(57)【要約】  本開示は、新規T細胞受容体（TCR）、特に少なくとも1つのその相補性決定領域（CDR）；前記TCRを発現するT細胞；前記TCRを発現するクローン；前記TCRをコードするベクター；可溶性形態の前記TCR；前記TCR、前記細胞、前記クローン、又は前記ベクターを含む医薬組成物又は免疫原性物質又は二重特異性又はワクチン；癌の治療における使用のための前記TCR又は前記細胞又は前記クローン又は前記ベクター又は前記医薬組成物又は免疫原性物質又は二重特異性又はワクチン；前記TCR、前記細胞、前記クローン、前記ベクター、前記TCRを含む前記医薬組成物、免疫原性物質、二重特異性又はワクチンを使用して癌を治療する方法；及び前記TCRと結合するリガンドに関する。【選択図】図１
2021505190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（CDR）
【化１】
2021505190.tif 000016
又はいずれかのCDR（すなわち、配列番号：1又は2）と少なくとも88%の同一性を共有しているCDRを含む、又はこれらからなる少なくとも1つの相補性決定領域を特徴とする、腫瘍特異的T細胞受容体（TCR）又はその断片。
【請求項２】
前記CDRの両方を含む、請求項1記載の腫瘍特異的T細胞受容体（TCR）。
【請求項３】
以下の相補性決定領域：
【化２】
2021505190.tif 000017
の任意の組合わせを含む1以上を含む、又はこれらからなる、請求項1又は2記載の腫瘍特異的T細胞受容体（TCR）。
【請求項４】
【化３】
2021505190.tif 000018
を含む、若しくはこれからなるγ鎖、又はそれと少なくとも88%の同一性を共有するγ鎖である、請求項1〜3のいずれか1項記載の腫瘍特異的T細胞受容体（TCR）。
【請求項５】
【化４】
2021505190.tif 000019
を含む、若しくはこれからなるδ鎖、又はそれと少なくとも88%の同一性を共有するδ鎖である、請求項1〜3のいずれか1項記載の腫瘍特異的T細胞受容体（TCR）。
【請求項６】
前記TCRの前記CDRが、さらに、又は代わりに、
【化５】
2021505190.tif 000020
であるγ鎖配列；並びに/又は
【化６】
2021505190.tif 000021
であるδ鎖配列；又は該γ鎖配列若しくは該δ鎖配列と少なくとも88%の同一性を共有するCDRを含む、又はこれらからなる、請求項1〜5のいずれか1項記載の腫瘍特異的T細胞受容体（TCR）。
【請求項７】
可溶性である、請求項1〜6のいずれか1項記載の腫瘍特異的T細胞受容体（TCR）。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか1項記載のTCRを発現するT細胞。
【請求項９】
請求項1〜7のいずれか1項記載のTCRを発現するT細胞クローン。
【請求項１０】
SW.3G1クローンである、請求項9記載のT細胞クローン。
【請求項１１】
請求項1〜7のいずれか1項記載のTCRをコードするベクター。
【請求項１２】
請求項1〜7のいずれか1項記載のTCRを含む医薬組成物若しくは免疫原性物質若しくは二重特異性若しくはワクチン、又は請求項8記載の細胞、又は請求項9若しくは10記載のクローン、又は請求項11記載のベクター。 
【請求項１３】
癌の治療における使用のための、請求項1〜7のいずれか1項記載のTCR、又は請求項8記載の細胞、又は請求項9若しくは10記載のクローン、又は請求項11記載のベクター、又は請求項12記載の医薬組成物若しくは免疫原性物質若しくは二重特異性若しくはワクチン。
【請求項１４】
前記癌が、結腸直腸癌、肺癌、腎癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頚癌、黒色腫（皮膚）、骨癌、乳癌、血液癌、脳癌、膵癌、精巣癌、卵巣癌、頭頚部癌、肝癌、膀胱癌、甲状腺癌、及び子宮癌を含む、又はこれらからなる群から選択される、請求項13記載のTCR、細胞、クローン、ベクター、又は医薬組成物若しくは免疫原性物質若しくは二重特異性若しくはワクチン。
【請求項１５】
癌を治療する方法であって、請求項1〜7のいずれか1項記載のTCR、又は請求項8記載の細胞、又は請求項9若しくは10記載のクローン、又は請求項11記載のベクター、又は請求項12記載の医薬組成物若しくは免疫原性物質若しくは二重特異性若しくはワクチンを、治療すべき個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記癌が、結腸直腸癌、肺癌、腎癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頚癌、黒色腫（皮膚）、骨癌、乳癌、血液癌、脳癌、膵癌、精巣癌、卵巣癌、頭頚部癌、肝癌、膀胱癌、甲状腺癌、及び子宮癌を含む、又はこれらからなる群から選択される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記TCR、細胞、クローン、ベクター、医薬組成物、免疫原性物質、二重特異性、又はワクチンを、抗腫瘍剤と組み合わせて投与する、請求項15又は16記載の方法。
【請求項１８】
癌の治療のための医薬の製造における、請求項1〜7のいずれか1項記載のTCR、又は請求項8記載の細胞、又は請求項9若しくは10記載のクローン、又は請求項11記載のベクターの使用。
【請求項１９】
a) 請求項1〜7のいずれか1項記載のTCR、又は請求項8記載の細胞、又は請求項9若しくは10記載のクローン、又は請求項11記載のベクター、又は請求項12記載の医薬組成物若しくは免疫原性物質若しくは二重特異性若しくはワクチンを；
b) さらなる癌治療剤と組み合わせて含む、癌の治療のための組合わせ治療薬。
【請求項２０】
図9に示す少なくとも1つのSCNNA1遺伝子産物のアイソフォームと結合する、TCR又はポリペプチド又は二重特異性又は抗体又は該抗体の断片。
【請求項２１】
前記アイソフォームの細胞外ドメインと結合する、請求項20記載のTCR又はポリペプチド又は二重特異性又は抗体又は該抗体の断片。
【請求項２２】
前記抗体がモノクローナルである、請求項20又は21記載のTCR又はポリペプチド又は二重特異性又は抗体又は該抗体の断片。
【請求項２３】
請求項1〜7のいずれか1項記載のTCRと結合する、図9に示す少なくとも1つのSCNNA1遺伝子産物のアイソフォーム又はその断片。
【請求項２４】
実質的に本明細書及び特許請求の範囲に記載されている、TCR、細胞、クローン、ベクター、医薬組成物、免疫原性物質、二重特異性、若しくはワクチン、又はポリペプチド、若しくは抗体、若しくは該抗体の断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本開示は、新規T細胞受容体（TCR）、特に少なくとも1つのその相補性決定領域（CDR）；前記TCRを発現するT細胞；前記TCRを発現するクローン；前記TCRをコードするベクター；可溶性形態の前記TCR；前記TCR、前記細胞、前記クローン、又は前記ベクターを含む医薬組成物又は免疫原性物質又は二重特異性又はワクチン；癌を治療するための前記TCR又は前記細胞又は前記クローン又は前記ベクター又は前記医薬組成物又は免疫原性物質又は二重特異性又はワクチンの使用；前記TCR、前記細胞、前記クローン、前記ベクター、前記TCRを含む前記医薬組成物、免疫原性物質、二重特異性又はワクチンを使用して癌を治療する方法；及び前記TCRと結合するリガンドに関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
本発明者らは、癌を治療するために有効な新たなクラスのγδ T細胞を発見した。該T細胞は、認識に標的細胞がインタクトなSCNN1A遺伝子を発現することを要求する。このT細胞は標的の認識に特異的ヒト白血球抗原（HLA）を必要とするという従来の知見に従わないことから、「従来型と異なる」と言われている。HLA座位は高度な可変性を有し、今日にあっては17,000を超える異なる対立遺伝子が記述されている。従って、HLAを介して機能するあらゆる治療的アプローチは、ごく少数の患者においてしか有効となり得ない。対照的に、ヒト集団の全体でSCNN1Aが発現する。この遺伝子は本発明者らの得たγδ TCR及び以後本明細書においてSW.3G1と命名するその対応する新たなT細胞クローンを介した癌細胞の認識に必要となる。このクローンは、健常B細胞にヒトヘルペスウイルス4（HHV-4）とも呼ばれるエプスタイン・バーウイルス（EBV）を感染させることにより作製したリンパ芽球状細胞株（LCL）を認識することができるγδ T細胞のスクリーニングの中で発見された。SW.3G1 γδ T細胞クローンが健常B細胞又は他の健常細胞株と反応しないことは、有利である。
【０００３】
さらなる研究から、SW.3G1 γδ T細胞クローンは全てではないにしろ、大部分の癌細胞を認識し得ることが、示された。SCNN1A遺伝子はこの認識に必要とされ、従ってSW.3G1 TCRの結合リガンドとなる。
【０００４】
知られているように、図2に示すように、TCRはジスルフィド結合を有する膜係留型ヘテロ二量体タンパク質であり、通常不変のCD3鎖分子と会合して完全機能性TCRを形成する、高度な可変性を有するγ及びδ鎖からなる。この受容体を発現するT細胞を、γ:δ（又はγδ）T細胞と呼ぶ。
【０００５】
γ及びδ鎖は、定常（C）領域及び可変（V）領域を含む細胞外ドメインから構成される。定常領域は、細胞膜に近接し、これに膜貫通領域及び短い細胞質尾部が続くのに対し、可変領域はリガンドに結合する。大部分のγδ T細胞のリガンドは、依然として不明である。
【０００６】
TCR γ鎖及びδ鎖の両方の可変ドメインはそれぞれ、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる3つの可変領域を有する。一般に、抗原結合部位は、TCR γ鎖及びδ鎖のCDRループによって形成される。CDR1γ及びCDR2γは個別のVγ遺伝子によってコードされるのに対し、CDR1δ及びCDR2δは個別のVδ遺伝子によってコードされる。TCR γ鎖のCDR3は、V領域及びJ領域（Joining region）の結合部周辺においてヌクレオチド付加及び除去が起こり得ることによる超可変性を有する。TCR δ鎖のCDR3は、VDJ組換えを起こした後の多様性（D）遺伝子も含み得るためにさらに高い変化可能性を有する。
【０００７】
2015年には、約9050万人が癌を有していた。1年につき約1410万の新規症例が発生している（黒色腫以外の皮膚癌は含まない）。ヒトの死のうち約880万件の死（15.7%）が、癌に起因する。男性における最も一般的な種類の癌は、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、及び胃癌である。女性においては、最も一般的な種類の癌は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、及び子宮頚癌である。各年の新規癌件数の合計に黒色腫以外の皮膚癌を含めれば、これは症例のおよそ40%を占めるだろう。アフリカ以外においては、子供について急性リンパ球性白血病及び脳腫瘍が最も一般的であり、アフリカにおいては非ホジキンリンパ腫がより高頻度で発生する。2012年には、15歳以下の約165,000人の子供たちが癌と診断された。癌のリスクは年齢とともに顕著に高まり、先進国において多くの癌がより一般的に発生する。比率は、古き時代に対しより人口が増え、発展途上世界における生活様式が変化するにつれ、上昇している。2010年については、癌の財政コストは、年当たり1.16兆ドル、USDと推定された。その結果、この疾患を治療し、又は根絶するより優れた、より安全な方法を提供することが求められている。異常な組織を殺傷する生体の自然防衛システムを使用する免疫療法が化学的介入よりも安全であることが認知されているが、有効性を高めるためには、免疫療法は癌に特異的でなくてはならない。さらに、あらゆる種類の癌に対して有効な免疫療法が発見されれば、多くの異なる種類の癌に罹患する個体に投与することができる（すなわち、汎集団的な応用性を有する）だけでなく、2以上の種類の癌に罹患する単一の個体に投与することもできるため、きわめて有益であろう。さらに、MHCに拘束されない免疫療法を特定すれば、MHC組織型にかかわりなくあらゆる個体に投与することができることを意味するので、きわめて有利ともなるであろう。
【０００８】
本明細書における本発明者らが同定したT細胞は、あらゆる種類の癌に有効であり、MHCに拘束されておらず、したがって認識に必要とされるSCNN1Aの遺伝子産物のユビキタスな発現に起因する汎集団的な応用性を有するという点で前述の有利な特徴を有する。
【発明の概要】
【０００９】
（発明の言及）
本発明の第1の態様に従って、
【化１】
2021505190.tif 000003
を含む、又はこれらからなる少なくとも1つの相補性決定領域（CDR）を特徴とする腫瘍特異的T細胞受容体（TCR）又はその断片を提供する。
【００１０】
本発明の好ましい実施態様において、前記CDRは（CDR）
【化２】
2021505190.tif 000004
又はそれらと少なくとも88%、例えば89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の同一性を共有するCDRを含む、又はこれらからなる。
【００１１】
本明細書に記載するCDRは、前記TCRのCDR3であり、従ってプロセシングされた抗原又はリガンドの認識を担う主要なCDRである。その他のCDR（CDR1γ、CDR2γ、CDR1δ、及びCDR2δ）は、生殖細胞系列によってコードされている。従って、本発明は1以上のこれらのその他のCDR、すなわちCDR1γ、CDR2γ、CDR1δ、及び/又はCDR2δを、前記1以上のCDR3配列との組合わせで同様に含むTCRとさらに関係する。
【００１２】
従って、好ましい実施態様において、前記TCRは以下の相補性決定領域：
【化３】
2021505190.tif 000005
の任意の組合わせを含む1以上を含む、又はこれらからなる。
【００１３】
本明細書における腫瘍特異的TCRの語は、SCNN1A遺伝子の発現する状況下で腫瘍細胞又は腫瘍細胞リガンドを特異的に認識し、腫瘍細胞又は腫瘍細胞リガンドによって活性化されるが、非腫瘍細胞又は非腫瘍細胞リガンドによって活性化されないTCRを指す。
【００１４】
本発明の好ましい実施態様において、前記TCRはγ鎖及びδ鎖を有するγδ TCRであり、前記γ鎖の前記CDRは、CDR：
【化４】
2021505190.tif 000006
又はそれと少なくとも88%、例えば89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の同一性を共有するCDRを含む、又はこれらからなり、前記δ鎖の前記CDRは、CDR：
【化５】
2021505190.tif 000007
又はそれと少なくとも88%、例えば89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の同一性を共有するCDRを含む、又はこれらからなる。従って、前記TCRは前述のCDRの一方又は両方を含み、かつ好ましい実施態様において、前記CDRの両方を含み得る。
【００１５】
本発明のさらに好ましい実施態様において、前記TCRの前記CDRが、さらに、又は代わりに、
【化６】
2021505190.tif 000008
であるγ鎖配列；並びに/又は
【化７】
2021505190.tif 000009
であるδ鎖配列；又はそれらと少なくとも88%、例えば89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の同一性を共有するCDRを含む、又はこれらからなる。
【００１６】
なおさらに好ましい実施態様において、前記TCRはMHCに拘束されず、SCNN1A遺伝子の発現する状況下で腫瘍特異的なリガンドと結合する点で従来型と異なる。これらのT細胞及びそのTCRがMHCに拘束されていないという事実は、これらが汎集団的な治療の潜在性を有し、従ってきわめて重要な新規癌治療となることを意味する。
【００１７】
本発明のさらに好ましい実施態様において、前記TCRγ鎖は、
【化８】
2021505190.tif 000010
又はそれと少なくとも88%、例えば89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の同一性を有する配列を含む、又はこれらからなる。
【００１８】
本発明のさらに好ましい実施態様において、前記TCRδ鎖は、
【化９】
2021505190.tif 000011
又はそれと少なくとも88%、例えば89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の同一性を有する配列を含む、又はこれらからなる。
（上記パラグラフにおいて、太字かつ下線の引かれたテキストは、CDRを、すなわち、CDR1、2、3をこの順で表す）
【００１９】
本発明のなおさらに好ましい実施態様において、前記TCRは、前記TCRγ鎖及び前記TCRδ鎖を含む。
【００２０】
なおさらに好ましい実施態様において、前記TCRは可溶性TCRすなわちsTCRであり、従って膜貫通を、理想的には細胞内ドメインをも有さない。
【００２１】
本発明のなお別の好ましい実施態様において、前記TCRは本明細書に記載の機能性を有するキメラ受容体の部分である。理想的には、前記TCRはαβ TCR定常ドメインに融合している。
【００２２】
あるいは、前記TCRの断片、例えばその単量体部分、理想的には単鎖形態のTCRを提供する。
【００２３】
本発明のさらなる態様に従って、理想的には可溶性又は膜適合型形態の、すなわち膜貫通領域及び細胞内領域を有する本発明の前記TCRを発現するT細胞を提供する。
【００２４】
本発明のなおさらなる態様に従って、理想的には可溶性又は膜適合型形態の、すなわち膜貫通領域及び細胞内領域を有する本発明の前記TCRを発現するT細胞クローンを提供する。好ましくは、前記クローンは、本明細書に記載のSW.3G1クローンである。
【００２５】
本発明のなおさらなる態様に従って、本発明の前記TCRをコードするベクターを提供する。
【００２６】
本発明のなおさらなる態様に従って、本発明の前記TCR又は細胞又はクローン又はベクターを含む医薬組成物又は免疫原性物質又は二重特異性又はワクチンを提供する。
【００２７】
好ましい実施態様において、前記医薬組成物又は免疫原性物質又は二重特異性又はワクチンは、あらゆる癌、理想的には結腸直腸癌、肺癌、腎癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頚癌、黒色腫（皮膚）、骨癌、乳癌、血液癌、脳癌、膵癌、精巣癌、卵巣癌、頭頚部癌、肝癌、膀胱癌、甲状腺癌、及び子宮癌を治療するために使用する。
【００２８】
本発明のなおさらなる態様に従って、本明細書に記載する癌の治療における使用のための前記TCR又は細胞又はクローン又はベクターを提供する。
【００２９】
本発明のなおさらなる態様に従って、前記TCR又は細胞又はクローン又はベクターを、治療するべき個体に投与することを含む、癌の治療方法を提供する。
【００３０】
理想的には、前記癌はあらゆる種類のものであるが、特に結腸直腸癌、肺癌、腎癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頚癌、黒色腫（皮膚）、骨癌、乳癌、血液癌、脳癌、膵癌、精巣癌、卵巣癌、頭頚部癌、肝癌、膀胱癌、甲状腺癌、及び子宮癌である。
【００３１】
本発明の好ましい方法において、前記TCR、細胞、クローン、又はベクターを、抗腫瘍剤、例えばこれらに限定はされないが、二重特異性と組み合わせて投与する。
【００３２】
本明細書における二重特異性の語は、2つの異なる種類の抗原に同時に結合することができる人工タンパク質である二重特異性モノクローナル抗体（BsMAb、BsAb）を指す。
【００３３】
あるいはなお、前記TCRは、癌細胞表面のそのリガンドと、及び同時にキラーT細胞などの免疫細胞と結合し、従ってこれを活性化させる免疫細胞活性化成分又はリガンドと結合させることを目的とした前記TCRを含む、二重特異性の部分を形成し得る。
【００３４】
本発明のなおさらなる態様に従って、癌を治療するための医薬の製造における前記TCR又は細胞又はクローン又はベクターの使用を提供する。
【００３５】
本発明のなおさらなる態様に従って、癌の治療のための組合わせ治療薬であって：
a) 前記TCR又は細胞又はクローン又はベクター又は免疫原性物質又は二重特異性又はワクチンを、 
b) さらなる癌治療薬と組み合わせたものを含む、前記組合わせ治療薬を提供する。
【００３６】
本発明のなおさらなる態様に従って、図9に示す少なくとも1つのSCNNA1遺伝子産物のアイソフォーム、特にそれらの細胞外ドメインと結合する、TCR又はポリペプチド又は二重特異性又は抗体又は該抗体の断片を提供する。
【００３７】
本発明の好ましい実施態様において、前記ポリペプチド、抗体、又は断片は前記SCNNA1遺伝子の産物の活性を阻害する。前記抗体の例においては、最も理想的にはモノクローナルである。
【００３８】
以下の特許請求の範囲及び本発明の先行する記述において、文脈により表現言語又は必要な意味を理由として別段に要求される場合を除き、「含む」という語、又は「含む」、若しくは「含んでいる」などの変形を、非排他的な意味で、すなわち言及された特徴の存在を特定するが、本発明の様々な実施態様におけるさらなる特徴の存在又は追加を排除しないように使用する。
【００３９】
本明細書中で引用するあらゆる特許又は特許出願を含むすべての参考文献は、参照により本明細書に組み込む。任意の参考文献が先行技術を構成することは容認しない。さらに、いずれの先行技術も当技術分野の共通一般知識の部分を構成することは容認しない。
【００４０】
本発明の各態様の好ましい特徴は、いずれかの他の態様と関連して説明することができる。
【００４１】
本発明の他の特徴は、以下の実施例から明らかとなる。一般的に、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲及び図面を含む）に開示された特徴の任意の新規なもの、又は任意の新規な組合わせに拡張する。従って、本発明の特定の態様、実施態様、又は実施例と関連して記載される特徴、整数、特性、化合物又は化学成分は、本明細書に記載される任意の他の態様、実施態様又は実施例に不適合ではない限り、それらに適用可能であると理解すべきである。
【００４２】
さらに、別段に言及しない限り、本明細書に開示する任意の特徴は、同じ又は同様の目的に役立つ代替の特徴によって置換することができる。
【００４３】
本明細書の記載および特許請求の範囲の全体を通じて、文脈により別段に要求されない限り、単数形は複数を包含する。特に、不明確な冠詞が使用される場合、文脈により別段に要求されない限り、本明細書は複数形並びに単数形を意図するものとして理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
本発明の実施態様は、ここで以下を参照してのみ例として記載される：
【図１】自己及び非自己リンパ芽球状細胞株（LCL）への反応性を有するγδ T細胞のクローン型を決定し、かつそれぞれCDR3
【化１０】
2021505190.tif 000012
を有するTRGV3及びTRDV1遺伝子から構成されるTCR を発現することを見出した方法を示す。限界希釈法によりこのTCRを発現するクローンを増殖させ、SW.3G1と命名した。 (A) 健常ドナー9909から精製したγδ T細胞を3名のドナー由来のLCLのプール（0439、pt146、及びHom-2）で初回刺激し（primed)（第0日）、かつ再刺激した（第14日）。第28日に、T細胞株を初回刺激に使用したLCLとともに、及びまた自己LCL-9909とともに4時間インキュベートし、TAPI-0、抗CD107a及び抗TNFα抗体を含めることにより活性化を評価した。活性化した細胞をフローサイトメトリーによりソーティングし、T細胞受容体（TCR）を次世代配列決定法により解析した。円グラフに、ソーティングされた細胞に存在していた、提示されたTCR鎖及びCDR3（相補性決定領域）の割合を図示する。フローサイトメトリープロットのための活性化細胞のパーセンテージを各ゲートの上に示す。複数の株から得たT細胞クローンSW.3G1は、強調されたTCR鎖を表す。全長TCR配列を図2に示す。(B) クローンSW.3G1の表現型を抗体を用いて解析し、TCRδ1鎖を発現することが確認された。SW.3G1はαβ TCRも、従来型のペプチド-HLA抗原の認識に関連するCD8若しくはCD4糖タンパク質も発現しなかった。
【図２】クローンSW.3G1のγ及びδ TCR鎖のT細胞受容体配列を示す。mRNA構造（上）は、各鎖についてCDR1及びCDR2は生殖細胞系列にコードされることを示している。CDR3はT細胞受容体（TCR）-鎖のV-J結合部及びTCR-鎖におけるV-D-J結合部での連結多様性の産物である。CDR3は結果的に、超可変性を有する。CDRループに採用された色コードは、図の全体を通して維持される。灰色に着色された領域は、TCRの定常及び可変ドメインを表す（超可変CDRループを含まない）。右のパネルは、予測されたタンパク質のフォールディングを示す。TCRは分子の膜遠位端に相補性決定領域（CDR）ループを配置する類似した三次構造を採用する。6つのCDRループは一緒になって抗原結合部位を形成する。
【図３】SW.3G1は、自己及び非自己のLCLを認識し、殺傷することができるが、様々な組織を起源とする健常細胞を認識も殺傷もしないことを示す。(A) SW.3G1のLCLとの4時間の共インキュベーション。TAPI-0、抗CD107a及び抗TNFα抗体を含めることにより活性化を評価した。(B) （A)と同じLCLを使用した6.5時間のクロム放出細胞傷害性アッセイ。(C) ドナー9909からエクスビボで直接磁気により精製した自己健常B細胞をAと同様の活性化アッセイにおいて使用した。LCL-9909を、活性化についての陽性対照として使用した。(D) LCL-9909及び健常細胞株CIL-1（毛様体無色素上皮）及びHep2（肝細胞）を使用した、Aと同様の活性化アッセイ。ゲーティングした細胞のパーセンテージを示す。
【図４】SW.3G1が共通のHLAを有さない複数のドナー由来のLCL及び異なる組織から得た癌細胞株のアレイの溶解を仲介したことを示す。SW.3G1を6.5時間のクロム放出細胞傷害性アッセイで使用した。(A) 24名のドナー由来のリンパ芽球細胞株（LCL）のパネル（x軸上に名前を示す）。赤いバーは、SW.3G1をクローニングしたドナー9909から得たT細胞株を作製するために使用したLCL。T細胞対LCL比は1:1。(B) T細胞対癌細胞比を10:1とした、異なる組織を起源とする（key）癌細胞株のパネル（x軸上に名前を示す）のSW.3G1を仲介した殺傷能。
【図５】SW.3G1は既知の機構によっては標的細胞を認識しないことを示す。(A) γδ SW.3G1クローンをHMB-PP、リンパ芽球細胞株（LCL）-9909及びフィトヘマグルチニン（PHA）とともに4時間共インキュベートした。また、T細胞を単独でインキュベートした。TAPI-0、抗CD107a及び抗TNFα抗体を含めることによりT細胞の活性化を評価した。活性化された細胞のパーセンテージをゲーティングされた細胞の上に示す。(B) （A)と同じ活性化アッセイを使用して、SW.3G1を、x軸上に名前を示したタンパク質と結合する抗体（Ab）を用いて事前標識したLCLとともにインキュベートした。また、SW.3G1をAbなしのLCLとともにインキュベートした（無Ab対照）。反応のパーセンテージをグラフにより示す（y軸）。MICA/B（主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスI関連鎖A/B）及びEPCR（内皮タンパク質C受容体）、抗MHCクラスI及びII Abも含めた。
【図６】SW.3G1による標的細胞の認識に関与する候補遺伝子/タンパク質を同定するために使用した全ゲノムCRISPR/Cas9アプローチを示す。
【図７】SW.3G1による標的細胞の認識についての複数の候補遺伝子を同定する全ゲノムCRISPR/Cas9アプローチの結果を示す。(A) 自己LCL-9909及び癌細胞株KBM7に全ゲノムCRISPR/Cas9ライブラリを形質導入した。ライブラリをSW.3G1 T細胞クローンを使用した数回の選択にかけ、溶解に抵抗性を示す標的細胞株を作製した。生存する標的細胞（選択後）をSW.3G1を使用した活性化アッセイにおいて事前選択した細胞株とともに試験した。活性化は、TAPI-0、抗CD107a、及び抗TNFα抗体を含めることにより評価した。(B) 選択後ライブラリの配列決定により、(C)に示す遺伝子に対応する富化されたガイドRNAが明らかとなった。(C) 候補遺伝子は、LCL-9909及びKBM7ライブラリの両方に見られたか、又はLCL-9909若しくはKBM7のみに見られた。遺伝子及び（タンパク質）の名称をさらなる情報のためのウェブサイトへのリンクとともに示す。
【図８】全ゲノムCRISPR/cas9ライブラリアプローチによって同定された候補遺伝子/タンパク質SCNN1Aについての情報を示す。
【図９】5つの発現されたスプライスバリアントとアラインさせたSCNN1Aの標準的タンパク質配列を示す。アイソフォーム1は標準的配列である（アイソフォーム1 UniProt P37088-1）。黒で強調されたアミノ酸は、本研究において使用したポリクローナルAbを作製するために使用した領域である。赤は、示されるものと異なるアミノ酸残基によるタンパク質バリアントの部位である。タンパク質バリアントのアミノ酸残基は図中に表示しないが、http://www.uniprot.org/uniprot/P37088に見出すことができる。青は、スプライスアイソフォーム間のアミノ酸の相違である。
【図１０】SW.3G1による標的細胞の認識におけるSCNN1Aの役割を検証するための実験結果を示す。(A) SCNN1A遺伝子及びタンパク質の模式図。全ゲノムGeCKOライブラリからのガイドRNA（gRNA）部位（番号1）及び本発明者らが設計した異なる検証用gRNA SCNN1A配列（番号2）。図は、Chenの文献、2014から改変した。(B) SW.3G1をLCL .174野生型、GeCKO gRNA-1及びgRNA-2ノックアウトLCL.174細胞と共に使用した、長期殺傷能アッセイ。(C) SCNN1Aに対するgRNA-2を受けた乳癌細胞株MDA-MB-231のウェスタンブロット解析。比較用に使用した野生型細胞。赤い矢印は76 kDa SCNN1Aタンパク質を示す。(D) SW.3G1による長期殺傷能アッセイに使用した、(C)で得たMDA-MB-231細胞及び黒色腫MM909.24、野生型及びSCNN1Aノックアウト（KO）細胞株。癌細胞は株として使用し、gRNAを発現するものをピューロマイシン処理により選択した。その後は細胞クローニングは行わなかった。
【図１１】SW.3G1から得たTCRの導入により、3名の健常ドナー由来のαβ T細胞に標的細胞への反応性が付与されることを示す。（A) 3名のドナーから得た精製CD8+ T細胞にSW.3G1 T細胞受容体鎖（マーカー及びラット（r）CD2を介して精製）及びレシピエントT細胞のTCRβ鎖を陰性にするためのgRNAを共形質導入した（ピューロマイシン処理により選択した）（Legutらの文献、2017）。細胞の純度をrCD2抗体（Ab）及び抗γδ TCR Abを用いて確認した。（B) 1名のドナーから得た細胞を長期殺傷能アッセイで試験した（下のグラフ）。LCL .174細胞株を使用した：野生型、SCNN1Aノックアウト（gRNA-1及び-2を使用）、及びSCNN1Aノックイン（コドン最適化されたSCNN1A導入遺伝子を受けたKO細胞）細胞。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
（詳細な説明）
（方法及び材料）
（T細胞株の作製及びクローン型の決定）
健常ドナー（コード9909）の血液から標準的密度勾配分離により末梢血単核球（PBMC）を精製した。末梢血中のγδ T細胞の優勢な集団は、Vγ9Vδ2 TCRを発現し、典型的には細菌由来の抗原に反応する。γδTCR+/Vδ2- T細胞を富化させて、それにより癌に反応するT細胞を発見する可能性を高めるため、本発明者らは磁気ベースの精製プロトコルを改変した。第1の改変は、PEコンジュゲート抗Vδ2抗体（Ab）（クローンB6, BioLegend, San Diego, CA）を用いてPBMCを染色することであった。次に、γδ TCR+ T細胞を製造業者の説明書に従って（Miltheyi Biotec, Bergish Gladbach, Germany）、ポジティブにγδ TCR-細胞を除去することにより、ネガティブに富化させた。第2の改変には、抗PEマイクロビーズ（Miltneyi Biotec）をγδ TCR精製キットのビーズに加え、それによりδ2+細胞をγδ TCR-細胞と同時に除去することを含めた。精製した細胞を、エプスタイン・バーウイルス（EBV）によりB細胞を不死化することにより、3名のドナーから得たPBMCから作製した、LCLに放射線照射（3000-3100 rad）したものと共インキュベートした。全てのLCLは、R10培地（RPMI-1640、10%熱非働化ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、100 U/mLペニシリン及び100 μg/mLストレプトマイシン、全てLife Technologies, Carlsbad, CA）中、浮遊細胞として増殖させた。14日後、T細胞を同じドナーから得た放射線照射されたLCLにより、再刺激した。第28日に、T細胞を収集して、LCLに対する反応性を評価するための活性化アッセイに使用した。T細胞（30,000個）を同数のLCLと、96穴U底ウェルプレート中4時間インキュベートした。アッセイの開始時に、30 mM TNFαプロセシングインヒビター-0（TAPI-0、Sigma Aldrich社製）(Haneyらの文献、2011)、抗CD107a Ab（H4A2, Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ）、及び抗TNFα Ab（cA2, Miltenyi Biotec）をアッセイ培地に加えた。続いて細胞を細胞生存性色素Vivid（Life Technologies, PBS中1:40に希釈し、続いて染色当たり50 μL中2 μL)及び抗CD3抗体（Ab）（BW264/56, Miltenyi Biotec）で染色した。活性化した細胞を、TCR鎖の配列決定用に準備を整えたRLT Plus緩衝液（40 mM DTTを補充）（Qiagen）中BD FACS Ariaを用いてソーティングした。RNAをRNEasy Microキット（Qiagen, Hilden, Germany）を使用して抽出した。cDNAを製造業者の説明書に従って、5’/3’ SMARTerキット（Clontech, Paris, France）を使用して合成した。SMARTerアプローチでは、マウスモロニー白血病ウイルス（MMLV）逆転写酵素、3’オリゴdTプライマー、及び5’オリゴヌクレオチドを使用して、既知のユニバーサルアンカー配列に隣接するcDNA鋳型を生成した。PCRは、γ又はδ TCR鎖の定常領域のアンカー特異的フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して実施した。最後のPCR産物をゲル精製して、次世代配列決定法のために調製した(Doniaらの文献、2017)。
【００４６】
（クローンSW.3G1の入手及び表現型解析）
T細胞は、限界希釈法により、T細胞株から直接クローニングした(Theakerらの文献、2016)。4週間の培養後、各クローンを培養体積の50%だけ収集し、上記の通りLCLによる活性化アッセイに使用した。活性化アッセイを実施する前に、T細胞クローンを洗浄し、低減血清培地中24時間インキュベートした。LCLに対する反応性を示すクローンをTCRの配列決定（以下参照）に十分な数まで増殖させた。クローンSW.3G1をCD3（Miltenyi Biotec）、CD8（BW135/80, Miltenyi Biotec）、CD4（M-T466, Miltenyi Biotec）、αβTCR（BW242/412, Miltenyi Biotec）、及びTCR Vδ1鎖（REA173, Miltenyi Biotec）の表面発現のためにAbで染色した。
【００４７】
（SW.3G1 TCRの配列決定）
上記の通り、T細胞株の配列決定のため、最終のPCR後に精製したPCR産物をZero-Blunt TOPOにクローニングし、標準の配列決定用に、One Shot化学コンピテント大腸菌（E. coli）細胞に形質転換した（両方ともLife Technologies社製）。
【００４８】
（SW.3G1はLCLを認識したが、健常細胞を認識しなかった）
LCLに対するSW.3G1の反応性を確認するため、上記活性化アッセイ及びクロム放出細胞傷害性アッセイを実施した。PEコンジュゲート抗CD19 Ab（HIB19, Miltenyi Biotec）及び抗PEマイクロビーズ（Miltenyi Biotec）によるポジティブな捕捉を使用してドナー9909から健常B細胞を精製し、すぐにアッセイに使用した。他の健常細胞株及びそれらにつき専売される培養培地をSciencell（Carlsbad, CA）から入手した：CIL-1（ヒト毛様体無色素上皮）及びHep2（ヒト肝細胞）を上記の通り活性化に使用した。
【００４９】
（SW.3G1は試験した全ての不死化及び癌細胞を殺傷した）
LCL及び腫瘍細胞を細胞傷害性アッセイ(Ekeruche-Makindeらの文献、2012)のためにクロム51で標識した。T細胞対標的比は1:1（LCL）又は10:1（癌細胞）とした。LCLを上記の通り維持した。癌細胞株（背景及び培養の情報については、ATCC（登録商標）参照）/起源となる組織：SiHa（HTB-35）及びMS751（HTB-34）/子宮頚部；MCF7（HTB-22)、MDA-MB-231（CRM-HTB-26）及びSKBR3（HTB-30）/乳房；TK143（CRL-8303）及びU20S（HTB-96）/骨；HCT-116（CCL-247）及びColo205（CCL-222）/結腸；Jurkat（TIB-152)、K562（CCL-243)、THP-1（TIB-202)、U266（TIB-196）及びMolt-3（CRL-1552）/血液；Caki-1（HTB-46）/腎臓；A549（CCL-185）及びH69（HTB-119）/肺。MM909.11、MM909.12、MM909.15、MM909.46、及びMM909.24は、癌免疫治療センター（Center for Cancer Immune Therapy）（CCIT, Herlev Hospital, Copenhagen, Denmark）で治療する癌患者から入手した皮膚黒色腫である。「MM」細胞株及び黒色腫Mel 526及びMel 624は、R10中接着細胞として維持し、週に1回又は必要な時に継代し、20-80%のコンフルエンスに合わせた。細胞をD-PBSですすぐことにより組織培養フラスコから引き離し、続いて分離するまでD-PBS及び2 mM EDTAにより37℃でインキュベートした。
【００５０】
（SW.3G1は既知の機構によっては標的細胞を認識しなかった）
Vγ9Vδ2 T細胞活性化因子(E)-4-ヒドロキシ-3-メチル-ブタ-2-エニルピロリン酸（HMB-PP）（Sigma Aldrich）をDMSO中で再構成し、アッセイウェルに直接加えた。以下のモノクローナルAbをブロッキングアッセイに使用した：抗HLA、-B、-C（クローンW6/32、Biolegend）、抗HLA-DR、-DP、-DQ（クローンTu39、Bioloegend）、抗EPCR（ポリクローナル、R&D systems）、抗MICA/MICB（クローン6D4、BioLegend）、及び抗CD1d（クローン51.1、Miltenyi Biotech）を最終濃度を10 μg/mLとして使用した。 
【００５１】
（全ゲノムCRISPRによる遺伝子トラップ）
全ゲノムCRISPR/Cas9ライブラリアプローチを使用した（概観については図5）。GeCKO v2サブライブラリA及びB（Adgeneプラスミド、#1000000048、親切にもFeng Zhang博士に提供いただいた(Patelらの文献、2017)）を用いた全ゲノム標的化LCL-9909及びKBM7を、SW.3G1による選択のために使用した。簡潔に説明すると、ピューロマイシンを用いて選択して形質導入に成功した標的細胞をあらかじめ定めた比で、96穴U底ウェルプレート中2〜3週間SW.3G1とともに共インキュベートした。選択前後の標的細胞を用いて（上記の通り）活性化アッセイを実施して、選択された細胞に対するSW.3G1の活性の喪失を確認した。SW.3G1による2ラウンドの選択を生き残った標的細胞からのゲノムDNAを次世代配列決定法のために使用して、挿入されたガイドRNA及び候補遺伝子を明らかにした。
【００５２】
（標的細胞認識におけるSCNN1Aの役割の確認）
レンチウイルス粒子をHEK 293T細胞への塩化カルシウムトランスフェクションにより作製し、超遠心分離により濃縮した後、8 μg/mLのポリブレン及びスピンフェクションを使用して標的細胞に形質導入した。gRNAをSpCas9タンパク質及びピューロマイシン抵抗性マーカー遺伝子（pac、ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ）をコードするpLentiCRISPR v2プラスミド（親切にもFeng Zhang博士に提供いただいた、Addgene plasmid 52961）にクローニングし、パッケージング及びエンベローププラスミドpMD2.G及びpsPAX2（全てAddgene社製)を共トランスフェクションした。コドン最適化された全長SCNN1A導入遺伝子（アイソフォーム1、UniProt P37088-1）を第3世代レンチウイルス導入ベクターpELNS（親切にもUniversity of Pennsylvania, PAのJames Riley博士に提供いただいた）にクローニングした。pELNSベクターは、抗ラットCD2（rCD2） PE Ab（OX-34, BioLegend）を使用して細胞を選択するためのrCD2遺伝子を含む。標的細胞におけるSCNN1Aの発現を、製造業者の説明書に従って、フローサイトメトリー（データは示さない）及びウェスタンブロット解析のためにウサギ抗SCNN1Aポリクローナル抗体（PA1-902A, ThermoFisher Scientific）を使用して評価した。
【００５３】
（SW.3G1 TCRによるポリクローナルT細胞の形質導入により標的細胞認識能が付与される）
コドン最適化された、全長TCR鎖は、自己切断2A配列で隔てられており、合成され（Genewiz）、第3世代レンチウイルス導入ベクターpELNS（親切にもUniversity of Pennsylvania, PAのJames Riley博士に提供いただいた）にクローニングした。pELNSベクターはもう1つの自己切断2A配列によりTCRから隔てられたラットCD2（rCD2）マーカー遺伝子を含む。さらに、細胞にgRNAを共形質導入して、両方のTCR-β定常ドメインを標的化することにより（原稿は現在Blood誌への掲載準備にある）、レシピエント細胞におけるTCRβ鎖の発現を除去した。レンチウイルス粒子はHEK293T細胞の塩化カルシウムトランスフェクションによって作製した。TCR導入ベクターをパッケージング及びエンベローププラスミドpMD2.G、pRSV-Rev、及びpMDLg/pRREにより共トランスフェクションした。レンチウイルス粒子を超遠心分離により濃縮した後、5 μg/mlポリブレンを使用してCD8+ T細胞に形質導入し、CD8+ T細胞は24時間前に3名の健常ドナーから磁気分離（Miltenyi Biotec）により精製し、CD3/CD28ビーズ（Dynabeads, Life Technologies）を用いて3:1のビーズ：T細胞比として終夜活性化させた。ウイルスを取り込んだT細胞は、2 μg/mlピューロマイシンによるインキュベーション（TCRβ鎖ノックアウト）及び抗rCD2 PE Ab（OX-34, BioLegend）とそれに続く抗PE磁気ビーズ（Miltenyi Biotec）を用いた富化によって選択した。形質導入から14日後にT細胞を同種異系のフィーダー及びPHAとともに増殖させた。TCRを形質導入した細胞は、LCL.174標的を96穴U底ウェルプレート中に密度を50,000細胞/ウェルとして2連で播種する長期殺傷能アッセイに使用した。SW.3G1を標的に加え、7日間インキュベートした。また、標的細胞をT細胞なしで播種し、100%生存対照として役立てた。細胞を収集し、PBSで洗浄し、Vivid及び抗CD3抗体で染色した（T細胞を除くため）。内部標準として、CountBright（商標） Absolute Counting Beads（Life Technologies）を各ウェルに加えた後（およそ10,000ビーズ/ウェル）、収集/洗浄を行った。試料はFACS Canto II上で取得し、少なくとも1,000個のビーズ事象を試料ごとに取得した。標的細胞の生存率は、以下の式に従い計算した。
【数１】
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【００５４】
（結果） 
（クローンの特性評価）
1. 健常ドナー（9909）から精製したγδ T細胞を3つの非自己リンパ芽球状細胞株（-0439、-pt146、及び-HOM-2）のプールを用いて初回刺激（primed）及び再刺激した。各細胞株に対する反応性を第28日に試験した（図1）。T細胞株は自己LCL-9909も認識した（図1）。
【００５５】
2. 上述の株から得たT細胞を各々のLCLに対する反応性に基づいてフローサイトメトリーによりソーティングし、それらのTCRを次世代配列決定法により解析した（図1）。γ鎖の配列決定について、可変鎖TRGV9及びTRGV3に2つの特有のCDR3が存在した。δ鎖について、可変鎖TRDV1及びTRDV2に3つのCDR3が存在した。
【００５６】
3. ドナー9909T細胞株から入手したT細胞クローンは、γ3δ1 TCR及びそれぞれの各鎖にCDR3
【化１１】
2021505190.tif 000014
を発現していた（図1及び図2）。全ての増殖したクローンは同じTCRを発現していた。このクローンをSW.3G1と命名した。
【００５７】
SW.3G1のAbを用いた染色により、Vδ1鎖の発現及びαβ TCR-/CD8低/CD4-であることが確認された (図1B）。
【００５８】
4. TNFα及びCD107aを読み出し情報（readouts）として用いる活性化アッセイにより、自己LCL-9909及び非自己LCL-0439に対するSW.3G1の反応性を確認した（図3A）。ドナー9909及び0439はMHCクラスI及びクラスII対立遺伝子の両方について完全にHLA不適合である。従って、SW.3G1は標的細胞をHLA非依存的な様式で認識している。また、SW.3G1はLCL-9909及び-0439を溶解させることができ、従って細胞傷害性である（図3B）。9909からエクスビボで直接精製した自己健常B細胞はSW.3G1の標的として作用しないため（図3C）、LCLの認識はEBVがB細胞に感染する際の不死化プロセスに依存していた。同様に、健常細胞CIL-1（上皮細胞）及びHep2（肝細胞）はSW.3G1の活性化を誘発しなかった（図3D）。
【００５９】
5. SW.3G1は試験した24名の全てのドナーに由来するLCLを溶解することができ（自己LCLについては図3B、23の非自己LCLについては図4A）、SW.3G1がHLA非依存的な様式で作用することがさらに確認された。さらに、LCL.174（図4A、左から4番目のバー）はMHC座位を有するヒト染色体である染色体6から1コピーしか発現しない。LCL.174細胞の染色体6は、大きな欠失を含み、MHCクラスII及びMHCクラスIの抗原プロセシングに関与する多くの構成要素についての遺伝子を有さない。 
【００６０】
6. SW.3G1は8つの異なる組織：皮膚/黒色腫、腎臓、結腸、乳房、血液/白血病、肺、子宮頚部、及び骨を起源とする23種の癌細胞株を殺傷した（図4B）。 
【００６１】
7. SW.3G1は、自己ピロリン酸の認識と同様の様式でVγ9Vδ2 TCR T細胞のサブセットによる病原体感染細胞の認識を引き起こす既知のγδ T細胞の抗原、HMB-PP（図5A）に反応しなかった。この経路は、標的細胞がブチロフィリン3A1を発現することを必要とする。SW.3G1のLCL-9909（自己）、-0439、及び-pt146に対する反応性は、既知のγδ T細胞リガンド：主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスI関連鎖A及びB（MICA/MICB）、EPCR内皮タンパク質C受容体（EPCR）、及びCd1dと結合する遮断抗体を含めることによっては、妨害されなかった。また、MHCクラスI及びクラスIIはSW.3G1の活性化を遮断することができなかった。徹底的に排除するプロセスではないものの、これらのデータはSW.3G1が癌細胞表面の未知のγδ TCRリガンドを認識し得ることを示唆していた。従って、全ゲノムCRISPR/Cas9ライブラリアプローチを採用して、SW.3G1による標的細胞の認識に関与する候補遺伝子/タンパク質を見出した（図6）。
【００６２】
8. 全ゲノムCRISPR/Cas9ライブラリを使用して、自己LCL-9909及び半数体骨髄性白血病細胞株KBM7における遺伝子ノックアウトを作製した。両方のライブラリを、連続するラウンドの選択にわたりSW.3G1と共インキュベートして、SW.3G1に仲介される溶解を免れさせるgRNAを含む標的細胞を富化させた（図7A）。SW.3G1の反応性は、選択前のLCL-9909の59%から、選択後の12%まで低下した。KMB7について、反応性は12%から4.2%へと減少した。選択後のLCL-9909及びKBM7を、富化されたgRNAを特定するための次世代配列決定法に使用した。手掛かりとなる遺伝子が特定され、全部で7つの遺伝子のうち、4つがLCL-9909及びKBM7ライブラリの間で共通していた（図7B及び7C）。タンパク質ナトリウムチャネル上皮1αサブユニットをコードする遺伝子SCNN1A（本明細書では、コードされたタンパク質を記載する時にも使用する）に特異的なガイドが、両ライブラリにおいて高度に富化して存在していた（図7B及びC）。SCNN1A遺伝子及びタンパク質の別名を、図8に示す。このタンパク質は細胞表面に発現し、したがってさらなる探索に適した候補である。SCNN1Aは6つのスプライスバリアントアイソフォーム及び様々な自然発生の突然変異を有する（図8及び9）。 
【００６３】
9. 全ゲノムライブラリから得たSCNN1A gRNA（GeCKO, gRNA-1）又は社内で設計した別のガイド（gRNA-2）（図10A）を用いて形質導入したLCL.174は、もはやSW.3G1の標的とはならず、野生型細胞に対する100%の殺傷と比較して、ノックアウト細胞株の溶解は5%未満に減少した。これにより標的細胞認識におけるSCNN1Aの役割が確認された（図10B）。SCNN1A遺伝子ノックアウト株は、2つの癌細胞において作製し、これらの株は部分的又は完全にSW.3G1による溶解を免れた（図10C）。本研究の全体を通じて、作製したSCNN1Aノックアウト細胞は、株として使用したのであり、アッセイ実施前にクローニングしたものではないことは、注目に値する。これにより、一部の「ノックアウト」細胞株について残存する反応性が見られたことの説明がつく。おそらくピューロマイシン選択から逃れ、かつ/又はSCNN1A,遺伝子の除去の失敗により、ノックアウト株中の少数派の細胞集団が依然としてSCNN1Aを発現するためであろう。SW.3G1活性化アッセイに使用したSCNN1AノックアウトMDA-MB-231細胞のウェスタンブロット解析により、野生型細胞と比較して、ノックアウト細胞株においてSCNN1Aタンパク質が大幅に減少することが明らかとなり（図10C）、これにより遺伝子がノックアウトされていることが確認された。使用したAbは全てのSCNN1Aのアイソフォームを認識することができる（図9）。また、本発明者らはSCNN1Aノックアウト細胞が長期培養（extensive culture）（3＋週）により生存能が低下したこと、及びいくつかの事例では、細胞分裂が完全に停止したことに気づいた。多くの他の遺伝子に対するgRNAを用いて形質導入した同じ細胞株は同じ細胞増殖及び生存性の変化を示さなかったため、この観察結果はSCNN1A gRNAに特有であった。この結果は、SCNN1A遺伝子が培養細胞の長期の増殖に不可欠であることを示唆している。 
【００６４】
10. 3名の健常ドナーから得たポリクローナルCD8+ T細胞にSW.3G1 TCRを導入すると、標的細胞LCL-pt146への反応性が付与された（図11A）。TCRを形質導入した細胞は、SCNN1Aノックアウト細胞に対し、SW.3G1クローンについて上述したものと同じ機能プロファイルを示した（図11B）。SCNN1Aノックアウトデータに補足し（compliment）、標的細胞の認識におけるSCNN1Aの役割をさらに確認するため、本発明者らはノックアウト細胞にSCNN1A遺伝子を形質導入した。SCNN1A gRNAを発現するノックアウト細胞にネイティブのSCNN1A遺伝子を導入しても、導入遺伝子の遺伝子除去が引き起こされてしまう。そのため、ネイティブの遺伝子（アイソフォーム1 UniProt P37088-1、図9）のDNA配列と異なるが同じタンパク質を発現する、コドン最適化された遺伝子を導入した。gRNA-1又はgRNA-2を形質導入された細胞の殺傷能は除去されたが、ノックアウト細胞にSCNN1A遺伝子を発現させることにより、殺傷能を復帰させることができた（図11B）。
【００６５】
（結論）
SW.3G1 TCRは、T細胞が広範囲の腫瘍を認識することを可能にする。認識は、SCNN1A遺伝子の産物を介して発生する。SW.3G1 T細胞クローンは、MHC拘束の非存在下で癌細胞特異的SCNN1Aリガンドを認識する。
【００６６】
本発明は、T細胞クローンSW.3G1において同定されたTCRを中心にする。このTCRはSCNN1Aの発現を介して広範囲の癌細胞を認識する。このTCRは非腫瘍細胞を認識しない。腫瘍株由来のSCNN1AのCRISPR/Cas9ノックアウト又は抗体による遮断から、ここでTCRは腫瘍細胞の認識にSCNN1A遺伝子の産物を必要とすることが確認された。SW.3G1 TCRは、様々な異なる癌免疫療法戦略に使用することができる。広い腫瘍認識能及び認識についてのヒト白血球抗原（HLA）非依存性から、このTCRを使用して汎癌、汎集団的免疫療法の心躍るような可能性が開かれる。
【００６７】
（参考文献）
【化１２】
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【図１Ａ】
2021505190.tif 000022
【図１Ｂ】
2021505190.tif 000023
【図２】
2021505190.tif 000024
【図３Ａ−Ｂ】
2021505190.tif 000025
【図３Ｃ−Ｄ】
2021505190.tif 000026
【図４】
2021505190.tif 000027
【図５Ａ】
2021505190.tif 000028
【図５Ｂ】
2021505190.tif 000029
【図６】
2021505190.tif 000030
【図７Ａ−Ｂ】
2021505190.tif 000031
【図７Ｃ】
2021505190.tif 000032
【図８】
2021505190.tif 000033
【図９−１】
2021505190.tif 000034
【図９−２】
2021505190.tif 000035
【図１０Ａ−Ｂ】
2021505190.tif 000036
【図１０Ｃ−Ｄ】
2021505190.tif 000037
【図１１Ａ】
2021505190.tif 000038
【図１１Ｂ】
2021505190.tif 000039
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月19日(2020.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021505190000001.app
【国際調査報告】
2021505190.tif 000040
2021505190.tif 000041
2021505190.tif 000042