(57)【要約】本開示は、抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；抗ＣＬＬ１  ＣＡＲ；ならびに抗ＣＤ１２３および／または抗ＣＡＲ  ＦＬＴ３  ＣＡＲを含む細胞を提供する。前述の細胞を、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）などの疾患の処置で使用することができる。上記細胞は、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）に特徴的な複数の抗原を標的にし得、臨床段階への移行が遅延し、初期臨床試験段階にある従来のＴ細胞治療と比較して、ＡＭＬ処置のための治療アプローチの改善を提供し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；抗ＣＬＬ１  ＣＡＲ；および抗ＣＤ１２３  ＣＡＲを含む細胞。
【請求項２】
抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；抗ＣＬＬ１  ＣＡＲ；および抗ＦＬＴ３  ＣＡＲを含む細胞。
【請求項３】
抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；抗ＣＬＬ１  ＣＡＲ；抗ＣＤ１２３  ＣＡＲ；および抗ＦＬＴ３  ＣＡＲを含む請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
１またはそれを超えるＣＡＲ（単数または複数）が、ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを含む、前記請求項のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】
各ＣＡＲがドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】
１またはそれを超えるタンデムキメラ抗原受容体（単数または複数）（ｔａｎＣＡＲ（単数または複数））を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
【請求項７】
前記ｔａｎＣＡＲ（単数または複数）がドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを含む、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記抗ＣＤ３３  ＣＡＲが、以下の相補性決定領域：
（ｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＦＳＭＨＳ（配列番号１）；ＣＤＲ２−ＶＴＷＳＧＤＴＦ（配列番号２）；ＣＤＲ３−ＫＤＤＰＹＲＰＡＹＤＹ（配列番号３）；
（ｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＦＳＳＹＶ（配列番号４）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＳＧＧＳＴ（配列番号５）；ＣＤＲ３−ＡＡＭＥＬＲＧＧＳＹＮＹＡＳＳＲＱＹＤＹ（配列番号６）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１−ＥＩＡＦＳＮＦＮ（配列番号７）；ＣＤＲ２−ＩＳＳＨＧＤＴＮＹ（配列番号８）；ＣＤＲ３−ＮＡＮＤＰＦＬＳＶＳＤＦ（配列番号９）；
（ｉｖ）ＣＤＲ１−ＧＳＩＦＳＩＮＡ（配列番号１０）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＳＧＧＳＴ（配列番号５）；ＣＤＲ３−ＡＡＩＳＧＷＧＲＳＩＲＶＧＥＲＹＥＹＤＹ（配列番号１１）；
（ｖ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＳＳＳＳＴ（配列番号１２）；ＣＤＲ２−ＩＴＬＳＧＧＳＴ（配列番号１３）；ＣＤＲ３−ＡＡＲＲＷＳＮＮＲＧＧＹＤＲＡＧＹＤＹ（配列番号１４）；または
（ｖｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＦＳＳＹＡ（配列番号１５）；ＣＤＲ２−ＩＴＷＳＧＧＳＴ（配列番号１６）；ＣＤＲ３−ＡＭＬＬＲＧＧＬＹＤＹＴＤＹＩＬＹＮＹ（配列番号１７）
を含むドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを有する、前記請求項のいずれかに記載の細胞。
【請求項９】
前記抗原結合ドメインが、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、または２３に示す配列のうちの１つを含む、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記抗ＣＬＬ１  ＣＡＲが、以下の相補性決定領域：
（ｉ）ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＧＮＨＤ（配列番号４８）；ＣＤＲ２−ＩＤＳＧＧＮＶＩ（配列番号４９）；ＣＤＲ３−ＡＴＤＬＤＳＧＡＥＳＬＥＳＶＹ（配列番号５０）；
（ｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＦＡＦＧＳＡＤ（配列番号５１）；ＣＤＲ２−ＩＤＳＧＧＮＴＱ（配列番号５２）；ＣＤＲ３−ＴＤＬＤＰＴＴＤＳＬＥＮＶＹ（配列番号５３）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＦＳＡＹＦ（配列番号５４）；ＣＤＲ２−ＩＮＷＮＧＤＳＳ（配列番号５５）；ＣＤＲ３−ＡＡＤＴＨＧＡＶＧＬＧＳＥＲＬＹＤＹ（配列番号５６）；
（ｉｖ）ＣＤＲ１−ＧＩＧＶＳＳＴＧ（配列番号５７）；ＣＤＲ２−ＩＤＲＤＧＴＴ（配列番号５８）；ＣＤＲ３−ＴＶＶＧＤＹＹ（配列番号５９）；
（ｖ）ＣＤＲ１−ＧＦＩＦＧＮＹＤ（配列番号６０）；ＣＤＲ２−ＩＳＳＧＧＮＤＩ（配列番号６１）；ＣＤＲ３−ＡＡＤＬＤＰＧＴＤＳＬＤＮＩＨ（配列番号６２）；または
（ｖｉ）ＣＤＲ１−ＧＦＴＬＤＹＹＡ（配列番号６３）；ＣＤＲ２−ＩＳＳＳＤＧＳＴ（配列番号６４）；ＣＤＲ３−ＡＥＡＶＹＹＡＧＶＣＶＡＭＹＤＳ（配列番号６５）
を含むドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを有する、前記請求項のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１】
前記抗原結合ドメインが、配列番号６６、６７、６８、６９、７０、または７１に示す配列のうちの１つを含む、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記抗ＣＤ１２３  ＣＡＲが、以下の相補性決定領域：
（ｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＳＩＮＴＹＡ（配列番号２４）；ＣＤＲ２−ＩＮＹＮＳＲＹＴ（配列番号２５）；ＣＤＲ３−ＡＡＴＳＹＹＰＴＤＹＤＶＡＳＲＶＡＴＷＰＳ（配列番号２６）；
（ｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＩＳＬＮＡ（配列番号２７）；ＣＤＲ２−ＩＫＩＧＧＶＳ（配列番号２８）；ＣＤＲ３−ＮＴＹＰＰＹＬＮＧＭＤＹ（配列番号２９）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＳＦＮＴＤＡ（配列番号３０）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＤＧＴＲＴ（配列番号３１）；ＣＤＲ３−ＡＡＥＰＱＫＡＷＰＩＧＴＳＡＡＧＦＲＳ（配列番号３２）；
（ｉｖ）ＣＤＲ１−ＧＳＳＩＳＶ（配列番号３３）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＳＤＧＮＴ（配列番号３４）；ＣＤＲ３−ＡＶＥＰＲＧＷＰＫＧＨＲＹ（配列番号３５）；
（ｖ）ＣＤＲ１−ＧＳＳＦＳＩＮＶ（配列番号３６）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＳＤＧＳＴ（配列番号３７）；ＣＤＲ３−ＡＶＥＰＲＧＷＰＫＧＨＲＹ（配列番号３８）；または
（ｖｉ）ＣＤＲ１−ＧＳＩＦＲＩＮＡ（配列番号３９）；ＣＤＲ２−ＶＮＷＩＧＧＴＴ（配列番号４０）；ＣＤＲ３−ＳＡＴＤＫＧＧＳＳＲＹ（配列番号４１）
を含むドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを有する、請求項１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記抗原結合ドメインが、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、または４７に示す配列のうちの１つを含む、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記抗ＦＴＬ３  ＣＡＲが、以下の相補性決定領域：
（ｉ）ＣＤＲ１−（配列番号７２）；ＣＤＲ２−（配列番号７３）；ＣＤＲ３−（配列番号７４）；
（ｉｉ）ＣＤＲ１−（配列番号７５）；ＣＤＲ２−（配列番号７６）；ＣＤＲ３−（配列番号７７）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１−（配列番号７８）；ＣＤＲ２−（配列番号７９）；ＣＤＲ３−（配列番号８０）；
（ｉｖ）ＣＤＲ１−（配列番号８１）；ＣＤＲ２−（配列番号８２）；ＣＤＲ３−（配列番号８３）；
（ｖ）ＣＤＲ１−（配列番号８４）；ＣＤＲ２−（配列番号８５）；ＣＤＲ３−（配列番号８６）；または
（ｖｉ）ＣＤＲ１−（配列番号８７）；ＣＤＲ２−（配列番号８８）；ＣＤＲ３−（配列番号８９）
を含むドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを有する、請求項２に記載の細胞。
【請求項１５】
前記抗原結合ドメインが、配列番号９０、９１、９２、９３、９４、または９５に示す配列のうちの１つを含む、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；抗ＣＬＬ１  ＣＡＲ；および抗ＣＤ１２３  ＣＡＲをコードする核酸構築物。
【請求項１７】
抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；抗ＣＬＬ１  ＣＡＲ；および抗ＦＬＴ３  ＣＡＲをコードする核酸構築物。
【請求項１８】
抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；抗ＣＬＬ１  ＣＡＲ；抗ＣＤ１２３  ＣＡＲ；および抗ＦＬＴ３  ＣＡＲをコードする請求項１６または１７に記載の核酸構築物。
【請求項１９】
請求項１６に記載の核酸構築物で細胞を形質導入するかトランスフェクトする工程を含む、請求項１に記載の細胞を作製する方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の核酸構築物で細胞を形質導入するかトランスフェクトする工程を含む、請求項２に記載の細胞を作製する方法。
【請求項２１】
請求項１６〜１８のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項２２】
ベクターのキットであって、
（ｉ）ＣＤ３３に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む第１のベクター；
（ｉｉ）ＣＬＬ１に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含む第２のベクター；および
（ｉｉｉ）ＣＤ１２３に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含む第３のベクター
を含む、ベクターのキット。
【請求項２３】
ベクターのキットであって、
（ｉ）ＣＤ３３に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む第１のベクター；
（ｉｉ）ＣＬＬ１に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含む第２のベクター；および
（ｉｉｉ）ＦＬＴ３に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含む第３のベクター
を含む、ベクターのキット。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれかに記載の複数の細胞を、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、癌を処置する方法。
【請求項２６】
前記癌が急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
その後に前記患者に同種移植片を投与する工程も含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
癌の処置で使用するための請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
癌を処置するための医薬組成物の製造における請求項１〜１５のいずれかに記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞に関する。前述の細胞は、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）に特徴的な複数の抗原を標的にする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
急性骨髄球性白血病
急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）は、骨髄および血液中の骨髄前駆体の無制御のクローン増殖を特徴とする異質性疾患であり、白血病性芽球の蓄積および正常造血の重度障害に至る。ＡＭＬは成人において最もよく見られる急性白血病であり、全ての白血病のうちで死亡率が最も高い。２０１５年の米国において２０８３０人がＡＭＬの診断を受けたと推定され、ＡＭＬによる死亡数は１０４６０人と推定された。過去１０年間のＡＭＬにおける長期生存者は、微増にとどまっている。
【０００３】
現在の導入化学療法により、若年成人患者のほぼ７０％が初期に完全寛解させることができる。しかしながら、４３％の患者が最終的に再発し、１８％がフロントライン導入処置では完全寛解に至ることがない。最初の再発後のＡＭＬ患者の５年全生存率は、７〜１２％の範囲である。同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏＨＳＣＴ）は、再発したか難治性のＡＭＬ患者を治癒させるための絶好の機会を提供する。これは、第２寛解期後の好ましい処置ルートであり、４０〜５０％の患者が５年間の無病生存期間を得ることができる。
【０００４】
現在の処置ストラテジーを使用して、以前に完全寛解が６ヶ月を超えた再発患者の約半分のみならびに原発性の難治性疾患患者および最初の完全寛解の持続が６ヶ月未満の患者の２０％またはそれ未満のみでしか第２の完全寛解率は達成されない。さらに、従来の救済化学療法による深刻な合併症は、患者のパフォーマンスステータスおよび臓器機能を悪化させ、首尾の良いａｌｌｏＨＳＣＴの利用機会が減少し得る。
【０００５】
したがって、ＡＭＬ処置のための治療アプローチの改善が必要である。
【０００６】
キメラ抗原受容体
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞のエフェクター機能に、モノクローナル抗体の特異性を移植したものである。ＣＤ１９に指向するＣＡＲ  Ｔ細胞治療はＢ細胞悪性疾患に極めて有効であるが、ＣＤ１９陰性エスケープが相当数の患者における再発原因である。
【０００７】
ＡＭＬに対するＣＡＲ  Ｔ細胞治療は、初期臨床試験段階にある。いくつかの前臨床研究において種々のＡＭＬ抗原ターゲティングＣＡＲ  Ｔ細胞の潜在的な細胞傷害性が実証されているにもかかわらず、臨床段階への移行は遅延している。これは、ＡＭＬ患者のためのＣＡＲ関連処置ストラテジーの開発における固有の課題を強調するものである。今日まで、表１に記載のように、少数の再発／難治性ＡＭＬ患者が初期臨床試験を介してＣＡＲ  Ｔ細胞免疫療法で処置されている。
【０００８】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ヒトの造血を示す概要図。
【００１０】
【図２】キメラ抗原受容体の異なる結合ドメイン形式  （ａ）Ｆａｂ  ＣＡＲ形式；（ｂ）ｄＡｂ  ＣＡＲ形式；（ｃ）ｓｃＦｖ  ＣＡＲ形式
【００１１】
【図３−１】健康な３ドナー由来の初代Ｔ細胞上のａＣＤ３３  ＣＡＲの発現。Ｔ細胞で形質導入したＣＡＲを、ＲＱＲ８マーカー遺伝子で染色した。ＦＡＣＳプロットは、ｅＦｌｕｏｒ７８０を使用して生細胞集団を予めゲーティングしたものである。
【図３−２】健康な３ドナー由来の初代Ｔ細胞上のａＣＤ３３  ＣＡＲの発現。Ｔ細胞で形質導入したＣＡＲを、ＲＱＲ８マーカー遺伝子で染色した。ＦＡＣＳプロットは、ｅＦｌｕｏｒ７８０を使用して生細胞集団を予めゲーティングしたものである。
【００１２】
【図４−１】ａＣＤ１２３−ＶＨＨ  ＣＡＲスクリーニングおよび確証アッセイで使用したＣＡＲ構築物の形質導入発現。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３４−ＰＥ抗体（ＱＢｅｎｄ１０）または２×ＳｔｒｅｐＴａｇ２（Ｓｔｒｅｐ−ＰＥ二次染色剤）に融合したマウスＦｃに融合した可溶性ヒトＣＤ１２３エクトドメインで個別に染色した。全てのプロットは、生存性色素（ＦＶＤ−ｅＦｌｏｕｒ７８０）を使用して単一生細胞に対して予めゲーティングしたものである。
【図４−２】ａＣＤ１２３−ＶＨＨ  ＣＡＲスクリーニングおよび確証アッセイで使用したＣＡＲ構築物の形質導入発現。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３４−ＰＥ抗体（ＱＢｅｎｄ１０）または２×ＳｔｒｅｐＴａｇ２（Ｓｔｒｅｐ−ＰＥ二次染色剤）に融合したマウスＦｃに融合した可溶性ヒトＣＤ１２３エクトドメインで個別に染色した。全てのプロットは、生存性色素（ＦＶＤ−ｅＦｌｏｕｒ７８０）を使用して単一生細胞に対して予めゲーティングしたものである。
【００１３】
【図５−１】ａＣＬＬ１−ＶＨＨ  ＣＡＲスクリーニングおよび確証アッセイで使用したＣＡＲ構築物の形質導入発現。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３４−ＰＥ抗体（ＱＢｅｎｄ１０）または２×ＳｔｒｅｐＴａｇ２（Ｓｔｒｅｐ−ＰＥ二次染色剤）に融合したヒトＦｃに融合した可溶性ヒトＣＬＬ１エクトドメインで個別に染色した。全てのプロットは、生存性色素（ＦＶＤ−ｅＦｌｏｕｒ７８０）を使用して単一生細胞に対して予めゲーティングしたものである。
【図５−２】ａＣＬＬ１−ＶＨＨ  ＣＡＲスクリーニングおよび確証アッセイで使用したＣＡＲ構築物の形質導入発現。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３４−ＰＥ抗体（ＱＢｅｎｄ１０）または２×ＳｔｒｅｐＴａｇ２（Ｓｔｒｅｐ−ＰＥ二次染色剤）に融合したヒトＦｃに融合した可溶性ヒトＣＬＬ１エクトドメインで個別に染色した。全てのプロットは、生存性色素（ＦＶＤ−ｅＦｌｏｕｒ７８０）を使用して単一生細胞に対して予めゲーティングしたものである。
【００１４】
【図６】関連抗原をコードするレトロウイルスベクターで形質導入したＳｕｐＴ１。Ａ）ＣＤ１２３、ＣＤ３３、およびＣＬＬ１で形質導入したＳｕｐＴ１細胞上の抗原発現を青色で示し、一方、赤色のピークは関連アイソタイプコントロールに対応する。Ｂ）フローサイトメトリーによるＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ（商標）ビーズを使用した各形質導入ＳｕｐＴ１細胞内の平均抗原密度（細胞毎）。
【００１５】
【図７−１】フローサイトメトリーによるＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ（商標）ビーズを使用した抗原密度の分析。Ａ）関連アイソタイプコントロール（赤色）と比較した、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、およびＣＬＬ１で染色した標的細胞（青色）上の抗原発現。各抗原についての平均抗原密度（細胞毎）を測定した。
【図７−２】フローサイトメトリーによるＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ（商標）ビーズを使用した抗原密度の分析。Ａ）関連アイソタイプコントロール（赤色）と比較した、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、およびＣＬＬ１で染色した標的細胞（青色）上の抗原発現。各抗原についての平均抗原密度（細胞毎）を測定した。
【００１６】
【図８−１】ａＣＤ３３  ＣＡＲについてのＳｕｐＴ１  ＮＴ上の抗ＣＤ３抗体を使用した標的細胞からのＴ細胞分離の例。
【図８−２】ａＣＤ３３  ＣＡＲについてのＳｕｐＴ１  ＮＴ上の抗ＣＤ３抗体を使用した標的細胞からのＴ細胞分離の例。
【図８−３】ａＣＤ３３  ＣＡＲについてのＳｕｐＴ１  ＮＴ上の抗ＣＤ３抗体を使用した標的細胞からのＴ細胞分離の例。
【図８−４】ａＣＤ３３  ＣＡＲについてのＳｕｐＴ１  ＮＴ上の抗ＣＤ３抗体を使用した標的細胞からのＴ細胞分離の例。
【００１７】
【図９−１】３ドナーにおける異なるＡＭＬ細胞に対する全てのａＣＤ３３  ＣＡＲを使用した細胞傷害性アッセイ。細胞傷害性を、細胞（ＨＬ−６０：２４時間）、（ＳＵＰＴ１、ＭＯＬＭ、およびＴＨＰ１：４８時間）に応じて異なる時間間隔で測定した。１２７８３（ａＣＤ１９  ＦＭＣ６３  ｓｃＦｖ）をネガティブコントロールとして使用し、２７９８３（ａＣＤ３３  ｓｃＦｖ）をポジティブコントロールとして使用した。全てのデータを、非形質導入対照に対して正規化した。
【図９−２】３ドナーにおける異なるＡＭＬ細胞に対する全てのａＣＤ３３  ＣＡＲを使用した細胞傷害性アッセイ。細胞傷害性を、細胞（ＨＬ−６０：２４時間）、（ＳＵＰＴ１、ＭＯＬＭ、およびＴＨＰ１：４８時間）に応じて異なる時間間隔で測定した。１２７８３（ａＣＤ１９  ＦＭＣ６３  ｓｃＦｖ）をネガティブコントロールとして使用し、２７９８３（ａＣＤ３３  ｓｃＦｖ）をポジティブコントロールとして使用した。全てのデータを、非形質導入対照に対して正規化した。
【００１８】
【図１０−１】全てのＣＤ１２３−ＶＨＨ−ＣＡＲ  Ｔ細胞構築物についての２４時間細胞傷害性アッセイ。各条件を、最低限の３ドナー（ｎ＝３）を用いて試験し、中央値を示した。上の行−ＳｕｐＴ１  ＮＴを標的細胞として使用し、中央の行−ＳｕｐＴ１細胞を、高レベルのＣＤ１２３を発現するように操作し、下の行−ＡＭＬ由来ＫＧ１αを標的細胞株として使用した。非形質導入Ｔ細胞は抗原非依存性細胞傷害性のみに寄与するので、全てのデータを非形質導入Ｔ細胞に対して正規化した。ＣＡＲを、二元配置の対応のあるｔ検定によって比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１０−２】全てのＣＤ１２３−ＶＨＨ−ＣＡＲ  Ｔ細胞構築物についての２４時間細胞傷害性アッセイ。各条件を、最低限の３ドナー（ｎ＝３）を用いて試験し、中央値を示した。上の行−ＳｕｐＴ１  ＮＴを標的細胞として使用し、中央の行−ＳｕｐＴ１細胞を、高レベルのＣＤ１２３を発現するように操作し、下の行−ＡＭＬ由来ＫＧ１αを標的細胞株として使用した。非形質導入Ｔ細胞は抗原非依存性細胞傷害性のみに寄与するので、全てのデータを非形質導入Ｔ細胞に対して正規化した。ＣＡＲを、二元配置の対応のあるｔ検定によって比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００１９】
【図１１−１】全てのＣＤ１２３−ＶＨＨ−ＣＡＲ  Ｔ細胞構築物についての４８時間細胞傷害性アッセイ。各条件を、最低限の３ドナー（ｎ＝３）を用いて試験し、中央値を示した。左から右に、標的細胞株  ＳｕｐＴ１  ＮＴ、ＴＨＰ１、およびＭｏｌｍ１４を、標的細胞株として使用した。非形質導入Ｔ細胞は抗原非依存性細胞傷害性のみに寄与するので、全てのデータを非形質導入Ｔ細胞に対して正規化した。
【図１１−２】全てのＣＤ１２３−ＶＨＨ−ＣＡＲ  Ｔ細胞構築物についての４８時間細胞傷害性アッセイ。各条件を、最低限の３ドナー（ｎ＝３）を用いて試験し、中央値を示した。左から右に、標的細胞株  ＳｕｐＴ１  ＮＴ、ＴＨＰ１、およびＭｏｌｍ１４を、標的細胞株として使用した。非形質導入Ｔ細胞は抗原非依存性細胞傷害性のみに寄与するので、全てのデータを非形質導入Ｔ細胞に対して正規化した。
【００２０】
【図１２−１】全てのＣＬＬ１−ＶＨＨ−ＣＡＲ  Ｔ細胞構築物についての２４時間細胞傷害性アッセイ。各条件を、最低限の３ドナー（ｎ＝３）を用いて試験し、中央値を示した。上の行−ＳｕｐＴ１  ＮＴを標的細胞として使用し、下の行−ＳｕｐＴ１細胞を、高レベルのＣＬＬ１を発現するように操作した。非形質導入Ｔ細胞は抗原非依存性細胞傷害性のみに寄与するので、全てのデータを非形質導入Ｔ細胞に対して正規化した。
【図１２−２】全てのＣＬＬ１−ＶＨＨ−ＣＡＲ  Ｔ細胞構築物についての２４時間細胞傷害性アッセイ。各条件を、最低限の３ドナー（ｎ＝３）を用いて試験し、中央値を示した。上の行−ＳｕｐＴ１  ＮＴを標的細胞として使用し、下の行−ＳｕｐＴ１細胞を、高レベルのＣＬＬ１を発現するように操作した。非形質導入Ｔ細胞は抗原非依存性細胞傷害性のみに寄与するので、全てのデータを非形質導入Ｔ細胞に対して正規化した。
【００２１】
【図１３−１】全てのＣｌｌ１−ＶＨＨ−ＣＡＲ  Ｔ細胞構築物についての４８時間細胞傷害性アッセイ。各条件を、最低限の３ドナー（ｎ＝３）を用いて試験し、中央値を示した。上の行−ＳｕｐＴ１  ＮＴを標的細胞として使用し、中央の行−ＴＨＰ１患者由来の標的、下の行−ＫＧ１α患者由来の標的細胞株。非形質導入Ｔ細胞は抗原非依存性細胞傷害性のみに寄与するので、全てのデータを非形質導入Ｔ細胞に対して正規化した。ＣＡＲを、二元配置の対応のあるｔ検定によって比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意性なし。
【図１３−２】全てのＣｌｌ１−ＶＨＨ−ＣＡＲ  Ｔ細胞構築物についての４８時間細胞傷害性アッセイ。各条件を、最低限の３ドナー（ｎ＝３）を用いて試験し、中央値を示した。上の行−ＳｕｐＴ１  ＮＴを標的細胞として使用し、中央の行−ＴＨＰ１患者由来の標的、下の行−ＫＧ１α患者由来の標的細胞株。非形質導入Ｔ細胞は抗原非依存性細胞傷害性のみに寄与するので、全てのデータを非形質導入Ｔ細胞に対して正規化した。ＣＡＲを、二元配置の対応のあるｔ検定によって比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意性なし。
【００２２】
【図１４】２ドナーにおけるＥ：Ｔ比１：１の標的細胞とのａＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の共培養物のＩＬ−２分泌（ドナー６のデータは示さず）。ＩＬ−２産生を、高レベルのＣＤ３３を発現するように操作されたＳｕｐＴ１細胞およびＡＭＬ由来細胞を使用して測定した。
【００２３】
【図１５】２ドナーにおけるＥ：Ｔ比１：１の標的細胞におけるａＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生。
【００２４】
【図１６ａ】ＣＤ１２３−ＶＨＨ−ＣＡＲ  Ｔ細胞構築物を使用した２４および４８時間後の細胞傷害性アッセイのサイトカインの測定値。３ドナー（ｎ＝３）について１：８の比で行った。Ａ）ＩＬ−２測定値、Ｂ）ＩＦＮ−γ測定値。ＣＡＲを、二元配置の対応のあるｔ検定によって比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意性なし。
【図１６ｂ】ＣＤ１２３−ＶＨＨ−ＣＡＲ  Ｔ細胞構築物を使用した２４および４８時間後の細胞傷害性アッセイのサイトカインの測定値。３ドナー（ｎ＝３）について１：８の比で行った。Ａ）ＩＬ−２測定値、Ｂ）ＩＦＮ−γ測定値。ＣＡＲを、二元配置の対応のあるｔ検定によって比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意性なし。
【００２５】
【図１７ａ】ＣＬＬ１−ＶＨＨ−ＣＡＲ  Ｔ細胞構築物を使用した２４および４８時間後の細胞傷害性アッセイのサイトカインの測定値。３ドナー（ｎ＝３）について１：８の比で行った。Ａ）ＩＬ−２測定値、Ｂ）ＩＦＮ−γ測定値。ＣＡＲを、二元配置の対応のあるｔ検定によって比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意性なし。
【図１７ｂ】ＣＬＬ１−ＶＨＨ−ＣＡＲ  Ｔ細胞構築物を使用した２４および４８時間後の細胞傷害性アッセイのサイトカインの測定値。３ドナー（ｎ＝３）について１：８の比で行った。Ａ）ＩＬ−２測定値、Ｂ）ＩＦＮ−γ測定値。ＣＡＲを、二元配置の対応のあるｔ検定によって比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意性なし。
【００２６】
【図１８】異なる細胞株に対する各ａＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖アッセイ。１２７８３（ａＣＤ１９  ＦＭＣ６３  ｓｃＦｖ）をネガティブコントロールとして使用し、２７９８３（ａＣＤ３３  ｓｃＦｖ）をポジティブコントロールとして使用した。発現倍数を、非形質導入対照に対して正規化した。アッセイを、Ｅ：Ｔ比１：１で６日間に設定した。増殖アッセイを、ＨＬ−６０細胞における２ドナーを用いて設定した。
【００２７】
【図１９】全てのＣＤ１２３−ＶＨＨ−ＣＡＲ  Ｔ細胞構築物についての４日間増殖アッセイ。発現倍数を、ＣＤ３＋非形質導入Ｔ細胞条件に対して正規化した。各条件を、最低限の３ドナー（ｎ＝３）を用いて試験した。
【００２８】
【図２０】全てのＣＬＬ１−ＶＨＨ−ＣＡＲ  Ｔ細胞構築物についての４日間増殖アッセイ。発現倍数を、ＣＤ３＋非形質導入Ｔ細胞条件に対して正規化した。各条件を、最低限の３ドナー（ｎ＝３）を用いて試験した。ＣＡＲを、二元配置の対応のあるｔ検定によって比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意性なし。
【発明の概要】
【００２９】
発明の態様の概要
第１の態様では、本発明は、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）に関連する複数の抗原を標的にするＣＡＲ発現細胞を提供する。この細胞は、以下の抗原のうちの３つまたは４つを標的にする：ＣＤ３３、ＣＬＬ−１、ＣＤ１２３、およびＦＬＴ３。
【００３０】
例えば、細胞は、抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；抗ＣＬＬ１  ＣＡＲ；および抗ＣＤ１２３  ＣＡＲを含み得る。
【００３１】
細胞は、抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；抗ＣＬＬ１  ＣＡＲ；および抗ＦＬＴ３  ＣＡＲを含み得る。
【００３２】
細胞は、抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；抗ＣＬＬ１  ＣＡＲ；および抗ＣＤ１２３  ＣＡＲ；および抗ＦＬＴ３  ＣＡＲを含み得る。
【００３３】
ＣＡＲ（単数または複数）のうちの１もしくはそれより多く、またはすべては、ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを含み得る。
【００３４】
細胞は、１またはそれを超えるタンデムキメラ抗原受容体（単数または複数）（ｔａｎＣＡＲ（単数または複数））を含み得る。ｔａｎＣＡＲまたは各ｔａｎＣＡＲはドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを含み得る。
【００３５】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを有する抗ＣＤ３３  ＣＡＲは、以下の相補性決定領域を含み得る：
（ｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＦＳＭＨＳ（配列番号１）；ＣＤＲ２−ＶＴＷＳＧＤＴＦ（配列番号２）；ＣＤＲ３−ＫＤＤＰＹＲＰＡＹＤＹ（配列番号３）；
（ｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＦＳＳＹＶ（配列番号４）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＳＧＧＳＴ（配列番号５）；ＣＤＲ３−ＡＡＭＥＬＲＧＧＳＹＮＹＡＳＳＲＱＹＤＹ（配列番号６）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１−ＥＩＡＦＳＮＦＮ（配列番号７）；ＣＤＲ２−ＩＳＳＨＧＤＴＮＹ（配列番号８）；ＣＤＲ３−ＮＡＮＤＰＦＬＳＶＳＤＦ（配列番号９）；
（ｉｖ）ＣＤＲ１−ＧＳＩＦＳＩＮＡ（配列番号１０）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＳＧＧＳＴ（配列番号５）；ＣＤＲ３−ＡＡＩＳＧＷＧＲＳＩＲＶＧＥＲＹＥＹＤＹ（配列番号１１）；
（ｖ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＳＳＳＳＴ（配列番号１２）；ＣＤＲ２−ＩＴＬＳＧＧＳＴ（配列番号１３）；ＣＤＲ３−ＡＡＲＲＷＳＮＮＲＧＧＹＤＲＡＧＹＤＹ（配列番号１４）；または
（ｖｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＦＳＳＹＡ（配列番号１５）；ＣＤＲ２−ＩＴＷＳＧＧＳＴ（配列番号１６）；ＣＤＲ３−ＡＭＬＬＲＧＧＬＹＤＹＴＤＹＩＬＹＮＹ（配列番号１７）。
【００３６】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを有する抗ＣＤ３３  ＣＡＲは、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、または２３に示す配列のうちの１つを含み得る。
【００３７】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを有する抗ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、以下の相補性決定領域を含み得る：
（ｉ）ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＧＮＨＤ（配列番号４８）；ＣＤＲ２−ＩＤＳＧＧＮＶＩ（配列番号４９）；ＣＤＲ３−ＡＴＤＬＤＳＧＡＥＳＬＥＳＶＹ（配列番号５０）；
（ｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＦＡＦＧＳＡＤ（配列番号５１）；ＣＤＲ２−ＩＤＳＧＧＮＴＱ（配列番号５２）；ＣＤＲ３−ＴＤＬＤＰＴＴＤＳＬＥＮＶＹ（配列番号５３）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＦＳＡＹＦ（配列番号５４）；ＣＤＲ２−ＩＮＷＮＧＤＳＳ（配列番号５５）；ＣＤＲ３−ＡＡＤＴＨＧＡＶＧＬＧＳＥＲＬＹＤＹ（配列番号５６）；
（ｉｖ）ＣＤＲ１−ＧＩＧＶＳＳＴＧ（配列番号５７）；ＣＤＲ２−ＩＤＲＤＧＴＴ（配列番号５８）；ＣＤＲ３−ＴＶＶＧＤＹＹ（配列番号５９）；
（ｖ）ＣＤＲ１−ＧＦＩＦＧＮＹＤ（配列番号６０）；ＣＤＲ２−ＩＳＳＧＧＮＤＩ（配列番号６１）；ＣＤＲ３−ＡＡＤＬＤＰＧＴＤＳＬＤＮＩＨ（配列番号６２）；または
（ｖｉ）ＣＤＲ１−ＧＦＴＬＤＹＹＡ（配列番号６３）；ＣＤＲ２−ＩＳＳＳＤＧＳＴ（配列番号６４）；ＣＤＲ３−ＡＥＡＶＹＹＡＧＶＣＶＡＭＹＤＳ（配列番号６５）。
【００３８】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを有する抗ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、配列番号６６、６７、６８、６９、７０、または７１に示す配列のうちの１つを含み得る。
【００３９】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを有する抗ＣＤ１２３  ＣＡＲは、以下の相補性決定領域を含み得る：
（ｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＳＩＮＴＹＡ（配列番号２４）；ＣＤＲ２−ＩＮＹＮＳＲＹＴ（配列番号２５）；ＣＤＲ３−ＡＡＴＳＹＹＰＴＤＹＤＶＡＳＲＶＡＴＷＰＳ（配列番号２６）；
（ｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＩＳＬＮＡ（配列番号２７）；ＣＤＲ２−ＩＫＩＧＧＶＳ（配列番号２８）；ＣＤＲ３−ＮＴＹＰＰＹＬＮＧＭＤＹ（配列番号２９）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＳＦＮＴＤＡ（配列番号３０）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＤＧＴＲＴ（配列番号３１）；ＣＤＲ３−ＡＡＥＰＱＫＡＷＰＩＧＴＳＡＡＧＦＲＳ（配列番号３２）；
（ｉｖ）ＣＤＲ１−ＧＳＳＩＳＶ（配列番号３３）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＳＤＧＮＴ（配列番号３４）；ＣＤＲ３−ＡＶＥＰＲＧＷＰＫＧＨＲＹ（配列番号３５）；
（ｖ）ＣＤＲ１−ＧＳＳＦＳＩＮＶ（配列番号３６）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＳＤＧＳＴ（配列番号３７）；ＣＤＲ３−ＡＶＥＰＲＧＷＰＫＧＨＲＹ（配列番号３８）；または
（ｖｉ）ＣＤＲ１−ＧＳＩＦＲＩＮＡ（配列番号３９）；ＣＤＲ２−ＶＮＷＩＧＧＴＴ（配列番号４０）；ＣＤＲ３−ＳＡＴＤＫＧＧＳＳＲＹ（配列番号４１）。
【００４０】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを有する抗ＣＤ１２３  ＣＡＲは、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、または４７に示す配列のうちの１つを含み得る。
【００４１】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを有する抗ＦＬＴ３  ＣＡＲは、以下の相補性決定領域を含み得る：
（ｉ）ＣＤＲ１−ＧＩＦＫＴＮＹ（配列番号７２）；ＣＤＲ２−ＦＴＮＤＧＳＴ（配列番号７３）；ＣＤＲ３−ＹＧＬＧＨ（配列番号７４）；
（ｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＴＩＳＳＩＲＹ（配列番号７５）；ＣＤＲ２−ＩＴＳＳＧＮＴ（配列番号７６）；ＣＤＲ３−ＹＴＭＧＹ（配列番号７７）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＩＦＳＴＮＹ（配列番号７８）；ＣＤＲ２−ＦＴＮＤＧＧＴ（配列番号７９）；ＣＤＲ３−ＣＧＬＧＨ（配列番号８０）；
（ｉｖ）ＣＤＲ１−ＧＳＩＳＳＩＲＹ（配列番号８１）；ＣＤＲ２−ＩＴＳＳＧＳＴ（配列番号８２）；ＣＤＲ３−ＹＴＭＧＹ（配列番号８３）；または
（ｖ）ＣＤＲ１−ＧＩＦＳＴＮＨ（配列番号８４）；ＣＤＲ２−ＦＴＮＤＧＳＴ（配列番号８５）；ＣＤＲ３−ＹＧＬＧＨ（配列番号８６）。
【００４２】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを有する抗ＦＬＴ３  ＣＡＲは、配列番号８７、８８、８９、９０、または９１に示す配列のうちの１つを含み得る。
【００４３】
第２の態様では、本発明は、複数のＣＡＲをコードする核酸構築物を提供する。核酸構築物は、以下の抗原のうちの３つまたは４つ全てに対するＣＡＲをコードし得る：ＣＤ３３、ＣＬＬ−１、ＣＤ１２３、およびＦＬＴ３。例えば、核酸構築物は、以下をコードし得る：抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；抗ＣＬＬ１  ＣＡＲ；および抗ＣＤ１２３  ＣＡＲ。
【００４４】
核酸構築物は、以下をコードし得る：抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；抗ＣＬＬ１  ＣＡＲ；および抗ＦＬＴ３  ＣＡＲ。
【００４５】
核酸構築物は、以下をコードし得る：抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；抗ＣＬＬ１  ＣＡＲ；および抗ＣＤ１２３  ＣＡＲ；および抗ＦＬＴ３  ＣＡＲ。
【００４６】
第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様の核酸構築物で細胞を形質導入するかトランスフェクトする工程を含む、本発明の第１の態様の細胞を作製する方法を提供する。
【００４７】
第４の態様では、本発明は、本発明の第２の態様の核酸構築物を含むベクターを提供する。
【００４８】
第５の態様では、複数のベクターを含み、各ベクターが標的抗原に対するＣＡＲをコードする、ベクターのキットを提供する。キットは、以下の標的抗原のうちの３つまたは４つ全てに対するＣＡＲをコードするベクターを含み得る：ＣＤ３３、ＣＬＬ−１、ＣＤ１２３、およびＦＬＴ３。例えば、キットは、以下を含み得る：
（ｉ）ＣＤ３３に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む第１のベクター；
（ｉｉ）ＣＬＬ１に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含む第２のベクター；および
（ｉｉｉ）ＣＤ１２３に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含む第３のベクター。
【００４９】
キットは、以下を含み得る：
（ｉ）ＣＤ３３に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む第１のベクター；
（ｉｉ）ＣＬＬ１に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含む第２のベクター；および
（ｉｉｉ）ＦＬＴ３に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含む第３のベクター。
【００５０】
キットは、以下を含み得る：
（ｉ）ＣＤ３３に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む第１のベクター；
（ｉｉ）ＣＬＬ１に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含む第２のベクター；
（ｉｉｉ）ＣＤ１２３に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含む第３のベクター；および
（ｉｖ）ＦＬＴ３に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含む第４のベクター。
【００５１】
第６の態様では、本発明の第１の態様の複数の細胞を、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物を提供する。
【００５２】
第７の態様では、本発明の第６の態様の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、がんを処置する方法を提供する。
【００５３】
癌は、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）であり得る。
【００５４】
また、本方法は、その後に患者に同種移植片を投与する工程を含み得る。
【００５５】
第８の態様では、がんの処置で使用するための本発明の第６の態様の医薬組成物を提供する。
【００５６】
第９の態様では、がんを処置するための医薬組成物の製造における本発明の第１の態様の細胞の使用を提供する。
【００５７】
ＡＭＬ芽球表現型は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）芽球よりもさらに異質性が高い。骨髄造血は、確率的かつ合図に応答してその区画を補充するか分化する幹細胞によって駆動される。通常の骨髄系幹細胞に類似して、ＡＭＬ幹細胞は、異なる分化状態のある範囲の細胞との骨髄置換を生じるように増殖するか分化する。ＡＭＬ幹細胞は、前述の骨髄造血範囲に沿って生じることができ、結果的に、異なる表面抗原プロフィールを有する。さらに、所与の患者において、幹細胞ネキシーまたは個体発生の異なる時点での異なる幹細胞の階層が存在する場合があり、その全てが疾病負荷に寄与する（図１）。
【００５８】
最大数の患者を処置するために、本発明者らは、キメラ抗原受容体によるＡＭＬターゲティングには、骨髄細胞系列に沿った複数の抗原の同時ターゲティングが必要であることを見出した。
【００５９】
本発明のＯＲゲートは、上記の表１に示す再発／難治性ＡＭＬのためのＣＡＲ  Ｔ細胞免疫療法の現在の第Ｉ相臨床試験に勝る利点を提供する。単一の抗原を標的にすると、疾患関連幹細胞区画を排除できない場合がある。しかしながら、複数の骨髄性抗原を同時に標的にすることは、ＡＭＬが普遍的に処置されることを意味する。複数の抗原を標的にするＣＡＲ−Ｔ細胞を使用した免疫療法は、幹細胞区画の数および位置と無関係に疾患幹細胞区画を根絶する。また、複数の抗原を標的にすると、抗原下方制御による回避の可能性が低下する。
【００６０】
さらなる態様
また、本発明は、複数のＣＡＲを発現するＣＡＲ発現細胞を含む細胞組成物を提供する。
【００６１】
細胞の組成物は、以下を発現し得る：抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；抗ＣＬＬ１  ＣＡＲ；および抗ＣＤ１２３  ＣＡＲ。
【００６２】
細胞の組成物は、以下を発現し得る：抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；抗ＣＬＬ１  ＣＡＲ；および抗ＦＬＴ３  ＣＡＲ。
【００６３】
細胞の組成物は、以下を発現し得る：抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；抗ＣＬＬ１  ＣＡＲ；および抗ＣＤ１２３  ＣＡＲ；および抗ＦＬＴ３  ＣＡＲ。
【００６４】
組成物の細胞は、１つのＣＡＲ型を各々発現し得る。例えば、組成物は、以下のうちの１つの混合物を含み得る：
ＣＤ３３  ＣＡＲ発現細胞、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞、およびＣＤ１２３  ＣＡＲ発現細胞；
ＣＤ３３  ＣＡＲ発現細胞、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞、およびＦＬＴ３  ＣＡＲ発現細胞；または
ＣＤ３３  ＣＡＲ発現細胞、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞、ＣＤ１２３  ＣＡＲ発現細胞、およびＦＬＴ３  ＣＡＲ発現細胞。
【００６５】
あるいは、組成物の細胞のうちの少なくともいくつかは、１つを超えるＣＡＲを発現し得、例えば、組成物は、以下の組み合わせを含み得る：
ＣＤ３３  ＣＡＲ／ＣＬＬ−１  ＣＡＲ  ＯＲゲートを発現する細胞およびＣＤ１２３  ＣＡＲを発現する細胞；
ＣＤ３３  ＣＡＲ／ＣＤ１２３  ＣＡＲ  ＯＲゲートを発現する細胞およびＣＬＬ−１  ＣＡＲを発現する細胞；
ＣＤ１２３  ＣＡＲ／ＣＬＬ−１  ＣＡＲ  ＯＲゲートを発現する細胞およびＣＤ３３  ＣＡＲを発現する細胞；
ＣＤ３３  ＣＡＲ／ＣＬＬ−１  ＣＡＲ  ＯＲゲートを発現する細胞およびＦＬＴ３  ＣＡＲを発現する細胞；
ＣＤ３３  ＣＡＲ／ＦＬＴ３  ＣＡＲ  ＯＲゲートを発現する細胞およびＣＬＬ−１  ＣＡＲを発現する細胞；
ＦＬＴ３  ＣＡＲ／ＣＬＬ−１  ＣＡＲ  ＯＲゲートを発現する細胞およびＣＤ３３  ＣＡＲを発現する細胞；
ＣＤ３３  ＣＡＲ／ＣＬＬ−１  ＣＡＲ  ＯＲゲートを発現する細胞およびＣＤ１２３  ＣＡＲ／ＦＬＴ３  ＣＡＲ  ＯＲゲートを発現する細胞；
ＣＤ１２３  ＣＡＲ／ＣＬＬ−１  ＣＡＲ  ＯＲゲートを発現する細胞およびＣＤ３３  ＣＡＲ／ＦＬＴ３  ＣＡＲ  ＯＲゲートを発現する細胞；または
ＣＤ３３  ＣＡＲ／ＣＤ１２３  ＣＡＲ  ＯＲゲートを発現する細胞およびＣＬＬ−１  ＣＡＲ／ＦＬＴ３  ＣＡＲ  ＯＲゲートを発現する細胞。
【００６６】
組成物の細胞のうちの少なくともいくつかは、下記のｔａｎＣＡＲを発現し得る。例えば、組成物は、以下の組み合わせを含み得る：
ＣＤ３３／ＣＬＬ−１  ｔａｎＣＡＲを発現する細胞およびＣＤ１２３  ＣＡＲを発現する細胞；
ＣＤ３３／ＣＤ１２３  ｔａｎＣＡＲを発現する細胞およびＣＬＬ−１  ＣＡＲを発現する細胞；
ＣＤ１２３／ＣＬＬ−１  ｔａｎＣＡＲを発現する細胞およびＣＤ３３  ＣＡＲを発現する細胞；
ＣＤ３３／ＣＬＬ−１  ｔａｎＣＡＲを発現する細胞およびＦＬＴ３  ＣＡＲを発現する細胞；
ＣＤ３３／ＦＬＴ３  ｔａｎＣＡＲを発現する細胞およびＣＬＬ−１  ＣＡＲを発現する細胞；
ＦＬＴ３／ＣＬＬ−１  ｔａｎＣＡＲを発現する細胞およびＣＤ３３  ＣＡＲを発現する細胞；
ＣＤ３３／ＣＬＬ−１  ｔａｎＣＡＲを発現する細胞およびＣＤ１２３／ＦＬＴ３  ｔａｎＣＡＲを発現する細胞；
ＣＤ１２３／ＣＬＬ−１  ｔａｎＣＡＲを発現する細胞およびＣＤ３３／ＦＬＴ３  ｔａｎＣＡＲを発現する細胞；または
ＣＤ３３／ＣＤ１２３  ｔａｎＣＡＲを発現する細胞およびＣＬＬ−１／ＦＬＴ３  ｔａｎＣＡＲを発現する細胞。
【００６７】
下記の核酸配列、核酸構築物、ベクターおよびベクターのキット、ならびに方法を、本発明のこの態様の細胞組成物の細胞を作製するために使用してよい。
【００６８】
細胞組成物を、下記のように、疾患の処置方法で使用してよい。
【００６９】
本発明のなおさらなる態様を、以下の番号をつけたパラグラフにまとめている：
【００７０】
Ａ１．ＣＤ３３に結合し、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ドメイン抗体（ｄＡｂ）：
（ｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＦＳＭＨＳ（配列番号１）；ＣＤＲ２−ＶＴＷＳＧＤＴＦ（配列番号２）；ＣＤＲ３−ＫＤＤＰＹＲＰＡＹＤＹ（配列番号３）；
（ｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＦＳＳＹＶ（配列番号４）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＳＧＧＳＴ（配列番号５）；ＣＤＲ３−ＡＡＭＥＬＲＧＧＳＹＮＹＡＳＳＲＱＹＤＹ（配列番号６）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１−ＥＩＡＦＳＮＦＮ（配列番号７）；ＣＤＲ２−ＩＳＳＨＧＤＴＮＹ（配列番号８）；ＣＤＲ３−ＮＡＮＤＰＦＬＳＶＳＤＦ（配列番号９）；
（ｉｖ）ＣＤＲ１−ＧＳＩＦＳＩＮＡ（配列番号１０）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＳＧＧＳＴ（配列番号５）；ＣＤＲ３−ＡＡＩＳＧＷＧＲＳＩＲＶＧＥＲＹＥＹＤＹ（配列番号１１）；
（ｖ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＳＳＳＳＴ（配列番号１２）；ＣＤＲ２−ＩＴＬＳＧＧＳＴ（配列番号１３）；ＣＤＲ３−ＡＡＲＲＷＳＮＮＲＧＧＹＤＲＡＧＹＤＹ（配列番号１４）；または
（ｖｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＦＳＳＹＡ（配列番号１５）；ＣＤＲ２−ＩＴＷＳＧＧＳＴ（配列番号１６）；ＣＤＲ３−ＡＭＬＬＲＧＧＬＹＤＹＴＤＹＩＬＹＮＹ（配列番号１７）。
【００７１】
Ａ２．配列番号１８、１９、２０、２１、２２、または２３に示す配列のうちの１つを含む、パラグラフＡ１に記載のｄＡｂ。
【００７２】
Ａ３．パラグラフＡ１またはＡ２のｄＡｂを含む抗原結合ドメインを有する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
【００７３】
Ａ４．パラグラフＡ１またはＡ２に記載のｄＡｂまたはパラグラフＡ３のＣＡＲをコードする核酸配列。
【００７４】
Ａ５．パラグラフＡ４に記載の核酸配列を含むベクター。
【００７５】
Ａ６．パラグラフＡ３のＣＡＲを発現する細胞。
【００７６】
Ａ７．パラグラフＡ５に記載のベクターで細胞を形質導入するかトランスフェクトする工程を含む、パラグラフＡ６に記載の細胞を作製する方法。
【００７７】
Ａ８．パラグラフＡ６に記載の複数の細胞を含む医薬組成物。
【００７８】
Ａ９．パラグラフＡ８に記載の医薬組成物を被検体に投与する工程を含む、癌を処置する方法。
【００７９】
Ａ１０．前述の癌が急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）である、パラグラフＡ９に記載の方法。
【００８０】
Ａ１１．癌の処置で使用するためのパラグラフＡ８に記載の医薬組成物。
【００８１】
Ａ１２．癌を処置するための医薬組成物の製造におけるパラグラフＡ６に記載の細胞の使用。
【００８２】
Ｂ１．ＣＤ１２３に結合し、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ドメイン抗体（ｄＡｂ）：
（ｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＳＩＮＴＹＡ（配列番号２４）；ＣＤＲ２−ＩＮＹＮＳＲＹＴ（配列番号２５）；ＣＤＲ３−ＡＡＴＳＹＹＰＴＤＹＤＶＡＳＲＶＡＴＷＰＳ（配列番号２６）；
（ｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＩＳＬＮＡ（配列番号２７）；ＣＤＲ２−ＩＫＩＧＧＶＳ（配列番号２８）；ＣＤＲ３−ＮＴＹＰＰＹＬＮＧＭＤＹ（配列番号２９）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＳＦＮＴＤＡ（配列番号３０）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＤＧＴＲＴ（配列番号３１）；ＣＤＲ３−ＡＡＥＰＱＫＡＷＰＩＧＴＳＡＡＧＦＲＳ（配列番号３２）；
（ｉｖ）ＣＤＲ１−ＧＳＳＩＳＶ（配列番号３３）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＳＤＧＮＴ（配列番号３４）；ＣＤＲ３−ＡＶＥＰＲＧＷＰＫＧＨＲＹ（配列番号３５）；
（ｖ）ＣＤＲ１−ＧＳＳＦＳＩＮＶ（配列番号３６）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＳＤＧＳＴ（配列番号３７）；ＣＤＲ３−ＡＶＥＰＲＧＷＰＫＧＨＲＹ（配列番号３８）；または
（ｖｉ）ＣＤＲ１−ＧＳＩＦＲＩＮＡ（配列番号３９）；ＣＤＲ２−ＶＮＷＩＧＧＴＴ（配列番号４０）；ＣＤＲ３−ＳＡＴＤＫＧＧＳＳＲＹ（配列番号４１）。
【００８３】
Ｂ２．配列番号４２、４３、４４、４５、４６、または４７に示す配列のうちの１つを含む、パラグラフＢ１に記載のｄＡｂ。
【００８４】
Ｂ３．パラグラフＢ１またはＢ２のｄＡｂを含む抗原結合ドメインを有する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
【００８５】
Ｂ４．パラグラフＢ１またはＢ２に記載のｄＡｂまたはパラグラフＢ３のＣＡＲをコードする核酸配列。
【００８６】
Ｂ５．パラグラフＢ４に記載の核酸配列を含むベクター。
【００８７】
Ｂ６．パラグラフＢ３のＣＡＲを発現する細胞。
【００８８】
Ｂ７．パラグラフＢ５に記載のベクターで細胞を形質導入するかトランスフェクトする工程を含む、パラグラフＢ６に記載の細胞を作製する方法。
【００８９】
Ｂ８．パラグラフＢ６に記載の複数の細胞を含む医薬組成物。
【００９０】
Ｂ９．パラグラフＢ８に記載の医薬組成物を被検体に投与する工程を含む、癌を処置する方法。
【００９１】
Ｂ１０．前述の癌が急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）である、パラグラフＢ９に記載の方法。
【００９２】
Ｂ１１．癌の処置で使用するためのパラグラフＢ８に記載の医薬組成物。
【００９３】
Ｂ１２．癌を処置するための医薬組成物の製造におけるパラグラフＢ６に記載の細胞の使用。
【００９４】
本発明は、ＦＬＴ３に結合し、以下の相補性決定領域を含むドメイン抗体（ｄＡｂ）を提供する：
【００９５】
Ｃ１．ＦＬＴ３に結合し、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ドメイン抗体（ｄＡｂ）：
（ｉ）ＣＤＲ１−ＧＩＦＫＴＮＹ（配列番号７２）；ＣＤＲ２−ＦＴＮＤＧＳＴ（配列番号７３）；ＣＤＲ３−ＹＧＬＧＨ（配列番号７４）；
（ｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＴＩＳＳＩＲＹ（配列番号７５）；ＣＤＲ２−ＩＴＳＳＧＮＴ（配列番号７６）；ＣＤＲ３−ＹＴＭＧＹ（配列番号７７）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＩＦＳＴＮＹ（配列番号７８）；ＣＤＲ２−ＦＴＮＤＧＧＴ（配列番号７９）；ＣＤＲ３−ＣＧＬＧＨ（配列番号８０）；
（ｉｖ）ＣＤＲ１−ＧＳＩＳＳＩＲＹ（配列番号８１）；ＣＤＲ２−ＩＴＳＳＧＳＴ（配列番号８２）；ＣＤＲ３−ＹＴＭＧＹ（配列番号８３）；または
（ｖ）ＣＤＲ１−ＧＩＦＳＴＮＨ（配列番号８４）；ＣＤＲ２−ＦＴＮＤＧＳＴ（配列番号８５）；ＣＤＲ３−ＹＧＬＧＨ（配列番号８６）。
【００９６】
Ｃ２．配列番号８７、８８、８９、９０、または９１に示す配列のうちの１つを含む、パラグラフＣ１に記載のｄＡｂ。
【００９７】
Ｃ３．パラグラフＣ１またはＣ２のｄＡｂを含む抗原結合ドメインを有する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
【００９８】
Ｃ４．パラグラフＣ１またはＣ２に記載のｄＡｂまたはパラグラフＣ３のＣＡＲをコードする核酸配列。
【００９９】
Ｃ５．パラグラフＣ４に記載の核酸配列を含むベクター。
【０１００】
Ｃ６．パラグラフＣ３のＣＡＲを発現する細胞。
【０１０１】
Ｃ７．パラグラフＣ５に記載のベクターで細胞を形質導入するかトランスフェクトする工程を含む、パラグラフＣ６に記載の細胞を作製する方法。
【０１０２】
Ｃ８．パラグラフＣ６に記載の複数の細胞を含む医薬組成物。
【０１０３】
Ｃ９．パラグラフＣ８に記載の医薬組成物を被検体に投与する工程を含む、癌を処置する方法。
【０１０４】
Ｃ１０．前述の癌が急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）である、パラグラフＣ９に記載の方法。
【０１０５】
Ｃ１１．癌の処置で使用するためのパラグラフＣ８に記載の医薬組成物。
【０１０６】
Ｃ１２．癌を処置するための医薬組成物の製造におけるパラグラフＣ６に記載の細胞の使用。
【０１０７】
Ｄ１．ＣＬＬ１に結合し、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ドメイン抗体（ｄＡｂ）：
（ｉ）ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＧＮＨＤ（配列番号４８）；ＣＤＲ２−ＩＤＳＧＧＮＶＩ（配列番号４９）；ＣＤＲ３−ＡＴＤＬＤＳＧＡＥＳＬＥＳＶＹ（配列番号５０）；
（ｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＦＡＦＧＳＡＤ（配列番号５１）；ＣＤＲ２−ＩＤＳＧＧＮＴＱ（配列番号５２）；ＣＤＲ３−ＴＤＬＤＰＴＴＤＳＬＥＮＶＹ（配列番号５３）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＦＳＡＹＦ（配列番号５４）；ＣＤＲ２−ＩＮＷＮＧＤＳＳ（配列番号５５）；ＣＤＲ３−ＡＡＤＴＨＧＡＶＧＬＧＳＥＲＬＹＤＹ（配列番号５６）；
（ｉｖ）ＣＤＲ１−ＧＩＧＶＳＳＴＧ（配列番号５７）；ＣＤＲ２−ＩＤＲＤＧＴＴ（配列番号５８）；ＣＤＲ３−ＴＶＶＧＤＹＹ（配列番号５９）；
（ｖ）ＣＤＲ１−ＧＦＩＦＧＮＹＤ（配列番号６０）；ＣＤＲ２−ＩＳＳＧＧＮＤＩ（配列番号６１）；ＣＤＲ３−ＡＡＤＬＤＰＧＴＤＳＬＤＮＩＨ（配列番号６２）；または
（ｖｉ）ＣＤＲ１−ＧＦＴＬＤＹＹＡ（配列番号６３）；ＣＤＲ２−ＩＳＳＳＤＧＳＴ（配列番号６４）；ＣＤＲ３−ＡＥＡＶＹＹＡＧＶＣＶＡＭＹＤＳ（配列番号６５）。
【０１０８】
Ｄ２．配列番号６６、６７、６８、６９、７０、または７１に示す配列のうちの１つを含む、パラグラフＤ１に記載のｄＡｂ。
【０１０９】
Ｄ３．パラグラフＤ１またはＤ２のｄＡｂを含む抗原結合ドメインを有する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
【０１１０】
Ｄ４．パラグラフＤ１またはＤ２に記載のｄＡｂまたはパラグラフＤ３のＣＡＲをコードする核酸配列。
【０１１１】
Ｄ５．パラグラフＤ４に記載の核酸配列を含むベクター。
【０１１２】
Ｄ６．パラグラフＤ３のＣＡＲを発現する細胞。
【０１１３】
Ｄ７．パラグラフＤ５に記載のベクターで細胞を形質導入するかトランスフェクトする工程を含む、パラグラフＤ６に記載の細胞を作製する方法。
【０１１４】
Ｄ８．パラグラフＤ６に記載の複数の細胞を含む医薬組成物。
【０１１５】
Ｄ９．パラグラフＤ８に記載の医薬組成物を被検体に投与する工程を含む、癌を処置する方法。
【０１１６】
Ｄ１０．前述の癌が急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）である、パラグラフＤ９に記載の方法。
【０１１７】
Ｄ１１．癌の処置で使用するためのパラグラフＤ８に記載の医薬組成物。
【０１１８】
Ｄ１２．癌を処置するための医薬組成物の製造におけるパラグラフＤ６に記載の細胞の使用。
【発明を実施するための形態】
【０１１９】
詳細な説明
キメラ抗原受容体
本発明は、細胞表面で複数のキメラ抗原受容体を発現する細胞に関する。
【０１２０】
古典的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）が細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続しているキメラタイプＩ膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他の形式に基づくことができる。スペーサードメインは、通常、バインダーを膜から分離し、適切な配向を可能にするために必要である。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。より小型のスペーサー、例えば、抗原に応じて、ＣＤ８α由来のストーク、さらにはＩｇＧ１ヒンジのみですら十分な場合がある。膜貫通ドメインは、細胞膜内にタンパク質を係留し、スペーサーをエンドドメインに接続する。
【０１２１】
初期のＣＡＲデザインは、ＦｃεＲ１のγ鎖またはＣＤ３ζのいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有していた。結果的に、これらの第１世代の受容体は免疫学的シグナル１を伝達し、同族標的細胞のＴ細胞による殺滅を引き起こすのに十分であったが、Ｔ細胞を、それが増殖および生存するように十分に活性化することはできなかった。この限界を克服するために、複合エンドドメインが以下のように構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ζの細胞内部分との融合により、抗原認識後に活性化および共刺激シグナルを同時に伝達することができる第２世代の受容体が得られる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは最も効力のある共刺激シグナル（すなわち、Ｔ細胞増殖を引き起こす免疫学的シグナル２）を供給する。いくつかの受容体も記載されており、この受容体には、ＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン（生存シグナルを伝達する密接に関連するＯＸ４０および４１ＢＢなど）が含まれる。活性化、増殖、および生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するさらにより効力のある第３世代のＣＡＲをここに記載している。
【０１２２】
ＣＡＲが標的抗原に結合するとき、この結合により、ＣＡＲが発現されるＴ細胞に活性化シグナルが伝達される。したがって、ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性および細胞傷害性を、標的にされた抗原を発現する腫瘍細胞に向ける。
【０１２３】
ＣＡＲは、典型的には、以下を含む：（ｉ）抗原結合ドメイン；（ｉｉ）スペーサー；（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および（ｉｉｉ）シグナル伝達ドメインを含むか、それと会合している細胞内ドメイン。
【０１２４】
ＣＡＲは、以下の一般構造を有し得る：
抗原結合ドメイン−スペーサードメイン−膜貫通ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）。
【０１２５】
抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識するキメラ受容体の一部である。古典的ＣＡＲでは、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む（図２ｃを参照のこと）。ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインまたはＶＨＨ抗原結合ドメインを有する（図２ｂを参照のこと）またはＦａｂ  ＣＡＲ形式（図２ａ）の、ＣＡＲも産生されている。ＦａｂＣＡＲは、以下の２つの鎖を含む：抗体様軽鎖可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）を有する鎖；および重鎖可変領域（ＶＨ）および定常領域（ＣＨ）を有する鎖。一方の鎖はまた、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＬとＣＨとの間の会合により、受容体が組み立てられる。
【０１２６】
ＣＡＲの抗原結合ドメイン（単数または複数）は、「ｄＡｂ」、「ＶＨＨ」、「ドメイン抗体」、または「ナノボディ」としても公知のシングルドメインバインダーであり得る。
【０１２７】
従来のＩｇＧ分子は、２つの重および２つの軽鎖から構成される。重鎖は、３つの定常ドメインおよび１つの可変ドメイン（ＶＨ）を含み；軽鎖は、１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメイン（ＶＬ）を含む。天然に機能する抗原結合単位は、ＶＨドメインとＶＬドメインの非共有結合性の会合によって形成される。この会合は、疎水性フレームワーク領域によって媒介される。
【０１２８】
シングルドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１のシングルドメイン抗体は、ラクダ科動物で見出された重鎖抗体から操作され、古典的抗体の軽鎖およびＣＨ１ドメインを欠く。これらの重鎖抗体は、単一の抗原結合ドメインであるＶＨＨドメインを含む。また、軟骨魚類は、重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新規抗原受容体」）を有し、この抗体からＶＮＡＲ断片と呼ばれるシングルドメイン抗体を得ることができる。別のアプローチは、ヒトまたはマウス由来の共通の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）由来の二量体可変ドメインを単量体に分割することである。シングルドメイン抗体のほとんどの研究が現在は重鎖可変ドメインに基づいているにもかかわらず、軽鎖由来のナノボディも標的エピトープに特異的に結合することが示されている。
【０１２９】
シングルドメイン抗体を、所望の抗原を用いたヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、アルパカ、またはサメの免疫化およびその後の重鎖抗体をコードするｍＲＮＡの単離によって得ることができる。逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応により、シングルドメイン抗体の遺伝子ライブラリーが産生され得る。ファージディスプレイおよびリボゾームディスプレイのようなスクリーニング技術は、抗原に結合するクローンを同定するのに役立つ。あるいは、シングルドメイン抗体を、４本の鎖を有する共通のマウスまたはヒトのＩｇＧから作製することができる。
【０１３０】
本発明は、複数の抗原のターゲティングに関する。いくつかのアプローチ（ＯＲゲートおよびｔａｎＣＡＲｓ（以下により詳細に記載）が含まれる）によってこれを行うことができる。ドメイン抗体の抗原結合ドメインは、これらが個別であり、かつ連結する傾向がないので、かかるアプローチに特に適する。これらのドメインは、あまり複雑ではなく、これは、発現および折りたたみが損なわれる可能性が低いこと、および、かかるＣＡＲ／ｔａｎＣＡＲをコードする配列がウイルスベクターゲノム上の空間をあまり必要としないことを意味する。
【０１３１】
ＴａｎＣＡＲ
本発明の細胞は、ＴａｎＣＡＲを含み得る。
【０１３２】
タンデムＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲとして公知の二重特異性ＣＡＲは、２つまたはそれを超える癌特異的マーカーを同時に標的にするように開発されている。ＴａｎＣＡＲでは、細胞外ドメインは、リンカーによって連結された２つの抗原結合特異性部位をタンデムで含む。したがって、２つの結合特異性部位（ｓｃＦｖｓ）の両方は、単一の膜貫通部分に連結される：一方のｓｃＦｖは膜に近接しており、他方は遠位にある。ＴａｎＣＡＲが標的抗原のいずれかまたは両方に結合する場合、これにより、ＴａｎＣＡＲが発現される細胞に活性化シグナルが伝達される。
【０１３３】
Ｇｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ（２０１３、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２：ｅ１０５）は、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖを含み、その後にＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー、次いで、ＨＥＲ２特異的ｓｃＦｖが続くＴａｎＣＡＲを記載している。ＨＥＲ２−ｓｃＦｖは、膜近傍の位置に存在し、ＣＤ１９−ｓｃＦｖは遠位に存在した。ＴａｎＣＡＲは、２つの腫瘍制限抗原の各々に対して別個のＴ細胞反応性を誘導することが示された。それぞれの長さのＨＥＲ２（６３２ａａ／１２５Å）およびＣＤ１９（２８０ａａ、６５Å）が空間配置に役立つので、この配置を選択した。ＨＥＲ２  ｓｃＦｖがＨＥＲ２の最も遠位の４ループに結合することも知られていた。
【０１３４】
本発明の細胞は、２つの抗原結合特異性部位をタンデムで含むＴａｎＣＡＲを含み得る。ｔａｎＣＡＲは、以下の抗原対のうちの１対に結合し得る：ＣＤ３３およびＣＤ１２３；ＣＤ３３およびＣＬＬ−１、ＣＤ３３およびＦＬＴ−３；ＣＤ１２３およびＣＬＬ−１；ＣＤ１２３およびＦＬＴ−３；Ｃｌｌ１およびＦＬＴ−３。
【０１３５】
これらの抗原対の各々において、抗原結合ドメインは、分子中でいずれかの順序で存在し得る。例えば、標的抗原対ＣＤ３３およびＣＤ１２３について、ＣＤ３３結合抗原結合ドメインは膜に近接して存在し得、ＣＤ１２３結合抗原結合ドメインは膜の遠位に存在し得る；またはＣＤ１２３結合抗原結合ドメインは膜に近接して存在し得、ＣＤ３３結合抗原結合ドメインは膜の遠位に存在し得る。
【０１３６】
本発明の細胞は、ｔａｎＣＡＲと、ｓｃＦｖ−ＣＡＲまたはｄＡｂ  ＣＡＲなどの単一抗原特異性部位を含むＣＡＲの組み合わせを含み得る。この点において、細胞は、以下の３つの抗原特異性を有する：ＴａｎＣＡＲについての２つの抗原特異性およびｓｃＦｖまたはｄＡｂ  ＣＡＲについての１つ抗原特異性。細胞は、例えば、表２に示す組み合わせのうちの１つを含み得る。
【０１３７】
【表２】
2021533766.tif 000003
【０１３８】
本発明の細胞は、２つのｔａｎＣＡＲを含み得る。例えば、細胞は、表３に示す二重ｔａｎＣＡＲを含み得る。
【０１３９】
【表３】
2021533766.tif 000004
【０１４０】
ＯＲゲート
「論理ゲート」ＣＡＲ組み合わせは、ＷＯ２０１５／０７５４６９号、ＷＯ２０１５／０７５４７０号、およびＷＯ２０１５／０７５４７０号に記載されている。ＣＡＲ論理ゲートは、Ｔ細胞などの細胞によって発現される場合、少なくとも２つの標的抗原の特定の発現パターンを検出することができるＣＡＲ組み合わせである。
少なくとも２つの標的抗原が抗原Ａおよび抗原Ｂとして任意に示される場合、３つの可能な選択肢は以下の通りである：
【０１４１】
「ＯＲゲート」−Ｔ細胞は、抗原Ａまたは抗原Ｂのいずれかが標的細胞上に存在するときに引き起こす
「ＡＮＤゲート」−Ｔ細胞は、抗原ＡおよびＢの両方が標的細胞上に存在するときに引き起こす
「ＡＮＤ  ＮＯＴゲート」−Ｔ細胞は、抗原Ａが単独で標的細胞上に存在する場合に引き起こすが、Ｔ細胞は、抗原ＡおよびＢの両方が標的細胞上に存在する場合に引き起こさない。
【０１４２】
これらのＣＡＲ組み合わせを発現する操作されたＴ細胞を、２またはそれより多くのマーカーのがん細胞の特定の発現（または発現の欠如）に基づいて、がん細胞に精巧に特異的であるように調整することができる。
【０１４３】
「ＯＲゲート」は、各々が標的細胞によって発現される別個の標的抗原に指向する２つまたはそれを超えるＣＡＲを含む。ＯＲゲートの利点は、有効性が抗原Ａ＋抗原Ｂとなるので、標的細胞上の有効に標的可能な抗原が増加することである。単一抗原のレベルが、ＣＡＲ−Ｔ細胞が有効に標的にするのに必要な閾値未満であり得るので、このことは標的細胞上に変動するか低い密度で発現される抗原に特に重要である。また、ＯＲゲートは、抗原回避現象が避けられる。例えば、いくつかのリンパ腫および白血病は、ＣＤ１９が標的にされた後にＣＤ１９陰性になる：この現象が起こる場合、別の抗原と組み合わせてＣＤ１９を標的にするＯＲゲートを使用すると「バックアップ」抗原が得られる。
【０１４４】
本発明の細胞は、３つのＣＡＲを含むトリプルＯＲゲートを発現し得る。例えば、細胞は、以下を発現し得る：
ＣＤ３３に結合するＣＡＲ、ＣＬＬ−１に結合するＣＡＲ；およびＣＤ１２３に結合するＣＡＲまたは
ＣＤ３３に結合するＣＡＲ、ＣＬＬ−１に結合するＣＡＲ；およびＦＬＴ３に結合するＣＡＲ。
【０１４５】
本発明の細胞は、４つのＣＡＲを含むクワドループルＯＲゲートを発現し得る。例えば、細胞は、以下を発現し得る：ＣＤ３３に結合するＣＡＲ、ＣＬＬ−１に結合するＣＡＲ；ＣＤ１２３に結合するＣＡＲ；およびＦＬＴ３に結合するＣＡＲ。
【０１４６】
本発明のトリプルおよびクワドループルＯＲゲートでは、１またはそれを超えるＣＡＲ（単数または複数）は、ｄＡｂ  ＣＡＲであり得る。特に、細胞の全てのＣＡＲは、ｄＡｂ  ＣＡＲであり得る。
【０１４７】
標的抗原
ＣＡＲの抗原結合ドメイン（単数または複数）またはそのうちの１つは、以下の標的抗原のうちの１つに特異的に結合し得る：ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＬＬ−１、およびＦＬＴ−３。
【０１４８】
ＣＤ３３
ＣＤ３３は、いくつかの正常なＢ細胞および活性化Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞上に提示されるが、多能性造血幹細胞上や造血系の外側に発現されないミエロイド分化抗原である。ＣＤ３３は、ほとんど全ての急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）において芽球の少なくともサブセット上に見出される。平均で１０４分子／白血病細胞のＣＤ３３は、あまり豊富ではないが、レベルは個々の患者でかなり異なる。
【０１４９】
ＣＤ３３の細胞外部分は２つの免疫グロブリンドメインを含み、細胞内部分は免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ｉｎｎｕｍｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＩＭ）を含む。ヒトＣＤ３３のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ２０１３８から入手可能である。
【０１５０】
いくつかの市販のＣＤ３３に対する抗体が公知である（ＷＭ−５３、Ｐ６７．６、ＨＩＭ３−４（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）など）。
【０１５１】
本発明は、ＣＤ３３に結合し、以下の相補性決定領域を含むドメイン抗体（ｄＡｂ）を提供する：
（ｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＦＳＭＨＳ（配列番号１）；ＣＤＲ２−ＶＴＷＳＧＤＴＦ（配列番号２）；ＣＤＲ３−ＫＤＤＰＹＲＰＡＹＤＹ（配列番号３）；
（ｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＦＳＳＹＶ（配列番号４）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＳＧＧＳＴ（配列番号５）；ＣＤＲ３−ＡＡＭＥＬＲＧＧＳＹＮＹＡＳＳＲＱＹＤＹ（配列番号６）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１−ＥＩＡＦＳＮＦＮ（配列番号７）；ＣＤＲ２−ＩＳＳＨＧＤＴＮＹ（配列番号８）；ＣＤＲ３−ＮＡＮＤＰＦＬＳＶＳＤＦ（配列番号９）；
（ｉｖ）ＣＤＲ１−ＧＳＩＦＳＩＮＡ（配列番号１０）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＳＧＧＳＴ（配列番号５）；ＣＤＲ３−ＡＡＩＳＧＷＧＲＳＩＲＶＧＥＲＹＥＹＤＹ（配列番号１１）；
（ｖ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＳＳＳＳＴ（配列番号１２）；ＣＤＲ２−ＩＴＬＳＧＧＳＴ（配列番号１３）；ＣＤＲ３−ＡＡＲＲＷＳＮＮＲＧＧＹＤＲＡＧＹＤＹ（配列番号１４）；または
（ｖｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＦＳＳＹＡ（配列番号１５）；ＣＤＲ２−ＩＴＷＳＧＧＳＴ（配列番号１６）；ＣＤＲ３−ＡＭＬＬＲＧＧＬＹＤＹＴＤＹＩＬＹＮＹ（配列番号１７）。
【０１５２】
抗ＣＤ３３  ｄＡｂは、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、または２３に示す配列のうちの１つを含み得る。
【０１５３】
配列番号１８（ＣＤ３３  ｄＡｂ  Ｐ１．Ｅ４  −  ４４７３８）
ＱＶＱＬＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＭＨＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＶＴＷＳＧＤＴＦＡＹＡＤＦＶＫＧＲＦＴＩＳＲＧＩＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＫＤＤＰＹＲＰＡＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号１９（ＣＤ３３  ｄＡｂ  Ｐ１．Ｈ３−  ４４７３９）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＶＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＷＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＭＥＬＲＧＧＳＹＮＹＡＳＳＲＱＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２０（ＣＤ３３  ｄＡｂ  Ｐ１．Ｇ８  −  ４４７４２）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＴＧＧＳＬＴＬＳＣＡＡＳＥＩＡＦＳＮＦＮＭＧＷＹＲＱＧＳＧＫＱＲＴＬＶＡＱＩＳＳＨＧＤＴＮＹＬＤＳＭＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＮＫＫＴＶＹＬＱＭＮＡＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＮＤＰＦＬＳＶＳＤＦＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２１（ＣＤ３３  ｄＡｂ  Ｐ２．Ａ７  −  ４６１７３）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＮＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＷＳＧＧＳＴＹＹＡＤＦＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＩＳＧＷＧＲＳＩＲＶＧＥＲＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ  
配列番号２２（ＣＤ３３  ｄＡｂ  Ｐ２．Ｂ１２  −  ４６１７４）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＳＳＳＳＴＭＡＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＬＳＧＧＳＴＨＹＡＤＳＡＫＧＲＦＴＩＳＲＥＳＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＤＹＹＣＡＡＲＲＷＳＮＮＲＧＧＹＤＲＡＧＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２３（ＣＤ３３  ｄＡｂ  Ｐ２．Ｆ２  −  ４６１７６）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＷＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＭＬＬＲＧＧＬＹＤＹＴＤＹＩＬＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
【０１５４】
また、本発明は、以下を提供する：
抗原結合ドメインとしてかかるＣＤ３３  ｄＡｂを含むＣＡＲ；
かかるｄＡｂまたはＣＡＲをコードする核酸配列。
【０１５５】
ＣＤ１２３
ＣＤ１２３は、インターロイキン−３受容体の膜貫通ａサブユニット（ＩＬ−３Ｒａ）であり、ＣＤ１３１と共に高親和性ＩＬ−３Ｒを形成する。ＩＬ−３への結合の際、ＩＬ−３Ｒは、細胞の増殖および生存を促進する。ＣＤ１２３は、通常は形質細胞様樹状細胞および好塩基球上に高レベルで発現される。ＣＤ１２３は、単球、好酸球、および骨髄系樹状細胞上に低レベルで発現される。ヒトＣＤ１２３のアミノ酸配列は、以下のＮＣＢＩ参照配列から入手可能である：ＮＰ＿００２１７４．１。
【０１５６】
いくつかの市販のＣＤ１２３に対する抗体が公知である（６Ｈ６および５Ｂ１１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）など）。
【０１５７】
本発明は、ＣＤ１２３に結合し、以下の相補性決定領域を含むドメイン抗体（ｄＡｂ）を提供する：
（ｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＳＩＮＴＹＡ（配列番号２４）；ＣＤＲ２−ＩＮＹＮＳＲＹＴ（配列番号２５）；ＣＤＲ３−ＡＡＴＳＹＹＰＴＤＹＤＶＡＳＲＶＡＴＷＰＳ（配列番号２６）；
（ｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＩＳＬＮＡ（配列番号２７）；ＣＤＲ２−ＩＫＩＧＧＶＳ（配列番号２８）；ＣＤＲ３−ＮＴＹＰＰＹＬＮＧＭＤＹ（配列番号２９）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＳＦＮＴＤＡ（配列番号３０）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＤＧＴＲＴ（配列番号３１）；ＣＤＲ３−ＡＡＥＰＱＫＡＷＰＩＧＴＳＡＡＧＦＲＳ（配列番号３２）；
（ｉｖ）ＣＤＲ１−ＧＳＳＩＳＶ（配列番号３３）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＳＤＧＮＴ（配列番号３４）；ＣＤＲ３−ＡＶＥＰＲＧＷＰＫＧＨＲＹ（配列番号３５）；
（ｖ）ＣＤＲ１−ＧＳＳＦＳＩＮＶ（配列番号３６）；ＣＤＲ２−ＩＳＷＳＤＧＳＴ（配列番号３７）；ＣＤＲ３−ＡＶＥＰＲＧＷＰＫＧＨＲＹ（配列番号３８）；または
（ｖｉ）ＣＤＲ１−ＧＳＩＦＲＩＮＡ（配列番号３９）；ＣＤＲ２−ＶＮＷＩＧＧＴＴ（配列番号４０）；ＣＤＲ３−ＳＡＴＤＫＧＧＳＳＲＹ（配列番号４１）。
【０１５８】
抗ＣＤ１２３  ｄＡｂは、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、または４７に示す配列のうちの１つを含み得る。
【０１５９】
配列番号４２（ＣＤ１２３  ｄＡｂ  Ｈ１１  ４５８９７）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＲＳＩＮＴＹＡＭＡＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＳＩＮＹＮＳＲＹＴＨＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＴＬＦＬＱＭＤＳＬＮＲＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＳＹＹＰＴＤＹＤＶＡＳＲＶＡＴＷＰＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４３（ＣＤ１２３  ｄＡｂ  Ｆ８  ４５８８８）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＥＳＬＲＬＴＣＡＶＳＧＩＳＬＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＬＲＥＷＶＡＶＩＫＩＧＧＶＳＮＹＡＶＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＩＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＶＹＹＣＮＴＹＰＰＹＬＮＧＭＤＹＷＧＫＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４４（ＣＤ１２３  ｄＡｂ  Ａ７  ４５８６５）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＦＳＧＲＳＦＮＴＤＡＶＡＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＷＤＧＴＲＴＹＹＡＤＳＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＮＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＥＰＱＫＡＷＰＩＧＴＳＡＡＧＦＲＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４５（ＣＤ１２３  ｄＡｂ  Ｂ４  ４５８６８）  
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＳＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＩＳＶＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＷＳＤＧＮＴＮＹＡＤＳＶＮＧＲＦＳＶＳＲＤＮＴＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＶＥＰＲＧＷＰＫＧＨＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４６（ＣＤ１２３  ｄＡｂ  Ａ１０  ４５８６６）  
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＳＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＩＮＶＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＷＳＤＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＶＥＰＲＧＷＰＫＧＨＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４７（ＣＤ１２３  ｄＡｂ  Ｃ１１  ４５８７４）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＲＩＮＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＴＡＶＮＷＩＧＧＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＦＣＳＡＴＤＫＧＧＳＳＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
【０１６０】
また、本発明は、以下を提供する：
抗原結合ドメインとしてかかるＣＤ１２３  ｄＡｂを含むＣＡＲ；
かかるｄＡｂまたはＣＡＲをコードする核酸配列。
【０１６１】
ＦＬＴ３
ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）（受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ））は、内因性のチロシンキナーゼドメインを有する膜結合受容体である。ＦＬＴ３は、免疫グロブリン様細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、膜近傍二量体化ドメイン、およびキナーゼインサートによって分割された高度に保存された細胞内キナーゼドメインから構成される。ＦＬＴ３は、ＲＴＫのクラスＩＩＩサブファミリーに属し、このサブファミリーには、ｃ−ＦＭＳ受容体、ｃ−ＫＩＴ受容体、およびＰＤＧＦ受容体などの構造が類似したメンバーが含まれる。ＦＬＴ３は、骨髄系およびリンパ球系の委任前駆体上で主に発現され、より成熟した単球系譜において発現が変動する。
【０１６２】
ＦＬＴ３発現は、肝臓、脾臓、胸腺、および胎盤などのリンパ造血器において報告されている。非刺激状態では、ＦＬＴ３受容体は、不活性キナーゼ部分を有する単量体の非リン酸化形態で存在する。この受容体がＦＬＴリガンド（ＦＬ）と相互作用すると、この受容体は立体構造が変化し、それにより受容体がアンフォールドされて二量体化ドメインが露呈し、受容体間二量体化が起こる。この受容体二量体化は、細胞内ドメイン中の種々の部位のリン酸化に至るチロシンキナーゼ酵素の活性化の準備段階である。ヒトＦＬＴ３のアミノ酸配列は、以下のＮＣＢＩ参照配列から入手可能である：ＮＰ＿００４１１０．２。
【０１６３】
ＦＬＴ３は、ＡＭＬの一部の症例の生物学に重要であり、ＦＬＴ３の変異は、この疾患において最もよく見られる変異である。これらの変異は、典型的には、構成性活性化に至る。ＡＭＬの一部の症例は、ＦＬＴ３の小分子阻害に応答する。
【０１６４】
いくつかの市販のＦＬＴ３に対する抗体が公知である（Ａ２Ｆ１０およびＢＶ１０Ａ４Ｈ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）など）。
【０１６５】
本発明は、ＦＬＴ３に結合し、以下の相補性決定領域を含むドメイン抗体（ｄＡｂ）を提供する：
（ｉ）ＣＤＲ１−ＧＩＦＫＴＮＹ（配列番号７２）；ＣＤＲ２−ＦＴＮＤＧＳＴ（配列番号７３）；ＣＤＲ３−ＹＧＬＧＨ（配列番号７４）；
（ｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＴＩＳＳＩＲＹ（配列番号７５）；ＣＤＲ２−ＩＴＳＳＧＮＴ（配列番号７６）；ＣＤＲ３−ＹＴＭＧＹ（配列番号７７）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＩＦＳＴＮＹ（配列番号７８）；ＣＤＲ２−ＦＴＮＤＧＧＴ（配列番号７９）；ＣＤＲ３−ＣＧＬＧＨ（配列番号８０）；
（ｉｖ）ＣＤＲ１−ＧＳＩＳＳＩＲＹ（配列番号８１）；ＣＤＲ２−ＩＴＳＳＧＳＴ（配列番号８２）；ＣＤＲ３−ＹＴＭＧＹ（配列番号８３）；または
（ｖ）ＣＤＲ１−ＧＩＦＳＴＮＨ（配列番号８４）；ＣＤＲ２−ＦＴＮＤＧＳＴ（配列番号８５）；ＣＤＲ３−ＹＧＬＧＨ（配列番号８６）。
【０１６６】
抗ＦＬＴ３  ｄＡｂは、配列番号８７、８８、８９、９０、または９１に示す配列のうちの１つを含み得る。
【０１６７】
配列番号８７（ＦＬＴ３  ｄＡｂ  Ｂ５）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＦＫＴＮＹＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＦＴＮＤＧＳＴＬＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＡＫＹＴＶＳＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＧＬＧＨＷＧＱＧＴＱＶＩＶＳＳＥＰＫＴＰＫＰＱＰＡＡＡＤＤＤＤＫＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＨＨＨＨＨＨＧＡＡ
配列番号８８（ＦＬＴ３  ｄＡｂ  Ｇ３）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＴＩＳＳＩＲＹＭＮＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＶＶＡＹＩＴＳＳＧＮＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＤＮＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＹＴＭＧＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＥＰＫＩＰＱＰＱＰＡＡＡＤＤＤＤＫＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＨＨＨＨＨＨＧＡＡ
配列番号８９（ＦＬＴ３  ｄＡｂ  Ｈ５）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＦＳＴＮＹＭＶＷＣＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＦＴＮＤＧＧＴＬＹＡＤＳＬＫＧＲＦＳＩＳＱＤＮＡＫＮＴＶＬＬＬＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＣＧＬＧＨＷＧＲＧＴＫＶＴＶＳＳＥＰＫＩＰＱＰＱＰＡＡＡＤＤＤＤＫＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＨＨＨＨＨＨＧＡＡ
配列番号９０（ＦＬＴ３  ｄＡｂ  Ｄ１２）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＳＳＩＲＹＭＮＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＳＶＡＷＩＴＳＳＧＳＴＮＹＡＤＳＶＱＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＤＮＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＴＭＧＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＥＰＫＩＰＱＰＱＰＡＡＡＤＤＤＤＫＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＨＨＨＨＨＨＧＡＡ
配列番号９１（ＦＬＴ３  ｄＡｂ  Ｆ１０）
ＱＡＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＦＳＴＮＨＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＦＴＮＤＧＳＴＬＹＧＤＳＶＫＧＲＦＶＩＳＲＤＮＡＫＹＴＶＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＧＬＧＨＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＥＰＫＴＰＫＰＱＰＡＡＡＤＤＤＤＫＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＨＨＨＨＨＨＧＡＡ
【０１６８】
また、本発明は、以下を提供する：
抗原結合ドメインとしてかかるＦＬＴ３  ｄＡｂを含むＣＡＲ；
かかるｄＡｂまたはＣＡＲをコードする核酸配列。
【０１６９】
ＣＬＬ１
ヒトＣ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１、ＭＩＣＬ、またはＣＬＥＣ１２Ａ）は、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、免疫制御に関与するＣ型レクチン様受容体の大きなファミリーのメンバーである。ＣＬＬ−１の細胞内ドメインは、ＩＴＩＭモチーフおよびＰＩ−３キナーゼの結合部分を含む。造血細胞におけるＣＬＬ−１の発現パターンは制限されており、末梢血および骨髄に由来する骨髄性細胞で特に認められる。ヒトＣＬＬ１のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ５ＱＧＺ９から入手可能である。
【０１７０】
いくつかのＣＬＬ−１に対する抗体が、例えば、ＷＯ２００９０５１９７４号、ＷＯ２０１３１６９６２５号、ＷＯ２０１６２０５２００号、およびＷＯ２０１６０４０８６８号に記載されている。
【０１７１】
本発明は、ＣＬＬ１に結合し、以下の相補性決定領域を含むドメイン抗体（ｄＡｂ）を提供する：
（ｉ）ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＧＮＨＤ（配列番号４８）；ＣＤＲ２−ＩＤＳＧＧＮＶＩ（配列番号４９）；ＣＤＲ３−ＡＴＤＬＤＳＧＡＥＳＬＥＳＶＹ（配列番号５０）；
（ｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＦＡＦＧＳＡＤ（配列番号５１）；ＣＤＲ２−ＩＤＳＧＧＮＴＱ（配列番号５２）；ＣＤＲ３−ＴＤＬＤＰＴＴＤＳＬＥＮＶＹ（配列番号５３）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１−ＧＲＴＦＳＡＹＦ（配列番号５４）；ＣＤＲ２−ＩＮＷＮＧＤＳＳ（配列番号５５）；ＣＤＲ３−ＡＡＤＴＨＧＡＶＧＬＧＳＥＲＬＹＤＹ（配列番号５６）；
（ｉｖ）ＣＤＲ１−ＧＩＧＶＳＳＴＧ（配列番号５７）；ＣＤＲ２−ＩＤＲＤＧＴＴ（配列番号５８）；ＣＤＲ３−ＴＶＶＧＤＹＹ（配列番号５９）；
（ｖ）ＣＤＲ１−ＧＦＩＦＧＮＹＤ（配列番号６０）；ＣＤＲ２−ＩＳＳＧＧＮＤＩ（配列番号６１）；ＣＤＲ３−ＡＡＤＬＤＰＧＴＤＳＬＤＮＩＨ（配列番号６２）；または
（ｖｉ）ＣＤＲ１−ＧＦＴＬＤＹＹＡ（配列番号６３）；ＣＤＲ２−ＩＳＳＳＤＧＳＴ（配列番号６４）；ＣＤＲ３−ＡＥＡＶＹＹＡＧＶＣＶＡＭＹＤＳ（配列番号６５）。
抗ＣＬＬ−１  ｄＡｂは、配列番号６６、６７、６８、６９、７０、または７１に示す配列のうちの１つを含み得る。
【０１７２】
配列番号６６（ＣＬＬ−１  ｄＡｂ  ４４５４８）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＧＳＧＦＴＦＧＮＨＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＥＶＥＦＶＡＧＩＤＳＧＧＮＶＩＶＹＥＥＶＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＤＧＬＫＰＥＤＡＧＭＹＦＣＡＴＤＬＤＳＧＡＥＳＬＥＳＶＹＨＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６７（ＣＬＬ−１  ｄＡｂ  ４４５４４）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＥＳＧＧＳＬＲＩＳＣＴＧＦＧＦＡＦＧＳＡＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＥＶＥＦＶＡＧＩＤＳＧＧＮＴＱＴＹＥＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＱＳＥＤＡＧＶＹＦＣＡＴＤＬＤＰＴＴＤＳＬＥＮＶＹＨＧＱＧＴＱＶＩＶＳＳ
配列番号６８（ＣＬＬ−１  ｄＡｂ  ４４５３８）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＴＧＤＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＦＳＡＹＦＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＡＩＮＷＮＧＤＳＳＷＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＥＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＴＨＧＡＶＧＬＧＳＥＲＬＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６９（ＣＬＬ−１  ｄＡｂ  ４４５４６）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＩＧＶＳＳＴＧＭＧＷＳＲＱＴＰＧＫＱＶＥＬＶＡＬＩＤＲＤＧＴＴＮＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＫＤＮＳＫＮＭＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＬＹＨＣＴＶＶＧＤＹＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号７０（ＣＬＬ−１  ｄＡｂ  ４４５４５）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＧＳＧＦＩＦＧＮＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＥＶＥＦＶＡＧＩＳＳＧＧＮＤＩＶＹＥＤＡＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＡＲＮＴＶＹＬＤＭＡＳＶＫＰＥＤＡＧＶＹＹＣＡＡＤＬＤＰＧＴＤＳＬＤＮＩＨＨＧＱＧＴＱＶＦＶＳＳ
配列番号７１（ＣＬＬ−１  ｄＡｂ  ４４５３６）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＤＹＹＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＳＳＤＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＥＡＶＹＹＡＧＶＣＶＡＭＹＤＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
【０１７３】
また、本発明は、以下を提供する：
抗原結合ドメインとしてかかるＣＤ１２３  ｄＡｂを含むＣＡＲ；
かかるｄＡｂまたはＣＡＲをコードする核酸配列。
【０１７４】
スペーサー
古典的ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続し、かつ抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するスペーサー配列を含む。可動性スペーサーにより、抗原結合ドメインを異なる方向に配向させて結合を容易にすることが可能である。
【０１７５】
スペーサーにより２本のＣＡＲ形成ポリペプチド鎖を二量体化させることができる。２本のポリペプチド鎖は、例えば、ジスルフィド架橋（単数または複数）を形成するのに適切な１またはそれを超えるシステイン残基を含み得る。一般的に使用されるスペーサーには、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ、またはヒトＣＤ８ストークが含まれる。ヒンジスペーサーは、配列番号９２に示す配列を含み得る。
【０１７６】
配列番号９２（ヒンジスペーサー）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ
【０１７７】
スペーサーは、標的抗原に適するように選択され得る（すなわち、標的抗原上のエピトープの位置および配向ならびに標的細胞膜からの標的エピトープの距離）。ＯＲゲートでは、標的エピトープの異なる相対的位置に適し、また、２つのＣＡＲの間の交差対合を回避するように、異なるスペーサーを使用することができる。
【０１７８】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜を横切るＣＡＲの一部である。膜貫通ドメインは、膜内で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造であり得る。これは、典型的には、いくつかの疎水性残基から構成されるαヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインを、キメラ受容体の膜貫通部分を供給するために使用することができる。タンパク質の膜貫通ドメインの配列および全長を、当業者がＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）を使用して決定することができる。あるいは、人為的にデザインされたＴＭドメインを使用しても良い。
【０１７９】
エンドドメイン
エンドドメインは、ＣＡＲのシグナル伝達部分である。エンドドメインは、ＣＡＲの細胞内ドメインの一部であり得るか、前記細胞内ドメインに会合し得る。抗原認識後、受容体がクラスター形成し、天然のＣＤ４５およびＣＤ１４８がシナプスから排除され、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されているエンドドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３−ゼータのエンドドメイン成分である。これは、抗原への結合後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する。ＣＤ３−ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない場合があり、さらなる共刺激シグナル伝達が必要であり得る。共刺激シグナルは、Ｔ細胞の増殖および生存を促進する。共刺激シグナルには以下の２つの主なタイプが存在する：Ｉｇファミリーに属するもの（ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）およびＴＮＦファミリーに属するもの（ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲなど）。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０を、増殖／生存シグナルを伝達させるためにＣＤ３−ゼータと共に使用することができるか、３つ全てを共に使用することができる。
【０１８０】
エンドドメインは、以下を含み得る：
（ｉ）ＩＴＡＭ含有エンドドメイン（ＣＤ３ゼータ由来のエンドドメインなど）；および／または
（ｉｉ）共刺激ドメイン（ＣＤ２８またはＩＣＯＳ由来のエンドドメインなど）；および／または
（ｉｉｉ）生存シグナルを伝達するドメイン（例えば、ＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン（ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＧＩＴＲなど）。
【０１８１】
抗原認識部分がシグナル伝達部分由来の個別の分子上に存在するいくつかの系が記載されている（ＷＯ０１５／１５０７７１号；ＷＯ２０１６／１２４９３０号、およびＷＯ２０１６／０３０６９１号に記載のものなど）。したがって、本発明の細胞は、抗原結合ドメイン（単数または複数）を含む抗原結合成分および膜貫通ドメイン（シグナル伝達ドメインを含む個別の細胞内シグナル伝達成分と相互作用することができる）を含むＣＡＲシステムを発現することができる。
【０１８２】
ＣＡＲはシグナルペプチドを含み得るため、シグナルペプチドが細胞の内側で発現されるときに、新生タンパク質は小胞体、その後に細胞表面に向かい、そこで発現される。シグナルペプチドは、分子のアミノ末端に存在し得る。
【０１８３】
自殺遺伝子
また、本発明の細胞は、自殺遺伝子を発現し得る。
【０１８４】
自殺遺伝子は、容認できない毒性（オンターゲットオフ腫瘍毒性、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、または神経毒性など）に直面した場合にＴ細胞などの養子導入細胞を選択的に破壊可能な遺伝子コードされた機序である。
【０１８５】
本発明の細胞を使用して急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）を処置する場合、処置によって患者が持続性または永続性であり得る骨髄形成不全を発症する場合がある。同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏＨＳＣＴ）などの同種移植を使用してこの状態から患者を救出することが可能である。また、ＣＡＲ発現細胞中への自殺遺伝子の組み込みは、移植片を使用する場合にＣＡＲ媒介性の移植片拒絶を防止するためにＣＡＲ発現細胞を除去することができる。
【０１８６】
本発明の細胞は、臨床研究で以前に試験された自殺遺伝子（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）または誘導型カスパーゼ  ９（ｉＣａｓｐ９）など）のうちの１つを含み得る。
【０１８７】
ＷＯ２０１３／１５３３９１号は、ポリペプチドを発現する細胞をリツキシマブを用いて選択的に死滅させることができるＣＤ２０エピトープを含むコンパクトソート−自殺遺伝子を記載している。本発明の細胞は、配列番号９３に示す配列を有する自殺遺伝子を発現し得る。
【０１８８】
配列番号９３
ＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳＰＡＫＰＴＴＴＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ
【０１８９】
ＷＯ２０１６／１３５４７０号は、細胞のカスパーゼ誘導性アポトーシスを生じるラパマイシンまたはラパマイシンアナログなどの二量体化誘導化学物質（ＣＩＤ）の存在下で二量体化する自殺遺伝子を記載している。
【０１９０】
自殺遺伝子は、以下の構造を有し得る：
Ｈｔ１−ＨＴ２−Ｃａｓｐ
ここで、
Ｈｔ１およびＨｔ２はヘテロ二量体化ドメインであり、そのうちの一方がＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含み、他方はｍＴＯＲのＦＲＢドメインを含み；そして
Ｃａｓｐはカスパーゼ９ドメインである。
【０１９１】
自殺遺伝子は、配列番号９４に示す配列または９０、９５、もしくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを有し得る。
【０１９２】
配列番号９４（ＦＲＢ−ＦＫＢＰ１２−Ｌ３−ｄＣａｓｐ９）
【化１】
2021533766.tif 000005
【０１９３】
核酸構築物
ＣＡＲをコードする核酸配列は、以下の構造を有し得る：
ＡｇＢ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ
ここで、
ＡｇＢは、ＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒは、ＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭは、ＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、ＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である。
【０１９４】
ｔａｎＣＡＲをコードする核酸配列は、以下の構造を有し得る：
ＡｇＢ１−ｌｉｎｋｅｒ−ＡｇＢ２−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ
ここで、
ＡｇＢ１は、ｔａｎＣＡＲの第１の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｌｉｎｋｅｒは、ｔａｎＣＡＲのリンカーをコードする核酸配列であり；
ＡｇＢ２は、ｔａｎＣＡＲの第２の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒは、ｔａｎＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭは、ｔａｎＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、ｔａｎＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である。
【０１９５】
ヌクレオチド配列は、細胞中で発現されたとき、細胞表面にてタンデムで第１および第２の抗原結合ドメインを発現するポリペプチドをコードする。
【０１９６】
リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ可動性リンカーであり得るか、これを含み得る。
【０１９７】
ＣＡＲまたはｔａｎＣＡＲの抗原結合ドメイン（単数または複数）は、例えば、ｓｃＦｖ（単数または複数）またはｄＡｂ（単数または複数）であり得る。
【０１９８】
本発明は、３つのＣＡＲを含むトリプルＯＲゲートをコードする核酸構築物を提供する。
【０１９９】
トリプルＯＲゲートをコードする核酸構築物は、以下の構造を有し得る：
ＡｇＢＤ１−ｓｐａｃｅｒ１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＡｇＢＤ２−ｓｐａｃｅｒ２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２−ｃｏｅｘｐｒ２−ＡｇＢＤ３−ｓｐａｃｅｒ３−ＴＭ３−ｅｎｄｏ３
ここで、
ＡｇＢＤ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒ１およびｃｏｅｘｐｒ２は、同一でも異なっていてもよく、第１、第２、および第３のＣＡＲの同時発現が可能な核酸配列であり；
ＡｇＢＤ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ＡｇＢＤ３は、第３のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ３は、第３のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ３は、第３のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ３は、第３のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である。
【０２００】
第１、第２、および第３のＣＡＲの抗原結合ドメインは、例えば、ｓｃＦｖまたはｄＡｂであり得る。特に、３つ全てのＣＡＲがｄＡｂ  抗原結合ドメインを有し得る。
【０２０１】
本発明は、４つのＣＡＲを含むクワドループルＯＲゲートをコードする核酸構築物を提供する。
【０２０２】
クワドループルＯＲゲートをコードする核酸構築物は、以下の構造を有し得る：
ＡｇＢＤ１−ｓｐａｃｅｒ１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＡｇＢＤ２−ｓｐａｃｅｒ２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２−ｃｏｅｘｐｒ２−ＡｇＢＤ３−ｓｐａｃｅｒ３−ＴＭ３−ｅｎｄｏ３−ｃｏｅｘｐｒ３−ＡｇＢＤ４−ｓｐａｃｅｒ４−ＴＭ４−ｅｎｄｏ４
ここで、
ＡｇＢＤ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒ１、ｃｏｅｘｐｒ２、およびｃｏｅｘｐｒ３は、同一でも異なっていてもよく、第１、第２、第３、および第４のＣＡＲの同時発現が可能な核酸配列であり；
ＡｇＢＤ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ＡｇＢＤ３は、第３のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ３は、第３のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ３は、第３のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ３は、第３のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ＡｇＢＤ４は、第４のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ４は、第４のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ４は、第４のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；そして
ｅｎｄｏ４は、第４のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である。
【０２０３】
第１、第２、第３、および第４のＣＡＲの抗原結合ドメインは、例えば、ｓｃＦｖまたはｄＡｂであり得る。特に、４つ全てのＣＡＲはｄＡｂ抗原結合ドメインを有し得る。
【０２０４】
また、本発明は、ｓｃＦｖ／ｄＡｂ  ＣＡＲおよびｔａｎＣＡＲをコードする核酸構築物を提供する。この実施形態では、核酸構築物は、以下の構造：
ＡｇＢ１−ｌｉｎｋｅｒ−ＡｇＢ２−ｓｐａｃｅｒ１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｇＢ３−ｓｐａｃｅｒ２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２
ここで、
ＡｇＢ１は、ｔａｎＣＡＲの第１の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｌｉｎｋｅｒは、ｔａｎＣＡＲのリンカーをコードする核酸配列であり；
ＡｇＢ２は、ｔａｎＣＡＲの第２の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ１は、ｔａｎＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、ｔａｎＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ１は、ｔａｎＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、ＣＡＲおよびｔａｎＣＡＲの同時発現が可能な核酸配列であり；
ＡｇＢ３は、ＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり
ｓｐａｃｅｒ２は、ＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、ＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ２は、ＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である；
または以下の構造：
ＡｇＢ１−ｓｐａｃｅｒ１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｇＢ２−ｌｉｎｋｅｒ−ＡｇＢ３−ｓｐａｃｅｒ２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２
ここで、
ＡｇＢ１は、ＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり
ｓｐａｃｅｒ１は、ＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、ＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ１は、ＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、ＣＡＲおよびｔａｎＣＡＲの同時発現が可能な核酸配列であり；
ＡｇＢ２は、ｔａｎＣＡＲの第１の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｌｉｎｋｅｒは、ｔａｎＣＡＲのリンカーをコードする核酸配列であり；
ＡｇＢ３は、ｔａｎＣＡＲの第２の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ２は、ｔａｎＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、ｔａｎＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ２は、ｔａｎＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である
を有し得る。
【０２０５】
また、本発明は、２つのｔａｎＣＡＲをコードする核酸構築物を提供する。この実施形態では、核酸構築物は、以下の構造を有し得る：
ＡｇＢ１−ｌｉｎｋｅｒ１−ＡｇＢ２−ｓｐａｃｅｒ１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｇＢ３−ｌｉｎｋｅｒ２−ＡｇＢ４−ｓｐａｃｅｒ２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２
ここで、
ＡｇＢ１は、第１のｔａｎＣＡＲの第１の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｌｉｎｋｅｒ１は、第１のｔａｎＣＡＲのリンカーをコードする核酸配列であり；
ＡｇＢ２は、第１のｔａｎＣＡＲの第２の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ１は、第１のｔａｎＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のｔａｎＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ１は、第１のｔａｎＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のｔａｎＣＡＲの同時発現が可能な核酸配列であり；
ＡｇＢ３は、第２のｔａｎＣＡＲの第１の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｌｉｎｋｅｒ２は、第２のｔａｎＣＡＲのリンカーをコードする核酸配列であり；
ＡｇＢ４は、第２のｔａｎＣＡＲの第２の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ２は、第２のｔａｎＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のｔａｎＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ２は、第２のｔａｎＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である。
【０２０６】
また、本発明の核酸構築物は、自殺遺伝子をコードする核酸配列を含み得る。
【０２０７】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」は、相互に同義であることが意図される。
【０２０８】
当業者は、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が遺伝暗号の縮重の結果として同一のポリペプチドをコードすることができることを理解する。さらに、当業者は、日常的な技術を使用して、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するように、本明細書中に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチドを置換することができると理解すべきである。
【０２０９】
本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。本発明の核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。本発明の核酸はまた、本発明の核酸内に合成または改変されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの改変が当該分野で公知である。これらの改変には、メチルホスホナート骨格およびホスホロチオアート骨格、分子の３’末端および／または５’末端でのアクリジン鎖またはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書中に記載の使用のために、当該分野で利用可能な任意の方法によってポリヌクレオチドを改変することができると理解すべきである。かかる改変は、目的のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を強化し、寿命を延ばすために実施され得る。
【０２１０】
ヌクレオチド配列に関連する用語「バリアント」、「ホモログ」、または「誘導体」は、前記配列からか、前記配列への、１（またはそれより多くの）核酸の任意の置換、変形、改変、置き換え、欠失、または付加を含む。
【０２１１】
上記の構造物では、「ｃｏｅｘｐｒ」は、個別の実体として２つのポリペプチドの共発現が可能な核酸配列である。ｃｏｅｘｐｒは、核酸構築物が切断部位（複数可）によって連結した両方のポリペプチドを産生するように、切断部位をコードする配列であり得る。ポリペプチドが産生されたときに、いかなる外部の切断活性を必要とすることなく個別のペプチドに直ちに切断されるように、切断部位は自己切断され得る。
【０２１２】
切断部位は、２つのポリペプチドが分離するようになることが可能な任意の配列であり得る。
【０２１３】
用語「切断」を本明細書中で便宜上使用するが、切断部位により、古典的な切断以外の機序によってペプチドを個別の実体に分離することができる。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（以下を参照のこと）について、以下の「切断」活性を説明するための種々のモデルが提案されている：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解活性、自己タンパク質分解、または翻訳効果（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。かかる「切断」の正確な機序は、切断部位がタンパク質をコードする核酸配列の間に配置されたときに個別の実体としてタンパク質を発現する限り、本発明の目的には重要でない。
【０２１４】
切断部位は、例えば、フューリン切断部位、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり得るか、自己切断ペプチドをコードし得る。
【０２１５】
「自己切断ペプチド」は、タンパク質および自己切断ペプチドを含むポリペプチドが産生されたときに、いかなる外部の切断活性も必要とせずに個別かつ分離した第１および第２のポリペプチドに直ちに「切断される」かまたは分離されるように機能するペプチドを
指す。
【０２１６】
自己切断ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドであり得る。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの一次２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端での２Ａ「切断」によって媒介される。アフトウイルス（ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓ）（口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスなど）では、２Ａ領域は、約１８アミノ酸の短い部分であり、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存プロリン残基）と共に、それ自体のＣ末端での「切断」を媒介することができる自律エレメントを示す（上記のＤｏｎｅｌｌｙら（２００１））。
【０２１７】
「２Ａ様」配列は、アフトウイルスまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、タイプＣロタウイルス、ならびにＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐおよび細菌配列内の反復配列で見出されている（上記のＤｏｎｎｅｌｌｙら（２００１））。
【０２１８】
切断部位は、配列番号９５に示す２Ａ様配列を含み得る。
配列番号９５：
ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
【０２１９】
ベクター
また、本発明は、本発明の細胞の１またはそれを超えるキメラ抗原受容体（単数または複数）をコードする１またはそれを超える核酸配列（単数または複数）を含むベクターまたはベクターのキットを提供する。かかるベクターを使用して、宿主細胞がＣＡＲまたは各ＣＡＲ（単数または複数）を発現するように、宿主細胞中に核酸配列（単数または複数）を導入することができる。
【０２２０】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなど）、またはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。
【０２２１】
ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの細胞にトランスフェクトするか形質導入することが可能であり得る。
【０２２２】
細胞
本発明は、複数のキメラ抗原受容体を含む細胞を提供する。
【０２２３】
細胞は、細胞溶解性免疫細胞（Ｔ細胞またはＮＫ細胞など）であり得る。
【０２２４】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の１つの型である。これらは、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって他のリンパ球（Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など）と区別することができる。以下にまとめているように、種々のタイプのＴ細胞が存在する。
【０２２５】
ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、免疫学的過程（Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化が含まれる）において他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、その表面上でＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されたときに活性化されるようになる。これらの細胞は、異なるタイプの免疫応答を容易にするために異なるサイトカインを分泌するいくつかのサブタイプ（ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨ）のうちの１つに分化することができる。
【０２２６】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関与する。ＣＴＬは、その表面にＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩに関連する抗原への結合によってその標的を認識する。ＩＬ−１０、アデノシン、および制御性Ｔ細胞によって分泌される他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞をアネルギー状態に不活性化することができ、それにより実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患を予防する。
【０２２７】
メモリーＴ細胞は、感染から回復した後に長期間にわたって維持される抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。メモリーＴ細胞は、その同族抗原への再曝露の際に迅速に多数のエフェクターＴ細胞へと拡大増殖する（expand）ため、免疫系に過去の感染を「記憶」させている。メモリーＴ細胞は、以下の３つのサブタイプを含む：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２つのタイプのエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、典型的には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０２２８】
以前は抑制性Ｔ細胞として公知であった制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に不可欠である。その主な役割は、免疫反応の終了に向けてＴ細胞性免疫を停止させること、および胸腺内でのネガティブ選択過程を回避した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０２２９】
ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主なクラス（内在性Ｔｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞）が記載されている。
【０２３０】
内在性Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても公知）は、胸腺内で生じ、発生中のＴ細胞の、ＴＳＬＰで活性化されている骨髄系（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方との相互作用に関与している。内在性Ｔｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在によって他のＴ細胞と区別することができる。ＦＯＸＰ３遺伝子を変異させると制御性Ｔ細胞の発生が阻止され、致死性自己免疫疾患ＩＰＥＸを引き起こし得る。
【０２３１】
適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても公知）は、正常な免疫応答中に生じ得る。
【０２３２】
細胞は、ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）であり得る。ＮＫ細胞は、先天性免疫系の一部を成し得る。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞からの内生シグナルに対してＭＨＣ依存性様式で迅速に応答する。
【０２３３】
ＮＫ細胞（先天性リンパ球系細胞群に属する）は大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）と定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生成する共通のリンパ球系前駆細胞から分化した第３の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、および胸腺で分化および成熟し、次いで、循環内に入ることが公知である。
【０２３４】
本発明の細胞は、上記の細胞型のうちのいずれかであり得る。
【０２３５】
本発明の第１の態様のＴ細胞またはＮＫ細胞は、患者自体の末梢血（第一者）から、またはドナー末梢血（第二者）または無関係のドナー由来の末梢血（第三者）由来の造血幹細胞移植においてｅｘ  ｖｉｖｏで作り出すことができる。
【０２３６】
あるいは、本発明の第１の態様のＴ細胞またはＮＫ細胞は、誘導前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞またはＮＫ細胞へのｅｘ  ｖｉｖｏ分化に由来し得る。あるいは、溶解機能を保持し、かつ治療に役立つもの（therapeutic）として作用することができる不死化
Ｔ細胞株が使用され得る。
【０２３７】
これらの全ての実施形態では、キメラポリペプチド発現細胞は、多数の手段（ウイルスベクターを用いた形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いたトランスフェクションが含まれる）のうちの１つによってキメラポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成される。
【０２３８】
本発明の細胞は、被験体由来のｅｘ  ｖｉｖｏでのＴ細胞またはＮＫ細胞であり得る。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料に由来し得る。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、本発明の第１の態様のキメラポリペプチドが得られる分子をコードする核酸で形質導入される前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処置によって活性化および／または拡大増殖され得る。
【０２３９】
本発明のＴまたはＮＫ細胞は、以下によって作製され得る：
（ｉ）上記列挙の被験体または他の供給源からのＴまたはＮＫ細胞を含む試料の単離；および
（ｉｉ）本発明の核酸構築物、ベクター、またはベクターのキットでのＴ細胞またはＮＫ細胞の形質導入またはトランスフェクション。
【０２４０】
次いで、ＴまたはＮＫ細胞は、精製され得る（例えば、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて選択され得る）。
【０２４１】
医薬組成物
本発明はまた、複数の本発明による細胞を含む医薬組成物に関する。
【０２４２】
医薬組成物は、さらに、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤を含み得る。医薬組成物は、必要に応じて、１またはそれより多くのさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に適切な形態であり得る。
【０２４３】
処置方法
本発明は、（例えば、上記の医薬組成物中の）本発明の細胞を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置する方法を提供する。
【０２４４】
疾患を処置する方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。本明細書中では、疾患に関連する少なくとも１つの症状を緩和、軽減、もしくは改善し、および／または疾患の進行を遅延、軽減、もしく遮断するために、疾患または状態を既に有する被験体に細胞を投与することができる。
【０２４５】
本方法は、以下のステップを含み得る：
（ｉ）ＴまたはＮＫ細胞を含む試料を単離するステップ；
（ｉｉ）かかる細胞を、本発明によって提供された核酸配列またはベクターで形質導入するかトランスフェクトするステップ；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与するステップ。
【０２４６】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含む試料は、例えば上記の被験体または他の供給源から単離され得る。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、患者自体の末梢血（第一者）から、またはドナー末梢血（第二者）または無関係のドナー由来の末梢血（第三者）由来の造血幹細胞移植において単離され得る。
【０２４７】
本発明は、以下の工程を含み得る：
（ｉ）本発明の第１の態様の細胞を被験体に投与する工程；
（ｉｉ）同種造血幹細胞移植片（ａｌｌｏＨＳＣＴ）を前述の被験体に投与する工程。
【０２４８】
例えば、本発明は、以下の工程を含み得る：
（ｉ）本発明の第１の態様の細胞を被験体に投与する工程；
（ｉｉ）前述の被験体の骨髄形成不全をモニタリングする工程
（ｉｉ）骨髄形成不全が検出された場合、同種造血幹細胞移植片（ａｌｌｏＨＳＣＴ）を前述の被験体に投与する工程。
【０２４９】
骨髄様化生は、脾臓で絶えず起こり、肝臓でほぼ必ず起こる髄外造血、脾腫（通常は肝腫大）、ならびに末梢血中の未成熟の赤血球および白血球を伴う貧血を特徴とする臨床的および病態的症候群である。
【０２５０】
本発明は、疾患の処置および／または予防で用いるための本発明の細胞を提供する。
【０２５１】
本発明はまた、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における本発明の細胞の使用に関する。
【０２５２】
本発明の急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）法によって処置すべき疾患は癌疾患であり得る。特に、前述の疾患は、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）であり得る。
【０２５３】
急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）は、血球の骨髄細胞系列の癌であり、骨髄中および血中で発達し、正常な血球に干渉する異常な細胞の急速な成長を特徴とする。症状には、倦怠感、息切れ、あざおよび出血が生じやすいこと、および感染リスクの増加が含まれ得る。通常、骨髄穿刺および血液検査に基づいて診断される。急性白血病として、ＡＭＬは急速に進行し、無処置の場合、典型的には、数週間または数ヶ月以内に死亡する。
【０２５４】
本発明の細胞は、癌細胞などの標的細胞を死滅させることが可能な場合がある。標的細胞を、以下のうちの１つ、２つ、３つ、または４つ全てなどの１またはそれを超える標的抗原の発現によって特徴づけることができる：ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＬＬ−１、およびＦＬＴ３。
【０２５５】
本発明の細胞および医薬組成物は、上記の疾患の処置および／または防止で使用されるためのものであり得る。
【０２５６】
本発明を、ここに、実施例によってさらに説明するが、実施例は本発明の実施において当業者を補助することを意図し、本発明の範囲を制限することを決して意図しない。
【実施例】
【０２５７】
実施例１−シングルＣＡＲおよびトリプルＯＲゲートを発現する細胞のデザインおよび生成
ＣＡＲをコードする核酸構築物のパネルを、以下のように生成する：
ＲＱＲ８−２Ａ−Ｖ５ＣＤ１２３ＣＡＲ−Ｖ５タグを有するＣＤ１２３  ＣＡＲを発現するシングルＣＡＲ構築物
ＲＱＲ８−２Ａ−Ｖ５ＦＬＴ３ＣＡＲ−Ｖ５タグを有するＦＬＴ３  ＣＡＲを発現するシングルＣＡＲ構築物
ＲＱＲ８−２Ａ−ＨＡＣＤ３３ＣＡＲ−ＨＡタグを有するＣＤ３３  ＣＡＲを発現するシングルＣＡＲ構築物
ＲＱＲ８−２Ａ−ＦＬＡＧＣＬＬ１ＣＡＲ−ＦＬＡＧタグを有するＣＬＬ１  ＣＡＲを発現するシングルＣＡＲ構築物
ＲＱＲ８−２Ａ−Ｖ５ＣＤ１２３ＣＡＲ−２Ａ−ＨＡＣＤ３３ＣＡＲ−２Ａ−ＦＬＡＧＣＬＬ１ＣＡＲ−Ｖ５タグを有するＣＤ１２３  ＣＡＲ；ＨＡタグを有するＣＤ３３  ＣＡＲ；およびＦＬＡＧタグを有するＣＬＬ１  ＣＡＲを発現するトリプルＣＡＲ構築物
ＲＱＲ８−２Ａ−Ｖ５ＦＬＴ３ＣＡＲ−２Ａ−ＨＡＣＤ３３ＣＡＲ−２Ａ−ＦＬＡＧＣＬＬ１ＣＡＲ−Ｖ５タグを有するＦＬＴ３  ＣＡＲ；ＨＡタグを有するＣＤ３３  ＣＡＲ；およびＦＬＡＧタグを有するＣＬＬ１  ＣＡＲを発現するトリプルＣＡＲ構築物
【０２５８】
全ての構築物は、ＷＯ２０１３／１５３３９１号に記載のソート−自殺遺伝子ＲＱＲ８を同時発現する。
【０２５９】
全てのＣＡＲは、ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ同時刺激ドメインを含む第２世代のエンドドメインを有するｄＡｂ  ＣＡＲである。
【０２６０】
末梢血由来のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、構築物で形質導入した。シングルＣＡＲの発現を、ＣＡＲ特異的タグ抗体（Ｖ５、ＨＡ、またはＦＬＡＧに対する）およびＱＢＥＮＤ１０（ＲＱＲ８の発現を検出するため）でのＴ細胞の同時染色によって検出する。図３は、ａＣＤ３３  ＣＡＲの発現を示す。図４は、ａＣＤ１２３  ＣＡＲの発現を示す。図５は、ａＣＬＬ１  ＣＡＲの発現を示す。
【０２６１】
トリプルＣＡＲの発現を、３つ全てのＣＡＲ特異的タグ抗体（Ｖ５、ＨＡ、およびＦＬＡＧに対する）およびＱＢＥＮＤ１０（ＲＱＲ８の発現を検出するため）でのＴ細胞の同時染色によって検出する。
【０２６２】
実施例２−ＦＡＣＳベースの死滅アッセイ（ＦＢＫ）
シングルＣＡＲを発現する細胞が、個々の抗原ＣＤ１２３、ＣＬＬ１、およびＣＤ３３を発現する標的細胞を死滅させる能力を、ＦＡＣＳベースの死滅アッセイを使用して調査した。このアッセイを、所望の抗原を発現するように操作されたＳｕｐＴ１細胞株および使用前の抗原発現の均一性が調査された文献由来のヒト患者由来の細胞株（Ｍｏｌｍ−１４、ＫＧ１α、ＨＬ−６０、Ｋ５６２、およびＴＨＰ−１）を使用して行った（図６および７）。
【０２６３】
Ｔ細胞を、１：１の比で標的細胞と共培養した。ウェルあたり５×１０４個の形質導入したＴ細胞および標的細胞を１：１、１：２、１：４、または１：８の比で使用して、総体積０．２ｍｌで９６ウェルプレート中にてアッセイを行った。形質導入効率について正規化した後に共培養物を準備した。インキュベーションの２４または４８時間後にＦＢＫを行った。
【０２６４】
ＦＢＫの結果を、ａＣＤ３３については図８および９に、ａＣＤ１２３については図１０および１１に、ａＣＬＬ１については図１２および１３に示す。
【０２６５】
全てのシングルａＣＤ３３  ｄａｂ  ＣＡＲは、ネガティブコントロールと比較して、ＣＤ３３を発現する各ＡＭＬ細胞に対して強力な細胞傷害活性を示した。用量反応死滅は予想通りであり、エフェクター標的比が高いほど（１：１）、多くの標的が死滅した。ａＣＤ１９  ＦＭＣ６３  ＣＡＲは、いくつかの細胞においていくらかのレベルの低バックグラウンド細胞傷害活性を示した。ＣＤ３３シングルドメインＣＡＲの間で、細胞障害レベルの大きな有意差は認められなかった。全ての細胞において、最低のＥ：Ｔ比を用いたとしても、およそ５０〜６０％の死滅応答が認められた。
【０２６６】
ＣＤ１２３−ＶＨＨ−ＣＡＲ−２は、ＳｕｐＴ１  ＣＤ１２３に対して１：２および１：４でＣＤ１２３−ＶＨＨ−ＣＡＲ＿１を超える有意差を示した（それぞれ、ｐ＝０．０２０５  Ｎ＝４およびｐ＝０．００１２  ｎ＝４）。一方で、１：４でＳｕｐＴ１  ＣＤ１２３に対してＣＤ１２３−ＶＨＨ−ＣＡＲ＿３を超える有意差はＣＤ１２３−ＶＨＨ−ＣＡＲ＿２のみで認められた（ｐ＝０．０１９４、ｎ＝４）。２４時間持続した共培養物について、全てのＣＤ１２３  ＣＡＲにわたって強力なＣＤ１２３特異的細胞障害活性が認められ、全ての比にわたって構築物の間で有意差はなかった（図１０）。しかしながら、１：１比のみにおいてＣＤ１２３−／ＳｕｐＴ１  ＮＴ細胞について有意な抗原非依存性基礎細胞傷害性が認められた。予想通り、Ｅ：Ｔ比が増加するにつれて標的生存が増加するという用量応答挙動を示した。全ての構築物は、基礎抗原非依存性細胞傷害性の非存在下でＳｕｐＴ１  ＣＤ１２３およびＫＧ１ａ細胞株において７０％標的溶解を示した（Ｅ：Ｔ、１：２）。４８時間の共培養物について、全ての構築物にわたって１：１および１：２の比の場合にＳｕｐＴ１  ＮＴについて有意な非特異性細胞傷害性が認められた。１：８では、全てのＣＡＲ構築物についてＣＤ１２３−／ＳｕｐＴ１  ＮＴに対する有意な基礎細胞傷害性は認められず、全てのＣＡＲ構築物は、Ｍｏｌｍ１４およびＴＨＰ１について７０％標的溶解を達成した（図１１）。
【０２６７】
強力なＣＬＬ１特異的細胞傷害性を示す全てのＶＨＨバインダーを有するＳｕｐＴ１  ＣＬＬ１について有意差は認められなかった（図１２）。この傾向は全てのＥ：Ｔ比にわたって示され、シングルＶＨＨは活性の増加を示さなかった。基礎活性は、ＣＬＬ１−／ＳｕｐＴ１細胞と１：１比で４８時間インキュベートした全てのＣＡＲについて有意であり、ＣＬＬ１−ＶＨＨ−ＣＡＲ−３のみはＥ：Ｔ比１：２について有意な基礎活性を示した（ｐ＝０．０４２５、ｎ＝７）。全てのＣＡＲは、ＴＨＰ１細胞およびＫＧ１ａ細胞とインキュベートしたときにＣＬＬ特異的細胞傷害性を示し、ＶＨＨ−ＣＡＲ  ２および５は、ＶＨＨ  ＣＡＲ死滅が増加した（図１３）。ＴＨＰ１に有意なＣＬＬ１特異的細胞傷害性を示す唯一のＣＡＲは、Ｅ：Ｔ比１：２でＣＡＲ−３よりもＣＡＲ−５であった（ｐ＝０．０１３３、ｎ＝７）。全ての細胞株を用いた全ての比にわたってＣＡＲ２とＣＡＲ５との間にＣＬＬ１特異的細胞傷害性の有意差はなかった。
【０２６８】
実施例３−サイトカイン放出
ＩＬ−２分泌は、Ｔ細胞活性化の指標であり、細胞傷害性共培養アッセイの上清を使用して評価した。シングルＣＡＲについてのサイトカイン分泌を関連対照と共に分析し、Ｔ細胞活性化のマーカーとしてのＩＬ−２およびＩＦＮγの産生を調査した。ＩＬ−２およびＩＦＮγの産生を、ＥＬＩＳＡによって検出した。
【０２６９】
サイトカイン放出アッセイの結果を、ａＣＤ３３については図１４および１５に示し、ａＣＤ１２３については図１６に示し、ａＣＬＬ１については図１７に示した。
【０２７０】
ａＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＣＤ３３陽性細胞に暴露したときに、より高いＩＬ−２分泌が認められた。全てのａＣＤ３３  ｓｄＡｂ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、非形質導入対照およびネガティブコントロールよりも比較的多くのＩＬ−２を産生した。ＩＬ−２分泌レベルは、ａＣＤ３３  ｓｃＦｖ  ポジティブコントロールを用いた場合、比較的低かった。ＦＭＣ６３ネガティブコントロールを用いた場合、ａＣＤ３３  ｓｃＦｖポジティブコントロールと比較して、ＩＬ−２産生レベルは類似していた。ａＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞についてのＩＦＮγ産生は、ネガティブコントロールよりも有意に高かった。全てのａＣＤ３３  ｓｄＡｂ  ＣＡＲは、操作されたＳｕｐＴ１細胞およびＡＭＬ由来細胞の両方において類似レベルのＩＦＮ−γを産生した（図１５）。ｓｄＡｂ  ＣＤ３３．６は、全ての細胞においてより高いレベルのＩＦＮ−γ産生を維持した。それに対して、ｓｄＡｂ  ＣＤ３３．２のＩＦＮ−γ産生は、他の全てのｓｄＡｂ  ＣＤ３３  ＣＡＲと比較して低かった。
【０２７１】
ａＣＤ３３  ｓｃＦｖによって産生されたＩＦＮγレベルは、ＴＨＰ１細胞およびＭＯＬＭ１４細胞でチャレンジしたときにより低かった。操作されたＳｕｐＴ１由来細胞とＡＭＬ由来細胞との間のＩＦＮ−γ産生の差はあまり大きくなかった。また、ＦＭＣ６３  ｓｃＦｖネガティブコントロールは、ＭＯＬＭ１４細胞上のａＣＤ３３  ｓｃＦｖポジティブコントロールと比較して、同一レベルのＩＦＮ−γ（約１００００ｐｇ／ｍｌ）を産生した。
【０２７２】
全てのａＣＤ１２３  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１２３＋細胞に暴露したときにＩＬ−２を産生したが、ＶＨＨ−ＣＡＲ−Ｔ細胞構築物との間にＩＬ−２産生の有意差はなかった。ＶＨＨ−ＣＡＲ−２および６は、Ｍｏｌｍ１４では最高レベルのＩＬ−２を産生し（平均約１．７７×１０４および１．６３×１０４ｐｇ／ｍｌ）、ＶＨＨ−ＣＡＲ−４は、ＴＨＰ１では最低レベルのＩＬ−２を産生した（平均約３．５×１０３ｐｇ／ｍｌ）。２４および４８時間の両方の経時変化について、細胞傷害性アッセイにおいて有意差は認められなかったにもかかわらず、ＶＨＨ−ＣＡＲ−構築物は、ｓｃＦｖ  ＣＡＲ  ポジティブコントロールと比較したときにＩＬ−２産生が改善された。
【０２７３】
全てのａＣＤ１２３  ＣＡＲは、ＳｕｐＴ１  ＣＤ１２３およびＭｏｌｍ１４に対して類似のレベルのＩＦＮγを産生する（それぞれ、平均約３．４×１０３および約４．０×１０４ｐｇ／ｍｌ）。全ての構築物にわたって、ＩＦＮγ産生についてＣＤ１２３  ＣＡＲ構築物の間に有意差はなかった。ＩＬ−２産生と同様に、ＶＨＨ−ＣＡＲ−６は、全ての構築物にわたって一貫してより高いレベルのサイトカインを産生したが、有意差はなかった。ｓｃＦｖ対照ＣＡＲは、ＶＨＨ  ＣＡＲと類似レベルのＩＦＮγを産生し、これは、細胞傷害性アッセイにおける標的溶解について認められた傾向と一致していた。ＩＦＮγ産生は、Ｍｏｌｍ１４を用いたＶＨＨ−ＣＡＲ−６で最も高く（平均約４．０×１０４ｐｇ／ｍｌ）、一方で、ＴＨＰ１を用いたＶＨＨ−ＣＡＲ−４で最も低かった（平均約１．４５×１０３ｐｇ／ｍｌ）。
【０２７４】
抗原特異的ＩＬ−２産生はＳｕｐＴ１  ＣＬＬ１およびＴＨＰ１を用いた全てのＣＬＬ１−ＶＨＨ−ＣＡＲ構築物で認められたが、構築物の間に有意差はなかった（図１７、ａ）。しかしながら、死滅データが抗原特異的細胞傷害性を示しているにも関わらず、ＫＧ１ａと共培養したＣＡＲにおいて抗原特異的ＩＬ−２産生は認められなかった。この所見を、ＫＧ１ａ細胞の細胞表面上でのＣＬＬ１の発現レベルが非常に低いこと関連付けることができる（６３８／細胞、図７）。類似の傾向がＩＦＮγ産生で認められ、ＳｕｐＴ１  ＣＬＬ１およびＴＨＰ１について全てのＣＡＲ構築物が抗原特異的ＩＦＮγ産生を示したが、構築物間に有意差はなかった（図１７、ｂ）。また、ＫＧ１ａでは比較的低レベルのＩＦＮγが産生され、細胞傷害性アッセイでうまく機能したＣＡＲはより高いレベルのサイトカインを産生した（ＶＨＨ−ＣＡＲ  ２、４、および５）。
【０２７５】
実施例４−増殖アッセイ（ＰＡ）
増殖を測定するために、実施例１に記載のＣＡＲ発現Ｔ細胞の同一のパネルを、色素Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）（細胞内で加水分解されて保持される蛍光色素）で標識した。ＣＴＶは４０５ｎｍ（紫色）レーザーによって励起され、蛍光をパシフィックブルーチャネルで検出することができる。ＣＴＶ色素を、ＤＭＳＯで５ｍＭに再構成した。Ｔ細胞を、ＰＢＳ中で２×１０６細胞／ｍｌに再懸濁し、１ｕｌ／ｍｌのＣＴＶを添加した。Ｔ細胞を、ＣＴＶと３７℃で２０分間インキュベートした。その後に、細胞を５Ｖの完全培地を添加してクエンチした。５分間のインキュベーション後、Ｔ細胞を洗浄し、２ｍｌの完全培地に再懸濁した。室温でさらに１０分間インキュベートすると酢酸加水分解が生じ、色素が保持された。
【０２７６】
標識したＴ細胞を、標的細胞と４日間共培養した。ウェルあたり５×１０４個の形質導入されたＴ細胞および等数の標的細胞（比１：１）を使用して、総体積が０．２ｍｌの９６ウェルプレート中でアッセイを行った。その日の４つの時点で、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって分析して、Ｔ細胞が分裂するにつれて生じるＣＴＶの希釈を測定した。共培養終了時のＴ細胞の存在数を計算し、Ｔ細胞の投入数と比較した増殖を倍数として表した。
【０２７７】
増殖アッセイの結果を、ａＣＤ３３については図１８に、ａＣＤ１２３については図１９に、ａＣＬＬ１については図２０に示した。
【０２７８】
６日後に認められたａＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の発現倍率に有意差があった。非形質導入対照およびネガティブコントロール（ＦＭＣ６３  ｓｃＦｖ）と比較して、ａＣＤ３３  ｓｄＡｂ  ＣＡＲ  Ｔ細胞でより高い発現倍率が認められた。ポジティブコントロール（ａＣＤ３３  ｓｃＦｖ）の増殖レベルが全てのＡＭＬ細胞においてａＣＤ３３  ｓｄＡｂ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して低かったことに留意すべきである。ＣＡＲ  Ｔ細胞の発現倍率は、他の細胞と比較して、ＣＤ３３で人為的に形質導入したＳｕｐＴ１で有意に高かった。
【０２７９】
全ての条件にわたって全てのＣＤ１２３−ＶＨＨ−ＣＡＲ構築物の間に有意差はなかった。
【０２８０】
抗原特異的増殖は、ＣＬＬ１＋標的細胞株を用いた全てのＣＬＬ１−ＶＨＨ−ＣＡＲ構築物で認められたが、しかしながら、ＳｕｐＴ１  ＣＬＬ１およびＴＨＰ１では増殖能力に有意差はなかった。ＫＧ１ａ共培養物について、ＣＬＬ１−ＶＨＨ−ＣＡＲ  ２および５は、全ての比にわたってＣＬＬ１−ＶＨＨ−ＣＡＲ  １、２、および３より有意に増殖に有利であった（ｐ値は、＜０．０５から＜０．０１までの範囲である、ｎ＝７）。ＣＬＬ１−ＶＨＨ−ＣＡＲ−５は、ＫＧ１ａを用いた場合にＣＬＬ１−ＶＨＨ−ＣＡＲ−２より有意に増殖に有利であった（ｐ＝０．０４４５、ｎ＝７）。
【０２８１】
６つ全てのａＣＤ３３シングルｄａｂ  ＣＡＲは、ネガティブＣＡＲコントロール（ＦＭＣ６３  ｓｃＦｖ）と比較して、増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイ、およびサイトカイン産生アッセイの全てにおいて標的細胞に類似のレベルの応答を示した。ｓｄＡｂ  ＣＤ１２３  ＣＡＲは、操作されたＳｕｐＴ１  ＣＤ１２３細胞および他のＡＭＬ由来細胞（ＭＯＬＭ１４、ＴＨＰ１、ＫＧ１ａ）に対して用量応答様式で有効性を示した。また、ｓｄＡｂ  ＣＬＬ１  ＣＡＲは、ＣＬＬ１＋細胞に対して有効であった。第Ｉ相研究から得られた結果は、各シングルドメインバインダー（ＣＤ１２３、ＣＤ３３、およびＣＬＬ１）が、ＡＭＬ対する第２世代のＣＡＲとして有効に作用したことを実証していた。
【０２８２】
上記明細書中に記載の全ての刊行物は、本明細書中で参考として援用される。本発明の記載の方法およびシステムの種々の修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と併せて記載しているが、特許請求の範囲に記載の発明がかかる特定の実施形態に過度に制限されるべきではないと理解すべきである。実際、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな本発明の実施のための記載の様式の種々の修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図１】
2021533766.tif 000006
【図２（ａ）】
2021533766.tif 000007
【図２（ｂ）】
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【図２（ｃ）】
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【図３−１】
2021533766.tif 000010
【図３−２】
2021533766.tif 000011
【図４−１】
2021533766.tif 000012
【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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