(57)【要約】  本開示は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する抗体の誘発に使用するための抗原性ＲＳＶポリペプチドに関する。ＲＳＶポリペプチドおよびフェリチンタンパク質を含む抗原性ポリペプチドもまた開示される。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む抗原性ＲＳＶポリペプチドであって、融合前ＲＳＶ  Ｆと融合後ＲＳＶ  Ｆの間で共有されるＲＳＶポリペプチドのエピトープがブロックされている、前記抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項２】
ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む抗原性ＲＳＶポリペプチドであって、該ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号２６のアミノ酸残基６２〜６９および１９６〜２０９、ならびに配列番号２６の３２８、３４８、または５０７位に対応するアスパラギンを含む、前記抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項３】
融合前ＲＳＶ  Ｆと融合後ＲＳＶ  Ｆの間で共有されるＲＳＶポリペプチドのエピトープがブロックされている、請求項２に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項４】
融合前ＲＳＶ  Ｆを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項５】
Ｄ２５またはＡＭ１４から選択される融合前ＲＳＶ  Ｆ特異的抗体によって認識される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項６】
融合前ＲＳＶ  Ｆが、融合後ＲＳＶ  Ｆ上に見出されないエピトープを含む、請求項４または５に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項７】
融合後ＲＳＶ  Ｆを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項８】
エピトープが、アスパラギンに結合したＮ−グリカンでブロックされている、請求項１または３〜６のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項９】
アスパラギンが野生型ＲＳＶ  Ｆ配列（配列番号２６）中の非アスパラギン残基に対応し、場合により、該非アスパラギン残基が配列番号２６の３２８、３４８、または５０７位に対応する、請求項８に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項１０】
フェリチンタンパク質をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項１１】
フェリチンが、表面に露出したアミノ酸をシステインで置き換える変異を含む、請求項１０に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項１２】
ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよびフェリチンタンパク質を含む抗原性ＲＳＶポリペプチドであって、該フェリチンタンパク質が、表面に露出したアミノ酸をシステインで置き換える変異を含む、前記抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項１３】
フェリチンが、Ｈ．ピロリ（H. pylori）フェリチンのＥ１２Ｃ、Ｓ２６Ｃ、Ｓ７２Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｋ７９Ｃ、Ｓ１００Ｃ、およびＳ１１１Ｃ変異のうちの１つもしくはそれ以上、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける１つまたは複数の対応する変異を含む、請求項１１または１２に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項１４】
表面に露出したアミノ酸を介してフェリチンに連結された１つまたはそれ以上の免疫刺激性部分を含み、場合により、該表面に露出したアミノ酸が変異から生じるシステインである、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項１５】
フェリチンが、表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸で置き換える変異を含み、場合により、該アスパラギンが、Ｈ．ピロリフェリチンの１９位、またはペアワイズまたは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンの類似の位置にある、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項１６】
フェリチンが、内部システインを非システインアミノ酸で置き換える変異を含み、場合により、該内部システインが、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に対応する位置にある、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項１７】
ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、部位０エピトープである融合後ＲＳＶ  Ｆ上に見出されないエピトープを含み、場合により、該部位０エピトープが配列番号２６のアミノ酸残基６２〜６９および１９６〜２０９を含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項１８】
ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号２６の３２８位に対応する位置にアスパラギンを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項１９】
ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号２６の３４８位に対応する位置にアスパラギンを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項２０】
ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号２６の５０７位に対応する位置にアスパラギンを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項２１】
ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号２６のリシン４９８位に対応する位置にロイシンを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項２２】
ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号２６のイソロイシン２１７位に対応する位置にプロリンを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項２３】
ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号２６の１５５位に対応する位置にシステイン以外のアミノ酸、および／または配列番号２６の２９０位に対応する位置にシステイン以外のアミノ酸を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号２６の１５５位に対応する位置にセリン、および／または配列番号２６の２９０位に対応する位置にセリンを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項２５】
ＲＳＶ  Ｆポリペプチドがフリン切断部位を欠損し、場合により、リンカーがフリン切断部位の代わりに存在する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項２６】
ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号１７のアミノ酸１〜４７８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項２７】
ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号１７の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号１７のアミノ酸１〜４７８を含む、請求項２６または２７に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項２９】
ＲＳＶポリペプチドが、配列番号２３のアミノ酸１〜４７８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項３０】
ＲＳＶポリペプチドが、配列番号２３の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜１９または２９のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号２３のアミノ酸１〜４７８を含む、請求項２９または３０に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項３２】
配列番号３〜２３のいずれか１項に記載の配列を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【請求項３３】
請求項１０〜３２のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドを含むフェリチン粒子。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドまたはフェリチン粒子、およびＲＳＶ  Ｇポリペプチドを含む組成物。
【請求項３５】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドもしくはフェリチン粒子を含む組成物、または請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法において、またはＲＳＶ感染に対する対象の保護に使用するための、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド、フェリチン粒子、または組成物。
【請求項３７】
対象に請求項１〜３６のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド、フェリチン粒子、または組成物のうちのいずれか１つまたはそれ以上を投与することを含む、ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法、またはＲＳＶ感染に対して対象を保護する方法。
【請求項３８】
対象がヒトである、請求項３６または３７に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド、フェリチン粒子、組成物、または方法。
【請求項３９】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドをコードする核酸であって、場合により、核酸がｍＲＮＡである前記核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、２０１８年４月３日に提出された米国仮特許出願第６２／６５２，１９９号の利益を主張する。
【０００２】
本出願は、配列表を含有し、それらはＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年３月２７日に作成され、名称は２０１９−０３−２７＿０１１２１−００３１−００ＰＣＴ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは１８７，３５４バイトである。
【背景技術】
【０００３】
ワクチン学の分野での多くの成功にも関わらず、生命を脅かす多くの感染疾患からヒトを保護するために、新規打開策が必要である。現在認可されている多くのワクチンは、何十年も前の技術に依存して生弱毒化または不活化死菌ワクチンを産生しているが、これらは固有の安全性の懸念を有し、多くの場合、ごく短命な弱い免疫応答を刺激するに過ぎず、複数回用量の投与を必要とする。遺伝子工学および生化学工学の進歩により、難題である疾患標的に対する治療薬を開発することが可能となっているが、ワクチン学の分野へのこれらの応用は、まだ十分に実現されていない。現在、組換えタンパク質技術は、最適な抗原の設計を可能にしている。さらに、ナノ粒子は、最適な抗原提示および標的薬物送達の可能性をますます実証している。複数の抗原を付着させたナノ粒子は、それらの分子カーゴの多価ディスプレイによってもたらされる結合アビディティを増加させ、それらのナノスケールのサイズのために生物学的障壁をより効率的に通過する能力が示されている。インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タンパク質に融合したヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）（Ｈ．ピロリ）フェリチンナノ粒子は、マウスインフルエンザモデルにおいて抗原安定性を改善し、免疫原性を増加させた（非特許文献１を参照されたい）。この融合タンパク質は、８面体の対称性ナノ粒子へと自己集合して８個の３量体ＨＡスパイク構造を提示し、アジュバントと共に使用する場合、様々な前臨床モデルにおいて強力な免疫応答を与える。
【０００４】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、乳児における重症呼吸器疾患の主要な原因であり、高齢者における呼吸器の病の主要な原因である。何十年にもわたる研究にもかかわらず、ワクチンの需要は依然として満たされていない。ワクチンの必要性は明らかであるが、ＲＳＶワクチンの開発は、ホルマリン不活化ＲＳＶウイルスを用いた臨床試験が、ＲＳＶ感染後、乳児において疾患をより重症にした１９６０年代に妨げられた。非特許文献２を参照されたい。より最近では、融合後コンフォメーションにおいてＲＳＶ  Ｆ抗原を用いた臨床プログラムでは、成人において十分な有効性を引き出すことができなかった。非特許文献３を参照されたい。しかしながら、融合前コンフォメーションで安定化されたＲＳＶ  Ｆ抗原は、臨床において失敗した融合後の抗原よりも優れた中和反応を誘発する可能性がある。
【０００５】
本明細書において、ＲＳＶポリペプチドを含む一連の新規なポリペプチド、ナノ粒子、組成物、方法、および使用を提示する。融合前ＲＳＶ  Ｆと融合後ＲＳＶ  Ｆの間で共有されるＲＳＶポリペプチドのエピトープが、例えば、変異によって付加されたグリコシル化部位のＮ−グリカンによってブロックされているポリペプチドを含む、新規なＲＳＶ  Ｆポリペプチドを生成した。また、これらの新規なＲＳＶポリペプチドおよびフェリチンを含む抗原性ポリペプチドおよびナノ粒子もまた生成した。ＲＳＶ  Ｇポリペプチドを含む抗原性フェリチンポリペプチドもまた生成した。さらに、ＲＳＶポリペプチドおよびフェリチンを含む自己アジュバント性抗原性ポリペプチドが開発され、アジュバントなどの免疫刺激性部分が抗原性ポリペプチドに直接化学的に結合している。免疫刺激性部分の抗原性ポリペプチドへの直接結合は、単一の巨大分子実体中の免疫刺激性部分とＲＳＶポリペプチドとの標的化された同時送達を可能にし、抗原、および別個の分子としてアジュバントなどの免疫刺激性分子を含む従来のワクチンで懸念される全身毒性の可能性を大幅に減少させることができる。巨大分子実体中のＲＳＶポリペプチドとともに免疫刺激性部分の同時送達すること、およびそれらの多価提示もまた、防御を誘発するのに必要な総用量を減少させ、製造負荷およびコストを減少させることがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ４９９：１０２〜１０６頁（２０１３）
【非特許文献２】Ｈｕｒｗｉｔｚ（２０１１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  １０（１０）：１４１５〜１４３３頁
【非特許文献３】Ｆａｌｏｏｎら（２０１７）ＪＩＤ  ２１６：１３６２〜１３７０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示の目的は、上記の利点の１つまたはそれ以上を提供することができる、または有用な選択を公共に少なくとも提供する組成物、キット、方法、および使用を提供することである。したがって、以下の実施形態が本明細書で開示される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
実施形態１は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む抗原性ＲＳＶポリペプチドであって、融合前ＲＳＶ  Ｆと融合後ＲＳＶ  Ｆの間で共有されるＲＳＶポリペプチドのエピトープがブロックされている抗原性ＲＳＶポリペプチド。
【０００９】
実施形態２は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号２６のアミノ酸残基６２〜６９および１９６〜２０９、ならびに配列番号２６の３２８、３４８、または５０７位に対応するアスパラギンを含む、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００１０】
実施形態３は、融合前ＲＳＶ  Ｆと融合後ＲＳＶ  Ｆの間で共有されるＲＳＶポリペプチドのエピトープがブロックされている、実施形態２に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００１１】
実施形態３ｂは、ブロックされたエピトープが、ＲＳＶ  Ｆの抗原部位１エピトープである、実施形態１または３に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００１２】
実施形態３ｃは、融合前ＲＳＶ  Ｆと融合後ＲＳＶ  Ｆの間で共有される２つ以上のエピトープがブロックされている、実施形態１または３〜３ｂに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００１３】
実施形態３ｄは、ＲＳＶ  Ｆの抗原部位１の２つ以上のエピトープがブロックされている、実施形態１または３〜３ｃに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００１４】
実施形態３ｅは、ブロックされたエピトープとトポロジー的に重複する１つもしくはそれ以上の、または全てのエピトープもまたブロックされている、実施形態１または３〜３ｄに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００１５】
実施形態３ｆは、ブロックされたエピトープが、ＲＳＶ  Ｆの抗原部位１エピトープである、実施形態３ｅに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００１６】
実施形態４は、融合前ＲＳＶ  Ｆを含む、実施形態１〜３ｆのいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００１７】
実施形態５は、Ｄ２５またはＡＭ１４から選択される融合前ＲＳＶ  Ｆ特異的抗体によって認識される、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００１８】
実施形態６は、融合前のＲＳＶ  Ｆが、融合後のＲＳＶ  Ｆには見出されないエピトープを含む、実施形態４または５に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００１９】
実施形態７は、融合後ＲＳＶ  Ｆを含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００２０】
実施形態８は、エピトープが、アスパラギンに結合したＮ−グリカンでブロックされている、実施形態１または３〜６のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００２１】
実施形態９は、アスパラギンが、野生型ＲＳＶ  Ｆ配列（配列番号２６）中の非アスパラギン残基に対応し、非アスパラギン残基が、配列番号２６の３２８、３４８、または５０７位に対応する、実施形態７に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００２２】
実施形態１０は、フェリチンタンパク質をさらに含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００２３】
実施形態１１は、フェリチンが、表面に露出したアミノ酸をシステインで置き換える変異を含む、実施形態１１に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００２４】
実施形態１２は、フェリチンタンパク質が、表面に露出したアミノ酸をシステインで置き換える変異を含む、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよびフェリチンタンパク質を含む抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００２５】
実施形態１３は、フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２Ｃ、Ｓ２６Ｃ、Ｓ７２Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｋ７９Ｃ、Ｓ１００Ｃ、およびＳ１１１Ｃ変異の１つもしくはそれ以上、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける１つまたはそれ以上の対応する変異を含む、実施形態１１〜１２のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００２６】
実施形態１４は、表面に露出したアミノ酸を介してフェリチンに連結された１つまたはそれ以上の免疫刺激性部分を含み、場合により、表面に露出したアミノ酸が変異から生じるシステインである、実施形態１０〜１３のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００２７】
実施形態１５は、フェリチンが、表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸で置き換える変異を含み、場合により、アスパラギンが、Ｈ．ピロリフェリチンの１９位、またはペアワイズまたは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンの類似の位置にある、実施形態１０〜１４のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００２８】
実施形態１６は、フェリチンが、内部システインを非システインアミノ酸で置き換える変異を含み、場合により、内部システインが、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位、またはペアワイズまたは構造アライメントによって決定される、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に対応する位置にある、実施形態１０〜１５のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００２９】
実施形態１７は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、部位０エピトープである融合後ＲＳＶ  Ｆ上に見出されないエピトープを含み、場合により、部位０エピトープが、配列番号２６のアミノ酸残基６２〜６９および１９６〜２０９を含む、実施形態１２〜１６のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００３０】
実施形態１８は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号２６の３２８位に対応する位置にアスパラギンを含む、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００３１】
実施形態１９は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号２６の３４８位に対応する位置にアスパラギンを含む、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００３２】
実施形態２０は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号２６の５０７位に対応する位置にアスパラギンを含む、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００３３】
実施形態２１は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号２６の４９８位に対応する位置にロイシンを含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００３４】
実施形態２２は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号２６のイソロイシン２１７位に対応する位置にプロリンを含む、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００３５】
実施形態２３は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号２６の１５５位に対応する位置にシステイン以外のアミノ酸、および／または配列番号２６の２９０位に対応する位置にシステイン以外のアミノ酸を含む、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００３６】
実施形態２４は、配列番号２６の１５５位に対応する位置にセリン、および／または配列番号２６の２９０位に対応する位置にセリンを含む、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００３７】
実施形態２５は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドがフリン切断部位を欠損し、場合により、リンカーがフリン切断部位の代わりに存在する、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００３８】
実施形態２６は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号１７のアミノ酸１〜４７８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００３９】
実施形態２７は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号１７の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００４０】
実施形態２８は、配列番号１７のアミノ酸１〜４７８を含む、実施形態２０または２１に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００４１】
実施形態２９は、配列番号２３のアミノ酸１〜４７８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００４２】
実施形態３０は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、配列番号２３の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む、実施形態１〜１９または２３のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００４３】
実施形態３１は、配列番号２３のアミノ酸１〜４７８を含む、実施形態２３または２４に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００４４】
実施形態３２は、配列番号３〜２３のいずれか１つの配列を含む、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００４５】
実施形態３２ａは、配列番号１７の配列を含む、実施形態３２に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００４６】
実施形態３２ｂは、配列番号２３の配列を含む、実施形態３２に記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドである。
【００４７】
実施形態３３は、実施形態１０〜３２ｂのいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドを含むフェリチン粒子である。
【００４８】
実施形態３４は、実施形態１〜３３のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドまたはフェリチン粒子、およびＲＳＶ  Ｇポリペプチドを含む組成物である。
【００４９】
実施形態３４ｂは、組成物がフェリチン粒子を含み、フェリチン粒子がＲＳＶ  Ｇポリペプチドを含み、場合により、ＲＳＶ  Ｇポリペプチドがフェリチン粒子に化学的にコンジュゲートされている、実施形態３４の組成物である。
【００５０】
実施形態３４ｃは、ＲＳＶ  Ｇポリペプチドがグリコシル化されていない、実施形態３４または３４ｂに記載の組成物である。
【００５１】
実施形態３５は、実施形態１〜３３のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドまたはフェリチン粒子、または実施形態３４〜３４ｃのいずれか１つに記載の組成物を含み、さらに薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【００５２】
実施形態３６は、ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法において、またはＲＳＶ感染に対する対象の保護において使用するための、実施形態１〜３５のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド、フェリチン粒子、または組成物である。
【００５３】
実施形態３７は、ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する、またはＲＳＶ感染に対して対象を保護する方法であって、実施形態１〜３６のいずれか１つに記載の１つまたはそれ以上の抗原性ＲＳＶポリペプチド、フェリチン粒子、または組成物を対象に投与する工程を含む方法である。
【００５４】
実施形態３８は、対象がヒトである、実施形態３６〜３７のいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチド、フェリチン粒子、組成物、または方法である。
【００５５】
実施形態３９は、場合により核酸がｍＲＮＡである、実施形態１〜３２ｂのいずれか１つに記載の抗原性ＲＳＶポリペプチドをコードする核酸である。
【００５６】
実施形態３９ｂは、実施形態３９に記載の核酸、およびＲＳＶ  Ｇポリペプチドをコードする核酸を含む組成物またはキットであり、場合により、一方または両方の核酸がｍＲＮＡである。
【００５７】
追加の目的および利点は、以下の説明に部分的に記載され、部分的に説明から明白であり、または実践により学ぶことができるであろう。目的および利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘された要素および組合せによって実現および達成される。
【００５８】
前述の一般的説明および以下の詳細な説明は、単なる例示および説明であり、特許請求の範囲を制限するものではない。
【００５９】
本明細書に組み入れられ、本明細書の一部を構成する以下の図面は、いくつかの実施形態を例証し、説明と共に本明細書に記載する原理を説明するために役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１Ａ】例示的なＲＳＶ  Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰポリペプチド構造を示す図である。（図１Ａ）各セグメントのＮ末端に対応する残基番号を列挙する線形図。番号付けは配列番号２６による。ドメイン１〜３は、それぞれＤＩ、ＤＩＩおよびＤＩＩＩで示され、７残基（ｈｅｐｔａｄ）反復領域Ａ（ＨＲＡ）および７残基反復領域Ｂ（ＨＲＢ）もまた標識される。Ｃ末端フェリチンは標識される（フェリチンナノ粒子）。ＲＳＶ  Ｆ部分のＦ１およびＦ２断片を描画の下に表示する。ペプチド２７断片（ｐ２７）融合ペプチド（ＦＰ）とフリン切断部位（フリン部位）を欠失させ、可撓性リンカーで置き換えて一本鎖Ｆ構築物を形成したＦ１とＦ２断片の間の領域をラインとして示し、描画の上に表示した。図の上の星印は、操作されたグリコシル化部位Ｅ３２８Ｎ、Ｓ３４８ＮおよびＲ５０７Ｎのおおよその位置を示す。
【図１Ｂ】例示的なＲＳＶ  Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰポリペプチド構造を示す図である。（図１Ｂ）Ｄ２５、ＡＭ１４、１０１Ｆ、およびパリビズマブ抗体についての鍵となる中和（Ｎａｂ）エピトープを示す、融合前ＲＳＶ  Ｆ部分の構造モデル。共有される融合前および融合後の構造エピトープの近似領域は、白い三角形で示される。例示的な操作されたグリコシル化部位Ｅ３２８Ｎ、Ｓ３４８ＮおよびＲ５０７Ｎの位置は標識される。操作されたグリコシル化部位は、融合前と融合後のコンフォメーション間で構造的に共有され、Ｄ２５、ＡＭ１４、１０１Ｆおよびパリビズマブなどの抗体によって認識される鍵となる中和エピトープから離れた領域にマップされる。このように、これらの操作されたグリカン部位を含有する構築物は、依然として上記の中和抗体に結合する（データは示されていない）。
【図１Ｃ】例示的なＲＳＶ  Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰポリペプチド構造を示す図である。（図１Ｃ）ＨＲＡおよびＨＲＢ領域を有するＲＳＶ融合前Ｆタンパク質ナノ粒子（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ）の構造モデルはより濃い影の者である。得られた折り畳まれたＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ構築物は、図１Ｂにリストされた鍵となるエピトープを提示する２４−量体を形成することができる。
【図１Ｄ】例示的なＲＳＶ  Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰポリペプチド構造を示す図である。（図１Ｄ）ＲＳＶ  Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ構築物ＲＦ８０８５（配列番号１）の電子顕微鏡写真の２Ｄクラス平均は、２４マーのフェリチンナノ粒子上のＲＳＶ  Ｆ三量体部分の対称性を示す。
【図２】Ｄ２５抗体ウエスタンブロットにより測定された、２９３細胞馴化培地中で発現された、いくつかのＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ構築物の小規模発現を示す図である。ＲＦ８０９０は、配列番号２であり、これは、ＲＦ８０８５と同じ配列、すなわち配列番号１を有するＣＨＯ発現において使用されるクローニング変異体である。ＲＦ８０８５およびＲＦ８０９０は、図１Ａに記載の欠失および一本鎖リンカーを有するＤＳ−ＣＡＶのジスルフィドおよび空洞充填変異を有するＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ構築物であり、Ｎ末端をフェリチンに融合させたものである。ＲＦ８１００−ＲＦ８１０５およびＲＦ８１０８−ＲＦ８１１２は、それぞれ配列番号３〜８および１１〜１４の配列を有する。ｓｃＦ−ｐＦｅｒｒ＝ＲＳＶ  Ｆポリペプチドとフェリチンの融合タンパク質。ＲＦ８０９０ベンチマークに対する構築物の発現を改善すると思われる変異は、ウエスタンブロット下に示される。注目すべき変異には、Ｅ３２８Ｎ、Ｓ３４８ＮおよびＲ５０７Ｎ変異を介したグリカン部位の付加、ならびにウエスタンブロットで測定した馴化培地中へのＲＳＶ  Ｆナノ粒子の発現および分泌を増加させた中央ヘリックスキャッピング変異Ｉ３２７Ｐがある。
【図３】２９３発現からの馴化培地のウエスタンブロット分析により測定した、ＲＦ８０８５（配列番号１、対照構築物）およびＲＦ８１０６（配列番号９、ＲＦ８１０８におけるＩ２１７Ｐ変異およびＤＳ−ＣＡＶ１のジスルフィド（ＤＳ）変異を欠如するＩ２１７Ｐ変異を含む）の発現を示す図である。ＤＳを中心ヘリックスキャッピング変異Ｉ２１７Ｐで置き換えると、発現が有意に増加した。ＤＳを中心ヘリックスキャッピング変異で置き換えても、融合前特異的抗体Ｄ２５およびＡＭ１４への構築物の結合に影響を及ぼさない。
【図４】ＲＦ８１０６構築物（配列番号９）のサイズ排除クロマトグラフィー精製の結果を示す。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６調製ＳＥＣカラム上の約６５ｍｌのＲＦ８１０６ナノ粒子の保持体積は、折り畳まれた２４マーのナノ粒子と一致しており、これは、ＲＦ８１０６における変異はナノ粒子形成を妨げなかったことを示唆する。
【図５】図５Ａ−５Ｂは、非還元（５Ａ）および還元（５Ｂ）ＲＦ８１０６の動的光散乱（ＤＬＳ）分析を示す図である。ＳＥＣ分析と同様に、ＤＬＳは、ＲＳＶ  Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰが予想される折り畳みナノ粒子を形成することを実証した。さらに、還元データは、粒子が還元によって破壊されなかったことを示しており、これは、変異によってフェリチン上に導入された表面露出システインへのアジュバントコンジュゲーション前に行われた（図６を参照されたい）。
【図６】ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧへのコンジュゲーションの有無に関わらず、ＲＦ８１０６のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を示す図である。ＣｐＧ処理ナノ粒子のゲルシフトの増加は、ＣｐＧアジュバントをＲＳＶ  Ｆナノ粒子に約４０〜５０％完了まで添加し得ることを実証した。ＣｐＧ、またはＴＬＲ７／８アゴニストＳＭ７／８などの他の免疫刺激性部分のコンジュゲーションは、融合前特異的抗体Ｄ２５およびＡＭ１４に結合する粒子の能力を阻害しなかった。
【図７】（ＲＦ８１１７、配列番号１７）を有するＲＳＶ  Ｆ、および追加のグリカン（ＲＦ８０８５、配列番号１、およびＲＦ８１１３、配列番号１６）を有しないＲＳＶ  Ｆを含むナノ粒子のウエスタンブロットを示す図である。ＲＦ８１１３は、ＲＦ８１０６と同様であるが、ＲＦ８１０６からのＳ１１１Ｃ表面露出システイン（フェリチン残基番号付けを使用して、すなわち、配列番号２０８のフェリチン配列中の位置に対応する）を、Ｋ７９Ｃ表面露出システイン（またフェリチン残基番号付けを使用する）に置き換えて、コンジュゲーション部位をＰｒｅ−Ｆ部分からさらに離すようにした。ＲＦ８１０６と同様に、ＲＦ８１１３は、ベンチマーク分子ＲＦ８０８５に対して改善された発現を保持する。ＲＦ８１１７は、ＲＦ８１１３と同様であるが、図２で同定された３つのグリコシル化変異、すなわち、Ｅ３２８Ｎ、Ｓ３４８ＮおよびＲ５０７Ｎをさらに含み、発現をさらに改善し、図１Ｂに記載されるように、融合前Ｆおよび融合後Ｆコンフォメーション間で共有される非中和エピトープをブロックする。
【図８】潜在的トリプシン様プロテアーゼ切断部位における異なる置換を有するＲＳＶ  Ｆ構築物の発現を示す図である。ＲＦ８０９０（ＣＨＯ発現ベクターに適合した異なるＤＮＡ配列を有するＲＦ８０８５と同じタンパク質配列）のＣＨＯ細胞株発現において、ポリペプチドがＦとフェリチン部分の間で切り取られ、発現の低下をもたらすことが観察された。Ｆ部分の得られた質量により、タンパク質分解は、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ構築物のＨＲＢ、ブル−フロッグリンカー領域の近くで起こる可能性があると推定された。この領域内のリシンおよびアルギニン残基（残基約４５０〜５５０）の変異を、構築物の潜在的トリプシン様タンパク質分解を排除するために探索した。ＲＦ８１１７（Ｋ４９８ＬおよびＫ５０８Ｑ）に対するＲＦ８１２２（配列番号１８）の変異は、２９３細胞における改善された発現をもたらし、ＣＨＯ細胞におけるタンパク質分解を減少または排除し得る。選択的変異は、発現を制限した。
【図９−１】図９Ａ−Ｂは、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるＲＦ８０９０、ＲＦ８１１７およびＲＦ８１４０の発現を示す図である。ＲＦ８０９０（配列番号２）の発現収率は、低レベルで観察された。ＤＳ−ＣＡＶ１のジスルフィドを置き換える変異、および潜在的なチプシン切断部位を除去するためのＦ部分とフェリチン部分の間のリンカーへの変異を上記のように導入して、ＲＦ８１１７（配列番号１７）およびＲＦ８１４０（配列番号２３）を構築し、これを安定発現ＣＨＯ細胞にクローニングした。（図９Ａ）ＣＨＯ馴化培地中のＣＨＯ細胞の３つおよび４つのプールからのＲＦ８１１７およびＲＦ８１４０のそれぞれの発現を、Ｄ２５−ウエスタンブロット分析によりＣＨＯ馴化培地中のＲＦ８０９０の収率と比較した。ＲＦ８１１７の３つ全てのＣＨＯプール、およびＲＦ８１４０の４つ全てのＣＨＯプールは、ＲＦ８０９０よりも高い収率で発現する。（図９Ｂ）ＯｃｔｅｔによるＤ２５融合前Ｆ特異抗体により測定したＣＨＯ馴化培地へのＲＦ８１１７の発現。左のパネルは、標準曲線を提供するプロテインＡチップ上のＤ２５への結合の応答に対してプロットされた既知濃度の２９３培地から精製されたＲＦ８１４０の応答を示す。個々のドットは、ＲＦ８１１７  ＣＨＯ馴化培地からのＤ２５結合に対する応答を表す。右のパネルは、Ｄ２５結合応答に基づくＣＨＯプール馴化培地中のＲＦ８１１７またはＲＦ８１４０の計算された収率を示す。ＲＦ８１１７とＲＦ８１４０の両方は、Ｄ２５およびＡＭ１４の結合によって測定すると培地中で発現され、２９３細胞と同様に、ＣＨＯ細胞は、融合前Ｆ三量体構造を保持する折り畳まれた様式でＰｒｅ−Ｆ−ＮＰを発現することができることを実証した。
【図９−２】図９−１の続き。
【図１０】図１０Ａ−Ｂは、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ  ＲＦ８１１７に対する中和抗体応答。（図１０Ａ）ＤＳ−ＣＡＶ１（Ｐｒｅ−Ｆ三量体、配列番号２５）、融合後Ｆ三量体（Ｐｏｓｔ−Ｆ三量体、配列番号２４）または操作されたグリコシル化を有するＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ、ＲＦ８１１７、配列番号１７）の高用量（１μｇ）および低用量（０．１μｇ）免疫によって誘発されたＲＳＶ中和力価の比較をＶＥＲＯ細胞アッセイによって測定した。全てのＲＳＶポリペプチドを、本明細書に記載されるように、アジュバントＡＦ０３とともに投与した。全体を通じて、別段の記載がない限り、ＡＦ０３は、ＲＳＶポリペプチドまたはナノ粒子とともに投与されたが、それにコンジュゲートされなかった。ＲＳＶポリペプチドおよび用量は、ｘ軸の下に表示される。Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ免疫と比較した高用量反応の統計学的解析が示される。（図１０Ｂ）ＤＳ−ＣＡＶ１（Ｐｒｅ−Ｆ三量体）、操作されたグリコシル化を伴わないＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１１３、配列番号１６）、または操作されたグリコシル化を伴うＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１１７、配列番号１７）を用いた高用量（１μｇ）および低用量（０．１μｇ）免疫によって誘発されたＲＳＶ中和力価の比較をＶＥＲＯ細胞アッセイによって測定した。全てのＲＳＶポリペプチドは、本明細書に記載されるように、アジュバントＡＦ０３（いずれのポリペプチドまたはナノ粒子にもコンジュゲートしていない）とともに投与された。ＲＳＶポリペプチドおよび用量は、ｘ軸の下に表示される。
【図１１−１】図１１Ａ−Ｄは、マウスまたは非ヒト霊長類モデルにおいて、融合後Ｆ三量体（配列番号２４）またはＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号２３）を用いた免疫によって誘発されたＲＳＶ融合前Ｆ三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１）結合抗体およびＲＳＶ中和抗体の比較を示す図である。（図１１Ａ）融合後ＦとＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号２３）との間の免疫からマウスにおいて誘発された融合前Ｆ三量体結合抗体応答を比較する。（図１１Ｂ）融合後ＦおよびＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号２３）による免疫からマウスにおいて誘発された中和抗体応答を示す。（図１１Ｃ）アジュバントの有無に関わらず、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰによって非ヒト霊長類において誘発された融合前Ｆ三量体結合抗体応答（ＡＦ０３、下記括弧内に示される）を比較する。（図１１Ｄ）ＡＦ０３アジュバントの有無に関わらず、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号２３）による免疫によって誘発されたＲＳＶ中和力価を比較する。マウスにおいては、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰは、融合後三量体と比較して、高い融合前のＦ結合応答およびＲＳＶ中和反応を誘発する。非ヒト霊長類においては、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰは、強力な中和反応を誘発する。
【図１１−２】図１１−１の続き。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｂは、操作されたグリコシル化部位が融合後エピトープをブロックすることを示す図である。（図１２Ａ）Ｏｃｔｅｔにより測定した、高用量（１μｇ）および低用量（０．１μｇ）での操作されたグリコシル化を伴わないＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１１３）、または操作されたグリコシル化を伴うＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（操作されたＧｌｙ粒子）による免疫によって誘発された融合前Ｆ（ＤＳ−ＣＡＶ１）に対する抗体応答を示す。（図１２Ｂ）Ｏｃｔｅｔにより測定した、高用量（１μｇ）および低用量（０．１μｇ）での操作されたグリコシル化を伴わないＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１１３）、または操作されたグリコシル化を伴うＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１１７）による免疫によって誘発された融合後三量体に対する抗体応答を示す。上記のように、全てのＲＳＶポリペプチドを免疫中にＡＦ０３と混合した。ＲＦ８１１３とＲＦ８１１７はいずれも、融合前Ｆに対する強固な抗体応答を誘発するが、ＲＦ８１１７によって誘発される融合後Ｆ抗体応答は、大幅に低下する。これは、共有される融合前エピトープおよび融合後エピトープへの操作されたグリカンマッピングによる（図２Ｂ）。
【図１３−１】図１３Ａ−Ｃは、操作されたグリコシル化部位による非中和エピトープのブロッキングを示す図である。（図１３Ａ）ＶＥＲＯ細胞アッセイにより測定したマウス試験における０．１μｇ用量での野生型グリコシル化部位（「Ｗｔグリカン粒子」、ＲＦ８１１３、配列番号１６）を有するＰｒｅ−Ｆ  ＮＰ対追加的な操作されたグリコシル化部位（「＋グリカン粒子」、ＲＦ８１１７、配列番号１７）を有するＰｒｅ−Ｆ  ＮＰによる免疫によって誘発されたＲＳＶ中和力価の比較。（図１３Ｂ）マウス研究における０．１μｇ用量でのＷｔグリカン粒子（ＲＦ８１１３、配列番号１６）対＋グリカン粒子（ＲＦ８１１７、配列番号１７）による免疫によって誘発されたＲＳＶ融合後Ｆ三量体結合抗体応答の比較。（図１３Ｃ）パネルＡおよびＢからの結合力価に対する測定された中和力価の比は、操作されたグリカンが、機能的な中和抗体応答を低下させなかったが、共有された融合前後エピトープに誘発された非中和抗体を低下させ（図１Ｂ）、それによって中和／結合抗体比を改善したことを実証する。
【図１３−２】図１３−１の続き。
【図１４−１】図１４Ａ−Ｄは、フェリチンナノ粒子にコンジュゲートしたＲＳＶ  Ｇ中央ドメインペプチド（Ｇｃｃ）の特徴付けを示す図である。（図１４Ａ）Ｇｃｃ−ＮＰ抗原を形成する、ＲＳＶ  Ｇ中央ドメイン（配列番号２９）のフェリチンナノ粒子へのクリックコンジュゲーションを示すクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。（図１４Ｂ）Ｇｃｃ−ＮＰの構造モデル。（図１４Ｃ）マウス研究における、Ｇｃｃペプチド単独（Ｇｃｃペプチド、配列番号２９）対ナノ粒子にコンジュゲートしたＧｃｃペプチド（Ｇｃｃ−ＮＰ）による免疫によって誘発されたＧｃｃ結合抗体応答の比較。未処理血清からの代表的な反応を白枠で示し、２回目の免疫後からの反応を薄灰色枠で示し、３回目の免疫後からの反応を濃灰色枠で示す。（図１４Ｄ）ＨＡＥ細胞アッセイによって測定された、３回目の注射後のマウス研究におけるＧｃｃペプチド（配列番号２９）対Ｇｃｃ−ＮＰによる免疫によって誘発されたＲＳＶ中和力価の比較。未処置動物からの血清およびＧｃｃペプチドで免疫した動物からの血清をプールし、力価をバーとして示した。
【図１４−２】図１４−１の続き。
【図１５−１】図１５Ａ−Ｃは、ＲＳＶ  Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０）およびＧｃｃ−ＮＰの同時投与は、中和反応を誘発する。マウスを、抗原あたり１μｇ用量で、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０）単独、Ｇｃｃ−ＮＰ単独、またはＰｒｅ−Ｆ−ＮＰおよびＧｃｃ−ＮＰを組み合わせて免疫した。上記のように、全ての免疫をＡＦ０３でアジュバント化した。（図１５Ａ）ＲＦ８１４０単独（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ）またはＲＦ８１４０およびＧｃｃ−ＮＰ（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ＋Ｇｃｃ−ＮＰ）によるマウスの免疫は、融合前Ｆ三量体に結合する抗体を誘発した。（図１５Ｂ）Ｇｃｃ−ＮＰ単独（Ｇｃｃ−ＮＰ）またはＲＦ８１４０およびＧｃｃ−ＮＰ（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＯ＋Ｇｃｃ−ＮＰ）によるマウスの免疫は、Ｇｃｃペプチドに結合する抗体を誘発した。（図１５Ｃ）Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ単独、Ｇｃｃ−ＮＰ単独、またはＰｒｅ−Ｆ−ＮＰとＧｃｃ−ＮＰの同時投与のいずれかで免疫した動物は、ＨＡＥ中和アッセイで測定した場合、第２および第３の免疫後に中和反応を誘発する。Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ＋Ｇｃｃ−ＮＰの同時投与は、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ単独による免疫によって誘発されるものよりも優れた中和反応を誘発した。
【図１５−２】図１５−１の続き。
【図１６】図１６Ａ−Ｂは、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰおよびＧｃｃ−ＮＰの同時投与は、Ｐｒｅ−融合Ｆ三量体またはＧｃｃ−ナノ粒子に結合する抗体の誘発と干渉しない。Ｆ感受性ＶＥＲＯ細胞アッセイによって測定された中和力価は、図１６Ａの左側にあり、ＦおよびＧ感受性ＨＡＥアッセイによって測定された中和力価は、図１６Ｂの右側に示される。動物の免疫は、図１５と同様であった。免疫に使用されるＲＳＶポリペプチドは、水平軸下にある。黒いバーは、図１５に記載される免疫群からプールされた血清を表し、同様に標識される。未処置動物の血清もまた黒いバーで示され、比較のために表示される。融合前Ｆ三量体で枯渇された血清は白色で示され、対応する黒いバーの右側にある。Ｇエクトドメインで枯渇された血清は、対応する黒いバーのちょうど右側に、斜めにストライプされた棒で示される。融合前Ｆ三量体で枯渇され、続いてＧエクトドメインで枯渇された血清は、垂直にストライプされたバーで示される。（図１６Ａ）中和力価は、ＲＦ８１４０免疫およびＲＦ８１４０＋Ｇｃｃ−ＮＰ同時投与由来の血清について、ＶＥＲＯ細胞アッセイにおいて観察されたが、未処理血清またはＧｃｃ−ＮＰ免疫単独由来の血清では観察されなかった。ＲＦ８１４０またはＲＦ８１４０＋Ｇｃｃ−ＮＰ群の血清を融合前Ｆ三量体で枯渇させると、測定可能な中和力価が低下した。（図１６Ｂ）中和力価は、ＲＦ８１４０、Ｇｃｃ−ＮＰ、またはＧｃｃ−ＮＰと同時投与したＲＦ８１４０で免疫した動物由来の血清について、ＨＡＥ細胞アッセイにおいて観察された。未処置動物からの血清は中和反応を示さなかった。融合前Ｆ三量体で枯渇させたＲＦ８１４０で免疫した動物由来の血清は、測定可能な中和力価の低下を示す。Ｇエクトドメインで枯渇させたＧｃｃ−ＮＰで免疫した動物由来の血清は、測定可能な中和力価の低下を示す。ＲＦ８１４０とＧｃｃ−ＮＰの同時投与で免疫した動物由来の血清は、融合前Ｆ三量体単独で枯渇させた場合、測定可能な中和力価の低下を示さないが、融合前Ｆ三量体とＧエクトドメインの両方で枯渇させた場合、測定可能な中和力価の低下を示す。まとめると、これらのデータは、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰとＧｃｃ−ＮＰの同時投与は、融合前ＦまたはＧに対する中和抗体を誘発する抗原のそれぞれの能力と干渉しないことを示唆する。
【図１７】図１７Ａ−Ｂは、ＡＦ０３、ＳＰＡ０９もしくはミョウバンによるＲＦ８１１７またはＲＦ８１４０のアジュバント化は、非アジュバント化ＲＦ８１１７と比較して、マウスにおいて優れた中和反応を誘発する。（図１７Ａ）非アジュバント化（Ｎｏ  Ａｄｊ）、ミョウバンでアジュバント化またはＡＦ０３でアジュバント化のいずれかのＲＦ８１１７で免疫したマウス由来の血清の中和力価は、ＶＥＲＯ細胞アッセイによって測定した場合に示される。（図１７Ｂ）非アジュバント化（Ａｄｊなし）のＲＦ８１１７、ＳＰＡ０９でアジュバント化されたＲＦ８１１７、またはＡＦ０３でアジュバント化されたＲＦ８１４０のいずれかで免疫したマウス由来の血清の中和力価は、ＶＥＲＯ細胞アッセイによって測定した場合に示される。ＲＦ８１１７またはＲＦ８１４０のいずれについての全ての場合において、未処置マウスのアジュバント化群では、非アジュバント化非群よりも高い中和力価が誘発された。
【図１８−１】図１８Ａ−Ｂは、ＡＦ０３またはＳＰＡ０９を用いたＲＦ８１４０のアジュバント化は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において、非アジュバント化Ｆ８１４０免疫と比較して優れた中和反応を誘発する。（図１８Ａ）ＥＬＩＳＡで測定された、非アジュバント化（Ａｄｊなし）、ＡＦ０３でアジュバント化またはＳＰＡ０９でアジュバント化（以下に示されように、ＳＰＡ０９の２用量を使用した）のいずれかのＲＦ８１４０による免疫後のＮＨＰ血清で測定された融合前Ｆ三量体応答。全ての時点で、ＡＦ０３またはＳＰＡ０９によるアジュバント化は、優れた中和反応を誘発する。（図１８Ｂ）非アジュバント化（Ｎｏ  Ａｄｊ）、ＡＦ０３でアジュバント化された、またはＳＰＡ０９でアジュバント化された（下記に示すように、ＳＰＡ０９の２用量を使用した）のいずれかの、ＲＦ８１４０で免疫したＮＨＰからの血清の中和力価を、ＶＥＲＯ細胞アッセイにより測定した。全ての場合において、アジュバントによるＲＦ８１４０による免疫は、全ての時点において、アジュバント非アジュバント投与群よりも高い中和力価を誘導する。
【図１８−２】図１８−１の続き。
【図１９】図１９Ａ−Ｂは、ＲＦ８１４０のＴＬＲ７／８アゴニストＳＭ７／８またはＴＬＲ９アゴニストＣｐＧへのコンジュゲーションは、非アジュバント化ＲＦ８１４０単独と比較して優れた融合前Ｆ結合力価を誘導する。（図１９Ａ）未処置マウス、非アジュバント化ＲＦ８１４０で免疫したマウス、ＳＭ７／８アジュバントとコンジュゲートされたＲＦ８１４０で免疫したマウス、１３０ｎｇのＳＭ７／８でアジュバント化されたＲＦ８１４０、または２０μｇのＳＭ７／８でアジュバント化されたＲＦ８１４０のいずれかからの血清において測定された融合前Ｆ三量体結合応答が示されている。ＳＭ７／８にコンジュゲートされたＲＦ８１４０は、非アジュバント化群またはＳＭ７／８アジュバント化群よりも高い融合前Ｆ三量体結合力価を誘発する。（図１９Ｂ）未処置マウス、非アジュバント化ＲＦ８１４０で免疫したマウス、ＣｐＧアジュバントとコンジュゲートされたＲＦ８１４０、６８０ｎｇのＣｐＧでアジュバント化されたＲＦ８１４０、または２０μｇのＳＭ７／８でアジュバント化されたＲＦ８１４０のいずれかで免疫したマウスからの血清において測定された融合前Ｆ三量体結合応答を示す。ＳＭ７／８にコンジュゲートされたＲＦ８１４０は、非アジュバント化群またはＳＭ７／８アジュバント化群よりも高い融合前Ｆトリマー結合力価を誘発する。
【図２０−１】図２０Ａ−Ｇは、Ｆサブユニットワクチン候補は、ＭＩＭＩＣシステムにおいて、Ｐｒｅ−Ｆ指向性中和抗体およびＴｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞反応を誘発する。（図２０Ａ）ＭＩＭＩＣシステムにおける抗ｐｒｅ−Ｆ力価は、１０ｎｇ／ｍｌのＰｒｅ−Ｆ  ＮＰで各Ａｇをモル等量濃度のＦでプライミングした後、ＡＦにより測定された（ｎ＝４８〜４９ドナー／群）。（図２０Ｂ）微小中和力価を測定し、国際単位／ｍｌ（ＩＵ／ｍｌ）で表す。（図２０Ｃ）抗ｐｒｅ−Ｆとｐｏｓｔ−Ｆとの比＞１は、Ｆ結合後抗体と比較して、Ｆ結合前抗体のより高いレベルを表し、一方、比値＜１は、ポストＦに対するより大きな抗体応答を表す。（図２０Ｄ）Ｆタンパク質負荷された標的細胞で再刺激された活性化ＣＤ１５４＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴＮＦαの産生は、フローサイトメトリーを用いて測定された（ｎ＝４８）。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ−ＨＳＤ多重比較によって決定された。（図２０Ｅ）ヒト対象における既存の抗体力価（血清状態）は、ＭＩＭＩＣシステムにおけるＲＳＶ免疫応答の大きさと強く相関する。各ドナーからの血清中の抗Ｐｒｅ−Ｆ  ＩｇＧを示す線形回帰プロット対総抗Ｐｒｅ−Ｆ  ＩｇＧ応答をソフトウェアまたはアルゴリズムにより生成し、共通の勾配に関するｐ値を統計学的方法により分析した（ｎ＝５０）。Ｙ軸は、ＲＳＶによるプライミング後に得られた抗Ｐｒｅ−Ｆ  ＩｇＧレベルを表す。（図２０Ｆ）図２０Ｅと同様に、Ｆサブユニットワクチン候補でプライミングした後の各ドナーからの血清中の抗Ｐｒｅ−Ｆ  ＩｇＧ対総抗Ｐｒｅ−Ｆ  ＩｇＧを示す線形回帰プロット（ポストＦは四角形、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰは円形、およびＤＣ−Ｃａｖ１は菱形）。抗Ｐｒｅ−ＩｇＦ  ＩｇＧの既存循環力価は、１９９，８００〜３，０３７，６００，０００の範囲であった。各ドナーは、各々、各ドナーのＩｇＧ値を表す。（図２０Ｇ）ヒトＢ細胞において、Ｇｃｃペプチド単独（Ｇｃｃペプチド）対ナノ粒子にコンジュゲートされたＧｃｃペプチド（Ｇｃｃ−ＮＰ）による処置によって誘発されたＧｃｃ結合抗体応答の比較。上述のように、比較のために処置なし群を示す。
【図２０−２】図２０−１の続き。
【図２０−３】図２０−２の続き。
【図２０−４】図２０−３の続き。
【図２１】図２１Ａ−Ｃは、低用量（０．５μｇ）のＲＳＶ  Ｇｃｃ−フェリチンナノ粒子（「Ｇｃｃ−ＮＰ」）によって誘発される中和抗体力価を示す図である。陰性対照および陽性対照として未処理および高度免疫血清を用いて、２回目の免疫の２週間後（２ｗｐ２）に採取された血清（図２１Ａ）、または３回目の免疫の２週間後（２ｗｐ３）に採取された血清（図２１Ｂ）から、ＲＳＶ  Ａ２  Ｇｃｃ配列（ＡＦ０３で製剤化される）を含有するＲＳＶ  Ｇｃｃ−ＮＰによる免疫から誘発されたＲＳＶ  Ａ株ＨＡＥ中和力価が示される。また、３回目の免疫の２週間後（２ｗｐ３）に採取された血清（図２１Ｃ）から、ＲＳＶ  Ａ２  Ｇｃｃ配列（ＡＦ０３で製剤化される）を含有するＲＳＶ  Ｇｃｃ−ＮＰによる免疫から誘発されたＲＳＶ  Ｂ株ＨＡＥ中和力価もまた示される。
【図２２】図２２Ａ−Ｂは、ＲＳＶ  Ｇｃｃ−ＮＰによって誘発されたＲＳＶ  Ａ２株抗原結合抗体応答を示す図である。（図２２Ａ）高用量（５μｇ）のＲＳＶ  Ｇｃｃ−ＮＰによって誘発された、２回目の注射から２週間後（薄灰色枠）および３回目の注射から２週間後（濃灰色枠）に測定されたＧｃｃ  Ａ２株に対して誘発されたＧｃｃ結合抗体応答。未処置マウスの血清反応は陰性対照として示される。（図２２Ｂ）低用量（０．５μｇ）のＲＳＶ  Ｇｃｃ−ＮＰによって誘発された、２回目の注射から２週間後（薄灰色枠）および３回目の注射から２週間後（濃灰色枠）に測定されたＧｃｃ  Ａ２株に対して誘発されたＧｃｃ結合抗体応答。
【図２３】図２３Ａ−Ｂは、ＲＳＶ  Ｇｃｃ−ＮＰによって誘発されたＲＳＶ  Ｂ１株抗原結合抗体応答を示す図である。（図２３Ａ）高用量（５μｇ）のＲＳＶ  Ｇｃｃ−ＮＰによって誘発された、２回目の注射から２週間後（薄灰色枠）および３回目の注射から２週間後（濃灰色枠）に測定されたＧｃｃ  Ｂ１株に対して誘発されたＧｃｃ結合抗体応答。未処置マウスの血清反応は、陰性対照として示される。（図２３Ｂ）低用量（０．５μｇ）のＲＳＶ  Ｇｃｃ−ＮＰによって誘発された、２回目の注射から２週間後（薄灰色枠）および３回目の注射から２週間後（濃灰色枠）に測定されたＧｃｃ  Ｂ１株に対して誘発された、Ｇｃｃ結合抗体応答。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
ＲＳＶポリペプチドは、単独で、別個の分子としてのアジュバントとともに、および／またはナノ粒子（例えば、フェリチン粒子またはルマジンシンターゼ粒子）の一部として投与した場合に抗原性であり得、自己アジュバント性であり得る。一部の実施形態では、抗原性ＲＳＶポリペプチドは、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよびフェリチン、ならびに／または融合前ＲＳＶ  Ｆと融合後ＲＳＶ  Ｆの間で共有されるＲＳＶポリペプチドのエピトープがブロックされているＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む。ＲＳＶ  Ｆの融合前コンフォメーションに対する抗体の産生を導くＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、融合後のＲＳＶ  Ｆと比較して、融合前のＲＳＶ  Ｆに対するより高いインビボ抗体反応を誘導した。また、本明細書には、ＲＳＶ  Ｇの全部または一部を含むＲＳＶ  Ｇポリペプチドが記載され、さらにフェリチンを含むことができる。ＲＳＶ  ＧおよびＲＳＶ  Ｆタンパク質は、宿主細胞へのＲＳＶの接着および融合に必須である。
【００６２】
ＲＳＶ  Ｆは、２つのコンフォメーション状態、すなわち融合前と融合後のコンフォメーションで存在する。自然の融合前状態では、ＲＳＶ  Ｆは３個のプロトマーで構成される三量体である。したがって、融合前コンフォメーションにおけるＲＳＶ  Ｆポリペプチドによる免疫化は、改善された特性を有する可能性がある。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、融合前コンフォメーションにおいてＲＳＶ  Ｆに対する免疫を誘導するように設計される。ＲＳＶ  Ｇは、ＲＳＶとヒト気道上皮細胞との会合に関与する結合タンパク質である。
【００６３】
Ａ．定義
「抗原性部位０」または「部位０エピトープ」は、本明細書で使用される場合、野生型ＲＳＶ  Ｆ（配列番号２６）のアミノ酸残基６２〜６９および１９６〜２０９を含む、融合前ＲＳＶ  Ｆ三量体の頂点に位置する部位を指す。部位０エピトープは、Ｄ２５およびＡＭ１４などの、融合前ＲＳＶ  Ｆに対して特異性を有する抗体の結合部位であり、部位０エピトープに対する抗体の結合は、ＲＳＶの細胞表面接着をブロックする（Ｍｃｌｅｌｌａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０（６１３６）：１１１３〜１１１７頁（２０１３）を参照されたい）。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「抗原安定性」は、経時的なまたは溶液中での抗原の安定性を指す。
【００６５】
「空洞充填置換」は、本明細書で使用される場合、融合前のＲＳＶ  Ｆ三量体に存在する空洞を充填するための操作された疎水性置換を指す。
【００６６】
「Ｆタンパク質」または「ＲＳＶ  Ｆタンパク質」は、ウイルス侵入時のウイルスエンベロープと宿主細胞膜との融合の促進に関与するＲＳＶのタンパク質を指す。
【００６７】
「ＲＳＶポリペプチド」または「Ｆポリペプチド」は、Ｆタンパク質の少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドを指す。
【００６８】
「グリカン付加」は、本明細書で使用される場合、構築物の発現を増加させ、構築物の安定性を増加させ、または融合前および融合後のコンフォメーションの間で共有されるエピトープをブロックするように操作することができる、野生型ＲＳＶ  Ｆには存在しないグリコシル化部位を導入する変異の付加を指す。グリカン付加を含む修飾されたタンパク質は、より多くのグリコシル化を有し、したがって、より高い分子量を有する。グリカン付加は、ＲＳＶ  ＦポリペプチドがＲＳＶ  Ｆの融合後コンフォメーションに対する抗体を誘発する程度を低減させることができる。
【００６９】
「Ｇタンパク質」または「ＲＳＶ  Ｇタンパク質」は、本明細書で使用される場合、ＲＳＶとヒト気道上皮細胞との会合に関与する結合タンパク質を指す。例示的な野生型ＲＳＶ  Ｇアミノ酸配列を配列番号２７として提供する。ＲＳＶ  Ｇタンパク質は、細胞外に存在するエクトドメイン（ＲＳＶ  Ｇ（配列番号２７）のアミノ酸およそ６６〜２９７）を含む。ＲＳＶ  Ｇのエクトドメイン内に中央保存領域（ＧｃｃまたはＣＣＲ、配列番号２７のアミノ酸およそ１５１〜１９３）がある。ＲＳＶ  ＧのＣＣＲは、ＣＸ３Ｃモチーフを含む。ＣＸ３Ｃモチーフは、ＣＸ３ＣＲ１受容体に対するＧタンパク質の結合を媒介する。
【００７０】
「ヘリックスＰＲＯキャッピング」または「ヘリックスプロリンキャッピング」は、本明細書で使用される場合、ヘリックスキャップがプロリンを含む場合、ヘリックス形成を安定化できることを指す。
【００７１】
「プロモーター内安定化置換」は、本明細書で使用される場合、ＲＳＶ  Ｆ三量体のプロモーター内の相互作用を安定化することによって融合前のコンフォメーションを安定化させる、ＲＳＶにおけるアミノ酸置換を記載する。
【００７２】
「プロモーター間安定化置換」は、本明細書で使用される場合、ＲＳＶ  Ｆ三量体のプロモーターと互いとの相互作用を安定化させることによって融合前コンフォメーションを安定化させる、ＲＳＶにおけるアミノ酸置換を記載する。
【００７３】
「プロテアーゼ切断」は、本明細書で使用される場合、ポリペプチド配列における感受性がある残基（例えば、リシンまたはアルギニン）のタンパク質分解（時に、当該技術分野において「クリッピング」とも呼ばれる）を指す。
【００７４】
「融合後」は、ＲＳＶ  Ｆに関連して本明細書で使用される場合、ウイルスと細胞膜の融合後に起こるＲＳＶ  Ｆの安定なコンフォメーションを指す。
【００７５】
「融合前」は、ＲＳＶ  Ｆに関連して本明細書で使用される場合、ウイルス−細胞相互作用の前に取り入れられるＲＳＶ  Ｆのコンフォメーションを指す。
【００７６】
「プロトマー」は、本明細書で使用される場合、オリゴマータンパク質の構造単位を指す。ＲＳＶ  Ｆの場合、ＲＳＶ  Ｆ三量体の個々の単位はプロトマーである。
【００７７】
「フェリチン」または「フェリチンタンパク質」は、本明細書で使用される場合、Ｈ．ピロリフェリチン（配列番号２０８または２０９）、またはＰ．フリオスス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）フェリチン、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）フェリチン、もしくはヒトフェリチンのような本明細書で考察される別のフェリチンと検出可能な配列同一性を有し、鉄を例えば細胞内もしくは組織内で貯蔵する、または鉄を血流に運ぶ役目を果たすタンパク質を指す。重鎖および軽鎖（例えば、イラクサギンウワバおよびヒトフェリチン）として知られる２つのポリペプチド鎖として存在するフェリチンを含むそのような例示的なフェリチンを、以下で詳細に考察する。一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に、例えば表１（配列表）に開示されるフェリチン配列と少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む。フェリチンは、完全長の天然に存在する配列の断片であり得る。
【００７８】
「野生型フェリチン」は、本明細書で使用される場合、その配列が天然に存在する配列からなるフェリチンを指す。フェリチンはまた、完全長のフェリチン、または野生型フェリチンとはそのアミノ酸配列において１つまたはそれ以上の差を有するフェリチンの断片も含む。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「フェリチン単量体」は、他のフェリチン分子と集合していない単一のフェリチン分子（例えば、該当する場合、単一のフェリチン重鎖または軽鎖）を指す。「フェリチン多量体」は、複数の会合したフェリチン単量体を含む。「フェリチンタンパク質」は、単量体フェリチンおよび多量体フェリチンを含む。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「フェリチン粒子」は、球状形態に自己集合したフェリチンを指す。フェリチン粒子は時に、「フェリチンナノ粒子」または単に「ナノ粒子」と呼ばれる。一部の実施形態では、フェリチン粒子は、２４個のフェリチン単量体（または該当する場合、全体で２４個の重鎖および軽鎖）を含む。
【００８１】
「ハイブリッドフェリチン」は、本明細書で使用される場合、ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部を有するＨ．ピロリフェリチンを含むフェリチンを指す。ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部として使用される例示的な配列を、配列番号２１７として示す。ハイブリッドフェリチンでは、免疫刺激性部分の結合部位がフェリチン粒子表面上に均一に分布するように、ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部をＨ．ピロリフェリチンに融合することができる。「ウシガエルリンカー」は、本明細書で使用される場合、配列番号２１７の配列を含むリンカーである。ハイブリッドフェリチンはまた、時に「ｂｆｐＦｅｒｒ」または「ｂｆｐフェリチン」と呼ばれる。ウシガエル配列を含むいずれの構築物も、ウシガエル配列がなくとも、例えばリンカーまたは代替リンカーがなくとも提供することができる。例示的なウシガエルリンカー配列を、表１に提供する。表１はウシガエルリンカーを示すが、リンカーまたは代替リンカーを有しない同じ構築物を作製してもよい。
【００８２】
「Ｎ−グリカン」は、本明細書で使用される場合、タンパク質のＮ（アスパラギン）残基のアミド窒素でタンパク質に結合した糖質鎖を指す。そのため、Ｎ−グリカンは、Ｎグリコシル化のプロセスによって形成される。このグリカンは多糖類であり得る。
【００８３】
「グリコシル化」は、本明細書で使用される場合、タンパク質への糖質単位の付加を指す。
【００８４】
「免疫応答」は、本明細書で使用される場合、抗原またはワクチンのような刺激に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、または多形核細胞のような免疫系の細胞の応答を指す。免疫応答は、例えばインターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞を含む、宿主防御応答に関係する体の任意の細胞を含み得る。免疫応答は、生得のおよび／または適応免疫応答を含むがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、「保護的免疫応答」は、対象を感染から保護する（例えば、感染を防止する、または感染に関連する疾患の発生を防止する）免疫応答を指す。免疫応答を測定する方法は、当技術分野で周知であり、例えばリンパ球（例えば、ＢまたはＴ細胞）の増殖および／または活性、サイトカインまたはケモカインの分泌、炎症、抗体産生等を測定することを含む。「抗体応答」は、抗体が産生される免疫応答である。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「抗原」は、生物に曝露または投与した場合に、免疫応答を誘発する作用物質、および／またはＴ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子によって提示される場合）が結合する、もしくは抗体（例えば、Ｂ細胞によって産生される場合）に結合する作用物質を指す。一部の実施形態では、抗原は、生物において液性応答（例えば、抗原特異的抗体の産生を含む）を誘発する。あるいはまたは加えて、一部の実施形態では、抗原は、生物において細胞性応答（例えば、その受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞を含む）を誘発する。特定の抗原は、標的生物（例えば、マウス、ウサギ、霊長類、ヒト）の１つまたはいくつかのメンバーにおいて免疫応答を誘発し得るが、標的生物種の全てのメンバーにおいて誘発するわけではない。一部の実施形態では、抗原は、標的生物種のメンバーの少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％において免疫応答を誘発する。一部の実施形態では、抗原は、抗体および／またはＴ細胞受容体に結合するが、生物において特定の生理的応答を誘導しても誘導しなくてもよい。一部の実施形態では、例えば、抗原は、ｉｎ  ｖｉｖｏでそのような相互作用が起こるか否かによらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗体および／またはＴ細胞受容体に結合し得る。一部の実施形態では、抗原は、異種免疫原によって誘導される産物を含む、特異的液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。抗原は、本明細書に記載されるフェリチン（例えば、１つまたはそれ以上の変異を含む）および非フェリチンポリペプチド（例えば、ＲＳＶポリペプチド）を含む抗原性フェリチンタンパク質を含む。
【００８６】
「免疫刺激性部分」は、本明細書で使用される場合、フェリチンまたは抗原性フェリチンポリペプチドに共有結合し、免疫系の構成要素を活性化することができる（単独で、またはフェリチンまたは抗原性フェリチンポリペプチドに結合した場合）部分を指す。例示的な免疫刺激性部分は、ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）、例えば、ＴＬＲ４、７、８、または９のアゴニストを含む。一部の実施形態では、免疫刺激性部分はアジュバントである。
【００８７】
「アジュバント」は、本明細書で使用される場合、抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する物質またはビヒクルを指す。アジュバントには、抗原を吸着させた無機質（例えば、ミョウバン、水酸化アルミニウム、またはリン酸塩）の懸濁液、抗原溶液を鉱油または水中で乳化させた油中水型または水中油型乳剤（例えば、フロイント不完全アジュバント）を挙げることができるがこれらに限定されない。時に、抗原性をさらに増強するために死菌マイコバクテリア（例えば、フロイント完全アジュバント）を含める。免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフ）もまた、アジュバントとして使用することができる（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；第６，３３９，０６８号；第６，４０６，７０５号；および第６，４２９，１９９号を参照されたい）。アジュバントはまた、Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）アゴニストおよび共刺激分子のような生物学的分子も含み得る。アジュバントは、組成物中の個別の分子として、またはフェリチンもしくは抗原性フェリチンポリペプチドに共有結合（コンジュゲート）して投与してもよい。
【００８８】
「抗原性ＲＳＶポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、分子がＲＳＶに関して抗原性であるのに十分な長さのＲＳＶアミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドを指す。抗原性は、フェリチンのような異種配列、および／または免疫刺激性部分をさらに含む構築物の一部としてのＲＳＶ配列の特色であり得る。すなわち、ＲＳＶ配列が異種配列をさらに含む構築物の一部である場合、構築物は、異種配列を有しないＲＳＶ配列がそうすることができるか否かによらず、抗ＲＳＶ抗体を生成する抗原としての役目を果たすことができれば十分である。
【００８９】
「抗原性フェリチンポリペプチド」および「抗原性フェリチンタンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、分子が非フェリチンポリペプチドに関して抗原性である十分な長さのフェリチンおよび非フェリチンポリペプチドを含むポリペプチドを指す。抗原性フェリチンポリペプチドはさらに、免疫刺激性部分を含み得る。抗原性は、より大きい構築物の一部としての非フェリチン配列の特色であり得る。すなわち、構築物は、フェリチンを有しない非フェリチンポリペプチド（および該当する場合、免疫刺激性部分）がそうすることができるか否かによらず、非フェリチンポリペプチドに対する抗原としての役目を果たすことができれば十分である。一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドは、ＲＳＶポリペプチドであり、この場合抗原性フェリチンポリペプチドはまた、「抗原性ＲＳＶポリペプチド」である。しかしながら、明白にするために、抗原性ＲＳＶポリペプチドは、フェリチンを含む必要はない。「抗原性ポリペプチド」は、本明細書において使用される場合、抗原性フェリチンポリペプチド、および抗原性ＲＳＶポリペプチドのいずれかまたは両方であるポリペプチドを指す。
【００９０】
「自己アジュバント性」は、本明細書で使用される場合、フェリチンおよび免疫刺激性部分が同じ分子実体中にあるように、フェリチンおよびフェリチンに直接コンジュゲートされた免疫刺激性部分を含む組成物またはポリペプチドを指す。非フェリチンポリペプチドを含む抗原性フェリチンポリペプチドを、免疫刺激性部分にコンジュゲートして、自己アジュバント性ポリペプチドを生成してもよい。
【００９１】
「表面に露出した」アミノ酸は、本明細書で使用される場合、該当する場合に、多量体形成後、タンパク質がその本来の三次元コンフォメーションにある場合に溶媒分子が接触することができる側鎖を有するタンパク質（例えば、フェリチン）中のアミノ酸残基を指す。このように、例えば２４量体を形成するフェリチンの場合、表面に露出したアミノ酸残基は、フェリチンが２４量体として、例えばフェリチン多量体またはフェリチン粒子として集合する場合に、その側鎖に溶媒が接触することができる残基である。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「対象」は、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「対象」はヒトを指す。一部の実施形態では、「対象」は非ヒト動物を指す。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類、昆虫、および／または虫を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、非ヒト対象は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、対象は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、および／またはクローンであり得る。本発明のある特定の実施形態では、対象は成体、青年期、または幼体である。一部の実施形態では、用語「個体」または「患者」は、「対象」と互換的に使用され、互換的であると意図される。
【００９３】
本明細書で使用される場合、用語「ワクチン接種」または「ワクチン接種する」は、例えば病原体に対して免疫応答を生成することが意図される組成物の投与を指す。ワクチン接種は、病原体に対する曝露および／または１つもしくはそれ以上の症状の発生の前、間、および／または後に投与することができ、一部の実施形態では、病原体に対する曝露の前、間、および／または直後に投与することができる。一部の実施形態では、ワクチン接種は、ワクチン接種組成物の適切な間隔を空けた複数回の投与を含む。
【００９４】
本開示は、所定の核酸配列またはアミノ酸配列（参照配列）に対してそれぞれ、ある特定の程度の同一性を有する核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。
【００９５】
２つの核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同定されたヌクレオチドのパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。
【００９６】
用語「同一％」、「同一性％」、または類似の用語は、特に比較される配列間の最適なアライメントにおいて同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指すと意図される。前記パーセンテージは、純粋に統計学的であり、２つの配列間の差は、比較される配列の全長にわたって分布していてもよいが、必ずしもランダムに分布している必要はない。２つの配列の比較は通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアライメント後に前記配列を、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して比較することによって実行される。比較のための最適なアライメントは、手動で、またはＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２頁によるローカルホモロジーアルゴリズムの助けを借りて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３頁のローカルホモロジーアルゴリズムの助けを借りて、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，２４４４頁の類似性検索アルゴリズムの助けを借りて、または前記アルゴリズムを使用するコンピュータプログラムの助けを借りて（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ、およびＴＦＡＳＴＡ、  ｉｎ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）実行してもよい。
【００９７】
パーセンテージ同一性は、比較される配列が対応する同一の位置の数を決定する工程、この数を比較される位置の数（例えば、参照配列における位置の数）で除算する工程、およびこの結果に１００を乗算する工程によって得られる。
【００９８】
一部の実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％である領域に関して与えられる。例えば、参照核酸配列が２００ヌクレオチドからなる場合、同一性の程度は、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００ヌクレオチド、一部の実施形態では、連続ヌクレオチドに関して与えられる。一部の実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長にわたって与えられる。
【００９９】
所定の核酸配列またはアミノ酸配列に対してそれぞれ、特定の同一性の程度を有する核酸配列またはアミノ酸配列は、前記所定の配列の少なくとも１つの機能的特性を有することができ、例えば、一部の例では前記所定の配列と機能的に等価である。１つの重要な特性は、特に、対象に投与した場合にサイトカインとして作用する能力を含む。一部の実施形態では、所定の核酸配列またはアミノ酸配列に対して特定の同一性の程度を有する核酸配列またはアミノ酸配列は、前記所定の配列と機能的に等価である。
【０１００】
本明細書で使用される場合、用語「キット」は、１つまたはそれ以上の化合物または組成物のような関連する構成要素、および溶媒、溶液、緩衝液、説明書、または乾燥剤のような１つまたはそれ以上の関連する材料の包装された組を指す。
【０１０１】
Ｂ．特定の位置に１つまたはそれ以上のアスパラギンを含むＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む抗原性ＲＳＶポリペプチド
本明細書において、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む抗原性ＲＳＶポリペプチドを提供する。ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、ＲＳＶ  Ｆの全配列またはＲＳＶ  Ｆの一部を含み得る。一部の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆと融合後ＲＳＶ  Ｆの間で共有されるＲＳＶポリペプチドのエピトープはブロックされている。エピトープをブロックすることは、抗原性ＲＳＶポリペプチドが対象に投与される場合に、エピトープに対する抗体の生成を減少または排除する。これは、融合前コンフォメーションなどの、Ｆの特定のコンフォメーションに特異的なエピトープを標的とする抗体の割合を増加させることができる。Ｆは、まだ細胞に侵入していないウイルスにおいて融合前コンフォメーションを有するため、融合前Ｆを標的とする抗体の割合が増加すると、より高い程度の中和（例えば、本明細書に記載されているように、中和対結合比として発現される）を提供することができる。ブロッキングは、共有エピトープの近傍にＮ−グリカンなどの嵩高い部分を操作することによって達成することができる。例えば、野生型Ｆには存在しないＮ−グリコシル化部位は、例えば、適切な残基をアスパラギンに変異させることによって付加させることができる。一部の実施形態では、ブロックされたエピトープは、ＲＳＶ  Ｆの抗原部位１のエピトープである。一部の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆと融合後ＲＳＶ  Ｆの間で共有される２つまたはそれを超えるエピトープがブロックされている。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆの抗原部位１の２つまたはそれを超えるエピトープがブロックされている。一部の実施形態では、ブロックされたエピトープとトポロジー的に重複する１つもしくはそれ以上の、または全てのエピトープもブロックされ、場合により、ブロックされたエピトープは、ＲＳＶ  Ｆの抗原部位１のエピトープである。
【０１０２】
一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号２６の３２８、３４８、または５０７位に対応するアスパラギンを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６の３２８、３４８、または５０７位の少なくとも２つに対応するアスパラギンを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６の３２８、３４８、または５０７位に対応するアスパラギンを含む。実施例に記載されるように、このようなアスパラギンは、グリコシル化部位として機能し得ることが見出されている。さらに、いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、これらの部位におけるグリカンは、ポリペプチドが対象に投与される場合、融合前および融合後のＲＳＶ  Ｆタンパク質に共通のエピトープを含む、近傍のエピトープに対する抗体の発生を阻害し得る。一部の実施形態では、配列番号２６の３２８、３４８、または５０７位に対応するアスパラギンのグリコシル化は、融合前ＲＳＶ  Ｆと融合後ＲＳＶ  Ｆの間で共有される少なくとも１つのエピトープ、例えば、抗原部位１エピトープをブロックする。融合前および融合後のＲＳＶ  Ｆタンパク質に共通のエピトープに対する抗体の発生を阻害することは、融合前のＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的なエピトープ、例えば、部位０エピトープに対する抗体の発生を導くことができるため有益であり得、これは、他のＲＳＶ  Ｆエピトープに対する抗体よりも効果的な中和活性を有する可能性がある。部位０エピトープは、配列番号２６のアミノ酸残基６２〜６９および１９６〜２０９を含む。したがって、一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸残基６２〜６９および１９６〜２０９を含む。
【０１０３】
本明細書に記載される構築物は、野生型ＲＳＶ  Ｆに対して異なる長さの欠失または置換を有し得ることに留意されたい。例えば、配列番号２３およびその他の構築物において、野生型配列（配列番号２６）の９８〜１４４位は、ＧＳＧＮＶＧＬ（配列番号２３の９８〜１０４位；また配列番号３１）で置換され、配列番号２６の３２８、３４８、または５０７位が、配列番号２３の２８８、３０８、および４６７位に対応するように、４０個のアミノ酸の正味除去がもたらされる。一般的に、本明細書に記載される構築物中の位置は、例えば、標準パラメータ（ＥＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、ギャップペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５）を有するＮＥＥＤＬＥＭＡＮ−ＷＵＮＳＣＨアルゴリズムを用いて、ペアワイズアライメントにより、配列番号２６の野生型配列上にマッピングすることができる対応する位置を同定するための代替のアプローチとして本明細書に提供される構造アライメントの検討もまた参照されたい。
【０１０４】
一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、融合後ＲＳＶ  Ｆの表面上のエピトープと構造的に類似する、融合前抗原上のエピトープをブロックするためにグリカンを付加する変異を含む。一部の実施形態では、グリカンは、ＲＳＶ  Ｆの融合後コンフォメーション中に存在し得るエピトープを特異的にブロックするために付加される。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆの融合後コンフォメーション中に存在し得るが、ＲＳＶ  Ｆの融合前コンフォメーション中に存在する１つまたはそれ以上のエピトープ、例えば、部位０エピトープには影響しないエピトープをブロックするグリカンが添加される。
【０１０５】
一部の実施形態では、上記で検討された１つまたはそれ以上のグリコシル化部位で付加されたグリカンは、他の構築物と比較して、哺乳動物細胞などの発現系における分泌を増加させる。
【０１０６】
一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸１〜４７８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号１７の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸１〜４７８を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号１７の配列を含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸１〜４７８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号２３の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸１〜４７８を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号２３の配列を含む。
【０１０８】
一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、ＤＳ−ＣＡＶ１配列（例えば、Ｍｃｌｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４２（６１５８）：５９２〜５９８頁（２０１３）に記載される）（配列番号２５）を含み、上記されるアスパラギンの少なくとも１つ、２つ、または３つを含むさらなる修飾がなされる。
【０１０９】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、フェリチンタンパク質をさらに含む。フェリチンタンパク質は、フェリチンに関するセクションにおいて後述される特色のいずれか、またはそれらの組合せをさらに含むことができる。
【０１１０】
ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、以下の検討において記載される付加的特色のいずれか、またはこのような特色の任意の実施可能な組合せをさらに含むことができる。
【０１１１】
一本鎖構築物
一部の実施形態では、ＲＳＶポリペプチドは、一本鎖構築物、例えば、フリン切断部位を欠損するＲＳＶポリペプチドである。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆは、１つまたはそれ以上のフリン切断部位を欠損する。フリン切断部位を欠損する構築物は、天然Ｆタンパク質の生物学的Ｆ１／Ｆ２断片に切断されない単一のポリペプチドとして発現される。
【０１１２】
アミノ酸置換
一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆは、野生型配列に対して単一のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆは、野生型配列に対して、１を超えるアミノ酸置換、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の置換を含む。例示的な野生型配列は、配列番号２６である。
【０１１３】
一部の実施形態では、アミノ酸置換またはアミノ酸置換対は、プロトマー間安定化置換（複数可）である。プロトマー間安定化であり得る例示的な置換は、配列番号２６の位置番号を用いると、Ｖ２０７Ｌ；Ｎ２２８Ｆ；Ｉ２１７ＶおよびＥ２１８Ｆ；Ｉ２２１ＬおよびＥ２２２Ｍ；またはＱ２２４ＡおよびＱ２２５Ｌである。
【０１１４】
一部の実施形態では、アミノ酸置換またはアミノ酸置換対は、プロトマー内安定化である。プロトマー内安定化であり得る例示的な置換は、配列番号２６の位置番号を用いると、Ｖ２２０Ｉ；およびＡ７４ＬおよびＱ８１Ｌである。
【０１１５】
一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ヘリックス安定化であり、すなわち、ＲＳＶ  Ｆのヘリックスドメインを安定化するが予測される。ヘリックドメインの安定化は、部位０エピトープの安定化およびＲＳＶ  Ｆの融合前コンフォメーションの安定化に一般的に寄与し得る。ヘリックス安定化であり得る例示的な置換は、配列番号２６の位置番号を用いるとＮ２１６ＰまたはＩ２１７Ｐである。
【０１１６】
一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ヘリックスキャッピングである。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ヘリックスＰＲＯキャッピングである。ヘリックスキャッピングは、生物物理学的観察に基づいており、アルファヘリックス中のプロリン残基変異がヘリックス形成を破壊し得る一方で、ヘリックス領域のＮ末端のプロリンが、ＰＨＩ／ＰＳＩ結合角を安定化することによってヘリックス形成を誘導するのを助けることがある。ヘリックスキャッピングであり得る例示的な置換は、配列番号２６の位置番号を用いるとＮ２１６ＰまたはＩ２１７Ｐである。
【０１１７】
一部の実施形では、アミノ酸置換は、ＤＳ−ＣＡＶ１のジスルフィド変異に置き換える。一部の実施形態では、ＤＳ−ＣＡＶ１の操作されたジスルフィドは、配列番号２６の位置番号を用いると、野生型（ＤＳ−ＣＡＶ１のＣ６９Ｓおよび／またはＣ２１２Ｓ変異）に復帰する。一部の実施形態では、ＤＳ−ＣＡＶ１の１つまたはそれ以上のＣ残基をＳ残基で置換して、ジスルフィド結合を除去する。一部の実施形態では、配列番号２６の位置番号を用いたＣ６９ＳまたはＣ２１２Ｓ置換は、ジスルフィド結合を除去する。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号２６の位置番号を用いたＣ６９ＳとＣ２１２Ｓの両方を含む。一部の実施形態では、このようなシステインを置換し、それによってジスルフィド結合を除去することは、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの還元（すなわち、還元剤からの電子の受容）をブロックする。一部の実施形態では、配列番号２６の位置番号を用いたＩ２１７Ｐ置換は、Ｃ６９および／またはＣ２１２での置換の代わりに抗原に含まれる。配列番号２６の位置２１７は、配列番号２３の位置１７７に対応する。
【０１１８】
一部の実施形態では、アミノ酸置換は、トリプシンまたはトリプシン様プロテアーゼによるタンパク質分解を妨げる。一部の実施形態では、このようなタンパク質分解を妨げるアミノ酸置換は、ＲＳＶ  Ｆの７残基反復領域Ｂ（ＨＲＢ）領域にある。野生型ＨＲＢ領域を含むＲＳＶ  Ｆ−フェリチン構築物のタンパク質分解と一致する断片の出現は、この領域におけるリシンまたはアルギニンがタンパク質分解の標的であることを示唆する。ＫまたはＲ残基を除くアミノ酸置換は、ノックアウト（ＫＯ）と呼ばれる。一部の実施形態では、ＫまたはＲは、ＬまたはＱに置換される。一部の実施形態では、Ｋは、ＬまたはＱに置換される。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号２６の位置番号を用いると、Ｋ４９８Ｌおよび／またはＫ５０８Ｑを含む。配列番号２３の対応する位置は、それぞれ４５８および４６８である。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、Ｋ４９８ＬとＫ５０８Ｑの両方を含む。
【０１１９】
一部の実施形態では、アミノ酸置換は、グリカンを付加する。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドにグリカンを付加することによって、グリコシル化を増加させる。グリカンを付加するための置換はまた、天然のグリコシル化（追加のグリカンなし）と比較して、操作されたグリコシル化と呼ばれる。
【０１２０】
一部の実施形態では、グリカンを付加するためのアミノ酸置換は、Ｎによる置換であった。一部の実施形態では、Ｎによるアミノ酸置換は、Ｎ結合型グリコシル化を可能にする。一部の実施形態では、Ｎによる置換は、Ｎに対する第２のアミノ酸位置Ｃ末端でのＴまたはＳによる置換を伴い、Ｎ×Ｔ／Ｓグリコシル化モチーフを形成する。一部の実施形態では、Ｎは、表面露出される。以下の実施例に示されるように、グリコシル化を増加させる変異は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含むポリペプチドの発現増加提供することができる。
【０１２１】
修飾に基づくＲＳＶ  Ｆポリペプチドの特性の変化
ＲＳＶ  Ｆのアミノ酸配列の修飾は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの特性を変化させることができる。ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの特性には、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの構造的または機能的な特徴を含めることができる。
【０１２２】
一部の実施形態では、アミノ酸配列に対する単一の修飾は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの複数の特性を変化させる。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの異なる特性を変化させる複数の修飾を含むことができる。一部の実施形態では、複数の修飾は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの特性のより大きな変化をもたらす。
【０１２３】
一部の実施形態では、複数の修飾は、特定の特性に対して相加効果を有することができる。例えば、グリカンを付加するための２つのアミノ酸置換は、いずれかの単一アミノ酸置換と比較して、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドのグリコシル化のより大きな増加をもたらすことができる。
【０１２４】
一部の実施形態では、複数の修飾は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの異なる特性に影響を及ぼす。例えば、グリコシル化を増加させるための１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を１つまたはそれ以上のアミノ酸置換とともに作製して、還元をブロックすることができる。
【０１２５】
一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドへの修飾は、融合前コンフォメーション（一部の実施形態では、複数の修飾は、特定の特性に対して相加効果を有することができる。）を安定化する。
【０１２６】
一部の実施形態では、修飾は、例えば、Ｍｃｌｅｌｌａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０（６１３６）：１１１３〜１１１７頁（２０１３）に記載されるように、融合前ＲＳＶ  Ｆの部位０エピトープ（抗原部位０としても知られる）を安定化する。一部の実施形態では、部位０エピトープを安定化する修飾は、プロトマー間安定化である。一部の実施形態では、部位０エピトープを安定化する修飾は、それぞれ、抗体Ｄ２５またはＡＭ１４への結合によって測定した場合、部位０および部位Ｖの結合によって測定されるように融合前Ｆを安定化する。
【０１２７】
一部の実施形態では、修飾は、発現系におけるＲＳＶ  Ｆの発現を増加させる。一部の実施形態では、修飾は、発現系におけるＲＳＶ  Ｆの分泌を増加させる。一部の実施形態では、修飾は、発現後の組換えＲＳＶ  Ｆの安定性を増大させる。この変化は、細菌、真菌、昆虫、または哺乳動物などの任意のタイプの発現系であり得る。
【０１２８】
一部の実施形態では、プロリンを導入するアミノ酸置換は、他の構築物と比較して発現を増加させる。一部の実施形態では、グリカンを付加するアミノ酸置換は、他の構築物と比較して発現を増加させる。一部の実施形態では、ＫまたはＲを他のアミノ酸で置換するアミノ酸置換は、他の構築物と比較して発現を増加させる。発現の観察可能な増加は、プロテアーゼ切断もしくは分解の相対的阻害、および／または宿主細胞もしくは細胞外環境における安定性の増加を含む、発酵稼働または他の生産プロセスの収量を増加させる任意のメカニズムに起因し得る。一部の実施形態では、ＲＳＶ  ＦのＨＲＢ領域の１つまたはそれ以上のＫ残基を他のアミノ酸で置換するアミノ酸置換は、他の構築物と比較して発現を増加させる。
【０１２９】
一部の実施形態では、Ｋを他のアミノ酸で置換するアミノ酸置換は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの安定性を増加させる。一部の実施形態では、ＲＳＶ  ＦのＨＲＢ領域の１つまたはそれ以上のＫ残基を他のアミノ酸で置換するアミノ酸置換は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの安定性を増大させる。一部の実施形態では、この増加した安定性は、プロテアーゼ切断の減少に起因する。
【０１３０】
一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆは、ジスルフィドを除く変異、例えば、還元後のコンジュゲーションを防止する変異を含む。一部の実施形態では、Ｉ２１７Ｐ置換は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの還元をブロックする。一部の実施形態では、Ｋを他のアミノ酸で置換するアミノ酸置換は、還元剤の存在下でのＲＳＶ  Ｆポリペプチドの還元をブロックする。
【０１３１】
一部の実施形態では、一本鎖構築物は、他の構築物と比較して発現を増加させる。
【０１３２】
一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、ＤＳ−ＣＡＶ１配列（配列番号２５）（Ｍｃｌｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４２（６１５８）：５９２〜５９８頁（２０１３）に記載される）を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、さらなる修飾がなされるＤＳ−ＣＡＶ１の配列を含み、例えば、上記されるアスパラギンの少なくとも１つ、２つ、または３つを含む。
【０１３３】
Ｃ．ＲＳＶ  Ｇポリペプチド
本明細書で使用される場合、ＲＳＶ  Ｇポリペプチドは、ＲＳＶ  Ｇの全配列またはＲＳＶ  Ｇの一部を含み得る。ＲＳＶ  Ｇポリペプチドは、野生型配列と比較して修飾を含み得る。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｇポリペプチドは、野生型ＲＳＶ  Ｇ（配列番号２７）と比較して修飾されたＲＳＶ  Ｇである。
【０１３４】
一部の実施形態では、これらの修飾は、野生型ＲＳＶ  Ｇと比較して、ＲＳＶ  Ｇポリペプチドのアミノ酸に対する変化である。
【０１３５】
一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｇポリペプチドは、ＲＳＶ  Ｇのエクトドメインの全部または一部（配列番号２８またはそれに対応する位置）を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｇポリペプチドは、Ｇｃｃ領域の全部または一部（ＲＳＶ  Ｇのアミノ酸１５１〜１９３（配列番号２７））を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｇポリペプチドは、ＣＸ３Ｃモチーフを含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｇポリペプチドは、ＣＸ３ＣＲ１受容体に結合する。Ｇｃｃ領域は保存されており、免疫原性を有している。したがって、ＲＳＶ株に対して広範な活性を有する抗体を誘発するために使用することができる。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｇｃｃ株Ａは、配列番号３２に示されるように提供される。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｇｃｃ株Ｂは、配列番号３３に示されるように提供される。
【０１３６】
一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｇポリペプチドはグリコシル化されていない。例えば、ＲＳＶ  Ｇポリペプチドは、ＮまたはＳ／Ｔ残基（例えば、それぞれＱまたはＡ）の切断もしくは変異、またはそれらの組合せのいずれかによる、ＮＸＳ／ＴＸグリコシル化部位を欠損させることができる。
【０１３７】
一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｇポリペプチドは、抗原性フェリチンポリペプチドの一部である。例えば、ＲＳＶ  Ｇポリペプチドは、フェリチン上の表面に露出したシステインを介して、本明細書に記載されるようにフェリチンにコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、このフェリチンナノ粒子はまた、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび上記されるフェリチンタンパク質を含むポリペプチドのいずれかなどのＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む融合タンパク質である。
【０１３８】
Ｄ．フェリチンを含む抗原性ＲＳＶポリペプチド
また、本明細書には、フェリチンおよびＲＳＶポリペプチドを含む抗原性ＲＳＶポリペプチドを提供する。ＲＳＶポリペプチドは、本明細書に記載されるＲＳＶ  ＦポリペプチドのいずれかのなどのＲＳＶ  Ｆポリペプチドであり得る。ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、ＲＳＶ  Ｆの全配列またはＲＳＶ  Ｆの一部を含み得る。ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、野生型配列と比較して、１つまたはそれ以上の修飾（例えば、アミノ酸置換）を含み得る。ＲＳＶポリペプチドは、本明細書に記載されるＲＳＶ  ＧポリペプチドのいずれかなどのＲＳＶ  Ｇポリペプチドであり得る。
【０１３９】
一部の実施形態では、ポリペプチド中のフェリチンは、野生型フェリチンである。一部の実施形態では、フェリチンは、細菌、昆虫、真菌、鳥、または哺乳動物である。一部の実施形態では、フェリチンはヒトである。一部の実施形態では、フェリチンは細菌である。
【０１４０】
一部の実施形態では、フェリチンは、軽鎖および／または重鎖フェリチンである。一部の実施形態では、フェリチンは、昆虫フェリチン、例えば、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）重鎖フェリチン（配列番号２１１）またはイラクサギンウワバ軽鎖フェリチン（配列番号２１２）である。一部の実施形態では、フェリチンは、ヒトフェリチン、例えば、ヒト重鎖フェリチン（配列番号２１４またはＦＴＨ１、遺伝子番号２４９５）またはヒト軽鎖フェリチン（配列番号２１５またはＦＴＬ、遺伝子番号２５１２）である。一部の実施形態では、フェリチンナノ粒子は、ヒトまたはイラクサギンウワバフェリチンナノ粒子などの重鎖フェリチンおよび軽鎖フェリチンの２４個の総サブユニットを含む。イラクサギンウワバフェリチンナノ粒子は、重鎖フェリチンの１２個のサブユニットおよび軽鎖フェリチンの１２個のサブユニットを含むことができる。
【０１４１】
一部の実施形態では、抗原性ＲＳＶポリペプチドは、軽鎖フェリチンおよびＲＳＶポリペプチドを含む。一部の実施形態では、抗原性ＲＳＶポリペプチドは、重鎖フェリチンおよびＲＳＶポリペプチドを含む。一部の実施形態では、軽鎖フェリチンおよびＲＳＶポリペプチドを含む抗原性ＲＳＶポリペプチドは、ＲＳＶポリペプチドに連結していない重鎖フェリチンと集合することができる。一部の実施形態では、重鎖フェリチンおよびＲＳＶポリペプチドを含む抗原性ＲＳＶポリペプチドは、ＲＳＶポリペプチドに連結していない軽鎖フェリチンと集合することができる。ＲＳＶポリペプチド（またはより一般的には、非フェリチンポリペプチド）と連結していないフェリチンは、「裸のフェリチン」と呼ばれる。
【０１４２】
一部の実施形態では、重鎖フェリチンおよびポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドは、軽鎖フェリチンおよびＲＳＶポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドと集合して、単一のフェリチンナノ粒子上の同一または異なる非フェリチンポリペプチドの２つの提示を可能にする。一部の実施形態では、２つの異なる非フェリチンポリペプチドは、ＲＳＶポリペプチドである。一部の実施形態では、２つの異なる非フェリチンポリペプチドは、ＲＳＶおよび異なる感染性因子によってコードされる。一部の実施形態では、異なる感染因子由来の異なる非フェリチンポリペプチドは、ウイルスまたは細菌由来である。
【０１４３】
一部の実施形態では、重鎖フェリチンおよび非フェリチンポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドは、軽鎖フェリチンおよび非フェリチンポリペプチドを含むポリペプチドと集合して二価組成物を生成することができ、非フェリチンポリペプチドの一方または両方は、ＲＳＶ  ＦまたはＧポリペプチド、例えば、本明細書に記載されるＲＳＶ  ＦまたはＧポリペプチドであるなどのＲＳＶポリペプチドである。
【０１４４】
一部の実施形態では、フェリチンは、場合により、本明細書に記載されるものなどの１つまたはそれ以上の変異を有する、Ｈ．ピロリフェリチン（例示的なＨ．ピロリフェリチン配列については配列番号２０８または２０９を参照されたい）である。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチン（または他の細菌フェリチン）とヒトフェリチンとの間の配列相同性がより低いことにより、ワクチンプラットフォームとして使用した場合に自己免疫の可能性を減少させ得る（Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｃｅｌｌ  １６２，１０９０〜１１００頁（２０１５）を参照されたい）。
【０１４５】
一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の変異を有するピュロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）フェリチン（ＮＣＢＩ  ｓｅｑ  ＷＰ＿０１１０１１８７１．１）である。
【０１４６】
一部の実施形態では、フェリチンは、野生型フェリチンと７０％より高い、７５％より高い、８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、９７％より高い、９８％より高い、または９９％より高い同一性を有する配列を含む。
【０１４７】
一部の実施形態では、ＲＳＶポリペプチドおよびフェリチンを含む、本明細書に開示される抗原性ＲＳＶポリペプチドを含むナノ粒子が提供される。
【０１４８】
一部の実施形態では、ナノ粒子を形成することが可能な異なるタンパク質を、フェリチンの代わりに使用する。一部の実施形態では、このタンパク質は、ルマジンシンターゼ（Ｒａら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓ  ３：２２７〜２３４頁（２０１４）を参照されたい）である。一部の実施形態では、このタンパク質は、ルマジンシンターゼ血清型１、２、３、４、５、６、または７である。例示的なルマジンシンターゼ配列を、配列番号２１６および２１９に提供する。一部の実施形態では、ルマジンシンターゼは、配列番号２１６または２１９と、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
【０１４９】
１．コンジュゲーションのためのシステイン
一部の実施形態では、フェリチンを、免疫刺激性部分および／またはＲＳＶポリペプチドのコンジュゲーションのための化学ハンドルを提供するように変異させる。これは、表面に露出した非システインアミノ酸をシステインに置き換える変異によって達成することができる。誤解を避けるため、「表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える」のような表現は、野生型または変異前配列における表面に露出したアミノ酸がシステインではないことを必然的に暗示している。免疫刺激性部分またはＲＳＶポリペプチドのコンジュゲーションのための化学ハンドルを提供する別のアプローチは、リンカーのようなアミノ酸のセグメントをフェリチンのＮまたはＣ末端に含めることであり、アミノ酸のセグメントはシステインを含む。一部の実施形態では、このシステイン（表面に露出したアミノ酸を置き換えるか、またはＮもしくはＣ末端リンカーにある）は不対であり、このことは、これがジスルフィド結合を形成するために適切なパートナーシステインを有していないことを意味する。一部の実施形態では、このシステインは、フェリチンの二次構造を変化させない。一部の実施形態では、このシステインは、フェリチンの三次構造を変化させない。
【０１５０】
一部の実施形態では、このシステインを使用して、免疫刺激性部分のような作用物質をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、このシステインは、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン上のこのシステインにコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン粒子の表面上で露出する。一部の実施形態では、このシステインは、投与後にフェリチン粒子が集合する間、対象の分子および細胞と相互作用することができる。
【０１５１】
一部の実施形態では、このシステインの存在により、１つまたはそれ以上の免疫刺激性部分、例えばアジュバントのコンジュゲーションが可能となる。一部の実施形態では、免疫刺激性部分のコンジュゲーションは、このシステインの非存在下では起こらない。
【０１５２】
一部の実施形態では、システインに置き換えられる非システインアミノ酸は、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２、Ｓ７２、Ａ７５、Ｋ７９、Ｓ１００、およびＳ１１１から選択される。このように、一部の実施形態では、システインのために置き換えられる表面に露出したアミノ酸は、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２、Ｓ２６、Ｓ７２、Ａ７５、Ｋ７９、Ｓ１００、またはＳ１１１に対応するアミノ酸残基である。類似のアミノ酸を、ペアワイズまたは構造アライメントによって、非Ｈ．ピロリフェリチンにおいて見出すことができる。一部の実施形態では、システインに置き換えられる非システインアミノ酸は、ヒト軽鎖フェリチンのＳ３、Ｓ１９、Ｓ３３、Ｉ８２、Ａ８６、Ａ１０２、およびＡ１２０に対応するアミノ酸から選択することができる。一部の実施形態では、システインに置き換えられる表面に露出したアミノ酸は、本来のアミノ酸がシステインに置き換えられた場合、これは集合したフェリチン多量体もしくは粒子において反応性である、および／またはこのシステインはフェリチン多量体もしくは粒子の安定性を妨害しない、および／またはこのシステインがフェリチンの発現レベルの低減をもたらさないという理解に基づいて選択される。
【０１５３】
一部の実施形態では、フェリチンはＥ１２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｅ１２Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはＲＳＶポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｅ１２Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＥ１２Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＥ１２Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１５４】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ２６Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ２６Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはＲＳＶポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ２６Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ２６Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ２６Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１５５】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ７２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ７２Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはＲＳＶポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ７２Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ７２Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ７２Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１５６】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ａ７５Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ａ７５Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはＲＳＶポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ａ７５Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＡ７５Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＡ７５Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１５７】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｋ７９Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｋ７９Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはＲＳＶポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｋ７９Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＫ７９Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＫ７９Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１５８】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ１００Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ１００Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはＲＳＶポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ１００Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ１００Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ１００Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１５９】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ１１１Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ１１１Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはＲＳＶポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ１１１Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ１１１Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ１１１Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１６０】
２．内部システインの除去
一部の実施形態では、フェリチンは、内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異を含む。本来の内部システイン残基を除去することによって、フェリチン単量体あたり１つのみの不対システインが存在することを確実にし、ジスルフィド形成のような望ましくない反応を回避することができ、より安定かつ効率的な結果（例えば、アジュバントの提示）をもたらし得る。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１が非システインアミノ酸に置き換えられる。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１がセリンに置き換えられる（Ｃ３１Ｓ）が、任意の非システイン残基、例えばアラニン、グリシン、トレオニン、またはアスパラギンを使用してもよい。類似のアミノ酸を、ペアワイズまたは構造アライメントによって、非Ｈ．ピロリフェリチンにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、非システインのために置き換えられる内部システインは、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１と整列するアミノ酸残基である。Ｃ３１Ｓ変異を示す例示的なフェリチン配列を、配列番号２０１〜２０７に示す。一部の実施形態では、１つより多くの内部システインがフェリチンに存在する場合、２つまたはそれより多く（例えば、各々の）内部システインは、セリン、またはセリン、アラニン、グリシン、トレオニン、もしくはアスパラギンから選択されるアミノ酸のような非システインアミノ酸に置き換えられる。
【０１６１】
３．グリコシル化
ヒト適合性のグリコシル化は、組換え薬物製品における安全性および効能に関与し得る。規制当局の承認は、極めて重要な品質属性として適切なグリコシル化を証明することを条件とし得る（Ｚｈａｎｇら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１（５）：７４０〜７６５頁（２０１６）を参照されたい）。Ｎ−グリカンは、アスパラギン側鎖のグリコシル化に起因することができ、ヒトと、細菌および酵母のような他の生物との間で構造が異なり得る。このように、本開示に従うフェリチンにおいて、非ヒトグリコシル化および／またはＮグリカン形成を低減または除去することが望ましいであろう。一部の実施形態では、フェリチンのグリコシル化を制御することにより、特にヒトワクチン接種に使用する場合、組成物の効能および／または安全性が改善される。
【０１６２】
一部の実施形態では、フェリチンを、Ｎ−グリカンの形成を阻害するように変異させる。一部の実施形態では、変異したフェリチンは、その対応する野生型フェリチンと比較して低減されたグリコシル化を有する。
【０１６３】
一部の実施形態では、フェリチンは、表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異を含む。一部の実施形態では、表面に露出したアスパラギンは、Ｈ．ピロリフェリチンのＮ１９、またはペアワイズまたは構造アライメントによって決定される、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に対応する位置である。一部の実施形態では、そのようなアスパラギン、例えばＨ．ピロリフェリチンのＮ１９を変異させることは、フェリチンのグリコシル化を減少させる。一部の実施形態では、変異は、アスパラギンをグルタミンに置き換える。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異を含むＨ．ピロリフェリチンである。配列番号２０１〜２０７は、Ｎ１９Ｑ変異を含む例示的なフェリチン配列である。
【０１６４】
細菌または酵母において産生されたグリコシル化タンパク質に曝露された哺乳動物は、細菌または酵母における所定のタンパク質のグリコシル化パターンが、哺乳動物における同じタンパク質のグリコシル化パターンとは異なり得ることから、グリコシル化タンパク質に対する免疫応答を生じ得る。このように、いくつかのグリコシル化治療タンパク質は、細菌または酵母における産生にとって適切ではないことがあり得る。
【０１６５】
一部の実施形態では、アミノ酸変異によるフェリチンのグリコシル化の減少は、細菌または酵母におけるタンパク質の産生を促進する。一部の実施形態では、フェリチンのグリコシル化の減少は、細菌または酵母において発現された変異フェリチンの投与時の哺乳動物における副作用の可能性を低減させる。一部の実施形態では、細菌または酵母において産生された変異フェリチンのヒト対象における反応原性は、グリコシル化が減少していることから低い。一部の実施形態では、ヒト対象における過敏応答の発生率は、野生型フェリチンと比較して低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンによる処置後では低い。
【０１６６】
一部の実施形態では、低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンを含む組成物の対象における分解は、野生型フェリチンを含む組成物、または野生型グリコシル化を有する対応するフェリチンを含む組成物と比較して遅い。一部の実施形態では、低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンを含む組成物は、野生型フェリチン、または野生型グリコシル化を有する対応するフェリチンを含む組成物と比較して、対象において低減されたクリアランスを有する。一部の実施形態では、低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンを含む組成物は、野生型フェリチン、または野生型グリコシル化を有する対応するフェリチンを含む組成物と比較してより長い血清中半減期を有する。
【０１６７】
４．変異の組合せ
一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に記載される変異の１つより多くのタイプを含む。一部の実施形態では、フェリチンは、グリコシル化を減少させる変異、内部システインを除去する変異、および表面に露出したシステインを生成する変異から独立して選択される１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、グリコシル化を減少させる変異、内部システインを除去する変異、および表面に露出したシステインを生成する変異を含む。
【０１６８】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、および表面に露出したシステインを生成する変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＥ１２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＳ７２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＡ７５Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＫ７９Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＳ１００Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＳ１１１Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、前述の変異の組のいずれかに対応する変異を含み、対応する変異は、フェリチンアミノ酸配列とＨ．ピロリフェリチンアミノ酸配列（配列番号２０８または２０９）とのペアワイズアライメントによって決定した位置で、ＮをＱに、ＣをＳに、および非システインの表面に露出したアミノ酸をシステインに変化させる。
【０１６９】
１つより多くのタイプの変異を含む例示的なフェリチンを、配列番号２０１〜２０７に提供する。
【０１７０】
５．構造アライメント
本明細書で考察したように、所与のポリペプチド（例えば、Ｈ．ピロリフェリチン）に関して記載した変異に対応する変異の位置は、ペアワイズまたは構造アライメントによって同定することができる。構造アライメントは、タンパク質がかなりの配列変動にも関わらず類似の構造を共有し、ファミリーの多くのメンバーが構造的に特徴付けされている、フェリチンのような大きいタンパク質ファミリーにとって適切であり、これもまた、ＲＳＶポリペプチド（例えば、ＲＳＶ  ＦまたはＧ）のような、本明細書に記載される他のポリペプチドの異なる形態における対応する位置を同定するために使用することができる。タンパク質データバンク（ＰＤＢ）は、その受託番号と共に以下に列挙するフェリチンを含む、多くのフェリチンに関する３Ｄ構造を含む。
【０１７１】
２ｊｄ６，２ｊｄ７−ＰｆＦＲ−ピュロコックス・フリオスス。２ｊｄ８−ＰｆＦＲ＋Ｚｎ。３ａ６８−遺伝子ＳｆｅｒＨ４由来のｓｏＦＲ−ダイズ。３ａ９ｑ−遺伝子ＳｆｅｒＨ４（変異体）由来のｓｏＦＲ。３ｅｇｍ，３ｂｖｆ，３ｂｖｉ，３ｂｖｋ，３ｂｖｌ−ＨｐＦＲ−ヘリコバクター・ピロリ。５ｃ６ｆ−ＨｐＦＲ（変異体）＋Ｆｅ。１ｚ４ａ，１ｖｌｇ−ＦＲ−テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ）。１ｓ３ｑ，１ｓｑ３，３ｋｘ９−ＦＲ−アルカエオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｕｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ），１ｋｒｑ−ＦＲ−カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）。１ｅｕｍ−ＥｃＦＲ−大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）。４ｒｅｕ−ＥｃＦＲ＋Ｆｅ。４ｘｇｓ−ＥｃＦＲ（変異体）＋Ｆｅ２Ｏ２。４ｚｔｔ−ＥｃＦＲ（変異体）＋Ｆｅ２Ｏ＋Ｆｅ２＋Ｆｅ＋Ｏ２。１ｑｇｈ−ＬｉＦＲ−リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）。３ｑｚ３−ＶｃＦＲ−ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）。３ｖｎｘ−ＦＲ−アナアオサ（Ｕｌｖａ  ｐｅｒｔｕｓａ）。４ｉｓｍ，４ｉｓｐ，４ｉｔｔ，４ｉｔｗ，４ｉｗｊ，４ｉｗｋ，４ｉｘｋ，３ｅ６ｓ−ＰｎｍＦＲ−プセウドニッチア（Ｐｓｅｕｄｏ−ｎｉｔｓｃｈｉａ  ｍｕｌｔｉｓｅｒｉｅｓ）。４ｚｋｈ，４ｚｋｗ，４ｚｋｘ，４ｚｌ５，４ｚｌ６，４ｚｌｗ，４ｚｍｃ−ＰｎｍＦＲ（変異体）＋Ｆｅ。１ｚ６ｏ−ＦＲ−イラクサギンウワバ。４ｃｍｙ−ＦＲ＋Ｆｅ−緑色硫黄細菌（Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ）。フェリチン軽鎖（ＦＴＬ）。１ｌｂ３，１ｈ９６−ｍＦＴＬ−マウス。１ｒｃｃ，１ｒｃｄ，１ｒｃｉ−ｂＦＴＬ＋タルトレート＋Ｍｇ。１ｒｃｅ，１ｒｃｇ−ｂＦＴＬ＋タルトレート＋Ｍｎ。３ｎｏｚ，３ｎｐ０，３ｎｐ２，３ｏ７ｒ−ｈｏＦＴＬ（変異体）−ウマ。３ｏ７ｓ，３ｕ９０−ｈｏＦＴＬ。４ｖ１ｗ−ｈｏＦＴＬ−ｃｒｙｏ  ＥＭ。３ｒａｖ，３ｒｄ０−ｈｏＦＴＬ＋バルビツレート。フェリチン軽鎖＋重鎖：５ｇｎ８−ｈＦＴＨ＋Ｃａ。
【０１７２】
構造アライメントは、（ｉ）第２の配列の公知の構造を使用して第１の配列の構造をモデリングする工程、または（ｉｉ）両方が公知である第１および第２の配列の構造を比較する工程、ならびに第２の配列における目的の残基に最も類似に位置する第１の配列中の残基を同定する工程によって、２つ（またはそれより多く）のポリペプチド配列を超えて対応する残基を同定する工程を伴う。対応する残基は、重ねた構造におけるアルファ炭素の距離の最小化（例えば、どの組のアルファ炭素対がアライメントに関する最小平均二乗偏差を提供するか）に基づいて一部のアルゴリズムにおいて同定される。Ｈ．ピロリフェリチンに関して記載された位置に対応する非Ｈ．ピロリフェリチンにおける位置を同定する場合、Ｈ．ピロリフェリチンは、「第２の」配列であり得る。目的の非Ｈ．ピロリフェリチンが利用可能な公知の構造を有しないが、公知の構造を有する別の非Ｈ．ピロリフェリチンに、Ｈ．ピロリフェリチンより密接に関連する場合、密接に関連する非Ｈ．ピロリフェリチンの公知の構造を使用して目的の非Ｈ．ピロリフェリチンをモデリングし、次にそのモデルをＨ．ピロリフェリチン構造と比較して、目的のフェリチンにおける所望の対応する残基を同定することが最も有効であり得る。構造モデリングおよびアライメントに関して広範囲の文献が存在し、代表的な開示には、米国特許第６８５９７３６号；米国特許第８７３８３４３号；およびＡｓｌａｍら、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０（２０１６）９〜１３頁において引用される開示が挙げられる。公知の関連する構造または複数の構造に基づく構造のモデリングの考察に関して、例えば、Ｂｏｒｄｏｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ４（２００９）１〜１３頁、およびその中で引用されている参考文献を参照されたい。
【０１７３】
６．免疫刺激性部分；アジュバント；コンジュゲートされたＲＳＶポリペプチド
一部の実施形態では、ＲＳＶポリペプチドおよび／またはアジュバントのような免疫刺激性部分は、表面に露出したアミノ酸に結合する。一部の実施形態では、表面に露出したアミノ酸は、例えば上記で考察した変異に起因するシステインである。一部の実施形態では、表面に露出したアミノ酸は、リシン、アスパルテート、またはグルタメートである。グルタルアルデヒド（リシンをアミノ担持リンカーまたは部分にコンジュゲートするため）またはカルボジイミド（例えば、アスパルテートもしくはグルタメートをアミノ担持リンカーもしくは部分にコンジュゲートするための、またはリシンをカルボキシル担持リンカーもしくは部分にコンジュゲートするための、１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリン−４−イル−エチル）カルボジイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ；ＥＤＡＣ））を使用するコンジュゲーション手順は、例えばｗｗｗ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ．から入手可能な、Ｃｈａｐｔｅｒ  ４  ｏｆ  Ｈｏｌｔｚｈａｕｅｒ，Ｍ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌａｂ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ２００６，ＩＳＢＮ  ９７８−３−５４０−３２７８５−１に記載されている。
【０１７４】
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分は、フェリチンの表面に露出したアミノ酸に結合する。一部の実施形態では、アジュバントのような１つより多くの免疫刺激性部分が、フェリチンの表面に露出したアミノ酸に結合する。一部の実施形態では、２４個の免疫刺激性部分が、フェリチン多量体または粒子（例えば、Ｈ．ピロリフェリチン粒子における各々の単量体の１つの部分）に結合する。複数の免疫刺激性部分がフェリチンナノ粒子に結合した一部の実施形態では、免疫刺激性部分は全て同一である。複数の免疫刺激性部分がフェリチンナノ粒子に結合した一部の実施形態では、免疫刺激性部分は全て同一ではない。
【０１７５】
ａ）免疫刺激性部分のタイプ；アジュバント
表面に露出したアミノ酸（例えば、システイン）に結合することができる免疫刺激性部分を、本開示に従ってフェリチンにおいて使用することができる。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、Ｂ細胞アゴニストである。
【０１７６】
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、疎水性ではない。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は親水性である。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、極性である。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、水素結合またはイオン結合することが可能であり、例えば水素結合ドナー、水素結合アクセプター、カチオン性部分またはアニオン性部分を含む。部分が、ｐＨ  ６、７、７．４、または８のような生理的に関連するｐＨで、水溶液中でイオン化される場合、部分はカチオン性またはアニオン性であると考えられる。
【０１７７】
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、アジュバントである。一部の実施形態では、アジュバントは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を含む。一部の実施形態では、アジュバントは、ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）アゴニストまたはインターフェロン遺伝子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストの刺激剤である。一部の実施形態では、アジュバントはＢおよび／またはＴ細胞におけるＴＬＲシグナル伝達を活性化する。一部の実施形態では、アジュバントは、適応免疫応答を調節する。
【０１７８】
（１）ＴＬＲ２アゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２アゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
【０１７９】
一部の実施形態では、ＴＬＲ２アゴニストは、ＰＡＭ２ＣＳＫ４、ＦＳＬ−１、またはＰＡＭ３ＣＳＫ４である。
【０１８０】
（２）ＴＬＲ７／８アゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニスト（すなわち、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の少なくとも１つのアゴニスト）である。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
【０１８１】
一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、一本鎖（ｓｓＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、イミダゾキノリンである。一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、ヌクレオシドアナログである。
【０１８２】
一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、３Ｍ−０１２（３Ｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のようなイミダゾキノリンアミンＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。遊離の３Ｍ−０１２の構造は：
【化１】
2021519597.tif 000003
である。３Ｍ−０１２または本明細書で考察する任意の部分のような免疫刺激性部分は、この部分の適切な末端原子（例えば、水素）を、例えば表面に露出したシステインの硫黄での本明細書に記載されるフェリチンとの結合に置換することによって、またはそのような硫黄に結合するリンカーによってフェリチンにコンジュゲートすることができると理解される。このように、フェリチンにコンジュゲートする場合、免疫刺激性部分の構造は、遊離の分子の構造とはわずかに異なる。
【０１８３】
一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、ＳＭ７／８ａである。遊離のＳＭ７／８ａの構造は：
【化２】
2021519597.tif 000004
である。
【０１８４】
例えば、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５  Ｎｏｖ；３３（１１）：１２０１〜１０頁．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３３７１を参照されたい。
【０１８５】
（３）ＴＬＲ９アゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９アゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
【０１８６】
一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、非メチル化ＣｐＧ  ＯＤＮである。一部の実施形態では、ＣｐＧ  ＯＤＮは、通常のＤＮＡにおいて見出される天然のホスホジエステル（ＰＯ）骨格の代わりに、部分的または完全なホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を含む。
【０１８７】
一部の実施形態では、ＣｐＧ  ＯＤＮは、クラスＢ  ＯＤＮであり、これは５’プリン（Ｐｕ）−ピリミジン（Ｐｙ）−Ｃ−Ｇ−Ｐｙ−Ｐｕ３’を含む１つまたはそれ以上の６量体ＣｐＧモチーフを含み；十分にホスホロチオエート化された（すなわち、ＰＳ改変された）骨格を有し；１８〜２８ヌクレオチド長を有する。一部の実施形態では、ＣｐＧ  ＯＤＮは、配列番号２１０の配列を含み、場合により、骨格にホスホロチオエート結合を含む。
【０１８８】
一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、免疫刺激性配列（ＩＳＳ）を含む。一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、ＩＳＳ−１０１８（Ｄｙｎａｖａｘ）（配列番号２１０）である。
【０１８９】
（４）ＳＴＩＮＧアゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子タンパク質刺激因子、小胞体ＩＦＮ刺激因子とも呼ばれる）アゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧの合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
【０１９０】
一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）である。例えば、Ｄａｎｉｌｃｈａｎｋａら、Ｃｅｌｌ  １５４：９６２〜９７０頁（２０１３）を参照されたい。例示的なＣＤＮは、ｃｄＡ、ｃｄＧ、ｃＡＭＰ−ｃＧＭＰ、および２’−５’，３’−５’ｃＧＡＭＰを含む（構造に関しては、Ｄａｎｉｌｃｈａｎｋａら、を参照されたい）。ＳＴＩＮＧアゴニストはまた、ＤＭＸＡＡのような合成アゴニストも含む。
【化３】
2021519597.tif 000005
【０１９１】
ｂ）コンジュゲートされたＲＳＶポリペプチド
一部の実施形態では、ＲＳＶポリペプチドは、フェリチンの表面に露出したアミノ酸にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＲＳＶポリペプチドは、フェリチンタンパク質を抗原性にする。一部の実施形態では、ＲＳＶポリペプチドは、単独で抗原性であるが、一部の実施形態では、ＲＳＶポリペプチドは、フェリチンとのその会合のために抗原性である。一部の実施形態では、ＲＳＶポリペプチドは、本明細書に記載されるＲＳＶ  ＦまたはＧポリペプチドのいずれか１つである。
【０１９２】
ｃ）コンジュゲーション
一部の実施形態では、表面に露出したシステイン（例えば、本明細書に記載される変異に起因する）、またはフェリチン（例えば、フェリチンのＮ末端）に結合したペプチドリンカー中のシステインを使用して、アジュバントのような免疫刺激性部分またはＲＳＶポリペプチドを、フェリチンにコンジュゲートする。一部の実施形態では、リンカーは、そのようなシステインにコンジュゲートされ、リンカーを次に、アジュバントのような免疫刺激性部分、またはＲＳＶポリペプチドにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、そのようなシステインは、アジュバント、リンカー、またはＲＳＶポリペプチドを結合させるコンジュゲーション反応のための化学ハンドルを作製する。一部の実施形態では、バイオコンジュゲートが産生され、アジュバントのような免疫刺激性部分またはＲＳＶポリペプチドは、そのようなシステインの還元後にフェリチンに連結される。一部の実施形態では、システインは、表面に露出した不対システイン、すなわちジスルフィド結合を形成するための適切な位置にパートナーシステインを欠如するシステインである。一部の実施形態では、システインは、遊離のチオール側鎖を含む不対システインである。
【０１９３】
（１）コンジュゲーションケミストリーのタイプ
任意のタイプのケミストリーを使用して、例えばシステインまたはＬｙｓ、Ｇｌｕ、もしくはＡｓｐのような別のアミノ酸のような表面に露出したアミノ酸の反応を介して、アジュバントのような免疫刺激性部分またはＲＳＶポリペプチドをフェリチンにコンジュゲートすることができる。
【０１９４】
一部の実施形態では、コンジュゲーションは、クリックケミストリーを使用して実施される。本明細書で使用される場合、「クリックケミストリー」は、互いに急速かつ選択的に反応する（すなわち、「クリックする」）１対の官能基間での反応を指す。一部の実施形態では、クリックケミストリーは、緩和な水性条件下で実施することができる。一部の実施形態では、クリックケミストリー反応は、表面に露出したアミノ酸の変異に起因するシステインのようなフェリチンの表面上のシステインを利用し、システインと反応することができる官能基を使用してクリックケミストリーを実施する。
【０１９５】
クリックケミストリーの基準を満たす多様な反応が、当技術分野で公知であり、当業者は、複数の公表された方法論のいずれかを使用することができる（例えば、Ｈｅｉｎら、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２５（１０）：２２１６〜２２３０頁（２００８）を参照されたい）。クリックケミストリーに関してＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、またはＬｕｍｉｐｒｏｂｅの試薬のような広範囲の市販の試薬を使用することができる。一部の実施形態では、コンジュゲーションは、以下の実施例に記載されるようにクリックケミストリーを使用して実施される。
【０１９６】
一部の実施形態では、クリックケミストリーは、フェリチンの還元後に起こる。
【０１９７】
一部の実施形態では、クリックケミストリーは、１ステップクリック反応であり得る。一部の実施形態では、クリックケミストリーは、２ステップクリック反応であり得る。
【０１９８】
一部の実施形態では、反応は、金属フリーのクリックケミストリーを含む。一部の実施形態では、反応は、チオール−マレイミドおよび／またはジスルフィド交換を含む。
【０１９９】
金属フリークリックケミストリー
金属フリークリックケミストリーは、タンパク質の起こり得る酸化を回避するためにコンジュゲーション反応に関して使用することができる。金属フリークリックケミストリーは、抗体コンジュゲートを形成するために使用されている（ｖａｎ  Ｇｅｅｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０１５，２６，２２３３〜２２４２頁を参照されたい）。
【０２００】
一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、アジュバントをフェリチンに結合させる反応において使用される。一部の実施形態では、アジュバントをフェリチンに結合させる反応において銅フリーコンジュゲーションを使用する。一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）を使用する。一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、ジベンゾアザシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を使用する。一部の実施形態では、ＢＣＮまたはＤＢＣＯは、アジド基と反応する。
【０２０１】
ＤＢＣＯは、触媒の非存在下での歪み促進型クリック反応を介してアジド基に対して高い特異性を有し、高収率の安定なトリアゾールをもたらす。一部の実施形態では、ＤＢＣＯは、銅触媒の非存在下でアジドと反応する。
【０２０２】
一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、１ステップクリック反応において使用される。一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、２ステップクリック反応において使用される。
【０２０３】
チオール−マレイミドおよびジスルフィド交換
本明細書で使用されるフェリチンは、スルフヒドリルとしても知られるチオールを含むシステインを含むことができ、これはスルフヒドリル反応性化学基との反応に関して利用可能である（または還元を通して利用可能となり得る）。このように、システインは、アジュバントのような免疫刺激性部分をフェリチンに付加するための化学選択的改変を可能にする。塩基性条件下では、システインは、脱プロトン化されて、チオレート求核試薬を生成し、これはマレイミドおよびヨードアセトアミドのような弱い求電子試薬と反応することができる。システインとマレイミドまたはヨードアセトアミドとの反応は、炭素−硫黄結合をもたらす。
【０２０４】
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、表面に露出したシステインまたはフェリチンのリンカー中のシステインと反応する。一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、またはＴＮＢ−チオールである。
【０２０５】
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、アルキル化によってシステインのスルフヒドリルにコンジュゲートする（すなわち、チオエーテル結合の形成）。一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ジスルフィド交換によってシステインのスルフヒドリルにコンジュゲートする（すなわち、ジスルフィド結合の形成）。
【０２０６】
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分をフェリチンにコンジュゲートする反応は、チオール−マレイミド反応である。
【０２０７】
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、マレイミドである。一部の実施形態では、マレイミドとシステインとの反応は、例えば可逆的ではない安定なチオエステル結合の形成をもたらす。一部の実施形態では、マレイミドは、フェリチン中のチロシン、ヒスチジン、またはメチオニンとは反応しない。一部の実施形態では、非反応マレイミドは、遊離のチオールを例えば過剰に添加することによって、反応終了時にクエンチされる。
【０２０８】
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分をフェリチンにコンジュゲートする反応は、ジスルフィド相互交換としても知られるチオール−ジスルフィド交換である。一部の実施形態では、反応は、当初のジスルフィドの一部を含む混合ジスルフィドの形成を伴う。一部の実施形態では、当初のジスルフィドは、表面に露出したアミノ酸の変異またはＮ末端リンカーの付加によってフェリチンに導入されたシステインである。
【０２０９】
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ピリジルジチオールである。一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ＴＮＢ−チオール基である。
【０２１０】
（２）コンジュゲートされたリンカー
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分、またはＲＳＶポリペプチドは、システインのような表面に露出したアミノ酸に共有結合したリンカーを介してフェリチンに結合する。一部の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧリンカーを含む。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ）リンカーは、アジュバントのような免疫刺激性部分に連結したフェリチンの水溶性およびライゲーション効率を増加させる。ＰＥＧリンカーは、２〜１８ＰＥＧ長の間、例えば、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ１４、ＰＥＧ１５、ＰＥＧ１６、ＰＥＧ１７、およびＰＥＧ１８である。
【０２１１】
一部の実施形態では、リンカーは、マレイミドを含む。一部の実施形態では、リンカーは、免疫刺激性部分（ＩＳＭ）−リンカー−マレイミドの構成要素を含む。一部の実施形態では、ＩＳＭ−リンカー−マレイミドは、マレイミドとフェリチンのシステインとの反応によって１ステップクリックケミストリーにおいてフェリチンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、アジュバント−リンカー−マレイミドのＩＳＭは、ＳＭ７／８ａである。一部の実施形態では、ＩＳＭ−リンカー−マレイミドのリンカーはＰＥＧ４である。一部の実施形態では、ＩＳＭ−リンカー−マレイミドは、ＳＭ７／８ａ−ＰＥＧ４−マレイミドである。
【０２１２】
一部の実施形態では、２ステップクリックケミストリープロトコルを、１つの末端でスルフヒドリル反応性化学基および他方の末端でアミン反応基を含むリンカーと共に使用する。そのような２ステップクリックケミストリープロトコルでは、スルフヒドリル反応性化学基は、フェリチンのシステインと反応するが、アミン反応基はＩＳＭに結合した試薬と反応する。このようにして、ＩＳＭは、１組の２クリックケミストリー試薬の組を介してフェリチンにコンジュゲートされる。
【０２１３】
２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基はマレイミドである。２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、マレイミドは、表面に露出したアミノ酸の変異またはＮ末端リンカーの付加によってフェリチンに導入されたシステインと反応する。
【０２１４】
２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、アミン反応基はＤＢＣＯである。２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、ＤＢＣＯは、ＩＳＭに結合したアジド基と反応する。
【０２１５】
一部の実施形態では、マレイミド−リンカー−ＤＢＣＯを使用する。一部の実施形態では、マレイミド−リンカー−ＤＢＣＯは、フェリチンの還元後、フェリチンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、マレイミド−リンカー−試薬は、第１のステップでマレイミドとフェリチンのシステインとの反応によってフェリチンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＤＢＣＯを使用してアジドに結合したＩＳＭに連結する。一部の実施形態では、アジドに連結したＩＳＭは、ＩＳＳ−１０１８である。一部の実施形態では、アジドにカップリングしたアジュバントは、３Ｍ−０１２またはＣｐＧである。
【０２１６】
一部の実施形態では、反応基を有するリンカーをＩＳＭに付加する。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧ４−アジドリンカー、またはＰＥＧ４−マレイミドリンカーである。
【０２１７】
一部の実施形態では、ＰＥＧ４−アジドリンカーは、３Ｍ−０１２にコンジュゲートされる。ＰＥＧ４−アジドリンカーにコンジュゲートされた３Ｍ−０１２の例示的な構造は：
【化４】
2021519597.tif 000006
である。
【０２１８】
一部の実施形態では、ＰＥＧ４−アジドリンカーは、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートされる。ＰＥＧ４−アジドリンカーにコンジュゲートされたＳＭ７／８ａの例示的な構造は：
【化５】
2021519597.tif 000007
である。
【０２１９】
一部の実施形態では、ＰＥＧ４−マレイミドリンカーは、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートされる。ＰＥＧ４−マレイミドリンカーにコンジュゲートされたＳＭ７／８ａの例示的な構造は：
【化６】
2021519597.tif 000008
である。
【０２２０】
一部の実施形態では、アジド基は、ＩＳＳ−１０１８にコンジュゲートされる。ＮＨＳエステル−アジドリンカーにコンジュゲートされたＩＳＳ−１０１８の例示的な構造は：
【化７】
2021519597.tif 000009
である。
【０２２１】
Ｅ．リンカー
一部の実施形態では、リンカーは、ＲＳＶポリペプチドのアミノ酸配列をフェリチンのアミノ酸配列から分離する。任意のリンカーを使用してもよい。一部の実施形態では、リンカーは、融合タンパク質としての抗原性フェリチンポリペプチドの発現を容易にすることができるペプチドリンカーである（例えば、単一のオープンリーディングフレーム由来）。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンリンカーである。一部の実施形態では、グリシン−セリンリンカーは、ＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号２２６）、２ＸＧＧＧＳ（配列番号２２７）（すなわち、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２２７））、または５ＸＧＧＧＳ（配列番号２２８）である。リンカーは、フェリチンに対してＮまたはＣ末端である。
【０２２２】
一部の実施形態では、リンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、約２〜４、２〜６、２〜８、２〜１０、２〜１２、または２〜１４アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも１５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも２５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも３０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも３５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも４０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、６０アミノ酸長未満またはそれに等しい。一部の実施形態では、リンカーは、５０アミノ酸長未満またはそれに等しい。一部の実施形態では、リンカーは、約１６、２８、４０、４６、または４７アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、フレキシブルである。一部の実施形態では、リンカーは、例えば免疫刺激性部分（例えば、アジュバント）のコンジュゲーション部位として使用するためのシステインを含む；システインを含む例示的なリンカーを、配列番号２２５として提供する。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２２５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含み、配列番号２２５中のシステインに対応するシステインをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも２５アミノ酸（例えば、２５〜６０アミノ酸）を含み、システインは、Ｎ末端から８番目のアミノ酸からＣ末端から８番目のアミノ酸までの範囲の位置、または中央残基の１０アミノ酸以内の位置、またはリンカーの結合位置に位置する。
【０２２３】
一部の実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）および／またはセリン（Ｓ）アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、および／またはアラニン（Ａ）アミノ酸、ならびに場合により上記で考察されているようなシステインを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２２２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２２０）、ＧＧＳＧＳＧＳＮＳＳＡＳＳＧＡＳＳＧＧＡＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２２１）、ＧＧＳＧＳＡＳＳＧＡＳＡＳＧＳＳＮＧＳＧＳＧＳＧＳＮＳＳＡＳＳＧＡＳＳＧＧＡＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２２２）、またはＧＳを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＦＲ１（配列番号２２３）またはＦＲ２（配列番号２２４）を含む。
【０２２４】
一部の実施形態では、フェリチンは、ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部を有するＨ．ピロリフェリチン（ハイブリッドフェリチンと呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、このハイブリッドフェリチンは、表面上に均一に分布したＲＳＶポリペプチド結合部位を有する多量体を形成する（Ｋａｎｅｋｉｙｏ  ２０１５を参照されたい）。一部の実施形態では、ハイブリッドフェリチンとのＮ末端融合タンパク質は、フェリチンナノ粒子表面上のＲＳＶポリペプチドの提示を可能にする。一部の実施形態では、フェリチンは、配列番号２０８（このグルタメートを含むハイブリッドフェリチン）の１３位、または配列番号２０９（６位がイソロイシンである野生型Ｈ．ピロリフェリチン）の６位に対応する位置でグルタメートを含む。ウシガエルリンカーと組み合わせると、このグルタメートは、ヒトおよびウシガエルフェリチンにおいて見出される保存された塩架橋を維持すると考えられる（ヒト軽鎖およびウシガエル下部サブユニットフェリチンの両方における６Ｒおよび１４Ｅ）。Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｃｅｌｌ  １６２，１０９０〜１１００頁（２０１５）を参照されたい。
【０２２５】
一部の実施形態では、ＲＳＶポリペプチドは、システイン−トロンビン−ヒスチジンリンカーを介してフェリチンに連結される。一部の実施形態では、このリンカーを使用して、クリックケミストリーを介してある部分（例えば、免疫刺激性部分またはＲＳＶポリペプチド）をフェリチンに直接コンジュゲートする。システイン−トロンビン−ヒスチジンリンカーを含む例示的な配列は、配列番号２１８である。システイン−トロンビン−ヒスチジンリンカーを伴うコンジュゲーション反応にとって適したクリックケミストリーは上記で考察されている。
【０２２６】
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分のためのコンジュゲーション部位としてシステインを含むリンカーは、表面に露出した不対システインを欠如するフェリチン分子を含む構築物において、または表面に露出した不対システインを含むフェリチン分子を含む構築物において使用される。
【０２２７】
一部の実施形態では、構築物はリンカーを含まない。一部の実施形態では、構築物は、１つのリンカーを含む。一部の実施形態では、構築物は、２つまたは２つより多くのリンカーを含む。
【０２２８】
Ｆ．組成物；ワクチン接種のための使用および方法
一部の実施形態では、本発明は、ＲＳＶによる感染に対して対象を免疫する方法を提供する。本発明は、対象におけるＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法をさらに提供する。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載される有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載される有効量の抗原性ＲＳＶポリペプチド、抗原性フェリチンポリペプチド、またはナノ粒子を対象に投与することを含む。
【０２２９】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド、ナノ粒子、または融合タンパク質のうちのいずれか１つまたはそれ以上と、薬学的に許容されるビヒクル、アジュバント、または賦形剤とを含む組成物が提供される。
【０２３０】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド、ナノ粒子、または組成物は、ＲＳＶによって引き起こされる感染に対して免疫化するために、ヒトなどの対象に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは融合タンパク質は、ヒトなどの対象に投与され、ＲＳＶによる将来の感染に対する防御免疫応答を生成する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド、ナノ粒子、または組成物のうちのいずれか１つまたはそれ以上は、ＲＳＶによって引き起こされる感染に対する免疫化に使用するために提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド、ナノ粒子、または組成物のうちのいずれか１つまたはそれ以上は、ＲＳＶによる将来の感染に対する防御的免疫応答の生成に使用するために提供される。一部の実施形態では、防御免疫応答は、ＲＳＶによる感染、肺炎、細気管支炎、または喘息の発症を減少させる。
【０２３１】
一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるＲＳＶ  Ｇポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるＲＳＶ  ＦポリペプチドおよびＲＳＶ  Ｇポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるＲＳＶ  ＧポリペプチドおよびＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび本明細書に記載されるＲＳＶ  Ｇポリペプチドを含む。
【０２３２】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む組成物は、融合後ＲＳＶ  Ｆポリペプチドによる免疫化と比較して、ＲＳＶに対して優れた中和反応を誘発する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＲＳＶ  Ｆポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるＲＳＶポリペプチドを含むポリペプチドまたはナノ粒子）による免疫化は、融合後ＲＳＶ  Ｆによる免疫化と比較して、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドに対する高い力価を誘発する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＲＳＶ  Ｆポリペプチドによる免疫化は、融合後ＲＳＶ  Ｆによる免疫化と比較して、融合後ＲＳＶ  Ｆに対する低い力価の抗体を誘発する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＲＳＶ  Ｆポリペプチドによる免疫化は、融合後ＲＳＶ  Ｆによる免疫化と比較して、融合前ＲＳＶ  Ｆに対する高い比率の全抗体を誘発する。本明細書に記載されるＲＳＶ抗原による免疫化は、融合後ＲＳＶ  Ｆによる免疫化と比較して、ＲＳＶに対するより良好な防御を提供し得る。融合後ＲＳＶ  Ｆに存在し、融合前Ｆと共有されるエピトープは、非中和性であり、場合によっては、ＲＳＶ感染を増加させる抗体を誘発することが示唆されている。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む組成物は、ＲＳＶに対するより高い中和反応を誘発し、一方、融合後ＲＳＶ  Ｆに対しする抗体を低下させる。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載されるＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む組成物は、融合後Ｆ結合反応に対してより高いＲＳＶ中和力価を誘発する。
【０２３３】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＲＳＶ抗原による免疫化は、融合後ＲＳＶ  Ｆによる免疫化と比較して、改善された安全性プロファイルをもたらす。この改善された安全性プロファイルは、非中和エピトープのブロック、または融合後コンフォメーションに存在する不十分な中和エピトープに関連し得る。融合後コンフォメーションに結合する抗体は、抗体媒介性ウイルス感染を介してＲＳＶ感染を増加させ得ることが報告されている。したがって、例えば融合前と融合後のコンフォメーションの両方を認識する抗体など、ＲＳＶウイルスを有意に中和しない融合後抗体は、ＲＳＶ感染を増加させる可能性がある。
【０２３４】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＲＳＶ  Ｇポリペプチドを含む組成物は、ＲＳＶに対する中和反応を誘発する。
【０２３５】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＲＳＶ  ＦおよびＲＳＶ  Ｇポリペプチドを含む組成物は、ＲＳＶに対する中和反応を誘発する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＲＳＶ  ＦおよびＲＳＶ  Ｇポリペプチドを含む組成物は、ＲＳＶに対する改善された防御、例えば、両方の抗原を含まない組成物よりも高い中和力価を提供する。
【０２３６】
１．対象
一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。
【０２３７】
一部の実施形態では、対象は成人（年齢１８歳より上または１８歳に等しい）である。一部の実施形態では、対象は小児または青年（年齢１８歳未満）である。一部の実施形態では、対象は高齢者（年齢６０歳より上）である。一部の実施形態では、対象は、非高齢成人（年齢１８歳より上またはそれに等しく、年齢６０歳未満またはそれに等しい）である。
【０２３８】
一部の実施形態では、組成物の１回より多くの投与を対象に投与する。一部の実施形態では、ブースター投与は免疫応答を改善する。
【０２３９】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドまたは組成物の１つまたはそれ以上は、霊長類（例えば、サル（例えば、アカゲザルまたはカニクイザルのようなマカク）または類人猿のような非ヒト霊長類）、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、または家畜哺乳動物（例えば、イヌ、ウサギ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ラクダ、またはロバ）のような哺乳動物において使用するためである。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドまたは組成物の１つまたはそれ以上は、家禽（例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ホロホロ鳥、または白鳥）のような鳥類において使用するためである。
【０２４０】
２．アジュバント
本明細書で使用される場合、アジュバントは、表面に露出したアミノ酸，例えば、システインを介してフェリチンにコンジュゲートしてもよい。非コンジュゲートアジュバントもまた、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドと共に対象に投与してもよい。一部の実施形態では、抗原性フェリチンポリペプチドと共にアジュバントを投与すると、アジュバントを投与しないＲＳＶポリペプチド単独、または抗原性フェリチンポリペプチド単独の投与と比較して、対象においてＲＳＶポリペプチドに対するより高力価の抗体を生じる。アジュバントは、抗原性ポリペプチドに対するより早期の、より強力な、またはより持続性の免疫応答を促進し得る。
【０２４１】
一部の実施形態では、組成物は、１つのアジュバントを含む。一部の実施形態では、組成物は１つより多くのアジュバントを含む。一部の実施形態では、組成物は、アジュバントを含まない。
【０２４２】
一部の実施形態では、アジュバントはアルミニウムを含む。一部の実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。一部の実施形態では、アジュバントはミョウバン（Ａｌｙｈｙｄｒｏｇｅｌ’８５  ２％；Ｂｒｅｎｎｔａｇ−カタログ番号２１６４５−５１−２）である。
【０２４３】
一部の実施形態では、アジュバントは有機アジュバントである。一部の実施形態では、アジュバントは油基剤のアジュバントである。一部の実施形態では、アジュバントは水中油型ナノ乳剤を含む。
【０２４４】
一部の実施形態では、アジュバントはスクアレンを含む。一部の実施形態では、スクアレンを含むアジュバントは、Ｒｉｂｉ（Ｓｉｇｍａ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍカタログ番号Ｓ６３２２−１ｖｌ）、Ａｄｄａｖａｘ（商標）ＭＦ５９、ＡＳ０３、またはＡＦ０３（米国特許第９７０３０９５号を参照されたい）である。一部の実施形態では、スクアレンを含むアジュバントは、ナノ乳剤である。
【０２４５】
一部の実施形態では、アジュバントは、ポリアクリル酸ポリマー（ＰＡＡ）を含む。一部の実施形態では、ＰＡＡを含むアジュバントはＳＰＡ０９である（ＷＯ２０１７２１８８１９を参照されたい）。
【０２４６】
一部の実施形態では、アジュバントは非代謝性油を含む。一部の実施形態では、アジュバントは、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を含む。
【０２４７】
一部の実施形態では、アジュバントは、非代謝性油および結核死菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む。一部の実施形態では、アジュバントはフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）である。
【０２４８】
一部の実施形態では、アジュバントは、リポ多糖類である。一部の実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルＡ（ＭＰＬまたはＭＰＬＡ）である。
【０２４９】
３．医薬組成物
様々な実施形態では、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドおよび／または関連する実体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、病原体に対して保護的免疫応答のような免疫応答を誘発することが可能な免疫原性組成物（例えば、ワクチン）である。
【０２５０】
例えば、一部の実施形態では、医薬組成物は、以下のうちの１つまたはそれ以上を含み得る：（１）（Ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインで置き換える変異と、（ＩＩ）ＲＳＶポリペプチドとを含む抗原性フェリチンタンパク質；（２）（Ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインおよびシステインに連結した免疫刺激性部分で置き換える変異と、（ＩＩ）ＲＳＶポリペプチドとを含む抗原性フェリチンタンパク質；（３）（Ｉ）表面に露出したシステインと、（ＩＩ）フェリチンタンパク質のＮ末端にあるペプチドリンカーと、（ＩＩＩ）ペプチドリンカーのＮ末端にあるＲＳＶポリペプチドとを含む抗原性フェリチンタンパク質；（４）（Ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインおよびシステインに連結した免疫刺激性部分で置き換える変異と、（ＩＩ）Ｈ．ピロリフェリチンの３１位の内部システインを非システインで置き換える変異、もしくはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に類似した位置の内部システインを非システインで置き換える変異と、（ＩＩＩ）表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異と、および（ＩＶ）ＲＳＶポリペプチドとを含む抗原性フェリチンタンパク質；または（５）前述のフェリチンタンパク質のいずれかを含むフェリチン粒子。一部の実施形態では、医薬組成物は、融合前ＲＳＶポリペプチドと融合後ＲＳＶポリペプチドの間で共有されるＲＳＶポリペプチドのエピトープがブロックされている、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む抗原性ＲＳＶポリペプチド、および／またはＲＳＶポリペプチドを含む抗原性ＲＳＶポリペプチドであって、ＲＳＶポリペプチドが配列番号２６のアミノ酸残基６２〜６９および１９６〜２０９、ならびに配列番号２６の３２８、３４８または５０７位に対応するアスパラギンを含み、場合により、抗原性ＲＳＶポリペプチドがフェリチンをさらに含む抗原性ＲＳＶポリペプチドを含む。
【０２５１】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドに関連する抗体または他の作用物質を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドに結合するおよび／またはそれと競合する抗体を含む。あるいは、抗体は、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドのＲＳＶポリペプチド構成要素を含むウイルス粒子を認識し得る。
【０２５２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、単独で、または免疫応答を増強するための１つもしくはそれ以上の作用物質、例えば本明細書に記載されるアジュバントと組み合わせて投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、上記のアジュバントをさらに含む。
【０２５３】
一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「担体」は、それと共に医薬組成物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。例示的な実施形態では、担体は、滅菌液体、例えば水、および石油、動物、植物、または合成起源の油を含む油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等を含み得る。一部の実施形態では、担体は、１つまたはそれ以上の固体構成要素であるか、またはそれらを含む。薬学的に許容される担体はまた、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびその組合せを含み得るがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、賦形剤は、例えば所望のコンシステンシーまたは安定化効果を提供するまたはそれに関与するように医薬組成物に含めることができる任意の非治療剤である。適した薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を含むがこれらに限定されない。様々な実施形態では、医薬組成物は無菌的である。
【０２５４】
一部の実施形態では、医薬組成物は、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、安定化剤、緩衝剤、または保存剤のような任意の多様な添加剤を含み得る。加えて、補助剤、安定化剤、濃化剤、潤滑剤、および着色剤を含めることができる。
【０２５５】
様々な実施形態では、医薬組成物は、任意の所望の投与様式に適合するように製剤化することができる。例えば、医薬組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、滴剤、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル剤、液体を含有するカプセル、ゼラチンカプセル、散剤、徐放性製剤、坐剤、乳剤、エアロゾル、噴霧剤、懸濁剤、凍結乾燥粉末、凍結懸濁液、乾燥粉末の形態、または使用するために適した他の任意の形態をとることができる。薬剤の製剤化および製造における一般的検討は、例えば参照によって本明細書に組み入れられる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に見出すことができる。
【０２５６】
医薬組成物は、任意の投与経路を介して投与することができる。投与経路は、例えば経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、粘膜、硬膜外、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸内、気管内点滴、気管支点滴、吸入、または局所投与経路を含む。投与は局所または全身であり得る。一部の実施形態では、投与は経口で実施される。別の実施形態では、投与は非経口注射による。一部の例では、投与は、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドの血流への放出をもたらす。投与様式は、医師の裁量に委ねることができる。
【０２５７】
一部の実施形態では、医薬組成物は、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、および皮下）にとって適している。そのような組成物は、例えば、液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤等として製剤化することができる。それらは、使用直前に滅菌注射可能媒体に溶解または懸濁することができる滅菌固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造してもよい。例えば、非経口投与は注射によって達成することができる。そのような実施形態では、注射剤は、通常の形態、すなわち液体溶液または懸濁液、注射前に液体中の溶液または懸濁液にとって適した固体形態、または乳剤として調製される。一部の実施形態では、注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、凍結乾燥粉末、または顆粒から調製される。
【０２５８】
さらなる実施形態では、医薬組成物は、吸入（例えば、肺および呼吸器への直接送達）による送達のために製剤化される。例えば、組成物は、点鼻用噴霧剤または他の任意の公知のエアロゾル製剤の形態をとり得る。一部の実施形態では、吸入用またはエアロゾル送達のための調製物は、複数の粒子を含む。一部の実施形態では、そのような調製物は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、または約１３ミクロンの平均粒子サイズを有し得る。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、乾燥粉末として製剤化される。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、例えば湿潤剤を含めることを通して湿潤粉末として製剤化される。一部の実施形態では、湿潤剤は、水、食塩水、または生理的ｐＨの他の液体からなる群から選択される。
【０２５９】
一部の実施形態では、本発明に従う医薬組成物は、鼻または口腔への滴剤として投与される。一部の実施形態では、用量は、複数の液滴（例えば、１〜１００、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１〜５滴等）を含み得る。
【０２６０】
本発明の医薬組成物は、所望の転帰を達成するために適切な任意の用量で投与することができる。一部の実施形態では、所望の転帰は、組成物に存在する抗原性フェリチンポリペプチドに存在するＲＳＶポリペプチドの起源に対する長期間持続する適応免疫応答の誘導である。一部の実施形態では、所望の転帰は、感染症の１つまたはそれ以上の症状の強度、重症度、頻度の低減、および／または発生の遅延である。一部の実施形態では、所望の転帰は、感染症の阻害または予防である。必要な用量は、対象の種、年齢、体重、および全身状態、予防または処置される感染の重症度、使用される特定の組成物、およびその投与様式に応じて対象毎に変化する。
【０２６１】
一部の実施形態では、本発明に従う医薬組成物は、単回または複数回用量で投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、異なる日に投与される複数回用量で投与される（例えば、プライム−ブーストワクチン接種戦略）一部の実施形態では、医薬組成物は、ブースターレジメンの一部として投与される。
【０２６２】
様々な実施形態では、医薬組成物は、１つまたはそれ以上の追加の治療剤と同時投与される。同時投与は、それらの投与時期が、追加の治療剤および医薬組成物中の活性成分の薬理活性が時間的に重複し、それによって組み合わせた治療効果を発揮する場合には、治療剤を同時に投与する必要はない。一般的に、各々の作用物質は、その作用物質に関して決定された用量および時間スケジュールで投与される。
【０２６３】
４．核酸／ｍＲＮＡ
同様に、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドをコードする核酸も提供される。一部の実施形態では、核酸はｍＲＮＡである。ポリペプチドをもたらす翻訳を受けることが可能な任意の核酸は、本開示の目的に関してｍＲＮＡであると考えられる。
【０２６４】
５．キット
同様に本明細書において、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の抗原性ポリペプチド、核酸、抗原性フェリチン粒子、抗原性ルマジンシンターゼ粒子、組成物、または医薬組成物を含むキットも提供される。一部の実施形態では、キットは、溶媒、溶液、緩衝剤、説明書、または乾燥剤の１つまたはそれ以上をさらに含む。
【０２６５】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【０２６６】
この説明および例示的な実施形態は、限定的と解釈されるべきではない。本明細書および添付の特許請求の範囲の目的で、特に断らない限り、明細書および特許請求の範囲において使用される量、パーセンテージまたは比率を表す全ての数字、および他の数値は、全ての場合において、まだそのように修飾されていない程度で、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。「約」は、記載された主題の特性に実質的に影響しない、例えば、１０％、５％、２％または１％以内の変動の程度を示す。したがって、別段の指示がない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、得られるべき所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、均等論の適用を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効桁数に照らし、および通常の丸め技法を適用して、少なくとも解釈されるべきである。
【０２６７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形は、明示的および明確に１つの指示対象に限定されない限り、「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」、および任意の単数形の使用は、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本明細書で使用される場合、用語「含む」およびその文法的変形は、リスト中の項目の記載が、リスト中の項目に置換または追加することができる他の同様の項目の除外にならないように、非限定的であることを意図している。
【実施例】
【０２６８】
以下の実施例は開示した特定の実施形態を説明するために提供され、本開示の範囲を限定するものとは決して解釈すべきでない。
【０２６９】
１．ＲＳＶ  Ｆポリペプチドに対する改変の設計および特徴解析
他のパラミキソウイルスＦタンパク質と同じく、ＲＳＶ  ＦはＮ末端シグナルペプチドおよびタンパク質をウイルス表面に固定するＣ末端膜貫通領域を有する前駆体タンパク質として発現される。ＲＳＶ  Ｆはプロテアーゼフリンによって細胞内切断を受けて疎水性の融合ペプチド（図１Ａの「ＦＰ」）を放出する。融合ペプチドの役割は、感染の際に標的細胞に結合することである。融合ペプチドに隣接してヘプタッドリピート領域Ａ（ＨＲＡ）があり、一方ヘプタッドリピート領域Ｂ（ＨＲＢ）は膜貫通ドメインに隣接している。
【０２７０】
融合前および融合後のコンフォメーションにおけるＲＳＶ  Ｆエクトドメイン三量体の結晶構造によって、ＨＲＡおよびＨＲＢ領域がどのように顕著な再配置を受けて細胞融合事象を促進するかが実証される（図１Ｂ）（Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｋ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８（２３）：９６１９〜２４頁（２０１１）；ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４２（６１５８）：５９２〜５９８頁（２０１３）；ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８５（１５）：７７８８〜９６頁（２０１１）；およびＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４２（６１５８）：５９２〜８頁（２０１３）参照）。融合前のコンフォメーションにおいて、ヘプタッドリピートＡ（ＨＲＡ）領域は球状のヘッドに関連しており、融合ペプチドの先端は大部分、タンパク質の中央に埋め込まれている。融合前のコンフォメーションはいくつかのヘリックスを含み、プロトマーの間のある種の接触が関与して融合前三量体を形成している。
【０２７１】
プロトマー間の安定化であるように一連のアミノ酸置換を設計した。例示的な置換にはＶ２０７Ｌ；Ｎ２２８Ｆ；Ｉ２１７ＶおよびＥ２１８Ｆ；Ｉ２２１ＬおよびＥ２２２Ｍ；またはＱ２２４ＡおよびＱ２２５Ｌが含まれる。実施例におけるＲＳＶ  Ｆアミノ酸配列の全ての番号付けは、配列番号２６の番号付けを用いる。
【０２７２】
ヘリックスの安定化であるようにアミノ酸置換を設計した。したがって、これらの置換はＲＳＶ  Ｆのヘリカルドメインを安定化することが予測される。例示的な置換にはＮ２１６ＰまたはＩ２１７Ｐが含まれる。
【０２７３】
プロトマー内の安定化であるようにアミノ酸置換を設計した。例示的な置換にはＶ２２０Ｉ；またはＡ７４ＬおよびＱ８１Ｌが含まれる。
【０２７４】
ヘリックスのキャッピングであるようにアミノ酸置換を設計した。例示的な置換にはＮ２１６ＰまたはＩ２１７Ｐが含まれる。
【０２７５】
凝集を減少させるようにアミノ酸置換を設計した。例示的な置換にはＶ１９２ＥおよびＬ６１Ｑが含まれる。
【０２７６】
Ｎ２２８Ｆ等の疎水性アミノ酸を導入することによって空洞を満たすように他のアミノ酸置換を設計した。
【０２７７】
非アスパラギン残基をアスパラギンに置き換えることによってグリコシル化部位を追加するために、アミノ酸置換Ｅ３２８Ｎ、Ｓ３４８Ｎ、およびＲ５０７Ｎを設計した。融合前のＦタンパク質の表面上の融合後のＲＳＶ  Ｆに露出したエピトープをブロックするために非天然グリカンの付加を用いることができると仮定された（図１Ｂ）。
【０２７８】
目的のＲＳＶ  Ｆ構築物は、Ｎ末端ウシガエルフェリチンリンカーとＨ．ピロリフェリチン（ｐＦｅｒｒ）を含むハイブリッドフェリチンとの一本鎖（ｓｃＦ）融合タンパク質として産生した（図１Ａ）。フェリチンはＫ７９ＣまたはＳ１１１Ｃの変異に起因する表面露出システインを含んでいた（フェリチン配列の番号付けは配列番号２０８に対応する）。
【０２７９】
当分野で公知の標準的なクローニング慣習を用いて種々のＲＳＶ  Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰおよびフェリチンコーディング配列の産生を実施した。一般的に言えば、記載した置換を有するＲＳＶ  Ｆ構築物のためのＤＮＡを合成して、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって哺乳動物の発現ベクターにクローニングした。以前に刊行されたプロトコルと同様にＲＳＶ  Ｆ  ＤＳ−ＣＡＶ１および融合後Ｆ三量体を産生した（ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４２（６１５８）：５９２〜５９８頁（２０１３）参照）。ＤＳ−ＣＡＶ１構築物はＲＳＶ  ＦのＣ末端三量体化ドメインを保持しており、これを空洞充填疎水性置換と組み合わせた。ＲＳＶ  Ｆ  ＤＳ−ＣＡＶ１はＳ１５５Ｃ〜Ｓ２９０Ｃジスルフィドマルチネイション（ＤＳ）およびＳ１９０Ｆ〜Ｖ２０７Ｌ（ＣＡＶ１）を含んでいる。
【０２８０】
ＲＳＶ  Ｆ−フェリチンナノ粒子をコードするベクター、裸のフェリチン（ＲＳＶ  Ｆに結合していない）、およびＲＳＶ  Ｆ三量体を２９３ＥＸＰＩ細胞にトランスフェクトし、４日後に馴化培地から発現生成物を回収した。ＲＳＶ  Ｆナノ粒子は従来のクロマトグラフィー法を用い、ｐＨ７．０および８．５の一連のアニオン性Ｑカラム精製（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｃａｔ＃１７−１１５４−０１）およびそれに続くＰＢＳ中Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６  ＳＥＣ精製（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｃａｔ＃９０−１０００−４２）によって精製した。ＤＳ−ＣＡＶ１融合前三量体および融合後三量体は−８０℃で保存し、ＲＳＶ  Ｆナノ粒子は４℃で保存した。
【０２８１】
ＲＳＶ  Ｆナノ粒子のコンフォメーションを決定するため、電子顕微鏡を実施した。ＲＳＶ  Ｆナノ粒子調製物（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中、３０μｇ／ｍＬ）を４００メッシュの炭素コートグリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に吸収させ、０．７５％のギ酸ウラニルで染色した。８０ｋＶで操作するＪＥＯＬ社の１２００ＥＸ顕微鏡を用いてサンプルを解析した。顕微鏡写真は６５，０００倍の拡大で取得し、ＥＭ会社Ｎａｎｏｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）による当分野の従来法を用いて２Ｄクラス平均を調製した（図１Ｄ）。
【０２８２】
過渡的にトランスフェクトした２９３ＥＸＰＩ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によるこれらのＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよびフェリチンを含むポリペプチド（配列番号１〜８および１１〜１５）の発現および分泌を、抗ＲＳＶ  Ｆウエスタンブロットによって評価した。全ての抗ＲＳＶ  Ｆウエスタンブロットは、ＭｃＬｅｌｌａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０（６１３６）：１１１３〜１１１７頁（２０１３）および米国特許第８，５６２，９９６号に記載された部位０特異的Ｄ２５抗体を用いた。図２に示すように、多くの構築物の発現および分泌に成功した。
【０２８３】
ＲＦ８０８５ポリペプチド（配列番号１）は、Ｎ末端でフェリチンナノ粒子に融合した発表済みのＤＳ−ＣＡＶ１  ＲＳＶ  Ｆの一本鎖変異体を表す（ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４２（６１５８）：５９２〜５９８頁（２０１３）参照）。この構築物は抗原部位０を保持したＲＳＶ  ＦのＳ１５５Ｃ〜Ｓ２９０Ｃ二重変異体（ＤＳ）を含んでいる。
【０２８４】
ＲＦ８１０６ポリペプチド（配列番号９）は、ＤＳ−ＣＡＶ１に置換される２つのシステインの代わりにＩ２１７Ｐ置換を有している。図３に示すように、ＲＦ８１０６構築物は４日後に抗ＲＳＶ  Ｆウエスタンブロットによる馴化培地からの評価で、過渡的にトランスフェクトした２９３ＥＸＰＩ細胞において顕著に良好な発現を有していた。
【０２８５】
ＲＦ８１０６のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、融合タンパク質ナノ粒子と符合するＲＳＶ抗原に融合した集合したフェリチン粒子と符合する保持時間において主ピークの溶出を示した（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ、図４）。ＲＦ８１０６の動的光散乱（ＤＬＳ）解析を、還元状態（図５Ｂ）および非還元状態（図５Ａ）で行った。還元は２ｍＭ  ＴＣＥＰによる処理で行った。ＲＦ８１０６はほぼ１５ｎｍの半径を有しており、これは還元状態および非還元状態のナノ粒子（２４量体）への組み込みと符合している。以下に述べるように、融合タンパク質の還元剤への安定性は、アジュバントが融合タンパク質にコンジュゲートして自己アジュバント性ナノ粒子を形成することを容易にしている。
【０２８６】
次に、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドとフェリチンとの融合タンパク質へのアジュバントのコンジュゲーション（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ）を評価した。フェリチンの上の遊離の表面システインを用いてｓｃＦ−ｐＦｅｒｒ融合タンパク質に追加の部分を結合させることができることが見出された。図６に、配列Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ（配列番号３０、＊はホスホロチオエートリンケージを示す）を有するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）のＲＦ８１０６へのコンジュゲーションの成功を示す。これは、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで評価した分子量の増大によって証明された。
【０２８７】
Ｅ３２８Ｎ、Ｓ３４８Ｎ、およびＲ５０７Ｎの置換（ＲＦ８１１７、配列番号１７）を用いてグリコシル化部位を追加することの効果を、フェリチンとの融合タンパク質としてのこの構築物（すなわちＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ構築物として）を過渡的にトランスフェクトした２９３ＥＸＰＩ細胞で評価した。ＲＦ８１１７はまた、ＲＦ８１１３と同様にＩ２１７Ｐ置換を含んでいる。図７に示すように、ＲＦ８０８５対照構築物およびＲＦ８１１３構築物（配列番号１６、これはＩ２１７Ｐのプロリン置換を含むが、Ｅ３２８Ｎ、Ｓ３４８Ｎ、およびＲ５０７Ｎの置換を含まない）と比較して、ＲＦ８１１７の発現の増大が見られた。ＲＦ８１１３は、操作されたフェリチンのシステインがフェリチン残基のＳ１１１ＣでなくＫ７９Ｃの上にあることを除いて、既に述べたＲＦ８１０６と同様である。ＲＦ８１１７構築物はまた、ＲＦ８１１３およびＲＦ８１１７の分子量の増大を示し、グリカンの付加に成功したことを示した。
【０２８８】
図８に、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰのタンパク質分解安定性を増大したＲＳＶ  Ｆナノ粒子の改変をまとめる。出発構築物はＲＦ８１１７（上記）であった。その前の構築物ＲＦ８０８５をＲＦ８０９０としてＣＨＯベクターにクローニングしてＣＨＯ細胞にトランスフェクトした際、いくらかの物質がＦとフェリチン部分との間で切り取られたことが観察された。ＨＲＢ領域またはＦとフェリチン部分との間のリンカーにおけるアルギニンまたはリシンの残基がトリプシン様のプロテアーゼで切断されていたことが疑われた。この領域内のリシンおよびアルギニン残基の変異を、２９３細胞中での発現に関して試験した。図８より、Ｋ４９８ＬおよびＲ５０８Ｑの変異（ＲＦ８１２２、配列番号１８における）が、ＲＦ８１１７と比較して発現に影響しまたは発現を増大させないことが確認された。これらの変異をＲ５２３Ｑとともに本明細書で述べたＲＦ８１１７の変異と組み合わせて、構築物ＲＦ８１４０（配列番号２３）を形成した。
【０２８９】
２９３細胞での発現において、一本鎖とプロリン（Ｉ２１７Ｐ）改変の組合せにより、発現のより大きな改善（ほぼ５倍）（これらの置換を有する例示的な構築物にはＲＦ８１０６（配列番号９）およびＲＦ８１１３（配列番号１６）が含まれる）、およびＲＳＶ  Ｆのグリコシル化部位改変の追加に起因する発現および溶解性のさらなる改善（例示的な構築物ＲＦ８１１７（配列番号１７）およびＲＦ８１４０（配列番号２３））が見られた。これらの構築物は全て、配列ＧＳＧＮＶＧＬ（配列番号３１）に置き換えられた融合ペプチドおよびｐ２７ペプチド領域（配列番号２６のアミノ酸９８〜１４４）を有していた。しかし、ＲＦ８０９０を製造用ＣＨＯ細胞株で発現した場合には、ウエスタンブロットでさらなるＲＳＶ  Ｆバンドが観察され、この構築物はおそらくアルギニンまたはリシン残基におけるトリプシン様切断によるタンパク質分解を受けやすいことを示唆している。
【０２９０】
プロテアーゼに対する感受性の潜在的役割も検討した。ＨＲＢ領域およびＦ部分とフェリチン部分との間のリンカーにおけるＫ残基の置換（ノックアウトまたはＫＯ）を行った。それは、これらの部分が製造用ＣＨＯ細胞株において初期に観察されたＫ介在切断の可能性のある部位であると予想されたからである。図９Ａおよび図９Ｂに示すように、Ｄ２５ウエスタンブロットまたはＤ２５およびＡＭ１４  Ｏｃｔｅｔ解析で測定して、ＲＦ８１１７およびＲＦ８１４０はいずれも、製造用ＣＨＯ細胞株においてＲＦ８０９０と比較して高いレベルを発現した。
【０２９１】
これらのデータより、一本鎖の構築物およびヘリックスキャッピングのためのアミノ酸の改変、グリコシル化の増大、ならびにプロテアーゼによる切断を受けやすいリシンまたはアルギニンの除去によって、ＲＳＶ  Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ抗原を含むＲＳＶ  Ｆポリペプチドの発現を改善できることが示される。
【０２９２】
２．ＲＳＶ  Ｆおよびフェリチンナノ粒子の融合タンパク質の特徴解析
動物研究に先立って、ＤＳ−ＣＡＶ１およびＲＳＶ  Ｆナノ粒子の濃度を、Ｏｃｔｅｔを用いる結合によって解析した。融合前抗原の融合前特異的抗体Ｄ２５およびＡＭ１４への結合も、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ装置を用いて測定した。全てのアッセイはＰＢＳ中、３０℃で実施した。抗体をプロテインＡ（ＰｒｏＡ）センサーチップ（ｆｏｒｔｅＢｉｏ＃１８−５０１３）に４００秒、負荷して、ほぼ飽和に達するまで捕捉させた。次いでバイオセンサーチップをＰＢＳ中で９０秒、平衡にし、次いで公知の濃度の抗原とＰＢＳ中で３００秒会合させ、次いでＰＢＳ中で抗原を解離させた。１：１の相互作用を仮定したデータ解析および曲線フィッティングを、公知の濃度の精製したＰｒｅ−Ｆ−ＮＰの結合の外部標準曲線を用いるＯｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＨＴ１０．０ソフトウェアで行った。ＣＨＯ馴化培地中のＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ濃度を決定する例示的なアッセイ結果を図９Ｂに示す。
【０２９３】
３．ＲＳＶ  Ｆポリペプチドへの免疫応答のｉｎ  ｖｉｖｏ特徴解析
マウスにおけるＲＳＶ抗原に対するｉｎ  ｖｉｖｏ応答を評価するため、雌ＢＡＬＢｃマウスを０週、３週、および６週で指定した用量のＲＳＶ抗原で筋肉内免疫した。他に注記しなければ、ＲＳＶ抗原を（例えばとりわけ図１０Ａ〜図１０Ｂ、および図１２Ａ〜図１２Ｂの実験において）ベッドサイド混合戦略によりＡＦ０３でアジュバント化した。すなわち、それぞれの後ろ足に５０μｌを注射する直前に、関連するタンパク質の溶液５０μｌをＳａｎｏｆｉ社のアジュバントＡＦ０３（スクアレン系エマルジョン、Ｋｌｕｃｋｅｒら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２０１２  Ｄｅｃ；１０１（１２）：４４９０〜５００頁参照）５０μｌと混合した。非アジュバント化群については、抗原を上記のように混合したが、ＡＦ０３を等体積のＰＢＳに置き換えた。ＳＰＡ０９またはアラムと混合した抗原については、ＡＦ０３をそれぞれ等体積のＳＰＡ０９またはアラムに置き換えて上記の手順を実施した。いずれの処方についても免疫による有害な影響は観察されなかった。最初の免疫の１日前、およびそれぞれの注射の少なくとも２週後（すなわち、２週、５週、および８週）に血液を採取した。他に特定しなければ、示したデータは３回目の注射の２週後（８週、２ｗｐ３とも注記する）のものであった。典型的には、血清は免疫前の動物（ナイーブと注記）、２回目の注射の２週後（ポスト２または２ｗｐ２）、または３回目の注射の２週後（ポスト３ｒｄまたは２ｗｐ３）から分析した。
【０２９４】
Ｖｅｒｏ細胞中和アッセイのため、血清を５６℃で３０分、熱不活化した。不活化血清の４倍連続希釈系列を、２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％のＧｌｕｔａＭＡＸ、および１％の抗生−抗有糸分裂剤を補ったＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で作成した。ＲＳＶウイルスストックを希釈血清と１：１で合わせ、３７℃で１．５時間インキュベートした。次いでウイルス−血清混合物を、コンフルエントなＶｅｒｏ細胞単層を含む２４ウェルのプレートに１ウェルあたり１００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１．５時間インキュベートした。次いで接種材料を１ウェルあたり１ｍＬの、２％のＦＢＳ、２％のＧｌｕｔａＭＡＸ、および２％の抗生−抗有糸分裂剤を補ったＤＭＥＭ中、０．７５％のメチルセルロースで覆った。５％ＣＯ２中、３７℃で５日インキュベートした後、上層を除去し、単層を氷冷メタノールで２０分固定した。
【０２９５】
次いでプレートを水で１回洗浄し、室温で３０分、穏やかに振盪しながらリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中５％の脂肪を含まないドライミルクでブロックした。次いでブロッキング溶液を、１ウェルあたり２００μＬのセイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗ＲＳＶ抗体（Ａｂｃａｍ社ＡＢ２０６８６）の２０００倍希釈物を含むＰＢＳ中、２％ドライミルクに置き換えた。室温で３時間インキュベートした後、プレートを水で２回洗浄し、ＴｒｕｅＢｌｕｅ  ＨＲＰ基質で発色させ、水でさらに２回洗浄して風乾した。
【０２９６】
染色したプラークを解剖用顕微鏡を用いて計数した。中和抗体力価は、式：６０％プラーク低減力価＝（Ｃ／Ｖ×０．４−Ｌｏｗ）／（Ｈｉｇｈ−Ｌｏｗ）×（ＨＳＤ−ＬＳＤ）＋ＬＳＤを用いてモック中和ウイルス対照の６０％低減エンドポイントで決定した。ここでＣ／Ｖ＝モック中和ウイルス対照ウェルにおけるＲＳＶプラークの平均、ＬｏｗおよびＨｉｇｈは血清サンプルのＣ／Ｖ×０．４値を挟む２つの希釈におけるＲＳＶプラークの平均数、ＨＳＤおよびＬＳＤは高い方および低い方の血清希釈倍率である。
【０２９７】
ＨＡＥ中和アッセイのため、血清を５６℃で３０分、熱不活化した。不活化血清の４倍連続希釈系列を、ＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ（商標）−ＡＬＩ  １０Ｘ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、０５００３）および１％の抗生−抗有糸分裂剤を補ったＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ（商標）−ＡＬＩ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、０５００２）（以下、培地）中で作成した。ＲＳＶウイルスストックを希釈血清と１：１で合わせ、３７℃で１．５時間インキュベートした。次いでウイルス−血清混合物を、完全に分化したＨＡＥ細胞を含む２４ウェルのプレートに１ウェルあたり５０μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２で１．５時間インキュベートした。インキュベーションの後、接種材料を除去し、ウェルを培地で２回洗浄して未結合のウイルスを除去し、３７℃、５％ＣＯ２でさらに２０時間インキュベートした。ｍＫａｔｅ（ＴａｇＦＰ６３５）レポーターを発現するＲＳＶに感染した培養における感染事象を、蛍光顕微鏡で計数した。
【０２９８】
ｍＫａｔｅレポーターを発現しないＲＳＶによる感染を検出するため、偽重層上皮を培地で十分に洗浄して粘液を除去し、次いで４％パラホルムアルデヒドで室温、３０分固定し、０．２５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３０分透過性にし、２％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭで３７℃で、１時間ブロックした。ブロッキング液を１ウェルあたり１００μＬの２％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭで２００倍に希釈したマウス抗ＲＳＶモノクローナル抗体混合物（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＡＢ  ８５８−４）に置き換え、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。次いでプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を補ったＰＢＳで３回洗浄した。２％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭ中、２００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ１１００１）１００μＬを１ウェルあたりに加え、プレートを４℃で終夜インキュベートした。翌朝、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を補ったＰＢＳで３回洗浄し、蛍光シグナルをＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  ＡｎｔｉＦａｄｅおよびＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｐ３６９３５）で安定化させ、蛍光顕微鏡で計数した。中和抗体力価は上記のように６０％低減エンドポイントで決定した。
【０２９９】
抗Ｆ結合のため、融合前Ｆ（ＤＳ−ＣＡＶ１）または融合後ＦのいずれかをＯｃｔｅｔ上の抗ＨＩＳ抗体チップに結合した。特定しない限り、全ての抗Ｆ結合は抗融合前Ｆ三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１）結合を意味する。Ｈｉｓ６−タグ付け（配列番号２３０）ＲＳＶ  Ｆ三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１）または融合後Ｆを抗ペンタ−ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ）センサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社＃１８−５１２２）に４００秒、前負荷して、ほぼ飽和に達するまで捕捉させた。次いでバイオセンサーチップをＯｃｔｅｔ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ中で９０秒、平衡にし、希釈した血清と３００秒会合させた。会合曲線の最終応答は、Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＨＴ１０．０ソフトウェアを用いて測定し、応答に希釈係数（１００または３００）を乗じて最終報告応答を得た。
【０３００】
抗Ｇｃｃ結合のため、Ｃ末端ＨＩＳタグを有するＧｃｃペプチドの三量体化二量体を上と同様にＯｃｔｅｔチップ上で用いた。Ｈｉｓ６−タグ付け（配列番号２３０）Ｇｃｃ（Ａ２株）六量体を抗ペンタ−ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ）センサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社＃１８−５１２２）に４００秒、前負荷して、ほぼ飽和に達するまで捕捉させた。次いでバイオセンサーチップをＯｃｔｅｔ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ中で９０秒、平衡にし、希釈した血清と３００秒会合させた。会合曲線の最終応答は、Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＨＴ１０．０ソフトウェアを用いて測定し、応答に希釈係数（１００または３００）を乗じて最終報告応答を得た。
【０３０１】
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の研究のため、ＮＨＰをＲＳＶ応答について事前スクリーニングした（ベースラインは全てのアッセイについて検出限界未満であることが見出された）。ＮＨＰは上記のマウスプロトコルと同様に表示されたアジュバントとともにＲＦ８１４０  ５０μｇで免疫したが、アジュバントの体積は多かった（図１１Ｃ〜図１１Ｄおよび図１８）。
【０３０２】
非ヒト霊長類の研究のため、ＶＥＲＯ中和アッセイを上記のように実施した。Ｐｒｅ−Ｆ結合は下記のＥＬＩＳＡアッセイによって評価した。
【０３０３】
ＮＨＰ血清サンプルを２倍段階希釈し（初期希釈１００倍）、ブロックされたＲＳＶ可溶性Ｆ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社＃１１０４９−Ｖ０８Ｂ）でコートしたプレート（１μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）上、３７℃で１時間インキュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗サルＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ社  ＡＡＩ４２Ｐ、１０，０００倍希釈）を用いて３７℃、９０分でＲＳＶ  Ｆ特異的ＩｇＧを検出した。３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ  Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ社）を用いてプレートを発色させ、１Ｎ塩酸（Ｐｒｏｌａｂｏ社＃３００２４２９０）で停止した。マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ社）を用いて４５０ｎｍ〜６５０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を測定した。ＲＳＶ  ｓＦ特異的ＩｇＧ力価はＳｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを用いて滴定曲線からＯＤ値範囲０．２〜３．０について計算した（各プレートに標準のマウス超免疫血清を加えた）。
【０３０４】
随意のＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）で表したこの参照のＩｇＧ力価はＯＤ１．０を与える希釈倍数の逆数のｌｏｇ１０に対応した。抗体検出の閾値は２０（１．３ｌｏｇ１０）ＥＵであった。グラフ化のため、全ての最終力価をｌｏｇ１０で表した。１．３ｌｏｇ１０未満のそれぞれの力価に、随意の力価１．０ｌｏｇ１０を割り付けた。
【０３０５】
ＮＨＰ研究における細胞介在免疫を評価するため、ＩＦＮγ／ＩＬ−２  ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔキット（ＦＳ−２１２２−１０、Ｍａｂｔｅｃｈ社）をメーカーの説明書に従って用いた。簡単には、ＩＰＦＬプレートの膜を３５％エタノールで前湿潤化し、捕捉抗体（抗ＩＦＮγおよび抗ＩＬ−２）を４℃で終夜コートした。
【０３０６】
次いでプレートを、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む２００μＬ／ウェルの細胞インキュベーション培地で、３７℃で２時間ブロックした。培地を除去し、刺激剤：完全長のＦ抗原（抗原特異的刺激）、抗ＣＤ３（陽性対照）、または細胞培養培地（非刺激対照）をウェルに加えた。マカク末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を解凍して計数した。１ウェルあたり４００，０００個の細胞を加え、５％ＣＯ２を含む加湿したインキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０３０７】
検出のため細胞を取り出し、検出抗体（コンジュゲートした抗ＩＦＮγおよび抗ＩＬ−２）を加え、室温で２時間インキュベートした。次いでフルオロフォアをコンジュゲートした試薬を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを空にし、乾燥させ、分析まで暗所に室温で保存した。陽性対照として抗ＣＤ３ｍＡｂを用い、ＰＢＭＣ百万個あたり５００超のスポット形成カウント（ＳＦＣ）の応答が全サンプルで見られ、サンプルの品質が許容できることを確認した。非刺激ウェル（細胞培養培地）で検出されたスポットをＦ抗原刺激細胞から差し引いた。
【０３０８】
ヒト細胞（またはＢ細胞）の解析のため、Ｄａｕｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１７  Ｏｃｔ  ４；３５（４１）：５４８７〜５４９４頁の参照した実験と同様の実験を実施した（図２０）。細胞は未処理（ＰＢＳで処理）、または１００ｎｇ用量と注記したようにＲＳＶ  ＦまたはＲＳＶ  Ｇポリペプチドで処理した。Ｆ結合およびＧ結合の応答は、それぞれプレＦ三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１）またはＧエクトドメインでコートしたビーズを用いて文献に記載されたルミネックスアッセイを用いて実施した。
【０３０９】
ＲＦ８１１７（配列番号１７）はＥ３２８Ｎ、Ｓ３４８Ｎ、およびＲ５０７Ｎで操作されたグリコシル化部位を含み、これらは上述のようにＤ２５またはＡＭ１４の結合を阻止しない。これらの融合前ナノ粒子が他の融合前抗原（ＤＳ−ＣＡ１）と同様の免疫応答を誘発することを実証するため、５匹の群のマウスを１μｇまたは０．１μｇの用量で、全てＡＦ０３アジュバントとともに、ｐｒｅ−Ｆ三量体（ＤＳ−ＣＡ１）、融合後Ｆ、またはＲＦ８１１７で、注射の間３週あけて３回免疫した。３回目の免疫の２週後に血清の中和力価をＶＥＲＯ細胞アッセイによって試験した。高用量のＲＦ８１１７は融合前対照と同様で融合後対照よりも優れた中和力価を誘発した。低用量ではＲＦ８１１７は融合前対照および融合後対照のいずれよりも高い中和力価を誘発した（図１０Ａ）。
【０３１０】
ＲＳＶ  Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰは、融合前および融合後のコンフォメーションの間で共有されたエピトープをブロックするように操作されたグリコシル化部位を有している。これらのグリカンが中和性応答を阻害していたかどうかを評価した。操作されたグリカンを有するＲＦ８１１７（配列番号１７）を、ＲＦ８１１３（ＲＦ８１１７と同様であるが操作されたグリカンを欠如する。配列番号１６）および融合前三量体対照（ＤＳ−ＣＡＶ１）と比較した。５匹の群のマウスを１μｇまたは０．１μｇの用量で、全てＡＦ０３アジュバントとともに、注射の間３週あけて３回免疫した。３回目の免疫の２週後に血清の中和力価をＶＥＲＯ細胞アッセイを用いて試験した。中和力価によって判断して、ＲＦ８１１３およびＲＦ８１１７の構築物の間でいずれの用量でも有意な相違はなかった（図１０Ｂ）。
【０３１１】
本明細書で述べたＲＦ８１４０（配列番号２３）のリシンおよびアルギニンのノックアウトが抗原の中和性応答を誘発する能力に影響しないことを実証するため、ＲＦ８１４０（配列番号２５）の免疫原性を、融合後Ｆ三量体（配列番号２４）の免疫原性とマウスで比較した（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。低用量（０．１μｇ）ではＲＦ８１４０（配列番号２５）は融合後三量体（配列番号２４）より優れた中和力価を誘発する。ＲＦ８１４０（配列番号２３）がＮＨＰで免疫応答を誘発することを実証するため、アジュバント（ＡＦ０３）の存在下または非存在下で、ＮＨＰをＲＦ８１４０（配列番号２５）で免疫した。図１１ＣにＲＳＶ  Ｆ結合応答（ＥＬＩＳＡ力価）を示す一方、図１１ＤでＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号２３）による免疫で誘発されたＲＳＶ中和力価を比較する。アジュバントの非存在下および存在下のＲＦ８１４０（配列番号２５）はいずれもＮＨＰで免疫応答を誘発する。
【０３１２】
ＲＦ８１１７（配列番号１７）およびＲＦ８１４０（配列番号２３）の操作されたグリコシル化部位はこれらの抗原が中和性応答を誘発することを阻止しないことが示されたので、これらが融合前および融合後のコンフォメーションの間で共有された非中和性または低中和性のエピトープをブロックすることを実証することが望まれた（図１２）。Ｏｃｔｅｔで測定して、高用量（１μｇ）および低用量（０．１μｇ）で、操作されたグリコシル化なしのＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１１３、配列番号１６）または操作されたグリコシル化ありのＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（操作されたＧｌｙ粒子、ＲＦ８１１７、配列番号１７）による免疫で誘発された融合前Ｆ（ＤＳ−ＣＡＶ１、配列番号２５）に対する抗体応答（図１２Ａ）。いずれかのＰｒｅ−Ｆ−ＮＰによって誘発された応答は同様であった。Ｏｃｔｅｔで測定して、高用量（１μｇ）および低用量（０．１μｇ）で、操作されたグリコシル化なしのＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１１３、配列番号１６）または操作されたグリコシル化ありのＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１１７、配列番号１７）による免疫で誘発された融合後三量体に対する抗体応答（図１２Ｂ）。ＲＦ８１１７（配列番号１７）によって誘発された融合後Ｆ結合応答は、ＲＦ８１１３（配列番号１６）によって誘発された応答より有意に低かった。したがって、ＲＦ８１１３とＲＦ８１１７はいずれも融合前Ｆに強力な抗体応答を誘発する一方、ＲＦ８１１７によって誘発される融合後Ｆ抗体応答は大きく抑制される。これは、共有された融合前および融合後のエピトープに対する操作されたグリカンのマッピングによる（図２Ｂ）。
【０３１３】
操作されたグリコシル化部位は非中和性エピトープをブロックするが、中和性抗体力価を非中和性抗体力価に迂回することをさらに実証するため、上記のデータを異なる方法で解析した（図１３）。マウス研究における野生型グリコシル化部位を有するＰｒｅ−Ｆ  ＮＰ（Ｗｔ  グリカン粒子、ＲＦ８１１３、配列番号１６）による免疫で誘発され、ＶＥＲＯ細胞アッセイによって測定したＲＳＶ中和力価と、操作されたグリコシル化部位を追加したＰｒｅ−Ｆ  ＮＰ（＋グリカン粒子、ＲＦ８１１７、配列番号１７）の比較を測定し、有意な相違がなかった（図１３Ａ）。マウス研究におけるＷｔグリカン粒子（ＲＦ８１１３、配列番号１６）による免疫と、＋グリカン粒子（ＲＦ８１１７、配列番号１７）による免疫で誘発されたＲＳＶ融合後Ｆ三量体結合抗体応答の比較は、操作されたグリカンを有するＰｒｅ−Ｆ−ＮＰについて抑制された融合後Ｆ結合応答を示した（図１３Ｂ）。操作されたグリカンが機能的な中和性抗体応答を低減しないが、共有された融合前／融合後エピトープに対して誘発される非中和性抗体を減少させ、それにより操作されたグリカン構築物によって誘発される中和性抗体の全抗体に対する比を改善することを実証するため、Ｆ結合応答に対する中和力価の比をプロットした（図１３Ｃ）。したがって、操作されたグリカンを有するＰｒｅ−Ｆ−ＮＰはマウスの研究において結合抗体プロファイルに優れた中和性を誘発する。
【０３１４】
フェリチンナノ粒子がＲＳＶ  Ｇの中央ドメイン抗原の免疫原性を改善するために用いることができることを実証するため、Ｇｃｃペプチド（配列番号２９）をフェリチンナノ粒子に化学的にコンジュゲートする方法を開発した。本明細書に記載したＳ１１１Ｃ変異を有するフェリチンは、ＮＨＳ基を介してＮ末端に結合したＰＥＧ４リンカーの上のマレイミド基を用いて合成されたＧｃｃペプチド（配列番号２９）でコンジュゲートすることができる。Ｎ末端マレイミドを有するＧｃｃペプチドを合成し、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ，ＵＳＡ）がＨＰＬＣで精製した。マレイミド−Ｇｃｃ抗原をフェリチンＳ１１１Ｃ粒子に添加すれば、マレイミドが遊離のシステインにコンジュゲートしてＧｃｃ−ＮＰを形成し、これはクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで観察することができる（図１４Ａ）。コンジュゲーションの効率は典型的には５０％〜９０％であるが、Ｇｃｃペプチドフェリチンナノ粒子（１００％コンジュゲーション）のモデルを図１４Ｂに示す。
【０３１５】
Ｇｃｃ−ＮＰがＧｃｃペプチド（配列番号２９）より優れた免疫応答を誘発するかどうかを決定するため、１群あたり５匹のマウスをＧｃｃペプチドまたはＧｃｃ−ＮＰで免疫した（それぞれの免疫のため１．３μｇの用量をＲＩＢＩと１：１で混合）。２回目の免疫の２週後、および３回目の免疫の２週後のＧｃｃ結合応答（Ｏｃｔｅｔ）を、ナイーブなマウス血清の代表的な群と比較した（図１４Ｃ）。マウスの研究における３回目の注射後のＧｃｃペプチド（配列番号２９）とＧｃｃ−ＮＰによる免疫で誘発された中和性応答も、ＨＡＥ中和アッセイで比較した（図１４Ｄ）。Ｇｃｃ結合応答と中和性応答の両方で判断して、Ｇｃｃ−ＮＰはＧｃｃペプチド単独より優れた免疫応答を誘発する。
【０３１６】
ＲＳＶ  Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０）とＧｃｃ−ＮＰの共投与がいずれの抗原の免疫応答を誘発する能力に干渉しないことを実証するため、マウスをＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ単独（ＲＦ８１４０、配列番号２３）、Ｇｃｃ−ＮＰ（Ｇｃｃペプチド配列番号２９とコンジュゲートしたフェリチン）、またはＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号２３）とＧｃｃ−ＮＰとの組合せで免疫した（図１５Ａ〜図１５Ｃ）。全ての免疫はＡＦ０３でアジュバント化した。ＲＦ８１４０単独（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ）またはＲＦ８１４０とＧｃｃ−ＮＰ（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ＋Ｇｃｃ−ＮＰ）で免疫したマウスは融合前Ｆ三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１、配列番号２５）に結合する抗体を生じたが、Ｇｃｃ−ＮＰで免疫したマウスはこれを生じなかった。Ｇｃｃ−ＮＰ単独（Ｇｃｃ−ＮＰ）またはＲＦ８１４０とＧｃｃ−ＮＰで免疫したマウスはＧｃｃペプチドに結合する抗体を生じたが、ＲＦ８１４０だけで免疫したマウスはこれを生じなかった。Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ単独、Ｇｃｃ−ＮＰ単独、またはＰｒｅ−Ｆ−ＮＰとＧｃｃ−ＮＰの共投与で免疫した動物は全て、ＨＡＥ中和アッセイで測定して２回目の免疫および３回目の免疫の後で中和性応答を生じた。
【０３１７】
ＲＳＶ  Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰとＧｃｃ−ＮＰの共投与がいずれの抗原の中和性抗体を誘発する能力に干渉するかどうかを決定するため、ＦおよびＧに対する中和性抗体を枯渇アッセイで検討した（図１６Ａ〜図１６Ｂ）。Ｇｃｃ−ＮＰの添加がＰｒｅ−Ｆ−ＮＰの中和性応答を誘発する能力に干渉しないことを実証するため、上記の群についてＦ感受性ＶＥＲＯ細胞アッセイによって中和力価を測定した（図１６Ａ）。抗原枯渇の品質を判断するため、ナイーブな動物からの血清も試験した。ＶＥＲＯアッセイにおいて、ＲＦ８１４０（配列番号２３）単独またはＧｃｃ−ＮＰと混合したＲＦ８１４０で免疫したマウスの血清は同様の中和性応答を誘発した一方、Ｇｃｃ−ＮＰはＦ抗体感受性ＶＥＲＯアッセイにおいて中和性応答を誘発しないようであった。融合前三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１、配列番号２５）に結合する抗体がＲＦ８１４０（配列番号２３）単独で免疫された動物またはＲＦ８１４０（配列番号２３）とＧｃｃ−ＮＰで免疫された動物からのプール血清から枯渇している場合には、ＶＥＲＯアッセイにおいて測定可能な中和力価の低減が観察された。上記の群をＨＡＥ細胞アッセイにおける中和力価について測定すると、全ての免疫群はＦおよびＧ感受性アッセイにおいて中和性応答を生じることが観察された（図１６Ｂ）。ＲＦ８１４０（配列番号２３）単独で免疫された動物からのプール血清はＨＡＥアッセイにおいて融合前Ｆ三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１、配列番号２５）で枯渇された可能性がある中和性応答を誘発した。Ｇｃｃ−ＮＰ単独で免疫された動物からのプール血清はＨＡＥアッセイにおいてＧエクトドメイン（配列番号２８）で枯渇された可能性がある中和性応答を誘発した。Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号２３）とＧｃｃ−ＮＰの両方で免疫された動物からのプール血清はＨＡＥアッセイにおいて、ＤＳ−ＣＡＶ１（配列番号２５）によって完全には枯渇しないが、ＤＳ−ＣＡＶ１、次いでＧエクトドメイン（配列番号２８）による引き続く枯渇によって完全に枯渇する中和性応答を誘発した。併せて、これらのデータは、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰおよびＧｃｃ−ＮＰの共投与が、いずれの抗原のそれぞれ融合前のＦまたはＧに対する中和性抗体を誘発する能力にも干渉しないことを示唆している。
【０３１８】
ＲＦ８１１７（配列番号１７）またはＲＦ８１４０（配列番号２３）のアジュバント化の効果を実証するため、ＡＦ０３、ＳＰＡ０９、またはアラムと混合したこれらの構築物をマウスに投与した。図１７Ａではアジュバントと混合した抗原１０μｇでマウスを免疫し、図１７Ｂではアジュバントと混合した抗原１μｇでマウスを免疫した。図１７Ａでは３回目の免疫時点の２週後にＶＥＲＯ細胞アッセイによって中和力価を測定した。非アジュバント化（Ｎｏ  Ａｄｊ）、アラムでアジュバント化、またはＡＦ０３でアジュバント化したＲＦ８１１７（配列番号１７）で免疫したマウスからの血清を示す。図１７Ｂでは、ＡＦ０３でアジュバント化したＲＦ８１１７（配列番号１７）、ＳＰＡ０９でアジュバント化したＲＦ８１１７（配列番号１７）、またはＡＦ０３でアジュバント化したＲＦ８１４０によって免疫したマウスからの血清についてのＶＥＲＯ細胞アッセイによって中和力価を測定した。ＲＦ８１１７（配列番号１７）またはＲＦ８１４０（配列番号２３）のいずれについても全ての場合に、ナイーブマウスのアジュバント群は非アジュバント群より高い中和力価を誘発した。ＡＦ０３と混合したＲＦ８１１７（配列番号１７）またはＲＦ８１４０（配列番号２３）で免疫したマウスは同様の中和性応答を誘発し、ＲＦ８１４０（配列番号２３）に付加されたリシンおよびアルギニンの変異はＰｒｅ−Ｆ−ＮＰの中和性応答を誘発する能力に干渉しないことが示唆された。
【０３１９】
ＡＦ０３およびＳＰＡ０９のアジュバント効果をさらに検討するため、非アジュバント化、ＡＦ０３でアジュバント化、または２種の用量のＳＰＡ０９でアジュバント化したＲＦ８１４０で非ヒト霊長類（ＮＨＰ）を免疫した（図１８Ａ）。ＮＨＰは０日および２９日に指示されたアジュバントと混合した抗原５０μｇで免疫し、指示された時点でＥＬＩＳＡまたはＶＥＲＯ中和性応答によって免疫応答を測定した。融合前Ｆ三量体ＥＬＩＳＡ応答は、非アジュバント化（Ｎｏ  Ａｄｊ）、ＡＦ０３でアジュバント化、またはＳＰＡ０９でアジュバント化したＲＦ８１４０で免疫した後のＮＨＰ血清で測定した（ＳＰＡ０９の５００μｇおよび２０００μｇの用量を用いた）。全ての時点で、ＡＦ０３またはＳＰＡ０９によるアジュバント化により、優れた中和性応答が誘発された。上記のＮＨＰ群の血清の中和力価も、ＶＥＲＯ細胞アッセイによって測定した（図１８Ｂ）。全ての例では、アジュバントを伴うＲＦ８１４０による免疫は、全ての時点において非アジュバント化群より高い中和力価を誘発した。
【０３２０】
ＲＦ８１４０（配列番号２３）のＴＬＲ７／８アゴニストＳＭ７／８またはＴＬＲ９アゴニストＣｐＧへの直接コンジュゲーションの効果を試験した。抗原を小分子のＳＭ７／８またはＣｐＧでコンジュゲートし、マウスに１０μｇ用量を投与した。ＲＦ８１４０はそのフェリチン配列中に、表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異（Ｋ７９Ｃ）を含んでおり、これをクリックケミストリーによってコンジュゲーションに用いることができる。比較のため、図１９に示すように、高用量または低用量（コンジュゲートしない）で小分子と混合することによって、非アジュバント化（Ｎｏ−ａｄｊ）またはアジュバント化したＲＦ８１４０をマウスに投与した。２回目および３回目の免疫の後の動物からの血清を融合前Ｆ三量体結合について試験した。
【０３２１】
図１９Ａでは、融合前Ｆ三量体結合応答を、ナイーブなマウス、非アジュバント化ＲＦ８１４０（配列番号２３）で免疫したマウス、ＳＭ７／８アジュバントとコンジュゲートしたＲＦ８１４０（配列番号２３）、１３０ｎｇのＳＭ７／８でアジュバント化したＲＦ８１４０（配列番号２３）、または２０μｇのＳＭ７／８でアジュバント化したＲＦ８１４０（配列番号２３）で免疫したマウスのいずれかの血清中で測定した。ＳＭ７／８にコンジュゲートしたＲＦ８１４０（配列番号２３）は、非アジュバント群またはＳＭ７／８アジュバント群より高い融合前Ｆ三量体結合力価を誘発した。
【０３２２】
図１９Ｂでは、融合前Ｆ三量体結合応答を、ナイーブなマウス、非アジュバント化ＲＦ８１４０（配列番号２３）で免疫したマウス、ＣｐＧアジュバントとコンジュゲートしたＲＦ８１４０（配列番号２３）、６８０ｎｇのＣｐＧでアジュバント化したＲＦ８１４０（配列番号２３）、または２０μｇのＣｐＧでアジュバント化したＲＦ８１４０（配列番号２３）で免疫したマウスのいずれかの血清中で測定した。ＳＭ７／８にコンジュゲートしたＲＦ８１４０（配列番号２３）は、非アジュバント群またはＳＭ７／８アジュバント群より高い融合前Ｆ三量体結合力価を誘発した。
【０３２３】
Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ抗原およびＧｃｃ−ＮＰ抗原のヒト細胞における応答を誘発する能力を実証するため、ＭＩＭＩＣプラットフォームでの実験を実施した（図２０Ａ〜図２０Ｄ）。ＭＩＭＩＣプラットフォームはチャレンジに際して先天的なまたは後天的な抗原特異的応答を迅速かつ再現性よく産生することができる自己ヒト免疫細胞のみからなっている。以前の研究により、ＨＢＶ、破傷風トキソイド、モノクローナル抗体、ＹＦ−ＶＡＸ、およびインフルエンザＢ細胞応答等の多様な標的に対してｉｎ  ｖｉｖｏの免疫プロファイルを反復するＭＩＭＩＣシステムの能力が実証されている。Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ  ＲＦ８１４０（配列番号２３）、対、融合後Ｆ三量体（配列番号２４）による処置によって誘発されるＲＳＶ融合前Ｆ三量体結合抗体応答をヒトＢ細胞で比較した。代表的なベースライン応答を比較のために示す（処置なし）（図２０Ａ）。ヒトＢ細胞において、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号２３）、対、融合後Ｆ（配列番号２４）による処置によって誘発された融合前Ｆ三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１、配列番号２５）、対、融合後Ｆ三量体（配列番号２４）に対する測定された結合応答の比を図２０Ｃに示す。異なるＦ抗原による処置によって誘発されたＭＩＭＩＣからの抗体をＶＥＲＯ細胞アッセイを用いて測定した（図２０Ｂ）。ヒトＢ細胞において、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号２３）、対、融合後Ｆ三量体（配列番号２４）による処理によって誘発された中和力価を非処理群と比較し、ＲＦ８１４０（配列番号２３）がヒト細胞において優れた中和性応答を誘発することを示した。
【０３２４】
ＲＳＶ感染またはＦサブユニットワクチンの候補に対する抗体応答の大きさを、ＭＩＭＩＣ研究で検討したヒト対象の血清状態に基づいて決定した。これは線形回帰解析によって評価した。以前から存在する抗ｐｒｅ−Ｆ  ＩｇＧの高い循環力価を有するドナーは、ＲＳＶ処置の後（図２０Ｅ、ｐ＝０．００４１）およびｐｏｓｔ−Ｆプライミングの後（図２０Ｆ、ｐ＝０．００１９）に、有意により高い抗ｐｒｅ−Ｆ  ＩｇＧを生成した。相関は統計的有意性に達しなかったが、ｐｒｅ−Ｆはまた、誘起された抗体のレベルと以前から存在する抗体のレベルとの間に関連性を示した。他の処置と異なり、ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰは以前から存在する抗ｐｒｅ−Ｆ  ＩｇＧが高いドナーからと同様に、以前から存在する抗体が低いドナーから比較的高いレベルの抗ｐｒｅ−Ｆ  ＩｇＧを誘起したことは注目に値する（図２０Ｆ）。これは、ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰが以前から存在するＩｇＧのレベルが低いドナーからでも効果的に抗体応答を取り戻す（または強化する）ことができることを示している。
【０３２５】
Ｇｃｃ−ＮＰがＧｃｃペプチド（配列番号２９）単独より優れたＧ抗体応答を誘発することを実証するため、ヒト細胞をＧｃｃペプチド単独（配列番号２９）またはヒトＢ細胞中でナノ粒子にコンジュゲートしたＧｃｃペプチド（Ｇｃｃ−ＮＰ）で処理した。Ｇｃｃ−ＮＰは優れたＧ結合抗体応答を誘発した（図２０Ｇ）。組み合わせて、これらのデータは、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰおよびＧｃｃ−ＮＰがヒトの免疫において免疫応答を誘発することを示唆している。
【０３２６】
４．ＲＳＶ  Ｇｃｃ−フェリチンナノ粒子に対する免疫応答のｉｎ  ｖｉｖｏ特徴解析
ＲＳＶ  Ｇｃｃ−ＮＰを上述のように調製した。マウスにおけるＲＳＶ  Ｇｃｃ−ＮＰに対するｉｎ  ｖｉｖｏ応答を評価するため、雌ＢＡＬＢｃマウスを０週、３週、および６週で、高用量（５μｇ）または低用量（０．５μｇ）の抗原を用い、指定された用量のＲＳＶ抗原で筋肉内免疫した。他に注記しなければ、ＲＳＶ  Ｇｃｃ−ＮＰをベッドサイド混合戦略によりＡＦ０３でアジュバント化した。すなわち、それぞれの後ろ足に５０μｌを注射する直前に、タンパク質溶液５０μｌをＳａｎｏｆｉ社のアジュバントＡＦ０３（スクアレン系エマルジョン、Ｋｌｕｃｋｅｒら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２０１２  Ｄｅｃ；１０１（１２）：４４９０〜５００頁参照）５０μｌと混合した。免疫による有害な影響は観察されなかった。最初の免疫の１日前、およびそれぞれの注射の少なくとも２週後（すなわち、２週、５週、および８週）に血液を採取した。他に特定しなければ、示したデータは３回目の注射の２週後（８週、２ｗｐ３とも注記する）のものである。典型的には、血清は免疫前の動物（ナイーブと注記）、２回目の注射の２週後（ポスト２または２ｗｐ２）、または３回目の注射の２週後（ポスト３ｒｄまたは２ｗｐ３）から分析した。
【０３２７】
ＨＡＥ中和アッセイのため、血清を５６℃で３０分、熱不活化した。不活化血清の４倍連続希釈系列を、ＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ（商標）−ＡＬＩ  １０Ｘ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、０５００３）および１％の抗生−抗有糸分裂剤を補ったＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ（商標）−ＡＬＩ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、０５００２）（以下、培地）中で作成した。ＲＳＶウイルスストックを希釈血清と１：１で合わせ、３７℃で１．５時間インキュベートした。次いでウイルス−血清混合物を、完全に分化したＨＡＥ細胞を含む２４ウェルのプレートに１ウェルあたり５０μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、接種材料を除去し、ウェルを培地で２回洗浄して未結合のウイルスを除去し、３７℃、５％ＣＯ２でさらに２０時間インキュベートした。ｍＫａｔｅ（ＴａｇＦＰ６３５）レポーターを発現するＲＳＶに感染した培養における感染事象を、蛍光顕微鏡で計数した。
【０３２８】
ｍＫａｔｅレポーターを発現しないＲＳＶによる感染を検出するため（ＲＳＶ  Ｂ株中和）、偽重層上皮を培地で十分に洗浄して粘液を除去し、次いで４％パラホルムアルデヒドで室温、３０分固定し、０．２５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３０分透過性にし、２％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭで３７℃、１時間ブロックした。ブロッキング液を１ウェルあたり１００μＬの２％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭで２００倍に希釈したマウス抗ＲＳＶモノクローナル抗体混合物（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＡＢ  ８５８−４）に置き換え、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。次いでプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を補ったＰＢＳで３回洗浄した。２％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭ中、２００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ１１００１）１００μＬを１ウェルあたりに加え、プレートを４℃で終夜インキュベートした。翌朝、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を補ったＰＢＳで３回洗浄し、蛍光シグナルをＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  ＡｎｔｉＦａｄｅおよびＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｐ３６９３５）で安定化させ、蛍光顕微鏡で計数した。中和抗体力価は６０％低減エンドポイントで決定した。
【０３２９】
ＲＳＶ  Ｇ抗原による中和性応答の誘発が高い多価性によって改善されることを実証するため、ＲＳＶ  Ｆ抗原によってマウスを免疫した。全ての免疫はＡＦ０３によってアジュバント化した。ＡＦ０３とともに処方したＲＳＶ  Ｇｃｃ−ＮＰでマウスを免疫し、２回目の注射の２週後および３回目の注射の２週後に中和力価を測定した（図２１Ａ〜図２１Ｃ）。ＲＳＶ  Ｇｃｃ−ＮＰは、ナイーブなマウス血清に関連する中和性応答を誘発した。２回目の免疫の２週後（図２１Ａ）および３回目の免疫の２週後（図２１Ｂ）に、Ａ２株からのＧｃｃを含むＧｃｃ−ＮＰで免疫したマウスはＲＳＶ  Ａ株に対する中和性応答を示した。３回目の注射の２週後に、Ｇｃｃ−ＮＰはＲＳＶ  Ｂ１株に対する中和性応答をも誘発した（図２１Ｃ）。
【０３３０】
抗Ｇｃｃ結合のため、Ｃ末端ＨＩＳタグを有するＧｃｃペプチドの三量体化された二量体をＯｃｔｅｔチップ上で用いた。Ｈｉｓ６タグ付けしたＧｃｃ（Ａ２株）六量体またはＨｉｓ６タグ付けしたＧｃｃ（Ｂ１株）六量体を抗ペンタ−ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ）センサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社＃１８−５１２２）に４００秒、前負荷して、ほぼ飽和に達するまで捕捉させた。次いでバイオセンサーチップをＯｃｔｅｔ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ中で９０秒、平衡にし、希釈した血清と３００秒会合させた。会合曲線の最終応答は、Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＨＴ１０．０ソフトウェアを用いて測定し、応答に希釈係数（１００または３００）を乗じて最終報告応答を得た。
【０３３１】
ＲＳＶ  Ｇｃｃ−ＮＰがＧｃｃ結合免疫応答を誘発するかどうかを決定するため、上記の免疫による血清のＧｃｃ  Ａ２六量体またはＧｃｃ  Ｂ１六量体に結合する能力について試験した。高用量（図２２Ａおよび図２３Ａ）および低用量（図２２Ｂおよび図２３Ｂ）におけるＧｃｃ結合応答を２回目の免疫の２週後および３回目の免疫の２週後に試験した。Ａ２株（図２２Ａ〜図２２Ｂ）およびＢ１株（図２３Ａ〜図２３Ｂ）のいずれについても、ＲＳＶ  Ｇｃｃ−ＮＰはナイーブなマウス血清に関連する結合応答を誘発した。
【０３３２】
５．ヒト細胞におけるＰｒｅ−Ｆ−ＮＰおよびＧｃｃ−ＮＰへの応答
Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰおよびＧｃｃ−ＮＰのヒト細胞における応答を誘発する能力を実証するため、ＭＩＭＩＣプラットフォームでの実験を実施した。ＭＩＭＩＣプラットフォームはチャレンジに際して先天的なおよび後天的な抗原特異的応答を迅速かつ再現性よく産生することができる自己ヒト免疫細胞のみからなっている。以前の研究により、ＨＢＶ、破傷風トキソイド、モノクローナル抗体、ＹＦ−ＶＡＸ、およびインフルエンザＢ細胞応答等の多様な標的に対してｉｎ  ｖｉｖｏの免疫プロファイルを反復するＭＩＭＩＣシステムの能力が実証されている。Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ  ＲＦ８１４０（配列番号２３）、対、融合後Ｆ三量体（配列番号２４）による処置によって誘発されるＲＳＶ融合前Ｆ三量体結合抗体応答をヒトＢ細胞で比較し、代表的なベースライン応答と比較した。ヒトＢ細胞において、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号２３）、対、融合後Ｆ（配列番号２４）による処置によって誘発された融合前Ｆ三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１、配列番号２５）、対、融合後Ｆ三量体（配列番号２４）に対する測定された結合応答の比を決定した。異なるＦ抗原による処置によって誘発されたＭＩＭＩＣからの抗体をＶＥＲＯ細胞アッセイを用いて測定した。ヒトＢ細胞において、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号２３）、対、融合後Ｆ三量体（配列番号２４）による処理によって誘発された中和力価を非処理群と比較し、ＲＦ８１４０（配列番号２３）がヒト細胞において優れた中和性応答を誘発することを示す。Ｇｃｃ−ＮＰがＧｃｃペプチド（配列番号２９）単独より優れたＧ抗体応答を誘発することを実証するため、ヒト細胞をＧｃｃペプチド単独（配列番号２９）またはヒトＢ細胞中でナノ粒子にコンジュゲートしたＧｃｃペプチド（Ｇｃｃ−ＮＰ）で処置した。Ｇｃｃ−ＮＰは優れたＧ結合抗体応答を誘発した。したがって、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰおよびＧｃｃ−ＮＰはヒトの免疫において免疫応答を誘発した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
2021519597000001.app
【国際調査報告】
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