあり、上澄みの上部を吸引することで分離されたビテリンを得ることができる。具体的には、含有濃度が１ｍＭであるＰＭＳＦ、密度が１．２１５ｇ／ｍＬであるＫＢｒを含む溶液４ｍＬを超遠心管の底部に加え、ハネジナマコの体腔液１ｍＬを超遠心管の上部に加え、Ｈｉｍａｃ  ＣＰ  １００ＭＸ超遠心機にＰ１００ＡＴ−０１３２のローターを使用し、回転数１８００００ｇ、１０℃で２４時間遠心し、上部の液体、すなわちビテリンが含まれる溶液を３００μＬ取る。
【０００９】
前述の染色は、クマシーブリリアントブルーでの染色である。
【００１０】
好ましくは、ハネジナマコの体腔液の抽出は、プロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦの溶液が予め加えられたシリンジを使用し、ハネジナマコの体壁を通して体腔に挿入し、体腔液を抽出する。
【００１１】
好ましくは、プロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦの溶液は、ＰＭＳＦの１００ｍＭ溶液である。
【００１２】
超遠心沈降のプロセスにおいて、アポリポタンパク質は脂質と結合し、密度が溶剤の密度よりも小さく、遠心した後で溶剤の上方にあるが、他の非脂質結合性のタンパクは密度が溶剤よりも大きく、遠心した後で溶剤の下方に沈降する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、超遠心法によりビテリンを他の夾雑タンパクと分離した後、ビテリンにＳＤＳ−ＰＡＧＥのタンパク質電気泳動とクマシーブリリアントブルーでの染色を行い、ビテリンの特異的なバンドにより卵巣発育期のメスナマコ個体を同定する初の方法である。分析の結果によれば、卵巣発育期のメスナマコ個体のサンプルは、２００〜２５０ｋＤに特異的なバンドが現れ、性腺無発育の個体およびオスナマコ個体のサンプルはこの特異的なバンドがないことを示した。本発明は、ハネジナマコを損傷することなく、体腔液のサンプルを抽出することで、卵巣発育期のメスナマコ個体を同定でき、人工種苗生産おける親ナマコの選抜に適用する価値がある。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ハネジナマコの卵巣発育期のメスナマコ個体、性腺無発育の個体、及びオスナマコ個体の体腔液のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動結果である。
【図２】ハネジナマコの体腔液の超遠心による結果であり、左側はズダンブラック染料が添加された超遠心液で、右側はズダンブラック染料が添加されない超遠心液である。
【図３】ハネジナマコの卵巣発育期のメスナマコ個体、性腺無発育の個体、オスナマコ個体の体腔液を超遠心した後の上層液体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の目的、技術方案、及び有益な技術的効果をより明確にするために、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。本明細書に記載の実施例は、本発明を限定するものではなく、本発明を解釈するためのものであり、場合によって実施例のパラメーター、比率などを選択することができ、その結果に実質的に影響を与えないことが理解されるべきである。実施例において、特別な説明を除いて、すべて当技術領域の慣用試薬、方法及び工程である。特別明記しない限り、以下の実施例で使用される試薬と材料はすべて市販されているものである。
【００１６】
実施例１：
１．ハネジナマコの体腔液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動
（１）１００ｍＭのプロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル）の調製
ＰＭＳＦ１７４ｍｇを量り、エタノール１ｍＬに溶解させ、１７４ｍｇ／ｍＬの原液を調製した。その後、ＰＢＳ９ｍＬにより、濃度が１７４ｍｇ／ｍＬであるＰＭＳＦを希釈し、１００ｍＭのＰＭＳＦ作業液とした。
【００１７】
（２）ハネジナマコの体腔液の抽出と遠心
体長が２０ｃｍより長く、体重が５００ｇより重いハネジナマコの熟ナマコを２０匹選抜した。予め１００ｍＭのＰＭＳＦが２０μＬ加えられた２ｍＬのシリンジにより、ハネジナマコの体壁を通し、体腔まで２ｃｍ挿入し、体腔液を抽出した。冷却遠心機により、抽出した体腔液を回転数１０００ｇ、４℃で１５分間遠心した。沈殿物を捨て、上澄みを新しい遠心管に移して予備した。
【００１８】
（３）ハネジナマコの体腔液サンプルの選抜とＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動
体腔液を採取した後、ハネジナマコを解剖し、ハネジナマコの性別と性腺発育の状況を同定した。卵巣発育期のメスナマコを３匹、性腺無発育のハネジナマコを３匹、オスナマコを３匹選抜し、対応する体腔液の予備サンプル（工程（２）における体腔液の遠心分離後に得られた上澄み）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。上記の９つの体腔液の予備サンプルをそれぞれ２０μＬ取り、等容量の２×ローディングバッファーを加え、沸騰水で３〜５分間沸騰させた後、処理後のタンパクサンプルを８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質電気泳動し、クマシーブリリアントブルーでの染色を行った。電気泳動の結果によれば、選抜された９つのナマコ体腔液サンプルは、すべてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の後で＞２００ｋＤａに明らかなバンドが現れ（図１）、この方法では、卵巣発育期のハネジナマコのメス個体と、性腺無発育の個体およびオスナマコ個体とを区別できないことを示した。
【００１９】
２．リポタンパクの超遠心分離
超遠心分離液の調製とリポタンパク質の分離法は、ヒト血漿リポタンパク質の超遠心分離精製の慣用法を参照して行われる。
【００２０】
（１）超遠心分離液の調製
ＥＤＴＡ−Ｎａ２１８６ｇを量り、脱イオン水９５０ｍＬを加え、ＮａＯＨでｐＨ値を８．０に調整して、１Ｌまで水を加え、０．５ＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）を調製した。
ＮａＣｌ  １１．４０ｇを量り、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液０．５ｍＬを加え、１Ｌまで脱イオン水を加え、溶液Ａを調製した。
ＫＢｒ３３．４９６ｇを量り、溶液Ａ１００ｍＬに溶解させ、最終濃度１ｍＭまで１００ｍＭのＰＭＳＦ１ｍＬを加え、密度が１．２１５ｇ／ｍＬである分離液を調製した。
【００２１】
（２）超遠心
超遠心管の底部に、含有濃度が１ｍＭであるＰＭＳＦと密度が１．２１５ｇ／ｍＬであるＫＢｒ溶液（分離液）を合計４ｍＬ加え、超遠心管上部に体腔液［工程１．の工程（２）参照］１ｍＬを加えた。Ｈｉｍａｃ  ＣＰ  １００ＭＸ超遠心機にＰ１００ＡＴ−０１３２のローターを使用し、回転数１８００００ｇ、１０℃で２４時間遠心した。
【００２２】
（３）リポタンパク質の同定
ハネジナマコの体腔液を超遠心した後、１．２‰のズダンブラック溶液（脂質染色剤）を加えて染色した。その結果によれば、超遠心液の上層液体がズダンブラックによって黒く染色されたことを示し（図２）、リポタンパク質（ビテリン）が超遠心管の頂上部にあることが示された。ズダンブラックでの染色は、その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に影響を与えるため、実際の操作ではズダンブラックでの染色法を使用しない。
【００２３】
３．卵巣発育期のハネジナマコのオス個体の同定
超遠心した後で、遠心管上部の液体（リポタンパク質を含む）３００μＬを吸引し、新しい遠心管に移して予備した。予備液を２０μＬ取り、等容量の２×ローディングバッファーを加え、沸騰水で３〜５分間沸騰させた後、処理後のタンパク質サンプルを８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質電気泳動とクマシーブリリアントブルーでの染色を行った。電気泳動の結果によれば、卵巣発育期のメスナマコ個体からのサンプルはすべて２００〜２５０ｋＤａに明らかなバンドがあるが（ビテリンと推定）、性腺無発育の個体とオス個体からのサンプルはすべてこの特異的なバンドがないことを示した。従って、まず超遠心によってリポタンパクを他のタンパクと分離した後、リポタンパクにＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク電気泳動を行い、ビテリンの特異的なバンドに基づいて卵巣発育期のメスナマコ個体を同定することができる。
【００２４】
（付記１）
ハネジナマコの体腔液を抽出した後、ビテリンを遠心分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動と染色を行い、電気泳動の結果に基づいて、卵巣発育期のメスナマコ、オスナマコ、及び性腺無発育のハネジナマコを区別する工程が含まれることを特徴とする、卵巣発育期のハネジナマコのメス個体を同定するための方法。
【００２５】
（付記２）
前記電気泳動の結果に基づいて、卵巣発育期のメスナマコ、オスナマコ、及び性腺無発育のハネジナマコを区別する工程は、２００〜２５０ｋＤａに明らかなバンドがあるものが卵巣発育期のメスナマコ個体であり、性腺無発育の個体とオス個体がこの特異的なバンドがないことに基づいて、卵巣発育期のハネジナマコのメス個体を同定することを特徴とする、付記１に記載の方法。
【００２６】
（付記３）
前記ビテリンの遠心分離は、超遠心によりビテリンを分離することを特徴とする、付記１に記載の方法。
【００２７】
（付記４）
超遠心によるビテリンの分離は、含有濃度が１ｍＭであるＰＭＳＦ、密度が１．２１５ｇ／ｍＬであるＫＢｒを含む溶液４ｍＬを超遠心管の底部に加え、ハネジナマコの体腔液１ｍＬを超遠心管の上部に加え、Ｈｉｍａｃ  ＣＰ  １００ＭＸ超遠心機にＰ１００ＡＴ−０１３２ローターを使用し、回転数１８００００ｇ、１０℃で２４時間遠心し、上部の液体、すなわちビテリンが含まれる溶液を３００μＬ取ることを特徴とする、付記３に記載の方法。
【００２８】
（付記５）
前記染色は、クマシーブリリアントブルーでの染色であることを特徴とする、付記１に記載の方法。
【００２９】
（付記６）
前記ハネジナマコの体腔液の抽出は、プロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦの溶液が予め加えられたシリンジを使用し、ハネジナマコの体壁を通して体腔に挿入し、体腔液を抽出することを特徴とする、付記１に記載の方法。
【００３０】
（付記７）
前記プロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦの溶液は、ＰＭＳＦの１００ｍＭ溶液であることを特徴とする、付記６に記載の方法。
【図１】
2021519575.tif 000003
【図２】
2021519575.tif 000004
【図３】
2021519575.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月26日(2020.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
超遠心によるビテリンの分離は、含有濃度が１ｍＭであるＰＭＳＦ、密度が１．２１５ｇ／ｍＬであるＫＢｒを含む溶液４ｍＬを超遠心管の底部に加え、ハネジナマコの体腔液１ｍＬを超遠心管の上部に加え、Ｈｉｍａｃ  ＣＰ  １００ＭＸ超遠心機にＰ１００ＡＴ−０１３２ローターを使用し、遠心力１８００００ｇ、１０℃で２４時間遠心し、上部の液体、すなわちビテリンが含まれる溶液を３００μＬ取ることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
好ましくは、ビテリンの遠心分離は、超遠心によりビテリンを分離する。ハネジナマコの体腔液を高速遠心した後、ビテリンは上澄みの上部にあり、上澄みの上部を吸引することで分離されたビテリンを得ることができる。具体的には、含有濃度が１ｍＭであるＰＭＳＦ、密度が１．２１５ｇ／ｍＬであるＫＢｒを含む溶液４ｍＬを超遠心管の底部に加え、ハネジナマコの体腔液１ｍＬを超遠心管の上部に加え、Ｈｉｍａｃ  ＣＰ  １００ＭＸ超遠心機にＰ１００ＡＴ−０１３２のローターを使用し、遠心力１８００００ｇ、１０℃で２４時間遠心し、上部の液体、すなわちビテリンが含まれる溶液を３００μＬ取る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
（２）ハネジナマコの体腔液の抽出と遠心
体長が２０ｃｍより長く、体重が５００ｇより重いハネジナマコの熟ナマコを２０匹選抜した。予め１００ｍＭのＰＭＳＦが２０μＬ加えられた２ｍＬのシリンジにより、ハネジナマコの体壁を通し、体腔まで２ｃｍ挿入し、体腔液を抽出した。冷却遠心機により、抽出した体腔液を遠心力１０００ｇ、４℃で１５分間遠心した。沈殿物を捨て、上澄みを新しい遠心管に移して予備した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
（２）超遠心
超遠心管の底部に、含有濃度が１ｍＭであるＰＭＳＦと密度が１．２１５ｇ／ｍＬであるＫＢｒ溶液（分離液）を合計４ｍＬ加え、超遠心管上部に体腔液［工程１．の工程（２）参照］１ｍＬを加えた。Ｈｉｍａｃ  ＣＰ  １００ＭＸ超遠心機にＰ１００ＡＴ−０１３２のローターを使用し、遠心力１８００００ｇ、１０℃で２４時間遠心した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
（付記４）
超遠心によるビテリンの分離は、含有濃度が１ｍＭであるＰＭＳＦ、密度が１．２１５ｇ／ｍＬであるＫＢｒを含む溶液４ｍＬを超遠心管の底部に加え、ハネジナマコの体腔液１ｍＬを超遠心管の上部に加え、Ｈｉｍａｃ  ＣＰ  １００ＭＸ超遠心機にＰ１００ＡＴ−０１３２ローターを使用し、遠心力１８００００ｇ、１０℃で２４時間遠心し、上部の液体、すなわちビテリンが含まれる溶液を３００μＬ取ることを特徴とする、付記３に記載の方法。
【国際調査報告】
2021519575.tif 000006
2021519575.tif 000007
2021519575.tif 000008
2021519575.tif 000009
2021519575.tif 000010
2021519575.tif 000011