(57)【要約】  本明細書に提供されるのは、MSR1に結合する抗体及び抗原結合断片、並びにその使用方法である。ある実施態様によれば、該抗体は、高い親和性でヒトMSR1に結合する。ある実施態様において、該抗体は、MSR1に対する修飾LDL結合を遮断することなく、又は該結合を90％未満遮断して、MSR1に結合する。いくつかの実施態様において、該抗体は、細胞表面発現MSR1に結合し、内在化される。本発明の抗体は、完全ヒト抗体であってもよい。本発明は、薬物又は治療的化合物にコンジュゲートされた抗MSR1抗体又はその抗原結合断片を含む。【選択図】図２１
2021523147.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージスカベンジャー受容体1(MSR1)に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗原結合断片が、以下のこと:
(i)表面プラズモン共鳴により測定したとき、37℃で約1.4nM未満のKDでヒトMSR1に結合すること;
(ii)表面プラズモン共鳴により測定したとき、37℃で約4分超のt1/2でヒトMSR1に結合すること;
(iii)リガンド取込みアッセイにより測定したとき、約10nM未満のIC50でヒトMSR1による修飾LDL取込みの約90％未満の最大阻害を示すこと;
(iv)競合ELISAアッセイにより測定したとき、ヒトMSR1に対する修飾LDL結合を＜50％遮断すること;及び
(v)THP-1細胞における結合によりアッセイしたとき、ヒトMSR1の結合及び約10％超の結合複合体の内在化を示すこと
からなる群から選択される1以上の特性を示す、前記単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
細胞表面発現マクロファージスカベンジャー受容体1(MSR1)に結合し、かつ3.5nM未満のIC50でMSR1による修飾LDL取込みの阻害を80％未満遮断する、単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体又はその抗原結合断片が1.5nM未満のIC50でMSR1による修飾LDL取込みの阻害を60％未満遮断する、請求項2記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
【請求項４】
マクロファージスカベンジャー受容体1(MSR1)に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又は抗原結合断片が:(a)表4に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)の相補性決定領域(CDR);及び(b)表4に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)のCDRを含む、前記単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗体又は抗原結合断片が、表4に示されるアミノ酸配列を有するHCVR及び表4に示されるアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項4記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体又は抗原結合断片が:
(i)配列番号4、36、52、92、及び284からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するHCDR1ドメイン;
(ii)配列番号6、38、54、94、及び286からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するHCDR2ドメイン;
(iii)配列番号8、40、56、96、及び288からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するHCDR3ドメイン;
(iv)配列番号12、44、60、100、及び292からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するLCDR1ドメイン;
(v)配列番号14、46、62、102、及び294からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するLCDR2ドメイン;並びに
(vi)配列番号16、48、64、104、及び296からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するLCDR3ドメイン
を含む、請求項4記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗体又は抗原結合断片が:
(i)配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3;
(ii)配列番号4を含むHCDR1;配列番号6を含むHCDR2;配列番号8を含むHCDR3;配列番号12を含むLCDR1;配列番号14を含むLCDR2;及び配列番号16を含むLCDR3;
(iii)配列番号36を含むHCDR1;配列番号38を含むHCDR2;配列番号40を含むHCDR3;配列番号44を含むLCDR1;配列番号46を含むLCDR2;及び配列番号48を含むLCDR3;
(iv)配列番号92を含むHCDR1;配列番号94を含むHCDR2;配列番号96を含むHCDR3;配列番号100を含むLCDR1;配列番号102を含むLCDR2;及び配列番号104を含むLCDR3;
(v)配列番号284を含むHCDR1;配列番号286を含むHCDR2;配列番号288を含むHCDR3;配列番号292を含むLCDR1;配列番号294を含むLCDR2;及び配列番号296を含むLCDR3;
を含む、請求項4記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
【請求項８】
単離された抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗原結合断片が、ヒトMSR1に対する結合について、配列番号2/10、23/42、50/58; 90/98、及び282/290からなる群から選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む参照抗体と競合する、前記単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
任意にリンカーを介して又はリンカー-スペーサーを介してペイロード残基にコンジュゲートされた、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片を含む抗体-薬物コンジュゲート。
【請求項１０】
式(I)の構造を有する、請求項9記載の抗体-薬物コンジュゲート:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、その位置異性体、もしくはその位置異性体の混合物;
【化１】
2021523147.tif 000906
(式中:
BAは、結合剤であり;
Lは、リンカーであり;
PAは、ステロイド残基、LXRモジュレーター残基、又はリファマイシン類似体残基からなる群から選択されるペイロード部分であり;かつ
下付文字nは、1〜30の整数である)。
【請求項１１】
式(IA)の構造を有する、請求項9又は請求項10記載の抗体-薬物コンジュゲート:
【化２】
2021523147.tif 000907
(式中、
SP1は、非存在、又はスペーサーであり;
RG1は、反応基残基であり;
AA1は、非存在、又は任意に基HGと直接的にもしくは間接的に結合しているアミノ酸残基を含む二価もしくは三価リンカーであり;
AA2は、非存在、又はジペプチド、トリペプチド、もしくはテトラペプチド残基であり;
Qは、存在する場合、コネクター基残基であり;
SPは、非存在、又はスペーサーであり;かつ
HGは、存在する場合、親水基である)。
【請求項１２】
式(IB-1)の構造を有する、請求項9〜11のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート:
【化３】
2021523147.tif 000908
(式中、
SP1は、非存在、又はスペーサーであり;
RG1は、反応基残基であり;
Qは、存在する場合、
【化４】
2021523147.tif 000909
であり;かつ
SPは、非存在、又はスペーサーであり;
ここで、
【化５】
2021523147.tif 000910
は、それを介して言及された基が該式中の隣接する基に結合している原子を示す)。
【請求項１３】
式(IB-2)の構造を有する、請求項9〜11のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート:
【化６】
2021523147.tif 000911
(式中、
SP1は、非存在、又はスペーサーであり;
RG1は、反応基残基であり;
AA1は、非存在、又は任意に基HGと直接的にもしくは間接的に結合しているアミノ酸残基を含む二価もしくは三価リンカーであり;
AA2は、非存在、又はジペプチド、トリペプチド、もしくはテトラペプチド残基であり;
Qは、存在する場合、
【化７】
2021523147.tif 000912
であり;
SPは、非存在、又はスペーサーであり;かつ
HGは、存在する場合、
【化８】
2021523147.tif 000913
であり、
ここで、
【化９】
2021523147.tif 000914
は、それを介して言及された基が該式中の隣接する基に結合している原子を示す)。
【請求項１４】
式(IC)、式(ID)、又は式(IE)の構造を有する、請求項9〜11及び13のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート:
【化１０】
2021523147.tif 000915
(式中、
SP1は、非存在、又はスペーサーであり;
RG1は、反応基残基であり;
SP2は、非存在、又はスペーサーであり;
RG2は、反応基残基であり;
AA1は、アミノ酸残基を含む二価又は三価リンカーであり;
AA2は、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチド残基であり;
Qは、存在する場合、
【化１１】
2021523147.tif 000916
であり;
SPは、非存在、又はスペーサーであり;かつ
HGは、
【化１２】
2021523147.tif 000917
であり、
ここで、
【化１３】
2021523147.tif 000918
は、それを介して言及された基が該式中の隣接する基に結合している原子を示す)。
【請求項１５】
AA1-AA2が式(LL1)によるものである、請求項11及び13〜14のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート:
【化１４】
2021523147.tif 000919
(式中、RAA1、RAA2、及びRAA3は、各々独立に、その少なくとも1つが、-(RG2)-SP2-HG、-(RG2)-HG、又はHGに結合しているアミノ酸側鎖であり;ここで、
【化１５】
2021523147.tif 000920
は、それを介してAA1-AA2が該式中の隣接する基に結合している原子を示す)。
【請求項１６】
RAA1が、HGに直接的に又は間接的に結合しているリジン、グルタミン、グルタミン酸、又はアスパラギン酸側鎖であり、かつRAA2及びRAA3が、それぞれ、バリン及びアラニン又はバリン及びシトルリン側鎖のいずれかである、請求項15記載の抗体-薬物コンジュゲート。
【請求項１７】
AA1-AA2が、
【化１６】
2021523147.tif 000921
であり、ここで、
【化１７】
2021523147.tif 000922
が、それを介してAA1-AA2が該式中の隣接する基に結合している原子を示す、請求項11及び13〜16のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート。
【請求項１８】
RG1及びRG2残基が、各々の場合に独立に:
【化１８】
2021523147.tif 000923
からなる群から選択され;
ここで、
【化１９】
2021523147.tif 000924
が、それを介して該RG1又はRG2残基が該式中の隣接する基に結合している原子を示す、請求項11〜17のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート。
【請求項１９】
SP、SP1、及びSP2が、各々の場合に独立に、非存在であるか、又はC1-6アルキレン、-NH-、-S-、-O-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、(グリシン)4-セリン、及びその組合せからなる群から選択され、ここで、下付文字eが0〜4の整数であり、下付文字uが1〜8の整数であり、かつ下付文字vが1〜8の整数である、請求項11〜18のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート。
【請求項２０】
nが、1、2、3、又は4である、請求項9〜19のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート。
【請求項２１】
【化２０】
2021523147.tif 000925
が、
【化２１】
2021523147.tif 000926
2021523147.tif 000927
2021523147.tif 000928
2021523147.tif 000929
2021523147.tif 000930
である、請求項11〜20のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート。
【請求項２２】
前記抗体又はその抗原結合断片が、リンカー又はリンカー-スペーサーを介して、ステロイドペイロードにコンジュゲートされている、請求項9記載の抗体-薬物コンジュゲート分子。
【請求項２３】
前記抗体又はその抗原結合断片が、リンカーを介して、LXRモジュレーターペイロードにコンジュゲートされている、請求項9記載の抗体-薬物コンジュゲート分子。
【請求項２４】
前記抗体又はその抗原結合断片が、リンカーを介して、リファマイシン類似体ペイロードにコンジュゲートされている、請求項9記載の抗体-薬物コンジュゲート分子。
【請求項２５】
リンカー又はリンカー-スペーサーを介して前記抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされたステロイドが式(A-1)の化合物である、請求項22記載の抗体-薬物コンジュゲート分子、又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態;
【化２２】
2021523147.tif 000931
(式中、
R1及びR2は、独立に、-H、アルキル、アルキル-C(O)-O-、-OH、もしくはハロであるか;又はR1及びR2は、一緒に、
【化２３】
2021523147.tif 000932
を形成し、
ここで、R4は、アルキル、アリール、アリールアルキル、又はN-含有ヘテロシクロアルキルであり、
ここで、該アルキル、アリール、アリールアルキル、及びN-含有ヘテロシクロアルキルは、各々の場合に独立に、-NRAaRAbで任意に置換されており;
R3は、-O、RZ-C(O)-X-、-ヘテロアルキル、-ピペリジニル、-NRAaRAb、-オキシアリール-NRAaRAb、又は-Z-A'(RP)tであり;
RZは、アルキルであり;
Xは、O又はNRAaであり;
Zは、S、S(O)、S(O)2、SO2NRAa、O、C(O)NRAa、C(O)、又はNRAaであり;
A'は、アリール、アリールアルキル、又はヘテロアリールであり;
RPは、各々の場合に独立に、ハロ、任意に置換されたアルキル、-OH、又は-NRAaRAbであり;
RAa及びRAbは、各々の場合に独立に、-H、任意に置換されたアルキル、又は任意に置換されたアリール(optionally subtitued aryl)であり;
下付文字aは、0〜19の整数であり;かつ
tは、1〜3の整数であり;かつ
R5A及びR5Bは、各々独立に、ハロ又は水素原子であり;
ここで、基R3又はR4は、該リンカーに結合している)。
【請求項２６】
式(3000)の構造を有する、請求項22記載の抗体-薬物コンジュゲート:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態;
BA-(L′-SP-D)n  式(3000)
(式中、
Dは、
a)
【化２４】
2021523147.tif 000933
(ここで、式(a)中の両方のRxは、水素であり; R34は、アルキル、アリール、アリールアルキル、もしくはN-含有ヘテロシクロアルキルであり;かつSPは、-C(O)-C1-C10-アルキレン-C(O)-、-C(O)-N(C1-6アルキル)-C1-C10-アルキレン-X1-(ここで、X1は、式(3000)中のL'に付加されている)、-C(O)-N(H)-(C1-C10-アルキレン)-S-(ここで、Sは、式(3000)中のL'に付加されている)、-C(O)-N(C1-6アルキル)-(C1-C10-アルキレン)-S-(ここで、Sは、式(3000)中のL'に付加されている)、
【化２５】
2021523147.tif 000934
(ここで、右側にある(すなわち、Nにおける)結合点は、式(3000)中のL'に対するものである)、-CH2-NH-(ここで、Nは、式(3000)中のL'に付加されている)、
【化２６】
2021523147.tif 000935
(ここで、Nは、式(3000)中のL'に付加されており、かつここで、Arは、任意に置換されたアリーレン(いくつかの実施態様において、
【化２７】
2021523147.tif 000936
)もしくは任意に置換されたヘテロアリーレンである)、-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(3000)中のL'に付加されている)、-C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(3000)中のL'に付加されており、かつここで、各々のC1-C10-アルキレンは、独立に、1以上のヒドロキシで任意に置換されている)、-C(O)-N(R35)-C1-C10-アルキレン-C(O)NH-X2-(ここで、X2は、式(3000)中のL'に付加されている)、又は
【化２８】
2021523147.tif 000937
(ここで、X4は、式(3000)中のL'に付加されている)であるか;或いは
ここで、式(a)中の両方のRxは、フルオロであり; R34は、アルキル、アリール、アリールアルキル、もしくはN-含有ヘテロシクロアルキルであり;かつSPは、-C(O)-C1-C10-アルキレン-C(O)-、-C(O)-N(C1-6アルキル)-C1-C10-アルキレン-X1b-(ここで、X1bは、式(3000)中のL'に付加されている)、-C(O)-N(H)-(C1-C10-アルキレン)-X1b-(ここで、X1bは、式(3000)中のL'に付加されている)、
【化２９】
2021523147.tif 000938
(ここで、右側にある(すなわち、Nにおける)結合点は、式(3000)中のL'に対するものである)、-CH2-NH-(ここで、Nは、式(3000)中のL'に付加されている)、
【化３０】
2021523147.tif 000939
(ここで、Nは、式(3000)中のL'に付加されており、かつここで、Arは、任意に置換されたアリーレン(いくつかの実施態様において、
【化３１】
2021523147.tif 000940
)もしくは任意に置換されたヘテロアリーレンである)、-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(3000)中のL'に付加されている)、-C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(3000)中のL'に付加されており、かつここで、各々のC1-C10-アルキレンは、独立に、1以上のヒドロキシで任意に置換されている)、-C(O)-N(R35)-(C1-C10-アルキレン)-C(O)NH-X2-(ここで、X2は、式(3000)中のL'に付加されている)、又は
【化３２】
2021523147.tif 000941
(ここで、X4は、式(3000)中のL'に付加されている)である);並びに/或いは
b)表Aの化合物(ここで、該表Aの化合物は、-C(O)CH2OH基のヒドロキシを介して又はマプラコラトのヒドロキシを介して、式(III)の化合物のBAに連結されている)
から選択され;
X1は、-N(C1-6アルキル)-であり;
X1bは、-S-、-NH-、又は-N(C1-6アルキル)-であり;
X2は、-NH-であり;
X3は、-CH2-であり、X3は、-CH2-O-(C1-C10-アルキレン)-C(O)-(ここで、C(O)は、X4に結合している)であるか、X3は、-C(O)-であり;
X4は、-O-であり;
R35は、H、-OH、-OCH3、又はC1-6アルキルであり;
R50及びR50aは、独立に、水素又はC1-C6-アルキルであり;
Rd、Re、及びRfは、独立に、-H、-OH、ヒドロキシアルキル、アルコキシカルボニル、-C(O)OH、又は-CH2ORgであり、ここで、各々のRgは、独立に、-CH2C(O)OH又は-CH2C(O)O(アルキル)であり;かつ
mmは、0又は1であり;
nは、1〜30までから選択される整数であり;
L'は、リンカーであり;かつ
BAは、結合剤である)。
【請求項２７】
前記ステロイドペイロードが:
【化３３】
2021523147.tif 000942
2021523147.tif 000943
2021523147.tif 000944
からなる群から選択され、
ここで、
【化３４】
2021523147.tif 000945
が前記リンカーとの結合である、請求項22記載の抗体-薬物コンジュゲート。
【請求項２８】
前記ステロイドペイロードが:
【化３５】
2021523147.tif 000946
又はその混合物からなる群から選択される、請求項22記載の抗体-薬物コンジュゲート。
【請求項２９】
リンカーを介して前記抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされたLXRモジュレーターが式(B)の化合物である、請求項23記載の抗体-薬物コンジュゲート:又は医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態
【化３６】
2021523147.tif 000947
(式中、
Wは、-CH2-、-N(H)-、又は-O-であり;
RB1は、-H、-OH、-NH2、アルキル、又は-OP(O)(OR6)2であり;
RB2は、-H、-OH、-CH2NH2、RB3、RB4、RB5、又は-O-RB5であり、ここで、RB1及びRB2は、同時に-Hであることはなく;
RB3は、-N(R6)2であり;
RB4は、-X-Y-Zであり;
Xは、-O-及び-N(H)-からなる群から選択され;
Yは、アルキレン、置換アルキレン(限定されないが、オキソ置換、すなわち、=O)を含む)、ヘテロアルキレン、及び置換ヘテロアルキレン(限定されないが、オキソ置換(すなわち、=O)を含む)からなる群から選択され;
Zは、-OH及び-NH2からなる群から選択され;
RB5は、アルキル、ヘテロシクロアルキル、又は置換ヘテロシクロアルキルであり、ここで、各々のヘテロシクロアルキル又は置換ヘテロシクロアルキルは、窒素及び酸素から選択される1、2、又は3個のヘテロ原子を含み、かつ少なくとも1つの-OH及び-CH2OH置換基又は少なくとも1つの一級もしくは二級窒素、例えば、O-グルコースを含み;
各々のR6は、各々の場合に、-H、アミノ酸残基、N-アルキルアミノ酸残基、ペプチド、又はアルキルであり;かつ
各々のR7は、独立に、ハロ、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、-CN、O-グルコース、O-アミノ酸残基、及びO-PEGb(ここで、各々の下付文字bは、0〜3の整数である)であり;
ここで、基RB1又はRB2は、該リンカーに結合している)。
【請求項３０】
リンカーを介して、前記抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされたLXRモジュレーターが式(B-1)の化合物である、請求項23記載の抗体-薬物コンジュゲート:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態;
【化３７】
2021523147.tif 000948
(式中:
RB1は、-N(H)R8又は-N(R9)2であり;
RB2は、-N(H)R8であり;
各々のR8は、各々の場合に独立に、水素、アミノ酸残基、N-アルキルアミノ酸残基、ペプチド残基、生体分解性部分、又はアルキルであり;
R9は、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、又は置換ヘテロシクロアルキルであり、ここで、各々のヘテロシクロアルキル又は置換ヘテロシクロアルキルは、窒素及び酸素から選択される1、2、又は3個のヘテロ原子を含み、かつ置換されているとき、少なくとも1つの-OH及び-CH2OHを含むか、又は少なくとも1つの一級もしくは二級窒素を含み;
各々のR7は、独立に、ハロ、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、-CN、O-グルコース、O-アミノ酸残基、又はO-PEGb(ここで、各々の下付文字bは、0〜3の整数である)であり;
ここで、基RB1又はRB2は、該リンカーに結合している)。
【請求項３１】
式(6005)の構造を有する、請求項9〜21、23、及び29〜30のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート
【化３８】
2021523147.tif 000949
。
【請求項３２】
前記LXRモジュレーターが:
【化３９】
2021523147.tif 000950
からなる群から選択され、
ここで、
【化４０】
2021523147.tif 000951
が前記リンカーとの結合である、請求項23記載の抗体-薬物コンジュゲート。
【請求項３３】
前記LXRモジュレーターが:
【化４１】
2021523147.tif 000952
2021523147.tif 000953
2021523147.tif 000954
2021523147.tif 000955
からなる群から選択され、
ここで、
【化４２】
2021523147.tif 000956
が前記リンカーとの結合である、請求項23記載の抗体-薬物コンジュゲート。
【請求項３４】
前記LXRモジュレーターが、
【化４３】
2021523147.tif 000957
であり;
ここで、
【化４４】
2021523147.tif 000958
が前記リンカーとの結合である、請求項23記載の抗体-薬物コンジュゲート。
【請求項３５】
前記リファマイシン類似体が式(C-1)の化合物である、請求項24記載の抗体-薬物コンジュゲート:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態;
【化４５】
2021523147.tif 000959
(式中:
X1cは、-S-; -O-及び-NR5cから選択され;
R1cは、アミノ-C1-6アルキル; C1-6アルキルアミノC1-6アルキル;ジ-C1-6アルキルアミノC1-6アルキル;ヒドロキシ-C1-6アルキル; HS-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-N(R5c)-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-O-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-S-C1-6アルキル;ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクロアルキル-C1-6アルキルであり;ここで、ヘテロシクロアルキルは、O、N、及びSから選択される1、2、又は3個のヘテロ原子を含み;かつここで、ヘテロシロアルキル(heterocyloalkyl)は、ハロ、C1-6アルキル、-OH、=O、又は-N(R5c)2で任意に置換されており;
R2c、R3c、及びR4cは、独立に、水素、C1-6アルキル、及び-(C=O)-R5cから選択され;
各々のRacは、存在する場合、独立に、-F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NH2;及びC1-6アルコキシから選択され;かつ
R5cは、出現する毎に独立に、水素;及びC1-6アルキルから選択され;
ここで、基R1cは、前記リンカーに結合している)。
【請求項３６】
前記リファマイシン類似体が式(C-2)の化合物である、請求項24記載の抗体-薬物コンジュゲート:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態;
【化４６】
2021523147.tif 000960
(式中:
X1cは、-S-; -O-及び-NR5cから選択され;
R1cは、アミノ-C1-6アルキル; C1-6アルキルアミノC1-6アルキル;ジ-C1-6アルキルアミノC1-6アルキル;ヒドロキシ-C1-6アルキル; HS-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-N(R5c)-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-O-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-S-C1-6アルキル;ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクロアルキル-C1-6アルキルであり;ここで、ヘテロシクロアルキルは、O、N、及びSから選択される1、2、又は3個のヘテロ原子を含み;かつここで、ヘテロシロアルキル(heterocyloalkyl)は、ハロ、C1-6アルキル、-OH、=O、又は-N(R5c)2で任意に置換されており;
R2c、R3c、及びR4cは、独立に、水素、C1-6アルキル、及び-(C=O)-R5cから選択され;
Rac及びRbcは、独立に、-F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NH2;及びC1-6アルコキシから選択され;かつ
R5cは、出現する毎に独立に、水素;及びC1-6アルキルから選択され;
ここで、基R1cは、前記リンカーに結合している)。
【請求項３７】
前記リファマイシン類似体が式(C-3)の化合物である、請求項24記載の抗体-薬物コンジュゲート:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態;
【化４７】
2021523147.tif 000961
(式中:
R1cは、ジ-C1-6アルキルアミノC1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-N(R5c)-C1-6アルキル;ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクロアルキル-C1-6アルキルであり;ここで、ヘテロシクロアルキルは、O、N、及びSから選択される1、2、又は3個のヘテロ原子を含み;かつここで、ヘテロシロアルキル(heterocyloalkyl)は、ハロ、C1-6アルキル、-OH、=O、又は-N(R5c)2で任意に置換されており;かつ
R2c、R3c、及びR4cは、独立に、水素、C1-6アルキル、及び-(C=O)-R5cから選択され;かつ
R5cは、水素及びC1-6アルキルから選択され;
ここで、基R1cは、前記リンカーに結合している)。
【請求項３８】
前記リファマイシン類似体が式(C-4)の化合物である、請求項24記載の抗体-薬物コンジュゲート:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態;
【化４８】
2021523147.tif 000962
(式中:
R1cは、
【化４９】
2021523147.tif 000963
であり;ここで、Yは、C又はNであり;
R2c、R3c、及びR4cは、独立に、水素、C1-6アルキル、及び-(C=O)-R5cから選択され;かつ
R5cは、出現する毎に独立に、非存在であるか、又は水素及びC1-6アルキルから選択され;
ここで、基R1cは、波線
【化５０】
2021523147.tif 000964
によって示される窒素原子を介して、前記リンカーに結合している)。
【請求項３９】
式(7002)の構造を有する、請求項9〜11、13、17〜21、24、及び35〜38のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート:
【化５１】
2021523147.tif 000965
。
【請求項４０】
前記リファマイシン類似体が:
【化５２】
2021523147.tif 000966
2021523147.tif 000967
からなる群から選択され、
ここで、
【化５３】
2021523147.tif 000968
が前記リンカーとの結合である、請求項9〜11、13、17〜21、24、及び35〜39のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート。
【請求項４１】
式(7003)の構造を有する、抗体-リファマイシン類似体コンジュゲート:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態;
【化５４】
2021523147.tif 000969
(式中:
X1cは、-S-; -O-及び-NR5cから選択され;
R1cは、
【化５５】
2021523147.tif 000970
であり;ここで、Yは、C又はNであり;
R2c、R3c、及びR4cは、独立に、水素、C1-6アルキル、及び-(C=O)-R5cから選択され;
R5cは、出現する毎に独立に、非存在であるか、又は水素;及びC1-6アルキルから選択され;
各々のAAは、独立に選択されるアミノ酸であり;
SP1は、非存在、又はスペーサーであり;
RG1は、反応基残基であり;
BAは、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片であり;
下付文字nは、1〜30の整数であり;
下付文字wは、2、3、又は4であり;
ここで、R1cは、波線
【化５６】
2021523147.tif 000971
によって示される窒素原子を介して、前記リンカーに結合している)。
【請求項４２】
X1cがOである、請求項41記載の抗体-リファマイシン類似体コンジュゲート。
【請求項４３】
BAがN297Q突然変異を含む;抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である、請求項41又は請求項42記載の抗体-リファマイシン類似体コンジュゲート。
【請求項４４】
下付文字wが2である、請求項41〜43のいずれか一項記載の抗体-リファマイシン類似体コンジュゲート。
【請求項４５】
(AA)2がバリン-シトルリンである、請求項41〜44のいずれか一項記載の抗体-リファマイシン類似体コンジュゲート。
【請求項４６】
SP1が、
【化５７】
2021523147.tif 000972
を含む、請求項41〜45のいずれか一項記載の抗体-リファマイシン類似体コンジュゲート。
【請求項４７】
SP1が、
【化５８】
2021523147.tif 000973
を含む、請求項41〜45のいずれか一項記載の抗体-リファマイシン類似体コンジュゲート。
【請求項４８】
RG1が、
【化５９】
2021523147.tif 000974
を含む、請求項41〜47のいずれか一項記載の抗体-リファマイシン類似体コンジュゲート。
【請求項４９】
X1cがOであり;
R1cが、
【化６０】
2021523147.tif 000975
であり;ここで、Yは、C又はNであり;ここで、R1cは、R1cの4級窒素原子を介して、前記リンカーに結合しており;
R5cがC1-6アルキルであり;かつ
R6cが対イオンである、
請求項41〜47のいずれか一項記載の抗体-リファマイシン類似体コンジュゲート。
【請求項５０】
前記リファマイシン類似体が:
【化６１】
2021523147.tif 000976
である、請求項41〜49のいずれか一項記載の抗体-リファマイシン類似体コンジュゲート。
【請求項５１】
以下のもの:
【化６２】
2021523147.tif 000977
2021523147.tif 000978
2021523147.tif 000979
2021523147.tif 000980
2021523147.tif 000981
2021523147.tif 000982
2021523147.tif 000983
2021523147.tif 000984
2021523147.tif 000985
2021523147.tif 000986
2021523147.tif 000987
2021523147.tif 000988
2021523147.tif 000989
2021523147.tif 000990
2021523147.tif 000991
2021523147.tif 000992
2021523147.tif 000993
2021523147.tif 000994
2021523147.tif 000995
2021523147.tif 000996
2021523147.tif 000997
2021523147.tif 000998
2021523147.tif 000999
2021523147.tif 001000
2021523147.tif 001001
2021523147.tif 001002
2021523147.tif 001003
からなる群から選択され、ここで、
各々のAbが抗MSR1抗体又はその抗原結合断片であり;
各々のBAが、
【化６３】
2021523147.tif 001004
であり、
ここで、Ab1が抗MSR1抗体又はその抗原結合断片であり; RがC2-4-アルキレンであり;かつnnが2〜4までから選択される整数であり、かつ
各々のnが1〜4の整数である、
請求項9〜24のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート、又はその立体異性体形態もしくはその位置異性体もしくはその位置異性体の混合物。
【請求項５２】
以下のもの
【化６４】
2021523147.tif 001005
から選択され、ここで、
各々のAbが抗MSR1抗体又はその抗原結合断片であり;かつ
各々のnが1〜4の整数である、
抗体-薬物コンジュゲート(又はその立体異性体形態もしくはその位置異性体もしくはその位置異性体の混合物)。
【請求項５３】
以下の式のうちの1つ又はその立体異性体形態もしくはその位置異性体もしくはその位置異性体の混合物による抗体-薬物コンジュゲート又はその立体異性体形態もしくはその位置異性体もしくはその位置異性体の混合物:
【化６５】
2021523147.tif 001006
2021523147.tif 001007
2021523147.tif 001008
2021523147.tif 001009
2021523147.tif 001010
(式中、
各々のAbは、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片であり;
各々のBAは、
【化６６】
2021523147.tif 001011
であり、ここで、Ab1は、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片であり; Rは、C2-4-アルキレンであり;かつnnは、2〜4までから選択される整数であり、かつ
各々のnは、1〜4の整数である)。
【請求項５４】
式(7004)による、請求項9〜10及び24のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート:
【化６７】
2021523147.tif 001012
。
【請求項５５】
抗MSR1抗体もしくはPEG修飾抗MSR1抗体又はその抗原結合断片を、以下のものからなる群から選択されるリンカーペイロード又はその立体異性体形態もしくはその位置異性体もしくはその位置異性体の混合物とコンジュゲートすることにより調製される、抗体薬物コンジュゲート:
【化６８】
2021523147.tif 001013
2021523147.tif 001014
2021523147.tif 001015
2021523147.tif 001016
2021523147.tif 001017
2021523147.tif 001018
2021523147.tif 001019
2021523147.tif 001020
2021523147.tif 001021
2021523147.tif 001022
2021523147.tif 001023
2021523147.tif 001024
2021523147.tif 001025
2021523147.tif 001026
。
【請求項５６】
抗MSR1抗体もしくはPEG修飾抗MSR1抗体又はその抗原結合断片を、式(D):
【化６９】
2021523147.tif 001027
によるリンカーペイロード又はその立体異性体形態もしくはその位置異性体と、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片間の結合を形成するのに好適な条件下で接触させることにより調製される、請求項9記載の抗体-薬物コンジュゲート。
【請求項５７】
請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項５８】
請求項9〜54のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項５９】
対象の増殖性疾患、代謝性疾患、炎症、神経変性疾患、又はグルココルチコイド受容体シグナル伝達と関連する疾患、障害、もしくは疾病を治療する方法であって、該対象に、請求項1〜23、25〜34、51〜53のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート、又は請求項47〜48のいずれか一項記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項６０】
前記方法がアテローム性動脈硬化症を治療するためのものである、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
前記グルココルチコイド受容体シグナル伝達と関連する疾患、障害、又は疾病が、炎症性疾患、障害、又は疾病である、請求項59記載の方法。
【請求項６２】
前記方法が関節炎を治療するためのものである、請求項59記載の方法。
【請求項６３】
前記化合物のコンジュゲートされていないステロイドペイロードの投与と関連する副作用が低下する、請求項59記載の方法。
【請求項６４】
前記方法の代謝性疾患が脂質異常症である、請求項59記載の方法。
【請求項６５】
対象の細菌感染を予防又は治療する方法であって、該対象に、請求項1〜21、24、35〜50、及び54のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート又は請求項57〜58のいずれか一項記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項６６】
前記細菌が、グラム陽性細菌、ペンシリン(pencillin)耐性細菌黄色ブドウ球菌、メチシリイン(methiciliin)耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)、もしくはバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌(VRSA)、又は多剤耐性結核菌(Mycobacterium tuberculosis)である、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
請求項1〜21、24、35〜50、及び54のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート、又は請求項57〜58のいずれか一項記載の医薬組成物がバンコマイシンと組み合わせて投与される、請求項65記載の方法。
【請求項６８】
対象の蜂巣炎、菌血症、皮膚壊死症、眼瞼感染症、眼感染症、新生児結膜炎、骨髄炎、膿痂疹、炎症性の腫れ物、熱傷様皮膚症候群、食中毒、肺炎、外科感染症、尿路感染症、熱傷後感染、髄膜炎、心内膜炎、敗血症、毒素性ショック症候群、化膿性関節炎、乳腺炎、人工関節と関連する感染症、カテーテルと関連する感染症、又はインプラントと関連する感染症を予防又は治療する方法であって、該対象に、請求項11〜21、24、35〜50、及び54のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート、又は請求項57〜58のいずれか一項記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項６９】
対象の細胞内細菌感染を予防又は治療する方法であって、該対象に、請求項11〜21、24、35〜50、及び54のいずれか一項記載の抗体-薬物コンジュゲート、又は請求項57〜58のいずれか一項記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、あらゆる目的のために引用により完全に組み込まれている、2018年5月9日に出願された米国仮出願第62/669,276号、2018年5月30日に出願された米国仮出願第62/678,200号、2018年11月20日に出願された米国仮出願第62/769,946号、2019年1月8日に出願された米国仮出願第62/789,987号、及び2019年3月20日に出願された米国仮出願第62/821,362号に対する優先権を主張する。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は、三量体膜糖タンパク質受容体(MSR1)に特異的に結合し、MSR1シグナル伝達を調節する、抗体及びその抗原結合断片並びにそのような抗体の抗体-薬物コンジュゲート、並びにその使用方法に関する。
【０００３】
(配列表)
配列表の写しは、ファイル名114581.00244_ST25.TXT、作成日2018年5月30日、及びサイズ約165キロバイトのASCII形式の配列表のハードコピーとして、EFS-Web経由で本明細書と同時に提出される。ASCII形式の文書のこのハードコピーに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、引用により本明細書中に完全に含まれる。
【背景技術】
【０００４】
(背景)
マクロファージスカベンジャー受容体1(MSR1)は、修飾低密度リポタンパク質(LDL)(Krieger, M.の文献、1994. Annu. Rev. Biochem. 63:601-637; Platt, N.及びS. Gordon.の文献、2001. J Clin Invest. 108(5):649-654)及びウシ血清アルブミンの終末糖化産物(AGE-BSA)(Smedsrodらの文献、1997. Biochem J. 322(Pt 2):567-573)を含む、一連の負荷電性/ポリアニオン性リガンドの取込みを媒介する1回膜貫通型三量体II型膜糖タンパク質パターン認識受容体である。MSR1受容体は、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、及び宿主防御を含む、多くのマクロファージ関連の生理学的及び病理学的プロセスに関係があるとされている。
【０００５】
MSR1発現は、当初は、マクロファージ特異的であると考えられた。しかしながら、最近、これは、様々なクラスの樹状細胞上に存在することが示されている(Herberらの文献、2010. Nat. Med. 16(8): 880-886)。さらに、MSR1は、内皮細胞及び平滑筋肉細胞で発現されるように思われる。これは、細胞表面の被覆ピットを経由して内在化され、酸性pHでそのリガンドを放出した後、トランス-ゴルジ装置から細胞表面に戻って再利用される(Doiらの文献、1994. Journal of Biological Chemistry; Mori, T. 1994. Lab Invest.)。これは、アテローム性動脈硬化症進行の重要なステップである単球由来マクロファージから泡沫細胞への変換を促進する。
【０００６】
MSR1アイソフォーム1型及び2型は機能性受容体であり、修飾低密度リポタンパク質(LDL)のエンドサイトーシスを媒介することができる。MSR1アイソフォーム3型は、修飾LDL(アセチル-LDL)に結合することができるが、結合した複合体を内在化することはできないように思われる。しかしながら、MSR1は、修飾LDL以外の多種多様なリガンドにも結合する。これらのリガンドには、β-アミロイドタンパク質、分子シャペロン、細胞外マトリックスタンパク質、終末糖化産物、アポトーシス細胞、及び活性化B細胞が含まれる。
【０００７】
肝臓X受容体(LXR)には、コレステロール、脂質、及びグルコース恒常性、炎症、並びに自然免疫に関与する遺伝子の発現を制御するリガンド依存的転写因子であるLXRα及びLXRβが含まれる。LXRαは、肝臓、腸、脂肪組織、及び分化したマクロファージで高度に発現されており; LXRβは広範に発現されている。LXRは、(i)コレステロール輸送体、例えば、ABCA1及びABCG1(これらは両方とも細胞性コレステロール流出を媒介する)の発現を刺激すること;並びに(ii)NF-kB活性化の抑制を介してマクロファージ炎症性遺伝子発現を負に調節することを含む、様々な生物学的機能を有する。LXRは、アテローム性動脈硬化症、増殖性障害、神経変性障害、及び炎症にも関係があるとされている。増殖性障害には、メラノーマ、肺癌、口腔扁平上皮癌、及び前立腺癌が含まれる(Penchevaらの文献、2004; Wuらの文献、2015; Kanekoらの文献、2015; Chuuらの文献、2006)。神経変性障害には、アルツハイマー病及びミエリン遺伝子発現が含まれる(Terwelらの文献、2011; Sandoval-Hernandezらの文献、2016; Meffreらの文献、2014)。炎症には、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、及び関節炎が含まれる(Andersonらの文献、2011; Huangらの文献、2015; Cuiらの文献、2012)。マクロファージLXRは、抗アテローム形成活性を含むことが知られている。LXRアゴニストは、(i)アテローム性動脈硬化症の開始を阻害し、その進行を遅延させ;(ii)アテローム性動脈硬化症を緩和し、確立されたアテローム性動脈硬化病変を安定化し;かつ(iii)アポトーシスにより病変マクロファージ含量を低下させることができると考えられている。
【０００８】
低分子LXRモジュレーターの治療効力は、例えば、非標的細胞での望ましくないLXRの調節及び/又は低バイオアベイラビリティによって制限される。非標的細胞でのLXRの調節は、望ましくない副作用をもたらすことがあり、低バイオアベイラビリティは、限定されないが、治療の不十分な治療域をさらに悪化させる低溶解度を含む、数多くの理由により現れ得る。LXRモジュレーターを含むADCが開発されれば、標的特異的なLXRの調節が可能になり、それにより、LXRのオフターゲット調節に起因する副作用が回避されるであろう。さらに、そのようなADCであれば、生物学的標的の調節の改善、バイオアベイラビリティの改善、及び治療域の改善をもたらすであろう。それゆえ、LXRモジュレーターの抗体-薬物コンジュゲートを用いる、例えば、代謝性疾患の効果的な治療が引き続き必要とされている。
【０００９】
グルココルチコイド(GC)は、グルココルチコイド受容体(GR)に結合する低分子ステロイドであり、抗炎症及び免疫抑制療法に広く利用されている。しかしながら、多くの細胞型におけるグルココルチコイド受容体の遍在的発現のため、グルココルチコイド治療は、ほとんどの器官系への毒性により損なわれている。したがって、グルココルチコイド投与から生じる副作用、特に、非標的細胞におけるグルココルチコイド受容体の活性化から生じる副作用を最小限にする新規のグルココルチコイド及び新規の療法の両方が必要とされている。
【００１０】
リファマイシンは、グラム陽性及びグラム陰性細菌に対する活性スペクトルを有するアンサマイシン抗生物質ファミリーのサブクラスを形成し、結核、ハンセン病、及び/又はマイコバクテリウム・アビウムコンプレックス(MAC)の治療のための一般的に処方される抗マイコバクテリア薬である。リファマイシン群の抗生物質には、「古典的」リファマイシン薬及びリファマイシン誘導体、例えば、リファンピシン(又はリファンピン)、リファブチン、リファペンチン、リファラジル、及びリファキシミンが含まれる。特に、病院内環境での、抗生物質耐性細菌株(例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌(VRSA))、多剤耐性結核菌)の発生の増加は、現在進行中の問題である。より効果的なリファマイシンの類似体が必要とされている。リファマイシンは、バイオアベイラビリティの低下及びシトクロムP450酵素系(特に、CYP3A4)による代謝を受ける一部の共投与薬のクリアランスの増強をもたらすことができる、シトクロムP450酵素系(特に、CYP3A4)の適度から強度の誘導物質である。そのような相互作用は、発生が遅延する場合があるが、リファマイシン共投与を過ぎても持続する。リファンピンは、P-糖タンパク質(P-gp)多剤排出トランスポーターを誘導することもできる。リファマイシンの投与によって生じる副作用、特に、シトクロムP450酵素系の活性化によって生じる副作用を最小限に抑える新規の療法が必要とされている。
【００１１】
本出願に開示されているように、MSR抗体は、そのような化合物の全身投与によって生じる望ましくない副作用を最小限に抑えるための治療的分子、例えば、LXRアゴニスト、ステロイド、及びリファマイシンの特異的ターゲッティングのための手段を提供することができる。
【発明の概要】
【００１２】
(概要)
本明細書に提供されるのは、MSR1として知られる膜糖タンパク質受容体に結合する抗体、抗体の抗原結合断片、及びその抗体-薬物コンジュゲートである。該抗体は、とりわけ、MSR1を発現する細胞、例えば、マクロファージ細胞をターゲッティングするのに有用である。該抗MSR1抗体及びその抗原結合部分は、未修飾の形態で単独で使用することができ、又は抗体-薬物コンジュゲートの一部として含めることができる。
【００１３】
本明細書に開示される抗体は、全長(例えば、IgG1もしくはIgG4抗体)であることができるか、又は抗原結合部分(例えば、Fab、F(ab')2、もしくはscFv断片)のみを含むことができ、かつ機能性に影響を及ぼすように、例えば、残りのエフェクター機能を消失させるように修飾することができる(Reddyらの文献、2000, J. Immunol. 164:1925-1933)。
【００１４】
本明細書に開示される抗MSR1抗体の実施態様は、表4及び5に掲載されている。表4は、例示的な抗MSR1抗体の重鎖可変領域(HCVR)、軽鎖可変領域(LCVR)、重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)、並びに軽鎖相補性決定領域(LCDR1、LCDR2、及びLCDR3)のアミノ酸配列識別子を示している。表5は、例示的な抗MSR1抗体のHCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3の核酸配列識別子を示している。
【００１５】
本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているHCVRアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、又はそれに対する少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含むHCVRを含む、MSR1に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。
【００１６】
また本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているLCVRアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、又はそれに対する少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含むLCVRを含む、MSR1に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。
【００１７】
また本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているLCVRアミノ酸配列のいずれかと対になった表4に掲載されているHCVRアミノ酸配列のいずれかを含むHCVR及びLCVRアミノ酸配列対(HCVR/LCVR)を含む、MSR1に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。ある実施態様は、表4に掲載されている例示的な抗MSR1抗体のいずれかに含まれるHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む、抗体又はその抗原結合断片に関する。いくつかの実施態様において、該HCVR/LCVRアミノ酸配列対は: 2/10、23/42、50/58; 90/98、及び282/290からなる群から選択される。
【００１８】
本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているHCDR1アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む重鎖CDR1(HCDR1)を含む、MSR1に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。
【００１９】
また本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているHCDR2アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む重鎖CDR2(HCDR2)を含む、MSR1に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。
【００２０】
また本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているHCDR3アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む重鎖CDR3(HCDR3)を含む、MSR1に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。
【００２１】
本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているLCDR1アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む軽鎖CDR1(LCDR1)を含む、MSR1に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。
【００２２】
また本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているLCDR2アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む軽鎖CDR2(LCDR2)を含む、MSR1に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。
【００２３】
また本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているLCDR3アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む軽鎖CDR3(LCDR3)を含む、MSR1に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。
【００２４】
また本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているLCDR3アミノ酸配列のいずれかと対になった表4に掲載されているHCDR3アミノ酸配列のいずれかを含むHCDR3及びLCDR3アミノ酸配列対(HCDR3/LCDR3)を含む、MSR1に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。ある実施態様は、表4に掲載されている例示的な抗MSR1抗体のいずれかに含まれるHCDR3/LCDR3アミノ酸配列対を含む、抗体又はその抗原結合断片に関する。いくつかの実施態様において、該HCDR3/LCDR3アミノ酸配列対は: 8/16、40/48、56/64; 96/104、及び288/296からなる群から選択される。
【００２５】
本明細書に提供されるのは、表4に掲載されている例示的な抗MSR1抗体のいずれかに含まれる6つのCDRの組(すなわち、HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含む、MSR1に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。ある実施態様において、該HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3アミノ酸配列組は: 4-6-8-12-14-16; 36-38-40-44-46-48; 52-54-56-60-62-64; 92-94-96-100-102-104、及び284-286-288-292-294-296からなる群から選択される。
【００２６】
関連する実施態様において、本明細書に提供されるのは、表4に掲載されている例示的な抗MSR1抗体のいずれかによって定義されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対に含まれる6つのCDRの組(すなわち、HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含む、MSR1に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。例えば、本発明は、2/10、23/42、50/58、90/98、及び282/290:からなる群から選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対に含まれるHCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3アミノ酸配列組を含む、MSR1に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。HCVR及びLCVRアミノ酸配列に含まれるCDRを同定するための方法及び技法は、当技術分野で周知であり、本明細書に開示される特定のHCVR及び/又はLCVRアミノ酸配列内のCDRを同定するために使用することができる。CDRの境界を同定するために使用することができる例示的な慣例としては、例えば、Kabat定義、Chothia定義、及びAbM定義が挙げられる。一般的には、Kabat定義は、配列可変性に基づいており、Chothia定義は、構造ループ領域の位置に基づいており、AbM定義は、KabatアプローチとChothiaアプローチの折衷案である。例えば、Kabatの文献、「免疫学的に関心のあるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」、米国立衛生研究所、Bethesda, Md.(1991); Al-Lazikaniらの文献、J. Mol. Biol. 273:927-948(1997);及びMartinらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272(1989)を参照されたい。公的データベースも、抗体内のCDR配列を同定するために利用可能である。
【００２７】
また本明細書に提供されるのは、抗MSR1抗体又はその部分をコードする核酸分子である。例えば、本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているHCVRアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子であり;ある実施態様において、該核酸分子は、表5に掲載されているHCVR核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれに対する少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００２８】
また本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているLCVRアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子であり;ある実施態様において、該核酸分子は、表5に掲載されているLCVR核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれに対する少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００２９】
また本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているHCDR1アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子であり;ある実施態様において、該核酸分子は、表5に掲載されているHCDR1核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれに対する少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００３０】
また本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているHCDR2アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子であり;ある実施態様において、該核酸分子は、表5に掲載されているHCDR2核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれに対する少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００３１】
また本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているHCDR3アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子であり;ある実施態様において、該核酸分子は、表5に掲載されているHCDR3核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれに対する少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００３２】
また本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているLCDR1アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子であり;ある実施態様において、該核酸分子は、表5に掲載されているLCDR1核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列又はそれに対する少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００３３】
また本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているLCDR2アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子であり;ある実施態様において、該核酸分子は、表5に掲載されているLCDR2核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列又はそれに対する少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００３４】
また本明細書に提供されるのは、表4に掲載されているLCDR3アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子であり;ある実施態様において、該核酸分子は、表5に掲載されているLCDR3核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列又はそれに対する少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００３５】
また本明細書に提供されるのは、HCVRをコードする核酸分子であり、ここで、該HCVRは、3つのCDRの組(すなわち、HCDR1-HCDR2-HCDR3)を含み、ここで、該HCDR1-HCDR2-HCDR3アミノ酸配列組は、表4に掲載されている例示的な抗MSR1抗体のいずれかによって定義されている通りである。
【００３６】
また本明細書に提供されるのは、LCVRをコードする核酸分子であり、ここで、該LCVRは、3つのCDRの組(すなわち、LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含み、ここで、該LCDR1-LCDR2-LCDR3アミノ酸配列組は、表4に掲載されている例示的な抗MSR1抗体のいずれかによって定義されている通りである。
【００３７】
また本明細書に提供されるのは、HCVRとLCVRの両方をコードする核酸分子であり、ここで、該HCVRは、表4に掲載されているHCVRアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつ該LCVRは、表4に掲載されているLCVRアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、該核酸分子は、表5に掲載されているHCVR核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれに対する少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列、及び表5に掲載されているLCVR核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれに対する少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。本発明のこの態様によるある実施態様において、該核酸分子は、HCVR及びLCVRをコードし、ここで、該HCVR及びLCVRは両方とも、表4に掲載されている同じ抗MSR1抗体に由来する。
【００３８】
また本明細書に提供されるのは、抗MSR1抗体の重鎖又は軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターである。例えば、実施態様には、上述の核酸分子、すなわち、表4に記載されているHCVR、LCVR、及び/又はCDR配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターが含まれる。また本発明の範囲内に含まれるのは、そのようなベクターが導入されている宿主細胞、並びに該宿主細胞を抗体又は抗体断片の産生を許容する条件下で培養することにより該抗体又はその部分を産生し、かつそのようにして産生された抗体及び抗体断片を回収する方法である。
【００３９】
本明細書に提供されるのは、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗MSR1抗体である。いくつかの実施態様において、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾は、例えば、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)機能を増大させるために有用であり得る(Shieldらの文献(2002) JBC 277:26733を参照)。いくつかの実施態様において、オリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠く抗体を提供するための修飾は、例えば、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)機能を増大させるために有用であり得る。他の応用において、ガラクトシル化の修飾を、補体依存性細胞傷害性(CDC)を修飾するために行うことができる。
【００４０】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、MSR1に特異的に結合する組換えヒト抗体又はその断片及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。関連する態様において、実施態様は、抗MSR1抗体と第二の治療剤の組合せである組成物に関する。一実施態様において、第二の治療剤は、抗MSR1抗体と有利に組み合わされる任意の薬剤である。また本明細書に提供されるのは、薬物又は治療剤にコンジュゲートされた抗MSR1抗体を含む抗体-薬物コンジュゲート(ADC)である。抗MSR1抗体を含む例示的な組合せ療法、共製剤、及びADCは、本明細書中の別の場所に開示されている。
【００４１】
また本明細書に提供されるのは、薬物又は治療剤にコンジュゲートされた抗MSR1抗体又はそのMSR1抗原結合断片を含む抗体-薬物コンジュゲート(ADC)である。また本明細書に提供されるのは、ADCを作製するのに有用な反応性リンカー-ペイロードである。さらに本明細書に提供されるのは、ADCを作製するのに有用な修飾抗MSR1抗体及び修飾MSR1抗原結合断片である。
【００４２】
また本明細書に提供されるのは、それを必要としている対象への抗MSR1抗体、MSR1抗体の抗原結合部分、又は抗MSR1抗体もしくはそのMSR1抗原結合断片を含むADCの投与を含む治療方法である。該治療方法は、抗MSR1抗体、MSR1抗体の抗原結合部分、又は抗MSR1抗体もしくはそのMSR1抗原結合断片を含むADCを含む医薬組成物の治療有効量を対象に投与することを含む。治療される障害は、MSR1を標的とすることにより改善され(improved)、改善され(ameliorated)、阻害され、又は予防される任意の疾患又は疾病である。いくつかの実施態様において、該疾患又は疾病は、増殖性疾患、代謝性疾患、炎症、神経変性疾患、又はグルココルチコイド受容体シグナル伝達と関連する疾患、障害、もしくは疾病である。いくつかの実施態様において、該疾患又は疾病は、アテローム性動脈硬化症である。いくつかの実施態様において、グルココルチコイド受容体シグナル伝達と関連する疾患、障害、又は疾病は、炎症性疾患、障害、又は疾病である。そのような実施態様のいくつかにおいて、該化合物のコンジュゲートされていないステロイドペイロードの投与と関連する副作用は軽減される。また本明細書に提供されるのは、対象の細菌感染の治療及び/又は予防のための、抗MSR1抗体、MSR1抗体の抗原結合部分、又は抗MSR1抗体もしくはそのMSR1抗原結合断片を含むADCの投与を含む治療方法である。
【００４３】
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される任意の疾患、障害、又は疾病の治療のための、本明細書に記載される抗MSR1抗体、MSR1抗体の抗原結合部分、又は抗MSR1抗体もしくはそのMSR1抗原結合断片を含むADCの使用である。
【００４４】
また本明細書に提供されるのは、アテローム性動脈硬化症を治療し、停止させ、又は改善するための治療方法であって、抗MSR1抗体、MSR1抗体の抗原結合部分、又は抗MSR1抗体もしくはそのMSR1抗原結合断片を含むADCを、それを必要としている対象に投与することを含む、治療方法である。該治療方法は、抗MSR1抗体、MSR1抗体の抗原結合部分、又は抗MSR1抗体もしくはそのMSR1抗原結合断片を含むADCを含む医薬組成物の治療有効量を対象に投与することを含む。
【００４５】
他の実施態様は、以下の詳細な説明の概観から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
(図面の簡単な説明)
【図１】図1は、P1及びP2Bの合成スキームを提供している。
【００４７】
【図２】図2は、LP1の合成スキームを提供している。
【００４８】
【図３】図3は、LP2の合成スキームを提供している。
【００４９】
【図４】図4は、LP5の合成スキームを提供している。
【００５０】
【図５】図5は、LP6の合成スキームを提供している。
【００５１】
【図６】図6は、LP18の合成スキームを提供している。
【００５２】
【図７】図7は、LP4の合成スキームを提供している。
【００５３】
【図８】図8は、LP11の合成スキームを提供している。
【００５４】
【図９】図9は、LP9の合成スキームを提供している。
【００５５】
【図１０】図10は、LP12の合成スキームを提供している。
【００５６】
【図１１】図11は、P3及びP4の合成スキームを提供している。
【００５７】
【図１２】図12は、LP3の合成スキームを提供している。
【００５８】
【図１３】図13は、LP13の合成スキームを提供している。
【００５９】
【図１４】図14は、LP14の合成スキームを提供している。
【００６０】
【図１５】図15は、LP15の合成スキームを提供している。
【００６１】
【図１６】図16は、抗体-薬物コンジュゲート(ADC)の合成スキームを提供している。
【００６２】
【図１７】図17は、例示的なMSR1抗体-LXRコンジュゲート、そのコンジュゲートされていない対応物、アイソタイプ対照-ステロイドコンジュゲート、及び対応する遊離ペイロードについてのTHP-1マクロファージにおける用量依存的コレステロール流出のパーセンテージを示す折れ線グラフである。
【００６３】
【図１８】図18は、アテローム性動脈硬化症のマウスモデルにおける血清脂質レベルに対する例示的なMSR1抗体-LXRアゴニストコンジュゲート及びそのコンジュゲートされていない対応物の効果を示す一連の棒グラフを提供している。
【００６４】
【図１９】図19は、アテローム性動脈硬化症のマウスモデルにおける病変脂質面積及びマクロファージ(CD68)含量に対する例示的なMSR1抗体-LXRアゴニストコンジュゲート及びそのコンジュゲートされていない対応物の効果を示す一連の棒グラフを提供している。
【００６５】
【図２０】図20は、アテローム性動脈硬化症のマウスモデルにおける肝臓のトリグリセリド及びコレステロールレベルに対する例示的なMSR1抗体-LXRアゴニストコンジュゲート及びそのコンジュゲートされていない対応物の効果を示す一連の棒グラフを提供している。
【００６６】
【図２１】図21は、アテローム性動脈硬化症のマウスモデルにおけるデノボ脂質生成に対する例示的なMSR1抗体-LXRアゴニストコンジュゲート及びそのコンジュゲートされていない対応物の効果を示す一連の棒グラフを提供している。
【００６７】
【図２２】図22は、反応基である、suc-酸(化合物1c)、カルバメート類似体(1d、1e)、THP-類似体(1g及び1h)、グルコース類似体(1i及び1j)、ホスフェート類似体(1k及び1l)、並びに市販のホスフェート類似体(1m)を含有するブデソニド-スペーサーの合成スキームを提供している。
【００６８】
【図２３】図23は、ペイロード、化合物、及びビス-オクタヒドロフェナントレンカルボキサミドP3B〜P9Bの合成スキームを提供している。
【００６９】
【図２４】図24は、ペイロード、化合物、及びビス-オクタヒドロフェナントレンカルボキサミドP10B〜P11Bの合成スキームを提供している。
【００７０】
【図２５】図25は、リンカー及びリンカーペイロードLP1B〜LP5Bの合成スキームを提供している。
【００７１】
【図２６】図26は、リンカー及びリンカーペイロードLP6Bの合成スキームを提供している。
【００７２】
【図２７】図27は、リンカー及びリンカーペイロードLP7Bの合成スキームを提供している。
【００７３】
【図２８】図28は、リンカー及びリンカーペイロードLP8Bの合成スキームを提供している。
【００７４】
【図２９】図29は、リンカー及びリンカーペイロードLP9Bの合成スキームを提供している。
【００７５】
【図３０】図30は、リンカー及びリンカーペイロードLP10B及びLP11Bの合成スキームを提供している。
【００７６】
【図３１】図31は、ペイロード12B、リンカー及びリンカーペイロードLP12Bの合成スキームを提供している。
【００７７】
【図３２】図32は、シクロデキストリン-アジド105aの合成スキームを提供している。
【００７８】
【図３３】図33は、アジド-PEG4-タウリン105bの合成スキームを提供している。
【００７９】
【図３４】図34は、マルトース-アジド105cの合成スキームを提供している。
【００８０】
【図３５】図35は、リファマイシン類似体を用いて実施された黄色ブドウ球菌増殖阻害アッセイの結果のプロットである。
【００８１】
【図３６】図36は、リファマイシン類似体を用いて実施された黄色ブドウ球菌細胞内死滅化アッセイの結果の棒グラフである。
【００８２】
【図３７】図37は、リファマイシン類似体を用いて実施された黄色ブドウ球菌細胞内死滅化アッセイの結果のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
(詳細な説明)
本発明を説明する前に、記載されている特定の方法及び実験条件は様々に変わり得るので、本発明は、そのような方法及び条件に限定されないことが理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語法は、特定の実施態様を説明する目的のためだけのものであり、限定的であるようには意図されないことも理解されるべきである。
【００８４】
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的用語は全て、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙されている数値に関して使用されるとき、該値が列挙されている値とわずか1％異なり得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約100」という表現は、99及び101並びにその間の全ての値(例えば、99.1、99.2、99.3、99.4など)を含む。
【００８５】
本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料をこれから記載する。本明細書で言及される特許、出願、及び非特許刊行物は全て、引用により本明細書中に完全に組み込まれる。
【００８６】
(定義)
本明細書で使用される「MSR1」、「hMSR1」などの表現は、クラスAマクロファージスカベンジャー受容体の様々なタイプ及びアイソフォームを表す、(i)NCBIアクセッション番号NP_002436.1に記載されているアミノ酸配列、(ii)NCBIアクセッション番号NP_619729.1に記載されているアミノ酸配列、及び/又は(iii)NCBIアクセッション番号NP_619730.1に記載されているアミノ酸配列を含むヒト1回膜貫通型三量体II型膜糖タンパク質パターン認識受容体を指す。「MSR1」という表現は、単量体MSR1分子と多量体MSR1分子の両方を含む。本明細書で使用される場合、「単量体ヒトMSR1」という表現は、多量体化ドメインを含有又は保有せず、かつ通常の条件下で、別のMSR1分子と直接物理的に接続しないで、単一のMSR1分子として存在する、MSR1タンパク質又はその部分を意味する。例示的な単量体MSR1分子は、配列番号393のアミノ酸配列を含む「His-hMSR1」と本明細書で称される分子である(例えば、本明細書中の実施例3を参照)。
【００８７】
本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、及びタンパク質断片への言及は全て、非ヒト種に由来するものであると明示的に特定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、又はタンパク質断片のヒトバージョンを指すことが意図される。したがって、「MSR1」という表現は、非ヒト種に由来するもの、例えば、「マウスMSR1」、「サルMSR1」などと特定されない限り、ヒトMSR1を意味する。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「細胞表面発現MSR1」という表現は、MSR1タンパク質の少なくとも一部が細胞膜の細胞外側面に曝露されて、抗体の抗原結合部分に接近可能となるように、インビトロ又はインビボで細胞の表面に発現される1以上のMSR1タンパク質、又はその細胞外ドメインを意味する。「細胞表面発現MSR1」は、通常MSR1タンパク質を発現する細胞の表面に発現されるMSR1タンパク質を含むことができるか又は該MSR1タンパク質からなることができる。或いは、「細胞表面発現MSR1」は、通常はその表面にヒトMSR1を発現しないが、その表面にMSR1を発現するように人為的に改変されている細胞の表面に発現されるMSR1タンパク質を含むことができるか又は該MSR1タンパク質からなることができる。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「抗MSR1抗体」という表現は、単一特異性を有する一価抗体、並びにMSR1に結合する第一のアーム及び第二の(標的)抗原に結合する第二のアームを含む二重特異性抗体を含み、ここで、抗MSR1アームは、本明細書中の表4に記載されているHCVR/LCVR又はCDR配列のいずれかを含む。「抗MSR1抗体」という表現は、薬物又は治療剤にコンジュゲートされた抗MSR1抗体又はその抗原結合部分を含む抗体-薬物コンジュゲート(ADC)も含む。「抗MSR1抗体」という表現は、放射性核種にコンジュゲートされた抗MSR1抗体又はその抗原結合部分を含む抗体-放射性核種コンジュゲート(ARC)も含む。
【００９０】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、特定の抗原(例えば、MSR1)に特異的に結合するか又はそれと特異的に相互作用する少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含む任意の抗原結合分子又は分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に接続された、2本の重(H)鎖と2本の軽(L)鎖の4本のポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、及びその多量体(例えば、IgM)を含む。各々の重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではHCVR又はVHと略す)及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2、及びCH3を含む。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではLCVR又はVLと略す)及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、1つのドメイン(CL1)を含む。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域にさらに細かく分けることができる。各々のVH及びVLは、3つのCDR及び4つのFRから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、以下の順序: FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置されている。本発明の様々な実施態様において、抗MSR1抗体(又はその抗原結合部分)のFRは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、又は自然にもしくは人為的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、2以上のCDRの対比分析に基づいて定義することができる。
【００９１】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、完全な抗体分子の抗原結合断片も含む。本明細書で使用される、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得られる、合成された、又は遺伝子改変されたポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、任意の好適な標準的技法、例えば、タンパク分解的消化又は抗体可変ドメイン及び任意に定常ドメインをコードするDNAの操作及び発現を伴う組換え遺伝子工学技法を用いて完全な抗体分子から得ることができる。そのようなDNAは公知であり、及び/又は例えば、商業的な供給源、DNAライブラリー(例えば、ファージ-抗体ライブラリーを含む)から容易に入手可能であるか、又は合成することができる。DNAをシークエンシングし、化学的に又は分子生物学的技法を用いることにより操作して、例えば、1以上の可変及び/もしくは定常ドメインを好適な配置に配置すること、又はコドンを導入し、システイン残基を生成させ、アミノ酸を修飾し、付加し、もしくは欠失させること、などができる。
【００９２】
抗原結合断片の非限定的な例としては:(i)Fab断片;(ii)F(ab')2断片;(iii)Fd断片;(iv)Fv断片;(v)単鎖Fv(scFv)分子;(vi)dAb断片;及び(vii)抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位(例えば、CDR3ペプチドなどの単離された相補性決定領域(CDR))、又は拘束性FR3-CDR3-FR4ペプチドが挙げられる。他の改変分子、例えば、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ(例えば、一価のナノボディ、二価のナノボディなど)、小モジュラー免疫医薬(SMIP)、及びサメ可変IgNARドメインも、本明細書で使用される「抗原結合断片」という表現に包含される。
【００９３】
抗体の抗原結合断片は、通常、少なくとも1つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズ又はアミノ酸組成であってもよく、通常、1以上のフレームワーク配列に隣接しているか、又はそれとインフレームになっている少なくとも1つのCDRを含む。VHドメインがVLドメインと会合している抗原結合断片において、VHドメインとVLドメインは、互いに対して任意の好適な配置にあってもよい。例えば、可変領域は二量体であり、かつVH-VH、VH-VL、又はVL-VL二量体を含有していてもよい。或いは、抗体の抗原結合断片は、単量体のVH又はVLドメインを含有していてもよい。
【００９４】
ある実施態様において、抗体の抗原結合断片は、少なくとも1つの定常ドメインに共有結合した少なくとも1つの可変ドメインを含有していてもよい。本発明の抗体の抗原結合断片内に見出し得る可変及び定常ドメインの非限定的で例示的な配置としては:(i)VH-CH1;(ii)VH-CH2;(iii)VH-CH3;(iv)VH-CH1-CH2;(v)VH-CH1-CH2-CH3;(vi)VH-CH2-CH3;(vii)VH-CL;(viii)VL-CH1;(ix)VL-CH2;(x)VL-CH3;(xi)VL-CH1-CH2;(xii)VL-CH1-CH2-CH3;(xiii)VL-CH2-CH3;及び(xiv)VL-CLが挙げられる。上記の例示的な配置のいずれかを含む、可変ドメインと定常ドメインの任意の配置において、可変ドメインと定常ドメインは、互いに直接連結されていてもよく、又は完全なもしくは部分的なヒンジもしくはリンカー領域によって連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子中の隣接する可変ドメイン及び/又は定常ドメイン間に柔軟な又は半ば柔軟な連結を生じさせる少なくとも2個(例えば、5個、10個、15個、20個、40個、60個、又はそれより多く)のアミノ酸からなっていてもよい。さらに、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いに非共有結合的に会合した及び/又は1以上の単量体VHもしくはVLドメインと(例えば、ジスルフィド結合によって)非共有結合的に会合した上記の可変及び定常ドメイン配置のいずれかのホモ二量体又はヘテロ二量体(又は他の多量体)を含むことができる。
【００９５】
完全な抗体分子と同様、抗原結合断片は、単一特異性又は多重特異性(例えば、二重特異性)であってもよい。抗体の多重特異性抗原結合断片は、通常、少なくとも2つの異なる可変ドメインを含み、ここで、各々の可変ドメインは、別々の抗原に又は同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む、任意の多重特異性抗体フォーマットは、当技術分野で利用可能なルーチンの技法を用いて、本発明の抗体の抗原結合断片と関連した使用に適合させることができる。
【００９６】
本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害性(CDC)又は抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)を介して機能することができる。「補体依存性細胞傷害性」(CDC)は、補体の存在下における本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介細胞傷害性」(ADCC)は、Fc受容体(FcR)を発現する非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞上の結合抗体を認識し、それにより、標的細胞の溶解をもたらす細胞媒介反応を指す。CDC及びADCCは、当技術分野で周知でありかつ利用可能であるアッセイを用いて測定することができる(例えば、米国特許第5,500,362号及び第5,821,337号、並びにClynesらの文献(1998) Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 95:652-656を参照)。抗体の定常領域は、補体を固定し、細胞依存性細胞傷害性を媒介する抗体の能力において重要である。したがって、抗体のアイソタイプは、抗体が細胞傷害性を媒介するのに望ましいかどうかに基づいて選択することができる。
【００９７】
ある実施態様において、本明細書に開示される抗MSR1抗体は、ヒト抗体である。本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒト抗体は、例えば、CDR、特に、CDR3中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダムなもしくは部位特異的な突然変異誘発によるか、又はインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異)を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことが意図されない。
【００９８】
本明細書に開示される抗体は、いくつかの実施態様において、組換えヒト抗体であってもよい。本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製され、発現され、作出され、又は単離される全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現される抗体(以下でさらに記載する)、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体(以下でさらに記載する)、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物(例えば、マウス)から単離される抗体(例えば、Taylorらの文献(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295を参照)、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製され、発現され、作出され、もしくは単離される抗体を含むことが意図される。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する。しかしながら、ある実施態様において、そのような組換えヒト抗体は、インビトロでの突然変異誘発(又はヒトIg配列についてトランスジェニックな動物を使用する場合、インビボでの体細胞突然変異誘発)を受け、したがって、該組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH及びVL配列に由来し、かつそれに関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しなくてもよい配列である。
【００９９】
ヒト抗体は、ヒンジの不均一性と関連する2つの形態で存在することができる。ある形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって結合している、約150〜160kDaの安定な4鎖構築物を含む。第二の形態では、二量体が鎖間ジスルフィド結合によって連結されず、共有結合した軽鎖及び重鎖(半分の抗体)から構成された、約75〜80kDaの分子が形成される。これらの形態は、親和性精製後でさえも、分離するのが極めて難しい。
【０１００】
様々なインタクトのIgGアイソタイプにおける第二の形態の出現頻度は、限定されないが、抗体のヒンジ領域アイソタイプと関連する構造上の違いによるものである。ヒトIgG4ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、ヒトIgG1ヒンジを用いて通常観察されるレベルにまで第二の形態の出現を有意に低下させることができる(Angalらの文献(1993) Molecular Immunology 30:105)。本明細書に開示される実施態様は、ヒンジ、CH2、又はCH3領域中に1以上の突然変異を有する抗体を包含し、該突然変異は、例えば、産生において、所望の抗体形態の収率を改善するために望ましい場合がある。
【０１０１】
本明細書に開示される抗体は、単離された抗体であってもよい。本明細書で使用される「単離された抗体」は、同定され、かつその天然環境の少なくとも1つの構成要素から分離及び/又は回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも1つの構成要素から、又は抗体が天然に存在しもしくは天然に産生される組織もしくは細胞から分離又は除去された抗体は、本発明の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体は、組換え細胞内のインサイチュの抗体も含む。単離された抗体は、少なくとも1つの精製又は単離工程にかけられた抗体である。ある実施態様によれば、単離された抗体は、他の細胞物質及び/又は化学物質を実質的に含まないものであってもよい。
【０１０２】
本明細書に開示される抗MSR1抗体は、抗体が由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び/又はCDR領域中に1以上のアミノ酸置換、挿入、及び/又は欠失を含むことができる。そのような突然変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公的な抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することにより、すぐに確認することができる。実施態様には、1以上のフレームワーク及び/又はCDR領域内の1以上のアミノ酸が、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基に、又は別のヒト生殖系列配列の対応する残基に、又は対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に突然変異させられている(そのような配列変化は、本明細書において、「生殖系列突然変異」と総称される)、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体及びその抗原結合断片が含まれる。当業者は、本明細書に開示される重鎖及び軽鎖可変領域配列から出発して、1以上の個々の生殖系列突然変異又はその組合せを含む多くの抗体及び抗原結合断片を容易に産生することができる。ある実施態様において、VH及び/又はVLドメイン内の全てのフレームワーク及び/又はCDR残基を突然変異させて、抗体が由来したもとの生殖系列配列中に見出される残基に戻す。他の実施態様において、特定の残基のみ、例えば、FR1の最初の8つのアミノ酸もしくはFR4の最後の8つのアミノ酸に見出される突然変異残基のみ、又はCDR1、CDR2、もしくはCDR3に見出される突然変異残基のみを突然変異させて、もとの生殖系列配列に戻す。他の実施態様において、1以上の該フレームワーク及び/又はCDR残基を、異なる生殖系列配列(すなわち、抗体がもともと由来した生殖系列配列と異なる生殖系列配列)の対応する残基に突然変異させる。さらに、本発明の抗体は、例えば、特定の個々の残基が特定の生殖系列配列の対応する残基に突然変異させられている一方で、もとの生殖系列配列と異なる特定の他の残基が維持されているか又は異なる生殖系列配列の対応する残基に突然変異させられているフレームワーク及び/又はCDR領域内に2以上の生殖系列突然変異の任意の組合せを含有し得る。ひとたび得られれば、1以上の生殖系列突然変異を含有する抗体及び抗原結合断片を、例えば、改善された結合特異性、増大した結合親和性、改善又は増強された拮抗的又は作動的生体特性(場合による)、低下した免疫原性などの1以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な方法で得られる抗体及び抗原結合断片は、本明細書に開示される実施態様の範囲内に包含される。
【０１０３】
実施態様には、1以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるHCVR、LCVR、及び/又はCDRアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗MSR1抗体も含まれる。例えば、実施態様には、例えば、本明細書中の表4に記載されているHCVR、LCVR、及び/又はCDRアミノ酸配列組のいずれかに対する10個以下、8個以下、6個以下、4個以下のなど保存的アミノ酸置換を有する、HCVR、LCVR、及び/又はCDRアミノ酸配列を有する抗MSR1抗体が含まれる。
【０１０４】
「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域中の特異的抗原結合部位と相互作用する抗原性決定基を指す。単一の抗原は、複数のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体が抗原上の異なる部分に結合し得、かつ異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体構造的又は線状のいずれかであり得る。立体構造エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメント由来の空間的に並置されたアミノ酸により生じる。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基により生じるものである。ある状況において、エピトープは、抗原上のサッカリド、ホスホリル基、又はスルホニル基の部分を含み得る。
【０１０５】
核酸又はその断片を指す場合の「実質的同一性」又は「実質的に同一」という用語は、適切なヌクレオチド挿入又は欠失を伴って、別の核酸(又はその相補鎖)と最適に整列させたとき、以下で論じられるような、任意の周知の配列同一性のアルゴリズム、例えば、FASTA、BLAST、又はGAPにより測定して、少なくとも約95％、より好ましくは、少なくとも約96％、97％、98％、又は99％のヌクレオチド塩基においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子との実質的同一性を有する核酸分子は、ある例において、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じ又は実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【０１０６】
ポリペプチドに適用される場合、「実質的類似性」又は「実質的に類似」という用語は、例えば、デフォルトのギャップウェイトを用いて、GAP又はBESTFITというプログラムによって最適に整列させたとき、2つのペプチド配列が、少なくとも95％の配列同一性、さらにより好ましくは、少なくとも98％又は99％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なっている。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学的性質(例えば、電荷又は疎水性)を有する側鎖(R基)を有する別のアミノ酸残基によって置換される置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的性質を実質的には変化させない。2以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、パーセント配列同一性又は類似性度を上方に調整して、置換の保存的性質に合わせて補正することができる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Pearsonの文献(1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331を参照されたい。類似の化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、(1)脂肪族側鎖:グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン;(2)脂肪族-ヒドロキシル側鎖:セリン及びトレオニン;(3)アミド含有側鎖:アスパラギン及びグルタミン;(4)芳香族側鎖:フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン;(5)塩基性側鎖:リジン、アルギニン、及びヒスチジン;(6)酸性側鎖:アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに(7)システイン及びメチオニンである硫黄含有側鎖が挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は:バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸、及びアスパラギン-グルタミンである。或いは、保存的置換は、Gonnetらの文献(1992) Science 256: 1443-1445に開示されているPAM250対数-確率行列において正の値を有する任意の変化である。「中等度に保存的な」置換は、PAM250対数-確率行列において非負の値を有する任意の変化である。
【０１０７】
配列同一性とも称されるポリペプチドの配列類似性は、通常、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠失、及び他の修飾に割り当てられる類似性の尺度を用いて、類似の配列をマッチさせる。例えば、GCGソフトウェアは、密接に関連するポリペプチド、例えば、異なる生物種由来のホモログポリペプチド間の、又は野生型タンパク質とその突然変異体間の配列相同性又は配列同一性を決定するために、デフォルトパラメータを用いて使用することができるGAP及びBESTFITなどのプログラムを含む。例えば、GCGバージョン6.1を参照されたい。ポリペプチド配列は、デフォルトの又は推奨されるパラメータを用いる、GCGバージョン6.1中のプログラムであるFASTAを用いて比較することもできる。FASTA(例えば、FASTA2及びFASTA3)は、クエリー配列と検索配列の間の最も高いオーバーラップ領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を提供する(Pearsonの文献(2000)、上記)。本発明の配列を様々な生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いる、コンピュータプログラムBLAST、特に、BLASTP又はTBLASTNである。例えば、Altschulの文献(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410及びAltschulの文献(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402を参照されたい。
【０１０８】
本明細書に提供される化合物に言及する場合、以下の用語は、別途示されない限り、以下の意味を有する。別途定義されない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的用語は全て、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に提供される用語について複数の定義がある場合、別途明記されない限り、これらの定義が優先する。
【０１０９】
本明細書で使用される「1つの(a)」又は「1つの(an)」という用語は、文脈上明らかに矛盾しない限り、1つ又は複数を意味する。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、一価及び飽和炭化水素ラジカル部分を指す。アルキルは、任意に置換されており、線状、分岐状、又は環状、すなわち、シクロアルキルであることができる。アルキルとしては、1〜20個の炭素原子を有するラジカル、すなわち、C1-20アルキル; 1〜12個の炭素原子を有するラジカル、すなわち、C1-12アルキル; 1〜8個の炭素原子を有するラジカル、すなわち、C1-8アルキル; 1〜6個の炭素原子を有するラジカル、すなわち、C1-6アルキル;及び1〜3個の炭素原子を有するラジカル、すなわち、C1-3アルキルが挙げられるが、これらに限定されない。アルキル部分の例としては、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、s-ブチル、t-ブチル、i-ブチル、ペンチル部分、ヘキシル部分、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。ペンチル部分としては、n-ペンチル及びi-ペンチルが挙げられるが、これらに限定されない。ヘキシル部分としては、n-ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「アルキレン」は、二価アルキル基を指す。別途指定されない限り、アルキレンは、1〜20個の炭素原子を含むが、これらに限定されない。アルキレン基は、アルキルについて本明細書に記載されている通りに任意に置換されている。いくつかの実施態様において、アルキレンは、置換されていない。いくつかの実施態様において、アルキレンは、二価分岐状アルキル基である。
【０１１２】
「アミノ」という用語は、-NH2を意味する。
【０１１３】
「アルキルアミノ」という用語は、本明細書で使用される場合、別途指定されない限り、基-NHR'を指し、ここで、R'は、本明細書で定義されるC1-10アルキルである。いくつかの又は任意の実施態様において、アルキルアミノは、C1-6アルキルアミノである。
【０１１４】
「ジアルキルアミノ」という用語は、本明細書で使用される場合、別途指定されない限り、基-NR'R'を指し、ここで、各々のR'は、独立に、本明細書で定義されるC1-10アルキルである。いくつかの又は任意の実施態様において、ジアルキルアミノは、ジ-C1-6アルキルアミノである。
【０１１５】
「アミノアルキル」という用語は、本明細書で使用される場合、別途指定されない限り、1以上のアミノ基で置換されている、本明細書で定義されるアルキル基を指す。いくつかの又は任意の実施態様において、アミノアルキルは、1つの-NH2基(例えば、-R'(NH2)、ここで、R'は、本明細書で定義される-C1-10アルキルである)で置換されたアルキル基である。いくつかの又は任意の実施態様において、アミノアルキルは、2つの-NH2基で置換されたアルキル基である。いくつかの実施態様において、「アミノアルキル」は、アミノC1-6アルキルである。
【０１１６】
「アルキルアミノアルキル」は、本明細書で使用される場合、別途指定されない限り、本明細書で定義される1以上のアルキルアミノ基で置換されている、本明細書で定義されるアルキル基を指す。いくつかの実施態様において、「アルキルアミノアルキル」は、C1-6アルキルアミノC1-6アルキルである。いくつかの実施態様において、アルキルアミノアルキル中の各々のアルキルは、独立に選択される。
【０１１７】
「ジアルキルアミノアルキル」は、本明細書で使用される場合、別途指定されない限り、本明細書で定義される1以上のジアルキルアミノ基で置換されている、本明細書で定義されるアルキル基を指す。いくつかの実施態様において、「ジアルキルアミノアルキル」は、ジ-C1-6アルキルアミノC1-6アルキルである。いくつかの実施態様において、ジアルキルアミノアルキル中の各々のアルキルは、独立に選択される。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「O-アミノ酸」又は「HO-アミノ酸」という用語は、アミノ酸又はアミノ酸配列のN-末端の天然アミノ基が、それぞれ、酸素又はヒドロキシル基と置き換えられているアミノ酸を表す。例えば、「O-AAAA」又は「HO-AAAA」は、N-末端の天然アミノ基が、それぞれ、酸素又はヒドロキシル基と置き換えられているアミノ酸配列(AAAA)(例えば、
【化１】
2021523147.tif 000003
ここで、各々のRは、アミノ酸側鎖である)を表すことが意図される。同様に、「O-アミノ酸残基」又は「HO-アミノ酸残基」という用語は、化学反応後に残る化合物内の化学的部分を指す。例えば、「O-アミノ酸残基」又は「HO-アミノ酸残基」は、O-アミノ酸又はHO-アミノ酸と好適なカップリングパートナーとのアミドカップリング又はペプチドカップリングの生成物を指し;ここで、例えば、水分子は、該O-アミノ酸又は該HO-アミノ酸のアミド又はペプチドカップリング後に追い出され、結果として、該O-アミノ酸残基又は該HO-アミノ酸残基がその中に取り込まれた生成物が生じる。
【０１１９】
その立体化学を特定しないアミノ酸又はアミノ酸残基の表記は、L型のアミノ酸、D型のアミノ酸、又はそのラセミ混合物を包含することが意図される。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「ハロアルキル」は、上で定義されているようなアルキルを指し、ここで、該アルキルは、ハロゲン、例えば、フッ素(F)、塩素(Cl)、臭素(Br)、又はヨウ素(I)から選択される少なくとも1つの置換基を含む。ハロアルキルの例としては、-CF3、-CH2CF3、-CCl2F、及び-CCl3が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、少なくとも2つの炭素原子及び1以上の非芳香族炭素-炭素二重結合を含有する一価炭化水素ラジカル部分を指す。アルケニルは、任意に置換されており、線状、分岐状、又は環状であることができる。アルケニルとしては、2〜20個の炭素原子を有するラジカル、すなわち、C2-20アルケニル; 2〜12個の炭素原子を有するラジカル、すなわち、C2-12アルケニル; 2〜8個の炭素原子を有するラジカル、すなわち、C2-8アルケニル; 2〜6個の炭素原子を有するラジカル、すなわち、C2-6アルケニル;及び2〜4個の炭素原子を有するラジカル、すなわち、C2-4アルケニルが挙げられるが、これらに限定されない。アルケニル部分の例としては、ビニル、プロペニル、ブテニル、及びシクロヘキセニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、少なくとも2つの炭素原子及び1以上の炭素-炭素三重結合を含有する一価炭化水素ラジカル部分を指す。アルキニルは、任意に置換されており、線状、分岐状、又は環状であることができる。アルキニルとしては、2〜20個の炭素原子を有するラジカル、すなわち、C2-20アルキニル; 2〜12個の炭素原子を有するラジカル、すなわち、C2-12アルキニル; 2〜8個の炭素原子を有するラジカル、すなわち、C2-8アルキニル; 2〜6個の炭素原子を有するラジカル、すなわち、C2-6アルキニル;及び2〜4個の炭素原子を有するラジカル、すなわち、C2-4アルキニルが挙げられるが、これらに限定されない。アルキニル部分の例としては、エチニル、プロピニル、及びブチニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」は、一価及び飽和炭化水素ラジカル部分を指し、ここで、該炭化水素は酸素原子との単結合を含み、かつ該ラジカルは酸素原子上に位置し、例えば、エトキシの場合、CH3CH2-O・である。アルコキシ置換基は、それが該アルコキシ置換基のこの酸素原子を介して置換する化合物に結合する。アルコキシは、任意に置換されており、線状、分岐状、又は環状、すなわち、シクロアルコキシであることができる。アルコキシとしては、1〜20個の炭素原子を有するもの、すなわち、C1-20アルコキシ; 1〜12個の炭素原子を有するもの、すなわち、C1-12アルコキシ; 1〜8個の炭素原子を有するもの、すなわち、C1-8アルコキシ; 1〜6個の炭素原子を有するもの、すなわち、C1-6アルコキシ;及び1〜3個の炭素原子を有するもの、すなわち、C1-3アルコキシが挙げられるが、これらに限定されない。アルコキシ部分の例としては、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、i-プロポキシ、n-ブトキシ、s-ブトキシ、t-ブトキシ、i-ブトキシ、ペントキシ部分、ヘキソキシ部分、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペントキシ、及びシクロヘキソキシが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「ハロアルコキシ」は、上で定義されているようなアルコキシを指し、ここで、該アルコキシは、ハロゲン、例えば、F、Cl、Br、又はIから選択される少なくとも1つの置換基を含む。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「アリール」は、環原子が炭素原子である芳香族化合物のラジカルである一価部分を指す。アリールは、任意に置換されており、単環式又は多環式、例えば、二環式もしくは三環式であることができる。アリール部分の例としては、6〜20個の環炭素原子を有するもの、すなわち、C6-20アリール; 6〜15個の環炭素原子を有するもの、すなわち、C6-15アリール、及び6〜10個の環炭素原子を有するもの、すなわち、C6-10アリールが挙げられるが、これらに限定されない。アリール部分の例としては、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アズレニル、アントリル、フェナントリル、及びピレニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「アリールアルキル」は、アルキル化合物のラジカルである一価部分を指し、ここで、該アルキル化合物は芳香族置換基で置換されている、すなわち、芳香族化合物はアルキル基との単結合を含み、かつ該ラジカルは該アルキル基上に位置する。アリールアルキル基は、アルキル基を介して、図示されている化学構造に結合する。アリールアルキルは、構造、例えば、
【化２】
2021523147.tif 000004
(ここで、Bは、芳香族部分、例えば、フェニルである)によって表すことができる。アリールアルキルは任意に置換されている、すなわち、アリール基及び/又はアルキル基は、本明細書に開示されているように置換されることができる。アリールアルキルの例としては、ベンジルが挙げられるが、これに限定されない。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「アルキルアリール」は、アリール化合物のラジカルである一価部分を指し、ここで、該アリール化合物はアルキル置換基で置換されている、すなわち、アリール化合物はアルキル基との単結合を含み、かつ該ラジカルは該アリール基上に位置する。アルキルアリール基は、アリール基を介して、図示されている化学構造に結合する。アルキルアリールは、構造、例えば、
【化３】
2021523147.tif 000005
(ここで、Bは、芳香族部分、例えば、フェニルである)によって表すことができる。アルキルアリールは任意に置換されている、すなわち、アリール基及び/又はアルキル基は、本明細書に開示されているように置換されることができる。アルキルアリールの例としては、トルイルが挙げられるが、これに限定されない。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「アリールオキシ」は、環原子が炭素原子であり、かつ該環が酸素ラジカルと置換されている芳香族化合物のラジカルである一価部分を指す、すなわち、該芳香族化合物は酸素原子との単結合を含み、かつ該ラジカルは該酸素原子上に位置し、例えば、フェノキシの場合、
【化４】
2021523147.tif 000006
である。アリールオキシ置換基は、それがこの酸素原子を介して置換する化合物に結合する。アリールオキシは、任意に置換されている。アリールオキシとしては、6〜20個の環炭素原子を有するラジカル、すなわち、C6-20アリールオキシ; 6〜15個の環炭素原子を有するもの、すなわち、C6-15アリールオキシ、及び6〜10個の環炭素原子を有するもの、すなわち、C6-10アリールオキシが挙げられるが、これらに限定されない。アリールオキシ部分の例としては、フェノキシ、ナフトキシ、及びアントロキシが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「RaRbN-アリールオキシ」は、環原子が炭素原子であり、かつ該環が少なくとも1つのRaRbN-置換基及び少なくとも1つの酸素ラジカルと置換されている芳香族化合物のラジカルである一価部分を指す、すなわち、該芳香族化合物は、RaRbN-置換基との単結合及び酸素原子との単結合を含み、かつ該ラジカルは該酸素原子上に位置し、例えば、
【化５】
2021523147.tif 000007
である。RaRbN-アリールオキシ置換基は、それがこの酸素原子を介して置換する化合物に結合する。RaRbN-アリールオキシは、任意に置換されている。RaRbN-アリールオキシとしては、6〜20個の環炭素原子を有するもの、例えば、C6-20(RaRbN)n-アリールオキシ、6〜15個の環炭素原子を有するもの、例えば、C6-15(RaRbN)n-アリールオキシ、及び6〜10個の環炭素原子を有するもの、例えば、C6-10(RaRbN)n-アリールオキシ(ここで、nは、RaRbN-置換基の数を表す)が挙げられるが、これらに限定されない。RaRbN-アリールオキシ部分の例としては、4-(ジメチル-アミノ)-フェノキシ、
【化６】
2021523147.tif 000008
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「アリーレン」は、環原子が炭素原子のみである芳香族化合物の二価部分を指す。アリーレンは、任意に置換されており、単環式又は多環式、例えば、二環式もしくは三環式であることができる。アリーレン部分の例としては、6〜20個の環炭素原子を有するもの、すなわち、C6-20アリーレン; 6〜15個の環炭素原子を有するもの、すなわち、C6-15アリーレン、及び6〜10個の環炭素原子を有するもの、すなわち、C6-10アリーレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」は、1以上の炭素原子がヘテロ原子に置換されているアルキルを指す。本明細書で使用される場合、「ヘテロアルケニル」は、1以上の炭素原子がヘテロ原子に置換されているアルケニルを指す。本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキニル」は、1以上の炭素原子がヘテロ原子に置換されているアルケニルを指す。好適なヘテロ原子としては、窒素、酸素、及び硫黄原子が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアルキルは、任意に置換されている。ヘテロアルキル部分の例としては、アミノアルキル、スルホニルアルキル、及びスルフィニルアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアルキル部分の例としては、メチルアミノ、メチルスルホニル、及びメチルスルフィニルも挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、環原子が炭素原子及び少なくとも1つの酸素、硫黄、窒素、又はリン原子を含有する芳香族化合物のラジカルである一価部分を指す。ヘテロアリール部分の例としては、5〜20個の環原子; 5〜15個の環原子;及び5〜10個の環原子を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリールは、任意に置換されている。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリーレン」は、芳香環の1以上の炭素環原子が酸素、硫黄、窒素、又はリン原子と置換されているアリーレンを指す。ヘテロアリーレンは、任意に置換されている。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「ヘテロシクロアルキル」は、1以上の炭素原子がヘテロ原子に置換されているシクロアルキルを指す。好適なヘテロ原子としては、窒素、酸素、及び硫黄原子が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルは、任意に置換されている。ヘテロシクロアルキル部分の例としては、モルホリニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、ジオキソラニル、ジチオラニル、オキサニル、又はチアニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「N-含有ヘテロシクロアルキル」は、1以上の炭素原子がヘテロ原子に置換されており、かつ少なくとも1つのヘテロ原子が窒素原子であるシクロアルキルを指す。窒素の他に好適なヘテロ原子としては、酸素及び硫黄原子が挙げられるが、これらに限定されない。N-含有ヘテロシクロアルキルは、任意に置換されている。N-含有ヘテロシクロアルキル部分の例としては、モルホリニル、ピペリジニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、又はチアゾリジニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、ラジカル部分を説明するために使用されるときの「任意に置換された」、例えば、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換ヘテロアリール、任意に置換されたアリーレン、及び任意に置換されたヘテロアリーレンは、そのような部分が1以上の置換基に任意に結合していることを意味する。そのような置換基の例としては、ハロ、シアノ、ニトロ、任意に置換されたハロアルキル、アジド、エポキシ、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたヘテロシクロアルキル、
【化７】
2021523147.tif 000009
(ここで、RA、RB、及びRCは、出現する毎に独立に、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクロアルキルであるか、又はRA及びRBは、それらが結合している原子と一緒に、飽和もしくは不飽和炭素環を形成し、ここで、該環は、任意に置換されており、かつ1以上の環原子はヘテロ原子で任意に置換されている)が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施態様において、ラジカル部分が、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたヘテロシクロアルキル、又は任意に置換された飽和もしくは不飽和炭素環で任意に置換されているとき、該任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたヘテロシクロアルキル、又は任意に置換された飽和もしくは不飽和炭素環上の置換基は、それらが置換されている場合、さらなる置換基でさらに任意に置換されている置換基で置換されていない。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される基が任意に置換されているとき、該基に結合している置換基は、別途規定されない限り、置換されていない。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「O-グルコース」は、環外グルコース酸素原子を介して付加された一価部分を指す。好適なO-グルコース部分には、限定されないが、
【化８】
2021523147.tif 000010
などが含まれる。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「O-PEGn」は、末端酸素原子を介して付加された一価部分を指し、ここで、nは1〜100である。例えば、nが1である場合、O-PEGnは-O-CH2CH2OHであり; nが2である場合、O-PEGnは-O-CH2CH2O-CH2CH2OHであり;かつnが3である場合、O-PEGnは-O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2OHである。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「結合剤」は、所与の結合パートナー、例えば、抗原と特異性を伴って結合することができる任意の分子、例えば、タンパク質又は抗体を指す。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「リンカー」は、結合剤を、本明細書に記載される1以上の化合物、例えば、本明細書に記載されるペイロード化合物及び/又は親水基に共有結合させる二価、三価、又は多価部分を指す。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「コネクター基」又は「コネクター基残基」は、ペイロードの放出を容易にし得る任意の基を指す。好適なコネクター基は、二価又は多価付加ペイロードの放出を容易にして、ほとんど又は全く誘導体化されていない、もとのコンジュゲートされていない形態に戻す。コネクター基の例としては、
【化９】
2021523147.tif 000011
又はその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。別の例において、コネクター基は、
【化１０】
2021523147.tif 000012
である。
【０１４２】
さらなる例において、コネクター基は、自壊基である。「自壊基」は、当業者に公知の任意のそのような基を指す。特定の実施態様において、自壊基は、p-アミノベンジルオキシカルボニル(PAB/PABC)、すなわち、
【化１１】
2021523147.tif 000013
である。当業者は、自壊基がリンカーの残りの原子からペイロードを放出する化学反応を実施することができることを認識しているであろう。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「接続リンカー(単数)」(L2)又は「接続リンカー(複数)」という用語は、切断性又は非切断性である二価基を指す。切断性リンカーは、内在化後の細胞内代謝、例えば、加水分解、還元、又は酵素反応を介する切断によって切断されるリンカーである。非切断性リンカーは、内在化後の抗体のリソソーム分解を介して、付加されたペイロードを放出するリンカーである。好適な接続リンカーとしては、酸不安定性リンカー、加水分解不安定性リンカー、酵素切断性リンカー、還元不安定性リンカー、及び非切断性リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。好適なリンカーとしては、グルクロニド、スクシンイミド-チオエーテル、ポリエチレングリコール(PEG)単位、ヒドラゾン、マル-カプロイル単位、ジスルフィド単位(例えば、-S-S-、-S-C(R1bR2b)-(ここで、R1b及びR2bは、独立に、水素もしくはヒドロカルビルである))、カルバメート単位、パラ-アミノ-ベンジル単位(PAB)、ホスフェート単位、例えば、モノ-、ビス-、もしくはトリス-ホスフェート単位、並びにペプチド単位、例えば、限定されないが、バリン-シトルリン残基単位を含む、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、もしくはそれより多くのアミノ酸残基を含有するペプチド単位であるか、又はこれらを含むものも挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「カプロイル」は、-(CH2)5-C(O)-基を意味する。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「反応基」(「RG」)という語句は、抗体、修飾抗体、又はその抗原結合断片の反応性部分と反応する官能基又は官能部分を指す。ある実施態様において、「反応基」は、抗体又はその抗原結合断片のシステイン又はリジン残基と反応する官能基又は官能部分(例えば、マレイミド又はNHSエステル)である。ある実施態様において、「反応基」は、クリック化学反応を受けることができる官能基又は官能部分である。該クリック化学反応のいくつかの実施態様において、反応基は、アジドとの1,3付加環化反応を受けることができるアルキンを含む。そのような好適な反応基としては、歪みアルキン、例えば、歪み促進アルキン-アジド付加環化(SPAAC)に好適なもの、シクロアルキン、例えば、シクロオクチン、ベンズ環化アルキン、及び銅触媒の非存在下でアルキンとの1,3付加環化反応を受けることができるアルキンが挙げられるが、これらに限定されない。好適なアルキンとしては、DIBAC(ここで、DIBAC部分の-C(O)CH2CH2C(O)-部分は、L及び/又はL2によって表すことができる)、DIBO(ここで、DIBO部分の-O-部分は、L及び/又はL2によって表すことができる)、BARAC(ここで、BARAC部分の
【化１２】
2021523147.tif 000014
部分は、L及び/又はL2によって表すことができる)、DIFO(ここで、-O-部分は、L及び/又はL2によって表すことができる)、置換アルキン、例えば、フッ素化アルキン、アザ-シクロアルキン、BCN、並びにその誘導体も挙げられるが、これらに限定されない。そのような反応基を含むリンカー-ペイロードは、アジド基で官能化されている抗体をコンジュゲートするのに有用である。そのような官能化抗体としては、アジド-ポリエチレングリコール基で官能化された抗体が挙げられる。ある実施態様において、そのような官能化抗体は、少なくとも1つのグルタミン残基、例えば、重鎖Q295(EU付番)を含む抗体を、酵素トランスグルタミナーゼの存在下で、式H2N-LL-N3による化合物(式中、LLは、二価ポリエチレングリコール基である)と反応させることにより得られる。
【０１４５】
いくつかの実施態様において、反応基(RG)は、アルキン、例えば、
【化１３】
2021523147.tif 000015
であり、これは、クリック化学反応を介して、アジド、例えば、
【化１４】
2021523147.tif 000016
と反応して、クリック化学反応生成物、例えば、
【化１５】
2021523147.tif 000017
その位置異性体、又はその混合物を形成することができる。いくつかの実施態様において、反応基は、アルキン、例えば、
【化１６】
2021523147.tif 000018
(ここで、L及び/又はL2は、-OCH2C(O)-を包含する)であり、これは、クリック化学反応を介して、アジド、例えば、
【化１７】
2021523147.tif 000019
と反応して、クリック化学反応生成物、例えば、
【化１８】
2021523147.tif 000020
を形成することができる。いくつかの実施態様において、反応基は、アルキン、例えば、
【化１９】
2021523147.tif 000021
であり、これは、クリック化学反応を介して、アジド、例えば、
【化２０】
2021523147.tif 000022
と反応して、クリック化学反応生成物、例えば、
【化２１】
2021523147.tif 000023
その位置異性体、又はその混合物を形成することができる。いくつかの実施態様において、反応基は、官能基、例えば、
【化２２】
2021523147.tif 000024
であり、これは、抗体又はその抗原結合断片上のシステイン残基と反応して、それとの結合、例えば、
【化２３】
2021523147.tif 000025
(ここで、Abは、抗体又はその抗原結合断片を表し、Sは、それを介して該官能基が該Abに結合するシステイン残基上のS原子を表す)を形成する。いくつかの実施態様において、反応基は、官能基、例えば、
【化２４】
2021523147.tif 000026
であり、これは、抗体又はその抗原結合断片上のリジン残基と反応して、それとの結合、例えば、
【化２５】
2021523147.tif 000027
(ここで、Abは、抗体又はその抗原結合断片を表し、Nは、それを介して該官能基が該Abに結合するリジン又はアミノ末端残基上のN原子を表す)を形成する。いくつかの例において、反応基は、
【化２６】
2021523147.tif 000028
であり、これは、抗体又はその抗原結合断片の2つのチオール(例えば、2つの異なる鎖上のチオール)と反応して、それとの結合、例えば、
【化２７】
2021523147.tif 000029
を形成する。いくつかの例において、反応基は、
【化２８】
2021523147.tif 000030
であり、これは、抗体又はその抗原結合断片の2つのチオール(例えば、2つの異なる鎖上のチオール)と反応して、それとの結合、例えば、
【化２９】
2021523147.tif 000031
を形成する。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「反応基残基」という語句は、クリック化学の生成物を含む、リンカー部分中の官能基と結合剤(BA)の反応部分との反応の生成物を指す。反応基残基は、結合剤のアミノ酸上の反応基の反応によって形成され、結合剤(例えば、抗体)及びリンカーに付加される。いくつかの実施態様において、反応基残基は、1,2,3-テトラゾールを含む、すなわち、アルキンとアジドとの反応によって形成される基である。いくつかの実施態様において、反応基残基は、
【化３０】
2021523147.tif 000032
であり、ここで、Sは、それを介して(a)が該Abに結合するシステイン残基上のS原子を表し、かつ
【化３１】
2021523147.tif 000033
と抗体又はその抗原結合断片上のシステイン残基との反応によって形成される。いくつかの実施態様において、反応基残基は、
【化３２】
2021523147.tif 000034
であり、ここで、Nは、リジン残基上のN原子を表し、かつ官能基、例えば、
【化３３】
2021523147.tif 000035
と抗体又はその抗原結合断片上のリジン残基との反応によって形成される。当業者は、反応基残基の部分が、反応基、抗体、又はその両方に由来し得ることを認識しているであろう。いくつかの例において、反応基残基は、
【化３４】
2021523147.tif 000036
であり、ここで、Sは、システイン残基上のS原子を表し、かつ官能基
【化３５】
2021523147.tif 000037
と抗体又はその抗原結合断片上のシステイン残基との反応によって形成される。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「医薬として許容し得る塩」は、患者への投与に好適な任意の塩を指す。好適な塩としては、引用により本明細書中に組み込まれる、Bergeらの文献、「医薬塩(Pharmaceutical Salts)」、J. Pharm. Sci., 1977, 66:1に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。塩の例としては、酸により誘導された、塩基により誘導されたアミン、有機アミン、無機アミン、及び限定されないが、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸などを含む、アルカリ又はアルカリ土類金属塩が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例において、本明細書に記載されるペイロード(例えば、本明細書に記載されるリファマイシン類似体)は、三級アミンを含み、ここで、三級アミン中の窒素原子は、それを介して該ペイロードがリンカー又はリンカー-スペーサーに結合している原子である。そのような例において、三級アミンとペイロードとの結合は、リンカー-ペイロード分子中に四級アミンを生じさせる。四級アミン上の正電荷は、対イオン(例えば、クロロ、ブロモ、ヨード、又は他の好適に電荷を帯びた部分、例えば、上記のもの)によって相殺することができる。
【０１４８】
特定の基、部分、置換基、及び原子は、波線とともに示されている。波線は、結合(単数)もしくは結合(複数)を交差することができ、又は結合(単数)もしくは結合(複数)をキャッピングすることができる。波線は、それを介して、基、部分、置換基、又は原子が結合している原子を示す。例えば、以下に示されるプロピル基:
【化３６】
2021523147.tif 000038
で置換されているフェニル基は、以下の構造を有する:
【化３７】
2021523147.tif 000039
。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「アミド合成条件」は、例えば、カルボン酸、活性化カルボン酸、又はアシルハライドとアミンとの反応によって、アミドの形成を達成するために好適な反応条件を指す。いくつかの例において、「アミド合成条件」は、カルボン酸とアミンの間のアミド結合の形成を達成するために好適な反応条件を指す。これらの例のいくつかにおいて、カルボン酸は、まず、活性化カルボン酸に変換され、その後、該活性化カルボン酸がアミンと反応して、アミドを形成する。アミドの形成を達成するための好適な条件としては、限定されないが、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)、(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP)、(7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyAOP)、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBrOP)、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU)、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム 3-オキシドヘキサフルオロホスフェート(HATU)、N-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキノリン(EEDQ)、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)、2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート(CIP)、2-クロロ-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン(CDMT)、及びカルボニルジイミダゾール(CDI)を含む、カルボン酸とアミンの反応を達成するための試薬を利用するものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例において、カルボン酸を、まず、活性化カルボン酸エステルに変換し、その後、該活性化カルボン酸エステルをアミンで処理して、アミド結合を形成させる。ある実施態様において、カルボン酸を試薬で処理する。試薬は、カルボン酸を脱プロトン化し、その後、脱プロトン化されたカルボン酸によるプロトン化された試薬への求核攻撃の結果として、脱プロトン化されたカルボン酸との生成物複合体を形成させることにより、カルボン酸を活性化する。その後、特定のカルボン酸の活性化カルボン酸エステルは、カルボン酸が活性化される前よりも、アミンによる求核攻撃に対して感受性が高い。この結果として、アミド結合形成が生じる。したがって、カルボン酸は、活性化されたと記載されている。例示的な試薬としては、DCC及びDICが挙げられる。
【０１５０】
「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」は、いくつかの実施態様において、天然のアミノ酸を指す。他の実施態様において、アミノ酸又はアミノ酸残基は、天然アミノ酸及び/又は非天然アミノ酸(例えば、β-アミノ酸(β3及びβ2)、ホモ-アミノ酸、プロリン及びピルビン酸誘導体、3-置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換フェニルアラニン及びチロシン誘導体、線状コアアミノ酸、並びに/もしくはN-メチルアミノ酸、又は任意の他の市販の非天然アミノ酸(例えば、Sigma-Aldrichから入手可能な非天然アミノ酸))であってもよい。他の実施態様において、アミノ酸残基は、トランスグルタミナーゼによって媒介される反応、例えば、アミノ酸側鎖と一級アミンとのトランスグルタミナーゼ媒介反応に関与する側鎖を有する残基であってもよい。例えば、アスパラギン及び/又はグルタミン側鎖と一級アミンとの反応は、本明細書に記載される特定のADCの調製のために使用される。ある実施態様において、そのような官能化抗体は、少なくとも1つのグルタミン残基、例えば、重鎖Q295(EU付番)を含む抗体を式H2N-LL-N3による化合物(式中、LLは、二価ポリエチレングリコール基である)と酵素トランスグルタミナーゼの存在下で反応させることにより得られる。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、「タウリン」は、試薬
【化３８】
2021523147.tif 000040
又は基
【化３９】
2021523147.tif 000041
(ここで、
【化４０】
2021523147.tif 000042
は、それを介してタウリンが該式中の隣接する基に結合している原子を示す)を指す。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、「立体異性体形態」又は「立体異性体」は、化合物中の異なる基の相対的空間配向を指す。立体異性体形態には、エナンチオマー、ジアステレオマー、及び/又はその混合物が含まれる。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「位置異性体(単数)」、「位置異性体(複数)」、又は「位置異性体の混合物」は、好適なアルキンで処理された好適なアジド(例えば、-N3、又はPEG-N3誘導体化抗体)から誘導される1,3-付加環化又は歪み促進アルキン-アジド付加環化(SPAAC)−別名、クリック反応として知られる−の生成物を指す。ある実施態様において、例えば、位置異性体及び位置異性体の混合物は、下に示されるクリック反応生成物によって特徴付けられる:
【化４１】
2021523147.tif 000043
。
【０１５４】
ほんの一例として、化合物A1'の位置異性体、すなわち、化合物A2'、A3'、A4'が以下に示されており、ここで、各々の
【化４２】
2021523147.tif 000044
は、結合剤との結合であり;かつ各々の
【化４３】
2021523147.tif 000045
は、ペイロードとの結合である:
【化４４】
2021523147.tif 000046
。
【０１５５】
(Fc変異体を含む抗MSR1抗体)
ある実施態様によれば、例えば、中性pHと比較したとき、酸性pHでのFcRn受容体に対する抗体結合を増強又は低減させる1以上の突然変異を含むFcドメインを含む抗MSR1抗が提供される。例えば、本明細書に提供されるのは、FcドメインのCH2又はCH3領域中に突然変異を含む抗MSR1抗体であり、ここで、該突然変異は、酸性環境中で(例えば、pHの範囲が約5.5〜約6.0であるエンドソーム中で)、FcRnに対するFcドメインの親和性を増大させる。そのような突然変異は、動物に投与されたとき、抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。そのようなFc修飾の非限定的な例としては、例えば、位置250(例えば、EもしくはQ); 250及び428(例えば、LもしくはF); 252(例えば、L/Y/F/WもしくはT)、254(例えば、SもしくはT)、及び256(例えば、S/R/Q/E/DもしくはT)における修飾;又は位置428及び/もしくは433(例えば、H/L/R/S/P/QもしくはK)及び/もしくは434(例えば、H/FもしくはY)における修飾;又は位置250及び/もしくは428における修飾;又は位置307もしくは308(例えば、308F、V308F)及び434における修飾が挙げられる。一実施態様において、該修飾は、428L(例えば、M428L)及び434S(例えば、N434S)修飾; 428L、259I(例えば、V259I)、及び308F(例えば、V308F)修飾; 433K(例えば、H433K)及び434(例えば、434Y)修飾; 252、254、及び256(例えば、252Y、254T、及び256E)修飾; 250Q及び428L修飾(例えば、T250Q及びM428L);並びに307及び/又は308修飾(例えば、308Fもしくは308P)を含む。
【０１５６】
例えば、実施態様には、250Q及び248L(例えば、T250Q及びM248L); 252Y、254T、及び256E(例えば、M252Y、S254T、及びT256E); 428L及び434S(例えば、M428L及びN434S);並びに433K及び434F(例えば、H433K及びN434F):からなる群から選択される突然変異の1以上の対又は群を含むFcドメインを含む抗MSR1抗体が含まれる。前述のFcドメイン突然変異、及び本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の突然変異の全てのあり得る組合せが本発明の範囲内で企図される。
【０１５７】
(抗体の生物学的特徴)
実施態様には、高い親和性でヒトMSR1に結合する抗体及びその抗原結合断片が含まれる。例えば、本発明は、例えば、本明細書中の実施例3で定義されているアッセイ形式を用いる25℃もしくは37℃での表面プラズモン共鳴、又は実質的に同様のアッセイにより測定したとき、N-末端ノナヒスチジンタグ(例えば、His9-hMSR1)とともに発現されるヒトMSR1細胞外ドメインに約10nM未満のKDで結合する抗MSR1抗体を含む。ある実施態様によれば、例えば、本明細書中の実施例3で定義されているアッセイ形式を用いる表面プラズモン共鳴、又は実質的に同様のアッセイにより測定したとき、37℃で、約10nM未満、約9nM未満、約8nM未満、約7nM未満、約6nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、約1nM未満、約900pM未満、約800pM未満、約700pM未満、約600pM未満、約500pM未満、約400pM未満、約300pM未満、約200pM未満、約100pM未満、約90pM未満、約80pM未満、約70pM未満、約60pM未満、約50pM未満、約40pM未満、約30pM未満、約20pM未満、又は約10pMのKDでヒトMSR1に結合する抗MSR1抗体が提供される。いくつかの実施態様において、本明細書に開示される抗MSR1抗体は、本明細書中の実施例3で定義されているアッセイ形式を用いる表面プラズモン共鳴、又は実質的に同様のアッセイにより測定したとき、25℃で、約6nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、約1nM未満、約900pM未満、約800pM未満、約700pM未満、約600pM未満、約500pM未満、約400pM未満、約300pM未満、約200pM未満、約100pM未満、約90pM未満、約80pM未満、約70pM未満、約60pM未満、約50pM未満、約40pM未満、約30pM未満、又は約20pMのKDでヒトMSR1に結合する。
【０１５８】
実施態様には、サルMSR1に高い親和性で結合する抗体及びその抗原結合断片も含まれる。例えば、本明細書に開示されるのは、例えば、本明細書中の実施例3で定義されているアッセイ形式を用いる25℃もしくは37℃での表面プラズモン共鳴、又は実質的に同様のアッセイにより測定したとき、約20nM未満のKDで、N-末端myc-myc-ヘキサヒスチジンタグとともに発現されるサルMSR1細胞外ドメイン(例えば、HMM-mfMSR1)に結合する抗MSR1抗体である。ある実施態様によれば、本明細書中の実施例3で定義されているアッセイ形式を用いる表面プラズモン共鳴、又は実質的に同様のアッセイにより測定したとき、37℃で、約20nM未満、約18pM未満、約15nM未満、約12nM未満、約10nM未満、約9nM未満、約8nM未満、約7nM未満、約6nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、約1nM未満、約900pM未満、約800pM未満、約700pM未満、約600pM未満、約500pM未満、約400pM未満、約300pM未満、約200pM未満、約100pM未満、約90pM未満、約80pM未満、約70pM未満、約60pM未満、約50pM未満、約40pM未満、約30pM未満、約20pM未満、又は約10pMのKDでサルMSR1に結合する抗MSR1抗体が提供される。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗MSR1抗体は、本明細書中の実施例3で定義されているアッセイ形式を用いる表面プラズモン共鳴、又は実質的に同様のアッセイにより測定したとき、25℃で、約12nM未満、約10nM未満、約9nM未満、約8nM未満、約7nM未満、約6nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、約1nM未満、約900pM未満、約800pM未満、約700pM未満、約600pM未満、約500pM未満、約400pM未満、約300pM未満、約200pM未満、約100pM未満、約90pM未満、約80pM未満、約70pM未満、約60pM未満、約50pM未満、約40pM未満、約30pM未満、又は約20pMのKDでサルMSR1に結合する。
【０１５９】
本発明は、例えば、本明細書中の実施例3で定義されているアッセイ形式を用いる25℃もしくは37℃での表面プラズモン共鳴、又は実質的に同様のアッセイにより測定したとき、約5分超の解離半減期(t1/2)で、N-末端ノナヒスチジンタグとともに発現されるヒトMSR1細胞外ドメイン(例えば、His9-hMSR1)に結合する抗体及びその抗原結合断片も含む。ある実施態様によれば、本明細書中の実施例3で定義されているアッセイ形式を用いる表面プラズモン共鳴、又は実質的に同様のアッセイにより測定したとき、37℃で、約4分超、約5分超、約6分超、約8分超、約10分超、約12分超、約14分超、約16分超、約18分超、約20分超、約30分超、約40分超、約50分超、約60分超、約70分超、約80分超、約90分超、約120分超、約150分超、約180分超、約210分超、約240分超、又はそれより長いt1/2でヒトMSR1に結合する抗MSR1抗体が提供される。
【０１６０】
実施態様には、N-末端myc-myc-ヘキサヒスチジンタグとともに発現されるサルMSR1細胞外ドメイン(例えば、HMM-mfMSR1)に高い親和性で結合することができる抗体及びその抗原結合断片も含まれる。例えば、本発明は、例えば、本明細書中の実施例3で定義されているアッセイ形式を用いる25℃もしくは37℃での表面プラズモン共鳴、又は実質的に同様のアッセイにより測定したとき、約20nM未満のKDでHMM-mfMSR1に結合する抗MSR1抗体を含む。ある実施態様によれば、本明細書中の実施例3で定義されているアッセイ形式を用いる表面プラズモン共鳴、又は実質的に同様のアッセイにより測定したとき、37℃で、約20nM未満、約15nM未満、約10nM未満、約9nM未満、約8nM未満、約7nM未満、約6nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、約1nM未満、約900pM未満、約800pM未満、約800pM未満、約700pM未満、約600pM未満、約500pM未満、約400pM未満、約300pM未満、約200pM未満、約150pM未満、約100pM未満、約90pM未満、約80pM未満、約70pM未満、約60pM未満、又は約50pMのKDでHMM-mfMSR1に結合する抗MSR1抗体が提供される。いくつかの実施態様において、本明細書に開示される抗MSR1抗体は、本明細書中の実施例3で定義されているアッセイ形式を用いる表面プラズモン共鳴、又は実質的に同様のアッセイにより測定したとき、25℃で、約12nM未満、約10nM未満、約9nM未満、約8nM未満、約7nM未満、約6nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、約1nM未満、約900pM未満、約800pM未満、約800pM未満、約700pM未満、約600pM未満、約500pM未満、約400pM未満、約300pM未満、約200pM未満、約150pM未満、約100pM未満、約90pM未満、約80pM未満、約70pM未満、約60pM未満、又は約50pMのKDでHMM-mfMSR1に結合する。
【０１６１】
実施態様には、例えば、本明細書中の実施例3で定義されているアッセイ形式を用いる25℃もしくは37℃での表面プラズモン共鳴、又は実質的に同様のアッセイにより測定したとき、約55分超の解離半減期(t1/2)で、N-末端myc-myc-ヘキサヒスチジンタグとともに発現されるサルMSR1細胞外ドメイン(例えば、HMM-mfMSR1)に結合する抗体及びその抗原結合断片も含まれる。ある実施態様によれば、本明細書中の実施例3で定義されているアッセイ形式を用いる表面プラズモン共鳴、又は実質的に同様のアッセイにより測定したとき、37℃で、約1分超、約2分超、約3分超、約4分超、約5分超、約6分超、約8分超、約10分超、約12分超、約14分超、約16分超、約18分超、約20分超、約30分超、約40分超、約50分超、約60分超、約70分超、約80分超、約90分超、約120分超、約150分超、約180分超、約210分超、又はそれより長いt1/2で二量体ヒトMSR1に結合する抗MSR1抗体が提供される。
【０１６２】
実施態様には、例えば、本明細書中の実施例5で定義されているアッセイ形式を用いる抗体結合アッセイ、又は実質的に同様のアッセイにより測定したとき、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約12倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約30倍、少なくとも約35倍、少なくとも約40倍、少なくとも約45倍、少なくとも約50倍、又はそれより大きい改変hMSR1発現細胞対非発現細胞の結合比で、改変された細胞表面発現hMSR1に結合する抗体及びその抗原結合断片も含まれる。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、例えば、本明細書中の実施例5で定義されているアッセイ形式を用いる抗体結合アッセイ、又は実質的に同様のアッセイにより測定したとき、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、もしくは少なくとも約12倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約30倍、少なくとも約35倍、少なくとも約40倍、少なくとも約45倍、少なくとも約50倍、又はそれより大きい内在性hMSR1発現細胞対非発現細胞の結合比で、内在性発現hMSR1を有する細胞に結合する抗体である。いくつかの実施態様において、本明細書に開示されるMSR1抗体又は抗原結合断片は、例えば、本明細書中の実施例5で定義されているアッセイ形式を用いる抗体結合アッセイ、又は実質的に同様のアッセイにより測定したとき、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約12倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約30倍、少なくとも約35倍、少なくとも約40倍、少なくとも約45倍、少なくとも約50倍、又はそれより大きい改変マウスMSR1発現細胞対非発現細胞の結合比で、改変された細胞表面発現マウスMSR1に結合する。
【０１６３】
実施態様には、MSR1に結合し、かつヒトMSR1を発現する細胞における修飾低密度リポタンパク質(LDL)の取込みの約95％未満の最大阻害を示す抗体及びその抗原結合断片も含まれる。例えば、実施態様には、本明細書中の実施例8で定義されているアッセイ形式を用いるリガンド取込みアッセイ、又は実質的に同様のアッセイを用いて測定したとき、約6.1nM未満のIC50で、ヒトMSR1を発現する細胞における修飾LDL(例えば、酸化又はアセチル化されたもの)の取込みの約95％未満の最大阻害を示す抗MSR1抗体が含まれる。ある実施態様によれば、本明細書中の実施例8で定義されているアッセイ形式を用いるリガンド取込みアッセイ、又は実質的に同様のアッセイを用いて測定したとき、約6.1nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、約1.5nM未満、約1.4nM未満、約1.3nM未満、約1.2nM未満、約1.0nM未満、約900pM未満、約800pM未満、約600pM未満、約400pM未満、約200pM未満、約100pM未満、約80pM未満、約60pM未満、約40pM未満、約20pMのIC50で、ヒトMSR1を発現する細胞における修飾LDL取込みの約95％未満の最大阻害を示す抗MSR1抗体が提供される。
【０１６４】
いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体は、本明細書中の実施例8で定義されているアッセイ形式を用いるリガンド取込みアッセイ、又は実質的に同様のアッセイを用いて測定したとき、約6.1nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、約1.5nM未満、約1.4nM未満、約1.3nM未満、約1.2nM未満、約1.0nM未満、約900pM未満、約800pM未満、約600pM未満、約400pM未満、約200pM未満、約100pM未満、約80pM未満、約60pM未満、約40pM未満、約20pMのIC50で、ヒトMSR1を発現する細胞における修飾LDL取込みの約90％未満の最大阻害を示す。
【０１６５】
いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体は、本明細書中の実施例8で定義されているアッセイ形式を用いるリガンド取込みアッセイ、又は実質的に同様のアッセイを用いて測定したとき、約6.1nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、約1.5nM未満、約1.4nM未満、約1.3nM未満、約1.2nM未満、約1.0nM未満、約900pM未満、約800pM未満、約600pM未満、約400pM未満、約200pM未満、約100pM未満、約80pM未満、約60pM未満、約40pM未満、約20pMのIC50で、ヒトMSR1を発現する細胞における修飾LDL取込みの約75％未満の最大阻害を示す。
【０１６６】
いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体は、本明細書中の実施例8で定義されているアッセイ形式を用いるリガンド取込みアッセイ、又は実質的に同様のアッセイを用いて測定したとき、約6.1nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、約1.5nM未満、約1.4nM未満、約1.3nM未満、約1.2nM未満、約1.0nM未満、約900pM未満、約800pM未満、約600pM未満、約400pM未満、約200pM未満、約100pM未満、約80pM未満、約60pM未満、約40pM未満、約20pMのIC50で、ヒトMSR1を発現する細胞における修飾LDL取込みの約60％未満の最大阻害を示す。
【０１６７】
いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体は、本明細書中の実施例8で定義されているアッセイ形式を用いるリガンド取込みアッセイ、又は実質的に同様のアッセイを用いて測定したとき、約6.1nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、約1.5nM未満、約1.4nM未満、約1.3nM未満、約1.2nM未満、約1.0nM未満、約900pM未満、約800pM未満、約600pM未満、約400pM未満、約200pM未満、約100pM未満、約80pM未満、約60pM未満、約40pM未満、約20pMのIC50で、ヒトMSR1を発現する細胞における修飾LDL取込みの約50％未満の最大阻害を示す。
【０１６８】
実施態様には、細胞表面発現MSR1に結合し、かつ細胞によって内在化される抗体及びその抗原結合断片も含まれる。例えば、THP-1細胞上の細胞表面発現MSR1に結合し、かつ該細胞によって内在化されるようになる抗体が本明細書に提供される。例えば、本開示は、THP-1細胞上の細胞表面発現MSR1に結合し、かつ本明細書中の実施例9で定義されているアッセイ形式を用いる化学発光、又は実質的に同様のアッセイを用いて測定したとき、少なくとも約10％の相対的パーセンテージで、該細胞によって内在化されるようになる抗MSR1抗体を含む。ある実施態様において、THP-1細胞上の細胞表面発現MSR1に結合し、かつ本明細書中の実施例9で定義されているアッセイ形式を用いる化学発光、又は実質的に同様のアッセイを用いて測定したとき、少なくとも約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％の相対的パーセンテージで、該細胞によって内在化されるようになる抗MSR1抗体。
【０１６９】
本明細書に開示される抗体は、上述の生物学的特徴のうちの1つもしくは複数、又はその任意の組合せを保有することができる。本明細書に開示される抗体の生物学的特徴の前述のリストは、網羅的であるようには意図されていない。本明細書に開示される抗体の他の生物学的特徴は、本明細書中の作業実施例を含む本開示の概観により、当業者に明白であろう。
【０１７０】
(抗体-薬物コンジュゲート(ADC))
本明細書に提供されるのは、薬物又は治療剤にコンジュゲートされた抗MSR1抗体又はその抗原結合断片を含む抗体-薬物コンジュゲート(ADC)である。いくつかの実施態様において、該治療剤は、肝臓X受容体(LXR)アゴニスト又はステロイドである。また本明細書に提供されるのは、ADCを作製するのに有用な反応性リンカー-ペイロードである。さらに本明細書に提供されるのは、ADCを作製するのに有用な修飾された抗MSR1抗体及び修飾されたMSR1抗原結合断片である。
【０１７１】
ADCは、通常、式(I): BA-[(L)0-1-PA]nを有する。式中、BAは、結合剤、例えば、抗MSR1抗体、又はそのMSR1抗原結合断片である。Lは、以下で詳細に記載されるリンカーである。PAは、ペイロードである。好適なペイロードとしては、MSR1へのその送達によって治療的利益をもたらすことができる任意の小分子が挙げられる。ある実施態様において、ペイロードは、例えば、ステロイド、LXRモジュレーター、又はリファマイシン類似体であり得る。有用なペイロードは、以下で詳細に記載されている。式中、nは、1〜30の整数、例えば、1〜4、例えば、2又は4である。各々のL-PAは、PAの官能基に共有結合している。いくつかの特定の実施態様において、各々のL-PAは、BAのリジン側鎖、システイン側鎖、グルタミン側鎖、又はアミノ末端に共有結合している。
【０１７２】
抗体又は抗原結合断片の残基にコンジュゲートするための技法及びリンカーは、当技術分野で公知である。この態様との関連において使用することができる例示的なアミノ酸付加、例えば、リジン(例えば、US 5,208,020号; US 2010/0129314号; Hollanderらの文献、Bioconjugate Chem., 2008, 19:358-361; WO 2005/089808号; US 5,714,586号; US 2013/0101546号;及びUS 2012/0585592号を参照)、システイン(例えば、US 2007/0258987号; WO 2013/055993号; WO 2013/055990号; WO 2013/053873号; WO 2013/053872号; WO 2011/130598号; US 2013/0101546号;及びUS 7,750,116号を参照)、セレノシステイン(例えば、WO 2008/122039号;及びHoferらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2008, 105: 12451-12456を参照)、ホルミルグリシン(例えば、Carricoらの文献、Nat. Chem. Biol., 2007, 3:321-322; Agarwalらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2013, 110:46-51、及びRabukaらの文献、Nat. Protocols, 2012, 10:1052-1067を参照)、非天然アミノ酸(例えば、WO 2013/068874号及びWO 2012/166559号を参照)、並びに酸性アミノ酸(例えば、WO 2012/05982号を参照)。リンカーは、炭水化物(例えば、US 2008/0305497号、WO 2014/065661号、及びRyanらの文献、Food & Agriculture Immunol., 2001, 13: 127-130を参照)並びにジスルフィドリンカー(例えば、WO 2013/085925号、WO 2010/010324号、WO 2011/018611号、及びShaunakらの文献、Nat. Chem. Biol., 2006, 2:312-313を参照)への付加を介して抗原結合タンパク質にコンジュゲートすることもできる。部位特異的コンジュゲーション技法を利用して、抗体又は抗原結合タンパク質の特定の残基へのコンジュゲーションを導くこともできる(例えば、Schumacherらの文献、J Clin Immunol(2016) 36(Suppl 1): 100を参照)。部位特異的コンジュゲーション技法としては、トランスグルタミナーゼによるグルタミンコンジュゲーションが挙げられるが、これに限定されない(例えば、Schibliの文献、Angew Chemie Inter Ed. 2010, 49 ,9995を参照)。
【０１７３】
リンカーは、トランスグルタミナーゼに基づく化学的酵素的コンジュゲーションを介して1以上のグルタミン残基にコンジュゲートすることができる(例えば、Dennlerらの文献、Bioconjugate Chem. 2014, 25, 569-578及びWO 2017/147542号を参照)。例えば、トランスグルタミナーゼの存在下において、抗体の1以上のグルタミン残基を一級アミン化合物にカップリングさせることができる。簡潔に述べると、いくつかの実施態様において、グルタミン残基(例えば、Gln295残基)を有する抗体を、酵素トランスグルタミナーゼの存在下において、以下でより詳細に記載される一級アミン化合物で処理する。一級アミン化合物には、トランスグルタミナーゼ媒介カップリングを介して抗体薬物コンジュゲートを直接的に提供する、ペイロード又はリンカー-ペイロードが含まれる。一級アミン化合物には、抗体薬物コンジュゲートの合成に向けて後にさらなる化合物と反応することができる反応基で官能化されているリンカー及びスペーサーも含まれる。グルタミン残基を含む抗体は、天然源から単離するか又は1以上のグルタミン残基を含むように改変することができる。抗体ポリペプチド鎖中のグルタミン残基(グルタミニル修飾抗体又は抗原結合分子)を人為作製する技法は、当業者の能力の範囲内である。ある実施態様において、該抗体は、アグリコシル化される。
【０１７４】
ある実施態様において、該抗体又はグルタミニル修飾抗体もしくは抗原結合分子は、少なくとも1つのポリペプチド鎖配列中に、少なくとも1つのグルタミン残基を含む。ある実施態様において、該抗体又はグルタミニル修飾抗体もしくは抗原結合分子は、各々1つのGln295残基を有する2つの重鎖ポリペプチドを含む。さらなる実施態様において、該抗体又はグルタミニル修飾抗体もしくは抗原結合分子は、重鎖295以外の部位に1以上のグルタミン残基を含む。いくつかの実施態様において、抗体は、障害のある抗体機能又は結合をもたらすことなく、ある部位にグルタミン残基を挿入する部位特異的突然変異誘発により調製することができる。例えば、本明細書に含まれるのは、本明細書に記載されるAsn297Gln(N297Q)突然変異を担持する抗体である。いくつかの実施態様において、Gln295残基及び/又はN297Q突然変異を有する抗体は、トランスグルタミナーゼに接近することができ、それゆえ、リンカー又はリンカー-ペイロードにコンジュゲートすることができる1以上のさらなる天然グルタミン残基をその可変領域に含有する。例示的な天然グルタミン残基は、例えば、軽鎖のQ55に見出すことができる。そのような場合、トランスグルタミナーゼを介してコンジュゲートされる抗体は、予想よりも高いDAR値(例えば、4よりも高いDAR)を有することができる。任意のそのような抗体は、自然源又は人工源から単離することができる。
【０１７５】
グルタミンを含む抗体(又は抗原結合化合物)のトランスグルタミナーゼ媒介カップリングに有用な一級アミン化合物は、当業者によって有用であるとみなされる任意の一級アミン化合物であることができる。通常、一級アミン化合物は、式H2N-Rを有し、式中、Rは、抗体及び反応条件と適合する任意の基であることができる。ある実施態様において、Rは、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、又は置換ヘテロアルキルである。
【０１７６】
いくつかの実施態様において、該一級アミン化合物は、反応基又は保護された反応基を含む。有用な反応基としては、アジド、アルキン、シクロアルキン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、酸、エステル、ヒドロジド(hydrozide)、アナリン(analine)、及びアミンが挙げられる。ある実施態様において、該反応基は、アジド、アルキン、スルフヒドリル、シクロアルキン、アルデヒド、及びカルボキシルからなる群から選択される。
【０１７７】
ある実施態様において、該一級アミン化合物は、式H2N-LL-Xによるものであり、式中、LLは、二価スペーサーであり、かつXは、反応基又は保護された反応基である。特定の実施態様において、LLは、二価ポリエチレングリコール(PEG)基である。ある実施態様において、Xは、-SH、-N3、アルキン、アルデヒド、及びテトラゾールからなる群から選択される。特定の実施態様において、Xは、-N3である。
【０１７８】
ある実施態様において、該一級アミン化合物は、以下の式のうちの1つによるものである:
H2N-(CH2)n-X;
H2N-(CH2CH2O)n-(CH2)p-X;
H2N-(CH2)n-N(H)C(O)-(CH2)m-X;
H2N-(CH2CH2O)n-N(H)C(O)-(CH2CH2O)m-(CH2)p-X;
H2N-(CH2)n-C(O)N(H)-(CH2)m-X;
H2N-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2CH2O)m-(CH2)p-X;
H2N-(CH2)n-N(H)C(O)-(CH2CH2O)m-(CH2)p-X;
H2N-(CH2CH2O)n-N(H)C(O)-(CH2)m-X;
H2N-(CH2)n-C(O)N(H)-(CH2CH2O)m-(CH2)p-X;及び
H2N-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)m-X;
(式中、nは、1〜12から選択される整数であり;
mは、0〜12から選択される整数であり;
pは、0〜2から選択される整数であり;
かつXは、-SH、-N3、-C≡CH、-C(O)H、テトラゾール、及び
【化４５】
2021523147.tif 000047
のいずれかからなる群から選択される)。
【０１７９】
上記において、該アルキル又はアルキレン(すなわち、-CH2-)基のいずれかは、例えば、C1-8アルキル、メチルホルミル、又は-SO3Hで任意に置換されていてもよい。ある実施態様において、アルキル基は、置換されていない。
【０１８０】
ある実施態様において、該一級アミン化合物は:
【化４６】
2021523147.tif 000048
からなる群から選択される。
【０１８１】
特定の実施態様において、該一級アミン化合物は、
【化４７】
2021523147.tif 000049
である。
【０１８２】
上記の反応のための例示的な条件は、下記の実施例に提供されている。
【０１８３】
したがって、本明細書に提供されるのは、1以上の一級アミン化合物に連結された、修飾された抗MSR1抗体及びその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、次式による、修飾された抗MSR1抗体及びその抗原結合断片である:
【化４８】
2021523147.tif 000050
。
【０１８４】
該式において、BAは、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。変数nは、1〜30の整数である。ある実施態様において、nは、1からBA中のグルタミン残基の数である。ある実施態様において、nは、1〜4である。ある実施態様において、nは、1、2、3、又は4である。いくつかの実施態様において、nは2である。いくつかの実施態様において、nは4である。修飾された抗MSR1抗体及びその抗原結合断片は、例えば、1以上のL-PA分子を連結して、ADCを形成させるのに有用である。
【０１８５】
ある実施態様において、BAは、2つ又は4つのグルタミン残基を含む。ある実施態様において、BAは、Q295残基を含む。ある実施態様において、BAは、N297Q突然変異を含む。ある実施態様において、BAは、Q295及びN297Qを含む。そのような実施態様において、BAが二量体であり得るので、BAは、L-PA部分へのコンジュゲーションための4つのグルタミン残基を有する。
【０１８６】
(化合物)
一態様において、本明細書に提供されるのは、化合物及び/又は任意にリンカーを介してもしくはリンカー-スペーサーを介してペイロード残基にコンジュゲートされた、本明細書に記載される任意の抗体もしくはその抗原結合断片を含む抗体-薬物コンジュゲートである。
【０１８７】
実施態様の群において、該化合物及び/又は該抗体-薬物コンジュゲートは、式(I)の構造を有する:
【化４９】
2021523147.tif 000051
(式中:
BAは、結合剤であり;
Lは、リンカーであり;
PAは、ステロイド残基、LXRモジュレーター残基、又はリファマイシン類似体残基からなる群から選択されるペイロード部分であり;かつ
下付文字nは、1〜30の整数である)。
【０１８８】
実施態様の群において、上記の及び本明細書中の化合物及び/又は抗体-薬物コンジュゲートは、式(IA)の構造を有する:
【化５０】
2021523147.tif 000052
(式中、
SP1は、非存在、又はスペーサーであり;
RG1は、反応基残基であり;
AA1は、非存在、又は任意に基HGと直接的にもしくは間接的に結合しているアミノ酸残基を含む二価もしくは三価リンカーであり;
AA2は、非存在、又はジペプチド、トリペプチド、もしくはテトラペプチド残基であり;
Qは、存在する場合、コネクター基残基であり;
SPは、非存在、又はスペーサーであり;かつ
HGは、存在する場合、親水基である)。
【０１８９】
実施態様の群において、上記の及び本明細書中の化合物及び/又は抗体-薬物コンジュゲートは、式(IB-1)の構造を有する:
【化５１】
2021523147.tif 000053
(式中、
SP1は、非存在、又はスペーサーであり;
RG1は、反応基残基であり;
Qは、存在する場合、
【化５２】
2021523147.tif 000054
であり;かつ
SPは、非存在、又はスペーサーであり;
ここで、
【化５３】
2021523147.tif 000055
は、それを介して言及された基が該式中の隣接する基に結合している原子を示す)。
【０１９０】
実施態様の群において、上記の及び本明細書中の化合物及び/又は抗体-薬物コンジュゲートは、式(IB-2)の構造を有する:
【化５４】
2021523147.tif 000056
(式中、
SP1は、非存在、又はスペーサーであり;
RG1は、反応基残基であり;
AA1は、非存在、又は任意に基HGと直接的にもしくは間接的に結合しているアミノ酸残基を含む二価もしくは三価リンカーであり;
AA2は、非存在、又はジペプチド、トリペプチド、もしくはテトラペプチド残基であり;
Qは、存在する場合、
【化５５】
2021523147.tif 000057
であり;
SPは、非存在、又はスペーサーであり;かつ
HGは、存在する場合、
【化５６】
2021523147.tif 000058
であり、ここで、
【化５７】
2021523147.tif 000059
は、それを介して言及された基が該式中の隣接する基に結合している原子を示す)。
【０１９１】
実施態様の群において、上記の及び本明細書中の化合物及び/又は抗体-薬物コンジュゲートは、式(IC)、式(ID)、又は式(IE)の構造を有する:
【化５８】
2021523147.tif 000060
(式中、
SP1は、非存在、又はスペーサーであり;
RG1は、反応基残基であり;
SP2は、非存在、又はスペーサーであり;
RG2は、反応基残基であり;
AA1は、アミノ酸残基を含む二価又は三価リンカーであり;
AA2は、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチド残基であり;
Qは、存在する場合、
【化５９】
2021523147.tif 000061
であり;
SPは、非存在、又はスペーサーであり;かつ
HGは、
【化６０】
2021523147.tif 000062
である)。
【０１９２】
ここで、
【化６１】
2021523147.tif 000063
は、それを介して言及された基が該式中の隣接する基に結合している原子を示す。上記の及び本明細書中の任意の化合物及び/又は抗体-薬物コンジュゲートについてのいくつかの又は任意の例において、AA1-AA2は、式(LL1)によるものである:
【化６２】
2021523147.tif 000064
(式中、RAA1、RAA2、及びRAA3は、各々独立に、その少なくとも1つが、-(RG2)-SP2-HG、-(RG2)-HG、又はHGに結合しているアミノ酸側鎖であり;ここで、
【化６３】
2021523147.tif 000065
は、それを介してAA1-AA2が該式中の隣接する基に結合している原子を示す)。そのような実施態様のいくつかにおいて、RAA1は、HGに直接的に又は間接的に結合しているリジン、グルタミン、グルタミン酸、又はアスパラギン酸側鎖であり、かつRAA2及びRAA3は、それぞれ、バリン及びアラニン又はバリン及びシトルリン側鎖のいずれかである。
【０１９３】
上記の及び本明細書中の任意の化合物及び/又は抗体-薬物コンジュゲートについてのいくつかの又は任意の例において、AA1-AA2は、
【化６４】
2021523147.tif 000066
であり、ここで、
【化６５】
2021523147.tif 000067
は、それを介してAA1-AA2が該式中の隣接する基に結合している原子を示す。
【０１９４】
上記の及び本明細書中の任意の化合物及び/又は抗体-薬物コンジュゲートについてのいくつかの又は任意の例において、RG1及びRG2残基は、各々の場合に独立に:
【化６６】
2021523147.tif 000068
からなる群から選択され;
ここで、
【化６７】
2021523147.tif 000069
は、それを介して該RG1又はRG2残基が該式中の隣接する基に結合している原子を示す。
【０１９５】
上記の及び本明細書中の任意の化合物及び/又は抗体-薬物コンジュゲートについてのいくつかの又は任意の例において、SP、SP1、及びSP2は、各々の場合に独立に、非存在であるか、又はC1-6アルキレン、-NH-、-S-、-O-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、(グリシン)4-セリン、及びその組合せからなる群から選択され、ここで、下付文字eは0〜4の整数であり、下付文字uは1〜8の整数であり、かつ下付文字vは1〜8の整数である。
【０１９６】
上記の及び本明細書中の任意の化合物及び/又は抗体-薬物コンジュゲートについてのいくつかの又は任意の例において、nは、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4の整数であるか、又はnは、1、2、3、もしくは4である。
【０１９７】
上記の及び本明細書中の任意の化合物、リンカー-ペイロード、及び/又は抗体-薬物コンジュゲートについてのいくつかの又は任意の例において、
【化６８】
2021523147.tif 000070
は、
【化６９】
2021523147.tif 000071
2021523147.tif 000072
2021523147.tif 000073
2021523147.tif 000074
2021523147.tif 000075
である。
【０１９８】
上記の及び本明細書中の任意の化合物及び/又は抗体-薬物コンジュゲートについてのいくつかの又は任意の実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、リンカー又はリンカー-スペーサーを介して、ステロイドペイロードにコンジュゲートされている。
【０１９９】
上記の及び本明細書中の任意の化合物及び/又は抗体-薬物コンジュゲートについてのいくつかの又は任意の実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、リンカーを介して、LXRモジュレーターペイロードにコンジュゲートされている。
【０２００】
上記の及び本明細書中の任意の化合物及び/又は抗体-薬物コンジュゲートについてのいくつかの又は任意の実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、リンカーを介して、リファマイシン類似体ペイロードにコンジュゲートされている。
【０２０１】
(ペイロード)
式(I) BA-[L-PA]nにおいて、PAは、有用と思われる任意のペイロードであることができる。そのようなペイロードには、MSR1を介するその送達によって治療的利益を提供する小分子が含まれる。ある実施態様において、PAは、ステロイド、LXRモジュレーター、又はリファマイシン類似体からなる群から選択される分子の残基である。いくつかの場合において、PAは、ステロイドである。いくつかの場合において、PAは、LXRモジュレーターである。いくつかの場合において、PAは、LXRアゴニストである。いくつかの実施態様において、PAは、LXRアンタゴニストである。例示的なLXRモジュレーターペイロードは、例えば、引用より本明細書中に完全に組み込まれる、US 2018/0334426号として公開された「ビス-オクタヒドロフェナントレンカルボキサミド及びそのタンパク質コンジュゲート(BIS-OCTAHYDROPHENANTHRENE CARBOXAMIDES AND PROTEIN CONJUGATES THEREOF)」という表題の2017年5月18日に出願された米国出願第62/508,327号に記載されている。いくつかの例において、PAは、本明細書に記載される任意のリファマイシン類似体を含む、リファマイシン類似体である。いくつかの例において、PAは、以下の構造を有するリファログである:
【化７０】
2021523147.tif 000076
。
【０２０２】
ある実施態様において、式(I)の化合物中のペイロードは、式(A)によるグルココルチコイド:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である;
【化７１】
2021523147.tif 000077
(式中、
R1及びR2は、独立に、-H、アルキル、アルキル-C(O)-O-、-OH、もしくはハロであるか;又はR1及びR2は、一緒に、
【化７２】
2021523147.tif 000078
を形成し、
ここで、R4は、アルキル、アリール、アリールアルキル、又はN-含有ヘテロシクロアルキルであり、
ここで、該アルキル、アリール、アリールアルキル、及びN-含有ヘテロシクロアルキルは、各々の場合に独立に、-NRAaRAbで任意に置換されており;
R3は、-OH、RZ-C(O)-X-、ヘテロアルキル、ピペリジニル、-NRAaRAb、-オキシアリール-NRAaRAb、又は-Z-A'(RP)tであり;
RZは、アルキルであり;
Xは、O又はNRAaであり;
Zは、S、S(O)、S(O)2、SO2NRAa、O、C(O)NRAa、C(O)、又はNRAaであり;
A'は、アリール、アリールアルキル、又はヘテロアリールであり;
RPは、各々の場合に独立に、ハロ、任意に置換されたアルキル、-OH、又は-NRAaRAbであり;
RAa及びRAbは、各々の場合に独立に、-H、任意に置換されたアルキル、又は任意に置換されたアリールであり;
下付文字aは、0〜19の整数であり;かつ
tは、1〜3の整数であり;
ただし:
(1)R1が-OHである場合、又は(b)R1及びR2が一緒に、
【化７３】
2021523147.tif 000079
(ここで、R4は、C1-9アルキル又は
【化７４】
2021523147.tif 000080
である)を形成する場合、R3は-OH(a)ではなく、かつ
(2)R3は、
【化７５】
2021523147.tif 000081
ではなく、かつ
R5A及びR5Bは、各々独立に、ハロ又は水素原子であり;
ここで、基R3又はR4は、リンカーに結合している)。
【０２０３】
そのような実施態様のいくつかにおいて、R3はNH2である。そのような実施態様のいくつかの他のものにおいて、R3は、
【化７６】
2021523147.tif 000082
であり、ここで、
【化７７】
2021523147.tif 000083
は、R3が式(I)中の隣接する基に結合している原子を示す。
【０２０４】
ある実施態様において、PAは、ステロイドである。例示的なステロイドペイロードは、例えば、その各々が引用により本明細書中に完全に組み込まれる、2018年1月8日に出願された「ステロイド及びその抗体コンジュゲート(STEROIDS AND ANTIBODY CONJUGATES THEREOF)」という表題の米国出願第62/614,905号、及びUS 2018/0155389号として公開された「ステロイド及びそのタンパク質-コンジュゲート(STEROIDS AND PROTEIN-CONJUGATES THEREOF」」という表題の2017年11月7日に出願された米国出願第15/806,197号に記載されている。ある実施態様において、PAは、
【化７８】
2021523147.tif 000084
又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体から選択される。式1110〜1140のいずれかによるある実施態様において、R3は、-O-アリール、-NRAaRAb、-アルキレン-NRAaRAb、-X-アリーレン-Y-NRAaRAb、-X-ヘテロアリーレン-Y-NRAaRAb、又はN-含有ヘテロシクロアルキルであり;ここで、Xは、非存在、-N-、-CH2-、又は-O-であり;ここで、Yは、非存在又は-CH2-であり;かつR4は、アルキル、アリール、アルキルアリール、又はアリールアルキルである。ある実施態様において、R3は、-O-アリーレン-NRAaRAb、-O-ヘテロアリーレン-NRAaRAbであり;ここで、アリール又はヘテロアリールは、ハロゲン、重水素、ヒドロキシル、又はメトキシルで任意に置換されている。ある実施態様において、R3は、-O-フェニル-NRAaRAb、-O-ヘテロアリーレン-NRAaRAbであり;ここで、フェニル又はヘテロアリールは、ハロゲン又は重水素で任意に置換されている。ある実施態様において、R4は、n-プロピルである。ある実施態様において、RAa及びRAbは、各々独立に、水素又はアルキルである。特定の実施態様において、RAa及びRAbのうちの一方は、リンカー(例えば、L又はLL)との結合で置換されている。ある実施態様において、PAは、
【化７９】
2021523147.tif 000085
又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは、
【化８０】
2021523147.tif 000086
又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは、
【化８１】
2021523147.tif 000087
又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは、
【化８２】
2021523147.tif 000088
又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは、
【化８３】
2021523147.tif 000089
又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは、
【化８４】
2021523147.tif 000090
又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である。そのような実施態様において、波線は、リンカー(例えば、L又はLL)との結合を示す。
【０２０５】
ある実施態様において、PAは、以下の残基:
【化８５】
2021523147.tif 000091
2021523147.tif 000092
2021523147.tif 000093
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体から選択される。特定の実施態様において、一級又は二級アミンをリンカーLに連結させて、リンカーペイロードを形成させ、これをBAに連結させて、コンジュゲートを形成させる。当業者は、上記の化合物を、Hの代わりになる、一級又は二級アミン基との結合を有するLに連結させることができることを認識しているであろう。
【０２０６】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗MSR1抗体は:
【化８６】
2021523147.tif 000094
にコンジュゲートされる。
【０２０７】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗体-薬物コンジュゲートは、ステロイドペイロードを含み、ここで、該ステロイドペイロードは:
【化８７】
2021523147.tif 000095
又はその混合物からなる群から選択される。
【０２０８】
ある実施態様において、PAは:
【化８８】
2021523147.tif 000096
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは:
【化８９】
2021523147.tif 000097
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは:
【化９０】
2021523147.tif 000098
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。
【０２０９】
ある実施態様において、PAは:
【化９１】
2021523147.tif 000099
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは:
【化９２】
2021523147.tif 000100
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは:
【化９３】
2021523147.tif 000101
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。
【０２１０】
ある実施態様において、PAは、肝臓X受容体(LXR)モジュレーターである。ある実施態様において、PAは、式(B)によるもの又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である:
【化９４】
2021523147.tif 000102
(式中、
Wは、-CH2-、-N(H)-、又は-O-であり;
RB1は、-H、-OH、-NH2、アルキル、又は-OP(O)(OR6)2であり;
RB2は、-H、-OH、-CH2NH2、RB3、RB4、RB5、又は-O-RB5であり、ここで、RB1及びRB2は、同時に-Hであることはなく;
RB3は、-N(R6)2であり;
RB4は、-X-Y-Zであり;
Xは、-O-及び-N(H)-からなる群から選択され;
Yは、アルキレン、置換アルキレン(限定されないが、オキソ置換、すなわち、=O)を含む)、ヘテロアルキレン、及び置換ヘテロアルキレン(限定されないが、オキソ置換(すなわち、=O)を含む)からなる群から選択され;
Zは、-OH及び-NH2からなる群から選択され;
RB5は、アルキル、ヘテロシクロアルキル、又は置換ヘテロシクロアルキルであり、ここで、各々のヘテロシクロアルキル又は置換ヘテロシクロアルキルは、窒素及び酸素から選択される1、2、又は3個のヘテロ原子を含み、かつ少なくとも1つの-OH及び-CH2OH置換基又は少なくとも1つの一級もしくは二級窒素、例えば、O-グルコースを含み;
各々のR6は、各々の場合に、-H、アミノ酸残基、N-アルキルアミノ酸残基、ペプチド、又はアルキルであり;かつ
各々のR7は、独立に、ハロ、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、-CN、O-グルコース、O-アミノ酸残基、及びO-PEGbであり、ここで、各々の下付文字bは、0〜3の整数であり;
ここで、基RB1、RB2、又はR7は、リンカーに結合している)。
【０２１１】
特定の実施態様において、RB1又はRB2は、リンカー(例えば、L又はLL)との結合で置換されている。
【０２１２】
ある実施態様において、PAは:
【化９５】
2021523147.tif 000103
から選択される。
【０２１３】
特定の実施態様において、
【化９６】
2021523147.tif 000104
中の波線は、リンカー(例えば、L又はLL)との結合を示している。
【０２１４】
ある実施態様において、式(B)のペイロードは:
【化９７】
2021523147.tif 000105
2021523147.tif 000106
又はその医薬として許容し得る立体異性体形態からなる群から選択される。
【０２１５】
ある実施態様において、PAは:
【化９８】
2021523147.tif 000107
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。
【０２１６】
ある実施態様において、PAは:
【化９９】
2021523147.tif 000108
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。
【０２１７】
ある実施態様において、PAは:
【化１００】
2021523147.tif 000109
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。
【０２１８】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗MSR1抗体は:
【化１０１】
2021523147.tif 000110
にコンジュゲートされている。
【０２１９】
いくつかの実施態様において、PAは、式(B-1)による肝臓X受容体(LXR)モジュレーター又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である:
【化１０２】
2021523147.tif 000111
(式中、
RB1は、-N(H)R8又は-N(R9)2であり;
RB2は、-N(H)R8であり;
各々のR8は、各々の場合に独立に、水素、アミノ酸残基、N-アルキルアミノ酸残基、ペプチド残基、生体分解性部分、又はアルキルであり;
R9は、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、又は置換ヘテロシクロアルキルであり、ここで、各々のヘテロシクロアルキル又は置換ヘテロシクロアルキルは、窒素及び酸素から選択される1、2、又は3個のヘテロ原子を含み、かつ置換されているとき、少なくとも1つの-OH及び-CH2OHを含むか、又は少なくとも1つの一級もしくは二級窒素を含み;
各々のR7は、独立に、ハロ、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、-CN、O-グルコース、O-アミノ酸残基、又はO-PEGb(ここで、各々の下付文字bは、0〜3の整数である)であり、;
ここで、基RB1、RB2、又はR7は、リンカーに結合している)。
【０２２０】
いくつかの例において、式(B-1)の化合物は:
【化１０３】
2021523147.tif 000112
2021523147.tif 000113
2021523147.tif 000114
2021523147.tif 000115
又はその医薬として許容し得る塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される。
【０２２１】
特定の実施態様において、RB1又はRB2は、リンカー(例えば、L又はLL)との結合で置換されている。
【０２２２】
ある実施態様において、PAは、
【化１０４】
2021523147.tif 000116
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは:
【化１０５】
2021523147.tif 000117
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは:
【化１０６】
2021523147.tif 000118
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは:
【化１０７】
2021523147.tif 000119
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは、
【化１０８】
2021523147.tif 000120
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは、
【化１０９】
2021523147.tif 000121
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは、
【化１１０】
2021523147.tif 000122
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは、
【化１１１】
2021523147.tif 000123
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。ある実施態様において、PAは、
【化１１２】
2021523147.tif 000124
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。そのような実施態様のいくつかにおいて、P10Bのカルボン酸基は、上に示されているようなアミド結合を介して、リンカーに結合している。ある実施態様において、PAは、
【化１１３】
2021523147.tif 000125
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。そのような実施態様のいくつかにおいて、P11Bのカルボン酸基は、上に示されているようなアミド結合を介して、リンカーに結合している。ある実施態様において、PAは、
【化１１４】
2021523147.tif 000126
又はその医薬として許容し得る塩もしくは立体異性体である。この段落に記載されている任意の実施態様について、
【化１１５】
2021523147.tif 000127
中の波線は、上記のようなリンカー(例えば、L又はLL)との結合を示している。
【０２２３】
実施態様の群において、本明細書に提供されるのは、式(III)の化合物又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である:
【化１１６】
2021523147.tif 000128
(式中:
R34は、アルキル、アリール、アリールアルキル、又はN-含有ヘテロシクロアルキルであり;
両方のRxは水素であり;かつSPは、-C(O)-C1-C10-アルキレン-C(O)-、-C(O)-N(C1-6アルキル)-C1-C10-アルキレン-X1-(ここで、X1は、式(III)中のL'に付加されている)、-C(O)-N(H)-(C1-C10-アルキレン)-S-(ここで、Sは、式(III)中のL'に付加されている)、-C(O)-N(C1-6アルキル)-(C1-C10-アルキレン)-S-(ここで、Sは、式(III)中のL'に付加されている)、
【化１１７】
2021523147.tif 000129
(ここで、右側にある(すなわち、Nにおける)結合点は、式(III)中のL'に対するものである)、-CH2-NH-(ここで、Nは、式(III)中のL'に付加されている)、
【化１１８】
2021523147.tif 000130
(ここで、Nは、式(III)中のL'に付加されており、かつArは、任意に置換されたアリーレン又は任意に置換されたヘテロアリーレンである)、-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(III)中のL'に付加されている)、-C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(III)中のL'に付加されており、かつ各々のC1-C10-アルキレンは、1以上のヒドロキシで独立に任意に置換されている)、-C(O)-N(R35)-C1-C10-アルキレン-C(O)NH-X2-(ここで、X2は、式(III)中のL'に付加されている)、もしくは
【化１１９】
2021523147.tif 000131
(ここで、X4は、式(III)中のL'に付加されている)であるか;又は
両方のRxはフルオロであり;かつSPは、-C(O)-C1-C10-アルキレン-C(O)-、-C(O)-N(C1-6アルキル)-C1-C10-アルキレン-X1b-(ここで、X1bは、式(III)中のLに付加されている)、-C(O)-N(H)-(C1-C10-アルキレン)-X1b-(ここで、X1bは、式(III)中のL'に付加されている)、
【化１２０】
2021523147.tif 000132
(ここで、右側にある(すなわち、Nにおける)結合点は、式(III)中のL'に対するものである)、-CH2-NH-(ここで、Nは、式(III)中のL'に付加されている),
【化１２１】
2021523147.tif 000133
(ここで、Nは、式(III)中のL'に付加されており、かつArは、任意に置換されたアリーレン又は任意に置換されたヘテロアリーレンである)、-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(III)中のL'に付加されている)、-C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(III)中のL'に付加されており、かつ各々のC1-C10-アルキレンは、1以上のヒドロキシで独立に任意に置換されている)、-C(O)-N(R35)-(C1-C10-アルキレン)-C(O)NH-X2-(ここで、X2は、式(III)中のL'に付加されている)、もしくは
【化１２２】
2021523147.tif 000134
(ここで、X4は、式(III)中のL'に付加されている)であり;かつ
X1は、-N(C1-6アルキル)-であり;
X1bは、-S-、-NH-、又は-N(C1-6アルキル)-であり;
X2は、-NH-であり;
X3は、-CH2-であるか、X3は、-CH2-O-(C1-C10-アルキレン)-C(O)-(ここで、C(O)は、X4に付加されている)であるか、又はX3は、-C(O)-であり;
X4は、-O-であり;
R35は、H、-OH、-OCH3、又はC1-6アルキルであり;
R50及びR50aは、独立に、水素又はC1-C6-アルキルであり;Rd、Re、及びRfは、独立に、-H、-OH、ヒドロキシアルキル、アルコキシカルボニル、-C(O)OH、又は-CH2ORgであり、ここで、各々のRgは、独立に、-CH2C(O)OH又は-CH2C(O)O(アルキル)であり;かつ
mmは、0又は1であり;
nは、1〜30までから選択される整数であり;
L'は、リンカーであり;かつ
BAは、結合剤である)。
【０２２４】
いくつかの実施態様において、式(III)の化合物中、両方のRxは水素であり、かつSP、BA、L'、R34、及びnは、いくつかの又は任意に実施態様において、本明細書に記載されている通りである。いくつかの実施態様において、式(III)の化合物中、両方のRxは、フルオロであり、かつSP、BA、L'、R34、及びnは、いくつかの又は任意の実施態様において、本明細書に記載されている通りである。いくつかの実施態様において、R34は、R-配置のものである。いくつかの実施態様において、R34は、S-配置のものである。いくつかの実施態様において、R34は、R-配置とS-配置の混合物である。いくつかの実施態様において、R34は、R-配置とS-配置の混合物であり、ここで、R:S混合物は、約1:1、約2:1、約3;1、約4:1、約5:1、約6;1、約7:1、約8:1、約9:1又は約10:1である。
【０２２５】
いくつかの実施態様において、式(III)の化合物であり、式中、
両方のRxは、水素であり;かつSPは、-C(O)-C1-C10-アルキレン-C(O)-、-C(O)-N(C1-6アルキル)-C1-C10-アルキレン-X1-(ここで、X1は、式(III)中のL'に付加されている)、-C(O)-N(H)-(C1-C10-アルキレン)-S-(ここで、Sは、式(III)中のL'に付加されている)、-C(O)-N(C1-6アルキル)-(C1-C10-アルキレン)-S-(ここで、Sは、式(III)中のL'に付加されている)、-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(III)中のL'に付加されている)、-C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(III)中のL'に付加されており、かつ各々のC1-C10-アルキレンは、1以上のヒドロキシで独立に任意に置換されている)、-C(O)-N(R5)-C1-C10-アルキレン-C(O)NH-X2-(ここで、X2は、式(III)中のL'に付加されている)、もしくは
【化１２３】
2021523147.tif 000135
(ここで、X4は、式(III)中のL'に付加されている)であるか;又は
両方のRxは、フルオロであり;かつSPは、-C(O)-N(C1-6アルキル)-C1-C10-アルキレン-X1b-(ここで、X1bは、式(III)中のL'に付加されている)、-C(O)-N(H)-(C1-C10-アルキレン)-X1b-(ここで、X1bは、式(III)中のL'に付加されている)、
【化１２４】
2021523147.tif 000136
(ここで、右側にある(すなわち、Nにおける)結合点は、式(III)中のL'に対するものである)、-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(III)中のL'に付加されている)、-C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(III)中のL'に付加されており、かつ各々のC1-C10-アルキレンは、1以上のヒドロキシで独立に任意に置換されている)、もしくは-C(O)-N(R5)-(C1-C10-アルキレン)-C(O)NH-X2-(ここで、X2は、式(III)中のL'に付加されている)である。
【０２２６】
いくつかの実施態様において、式(I)の化合物は、式(3000)の化合物又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である:
BA-(L′-SP-D)n  式(3000)
(式中、
Dは、
a)
【化１２５】
2021523147.tif 000137
(ここで、式(a)中の両方のRxは、水素であり; R34は、アルキル、アリール、アリールアルキル、又はN-含有ヘテロシクロアルキルであり;かつSPは、-C(O)-C1-C10-アルキレン-C(O)-、-C(O)-N(C1-6アルキル)-C1-C10-アルキレン-X1-(ここで、X1は、式(3000)中のL'に付加されている)、-C(O)-N(H)-(C1-C10-アルキレン)-S-(ここで、Sは、式(3000)中のL'に付加されている)、-C(O)-N(C1-6アルキル)-(C1-C10-アルキレン)-S-(ここで、Sは、式(3000)中のL'に付加されている)、
【化１２６】
2021523147.tif 000138
(ここで、右側にある(すなわち、Nにおける)結合点は、式(3000)中のL'に対するものである)、-CH2-NH-(ここで、Nは、式(3000)中のL'に付加されている)、
【化１２７】
2021523147.tif 000139
(ここで、Nは、式(3000)中のL'に付加されており、かつArは、任意に置換されたアリーレン(いくつかの実施態様において、
【化１２８】
2021523147.tif 000140
)もしくは任意に置換されたヘテロアリーレンである)、-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(3000)中のL'に付加されている)、-C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(3000)中のL'に付加されており、かつ各々のC1-C10-アルキレンは、独立に、1以上のヒドロキシで任意に置換されている)、-C(O)-N(R35)-C1-C10-アルキレン-C(O)NH-X2-(ここで、X2は、式(3000)中のL'に付加されている)、又は
【化１２９】
2021523147.tif 000141
(ここで、X4は、式(3000)中のL'に付加されている)であるか;或いは
ここで、式(a)中の両方のRxは、フルオロであり; R34は、アルキル、アリール、アリールアルキル、又はN-含有ヘテロシクロアルキルであり;かつSPは、-C(O)-C1-C10-アルキレン-C(O)-、-C(O)-N(C1-6アルキル)-C1-C10-アルキレン-X1b-(ここで、X1bは、式(3000)中のL'に付加されている)、-C(O)-N(H)-(C1-C10-アルキレン)-X1b-(ここで、X1bは、式(3000)中のL'に付加されている)、
【化１３０】
2021523147.tif 000142
(ここで、右側にある(すなわち、Nにおける)結合点は、式(3000)中のL'に対するものである)、-CH2-NH-(ここで、Nは、式(3000)中のL'に付加されており、
【化１３１】
2021523147.tif 000143
(ここで、Nは式(3000)中のL'に付加されており、かつArは、任意に置換されたアリーレン(いくつかの実施態様において、
【化１３２】
2021523147.tif 000144
)もしくは任意に置換されたヘテロアリーレンである))、-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(3000)中のL'に付加されている)、-C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(3000)中のL'に付加されており、かつ各々のC1-C10-アルキレンは、独立に、1以上のヒドロキシで任意に置換されている)、-C(O)-N(R35)-(C1-C10-アルキレン)-C(O)NH-X2-(ここで、X2は、式(3000)中のL'に付加されている)、又は
【化１３３】
2021523147.tif 000145
(ここで、X4は、式(3000)中のL'に付加されている)である);並びに/或いは
b)下の表A中の化合物(ここで、表A中の化合物は、-C(O)CH2OH基のヒドロキシを介して、すなわち、-C(O)CH2-O-SP-L'-によって、又はマプラコラトのヒドロキシを介して、すなわち、-O-SP-L'-によって、式(III)の化合物のBAに連結されている)から選択され;
X1は、-N(C1-6アルキル)-であり;
X1bは、-S-、-NH-、又は-N(C1-6アルキル)-であり;
X2は、-NH-であり;
X3は、-CH2-であり、X3は、-CH2-O-(C1-C10-アルキレン)-C(O)-(ここで、C(O)は、X4に付加されている)であるか、X3は、-C(O)-であり;
X4は、-O-であり;
R35は、H、-OH、-OCH3、又はC1-6アルキルであり;
R50及びR50aは、独立に、水素又はC1-C6-アルキルであり;
Rd、Re、及びRfは、独立に、-H、-OH、ヒドロキシアルキル、アルコキシカルボニル、-C(O)OH、又は-CH2ORgであり、ここで、各々のRgは、独立に、-CH2C(O)OH又は-CH2C(O)O(アルキル)であり;かつ
mmは、0又は1であり;
nは、1〜30までから選択される整数であり;
L'は、リンカーであり;かつ
BAは、結合剤である)。
【０２２７】
式(3000)のいくつかの例において、Dは、ブデソニド又は表Aに示されている任意の他のステロイドである。式(3000)のいくつかの例において、Dは、本明細書に記載される任意のブデソニド類似体である。表A中の化合物は、-C(O)CH2OH基のヒドロキシを介して、すなわち、-C(O)CH2-O-SP-L'-によって、又はマプラコラトのヒドロキシを介して、すなわち、-O-SP-L'-によって、式(III)の化合物のBAに連結されている。式(3000)のいくつかの例において、部分SP-D(又はH-SP-D)は、本明細書において、「ブデソニド-スペーサー」と呼ばれ、例えば、表B、実施例の節、及び図22のスキーム1に示されているブデソニド-スペーサー又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体を含む。
表A.
【表１】
2021523147.tif 000146
2021523147.tif 000147
2021523147.tif 000148
2021523147.tif 000149
2021523147.tif 000150
表B.ブデソニド-スペーサー(ブデソニド-SP)
【表２】
2021523147.tif 000151
2021523147.tif 000152
2021523147.tif 000153
2021523147.tif 000154
2021523147.tif 000155
いくつかの例において、上記の構造の各々における
【化１３４】
2021523147.tif 000156
のn-プロピルは、R-配置におけるもの、すなわち、アステリスクによって示される炭素におけるものである。いくつかの例において、上記の構造の各々における
【化１３５】
2021523147.tif 000157
のn-プロピルは、S-配置におけるもの、すなわち、アステリスクによって示される炭素におけるものである。いくつかの例において、上記の構造の各々における
【化１３６】
2021523147.tif 000158
のn-プロピルは、R-配置とS-配置の混合物、すなわち、アステリスクによって示される炭素におけるものである。いくつかの例において、上記の構造の各々における
【化１３７】
2021523147.tif 000159
のn-プロピルは、R-配置とS-配置の混合物、すなわち、アステリスクによって示される炭素におけるものであり、ここで、R:S混合物は、約1:1、約2:1、約3;1、約4:1、約5:1、約6;1、約7:1、約8:1、約9:1、又は約10:1である。
【０２２８】
様々な実施態様において、Ab-L'-SP-Dの-SP-D又は式(3000)の
【化１３８】
2021523147.tif 000160
は、
【化１３９】
2021523147.tif 000161
2021523147.tif 000162
2021523147.tif 000163
から選択され、ここで、
【化１４０】
2021523147.tif 000164
は、リンカーとの結合である。
【０２２９】
いくつかの例において、上記の構造の各々における
【化１４１】
2021523147.tif 000165
のn-プロピルは、R-配置におけるもの、すなわち、アステリスクによって示される炭素におけるものである。いくつかの例において、上記の構造の各々における
【化１４２】
2021523147.tif 000166
のn-プロピルは、S-配置におけるもの、すなわち、アステリスクによって示される炭素におけるものである。いくつかの例において、上記の構造の各々における
【化１４３】
2021523147.tif 000167
のn-プロピルは、R-配置とS-配置の混合物、すなわち、アステリスクによって示される炭素におけるものである。いくつかの例において、上記の構造の各々における
【化１４４】
2021523147.tif 000168
のn-プロピルは、R-配置とS-配置の混合物、すなわち、アステリスクによって示される炭素におけるものであり、ここで、R:S混合物は、約1:1、約2:1、約3;1、約4:1、約5:1、約6;1、約7:1、約8:1、約9:1、又は約10:1である。
【０２３０】
様々な実施態様において、
【化１４５】
2021523147.tif 000169
は、表Bから選択されるか、又は
【化１４６】
2021523147.tif 000170
から選択される。
【０２３１】
いくつかの実施態様において、ペイロードは、式(C)の構造を有するリファマイシン類似体:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である;
【化１４７】
2021523147.tif 000171
(式中:
X1cは、-O-、-S--、及び-NR5cから選択され;
R1cは、水素;アミノ-C1-6アルキル; C1-6アルキルアミノC1-6アルキル;ジ-C1-6アルキルアミノC1-6アルキル;ヒドロキシ-C1-6アルキル; HS-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-N(R5c)-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-O-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-S-C1-6アルキル;ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクロアルキル-C1-6アルキルであり;ここで、ヘテロシクロアルキルは、O、N、及びSから選択される1、2、又は3個のヘテロ原子を含み;かつここで、ヘテロシロアルキル(heterocyloalkyl)は、ハロ、C1-6アルキル、-OH、=O、又は-N(R5c)2で任意に置換されており;
R2c、R3c、及びR4cは、独立に、水素、C1-6アルキル、及び-(C=O)-R5cから選択され;
Racは、-F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NH2;及びC1-6アルコキシから選択され;
Rbcは、出現する毎に、水素であり;かつ
R5cは、出現する毎に独立に、水素;及びC1-6アルキルから選択され;
ただし、R1cは、n-ブチル基ではなく;かつ
さらに、ただし、X1cが-O-であるとき、R1cは、水素ではなく;
ここで、基R1cは、リンカーに結合している)。
【０２３２】
いくつかの実施態様において、ペイロードは、式(C-1)の構造を有するリファマイシン類似体:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である;
【化１４８】
2021523147.tif 000172
(式中:
X1cは、-S-; -O-及び-NR5cから選択され;
R1cは、アミノ-C1-6アルキル; C1-6アルキルアミノC1-6アルキル;ジ-C1-6アルキルアミノC1-6アルキル;ヒドロキシ-C1-6アルキル; HS-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-N(R5c)-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-O-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-S-C1-6アルキル;ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクロアルキル-C1-6アルキルであり;ここで、ヘテロシクロアルキルは、O、N、及びSから選択される1、2、又は3個のヘテロ原子を含み;かつここで、ヘテロシロアルキル(heterocyloalkyl)は、ハロ、C1-6アルキル、-OH、=O、又は-N(R5c)2で任意に置換されており;
R2c、R3c、及びR4cは、独立に、水素、C1-6アルキル、及び-(C=O)-R5cから選択され;
各々のRacは、存在する場合、独立に、-F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NH2;及びC1-6アルコキシから選択され;かつ
R5cは、出現する毎に独立に、水素;及びC1-6アルキルから選択され;
ここで、基R1cは、リンカーに結合している)。
【０２３３】
いくつかの実施態様において、ペイロードは、式(C-2)の構造を有するリファマイシン類似体:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である;
【化１４９】
2021523147.tif 000173
(式中:
X1cは、-S-; -O-及び-NR5cから選択され;
R1cは、アミノ-C1-6アルキル; C1-6アルキルアミノC1-6アルキル;ジ-C1-6アルキルアミノC1-6アルキル;ヒドロキシ-C1-6アルキル; HS-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-N(R5c)-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-O-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-S-C1-6アルキル;ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクロアルキル-C1-6アルキルであり;ここで、ヘテロシクロアルキルは、O、N、及びSから選択される1、2、又は3個のヘテロ原子を含み;かつここで、ヘテロシロアルキル(heterocyloalkyl)は、ハロ、C1-6アルキル、-OH、=O、又は-N(R5c)2で任意に置換されており;
R2c、R3c、及びR4cは、独立に、水素、C1-6アルキル、及び-(C=O)-R5cから選択され;
Rac及びRbcは、独立に、-F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NH2;及びC1-6アルコキシから選択され;かつ
R5cは、出現する毎に独立に、水素;及びC1-6アルキルから選択され;
ここで、基R1cは、リンカーに結合している)。
【０２３４】
いくつかの実施態様において、ペイロードは、式(C-3)の構造を有するリファマイシン類似体:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である;
【化１５０】
2021523147.tif 000174
(式中:
R1cは、ジ-C1-6アルキルアミノC1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-N(R5c)-C1-6アルキル;ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクロアルキル-C1-6アルキルであり;ここで、ヘテロシクロアルキルは、O、N、及びSから選択される1、2、又は3個のヘテロ原子を含み;かつここで、ヘテロシロアルキル(heterocyloalkyl)は、ハロ、C1-6アルキル、-OH、=O、又は-N(R5c)2で任意に置換されており;かつ
R2c、R3c、及びR4cは、独立に、水素、C1-6アルキル、及び-(C=O)-R5cから選択され;かつ
R5cは、水素及びC1-6アルキルから選択され;
ここで、基R1cは、リンカーに結合している)。
【０２３５】
いくつかの実施態様において、ペイロードは、式(C-4)の構造を有するリファマイシン類似体:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である;
【化１５１】
2021523147.tif 000175
(式中:
R1cは、
【化１５２】
2021523147.tif 000176
であり;
ここで、Yは、C又はNであり;
R2c、R3c、及びR4cは、独立に、水素、C1-6アルキル、及び-(C=O)-R5cから選択され;かつ
R5cは、水素及びC1-6アルキルから選択され;
ここで、基R1cは、波線
【化１５３】
2021523147.tif 000177
によって示される窒素原子を介して、リンカーに結合している)。
【０２３６】
式(C-1)及び/又は(C-2)及び/又は(C-3)及び/又は(C-4)のいくつかの又は任意の実施態様において、Rbcは、水素であり、及び/又はRacは、水素である。式(C-1)及び/又は(C-2)及び/又は(C-3)及び/又は(C-4)のいくつかの又は任意の実施態様において、R2cは、メチル、エチル、プロピル、又はイソプロピル、好ましくは、メチルである。式(C-1)及び/又は(C-2)及び/又は(C-3)及び/又は(C-4)のいくつかの又は任意の実施態様において、R3cは、CH3-(C=O)-(アセチル)基、CH3CH2-(C=O)-、CH3CH2CH2-(C=O)-、又は(CH3)2CH-(C=O)-;好ましくは、アセチルである。式(C-1)及び/又は(C-2)及び/又は(C-3)及び/又は(C-4)のいくつかの又は任意の実施態様において、R4cは、水素である。
【０２３７】
式(C-1)及び/又は(C-2)及び/又は(C-3)及び/又は(C-4)のいくつかの実施態様において、-OR1cは、
【化１５４】
2021523147.tif 000178
のうちの1つ又は複数である。式(C-1)及び/又は(C-2)及び/又は(C-3)及び/又は(C-4)のいくつかの実施態様において、-OR1cは、
【化１５５】
2021523147.tif 000179
である。
【０２３８】
式(C-1)及び/又は(C-2)及び/又は(C-3)及び/又は(C-4)のいくつかの又は任意の実施態様において、X1cは、Oであり、かつ-OR1cは、三級アミンを含み、該三級アミンは、リンカーに結合した後、四級アミンに変化する。そのような実施態様のいくつかにおいて、-OR1cは、
【化１５６】
2021523147.tif 000180
である。そのような実施態様において、四級アミンが形成される場合、好適な対イオンが存在する、すなわち、リファマイシン類似体が、正電荷を担持する四級アミンを含む医薬として許容し得る塩として、及び塩、例えば、負電荷を帯びた電荷平衡対イオン(例えば、I-、Br-、Cl-、又は任意の他の好適な対イオン)として存在する。
【０２３９】
いくつかの実施態様において、式(C-1)及び/又は(C-2)及び/又は(C-3)及び/又は(C-4)の化合物は:
【化１５７】
2021523147.tif 000181
2021523147.tif 000182
からなる群から選択され、
ここで、
【化１５８】
2021523147.tif 000183
は、リンカーとの結合である。
【０２４０】
(リンカー)
式(I)、(III)、又は(3000)のいくつかの実施態様において、Lは、-L1-L2-(L3)0-1-を含み、かつL2は、
【化１５９】
2021523147.tif 000184
-OCH2C(O)-、もしくはシクロデキストリン残基(CD);又はその組合せを含む。いくつかの実施態様において、Lは、-L1-L2-(L3)0-1-を含み、かつL2は、
【化１６０】
2021523147.tif 000185
もしくはCD、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施態様において、Lは、-L1-L2-(L3)0-1-を含み、かつL2はCDを含む。いくつかの実施態様において、L及び/又はL2がCDを含む場合、CDは、
【化１６１】
2021523147.tif 000186
2021523147.tif 000187
からなる群から選択される。
【０２４１】
式(I)、(III)、又は(3000)のいくつかの実施態様において、Lは、-L1-L2-(L3)0-1-を含み、かつL2は、本明細書に記載されるHGを含む。いくつかの実施態様において、L及び/又はL2は、
【化１６２】
2021523147.tif 000188
を含む。いくつかの実施態様において、L及び/又はL2は、
【化１６３】
2021523147.tif 000189
を含む。
【０２４２】
式(I)、(III)、又は(3000)のいくつかの実施態様において、Lは、-L1-L2-(L3)0-1-を含み、かつL1は、
【化１６４】
2021523147.tif 000190
又はその位置異性体もしくは異性体の混合物;
【化１６５】
2021523147.tif 000191
或いはその立体異性体もしくは立体異性体の混合物(ここで、Sは、それを介して反応基残基がBAに付加されているシステイン残基上のS原子を表す);及び
【化１６６】
2021523147.tif 000192
(ここで、Nは、それを介して反応基残基がBAに付加されているリジン残基上のN原子を表す)から選択される。
【０２４３】
いくつかの実施態様において、Lは、本明細書に記載される-L1-L2-(L3)0-1-及び-L2-(L3)0-1-を含む。いくつかの実施態様において、Lは、式(III)及び式(3000)について本明細書に記載されるL'-SPである。いくつかの実施態様において、Lは:
【化１６７】
2021523147.tif 000193
2021523147.tif 000194
2021523147.tif 000195
2021523147.tif 000196
2021523147.tif 000197
を含む。
【０２４４】
いくつかの例において、式(I)又は(III)又は(3000)の化合物は、
【化１６８】
2021523147.tif 000198
又はその立体異性体形態もしくはその位置異性体もしくはその位置異性体の混合物から選択され、
ここで、
各々のAbが抗MSR1抗体又はその抗原結合断片であり;かつ
各々のnは、1〜4の整数である。
【０２４５】
いくつかの例において、式(I)又は(III)又は(3000)の化合物は、
【化１６９】
2021523147.tif 000199
2021523147.tif 000200
2021523147.tif 000201
2021523147.tif 000202
2021523147.tif 000203
2021523147.tif 000204
又はその立体異性体形態もしくはその位置異性体もしくはその位置異性体の混合物から選択され、
ここで、
各々のAbは、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片であり;
各々のBAは、
【化１７０】
2021523147.tif 000205
であり、ここで、Ab1は、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片であり; Rは、C2-4-アルキレンであり;かつnnは、2〜4までから選択される整数であり、かつ
各々のnは、1〜4の整数である。
【０２４６】
いくつかのさらなる実施態様において、本明細書に記載されるADCは、2016年11月29日に出願され、2018年4月24日に発行されたUS 9,951,141 B2号に記載されているリンカーを含むことができ、このリンカーは、引用により本明細書中に組み込まれる。いくつかの例において、該リンカーは:
【化１７１】
2021523147.tif 000206
を含み、ここで、bは、2〜8の整数であり、かつ
【化１７２】
2021523147.tif 000207
は、結合剤との結合である。いくつかの実施態様において、該リンカーは、2つの反応基を含み、かつ例えば、抗体又はその抗原結合断片の2つの異なる鎖上のチオールとの結合を形成することができ:
【化１７３】
2021523147.tif 000208
ここで、bは、2〜8の整数である。さらなる実施態様において、該リンカーは、2つの反応基を含み、かつ例えば、抗体又はその抗原結合断片の2つの異なる鎖上のチオールとの結合を形成することができ:
【化１７４】
2021523147.tif 000209
ここで、bは、2〜8の整数である。いくつかの他の実施態様において、該リンカーは、2つの反応基を含み、かつ例えば、抗体又はその抗原結合断片の2つの異なる鎖上のチオールとの結合を形成することができ:
【化１７５】
2021523147.tif 000210
ここで、bは、2〜8の整数であり、RNは、水素原子又はアルキルであり、かつRMは、アルキルである。さらなる実施態様において、該リンカーは、2つの反応基を含み、かつ例えば、抗体又はその抗原結合断片の2つの異なる鎖上のチオールとの結合を形成することができ:
【化１７６】
2021523147.tif 000211
ここで、bは、2〜8の整数である。ある実施態様において、該リンカーは、2つの反応基を含み、かつ例えば、抗体又はその抗原結合断片の2つの異なる鎖上のチオールとの結合を形成することができ:
【化１７７】
2021523147.tif 000212
ここで、bは、2〜8の整数である。いくつかの実施態様において、該リンカーは、2つの反応基を含み、かつ例えば、抗体又はその抗原結合断片の2つの異なる鎖上のチオールとの結合を形成することができ:
【化１７８】
2021523147.tif 000213
ここで、bは、2〜8の整数であり; RNは、水素原子又はアルキルであり;かつRMは、アルキルである。
【０２４７】
本明細書に記載される式(I)、(IA)、(IB)、(IB-1)、(IB-2)、(IC)、(ID)、(IE)、(III)、(3000)、(5001)、(5002)、(5003)、(5004)、(6001)、(6002)、(6003)、(6004)、(6005)、(7001)、(7002)、(7003)、(7004)、及び/もしくは(7005)において、並びに/又はBA-[(L)0-1-PA]nにおいて、PAは、好適と考えられる任意のリンカーLとともにBAに連結させることができる。リンカーは、本明細書に記載される抗体又は抗原結合タンパク質を、治療的部分、例えば、ステロイド又はLXRモジュレーターと連結させるか、接続させるか、又は結合させる任意の基又は部分である。好適なリンカーは、例えば、各々の内容が引用により本明細書中に完全に組み込まれる、抗体-薬物コンジュゲート及び免疫毒素(Antibody-Drug Conjugates and Immunotoxins); Phillips, G. L.編; Springer Verlag: New York, 2013;抗体-薬物コンジュゲート(Antibody-Drug Conjugates); Ducry, L.編; Humana Press, 2013;抗体-薬物コンジュゲート(Antibody-Drug Conjugates); Wang, J.、Shen, W.-C.、及びZaro, J. L.編; Springer International Publishing, 2015に見出すことができる。通常、本明細書に記載される抗体コンジュゲートのための好適な結合剤リンカーは、抗体の循環半減期を利用するのに十分に安定であり、かつ同時に、抗原によって媒介されるコンジュゲートの内在化の後にそのペイロードを放出することができるものである。リンカーは、切断性又は非切断性であることができる。切断性リンカーには、内在化後の細胞内代謝、例えば、加水分解、還元、又は酵素反応を介する切断によって切断されるリンカーが含まれる。非切断性リンカーには、内在化後の抗体のリソソーム分解を介して、付加されたペイロードを放出するリンカーが含まれる。好適なリンカーとしては、酸不安定性リンカー、加水分解不安定性リンカー、酵素切断性リンカー、還元不安定性リンカー、自壊性リンカー/基、及び非切断性リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。好適なリンカーとしては、ペプチド、グルクロニド、スクシンイミド-チオエーテル、ポリエチレングリコール(PEG)単位、ヒドラゾン、マル-カプロイル単位、ジペプチド単位、バリン-シトルリン単位、及びパラ-アミノベンジル(PAB)単位であるもの、又はこれらを含むものも挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４８】
当技術分野で公知の任意のリンカー分子又はリンカー技術を用いて、本開示のADCを作出又は構築することができる。ある実施態様において、該リンカーは、切断性リンカーである。他の実施態様によれば、該リンカーは、非切断性リンカーである。本開示との関連において使用することができる例示的なリンカーとしては、例えば、MC(6-マレイミドカプロイル)、MP(マレイミドプロパノイル)、val-cit(バリン-シトルリン)、val-ala(バリン-アラニン)、プロテアーゼ切断性リンカー中のジペプチド部位、ala-phe(アラニン-フェニルアラニン)、プロテアーゼ切断性リンカー中のジペプチド部位、PAB(p-アミノベンジルオキシカルボニル)、SPP(N-スクシンイミジル 4-(2-ピリジルチオ)ペンタノエート)、SMCC(N-スクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1 カルボキシレート)、SIAB(N-スクシンイミジル(4-ヨード-アセチル)アミノベンゾエート)、並びにその変異体及び組合せを含むか、又はこれらからなるリンカーが挙げられる。本開示との関連において使用することができるリンカーのさらなる例は、例えば、その内容が引用により本明細書中に完全に組み込まれる、US 7,754,681号及びDucryの文献、Bioconjugate Chem., 2010, 21:5-13、並びにその中で引用されている参考文献に提供されている。
【０２４９】
ある実施態様において、該リンカーは、生理的条件で安定である。ある実施態様において、該リンカーは切断性であり、例えば、酵素の存在下で又は特定のpH範囲もしくは値で、少なくともペイロード部分を放出することができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、酵素切断性部分を含む。例示的な酵素切断性部分としては、ペプチド結合、エステル連結、ヒドラゾン、及びジスルフィド連結が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、該リンカーは、カテプシン切断性リンカーを含む。
【０２５０】
いくつかの実施態様において、該リンカーは、非切断性部分を含む。
【０２５１】
好適なリンカーとしては、単一の結合剤、例えば、抗体の2つのシステイン残基に化学的に結合しているものが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなリンカーは、コンジュゲーションプロセスの結果として破壊される抗体のジスルフィド結合を模倣する働きをすることができる。
【０２５２】
いくつかの実施態様において、該リンカーは、1以上のアミノ酸を含む。好適なアミノ酸としては、天然、非天然、標準的、非標準的、タンパク質構成性、非タンパク質構成性、及びL-又はD-α-アミノ酸が挙げられる。いくつかの実施態様において、該リンカーは、アラニン、バリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、もしくはシトルリン、その誘導体、又はその組合せを含む。ある実施態様において、該アミノ酸の1以上の側鎖は、下記の側鎖基に連結される。いくつかの実施態様において、該リンカーは、バリン及びシトルリンを含む。いくつかの実施態様において、該リンカーは、リジン、バリン、及びシトルリンを含む。いくつかの実施態様において、該リンカーは、リジン、バリン、及びアラニンを含む。いくつかの実施態様において、該リンカーは、バリン及びアラニンを含む。
【０２５３】
いくつかの実施態様において、該リンカーは、自壊基を含む。該自壊基は、当業者に公知の任意のそのような基であることができる。特定の実施態様において、該自壊基は、p-アミノベンジル(PAB)又はその誘導体である。いくつかの実施態様において、該自壊基は、p-アミノベンジルオキシである。いくつかの実施態様において、該自壊基は、切断性ジスルフィド基を含む。有用な誘導体としては、p-アミノベンジルオキシカルボニル(PABC)が挙げられる。当業者は、自壊基がペイロードからリンカーの残りの原子を放出する化学反応を行うことができることを認識しているであろう。
【０２５４】
いくつかの実施態様において、該リンカーは:
【化１７９】
2021523147.tif 000214
であり、ここで、
【化１８０】
2021523147.tif 000215
は、(例えば、リジン残基を介する)抗体又は抗原結合タンパク質との結合であり、かつ
【化１８１】
2021523147.tif 000216
は、ペイロードとの結合である。いくつかの実施態様において、該リンカーは:
【化１８２】
2021523147.tif 000217
であり、ここで、
【化１８３】
2021523147.tif 000218
は、(例えば、リジン残基を介する)抗体又は抗原結合タンパク質との結合であり、かつ
【化１８４】
2021523147.tif 000219
は、ペイロードとの結合である。ある実施態様において、リンカーは:
【化１８５】
2021523147.tif 000220
である。
【０２５５】
ある実施態様において、該リンカーは:
【化１８６】
2021523147.tif 000221
である。
【０２５６】
いくつかの実施態様において、該リンカーは、マレイミジルメチル-4-trans-シクロヘキサンカルボキシスクシネート:
【化１８７】
2021523147.tif 000222
に由来する。
【０２５７】
いくつかの実施態様において、該リンカーは:
【化１８８】
2021523147.tif 000223
であり、ここで、
【化１８９】
2021523147.tif 000224
は、(例えば、リジン残基を介する)抗体又は抗原結合タンパク質との結合であり、かつ
【化１９０】
2021523147.tif 000225
は、ペイロードとの結合である。
【０２５８】
いくつかの実施態様において、Lは、切断性リンカーである。いくつかの実施態様において、Lは、非切断性リンカーである。いくつかの実施態様において、Lは、ジペプチドを含む。いくつかの実施態様において、Lは、PAB部分を含む。いくつかの実施態様において、Lは、ジスルフィド部分を含む。
【０２５９】
いくつかの実施態様において、Lは、以下の構造を有する部分を含む:
【化１９１】
2021523147.tif 000226
。
【０２６０】
いくつかの実施態様において、Lは、以下の構造を有する部分を含む:
【化１９２】
2021523147.tif 000227
。
【０２６１】
いくつかの実施態様において、Lは、以下の構造を有する部分を含む:
【化１９３】
2021523147.tif 000228
。
【０２６２】
いくつかの実施態様において、Lは、以下の構造を有する部分を含む:
【化１９４】
2021523147.tif 000229
。
【０２６３】
ある実施態様において、該リンカーは、シクロデキストリン基を含む。ある実施態様において、該リンカーは、式(Ia)によるADCを提供する:
【化１９５】
2021523147.tif 000230
。
【０２６４】
式(Ia)において、BAは、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片であり、LLは、三価リンカーであり、RGは、反応性リンカー残基であり、SPは、各々の場合に独立に、非存在、又はスペーサー基であり、下付文字nは、1〜30の整数であり;かつPAは、ペイロードである。ある実施態様において、nは、1〜4である。ある実施態様において、nは4である。ある実施態様において、nは2である。ある実施態様において、nは1である。ある実施態様において、nは3である。
【０２６５】
ある実施態様において、該リンカーは、シクロデキストリン基を含む。ある実施態様において、該リンカーは、式(Id)によるADCを提供する:
【化１９６】
2021523147.tif 000231
。
【０２６６】
式(Id)において、BAは、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片であり; RGは、反応基残基であり; SP1及びSP2は各々、各々の場合に独立に、非存在又はスペーサー基残基であり、かつここで、SP1は、三価リンカーを含み; AA1は、アミノ酸残基を含む三価リンカーであり; AA2は、ジペプチド残基であり; PEGは、ポリエチレングリコール残基であり; PABは、
【化１９７】
2021523147.tif 000232
であり、ここで、
【化１９８】
2021523147.tif 000233
は、それを介してPABが該式中の隣接する基に結合している原子を示し、CDは、各々の場合に独立に、非存在又はシクロデキストリン残基であり、ここで、少なくとも1つのCDは存在し、下付文字nは、1〜30の整数であり;下付文字mは、0〜5の整数であり;下付文字pは0又は1であり;かつPAは、ペイロード部分である。これらの例において、下付文字mは、0、1、2、3、4、又は5である。いくつかの例において、下付文字mは0である。いくつかの例において、下付文字mは1である。いくつかの例において、下付文字mは2である。いくつかの例において、下付文字mは3である。いくつかの例において、下付文字mは4である。いくつかの例において、下付文字mは5である。いくつかの例において、下付文字pは0である。いくつかの例において、下付文字pは1である。いくつかの例において、AA1又はAA2のいずれか1つは、各々の場合に独立に、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、もしくはシトルリンから選択されるアミノ酸、又はその誘導体、又はその組合せを含む。ある実施態様において、AA1は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、又はシトルリンから選択されるアミノ酸、その誘導体、又はその組合せである。ある実施態様において、AA1は、リジンである。ある実施態様において、AA1は、リジン又はリジンの誘導体である。ある実施態様において、AA2は、バリン-シトルリンである。いくつかの実施態様において、AA2は、シトルリン-バリンである。いくつかの実施態様において、AA2は、バリン-アラニンである。いくつかの実施態様において、AA2は、アラニン-バリンである。いくつかの実施態様において、AA2は、バリン-グリシンである。いくつかの実施態様において、AA2は、グリシン-バリンである。いくつかの実施態様において、AA1-AA2は、グルタミン-バリン-シトルリンである。いくつかの実施態様において、AA1-AA2は、グルタミン-バリン-シトルリンである。いくつかの実施態様において、AA1-AA2は、リジン-バリン-アラニンである。いくつかの実施態様において、AA1-AA2は、リジン-バリン-シトルリンである。いくつかの実施態様において、AA1-AA2は、グルタミン-バリン-シトルリンである。ある実施態様において、リジンは、L-リジンである。ある実施態様において、リジンは、D-リジンである。いくつかの例において、SP1は、各々の場合に独立に、C1-6アルキレン、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、及びその組合せからなる群から選択され、ここで、下付文字eは0〜4の整数であり、下付文字uは1〜8の整数であり、かつ下付文字vは1〜8の整数である。いくつかの例において、SP2は、各々の場合に独立に、C1-6アルキレン、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、及びその組合せからなる群から選択され、ここで、下付文字eは0〜4の整数��あり、下付文字uは1〜8の整数であり、かつ下付文字vは1〜8の整数である。
【０２６７】
式(I)、(IA)、(IB)、(IB-1)、(IB-2)、(IC)、(ID)、(IE)、(III)、(3000)、(5001)、(5002)、(5003)、(5004)、(6001)、(6002)、(6003)、(6004)、(6005)、(7001)、(7002)、(7003)、(7004)、及び/又は(7005)についてのある実施態様において、該リンカーは:
【化１９９】
2021523147.tif 000234
2021523147.tif 000235
2021523147.tif 000236
2021523147.tif 000237
2021523147.tif 000238
2021523147.tif 000239
2021523147.tif 000240
2021523147.tif 000241
2021523147.tif 000242
2021523147.tif 000243
2021523147.tif 000244
2021523147.tif 000245
から選択される。またこれらの例に含まれるのは、その医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、その位置異性体、又はその位置異性体の混合物であり、ここで、各々の
【化２００】
2021523147.tif 000246
は、結合剤との結合であり;かつ各々の
【化２０１】
2021523147.tif 000247
は、ペイロードとの結合である。
【０２６８】
ある実施態様において、該リンカーは、末端親水基(HG)を含む。ある実施態様において、該リンカーは、タウリン基を含む。ある実施態様において、該リンカーは、末端スルホン酸基を含む。ある実施態様において、該リンカーは、式(II)によるADCを提供し:
【化２０２】
2021523147.tif 000248
ここで、式(II)において、BAは、結合剤であり; LLは、三価リンカーであり; RG1及びRG2は、反応基残基であり; SP1及びSP2は、各々の場合に独立に、非存在又はスペーサー基残基であり; HGは、親水性残基であり; PAは、ペイロード残基であり;下付文字nは、1〜30の整数であり;かつ下付文字qは0又は1である。いくつかの例において、複数の三価リンカーLLが存在していてもよい。いくつかの例において、nは1〜4の整数である。いくつかの例において、nは1である。いくつかの例において、nは2である。いくつかの例において、nは3である。いくつかの例において、nは4である。いくつかの例において、HGは、末端親水基である。いくつかの例において、HGは、1つの末端スルホン酸基又はその塩を含む。他の例において、HGは、複数の末端スルホン酸基又はその塩を含む。いくつかの例において、HGは、1つの末端ホスホン酸基又はその塩を含む。他の例において、HGは、複数の末端ホスホン酸基又はその塩を含む。いくつかの例において、HGは、1つの末端三級アミン基又はその塩を含む。他の例において、HGは、複数の末端三級アミン基又はその塩を含む。いくつかの例において、HGは、1つの末端ポリオール(例えば、グルコース、マルトース)又はその誘導体を含む。他の例において、HGは、複数の末端ポリオール(例えば、グルコース、マルトース)又はその誘導体を含む。
【０２６９】
別の例において、式(II)の化合物は、式(IV)によるものである:
【化２０３】
2021523147.tif 000249
。
【０２７０】
式(IV)において、BA、RG1、SP1、RG2、SP2、及びHGは、上で定義されている通りのものであり、AA1は、アミノ酸残基を含む三価リンカーであり; AA2は、ジペプチド残基であり;かつPABは、
【化２０４】
2021523147.tif 000250
であり、ここで、
【化２０５】
2021523147.tif 000251
は、それを介してPABが該式中の隣接する基に結合している原子を示し;下付文字pは0又は1であり;かつ下付文字qは0又は1である。いくつかの例において、下付文字pは0であり、かつ下付文字qは0である。いくつかの例において、下付文字pは1であり;かつ下付文字qは0である。いくつかの例において、下付文字pは0であり;かつ下付文字qは1である。いくつかの例において、下付文字pは1であり;かつ下付文字qは1である。いくつかの例において、SP1は、0〜5個のポリエチレングリコール(PEG)残基を含む。いくつかの例において、SP2は、0〜5個のPEG残基を含む。いくつかの例において、SP1は、各々の場合に独立に、C1-6アルキレン、-NH-、-C(O)-、(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、及びその組合せからなる群から選択され、ここで、下付文字eは0〜4の整数であり、下付文字uは1〜8の整数であり、かつ下付文字vは1〜8の整数である。いくつかの例において、SP2は、各々の場合に独立に、C1-6アルキレン、-NH-、-C(O)-,(-CH2-CH2-O)e、-NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-、-C(O)-(CH2)u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2)v-、及びその組合せからなる群から選択され、ここで、下付文字eは0〜4の整数であり、下付文字uは1〜8の整数であり、かつ下付文字vは1〜8の整数である。いくつかの例において、AA1又はAA2のいずれか1つは、各々の場合に独立に、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、もしくはシトルリンから選択されるアミノ酸、その誘導体、又はその組合せを含む。ある実施態様において、AA1は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、もしくはシトルリンから選択されるアミノ酸、その誘導体、又はその組合せである。ある実施態様において、AA1は、リジンである。ある実施態様において、AA1は、リジン又はリジンの誘導体である。ある実施態様において、AA1は、グルタミン酸である。ある実施態様において、AA2は、バリン-シトルリンである。いくつかの実施態様において、AA2は、シトルリン-バリンである。いくつかの実施態様において、AA2は、バリン-アラニンである。いくつかの実施態様において、AA2は、アラニン-バリンである。いくつかの実施態様において、AA2は、バリン-グリシンである。いくつかの実施態様において、AA2は、グリシン-バリンである。いくつかの実施態様において、AA1-AA2は、グルタミン-バリン-シトルリンである。いくつかの実施態様において、AA1-AA2は、リジン-バリン-シトルリンである。いくつかの実施態様において、AA1-AA2は、リジン-バリン-アラニンである。いくつかの実施態様において、AA1-AA2は、グルタミン-バリン-アラニンである。ある実施態様において、リジンは、L-リジンである。ある実施態様において、リジンは、D-リジンである。
【０２７１】
式(I)、(IA)、(IB)、(IB-1)、(IB-2)、(IC)、(ID)、(IE)、(III)、(3000)、(5001)、(5002)、(5003)、(5004)、(6001)、(6002)、(6003)、(6004)、(6005)、(7001)、(7002)、(7003)、(7004)、及び/又は(7005)についてのある実施態様において、該リンカーは:
【化２０６】
2021523147.tif 000252
又はその立体異性体形態もしくはその位置異性体もしくはその位置異性体の混合物から選択され、ここで、
各々の
【化２０７】
2021523147.tif 000253
は、結合剤との結合であり;かつ
各々の
【化２０８】
2021523147.tif 000254
は、ペイロード残基との結合である。
【０２７２】
いくつかの例において、部分L-PAは、反応基(RG)に付加されて、RG-L-PA(例えば、表3に示されるリンカーペイロード)を形成する。いくつかの例において、BA(又はBAの修飾形態、例えば、表2に示されるPEG修飾Ab、又はAb1)は、リンカーペイロードと反応して、表1及び表2に記載されるADCを形成する。また本明細書に提示される実施態様の範囲内で企図されるのは、表5A及び表5Bに記載される任意のリンカーペイロードから調製されるADCである。
【０２７３】
(リンカーペイロード)
本明細書に提供されるのは、抗体-薬物コンジュゲートの調製において有用である;式(2000)によるリンカー-ステロイド又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である;
RG-L2-(L3)0-1-SP-D
(式中、
Dは、
a)
【化２０９】
2021523147.tif 000255
(ここで、式(a)中の両方のRxは、水素であり; R34は、アルキル、アリール、アリールアルキル、もしくはN-含有ヘテロシクロアルキルであり;かつSPは、-C(O)-C1-C10-アルキレン-C(O)-、-C(O)-N(C1-6アルキル)-C1-C10-アルキレン-X1-(ここで、X1は、式(2000)中の(L3)0-1に付加されている)、-C(O)-N(H)-(C1-C10-アルキレン)-S-(ここで、Sは、式(2000)中の(L3)0-1に付加されている)、-C(O)-N(C1-6アルキル)-(C1-C10-アルキレン)-S-(ここで、Sは、式(2000)中の(L3)0-1に付加されている)、
【化２１０】
2021523147.tif 000256
(ここで、右側にある(すなわち、Nにおける)結合点は、式(2000)中の(L3)0-1に対するものである)、-CH2-NH-(ここで、Nは、式(2000)中の(L3)0-1に付加されている)、
【化２１１】
2021523147.tif 000257
(ここで、Nは、式(2000)中の(L3)0-1に付加されており、かつここで、Arは、任意に置換されたアリーレン(いくつかの実施態様において、
【化２１２】
2021523147.tif 000258
)もしくは任意に置換されたヘテロアリーレンである)、-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(2000)中の(L3)0-1に付加されている)、-C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(2000)中の(L3)0-1に付加されており、かつここで、各々のC1-C10-アルキレンは、独立に、1以上のヒドロキシで任意に置換されている)、-C(O)-N(R5)-(C1-C10-アルキレン)-C(O)NH-X2-(ここで、X2は、式(2000)中の(L3)0-1に付加されている)、又は
【化２１３】
2021523147.tif 000259
(ここで、X4は、式(2000)中の(L3)0-1に付加されている)であるか;或いは
ここで、式(a)中の両方のRxは、フルオロであり; R34は、アルキル、アリール、アリールアルキル、もしくはN-含有ヘテロシクロアルキルであり;かつSPは、-C(O)-C1-C10-アルキレン-C(O)-、-C(O)-N(C1-6アルキル)-C1-C10-アルキレン-X1b-(ここで、X1bは、式(2000)中の(L3)0-1に付加されている)、-C(O)-N(H)-(C1-C10-アルキレン)-X1b-(ここで、X1bは、式(2000)中の(L3)0-1に付加されている)、
【化２１４】
2021523147.tif 000260
(ここで、右側にある(すなわち、Nにおける)結合点は、式(2000)中の(L3)0-1に対するものである)、-CH2-NH-(ここで、Nは、式(2000)中の(L3)0-1に付加されている)、
【化２１５】
2021523147.tif 000261
(ここで、Nは、式(2000)中の(L3)0-1に付加されており、かつここで、Arは、任意に置換されたアリーレン(いくつかの実施態様において、
【化２１６】
2021523147.tif 000262
)もしくは任意に置換されたヘテロアリーレンである)、-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(2000)中の(L3)0-1に付加されている)、-C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50C(O)-(C1-C10-アルキレン)-NR50a-(ここで、NR50aは、式(2000)中の(L3)0-1に付加されており、かつここで、各々のC1-C10-アルキレンは、独立に、1以上のヒドロキシで任意に置換されている)、-C(O)-N(R5)-(C1-C10-アルキレン)-C(O)NH-X2-(ここで、X2は、式(2000)中の(L3)0-1に付加されている)、又は
【化２１７】
2021523147.tif 000263
(ここで、X4は、式(2000)中の(L3)0-1に付加されている)である);並びに/或いは
b)上の表Aの化合物(ここで、表Aの化合物は、-C(O)CH2OH基のヒドロキシを介して、すなわち、-C(O)CH2-O-SP-(L3)0-1-によって、又はマプラコラトのヒドロキシを介して、すなわち、-O-SP-(L3)0-1-によって、式(2000)の化合物のBAに連結されている)
から選択され:
X1は、-N(C1-6アルキル)-であり;
X1bは、-S-、-NH-、又は-N(C1-6アルキル)-であり;
X2は、-NH-であり;
X3は、-CH2-であるか、X3は、-CH2-O-(C1-C10-アルキレン)-C(O)-(ここで、C(O)は、X4に付加されている)であるか、又はX3は、-C(O)-であり;
X34は、-O-であり;
R35は、H、-OH、-OCH3、又はC1-6アルキルであり;
R50及びR50aは、独立に、水素又はC1-C6-アルキルであり;
Rd、Re、及びRfは、独立に、-H、-OH、ヒドロキシアルキル、アルコキシカルボニル、-C(O)OH、又は-CH2ORgであり、ここで、各々のRgは、独立に、-CH2C(O)OH又は-CH2C(O)O(アルキル)であり;かつ
mmは、0又は1であり;
RGは、反応基残基であり;
L2は、接続リンカーであり;かつ
L3は、存在する場合、自壊基である)。
【０２７４】
本明細書に提供されるのは、抗体-薬物コンジュゲートの調製において有用である、式(4000)によるリンカー-LXR-モジュレーター又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である;
RG-L-E  式(4000)
(式中、
Eは、
a)上記の及び本明細書に記載される式(B)の化合物;並びに/又は
b)上記の及び本明細書に記載される式(B-1)の化合物;並びに/又は
c)本明細書中の表Cに記載されるペイロード
から選択され;
Lは、本明細書に記載されるリンカーであり;かつ
RGは、本明細書に記載される任意の反応基残基である)。
【０２７５】
いくつかの実施態様において、LXRペイロードは、
【化２１８】
2021523147.tif 000264
である。いくつかの実施態様において、LXRペイロードは、
【化２１９】
2021523147.tif 000265
である。
【０２７６】
いくつかの実施態様において、式(4000)のリンカー-ペイロードは、式(4001)、(4002)、(4003)、又は(4004)の構造:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体を有する;
【化２２０】
2021523147.tif 000266
(式中、
SP1及びSP2は、存在する場合、いくつかの及び任意の実施態様において、本明細書で定義されるスペーサー基であり;
各々のAAは、アミノ酸残基であり;
pは、1〜10の整数であり;
RGは、反応基残基であり;かつ
RB1、RB2、R7、及びbは、いくつかの及び任意の実施態様において、本明細書で定義されている通りである)。
【０２７７】
いくつかの実施態様において、式(4000)、(4001)、(4002)、(4003)、又は(4004)のリンカー-ペイロードは、表3のリンカー-ペイロードから選択される。
【０２７８】
本明細書に提供されるのは、式(7000)によるリンカー-リファマイシン類似体又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である;
RG-L-F  式(7000)
(式中、
Fは、リファマイシン類似体であり;
Lは、本明細書に記載されるリンカーであり;かつ
RGは、本明細書に記載される任意の反応基残基である)。
【０２７９】
いくつかの実施態様において、Fは、本明細書に記載されるリファマイシン類似体である。いくつかの実施態様において、Fは、リファログ:
【化２２１】
2021523147.tif 000267
である。いくつかの実施態様において、Fは、リファンピシン:
【化２２２】
2021523147.tif 000268
である。
【０２８０】
また本明細書に提供されるのは、式(D)によるリンカーペイロードである:
【化２２３】
2021523147.tif 000269
。
【０２８１】
本明細書に提供されるのは、リンカー又はリンカー-スペーサーを介して抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされたステロイドが、式(A-1)の化合物又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である、リンカー-ステロイドである;
【化２２４】
2021523147.tif 000270
(式中、
R1及びR2は、独立に、-H、アルキル、アルキル-C(O)-O-、-OH、もしくはハロであるか;又はR1及びR2は、一緒に、
【化２２５】
2021523147.tif 000271
を形成し、
ここで、R4は、アルキル、アリール、アリールアルキル、又はN-含有ヘテロシクロアルキルであり、
ここで、該アルキル、アリール、アリールアルキル、及びN-含有ヘテロシクロアルキルは、各々の場合に独立に、-NRAaRAbで任意に置換されており;
R3は、-O、RZ-C(O)-X-、-ヘテロアルキル、-ピペリジニル、-NRAaRAb、-オキシアリール-NRAaRAb、又は-Z-A'(RP)tであり;
RZは、アルキルであり;
Xは、O又はNRAaであり;
Zは、S、S(O)、S(O)2、SO2NRAa、O、C(O)NRAa、C(O)、又はNRAaであり;
A'は、アリール、アリールアルキル、又はヘテロアリールであり;
RPは、各々の場合に独立に、ハロ、任意に置換されたアルキル、-OH、又は-NRAaRAbであり;
RAa及びRAbは、各々の場合に独立に、-H、任意に置換されたアルキル、又は任意に置換されたアリールであり;
下付文字aは、0〜19の整数であり;かつ
tは、1〜3の整数であり;かつ
R5A及びR5Bは、各々独立に、ハロ又は水素原子であり;
ここで、基R3又はR4は、リンカーに結合している)。
【０２８２】
本明細書に提供されるのは、式Ab-L'-SP-D又はBA-L'-SP-Dの抗体-薬物コンジュゲートであり、ここで、Dは、ブデソニドプロドラッグ又はブデソニド類似体もしくは誘導体(フッ素化類似体及び誘導体を含む)のプロドラッグであり、かつここで、Ab、BA、L'、及びSPは、本明細書に記載される任意の実施態様において定義されている通りである。いくつかの実施態様において、SPは、D又は
【化２２６】
2021523147.tif 000272
を放出することができる部分である。いくつかの実施態様において、生理的条件下で、LとSPの間の結合が切断されて、ステロイドプロドラッグ、すなわち、H-SP-D又は
【化２２７】
2021523147.tif 000273
を放出し、その後、SPとDの間の結合、又はSPと
【化２２８】
2021523147.tif 000274
の間の結合が切断されて、生物学的活性ステロイドを放出する。
【０２８３】
いくつかの例において、式(I)、(IA)、(IB)、(IB-1)、(IB-2)、(IC)、(ID)、(IE)、(III)、又は(3000)のADCは、表1及び/又は表2並びに実施例の節に記載されているADCである。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される任意の抗体薬物コンジュゲート中のステロイドペイロードは、
【化２２９】
2021523147.tif 000275
又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である。
【０２８４】
本明細書に提供されるのは、式(5001)、(5002)、(5003)、又は(5004)の本明細書に記載される任意のLXR-モジュレーター化合物の抗体-薬物コンジュゲート:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくはその位置異性体、或いはその混合物である;
【化２３０】
2021523147.tif 000276
(式中、Lは、いくつかの又は任意の実施態様において、本明細書に記載される任意のリンカーであり;
nは、1〜30の整数であり;
BAは、結合剤又はPEG修飾結合剤であり;かつ
RB1、RB2、R7、及びbは、いくつかの及び任意の実施態様において、本明細書で定義されている通りである)。
【０２８５】
本明細書に提供されるのは、式(6001)、(6002)、(6003)、又は(6004)の本明細書に記載される任意のLXR-モジュレーター化合物の抗体-薬物コンジュゲート:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくはその位置異性体、或いはその混合物である;
【化２３１】
2021523147.tif 000277
(式中、SP1及びSPは、存在する場合、いくつかの又は任意の実施態様において、本明細書で定義されるスペーサー基であり;
各々のAAは、アミノ酸残基であり;
pは、1〜10の整数であり;
nは、1〜30の整数であり;
BAは、結合剤又はPEG修飾結合剤であり;かつ
RB1、RB2、R7、及びbは、いくつかの及び任意の実施態様において、本明細書で定義されている通りである)。
【０２８６】
本明細書に提供されるのは、式(6005)の本明細書に記載される任意のLXR-モジュレーター化合物の抗体-薬物コンジュゲート:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくはその位置異性体、或いはその混合物である;
【化２３２】
2021523147.tif 000278
(式中、RB1、RB2、R7、b、BA、RG1、SP1、AA1、及びAA2は、いくつかの又は任意の実施態様において、本明細書で定義されている通りである)。
【０２８７】
いくつかの例において、式(I)、(IA)、(IB)、(IB-1)、(IB-2)、(IC)、(ID)、(IE)、(5001)、(5002)、(5003)、(5004)、(6001)、(6002)、(6003)、(6004)、又は(6005)のADCは、表1及び/又は表2並びに実施例の節に記載されるADCである。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される任意の抗体薬物コンジュゲート中のLXRモジュレーターペイロードは、
【化２３３】
2021523147.tif 000279
又はその医薬として許容し得る塩又は溶媒和物である。
【０２８８】
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載され、かつ式(7001)の構造を有する任意のリファマイシン類似体の抗体-薬物コンジュゲート、又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくはその位置異性体、或いはその混合物である;
【化２３４】
2021523147.tif 000280
(式中:
X1cは、-S-; -O-及び-NR5cから選択され;
R1cは、アミノ-C1-6アルキル; C1-6アルキルアミノC1-6アルキル;ジ-C1-6アルキルアミノC1-6アルキル;ヒドロキシ-C1-6アルキル; HS-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-N(R5c)-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-O-C1-6アルキル;(R5c)2N-C1-6アルキレン-S-C1-6アルキル;ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクロアルキル-C1-6アルキルであり;ここで、ヘテロシクロアルキルは、O、N、及びSから選択される1個、2個、又は3個のヘテロ原子を含み;かつここで、ヘテロシロアルキル(heterocyloalkyl)は、ハロ、C1-6アルキル、-OH、又は=Oで任意に置換されており;
R2c、R3c、及びR4cは、独立に、水素、C1-6アルキル、及び-(C=O)-R5cから選択され;
各々のRacは、存在する場合、独立に、-F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NH2;及びC1-6アルコキシから選択され;かつ
R5cは、出現する毎に独立に、水素;及びC1-6アルキルから選択され;
Lは、リンカーであり;
BAは、結合剤であり;かつ
下付文字nは、1〜30の整数である)。
【０２８９】
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載され、かつ式(7002)の構造を有する任意のリファマイシン類似体の抗体-薬物コンジュゲート:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくはその位置異性体、或いはその混合物である;
【化２３５】
2021523147.tif 000281
(式中、BA、RG1、SP1、AA1、AA2、R1c、Rbc、Rac、X1c、R2c、R3c、R4c、及びnは、いくつかの又は任意の実施態様において、本明細書で定義されている通りである)。
【０２９０】
本明細書に提供されるのは、式(7003)の構造を有する抗体-リファマイシン類似体コンジュゲート:又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくはその位置異性体、或いはその混合物である;
【化２３６】
2021523147.tif 000282
(式中:
X1cは、-S-; -O-、及びcから選択され;
R1cは、
【化２３７】
2021523147.tif 000283
であり;ここで、Yは、C又はNであり;
R2c、R3c、及びR4cは、独立に、水素、C1-6アルキル、及び-(C=O)-R5cから選択され;
R5cは、出現する毎に独立に、非存在であるか、又は水素;及びC1-6アルキルから選択され;
各々のAAは、独立に選択されるアミノ酸であり;
SP1は、非存在、又はスペーサーであり;
RG1は、反応基残基であり;
BAは、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片であり;
下付文字nは、1〜30の整数であり;
下付文字wは、2、3、又は4であり;
ここで、R1cは、波線
【化２３８】
2021523147.tif 000284
によって示される窒素原子を介して、リンカーに結合している)。
【０２９１】
式(7003)の様々な実施態様において、SP1、RG1、及びAAは、いくつかの及び/又は任意の特定の実施態様において、本明細書で定義されている通りである。
【０２９２】
式(7003)のいくつかの実施態様において、X1cはOである。式(7003)のいくつかの実施態様において、X1cはSである。式(7003)のいくつかの実施態様において、X1cはである。式(7003)のいくつかの実施態様において、X1cはNR5cである。
【０２９３】
式(7003)のいくつかの実施態様において、BAは、N297Q突然変異を含む;抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。
【０２９４】
式(7003)のいくつかの実施態様において、下付文字wは2である。
【０２９５】
式(7003)のいくつかの実施態様において、(AA)2は、バリン-シトルリンである。
【０２９６】
式(7003)のいくつかの実施態様において、SP1は、
【化２３９】
2021523147.tif 000285
を含む。式(7003)のいくつかの実施態様において、SP1は、
【化２４０】
2021523147.tif 000286
を含む。
【０２９７】
式(7003)のいくつかの実施態様において、RG1は、
【化２４１】
2021523147.tif 000287
を含む。
【０２９８】
式(7003)のいくつかの実施態様において、
X1cは、Oであり;
R1cは、
【化２４２】
2021523147.tif 000288
であり;ここで、Yは、C又はNであり;ここで、R1cは、R1cの四級窒素原子を介して、リンカーに結合しており;
R5cは、C1-6アルキル;かつ
R6cは、対イオンである。
【０２９９】
そのような実施態様のいくつかにおいて、R1cは、
【化２４３】
2021523147.tif 000289
である。そのような実施態様のいくつかにおいて、R1cは、
【化２４４】
2021523147.tif 000290
である。そのような実施態様のいくつかにおいて、R1cは、
【化２４５】
2021523147.tif 000291
である。そのような実施態様のいくつかにおいて、R6cは、I-、Cl-、又はBr-であり、いつのかの例において、R6cは、I-である。
【０３００】
式(7003)のいくつかの実施態様において、リファマイシン類似体は:
【化２４６】
2021523147.tif 000292
である。式(7003)のいくつかの実施態様において、リファマイシン類似体は:
【０３０１】
【化２４７】
2021523147.tif 000293
である。式(7003)のいくつかの実施態様において、リファマイシン類似体は:
【化２４８】
2021523147.tif 000294
である。
【０３０２】
さらに本明細書に提供されるのは、式(7004)によるリファマイシン化合物(例えば、リファンピシン)を含む抗体-薬物コンジュゲートである:
【化２４９】
2021523147.tif 000295
。
【０３０３】
さらに本明細書に提供されるのは、式(7005)によるリファマイシン化合物(例えば、リファンピシン)を含む抗体-薬物コンジュゲートである:
【化２５０】
2021523147.tif 000296
(式中、L及びBAは、いくつかの又は任意の実施態様において、本明細書で定義されている通りである)。
【０３０４】
いくつかの例において、式(I)、(IA)、(IB)、(IB-1)、(IB-2)、(IC)、(ID)、(IE)、(7001)(7002)、(7003)、(7004)、及び/又は(7005)のADCは、表2及び/又は実施例の節に記載されるADCである。
【０３０５】
またADCのこれらの例に含まれるのは、その医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、その位置異性体、又はその位置異性体の混合物であり、ここで、各々の
【化２５１】
2021523147.tif 000297
は、結合剤との結合であり;かつ各々の
【化２５２】
2021523147.tif 000298
は、ペイロードとの結合である。
【０３０６】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示される抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片、又はPEG修飾抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片及び表3のリンカー-ペイロードからなる群から選択されるリンカー-ペイロード(LP)を含むADC、又はその立体異性体形態もしくはその位置異性体もしくはその位置異性体の混合物である。
【０３０７】
また本明細書に提供されるのは、1以上の放射性核種にコンジュゲートされた抗MSR1抗体を含む抗体-放射性核種コンジュゲート(ARC)である。本開示のこの態様との関連において使用することができる例示的な放射性核種としては、例えば、225Ac、212Bi、213Bi、131I、186Re、227Th、222Rn、223Ra、224Ra、及び90Yが挙げられるが、これらに限定されない。
表1: ADC及びその構造のリスト
【表３】
2021523147.tif 000299
2021523147.tif 000300
2021523147.tif 000301
2021523147.tif 000302
2021523147.tif 000303
2021523147.tif 000304
2021523147.tif 000305
2021523147.tif 000306
【０３０８】
表1のADCにおいて、Abは、本明細書に提供される抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、Abは、本明細書に記載されるグルタミン側鎖上のPEG基
【化２５３】
2021523147.tif 000307
で修飾される(本明細書において、PEG修飾抗体と呼ばれる)。ある実施態様において、PEG基は、アジド基で終わり、本明細書に記載されるリンカー-ペイロード(例えば、表3及び実施例に記載されるリンカーペイロード)との反応を容易にする。ある実施態様において、PEG基は、本明細書に記載されるトリアゾール又はトリアゾール誘導体を介して、リンカー-ペイロードに連結される。ADCにおいて、nは、1〜10の整数、例えば、1、2、3、又は4である。PEG基において、nnは、1〜10の整数、例えば、1、2、3、4、又は5である。他の実施態様において、表1のADC中の各々のBAは、
【化２５４】
2021523147.tif 000308
であり、ここで、Ab1は、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片であり; Rは、C2-4-アルキレンであり;かつnnは、2〜4までから選択される整数であり、かつ各々のnは、1〜10の整数、例えば、1、2、3、又は4である。
【０３０９】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示される抗体及び表2のリンカー-ペイロードからなる群から選択されるリンカー-ペイロード(LP)を含むADC、又はその立体異性体形態もしくはその位置異性体もしくはその位置異性体の混合物である。
表2: ADC及びその構造のリスト
【表４】
2021523147.tif 000309
2021523147.tif 000310
2021523147.tif 000311
2021523147.tif 000312
2021523147.tif 000313
2021523147.tif 000314
2021523147.tif 000315
2021523147.tif 000316
2021523147.tif 000317
2021523147.tif 000318
2021523147.tif 000319
2021523147.tif 000320
2021523147.tif 000321
2021523147.tif 000322
2021523147.tif 000323
2021523147.tif 000324
2021523147.tif 000325
2021523147.tif 000326
2021523147.tif 000327
2021523147.tif 000328
2021523147.tif 000329
2021523147.tif 000330
2021523147.tif 000331
2021523147.tif 000332
2021523147.tif 000333
2021523147.tif 000334
【０３１０】
表2のADCにおいて、Abは、本明細書に提供される抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、Abは、本明細書に記載されるグルタミン側鎖上のPEG基で修飾される。ADCにおいて、nは、1〜10の整数、例えば、1、2、3、又は4である。
【０３１１】
本明細書に提供されるのは、ペイロード
【化２５５】
2021523147.tif 000335
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、N297Q突然変異を含む。
【０３１２】
本明細書に提供されるのは、表4の6つの相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)の組を含み、かつペイロード
【化２５６】
2021523147.tif 000336
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片、又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、表4の6つの相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)の組及びN297Q突然変異を含む。
【０３１３】
本明細書に提供されるのは、配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3を含み、かつペイロード
【化２５７】
2021523147.tif 000337
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３１４】
本明細書に提供されるのは、表4の可変領域である重鎖可変領域(HCVR)の組及び軽鎖可変領域(LCVR)の組を含み、かつペイロード
【化２５８】
2021523147.tif 000338
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、表4の可変領域である重鎖可変領域(HCVR)の組及び軽鎖可変領域(LCVR)の組及びN297Q突然変異を含む。
【０３１５】
本明細書に提供されるのは、配列番号50を含む重鎖可変領域(HCVR)及び配列番号58の軽鎖可変領域(LCVR)を含み、かつペイロード
【化２５９】
2021523147.tif 000339
にコンジュゲートされた、
抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、配列番号50を含む重鎖可変領域(HCVR)及び配列番号58の軽鎖可変領域(LCVR)、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３１６】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２６０】
2021523147.tif 000340
ここで、該抗体は、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、N297Q突然変異を含む。
【０３１７】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２６１】
2021523147.tif 000341
ここで、該抗体は、表4の6つの相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)の組を含む抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、表4の6つの相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)の組及びN297Q突然変異を含む。
【０３１８】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２６２】
2021523147.tif 000342
ここで、該抗体は、配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3を含む、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３１９】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２６３】
2021523147.tif 000343
ここで、該抗体は、表4の可変領域である重鎖可変領域(HCVR)の組及び軽鎖可変領域(LCVR)の組を含む、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、表4可変領域である重鎖可変領域(HCVR)の組及び軽鎖可変領域(LCVR)の組、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３２０】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２６４】
2021523147.tif 000344
ここで、該抗体は、配列番号50を含む重鎖可変領域(HCVR)及び配列番号58の軽鎖可変領域(LCVR)を含む、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、配列番号50を含む重鎖可変領域(HCVR)及び配列番号58の軽鎖可変領域(LCVR)、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３２１】
本明細書に提供されるのは、ペイロード
【化２６５】
2021523147.tif 000345
にコンジュゲートされた抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、N297Q突然変異を含む。
【０３２２】
本明細書に提供されるのは、表4の6つの相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)の組を含み、かつペイロード
【化２６６】
2021523147.tif 000346
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、表4の6つの相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)の組及びN297Q突然変異を含む。
【０３２３】
本明細書に提供されるのは、配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3を含み、かつペイロード
【化２６７】
2021523147.tif 000347
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３２４】
本明細書に提供されるのは、表4の可変領域である重鎖可変領域(HCVR)の組及び軽鎖可変領域(LCVR)の組を含み、かつペイロード
【化２６８】
2021523147.tif 000348
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、表4の可変領域である重鎖可変領域(HCVR)の組及び軽鎖可変領域(LCVR)の組、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３２５】
本明細書に提供されるのは、配列番号50を含む重鎖可変領域(HCVR)及び配列番号58の軽鎖可変領域(LCVR)を含み、かつペイロード
【化２６９】
2021523147.tif 000349
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、配列番号50を含む重鎖可変領域(HCVR)及び配列番号58の軽鎖可変領域(LCVR)、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３２６】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２７０】
2021523147.tif 000350
ここで、該抗体は、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、N297Q突然変異を含む。
【０３２７】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２７１】
2021523147.tif 000351
ここで、該抗体は、表4の6つの相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)の組を含む抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、表4の6つの相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)の組及びN297Q突然変異を含む。
【０３２８】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２７２】
2021523147.tif 000352
ここで、該抗体は、配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3を含む、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３２９】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２７３】
2021523147.tif 000353
ここで、該抗体は、表4の可変領域である重鎖可変領域(HCVR)の組及び軽鎖可変領域(LCVR)の組を含む、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、表4の可変領域である重鎖可変領域(HCVR)の組及び軽鎖可変領域(LCVR)の組、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３３０】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２７４】
2021523147.tif 000354
ここで、該抗体は、配列番号50を含む重鎖可変領域(HCVR)及び配列番号58の軽鎖可変領域(LCVR)を含む、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、配列番号50を含む重鎖可変領域(HCVR)及び配列番号58の軽鎖可変領域(LCVR)、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３３１】
本明細書に提供されるのは、ペイロード
【化２７５】
2021523147.tif 000355
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、N297Q突然変異を含む。
【０３３２】
本明細書に提供されるのは、表4の6つの相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)の組を含み、かつペイロード
【化２７６】
2021523147.tif 000356
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、表4の6つの相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)の組及びN297Q突然変異を含む。
【０３３３】
本明細書に提供されるのは、配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3を含み、かつペイロード
【化２７７】
2021523147.tif 000357
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３３４】
本明細書に提供されるのは、表4の可変領域である重鎖可変領域(HCVR)の組及び軽鎖可変領域(LCVR)の組を含み、かつペイロード
【化２７８】
2021523147.tif 000358
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、表4の可変領域である重鎖可変領域(HCVR)の組及び軽鎖可変領域(LCVR)の組、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３３５】
本明細書に提供されるのは、配列番号50を含む重鎖可変領域(HCVR)及び配列番号58の軽鎖可変領域(LCVR)を含み、かつペイロード
【化２７９】
2021523147.tif 000359
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、配列番号50を含む重鎖可変領域(HCVR)及び配列番号58の軽鎖可変領域(LCVR)、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３３６】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２８０】
2021523147.tif 000360
ここで、該抗体は、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、N297Q突然変異を含む。
【０３３７】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２８１】
2021523147.tif 000361
ここで、該抗体は、表4の6つの相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)の組を含む抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、表4の6つの相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)の組及びN297Q突然変異を含む。
【０３３８】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２８２】
2021523147.tif 000362
ここで、該抗体は、配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3を含む、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３３９】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２８３】
2021523147.tif 000363
ここで、該抗体は、表4の可変領域である重鎖可変領域(HCVR)の組及び軽鎖可変領域(LCVR)の組を含む、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、表4の可変領域である重鎖可変領域(HCVR)の組及び軽鎖可変領域(LCVR)の組、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３４０】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２８４】
2021523147.tif 000364
ここで、該抗体は、配列番号50を含む重鎖可変領域(HCVR)及び配列番号58の軽鎖可変領域(LCVR)を含む、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、配列番号50を含む重鎖可変領域(HCVR)及び配列番号58の軽鎖可変領域(LCVR)、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３４１】
本明細書に提供されるのは、ペイロード
【化２８５】
2021523147.tif 000365
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、N297Q突然変異を含む。
【０３４２】
本明細書に提供されるのは、表4の6つの相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)の組を含み、かつペイロード
【化２８６】
2021523147.tif 000366
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、表4の6つの相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)の組及びN297Q突然変異を含む。
【０３４３】
本明細書に提供されるのは、配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3を含み、かつペイロード
【化２８７】
2021523147.tif 000367
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３４４】
本明細書に提供されるのは、表4の可変領域である重鎖可変領域(HCVR)の組及び軽鎖可変領域(LCVR)の組を含み、かつペイロード
【化２８８】
2021523147.tif 000368
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、表4の可変領域である重鎖可変領域(HCVR)の組及び軽鎖可変領域(LCVR)の組、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３４５】
本明細書に提供されるのは、配列番号50を含む重鎖可変領域(HCVR)及び配列番号58の軽鎖可変領域(LCVR)を含み、かつペイロード
【化２８９】
2021523147.tif 000369
にコンジュゲートされた、抗MSR1抗体もしくはその抗原結合断片又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくは立体異性体形態である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、配列番号50を含む重鎖可変領域(HCVR)及び配列番号58の軽鎖可変領域(LCVR)、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３４６】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２９０】
2021523147.tif 000370
ここで、X-は、医薬として許容し得る対イオンであり、かつここで、該抗体は、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、N297Q突然変異を含む。
【０３４７】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２９１】
2021523147.tif 000371
ここで、X-は、医薬として許容し得る対イオンであり、かつここで、該抗体は、表4の6つの相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)の組を含む抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、表4の6つの相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)の組及びN297Q突然変異を含む。
【０３４８】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２９２】
2021523147.tif 000372
ここで、X-は、医薬として許容し得る対イオンであり、かつここで、該抗体は、配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3を含む、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、配列番号52を含む重鎖相補性決定領域(HCDR)-1;配列番号54を含むHCDR2;配列番号56を含むHCDR3;配列番号60を含む軽鎖相補性決定領域(LCDR)-1;配列番号62を含むLCDR2;及び配列番号64を含むLCDR3、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３４９】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２９３】
2021523147.tif 000373
ここで、X-は、医薬として許容し得る対イオンであり、かつここで、該抗体は、表4の可変領域である重鎖可変領域(HCVR)の組及び軽鎖可変領域(LCVR)の組を含む、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、表4の可変領域である重鎖可変領域(HCVR)の組及び軽鎖可変領域(LCVR)の組、並びにN297Q突然変異を含む。
【０３５０】
次式による抗体-薬物コンジュゲート(ADC):又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、立体異性体形態、もしくは位置異性体、或いはその混合物;
【化２９４】
2021523147.tif 000374
ここで、X-は、医薬として許容し得る対イオンであり、かつここで、該抗体は、配列番号50を含む重鎖可変領域(HCVR)及び配列番号58の軽鎖可変領域(LCVR)を含む、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片である。そのような実施態様のいくつかにおいて、薬物抗体比(DAR)は1〜4である。いくつかの実施態様において、DARは1である。いくつかの実施態様において、DARは2である。いくつかの実施態様において、DARは3である。いくつかの実施態様において、DARは4である。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片は、配列番号50を含む重鎖可変領域(HCVR);配列番号58の軽鎖可変領域(LCVR);及びN297Q突然変異を含む。
【０３５１】
本明細書で使用される場合、ある実施態様において、アミノ酸が、例えば、部分-SP1-AA1-AA2-中のスペーサーSP1に結合している場合、アミノ酸AA1は、そのアミノ基を介して、スペーサーSP1に結合している。スペーサー残基は、アミノ酸中のアミノ基との結合を形成した官能基の部分を含む。ほんの一例として、以下の構造:
【化２９５】
2021523147.tif 000375
において、バリン残基は、示されているようなSP1に結合し、SP1残基は、この例において、(C=O)部分を含む。また、この例において、SP1残基は、反応基との結合を形成するのに好適な官能基を含み、かつSP1残基は、-NH-部分を含む。当業者は、同様の分類を本明細書に記載される他の全ての式に適用することができることを認識しているであろう。
【０３５２】
本明細書に記載される抗体薬物コンジュゲートは、当業者に公知のコンジュゲーション条件を用いて調製することができる(例えば、引用により本明細書中に完全に組み込まれる、Doroninaらの文献、Nature Biotechnology 2003, 21, 7, 778を参照)。いくつかの実施態様において、ADCは、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片を所望のリンカー及びペイロードを含む化合物と反応させることにより調製され、ここで、該リンカーは、抗体又は抗原結合タンパク質と、例えば、該抗体又は抗原結合タンパク質の所望の残基で反応する部分を保有する。例示的な条件は、以下の実施例に記載されている。
【０３５３】
(抗体-薬物コンジュゲートの調製)
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、抗体-薬物コンジュゲートを調製するプロセスであって、抗MSR1抗体もしくはPEG修飾抗MSR1抗体又はその抗原結合断片を表3から選択されるリンカー-ペイロード又はリンカー-スペーサー-ペイロードと接触させることを含む、プロセスである。また本明細書に提供されるのは、抗MSR1抗体もしくはPEG修飾抗MSR1抗体又はその抗原結合断片を表3から選択されるリンカーペイロード又はリンカー-スペーサー-ペイロードとコンジュゲートすることにより調製される抗体薬物コンジュゲート又はその立体異性体形態もしくはその位置異性体もしくはその位置異性体の混合物である。
表3:リンカー-ペイロード(LP)及びその構造のリスト
【表５】
2021523147.tif 000376
2021523147.tif 000377
2021523147.tif 000378
2021523147.tif 000379
2021523147.tif 000380
2021523147.tif 000381
2021523147.tif 000382
2021523147.tif 000383
2021523147.tif 000384
2021523147.tif 000385
2021523147.tif 000386
2021523147.tif 000387
2021523147.tif 000388
2021523147.tif 000389
【０３５４】
上の表の化合物は、本明細書中の実施例に記載されている通りに調製することができる。
【０３５５】
また本明細書に提供されるのは、リファマイシン類似体(例えば、リファンピシン)の抗体-薬物コンジュゲートを調製する方法であって、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片を、式(D)によるリンカーペイロード:
【化２９６】
2021523147.tif 000390
と、抗MSR1抗体又はその抗原結合断片間の結合を形成させるのに好適な条件下で接触させる工程を含む、方法である。
【０３５６】
(エピトープマッピング及び関連技術)
本発明の抗体が結合するエピトープは、MSR1タンパク質の3以上(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより多く)のアミノ酸の単一の連続する配列からなり得る。或いは、該エピトープは、MSR1の複数の不連続なアミノ酸(又はアミノ酸配列)からなり得る。いくつかの実施態様において、該エピトープは、MSR1の修飾LDL結合ドメイン又はその近くに位置する。他の実施態様において、該エピトープは、MSR1の修飾LDL結合ドメインの外側に、例えば、抗体が、そのようなエピトープに結合したときに、MSR1に対する修飾LDLの結合を妨害しないMSR1の表面上の位置に位置する。
【０３５７】
当業者に公知の様々な技法を用いて、抗体がポリペプチド又はタンパク質内の「1以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定することができる。例示的な技法としては、例えば、ルーチンの交差遮断アッセイ、例えば、Harlow及びLaneの文献、抗体(Antibodies)(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)に記載されているもの、アラニンスキャニング突然変異解析、ペプチドブロット解析(Reinekeの文献、2004, Methods Mol Biol 248:443-463)、及びペプチド切断解析が挙げられる。さらに、抗原のエピトープ切り出し、エピトープ抽出、及び化学修飾などの方法を利用することができる(Tomerの文献、2000, Protein Science 9:487-496)。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することができる別の方法は、マススペクトロメトリーによって検出される水素/重水素交換である。一般的に、水素/重水素交換法は、対象となるタンパク質を重水素標識し、その後、抗体を重水素標識タンパク質に結合させることを含む。次に、タンパク質/抗体複合体を水に移して、抗体によって保護される残基(重水素標識されたままである)を除く全ての残基で水素-重水素交換を生じさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断及びマススペクトロメトリー解析に供し、それにより、抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ehringの文献(1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen及びSmithの文献(2001) Anal. Chem. 73:256A-265Aを参照されたい。
【０３５８】
実施態様には、本明細書に記載される特異的な例示的抗体(例えば、本明細書中の表4に示されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体)のいずれかと同じエピトープに結合する抗MSR1抗体が含まれる。同様に、実施態様には、MSR1との結合を、本明細書に記載される特異的な例示的抗体(例えば、本明細書中の表4に示されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体)のいずれかと競合する抗MSR1抗体も含まれる。
【０３５９】
当技術分野で公知の及び本明細書中に、例えば、実施例7に例示されているルーチンの方法を使用することにより、抗体が参照抗MSR1抗体と同じエピトープに結合するかどうか、又は参照抗MSR1抗体との結合について競合するかどうか容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本明細書に開示される参照抗MSR1抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、該参照抗体をMSR1タンパク質に結合させる。次に、試験抗体がMSR1分子に結合する能力を評価する。参照抗MSR1抗体との飽和結合の後、試験抗体がMSR1に結合することができる場合、試験抗体が参照抗MSR1抗体と異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。他方、参照抗MSR1抗体との飽和結合の後、試験抗体がMSR1分子に結合することができない場合、試験抗体は、本発明の参照抗MSR1抗体によって結合されるエピトープと同じエピトープに結合することができる。その後、さらなるルーチンの実験(例えば、ペプチド突然変異及び結合解析)を実施して、観察される試験抗体の結合の欠如が、実際に、参照抗体と同じエピトープとの結合によるものであるかどうか、又は立体遮断(もしくは別の現象)が観察される結合の欠如の原因であるかどうかを確認することができる。この種の実験は、当技術分野で利用可能なELISA、RIA、Biacore、フローサイトメトリー、又は任意の他の定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを用いて実施することができる。本発明のある実施態様によれば、例えば、競合結合アッセイで測定したとき、1、5、10、20、又は100倍過剰の一方の抗体が、もう一方の結合を、少なくとも50％、しかし、好ましくは、75％、90％、又はさらには99％阻害する場合、2つの抗体は、同じ(又は重複する)エピトープに結合する(例えば、Junghansらの文献、Cancer Res. 1990:50:1495-1502を参照)。或いは、一方の抗体の結合を低下又は消失させる抗原中の本質的に全てのアミノ酸突然変異がもう一方の結合を低下又は消失させる場合、2つの抗体は、同じエピトープに結合するとみなされる。一方の抗体の結合を低下又は消失させるアミノ酸突然変異のサブセットのみがもう一方の結合を低下又は消失させる場合、2つの抗体は、「重複するエピトープ」を有するとみなされる。
【０３６０】
抗体が参照抗MSR1抗体との結合について競合する(又は結合について交差競合する)かどうかを決定するために、上記の結合方法を2つの方向で実施する。第一の方向では、参照抗体を飽和条件下でMSR1タンパク質に結合させ、その後、MSR1分子に対する試験抗体の結合を評価する。第二の方向では、試験抗体を飽和条件下でMSR1分子に結合させ、その後、MSR1分子に対する参照抗体の結合を評価する。両方の方向で、第一の(飽和)抗体がMSR1分子に結合することができる場合、試験抗体及び参照抗体はMSR1との結合について競合すると結論付けられる。当業者によって理解されているように、参照抗体との結合について競合する抗体は、必ずしも、参照抗体と同じエピトープに結合することができるのではなく、重複又は隣接するエピトープに結合することにより、参照抗体の結合を立体的に遮断することができる。
【０３６１】
(ヒト抗体の調製)
本明細書に開示される抗MSR1抗体は、完全ヒト抗体であることができる。完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である。任意のそのような既知の方法を本発明との関連において用いて、ヒトMSR1に特異的に結合するヒト抗体を作製することができる。
【０３６２】
例えば、VELOCIMMUNE(商標)技術、又は完全ヒトモノクローナル抗体を作製するための任意の他の同様の既知の方法を用いて、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有するMSR1に対する高親和性キメラ抗体をまず単離する。下の実験の節に見られるように、該抗体を特徴解析し、親和性、リガンド遮断活性、選択性、エピトープなどを含む、所望の特徴について選択する。必要な場合、マウス定常領域を所望のヒト定常領域、例えば、野生型又は修飾IgG1又はIgG4と交換して、完全ヒト抗MSR1抗体を作製する。選択される定常領域は特定の用途によって異なり得るが、高親和性抗原結合及び標的特異性特徴は可変領域中に存在する。ある例において、完全ヒト抗MSR1抗体は、抗原陽性B細胞から直接単離される。
【０３６３】
(生物学的等価物)
本明細書に開示される抗MSR1抗体及び抗体断片は、記載されている抗体のアミノ酸配列と異なるが、ヒトMSR1に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのような変異体抗体及び抗体断片は、親配列と比較したとき、アミノ酸の1以上の付加、欠失、又は置換を含むが、記載されている抗体の生物活性と本質的に等価である生物活性を示す。同様に、本明細書に開示される抗MSR1抗体をコードするDNA配列は、開示されている配列と比較したとき、ヌクレオチドの1以上の付加、欠失、又は置換を含むが、本明細書に開示される抗MSR1抗体又は抗体断片と本質的に生物学的に等価である抗MSR1抗体又は抗体断片をコードする配列を包含する。そのような変異体アミノ酸及びDNA配列の例は、上で論じられている。
【０３６４】
例えば、2つの抗原結合タンパク質又は抗体が、その吸収の速度及び度合いが、同様の実験条件下、単一用量又は複数用量のいずれかで、同じモル用量で投与されたときに有意差を示さない医薬等価物又は医薬代替物である場合、これらは、生物学的に等価であるとみなされる。いくつかの抗体は、その吸収の度合いは等価であるが、その吸収速度が等価でない場合、等価物又は医薬代替物とみなされ、なおかつ、生物学的に等価であるとみなされてもよい。なぜなら、そのような吸収速度の差は、意図されたものであり、表示に反映されており、例えば、長期使用時の有効な体内薬物濃度の達成にとって本質的ではなく、かつ試験される特定の薬品について医学的に重要ではないとみなされるからである。
【０３６５】
一実施態様において、2つの抗原結合タンパク質が、その安全性、純度、及び効力の点で臨床的に意義のある差がない場合、これらは、生物学的に等価である。
【０３６６】
一実施態様において、参照製品と生物学的製品の1回以上の切り替えのない持続的な療法と比較して、臨床的に重要な免疫原性の変化、又は有効性の低下を含む、有害作用のリスクの予想される増加を伴わずに、患者に、そのような切り替えをさせることができる場合、2つの抗原結合タンパク質は、生物学的に等価である。
【０３６７】
一実施態様において、2つの抗原結合タンパク質は、それらが両方とも、そのような機序が知られている範囲内で、使用条件(単数又は複数)について共通の作用機序(単数又は複数)により作用する場合、生物学的に等価である。
【０３６８】
生物学的等価性は、インビボ及びインビトロの方法によって示すことができる。生物学的等価性の尺度としては、例えば、(a)抗体又はその代謝物の濃度が、血液、血漿、血清、又は他の生体液中で時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験;(b)ヒトのインビボバイオアベイラビリティデータと相関性があり、かつこれを合理的に予測するインビトロ試験;(c)抗体(又はその標的)の適切な急性薬理効果が時間の関数として測定されるヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験;及び(d)抗体の安全性、効力、又はバイオアベイラビリティもしくは生物学的等価性を確立する十分に管理された臨床試験が挙げられる。
【０３６９】
本明細書に開示される抗MSR1抗体の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うか、又は生物活性に必要とされない末端もしくは内部残基もしくは配列を欠失させることにより構築することができる。例えば、生物活性に必須ではないシステイン残基を欠失させるか、又は他のアミノ酸と交換して、再生時の不必要又は不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことができる。他との関連において、生物学的に等価な抗体は、抗体のグリコシル化特徴を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を消失させるか又は除去する突然変異を含む抗MSR1抗体変異体を含み得る。
【０３７０】
(種選択性及び種交差反応性)
ある実施態様によれば、本明細書に提供されるのは、ヒトMSR1に結合するが、他の種由来のMSR1に結合しない抗MSR1抗体である。実施態様には、ヒトMSR1及び1以上の非ヒト種由来のMSR1に結合する抗MSR1抗体も含まれる。例えば、本明細書に開示される抗MSR1抗体は、ヒトMSR1に結合することができ、場合により、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、マカクザル、マーモセット、アカゲザル、又はチンパンジーMSR1のうちの1つ又は複数に結合しても、結合しなくてもよい。ある例示的な実施態様によれば、ヒトMSR1及びマカクザル(例えば、カニクイザル(Macaca fascicularis))MSR1に特異的に結合する抗MSR1抗体が提供される。本明細書に開示される他の抗MSR1抗体は、ヒトMSR1に結合するが、マカクザルMSR1には結合しない、又は弱くしか結合しない。
【０３７１】
(多重特異性抗体)
本明細書に開示される抗体は、単一特異性又は多重特異性(例えば、二重特異性)であることができる。多重特異性抗体は、1つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であってもよく、又は複数の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有していてもよい。例えば、Tuttらの文献、1991, J. Immunol. 147:60-69; Kuferらの文献、2004, Trends Biotechnol. 22:238-244を参照されたい。本明細書に開示される抗MSR1抗体は、別の機能性分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質に連結させるか、又はこれらと共発現させることができる。例えば、抗体又はその断片を(例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合、又はその他によって)1以上の他の分子実体、例えば、別の抗体又は抗体断片に機能的に連結させて、第二の結合特異性を有する二重特異性又は多重特異性抗体を産生することができる。
【０３７２】
実施態様には、免疫グロブリンの一方のアームがヒトMSR1に結合し、免疫グロブリンのもう一方のアームが第二の抗原に特異的である二重特異性抗体が含まれる。MSR1結合アームは、本明細書中の表4に示されるHCVR/LCVR又はCDRアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。ある実施態様において、MSR1結合アームは、ヒトMSR1に結合し、MSR1に対する修飾LDL結合を遮断する。他の実施態様において、MSR1結合アームは、ヒトMSR1に結合するが、MSR1に対する修飾LDL結合を遮断しない。いくつかの実施態様において、MSR1結合アームは、ヒトMSR1に結合し、MSR1シグナル伝達を活性化する。他の実施態様において、MSR1結合アームは、MSR1媒介性受容体刺激を遮断する。実施態様には、抗体の一方のアームがヒトMSR1の第一のエピトープに結合し、該抗体のもう一方のアームがヒトMSR1の第二の異なるエピトープに結合する二重特異性抗体も含まれる。
【０３７３】
本発明との関連において使用することができる例示的な二重特異性抗体フォーマットは、第一の免疫グロブリン(Ig) CH3ドメイン及び第二のIg CH3ドメインの使用を含み、ここで、該第一及び第二のIg CH3ドメインは、少なくとも1アミノ酸だけ互いに異なり、かつここで、少なくとも1つのアミノ酸の違いは、アミノ酸の違いを欠く二重特異性抗体と比較したとき、プロテインAに対する二重特異性抗体の結合を低下させる。一実施態様において、第一のIg CH3ドメインは、プロテインAに結合し、第二のIg CH3ドメインは、プロテインA結合を低下又は消失させる突然変異、例えば、H95R修飾(IMGTエキソン付番による; EU付番によると、H435R)を含有する。第二のCH3は、Y96F修飾(IMGTによる; EUによると、Y436F)をさらに含むことができる。第二のCH3内で見出され得るさらなる修飾としては: IgG1抗体の場合、D16E、L18M、N44S、K52N、V57M、及びV82I(IMGTによる; EUによるとD356E、L358M、N384S、K392N、V397M、及びV422I); IgG2抗体の場合、N44S、K52N、及びV82I(IMGT; EUによるとN384S、K392N、及びV422I);並びにIgG4抗体の場合、Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q、及びV82I(IMGTによる; EUによるとQ355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q、及びV422I)が挙げられる。上記の二重特異性抗体フォーマットに対するバリエーションが本発明の範囲内で企図される。
【０３７４】
本発明との関連において使用することができる他の例示的な二重特異性フォーマットとしては、限定されないが、例えば、scFvベース又はダイアボディ二重特異性のフォーマット、IgG-scFv融合体、二重可変ドメイン(DVD)-Ig、クアドローマ(Quadroma)、ノブ・イントゥ・ホール(knobs-into-holes)、共通軽鎖(例えば、ノブ・イントゥ・ホールを有する共通軽鎖など)、CrossMab、CrossFab、(SEED)ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ(Duobody)、IgG1/IgG2、二重作用性Fab(DAF)-IgG、及びMab2二重特異性フォーマット(前述のフォーマットの概説については、例えば、Kleinらの文献、2012, mAbs 4:6, 1-11、及びその中で引用されている参考文献を参照)が挙げられる。二重特異性抗体は、例えば、オルソゴナルな化学反応性を有する非天然アミノ酸を用いて、規定の組成、原子価、及び形状を有する多量体複合体へと後に自己集合する部位特異的抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲートを生成させるペプチド/核酸コンジュゲーションを用いて構築することもできる(例えば、Kazaneらの文献、J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]を参照)。
【０３７５】
(治療的製剤及び投与)
実施態様は、本明細書に開示される抗MSR1抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、改善された転移、送達、忍容性などをもたらす好適な担体、賦形剤、及び他の薬剤とともに製剤化される。多くの適切な製剤を全ての薬剤師に公知の処方集:レミントンの調剤科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、Mack Publishing Company, Easton, PAにおいて見出すことができる。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ジェル、ワックス、油、脂質、脂質(カチオン性又はアニオン性)含有小胞(例えば、LIPOFECTIN(商標)、Life Technologies, Carlsbad, CA)、DNAコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型及び油中水型エマルジョン、カーボワックスエマルジョン(様々な分子量のポリエチレングリコール)、半固体ゲル、並びにカーボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Powellらの文献、「非経口製剤のための賦形剤の概要(Compendium of excipients for parenteral formulations)」、PDAの文献(1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311も参照されたい。
【０３７６】
患者に投与される抗体の用量は、患者の年齢及びサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに応じて異なり得る。好ましい用量は、通常、体重又は体表面積に従って計算される。成体患者において、本発明の抗体を、通常、約0.01〜約20mg/kg体重、より好ましくは、約0.02〜約7、約0.03〜約5、又は約0.05〜約3mg/kg体重の単一用量で静脈内投与することが有利であり得る。疾病の重症度に応じて、治療の頻度及び持続期間を調整することができる。抗MSR1抗体を投与するための有効投薬量及びスケジュールを実験的に決定することができ;例えば、患者の進展を定期的な評価によってモニタリングし、用量をそれに応じて調整することができる。さらに、投薬量の種間スケーリングを当技術分野で周知の方法を用いて実施することができる(例えば、Mordentiらの文献、1991, Pharmaceut. Res. 8:1351)。
【０３７７】
様々な送達系が公知であり、これらを用いて、本明細書に開示される医薬組成物を投与することができ、該送達系には、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、突然変異体ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス(例えば、Wu及びWuの文献、1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432)がある。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。該組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば、注入又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層(例えば、口腔粘膜、直腸、及び腸粘膜など)からの吸収によって投与することができ、かつ他の生物学的活性剤と一緒に投与することができる。投与は、全身性又は局所性であることができる。
【０３７８】
本明細書に開示される医薬組成物は、標準的な針及びシリンジで皮下又は静脈内送達することができる。さらに、皮下送達に関して、ペン送達装置は、本発明の医薬組成物の送達に容易に応用される。そのようなペン送達装置は、再利用可能又は使い捨てであることができる。再利用可能なペン送達装置は、通常、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用している。カートリッジ内の医薬組成物が全て投与され、カートリッジが空になったら、空のカートリッジをすぐに廃棄し、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。その後、ペン送達装置を再利用することができる。使い捨てペン送達装置には、交換可能なカートリッジがない。それどころか、使い捨てペン送達装置は、装置内のリザーバに保持された医薬組成物で予め充填された状態になっている。該リザーバから医薬組成物が空になったら、装置全体を廃棄する。
【０３７９】
多くの再利用可能なペン及びオートインジェクター送達装置は、本明細書に開示される医薬組成物の皮下送達に応用される。例としては、いくつか例を挙げると、AUTOPEN(商標)(Owen Mumford社, Woodstock, UK)、DISETRONIC(商標)ペン(Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25(商標)ペン、HUMALOG(商標)ペン、HUMALIN 70/30(商標)ペン(Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN)、NOVOPEN(商標) I、II、及びIII(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark)、NOVOPEN JUNIOR(商標)(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark)、BD(商標)ペン(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)、OPTIPEN(商標)、OPTIPEN PRO(商標)、OPTIPEN STARLET(商標)、並びにOPTICLIK(商標)(sanofi-aventis, Frankfurt, Germany)が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物の皮下送達に応用される使い捨てペン送達装置の例としては、いくつか例を挙げると、SOLOSTAR(商標)ペン(sanofi-aventis)、FLEXPEN(商標)(Novo Nordisk)、及びKWIKPEN(商標)(Eli Lilly)、SURECLICK(商標) Autoinjector(Amgen, Thousand Oaks, CA)、PENLET(商標)(Haselmeier, Stuttgart, Germany)、EPIPEN(Dey, L.P.)、並びにHUMIRA(商標)ペン(Abbott Labs, Abbott Park IL)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８０】
ある状況において、医薬組成物を制御放出系で送達することができる。一実施態様において、ポンプを使用してもよい(Langerの文献、上記; Seftonの文献、1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201を参照)。別の実施態様において、ポリマー材料を使用することができる;制御放出の医学的応用(Medical Applications of Controlled Release)、Langer及びWise(編), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Floridaを参照されたい。また別の実施態様において、制御放出系を組成物の標的の近傍に配置することができ、そのため、全身用量のほんの一部のみが必要とされる(例えば、制御放出の医学的応用(Medical Applications of Controlled Release)、上記、第2巻、pp. 115-138に所収のGoodsonの文献、1984を参照)。他の制御放出系は、Langerの文献、1990, Science 249:1527-1533による概説で考察されている。
【０３８１】
注射可能製剤には、静脈内、皮下、皮内、及び筋肉内注射、点滴などのための剤形が含まれ得る。これらの注射可能調製物は、公知の方法によって調製することができる。例えば、注射可能調製物は、例えば、上記の抗体又はその塩を、従来注射に使用されている滅菌水性媒体又は油性媒体中で溶解させるか、懸濁させるか、又は乳化させることにより調製することができる。注射用の水性媒体として、例えば、アルコール(例えば、エタノール)、ポリアルコール(例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤[例えば、ポリソルベート80、HCO-50(水素化ヒマシ油)のポリオキシエチレン(50mol)付加物]などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用し得る、生理食塩水、グルコースを含有する等張溶液、及び他の助剤などがある。油性媒体として、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用し得る、ゴマ油、大豆油などが利用される。このようにして調製された注射剤は、好ましくは、適切なアンプルに充填される。
【０３８２】
有利なことに、上記の経口又は非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に適合するのに適している単位用量の剤形へと調製される。単位用量のそのような剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、注射剤(アンプル)、坐剤などが挙げられる。含まれる前述の抗体の量は、通常、単位用量の剤形当たり約5〜約500mgであり;特に、注射剤の形態では、前述の抗体は、約5〜約100mgで、他の剤形の場合、約10〜約250mgで含まれることが好ましい。
【０３８３】
(抗体の治療的使用)
実施態様には、それを必要としている対象に、抗MSR1抗体又は抗MSR1抗体を含む抗体-薬物コンジュゲート(例えば、本明細書中の表4に記載されるHCVR/LCVR又はCDR配列のいずれかを含む抗MSR1抗体又はADC)を含む治療的組成物を投与することを含む方法が含まれる。治療的組成物は、本明細書に開示される抗MSR1抗体、その抗原結合断片、又はADC(例えば、式(I)、(IA)、(IB)、(IB-1)、(IB-2)、(IC)、(ID)、(IE)、(III)、(3000)、(5001)、(5002)、(5003)、(5004)、(6001)、(6002)、(6003)、(6004)、(6005)、(7001)、(7002)、(7003)、(7004)、及び/もしくは(7005)のADC)のいずれか、並びに医薬として許容し得る担体又は希釈剤を含むことができる。
【０３８４】
本明細書に開示される抗体及びADCは、とりわけ、MSR1発現もしくは活性と関連するか又はMSR1発現もしくは活性によって媒介される、或いは修飾LDLに対して競合することなくMSR1に結合すること及び/もしくはMSR1受容体内在化を促進すること及び/もしくは細胞表面受容体数を減少させることにより治療可能である、任意の疾患もしくは障害の治療、予防、及び/又は改善に有用である。例えば、本明細書に開示される抗体及びADCは、MSR1を発現する及び/又はMSR1媒介性シグナル伝達に応答する細胞、例えば、マクロファージを標的とすることによるアテローム性動脈硬化症、増殖性障害、神経変性障害、及び炎症の治療、停止、又は改善に有用である。
【０３８５】
本明細書に記載される治療方法との関連において、抗MSR1抗体又はそのADCは、単剤療法として(すなわち、唯一の治療剤として)又は1以上の追加の治療剤(その例は、本明細書中の別の場所に記載されている)と組み合わせて投与することができる。
【０３８６】
本明細書に提供されるのは、対象の増殖性疾患、代謝性疾患、炎症、神経変性疾患、又はグルココルチコイド受容体シグナル伝達と関連する疾患、障害、もしくは疾病を治療する方法であって、該対象に、本明細書に記載される化合物(例えば、抗MSR1 ADC)、又は本明細書に記載される化合物を含む医薬組成物の有効治療量を投与することを含む、方法である。
【０３８７】
いくつかの実施態様において、ペイロードがステロイドである場合、該疾患、障害、又は疾病は、限定されないが、喘息、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、薬物過敏反応、アナフィラキシー性鼻炎、通年性又は季節性アレルギー性鼻炎、及び血清病を含む、アレルギー状態;限定されないが、掻痒、脂漏性皮膚炎、神経皮膚炎、湿疹、水疱性ヘルペス状皮膚炎、剥脱性紅皮症、菌状息肉腫、天疱瘡、及び重症多形紅斑(スティーブンス・ジョンソン症候群)を含む、皮膚疾患;限定されないが、原発性又は続発性の副腎皮質不全、先天性副腎過形成、癌と関連する高カルシウム血症、及び非化膿性甲状腺炎を含む、内分泌障害;消化器疾患;限定されないが、後天性(自己免疫)溶血性貧血、先天性(赤芽球)再生不良性貧血(ダイアモンド・ブラックファン貧血)、成人特発性血小板減少性紫斑病、赤芽球癆、及び続発性血小板減少症を含む、血液障害;旋毛虫症;くも膜下ブロック又は切迫ブロックを伴う結核性髄膜炎;限定されないが、白血病及びリンパ腫を含む、腫瘍性疾患;限定されないが、多発性硬化症の急性増悪、原発性又は転移性脳腫瘍と関連する脳浮腫、開頭術、又は頭部損傷を含む、神経系障害;限定されないが、交感性眼炎、側頭動脈炎、ぶどう膜炎、眼球乾燥症、及び局所コルチコステロイドに不応性の眼の炎症状態を含む、眼科疾患;限定されないが、特発性ネフローゼ症候群におけるタンパク尿の利尿もしくは寛解の誘発のためのもの、又はエリテマトーデスによるタンパク尿の利尿もしくは寛解の誘発のためのものを含む、腎疾患;限定されないが、ベリリウム症、適切な抗結核化学療法と同時に使用される場合の劇症又は播種状肺結核、特発性好酸球性肺炎、症候性サルコイドーシスを含む、呼吸器疾患;並びに限定されないが、急性痛風性関節炎、急性リウマチ性心臓炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、若年性関節リウマチを含む関節リウマチにおける(患者に急性エピソード又は増悪を乗り越えさせるための)短期投与のための、並びに皮膚筋炎、多発性筋炎、口内炎、及び全身性エリテマトーデスにおける使用のための補助療法としての使用を含む、リウマチ障害である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、関節炎を治療又は予防する方法である。
【０３８８】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるのは、自己免疫疾患、アレルギー、関節炎、喘息、呼吸障害、血液疾患、癌、膠原病、結合組織障害、皮膚疾患、眼疾患、内分泌異常、免疫疾患、炎症性疾患、腸障害、胃腸疾患、神経学的障害、臓器移植疾患、リウマチ様障害、皮膚障害、腫脹状態、創傷治癒状態、及びその組合せから選択される疾患、障害、又は疾病を治療する方法であって、本明細書に記載されるステロイドペイロード又はそのコンジュゲートを投与することを含む、方法である。
【０３８９】
自己免疫疾患は、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、帯状疱疹、全身性エリテマトーデス(すなわち、狼瘡)、重症筋無力症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、及びサルコイドーシスから選択される。いくつかの実施態様において、呼吸障害は、喘息、慢性呼吸器疾患、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎症、及び急性気管支炎から選択される。いくつかの実施態様において、癌は、白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、及び多発性骨髄腫から選択される。いくつかの実施態様において、膠原病は、全身性エリテマトーデスである。いくつかの実施態様において、眼疾患は、角膜炎である。いくつかの実施態様において、内分泌異常は、アジソン病、副腎不全、副腎皮質機能不全、副腎皮質過形成及び先天性副腎過形成から選択される。いくつかの実施態様において、炎症性疾患は、白内障手術後の炎症、関節炎症、免疫性炎症、腱炎症、滑液包炎、上顆炎、クローン病、炎症性腸疾患、脂肪性肺臓炎、甲状腺炎、蕁麻疹(urticaria)(蕁麻疹(hives))、心膜炎、ネフローゼ症候群、及びぶどう膜炎から選択される。いくつかの実施態様において、腸疾患は、膠原性大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、及び炎症性腸疾患から選択される。いくつかの実施態様において、リウマチ様障害は、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び全身性エリテマトーデスから選択される。いくつかの実施態様において、皮膚障害は、乾癬、湿疹、及びポイズン・アイビーから選択される。いくつかの実施態様において、神経学的障害は慢性炎症性脱髄性多発根ニューロパチーである。
【０３９０】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される化合物は、限定されないが、ショック、脳浮腫、及び移植片対宿主病を含む、急性炎症イベントを治療するために患者に投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される化合物は、限定されないが、血液学的悪性腫瘍、例えば、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫と関連するものを含む、リンパ球溶解作用を治療するために投与される。
【０３９１】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるのは、それを必要としている対象の炎症を低下させる方法であって、それを必要としている対象に、本明細書に記載されるステロイド又はそのコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、方法である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるのは、それを必要としている対象の免疫系を調節をする方法であって、それを必要としている対象に、本明細書に記載されるステロイド又はそのコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、方法である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるのは、それを必要としている対象のコルチゾールレベルを調節する方法であって、それを必要としている対象に、本明細書に記載されるステロイド又はそのコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、方法である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるのは、それを必要としている対象のリンパ球遊走を低下させる方法であって、それを必要としている対象に、本明細書に記載されるステロイド又はそのコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、方法である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるのは、癌による高カルシウム血症、メニエール病、片頭痛、群発頭痛、重度のアフタ性潰瘍、喉頭炎、重度結核、梅毒に対するヘルクスハイマー反応、非代償性心不全、アレルギー性鼻炎、又は鼻ポリープを治療する方法であって、それを必要としている対象に、本明細書に記載されるステロイド又はそのコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、方法である。いくつかの実施態様において、本明細書に開示される化合物は、炎症性腸疾患、クローン病、又は潰瘍性大腸炎の治療に使用することができる。いくつかの実施態様において、該疾患、障害、又は疾病は、限定されないが、喘息、皮膚感染症、及び眼感染症を含む、慢性炎症性疾患である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される化合物は、臓器移植を受けている患者の免疫抑制に使用される。
【０３９２】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるステロイドペイロード及びそのコンジュゲートは、限定されないが、統合失調症、薬物中毒、心的外傷後ストレス障害(PTSD)、及び気分障害、薬物乱用、ストレス、並びに不安症などの精神障害を含む、GRシグナル伝達と関連する神経障害を治療するために患者に投与される。
【０３９３】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるステロイドペイロード及びそのコンジュゲートは、限定されないが、眼の炎症(例えば、結膜炎、角膜炎、ぶどう膜炎)、黄斑浮腫、及び黄斑変性症を含む、視覚系障害を治療するために患者に投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるステロイドペイロード及びそのコンジュゲートは、心血管障害を治療するために患者に投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるステロイドペイロード及びそのコンジュゲートは、グルコース及び/又は肝臓代謝障害を治療するために患者に投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるステロイドペイロード及びそのコンジュゲートは、筋骨格系障害を治療するために患者に投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるステロイドペイロード及びそのコンジュゲートは、湿疹及び乾癬などの皮膚炎症状態を治療するために患者に投与される。
【０３９４】
本明細書に記載されるタンパク質コンジュゲートは、そのステロイドペイロードの特定の細胞又は器官系への標的化送達の手段を提供し、それにより、遊離のコンジュゲートされていないステロイドペイロードの投与から生じる副作用を低下させ又は予防する。低下させ又は予防すべきそのような潜在的な副作用の例としては、引用により本明細書中に完全に組み込まれるDecadron(登録商標)(デキサメタゾム(dexamethasome))の認可された薬物ラベルに掲載されているものが挙げられる。いくつかの実施態様において、低下させ又は予防すべき副作用は、血圧の上昇;ナトリウム貯留;水/体液貯留(浮腫、血管性浮腫、肺浮腫);カリウム排泄の増加;可逆的な視床下部-下垂体副腎(HPA)軸抑制;治療の離脱後の潜在的なコルチコステロイド欠乏;感染症への易罹患性;全身性真菌感染症の増悪;小児及び成人患者の水痘の重症度の悪化;小児及び成人患者の麻疹の重症度の悪化;後嚢下白内障;視神経の潜在的損傷を伴う緑内障;細菌、真菌、又はウイルスによる続発性眼感染症の確立の促進;視神経炎の新たなエピソードの増加;カポジ肉腫;薬剤誘発性の続発性副腎皮質機能不全;活動性又は潜伏性消化性潰瘍、憩室炎、新鮮な腸吻合、及び非特異性潰瘍性大腸炎が存在する場合の穿孔のリスクの増加;胃腸の穿孔後の腹膜刺激;骨形成の減少;骨吸収の増加;骨芽細胞機能の阻害;小児患者の骨成長の阻害;あらゆる年齢での骨粗鬆症の発症;急性ミオパチー(おそらく眼及び呼吸器の筋肉を含み、潜在的に四肢不全麻痺を引き起こす);クレアチニンキナーゼの上昇;多幸感、不眠、気分変動、人格変化、及び重度の鬱病から明らかな精神病的発現にわたる精神錯乱;既存の情緒不安定又は精神病の傾向の悪化;眼内圧亢進;徐脈;心停止;心不整脈;心臓肥大;循環虚脱;鬱血性心不全;脂肪塞栓症;高血圧;早産児の肥大型心筋症;亜急性心筋梗塞後の心破裂;失神;頻脈;血栓塞栓症;血栓性静脈炎;血管炎;座瘡;アレルギー性皮膚炎;鮫肌;斑状出血及び点状出血;紅斑;創傷治癒障害;多汗;発疹;皮膚線条;皮膚試験に対する反応の抑制;薄く脆い皮膚;頭毛が薄くなること;蕁麻疹;炭水化物及びグルコースへの耐性の減少;クッシング様状態の発生;高血糖症;糖尿;多毛症(hirsutism);多毛症(hypertrichosis);糖尿病におけるインスリン又は経口血糖降下剤の要求量増加(インスリン抵抗性);潜伏性糖尿病の徴候;月経不順;続発性の副腎皮質及び下垂体の不応性(特に、ストレスの時;外傷;手術;又は病気の場合);小児患者における成長抑制;罹患しやすい患者における鬱血性心不全;体液貯留;低カリウム血症性アルカローシス;カリウム喪失;ナトリウム貯留;腹部膨満;血清肝酵素レベルの上昇(通常、中断時に可逆的);肝肥大;食欲増加;吐き気;膵炎;穿孔及び出血の可能性がある消化性潰瘍;小腸及び大腸の穿孔(特に、炎症性腸疾患の患者);潰瘍性食道炎;タンパク質異化による負の窒素バランス;大腿骨頭及び上腕骨頭の無菌壊死;筋肉量低下;筋力低下;骨粗鬆症;長骨の病的骨折;ステロイドミオパチー;腱断裂;脊椎圧迫骨折;痙攣;鬱病;情緒不安定;多幸感;頭痛;通常、治療の中断後の乳頭浮腫を伴う頭蓋内圧増加(偽脳腫瘍);不眠;気分変動;神経炎;ニューロパチー;感覚異常;人格変化;精神障害;回転性目眩;眼球突出;緑内障;眼内圧上昇;後嚢下白内障;異常な脂肪蓄積;感染に対する抵抗性の減少;吃逆;精子の運動性及び数の増加又は減少;倦��;抗コリンエステラーゼ剤;及び体重増加;並びに薬物間相互作用と関連する副作用から選択される。いくつかの実施態様において、低下させ又は予防すべき副作用は、薬物間相互作用と関連するものである。いくつかの実施態様において、低下させ又は予防すべき副作用は、コルチコステロイドによる副腎抑制の減弱を含む、コルチコステロイドとアミノグルテチミドの使用による薬物間相互作用;低カリウム血症、心臓肥大、及び鬱血性心不全の発症を含む、アムホテリシンB注射とカリウム除去剤の使用による薬物間相互作用;コルチコステロイドクリアランスの顕著な減少を含む抗生物質の使用による薬物間相互作用;重症筋無力症の患者で重度の衰弱をもたらすことを含む、抗コリンエステラーゼ剤の使用による薬物間相互作用;ワルファリンへの応答の阻害を含む、経口抗凝固薬の使用による薬物間相互作用;血糖値の上昇を含む、抗糖尿病剤の使用による薬物間相互作用;イソニアジドの血清濃度の減少を含む、抗結核薬の使用による薬物間相互作用;コルチコステロイドのクリアランスの増加を含む、コレスチラミンの使用による薬物間相互作用;シクロスポリンとコルチコステロイドの両方の活性及び痙攣の発生率の増加を含む、シクロスポリンの使用による薬物間相互作用;インドメタシンで治療されている患者における偽陰性結果を含む、デキサメタゾン抑制試験(DST)干渉の使用による薬物間相互作用;低カリウム血症による不整脈のリスク増加を含む、ジギタリスグリコシドの使用による薬物間相互作用;血液レベルの減少及び生理的活性の低下をもたらすコルチコステロイドの代謝クリアランスの増大を含む、エフェドリンの使用による薬物間相互作用;特定のコルチコステロイドの肝臓代謝の減少及び付随するその効果の増加を含む、経口避妊薬を含むエストロゲンの使用による薬物間相互作用;コルチコステロイドの代謝の増強を含む、肝臓酵素誘導剤、阻害剤、及び基質(チトクロムP450 3A4(CYP 3A4)酵素活性を誘導する薬物、例えば、バルビツレート、フェニトイン、カルバマゼピン、リファンピン)の使用による薬物間相互作用;コルチコステロイドの血漿濃度増加の可能性を含む、CYP 3A4を阻害する薬物(例えば、ケトコナゾール、マクロライド抗生物質、例えば、エリスロマイシン)の使用による薬物間相互作用;血漿濃度の減少をもたらす、そのクリアランスの増加を含む、CYP 3A4によって代謝される薬物(例えば、インジナビル、エリスロマイシン)の使用による薬物間相互作用;コルチコステロイド副作用のリスクの増加をもたらす特定のコルチコステロイドの最大60％の代謝減少及びコルチコステロイド離脱中に副腎不全を引き起こす可能性のある副腎コルチコステロイド合成の阻害を含む、ケトコナゾールの使用による薬物間相互作用;胃腸の副作用のリスクの増加及びサリチレートのクリアランスの増加を含む、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDS)の使用による薬物間相互作用;フェニトインレベルの増加又は減少、発作制御の変化を含む、フェニトインの使用による薬物間相互作用;皮膚試験に対する反応の抑制を含む、皮膚試験の使用による薬物間相互作用;中毒性表皮壊死症を含む、サリドマイドの使用による薬物間相互作用;並びに抗体応答の阻害又は弱毒生ワクチンに含まれる何らかの生物の複製の増強によるトキソイド及び生ワクチン又は不活化ワクチンへの応答の減少を含む、ワクチンの使用による薬物間相互作用と関連する。
【０３９５】
したがって、本明細書に提供されるのは、グルココルチコイド受容体と関連する疾患、障害、又は疾病を治療する方法であって、式(I)、(IA)、(IB)、(IB-1)、(IB-2)、(IC)、(ID)、(IE)、式(III)、又は式(3000)のコンジュゲートを、該疾患、障害、又は疾病を有する患者に投与することを含み、ここで、該コンジュゲートの遊離のステロイドペイロードの投与と関連する副作用が軽減される、方法である。さらに、本明細書に提供されるのは、式(III)又は式(3000)の化合物を細胞に送達する方法であって、該細胞を、式(III)又は式(3000)の化合物のタンパク質コンジュゲートと接触させることを含み、ここで、該タンパク質コンジュゲートが該細胞の表面抗原に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、方法である。
【０３９６】
ペイロードがLXRモジュレーターであるいくつかの例において、本明細書に記載されるのは、疾患、障害、又は疾病を治療する方法であって、該障害を有する患者に、化合物及び/もしくはADC(例えば、式(I)、(IA)、(IB)、(IB-1)、(IB-2)、(IC)、(ID)、(IE)、(5001)、(5002)、(5003)、(5004)、(6001)、(6002)、(6003)、(6004)、もしくは(6005)のADC)又はその医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法である。
【０３９７】
いくつかの例において、本明細書に記載されるのは、疾患、障害、又は疾病を予防する方法であって、該障害を有する患者に、化合物及び/もしくはADC(例えば、式(I)、(IA)、(IB)、(IB-1)、(IB-2)、(IC)、(ID)、(IE)、(5001)、(5002)、(5003)、(5004)、(6001)、(6002)、(6003)、(6004)、又は(6005)のADC又はその医薬組成物の予防有効量を投与することを含む、方法である。
【０３９８】
いくつかの例において、本明細書に記載されるのは、LXRシグナル伝達の調節に応答性の任意の疾患、障害、又は疾病を治療又は予防する方法である。いくつかの例において、該疾患又は障害は、LXR機能、LXR多型、LXRアゴニスト活性、又はLXRアンタゴニスト活性と関連する。いくつかの例において、本明細書に記載されるのは、増殖性障害、神経変性障害、免疫学的障害、自己免疫疾患、炎症性障害、皮膚疾患、代謝性疾患、心血管疾患、及び胃腸疾患からなる群から選択される疾患、障害、又は疾病を治療又は予防する方法である。
【０３９９】
増殖性障害は、当業者に公知の任意の増殖性障害であることができる。ある実施態様において、増殖性障害には、限定されないが、腫瘍学的障害(oncology disorder)が含まれ、ここで、該腫瘍学的障害は、当業者に公知の任意の癌障害であることができる。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、メラノーマを治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、転移性メラノーマを治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、肺癌を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、EGFR-チロシンキナーゼインヒビター抵抗性肺癌を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、口腔癌を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、口腔扁平上皮細胞癌を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、前立腺癌を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、ホジキンリンパ腫を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、乳癌を治療又は予防する方法である。
【０４００】
神経変性障害は、当業者に公知の任意の神経変性障害であることができる。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、アルツハイマー病を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、パーキンソン病を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、ハンチントン病を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、筋萎縮性側索硬化症を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、ミエリン遺伝子発現を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、髄鞘形成及び髄鞘再生の疾病、疾患、又は障害を治療又は予防する方法である。
【０４０１】
免疫学的障害は、当業者に公知の任意の免疫学的障害であることができる。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、炎症性腸疾患を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、潰瘍性大腸炎を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、クローン病を治療又は予防する方法である。
【０４０２】
炎症性障害は、当業者に公知の任意の炎症性障害であることができる。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、関節炎を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、関節リウマチを治療又は予防する方法である。
【０４０３】
代謝性疾患は、当業者に公知の任意の代謝性疾患であることができる。ある実施態様において、代謝性疾患は、脂質異常症である。脂質異常症は、当業者に公知の任意の脂質異常症であることができる。ある実施態様において、脂質異常症は、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高リポタンパク血症、HDL欠損症、ApoA-I欠損症、並びに心血管疾患、例えば、冠動脈疾患(例えば、狭心症、心筋梗塞、及び突然心臓死の治療及び予防を含む);アテローム性動脈硬化症(例えば、アテローム性動脈硬化症の治療及び予防を含む);並びに再狭窄(例えば、バルーン血管形成術などの医療処置の結果として生じるアテローム性動脈硬化性プラークの治療又は予防を含む)からなる群から選択される。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、糖尿病を治療又は予防する方法である。
【０４０４】
心血管疾患は、当業者に公知の任意の心血管疾患であることができる。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、アテローム性動脈硬化症を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、異常なマクロファージプロセシングから生じるアテローム性動脈硬化症を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、マクロファージがoxLDLをプロセシングすることができない酸化低密度リポタンパク質(oxLDL)の形成から生じるアテローム性動脈硬化症を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、虚血性心疾患を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、卒中を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、高血圧性心疾患を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、大動脈瘤を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、心内膜炎を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、末梢動脈疾患を治療又は予防する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、この段落で提供されている疾患のいずれかの組合せを治療又は予防する方法である。
【０４０５】
いくつかの例において、本明細書に記載されるのは、核内受容体の機能を調節する方法である。非限定的な例として、該機能は、炎症性メディエーター(例えば、サイトカイン、ケモカイン)の発現/分泌、コレステロール調節、コレステロール摂取、コレステロール流出、コレステロール酸化、遊走、走化性、アポトーシス及び壊死、炎症活性、脂質調節、アポトーシス、遊走、走化性、遺伝子転写、並びにタンパク質発現から選択され得る。
【０４０６】
いくつかの例において、本明細書に記載されるのは、疾患、障害、又は疾病を予防する方法であって、該障害を有する患者に、式(I)、(IA)、(IB)、(IB-1)、(IB-2)、(IC)、(ID)、(IE)、(7001)、(7002)、(7003)、(7004)、及び/又は(7005)の化合物及び/又はADC、又はその医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法である。
【０４０７】
黄色ブドウ球菌は、マクロファージ及び他の細胞型による食作用を切り抜けて生き残ることができる通性細胞内細菌である(Horn, J.らの文献、内部犯行:黄色ブドウ球菌の宿主病原体相互作用(Inside job: Staphylococcus aureus host-pathogen interactions). Int J Med Microbiol, 2018. 308(6): p. 607-624; Jubrail, J.らの文献、黄色ブドウ球菌のファゴリソソーム内死滅化を持続する能力の欠如はマクロファージにおける細菌持続の原因となる(Inability to sustain intraphagolysosomal killing of Staphylococcus aureus predisposes to bacterial persistence in macrophages). Cell Microbiol, 2016. 18(1): p. 80-96)。生体内イメージングにより、マクロファージは、黄色ブドウ球菌が複製し、その後、感染中に他の器官に播種する貯留層としての役割を果たすことができることが示されている(Surewaard, B.G.らの文献、インビボの黄色ブドウ球菌貯留層の同定及び治療(Identification and treatment of the Staphylococcus aureus reservoir in vivo). J Exp Med, 2016. 213(7): p. 1141-51)。ほとんどの抗生物質は、マクロファージを含む細胞をあまり透過せず、細胞内黄色ブドウ球菌貯留層が標準治療の抗生物質による処置を回避することができることを示している(Lehar, S.M.らの文献、新規の抗体-抗生物質コンジュゲートは細胞内黄色ブドウ球菌を消失させる(Novel antibody-antibiotic conjugate eliminates intracellular S. aureus). Nature, 2015. 527(7578): p. 323-8)。しかしながら、バンコマイシンのリポソーム製剤は、マクロファージへの抗生物質の透過を増大させ、標準治療のバンコマイシンよりも効果的に黄色ブドウ球菌の臓器負荷を低下させた(Surewaard, B.G.らの文献、インビボの黄色ブドウ球菌貯留層の同定及び治療(Identification and treatment of the Staphylococcus aureus reservoir in vivo). J Exp Med, 2016. 213(7): p. 1141-51)。まとめると、これらのデータは、マクロファージへの抗生物質の送達が細胞内黄色ブドウ球菌貯留層を消失させる効果的な方法であり得ることを示している。
【０４０８】
米国において、抗生物質耐性黄色ブドウ球菌は、公衆衛生問題であり続けており、おおよそ40％の血流感染は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)によって引き起こされる。FDAによって承認された治療選択肢は、MRSA血流感染についてはほとんど存在せず、バンコマイシンが一般に好まれる抗生物質であり続けている。適切な抗生物質治療にもかかわらず、黄色ブドウ球菌血流感染による死亡率は〜18％であり、治療を改善し得る組合せの研究を促している。
【０４０９】
リファマイシンクラスの抗生物質は、細菌RNAポリメラーゼ(RNAP)を阻害し、黄色ブドウ球菌に対する強力な活性を有する。しかしながら、このクラスの抗生物質による単剤療法は、治療期間中の耐性集団の選択につながり得る。それゆえ、リファマイシン抗生物質を第一選択抗生物質と組み合わせて用いて、一般に補綴又は外来装置が関与する感染症の転帰を改善することができる。
【０４１０】
リファマイシン類似体を含む本明細書に記載されるADCは、対象における細菌増殖及び/又は細菌感染を予防又は治療するのに有用である。いくつかの例において、細菌は、グラム陽性細菌である(グラム陽性細菌が細菌感染の原因である)。いくつかの例において、細菌は、ペンシリン(pencillin)耐性細菌である(ペニシリン耐性細菌が細菌感染の原因である)。いくつかの例において、細菌は、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)細菌である(MRSA細菌が細菌感染の原因である)。いくつかの例において、細菌は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)細菌である(MSSA細菌が細菌感染の原因である)。いくつかの例において、細菌は、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌(VRSA)細菌である(VRSA細菌が細菌感染の原因である)。いくつかの例において、細菌は、多剤耐性結核菌である(多剤耐性結核菌細菌が細菌感染の原因である)。さらなる例において、細菌は、例えば、アジスロマイシンに耐性のあるクラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)である(例えば、アジスロマイシンに耐性のあるクラミジア・トラコマチスが細菌感染の原因である)。さらなる例において、細菌は、例えば、メトロニダゾール、バンコマイシン、及び/又はフィダキソマイシンに耐性のあるクロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)である(例えば、メトロニダゾール、バンコマイシン、及び/又はフィダキソマイシンに耐性のあるクロストリジウム・ディフィシルが細菌感染の原因である)。
【０４１１】
本明細書に提供されるのは、対象の蜂巣炎、菌血症、皮膚壊死症、眼瞼感染症、眼感染症、新生児結膜炎、骨髄炎、膿痂疹、炎症性の腫れ物、熱傷様皮膚症候群、食中毒、肺炎、外科感染症、尿路感染症、熱傷後感染、髄膜炎、心内膜炎、敗血症、毒素性ショック症候群、化膿性関節炎、乳腺炎、人工関節と関連する感染症、カテーテルと関連する感染症、又はインプラントと関連する感染症を予防又は治療する方法であって、該対象に、リファマイシン類似体を含む抗体-薬物コンジュゲート(例えば、式(I)、(IA)、(IB)、(IB-1)、(IB-2)、(IC)、(ID)、(IE)、(7001)、(7002)、(7003)、(7004)、及び/又は(7005)のADC)の治療有効量を投与することを含む、方法である。また本明細書に提供されるのは、対象の細胞内細菌感染を予防又は治療する方法であって、該対象に、リファマイシン類似体を含む抗体-薬物コンジュゲート(例えば、式(I)、(IA)、(IB)、(IB-1)、(IB-2)、(IC)、(ID)、(IE)、(7001)、(7002)、(7003)、(7004)、及び/又は(7005)のADC)の治療有効量を投与することを含む、方法である。
【０４１２】
いくつかの例において、本明細書に提供されるのは、対象の細菌感染、及び/又はブドウ球菌感染、例えば、黄色ブドウ球菌感染と関連する疾患もしくは障害もしくは疾病の治療及び/もしくは予防、並びに/又はそのような疾患もしくは障害もしくは疾病の少なくとも1つの症状の改善に有用である、抗MSR1抗体、MSR1抗体の抗原結合部分、又は抗MSR1抗体もしくはそのMSR1抗原結合断片を含むADCを、それを必要としている対象に投与することを含む治療方法である。そのような疾患、障害、又は疾病は、蜂巣炎、菌血症、皮膚壊死症、眼瞼感染症、眼感染症、新生児結膜炎、骨髄炎、膿痂疹、炎症性の腫れ物、熱傷様皮膚症候群、食中毒、肺炎、外科感染症、尿路感染症、熱傷後感染、髄膜炎、心内膜炎、敗血症、毒素性ショック症候群、又は化膿性関節炎であることができる。いくつかの例において、該対象は、人工関節を有し、本明細書に開示される抗体は、人工関節の周囲の組織の黄色ブドウ球菌感染を治療及び/又は予防するために使用される。いくつかの例において、該対象は、カテーテルを有し、本明細書に開示される抗体は、カテーテル及び/又はカテーテルの周囲の組織の黄色ブドウ球菌感染を治療及び/又は予防するために使用される。いくつかの例において、該対象は、移植された異物を有し、本明細書に開示される抗体は、異物及び/又は異物の周囲の組織の黄色ブドウ球菌感染を治療及び/又は予防するために使用される。いくつかの例において、該対象は、乳腺炎を有し、本明細書に開示される抗体は、乳腺炎を治療するのに有用である。
【０４１３】
いくつかの例において、リファマイシン類似体及び/又はその抗MSR1 ADCは、1以上の追加の抗生物質(例えば、MRSA感染に使用し得る抗生物質)、例えば、バンコマイシン、トリメトプリム-スルファメトキサゾール、テトラサイクリン、ドキシサイクリン/ミノサイクリン、クリンダマイシン、セファロスポリン(例えば、セファレキシン)、ナフィシリン(naficillin)、フィダキソマイシン、リネゾリドなど、及び/又は任意の他の好適な抗生物質と組み合わせて投与される。いくつかの例において、リファマイシン類似体を含む本明細書に記載されるADCは、バンコマイシンと組み合わせて投与され、対象の細菌感染を予防又は治療するのに有用である。
【０４１４】
(組合せ療法及び製剤)
実施態様には、本明細書に記載される抗MSR1抗体のいずれかを1以上のさらなる治療活性成分との組合せで含む組成物及び治療製剤、並びにそのような組合せを、それを必要としている対象に投与することを含む治療方法が含まれる。
【０４１５】
本明細書に開示される抗MSR1抗体は、小分子サイトカイン阻害剤及びIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18などのサイトカイン、もしくはそのそれぞれの受容体に結合する抗体を含む、サイトカイン阻害剤:からなる群から選択される1以上のさらなる治療活性成分との組合せで共製剤化及び/又は投与することができる。
【０４１６】
本明細書に開示される抗MSR1抗体は、抗炎症剤、免疫調節剤、鎮痛剤、コルチコステロイド、ステロイド、抗酸化剤、COX阻害剤、心臓保護薬、金属キレート剤、IFN-γ、及び/又はNSAIDとの組合せで投与及び/又は共製剤化することもできる。いくつかの実施態様において、抗MSR1抗体は、抗PCSK9抗体、抗ANGPTL3抗体、スタチン、エゼチミブ、及び他の脂質低下療法との組合せで投与及び/又は共製剤化することができる。
【０４１７】
さらなる治療活性成分、例えば、上記の薬剤又はその誘導体のいずれかは、本明細書に開示される抗MSR1抗体の投与の直前に、その投与と同時に、又はその投与の直後に投与することができる;(本開示の目的のために、そのような投与レジメンは、さらなる治療活性成分「と組み合わせた」抗MSR1抗体の投与と考えられる)。実施態様には、本明細書に開示される抗MSR1抗体が本明細書中の別の場所に記載されるさらなる治療活性成分のうちの1つ又は複数と共製剤化されている医薬組成物が含まれる。
【０４１８】
(投与レジメン)
ある実施態様によれば、複数用量の抗MSR1抗体(又はADCもしくは抗MSR1抗体と本明細書に言及されるさらなる治療活性剤のいずれかの組合せを含む医薬組成物)を規定の時間経過にわたって対象に投与することができる。本方法は、対象に、複数用量の本明細書に開示される抗MSR1抗体を順次投与することを含む。本明細書で使用される場合、「順次投与する」とは、各々の用量の抗MSR1抗体が、異なる時点で、例えば、所定の間隔(例えば、時間、日、週、又は月)で区切られた異なる日に、対象に投与されることを意味する。実施態様には、患者に、単一の初回用量の抗MSR1抗体、その後、1以上の二次用量の抗MSR1抗体、及び任意にその後、1以上の三次用量の抗MSR1抗体を順次投与することを含む方法が含まれる。
【０４１９】
「初回用量」、「二次用量」、及び「三次用量」という用語は、本明細書に開示される抗MSR1抗体の投与の時系列を指す。したがって、「初回用量」は、治療レジメンの開始時に投与される用量(別名、「ベースライン用量」)であり;「二次用量」は、初回用量の後に投与される用量であり;「三次用量」は、二次用量の後に投与される用量である。初回用量、二次用量、及び三次用量は全て、同じ量の抗MSR1抗体を含有し得るが、通常、投与の頻度に関して互いに異なり得る。ある実施態様において、初回用量、二次用量、及び/又は三次用量に含まれる抗MSR1抗体の量は、治療経過中、互いに変化する(例えば、必要に応じて、上方調整又は下方調整される)。ある実施態様において、2以上の(例えば、2、3、4、又は5)用量が治療レジメンの開始時に「ローディング用量」として投与され、その後、より低い頻度で投与される後続の用量(例えば、「維持用量」)として投与される。
【０４２０】
ある例示的な実施態様において、各々の二次及び/又は三次用量は、直前の用量から1〜26週間(例えば、1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2週間、又はそれより長い期間)後に投与される。本明細書で使用される「直前の用量」という語句は、一連の複数回の投与において、介入用量のない順序で、そのまさに次の用量の投与前に患者に投与される抗MSR1抗体の用量を意味する。
【０４２１】
本開示のこの態様による方法は、患者に、任意の数の二次及び/又は三次用量の抗MSR1抗体を投与することを含み得る。例えば、ある実施態様において、単一の二次用量のみが患者に投与される。他の実施態様において、2以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、又はそれより多く)の二次用量が患者に投与される。同様に、ある実施態様において、単一の三次用量のみが患者に投与される。他の実施態様において、2以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、又はそれより多く)の三次用量が患者に投与される。投与レジメンは、特定の対象の生涯にわたって無期限に、又はそのような治療がもはや治療的に必要でなくなるかもしくは有益でなくなるまで実施することができる。
【０４２２】
複数の二次用量を含む実施態様において、各々の二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各々の二次用量は、患者に、直前の用量から1〜2週間後又は1〜2カ月後に投与されてもよい。同様に、複数の三次用量を含む実施態様において、各々の三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各々の三次用量は、患者に、直前の用量から2〜12週間後に投与されてもよい。ある実施態様において、二次及び/又は三次用量が患者に投与される頻度は、治療レジメンの経過にわたって変化し得る。投与の頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師により、治療経過中に調整されてもよい。
【０４２３】
実施態様には、2〜6のローディング用量が、第一の頻度(例えば、週に1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回、月に1回、2カ月毎に1回など)で患者に投与され、その後、2以上の維持用量がより低い頻度で患者に投与される投与レジメンが含まれる。例えば、本発明のこの態様によれば、ローディング用量が月に1回の頻度で投与される場合、維持用量は、6週間毎に1回、2カ月毎に1回、3カ月毎に1回などで、患者に投与されてもよい。
【０４２４】
(抗体の診断的使用)
本明細書に開示される抗MSR1抗体を用いて、例えば、診断目的のための試料中のMSR1又はMSR1発現細胞を検出及び/又は測定することもできる。例えば、抗MSR1抗体又はその断片を用いて、MSR1の異常な発現(例えば、過剰発現、低発現、発現の欠如など)を特徴とする疾病又は疾患を診断することができる。MSR1の例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を本明細書に開示される抗MSR1抗体と接触させることを含むことができ、ここで、該抗MSR1抗体は、検出可能な標識又はレポーター分子で標識されている。或いは、非標識抗MSR1抗体を、それ自体検出可能に標識されている二次抗体と組み合わせて、診断用途で使用することができる。検出可能な標識又はレポーター分子は、放射性同位体、例えば、3H、14C、32P、35S、もしくは125I;蛍光もしくは化学発光部分、例えば、フルオレセインもしくはローダミン;又は酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼであることができる。試料中のMSR1を検出又は測定するために使用し得る具体的な例示的アッセイとしては、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射免疫アッセイ(RIA)、免疫-PET(例えば、89Zr、64Cuなど)、及び蛍光活性化細胞選別(FACS)が挙げられる。
【０４２５】
本発明によるMSR1診断アッセイで使用し得る試料としては、正常又は病的状態下の、検出可能な量のMSR1タンパク質又はその断片を含有する患者から取得可能な任意の組織又は流体試料が挙げられる。通常、健康な患者(例えば、異常なMSR1レベル又は活性と関連する疾患又は疾病に罹患していない患者)から得られる特定の試料中のMSR1のレベルを測定して、MSR1のベースライン又は標準レベルを最初に確立する。その後、このMSR1のベースラインレベルを、MSR1関連の疾患又は疾病を有することが疑われる個体から得られる試料中のMSR1のレベルと比較することができる。
【実施例】
【０４２６】
(実施例)
以下の実施例は、当業者に、本明細書に提供される方法及び組成物を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を提供するために提示されており、本発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。使用される数字(例えば、量、温度など)に関して正確性を確保するために努力がなされているが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途示されない限り、部分は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、圧力は大気圧又はその付近である。実施例は、実施態様及びその様々な態様の具体的な理解及び実施を単に提供するので、実施例は、限定するものとみなされるべきではない。
【０４２７】
本明細書で使用される場合、本明細書中のプロセス及び実施例で使用される記号及び慣例は、別途それに反する規定がない限り、現代の科学文献、例えば、the Journal of the American Chemical Society又はthe Journal of Biological Chemistryで使用されているものと一致している。具体的には、限定されないが、以下の略語を実施例及び本明細書の全体を通じて使用することができる:
【表６】
2021523147.tif 000391
2021523147.tif 000392
【０４２８】
別途明示的に記述されない限り、試薬及び溶媒は、市販の供給源、例えば、Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC)、Sigma-Aldrich、Alfa、又は他の供給業者から入手した。
【０４２９】
1H NMR及び他のNMRスペクトルをBruker AVIII 400又はBruker AVIII 500で記録した。データをNutsソフトウェア又はMestReNovaソフトウェアで処理し、プロトンシフトを内部標準のテトラメチルシラン(TMS)から低磁場方向に移動した百万分率(ppm)で測定した。
【０４３０】
HPLC-MS測定を、以下の条件を用いて、Agilent 1200 HPLC/6100 SQシステムで実行した。
【０４３１】
HPLC-MS測定のための方法Aには、移動相として: A:水(0.01％トリフルオロ酢酸(TFA))、B:アセトニトリル(0.01％TFA);勾配相: 5％のBを15分(min)以内に95％のBまで増大させた;流速: 1.0mL/分;カラム: SunFire C18、4.6×50mm、3.5μm;カラム温度: 50℃、検出器:アナログ・デジタル変換器(ADC)蒸発光散乱検出器(ELSD)、ダイオードアレイ検出器(DAD)(214nm及び254nm)、エレクトロスプレーイオン化-大気イオン化(ES-API)が含まれた。
【０４３２】
HPLC-MS測定のための方法Bには、移動相として: A:水(10mM NH4HCO3)、B:アセトニトリル;勾配相: 15分以内に5％から95％のB;流速: 1.0mL/分;カラム: XBridge C18、4.6×50mm、3.5μm;カラム温度: 50℃、検出器: ADC ELSD、DAD(214nm及び254nm)、質量選択的検出器(MSD)(ES-API)が含まれた。
【０４３３】
LC-MS測定を、以下の条件を用いて、Agilent 1200 HPLC/6100 SQシステムで実行した:
【０４３４】
LC-MS測定のための方法Aには、装置として: WATERS 2767;カラム: 2つが直列に接続された、Shimadzu Shim-Pack、PRC-ODS、20×250mm、15μm;移動相: A:水(0.01％TFA)、B:アセトニトリル(0.01％TFA);勾配相: 5％のBを3分以内に95％のBまで増大させた;流速: 1.8〜2.3mL/分;カラム: SunFire C18、4.6×50mm、3.5μm;カラム温度: 50℃、検出器: ADC ELSD、DAD(214nm及び254nm)、ES-APIが含まれた。
【０４３５】
LC-MS測定のための方法Bには、装置として: Gilson GX-281;カラム: Xbridge Prep C18 10μm OBD、19×250mm;移動相: A:水(10mM NH4HCO3)、B:アセトニトリル;勾配相: 3分以内に5％から95％のB;流速: 1.8〜2.3mL/分;カラム: XBridge C18、4.6×50mm、3.5μm;カラム温度: 50℃。検出器: ADC ELSD、DAD(214nm及び254nm)、MSD(ES-API)が含まれた。
【０４３６】
酸性又は塩基性溶媒系での分取高圧液体クロマトグラフィー(分取HPLC)をGilson GX-281装置で利用した。酸性溶媒系では、Waters SunFire 10μm C18カラム(100Å、250×19mm)が使用され、分取HPLC用の溶媒Aは、水/0.05％TFAであり、溶媒Bは、アセトニトリルであった。溶出条件は、30mL/分の流速での20分間にわたる5％から100％への溶媒Bの線形勾配増加であった。塩基性溶媒系には、Waters Xbridge 10μm C18カラム(100Å、250×19mm)が含まれ、分取HPLC用の溶媒Aは、水/10mM重炭酸アンモニウム(NH4HCO3)であり、溶媒Bは、アセトニトリルであった。溶出条件は、30mL/分の流速での20分間にわたる5％から100％への溶媒Bの線形勾配増加であった。
【０４３７】
フラッシュクロマトグラフィーは、Agelaフラッシュカラムシリカ-CSカートリッジを用いて、Biotage装置で実施し;逆相フラッシュクロマトグラフィーは、Boston ODS又はAgela C18カートリッジを用いて、Biotage装置で実施した。
【０４３８】
(分析的キラルHPLC法−SFC条件:)
a)装置: SFC法ステーション(Thar, Waters)
b)カラム: CHIRALPAK AD-H/AS-H/OJ-H/OD-H 4.6×100mm、5μm(Daicel)
c)カラム温度: 40℃
d)移動相: CO2/IPA(0.1％DEA)＝55/45
e)流量: 4.0ml/分
f)背圧: 120バール
g)注入容量: 2μL。
【０４３９】
分取キラルHPLC法−SFC条件:
a)装置: SFC-80(Thar, Waters)
b)カラム: CHIRALPAK AD-H/AS-H/OJ-H/OD-H 20×250mm、10μm(Daicel)
c)カラム温度: 35℃
d)移動相: CO2/IPA(0.2％メタノールアンモニア)＝30/70
e)流量: 80g/分
f)背圧: 100バール
g)検出波長: 214nm
h)サイクル時間: 6.0分
i)試料溶液: 70mLメタノールに溶解した1500mg
j)注入容量: 2mL(ローディング: 42.86mg/注入)。
【０４４０】
本明細書で使用される場合、これらのプロセス、スキーム、及び実施例で使用される記号及び慣例は、特定の略語が具体的に定義されているかどうかにかかわらず、現代の科学文献、例えば、the Journal of the American Chemical Society又はthe Journal of Biological Chemistryで使用されているものと一致している。
【０４４１】
(実施例1.抗MSR1抗体の作製)
ヒト免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖可変領域をコードするDNAを含む遺伝子改変マウスをN-末端ノナヒスチジンタグ(R&D Systems、カタログ # 2708-MS-050, Minneapolis, MN)に融合した組換えヒトMSR1細胞外ドメインを含む免疫原で免疫することにより、抗MSR1抗体を得た。免疫に使用されたマウスは、Velocimmuneマウス又は「ユニバーサル軽鎖」を発現するマウス(「ULC」マウス)であった。ULCマウスで産生された抗体は、異なる重鎖可変領域を有するが、実質的に同一の軽鎖可変ドメインを有する。
【０４４２】
抗体免疫応答をMSR1特異的免疫アッセイによりモニタリングした。所望の免疫応答が達成されたとき、脾臓細胞を回収し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、その生存を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成させた。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して、MSR1特異的抗体を産生する細胞株を同定した。この技法を用いて、いくつかの抗MSR1キメラ抗体(すなわち、ヒト可変ドメイン及びマウス定常ドメインを保有する抗体)を得た。さらに、いくつかの完全ヒト抗MSR1抗体を、US 2007/0280945A1号に記載されている通りに、骨髄腫細胞への融合なしで、抗原陽性B細胞から直接単離した。
【０４４３】
この実施例の方法に従って作製される例示的な抗MSR1抗体の特定の生物学的特性は、下記の実施例で詳細に記載されている。
【０４４４】
(実施例2.重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸及び核酸配列)
表4には、本明細書に記載される選択された抗MSR1抗体の重鎖及び軽鎖可変領域並びにCDRのアミノ酸配列識別子が記載されている。対応する核酸配列識別子は、表5に記載されている。
表4:アミノ酸配列識別子
【表７】
2021523147.tif 000393
2021523147.tif 000394
表5:核酸配列識別子
【表８】
2021523147.tif 000395
2021523147.tif 000396
【０４４５】
抗体は、通常、本明細書において、表4及び5に示されているように、以下の命名法に従って呼ばれる: Fc接頭辞(例えば、「H1H」、「H2aM」など)、次に、数字の識別子(例えば、「21227」、「21228」、「21231」など)、次に、「P」、「N」、又は「P2」接尾辞。したがって、この命名法によれば、抗体は、本明細書において、例えば、「H1H21227N」、「H2aM21228N」、「H1H27729P」、「H1H27760P2」などと呼ぶことができる。本明細書で使用される抗体表記上の接頭辞は、抗体の特定のFc領域アイソタイプを示す。特に、「H1H」抗体は、ヒトIgG1 Fcを有する(抗体表記中の最初の「H」によって表されているように、全ての可変領域が完全ヒトである)が、「H2aM」抗体は、マウスIgG2a Fcを有する。当業者によって理解されるように、特定のFcアイソタイプを有する抗体を、異なるFcアイソタイプを有する抗体に変換することができる(例えば、マウスIgG4 Fcを有する抗体を、ヒトIgG1を有する抗体に変換することができる、など)が、いずれにしても、可変ドメイン(CDRを含む)−これは、表4及び5に示される数字の識別子によって示されている−は同じ状態のままであり、その結合特性は、Fcドメインの性質にかかわらず、同一であるか又は実質的に類似していると考えられる。
【０４４６】
抗体修飾。実施例1に記載される3つの抗MSR1抗体(21227N、21231N、21234N)は、もとのヒトFcγ部分、及び3つ全ての抗MSR1抗体についてのN297Q単一点突然変異を有するバージョンを伴って産生された。本明細書に記載される全ての他の抗体は、ヒトFcγ部分中のN297Q単一点突然変異を伴って作製された。第三のバージョンであるN297D突然変異は、21227N抗体のみについて産生した。
【０４４７】
(実施例3.表面プラズモン共鳴から得られたヒトモノクローナル抗MSR1抗体の結合親和性及び反応速度定数)
様々なMSR1試薬に対するヒト抗MSR1抗体の結合親和性及び反応速度定数をリアルタイム表面プラズモン共鳴(Biacore 4000)によって決定した。結合試験は全て、10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、及び0.05％v/v界面活性剤Tween-20、pH 7.4(HBS-ET)泳動バッファー中、25℃及び37℃で実施した。まず、Biacore CM4センサーチップ表面をヤギ抗ヒトFcγ特異的ポリクローナル抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Cat# BR-1008-39)とのアミンカップリングにより誘導体化して、抗MSR1モノクローナル抗体を捕捉した。結合試験は、N-末端ノナヒスチジンタグとともに発現されたヒトMSR1細胞外ドメイン(His9-hMSR1; R&D Systems, Cat# 2708-MS)、及びN-末端ヘキサヒスチジン-myc-mycタグとともに発現されたサルMSR1細胞外ドメイン(HMM-mfMSR1;配列番号418)に対して実施した。まず、様々な濃度のHis9-hMSR1及びHMM-mfMSR1(100nM〜3.7nM; 3倍連続希釈)をHBS-ET泳動バッファー中で調製し、抗ヒトFcγ捕捉抗MSR1モノクローナル抗体表面に、30μL/分の流速で3分間注入し、一方、モノクローナル抗体に結合したMSR1試薬の解離をHBS-ET泳動バッファー中で10分間モニタリングした。
【０４４８】
リアルタイム結合センサーグラムを、Scrubber 2.0c曲線フィッティングソフトウェアを用いて、物質移動制限を有する1:1結合モデルにフィッティングさせることにより、会合速度(ka)及び解離速度(kd)を決定した。結合解離平衡定数(KD)及び解離半減期(t1/2)を、以下のように反応速度から計算した:
【数１】
2021523147.tif 000397
。
【０４４９】
25℃及び37℃での様々な抗MSR1モノクローナル抗体に対するHis9-hMSR1又はHMM-mfMSR1結合についての結合反応速度パラメータは、それぞれ、表6及び7に示されている。
表6: 25℃での抗MSR1 mAbのBiacore結合親和性
【表９】
2021523147.tif 000398
2021523147.tif 000399
*は、現在の実験条件下でHis9-hMSR1又はHMM-mfMSR1の解離が観察されず、データをフィッティングする間、kd値が手動で1.00E-05に固定されたことを示している。
$は、結合が現在の実験条件下では観察されなかったことを示している。
表7: 37℃での抗MSR1 mAbのBiacore結合親和性
【表１０】
2021523147.tif 000400
2021523147.tif 000401
*は、現在の実験条件下でHis9-hMSR1又はHMM-mfMSR1の解離が観察されず、データをフィッティングする間、kd値が手動で1.00E-05に固定されたことを示している。
$は、結合が現在の実験条件下では観察されなかったことを示している。
【０４５０】
表6に示されているように、25℃で、本発明の抗MSR1モノクローナル抗体は全て、12pM〜5.45nMの範囲のKD値で、His9-hMSR1に結合した。表7に示されているように、37℃で、本発明の抗MSR1モノクローナル抗体は全て、3.66pM〜8.53nMの範囲のKD値で、His9-hMSR1に結合した。
【０４５１】
表6に示されているように、25℃で、本発明の抗MSR1モノクローナル抗体は全て、29.9pM〜10.1nMの範囲のKD値で、HMM-mfMSR1に結合した。表7に示されているように、37℃で、本発明の抗MSR1モノクローナル抗体は全て、3.62pM〜18.4nMの範囲のKD値で、HMM-mfMSR1に結合した。
【０４５２】
(実施例4. Octetから得られたヒトモノクローナル抗MSR1抗体の結合親和性及び反応速度定数)
様々なMSR1試薬に対するヒト抗MSR1抗体の結合親和性及び反応速度定数を、OCTET(登録商標) HTXバイオセンサープラットフォーム(Pall ForteBio社, Menlo Park, CA)でのリアルタイム無標識バイオレイヤー干渉法アッセイを用いて決定した。実験は、1000rpmの速度でプレートを振盪させながら、10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v界面活性剤Tween-20、及び1mg/mL BSA、pH7.4(HBS-EBT)バッファー中、25℃で実施した。結合試験は、N-末端ノナヒスチジンタグとともに発現されたヒトMSR1細胞外ドメイン(His9-hMSR1; R&D Systems, Cat# 2708-MS)、N-末端ヘキサヒスチジン-myc-mycタグとともに発現されたサルMSR1細胞外ドメイン(HMM-mfMSR1;配列番号418)、及びN-末端ノナヒスチジンタグとともに発現されたマウスMSR1細胞外ドメイン(His9-mMSR1; R&D Systems, Cat# 1797-MS)に対して実施した。抗ヒトFc(AHC)又は抗マウスFc(AMC) Octetバイオセンサーのいずれかを、5μg/mL又は10μg/mLの抗MSR1モノクローナル抗体を含有するウェルに45〜90秒間浸漬させることにより、抗MSR1モノクローナル抗体を捕捉した。その後、AHC捕捉抗MSR1モノクローナル抗体を、50nMのHis9-mMSR1を含有するウェルに浸漬させ、一方、AMC捕捉抗MSR1モノクローナル抗体を、様々な濃度のHis9-hMSR1もしくはHMM-mfMSR1(100nM、25nM)又は100nM His9-mMSR1を含有するウェルに浸漬させた。捕捉された抗MSR1モノクローナル抗体に対する様々なMSR1試薬の結合を4分間測定し、モノクローナル抗体に結合したMSR1試薬の解離をHBS-EBTバッファー中で8〜10分間モニタリングした。
【０４５３】
リアルタイム結合センサーグラムを、Scrubber 2.0c曲線フィッティングソフトウェアを用いて、物質移動制限を有する1:1結合モデルにフィッティングさせることにより、会合速度(ka)及び解離速度(kd)を決定した。結合解離平衡定数(KD)及び解離半減期(t1/2)を、以下のように反応速度から計算した:
【数２】
2021523147.tif 000402
。
【０４５４】
25℃での本発明の様々な抗MSR1モノクローナル抗体に対するHis9-hMSR1、HMM-mfMSR1、又はHis9-mMSR1結合についての結合反応速度パラメータは、表8及び9に示されている。
表8: 25℃での抗MSR1 mAbのOCTET(登録商標)結合親和性
【表１１】
2021523147.tif 000403
$は、結合が現在の実験条件下では観察されなかったことを示している。
表9: 25℃での抗MSR1 mAbのOCTET(登録商標)結合親和性
【表１２】
2021523147.tif 000404
*は、現在の実験条件下でHis9-hMSR1の解離が観察されず、データをフィッティングする間、kd値が手動で5.00E-05に固定されたことを示している。
$は、結合が現在の実験条件下では観察されなかったことを示している。
#は、結合データが確定的でない(IC)ことを示している。
【０４５５】
表8に示されているように、抗MSR1モノクローナル抗体は、205pM〜2.2nMの範囲のKD値で、His9-hMSR1に結合した。表8に示されているように、抗MSR1モノクローナル抗体は、208pM〜19.7nMの範囲のKD値で、HMM-mfMSR1に結合した。
【０４５６】
表9に示されているように、35個の抗MSR1モノクローナル抗体のうちの23個はHis9-mMSR1に結合せず、一方、6個の抗MSR1モノクローナル抗体の結合データは確定的でなかった。35個の抗MSR1モノクローナル抗体のうちの6個(6)は、表9に示されているように、1.09nM〜5.2nMの範囲のKD値で、His9-mMSR1に結合した。
【０４５７】
(実施例5.抗MSR1抗体は細胞表面発現ヒト及びサルMSR1に対する特異的結合を示す)
ヒト又はサルMSR1発現細胞に結合する抗MSR1モノクローナル抗体の能力を、電気化学発光(ECL)に基づく検出を用いて決定した。
【０４５８】
MSR1発現細胞株の作製。ヒトMSR1又はサルMSR1のいずれかを過剰発現する2つの細胞株を作製した。ヒトMSR1を過剰発現する細胞株を作製するために、ヒト胎児腎臓(HEK) 293 細胞を、C-末端Mycタグを有する全長ヒトMSR1(hMSR1、アクセッション番号NP_619729.1のアミノ酸M1〜L451)をコードするハイグロマイシン耐性レンチウイルスベクターの形質導入により改変した。得られた細胞株は、HEK293.Myc.hMSR1と呼ばれる。同様に、サルMSR1を過剰発現する細胞株を作製するために、HEK293細胞を、全長サルMSR1(カニクイザル、mfMSR1、アクセッション番号XP_005562705.1のアミノ酸M1〜L451)をコードするジェネティシン耐性発現プラスミドのトランスフェクションにより改変した。得られた細胞株は、HEK293.mfMSR1細胞と呼ばれる。内在性に発現されたヒトMSR1に結合する抗体の能力を測定するために、THP-1ヒト単球細胞を200nMのホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート(PMA; Sigma, Cat # P8139)で72時間処理して、抗体結合前に、高MSR1発現を誘導した。トランスフェクトされていないHEK293細胞は、遺伝子発現の次世代シークエンシングによってMSR1の発現が検出されないので、これも非特異的結合対照として含めた(データは示さない)。
【０４５９】
抗体結合アッセイ。抗体結合アッセイを実施するために、上記の細胞株の各々由来の細胞を、Ca2+/Mg2+を含まないPBSバッファー中で1回すすぎ、酵素非含有細胞溶解溶液(Millipore, Cat. # S-004-C, Burlington, MA)とともに37℃で5分間インキュベートして、細胞をフラスコから剥離させた。全ての細胞を、Ca2+/Mg2+を含む1×PBSで1回洗浄し、Cellometer(商標) Auto T4細胞カウンター(Nexcelom Bioscience)で計数した。約1.0×104個の細胞を96-ウェル炭素電極プレート[MULTI-ARRAY高結合プレート、Meso Scale Diagnostics]上に別々播種し、37℃で1時間インキュベートした。その後、非特異的結合部位を、Ca2+/Mg2+を含むPBS中の2％BSA(w/v)により、室温で1時間遮断した。THP-1細胞を試中で料希釈バッファー: 1)THP-1細胞表面のFcγ受容体を遮断する1mg/mLのFc受容体遮断試薬[抗MSR1-mFc抗体を用いて試験されているウェルについては、全分子ヒトIgG(Jackson Immunoresearch, Cat #009-000-003)、又は2)抗MSR1-hFc抗体を用いて試験されているウェルについては、全分子mIgG(Jackson Immunoresearch, Cat #015-000-003)とともに、室温で0.5時間プレインキュベートした。HEK293.Myc.hMSR1、HEK293.mfMSR1、及びHEK293細胞上での抗体結合をFc受容体遮断試薬なしで試験した。プレートに結合したHEK293.Myc.hMSR1、HEK293.mfMSR1、及びHEK293細胞又はTHP-1＋Fcブロックに、1.7pM〜100nMの範囲の連続希釈液中の抗MSR1又は対照抗体の溶液、及び抗体が存在しない溶液を2連で添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、細胞洗浄ヘッドを有するAquaMax2000プレートウォッシャー(MDS Analytical Technologies)により、結合していない抗体を除去した。プレートに結合した抗体を、Fcγ断片に特異的なSULFO-TAG(商標)コンジュゲートヤギポリクローナル抗ヒトIgG抗体 (Jackson Immunoresearch, Cat #109-005-098)又はFcγ断片に特異的なSULFO-TAG(商標)コンジュゲートヤギポリクローナル抗マウスIgG抗体(Jackson Immunoresearch, Cat #115-005-164)のいずれかで、室温で1時間検出した。プレートを洗浄し、製造元の推奨する手順に従って読取りバッファー(Meso Scale Diagnostics, Cat # R92TD-2)で顕色させ、発光シグナルをSECTOR Imager 600(Meso Scale Diagnostics)で記録した。相対発光単位(RLU)で測定された発光強度を記録して、各々の抗体の結合強度を濃度の範囲で示した。アイソタイプ対照抗体と比較した各々の抗MSR抗体(どちらも11nM)の細胞表面結合について検出されたシグナルの比をMSR1結合の特異性を示すものとして報告した。親HEK293細胞上での比と比較してMSR-1発現細胞上で2以上の結合比を有する抗体を特異的バインダーとして分類した。親HEK293細胞上での比と比較して2未満の結合比を有する抗体を示されているような非バインダーとして分類した(表10を参照)。
表10: MSR1発現細胞に対する抗MSR1抗体の結合
【表１３】
2021523147.tif 000405
2021523147.tif 000406
【０４６０】
表10に示されているように、試験された39個の抗MSR1抗体のうちの38個は、11nMの抗MSR1抗体濃度で、アイソタイプ対照を上回る5〜166倍の範囲の結合比でHEK293.Myc.hMSR1細胞に特異的に結合した。これらの抗MSR1抗体のうちの33個は、PMA細胞分化の後、11nMで、アイソタイプを上回る3〜66倍の範囲の細胞結合比で、ヒトMSR1を内在性に発現するTHP-1細胞に特異的に結合した。改変hMSR1細胞に結合した35個の抗MSR1抗体は、11nMで、アイソタイプを上回る6〜77倍の範囲の細胞結合比で、mfMSR1改変細胞にも特異的に結合した。12個の抗MSR1抗体(H1H21234N-N297Q、H1H27731P-N297Q、H1H27732P-N297Q、H1H27734P-N297Q、H1H27736P-N297Q、H1H27751P-N297Q、H1H27754P-N297Q、H1H27756P-N297Q、H2aM25695N、H2aM21235N、H2aM21229N、H1H27766P2-N297Q)は、アイソタイプ対照よりも5倍以上大きい比で親HEK293細胞に結合した。N297Q又はN297D単一点突然変異を含有するヒトIgG1を伴って産生された抗MSR1抗体は、その対応する未修飾の親抗体と同程度の細胞に結合した。
【０４６１】
H1xH29273P2という1つの抗MSR1抗体は、11nMの抗体濃度で、HEK293細胞と比較して2未満の比でMSR1細胞に結合したので、非特異的バインダーとして特徴付けられた。hIgG1及びmIgG1アイソタイプ対照は、予想通り、特異的ではなかった。
【０４６２】
(実施例6.細胞表面発現マウスMSR1に対する抗MSR1抗体の相対的結合)
マウスMSR1発現細胞に対する抗MSR1抗体の相対的細胞表面結合を、MSR1陽性RAW264.7細胞(ATCC、カタログ#TIB-71)及びMSR1陰性B16F10.9細胞(Linらの文献、1998. PNAS 95:8829-8834)を用いるフローサイトメトリーにより決定した。このアッセイのために、細胞を、96ウェルV底プレート(Axygen Scientific, Cat# P-96-450-V-C-S)中のカルシウム及びマグネシウム(VWR Cat# 45000-446)並びに2％FBS(Saradigm Cat# 1500-500)を含まないPBS(染色バッファー)中にプレーティングした。Fc受容体への結合を遮断するために、RAW264.7細胞を染色バッファー中で500μg/mLのマウスIgG(Jackson ImmunoResearch,Cat# 015-000-003)とともに4℃で30分間インキュベートし、一方、B16F10.9細胞は、染色バッファー中に残っていた。Fc受容体遮断の後、10μg/mLの抗MSR1抗体又はアイソタイプ対照抗体を細胞に添加し、その後、氷上で30分間インキュベートした。陽性対照については、市販の抗マウスMSR1(Sino Biological, Cat# 50129-R004)抗体を使用し、一方、ウサギIgG抗体(Thermo Scientific, Cat# 26102)を陰性対照として使用した。その後、細胞を染色バッファーで1回洗浄し、10μg/mLのAPCコンジュゲート抗ヒトFc二次抗体(Jackson ImmunoResearch, Cat# 109-136-170)又はAlexa-Flour 647コンジュゲート抗ウサギFc二次抗体[Jackson ImmunoResearch Cat# 111-606-046]とともに、4℃で30分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、PBSに希釈したCytofix(BD Biosciences, Cat# 554655)の50％溶液を用いて固定した。試料をBeckman Coulter Cytoflexで泳動させ、結果をFlowjo 10.2ソフトウェア(BD)で解析して、平均蛍光強度(MFI;表11)を計算した。抗MSR1抗体又は対照抗体のMFIと染色されていない試料のMFIの比を計算することにより、シグナル対ノイズ(S/N)を決定した(表11)。
表11: RAW264.7細胞に対する抗MSR1抗体の結合(フローサイトメトリー)
【表１４】
2021523147.tif 000407
【０４６３】
表11に示されているように、2つの抗MSR1抗体(H1H21227N-N297Q及びH1H21234N-N297Q)は、それぞれ、5及び3のS/N値でRAW264.7細胞に弱く結合した。非結合性の対照抗体は、RAW264.7細胞に結合しなかった。22個の抗MSR1抗体はいずれも、B16F10.9細胞に結合しなかった。参照陽性対照(マウスMSR1/CD204抗体, Sino Biological, Cat. # 50129-R004)は、97のS/NでRaw 264.7細胞に結合した。
【０４６４】
(実施例7.抗MSR1抗体は抗MSR1抗体間のMSR1受容体/交差競合で異なるエピトープに結合する)
様々な抗MSR1抗体間の結合競合を、OCTET(登録商標) HTXバイオセンサープラットフォーム(Pall ForteBio社, Menlo Park, CA)でのリアルタイム無標識バイオレイヤー干渉法アッセイを用いて評価した。実験は、1000rpmの速度でプレートを振盪させながら、10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v界面活性剤Tween-20、及び1mg/mL BSA、pH7.4(HBS-EBT)バッファー中、25℃で実施した。
【０４６５】
異なる抗体がN-末端ノナヒスチジンタグとともに発現される組換えヒトMSR1細胞外ドメイン(His9-hMSR1; R&D Systems, Cat# 2708-MS)上のそのぞれぞれのエピトープに対する結合について互いに競合することができるかどうかを評価するために、まず、バイオセンサー端部を、His9-hMSR1の20μg/mL溶液を含有するウェルに45秒間浸漬させることにより、約0.59〜0.79nMのHis9-hMSR1を抗ペンタ-His抗体がコーティングされたOCTET(登録商標)バイオセンサー端部(Pall ForteBio社, # 18-5122)上で捕捉した。その後、mAb-1の50μg/mL溶液を含有するウェルに4分間浸漬させることにより、抗原が捕捉されたバイオセンサー端部を第一の抗MSR1モノクローナル抗体(以後、「mAb-1」と呼ばれる)で飽和させた。その後、バイオセンサー端部を、第二の抗MSR1モノクローナル抗体(以後、「mAb-2」と呼ばれる)の50μg/mL溶液を含有するウェルに4分間浸漬させた。バイオセンサー端部は全て、実験の各々の工程の合間にHBS-EBTバッファー中で洗浄した。リアルタイム結合応答を実験の経過中モニタリングし、各々の工程の終了時の結合応答を記録した。mAb-1との複合体を予め形成したHis9-hMSR1に対するmAb-2結合の応答を比較し、様々な抗MSR1モノクローナル抗体の競合/非競合挙動を50％阻害閾値を用いて決定した。表12は、結合の順序とは無関係に、両方の方向で競合する抗体の関係性を明示的に規定している。
表12: His9-hMSR1に対する結合についての抗MSR1抗体の交差競合
【表１５】
2021523147.tif 000408
2021523147.tif 000409
2021523147.tif 000410
*は、「mAb-1」として捕捉されたとき、MSR1に対する結合について任意の他のmAbと交差競合しない
**mAbは、MSR1表面を飽和状態にしなかった、又はMSR1表面に結合しなかった
【０４６６】
(実施例8.抗MSR1抗体のリガンド取込み)
MSR1は、修飾低密度リポタンパク質(LDL)を含む、化学修飾された又は改変されたポリアニオン性分子に結合し、それを内在化することができる(Platt, N.及びS. Gordon.の文献、2001. J Clin Invest. 108(5):649-654)。特定のMSR1リガンドの取込みを調節する例示的な抗MSR1抗体の能力を評価するために、バイオアッセイを作製した。
【０４６７】
アッセイ用のMSR1発現細胞株の作製。ヒト胎児腎臓細胞(HEK293)に形質導入して、C-末端Mycタグを有するヒトMSR1(UniProtKBアクセッション番号NP_619729.1のアミノ酸1〜451)を安定発現させた。本明細書において「HEK293.Myc.hMSR1」と呼ばれる、得られた細胞株を選択し、10％FBS、NEAA、ペニシリン/ストレプトマイシン、L-グルタミン、及び100μg/mLハイグロマイシンを含有するDMEM中で維持した。
【０４６８】
リガンド取込みアッセイ。バイオアッセイのために、HEK293.Myc.hMSR1細胞を、0.1％FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン、及びL-グルタミンを含有するOpti-MEM(アッセイ培地)中、ウェル当たり20,000細胞で、96-ウェルポリ-D-リジンがコートされたアッセイプレート(Greiner Bio One, Cat #655946)上にプレーティングし、37℃、5％CO2中で一晩インキュベートした。翌日、抗体を300nMから5.08pMまで連続希釈し(1:3連続希釈)、アッセイ培地のみからなる陰性対照と併せて、該細胞とともに37℃、5％CO2で30分間プレインキュベートした。30分後、過塩素酸1,1'ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニンで標識された酸化又はアセチル化低密度リポタンパク質(LDL)(それぞれ、「DiI-OxLDL」又は「DiI-AcLDL」と呼ばれる)のいずれかを10μg/mLの一定濃度で該細胞に添加した。リガンド取込みの用量応答を決定するために、DiI-OxLDL又はDiI-AcLDLを25μg/mLから24.4pg/mLまで連続希釈し(＋LDLなしのアッセイ培地のみ)、抗体なしで細胞に添加した。37℃、5％CO2で一晩のインキュベーションの後、細胞をBD CytoFix(商標)(BD Biosciences, Cat# 554655)で、4℃で2時間固定し、514nmでの励起及び565nmでの放出でFlexstation3プレートリーダー(Molecular Devices)を用いて、リガンド取込みを評価した。Prism 7プログラムとともに非線形回帰(4-パラメータロジスティックス)を用いて、結果を解析し、EC50及びIC50値を得た。阻害のパーセンテージを、以下の方程式を用いて、相対蛍光単位(RFU)値で計算した:
【数３】
2021523147.tif 000411
。
【０４６９】
この方程式において、「RFUベースライン」は、抗体なしで10μg/mLのリガンドで処理された細胞からの蛍光値であり、「RFU阻害」は、10μg/mLのリガンドを用いた特定の抗体についての最小蛍光値であり、「RFUバックグラウンド」は、リガンド又は抗体なしの細胞からの蛍光値である。リガンド取込みアッセイの結果及び計算値は、表13に提供されている。
表13: HEK293.Myc.hMSR1細胞におけるDil-OxLDL及びDil-AcLDL取込みの抗体阻害
【表１６】
2021523147.tif 000412
2021523147.tif 000413
【０４７０】
好適な抗体候補は、相対的に効率的な阻害(例えば、約10nM未満のIC50値)を示す。いくつかの実施態様において、好適な抗体候補は、リガンド取込みの約65％未満の最大阻害も示す。
【０４７１】
表13(列1〜10)に示されているように、8つの抗体は、26％〜90％の範囲の最大阻害及び2.3nM〜＞100nMの範囲のIC50値で、HEK293.Myc.hMSR1細胞でのDiI-OxLDL取込みの阻害を示した。8つの抗体のうちの7つは、10％〜62％の範囲の最大阻害及び1.8nM〜＞100nMの範囲のIC50値で、DiI-AcLDL取込みの阻害を示した。抗体H2aM21229Nは、DiI-AcLDL取込みの阻害を示さなかった。
【０４７２】
表13(列11〜15)に示されているように、4つの抗体は、43％〜91％の範囲の最大阻害及び1.7nM〜＞100nMの範囲のIC50値で、MSR1媒介DiI-OxLDL取込みの阻害を示した。本発明の4つの抗体は、22％〜79％の範囲の最大阻害及び2.1nM〜＞100nMの範囲のIC50値で、MSR1媒介DiI-AcLDL取込みの阻害を示した。
【０４７３】
表13(列16〜42)に示されているように、25個の抗体のうちの24個は、22％〜94％の範囲の最大阻害及び1.7nM〜＞100nMの範囲のIC50値で、DiI-OxLDLのMSR1媒介取込みの阻害を示した。25個の抗体のうちの23個は、26％〜65％の範囲の最大阻害及び0.42nM〜＞100nMの範囲のIC50値で、DiI-AcLDL取込みの阻害を示した。抗体H1H27729P-N297Qは、DiI-OxLDL取込みの阻害を示さず、一方、抗体H1H27739P-N297Q及びH1H27734P-N297Qは、HEK293.Myc.hMSR1細胞でのDiI-AcLDL取込みの阻害を示さなかった。
【０４７４】
ヒト及びマウスアイソタイプ対照抗体は、これらのアッセイのいずれにおいてもHEK293.Myc.hMSR1細胞によるDiI-OxLDL及びDiI-AcLDL取込みの阻害を示さなかった。
【０４７５】
(実施例9.抗MSR1抗体による細胞表面発現MSR1の結合及び内在化)
例示的な抗MSR1抗体を、MSR1発現細胞上のMSR1に結合し、それを内在化するその能力について評価した。
【０４７６】
このアッセイのために、THP-1細胞[ATCC, Cat #TIB-202]を、10％FBS(ATCC, Cat# 30-2020)、ペンシリン(pencillin)/ストレプトマイシン/L-グルタミン(Gibco, Cat #10378-016)、50μMのβ-メルカプトエタノール(Sigma, Cat # M7522)(成長培地)＋200nMホルボールミリステート酢酸塩(PMA; Sigma, Cat# P1585)を含有するRPMI(Irvine Scientific, Cat #9160)中の96ウェルPDLコーティングプレート(Perkin Elmer, Cat# 6055500)に播種した。THP-1細胞を37℃、5％CO2で4日間分化させておいた。染色するために、細胞の4連のプレートを、カルシウム及びマグネシウム(Irving, Cat # 9240)を含まないPBS中の2％FBS(染色バッファー)に希釈した10μg/mLの抗MSR1抗体とともに4℃で30分間インキュベートした。細胞を染色バッファーで2回洗浄し、10μg/mLのAlexa-Flour 488コンジュゲート二次Ab(Jackson Immunoresearch, Cat # 115-547-003又はJackson Immunoresearch, Cat # 109-547-003)とともに4℃で30分間インキュベートし、その後、染色バッファーで2回洗浄した。2枚のプレートをすぐに固定し、PBS中の4％パラホルムアルデヒド(PFA; ThermoFisher, Cat #28908)＋5μM DRAQ5(ThermoFisher, Cat #62251)で20分間洗浄した(非内在化プレート)。残り2枚のプレートを37℃で1時間インキュベートし、その後、固定し、PBSに希釈した4％PFA＋5μM DRAQ5の溶液を用いて20分間染色した(内在化プレート)。固定後、全てのプレートをPBSで1回洗浄した。1枚の非内在化プレート及び1枚の内在化プレートをPBS中の50μg/mLの抗Alexa Fluor 488抗体(Regeneron)とともに4℃で一晩インキュベートして、表面のAlexa Fluor 488蛍光をクエンチした。残りのプレートをPBSのみとともにインキュベートした。共焦点画像を40×倍率のOpera Phenix(Perkin Elmer)で取得した。Harmony解析ソフトウェア(Perkin Elmer)を利用して、DRAQ5標識細胞を同定し、細胞当たりの全Alexa-Fluor 488相対蛍光単位(RFU)を決定した。4℃での全結合(4℃のクエンチされていないウェルのRFU値)、37℃での全結合(37℃のクエンチされていないウェルのRFU値)、全内在化RFU、及び％内在化を、表14に示される各々の抗体について決定した。
【０４７７】
全ての計算のために、未染色ウェル由来のバックグラウンド蛍光を全てのウェルから差し引いた。全内在化RFUを次のように計算した: 37℃のクエンチされていない試料の全RFU−37℃での表面RFU。表面RFUは、37℃でのクエンチされていないRFU-37℃でのクエンチされたRFU)/QEと定義される。QE(クエンチング効率)は: 1−(4℃のクエンチされた試料の全RFU/4℃のクエンチされていない試料の全RFU)と定義される。％内在化は、以下の式から決定した:(37℃での全内在化RFU/37℃での全RFU)*100。
表14:分化したTHP-1細胞における抗MSR1抗体の内在化及び表面結合
【表１７】
2021523147.tif 000414
ND*:弱い結合及び/又はクエンチング効率の決定不能のため、％内在化を決定することができなかった。
**:＞100％の％内在化値は37℃での合計値よりもわずかに高い合計内在化値によるものである。100％の内在化は、37℃での全Alex488蛍光の小胞構造内への出現により視覚的に確認された。
【０４７８】
表14に示されているように、アッセイされた21個の抗MSR1抗体のうちの19個は、13.3％〜117.9％の内在化の範囲の、分化したTHP-1細胞への内在化を示した。21個の抗MSR1抗体のうちの2個については、弱い結合及び/又はクエンチング効率の決定不能のため、内在化を決定することができなかった。対照として、アイソタイプ対照は、測定可能な内在化を示さなかった。
【０４７９】
(実施例10.ヒトMSR1に対する抗MSR1抗体の遮断能力の評価)
ヒトMSR1に対する様々なリガンドの結合を遮断する本明細書に開示される抗MSR1抗体の能力を3つの競合サンドイッチELISAアッセイを用いて測定した。これらのアッセイで使用されたリガンドは:(1)アセチル化LDL(Ac-LDL)、(2)酸化LDL(Ox-LDL)、及び(3)ウシ血清アルブミンの終末糖化産物(AGE-BSA)であった。
【０４８０】
このアッセイのために、N-末端9-ヒスチジンタグとともに発現されるヒトMSR1細胞外ドメイン(His9-hMSR1; R&D Systems, Cat# 2708-MS)の一部から構成された組換え単量体ヒトMSR1タンパク質を、Ac-LDL、Ox-LDL、又はビオチン化AGE-BSA(「biot-AGE-BSA」)を用いる競合ELISAアッセイで使用するために、96-ウェルマイクロタイタープレート上のPBS中で、2μg/mLの濃度で、4℃で一晩コーティングした。その後、非特異的結合部位をウシ血清アルブミン(BSA)の0.5％(w/v)リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液を用いてブロッキングした。抗MSR1抗体又はアイソタイプ対照抗体を、各々の試験リガンドに適切なように、連続希釈し、各々の連続希釈セットについて、His9-hMSR1がコーティングされたマイクロタイタープレートに2連で添加した。各々のコーティング時に、バッファーのみもウェルに添加した。室温で1時間のインキュベーションの後、洗浄なしで、最終的な一定濃度の50pM Ac-LDL(Life Technologies/ThermoFisher Scientific, Cat # L-35354)、5nMもしくは10nM Ox-LDL(Alfa Aesar, Cat # J65591)、又は400pM biot-AGE-BSA(R&D Systems, Cat # BT4127)をHis9-hMSR1を含むプレートに添加し、該プレートを室温でもう1時間インキュベートした(抗体阻害アッセイのためのAc-LDL、Ox-LDL、及びbiot-AGE-BSAの濃度は、プレートにコーティングされたHis9-hMSR1に対するAc-LDL、Ox-LDL、又はbiot-AGE-BSAの個々の結合曲線の直線部分内のおおよその中間点から選択された)。ウェルを洗浄し、プレートに結合したAc-LDL又はOx-LDLを、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)にコンジュゲートされた抗ウサギIgG(H+L)特異的ロバポリクローナル抗体(JacksonImmunoResearch, Cat #711-035-152)と組み合わせた抗LDLウサギ抗体(Alfa Aesar, Cat # J64398)で検出し、biot-AGE-BSAをストレプトアビジン-HRP(ThermoFisher Scientific, Cat # N200)で検出した。プレートを製造元の推奨に従ってTMB基質溶液(BD Biosciences, Cat #51-2606KC & Cat #51-2607KC)を用いて顕色させ、450nmでの吸光度をVictor(商標) Multilabel Plate Reader(PerkinElmer(商標))で測定した。このアッセイを4つの異なるアッセイ実施で行った。
【０４８１】
Prism(商標)ソフトウェア(GraphPad)内のシグモイド用量-応答モデルを用いて、データ解析を実施した。各々のアッセイで試験された抗体の最大濃度のパーセント遮断を、アッセイのベースラインと比べて、プレート上のHis9-hMSR1に対するAc-LDL、Ox-LDL、又はbiot-AGE-BSAの結合を遮断する抗体の能力の指標として計算した。計算においては、抗体の非存在下でアッセイに使用される同じ濃度のAc-LDL、Ox-LDL、又はbiot-AGE-BSAの結合シグナルの基準を100％結合又は0％遮断とし、一方、MSR1リガンド又は抗体を含まないバッファーの試料の結合シグナルとして規定されるアッセイのベースラインの基準を0％結合又は100％遮断とした。各々のアッセイで試験された抗体の最大濃度での最大パーセント遮断が全ての抗体について報告されている。負のパーセント遮断数は、抗体の存在下でプレートにコーティングされたHis9-hMSR1に対するより高いMSR1リガンド結合を反映した。遮断結果は、表15にまとめられている。
表15:競合ELISAアッセイにおける抗MSR1抗体の遮断能力
【表１８】
2021523147.tif 000415
2021523147.tif 000416
2021523147.tif 000417
【０４８２】
アッセイされた35個の抗MSR1抗体のうちの4個は、hMSR1に対するAc-LDL、Ox-LDL、及びbiot-AGE-BSA結合の＞50％を遮断するものとして同定された。これら4個の抗MSR1抗体は、His9-hMSR1に対する50pM Ac-LDL、10nM Ox-LDL、及び400pM biot-AGE-BSA結合の95％超を遮断した。
【０４８３】
試験された抗体の最大濃度で、35個の抗MSR1抗体のうちの4個は、hMSR1に対するAc-LDL及び/又はOx-LDL結合を＞50％遮断したが、hMSR1に対するbiot-AGE-BSA結合を遮断しなかった。これらの抗体のうちの3個は、hMSR1に対する50pM Ac-LDL結合と10nM Ox-LDL結合の両方を52％〜98％遮断で遮断した。1つの抗体(H1H21234N-N297Q)は、hMSR1に対する50pM Ac-LDL結合のみを75％遮断で遮断した。
【０４８４】
35個の抗MSR1抗体のうちの27個(27)及び無関係なアイソタイプ対照抗体は、hMSR1に対するAc-LDL、Ox-LDL、及びbiot-AGE-BSA結合の＜50％を遮断した。
【０４８５】
3つの抗MSR1抗体(21227N、21231N、21234N)を、もとのヒトFcγ部分を有するものとN297Q単一点突然変異を有するバージョンの両方で産生した。21227N抗体は、N297D突然変異を有する第三のバージョンとしても産生した。修飾バージョンの21227N(H1H21227N-N297Q及びH1H21227N-N297D)並びに21231N(H1H21231N-N297Q)抗MSR1抗体は、もとの特徴を保持した。抗体H1H21227N-N297Q及びH1H21227N-N297Dは、hMSR1に対する＞50％のAc-LDL、Ox-LDL、及びbiot-AGE-BSA結合を遮断し、一方、抗体H1H21231N-N297Qは、hMSR1に対するAc-LDL、Ox-LDL、及びbiot-AGE-BSA結合の＜50％を遮断した。抗MSR1修飾抗体H1H21234N-N297Qは、hMSR1に対するAc-LDL結合とOx-LDL結合の両方について＞50％遮断する未修飾のH1H21234N抗体と比較して、hMSR1に対する50pM Ac-LDL結合のみを遮断した。
【０４８６】
(実施例11.ペイロードP1及びP2Bの合成)(図1)
メチル(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキシレート(P1-2)
【化２９７】
2021523147.tif 000418
メタノール(200mL)及びトルエン(600mL)中のポドカルピン酸(P1-1、90g、0.33mol)の溶液に、(トリメチルシリル)ジアゾメタン(ヘキサン中2M、200mL)を添加した。反応混合物を室温で2時間撹拌した。その後、LCMSによると、ポドカルピン酸が完全に消費された。揮発性物質を真空中で除去し、残渣を石油エーテル(2L)からトリチュレートすると、化合物P1-2(91g、96％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 289(M+H)+。
【化２９８】
2021523147.tif 000419
【０４８７】
メチル(1S,4aS,10aR)-1,4a-ジメチル-6-(トリフルオロメタンスルホニルオキシ)-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキシレート(P1-3)
【化２９９】
2021523147.tif 000420
化合物P1-2(10g、35mmol)の塩化メチレン(200mL)溶液に、ピリジン(3.3g、42mmol)及びDMAP(0.84g、6.9mmol)を窒素雰囲気下で添加した。混合物を-78℃に冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸無水物(12g、42mmol)に添加し、得られた混合物を25℃まで温めておき、25℃でさらに4時間撹拌した。反応混合物をDCM(500mL)で希釈し、水(100mL)、水性塩酸(1N、150mL)、及びブライン(100mL)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮すると、粗化合物P1-3(14g、97％粗収率)が粘性のある油状物として得られ、これは、次の工程のために十分純粋であった。粗化合物P1-3をフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜10％酢酸エチル)により精製すると、純粋な生成物を粘性のある油状物として得ることができた。ESI m/z: 421.2(M+1)+。
【化３００】
2021523147.tif 000421
【０４８８】
メチル(1S,4aS,10aR)-6-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキシレート(P1-4)
【化３０１】
2021523147.tif 000422
化合物P1-3(14g、34mmol)及びtert-ブチルカルバメート(BocNH2、7.9g、68mmol)のtert-ブタノール(100mL)溶液に、炭酸セシウム(22g、68mmol)、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)(Pd2(dba)3、1.8g、2.0mmol)、及びX-Phos(1.8g、4.0mmol)を室温で順次添加した。混合物を脱気し、アルゴンで3回パージし、その後、TLCによりモニタリングして、化合物P1-3が完全に消費されるまで、アルゴン(バルーン)下、80℃で一晩撹拌した。室温に冷却した後、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、セライトに通して濾過した。固体を酢酸エチルで3回洗浄した。合わせた濾液を真空中で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜6.25％酢酸エチル)により精製すると、化合物P1-4(11g、82％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 410(M+23)+。
【化３０２】
2021523147.tif 000423
【０４８９】
(1S,4aS,10aR)-6-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボン酸(P1-5)
【化３０３】
2021523147.tif 000424
化合物P1-4(4.9g、13mmol)のDMSO溶液に、カリウム tert-ブトキシド(15g、0.13mol)を室温で一度に添加した。LCMSにより反応が終了するまで、反応混合物を、アルゴン下、60℃で3時間撹拌した。室温に冷却した後、該反応混合物を氷に注ぎ入れ、水性塩酸(0.5M)でゆっくりとpH 5まで酸性化し、その間、温度は25℃を超えなかった。沈殿を濾過により回収し、水で数回洗浄した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜20％酢酸エチル)によりさらに精製すると、化合物P1-5(4.5g、93％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 318(M-55)+。
【化３０４】
2021523147.tif 000425
【０４９０】
tert-ブチル N-[(4bS,8S,8aR)-8-カルバモイル-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバメート(P1-6)
【化３０５】
2021523147.tif 000426
P1-5(4.5g、12mmol)及びHATU(4.9g、13mmol)のDMF(50mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(20mL、0.12mol)を添加し、混合物を25℃で1時間撹拌した。その後、該混合物に、塩化アンモニウム(16g、0.30mol)を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。得られた混合物を酢酸エチルで希釈し、水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜20％酢酸エチル)により精製すると、化合物P1-6(4.2g、94％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 373.3(M+1)+。
【化３０６】
2021523147.tif 000427
【０４９１】
メチル(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキシレートトリフルオロ酢酸塩(P1-7)
【化３０７】
2021523147.tif 000428
化合物P1-4(6.0g、15mmol)のDCM(60mL)溶液に、TFA(12mL)をRTで添加した。TLCによりモニタリングして、Bocが完全に除去されるまで、得られた混合物をRTで2時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮すると、粗化合物P1-7がTFA塩として得られ、これを、それ以上精製することなく、次の工程で使用した。ESI m/z: 288(M+1)+。
【０４９２】
メチル(1S,4aS,10aR)-6-(ベンジルオキシ)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキシレート(P1-8a)
【化３０８】
2021523147.tif 000429
DMF(100mL)中の化合物P1-2(12g、40mmol)及び炭酸セシウム(14g、44mmol)の混合物を20〜25℃で15分間撹拌した。該混合物に、臭化ベンジル(7.1mL、60mmol)を室温で添加した。室温で4時間撹拌した後、得られた混合物を冷水に注ぎ入れ、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機溶液を水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜10％酢酸エチル)により精製すると、表題化合物P1-8a(13g、89％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 379(M+H)+。
【化３０９】
2021523147.tif 000430
【０４９３】
メチル(1S,4aS,10aR)-6-(ジベンジルアミノ)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキシレート(8b)
【化３１０】
2021523147.tif 000431
上で得られた粗化合物P1-7(計算量15mmol)のDMF(60mL)溶液に、炭酸カリウム(6.4g、46mmol)及び臭化ベンジル(5.8g、34mmol)をRTで添加した。TLCによりモニタリングして、反応が終了するまで、反応混合物を80℃で一晩撹拌した。RTに冷却した後、混合物を冷水(300mL)に注ぎ入れ、酢酸エチル(×3)で抽出した。合わせた有機溶液を水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮すると、粗生成物8bが得られ、これを、それ以上精製することなく、次の工程で使用した。ESI m/z: 468(M+1)+。
【０４９４】
(1S,4aS,10aR)-6-(ベンジルオキシ)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボン酸(P1-9a)
【化３１１】
2021523147.tif 000432
LCMS及びTLCによりモニタリングして、メチル基が完全に除去されるまで、DMSO(0.19L)中の化合物P1-8a(11g、29mmol)及びカリウム tert-ブトキシド(33g、0.29mol)の混合物を100℃で1時間撹拌した。25℃に冷却した後、該混合物を水性塩酸(1N)でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機溶液をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜24％酢酸エチル)により精製すると、化合物P1-9a(7.5g、71％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 365(M+H)+。
【化３１２】
2021523147.tif 000433
【０４９５】
(1S,4aS,10aR)-6-(ジベンジルアミノ)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボン酸(9b)
【化３１３】
2021523147.tif 000434
上で得られた粗化合物8b(計算量15mmol)のDMSO(100mL)溶液に、カリウム tert-ブトキシド(17g、0.15mol)をRTで一度に添加した。LCMSにより反応が終了するまで、反応混合物を、アルゴン下、100℃で2時間撹拌した。RTに冷却した後、該反応混合物を氷に注ぎ入れ、水性塩酸(4M)でpH 5までゆっくりと酸性化し、この間、温度が25℃よりも高く達しないようにした。混合物を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機溶液を水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜20％酢酸エチル)により精製すると、化合物9b(6.8g、化合物P1-4から3工程で99％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 454(M+1)+。
【０４９６】
ペンタフルオロフェニル(1S,4aS,10aR)-6-(ベンジルオキシ)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキシレート(P1-10a)
【化３１４】
2021523147.tif 000435
P1-9a(9.6g、26mmol)のDMF(100mL)溶液に、DIPEA(14mL、79mmol)及びパーフルオロフェニル 2,2,2-トリフルオロアセテート(15g、53mmol)を添加した。この混合物を室温で一晩撹拌し、LCMSによりモニタリングした。その後、反応混合物をエーテル(200mL)で希釈し、水(300mL)及びブライン(200mL)で洗浄した。有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜10％酢酸エチル)により精製すると、化合物P1-10a(12g、88％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 531(M+H)+。
【化３１５】
2021523147.tif 000436
【０４９７】
ペンタフルオロフェニル(1S,4aS,10aR)-6-(ジベンジルアミノ)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキシレート(10b)
【化３１６】
2021523147.tif 000437
9b(6.8g、15mmol)のDMF(100mL)溶液に、DIPEA(10mL、0.61mol)及びパーフルオロフェニル 2,2,2-トリフルオロアセテート(10mL、58mmol)を添加した。この混合物を、窒素下、25℃で一晩撹拌し、その後、エーテルで希釈した。有機物を水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜10％酢酸エチル)により精製すると、化合物10b(7.5g、81％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 620(M+1)+。
【化３１７】
2021523147.tif 000438
【０４９８】
tert-ブチル N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-(ベンジルオキシ)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバメート(P1-11a)
【化３１８】
2021523147.tif 000439
化合物P1-6(2.3g、6.2mmol)のTHF(20mL)溶液に、n-BuLi(ヘキサン中2.5M、5.5mL、14mmol)を-78℃で滴加した。反応液をこの温度で1時間撹拌した。混合物に、P1-10a(3.0g、5.6mmol)のTHF(20mL)溶液を添加し、その後、LCMSによりモニタリングして、化合物P1-10aが消費されるまで、得られた混合物を10〜20℃で一晩撹拌した。反応液を飽和水性塩化アンモニウムでクエンチし、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機溶液を水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜30％酢酸エチル)により精製すると、化合物P1-11a(1.59g、51％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 719(M+1)+。
【０４９９】
(下の11bの手順と比較して、n-BuLiをLiHMDSの代わりにここで使用した。P1-6は完全には消費されなかったが、この手順は、より少ない副生成物を生じさせ、P1-11aの収率は、約40％から51％に増加した。未反応の化合物P1-6を回収した(回収された収率: 10〜20％)。
【０５００】
tert-ブチル N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-(ジベンジルアミノ)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバメート(11b)
【化３１９】
2021523147.tif 000440
化合物P1-6(1g、2.7mmol)のTHF(15mL)溶液に、リチウムビス(トリメチルシリル)アミド(ヘキサン中1M、8.0mL)を0℃で滴加した。反応液を0℃で1時間撹拌した。混合物に、化合物10b(2.5g、4.0mmol)のTHF(10mL)溶液を添加し、その後、得られた混合物をRTで一晩撹拌した。その後、反応液を飽和水性塩化アンモニウムでクエンチし、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機溶液を水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜35％酢酸エチル)により精製すると、化合物11b(0.95g、44％収率)が白色の固体;及び回収された化合物P1-6(回収された収率37％)として得られた。ESI m/z: 808(M+1)+。
【化３２０】
2021523147.tif 000441
【０５０１】
tert-ブチル N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバメート(P1-12a)
【化３２１】
2021523147.tif 000442
P1-11a(2.0g、2.78mmol)の酢酸エチル(40mL)溶液に、湿潤パラジウム炭(10％Pd、0.9g)を窒素保護下で添加した。混合物を脱気し、水素でパージし、P1-11aが完全に消費されるまで、水素バルーン下、室温で一晩撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。混合物をセライトに通して濾過し、濾過を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜55％酢酸エチル)により精製すると、P1-12a(1.06g、61％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 629(M+H)+。
【化３２２】
2021523147.tif 000443
【０５０２】
tert-ブチル N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバメート(12b)
【化３２３】
2021523147.tif 000444
11b(0.45g、0.56mmol)の酢酸エチル(5mL)溶液に、湿潤パラジウム炭(10％Pd、50mg)を窒素下で添加した。混合物を脱気し、水素で3回パージし、水素バルーン下、RTで一晩撹拌した。該混合物をセライトに通して濾過し、濾液を真空中で濃縮すると、化合物12b(0.33g、94％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 628(M+1)+。
【０５０３】
(1S,4aS,10aR)-N-[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキサミド(P1)
【化３２４】
2021523147.tif 000445
化合物P1-12a(0.17g、0.27mmol)のDCM(10mL)溶液に、TFA(3mL)を室温で滴加した。LCMSによりBocが除去されるまで、反応混合物を室温で1時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去し、残渣を分取HPLC(方法B)により精製すると、P1(0.10g、70％収率)が白色の固体として得られた。
【０５０４】
ESI m/z: 529.3(M+1)+。
【０５０５】
【化３２５】
2021523147.tif 000446
【０５０６】
【化３２６】
2021523147.tif 000447
【０５０７】
【化３２７】
2021523147.tif 000448
【０５０８】
HPLC(方法B):保持時間: 8.92分、純度: 99.4％。キラルHPLC:＞99.9％(カラムAD、AS、OD、及びOJ中)。
【０５０９】
旋光度(α): +2.53°(1.7g/100mL THF、25℃)。
【０５１０】
(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-N-((1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキサミド(P2B)
【化３２８】
2021523147.tif 000449
化合物12b(0.63g、1.0mmol)のDCM(10mL)溶液に、TFA(3mL)をRTで滴加した。LCMSによりBocが除去されるまで、反応混合物をRTで4時間撹拌した。該混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、P2B(0.42g、79％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 528.2(M+1)+。
【化３２９】
2021523147.tif 000450
【０５１１】
(実施例11-2. P3Bの合成)
本実施例は、下の表Cのポドカルピン酸誘導体P3Bの合成のための一般的な方法を示している。本実施例は、図23の11bからP3Bまでの番号の化合物に言及している。
【０５１２】
(3S,8R,9S,10R,13S,14S)-17-イミノ-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-オール、トリフルオロ酢酸塩(P3B)
【化３３０】
2021523147.tif 000451
化合物11b(10mg、12μmol)のDCM(2mL)溶液に、TFA(1mL)を添加した。LCMSによりBocが除去されるまで、反応混合物をRTで2時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去し、残渣を水中の5％アセトニトリルに溶解させた。該溶液を凍結乾燥させると、化合物P3B(7mg、80％収率)が薄黄色の固体として得られた。ESI m/z: 354.8(M/2+H)+。
【化３３１】
2021523147.tif 000452
【０５１３】
(実施例11-3)
本実施例は、下の表Cのポドカルピン酸誘導体P4B〜P8Bの合成のための一般的な方法を示している。本実施例は、図23の12bからP4B〜P8Bまでの番号の化合物に言及している。
【０５１４】
(実施例11-3a)
中間体13a〜e
【化３３２】
2021523147.tif 000453
化合物12b(1.0当量)のDMF又はDCM溶液に、Fmoc-アミノ酸(1.1〜1.2当量)、HATU(1.2〜1.5当量)、及びDIPEA(2.0〜3.0当量)を順次添加した。反応混合物をRTで4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。混合物を真空中で濃縮し(DCMが溶媒である場合)、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜90％酢酸エチル)により精製するか;又は反応混合物(DMFが溶媒である場合)を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性重炭酸アンモニウム(10mM)中の50〜90％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、化合物13が白色の固体として得られた。
【表１９】
2021523147.tif 000454
【０５１５】
9H-フルオレン-9-イルメチル N-({[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}メチル)カルバメート(13a)
【化３３３】
2021523147.tif 000455
中間体13a〜eのための一般的手順に従うと、化合物13a(0.14g、78％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 907(M+H)+。
【０５１６】
9H-フルオレン-9-イルメチル N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}-2-ヒドロキシエチル]カルバメート(13b)
【化３３４】
2021523147.tif 000456
中間体13a〜eのための一般的手順に従うと、化合物13b(0.39g、83％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 938(M+H)+。
【０５１７】
9H-フルオレン-9-イルメチル N-[(5S)-5-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}-5-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}ペンチル]カルバメート(13c)
【化３３５】
2021523147.tif 000457
中間体13a〜eのための一般的手順に従うと、化合物13c(0.30g、78％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1201(M+H)+。
【０５１８】
(S)-tert-ブチル 3-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-4-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニルカルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イルアミノ)-4-オキソブタノエート(13d)
【化３３６】
2021523147.tif 000458
中間体13a〜eのための一般的手順に従うと、化合物13d(0.43g、85％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1021(M+H)+。
【０５１９】
(S)-tert-ブチル 4-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-5-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニルカルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イルアミノ)-5-オキソペンタノエート(13e)
【化３３７】
2021523147.tif 000459
中間体13a〜eのための一般的手順に従うと、化合物13e(0.42g、82％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1036(M+H)+。
【０５２０】
(実施例11-3b)
中間体14a〜e
【化３３８】
2021523147.tif 000460
化合物13(1.0当量)のDCM溶液に、TFAをRTで添加した。反応混合物をRTで1時間撹拌し、真空中で濃縮すると、粗生成物14が無色の油状物として得られ、これを、それ以上精製することなく、次の工程に使用した。
【表２０】
2021523147.tif 000461
【０５２１】
9H-フルオレン-9-イルメチル N-({[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}メチル)カルバメート、トリフルオロ酢酸塩(14a)
【化３３９】
2021523147.tif 000462
中間体14a〜eのための一般的手順に従うと、粗化合物14a(0.14g、99％収率、TFA塩)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 807(M+1)+。
【０５２２】
9H-フルオレン-9-イルメチル(S)-1-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニルカルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イルアミノ)-3-ヒドロキシ-1-オキソプロパン-2-イルカルバメート、トリフルオロ酢酸塩(14b)
【化３４０】
2021523147.tif 000463
中間体14a〜eのための一般的手順に従うと、粗化合物14b(0.14g、99％収率、TFA塩)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 837(M+1)+。
【０５２３】
9H-フルオレン-9-イルメチル N-[(5S)-5-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}-5-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}ペンチル]カルバメート、トリフルオロ酢酸塩(14c)
【化３４１】
2021523147.tif 000464
中間体14a〜eのための一般的手順に従うと、粗化合物14c(0.22g、92％収率、TFA塩)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 1101(M+1)+。
【０５２４】
(S)-3-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-4-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニルカルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イルアミノ)-4-オキソブタン酸、トリフルオロ酢酸塩(14d)
【化３４２】
2021523147.tif 000465
中間体14a〜eのための一般的手順に従うと、粗化合物14d(0.10g、87％収率、TFA塩)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 866(M+1)+。
【０５２５】
(S)-4-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-5-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニルカルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イルアミノ)-5-オキソペンタン酸、トリフルオロ酢酸塩(14e)
【化３４３】
2021523147.tif 000466
中間体14a〜eのための一般的手順に従うと、粗化合物14e(84mg、86％収率、TFA塩)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 880(M+1)+。
【０５２６】
(実施例11-3c)
ペイロードP4B〜P8B
【化３４４】
2021523147.tif 000467
上で得られた粗14のDMF溶液に、ピペリジンを添加した。混合物をRTで30分間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、ペイロードP4-8が白色の固体として得られた。
【表２１】
2021523147.tif 000468
【０５２７】
(1S,4aS,10aR)-N-[(1S,4aS,10aR)-6-(2-アミノアセトアミド)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキサミド(P4B)
【化３４５】
2021523147.tif 000469
ペイロードP4B〜8Bのための一般的手順に従うと、化合物P4B(12mg、28％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 585(M+1)+。
【化３４６】
2021523147.tif 000470
【０５２８】
(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-N-((1S,4aS,10aR)-6-((S)-2-アミノ-3-ヒドロキシプロパンアミド)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキサミド(P5B)
【化３４７】
2021523147.tif 000471
ペイロードP4B〜8Bのための一般的手順に従うと、化合物P5B(41mg、67％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 615(M+1)+。
【化３４８】
2021523147.tif 000472
【０５２９】
(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-N-((1S,4aS,10aR)-6-((S)-2,6-ジアミノヘキサンアミド)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキサミド(P6B)
【化３４９】
2021523147.tif 000473
ペイロードP4B〜8Bのための一般的手順に従うと、化合物P6B(5mg、17％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 656(M+1)+。
【化３５０】
2021523147.tif 000474
【０５３０】
(S)-3-アミノ-4-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニルカルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イルアミノ)-4-オキソブタン酸(P7B)
【化３５１】
2021523147.tif 000475
ペイロードP4B〜8Bのための一般的手順に従うと、化合物P7B(39mg、51％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 643(M+1)+。
【化３５２】
2021523147.tif 000476
【０５３１】
(S)-4-アミノ-5-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニルカルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イルアミノ)-5-オキソペンタン酸(P8B)
【化３５３】
2021523147.tif 000477
ペイロードP4B〜8Bのための一般的手順に従うと、化合物P8B(44mg、58％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 657(M+1)+。
【化３５４】
2021523147.tif 000478
【０５３２】
(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-N-((1S,4aS,10aR)-6-((S)-2-アミノ-3-(1H-イミダゾール-4-イル)プロパンアミド)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキサミド(P9B)
【化３５５】
2021523147.tif 000479
Fmoc-His-OH(0.38g、1.0mmol)のDCM(5mL)溶液に、Fmoc-OSu(0.37g、1.1mmol)及びDIPEA(0.26g、2.0mmol)を添加した。反応混合物をRTで一晩撹拌した。揮発性物質を真空中で除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー(DCM中の5〜10％メタノール)により精製すると、Fmoc-His(Fmoc)-OH(0.50g、84％収率、ESI m/z: 600(M+1)+)が白色の固体として得られた。
【０５３３】
化合物12b(0.31g、0.50mmol)のDCM(20mL)の溶液に、上で得られたFmoc-His(Fmoc)-OH(0.33g、0.55mmol)、HATU(0.23g、0.60mmol)、及びDIPEA(0.19g、1.5mmol)を順次添加した。得られた混合物をRTで4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物に、ピペリジン(0.5mL)を添加し、LCMSによりモニタリングして、Fmocが完全に除去されるまで、混合物をRTで1時間撹拌した。該混合物を真空中で濃縮し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中の50〜80％アセトニトリル)により精製すると、Boc-P9B(0.15g)が白色の固体として得られ、このうちの半分をDCM(20mL)に溶解させた。該溶液に、TFA(3mL)を添加した。LCMSによりBocが除去されるまで、混合物をRTで1時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去し、残渣を分取HPLC(方法B)により精製すると、化合物P9B(17mg、12％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 665(M+1)+。
【化３５６】
2021523147.tif 000480
【０５３４】
(実施例11-4)
本実施例は、下の表Cのポドカルピン酸誘導体P10B及びP11Bの合成のための一般的な方法を示している。本実施例は、図24の14a、15a〜b、並びにP10B及びP11Bの番号の化合物に言及している。
【０５３５】
(S)-tert-ブチル 4-アミノ-5-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-(2-アミノアセトアミド)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニルカルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イルアミノ)-5-オキソペンタノエート、ジ-トリフルオロ酢酸塩(15a)
【化３５７】
2021523147.tif 000481
Fmoc-Glu(OtBu)-OH(74mg、0.17mmol)及びDIPEA(55μL、0.32mmol)のDMF(5.0mL)溶液に、HATU(91mg、0.24mmol)を添加した。混合物をRTで15分間撹拌し、その後、化合物14a(0.14g、0.16mmol)を添加した。反応混合物をRTで一晩撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。その後、反応混合物に、ピペリジン(1mL)を滴加した。LCMSによりFmocが完全に除去されるまで、反応混合物をRTで1時間撹拌した。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性TFA(0.01％)中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま分離すると、化合物15a(0.13g、80％収率)が黄色の固体として得られた。ESI m/z: 770.5(M+1)+。
【０５３６】
(4S,4'S)-tert-ブチル 5,5'-(4bS,4b'S,8S,8aR,8'S,8a'R)-8,8'-(アザンジイルビス(オキソメチレン))ビス(4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-8,3-ジイル)ビス(アザンジイル)ビス(4-アミノ-5-オキソペンタノエート)ジ-トリフルオロ酢酸塩(15b)
【化３５８】
2021523147.tif 000482
Fmoc-Glu(OtBu)-OH(0.15g、0.35mmol)及びDIPEA(83μL、0.48mmol)のDMF(5.0mL)溶液に、HATU(0.15g、0.40mmol)を添加した。混合物をRTで30分間撹拌し、その後、化合物P2B(0.10g、0.16mmol)を添加した。反応混合物をRTで一晩撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。その後、反応混合物に、ピペリジン(1mL)を滴加した。LCMSによりFmocが完全に除去されるまで、反応混合物をRTで3時間撹拌した。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性TFA(0.01％)中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま分離すると、化合物15b(0.14g、78％収率)が黄色の固体として得られた。ESI m/z: 899(M+1)+。
【０５３７】
(S)-4-アミノ-5-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-(2-アミノアセトアミド)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニルカルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イルアミノ)-5-オキソペンタン酸(P10B)
【化３５９】
2021523147.tif 000483
ニートのTFA(2.0mL)中の化合物15a(0.13g、0.13mmol)の混合物をRTで1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物をDCM(20mL)で希釈し、真空中で濃縮した。残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性炭酸水素ナトリウム(10mM)中の0〜100％アセトニトリル)により精製すると、P10B(20mg、22％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 358(M/2+1)+; 714.5(M+1)+。
【化３６０】
2021523147.tif 000484
【０５３８】
(4S,4'S)-5,5'-(4bS,4b'S,8S,8aR,8'S,8a'R)-8,8'-(アザンジイルビス(オキソメチレン))ビス(4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-8,3-ジイル)ビス(アザンジイル)ビス(4-アミノ-5-オキソペンタン酸)(P11B)
【化３６１】
2021523147.tif 000485
ニートのTFA(3.0mL)中の化合物15b(0.14g、0.14mmol)の混合物をRTで1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物をDCM(30mL)で希釈し、真空中で濃縮した。残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性炭酸水素ナトリウム(10mM)中の0〜100％アセトニトリル)により精製すると、P11B(20mg、18％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 394(M/2+1)+。
【化３６２】
2021523147.tif 000486
【０５３９】
(実施例11-5)
本実施例は、上の表3のリンカー-ペイロードLP1B〜LP5Bの合成のための方法を示している。本実施例は、図25の12b及び102a〜bから106a〜eの番号の化合物並びにリンカー-ペイロードLP1B〜LP5Bに言及している。
【０５４０】
(実施例5a)
中間体102a〜b
【化３６３】
2021523147.tif 000487
酸(Fmoc-Val-Ala-OH(101a、1.2当量)又はFmoc-Val-Cit-OH(101b、1.2当量)のDMF溶液に、HATU(1.2当量)及びDIPEA(2.0〜3.0当量)をRTで添加した。混合物をRTで5分間撹拌し、化合物12b(1.0当量)を添加した。LCMSによりアミンが消費されるまで、得られた混合物をRTで4〜20時間撹拌した。その後、該混合物に、ピペリジン(過剰)を添加し、LCMSによりモニタリングして、Fmocが完全に除去されるまで、混合物をRTで1〜6時間撹拌した。反応混合物を膜に通して濾過し、濾液を分取HPLC(方法B)又は逆相フラッシュクロマトグラフィーによりそのまま精製すると、化合物102(38-72％収率)が白色の固体として得られた。
【表２２】
2021523147.tif 000488
【０５４１】
tert-ブチル N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド]プロパンアミド]-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]カルボニル}カルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバメート(102a)
【化３６４】
2021523147.tif 000489
中間体102a、bのための一般的手順に従うと、化合物102a(0.29g、72％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 799(M+1)+。
【０５４２】
tert-ブチル N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]カルボニル}カルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバメート(102b)
【化３６５】
2021523147.tif 000490
中間体102a、bのための一般的手順に従うと、化合物102b(0.27g、38％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 885(M+1)+。
【０５４３】
(実施例5b)
中間体104a〜b
tert-ブチル N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-{2-アミノ-6-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]ヘキサンアミド}-3-メチルブタンアミド]プロパンアミド]-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]カルボニル}カルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバメート(104a)
【化３６６】
2021523147.tif 000491
化合物103(70mg、0.13mmol)のDMF(2mL)溶液に、HATU(68mg、0.18mmol)及びDIPEA(44μL、0.24mmol)をRTで添加した。混合物をRTで5分間撹拌し、その後、化合物102a(95mg、0.12mmol)を添加した。その後、LCMSによりモニタリングして、化合物102aが完全に消費されるまで、反応混合物をRTで3時間撹拌した。その後、該反応混合物に、ピペリジン(0.5mL、過剰)を添加した。混合物をRTで2時間撹拌した。その後、該混合物を濾過し、濾液を濃縮した。残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性重炭酸アンモニウム(10mM)中の0〜100％アセトニトリル)により精製すると、化合物104a(0.13g、96％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 518.0((M-55)/2)+。
【０５４４】
tert-ブチル N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-{2-アミノ-6-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]ヘキサンアミド}-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]カルボニル}カルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバメート(104b)
【化３６７】
2021523147.tif 000492
化合物103(0.27g、0.31mmol)及びDIPEA(0.11mL、0.61mmol)のDMF(6mL)溶液に、化合物102b(0.18g、0.34mmol)を添加し、その後、HATU(0.14g、0.37mmol)を添加した。反応混合物をRTで3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた溶液を逆相フラッシュクロマトグラフィーによりそのまま精製すると、化合物Fmoc-104b(0.30g、ESI m/z: 711((M+Na)/2+1)+)が淡黄色の固体として得られ、これをDCM(6.0mL)に溶解させた。該溶液に、ピペリジン(0.5mL)を添加し、LCMSによりFmocが完全に除去されるまで、反応混合物をRTで2時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去し、残渣を石油エーテルでトリチュレートすると、化合物104b(0.26g、65％収率)が薄黄色の固体として得られた。ESI m/z: 1177.6((M+H)+。
【０５４５】
(実施例5c)
中間体105a〜c
アジド中間体α-CD-N3(105a)は、J. Am. Chem. Soc., 2012, 134(46), 19108-19117に従って合成した(図32)。
【０５４６】
アジド-15-オキソ-3,6,9,12-テトラオキサ-16-アザオクタデカン-18-スルホン酸(105b)、図33
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-アジド-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-オエート(N3-PEG4-Osu、0.10g、0.26mmol)及びタウリン(39mg、0.31mmol)の無水DMF(4mL)溶液に、DIPEA(15mg、0.52mmol)を添加した。混合物をRTで一晩撹拌した。反応混合物を濾過し、溶液を分取HPLC(方法A)により精製すると、中間体105b(0.80g、収率78％)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 399.1(M+H)+。
【化３６８】
2021523147.tif 000493
【０５４７】
アジド中間体マルトース-N3(105c)は、Tetrahedron Letters, 2001, 42(7), 1325-1328に従って合成した(図34)。
【０５４８】
(実施例5d)
中間体106a〜e
【化３６９】
2021523147.tif 000494
化合物104のDMF溶液に、アジド中間体105をRTで添加した。LCMSにより完全な反応が示されるまで、反応液をRTで3〜48時間撹拌した。反応混合物を分取HPLCによりそのまま精製すると、化合物Boc-106が白色の固体として得られ、これをTFA溶液(又はニートのTFA)に溶解させた。LCMSによりBocが除去されるまで、該溶液をRTで0.5〜20時間撹拌した。該溶液を濃縮すると、106が(TFA塩として)得られた。
【表２３】
2021523147.tif 000495
*全てtのBoc-106aを脱Bocに使用したわけではない。
【０５４９】
(1S,4aS,10aR)-N-[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-2,3,4,9,10,10a-ヘキサヒドロフェナントレン-1-カルボニル]-6-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-アミノ-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-ドデカヒドロキシ-10,15,20,25,30-ペンタキス(ヒドロキシメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-5-イル]メチル}-4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル)オキシ]アセトアミド}ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]プロパンアミド]-1,4a-ジメチル-2,3,4,9,10,10a-ヘキサヒドロフェナントレン-1-カルボキサミドトリフルオロ酢酸塩(106a)
【化３７０】
2021523147.tif 000496
中間体106a〜eのための一般的手順に従うと、化合物Boc-106a(72mg、76％収率、トリアゾール位置異性体の混合物として)が白色の固体として得られた(ESI m/z: 1045(M/2+1)+)。逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性TFA(0.01％)中の0〜60％アセトニトリル)によるさらなる精製の後、少量の純粋な主要異性体(7mg)を得ることができ、これを1H NMR(500MHz、DMSOd6)により決定した。
【化３７１】
2021523147.tif 000497
DCM(3mL)中のBoc-106a(位置異性体の混合物として)(20mg、9.6μmol)の混合物に、TFA(1mL)を添加した。LCMSによりモニタリングして、Bocが除去されるまで、得られた混合物をRTで1時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去すると、化合物106a(19mg、104aから69％収率)が淡黄色の固体として得られ、これを、それ以上精製することなく、次の工程に使用した。ESI m/z: 995(M/2+1)+。
【０５５０】
(1S,4aS,10aR)-N-{[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-アミノ-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-ドデカヒドロキシ-10,15,20,25,30-ペンタキス(ヒドロキシメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-5-イル]メチル}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル)オキシ]アセトアミド}ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]カルボニル}-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキサミドトリフルオロ酢酸塩(106b)
【化３７２】
2021523147.tif 000498
中間体106a〜eのための一般的手順に従うと、化合物106b(76mg、104bから87％収率)が黄色の固体として得られた。ESI m/z: 692(M/3+1)+。
【０５５１】
1-(4-(2-(((R)-5-アミノ-6-(((S)-1-(((S)-1-(((4bS,8S,8aR)-8-(((1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル)カルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル)アミノ)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)アミノ)-6-オキソヘキシル)アミノ)-2-オキソエトキシ)-4,5,6,7,8,9-ヘキサヒドロ-1H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル)-15-オキソ-3,6,9,12-テトラオキサ-16-アザオクタデカン-18-スルホン酸(106c)
【化３７３】
2021523147.tif 000499
中間体106a〜eのための一般的手順に従うと、化合物106c(90mg、104cから39％収率)が黄色の固体として得られた。ESI m/z: 463.8(M/3+1)+。
【０５５２】
1-(4-(((6S,9S,12R)-1,12-ジアミノ-6-(((4bS,8S,8aR)-8-(((1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル)カルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル)カルバモイル)-9-イソプロピル-1,8,11,18-テトラオキソ-2,7,10,17-テトラアザノナデカン-19-イル)オキシ)-4,5,6,7,8,9-ヘキサヒドロ-1H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル)-15-オキソ-3,6,9,12-テトラオキサ-16-アザオクタデカン-18-スルホン酸(106d)
【化３７４】
2021523147.tif 000500
中間体106a〜eのための一般的手順の後、逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中の0〜80％アセトニトリル、25分間)による精製の後に、そのTFA塩としての化合物106d(22mg、36％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 788(M/2+H)+。
【０５５３】
(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-N-((1S,4aS,10aR)-6-((2S)-2-((2S)-2-((2R)-2-アミノ-6-(2-((1-((2S,3R,4R,5S,6R)-3,4-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)-5-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-トリヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-3a,4,5,6,7,8,9,9a-オクタヒドロ-1H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル)オキシ)アセトアミド)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキサミド(106e)
【化３７５】
2021523147.tif 000501
中間体106a〜eのための一般的手順に従うと、そのTFA塩としての化合物106e(34mg、77％収率)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 1358(M+H)+。
【０５５４】
(実施例5e)
リンカー-ペイロードLP1B〜LP5B
【化３７６】
2021523147.tif 000502
化合物106のDMF溶液に、化合物DIBAC-PEG4-NHS 107及びDIPEAをRTで添加した。反応混合物をRTで3時間撹拌した。該反応混合物を分取HPLC(方法B)又は逆相フラッシュクロマトグラフィー(方法B)によりそのまま精製すると、化合物LP1B〜5Bが得られた。
【表２４】
2021523147.tif 000503
*遊離塩基としての7mgの化合物106aを再利用した。
【０５５５】
1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-2,3,4,9,10,10a-ヘキサヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-5,6,7,8a,9,10-ヘキサヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}エチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-ドデカヒドロキシ-10,15,20,25,30-ペンタキス(ヒドロキシメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-5-イル]メチル}-4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル)オキシ]アセトアミド}ペンチル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(LP1B)
【化３７７】
2021523147.tif 000504
リンカー-ペイロードLP1〜5のための一般的手順に従うと、リンカー-ペイロードLP1B(8mg、36％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 842(M/3+1)+; 1262(M/2+1)+。
【化３７８】
2021523147.tif 000505
【０５５６】
分析的HPLC: 95％、保持時間: 7.93分(方法B)。
【０５５７】
1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}-4-(カルバモイルアミノ)ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-ドデカヒドロキシ-10,15,20,25,30-ペンタキス(ヒドロキシメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-5-イル]メチル}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル)オキシ]アセトアミド}ペンチル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(LP2B)
【化３７９】
2021523147.tif 000506
リンカー-ペイロードLP1〜5のための一般的手順に従うと、リンカー-ペイロードLP2B(20mg、21％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 870(M/3+H)+。
【化３８０】
2021523147.tif 000507
分析的HPLC: 100％、保持時間: 7.35分(方法B)。溶解度:＜0.1mg/mL水。
【０５５８】
2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]カルボニル}カルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}エチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ペンチル]カルバモイル}メトキシ)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}エタン-1-スルホン酸(LP3B)
【化３８１】
2021523147.tif 000508
リンカー-ペイロードLP1〜5のための一般的手順に従うと、リンカー-ペイロードLP3B(60mg、52％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 642(M/3+H)+。
【化３８２】
2021523147.tif 000509
【０５５９】
2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]カルボニル}カルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}-4-(カルバモイルアミノ)ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ペンチル]カルバモイル}メトキシ)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}エタン-1-スルホン酸(LP4B)
【化３８３】
2021523147.tif 000510
リンカー-ペイロードLP1〜5のための一般的手順に従うと、化合物LP4B(6.0mg、20％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 671(M/3+H)+。
【化３８４】
2021523147.tif 000511
【０５６０】
1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}エチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-5-[2-({1-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3,4-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)-5-{[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-トリヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)オキサン-2-イル]オキシ}オキサン-2-イル]-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル}オキシ)アセトアミド]ペンチル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(LP5B)
【化３８５】
2021523147.tif 000512
リンカー-ペイロードLP1〜5のための一般的手順に従うと、化合物LP5B(15mg、27％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 947(M/2+H)+。
【化３８６】
2021523147.tif 000513
【０５６１】
(実施例11-6)
リンカー-LP6B
本実施例は、上の表3のリンカー-ペイロードLP6Bの合成のための方法を示している。本実施例は、図26の109〜113の番号の化合物及びリンカー-ペイロードLP6Bに言及している。
【０５６２】
1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(110)
【化３８７】
2021523147.tif 000514
化合物108(0.30g、0.54mmol)のDMF(10mL)溶液に、HATU(0.31g、0.81mmol)及びDIPEA(0.14g、1.1mmol)をRTで順次添加した。混合物をRTで15分間撹拌した。その後、反応溶液に、VC-PAB-OH 109(CAS: 159857-79-1、0.21g、0.54mmol)をRTで添加し、LCMSによりモニタリングして、108又は109が消費されるまで、得られた混合物をRTで3時間撹拌した。その後、反応混合物を濾過膜に通して濾過し、濾液を濃縮し、逆相フラッシュクロマトグラフィー(水(10mmol/L重炭酸アンモニウムを含む)中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、化合物110(0.30g、60％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 617(M+H)+。
【０５６３】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル 4-ニトロフェニルカルボネート(112)
【化３８８】
2021523147.tif 000515
化合物110(0.15g、0.16mmol)のDMF(10mL)溶液に、ビス(4-ニトロフェニル)カルボネート111(0.15g、0.49mmol)及びDIPEA(63mg、0.49mmol)を0℃で順次添加した。その後、LCMSによりモニタリングして、110が消費されるまで、混合物をRTで3時間撹拌した。反応混合物を濾過膜に通して濾過し、濾液を濃縮し、逆相フラッシュクロマトグラフィー(水(10mmol/L重炭酸アンモニウムを含む)中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、化合物112(50mg、28％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1079(M+H)+。
【０５６４】
9H-フルオレン-9-イルメチル N-({[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル]アミノ}-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}メチル)カルバメート(113)
【化３８９】
2021523147.tif 000516
DMF(5mL)中の化合物14a(0.10g、0.12mmol)及び化合物112(0.15g、0.14mmol)の混合物に、HOBt(20mg、0.15mmol)及びDIPEA(48mg、0.37mmol)を添加し、混合物をRTで4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物を分取HPLC(方法B)により精製すると、化合物113(0.16g、72％収率)が薄黄色の固体として得られた。ESI m/z: 874(M/2+1)+。
【０５６５】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-(2-アミノアセトアミド)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバメート(LP6B)
【化３９０】
2021523147.tif 000517
化合物113(0.10g、0.057mmol)のDMF(5mL)溶液に、ピペリジン(1mL)を添加し、LCMSによりFmocが完全に除去されるまで、混合物をRTで30分間撹拌した。反応混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物LP6B(35mg、23％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 763(M/2+1)+。
【化３９１】
2021523147.tif 000518
【０５６６】
(実施例11-7)
リンカー-ペイロードLP7B
本実施例は、上の表2のリンカー-ペイロードLP7Bの合成のための方法を示している。本実施例は、図27の14a、107、114、及び115の番号の化合物並びにリンカー-ペイロードLP7Bに言及している。
【０５６７】
9H-フルオレン-9-イルメチル N-({[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-3-メチルブタンアミド]プロパンアミド]-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}メチル)カルバメート(114)
【化３９２】
2021523147.tif 000519
化合物14a(66mg、0.082mmol)のDMF(10mL)溶液に、Boc-Val-Ala-OH 101c(28mg、0.098mmol)、DIPEA(32mg、0.25mmol)、及びHATU(47mg、0.12mmol)を添加した。反応混合物をRTで4時間撹拌し、LCMSによりモニタリングした。該混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性重炭酸アンモニウム(10mM)中の50〜90％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、化合物114(74mg、84％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 978(M-Boc+1)+。
【０５６８】
9H-フルオレン-9-イルメチル N-({[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド]プロパンアミド]-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}メチル)カルバメートトリフルオロ酢酸塩(115)
【化３９３】
2021523147.tif 000520
化合物114(74mg、0.069mmol)のDCM(3mL)溶液に、TFA(1mL)を添加した。LCMSによりBocが完全に除去されるまで、反応混合物をRTで1時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去すると、粗生成物115(66mg、TFA塩としての97％収率)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 978(M+1)+。
【０５６９】
1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-(2-アミノアセトアミド)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}エチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(LP7B)
【化３９４】
2021523147.tif 000521
化合物115(60mg、61μmol)のDMF(5mL)溶液に、DIBAC-suc-PEG4-OSu 107(48mg、74μmol)及びDIPEA(24mg、0.18mmol)を添加した。反応混合物をRTで4時間撹拌し、LCMSによりモニタリングした。その後、反応液に、ピペリジン(0.2mL、過剰)を添加した。LCMSによりFmocが完全に除去されるまで、反応混合物をRTで30分間撹拌した。反応混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、LP7B(22mg、28％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1292(M+H)+。
【化３９５】
2021523147.tif 000522
【０５７０】
(実施例11-8)
(リンカー-ペイロードLP8B)
本実施例は、上の表3のリンカー-ペイロードLP8Bの合成のための方法を示している。本実施例は、図28のP4B、117〜120の番号の化合物及びリンカー-ペイロードLP8Bに言及している。
【０５７１】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-({[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}メチル)カルバメート(117)
【化３９６】
2021523147.tif 000523
Fmoc-vc-PAB-PNP 116(0.14g、0.18mmol)及びペイロードP4B(0.11g、0.18mmol)のDMF(2mL)溶液に、HOBt(24mg、0.18mmol)及びDIPEA(70mg、0.54mmol)をRTでシリンジにより添加した。混合物をRTで2時間撹拌し、LCMSにより化合物P4Bが消費された。得られた混合物に、ピペリジン(42mg、0.50mmol)を添加し、LCMSによりモニタリングして、Fmocが完全に除去されるまで、反応液をRTで2時間撹拌した。膜に通して濾過した後、濾液を濃縮し、分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物117(45mg、27％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 991(M+1)+。
【化３９７】
2021523147.tif 000524
【０５７２】
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル(2R)-6-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-2-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}ヘキサノエート(118)
【化３９８】
2021523147.tif 000525
DCM(3mL)中の化合物103(0.10g、0.19mmol)、EDCI(72mg、0.38mmol)、及びHOSu(43mg、0.38mmol)の混合物をRTで3時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の70％の酢酸エチル)により精製すると、中間体118(55mg、47％収率)が白色の固体として得られ、これを、精製することなく、次の工程で使用した。ESI m/z: 630(M+1)+。
【０５７３】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-アミノ-6-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-({[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}メチル)カルバメート(119)
【化３９９】
2021523147.tif 000526
化合物117(55mg、56μmol)及びDIPEA(24mg、0.19mmol)のDMF(1.5mL)溶液に、粗中間体118(40mg、63μmol)を添加した。LCMSにより118が消費されるまで、反応混合物をRTで2時間撹拌した。該反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、Fmoc-119(60mg、ESI m/z: 753(M/2+1)+)が白色の固体として得られ、これをDMF(1.5mL)に溶解させた。該溶液に、ジエチルアミン(24mg、0.33mmol)を添加し、LCMSによりFmocが完全に除去されるまで、溶液をRTで2時間撹拌した。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性重炭酸アンモニウム中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、化合物119(35mg、化合物117から50％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1282(M+H)+。
【０５７４】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-アミノ-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-ドデカヒドロキシ-10,15,20,25,30-ペンタキス(ヒドロキシメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-5-イル]メチル}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル)オキシ]アセトアミド}ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-({[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}メチル)カルバメート(120)
【化４００】
2021523147.tif 000527
化合物119(70mg、54μmol)のDMF(3mL)溶液に、α-CD-N3 105a(0.16g、0.16mmol)を添加した。反応混合物を50℃で3日間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。その後、得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性重炭酸アンモニウム(10mM)中の0〜100％アセトニトリルにより精製すると、化合物120(20mg、16％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1141(M/2+1)+。
【０５７５】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-ドデカヒドロキシ-10,15,20,25,30-ペンタキス(ヒドロキシメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-5-イル]メチル}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル)オキシ]アセトアミド}ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-({[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}メチル)カルバメート(LP8B)
【化４０１】
2021523147.tif 000528
化合物120(10mg、4.4μmol)及び中間体107(5mg、7.7μmol)のDMF(2mL)溶液に、DIPEA(16mg、0.12mmol)を添加し、混合物を室温で16時間撹拌した。反応混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま2回精製すると、LP8B(1.5mg、12％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 939(M/3+H)+。
【化４０２】
2021523147.tif 000529
分析的HPLC(トリアゾール位置異性体の混合物として): 63％、保持時間: 6.03分; 36％、保持時間: 6.13分(方法B)。
【０５７６】
(実施例11-9)
(リンカー-ペイロードLP9B)
本実施例は、上の表3のリンカー-ペイロードLP9Bの合成のための方法を示している。本実施例は、図29の12b、15、112、121、及び122の番号の化合物並びにリンカー-ペイロードLP9Bに言及している。
【０５７７】
9H-フルオレン-9-イルメチル N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバメート、トリフルオロ酢酸塩(15)
【化４０３】
2021523147.tif 000530
化合物12b(0.63g、1.0mmol)のDCM(50mL)溶液に、Fmoc-OSu(0.40g、1.2mmol)及びDIPEA(0.26g、2.0mmol)を添加した。混合物をRTで16時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。混合物を真空中で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の50〜80％酢酸エチル)により精製すると、Boc-15(0.71g)が白色の固体として得られ、これをDCM(10mL)に溶解させた。該溶液に、TFA(3mL)をRTで添加した。LCMSによりBocが完全に除去されるまで、反応混合物をRTで4時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去すると、TFA塩としての化合物15(0.62g、74％収率)及び無色の油状物が得られた。ESI m/z: 751(M+H)+。
【０５７８】
9H-フルオレン-9-イルメチル N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-6-アミノ-2-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}ヘキサンアミド]-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバメート、トリフルオロ酢酸塩(122)
【化４０４】
2021523147.tif 000531
化合物15(0.30g、0.40mmol)のDMF(20mL)溶液に、Fmoc-Lys(Boc)-OH 121(0.23g、0.48mmol)、HATU(228mg、0.60mmol)、及びDIPEA(0.16g、1.2mmol)をRTで順次添加した。反応混合物をRTで4時間撹拌し、LCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性重炭酸アンモニウム(10mM)中の50〜90％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、Boc-122(0.41g)が白色の固体として得られ、そのうちの0.24gをDCM(20mL)に溶解させた。該溶液に、TFA(3mL)を添加し、LCMSによりBocが完全に除去されるまで、反応混合物をRTで1時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去すると、TFA塩としての化合物122(0.22g、79％収率)及び無色の油状物が得られた。ESI m/z: 1101(M+H)+。
【０５７９】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-[(5S)-5-アミノ-5-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}ペンチル]カルバメート(LP9B)
【化４０５】
2021523147.tif 000532
DMF(5mL)中の化合物122(14mg、12μmol)及び化合物112(15mg、14μmol)の混合物に、HOBt(2mg、15μmol)及びDIPEA(5mg、37μmol)を添加し、混合物をRTで4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。その後、反応混合物に、ピペリジン(0.5mL)を添加し、LCMSによりFmocが完全に除去されるまで、混合物をRTで0.5時間撹拌した。その後、反応混合物を膜に通して濾過し、濾液を濃縮し、分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、LP9B(6mg、31％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 798(M/2+H)+。
【化４０６】
2021523147.tif 000533
【０５８０】
(実施例11-10)
(リンカー-ペイロードLP10B及びLP11B)
本実施例は、上の表3のリンカー-ペイロードLP10B〜LP11Bの合成のための方法を示している。本実施例は、図30のP7B、P8B、116、123a〜bの番号の化合物、リンカー-ペイロードLP10B及びLP11Bに言及している。
【０５８１】
(S)-4-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニルカルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イルアミノ)-3-((4-((S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)-5-ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)カルボニルアミノ)-4-オキソブタン酸(123a)
【化４０７】
2021523147.tif 000534
ペイロードP7(64mg、0.10mmol)のDMF(5mL)溶液に、中間体116(92mg、0.12mmol)及びDIPEA(26mg、0.20mmol)をRTで順次添加した。反応混合物をRTで4時間撹拌し、LCMSによりモニタリングした。その後、該混合物に、ピペリジン(0.5mL)を添加し、LCMSによりFmocが完全に除去されるまで、反応混合物をRTで10分間撹拌した。混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性重炭酸アンモニウム(10mM)中の40〜70％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、化合物123a(41mg、39％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1049(M+H)+。
【０５８２】
(S)-5-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニルカルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イルアミノ)-4-((4-((S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)-5-ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)カルボニルアミノ)-5-オキソペンタン酸(123b)
【化４０８】
2021523147.tif 000535
P7の代わりにP8(0.53g、0.81mmol)を使用することを除き、123aと同様の手順に従うと、化合物123b(0.61g、71％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1063(M+H)+。
【０５８３】
(3S)-3-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル]アミノ}-3-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}プロパン酸(LP10B)
【化４０９】
2021523147.tif 000536
化合物123(21mg、20μmol)のDMF(2mL)溶液に、中間体107(16mg、24μmol)及びDIPEA(5mg、40μmol)をRTで順次添加した。反応混合物をRTで4時間撹拌し、LCMSによりモニタリングした。得られた混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物LP10B(12mg、38％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 792(M/2+H)+。
【化４１０】
2021523147.tif 000537
【０５８４】
(4S)-4-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル]アミノ}-4-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}ブタン酸(LP11B)
【化４１１】
2021523147.tif 000538
123aの代わりに123b(0.10g、94μmol)を使用することを除き、LP10Bと同様の手順に従うと、化合物LP11B(50mg、33％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 799(M/2+H)+。
【化４１２】
2021523147.tif 000539
【０５８５】
(実施例11-11)
(ペイロードP12B及びリンカー-ペイロードLP12B)
本実施例は、下の表CのペイロードP12B及び上の表Cのリンカー-ペイロードLP12Bの合成のための方法を示している。本実施例は、図31の12b、107、124、125、及び126の番号の化合物、並びにペイロードP12Bリンカー-ペイロードLP12Bに言及している。
【０５８６】
((S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-5-(tert-ブトキシ)-5-オキソペンタノイル)-L-アラニン(125)
【化４１３】
2021523147.tif 000540
Fmoc-Glu(OtBu)-OH(6.0g、14mmol)のDCM(300mL)溶液に、HOSu(3.2g、28mmol)及びEDCI(5.4g、28mmol)を添加した。反応混合物をRTで一晩撹拌し、LCMSによりモニタリングした。得られた混合物をDCM(200mL)で希釈し、水(100mL×2)及びブライン(100mL)で洗浄した。有機溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮すると、粗化合物124(8.5g、ESI m/z: 545(M+23)+)が得られ、これをDMF(10mL)に溶解させた。該溶液に、アラニン(4.2g、48mmol)及びDIPEA(6.2g、48mmol)を添加した。反応混合物をRTで一晩撹拌し、LCMSによりモニタリングした。得られた混合物を水(100mL)に注ぎ入れ、酢酸でpH 5〜6に酸性化した。混合物を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機溶液を真空中で濃縮した。粗生成物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性TFA(0.01％)中の0〜60％アセトニトリル)により精製すると、化合物125(1g、15％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 497(M+H)+。
【０５８７】
(S)-tert-ブチル 4-アミノ-5-((S)-1-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニルカルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イルアミノ)-1-オキソプロパン-2-イルアミノ)-5-オキソペンタノエート(126)
【化４１４】
2021523147.tif 000541
化合物125(42mg、84μmol)及びDIPEA(28μl、0.16mmol)のDMF(3.0mL)溶液に、HATU(36mg、95μmol)を添加した。反応混合物をRTで10分間撹拌し、その後、化合物12b(50mg、80μmol)を添加し、混合物をRTで一晩撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。その後、反応混合物に、ピペリジン(1.0mL)を添加し、LCMSによりFmocが完全に除去されるまで、混合物をRTで3時間撹拌した。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性TFA(0.01％)中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、化合物126(20mg、28％収率)が黄色の固体として得られた。ESI m/z: 885(M+H)+。
【０５８８】
(S)-4-アミノ-5-((S)-1-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニルカルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イルアミノ)-1-オキソプロパン-2-イルアミノ)-5-オキソペンタン酸(P12B)
【化４１５】
2021523147.tif 000542
ニートのTFA(2.0mL)中の化合物126(57mg、64μmol)の混合物をRTで1時間撹拌し、LCMSによりモニタリングした。得られた混合物をDCM(20mL)で希釈し、真空中で濃縮した。残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性炭酸水素ナトリウム(10mM)中の0〜100％アセトニトリル)により精製すると、P12B(20mg、43％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 365(M/2+H)+。
【化４１６】
2021523147.tif 000543
【０５８９】
(4S)-4-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-4-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-アミノ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}エチル]カルバモイル}ブタン酸(LP12B)
【化４１７】
2021523147.tif 000544
化合物P12B(10mg、14μmol)のDMF(2.0ml)溶液に、DIPEA(6μl、21μmol)及び化合物107(11mg、16μmol)を添加した。反応混合物をRTで3時間撹拌し、LCMSによりモニタリングした。得られた混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物LP12B(3.5mg、20％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 632(M/2+H)+。
【化４１８】
2021523147.tif 000545
表C. LXRモジュレーターペイロード
【表２５】
2021523147.tif 000546
2021523147.tif 000547
【０５９０】
上記のペイロード化合物の構造、計算LogP値、MS、及びHPLCの結果は、表Dにまとめられている。
表D  ペイロードの化学的-物理的特性
【化４１９】
2021523147.tif 000548
【表２６】
2021523147.tif 000549
6＜+++＜12; 4＜++＜6; 0＜+＜4
【０５９１】
上記のリンカー-ペイロード化合物の分子式、分子量、計算LogP値、MS、及びHPLCの結果は、表Eにまとめられている。
表E  ペイロードの化学的-物理的特性
【表２７】
2021523147.tif 000550
6＜+++＜12; 4＜++＜6; 0＜+＜4
【０５９２】
(実施例12. LP1の合成)(図2)
(1S,4aS,10aR)-6-((S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-N-((1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキサミド(LP1-2)
【化４２０】
2021523147.tif 000551
P1(53mg、0.10mmol)のDMF(1mL)溶液に、Fmoc-Val-Ala-OH(41mg、0.10mmol)、HATU(38mg、0.1mmol)、及びジイソプロピルエチルアミン(26mg、0.20mmol)を順次添加した。LCMSにより、P1が消費されるまで、25℃で24時間撹拌した後、混合物に、ピペリジン(0.1mL)を添加し、得られた溶液を25℃でさらに3時間撹拌した。濾過後、濾液を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物LP1-2(45mg、64％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 699(M+1)+。
【化４２１】
2021523147.tif 000552
【０５９３】
(1S,4aS,10aR)-6-((2S)-2-((2S)-2-((2R)-2-アミノ-6-(2-(シクロオクタ-2-イニルオキシ)アセトアミド)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-N-((1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキサミド(LP1-4)
【化４２２】
2021523147.tif 000553
化合物LP1-3(35mg、0.064mmol)のDMF(1mL)溶液に、HATU(24mg、0.064mmol)及び化合物LP1-2(45mg、0.064mmol)を室温で順次添加した。混合物が均一になるまで、該混合物を室温で数分間撹拌した。この混合物に、ジイソプロピルエチルアミン(41mg、0.32mmol)を室温でシリンジにより添加した。LCMSにより、LP1-2がほとんど消費されるまで、得られた混合物を室温で一晩(16時間)撹拌した。その後、この反応混合物に、ピペリジン(0.1mL、過剰)を室温で滴加し、LCMSによりモニタリングして、Fmocが除去されるまで、混合物をさらに3時間撹拌した。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー又は分取HPLC(方法B、塩基性条件)によりそのまま精製すると、化合物LP1-4(30mg、47％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 991(M+1)+。
【化４２３】
2021523147.tif 000554
【０５９４】
(1S,4aS,10aR)-N-{[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-アミノ-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-ドデカヒドロキシ-10,15,20,25,30-ペンタキス(ヒドロキシメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-5-イル]メチル}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル)オキシ]アセトアミド}ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]プロパンアミド]-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]カルボニル}-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキサミド(LP1-5)
【化４２４】
2021523147.tif 000555
化合物LP1-4(30mg、30μmol)のDMF(0.5mL)溶液に、CD-N3(60mg、60μmol)のDMF(0.5mL)溶液を室温でシリンジにより添加した。混合物を20〜25℃で3日間撹拌した。LCMSにより、化合物LP1-4がほとんど消費された。反応混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物LP1-5(14mg、23％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 995(M/2+1)+。
【化４２５】
2021523147.tif 000556
【０５９５】
1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}エチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-ドデカヒドロキシ-10,15,20,25,30-ペンタキス(ヒドロキシメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-5-イル]メチル}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル)オキシ]アセトアミド}ペンチル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(LP1)
【化４２６】
2021523147.tif 000557
化合物LP1-5(14mg、7.4μmol)及びDIBAC-Suc-PEG4-OSu(6.5mg、10μmol)のDMF(1mL)溶液に、トリエチルアミン(2.0mg、20μmol)を添加し、混合物を20〜25℃で16時間撹拌した。揮発性物質の大部分を真空中で除去し、残渣を分取HPLC(方法B)により精製すると、化合物LP1(5.0mg、27％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1261(M/2+1)+。
【化４２７】
2021523147.tif 000558
【０５９６】
(実施例13. LP2の合成)(図3)
(1S,4aS,10aR)-N-{[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-アミノ-6-{2-[(1-{[41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56-ヘキサデカヒドロキシ-10,15,20,25,30,35,40-ヘプタキス(ヒドロキシメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29,32,34,37,39-ヘキサデカオキサノナシクロ[36.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26.228,31.233,36]ヘキサペンタコンタン-5-イル]メチル}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル)オキシ]アセトアミド}ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]プロパンアミド]-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]カルボニル}-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキサミド(LP2-5)
【化４２８】
2021523147.tif 000559
化合物LP1-4(30mg、0.030mmol)のDMF(2mL)溶液に、γCD-N3(0.12mg、0.091mmol)を添加した。混合物をRTで16時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。該混合物を膜に通して濾過し、その後、濾液を分取HPLC(方法A)により精製すると、化合物LP2-5(40mg、57％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1157.6(M/2+1)+。
【化４２９】
2021523147.tif 000560
【０５９７】
1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}エチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-5-{2-[(1-{[41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56-ヘキサデカヒドロキシ-10,15,20,25,30,35,40-ヘプタキス(ヒドロキシメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29,32,34,37,39-ヘキサデカオキサノナシクロ[36.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26.228,31.233,36]ヘキサペンタコンタン-5-イル]メチル}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル)オキシ]アセトアミド}ペンチル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(LP2)
【化４３０】
2021523147.tif 000561
化合物LP2-6(4.3mg、7.8μmol)の無水DMF(1mL)溶液に、HATU(3.0mg、7.8μmol)を添加した。混合物を10℃で10分間撹拌した後、化合物LP2-5(15mg、6.5μmol)及びDIPEA(1.7mg、13μmol)を添加した。LCMSによりモニタリングして、LP2-5が完全に消費されるまで、混合物をRTで2時間撹拌した。該混合物を膜に通して濾過し、濾液を分取HPLC(方法B)により精製すると、化合物LP3(6.0mg、32％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1424.2(M/2+1)+。
【化４３１】
2021523147.tif 000562
溶解度: 0.075mg/mL H2O
【０５９８】
(実施例14. LP5の合成)(図4)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-アミノ-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-ドデカヒドロキシ-10,15,20,25,30-ペンタキス(ヒドロキシメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-5-イル]メチル}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル)オキシ]アセトアミド}ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}-2-ヒドロキシエチル]カルバメート(LP5-1)
【化４３２】
2021523147.tif 000563
化合物LP4(20mg、15μmol)のDMF(1mL)溶液に、アセトニトリル(2mL)及び水(2mL)中のCD-N3(46mg、45μmol)の溶液をRTで添加した。LCMSにより、化合物LP4がほとんど消費されるまで、混合物を30℃で16時間撹拌した。反応混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物LP5-1(20mg、57％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1156.0(M/2+1)+。
【０５９９】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-ドデカヒドロキシ-10,15,20,25,30-ペンタキス(ヒドロキシメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-5-イル]メチル}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル)オキシ]アセトアミド}ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}-2-ヒドロキシエチル]カルバメート(LP5)
【化４３３】
2021523147.tif 000564
DIBAC-PEG4-酸LP5-2(4.3mg、7.8μmol)のDMF(1mL)溶液に、HATU(3.0mg、3.6μmol)及びDIPEA(1.7mg、13μmol)をRTで添加した。得られた混合物をRTで10分間撹拌した。その後、該混合物に、LP5-1(15mg、6.5μmol)を添加した。LCMSによりモニタリングして、反応が終了するまで、反応混合物を30℃で2時間撹拌した。該反応混合物を濾過し、分取HPLC(方法B)により精製すると、LP5(10mg、42％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1424.3(M/2+1)+。
【化４３４】
2021523147.tif 000565
【０６００】
(実施例15. LP6の合成)(図5)
1-アジド-15-オキソ-3,6,9,12-テトラオキサ-16-アザオクタデカン-18-スルホン酸(L6-2)
【化４３５】
2021523147.tif 000566
アジド-PEG4-NHS(L6-1、0.10g、0.26mmol)の無水DMF(4mL)溶液に、タウリン(39mg、0.31mmol)及びDIPEA(15mg、0.52mmol)を添加した。混合物を25℃で一晩撹拌した。該混合物を濾過し、濾液を分取HPLC(方法A)により精製すると、化合物LP6-2(80mg、78％収率)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 399.1(M+H)+。
【化４３６】
2021523147.tif 000567
【０６０１】
2-{1-[4-({[(5R)-5-アミノ-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}-2-ヒドロキシエチル]カルバモイル}オキシ)メチル]フェニル}カルバモイル)-4-(カルバモイルアミノ)ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ペンチル]カルバモイル}メトキシ)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}エタン-1-スルホン酸(LP6-3)
【化４３７】
2021523147.tif 000568
化合物LP6-2(20mg、50μmol)の水(1mL)溶液に、pH〜7まで飽和水性炭酸水素ナトリウム溶液を0℃で滴加した。その後、該撹拌溶液に、化合物LP4(28mg、21μmol)のアセトントリル(acetontrile)(1mL)溶液をシリンジにより添加した。混合物を25℃で一晩撹拌した。化合物LP4が完全に消費されるまで、反応混合物をLCMSによりモニタリングした。該反応混合物を濾過し、分取HPLC(方法A)により精製すると、化合物LP6-3(15mg、41％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 856.5(M/2+1)+。
【０６０２】
2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}-2-ヒドロキシエチル]カルバモイル}オキシ)メチル]フェニル}カルバモイル)-4-(カルバモイルアミノ)ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ペンチル]カルバモイル}メトキシ)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}エタン-1-スルホン酸(LP6)
【化４３８】
2021523147.tif 000569
化合物LP6-3(15mg、8.8μmol)及び市販のDIBAC-Suc-PEG4-OSu LP6-4(5.7mg、8.8μmol、CAS 1427004-19-0)のDMF(1mL)溶液に、DIPEA(2.3mg、18μmol)を添加し、混合物をRTで2時間撹拌した。揮発性物質の大部分を真空中で除去し、残渣を分取HPLC(方法B)により精製すると、LP6(6.0mg、30％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1123.8(M/2+H)+、749.5(M/3+H)+。
【化４３９】
2021523147.tif 000570
【０６０３】
(実施例16. LP18の合成)(図6)
1-アジド-15-オキソ-3,6,9,12-テトラオキサ-16-アザオクタデカン-18-スルホン酸(L18-2)
【化４４０】
2021523147.tif 000571
アジド-PEG4-NHS(L18-1、0.10g、0.26mmol)の無水DMF(4mL)溶液に、タウリン(39mg、0.31mmol)及びDIPEA(15mg、0.52mmol)を添加した。混合物を25℃で一晩撹拌した。該混合物を濾過し、濾液を分取HPLC(方法A)により精製すると、化合物LP18-2(80mg、78％収率)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 399.1(M+H)+。
【化４４１】
2021523147.tif 000572
【０６０４】
1-(4-(2-((R)-5-アミノ-6-((S)-1-((S)-1-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニルカルバモイル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イルアミノ)-1-オキソプロパン-2-イルアミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イルアミノ)-6-オキソヘキシルアミノ)-2-オキソエトキシ)-4,5,6,7,8,9-ヘキサヒドロ-1H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル)-15-オキソ-3,6,9,12-テトラオキサ-16-アザオクタデカン-18-スルホン酸(LP18-3)
【化４４２】
2021523147.tif 000573
化合物LP1-4(40mg、40μmol)のDMF(1mL)溶液に、アジドLP18-2(40mg、0.10mmol)をRTで添加した。LCMSにより反応の終了が示されるまで、反応液をRTで16時間撹拌した。反応混合物を分取HPLCによりそのまま精製すると、化合物LP18-3(43mg、77％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 695.4(M/2+H)+。
【０６０５】
2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}エチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ペンチル]カルバモイル}メトキシ)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}エタン-1-スルホン酸(LP18)
【化４４３】
2021523147.tif 000574
化合物LP18-3(30mg、22μmol)のDMF(1mL)溶液に、DMF(1mL)及びDIPEA(4mg、32μmol)中のDIBAC-suc-PEG4-OSu(LP18-4、14mg、22μmol)の溶液をRTで順次添加した。反応混合物をRTで2時間撹拌した。該反応混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物LP18(15mg、37％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 642(M/3+H)+。
【化４４４】
2021523147.tif 000575
【０６０６】
(実施例17.ペイロードP5、ペイロードP6、及びペイロードP7の合成)
【化４４５】
2021523147.tif 000576
【表２８】
2021523147.tif 000577
ペイロードP5
(1S,4aS,10aR)-6-((S)-2-アミノ-3-ヒドロキシプロパンアミド)-N-((1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル)-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキサミド(P5)
【化４４６】
2021523147.tif 000578
Fmoc-Ser-OH(33mg、0.1mmol)のDMF(1mL)溶液に、HATU(38mg、0.1mmol)及びDIPEA(39mg、0.3mmol)を25℃で添加した。得られた混合物をこの温度で1時間撹拌した。その後、該混合物に、P1(30mg、0.06mmol)を添加した。反応混合物を25℃で16時間撹拌し、(LCMSによりモニタリングして)P1が完全に消費された後、ピペリジン(0.2mL)を該混合物中に添加し、これを室温でさらに30分間撹拌した。残渣を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、P5(18mg、51％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 616(M+1)+。
【化４４７】
2021523147.tif 000579
【０６０７】
ペイロードP6
(4S)-4-アミノ-4-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}ブタン酸;トリフルオロ酢酸塩(P6)
【化４４８】
2021523147.tif 000580
OtBu-N-Boc-Glu-OH(15mg、0.05mmol)のDMF(1mL)溶液に、HATU(19mg、0.05mmol)及びDIPEA(13mg、0.1mmol)を25℃で添加した。得られた混合物をこの温度で1時間撹拌した。その後、該混合物に、P1(14mg、0.026mmol)を添加した。25℃で16時間撹拌し、(LCMSによりモニタリングして)P1が完全に消費された後、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をDCM(1mL)に溶解させ、該溶液に、TFA(0.1mL)を室温でゆっくりと添加した。混合物を室温で2時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去し、残渣を分取HPLC(方法A)により精製すると、P6(8mg、46％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 658.3(M+1)+。
【化４４９】
2021523147.tif 000581
【０６０８】
ペイロードP7
(1S,4aS,10aR)-N-[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]-6-[(2S)-2,6-ジアミノヘキサンアミド]-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボキサミド;トリフルオロ酢酸塩(P7)
【化４５０】
2021523147.tif 000582
Boc-Lys-OH(15mg、0.05mmol)のDMF(1mL)溶液に、HATU(19mg、0.05mmol)及びDIPEA(13mg、0.1mmol)を25℃で添加した。得られた混合物をこの温度で1時間撹拌した。その後、該混合物に、P1(15mg、0.028mmol)を添加した。25℃で16時間撹拌し、(LCMSによりモニタリングして)P1が完全に消費された後、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣(Boc-P7)をDCM(1mL)に溶解させ、該溶液に、TFA(0.1mL)を室温でゆっくりと添加した。混合物を室温で2時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去し、残渣を分取HPLC(方法A)により精製すると、P7(9mg、49％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 657.5(M+1)+。
【化４５１】
2021523147.tif 000583
【０６０９】
(実施例18. LP4の合成)(図7)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}-2-ヒドロキシエチル]カルバメート(LP4-2)
【化４５２】
2021523147.tif 000584
Fmoc-vc-PAB-PNP(LP4-1、58mg、76μmol)及びP5(36mg、58μmol)のDMF(3mL)溶液に、HOBt(7.9mg、58μmol)及びDIPEA(15mg、0.12mmol)を添加し、混合物を30℃で16時間撹拌した。その後、LCMSにより、化合物P5が完全に消費された。得られた混合物に、ジエチルアミン(0.1mL)を添加し、LCMSによりモニタリングして、Fmocが除去されるまで、反応液をRTで1時間撹拌した。反応液を濾過した後、濾液を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物LP4-2(36mg、48％収率)が薄黄色の固体として得られた。ESI m/z: 1021(M+1)+。
【化４５３】
2021523147.tif 000585
【０６１０】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-アミノ-6-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-イル]ホルムアミド}カルボニル)-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}-2-ヒドロキシエチル]カルバメート(LP4)
【化４５４】
2021523147.tif 000586
化合物LP4-3(24mg、44μmol)のDMF(2mL)溶液に、HATU(17mg、44μmol)及び化合物LP4-2(35mg、34μmol)をRTで順次添加した。混合物が均一になるまで、該混合物をRTで数分間撹拌した。この混合物に、DIPEA(8.8mg、68μmol)をRTでシリンジにより添加した。LCMSによりLP4-2がほとんど消費されるまで、得られた混合物をRTで2時間撹拌した。その後、この反応混合物に、ジエチルアミン又はピペリジン(0.1mL、過剰)をRTで滴加しLCMSによりモニタリングして、Fmoc基が除去されるまで、混合物を1時間撹拌した(注:ジエチルアミンとピペリジンはどちらも同等に効果的であった)。反応混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物LP4(15mg、33％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1313.6(M+H)+。
【化４５５】
2021523147.tif 000587
【０６１１】
(実施例19. LP11の合成)(図8)
tert-ブチル N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}-5-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}ペンチル]カルバメート(LP11-1)
【化４５６】
2021523147.tif 000588
N-Boc-N'-Fmoc-L-リジン(0.21g、0.45mmol)のDMF(2mL)溶液に、HATU(0.24g、0.64mmol)及びDIPEA(0.15g、1.1mmol)をRTで添加した。得られた混合物をRTで3分間撹拌した。その後、該混合物に、ペイロードP1(0.20g、0.38mmol)を添加した。LCMSによりモニタリングして、反応が終了するまで、反応混合物をRTで15分間撹拌した。反応混合物を濾過し、分取HPLC(方法B)により精製すると、化合物LP11-1(0.10g、27％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 979(M+1)+。
【０６１２】
9H-フルオレン-9-イルメチル N-[(5S)-5-アミノ-5-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}ペンチル]カルバメート(LP11-2)
【化４５７】
2021523147.tif 000589
化合物LP11-1(0.10g、0.10mmol)のDCM溶液に、TFA(2mL)をRTで添加した。LCMSによりBocが完全に除去されるまで、得られた混合物をRTで1時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性重炭酸アンモニウム(10mM)中の0〜100％アセトニトリル)により精製すると、化合物LP11-2(77mg、86％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 879(M+1)+。
【化４５８】
2021523147.tif 000590
【０６１３】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}-5-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}ペンチル]カルバメート(LP11-3)
【化４５９】
2021523147.tif 000591
DMF(3mL)中の化合物LP11-2(57mg、65μmol)及び化合物LP9-5(0.10g、96μmol)の混合物に、HOBt(30mg、0.22mmol)及びDIPEA(0.11g、0.81mmol)を添加し、混合物をRTで1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性重炭酸アンモニウム(10mM)中の0〜100％アセトニトリル)により精製すると、化合物LP11-3(97mg、81％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 909(M/2+1)+。
【０６１４】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-[(1S)-5-アミノ-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}ペンチル]カルバメート(LP11)
【化４６０】
2021523147.tif 000592
化合物LP11-3(97mg、53μmol)のDMF(3mL)溶液に、ジエチルアミン(45mg、0.62mmol)を添加した。LCMSによりFmocが除去されるまで、混合物をRTで2時間撹拌した。反応混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物LP11(40mg、47％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 798(M/2+1)+。
【化４６１】
2021523147.tif 000593
【０６１５】
(実施例20. LP9の合成)(図9)
1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(LP9-3)
【化４６２】
2021523147.tif 000594
化合物LP9-2(0.30g、0.54mmol)のDMF(10mL)溶液に、HATU(0.31g、0.81mmol)及びDIPEA(0.14g、1.1mmol)を室温で順次添加した。混合物を室温で15分間撹拌した。反応溶液に、VC-PAB-OH(LP9-1、CAS: 159857-79-1、0.21g、0.54mmol)をRTで添加し、LCMSによりモニタリングして、LP9-2が消費されるまで、得られた混合物をRTで3時間撹拌した。反応混合物を濾過膜に通して濾過し、濾液をリバースフラッシュクロマトグラフィー(水(10mmol/Lの重炭酸アンモニウムを含む)中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、化合物LP9-2(0.30g、60％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 617(M+H)+。
【０６１６】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル 4-ニトロフェニルカルボネート(LP9-5)
【化４６３】
2021523147.tif 000595
化合物LP9-3(0.15g、0.16mmol)のDMF(10mL)溶液に、ビス(4-ニトロフェニル)カルボネート(LP9-4、0.15g、0.49mmol)及びDIPEA(63mg、0.49mmol)を0℃で順次添加した。その後、LCMSによりモニタリングして、LP9-3がほとんど消費されるまで、混合物をRTで3時間撹拌した。反応混合物を濾過膜に通して濾過し、濾液をリバースフラッシュクロマトグラフィー(水(10mmol/Lの重炭酸アンモニウムを含む)中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、化合物LP9-5(50mg、28％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1079(M+H)+。
【０６１７】
(4S)-4-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル]アミノ}-4-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-ヒドロキシ-1,4a-ジメチル-1,2,3,4,4a,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボニル]カルバモイル}-4b,8-ジメチル-4b,5,6,7,8,8a,9,10-オクタヒドロフェナントレン-3-イル]カルバモイル}ブタン酸(LP9)
【化４６４】
2021523147.tif 000596
DMF(1mL)中の化合物P6(50mg、76μmol)及び化合物LP9-5(0.10g、96μmol)の混合物に、HOBt(16mg、0.12mmol)及びDIPEA(39mg、0.31mmol)を添加し、混合物をRTで1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物を分取HPLC(方法B)により精製すると、化合物LP9(40mg、33％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 799(M/2+1)+。
【化４６５】
2021523147.tif 000597
【０６１８】
(実施例21.ペイロードP9及びリンカー-ペイロードLP12の合成)(図10)
ペイロードP9
ペイロードP9の合成は、少なくとも一部は、引用により本明細書中に完全に組み込まれるUS 2015/0291563A1号に基づいている。
【０６１９】
4-(4-ブロモフェニル)-2-オキソブタ-3-エン酸(P9-3)
【化４６６】
2021523147.tif 000598
4-ブロモベンズアルデヒドP9-2(5.5g、30mmol)及びピルビン酸P9-1(2.8g、32mmol)のメタノール(100mL)溶液に、水酸化カリウム(2.5g、45mmol)のメタノール(100mL)溶液を0℃で添加した。塩基を添加している間に沈殿が生じ、混合物を1時間RTに到達させておいた。該混合物をRTで16時間撹拌させておき、その後、真空中で濃縮すると、揮発性物質が除去された。残渣を水(200mL)で希釈し、水性HCl(1M)でpH 3に酸性化した。混合物を酢酸エチル(100mL×3)で抽出した。合わせた有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮すると、化合物P9-3(7.1g、93％収率)が粘性のある油状物として得られた。ESI m/z: 255(M+1)+。
【０６２０】
5-(4-ブロモフェニル)-1-(2,6-ジクロロフェニル)-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-3-カルボン酸(P9-5)
【化４６７】
2021523147.tif 000599
氷酢酸(100mL)中の化合物P9-3(5.1g、20mmol)及び(2,6-ジクロロフェニル)ヒドラジン塩酸塩P9-4(4.1g、20mmol)の混合物を窒素雰囲気下で4時間還流させた。25℃に冷却した後、反応混合物を氷水に注ぎ入れ、それにより、粘着性のある物質が得られ、これをDCMで抽出した。合わせた有機溶液を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。残渣を大気中で乾燥させると、化合物P9-5(5.4g、65％収率)が淡黄色の固体として得られた。ESI m/z: 413(M+1)+。
【０６２１】
メチル 5-(4-ブロモフェニル)-1-(2,6-ジクロロフェニル)-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-3-カルボキシレート(P9-6)
【化４６８】
2021523147.tif 000600
化合物P9-5(8.2g、20mmol)のメタノール(200mL)溶液に、硫酸(0.5mL)を滴加した。混合物を4時間還流させ、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物をRTに冷却し、揮発性物質を真空中で除去した。残渣を酢酸エチル(300mL)で抽出し、その後、飽和水性塩化アンモニウム及び水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/n-ヘキサン＝1/4)により精製すると、化合物P9-6(2.1g、25％収率)が黄色の油状物として得られた。ESI m/z 429(M+1)+。
【化４６９】
2021523147.tif 000601
【０６２２】
2-(5-(4-ブロモフェニル)-1-(2,6-ジクロロフェニル)-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-3-イル)-1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロプロパン-2-オール(P9-7)
【化４７０】
2021523147.tif 000602
トルエン(20mL)中の化合物P9-6(0.49g、1.2mmol)の混合物に、(トリフルオロメチル)トルメチルシラン(0.68mL、4.6mmol)、4Å分子篩(100mg)、及びTBAF(THF中1M、4.6mL)を窒素雰囲気下でゆっくりと添加した。得られた混合物を46℃で16時間撹拌した。得られた混合物をセライトパッドに通して濾過し、濾液をDCMで希釈した。該溶液を蒸留水及びブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。黄色の残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/n-ヘキサン＝1/8)により精製すると、化合物P9-7(0.15g、25％収率)が褐色の油状物として得られた。
【化４７１】
2021523147.tif 000603
【０６２３】
tert-ブチル 3-(3-ブロモフェニルチオ)プロピル(メチル)カルバメート(P9-11)
【化４７２】
2021523147.tif 000604
tert-ブチル 3-ヒドロキシプロピル(メチル)カルバメートP9-8(1.9g、10mmol)のピリジン(5mL)溶液に、塩化トシル(2.1g、11mmol)を0℃で滴加した。混合物をRTで2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。混合物を真空中で濃縮して、ピリジンを除去すると、粗生成物P9-9(ESI m/z: 244(M-Boc+1)+)が得られ、これをアセトニトリル(100mL)に溶解させた。該溶液に、3-ブロモベンゼンチオールP9-10(1.9g、10mmol)及び炭酸セシウム(6.5g、20mmol)を添加した。混合物を4時間還流させ、これをLCMSによりモニタリングした。RTに冷却した後、反応混合物を濾過し、濾液を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の8〜10％酢酸エチル)により精製すると、化合物P9-11(2.2g、61％収率)が薄黄色の油状物として得られた。ESI m/z: 260(M-Boc+1)+。
【０６２４】
tert-ブチル 3-(3-ブロモフェニルスルホニル)プロピル(メチル)カルバメート(P9-12)
【化４７３】
2021523147.tif 000605
化合物P9-11(0.36g、1.0mmol)のDCM(20mL)溶液に、mCPBA(1.0g、0.4mmol)を0℃でゆっくりと添加した。混合物をRTで4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物を飽和水性炭酸ナトリウム(20mL×3)及びブラインで洗浄した。有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の8〜10％酢酸エチル)により精製すると、化合物P9-12(0.22g、56％収率)が薄黄色の油状物として得られた。ESI m/z: 294(M-Boc+1)+。
【０６２５】
tert-ブチルメチル(3-(3-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2イル)フェニルスルホニル)プロピル)カルバメート(P9-13)
【化４７４】
2021523147.tif 000606
化合物P9-12(0.20g、0.51mmol)の1,4-ジオキサン(20mL)溶液に、ビス(ピナコレート)ジボロン(0.26g、1.0mmol)、Pd(dppf)Cl2(37mg、0.051mmol)、及び酢酸カリウム(0.20g、2.0mmol)を窒素雰囲気下で添加した。反応混合物を、窒素雰囲気下、80℃で16時間撹拌した。RTに冷却した後、該混合物をセライトパッドに通して濾過した。濾液に蒸留水を添加し、混合物をジエチルエーテルで3回抽出した。合わせた抽出物を蒸留水及びブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空中で濃縮すると、黄色の液体残渣が得られた。該残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の8〜10％酢酸エチル)により精製すると、化合物P9-13(0.20g、87％収率)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 340(M-Boc+1)+。
【化４７５】
2021523147.tif 000607
【０６２６】
tert-ブチル 3-(4'-(1-(2,6-ジクロロフェニル)-3-(1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-ヒドロキシプロパン2-イル)-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-5-イル)ビフェニル-3-イルスルホニル)プロピル(メチル)カルバメート(P9-14)
【化４７６】
2021523147.tif 000608
1,4-ジオキサン(20mL)及び水(3mL)中の化合物P9-13(0.20g、0.51mmol)及び化合物P9-7(0.27g、0.51mmol)の混合物に、Pd(dppf)Cl2(37mg、0.051mmol)及び炭酸カリウム(0.28g、2.0mmol)を窒素保護下で添加した。反応混合物を窒素で3回交換し、窒素雰囲気下、80℃で16時間撹拌した。RTに冷却した後、反応混合物をセライトパッドに通して濾過した。濾液を蒸留水で希釈し、ジエチルエーテルで3回抽出した。合わせた抽出物を蒸留水及びブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の8〜10％酢酸エチル)により精製すると、化合物P9-14(0.33g、84％収率)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 667(M-Boc+1)+。
【０６２７】
2-(1-(2,6-ジクロロフェニル)-5-(3'-(3-(メチルアミノ)プロピルスルホニル)ビフェニル-4-イル)-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-3-イル)-1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロプロパン-2-オール、トリフルオロ酢酸塩(P9)
【化４７７】
2021523147.tif 000609
化合物P9-14(0.20g、0.26mmol)のDCM(10mL)溶液に、TFA(3mL)を添加した。反応混合物をRTで1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。揮発性物質を真空中で除去した。得られた黄色の残渣を分取HPLC(方法A)により精製すると、化合物P9(55mg、そのTFA塩として32％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 667(M+1)+。
【化４７８】
2021523147.tif 000610
(TFAのHは、明らかにされなかった)。
【０６２８】
リンカー-ペイロードLP12
4-((S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)-5-ウレイドペンタンアミド)ベンジル 3-(4'-(1-(2,6-ジクロロフェニル)-3-(1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-ヒドロキシプロパン2-イル)-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-5-イル)ビフェニル-3-イルスルホニル)プロピル(メチル)カルバメート(LP12-2)
【化４７９】
2021523147.tif 000611
化合物P9(50mg、0.075mmol)のDMF(5mL)溶液に、Fmoc-VC-PAB-PNP P12-1(63mg、0.083mmol)、DIPEA(19mg、0.15mmol)、及びHOBt(15mg、0.11mmol)を添加した。反応混合物をRTで4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。その後、ピペリジン(1mL、過剰)を反応混合物に添加した。LCMSによりFmocが完全に除去されるまで、混合物をRTで1時間撹拌した。該混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性重炭酸アンモニウム(10mM)中の0〜50％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、化合物LP12-2(48mg、60％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1073(M+1)+。
【０６２９】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-[3-(3-{4-[1-(2,6-ジクロロフェニル)-3-(1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-ヒドロキシプロパン2-イル)-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-5-イル]フェニル}ベンゼンスルホニル)プロピル]-N-メチルカルバメート(LP12)
【化４８０】
2021523147.tif 000612
DIBAC-PEG4-酸LP12-3(18mg、32μmol)のDMF(5mL)溶液に、HATU(15mg、39μmol)及びDIPEA(14mg、0.11mmol)をRTで添加した。得られた混合物をRTで30分間撹拌した。その後、該混合物に、LP12-2(29mg、27μmol)を添加した。反応が終了するまで、反応混合物をRTで1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物を濾過し、分取HPLC(方法B)により精製すると、LP12(25mg、58％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 805(M/2+1)+。
【化４８１】
2021523147.tif 000613
【０６３０】
(実施例22.ペイロードP3及びペイロードP4の合成)(図11)
本実施例は、図11に言及している。特定のステロイド性ペイロードを市販のフルオシノロンアセトニドP3-1(CAS: 67-73-2)から出発して調製した。過塩素酸の存在下でのブチルアルデヒドとのケタール交換によってP3-1から得られた化合物P3-2をメシレートP3-3に変換し、その後、メシレート基をアジド部分と置換して、P4-4を形成させ、これをアミンP4に還元した。別の方法では、P3-3中のメシレート部分を4-アミノ-フェノールにより置換して、アニリンP3も得た。
【０６３１】
ペイロードP3
(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-8-(2-ヒドロキシアセチル)-9,13-ジメチル-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-16-オン(P3-2)
【化４８２】
2021523147.tif 000614
【０６３２】
ヘプタン(90mL)中のフルオシノロンアセトニド(P3-1、0.90g、2.0mmol)及びシリカゲル(18g)の混合物に、ブチルアルデヒド(0.27mL、3.0mmol)を10℃で添加し、懸濁液を10〜20℃で10分間撹拌した。混合物に、過塩素酸(70％、0.68mL、8.3mmol)を0℃で滴加した。その後、反応混合物を10〜20℃で一晩撹拌した。TLC及びLCMSによると、フルオシノロンアセトニドP3-1の大部分が消費された。反応混合物を石油エーテルで希釈し、飽和水性Na2CO3でクエンチした。懸濁液を濾過し、固体をDCM/メタノール(v/v＝1)で洗浄した。合わせた濾液を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜100％酢酸エチル)により精製すると、化合物P3-2(0.15g、16％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 467.1(M+H)+。
【０６３３】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチルメタンスルホネート(P3-3)
【化４８３】
2021523147.tif 000615
化合物P3-2(0.28g、0.65mmol))及びトリエチルアミン(0.13g、1.3mmol)のDCM(3mL)溶液に、塩化メタンスルホニル(89mg、0.78mmol)を0℃で添加した。0℃で0.5時間撹拌した後、反応混合物をDCM(20mL)で希釈した。該混合物をH2O(20mL×2)で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲル上でのシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜50％酢酸エチル)により精製すると、化合物P3-3(0.26g、>99％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 545(M+H)+。
【０６３４】
(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-[2-(4-アミノフェノキシ)アセチル]-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-16-オン(P3)
【化４８４】
2021523147.tif 000616
アセトン(0.5mL)中の化合物P3-3(93mg、0.17mmol)、4-アミノフェノール(37mg、0.34mmol)、及び炭酸セシウム(0.11g、0.34mmol)の混合物を2時間還流した。該混合物をRTに冷却し、H2O(10mL)で希釈した。混合物を酢酸エチル(10mL×3)で抽出した。合わせた有機層を水(20mL)及びブライン(20mL)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣を分取HPLCにより精製すると、ペイロードP3(6.0mg、6.3％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 298(M/2+H)+、558(M+H)+(10％)。
【化４８５】
2021523147.tif 000617
分析的HPLC:純度97.4％、保持時間: 7.55分(方法B)。
【０６３５】
ペイロードP4
(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2-アジドアセチル)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-16-オン(P4-4)
【化４８６】
2021523147.tif 000618
化合物P3-3(1.0g、1.8mmol)及びアジ化ナトリウム(1.2g、18mmol)のアセトン(15mL)懸濁液を50℃で一晩撹拌した。混合物をRTに冷却し、水(80mL)に注ぎ入れた。水性混合物を酢酸エチル(50mL×3)で抽出した。合わせた有機層をブライン(30mL)で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮すると、粗アジド前駆体の化合物P4-4(0.90g、＞99％収率)が黄色の固体として得られ、これを、それ以上精製することなく、次の工程に使用した。ESI m/z: 492(M+H)+。
【０６３６】
(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2-アミノアセチル)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-16-オン;トリフルオロ酢酸塩(P4)
【化４８７】
2021523147.tif 000619
化合物P4-4(0.85g、1.7mmol)のTHF(20mL)溶液に、水性塩酸(1N、10mL)を添加した。混合物を透明になるまで28〜32℃で撹拌し、その後、該混合物にトリフェニルホスフィン(0.68g、2.6mmol)を添加した。得られた黄色の透明な溶液をRTで18時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性TFA(0.05％)中の0〜50％アセトニトリル)により精製すると、化合物P4(R/S)(0.56g、57％収率、TFA塩)がオフホワイト色の固体として得られた。ESI m/z: 466(M+H)+。
【化４８８】
2021523147.tif 000620
分析的HPLC: 100％、保持時間: 6.86分(方法A)。
【０６３７】
ペイロードP4を任意にHPLC及び/又は超臨界クロマトグラフィー(SFC)によるキラル分離に供した。P4の立体化学的に純粋なエピマー、すなわち、P4-1(R)及びP4-2(S)又はその濃縮混合物P4-3をその対応するR/S異性体の混合物からキラル分離により得た。各々の化合物の絶対立体化学を2D-NOESYにより決定した。米国出願公開US 2018/0155389号を参照されたく、これには、その中の化合物11-5R/Sの2D-NOESYスペクトルにおいて、H22とH18が化合物11-5Rについて相関すること、及び11-5S中のH22とH18の間に相関がないことが示されている。化合物11-5R/SについてUS 2018/0155389号に示されているのと同様の解析を用いて、C22-位のキラル中心が、本明細書中の化合物P4-1及びP4-2について、2D-NOESYにより同定されている。
【化４８９】
2021523147.tif 000621
【０６３８】
(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2-アミノアセチル)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-16-オン;トリフルオロ酢酸塩P4-1(R)の交互合成
工程1:上記の同じ手順を用いると、フラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜50％酢酸エチル)による精製の後に、アジド前駆体P4-4(R)(0.12g、87％収率)が化合物(P3-3R)から白色の固体として得られた。ESI m/z: 492(M+H)+。
【化４９０】
2021523147.tif 000622
【０６３９】
工程2:上記の同じ手順を用いて、分取HPLC(方法A)による精製の後に、化合物P4-1(R)(30mg、66％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 466(M+H)+。
【化４９１】
2021523147.tif 000623
分析的HPLC: 100％、保持時間: 6.85分(方法A)。
【０６４０】
P4-2(S)は、同様の手順を用いて得られる。
【０６４１】
下の表は、P4(R/S)のSFCによって単離されたR-P4(本明細書中のP4-1)及びS-P4(本明細書中のP4-2)の1H NMR化学シフト(d6-DMSO中のppm)の比較を提供している。
【化４９２】
2021523147.tif 000624
【表２９】
2021523147.tif 000625
2021523147.tif 000626
【０６４２】
(実施例23.リンカー-ペイロードLP3の合成)(図12)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}フェニル)カルバメート(LP3-2)
【化４９３】
2021523147.tif 000627
Fmoc-vc-PAB-PNP(LP3-1、100mg、0.13mmol)及び化合物P3(87mg、0.15mmol)のDMF(5mL)溶液に、DIPEA(67mg、0.52mmol)をRTでシリンジにより添加した。混合物をRTで3時間撹拌し、LCMSによると、LP3-1の大部分が消費された。得られた混合物に、ピペリジン(1mL、過剰)を添加し、Fmocが完全に消費されるまで、それを25℃で2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。膜に通して濾過した後、濾液を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物LP3-2(80mg、64％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 963(M+1)+。
【化４９４】
2021523147.tif 000628
【０６４３】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}フェニル)カルバメート(LP3)
【化４９５】
2021523147.tif 000629
酸LP3-3(37mg、67μmol)のDMF(5mL)溶液に、DIPEA(15mg、0.12mmol)及びHATU(34mg、90μmol)をRTで順次添加した。得られた混合物をこの温度で0.5時間撹拌し、その後、アミンLP3-2(58mg、60μmol)を添加した。アミンが完全に消費されるまで、反応混合物をRTで3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。該反応混合物を膜に通して濾過し、その後、濾液を分取HPLCにより分離すると、化合物LP3(20mg、22％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1499(M+H)+。
【化４９６】
2021523147.tif 000630
分析的HPLC: 100％、保持時間: 7.99分(方法B)。溶解度:＜0.01mg/mL水
【０６４４】
(実施例24.リンカー-ペイロードLP13の合成)(図13)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル}カルバメート(LP13-1)
【化４９７】
2021523147.tif 000631
Fmoc-VC-PAB-PNP(LP3-1、0.17g、0.22mmol)及び化合物P4(93mg、0.20mmol)のDMF(3mL)溶液に、DIPEA(51mg、0.40mmol)をRTでシリンジにより添加した。混合物をRTで3時間撹拌し、LCMSにより材料の大部分が消費された。得られた混合物に、ピペリジン(0.3mL、過剰)を添加し、Fmocが完全に除去されるまで、これをRTで1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。膜に通して濾過した後、濾液を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物LP13-1(0.13g、73％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 871(M+1)+。
【０６４５】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル}カルバメート(LP13)
【化４９８】
2021523147.tif 000632
酸LP3-3(30mg、54μmol)のDMF(5mL)溶液に、DIPEA(13mg、0.10mmol)及びHATU(31mg、81μmol)をRTで順次添加した。得られた混合物をこの温度で0.5時間撹拌し、その後、アミンLP13-1(43mg、50μmol)を添加した。アミンが完全に消費されるまで、反応混合物をRTで3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。該反応混合物を膜に通して濾過し、その後、濾液を分取HPLC(方法B)により分離すると、化合物LP13(16mg、23％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1406(M+H)+。
【化４９９】
2021523147.tif 000633
分析的HPLC: 100％、保持時間: 7.40分(方法B)。溶解度: 0.02mg/mL水
【０６４６】
(実施例25.リンカー-ペイロードLP14の合成)(図14)
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-アミノ-6-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル}カルバメート(LP14-1)
【化５００】
2021523147.tif 000634
酸LP1-3(0.12g、0.22mmol)のDMF(5mL)溶液に、HATU(0.11g、0.30mmol)及びDIPEA(77mg、0.60mmol)をRTで添加した。混合物をRTで30分間撹拌した後、アミンLP13-1(0.17g、0.20mmol)のDMF(5mL)溶液をシリンジにより添加した。アミンがLCMSによりほとんど消費されるまで、得られた混合物をRTで3時間撹拌した。その後、該混合物にピペリジン(1mL、過剰)を添加し、Fmocが完全に除去されるまで、混合物をRTで30分間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物を膜に通して濾過し、濾液を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性重炭酸アンモニウム(10mM)中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、化合物LP14-1(0.12g、52％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1163(M+1)+。
【化５０１】
2021523147.tif 000635
【０６４７】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-アミノ-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-ドデカヒドロキシ-10,15,20,25,30-ペンタキス(ヒドロキシメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-5-イル]メチル}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル)オキシ]アセトアミド}ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル}カルバメート(LP14-2)
【化５０２】
2021523147.tif 000636
アルキンLP14-1(0.12g、0.10mmol)のDMF(5mL)溶液に、α-シクロデキストリン-アジド(0.30g、0.30mmol)を添加した。その後、化合物LP14-1がほとんど消費され、所望の質量が検出されるまで、得られた混合物を50℃で3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。濾過した後、得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性重炭酸アンモニウム(10mM)中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、化合物LP14-2(0.11g、51％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1081(M/2+1)+。
【化５０３】
2021523147.tif 000637
【０６４８】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-ドデカヒドロキシ-10,15,20,25,30-ペンタキス(ヒドロキシメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-5-イル]メチル}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル)オキシ]アセトアミド}ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル}カルバメート(LP14)
【化５０４】
2021523147.tif 000638
酸LP14-3(30mg、54μmol)のDMF(5mL)溶液に、DIPEA(18mg、0.14mmol)及びHATU(26mg、69μmol)をRTで順次添加した。得られた混合物をこの温度で0.5時間撹拌し、その後、アミンLP14-2(0.10g、46μmol)を添加した。アミンが完全に消費されるまで、反応混合物をRTで4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。該反応混合物を膜に通して濾過し、その後、濾液を分取HPLC(方法B)により分離すると、化合物LP14(26mg、22％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1349(M+H)+。
【化５０５】
2021523147.tif 000639
分析的HPLC: 100％、保持時間: 6.23分(方法B)。溶解度: 0.026mg/mL水
【０６４９】
(実施例26.リンカー-ペイロードLP15の合成)(図15)
2-{1-[4-({[(5R)-5-アミノ-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル}カルバモイル)オキシ]メチル}フェニル)カルバモイル]ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ペンチル]カルバモイル}メトキシ)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}エタン-1-スルホン酸(LP15-2)
【化５０６】
2021523147.tif 000640
化合物LP14-1(60mg、52μmol)のDMF(2mL)溶液に、アジド化合物LP15-1(62mg、0.16mmol)を添加した。反応液を30℃で一晩撹拌した。LCMSにより反応の終了が示された。反応混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物LP15-2(60mg、74％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 781(M/2+H)+。
【化５０７】
2021523147.tif 000641
【０６５０】
2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル}カルバモイル)オキシ]メチル}フェニル)カルバモイル]ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ペンチル]カルバモイル}メトキシ)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}エタン-1-スルホン酸(LP15)
【化５０８】
2021523147.tif 000642
化合物LP15-2(47mg、30μmol)のDMF(1mL)溶液に、化合物LP15-3(21mg、33μmol)及びDIPEA(19mg、0.15mmol)をRTで添加した。反応混合物をRTで3時間撹拌した。該反応混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物LP15(28mg、45％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1049(M/2+H)+。
【化５０９】
2021523147.tif 000643
分析的HPLC: 98％、保持時間: 5.88分(方法B)。
【０６５１】
(実施例26A:ブデノシド(Budenoside)スペーサーの合成)(図22を参照)
図22は、反応基、suc-酸(化合物1c)、カルバメート類似体(1d、1e)、THP-類似体(1g及び1h)、グルコース類似体(1i及び1j)、ホスフェート類似体(1k及び1l)、並びに市販のホスフェート類似体(1m)を含有するブデソニド-スペーサーの合成のためのスキーム1を示している。
【０６５２】
中間体3a
1-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)オキシ]ピロリジン-2,5-ジオン(3a)
【化５１０】
2021523147.tif 000644
ブデソニド1a(0.10g、0.26mmol)のDCM(1mL)溶液に、ビス(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)カルボネート(71mg、0.30mmol)、トリエチルアミン(47mg、0.52mmol)、及びDMAP(3.0mg、触媒)を添加した。ブデソニドが消費されるまで、反応混合物を15〜25℃で12時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。その後、該反応混合物をDCMで希釈し、水により洗浄した。有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。濾過した後、溶液を真空中で濃縮し、残渣(粗3a)を、精製することなく、次の工程にそのまま使用した(93mg、収率71％)。ESI m/z: 572.2(M+H)+。
【０６５３】
(実施例1c)
4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}-4-オキソブタン酸(1c)
【化５１１】
2021523147.tif 000645
WO2015005459号; WO2013074988号; Research in Pharmaceutical Science, 2011, 6(2), 107-116;及びInternational Journal of Pharmaceutics, 2009, 365(1-2), 69-76を参照されたい。
【０６５４】
ブデソニド(1a、0.10g、0.26mmol)のDCM(1mL)溶液に、無水コハク酸(30mg、0.30mmol)、トリエチルアミン(47mg、0.52mmol)、及びDMAP(3mg、触媒、0.02mmol)を添加した。ブデソニドが消費されるまで、混合物をRTで12時間撹拌し、これをTLC及びLCMSによりモニタリングした。その後、反応混合物をDCMで希釈し、水で洗浄した。有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。濾過した後、溶液を真空中で濃縮し、残渣を分取HPLCにより精製すると、表題化合物1c(22mg、収率18％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 531.3(M+H)+。
【化５１２】
2021523147.tif 000646
【０６５５】
(実施例1d)
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-メチル-N-[2-(メチルアミノ)エチル]カルバメート(1d)
【化５１３】
2021523147.tif 000647
粗中間体3a(63mg、0.11mmol)のDCM(5mL)溶液に、N,N'-ジメチルエタン-1,2-ジアミン(28mg、0.32mmol)及びトリエチルアミン(38mg、0.38mmol)をRTで添加した。3aの大部分が消費されるまで、得られた混合物をRTで2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。揮発性物質を真空中で除去し、残渣を分取HPLC(方法B)により精製すると、1d(4mg、収率4.5％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 545.3(M+H)+。
【化５１４】
2021523147.tif 000648
【０６５６】
(実施例1e)
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-[(ヒドラジンカルボニル)メチル]カルバメート(1e)
【化５１５】
2021523147.tif 000649
DMF(3mL)中の粗3a(0.16g、0.28mmol)の混合物に、Boc-2-(2-アミノアセチル)ヒドラジン(80mg、0.42mmol)及びトリエチルアミン(85mg、0.84mmol)を添加した。反応混合物を25℃で16時間撹拌すると、中間体3aが消費され、これをLCMSによりモニタリングした。その後、混合物を水でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。濾過した後、溶液を真空中で濃縮した。残渣シリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の30〜50％酢酸エチル)により精製すると、Boc-1e(70mg)が白色の固体(ESI m/z: 646(M+H)+)として得られ、これをDCM(2mL)に溶解させた。該溶液に、TFA(1mL)を0℃で滴加した。Boc-1eが消費されるまで、混合物を25℃で2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。揮発性物質を真空中で除去し、残渣を分取HPLCにより精製すると、表題化合物1e(7mg、収率12％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 546(M+H)+。
【０６５７】
(実施例1g)
(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-8-(2-{[6-(ヒドロキシメチル)オキサン-2-イル]オキシ}アセチル)-9,13-ジメチル-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-16-オン(1g)
【化５１６】
2021523147.tif 000650
ブデソニド(1a、50mg、0.12mmol)の無水DCM(4mL)の溶液に、(3,4-ジヒドロ-2H-ピラン-2-イル)メタノール(0.11g、0.93mmol)及びp-トルエンスルホン酸(31mg、0.18mmol)を0℃で添加した。反応混合物をRTで4日間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。揮発性物質を真空中で除去し、残渣をDMFに溶解させ、分取HPLC(方法B)により分離すると、表題化合物1g(13mg、収率20％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 545(M+H)+。
【０６５８】
(実施例1h)
メチル2-[(6-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}オキサン-2-イル)メトキシ]酢酸塩(1h)
【化５１７】
2021523147.tif 000651
(3,4-ジヒドロ-2H-ピラン-2-イル)メタノール(2.0g、18mmol)のTHF(30mL)溶液に、水素化ナトリウム(鉱油中60％、0.88g、22mmol)を、窒素保護下、0℃で1滴ずつ添加した。水素の蒸発が終了するまで、懸濁液を0℃で撹拌した。その後、得られた混合物に、エチル 2-ブロモアセテート(4.0g、26mmol)のTHF(18mL)溶液を添加した。LCMSにより出発材料がほとんど消費されるまで、混合物をRTで一晩撹拌した。0℃に冷却した後、反応液を、窒素保護下、水でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機溶液を水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル中の0〜8％酢酸エチル)により精製すると、エチル 2-((3,4-ジヒドロ-2H-ピラン-2-イル)メトキシ)アセテート(0.70g、21％収率)が無色の油状物として得られた。
【化５１８】
2021523147.tif 000652
【０６５９】
ブデソニド(1a、0.11g、0.25mmol)の無水DCM(8mL)溶液に、上で得られたエチル 2-((3,4-ジヒドロ-2H-ピラン-2-イル)メトキシ)アセテート(0.35g、1.9mmol)及びp-トルエンスルホン酸(66mg、0.35mmol)を0℃で添加した。反応混合物をRTで4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。揮発性物質を真空中で除去し、残渣をDMFに溶解させ、分取HPLC(方法A)により分離すると、表題化合物1h(46mg、収率29％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 617(M+H)+。
【０６６０】
(実施例1i)
(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-6-プロピル-8-(2-{[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-トリヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)オキサン-2-イル]オキシ}アセチル)-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.002,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-16-オン(1i、エピマーを含む)
【化５１９】
2021523147.tif 000653
DCM(15mL)中のブデソニド(1a、0.22g、0.50mmol)及びアセトブロモ-α-D-グルコース(0.33g、0.80mmol)混合物に、4Å分子篩(1.0g)を添加し、混合物をRTで30分間撹拌し、その後、トリフルオロメタンスルホン酸銀(0.19g、0.75mmol)を0℃で添加した。懸濁液を、窒素保護下、暗所RTで週末の間(72時間)撹拌した。混合物をセライトに通して濾過し、濾液を真空中で濃縮した。残渣を分取HPLC(方法B)により精製すると、Ac-1i(25mg、収率9.2％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 761(M+H)+。
【化５２０】
2021523147.tif 000654
【０６６１】
水(1mL)及びメタノール(3mL)中の上で得られた化合物Ac-1i(30mg、39μmol)の溶液に、水酸化リチウム一水和物(17mg、0.40mmol)を0℃で添加した。0℃で1時間撹拌した後、混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、1i(24mg、98％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 593(M+H)+。
【化５２１】
2021523147.tif 000655
【０６６２】
(実施例1j)
(2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-トリヒドロキシ-6-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.002,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}オキサン-2-カルボン酸(1j、エピマーを含む)
【化５２２】
2021523147.tif 000656
アセトブロモ-α-D-グルコースの代わりに、アセトブロモ-α-D-グルクロン酸メチルエステルを使用することを除き、1iと同様の手順に従うと、白色の固体としての化合物1j(24mg、2工程で9.2％収率)が得られた。ESI m/z: 607(M+H)+。
【化５２３】
2021523147.tif 000657
【０６６３】
(実施例1k)
(2, 2113エトキシ)({2 1H)S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)13オキシ)({2 1H), 3.30-3.28(m, 1H), 2.70-2.62(m, 1H), 2.40-2.36(m, 1H)2,9.04,8.013,18]イコサ)({2 1H), 3.30-3.28 オキソエトキシ})ホスフィン酸(1k)
【化５２４】
2021523147.tif 000658
トリエチルアミン(0.67g、6.6mmol)のクロロホルム(4mL)溶液に、オキシ塩化リン(0.51mg、3.3mmol)を0℃で添加し、その後、ブデソニド(1a、1.3g、3.0mmol)のクロロホルム(4mL)溶液を添加した。20℃で2時間撹拌した後、混合物を0℃に冷却し、クロロホルム(4mL)及びピリジン(3mL)中のBoc-エタノールアミン(0.41mg、2.6mmol)の溶液を添加した。LCMSにより反応が終了するまで、20℃で1時間撹拌した後、反応混合物を0℃での水(2mL)の添加によりクエンチした。混合物を20℃で一晩撹拌した。揮発性物質を真空中で除去し、残渣を分取HPLC(方法B)により精製すると、粗Boc-1k(330mg、17％)が黄色の薄膜として得られた。ESI m/z: 676(M+Na)+。
【０６６４】
Boc-1k(0.18g、0.28mmol)のDCM(5mL)溶液に、トリフルオロ酢酸(0.5mL)を0℃で添加した。LCMSによりBocが完全に除去されるまで、得られた混合物を23℃で2時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣を分取HPLC(方法B)により精製すると、1kが白色の固体(90mg、59％収率)として得られた。ESI m/z: 554(M+H)+。
【化５２５】
2021523147.tif 000659
分析的HPLC:＞99.9％、保持時間: 3.90分(方法B)。
【０６６５】
(実施例1l)
(2-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エトキシ)ホスホン酸
J. Am. Chem. Soc., 2016, 138(4), 1430-1445; WO2015153401号;及びPhosphorus, Sulfur and Silicon and the Related Elements, 2000, 165, 83-90を参照されたい。
【０６６６】
【化５２６】
2021523147.tif 000660
THF(16mL)中のFmoc-エタノールアミン(1.1g、3.9mmol)の混合物に、塩化ジホスホリル(2.2g、8.8mmol)を-40℃でシリンジにより添加した。出発材料が完全に消費されるまで、-40℃で1時間撹拌した後、これをLCMSによりモニタリングし、反応混合物を-40℃で水(1mL)でクエンチし、飽和水性重炭酸ナトリウム溶液(200mL)で処理し、10〜20℃で一晩保持した。得られた混合物を濃HClでpH 2に酸性化し、その後、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮すると、粗表題化合物(1.6g、粗)が白色の固体として得られ、これを、精製することなく、次の工程に使用した。ESI m/z: 364(M+H)+。
【０６６７】
(2-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エトキシ)({[ヒドロキシ({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ})ホスホリル]オキシ})ホスフィン酸(Fmoc-1l)
【化５２７】
2021523147.tif 000661
Fmoc-エタノールアミンの代わりにブデソニド(1a、0.86g、20mmol)を使用することを除き、上の手順に従うと、白色の固体(ESI m/z: 551(M+H)+)としてのホスホン酸ブデソニド中間体1a-PO3H2(1.1g、粗)が得られた。
【０６６８】
粗(2-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エトキシ)ホスホン酸(0.29g、0.80mmol)のDMF(5mL)溶液に、トリエチルアミン(81mg、0.80mmol)及び1,1'-カルボニルジイミダゾール(CDI、0.32g、2.0mmol)を10℃で添加した。混合物を10〜20℃で30分間撹拌し、その後、上で得られたホスホン酸ブデソニド中間体1a-PO3H2(0.41g、0.80mmol)及び塩化亜鉛(0.87g、6.4mmol)を反応混合物に添加した。得られた混合物を10〜20℃で一晩撹拌し、LCMSにより出発材料が完全に消費された。その後、反応液を水性希HCl(1N、50mL)でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機溶液を濃縮し、残渣を分取HPLC(方法B)により精製すると、Fmoc-1l(0.32g、収率47％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 856(M+H)+。
【０６６９】
(2-アミノエトキシ)({[ヒドロキシ({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ})ホスホリル]オキシ})ホスフィン酸(1l)
【化５２８】
2021523147.tif 000662
WO2015153401号を参照されたい。
【０６７０】
Fmoc-1l(0.10g、0.12mmol)のDCM(2mL)溶液に、ピペリジン(67mg、0.79mmol)を10℃で添加した。反応混合物を10〜20℃で16時間撹拌した。LCMSにより化合物Fmoc-1lが完全に消費された。揮発性物質を真空中で除去し、残渣を分取HPLC(方法B)により精製すると、1l(50mg、収率68％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 634(M+H)+。
【化５２９】
2021523147.tif 000663
分析的HPLC:＞99.9％、保持時間: 2.74分(方法B)。
【０６７１】
下の表1aは、本明細書に記載される方法を用いて作製されるステロイドを提示している。
表1a−化合物の構造及び化学的-物理的特性
【表３０】
2021523147.tif 000664
2021523147.tif 000665
2021523147.tif 000666
2021523147.tif 000667
【０６７２】
(スキーム2. VC-PABスペーサー-ブデソニドの合成)
【化５３０】
2021523147.tif 000668
(MC-スペーサー-ブデソニド(2a及び2c)の合成のための一般的手順A)
【化５３１】
2021523147.tif 000669
スキーム2のvcPAB-ブデソニド(4a A＝CO、1.0当量)又はアミン9(1.0当量)のDMF(10mgのアミン当たり約1mL)溶液に、下の表の活性化NHSエステル5(1.5〜3.0当量)及びDIPEA(2.0当量)をRTで添加した。LCMSスペクトルによりNHSエステルとアミンの大部分とが消費されたとき、反応混合物をRTで一晩撹拌した。濾過後、反応溶液を分取HPLC又は逆相フラッシュクロマトグラフィーによりそのまま精製すると、所望のアミド2(約17％収率)が白色の固体として得られた。
【表３１】
2021523147.tif 000670
c. TFA塩
【０６７３】
(酸からのアミド2b、2l、2m-前駆体の合成のための一般的手順B)
【化５３２】
2021523147.tif 000671
【表３２】
2021523147.tif 000672
DMF又はDCM又はTHF(5mgの5当たり1mL)中の酸5(1.0〜1.5当量)の溶液に、DIPEA(2.0〜5.0当量)及びHATU(1.4〜2.2当量)をRTで添加した。得られた混合物をこの温度で0.5〜1時間撹拌し、その後、vcPAB-ブデソニド(4、1.0当量)を添加した。アミンが完全に消費されるまで、反応混合物をRTで3〜16時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物を膜に通して濾過し、その後、濾過を分取HPLC又は逆相フラッシュクロマトグラフィーにより分離すると、アミド2(21-54％収率)が白色の固体として得られた。下の表に、さらなる詳細がある。
【表３３】
2021523147.tif 000673
【０６７４】
(中間体7及び10の合成のための一般的手順C)
【化５３３】
2021523147.tif 000674
【表３４】
2021523147.tif 000675
中間体6(1.2〜1.4当量)のDMF溶液に、HATU(1.5〜1.7当量)をRTで添加した。得られた溶液をRTで1時間撹拌した。この懸濁液に、vcPAB-ブデソニド(4a、1.0当量)のDMF(4aのmg当たり0.10mL)の溶液、その後、NMM(2.3〜3.0当量)を添加した。反応混合物をRTで16時間撹拌すると、透明になった。化合物4aが完全に消費されるまで、反応液をLCMSによりモニタリングした。その後、反応混合物に、ジエチルアミン(過剰)を添加し、その後、LCMSによりFmocが除去されるまで、得られた混合物をRTで1〜3時間撹拌した。揮発性物質を真空中で除去し、残渣を分取HPLC(方法A)により精製すると、化合物7(化合物4aから18％収率)が得られ、又は分取HPLC(方法B)により精製すると、化合物10(5％収率)が白色の固体として得られた。下の表に、さらなる詳細がある。
【表３５】
2021523147.tif 000676
【０６７５】
(カルバメート2j、2k、2r、及び2sの合成のための一般的手順D)
【化５３４】
2021523147.tif 000677
PNP活性化エステルが完全に消費されるまで、混合物をRTで3〜24時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物を膜に通して濾過し、濾液を分取HPLCによりそのまま分離すると、化合物2(ジアステレオ異性体を含む又はジアステレオ異性体を含まない、11〜63％収率)が白色の固体として得られた。下の表に、さらなる詳細がある。
【表３６】
2021523147.tif 000678
【０６７６】
(2a〜dの合成)
ブデソニド-リンカー2a〜dは、スキーム2による3つのアプローチから調製した。第一のアプローチは、リンカー5を有するブデソニド3aの活性化エステルから得られるvcPAB-ブデソニド(4a)からの直接的なアミドカップリング反応である。第二のアプローチは、ブデソニド-リンカー7を生成させるためのvcPAB-ブデソニド(4a)と中間体6aからの最初のアミドカップリング反応、次いで、中間体9を生成させるためのガラクトース-アジド(8a)との3+2環化、及び最後に5との第二のアミドカップリング反応によるものであった。第三のアプローチは、4と中間体6bとの第一のアミドカップリング反応、次いで、5bとのアミド形成、及び2dを生じるアセトンの連続的な脱保護によるものであった。
【０６７７】
中間体4a
【化５３５】
2021523147.tif 000679
無水DMF(10mL)中の1.4mmol)に、Boc-vc-PAB(12a)[WO2008/34124 A2号](0.59g、1.2mmol)、DMAP(0.30g、2.4mmol)、及びピリジン(0.29g、3.7mmol)を添加した。LCMSにより3aが完全に消費されるまで、混合物をRTで16時間撹拌した。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中の50〜80％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、中間体Boc-4a(0.74g、収率38％、ESI m/z: 936(M+H)+)が白色の固体として得られ、これをDCM(40mL)に溶解させた。5mLのDCM溶液(94mgのBoc-4aを含有)に、TFA(0.5mL)を0℃で滴加した。Boc-4aが消費されるまで、RTで1.5時間撹拌した後(これは、LCMSによりモニタリングされる)、得られた混合物を真空中で濃縮すると、そのTFA塩としての粗表題生成物4a(83mg、ブデソニドから収率34％)が無色の油状物として得られた。これは、精製することなく、次の工程の合成に使用することができる。20mgの粗4aを分取HPLC(方法B)により精製すると、純粋な4a(8mg)が血漿安定性試験用の遊離塩基として得られた。ESI m/z: 836(M+H)+。
【化５３６】
2021523147.tif 000680
【０６７８】
(実施例2a)
N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)オキシ]メチル}フェニル)カルバモイル]ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド(2a)
【化５３７】
2021523147.tif 000681
一般的手順Aに従うと、表題化合物2a(10mg、17％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1029(M+H)+。分析的HPLC: 92.5％、保持時間: 7.66分(方法A)。
【０６７９】
(実施例2b)
1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタナム-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-イド)-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-[(4-{[({2ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)オキシ]メチル}フェニル)カルバモイル]ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(2b)
【化５３８】
2021523147.tif 000682
一般的手順Bに従うと、表題化合物2b(3.0mg、21％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 686(M/2+H)+。
【化５３９】
2021523147.tif 000683
分析的HPLC: 96.9％、保持時間: 8.10分(方法B)。
【０６８０】
(実施例2c)
(2R)-2-アミノ-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)オキシ]メチル}フェニル)カルバモイル]ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]-6-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]ヘキサンアミド(7)
【化５４０】
2021523147.tif 000684
ESI m/z: 565(M/2+H)+。
【化５４１】
2021523147.tif 000685
【０６８１】
(2R)-2-アミノ-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)オキシ]メチル}フェニル)カルバモイル]ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]-6-[2-({1-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-トリヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)オキサン-2-イル]-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル}オキシ)アセトアミド]ヘキサンアミド(9)
【化５４２】
2021523147.tif 000686
濾過後、得られた9の溶液を次の工程に直接そのまま使用した。ESI m/z: 667(M/2+H)+
【０６８２】
N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)オキシ]メチル}フェニル)カルバモイル]ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-5-[2-({1-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-トリヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)オキサン-2-イル]-4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-4-イル}オキシ)アセトアミド]ペンチル]-1-(2,5-ジオキソピロール-1-イル)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(Mc-PEG4-N(糖-COT)Lys-vc-PAB-ブデソニド)(2c)
【化５４３】
2021523147.tif 000687
ESI m/z: 831(M/2+H)+。
【化５４４】
2021523147.tif 000688
分析的HPLC: 97.6％、保持時間: 7.63分(方法A)。
【０６８３】
(実施例2d)
(2R)-2-アミノ-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)オキシ]メチル}フェニル)カルバモイル]ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]-N'-[(2S)-2-[(4R,5R)-5-[(4R)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル]-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル]-2-ヒドロキシエチル]ペンタンジアミド(10)
【化５４５】
2021523147.tif 000689
一般的手順Cに従うと、化合物10(13mg、5％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 605(M/2+H)+。
【化５４６】
2021523147.tif 000690
【０６８４】
(2R)-2-アミノ-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)オキシ]メチル}フェニル)カルバモイル]ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]-N'-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-ペンタヒドロキシヘキシル]ペンタンジアミド(10A)
【化５４７】
2021523147.tif 000691
DCM(1mL)中の化合物10(13mg、11μmol)の混合物に、TFA(1mL)を滴加した。混合物をRTで1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。揮発性物質を真空中で除去すると、粗脱保護生成物10A(13mg)が薄黄色の油状物として得られ、これを、それ以上精製することなく、次の工程に使用した。ESI m/z: 565(M/2+H)+。
【０６８５】
(2R)-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)オキシ]メチル}フェニル)カルバモイル]ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]-2-[1-(2,5-ジオキソピロール-1-イル)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-N'-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-ペンタヒドロキシヘキシル]ペンタンジアミド(2d)
【化５４８】
2021523147.tif 000692
一般的手順Aに従うと、表題化合物2d(3.5mg、4aから1％全収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 829.7(M/2+H)+。
【化５４９】
2021523147.tif 000693
分析的HPLC:＞99％、保持時間: 6.40分(方法A)。
【０６８６】
(スキーム3. 2eの合成)
【化５５０】
2021523147.tif 000694
(実施例2e)
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-[(4-アミノフェニル)メチル]カルバメート(13)
【化５５１】
2021523147.tif 000695
4-アミノベンジルアミン(9.7mg、79μmol)及びDIPEA(12mg、93μmol)のTHF(10mL)溶液に、3a(24mg、44μmol)のTHF(5.0mL)溶液をRTで滴加した。3aが完全に消費されるまで、混合物をRTで3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。揮発性物質を真空中で除去し、残渣を分取HPLC(方法B)により精製すると、化合物13(5.6mg、収率22％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 579.2(M+H)+。
【化５５２】
2021523147.tif 000696
【０６８７】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-({4-[(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル}メチル)カルバメート(2e)
【化５５３】
2021523147.tif 000697
無水DMF(1.5mL)中のMC-VC-OH 5f(WO2014/191578 A1号)(5.7mg、12μmol)の混合物に、HATU(4.6mg、12μmol)及びNMM(4.0mg、40μmol)をRTで添加した。混合物をRTで10分間撹拌し、その後、化合物13(4.7mg、8.1μmol)を反応混合物に添加した。得られた混合物をRTで一晩撹拌した。LCMSにより、化合物13が完全に消費され、所望の生成物が主要な生成物として検出された。混合物を分取HPLCによりそのまま精製すると、表題化合物2e(2.9mg、収率35％)が白色の固体として得られた。ES m/z: 1029.1(M+H)+、514.7(M/2+H)+。分析的HPLC:＞99％、保持時間: 7.54分(方法A)。
【０６８８】
(スキーム4.リンカー-スペーサー-ブデソニド2f及び2gの合成(エステルを経由))
【化５５４】
2021523147.tif 000698
【表３７】
2021523147.tif 000699
(実施例2f)
1-{4-[(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル}メチル 4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル}ブタンジオエート(2f)
【化５５５】
2021523147.tif 000700
1c(20mg、38μmol)のDMF(2mL)溶液に、MC-VCPAB(12b、0.11g、0.19mmol)、TBTU(63mg、0.19mmol)、HOBt(26mg、0.19mmol)、及びDIPEA(41mg、0.19mmol)をRTで添加した。得られた混合物を70℃で12時間撹拌した。生成物2f以上のものは形成されず、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物を分取HPLC(方法A)によりそのまま精製すると、表題化合物2f(2.6mg、収率6％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1085.3(M+H)+。
【化５５６】
2021523147.tif 000701
【０６８９】
(実施例2g)
1-{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル 4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル}ブタンジオエート(2g)
【化５５７】
2021523147.tif 000702
12bの代わりにDIBAC-suc-PEG4-vc-PAB(12c)を使用することを除き、実施例2fの手順に従うと、表題化合物2g(15mg、収率19％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 714(M/2+H)+。
【化５５８】
2021523147.tif 000703
分析的HPLC: 99.5％、保持時間: 7.86分(方法B)。
【０６９０】
(スキーム5.リンカー-スペーサー-ブデソニド2j〜2nの合成(アミド又はカルバメートを経由))
【化５５９】
2021523147.tif 000704
スキーム5において、Budは、ブデソニドを指す。
【０６９１】
VC-PAB部分を有する大部分のブデソニド-リンカー(2)は、アミド又はカルバメート経由で3つのアプローチから合成された(スキーム5)。化合物1d、1eを、アミドカップリングにより、リンカーと別々にコンジュゲートすると、アミド又はカルバメート(スキーム5)が得られた。下の表に、さらなる詳細がある。
【表３８】
2021523147.tif 000705
【０６９２】
中間体4c
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-(2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル](メチル)アミノ}エチル)-N-メチルカルバメート(4c)
【化５６０】
2021523147.tif 000706
化合物1d(40mg、73μmol)のDMF(3mL)溶液に、Fmoc-vcPAB-PNP(11d、60mg、78μmol)、DMAP(9.0mg、74μmol)、及びDIPEA(20mg、0.16mmol)を室温で添加した。出発材料の大部分が消費されるまで、混合物を室温で3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。その後、反応混合物に、ピペリジン(1mL)を添加した。脱Fmoc反応が終了するまで、室温で1時間撹拌した後(これは、LCMSによりモニタリングされる)、反応混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物4c(9.0mg、収率13％、LC中の第二のピーク)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 951(M+H)+、973(M+Na)+。
【０６９３】
(実施例2j)
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-({N'-[({4-[(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル]ヒドラジンカルボニル}メチル)カルバメート(2j)
【化５６１】
2021523147.tif 000707
ESI m/z: 1144.3(M+H)+。
【化５６２】
2021523147.tif 000708
【０６９４】
(実施例2k)
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-(2-{[({4-[(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル](メチル)アミノ}エチル)-N-メチルカルバメート(2k-A及び2k-B)
【化５６３】
2021523147.tif 000709
一般的手順Dに従うと、ジアステレオ異性体としての表題化合物2k〜A(3.3mg、収率10％、LC中の第二のピーク)及び2k-B(4.1mg、収率12％、LC中の第一のピーク)が白色の固体として得られた。
2k-A: ESI m/z: 1143.4(M+H)+、保持時間: 1.70分(方法A)。
2k-B : ESI m/z: 1143.4(M+H)+、保持時間: 1.65分(方法A)。
【０６９５】
(実施例2l)
ビシクロ[6.1.0]ノナ-4-イン-9-イルメチル N-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-[(4-{[({2-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)(メチル)アミノ]エチル}(メチル)カルバモイル)オキシ]メチル}フェニル)カルバモイル]ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカン-1-イル)カルバメート(2l)
【化５６４】
2021523147.tif 000710
ESI m/z: 687.5(M/2+H)+、1396.8(M+Na)+(50％)。
【化５６５】
2021523147.tif 000711
分析的HPLC:＞99.9％、保持時間: 9.40分(方法A)。
【０６９６】
(実施例2m)
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-(2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-6-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-2-[6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド]ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル](メチル)アミノ}エチル)-N-メチルカルバメート(2m-前駆体)
【化５６６】
2021523147.tif 000712
一般的手順Bに従うと、粗化合物2m-前駆体(2mの前駆体)(5mg)が薄黄色の油状物として得られ、これを次の工程にそのまま使用した。ESI m/z: 780(M/2+H)+
【０６９７】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-(2-{[({4-[(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド]-6-[4-(3-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-ドデカヒドロキシ-10,15,20,25,30-ペンタキス(ヒドロキシメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-5-イル]メチル}-3,4,5,13-テトラアザテトラシクロ[13.4.0.02,6.07,12]ノナデカ-1(15),2(6),4,7(12),8,10,16,18-オクタエン-13-イル)-4-オキソブタンアミド]ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル](メチル)アミノ}エチル)-N-メチルカルバメート(2m)
【化５６７】
2021523147.tif 000713
粗2m(5mg)のDMF(1mL)溶液に、CD-N3(8b、63mg、63μmol)を添加した。得られた混合物をRTで72時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を分取HPLC(方法A)によりそのまま精製すると、化合物2m(2mg、4cから4％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1278.8(M/2+H)+。分析的HPLC: 97.9％、保持時間: 6.49分(方法A)。
【０６９８】
(実施例2n)
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-(2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(4R)-4-アミノ-4-[(2-アジドエチル)カルバモイル]ブタンアミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル](メチル)アミノ}エチル)-N-メチルカルバメート(2n)
【化５６８】
2021523147.tif 000714
その後、反応混合物をRTで一晩撹拌した。LCMSにより化合物4cが完全に消費された。混合物を分取HPLC(方法A)により分離し、凍結乾燥後、Fmoc-2nが得られ(20mg)、これをDMF(2mL)に溶解させた。DMF溶液に、ジエチルアミン(4滴、約0.08mL)を添加した。脱Fmoc反応が終了するまで、反応混合物をRTで2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。該混合物を濾過膜に通して濾過し、溶液を分取HPLC(方法A)により精製すると、表題化合物2n(10mg、収率8.4％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1147(M+H)+。分析的HPLC: 99.6％、保持時間: 5.67分(方法A); 7.72分(方法B)。
【０６９９】
(スキーム6.リンカー-ブデソニド2q(THP類似体)の合成)
【化５６９】
2021523147.tif 000715
(実施例2q)
(2S)-(3,4-ジヒドロ-2H-ピラン-2-イル)メチル 2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-5-ウレイドペンタノエート(15)
【化５７０】
2021523147.tif 000716
DMF(5mL)中のFmoc-Cit-OH(14、0.29g、0.73mmol)の混合物に、DHP(0.10mg、0.88mmol)、TBTU(0.70g、2.2mmol)、及びトリエチルアミン(0.37g、3.7mmol)をRTで添加した。得られた混合物をRTで24時間撹拌した。LCMSにより所望の質量の15％が検出された。反応液を水(30mL)でクエンチし、酢酸エチル(10mL×3)で抽出した。合わせた有機溶液を水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。粗生成物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中の0〜100％アセトニトリル)により精製すると、表題化合物15(110mg、収率30％)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 494(M+H)+。
【０７００】
(6-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}オキサン-2-イル)メチル(2S)-2-アミノ-5-(カルバモイルアミノ)ペンタノエート(16)
【化５７１】
2021523147.tif 000717
化合物15(80mg、0.16mmol)の無水DCM(3mL)溶液に、ブデソニド(1a、70mg、0.16mmol)及びp-トルエンスルホン酸(42mg、0.24mmol)の無水DCM(2mL)溶液を、アルゴンバルーンの保護下、RTで、シリンジにより添加した。反応混合物を、アルゴンバルーン下、30℃で12時間撹拌した。化合物15の大部分がLCMSにより消費された。反応混合物をRTに冷却し、該反応混合物に、ジエチルアミン(1mL)を添加した。脱Fmoc反応が終了するまで、反応混合物をRTで1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。揮発性物質を真空中で除去し、残渣を分取HPLC(方法B)により精製すると、表題化合物16(17mg、収率31％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 702(M+H)+。
【０７０１】
(S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタン酸(5i)
【化５７２】
2021523147.tif 000718
L-バリン(0.12g、1.0mmol)の無水DMF(2mL)溶液に、化合物5a(0.31g、1.0mmol)及びトリエチルアミン(0.51g、5.0mmol)をRTで添加した。化合物5aが完全に消費されるまで、反応混合物をRTで8時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。該反応混合物を濾過膜に通して濾過し、濾液を分取HPLC(方法A)によりそのまま精製すると、表題化合物5i(0.14g、収率46％)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 311(M+H)+。
【０７０２】
6-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}オキサン-2-イル)メチル(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド]-3-メチルブタンアミド]ペンタノエート(2q)
【化５７３】
2021523147.tif 000719
化合物5i(5.8mg、19μmol)のDMF(1mL)溶液に、HATU(10mg、26μmol)及びDIPEA(6.6mg、51μmol)をRTで添加した。混合物をRTで15分間撹拌し、その後、該溶液に、化合物16(12mg、17μmol)をRTで添加した。化合物5iが完全に消費されるまで、得られた混合物をRTで4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。その後、反応混合物を濾過膜に通して濾過し、濾液を分取HPLC(方法A)によりそのまま2回精製すると、表題化合物2q(2mg、収率12％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 995.3(M+H)+。分析的HPLC: 83.5％、保持時間: 10.36分(方法B)。
【０７０３】
(スキーム7.リンカー-ホスフェート-ブデソニド2r及び2sの合成)
【化５７４】
2021523147.tif 000720
ホスフェート-ブデソニドをBCN-PNP(11c)とカップリングさせると、BCN-ホスフェート-ブデソニド(化合物2r及び2s)が得られた(スキーム7)。
【０７０４】
(実施例2r)
{2-[({ビシクロ[6.1.0]ノナ-4-イン-9-イルメトキシ}カルボニル)アミノ]エトキシ}({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ})ホスフィン酸(2r)
【化５７５】
2021523147.tif 000721
一般的手順Dに従うと、化合物2r(40mg、61％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 730(M+H)+。
【化５７６】
2021523147.tif 000722
分析的HPLC:＞99.9％、保持時間: 5.26分(方法B)。
【０７０５】
(実施例2s)
{2-[({ビシクロ[6.1.0]ノナ-4-イン-9-イルメトキシ}カルボニル)アミノ]エトキシ}({[ヒドロキシ({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ})ホスホリル]オキシ})ホスフィン酸(2s)
【化５７７】
2021523147.tif 000723
ESI m/z: 810(M+H)+。
【化５７８】
2021523147.tif 000724
分析的HPLC:＞99.9％、保持時間: 4.03分(方法B)。
【０７０６】
(中間体のための実験手順)
表4.重要な中間体及び出発材料
【表３９】
2021523147.tif 000725
2021523147.tif 000726
2021523147.tif 000727
2021523147.tif 000728
(スキーム8. 5eの合成)
【化５７９】
2021523147.tif 000729
(2R)-6-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4,6,8,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-2-[6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド]ヘキサン酸(5e)
【化５８０】
2021523147.tif 000730
DMF(10mL)中のH-D-Lys(Boc)-OH(17、0.25g、1.0mmol)の混合物に、6-マレイミドカプロン酸-NHS(5a、0.31g、1.0mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、0.26g、2.0mmol)をRTで添加した。反応液をRTで一晩撹拌した後、化合物5aが完全に消費された。該混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水(0.05％TFA)中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま分離すると、中間体Boc-18(ESI m/z: 440(M+H)+)が無色の油状物として得られ、これをDCM(5mL)に溶解させた。該溶液に、TFA(0.5mL)を0℃で滴加し、混合物をRTで1時間撹拌した。反応をLCMSによりモニタリングすると、中間体Boc-18が完全に消費された。揮発性物質を真空中で除去すると、粗18(ESI m/z: 340(M/2+H)+)が得られ、これを、それ以上精製することなく、次の工程に使用した。DMF(5mL)中の粗化合物18(0.21g、0.62mmol)の混合物に、活性化エステル19(0.20g、0.50mmol)及びDIPEA(50mg、0.39mmol)をRTで添加した。反応混合物をRTで一晩撹拌した後、化合物19が完全に消費され、これをLCMSによりモニタリングした。その後、反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま分離すると、表題化合物5e(0.10g、5aから3工程で20％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 627(M+H)+。
【化５８１】
2021523147.tif 000731
【０７０７】
(スキーム9. 5gの合成)
【化５８２】
2021523147.tif 000732
(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタン酸(5g)
【化５８３】
2021523147.tif 000733
化合物5c(0.30g、0.54mmol)のDMF(10mL)溶液に、HATU(0.31g、0.81mmol)及びDIPEA(0.14g、1.1mmol)をRTで添加した。混合物をRTで15分間撹拌した。反応溶液に、Val-Cit-OH(20(CAS# 159858-33-0)、0.21g、0.76mmol)をRTで添加し、大部分の材料が消費されるまで、得られた混合物をRTで3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物を濾過膜に通して濾過し、濾液をリバースフラッシュクロマトグラフィー(水(10mmol/L重炭酸アンモニウムを含む)中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、表題中間体5g(0.25g、収率57％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 809.5(M+H)+。
【０７０８】
(スキーム10.中間体5hの合成)
【化５８４】
2021523147.tif 000734
tert-ブチル(4R)-4-[(2-アジドエチル)カルバモイル]-4-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}ブタノエート(22)
【化５８５】
2021523147.tif 000735
DCM(50mL)中のFmoc-D-Glu(OTBU)-OH(21、(104091-08-9)、0.30g、0.71mmol)及び2-アジドエタンアミン(87156-40-9、73mg、0.85mmol)の混合物に、HATU(0.41g、1.1mmol)及びトリエチルアミン(0.3mL)をRTで添加した。反応混合物をRTで一晩撹拌した。その後、TLC及びLCMSにより化合物21の大部分が消費された。反応混合物をRTで水(50mL)でクエンチし、有機溶液を水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣を分取TLC(シリカゲル、石油エーテル/酢酸エチル(v/v＝1)で溶出)により精製すると、表題化合物22(0.30g、収率76％)が粘性のある油状物として得られた。ESI m/z: 494(M+H)+。
【化５８６】
2021523147.tif 000736
【０７０９】
(4R)-4-[(2-アジドエチル)カルバモイル]-4-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}ブタン酸(5h)
【化５８７】
2021523147.tif 000737
化合物22が完全に消費されるまで、得られた混合物をRTで2時間撹拌し、これをTLC及びLCMSによりモニタリングした。揮発性物質を真空中で除去すると、粗化合物5h(17mg、収率96％)が黄色の油状物として得られ、これを、それ以上精製することなく、次の工程に使用した。ESI m/z: 438(M+H)+。
【０７１０】
(スキーム11.中間体6aの合成)
【化５８８】
2021523147.tif 000738
(2R)-6-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-2-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}ヘキサン酸(6a)
【化５８９】
2021523147.tif 000739
DMF(2mL)中の市販化合物23(65mg、0.23mmol、CAS: 1425803-45-7)の混合物に、Fmoc-D-Lys-OH(85mg、0.23mmol)及びトリエチルアミン(52mg、0.51mmol)を添加した。反応混合物をRTで30分間撹拌した。該混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水(0.05％TFA)中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま分離すると、中間体6a(85mg、収率70％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 533(M+H)+。
【化５９０】
2021523147.tif 000740
【０７１１】
(スキーム12.中間体11b及び12cの合成)
【化５９１】
2021523147.tif 000741
1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(12c)
【化５９２】
2021523147.tif 000742
混合物をRTで15分間撹拌した。反応溶液に、vc-PAB(24(159857-79-1)、0.21g、0.54mmol)をRTで添加し、大部分の材料が消費されるまで、得られた混合物をRTで3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物を濾過膜に通して濾過し、濾液をリバースフラッシュクロマトグラフィー(水(10mmol/L重炭酸アンモニウムを含む)中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、表題中間体12c(0.30g、収率60％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 617(M+H)+。
【０７１２】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル 4-ニトロフェニルカルボネート(11b)
【化５９３】
2021523147.tif 000743
化合物12c(0.15g、0.16mmol)のDMF(10mL)溶液に、ビス(4-ニトロフェニル)カルボネート(0.15g、0.49mmol)及びDIPEA(63mg、0.49mmol)を0℃で添加した。その後、12cがほとんど消費されるまで、混合物RTで3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物を濾過膜に通して濾過し、濾液をリバースフラッシュクロマトグラフィー(水(10mmol/L重炭酸アンモニウムを含む)中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、表題中間体11b(50mg、収率28％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1079(M+H)+。
【０７１３】
下の表5Aは、本明細書に記載される方法を用いて作製されたリンカーペイロードを提示している。
表5A.リンカー-ペイロードの例
【表４０】
2021523147.tif 000744
2021523147.tif 000745
2021523147.tif 000746
2021523147.tif 000747
表6A.リンカー-ペイロードの特徴解析データ
【表４１】
2021523147.tif 000748
2021523147.tif 000749
【０７１４】
(リンカー-ペイロードLP1A〜4Aの合成)
(スキーム101.ペイロード100、スペーサー-ペイロード101a〜d、及びリンカー-ペイロードLP1A〜4Aの合成)
【化５９４】
2021523147.tif 000750
(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-8-(2-ヒドロキシアセチル)-9,13-ジメチル-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-16-オン(100)
【化５９５】
2021523147.tif 000751
ヘプタン(900mL)中のフルオシノロンアセトニド(10g、22mmol)及びシリカゲル(100g)の混合物に、ブチルアルデヒド(3.0mL、33mmol)を10℃未満で添加し、懸濁液を10〜20℃で30分間撹拌した。混合物に、過塩素酸(70％、7.6mL、91mmol)を0℃で滴加した。その後、反応混合物をRTで一晩撹拌した。TLC及びLCMSにより、フルオシノロンアセトニドの大部分が消費された。反応混合物を石油エーテルで希釈し、飽和水性炭酸ナトリウムでクエンチした。懸濁液を濾過し、固体をDCM/メタノール(v/v＝1:1)で洗浄した。合わせた濾液を真空中で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(DCM中の0〜1.5％メタノール)により精製すると、化合物100(8.0g、収率: 78％)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 467.1(M+H)+。
【０７１５】
1-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)オキシ]ピロリジン-2,5-ジオン(101-1a)
【化５９６】
2021523147.tif 000752
化合物100(0.47g、1.0mmol)のDCM(20mL)溶液に、ビス(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)カルボネート(0.28g、1.1mmol)、トリエチルアミン(0.40g、4.0mmol)、及びDMAP(3.0mg、触媒)を添加した。化合物100が消費されるまで、反応混合物をRTで4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。その後、反応混合物をDCMで希釈し、水で洗浄した。有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。濾過した後、該溶液を真空中で濃縮し、残渣(粗101-1a)を、精製することなく、次の工程にそのまま使用した。ESI m/z: 608.2(M+H)+。
【０７１６】
(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-8-{2-[(4-ニトロフェノキシカルボニル)オキシ]アセチル}-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-16-オン(101-1b)
【化５９７】
2021523147.tif 000753
THF(20mL)中の化合物100(0.80g、1.7mmol)、ビス(4-ニトロフェニル)カルボネート(1.6g、5.2mmol)、及びDIPEA(1.1g、8.6mmol)の混合物をRTで4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。該混合物を真空中で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の50％酢酸エチル)により精製すると、化合物101-1b(0.75g、69％収率)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 632(M+H)+。
【０７１７】
(化合物101のための一般的手順)
【化５９８】
2021523147.tif 000754
化合物101-1a又は101-1b(1.0mmolとして計算された粗製物)のDCM(20mL)溶液に、ジアミン101-2(a、b、c、又はd)(1.1mmol)及びDMAP(0.1mmol)を添加した。反応混合物をRTで4時間撹拌し、その後、TFA(1mL)を添加した。混合物をRTで30分間撹拌した(R13＝Bocの場合、Bocが完全に除去されるまで、反応液を撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした)。得られた混合物を真空中で濃縮し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性TFA(0.5％)中の50〜80％アセトニトリル)により精製すると、化合物101(a、b、c、又はd)が無色の油状物として得られた。
【０７１８】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-[2-(メチルアミノ)エチル]カルバメート(101a)
【化５９９】
2021523147.tif 000755
一般的手順に従い、化合物101-1aをBoc-ジアミン101-2aとともに使用すると、化合物101a(0.38g、2工程で57％、TFA塩)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 567(M+H)+。
【０７１９】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-メチル-N-[2-(メチルアミノ)エチル]カルバメート(101b)
【化６００】
2021523147.tif 000756
一般的手順に従い、化合物101-1aをジアミン101-2bとともに使用すると、化合物101b(0.45g、2工程で66％収率、TFA塩)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 581(M+H)+。
【０７２０】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-エチル-N-[2-(エチルアミノ)エチル]カルバメート(101c)
【化６０１】
2021523147.tif 000757
一般的手順に従い、化合物101-1bをジアミン101-2cとともに使用すると、化合物101c(24mg、2工程で18％収率、TFA塩)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 609(M+H)+。
【化６０２】
2021523147.tif 000758
【０７２１】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチルピペラジン-1-カルボキシレート(101d)
【化６０３】
2021523147.tif 000759
一般的手順に従い、TFAによる処理なしで化合物101-1bをピペラジン(101-2d)とともに使用し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(DCM中の0〜10％メタノール)により精製すると、化合物101d(0.21g、2工程で49％収率、遊離塩基)が無色の油状物として得られた。 ESI m/z: 579(M+H)+。
【０７２２】
(化合物101-3のための一般的手順)
【化６０４】
2021523147.tif 000760
化合物101a、b、又はd(0.20mmol)のDMF(3mL)溶液に、Fmoc-VC-PAB-PNP 11d(0.17g、0.22mmol)、HOBT(41mg、0.30mmol)、及びDIPEA(77mg、0.60mmol)を添加した。混合物をRTで3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。その後、該混合物に、ピペリジン(0.3mL)を添加した。反応混合物をRTで1時間撹拌した。LCMSによりFmocが完全に除去されるまで、得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性NH4HCO3(10mM)中の50〜80％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、化合物101-3a、b、又はdが白色の固体として得られた。
【０７２３】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-(2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル](メチル)アミノ}エチル)カルバメート(101-3a)
【化６０５】
2021523147.tif 000761
一般的手順に従い、化合物101aを使用すると、化合物101-3a(0.11g、57％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 972(M+H)+。
【０７２４】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-メチル-N-[2-(メチルアミノ)エチル]カルバメート(101-3b)
【化６０６】
2021523147.tif 000762
一般的手順に従い、化合物101bを使用すると、化合物101-3b(0.13g、65％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 986(M+H)+。
【０７２５】
1-{4-[(2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル 4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル}ピペラジン-1,4-ジカルボキシレート(101-3d)
【化６０７】
2021523147.tif 000763
一般的手順に従い、化合物101d(58mg、0.10mmol)を使用すると、化合物101-3d(52mg、53％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 984(M+H)+。
【化６０８】
2021523147.tif 000764
【０７２６】
(化合物LP1A、LP2A、及びLP4Aのための一般的手順)
【化６０９】
2021523147.tif 000765
化合物5c(34mg、60μmol)のDMF(1mL)溶液に、HATU(27mg、71μmol)及びDIPEA(20mg、0.15mmol)を添加した。混合物をRTで5分間撹拌した後、化合物101-3a、b、又はd(50μmol)を該混合物に添加した。混合物をRTで2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物LP1A、2A、又は4Aが白色の固体として得られた。
【０７２７】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-(2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル](メチル)アミノ}エチル)カルバメート(LP1A)
【化６１０】
2021523147.tif 000766
一般的手順に従い、化合物101-3aを使用すると、リンカー-ペイロードLP1A(20mg、26％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 754(M/2+H)+。
【０７２８】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-(2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル](メチル)アミノ}エチル)-N-メチルカルバメート(LP2A)
【化６１１】
2021523147.tif 000767
一般的手順に従い、化合物101-3bを使用すると、リンカー-ペイロードLP2A(20mg、26％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 761(M/2+H)+。
【化６１２】
2021523147.tif 000768
【０７２９】
1-{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル 4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル}ピペラジン-1,4-ジカルボキシレート(LP4A)
【化６１３】
2021523147.tif 000769
一般的手順に従い、化合物101-3dを使用すると、リンカー-ペイロードLP4A(35mg、44％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 760(M/2+H)+。
【化６１４】
2021523147.tif 000770
【０７３０】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-エチル-N-[2-(エチルアミノ)エチル]カルバメート(101-4)
【化６１５】
2021523147.tif 000771
DIBAC-suc-PEG4-vcPAB-PNP 11b(0.11g、0.10mmol)のDMF(5mL)溶液に、N,N'-ジエチルエチレンジアミン(58mg、0.50mmol)及びDMAP(1mg、0.01mmol)を添加した。反応混合物をRTで4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物101-4が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 1056.6(M+H)+、529(M/2+H)+。
【０７３１】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-(2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル](エチル)アミノ}エチル)-N-エチルカルバメート(LP3A)
【化６１６】
2021523147.tif 000772
DMF(5mL)中の化合物101-4(16mg、15μmol)、101-1b(11mg、17μmol)、及びDIPEA(4.0mg、31μmol)の混合物をRTで4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、リンカー-ペイロードLP3A(3mg、13％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 775(M/2+H)+。
【化６１７】
2021523147.tif 000773
【０７３２】
(システアミンプロドラッグ:リンカー-ペイロードLP5A、6A、7A、及びLP8Aの合成)
【化６１８】
2021523147.tif 000774
2-(ピリジン-2-イルジスルファニル)エタンアミン塩酸塩(102-1e)は、CAS 83578-21-6で市販で入手可能であった。tert-ブチル(2-メルカプトエチル)(メチル)カルバメート(102-1f)は、Eur. J. Med. Chem., 2015, 95, 483-491に従って合成した。
【０７３３】
エンド-ビシクロ[6.1.0]ノナ-4-イン-9-イルメチル N-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エチル)カルバメート(5f)は、WO2016168769号に従って合成した。
【０７３４】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-[2-(ピリジン-2-イルジスルファニル)エチル]カルバメート(102-3e)
【化６１９】
2021523147.tif 000775
化合物101-1b(0.54g、0.86mmol)のアセトニトリル(10mL)溶液に、DIPEA(0.22g、1.7mmol)、102-1e(0.19g、0.86mmol)、及びDMAP(10mg、86μmol)を添加した。LCMSにより101-1bが完全に消費されるまで、反応混合物をRTで48時間撹拌した。その後、該混合物を濾過し、濾液を真空中で濃縮した。残存する油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン中の20〜50％酢酸エチル)により精製すると、化合物102-3e(0.47g、80％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 679.2(M+H)+。
【０７３５】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-メチル-N-[2-(ピリジン-2-イルジスルファニル)エチル]カルバメート(102-3f)
【化６２０】
2021523147.tif 000776
102-1eの代わりに102-1fを使用することを除き、102-3eと同様の手順に従うと、化合物102-3f(0.45g、75％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 693.2(M+H)+。
【０７３６】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-(2-スルファニルエチル)カルバメート(102e)
【化６２１】
2021523147.tif 000777
化合物102-3e(1.4g、2.1mmol)のクロロホルム(30mL)溶液に、トリエチルアミン(0.82mL、5.9mmol)及び1,4-ジチオスレイトール(クレランド試薬、DTT)(1.2g、7.8mmol)を添加した。反応混合物を、窒素下、RTで4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン中の50〜70％酢酸エチル)により精製すると、化合物102e(0.95g、83％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 570.2(M+H)+。
【０７３７】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル N-メチル-N-(2-スルファニルエチル)カルバメート(102f)
【化６２２】
2021523147.tif 000778
102-3eの代わりに102-3fを使用することを除き、102eと同様の手順に従うと、化合物102f(0.97g、83％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 584.3(M+H)+。
【０７３８】
3-({2-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)アミノ]エチル}ジスルファニル)-3-メチルブタン酸(102-5e)
【化６２３】
2021523147.tif 000779
化合物102-3e(0.68g、1.0mmol)のメタノール(5mL)溶液に、化合物102-4(0.13g、1.0mmol)を添加した。反応混合物をRTで18時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。その後、得られた混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物102-5e(0.39g、55％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 702.2(M+H)+。
【０７３９】
3-({2-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)(メチル)アミノ]エチル}ジスルファニル)-3-メチルブタン酸(102-5f)
【化６２４】
2021523147.tif 000780
102-3eの代わりに102-3fを使用することを除き、102-5eと同様の手順に従うと、化合物102-5f(0.29g、40％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 716.3(M+H)+。
【０７４０】
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 3-({2-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)アミノ]エチル}ジスルファニル)-3-メチルブタノエート(LP5A)
【化６２５】
2021523147.tif 000781
化合物102-5e(0.20g、0.29mmol)のDCM(10mL)溶液に、HOSu(73mg、0.64mmol)及びEDCI(0.12g、0.64mmol)を添加し、混合物をRTで24時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物をDCM(50mL)で希釈し、有機溶液を水及びブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣を分取HPLC(方法A)により精製すると、LP5A(85mg、37％収率)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 799.3(M+H)+。
【０７４１】
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 3-({2-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)(メチル)アミノ]エチル}ジスルファニル)-3-メチルブタノエート(LP6A)
【化６２６】
2021523147.tif 000782
102-5eの代わりに102-5fを使用することを除き、LP5Aと同様の手順に従うと、化合物LP6A(86mg、36％収率)が無色の油状物として得られた。ESI m/z: 813.3(M+H)+。
【０７４２】
エンド-ビシクロ[6.1.0]ノナ-4-イン-9-イルメチル N-{2-[2-(2-{2-[3-({2-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)アミノ]エチル}ジスルファニル)-3-メチルブタンアミド]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバメート(LP7A)
【化６２７】
2021523147.tif 000783
化合物102-5e(0.20g、0.29mmol)のDMF(10mL)溶液に、HATU(0.11g、0.29mmol)及びDIPEA(75mg、0.58mmol)を添加した。反応混合物をRTで10分間撹拌し、その後、化合物5f(0.11g、0.29mmol)を添加した。反応混合物をRTで18時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。その後、得られた混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま分離すると、化合物LP7A(0.16g、55％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 526.7(M/2+H)+。
【０７４３】
エンド-ビシクロ[6.1.0]ノナ-4-イン-9-イルメチル N-{2-[2-(2-{2-[3-({2-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}カルボニル)(メチル)アミノ]エチル}ジスルファニル)-3-メチルブタンアミド]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバメート(LP8A)
【化６２８】
2021523147.tif 000784
102-5eの代わりに102-5fを使用することを除き、LP7Aと同様の手順に従うと、化合物LP8A(0.13g、41％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 533.8(M/2+H)+。
【０７４４】
(AMOリンカー-ペイロードLP9A〜11Aの合成)
(スキーム103A.ペイロード103a、b、及びリンカー-ペイロードLP9A〜10Aの合成)
【化６２９】
2021523147.tif 000785
酢酸(2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)アセトアミド)メチル(103-1)
【化６３０】
2021523147.tif 000786
THF(0.12L)及びトルエン(40mL)中のFmoc-Gly-Gly-OH(4.3g、12mmol)の混合物に、ピリジン(1.2mL、15mmol)及び四酢酸鉛(6.8g、15mmol)を添加した。反応混合物を5時間還流させ、これをLCMSによりモニタリングした。RTに冷却した後、該反応混合物をセライトに通して濾過して、不溶性材料を除去し、濾液を真空中で濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解させ、溶液を水及びブラインで洗浄した。有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の10％酢酸エチル)により精製すると、化合物103-1(3.0g、67％収率)が無色の固体として得られた。ESI m/z: 391(M+Na)+。
【０７４５】
9H-フルオレン-9-イルメチル N-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}メチル)カルバモイル]メチル}カルバメート(103-2a)
【化６３１】
2021523147.tif 000787
化合物103-1(0.37g、1.0mmol)及びブデソニド1a(1.3g、3.0mmol)のTHF(4mL)溶液に、カリウム tert-ブトキシド(0.22g、2.0mmol)を0℃で添加した。反応混合物をRTで15分間撹拌し、これをTLCによりモニタリングした。反応溶液に酢酸エチル及び水を0℃で投入し、酢酸エチル及びクロロホルムで抽出した。合わせた有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の30〜35％酢酸エチル)により精製すると、化合物103-2a(0.19g、40％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 739(M+H)+。
【０７４６】
9H-フルオレン-9-イルメチル N-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}メチル)カルバモイル]メチル}カルバメート(103-2b)
【化６３２】
2021523147.tif 000788
密封管に、DCM(4mL)及びピリジニウム p-トルエンスルホネート(21mg、81μmol)中の化合物103-1(0.30g、0.81mmol)及び化合物100(0.38g、0.81mmol)の溶液をRTで添加した。反応管を密閉し、50℃で24時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。冷却後、反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を分取HPLC(方法A)により精製すると、化合物103-2b(0.23g、37％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 775(M+H)+。
【０７４７】
2-アミノ-N-({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}メチル)アセトアミド(103a)
【化６３３】
2021523147.tif 000789
化合物103-2a(0.10g、0.14mmol)のDMF(2mL)溶液に、ピペリジン(35mg、0.41mmol)を添加した。Fmocが完全に除去されるまで、反応混合物をRTで2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性TFA(0.05％)中の0〜100％アセトニトリル)によりそのまま精製すると、化合物103a(50mg、70％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 517.6(M+H)+。
【０７４８】
2-アミノ-N-({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}メチル)アセトアミド(103b)
【化６３４】
2021523147.tif 000790
103-2aの代わりに103-2bを使用することを除き、103aと同様の手順に従うと、化合物103b(0.26g、65％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 553.2(M/2+H)+。
【０７４９】
【化６３５】
2021523147.tif 000791
化合物105(b)を上記の手順に従って調製した。
【０７５０】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}メチル)カルバモイル]メチル}カルバメート(LP9A)
【化６３６】
2021523147.tif 000792
化合物103a(15mg、29μmol)のDMF(1.0mL)溶液に、化合物11b(30mg、28μmol)、HOBT(2.0mg、15μmol)、及びDIPEA(7.7mg、60μmol)を添加した。反応混合物をRTで2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。該混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、リンカー-ペイロードLP9A(5.0mg、11％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 729(M/2+H)+。
【０７５１】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}メチル)カルバモイル]メチル}カルバメート(LP10A)
【化６３７】
2021523147.tif 000793
103aの代わりに103bを使用することを除き、LP9Aと同様の手順に従うと、リンカー-ペイロードLP10A(23mg、58％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 747.0(M/2+H)+; 513.8(LCMSにより切断された断片、NHCH2-Oで切断された小片)
【化６３８】
2021523147.tif 000794
【０７５２】
(スキーム103B.リンカー-ペイロードLP11Aの合成)
【化６３９】
2021523147.tif 000795
(2S)-2-(2-{2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]アセトアミド}アセトアミド)-3-フェニルプロパン酸(103-3)
【化６４０】
2021523147.tif 000796
化合物5c(0.16g、0.29mmol)のDCM(20mL)溶液に、HOSu(73mg、0.64mmol)及びEDCI(0.12g、0.64mmol)を添加した。LCMSにより化合物5cが完全に消費されるまで、混合物をRTで24時間撹拌した。得られた混合物をDCM(50mL)で希釈し、有機溶液を水(50mL)及びブライン(50mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で濃縮すると、OSu活性エステル(0.16g、84％収率)が無色の油状物として得られ、これを次の工程にそのまま使用した。
H-Gly-Gly-Phe-OH(10mg、36μmol)のDMF(0.5mL)溶液に、上で得られたOSu活性エステル(23mg、36μmol)及びDIPEA(9.0mg、72μmol)を添加した。反応混合物をRTで一晩撹拌した。該混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物103-3(15mg、51％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 408.2(M/2+H)+。
【０７５３】
1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-N-{[({[(1S)-1-({[({2-[(19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}メチル)カルバモイル]メチル}カルバモイル)-2-フェニルエチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]メチル}-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(LP11A)
【化６４１】
2021523147.tif 000797
化合物103-3(15mg、18μmol)のDMF(0.5mL)溶液に、HATU(14mg、36μmol)及びDIPEA(9.3mg、72μmol)を添加した。反応混合物をRTで10分間撹拌した後、化合物103b(10mg、18μmol)を該混合物に添加した。その後、反応混合物をRTで一晩撹拌した。得られた混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、リンカー-ペイロードLP11A(5.0mg、20％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 420.2(M/3+H)+。
【０７５４】
(ジペプチドプロドラッグ:リンカー-ペイロードLP12Aの合成)
(スキーム104A.ペイロード104aの合成)
【化６４２】
2021523147.tif 000798
α-アジドイソ酪酸104-1をOrg. Lett., 2001, 3(5), 781-783に従って合成した。
【０７５５】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル 2-アジド-2-メチルプロパノエート(104-2a)
【化６４３】
2021523147.tif 000799
化合物100(0.10g、0.21mmol)のDCM(30mL)溶液に、化合物104-1(52mg、0.40mmol)、DCC(90mg、0.44mmol)、及びDMAP(10mg)を添加し、混合物をRTで一晩撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を真空中で濃縮し、残渣を分取HPLC(方法A)により精製すると、化合物104-2a(80mg、70％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 578.3(M+H)+。
【０７５６】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル 2-アミノ-2-メチルプロパノエート(104-3a)
【化６４４】
2021523147.tif 000800
化合物104-2a(75mg、0.15mmol)のTHF(5mL)溶液に、PPh3(0.15g、0.57mmol)、水(5mL)、及び濃HCl(1滴)を添加し、反応混合物をRTで一晩撹拌した。該混合物を真空中で濃縮し、DMFで希釈した。沈殿を濾過により完全に除去した。濾液を分取HPLC(方法A)により精製すると、化合物104-3a(45mg、54％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 552.3(M+H)+。
【０７５７】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル 2-[(2S)-2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-4-メチルペンタンアミド]-2-メチルプロパノエート(104-4a)
【化６４５】
2021523147.tif 000801
DMF(3mL)中のBoc-Leu-OH(20mg、87μmol)及びHATU(50mg、0.13mmol)の混合物に、DIPEA(30mg、0.23mmol)、DMAP(2mg)、及び化合物104-3a(30mg、54μmol)を添加した。混合物をRTで1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。該混合物を分取HPLC(方法A)によりそのまま精製すると、化合物104-4a(25mg、55％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 787.4(M+Na)+。
【０７５８】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル 2-[(2S)-2-アミノ-4-メチルペンタンアミド]-2-メチルプロパノエート(104a)
【化６４６】
2021523147.tif 000802
DCM(1.5mL)中の化合物104-4a(25mg、33μmol)の混合物に、TFA(0.15mL)を添加し、LCMSによりBocが完全に除去されるまで、混合物をRTで1時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を分取HPLC(方法A)により精製すると、化合物104a(13mg、61％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 665.4(M+H)+。
【化６４７】
2021523147.tif 000803
【０７５９】
(スキーム104B.リンカー-ペイロードLP12Aの合成)
【化６４８】
2021523147.tif 000804
tert-ブチル(2S)-2-{[({4-[(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[(2S)-2-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}-3-メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル]アミノ}-4-メチルペンタノエート(104-5)
【化６４９】
2021523147.tif 000805
化合物11b(0.30g、0.39mmol)及びH-Leu-OTBU-OH(0.14g、0.63mmol)のDMF(3mL)溶液に、DIPEA(0.26g、2.0mmol)を添加し、反応混合物をRTで2時間撹拌した。得られた混合物を分取HPLC(方法A)によりそのまま精製すると、化合物104-5(0.11g、35％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 815.4(M+H)+。
【０７６０】
(2S)-2-{[({4-[(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[(2S)-2-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}-3-メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル]アミノ}-4-メチルペンタン酸(104-6)
【化６５０】
2021523147.tif 000806
化合物104-5(25mg、31μmol)のDCM(4mL)溶液に、TFA(0.8mL)を添加し、混合物をRTで2時間撹拌した。得られた混合物を真空中で濃縮し、残渣を分取HPLC(方法A)により精製すると、化合物104-6(15mg、67％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 759.3(M+H)+。
【０７６１】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル 2-[(2S)-2-{[({4-[(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[(2S)-2-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}-3-メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル]アミノ}-4-メチルペンタンアミド]-2-メチルプロパノエート(104-7a)
【化６５１】
2021523147.tif 000807
化合物104-5(20mg、26μmol)及び化合物104-3(17mg、32μmol)のDMF(2mL)溶液に、HATU(20mg、52μmol)、DIPEA(13mg、0.10mmol)、及びDMAP(1mg)を添加し、反応混合物をRTで1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を分取HPLC(方法A)によりそのまま精製すると、化合物104-7a(30mg、89％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1293(M+H)+。
【０７６２】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル 2-[(2S)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル]アミノ}-4-メチルペンタンアミド]-2-メチルプロパノエート(104-8a)
【化６５２】
2021523147.tif 000808
化合物104-7a(25mg、19μmol)のDMF(2mL)溶液に、ピペリジン(0.2mL)を添加し、LCMSによりFmocが完全に除去されるまで、混合物をRTで30分間撹拌した。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水性TFA(0.03％)中の0〜50％アセトニトリル)によりすぐに精製すると、化合物104-8a(20mg、95％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 1070.5(M+H)+。
【０７６３】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル 2-[(2S)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-({[エンド-ビシクロ[6.1.0]ノナ-4-イン-9-イルメトキシ]カルボニル}アミノ)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル]アミノ}-4-メチルペンタンアミド]-2-メチルプロパノエート(LP12A)
【化６５３】
2021523147.tif 000809
化合物104-8a(20mg、26μmol)及び化合物5d(14mg、32μmol)のDMF(2mL)溶液に、HATU(22mg、58μmol)、DIPEA(15mg、0.12mmol)、及びDMAP(1mg)を添加し、反応混合物をRTで2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を分取HPLC(方法A)によりそのまま精製すると、リンカー-ペイロードLP12A(10mg、21％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 747.6(M/2+H)+。
【化６５４】
2021523147.tif 000810
【０７６４】
(スキーム104C.ペイロード104b及びそのリンカー-ペイロードLP13Aの合成)
【化６５５】
2021523147.tif 000811
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル(2S)-2-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}-4-メチルペンタノエート(104-2b)
【化６５６】
2021523147.tif 000812
化合物100(0.47g、1.0mmol)及びFmoc-Leu-OH(0.39g、1.1mmol)のDCM(10mL)溶液に、EDCI(0.23g、1.2mmol)及びDMAP(12mg、0.10mmol)を添加した。混合物をRTで16時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を水(50mL)で希釈し、DCM(50mL×2)で抽出した。合わせた有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の10〜50％酢酸エチル)により精製すると、化合物104-2b(0.52g、65％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 802.4(M+H)+。
【０７６５】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル(2S)-2-アミノ-4-メチルペンタノエート(104-3b)
【化６５７】
2021523147.tif 000813
化合物104-2b(0.50g、0.62mmol)のDCM(9mL)溶液に、ピペリジン(1mL)を添加し、LCMSによりFmocが完全に除去されるまで、反応混合物をRTで30分間撹拌した。得られた混合物を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(DCM中の5〜10％メタノール)により精製すると、化合物104-3b(0.32g、90％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 580.3(M+H)+。
【０７６６】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル(2S)-2-[(2S)-2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-3-ヒドロキシプロパンアミド]-4-メチルペンタノエート(104-4b)
【化６５８】
2021523147.tif 000814
DMF(3mL)中の化合物104-3b(0.32g、0.55mmol)及びBoc-Ser-OH(0.14g、0.66mmol)の混合物に、HATU(0.25g、0.66mmol)及びDIPEA(0.21g、1.6mmol)をRTで添加した。混合物をRTで6時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を真空中で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の10〜50％酢酸エチル)により精製すると、化合物104-4b(0.34mg、80％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 767.4(M+H)+。
【０７６７】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル(2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-ヒドロキシプロパンアミド]-4-メチルペンタノエートトリフルオロ酢酸塩(104b)
【化６５９】
2021523147.tif 000815
化合物104-4b(0.34g、0.44mmol)のDCM(5mL)溶液に、TFA(1mL)を添加した。LCMSによりBocが完全に除去されるまで、反応混合物をRTで2時間撹拌した。得られた混合物を濃縮すると、残渣(0.33g、95％収率)は、次の工程のために十分純粋であった。100mgの粗生成物を分取HPLC(方法A)によりさらに精製すると、化合物104b(80mg、80％収率)が黄色の固体として得られた。ESI m/z: 667.3(M+H)+。
【０７６８】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル(2S)-2-[(2S)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル]アミノ}-3-ヒドロキシプロパンアミド]-4-メチルペンタノエート(104-8b)
【化６６０】
2021523147.tif 000816
上記の新たに得られた粗化合物104b(0.10g、0.13mmol)のDMF(3mL)溶液に、Fmoc-vcPAB-PNP(11d)(0.12g、0.16mmol)、DMAP(16mg、0.13mmol)、及びDIPEA(50mg、0.39mmol)をRTで添加した。出発材料の大部分が消費されるまで、混合物をRTで3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。その後、反応混合物に、ピペリジン(1mL)を添加した。LCMSによりFmocが完全に除去されるまで、室温で1時間撹拌した後。反応混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物104-8b(28mg、20％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 536.8(M/2+H)+。
【０７６９】
2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエチル(2S)-2-[(2S)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-({[エンド-ビシクロ[6.1.0]ノナ-4-イン-9-イルメトキシ]カルボニル}アミノ)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メトキシ)カルボニル]アミノ}-3-ヒドロキシプロパンアミド]-4-メチルペンタノエート(LP13A)
【化６６１】
2021523147.tif 000817
化合物5d(10mg、22μmol)のDMF(1mL)溶液に、HATU(9mg、22μmol)及びDIPEA(8.0mg、62μmol)をRTで順次添加した。混合物をRTで30分間撹拌し、その後、化合物104-8b(20mg、19μmol)のDMF(1mL)溶液を添加した。化合物104-8bが消費されるまで、得られた混合物をRTで2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。膜に通して濾過した後、濾液を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、リンカー-ペイロードLP13A(10mg、35％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 748.4(M/2+H)+。
【０７７０】
(スキーム105. LP18A〜21Aの合成)
【化６６２】
2021523147.tif 000818
2021523147.tif 000819
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-オエート(5-1c)
【化６６３】
2021523147.tif 000820
化合物5c(160mg、0.290mmol)のDCM(20mL)溶液に、HOSu(73.3mg、0.637mmol)及びEDCI(122mg、0.637mmol)を添加し、混合物をRTで24時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物をDCM(50mL)で希釈し、有機層を水(50mL)及びブラインで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮すると、化合物5-1c(159mg、84％収率)が無色の油状物として得られ、これを次の工程にそのまま使用した。ESI m/z: 650(M+H)+。
【０７７１】
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-[({エンド-ビシクロ[6.1.0]ノナ-4-イン-9-イルメトキシ}カルボニル)アミノ]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-オエート(5-1d)
【化６６４】
2021523147.tif 000821
5cの代わりに5dを使用することを除き、5-1cと同様の手順に従うと、化合物5-1d(150mg、54％収率)が無色の油状物として得られ、これを、それ以上精製することなく、次の工程にしそのまま使用した。ESI m/z: 539(M+H)+。
【０７７２】
{4-[(2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチル N-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}メチル)カルバモイル]メチル}カルバメート(103-8b)
【化６６５】
2021523147.tif 000822
104bの代わりに103bを使用することを除き、104-8bと同様の手順に従うと(スキーム104Cを参照)、化合物103-8b(28mg、20％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 480(M/2+H)+。
【０７７３】
(4S)-4-アミノ-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-[(4-{[({[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}メチル)カルバモイル]メチル}カルバモイル)オキシ]メチル}フェニル)カルバモイル]ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ブタン酸(103-9a)
【化６６６】
2021523147.tif 000823
化合物Boc-L-Glu(OTBU)-OH(0.15g、0.50mmol)のDMF(5mL)溶液に、HATU(0.19g、0.50mmol)及びDIPEA(0.13g、1.0mmol)を添加した。反応混合物をRTで10分間撹拌し、その後、化合物103-8b(0.48g、0.50mmol)を反応混合物に添加した。その後、LCMSにより103-8bが完全に消費されるまで、反応混合物をRTで3時間撹拌した。該混合物をEtOAcで抽出し、合わせた有機溶液を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をDCM(10mL)に溶解した。該溶液に、TFA(2mL)を添加し、反応混合物をRTで3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。該反応混合物を濃縮し、残渣を分取HPLC(方法B)によりそのまま精製すると、化合物103-9a(0.41g、75％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 536.8(M/2+H)+。
【０７７４】
(4R)-4-アミノ-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-[(4-{[({[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}メチル)カルバモイル]メチル}カルバモイル)オキシ]メチル}フェニル)カルバモイル]ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ブタン酸(103-9b)
【化６６７】
2021523147.tif 000824
Boc-L-Glu(OTBU)-OHの代わりにBoc-D-Glu(OTBU)-OHを使用することを除き、103-9aと同様の手順に従うと、化合物103-9b(0.40g、74％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 536.8(M/2+H)+。
【０７７５】
(4S)-4-アミノ-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(2S)-1-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}-4-メチル-1-オキソペンタン-2-イル]カルバモイル}-2-ヒドロキシエチル]カルバモイル}オキシ)メチル]フェニル}カルバモイル)ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ブタン酸(104-9a)
【化６６８】
2021523147.tif 000825
103-8bの代わりに104-8bを使用することを除き、103-9aと同様の手順に従うと、化合物104-9a(0.39g、65％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 601.3(M/2+H)+。
【０７７６】
(4R)-4-アミノ-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(2S)-1-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}-4-メチル-1-オキソペンタン-2-イル]カルバモイル}-2-ヒドロキシエチル]カルバモイル}オキシ)メチル]フェニル}カルバモイル)ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ブタン酸(104-9b)
【化６６９】
2021523147.tif 000826
103-8bの代わりに104-8b、Boc-L-Glu(OTBU)-OHの代わりにBoc-D-Glu(OTBU)-OHを使用することを除き、103-9aと同様の手順に従うと、化合物104-9b(0.39g、65％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 601.3(M/2+H)+。
【０７７７】
(4S)-4-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-[(4-{[({[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエン-8-イル]-2-オキソエトキシ}メチル)カルバモイル]メチル}カルバモイル)オキシ]メチル}フェニル)カルバモイル]ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ブタン酸(LP18A)
【化６７０】
2021523147.tif 000827
化合物103-9a(57mg、53μmol)のDMF(1mL)溶液に、化合物5-1c(36mg、56μmol)及びDIPEA(27mg、0.21mmol)を添加した。反応混合物をRTで4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。その後、得られた混合物を分取HPLC(方法B)によりそのまま分離すると、化合物LP18A(12mg、15％収率)が白色の固体として得られた。ESI m/z: 811.4(M/2+H)+。
【０７７８】
(4R)-4-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-[(4-{[({[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-ジフルオロ-11-ヒドロキシ-9,13-ジメチル-16-オキソ-6-プロピル-5,7-ジオキサペンタシクロ[10.8.0.02,9.04,8.013,18]イコサ-14,17-ジエ菣ⶳⴸ苣ꮃⵝⴲ苣궂苣ꢂ菣궂苣綷菣膃菣⦫苣ꮃ菣ꊃ苣ꮃꆃ菣ꮃꮂ菣邃菣ꒂ菣⦫苣궂苣嶷菣膃菣綫菣Ꞃ菣ꮃꮂ菣邃菣ꒂ菣嶫菣膃菣嶫苣ꮃ菣ꊃ苣ꮃ⵽ⴲ菣膃菣鞃菣钃菣嶫苣ꮃ菣ꊃ苣ꮃ隃苣뎃藩⢸偌㤱⥁戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㈸㰸愯㰾䐯噉ਾ ㄠ㌰㤭꺁믤辂苣ꮁ〱ⴳ戹苣뾽铧馁苣鎁臣銂駩趁胣䲁ㅐ䄸臣貐꟦꺁触蚠臣鎾臣ꢁ胣隌郥ꦉ偌㤱⡁㐱杭胣ㆁ薼迥螎貁駧늉臣몛뷤ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䖂䥓洠稯›ㄸ⸱⠴⽍⬲⥈猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰⬾⼼畳㹰胣ં䐼噉邀볯鞼볯馼胣㲑䐯噉ਾ㐨⥓㐭笭ⴱ⡛ꢂ菣覃鎃苣꾂菣宭⸶⸱崰菣誃㐭ꒂ菣ⶳⴹ苣ꮃ菣袃苣랂ꮂ菣鲃菣ꮃꊂ菣躃ⵝⰳⰶⰹ㈱蚃菣ꦃ苣궂苣骃菣뾂菣ꮂ菣ⶳ㔱ꊂ菣覃⵽ⴴ孻ㄨ⥓ㄭ笭⡛匱⴩ⴴꮂ菣邃菣ꒂ菣ꊂ菣躃⴩ⴱ笨ⴴ⡛孻ㄨ⥓ㄭ笭⡛匲⴩ⴱ㉻嬭ㄨⱓ匲㐬ⱒ匸㤬ⱓㄱⱓ㈱ⱒ㌱ⱓ㤱⥓ㄭⰲ㤱뢂菣ꮃ苣궃ㄭⴱ菣覃菣궂苣⶷ⰹ㌱뢂菣膃菣ⶫ㘱ꪂ苣붂㘭鞃菣钃菣ⶫⰵⴷ苣ꪂ苣떂菣뎃苣랂苣궃ㅛ⸰⸸⸰㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯灵ⰾ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㤾⼼畳㹰〮猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹰㰬畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰸猯灵⸾㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌱⼼畳㹰㰬畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㠱⼼畳㹰ꒂ苣떂ㄭⰴ㜱뢂苣뎃㠭ꒂ菣嶫㈭ꪂ苣붂苣袃苣랂⵽ⴴ菣膃菣ⶫⴱ苣궂苣骃菣뾂菣ⶳⴲ苣ꮃꮂ菣邃菣ꒂ菣綫㈭銃菣궃苣랂苣膃菣嶫苣ꮃ菣ꊃ苣ꮃꪂ苣랂ꆃ菣ꮃ閃苣讃菣綫苣ꮃ菣ꊃ苣ꮃ隃菣ꮃꮂ菣邃菣ꒂ菣綫㈭ꆃ菣ꮃ菣궃菣ꮃꮂ菣邃菣ꒂ菣綫菣뾂菣뢅䰨㉐䄰㰩牢ਾ䐼噉邀賥隼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㤲⼼㹡⼼䥄㹖ਊ†賥袐觧ㆩ㐰㤭⡡㐶杭胣㖁츳涼汯꺁䵄⡆洱⥌뫦늶臣膀賥袐觧㖩ㄭ⡤〳杭胣㖁츶涼汯誏臣䒳偉䅅㈨洷膀⸰ㄲ浭汯銂럦ꂊ臣龁胣趏뿥랷郥ꦉ苣劒ꞁ芙雩릒详鞁胣鎁苣銂䍌卍臣袂苣ꊃ菣뾂菣뎃苣鞁臣芀臣꺁뻥膀뻥覂苣龁럦袐觧銂裥随偈䍌릖돦䊕ꮁ苣誂臣꺁臣뺁裥ꊛ臣讂臣膀賥袐觧䲩㉐䄰ㄨ洷膀〲볯躏軧⦇臣붙觨꺁鯥鎽臣鞁臣鞾苣貂臣芀卅⁉⽭㩺㠠㌱〮䴨㈯䠫㰩畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰫猯灵芀㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖⠊刴⴩ⴴㅻ嬭笨苣뎃菣ⶉ菣랂苣궃㙛ㄮ〮躃菣ⶊⴴ苣뎃㤭ꒂ菣ꆃ菣궂苣綷苣ꮃ菣讃菣⦫苣龃菣嶎㌭㘬㤬ㄬⴲ菣袃菣ꪂ苣떂菣뎃苣螃苣뎃ㄭⴵ苣龃菣綉㐭笭⡛匱⴩ⴱ孻ㄨ⥓㐭⠭苣ꮃ菣ꊃ苣ꮃ��龃菣⦎ㄭ⠭㑻嬭笨⡛匱⴩ⴱ孻㈨⥓ㄭ笭ⴲ⡛匱㈬ⱓ刴㠬ⱓ匹ㄬ匱ㄬ刲ㄬ匳ㄬ匹⴩㈱ㄬⴹ苣閃菣ꪂ菣ⶭㄱ銃菣궃苣랂㤭ㄬⴳ苣ꆃ菣ꮃㄭⴶ苣궂苣ⶽⴶ菣궃菣ꮃ㔭㜬뢂苣궂苣骃菣뾂苣꾂菣宭〱㠮〮〮猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹰㰬畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰹猯灵⸾㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯灵ⰾ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㠾⼼畳㹰〮猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰳猯灵ⰾ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰸猯灵崾苣뎂苣ⶵ㐱ㄬⴷ苣ꢂ菣ⶳⴸ苣ꮃⵝⴲ苣궂苣ꢂ菣궂苣綷㐭ꆃ菣ꮃㄭꪂ苣붂菣뎃苣뎃㈭ꒂ菣嶫苣ꮃ菣ꊃ苣ꮃ⵽ⴲ菣覃菣궂苣ꢂ菣ꮃꮂ菣邃菣ꒂ菣綫苣궂苣⦷菣膃菣嶫菣Ꞃ菣ꮃꮂ菣邃菣ꒂ菣⦫菣膃菣嶫苣ꮃ菣ꊃ苣ꮃ⵽ⴲ菣膃菣鞃菣钃菣嶫苣ꮃ菣ꊃ苣ꮃ隃苣뎃藩⢸偌ㄲ⥁戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㌸㰰愯㰾䐯噉ਾ ㄠ㐰㤭꺁믤辂苣ꮁ〱ⴴ戹苣뾽铧馁苣鎁臣銂駩趁胣䲁㉐䄰臣貐꟦꺁触蚠臣鎾臣ꢁ胣隌郥ꦉ偌ㄲ⡁㐱杭胣ㆁ薼迥螎貁駧늉臣몛뷤ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䖂䥓洠稯›ㄸ⸳⠰⽍⬲⥈猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰⬾⼼畳㹰胣ં䐼噉邀볯鞼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†룤꺁ꇨ㖨꾁胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣貂苣릖돦銂铧蒁臣鲽ꏨ閁苣龁菣뎃苣벃菣ꒂ菣벃菣銂迦몤臣ꚁ臣讂胣㲂牢ਾꇨ㖨⹂菣뎃苣벃骃苣궃菣覃臣设戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰ㄳ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㈳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㌸㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀볯鞼볯銼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㜲ꪃ菣ꮂ菣ⶼ菣ꒂ菣벃菣꺁觧뒾꟨邞㰩牢ਾ†ꇨㆨ꾁胣ꪃ菣ꮂ菣ⶼ菣ꒂ菣벃菣꺁偈䍌듧ꚺ迥뎁偈䍌룤ꞁ臣䲮鶿賦芙雩膀돨辇苣骃苣袃菣讁苣꺁⽍꺁뗧鲞苣뺁臣膂臣节臣ꞁ臣讂胣蚈黦蒚偈䍌迥뎁卍돦꾁胣겜飦내鯦ꮁ雩몤臣貂苣肸裨蒚触蚠臣誁臣ꚁ꣨覼臣貂臣芀戼㹲ꢡ㘱ꪃ菣ꮂ菣ⶼ菣ꒂ菣벃菣꺁賥ꚭ髧ⶄ觧蚐髧릉胦㲧牢ਾ䐼噉邀ꇨ钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㌸㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰱猯灵䠾䱐ⵃ卍臣龁苣꺁雦閳㱂牢ਾꇨㆨ㨷菣뎃苣벃骃苣궃菣覃觧Ꞁ戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㔳⼼㹡⼼䥄㹖ਊꇨㆨ䄷†菣뎃苣벃骃苣궃菣覃臣릉뻥ꎧ黦螃菣뾂戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㘳⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯鞼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㠲‮䑁뎂菣뢂菣늂菣랂菣뎃㰩牢ਾ†鳦龮雦设臣膀藥鎽臣鞁臣膀菣ꒂ菣벃菣꺁諦鎽迥꾁臣꺁諦龎뗧袐雦螉臣꺁菩趽觧낕髧뎂菣뢂菣늂菣랂菣뎃臣龁苣꺁雦閳苣몤臣ꚁ臣讂胣뎛㘱苣芏��閁苣龁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 鲽ꏨ閁苣龁諦䶗剓鞊뷤⢓ꇨ㒨銂ꫧ뚄ꓥ낕臣鮁臣⢦㉎㜹⥑胣뮲駧蒚菣ꒂ菣벃菣ꢁ臣뎂菣뢂菣늂菣랂菣뎃臣龁苣꺁菣ꦃ菣릂苣ꮃ苣龃菣벃苣ꢃ뷤銂뗧뾁뻨鎂臣芀㉎㜹膪蓧覤闧銂郥覜臣讂菩趽觧낕髧ꊂ苣ꪃ苣랂菣隌諦鎽苣ꊂ菣뎃倭䝅猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢中猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢臣뎂菣뢂菣늂菣袃臣鮁臣膀諦䶗剓‱扁倭䝅猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢中猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢苣ꮐ苣膀苣뢂菣颮菨隌諦鎽苣뎃苣ꖃ苣벃菣⢈䅭ⵢ㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵⤾苣鲽ꏨ鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 겜껥붖뻤꾁胣늩苣뎃苣ꖃ苣벃菣銂뷤붣臣讂臣膂臣릖돦銂ꓧ鞁臣蒁苣芀畂䡰蚕꣦⦙瀨⁈鲀⤸룤꺁菣袃杉ㅇ苣ꒂ苣뾂苣鞃苣覜臣讂苣낂菣뎂苣ꮃ賥鞊뷤銂觢㊧〰菣ꮃ뷥辇臣ꊂ苣覃搭䕐㱇畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵ⴾ苣龃菣⢳坍㈮㠱㈮朶洯汯ꢁ럦袐臣龁胣鞾苣貂臣뚺뛦銂菣ꦃ菣릂苣ꮃ苣龃菣벃苣⢼㔲⽕䱭※洱꺁諦鎽뷥龁苣㖊⁕呍⥇臣랷郥馁苣ꢁ胣め㔮胣㆜洰⽧䱭臣肜뗧莿뫥꺁諦鎽臣鞾苣貂胣鶁臣貾胣辩苣讁臣꾌鯧閁臣ꪁ臣覂胣늩뫦늶苣㎒莄臣㒧胣㊜芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣趏뿥銂䑓ⵓ䅐䕇迥꾁卅ⵉ卍臣袂苣ꊃ菣뾂菣뎃苣鞁臣芀뗧蚺뻥膀뷤蚈臣ꊂ菣뎃迥뎁呍銂苣ꒂ苣銎駩꾂菣麃菣낂菣閃苣벃匨䍅ꮁ苣誂駩뮎臣讂臣膀苣뢂菣颮菨隌諦鎽洨扁中猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢貁铧邈臣貂臣芀臣꺁铧邈觧銂䑓ⵓ䅐䕇迥뎁卅ⵉ卍臣ꎧ黦鞁臣芀ꧨ鞊뷤꺁ꒁ臣ꢃ뷤銈㉑㔹迥뎁㉑㜹裢ꮁ믤ꂊ臣貂臣ꊂ苣覃搭䕐㱇畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵ⴾ苣龃菣꾁胣邵黦ꢁ臣ꚁ胣㒁䅄꺁苣낂菣뎂苣ꮃ賥鞊뷤ⶓ䕐㱇畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵ⴾ苣뢂菣뎂菣뢂菣늂菣袃臣ꒁ臣ꚁ胣㢁㐰慄臣鞢諥銂苣龁苣鞁臣芀苣뎃苣ꖃ苣벃苣ꞃ菣ꢃ뷤銂胣袃菣鞃苣뎃뛦隌臣貂臣趇軩꺁菣鞃菣覃藩鞈菣莃菣뎃苣ꮁ苣誂胣㒁䅄꺁苣뢂菣颮菨隌諦鎽臣ꒁ臣ꚁ胣䖁充猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ꪃ菣ꮂ菣㲼猯灵夾㱑畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢菣뎃苣벃⼼畳㹰呓剙臣貐껥鞁胣몢ꫨ鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 丠㤲儷ꫧ뚄ꓥ낕苣ꮐ鳦馁苣銃菣䦈䝧銂鳦馁苣ꢃ뷤릉闧蒚苣낂菣뎂苣ꮃ賥鞊뷤겖觧뎂菣뢂菣늂菣袃䄨䍄銂胣ꊂ菣궂菣ꮐ鳦ꪃ菣ꮂ菣ⶼ菣ꒂ菣벃菣⢉偌銂鳦馁苣ꊂ苣覃껥붃賥鞊뷤⢓䅭ⵢ㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵⤾雩꺁㉛㌫꾂菣莃苣趏뿥ꮁ苣誂ꫨ붣臣龁胣ં䐼噉邀볯鞼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†菣뎃苣벃骃苣궃菣覃䰨⥐苣覜臣讂菩趽觧낕��鞊뷤뎂菣뢂菣늂菣袃苣膀냦Ꞁꫥ鎽设臣낁胣傁卂胣㖁볯낂菣뮂菣벃菣銂郥覜臣讂䉐膀䉈⥓룤꺁䅭ⵢ䕐㱇畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵ⴾ㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵⠾鲀㈱杭洯⥌苣膀䵄体胣䒁䙍胣袏臣䒯䅍臣ꦁ臣붥臩ꪁ鳦龩뫦銪臣뚺꟨鞁臣꞉ꊃ菣鎽蟩꺁偌臣ꢁ苣ꮁ㐲蓢鲀㜳蓢ꞁ〳裥鲀㐲駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣鎁臣ꮁ苣誂ꫨ붣臣龁馁臣辂臣膀迥鲿럦袐觧꾁胣㖁胣㊜薼鳦龩뫦銪胣皁瘯苣ꮐ鳦馁苣⦋胣趏뿥꺁胩財苣䖒䥓䴭ꮁ苣誂菣讃苣ꪃ菣낂臣膀䅭ⵢ䕐㱇畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵ⴾ㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵꺁곦芦臣膀苣뎃苣ꖃ苣벃苣ꞃ菣꺁뗧蚺苣몤臣龁胣馽裥ꪁ蟩꺁偌迥뎁鳦龩뫦銪苣膀䉐ꮁ苣讂뫦몇苣讻臣讂䕓ꮁ苣讂臣膀迥꾁藩Ꞁ菣莃菣ꆂ菣ꞁ뫦몇臣鮁胣鶁臣貾臣袃菣릂瀨⁈⸸⤰臣궸鋥馁苣鞃菣蚃苣뎃ꮂ菣ꂃ苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣ꮁ苣誂駩뮎臣龁胣뺲ꏨ閁苣龁苣뎃苣ꖃ苣벃菣銂胣厁䍅胣厁卄倭䝁膀迥뎁卅ⵉ卍臣袂苣ꎧ黦鞁臣芀ꇨㆨꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂臣꾁胣뺯뿥馁苣䲋놔鷦꺁䵍䕁諦鎽苣뎃苣ꖃ苣벃菣膀苣蚃菣ꒂ菣鞊뷤뎂菣뢂菣늂菣袃胣誏臣䲳剘苣뒂菣릂菣鞊뷤뎂菣뢂菣늂菣袃胣鶁苣覂臣蚈귥辇迥뎁卅ⵉ䅄ꒀ臣ꪃ苣袃臣芁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 랅뷤蒚臣设臣誁臣ꚁ胣め㠮〰䱭臣傮卂⡧䉐膀薼苣ꪃ苣궃菣ꮃ胣炁⁈⸷⤴룤꺁苣뢂菣颮菨隌諦鎽ㄨ杭銂ꊃ菣鎽蟩꺁ꇨㆨ臣ꪃ菣ꮂ菣骃苣궃菣覃䰨⥐莿뫥膀䵄体룤ㆭ洰⽧䱭ꞁ呒臣㊧駦鎖蟥蚐臣膀뷤蚈臣ꪃ菣ꮂ菣骃苣궃菣覃䰨⥐苣떂苣몂軦꒙苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣⢼䕓膀畓数摲硥㈠〰䠠膀䕇䠠慥瑬捨牡⥥臣袂苣꒙軥鞁臣芀鳦芵铧邈觧銂뛨ꂁ뿥蚈鯩ꮁ苣誂뿦꺸臣膀噕胣厁䍅胣厁卄倭䝁膀迥뎁卅ⵉ卍臣袂苣릉뻥ꎧ黦鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖⠊껥붖뻤㊋䄸›䑁뎂菣뢂菣늂菣랂菣뎃㰩牢ਾ†鳦龮雦设臣膀菣ꪂ菣ꮃ麃菣ꒂ菣覃迥鲿苣ꢔ臣ꚁ胣겖觧ꢁ諦鎽臣꺁鷩ꢃ뷤릉闧蒚苣뎃苣ꖃ苣벃苣ꞃ菣銂ꇨ蚁臣膂臣릖돦銂ꓧ鞁臣蒁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 鞊뷤랂苣蚃苣뎃苣讻臣讂苣뎃苣ꖃ苣벃苣ꞃ菣銂胣䶁汯倠慨浲‮〲㔱䨠湵ㄠㄻ⠲⤶ㄺ㘸ⴳㄷ臣風볨閁苣ꚁ臣讂雦閳臣貐꟦꺁꣨覼臣貂臣蒁苣릖돦銂铧蒁臣膀ꖷ꣧ꞁ껥붖臣讂胣ં䐼噉邀볯鞼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†䡰㜠㔮臣ꊃ菣꾂菣벃菣ꮃ諦鎽洨扁胣㖁洰⁍䕈䕐膀㔱洰⁍慎汃룤ㆭ洰⽧汭銂胣ㆁ䵭苣膃苣릂菣ꒂ菣벃菣⢫諦鎽洱鎽臣誂⸰〰洶⥧迥꾁䍔偅鞊뷤ꮁ꿥鞁臣㊦㔮菣ꮃ뷥辇ꞁ胣㎁莄臣㎧蚈雩蒂藥馁苣芀諦鎽臣莿뫥꾁胣亁湡摯潲⡰桔牥潭楆桳牥匠楣湥楴楦⥣臣꺁㠲渰ꮁ臣醁苣뢐藥ꚺ迥뎁ꧨ鞊뷤꺁룦낡뿤낕臣��몟臣蒁臣袨껧鞁臣芀苣ꮃ뿦躁䜨㈭膀䡰㐠㔮臣ꊅ藩誃菣ꪃ苣ꂃ貾胣䒁卍궸臣䲮隌郥ꦉㄨ洰⽧䱭銂苩莅諦鎽臣뮷諥鞁胣랷郥ꦉ苣㆒⁍䕈䕐⡓䡰㜠㐮ꞁ䡰㜠〮臣뾪闦鞁臣芀迥鲿뛦銂鲀㐱駦鎖迥鲿臣鮁臣誁臣芀뻥覂苣讂苣뎃苣ꖃ苣벃菣銂䕓ꮁ苣誂닧붣臣龁胣溂䅣䍄臣겸껥閁苣龁郥覅뫥ꚸ臣ꮁꧨ鞊뷤誏臣䲳隌郥ꦉ臣鮸ꇨ芿闦銂铧蒁臣膀䅄⡒噕ꒀ苣몱껥馁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖⠊껥붖뻤㊋⸹䰠ⵃ卅ⵉ卍臣袂苣䆋䍄臣릉뻥ꎧ黦⦐戼㹲 겖觧ⶩ菣ꒂ菣벃菣蚈룥鞃菣閃苣ꒂ菣銂뇦骮臣讂臣膂臣誏臣뎹鷥䒇剁苣袨껧馁苣龁苣ꮁ胣䲁ⵃ卅ⵉ卍臣袂苣䆋䍄ꧨ首臣ꒂ菣뾂苣袃돨辇臣겸껥銂ꇨꎁ臣芀郥薀臣ꚩ꣩ꚩ雦⢙〲胣㖜渰膀电⥌苣䆒煣極祴唠䱐⁃牐瑯楥⁮䕂⁈㑃苣ꦃ菣⢠〱⁋獰膀〳ꮄ胣ㆁ㜮볎膀㔷볎썭㆗〰浭ꮂ苣궃苣ꪕ迥ㆷ㘸〰㠳〱ꮁ藥ꮡ臣龁胣㎂裥鎖臣놄ꇥ꺁뻥膀苣뎃菣꾂돨銂뫦몇臣鮁胣ꪳ蟩릂菣꾂菣ꮃ苣垒瑡牥⁳祓慮瑰䜠ⴲ楓菣릂苣骃苣袃菣ꆃ菣ꪃ菣袨臣袂苣늍뻥鞁臣芀ꇨㆨꮁ臣ꢁ苣覂苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀臣ꢁ苣ꦁ臣ꢃ뷤릉闧蒚䑁꾁胣ꢃ뷤릉闧蒚苣뎃苣ꖃ苣벃菣ꮁ臣蒁臣膀⸳鲀‴䅄銂鳦馁苣芀戼㹲ꢡ㠱›䑁릉胦㲧牢ਾ䐼噉邀ꇨ钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㌸㰷愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㌸㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㤳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㐸㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀볯鞼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设〳‮楂捡牯ꢡ鷩鞃菣몂菣뎃藥뒳臣覂뻥覂苣讂諦䶗剓鞊뷤ⶓ雨ꦉ苣뎃苣ꖃ苣벃菣꺁뗧袐迥鲿胩ꚺ㰩牢ਾ†鳦躘듧뢛臣讖ꓧ閁苣讂卍ㅒ諦鎽苣颧胣ꪁ苨鎇鞏껥鎽䰨剘骃苣궃菣覃迥꾁꟦薀臣릂菣궃苣覃菣ꒂ菣벃菣ꮁ苣뎃苣ꖃ苣벃菣鞁臣芀鳦龮雦设臣膀菣袃諦䶗剓鞊뷤ⶓ雨ꦉ苣뎃苣ꖃ苣벃菣誏臣鶁臣뺯뿥馁苣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣蒁臣蒁ꛨ鞊뷤ꮁ꿥馁苣銃菣䶈剓ꚩ雨邵郥꺁맥ꆡ꟨ꊛ껥낕䬨猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䐾⼼畳㹢ꒀ臣ꪃ苣ꮃ苣ꒂ菣ꢡ鷩鞃菣몂菣뎃藥뒳菣벃苣꺁楂捡牯⁥㉔〰菣ꒂ苣뮂菣떂菣銂铧蒁臣ꦁ臣袂臣ꮁ뇦骮臣貂臣讁臣蒁臣鎁臣銂꣨覼臣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯鞼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†뗧袐ꧨ鎨臣ꢅ臣膀〱䵭䠠偅卅胣㎁〰䵭丠䍡膀洳⁍䑅䅔胣誏臣コ〮薼⽶貕鷩뮴胦ꒉ睔敥⵮〲胣炁⁈⸷⠴䉈ⵓ呅뎳该邃菣閃苣벃룤膀㔲蓢ꞁ껥붖臣龁胣鞊卍ㅒ菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤銂跦覍臣讂臣膂臣膀鳦鶈臣膀楂捡牯⁥䵃뮂菣떂菣膃菣鞃ꇨꊝ苣ꒃ苣鞊菣袃捆돎觧낕髧鶃菣꾂菣벃菣ꮃ諦鎽䨨捡獫湯䤠浭湵副獥慥捲⁨慌潢慲潴楲獥胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥䊷ⵒ〱㠰㌭⤹臣꺁苣龃菣ꮂ菣鞃菣뎃苣ꮁ苣��誂ꫨ躰뷤隌臣龁胣邵郥ꚩ꣩꾁胣亁ꮜꯧ躃菣銃苣膃苣뎃苣낂믤趁臣몙迧閁苣讂菣袃卍ㅒ듧麃ꓥ覃菣ꒂ菣⢳楈㥳栭卍ㅒ※♒浡㭰⁄祓瑳浥膀苣뾂菣낂闧랏㜲㠰䴭⥓臣뺯臣ꚁ껥붖臣龁胣肜裥ꮁ胣颧胣ꪁ뿦ꚺ臣䢮獩ⴹ䵨剓⠱〱渰鲀⸳渷袏臣㎯渰鲀⸳㌳䵮※趀胩骶룥袇觧⦩苣䢒卂䔭뎳该邃菣閃苣벃룤ꞁꫨ붣臣膀諦銃菣䚈칣閍跦鞊卍ㅒ菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤ꢡ鷩ꮁ〵볎⽌裥꺁뗦龀臣㎧裥鎖돦ꖅ臣膀臣꺁룤릖臣膀菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤ꮁ뗧袐臣龁卍ㅒꧨ겖臣ꎧ鯩銂䉈ⵓ呅돦開菣莃菣ꆂ菣궸臣蒴鲀〱裥鎖菣讃苣ꪃ菣낂臣龁胣ં䐼噉邀볯鞼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†捓畲扢牥㈠〮ꮂ菣隃菣ꎂ菣蚃苣뎃苣붂菣袃苣Ꞃ苣銂铧蒁臣膀菣ꊂ菣뾂苣ꂃ뗧袐苣뎃苣벃苣ꦃ菣銂돨辇꟧開駩貕苣뒼臣ㆆㄺ뗧袐菣螃菣ꮁ뷥ꚁ臣膂苣鎁臣ꮁ苣誂胣骼郥龀뫥⢦㱫畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱡猯扵⤾迥뎁꟨ꊛ胩ꚺ欨猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰搾⼼畳㹢銂뇦骮臣龁胣邵郥ꎧ鯩뎹ꇨ骮闦⢰㱋畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱄猯扵⤾迥뎁꟨ꊛ跥鮸鳦⢟㱴畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰱猯灵⼾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢꾁胣ꖻ룤꺁苣蚁臣趏뿥龀뫥讁苣袨껧鞁臣㪟戼㹲㰊䥄㹖胣낕볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㐸㰱愯㰾䐯噉ਾ芀㰊䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ㈠莄臣꺁꟦薀臣鞊卍ㅒ諦鎽䰭剘䄠䍄迥뎁臣꺁苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣ꚁ臣ꪁ臣ꪦ諦鎽臣뺯臣讂楈㥳栭卍ㅒ뗧袐臣邵郥趏뿥龀뫥醃菣ꆃ菣뾂苣ꢡ㤱臣몤臣芀胣䲌ㅐ胣꾁胣鶁苣ꮁ臣蒁臣꺁菣ꒂ菣벃菣讧胩貁껥붖뻤ㆋꮁ迦鮾臣貂臣蒁苣ꪃ菣ꮂ菣ⶼ菣ꒂ菣벃菣銂ꇨ馁胣㲂牢ਾꇨㆨ㨹㈠莄臣꺁卍ㅒ諦鎽䰭剘䄠䍄迥뎁꿥鲿臣讂苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣ꚁ臣ꪁ臣鞊뷤ꮁ꿥馁苣䢋獩栭卍ㅒ뗧袐臣邵郥趏뿥龀뫥㲦牢ਾ䐼噉邀ꇨ钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㐸㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰪猯灵꾁胣뺏鳥꺁껥鎨鷦뚻룤ꞁ楈㥳栭卍ㅒ臣ꎧ鯩貁ꛨ龯臣貂臣膀菣벃苣銂菣ꎂ菣蚃苣뎃苣馁苣鎖胣殁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰搾⼼畳㹢胥貁触開臣ㆧ〮䔰〭ꮁ鯥骮臣貂臣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁苣芀戼㹲㰊畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰤猯灵꾁胣뺏鳥꺁껥鎨鷦뚻룤ꞁ뗧袐臣뎦꿥閁苣ꪁ臣ꎁ臣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꢡ㤱臣몤臣貂臣蒁苣袂臣ꮁ胣㊁莄臣膀꟦薀臣鞊卍ㅒ諦鎽䰭剘苣뎃苣ꖃ苣벃菣꾁胣め㘮䵰믤许胣㎜⸴游꺁꿧늛臣䮮猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䐾⼼畳㹢胥ꞁ砹楈⵳䵨剓ꮁ뗧袐臣膀臣꺁룤릖胣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣蒁臣蒁ꛨ鞊뷤꾁胣め㘮䵰믤许胣㆜⸳渷꺁꿧늛臣䮮猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧��≰䐾⼼畳㹢胥ꞁ砹楈⵳䵨剓ꮁ뗧袐臣龁胣ં䐼噉邀볯鞼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†뗧袐ꧨ鎨苣鞊卍ㅒ諦鎽ㅈ㉈㈱㐳中㤲儷迥뎁苣蚃菣ꒂ菣ꪃ菣ꮂ菣骃苣궃菣覃䰨⥐臣낹苣钿臣龁胣㊂莄臣꺁楈㥳栭卍ㅒ뗧袐臣邵郥趏뿥龀뫥醃菣ꆃ菣뾂苣ꢡ〲臣몤臣芀胣䲌㍐胣꾁胣鶁苣ꮁ臣蒁臣讧胩貁껥붖뻤㊋ꮁ迦鮾臣貂臣蒁苣ꪃ菣ꮂ菣ⶼ菣ꒂ菣벃菣銂ꇨ鞁胣貀偌㌱胣꾁胣鶁苣ꮁ臣蒁臣讧胩貁껥붖뻤㊋ꮁ迦鮾臣貂臣蒁苣ꪃ菣ꮂ菣ⶼ菣ꒂ菣벃菣銂ꇨ馁胣㲂牢ਾꇨ㊨㨰㈠莄臣꺁卍ㅒ諦鎽릂菣궃苣覃䑁誏臣뺯뿥馁苣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣蒁臣蒁諦鎽臣뺯臣讂楈⵳䵨剓邵郥꺁뗧袐迥鲿胩ꚺ戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㌴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰⨾⼼畳㹰臣膀迧ꢜ臣龮꣩ꆝ믤许臣䢧獩ⴹ䵨剓꺁꟨ꊛ臣뎦꿥閁苣骁胣螃菣뾂苣閃苣莃菣ꎂ菣낂臣讂雩膀㱫畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱤猯扵ꒀ臣讉该ꞁ⸱〰ⵅ㔰臣몛껥閁苣龁臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣㲂牢ਾ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰␾⼼畳㹰臣膀迧ꢜ臣龮꣩ꆝ믤许臣邵郥貁ꛨ龯臣貂臣讁臣龁臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯鞼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†㔲蓢ꞁ胣䲁㍐迥뎁偌㌱臣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣鞊卍ㅒ菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤꾁胣ꢡ〲臣몤臣貂臣蒁苣袂臣ꮁ胣鶁苣麁苣膀㔲〮䵰胣㊜⸴瀰꺁꿧늛臣䮮猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䐾⼼畳㹢胥ꞁ楈㥳栭卍ㅒ臣邵郥鞁臣芀꿦莼臣讂臣膀꿥鲿臣讂苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣ꚁ臣ꪁ臣鞊卍ㅒ菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤꾁胣㎁⸳瀳꺁㱋畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱄猯扵ꒀ臣䢧獩ⴹ䵨剓ꮁ뗧袐臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设ㄳ鞊卍ㅒ諦鎽䰭剘苣뎃苣ꖃ苣벃菣꾁塌ⵒ菣랂菣Ꞃ菣벃苣것菣벃苣벃菣ꒂ苣ꊂ菣뮂苣ꞁ塌랂苣誃菣鶼臩銂듦Ꞁ賥馁苣⦋戼㹲 ꊂ菣뮂苣내菨ꪠ臣鲽ꏨ芀苣뎃菣袃菣ꞁ臣鞊卍ㅒ諦鎽䰭剘苣뎃苣ꖃ苣벃菣꺁諥鮊苣ꚩ꣩馁苣龁苣ꮁ胣내菨馃菣릂臣䲮剘뿥钭菣랂菣Ꞃ菣벃苣것菣벃苣벃苣莃苣ꒂ苣讖駧鞁臣芀苣莃苣ꒂ듧麃ꃦ銂뷤붣臣讂臣膂臣膀塌뾪꿧讞菣랂菣Ꞃ菣벃苣것菣벃苣벃臩鶼귥宐楃湧污菣뎃菣䲁剘菣鶃菣뾂菣⢼畬⥣苣莃菣⢈楑条湥胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥䎷卌〭㄰⥌銂䡔ㅐ듧麃臣ꊽ돨躰藥鞁胣내菨銂菣ꖃ菣궃菣ꒂ苣뎃룤ꞁ놀雩뢁諦鞁臣芀臣꺁菣뎃菣Ꚃ苣ꮃ苣꾁胣肜냥䎏噍菣궃菣벃苣벃迥뎁塌ꊻ蛥鲿귧ꢂ菣ꆃ菣袃臣뾂菣螃菣ꪃ菣벃菣꺁裥ꆾ룤ꞁ菣뾂菣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂臩鶼귥銂駧뺏臣讂胣鞾苣貂苣내菨ꪠ苣咒偈⼱塌ⵒ界내菨ꢁ釥뚁胣ં䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†苣莃苣ꒂ菣궃菣뎂菣芀䡔ㅐ䰯剘䰭捵듧麃苣膀〱볯䚅卂迥뎁菣��뎃苣ꪃ菣⢳数据汩楬⥮릂菣것菣袃菣ꒂ苣뎃臣鲣藥閁苣龁偒䥍苣ꮐ鳦馁苣릟鳥궸胣㒁ⰰ〰내菨⾞苣Ꞃ菣ꞁ胣㦁Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃臣궒꣧鞁胣鶁臣貾胣㊁〰䵮菣ꮃ菣벃菣龃菣릂菣벃菣ꊅ藩ꦡ倨䅍ꞁ胣㎁韦鎖裥隌臣鮁臣芀ꖗ雩꺁裥隌鳦鎖臣貾胣낖껩ꪁ鿥난룤꺁諦鎽雨ꦉ苣뎃苣ꖃ苣벃菣膀苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣ꚁ臣ꪁ臣鞊뷤膀迥꾁臩ꊛ菣ꒂ菣벃菣꺁趀胩骶룥袇觧銂〱渰鲀⸰㄰䵮臣蒯鯥꺁鳦芵뿦ꚺ臣내菨ꮁ럦ꂊ臣龁胣릟鳥꺁臣꾁胣隃菣뎃苣뺯藧ꢁ臣ꚁ臣립觥銂黦龁臣龁胣㒂芙雩貾胣侁敮䜭潬蚕꣦⦙ꧨ겖倨潲敭慧胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥䖷ㄶ〳銂郥薀臣Ꚃ苣ꮃ臣뮷諥鞁臣貾臣膀菣랂菣Ꞃ菣벃苣뮴胦銂뇦骮臣龁胣뢛꿥몙藥颍뷤⢍䱒⥕苣嚒捩潴ꮃ菣躃菣벃苣벃倨牥楫䕮浬牥ꞁ룦骮臣膀䍅猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰰猯扵ꒀ苣㆒릂铧辇뿥钭鯦骷䜨慲桰慐⁤牐獩⥭臣뺯臣讂醃菣ꆃ菣뾂菣뢂苣蚃苣莃苣릖꣧込苣ꢔ臣ꚁ뇦骮臣龁胣蒐胣꺁ꋨ鎨ꧨ겖臣䖮㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〵⼼畳㹢胥꾁胣ꢡㄲ臣몤臣貂臣蒁苣芀苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣ꚁ臣ꪁ臣鞊卍ㅒ諦鎽迥꾁臩ꊛ菣ꒂ菣벃菣꺁郥薀臣ꒁ臣ꚁ胣馨뫦蒚臣节臣ㆮ臣꺁䱒⽕꣦隺髧ꪁ苣꺁ꒁ臣劮啌苣袨껧馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣랂苣誃菣뺯菣ꒂ苣钯匨丯銂뇦骮臣龁胣貀偌趀臣膀臣貂臣ꒁ臣ꚁ臣뺯뿥馁苣讧胩貁鳦躘듧뢛룤꺁裥꺁ꃥ肉臣邏뻤閁苣ꚁ臣讂菣뎃苣벃骃苣궃菣覃苣ꢡ臣膀胣傌趀臣膀臣貂臣ꒁ臣ꚁ臣뺯뿥馁苣讧胩貁鳦躘듧뢛룤꺁裥꺁ꃥ肉臣邏뻤閁苣ꚁ臣讂菣ꒂ菣벃菣銂ꇨ馁胣㲂牢ਾꇨ㊨㨱諦䶗剓鞊뷤ⶓ塌뎂菣뢂菣늂菣袃胣骃苣궃菣覃胣誏臣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣蒁臣蒁諦鎽臣ꊂ苣讃苣袃듦Ꞁ戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㐴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨ㊨ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀㠴駦鎖臣芙苧ꞁ胣䲁ㅐ臣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣鞊卍ㅒ諦鎽臣ꢅ臣膀⸰渲鲀㐱⸰渵薶臣蒯鯥꺁䍅猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰰猯扵ꒀ迥뎁⸷鲀㠳㘮臣蒯鯥꺁⽓ꒀ臣膀䡔ㅐ䰯捵듧麃臣몈뿦銂ꓧ鞁臣芀臣讂뻤몤髧ꪁ諦䶗剓鞊뷤ⶓ塌뎂菣뢂菣늂菣袃䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷䰭ㅐ꾁胣㎁㜮䵮臣䖮㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〵⼼畳㹢胥誏臣ㆳ⸸꺁⽓ꞁ胣咁偈⼱界내菨꺁裥肿苣몤臣龁胣誁鯩骃苣궃菣覃ㅐ臣膀㔱㤮䵮臣뎹鷥䖇㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〵⼼畳㹢臣膀䡔ㅐ䰯捵듧麃臣몈뿦銂ꓧ鞁臣芀偌ꢁ苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣龁苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ諦鎽ꊂ苣붂苣ꒂ菣뺯藧⶧偌⤱臣膀볯㚞渶꺁맥螝䍅猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰰猯扵ꒀ迥뎁⸲꺁⽓銂鳦鞁臣��臣芀臣覂臣膀臣覂臣讂ꋨ鎨塌ꊂ苣讃苣袃菣뎃苣벃骃苣궃菣覃臣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣䢟䠱ㄲ㌲临中㤲儷䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷䰭㑐胣䢁䠱ㄲ㌲临中㤲儷䰭㕐胣䢁䠱ㄲ㌲临中㤲儷䰭㙐胣䢁䠱ㄲ㌲临中㤲儷䰭ㅐ膀ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹ⵑ偌膀ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹ⵑ偌ㄱ胣誏臣䢳䠱ㄲ㌲临中㤲儷䰭㉐꾁胣め㘮渳鲀㌷䵮뛨꺁꿧늛臣䖮㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〵⼼畳㹢胥誏臣ㆳ㐮胣㆜꺁꿧늛臣厮丯臣膀䡔ㅐ䰯捵듧麃臣몈뿦銂ꓧ鞁臣芀꿥ꞅ髧ꮁ胣겜苣莃苣ꒂ臣誁臣讂꿦莼鿥隺觧ꪳ臣鞁臣꺁뷥늉苣鲞臣馁塌ꊂ苣讃苣袃菣뎃苣벃骃苣궃菣覃臣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣鞊卍ㅒ諦鎽䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷䰭ㅐ⤲臣膀䡔ㅐ䰯捵듧麃臣뮴胦隌苣몤臣ꪁ臣ꎁ臣芀臣覂臣讂ꋨ鎨塌ꊂ苣讃苣袃菣ꒂ菣벃菣⢉㕐胣傁膀迥뎁㙐꾁胣め㌮渷鲀⸲㤰䵮臣蒯鯥꺁䍅猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰰猯扵ꒀ迥뎁⸵鲀⸸꺁꿧늛臣厮丯臣膀䡔ㅐ䰯捵듧麃臣몈뿦銂ꓧ鞁臣芀臣讂苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣ꚁ臣ꪁ臣鞊卍ㅒ諦鎽䠨䠱ㄲ㌲临颍诧ꞁ臣膀䡔⽐界내菨꺁裥肿臣閽苣놽鿩銂迥벁臣ꪁ臣ꎁ臣芀㰊䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖⠊껥붖뻤㎋⸲諦䶗剓鞊뷤ⶓ苣蚃菣ꒂ菣뎂菣뢂菣늂菣袃臣䲯卐ꫥ讻꟥䦓ⵌ츱꺁铦몇苣ꒂ菣鎃菣궃臣뮘껥馁苣⦋戼㹲 ꒂ菣鎃菣궃臣꺁諦䶗剓鞊뷤ⶓ苣蚃菣ꒂ菣뎂菣뢂菣늂菣袃臣鞊苧螗觧Ꞁ苣ꚩ꣩馁苣龁苣ꮁ胣ꪃ菣骤돧⢖偌⥓ꫥ讻꟥䦓ⵌ츱뺔蟥ꊂ菣뮂苣銂껥붖臣龁胣겜苣莃苣ꒂ臣龁苣ꮁ胣咁偈ㄭ듧麃苣膀〱볯䚅卂迥뎁菣뎃苣ꪃ菣⢳数据汩楬⥮릂菣것菣袃菣ꒂ苣뎃臣鲣藥閁苣龁偒䥍苣ꮐ鳦馁苣릟鳥궸胣㒁ⰰ〰내菨⾞苣Ꞃ菣ꞁ胣㦁Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃룤ꮁ鋦꺨臣膀〲渰鮃菣鲃菣ꮃ菣ꪃ苣蚃菣袃藩뢅ꇥ⢩䵐⥁臣㎧韦鎖裥隌臣鮁臣芀ꖗ雩꺁裥隌鳦鎖臣貾胣낖껩ꪁ鿥난룤꺁諦鎽雨ꦉ苣뎃苣ꖃ苣벃菣膀苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣ꚁ臣ꪁ臣鞊뷤膀迥꾁臩ꊛ菣ꒂ菣벃菣꺁趀胩骶룥袇觧銂ꧨ내菨ꮁ〱渰鲀⸰㄰䵮臣蒯鯥꺁鳦芵뿦ꚺ臣뮷諥鞁臣芀鿥난臣뾁臣膀菣ꦃ菣꾂꿥ꞅ臣鞁臣꺁뷥늉苣鲞臣鞁臣芀臣꺁뻥膀㐲胣㒁膀迥꾁㈷駦鎖뻥ꮁ胣내菨銂〱渰⽧汭䰠卐䤨噮癩䝯湥‬慃⍴琠牬⵬步灬⥳臣㖧駦鎖蟥蚐臣龁胣鶁臣貾胣내菨릟鳥銂鯥躏臣膀ⵖ䱐塅苧螗뿤늀菣趃菣ㆫ菣袃苣莃菣⢈敍潳匠慣敬䐠慩湧獯楴獣‬慃⁴‣㔱㐰䐹㈭銂ꏨꂀ藥꺁賦몤臣鎾臣ꚁ铧蒁臣膀䱉ㄭ닎菣馃菣銂룦骮臣龁胣鶁臣貾胣鞃菣벃菣銂敍潳匠慣敬䐠慩湧獯楴獣ꏨ꺽臣궪臣随臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†〱苧鲿귧늛럧⢚片灡偨摡倠楲浳ꮁ꿥馁苣㒋菣ꦃ菣벃苣궃苣릂菣ꎂ菣꾂雦讨볥銂铧蒁臣膀䍉猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰰猯扵ꒀ苣몱껥鞁臣芀䍉猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰰猯扵ꒀ臣��ꢅ臣膀⡍菣ꮃ莿뫥ꞁꇨ閁苣讂胣鞊뷤ⶓ苣蚃菣ꒂ菣뎂菣뢂菣늂菣袃迥꾁꿥ꞅ臣肜ꓥ莿뫥ꞁ臣䦮㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〵⼼畳㹢胥誏臣䦳ⵌ츱辇臣膀郥薀臣芙苧貁ꧨ鎨臣貂臣ꢡ㈲臣몤臣貂臣蒁苣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㔴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨ㊨ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀㐲駦鎖臣芙苧ꞁ胣鞊卍ㅒ諦鎽릂菣궃苣覃苣뎃苣ꖃ苣벃菣⢈ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹ⵑ偌㌱꾁胣㚁㈮㜸䵮臣䦮㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〵⼼畳㹢臣膀偌颪냥Ꞁ䱉ㄭ닎裥貳苣뮘껥鞁臣芀臩ꊛ菣ꒂ菣벃菣傉誏臣誁鯩骃苣궃菣覃꿥ꞅ菣궂苣ꆃ苣뺂菣꾁胣鶁苣麁苣膀⸰㐸㘸䵮迥뎁⸰ㄴ㤹䵮臣䦮㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〵⼼畳㹢胥ꞁ偌颪냥Ꞁ䱉ㄭ닎裥貳苣뮘껥鞁臣芀偌㌱臣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣ꊂ苣붂苣ꒂ菣뺯藧鞊뷤⢓苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ中㤲儷䰭ㅐ⤳苣膀苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣ꚁ臣ꪁ臣鞊卍ㅒ諦鎽䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷节胣䲁卐ꫨ躰胦䦧ⵌ츱뺔蟥ꮁ꿥鞁臣閽苣놽鿩銂迥벁臣ꪁ臣ꎁ臣芀㰊䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖 ꢡ㈲臣몤臣貂臣蒁苣袂臣ꮁ胣㒁芙雩꺁駦릂臣膀諦䶗剓鞊뷤ⶓ苣蚃菣ꒂ菣뎂菣뢂菣늂菣袃䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷䰭ㅐ⤳臣膀⸳㠵渶꺁䍉猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰰猯扵ꞁ胣䲁卐ꫨ躰胦䦧ⵌ츱蚈돦銂飩뎮臣龁胣誁鯩骃苣궃菣覃㑐迥뎁臩ꊛ菣ꒂ菣벃菣뺯藧螃苣떂菣뾂苣뎃臣膀臣貂臣貂胣ㆁ〮㜱䵮迥뎁⸰㤷ㄴ䵮臣䦮㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〵⼼畳㹢胥ꞁ偌颪냥Ꞁ䱉ㄭ닎裥貳苣뮘껥鞁臣芀偌㌱臣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣ꊂ苣붂苣ꒂ菣뺯藧鞊뷤⢓苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ中㤲儷䰭ㅐ⤳苣膀苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣ꚁ臣ꪁ臣鞊卍ㅒ諦鎽䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷节胣䲁卐ꫨ躰胦䦧ⵌ츱뺔蟥ꮁ꿥鞁臣閽苣놽鿩銂迥벁臣ꪁ臣ꎁ臣芀㰊䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖 ꢡ㈲臣몤臣貂臣蒁苣袂臣ꮁ胣㞁芙雩꺁駦릂臣膀諦䶗剓鞊뷤ⶓ苣蚃菣ꒂ菣뎂菣뢂菣늂菣袃䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷䰭ㅐ⤳臣膀⸱渷꺁䍉猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰰猯扵ꞁ胣䲁卐ꫨ躰胦䦧ⵌ츱蚈돦銂飩뎮臣龁胣誁鯩骃苣궃菣覃㑐迥뎁臩ꊛ菣ꒂ菣벃菣뺯藧螃苣떂菣뾂苣뎃臣膀臣貂臣貂胣ㆁㄮ㤹䵮迥뎁⸰㐵㌳䵮臣䦮㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〵⼼畳㹢胥ꞁ偌颪냥Ꞁ䱉ㄭ닎裥貳苣뮘껥鞁臣芀偌㌱臣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣ꊂ苣붂苣ꒂ菣뺯藧鞊뷤⢓苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ中㤲儷䰭ㅐ⤳苣膀苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣ꚁ臣ꪁ臣鞊卍ㅒ諦鎽䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷节胣䲁卐ꫨ躰胦䦧ⵌ츱뺔蟥ꮁ꿥鞁臣閽苣놽鿩銂迥벁臣ꪁ臣ꎁ臣芀㰊䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖⠊껥붖뻤㎋⸳諦䶗剓鞊뷤ⶓ苣蚃菣ꒂ菣뎂菣뢂菣늂菣袃臣ꒂ菣鎃菣ꞁ臣䲮卐ꫥ��꟥躂韧鲿귧꺁铦몇苣뮘껥馁苣⦋戼㹲 鞊卍ㅒ諦鎽릂菣궃苣覃苣뎃苣ꖃ苣벃菣꺁諦躂韧릊黦銂ꫨ릁苣龁苣ꮁ胣ꢂ苣릂菣鲃迥뎁苣뎃菣鲃偌颪냥Ꞁ苧螗胦超雧鲿귧ꊃ菣ꮃ苣龮雦鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖 麃苣릂苧螗藥ꮖ뿥钭菣螃菣꺁뷤붣胣麃苣릂卍ㅒ듧麃ꓥ覃菣ꒂ菣꺁믤辂苣ꮁ菣袃卍ㅒ듧麃ꓥ覃菣ꒂ菣銂菣ꊃ軦袐胦ꮁ駧뺏臣膀臣ꒁ灁䕯臩鶼귥꺁菣ꊃ軦袐胦ꂬꓥ銂鳦馁苣麃苣릂苣ꦈ铧鞁臣⢟뻥覂苣讂菣Ꚃ苣꾁胣䶁牳㰱畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢畨栯㱵猯灵‾灁䕯猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ⴾ⴯⼼畳㹰菣Ꚃ苣ꢁ釥낁苣讂芀㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꢂ苣릂菣鲃偌颪냥Ꞁ뿥钭臣龁苣꺁苣莃苣ꒂ菣궃菣뎂菣芀苣꾂苣鎃菣䲜卐諦躸껥鎨臣誁臣ꚁ胣릅藨놔鷦꺁藨钅듧麃苣ꆎ迥馁苣趉臣膀菣Ꚃ苣ꮁ胣ㆁ츰䲼术臣鞊卍ㅒ諦鎽릂菣궃苣覃苣뎃苣ꖃ苣벃菣⢈ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹ⵑ偌㌱膀苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ苣蚃菣ꒂ菣뎂菣뢂菣늂菣袃ꊂ苣붂苣ꒂ菣뺯藧⶧偌㌱膀苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣ꚁ臣ꪁ臣鞊卍ㅒ諦鎽䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷膀迥뎁苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ諦鎽苣颧胣ꪁ駦릂㈨膀㠴胣誏臣㞳芙雩⦓臣릅藨薆諦躸臣龁胣傂卂迥뎁臩ꊛ苣蚃菣ꒂ菣傉誏臣螃苣떂菣뾂苣뎃䠨湥祲匠档楥⁮湁浩污䠠慥瑬ⱨ䌠瑡⌠丠䍄ㄣ㘱㔹㐭㄰ⴷ⤱苣릅藨내菨颍鯩꺁芙雩趉臣릅藨薆돦蒰臣龁胣麃苣릂臣꒾臣ꒁ臣ꚁ臣龮꣩蒚諦躸迥뎁蟥꺽菣궃菣뎂菣꾁胣ꢡ㌲臣몤臣貂臣蒁苣芀藥ꚁ臣麃苣릂苣を駦鎖臣芙苧ꞁ뇥몮臣膀藨钅듧麃苣릅藨鞴뗦肊돦ꮁ苣誂藨钅臣覂뻥龁胣ꆰ뷦ꮁ뿨릁苣ꢁ胣㊁볯䊅䅓䜨扩潣‬慃⁴䄣㔹㘷誏臣コ㘮䵭䔠呄⡁桔牥潭楆桳牥匠楣湥楴楦Ᵽ䌠瑡⌠㔱㜵〵〲銂郥覜臣讂洵꺁냦랆쌱傗卂吨敨浲䙯獩敨⁲捓敩瑮晩捩‬慃⁴㈣〰㈱㈰⤷苣膀㜲鶇苣ꢔ臣ꚁ藨钅臣ꢳ냥鞁臣芀藨钅듧麃苣㖒洭랂菣뎃苣ꮁꏨ肝臣貂臣㊟朰蟩ꞁ㔱䱭菣ꖃ菣隃룤ꮁ鯥躏臣膀〳쌰林臣㢧裥鎖臩莿裥ꊛ臣膀〱볯꺁䉆⡓桔牥潭楆桳牥匠楣湥楴楦Ᵽ䌠瑡⌠〱㠰ㄲ㜴誏臣ㆳ볯꺁菣讃苣ꪃ菣ⶳ苣袃菣鞃菣麃苣랂菣⢳桔牥潭楆桳牥匠楣湥楴楦Ᵽ䌠瑡⌠ㄱ㜸〵㌹銂郥覜臣讂偒䥍ㄭ㐶⠰桔牥潭楆桳牥匠楣湥楴楦Ᵽ⌠㔱㐱㄰㈲궸臣膀쌱㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰶猯灵내菨⾞䱭臣뾪闦鞁臣芀蛥뢇뿦鞁臣내菨銂㐲Ꚃ苣ꮃ뗧钹鿥誤菣것菣袃룤ꮁ苣Ꞃ菣鎽臣誂〵ⰰ〰내菨ꞁ菣것菣蚃苣뎃苣鞁胣ㆁ渰⽧䱭臣䲮卐臣ꢁ苣ꮁ迥꾁臣貂臣鞁臣ㆧ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣㲂牢ਾꇨ㊨㨳苣꾂苣鎃菣䲜卐諦躸껥鎨臣ꒁ臣ꚁ臣龮꣩궨꣨膀諦躸胣誏臣ꚇ뷧鞃菣袃苣ꮃ戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㘴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†苣��뎃菣鲃偌颪냥Ꞁ뿥钭臣龁苣꺁苣莃苣ꒂ菣궃菣뎂菣芀苣뎃菣鲃偌閊룤龮꣩ꮁ臣蒁臣膀菣Ꚃ苣ꮁ胣ㆁ츰䲼术臣鮸냥莿뫥꺁諦䶗剓鞊뷤ⶓ苣蚃菣ꒂ菣뎂菣뢂菣늂菣袃䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷䰭ㅐ⤳迥뎁苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ苣蚃菣ꒂ菣뎂菣뢂菣늂菣袃ꊂ苣붂苣ꒂ菣뺯藧⶧㉎㜹ⵑ偌㌱銂苣뎃菣鲃偌閊룤꺁㐲駦鎖觥ꮁ藨钅蛥閊룤鞁臣芀䉐誏臣誁鯩릂菣궃苣覃㑐苣ꒂ菣鎃菣䲜卐諦躸臣㊮駦鎖觥ꮁ藨钅蛥ꢳ냥鞁臣芀菣Ꚃ苣꒾臣꒾臣ꒁ臣ꚁ臣龮꣩蒚諦躸迥뎁蟥꺽菣궃菣뎂菣꾁胣ꢡ㐲臣몤臣貂臣蒁苣芀芙雩꺁駦릂臣膀ꓥ銲臣㎮믦꺁ꇨ늶릮蟩鲀〱츰䲼銂郥薀臣麃苣릂臣躡鷩袄臣覂ꇨ薸苣ꮃ裥ꊛ駥膃菣벃菣궸臣麛迥鞁臣芀菣ꖃ菣隃苣㊒〲鲀㔲〰灲ꞁ㔱裥鎖臩莿裥ꊛ臣膀뻥骶臣떂苣袃苣ꒂ菣겸껥꺁臣膂臣膀ꇨ薸苣㦒ⴶ苣Ꞃ菣鞃菣벃菣ꮁ鯥躏臣龁胣ꒂ菣鎃菣䲜卐諦躸뻥ㆌ芙雩ꞁ胣貾뛧꺁菣궃菣떂苣袃菣袃菣벃꟨邞臣龁苣ꮁ胣릅藨내菨銂觥낿臣袂臣ꮁ藨钅臣覂迥鞾臣龁胣㲂牢ਾꇨ㊨㨴苣뎃菣鲃偌閊룤龮꣩ꮁ臣蒁臣꺁껥鎨꣨袨胣閊룤膀迥뎁蟥꺽菣궃菣뎂菣㲫牢ਾ䐼噉邀ꇨ閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㐸㰷愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 䰠卐苣꾂苣鎃菣閊룤貾㠱駦鎖臣꺁苣ꒂ菣ꮂ苣뎃臣겸껥芀苣꾂苣鎃菣䲜卐諦躸뻥ㆌ芙雩ꞁ胣誸룦銂㘹Ꚃ苣ꮃ룤閺뗧钹鿥誤菣것菣袃臣麛迥鞁胣閁苣ꪁ苣ꎧ黦뺁臣㊧莄臣鶿귥鞁臣芀苧螗뿤늀菣趃菣ㆫ麃苣릂麃菣膃菣것菣꾂苣超雧ꊂ菣뮂苣궂菣袃䴨獥卯慣敬䐠慩湧獯楴獣‬慃⁴䬣㔱㐰䐸銂ꏨꂀ藥꺁賦몤臣鎾臣ꚁ铧蒁臣膀룤薸룤꺁苣ꒂ菣ꮂ苣뎃뿦ꚺ苣겸껥鞁臣芀鯩鞰賥ꚭ駧覅苣䶒獥⁯捓污⁥楄条潮瑳捩⁳䕓呃剏뮙賩蚕꣦⦙ꏨ꺽臣궪臣随臣龁胣螃菣뾂꟨邞苣膀片灡偨摡倠楲浳蚕꣦⦙苣閃菣Ꚃ苣ꊂ苣ꢔ臣ꚁ껥붖臣龁胣꒾蛥꺁뗧袨髧覜蓦Ꞁ苣膀菣ꖃ菣궂菣꺁ꓥ趇꿦莼뫤貾ꓦ骮苣뒼臣肸藥超뷧䆮潮慶臣袂苣몱껥鞁臣⢟猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰⨾⼼畳㹰鲼⸰㄰※猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰⨾㰪猯灵瀾볯゜〮㄰※猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰⨾⨪⼼畳㹰鲼⸰〰㄰芀㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 䰠卐苣꾂苣鎃菣閊룤貾臣릅藨麃苣궃菣ꆂ菣뢂룤꺁듦Ꞁ賥麃菣ꮂ菣꺁駧뺏臣ꎧ黦芀苣ꒂ菣ꮂ苣뎃꟨邞臣龁苣ꮁ룤薸苣麛迥鞁臣貾胣鞃菣벃菣銂胣䎁㱡畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⬫⼼畳㹰䴯㉧猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰⬾㰫猯灵銂郥뺁臣蒁쌱傗卂⠠桔牥潭楆桳牥匠楣湥楴楦Ᵽ䌠瑡⌠㐱㤱㄰㐴ꞁ麛듦蒵臣膀軦肝臣ꚁ臣讂藨钅듧麃苣㒒蚈雩꺁㔲鲀〳츰䲼臣랆菣꾂菣閃苣벃苣ꖉ鯩뚺뛦䒲䙘倨潲潭敃汬‬慃⁴䌣ㄴ��⤰臣뮷諥ꮁ苣誂鯥躏臣龁胣ꖉ鯩鞁臣내菨銂〵洭膃菣벃菣ꮁ鯥躏臣膀㔳쌰林臣ㆧ蚈雩ꂁ뿥蚈鯩鞁臣芀洲⁍䑅䅔臣鲣藥閁苣龁쌱傗卂臣㊧鯥鞴뗦鞁臣貾胣내菨銂듧麃鿦늉菣莃菣ꆂ菣⢼楂汯来湥Ɽ⌠㈴㈰㄰ꮁ蛥뢇뿦閁臣膀㘹Ꚃ苣ꮃ閺菣것菣袃룤ꮁ苣Ꞃ菣鎽臣誂쌱㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰶猯灵내菨ꞁ菣것菣蚃苣뎃苣鞁臣芀듧麃苣ꂁ뿥蚈鯩鞁胣내菨龔귥螎苣몱껥馁苣龁苣ꮁ胣내菨骃菣莃菣銂胣ㆁ韃䉐궸臣ㆫ㘺〰臣貸蟩鞁臣㆟〰볎꺁䥌䕖䐯䅅⁄求敵鯨覅迥鲿胦늉듧⢠楌敦吠捥湨汯杯敩ⱳ䌠瑡⌠㍌㤴㈶ꮁ蛥뢇뿦閁臣龁胣내菨銂髦肉껥ꦸ臣㊧蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣ㆂ韃䉐ꞁ麛듦蒵臣龁뻥膀듧麃苣膀〱볎⽧䱭臣뺲ꏨꦃ菣袃諦麃苣릂䑃㘱䌯㍄′捆菣궃菣꾂꾂菣벃菣㪳㈠㐮㉇※䑂䈠潩捳敩据獥‬慃⁴㔣㌵㐱⤲苣ꮐ鳦馁苣내菨鎟觨邃菣閃苣벃룤膀莄臣ㆧ蚈雩ꞁ苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀듧麃苣㆒鯥鞴뗦鞁胣䊁楲汬慩瑮鿦늉菣莃菣ꆂ菣⢼䑂䈠潩捳敩据獥‬慃⁴㔣㘶㐳⤵臣貸蟩鞁臣ꦁ裥ꪁ諦鎽럦袐觧궸胣鞚触㒀蓢ꞁ〳裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀菣궃菣떂苣袃菣袃菣벃꟨邞臣뾽铧鞁臣鞊뷤醃菣ꮃ臣膀ꇨ㊨ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂胣鶁臣貾胣내菨銂쌱傗卂臣鞴뗦鞁胣내菨鎟觨邃菣閃苣벃臣趆蟦膿臣鮁胣䚁䍁⁓卌䙒牯整獳⁡ⵘ〲菣궃菣떂苣袃菣벃苣벃䈨捥潴⁮楄正湩潳⥮臣늍뻥鞁臣芀汆睯潊吨敲⁥瑓牡銂铧蒁臣膀菣벃苣銂꟨邞臣龁胣㲂牢ਾꇨ㊨㨵菣궃菣떂苣袃菣袃菣벃꟨邞臣뾽铧鞁臣鞊뷤㲓牢ਾ䐼噉邀ꇨ閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㐸㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 邵黦꾁胣ꢡ㘲胣㊜ꮁ迦鮾臣貂臣蒁苣芀獍ㅲ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰栾⽵畨⼼畳㹰䄠潰㱅畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⼭㰭猯灵麃苣릂臣놔鷦馁苣릅藨내菨꺁菣궃菣떂苣袃菣袃菣벃꟨邞臣袂苣膀䵨剓誏臣咳剌貁㑆㠯㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰫猯灵䌾ㅄ戱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰⬾⼼畳㹰藨钅菣꾂菣閃苣벃苣꺁ꇨꊝ臣뮸臣몙迧閁苣讂臣ꢁ臣躘苣讁臣ꪁ苣膀卍ㅒ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰⬾⼼畳㹰듧麃臣䲌卐裥肿臣뺯臣讂룤膦臣것苣鶃菣肃菣ꞁ臣讂臣ꢁ臣몤铥閁苣龁胣㲂牢ਾꇨ㊨㨶諦䶗剓鞊뷤ⶓ苣蚃菣ꒂ菣뎂菣뢂菣늂菣袃迥뎁꿥ꞅ臣ꒁ臣ꚁ臣ꢂ苣릂菣鲃偌颪냥Ꞁ苣ꒂ菣ꮂ苣뎃铧龔戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㤴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨ㊨ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀苣꾂苣鎃菣䲜卐諦躸臣膀䉐ꞁ觥ꚇ뷧鞁臣䶟牳㰱畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢畨栯㱵猯灵‾灁䕯猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ⴾ⴯⼼畳㹰菣Ꚃ苣ꮁ铧ꖝ臣讂藨钅듧��麃臣袂苣䦋ⵌ膀䍋䜭佒胣誏臣咳䙎츭꺁ꃩ랼臣ꎔ铧銂ꫨ躰臣龁胣뺯藧蒚臣膀洱⽧杫臣螃苣떂菣뾂苣뎃臣覭뻤ꪁ铧辇臣꺁卍ㅒ渭䅣䍄苣뎃苣ꖃ苣벃菣⢈ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹ⵑ偌㌱꺁苣뎃菣鲃諦躸臣膀駦鎖뻤颭髧ꪁ꟦込臣꺁藨钅듧麃臣袂苣䲋卐ꫨ躰胦떂苣袃苣ꒂ菣ꎔ铧꺁飩뎮臣覜諥ꞁ臣ꎁ臣芀㐲胣㒁膀迥뎁㈷駦鎖臣꺁諦鎽릂菣궃苣覃苣뎃苣ꖃ苣벃菣꺁諦躸臣㊨駦鎖臣꺁臩ꊛ菣ꒂ菣벃菣傉꺁諦躸臣鎖臣膀偌颪냥Ꞁ藥ꮖ뿥钭臣貐꣧ꚺ臣뮘껥貁ꛨ龯臣貂臣⢟ꇨ㊨⤶胣㊂膀㠴胣誏臣㞳芙雩ꞁ臣ꊂ苣붂苣ꒂ菣뺯藧⶧苣蚃菣ꒂ菣뎂菣뢂菣늂菣袃臣閊룤ꢁ芙雩ꞁ臣螃苣떂菣뾂苣뎃臣閊룤꺁雩ꞁ胣䲁卐ꫨ躰胦超雧鲿귧꺁飩뎮臣뺯臣讂郥颧臣릊黦貁ꛨ龯臣貂臣⢟ꇨ㊨⤶胣䲂卐ꫨ躰胦떂苣袃苣ꒂ菣ꎔ铧ꮁ꿥馁苣릊黦꾁胣颧胣ꪁ駦릂臣閊룤閁苣龁苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ릂菣궃苣覃苣뎃苣ꖃ苣벃菣⢈苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ中㤲儷䰭ㅐ⤳胣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣蒁臣蒁諦䶗剓鞊뷤⢓ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹⥑胣誏臣ꊂ苣붂苣ꒂ菣뺯藧鞊뷤ꞁꛨ龯臣貂臣讁臣龁ꢡ㘲芀戼㹲ꢡ㜲鞊卍ㅒ諦鎽릂菣궃苣覃苣뎃苣ꖃ苣벃菣誏臣뺯藧ꮁ臣蒁臣꺁ꇨ薸룤ꞁ臣ꒂ菣鎃菣䲜卐ꫨ躰胦떂苣袃苣ꒂ菣ꎔ铧㲟牢ਾ䐼噉邀ꇨ閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㔸㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 䴠剓ⴱ苣蚃菣ꒂ菣뎂菣뢂菣늂菣袃䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷䰭ㅐ⤳臣ꒂ菣鎃菣閊룤节胣䲁卐諦躸뻥㊌駦鎖臣꺁獍ㅲ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰栾⽵畨⼼畳㹰䄠潰㱅畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⼭㰭猯灵麃苣릂臣誁臣讂铧辇뻤颭髧ꪁ꟦込臣꺁苣뎃菣鲃偌颪냥Ꞁ苣ꒂ菣ꮂ苣뎃铧龔臣뮘껥ꮁ鳦릊臣芁臣龁ꢡ㜲芀苣뎃菣鲃臣꺁偌颪냥Ꞁ苣ꒂ菣ꮂ苣뎃铧龔臣뺯臣讂諥鲞臣膀苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ渭䅣䍄ꊂ苣붂苣ꒂ菣뺯藧⶧㉎㜹ⵑ偌㌱胣ꢡ㜲ꞁꛨ龯臣貂臣讁臣龁胣㲂牢ਾꇨ㊨㨸諦䶗剓鞊뷤ⶓ苣蚃菣ꒂ菣뎂菣뢂菣늂菣袃迥뎁꿥ꞅ臣ꒁ臣ꚁ臣ꢂ苣릂菣鲃偌颪냥Ꞁ苣ꒂ菣ꮂ苣뎃铧龔戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰ㄵ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†臣覂臣膀ꇨ㊨ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀諦䶗剓鞊뷤ⶓ苣蚃菣ꒂ菣뎂菣뢂菣늂菣袃䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷䰭ㅐ⤳臣ꒂ菣鎃菣閊룤ꮁ苣誂胣梁卍ㅒ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰⬾⼼畳㹰㑆㠯㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰫猯灵䌾ㅄ戱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰⬾⼼畳㹰藨钅菣꾂菣閃苣벃苣⢸䵰ꛎ誸臣꺁偌銪믤Ꞁ䑃〸駧뺏臣覜蓦ꪁ뷤许臣节臣覂臣貂臣貁胣梁卍ㅒ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ⴾ⼼畳㹰㑆㠯㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯��㸢㰭猯灵䌾ㅄ戱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ⴾ⼼畳㹰듧麃麝䵰ꛎ誸臣꾁苣龁苣閁苣ꪁ臣ꎁ臣芀䑃〸駧뺏臣뺯臣讂諥鲞臣膀苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ諦鎽臣뎦꿥閁苣ꪁ臣ꎁ臣⢟ꇨ㊨⤸胣ં䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㐳鞊卍ㅒ諦鎽䰭剘苣뎃苣ꖃ苣벃菣꾁䡔ⵐ내菨ꮁ臣醁苣뎂菣릂菣궃菣ꮃ뗦몇苣뮴胦隌臣讂㰩牢ਾ†菣袃菣꾂菣閃苣벃苣내菨ꪠ吨偈ㄭ※呁䍃苣뾂菣낂闧랏䥔ⵂ〲⤲臣誁臣ꚁ苣것苣蚃菣벃菣膵蟥銂듦Ꞁ賥馁苣鞊卍ㅒ諦鎽䰭剘苣뎃苣ꖃ苣벃菣꺁菨鮊苣膀鯨覅苣것苣蚃菣벃菣麡볤鎽苣ꢔ臣ꚁꧨꆾ臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†냧钽臣낿臣讂臣膀䡔ⵐ내菨銂胣㦁Ꚃ苣ꮃ菣ꪃ菣뢂菣뎂菣袃菣것菣袃䌨牯楮杮胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥㎷㐵㐶⤰臣膀〱볯䚅卂䜨扩潣胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥ㆷ㐰〳〱膀〱볎⽧䱭菣讃苣ꪃ菣ⶳ苣袃菣鞃菣麃苣랂菣⢳楇换膀苣뾂菣낂闧랏㔱㐱㄰㈲銂郥覜臣讂偒䥍ㄠ㐶릟鳥⢰牉楶敮匠楣湥楴楦膀苣뾂菣낂闧랏ㄹ〶궸胣ㆁ〰〬〰듧麃Ꚃ苣ꮃ臣궒꣧鞁胣㖁볯䎅㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵膀㜳蓢ꞁ苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀〱渰鮃菣鲃菣ꮃㄭ龃菣릂菣벃菣₈㌱ꊂ苣蚃菣袃匨杩慭胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥傷ㄸ㤳銂鿥난臣뮷諥鞁臣膀듧麃苣麃苣궃菣ꆂ菣뢂臣蚈賥閁臣膀㘹駦鎖臣閁苣ꪁ苣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃臣鮾臣龁胣鶁臣貾胣蚈賥鞁臣麃苣궃菣ꆂ菣뢂苣膀㔲볎⁍佂䥄奐뎂菣릂菣궃菣ꮃ䄨慶瑮⁩潐慬⁲楌楰獤胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥㢷〱㔲倵膀⸰薼苣랂ꇨ薸苣ꮃ菣龃菣⢳卂㭁匠杩慭苣뾂菣낂闧랏㝁ㄲ⤱胣誏臣ㆳ츰枼洯骃菣랂菣뎃릂菣것菣袃菣ꒂ苣뎃苣ꮐ鳦馁苣閃苣躃菣ꮃ菣莃菣趸郥劫䵐⁉㘱〴鿥난䜨扩潣胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥㎷㐲㐰〭㐱궸臣㊧芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣膀臣꺁뻥膀⸰薼卂銂郥覜臣讂菣Ꞃ菣벃菣것菣覃룤ꮐ偒䥍ㄠ㐶릟鳥궸胣ㆁ韃〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㜾⼼畳㹰鲀쌵㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢ㄭ㰴猯灵䴾臣蒯鯥꺁臩ꊛ菣ꒂ菣벃菣膀諦䶗剓鞊뷤ⶓ塌뎂菣뢂菣늂菣袃䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷䰭ㅐ膀苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ䰭剘苣뎃苣ꖃ苣벃菣⢈苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ中㤲儷䰭ㅐ膀迥뎁苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣ꚁ臣ꪁ臣鞊卍ㅒ諦鎽䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷꺁臣骁苣讁臣ꎀ뛧貸蟩ꦉ臣㊧芙雩ꚇ郧鞁臣芀듧麃苣閃苣躃菣ꮃ菣莃菣趸郥劫䵐⁉㘱〴鿥난臣鞴뗦鞁胣㖁츰枼洯颫꿥ꚺ菣鶃苣뎃菣꾂돨⢪楍汬灩牯ꮂ苣궃苣ꪕ迥㒷㜳㐶⤱胣ㆁ츰枼洯ꊂ菣ꪃ菣鞃菣蚃苣뎃ㅁ䴨汩楬潰敲胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥䆷偌〱銂郥覜臣讂〱츰䲼臣ꊂ苣뮂菣뾂菣릟鳥ꢁ臣节臣膀菣Ꞃ菣벃菣것菣覃룤ꮐ偒䥍ㄠ㐶릟鳥궸臣㖧駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁胣鶁臣貾胣ꊂ苣뮂菣뾂菣릟鳥銂鯥躏臣膀껥ꦸ臣辩苣讁臣릒详鞁臣貁��膀듧麃苣㆒〰볎꺁䥒䅐菣莃菣ꆂ菣⢼楍汬灩牯膀苣뾂菣낂闧랏〲ㄭ㠸궸臣㊧駦鎖뫦ꎧ臣鮁臣芀鯨覅苣膀灓捥牴䵡硡椠鞃菣벃菣ꪃ菣肃菣⢼潍敬畣慬⁲敄楶散⥳臣膀諥략㠴渲膀铦몇ㄵ渵ꞁ胣鎁苣覂臣뮔裥궸臣겸껥鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖 ꖻ룤꺁볥㪏ꊂ苣뮂菣뾂菣릟鳥궸臣꺁鯨覅⠯苣꾂苣鞃苣벃鿥난룤ꞁ臣趛藥讼듧麃뫦ꎧ觧궸臣꺁鯨覅崩韃〱銂铧蒁臣膀佂䥄奐뎂菣릂菣궃菣ꮃ뗦몇臣醃菣뮂菣蚃菣뢂苣袨껧鞁臣芀ꇨ㊨꾁胣ꚩ꣩膓臣ꒁ臣ꚁ臣뮴胦隌苣것苣蚃菣벃菣膵蟥銂迦鮾臣膀鯥ㆳ꾁胣낂菣閃뷥込臣꺁菣벃苣銂ꓧ鞁臣蒁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖ꢡ㤲鞊뷤ⶓ塌뎂菣뢂菣늂菣袃迥뎁꿦莼鿥隺觧ꪳ臣袂苣뎂菣릂菣궃菣ꮃ뗦몇臣뮴胦隌戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㈵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ†ꇨ㊨ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀㐲駦鎖뻥膀ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹ⵑ偌뎂菣뢂菣늂菣袃臣膀㘳㘮볯꺁鳦Ꞥ뗦몇軧誏臣㖳瀰꺁䍅猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰰猯扵ꒀ臣膀鳦Ꞥ蟩꺁苣것苣蚃菣벃菣膵蟥銂ꓧ鞁臣芀臩ꊛ菣ꒂ菣벃菣傉꾁胣㎁⸶薼臣肜ꓥ膵蟥螎迥뎁㔱瀰꺁䍅猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰰猯扵ꒀ臣膀ꪕ鯧ꮁꓥ趁臣辇臣뎂菣릂菣궃菣ꮃ뗦몇苣몤臣龁胣ꊂ苣붂苣ꒂ菣뺯藧⶧㉎㜹ⵑ偌뎂菣뢂菣늂菣袃臣膀〳㌮볯꺁鳦Ꞥ뗦몇軧ꞁ胣肜냥辇臣뎂菣릂菣궃菣ꮃ뗦몇苣몤臣龁胣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣蒁臣蒁諦鎽ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹꾁胣겸껥꾏菨ꪁ苣것苣蚃菣벃菣膵蟥銂ꓧ閁臣讁臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㐳⁁내菨馃菣릂臣䲮剘뿥钭胦ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂菣鶃菣뾂菣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣醁苣䲋剘苣뒂菣릂菣骃苣궃菣覃臣뮴胦⦧戼㹲 겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣貂苣릉껥꺁塌ꊂ苣讃苣袃菣ꒂ菣벃菣꺁듦Ꞁ苣내菨馃菣릂臣䲮剘뿥钭胦ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂菣鶃菣뾂菣ꊂ菣뮂苣ꞁꧨꆾ臣龁胣ꊂ菣뮂苣내菨ꪠ苣鲽ꏨ馁苣龁苣ꮁ胣䲁剘ꫨ肯黥ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂菣鶃菣뾂菣몁볤邭䌨杩慮⁬敌瑮⁩塌것菣벃苣벃氨捵궂菣袃儨慩敧Ɱ䌠瑡‣䱃ⵓ〰䰱⤩苣咒偈내菨ꮁ뷥ꪳ냥ꖅ臣膀듧麃苣钃菣벃菣麃苣랂菣궸臣㊧胩鎖臩麊臣龁胣것菣膃苣ꒂ菣릂臣膀鳦辰䵃鞃菣ꊃ菣뾂菣誏臣䲳剘믨馆뿥钭苣것菣뎃菣꺁苣뎃菣ꂃ菣钃菣袃臣뚈뻥许臣鮃苣ꮃ菣랂菣Ꞃ菣벃苣몁볤邭苣몙迧馁苣芀뻥覂苣讂듧麃ꃦ꾁胣咁偈⼱塌ⵒ界내菨ꢁ釥낁苣讂胣겜苣莃苣ꒂ臣龁苣ꮁ胣咁偈⼱塌ⵒ界내菨銂胣ㆁ薼䉆誏臣骃菣랂菣뎃릂菣것菣袃菣ꒂ苣뎃臣鲣藥閁苣龁偒䥍苣ꮐ鳦馁苣릟鳥궸胣㦁Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃臣㒫ⰰ〰내菨⾞苣Ꞃ菣ꞁ鋦꺨臣膀臣��뻥膀〲渰鮃菣鲃菣ꮃ菣ꪃ苣蚃菣袃藩뢅ꇥ⢩䵐⥁臣膀ꖗ雩蚈賥閁臣龁胣鶁臣貾胣릟鳥銂駩뮎臣膀䵐銂郥뺁臣蒁〸䱵臣낖껩ꪁ鿥난臣꒺迦鞁臣芀臩ꊛ菣ꒂ菣벃菣꺁趀胩骶룥袇觧銂〱薼䵄体룤ꞁꫨ붣臣膀雦꺮臣릟鳥ꮁ꟧鞁胣㊁田銂⸰薼臣肜뗧蒚臣肸껥䒚卍莿뫥ꞁ胣誏臣誁鯩骃苣궃菣覃苣㆒〰䵮胣゜〮㔱䵮臣蒯鯥꺁鳦芵뿦ꚺ臣내菨ꮁ럦ꂊ臣龁胣鞃菣벃菣궸臣肜뻥꺁苣Ꞃ菣꾁胣릟鳥誏臣コ㈮볯䒅卍꺁臣銂郥覜臣讂菣ꦃ菣꾂꿥ꞅꪜ蟥꺽臣Ꚃ苣ꮃꢁ臣ꚁ臣립觥銂黦龁臣膀趀胩骶룥袇臣뚻闩ꢁ臣ꚁ菣궃菣袃臣貂臣芀㠴駦鎖뻥膀湏ⵥ汇⡯闥馨ꚩ雨⢬牐浯来ⱡ䌠瑡‣㙅㌱⤰苣蒐胣꺁苣Ꞃ菣ꮁ럦ꂊ臣龁뻥ꮁ胣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂듦Ꞁ苣몱껥鞁臣芀鯧뺯駧覅跥趽刨啌銂楖瑣牯菣龃菣ꆃ菣뾂菣⢼敐歲湩汅敭⥲臣겸껥鞁胣䖁㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〵⼼畳㹢胥銂〱苧鲿귧늛럧⢚片灡偨摡倠楲浳ꮁ꿥馁苣㒋菣ꦃ菣벃苣궃苣릂菣ꎂ菣꾂雦讨볥銂铧蒁臣몱껥鞁臣芀郥薀臣蚈귥꺁䍅猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰰猯扵ꒀ臣膀ꇨㆨ臣몤臣貂臣蒁苣芀铧辇뿥钭鯦骷룤꺁鳦Ꞥ臣劮啌臣ꪜ蟥꺽臣Ꚃ苣ꮃ臣誁臣讂䱒ꢁ臣钯苣随苣鎁臣ꮁ苣誂胣랂苣誃菣뺯菣ꒂ苣⢺⽓⥎苣몱껥鞁臣芀ꇨ㖨臣몤臣貂臣蒁苣袂臣ꮁ胣ꢅ臣꺁ꋨ鎨菣ꒂ菣벃菣隌郥ꦉ臣膀ㄱ瀲鲀⸳ㄵ䵮臣蒯鯥꺁䍅猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰰猯扵ꒀ迥뎁〱㐮胣㆜⸳꺁꿧늛臣厮丯胥ꞁ胣咁偈⼱塌ⵒ界내菨ꮁ臣醁苣䲋剘뻤颭髧ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂듦Ꞁ苣鞢ꓥ閁臣龁胣㲂牢ਾꇨ㎨㨰裥隌臣龁䡔ⵐ⼱塌ⵒ界내菨ꮁ臣醁苣骃苣궃菣覃賥袐觧ꮁ苣讂塌ⵒ菣鶃菣뾂菣뮴胦㲧牢ਾ䐼噉邀ꇨ閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㔸㰳愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖⠊껥붖뻤㎋䈴†諦鎽苣뎃苣ꖃ苣벃苣ꞃ菣⦳戼㹲 鞊뷤랂苣蚃苣뎃苣讻臣讂苣뎃苣ꖃ苣벃苣ꞃ菣꾁胣䶁汯‮桐牡⹭㈠㄰ⰵㄠ⠲⤶‬㠱㌶㜭ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣릖돦ꢁ郥颧臣릖돦銂铧蒁臣㊦럥讨臣龮雦馁苣芀뻤몤髧ꪁ触蚠臣誁臣ꚁ胣ꊃ菣꾂菣벃菣ꮃ諦鎽洨扁銂苣膃苣릂菣ꒂ菣벃菣袏臣咯䕃ꞁ苩莅臣讂胣늂菣뺿臩貾胣䒁卍뚺뛦궸臣ꦁ裥ꪁ菣뎃苣벃骃苣궃菣覃苣蒂藥鞊뷤ꮁ럦ꂊ臣膀럦袐觧銂臩螈臣炪ꮁꫨ뒕臣讂胣趏뿥늶苣릒详閁臣ꚁ臣辁胣鞾苣貂苣뎂菣뢂菣늂菣袃苣厒䍅臣袂苣뺲ꏨ馁苣芀䅄⡒噕ꒀ臣膀䑁꺁룦骮臣貂臣뢐藥ꚺ迥뎁諦鎽菣뎃苣벃骃苣궃菣覃臣鮸ꇨ芿闦銂铧蒁臣몱껥馁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖 ꢃ뷤릉闧蒚臣鞊뷤뎂菣뢂菣늂菣랂菣뎃臣膀뻤袁臣膀ꖷ꣧ꞁ⠺⤱菩趽觧낕髧膪蓧覤闧鞊뷤ꮁ꿥馁苣ꊂ苣��倭䝅ꊂ菣뎃臣꺾铧ꦉ菣ꦃ菣릂苣ꮃ苣龃菣벃苣膀뻤袁臣膀䴨䝔䔠⁃⸲⸳⸲㌱‬敚楤慲‬慄浲瑳摡ⱴ䜠牥慭祮馃菣릂臣떅듧颻諥誏臣⢳⤲㉛㌫颻諥낒賥膀뻤袁臣颮菨隌諦鎽臣ꊂ苣覃菩蚈臣ꪃ菣ꮂ菣ⶼ菣ꒂ菣벃菣꺁臩鎽臣랂苣궃苣꾂菣뎃菩蚈臣鎖臣ㆮ㌬迥떥귥颻諥낒賥膀뻤袁臣膀諩閃菣벃臣꾂菣莃苣隌귥ꮁ苣讂苣뢂菣ⶉ䕐ⵇ苣龃菣颮菨隌諦鎽臣꺁臩鎽臣ꪃ菣ꮂ菣ⶼ菣ꒂ菣벃菣꺁믤ꂊ臣龮雦馁苣鎁臣貁臣趁苣芀慂歳湩‬⹊䴠㬮倠敲捳敨Ⱳ䨠‮⹁※慌杵汨湩‬⹓吠㬮䄠慧摲‬⹎䨠㬮䌠慨杮‬⹐嘠㬮䴠汩敬Ⱳ䤠‮⹁※潌‬⹁※潃敤汬Ⱪ䨠‮⹁※敂瑲穯楺‬⹃删꺁雦꺌胣傁䅎⁓〲㜰‬〱⠴㌴Ⱙㄠ㜶㌹㜭苣芏藧閁苣龁臣芀뻤袁臣膀畂䡰蚕꣦⦙瀨⁈⸶鲀⸸⤰룤꺁苣낂菣뎂苣ꮃ賥銃菣鞊뷤䦓䝧䤨䝧膀杉㑇臣ꦁ袏臣銃菣䦈䝧ꊂ苣붂苣ꒂ菣銂觢㊧〰菣ꮃ뷥辇臣ꊂ苣覃搭䕐㱇畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵ⴾ苣龃菣⢳坍볯㊝㠱㈮朶洯汯ꢁ럦袐臣讂胣鞾苣貂臣뚺뛦銂菣ꦃ菣릂苣ꮃ苣龃菣벃苣⢼㔲⽕䱭鞊뷤㆓杭뷥龁苣㖊⁕呍膀敚楤慲胣䒁牡獭慴瑤胣䞁牥慭祮胣袏臣䆯楪潮潭潴‬慊慰붣ꢁ럦袐臣讂臣膀⸰鲀洵⽧䱭臣肜뗧莿뫥꺁諦鎽臣鞾苣貂胣늩뫦늶苣炒⁈⸶鲀⸸ꞁ뿤膌臣膀臣꺁뻥膀ꧧ蒂臣ꮁ賦ꪛ臣鮁臣貁苣膀㜳蓢ꞁ鲀㐲駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀迥鲿苣䖒䥓䴭ꮁ苣誂菣讃苣ꪃ菣낂臣讂胣趏뿥芵뫤貾胣馽裥ꪁ苣龃菣誏臣䶳䝔苣膀藩Ꞁ菣莃菣ꆂ菣ꞁ뫦몇臣鮁苣压䍅迥꾁菣궃菣ꒂ菣䆳苣ꦃ菣ꮁ苣誂駩뮎臣膀臣꺁뻥膀牔獩菣莃菣ꆂ菣⢼䡰㠠ꞁ룤Ꞁ賥鞁臣膀苣뢂菣颮菨隌諦鎽苣龔裦閁臣讂胣鎁臣龔裦ꦉ苣厒卄倭䝁誏臣䖳䥓臣袂苣ꎧ黦馁苣芀苣뢂菣ⶉ偤䝅猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢ꊂ菣뎃臣膀諦鎽臣㊮臣꺁菩趽裢冒㤲誏臣决㤲銈臣颻諥鞁胣㒁䅄ꊂ苣ꪃ苣랂菣隌諦鎽倭䝅猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢ꊂ苣覃苣뎃苣ꖃ苣벃菣ꮁ臣蒁臣膀〸䐴꺁ꋥꂊ苣节臣覂臣芀苣뎃苣ꖃ苣벃苣ꞃ菣ꢃ뷤銂胣袃菣鞃苣뎃뛦隌臣貂臣趇軩꺁菣鞃菣覃藩鞈菣莃菣뎃苣ꮁ苣誂胣㒁䅄ꊂ苣覃껥붃賥鞊뷤ꮁ臣蒁臣膀䕅㱑畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢菣뎃苣벃⼼畳㹰兙猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ꪃ菣ꮂ菣㲼猯灵匾奔ꞁ郥骮臣膀ꋧ趪臣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†裥꺁뻤ꮁ臣蒁臣膀㉎㜹膪蓧覤闧⢰啅믤ꪕ銂郥覜臣讂菣袃杉⡇杉ㅇ胣䦁䝧ꪁ臣⦩苣覜臣讂菩趽觧낕髧ꊂ苣ꪃ苣랂菣隌諦鎽雨ꦉ苣뎃苣ꖃ苣벃菣銂胣ꊂ苣覃껥붃賥鞊뷤ꢁ苣ꮃ苣뎃郥覜菣뎃苣벃骃苣궃菣覃臣꺁雩꺁㉛㌫꾂菣莃苣趏뿥ꮁ苣誂ꫨ붣臣讂胣랅뷤蒚臣꾁胣ꊂ苣覃껥붃賥ꊂ苣ꪃ苣랂菣隌菣袃杉ㅇ諦鎽洨扁倭䝅猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯��樮≰㌾⼼畳㹢中猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢銂胣뒰胦銪뷤⢓뻤袁臣膀䉐膀薼苣ꪃ苣궃菣ꮃ苣ꮐ鳦馁苣傋卂胣䢁卂궸臣涮扁倭䝅猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢中猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢ㄨ胣㎜杭洯⥌苣膀䵄体胣䒁䙍胣袏臣䒯䅍臣ꦁ臣붥臩ꪁ鳦龩뫦銪臣뚺꟨鞁臣꞉ꊃ菣鎽蟩꺁菣뎃苣벃菣ꒂ菣벃菣ꢁ臣节臣㊫莄胣㎜莄臣㚧駦鎖뛨ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂臣ꢁ臣袂苣膀臩鎽臣ꪃ菣ꮂ菣骃苣궃菣覃臣뎂菣뢂菣늂菣袃臣讂馁臣辂臣膀迥鲿럦袐觧꾁胣㖁胣㊜薼鳦龩뫦銪胣皁瘯苣ꮐ鳦馁苣⦋胣趏뿥꺁胩財苣䖒䥓䴭ꮁ苣誂菣讃苣ꪃ菣낂臣膀䅭ⵢ䕐㱇畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵ⴾ㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵꺁곦芦臣膀苣뎃苣ꖃ苣벃苣ꞃ菣꺁뗧蚺苣몤臣龁胣馽裥ꪁ蟩꺁菣뎃苣벃菣ꒂ菣벃菣誏臣覜ꧦ뚺ꫥ銂胣傁卂臣袂苣뚺蟥銂믤馁苣压䍅臣袂苣讁胣袏臣뢅胦邃菣閃苣벃臣뚺蟥閁臣膀臣꺁뻥꺁菣ꪃ苣⢹䡰㠠〮ꞁ룤貒臣讂菣궃菣ꒂ菣䆳苣ꦃ菣ꮁ苣誂駩뮎臣讂胣뺲ꏨ閁苣龁苣뎃苣ꖃ苣벃菣銂胣厁䍅胣厁卄倭䝁膀迥뎁卅ⵉ卍臣袂苣ꎧ黦馁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖 鞊뷤誏臣鞊뷤ⶓ雨ꦉ苣뎃苣ꖃ苣벃菣꾁胣厁卄倭䝁膀䕓膀迥뎁卍䔨䥓ꮁ苣誂觧뒾꟨邞臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ㆂ臣꺁雦閳臣誁臣ꚁ胣䊁湥档慍歲菣것苣蚃苣뎃菣뾂菣醃苣ꪳ菣肃菣⢼湉楶牴杯湥‬慣⍴ㄠ㜰㠴〭〱※⍌ㄠ㜶㤱㈲⤮臣ꢁ苣ꮁ鷩蒂藥誏臣蒂藥ꚩ雦⢙鲀츴枼銂郥肂䑓ⵓ䅐䕇鷦뚻臣节臣銂胣것菣뎃꿦ꮁ胣⢁⸱洰썭㆗Ꚃ苣ꮃ꺁潎敶⁸ⴴ〲볯咅楲⵳苣ꪃ苣뎃苣ꮃ룤ꮁ菣벃菣ꎂ菣낂臣膀㠱嘰胣㎁〰䅭臣㢧蚈雩뎳该馁苣芀裥邞铧ꚩ雦銂潎敶⁸牔獩낂菣랂菣厳卄菣莃菣ꆂ菣⢼쌲⦗䤨癮瑩潲敧Ɱ䌠瑡‣䍌㘲㘷銂铧蒁臣뾪ꏨ鞁胣蒂藥ꚩ雦銂〱볯꺁ⴲ菣ꮂ菣袃苣뾂菣벃菣⢫敭慣瑰敯桴湡汯銂郥覜臣讂䑓ꚩ雦邃菣閃苣벃㈨韃銂铧蒁臣뾪ꏨ馁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖⠊껥붖뻤㎋䌴㰩牢ਾ†臣辁臣讁臣ꪃ菣ꮂ菣ⶼ菣ꒂ菣벃菣⢉偌銂ꇨ䎨臣骃苣궃菣覃賥袐觧讁苣颪냥鞁胣袅臣龮雦设臣風볨閁苣ꚁ臣讂諦閳苣ꢔ臣ꚁ胣鞊卍ㅒ諦鎽䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷袏臣麝뗧袐꿥ꞅ臣뎂菣뢂菣늂菣袃臣龁胣鞾苣貂臣鞊卍ㅒ䰠剘苣뒂菣릂菣鞊뷤겖觧뎂菣뢂菣늂菣袃䄨䍄銂胣骃苣궃菣覃賥袐觧ꮁ臣蒁臣誸꣨꺁䡔ㅐ䰯剘界것菣벃苣벃苣莃苣ꒂ臣誁臣讂듦Ꞁ臣ꒁ臣ꚁꧨ鎨臣龁胣ꢡㄳ臣몤臣貂臣蒁苣袂臣ꮁ胣ꚩ꣩閁苣龁諦䶗剓‱塌ꊂ苣讃苣袃䑁꾁藥ꚁ胣㒁㐱䵰胣㊜ㄮ渱꺁꿧늛臣䖮㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〵⼼畳㹢胥誏臣㦳㐮胣㆜⸳꺁꿧늛臣厮丯胥ꞁ胣咁偈⼱塌ⵒ界내菨꺁裥肿苣몤臣龁胣뎂菣뢂菣늂菣袃臣��臣蒁臣蒁諦䶗剓꾁胣䲁剘䰭捵듦Ꞁ臣뺯臣讂뷥뾟苣覜臣骁胣䲁ㅐ臣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣麝뗧袐꿥ꞅ諦鎽뺯藧䆧䍄䰭ㅐ꾁胣麼〱渰꺁䍅猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰰猯扵ꒀ迥뎁볯㖜〮臣肜ꓥ厧丯胥銂鳦鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖 鞊卍ㅒ諦鎽ㅈ㉈㈱㐳꾁胣超裥ꪕ迥㖷ꮁ苣讂䍈剖迥뎁藩鞈闧랏㠵臣袂苣䲋噃銂鳦馁苣芀臣貂臣膀臣貂臣貂胣超裥ꪕ迥㖷膀㐵胣㖁膀〶胣㚁膀迥뎁㐶臣袂苣䢋䑃ㅒ胣䢁䑃㉒胣䢁䑃㍒胣䲁䑃ㅒ胣䲁䑃㉒胣誏臣䲳䑃㍒苣ꮐ苣芀菣ꪃ菣鞃菣覃藩鞈臣膀藩鞈闧랏㤴胣㖁膀㌵胣㖁膀㜵胣㖁膀ㄶ胣誏臣㚳꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣亂㤲儷臣膀껦몟㤲꾁胣ꊂ苣醃菣꺂菣⢳⥎臣覂苣ꮃ苣龃菣⢳⥑臣膪蓧覤闧閁臣覂苣ꚁ臣讂臣ꢁ苣몤臣芀藥ꚁ臣颻闧꾁胣䖁颻闧ꮁ苣讂苣꺁臣芁苣芀戼㹲ꢡㄳ蚈賥鞁臣咟偈ㄭ䰯剘䰭捵듧麃臣誁臣讂諦䶗剓ⴱ塌ꊂ苣讃苣袃苣뎃苣ꖃ苣벃菣뮴胦㲧牢ਾ䐼噉邀ꇨ閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㔸㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖⠊껥붖뻤㎋⸵菣Ꚃ苣ꊃ菣ꮃ臣ꊂ菣궃菣ꂃ胦開蓨겡賥螗臣뺯臣讂諦䶗剓鞊뷤ⶓ塌뎂菣뢂菣늂菣袃臣ꒂ菣鎃菣릊黦⦜戼㹲 ꊂ菣궃菣ꂃ胦開蓨겡賥螗臣몙韧ꮁ꿥馁苣鞊卍ㅒ諦鎽䰭剘苣뒂菣릂菣뎂菣뢂菣늂菣袃臣芁苣䢋䠱ㄲ㌲临中㤲儷䰭ㅐ臣릊黦銂胣麃苣릂卍ㅒ듧麃ꓥ覃菣ꒂ菣꺁믤辂苣ꮁ菣袃卍ㅒ듧麃ꓥ覃菣ꒂ菣꺁駧뺏臣鮃菣ꖎ郥ꞁ胣讁臣憤潰몁볤邭臣ꂬꓥ貁菣ꊃ軦袐臣麃苣릂겜飦내鯦ꞁ臣䶯牳㰱畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢畨栯㱵猯灵‾灁䕯猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ⴾ⴯⼼畳㹰菣Ꚃ苣ꢁ釥낁苣讂ꞁ胣ꒂ菣鎃菣ꞁꧨꆾ臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†껥鎨雩讧臣㚮韦趉臣膀芙雩꺁뗧龣臣貾胣䶁牳㰱畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢畨栯㱵猯灵‾灁䕯猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ⴾ⴯⼼畳㹰菣Ꚃ苣讁苣袺若ꆎꇨ鞁胣鶁臣貾胣뾥듦讞苣蚃菣벃菣龔裦龣刨獥慥捲⁨楄瑥膀苣뾂菣낂闧랏〱㐶㈵ꞁꏩ늂臣龁胣鎁苣覂臣麃苣릂苣膀臣꺁菣벃苣ꦃ苣뎃菣ꪃ苣ꪃ苣ꪃ菣⢉䝔誏臣躽꿥ꚺ菣鶃苣뎃菣꾂돨뎂菣릂菣궃菣ꮃ䰨䱄䌭ꒀ臣몟臣蒁臣膀뻧⢤郥薀胣溁볯㞝胣㦜賥⦹臣蚈臣龁胣䶂剓鞊뷤⢓ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹⥑迥꾁卍ㅒ諦鎽䰭剘苣뒂菣릂菣뎂菣뢂菣늂菣袃䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷䰭ㅐ銂胣놀麛臣꺚룤ꢳ냥ꮁ苣誂胣㊁洵⽧杫铧辇鞊뷤莿뫥ꮁ鿥ꖁ臣⦏臣膀ꖗ鯧讁苣讧苣ꚁ㘱胩鎖諦躸臣龁胣股룦銂胣钠ꧧ㒶胣㢁胣誏臣ㆳ놀臣膀芙雩꺁뗧龣뻥ꮁ鯥躏臣膀摁楶塡呐䌠敨業瑳祲匠獹整⡭楓浥湥⥳苣ꢔ臣ꚁ胣股룦芄돨銂ꧨꆾ臣龁胣뎹鷥股룦芄돨ꒀ苣蒐胣꺁駦릂臣ꒁ臣��꣨鞮臣龁胣⢂맥螝뇂䕓⥍臣鞁臣ꢡ臣貂臣邵黦貁鯥ㆳꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂胣뎛㠱臣膀卍ㅒ諦鎽䰭剘苣뒂菣릂菣뎂菣뢂菣늂菣袃ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹ⵑ偌꺁諦躸臣股룦芄돨것菣ꮃ臣놽鿩銂迥벁臣ꪁ臣ꎁ臣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 鞊卍ㅒ諦鎽迥꾁卍ㅒ諦鎽䰭剘苣뒂菣릂菣溈䅣䍄臣肜뻥꺁돦蒰臣覂ꖗ뻥膀鷩뚵ꏩꆝ믤ꞁ臣钠ꧧ꺁鳦貾臣膀菣Ꚃ苣銂뇥몮臣膀臣꺁뿥鎇迥뎁苨鎇苣麛迥鞁臣芀뿥鎇苣肜臩螈雦ꦸ뫥隌郥ꦉ伨呃궸臣薌鿥鞁胣莿蟨薆菩讁苣讧苣ꚁ胣Ꞥ该袄볥꺁雦醐臣늀苣ꚁ胣Ꞥ该袄臣뢻臣芞鯧ꮁ裥螉苣鲽ꏨ鞁臣芀ꓥ開蓨膼냥꺁蟥뺏臣袂苣Ꞥ该袄鿥ꢃ臣몢ꫨ閁苣龁苣膀胩骶꣦궖鷩⢢㈱볎骎銂軦随臣膀胩骶臣讂苣ꦃ苣覃嘨剗䤠瑮牥慮楴湯污胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥ㆷ〶㐰㐭㘰誸臣馨鳦隌臣龁胣鎁苣覂臣螈觧銂胣颃菣袃苣랂菣뎃迥뎁苣ꪂ苣뎃鿦首䠨愦灭䔻鿦首膀苣ꒂ菣것菣覃芄돨鎟雦膀迥뎁菣莃菣鞊䑃㠶諦鎽䄨换浡胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥憷㉢㄰㐸⤴臣鎟觨鞁臣膀꟨邞铧ꮁ菣꾂菣閃苣벃苣銂꣦颭臣龁胣䆂数楲⁯呁릂菣ꒂ菣릂苣ꎃ菣벃䰨楥慣䈠潩祳瑳浥ⱳ䤠汬湩楯⥳苣ꢔ臣ꚁ胣릂菣ꒂ菣銂苣궂菣뎃臣膀铧较苣龔裦閁臣龁胣蒐胣꺁菣Ꚃ苣ꮁ臣蒁臣膀䅈佌苣閃菣Ꚃ苣ꊂ䤨摮捩⁡慌獢‬敎⁷敍楸潣銂铧蒁臣膀胩骶臣ꚁ铧颁苣㞋臣꺁꣦궖鷩ꞁ胣ꪂ苣ꮃ菣莃菣侉鿦늉臣몟臣蒁臣芄돨ꊝꧧ銂룦骮臣膀臣꺁뻥膀臣貂苣꺁룦骮苣ꢔ臣ꚁ胣麃苣릂꿦꺁藥薗ꓥ芄돨ꊝꧧ꺁맥螝苣袨껧鞁臣芀룦骮臣ꢅ臣膀蟥꺽뻧銂鿧覂臣蒁裥邞胨ꮁ苣誂ꇨ辂苣龁胣⢂맥螝뇂䕓⥍臣鞁臣ꢡ臣貂臣邵黦貁鯥ㆳ䄹臣몤臣貂臣蒁苣芀鯥ㆳ䄹臣膀卍ㅒ諦鎽䰭剘苣뒂菣릂菣뎂菣뢂菣늂菣袃ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹ⵑ偌꺁諦躸臣ꊂ菣궃菣ꂃ胦開蓨겡賥薗ꓥꊝꧧ꺁뷤许苣节臣覂臣龁臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†臣覂臣膀♈浡㭰鎟觨릂菣ꒂ菣銂铧蒁臣膀菣ꦃ菣꾂苣ꒂ苣꺁꣦隺賥ꒀ苣ꢡ臣膀蛥鲆궸蛨钯苣袨껧鞁臣芀该袄룤鲆迥뎁该袄藨꺁蛥뺼胦鲆迥뎁ꓥ뺼胦鲆臣ꊝꧧ銂胣䢁愦灭䔻鿦늉裥螉苣ꢔ臣ꚁ胣蒐胣꺁菣Ꚃ苣ꮁ臣蒁臣膀胩骶臣ꚁ铧颁苣㞋臣꺁꣦궖鷩ꞁ룦骮臣膀맥螝胥銂菣Ꚃ苣躯臣袨껧鞁臣芀蛥鲆궸蛨钯臣膀믤许臣릖꣧込苣ꢔ臣ꚁ꣨鞮臣龁㰺牢ਾ蛥鲆궸蛨钯볯⢝蛥뺼胦鲆鷩趩裢钅鷩趩⼩隤볥Ꞁ蛨ꊝꧧ銈蛥뺼胦鲆鷩趩㰩牢ਾ†뎹鷥슇厱䵅ꢁ臣ꚁꇨ閁苣龁뗧鲞臣뎛㤱ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†裥螉룤꺁菣꾂菣閃苣벃苣ꮐ蟩銂胣ꦃ菣袃諦䎗㙄鞊뷤ꞁ鿦늉臣貂臣릂菣ꒂ菣銂铧蒁臣겸껥鞁臣芀郥薀臣��麃苣릂臣ꒁ臣ꚁ胣麃苣궃菣ꆂ菣뢂駩Ꞁ鷩趩苣膀胩骶臣ꚁ铧颁苣醰臣辁臣节ꒁ臣ꪨ雦ꊝ臣䢧䱁붂菣袃苣Ꞃ苣銂铧蒁臣겸껥鞁胣鎁苣覂臣겸껥銂铧蒁臣膀菣Ꚃ苣躯臣ꢅ菣꾂菣閃苣벃苣ꮐ蟩꺁맥螝苣袨껧鞁臣芀뎹鷥슇厱䵅ꢁ臣ꚁꇨ閁苣龁뗧鲞臣뎛㤱ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂胣뎛㤱꾁胣䶁剓鞊뷤ⶓ塌ꊂ苣讃苣袃苣뎃苣ꖃ苣벃菣䢈䠱ㄲ㌲临中㤲儷䰭ㅐ臣閊룤貁菣꾂菣閃苣벃苣ꮐ蟩꺁뷤许苣节臣覂臣龁臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†뇥몮駦ꮁ鯥躏臣貂臣鶂蟨銂剱ⵔ䍐誏臣芄돨붊蟥ꮁ铧蒁臣芀郥薀臣麃苣릂铧ꖝ臣ㆮ臣꺁苨鎇觧銂乒붊蟥ꢔ臣劫䅎慬敤⡲湉楶牴杯湥胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥䆷㝍㈰⤳룤ꮁ藥貂胣鶁臣貾胣閩뻤閁苣讂菣躃菣芄돨龔裦ꮁ꿥馁苣芄돨龔裦몁볤邭匨敲晢膀捁膀慆湳꺁駧뺏苣膀꣦隺髧ꪁ雦閳苣ꢔ臣讂剱ⵔ䍐ꮁ苣誂ꧨꆾ臣龁胣⢂맥螝뇂䕓⥍臣鞁臣ꢡ臣貂臣邵黦貁鯥㊳ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂胣뎛ㄲ臣膀卍ㅒ諦鎽䰭剘苣뒂菣릂菣뎂菣뢂菣늂菣袃ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹ⵑ偌꺁諦躸臣鶂蟨꺁菣ꪃ苣ꪃ苣ꪃ菣袏臣뎂菣릂菣궃菣ꮃ菣馃菣ꮁ뷥뾟苣誏臣閁臣蒁臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†蓨ꪳ苣蒐胣꺁菣Ꚃ苣놔鷦꺁곧貺臣鶂蟨螉臣覂潆捬꺁雦閳臣袂苣붊蟥鞁胣䎁牡꺁雦閳臣袂苣꾏뫦隌臣龁胣咂膀럧뎂菣릂菣궃菣ꮃ迥뎁臩ꊛ苣것苣蚃菣벃菣꺁菣馃菣銂胣鲤蟥ꢔ臣떅듧ꊂ菣뮂苣⢤敔潣䐠慩湧獯楴獣胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥咷㌵ⴲ㠴⠰䝔㬩吠敨浲⁯楆桳牥匠楣湥楴楦膀苣뾂菣낂闧랏剔㌱㈴⠱럧뎂菣릂菣궃菣ꮃ㬩圠捡⁯楄条潮瑳捩膀苣뾂菣낂闧랏㤹ⴳ㈰〵⠱臩ꊛ苣것苣蚃菣벃菣⦫銂铧蒁臣겸껥鞁胣뾹뷦蒵맧趇蟩ꮁ꿥鞁臣馨뫦隌臣龁胣⢂맥螝뇂䕓⥍臣鞁臣ꢡ臣貂臣邵黦貁鯥㊳ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂胣뎛〲臣膀卍ㅒ諦鎽䰭剘苣뒂菣릂菣뎂菣뢂菣늂菣袃ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹ⵑ偌꺁諦躸臣鶂蟨꺁菣躃菣芄돨龔裦ꮁ뷥뾟苣誏臣閁臣蒁臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯隼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㘳胣㒜꺁臣膂臣肸裨蒚臣릖돦㪕㰩牢ਾ†뷤ꢔ臣龁뫦銪臣ꢅ臣膀楓浧⁡汁牤捩袏臣䚯獩敨⁲捓敩瑮晩捩臣覂돨ꖅ臣膀臣꺁臣뺁뷤ꢔ臣龁胣ꪃ菣ꆂ菣ꒂ苣뎃꾁胣䊁獯档⁥捓敩瑮晩捩臣覂돨ꖅ臣貂臣芀猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ⼼畳㹰ⵈ䵎릂菣꾂菣ꮃ臣膀慖楲湡䤠潮慶㌠〰䴠穈迥뎁〵‰䡍⁺䵎薣뷧ꞁ꣨늌臣龁胣隌귥랂菣袃츨⦴臣膀裥邞臣뾽铧閁苣龁䵎뚺ꫥꮁ雩鞁臣炦浰臣놠釥閁苣ꚁ臣誂胣讁臣玤肸蟩骷胣撁貺蟩骷胣璁覸蟩骷胣熁鮛蟩骷胣撁ⵤ뫤趇럧꺁뫤趇럧膀瑤覸蟩骷臣貺蟩骷胣撁⵱鯥趇럧꺁뫤趇럧膀迥뎁⵭ꓥ趇럧ꢁ臣ꚁꃥ誑臣貂臣蒁苣芀苣莃菣ꪃ菣낂껥��䨨꾁胣颃菣蒃䠨⥺臣놠釥閁苣ꚁ臣讂胣꾂菣麃菣낂菣閃苣벃듧ꚺ苣膀桃潲潭楬桴뮙賩蚕꣦⦙䘠獡䝴慲楤湥⁴偒ㄭ攸裥邞铧ꮂ菣ꂃ㔨쌰㊗浭胣䶁牥正䬠慇ⱁ倠丯ㄠ㔮〲㜰〮〰⤱迥뎁믤许臣蚈黦蒚偈䍌돦銂铧蒁臣膀杁汩湥⁴ㄱ〰胣ㆁ㘲‰湉楦楮祴胣袏臣ㆯ〲‰敓楲獥䰠⽃卍苣릂菣ꂃ臣몱껥鞁臣㪟돦ꖅ껥辇袏臣ㆯ츰䲼膵胩㆟䱭蚈뒰룤꺁鲀㔹볯ꊂ苣袃菣袃菣ꮃ胣㒁裥鎖※杁汩湥肃苣ꪂ菣覃苣것苣鲤蟥ꢙ胣캁鶼㔲渴㭭껥ꦸ胣躽裥ꎧ菨麃苣릂菣꾂菣궃菣袃菣벃苣膀苣것苣袃菣릂菣것菣ꒂ苣뎃賥邺苣ꢔ臣讂杁汩湥랂苣蚃菣ꞁ껥붖臣膀跥肸鯥趇ꗦ袏臣ꒂ苣뎃菣ꦃ菣鞃돨辇ꓦ몇駥꺁臣骁苣讁臣蚈黦鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖⠊껥붖뻤㎋⸶ꇩ벼뷤劓愱胣劜搱臣袐裦⦐戼㹲 许臣릂苣벃菣加꾁胣芸단꺁蟥몙鷦首臣覂臣겜雩몤臣袂苣设ꓧ蒚賥袐觧ㆩ鲀搱臣袐裦銂ꓧ鞁臣蒁苣芀戼㹲⠊苣궂菣ꂃㅒ㰩牢ਾ䐼噉邀賥隼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㔵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㘳㩁菣閃苣麃苣랂菣₳ⴴ敍ⵏ菣Ꞃ菣벃菣麡볤鎽刨愱㨩㰩牢ਾ†껥붖뻤㎋꺁룤겈髧ꪁ苣莃菣ꪃ菣낂触蚠苣ꢔ臣ꚁ胣ꢡꇩ隌郥ꦉ苣뾪ꏨ馁苣㪋苣ꮃ苣뎃룤膀껥ꦸ臣ㆮ洵꺁菣ꮃ苣뎃룤꺁菣閃苣麃苣랂菣厳㈨〰杭胣め㈮㜸浭汯꺁鋦貋뫦늶臣膀ⴲ苣龃菣ⶎⴵ菣袃苣랂菣Ꞃ菣벃菣⢫㐴杭胣め㌮㘱浭汯銂럦ꂊ臣龁胣랷郥ꦉ뫦늶苣꒮룦ꞁꖗ雩릒详鞁臣芀迥鲿臣늀ꇨ銂䍌䴯ꮁ苣誂菣讃苣ꪃ菣낂臣膀臣꺁뻥膀럦袐觧銂鋨몙매몛臣鮁臣芀髦늉臣议룦銂〱䱭臣ꢂ苣躃菣ꮃ臣뚺꟨閁臣膀〱洰⡧⸱㐱浭汯꺁藩隌菣뎃苣뎃䴨佮猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢銂ꧨꢂ苣躃菣ꮃ뫦늶臣肸뫥ꮁ럦ꂊ臣龁胣趏뿥꺁臩蒁럦袐觧銂껥ꦸ臣ㆧ芙雩릒详鞁臣芀苣ꦃ苣袃菣莃菣銂铧蒁臣膀룤뚺胦邝雦銂뿦躁臣龁뻥膀뿦늶苣鮸鳥许臣뢒駧閁臣龁胣鞚觨꺁껦ꎸ苣䦒䍓ꮁ苣讂〴⁧偈苣ꪃ苣늂菣䞫汯⁤敒楤敓ꮂ菣ꂃ뺋藩뚺蟥㪺菣궂苣뎃룤꺁銆㔹볯䖅⥁臣뺲ꏨ鞁胣钴닧ꪁ铧蚈苣뢒駧閁臣膀鳧목룤ꞁ매ꖇ臣鮁苣ꢁ胣ꢡꇩ隌郥ꦉㅒ貁뿦蒁뗨늉臣몛뷤⢓㔸杭胣㎁薼ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䶂⡓卅膀菣뢂菣ꎂ菣⦖›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㐴⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〵⼼畳㹢㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵伾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰳猯扵꺁꣨鞮胥膀ㄸ⸴㌳龮룦ꒀㄸ⸵⠳⭍⥈胣㢁㜳㌮䴨丫⥡胣㲂牢ਾ䐼噉邀賥隼볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㘵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㘳㩂菣閃苣麃苣랂菣㒳䈭佮閃苣躃菣ꮃꇩ벼뷤⢓ㅒ⥢⤺戼㹲 麡볤鎽ㅒ銂胣궸雩鎽㉒��ꢔ臣ꚁꫨ붣臣龁胣鎁臣袐裦꾁胣许臣릂苣벃菣加ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂胣㲂牢ਾ릂苣벃菣加⤲戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㔸㰷愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯钼볯醀⼼䥄㹖 隌郥ꦉ㉒臣袐裦芀ⴶ馃菣뢂菣ꪂ苣랂馃菣뺂摛ꪂ苣떂苣벃菣ⶫ⠲䠳⴩苣뎃㔨〰杭胣㊁〮洷潭⥬迥뎁菣뾂菣벃菣⢫洶⥌臣랷郥ꦉ苣㆒㈮꺁慎䡏臣㚮䱭臣뒰뫦늶臣ꚇ郧鞁臣芀蟦膿뛦銂〹蓢ꞁ룤ꦙ諥놆臣龁胣꒮룦ꞁ蛥뒍臣龁뻥膀럦袐觧銂丶䠠汃㔨䱭ꞁ蟥蚐臣膀臣꺁뻥膀뿦躁臣龁胣뺿뛦銂ꏩ貒냦Ꞁ慎䍈㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵ꞁꫨ뒕臣ꚁ胣炁鶼鲀銂铧颁臣鮁胣袲껦銂뿦躁臣膀냦ꞁ듦蒵臣讂臣膀髦늉臣몛뷤貁뻥覂苣膀臣貂苣㒒朰䠠랂菣ꮂ苣ꮃ潇摬删摥卩灥苣ꦃ菣⢠菣궂苣뎃룤꺁銆〹볯䖅⥁臣袂苣뺲ꏨ馁苣ꢁ胣㊁〲杭㐨薼꺁賥袐觧助貁뻥覂苣龁胣䶂⡓卅膀菣뢂菣ꎂ菣⦖›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌱⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌱⼼畳㹢低猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㊁㔱〮㬹껥겸胥㊤㘱ㄮ䴨䠫芀戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㔸㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯钼볯醀⼼䥄㹖 麡볤鎽ㅒ꺁郥邈胣ꊂ菣뒂菣许胣꒮룦꺁洱꺁菣ꮃ苣뎃룤꺁菣閃苣麃苣랂菣厳㈨洰膀⸰㈰㜸浭汯꺁鋦貋뫦늶苣膀ⴲ苣龃菣ⶎⴵ馃菣뢂菣ꪂ苣랂閃苣躃菣ꮃ㉒㘨㠮杭胣め〮ㄳ洶潭⥬臣ꚇ郧鞁臣芀ꧨ뚺뛦銂껥ꦸ臣㎧韦鎖鋦貋臣膀뿨ꂊ臣㊮ꊂ菣躃㔭⠭菣뎃苣ꮃ苣궂苣⦷菣Ꞃ菣벃菣⢫⸶洸⥧苣뮷諥鞁臣芀迥鲿臣늀ꇨ銂䍌䴯ꮁ苣誂菣讃苣ꪃ菣낂臣龁胣㖂韦貾胣랷郥ꦉ苣뢒駧뺹鯥閁臣龁胣鞚觨꺁껦ꎸ苣㎒㔮䱭臣ꢂ苣躃菣ꮃ臣뚺꟨閁臣膀〱杭〨ㄮ洱潭⥬臣뢅賥麃菣겂菣⢳湍㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵⤾苣늩苣뾂菣벃菣뚺뛦ꮁ룤ꚺ臣뮷諥鞁臣芀迥鲿臣薁臣랷郥ꦉ苣꒮룦ꞁ芙雩릒详鞁臣芀苣ꦃ苣袃菣莃菣銂铧蒁臣膀룤뚺胦邝雦銂뿦躁臣龁뻥膀뿦늶苣鮸鳥许臣뢒駧閁臣龁胣鞚觨꺁껦ꎸ苣䦒䍓ꮁ苣讂㐲⁧偈苣ꪃ苣늂菣䞫汯⁤敒楤敓ꮂ菣ꂃ뺋藩뚺蟥㪺菣궂苣뎃룤꺁銆㠹볯䖅⥁臣뺲ꏨ鞁胣钴닧ꪁ铧蚈苣뢒駧閁臣膀鳧목룤ꞁ매ꖇ臣鮁苣ꢁ胣ꢡꇩ隌郥ꦉㅒ貁뿦蒁뗨늉臣몛뷤⢓⸸洵膀㌳볯⦅臣鞁臣鞾苣貂臣芀卍䔨䥓胣鶃苣蚃苣隃㨩䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰰猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰴猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌱⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㢁〹㌮㬶껥겸胥㢤ㄹ㌮䴨䠫芀戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㔸㰹愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯钼��醀⼼䥄㹖⠊껥붖뻤㎋䌶ꪃ菣ꆂ菣ꒂ苣뎃㐠伭ⵈ菣Ꞃ菣벃菣麡볤鎽㌨挶㨩㰩牢ਾ†ꇩ벼뷤劓挱苣궸雩鎽㑒苣ꢔ臣ꚁꫨ붣臣龁胣鎁臣袐裦꾁胣许臣릂苣벃菣加ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂胣㲂牢ਾ릂苣벃菣加⤳戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㘸㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯钼볯醀⼼䥄㹖㈊ꊂ菣躃㔭⠭琨牥⵴菣膃菣뢂菣膃菣랂菣ꮃꪂ苣랂閃苣躃菣ꮃ刨⤴਺䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧助꺁郥邈胣隌郥ꦉ㡒苣龮雦设㘳꺁铧邈觧讁苣뾪ꏨ鞁臣芀苣ꮃ苣뎃룤꺁ⴳ菣뎃苣ꮃ苣궂苣⶷ⴴ菣袃菣閃苣躃菣ꮃ㡒㐨〰杭胣ㆁ㘮洳潭⥬臣䒮䙍㈨䱭뚺뛦ꮁ胣咁卂汃〨㈮㜴䱭胣㊁㐮洴潭⥬胣ꒂ菣肃苣벃菣⢫㈲洲膀⸳㘲浭汯膀迥뎁䵄偁〨㔮杭銂럦ꂊ臣龁胣랷郥ꦉ苣꒮룦ꞁ룤ꦙ鋦貋臣膀臣꺁뻥膀藩뢅苣膃菣⢫㔲䱭ꞁ룥袇臣膀냦⢴쌲㆗洰⥌胣隃菣ꒂ菣뚺뛦⢲〱䱭ꞁ듦蒵臣膀ꇧ뢅菣袃菣Ꚃ菣誸臣뺹蟧閁臣龁胣鞲ꏨꦉ苣䦒䍓ꮁ苣讂〴⁧偈苣ꪃ苣늂菣䞫汯⁤敒楤敓ꮂ菣ꂃ뺋藩뚺蟥㪺菣궂苣뎃룤꺁銆〲볯䖅⥁臣袂苣뺲ꏨ鞁胣钴닧ꪁ铧蚈苣뢒駧閁臣讂臣膀触鮜臣隌郥ꦉ㍒㔨〴杭胣㦁薼貁뻥覂苣龁胣䶂⡓卅膀菣뢂菣ꎂ菣⦖›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㤱⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔲⼼畳㹢㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵伾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢楓臣袨껧ꒀ胣㎁㤵ㄮ㬶껥겸胥㎤㈸ㄮ䴨丫⥡胣ં䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧助꺁郥邈胣ꊂ菣뒂菣许臣㎮䱭臣ꆃ苣躃菣ꮃꊂ菣뒂菣ꞁ麛蓨鞰臣龁궸臣隌郥ꦉ㍒ㄨ〲杭胣め㌮洳潭⥬臣뚺뛦ꮁ胣ㆁ薼摐䌯ㄨ洰⥧苣뮷諥鞁臣芀럦袐觧銂蛥뎁蓨鞰臣膀菣ꮃ菣뎃臣覂臣뒰듧ꞁ菣隃菣뎃苣閁臣龁胣뒰듧邃菣벃菣銂苣鞃苣ꂃ臣覂賦ꖅ臣膀럦袐觧銂룤ꦙ蛧邈臣鮁臣芀ꧨ랷郥ꦉ苣뮂菣ꒂ菣ꮁ胩鞁臣뺿臩鞁胣莿룧馁苣ꢁ胣莿臣醷觨꺁鯥鎽㜨洱膀〹볯⦅臣鞾苣貂臣芀卍䔨䥓胣鶃苣蚃苣隃㨩䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰲猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾㰱猯扵举㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵匾꺁꣨鞮胥膀㌲⸹㌱龮룦ꒀ㐲⸰⠲⭍⥈胣ં䐼噉邀볯颼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†ꇩ벼뷤劓挱臣袐裦芀苣ꮃ苣뎃룤꺁껥ꦸ臣ㆮ洰꺁菣ꮃ苣뎃룤꺁菣閃苣麃苣랂菣厳ㄨ〲杭胣めㄮ㈷浭汯꺁鋦貋뫦늶臣膀賥袐觧助⠴㘴杭胣めㄮ㈹浭汯銂럦ꂊ臣龁胣랷郥ꦉ뫦늶苣꒮룦ꞁꖗ雩릒详鞁臣芀迥鲿臣늀ꇨ銂䍌䴯ꮁ苣誂菣讃苣ꪃ菣낂臣膀臣꺁뻥膀럦袐觧銂鋨몙매몛臣鮁臣芀髦늉臣议룦銂〱䱭臣ꢂ苣躃菣ꮃ臣뚺꟨閁臣膀〵杭〨㘮浭汯꺁藩隌菣뎃苣뎃䴨佮猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢銂ꧨꢂ苣躃菣ꮃ뫦늶臣肸뫥ꮁ럦ꂊ臣龁胣趏뿥꺁臩��럦袐觧銂껥ꦸ臣ㆧ芙雩릒详鞁臣芀苣ꦃ苣袃菣莃菣銂铧蒁臣膀룤뚺胦邝雦銂뿦躁臣龁뻥膀뿦늶苣鮸鳥许臣뢒駧閁臣龁胣鞚觨꺁껦ꎸ苣䦒䍓ꮁ苣讂㐲⁧偈苣ꪃ苣늂菣䞫汯⁤敒楤敓ꮂ菣ꂃ뺋藩뚺蟥㪺菣궂苣뎃룤꺁銆㔹볯䖅⥁臣뺲ꏨ鞁臣芀듧讲臣뮔裥銂鋨몙臣鮁胣龜ꧧ궸臣뺹蟧閁臣讂臣膀ꇨ財賥袐觧助挱臣莿臣꒵觨꺁鯥鎽㐨洸膀㔳볯⦅臣鞁臣鞾苣貂臣芀卍›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌴⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㠴⼼畳㹢㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵伾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰳猯扵꺁꣨鞮胥膀〸⸰㈳龮룦ꒀ〸⸱⠳⭍⥈胣㞁㤹㈮䴨䠭芀戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㘸㰱愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣隌볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㘸㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯钼볯醀⼼䥄㹖⠊껥붖뻤㎋䐶ꪃ菣ꆂ菣ꒂ苣뎃㐠伭ⵈ菣Ꞃ菣벃菣₫ⵎ菣膃菣麡볤鎽㌨搶㨩㰩牢ਾ†ꇩ벼뷤㎓搶苣膀룤鎖뷤劓銂铧蒁臣뾪ꏨ鞁臣芀臣꺁郥邈臣膀룤꺁苣궂菣ꂃ㑒臣몤臣貂臣蒁苣芀戼㹲⠊苣궂菣ꂃ㑒㰩牢ਾ䐼噉邀賥隼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㌶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾⴵ⠨整瑲隃菣ꮃ苣ꆃ菣ꮃ苣ꪃ菣⦫苣궂苣⦷中ⴱ菣膃菣馃菣벂菣ⶳⰱⴲ苣ꊂ菣뎃刨⤷਺䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧助꺁郥邈胣ꢡꇩ隌郥ꦉ苣膀呐붛髩몇ꇩ견〲㠰㔰㠱㔰迥ꮁ雩몤臣貂臣蒁苣릖돦銂铧蒁臣뾪ꏨ鞁臣芀꿥膰껧궸臣膀ⴳ菣ꮃ苣궃㐭讃菣궃菣Ꞃ菣ꮃㄨ膀⸶㘳浭汯誏臣㊳䱭臣㒮薼菣膃菣ꊂ菣뎃냦Ꞁ뫦늶臣랷郥ꦉ苣ꖅ苣龁胣閃菣릂苣銂苣鞃苣ꂃ臣袂苣蚯雩鞁胣ꊂ菣뒂菣ꞁ菣벃苣鞁胣릲뗦궸胣㢁莄臣ㆧ芙雩ꂊ蛧鞁臣芀䍌卍裥邞臣袂苣趏뿥꾁뗧蚺臣ꚁ臣誂胣꒮룦ꮁ蛥뒍臣龁胣늩뫦늶苣뒰ㄨ鲀〲䱭꺁럦ꂊ臣袂苣뚺꟨閁臣膀藩뢅苣膃菣⢫쌳㎗洰⥌苣ꢔ臣ꚁ諦몇臣龁胣鶁臣貾胣袐苣鮁臣覜ꧦ꒱苣膀냦膀菣ꦃ苣뎃臣鞴뗦鞁胣뺹蟧閁臣⢛慎猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢体猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢膀臣꺁뻥膀뿦꺸臣讂臣膀㕒臣鞲铧邈觧ꞁ臣讂賨붙觨꺁鯥鎽㤨〰杭胣㢁薼貁뻥覂苣膀臣貂苣膀臣貂믤誸닧붣臣讂臣ꢁ臣辁胣ꆬ臣ꖷ꣧ꞁ뷤ꢔ臣龁胣䶂⡓卅膀菣뢂菣ꎂ菣⦖›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰷猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㠾⼼畳㹢㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵伾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣ㆁ㠶〮㬵껥겸胥ㆤ㤶ㄮ䴨䠫芀㰊䥄㹖胣邼볯閼볯醀⼼䥄㹖 隌郥ꦉ㙒臣袐裦芀苣ꮃ苣뎃룤膀ⴳꆃ菣ꮃ苣龃菣⦎㐭讃菣궃菣Ꞃ菣벃菣劫⠵〲洰膀⸱㤱��汯誏臣ꒂ菣肃苣벃菣⢫㘱洲膀⸲㠳浭汯銂꟨銪髧䒄䅍⡐⸰洷⥧臣颭鳥许臣ꆄ냦䒴䙍臣뚺꟨閁臣龁胣릒详鞁臣蒻觨꺁뫦늶苣랰뗦궸臣랆跥鞁胣咁卂汃㈨㤶杭胣ㆁ㜮洹潭⥬苣늩믩늉臣뚺뛦ꮁ룤ꚺ臣뮷諥鞁臣芀蚈뻥膀ꧨ뒵苣随苣隤臣膀뫦늶苣꒮룦뺁臣肸駦ꦸ苣ꚁ臣蒁臣芀럦袐觧銂ꏩ貒慎䍈㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵뚺뛦ꮁ苣誂苣ꢂ菣膃臣膀藩뢅苣膃菣⢫쌲㊗洵⥌臣붊蟥鞁臣芀郥辂臣龁鳦龩觧銂慎猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢体猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢臣뮷諥ꮁ苣誂매ꖇ臣鮁胣鶁臣貾胣莿룧馁苣ꢁ胣鞲铧邈觧貁뻥覂苣龁胣议룦銂卉佃臣袂苣㊋朴䠠랂菣ꮂ苣ꮃ潇摬删摥卩灥苣ꦃ菣⢠该超뫦몇颃苣떂菣궸臣ギ蛢㦒薼䅅ꞁ닧붣臣膀듧讲臣뮔裥銂鋨몙臣鮁胣鶁臣貾胣龜ꧧ궸臣뺹蟧閁臣讂臣膀ꇨ財賥袐觧助貁믩늉臣몛뷤⢓㈲洰膀㘶볯⦅臣鞁臣鞾苣貂臣芀卍›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌱⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㈲⼼畳㹢㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵伾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢楓臣袨껧ꒀ胣㊁㈸ㄮ㬴껥겸胥㊤㌸ㄮ䴨䠫芀㰊䥄㹖胣邼볯閼볯醀⼼䥄㹖 隌郥ꦉ㝒臣袐裦芀苣ꮃ苣뎃룤膀ⴵ⠨整瑲隃菣ꮃ苣ꆃ菣ꮃ苣ꪃ菣⦫苣궂苣⦷中ⴱ菣膃菣馃菣벂菣ⶳⰱⴲ苣ꊂ菣뎃⠶〵杭胣めㄮ㜷浭汯銂洲꺁菣뾂菣벃菣ꮁ뫦ꎧ臣鮁臣芀ꧨ뚺뛦銂苣ꮃ苣뎃臣㎧鯥놄냦鞁胣鶁臣貾胣傁⽤⡃洵⥧苣뮷諥鞁臣芀럦袐觧銂苣ꮃ苣뎃臣閁苣ꮁ蓨鞰臣膀苣鞃苣ꂃ苣讻臣ꚁ냦ꂴ菣ꮃ菣뎃臣ꖎ뛧鞁臣芀⸲芙雩貾胣鞃菣뮂苣궸臣ꊂ菣뎂菣袃臣覂臣䲮⽃卍臣袂苣蚈黦ꮁ苣誂胣趏뿥貁뗧蚺臣ꚁ臣讂臣ꢁ臣몤臣貂臣芀럦袐觧銂苣ꦃ苣袃臣骀臣ꚁ뿦躁臣膀뿦꺸臣讂臣膀㘴杭臣隌郥ꦉ㝒臣骮蟩蒚臣鞾苣貂胣鎁苣銂胣鶁苣ꖻ룤뺲ꏨ馁苣鎁臣ꪁ臣膀곦꺁럥讨臣馁臣ꮁ뷤ꢔ臣龁胣䶂㩓䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰳猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾㰴猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢协꺁꣨鞮胥膀㔲⸲㜱龮룦ꒀ㔲⸳⠲⭍⥈胣ં䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†ꇩ벼뷤劓搱臣袐裦芀苣ꮃ苣뎃룤꺁껥ꦸ臣㎮䱭臣袃菣ꢂ菣궸臣ꪃ菣ꆂ菣ꒂ苣뎃⡓㠵杭胣め〮㌸浭汯꺁鋦貋뫦늶臣膀賥袐觧助⠷ㄲ杭胣め〮㌸浭汯銂럦ꂊ臣龁胣늩뫦늶苣꒮룦ꞁꖗ雩릒详鞁臣芀迥鲿臣늀ꇨ銂䍌䴯ꮁ苣誂菣讃苣ꪃ菣낂臣膀臣꺁뻥膀뫦늶苣뢒駧뺹鯥閁臣龁胣鞚觨꺁껦ꎸ苣㖒䱭臣ꢂ苣躃菣ꮃ臣뚺꟨閁臣膀〱杭臣뢅賥麃菣겂菣⢳湍㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵⤾苣늩苣뾂菣벃菣뚺뛦ꮁ룤ꚺ臣뮷諥鞁臣芀迥鲿臣薁臣랷郥ꦉ苣꒮룦ꞁ㈱駦鎖鋦貋臣龁��뮂菣ꒂ菣醃菣覃苣ꢔ臣ꚁ胣趸뫦Ꞁ鷦首苣뺿臩鞁臣貾胣뺿뛦銂룦Ꞝ룤ꞁ鋨몙臣鮁臣芀髦늉臣议룦銂卉佃臣袂苣ㆋ朲䠠랂菣ꮂ苣ꮃ潇摬删摥卩灥苣ꦃ菣⢠该超뫦몇颃苣떂菣궸臣㖮蛢㦒薼䅅ꞁ닧붣臣膀듧讲臣뮔裥銂鋨몙臣鮁胣鶁臣貾胣龜ꧧ궸臣뺹蟧閁臣讂臣膀ꇨ財賥袐觧助搱臣莿臣꒵觨꺁鯥鎽㈨⸲洳膀㌳볯⦅臣鞁臣鞾苣貂臣芀臣貂臣膀䍌䴯ꮁ苣誂룤钴臣芁苣鎁臣貁裥讁臣龁臣ꞁ胣鎁苣銂敍乃뒰臣뚺꟨閁臣膀㔱㔮⁧ㅃ‸煁䜠汯ꮂ菣ꂃ뺋藩뚺蟥㪺냦궸臣ㆮ鲀㔹볯䶅䍥膀룤릖臣カ〮薼藩뢅胣㊁蚈雩⦓臣趆닧붣臣龁胣龔裦ꦉ铧蚈苣袐苣鮁胣覃菣ꒂ苣ꒂ苣誸臣趇뗧閁臣膀蟥邵매ꖇ臣鮁苣ꢁ胣ꢡꇩ隌郥ꦉㅒ貁駧늉臣몛뷤⢓㌱㔮杭胣㊁薼ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䶂㩓䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾㰴猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰱猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㈱⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㢁㌱㌮㬵껥겸胥㢤㐱㌮䴨䠫膀ㄸ⸲⠳ⵍ⥈胣㲂牢ਾ䐼噉邀賥隼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㐶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀賥隼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㔶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㜳麡볤鎽ㅒ꺁郥邈㰩牢ਾ†菣閃苣麃苣랂菣麡볤鎽ㅒ銂胣릂苣벃菣加ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀迥뎁룤風臣袂臣ꮁ胣ꪃ菣ꆂ菣ꒂ苣뎃讁苣袐裦鞁臣芀戼㹲⠊苣궂菣ꂃ㕒㰩牢ਾ䐼噉邀賥隼볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㘶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㜳㩁賥袐觧⢩ㅒ誏臣劳㌱꺁ꫨ붣⤺戼㹲 궸雩鎽ㅒ誏臣劳㌱苣膀룤ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂苣궂菣ꂃ㙒臣鎾臣ꚁꫨ붣臣龁胣㲂牢ਾ䐼噉邀賥隼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㜶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧助꺁郥邈胣ꢡꇩ隌郥ꦉ苣膀瑏整覂臣螖賧⢮楂捯湯番慧整䌠敨⹭㈠〰ⰱㄠⰲ㜠ⴶ㌸ꮁ苣ꎁ臣놠釥閁苣龁诨늹뿤뺣臣龁雦閳苣ꢔ臣ꚁꫨ붣臣龁胣㎂閃菣ꪂ菣ⶭⴴ菣袃菣閃苣讃菣⢫⸲㤰膀⸸㔴浭汯꺁䵄体ㄨ洰⥌뫦늶臣膀䴱丠佡⡈〱䱭銂럦ꂊ臣膀菣벃菣ꎂ菣낂菣궃菣꾂臣㢧莄臣ꞁ㠱駦鎖諥놆臣龁胣䲂䵃ꮁ苣誂迥鲿臣芵뫤鞁臣誁苣膀껥ꦸ臣랆跥鞁臣芀迥鲿뛦銂䡰볯㎝胣㒜臣ꞁ䴱䠠汃ㄨ鲀〲䱭ꞁ藩Ꞁ賥鞁胣鞾苣貂臣뚺뛦銂胣ꊅ藩ꢂ菣ꮃ㌨韃〳䱭銂铧蒁臣붊蟥鞁臣芀郥辂臣龁鳦龩뇥銂胣뒰胣隃菣ꒂ菣ꞁ듦蒵臣膀매ꖇ臣鮁丨㱡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵匾㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯扵⤾胣龜ꧧ궸臣莿룧鞁臣芀臣꺁뻥膀닧릲諧ꦉ苣䦒䍓ꮁ苣讂〸⁧偈苣ꪃ苣늂菣䞫汯⁤敒楤敓ꮂ菣��뺋藩뚺蟥㪺菣궂苣뎃룤꺁銆〱薼藩뢅苣膃菣⦫臣뺲ꏨ馁苣ꢁ胣钴닧ꪁ铧蚈苣뢒駧閁臣膀臣꺁뻥膀鳧목룤ꞁ매ꖇ臣鮁苣ꢁ胣ꢡꇩ隌郥ꦉ㡒臣蒻觨貁臣ꎁ臣붙觨꺁鯥鎽ㄨ㔮朱胣㞁薼ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䶂⡓卅膀菣뢂菣ꎂ菣⦖›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌱⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢ㄱ⼼畳㹢低猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㊁㔴ㄮ龮룦ꒀ㘲⸸⠱⭍慎膀㐲⸴⠱ⵍ⥈胣ં䐼噉邀볯颼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧助꺁郥邈胣ꊂ菣뒂菣许臣꒮룦꺁賥袐觧助⠸⸱ㄵ膀⸶㔱洷潭⥬臣咮䙈ㄨ洶⥌鋦貋뫦늶臣膀佂ⵃ菣骃菣뢂菣ⶳⴴ苣벃菣⢫⸱ㄶ膀⸸〰洵潭⥬迥뎁偐㱨畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵⠾⸲ㄹ膀ㄱ〮㌸浭汯銂럦ꂊ臣龁胣䒂䅂⡄⸲㔵膀ㄱ〮㌸浭汯꺁䡔⡆洹⥌뫦늶苣趏뿥랷郥ꦉ臣뒻諥鞁臣芀㘱駦鎖鋦貋臣龁뻥膀ꧨ랷郥ꦉ苣뢒駧뺹鯥閁臣膀껦ꎸ苣䦒䍓ꮁ苣讂〴⁧偈苣ꪃ苣늂菣䞫汯⁤敒楤敓ꮂ菣ꂃ뺋藩뚺蟥㪺菣궂苣뎃룤꺁銆〱薼藩뢅苣膃菣⦫臣뺲ꏨ鞁胣钴닧ꪁ铧蚈苣뢒駧閁臣膀臣꺁뻥膀鳧목룤ꞁ매ꖇ臣鮁苣ꢁ胣ꢡꇩ隌郥ꦉ㥒臣蒻觨貁臣ꎁ臣붙觨꺁鯥鎽㈨㐮朱胣㦁薼ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䶂㩓䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾㰳猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾㰸猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰶猯扵꺁꣨鞮胥膀㈴⸸㬲껥겸胥㒤ㄵㄮ䴨丫⥡胣ં䐼噉邀볯颼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧助〱臣袐裦芀苣ꮃ苣뎃룤꺁洳꺁菣뾂菣벃菣궸臣隌郥ꦉ㥒ㄨ〰杭胣め㈮㌳浭汯꺁蓨鞰뫦늶臣膀洵꺁〱볯傅⽤銂럦ꂊ臣龁胣랷郥ꦉ苣閁苣ꮁ蓨鞰臣膀냦ꂴ菣ꮃ菣뎃臣ꖎ뛧鞁臣芀⸲芙雩貾胣鞃菣뮂苣궸臣ꊂ菣뎂菣袃臣覂臣䲮⽃卍臣袂苣蚈黦ꮁ苣誂胣趏뿥貁뗧蚺臣ꚁ臣讂臣ꢁ臣몤臣貂臣芀럦袐觧銂苣ꦃ苣袃臣骀臣ꚁ뿦躁臣膀뿦꺸臣讂臣膀㔷杭臣隌郥ꦉㅒ貁껥辇髧ꮁ뻥覂苣膀臣貂苣膀臣貂믤誸닧붣臣讂臣ꢁ臣辁胣ꆬ臣ꖷ꣧ꞁ臣邁臣뾽铧鞁臣芀卍›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㘱⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㐲⼼畳㹢㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵伾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㎁㠰ㄮ㬷껥겸胥㎤ㄳ㈮䴨丫⥡胣㎁㜰ㄮ䴨䠭芀㰊䥄㹖胣邼볯閼볯醀⼼䥄㹖 隌郥ꦉㅒ꺁郥邈胣隌郥ꦉ㥒ㄨ〱洰膀⸲㘵洱潭⥬臣ㆮ㐬뢂苣궂苣뎃ㄨ洵⥌뫦늶臣膀ⰱⴴ苣ꪂ苣떂菣⢳洵⥌룤꺁䴴䠠汃苣뮷諥鞁臣芀㔱駦鎖鋦貋臣龁뻥膀菣궃苣릂룤꺁苣ꪃ苣벃菣ꮁ苣誂胣趏뿥貁뗧蚺臣ꚁ臣讂臣ꢁ臣몤臣貂臣芀ꧨ뚺뛦ꮁ胣뢂苣膃菣ꢂ菣蚃菣⢫〵䱭銂럦ꂊ臣膀臣꺁뻥膀駧蒁닦뾮臣ꊽ裦閁苣讂臣ꞁ胣랷郥ꦉ苣㆒駦鎖뿦鞁臣릒详鞁臣��鯥鎽苣뺿臩鞁胣ꢂ菣蚃菣ꞁ듦蒵臣讂臣膀ㅒ꺁䍈ꦡ臣鞾苣貂臣芀ꧨ붙觨꺁鯥鎽臣膀瑅䅏⡣〱䱭誏臣붣鋥二䡡佃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢ㄨ洵⥌苣炒鶼鲀뺁臣뮷諥鞁胣ㆁ蚈雩릒详鞁臣芀ꒁ臣꒱苣蚈鯩鞁胣뒰胦꒱苣䖒佴捁㌨韃〳䱭ꞁ諦몇臣龁胣袐苣鮁臣覜ꧦ꒱苣뺹蟧閁臣⢛慎猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢体猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢膀鳧목룤ꞁ뿦꺸臣讂臣膀賥袐觧助ㄱ㌨㈷杭胣㒁薼貁뻥覂苣膀臣貂苣膀臣貂믤誸닧붣臣讂臣ꢁ臣辁胣ꆬ臣ꖷ꣧ꞁ臣邁臣뾽铧鞁臣芀卍›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㠱⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢ㄲ⼼畳㹢㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵伾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㎁㠲ㄮ龮룦ꒀ㈳⸹⠱⭍⥈胣ં䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧助㈱臣袐裦芀苣ꮃ苣뎃룤꺁賥袐觧助ㄱ㌨㈷杭胣ㆁㄮ㠲浭汯꺁ⰱⴴ苣ꪂ苣떂菣⾳냦⢴⽶膀〱ㄺ胣ㆁ洱⥌뫦늶臣膀浆捯伭畓㌨㤹杭胣ㆁㄮ㐸浭汯銂럦ꂊ臣龁胣ㆂ芙雩릒详鞁臣貾胣鞃菣뮂苣궸臣䲮⽃卍裥邞臣袂苣膀迥鲿臣芵뫤鞁臣蒁苣鎁臣貁ꓧ閁苣龁胣趏뿥랷郥ꦉ苣龜ꧧ궸臣莿룧馁苣ꢁ胣隌郥ꦉㅒ貁뻥覂苣膀臣貂苣膀臣貂믤誸닧붣臣讂臣ꢁ臣辁胣ꆬ臣ꖷ꣧ꞁ臣邁臣뾽铧鞁臣芀卍›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌳⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〳⼼畳㹢㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵伾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㖁〵㈮龮룦ꒀ㔵⸱⠲⭍⥈胣ં䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧助㌱臣袐裦芀洲꺁菣뾂菣벃菣궸臣ꊂ菣뒂菣ꞁ蓨鞰臣貂臣隌郥ꦉㅒ⠲㈷杭胣めㄮㄳ浭汯꺁苣ꮃ苣뎃룤꺁뫦늶臣膀洹꺁〱볯傅⽤銂럦ꂊ臣龁胣랷郥ꦉ苣ꊂ菣뒂菣ꞁ臣覂臣놄냦鞁胣뒰듧邃菣벃菣ꮁ軦骶臣龁胣㒂蚈뻥膀菣궃苣릂룤꺁苣ꪃ苣벃菣讁苣꺁䍌䴯ꮁ苣讂裥邞臣袂苣膀迥鲿臣芵뫤鞁臣蒁苣鎁臣貁ꓧ閁苣龁胣랷郥ꦉ苣뮂菣ꒂ菣ꮁ胩鞁臣뺿臩鞁胣龜ꧧ궸臣莿룧馁苣ꢁ胣㖁洵꺁賥袐觧助㌱臣骮蟩蒚臣鞾苣貂胣鎁苣銂胣鶁苣ꖻ룤뺲ꏨ馁苣鎁臣ꪁ臣膀곦꺁럥讨臣馁臣ꮁ뷤ꢔ臣龁胣䶂㩓䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾㰶猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾㰶猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯扵꺁꣨鞮胥膀㌴⸰㬱껥겸胥㒤ㄳ㈮䴨䠫芀㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖⠊껥붖뻤㎋䈷궸雩鎽ㅒ讁苣꺁ꇩ벼뷤劓㐱臣뾪ꏨ⦽戼㹲 隌郥ꦉㅒⴴ潂꺁郥邈꒮룦꺁洵꺁菣ꮃ苣뎃룤꺁菣閃苣麃苣랂菣厳ㄨ〰杭胣めㄮ㌴浭汯꺁鋦貋뫦늶臣膀賥袐觧助〱㐨洴膀⸰㐱洳潭⥬苣뮷諥鞁臣芀럦袐觧뚺뛦銂껥ꦸ臣㒧韦鎖鋦��臣龁胣趏뿥꺁胩財苣芵뫤뺁臣䲧⽃卍臣袂苣ꊃ菣뾂菣뎃苣鞁胣鶁臣貾胣랷郥ꦉ苣뢒駧뺹鯥閁臣龁胣鞚觨꺁껦ꎸ苣㆒洰꺁苣뾂菣벃菣ꮁ뫦ꎧ臣鮁胣㚁洲⡧⸰ㄷ洵潭⥬臣뢅賥麃菣겂菣⢳湍㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵⤾苣늩苣뾂菣벃菣뚺뛦ꮁ룤ꚺ臣뮷諥鞁臣芀迥鲿臣薁臣랷郥ꦉ苣꒮룦ꞁ㔱駦鎖鋦貋臣龁胣뮂菣ꒂ菣醃菣覃苣ꢔ臣ꚁ胣趸뫦Ꞁ鷦首苣뺿臩鞁臣貾胣뺿뛦銂룦Ꞝ룤ꞁ鋨몙臣鮁臣芀髦늉臣议룦銂卉佃臣袂苣ㆋ朲䠠랂菣ꮂ苣ꮃ潇摬删摥卩灥苣ꦃ菣⢠该超뫦몇颃苣떂菣궸臣㖮볯銆㔹볯ꊅ藩ꢂ菣ꮃꞁ닧붣臣龁胣鮸鳥许臣莿룧鞁臣貾胣鞲铧邈觧⢩듧㢄薼듧讲銂〵⁧ㅃ‸煁䜠汯ꮂ菣ꂃ뺋藩뚺蟥㪺냦궸臣ㆮ鲀㔹볯䶅䍥膀룤릖臣カ〮薼藩뢅ꞁ蛥뺲ꏨ鞁臣芀듧讲臣뮔裥銂郥辂臣膀菣ꦃ苣ꊂ苣릂룤ꞁ蟥邵臣鮁胣趇뗧뺹蟧閁臣讂臣膀ㅒⴴ潂貁뿦蒁뗨늉臣몛뷤⢓㘳杭胣㊁薼ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䶂㩓䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰳猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾㰵猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔱⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㦁㌸㐮㬴껥겸胥㦤㐸㐮䴨䠫芀戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㘸㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖 隌郥ꦉㅒ꺁郥邈›ㅒⴴ潂⡣〳杭胣め〮洳潭⥬苣咒䅆ꊂ苣袃菣袃菣ꮃ뒰〨㈮洵⽌洵⽌洵⥌臣랷郥ꦉ臣꒮룦ꞁ〲駦鎖蟥蚐臣讂臣膀賥袐觧助㐱臣鞾苣貂臣芀迥鲿럦袐觧銂卉佃苣릂菣ꂃ뺋藩뚺蟥㪺냦궸臣ㆮ薼胣㆜〰볯䶅䍥膀룤릖臣カ〮薼藩뢅胣㎁蚈雩⦓臣袂苣ㆋ⸵朵䌠㠱䄠⹱䜠汯ꮂ菣ꂃ臣뺲ꏨ鞁臣芀铧邈觧銂郥覜臣讂铧蚈苣袐苣鮁胣覃菣ꒂ苣ꒂ苣誸臣趇뗧閁臣膀룤ꦙ蟥邵매ꖇ臣鮁苣ꢁ胣ꢡꇩ隌郥ꦉㅒ⠴〱杭胣㎁薼貁뿦蒁뗨늉臣몛뷤ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䶂㩓䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾㰸猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰷猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌱⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㢁㌸㐮龮룦ꒀ㠸⸴⠳⭍⥈胣ં䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㜳㩃룤鎖뷤劓㌱臣覂臣麡볤鎽ㅒ꺁ꫨ붣㰩牢ਾ†賥袐觧助㐱臣袐裦㪐菣覃菣궂苣ꊂ菣ꪃ菣劳㌱㔨洵膀⸰㈱㠷浭汯銂郥肂룤閺菣ꦃ苣뎂臣膀菣ꮃ苣뎃ㄨ㔮䱭誏臣ꪃ菣ꆂ菣ꒂ苣뎃⡓㜶杭胣め〮㔹洶潭⥬苣뮷諥鞁臣芀迥鲿럦袐觧銂蚈雩薶鿩ꊳ蟥蚐臣ꚁ胣趏뿥랷郥ꦉ苣뚺꟨閁臣膀菣邃菣뮂菣뾂菣ꮁ苣誂꿥視臣膀苣ꮃ苣뎃臣醃菣뢂臣膀迥鲿뛦銂釥늛룦ꚺ臣릒详鞁臣芀ꖗ뻥膀苣蚁麛裥꺁菣覃菣궂苣ꊂ菣ꪃ菣⢳㔴杭胣めㄮ㐰洵潭⥬苣뮷諥鞁胣ㆁ韦鎖鋦貋臣龁胣趏뿥늶苣龜ꧧ궸臣莿룧鞁��膀菣ꮃ苣뎃苣꒙軥鞁胣䖁佴⡈洶⥌臣뚺꟨閁臣膀湍㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵⠾〲杭銂럦ꂊ臣龁胣㎂韦鎖鋦貋臣龁뻥膀迥鲿뛦銂鳧목룤ꞁ뿦꺸臣膀卉佃臣袂苣㒋朰䠠랂菣ꮂ苣ꮃ潇摬删摥卩灥苣ꦃ菣誸臣꺁苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣⢼该超뫦몇颃苣떂菣궸臣ギ蛢㆒〰볯ꊅ藩ꢂ菣ꮃꮁ苣誂닧붣臣龁胣钴닧ꪁ铧蚈苣뢒駧閁臣膀鳧목룤ꞁ매ꖇ臣鮁苣ꢁ胣ꢡꇩ隌郥ꦉㅒⴴ浆捯臣莿臣꒵觨꺁鯥鎽㌨洵膀㌳볯⦅臣鞁臣鞾苣貂臣芀卍䔨䥓胣鶃苣蚃苣隃㨩䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾㰳猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾㰷猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔱⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣ㆁ〱⸵㬴껥겸胥ㆤ〱⸶⠵⭍⥈胣ㆁ㈱⸸⠵⭍慎芀戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㘸㰹愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖 趉럥讨臣ꊂ菣뒂菣许臣䚮潭ⵣ菣閃苣麃苣랂菣ⶳ菣骃菣뢂菣ⶳⵏ菣Ꞃ菣벃菣劫㐱䘭潭⡣㔳杭胣め〮㘳洱潭⥬臣亮丬뢂菣膃菣鮃菣ꂃ苣龃菣⢉䵄膀洱⥌鋦貋뫦늶苣㊒볯钃菣ꪃ苣뎃㌨㔮杭胣め㈮䱭胣め〮ㄴ洱潭⥬臣䒮䙍뫦늶臣ꚇ郧鞁胣趏뿥늶苣ꢑ鯥ꦸ뫥ꞁ鋦貋臣龁胣㊂駦鎖뻥膀迥鲿뛦銂卉佃苣릂菣ꂃ뺋藩뚺蟥㪺냦궸臣ギ胣㆜〰볯䶅䍥膀룤릖臣カ〮薼藩뢅胣㎁蚈雩⦓臣袂苣㖋朰䌠㠱删摥卩灥䜠汯ꮂ菣ꂃ臣鶁臣뺁臣뺲ꏨ鞁臣芀铧邈觧銂郥覜臣讂铧蚈苣袐苣鮁胣覃菣ꒂ苣ꒂ苣誸臣趇뗧閁臣膀룤ꦙ蟥邵매ꖇ臣鮁苣ꢁ胣ꢡꇩ隌郥ꦉㅒ貁뿦蒁뗨늉臣몛뷤⢓㈱杭胣㒁薼ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䶂㩓䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾㰸猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰷猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌱⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㢁㌸㐮龮룦ꒀ㠸⸴⠳⭍⥈胣㲂牢ਾ䐼噉邀賥隼볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰〷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㠳麡볤鎽ㅒ愶胣劜㘱꺁郥邈㰩牢ਾ†菣閃苣麃苣랂菣麡볤鎽ㅒ愶胣劜㘱銂胣许臣릂苣벃菣加ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀迥뎁룤風臣袂臣ꮁ胣ꪃ菣ꆂ菣ꒂ苣뎃讁苣袐裦鞁臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㜸㰱愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖⠊껥붖뻤㎋䄸›摐꟨銪臣袂苣例ꊂ菣궂菣隌刨㘱鲀ㅒ挶㨩㰩牢ਾ†賥袐觧助㔱臣袐裦芀苣ꮃ苣뎃룤꺁껥ꦸ臣㢮洰꺁菣ꮃ苣뎃룤꺁菣閃苣麃苣랂菣厳㈨〮膀⸲㜸浭汯꺁鋦貋뫦늶臣膀ⴲ苣龃菣ⶎⴵ菣궃菣閃苣躃菣ꮃ〨㔮朴胣㊁㠮洷潭⥬苣뮷諥鞁臣芀ꧨ뚺뛦銂껥ꦸ臣㊧韦鎖鋦貋臣龁胣鶁臣貾胣趏뿥랷郥ꦉ苣뢒駧뺹鯥閁臣膀髦늉臣议룦銂〲䱭臣ꢂ苣躃菣ꮃ臣뚺꟨閁臣��膀〳洰꺁藩隌菣뎃苣뎃䴨佮猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢銂ꧨꢂ苣躃菣ꮃ뫦늶臣肸뫥ꮁ럦ꂊ臣龁胣趏뿥꺁臩蒁럦袐觧銂胣ꊂ菣뒂菣许胣꒮룦ꞁ㔱駦鎖鋦貋臣龁胣뮂菣ꒂ菣醃菣覃苣ꢔ臣ꚁ胣趸뫦Ꞁ鷦首苣뺿臩鞁臣貾胣뺿뛦銂룦Ꞝ룤ꞁ鋨몙臣鮁臣芀髦늉臣议룦銂卉佃臣袂苣ㆋ〲⁧偈苣ꪃ苣늂菣䞫汯⁤敒楤敓ꮂ菣ꂃ뺋藩뚺蟥㪺菣궂苣뎃룤꺁銆㔹볯䖅⥁臣뺲ꏨ鞁臣芀듧讲臣뮔裥銂鋨몙臣鮁胣龜ꧧ궸臣뺹蟧閁臣讂臣膀ꇨ財賥袐觧助㔱臣莿臣꒵觨꺁鯥鎽ㄨ㘮膀㔶볯⦅臣鞁臣鞾苣貂臣芀卍䔨䥓胣鶃苣蚃苣隃㨩䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾㰳猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾㰷猯扵䈾乲猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌱⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㢁㈶㈮㬳껥겸胥㢤㌶ㄮ迥뎁㘸⸵⠱⭍⥈胣㢁㔸ㄮ迥뎁㠸⸸⠰⭍慎芀戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㜸㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖 隌郥ꦉㅒ愶臣袐裦芀畂档慷摬匠‮⹌苣꺁雦꺌伨杲‮敌瑴‮〲㠱‬〲‬㔱〸ꮁ苣ꎁ臣놠釥閁苣龁郥颧臣릖돦銂铧蒁臣膀菣ꦃ苣Ꚃ菣ꚧꫥꮁ苣讂룤骴苣ꮃ苣벃菣ꢁ賥袐觧助㔱臣꺁ⵃꮂ菣鞃菣뎃苣銂ꇨ財賥袐觧助㘱鲀ㅒ挶臣ꦈ铧鞁臣芀鋦貋귥銂若袁胣릂苣ꪃ菣벃苣ꎃ菣鞃臣蚯雩閁苣龁覃菣ꂃ臣ꪂ菣隃菣뺹蟧鞁臣릂苣ꪃ菣벃菣莃菣ꚩ꣩ꆮ臣膀賥袐觧助㔱㐨洰膀⸰㐰㌶浭汯胣ㆁ〮鎽蟩⦏胣㊁⠭苣ꆃ菣ꮃ苣龃菣⦎苣뾂菣ⶳⴱ苣벃菣⢫㈴杭胣め㐮㈶浭汯胣ㆁ鎽蟩⦏胣璁畂牂瑥側潨⁳摐䜠ⴳ菣ꦃ菣떂苣꾂菣⢫ㄱ㠮杭胣㎁洰汯볯⦅胣誏臣亳佡⵴畂㔨杭胣め〮ㄵ浭汯胣ㆁㄮ뷥辇銂諦ꖅ臣龁胣趏뿥ꆮ苣뮂菣뾂菣ꞁ蛥뎁鏨銂臣膀ꏨ肝臣貂臣鶇臣뒩苣讖臣ꚁ軦鞰臣膀苣ꮃ苣뎃苣薅ꇥ鞁鯧鞁鎁臣鞃菣뮂苣銂麛맧誂뿨鞁臣⦟胣鶁臣貾胣랂菣뎃苣ꮁ苣誂ⰱⴴ苣ꪂ苣떂菣⢳⸲洰⥌苣뮷諥鞁臣芀迥鲿뛦銂胣ꊂ菣뒂菣Ꞝ룤膀닦뒵룤膀㔵뇂莄臣ㆧ芙雩ꂊ蛧鞁胣趏뿥늶苣꒮룦ꮁ蛥뒍臣鮁臣誁臣膀臣꺁뻥膀苣ꦃ苣袃뮙賩蚕꣦⦙臣醃菣覃臣骀臣ꚁ뿦躁臣膀瑅䅏ꞁ臣馁臣ꂁ胣鞲鷦首苣龜ꧧ궸臣莿룧鞁胣ㆁ⸵朵䌠㠱䄠ⁱ潇摬苣ꦃ菣⢠该超뫦몇뒰룤꺁〱胣㦜薼敍乃胣ꆸ雦ꮁ⸰㔰볯ꊅ藩⦸臣뺲ꏨ鞁臣芀铧邈觧뮔裥銂郥辂臣膀菣ꦃ苣ꊂ苣릂룤ꞁ蟥邵臣鮁胣趇뗧뺹蟧閁臣讂臣膀ꇨ財賥袐觧助㘱貁뿦蒁뗨늉臣몛뷤⢓㈱㔮杭胣㎁薼ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䶂㩓䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾㰷猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰷猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌱⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㢁ㄷ㌮㬹껥겸胥㢤㈷㌮䴨䠫膀㜸⸰⠲ⵍ⥈胣㲂牢ਾ��噉邀賥隼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㌷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧助㘱꺁郥邈胣릒详邭苣馂臣膀苣꾂菣ꖃ菣궂菣莃菣ꞁ꿥視臣貂臣㢟䱭臣ꪂ菣隃菣뺹蟧鞁臣릂苣ꪃ菣벃菣莃菣邃苣ꊂ菣ꮁ胣隌郥ꦉㅒ⠵〴杭胣め〮㘴洳潭膀⸱〰뷥辇膀浆捯낂菣랂菣벃菣⢫㌱洱膀⸰㘴洳潭膀〱뷥辇膀⵴畂牂瑥側潨⵳摐䜭ⴳ菣ꦃ菣떂苣꾂菣⢫㘱杭胣め㐮뷥辇膀迥뎁㱋畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵倾㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯扵⠾〲杭胣め〮㐹洲潭膀⸲鎽蟩⦏苣閊藥鞁臣芀迥鲿菣ꒂ苣ꮃ臣ꦃ菣벃苣鞃苣ꂃ臣讓苣鞁胣薣鷧閁苣龁蟩ꞁꧧ銂雩醁臣銎냦鞁胣ꊂ菣뒂菣銂藥ꮡ臣뒛臣⢗臣꺁菣궃苣릂苣㊒鯥낹苣钿臣龁膀臣꺁뻥膀苣ꪃ菣뢂臣袂苣ㆊ㐬뢂苣궂苣뎃㈨〮䱭銂럦ꂊ臣龁胣趏뿥늶苣膀苣ꮃ苣뎃鳥许胣銃菣蚃苣뎃苣隃菣莃苣궸胣㚁莄臣ㆧ芙雩ꂊ蛧鞁胣趏뿥늶苣꒮룦ꮁ蛥뒍臣鮁臣誁臣膀臣꺁뻥膀苣ꦃ苣袃뮙賩蚕꣦⦙臣醃菣覃臣骀臣ꚁ뿦躁臣膀敍䡏臣馁臣蒁臣芀닧邝雦銂鳧목룤ꞁ뿦꺸臣膀〵⁧ㅃ‸煁䜠汯ꮂ菣ꂃ뺋藩뚺蟥㪺냦궸臣㖮胣㆜〰볯䶅䍥膀룤릖臣カ〮薼藩뢅ꞁ닧붣臣龁胣龔裦ꦉ铧蚈苣袐苣鮁胣覃菣ꒂ苣ꒂ苣誸臣趇뗧閁臣膀蟥邵매ꖇ臣鮁苣ꢁ胣ꢡꇩ隌郥ꦉㅒ戶臣莿臣꒵觨꺁鯥鎽ㄨ洹膀㠳볯⦅臣鞁臣鞾苣貂臣芀卍䔨䥓胣鶃苣蚃苣隃㨩䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾㰰猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾㰳猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔱⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣ㆁ㘰⸵㬴껥겸胥ㆤ㘰⸶⠴⭍⥈胣ં䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧助㘱꺁郥邈胣趉럥讨臣隌郥ꦉㅒ戶㈨洶膀⸰㈰㐴浭汯銂䵄⡆洱⥌臣뚺꟨閁臣膀薼菣骃菣뢂菣⢳⸳洱膀⸰洲膀⸰㌰㘶浭汯꺁䵄뚺뛦ꞁ蟥蚐臣膀迥鲿뛦銂胣ꊂ菣뒂菣许胣ꢑ鯥ꦸ뫥ꞁ鋦貋臣龁胣㊂駦鎖뻥膀迥鲿뛦銂卉佃苣릂菣ꂃ臣袂苣㖋朰䌠㠱䄠ⁱ潇摬苣ꦃ菣⢠该超뫦몇뒰룤꺁鲀〱薼敍乃胣ꆸ雦ꮁ⸰㔰볯ꊅ藩膀〳裥鎖ꞁ臣꺁臣뺁닧붣臣龁胣龔裦ꦉ苣ꮐ鳦馁苣뮔裥銂郥辂臣膀菣ꦃ苣ꊂ苣릂룤ꞁ蟥邵臣鮁胣肸駦趇뗧뺹蟧閁臣讂臣膀ꇨ財賥袐觧助㘱貁뿦蒁鷩늉臣몛뷤⢓洹膀㐴볯⦅臣鞁臣鞾苣貂臣芀卍›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔴⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌵⼼畳㹢㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵伾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰳猯扵꺁꣨鞮胥膀㐸⸳㬴껥겸胥㢤㐴㐮䴨䠫膀㐸⸲⠳ⵍ⥈胣㲂牢ਾ䐼噉邀賥隼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㐷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧助㘱꺁郥邈胣릒详邭苣馂臣��膀苣꾂菣ꖃ菣궂菣莃菣ꞁ꿥視臣貂臣㢟䱭臣ꪂ菣隃菣뺹蟧鞁臣릂苣ꪃ菣벃菣莃菣邃苣ꊂ菣ꮁ胣隌郥ꦉㅒ⠵〸杭胣め〮㈹洶潭膀⸱〰뷥辇膀浆捯떂菣뎂苣躃菣ꮃ㈨㔷杭胣め㤮㘲洲潭膀〱뷥辇膀⵴畂牂瑥側潨⵳摐䜭ⴳ菣ꦃ菣떂苣꾂菣⢫〴杭胣め㔮뷥辇膀迥뎁㱋畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵倾㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯扵⠾㤳杭胣めㄮ㔸洲潭膀鎽蟩⦏苣閊藥鞁臣芀迥鲿菣ꒂ苣ꮃ臣ꦃ菣벃苣鞃苣ꂃ臣讓苣鞁胣薣鷧閁苣龁蟩ꞁꧧ銂雩醁臣銎냦鞁胣ꊂ菣뒂菣銂藥ꮡ臣뒛臣⢗臣꺁菣궃苣릂苣㊒鯥낹苣钿臣龁膀臣꺁뻥膀苣ꪃ菣뢂臣袂苣ㆊ㐬뢂苣궂苣뎃㌨〮䱭銂럦ꂊ臣龁胣趏뿥늶苣膀苣ꮃ苣뎃鳥许胣銃菣蚃苣뎃苣隃菣莃苣궸胣㚁莄臣ㆧ芙雩ꂊ蛧鞁胣趏뿥늶苣꒮룦ꮁ蛥뒍臣鮁臣誁臣膀臣꺁뻥膀苣ꦃ苣袃뮙賩蚕꣦⦙臣醃菣覃臣骀臣ꚁ뿦躁臣膀敍䡏臣馁臣蒁臣芀닧邝雦銂鳧목룤ꞁ뿦꺸臣膀〵⁧ㅃ‸煁䜠汯ꮂ菣ꂃ뺋藩뚺蟥㪺냦궸臣㖮胣㆜〰볯䶅䍥膀룤릖臣カ〮薼藩뢅ꞁ닧붣臣龁胣龔裦ꦉ铧蚈苣袐苣鮁胣覃菣ꒂ苣ꒂ苣誸臣趇뗧閁臣膀蟥邵매ꖇ臣鮁苣ꢁ胣ꢡꇩ隌郥ꦉㅒ挶臣莿臣꒵觨꺁鯥鎽㐨洹膀㤴볯⦅臣鞁臣鞾苣貂臣芀卍›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢ㄶ⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔶⼼畳㹢㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵伾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰵猯扵꺁꣨鞮胥膀〱㤷㐮龮룦ꒀ〱〸㔮䴨䠫芀㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 隌郥ꦉㅒ收臣袐裦芀觥ꖷ꣧꺁賥袐觧助㘱⡣㤴杭胣め〮㔴浭汯銂䵄⡆洱⥌臣뚺꟨閁臣膀薼菣骃菣뢂菣⢳⸷洷膀⸰㔴䱭胣め〮ㄹ浭汯꺁䵄뚺뛦ꞁ蟥蚐臣膀迥鲿뛦銂胣ꊂ菣뒂菣许胣ꢑ鯥ꦸ뫥ꞁ鋦貋臣龁胣㊂駦鎖뻥膀迥鲿뛦銂卉佃苣릂菣ꂃ臣袂苣㖋朰䌠㠱䄠ⁱ潇摬苣ꦃ菣⢠该超뫦몇뒰룤꺁鲀〱薼敍乃胣ꆸ雦ꮁ⸰㔰볯ꊅ藩膀〳裥鎖ꞁ臣꺁臣뺁닧붣臣龁胣龔裦ꦉ苣ꮐ鳦馁苣뮔裥銂郥辂臣膀菣ꦃ苣ꊂ苣릂룤ꞁ蟥邵臣鮁胣肸駦趇뗧뺹蟧閁臣讂臣膀ꇨ財賥袐觧助㘱貁뿦蒁鷩늉臣몛뷤⢓㠱杭胣㒁薼ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䶂㩓䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾㰶猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰵猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌱⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㢁㜵㌮龮룦ꒀ㔸⸸⠳⭍⥈胣㲂牢ਾ䐼噉邀賥隼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㔷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ龮雦设㤳ꪃ菣ꆂ菣ꒂ苣뎃ꇩ벼뷤劓㜱臣袐裦⦐戼㹲 ꪃ菣ꆂ菣ꒂ苣뎃ꇩ벼뷤⢓ㅒ⤷苣蒂藥ꊂ菣躃賥꺁뷤ꢔ臣袂苣隌郥ꦉㅒ讁苣袐裦鞁臣芀껥ꦸ臣ㆮ〮䱭臣ꆄ냦䒴䵃룤꺁賥袐觧助㐱㤨杭胣め〮〱洲潭⥬迥뎁菣ꦃ菣ꮃ菣ꊂ菣螃菣覃ㄨ㔮洲��⸰㔰洱潭⥬臣뚺뛦ꮁ胣亁䉡⡈䅏⥣猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢㐨㌮浭汯胣め〮〲洴潭⥬苣뮷諥鞁臣芀럦袐觧銂芙雩릒详鞁臣芀迥鲿菣궃苣릂苣䲒⽃卍臣袂苣ꊃ菣뾂菣뎃苣馁苣ꢁ胣肉鳦꺁铧邈觧貁뻥覂苣龁胣鞲迥鲿럦袐觧銂鲀뒻臣뒰臣뮷諥ꮁ苣誂苣ꢂ菣膃臣龁胣ꢅ臣꺁迦몙胦ꦉ돨銂룦Ꞝ룤ꞁ駩뮎臣膀臣꺁뻥膀䵄体〨㔮䱭ꞁ룥袇臣龁胣鞲럦袐觧銂裥随偈䍌䜨浥湩膀층涼胣ㆁ〵浭韃〳浭胣뚺鯩ꒉ뒰룤꺁〱胣㦜薼敍乃胣め〮薼捁䡏ꮁ苣誂닧붣臣膀듧讲臣뮔裥銂郥辂臣膀蟥邵매ꖇ臣鮁苣ꢁ胣㚁杭㘨薼꺁ㅒ貁뗨뾁臣讁臣龁鯥鎽臣鞁臣鞾苣貂臣芀卍䔨䥓胣鶃苣蚃苣隃㨩䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾㰹猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰹猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌱⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㢁㜹㐮㬰껥겸胥㢤㠹㐮䴨䠫芀戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㜸㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣隌볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㜸㰷愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖⠊껥붖뻤㒋⤰戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㜸㰸愯㰾䐯噉ਾ 겜껥붖뻤꾁胣ꢡꇩ隌郥ꦉ㉒銂ꫨ붣臣讂臣膂뷤ꢔ臣貂苣ꪃ菣ꮂ菣骃苣궃菣覃賥ꚭ苣風볨鞁臣蒁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 隌郥ꦉㅒ㨸ꇨ財賥袐觧銂胣傁呃鯥鮚蟥颡곧㊬㄰ㄴ㔴㤰랏臣讉ꃩ銂铧蒁臣뾪ꏨ鞁臣芀整瑲隃菣ꮃ⠨⥓ㄭ⠭⠨⥓ㄭ⠭㐨⠭菣覃菣궂苣ꆃ菣ꮃ閃苣讃菣⦫苣龃菣⦎ㄭꪂ苣붂㔭Ꚃ菣ꒂ菣骃菣뾂菣ⶳⴲ苣ꮃꊂ菣躃⴩ⴳ菣膃菣ⶫⴱ苣궂苣隃苣뎃㈭ꒂ菣⦫苣ꮃ菣ꆃ菣袃ㅒ愸㔨〰杭胣ㆁ〮洴潭⥬苣䎒㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵䌾⽎㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵伾启䅆㌨ㄺㄺ볯皝瘯瘯胣ㆁ洲⽌洴⽌洴⥌臣랷郥ꦉ臣뚺꟨閁臣龁胣趏뿥랷郥ꦉ苣꒮룦ꞁ㠴駦鎖鋦貋臣龁胣䲂䵃ꮁ苣誂迥鲿臣늀ꇨ貁뗧蚺臣ꚁ臣讂臣ꢁ臣躘苣讁臣閁苣龁胣龜ꧧ궸臣莿룧鞁臣貾胣鞲铧邈觧助㠱⡢⸰朹맦꒽銂胣鶁苣ꖻ룤뺲ꏨ馁苣鎁臣ꪁ臣膀곦꺁럥讨臣鶁臣뺁臣뾽铧鞁臣芀卍䔨䥓胣鶃苣蚃苣隃㨩䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰸猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾㰹猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯扵꺁꣨鞮胥膀㜳⸹㈲龮룦ꒀ㠳⸰⠲⭍⥈胣ં䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†ㅒ戸㜨〰杭胣ㆁ㐮洷潭膀⸱鎽蟩⦏臣뒰㠨䱭뚺뛦銂洲꺁냦Ꞁ慎䍈㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵뚺뛦ꞁ莄臣貸蟩鞁胣랷郥ꦉ瀨鶼⸸⤰苣㆒洰꺁苣뮂菣讃菣ꪃ菣궸臣芸단꺁ⰲⴵ苣ꪂ苣붂菣궃菣뢂菣ⶳⴱ苣ꮃ㘠⠭ⰲ��苣ꪂ苣붂㈭㔬뢂菣覃菣ⶭ䠱钃菣벃菣ⶫⴱ苣ꮃ颃苣떂菣ꢂ菣袃㐨㠰杭胣め㤮뷥辇ꞁ蟥蚐臣龁胣趏뿥貁뗧蚺臣讂臣ꞁ胣뢇뿦늶苣꒮룦ꞁ㘱駦鎖鋦貋臣龁胣鞲铧邈觧銂룦Ꞝ룤ꞁ뿦꺸臣膀䵄体㔨䱭ꞁ룥袇臣龁胣鞲铧邈觧銂卉佃ㄠ〵⁧ㅃꮂ菣ꂃ뚺鯩ꒉ뒰룤꺁〱胣㦜薼敍乃胣䆁佣궸⸰㔰볯⦅臣袂苣뺲ꏨ鞁臣芀듧讲臣뮔裥銂臣辂臣膀蟥邵매ꖇ臣鮁苣ꢁ胣㎁㠶杭㐨薼꺁賥袐觧助㠱臣붙觨꺁鯥鎽臣鞁臣鞾苣貂臣芀卍䔨䥓胣鶃苣蚃苣隃㨩䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾㰸猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾㰰猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰷猯扵꺁꣨鞮胥膀㜵⸲〳龮룦ꒀ㜵⸳⠶⭍⥈胣⢁䴲䠫膀ㄱ㔴㤮胣㲂牢ਾ䐼噉邀賥隼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㤷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧助㤱꒮룦꺁ㅒ⠸〱洰膀⸰㜱洴潭膀⸱鎽蟩⦏臣릒详뚺뛦ꮁ胣麃苣꾂菣랂菣뎃苣銂铧蒁臣膀体汃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢ㄨ츴䲼胣めㄮ㈹浭汯胣ㆁㄮ뷥辇銂苣ꎁ臣誂臣뮷諥鞁臣芀苣ꦃ菣벃迥鲿럦袐觧銂⸱芙雩릒详鞁胣䲁⽃卍臣袂苣蚈黦閁苣龁苣ꪃ苣벃菣꾁胣肉鳦꺁苣꺁臣ꊽ裦銂ꓧ鞁臣芀닧랷郥ꦉ苣莿룧鞁臣膀藥ꚁ臣꺏駧Ꞁ觧ꪳ苣鮸鳥许臣꒙軥鞁臣芀럦袐觧銂洲꺁䵄体臣貸蟩鞁胣뺲ꏨꢔ臣䦮䍓⁏ㅃ‸煁㔠朰苣ꦃ菣⢠냦궸臣ㆮ鲀㔹볯䶅䍥膀⸰㔰볯䆅佣⥈臣薅ꇥ鞁臣芀듧讲臣뮔裥銂郥辂臣膀蟥邵매ꖇ臣鮁苣ꢁ胣㞁洲⡧ㄷ볯⦅臣劮㤱臣ꪂ菣鮃菣ꒂ菣늉臣몛뷤ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䶂⡓卅膀菣뢂菣ꎂ菣⦖›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㠲⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㤳⼼畳㹢汃㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰶猯扵伾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㖁〹㈮㬶껥겸胥㖤ㄹ㌮䴨䠫膀ㄱㄸ㔮㈨⭍⥈胣㲂牢ਾ䐼噉邀賥隼볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰〸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧助〲›覃菣ꂃ臣邃苣ꊂ菣궸臣劮㤱ㄨ⸳洵膀⸰㈰㠲浭汯胣ㆁ㈮뷥辇膀ㅒ愶ㄨ⸶洶膀⸰㄰〹浭汯胣ㆁ〮뷥辇膀迥뎁慎⡉㐱㈮杭胣め〮㔹浭汯꺁럦袐觧銂洱꺁蓧뒰䵄ꮁ뫦ꎧ臣鮁臣芀꟨銪蟩⢏〱볎⥌臣ギ㔮⁍䥄䕐꺁䵄뚺뛦銂苣ꪃ菣뢂臣袂苣뮷諥鞁臣芀럦袐觧銂胣릲뗦궸胣㖁莄臣肸駦ꂊ蛧鞁臣芀䍌䴯ꮁ苣誂迥鲿臣芵뫤鞁胣肉鳦꺁铧邈觧貁뻥覂苣龁胣랷郥ꦉ苣㒒蓢ꮁ蛥뒍臣膀洱꺁냦ꞁ룥袇臣龁胣뺿臩貾胣鞚觨꺁닧랷郥ꦉ苣䖒蚈迥䢖䱐ꮂ菣ꂃ䜨浥湩膀층涼胣ㆁ〵浭韃〳浭胣뚺鯩ꒉ뒰룤꺁〱胣㦜薼敍乃胣め〮薼捁䡏ꮁ苣誂닧붣臣龁胣钴닧ꪁ铧蚈苣袐苣鮁胣趇뗧뺹蟧閁臣讂臣膀㐱㘮杭㔨薼꺁㉒貁뿦蒁뗨늉��몛뷤ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䶂⡓卅膀菣뢂菣ꎂ菣⦖›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔷⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㘹⼼畳㹢㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰹猯扵伾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰹猯扵㰾畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰫猯灵꺁꣨鞮胥膀㐱㘲㘮㬸껥겸胥ㆤ㈴⸷⠳⭍⤱迥뎁㐱㔲㔮䴨ㄭ芀戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㠸㰱愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣隌볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㠸㰲愯㰾䐯噉ਾ 隌郥ꦉ㉒㨱㈠菣ꦃ菣꺁菣ꒂ苣ꮃ룤꺁ㅒ⠹〲杭胣め〮㐳洹潭膀⸱鎽蟩⦏胣ꪃ菣ꆂ菣钃苣뎃㈨⸵洸膀⸰㌰㐱浭汯胣め㤮뷥辇膀迥뎁慎⡉㤳杭胣め㈮ㄶ浭汯꺁럦袐觧銂洱꺁蓧뒰䵄ꮁ뫦ꎧ臣鮁臣芀럦袐觧銂胣릲뗦궸胣㖁莄臣肸駦ꂊ蛧鞁臣芀䍌䴯ꮁ苣誂迥鲿臣芵뫤鞁臣蒁苣鎁臣貁飦覂臣ꮁ臣貂臣芀럦袐觧銂莄臣랆跥鞁胣ㆁ䱭臣뒰臣貸蟩鞁臣芀뿦躁뻥膀髦늉臣鞲럦袐觧銂婅裥随偈䍌苣ꦃ菣⢠敇業楮胣㖁볎膀㔱洰썭㎗洰膀뫦ꊛ觥㪤냦궸臣ㆮ鲀㔹볯䶅䍥膀⸰㔰볯䆅佣⥈臣袂苣뺲ꏨ鞁臣芀듧讲臣뮔裥銂郥辂臣膀〳駦鎖蟥邵매ꖇ臣鮁苣ꢁ胣㊁洲⡧ㄵ볯⦅臣劮ㄲ臣꒵臣貁臣ꎁ臣蒻觨꺁鯥鎽臣鞁臣鞾苣貂臣芀卍䔨䥓胣鶃苣蚃苣隃㨩䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㜾㰱猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㤾㰷猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰰猯扵伾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰸猯扵㰾畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰫猯灵꺁꣨鞮胥膀㌱㜷㜮㬰껥겸胥ㆤ㜳⸷⠶⭍⥈胣㲂牢ਾ䐼噉邀賥鞼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㌸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀賥鞼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㐸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ†賥袐觧助㌲鶁臣貾胣ꆄ냦䒴䙍ㄨ㔮䱭궸臣劮㈲ㄨ〰杭胣めㄮ㐴浭汯誏臣劳㠱⡢㈸杭胣め㈮㜱浭汯꺁럦袐觧銂胣麃苣꾂菣랂菣뎃苣ꮁ苣誂胣䒁䕉⡁〵볎膀⸰㠲洸潭⥬臣ꚇ郧鞁臣芀迥鲿럦袐觧銂껥ꦸ臣㊧駦鎖鋦貋臣膀䍌䴯ꮁ苣誂㉒貁뻥覂苣讂臣ꢁ臣躘苣讁臣閁苣龁胣鞲럦袐觧銂卉佃䌠㠱ㄠ〰⁧煁苣ꦃ菣⢠뫦ꊛ觥㪤냦궸臣ㆮ鲀㔹볯䶅䍥膀捁䡏룤꺁⸰㔰볯⦅臣袂苣뺲ꏨ鞁胣钴닧ꪁ铧蚈苣袐苣鮁胣趇뗧뺹蟧閁臣讂臣膀㐸㐮杭㘨薼꺁㌲臣鞾苣貂臣芀卍䔨䥓胣鶃苣蚃苣隃㨩䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾㰴猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㜾㰱猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㜾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㘱⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㦁㌵㔮㬰껥겸胥㦤㐵㐮䴨䠫膀㜹⸶⠴⭍慎膀㔹⸲⠴ⵍ⥈胣㲂牢ਾ䐼噉邀賥鞼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㔸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ��賥袐觧助㐲꒮룦꺁菣ꒂ苣ꮃ룤꺁㉒⠳㔱杭胣め〮㔱洷潭膀⸱鎽蟩⦏臣릒详뢇뿦늶臣膀菣ꒂ苣궃苣ꪃ菣뢂臣袂苣膀体汃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢ㄨ㌮볎膀⸰㄰㌷浭汯胣ㆁㄮ뷥辇銂苣ꎁ臣誂臣뮷諥鞁臣芀芙雩貾胣䲁⽃卍臣袂苣蚈黦閁苣龁苣ꪃ苣벃菣꾁胣肉鳦꺁铧邈觧꺁뷥邈苣몤臣龁胣鞲럦袐觧銂뿦꺸臣ꚁ胣ꢅ臣꺁迦몙胦ꦉ돨銂룦Ꞝ룤ꞁ駩뮎臣龁胣鞲럦袐觧銂⸰洸꺁敍乃臣貸蟩鞁胣䖁⁚裥随偈䍌苣ꦃ菣ꮁ藥ꮡ臣膀뫦몇臣鮁臣⢟敇業楮胣㖁볎膀㔱洰썭㎗洰膀뫦ꊛ觥㪤냦궸臣ㆮ鲀㔹볯䶅䍥膀⸰㔰볯䆅佣⥈胣钴닧ꪁ铧蚈苣袐苣鮁胣趇뗧뺹蟧閁臣讂臣膀⸹洵⡧㌶볯⦅臣劮㐲臣ꪂ菣鮃菣ꒂ菣늉臣몛뷤ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䶂⡓卅膀菣뢂菣ꎂ菣⦖›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㐴⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〷⼼畳㹢汃㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰷猯扵伾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰵猯扵꺁꣨鞮胥膀㜹⸱㘴龮룦ꒀ㜹⸲⠴⭍⥈胣㦁㐹㐮䴨丫⥡胣㦁〷㌮䴨ㄭ芀㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 隌郥ꦉ㉒㨵ㄠ菣ꦃ菣꺁菣ꒂ苣ꮃ룤꺁㉒⠴⸹洵膀⸰〰㜹洶潭膀⸱鎽蟩⦏胣劁㘱⡡⸸ㄵ杭胣め〮㤰㘷浭汯胣ㆁ〮뷥辇膀迥뎁慎⡉⸷洳膀⸰㐰㠸浭汯꺁럦袐觧銂洱꺁蓧뒰䵄ꮁ뫦ꎧ臣鮁臣芀꟨銪蟩⢏〲볎⥌臣ギ㔮⁍䥄䅅臣䒮䙍뫦늶苣랂菣뎃苣ꮁ苣誂럦ꂊ臣龁胣랷郥ꦉ苣膀닦뒵룤膀㔵蓢ꞁ룤ꦙ諥놆臣龁胣䲂⽃卍臣袂苣趏뿥貁뗧蚺臣膀触鮜臣龔裦ꦉ臣鞾苣貂臣芀럦袐觧銂냦뒵룤ꞁ蛥뒍臣膀洱꺁냦ꞁ룥袇臣龁胣뺿臩貾胣鞚觨꺁닧랷郥ꦉ苣䖒蚈迥䢖䱐ꮂ菣ꂃ䜨浥湩膀층涼胣ㆁ〵浭韃〳浭胣뚺鯩ꒉ뒰룤꺁〱胣㦜薼敍乃胣め〮薼捁䡏ꮁ苣誂닧붣臣龁胣钴닧ꪁ铧蚈苣袐苣鮁胣趇뗧뺹蟧閁臣讂臣膀⸷洴⡧㈴볯⦅臣劮㔲臣莿臣꒵觨꺁鯥鎽臣鞁臣鞾苣貂臣芀卍䔨䥓胣鶃苣蚃苣隃㨩䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㤾㰱猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㜲⼼畳㹢㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〱⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㠲⼼畳㹢猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰⬾⼼畳㹰臣袨껧ꒀ胣ㆁ〸⸷㠸龮룦ꒀ㠱㠰㠮䴨䠫誏臣ㆳ〸⸶⠵ⵍ⤱胣㲂牢ਾ䐼噉邀賥鞼볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㘸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设ㄴ㰩牢ਾ䐼噉邀賥鞼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㜸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ†賥袐觧助㘲›㔳洰꺁蓧뒰䍄궸臣㊮㘬뢂菣袃苣랂苣讃菣뎃㤨〮膀㠵㜮浭汯胣ㆁ〮뷥辇꺁鋦貋뫦늶臣膀〳裥鎖臣醁臣膀〵䱭臣ꆄ냦䒴䵃룤꺁牂猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢뫦늶苣㒒蓢ꞁ믦ꂊ臣龁胣붿諥꺁〲洰銂苣ꦃ菣벃臣뮷諥鞁臣膀跥螝룤ꪁ뫦늶苣늍뻥鞁臣芀迥鲿럦袐觧銂껥ꦸ臣��駦릒详鞁臣芀뿦蒁賨늉臣랷郥ꦉ苣㒒蓢ꮁ蛥뒍臣膀⸱䴰丠佡뚺뛦⢲듧ㆄ〰䱭꺁럦ꂊ臣袂苣炊鶼〱胣㆜ꮁꇥ몟胦隌臣龁胣랷郥ꦉ苣㊒〰䱭臣䒮䵃臣貸蟩鞁胣꒱苣蚈鯩鞁臣芀냦Ꞁ뇥銂䍄⡍郥袨〲洰⥌臣붊蟥鞁臣芀郥辂臣龁䍄꒱苣膀냦膀菣ꦃ苣뎃臣鞴뗦鞁胣亁㱡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵匾㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯扵誸臣뺹蟧閁臣龁胣龜ꧧ궸臣莿룧鞁臣貾胣鞲铧邈觧貁苣骁臣ꮁ뗨뾁臣讁臣龁鯥鎽臣鞁臣鞾苣貂臣芀껦ꎸ苣䒒䵃㠨䱭ꮁ뫦ꎧ臣鮁胣㊁〲⁧偈苣ꪃ苣늂菣䞫汯⁤敒楤敓ꮂ菣ꂃ臣薅ꇥ鞁胣䦁䍓⡏该超뫦몇颃苣떂菣궸臣㖮胣㦜薼䅅ꮁ苣誂닧붣臣膀듧讲臣뮔裥銂郥辂臣膀뫦銪苣龜ꧧ궸臣뢒駧閁臣龁胣몛뷤銂䍄誏臣颃苣떂菣ꞁ菣ꪃ菣ꖃ菣벃菣鞁胣뺿臩鞁臣芀苣閃菣꾃苣袃觨꺁鯥鎽苣龜ꧧ궸臣뺹蟧閁臣讂臣膀ꇨ財賥袐觧助㘲臣ꪂ菣鮃菣ꒂ菣늉臣몛뷤⢓⸹朴胣㞁薼ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䶂⡓卅膀菣뢂菣ꎂ菣⦖›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰸猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰰猯扵䈾乲㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵꺁꣨鞮胥膀㌲⸰㤹龮룦ꒀ㌲⸱誏臣㊳㐳〮䴨䠫芀戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㠸㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 隌郥ꦉ㉒㨷賥袐觧助㘲㈨㈮膀⸹㜴浭汯胣ㆁ〮뷥辇銂〱䱭臣ꆄ냦䒴䵃臣뚺꟨閁臣膀䉂㱲畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵뚺뛦銂〱裥鎖臣醁臣㒦蓢ꞁ믦ꂊ臣龁ㄨ洰膀⸱䴰臣䒮䵃뫦늶芀迥鲿臣몙蛧Ꞁ臣芁苣膀닦뾮苣龔裦閁臣龁胣붿諥辇臣䊮牂猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢㤨䱭胣㦁⸴洷潭膀〱뷥辇銂럦ꂊ臣膀迥鲿럦袐觧銂껥ꦸ臣肸駦릒详鞁臣芀뗨뾁臣讁臣龁蟦膿뛦銂䍌䴯ꮁ苣誂菣Ꞃ菣꾂臣ꚁ胣肉鳦꺁铧邈觧銂ꋧ趪臣龁胣趏뿥랷郥ꦉ苣㊒〵䱭菣ꦃ苣뎂臣뮧臣膀莄臣랆跥鞁臣芀ꧨ랷郥ꦉ苣뒰臣躅蟩ꮁ苣ꢂ菣膃臣膀臣꺁뻥膀냦Ꞁꏩ貒慎䍈㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵뚺뛦ꞁ蟥蚐臣讂臣膀䡰볯㞝胣㢜臣鞾苣貂臣芀럦袐觧銂䍄ꞁ諦몇臣膀냦Ꞁ뇥銂莄臣랆跥馁苣ꢁ胣莿賨늉臣袲껦貁뻥覂苣龁胣랷郥ꦉ苣뺿臩鞁胣뚌觨꺁鯥鎽苣㆒洰꺁菣뾂菣벃菣ꮁ뫦ꎧ臣鮁胣亁㱡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵匾㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯扵誸臣뺹蟧閁臣讂臣膀触鮜臣龔裦ꦉ㉒⠷⸱朹胣ㆁ〰볯⦅臣鞾苣貂臣芀卍䔨䥓胣鶃苣蚃苣隃㨩䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰶猯扵䈾乲㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵꺁꣨鞮胥膀〲⸲㘹龮룦ꒀ〲⸴誏臣㊳㘰ㄮ䴨䠫芀戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦��㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㠸㰹愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 隌郥ꦉ㉒㨸껥ꦸ臣袃菣ꢂ菣⢳〲䱭誏臣咳䙈㈨洰⥌룤꺁賥袐觧助㜲〨ㄮ㘴膀⸰㈷浭汯꺁鋦貋뫦늶臣膀菣閃苣麃苣랂菣厳〨㔮膀⸰㈷浭汯銂럦ꂊ臣龁胣늩뫦늶苣꒮룦ꞁꖗ雩릒详馁苣ꢁ胣肉鳦꺁铧邈觧貁뻥覂苣龁胣뚺ꫥ銂鳧목룤ꞁ駩뮎臣膀髦늉臣议룦銂胣ㆁ洰꺁苣뾂菣벃菣膀臣꺁뻥膀〱洰꺁뫤뢅賥麃菣겂菣⢳湍㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵⤾臣뚺꟨閁臣龁胣趏뿥꺁臩蒁럦袐觧銂껥ꦸ臣㖧駦鎖鋦貋臣龁胣뮂菣ꒂ菣醃菣覃苣ꢔ臣ꚁ胣趸뫦Ꞁ鷦首苣뺿臩鞁臣貾胣뺿뛦銂鳧목룤ꞁ鋨몙臣鮁臣芀髦늉臣议룦銂卉佃臣袂苣ㆋ〲⁧偈苣ꪃ苣늂菣䞫汯⁤敒楤敓ꮂ菣ꂃ뺋藩뚺蟥㪺菣궂苣뎃룤꺁鲀㔹볯䖅⥁臣뺲ꏨ鞁臣芀듧讲臣뮔裥銂郥辂臣膀鳧목룤ꞁ鋨몙臣鮁苣ꢁ胣ꢡꇩ隌郥ꦉ㉒貁뿦蒁뗨늉臣몛뷤⢓㜲洰膀㌴볯⦅臣鞁臣鞾苣貂臣芀卍䔨䥓胣鶃苣蚃苣隃㨩䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾㰳猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾㰷猯扵䈾乲猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌱⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㢁㠷㈮㬳껥겸胥㢤㤷㈮迥뎁㠸⸰⠲⭍⥈胣㢁㠷ㄮ迥뎁㜸⸹⠱ⵍ⤱胣㲂牢ਾ䐼噉邀賥鞼볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰〹⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧助㤲릒详邭苣馂臣龁胣ꪂ菣隃菣뺹蟧鞁臣㢟䱭臣릂苣ꪃ菣벃菣莃菣邃苣ꊂ菣ꮁ胣隌郥ꦉㅒ⠵〶杭胣め〮㤶浭汯胣ㆁ〮鎽蟩⦏胣㊁⠭苣ꆃ菣ꮃ苣龃菣⦎苣뾂菣ⶳⴱ苣벃菣⢫ㄶ杭胣め㘮洹潭膀〱뷥辇膀⵴畂牂瑥側潨⵳摐䜭ⴳ菣ꦃ菣떂苣꾂菣⢫ㄳ杭胣め〮㐳洵潭膀⸰鎽蟩⦏胣誏臣䮳猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢佐猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢㌨洰膀⸰㐱洱潭膀⸲鎽蟩⦏苣閊藥鞁臣芀迥鲿菣ꒂ苣ꮃ臣ꦃ菣벃苣鞃苣ꂃ臣讓苣鞁臣芀苣鞃苣ꂃ臣薣鷧閁苣龁蟩ꞁꧧ銂雩醁臣銎냦鞁胣ꊂ菣뒂菣銂藥ꮡ臣뒛臣⢗臣꺁菣궃苣릂苣㊒鯥낹苣钿臣龁膀臣꺁뻥膀苣ꪃ菣뢂臣袂苣ㆊ㐬뢂苣궂苣뎃ㄨ㔮䱭銂럦ꂊ臣龁胣趏뿥늶苣膀苣ꮃ苣뎃鳥许胣㚁莄臣ㆧ芙雩ꂊ蛧鞁胣趏뿥늶苣꒮룦ꮁ蛥뒍臣鮁臣誁臣膀苣ꦃ苣袃뮙賩蚕꣦⦙臣醃菣覃臣骀臣ꚁ뿦躁臣膀敍䡏臣馁臣蒁臣芀닧邝雦銂鳧목룤ꞁ뿦꺸臣膀〵⁧ㅃ‸煁苣ꦃ菣⢠该超뫦몇뒰룤꺁〱胣㦜薼敍乃胣ꆸ雦ꮁ⸰㔰볯ꊅ藩⦸臣뺲ꏨ鞁臣芀铧邈觧뮔裥銂郥辂臣膀蟥邵매ꖇ臣鮁苣ꢁ胣ꢡꇩ隌郥ꦉ㉒貁뿦蒁뗨늉臣몛뷤⢓ㄲ杭胣㎁薼ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䶂⡓卅膀菣뢂菣ꎂ菣⦖›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㜴⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㜵⼼畳㹢㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺��睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵伾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ㰴猯扵꺁꣨鞮胥膀㠸⸷㠳龮룦ꒀ㠸⸸⠳⭍⥈胣㲂牢ਾ䐼噉邀賥鞼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰ㄹ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㈴ꪃ菣ꆂ菣ꒂ苣뎃ꇩ벼뷤劓㔳臣袐裦⦐戼㹲 ꪃ菣ꆂ菣ꒂ苣뎃ꇩ벼뷤劓㔳苣膀룤風臣袂臣ꮁ胣ꪃ菣ꆂ菣ꒂ苣뎃讁苣袐裦鞁臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㤸㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 隌郥ꦉ㍒㨱苣ꮃ苣뎃룤꺁賥袐觧助〳㈨〰杭胣ㆁ㤮〲浭汯꺁ⰱⴴ苣ꪂ苣떂菣⾳냦⢴⽶膀〱ㄺ胣ㆁ洱⥌뫦늶臣膀浆捯伭畓ㄨ㘳洰膀⸴㌰洲潭⥬苣뮷諥鞁臣芀芙雩릒详鞁臣貾胣䲁⽃卍裥邞臣袂苣膀迥鲿臣芵뫤鞁臣蒁苣鎁臣貁ꓧ閁苣龁胣趏뿥랷郥ꦉ苣붣鋥二䡡佃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢㔨䱭ꞁ蟥蚐臣膀瑅䅏⡣쌳㆗洵⥌臣붊蟥鞁臣芀臣꺁뻥膀郥辂臣龁鳦龩뇥銂菣ꦃ苣뎃ㄨ洰⥌臣ꚇ郧鞁胣뺹蟧閁臣⢛慎猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢体猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢膀鳧목룤ꞁ뿦꺸臣讂臣膀닧隌郥ꦉ㍒貁駧늉臣ꆳ諧ꦉ㠨〰杭胣㞁薼ꢁ臣ꚁ뻥覂苣膀臣貂苣膀臣貂믤誸닧붣臣讂臣ꢁ臣辁胣ꆬ臣ꖷ꣧ꞁ臣邁臣뾽铧鞁臣芀卍›㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㐳⼼畳㹢㱈畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㈳⼼畳㹢㱎畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵伾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㖁㠴㈮龮룦ꒀ㐵⸹⠲⭍⥈胣ં䐼噉邀볯颼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧助㈳ꊂ菣뒂菣许臣꒮룦꺁賥袐觧助⠸㘱洰膀⸰㔶洲潭⥬臣咮䙈㈨䱭릒详뚺뛦ꮁ胣ꊂ菣뎂菣ꮃ㍒⠱㌴洲膀⸰㠷洸潭⥬迥뎁偐㱨畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯扵⠾〳洸膀⸱㜱洴潭⥬苣뮷諥鞁臣芀臣꺁뻥膀䉄䑁㈨〷杭胣ㆁㄮ㐷浭汯꺁䡔⡆洱⥌뫦늶苣趏뿥랷郥ꦉ臣뒻諥鞁臣芀㔱駦鎖鋦貋臣龁뻥膀럦袐觧銂鋨몙매몛臣鮁胣议룦銂卉佃臣袂苣㒋朰䠠랂菣ꮂ苣ꮃ潇摬删摥卩灥苣ꦃ菣⢠该超뫦몇颃苣떂菣궸臣ギ胣㆜〰볯ꊅ藩ꢂ菣ꮃꞁ닧붣臣膀듧讲臣뮔裥銂鋨몙臣鮁胣龜ꧧ궸臣뺹蟧閁臣讂臣膀ꇨ財賥袐觧助㈳臣蒻觨貁臣ꎁ臣붙觨꺁鯥鎽㈨㘸杭胣㖁薼ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䶂㩓䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾㰷猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾㰱猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰸猯扵꺁꣨鞮胥膀㜷⸵㬳껥겸胥㞤㘷㌮䴨䠫膀㤷⸸⠲⭍慎芀㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 隌郥ꦉ㍒㨳㔠䱭臣ꆃ苣躃菣ꮃ䔯佴捁㈨㌺궸臣膀苣ꮃ苣뎃臣놄냦閁苣龁賥袐觧助㈳㈨〲杭胣め㈮㐸浭汯꺁苣ꮃ苣뎃룤꺁뫦늶臣膀ㄳ杭臣ㆮ薼摐䌯苣뮷諥鞁臣芀럦袐觧銂苣ꮃ苣뎃臣閁苣ꮁ蓨鞰��膀냦ꂴ菣ꮃ菣뎃臣ꖎ뛧鞁臣芀芙雩貾胣鞃菣뮂苣궸臣ꊂ菣뎂菣袃臣覂臣䲮⽃卍臣袂苣蚈黦ꮁ苣誂胣趏뿥貁뗧蚺臣ꚁ臣讂臣ꢁ臣몤臣貂臣芀럦袐觧銂苣ꦃ苣袃臣骀臣ꚁ뿦躁臣膀뿦꺸臣讂臣膀㔱洰꺁賥袐觧助㌳䰨⽃卍臣袂苣㢊薼듧讲貁믩늉臣讁臣龁鯥鎽臣鞁臣鞾苣貂胣鎁苣銂胣鶁苣ꖻ룤뺲ꏨ馁苣鎁臣ꪁ臣膀곦꺁럥讨臣馁臣ꮁ뷤ꢔ臣龁胣䶂㩓䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾㰰猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾㰷猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰶猯扵꺁꣨鞮胥膀㔶⸵㬳껥겸胥㚤㘵㌮䴨䠫芀㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 隌郥ꦉ㍒㨴菣覃菣궂苣ꊂ菣ꪃ菣劳㌳ㄨ〵杭胣めㄮ㐹浭汯胣㢁薼듧讲銂郥肂룤閺菣ꦃ苣뎂臣膀菣ꮃ苣뎃㈨䱭誏臣ꪃ菣ꆂ菣ꒂ苣뎃⡓㈱洹膀⸰㠱洵潭⥬苣뮷諥鞁臣芀迥鲿럦袐觧銂蚈雩薶鿩ꊳ蟥蚐臣ꚁ胣趏뿥랷郥ꦉ苣뚺꟨閁臣膀菣邃菣뮂菣뾂菣ꮁ苣誂꿥視臣膀苣ꮃ苣뎃臣醃菣뢂臣膀迥鲿뛦銂釥늛룦ꚺ臣릒详鞁臣芀ꖗ뻥膀菣ꮃ苣뎃㈨䱭궸臣节臣ㆆ鯥蚈臣銃菣궃苣랂苣讃菣뎃㍒⠳㔴杭胣め〮㤵浭汯胣㢁薼듧讲胣袅臣風볨閁苣龁臣ꢁ郥颁触蚠苣ꢔ臣ꚁ郥邈臣龁銂럦ꂊ臣膀ꖗ雩릒详鞁臣芀迥鲿뛦銂鳧목룤ꞁ뿦꺸臣ꚁ胣袃菣ꢂ菣銂駩뮎臣膀瑅䡏㐨䱭ꮁ뫦ꎧ臣鮁胣䶁佮猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢㈨洰⥧苣뮷諥鞁臣芀ꖗ雩릒详鞁臣貾胣趏뿥늶苣龜ꧧ궸臣莿룧鞁胣䦁䍓ꮁ苣讂〴⁧偈苣ꪃ苣늂菣䞫汯⁤敒楤敓ꮂ菣ꂃ뺋藩뚺蟥㪺菣궂苣뎃룤꺁鲀〱薼藩뢅苣膃菣⦫룤ꞁ臣꾂菣麃菣낂菣閃苣벃臣袂苣뺲ꏨ鞁臣芀듧讲臣뮔裥銂鋨몙臣鮁胣龜ꧧ궸臣뺹蟧閁臣讂臣膀ꇨ財賥袐觧助㐳臣莿臣꒵觨꺁鯥鎽㘨洵膀㘲볯⦅臣鞁臣鞾苣貂臣芀卍䔨䥓胣鶃苣蚃苣隃㨩䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㜾㰷猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㜾㰸猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㜱⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣ㆁ㌳⸰㬵껥겸胥膀㌱㌵㔮䴨丫⥡胣ં䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†賥袐觧助㔳ꊂ菣뒂菣许臣隌郥ꦉ㍒⠴㠲杭胣め〮ㄲ浭汯꺁䡔⡆洱⥌鋦貋뫦늶苣膀䉔䙁ㄨ洳膀⸰㔰䱭胣め〮〵浭汯胣咁䙈룤ㆭ⥍뫦늶臣ꚇ郧鞁胣趏뿥늶苣ꢑ鯥ꦸ뫥ꞁ鋦貋臣龁胣㊂駦鎖뻥膀迥鲿뛦銂卉佃苣릂菣ꂃ臣袂苣㖋朰䌠㠱删摥卩灥䜠汯ꮂ菣ꂃ뺋藩뚺蟥㪺냦궸臣ギ胣㆜〰볯䶅䍥膀룤릖臣カ〮薼藩뢅胣㎁蚈雩⦓臣鶁臣뺁臣뺲ꏨ鞁臣芀铧邈觧銂郥覜臣讂铧蚈苣袐苣鮁胣覃菣ꒂ苣ꒂ苣誸臣趇뗧閁臣膀룤ꦙ蟥邵매ꖇ臣鮁苣ꢁ胣ꢡꇩ隌郥ꦉ㔳臣莿臣꒵觨꺁鯥鎽㤨杭胣㒁薼ꢁ臣ꚁ뻥覂苣龁胣䶂㩓䌠猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯��⹷灪⹯潧樮≰㐾㰷猯扵䠾猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰸猯扵举猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㌱⼼畳㹢臣袨껧ꒀ胣㢁㘸㐮龮룦ꒀ㠸⸷⠳⭍⥈胣㲂牢ਾ䐼噉邀賥鞼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㌹⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㌴隃菣릂鳦辰飩뎮뿦ꚺ䴨䍉ꊂ菣뮂苣⦤戼㹲 ꒂ菣鎃菣궃臣꺁鳦讖ꓧ꺁菣閃苣麃苣랂菣麡볤鎽臣릊諥銂ꧨ鎨臣讂臣膂臣膀菣궃苣鞢껦뮘껥ꊂ菣뮂苣銂雩몙臣龁胣겜苣莃苣ꒂ臣龁苣ꮁ胣蒻觨隃菣Ꚃ郧貏剎㍓㐸苣袃菣鞃菣ꎂ菣꾂苣ꒂ菣궃苣⢹協⥂룤ꞁ룤ꦙꋥ隮臣鮁胣鶁臣貾胣낖껩ꪁ協궸臣ㆧ㔺ꞁ뛧ꎻ鿥誤臣膀臣覂臣㊫駦鎖ꋥ隮臣鮁臣芀臣꺁뻥膀鿥誤觧銂臩莿裥ꊛ臣袂苣骃菣莃菣隌臣膀䉐궸臣㊧鯥鞴뗦鞁臣芀臣꺁뻥膀鿥誤觧銂쌱㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯灵挾畦洯뺁臣咧䉓臣貸蟩鞁胣Ꚃ苣ꮃ뷥龁苣㖊츰䲼臣뢇뿦늶苣㦒Ꚃ苣ꮃ菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣ꎂ菣랂菣ꮁꎀ臣뮷諥鞁臣芀ꇨ몤臣貂臣蒁苣鞊铧ꦉ돨⢪鳦讖ꓧꮁ苣讂ꇩ벼뷤袏臣ꖻ觥ꮁ鿧覂苣ꚁ臣讂ꇩ벼뷤ꪃ菣ꆂ菣钃苣뎃꺁룥袇돧鞈苣膀㨱貸蟩꺁쌱㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔭⼼畳㹰꺁鳦芵髧ꪁ蟥몙뿦ꚺ臣龁苣ꮁ胣ㆁㄺ臣뮷諥鞁臣芀菣것菣袃苣꾌鯧閁臣ꪁ臣覂㜳蓢ꞁ㐲駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁胣鶁臣貾胣侁㙄〰浮苣厒数瑣慲慭⁸㍩䴠湩浩硡㌠〰臣궪臣随臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†뷤ꢔ臣龁ꧨ겖迥뎁菣莃菣ꪕ迥꾁胣许臣ꢡ㉒臣몤臣貂臣蒁苣芀戼㹲ꢡ㉒›䥍ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣꺁ꧨ겖迥뎁菣莃菣ꪕ迥㲷牢ਾ䐼噉邀ꇨ隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㤸㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 蒻觨隃菣Ꚃ郧貏臣鞢껦銂飩뎮臣讂鳦躽뿦ꚺ肜냥뮘껥莿뫥膀䥍⥃臣膀ꇨ动ꮁ軦覼臣貂臣蒁苣芀鳦讖ꓧꮁ苣讂菣閃苣麃苣랂菣麡볤鎽苣ꢔ臣ꚁ껥붖臣貂臣蒻觨隃菣Ꚃ郧貏飩뎮苣莃苣ꒂ臣鞃菣莃菣꾁胣뎛㔳臣몤臣貂臣蒁苣芀戼㹲ꢡ㍒隃菣릂ꋥ隮飩뎮苣莃苣ꒂ臣誁臣讂諦龔觧ꪳ臣肜냥뮘껥莿뫥⢦䥍⥃戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㔹⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨ动ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀鳦讖ꓧꮁ苣讂菣閃苣麃苣랂菣麡볤鎽臣ꢅ臣膀苣隃菣ꒂ苣궃菣ꮃ뿦ꚺ胣誃菣ꊃ菣莿뫥ꞁ믩늉菣覃苣莐迨꺁ꋥ隮苣뮘껥馁苣꺁臣覜諥ꞁ臣讂胣麡볤鎽㘱꾁胣ꪃ菣ꆂ菣钃苣뎃苣誂苣랼諥ꮁ⸱쌵㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㤭⼼畳㹰꺁䥍ꞁ믩늉菣覃苣莐迨꺁ꋥ隮苣뮘껥鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖⠊��붖뻤㒋㨴듧麃蛥ꊂ菣뮂苣⦤戼㹲 蒻觨隃菣Ꚃ郧貏臣뺯臣讂菣閃苣麃苣랂菣麡볤鎽賥袐觧꺁듦Ꞁ苣내菨薆胣뮭믦隌胣ꊂ菣뮂苣ꞁꧨ鎨臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†뷤ꢔ臣龁ꧨ겖迥뎁菣莃菣ꪕ迥꾁胣许臣ꢡ㑒臣몤臣貂臣蒁苣芀戼㹲ꢡ㑒내菨薆苣莃苣ꒂ臣ꒁ臣ꚁ臣ꚩ雨誏臣궃菣袃闧랏戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㘹⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†䡔ⵐ颍郧내菨ꪠ苣릟鳥⢰䵒䥐볯ㆋ薼䉆讼薼菣讃苣ꪃ菣⾳苣袃菣鞃菣麃苣랂菣⦳룤ꞁꋥ隮臣鮁胣鶁臣貾胣㦁Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃룤ꮁ攱내菨⾞苣Ꞃ菣꺁꿥ꚺ臣궒꣧鞁胣麃苣궃菣ꆂ菣뢂臣ꢁꖗ雩蚈賥閁臣膀臣꺁뻥膀〲渰⁍䵐銂铧蒁臣龄鿦閁臣龁胣蒻觨隃菣Ꚃ郧貏剎㍓㐸臣芵ꓥ릟ꓩꦉ苣劒䵐궸臣릟ꓩ閁臣膀䉐ꞁ麛듦蒵臣膀䉐ꮁ攱挷畦洯ꞁ蛥뢇뿦鞁臣芀䡔ⵐ銂룦讁臣릟鳥⢰䉆銂郥뺁臣蒁䵒䥐ꞁ듦蒵臣ꚁ胣骃菣랂菣뎃릂菣것菣袃菣ꒂ苣뎃苣꒙軥鞁胣鶁臣貾胣ㆁ㨰⠱믩늉菣覃苣莐迨㪌菣꾂菣閃苣벃苣⦸臣龄鿦骤蟩ꚺ臣蒻觨隃菣Ꚃ郧貏蟦膿뛦ꮁ蓦鎟臣鮁臣芀菣것菣袃苣㎒〰韃ꞁ蚈雩릂菣뎃臣ꚁ胣내迨꺁軦肝苣貐鳦閁臣膀臣꺁뻥膀㜳蓢ꞁ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣ꦸ臣蒁鿥난臣㊧鯥鞴뗦馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣ꪇ铧ꮁ뗦誁臣讂듧貏苣꒙軥鞁胣议귥馁苣내菨隤믩늉菣覃苣莐迨銂胣늂菣뾂菣ꒂ苣뎃㔨田⽧䱭銂郥覜臣讂鿥난臣뮷諥ꮁ苣誂귦薻臣鮁臣芀芙雩貾胣릟鳥銂郥閼臣膀ꇨ몤臣貂臣蒁苣隌郥ꦉ苣膀〵볎⽧䱭苣뎃苣麃苣랂菣銂郥覜臣讂鿥난룤꺁蓦鎟臣龁菣꾂菣閃苣벃苣ꮁ럦ꂊ臣ꚁ胣蒻觨隃菣Ꚃ郧貏臣내菨隤ꋥ隮苣늘臣ꂁ胣㊂駦鎖뻥膀菣것菣袃苣膀䉆銂郥뺁臣蒁룦讁臣劄䵐ꞁ麛듦蒵臣膀〱田꺁䡔ⵐ뚺꟨邃菣閃苣벃倨卂룤꺁⸰薼牔瑩湯銂郥薀臣Ꚃ苣ꮃ臣뮷諥鞁臣芀믩늉菣覃苣莐迨꺁铧颭苣ꎀ뛧貸蟩ꮁ苣誂苣궃菣벃뷥邈跥趽裥ꮁ裥馌臣膀協誸臣鞃菣벃菣ꎂ菣낂臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†듧麃蛥뮭믦隌苣莃苣ꒂ臣邵黦꾁胣ꢡ㕒룤뎁臣뎛㘳迥뎁㜳臣몤臣貂臣蒁苣芀鳦辰飩뎮뿦ꚺ䴨䍉꾁胣내菨薆믩늉菣覃苣莐迨꺁ꃦ뚵苣节臣覂臣龁郥薀臣隌郥ꦉ臣肜뷤莿뫥ꮁ꿥鲿臣讂胣㲂牢ਾꇨ动㰵牢ਾ䐼噉邀ꇨ隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰㤸㰷愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꢡ㕒룤뎁臣뎛㘳迥뎁㜳臣몤臣貂臣蒁苣袂臣ꮁ胣隌郥ꦉㅒ膀ㅒ膀ㅒ愶胣劁㘱膀迥뎁ㅒ收臣膀菣閃苣뎃菣랂菣ꢁ꿦莼臣ꚁꋥꞤ臣龁듧麃蛥蒻觨隃菣Ꚃ郧貏귦薻賥붃諥銂鳦鞁胣隌郥ꦉㅒ愶臣��ꓥ꺁듦Ꞁ苣覜臣ꚁ臣龁胣ં䐼噉邀볯馼볯邼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㔴麃菣ꒂ菣覃臣뎂菣뢂菣늂菣랂菣뎃돦⦕戼㹲 㔠洰⁍䕈䕐膀㔱洰⁍慎汃胣炁⁈⸷궸臣鞊뷤⢓鲀〱杭洯⥬苣膀洱뢂菣ꪂ苣것苣袃菣ꮃ臣膀㜳蓢ꞁ〳裥鎖蟥蚐臣龁胣늂菣뺿臩⢎ⵇ㔲胣炁⁈⸴ꊅ藩誃菣ꪃ苣ꂃ貾胣䒁卍⡏〱杭洯⥬룤꺁菣것苣龃菣ꪃ菣ꮂ菣骃苣궃菣覃ꫨ躰賥袐觧助㔲ㄨ㈮뷥辇匯몟銂苩莅諦鎽臣뮷諥鞁胣랷郥ꦉ苣㆒⁍䕈䕐⡓䡰㜠㐮ꞁ䡰㜠〮臣뾪闦鞁臣芀芙雩貾胣趏뿥늶苣躁觥꺁ⵎ苣膃菣麃菣ꒂ菣覃臣꾂苣뎃菣鞁臣芀苣뎃苣ꖃ苣벃菣銂苣ꒂ苣銎駩꾂菣麃菣낂菣閃苣벃臣袂苣㖊볯낂菣뮂菣벃菣銂郥肂䉐銂铧蒁臣뺲ꏨ鞁胣薻迨뺿臩鞁臣芀苣뎃菣꾂돨莿뫥誏臣骃苣궃菣覃꿥鞊뷤钯苣喒릂菣꾂菣ꮃ裥邞臣袂苣몱껥鞁臣芀苣ꒂ苣銎駩䢤䱐ꮁ苣誂胣뾽铧鞁臣ꢅ臣꺁苣뎃苣ꖃ苣벃菣貁볯㦞薼跥辇뷤ꞁ臣讂臣ꢁ臣讫꣨閁苣膀偒䠭䱐ꮁ苣誂胣鲼薼臣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣蒁臣蒁菣뎃苣벃菣ꒂ菣벃菣貁귥ꢜ臣讂臣ꢁ臣讫꣨閁苣龁胣ꢅ臣꺁苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣龁諦鎽苣ꪃ菣ꮂ菣骃苣궃菣覃菣벃菣ꎂ菣낂胥ꮁ臣蒁臣䢦䍉臣袂苣ꎧ黦鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖躖냦Ꞁ鯧銺뷤ꢔ苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣⢼䥈⥃臣袂苣뎂菣뢂菣늂菣袃臣릉뻥ꎧ黦㪐㰊䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖 鞊뷤誸臣꺁菣뎃苣벃骃苣궃菣覃臣궃菣螃苣뎃苣銂뇦骮臣讂臣膂臣膀苣뎃苣ꖃ苣벃菣銂胣ㆁꪃ菣뢅苣ꪃ苣ꂃ䡰㠠㔮臣覂냦뢁臣骷뷥뺋藩銂铧蒁臣膀協ⵋ偎隃菣ꮃ䥈ꮂ菣ꂃ苣뾽铧馁苣䆋楧敬瑮ㄠ㘲誸臣㚧蚈臣辂臣ꎁ臣뎳该閁臣龁胣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣鞊뷤ꢁ苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣ꚁ臣ꪁ臣鞊뷤꺁꣧ꮁ꿥鲿臣讂菣벃苣ꊝꧧ꺁ꧧ蚈臣袂苣膀菣ꒂ菣벃菣궃菣螃苣뎃苣銂뇦骮臣龁胣骃苣궃菣覃꿥鞊뷤钯臣膀ꇨ动ꮁꃥ誑臣貂臣蒁苣芀戼㹲ꢡ㙒戼㹲鞊뷤겖觧뎂菣뢂菣늂菣袃臣蒐胣ꮁ臣蒁臣꺁菣벃苣뎃菣躏軧誏臣骃苣궃菣覃꿥鞊뷤钯戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㠹⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯馼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㘴⤺戼㹲 䴠剓麝듧麃若뎮胦鞊뷤겖觧⢩据䑁⥃苣뎃苣ꖃ苣벃菣銂苣뎃菣鲃臣꺁諦䦗讞苣ꦃ菣늂菣鞊뷤颪냥Ꞁ雩肯苧⢎䅃䅉ꞁꧨ鎨臣龁躂韧莿胩醃菣ꮃ⠱菣Ꚃ苣⦹菣ꮃ菣鞃菣莃苣릂藥ꮖ苣莃苣ꒂ苣莃菣⢈卍⥄苣ꢔ臣龁苧螗雩肯臣떂苣袃苣ꒂ菣鲤蟥઺䐼噉邀볯馼볯钼胣㲑䐯噉ਾ菣鶃ꓥ隳䰨卐※㄰ㄱ䈺⤴䌨潨摮敲ⱸ䌠瑡⌠㌵〱ⰰ䰠瑯⌠㠱㄰ㄴ芀苣袃菣꾂뿦ꚺ›⸲洵⽧汭鲽ꗦ莿뫥㪦〠㔮杭洯芀㰊䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖 鞊卍ㅒ䄠ⵢ苣蚃菣ꒂ菣溉䅣䍄臣��苧螗諥鲞苣閁苣ꮁꫨ릁苣龁苣ꮁ胣ꒂ菣鎃菣ꞁ臣溮䅣䍄苣뎂菣벃苣뎃鞊뷤颪냥Ꞁ雩肯苧⢎䅃䅉ꊃ菣ꮃ臣閩뻤鞁臣芀鳦ꊃ菣ꮃ臣龁苣ꮁ胣麃苣릂卍ㅒ듧麃ꓥ誏臣鲆단骀菣ꆃ苣뎃臣ꎻ苣誂臣銃菣䶈剓내菨隤菣ꆃ苣뎃迥뎁蛨ꮲ胩覃菣ꒂ菣⢳菣袃賥䶖剓⤱苣鮃菣ꖎ郥Ꞁ臣몙迧鞁胣讁臣䆤潰몁볤邭臣鮃菣ꖎ郥Ꞁ곦놤䄨潰ⵅ佋銂鳦馁苣麃苣릂苣ꦈ铧鞁臣⢟뻥覂苣讂菣Ꚃ苣꾁胣梁卍ㅒ䄯潰ⵅ佋菣Ꚃ苣ꢁ釥낁苣讂芀㰊䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖ꒂ菣鎃菣ꞁ臣䎮䥁ꮁ臣醁苣溋䅣䍄ꧨ鎨਺䐼噉邀볯馼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†䅃䅉苣颪냥馁苣龁苣ꮁ胣梁卍ㅒ䄯潰ⵅ佋菣Ꚃ苣ꮁ胣㖁꣧꺁諦䦗讞苣ꦃ菣늂菣涳扁䌨潨摮敲ⱸ䌠瑡⌠㌵〱ⰰ䰠瑯⌠㠱㄰〴꺁洸⽧杫럦袐觧銂ꖗ鯧ꮁ藨钅蛥ꢳ냥鞁胣鶁臣貾胣㖁츰枼臣ꪃ菣骤돧⢖偌㭓〠ㄱ㨱㑂※桃湯牤硥‬慃⁴㔣ㄳ〰‬潌⁴ㄣ〸㐱⤱苣㎒韦꺛臣릅藨薆諦躸臣龁胣覂鳧蒚菣馃菣꺁雩肯苧꺁蟩螗뫥銂胣麃苣릂꿦ꮁ鯥ꊂ臣蒐胣ꮁ臣醁苣涋扁돦蒰뻥ㆌꖗ臣ꞁ胣ㆁ胣㒜臣릂苣벃菣ꞁ귧骴믤醁臣龁胣覭듧颻臣꺁鿥隺臣膀곦꺁胩誂臣芁臣龁›膀귦뢸※膀뛨隦讉ꛩ袏臣讀胣꺁賦뺶臣붻뫥꺁駧꒵迥뎁藨름※膀뛨隦讉ꛩ꺁룤覭뫥꺁駧꒵迥뎁藨름※膀賦뺶苣ꮐ苣뎶藥鎽臣趇뫥꺁駧꒵迥뎁藨름※膀ꓨ낕臣ꊖ꿧銂郥肂苨ꮁ臣醁苣肜ꓥ邙뫥꺁藨름胣蒐胣꺁菣Ꚃ苣꺁鯥ꊂ臣覂뻥覂苣讂苣뎂苣꺁郥袨臣肜ꓥꒀ臣ㆯꞁ臣ꎁ臣芀菣Ꚃ苣꾁胣㖁韦꺛臣ꊖ꿧躂臣肜裥꺁藥馀苣몙韧鞁胣㚁韦꺛臣覂ꖗ臣趁臣㊫츰䲼术臣鮸냥莿뫥⢦ㄲ杭欯膀㌶杭欯膀迥뎁㤱洱⽧杫꺁諦䶗剓‱扁릂菣궃苣覃据䑁뎂菣뢂菣늂菣袃䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷倭ⴴ⤳迥뎁苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ苣蚃菣ꒂ菣溉䅣䍄䤨潳祴数䌠湯牴汯中㤲儷倭ⴴ⤳臣릅藨薆蟥꺽臣貂臣芀䉐膀苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣ꚁ臣ꪁ臣鞊卍ㅒ䄠⡢ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹⥑胣誏臣誁鯩릂菣궃苣覃菣ꒂ菣벃菣⢉㑐ㄭ銂ꖗ臣趁臣袏臣躯韦⢥㑐ㄭ䑅臣벑臣貂苣⦋藨钅蛥ꢳ냥鞁臣芀菣Ꚃ苣꺁뻧ꮁ臣蒁臣꺁껥鎨髧閊룤誏臣ꚇ뷧鞃菣袃苣ꮃ臣膀ꇨ㎨ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂胣ꢅ臣꺁菣Ꚃ苣銂㌱韦꺛臣ꂱ껦鞁胣躂韧銂뗨鎁臣龁蛨讓苣貾뛧꺁菣ꊃ苣誃苣벂菣랂菣뎃迥뎁苣ꒂ菣ꮂ苣뎃ꓦ몇臣龁苣ꮁ鯥躏臣龁胣ં䐼噉邀볯馼볯颼胣㲑䐯噉ਾꊖ꿧鮃菣뢂菣벃菣ꮁ臣醁苣떂苣袃苣ꒂ菣꺁룦骮⤺㰊䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖 躂韧銂뗨鎁臣龁蛨讓苣膀꺨臣궂賥뾂菣낂苣蚃菣鎃菣몂儨慩敧Ɱ䌠瑡⌠㤶㤹⤷臣鞃菣蚃苣벃苣뮘껥ꒉ苣꾂菣ꮃ迥뎁⸰䴵䔠呄⡁桔牥潭匠楣湥楴楦Ᵽ䌠瑡⌠㠷㐴ⰴ䰠瑯⌠䙒㌲〱㜴銂郥肂〵츰䲼臣咮瀭牥菣莃菣ꆂ菣⢼桔牥潭匠楣湥楴楦Ᵽ䌠瑡⌠㠷ㄵⰰ䰠瑯⌠䙑ㄲ㜷㤵ꢁ苣ꮐ苣㊀䱭뻥辰臩莿裥ꊛ��ꖃ菣隃臣麛迥鞁臣芀뗧钹苣膀楑条湥吠獩畳⁥祌敳⁲䥉苣ꢔ臣ꚁ胣㎁猰猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ⴾ㰱猯灵꺁釥ꊳ闦ꞁ〱裥鎖ꃧ誣臣膀㐱〬〰灲ꞁ蚈雩ꂁ뿥蚈鯩鞁胣鶁臣貾胣骃菣莃菣銂매馁臣ꢁ臣辁胣誸룦銂鯥躏臣龁胣躂韧莿胩醃菣ꮃ⠱菣Ꚃ苣⦹菣ꮃ菣鞃菣莃苣릂藥ꮖ苣莃苣ꒂ苣莃菣⢈敍潳捓污⁥楄捳癯牥ⱹ䌠瑡⌠ㅋ〵㠴⥄苣붣胩莅臣螌ꓧꮁ뻥ꎁ臣ꢔ臣ꚁ胣誸룦궸臣떂苣袃苣ꒂ菣莿뫥銂룦骮臣龁胣ꆰ뷦ꮁ뿨릁苣ꢁ胣㖁츰䲼Ꚃ苣ꮃ臣⢮룥袇觥㒤ꮁ룥袇臣龁莼귦ꦉ돨誏臣ꚩ雦銂跦覍諦鎽臣鞃菣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁菣것菣袃臣뮷諥鞁胣㞁〰灲ꞁ賦ꪛ臣鮁臣貁苣꒮룦ꞁ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣鶁臣貾胣鞃菣벃菣銂胣め〮薼眨瘯 睔敥⵮〲苣ꮐ鳦馁苣ㆋ韃䉐ꞁ麛듦蒵臣膀臣꺁뻥膀룥袇觥㒤ꮁ룥袇臣龁㔲볎꺁ꓦ몇諦鎽뫦늶苣뮷諥鞁臣芀賦ꪛ臣鮁臣貁苣꒮룦ꞁ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁뻥膀菣것菣袃苣㎒鯥鞴뗦鞁胣ㆁ〵볎꺁쌲궪迥誂菣莃菣ꆂ菣銂郥薀臣Ꚃ苣ꮃ臣뮷諥鞁臣芀鯩鞰賥ꚭ駧覅苣䶒䑓匠数瑣牯뮙賩蚕꣦⦙ꏨ꺽臣馁臣ꮁꫨ뾁迥ꎁ臣芀苣ꒂ菣ꮂ苣뎃뿦ꚺ苣膀牂摡潦摲苣뎃菣꾂돨ꊂ菣뮂苣⢤楂副摡‬慃⁴㔣〰〰㘰‬潌⁴㘣ㄴ㐴㘲⤶苣ꢔ臣ꚁ룦骮臣貂臣蒵맧鮃菣뢂菣벃菣궸臣ꢅ苣뎃菣꾂돨ꮐ鳦辇꿦ꮁ꣦隺賥鞁臣芀菣벃苣ꎧ黦銂胣䞁慲桰慐⁤牐獩⡭闥馨붂菣袃苣Ꞃ苣銂铧蒁臣龮雦鞁臣芀뻧薆臣놵꣨蒚鳦辄胦銂胣蚃菣벃苣벃臣骤蟩钯볨论뻥鲤껥銂볤蚁룤莅藩꺽湁癯ꮁ苣誂뇦骮臣龁㰨畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰪猯灵瀾볯゜〮㬱㰠畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⨪⼼畳㹰鲼⸰〰㬱㰠畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⨪㰪猯灵瀾볯゜〮〰⤱胣㲂牢ਾꇨ㎨㨲䌠䥁⁁䵨剓⼱灁䕯䬭麃苣릂臣ꒁ臣ꚁ臣龮꣩궨꣨膀諦躸胣誏臣ꚇ뷧鞃菣袃苣ꮃ戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㠰㤹⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯馼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨ㎨ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀諦䦗讞苣ꦃ菣늂菣涳扁臣랷郥ꦉ臣膀䉐ꞁ蟥꺽臣龁䵨剓⼱灁䕯䬭麃苣릂臣誁臣ꚁꃩ랼臣䎪䥁銂ꫨ躰臣龁胣ꒂ菣鎃菣ꞁ臣鞊卍ㅒ䄠ⵢ苣蚃菣ꒂ菣溉䅣䍄䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷倭ⴴ⤳臣뮲駧蒚諦躸臣膀藥ꚁ臣ꢔ蟩ꞁ铧辇뻤颭髧ꪁ꟦込臣䎧䥁꺁胩財苣뮘껥鞁胣讁臣鶁臣趇韧ꚺ苣릔雥馁苣꺁臣覜諥ꞁ臣誂胣閡釨ꪁ諥鲞苣몤臣龁胣䎂䥁꺁郥讨뫥꺁飩뎮臣膀ㄲ杭欯ꞁ諦躸臣貂臣鞊卍ㅒ䄠ⵢ苣蚃菣ꒂ菣溉䅣䍄䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷倭ⴴ⤳臣躯韦閊룤閁苣龁臩ꊛ㑐ㄭ倨ⴴ䔱⥄臣꺁雩ꞁꛨ龯臣貂臣芀㤱洱⽧杫迥뎁㌶杭欯ꞁ諦躸臣貂臣鞊卍ㅒ䄠ⵢ苣蚃菣ꒂ菣溉䅣䍄䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷倭ⴴ⤳臣膀꿦ꖗ諦躸臣貂臣骃苣궃菣覃��誂苣Ꞥ臣蒁諥鮊苣몤臣龁胣ㆂ韦誁臣꺁㌶杭欯誏臣㊳洱⽧杫苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ渭䅣䍄ꊂ苣붂苣ꒂ菣뺯藧⶧㑐㌭膀苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣ꚁ臣ꪁ臣鞊卍ㅒ䄠⡢ㅈ㉈㈱㐳⥎胣誏臣誁鯩傢ⴴ꺁닦芙髧閊룤꾁胣梁卍ㅒ䄯潰ⵅ佋菣Ꚃ苣ꮁ臣醁苣䎋䥁銂룦낡臣鮁臣讁臣龁胣肜ꓥꢔ蟩꺁苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ据䑁꾁胣䎁䥁꺁蟩螗뫥꺁铦蒖臣誁臣ꚁ諥鮊苣몤臣龁胣ં䐼噉邀볯馼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨ㎨ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀諦䶗剓‱扁릂菣궃苣覃据䑁⡃ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹ⵑ㑐㌭꺁苣뎃菣鲃臣꺁닦芙髧閊룤꾁胣ꚩ꣩鞁臣ꢅ臣꺁铧辇臣ꢔ蟩鶾귥蒚臣颧볥ꞁ䵨剓⼱灁䕯䬭麃苣릂臣誁臣讂苣뎃菣鲃臣꺁苧螗뿤늀胦떂苣袃苣ꒂ菣ꎔ铧銂飩뎮臣讂臣ꮁ苣覜諥ꞁ臣誂胣䦁ⵌ膀䱉ㄭ닎胣誏臣䮳ⵃ則ꮁ꿥馁苣閡釨ꪁ뷥뾟苣몤臣龁臣㮌鳦Ꞥ铧辇臣뾁臣和䙎츭ꮁ꿥馁苣閡釨ꪁ諥鲞苣覜臣龁胣躂韧ꊖ꿧ꮁ臣醁苣躂韧莿胩Ꞁ苣ꒂ菣ꮂ苣뎃菣馃菣ꮁ꿥馁苣릊黦꾁胣ㆁ韦誁臣ꮁ諦躸臣貂臣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣蒁臣蒁諦䶗剓‱扁䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷誏臣誁鯩傢ⴴꞁꛨ龯臣貂臣讁臣龁胣ꊂ苣붂苣ꒂ菣뺯藧溧䅣䍄臣膀ꧨ鎨臣龁苣誂ꯩ蒁铧辇臣躂韧莿胩Ꞁ苣ꒂ菣ꮂ苣뎃臣뺯臣讂諥鲞苣몤臣龁胣㲂牢ਾꇨ㎨㨳諦䶗剓‱扁릂菣궃苣覃据䑁꾁苣뎃菣鲃臣ꢔ蟩鶾귥蒚臣颧볥ꞁ䵨剓⼱灁䕯䬭麃苣릂臣誁臣讂䅃䅉臣ꢇ뫥릂苣ꊂ苣릔雥馁苣芀䉐ꚇ뷧꒾迥뎁苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ㑐㌭蟥꺽뻧ꮁ꿥馁苣놵꣨蒚鳦辄胦꾁胣蚃菣벃苣벃臣骤蟩钯볨论뻥鲤껥誏臣袨껧閁苣龁꣦隺ꫨ꺷匨䵅뇂銂볤蚁룤莅藩꺽湁癯ꮁ苣誂뇦骮臣龁胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰〹㰰愯㰾䐯噉ਾꢡ㐳鞊卍ㅒ䄠ⵢ苣蚃菣ꒂ菣溉䅣䍄臣袂苣뮲駧蒚蟥꺽臣梯卍ㅒ䄯潰ⵅ佋菣Ꚃ苣ꮁ臣醁苣䎋䥁颪냥Ꞁ苧螗뿤늀胦떂苣袃苣ꒂ菣ꎔ铧銂飩뎮臣讂胣傂卂蟥꺽뻧誏臣ꊂ苣붂苣ꒂ菣뺯藧产㤲儷倭ⴴꚇ뷧꒾臣뺯臣讂뗧袨髧覜蓦Ꞁ臣膀菣ꖃ菣궂菣꺁ꓥ趇꿦莼뫤貾ꓦ骮迥뎁꣨鞮臣貂臣馨뫦꒪럥⢮䕓쉍⦱苣뒼臣肸藥超뷧䆮潮慶臣袂苣몱껥鞁臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㤰㄰⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯馼볯銼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㜴⤺戼㹲⠊듧麃蛥蒻觨隃菣Ꚃ郧貏귦薻賥ꊂ菣뮂苣⦤㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꖻ룤꺁諦䶗剓‱据䑁銂ꧨ鎨臣龁胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠〰〹㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꒂ菣鎃菣궃臣꺁鳦몙飦꺁諦䶗剓‱扁鞊铧ꦉ돨溪䅣䍄臣릊諥銂ꧨ鎨臣讂臣膂臣膀듧麃蛥蒻觨隃菣Ꚃ郧貏귦薻賥ꊂ菣뮂苣銂裥ꢔ臣龁胣겜苣莃苣��臣龁苣ꮁ胣咁偈ㄭ跥莐듧麃ꃦ銂胣ㆁ薼䉆誏臣ㆳ볯骃菣랂菣뎃릂菣것菣袃菣ꒂ苣뎃苣ꮐ鳦馁苣劋䵐讁苣讧裦閁苣讂鿥난룤ꞁꋥ隮臣鮁胣鶁臣貾胣㦁Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃룤ꮁ쌱㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰵猯灵내菨⾞苣Ꞃ菣꺁꿥ꚺ臣궒꣧鞁胣麃苣궃菣ꆂ菣뢂臣ꢁꖗ雩蚈賥閁臣膀臣꺁뻥膀〲渰鮃菣鲃菣ꮃ菣ꪃ苣蚃菣袃藩뢅ꇥ⢩䵐⥁苣ꢔ臣ꚁ蓦鎟臣鮁臣芀믩늉菣覃苣莐迨䶌卒ꪠ剎㍓㐸臣芵ꓥ릟ꓩꦉ苣劒䵐궸臣鞢껦閁臣膀䉐ꞁ麛듦蒵臣膀臣꺁뻥膀䉐ꮁ쌱㆗㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰷猯灵挾畦洯ꞁ蛥뢇뿦閁臣龁胣咂偈ㄭ듧麃苣ꦸ臣蒁鿥난䘨卂苣ꮐ臣ꪁ臣劄䵐⥉臣鞴뗦鞁臣膀菣讃苣ꪃ菣⾳苣袃菣鞃菣麃苣랂菣銂駩뮎臣膀臣꺁뻥膀〱ㄺ蒻觨隃菣Ꚃ郧貏麃苣궃菣ꆂ菣뢂꺁蓦鎟ꓥ趇뫥ꞁ믩늉菣覃苣莐迨뢇뿦늶臣龄鿦閁臣龁胣鞃菣벃菣銂〳쌰林臣㖧裥鎖苣钃菣鞁臣膀듧貏臣ꖎ鷧銂郥龜臣鮁胣鶁臣貾胣㎁莄臣㊧駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀룦讁臣릟鳥ꞁ麛듦蒵臣讂臣ꢁ臣袂苣膀蟨놔臣꺵臩馁苣내迨銂駩뮎臣膀껦颭臣讂듧麃ꓥ蒻觨隃菣Ꚃ郧貏苣膀〱田⽧䱭臣늂菣뾂菣ꒂ苣뎃苣ꮐ鳦馁苣릟鳥꺁럦ꂊ臣袂苣뮭믦閁臣龁胣ㆂ駦鎖뻥膀鿥난苣뢐볥鞁胣颧胣ꪁ铧辇ㄨ田⽧䱭胣㎁㌮杵洯膀⸱由⽧䱭胣め㐮杵洯膀⸰由⽧䱭꺁諦䶗剓‱扁鞊铧ꦉ돨溪䅣䍄䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷刭㔲誏臣ㆳ田⽧䱭臣ꊂ苣붂苣ꒂ菣뺯藧⶧諦龔觧ꪳ据䑁⡃苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ中㤲儷刭㔲銂胣㖁田⽧䱭苣뎃苣麃苣랂菣銂郥覜臣讂鿥난룤꺁蓦鎟臣龁菣꾂菣閃苣벃苣ꮁ럦ꂊ臣ꚁ胣蒻觨隃菣Ꚃ郧貏臣내菨隤ꋥ隮苣늘臣ꂁ胣溂䅣䍄臣鞁臣ꚩ雦节迥ꞅ铧ꮁ郥膂臣芀㐲駦鎖뻥膀菣것菣袃苣膀䉆銂郥뺁臣蒁룦讁臣劄䵐ꞁ麛듦蒵臣膀臣꺁뻥膀䉐궸臣ㆮ〰䱵臣ギㄮ볯咅楲潴⁮ⵘ〱銂럦ꂊ臣膀〱裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣膀䡔ⵐ銂뫦ꎧ臣鮁臣芀믩늉菣覃苣莐迨꺁铧颭苣傒卂룤뢁臣ꎀ뛧貸蟩ꮁ苣誂苣궃菣벃뷥邈跥趽裥ꮁ裥馌臣膀菣ꪃ菣膃苣벃苣붂苣銯ꓥ鞃菣벃菣誸臣鞃菣벃菣ꎂ菣낂臣龁胣ં䐼噉邀볯馼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨ动ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀〱胣㎁㌮胣誏臣ㆳㄮ杵洯꺁뿦ꚺ臣鞊卍ㅒ䄠ⵢ諦龔觧ꪳ据䑁⡃ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹ⵑ㉒⤵臣膀蓦鎟臣龁菣꾂菣閃苣벃苣놔鷦꺁듧麃蛥蒻觨隃菣Ꚃ郧貏苣ꒂ菣鎃菣궃臣릠뗧馁苣붃諥銂ꓧ鞁臣芀⸰甴⽧䱭迥뎁⸰由⽧䱭臣袂苣躽臣ꢔ蟩꺁諦䶗剓‱扁鞊铧ꦉ돨溪䅣䍄臣膀蓦鎟臣龁菣꾂菣閃苣벃苣놔鷦꺁듧麃蛥蒻觨隃菣Ꚃ郧貏苣ꒂ菣鎃菣궃臣躽룤閁臣讂菨鮊苣몤臣龁臣膀苣誂ꯩ蒁铧辇臣몤臣貂臣袂臣ꪁꓦ몇駩貕臣ꞁ臣꾁臣讁臣龁胣ㆂ田⽧䱭臣ꊂ苣��붂苣ꒂ菣뺯藧⶧諦龔觧ꪳ据䑁⡃苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ中㤲儷刭㔲ꞁ蟥蚐臣龁菣꾂菣閃苣벃苣꾁胣ꪜ蟥蚐꿥ꞅ臣貐꟦꺁菣馃菣ꞁ듧麃蛥蒻觨隃菣Ꚃ郧貏苣鶿鳦鞁臣蒁臣芀臣貂苣꺁菣벃苣꾁胣鞊卍ㅒ䄠ⵢ諦龔觧ꪳ据䑁銂铧蒁臣膀菣꾂菣閃苣벃苣꾲闧꒱臣颭鳥馁苣薗軥鎽苣릊黦蒚臣뮭믦閁臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣㲂牢ਾꇨ动㨷諦䶗剓‱扁鞊铧ꦉ돨꺁맥螝苣궃菣벃뷥邈跥趽戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㤰㌰⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯馼볯隼胣㲑䐯噉ਾ龮雦设㠴⤺戼㹲蒻觨隃菣Ꚃ郧貏噉鋦꺨胦龄鿦麃苣릂菣螃菣ફ䐼噉邀볯馼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†믤许臣䆮䍄苣겜껥鎨臣뾽铧鞁臣㪟戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㤰㐰⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯馼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†苣뎃菣鲃臣꺁鳦몙飦꺁諦䶗剓‱扁鞊铧ꦉ돨溪䅣䍄臣릊諥銂ꧨ鎨臣讂臣膂臣膀鷩袄蛥궒꣧龄鿦ꊃ菣ꮃ苣ꦈ铧鞁臣芀믩늉菣覃苣莐迨䶌剓ꪠ剎㍓㐸苣袃菣鞃菣ꎂ菣꾂苣ꒂ菣궃苣⢹協⥂룤ꞁ룤ꦙꋥ隮臣鮁胣뺯闦龜룤龜臣ꞁ뛧ꎻ鿥誤臣龁胣鶁臣貾胣내迨銂䉐ꞁ麛듦蒵臣膀⸱쌲㆗帰挸畦洯꺁뿦ꚺ臣傧卂臣趆蟦膿臣鮁臣芀臣꺁뻥膀菣Ꚃ苣䶹剓내菨隤迥뎁蛨ꮲ胩覃菣ꒂ菣꺁믤辂苣ꮁ菣袃卍ㅒ듧麃ꓥ覃菣ꒂ菣誏臣鲆단骀菣ꆃ苣뎃銃菣隌卍膀䅍䑉㜠㐳ⴳ卍ㅒ䠠浵湉搠汥祈⥧苣鮃菣ꖎ郥Ꞁ臣몙迧馁苣麃苣릂臣膀⸱쌲㆗帰挷畦麃苣릂臣肜뗧龄鿦ꢔ蟩銂뻥讂臣膂臣膀〱田꺁듧貏蟦膿뛦銂냥馝蓨讁苣馝蓨薆돦蒰臣龁胣龄鿦讁苣ㆉ胣㎜韦貾胣麃苣릂苣膀ꇨ몤臣貂臣蒁苣뒠郥膀ꖗ麛胣ㆁ〱杭欯邃菣뎂菣ꒂ苣뎃臣꺚룤ꚇ뷧鞁臣芀蓦鎟臣覂ꖗ뻥膀諦䶗剓ꊃ菣꾂菣벃菣ꮃ諦鎽䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷膀諦䶗剓‱扁鞊铧ꦉ돨溪䅣䍄䠨䠱ㄲ㌲临中㤲儷刭㔲膀苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ扁胣袏臣溯䅣䍄苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅꊂ苣붂苣ꒂ菣뺯藧⶧㉒⤵臣蒁臣貂臣銂胣ꢡꓧ閁苣ꚁ臣讂铧辇臣膀ꇨ动ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣袂臣ꮁ髧许諦躸臣龁胣麃苣릂苣鎽蟩鮸냥誏臣鎽蛥뎂菣螃苣랂菣讃菣낂苣뎂苣ꮁ臣蒁臣龄鿦꺁雩궸臣ꎁ臣ꊃ菣뾂菣뎃苣鞁臣芀蓦鎟臣覂ꖗ뻥ꮁ胣麃苣릂苣覮ꗦ뮭臣鮁胣蒻觨隃菣Ꚃ郧貏藨鎇단랍苣膀뗧钹菣ꊃ苣誃苣벂菣랂菣뎃臣膀臣꺁뻥꺁䉐궸臣꺁胩骶룥袇臣袂苣뎂菣讃菣ꊽ裦颍뷤꺁闦袁룤銁迥뎁菣ꪃ菣膃苣벃苣붂苣銯ꓥ鞃菣벃菣誸臣꺁菣것菣蚃苣뎃苣ꮁ苣誂껥辇臣龁胣鎁臣龮꣩讁苣꺁菣벃苣꾁胣ꢡ㡒臣몤臣貂臣蒁苣芀戼㹲ꢡ㡒戼㹲邃菣뎂菣ꒂ苣뎃臣蒵臣袐苣鮁臣鞊卍ㅒ䄠ⵢ諦龔觧ꪳ据䑁ꞁ蟥꺽臣龁菣Ꚃ苣ꮁ臣醁��뎹鷥蒻觨隃菣Ꚃ郧貏藨鎇단랍戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰㤰㔰⼼㹡⼼䥄㹖ਊꓦ몇駩貕볯㊝〵苣궃菣벃뷥邈跥趽挨畦਩䐼噉邀볯馼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨ动ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀믩늉菣覃苣莐迨䶌卒ꪠ剎㍓㐸臣袂苣馝蓨薆蓦鎟臣膀藨鎇臣誁臣讂ꯩ蒁듧貏단랍苣节臣覂臣膀꣦隺닦芙諦龔觧ꪳ菣뎃苣麃苣랂菣ꮁ苣讂菣Ꚃ苣꺁蟥꺽臣膀믩늉菣覃苣莐迨躅蟨ꂲ跨銂듧㊄꿥낕뷤许臣鮁苣貁胣ꦁ臣麃苣릂苣蒻觨隃菣Ꚃ郧貏臣것菣ꮃ苣鲤蟥邙闧ꪜ뫦⢀佌⥄臣躽룤閁臣ꪁ臣ꎁ臣芀菣뎃苣麃苣랂菣ꢁ뗧뾁郥辂臣龁誏臣コㄮ杭欯꺁铧辇臣鞊卍ㅒ䄠ⵢ諦龔觧ꪳ据䑁⡃ㅈ㉈㈱㐳ⵎ㉎㜹ⵑ㉒⤵臣膀㜷볯誏臣㞳薼臣麃苣릂臣䲌䑏鳦肺臣蒻觨隃菣Ꚃ郧貏菣馃菣銂鳦馁苣邵黦銂苣龁苣鞁胣䆁ⵢ諦龔觧ꪳ据䑁蒵郥鮁駧閳臣ꚇ뷧鞁臣麃苣릂臣誁臣讂믩늉菣覃苣莐迨꾂菣ꊂ菣뎃苣꺁铦蒖苣몤臣龁胣蒻觨隃菣Ꚃ郧貏苣ꪃ苣ꦃ菣릂臣膀苣ꒂ苣뾂苣鞃꿥ꞅ据䑁뎂菣뢂菣늂菣袃ꊂ苣붂苣ꒂ菣뺯藧⶧㉎㜹ⵑ㉒⤵볯邃菣뎂菣ꒂ苣뎃臣ꚇ뷧鞁臣麃苣릂臣꾁臣뺁苣閡釨ꞁ臣ꪁ臣膀菣꾂菣閃苣벃苣뢁臣骃苣궃菣覃苣벃苣莃菣ꎂ菣낂臣ꦈ鯧銂ꓧ鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖 겜駧躘臣膀鳦躘듧뢛臣風볨閁苣讂藥鎽髧ꪁ껥붖藦颧臣袂臣ꚁ꿧늛臣邙껥閁苣讂臣趁臣꾁臣蒁胣龮髩膀꣨覼臣貂臣蒁苣节臣ꮁ諥袁臣膀鳦몙飦꺁꟦薀臣꺿ꏩ貁룤낿臣겪飦誏臣뮷믤꺁鯥讁苣鎽ꗦ薀臣躘苣讁臣芁苣蚁胣鶁臣袂臣ꪁ뿤뺣臣膀럦颻臣릉꣨躘듧뢛臣蒯鯥薆臣ꮐ臣貂苣鎁臣貁蓦뎛臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀鯥醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㠲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠㄰㈰㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱〳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠㄰㌰㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㈳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠㄰㌰㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㐳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠㄰㌰㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㘳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ†��††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㜳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㠳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㤳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱〴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱ㄴ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㈴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㌴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㐴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㔴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㘴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㜴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㠴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㤴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱〵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱ㄵ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㈵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㌵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㐵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㔵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㘵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㜵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㠵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㤵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱〶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱ㄶ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣��볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㈶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㌶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㐶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䐯噉ਾ䐼噉邀触骶ꏨꎭ鯦醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣邏蟥ꖗ胣꒻鋥㎌맥㎴鳦㎈韦⢥〲ㄲ㌮㌮㰩䐯噉ਾ䐼噉邀触骶ꏨꎭ볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨뢛ꇩ趐胣躘듧뢛⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨薠鯧趐胣超裥ꢡ⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦릖돦醀뿨ꂊ⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦꺁蛥릮胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣超裥ꢡ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽⼮〲ㄲ㈵ㄳ㜴䄯䕍ぎ〰㄰㈯〮ㄲ㈵ㄳ㜴⭅㄰⼵〲ㄲ㈵ㄳ㜴〰〰㄰愮灰㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴〰〰㄰愮灰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鮚ꫨ뮟ꃥ誑胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㔶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠㄰㘰㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㜶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠㄰㘰㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㤶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠㄰㜰㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱ㄷ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠㄰㜰㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩㸢〲ㄲ㈵ㄳ㜴琮晩ꃂ〰〱㌷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔱㌲㐱⸷楴≦㈾㈰㔱㌲㐱⸷楴쉦゠㄰㜰㰴愯㰾䐯噉ਾ⼼潢祤ਾ⼼瑨汭ਾ