(57)【要約】  本開示は、ジカウイルスワクチン及びジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株、非ヒト細胞適応ジカウイルスなど）由来の１つ以上の抗原を有する免疫原性組成物、ならびにその製造方法、製剤方法、試験方法及び使用方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物であって、前記ジカウイルスが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含む、前記ワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異が、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）に存在する、請求項１に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１つの適応変異が、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置に起こる、請求項２に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つの適応変異が、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異である、請求項３に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つの適応変異が、前記少なくとも１つの適応変異を欠いたジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を高める、請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１つの適応変異が、前記少なくとも１つの適応変異を欠いたジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増強する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項７】
前記ジカウイルスが、エンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）において変異を含まない、請求項１〜６のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項８】
前記非ヒト細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項９】
前記非ヒト細胞がサル細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記サル細胞がＶｅｒｏ細胞株由来である、請求項９に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記Ｖｅｒｏ細胞株がＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７細胞株である、請求項１０に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記ジカウイルスが、アフリカ系統のウイルス、またはアジア系統のウイルスである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記ジカウイルスがアジア系統のウイルスである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記ジカウイルスが株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である、請求項１３に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、精製抗原ワクチンもしくは免疫原性組成物、サブユニットワクチンもしくは免疫原性組成物、不活化全ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物、または弱毒化ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、不活化全ウイルスワクチンまたは免疫原性組成物である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記ウイルスが化学的に不活化されていた、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記ウイルスが、界面活性剤、ホルマリン、過酸化水素、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、及びソラレンのうちの１つ以上によって化学的に不活化されていた、請求項１７に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記ウイルスが、ホルマリンによって化学的に不活化されていた、請求項１７に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項２０】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記アジュバントが、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）、合成脂質Ａ、脂質Ａ模倣物または類似体、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロソーム、コークレート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）からなる群から選択される、請求項２０に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項２２】
前記アジュバントが、アルミニウム塩である、請求項２０または２１に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びアルヒドロゲル８５からなる群から選択される、請求項２２に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項２４】
少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の前記１つ以上の抗原が前記アジュバントに吸着されている、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項２５】
約０．１μｇのジカウイルスまたはＥｎｖ〜約１００μｇのジカウイルスまたはＥｎｖを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項２６】
アジュバント化されていない、請求項２５に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項２７】
前記ジカウイルスが、クローン分離株である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項２８】
前記クローン分離株が、１つ以上の外来性感染体を実質的に含まない、請求項２７に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項２９】
配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を有するジカウイルスを含むワクチン。
【請求項３０】
前記変異が、配列番号１のＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異である、請求項２９に記載のワクチン。
【請求項３１】
前記ジカウイルスが、エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）に変異を含まない、請求項２９または３０に記載のワクチン。
【請求項３２】
前記エンベロープタンパク質をコードする配列が、配列番号２内の対応する配列と同一である、請求項３１に記載のワクチン。
【請求項３３】
前記ジカウイルスが、株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項３４】
株ＰＲＶＡＢＣ５９が、配列番号２によるゲノム配列を含む、請求項３３に記載のワクチン。
【請求項３５】
前記ジカウイルスが、不活化されている、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項３６】
アジュバントをさらに含む、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項３７】
前記アジュバントが、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）、合成脂質Ａ、脂質Ａ模倣物または類似体、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロソーム、コークレート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）からなる群から選択される、請求項３６に記載のワクチン。
【請求項３８】
前記アジュバントが、アルミニウム塩である、請求項３６または３７に記載のワクチン。
【請求項３９】
前記アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びアルヒドロゲル８５からなる群から選択される、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項４０】
ａ）アルミニウム塩アジュバント；及びｂ）精製された不活化全ジカウイルスを含み、前記ジカウイルスが、非ヒト細胞適応変異を含み、前記非ヒト細胞適応変異が、配列番号１の９８位の、または配列番号１の９８位に対応する位置のＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異である、ワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項４１】
ジカウイルス感染症の治療または予防を必要とする対象においてジカウイルス感染症を治療または予防する方法であって、治療有効量の請求項１〜４０のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４２】
免疫応答の誘導を必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、免疫原性量の請求項１〜４０のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４３】
前記対象がヒトである、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象が妊娠している、または妊娠しようとしている、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物の投与が、前記対象において、防御免疫応答を誘導する、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記対象に誘導される前記防御免疫応答が、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を欠くジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与された対応する対象に誘導される防御免疫応答よりも大きい、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物の投与が、前記対象においてジカウイルスに対する中和抗体の生成を誘導する、請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記対象で生成される中和抗体の濃度が、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を欠くジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与された対応する対象で生成される中和抗体の濃度よりも高い、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、皮下投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、鼻腔内投与、頬腔内投与、腹腔内投与、膣内投与、肛門内投与、及び頭蓋内投与からなる群から選択される経路で投与される、請求項４１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、第１の（プライム）投与及び第２の（ブースト）投与として投与される、請求項４１〜４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２の（ブースト）投与が、前記第１の（プライム）投与から２８日後に投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ジカウイルス感染症の治療または予防を必要とする対象におけるジカウイルス感染症を治療または予防することにおける使用のための、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項５３】
免疫応答の誘導を必要とする対象における免疫応答を誘導することにおける使用のための、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項５４】
前記対象がヒトである、請求項５２または５３に記載の使用のためのワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項５５】
前記対象が妊娠している、または妊娠しようとしている、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項５６】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物の投与が、前記対象において、防御免疫応答を誘導する、請求項５２〜５５のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項５７】
前記対象に誘導される前記防御免疫応答が、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を欠くジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与された対応する対象に誘導される防御免疫応答よりも大きい、請求項５６に記載の使用のためのワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項５８】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物の投与が、前記対象においてジカウイルスに対する中和抗体の生成を誘導する、請求項５２〜５７のいずれか１項に記載の使用のためのワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項５９】
前記対象で生成される中和抗体の濃度が、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を欠くジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与された対応する対象で生成される中和抗体の濃度よりも高い、請求項５８に記載の使用のためのワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項６０】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、皮下投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、鼻腔内投与、頬腔内投与、腹腔内投与、膣内投与、肛門内投与、及び頭蓋内投与からなる群から選択される経路で投与される、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の使用のためのワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項６１】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、第１の（プライム）投与及び第２の（ブースト）投与として投与される、請求項５２〜６０のいずれか１項に記載の使用のためのワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項６２】
前記第２の（ブースト）投与が、前記第１の（プライム）投与から２８日後に投与される、請求項６１に記載の使用のためのワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項６３】
ジカウイルス感染症の治療または予防を必要とする対象におけるジカウイルス感染症を治療または予防するための医薬の製造における、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物の使用。
【請求項６４】
免疫応答の誘導を必要とする対象における免疫応答を誘導するための医薬の製造における、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物の使用。
【請求項６５】
前記対象がヒトである、請求項６３または６４に記載の使用。
【請求項６６】
前記対象が妊娠している、または妊娠しようとしている、請求項６３〜６５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６７】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物の投与が、前記対象において、防御免疫応答を誘導する、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６８】
前記対象に誘導される前記防御免疫応答が、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を欠くジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与された対応する対象に誘導される防御免疫応答よりも大きい、請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物の投与が、前記対象においてジカウイルスに対する中和抗体の生成を誘導する、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７０】
前記対象で生成される中和抗体の濃度が、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を欠くジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与された対応する対象で生成される中和抗体の濃度よりも高い、請求項６９に記載の使用。
【請求項７１】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、皮下投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、鼻腔内投与、頬腔内投与、腹腔内投与、膣内投与、肛門内投与、及び頭蓋内投与からなる群から選択される経路で投与される、請求項６３〜７０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７２】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、第１の（プライム）投与及び第２の（ブースト）投与として投与される、請求項６３〜７１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７３】
前記第２の（ブースト）投与が、前記第１の（プライム）投与から２８日後に投与される、請求項７２に記載の使用。
【請求項７４】
ジカウイルス調製物を不活化するための方法であって、
（ａ）前記ウイルス調製物を生成するために使用される１以上の非ヒト細胞から前記ジカウイルス調製物を単離することであって、前記ジカウイルスは、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含む、前記単離することと、
（ｂ）前記ウイルス調製物を有効量のホルマリンで処理することと、
を含む、前記方法。
【請求項７５】
（ｃ）前記ホルマリン処理したウイルス調製物をメタ重亜硫酸ナトリウムで中和することをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ウイルス調製物が、ホルマリン処理の少なくとも５日後、少なくとも７日後、少なくとも９日後、少なくとも１１日後、または少なくとも１４日後に中和される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
（ｄ）前記中和されたウイルス調製物を精製することをさらに含む、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記中和されたウイルス調製物が、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）、マルチモーダルクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、及び陰イオン交換クロマトグラフィーからなる群から選択されるプロセスによって精製される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記ウイルス調製物が、アジュバントと混合される、請求項７４〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記アジュバントが、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）、合成脂質Ａ、脂質Ａ模倣物または類似体、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロソーム、コークレート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）からなる群から選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記アジュバントが、アルミニウム塩である、請求項７９及び８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びアルヒドロゲル８５からなる群から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記ウイルス調製物中の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の１つ以上の抗原が前記アジュバントに吸着されている、請求項７９〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異が、ジカウイルスＮＳ１に存在する、請求項７４〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記少なくとも１つの適応変異が、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置に起こる、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記少なくとも１つの適応変異が、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記少なくとも１つの適応変異が、前記少なくとも１つの適応変異を欠いたジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を高める、請求項７４〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記少なくとも１つの適応変異が、前記少なくとも１つの適応変異を欠いたジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増強する、請求項７４〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記ジカウイルスが、エンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）において変異を含まない、請求項７４〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
ジカウイルス調製物を不活化するための方法であって、
（ａ）１つ以上の非ヒト細胞から前記ジカウイルス調製物を単離することであって、前記細胞が、前記ウイルス調製物を産生するために使用され、前記ジカウイルスが、配列番号１の９８位または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含む、前記単離することと、
（ｂ）前記ウイルス調製物を有効量のホルマリンで処理することと、
を含む、前記方法。
【請求項９１】
前記変異が、配列番号１のＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ジカウイルスが、エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）に変異を含まない、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記エンベロープタンパク質をコードする配列が、配列番号２内の対応する配列と同一である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
（ｃ）前記ホルマリン処理したウイルス調製物をメタ重亜硫酸ナトリウムで中和することをさらに含む、請求項９０〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記ウイルス調製物が、ホルマリン処理の少なくとも５日後、少なくとも７日後、少なくとも９日後、少なくとも１１日後、または少なくとも１４日後に中和される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
（ｄ）前記中和されたウイルス調製物を精製することをさらに含む、請求項９０〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記中和されたウイルス調製物が、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）、マルチモーダルクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、及び陰イオン交換クロマトグラフィーからなる群から選択されるプロセスによって精製される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記ウイルス調製物が、アジュバントと混合される、請求項９０〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記アジュバントが、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）、合成脂質Ａ、脂質Ａ模倣物または類似体、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロソーム、コークレート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）からなる群から選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記アジュバントが、アルミニウム塩である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びアルヒドロゲル８５からなる群から選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ウイルス調製物中の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の１つ以上の抗原が前記アジュバントに吸着されている、請求項９８〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
ジカウイルスを精製する方法であって、
（ａ）ジカウイルスの集団を含む接種物を複数の細胞に接種することと、
（ｂ）前記接種した細胞の１つ以上からプラーク精製によってジカウイルスクローン分離株を取得することと、
を含む、前記方法。
【請求項１０４】
前記細胞が非ヒト細胞である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記細胞が昆虫細胞である、請求項１０３または請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記昆虫細胞が蚊細胞である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１０３または請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
前記哺乳動物細胞がサル細胞である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記サル細胞がＶｅｒｏ細胞株由来のものである、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記Ｖｅｒｏ細胞株がＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７細胞株である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ジカウイルスの集団が不均質である、請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ジカウイルスの集団が、ジカウイルスクローン分離株を含む、請求項１０３〜１１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ジカウイルス臨床分離株が株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ジカウイルスの集団が、細胞培養においてそれまでに１回以上継代されているジカウイルスを含む、請求項１０３〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記接種物がヒト血清を含む、請求項１０３〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記接種物が、１つ以上の外来性感染体を含む、請求項１０３〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ジカウイルスクローン分離株が、前記１つ以上の外来性感染体を実質的に含まない、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記ジカウイルスクローン分離株の１回以上のさらなるプラーク精製をさらに含む、請求項１０３〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記ジカウイルスクローン分離株が、２回以上さらにプラーク精製される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
細胞培養中で前記ジカウイルスクローン分離株を１回以上継代することをさらに含む、請求項１０３〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ジカウイルスクローン分離株が２回以上継代される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記ジカウイルスクローン分離株由来の１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を製剤化することをさらに含む、請求項１０３〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、精製抗原ワクチンもしくは免疫原性組成物、サブユニットワクチンもしくは免疫原性組成物、不活化全ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物、または弱毒化ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物である、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、不活化全ウイルスワクチンまたは免疫原性組成物である、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ジカウイルスクローン分離株が、化学的に不活化されていた、請求項１０３〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ジカウイルスクローン分離株が、界面活性剤、ホルマリン、過酸化水素、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、及びソラレンのうちの１つ以上によって化学的に不活化されていた、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ジカウイルスクローン分離株が、ホルマリンによって化学的に不活化されていた、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物をアジュバントと混合することをさらに含む、請求項１２２〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記アジュバントが、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）、合成脂質Ａ、脂質Ａ模倣物または類似体、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロソーム、コークレート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）からなる群から選択される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記アジュバントが、アルミニウム塩である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
前記アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びアルヒドロゲル８５からなる群から選択される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３２】
少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の前記１つ以上の抗原が前記アジュバントに吸着されている、請求項１２８〜１３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、約０．１μｇのジカウイルスまたはＥｎｖ〜約１００μｇのジカウイルスまたはＥｎｖを含む、請求項１２２〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、アジュバント化されていない、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記ジカウイルスクローン分離株が、均質な遺伝的集団である、請求項１０３〜１３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記ジカウイルスクローン分離株が、エンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）において変異を含まない、請求項１０３〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記ジカウイルスクローン分離株が、少なくとも１つの変異を含む、請求項１０３〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記少なくとも１つの変異が、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）に存在する、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記少なくとも１つの変異が、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置に起こる、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記少なくとも１つの変異が、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記少なくとも１つの変異が、エンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）に存在しない、請求項１３７〜１４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記少なくとも１つの変異が、前記少なくとも１つの変異を欠いたジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を高める、請求項１３７〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記少なくとも１つの変異が、前記少なくとも１つの変異を欠いたジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増強する、請求項１３７〜１４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４４】
ワクチンまたは免疫原性組成物の調製のためのジカウイルスを精製する方法であって、
（ａ）ジカウイルスを含む試料を深層濾過に通して前記ジカウイルスを含む溶出液を生成するステップ、
（ｂ）クロスフロー濾過（ＣＦＦ）によって、ジカウイルスを含む試料を緩衝液交換及び／または希釈して前記ジカウイルスを含む保持液を生成するステップ、
（ｃ）ジカウイルスを含む試料をイオン交換膜に結合して前記ジカウイルスを含む結合画分を生成し、前記結合画分を前記イオン交換膜から溶出するステップ、
（ｄ）ジカウイルスを含む試料を、有効量の化学的不活化剤で処理するステップ、
（ｅ）化学的に不活化されたジカウイルスを含む試料を、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップ、及び
（ｆ）クロスフロー濾過（ＣＦＦ）によって、化学的に不活化されたジカウイルスを含む馴化試料を精製するステップ、
の群から選択される、１つ以上のステップを含む、前記方法。
【請求項１４５】
（ａ）ジカウイルスを含む試料を深層濾過に通して前記ジカウイルスを含む溶出液を生成するステップ、
（ｂ）クロスフロー濾過（ＣＦＦ）によって、ジカウイルスを含む試料を緩衝液交換及び／または希釈して前記ジカウイルスを含む保持液を生成するステップ、
（ｃ）ジカウイルスを含む試料をイオン交換膜に結合して前記ジカウイルスを含む結合画分を生成し、前記結合画分を前記イオン交換膜から溶出するステップ、
（ｄ）ジカウイルスを含む試料を、有効量の化学的不活化剤で処理するステップ、
（ｅ）化学的に不活化されたジカウイルスを含む試料を、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップ、及び
（ｆ）クロスフロー濾過（ＣＦＦ）によって、化学的に不活化されたジカウイルスを含む馴化試料を精製するステップ、
を含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
（ａ）ジカウイルスを含む試料を第１の深層濾過に通して、前記ジカウイルスを含む第１の溶出液を生成するステップ、
（ｂ）前記第１の溶出液を、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）によって緩衝液交換及び／または希釈して、前記ジカウイルスを含む第１の保持液を精製するステップ、
（ｃ）前記第１の保持液をイオン交換膜に結合して、前記ジカウイルスを含む第１の結合画分を生成し、前記第１の結合画分を前記イオン交換膜から溶出して、前記ジカウイルスを含む第２の溶出液を生成するステップ、
（ｄ）前記第２の溶出液を第２の深層濾過に通して、前記ジカウイルスを含む第２の保持液を生成するステップ、
（ｅ）前記第２の保持液を有効量の化学的不活化剤で処理するステップ、
（ｆ）処理された前記第２の保持液をメタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップ、及び
（ｇ）前記中和された第２の保持液をクロスフロー濾過（ＣＦＦ）により精製するステップ、
を含む、請求項１４４または請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記イオン交換膜が、陰イオン交換膜である、請求項１４５〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４８】
前記陰イオン交換膜が、第四級アンモニウムリガンドを含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
ステップ（ｃ）の前記結合画分が、各ステップが漸増塩濃度を含む複数のステップで溶出される、請求項１４５〜１４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５０】
前記塩が塩化ナトリウムである、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
塩濃度を、２５０ｍＭから７５０ｍＭまで上昇させる、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記化学的不活化剤が、界面活性剤、ホルマリン、過酸化水素、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、及びソラレンの１つ以上である、請求項１４５〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記化学的不活化剤が、ホルマリンである、請求項１４５〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５４】
少なくとも５日間、少なくとも７日間、少なくとも９日間、少なくとも１１日間、または少なくとも１４日間、前記中和が生ずる、請求項１４５〜１５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５５】
前記ジカウイルスが、請求項１０３〜１４３のいずれかによって産生されるジカウイルスクローン分離株である、請求項１４５〜１５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５６】
プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株由来の１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１５７】
前記プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、ジカウイルス集団を含む接種物と接触した細胞からプラーク精製されていた、請求項１５６に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１５８】
前記細胞が非ヒト細胞である、請求項１５７に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１５９】
前記細胞が昆虫細胞である、請求項１５７または請求項１５８に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１６０】
前記昆虫細胞が蚊の細胞である、請求項１５９に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１６１】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１５７または請求項１５８に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１６２】
前記哺乳動物細胞がサル細胞である、請求項１６１に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１６３】
前記サル細胞がＶｅｒｏ細胞株由来である、請求項１６２に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１６４】
前記Ｖｅｒｏ細胞株がＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７細胞株である、請求項１６３に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１６５】
前記ジカウイルスの集団が不均質であった、請求項１５７〜１６４のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１６６】
前記ジカウイルスの集団がジカウイルス臨床分離株を含んでいた、請求項１５７〜１６５のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１６７】
前記ジカウイルス臨床分離株が株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である、請求項１６６に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１６８】
前記ジカウイルスの集団が、細胞培養においてそれまでに１回以上継代されているジカウイルスを含んでいた、請求項１５７〜１６５のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１６９】
前記接種物がヒト血清を含んでいた、請求項１５７〜１６８のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１７０】
前記接種物が、１つ以上の外来性感染体を含んでいた、請求項１５７〜１６９のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１７１】
前記プラーク精製されたジカウイルスクローン分離株が、前記１つ以上の外来性感染体を実質的に含まない、請求項１７０に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１７２】
前記プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株が、野生型ジカウイルスと比べて修飾されている、請求項１５７〜１７１のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１７３】
前記プラーク精製されたジカウイルスクローン分離株が、均質な遺伝的集団である、請求項１５７〜１７２のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１７４】
前記プラーク精製されたジカウイルスクローン分離株が、エンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）において変異を含まない、請求項１５７〜１７３のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１７５】
前記プラーク精製されたジカウイルスクローン分離株が、少なくとも１つの変異を含む、請求項１５７〜１７３のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１７６】
前記少なくとも１つの変異が、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）に存在する、請求項１７５に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１７７】
前記少なくとも１つの変異が、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置に起こる、請求項１７６に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１７８】
前記少なくとも１つの変異が、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異である、請求項１７７に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１７９】
前記少なくとも１つの変異が、エンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）に存在しない、請求項１７５〜１７８のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１８０】
前記少なくとも１つの変異が、前記少なくとも１つの変異を欠いたジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を高める、請求項１７４〜１７８のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１８１】
前記少なくとも１つの変異が、前記少なくとも１つの変異を欠いたジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増強する、請求項１７４〜１８０のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１８２】
前記プラーク精製されたジカウイルスクローン分離株が、アフリカ系統のウイルス、またはアジア系統のウイルスである、請求項１５７〜１８１のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１８３】
前記プラーク精製されたジカウイルスクローン分離株が、アジア系統のウイルスである、請求項１５７〜１８２のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１８４】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、精製抗原ワクチンもしくは免疫原性組成物、サブユニットワクチンもしくは免疫原性組成物、不活化全ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物、または弱毒化ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物である、請求項１５７〜１８３のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１８５】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、不活化全ウイルスワクチンまたは免疫原性組成物である、請求項１５７〜１８３のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１８６】
前記プラーク精製されたジカウイルスクローン分離株が、化学的に不活化されていた、請求項１５７〜１８５のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１８７】
前記プラーク精製されたジカウイルスが、界面活性剤、ホルマリン、過酸化水素、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、及びソラレンのうちの１つ以上によって化学的に不活化されていた、請求項１８６に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１８８】
前記プラーク精製されたジカウイルスクローン分離株が、ホルマリンによって化学的に不活化されていた、請求項１８６に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１８９】
アジュバントをさらに含む、請求項１５７〜１８８のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１９０】
前記アジュバントが、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）、合成脂質Ａ、脂質Ａ模倣物または類似体、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロソーム、コークレート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）からなる群から選択される、請求項１８９に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１９１】
前記アジュバントが、アルミニウム塩である、請求項１８９に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１９２】
前記アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びアルヒドロゲル８５からなる群から選択される、請求項１８９に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１９３】
少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の前記１つ以上の抗原が前記アジュバントに吸着されている、請求項１８９〜１９２のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１９４】
約０．１μｇのジカウイルスまたはＥｎｖ〜約１００μｇのジカウイルスまたはＥｎｖを含む、請求項１５７〜１８８のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１９５】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、アジュバント化されていない、請求項１９４に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、保健福祉省準備と対応のための次官補事務局バイオメディカル先端研究開発局（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｓｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｅｃｒｅｔａｒｙ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）との契約番号ＨＨＳＯ１００２０１６０００１５Ｃに基づく政府の支援を受けて行われたものである。本発明は、保健福祉省の機関である疾病管理予防センターとの共同研究開発協定の実施により作成された。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本開示は、ジカウイルスワクチン及びジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株、非ヒト細胞適応ジカウイルスなど）由来の１つ以上の抗原を有する免疫原性組成物、ならびにその製造方法、製剤方法、試験方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ジカウイルスは、他の蚊媒介ウイルス（黄熱病、デング熱、西ナイル熱、日本脳炎ウイルスなど）と共にフラビウイルス科に分類されるフラビウイルスであり、２０１３年にブラジルに持ち込まれて以来、急速に拡大し、半球規模で流行している。ウイルスは、米国の領土を含む、中央及び北アメリカ大陸に到達し、結果として現在、米国大陸を脅かしている。実際、ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９は、２０１５年にプエルトリコに旅行した人からの血清から単離した。この株のゲノムは、少なくとも３回（Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｍｅｒｇ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ２０１６  Ｍａｙ；２２（５）：９３３−５及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＵ５０１２１５．１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＸ０８７１０１．３；ならびにＹｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｕｎｃ．  ２０１６  Ａｕｇ  １８；４（４）及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＮＫ５７８９７．１を参照されたい）、シークエンシングされている。
【０００４】
１９４７年にウガンダで最初に単離されたウイルスは、１９５２年に初めてヒトの病気と結びつき、アフリカや東南アジアで軽度の自己限定熱性疾患の原因として散発的に認識されてきた（Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．  １３０：６９−８０；Ｆａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３５２（６２８３）：３４５−３４９）。しかしながら、２００７年に北太平洋のヤップ島で大流行が発生し、その後、太平洋上の島から島へと拡散し、２０１３年から２０１４年にかけてフランス領ポリネシアでの大規模な大流行をもたらし、その後、ニューカレドニア、クック諸島、そして最終的にはイースター島へと拡大していった。アジア系統のウイルスが、その後、未解明の経路で西半球に伝播した（Ｆａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３５２（６２８３）：３４５−３４９）。このウイルスは、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａ．  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、ならびに潜在的にＡ．  ｈｅｎｓｉｌｌｉ、及びＡ．  ｐｏｌｙｎｉｅｓｅｉｎｓｉｓによって人獣共通感染する可能性がある（Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．  １３０：６９−８０）。さらに、ウイルスを伝播するための他の媒介物が存在し得ると考えられ、ウイルスは、輸血、経胎盤性に、及び／または性感染によって伝播する可能性がある。
【０００５】
２０１５年後半、ジカウイルス感染が広範囲に起きている地域で胎児の異常（例えば、小頭症）やギランバレー症候群（ＧＢＳ）が大幅に増加したことで、ジカウイルスは当初考えられていたよりもはるかに病原性が高いかもしれないとの警戒感が高まり、世界保健機関（ＷＨＯ）は国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態（ＰＨＥＩＣ）を宣言した（Ｈｅｙｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｌａｎｃｅｔ  ３８７（１００２０）：７１９−２１）。ジカウイルスは公衆衛生上の大きな脅威を与えているが、ＦＤＡで承認されたワクチンや治療法は現在存在せず、ジカウイルスを制御する唯一の予防手段は蚊の個体数の管理を含む。
【０００６】
潜在的なワクチンの開発のために組換えジカウイルスを特性評価する最近の努力において、ウイルスエンベロープタンパク質中の３３０位における変異を有する非ヒト細胞適応ジカウイルスが同定された（Ｗｅｇｅｒ−Ｌｕｃａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９１（１）：１−１０）。本研究の著者らは、ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９の全長感染性ｃＤＮＡクローンがクローニング中に増幅されるときに遺伝的に不安定であることを発見し、観察された不安定性に対処するためにウイルスゲノムを分割することを選択し、２プラスミド系を開発して適用した。しかしながら、ジカワクチン開発のための２プラスミド系はあまり好ましくない。
【０００７】
発明の概要
したがって、２ベクター系を必要としない遺伝的に安定したジカウイルスを利用する、ジカウイルス感染を治療及び／または予防するためのワクチン及び免疫原性組成物を開発する必要性が存在する。上記及び他のニーズを満たすために、本開示は、少なくとも部分的には、ワクチン生産のための単一のウイルス／ウイルスゲノムシステムの使用を可能にする、非構造タンパク質１（野生型エンベロープタンパク質を有する）における適応を有する遺伝的に安定な非ヒト細胞適応ジカウイルスを対象とする。本開示はまた、少なくとも部分的には、遺伝的に均質であり、及び／または１つ以上の外来性感染体から精製されたジカウイルスクローン分離株をも対象とする。したがって、本開示は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異（例えば、ジカウイルス非構造タンパク質１の変異）を有するジカウイルス及び／またはジカウイルスクローン分離株由来の１つ以上のジカウイルス抗原（例えば、不活化ジカウイルス全体からの１つ以上の抗原）を含む、ジカウイルス感染症（例えば、ヒトにおける）の治療及び／または予防に有用なワクチン及び免疫原性組成物を提供する。
【０００８】
本開示は、非ヒト細胞適応ジカウイルスの別個に由来するクローンウイルス集団由来の１つ以上の抗原を含む高用量と低用量ワクチンの両方が、強力な免疫応答を誘導し、ジカウイルス感染症からの顕著な保護を提供することができたという驚くべき知見に少なくとも部分的に基づいている（以下の実施例２を参照されたい）。ジカウイルス株のクローン単離により、１）汚染物質（例えば、親株と共精製される可能性のある外来性感染体）からのウイルスの精製の成功、及び２）遺伝的に均質なウイルス集団の生成がもたらされる。さらに、本開示は、タンパク質ＮＳ１の適応変異を有するクローン単離されたジカウイルスが、ベロ細胞において高い力価まで良好かつ予測可能に増殖し、驚くべきことに、ウイルスエンベロープタンパク質における検出可能な変異を伴わずに、遺伝的に安定で／遺伝的に均質であったという知見に少なくとも部分的に基づいている（以下の実施例１及び２を参照されたい）。ジカウイルス非構造タンパク質１の類似の変異が、ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９の公開された３つのうち１つの配列のゲノム配列解析において観察できるが（Ｙｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｕｎｃ．  ２０１６  Ａｕｇ  １８；４（４））、この参考文献は、ＮＳ１における変異がウイルスの安定性を改善する可能性があることを教示または示唆せず、変異を有するウイルスが、ジカウイルスに対する有効なワクチンの開発に使用される可能性があることを教示または示唆せず、そのようなワクチンが、低用量と高用量の両方で使用されるとき、強固な免疫応答を誘導し、ジカウイルス感染症からの顕著な予防を提供するのに有効である可能性があることを教示または示唆していない。したがって、理論に拘束されることを望まないが、本開示の発明者らは、タンパク質ＮＳ１における適応変異が、ジカウイルス内の遺伝的安定性を増強するらしく、結果として、増加／増強された複製効率が得られると判定した。さらに、ＮＳ１タンパク質に適応変異を持つジカ株は、それ以上の変異をもたらすことなく、複数回継代することができた。このような安定したジカウイルス株は、マスターウイルスシード（ＭＶＳ）、またはＭＶＳに由来する後続のシードとして、ワクチン生産及び製造のために有利であり、これは、マスターウイルスシードが望ましくない変異を発生させるリスクが低減されるからである。さらに、理論に拘束されることを望まないが、本開示のジカ株のタンパク質ＮＳ１における適応変異はまた、ジカウイルス株のエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）内の変異のような望ましくない変異の発生を減少させるか、またはそうでなければ抑制することができる。
【０００９】
したがって、本開示の特定の態様は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含む、ジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物に関する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異は、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）に存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの適応変異は、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置で起こる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの適応変異がＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異である。
【００１０】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、少なくとも１つの適応変異は、少なくとも１つの適応変異を欠いたジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を高める。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、少なくとも１つの適応変異は、少なくとも１つの適応変異を欠いたジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増強する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ジカウイルスは、エンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）において変異を含まない。
【００１１】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、非ヒト細胞は哺乳動物細胞である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、非ヒト細胞はサル細胞である。いくつかの実施形態では、サル細胞はＶｅｒｏ細胞株由来のものである。いくつかの実施形態では、Ｖｅｒｏ細胞株はＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７細胞株である。
【００１２】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ジカウイルスはアフリカ系統のウイルス、またはアジア系統のウイルスである。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、アジア系統のウイルスである。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。
【００１３】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物が、精製抗原ワクチンもしくは免疫原性組成物、サブユニットワクチンもしくは免疫原性組成物、不活化全ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物、または弱毒化ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、不活化全ウイルスワクチンまたは免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、精製された不活化全ジカウイルスを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含む精製された不活化全ジカウイルスを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製された不活化全ジカウイルスを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製された不活化全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製された不活化全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含む株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の９８位のＴｒｐ９８Ｇｌｙにおいて株ＰＲＶＡＢＣ５９とは異なる精製された不活化全ジカウイルスを含む。
【００１４】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ウイルスは化学的に不活化されていた。いくつかの実施形態では、ウイルスは、界面活性剤、ホルマリン、過酸化水素、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、及びソラレンのうちの１つ以上によって化学的に不活化されていた。いくつかの実施形態では、ウイルスはホルマリンによって化学的に不活化されていた。
【００１５】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）、合成脂質Ａ、脂質Ａ模倣物または類似体、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロソーム、コークレート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び／または不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）から選択される。いくつかの実施形態では、アジュバントはアルミニウム塩である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びアルヒドロゲル８５からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の１つ以上の抗原がアジュバントに吸着されている。
【００１６】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、低用量ワクチンまたは免疫原性組成物（例えば、約１μｇ〜約５μｇの抗原を含む）である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、高用量ワクチンまたは免疫原性組成物（例えば、約１０μｇの抗原を含む）である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、約０．１μｇ〜約２５μｇの１つ以上の抗原を含む。特定のそのような実施形態では、抗原は、本明細書に記載されているような、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置に、トリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスのような、精製された不活化全ウイルスである。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製された不活化全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは株ＰＲＶＡＢＣ５９に由来する。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製された不活化全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含む株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、約０．１μｇのジカウイルスまたはＥｎｖ〜約１００μｇのジカウイルスまたはＥｎｖを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、アジュバント化されていない。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ジカウイルスはクローン分離株である。いくつかの実施形態では、クローン分離株は、１つ以上の外来性感染体を実質的に含まない（例えば、親株と共精製され得る１つ以上の外来性感染体を含まない）。
【００１７】
本開示の他の態様は、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置に、変異を有するジカウイルスを含むワクチンに関する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製された不活化全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製された不活化全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含む株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株である。
【００１８】
本開示の他の態様は、ワクチンまたは免疫原性組成物であって、ａ）アルミニウム塩アジュバント；及びｂ）精製された不活化全ジカウイルスを含み、ジカウイルスが、非ヒト細胞適応変異を含み、非ヒト細胞適応変が、配列番号１の９８位の、または配列番号１の９８位に対応する位置のＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異である、ワクチンまたは免疫原性組成物に関する。
【００１９】
本開示の他の態様は、ジカウイルス感染症の治療または予防を必要とする対象においてジカウイルス感染症を治療または予防する方法であって、治療有効量の本明細書に記載のワクチンまたは免疫原性組成物のいずれかを対象に投与することを含む、方法に関する。
【００２０】
本開示の他の態様は、免疫応答の誘導を必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、免疫原性量の本明細書に記載のワクチンまたは免疫原性組成物のいずれかを対象に投与することを含む、方法に関する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象が妊娠している、または妊娠しようとしている。
【００２１】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、対象において防御免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態では、対象に誘導される防御免疫応答は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を欠くジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与された対応する対象に誘導される防御免疫応答よりも大きい。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、対象においてジカウイルスに対する中和抗体の生成を誘導する。いくつかの実施形態では、対象で生成される中和抗体の濃度は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を欠くジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与された対応する対象で生成される中和抗体の濃度よりも高い。
【００２２】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、皮下投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、鼻腔内投与、頬腔内投与、腹腔内投与、膣内投与、肛門内投与、及び／または頭蓋内投与から選択される経路で投与される。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は１回以上投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、第１の（プライム）投与及び第２の（ブースター）投与として投与される。いくつかの実施形態では、第２の（ブースト）投与は、第１の（プライム）投与から少なくとも２８日後に投与される。
【００２３】
本開示の他の態様は、（ａ）１つの以上の非ヒト細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、この細胞がウイルス調製物を生成するために使用され、本ジカウイルスが少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含む、単離することと、（ｂ）ウイルス調製物を有効量のホルマリンで処理することと、を含む、ジカウイルス調製物を不活化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、（ｃ）ホルマリン処理済みウイルス調製物をメタ重亜硫酸ナトリウムで中和することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス調製物は、ホルマリン処理後少なくとも５日目、少なくとも７日目、少なくとも９日目、少なくとも１１日目、または少なくとも１４日目に中和される。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、（ｄ）中和されたウイルス調製物を精製することを含む。いくつかの実施形態では、中和されたウイルス調製物は、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）、マルチモーダルクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、及び／または陰イオン交換クロマトグラフィーから選択されるプロセスによって、精製される。
【００２４】
本開示の他の態様は、（ａ）１つ以上の非ヒト細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、この細胞が、ウイルス調製物を産生するために使用され、本ジカウイルスが、配列番号１の９８位または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含む、単離することと、（ｂ）ウイルス調製物を有効量のホルマリンで処理することと、を含む、ジカウイルス調製物を不活化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、（ｃ）ホルマリン処理済みウイルス調製物をメタ重亜硫酸ナトリウムで中和することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス調製物は、ホルマリン処理後少なくとも５日目、少なくとも７日目、少なくとも９日目、少なくとも１１日目、または少なくとも１４日目に中和される。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、（ｄ）中和されたウイルス調製物を精製することを含む。いくつかの実施形態では、中和されたウイルス調製物は、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）、マルチモーダルクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、及び／または陰イオン交換クロマトグラフィーから選択されるプロセスによって、精製される。
【００２５】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ウイルス調製物はアジュバントと混合される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）、合成脂質Ａ、脂質Ａ模倣物または類似体、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロソーム、コークレート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び／または不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）から選択される。いくつかの実施形態では、アジュバントはアルミニウム塩である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及び／またはアルヒドロゲル８５から選択される。いくつかの実施形態では、ウイルス調製物中の、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の１つ以上の抗原がアジュバントに吸着されている。
【００２６】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異は、ジカウイルスＮＳ１中に存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの適応変異は、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置に起こる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの適応変異は、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、少なくとも１つの適応変異は、少なくとも１つの適応変異を欠いたジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を高める。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、少なくとも１つの適応変異は、少なくとも１つの適応変異を欠いたジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増強する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ジカウイルスは、エンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）において変異を含まない。
【００２７】
本開示の他の態様は、（ａ）ジカウイルスの集団を含む接種物を複数の細胞に接種するステップと、（ｂ）接種した細胞の１つ以上からプラーク精製によってジカウイルスクローン分離株を取得するステップと、を含む、ジカウイルスを精製する方法に関する。いくつかの実施形態において、細胞は、非ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、蚊細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、サル細胞である。いくつかの実施形態では、サル細胞は、Ｖｅｒｏ細胞株由来である。いくつかの実施形態では、Ｖｅｒｏ細胞株はＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７細胞株である。
【００２８】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ジカウイルスの集団は不均質である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ジカウイルスの集団は、ジカウイルス臨床分離株を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルス臨床分離株は、株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ジカウイルスの集団は、細胞培養においてそれまでに１回以上継代されているジカウイルスを含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、接種物はヒト血清を含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、接種物は１つ以上の外来性感染体を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は、１つ以上の外来性感染体を実質的に含まない。
【００２９】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、方法は、ジカウイルスクローン分離株の１回以上のプラーク精製をさらに含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は、２回以上さらにプラーク精製される。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、方法は、細胞培養中でジカウイルスクローン分離株を１回以上継代することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は２回以上継代される。
【００３０】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、方法は、ジカウイルスクローン分離株由来の１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を製剤化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物が、精製抗原ワクチンもしくは免疫原性組成物、サブユニットワクチンもしくは免疫原性組成物、不活化全ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物、または弱毒化ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、精製された不活化全ウイルスワクチンまたは免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は、化学的に不活化されていた。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は、界面活性剤、ホルマリン、過酸化水素、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、及びソラレンのうちの１つ以上によって化学的に不活化されていた。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株はホルマリンによって化学的に不活化されていた。
【００３１】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、方法は、ワクチンまたは免疫原性組成物をアジュバントと混合することをさらに含む。いくつかの実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）、合成脂質Ａ、脂質Ａ模倣物または類似体、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロソーム、コークレート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）から選択される。いくつかの実施形態では、アジュバントはアルミニウム塩である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びアルヒドロゲル８５から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の１つ以上の抗原がアジュバントに吸着されている。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、約０．１μｇのＥｎｖ〜約１００μｇのＥｎｖを含む。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、アジュバント化されていない。
【００３２】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は、均質な遺伝的集団である。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は、エンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）において変異を含まない。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は、少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）に存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置に起こる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、エンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）に存在しない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、少なくとも１つの変異を欠いたジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を高める。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、少なくとも１つの変異を欠いたジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増強する。
【００３３】
本開示の他の態様は、ワクチンまたは免疫原性組成物の調製のためのジカウイルスを精製する方法に関する。本方法は、（ａ）ジカウイルスを含む試料を深層濾過に通してジカウイルスを含む溶出液を生成するステップ、（ｂ）クロスフロー濾過（ＣＦＦ）によって、ジカウイルスを含む試料を緩衝液交換及び／または希釈してジカウイルスを含む保持液を生成するステップ、（ｃ）ジカウイルスを含む試料をイオン交換膜に結合してジカウイルスを含む結合画分を生成し、結合画分をイオン交換膜から溶出するステップ、（ｄ）ジカウイルスを含む試料を、有効量の化学的不活化剤で処理するステップ、（ｅ）化学的に不活化されたジカウイルスを含む試料を、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップ、及び／または（ｆ）クロスフロー濾過（ＣＦＦ）によって、化学的に不活化されたジカウイルスを含む馴化試料を精製するステップ、から選択される、１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上もしくは６つとも全て）のステップを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）ジカウイルスを含む試料を深層濾過に通してジカウイルスを含む溶出液を生成するステップ、（ｂ）クロスフロー濾過（ＣＦＦ）によって、ジカウイルスを含む試料を緩衝液交換及び／または希釈してジカウイルスを含む保持液を生成するステップ、（ｃ）ジカウイルスを含む試料をイオン交換膜に結合してジカウイルスを含む結合画分を生成し、結合画分をイオン交換膜から溶出するステップ、（ｄ）ジカウイルスを含む試料を、有効量の化学的不活化剤で処理するステップ、（ｅ）化学的に不活化されたジカウイルスを含む試料を、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップ、及び／または（ｆ）クロスフロー濾過（ＣＦＦ）によって、化学的に不活化されたジカウイルスを含む馴化試料を精製するステップ、の全ステップを任意の順序にて含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）ジカウイルスを含む試料を第１の深層濾過に通して、ジカウイルスを含む第１の溶出液を生成するステップと、（ｂ）第１の溶出液を、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）によって、緩衝液交換及び／または希釈して、ジカウイルスを含む第１の保持液を生成するステップと、（ｃ）第１の保持液をイオン交換膜に結合して、ジカウイルスを含む第１の結合画分を生成し、第１の結合画分をイオン交換膜から溶出して、ジカウイルスを含む第２の溶出液を生成するステップと、（ｄ）第２の溶出液を第２の深層濾過に通して、ジカウイルスを含む第２の保持液を生成するステップと、（ｅ）第２の保持液を有効量の化学的不活化剤で処理するステップと、（ｆ）処理された第２の保持液をメタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップと、（ｇ）中和された第２の保持液をクロスフロー濾過（ＣＦＦ）により精製するステップと、を含む。先行する実施形態のいずれかと併用される場合のあるいくつかの実施形態において、イオン交換膜は、陰イオン交換膜である。先行する実施形態のいずれかと併用される場合のあるいくつかの実施形態において、陰イオン交換膜は、第四級アンモニウムリガンドを含む。
【００３４】
先行する実施形態のいずれかと併用される場合のあるいくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の結合画分は、各ステップが漸増塩濃度を含む複数のステップで溶出される。先行する実施形態のいずれかと併用される場合のあるいくつかの実施形態において、塩は塩化ナトリウムである。先行する実施形態のいずれかと併用される場合のあるいくつかの実施形態では、塩濃度を、２５０ｍＭから７５０ｍＭまで上昇させる。先行する実施形態のいずれかと併用される場合のあるいくつかの実施形態において、化学的不活化剤は、界面活性剤、ホルマリン、過酸化水素、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、及びソラレンの１つ以上である。先行する実施形態のいずれかと併用される場合のあるいくつかの実施形態において、化学的不活化剤は、ホルマリンである。先行する実施形態のいずれかと併用される場合のあるいくつかの実施形態では、少なくとも５日間、少なくとも７日間、少なくとも９日間、少なくとも１１日間、または少なくとも１４日間、中和が生ずる。先行する実施形態のいずれかと併用される場合のあるいくつかの実施形態では、ジカウイルスは、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生されるジカウイルスクローン分離株である。
【００３５】
本開示の他の態様は、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株由来の１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物に関する。いくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、ジカウイルス集団を含む接種物と接触した細胞からプラーク精製されていた。いくつかの実施形態では、細胞は非ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、昆虫細胞は蚊細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はサル細胞である。いくつかの実施形態では、サル細胞はＶｅｒｏ細胞株由来のものである。いくつかの実施形態では、Ｖｅｒｏ細胞株はＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７細胞株である。
【００３６】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ジカウイルス集団は不均質であった。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ジカウイルスの集団は、ジカウイルス臨床分離株を含んだ。いくつかの実施形態では、ジカウイルス臨床分離株は、株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ジカウイルスの集団は、細胞培養においてそれまでに１回以上継代されているジカウイルスを含んだ。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、接種物はヒト血清を含んだ。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、接種物は１つ以上の外来性感染体を含んだ。いくつかの実施形態では、プラーク精製されたジカウイルスクローン分離株は、１つ以上の外来性感染体を実質的に含まない。
【００３７】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、野生型ジカウイルスと比べて修飾されている。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、均質な遺伝的集団である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、エンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）において変異を含まない。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）に存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置に起こる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、ジカウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）に存在しない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、少なくとも１つの変異を欠いたジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を高める。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、少なくとも１つの変異を欠いたジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増強する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株はアフリカ系統のウイルス、またはアジア系統のウイルスである。いくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、アジア系統のウイルスである。
【００３８】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物が、精製抗原ワクチンもしくは免疫原性組成物、サブユニットワクチンもしくは免疫原性組成物、不活化全ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物、または弱毒化ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、不活化全ウイルスワクチンまたは免疫原性組成物である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、化学的に不活化されていた。いくつかの実施形態では、プラーク精製されたジカウイルスは、界面活性剤、ホルマリン、過酸化水素、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、及びソラレンのうちの１つ以上によって化学的に不活化されていた。いくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、ホルマリンによって化学的に不活化されていた。
【００３９】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）、合成脂質Ａ、脂質Ａ模倣物または類似体、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロソーム、コークレート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）から選択される。いくつかの実施形態では、アジュバントはアルミニウム塩である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びアルヒドロゲル８５から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の１つ以上の抗原がアジュバントに吸着されている。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることのできるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、約０．１μｇのＥｎｖ〜約１００μｇのＥｎｖを含む。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、アジュバント化されていない。
【００４０】
上述及び本明細書に記載の様々な実施形態の特性の１つ、いくつか、または全てを組み合わせて、本開示の他の実施形態を形成できることを理解されたい。本開示のこれら及び他の態様は、当業者に明らかになるであろう。本開示のこれら及び他の実施形態は、以下の詳細な説明によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】モック感染（上）またはＺＩＫＡＶ株ＰＲＶＡＢＣ５９に感染（下）したＶｅｒｏ細胞単層の明視野顕微鏡像を示す。
【図２】ＴＣＩＤ５０によって決定されるときの、Ｖｅｒｏ細胞単層上でのＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ１の増殖キネティクスを示す。
【図３】ジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ５クローンａ〜ｆの力価アッセイ試験（ＴＣＩＤ５０）を示す。
【図４】Ｖｅｒｏ細胞単層上でのジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６クローンａ〜ｆの増殖の細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す明視野顕微鏡画像を示す。
【図５】ジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６クローンａ〜ｆの力価アッセイ試験（ＴＣＩＤ５０）を示す。
【図６】ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｅ（配列番号８）及びＰＲＶＡＢＣ５９（配列番号９）由来の残基３３０近傍のジカウイルスのエンベロープ糖タンパク質配列を、いくつかの他のフラビウイルス（ＷＮＶ（配列番号１０）；ＪＥＶ（配列番号１１）；ＳＬＥＶ（配列番号１２）；ＹＦＶ（配列番号１３）；ＤＥＮＶ  １  １６００７（配列番号１４）；ＤＥＮＶ  ２  １６６８１（配列番号１５）；ＤＥＮＶ  ３  １６５６２（配列番号１６）；及びＤＥＮＶ  ４  １０３６（配列番号１７））と比較するアミノ酸配列アライメントを示す。
【図７】ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｅ（配列番号１８）及びＰＲＶＡＢＣ５９（配列番号１９）由来の残基９８近傍のＮＳ１タンパク質配列を、いくつかの他のフラビウイルス（ＷＮＶ（配列番号２０）；ＪＥＶ（配列番号２１）；ＳＬＥＶ（配列番号２２）；ＹＦＶ（配列番号２３）；ＤＥＮＶ  １  １６００７（配列番号２４）；ＤＥＮＶ  ２  １６６８１（配列番号２５）；ＤＥＮＶ  ３  １６５６２（配列番号２６）；及びＤＥＮＶ  ４  １０３６（配列番号２７））と比較するアミノ酸配列アライメントを示す。
【図８】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ１ウイルスと比較したＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ウイルスクローンａ〜ｆのプラーク表現型を示す。
【図９】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ１ウイルスと比較したＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ウイルスクローンの平均プラークサイズを示す。
【図１０】無血清増殖条件下でのＶｅｒｏ細胞におけるＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６クローンａ〜ｆの増殖キネティクスを示す。
【図１１】免疫実験のためのＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂ及びＰ６ｅの製剤を調製するために実行されるステップの模式図である。
【図１２Ａ】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂ及びＰ６ｅクローンに由来するワクチン製剤によるＣＤ−１マウスの投与スケジュールを示す。ＰＢＳをプラセボとして使用した。
【図１２Ｂ】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂ及びＰ６ｅクローンに由来するワクチン製剤を用いて、図１２Ａに記載のように免疫化したＣＤ−１マウスの血清ＺＩＫＡＶ中和抗体力価を示す。ＺＩＫＡＶ中和抗体力価は、レポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）中和アッセイによって決定した。実線は群の幾何学的平均を表す。検出限界（１．９３ｌｏｇ１０）は破線で表される。
【図１３Ａ】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂ及びＰ６ｅクローンに由来するワクチン製剤によるＡＧ１２９マウスの投与スケジュールを示す。ＰＢＳをプラセボとして使用した。
【図１３Ｂ】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂ及びＰ６ｅクローンに由来するワクチン製剤を用いて、図１３Ａに記載のように免疫化したＡＧ１２９マウスの血清ＺＩＫＡＶ中和抗体力価を示す。実線は群の幾何学的平均を表す。検出限界（１．３０ｌｏｇ１０）は破線で表される。検出可能な力価を持たない（＜１．３０）動物には、０．５の力価を割り当てた。
【図１４】開始体重のパーセンテージとして表した、ＡＧ１２９試験群の攻撃後の平均体重である。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１５】ＰＦＵ／ｍＬとして報告される、攻撃２日後の個々のＡＧ１２９マウスの血清ウイルス血症を示す。実線は群の平均を表す。検出限界（２．０ｌｏｇ１０）は破線で表される。
【図１６】攻撃後のＡＧ１２９試験群の生存分析を示す。
【図１７】ワクチン接種及び攻撃したＡＧ１２９マウスからのプールされた血清の受動的移入後の攻撃前血清循環ＺＩＫＡＶ中和抗体（Ｎａｂ）価を示す。
【図１８】ジカウイルスで攻撃した受動的移入マウスと対照マウスの平均体重を示す。
【図１９】ＰＦＵ／ｍＬとして報告される、個々のＡＧ１２９マウスの攻撃後３日後の血清ウイルス血症を示す。
【図２０】ジカウイルスで攻撃した受動的移入マウスと対照マウスの生存分析を示す。
【図２１】受動的移入マウスで観察されたＺＩＫＡＶ中和抗体力価とウイルス血症との相関を示す。
【図２２】カプラン・マイヤー生存曲線を用いて、Ｐ６ａ及びＰ６ｅのジカウイルスｐｒｅＭＶＳストックで感染させた後のＡＧ１２９マウスの生存解析を示す。
【図２３】Ｐ６ａとＰ６ｅのジカウイルスｐｒｅＭＶＳストックで感染させた後の本発明時の開始重量のパーセンテージで表した平均体重を示す。破線は参考のために開始時の体重の１００％を表す。
【図２４】ＰＦＵ／ｍＬとして報告される、個々のＡＧ１２９マウスの、Ｐ６ａ及びＰ６ｅのジカウイルスｐｒｅＭＶＳストックで感染後３日後の血清ウイルス血症を示す。破線は、アッセイの検出限界を表す。
【図２５】実施例４の臨床研究デザインの要約を示す。
【図２６】実施例４の対象のＰＲＮＴを使用して決定された幾何平均力価（ＧＭＴ）を示す。
【図２７】実施例４に記載の研究の２９日後（プライム投与後２８日後）及び５７日後（ブースト投与後２８日後）にＰＲＮＴを用いて決定された抗体陽転を達成する対象のパーセンテージを示す。
【図２８】実施例４に記載の研究の２９日後（プライム投与後２８日後）の特定の幾何平均力価（ＰＲＮＴを使用して決定される）を達成する対象のパーセンテージのプロットを示す。
【図２９】実施例４に記載の研究の５７日後（プライム投与後５６日後）の特定の幾何平均力価（ＰＲＮＴを使用して決定される）を達成する対象のパーセンテージのプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
一般的な技術
本明細書で記載または参照される技術及び手順は、一般によく理解されており、当業者によって従来の方法論を使用して慣用的に採用されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （２００１）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  （２００３））；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５）），  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  ｅｄｓ．（１９８８）、及びＡｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｄ．  （１９８７））；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，  ｅｄ．，  １９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｊ．  Ｍ．  Ｗａｌｋｅｒ，  ｅｄ．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８３））；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ  （Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９８））  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），  ｅｄ．，  １９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ｊ．Ｐ．  Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，  ｅｄｓ．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９８））；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  （Ａ．  Ｄｏｙｌｅ，  Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，  ｅｄｓ．，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９３−８））；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  （Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．  Ｃａｌｏｓ，  ｅｄｓ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８７））；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，  （Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  （１９９４））；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｗｉｌｅｙ  （１９９１））；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  １９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａ��ｄ  Ｐ．  Ｔｒａｖｅｒｓ，  （１９９７））；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （Ｐ．  Ｆｉｎｃｈ，  １９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｄ．  Ｃａｔｔｙ．，  ｅｄ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８８−１９８９））；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｐ．  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｄｅａｎ，  ｅｄｓ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  （２０００））；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｅ．  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｌａｎｅ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９９９））；及びＴｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （Ｍ．  Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｄ．  Ｃａｐｒａ，  ｅｄｓ．，  Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  （１９９５））に記載の広く利用されている方法論である。
【００４３】
ジカウイルス
本開示の特定の態様は、非限定的に、精製されたウイルス、不活化ウイルス、弱毒化ウイルス、組換えウイルス、またはサブユニットワクチンのために精製された及び／または組換えウイルスタンパク質を含む、ワクチン及び／または免疫原性組成物において有用であり得る、少なくとも１つのジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株、本明細書に記載の方法によって精製されたジカウイルス、１つ以上の非ヒト細胞適応変異を含むジカウイルスなど）に関する。
【００４４】
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）は、１９４７年にウガンダのジカの森で指標アカゲザルから初めて単離された蚊媒介のフラビウイルスである。それ以来、アフリカ及びアジア、最近ではアメリカ大陸でもヒトからの単離が実施されてきた。ＺＩＫＶは２つ（おそらく３つ）の系統：アフリカ系統（東アフリカ系統と西アフリカ系統に分かれている可能性がある）とアジア系統が存在する。したがって、本開示の適切なジカウイルスの例は、非限定的に、アフリカ系統及び／またはアジア系統のウイルスを含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、アフリカ系統のウイルスである。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、アジア系統のウイルスである。さらに、ジカウイルスのアフリカ系統及びアジア系統の系統内で、複数の株がこれまでに同定されている。例えば、株Ｍｒ  ７６６、ＡｒＤ  ４１５１９、ＩｂＨ  ３０６５６、Ｐ６−７４０、ＥＣ  Ｙａｐ、ＦＳＳ１３０２５、ＡｒＤ  ７１１７、ＡｒＤ  ９９５７、ＡｒＤ  ３０１０１、ＡｒＤ  ３０１５６、ＡｒＤ  ３０３３２、ＨＤ  ７８７８８、ＡｒＤ  １２７７０７、ＡｒＤ  １２７７１０、ＡｒＤ  １２７９８４、ＡｒＤ  １２７９８８、ＡｒＤ  １２７９９４、ＡｒＤ  １２８０００、ＡｒＤ  １３２９１２、１３２９１５、ＡｒＤ  １４１１７０、ＡｒＤ  １４２６２３、ＡｒＤ  １４９９１７、ＡｒＤ  １４９８１０、ＡｒＤ  １４９９３８、ＡｒＤ  １５７９９５、ＡｒＤ  １５８０８４、ＡｒＤ  １６５５２２、ＡｒＤ  １６５５３１、ＡｒＡ  １４６５、ＡｒＡ  ２７１０１、ＡｒＡ  ２７２９０、ＡｒＡ  ２７１０６、ＡｒＡ  ２７０９６、ＡｒＡ  ２７４０７、ＡｒＡ  ２７４３３、ＡｒＡ  ５０６／９６、ＡｒＡ  ９７５−９９、Ａｒａ  ９８２−９９、ＡｒＡ  ９８６−９９、ＡｒＡ  ２７１８、ＡｒＢ  １３６２、Ｎｉｇｅｒｉａ６８、Ｍａｌａｙｓｉａ６６、Ｋｅｄｏｕｇｏｕ８４、Ｓｕｒｉｎａｍｅ、ＭＲ１４２９、ＰＲＶＡＢＣ５９、ＥＣＭＮ２００７、ＤａｋＡｒ４１５２４、Ｈ／ＰＦ／２０１３、Ｒ１０３４５１、１０３３４４、８３７５、ＪＭＢ−１８５、ＺＩＫＶ／Ｈ、ｓａｐｉｅｎｓ／Ｂｒａｚｉｌ／Ｎａｔａｌ／２０１５、ＳＰＨ２０１５、ＺＩＫＶ／Ｈｕ／Ｃｈｉｂａ／Ｓ３６／２０１６、及び／またはＣｕｂａ２０１７を含む、当該技術分野で知られているジカウイルスのうちの任意の１つ以上の適切な株を本開示で使用することができる。いくつかの実施形態では、株ＰＲＶＡＢＣ５９が本開示において使用される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスゲノム配列の例は、以下の配列番号２に示される：
【数１】
2021505648.tif 000003
【数２】
2021505648.tif 000004
【数３】
2021505648.tif 000005
【数４】
2021505648.tif 000006
【数５】
2021505648.tif 000007
【００４６】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＵ５０１２１５．１のゲノム配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。いくつかの実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＵ５０１２１５．１のゲノム配列は、配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号２の配列と、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するゲノム配列を含み得る。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号２の配列によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号２の配列によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。
【００４８】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示のジカウイルスは、本明細書に開示されるワクチン及び／または免疫原性組成物のいずれかで使用し得る。例えば、本開示のジカウイルスは、ジカウイルス感染症の治療または予防を必要とする対象において、ジカウイルス感染症を治療または予防するのに、及び／または、ジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答の誘導を必要とする対象において、ジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導するのに、有用な１つ以上の抗原を提供するのに使用し得る。
【００４９】
ウイルス抗原
いくつかの実施形態では、精製されたウイルス、不活化ウイルス、弱毒化ウイルス、組換えウイルス、または、サブユニットワクチンのための精製された及び／または組換えウイルスタンパク質を非限定的に含む、ワクチン及び／または免疫原性組成物において有用な、本明細書に記載の任意のジカウイルス由来の１つ以上の抗原に関する。いくつかの実施形態では、ワクチン及び／または免疫原性組成物は、精製された不活化全ウイルスを含む。いくつかの実施形態において、このウイルスは、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株である。
【００５０】
本開示の抗原は、免疫応答を誘発することができる任意の物質であってよい。適切な抗原の例には、全ウイルス、弱毒化ウイルス、不活化ウイルス、タンパク質、ポリペプチド（活性タンパク質及びタンパク質内の個々のポリペプチドエピトープを含む）、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、多糖類、多糖類コンジュゲート、多糖類及び他の分子のペプチド及び非ペプチド模倣物、小分子、脂質、糖脂質、及び糖が含まれるが、これには限定されない。
【００５１】
本開示の抗原は、細胞培養中の１つ以上の細胞より生成された（例えば、プラーク精製を介する）任意のジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株）に由来し得る。ジカウイルスを生成するための当該技術分野で公知の任意の適切な細胞を使用することができ、例えば、以下のものを含む：昆虫細胞（例えば、ＣＣＬ−１２５細胞、Ａａｇ−２細胞、ＲＭＬ−１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７−１０細胞、ＡＰ−６１細胞、Ａ．ｔ．  ＧＲＩＰ−１細胞、Ａ．ｔ．  ＧＲＩＰ−２細胞、Ａ．ｔ．  ＧＲＩＰ−３細胞、ＵＭ−ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ−３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ−ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ−ＣＴＲ細胞、ＴＲＡ−１７１細胞、及び、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、Ａｅｄｅｓ  ｐｓｅｕｄｏｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｓ、Ａｅｄｅｓ  ｔｒｉｓｅｒｉａｔｕｓ、Ａｅｄｅｓ  ｖｅｘａｎｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ａｌｂｉｍｕｓ、Ｃｕｌｅｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ、Ｃｕｌｅｘ  ｔｈｅｉｌｅｒｉ、Ｃｕｌｅｘ  ｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ、Ｃｕｌｅｘ  ｂｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ、及び／または  Ｔｏｘｏｒｈｙｎｃｈｉｔｅｓ  ａｍｂｏｉｎｅｎｓｉｓなどの蚊の種に由来するさらなる細胞または細胞株などの蚊の細胞）、ならびに哺乳動物細胞（例えば、ＶＥＲＯ細胞（サルの腎臓由来）、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞（サルの腎臓由来）、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載の寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、非ヒト細胞より生成された（例えば、プラーク精製を介する）ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株）に由来する。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、昆虫細胞より生成された（例えば、プラーク精製を介する）ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株）に由来する。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、蚊の細胞より生成された（例えば、プラーク精製を介する）ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株）に由来する。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、哺乳動物細胞より生成された（例えば、プラーク精製を介する）ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株）に由来する。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、ＶＥＲＯ細胞より生成された（例えば、プラーク精製を介する）ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株）に由来する。プラーク精製を実施することによってウイルスを精製する方法は、当業者に公知である（例えば、下記の実施例１を参照されたい）。
【００５２】
本開示の抗原は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含み得る。適応変異は、ウイルスを特定の細胞株での増殖に適応させることにより生成され得る。例えば、細胞は、ウイルス、ウイルス（例えば、感染性ウイルス、または感染性クローン）から転写されたＲＮＡ、及び／またはウイルス全体から精製されたＲＮＡによってトランスフェクトまたはエレクトロポレーションされ得、ウイルス及び／またはウイルスＲＮＡが複製し、その核酸が変異するように継代され得る。核酸変異は、点変異、挿入変異、または欠失変異であってよい。核酸変異は、非ヒト細胞内でのウイルスの増殖を促進するウイルスタンパク質内のアミノ酸の変化をもたらし得る。適応変異は、細胞培養におけるプラークサイズの変化、増殖キネティクス、温度感受性、薬剤耐性、病原性、及びウイルス収量を含む、ウイルスの表現型の変化を促進し得る。これらの適応変異は、細胞株で培養したウイルスの速度、収量、及び一貫性を向上させることにより、ワクチン製造に有用であり得る。適応的変異は、免疫原性エピトープの構造を変化させることにより、ウイルス抗原の免疫原性を変化させる（例えば、増強または減少させる）ことができる。さらに、適応変異はまた、複数（例えば、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、またはそれ以上）の継代を通じて、ウイルスの遺伝的安定性を増加させ、及び／またはウイルスの望ましくない変異の発生を減少させるか、もしくはさもなくば抑制することができる。
【００５３】
したがって、特定の実施形態では、本開示の抗原は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含む。特定の実施形態では、適応変異は、非ヒト細胞へのウイルス抗原の変異である。いくつかの実施形態では、非ヒト細胞は哺乳動物細胞である。ＶＥＲＯ細胞（サルの腎臓由来）、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞（サルの腎臓由来）、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載の寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の任意の適切な哺乳動物細胞を使用することができる。いくつかの実施形態では、非ヒト細胞はサル細胞である。いくつかの実施形態では、サル細胞はＶｅｒｏ細胞株由来のものである。ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ  ７６（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８７）、またはＶｅｒｏ  Ｃ１００８（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８６）を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の任意の適切なＶｅｒｏ細胞株を使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｖｅｒｏ細胞株はＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７である。
【００５４】
ジカウイルスは、構造ポリペプチドと非構造ポリペプチドの両方をコードするプラスセンス鎖の一本鎖ＲＮＡゲノムを持つ。また、ゲノムはまた、ウイルスの複製に役割を果たす５’末端領域と３’末端領域の両方にノンコーディング配列を含む。これらのウイルスによってコードされる構造的ポリペプチドには、非限定的に、キャプシド（Ｃ）、前駆体膜（ｐｒＭ）、及びエンベロープ（Ｅ）が含まれる。これらのウイルスによってコードされる非構造（ＮＳ）ポリペプチドには、非限定的に、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５が含まれる。
【００５５】
特定の実施形態では、本開示の抗原は、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個など）の非ヒト細胞適応変異を、１つ以上（１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０個全て）の、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５を含むがこれらに限定されない、ウイルス抗原／ポリペプチド内に含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）内に含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個など）の非ヒト細胞適応変異を含み得る、不活化全ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）内に少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含み得る、不活化全ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含み得る、不活化全ウイルスを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異は、ＮＳ１ポリペプチド内に存在する。例示的なジカウイルス株からの野生型の、細胞適応していないＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は以下に示される：
【００５７】
ＤＶＧＣＳＶＤＦＳＫＫＥＴＲＣＧＴＧＶＦＶＹＮＤＶＥＡＷＲＤＲＹＫＹＨＰＤＳＰＲＲＬＡＡＡＶＫＱＡＷＥＤＧＩＣＧＩＳＳＶＳＲＭＥＮＩＭＷＲＳＶＥＧＥＬＮＡＩＬＥＥＮＧＶＱＬＴＶＶＶＧＳＶＫＮＰＭＷＲＧＰＱＲＬＰＶＰＶＮＥＬＰＨＧＷＫＡＷＧＫＳＹＦＶＲＡＡＫＴＮＮＳＦＶＶＤＧＤＴＬＫＥＣＰＬＫＨＲＡＷＮＳＦＬＶＥＤＨＧＦＧＶＦＨＴＳＶＷＬＫＶＲＥＤＹＳＬＥＣＤＰＡＶＩＧＴＡＶＫＧＫＥＡＶＨＳＤＬＧＹＷＩＥＳＥＫＮＤＴＷＲＬＫＲＡＨＬＩＥＭＫＴＣＥＷＰＫＳＨＴＬＷＴＤＧＩＥＥＳＤＬＩＩＰＫＳＬＡＧＰＬＳＨＨＮＴＲＥＧＹＲＴＱＭＫＧＰＷＨＳＥＥＬＥＩＲＦＥＥＣＰＧＴＫＶＨＶＥＥＴＣＧＴＲＧＰＳＬＲＳＴＴＡＳＧＲＶＩＥＥＷＣＣＲＥＣＴＭＰＰＬＳＦＲＡＫＤＧＣＷＹＧＭＥＩＲＰＲＫＥＰＥＳＮＬＶＲＳＭＶＴ（配列番号１）。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１の配列と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＵ５０１２１５．１（配列番号２）の配列によってコードされるアミノ酸配列に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＵ５０１２１５．１の配列によってコードされるアミノ酸配列の７９５〜１１４５位のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９由来であり得る。
【００５９】
「配列同一性」、「配列同一性％」、「同一性％」、「％同一」、または「配列アライメント」とは、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との比較、または第１の核酸配列と第２の核酸配列との比較を意味し、比較に基づくパーセンテージとして計算される。この計算結果は、「パーセント同一」または「パーセントＩＤ」と記載することができる。
【００６０】
概して、配列アライメントは、２つの異なるアプローチのいずれかによって、配列同一性を計算するために使用することができる。第１のアプローチでは、単一の位置でのミスマッチと単一の位置でのギャップの両方が、最終的な配列同一性計算において非同一の位置として計数される。第２のアプローチでは、単一の位置でのミスマッチは最終的な配列同一性計算において非同一の位置として計数されるが、単一の位置でのギャップは最終的な配列同一性計算において非同一の位置として計数されない（無視される）。換言すると、第２のアプローチでは、ギャップは最終的な配列同一性計算において無視される。これら２つのアプローチの違い、すなわち、単一の位置での、ギャップを非同一の位置として計数することとギャップを無視することの違いは、２つの配列間の配列同一性値にばらつきをもたらす可能性がある。
【００６１】
配列の同一性は、アライメントを作成するプログラムによって決定され、最終的な配列同一性計算において、単一の位置のミスマッチと単一の位置のギャップの両方を非同一の位置として計数して同一性を計算する。例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  １９７０，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３）を実装したプログラムＮｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳ）は、デフォルト設定に従い、最初に第１の配列と第２の配列との間のアライメントを作成し、次いでアライメントの長さにわたって同一の位置の数を計数し、次いで同一の残基の数をアライメントの長さで割り、次いでこの数を１００倍して配列同一性％［配列同一性％＝（同一の残基数／アライメントの長さ）×１００）］を生成することにより、配列同一性を計算する。
【００６２】
配列同一性は、第１の配列と第２の配列を全長で示し、両方の配列を全長にわたって示すペアワイズアライメントから計算することができる（「グローバル配列同一性」）。例えば、プログラムＮｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳＳ）は、そのようなアライメントを生成する；配列同一性％＝（同一残基数／アライメントの長さ）×１００）］。
【００６３】
配列同一性は、第１の配列または第２の配列の局所領域のみを示すペアワイズアライメントから計算することができる（「局所同一性」）。例えば、プログラムＢｌａｓｔ（ＮＣＢＩ）は、そのようなアライメントを生成する；配列同一性％＝（同一残基数／アライメントの長さ）×１００）］。
【００６４】
好ましくは、配列アラインメントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９７９）  ４８，  ｐ．  ４４３−４５３）を使用して生成される。好ましくは、プログラム「ＮＥＥＤＬＥ」（Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＯＳＳ））を、プログラムのデフォルトパラメーター（ギャップ開放＝１０．０、ギャップ拡張＝０．５、タンパク質の場合はｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２、ヌクレオチドの場合はｍａｔｒｉｘ＝ＥＤＮＡＦＵＬＬ）で使用する。したがって、配列同一性は、第１の配列と第２の配列を全長で示し、両方の配列を全長にわたって示すアライメントから計算することができる（「グローバル配列同一性」）。例えば：配列同一性％＝（同一残基数／アライメントの長さ）×１００）］。
【００６５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異は、ＮＳ１ポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸位置で生じる。いくつかの実施形態では、変異は、配列番号１の９８位に、またはペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１にアライメントするときの配列番号１の９８位に対応する位置に生じる。いくつかの実施形態では、９８位の変異はトリプトファンからグリシンへの置換である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含む。配列番号１の９８位に対応する位置は、ペアワイズアライメントアルゴリズムを用いてＮＳ−１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１にアライメントすることによって決定することができる。配列番号１の９８位にあるトリプトファン残基に対応するジカウイルス以外のウイルス中のアミノ酸残基は、本願の図７に示されており、これらの残基は四角で囲まれている。いくつかの実施形態では、９８位の変異はトリプトファンからグリシンへの置換である。いくつかの実施形態では、９８位の変異は、配列番号１の９８位におけるトリプトファンからグリシンへの置換である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、ＮＳ１タンパク質内に少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含み、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５ウイルスタンパク質のうちの１つ以上内に少なくとも１つの変異（例えば、少なくとも１つの適応変異）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、ＮＳ１タンパク質内に１つ以上の非ヒト細胞適応変異を含み、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５ウイルスタンパク質のうちの１つ以上内に少なくとも１つの変異（例えば、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異）を含まない。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、ＮＳ１タンパク質内に少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含み、エンベロープタンパク質Ｅ内に少なくとも１つの変異（例えば、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異）を含まない。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）内に少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含み、ジカウイルスエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）内に変異を含まない、不活化全ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含み、エンベロープタンパク質Ｅ内に変異をいっさい含まない。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含み、ジカウイルスエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）内に変異を含まない、不活化全ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、不活化全ウイルスは、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）内に少なくとも１つの変異を含み、エンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２内の対応する配列と同一である。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含み、エンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２内の対応する配列と同一である。いくつかの実施形態では、不活化全ジカウイルスは、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含み、エンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２内の対応する配列と同一である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスなどの本開示の抗原は、少なくとも１つの適応変異を欠いたジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を高める、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスなどの本開示の抗原は、少なくとも１つの適応変異を欠いたジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増強する、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスなどの本開示の抗原は、ジカウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）内の変異のような望ましくない変異の発生を減少させるか、またはそうでなければ抑制することができる、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含む。
【００６９】
本開示の上述の実施形態では、例示的なペアワイズアライメントアルゴリズムは、デフォルトのパラメーターを（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する、ギャップ開放ペナルティ＝１０．０、及びギャップ拡張ペナルティ＝０．５を有する）を使用する、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムである。このアルゴリズムはＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルツールに便利に実装されている。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス由来の本開示の抗原は、本開示のワクチン及び免疫原性組成物のいずれかで使用し得る。例えば、本開示の抗原は、ジカウイルス感染症の治療または予防を必要とする対象において、ジカウイルス感染症を治療または予防するのに、及び／または、ジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答の誘導を必要とする対象において、ジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導するのに、有用であり得る。
【００７１】
ワクチン及び免疫原性組成物の生成
本開示の他の態様は、少なくとも１つのジカウイルス、特に、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの、精製された不活化全ウイルスの形態のジカウイルス由来の本開示の１つ以上の抗原を含む、ジカウイルスワクチン及び免疫原性組成物に関する。いくつかの実施形態において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を有する、精製された不活化全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。いくつかの実施形態において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を有する、精製された不活化全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含む株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株を含む。そのようなワクチン及び免疫原性組成物は、例えば、ジカウイルス感染症の治療または予防を必要とする対象において、ジカウイルス感染症を治療または予防するのに、及び／または、ジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答の誘導を必要とする対象において、ジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導するのに、有用であり得る。本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、精製されたウイルス、不活化ウイルス、弱毒化ウイルス、組換えウイルス、サブユニットワクチンのための、精製された、及び／または組換えウイルスタンパク質を非限定的に含み得る。本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、精製抗原ワクチンもしくは免疫原性組成物、サブユニットワクチンもしくは免疫原性組成物、不活化全ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物、または弱毒化ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物をさらに含み得る。
【００７２】
本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の生成には、増殖されたウイルスより調製される抗原を伴うジカウイルスの増殖が含まれる。細胞培養中の増殖は、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を調製する方法である。ウイルス増殖のための細胞は、懸濁状態で培養してもよいし、接着状態で培養してもよい。
【００７３】
本開示の少なくとも１つのウイルスの増殖に適切な細胞株は、好ましくは哺乳動物起源であり：昆虫細胞（例えば、本明細書に記載の蚊の細胞、ＶＥＲＯ細胞（サルの腎臓由来）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、イヌの腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）またはＭＤＣＫ  ３３０１６、ＷＯ９７／３７００１に記載の寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）、ネコ、及びげっ歯類（例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などのハムスター細胞）を含むが、これには限定されず、例えば、成体、新生児、胎児、及び胚を含む様々な発生段階から取得し得る。特定の実施形態では、細胞は不死化されている（例えば、ＷＯ０１／３８３６２及びＷＯ０２／４０６６５に記載され、ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０の下で寄託されているようなＰＥＲＣ．６細胞）。好ましい実施形態では、哺乳動物細胞が利用され、以下の非限定的な細胞型から選択され得る、及び／またはその１つ以上に由来し得る：線維芽細胞（例えば、真皮、肺）、内皮細胞（例えば、大動脈、冠状動脈、肺、血管、真皮微小血管、臍帯）、肝細胞、ケラチノサイト、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状細胞）、乳腺細胞（例えば、上皮）、平滑筋細胞（例えば、血管、大動脈、冠動脈、動脈、子宮、気管支、頸部、網膜周囲細胞）、メラノサイト、神経細胞（例えばアストロサイト）、前立腺細胞（例えば上皮、平滑筋）、腎細胞（例えば、上皮細胞、中膜細胞、近位尿細管）、骨格細胞（例えば、軟骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞）、筋細胞（例えば、筋芽細胞、骨格細胞、平滑細胞、気管支細胞）、肝細胞、網膜芽細胞、及び間質細胞。ＷＯ９７／３７０００及びＷＯ９７／３７００１は、懸濁液中及び無血清培地中で増殖することができ、ウイルスの産生及び複製に有用である動物細胞及び細胞株の生成を記載している。
【００７４】
上述の細胞型の培養条件は公知であり、種々の刊行物に記載されている。代替的に、培地、サプリメント、及び条件は、例えば、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，  Ｎ．Ｊ．）のカタログ及び追加文献に記載されているように、商業的に購入することができる。
【００７５】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用される細胞は、無血清及び／または無タンパク質の培地中で培養される。培地は、本開示の文脈では、ヒトまたは動物起源の血清からの添加物を含まない無血清培地を指す。無タンパク質とは、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物、及び非血清タンパク質を排除して細胞を増殖させる培養を意味するが、必要に応じて、トリプシン及びウイルスの増殖に必要とされることがある他のプロテアーゼなどのタンパク質を含むことができる。このような培養で増殖する細胞には、タンパク質そのものが自然に含まれる。
【００７６】
無血清培地として知られているものには、Ｉｓｃｏｖｅ培地、Ｕｌｔｒａ−ＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、またはＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が含まれる。通常の血清含有培地には、Ｅａｇｌｅの基本培地（ＢＭＥ）または最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １３０，  ４３２  （１９５９））、またはＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭまたはＥＤＭ）が含まれ、通常１０％までのウシ胎仔血清または同様の添加物と共に使用される。必要に応じて、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １３０，  ４３２  （１９５９））またはＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭまたはＥＤＭ）は、血清を含むサプリメントなしで使用され得る。ＰＦ−ＣＨＯ（ＪＨＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のような無タンパク質培地、ＰｒｏＣＨＯ  ４ＣＤＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）またはＳＭＩＦ  ７（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のような既知組成培地、Ｐｒｉｍａｃｔｏｎｅ、Ｐｅｐｔｉｃａｓｅ、もしくはＨｙＰｅｐ．（商標）（全てＱｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）のような分裂促進ペプチド、またはラクタルブミン加水分解物（Ｇｉｂｃｏ及び他のメーカー）はまた、先行技術において十分に知られている。植物加水分解物に基づく培地添加物は、ウイルス、マイコプラズマ、または未知の感染体による汚染を除外することができるという特別な利点を有する。
【００７７】
細胞培養条件（温度、細胞密度、ｐＨ値など）は、本開示に従って採用される細胞株の適合性のために、非常に広い範囲で可変であり、特定のウイルス株の要求性に適合させることができる。
【００７８】
培養細胞内でウイルスを増殖させる方法は、一般に、培養細胞に培養すべき株を接種するステップと、例えばウイルス力価または抗原発現によって決定されるようなウイルス増殖のための所望の期間（例えば、接種後２４時間から１６８時間の間）、感染細胞を培養するステップと、増殖したウイルスを回収するステップとを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、プラーク精製を介して回収される。培養細胞に、１：５００〜１：１、好ましくは１：１００〜１：５のウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０により測定）対細胞の比率でウイルスを接種する。ウイルスは、細胞の懸濁液に添加されるか、または細胞の単層に適用され、ウイルスは、２５℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３８℃で、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、しかし通常は３００分未満の間、細胞上に吸着する。感染した細胞培養（例えば、単層）は、または回収された培養上清のウイルス含有量を増加させるために、凍結融解によって、または酵素作用によって、除去することができる。次いで、回収された液体は、不活化されるか、または冷凍保存される。培養細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは約０．００２〜５、より好ましくは約０．００１〜２の感染多重度（「ＭＯＩ」）で感染し得る。さらにより好ましくは、細胞は約０．０１のＭＯＩで感染する。感染細胞の上清は、感染後３０時間〜６０時間、または感染後３日〜１０日後に回収し得る。特定の好ましい実施形態では、感染細胞の上清は、感染後３〜７日後に回収される。より好ましくは、感染細胞の上清は、感染後３〜５日後に回収される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）は、ウイルスの放出を可能にするために、細胞培養中に添加してもよく、プロテアーゼは、培養中の任意の適切な段階で添加してもよい。代替的に、特定の実施形態では、感染細胞培養の上清を回収し、ウイルスを上清から単離するか、またはさもなくば精製してもよい。
【００７９】
ウイルス接種物及びウイルス培養物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、及び／またはパルボウイルスを含まない（すなわち、検査されており、汚染に対して陰性の結果が与えられている）ものである［ＷＯ２００６／０２７６９８］。
【００８０】
ウイルスが細胞株で増殖した場合、宿主細胞ＤＮＡの任意の発がん活性を最小限に抑えるために、最終的なワクチン中の残留細胞株ＤＮＡの量を最小限に抑えることは標準的な方法である。汚染ＤＮＡは、クロマトグラフィーなどの標準的な精製方法を用いてワクチン調製中に除去することができる。残存する宿主細胞ＤＮＡの除去は、例えばＤＮａｓｅを使用するヌクレアーゼ処理によって強化することができる。参考文献（Ｌｕｎｄｂｌａｄ  （２００１）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１９５−１９７，  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （ＣＤＥＲ）  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （ＣＶＭ）．  Ｍａｙ  ２００１．）に開示されている宿主細胞ＤＮＡ汚染を低減するための便利な方法は、医薬品評価獣医のための研究（ＣＤＥＲ）センター（ＣＶＭ）のための保健社会福祉食品医薬品管理センターの米国務省。Ｍａｙ  ２００１．）は、二段階の処理を含み、第１のものは、ウイルス増殖中に使用され得るＤＮａｓｅ（例えばＢｅｎｚｏｎａｓｅ）を使用し、次いで、ウイルス粒子の破壊中に使用され得るカチオン性界面活性剤（例えばＣＴＡＢ）を使用する。β−プロピオラクトン処理による除去も可能である。一実施形態では、汚染ＤＮＡは、培養上清のベンゾナーゼ処理によって除去される。
【００８１】
抗原の生成
ジカウイルス感染症を治療及び／または予防するための、及び／またはジカウイルスに対する防衛免疫応答などの免疫応答を誘導するための、精製されたウイルス、不活化ウイルス、弱毒化ウイルス、組換えウイルス、サブユニットワクチンのための、精製された、及び／または組換えウイルスタンパク質を非限定的に含むワクチン及び／または免疫原性組成物における使用のための本開示の抗原は、当該技術分野で知られている任意の適切な方法によって、生成されてもよく、さもなくば単離されてもよい。本開示の抗原は、ジカウイルスから生成、由来、精製、及び／またはさもなくば単離された、全ウイルス、弱毒化ウイルス、不活化ウイルス、タンパク質、ポリペプチド（活性タンパク質及びタンパク質内の個々のポリペプチドエピトープを含む）、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、多糖類、多糖類コンジュゲート、多糖類及びその他の分子のペプチド及び非ペプチド模倣物、低分子、脂質、糖脂質、及び糖を含み得るが、これらに限定されない。例えば、適切な抗原は、非限定的に、ジカウイルス由来の、Ｃ、ｐｒＭ、及び／またはＥのような構造ポリペプチド、ならびにＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及び／またはＮＳ５のような非構造ポリペプチドを含み得る。一実施形態では、本開示の抗原は、精製された不活化全ジカウイルスである。
【００８２】
本開示の抗原は、化学的または酵素的に合成されてもよいし、組換え的に生成されてもよいし、天然供給源から単離されてもよいし、これらの組み合わせであってもよい。特定の実施形態では、本開示の抗原は、少なくとも１つの本開示のジカウイルスから、生成、精製、単離、及び／または由来してもよい。本開示の抗原は、精製されていても、部分的に精製されていても、粗抽出物であってもよい。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、「ワクチン及び免疫原性組成物の生成」と題する上述のセクションに記載されるように生成された、不活化ウイルスなどのウイルスである。
【００８３】
特定の実施形態では、１つ以上の本開示の抗原は、非ヒト細胞を培養することによって生成することができる。１つ以上の本開示の抗原を生成するのに適した細胞株は、昆虫細胞（例えば、本明細書に記載の蚊の細胞のうちの任意のもの）を含み得る。１つ以上の本開示の抗原を生成するのに適した細胞株はまた：ＶＥＲＯ細胞（サルの腎臓由来）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、イヌの腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）またはＭＤＣＫ  ３３０１６、ＷＯ９７／３７００１に記載の寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）、ネコ、及びげっ歯類（例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などのハムスター細胞）を含むが、これには限定されない、哺乳動物起源の細胞であり得、例えば、成体、新生児、胎児、及び胚を含む様々な発生段階から取得し得る。特定の実施形態では、細胞は不死化されている（例えば、ＷＯ０１／３８３６２及びＷＯ０２／４０６６５に記載され、ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２９４０の下で寄託されているようなＰＥＲＣ．６細胞）。好ましい実施形態では、哺乳動物細胞が利用され、以下の非限定的な細胞型から選択され得る、及び／またはその１つ以上に由来し得る：線維芽細胞（例えば、真皮、肺）、内皮細胞（例えば、大動脈、冠状動脈、肺、血管、真皮微小血管、臍帯）、肝細胞、ケラチノサイト、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状細胞）、乳腺細胞（例えば、上皮）、平滑筋細胞（例えば、血管、大動脈、冠動脈、動脈、子宮、気管支、頸部、網膜周囲細胞）、メラノサイト、神経細胞（例えばアストロサイト）、前立腺細胞（例えば上皮、平滑筋）、腎細胞（例えば、上皮細胞、中膜細胞、近位尿細管）、骨格細胞（例えば、軟骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞）、筋細胞（例えば、筋芽細胞、骨格細胞、平滑細胞、気管支細胞）、肝細胞、網膜芽細胞、及び間質細胞。ＷＯ９７／３７０００及びＷＯ９７／３７００１は、懸濁液中及び無血清培地中で増殖することができ、ウイルス抗原の産生に有用である動物細胞及び細胞株の生成を記載している。特定の実施形態では、非ヒト細胞は、無血清培地で培養される。
【００８４】
ポリペプチド抗原は、液体クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー、高速タンパク質液体クロマトグラフィーなど）、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動（１次元ゲル電気泳動、２次元ゲル電気泳動を含む）、アフィニティクロマトグラフィー、またはその他の精製技術を含むが、これらに限定されない当該技術分野で知られているタンパク質精製の標準的な方法を使用して天然供給源から単離することができる。多くの実施形態では、抗原は、例えば、約５０％〜約７５％の純度、約７５％〜約８５％の純度、約８５％〜約９０％の純度、約９０％〜約９５％の純度、約９５％〜約９８％の純度、約９８％〜約９９％の純度、または９９％を超える純度の、精製された抗原である。
【００８５】
そのような技術が当業者に知られている固相ペプチド合成技術を使用することができる。Ｊｏｎｅｓ，  Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  （Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ）  （１９９４）を参照されたい。一般に、そのような方法では、ペプチドは、固相結合成長ペプチド鎖への活性化モノマー単位の逐次的付加を通じて生成される。
【００８６】
例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトが適切な宿主細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養で単細胞実体として増殖する真核生物宿主細胞、（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞など）または原核細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養で増殖））に導入され、遺伝子組換え宿主細胞を生成し、適切な培養条件下で、タンパク質が遺伝子組換え宿主細胞によって産生される、よく確立された組換えＤＮＡ技術をポリペプチドの生成に使用することができる。
【００８７】
死滅及び弱毒化されたウイルス免疫原性組成物に加えて、サブユニット免疫原性組成物またはジカウイルスの抗原性成分を動物に提供する他の型の免疫原性組成物を使用することができる。抗原性成分は、タンパク質、糖タンパク質、脂質コンジュゲートタンパク質または糖タンパク質、修飾された脂質部位、または他のウイルス成分であってもよく、これらは、ヒトに注射されるとき、ヒトがジカウイルスに対する防御免疫を生じるように、ヒトの免疫応答を刺激する。サブユニット免疫原性組成物に関して、上述のように哺乳動物細胞でウイルスを培養することができる。細胞培養物をホモジナイズし、細胞培養物ホモジネートを適切なカラム上で、または適切な細孔サイズのフィルターを通過させるか、または細胞培養物ホモジネートの遠心分離によって、免疫原性組成物を単離することができる。
【００８８】
抗原性成分がタンパク質である場合、そのタンパク質をコードする核酸を単離し、その単離された核酸を含む免疫原性組成物を生成することができる。抗原性成分をコードする核酸は、真核生物のプロモーターのシグナル配列の下流でプラスミド上に配置することができる。そのプラスミドは、１つ以上の選択可能マーカーを含むことができ、弱毒化原核生物、例えばサルモネラ属菌、シゲラ属菌、または他の適当な細菌にトランスフェクトされ得る。次いで、この細菌をヒトに投与して、ヒトが抗原性成分に対する防御免疫応答を生成できるようにすることができる。代替的に、抗原性成分をコードする核酸は、１つ以上の選択可能マーカーを有する原核生物プロモーターの下流に配置し得、弱毒化原核生物、例えばサルモネラ属菌、シゲラ属菌、または他の適当な細菌にトランスフェクトされ得る。次いで、目的の抗原に対する免疫応答が望まれる真核生物の対象に細菌を投与することができる。例えば、米国特許第６，５００，４１９号を参照されたい。
【００８９】
サブユニット免疫原性組成物に関して、ジカウイルスのプロテイナーゼ抗原性成分をコードする核酸を、国際特許出願公開番号ＷＯ００／３２０４７（Ｇａｌｅｎ）、及び国際特許出願公開番号ＷＯ０２／０８３８９０（Ｇａｌｅｎ）に記載されているようなプラスミドにクローニングすることができる。次いで、プラスミドを細菌にトランスフェクトし得、細菌は所望の抗原性タンパク質を産生することができる。両方の特許出願に記載されている種々の方法によって、所望の抗原性タンパク質を単離し、精製することができる。
【００９０】
ウイルスの不活化
本開示の特定の態様は、ジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含む、ジカウイルスワクチン及び免疫原性組成物に関する。本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、精製されたウイルス、全ウイルス、組換えウイルス、生弱毒化全ウイルス、または好ましくは不活化全ウイルス、または不活化ウイルスからのサブユニット、ポリペプチド、及び／または抗原を含むことができる。そのようなとき、本開示の特定の実施形態は、少なくとも１つの不活化ジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含む、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物に関する。本開示の特定の実施形態は、精製された不活化全ジカウイルスを含むジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物に関する。本明細書で使用されるとき、「不活化全ジカウイルス」という用語は、有効量のホルマリンでの処理などの不活化方法で処理されたジカウイルスを含むことが意図されている。特に、精製された不活化ジカウイルスは、ジカウイルスが約０．０２％ｗ／ｖの量のホルマリンで２２℃で１４日間処理される方法から得ることができるまたは得ている。不活化されたジカウイルスはもはや、不活化されていないジカウイルスに感染する可能性がある宿主細胞に感染することができない。一実施形態では、不活化ジカウイルスは、もはやＶＥＲＯ細胞に感染して、ＶＥＲＯ細胞に細胞変性効果を及ぼすことができない。「精製ジカウイルス」という用語は、ジカウイルスが下記のような精製プロセスに供されていたことを意味する。精製されたジカウイルスは、精製されていないジカウイルスと比べ、Ｖｅｒｏ細胞タンパク質などの宿主細胞のタンパク質、及びＶｅｒｏ細胞ＤＮＡなどの宿主細胞のＤＮＡを低含量で有する。精製されたジカウイルスの純度は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定できる。精製されたジカウイルスの、サイズ排除クロマトグラフィーにおけるメインピークが、サイズ排除クロマトグラフィーの曲線下の総面積の８５％より大きい、またはサイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下の総面積の９０％より大きい、またはサイズ排除クロマトグラフィーの曲線下の総面積の９５％より大きくあり得る。そのような結果は、「精製された」ジカウイルスとみなされる。したがって、「精製された不活化全ジカウイルス」という用語は、ジカウイルスが約０．０２％ｗ／ｖからの範囲の量のホルマリンで２２℃で複数日間処理され、サイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下の総面積の少なくとも８５％であるメインピークをもたらす方法から得ることができる／得ているジカウイルスを指す。特定の実施形態では、精製された不活化全ジカウイルスは、プラーク精製によって得ている／得ることができるクローン分離株である。
【００９１】
哺乳動物細胞を感染させる能力を破壊するが、ウイルスの二次、三次または四次構造及び免疫原性エピトープを破壊しないようにウイルスを不活化または殺傷する方法は、当該技術分野で公知である。そのような方法は、化学的手段と物理的手段の両方を含む。ウイルスを不活化するための適切な手段は、非限定的に、界面活性剤、ホルマリン（本明細書では「ホルムアルデヒド」とも呼ばれる）、過酸化水素、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、熱、電磁放射、Ｘ線放射、ガンマ線放射、紫外線放射（ＵＶ放射）、ＵＶ−Ａ放射、ＵＶ−Ｂ放射、ＵＶ−Ｃ放射、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、過酸化水素、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の有効量の薬剤で処理することを含む。
【００９２】
本開示の特定の実施形態では、少なくとも１つのウイルスは化学的に不活化される。化学的な不活化のための薬剤及び化学的な不活化の方法は、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのウイルスが、ＢＰＬ、過酸化水素、ホルマリン、またはＢＥＩのうちの１つ以上で化学的に不活化される。少なくとも１つのウイルスがＢＰＬで化学的に不活化される特定の実施形態では、ウイルスは１つ以上の改変を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の改変は、改変された核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、改変された核酸はアルキル化核酸である。他の実施形態では、１つ以上の改変は、改変されたポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、改変されたポリペプチドは、改変された、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リジン、セリン、及びスレオニンのうちの１つ以上を含む改変されたアミノ酸残基を含む。
【００９３】
少なくとも１つのウイルスがホルマリンで化学的に不活化される特定の実施形態では、不活化ウイルスは１つ以上の改変を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の改変は、改変されたポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の改変は、架橋されたポリペプチドを含み得る。少なくとも１つのウイルスがホルマリンで化学的に不活化されるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、ホルマリンをさらに含む。少なくとも１つのウイルスがＢＥＩで化学的に不活化される特定の実施形態では、ウイルスは１つ以上の改変を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の改変は、改変された核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、改変された核酸はアルキル化核酸である。
【００９４】
少なくとも１つのウイルスがホルマリンで化学的に不活化されるいくつかの実施形態では、残余の未反応ホルマリンはメタ重亜硫酸ナトリウムで中和してもよいし、透析して除去してもよいし、及び／または緩衝液を交換して残余の未反応ホルマリンを除去してもよい。いくつかの実施形態では、メタ亜硫酸ナトリウムが過剰に添加されている。いくつかの実施形態では、溶液は、インラインスタティックミキサーなどのミキサーを使用して混合し得、その後、濾過されるか、またはさらに精製されてもよい（例えば、クロスフロー濾過システムを使用する）。
【００９５】
本開示の特定の実施形態は、ジカウイルス調製物を不活化するための方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ウイルス調製物を生成するために使用される１以上の非ヒト細胞からジカウイルス調製物を単離することと、（ｂ）ウイルス調製物を有効量のホルマリンで処理することとを含む。特定の実施形態では、有効量のホルマリンで処理することは、非限定的に、約０．００１％ｖ／ｖ〜約３．０％ｖ／ｖの範囲である量のホルマリンで処理することを含む。例えば、有効量のホルマリンで処理することは、約０．００１％〜約３．０％ｖ／ｖ、約０．００５％〜約２．０％ｖ／ｖ、もしくは約０．０１％〜約１．０％ｖ／ｖの範囲である量、または約０．００１％、約０．００２５％、約０．００５％、約０．００７５％、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．２５％、約１．５％、約１．７５％、約２．０％、約２．２５％、約２．５％、約２．７５％、もしくは約３．０％ｖ／ｖの量のホルマリンで処理することを含んでもよい。
【００９６】
方法の特定の実施形態では、ジカウイルス調製物は、約２℃〜約４２℃の範囲の温度でホルマリンで処理される。例えば、ジカウイルス調製物は、約２℃〜約４２℃、約２℃〜約８℃、約１５℃〜約３７℃、約１７℃〜約２７℃、約２０℃〜約２５℃の範囲の温度、または約２℃、約４℃、約８℃、約１０℃、約１５℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３７℃、もしくは約４２℃の温度でホルマリンで処理され得る。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、室温でホルマリンで処理される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約１日間、ホルマリンで処理される。例えば、ジカウイルス調製物は、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２６日間、少なくとも約２７日間、少なくとも約２８日間、少なくとも約２９日間、少なくとも約３０日間、またはそれ以上、ホルマリンで処理され得る。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約９日間、ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約１１日間、ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約１４日間、ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約２０日間、ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約３０日間、ホルマリンで処理される。
【００９８】
不活化全ジカウイルス調製物は、ジカウイルスが約０．０２％ｗ／ｖの量のホルムアルデヒドで２２℃で１４日間処理される方法から得ることができる／得ているとみなされる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、方法はさらに、未反応のホルマリンを有効量のメタ重亜硫酸ナトリウムで中和することを含む。いくつかの実施形態では、有効量のメタ重亜硫酸ナトリウムは、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲である。例えば、メタ重亜硫酸ナトリウムは、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、もしくは約１ｍＭ〜約１０ｍＭの有効濃度、または約０．０１ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２５ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．７５ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭもしくは約１００ｍＭの濃度で添加することができる。いくつかの実施形態では、ホルマリンは約２ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウムで中和される。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、過酸化水素で処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．１〜３％の範囲、好ましくは０．１〜１％の濃度で過酸化水素で２０℃〜３０℃のいずれかの温度で５〜１２０分処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．０１％の最終濃度で過酸化水素で６０分以下処理される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ウイルス調製物を生成するために使用される１以上の非ヒト細胞からジカウイルス調製物を単離することと、（ｂ）ウイルス調製物を有効量のホルマリンで処理することと、（ｃ）ウイルス調製物を有効量のメタ重亜硫酸ナトリウムで中和することと、（ｄ）中和されたウイルス調製物を精製することと、を含む。クロスフロー濾過（ＣＦＦ）、マルチモーダルクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、及び／または陰イオン交換クロマトグラフィーを使用することを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知のウイルス調製物を精製する任意の方法を用いることができる。いくつかの実施形態では、中和されたウイルス調製物は、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）によって精製される。いくつかの実施形態では、ウイルス調製物は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上の量で高度に精製される。
【０１０２】
少なくとも１つの不活化ジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含む本開示のワクチン及び／または免疫組成物は、ジカウイルス感染症の治療または予防を必要とする対象において、ジカウイルス感染症を治療または予防するのに、及び／または、ジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答の誘導を必要とする対象において、ジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導するのに、有用であり得る。
【０１０３】
アジュバント
本開示の他の態様は、１つ以上のアジュバントと組み合わせて、本明細書に記載の少なくとも１つのジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含む、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物に関する。いくつかの実施形態では、ワクチン及び／または免疫原性組成物は、本明細書に記載の、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの、精製された不活化全ジカウイルスを、１つ以上のアジュバントと組み合わせて含む。いくつかの実施形態では、ワクチン及び／または免疫原性組成物は、本明細書に記載の、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である精製された不活化全ジカウイルスを、１つ以上のアジュバントと組み合わせて含む。いくつかの実施形態では、ワクチン及び／または免疫原性組成物は、本明細書に記載の、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、配列番号２によるゲノム配列を含む株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である精製された不活化全ジカウイルスを、１つ以上のアジュバントと組み合わせて含む。一実施形態では、ワクチン及び／または免疫原性組成物は、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株を、１つ以上のアジュバントと組み合わせて含む。本開示のそのようなアジュバント化されたワクチン及び／または免疫組成物は、ジカウイルス感染症の治療または予防を必要とする対象において、ジカウイルス感染症を治療または予防するのに、及び／または、ジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答の誘導を必要とする対象において、ジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導するのに、有用であり得る。
【０１０４】
ワクチンのアジュバント効果を達成する様々な方法が知られており、本明細書に開示されているジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物と組み合わせて使用することができる。一般的な原理及び方法は、“Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，  １９９５，  Ｄｕｎｃａｎ  Ｅ．  Ｓ．  Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ  （ｅｄ．），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ，  ＩＳＢＮ  ０−４７１−９５１７０−６、及び“Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，  １９９５，  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＩＳＢＮ  ０−３０６−４５２８３−９に詳述されている。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスワクチンまたは免疫原性組成物は、抗原とアジュバントとを含む。抗原は、約１０：１〜約１０１０：１の抗原：アジュバントの、例えば、約１０：１〜約１００：１、約１００：１〜約１０３：１、約１０３：１〜約１０４：１、約１０４：１〜約１０５：１、約１０５：１〜約１０６：１、約１０６：１〜約１０７：１、約１０７：１〜約１０８：１、約１０８：１〜約１０９：１、または約１０９：１〜約１０１０：１の抗原：アジュバントの重量ベースの比で、少なくとも１つのアジュバントとの混合物であってもよい。当業者は、最適な比率を決定するためのアジュバント及び日常的な実験に関する情報を通じて適切な比率を容易に決定することができる。
【０１０６】
例示的なアジュバントは、アルミニウム塩、リン酸カルシウム、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）、ＭＬＡ誘導体、合成脂質Ａ、脂質Ａ模倣物または類似体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション（オイルエマルション）、キトサン、ビタミンＤ、ステアリルまたはオクタデシルチロシン、ビロソーム、コークレート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を含み得るが、これらには限定されない。いくつかの実施形態では、アジュバントはアルミニウム塩である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びアルヒドロゲル８５のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、本開示のアルミニウム塩アジュバントは、本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物の抗原の吸着を増加させることが見出された。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の抗原が、アルミニウム塩アジュバントに吸着する。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、アルミニウム塩アジュバント（例えば、ミョウバン）を一用量当たり約１μｇ〜約５００μｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、約１０μｇ〜約５００μｇ、約１５μｇ〜約５００μｇ、約２５μｇ〜約５００μｇ、約５０μｇ〜約５００μｇ、約７５μｇ〜約５００μｇ、約１００μｇ〜約５００μｇ、約１２５μｇ〜約５００μｇ、約１５０μｇ〜約５００μｇ、約１７５μｇ〜約５００μｇ、約２００μｇ〜約５００μｇ、約２２５μｇ〜約５００μｇ、約２５０μｇ〜約５００μｇ、約２７５μｇ〜約５００μｇ、約３００μｇ〜約５００μｇ、約３２５μｇ〜約５００μｇ、約３５０μｇ〜約５００μｇ、約３７５μｇ〜約５００μｇ、約４００μｇ〜約５００μｇ、約４２５μｇ〜約５００μｇ、約４５０μｇ〜約５００μｇ、約４７５μｇ〜約５００μｇ、約１μｇ〜約４７５μｇ、約５μｇ〜約４７５μｇ、約１０μｇ〜約４７５μｇ、約１５μｇ〜約４７５μｇ、約２５μｇ〜約４７５μｇ、約５０μｇ〜約４７５μｇ、約７５μｇ〜約４７５μｇ、約１００μｇ〜約４７５μｇ、約１２５μｇ〜約４７５μｇ、約１５０μｇ〜約４７５μｇ、約１７５μｇ〜約４７５μｇ、約２００μｇ〜約４７５μｇ、約２２５μｇ〜約４７５μｇ、約２５０μｇ〜約４７５μｇ、約２７５μｇ〜約４７５μｇ、約３００μｇ〜約４７５μｇ、約３２５μｇ〜約４７５μｇ、約３５０μｇ〜約４７５μｇ、約３７５μｇ〜約４７５μｇ、約４００μｇ〜約４７５μｇ、約４２５μｇ〜約４７５μｇ、約４５０μｇ〜約４７５μｇ、約１μｇ〜約４５０μｇ、約５μｇ〜約４５０μｇ、約１０μｇ〜約４５０μｇ、約１５μｇ〜約４５０μｇ、約２５μｇ〜約４５０μｇ、約５０μｇ〜約４５０μｇ、約７５μｇ〜約４５０μｇ、約１００μｇ〜約４５０μｇ、約１２５μｇ〜約４５０μｇ、約１５０μｇ〜約４５０μｇ、約１７５μｇ〜約４５０μｇ、約２００μｇ〜約４５０μｇ、約２２５μｇ〜約４５０μｇ、約２５０μｇ〜約４５０μｇ、約２７５μｇ〜約４５０μｇ、約３００μｇ〜約４５０μｇ、約３２５μｇ〜約４５０μｇ、約３５０μｇ〜約４５０μｇ、約３７５μｇ〜約４５０μｇ、約４００μｇ〜約４５０μｇ、約４２５μｇ〜約４５０μｇ、約１μｇ〜約４２５μｇ、約５μｇ〜約４２５μｇ、約１０μｇ〜約４２５μｇ、約１５μｇ〜約４２５μｇ、約２５μｇ〜約４２５μｇ、約５０μｇ〜約４２５μｇ、約７５μｇ〜約４２５μｇ、約１００μｇ〜約４２５μｇ、約１２５μｇ〜約４２５μｇ、約１５０μｇ〜約４２５μｇ、約１７５μｇ〜約４２５μｇ、約２００μｇ〜約４２５μｇ、約２２５μｇ〜約４２５μｇ、約２５０μｇ〜約４２５μｇ、約２７５μｇ〜約４２５μｇ、約３００μｇ〜約４２５μｇ、約３２５μｇ〜約４２５μｇ、約３５０μｇ〜約４２５μｇ、約３７５μｇ〜約４２５μｇ、約４００μｇ〜約４２５μｇ、約１μｇ〜約４００μｇ、約５μｇ〜約４００μｇ、約１０μｇ〜約４００μｇ、約１５μｇ〜約４００μｇ、約２５μｇ〜約４００μｇ、約５０μｇ〜約４００μｇ、約７５μｇ〜約４００μｇ、約１００μｇ〜約４００μｇ、約１２５μｇ〜約４００μｇ、約１５０μｇ〜約４００μｇ、約１７５μｇ〜約４００μｇ、約２００μｇ〜約４００μｇ、約２２５μｇ〜約４００μｇ、約２５０μｇ〜約４００μｇ、約２７５μｇ〜約４００μｇ、約３���０μｇ〜約４００μｇ、約３２５μｇ〜約４００μｇ、約３５０μｇ〜約４００μｇ、約３７５μｇ〜約４００μｇ、約１μｇ〜約３７５μｇ、約５μｇ〜約３７５μｇ、約１０μｇ〜約３７５μｇ、約１５μｇ〜約３７５μｇ、約２５μｇ〜約３７５μｇ、約５０μｇ〜約３７５μｇ、約７５μｇ〜約３７５μｇ、約１００μｇ〜約３７５μｇ、約１２５μｇ〜約３７５μｇ、約１５０μｇ〜約３７５μｇ、約１７５μｇ〜約３７５μｇ、約２００μｇ〜約３７５μｇ、約２２５μｇ〜約３７５μｇ、約２５０μｇ〜約３７５μｇ、約２７５μｇ〜約３７５μｇ、約３００μｇ〜約３７５μｇ、約３２５μｇ〜約３７５μｇ、約３５０μｇ〜約３７５μｇ、約１μｇ〜約３５０μｇ、約５μｇ〜約３５０μｇ、約１０μｇ〜約３５０μｇ、約１５μｇ〜約３５０μｇ、約２５μｇ〜約３５０μｇ、約５０μｇ〜約３５０μｇ、約７５μｇ〜約３５０μｇ、約１００μｇ〜約３５０μｇ、約１２５μｇ〜約３５０μｇ、約１５０μｇ〜約３５０μｇ、約１７５μｇ〜約３５０μｇ、約２００μｇ〜約３５０μｇ、約２２５μｇ〜約３５０μｇ、約２５０μｇ〜約３５０μｇ、約２７５μｇ〜約３５０μｇ、約３００μｇ〜約３５０μｇ、約３２５μｇ〜約３５０μｇ、約１μｇ〜約３２５μｇ、約５μｇ〜約３２５μｇ、約１０μｇ〜約３２５μｇ、約１５μｇ〜約３２５μｇ、約２５μｇ〜約３２５μｇ、約５０μｇ〜約３２５μｇ、約７５μｇ〜約３２５μｇ、約１００μｇ〜約３２５μｇ、約１２５μｇ〜約３２５μｇ、約１５０μｇ〜約３２５μｇ、約１７５μｇ〜約３２５μｇ、約２００μｇ〜約３２５μｇ、約２２５μｇ〜約３２５μｇ、約２５０μｇ〜約３２５μｇ、約２７５μｇ〜約３２５μｇ、約３００μｇ〜約３２５μｇ、約１μｇ〜約３００μｇ、約５μｇ〜約３００μｇ、約１０μｇ〜約３００μｇ、約１５μｇ〜約３００μｇ、約２５μｇ〜約３００μｇ、約５０μｇ〜約３００μｇ、約７５μｇ〜約３００μｇ、約１００μｇ〜約３００μｇ、約１２５μｇ〜約３００μｇ、約１５０μｇ〜約３００μｇ、約１７５μｇ〜約３００μｇ、約２００μｇ〜約３００μｇ、約２２５μｇ〜約３００μｇ、約２５０μｇ〜約３００μｇ、約２７５μｇ〜約３００μｇ、約１μｇ〜約２７５μｇ、約５μｇ〜約２７５μｇ、約１０μｇ〜約２７５μｇ、約１５μｇ〜約２７５μｇ、約２５μｇ〜約２７５μｇ、約５０μｇ〜約２７５μｇ、約７５μｇ〜約２７５μｇ、約１００μｇ〜約２７５μｇ、約１２５μｇ〜約２７５μｇ、約１５０μｇ〜約２７５μｇ、約１７５μｇ〜約２７５μｇ、約２００μｇ〜約２７５μｇ、約２２５μｇ〜約２７５μｇ、約２５０μｇ〜約２７５μｇ、約１μｇ〜約２５０μｇ、約５μｇ〜約２５０μｇ、約１０μｇ〜約２５０μｇ、約１５μｇ〜約２５０μｇ、約２５μｇ〜約２５０μｇ、約５０μｇ〜約２５０μｇ、約７５μｇ〜約２５０μｇ、約１００μｇ〜約２５０μｇ、約１２５μｇ〜約２５０μｇ、約１５０μｇ〜約２５０μｇ、約１７５μｇ〜約２５０μｇ、約２００μｇ〜約２５０μｇ、約２２５μｇ〜約２５０μｇ、約１μｇ〜約２２５μｇ、約５μｇ〜約２２５μｇ、約１０μｇ〜約２２５μｇ、約１５μｇ〜約２２５μｇ、約２５μｇ〜約２２５μｇ、約５０μｇ〜約２２５μｇ、約７５μｇ〜約２２５μｇ、約１００μｇ〜約２２５μｇ、約１２５μｇ〜約２２５μｇ、約１５０μｇ〜約２２５μｇ、約１７��μｇ〜約２２５μｇ、約２００μｇ〜約２２５μｇ、約１μｇ〜約２００μｇ、約５μｇ〜約２００μｇ、約１０μｇ〜約２００μｇ、約１５μｇ〜約２００μｇ、約２５μｇ〜約２００μｇ、約５０μｇ〜約２００μｇ、約７５μｇ〜約２００μｇ、約１００μｇ〜約２００μｇ、約１２５μｇ〜約２００μｇ、約１５０μｇ〜約２００μｇ、約１７５μｇ〜約２００μｇ、約１μｇ〜約１７５μｇ、約５μｇ〜約１７５μｇ、約１０μｇ〜約１７５μｇ、約１５μｇ〜約１７５μｇ、約２５μｇ〜約１７５μｇ、約５０μｇ〜約１７５μｇ、約７５μｇ〜約１７５μｇ、約１００μｇ〜約１７５μｇ、約１２５μｇ〜約１７５μｇ、約１５０μｇ〜約１７５μｇ、約１μｇ〜約１５０μｇ、約５μｇ〜約１５０μｇ、約１０μｇ〜約１５０μｇ、約１５μｇ〜約１５０μｇ、約２５μｇ〜約１５０μｇ、約５０μｇ〜約１５０μｇ、約７５μｇ〜約１５０μｇ、約１００μｇ〜約１５０μｇ、約１２５μｇ〜約１５０μｇ、約１μｇ〜約１２５μｇ、約５μｇ〜約１２５μｇ、約１０μｇ〜約１２５μｇ、約１５μｇ〜約１２５μｇ、約２５μｇ〜約１２５μｇ、約５０μｇ〜約１２５μｇ、約７５μｇ〜約１２５μｇ、約１００μｇ〜約１２５μｇ、約１μｇ〜約１００μｇ、約５μｇ〜約１００μｇ、約１０μｇ〜約１００μｇ、約１５μｇ〜約１００μｇ、約２５μｇ〜約１００μｇ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約７５μｇ〜約１００μｇ、約１μｇ〜約７５μｇ、約５μｇ〜約７５μｇ、約１０μｇ〜約７５μｇ、約１５μｇ〜約７５μｇ、約２５μｇ〜約７５μｇ、約５０μｇ〜約７５μｇ、約１μｇ〜約５０μｇ、約５μｇ〜約５０μｇ、約１０μｇ〜約５０μｇ、約１５μｇ〜約５０μｇ、約２５μｇ〜約５０μｇ、約１μｇ〜約２５μｇ、約５μｇ〜約２５μｇ、約１０μｇ〜約２５μｇ、約１５μｇ〜約２５μｇ、約１μｇ〜約１５μｇ、約５μｇ〜約１５μｇ、約１０μｇ〜約１５μｇ、約１μｇ〜約１０μｇ、約５μｇ〜約１０μｇ、または約１μｇ〜約５μｇ含む。いくつかの実施形態において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、アルミニウム塩アジュバント（例えば、ミョウバン）を、一投与当たり約１μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２５μｇ、約５０μｇ、約７５μｇ、約１００μｇ、約１２５μｇ、約１５０μｇ、約１７５μｇ、約２００μｇ、約２２５μｇ、約２５０μｇ、約２７５μｇ、約３００μｇ、約３２５μｇ、約３５０μｇ、約３７５μｇ、約４００μｇ、約４２５μｇ、約４５０μｇ、約４７５μｇ、または約５００μｇ含む。
【０１０９】
本開示の特定の実施形態には、アジュバント化されたジカウイルスワクチン、または免疫原性組成物を調製する方法であって、（ａ）ワクチンまたは免疫原性組成物を、アルミニウム塩アジュバント、本明細書に記載の少なくとも１つのジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物と混合することと、（ｂ）混合物を、適切な条件下で、約１時間〜約２４時間（例えば、約１６時間〜約２４時間）の範囲の期間インキュベートして、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の抗原が、アルミニウム塩アジュバントに吸着することと、を含む方法が含まれる。方法の特定の実施形態では、少なくとも１つのジカウイルスは、非ヒト細胞適応変異（例えば、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異などのタンパク質ＮＳ１における非ヒト細胞適応変異）を含むジカウイルスである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのジカウイルスは、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製された不活化全ジカウイルスであり、ジカウイルスは、株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのジカウイルスは、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製された不活化全ジカウイルスであり、ジカウイルスは配列番号２によるゲノム配列を含む株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。
【０１１０】
方法のいくつかの実施形態では、混合物は、約２℃〜約８℃の範囲の温度でインキュベートされる。方法のいくつかの実施形態では、混合物は、当該技術分野で公知の任意の適切なミキサーを使用する持続的な混合のもと、インキュベートされる。方法のいくつかの実施形態では、混合物は、約６．５〜約８．５、約６．５〜約８、約６．８〜約７．８、約６．９〜約７．６、約７〜約７．５、約６．８〜約８．５、約６．９〜約８．５、または約７〜約８．５の範囲のｐＨでインキュベートされる。特定の好ましい実施形態では、混合物は中性ｐＨでインキュベートされる。方法のいくつかの実施形態では、アルミニウム塩アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びアルヒドロゲル８５から選択される。
【０１１１】
サルモネラ由来のリピドＡの非毒性誘導体であるモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）は、ワクチンのアジュバントとして開発された強力なＴＬＲ−４アゴニストである（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２（２）：２１９−２２９）。マウス前臨床試験では、経鼻的ＭＬＡは分泌反応ならびに全身性の体液性応答を促進することが示されている（Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）．  Ｖａｃｃｉｎｅ  １８（２２）：２４１６−２４２５；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７０（７）：３５５７−３５６５）。また、１２万人を超える患者での臨床試験において、ワクチンのアジュバントとして安全かつ効果的であることが証明されている（Ｂａｌｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｒｅｇｕｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３５（３）：３９８−４１３；Ｂａｌｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ２４（４）：２６１−２６８）。ＭＬＡはＴＬＲ−４受容体を介して自然免疫の誘導を刺激するため、グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方、ウイルス、及び寄生虫を含む広範囲の感染性病原体に対して非特異的な免疫応答を誘発することができる（Ｂａｌｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ２４（４）：２６１−２６８；Ｐｅｒｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １０（１０  Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ３２−３７）。鼻腔内製剤にＭＬＡを含めると、先天性応答が迅速に誘導され、ウイルス攻撃から非特異的免疫応答が誘発され、ワクチンの抗原性成分によって生成される特異的応答が強化される。
【０１１２】
したがって、一実施形態では、本開示は、適応免疫及び自然免疫の増強剤としてモノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）、３  Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＬＡ）、またはそれらの誘導体を含む組成物を提供する。化学的に、３Ｄ−ＭＬＡは、３  Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと４、５、または６つのアシル化鎖の混合物である。３  Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい形態は、欧州特許第０  ６８９  ４５４号Ｂ１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＳＡ）に開示されている。別の実施形態では、本開示は、ＢｉｏＭｉｒａのＰＥＴリピドＡなどの合成リピドＡ、リピドＡ模倣物もしくは類似体、またはＴＬＲ−４アゴニストのように機能するように設計された合成誘導体を含む組成物を提供する。
【０１１３】
さらなる例示的なアジュバントには、ポリペプチド成分との同時発現またはポリペプチド成分との融合によりキメラポリペプチドを生成することにより、本明細書に記載の抗原に容易に加えることができるポリペプチドアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。鞭毛の主要タンパク質成分である細菌フラジェリンは、トール様受容体ＴＬＲ５による自然免疫系による認識のために、アジュバントタンパク質として注目を集めているアジュバントである。ＴＬＲ５を介したフラジェリンシグナル伝達は、ＤＣ成熟と遊走、ならびにマクロファージ、好中球、腸上皮細胞の活性化を誘導することにより、自然免疫機能と適応免疫機能の両方に影響を与え、炎症促進性メディエーターの産生をもたらす。
【０１１４】
ＴＬＲ５は、このタンパク質に固有であり、鞭毛機能に必要なフラジェリンモノマー内の保存された構造を認識し、免疫圧力に応じるその変異を排除する。受容体は１００ｆＭの濃度に感受性であるが、無傷のフィラメントを認識しない。鞭毛のモノマーへの分解は、結合と刺激に必要である。
【０１１５】
アジュバントとして、フラジェリンは、非経口的または鼻腔内に投与された異種抗原に対する防御応答の誘導に対して強力な活性を有し、ＤＮＡワクチンに対するアジュバント効果も報告されている。インフルエンザなどの呼吸器ウイルスに適したフラジェリンを使用すると、Ｔｈ２バイアスが観察されるが、マウスまたはサルでのＩｇＥ誘導の証拠は観察されていない。さらに、サルでの鼻腔内または全身投与後の局所または全身性炎症応答は報告されていない。フラジェリンの使用後に誘発される応答のＴｈ２特性は、フラジェリンがＭｙＤ８８に依存する方法でＴＬＲ５を介してシグナルを送信し、ＴＬＲを介する他の全てのＭｙＤ８８依存性シグナルがＴｈ１バイアスをもたらすことが示されているため、いくぶん驚きであった。重要なことに、フラジェリンに対する既存の抗体は、アジュバントの有効性に感知できるほどの影響を与えず、フラジェリンは多用途のアジュバントとして魅力的なものとなっている。
【０１１６】
最近の多くの鼻腔内ワクチン試験における共通の課題は、ワクチンの有効性を改善するためのアジュバント及び／または送達システムの使用である。このような研究の１つでは、遺伝的に無毒化されたＥ．  ｃｏｌｉの熱不安定性エンテロトキシンアジュバント（ＬＴ  Ｒ１９２Ｇ）を含むインフルエンザＨ３ワクチンにより、Ｈ５攻撃に対する異種亜型防御がもたらされたが、鼻腔内送達のみであった。防御は交差中和抗体の誘導に基づいており、新しいワクチンの開発において鼻腔内経路に重要な影響を示した。
【０１１７】
サイトカイン、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦなど）；腫瘍壊死因子；インターロイキン−２、−７、−１２、インターフェロン及び他の同様の増殖因子もまた、ポリペプチド成分との混合または融合によりジカウイルスワクチンまたは免疫原性組成物に容易に含まれ得るため、アジュバントとして使用され得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、５’−ＴＣＧ−３’配列を含む核酸ＴＬＲ９リガンド；イミダゾキノリンＴＬＲ７リガンド；置換グアニンＴＬＲ７／８リガンド；ロキソリビン、７−デアザデオキシグアノシン、７−チア−８−オキソデオキシグアノシン、イミキモド（Ｒ−８３７）、及びレシキモド（Ｒ−８４８）などの他のＴＬＲ７リガンドなどのＴｏｌｌ様受容体を介して作用する他のアジュバントを含んでもよい。
【０１１９】
特定のアジュバントは、樹状細胞などのＡＰＣによるワクチン分子の取り込みを促進し、これらを活性化する。非限定的な例は、免疫標的化アジュバント；毒素、サイトカイン、及びマイコバクテリア誘導体などの免疫調節アジュバント；オイル製剤；ポリマー；ミセル形成アジュバント；サポニン；免疫刺激複合マトリックス（ＩＳＣＯＭマトリックス）；粒子；ＤＤＡ；アルミニウムアジュバント；ＤＮＡアジュバント；ＭＬＡ；ならびにカプセル化アジュバントからなる群から選択される。
【０１２０】
アジュバントのさらなる例には、一般的に緩衝生理食塩水中の０．０５〜０．１パーセント溶液として使用される、水酸化物またはリン酸塩（ミョウバン）などのアルミニウム塩などの薬剤（例えば、Ｎｉｃｋｌａｓ  （１９９２）  Ｒｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４３：４８９−４９３を参照されたい）、０．２５％溶液として使用される糖の合成ポリマー（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））との混合剤、それぞれ７０〜１０１℃の範囲の温度で３０秒〜２分間の熱処理によるワクチン中のタンパク質の凝集体、架橋剤の手段によるものも可能である凝集体が含まれる。アルブミンに対するペプシン処理抗体（Ｆａｂフラグメント）による再活性化による凝集体、Ｃ．  ｐａｒｖｕｍなどの細菌細胞またはグラム陰性菌のエンドトキシンもしくはリポ多糖成分との混合物、マンニドモノオレイン酸（アラセルＡ）などの生理学的に許容される油性ビヒクル中のエマルション、または、ブロック代替物として使用されるパーフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）の２０パーセント溶液を含むエマルションを使用することもできる。スクアレン及びＩＦＡなどのオイルとの混合物も使用できる。
【０１２１】
ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）は、アジュバントの興味深い候補であるが、フロイントの完全及び不完全アジュバントだけでなく、ＱｕｉｌＡ及びＱＳ２１などのキラヤサポニンも興味深いものである。さらなる可能性としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、及びスレオニルムラミルジペプチド（ｔＭＤＰ）などのリポ多糖のポリ［ジ（カルボキシレートフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰ）誘導体が含まれる。リポ多糖ベースのアジュバントはまた、例えば、３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡなどのモノホスホリルリピドＡとアルミニウム塩の組み合わせを含む、主にＴｈ１型応答を生成するために使用され得る。
【０１２２】
リポソーム製剤はアジュバント効果をもたらすことも知られているため、リポソームアジュバントはジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物と組み合わせて使用し得る。
【０１２３】
免疫刺激複合マトリックスタイプ（ＩＳＣＯＭ（登録商標）マトリックス）アジュバントは、特に、このタイプのアジュバントは、ＡＰＣによるＭＨＣクラスＩＩ発現を上方制御できることが示されているため、ジカウイルスワクチン抗原及び免疫原性組成物にも使用できる。ＩＳＣＯＭマトリックスは、Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ、コレステロール、及びリン脂質由来の（必要に応じて分画された）サポニン（トリテルペノイド）からなる。ジカウイルスワクチンまたは免疫原性組成物の抗原などの免疫原性タンパク質と混合した場合、得られる微粒子製剤はＩＳＣＯＭ粒子と呼ばれるもので、サポニンが６０〜７０％ｗ／ｗ、コレステロール及びリン脂質が１０〜１５％ｗ／ｗ、及びタンパク質が１０−１５％ｗ／ｗを構成し得る。免疫刺激複合体の組成及び使用に関する詳細は、例えば、アジュバントを扱った上記の教科書に見られるが、Ｍｏｒｅｉｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ３：４６１−４７５、及びＢａｒｒ  Ｉ  Ｇ  ａｎｄ  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｇ  Ｆ  （１９９６）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７４：８−２５もまた、完全な免疫刺激複合体の調製のための有用な説明を提供する。
【０１２４】
本明細書に開示されるジカウイルスワクチン及び免疫原性組成物と組み合わせるアジュバントで使用され得る、ｉｓｃｏｍの形態であるかどうかにかかわらず、サポニンは、米国特許第５，０５７，５４０号及び“Ｓａｐｏｎｉｎｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，  Ｋｅｎｓｉｌ，  Ｃ．  Ｒ．  （１９９６）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ  １２  （１−２）：１−５５；及びＥＰ  ０  ３６２  ２７９  Ｂ１に記載される、Ｑｕｉｌ  Ａと呼ばれるＱｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来するもの及びその分画を含む。Ｑｕｉｌ  Ａの例示的な画分は、ＱＳ２１、ＱＳ７、及びＱＳ１７である。
【０１２５】
β−エスチンは、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物のアジュバント組成物で使用するための別の溶血性サポニンである。Ｅｓｃｉｎは、Ｍｅｒｃｋインデックス（１２ｔｈ  ｅｄ：ｅｎｔｒｙ  ３７３７）で、マロニエの木、Ｌａｔ：Ａｅｓｃｕｌｕｓ  ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍの種に含まれるサポニンの混合物として説明されている。その単離は、クロマトグラフィー及び精製（Ｆｉｅｄｌｅｒ，  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈ．  ４，  ２１３  （１９５３））によるもの、及びイオン交換樹脂（Ｅｒｂｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第３，２３８，１９０号）によるものが記載されている。エスチンの画分は精製され、生物学的に活性であることが示されている（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  （Ｔｏｋｙｏ）  １９９６  Ａｕｇｕｓｔ；４４（８）：１４５４−１４６４））。β−エスチンはエスチンとも呼ばれる。
【０１２６】
ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物で使用するための別の溶血性サポニンは、ジギトニンである。ジギトニンはＭｅｒｃｋインデックス（１２ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｅｎｔｒｙ  ３２０４）に、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａの種子に由来するサポニンとして記載されており、Ｇｉｓｖｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９３４）  Ｊ．Ａｍ．Ｐｈａｒｍ．Ａｓｓｏｃ．  ２３：６６４；及びＲｕｈｅｎｓｔｒｏｔｈ−Ｂａｕｅｒ  （１９５５）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ３０１，  ６２１に記載されている手順に従って精製される。その使用はコレステロール決定のための臨床試薬であると記載されている。
【０１２７】
アジュバント効果を達成する別の興味深い可能性は、Ｇｏｓｓｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２に記載されている手法を使用することである。手短に言えば、本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物中の抗原などの関連する抗原の提示は、単球／マクロファージ上のＦＣ受容体に対する抗体（または抗原結合抗体フラグメント）に抗原をコンジュゲートさせることによって強化することができる。特に抗原と抗ＦＣＲＩとの間のコンジュゲートは、ワクチン接種の目的で免疫原性を高めることが実証されている。抗体は、生成後に、または、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物の抗原のポリペプチド成分のいずれか１つへの融合として発現することによるものを含む生成の一部として、ジカウイルスワクチンまたは免疫原性組成物の抗原にコンジュゲートすることができる。他の可能性は、標的化及び免疫調節物質（例えば、サイトカイン）の使用を含む。さらに、ポリＩ：Ｃなどのサイトカインの合成誘導剤も使用できる。
【０１２８】
適切なマイコバクテリア誘導体は、ムラミルジペプチド、完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｍｏｎｔ．）ならびにＴＤＭ及びＴＤＥなどのトレハロースのジエステルからなる群から選択することができる。
【０１２９】
適切な免疫標的化アジュバントの例には、ＣＤ４０リガンド及びＣＤ４０抗体またはそれらの特異的結合フラグメント（上述の議論を参照）、マンノース、Ｆａｂフラグメント、及びＣＴＬＡ−４が含まれる。
【０１３０】
適切なポリマーアジュバントの例には、デキストラン、ＰＥＧ、デンプン、マンナン、及びマンノースなどの糖；プラスチックポリマー；ラテックスビーズなどのラテックスが含まれる。
【０１３１】
免疫応答を調節するさらに別の興味深い方法は、「仮想リンパ節」（ＶＬＮ）（ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ，  Ｉｎｃ．，  ３６０  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  １００１７−６５０１によって開発された独自の医療装置）に免疫原を（必要に応じてアジュバントならびに薬学的に許容される担体及びビヒクルと共に）含めることである。ＶＬＮ（細い管状の装置）は、リンパ節の構造と機能を模倣する。ＶＬＮを皮膚の下に挿入すると、サイトカイン及びケモカインの急増を伴う無菌の炎症部位が作出される。Ｔ細胞及びＢ細胞、ならびにＡＰＣは、危険シグナルに迅速に反応し、炎症部位に誘導され、ＶＬＮの多孔性マトリックス内部に蓄積する。ＶＬＮを使用すると、抗原に対する免疫応答を開始するのに必要とする必要な抗原用量が減少し、ＶＬＮを使用したワクチン接種によって付与される免疫防御が、Ｒｉｂｉをアジュバントとして使用する従来の免疫を上回ったことが示されている。この技術は、“Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃ，  Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，  Ｏｃｔ．  １２−１５，  １９９８，  Ｓｅａｓｃａｐｅ  Ｒｅｓｏｒｔ，  Ａｐｔｏｓ，  Ｃａｌｉｆ．内のＧｅｌｂｅｒ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  “Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｏｂｕｓｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｓｍａｌｌ  Ａｍｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ  ｔｈｅ  Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅ”に簡単に説明されている。
【０１３２】
オリゴヌクレオチドは、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物の抗原と組み合わせてアジュバントとして使用でき、少なくとも３つ以上、またはさらには少なくとも６つ以上のヌクレオチドで分離された２つ以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含み得る。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていない）は、主にＴｈ１応答を誘導する。そのようなオリゴヌクレオチドはよく知られており、例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８、及び米国特許第６，００８，２００号及び同第５，８５６，４６２号に記載されている。
【０１３３】
そのようなオリゴヌクレオチドアジュバントは、デオキシヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド主鎖は、ホスホロジチオエートまたはホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステル及び他のヌクレオチド主鎖、例えば、混合主鎖結合を有するオリゴヌクレオチドを含むＰＮＡなども使用され得る。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートを生成するための方法は、米国特許第５，６６６，１５３号、米国特許第５，２７８，３０２号、及びＷＯ９５／２６２０４に記載されている。
【０１３４】
例示的なオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有する。配列は、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド主鎖を含んでもよい：
【０１３５】
（配列番号３）オリゴ１：ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴ  （ＣｐＧ  １８２６）；
【０１３６】
（配列番号４）オリゴ２：ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ  （ＣｐＧ  １７５８）；
【０１３７】
（配列番号５）オリゴ３：ＡＣＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＡＣＧ；
【０１３８】
（配列番号６）オリゴ４：ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  （ＣｐＧ  ２００６）；及び
【０１３９】
（配列番号７）オリゴ５：ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＧ  ＣＴ  （ＣｐＧ  １６６８）
【０１４０】
代替のＣｐＧオリゴヌクレオチドには、それへの重要ではない欠失または付加を含む上述の配列が含まれる。アジュバントとしてのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で公知の任意の方法によって合成することができる（例えば、ＥＰ４６８５２０）。例えば、そのようなオリゴヌクレオチドは、自動合成装置を利用して合成することができる。このようなオリゴヌクレオチドアジュバントは、１０〜５０塩基の長さであり得る。別のアジュバント系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組み合わせを含み、特にＣｐＧとＱＳ２１の組み合わせはＷＯ００／０９１５９に開示されている。
【０１４１】
多くの単相または多相エマルション系が記載されている。当業者は、エマルションが抗原の構造を破壊しないように、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物の抗原での使用にそのようなエマルション系を容易に適合させることができる。水中油型エマルションアジュバントそれ自体がアジュバント組成物として有用であることが示唆されており（ＥＰ  ３９９  ８４３Ｂ）、水中油型エマルションと他の活性薬剤の組み合わせもまた、ワクチンのためのアジュバントとして記載されている（ＷＯ９５／１７２１０；ＷＯ９８／５６４１４；ＷＯ９９／１２５６５；ＷＯ９９／１１２４１）。油中水型エマルション（米国特許第５，４２２，１０９号；ＥＰ  ０  ４８０  ９８２  Ｂ２）及び水中油中水型エマルション（米国特許第５，４２４，０６７号；ＥＰ  ０  ４８０  ９８１  Ｂ）などの他の油エマルションアジュバントが記載されている。
【０１４２】
本明細書に記載のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物で使用するための油エマルションアジュバントは、天然のものでも合成のものでもよく、鉱物性でも有機性でもよい。鉱油及び有機油の例は、当業者には容易に明らかであろう。
【０１４３】
水中油型組成物をヒトへの投与に適するようにするために、エマルション系の油相は、代謝可能な油を含み得る。代謝可能な油という用語の意味は、当該技術分野で周知である。代謝可能とは、「代謝によって変換されることができる」として定義することができる（Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，  Ｗ．Ｂ．  Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ２５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９７４））。油は、植物油、魚油、動物油、または合成油であってよく、レシピエントに毒性がなく、代謝によって変換することができる。ナッツ（ピーナッツオイルなど）、種子、及び穀物は、植物油の一般的な供給源である。合成油も使用でき、ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）他などの市販の油を含めることができる。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は、サメ肝油に大量に見られ、オリーブオイル、小麦胚芽油、米ぬか油、酵母でも少量で見られる不飽和油であり、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物と共に使用できる。スクアレンは、コレステロールの生合成の中間体であるという事実（Ｍｅｒｃｋ  インデックス、１０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｅｎｔｒｙ  ｎｏ．８６１９）のために、代謝可能なオイルである。
【０１４４】
例示的な油エマルションは、水中油型エマルションであり、特に水中スクアレンエマルションである。
【０１４５】
さらに、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物で使用するための油エマルションアジュバントには、油α−トコフェロール（ビタミンＥ、ＥＰ  ０  ３８２  ２７１  Ｂ１）などの抗酸化剤が含まれ得る。
【０１４６】
ＷＯ９５／１７２１０及びＷＯ９９／１１２４１は、スクアレン、α−トコフェロール、及びＴＷＥＥＮ  ８０（商標）に基づくエマルションアジュバントを開示しており、必要に応じて免疫刺激剤ＱＳ２１及び／または３Ｄ−ＭＬＡと共に製剤化される。ＷＯ９９／１２５６５は、油相へのステロールの添加によるこれらのスクアレンエマルションの改善を開示している。さらに、エマルションを安定させるために、トリカプリリン（Ｃ２７Ｈ５０Ｏ６）などのトリグリセリドを油相に添加できる（ＷＯ９８／５６４１４）。
【０１４７】
安定した水中油型エマルション内に見られる油滴のサイズは、１ミクロン未満であり得、光子相関分光法により測定されるとき、実質的に３０〜６００ｎｍ、実質的に約３０〜５００ｎｍの直径、または実質的に１５０〜５００ｎｍの直径の範囲、特に約１５０ｎｍの直径であり得る。これに関して、数による油滴の８０％はこれらの範囲内であり得、数による油滴の９０％超または９５％超は規定されたサイズ範囲内である。油エマルション中に存在する成分の量は、通常、２〜１０％の範囲のスクアレンなどの油であり、存在するとき、２〜１０％のアルファトコフェロール；及び、０．３〜３％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの界面活性剤である。油：アルファトコフェロールの比率は、これがより安定したエマルションを提供するため、１以下であり得る。ＳＰＡＮ  ８５（商標）は、約１％のレベルで存在し得る。場合によっては、本明細書に開示されるジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物がさらに安定剤を含むことが有利であり得る。
【０１４８】
水中油型エマルションを生成する方法は、当業者に周知である。一般的に、この方法は、油相をＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）溶液などの界面活性剤と混合するステップ、続いてホモジナイザーを使用して均質化するステップを含み、混合物を注射針に２回通過させることが、少量の液体を均質化するのに適していることは当業者には明らかである。同様に、マイクロフルイダイザー（Ｍ１１０Ｓマイクロフルイディクスマシン、最大５０パス、最大圧力入力６バール（出力圧力約８５０バール）で２分間）での乳化プロセスは、当業者によって、より少ないかより大きい体積のエマルションを生成するために適用できる。この適用は、必要な直径の油滴で調製が達成されるまで、得られたエマルションの測定を含む日常的な実験によって達成することができる。
【０１４９】
代替的に、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、キトサン（上述のとおり）または他のポリカチオン性ポリマー、ポリラクチド及びポリラクチド−コグリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリックス、多糖類または化学的に修飾された多糖類からなる粒子、リポソーム及び脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルなどからなる粒子からなるワクチンビヒクルと組み合わせることができる。サポニンはまた、コレステロールの存在下で製剤化されて、リポソームまたはＩＳＣＯＭなどの粒子構造を形成し得る。さらに、サポニンは、ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルと一緒に、非粒子状溶液または懸濁液のいずれかで、または薄層リポソームまたはＩＳＣＯＭなどの粒子構造で製剤化できる。
【０１５０】
本明細書に記載のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物で使用するためのさらなる例示的なアジュバントには、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ，  Ｃａｌｉｆ．，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ、例えば、Ｇｒａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ６５  （５）：１７１０−１７１５）を参照されたい）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えば、ＳＢ−ＡＳ２（ＭＬＡとＱＳ２１を含む水中油型エマルション）、ＳＢＡＳ−４（ミョウバンとＭＬＡを含むアジュバント系）、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ，  Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ，  Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＲＣ−５１２、ＲＣ−５２２、ＲＣ−５２７、ＲＣ−５２９、ＲＣ−５４４、及びＲＣ−５６０（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ならびに他のアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）、係属中の米国特許出願連続番号０８／８５３，８２６及び同０９／０７４，７２０に記載されるものなどが含まれる。
【０１５１】
アジュバントの他の例には、ＨｕｎｔｅｒのＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）アジュバント（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐ．，  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，  Ｇａ．）、Ｇｅｒｂｕアジュバント（Ｇｅｒｂｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ，  Ｇａｉｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）；ニトロセルロース（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓｓｏｎ  （１９９２）  Ｒｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４３：５５３−５５７）；ミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）、鉱油、非鉱油、油中水型または水中油型エマルションを含むエマルションベースの製剤、例えば、ＭｏｎｔａｍｉｄｅアジュバントのＳｅｐｐｉｃ  ＩＳＡシリーズなど（例えば、ＩＳＡ−５１、ＩＳＡ−５７、ＩＳＡ−７２０、ＩＳＡ−１５１など；Ｓｅｐｐｉｃ，  Ｐａｒｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）；及びＰＲＯＶＡＸ（登録商標）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＯＭ−１７４（リピドＡに結合するグルコサミン二糖）；リーシュマニア伸長因子；ＣＲＬ  １００５などのミセルを形成する非イオン性ブロックコポリマー；ならびにＳｙｎｔｅｘアジュバント製剤が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｏ’Ｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．  １８（３）：６９−８５；及び“Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”  Ｄ．  Ｏ’Ｈａｇａｎ，  ｅｄ．  （２０００）  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【０１５２】
他の例示的なアジュバントには、一般式：ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ、（Ｉ）、式中、ｎは１〜５０、Ａは結合または−−Ｃ（Ｏ）−−、ＲはＣ１−５０アルキルまたはフェニルＣ１−５０アルキルである、アジュバント分子が含まれる。
【０１５３】
一実施形態は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン製剤からなり、式中、ｎは、１〜５０、４〜２４または９であり、Ｒ成分はＣ１−５０、Ｃ４−Ｃ２０アルキル、またはＣ１２アルキルであり、Ａは結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％、０．１〜１０％、または０．１〜１％の範囲であるべきである。例示的なポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、及びポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋインデックス（１２ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ：ｅｎｔｒｙ  ７７１７）に記載されている。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載されている。
【０１５４】
上述の一般式（Ｉ）によるポリオキシエチレンエーテルは、必要に応じて、別のアジュバントと組み合わせることができる。例えば、アジュバントの組み合わせは、上述のＣｐＧを含み得る。
【０１５５】
本明細書に開示されるジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物と共に使用するための適切な薬学的に許容される賦形剤のさらなる例には、水、リン酸緩衝生理食塩水、等張緩衝液が含まれる。
【０１５６】
ウイルス精製
本開示のさらなる態様は、ジカウイルスを精製する方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、ジカウイルスの集団を含む接種物を複数の細胞に接種することと、接種した細胞の１つ以上からプラーク精製によってジカウイルスクローン分離株を取得することとを含む。いくつかの実施形態では、細胞は非ヒト細胞（例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞など）である。いくつかの実施形態では、細胞は昆虫細胞（本明細書に記載の蚊の細胞／細胞株のうちのいずれかなど）である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞（本明細書に記載の哺乳動物細胞／細胞株のうちのいずれかなど）である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はサル細胞である。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス集団は不均質である（例えば、２つ以上の遺伝子型を含む）。いくつかの実施形態では、ジカウイルス集団は、ジカウイルス臨床分離株（例えば、株ＰＲＶＡＢＣ５９）及び／またはこれまでに細胞培養で継代されている１つ以上のジカウイルスを含む。いくつかの実施形態では、（例えば、本明細書に記載の）プラーク精製により、（遺伝子的に均質な）クローン分離株を異種のウイルス集団から実質的に及び／または完全に分離することが可能になる。いくつかの実施形態では、サル細胞はＶＥＲＯ細胞株（例えば、ＶＥＲＯ  １０−８７細胞）由来のものである。いくつかの実施形態では、接種物はヒト血清を含む。いくつかの実施形態では、接種物は、１つ以上の外来性感染体（例えば、１つ以上の汚染ウイルス）を含む。いくつかの実施形態では、（例えば、本明細書に記載の）プラーク精製により、（遺伝子的に均質な）クローン分離株を１つ以上の外来性感染体から実質的に及び／または完全に精製することが可能になる。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローンを単離及び／または精製するために記載された方法には、ジカウイルスクローン分離株の、１回以上（例えば、１回以上、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上など）のさらなるプラーク精製が含まれる。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株を単離及び／または精製するために記載された方法には、細胞培養中（例えば、蚊の細胞株などの昆虫細胞中及び／またはＶＥＲＯ細胞株などの哺乳動物細胞中）で、１回以上（例えば、１回以上、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上など）、ジカウイルスクローン分離株を継代することが含まれる。
【０１５９】
本開示のさらなる態様は、ワクチンまたは免疫原性組成物の調製のための、ジカウイルスを精製する方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、以下のステップのうちの１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ）のステップを含む（次の順序を含む任意の順序で）：ジカウイルスを含む試料または調製物の深層濾過を実施するステップ、ジカウイルスを含む試料を（例えば、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）により）緩衝液交換及び／または希釈して保持液を生成するステップ、ジカウイルスを含む試料をイオン交換膜（例えば、陰イオン交換膜、陽イオン交換膜）に結合してジカウイルスを含む結合画分を生成し、結合画分をイオン交換膜から溶出するステップ、ジカウイルスを含む試料を、本明細書に記載の有効量の化学的不活化剤のいずれかで処理するステップ、化学的に不活化されたジカウイルスを含む試料をメタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップ、及び／または化学的に不活化されたジカウイルスを含む中和された試料を精製するステップ（例えば、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）により）。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ジカウイルスを含む試料を第１の深層濾過に通して、ジカウイルスを含む第１の溶出液を生成するステップと；（ｂ）第１の溶出液を、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）によって緩衝液交換及び／または希釈して、ジカウイルスを含む第１の保持液を精製するステップと；（ｃ）第１の保持液をイオン交換膜に結合して、ジカウイルスを含む第１の結合画分を生成し、第１の結合画分をイオン交換膜から溶出して、ジカウイルスを含む第２の溶出液を生成するステップと；（ｄ）第２の溶出液を第２の深層濾過に通して、ジカウイルスを含む第２の保持液を生成するステップと；（ｅ）第２の保持液を有効量の化学的不活化剤で処理するステップと；（ｆ）処理された第２の保持液をメタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップと；（ｇ）中和された第２の保持液をクロスフロー濾過（ＣＦＦ）により精製するステップと、を含む。
【０１６０】
深層濾過は、Ｂｉｏ  ２０  ＳＥＩＴＺ（登録商標）深層濾過シートを使用するＳＵＰＲＡＣＡＰ（商標）シリーズの深層濾過カプセル（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などのカートリッジまたはカプセル形式で適用できる。他の適切な深層濾過技術及び装置は当該技術分野で公知であり、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＰ３フィルターが含まれる。いくつかの実施形態では、深層濾過の孔径は約０．２μｍ〜約３μｍである。いくつかの実施形態では、深層濾過の孔径は、およそ次の孔径（μｍ単位）のいずれよりも小さい：３、２．８、２．６、２．４、２．２、２．０、１．８、１．６、１．４、１．２、１．０、０．８、０．６、及び０．４。いくつかの実施形態では、深層濾過の孔径は、およそ次の孔径（μｍ）のいずれよりも大きい：０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、または２．８。すなわち、深層濾過の孔径は、３、２．８、２．６、２．４、２．２、２．０、１．８、１．６、１．４、１．２、１．０、０．８、０．６、及び０．４の上限と、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、または２．８の独立して選択された下限とを有する孔径（μｍ単位）の範囲のいずれかであり得、ここで、下限は上限よりも小さい。
【０１６１】
本明細書に記載するように、陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを本開示の方法で使用して、本開示の細胞上清から採取されたジカウイルスを精製することができる。例えば、清澄化されたウイルス収集物は、塩基性化され、陰イオン交換膜にロードされ、塩またはｐＨにより溶出され、濾過され、不活化され得る。これは単なる例示的なスキームであり、当業者は、置換、削除、挿入、または再配列されたステップを有するその変形を容易に企図することができる。
【０１６２】
陰イオンクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーは、両方とも、移動相中の目的の荷電高分子（例えば、ウイルス）の、反対の電荷を持つ基質への引力に依存している。陽イオン交換クロマトグラフィーでは、負に荷電した基質または膜が正に荷電した高分子を引き付ける。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、正に荷電した基質または膜が負に荷電した高分子を引き付ける。高分子が基質に結合またはロードされると、それらは、その特性に応じた方法で、基質から直線的または段階的に溶出され、それにより、異なる荷電分子の分離を実行することができる。この原理は、他の高分子からウイルスを精製するために使用できる。溶出は、移動相緩衝液のｐＨまたは塩含量を変化させることによって影響を受け得る。溶出は勾配または段階的であり得る。本明細書に記載されるように、溶出は、移動相のｐＨの変化を使用して、または移動相のイオン強度の変化（例えば、塩の添加によって）を使用することにより達成され得る。塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウムを含むが、これらに限定されない様々な塩が溶出に使用される。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。様々な適切な緩衝液が当該技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。イオン交換クロマトグラフィーを使用するウイルス精製法も周知であり、例えば、ｗｗｗ．ｐａｌｌ．ｃｏｍ／ｐｄｆｓ／Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＭｕｓｔａｎｇＱＸＴ＿ＡｃｒｏＰｒｅｐ＿ＵＳＤ２９１６．ｐｄｆからオンラインで入手できるインフルエンザウイルスの精製を参照されたい。
【０１６３】
当該技術分野で公知の様々なデバイスが、孔径０．６５μｍの陽イオン交換膜を使用するＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓシステム（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などの陽イオン交換クロマトグラフィー（必要に応じて濾過を含む）に適している。架橋ポリマーコーティング中のペンダントスルホン酸官能基を含むがこれらに限定されない、様々な官能基が陽イオン交換膜に使用される。本開示のジカウイルスを含む溶出液を陽イオン交換膜に結合するために、様々な緩衝液を使用することができる。例示的な緩衝液には、クエン酸緩衝液及びリン酸緩衝液が含まれるが、これらに限定されない（さらなる緩衝液は以下に記載されている）。いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーで使用される緩衝液（例えば、ローディング及び／または溶出）には、ポリソルベートが（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０が０．０５％、０．１％、０．２５％、または０．５％で）含まれる。
【０１６４】
当該技術分野で公知の様々なデバイスが、孔径０．８μｍの陰イオン交換膜を使用するＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑシステム（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などの陰イオン交換クロマトグラフィー（必要に応じて濾過を含む）に適している。別の適切な陰イオン交換膜は、ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ  ＩＥＸＮａｎｏである。架橋ポリマーコーティング中のペンダント四級アミン官能基を含むがこれらに限定されない、様々な官能基が陰イオン交換膜に使用される。本開示のジカウイルスを含む溶出液を陰イオン交換膜に結合するために、様々な緩衝液を使用することができる。例示的な緩衝液には、リン酸緩衝液が含まれるが、これらに限定されない（さらなる緩衝液は以下に記載されている）。いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィーで使用される緩衝液（例えば、ローディング及び／または溶出）には、ポリソルベートが（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０が０．０５％、０．１％、０．２５％、または０．５％で）含まれる。いくつかの実施形態では、ウイルスは、例えば、２５０ｍＭ  のＮａＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、及び７５０ｍＭのＮａＣｌを使用する段階的溶出によって溶出される。
【０１６５】
ワクチン及び／または免疫原性組成物の製剤
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載のジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含む、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の製剤に関する。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、精製された不活化全ジカウイルスである。いくつかの実施形態では、精製された不活化全ジカウイルスは、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、精製された不活化全ジカウイルスは、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む。いくつかの実施形態では、精製された不活化全ジカウイルスは、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含み、ジカウイルスは、株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。いくつかの実施形態では、精製された不活化全ジカウイルスは、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含み、ジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含む株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。
【０１６６】
そのような、本明細書に記載のジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含む本開示のワクチン及び／または免疫組成物は、ジカウイルス感染症の治療または予防を必要とする対象において、ジカウイルス感染症を治療または予防するのに、及び／または、ジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答の誘導を必要とする対象において、ジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導するのに、有用であり得る。
【０１６７】
本開示のワクチン及び／または免疫組成物が溶液または懸濁液のいずれかの注入可能なものとして調製されること、注入前に液体または懸濁液とするために好適な固体形態もまた調製され得ることが典型的である。このような調製物はまた、乳化され得るか、または乾燥粉末として生成され得る。しばしば、活性免疫原性成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、スクロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組み合わせである。さらに、必要に応じて、ワクチンまたは免疫原性組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはワクチンまたは免疫原性組成物の効果を高めるアジュバントなどの補助物質を含んでもよい。
【０１６８】
ワクチンまたは免疫原性組成物は、例えば、皮下、経皮、皮内、皮下、または筋肉内のいずれかの注射により、従来通り非経口的に投与され得る。他の投与様式に適した追加の製剤には、坐剤が含まれ、場合によっては、経口、経口、鼻腔内、口腔内、舌下、腹腔内、膣内、肛門内及び頭蓋内製剤が含まれる。坐剤の場合、従来の結合剤及び担体には、例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドが含まれ得、そのような坐剤は、０．５％〜１０％、またはさらには１〜２％の範囲の有効成分を含む混合物から形成され得る。特定の実施形態では、脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合物などの低融点ワックスが最初に溶解され、本明細書に記載のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、例えば攪拌により均一に分散される。次いで、溶融した均質な混合物を都合のよいサイズの型に注ぎ、冷却して固化させる。
【０１６９】
鼻腔内送達に適した製剤には、液体（例えば、エアロゾルまたは点鼻薬として投与するための水溶液）及び乾燥粉末（例えば、鼻腔内での迅速な沈着のため）が含まれる。製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、キシリトール、及びキトサンなどの通常使用される賦形剤を含む。キトサンなどの粘膜付着剤は、液体または粉末製剤のいずれかで使用して、鼻腔内投与製剤の粘液線毛クリアランスを遅延させることができる。マンニトール、ソルビトール、トレハロース、及び／またはスクロースなどの糖は、液体製剤では安定剤として、乾燥粉末製剤では安定剤、増量剤、または粉末流動、及びサイズ剤として使用できる。さらに、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）もしくはその誘導体、またはＣｐＧオリゴヌクレオチドなどのアジュバントは、免疫刺激性アジュバントとして液体製剤と乾燥粉末製剤の両方で使用することができる。
【０１７０】
経口送達に適した製剤には、液体、固体、半固体、ゲル、錠剤、カプセル、ロゼンジなどが含まれる。経口送達に適した製剤には、錠剤、ロゼンジ、カプセル、ゲル、液体、食品、飲料、栄養補助食品などが含まれる。製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤を含む。他のジカウイルスワクチン及び免疫原性組成物は、溶液、懸濁液、丸薬、徐放性製剤または粉末の形状を取り、１０〜９５％、または２５〜７０％の有効成分を含み得る。経口製剤の場合、コレラ毒素は、興味深い製剤化パートナーである（及び、コンジュゲーションパートナーの候補でもある）。
【０１７１】
ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、膣内投与用に製剤化されるとき、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレーの形状を取り得る。上述の製剤はいずれも、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物に加えて、例えば当該技術分野において適切であることが知られている担体などの薬剤を含み得る。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、全身または局所送達用に製剤化される。そのような製剤化は当該技術分野において周知である。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤（例えば、リンゲルデキストロースに基づく電解質補充剤）などが含まれる。全身及び局所投与経路には、例えば、皮内、局所塗布、静脈内、筋肉内などが含まれる。
【０１７３】
本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、剤形に適合する方法で、治療的に有効で免疫原性となるような量で投与することができる。ワクチンは、本明細書に記載の、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの、精製された不活化全ジカウイルスを、プラーク精製から得ることができる／得ているクローン分離株の形状で含み得る。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、本明細書に記載の、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製された不活化全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製された不活化全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含む株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である。投与される量は、治療される対象、例えば、免疫応答を開始する個体の免疫系の能力、及び所望される防御の程度等に依存する。好適な投与量範囲は、例えば、一投与当たり約０．１μｇ〜約１００μｇ、約１μｇ〜約１００μｇ、約２μｇ〜約１００μｇ、約５μｇ〜約１００μｇ、約１０μｇ〜約１００μｇ、約１５μｇ〜約１００μｇ、約２０μｇ〜約１００μｇ、約２５μｇ〜約１００μｇ、約３０μｇ〜約１００μｇ、約３５μｇ〜約１００μｇ、約４０μｇ〜約１００μｇ、約４５μｇ〜約１００μｇ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約５５μｇ〜約１００μｇ、約６０μｇ〜約１００μｇ、約６５μｇ〜約１００μｇ、７０μｇ〜約１００μｇ、約７５μｇ〜約１００μｇ、約８０μｇ〜約１００μｇ、約８５μｇ〜約１００μｇ、約９０μｇ〜約１００μｇ、約９５μｇ〜約１００μｇ、約０．１μｇ〜約９５μｇ、約１μｇ〜約９５μｇ、約２μｇ〜約９５μｇ、約５μｇ〜約９５μｇ、約１０μｇ〜約９５μｇ、約１５μｇ〜約９５μｇ、約２０μｇ〜約９５μｇ、約２５μｇ〜約９５μｇ、約３０μｇ〜約９５μｇ、約３５μｇ〜約９５μｇ、約４０μｇ〜約９５μｇ、約４５μｇ〜約９５μｇ、約５０μｇ〜約９５μｇ、約５５μｇ〜約９５μｇ、約６０μｇ〜約９５μｇ、約６５μｇ〜約９５μｇ、７０μｇ〜約９５μｇ、約７５μｇ〜約９５μｇ、約８０μｇ〜約９５μｇ、約８５μｇ〜約９５μｇ、約９０μｇ〜約９５μｇ、約０．１μｇ〜約９０μｇ、約１μｇ〜約９０μｇ、約２μｇ〜約９０μｇ、約５μｇ〜約９０μｇ、約１０μｇ〜約９０μｇ、約１５μｇ〜約９０μｇ、約２０μｇ〜約９０μｇ、約２５μｇ〜約９０μｇ、約３０μｇ〜約９０μｇ、約３５μｇ〜約９０μｇ、約４０μｇ〜約９０μｇ、約４５μｇ〜約９０μｇ、約５０μｇ〜約９０μｇ、約５５μｇ〜約９０μｇ、約６０μｇ〜約９０μｇ、約６５μｇ〜約９０μｇ、７０μｇ〜約９０μｇ、約７５μｇ〜約９０μｇ、約８０μｇ〜約９０μｇ、約８５μｇ〜約９０μｇ、約０．１μｇ〜約８５μｇ、約１μｇ〜約８５μｇ、約２μｇ〜約８５μｇ、約５μｇ〜約８５μｇ、約１０μｇ〜約８５μｇ、約１５μｇ〜約８５μｇ、約２０μｇ〜約８５μｇ、約２５μｇ〜約８５μｇ、約３０μｇ〜約８５μｇ、約３５μｇ〜約���５μｇ、約４０μｇ〜約８５μｇ、約４５μｇ〜約８５μｇ、約５０μｇ〜約８５μｇ、約５５μｇ〜約８５μｇ、約６０μｇ〜約８５μｇ、約６５μｇ〜約８５μｇ、７０μｇ〜約８５μｇ、約７５μｇ〜約８５μｇ、約８０μｇ〜約８５μｇ、約０．１μｇ〜約８０μｇ、約１μｇ〜約８０μｇ、約２μｇ〜約８０μｇ、約５μｇ〜約８０μｇ、約１０μｇ〜約８０μｇ、約１５μｇ〜約８０μｇ、約２０μｇ〜約８０μｇ、約２５μｇ〜約８０μｇ、約３０μｇ〜約８０μｇ、約３５μｇ〜約８０μｇ、約４０μｇ〜約８０μｇ、約４５μｇ〜約８０μｇ、約５０μｇ〜約８０μｇ、約５５μｇ〜約８０μｇ、約６０μｇ〜約８０μｇ、約６５μｇ〜約８０μｇ、７０μｇ〜約８０μｇ、約７５μｇ〜約８０μｇ、約０．１μｇ〜約７５μｇ、約１μｇ〜約７５μｇ、約２μｇ〜約７５μｇ、約５μｇ〜約７５μｇ、約１０μｇ〜約７５μｇ、約１５μｇ〜約７５μｇ、約２０μｇ〜約７５μｇ、約２５μｇ〜約７５μｇ、約３０μｇ〜約７５μｇ、約３５μｇ〜約７５μｇ、約４０μｇ〜約７５μｇ、約４５μｇ〜約７５μｇ、約５０μｇ〜約７５μｇ、約５５μｇ〜約７５μｇ、約６０μｇ〜約７５μｇ、約６５μｇ〜約７５μｇ、７０μｇ〜約７５μｇ、約０．１μｇ〜約７０μｇ、約１μｇ〜約７０μｇ、約２μｇ〜約７０μｇ、約５μｇ〜約７０μｇ、約１０μｇ〜約７０μｇ、約１５μｇ〜約７０μｇ、約２０μｇ〜約７０μｇ、約２５μｇ〜約７０μｇ、約３０μｇ〜約７０μｇ、約３５μｇ〜約７０μｇ、約４０μｇ〜約７０μｇ、約４５μｇ〜約７０μｇ、約５０μｇ〜約７０μｇ、約５５μｇ〜約７０μｇ、約６０μｇ〜約７０μｇ、約６５μｇ〜約７０μｇ、約０．１μｇ〜約６５μｇ、約１μｇ〜約６５μｇ、約２μｇ〜約６５μｇ、約５μｇ〜約６５μｇ、約１０μｇ〜約６５μｇ、約１５μｇ〜約６５μｇ、約２０μｇ〜約６５μｇ、約２５μｇ〜約６５μｇ、約３０μｇ〜約６５μｇ、約３５μｇ〜約６５μｇ、約４０μｇ〜約６５μｇ、約４５μｇ〜約６５μｇ、約５０μｇ〜約６５μｇ、約５５μｇ〜約６５μｇ、約６０μｇ〜約６５μｇ、約０．１μｇ〜約６０μｇ、約１μｇ〜約６０μｇ、約２μｇ〜約６０μｇ、約５μｇ〜約６０μｇ、約１０μｇ〜約６０μｇ、約１５μｇ〜約６０μｇ、約２０μｇ〜約６０μｇ、約２５μｇ〜約６０μｇ、約３０μｇ〜約６０μｇ、約３５μｇ〜約６０μｇ、約４０μｇ〜約６０μｇ、約４５μｇ〜約６０μｇ、約５０μｇ〜約６０μｇ、約５５μｇ〜約６０μｇ、約０．１μｇ〜約５５μｇ、約１μｇ〜約５５μｇ、約２μｇ〜約５５μｇ、約５μｇ〜約５５μｇ、約１０μｇ〜約５５μｇ、約１５μｇ〜約５５μｇ、約２０μｇ〜約５５μｇ、約２５μｇ〜約５５μｇ、約３０μｇ〜約５５μｇ、約３５μｇ〜約５５μｇ、約４０μｇ〜約５５μｇ、約４５μｇ〜約５５μｇ、約５０μｇ〜約５５μｇ、約０．１μｇ〜約５０μｇ、約１μｇ〜約５０μｇ、約２μｇ〜約５０μｇ、約５μｇ〜約５０μｇ、約１０μｇ〜約５０μｇ、約１５μｇ〜約５０μｇ、約２０μｇ〜約５０μｇ、約２５μｇ〜約５０μｇ、約３０μｇ〜約５０μｇ、約３５μｇ〜約５０μｇ、約４０μｇ〜約５０μｇ、約４５μｇ〜約５０μｇ、約０．１μｇ〜約４５μｇ、約１μｇ〜約４５μｇ、約２μｇ〜約４５μｇ、約５μｇ〜約４５μｇ、約１０μｇ〜約４５μｇ、約１５μｇ〜約４５μｇ、約２０μｇ〜約４５μｇ、約２５μｇ〜約４��μｇ、約３０μｇ〜約４５μｇ、約３５μｇ〜約４５μｇ、約４０μｇ〜約４５μｇ、約０．１μｇ〜約４０μｇ、約１μｇ〜約４０μｇ、約２μｇ〜約４０μｇ、約５μｇ〜約４０μｇ、約１０μｇ〜約４０μｇ、約１５μｇ〜約４０μｇ、約２０μｇ〜約４０μｇ、約２５μｇ〜約４０μｇ、約３０μｇ〜約４０μｇ、約３５μｇ〜約４０μｇ、約０．１μｇ〜約３５μｇ、約１μｇ〜約３５μｇ、約２μｇ〜約３５μｇ、約５μｇ〜約３５μｇ、約１０μｇ〜約３５μｇ、約１５μｇ〜約３５μｇ、約２０μｇ〜約３５μｇ、約２５μｇ〜約３５μｇ、約３０μｇ〜約３５μｇ、約０．１μｇ〜約３０μｇ、約１μｇ〜約３０μｇ、約２μｇ〜約３０μｇ、約５μｇ〜約３０μｇ、約１０μｇ〜約３０μｇ、約１５μｇ〜約３０μｇ、約２０μｇ〜約３０μｇ、約２５μｇ〜約３０μｇ、約０．１μｇ〜約２５μｇ、約１μｇ〜約２５μｇ、約２μｇ〜約２５μｇ、約５μｇ〜約２５μｇ、約１０μｇ〜約２５μｇ、約１５μｇ〜約２５μｇ、約２０μｇ〜約２５μｇ、約０．１μｇ〜約２０μｇ、約１μｇ〜約２０μｇ、約２μｇ〜約２０μｇ、約５μｇ〜約２０μｇ、約１０μｇ〜約２０μｇ、約１５μｇ〜約２０μｇ、約０．１μｇ〜約１５μｇ、約１μｇ〜約１５μｇ、約２μｇ〜約１５μｇ、約５μｇ〜約１５μｇ、約１０μｇ〜約１５μｇ、約０．１μｇ〜約１０μｇ、約１μｇ〜約１０μｇ、約２μｇ〜約１０μｇ、約５μｇ〜約１０μｇ、約０．１μｇ〜約５μｇ、約１μｇ〜約５μｇ、約２μｇ〜約５μｇ、約０．１μｇ〜約２μｇ、約１μｇ〜約２μｇ、または約０．１μｇ〜約１μｇを含み得る。特定の実施形態において、投与量は、一投与当たり約０．１μｇ、約０．２μｇ、約０．３μｇ、約０．４μｇ、約０．５μｇ、約０．６μｇ、約０．７μｇ、約０．８μｇ、約０．９μｇ、約１μｇ、約１．１μｇ、約１．２μｇ、約１．３μｇ、約１．４μｇ、約１．５μｇ、約１．６μｇ、約１．７μｇ、約１．８μｇ、約１．９μｇ、約２μｇ、約２．１μｇ、約２．２μｇ、約２．３μｇ、約２．４μｇ、約２．５μｇ、約２．６μｇ、約２．７μｇ、約２．８μｇ、約２．９μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１１μｇ、約１２μｇ、約１３μｇ、約１４μｇ、約１５μｇ、約１６μｇ、約１７μｇ、約１８μｇ、約１９μｇ、約２０μｇ、約２１μｇ、約２２μｇ、約２３μｇ、約２４μｇ、約２５μｇ、約２６μｇ、約２７μｇ、約２８μｇ、約２９μｇ、約３０μｇ、約３１μｇ、約３２μｇ、約３３μｇ、約３４μｇ、約３５μｇ、約３６μｇ、約３７μｇ、約３８μｇ、約３９μｇ、約４０μｇ、約４１μｇ、約４２μｇ、約４３μｇ、約４４μｇ、約４５μｇ、約４６μｇ、約４７μｇ、約４８μｇ、約４９μｇ、約５０μｇ、約５１μｇ、約５２μｇ、約５３μｇ、約５４μｇ、約５５μｇ、約５６μｇ、約５７μｇ、約５８μｇ、約５９μｇ、約６０μｇ、約６１μｇ、約６２μｇ、約６３μｇ、約６４μｇ、約６５μｇ、約６６μｇ、約６７μｇ、約６８μｇ、約６９μｇ、約７０μｇ、約７１μｇ、約７２μｇ、約７３μｇ、約７４μｇ、約７５μｇ、約７６μｇ、約７７μｇ、約７８μｇ、約７９μｇ、約８０μｇ、約８１μｇ、約８２μｇ、約８３μｇ、約８４μｇ、約８５μｇ、約８６μｇ、約８７μｇ、約８８μｇ、約８９μｇ、約９０μｇ、約９１μｇ、約９２μｇ、約���３μｇ、約９４μｇ、約９５μｇ、約９６μｇ、約９７μｇ、約９８μｇ、約９９μｇ、または約１００μｇであり得る。精製された不活化ジカウイルスの量は、規定の量の組換えジカエンベロープタンパク質を使用して、標準曲線を確立する、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定することができる（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）。したがって、抗原の投与量は、ジカエンベロープタンパク質Ｅのマイクログラム（μｇ）（μｇ  Ｅｎｖ）と呼ばれることもある。したがって、下の段落に記載されるμｇ抗原とμｇ  Ｅｎｖは、この開示の意味において同一のものを意味する。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、投薬量はジカエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）のマイクログラム（μｇ）数で測定することが可能である。したがって、いくつかの実施形態では、投薬量の範囲は、例えば、一投与当たり約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約２５μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約３０μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約３５μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約４０μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約４５μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約５０μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約５５μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約６０μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約６５μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、７０μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約７５μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約８０μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約８５μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約９０μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約９５μｇ  Ｅｎｖ〜約１００μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約２５μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約３０μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約３５μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約４０μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約４５μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約５０μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約５５μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約６０μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約６５μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、７０μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約７５μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約８０μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約８５μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約９０μｇ  Ｅｎｖ〜約９５μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約２５μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約３０μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約３５μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約４０μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約４５μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約５０μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約５５μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約６０μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約６５μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、７０μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約７５μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約８０μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約８５μｇ  Ｅｎｖ〜約９０μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約２５μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約３０μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約３５μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約４０μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約４５μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約５０μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約５５μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約６０μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約６５μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、７０μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約７５μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約８０μｇ  Ｅｎｖ〜約８５μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約２５μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約３０μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約３５μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約４０μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約４５μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約５０μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約５５μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約６０μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約６５μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、７０μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約７５μｇ  Ｅｎｖ〜約８０μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、約２５μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、約３０μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、約３５μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、約４０μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、約４５μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、約５０μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、約５５μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、約６０μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、約６５μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、７０μｇ  Ｅｎｖ〜約７５μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約７０μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約７０μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約７０μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約７０μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約７０μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約７０μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ〜約７０μｇ  Ｅｎｖ、約２５μｇ  Ｅｎｖ〜約７０μｇ  Ｅｎｖ、約３０μｇ  Ｅｎｖ〜約７０μｇ  Ｅｎｖ、約３５μｇ  Ｅｎｖ〜約７０μｇ  Ｅｎｖ、約４０μｇ  Ｅｎｖ〜約７０μｇ  Ｅｎｖ、約４５μｇ  Ｅｎｖ〜約７０μｇ  Ｅｎｖ、約５０μｇ  Ｅｎｖ〜約７０μｇ  Ｅｎｖ、約５５μｇ  Ｅｎｖ〜約７０μｇ  Ｅｎｖ、約６０μｇ  Ｅｎｖ〜約７０μｇ  Ｅｎｖ、約６５μｇ  Ｅｎｖ〜約７０μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約６５μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約６５μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約６５μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約６５μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約６５μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約６５μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ〜約６５μｇ  Ｅｎｖ、約２５μｇ  Ｅｎｖ〜約６５μｇ  Ｅｎ���、約３０μｇ  Ｅｎｖ〜約６５μｇ  Ｅｎｖ、約３５μｇ  Ｅｎｖ〜約６５μｇ  Ｅｎｖ、約４０μｇ  Ｅｎｖ〜約６５μｇ  Ｅｎｖ、約４５μｇ  Ｅｎｖ〜約６５μｇ  Ｅｎｖ、約５０μｇ  Ｅｎｖ〜約６５μｇ  Ｅｎｖ、約５５μｇ  Ｅｎｖ〜約６５μｇ  Ｅｎｖ、約６０μｇ  Ｅｎｖ〜約６５μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約６０μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約６０μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約６０μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約６０μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約６０μｇ  Ｅｎｖ、
約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約６０μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ〜約６０μｇ  Ｅｎｖ、約２５μｇ  Ｅｎｖ〜約６０μｇ  Ｅｎｖ、約３０μｇ  Ｅｎｖ〜約６０μｇ  Ｅｎｖ、約３５μｇ  Ｅｎｖ〜約６０μｇ  Ｅｎｖ、約４０μｇ  Ｅｎｖ〜約６０μｇ  Ｅｎｖ、約４５μｇ  Ｅｎｖ〜約６０μｇ  Ｅｎｖ、約５０μｇ  Ｅｎｖ〜約６０μｇ  Ｅｎｖ、約５５μｇ  Ｅｎｖ〜約６０μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約５５μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約５５μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約５５μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約５５μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約５５μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約５５μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ〜約５５μｇ  Ｅｎｖ、約２５μｇ  Ｅｎｖ〜約５５μｇ  Ｅｎｖ、約３０μｇ  Ｅｎｖ〜約５５μｇ  Ｅｎｖ、約３５μｇ  Ｅｎｖ〜約５５μｇ  Ｅｎｖ、約４０μｇ  Ｅｎｖ〜約５５μｇ  Ｅｎｖ、約４５μｇ  Ｅｎｖ〜約５５μｇ  Ｅｎｖ、約５０μｇ  Ｅｎｖ〜約５５μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約５０μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約５０μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約５０μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約５０μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約５０μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約５０μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ〜約５０μｇ  Ｅｎｖ、約２５μｇ  Ｅｎｖ〜約５０μｇ  Ｅｎｖ、約３０μｇ  Ｅｎｖ〜約５０μｇ  Ｅｎｖ、約３５μｇ  Ｅｎｖ〜約５０μｇ  Ｅｎｖ、約４０μｇ  Ｅｎｖ〜約５０μｇ  Ｅｎｖ、約４５μｇ  Ｅｎｖ〜約５０μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約４５μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約４５μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約４５μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約４５μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約４５μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約４５μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ〜約４５μｇ  Ｅｎｖ、約２５μｇ  Ｅｎｖ〜約４５μｇ  Ｅｎｖ、約３０μｇ  Ｅｎｖ〜約４５μｇ  Ｅｎｖ、約３５μｇ  Ｅｎｖ〜約４５μｇ  Ｅｎｖ、約４０μｇ  Ｅｎｖ〜約４５μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約４０μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約４０μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約４０μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約４０μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約４０μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約４０μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ〜約４０μｇ  Ｅｎｖ、約２５μｇ  Ｅｎｖ〜約４０μｇ  Ｅｎｖ、約３０μｇ  Ｅｎｖ〜約４０μｇ  Ｅｎｖ、約３５μｇ  Ｅｎｖ〜約４０μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約３５μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約３５μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約３５μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約３５μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約３５μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約３５μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ〜約３５μｇ  Ｅｎｖ、約２５μｇ  Ｅｎｖ〜約３５μｇ  Ｅｎｖ、約３０μｇ  Ｅｎｖ〜約３５μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約３０μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約３０μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約３０μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約３０μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約３０μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約３０μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ〜約３０μｇ  Ｅｎｖ、約２５μｇ  Ｅｎｖ〜約３０μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約２５μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約２５μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約２５μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約２５μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約２５μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約２５μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ〜約２５μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約２０μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約２０μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約２０μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約２０μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約２０μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ〜約２０μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約１５μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約１５μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約１５μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約１５μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ〜約１５μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約１０μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約１０μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約１０μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ〜約１０μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約５μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約５μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ〜約５μｇ  Ｅｎｖ、約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約２μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ〜約２μｇ  Ｅｎｖ、または約０．１μｇ  Ｅｎｖ〜約１μｇ  Ｅｎｖを含み得る。特定の実施形態において、投与量は一投与当たり約０．１μｇ  Ｅｎｖ、約０．２μｇ  Ｅｎｖ、約０．３μｇ  Ｅｎｖ、約０．４μｇ  Ｅｎｖ、約０．５μｇ  Ｅｎｖ、約０．６μｇ  Ｅｎｖ、約０．７μｇ  Ｅｎｖ、約０．８μｇ  Ｅｎｖ、約０．９μｇ  Ｅｎｖ、約１μｇ  Ｅｎｖ、約１．１μｇ  Ｅｎｖ、約１．２μｇ  Ｅｎｖ、約１．３μｇ  Ｅｎｖ、約１．４μｇ  Ｅｎｖ、約１．５μｇ  Ｅｎｖ、約１．６μｇ  Ｅｎｖ、約１．７μｇ  Ｅｎｖ、約１．８μｇ  Ｅｎｖ、約１．９μｇ  Ｅｎｖ、約２μｇ  Ｅｎｖ、約２．１μｇ  Ｅｎｖ、約２．２μｇ  Ｅｎｖ、約２．３μｇ  Ｅｎｖ、約２．４μｇ  Ｅｎｖ、約２．５μｇ  Ｅｎｖ、約２．６μｇ  Ｅｎｖ、約２．７μｇ  Ｅｎｖ、約２．８μｇ  Ｅｎｖ、約２．９μｇ  Ｅｎｖ、約３μｇ  Ｅｎｖ、約４μｇ  Ｅｎｖ、約５μｇ  Ｅｎｖ、約６μｇ  Ｅｎｖ、約７μｇ  Ｅｎｖ、約８μｇ  Ｅｎｖ、約９μｇ  Ｅｎｖ、約１０μｇ  Ｅｎｖ、約１１μｇ  Ｅｎｖ、約１２μｇ  Ｅｎｖ、約１３μｇ  Ｅｎｖ、約１４μｇ  Ｅｎｖ、約１５μｇ  Ｅｎｖ、約１６μｇ  Ｅｎｖ、約１７μｇ  Ｅｎｖ、約１８μｇ  Ｅｎｖ、約１９μｇ  Ｅｎｖ、約２０μｇ  Ｅｎｖ、約２１μｇ  Ｅｎｖ、約２２μｇ  Ｅｎｖ、約２３μｇ  Ｅｎｖ、約２４μｇ  Ｅｎｖ、約２５μｇ  Ｅｎｖ、約２６μｇ  Ｅｎｖ、約２７μｇ  Ｅｎｖ、約２８μｇ  Ｅｎｖ、約２９μｇ  Ｅｎｖ、約３０μｇ  Ｅｎｖ、約３１μｇ  Ｅｎｖ、約３２μｇ  Ｅｎｖ、約３３μｇ  Ｅｎｖ、約３４μｇ  Ｅｎｖ、約３５μｇ  Ｅｎｖ、約３６μｇ  Ｅｎｖ、約３７μｇ  Ｅｎｖ、約３８μｇ  Ｅｎｖ、約３９μｇ  Ｅｎｖ、約４０μｇ  Ｅｎｖ、約４１μｇ  Ｅｎｖ、約４２μｇ  Ｅｎｖ、約４３μｇ  Ｅｎｖ、約４４μｇ  Ｅｎｖ、約４５μｇ  Ｅｎｖ、約４６μｇ  Ｅｎｖ、約４７μｇ  Ｅｎｖ、約４８μｇ  Ｅｎｖ、約４９μｇ  Ｅｎｖ、約５０μｇ  Ｅｎｖ、約５１μｇ  Ｅｎｖ、約５２μｇ  Ｅｎｖ、約５３μｇ  Ｅｎｖ、約５４μｇ  Ｅｎｖ、約５５μｇ  Ｅｎｖ、約５６μｇ  Ｅｎｖ、約５７μｇ  Ｅｎｖ、約５８μｇ  Ｅｎｖ、約５９μｇ  Ｅｎｖ、約６０μｇ  Ｅｎｖ、約６１μｇ  Ｅｎｖ、約６２μｇ  Ｅｎｖ、約６３μｇ  Ｅｎｖ、約���４μｇ  Ｅｎｖ、約６５μｇ  Ｅｎｖ、約６６μｇ  Ｅｎｖ、約６７μｇ  Ｅｎｖ、約６８μｇ  Ｅｎｖ、約６９μｇ  Ｅｎｖ、約７０μｇ  Ｅｎｖ、約７１μｇ  Ｅｎｖ、約７２μｇ  Ｅｎｖ、約７３μｇ  Ｅｎｖ、約７４μｇ  Ｅｎｖ、約７５μｇ  Ｅｎｖ、約７６μｇ  Ｅｎｖ、約７７μｇ  Ｅｎｖ、約７８μｇ  Ｅｎｖ、約７９μｇ  Ｅｎｖ、約８０μｇ  Ｅｎｖ、約８１μｇ  Ｅｎｖ、約８２μｇ  Ｅｎｖ、約８３μｇ  Ｅｎｖ、約８４μｇ  Ｅｎｖ、約８５μｇ  Ｅｎｖ、約８６μｇ  Ｅｎｖ、約８７μｇ  Ｅｎｖ、約８８μｇ  Ｅｎｖ、約８９μｇ  Ｅｎｖ、約９０μｇ  Ｅｎｖ、約９１μｇ  Ｅｎｖ、約９２μｇ  Ｅｎｖ、約９３μｇ  Ｅｎｖ、約９４μｇ  Ｅｎｖ、約９５μｇ  Ｅｎｖ、約９６μｇ  Ｅｎｖ、約９７μｇ  Ｅｎｖ、約９８μｇ  Ｅｎｖ、約９９μｇ  Ｅｎｖ、または約１００μｇ  Ｅｎｖであり得る。
【０１７５】
初期投与及びブースターショットに適したレジメンも様々存在するが、初期投与とその後の接種または他の投与が典型的である。適用方法は大きく変動し得る。ワクチンまたは免疫原性組成物の投与のための従来の方法のいずれも適用可能である。これらには、固体の生理学的に許容される基剤上または生理学的に許容される分散液中への経口適用、非経口的、注射などによるものが含まれる。ワクチンまたは免疫原性組成物の投与量は、投与経路に依存し、ワクチン接種を受ける人の年齢及び抗原の製剤によって異なり得る。本明細書に記載されているように、ワクチンまたは免疫原性組成物は、０．５ｍＬを超える、０．５ｍＬまたは０．５ｍＬ未満の単位投与量を有することができる。例えば、０．２５ｍＬの体積で投与することができる。
【０１７６】
粘膜付着性を改善する送達剤はまた、特に鼻腔内、経口、または肺ベースの送達製剤について、送達及び免疫原性を改善するために使用することもできる。そのような化合物の１つであるキトサンは、キチンのＮ−脱アセチル化型であり、多くの医薬製剤で使用されている。それは、粘液線毛クリアランスを遅らせ、粘膜抗原の取り込みと処理により多くの時間をかけることができるため、鼻腔内ワクチン送達のための魅力的な粘膜付着剤である。さらに、それはタイトジャンクションを一時的に開くことができ、ＮＡＬＴへの抗原の経上皮輸送を増強することができる。最近のヒト治験では、キトサンを含めて鼻腔内に投与したが、追加のアジュバントなしで投与された３価の不活化インフルエンザワクチンは、筋肉内接種後に得られたものよりわずかに低い抗体陽転及び高力価をもたらした。
【０１７７】
キトサンはまた、遺伝的に無毒化されたＥ．  ｃｏｌｉの熱不安定性エンテロトキシン変異体ＬＴＫ６３など、鼻腔内で良好に機能するアジュバントと共に製剤化することもできる。これにより、キトサンによってもたらされる送達及び接着の利点に加えて、免疫刺激効果が追加され、粘膜及び全身の応答が強化される。
【０１７８】
最後に、キトサン製剤は、ワクチンの安定性を改善し、液体製剤よりも粘液線毛クリアランスをさらに遅延させることが示されている乾燥粉末形状で調製することもできる。これは、キトサンを製剤化した鼻腔内乾燥粉末ジフテリアトキソイドワクチンを含む最近のヒト臨床治験で見出され、鼻腔内経路は、従来の筋肉内経路と同じくらい効果的であり、分泌型ＩｇＡ応答の追加の利点があった。ワクチンは、忍容性も非常に良好であった。キトサン及びＭＬＡ、またはその誘導体を含む炭疽菌の鼻腔内乾燥粉末ワクチンは、筋肉内接種よりもウサギに強い応答を誘導し、エアロゾル胞子攻撃に対しても保護的である。
【０１７９】
鼻腔内ワクチンは、下気道への影響がより優れている非経口投与ワクチンとは対照的に、上気道及び下気道に影響を与えることができるため、例示的な製剤を表す。これは、アレルゲンベースのワクチンに対する耐性を誘導し、病原体ベースのワクチンに対する免疫を誘導するのに有益であり得る。
【０１８０】
鼻腔内ワクチンは、上気道と下気道の両方に保護を提供することに加えて、針接種の合併症を回避し、粒子状及び／または可溶性抗原と鼻咽頭関連リンパ様組織（ＮＡＬＴ）の相互作用を介して粘膜及び全身の体液性応答と細胞性応答の両方を誘導する手段を提供する。
【０１８１】
本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、薬学的に許容される。それらは、抗原及びアジュバントに加えて、成分を含み得、例えば、それらは通常、１つ以上の製薬担体（複数可）及び／または賦形剤（複数可）を含む。このような成分の詳細な説明は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２で見ることができる。
【０１８２】
張性を制御するために、ナトリウム塩などの生理的塩を含めることが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在し得る。存在し得る他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。
【０１８３】
本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、１つ以上の緩衝液を含み得る。典型的な緩衝液には：リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸塩緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液（特に水酸化アルミニウムアジュバントと共に）；またはクエン酸緩衝液が含まれる。緩衝液は通常５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【０１８４】
ワクチンまたは免疫原性組成物のｐＨは、一般に５．０〜８．５または５．０〜８．１、より典型的には６．０〜８．５、例えば、６．０〜８．０、６．５〜８．０、６．５〜７．５、７．０〜８．５、７．０〜８．０、７．０〜７．８である。したがって、本開示の製造プロセスは、包装前にバルクワクチンのｐＨを調整するステップを含み得る。
【０１８５】
ワクチンまたは免疫原性組成物は無菌であることが好ましい。それは好ましくは非発熱性であり、例えば１用量あたり１ＥＵ未満（エンドトキシン単位、標準測定値）、好ましくは１用量あたり０．１ＥＵ未満を含む。それは好ましくはグルテンを含まない。
【０１８６】
特定の実施形態では、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、有効濃度で界面活性剤を含み得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤の有効量には、非限定的に、約０．００００５％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖ、または約０．０００１％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖが含まれる。特定の実施形態では、界面活性剤の有効量は、約０．００１％ｖ／ｖ、約０．００２％ｖ／ｖ、約０．００３％ｖ／ｖ、約０．００４％ｖ／ｖ、約０．００５％ｖ／ｖ、約０．００６％ｖ／ｖ、約０．００７％ｖ／ｖ、約０．００８％ｖ／ｖ、約０．００９％ｖ／ｖ、または約０．０１％ｖ／ｖである。理論に拘束されることを望まないが、界面活性剤は、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を溶液中に維持するのに役立ち、ワクチン及び／または免疫原性組成物が凝集するのを防ぐのに役立つ。
【０１８７】
適切な界面活性剤には、特にスプリットまたは表面抗原ワクチンの場合、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎｓ」として知られる）、オクトキシノール（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００）、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、及びデオキシコール酸ナトリウムが含まれる。界面活性剤は微量でのみ存在してもよい。微量の他の残留成分は抗生物質であってよい（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）。いくつかの実施形態では、界面活性剤にはポリソルベートが含まれる。いくつかの実施形態では、界面活性剤の有効濃度には、約０．００００５％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖの範囲が含まれる。
【０１８８】
ワクチン及び／または免疫原性組成物は、２℃〜８℃で保存することが好ましい。理想的には直射日光を避けるべきである。抗原とエマルションは、通常、混合状態であるが、それらは、即時混合するための別個の成分のキットの形態で最初に提供されてもよい。ワクチン及び／または免疫原性組成物は、対象に投与されるとき、一般に水性形態である。
【０１８９】
本開示の方法
本開示のさらなる態様は、ジカウイルスの治療もしくは予防を必要とする対象におけるジカウイルスを治療もしくは予防するための、またはジカウイルスに対する免疫応答の誘導を必要とする対象におけるジカウイルスに対する免疫応答を誘導するための、少なくとも１つのジカウイルス（例えば、クローンジカウイルス分離株、タンパク質ＮＳ１における非ヒト細胞適応変異などの非ヒト細胞適応変異を含むジカウイルス（本明細書に記載の、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの、精製された不活化全ジカウイルス（プラーク精製から得ることができる／得ているクローン分離株の形状））由来の１つ以上の抗原を含む、本明細書に記載のワクチン及び／または免疫原性組成物を使用する方法に関する。本開示のさらなる態様は、ジカウイルスの治療もしくは予防を必要とする対象におけるジカウイルスを治療もしくは予防するための、またはジカウイルスに対する免疫応答の誘導を必要とする対象におけるジカウイルスに対する免疫応答を誘導するための、本明細書に記載の、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製された不活化全ジカウイルスを含む、本明細書に記載のワクチン及び／または免疫原性組成物を使用する方法に関する。本開示のさらなる態様は、ジカウイルスの治療もしくは予防を必要とする対象におけるジカウイルスを治療もしくは予防するための、またはジカウイルスに対する免疫応答の誘導を必要とする対象におけるジカウイルスに対する免疫応答を誘導するための、本明細書に記載の、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する、株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である精製された不活化全ジカウイルスを含む、本明細書に記載のワクチン及び／または免疫原性組成物を使用する方法に関する。本開示のさらなる態様は、ジカウイルスの治療もしくは予防を必要とする対象におけるジカウイルスを治療もしくは予防するための、またはジカウイルスに対する免疫応答の誘導を必要とする対象におけるジカウイルスに対する免疫応答を誘導するための、本明細書に記載の、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する、配列番号２によるゲノム配列を含む株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である精製された不活化全ジカウイルスを含む、本明細書に記載のワクチン及び／または免疫原性組成物を使用する方法に関する。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ジカウイルス感染症の治療または予防を必要とする対象において、ジカウイルス感染症を治療または予防する方法であって、少なくとも１つのジカウイルス（例えば、クローンジカウイルス分離株、タンパク質ＮＳ１における非ヒト細胞適応変異などの非ヒト細胞適応変異を含むジカウイルス（本明細書に記載の、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの、精製された不活化全ジカウイルス（プラーク精製から得ることができる／得ているクローン分離株の形状））由来の１つ以上の抗原を含む、治療有効量の本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を対象に投与することによる、方法に関する。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ジカウイルス感染症の治療または予防を必要とする対象において、ジカウイルス感染症を治療または予防する方法であって、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製された不活化全ジカウイルスを含む、治療有効量の本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を対象に投与することによる、方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ジカウイルス感染症の治療または予防を必要とする対象において、ジカウイルス感染症を治療または予防する方法であって、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する、株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である精製された不活化全ジカウイルスを含む、治療有効量の本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を対象に投与することによる、方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ジカウイルス感染症の治療または予防を必要とする対象において、ジカウイルス感染症を治療または予防する方法であって、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する、配列番号２によるゲノム配列を含む株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である精製された不活化全ジカウイルスを含む、治療有効量の本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を対象に投与することによる、方法に関する。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本開示は、ジカウイルスに対する免疫応答の誘導を必要とする対象において、ジカウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、少なくとも１つのジカ（例えば、クローンジカウイルス分離株、タンパク質ＮＳ１における非ヒト細胞適応変異などの非ヒト細胞適応変異を含むジカウイルス（本明細書に記載の、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの、精製された不活化全ジカウイルス（プラーク精製から得ることができる／得ているクローン分離株の形状））由来の１つ以上の抗原を含む、治療有効量の本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を対象に投与することによる、方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ジカウイルスに対する免疫応答の誘導を必要とする対象において、ジカウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する、株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である精製された不活化全ジカウイルスを含む、治療有効量の本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を対象に投与することによる、方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ジカウイルスに対する免疫応答の誘導を必要とする対象において、ジカウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する、配列番号２によるゲノム配列を含む株ＰＲＶＡＢＣ５９由来である精製された不活化全ジカウイルスを含む、治療有効量の本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を対象に投与することによる、方法に関する。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、投与ステップは、対象においてジカウイルスに対する防御免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象が妊娠している、または妊娠しようとしている。
【０１９４】
本明細書に記載のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、鼻腔内、経口、経口、口腔内、舌下、筋肉内、腹腔内、皮内、経皮、皮下、膣内、肛門内、頭蓋内、静脈内、経皮、または皮下投与によるワクチンの投与の手段によって、ウイルス感染症にかかりやすいか、またはウイルス感染症に罹患している対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）を保護または治療するために使用できる。本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の全身投与の方法は、従来のシリンジ及び針、または固形ワクチンのバリスティック送達のために設計された装置（ＷＯ  ９９／２７９６１）、または無針圧力液体ジェット装置（米国特許第４，５９６，５５６号；米国特許第５，９９３，４１２号）、または経皮パッチ（ＷＯ９７／４８４４０；ＷＯ９８／２８０３７）を含み得る。本開示のジカウイルス  ワクチン及び／または免疫原性組成物は、皮膚に塗布することもできる（経皮または経皮送達、ＷＯ９８／２０７３４；ＷＯ９８／２８０３７）。したがって、本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、ジカウイルスワクチンまたは免疫原性組成物があらかじめ充填された全身投与用の送達装置を含み得る。したがって、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）においてジカウイルス感染症を治療または予防するための方法及び／または免疫応答を誘導するための方法であって、必要に応じてアジュバント及び／または担体を含む、本開示のワクチンまたは免疫原性組成物を対象に投与するステップを含み、ワクチンまたは免疫原性組成物が非経口または全身経路を介して投与される、方法が提供される。
【０１９５】
本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、経口／消化または経鼻経路などの粘膜経路を介したワクチンまたは免疫原性組成物を投与する手段によって、ウイルス感染症に罹患しやすいか、または罹患している対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）を保護または治療するために使用され得る。代替の粘膜経路は、膣内及び直腸内である。粘膜投与経路は、鼻腔内ワクチン接種と呼ばれる鼻経路を介するものであり得る。鼻腔内ワクチン接種の方法は、当該技術分野で周知であり、免疫される個体の鼻咽頭への液滴、スプレー、または乾燥粉末形態のワクチンの投与が含まれる。噴霧またはエアロゾル化されたワクチン製剤は、本明細書に開示されるジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物の潜在的な形態である。経口投与用の胃耐性カプセル及び顆粒などの腸溶性製剤、直腸または膣内投与用の坐剤もまた、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の製剤である。
【０１９６】
本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、経口経路を介して投与することもできる。そのような場合、薬学的に許容される賦形剤はまた、アルカリ性緩衝液、または腸溶カプセルまたは微小顆粒を含み得る。本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、膣経路によって投与され得る。そのような場合、薬学的に許容される賦形剤は、乳化剤、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）などのポリマー、及び膣クリーム及び坐剤の他の既知の安定剤も含み得る。ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、直腸経路によって投与され得る。そのような場合、賦形剤は、直腸坐剤を形成するための当該技術分野で既知のワックス及びポリマーも含み得る。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、投与するステップには１つ以上の投与が含まれる。投与は、単回投与スケジュールまたは複数回投与（プライム−ブースト）スケジュールによることができる。複数回投与スケジュールでは、例えば、非経口プライム及び粘膜ブースト、粘膜プライム及び非経口ブーストなど、様々な投与量が同一または異なる経路によって与えられ得る。典型的には、それらは、同一の経路によって与えられる。複数回投与は、典型的には少なくとも１週間間隔（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１６週間など）で投与される。２５〜３０日間（例えば、２８日間）隔てられた２回の投与を与えることは特に有用である。
【０１９８】
本開示の方法は、本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物の治療的有効量または免疫原性量の投与を含む。治療的有効量または免疫原性量は、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物が、それが投与される非感染、感染、または非曝露対象において防御免疫応答を誘導する量であり得る。このような応答は一般に、対象において、ワクチンに対する分泌型の細胞性及び／または抗体媒介性の免疫応答の発生をもたらす。通常、このような応答には、次の効果のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭなどの免疫学的クラスのいずれかからの抗体の産生；Ｂ及びＴリンパ球の増殖；免疫細胞への活性化、増殖、及び分化シグナルの提供；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、及び／または細胞傷害性Ｔ細胞の増殖。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト細胞適応ジカウイルスを含む、ワクチン及び／または免疫原性組成物の投与後に対象において誘導される防御免疫応答は、非ヒト細胞増殖に適応していない、及び／または異なる非ヒト細胞適応変異を含む、ジカウイルスを含むワクチン及び／または免疫原性組成物を投与された、対応する対象において誘導される免疫応答よりも大きい。いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト細胞適合ジカウイルスを含むワクチン及び／または免疫原性組成物の投与後に対象に誘導される防御免疫応答は、非ヒト細胞増殖に適応していない、及び／または異なる非ヒト細胞適応変異を含む、ジカウイルスを含むワクチン及び／または免疫原性組成物を投与された、対応する対象において誘導される免疫応答よりも、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％大きい。防御免疫学的応答を測定する方法は、当業者に周知である。
【０２００】
いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト細胞適合ジカウイルスを含むワクチン及び／または免疫原性組成物の投与は、対象においてジカウイルスに対する中和抗体の生成を誘導する。いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト細胞適合ジカウイルスを含むワクチン及び／または免疫原性組成物の投与は、対象におけるジカウイルスに対する中和抗体の生成を、非ヒト細胞増殖に適応していない、及び／または異なる非ヒト細胞適応変異を含む、ジカウイルスを含むワクチン及び／または免疫原性組成物を投与された対応する対象において誘導される中和抗体の量よりも多い量で誘導する。いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト細胞適合ジカウイルスを含むワクチン及び／または免疫原性組成物の投与は、非ヒト細胞増殖に適応していない、及び／または異なる非ヒト細胞適応変異を含む、ジカウイルスを含むワクチン及び／または免疫原性組成物を投与された、対応する対象において誘導される中和抗体よりも、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％多い量で対象におけるジカウイルスに対する中和抗体の生成を誘導する。いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト細胞適合ジカウイルスを含むワクチン及び／または免疫原性組成物の投与は、非ヒト細胞増殖に適応していない、及び／または異なる非ヒト細胞適応変異を含む、ジカウイルスを含むワクチン及び／または免疫原性組成物を投与された、対応する対象において誘導される中和抗体の量よりも、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、または少なくとも約１０００倍、多い量で対象におけるジカウイルスに対する中和抗体の生成を誘導する。対象における中和抗体を測定する方法は、当業者に周知である。
【０２０１】
好ましくは、治療的有効量または免疫原性量は、疾患症状の治療または予防をもたらすのに十分である。必要とされる正確な量は、いくつかある要素の中でも特に、治療される対象、治療される対象の年齢及び一般的な健康状態、対象の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、治療される病態の重症度、選択される特定のジカウイルス抗原及びその投与の様式に依存する。適切な治療有効量または免疫原性量は、当業者によって容易に決定することができる。治療有効量または免疫原性量は、日常的な試験によって決定され得る比較的広い範囲に入る。
【０２０２】
本開示は、以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本開示の任意の態様または範囲を決して制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２０３】
実施例１：クローンジカウイルス株生成
この実施例では、既知の研究履歴を有するジカウイルス（ＺＩＫＡＶ）株の生成について記載する。
【０２０４】
材料及び方法
Ｖｅｒｏ細胞の維持
ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７細胞の１つのバイアルをウォーターバスで急速に融解し、３６℃＋／２℃、５％ＣＯ２で、Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ中の、ペニシリン−ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン４０ｍＭ、及び１０％ＦＢＳを含む、あらかじめ温めた１９ｍＬのＤＭＥＭ（ダルベッコ改変基礎培地）中に直接播種した。細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、ＴｒｙｐｌＥを使用して継代培養した。このフラスコを２つのＴ−１８５ｃｍ２フラスコに拡張し、コンフルエントになるまで増殖させ、３１×Ｔ−１８５ｃｍ２フラスコに継代培養し、細胞が１００％コンフルエントに達するまで増殖させた。トリプシン処理により細胞を回収し、８００×ｇで１０分間遠心し、１．９×１０７細胞／ｍＬの濃度で１０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭに再懸濁した。Ｖｅｒｏ細胞の１つのバイアルを急速に融解し、上述のようにＴ−７５ｃｍ２フラスコ中に蘇生した。これらを２回継代培養し、１３×Ｔ−１８５ｃｍ２フラスコで細胞バンクを生成した。トリプシン処理後、細胞を８００×ｇで遠心し、４．６８×１０５細胞／ｍＬの濃度で、凍結培地（１０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ）中に再懸濁した。この細胞バンクはクライオバイアルに分注された。
【０２０５】
Ｖｅｒｏ細胞を増殖させ、ペニシリン−ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、及び１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（ｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳ）で維持した。ＴｒｙｐｌＥｘｐｒｅｓｓは、細胞の維持とトリプシン処理に使用された。ウイルス吸着の２日前に、６ウェルプレートに３ｍＬのｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳ中の４〜５×１０５細胞／ウェルを、またはＴ−２５ｃｍ２フラスコに５ｍＬのｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳ中の７×１０５細胞を、または９６ウェルプレートに０．１ｍＬのｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳ中の１×１０４細胞／ウェルを播種した。インキュベーターを毎日モニターして、指示された温度を維持した。Ｖｅｒｏ細胞株は液体窒素で保存した。
【０２０６】
プラークアッセイ
ウイルス力価は、６ウェルプレートで増殖させたＶｅｒｏ細胞の新たに調製したコンフルエントの単層におけるプラーク滴定によって決定された。凍結したアリコートを融解し、アリコートの１０倍希釈系列を９６ウェルプレート中でｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳによって作成した。希釈したウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞単層の接種前に氷上で維持した。アッセイ時に、増殖培地を６ウェルプレートから吸引し、各ウイルス希釈液１００μＬをウェルに添加した。ウイルスは３６℃±２℃、５％ＣＯ２で６０分間吸着され、細胞シートの乾燥を防ぐためにプレートを頻繁に（１０分ごとに）揺らした。ウイルス吸着後、４０〜４１℃に維持した最初のアガロースオーバーレイ（１×ｃＤＭＥＭ−２％−ＦＢＳ＋０．８％アガロース）４ｍＬを各ウェルに添加した。アガロースを室温で３０分間固化させた後、プレートを上下逆さまにして、３６℃＋／２℃、５％ＣＯ２で４〜６日間インキュベートした。１６０μｇ／ｍＬのニュートラルレッド生体染色色素を含む２ｍＬの２番目のアガロースオーバーレイを４日目に追加した。５日目と６日目にプラークを可視化した。
【０２０７】
ＴＣＩＤ５０アッセイによるウイルスの定量
ウイルス力価はまた、９６ウェルプレートで増殖させたＶｅｒｏ細胞の新たに調製したコンフルエントの単層における滴定によって決定された。凍結したアリコートを融解し、アリコートの１０倍希釈系列を９６ウェルプレート中でｃＤＭＥＭ−２％−ＦＢＳ希釈液によって作成した。希釈したウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞単層の接種前に氷上で維持した。アッセイ時に、増殖培地を９６ウェルプレートから吸引し、各ウイルス希釈液１００μＬをウェルに添加した。プレートを３６％＋／２℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の力価は、リード／ミュンヒ計算機を使用して計算された。
【０２０８】
試験試料
ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９（ドライアイス上の１本の０．５ｍＬバイアル）を疾病管理予防センター（ＣＤＣ）から受領した。ジカウイルスの同定は、ＲＴ−ＰＣＲにより確認された。この株は、アルファウイルスとマイコプラズマの混入がＰＣＲ検査で陰性であった。この情報を表１に要約する。
【表１】
2021505648.tif 000008
【０２０９】
シークエンシング
ＱＩＡａｍｐＶｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎキットを使用して、製造元のプロトコールに従って、各分離株の安定化されたウイルス回収物からＲＮＡを抽出した。各分離株から抽出したＲＮＡを使用して、ジカウイルスゲノム全体を網羅する６つのｃＤＮＡフラグメントを作成及び増幅した。増幅されたｃＤＮＡ断片のサイズと純度を１％アガロース／ＴＢＥゲルで分析し、その後Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してゲル精製した。ＡＢＩ  ３１３０ＸＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒシークエンサーを使用して、自動シークエンシング反応を行った。Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ＳｅｑＭａｎソフトウェアを使用して、シークエンスデータを分析した。
【０２１０】
結果
アメリカでの現在のＺＩＫＡＶの発生に関連する既知の研究履歴を持つＺＩＫＡＶ株を探した。この理由から、ＺＩＫＡＶ株ＰＲＶＡＢＣ５９が選択された。Ｖｅｒｏ細胞での増殖に適応した、よく特徴付けられたウイルスを生成するために、ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９が最初にＶｅｒｏ細胞で増幅された（Ｐ１）。
【０２１１】
１００％コンフルエントなＶｅｒｏ細胞のフラスコ（Ｔ−１７５ｃｍ２）を、４ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳ中のＭＯＩ０．０１で感染させた。ウイルスを３６℃±２℃、５％ＣＯ２で６０分間単層に吸着させ、次いで３６℃±２℃、５％ＣＯ２で、２０ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳをウイルス増幅のために適用した。細胞層を、接種後の細胞変性効果（ＣＰＥ）について毎日モニターした（図１）。９６時間後に、培地を収集し、遠心分離（６００×ｇ、４℃、１０分）で清澄化することにより、上清を回収した。収集物は、トレハロースを１８％ｗ／ｖの最終濃度まで添加することにより安定化された。バルクを０．５ｍＬのクライオバイアルに分注し、−８０℃で保存した。
【０２１２】
ＴＣＩＤ５０アッセイにより、Ｖｅｒｏ細胞単層上の感染性ウイルスの存在について、安定化されたＰ１収集物を分析した。増殖キネティクスは、０時間に開始して毎日アリコートを採取することによりモニターされた。ピーク力価は７２時間までに達した（図２）。
【０２１３】
Ｖｅｒｏ細胞の６ウェル単層上で３日目からの収集物を滴定することにより、Ｐ１材料をプラーク精製した。プラークは６日目に可視化され、プラスチックプレートの底にある別個のプラークの周りに円を描くことにより、単離される１０のプラークが特定された。ウェルの底を擦過してｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳですすぎながら、滅菌広口ピペットを使用してアガロースのプラグを抽出することにより、プラークを拾った。０．５ｍＬのｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳにアガロースプラグを添加し、ボルテックスし、ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ２ａ〜ｊとラベルを付け、３６％±２℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベーターに置いた。
【０２１４】
３つのプラーク（ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ２ａ〜ｃ）をさらに精製するために使用した。各分離株は、Ｖｅｒｏ細胞の新規に調製した６ウェル単層上に２重でニートで播種した。このＰ２／Ｐ３遷移はプラーク精製され、ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ３ａ〜ｊとラベル付けされた。
【０２１５】
６つのプラーク（ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ３ａ〜ｆ）を最終回の精製のために使用した。各分離株は、Ｖｅｒｏ細胞の新規に調製した６ウェル単層上に２重でニートで播種した。このＰ３／Ｐ４遷移はプラーク精製され、ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ４ａ〜ｊとラベル付けされた。
【０２１６】
Ｐ４プラーク精製からの６つのプラーク（ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ４ａ〜ｆ）を、Ｔ−２５ｃｍ２フラスコ中のＶｅｒｏ細胞の単層上でブラインドで継代した。各プラークを拾ったものを２ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳで希釈し、１ｍＬを３６％±２℃、５％ＣＯ２で１時間吸着させ；他の１ｍＬはトレハロース（１８％ｖ／ｖ最終）で安定化され、＜−６０℃で保存された。ウイルス吸着後、ｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳを各フラスコに添加し、３６℃±２℃、５％ＣＯ２で４日間増殖させた。ウイルスの上清を回収し、遠心分離（６００×ｇ、４Ｃ、１０分）で清澄化し、１８％トレハロースで安定化し、分注して＜−６０℃で保存した。このＰ５シードは、ジカウイルス効力についてＴＣＩＤ５０によって試験された（図３）。
【０２１７】
Ｖｅｒｏ細胞のＴ−１７５ｃｍ２フラスコのコンフルエントな単層に、ＰＲＶＡＢＣ５９の６つのクローン（Ｐ５ａ〜ｆ）をそれぞれ４ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳで０．０１のＭＯＩで感染させた。ウイルスを３６℃＋／２℃、５％ＣＯ２で６０分間吸着させた後、２０ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳを各フラスコに添加し、３６℃＋／２℃、５％ＣＯ２で増殖させた。Ｖｅｒｏ細胞単層の健康とＣＰＥを毎日モニターした。示されているように（図４）、３日目及び５日目にウイルスを収集した。３日目と５日目のＰ６株収集物をプールし、１８％トレハロースで安定化し、分注して＜−６０℃で保存した。
【０２１８】
ＰＲＶＡＢＣ５９の６つのクローン（Ｐ６ａ〜ｆ）のそれぞれを、ジカウイルスのインビトロ効力について試験した（図５）。効力は、ＴＣＩＤ５０及びプラーク滴定という２つの異なる方法によって決定された。ＴＣＩＤ５０は、ＣＰＥ（顕微鏡）の目視検査と、赤（ＣＰＥなし）と比較したＣＰＥ（黄色の色）を表示するウェルの吸光度の差（Ａ５６０−Ａ４２０）を測定することによって計算された。プレートをプレートリーダーで読み取り、顕微鏡で読み取ったプレート（吸光度）と同じ計算機に適用した。２つのスコアリング手法間のＴＣＩＤ５０の値は非常によく類似するが、プラーク滴定によって得られる値は低くなっている。
Ｐ６ウイルスの生成と特性評価の概要を以下の表２に示す。
【表２】
2021505648.tif 000009
【０２１９】
フラビウイルスのエンベロープタンパク質はウイルスの主要な免疫原性部分であるため、元の分離株のエンベロープ糖タンパク質配列によく似た単離されたジカウイルスクローンを探した。ＰＲＶＡＢＣ５９クローンＰ６ａ、Ｐ６ｃ、Ｐ６ｄ、及びＰ６ｆは、エンベロープ領域のヌクレオチド９９０にＧ→Ｔ変異（Ｇ９９０Ｔ）を含み、エンベロープ残基３３０にＶａｌ→Ｌｅｕのアミノ酸変異をもたらしたが、ＰＲＶＡＢＣ５９クローンＰ６ｂ及びＰ６ｅのエンベロープ遺伝子は、参照株（ＧｅｎＢａｎｋ  ｒｅｆ  ＫＵ５０１２１５．１）と比較して同一であった（表３及び図６）。
【表３】
2021505648.tif 000010
【０２２０】
次いで、ジカエンベロープ配列に変異のない２つのクローンを全長ゲノムシークエンシングに供した。シークエンシング結果を上述の表３に要約した。配列分析により、両方のクローンのＮＳ１領域のヌクレオチド２９２でＴ→Ｇ置換が明らかになり、ＮＳ１残基９８でＴｒｐ→Ｇｌｙ変異が生じた。この変異は、後にディープシークエンシングによっても確認された。ＮＳ１のＷ９８Ｇ変異は、膜結合、エンベロープタンパク質との相互作用、及び潜在的に六量体のＮＳ１形成に関与しているＺＩＫＡＶ  ＮＳ１の翼ドメインの絡み合ったループに位置する。他のトリプトファン残基（Ｗ１１５、Ｗ１１８）はフラビウイルス全体で高度に保存されているが、Ｗ９８はそうではない（図７）。しかしながら、興味深いことに、アフリカ系統とアジア系統を含む１１種類のＺＩＫＡＶ系統にわたって、Ｗ９８残基の１００％の保存が観察されている。各株で同定された変異を表４に要約した。
【表４】
2021505648.tif 000011
【０２２１】
ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６株の表現型分析は、ＺＩＫＡＶクローンを特性評価するために実施された。図８に示され、図９で定量化されるように、各クローン分離株は、大きいプラークと小さいプラークの混合集団を有するＰ１ウイルスと比較して、大型のプラークの比較的均一な集団からなる。これらのデータは、単一のＺＩＫＡＶクローンの単離が成功したことを示唆している。
【０２２２】
次に、ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６クローンのＶｅｒｏ細胞での増殖キネティクス解析を実施した。Ｖｅｒｏ細胞を無血清増殖培地で０．０１  ＴＣＩＤ５０／細胞の各ＺＩＫＡＶ  Ｐ６クローンに感染させた。ウイルス上清試料を毎日採取し、同時にＴＣＩＤ５０アッセイにより感染力価をアッセイした。全てのＰ６クローンで、ピーク力価は３日目から４日目に発生した（約９．０  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）。様々なＰ６クローンの増殖キネティクスに有意差はなかった（図１０）。
【０２２３】
まとめると、結果はジカウイルスシードの生成が成功したことを示す。このシードの選択には、ウイルスの増殖履歴、キネティクス、収量、遺伝子型、及び表現型の理解が必要である。重要なことに、ジカウイルス株のクローン分離により、汚染物質（例えば、親のヒト分離株に存在する可能性がある外来性感染体）からのウイルス精製の成功を可能にした。興味深いことに、３つの連続したプラーク精製の成功により、Ｖｅｒｏ細胞適応ウイルス（株Ｐ６ａ〜ｆ）を迅速に選択することに成功した。これらの株は、無血清Ｖｅｒｏ細胞培養でよく複製でき、株Ｐ６ａ、ｃ、ｄ、及びｆはウイルスエンベロープタンパク質における変異を保持し、一方で株ｐ６ｂ及びｐ６ｅはウイルスＮＳ１タンパク質における変異を獲得した（ウイルスエンベロープに変更はない）。さらに、Ｖｅｒｏに適応した株は、これらの株から増殖した後続のウイルス継代の効率的かつ再現可能な増殖と製造を可能にした。理論に拘束されることを望まないが、Ｐ６ａ、ｃ、ｄ、及びｆ株で観察されたＥｎｖ−Ｖ３３０Ｌ変異は、Ｖｅｒｏ細胞で継代した際にＥｎｖ  ３３０での変異も観察されたため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ適応の結果である可能性がある（Ｗｅｇｅｒ−Ｌｕｃａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１７．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）。エンベロープタンパク質はジカウイルスの主要な免疫原性エピトープであるため、ＥｎｖにＶｅｒｏ適応変異を含む株は、ワクチンの免疫原性に悪影響を及ぼす可能性がある。理論に拘束されることを望まないが、タンパク質ＮＳ１の適応変異はウイルス複製を増強するだけでなく、ジカウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）中などの望ましくない変異の発生を減少または阻害する可能性がある。さらに、ＮＳ１はウイルスのライフサイクル中にエンベロープタンパク質に結合することが知られている可能性がある。この変異（ＮＳ１  Ｗ９８Ｇ）は、ＮＳ１が下流の処理中にウイルスと結合し、場合によっては同時に精製する能力の変化に関係している可能性がある。ＮＳ１は免疫原性でもあることが知られており、ワクチンに対する免疫応答に関与している可能性がある。
【０２２４】
実施例２：Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ株由来の精製された不活化ジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）の前臨床の免疫原性及び有効性
次の例では、Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ株に由来する不活化ジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）のＣＤ１及びＡＧ１２９マウスにおける前臨床の免疫原性及び有効性について記載する。実施例１に記載されるように、流行に関連するＰＲＶＡＢＣ５９株から６つのクローンが生成され、そしてさらなる前臨床の免疫原性及び有効性の研究のために２つ（Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ）が選択された。
【０２２５】
材料及び方法
ジカウイルスワクチンの精製、不活化及び製剤
前臨床の免疫原性と有効性の研究での使用に適した不活化ＺＩＫＡＶワクチンの多くが生成され、特性評価された。ウイルスは、０．０１のＭＯＩでコンフルエントなＶｅｒｏ細胞のフラスコに感染させることにより、Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ株から増幅された。ウイルスは３６℃±２℃／５％ＣＯ２で１時間吸着された。吸着後、２０ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳを各フラスコに添加し、３６℃±２℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。感染後３日目と５日目に細胞上清を回収し、遠心分離により細胞残屑を清澄化した。
【０２２６】
各分離株について、清澄化した上清をプールし、１８％トレハロースを含むＤＭＥＭで安定化し、＜−６０℃で保存した。プールし、清澄化したウイルス上清を３７℃のウォーターバスで融解し、ベンゾナーゼで４℃で一晩処理した。ベンゾナーゼ処理後、各試料をＳａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＰ３深層濾過に適用した。深層濾過に続いて、各試料をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０タンジェント流濾過（ＴＦＦ）装置に適用した。保持液を緩衝液交換し、希釈して、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ  ＩＥＸＮａｎｏに適用した。各試料を２回目のＳａｒｔｏｒｉｕｓ  ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ  ＩＥＸＮａｎｏに適用し、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、及び７５０ｍＭ  ＮａＣｌの３段階溶出プロセスを使用して溶出した。ＭｏｎｏＱクロマトグラフィーと希釈の後、各２５０ｍＭ溶出液を緩衝液交換のためにＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０クロスフロー濾過（ＣＦＦ）装置に適用し、ＰＢＳで３５ｍＬに希釈し、２〜８℃で保存した。
【０２２７】
ホルマリン不活化のために、新たに調製した１％ホルムアルデヒドを各精製試料にゆっくりと攪拌しながら滴下し、最終ホルムアルデヒド濃度０．０２％を得た。試料を室温（約２２℃）で１４日間、毎日反転させてインキュベートした。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０タンジェント流濾過（ＴＦＦ）装置に適用する前に、ホルムアルデヒドをメタ重亜硫酸ナトリウムで１５分間室温で中和した。５０ｍＬの原薬緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６％スクロース、ｐＨ  ７．４）を追加して、緩衝液交換を４回行った。次に、各試料を原薬緩衝液で１５ｍＬに希釈し、０．２ｍシリンジフィルターを使用して滅菌し、無菌のストッパー付きガラスバイアル（バイアルあたり０．５ｍＬ）に分注し、＜−６０℃で凍結した。
【０２２８】
ウイルスの不活化は、ＴＣＩＤ５０アッセイと二重感染性アッセイによって確認された。簡潔に述べると、原薬試料をＣ６／３６細胞に適用し、６日間増幅させた。Ｃ６／３６細胞の上清をＶｅｒｏ細胞に適用し、ＣＰＥを８日間モニターした。製剤の製剤化の場合、ＰＩＺＶ原薬のバイアルを融解し、試料の種類に応じてプールし、アルヒドロゲルを伴って、または伴わずＰＢＳで１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬに希釈し（Ｂｒｅｎｎｔａｇ；最終的に０．５  ｍｇ／ｍＬ、０．０５０ｍｇ／用量）、穏やかに攪拌しながら、２〜８℃で一晩インキュベートした。次いで、得られた製剤ロットを無菌のストッパー付きガラスバイアルに分注し、使用するまで２〜８℃で保存した。図１１は、製剤を調製するために使用されるステップの要約を提供する。
【０２２９】
マウスの免疫化と攻撃
免疫原性試験では、６週齢のオスとメスのスイスＩＣＲ（ＣＤ−１）マウスを６つの群に分けた（ｎ＝１０／群）。０日目に、群１〜５のマウスに、筋肉内（ｉ．ｍ．）経路で０．１ｍＬのワクチンを接種した（２×０．０５ｍＬ注射）。群６のマウスには、プラセボ対照としてＰＢＳを接種した。マウスは、０日目と同じ用量とワクチンタイプを使用して２８日目と５６日目にブーストされた。血液試料は、−１日目（免疫前）、２７日目（プライム）、４２日目（ブースト１）、及び７０日目（ブースト２）に収集された。
【０２３０】
免疫原性と有効性の研究では、４週齢のオスとメスのＡＧ１２９マウスを７つの群に分けた（ｎ＝５／群）。０日目に、群１〜６のマウスに、筋肉内（ｉ．ｍ．）経路で０．１ｍＬのワクチンを接種した（２×０．０５ｍＬ注射）。群７のマウスには、プラセボ対照としてＰＢＳを接種した。マウスは、０日目と同じ用量とワクチンタイプを使用して２８日目にブーストされた。血液試料は、−１日目（免疫前）、２７日目（プライム）、及び５５日目（ブースト）に尾静脈から採取された。安楽死の時点で、イソフルラン（末端）による深麻酔下で、心臓穿刺を介してマウスから採血した。５６日目に、マウスの腹腔を１０４プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９で攻撃した。
【０２３１】
血清導入
血清を、ＰＩＺＶワクチン接種及び攻撃したＡＧ１２９マウスから収集し、プール後に凍結した（表６の群１、２、４、及び５）。血清プールを融解し、ＰＢＳで血清プールを３倍に希釈することで試験試料を生成した。プラセボは、ＰＢＳ中のＡＧ１２９正常マウス血清の３倍希釈を使用して生成した。
【０２３２】
試験試料は、ＡＧ１２９マウスへの０．１ｍＬ腹腔内注射として投与された（同量のプラセボ試料が対照マウスに投与された）。次いで動物の腹腔を、１００μＬ中に１０４プラーク形成単位のジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９株で攻撃した。
【０２３３】
−１１日目（免疫前）の１０匹のマウスからの尾部出血により、重量による許容血液量が全血として採取された。全血を各マウスから１日目（一次循環Ｎａｂ）及び４日目（ウイルス血症）に尾部出血により採取した。致死的攻撃後の最後の採血は、頸部脱臼による安楽死の前に、深い麻酔下で心臓穿刺により大量の体積で行われた。血液試料をマイクロテイナーＳＳＴ血清分離ゲルチューブに収集し、少なくとも３０分間凝固させた後、遠心分離（１０，０００×ｇで２分間）により血清を分離し、−８０℃で凍結した。
【０２３４】
プラーク減少中和試験
中和抗体力価は、以前に記載されているようにプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定された（例えば、Ｏｓｏｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２０１４  Ｓｅｐ；１４（９）：８３０−８を参照されたい）。
【０２３５】
レポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）中和アッセイ
中和抗体力価は、９６ウェルプレートで増殖させたＶｅｒｏ細胞で一定量のＺｉｋａ  ＲＶＰによって血清試料を滴定することにより分析した。ＲＶＰは、ジカ（株ＳＰＨ２０１２）のｐｒＭＥタンパク質及びデング熱ベースのウミシイタケルシフェラーゼレポーターを含んでいた。簡潔に述べると、血清を５６℃で３０分間熱不活化し、希釈した後、ＲＶＰと共に３７℃でインキュベートした。次いで、血清／ＲＶＰ混合物をＶｅｒｏ細胞と混合し、ルシフェラーゼ基質で検出する前に、３７℃±２℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。データはＪＭＰ１１非線形４パラメーター解析を用いて解析し、陽性トラッキング対照に対して正規化し、有効用量５０％（ＥＣ５０）を報告した。
【０２３６】
反対の指示がない限り、全ての追加の実験方法は、上述の実施例１に記載されているように実施された。
【０２３７】
結果
６週齢のオスとメスのＣＤ−１マウスにおけるＰＩＺＶ候補の免疫原性を評価するために、ＣＤ−１マウスの群（Ｎ＝１０／群）をｉ．ｍ．経路、０．１μｇ（＋ミョウバン）、１．０μｇ（＋ミョウバン）のいずれかの用量のＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ６９  Ｐ６ｂまたはＰ６ｅウイルス株に由来するワクチンで免疫化した。アジュバントの必要性を評価するために、一群の動物に、Ｐ６ｅに由来するミョウバンアジュバントを欠く０．１μｇのワクチンを接種した。ワクチン接種は０、２８、及び５６日目に行われ、群６はプラセボ対照としてＰＢＳを受けた（図１２Ａ及び表５）。
【表５】
2021505648.tif 000012
【０２３８】
ワクチン接種後、一次（２７日目）、二次（４０日目）、及び三次（７０日目）免疫後に収集した血清試料を、ＲＶＰ中和アッセイによりＺＩＫＡＶ特異的中和抗体について試験した（図１２Ｂ）。最初の投与を受けてから２７日後、ＰＢＳプラセボ対照群と比較して、ミョウバンを含むいずれかのクローンに由来するＰＩＺＶでワクチン接種されたマウスでわずかな中和抗体応答が観察された。重要なことに、この応答は２回目の免疫（４０日目）で大幅に増加したが、３回目の免疫（７０日目）でさらに強化されなかった。非アジュバントワクチンを接種されたマウスでは中和抗体応答は観察されなかった（図１２Ｂ）。
【０２３９】
ＰＩＺＶ候補の免疫原性と保護効果を評価するために、４週齢のＡＧ１２９マウスの群（ｎ＝５／群）をｉ．ｍ．経路で、１日目と２８日目のＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂまたはＰ６ｅ株のいずれかに由来するワクチンの０．１μｇ用量（＋ミョウバン）、１．０μｇ用量（＋ミョウバン）または０．１μｇ用量（−ミョウバン）のいずれかによって免疫化された（図１３Ａ及び表６）。
【表６】
2021505648.tif 000013
【０２４０】
ワクチン接種後、ワクチン接種したマウス及び対照マウスの腹腔を、５６日目に１０４ＰＦＵのＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９（低継代）で攻撃した。一次（Ｄ２７）及び二次（Ｄ５５）免疫後に収集された血清試料を、ＺＩＫＡＶ特異的中和抗体応答について試験した（図１３Ｂ及び表７）。ミョウバンアジュバントワクチンの高用量を受けた群（群２及び５）のみが、１回の免疫後に中和抗体応答を誘発し、ブースト後に劇的に増加した。対照的に、ミョウバンアジュバント化ワクチンの低用量または高用量を投与された群は、２回目の投与後に高い中和抗体応答を示した。ワクチンを２回投与すると、Ｐ６クローンの投与量や由来にかかわらず、ミョウバンアジュバント化ワクチンを投与したマウスの群間に統計的な差はなかった。
【表７】
2021505648.tif 000014
【０２４１】
全ての群はまた、攻撃後２１日間の死亡率、罹患率、及び体重減少についてモニターされた。攻撃後のウイルス血症が検出され、プラーク滴定によって定量化された。ミョウバンと共に製剤化された低用量または高用量のＰＩＺＶ候補（群１、２、４、及び５）でワクチン接種されたマウスは、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）アッセイ及び同等の二次中和アッセイによって評価されるとき、致死的なＺＩＫＡＶ攻撃から完全に保護された（表８）。ワクチン接種されたマウスでは体重減少または病気の臨床的徴候は観察されず、攻撃の３日後に感染性ウイルス血症が検出されなかった。また、低用量または高用量の抗原＋ミョウバンのアジュバントのいずれかでワクチン接種された全てのマウスは、攻撃後２１日まで生存した（図１４〜１６）。対照的に、全てのナイーブマウスの攻撃では、攻撃後２日目にウイルス血症が高くなり、攻撃後１０日と１８日の間の罹病率／死亡率が得られた（生存期間中央値＝Ｄ１３）。さらに、ミョウバンでアジュバント化されていないＰ６ｂ株由来の低用量ワクチンでワクチン接種したマウスの攻撃は、攻撃後２日目にウイルス血症が高くなり、生存期間中央値がプラセボ対照群と同様であったが、クローンｅに由来するミョウバンでアジュバント化されていない低用量でワクチン接種したマウスは、１９日間の生存期間中央値で部分的に保護されたままであった。これらの結果は、ミョウバンでは免疫がより効果的であり、二次免疫が必要である可能性があり、低用量が高用量と同じくらい効果的であったことを示す。
【表８】
2021505648.tif 000015
【０２４２】
さらに、不活化されたＰ７ｂ及びＰ７ｅ全ウイルス（それぞれＰ６ｂ及びＰ６ｅ株からさらに１継代）から生成されたワクチン原薬（ＤＳ）におけるＮＳ１の存在が試験された。サンドイッチＥＬＩＳＡは、ジカウイルスＮＳ１のアジアとアフリカの両方の系統に反応するが、デングＮＳ１には非交差反応性のモノクローナル抗体であらかじめコートされたプレートを使用して実施された。ＤＳの２倍、４倍、８倍、１６倍、及び３２倍の希釈を二重で準備し、組換え精製ＮＳ１を０〜８ｎｇ／ｍＬの濃度で二重にして使用する標準曲線と比較した。ＤＳ緩衝液のみの二重の希釈液を陰性対照として調製した。結合したＮＳ１が抗ＮＳ１  ＨＲＰコンジュゲートで検出され、ＤＳ緩衝液のみのウェルの吸光度（Ａ４５０−Ａ６３０）が、一致するＤＳ試料を含むウェルで測定された吸光度から差し引かれた。サンドイッチＥＬＩＳＡの結果を以下の表９に示す。興味深いことに、ＮＳ１はワクチン原薬調製物と一緒に精製されることが観察され、ウイルスＮＳ１が不活化全ウイルスワクチンの免疫原性成分であり得ることを示唆している。
【表９】
2021505648.tif 000016
【０２４３】
次に、抗体の受動移入の後、野生型ジカウイルス攻撃からの保護を与えるために必要な中和抗体（Ｎａｂ）の閾値を試験した（表１０Ａ及びＢ）。
【表１０】
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【０２４４】
ワクチン接種及び攻撃されたＡＧ１２９マウスからのプールされた血清をＰＢＳで３倍で連続希釈し、５〜６週齢のＡＧ１２９マウスの７群（Ｎ＝５／群）に腹腔内注射した。免疫前ＡＧ１２９マウス血清をプラセボ対照として使用した（群８）。受動的移入後（約１６〜１９時間後）、全血を採取し、循環中和抗体力価の決定のためにウイルス攻撃の前に各マウスから遠心分離により血清を分離した（図１７）。ウイルス攻撃の直前に、マウスの群（群１、２、３、４、５、６、７、８と指定）の平均ｌｏｇ１０中和抗体力価は、それぞれ、２．６９、２．２６、１．７２、１．３０、＜１．３０、＜１．３０、＜１．３０、＜１．３０であった。
【０２４５】
ＺＩＫＶ  ｎＡｂの受動的移入の２４時間後、マウスの腹腔を１０４  ｐｆｕのＺＩＫＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９で攻撃した。攻撃後、動物の体重を毎日測定し、病気の徴候について、日１〜３回２８日間モニターした。症状に基づいて各動物に臨床スコアが与えられた（表１１）。瀕死の及び／または明らかな神経学的徴候（臨床スコア≧２）を示した動物は人道的に安楽死させ、非生存者として数えた。
【表１１】
2021505648.tif 000018
【０２４６】
疾患の徴候は、対照群（群８）及び群５〜７において攻撃後９日で出現し始め、対応する体重減少を伴った（図１８）。全血を採取し、攻撃の３日後に各動物から遠心分離により血清を分離した。血清試料を、プラーク滴定アッセイを使用して感染性ＺＩＫＶの存在について分析した（図１９）。群１〜８のマウスの平均感染力価（ｌｏｇ  １０ｐｆｕ／ｍＬ）は、それぞれ１．６６、２．７４、４．７０、４．９２、７．２４、７．５４、７．５４、及び７．４６であった。重要なことに、検出可能なレベルのＺＩＫＶ中和抗体（≧１．３０ｌｏｇ１０）を持つ群１〜４のマウスは、対照マウスよりも統計的に有意に低いレベル（１０２．５〜１０６．０倍低い力価）のウイルス血症（ｐ＝０．０００１、０．０００３、０．０００７、及び０．０３７４）を有した。これらの結果は、検出可能なレベルのＺＩＫＶ中和抗体（≧１．３０  ｌｏｇ１０）がウイルス血症を用量依存的に減少させることを示唆している。
【０２４７】
群１〜８のマウスの生存期間中央値は、それぞれ、未決定、１７日、１７日、１３日、１１日、１１日、１１日、１０日であった（図２０）。重要なことに、検出可能なＺＩＫＶ中和抗体力価（群１〜４）を持つマウスの群の生存曲線は、対照群（群８）と比較して統計的に異なっていた（それぞれｐ＝０．００１９、０．００１９、０．００１９、０．０１５３）。これらの結果は、検出可能なレベル（≧１．３０  ｌｏｇ１０）のＺＩＫＶ中和抗体が疾患の発症を用量依存的に遅らせることを示唆している。
【０２４８】
最後に、各動物のＺＩＫＶ中和抗体力価を対応するウイルス血症力価に対してグラフ化し、線形回帰分析を実施した。攻撃後３日目におけるＺＩＫＶ中和抗体力価とウイルス血症レベルとの間に非常に逆相関の関係が観察された（図２１）。受動的移入研究の結果の要約を以下の表１２に示す。
【表１２】
2021505648.tif 000019
【０２４９】
この実験ではＺＩＫＡＶ中和抗体を投与されたマウスの群は致死的なＺＩＫＡＶ攻撃から完全に保護されなかったが、検出可能なレベルの循環ＺＩＫＡＶ中和抗体力価を有するマウスの群間で、用量依存的にウイルス血症レベルが低下し、疾患の発症が遅れることが示された。
【０２５０】
まとめると、ＣＤ−１とＡＧ１２９の両方のマウスの研究から得られた前臨床データは、別個のよく特徴付けられたウイルスクローンに由来するＰＩＺＶが免疫原性であり、野生型ＺＩＫＡＶの攻撃に対する防御を提供できることを示す。重要なことに、低用量と高用量のワクチンは２回の投与後に同様の中和抗体応答を誘発し、致死的なＺＩＫＡＶ攻撃に対して同様のレベルの防御を提供した。興味深いことに、アジュバントのないＰＩＺＶ候補をワクチン接種したマウスも、ＺＩＫＡＶ攻撃からの部分的な防御を示した。ワクチン抗血清は、受動免疫されたＡＧ１２９マウスのウイルス血症を有意に減少させ、致死的なＺＩＫＡＶ攻撃に対する生存を延長した。これらの結果はまた、よく特徴付けられたＰＩＺＶ候補が、ＺＩＫＡＶ感受性の高いＡＧ１２９マウスモデルでＺＩＫＡＶ感染に対して非常に効果的であったことも示す。
【０２５１】
さらに、継代７のＰＲＶＡＢＣ５９（ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｅからの）の配列は、継代６の配列と遺伝的に同一であることが見出された。これは、フラビウイルスが遺伝的に不安定であると一般にみなされていることを考慮すると驚くべきことであった。ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｅは、一部は７継代にわたるその遺伝的安定性により、マスターウイルスシードとして選択された。理論に拘束されることを望まないが、この強化された遺伝的安定性は、ＮＳ１の翼ドメインの単一アミノ酸置換（Ｗ９８Ｇ）が原因である可能性があると考えられている。これは、Ｖｅｒｏ細胞に適応したＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ゲノムで観察された唯一の変異であった。さらに、遺伝的安定性と均質性は、ばらつきを減らし、ワクチン製剤に使用できる後続の株の再現可能な生産を増やすという点で有利である。
【０２５２】
実施例３：Ｐ６ａ及びＰ６ｅ株の表現型の前臨床評価
材料及び方法
ＡＧ１２９マウス（インターフェロンα／β及びγ受容体を欠いている）は、ＺＩＫＶ感染症及び脳の重篤な病状を含む疾患に感受性である。１４週齢のＡＧ１２９マウスに、１０４及び１０３ｐｆｕのＺＩＫＶ継代６クローンａ（Ｐ６ａ）及びｅ（Ｐ６ｅ）を腹腔内感染させた。
【０２５３】
マウスの体重を量り、毎日（最大２８日間）病気の臨床的徴候（体重減少、波立つ毛皮、体のむくみ、嗜眠、四肢脱力、部分的／完全麻痺）をモニターした。さらに、ウイルス血症の分析は、実施例１に記載されるように、攻撃後３日後に収集された血清試料のプラーク滴定によって行われた。
【０２５４】
結果
Ｐ６ｅによる感染は１００％の死亡率（生存期間中央値＝１２．５日）をもたらしたが、Ｐ６ａによる感染はわずか３３％の死亡率（中央生存期間＝未決定）をもたらした（図２２）。これと一致して、ｐｒｅＭＶＳ  Ｐ６ｅ感染マウスは、ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ａ感染マウスと比較してより大きな体重減少を示した（３）。ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ａまたはＰ６ｅに感染したマウスの群間で、平均群ウイルス血症レベルに統計的差異は見られなかった（図２４）。これらのデータは、（両方の株が同様のウイルス血症とｉｎ  ｖｉｔｒｏでの同様のピーク力価を生成したため）増殖キネティクスだけでは重要な決定要因ではない可能性があり、エンベロープタンパク質の特性が（野生型株の）病原性と（不活化された候補の）免疫原性に重要であり得たことを示している。
【０２５５】
実施例４：Ｐ６ｅ株由来の精製された不活化ジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）の臨床の免疫原性及び有効性
次の例では、フラビウイルスナイーブ患者における精製された不活化ジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）の臨床免疫原性及び有効性研究について記載する。
【０２５６】
臨床免疫原性と有効性の研究での使用に適した精製した不活化ジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）のロットが生成され、特性評価された。
【０２５７】
不活化されたジカウイルス活性剤はもはや、不活化されていないジカウイルスに感染する可能性がある宿主細胞に感染することができない。例えば、不活化されたジカウイルスは、もはやＶＥＲＯ細胞に感染して、ＶＥＲＯ細胞に細胞変性効果を及ぼすことができない。
【０２５８】
精製された不活化ジカウイルスの量は、規定の量の組換えジカエンベロープタンパク質を使用して、標準曲線を確立する、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定することができる（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７６）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）。
【０２５９】
精製されたジカウイルスの純度は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定できる。この実施例では、精製されたジカウイルスの、サイズ排除クロマトグラフィーにおけるメインピークが、サイズ排除クロマトグラフィーの曲線下の総面積の８５％を超えていた。
【０２６０】
治験ワクチン（ＰＩＺＶ）は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にアジュバントとして２００μｇの水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３を共に製剤化したジカ精製ホルマリン不活化ウイルスを指す。最終的な液体製剤製品は、使い捨てバイアルに充填され、不正開封防止シールで密封される。治験ワクチンは、２８日間隔で、１用量あたり２、５、または１０μｇの抗原で０．５ｍＬの２用量レジメンとしてＩＭ（筋肉内）で投与される。
【０２６１】
注射用塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）０．９％溶液がプラセボとして使用される。これは使い捨てバイアルで提供される。これは、非経口での使用のみを目的として設計された保存剤を含まない、塩化ナトリウムの無菌で透明な無色の液体溶液である。プラセボは、２８日間隔で、１用量あたり０．５ｍＬの２用量レジメンとしてＩＭで投与される。
【０２６２】
試験方法
ＰＲＮＴアッセイ：中和抗体力価は、先に記載されたようなプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定された（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ａｆｔｅｒ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．１９３，  １６５８−１６６５  （２００６）  Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  Ｋ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＢＤ，  Ａｇａｒｗａｌ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＺＩＫＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐａｓｓｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｒＭＥｎｖ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ．  ＮＰＪ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２０１６；１：１６０２１を参照されたい）。ＰＲＮＴアッセイ開発に使用したジカ株はＰＲＶＡＢＣ５９であった。
【０２６３】
免疫結果測定：
定義：
血清陽性（ＰＲＮＴ）：≧ＬＯＤ（検出限界）の力価
【０２６４】
血清陰性（ＰＲＮＴ）：＜ＬＯＤ（検出限界）の力価
【０２６５】
抗体陽転（ＰＲＮＴ）：最初は血清陰性の対象におけるワクチン接種後の≧ＬＯＤの力価
【０２６６】
ＬＯＤ（ＰＲＮＴ）＝１０
【０２６７】
ＬＯＤ未満の割り当て値＝５
【０２６８】
ＬＬｏＱ（定量下限、ＰＲＮＴ）＝２６
【０２６９】
ＬＬｏＱ（定量下限）未満の割り当て値＝１３
【０２７０】
レポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）中和アッセイ：中和抗体力価は、９６ウェルプレートで増殖させたＶｅｒｏ細胞で一定量のＺｉｋａ  ＲＶＰによって血清試料を滴定することにより分析した。ＲＶＰは、ジカ（株ＳＰＨ２０１２）のｐｒＭＥタンパク質及びデング熱ベースのウミシイタケルシフェラーゼレポーターを含んでいた。簡潔に述べると、血清を５６℃で３０分間熱不活化し、希釈した後、ＲＶＰと共に３７℃でインキュベートした。次いで、血清／ＲＶＰ混合物をＶｅｒｏ細胞と混合し、ルシフェラーゼ基質で検出する前に、３７℃±２℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。データはＪＭＰ１１非線形４パラメーター解析を用いて解析し、陽性トラッキング対照に対して正規化し、有効用量５０％（ＥＣ５０）を報告した。
【０２７１】
研究の記載
フラビウイルスナイーブ及びプライムされた１８歳〜４９歳の健康な成人における、精製された不活化ジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）のフェーズ１、無作為化、評価者盲検、プラセボ対照、安全性、免疫原性、及び用量範囲研究
【０２７２】
研究デザインを図２５に示す。この研究は、１８歳から４９歳までのフラビウイルスナイーブ及びフラビウイルスでプライムされた健康な成人を順次登録するように設計された。２つの連続したコホートはそれぞれ、３０人の対象の４つの群の１つにランダムに割り当てられた１２０人の対象（計画）からなり、ＰＩＺＶワクチンまたは生理食塩水プラセボの３つの投与量のいずれかを投与される。ワクチン接種計画は、２８日間隔で投与される２回の投与からなる。この例のデータは、フラビウイルスのナイーブな対象（ｎ＝１２４）にのみ関連しており、フラビウイルスでプライムされた対象のさらなるデータが予想される。この例では、「フラビウイルスナイーブコホート」の５７日目（投与２の後２８日目）に続く最初の中間分析からのデータを提供する。フラビウイルスでプライムされたコホートからのデータは、この中間分析の一部ではない。この群の募集は、最初の中間分析時にはまだ進行中であったためである。
【０２７３】
要約すると、対象は４つの研究群に無作為に割り付けられ、プラセボ（生理食塩水）または２μｇ、５μｇ、及び１０μｇの濃度の精製された不活化ジカワクチン（ＰＩＺＶ）のいずれかの２回の投与を受けた。研究には、１日目と２９日目のワクチン（またはプラセボ）の筋肉内注射が含まれ、血液試料は研究の−１５、１、８、２９、３６、５７、２１１、３９３、７６７日目に採取した。−１５日目の血液試料を使用して、フラビウイルスの血清状態スクリーニングと適格性スクリーニングを判定した。１日目、２９日目、５７日目の試料は免疫原性評価のためのものであった。安全性実験室試験は、８日目と３６日目に行われた。免疫の持続性は２１１、３９３、７６７日目に評価される。
【０２７４】
用量２の２８日後のデータに基づくと、精製された不活化ジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）は、１８〜４９歳のフラビウイルスナイーブの成人で安全かつ免疫原性であった。
【０２７５】
主要目的
研究の主要目的は、２８日間隔で与えられたＰＩＺＶの２つの用量の安全性を記載し、その後の臨床研究で使用するために３つの異なる抗原濃度（２、５、または１０μｇ）から用量レベルを選択することであった。主要評価項目は、ＰＩＺＶまたはプラセボの各用量の投与後７日間に、応答型の、局所及び全身の有害事象（ＡＥ）が発生した対象のパーセンテージと、ワクチン接種後の２８日間に、非重篤な非応答型有害事象及び重篤な有害事象（ＳＡＥ）が発生した対象のパーセンテージであった。
【０２７６】
副次目的
副次目的は、フラビウイルスナイーブ成人における、投与１の２８日後及び投与２の２８日後の精製された不活化ジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）に対する免疫応答を記載するものであった。これらの目的に関連する副次的評価項目は、検討した時点での中和抗ＺＩＫＶ抗体の幾何平均力価（ＧＭＴ）、血清陽性率（ＳＰＲ）、抗体陽転率（ＳＣＲ）である。
【０２７７】
データの分析は、個別の治療割り当てにアクセスできる別の盲検化されていない統計家とプログラマーのセットによって実行された。試験の実施に関与した全ての職員は、個々の対象の治療割り当てについて盲検化されていた。研究チームは群レベルの非盲検結果のみにアクセスできた。
【０２７８】
研究対象集団：
合計１２４人の対象がフラビウイルスナイーブコホートに登録され、ＰＩＺＶまたはプラセボの少なくとも１回の投与を受けた全ての無作為化対象で構成される安全性セット（ＳＳ）に含まれた。それらのうち、１１８人（ＳＳの９５．２％）は、少なくとも１用量の治験ワクチン（ＰＩＺＶ）／プラセボを投与された無作為化対象の完全分析セット（ＦＡＳ）に含まれ、ベースライン及び少なくとも１回のワクチン接種後で有効な血清学結果を提供した。免疫原性分析に関連する主要なプロトコール違反がなかったＦＡＳの対象のパー・プロトコル・セット（ＰＰＳ）には、１１３人の対象（ＳＳの９１．１％）が含まれていた。分析セットを表１４に示す。
【表１３】
2021505648.tif 000020
安全性セット＝ＰＩＺＶまたはプラセボの少なくとも１回の投与を受けた全ての無作為化対象
完全分析セット＝ＰＩＺＶ／プラセボの少なくとも１回の投与を受け、有効なベースラインと少なくとも１回のワクチン接種後の血清学結果を提供した全ての無作為化された対象
パー・プロトコール・セット＝重大なプロトコール違反がなかったＦＡＳの全ての対象
【０２７９】
ＳＳの対象は、３５．３±８．９１歳（平均±標準偏差）で、１８〜２９歳の範囲で２８．２％、３０〜４９歳の範囲で７１．８％として分布していた。女性はコホートの５４．８％を占めた。研究参加者は、人種と民族に関して、白人（８１．５％）、黒色（１４．５％）、及び「非ヒスパニック」（９３．５％）であった。ＳＳの平均ＢＭＩは２７．５±４．０５（平均±標準偏差）であった。人口統計的特性（年齢、性別、身長、体重、ＢＭＩ、及び民族）は、４つの研究群間で全体的に類似していた。女性が研究参加者の６６％を占めるプラセボ群では、性別分布がよりバランスの取れた他の群と比べて、女性の方が代表的であった。人口統計とベースラインの特性を表１５に示す。
【０２８０】
安全性実験室パラメーターとバイタルサインは、選択基準の一部として研究のエントリー時にチェックされた。これらは、バイタルサインが通常の制限内にある必要があること（すなわち、ＦＤＡ毒性等級スケールで示されるとき、グレード１未満である必要があること）、及び安全性実験室試験はＦＤＡ毒性等級スケールで定義されるとき、通常の制限内にあるか、グレード１を超えてはならないことを指定している。
【表１４】
2021505648.tif 000021
ＢＭＩ＝体重（ｋｇ）／身長２  （ｍ２）。
注１：年齢は、インフォームドコンセントの日付を使用して計算される。
注２：複数の人種カテゴリーが選択されている場合のみ、対象は多民族カテゴリーに含まれる。
【０２８１】
安全性／反応性
応答型局所有害事象（ＡＥ）の全体的な報告発生率は、プラセボ群よりもワクチン（ＰＩＺＶ）接種群で高かった。疼痛は、注射部位で最も頻繁に報告された応答型ＡＥであった。投与１の後、ＰＩＺＶ群の対象の３０．０％〜３８．７％が疼痛を経験したのに対し、プラセボ群での疼痛は１３．８％であった。投与２の後、疼痛の発生率は投与１の後のそれと同様であった：ＰＩＺＶ群で２９．６％〜４０％、プラセボ群で１４．３％。疼痛の強度は、投与１後は軽度、投与２後は軽度から中等度と報告され、５μｇＰＩＺＶ群の２人の対象（６．７％）と１０μｇＰＩＺＶ群の１人の対象（３．３％）が中程度の疼痛を報告した。その他の応答型局所ＡＥ（紅斑、腫脹、及び硬結）は、対象の９．７％以下で報告された。
【０２８２】
疼痛の発生は、対象の９０％で１日目に、または２日目（３人の対象）で発生した。プラセボまたはＰＩＺＶ群の対象では、５日目を超えて疼痛は報告されなかった。
【０２８３】
何らかの性質の応答型全身性ＡＥは、投与１後に、ＰＩＺＶ群全体で対象の３０％〜４８．４％、プラセボ群では４１．４％で報告された。投与２後、発生率はＰＩＺＶ群全体で１０％〜３３．３％、プラセボ群で２７．６％であった。応答型全身性ＡＥの全体で８１．３％（投与１）及び７５％（投与２）は、研究ワクチン接種に関連すると判断された。両方の投与後、最も多く報告された全身事象は頭痛、疲労、及び筋肉痛であった。
【０２８４】
ほとんどの全身性ＡＥは軽度、すなわち、日常の活動を妨げないと報告された。いくつかの発生は中程度の強度であった：
投与１後、ＰＩＺＶ群の対象の６．７〜１２．９％及びプラセボ受容者の１７．２％；
投与２後、ＰＩＺＶ群全体で０〜３．３％、プラセボ群で１０．３％。
【０２８５】
重度のＡＥの単一の報告があった：プラセボ群の１人の対象が熱を経験した。この研究参加者は、２回目の研究ワクチン接種を受けてから４日後に経口で測定した３９．４℃の温度を示した。この熱は研究者によって研究関連として判断されなかった。
【０２８６】
応答型全身性ＡＥは、４つの群で７日間にわたって様々に報告された。発熱、疲労、関節痛、筋肉痛の発症は主にワクチン接種後２日間であり、頭痛と倦怠感については、変動していた。４日目にプラセボ群で重度の発熱を報告した対象以外で、ワクチン接種後２日間に発熱が報告された。
【０２８７】
ワクチン接種７日後の応答型の局所的及び全身性の有害事象の発生率を表１６に示す。
【表１５】
2021505648.tif 000022
Ｎ＝情報が入手可能な対象の数。ｎ（％）＝特定のＡＥを報告している対象の数（パーセント）。
【０２８８】
対象の合計３０．６％が、任意の投与後２８日間に、非応答型ＡＥ（長期応答型ＡＥは含まない）を報告した：ＰＩＺＶ群で２１．９〜３８．７％、プラセボ群で３６．７％。これらのＡＥは、主に感染症、寄生虫症（１３．７％）、及び神経系障害（３．２％：頭痛、片頭痛、めまい）であった。全てが軽度から中程度の強度であった。
【０２８９】
非応答型ＡＥは、３人の対象（２．４％）で研究ワクチン接種に関連するとみなされた。報告されたイベントは次のとおりであった。
投与１後で、５μｇＰＩＺＶ群の１人の対象のめまいと２μｇＰＩＺＶ群の１人の対象の紅潮；
投与２後で、１０μｇＰＩＺＶ群の１人の対象の目の掻痒と流涙の増加。
【０２９０】
これらは軽度から中程度の強度で、ワクチン接種後１日または２日から始まり、１〜３日の期間続き、全て回復した。
【０２９１】
１人の対象は、投与１後の頭痛のために研究ワクチン接種を中止した。この対象はＰＩＺＶを受け、ワクチン接種の１日後に頭痛を経験した。頭痛は発症後３６日で解消した。投与１から投与２の２８日後までの期間、重篤な有害事象（ＳＡＥ）は報告されなかった。
【０２９２】
ワクチン接種後７日間に血液安全検査値で観察されたベースラインからのいくつかの変化、例えば、正常から軽度、または軽度から中程度のＡＥが、４つの群間で同等のパーセンテージで発生した。尿検査パラメーターは全ての時点で正常であったか、または等級カテゴリーは群間と訪問間で類似していた。
【０２９３】
免疫原性
表１７は、ＰＲＮＴによって測定されるときの、ジカウイルス中和抗体の幾何抗体価（ＥＣ５０）、ならびに各ワクチン投与後の血清陽性率及び抗体陽転率を示す。
【０２９４】
ＰＩＺＶワクチンは、フラビウイルスナイーブの成人において免疫原性であった。全ての対象はベースラインで血清陰性であった。ジカウイルスに対する抗体に対して最初に血清陰性であった対象へのワクチン接種は、任意の投与量のＰＩＺＶワクチンを２回投与した後、全ての対象で血清陽性を誘発し：抗体陽転率は、投与１後６９．２３％〜９６．４３％の範囲であり、投与２後１００％であった。プラセボ群の全ての対象は、検討された期間にわたって血清陰性を維持した。
【０２９５】
投与１後の血清陽性率と各投与後のＧＭＴに対し、用量範囲での影響が観察された。最初の投与後、１０μｇのＰＩＺＶ投与を受けたほとんど全ての対象（９６．４％）がジカウイルスに対する中和抗体を獲得した。３つＰＩＺＶ群では、２回目の投与により、ＧＭＴが投与１から１０倍以上増加した。
【表１６】
2021505648.tif 000023
Ｎ＝利用可能なＰＲＮＴデータを持つＰＰＳの対象数。
血清陽性は≧１０の力価として定義される。抗体陽転は、次のように定義される：ベースラインで血清陰性の対象（力価＜１０）が、ワクチン接種後に≧１０の力価を持つ；＜１０の結果には５の力価が割り当てられる；≧１０の力価（検出限界）及び＜２６の力価（定量下限）には、１３の値が割り当てられる。
【０２９６】
表１７に従って、ＰＲＮＴを使用して決定された幾何平均力価を図２６にグラフで示す。表１７に従ってＰＲＮＴを使用して決定される抗体陽転を達成する対象のパーセンテージを図２７にグラフで示す。
【０２９７】
投与１後及び投与２後の中和力価の分布は、それぞれ図２８及び２９の逆累積分布曲線に示される。
【０２９８】
ＰＲＮＴアッセイで免疫応答を測定することに加えて、試料はＲＶＰ中和アッセイでも試験された。表１８は、ＲＶＰアッセイで測定するときの、ジカウイルス中和抗体の幾何抗体価（ＥＣ５０）を示す。ＲＶＰアッセイの結果は、ＰＲＮＴデータと同様の用量範囲の効果を示しており、ＰＩＺＶ用量の増加に伴ってＧＭＴが徐々に高くなっている。
【表１７】
2021505648.tif 000024
Ｎ＝利用可能なＲＶＰデータを持つＰＰＳの対象数。
【０２９９】
結論
ＰＩＺＶワクチンは、フラビウイルスナイーブコホートで評価された全ての抗原用量に対して忍容性が高く、安全であった。応答型全身性ＡＥは全ての群で報告され、用量強度の増加に伴う明らかな増加はなく、強度は軽度から中程度であった。報告された局所応答型ＡＥも、群全体で強度が軽度から中程度であった。４つの研究群で同様の頻度で非応答型症状が報告された。全体として、ワクチンはフラビウイルスナイーブの対象において免疫原性であり、陽性の用量範囲の応答が観察された。
【図１】
2021505648.tif 000025
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2021505648.tif 000035
【図１２Ａ】
2021505648.tif 000036
【図１２Ｂ】
2021505648.tif 000037
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2021505648.tif 000039
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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