(57)【要約】  分析物を検出および／または定量化するための方法およびシステムが提供される。  特に、サンプル中の２つ以上の分析物の同時検出および／または定量化のための方法およびシステムが提供される。いくつかの実施形態では、２セットの結合剤がサンプルに接触する前に共局在化されるように、支持体上に予め組み立てられた２セットの結合剤を含む微粒子上の結合による共局在化アッセイ（ＣＬＡＭＰ）が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分析物の検出及び／又は定量のための生体分子複合体であって、
ａ）支持体に取り付けられたアンカー鎖、
ｂ）前記支持体に取り付けられた捕捉試薬、および
ｃ）前記アンカー鎖に放出可能に取り付けられた検出試薬であって、前記検出試薬または前記アンカー鎖が、任意に、第１の標識に取り付けられ、前記第１の標識は、不活性であるかまたは検出不能である、検出試薬を含み、
ここで、前記捕捉試薬および前記検出試薬は、試料中に存在する場合には、前記分析物に同時に結合して、三成分複合体を形成することができ、
前記アンカー鎖からの前記検出試薬の放出は、前記分析物の非存在下で、前記検出試薬を支持体から放出することができ、そして
前記第１の標識は、前記検出試薬が前記アンカー鎖から放出されるときに活性化または検出できる、生体分子複合体。
【請求項２】
第１の標識は、分析物が存在するときに、支持体上でのみ検出される、請求項１に記載の生体分子。
【請求項３】
検出試薬がアンカー鎖から放出されるときの支持体上の第１の標識の量は、試料中の分析物の量および／または濃度に比例する、請求項２に記載の生体分子複合体。
【請求項４】
検出試薬が、共有結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合、水素結合、疎水性相互作用、親和性結合、または非共有結合的相互作用を介して、アンカー鎖に直接放出可能に取り付けられている、請求項１−３のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項５】
請求項１−３のいずれか１項に記載の生体分子複合体であって、検出試薬はフック鎖を介して間接的にアンカー鎖に取り付けられ、前記検出試薬はフック鎖に連結され、および前記フック鎖は前記アンカー鎖に放出可能に取り付けられ、
ここで、前記アンカー鎖からの前記フック鎖の放出は、分析物の非存在下で支持体から検出試薬を放出することができ、ならびに
第１の標識は、前記フック鎖が前記アンカー鎖から放出されるときに活性化または検出できる、生体分子複合体。
【請求項６】
フック鎖がアンカー鎖から放出されるときの支持体上の第１の標識の量は、試料中の分析物の量および／または濃度に比例する、請求項５に記載の生体分子複合体。
【請求項７】
第１の標識が、任意にフック鎖に取り付けられている、請求項５または６に記載の生体分子複合体。
【請求項８】
検出試薬およびフック鎖の少なくとも一方が、任意に第１の標識に取り付けられている、請求項７に記載の生体分子複合体。
【請求項９】
検出試薬が第１の標識に取り付けられかつフック鎖が第１の標識に取り付けられていないか、フック鎖が第１の標識に取り付けられかつ検出試薬が第１の標識に取り付けられていないか、または検出試薬とフック鎖の両方が第１の標識に取り付けられている、請求項８に記載の生体分子複合体。
【請求項１０】
フック鎖が、ポリマー、オリゴヌクレオチドまたは多糖類である、請求項５−９のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項１１】
ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１０に記載の生体分子複合体。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドもしくは二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１０または１１に記載の生体分子複合体。
【請求項１３】
捕捉試薬が支持体に直接取り付けられている、請求項１−１２のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項１４】
捕捉試薬は、共有結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合、ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカーまたはポリマーリンカーを介して支持体に取り付けられている、請求項１−１３のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項１５】
捕捉試薬は、アンカー鎖に取り付けられることによって間接的に支持体に取り付けられている、請求項１−１４のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項１６】
捕捉試薬は、共有結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合、水素結合、疎水性相互作用、親和性結合、または非共有結合的相互作用により、アンカー鎖に取り付けられている、請求項１５に記載の生体分子複合体。
【請求項１７】
捕捉試薬が、前記捕捉試薬およびアンカー鎖に連結された捕捉鎖によってアンカー鎖に取り付けられている、請求項１５に記載の生体分子複合体。
【請求項１８】
捕捉鎖が、オリゴヌクレオチド、ＰＥＧなどのポリマー、または多糖類である、請求項１７に記載の生体分子複合体。
【請求項１９】
アンカー鎖が、ＰＥＧなどのポリマー、オリゴヌクレオチド、またはオリゴ糖である、請求項１−１８のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１９に記載の生体分子複合体。
【請求項２１】
アンカー鎖が一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドもしくは二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドである、請求項１９または２０に記載の生体分子複合体。
【請求項２２】
支持体が微粒子、マルチウェルプレートの表面、スライドガラスの表面、またはヒドロゲルマトリックスである、請求項１−２１のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項２３】
微粒子がポリスチレンビーズであり、任意にバーコード化されている、請求項２２に記載の生体分子複合体。
【請求項２４】
アンカー鎖は、共有結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合、オリゴヌクレオチドリンカー、ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカー、ポリマーリンカー、ＰＥＧリンカー、または水素結合、疎水性相互作用、親和性結合、もしくは非共有結合的相互作用などの別の化学的相互作用を介して、支持体に取り付けられている、請求項１−２３のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項２５】
捕捉試薬が抗体、抗体フラグメント、アプタマー、修飾アプタマー、ソマーマー（ｓｏｍａｍｅｒ）、アフィマー、抗原、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、エキソソーム、オリゴヌクレオチド、または低分子量化合物である、請求項１−２４のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項２６】
検出試薬が抗体、抗体フラグメント、アプタマー、アフィマー、修飾アプタマー、ソマーマー、抗原、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、エキソソーム、オリゴヌクレオチド、または低分子量化合物である、請求項１−２５のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項２７】
捕捉試薬および検出試薬が異なっている、請求項１−２６のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項２８】
捕捉試薬および検出試薬が同一である、請求項１−２６のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項２９】
捕捉試薬および検出試薬が両方とも抗体である、請求項１−２８のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項３０】
捕捉試薬および検出試薬が同一の抗体である、請求項２８または２９に記載の生体分子複合体。
【請求項３１】
捕捉試薬および検出試薬が異なる抗体であり、分析物上の異なるエピトープに結合する、請求項２７または２９に記載の生体分子複合体。
【請求項３２】
捕捉試薬および検出試薬が、分析物上の同一のエピトープに結合し、前記分析物はエピトープの２つ以上の反復を有し、前記捕捉試薬および検出試薬は分析物上のエピトープの異なる反復に結合する、請求項１−３０のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項３３】
捕捉試薬および検出試薬が、同一であるか、構造的に類似しているか、または分析物の構造的に類似した部分もしくはエピトープに結合する、請求項１−３２のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項３４】
分析物が抗原、抗体、アフィマー、アプタマー、修飾アプタマー、ソマーマー、抗体フラグメント、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、エキソソーム、オリゴヌクレオチド、ホルモン、修飾オリゴヌクレオチド、または低分子化合物である、請求項１−３３のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項３５】
捕捉試薬および検出試薬が両方とも抗原であり、分析物が抗体である、請求項１−３４のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項３６】
フック鎖とアンカー鎖との間の放出可能な連結が、二本鎖ＤＮＡハイブリッドを含む、請求項５−３５のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項３７】
試料が生物学的試料である、請求項１−３６のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項３８】
試料が、体液、抽出物、タンパク質および／もしくはＤＮＡを含む溶液、細胞抽出物、細胞溶解物、または組織溶解物である、請求項１−３７のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項３９】
体液が尿、唾液、血液、血清、血漿、脳脊髄液、涙液、精液、または汗である、請求項３８に記載の生体分子複合体。
【請求項４０】
第１の標識がフルオロフォア、特異的ＤＮＡ配列、酵素、またはビオチン部分である、請求項１−３９のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項４１】
検出試薬は、酵素反応、開裂、または光開裂により、アンカー鎖から放出できる、請求項１−４０のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項４２】
フック鎖は、酵素反応、開裂、光開裂、またはオリゴヌクレオチド置換により、アンカー鎖から放出できる、請求項５−４０のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項４３】
アンカー鎖からフック鎖を放出させることが可能なディスプレーサ剤をさらに含み、それによって、分析物の非存在下で検出剤を支持体から放出させる、請求項５−４０および４２のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項４４】
フック鎖とアンカー鎖の両方がＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、フック鎖とアンカー鎖との間の放出可能な連結が二本鎖ＤＮＡハイブリッドである、請求項４３に記載の生体分子複合体。
【請求項４５】
ディスプレーサ剤が酵素、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、光またはＤＴＴである、請求項４３または４４に記載の生体分子複合体。
【請求項４６】
ディスプレーサ剤は、酵素反応、開裂、光開裂、またはオリゴヌクレオチド置換により、アンカー鎖からフック鎖を放出できる、請求項４３−４５のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項４７】
フック鎖とアンカー鎖との間の放出可能な連結が二本鎖ＤＮＡハイブリッドであり、ディスプレーサ剤がフック鎖の少なくとも一部に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、フック鎖にハイブリダイズ可能であり、それによって、ＤＮＡ置換反応を介してアンカー鎖からフック鎖を放出させる、請求項４３−４６のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項４８】
フック鎖とアンカー鎖との放出可能な連結が二本鎖ＤＮＡハイブリッドであり、ディスプレーサ剤が、アンカー鎖の少なくとも一部に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、アンカー鎖にハイブリダイズ可能であり、それによって、ＤＮＡ置換反応を介してアンカー鎖からフック鎖を放出させる、請求項４３−４６のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項４９】
ディスプレーサ剤が、第２の標識に取り付けられている、請求項４３−４８のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項５０】
第１の標識が存在せず、検出試薬もフック鎖も前記第１の標識に取り付けられていない、請求項４９に記載の生体分子複合体。
【請求項５１】
第２の標識がフルオロフォア、特異的ＤＮＡ配列、ビオチン部分、または酵素である、請求項４９または５０に記載の生体分子複合体。
【請求項５２】
ディスプレーサ剤が酵素または光またはＤＴＴであり、フック鎖とアンカー鎖との間の連結を、酵素反応または光開裂を介して破壊することが可能である、請求項４３−５１のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項５３】
検出試薬および捕捉試薬が両方とも抗体であり、分析物が抗原であり、検出試薬および捕捉試薬が抗原上の異なるエピトープに結合することができる、請求項１−５２のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項５４】
検出試薬および捕捉試薬が両方とも抗体であり、分析物が抗原であり、検出試薬および捕捉試薬が抗原上の同じエピトープに結合できる、請求項１−５２のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項５５】
抗原がエピトープの２つ以上の反復を有し、検出試薬および捕捉試薬が、抗原上のエピトープの異なる反復に同時に結合できる、請求項５４に記載の生体分子複合体。
【請求項５６】
アンカー鎖の表面近接配列に相補的なステム鎖をさらに含み、アンカー鎖は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、ステム鎖はアンカー鎖に結合して二本鎖オリゴヌクレオチドアンカー鎖を形成することが可能である、請求項１−５５のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項５７】
支持体上のアンカー鎖および捕捉試薬の相対密度を調整して、アッセイの有効親和性を制御できる、請求項１−５６のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項５８】
フック鎖および／もしくはアンカー鎖の長さを調整してアッセイの有効親和性を制御することができ、ならびに／または捕捉試薬および／もしくは検出試薬の表面密度を調整してアッセイの有効親和性を制御することができる、請求項５−５７のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項５９】
検出試薬とフック鎖との間の結合体が一価である、請求項５−５８のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項６０】
検出試薬の少なくとも９０％が、１つのフック鎖のみを介して支持体に連結されている、請求項５−５９のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項６１】
捕捉試薬が捕捉鎖を介してアンカー鎖に連結されるとき、捕捉試薬と捕捉鎖との間の結合体が一価である、請求項１−６０のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項６２】
捕捉試薬が捕捉鎖を介してアンカー鎖に連結されるとき、捕捉試薬の少なくとも９０％が１つの捕捉鎖のみを介してアンカー鎖に連結される、請求項１−５３のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項６３】
アンカー鎖が、支持体上に確率的に分散されている、請求項１−６２のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項６４】
捕捉試薬が、支持体上に確率的に分散されている、請求項１−６３のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項６５】
フック鎖の長さおよび／または柔軟性は、捕捉試薬の存在下で検出試薬を分析物に結合させることを可能にするために十分であるように選択することができる、請求項５−６４のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項６６】
フック鎖とアンカー鎖との間の連結が二本鎖ＤＮＡハイブリッドであるとき、二本鎖ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）が約５０〜約８０℃である、請求項５−６５のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項６７】
放出または置換後の検出試薬の濃度が約１０ピコモル濃度未満である、請求項１−６６のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項６８】
試料中の分析物の検出および／または定量のための生体分子複合体であって、
ａ）支持体に取り付けられたアンカー鎖、
ｂ）前記支持体に取り付けられた捕捉試薬、
ｃ）フック鎖に連結した検出試薬であって、前記フック鎖は前記アンカー鎖に放出可能に取り付けられ、前記フック鎖および前記アンカー鎖は、二本鎖ＤＮＡハイブリッドによって互いに連結されている、検出試薬、および
ｄ）フック鎖の少なくとも一部に相補的であり、かつフック鎖にハイブリダイズ可能であり、それによって、ＤＮＡ置換反応を介してアンカー鎖からフック鎖を放出するＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、検出可能に標識される、ディスプレーサ剤を含み、
前記捕捉試薬および前記検出試薬は、試料中に存在する場合、分析物に同時に結合して、三成分複合体を形成することができ、そして
前記ディスプレーサ剤によるアンカー鎖からのフック鎖の放出は、分析物の非存在下で支持体から検出試薬を放出することができる、生体分子複合体。
【請求項６９】
請求項１−６８のいずれか１項に記載の生体分子複合体であって、
ａ）支持体に取り付けられた第２のアンカー鎖、
ｂ）第２のアンカー鎖に放出可能に取り付けられた第２の検出試薬であって、前記第２の検出試薬が任意に第３の標識に取り付けられ、前記第３の標識は不活性または検出不可能である、第２の検出試薬をさらに含み、
捕捉試薬、検出試薬、および第２の検出試薬は、試料中に存在する場合、分析物に同時に取り付けられて、四成分複合体を形成することができ、
および
第２のアンカー鎖からの第２の検出試薬の放出は、分析物の非存在下で支持体から第２の検出試薬を放出することができ、そして
第３の標識は、第２の検出試薬が第２のアンカー鎖から放出されるときに、活性化または検出できる、生体分子複合体。
【請求項７０】
請求項６９に記載の生体分子複合体であって、第２の検出試薬が第２のフック鎖に連結され、第２のフック鎖が第２のアンカー鎖に放出可能に連結され、第２の検出試薬および  第２のフック鎖の少なくとも一方が任意に第３の標識に取り付けられ、第３の標識は不活性または検出不可能であり、
第２のアンカー鎖からの第２のフック鎖の放出は、分析物の非存在下で支持体から第２の検出試薬を放出することができ、そして
第２のフック鎖が第２のアンカー鎖から放出されるとき、第３の標識が活性化または検出される、生体分子複合体。
【請求項７１】
第２の検出試薬が第３の標識に取り付けられ、第２のフック鎖が第３の標識に取り付けられ、または第２の検出試薬と第２のフック鎖の両方が第３の標識に取り付けられている、請求項６９または７０に記載の生体分子複合体。
【請求項７２】
第３の標識がフルオロフォア、特異的ＤＮＡ配列、ビオチン部分または酵素である、請求項６９−７１のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項７３】
第３の標識は、分析物が存在する場合にのみ支持体上で検出される、請求項６９−７２のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項７４】
第２の検出剤が分析物の非存在下で支持体から放出されるように、第２のアンカー鎖から第２のフック鎖を放出することが可能である第２のディスプレーサ剤をさらに含む、請求項７０−７３のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項７５】
第２のフック鎖および第２のアンカー鎖がＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、第２のフック鎖と第２のアンカー鎖との間の連結が二本鎖ＤＮＡハイブリッドである、請求項７４に記載の生体分子複合体。
【請求項７６】
第２のディスプレーサ剤が、酵素反応、開裂、光開裂、またはオリゴヌクレオチド置換により、第２のアンカー鎖から第２のフック鎖を放出することができる、請求項７４または７５に記載の生体分子複合体。
【請求項７７】
第２のフック鎖と第２のアンカー鎖との間の連結が二本鎖ＤＮＡハイブリッドを含み、第２のディスプレーサ剤が第２のフック鎖と第２のアンカー鎖との間の連結を、ＤＮＡ鎖置換反応を介して破壊することが可能である、請求項７４から７６のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項７８】
第２のディスプレーサ剤が検出可能に標識されている、請求項７４−７７のいずれか１項に記載の生体分子複合体。
【請求項７９】
第２のディスプレーサ剤が、フルオロフォア、特異的ＤＮＡ配列、酵素、またはビオチン部分で標識されている、請求項７８に記載の生体分子複合体。
【請求項８０】
第３の標識が存在せず、第２の検出試薬も第２のフック鎖も第３の標識に取り付けられていない、請求項７８または７９に記載の生体分子複合体。
【請求項８１】
試料中の２つ以上の分析物の同時検出および／または定量のためのマルチプレックスサンドイッチアッセイシステムであって、前記システムは、請求項１−８０のいずれか１項において定義される２つ以上の生体分子複合体を含み、前記２つ以上の生体分子複合体が同一の支持体に取り付けられ、各生体分子複合体が、試料中の異なる分析物の検出および／または定量のためのものである、システム。
【請求項８２】
支持体が、ポリスチレンビーズなどの微粒子、マルチウェルプレート、スライドガラスの表面、またはヒドロゲルマトリックスである、請求項８１に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項８３】
試料中の２つ以上の分析物の同時検出および／または定量のためのマルチプレックスサンドイッチアッセイシステムであって、前記システムは、請求項１−８０のいずれか１項において定義される２つ以上の生体分子複合体を含み、前記２つ以上の生体分子複合体は試料中のそれぞれの第１の分析物およびそれぞれの第２の分析物の検出および／または定量のためのものであり、
２つ以上の生体分子複合体は、それぞれの第１の支持体およびそれぞれの第２の支持体に取り付けられ、試料は第１の支持体および第２の支持体に同時に接触する、システム。
【請求項８４】
第１の支持体および第２の支持体が同一の支持体である、請求項８３に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項８５】
前記同一の支持体が平坦な表面であり、２つ以上の生体分子複合体が平坦な表面上の別個の位置に配置されている、請求項８４に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項８６】
平坦な表面が、マルチウェルプレートの表面、スライドガラスの表面、またはヒドロゲルマトリックスである、請求項８５に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項８７】
第１の支持体および第２の支持体は、異なる支持体である、請求項８３に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項８８】
第１の支持体および第２の支持体が両方とも微粒子である、請求項８７に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項８９】
微粒子がポリスチレンビーズである、請求項８８に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項９０】
微粒子はバーコード化されている、請求項８８または８９に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項９１】
第１の支持体が第１のバーコードでエンコードされた第１のビーズであり、第２の支持体が第２のバーコードでエンコードされた第２のビーズであり、それぞれのビーズの同定を可能にしている、請求項８３−９０のいずれか１項に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項９２】
２つ以上の生体分子複合体が、それぞれの第１のフック鎖およびそれぞれの第２のフック鎖、およびそれぞれの第１のアンカー鎖およびそれぞれの第２のアンカー鎖とを含み、第１のフック鎖、第２のフック鎖、第１のアンカー鎖、および第２のアンカー鎖はすべてＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、第１のフック鎖と第１のアンカー鎖との間の連結、および第２のフック鎖と第２のアンカー鎖との間の連結は二本鎖ＤＮＡハイブリッドであり、
２つ以上の生体分子複合体は、それぞれの第１のディスプレーサ剤およびそれぞれの第２のディスプレーサ剤をさらに含み、第１のディスプレーサ剤は第１のアンカー鎖から第１のフック鎖を放出することが可能であり、第２のディスプレーサ剤は第２のアンカー鎖から第２のフック鎖を放出することが可能であり、第１のディスプレーサ剤および第２のディスプレーサ剤は同一である、
請求項８３から９１のいずれか１項に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項９３】
第１のディスプレーサ剤および第２のディスプレーサ剤は、第１のフック鎖および第２のフック鎖の両方に結合することができるディスプレーサＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、それにより、ＤＮＡ置換反応を介して第１のフック鎖および第３のフック鎖をそれぞれのアンカー鎖から置換させる、請求項９２に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイ。
【請求項９４】
ディスプレーサＤＮＡオリゴヌクレオチドが検出可能に標識されている、請求項９３に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイ。
【請求項９５】
標識がフルオロフォア、特異的ＤＮＡ配列、酵素、またはビオチン部分である、請求項９４に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイ。
【請求項９６】
第１のフック鎖および第２のフック鎖はそれぞれ第１の標識および第３の標識に取り付けられ、第１の標識および第３の標識は不活性または検出不能であり、第１のフック鎖が第１のアンカー鎖から放出され、かつ第２のフック鎖が第２のアンカー鎖からそれぞれ放出されるとき、第１の標識および第３の標識が活性化または検出できる、請求項８３−９５のいずれか１項に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイ。
【請求項９７】
第１の標識および第３の標識が存在せず、ディスプレーサＤＮＡオリゴヌクレオチドのみが標識されている、請求項８３−９５のいずれか１項に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイ。
【請求項９８】
試料中の２つ以上の分析物の同時検出および／または定量のためのマルチプレックスサンドイッチアッセイシステムであって、前記システムは、
ａ）試料中の第１の分析物の検出および／または定量のための第１の生体分子複合体であって、第１のアンカー鎖、第１の捕捉試薬、および第１のフック鎖とに任意に連結される第１の検出試薬とを含み、第１の検出試薬または第１のフック鎖は第１のアンカー鎖に放出可能に連結され、第１の検出試薬および第１のフック鎖の少なくとも１つは任意に第１の標識に取り付けられ、ここで、第１の捕捉試薬および第１の検出試薬は、試料中に存在する場合には、第１の分析物に同時に結合して第１の三成分複合体を形成することができ、および、
ｂ）試料中の第２の分析物の検出および／または定量のための第２の生体分子複合体であって、第２のアンカー鎖、第２の捕捉試薬、および第２のフック鎖に任意に連結された第２の検出試薬を含み、第２の検出試薬または第２のフック鎖は第２のアンカー鎖に放出可能に連結され、第２の検出試薬および第２のフック鎖の少なくとも１つは任意に第２の標識に取り付けられ、第２の捕捉試薬および第２の検出試薬は、試料中に存在する場合に、第２の分析物に同時に結合して第２の三成分複合体を形成することができ、
第１のアンカー鎖、第１の捕捉試薬、第２のアンカー鎖、および第２の捕捉試薬はすべて、支持体に取り付けられていることを特徴とし；
第１の標識および第２の標識は不活性または検出不能であり、それぞれの検出試薬またはフック鎖がそれらのそれぞれのアンカー鎖から放出されるときに活性化または検出できる、マルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項９９】
第１の標識および第２の標識は、第１の分析物および第２の分析物がそれぞれ存在するときに支持体上でのみ検出される、請求項９８に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項１００】
第１のアンカー鎖から第１の検出試薬または第１のフック鎖を放出し、第２のアンカー鎖から第２の検出試薬または第２のフック鎖を放出することが可能であるディスプレーサ剤をさらに含む、請求項９８または９９に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項１０１】
ディスプレーサ剤がＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、第１のフック鎖、第２のフック鎖、第１のアンカー鎖および第２のアンカー鎖が、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、フック鎖とそれらのそれぞれのアンカー鎖との間の連結は二本鎖ＤＮＡハイブリッドであり、ディスプレーサ剤は第１のフック鎖および第２のフック鎖にハイブリダイズ可能であり、ＤＮＡ鎖置換反応を介してフック鎖とそれらのそれぞれのアンカー鎖との間の前記連結を破壊することが可能である、請求項９８−１００のいずれか１項に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項１０２】
ディスプレーサ剤が検出可能に標識されている、請求項１００または１０１に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項１０３】
第１の標識および第２の標識が存在せず、ディスプレーサ剤のみが標識されている、請求項１０２に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項１０４】
ディスプレーサ剤がフルオロフォア、特異的ＤＮＡ配列、酵素、またはビオチン部分で標識されている、請求項１００−１０３のいずれか１項に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項１０５】
支持体は、平坦な表面もしくはマルチウェルプレートの表面、ガラスプレートの表面、またはヒドロゲルであり、第１および第２の生体分子複合体は、支持体上の第１の位置および第２の位置にそれぞれ配置される、請求項９８−１０４のいずれか１項に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項１０６】
第１の生体分子複合体が第１の支持体に取り付けられ、第２の生体分子複合体が第２の支持体に取り付けられている、請求項９８−１０５のいずれか１項に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項１０７】
第１の支持体がポリスチレンビーズなどの微粒子である、請求項１０６に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項１０８】
第２の支持体がポリスチレンビーズなどの微粒子である、請求項１０６または１０７に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項１０９】
第１の支持体および第２の支持体が互いに混合されている、請求項１０６−１０８のいずれか１項に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項１１０】
第１の支持体および第２の支持体はバーコード化されている、請求項１０９に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項１１１】
第１の生体分子複合体システムは、請求項１−８０のいずれか１項で定義された第１の生体分子複合系であり、第２の生体分子複合体システムは、請求項１−８０のいずれかで定義された第２の生体分子複合系である、請求項９８−１１０のいずれか１項に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステム。
【請求項１１２】
試料中の分析物を検出および／または定量するための方法であって、前記方法は、
ａ）支持体、支持体に取り付けられた捕捉試薬、支持体に取り付けられたアンカー鎖、および任意にフック鎖に連結された検出試薬を提供する工程であって、検出試薬またはフック鎖は、アンカー鎖に放出可能に連結され、ここで、検出試薬およびフック鎖の少なくとも１つは、任意に第１の標識に取り付けられ、前記第１の標識は不活性であるかまたは検出不可能である、提供する工程、
ｂ）捕捉試薬および検出試薬の分析物への同時結合を可能にする条件下で、支持体を試料と接触させて、三成分複合体を形成する工程、ならびに、
ｃ）第２の標識に任意選択で取り付けられたディスプレーサ剤を添加する工程であって、ここで、フック鎖に任意に連結された検出試薬が分析物の非存在下で支持体から放出されるように、ディスプレーサ剤は検出試薬またはフック鎖をアンカー鎖から放出し、アンカー鎖からの検出鎖またはフック鎖の前記放出は、前記第１の標識を活性化するか、または前記第１の標識を検出可能にする、添加する工程
を含む、方法。
【請求項１１３】
下記工程（ｄ）
ｄ）支持体上の第１の標識および／または第２の標識の存在および／または量を決定する工程であって、支持体上の第１および／または第２の標識の存在は試料中の分析物の存在を示し、第１および／または第２の標識の量は試料中の分析物の量および／または濃度に比例している工程をさらに含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
工程（ｃ）の後に、未結合の試薬または物質を除去するために、支持体を洗浄する工程をさらに含む、請求項１１２または１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
工程（ｃ）の後に、支持体を保存する工程をさらに含む、請求項１１２−１１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
第１の標識が検出試薬に取り付けられている、請求項１１２−１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
第１の標識がフック鎖に取り付けられている、請求項１１２−１１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
第２の標識がディスプレーサ剤に取り付けられている、請求項１１２−１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
第１の標識および／または第２の標識がフルオロフォア、特異的ＤＮＡ配列、酵素またはビオチン部分である、請求項１１２−１１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
第１の標識は存在せず、ディスプレーサ剤が第２の標識に取り付けられている、請求項１１２−１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
捕捉試薬が支持体に直接取り付けられている、請求項１１２−１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
捕捉試薬が共有結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合、ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカーまたはポリマーリンカーを介して支持体に取り付けられている、請求項１１２−１２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
捕捉試薬は、アンカー鎖に取り付けられることによって間接的に支持体に取り付けられている、請求項１１２−１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
捕捉試薬は、共有結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合、水素結合、疎水性相互作用、親和性結合、または非共有結合的相互作用により、アンカー鎖に取り付けられている、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
捕捉試薬が、捕捉試薬およびアンカー鎖に連結された捕捉鎖によって、アンカー鎖に取り付けられている、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
捕捉鎖が、オリゴヌクレオチド、ＰＥＧなどのポリマー、または多糖類である、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
アンカー鎖が、ＰＥＧなどのポリマー、オリゴヌクレオチド、またはオリゴ糖である、請求項１１２−１２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
オリゴヌクレオチドが、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドである、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
支持体が微粒子、マルチウェルプレートの表面、スライドガラスの表面、またはヒドロゲルマトリックスである、請求項１１２−１２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
微粒子がポリスチレンビーズである、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
微粒子がバーコード化されている、請求項１２９または１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
フック鎖がＰＥＧなどのポリマー、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドなどのＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドもしくは二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはオリゴ糖である、請求項１１２−１３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３３】
フック鎖が存在せず、検出試薬が共有結合またはビオチン−ストレプトアビジン結合を介してアンカー鎖に直接連結されている、請求項１１２−１３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３４】
アンカー鎖は、共有結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合、ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカー、ポリマーリンカー、もしくは水素結合、疎水性相互作用、親和性結合、または非共有結合的相互作用などの別の化学的相互作用を介して、支持体に取り付けられている、請求項１１２−１１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
捕捉試薬および／または検出試薬が、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、修飾アプタマー、ソマーマー、アフィマー、抗原、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、エキソソーム、オリゴヌクレオチドまたは低分子量化合物である、請求項１１２−１３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
捕捉試薬および検出試薬が異なっている、請求項１１２−１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
捕捉試薬および検出試薬が同一であるか、構造的に類似しているか、または分析物の構造的に類似の部分またはエピトープに結合する、請求項１１２−１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
分析物は、捕捉試薬および検出試薬が結合する部分の２つ以上の反復を有し、捕捉試薬および検出試薬が異なる反復に結合する、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
捕捉試薬および検出試薬が同一のエピトープに結合し、分析物がエピトープの２つ以上の反復を有し、捕捉試薬および検出試薬が分析物上のエピトープの異なる反復に結合する、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４０】
捕捉試薬および検出試薬が、分析物の異なる部分またはエピトープに結合する、請求項１１２−１３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４１】
捕捉試薬および検出試薬が両方とも抗体である、請求項１１２−１４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４２】
分析物が、抗原、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、ホルモン、またはエキソソームである、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
分析物が抗原である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
捕捉試薬および検出試薬が両方とも抗原、タンパク質、またはペプチドであり、分析物が抗体である、請求項１１２−１４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４５】
ディスプレーサ剤は、酵素反応、開裂、光開裂、またはオリゴヌクレオチド置換によって、アンカー鎖から検出試薬またはフック鎖を放出する、請求項１１２−１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
フック鎖およびアンカー鎖の両方がＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、フック鎖とアンカー鎖との間の連結が二本鎖ＤＮＡハイブリッドである、請求項１１２−１４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４７】
ディスプレーサ剤が、酵素または光またはＤＴＴである、請求項１１２−１４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４８】
ディスプレーサ剤が、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１１２−１４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４９】
ディスプレーサ剤は、フック鎖の少なくとも一部に相補的であり、フック鎖にハイブリダイズし、それによって、ＤＮＡ鎖置換反応を介してアンカー鎖からフック鎖を放出する、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
ディスプレーサ剤が、アンカー鎖の少なくとも一部に相補的であり、アンカー鎖にハイブリダイズし、それによって、ＤＮＡ鎖置換反応を介してアンカー鎖からフック鎖を放出する、請求項１４８に記載の方法。。
【請求項１５１】
第１の標識が存在せず、ディスプレーサ剤が第２の標識に取り付けられている、請求項１１２−１４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５２】
第２の標識が、フルオロフォア、特異的ＤＮＡ配列、酵素、またはビオチン部分である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
支持体が、アンカー鎖の表面近接配列に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドであるステム鎖をさらに含み、アンカー鎖は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、ステム鎖はアンカー鎖に結合して二本鎖オリゴヌクレオチドアンカー鎖を形成することが可能である、請求項１１２−１５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５４】
支持体上のアンカー鎖および捕捉試薬の相対密度を調整して、アッセイの有効親和性を制御できる、請求項１１２−１５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５５】
検出試薬とフック鎖との間の結合体が一価である、請求項１１２−１５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５６】
検出試薬の少なくとも９０％が、１つのフック鎖のみを介して支持体に連結されている、請求項１１２−１５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５７】
捕捉試薬が捕捉鎖を介してアンカー鎖に連結されるとき、捕捉試薬と捕捉鎖との間の結合体が一価である、請求項１１２−１５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５８】
捕捉試薬が捕捉鎖を介してアンカー鎖に連結されるとき、捕捉試薬の少なくとも９０％が１つの捕捉鎖のみを介してアンカー鎖に連結される、請求項１１２−１５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５９】
アンカー鎖が支持体上に確率的に分散されている、請求項１１２−１５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６０】
捕捉試薬が支持体上に確率的に分散されている、請求項１１２−１５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６１】
フック鎖の長さおよび／または柔軟性は、捕捉試薬の存在下で検出試薬を分析物に結合させることを可能にするために十分であるように選択することができる、請求項１１２−１６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６２】
フック鎖および／またはアンカー鎖の長さがアッセイの有効な親和性を制御するように選択され、および／または捕捉試薬および／または検出試薬の表面密度がアッセイの有効な親和性を制御するために選択される、請求項１１２−１６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６３】
フック鎖とアンカー鎖との間の連結が、摂氏約５０度から約８０度の融解温度（Ｔｍ）を有する二本鎖ＤＮＡハイブリッドである、請求項１１２−１６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６４】
捕捉試薬とアンカーとの間の連結が第２の二本鎖ＤＮＡハイブリッドであるように、捕捉試薬がオリゴヌクレオチドリンカーを介してアンカー鎖に連結され、第２の二本鎖ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）が摂氏約５０度から約８０度である、請求項１１２−１６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６５】
放出または置換後の検出試薬の濃度が約１０ピコモル濃度未満である、請求項１１２−１６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６６】
試料中の分析物の検出および／または定量のための方法であって、前記方法は、
ａ）支持体、前記支持体に取り付けられた捕捉試薬、前記支持体に取り付けられたアンカー鎖、およびフック鎖に連結された検出試薬を提供する工程であって、前記フック鎖は二本鎖ＤＮＡハイブリッドによってアンカー鎖に放出可能に連結される、提供する工程、
ｂ）捕捉試薬および検出試薬の分析物への同時結合を可能にする条件下で、支持体を試料と接触させて、三成分複合体を形成する工程、ならびに
ｃ）検出可能な標識に取り付けられたディスプレーサ剤を添加する工程であって、前記ディスプレーサ剤は、フック鎖の少なくとも一部に相補的であり、かつ前記フック鎖にハイブリダイズすることが可能なＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、前記ディスプレーサ剤は、分析物の非存在下で検出試薬が支持体から放出されるようにＤＮＡ置換反応を介してフック鎖をアンカーから放出する、添加する工程、ならびに
ｄ）支持体上の検出可能な標識の存在および／または量を任意に決定する工程であって、支持体上の標識の存在は試料中の分析物の存在を示し、標識の量は試料中の分析物の量および／または濃度に比例する、決定する工程
を含む、方法。
【請求項１６７】
請求項１１２から１６６のいずれか１項に記載の方法であって、
支持体は、支持体に取り付けられた第２のアンカー鎖、支持体に取り付けられた第２の捕捉試薬、および第２のフック鎖に任意に連結された第２の検出試薬をさらに含み、第２の検出試薬または第２のフック鎖は第２のアンカー鎖に連結され、第２の検出試薬および第２のフック鎖の少なくとも１つが任意に第３の標識に取り付けられ、前記第３の標識は不活性または検出不可能であり、第２の捕捉試薬および第２の検出試薬は試料中の第２の分析物に同時に結合することができ、第２の三成分複合体を形成し、
ここで、ディスプレーサ剤はまた、第２のフック鎖に任意に連結された第２の検出試薬が、第２の分析物の非存在下で支持体から放出されるように、第２の検出試薬または第２のフック鎖を第２のアンカー鎖から放出し、第２のアンカー鎖からの第２の検出試薬または第２のフック鎖の前記放出は、前記第３の標識を活性化するか、または前記第３の標識を検出可能にし、
ここで、支持体上の第３の標識の存在および／または量は、試料中の第２の分析物の存在を示し、支持体上の第３の標識の量は、試料中の第２の分析物の量および／または濃度に比例し、
その結果、試料中で、第１の分析物および第２の分析物を同時に検出および／または定量することができる、
方法。
【請求項１６８】
第２のアンカー鎖および第２の捕捉試薬は、支持体上の第１の位置および第２の位置にそれぞれ配置される、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
第２のアンカー鎖および第２の捕捉試薬は、第２の支持体に取り付けられている、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７０】
第２の支持体が、ポリスチレンビーズなどの微粒子である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
支持体がポリスチレンビーズなどの微粒子である、請求項１６７−１７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７２】
第１の支持体は第１のバーコードでエンコードされた第１のビーズであり、および第２の支持体は第２のバーコードでエンコードされた第２のビーズであり、それぞれのバーコードが検出されたときにそれぞれのビーズの同定を可能にする、請求項１６９−１７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７３】
第１の支持体および第２の支持体は、試料と接触する前に一緒に混合される、請求項１６９−１７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７４】
第１の支持体および第２の支持体は、試料と同時に接触される、請求項１６９−１７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７５】
試料が生物学的試料である、請求項１１２−１７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７６】
試料が体液、抽出物、タンパク質および／またはＤＮＡを含む溶液、細胞抽出物、細胞溶解物、または組織溶解物である、請求項１１２−１７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７７】
体液が、尿、唾液、血液、血清、血漿、脳脊髄液、涙液、精液または汗である、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
マルチプレックスサンドイッチアッセイシステムを調製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）第１の微粒子を含む第１の容器を提供する工程であって、第１の微粒子は第１のバーコードでエンコードされる、提供する工程、
（ｂ）第１の微粒子を第１の捕捉試薬および第１の検出試薬に取り付ける工程であって、第１の捕捉試薬および第１の検出試薬は、第１の分析物に同時に結合することが可能である、取り付ける工程、
（ｃ）任意に、第１の微粒子を保存する工程、
（ｄ）第２の微粒子を含む第２の容器を提供する工程であって、第２の微粒子は第２のバーコードでエンコードされる、提供する工程、
（ｅ）第２の微粒子を第２の捕捉試薬および第２の検出試薬に取り付ける工程であって、第２の捕捉試薬および第２の検出試薬は、第２の分析物に同時に結合することが可能である、取り付ける抗体
（ｆ）任意に、第２の微粒子を保存する工程、ならびに、
（ｇ）マルチプレックスサンドイッチアッセイシステムにおける使用のために、第１の微粒子と第２の微粒子を一緒に混合する工程、
を含み、
ここで、第１の捕捉試薬および第１の検出試薬は、それらのそれぞれの微粒子への取り付けの前に、第２の捕捉試薬および第２の検出試薬と混合されない、
方法。
【請求項１７９】
第１のバーコードおよび第２のバーコードは、独立した、スペクトル、グラフィック、または化学バーコードである、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
それぞれの捕捉試薬およびそれぞれの検出試薬が、それらのそれぞれの微粒子に同時に取り付けられる、請求項１７８または１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
それぞれの捕捉試薬およびそれぞれの検出試薬が、２段階反応においてそれらのそれぞれの微粒子に取り付けられ、捕捉試薬または検出試薬のいずれかが最初に微粒子に取り付けられ、続いて他の試薬の取り付けが行われる、請求項１７８または１７９に記載の方法。
【請求項１８２】
工程（ｇ）において、第１の微粒子および第２の微粒子を一緒に混合する前に、第１の微粒子および第２の微粒子を洗浄して、取り付けられていない試薬を除去する工程をさらに含む、請求項１７８−１８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８３】
第１の微粒子および第２の微粒子がポリスチレンビーズである、請求項１７８−１８２のいずれ１項に記載の方法。
【請求項１８４】
第１の捕捉試薬、第１の検出試薬、第２の捕捉試薬および第２の検出試薬が抗体である、請求項１７８−１８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８５】
第１の検出試薬が第１のフック鎖に連結され、第２の検出試薬が第２のフック鎖に連結され、第１の検出試薬および第２の検出試薬が、それらのそれぞれのフック鎖の第１のアンカー鎖および第２のアンカー鎖への結合を介してそれぞれの微粒子に取り付けられ、第１のアンカー鎖および第２のアンカー鎖がそれらのそれぞれの微粒子に予め取り付けられている、請求項１７８−１８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８６】
請求項８１−１１１のいずれか１項に記載のマルチプレックスサンドイッチアッセイシステムを調製するための、請求項１７８−１８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８７】
マルチプレックスサンドイッチアッセイシステムを調製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）支持体を提供する工程であって、前記支持体は、平面の表面、マルチウェルプレートの表面、ガラスプレートの表面、またはヒドロゲルである、提供する工程、
（ｂ）第１の捕捉試薬を第１の位置で前記支持体に取り付ける工程、
（ｃ）前記支持体を洗浄して、取り付けられていない第１の捕捉試薬を除去する工程、
（ｄ）第２の捕捉試薬を第２の位置で支持体に取り付ける工程、
（ｅ）前記支持体を洗浄して、取り付けられていない第２の捕捉試薬を除去する工程、
（ｆ）第１の位置において前記支持体に取り付けられた第１のアンカー鎖を介して、第１の検出試薬を支持体に取り付ける工程、
（ｇ）前記支持体を洗浄して、取り付けられていない第１の検出試薬を除去する工程、
（ｈ）第２の位置において前記支持体に取り付けられた第２のアンカー鎖を介して、第２の検出試薬を支持体に取り付ける工程、
（ｉ）前記支持体を洗浄して、取り付けられていない第２の検出試薬を除去する工程
を含み、
第１の捕捉試薬、第２の捕捉試薬、第１の検出試薬、および／または第２の検出試薬が一緒に混合されるときはいつでも、１つより多くの試薬が前記支持体に一度に取り付けられない、
方法。
【請求項１８８】
工程（ｂ）−（ｃ）、（ｄ）−（ｅ）、（ｆ）−（ｇ）、および（ｈ）−（ｉ）を任意の順序で実施することができる、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
第１の捕捉試薬、第１の検出試薬、第２の捕捉試薬および第２の検出試薬が抗体である、請求項１８７または１８８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、「Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ−ｂｙ−Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ａｓｓａｙｓ」と題された、２０１８年４月３日に出願された米国仮特許出願第６２／６５１，９４３号の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本発明は、生体分析の分野に関し、より詳細には、連結による共局在化サンドイッチアッセイを用いて生体分子を検出および／または定量するためのシステムおよび方法、ならびに試料中の複数の生体分子の同時検出および／または定量のためのマルチプレックスサンドイッチアッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
赤血球、白血球、血小板、タンパク質、ＤＮＡ、およびＲＮＡなどの生体細胞および生体分子の迅速かつ特異的な検出は、ゲノム、プロテオミクス、診断、治療学、および病理学的研究のような多様な分野においてますます重要になってきている。例えば、特定の抗原およびウイルスの迅速かつ正確な検出は、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、および他の感染性疾患のようなパンデミック疾患と闘うために決定的に重要である。ゲノム技術の成熟およびオーダーメイド医療の進歩は、多数の細胞および生体分子を検出および定量するためのより迅速かつより高感度なアッセイを必要とする。医療研究の進歩は、プロテオミクスを介する複数のタンパク質の正確で、タイムリーで、かつ費用効果的な評価にますます依存していくであろう。しかし、現在の自動化された、高感度かつ低コストのアッセイは、効率的に多重化することはできない。
【０００４】
サンドイッチアッセイは、生物学的アッセイのための最も一般的なフォーマットの１つである。このフォーマットでは、捕捉プローブ分子が表面に固定化される。次いで、目的の標的細胞または生体分子を含有する生物学的試料が、その表面に適用される。標的は、表面に固定化された捕捉プローブ分子に濃度依存的な様式で結合する。次の工程では、検出プローブ分子が表面に適用される。検出プローブ分子は標的生体分子に結合し、これにより、捕捉プローブ分子と検出プローブ分子との間に「サンドイッチ」される。いくつかのアッセイでは、検出プローブ分子を結合することができる二次プローブもまた表面に適用される。二次プローブは、フルオロフォアのような標識に結合体化することができ、この場合、結合は蛍光スキャナまたは蛍光顕微鏡を用いて検出することができる。いくつかの場合において、二次プローブは放射性元素に結合体化され、この場合、放射能が検出されてアッセイ結果に読み出される。いくつかの場合において、二次プローブは酵素に結合体化され、この場合、基質を含む溶液が表面に添加され、酵素による基質の変換が検出される。全ての場合において、検出されたシグナルの強度は、生物学的試料中の標的の濃度に比例する。サンドイッチアッセイにおける二重認識の要件は、低バックグラウンドノイズを有する高忠実度シグナルを提供し、その結果、高感度検出を提供する。
【０００５】
酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）は、サンドイッチアッセイのよく知られた例である。ＥＬＩＳＡは、典型的には、抗体および色変化反応を使用して、生物学的試料中の生体分子を同定する。例えば、ＥＬＩＳＡは固相酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を使用して、固相に適用された液体または湿った生物学的試料中の抗原などの生体分子の存在を検出することができる。ＥＬＩＳＡは、抗体およびタンパク質を受動的に結合する９６ウェルまたは３８４ウェルポリスチレンプレートにおいてしばしば実施される。ＥＬＩＳＡの設計と実施を非常に容易にするのは、この固体表面上の試薬の結合および固定化である。マイクロプレート表面上に試薬を固定化することにより、アッセイ中に結合された標的生体分子を結合していない物質から分離し、非特異的に結合した物質を洗い流すことが容易になる。さらに、捕捉プローブ分子と検出プローブ分子の両方による二重認識の要求は、高い特異性を提供する。このように、ＥＬＩＳＡは、粗製製剤中の特定の標的生体分子を測定するための強力なツールである。
【０００６】
サンドイッチアッセイは、複数の分析物を並行して（多重化、マルチプレックス化とも呼ばれる）測定または検出するように設計および組み立てることができる。多重化サンドイッチアッセイ（ＭＳＡ）は、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、または抗体マイクロアレイなどのマイクロアレイを用いて実行することができる。マイクロアレイは、ガラス、プラスチックまたはシリコンなどの基材表面に取り付けられた生体分子を含む微小スポットの集合体であり、それによって「微細な」アレイを形成する。このようなマイクロアレイは、例えば、多数の遺伝子またはタンパク質の発現レベルを同時に測定するために使用することができる。マイクロアレイチップ上のＤＮＡ、タンパク質または抗体などの生体分子は、典型的には、プローブ分子に特異的に取り付けまたはハイブリダイズされた標的分子に取り付けられた蛍光標識の光学的読み出しを通して検出される。使用される標識は、例えば、酵素、放射性同位体、またはフルオロフォアから構成され得る。
【０００７】
ＭＳＡはまた、粒子上でも行うことができる。この場合、溶液中に懸濁された粒子は、タンパク質または特定のＤＮＡ分子のような、目的の標的を捕捉するために必要な生体分子に取り付けられる。多重化におけるアッセイを行うために、粒子は、溶液中の様々なアッセイを区別できるようにエンコードされなければならない。一般的なフォーマットは、スペクトルエンコードされた微粒子であり、これは蛍光色素または発光色素を用いてエンコードされる。粒子はまた、図式的にエンコードすることができ、したがって、それらはしばしば「バーコード化された粒子」と呼ばれる。粒子サイズは、ナノメートル（ナノ粒子）からマイクロメートル（微粒子）までの大きさであってよい。これらの中で、蛍光的にエンコードされた微粒子をサイトメーター上で迅速かつ高スループットで読み取ることができる。
【０００８】
しかし、現在のサンドイッチアッセイは、試料中の複数の生体分子を同時に測定するために使用されるとき（多重化）、性能が悪い。多重化ＥＬＩＳＡは、抗体、タンパク質等の試薬間の交差反応性によって制限され、結果として非特異的なシグナル伝達を発生しやすい。アレイとビーズの両方のフォーマットの従来の多重化サンドイッチアッセイにおいて、検出抗体は、典型的には混合物として適用されるが、この方法は、交差反応性のマイナス要素を構成する試薬間の相互作用を引き起こす。したがって、検出抗体混合物の適用は、偽の結合をもたらし、例えば、捕捉と非標的分析物との間の非特異的結合事象から偽陽性シグナルを生成し（ここでは図１に示される）、これは、実際の標的タンパク質結合シグナルから区別することが困難である可能性がある。このような試薬で駆動される交差反応性は、ＭＳＡにおける固有の問題であり、標的の数とともに二次的にスケールし、多重化のスケールを厳しく制限する。交差反応性に伴う問題に起因して、現在のＭＳＡは一般に３０−４０個の標的に限定されている。それでも、交差反応性試薬（例えば、抗体）を発見し、除去するために、長くて費用のかかる最適化プロトコルが必要であり、このことは、これらのアッセイの適用性を厳しく制限し、これらのコストを増加させる。
【０００９】
交差反応性はまた、他のタイプの多重化アッセイを妨げる。例えば、正確なタンパク質リン酸化分析を用いて、タンパク質発現レベルから明らかでない細胞シグナル伝達事象を明らかにすることができる。特定のタンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）の画分を定量化するための現在の方法およびワークフローは、ＰＴＭ特異的抗体がタンパク質自体に対して不十分な特異性を有することが多いので、多重化において厳しく制限される（すなわち、蛍光体特異的抗体は、試薬で駆動される交差反応性の問題に対して非常に感度が高い）。その結果、従来のＰＴＭパネルは多重化されない。
【００１０】
従来のサンドイッチイムノアッセイはまた、タンパク質間相互作用を分析するために適していない。タンパク質間相互作用は、細胞プロセスの鍵となる部分であり、これらの相互作用のモジュレーターを理解することは、相関している疾患に対応するために極めて重要である。しかし、検出抗体混合物の使用は、望ましくない相互作用を許容し、相互作用シグナルを難読化することができる偽の結合を導く。現在の多重サンドイッチアッセイはまた、抗体のような高価な試薬が、アッセイの製造および実施の間に非効率的に使用されるので、コストがかかる。例えば、溶液中の抗体混合物の添加は高濃度（ナノモル濃度）を必要とし、一方、マイクロアレイまたはミクロビーズについて定量するためにタンパク質に結合するために必要とされる量は３桁少なく、これは抗体の９９．９％損失に相当する。さらに、所与のサンドイッチイムノアッセイの感度は、標識された検出抗体の非特異的結合および／または不完全な洗浄に起因することが多いバックグラウンドシグナルによって大きく影響される。洗浄サイクルを増加すること、および添加剤試薬を含めることによって、不完全な洗浄を低減する方法が使用されてきたが、しかし、これらの方法は、アッセイ時間の増加およびアッセイの複雑さを生じる。
【００１１】
米国特許第９，４８１，９４５号は、単一検出抗体によるマイクロアレイ上の各捕捉抗体スポットのアドレス指定に依存し、これにより、抗体試薬間の相互作用を回避し、単一プレックスＥＬＩＳＡアッセイで見い出されるアッセイ条件を再現する、抗体共局在化マイクロアレイ（ＡＣＭ）を記載している。この方法の遂行は、最初に捕捉抗体をスポッティングすること、スポッタからスライドを取り外すこと、それを試料とともにインキュベートすること、必要に応じてそれを洗浄および濯ぐこと、ならびに、それを検出抗体のスポッティングのために戻すこと、続いて結合およびインキュベーションを行うことを必要とする。これにより、この方法は、各々が異なる試薬を同様に有するｎ個のスポットへのｎ個の異なる試薬の移動に依存し、ｎからｎの移動を表す。アッセイの一部としてスポッティングを実施する必要性は、扱いにくくて遅く、また、スループットが制限される。
【００１２】
米国特許第７，３０６，９０４号は、１つ以上の分析物の検出および／または定量のためのアッセイがいわゆる近接プローブを用いた溶液であることを記載している。近接プローブは、結合部分および核酸を含む。１つの近接プローブからの核酸は、これらが近接している場合、すなわち、それらが特異的である分析物に結合したときにのみ、他の近接プローブからの核酸と相互作用することが可能である。しかし、一般的に、多重化された近接ベースのアッセイは、単一プレックスフォーマットで検出または読み出しを要求し、したがって、ｎ−プレックスアッセイのために試料をｎ個の画分に分画するために、複雑なマイクロ流体工学を必要とする。
【００１３】
米国特許出願公開第ＵＳ  ２０１６／０１５３９７３号には、イムノアッセイにおいて分析物を検出するために開裂可能なリンカーを使用する方法およびシステムが説明されている。しかし、この方法およびシステムは、高いバックグラウンドシグナルおよび試薬間の交差反応に起因して、高感度なイムノアッセイにおける複数の分析物の多重化または同時検出には適していない。
【発明の概要】
【００１４】
生化学アッセイを用いた生体分子の検出および／または定量のための方法およびシステムが提供される。本発明の目的は、先行技術に存在する欠陥の少なくともいくつかを改善することである。本技術の実施形態は、例えば、日常的な使用のためのＥＬＩＳＡを置き換えるために、スケール変更可能で、コスト効率の高い、感度が高い、迅速かつ／または単純な多重サンドイッチアッセイの必要性が存在するという、本発明者らの理解に基づいて開発された。それゆえに、いくつかの態様では、迅速で、感度が高く、コスト効果が高く、および／またはスケール変更可能である、試薬間の交差反応性が最小である多重サンドイッチイムノアッセイを含み、試料中の複数の分析物の同時検出および／または定量化を可能にする、多重サンドイッチアッセイが本明細書で提供される。
【００１５】
本明細書で提供される方法およびシステムは、少なくとも部分的に、試薬と支持体との間の連結の設計および構築に基づいており、ここで、連結は、アドレス可能かつプログラム可能なトポロジーおよび機能を可能にする。理論によって制限されることを望まないが、本明細書で提供されるシステムおよび方法は、多重サンドイッチアッセイにおいて、バックグラウンドノイズおよび／または偽陽性の１つ以上の原因を低減または排除することができると考えられている。いくつかの実施形態では、多重化アッセイにおける試薬間の交差反応性は、非同族の親和性結合剤間の相互作用を最小化または排除することによって最小化または排除される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法およびシステムは、検出試薬の不完全な洗浄および／または非特異的結合によって引き起こされるバックグラウンドノイズを低減または排除することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法およびシステムは、個別のアッセイ支持体上のコンビナトリアル試薬対のアセンブリを通して、翻訳後修飾の多重化検出および／またはタンパク質間相互作用の同定を可能にすることができる。いくつかの実施形態では、試薬の表面構造、リンカー長、および／または表面間隔を制御して、結合およびシグナル発生のストリンジェンシーを調節することができる。いくつかの実施形態では、追加の工程は、非結合を最小化するために可逆反応から安定なオリゴハイブリッドに変換することによってアッセイシグナルを安定化することを可能にし、したがって、アッセイ完了後のシグナル損失を最小化し、それによって感度を増大させる。
【００１６】
第１の態様において、試料中の分析物の検出および／または定量のための生体分子複合体が提供され、これは、
支持体に取り付けられたアンカー鎖、
上記支持体に取り付けられた捕捉試薬、および
上記アンカー鎖に放出可能に取り付けられた検出試薬であって、上記検出試薬または上記アンカー鎖が、任意に、第１の標識に取り付けられ、上記第１の標識は、不活性であるかまたは検出不能である、検出試薬を含み、
ここで、上記捕捉試薬および上記検出試薬は、試料中に存在する場合には、上記分析物に同時に結合して、三成分複合体を形成することができ、上記アンカー鎖からの上記検出試薬の放出は、上記分析物の非存在下で、上記検出試薬を支持体から放出することができ、そして上記第１の標識は、上記検出試薬が上記アンカー鎖から放出されたときに活性化または検出できる。これにより、試料中の分析物の存在は、検出試薬がアンカー鎖から放出された後の支持体上の第１の標識の検出を通して決定される。なぜなら、検出試薬は、捕捉試薬と三成分複合体中の分析物に結合した場合にのみ、支持体に取り付けられたままであるからである。それゆえに、いくつかの実施形態では、第１の標識は、分析物が存在するときに、支持体上でのみ検出される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、検出試薬がアンカー鎖から放出されるときの、支持体上の、または支持体上で検出される第１の標識の量は、試料中の分析物の量および／または濃度に比例する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、検出試薬またはアンカー鎖は、任意に、第１の標識に取り付けられる。いくつかの実施形態では、検出試薬は、任意に、第１の標識に取り付けられる。いくつかの実施形態では、アンカー鎖は、任意に、第１の標識に取り付けられる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、検出試薬は、共有結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合、水素結合、疎水性相互作用、親和性結合、または非共有結合的相互作用を介して、アンカー鎖に直接的に放出可能に取り付けられる。
【００２０】
他の実施形態では、検出試薬はフック鎖を介して間接的にアンカー鎖に取り付けられ、上記検出試薬はフック鎖に連結され、および上記フック鎖は上記アンカー鎖に放出可能に取り付けられ、ここで、上記アンカー鎖からの上記フック鎖の放出は、分析物の非存在下で支持体から検出試薬を放出することができ、ならびに第１の標識は、上記フック鎖が上記アンカー鎖から放出されるときに活性化または検出できる。いくつかのそのような実施形態では、フック鎖がアンカー鎖から放出されるときの支持体上の第１の標識の量は、試料中の分析物の量および／または濃度に比例する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、検出試薬およびフック鎖の少なくとも一方が、任意に第１の標識に取り付けられている。例えば、第１の標識は、フック鎖に取り付けられてもよく、第１の標識は、検出試薬に取り付けられてもよく、または、第１の標識は、フック鎖と検出試薬の両方に取り付けられてもよい。いくつかの実施形態では、第１の標識は存在せず、すなわち、第１の鎖または検出試薬のどちらにも取り付けられておらず、例えば、第２の標識は、生体分子複合体中の異なる成分に取り付けられる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、例えば、共有結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合、オリゴヌクレオチドリンカー（ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカーなど）、またはポリマーリンカー（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーなど）を介して、支持体に直接取り付けられる。他の態様において、捕捉試薬は、例えば、支持体に取り付けられたアンカー鎖への連結を介して、例えば、オリゴヌクレオチドリンカー、ポリマーリンカー、または共有結合を介して、間接的に支持体に取り付けられる。捕捉試薬は、化学的相互作用、親和性結合などを含むいずれの適切な手段を用いて支持体に取り付けられてもよいことが理解されるべきである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、アンカー鎖は、ＰＥＧなどのポリマー、あるいは一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドもしくは二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドである。アンカー鎖は、共有結合、化学的相互作用、親和性結合、共有結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合、ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカー、ポリマーリンカーなどのいずれの適切な手段を用いて支持体に取り付けられてもよいことが理解されるべきである。
【００２４】
支持体は特に限定されず、いかなる適切な支持体が使用されてもよい。支持体の非限定的な例としては、微粒子（ビーズなど）、マルチウェルプレートの表面、スライドガラスの表面、またはヒドロゲルマトリックスが挙げられる。いくつかの実施形態では、支持体はビーズまたは微粒子であり、典型的にはミクロンサイズであり、例えば、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、プラスチックビーズなどであるが、これらに限定されない。別の実施形態では、支持体は平坦なマイクロアレイである。いくつかの実施形態では、支持体は、バーコード化されたビーズ、例えば、蛍光色素または発光色素に取り付けられたビーズもしくはそれらの混合物、または、スペクトル的に、グラフィック的に、または化学的にエンコードされたビーズである。
【００２５】
検出試薬に取り付けられたフック鎖は、一般に、検出試薬および捕捉試薬が分析物に同時に結合して三成分複合体を形成することを可能にするために十分な長さおよび柔軟性のリンカーである。フック鎖の非限定的な例としては、ＰＥＧなどのポリマー、およびオリゴヌクレオチド、例えば、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドもしくは二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２６】
本明細書に提供される生体分子複合体の特定の実施形態では、フック鎖は存在せず、検出試薬は、例えば、共有結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合、親和性結合などを介して、アンカー鎖に直接的に放出可能に結合される。
【００２７】
捕捉試薬は、標的分析物を特異的に認識し、かつこれに結合することが可能である任意の分子であり得る。捕捉試薬の非限定的な例としては、抗体、抗原、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、エキソソーム、オリゴヌクレオチド、アプタマー、修飾アプタマー（スローオフレート修飾アプタマーまたはソマーマー（ｓｏｍａｍｅｒ）など）、および低分子量化合物が挙げられる。特定の実施形態では、捕捉試薬は抗体であり、分析物は、抗原、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、ホルモン、またはエキソソームである。他の実施形態では、捕捉試薬は、抗原、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、またはエキソソームであり、分析物は抗体である。
【００２８】
同様に、検出試薬は、標的分析物を特異的に認識し、かつこれに結合することが可能である任意の分子であり得る。検出試薬の非限定的な例としては、抗体、抗原、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、エキソソーム、オリゴヌクレオチド、および低分子量化合物が挙げられる。特定の実施形態では、、検出試薬は抗体であり、分析物は抗原、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、またはエキソソームである。他の実施形態では、検出試薬は、抗原、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、またはエキソソームであり、分析物は抗体である。
【００２９】
捕捉試薬が抗体であり、分析物が抗原、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、またはエキソソームである場合、検出試薬はまた、捕捉試薬と同時に分析物に結合することが可能である抗体でもあることが理解されるべきである。同様に、捕捉試薬が抗原、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、またはエキソソームであり、分析物が抗体である場合、検出試薬はまた、捕捉試薬と同時に分析物を結合することが可能である、抗原、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、またはエキソソームである。
【００３０】
捕捉試薬および検出試薬は、それらが両方とも標的分析物を同時に結合させて第３の複合体を形成できる限り、同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、捕捉試薬および検出試薬は両方とも抗体である。これらは同一の抗体または異なる抗体であってもよい。それらは、分析物上の同じエピトープに結合する異なる抗体であってもよく、または、これらは、分析物上の異なるエピトープに結合する異なる抗体であってもよい。捕捉試薬および検出試薬が同じエピトープに結合する場合、これらは、一般に、分析物上のエピトープの異なる反復に結合し、この分析物は、エピトープの２つ以上の反復を有する。
【００３１】
分析物は、特に限定されることが意味されるものではなく、試料中の検出および／または定量が望まれる任意の生体分子または生物学的細胞であってもよい。分析物の非限定的な例としては、抗原、抗体、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、ホルモン、エキソソーム、オリゴヌクレオチド、または低分子量化合物が挙げられる。分析物は、目的の任意の試料中で検出されてもよく、特に、生物学的試料、例えば、非限定的に、体液（例えば、尿、唾液、血液、血清、血漿、汗）、抽出物（例えば、細胞抽出物）、ならびにタンパク質および／またはＤＮＡ（例えば、反応混合物）であるが、これらに限定されない。
【００３２】
いくつかの実施形態では、検出試薬は、第１の標識に取り付けられる。いくつかの実施形態では、フック鎖は、第１の標識に取り付けられる。いくつかの実施形態では、検出試薬とフック鎖の両方が、第１の標識に取り付けられる。第１の標識が存在しない。いくつかの実施形態では、検出試薬もフック鎖も、第１の標識に取り付けられてない。
【００３３】
いくつかの実施形態では、フック鎖とアンカー鎖との間の放出可能な連結は、二本鎖ＤＮＡハイブリッド、フック鎖、およびアンカー鎖を含み、これらは、一緒にハイブリダイズして二本鎖ＤＮＡハイブリッドを形成する相補的な一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、アンカー鎖からのフック鎖の放出は、ＤＮＡハイブリッドが「融解する」かまたは非結合であるように温度を上昇させることによって行うことができる。例えば、二本鎖ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）が約５０〜約８０℃である場合、二本鎖ＤＮＡハイブリッドが解離し、それによってフック鎖をアンカー鎖から放出させるように、この温度をＴｍより上に上昇させてもよい。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される生体分子複合体は、アンカー鎖からフック鎖を放出させ、それによって分析物の非存在下で支持体から検出剤を放出することが可能であるディスプレーサ剤をさらに含む。ディスプレーサ剤は、フック鎖とアンカー鎖との間の連結を特異的に破壊または放出することが可能である任意の薬剤であってもよい例えば、ディスプレーサ剤は、フック鎖とアンカー鎖との間の放出可能な連結を切断する（またはさもなくば破壊する）酵素または他の薬剤であってもよい。ディスプレーサ剤の非限定的な例としては、酵素、光、およびＤＴＴのような還元剤が挙げられる。ディスプレーサ剤は、例えば、酵素反応を介してまたは光切断により、フック鎖とアンカー鎖との間の連結を破壊することが可能であってもよい。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ディスプレーサ剤は、オリゴヌクレオチドである。例えば、フック鎖とアンカー鎖との間の放出可能な連結が二本鎖ＤＮＡハイブリッドを含む場合、ディスプレーサ剤は、フック鎖またはアンカー鎖にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドであり得、それによって、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ置換反応を介してアンカー鎖からフック鎖を放出させる。ディスプレーサ剤がフック鎖にハイブリダイズする実施形態では、ディスプレーサ剤は、フック鎖と二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡハイブリッドを形成する。いくつかのそのような実施形態では、ディスプレーサ剤は検出可能に標識することができ、その結果、フック鎖が取り付けられている検出試薬が分析物に結合されている場合には、洗浄後に、ディスプレーサ剤が支持体上に保持されるだけであり、ディスプレーサ剤上の標識の検出は、それによって、試料中の分析物の存在を示す。いくつかのそのような実施形態では、第１の標識は存在せず、ディスプレーサ剤上の標識の検出は、分析物を検出および／または定量するために使用される。いくつかのそのような実施形態では、支持体上で検出されるディスプレーサ剤上の標識の量は、試料中の分析物の量および／または濃度に比例する。ディスプレーサ剤がアンカー鎖にハイブリダイズする実施形態では、ディスプレーサ剤は、アンカー鎖と二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡハイブリッドを形成する。このような実施形態では、ディスプレーサ剤は標識されておらず、その代わりに、標識は、検出試薬および／またはフック鎖に取り付けられ、その結果、標識は、分析物の存在下で支持体上でのみ検出されることが理解される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、第１の標識が存在せず、ディスプレーサ剤上の標識の検出が分析物を検出および／または定量するために使用され、ディスプレーサ剤がＤＮＡ置換反応を介して作用する場合、ディスプレーサ剤は、フック鎖に結合する（例えば、ハイブリダイズする）。他の実施形態では、第１の標識が検出試薬またはフック鎖上に存在し、ディスプレーサ剤が標識されておらず、ディスプレーサ剤がＤＮＡ置換反応を介して作用する場合、ディスプレーサ剤は、フック鎖またはアンカー鎖のいずれかに結合してもよい。
【００３７】
いくつかの実施形態では、生体分子複合体は、アンカー鎖の表面近接配列に相補的なステム鎖をさらに含み、ここで、ステム鎖およびアンカー鎖は、両方とも一本鎖オリゴヌクレオチドであり、ステム鎖は、アンカー鎖に結合して、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成することが可能である。いくつかの実施形態では、アンカー鎖と共に二本鎖オリゴヌクレオチドを形成することにより、ステム鎖は、例えば、複合体が支持体の表面に崩壊することを防止し、剛性を提供し、支持体の表面と複合体との間にスペーサーを形成し、または構造安定性を提供するために、アンカー鎖に構造的支持を提供することができる。いくつかの実施形態では、ステム鎖はまた、例えば、バーコード、例えば、蛍光色素または発光色素に取り付けることもでき、支持体にバーコード標識を取り付けるために使用することができる。一般に、ステム鎖は、例えば、ハイブリダイゼーションによってアンカー鎖に取り付けられ、支持体に直接的には共有結合しない。
【００３８】
生体分子複合体がアンカーに結合されたステム鎖を含み、支持体の表面に近接してＤＮＡハイブリッドを形成するいくつかの実施形態では、アンカー鎖は、標識に取り付けられる（検出試薬、フック鎖、またはディスプレーサ剤の代わりに、これらはすべて非標識である）。これらの態様において、アンカー鎖は、アンカー鎖がステム鎖にハイブリダイズしたときに不活性であるか、または検出不可能である標識に取り付けられ、アンカー鎖はまた、検出試薬に直接取り付けられる。標識と支持体との間の部位でのＤＮＡハイブリッドが切断に際して、標識が活性化され、または検出可能となる。検出試薬は、分析物の非存在下で支持体から放出され、その結果、シグナルは分析物の存在下で、かつ切断後（すなわち、検出試薬の放出後）にのみ検出される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、支持体上のアンカー鎖および捕捉試薬の相対密度を調節して、アッセイの有効な親和性を制御することができる。いくつかの実施形態では、フック鎖の長さを調節して、アッセイの有効な親和性を制御することができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、検出試薬とフック鎖との間の結合体化の価数は、交差反応性を最小化するように選択され、多重化アッセイにおける性能を最適化する。一実施形態では、検出試薬とフック鎖との間の結合体化は一価である。他の態様において、検出試薬とフック鎖との間の結合は、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７または１：８、または１：６未満、１：８未満、または１：１０未満である。他の実施形態では、検出試薬の少なくとも９０％が、１つのみのフック鎖のみを介して支持体に連結される。
【００４１】
捕捉試薬がアンカー鎖に連結されているいくつかの実施形態では、捕捉試薬と、アンカー鎖へのリンカーとの間の結合体化は一価である。捕捉試薬がアンカー鎖に連結されているいくつかの実施形態において、捕捉試薬と、アンカー鎖へのリンカーとの間の結合体化は、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７または１：８、または１：６未満、１：８未満、または１：１０未満である。いくつかの実施形態では、捕捉試薬の少なくとも９０％が、１つのみの捕捉鎖のみを介してアンカー鎖に連結される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、アンカー鎖および／または捕捉試薬は、支持体上に確率的に分散される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、フック鎖の長さおよび／または柔軟性は、捕捉試薬の存在下で分析物への検出試薬の結合を許容または最適化するように選択することができる。
【００４４】
フック鎖とアンカー鎖との間の連結が二本鎖ＤＮＡハイブリッドであるいくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）は約５０〜約８０℃である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、置換後の検出試薬の濃度は、置換または放出が生じた後に、オフターゲット試薬または分析物への検出試薬の再結合を回避するために、約１０ピコモル濃度未満である。
【００４６】
さらなる実施形態では、生体分子複合体は、２つの検出試薬を含み、分析物が取り付けられるとき、標識の２つのコピーが存在するので、より強いシグナルが生成されることを可能にする。これらの実施形態では、生体分子複合体は、支持体に連結された第２のアンカー鎖と、第２のフック鎖に連結された第２の検出試薬とをさらに含み、第２のフック鎖は、第２のアンカー鎖に連結され、上記第２の検出試薬および上記第２のフック鎖の少なくとも１つは、任意に、第３の標識に取り付けられ、上記捕捉試薬、検出試薬および第２の検出試薬は、試料中に存在する場合には、分析物に同時に結合して、四成分複合体を形成することができる。第２のアンカー鎖からの第２のフック鎖の放出は、分析物の非存在下で支持体から第２の検出試薬を放出しでき、第３の標識を活性化することができる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、第２の検出試薬は、第３の標識に取り付けられる。いくつかの実施形態では、第２のフック鎖は、第３の標識に取り付けられる。第３の標識は、任意の適切な標識、例えば、フルオロフォア、特異的ＤＮＡ配列、またはビオチン部分などであってもよいがこれらに限定されない。
【００４８】
第３の標識が第２の検出試薬および／または第２のフック鎖に取り付けられ、不活性または検出不能であるいくつかの実施形態では、第２のフック鎖が第２のアンカー鎖から放出され、分析物が存在する場合にのみ、第３の標識を活性化または検出することができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、上記生体分子複合体は、上記第２のアンカー鎖から上記第２のフック鎖を放出することが可能である第２のディスプレーサ剤をさらに含み、その結果、上記第２の検出剤は、上記分析物の非存在下で上記支持体から放出される。第２のディスプレーサ剤は、上記ディスプレーサ剤と同様に、酵素反応、開裂、またはオリゴヌクレオチド置換反応によって第２のアンカー鎖から第２のフック鎖を放出することができる。第２のディスプレーサ剤はまた、上記ディスプレーサ剤と同様に、検出可能に標識することもでき、この場合、第２の検出試薬および第２のフック鎖は、一般的に標識されていない（すなわち、第３の標識は存在しない）。第２のディスプレーサ剤は、ディスプレーサ剤と同一であっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、第２のディスプレーサ剤および上記ディスプレーサ剤は同じであり、その結果、一方の剤は、第２のフック鎖上記フック鎖の両方をそれらのそれぞれのアンカー鎖から放出することができる。
【００５０】
一実施形態では、担体に連結されたアンカー鎖と、支持体に連結された捕捉試薬と、フック鎖に連結された検出試薬であって、フック鎖がアンカー鎖に連結され、検出試薬もまた標識されている、検出試薬とを含む、試料中の分析物を検出するための生体分子複合体が提供され、ここで、試料中に存在する場合、捕捉試薬および検出試薬が同時に分析物に結合して、三成分複合体を形成することができ、フック鎖とアンカー鎖との間の連結を破壊することができ、分析物の非存在下で、検出試薬が担体から放出される。
【００５１】
別の実施形態では、支持体に連結されたアンカー鎖と、捕捉鎖に連結された捕捉試薬であって、捕捉鎖がアンカー鎖に連結された、捕捉試薬と、フック鎖に連結された検出試薬であって、フック鎖がアンカー鎖に連結され、検出試薬もまた標識されている、検出試薬とを含む、試料中の分析物の検出のための生体分子複合体が提供され、ここで、試料中に存在する場合、捕捉試薬および検出試薬が同時に分析物に結合して、三成分複合体を形成することができ、フック鎖とアンカー鎖との間の連結を破壊することができ、分析物の非存在下で、検出試薬が担体から放出される。
【００５２】
さらなる実施形態では、担体に連結されたアンカー鎖と、支持体に連結された捕捉試薬と、フック鎖に連結され、フック鎖がアンカー鎖に連結されている検出試薬と、フック鎖への結合により、アンカー鎖とフック鎖との間の連結を破壊することができるディスプレーサ剤を含む、試料中の分析物の検出のための生体分子複合体が提供され、分析物の非存在下での支持体からの検出試薬およびフック鎖の放出をもたらし、ディスプレーサは標識されており、ここで、捕捉試薬および検出試薬は、試料中に存在する場合に、分析物に同時に結合して、第３の複合体を形成することができる。
【００５３】
さらなる実施形態では、担体に連結されたアンカー鎖と、捕捉鎖に連結された捕捉試薬であって、捕捉鎖はアンカー鎖に連結された捕捉試薬と、フック鎖に連結された検出試薬であって、フック鎖がアンカー鎖に連結された検出試薬と、フック鎖に結合することにより、アンカー鎖とフック鎖との間の連結を破壊して、分析物の非存在下での支持体からの検出試薬およびフック鎖の放出をもたらすことができるディスプレーサ剤とを含む、試料中の分析物の検出のための生体分子複合体が提供され、ディスプレーサ剤は標識されており、捕捉試薬および検出試薬は、試料中に存在する場合には、同時に分析物に結合して、三成分複合体を形成することができる。
【００５４】
別の実施形態では、担体に連結されたアンカー鎖と、支持体に連結された捕捉試薬と、フック鎖に連結された検出試薬であって、フック鎖は、アンカー鎖に連結され、不活性化された標識を含む、検出試薬と、アンカー鎖とフック鎖との間の連結を破壊して、分析物の非存在下での支持体からの検出試薬およびフック鎖の放出をもたらすことが可能なディスプレーサ剤とを含む、試料中の分析物の検出のための生体分子複合体が提供され、捕捉試薬および検出試薬は、試料中に存在する場合には、同時に分析物に結合して三成分複合体を形成し、アンカー鎖とフック鎖との間の連結を破壊することができる。
【００５５】
別の実施形態では、支持体に連結されたアンカー鎖と、アンカー鎖に連結された捕捉鎖に連結された捕捉試薬と、アンカー鎖に連結されたフック鎖に連結された検出試薬であって、フック鎖が不活性化された標識を含む検出試薬と、アンカー鎖への結合によって、アンカー鎖とフック鎖との間の連結を破壊して、分析物の非存在下での支持体からの検出試薬およびフック鎖の放出をもたらすことが可能なディスプレーサ剤とを含む、試料中の分析物の検出のための生体分子複合体が提供され、捕捉試薬および検出試薬は、試料中に存在する場合に、分析物に同時に結合して、三成分複合体を形成し、アンカー鎖とフック鎖との間の連結を破壊することができ、アンカー鎖とフック鎖との間の連結を破壊することは、フック鎖上での標識を活性化する。
【００５６】
別の実施形態では、支持体に連結されたアンカー鎖と、アンカー鎖に連結されている捕捉鎖に連結された捕捉試薬と、アンカー鎖に連結され、不活性化された標識を含むフック鎖に連結された検出試薬と、アンカー鎖とフック鎖との間の連結を破壊して、分析物の非存在下のみでの支持体からの検出試薬およびフック鎖の放出をもたらすことが可能なディスプレーサ剤とを含む、試料中の分析物の検出のための生体分子複合体が提供され、ここで、捕捉試薬および検出試薬が同じであり、分析物が反復エピトープを有し、試料中に存在する場合には、捕捉試薬および検出試薬が同時に分析物に結合して三成分複合体を形成し、アンカー鎖とフック鎖との間の連結を破壊することは、上記フック鎖上の上記標識を活性化する。
【００５７】
さらなる実施形態では、支持体に連結されたアンカー鎖と、アンカー鎖に連結されている捕捉鎖に連結された捕捉試薬と、アンカー鎖に連結されたフック鎖に連結された検出試薬と、アンカー鎖とフック鎖との間の連結を破壊して、分析物の非存在下のみでの支持体からの検出試薬およびフック鎖の放出をもたらすことが可能なディスプレーサ剤とを含む、試料中の分析物の検出のための生体分子複合体が提供され、ディスプレーサ剤は標識されており、捕捉試薬および検出試薬が同じであり、分析物が反復エピトープを有し、試料中に存在する場合、捕捉試薬および検出試薬は同時に分析物に結合して三成分複合体を形成することができる。
【００５８】
別の実施形態では、支持体に連結された第１のアンカー鎖と、支持体に連結された第２のアンカー鎖と、支持体に連結された捕捉試薬と、第１のアンカー鎖に連結され、不活性化された第１の標識を含む第１のフック鎖に連結された第１の検出試薬と、第２のアンカー鎖に連結され、不活性化された第２の標識を含む第２のフック鎖に連結された第２の検出試薬と、第１のアンカー鎖と第１のフック鎖との間の連結を破壊して、分析物の非存在下での支持体からの第１の検出試薬および第１のフック鎖の放出をもたらすことが可能な第１のディスプレーサ剤と、第２のアンカー鎖と第２のフック鎖との間の連結を破壊して、分析物の非存在下での支持体からの第２の検出試薬および第２のフック鎖の放出をもたらすことが可能な第２のディスプレーサ剤とを含む、試料中の分析物の検出のための生体分子複合体が提供され、ここで、捕捉試薬、第１の検出試薬、および第２の検出試薬は、試料中に存在する場合、分析物に同時に結合して四成分複合体錯体を形成することができ、アンカー鎖と第１のフック鎖との間の連結を破壊することは、第１のフック鎖上の第１の標識を活性化し、アンカー鎖と第２のフック鎖との間の連結を破壊することは、第２のフック鎖上の第２の標識を活性化する。
【００５９】
別の実施形態では、支持体に連結された第１のアンカー鎖と、支持体に連結された第２のアンカー鎖と、支持体に連結された捕捉試薬と、第１のアンカー鎖に連結された第１のフック鎖に連結された第１の検出試薬と、第２のアンカー鎖に連結された第２のフック鎖に連結された第２の検出試薬と、第１のフック鎖に結合することにより、第１のアンカー鎖と第１のフック鎖との間の連結を破壊して、分析物の非存在下で、支持体から第１の検出試薬および第１のフック鎖の放出をもたらすことが可能である、標識されている第１のディスプレーサ剤と、第２のフック鎖に結合することにより、第２のアンカー鎖と第２のフック鎖との間の連結を破壊して、分析物の非存在下で、支持体から第２の検出試薬および第２のフック鎖の放出をもたらすことが可能である、標識されている第２のディスプレーサ剤とを含む、試料中の分析物の検出のための生体分子複合体が提供され、ここで、捕捉試薬、第１の検出試薬、および第２の検出試薬は、試料中に存在する場合、分析物に同時に結合して四成分複合体を形成することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、支持体は、微粒子、ウェルプレートの表面、ガラススライドの表面、またはヒドロゲルマトリックスである。
【００６１】
いくつかの実施形態では、捕捉試薬および検出試薬は抗体である。いくつかの実施形態では、分析物は抗原である。いくつかの実施形態では、分析物は、マルチタンパク質複合体である。いくつかの実施形態では、分析物は、エキソソームである。
【００６２】
他の実施形態では、捕捉試薬および検出試薬は抗原であり、分析物は抗体である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、共有結合を介して、またはビオチン−ストレプトアビジン結合を介して、担体に取り付けられる。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカーを介して、またはＰＥＧリンカーのようなポリマーリンカーを介して、支持体に連結される。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ＰＥＧリンカーのようなポリマーリンカーを介して、またはＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカーを介して、支持体に取り付けられる。
【００６４】
一実施形態では、フック鎖、アンカー鎖、およびディスプレーサ剤は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００６５】
さらなる実施形態では、フック鎖とアンカー鎖との間の連結は、二本鎖ＤＮＡハイブリッドである。
【００６６】
一実施形態では、アンカー鎖と支持体との間の連結は、共有結合またはビオチン−ストレプトアビジン結合である。別の実施形態では、アンカー鎖は、任意の適切な手段、例えば、非限定的に、共有結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合、ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカー、ポリマーリンカー、または水素結合、疎水性相互作用、親和性結合、または非共有結合的相互作用などの別の化学的相互作用を用いて支持体に取り付けられてもよいことが理解されるべきである。
【００６７】
さらなる実施形態では、ディスプレーサ剤は、ＤＮＡ鎖置換反応を介して、フック鎖とアンカー鎖との間の連結を破壊する。
【００６８】
別の実施形態では、ディスプレーサ剤は、酵素反応を介して、フック鎖とアンカー鎖との間の連結を破壊する。
【００６９】
一実施形態では、標識はフルオロフォアである。一実施形態では、標識は特異的ＤＮＡ配列である。一実施形態では、標識はビオチン部分である。
【００７０】
別の実施形態では、検出試薬は、捕捉試薬と同一の抗原を認識するが、同一のエピトープを認識しない。
【００７１】
別の実施形態では、検出試薬は、捕捉試薬によって結合された同じ抗原上に結合した異なるエピトープを認識する。
【００７２】
別の実施形態では、検出試薬は、捕捉試薬によって結合された同じ抗原上の同一のエピトープを認識する。
【００７３】
別の実施形態では、本明細書に記載の生体分子複合体は、アンカー鎖の表面近接配列に相補的なステム鎖をさらに含み、ステム鎖は、アンカーオリゴヌクレオチド二本鎖をレンダリングする。
【００７４】
一実施形態では、アンカー鎖および捕捉試薬の相対密度は、アッセイの有効な親和性を制御するように調節される。
【００７５】
別の実施形態では、分析物の検出の長さ（例えば、フック鎖の長さ）を調整して、検出の有効な親和性を制御する。
【００７６】
別の実施形態では、検出試薬とフック鎖との間の結合体化は一価である。
【００７７】
一実施形態では、アンカー鎖は確率的に分散される。別の実施形態では、捕捉試薬は確率的に分散される。
【００７８】
試料からの分析物を検出するための方法であって、支持体、捕捉試薬、アンカー鎖、フック鎖、および検出試薬を提供する工程であって、捕捉試薬は支持体に連結され、アンカー鎖は支持体とフック鎖に連結され、フック鎖は検出試薬に連結され、検出試薬は標識されている、提供する工程、支持体とともに試料をインキュベートして、分析物上の異なるエピトープへの捕捉試薬および検出試薬の結合を可能にする工程、フック鎖とアンカー鎖との間の結合を破壊する工程、捕捉試薬および検出試薬に結合した分析物の非存在下で、支持体から検出試薬およびフック鎖を分離する工程、ならびに支持体上に残存する検出試薬標識を分析することにより、結合した分析物の量を定量する工程を含む、方法が提供され、支持体上に残存する検出試薬の標識濃度は、結合した分析物の濃度に比例する。
【００７９】
試料からの分析物を検出するための方法であって、支持体、アンカー鎖、捕捉鎖、捕捉試薬、フック鎖、および検出試薬を提供する工程であって、アンカー鎖は支持体、捕捉鎖およびフック鎖に連結され、捕捉鎖は捕捉試薬に連結され、フック鎖は検出試薬に連結されている、提供する工程、支持体とともに試料をインキュベートして、捕捉試薬および検出試薬を、分析物上の異なるエピトープに結合させることを可能にする工程、捕捉試薬および検出試薬に結合された分析物の非存在下で、支持体から検出試薬およびフック鎖を分離することにより、フック鎖とアンカー鎖との間の結合を破壊する工程、ならびに支持体上に残っている検出試薬標識を分析することによって、結合した分析物の量を定量する工程を含む、方法が提供され、支持体上に残存する検出試薬の標識濃度は、結合した分析物の濃度に比例する。
【００８０】
試料からの分析物を検出するための方法であって、支持体、捕捉試薬、アンカー鎖、フック鎖、および検出試薬を提供する工程であって、捕捉試薬が支持体に連結され、アンカー鎖が支持体およびフック鎖に連結され、フック鎖が検出試薬に連結されている、提供する工程、支持体とともに試料をインキュベートして、捕捉試薬および検出試薬を、分析物上の異なるエピトープに結合させることを可能にする工程、捕捉試薬と検出試薬の両方に結合された分析物の非存在下で、支持体から検出試薬およびフック鎖を分離する工程であって、ディスプレーサ剤が標識されている、分離する工程、ならびに支持体上に残っているディスプレーサ剤を分析することによって、結合した分析物の量を定量する工程を含む、方法が提供され、支持体上に残存するディスプレーサ剤の標識濃度は、結合した分析物の濃度に比例する。
【００８１】
別の実施形態では、試料からの分析物を検出するための方法であって、支持体、アンカー鎖、捕捉鎖、捕捉試薬、フック鎖、および検出試薬を提供する工程であって、アンカー鎖は支持体および捕捉鎖に連結され、捕捉鎖は捕捉試薬に連結され、アンカー鎖はフック鎖に連結され、フック鎖は検出試薬に連結される、提供する工程、支持体とともに試料をインキュベートして、捕捉試薬および検出試薬を、分析物上の異なるエピトープに結合させることを可能にする工程、フック鎖に結合することによりフック鎖とアンカー鎖との間の結合を破壊するために、ディスプレーサ剤とともにインキュベートする工程、捕捉試薬と検出試薬の両方に結合した分析物の非存在下で、検出試薬およびフック鎖を支持体から分離する工程であって、ディスプレーサ剤が標識されている、分離する工程、ならびに、支持体上に残存しているディスプレーサ剤を分析することによって、結合した分析物の量を定量する工程を含む、方法が提供され、支持体上に残存するディスプレーサ剤の標識濃度は、結合した分析物の濃度に比例する。
【００８２】
試料からの分析物を検出するための方法であって、支持体、捕捉試薬、アンカー鎖、フック鎖、および検出試薬を提供する工程であって、捕捉試薬が支持体に連結され、アンカー鎖が支持体とフック鎖に連結され、フック鎖が検出試薬に連結され、フック鎖が不活性化された標識を含む、提供する工程、試料を支持体とともにインキュベートして、同じ分析物上の異なるエピトープへの捕捉試薬および検出試薬の結合を可能にする工程、フック鎖とアンカー鎖との間の結合を破壊するために、ディスプレーサ剤とともにインキュベートする工程、捕捉試薬と検出試薬の両方に結合した分析物の非存在下で、支持体から検出試薬およびフック鎖を支持体から分離する工程であって、アンカー鎖からフック鎖を分離することは、フック鎖上の標識を活性化する、分離する工程、ならびに支持体上に残存しているフック鎖標識を分析することにより、結合した分析物の量を定量する工程を含む、方法が提供され、支持体上に残存するフック鎖の標識濃度は、結合した分析物の濃度に比例する。
【００８３】
試料からの分析物を検出するための方法であって、支持体、アンカー鎖、捕捉鎖、捕捉試薬、フック鎖、および検出試薬を提供する工程であって、アンカー鎖が支持体、捕捉鎖およびフック鎖に連結され、捕捉鎖は捕捉試薬に連結され、フック鎖は検出試薬に連結され、不活性化された標識を含む、提供する工程、試料を支持体とともにインキュベートして、捕捉試薬および検出試薬を分析物上の異なるエピトープへの結合を可能にする工程、アンカー鎖に結合することにより、フック鎖とアンカー鎖との間の結合を破壊するためにディスプレーサ剤とともにインキュベートする工程、捕捉試薬と検出試薬の両方に結合した分析物の非存在下でのみ、支持体から検出試薬およびフック鎖を分離する工程であって、フック鎖をアンカー鎖から分離することは、フック鎖上の標識を活性化する、分離する工程、ならびに支持体上に残存しているフック鎖標識を分析することにより、結合した分析物の量を定量する工程を含む、方法がさらに提供され、支持体上に残存するフック鎖の標識濃度は、結合した分析物の濃度に比例する。
【００８４】
試料からの分析物を検出するための方法であって、支持体、アンカー鎖、捕捉鎖、フック鎖、捕捉試薬および検出試薬を提供する工程であって、アンカー鎖が支持体、捕捉鎖およびフック鎖に連結され、捕捉鎖は捕捉試薬に連結され、フック鎖は検出試薬に連結され、不活性化された標識を含み、捕捉試薬および検出試薬は構造的に類似している、提供する工程、試料を支持体とともにインキュベートして、捕捉試薬および検出試薬の分析物上の異なるエピトープへの結合を可能にする工程であって、これらのエピトープが構造的に類似している、工程、フック鎖とアンカー鎖との間の結合を破壊するためにディスプレーサ剤とともにインキュベートする工程、捕捉試薬と検出試薬の両方に結合した分析物の非存在下で、支持体から検出試薬およびフック鎖を分離する工程であって、フック鎖をアンカー鎖から分離することは、フック鎖上の標識を活性化する、分離する工程、ならびに支持体上に残存しているフック鎖標識を分析することにより、結合した分析物の量を定量する工程を含む、方法もまた提供され、支持体上に残存するフック鎖の標識濃度は、結合した分析物の濃度に比例する。
【００８５】
試料からの分析物を検出するための方法であって、支持体、アンカー鎖、捕捉鎖、フック鎖、捕捉試薬および検出試薬を提供する工程であって、アンカー鎖が支持体、捕捉鎖およびフック鎖に連結され、捕捉鎖は捕捉試薬に連結され、捕捉試薬および検出試薬は構造的に類似している、提供する工程、試料を支持体とともにインキュベートして、捕捉試薬および検出試薬の分析物上の異なるエピトープへの結合を可能にする工程であって、これらのエピトープが構造的に類似している、工程、フック鎖に結合することにより、フック鎖とアンカー鎖との間の結合を破壊するために、ディスプレーサ剤とともにインキュベートする工程、捕捉試薬と検出試薬の両方に結合した分析物の非存在下で、支持体から検出試薬およびフック鎖を分離する工程であって、ディスプレーサ剤が標識されている、分離する工程、ならびに支持体上に残存しているディスプレーサ鎖標識を分析することにより、結合した分析物の量を定量する工程を含む、方法がさらに提供され、支持体上に残存するディスプレーサ鎖の標識濃度は、結合した分析物の濃度に比例する。
【００８６】
一実施形態では、捕捉試薬および検出試薬はペプチドである。一実施形態では、捕捉試薬は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカーを介して支持体に取り付けられる。別の実施形態では、検出試薬はＰＥＧリンカーを介して支持体に取り付けられる。
【００８７】
さらなる実施形態では、フック鎖、アンカー鎖およびディスプレーサ剤は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、フック鎖とアンカー鎖との間の連結は、二本鎖ＤＮＡハイブリッドである。さらなる実施形態では、アンカー鎖と支持体との間の連結は、共有結合である。一実施形態では、アンカー鎖と支持体との間の連結は、ビオチン−ストレプトアビジン結合である。
【００８８】
一実施形態では、ディスプレーサ剤は、ＤＮＡ鎖置換反応を介して、フック鎖とアンカー鎖との間の連結を破壊する。一実施形態では、ディスプレーサ剤は、酵素反応を介して、フック鎖とアンカー鎖との間の連結を破壊する。
【００８９】
別の実施形態では、標識はビオチン部分である。
【００９０】
さらなる実施形態では、アンカー鎖は、化学的相互作用を介して微粒子に取り付けられる。
【００９１】
別の実施形態では、検出試薬は、捕捉試薬と同一の抗原を認識するが、同一のエピトープを認識しない。さらなる実施形態では、検出試薬は、捕捉試薬によって結合されたのと同じ抗原に結合した異なる抗原を認識する。一実施形態では、検出試薬は、捕捉試薬によって結合されたのと同じ抗原の異なる位置で同一のエピトープを認識する。
【００９２】
一実施形態では、本明細書に記載の生体分子複合体は、アンカー鎖の表面近接配列に相補的なステム鎖をさらに含み、アンカーオリゴヌクレオチド二本鎖をレンダリングする。
【００９３】
一実施形態では、アンカー鎖および捕捉試薬の相対密度は、アッセイの有効な親和性を制御するように調整される。
【００９４】
一実施形態では、分析物（例えば、フック鎖）の検出の長さを調整して、検出の有効な親和性を制御する。
【００９５】
一実施形態では、検出試薬とフック鎖との間の結合は一価である。
【００９６】
別の実施形態では、アンカー鎖は確率的に分散される。
【００９７】
さらなる実施形態では、捕捉試薬は確率的に分散される。
【００９８】
試料中の複数の分析物の検出のための複数の複合体検出システムもまた提供され、これは、複数の支持体、複数の捕捉試薬であって、各々がそのそれぞれの支持体に結合されている捕捉試薬、複数の検出試薬であって、各々がリンカーを介してそのそれぞれの支持体に結合されており、かつ標識されている検出試薬を含み、各支持体上で、各検出試薬がリンカーを介してそれぞれの支持体に取り付けられ、検出試薬が標識され、各支持体上で検出試薬が標識される、捕捉試薬および検出試薬は、試料中に存在する場合には、支持体特異的分析物に同時に結合して三成分複合体を形成することができ、検出試薬とそれらのそれぞれの支持体との間のリンカーは切断され、分析物の非存在下で支持体から検出試薬を放出することができる。
【００９９】
試料中の複数の分析物の検出のための複数の複合体検出システムがさらに提供され、これは、複数の支持体、複数の捕捉試薬であって、各々がそのそれぞれの支持体に結合されている捕捉試薬、複数の検出試薬であって、各々が支持体特異的フック鎖を介してそのそれぞれの支持体に結合されており、各フック鎖は、支持特異的不活性化標識を含む、検出試薬、複数のフック鎖と複数の支持体との間の結合を破壊し、検出試薬をそれぞれの支持体から分離することが可能であるディスプレーサ剤とを含み、ここで、各支持体上で、捕捉試薬および検出試薬は、試料中に存在する場合には、支持体特異的分析物に同時に結合して三成分複合体を形成することができ、支持体とフック鎖との間の結合を破壊することは、フック鎖上の担体特異的標識を活性化する。
【０１００】
試料中の複数の分析物の検出のための複数の複合体検出システムもまた提供され、これは、複数の支持体、複数の捕捉試薬であって、各々がそのそれぞれの支持体に結合されている捕捉試薬、複数の検出試薬であって、各々が支持体特異的フック鎖を介してそのそれぞれの支持体に結合されている、検出試薬、複数のフック鎖と複数の支持体との間の結合を破壊し、フック鎖と支持体との間の結合の破壊に際して、ディスプレーサ剤がフック鎖に結合し、標識されている、ディスプレーサ剤を含み。ここで、各支持体上で、捕捉試薬および検出試薬は、試料中に存在する場合には、支持体特異的分析物に同時に結合して三成分複合体を形成することができる。
【０１０１】
一実施形態では、試料中の複数の分析物の検出のための複数の複合体検出システムもまた提供され、これは、複数の支持体、複数の捕捉試薬であって、各々がそのそれぞれの支持体に結合されている捕捉試薬、複数の検出試薬であって、すべての検出試薬がそのそれぞれの支持体に結合されており、各検出試薬は、不活性化された標識を含み、検出試薬とそれらのそれぞれの支持体の間の連結は破壊することができ、ここで、各支持体上で、捕捉試薬および検出試薬は、試料中に存在する場合には、支持体特異的分析物に同時に結合して三成分複合体を形成することができ、検出試薬とそれらのそれぞれの支持体との間の連結を破壊する際には、検出試薬標識が活性化される。
【０１０２】
試料中の複数の分析物を検出するための方法がさらに提供され、これは、支持体、アンカー鎖、捕捉鎖、フック鎖、捕捉試薬および検出試薬を提供する工程であって、アンカー鎖は支持体に連結され、アンカー鎖は捕捉鎖にも連結され、捕捉鎖は捕捉試薬にも連結され、アンカー鎖はフック鎖にも連結され、フック鎖は検出試薬にも連結されている、提供する工程、同一の分析物上の異なるエピトープに捕捉試薬および検出試薬を結合させることを可能にする条件下で、試料を支持体とともにインキュベートする工程、フック鎖に結合することによって、フック鎖とアンカー鎖との間の結合を破壊するために、ディスプレーサ剤とともにインキュベートする工程、捕捉試薬と検出試薬の両方に結合した分析物の非存在下でのみ、支持体から検出試薬およびフック鎖を分離する工程であって、ディスプレーサ剤が標識されている、工程、支持体上に残存するディスプレーサ鎖標識を分析することにより、結合された分析物の量を定量する工程を含み、ここで、支持体上に残存するディスプレーサ鎖標識濃度は、結合した分析物の濃度の変化に比例する。
【０１０３】
試料中の複数の分析物を検出するための方法がさらに提供され、これは、支持体、アンカー鎖、捕捉鎖、フック鎖、捕捉試薬および検出試薬を提供する工程であって、アンカー鎖は支持体に連結され、捕捉鎖は支持体に連結され、アンカー鎖があり、フック鎖は支持体に連結され、フック鎖は検出試薬に連結されている、提供する工程、同一の分析物上の異なるエピトープに捕捉試薬および検出試薬を結合させることを可能にする条件下で、試料を支持体とともにインキュベートする工程、フック鎖と支持体との間の結合を破壊する工程、捕捉試薬と検出試薬の両方に結合した分析物の非存在下でのみ、支持体から検出試薬およびフック鎖を分離する工程、架橋鎖とともにインキュベートする工程であって、この架橋鎖はアンカー鎖をフック鎖に連結し、この架橋鎖は標識されている、工程、ならびに支持体上に残存する架橋鎖標識を分析することにより、結合された分析物の量を定量する工程を含み、ここで、支持体上に残存する架橋鎖標識濃度は、結合した分析物の濃度の変化に比例する。
【０１０４】
いくつかの態様において、フック鎖は、標識配列、すなわち検出できる独特なＤＮＡ配列を含めることを介して標識される。いくつかのそのような実施形態では、フック鎖は、再結合配列をさらに含み、アンカー鎖に結合するディスプレーサ剤オリゴヌクレオチドを使用して、アンカー鎖からフック鎖を放出した後、架橋鎖が付加され、ここで、架橋鎖は、フック鎖とアンカー鎖の両方の再結合配列に結合することができ、それによって、フック鎖をアンカー鎖に間接的に再接続する。このような態様において、フック鎖に取り付けられた標識が、アンカー鎖からの放出によって活性化または検出可能にされた後、活性／検出可能な標識を有するフック鎖は、支持体に再取り付けされる。
【０１０５】
１つの実施形態では、試料中の分析物の検出および／または定量のための生体分子複合体がさらに提供され、これは、ａ）支持体に取り付けられたアンカー鎖、ｂ）支持体に取り付けられた捕捉試薬、ｃ）フック鎖に連結された検出試薬であって、フック鎖はアンカー鎖に放出可能に取り付けられ、フック鎖およびアンカー鎖は、二本鎖ＤＮＡハイブリッドによって互いに連結されている、検出試薬、およびｄ）フック鎖の少なくとも一部に相補的であり、フック鎖にハイブリダイズすることが可能であるＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、それによって、ＤＮＡ置換反応を介してアンカー鎖からフック鎖を放出し、ディスプレーサ剤は検出可能に標識されており、ここで、捕捉試薬および検出試薬は、試料中に存在する場合に、分析物に同時に結合して、三成分複合体を形成し、そしてディスプレーサ剤によるアンカー鎖からのフック鎖の放出が、分析物の非存在下で、検出試薬を支持体から放出することができる。一実施形態では、捕捉試薬および検出試薬は抗体であり、分析物は抗原またはタンパク質であり、支持体はバーコード化微粒子である。
【０１０６】
第２の態様では、試料中の２つ以上の分析物の同時検出および／または同時定量のための多重サンドイッチアッセイシステムが提供され、このシステムは、本明細書に記載されるような２つ以上の生体分子複合体を含み、各生体分子複合体は、試料中の異なる分析物の検出および／または定量のためのものである。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、２つ以上の生体分子複合体は、同じ支持体に取り付けられる。例えば、支持体は、平坦な表面、マルチウェルプレートの表面、ガラススライドの表面、ヒドロゲルマトリックス、微粒子などであってもよい。このような実施形態では、各生体分子複合体は、支持体上の別個の場所に配置され、各標識された複合体（従って、各分析物）がその位置によって同定されることを可能にする。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、２つ以上の生体分子複合体は、異なる担体、例えば、異なるバーコード化微粒子に取り付けられる。例えば、第１の生体分子複合体は、バーコード化された第１のビーズに、例えば、第１の蛍光性または発光性の染料または染料の混合物、例えば、第１の蛍光色素または発光色素または色素の混合物に、例えば、スペクトル的、図形的、または化学的に取り付けられた第１のビーズに取り付けられてもよく、第２の生体分子複合体は、これもまたバーコード化された第２のビーズに、例えば、第２の蛍光性または発光性の染料または染料の混合物、例えば、第２の蛍光色素または発光色素または色素の混合物に、例えば、スペクトル的、図形的、または化学的に取り付けられた第２のビーズに取り付けられてもよい。第１の複合体および第２の複合体がそれぞれのビーズ上に組み立てられた後、これらを混合し、試料と一緒に接触させることができ、試料中の２つの異なる被分析物の同時検出を可能にする。ビーズ上のバーコード化は、各標識された複合体（従って、各分析物）が同定されることを可能にする。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、２つ以上の生体分子複合体のうちの１つ以上は、第２のアンカー鎖、第２のフック鎖に連結された第２の検出試薬などを含み、その結果、捕捉試薬と、２つの検出試薬と、分析物との間に四成分錯体が形成される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、２つ以上の生体分子複合体はすべて、検出試薬またはフック鎖上に任意の第１の標識を欠いており、標識は、ディスプレーサ剤にのみ提供される。いくつかの態様において、同じ標識されたディスプレーサ剤は、各生体分子複合体のそれぞれのアンカー鎖からそれぞれのフック鎖を放出するために使用され、各生体分子複合体（およびそのそれぞれの分析物）は、表面上のその位置によって、または、特に表面が微小粒子である場合の表面のバーコード化によって同定される。他の実施形態では、異なる標識を有する異なるディスプレーサ剤を、各生体分子複合体のために使用してもよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、２つ以上の生体分子複合体は、各々が同一の分析物を検出および／または定量することができ、各生体分子複合体は、分析物に対して異なる有効親和性を有する。例えば、分析物に対する生体分子複合体の有効親和性は、フック鎖および／もしくはアンカー鎖の長さを調節すること、ならびに／または捕捉試薬および／もしくは検出試薬の表面密度を調節することによって選択することができる。このようにして、分析物を広範囲の濃度にわたってアッセイすることができる。
【０１１２】
アッセイの有効親和性を制御するようにフック鎖および／もしくはアンカー鎖の長さを調整することができ、ならびに／または捕捉試薬および／もしくは検出試薬の表面密度を調整してアッセイの有効な親和性を制御することができる。
【０１１３】
多重サンドイッチアッセイ系において同時に検出および／または定量することができる分析物の数は、特に限定されないことが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、多重サンドイッチアッセイシステムは、試料中、５以上の分析物、１０以上の分析物、１５以上の分析物、２０以上の分析物、３０以上の分析物、４０以上の分析物、５０以上の分析物、７５以上の分析物、または１００以上の分析物の同時の検出および／または定量のために用いることができ、このシステムは、それぞれの分析物に特異的なそれぞれの生体分子複合体を含む。このように、多重サンドイッチアッセイシステムは、大規模多重化のために容易に拡張可能である。
【０１１４】
第３の態様では、本明細書に記載の生体分子複合体を用いて、試料中の分析物を検出および／または定量する方法が提供される。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の２つ以上の生体分子複合体を用いて、試料中の２つ以上の分析物の同時の検出および／または定量のための方法が提供され、ここで、各生体分子複合体は、試料中の異なる分析物の検出および／または定量のためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重サンドイッチアッセイシステムを用いて試料中の２つ以上の分析物の同時の検出および／または定量のための方法が提供され、このシステムは、本明細書に記載されるような２つ以上の生体分子複合体を含み、各生体分子複合体は、試料中の異なる分析物の検出および／または定量のためのものである。本明細書で提供される方法は、試料中の多数の分析物の同時の検出および／または定量のために使用することができ、この方法は、大規模な多重化を可能にするように拡張可能であることを理解すべきである。
【０１１６】
一実施形態では、試料中の分析物を検出および／または定量するための方法が提供され、この方法は、ａ）支持体と、支持体に結合した捕捉試薬と、支持体に取り付けられたアンカー鎖と、フック鎖に任意に連結された検出試薬とを提供する工程であって、検出試薬またはフック鎖は、アンカー鎖に放出可能に連結されており、検出試薬およびフック鎖の少なくとも一方が、任意に、第１の標識に取り付けられており、第１の標識は、不活性または検出不可能である、提供する工程、ｂ）捕捉試薬および検出試薬の分析物への同時結合を可能にする条件下で、担体を試料と接触させて、三成分複合体を形成する工程、およびｃ）第２の標識に任意に取り付けられたディスプレーサ剤を添加する工程を含み、このディスプレーサ剤は、検出試薬またはフック鎖をアンカー鎖から放出し、その結果、フック鎖に任意に連結された検出試薬は、分析物の非存在下で支持体から放出され、アンカー鎖からの検出鎖またはフック鎖の放出は、第１の標識を活性化し、または第１の標識を検出可能にする。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、この方法は、支持体上の第１の標識および／または第２の標識の存在および／または量を決定する工程をさらに含み、支持体上の第１および／または第２の標識の存在は、試料中の分析物の存在を示し、第１の標識および／または第２の標識の量は、試料中の分析物の量および／または濃度に比例する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本方法は、工程（ｃ）の後に、未結合の試薬または物質を除去するために、担体を洗浄する工程をさらに含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本方法は、工程（ｃ）の後に支持体を保存する工程をさらに含む。
【０１２０】
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態では、支持体は、支持体に取り付けられた第２のアンカー鎖、支持体に取り付けられた第２の捕捉試薬、および第２のフック鎖に取り付けられた第２の検出試薬をさらに含み、第２の検出試薬または第２のフック鎖は、第２のアンカー鎖に取り付けられ、第２の検出試薬および第２のフック鎖の少なくとも一方は、任意に第３の標識に取り付けられ、第３の標識は、不活性または検出不能であり、第２の捕捉試薬および第２の検出試薬は、試料中の第２の分析物に同時に結合することができ、第２の三成分複合体を形成し、ディスプレーサ剤はまた、第２の検出試薬または第２のフック鎖を第２のアンカー鎖から放出し、その結果、第２の分析物の非存在下で第２のフック鎖に任意に連結された第２の検出試薬が支持体から放出され、第２のアンカー鎖からの第２の検出試薬または第２のフック鎖の放出は第３の標識を活性化し、または第３の標識を検出可能にし、支持体上の第３の標識の存在および／または量は、試料中の第２の分析物の存在を示し、そして支持体上の第３の標識の量は、試料中の第２の分析物の量および／または濃度に比例し、その結果、第１の分析物および第２の分析物は、試料中で同時に検出および／または定量できる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、第２のアンカー鎖および第２の捕捉試薬は、支持体上の第１の位置および第２の位置にそれぞれ配置される。他の実施形態では、第２のアンカー鎖および第２の捕捉試薬は、第２の支持体に取り付けられる。支持体および／または第２の支持体は、例えば、ポリスチレンビーズのような微粒子であってもよい。一実施形態では、第１の支持体は、第１のバーコード化ビーズ（すなわち、第１の蛍光色素または発光色素または第１の色素の混合物などの、第１のバーコードでエンコードされた第１のビーズ）であり、第２の支持体は、第２のバーコード化ビーズ（すなわち、第２の蛍光色素または発光色素または第２の色素の混合物などの、第２のバーコードでエンコードされた第２のビーズ）であり、それぞれのバーコードが検出されるときに、それぞれのビーズの同定を可能にする。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、第１の支持体および第２の支持体は、試料と接触する前に一緒に混合される。例えば、第１の支持体および第２の支持体は、同時に試料と接触させることができる。試料は、生物学的試料、例えば、非限定的に、体液、抽出物、タンパク質および／もしくはＤＮＡを含む溶液、細胞抽出物、細胞溶解物、または組織溶解物であってもよい。体液の非限定的な例としては、尿、唾液、血液、血清、血漿、脳脊髄液、涙液、精液、および汗が挙げられる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、この方法は、標識配列、すなわち検出できる独特なＤＮＡ配列を含めることを介して標識されるフック鎖を使用する。いくつかのこのような実施形態では、フック鎖は、再結合配列をさらに含み、アンカー鎖に結合するディスプレーサ剤オリゴヌクレオチドを使用して、アンカー鎖からのフック鎖の放出、および任意の洗浄後、架橋鎖は、フック鎖上の再結合配列とアンカー鎖の両方に結合し、それによって、フック鎖をアンカー鎖に間接的に再結合させる。このような態様において、フック鎖に取り付けられた標識が、アンカー鎖からの放出によって活性化されるかまたは検出可能にされた後、活性／検出可能な標識を有するフック鎖は、支持体に再取り付けされる。
【０１２４】
一実施形態では、試料中の分析物の検出および／または定量のための方法が提供され、この方法は、ａ）支持体、支持体に取り付けられた捕捉試薬、支持体に取り付けられたアンカー鎖、およびフック鎖に結合した検出試薬を提供する工程であって、フック鎖は、二本鎖ＤＮＡハイブリッドによってアンカー鎖に放出可能に連結されている、提供する工程、ｂ）捕捉試薬と検出試薬の分析物への同時結合を可能にする条件下で、支持体を分析物と接触させて三成分複合体を形成させる工程、およびｃ）検出可能な標識に取り付けられたディスプレーサ剤を添加する工程であって、ディスプレーサ剤は、フック鎖の少なくとも一部に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、フック鎖にハイブリダイズすることが可能であり、ディスプレーサ剤は、検出試薬が分析物の非存在下で支持体から放出されるように、ＤＮＡ置換反応を介してアンカー鎖からフック鎖を放出する、添加する工程、ならびにｄ）支持体上の検出可能な標識の存在および／または量を任意に決定する工程であって、支持体上の標識の存在は、試料中の分析物の存在を示し、そして標識の量は、試料中の分析物の量および／または濃度に比例する、決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、捕捉試薬および検出試薬は抗体であり、分析物は抗原またはタンパク質であり、担体はバーコード化微粒子である。バーコード化微粒子は、例えば、スペクトル的に、グラフ的に、または化学的にバーコード化されていてもよい。
【０１２５】
第４の態様では、多重サンドイッチアッセイシステムを調製するための方法が提供され、この方法は、ａ）、第１のバーコードでコード化されている第１の微粒子を含む第１の容器を提供する工程、（ｂ）第１の捕捉試薬および第１の検出試薬に第１の微粒子を取り付ける工程、（ｃ）任意に、第１の微粒子を保存する工程、（ｄ）第２のバーコードでコード化されている第２の微粒子を含む第２の容器を提供する工程、（ｅ）第２の捕捉試薬および第２の検出試薬に第２の微粒子を取り付ける工程、（ｆ）任意に、第２の微粒子を保存する工程、および（ｇ）多重サンドイッチアッセイ系における使用のために第１の微粒子および第２の微粒子を一緒に混合する工程を含み、第１の捕捉試薬および第１の検出試薬は、それらのそれぞれの微粒子への取り付けの前に、第２の捕捉試薬および第２の検出試薬と混合されない。第１バーコードおよび第２のバーコードは、独立して、スペクトル、図形、または化学バーコードであってもよい。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、それぞれの捕捉試薬およびそれぞれの検出試薬は、それぞれの微粒子に同時に付着される。他の実施形態では、それぞれの捕捉試薬およびそれぞれの検出試薬は、２段階反応においてそれらのそれぞれの微粒子に取り付けられ、ここで捕捉試薬または検出試薬のいずれかが微粒子に最初に取り付けられ、続いて他の試薬のその後の取り付けが行われる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、工程（ｇ）において一緒に混合する前に、取り付けられていない試薬を除去するために、第１の微粒子および第２の微粒子を洗浄する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、追加の洗浄工程、捕捉試薬および／または検出試薬を取り付ける各工程の１つ以上をさらに含み、続いて、微粒子から取り付けられていない試薬、および／または非特異的に付着した試薬を除去するための洗浄工程が行われる。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、微粒子はビーズ、例えば、ポリスチレンビーズである。いくつかの実施形態では、工程（ａ）における微粒子は、バーコード化されておらず、この方法は、工程（ｇ）の前に、すなわち、第１の微粒子および第２の微粒子を一緒に混合する前に、微粒子をバーコード化する工程（例えば、蛍光色素または発光色素またはその混合物などのバーコードを微粒子に付着させる工程）をさらに含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、第１の捕捉試薬、第１の検出試薬、第２の捕捉試薬、および第２の検出試薬は、抗体である。
【０１３０】
一実施形態では、本明細書に記載の多重サンドイッチアッセイシステムを調製する方法が提供され、この方法は、（ａ）平面、マルチウェルプレートの表面、ガラスプレートの表面、またはヒドロゲルである支持体を提供する工程、（ｂ）第１の位置で支持体に第１の捕捉試薬を取り付ける工程、（ｃ）支持体を洗浄して、取り付けていない第１の捕捉試薬を除去する工程、（ｄ）第２の位置で支持体に第２の捕捉試薬を取り付ける工程、（ｅ）支持体を洗浄して取り付けられていない第２の捕捉試薬を除去する工程、（ｆ）第１の位置で支持体に取り付けられた第１のアンカー鎖を介して第１の検出試薬を支持体に取り付ける工程、（ｇ）支持体を洗浄して取り付けられていない第１の検出試薬を除去する工程、（ｈ）第２の位置で支持体に取り付けられた第２のアンカー鎖を介して第２の検出試薬を支持体に取り付ける工程、および（ｉ）支持体を洗浄して取り付けられていない第２の検出試薬を除去する工程を含み、第１の捕捉試薬、第２の捕捉試薬、第１の検出試薬、および／または第２の検出試薬が一緒に混合されるときはいつでも、一度に１つより多くの試薬が担体に付着しないようにする。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重サンドイッチアッセイシステムの調製の方法は、異なる試薬（捕捉試薬、検出試薬）が、担体に取り付けられ、および／または生体分子複合体に組み立てられる前に溶液中で一緒に混合されないので、交差反応性を最小化する際に有利である。このようにして、相互反応性を最小化するために、試薬のたがいに対する非特異的結合が回避されるか、または少なくとも低減される。望ましくないバックグラウンドシグナルまたは「ノイズ」は、回避されるか、または少なくとも低減されてもよい。いくつかの実施形態では、方法はまた、スケール変更可能であり、多重サンドイッチアッセイ系の迅速および／またはコスト効果的な調製を可能にする。いくつかの実施形態では、従来のアッセイ系よりもはるかに少ない捕捉および／または検出試薬が必要であり、これは、高価な抗体試薬等のための実質的なコスト削減につながる可能性がある。いくつかの実施形態では、例えば、生体分子複合体を調製するために、ナノリットル未満の抗体試薬が必要とされ得る。
【０１３２】
本発明の他の態様および特徴は、添付の図面と併せて、本発明の特定の実施形態の以下の説明を検討することにより、当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
特許または出願ファイルは、カラーで実行される少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有する本特許または特許出願公報のコピーは、必要な料金の要求および支払いの際に官庁によって提供される。
本発明のより良好な理解のために、およびそれがいかにして実行されて効果をもたらし得るかをより明確に示すために、本発明の実施形態による態様および特徴を例証する添付図面を例として参照する。
【図１】（ａ）１つの抗体対のみが使用される典型的なＥＬＩＳＡ反応（１−プレックスまたは単一プレックスアッセイ）、および（ｂ）標的生体分子と混合ＡＢ対（図中の抗体対として示される）との間に生じる非特異的結合事象によって生じる多重分析における交差反応性を示す概略図である。
【図２】本発明の技術の特定の実施形態を例証する概略図である。（ａ）ＤＮＡ連結を用いて個々のビーズ上の抗体対を共局在化させることにより交差反応性が防止されたＣＬＡＭＰシステムを示す。（ｂ）において、ＣＬＡＭＰパネルの各部材は、捕捉抗体（ｃＡｂ）および蛍光性バーコードシグナルの比率を有するビーズのワンポット製造を介して作製される。（ｃ）において、ｃＡｂおよびプレハイブリダイズした検出抗体（ｄＡＢ）の各々を有するビーズセットを混合して、ＣＬＡＭＰパネルを形成する。（ｄ）において、試料添加および標的タンパク質結合が示されている。（ｅ）において、洗浄は、非特異的に結合した生体分子を除去する。（ｆ）において、各ビーズ上のサンドイッチ複合体は、ｄＡＢの蛍光ＤＮＡ鎖置換を介して標識される。
【図３】本発明の技術の一実施形態によるＣＬＡＭＰアッセイを示し、（ａ）は、任意の多色サイトメーター上で、＞５８０個のビーズバーコードを実施することを可能にする自動化された４色バーコードストラテジーを示し、（ｂ）低価数の抗体−オリゴ結合体は、劇的に改善された鎖置換効率（＞９９％）を示し、最小化されたアッセイ背景シグナルを示し、（ｃ）ｕＰＡのための１−プレックスＣＬＡＭＰを示し、これは、ビーズ上の従来の（連続的な）免疫測定よりも増加した感度をもたらし、（ｄ）ＣＬＡＭＰ感度をさらに改善した低い価数の結合体を示し、（ｅ）は、従来のサンドイッチフォーマットで広範に交差反応する抗体対で組み立てられ、交差反応性を示さなかった５−プレックスＣＬＡＭＰを示し、そして（ｆ）５−プレックスＣＬＡＭＰの個々の標準曲線を示す。
【図４】（ａ）１つの抗体対のみが使用される典型的なＥＬＩＳＡ反応（１プレックスまたは単一プレックスアッセイ）および（ｂ）標的生体分子と混合ＡＢ対（図では抗体対として示されている）の間で発生する非特異的結合事象によって生成される多重分析における交差反応性を例証する概略図を示す。（ｃ）は、ＤＮＡ連結を使用して個々のビーズに抗体ペアを共局在化することによって交差反応性が防止されるＣＬＡシステムを示す。
【図５】生物学的試料との接触および置換の前のＣＬＡ複合体の例示的な実施形態を例証する概略図を示し、ここで、標識は存在しないか、または不活性／検出不可能である。（ａ）検出ＡＢは、アンカー鎖を使用して（すなわち、アンカー鎖への直接連結）支持体に連結される。（ｂ）ステムオリゴは、標識されているアンカー鎖にハイブリダイズし、放出前に検出されないように標識（例えば、特定のＤＮＡ配列）をマスクするよう機能する。（ｃ）捕捉抗体と検出抗体の両方が支持体に柔軟に連結される。（ｄ）検出ＡＢはフック鎖に連結され、フック鎖はアンカー鎖に放出可能に取り付けられ、任意に検出不可能な標識を含む（標識はフック鎖またはアンカー鎖に取り付けられてもよい）。（ｅ）検出ＡＢはフック鎖に連結されており、フック鎖はアンカー鎖に放出可能に取り付けられており、フック鎖は、これもまたアンカー鎖に結合しているステムオリゴ上の近位クエンチャーによって（放出前に）クエンチされる色素に結合体化される。（ｆ）捕捉抗体と検出抗体の両方がアンカー鎖に連結され、捕捉ＡＢはアンカー鎖に直接連結され、検出ＡＢは、検出不可能な標識（すなわち、フック鎖がアンカー鎖に取り付けられている場合、標識は検出できず、放出後に検出可能になる）に任意に取り付けられたフック鎖オリゴを介して間接的に取り付けられる。（ｇ）捕捉抗体と検出抗体の両方が、それらのそれぞれの捕捉鎖およびフック鎖を介してアンカー鎖に間接的に連結される。
【図６】成功した置換反応後の分析物の存在下での検出ＣＬＡの例示的な実施形態を例証する概略図を示す。（ａ）標識は、検出のためのＤＮＡハイブリダイゼーションを介して標的化され得るフック鎖上の特異的ＤＮＡ配列である。（ｂ）ディスプレーサ剤は、アンカー鎖からフック鎖オリゴを放出するために使用され、フック鎖に取り付けられた標識の活性化を生じる（この場合、放出後の色素のアンクエンチング）。（ｃ）色素標識されたディスプレーサ剤が、フック鎖オリゴに優先的に結合し、アンカー鎖からそれを放出し、フック鎖と、結合した三成分複合体の両方を同時標識する。（ｄ）配列標識されたディスプレーサ剤が、フック鎖オリゴに優先的に結合し、それをアンカー鎖から放出させ、フック鎖と、結合した三成分複合体の両方を同時に標識する。
【図７】置換依存性検出の実施形態を例証する概略図を示す。（ａ）ＣＬＡ実施形態が示されており、ここでは、標識が複合体上に存在せず、分析物が存在し、三成分複合体中の捕捉ＡＢと検出ＡＢの両方に結合している。本実施形態におけるオリゴである、色素標識されたディスプレーサ剤は、フック鎖オリゴに優先的に結合し、同時にフック鎖を標識し、アンカー鎖からそれを置き換える。（ｂ）置換依存性検出のＡＮＤ（ブール）論理ゲート表示、ここで、複合体レベルでの検出は、標的の２価の捕捉と成功したフック−アンカー置換の両方を必要とする。分析物の存在および置換の成功を考慮する様々な潜在的な結果のうち、（ａ）に示されるシナリオは、シグナルにつながる唯一のシナリオである。
【図８】置換依存性検出の実施形態を例証する概略図を示し、ここで、標識は、アンカー配列へのハイブリダイゼーションによってマスクされるか、または隠されるので、最初に検出不可能である（すなわち、結合のために利用できない）独特なＤＮＡ配列である。この図に示される実施形態では、未標識のディスプレーサ剤は、アンカーの足がかり配列にハイブリダイズし、フック鎖オリゴの置換をトリガーし、その結果、二次ハイブリダイゼーションまたは他のＤＮＡ検出および／またはＰＣＲなどの増幅方法のいずれかを介して、その後の検出のために利用可能な標識（ユニークなＤＮＡ配列）が得られる。
【図９】サンドイッチ抗体検出のための置換依存性検出を伴うＣＬＡの実施形態を例証する概略図である。同一の抗原（例えば、ペプチド）は、捕捉ＡＢと検出ＡＢの両方として使用され、抗原の１つは、アンカー鎖に放出可能に取り付けられたフック鎖に取り付けられる。標識されたディスプレーサ剤（本実施形態ではオリゴ）を使用した足がかり媒介置換は、フック鎖を置換および標識する二重機能を実施する。標識され放出されたフック鎖（示される）の画分は、標的抗体の存在下でのみ支持体に取り付けられたままである。
【図１０】多重化におけるタンパク質−タンパク質相互作用の検出のために使用されるＣＬＡの実施形態を例証する概略図を示し、アレイ（平面またはビーズ）は、ミスマッチＡＢ対を用いて組み立てられ、ＡＢ対によるタンパク質−タンパク質相互作用の検出を可能にする。
【図１１】多重化における翻訳後修飾（ＰＴＭ）の検出のために使用されるＣＬＡの実施形態を例証する概略図を示し、アレイ（平面またはビーズ）は、全体およびＰＴＭ特異的タンパク質を標的とするＡＢ対を用いて組み立てられる。
【図１２】捕捉試薬が担体に直接取り付けられた抗体であり、２つのアンカー鎖が存在するＣＬＡの実施形態を例証する概略図である。２つのアンカー鎖の各々は、検出試薬（抗体でもある）に連結されたフック鎖に、ＤＮＡハイブリッドによって連結されている。分析物の存在下では、四成分複合体が形成される。フック鎖は、それぞれのアンカー鎖から、標識されたディスプレーサ剤オリゴを使用して放出される。２つの標識は、同一であっても異なっていてもよい。
【図１３】再結合メカニズムを使用して、置換後に、および検出前に、シグナルを安定化するために使用されるＣＬＡの実施形態を例証する概略図を示す。本実施形態では、フック鎖オリゴは、標識配列と、再結合配列とを含み、アンカー鎖に結合するディスプレーサ剤オリゴを用いる置換および任意の洗浄の後、架橋鎖は、再結合配列とアンカー鎖の両方に結合し、それによって、フック鎖をアンカー鎖に間接的に再結合させる。このようにして、フック鎖は、活性／検出可能標識およびそれが連結されている検出ＡＢとともに、支持体に再取り付けされる。
【図１４】特定の実施形態に従う、単一プレックスおよび多重サンドイッチアッセイ、ならびに微粒子上のＣＬＡシステム（「ＣＬＡＭＰ」）の概略図を示す。（ａ）一対のマッチした抗体を含む、単一プレックスサンドイッチ免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡとしてもまた知られている）。（ｂ）抗体の混合を伴うＭＳＡが、マッチしない抗体とタンパク質との間の多数の相互作用にさらされ、しばしば、ｒＣＲおよび偽陽性をもたらす。（ｃ）非同族抗体間の相互作用を排除しながら、サンドイッチ結合を可能にするＤＮＡ連結を使用する抗体対のプレ共局在化を伴うＣＬＡＭＰ。（ｄ）ｄＡｂは捕捉オリゴ（ＣＯ）鎖との部分的ハイブリダイゼーションを介して表面につながれているフックオリゴ（ＨＯ）に結合されている。スペーサーオリゴ（ＳＯ）は、表面上のＣＯおよびｄＡｂ−ＨＯの密度を制御するために使用される（図１９参照）。（ｅ）マルチプレックスＣＬＡＭＰアッセイは、（ｉ）異なる標的に対するバーコード化ＣＬＡＭＰ微粒子を混合すること、（ｉｉ）標的分析物のみの存在下でサンドイッチ結合を生成する微粒子とともに生物学的試料をインキュベートすること、（ｉｉｉ）洗浄すること、および（ｉｖ）足がかり媒介置換（挿入）を介して蛍光標識されたディスプレーサオリゴ（ＤＯ）を使用してＨＯを置換および標識することによって実行され、（ｖ）表面上に残存しているサンドイッチ複合体の標識化をもたらす。（ｆ）標識化置換工程による検出のＡＮＤ（Ｂｏｏｌｅａｎ）論理ゲート表示、ここでは、単分子レベルでの検出は、標的の捕捉と成功したＨＯ放出の両方を必要とする。
【図１５】足がかり媒介置換効率の最適化を示す。（ａ）非標識ＤＯを使用してＣｙ５−標識されたＨＯが置換されている、置換反応の例証。（ｂ）ＣＯ開始量を変化させるためのＮａＣｌ濃度（ｘ軸）を増加させることに対する放出効率（ｎＣＯ＝１０ピコモル、ｎＣＯ＝１００ピコモルについてそれぞれ青色および赤色）。この実験では、ＳＯは使用されなかった（すなわち、ｎＳＯ＝０ピコモル）。放出効率は、（Ｉ０−Ｉｆ）／（Ｉ０−ＩＢ）として計算され、ここで、Ｉ０、Ｉｆ、およびＩＢは、それぞれ、放出前、放出後、およびバックグラウンドの蛍光である。放出効率は、イオン強度の増加で著しく改善された。ＣＯの密度が増加すると、放出効率の増大をもたらし、これは、非特異的に結合したオリゴの画分の減少に帰するかもしれない。（ｃ）高塩濃度（５００ｍＭのＮａＣｌ）のＣＯ密度に対する放出効率。
【図１６】結合体化価数および表面密度（ａ）を調節することによるＣＬＡＭＰの最適化を示す。（ａ）標準化ヒストグラムは、ＨＯ（青色）を有さず、多価ｄＡｂ−ＨＯ結合体（黄色）を有する微粒子についてのＣＬＡＭＰバックグラウンドシグナル（すなわち、Ｃｙ５−標識ＤＯとのインキュベーション後の残留シグナル）を比較する（図６参照）。（ｂ）標的分析物とのサンドイッチ結合の非存在にも関わらず、多価ｄＡｂ−ＨＯ結合体が成功しなかった置換ｄＡｂ−ＨＯ複合体を標識することによってバックグラウンドシグナルをいかにして増加させ得るかを描く例証である。（ｃ）価数を増加させたＨＯと結合体化したマウス抗ヤギＩｇＧの、銀増幅によって染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（ｄ）結合体化価数（列）の増加およびＣＯ密度の増加（行）に対してプロットしたアッセイバックグラウンドＭＦＩ。（ｅ）精製プロトコルの異なる段階における低価数ｄＡｂ−ＨＯ（マウスｕＰＡ  ｍＡｂ）結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ここで、（１）ネイティブｄＡｂ、（２）結合体生成物ｄＡｂ−ＨＯ（非精製）、（３）リサイクル（結合体でない）ｄＡｂ、および（４）精製ｄＡｂ−ＨＯ。（ｆ）ｕＰａ抗原の標準希釈に対するｘ−ｕＰａ  ＣＬＡＭＰアッセイについて、およびＣＯ密度を変化させることについてのＭＦＩアッセイ値。エラーバーは、Ｃｙ５チャネルにおける微粒子シグナルの標準偏差である。（ｇ）低い（青色ドット）および高い（赤色ドット）価数の結合体を用いたｘ−ｕＰＡ  ＣＬＡＭＰアッセイにおけるＭＦＩシグナル。エラーバーは、ウェル（ｎ＝３）にわたるＭＦＩシグナルの標準偏差である。各曲線に示されるＬＯＤは、以下の方法で議論されるように計算される。
【図１７】ＣＬＡＭＰにおける交差反応性（ＣＲ）の除去を示す。（ａ）従来のＭＳＡおよび（ｄ）ＣＬＡＭＰアッセイのために実施されるＣＲスクリーニングの概略図であり、ここで、バーコード化された微粒子は、多重化フォーマットでＣＲを明らかにするために一度に１つの標的とともに混合され、インキュベートされる。（ｂ、ｅ）１ｎｇ／ｍｌおよび（ｃ、ｆ）１００ｎｇ／ｍｌで個々の抗原の添加に応答して、従来のＭＳＡ（ｂ、ｃ）およびＣＬＡＭＰ（ｅ、ｆ）に対する特異的（対角）および非特異的（非対角）アッセイシグナルを定量するＳＮＲ。（ｇ）ＭＣＰ−１（青色）およびＥＧＦ（赤色）スパイク−インを特定の濃度（ｘ軸）で有するＭＣＰ−１単一プレックスサンドイッチアッセイのアッセイＭＦＩ。（ｈ）バーコード特異的バックグラウンドおよびグローバル標準偏差を使用して、５−プレックスＣＬＡＭＰ希釈系列のＳＮＲシグナル（インセット）。ＳＮＲはバーコード特異的バックグラウンドおよびグローバル標準偏差を使用して計算される。
【図１８】一実施形態による、ＣＬＡＭＰにおいて使用されるオリゴヌクレオチドの配列および融解温度を示す。捕捉オリゴ（ＣＯ、４２ｎｔ）は、５’ビオチンを介してストレプトアビジン表面に結合され、３’蛍光標識オリゴ（ＬＯ、（２１ｎｔ）と５’抗体結合体化フックオリゴ（ＨＯ、８１ｎｔ）の両方を微粒子表面に連結する。ディスプレーサオリゴ（ＤＯ  ３０ｎｔ）は、最初に、フックオリゴ上の９ｎｔの足がかり（ｔｏｅｈｏｌｄ）に結合して、ＨＯ−ＣＯハイブリッドを置換する。
【図１９】一実施形態による、バーコード化されたＣＬＡＭＰ微粒子の合成の概略図を示す。ＣＬＡＭＰ微粒子の合成における一次工程を説明する例証。（ａ）オリゴ構築物はプレアニールされ、抗体は、試薬のビオチン化混合物を形成するために添加される。ビオチン化オリゴの混合物は、正確に制御された全体で９０ピコモルのＣＯ／ＳＯ比率を含み、ＣＯ（および後のｄＡｂ−ＨＯ）表面密度を規定し、ビオチン化オリゴは、正確に制御された割合のＬＯ０／ＬＯ１／ＬＯ２にアニーリングされ、全体で９０ピコモルであり、バーコードを規定する。（ｂ）その後、ストレプトアビジンＭＰは、ビオチン化混合物に添加して、微粒子の表面上の試薬でそれらを比例的かつ確率的に標識し、オリゴ成分（例えば、ＬＯ１／ＬＯ２）の相対密度は、表面上で保存される。（ｃ）ｄＡｂ−ＨＯは、最後に表面上に引き下げられて、ＣＬＡＭＰの合成が完了する。表面上のｄＡｂ密度はＣＯ濃度、すなわち、ｎＣＯに比例する。
【図２０】表面密度の微調整および正確な制御を示す概略図を示す。（ａ）ＡＦ−６４７で標識された抗ヤギ抗体を使用したｃＡｂ検出。（ｂ）相補的であるが、非置換の、Ｃｙ５で標識されたオリゴを使用したＨＯ検出。ＡＦ６４７ｘ−ヤギ二次抗体（赤色）およびＨＯを標的とするｃｙ５標識オリゴ（非置換、青色ドット）を使用して標識された、様々なＣＯ反応量を有するＣＬＡＭＰ微粒子の蛍光強度。（ｃ）ｎＣＯ＋ｎＳＯ＝９０ｐモルであるように、出発ＣＯの量を増加させて、ＳＯを減少させて調製されたＣＬＡＭＰについてのｃＡｂおよびＨＯ検出（それぞれ、赤色および青色）。データへの線形フィットは破線で示され、エラーバーはＭＰ蛍光の標準偏差をプロットする。
【図２１】いくつかの実施形態の概略図を示す。（１）捕捉試薬および検出試薬が抗体であり、検出試薬がＤＮＡハイブリッドによってアンカー鎖に連結され、検出抗体が標識されている、ＣＬＡＭＰの実施形態を示す。（２）捕捉抗体と検出抗体の両方がオリゴリンカーおよびＤＮＡハイブリッドを介してアンカー鎖に取り付けられ、検出抗体が標識されている実施形態を示す。（３）捕捉試薬および検出試薬が抗体であり、検出試薬がＤＮＡハイブリッドによってアンカー鎖に連結され、検出試薬またはフック鎖上に標識が存在しない、ＣＬＡＭＰの実施形態を示す実施形態を示す。三成分複合体は分析物の存在下で形成され、フック鎖は、標識されたディスプレーサオリゴによってアンカー鎖から置換される。（４）捕捉抗体と検出抗体の両方がオリゴリンカーおよびＤＮＡハイブリッドを介してアンカー鎖に取り付けられ、検出試薬またはフック鎖に標識が存在しない実施形態を示す。三成分複合体は分析物の存在下で形成され、フック鎖は、標識されたディスプレーサオリゴによってアンカー鎖から置換される。（５）（１）の実施態様であるが、標識がフック鎖に取り付けられ、フック鎖をアンカー鎖に取り付けるＤＮＡハイブリッドによってマスクされる実施形態を示す。三成分複合体は、分析物の存在下で形成され、フック鎖は、アンカー鎖に結合またはハイブリダイズするディスプレーサオリゴによって、アンカー鎖から置換される。フック鎖上の標識は、置換反応後に活性化または非マスク化される。（６）（４）の実施態様であるが、（５）と同様に、標識は、フック鎖に取り付けられ、フック鎖をアンカー鎖に取り付けるＤＮＡハイブリッドによってマスクされる。三成分複合体は、分析物の存在下で形成し、フック鎖は、アンカー鎖に結合またはハイブリダイズするディスプレーサオリゴによって、アンカー鎖から置換される。フック鎖上の標識は、置換反応後に活性化または非マスク化される。（７）捕捉試薬および検出試薬が両方とも抗原であり、アンカー鎖にハイブリダイズするオリゴリンカーを介して両方ともアンカー鎖に連結されている実施形態を示す。両方の抗原を結合する抗体（本実施形態では分析物）の存在下で複合体が形成される。標識はフック鎖に取り付けられ、フック鎖をアンカー鎖に取り付けるＤＮＡハイブリッドによってマスクされる。フック鎖上の標識は、アンカー鎖からの切断後に活性化または非マスク化される。（８）捕捉試薬が支持体に直接取り付けられた抗体であり、２つのアンカー鎖が存在する実施形態を示す。２つのアンカー鎖の各々は、ＤＮＡハイブリッドによって検出抗体に連結される。分析物の存在下で、四成分複合体が形成される。２つのフック鎖の各々は標識され、フック鎖標識は、それらのそれぞれのアンカー鎖への連結の放出によって非マスク化される。２つの標識は、同一であっても異なっていてもよい。
【図２２】一実施形態による、ＣＬＡＭＰアッセイのための置換検出抗体濃度プロファイルの計算を示し、ここで、検出抗体濃度プロファイルは、置換工程の間の開始量（ｙ軸）および溶液の体積（ｘ軸）に対してプロットされる。
【図２３】標識置換工程による検出のＡＮＤ（Ｂｏｏｌｅａｎ）論理ゲート表現を示し、単分子レベルでの検出は、標的の捕捉と成功したフック鎖オリゴヌクレオチド（ＨＯ）放出の両方を必要とする。
【図２４】２つの標識方法、ＢＶ４２１標識二次抗体を用いたｄＡｂの直接検出、およびＣｙ５標識されたディスプレーサオリゴを用いた置換依存検出を用いて得られた較正曲線を示す。ＩＬ−７、ＦＮ−γ、およびＭＭＰ−９についての較正曲線は、減少した濃度でタンパク質標準をスパイクすること、および、記載されたようにアッセイを実行することによって緩衝液（ＰＢＳＴ）中で実施された。
【図２５】結合体化の価数を調節することによるＣＬＡＭＰ最適化を示す。（ａ）価数を増加させてＨＯを用いて結合体化し、銀増幅によって染色したマウス抗ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（ｂ）結合体化価数の増加（列）およびＣＯ密度の増加（行）に対してプロットされたアッセイバックグラウンドＭＦＩ。（ｃ）ｕＰＡ抗原の標準希釈に対するｘ−ｕＰＡ  ＣＬＡＭＰアッセイについて、および様々なＣＯ密度についてのＭＦＩアッセイ値。エラーバーは、Ｃｙ５チャネルにおける微粒子シグナルの標準偏差である。（ｇ）低い（青色ドット）および高い（赤色ドット）価数の結合体を用いたｘ−ｕＰＡ  ＣＬＡＭＰアッセイにおけるＭＦＩシグナル。エラーバーは、ウェル（ｎ＝３）にわたるＭＦＩシグナルの標準偏差である。各曲線に示されたＬＯＤは、下記の方法で説明されるように計算された。
【図２６】４０種のタンパク質（サイトカインなど）を標的とする、ＣＬＡＭＰアッセイの４０−プレックス特異性スクリーニングを示す。多重化ＣＬＡＭＰの混合物を含む緩衝液中に、抗原（組換え）を１つずつスパイクした。すべてのウェルは１つの抗原のみを含んでいた。すべてのウェルについてのすべてのクランプについての検出、読み出し、および各ウェル毎のシグナル対ノイズ比のプロットは、ヒートマップ内の最小の非対角シグナルによって示されるように、オフターゲットＣＬＡＭＰとの抗原の最小の相互作用を示した。
【発明を実施するための形態】
【０１３４】
詳細な説明
本明細書に記載されるように、連結による共局在化アッセイを用いて１つ以上の分析物を検出および／または定量するためのシステムおよび方法が提供される。特に、十分に低いバックグラウンドシグナル、試薬間の十分に低い交差反応性、および／または試料中の複数の生体分子の検出および／または定量を同時に可能にする十分に高い感度を有するシステムおよび方法が提供される。また、迅速で、感度が高く、コスト効率が高く、かつ／またはスケール変更可能である多重サンドイッチアッセイおよびそれらの調製方法が提供される。
【０１３５】
本開示は、特定の装置、システム、方法、または使用またはプロセス工程に限定されず、そのようにして変化し得ることが理解されるべきである。
【０１３６】
本明細書中で使用される用語の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下に多数の定義が提供される。さらに、他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【０１３７】
特許請求の範囲および／または明細書において、「含む」という用語に関連して使用される場合、ある（「ａ」または「ａｎ」）という語の使用は、「１つ」を意味するかもしれないが、これはまた、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたはそれ以上」の意味と一致する。同様に、「別の」という語は、少なくとも第２のまたはそれ以上を意味し得る。
【０１３８】
本明細書および請求項において使用される場合、「含む」（および含むの任意の形、例えば、「含んでいる」および「含むこと」など）、「有する」（および有するの任意の形、例えば、「有している」および「有すること」など）、備える（および備えるの任意の形、例えば、「備えている」および「備えること」など）、含有する（および含有するの任意の形、例えば、「含有している」および「含有すること」など）という語は、包括的であるかまたは限定的ではなく、追加の列挙されていない要素またはプロセス工程を除外しない。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、所定の値または範囲の文脈における「約」という用語は、所定の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内の値または範囲を指す。
【０１４０】
本明細書で使用されるように、「および／または」という用語は、他のものを伴うかまたは伴わずに、２つの特定の特徴または構成要素の各々の特定の開示として取られるべきである。例えば、Ａおよび／またはＢは、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の特定の開示として、あたかも各々が本明細書において個々に設定されたかのように取られるべきである。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「支持体」という用語は、例えば、微粒子、ナノ粒子、プレートのウェル、多孔質ポリマー、またはヒドロゲルであるがこれらに限定されない、固定化構造、表面または基材をいう。支持体は特に限定されることが意味されず、任意の固体、半固体、ゲルまたはゲル様構造が使用されてもよいことが理解すべきである。例えば、支持体は、アレイ、ビーズ（例えば、非限定的に、ポリスチレンビーズ）、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなど）の表面、ガラススライドの表面、ヒドロゲルマトリックス、マイクロ流体チップ、横流ストリップ、ガラス表面、プラスチック表面、シリコン表面、セラミック表面などであってもよい。一実施形態では、支持体はビーズまたは微粒子またはナノ粒子であり、典型的にはミクロンサイズまたはナノサイズであり、例えば、非限定的に、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、プラスチックビーズなどである。別の実施形態では、支持体は、平面マイクロアレイである。一実施形態では、支持体はナノ粒子である。一実施形態では、支持体は微粒子である。
【０１４２】
本明細書で使用されるように、「分析物」という用語は、特定され、検出され、測定され、および／または定量化されている、目的の標的生体分子または生物学的細胞をいう。分析物は、本明細書に提供されるシステムおよび方法を使用して検出することができる、任意の生体分子または生物学的細胞であってもよく、例えば、非限定的に、タンパク質、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、抗体、抗原、タンパク質、細胞、化学物質、バイオマーカー、酵素、ポリペプチド、アミノ酸、ポリマー、炭水化物、マルチタンパク質複合体、エキソソーム、オリゴヌクレオチド、低分子量化合物などである。分析物の非限定的な例としては、抗体、抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど）、アプタマー、修飾アプタマー、ソマーマー、アフィマー、抗原、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、エキソソーム、オリゴヌクレオチド、および低分子量化合物が挙げられる。
【０１４３】
本明細書で使用されるように、「試料」とは、分析物を検出および／または定量するために分析されている任意の流体または液体の試料をいう。いくつかの実施形態では、試料は生物学的試料である。試料の例としては、体液、抽出物、タンパク質および／またはＤＮＡを含む溶液、細胞抽出物、細胞溶解物、または組織溶解物が挙げられるが、これらに限定されない。体液の非限定的な例としては、尿、唾液、血液、血清、血漿、脳脊髄液、涙液、精液、汗、胸膜滲出液、液化糞便物質、および涙腺分泌物が挙げられる。
【０１４４】
本明細書で使用されるように、「エンコードされた微粒子」という用語は、バーコード化された、例えば、標的分析物またはアッセイにおいて実施される特定の試験のいずれかによってスペクトル的にコード化された微粒子をいう。バーコード化された（またはコード化された）微粒子は、多くの場合、大きな混合物中の粒子を区別することができるように、多重化された懸濁アッセイにおいて使用される。バーコード化の方法は限定されるものではない。バーコード化は、例えば、スペクトル的、図形的、または化学的手段を使用して、実施することができる。例えば、微粒子のスペクトル的エンコードは、微粒子を正確な比率の多色色素で標識することによって行うことができる。このアプローチは、フローサイトメトリーによる単純かつ高スループットの読み出しを可能にする。別の例として、図形的にバーコード化された微粒子は、典型的には、顕微鏡を介して特徴付けることができる視覚パターンを用いて彫刻されるか、または他の方法でパターン化される。微粒子は、例えば、ＤＮＡ検出手段を介して後に検出することができる独特なＤＮＡ配列を使用して、化学的にバーコード化することもできる。
【０１４５】
本明細書で使用されるように、「非特異的結合」という用語は、非同族抗体と疎水性相互作用を介して付着するタンパク質との間の反応を含むが、これらに限定されない、試料内の試薬および／または分子の間の意図しない反応を意味する。
【０１４６】
本明細書で使用されるように、「親和性結合剤」（ＡＢ）、「結合剤」および「反応物質」という用語は、例えば、非共有結合的相互作用を介して標的分析物を特異的に認識することが可能である任意の分子を意味するために交換可能に使用される。親和性結合剤（ＡＢ）の例としては、非限定的に、免疫グロブリン−Ｇ（ＩｇＧ）抗体（例えば、全分子またはＦａｂフラグメント）、アプタマー、アフィマー、ナノボディ、アンキリン、および単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【０１４７】
本明細書で使用されるように、「サンドイッチアッセイ」という用語は、２つのＡＢが目的の標的分析物に同時に結合し、それを検出および／または定量するために使用され得る、分析物標的化アッセイを意味するために使用される。
【０１４８】
本明細書で使用されるように、「多重サンドイッチアッセイ」、「マルチプレックスサンドイッチアッセイ」、および「ＭＳＡ」という用語は、同一の試料および／またはアッセイ体積から複数の（例えば、２つ以上の）分析物を同時に標的とするサンドイッチアッセイを意味するために交換可能に使用され、複数のＡＢ対が同時にアッセイシステムにおいて使用される。
【０１４９】
本明細書で使用されるように、「交差反応性」という用語は、多重サンドイッチアッセイにおける非特異的結合または非特異的反応の特定の場合を意味するために使用され、ここで、例えば、図１に示されるように、非同族親和性結合剤を含む意図しない複合体が形成される。
【０１５０】
本明細書で使用されるように、「捕捉親和性結合剤」、「ｃＡＢ」、「捕捉ＡＢ」、「捕捉結合剤」、および「捕捉試薬」という用語は、生体分子複合体中の支持体に取り付けられ、それから放出されないＡＢを指すために交換可能に使用される。捕捉ＡＢは、支持体に直接的に（例えば、共有結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合、ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカー、またはポリマーリンカーを介して）取り付けられ得るか、または間接的に（例えば、アンカー鎖への連結を介して、例えば、結合体化または捕捉鎖などのリンカーを通して）取り付けられ得る。捕捉試薬の非限定的な例としては、抗体、抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど）、アプタマー、修飾アプタマー（スローオフレート修飾アプタマーまたはソマーマーなど）、アフィマー、抗原、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、エキソソーム、オリゴヌクレオチド、および低分子量化合物が挙げられる。
【０１５１】
「捕捉鎖」という用語は、捕捉試薬をアンカー鎖に連結するリンカー（例えば、オリゴヌクレオチド、ポリマーなど）（および、したがって、アンカー鎖が取り付けられる支持体）をいう。
【０１５２】
本明細書中で使用されるように、「検出親和性結合剤」、「ｄＡＢ」、「検出ＡＢ」、「検出結合剤」、および「検出試薬」という用語は、支持体に放出可能に取り付けられた生体分子複合体中のＡＢを指すために交換可能に使用される。ｄＡＢは、一般にシグナル伝達およびアッセイシグナリングのために使用される。本明細書に提供される方法およびシステムのいくつかの実施形態では、例えば、分析物に結合されていないｄＡＢの画分は、結合した分析物の非存在下でシグナルが生成されないように、支持体から放出される。いくつかの実施形態において、ｄＡＢは、シグナル伝達およびアッセイシグナリングのための標識または手段に結合される。検出試薬の非限定的な例としては、抗体、抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど）、アプタマー、修飾アプタマー、ソマーマー、アフィマー、抗原、タンパク質、ポリペプチド、マルチタンパク質複合体、エキソソーム、オリゴヌクレオチド、および低分子量化合物が挙げられる。
【０１５３】
本明細書で使用されるように、「アンカー鎖」という用語は、支持体上の不動点に取り付けられるリンカーをいう。アンカー鎖の非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー、オリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、または二本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド）、およびオリゴ糖を含む。
【０１５４】
本明細書で使用されるように、「フック鎖」という用語は、検出ＡＢをアンカー鎖に連結し、すなわちそれを支持体に取り付けるリンカーをいう。フック鎖は、典型的には、例えば、取り付けが放出できるようなやり方で、アンカー鎖に放出可能に取り付けられる。一般に、フック鎖とアンカー鎖との間の取り付けが放出されるとき、標的分析物に結合されていないフック鎖に連結された検出ＡＢの画分が、アンカー鎖から放出され、したがって、標的分析物の非存在下で、検出ＡＢからのシグナルが支持体上で検出できないように、支持体からも放出される。このようにして、支持体上のシグナルは、標的分析物が存在し、検出ＡＢおよび捕捉ＡＢによって結合されたときにのみ検出される。
【０１５５】
標識がフック鎖および／または検出試薬上にあり、フック鎖および／または検出試薬がアンカー鎖から放出された後にのみ活性化または検出可能である、いくつかの実施形態では、シグナルは、アンカー鎖からのフック鎖および／または検出試薬の放出後にのみ検出可能であるので、放出依存性である。同様に、いくつかの実施形態では、標識が、フック鎖にハイブリダイズするディスプレーサ剤上に存在する場合、シグナルは、「置換依存性」である。
【０１５６】
本明細書で使用されるように、「ディスプレーサ剤」という用語は、アンカー鎖とフック鎖との間の放出可能な結合の放出を直接的または間接的にもたらし、それによって、支持体からのフック鎖（およびそれに連結された検出ＡＢ）を放出する剤をいう。ディスプレーサ剤が使用されるメカニズムは特に限定されるものではない。例えば、ディスプレーサ剤は、アンカー鎖とフック鎖との間の連結の切断、置換、または未結合を直接的または間接的に引き起こすか、または開始させることができ、他のメカニズムも可能であり、また企図される。いくつかの実施形態では、フック鎖は、フック鎖および／またはアンカー鎖にハイブリダイズするＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、アンカー鎖から置換される。ディスプレーサ剤の例としては、置換ＤＮＡオリゴヌクレオチド、単色光または多色光の光源、制限酵素、およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤が挙げられるが、これらに限定されない。光切断可能なＤＮＡセグメントが使用されるいくつかの実施形態では、ディスプレーサ剤は光開裂反応を介して放出をもたらす光であってもよい。いくつかの実施形態では、ディスプレーサ剤は、例えば、色素、フルオロフォア、特異的ＤＮＡ配列、酵素、ビオチン部分などを用いて標識されている。ディスプレーサ剤が標識されている場合、これは、フック鎖を放出し、同時に標識する二重機能を果たすことができる。
【０１５７】
本明細書で使用されるように、「標識」という用語は、シグナルを生成し、シグナル生成分子を標的とすることができ、または他のやり方で検出可能である、分子または分子の任意の一部をいう。標識の例としては、ビオチン、フルオロフォア、酵素、酵素基質、および特異的ＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。「不活性」または「検出不能な」標識とは、活性ではなく、マスクされているか、または他のやり方で、検出不可能である、例えば、検出可能なシグナルを生成することができない標識をいい、例えば、非限定的に、クエンチされた蛍光色素などである。
【０１５８】
本明細書に提供されるシステムおよび方法は、２セットのＡＢを使用する、事実上あらゆるタイプのサンドイッチアッセイに使用することができることが理解されるべきである。しかし、単純化のために、本発明の特定の実施形態は、多くの可能な実施形態の１つを表すＡＢとして全分子免疫グロブリンＧ抗体（ＩｇＧ）を使用して本明細書に提示される。抗体は、全分子ＩｇＧに限定されないこと、および多くの異なる抗体、抗体フラグメントなどを用いることができることが理解されるべきである。さらに、ＡＢは抗体に限定されない。同様に、本明細書に記載された特定のもの以外の多くの異なるタイプのサンドイッチアッセイが使用できる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、目的の分析物を含有する生物学的試料への曝露の前に、支持体上の２つのＡＢ（捕捉ＡＢおよび検出ＡＢ）を支持体上で共局在化することにより交差反応性を回避することができる二重ＡＢまたはサンドイッチアッセイが提供される。支持体上の共局在化は、分析物への曝露の前に異なるＡＢ対のいかなる混合も可能にしないので、試薬および／またはバックグラウンド間の交差反応性を低減または排除することができる（例えば、図１または図４に示される）。一実施形態では、捕捉ＡＢおよび検出ＡＢの混合物に取り付けられた支持体が提供され、ここで、捕捉ＡＢおよび検出ＡＢの各セットは、目的の分析物と結合することができ、検出ＡＢは、任意に、放出可能なリンカーを介して、支持体に取り付けられる。一実施形態では、捕捉ＡＢと検出ＡＢの混合物に取り付けられた支持体が提供され、ここで、各分析物は、捕捉ＡＢと検出ＡＢの両方に同時に結合することが可能であり、検出ＡＢは、任意に、放出可能なフック鎖を介して、支持体に放出可能に取り付けられる。検出試薬および／またはフック鎖が放出されると、対応する検出ＡＢは、捕捉ＡＢとの三成分複合体中の分析物に結合した場合にのみ支持体上に残存する。
【０１６０】
本明細書中に提供される方法およびシステムにおいて使用される「リンカー」および「鎖」は、特に限定されないことが理解されるべきである。リンカーおよび鎖の非限定的な例としては、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＤＮＡオリゴとも呼ばれる）、ポリマー、多糖類などが挙げられる。ＤＮＡ結合は、フック鎖オリゴと検出ＡＢとの間の結合体化などの共有結合、または２つの相補的ＤＮＡ配列間のハイブリダイゼーションもしくは塩基スタッキングなどの非共有結合であり得る。捕捉ＡＢ−抗原−検出ＡＢの三成分複合体の形成を可能にするために、フック鎖は、柔軟性がある一本鎖部分を有するように設計される。ＤＮＡ連結の置換には、限定されるものではないが、足がかり保持性ＤＮＡ置換反応、酵素的切断、および光活性化開裂が挙げられるがこれらに限定されない。特異的ＤＮＡ配列は、蛍光標識された相補的配列を用いて直接標的化され得る標識としても使用することができ、ハイブリダイゼーション連鎖反応またはポリメラーゼ連鎖反応を介して増幅トリガーまたはプライマーとして使用することができ、そして配列決定を介して読み取ることができる。
【０１６１】
本明細書中に提供される方法およびシステムにおいて使用される「オリゴヌクレオチド」（「オリゴ」とも呼ばれる）は、特に限定されないことが理解されるべきである。例えば、オリゴは、５’または３’末端の蛍光色素を用いて修飾することができ、タンパク質、ビオチン、または酵素などと結合体化された、光切断性のホスホジエステルのバックボーンで修飾することができる。
【０１６２】
これらの実施形態は、本明細書では、「連結による共局在化アッセイ」または「ＣＬＡ」と称してもよい。ＣＬＡのいくつかの実施形態では、検出ＡＢは標識されている（すなわち、標識に取り付けられている）。ＣＬＡのいくつかの実施形態では、検出ＡＢをアンカー鎖に連結するフック鎖は、標識されている（すなわち、標識に取り付けられている）。一般に、検出ＡＢまたはフック鎖に取り付けられた標識は不活性または検出不能であり、これにより、支持体からの検出ＡＢの放出後に（すなわち、フック鎖がアンカー鎖から放出された後に）に標識が検出できる。このように、標識からのシグナル検出は、放出依存性（いくつかの実施形態では、「置換依存性」とも呼ばれる）である。このようなやり方で、捕捉ＡＢを有する三成分複合体中の分析物に結合し、アンカー鎖から放出された検出ＡＢのみが検出される。未結合された検出ＡＢは、支持体から放出される（例えば、洗浄によって除去され得る）。また、標識は、放出前に不活性であるか、または検出不可能であるので、または所定のフック鎖が放出されない場合（すなわち、シグナルの放出依存性または置換依存性に起因して）、バックグラウンドシグナルは低減され得る。したがって、いくつかの実施形態では、放出依存性（または置換依存性）シグナル伝達を反映するために、本明細書中に提供される方法およびシステムは、放出依存性の伝達（もしくは「ＲＤＴ」）または「置換依存性検出」と称され得る。
【０１６３】
従来のサンドイッチアッセイは、一般に、シグナルを変換し、分析物の存在を検出するための検出ＡＢの存在に依存する。同様に、本明細書に提示されるシステムおよび方法の特定の実施形態では、検出ＡＢおよび／またはフック鎖は、シグナル伝達因子として作用することができる。しかし、従来のアッセイとは対照的に、本明細書に提供されるシステムおよび方法では、検出ＡＢおよび／またはそれに任意に連結されたフック鎖は、分析物および捕捉ＡＢとともに三成分複合体が形成されたときにのみ、支持体上に残存することができる。検出試薬および／またはフック鎖がアンカー鎖から成功裏にまたは完全に放出されない場合、分析物の非存在下で場合であっても、これは支持体上に残存することができることが理解される。この場合、検出ＡＢおよび／またはフック鎖は、アンカー鎖に付着している際も、活性または検出可能な標識に取り付けられている場合、任意の非放出の、標識された検出ＡＢ、および／またはフック鎖がシグナルを伝達する。言い換えると、その場合、任意の標識および非放出の検出試薬および／またはフック鎖は、分析物の存在に依存しないシグナルをもたらすことができ、非特異的バックグラウンドシグナルに寄与し、ならびにアッセイ性能および／または感度を低下させる。その場合のバックグラウンドシグナルは、非放出検出試薬および／またはフック鎖の画分に比例することが理解される。また、支持体からの複合体のほぼ完全な放出は、立体障害、固着、および／または不完全な洗浄に起因して達成することが困難である可能性があることもまた理解されるべきである。しかし、放出依存性変換（ＲＤＴ）は、図２４に実証されるように、アンカー鎖からの検出試薬および／またはフック鎖の放出が完了していない場合、シグナル伝達が生じないので、これらの問題を最小化または排除することができる。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、したがって、本明細書で提供されるシステムおよび方法は、バックグラウンドシグナルを低減するために、および／または、放出依存変換（ＲＤＴ）の使用による感度を増加させるために、さらなるレベルの冗長性を含む。ＲＤＴにおいて、以下の条件の両方が満たされた場合にのみシグナル伝達が起こる。（ｉ）三成分捕捉ＡＢ−分析物−検出ＡＢ複合体の形成、および（ｉｉ）アンカー鎖からの対応する検出ＡＢおよび／またはフック鎖の放出。このような場合、非放出検出ＡＢおよび／またはフック鎖は、バックグラウンドシグナルに寄与しない。本明細書では、本発明者が「放出依存性変換（ＲＤＴ）」と称するこのシグナル伝達メカニズムは、種々の手段を介して達成することができる。例えば、いくつかの実施形態は、フック鎖上の標識を含むことができ、ここで、非放出（例えば、非置換）のフック鎖および／または検出ＡＢが、シグナルに寄与しないか、またはそのシグナルに変換されないように、標識は、アンカー鎖からの放出後まで、不活性であるか検出できない。
【０１６５】
ＲＤＴのいくつかの実施形態では、フック鎖は、放出が蛍光色素の消光または活性化をもたらすように、アンカーまたは別の近位鎖上のクエンチャーによってクエンチされた蛍光色素で標識される。
【０１６６】
ＲＤＴのいくつかの実施形態では、検出試薬およびフック鎖は標識されず、代わりに、ディスプレーサ剤が標識される。この場合、ディスプレーサ剤は、フック鎖にハイブリダイズし、それをアンカー鎖から置換して、同時にそれを標識する。検出ＡＢが三成分複合体中で分析物および捕捉ＡＢに結合されない場合、フック鎖、ディスプレーサ剤、および標識は、支持体から洗浄される。標識はディスプレーサ剤に取り付けられるので、（ｉ）アンカー鎖からの放出または置換が生じること、および（ｉｉ）分析物が捕捉ＡＢと検出ＡＢの両方に結合しているという両方の条件が満たされたときに、標識は支持体上にのみ存在する（例えば、図７に示される）。
【０１６７】
ＲＤＴの他の実施形態も可能であり、ＲＤＴのメカニズムは特に限定されないことが意味されることが理解される。
【０１６８】
ＲＤＴのいくつかの実施形態では、検出ＡＢまたはアンカー鎖が標識に取り付けられる。いくつかの実施形態では、検出ＡＢをアンカー鎖に連結するフック鎖は、標識されている（すなわち、標識に取り付けられている）。一般に、検出ＡＢ、アンカー鎖、またはフック鎖に取り付けられた標識は、非活性または検出不能であり、その結果、標識は、支持体からの検出ＡＢの放出後にのみ検出できる（すなわち、フック鎖がアンカー鎖から放出された後、例えば、図６に示されるように）。このようにして、検出される唯一の検出ＡＢ−フックオリゴ複合体は、捕捉ＡＢおよび、アンカー鎖から成功裏に放出されたフック鎖とを有する三成分複合体中の分析物に結合した検出ＡＢを伴うものである。そうでない場合、未結合の検出ＡＢは、支持体から放出され（そして、例えば、洗浄によって除去され得る）、全ての非放出鎖は、分析物が結合しているか否かに関わらず、検出されない。このようにして、非放出検出ＡＢおよび／またはフック鎖からのバックグラウンドシグナルが軽減され、低バックグラウンドシグナルおよび／または高感度検出を確実にする。
【０１６９】
ＲＤＴの他の実施形態では、フック鎖は、フック鎖がアンカー鎖から放出されるまで不活性または検出不可能のままである標識を含む。例えば、フック鎖およびアンカー鎖がハイブリダイゼーションを介して一緒に結合されたＤＮＡオリゴヌクレオチドである場合、これは達成され得、ここで、フック鎖は、アンカー鎖に通常ハイブリダイズするＤＮＡ配列標識を含み、したがって結合のために利用できず、または検出不可能であるＤＮＡ配列を含む。アンカー鎖オリゴからのフック鎖オリゴの放出は、フック鎖上の検出可能な標識を明らかにする。このような放出は、例えば、酵素的切断、ＤＮＡ置換、または光を用いた光開裂を介して達成することができる。
【０１７０】
いくつかのそのような実施形態では、足がかり置換反応を介するアンカー鎖オリゴへの結合によって、アンカー鎖−フック鎖ハイブリッドを置換するオリゴヌクレオチドである放出またはディスプレーサ剤が提供される。一実施形態では、フック鎖および検出ＡＢは両方とも標識されておらず、標識されたディスプレーサ剤（例えば、蛍光標識されたオリゴヌクレオチド）は、放出（置換）および標識の二重機能を介してＲＤＴを実施する。このようにして、置換されたフック鎖のみを標識することによってのみ、検出可能なシグナル／シグナル伝達は、２つの条件（フック鎖の置換および分析物の存在）が満たされた場合、「ＡＮＤ」論理ゲートに対して同種である（例えば、図７Ｂに示されるように）。
【０１７１】
本明細書に提供されるアッセイおよびシステムのいくつかの実施形態では、１つ以上の捕捉ＡＢおよび検出ＡＢのセットが支持体に取り付けられ、各セットは目的の分析物に特異的である。このようにして、捕捉ＡＢおよび検出ＡＢは、目的の分析物を含有する生物学的試料への曝露の前に、支持体上で予め組み立てられ、共局在化される。上記のように、検出ＡＢは、支持体に取り外し可能に取り付けられる。いくつかの実施形態では、検出ＡＢは、支持体に取り付けられたアンカー鎖に連結された放出可能リンカー（フック鎖）によって支持体に取り付けられる。フック鎖は、一般に柔軟性であり、検出ＡＢが、フック鎖および／またはアンカー鎖の長さによって許容される範囲内で自由に拡散することを可能にする。フック鎖および放出可能連結は、検出ＡＢおよび捕捉ＡＢによる分析物の同時結合を可能にする限り、特に限定されず、サイズ、柔軟性、構造などを変更することができる。捕捉ＡＢおよび検出ＡＢは、分析物を同時に結合することが可能である限り、重複する部位を結合することができるが、分析物の別個の領域を一般的に結合する。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、検出ＡＢは、支持体に取り付けられたアンカー鎖に特異的に結合することができるＤＮＡオリゴヌクレオチドであるフック鎖を用いて支持体に取り付けられる。生物学的試料との接触およびインキュベーション（すなわち、標的認識工程）の後、表面上のフック鎖とアンカー鎖との間の結合を破壊することによって、検出ＡＢをアンカー鎖から分離する。これにより、三成分捕捉ＡＢ−分析物−検出ＡＢ複合体を形成していなかった検出ＡＢの画分が放出される。フック鎖とアンカー鎖との間の連結は、限定されるものではないが、例えば、ＤＮＡ鎖の置換、酵素的切断、光活性化開裂などのようないくつかの方法で放出または破壊され得ることが理解されるべきである。
【０１７３】
本明細書に包含されるように、多くの異なる分析物を標的とする多くのＡＢを同じアッセイ量で混合（すなわち、多重化）することができ、異なる支持体上の異なるＡＢ間の相互作用（または同じ支持体上の異なる位置／場所上の異なるＡＢ間の相互作用）は、支持体（単数または複数）への結合によって制限されるので、異なる支持体／場所からのＡＢ間の相互作用が回避される。これは、すべてのＡＢが溶液中で混合されるときのＡＢ間の相互作用を制限することができない従来の多重化技術とは対照的である。さらに、本明細書に記載の方法およびシステムでは、異なる微粒子集団を、特定の抗原を検出するために必要とされる異なるＡＢ捕捉検出対をそれぞれ含む、大きなバッチで別々に製造することができ、製造中に交差反応性が生じないことを確実にする。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、多重化されたＣＬＡ方法およびシステムは、例えば、図１に示される交差反応性のシナリオをこのように回避することができる。例えば、当業者によって理解されるように、それぞれの支持体（例えば、微粒子）上の同族の捕捉ＡＢおよび検出ＡＢ上の共局在化は、例えば、非同族の検出ＡＢと捕捉ＡＢとの間の結合などの望ましくない相互作用を排除する。図１に示されるこれらのシナリオに加えて、当業者は、従来の多重サンドイッチアッセイとは異なり、オフターゲット支持体に無差別的に結合し、または付着している分析物が、本明細書に提供される方法およびシステムにおいて、それらの同族検出ＡＢによって検出することができず、したがって、バックグラウンドシグナルの増加に寄与しないことを認識する。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、各支持体上で、捕捉ＡＢおよび検出ＡＢの局所的な濃度を高くすることができ、これは、分析物を濃縮し、感度を高めるのに役立つことができる。一方、全アッセイ体積における各捕捉ＡＢおよび検出ＡＢの全濃度は、標的特異的支持体（）例えば、微粒子、マイクロアレイスポット）の濃度にのみ依存し、放出時に低バルク密度の検出ＡＢをもたらすように設計することができる。例えば、局所濃度は、マイクロモル濃度の範囲内にあり得るが、少ない数の標的特異的微粒子の使用は、例えば、図２２に示されるように、いかなるオフターゲット結合を生じるにも低すぎる（＜ｐＭ）バルク検出ＡＢ濃度を生じ得る。このバルク濃度は、放出工程の間、体積を増加させることによってさらに減少させることができる。したがって、特定の実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、支持体上で使用される検出ＡＢの濃度または量が低いため、検出ＡＢ放出の後に起こる交差反応をさらに回避することができる。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、同一の分析物の異なるエピトープへの２つの共重合された結合剤（捕捉ＡＢ、検出ＡＢ）の同時結合（すなわち、増加した結合結合活性の増加）は、捕捉ＡＢおよび検出ＡＢが連続的に添加される従来のサンドイッチアッセイと比較して、はるかに低い有効なオフレート（ｋｏｆｆ）をもたらすことができる。試料導入およびインキュベーションの後、本明細書で提供される方法およびシステムにおける支持体は、分析物が高い結合活性で取り付けられるので、厳密に洗浄することができる。したがって、本明細書に提供される方法およびシステムのいくつかの実施形態では、ストリンジェントな洗浄を用いて、アッセイバックグラウンドを低減し、および／または感度および／または特異性を改善することができる。いくつかの実施形態では、アンカー鎖からのフック鎖の放出の後、およびアッセイシグナルの読み出しまでのアッセイ工程を迅速に実行することが望ましい場合がある。なぜなら、分析物のオフ結合は、感度の低減に寄与する可能性がある低減されたシグナルをもたらす可能性があり、そのような効果は一般にＣＬＡにおいて低減されるからである。
【０１７７】
本明細書に提供される方法およびシステムの一実施形態では、支持体は、エンコードされたミクロンサイズの微粒子であり、捕捉試薬および検出試薬は両方とも抗体であり、捕捉試薬およびその同族検出試薬は、ＤＮＡ連結を使用して同じ支持体の表面上に共局在化される（換言すれば、フック鎖およびアンカー鎖は、二本鎖ＤＮＡハイブリッドを介して互いに連結された一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである）。いくつかのそのような実施形態では、フック鎖およびアンカー鎖に連結された検出試薬は、均一に混合され、微粒子の表面に取り付けられ、ここで、アンカー鎖は、部分的ハイブリダイゼーションを通してフック鎖に連結され、フック鎖は、検出試薬に結合体化され、フック鎖は、柔軟性かつ放出可能なＤＮＡリンカーである。アンカーとフック鎖との間のハイブリッドは、試料インキュベーションの条件下では、一般に安定である。いくつかの実施形態では、捕捉試薬はまた、ＤＮＡリンカーを介して同様に微粒子にも連結される。いくつかのそのような実施形態では、アンカー鎖からのフック鎖の放出は、足がかり媒介ＤＮＡ置換反応を介して行うことができる。そのような実施形態では、ディスプレーサ剤は、フック鎖上の足がかり配列に結合して、置換反応を前方に駆動するように設計されたオリゴヌクレオチドである。いくつかのそのような実施形態では、アンカー鎖からのフック鎖の放出は、例えば、温度を上昇させることにより、ＤＮＡハイブリッド複合体が「融解」または未結合されるように温度を上昇させることにより、ディスプレーサ剤なしで実施することができる。
【０１７８】
一実施形態では、検出ＡＢおよび／またはフック鎖は、引き続く工程などにおいて、例えば色素、蛍光標識されたストレプトアビジンを使用して検出され得るビオチン部分で標識される。特定の実施形態では、分析物を標識結合剤と結合させた後に、検出ＡＢを検出することができ、例えば、標識された種特異的二次−ｌｇｇを使用してＩｇＧを標的化することができる。いくつかの実施形態では、検出ＡＢおよびフック鎖は標識されず、代わりに、アンカー鎖からフック鎖を放出させるために使用されるディスプレーサ剤が標識される。そのような実施形態では、標識されたディスプレーサ剤は、アンカー鎖からのフック鎖の放出の後に、フック鎖および／または検出ＡＢに取り付けられる。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、標識は、後続の工程（単数または複数）で検出または標的化され得る特異的ＤＮＡ配列である。例えば、特異的ＤＮＡ配列は、それを色素で標識する後続のＤＮＡハイブリダイゼーション工程を用いて標的とすることができる。一実施形態では、特異的ＤＮＡ配列が検出され、増幅されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の酵素的ＤＮＡ増幅手段を通して増幅される。特異的ＤＮＡ配列はまた、配列決定などの他の手段によって切断および検出することができる。ＤＮＡ配列を標識として使用する実施形態は、限定されず、フック鎖の一部であるか（したがって、最初に不活性／検出不能である）、またはディスプレーサ剤上に存在する配列を含むことができる（例えば、図６Ａ、Ｄに示される）。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、フック鎖に連結され、それに取り付けられたアンカー鎖への放出可能な連結を介して間接的に微粒子に取り付けられた検出ＡＢが提供される。フック鎖は、微粒子に取り付けられたアンカー鎖に部分的に相補的である。アンカー鎖は、例えば、ストレプトアビジン／ビオチン相互作用または化学結合を介して微粒子に取り付けられ得る。このようにして、検出ＡＢは微粒子に取り付けられる。本実施形態では、微粒子表面に取り付けられる捕捉ＡＢがさらに提供され、検出ＡＢは捕捉ＡＢと同一の抗原を認識し、両方のＡＢは同時に抗原を結合することができる。さらに、アンカー鎖の配列と重複する、フック鎖に相補的な配列を有する置換オリゴヌクレオチド（ディスプレーサ剤）が提供され、その結果、検出ＡＢがアンカー鎖から放出され、したがって、抗原が結合していない場合（すなわち、捕捉ＡＢ−抗原−検出ＡＢ間に三成分複合体が存在しない場合）、微粒子から放出される。さらなる実施形態では、置換反応後に微粒子上に残存する検出ＡＢに結合する蛍光標識二次抗体も提供される。
【０１８１】
捕捉ＡＢおよび検出ＡＢが支持体上に予め組み立てられ、検出ＡＢが検出可能な標識で標識されている実施形態では、任意の非放出フック鎖検出ＡＢ複合体が、分析物に依存しないシグナルをもたらし、これは（図２４に示すように）バックグラウンドノイズに寄与し得ることに留意されたい。したがって、バックグラウンドシグナルの増加を避けるために、ほぼ完全なアンカー鎖−フック鎖置換反応およびフック鎖−検出ＡＢ複合体の洗浄が必要とされることが理解される。また、最適化された条件を用いる際でさえ（図１５）、このようなほぼ完全な放出は困難であり得ることが理解される。アンカー鎖−フック鎖連結の非効率的な放出から生じるそのような増加したバックグラウンドシグナルを低減するために、いくつかの実施形態では、フック鎖、アンカー鎖、または検出ＡＢは、アンカー鎖からのフック鎖の置換または放出まで、非活性／検出不能であるままである標識で標識される。別の実施形態では、フック鎖、アンカー鎖、または検出ＡＢは標識されておらず、ディスプレーサ剤は検出可能な標識で標識されている。そのような実施形態では、（ｉ）三成分捕捉ＡＢ−分析物−検出性ＡＢ複合体の形成、および（ｉｉ）フック鎖−アンカー鎖ハイブリッドの置換の条件の両方が満たされる場合にのみ、支持体におけるシグナル伝達が起こる。これらの実施形態では、非置換フック鎖は、シグナルに寄与しない。同様に、非放出（例えば、非置換）フック鎖（または検出ＡＢ）がシグナルに寄与しないので、放出後まで検出ＡＢおよび／またはフック鎖上の標識が非活性であるか、または検出不可能である実施形態が有利であり得ることが理解されるべきである。
【０１８２】
一実施形態では、標識されたディスプレーサ剤（例えば、オリゴヌクレオチド）は、「ＡＮＤ」論理ゲートと同種の放出（置換）および標識の二重機能を実施することができる。このようにして、置換されたフック鎖を標識するだけで、検出可能なシグナル／シグナル伝達は、２つの条件を必要とする（図２３）。そのような実施形態の潜在的な利点は、それらが、フック鎖およびアンカー鎖を含む検出複合体のＤＮＡ配列または連結特性の設計の変化を必要としないことである。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、付加的なレベルの冗長性は、アンカー鎖からの置換の際に活性化または検出可能なのみである不活性または検出不可能な標識を有するフック鎖を使用することによって達成することができる。例えば、一実施形態では、フック鎖は、アンカー鎖に結合体化することができる色素クエンチャーによってクエンチされる色素で標識される。別の実施形態では、置換は、制限酵素を使用して同様に達成することができ、続いて、以前にハイブリダイズされた（したがって、結合のために利用可能でない）フック鎖の部分を標的化する標識されたオリゴを用いたシグナル生成が行われ、それによって、すでに置換されたフック鎖とハイブリダイズし、それを標識することのみが可能である。
【０１８４】
特定の実施形態では、フック鎖を介して微粒子に連結された検出ＡＢが提供され、フック鎖は、検出ＡＢに取り付けられたオリゴである。フック鎖オリゴは、例えば、ストレプトアビジン／ビオチン相互作用または化学結合を介して微粒子に連結されたオリゴでもあるアンカー鎖に部分的に相補的であり、したがって、検出ＡＢを微粒子に付着させる。さらに、微粒子表面に連結された捕捉ＡＢであって、検出ＡＢが捕捉ＡＢと同一の抗原を認識し、両方のＡＢが同時に抗原に結合することができる捕捉ＡＢを提供する。また、蛍光標識またはＤＮＡバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドであって、アンカー鎖オリゴヌクレオチドの配列と重複しているフック鎖オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する置換剤を提供することができ、その結果、検出Ａｂがアンカー鎖オリゴから放出され、したがって、微粒子から放出され得る。
【０１８５】
本明細書に提供される方法およびシステムでは、共局在化および結合の使用は、支持体にわたる両方のＡＢ（捕捉ＡＢおよび検出ＡＢ）の利用可能性を最適化するために、合理的なトポロジー設計を必要とすることができることが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、支持体に取り付けられた、確率的に分布した捕捉ＡＢおよび／または検出ＡＢを用いて、分析物の適切な結合は、２つの重要な設計パラメータ、（ｉ）捕捉ＡＢおよび検出ＡＢの相対密度、および（ｉｉ）フック鎖の長さの最適化を必要とし得る。これら２つのパラメータは、検出ＡＢの回転半径を考慮することにより、捕捉ＡＢと検出ＡＢとの間の時間平均距離を制御するために役立つ。場合によっては、捕捉ＡＢと検出ＡＢとの間の距離、および最終的に、単分子レベルでの有効親和性は、確率的であり、制御が困難であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、最適なアッセイ性能のために前述の２つパラメータを最適化することが望ましい場合がある。
【０１８６】
別の実施形態では、捕捉ＡＢおよび検出ＡＢは、両方ともアンカー鎖に連結され、同時にナノスケールでの共局在化を維持しながら、同時に捕捉ＡＢおよび検出ＡＢ密度の制御を可能にし、アッセイ性能のより正確な制御を潜在的に可能にする（例えば、図５Ｆ−Ｇおよび図２１のいくつかの実施形態で示される）。そのような実施形態では、捕捉ＡＢおよび検出ＡＢは共局在化され、それらの相対密度は同一であり、同時に調節することができる。この実施形態の一つの潜在的な利点は、支持体上の全ての対についての捕捉ＡＢと検出ＡＢとの間の均一な平均距離である。この実施形態の第２の潜在的な利点は、捕捉ＡＢおよび検出ＡＢのアーキテクチャが正確に制御され得ることである。例えば、アンカー鎖またはフック鎖の一本鎖部分の長さを減少させることにより、結合のストリンジェンシーを制御して、アッセイ系の熱力学を制御する決定的手段を提供することができる。結合のストリンジェンシーを増加させることにより、効果的な親和性の低下をもたらすことができることは、当業者によって理解される。いくつかの実施形態では、このような有効親和性の調整は、他の用途の中でも、アッセイのダイナミックレンジを制御し拡張するために使用することができる。
【０１８７】
フック鎖またはアンカー鎖の長さ（すなわち、リンカー長）を変化させることによって、または捕捉ＡＢおよび検出ＡＢの表面密度を調節することによって、有効親和性を調整することができるいくつかのそのような実施形態では、異なる有効親和性で設計される多重化アレイ（多重化微粒子など）を製造することができる。これは、特定の分析物についての特定のアッセイのダイナミックレンジを拡張するために有用であり得る。例えば、当業者は、いくつかのタンパク質が５桁以上の範囲の濃度で血液中に存在すること、そのような標的については、異なるバーコードを用いていくつかのアッセイを設計することができ、そのようなタンパク質をより大きなダイナミックレンジで定量することができることを理解する。
【０１８８】
一実施形態では、捕捉ＡＢは、支持体連結されたアンカー鎖の１つの配列ドメインにハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドに結合体化される。アンカー鎖の別の配列ドメインは、検出ＡＢに連結されたフック鎖にハイブリダイズされ得る。本実施形態では、シグナル伝達および生成のための前述の戦略の全てを利用することもできる。
【０１８９】
一実施形態では、同じ標的を検出する識別可能な（すなわち、多重化された）複合体の２つ以上のセットを、多重化アッセイのダイナミックレンジを増加させるように設計することができ、ここで、２つ以上のセットのためのフック鎖オリゴの長さ、したがって結合のストリンジェンシーを制御することができる。例えば、異なるバーコードを有するが同じ分析物を標的とする２つ以上の微粒子のセットを製造することができ、ここで、第１の微粒子セットは、柔軟性を低減し、結合のストリンジェンシーを増加させるために、より短いフック鎖オリゴを含み、第２の微粒子セットは、柔軟性を増大させ、結合のストリンジェンシーを低下させるために、より長いフック鎖オリゴを含む。このようにして、第１の微粒子セットは、より高濃度で存在するときに分析物を定量するように設計することができる。
【０１９０】
当業者は、多重化アッセイの別の課題は、干渉およびマトリックス効果であり、これは、分析物レベルでの制御が困難であり得ることを認識する。本明細書に提供される方法およびシステムの利点の一つは、いくつかの実施形態では、同じアッセイ容積内で同じ生物学的試料を多数のアッセイ構成と接触させる能力である。この柔軟性は、特異的ＡＢおよびアッセイ試薬に対するマトリックス効果を個別に制御する能力を提供することができる。例えば、特定の試料は、特定の分析物についてのアッセイシグナルの強度に正または負の影響を与える内因性抗体および他の分子を含むことができる。
【０１９１】
別の実施形態では、別個の支持体または生体分子複合体が提供され、この支持体または生体分子複合体は、捕捉ＡＢまたは検出ＡＢのいずれかを欠いているすべての分析物特異的支持体を伴い、マトリックス効果およびアッセイの失敗の他の潜在的な様式を制御する、分析物特異的内部標準として作用する。次いで、支持体上の完全に形成された生体分子複合体のアッセイシグナルを、これらの単ＡＢ対照と比較することができる。これらの内部対照は、潜在的な偽陽性のためのフラッグとして使用することができる。
【０１９２】
当業者は、特に非ゼロまたは高速のオフレート（ｋ−ｏｆｆ）を有する結合剤を使用する場合のアッセイの別の課題は、特に、生物学的試料の洗浄の間からアッセイシグナルの読み出しまでの時間において起こり得る分析物の未結合、したがってアッセイシグナルの低下であることを認識する。この未結合は、低濃度の分析物、および多重化（例えば、サイトメトリー）において異なるアッセイを測定することができない読み出し方法については特に問題である。この問題はまた、ＣＬＡセンサ手順においても存在し得、それによって、放出後（例えば、置換後）において、捕捉ＡＢまたは検出ＡＢのいずれかへの分析物の未結合は、シグナル損失をもたらす可能性がある。さらに別の実施形態では、したがって、本明細書に提供されるＣＬＡ方法およびシステムは、可逆的反応からのアッセイシグナル（例えば、ＡＢ分析物）を安定なオリゴハイブリッドに変換してさらなる未結合を停止することによって、未結合および時間依存的なシグナルのこの問題を軽減するように改変することができ、そしてより後の時点で保存および読み出しを可能にする支持体に連結される（例えば、図１３に示される）。この実施形態の潜在的な利点は、感度を増加させるために役立ち得るアッセイ完了後のシグナル損失を最小化することである。この実施形態の別の潜在的な利点は、異なるアッセイおよび試料にわたるシグナルの低下の標準化であり、これは、無視できない量の時間にわたって読み出すことができ、より良好なシグナル再現性および改善された精度を可能にする。いくつかのそのような実施形態では、アッセイは、以前の実施形態と同様に実施することができ、アッセイ標識は、独特なＤＮＡ配列であり、ここで、放出された検出ＡＢの洗浄後、置換剤を導入して、フック鎖をアンカー鎖上に再結合させ、それによって支持体上のシグナルを保存することができる。当業者に理解されるように、本実施形態の別の潜在的な利点は、シグナル強度の再現性であり、特に、測定および温度に対するアッセイシグナルの時間依存性を除去することである。
【０１９３】
いくつかのそのような実施形態では、足がかり置換反応を介してアンカー鎖オリゴに結合することにより、次いで、アンカー鎖−フック鎖ハイブリッドを置換するオリゴであり、放出され、未結合のフック鎖オリゴ−検出ＡＢ複合体を洗浄することによって、次いで、両方のオリゴにハイブリダイズさせることにより、アンカー鎖オリゴへのフック鎖オリゴの再結合を可能にする置換オリゴを付加することにより、アンカー鎖−フック鎖ハイブリッドを置換するオリゴであるディスプレーサ剤が提供される。
【０１９４】
いくつかの用途は、本明細書に提供される方法およびシステムから著しく利益を得、この方法およびシステムは、いくつかの実施形態では、多重サンドイッチアッセイにおけるバックグラウンドノイズおよび偽陽性のいくつかの原因に対処するように働く。特に、いくつかの実施形態では、タンパク質分析の多重化は、本明細書に提供される方法およびシステムによって著しく可能になる。例えば、サイトカインおよび他の可溶性因子などのタンパク質のプロファイリングは、試薬交差反応性に起因する従来の多重化において制限されてきた。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、多重化された血清学的分析を顕著に改善することができる。例えば、多くの特異的自己抗体を検出するために使用される多重化自己抗体アッセイは、特異性によって著しく妨げられてきた。自己抗体は、典型的には、固体支持体上の特異的な組換えまたは天然の抗原によって捕捉され、次いで、種特異的検出抗体（例えば、抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ）によって検出される。その結果、血清中に存在する自己抗体のあらゆる非特異的結合が検出され、しばしば偽陽性となり、このタイプのアッセイを単結合アッセイとする（換言すれば、単一プレックス形態に限定される）。対照的に、本明細書に提供される方法およびシステムは、二重結合アッセイを実行するために利用され得、すなわち、分析物（ここでは、自己抗体）が２つの特異的ＡＢ（ここでは特異的抗原）によって認識および検出されるものである。そのような態様において、組換えまたは天然の抗原は、捕捉鎖およびフック鎖にそれぞれ結合体化された捕捉ＡＢおよび検出ＡＢを表す２つの画分に分割することができ、ここで、捕捉鎖およびフック鎖は両方とも同じアンカー鎖に連結され、アンカー鎖は支持体に取り付けられている（図９のように）。先に議論したように、フック鎖の柔軟性は、分析物（ここでは抗体）の捕捉ＡＢおよび検出ＡＢ（ここでは、異なる官能性を有する別個の鎖に結合体化された同一のタンパク質）への同時結合を可能にすることができる。未結合試料の洗浄に続いて、シグナル伝達は、本明細書に記載されるように、標識鎖置換を介して進行することができる。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、ＡＢを用いたタンパク質−タンパク質相互作用の多重化分析における大きな課題に対処することができる。その目的のために、図１０に示されるように、ＡＢ対は予め組み立てられることができ、各ＡＢ対は１つの目的のタンパク質を標的とし、ＣＬＡが問題の対の間の相互作用を検出することを可能にする。このような多重化アッセイを別のものから完全に単離するために、交差反応性は有意に低減され、異なるタンパク質−タンパク質対にわたる相互作用の組み合わせ測定を可能にする。本明細書に提示された実施形態の製造方法のモジュラーアプローチは、異なるタンパク質を標的とするＡＢ対の実現および製造を比較的容易にする。例えば、微粒子上のＣＬＡの大きなバッチ製造は、捕捉ＡＢを有する微粒子のバルク官能化を可能にし、続いて、異なる検出ＡＢをすべての画分に分別し、添加することを可能にする。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、ＡＢを用いた翻訳後修飾（ＰＴＭ）の多重化分析における別の大きな課題に対処することができる。例えば、正確なタンパク質リン酸化分析を用いて、タンパク質発現レベルから明らかでない細胞シグナル伝達事象を明らかにすることができる。特定のタンパク質のＰＴＭの画分を定量化するための現在の方法およびワークフローは、ＰＴＭ特異的ＡＢがタンパク質自体に対して特異性が不十分なため、多重化において厳しく制限される（すなわち、蛍光体特異的ＡＢは、試薬で駆動される交差反応性の問題に対して非常に感受性である）。その結果、従来のＰＴＭパネルは多重化されない。本明細書に提供される多重化ＣＬＡアッセイ方法およびシステムは、抗ＰＴＭ結合剤を分析物特異的支持体に制限することによって（図１１におけるように）、この問題に対処することができる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、フック鎖は、柔軟性で放出可能なリンカーであり、オリゴヌクレオチドであり、これは、捕捉ＡＢ−分析物−検出ＡＢの三成分複合体の形成を可能にし、これにより、支持体から結合していないフック鎖オリゴの１つが放出されると、サンドイッチ捕捉ＡＢ−分析物−検出ＡＢの認識に応答してのみシグナルが生成される。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、検出ＡＢに連結されたオリゴヌクレオチドであるフック鎖を介して、微粒子などの支持体に取り付けられた抗体である検出ＡＢが提供される。フック鎖オリゴヌクレオチドは、ストレプトアビジン／ビオチン相互作用、例えば、化学結合を介して、例えば、支持体（例えば、微粒子）に取り付けられたアンカー鎖オリゴヌクレオチドに部分的に相補的であり、したがって、検出ＡＢを支持体に取り付ける。支持体に取り付けられた抗体である捕捉ＡＢがさらに提供され、ここで、検出ＡＢは捕捉ＡＢと同一の抗原を認識するが、同一のエピトープを認識しない。いくつかの実施形態では、蛍光標識またはＤＮＡバーコード配列を含み、アンカー鎖オリゴヌクレオチドの配列と重複している、フック鎖オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであるディスプレーサ剤が提供され、その結果、検出ＡＢがアンカー鎖オリゴから放出され、したがって標的分析物の非存在下で支持体から放出され得る。一旦、捕捉ＡＢおよび検出ＡＢが分析物に結合すると、三成分捕捉ＡＢ−分析物−検出ＡＢ複合体が支持体上（例えば、微粒子上）に形成されることが理解されるべきである。三成分複合体の形成後、未結合の検出ＡＢは、洗浄によって支持体から除去され、一方、三成分複合体は、支持体上に保持される。その後、支持体上の三成分複合体の存在を検出および／または定量することができる。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、本明細書中に提供される方法およびシステムは、「微粒子上の連結による共局在化アッセイ」または「ＣＬＡＭＰ」と呼ぶことができる。本明細書に記載されるＣＬＡＭＰ方法およびシステムは、ユーザにとって非常に利用しやすく、有利であり得る。例えば、予め組み立てられたＡＢ対（捕捉ＡＢおよび検出ＡＢの対）を有する微粒子を提供することにより、ユーザは、意のままに迅速にパネルを混合およびマッチさせることができ、多重化アッセイを実行でき、そして、例えば、任意の多色フローサイトメータを使用してアッセイ結果を読み出すことができる。したがって、本明細書に提供されるＣＬＡＭＰアッセイは、生物学における既存の実験的なワークフローに適合させることができ、いくつかの実施形態では、任意の多色フローサイトメータを使用して読み出すことができる。
【０２００】
ＣＬＡＭＰの実施形態は、交差反応性を避ける多重化されたパネルの大規模な工業的規模の製造のために一意に適合可能であることが理解される。平面アレイとは対照的に、ＣＬＡＭＰは、必要に応じて保存された大きなバッチで別々に製造することができ、次いでアッセイの前に混合することができる。この製造方法は、非同族のＡＢ間の相互作用なしに、したがって製造工程中に交差反応性を伴うことなく、ＣＬＡＭＰを独立に製造することを可能にし、これは、他のＣＬＡ実施形態よりも重要な利点である。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、多重化ＣＬＡＭＰを製造するために、ＡＢ対は、微粒子のセットに取り付けられ、ここで、各標的特異的ＡＢ対は、別個の容器内の微粒子のそれぞれのセットに取り付けられる。微粒子は、ＡＢ結合の前にバーコード化することができ、またはこのプロセス中にバ−コード化することができる。この反応は、大きなバッチで実施することができ、製造されたＣＬＡＭＰは保存することができる。アッセイを行うために、各バーコード／標的についてのビーズの画分が、生物学的試料と接触させる前に一緒に混合される。微粒子は、任意の手段、例えば、スペクトル的、図形的、または化学的に、バーコード化することができる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、支持体が微粒子（ＭＰ）である場合、ある種の利点が得られ得る。例えば、いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーにより多数のＭＰを迅速に読み出す能力は、増加した精度および試料スループットを提供することができる。加えて、ＭＰは、大量のバッチで官能化され、次いで保存され、使用され、そして溶液中で読み出されることが可能であり、これは、ロット間の変動性を低減し、定量分析を可能にすることができる（Ｔｉｇｈｅ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ９，４０６−４２２，２０１５；  Ｊａｎｉ，Ｉ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ２，２４３−２５０，２００２；  Ｋｒｉｓｈｈａｎ，Ｖ．Ｖ．，Ｋｈａｎ，Ｉ．Ｈ．＆  Ｌｕｃｉｗ，Ｐ．ａ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｅａｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：Ｂａｓｉｃ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ；Ｔｉｇｈｅ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｔｉｌｉｔｙ，ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｋｉｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）１−７  ２０１３；Ｆｕ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ４，２７１−８４，２０１０）。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法およびシステムは、試薬交差反応性を低減または排除することができる。ＣＬＡの一態様を例証する図２ａに示されるように、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを柔軟性およびアドレス可能なリンカーとして使用する表面上の２セットの抗体のプレ共局在化は、非同族抗体間の相互作用を排除することができる。さらに、表面からの柔軟性リンカーの１つを放出の際に、サンドイッチ抗体−抗原−抗体認識に応答してのみシグナルが生成される。
【０２０４】
図２Ｂ−図２Ｆは、一実施形態による、ナノスケール構造およびＣＬＡＭＰの動作原理を示す。蛍光オリゴヌクレオチドおよび抗体の規定された比率を有する微粒子のワンポット官能化を通して、ＣＬＡＭＰ集団を作製し（図２Ｂ）、続いて、フックオリゴ−検出ＡＢ（ｄＡＢ）複合体のハイブリダイゼーションを行い、ＣＬＡＭＰの構築を完了させた（図２Ｂ）。一実施形態では、安定なビオチン−ストレプトアビジン結合は、製造後に保存されたビーズセットとともに、試薬連結／取り付けに使用される。次に、１価の抗体−オリゴ結合体は、ハイブリダイゼーション（すなわち、抗体対Ａ１−Ａ２およびＢ１−Ｂ２がそれぞれビーズＡおよびＢに予め組み立てられている）（図２Ｃ）を介して、バーコード化ビーズセット上で対として組み立てられ、次いで、ビーズセットが一緒にプールされる。ＣＬＡＭＰパネルが試料に添加されると、標的タンパク質はサンドイッチ複合体を生成し、一方、非特異的に結合したタンパク質は完全なサンドイッチを形成しない（図２Ｄ）。インキュベーション後、ストリンジェントな洗浄は非特異的に結合したタンパク質を除去する（図２Ｅ）。次に、ＤＮＡ鎖置換を用いて、各ビーズ集団上のサンドイッチの１つの抗体を同時に脱ハイブリダイゼーションおよび標識し、サンドイッチ結合事象のみがシグナルを生成することを確実にする（図２Ｆ）。最後に、ＣＬＡＭＰパネルは、任意の一般的に利用可能な多色フローサイトメータを使用して、自動的に読み出され、ビードセットがデコードされる。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、ＣＬＡＭＰパネルは、従来のイムノアッセイよりも低い開発コストを有することができ、新たな標的分析物が添加されるときに回避されるパネルの高価な再最適化だけでなく、ＣＬＡＭＰはまた、アッセイ毎に有意に低い量の抗体を使用することができる。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、試薬の交差反応性を克服することに加えて、ＣＬＡＭＰ中の表面につながれた抗体の対は、結合活性効果をもたらすことができ、これにより、従来のサンドイッチイムノアッセイを超えたさらなる利点が得られる。ＣＬＡＭＰにおける抗体サンドイッチ複合体からの標的のオフレート（ｋｏｆｆ）は、連続的な抗体添加を用いたアッセイよりもはるかに低くできるので、ＣＬＡＭＰは標的に対するより高い親和性を示すことができる。いくつかの実施形態において、ＣＬＡＭＰアッセイは、インキュベーション後に厳密に洗浄することができ、アッセイバックグラウンドを減少させ、特異性を改善することができる。さらに、いくつかの実施形態では、ＣＬＡＭＰは偽陽性による不利益の低減を有することができ、ＣＬＡＭＰにおける誤った結合事象は完全なサンドイッチ複合体を形成しないので、それらは偽陽性シグナルにつながることはない。
【実施例】
【０２０７】
本発明は、本発明を説明するために提供され、また、本発明の範囲を決して限定するものと解釈されるべきではない、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解される。
【０２０８】
別途定義されていない限り、または文脈が明確に指示しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと同様または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができることが理解されるべきである。
【０２０９】
実施例１．ワンポットビードバーコーディングおよびＣＬＡＭＰの製造
いくつかの実施形態では、多重化アッセイ系は、スペクトル的にコード化されたビーズ上に実施され、ここで提供される方法およびシステムにおいて、ワンポットビーズバーコードストラテジーおよび自動化デコーディング方法を使用することができる。このようなバーコーディング／デコーディング方法の例は、米国特許出願番号第１６／１５３，０７１号およびＤａｇｈｅｒ，Ｍ。ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．９２５−９３２，２０１８に記載されており、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。このような方法は、フルオロフォアスペクトル重複および多色フォースター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の正確なモデルを使用する。例えば、このようなストラテジーは、バーコーディング用の２つのレーザーおよびアッセイ読み出し用の第３のレーザー（図３Ａに示す）を使用して５８０より多いバーコードの能力を有することができる。赤外レーザーを用いる細胞計は、５，０００を超えるバーコードまで性能を潜在的に拡張することができる。
【０２１０】
同じ製造ワークフローを使用して、本明細書に記載されるような共局在化抗体アッセイのバージョンを構築した。すなわち、第１の段階では、ストレプトアビジンビーズをビオチン化捕捉抗体、およびビオチン化アンカーまたは異なる色素で修飾された捕捉オリゴ糖と共カップリングさせ、識別可能なバーコードを得た。各バーコードおよび標的特異的抗体は、別個のチューブ中で製造した。第２の工程では、フックオリゴに結合体化した検出抗体（モノクローナル）を、第１の工程から対応する官能化されたビーズに添加した。フック鎖オリゴは、アンカー鎖オリゴと相補的であり、それにハイブリダイズし、これにより、一致した抗体対のアセンブリおよび共局在化をもたらした。ビーズは、後で使用するために別個に保存することができる。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、低オリゴ：抗体結合比もしくは価数および／または２段階精製を用いて、バックグラウンドシグナルを最適化（すなわち、より低く）することができる。例えば、低価数抗体−オリゴ結合体は、ＣＬＡＭＰ鎖置換効率を最大化し、バックグラウンドシグナルを最小化することが示された（図３Ｂ）。第１の最適化ラウンド（イオン強度の変化、洗浄およびインキュベーション時間、ナノスケールの設計および試薬濃度）の後、ｕＰＡに対する１−プレックスＣＬＡＭＰの感度は、従来のサンドイッチアッセイよりも３倍改善された（図３Ｃ）。高原子価ではなく一価の結合を実施することにより、さらなる３倍の改善がもたらされた（図３Ｄ）。
【０２１２】
一実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＬＡＭＰシステムは、以下の成分を含む。
１）全ての他の成分を適所に保持する微粒子
２）微粒子に共有結合した１つの型の捕捉抗体（ｃＡｂ）
３）フックオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した１つの型の検出抗体（ｄＡｂ）であって、検出抗体はｃＡｂ同一の抗原を認識するが、ｃＡＢと同一のエピトープを認識しない
４）例えば、ストレプトアビジン／ビオチン相互作用を介して微粒子に連結されたアンカーオリゴヌクレオチド（ＡＯ）
５）ＡＯに対して完全にまたは部分的に相補的であり、それによって少なくとも部分的に二本鎖を形成するステムオリゴヌクレオチド（ＳＯ）
６）ｃＡｂに共有結合的に連結され、アンカーオリゴヌクレオチドに部分的に相補的であり、したがってｃＡｂを微粒子に取り付けるフックオリゴヌクレオチド（ＨＯ）
７）２つの機能を有する置換オリゴヌクレオチド（ＤＯ）
ａ）蛍光標識を含有し、および
ｂ）ＨＯに対して相補的であり、ＡＯの配列と重複する配列を有し、その結果、ｄＡｂがＡＯから放出され、したがって、微粒子から放出される。
【０２１３】
抗体を使用した５−プレックスＣＬＡＭＰが組み立てられ、ここで、抗体が従来のサンドイッチ免疫アッセイにおいて高度に交差反応性であり、ＣＬＡＭＰが完全に交差反応性を避けたことを確認した（図３Ｅ）。５−プレックスＣＬＡＭＰの標準曲線を図３Ｆに示す。
【０２１４】
ヒト血清をプロフィール化するために、ＣＬＡＭＰを使用した。結合体化抗体およびバ−コード化ビーズは、＞１ヶ月独立して保存され、ＣＬＡＭＰは、血清中のＰＳＡの回復において良好なスパイクを生じた（データ示さず）。
【０２１５】
一実施形態では、本明細書に記載のＣＬＡＭＰシステムは、１０−プレックスサイトカインパネルである。本明細書に包含されるサイトカインは、例えば、ＩＬ１−ＩＬ１７、ＭＣＰ１／３、ＴＮＦ、ＥＧＦ／Ｒ、および／またはＶＥＧＦ／Ｒであるが、これらに限定されない。別の実施形態では、本明細書に包含されるＣＬＡＭＰシステムは、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ｐ５３および／またはＣＡ１５−３を標的とする、乳癌転移に焦点を合わせた１０−プレックスパネルである。
【０２１６】
実施例２．ＣＬＡＭＰアッセイアーキテクチャ
本発明者らは、一実施形態にしたがって、「ＣＬＡＭＰ」と呼ばれる微粒子（ＭＰ）上の連結による共局在化アッセイを調製および試験した。ＣＬＡＭＰは、１セットのバーコード化ＭＰ上に各抗体対を共局在化することおよび閉じ込めることによって、試薬で駆動される交差反応性（「ｒＣＲ」）を排除するように設計された多重化アッセイであって、それによって、非同族抗体間の相互作用を回避する（図１４Ｃ）。オリゴヌクレオチド（オリゴ）は、（ｉ）検出抗体（ｄＡｂ）の柔軟性連結、（ｉｉ）ｄＡｂのオンデマンド放出、（ｉｉｉ）アッセイシグナルの導入、ならびに（ｉｖ）ＭＰの蛍光バーコーディングを含む、ＣＬＡＭＰのキー分子「操作」を実施するためのプログラム可能な構築ブロックとして使用される。ここで、本発明者らは、従来のＭＳＡにおいて強く交差反応する試薬を使用して、ｒＣＲを排除するために、ＣＬＡＭＰアッセイおよびショーケースの概念的な動作および実験的検証および最適化を詳細に説明する。
【０２１７】
本明細書では、ＣＬＡＭＰアッセイと呼ばれる一実施形態のアーキテクチャおよび動作原理は、それぞれ、図１４のパネルｄおよびｅに概略的に例証されている。抗体の各々の対を共局在化するために、８２ｎｔフック鎖オリゴヌクレオチド（フックオリゴと呼ばれる）、または「ＨＯ」と呼ばれる）は、検出抗体または「ｄＡｂ」と呼ばれる抗体である検出試薬に共有結合され、捕捉抗体（ｃＡｂ）コート微粒子（ＭＰ）と呼ばれる抗体である捕捉試薬の表面に結合された捕捉オリゴ（ＣＯ）と呼ばれる捕捉鎖オリゴヌクレオチドへの２１ｂｐハイブリッドを介して部分的にハイブリダイズされる。ｃＡＢは表面上で不動であるが、ｄＡｂはＨＯの６１ｎｔ一本鎖ドメインのために柔軟性である。この柔軟性により、分析物との三成分複合体の形成が可能になる（図１４Ｅ）。抗体対の閉じ込めは、一致していない抗体間の相互作用を排除し、全てのＭＰ上での単一プレックスアッセイ構成を回復させ、単一の交差反応事象（例えば、非同族のｃＡｂに反応する標的分析物）がサンドイッチ結合をもたらさないことを確実にする。抗体の先験的な共局在化は、タンパク質の迅速な二重認識を可能にするが、シグナル伝達および生成のための付随する方法を必要とする。１つのアプローチは、ＨＯ−ＣＯ連結を最初に破壊することである。例えば、光誘導または酵素開裂または足がかり保持媒介置換を介して、次いで、放出されたｄＡｂ−ＨＯ複合体を洗浄した後、表面に残っているｄＡｂを標識してサンドイッチ形成をシグナルする。しかし、未破壊のＣＯ−ＨＯ結合は、標的分析物の存在に関係なく、対応するｄＡｂの標識をもたらし、その結果、バックグラウンドシグナルを増加させる。例えば、３μｍ  ＭＰ上の２％  ｄＡｂ被覆は、標識された場合、バックグラウンドシグナルの大きな増加をもたらし、感度検出を著しく妨げることができる１０００−５０００ｄＡｂに対応する。
【０２１８】
ＣＬＡＭＰアッセイにおけるこの影響を軽減するために、本発明者らは、ＨＯ上の足がかり保持ドメインに結合し、同時にそれを置換および標識する蛍光標識されたディスプレーサオリゴ（ＤＯ）の使用を通して、「成功裏に」放出された結合体を排他的に標識するための検出スキームを設計した（図１４Ｅ、図７）。重要なことは、この「置換による検出」はＡＮＤ論理ゲートとして動作し、検出可能なシグナルのためにタンパク質二重捕捉およびｄＡｂ放出の両方を必要とする（図１４Ｆ）。この実施形態において、ＣＬＡＭＰ試薬は、２段階で磁気ＭＰ上に組み立てられ、ビオチン−ストレプトアビジン結合とワトソン−クリック塩基対合の親和性から利益が得られる（図１８）。第１の工程では、ビオチン化オリゴ糖および抗体の混合物をストレプトアビジン被覆ＭＰの表面に共固定化する。標識のワンポットの性質により、ＣＯ表面密度に対して正確な制御が可能となり（図１９）、同時に、他の場所で説明したように多色分級色素を用いるワンポット標識を介してＭＰエンコードを可能にする（Ｄａｇｈｅｒ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．（９２５−９３２，（２０１８）。第２の工程では、ＨＯ−ＣＯハイブリダイゼーションを介してｄＡｂ−ＨＯ複合体をプルダウンし、ＣＬＡＭＰのアセンブリを完成させる。
【０２１９】
実施例３．ＣＬＡＭＰアッセイの最適化
本発明者らは、最初に、非結合体化Ｃｙ５−標識ＨＯ（図１５）を置換することにより、足がかり介在置換反応の効率を最適化した。ＨＯは、異なるＣＯ濃度を有するＭＰ上で引き下げられ、次いで、非標識ＤＯを使用して放出された。置換緩衝液（ＭＮａＣｌ＞５００ｍＭ）中の増加したイオン強度は、負に荷電したオリゴをスクリーニングするために役立ち、そして、ＨＯへのＤＯハイブリダイゼーションの効力およびＨＯの放出を改善した。９８％の置換は、増加したイオン強度およびＤＯ濃度（それぞれ、ＭＮａＣｌ〜５００ｍＭおよびＭＤＯ＝１μＭ）を有する広い範囲のＣＯ濃度にわたって達成された。
【０２２０】
次に、本発明者らは、緩衝液中の標識置換工程後のＭＰ上の残留シグナルを測定することにより、アッセイバックグラウンド上の抗体−オリゴヌクレオチド結合体の影響を研究した（下記の方法を参照）。本発明者らは、約９０％の抗体結合収率およびＩｇＧあたり２ＨＯ（すなわち、λ〜２）の平均をもたらす市販のキット（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を用いて、ＨＯを免疫グロブリン−Ｇ（ＩｇＧ）に最初に結合体化した。これらの結合体を使用して、アッセイバックグラウンドは、非結合体化されたＨＯのアッセイバックグラウンドよりも桁が大きかった（図１６Ａ）。バックグラウンドシグナルの増加は多価ＨＯ結合体によるものであり、これは、ＤＯの、他のＨＯ鎖の少なくとも１つとのハイブリダイゼーションによって標識されている非放出ｄＡｂ−ＨＯ複合体（未破壊のＨＯ−ＣＯ結合に起因する）をもたらし、それによってタンパク質とのサンドイッチ結合の非存在下で蛍光シグナルを発生させることができる（図１６Ｂ）。多価ｄＡｂ−ＨＯ結合体を最小化するための効果的な方法は、平均結合体化価を減少させることであり、例えば、０．１のλを目指すことによって、ポアソン統計値は、＜５％ｄＡｂが複数のＨＯに結合されることを示す。このような低結合体化価数のトレードオフは、抗体の結合体化収率（１０％）の減少であり、これは、未反応の抗体の９０％を残す。未反応の抗体を浪費することを避けるために、本発明者らは、未結合体化抗体の本来の状態を維持し、それらのリサイクルを可能にする、結合および精製のワークフローを開発した。ｄＡｂおよびＨＯの相対濃度を調節し、１．２５から０．１まで調節した（図１６Ｃ）。変化する価数を有するｄＡｂ−ＨＯ結合体は、変化するＣＯ濃度を有するＭＰ上で引き下げられた。予想されるように、より低い価数は、残存アッセイバックグラウンドを有意に減少させ、非結合体化ＨＯによって示されるバックグラウンドシグナルを０．１＜λ＜０．２（図１６Ｄ）に一致させる、８％の多価結合体よりも少ない、低い価数の結合体をもたらした。多価シナリオと一致して、ＣＯ密度を増加させることは、より少ない高い価数のｄＡｂ−ＨＯについてのより高いバックグラウンドシグナルを増幅した。
【０２２１】
アッセイ性能を最適化するために、ｄＡｂ−ＨＯ濃度を調節した。ＣＬＡＭＰにおいて、適切な局所ｄＡｂ濃度は、敏感で高容量のサンドイッチ結合のための鍵であり、これは、設定されたＨＯ長さについて、主としてｄＡｂ−ＨＯの表面密度に依存し、および、ハイブリダイゼーション捕捉を通して、ＣＯに依存する。種々のＣＯ濃度を有するウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（抗ｕＰＡ  ＣＬＡＭＰ）に対するＣＬＡＭＰを、８％未満の多価結合体を有する低価のｄＡｂ−ＨＯ結合体を使用して調製した（図１６Ｄ、下記の方法を参照のこと）。抗ｕＰＡ  ＣＬＡＭＰを、組換えｕｐａ抗原の連続希釈と共にインキュベートし、続いて、洗浄および標識置換による検出を行った。予想されるように、ＣＯ濃度を増加させると、アッセイのシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）が調節され、１０１４ｍ−２より大きい密度が十分なＳＮＲのために必要であることを明らかにした（図１６Ｅ）。一方、１０１４ｍ−２を超える密度は、増加したバックグラウンドシグナルももたらすので、ＳＮＲの改善をほとんど提供しない。最後に、アッセイ性能上の結合体の価数の重要性を評価するために、本発明者らは、低価数結合体（λ〜０．１、図１６Ｆ）に対して、高い価数（λ〜２、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）の抗ｕＰＡを比較した。低価数結合体は、有意に低いバックグラウンドシグナル（１０倍）をもたらし、それに対応して、検出限界の３倍の改善をもたらした（図１６Ｆ）。他方、低価結合体は、サンドイッチ結合ｄＡｂ−ＨＯ複合体が主に単一の色素で標識されているので、蛍光のダイナミックレンジの減少を示した。まとめると、これらの結果は、一般的にバックグラウンドシグナルおよびアッセイ性能における結合体価の重要性を強調している。
【０２２２】
実施例４．多重化ＣＬＡＭＰアッセイ
試薬駆動交差反応性（「ｒＣＲ」）を排除する際のＣＬＡＭＰの有効性を試験するために、本発明者らは、一実施形態による多重化されたＣＬＡＭＰのアッセイ特異性をスクリーニングした。さらに、ＣＬＡＭＰアッセイをチャレンジするために、本発明者らは、従来の多重サンドイッチアッセイ（「ＭＳＡ」）において一緒に使用された場合に、異なるタイプのｒＣＲを示すことが示された抗体対を選択した。この目的のために、６つの標的（ＥｐＣＡＭ、ＰＳＡ、Ｅ−カドヘリン、ＥＧＦ、ｕＰＡおよびＭＣＰ）に対する抗体が、従来のＭＳＡにおける特異的および非特異的結合を本発明者らが以前に特徴付けた３５タンパク質パネル（Ｄａｇｈｅｒ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ，Nａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ，１３，ｐｐ．９２５−９３２，２０１８）からの選考を経て残った。従来のＭＳＡについては、特異性スクリーンは、それぞれの個々の抗原をｃＡＢコートされたバーコード化ＭＰのプールとインキュベートすること、続いて、それぞれ検出および標識のための混合ｄＡｂカクテルおよび二次抗体（「ｓＡｂ」）を添加することからなっていた（図１７Ａ）。１および１００ｎｇ／ｍｌの抗原濃度に応答して、異なるバーコードにわたる蛍光を測定することは（図１７Ｂ−Ｃ）、偽陽性を発生させる２つの型の非特異的結合、すなわち、抗原の付着（Ｅ−カドヘリンおよびｕＰＡについて観察された）および抗原と抗体との間の交差反応性を識別する。他方、ＣＬＡＭＰアッセイのための特異性スクリーニングは、多重化ＣＬＡＭＰを用いて単一の抗原を−ａ時間でインキュベートすること、および標識−置換による検出を実行することによって行った（図１７ｄ−ｆ、下記の方法を参照）。従来のＭＳＡで検出された非特異的シグナルは、１つを除いて全て、ＣＬＡＭＰアッセイを用いて完全に除去された。例えば、従来のＭＳＡにおける全てのオフターゲットビーズ上のシグナルをもたらしたＥ−カドヘリンのまん延する非特異的結合は、ＣＬＡＭＰアッセイでは検出できなかった。対照的に、従来のＭＳＡとＣＬＡＭＰの両方において、１００ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ−１抗体とＥＧＦ抗原との間で交差反応性が検出可能であった。この偽陽性シグナルの発生源を調査するために、本発明者らは、ＭＣＰ−１抗体のみを使用して単一プレックスアッセイを行い、ＭＣＰ−１またはＥＧＦを１または１００ｎｇ／ｍｌで別々にスパイクした（図１７Ｇ）。単一プレックス中のＭＣＰ−１抗体によるＥＧＦの検出は、ｄＣＲを示した。実際に、このｄＣＲは、ＣＬＡＭＰやＥＬＩＳＡによっては軽減できず、親和性の乏しい結合剤である。全体として、これらの結果は、多重化されたアッセイにおけるｒＣＲの除去におけるＣＬＡＭＰの強度、ならびに多重化された、コンビナトリアルな様式でｄＣＲを同定することである。最後に、残りの５個のタンパク質の希釈曲線を生成し、それらのＳＮＲを、図１７Ｈに示すようにプロットした。
【０２２３】
要約すると、本発明者らは、本発明者らは、ＣＬＡＭＰの使用、オリゴヌクレオチドをＭＰ上でプレ共局在化された抗体対に使用する均一ＭＳＡを首尾よく実証した。試料のインキュベーション中に各抗体対をそれらのそれぞれのＭＰに制限することにより、各ＭＰ上の単一プレックスアッセイ環境を維持しながら、ＣＬＡＭＰを多重化することができ、そうすることにより、試薬駆動ＣＲを排除する。特に、ＣＬＡＭＰにおける抗体のプレ共局在化は、従来のサンドイッチイムノアッセイからの逸脱を表し、ここで、一致した抗体はアッセイの開始時に分離される。正確なサンドイッチ結合を検出するために、本発明者らは、標識されたディスプレーサオリゴを使用して、ｄＡｂ−オリゴ複合体を同時に放出および標識することができることを示した。本発明者らは、未放出の複合体を標識すること、バックグラウンドシグナルを増加させることを避けるために、一価の抗体−オリゴ結合体を使用することの重要性を研究し、実証した。本発明者らは、単一プレックスと多重化（マルチプレックス）の両方においてアッセイを実験的に検証し、ＣＲについて予め選択された５つの抗体対を用いて多重化におけるアッセイの特異性をスクリーニングし、これにより、ＣＬＡＭＰは、従来のＭＳＡで経験されたすべてのｒＣＲを排除することを実証する。
【０２２４】
ＣＬＡＭＰは、現在利用可能なＭＳＡよりもいくつかの異なる利点を提供することができる。第１に、ＣＬＡＭＰは、新たなワークフローを読み出しまたは導入するための専用の設備を必要としないので、容易に展開することができる。第２に、ＣＬＡＭＰは、３時間余りで以内にわずかに完了することができるので、迅速なアッセイとすることができる。最後に、溶液中の検出抗体をインキュベートする（典型的には高濃度で行われる）必要性を排除することにより、ＣＬＡＭＰは、試薬消費量を著しく減少させることができる。その高度にスケール変更可能で非常に効率的な性質のために、ＣＬＡＭＰを使用して、バイオマーカーの発見および薬物開発における増加する要求を満たす、真にスケール変更可能な多重化ＥＬＩＳＡプラットフォームを提供することができる。
【０２２５】
実施例６．低抗体濃度は、ＣＬＡＭＰアッセイにおける交差反応性を最小化する
従来の多重化サンドイッチイムノアッセイは、一般に、溶液相中の試薬の混合物を用いて行われる。特に、異なる標的に対する検出抗体（ｄＡｂ）が混合され、反応に適用される。このようなｄＡｂカクテルの適用は、偽の結合をもたらし、真の標的タンパク質結合シグナルから区別することが困難である非特異的結合事象（ｃＡｂまたはｄＡｂと非標的分析物との間）からの偽陽性シグナルを生成する。試薬駆動ＣＲのリスクは、標的分析物Ｎの数に伴って、〜４Ｎ２のスケールである。
【０２２６】
対照的に、ＣＬＡＭＰの実施形態では、試薬（例えば、抗体）対は、試薬混合を避けるために、バーコード化微粒子上で予め組み立てられ、共局在化され得る。検出抗体（ｄＡｂ）は、本明細書に記載されるように、置換反応後に溶液中でのみ放出される。いくつかの実施形態では、置換反応後のオフターゲットビーズ上での再結合を避けるために、溶液中に放出されたｄＡｂは、十分に低い濃度で最適に維持されるべきである。図１６は、置換工程の間の溶液の開始量（ｙ軸）および体積に対するｄＡｂ濃度プロファイルをプロットする。従来のＥＬＩＳＡにおける典型的なｄＡｂ濃度は、〜１μｇ／ｍＬ（６７ｎＭ）であり、十分に長いインキュベーションでは、ｄＡｂが１ｎＭ程度まで低い（ＱｕａｎｔｅｒｉｘによるＳｉｍｏａアッセイのような）場合に、結合が依然として起こる可能性がある。
【０２２７】
放出後にオフ結合が回避されることを確実にするために、標的あたりの抗体の量は、理想的には＜１０ｐｍ未満に保たれるべきである。１００μｌの体積では、抗体の量は＜１ｆモルである。ＣＬＡＭＰアッセイにおいて、いくつかの実施形態では、１０００微粒子からの放出されたＡｂの量は、０．１−１ｆモルであると推定された（図２２）。数字は、遊離の拡散ベースの試薬混合が必要とされる他の方法と比較して、ＣＬＡＭＰシステムから放出されたｄＡｂ濃度が有意に低いことを示す。
【０２２８】
実施例７．置換依存性シグナル伝達は、ＣＬＡＭＰアッセイにおいてバックグラウンドシグナルを最小化する 
両方の抗体が支持体上に予め共局在化されている、ＣＬＡＭＰ共局在化アッセイの実施形態において、シグナル伝達は、放出および洗浄後に表面に残っている全てのｄＡＢを検出することによって行うことができる。しかし、任意の非放出フックオリゴ−ｄＡｂ複合体は、分析物に依存しないシグナルをもたらすことができ、バックグラウンドノイズに有意に寄与する。したがって、バックグラウンドシグナルの増加を避けるために、いくつかの実施形態では、ほぼ完全なアンカー−フック置換およびフックオリゴ−ｄＡＢ複合体の洗浄が必要とされることが理解される。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、非効率的な放出に起因するバックグラウンドシグナルの増加の問題は、置換依存性シグナル伝達メカニズムを介して対処することができる。このようなメカニズムは、置換されたフックアンカー鎖のみが検出可能であることを確実にし、そのようなものとして、非効率的な置換によって生じ得る非置換鎖は、バックグラウンドシグナルを生じない。このような実施形態では、分子レベルでのシグナル伝達は、（ｉ）三成分複合体の形成、および（ｉｉ）フックアンカー鎖の置換の条件の両方が満たされる場合にのみ起こる。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、したがって、検出Ａｂおよびフック鎖は標識されず、標識された（例えば、蛍光標識された）ディスプレーサオリゴを使用して置換が起こる。この態様において、ディスプレーサオリゴは、優先的に（ｉ）アンカー鎖からそれを放出し、（ｉｉ）それを標識する、フック鎖に結合することができる。一方、非置換フックオリゴは標識されておらず、シグナルに寄与しない。このメカニズムは、図２３に示されるように、シグナル（出力）が置換（入力１）と分析物存在（入力２）の両方に依存するＡＮＤゲートと等価である。
【０２３１】
置換依存性シグナル伝達の有効性を実証するために、本発明者らは、ＩＬ−７、ＩＦＮ−γおよびＭＭＰ−９のための較正アッセイを実施した。第１の試験において、ディスプレーサオリゴは標識されず、マウス−ｄＡｂは抗マウスＢＶ４２１二次抗体を用いて標的化された。ＢＶ４２１標識二次抗体は、それが放出されたかどうかに依存しないｄＡｂで標的化され、したがって、標識化は、置換にかかわらず生じた。第２の試験において、置換依存性シグナル伝達を試験したＣｙ５を用いて、置換オリゴを標識した。論理ゲート表示チャートにおいて示されるように（図２３）、ＢＶ４２１シグナルは条件（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）に導入されるが、Ｃｙ５シグナルは条件（ｉｖ）でのみ現れる。２つの標識方法を使用することによって得られた標的からの較正曲線の例を図２４に示す。ＢＶ４２１からのシグナルバックグラウンドはＣｙ５シグナルと比較して有意に高かったが、感度およびダイナミックレンジに関するアッセイ性能は、標識置換（Ｃｙ５）を用いて改善された。
【０２３２】
実施例８．低価数抗体−オリゴは、ＣＬＡＭＰアッセイにおいてバックグラウンドシグナルを最小化する
いくつかの実施形態では、フック鎖およびアンカー鎖は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。抗体−ＤＮＡ結合体化は、例えば、ＩｇＧ分子上のリジン基を標的化することによって行うことができる。スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）のようなヘテロ二官能性リンカーを使用して、チオール末端ＤＮＡをＩｇＧ分子に結合させることができる。しかし、この反応は、異種結合体をもたらし、ここで、抗体あたりのオリゴの数は、反応中のＤＮＡ：抗体の化学量論に依存する。多価結合体（抗体当たり１つより多くのオリゴ）は、置換効率を低下させることができ、したがってバックグラウンドシグナルを増加させることができる。
【０２３３】
図２５Ａ−Ｂに示すように、本発明者らは結合価を調節し、それをＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定し、得られた結合体を用いて置換効率を決定した。高い価数の結合体は、アッセイバックグラウンドの増加をもたらした。予想されたように、より高いアンカー鎖オリゴ密度は、バックグラウンドシグナルのさらなる増加をもたらした。シグナルバックグラウンド上の高い結合体の価数の影響を決定するために、本発明者らは、置換依存性検出メカニズム用いてＣＬＡアッセイを実施した（図２５Ｃ）。高い価数（λ、平均、抗体あたりのオリゴの数〜２）および低い価数の結合体（λ〜０．１）を使用して、ｕＰＡについての較正曲線を生成した。価数が低いと、バックグラウンドの低下、および３倍の感度の改善を生じた。
【０２３４】
実施例９．４０−プレックスにおける交差反応特性
より高い多重化の多重化アッセイにおける交差反応性を評価するために、４０個の標的のパネルを試験し、４０個の標的に対するＣＬＡＭＰの混合物（図２６に示す）を一緒に混合し、各ウェル内の高濃度（１００ｎｇ／ｍＬ）の標的（タンパク質標準、典型的には組換え）の１つをスパイクした緩衝液中でインキュベートした。対角線上に見られるシグナルは、正しい抗原とそのバーコード化微粒子対との間の特異的相互作用を示す。少数のオフターゲットシグナルのみが測定可能であったが、しかし、これらは、試薬交差反応性に起因していなかった。その代わりに、抗原は両方の抗体と交差反応しているとみなされ、したがって、図１７に示されたように、単一プレックスＥＬＩＳＡについても同様に顕著であるようである。
【０２３５】
方法
材料および試薬。ＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドは、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）から購入した。配列および修飾は、図１１に示す。ｃＡＢ、抗原およびｄＡｂは、Ｒｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から購入し、−２０℃で３６ヶ月まで保存した。ストレプトアビジン−およびプロテインＧ磁気ＭＰ（Ｍ２７０）は、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。
【０２３６】
ＣＬＡＭＰの合成。ＣＬＡＭＰは、２段階で２．７μｍ直径を有するストレプトアビジンコート磁気ＭＰ（Ｍ２７０−ストレプトアビジン）上で組み立てられた。第１の工程は、抗体とオリゴのビオチン化混合物を固定化して、ＭＰを官能化し、他の箇所で詳細に記載されているようにそれらを同時にエンコードすることからなった（Ｄａｇｈｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．９２５−９３２、２０１８）。手短に述べると、９０ピコモルのビオチン化オリゴ（ＣＯ、ＳＯ）および合計９０ピコモルのＬＯ（ＬＯ０−ＬＯ２）を、２５μＬのＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０＋３００ｍＭ  ＮａＣｌ（ＰＢＳＴ０．０５＋ＮａＣＩ３００）中で一緒に混合した。各ＬＯ０：ＬＯ１：Ｌ０２の比率は、バーコードを定義する独特なアンサンブル蛍光を生成するように設計されているが、ＣＯ：ＳＯの比率は、引っ張られたｄＡｂ−ＨＯの表面密度の調整を可能にする。混合物を８０℃に加することによって混合物をアニールし、熱源から混合物を取り出すことにより室温まで冷却して戻した。次に、ＰＢＳＴ０．０５＋ＮａＣｌ３００の１７μｌ中の５μｇビオチン化ｃＡＢを、アニールされたオリゴヌクレオチド混合物に添加し、混合した。その後、１０μｌ  ＰＢＳＴ０．０５＋ＮａＣｌ３００中に３．２５Ｍ  ＭＰを添加すること、およびピペッティングによりすぐに混合することにより、ビオチン化試薬を単一の工程でｍｐ上に共固定化する。混合物を、室温でエンドオーバーエンド混合を用いて９０分間インキュベートし、続いて１５０μｌ  ＰＢＳＴ０．１中での磁気凝集による３回洗浄を行った。バ−コード化され、官能化されたＭＰは、必要とされるまで４℃で保存された。第２の工程では、調製されたＭＰ１００，０００個を、ＰＢＳＴ０．０５＋ＮａＣｌ３００で３０分間希釈したＨＯ含有溶液（例えば、ｄＡｂ−ＨＯ）と混合した。ＨＯのプルダウン後、完全に組み立てられたＣＬＡＭＰをＰＢＳＴ０．０１中で３回洗浄し、４℃で１週間までのアッセイの時間まで保存した。
【０２３７】
ＣＬＡＭＰの特徴付け。ＣＬＡＭＰを特徴付けるために、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ６４７（ＡＦ６４７）と結合体化した抗ヤギＩｇＧを用いた標識化、またはＨＯを標的とするＣｙ５標識オリゴ（ＬＯ）のハイブリダイゼーションにより、抗体およびオリゴの固定化を確認した。別の箇所で説明したように（Ｄａｇｈｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．９２５−９３２，２０１８）、多色蛍光モデルを用いて多色ＭＰのアンサンブル蛍光応答をフィッティングすることにより、ＣＯの密度を推定した。特定のＣＬＡＭＰのセットについて予想されるアッセイバックグラウンドシグナルを決定するために、ＭＰをＰＢＳＴ０．０５＋ＮａＣｌ３００中の１μＭ  Ｃｙ５標識ＤＯと共に１時間インキュベートし、続いてＰＢＳＴ０．０５中で３回磁気洗浄し、そして残りのシグナルをサイトメトリーにより測定した。
【０２３８】
抗体オリゴ結合体化、精製、および特徴付け。抗ｕＰＡモノクローナル抗体を、ヒドラゾン化学（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を用いてアミン修飾ＨＰに結合体化させ、続いて製造業者のプロトコルに従って精製を行った。あるいは、モノクローナル抗体は、ヘテロ二官能性アミン／チオール反応性架橋剤を用いて、チオール末端ＨＯに結合体化させた。４０μｌの３０μＭチオール修飾ＨＯを、最初にＰＢＳＴ中の２００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）中３７℃で１時間還元した。還元したオリゴは、（ｉ）Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（７Ｋ  ＭＷＣＯ，Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、緩衝液をＰＢＳ  ｐＨ７．０に交換し、（ｉｉ）８０％ＰＢＳ  ｐＨ７．０および溶解した９ｍＭ  スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）８μＬを用いて１０分間活性化し、（ｉｉｉ）再度ＰＢＳ  ｐＨ７．０に緩衝液交換して過度のスルホ−ＳＭＣＣを除去し、そして（ｉｖ）１−１０μｌ画分（所望に応じて）を１０μＬの１ｍｇ／ｍｌ抗体と反応させた。反応物を室温で１時間放置し、その後４℃で一晩インキュベートした。結合体は、その後、２つの精製工程、抗体およびＤＮＡ精製工程において、それぞれ精製された。
【０２３９】
抗体オリゴ結合体化、精製、および特徴付け。抗ｕＰＡモノクローナル抗体を、ヒドラゾン化学（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を用いてアミン修飾ＨＰに結合体化させ、続いて製造業者のプロトコルに従って精製を行った。あるいは、モノクローナル抗体は、ヘテロ二官能性アミン／チオール反応性架橋剤を用いて、チオール末端ＨＯに結合体化させた。４０μｌの３０μＭチオール修飾ＨＯを、最初にＰＢＳＴ中の２００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）中３７℃で１時間還元した。還元したオリゴは、（ｉ）Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（７Ｋ  ＭＷＣＯ，Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、緩衝液をＰＢＳ  ｐＨ７．０に交換し、（ｉｉ）８０％ＰＢＳ  ｐＨ７．０および溶解した９ｍＭ  スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）８μＬを用いて１０分間活性化し、（ｉｉｉ）再度ＰＢＳ  ｐＨ７．０に緩衝液交換して過度のスルホ−ＳＭＣＣを除去し、そして（ｉｖ）１−１０μｌ画分（所望に応じて）を１０μＬの１ｍｇ／ｍｌ抗体と反応させた。反応物を室温で１時間放置し、その後４℃で一晩インキュベートした。結合体は、その後、２つの精製工程において精製された。
【０２４０】
単一プレックスおよび多重ＣＬＡＭＰアッセイ。インキュベーションは、９５０ｒｐｍで水平方向に振とうしながら、室温で、円錐状の底部９６穴プレート中で行った。ＣＬＡＭＰを、約８０ＭＰ／バーコード／μｌで混合し、ＰＢＳＴ０．０５＋ＮａＣｌ１５０＋０．５％ＢＳＡ（ＰＢＳＴ０．０５＋ＮａＣｌ１５０＋ＢＳＡ０．５）で３０分間ブロックした。ブロックされ、多重化されたＣＬＡＭＰ混合物の２５μｌアリコートを各ウェルに添加し、ＰＢＳＴ０．０５＋ＮａＣｌ１５０＋ＢＳＡ０．２５中に特定の抗原（単数または複数）を２×特定濃度で含有する２５μｌと共にインキュベートし、インキュベーションは９５０ｒｐｍの振とうで３時間実施した。磁気凝集および１５０μＬのＰＢＳＴ０．１を用いる洗浄を合計３０分間にわたって４回繰り返した。最後に、置換による検出を、ＰＢＳＴ０．０５＋ＮａＣＩ３００＋ＢＳＡ０．２５中の１μＭ  ＤＯ−Ｃｙ５の添加を通して実施し、振盪しながら１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴ０．１で３回洗浄する。
【０２４１】
従来のＭＳＡ。従来のＭＳＡフォーマットで特異性および非特異的結合をスクリーニングするために、上記のように、ＭＰは、バーコード化され、合成中にそれらのそれぞれのビオチン化ｃＡｂとカップリングされた。ＭＰ混合物を、アッセイ毎に１バーコード当たり２０００個のＭＰの最終濃度に合わせた。インキュベーションは、９５０ｒｐｍで水平方向に振とうしながら、室温で、円錐状底部９６穴プレート中で行った。アッセイ試薬とのインキュベーションの前に、ＭＰを最初にＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ０．０５）中の１％ウシ血清アルブミンで１時間ブロックした。抗原とのインキュベーションは、指定された濃度で１２０分間行った。ＢＭＰを、ｄＡｂカクテルと共に２μｇ／ｍｌで６０分間インキュベートし、続いて４μｇ／ｍｌで４５分間、ｓＡｂとともにインキュベートした。ＳＮＲＡｇはＭＦＩシグナルからｃＡｂ特異的平均アッセイバックグラウンド（ｎ＝６）を減算し、アッセイバックグラウンドのグローバル標準偏差（すなわち、全てのバーコードにわたって、ｎ＝２１０）に正規化することによって計算された。
【０２４２】
読み出しおよびデータ分析。ＭＰは、青色（４８８ｎｍ）、赤色（６３３ｎｍ）、および紫色（４０５ｎｍ）レーザーを用いるＢＤにより、ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯＩＩサイトメーターを用いて読み出された。青色レーザーフローセルでは、それぞれＦＡＭおよびＣｙ３に５３０／３０および５８５／４２バンドパスフィルターを使用した。赤色レーザーフローセルでは、Ｃｙ５／ＡＦ６４７に６６０／２０バンドパスフィルターを用いた。ＭＰは、ＭＡＴＬＡＢ（Ｄａｇｈｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，ｎａｔｕｒｅｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．９２５−９３２，２０１８）上で実施された自動化アルゴリズムを用いてデコードされた。全てのデータ分析は、ＭＡＴＬＡＢで実施された。単一ビーズは、前方散乱強度およびサイド散乱強度を使用して、ビーズ凝集体および他の微粒子と区別され、ゲーティングは自動化された。
【０２４３】
本開示は、その特定の実施形態に関連して説明されてきたが、本開示からのそのような逸脱を含むあらゆる変形、使用、または適合を包含することが意図されており、本開示からのそのような逸脱を、当該技術分野における公知のまたは慣習的な実施の範囲内であり、本明細書に記載した本質的な特徴に適用することができ、添付の特許請求の範囲において以下のとおりであることが理解されるであろう。
【０２４４】
本明細書で引用された全ての文書および参考文献の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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