(57)【要約】  本発明は、葉酸塩製剤と、上皮組織刺激及び皮膚疾患の治療のための局所用剤としての前記製剤の使用とに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮組織刺激及び上皮組織疾患治療用の少なくとも一つの葉酸塩を含有する製剤において、前記製剤は局所用剤であることを特徴とする、前記製剤。
【請求項２】
請求項１に記載された上皮組織刺激及び上皮組織疾患治療用の少なくとも一つの葉酸塩を含有する製剤において、前記組織は皮膚であることを特徴とする、前記製剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載された皮膚刺激及び皮膚疾患治療用の少なくとも一つの葉酸塩を含有する製剤において、前記皮膚疾患は炎症性皮膚疾患であることを特徴とする、前記製剤。
【請求項４】
請求項１乃至３のうちのいずれか一項に記載された皮膚刺激及び皮膚疾患治療用の少なくとも一つの葉酸塩を含有する製剤において、前記皮膚疾患は乾癬であることを特徴とする、前記製剤。
【請求項５】
請求項１乃至３のうちのいずれか一項に記載された皮膚刺激及び皮膚疾患治療用の少なくとも一つの葉酸塩を含有する製剤において、前記皮膚疾患は皮膚炎又は神経皮膚炎であることを特徴とする、前記製剤。
【請求項６】
請求項１乃至３のうちのいずれか一項に記載された皮膚刺激及び皮膚疾患治療用の少なくとも一つの葉酸塩を含有する製剤において、前記皮膚位疾患は慢性創傷であることを特徴とする、前記製剤。
【請求項７】
生理的に有効な量の少なくとも一つの葉酸塩であって、前記葉酸塩のカチオンが、アルギニン、コリン、アセチルコリン、１、１ージメチルビグアニジン、フェニルエチルビグアニジン、グルコサミン及びジメチルアミノエタノールから成る群から選択される、前記葉酸塩と、
支持母材を形成するための在来の複合体と、
を含む、葉酸塩製剤。
【請求項８】
生理的に有効な量の少なくとも一つの葉酸塩であって、前記葉酸塩のアニオンが５ーホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、５−ホルミル−（６ＲＳ）−テトラヒドロ葉酸、１０−ホルミル−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、５−メチル−（６ＲＳ）−テトラヒドロ葉酸、（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、５、１０−メチレン−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸、５、１０−メテニル−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸、５、１０−ジホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、５−メチル−１０−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸から成る群から選択される、前記葉酸塩と、
支持母材を形成するための在来の複合体と、
を含む、葉酸塩製剤。
【請求項９】
請求項７又は８に記載された葉酸塩製剤において、前記葉酸塩製剤の全重量の０．０１乃至２．５重量パーセントの濃度の葉酸塩化合物を、微粒子乳濁液、水中油型乳剤、油中水型乳剤、ナノ粒子製剤、ゲル製剤、及び／又は、スプレー製剤の形で含有することを特徴とする、前記葉酸塩製剤。
【請求項１０】
請求項７乃至９のうちのいずれか一項に記載された葉酸塩製剤において、前記製剤は、Ａ相とＢ相とＣ相と選択的にＤ相とが完全に混合された相を有し、
Ａ相は、油を含有し、
Ｂ相は、グリセリンと乳化剤を含有し、
Ｃ相は、生理的に有効な量の少なくとも一つの葉酸塩を含有し、
任意のＤ相は、艶消し剤を含有する、
ことを特徴とする、前記葉酸塩製剤。
【請求項１１】
請求項１０に記載された葉酸塩製剤において、前記製剤のＣ相は、生理的に有効な量の少なくとも一つの葉酸塩を含み、前記葉酸塩のカチオンが、アルギニン、コリン、アセチルコリン、１、１−ジメチルビグアニジン、フェニルエチルビグアニジン、グルコサミン及びジメチルアミノエタノールから成る群から選択されることを特徴とする、前記葉酸塩製剤。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載された葉酸塩製剤において、前記製剤の前記Ｃ相は、生理的に有効な量の少なくとも一つの葉酸塩を含み、前記葉酸塩のアニオンが、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、５−ホルミル−（６ＲＳ）−テトラヒドロ葉酸、１０−ホルミル−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、５−メチル−（６ＲＳ）−テトラヒドロ葉酸、（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、５、１０−メチレン−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸、５、１０−ジホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、５−メチル−１０−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸から成る群から選択されることを特徴とする、前記葉酸塩製剤。
【請求項１３】
請求項７乃至１２のうちのいずれか一項に記載された葉酸塩製剤において、前記製剤は、アルギニン、アルギニンエステル、コリン、アセチルコリン、グルコサミン、ジメチルアミノエタノール、ビタミンＢ群、及びビタミンＤから成る群から選択された、少くとも一つの添加化合物を含有することを特徴とする、前記葉酸塩製剤。
【請求項１４】
請求項７乃至１３のうちのいずれか一項に記載された葉酸塩製剤において、前記Ｃ相は、１ミリリットルの極性溶液に対して０．１乃至１０００ｍｇのアルギニン、コリン、アセチルコリン、１、１−ジメチルビグアニジン、フェニルエチルビグアニジン、グルコサミン及びジメチルアミノエタノール、葉酸のカルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩又は亜鉛塩を含有することを特徴とする、前記葉酸塩製剤。
【請求項１５】
請求項７乃至１４のうちのいずれか一項に記載された葉酸塩製剤において、前記製剤は、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、グリセロリン酸ナトリウム塩、及びグリセロリン酸ジカリウム塩から成る群から選択された少くとも一つの化合物を含有することを特徴とする、前記葉酸塩製剤。
【請求項１６】
請求項７乃至１５のうちのいずれか一項に記載された葉酸塩製剤において、前記Ａ相の前記油は、脂肪酸がＣ６乃至Ｃ１２の範囲の鎖長を有する中鎖脂肪酸トリグリセロールを含み、選択的に、ジカルボン酸がＣ２乃至Ｃ１０の範囲の鎖長を有するジカルボン酸アルコールを含み、前記アルコールは、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ペンチルアルコールから成る群から選択されることを特徴とする、前記葉酸塩製剤。
【請求項１７】
請求項１６に記載された葉酸塩製剤において、前記油は、カプリル酸／カプリン酸トリグリセロールであることを特徴とする、前記葉酸塩製剤。
【請求項１８】
請求項７乃至１７のうちのいずれか一項に記載された葉酸塩製剤において、前記Ｂ相の前記乳化剤は５以上のＨＢＬ値を有することを特徴とする、前記葉酸塩製剤。
【請求項１９】
請求項７乃至１８のうちのいずれか一項に記載された葉酸塩製剤において、前記乳化剤は、Ｃ１４乃至Ｃ２０の範囲の鎖長を有する飽和脂肪酸を有するショ糖脂肪酸エステルであり、好ましくは、ステアリン酸スクロースであり、全てのショ糖脂肪酸エステルは５以上のＨＬＢ値を有することを特徴とする、前記葉酸塩製剤。
【請求項２０】
請求項７乃至１９のうちのいずれか一項に記載された皮膚刺激及び皮膚疾患治療のための葉酸塩製剤中のグルコン酸塩又はグリセロリン酸塩の使用であって、前記グルコン酸塩又は前記グリセロリン酸塩は、皮膚への葉酸の浸透促進剤として作用する、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、葉酸塩製剤と、炎症や疾患、特に皮膚の炎症や疾患の局所治療における葉酸塩製剤の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
葉酸は、ビタミンの特徴を有する、広く存在する増殖因子である。還元葉酸は、細胞が遺伝物質のＤＮＡを生成するために必要であるため、細胞が適正に分裂するために必要である。その結果、皮膚細胞や腸管細胞などの急速に分裂する細胞や組織は、葉酸の状態によって直接影響を受ける。
【０００３】
葉酸塩は、天然には、モノ−又はポリグルタミン酸塩群を保持する還元葉酸塩の形で存在する。ヒトの代謝は、この葉酸塩化合物を作り出すことはできない。したがって、葉酸塩はビタミンの特性を持つ。葉酸塩化合物の新規合成（Ｄｅ−ｎｏｖｏ合成）は、微生物や植物において起こるのみである。葉酸自体は生物学的には不活性であり、ジヒドロ葉酸還元酵素によって、７、８−ジヒドロ葉酸へ、そして更に５、６、７、８−テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）へと酵素学的に還元される必要がある。テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）は、葉酸の生物学的に活性な形である。ＴＨＦはＣ１ユニットのキャリアとして作用し、伝達は、それぞれ、５−メチル−テトラヒドロ葉酸、５、１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸、５−ホルミルーテトラヒドロ葉酸、５−ホルムイミノ−テトラヒドロ葉酸、１０−ホルミル−テトラヒドロ葉酸及び５、１０−メチニル−テトラヒドロ葉酸によって、達成される。Ｃ１ユニットは、例えば、プリンヌクレオチド及びデオキシチミジン−５’−モノホスフェートの合成に必要である。
【０００４】
多くの原因が葉酸の欠乏症を引き起こしうる。例えば、妊娠中に観られるような葉酸の要求量の増加が、結果的に葉酸欠乏状態につながり得る。さらに、セリアック病による食物からの葉酸の吸収障害、癌治療においてジヒドロ葉酸還元酵素の拮抗阻害剤として使用される、メトトレキサート、アミノプテリンのような代謝拮抗剤の摂取、及びアルコール乱用が、葉酸欠乏症を引き起こし得る。又、一つ又は複数の葉酸代謝酵素における遺伝的な機能不全が葉酸レベルを標準以下に導き得る。加えて、炎症症状が、現在の葉酸需要の高まり、及び前記炎症に冒された組織の修復プロセスに必要な葉酸の吸収障害、又はそのいずれかに起因する葉酸レベルの低下を引き起こし得る。皮膚においては、葉酸の欠乏は、脂漏性湿疹と呼ばれる症状に通じ、白斑（皮膚顔料の喪失）に関連づけられ得る。
【０００５】
例えばアミノ酸と核酸の代謝で分裂が起こるように、葉酸は代謝で役割を果たしているので、葉酸塩状態の欠乏の結果は多大である。後者は細胞分裂のプロセスに直接かかわる。骨髄のような細胞分裂の速い組織にあっては、巨赤芽球性貧血や血小板減少症につながり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
（循環器系疾患の危険因子の一つとして知られる）ホモシステイン濃度の減少にプラスの葉酸の効果が臨床試験で示された。プラスの効果、すなわち、血中のホモステイン濃度の低下を実現するためには、４００μｇの葉酸塩を標準的に毎日摂取する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
葉酸は、主に葉物野菜、穀類やレバーに含まれているが、熱や光の作用を受けやすいので、十分な供給はかなり難しい。従って、食物による健常者への葉酸の供給は十分な供給を保証しない。それどころか、葉酸状態の減少を引き起こす主因とみられる。他の経路、例えば皮膚と通した葉酸の摂取、並びに皮膚自体に中での摂取は、未だ十分に明らかになってはいない。
【０００８】
従って、葉酸の組織での良好な摂取を提供するような、葉酸塩の代替用法及び、葉酸塩の製剤の、進行中の必要性がある。
【０００９】
本発明の第一の態様においては、皮膚刺激及び皮膚疾患の防止及び治療のため、又はそのいずれかのために、活性剤としての葉酸塩の新規の使用が提供されている。
【００１０】
本発明の他の目的は、葉酸塩が容易に組織に吸収される葉酸塩製剤を提供することである。
【００１１】
前記の目的は、請求項１に記載された用法及び、請求項６に記載された製剤によって達成される。本発明の好ましい実施例は、従属項に従っている。
【００１２】
本発明によれば、少くとも一つの葉酸塩を含有する製剤が、上皮組織刺激及び上皮組織疾患、好ましくは皮膚刺激及び皮膚疾患の治療用に使用される。この製剤の用法は、局所使用である。好ましくは、皮膚刺激又は皮膚疾患は、炎症性の皮膚疾患である。炎症は、急性であっても慢性であっても良い。後者は、長期の炎症状態に当てはまる。慢性の炎症性疾患の１例は、乾癬である。更に、慢性創傷の治療も、葉酸塩製剤を用いた局所治療によって実現可能である。例えば８乃至１２週間といった、期待される期間内に治らない創傷が、慢性創傷を考えられる。慢性創傷は、創傷治癒の１又は複数の位相に留まっているようである。眼の上皮組織疾患の１例は、ドライアイ症候群（ＤＥＳ）であり、乾性角結膜炎（ＫＣＳ）としても知られている。
【００１３】
本発明による葉酸塩製剤は、生理学的に有効性のある量の、少くとも一つの葉酸塩を含有する。葉酸塩のカチオンは、アルギニン、コリン、アセチルコリン、１、１−ジメチルビグアニジン、フェニルエチルビグアニジン、グルコサミン及びジメチルアミノエタノールから成る群から選択される。本製剤は更に、支持母材を形成するための在来化合物を含有する。
【００１４】
葉酸塩のカチオンは又、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、及び亜鉛から成る群から選択しても良い。
【００１５】
アルギニン、コリン、アセチルコリン、１、１−ジメチルビグアニジン、フェニルエチルビグアニジン、グルコサミン及びジメチルアミノエタノールからなる群から選択されたカチオンが好ましい。
【００１６】
更なる実施例においては、葉酸塩の少くとも一つの葉酸は、以下の葉酸化合物から成る群から選択される：５−ホルミル−（６ＲＳ）−テトラヒドロ葉酸、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、１０−ホルミル−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸、５−メチル−（６ＲＳ）−テトラヒドロ葉酸、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、５、１０−メチレン−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸、５−メチル−１０−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、及び５、１０ージホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸。
【００１７】
本製剤は、別の実施例において、更に薬学的に活性な化合物を含有する。該化合物は、アルギニン、アルギニンエステル、コリン、アセチルコリン、ジメチルアミノエタノール、ビタミンＢ複合体、及びビタミンＤ、特にビタミンＤ３から成る群から選択されるのが好ましい。
【００１８】
更に別の実施例において、本製剤は更に、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、グリセロリン酸ジナトリウム塩、及びグリセロリン酸ジカリウム塩から成る群から選択された少くとも一つの化合物を含有する。
【００１９】
本発明による葉酸塩製剤は、葉酸塩製剤全重量に対して０．０１乃至２．５重量％濃度の葉酸化合物を、非水性相又は水性相を有する多相混合物中に含有する。
【００２０】
更に、本葉酸塩製剤は、製剤全重量に対してより高い濃度、５重量％又は１０重量％にさえ至るまでの高い濃度の葉酸化合物を含有しても良い。葉酸化合物は水性溶媒又は非水性溶媒中に溶かされ得る。後者は、例えばグリセリンである。葉酸化合物の最小量は、葉酸塩製剤の全重量の０．００１重量％である。
【００２１】
別の実施例において、本製剤は完全に混合された相を有する。Ａ相は油を含有する。Ｂ相はグリセリンと乳化剤を含有する。Ｃ相は生理的に有効な量の葉酸塩、及び任意に、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、グリセロリン酸ジナトリウム塩及びグリセロリン酸ジカリウム塩から成る群から選択された少くとも一つの化合物を有する水性葉酸塩組成物を含有する。更に、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（ＴＲＩＳ）のような薬理学的に許容される緩衝剤と、例えば、グルタチオンのような薬理学的に許容される抗酸化剤といった化合物を、任意に含有しても良い。任意のＤ相は一つ以上の艶消し剤を含有する。
【００２２】
本発明による葉酸塩製剤は、Ｃ相に、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、亜鉛、アルギニン、コリン、アセチルコリン、１−１−ジメチルビグアニジン、フェニルエチルビグアニジン、葉酸のジメチルアミノエタノール塩から成る群から選択された少くとも一つの葉酸塩を、極性溶剤１ｍｌにつき０．１乃至１０００ｍｇ含有するのが好ましい。極性溶剤は、例えば水、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、グリセリン、ジメチルスルホキシドである。前記極性溶剤の混合を使用しても良い。アルギニン、コリン、アセチルコリン、１、１−ジメチルビグアニジン、フェニルエチルビグアニジン、グルコサミン及び葉酸塩のジメチルアミノエタノール塩が好ましい。
【００２３】
別の実施例において、Ｃ相は、１モルの葉酸塩に対して０．８乃至１０モルのグルコン酸ナトリウム又はグルコン酸カリウムを含有する。Ｃ相がグリセロリン酸ジナトリウム塩又はグリセロリン酸ジカリウム塩を含有する場合には０．４乃至５モル濃度であるのが好ましい。
【００２４】
本発明による製剤は、Ａ相に中鎖トリグリセリンから成る脂肪を含有することが好ましい。中鎖トリグリセリンのような脂肪酸はＣ６乃至Ｃ１２の範囲内の鎖長を有する。最も好ましいのは、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリンの油剤である。更に、ジカルボン酸アルコールを任意に含有しても良い。このジカルボン酸の鎖長はＣ２乃至Ｃ１０の範囲内であり、アルコールはメチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ペンチルアルコールから成る群から選択される。
【００２５】
本製剤のＢ相に使用される乳化剤は、ＨＬＢ値が５以上であるのが好ましい。界面活性剤の親水性ー親油性バランスは、親水性や親油性の度合の尺度であり、１９５４年にグリフィンによって記述されたように、分子の様々な部分の値を算出することによって量定される。１９５４年の記述のような非イオン性界面活性剤のためのグリフィン法では次のように計算される：ＨＬＢ＝２０ｘＭｈ／Ｍ、  Ｍｈは化合物の親水部の分子量であり、Ｍは化合物の全分子量である。ＨＬＢ値０は完全に親油性／疎水性の分子に該当し、ＨＬＢ値２０は完全に親水性／疎油性の分子に該当する。ＨＬＢ値が８乃至１６の範囲内の乳化剤が水中の油（ｏ／ｗ）乳化を安定化するために適当である。
【００２６】
好ましい乳化剤は、脂肪酸の鎖長がＣ１４乃至Ｃ２０の範囲内であるショ糖エステルである。このショ糖エステルは、ＨＬＢ値が５以上であるはずである。最も好ましいのは，エミュレータショ糖ステアリン酸である。
【００２７】
別の実施例において、本発明による製剤は、皮膚刺激及び皮膚疾患の治療に使用される。この使用は局所使用が好ましい。葉酸塩製剤は、炎症性皮膚疾患、特に乾癬の治療に使用され得る。
【００２８】
更に、本葉酸塩製剤は、創傷、特に慢性創傷の治療にも使用され得る。創傷とは、皮膚が裂けたり、切れたり、刺して穴が空いたり（開放創）といった比較的急速に起こるタイプの損傷、又は鈍的損傷が打撲傷（閉鎖創）を起こすようなタイプの損傷である。病理学では、皮膚の真皮を破損する鋭利な損傷を指す。
【００２９】
別の態様においては、葉酸塩の皮膚への浸透を増大させる透過促進剤として、グルコン酸及びグリセロリン酸のナトリウム塩及びカリウム塩が使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本発明の更なる理解のために、添付の図面と関連付けて、以下の実施例が記載される。
【図１】図１は、被験物質又は製剤葉酸塩クリーム及びＬ−ＦＴＨＦの有効投与量の定量を示す。
【図２】図２は、被験物質Ｌ−ＭＴＨＦジ コリン及びＬ−ＦＴＨＦジ アルギニンの有効投与量の定量を示す。
【図３】図３は、様々なカルシウム濃度の媒体での、ケラチン生成細胞の成長を示す。
【図４．５．５Ａ．５Ｂ．５Ｃ】図４、５、５Ａ、５Ｂ、５Ｃは、掻皮評価分析の結果を示す。
【図６−７】図６、７は、葉酸に暴露した後の細胞生存率の結果を示す。
【図８−２２】図８乃至２２は、皮膚モデルにおける、葉酸、メチル葉酸及びホルミル葉酸の様々な時点での生物学的利用能に関する結果を示す。
【図２３】図２３は、ヒト皮膚におけるホリナートの浸透に関する結果を示す。
【図２４】図２４は、皮膚疾患を持つ患者に葉酸塩クリームを用いた治療の経過を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００３１】
レボホリナートカルシウム塩を含有する例示的クリームは、以下の化合物を含有する。
クリーム製剤１
【表１】
2021529198.tif 000002
クリーム製剤２
【表２】
2021529198.tif 000003
【実施例２】
【００３２】
掻皮評価分析
様々な葉酸塩製剤の創傷治癒に関する効果を評価するために、イン・ビトロ式掻皮評価分析が用いられた。このイン・ビトロ式は、閉鎖細胞層に限定された傷をつけ、それに続いて起こる、被験物質の存在下での閉鎖層への細胞の再成長を、適当な対照標準、すなわち被験物質を用いない（未治療の）細胞と比較して行う。
【００３３】
掻皮評価分析の実験手順は以下の通りであった。用いられた細胞は、ヒト初代表皮角化細胞（製品コードＣ−１２００５、ドイツ、ハイデルベルク、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社）である。最初に、細胞に細胞生存率低下のような負の効果を及ぼさない量の被験物質の投与量。次に、３種の異なった投与量が掻皮評価分析に使用された。更に、細胞は、被験物質の成長促進効果を示すために、成長を制限する培地で培養された。使用された培地（製品コードＣ−２００１１、ドイツ、ハイデルベルク、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社）については、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）又は血液ＢＰＥから派生した不確定因子の複合混合物の省略によっても、希釈化によっても、成長制限が達成され得た。通常、成長を制限する培地は、ＥＧＦの省略によって達成された。実際の掻皮評価分析用については、ケラチン生成細胞は、位置表示のついた、適正な細胞培養用プレート（ドイツ、フリッケンハウゼンのＧｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ社の６ウェル  プレート、製品番号６５７１６０）の中で培養された。細胞は、閉鎖単層膜へと成長した。次に、細胞は、ピペットの先端で、位置表示に沿って引っ掻かれ、これにより細胞の無い領域（掻き傷、損傷）が生み出された。細胞単層膜は、部分的に剥離された細胞を除去するために洗浄され、次に適当な投与量の被験物質を含有する培地で覆われた。細胞の無い領域への細胞の再成長が、経時的に、０時間、６時間及び２４時間後に観察され、写真によって文書化された。分析は、細胞の無い領域（ソフトウェア画像Ｊ）を表示し、算定することによって、そして、異なる時点での前記の算定された無細胞領域を比較することによってなされた。これにより、無治療対照群（被験物質をいっさい含まない細胞培養培地）と比較した、成長率に関する結論が可能となった。被験物質の投与量毎に３度の反復実験がなされた。試験全体は２度行われた。
【００３４】
被験物質：
【表３】
2021529198.tif 000004
【００３５】
サンプルを溶解するための指示
【００３６】
評価分析用溶液は以下のように作られた。
【００３７】
Ｌ−ＦＴＨＦカルシウム（レボロイコボリンカルシウム、レボホリナートカルシウム、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩）（２．５％）：１２５ｍｇのＬ−ＦＴＨＦカルシウムと１２５ｍｇのグルコン酸ナトリウムを混合し、４．２５ｇの再蒸留水に溶かす。
【００３８】
Ｌ−ＭＴＨＦ（２．５％）：１２５ｍｇのＬ−ＭＴＨＦジ コリン塩（５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸ジ コリン塩）を加え、４．８７５ｇの再蒸留水に溶かす。
【００３９】
Ｌ−ＦＴＨＦ（２．５％）：１２５ＭＧのＬ−ＦＴＨＦジ アルギニン塩（５ーホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸ジ Ｌ−アルギニン塩）を加え、４．８７５Ｇの再蒸留水に溶かす。
【００４０】
葉酸塩クリーム（０．２５％レボホリナートカルシウム）：葉酸塩クリームは、製造業者により配送され冷蔵庫に保管された状態のものが使用された。
【００４１】
予備実験では有効投与量が定量された。掻皮評価分析用の培養物は、生理学的利用能用に使用される器官型の皮膚モデルよりも著しく敏感な単層細胞組織であるから、希釈されていない溶液や製剤で処理することは不可能である。
【００４２】
この試験のために、ケラチン生成細胞が９６−ウェル  プレート上に播種され、５通りの希釈液又はクリームを用いて２４時間培養された。続いて、生体染色色素が加えられ、最後に、生細胞中で生体染色色素の転換によって引き起こされた色の変化が測光法で定量された。
【００４３】
図１と図２は、被験物質の有効投与量の定量を示す。単層培養でケラチン生成細胞を用いて行われた、生体染色色素ＭＴＴの生細胞による転換後の細胞毒性試験。濃度データは、希釈されてない溶液又はクリーム（＝１００％）に基づく。処理時間は２４時間。未処理の培養組織が負の対照として使われた。ＳＤＳは正の対照（「デッド  コントロール」）として使われた。Ｎ＝６＋ＳＥＭ
【００４４】
投与量定量の結果によると、葉酸塩クリームは濃度０．０００２２％（生存率＝対照の７０％）から有効である。Ｌ−ＦＴＨＦカルシウムは濃度０．１３％から有効である。Ｌ−ＭＴＨＦジコリンは濃度０．１４％から、Ｌ−ＦＴＨＦジアルギニンは濃度０．１２％から有効である。ＩＣ７０値が線形回帰（ヒル勾配、医療統計解析ソフト  グラフパットプリズム５．０４）によって算出された。ＩＣ７０という用語は、処理された細胞培養物の生存率が、未処理の対照の７０％にまで減少する濃度を示す。ＩＣ７０は、よく毒性と無毒性の間の境界として引用される。
【００４５】
また、スクラッチアッセイに備えて、ケラチン生成細胞の成長率が影響を受けるか否かが検査された。使用された無血清培地のような培地では、各細胞が可能な限り最高の増殖を起こし、この場合、これ以上の増殖の加速は不可能であろう。しかし、使用された培地は、細胞の最大限の増殖率につながらないことが分かった（図３参照）。従って、変更を加えられていない標準的な培地を用いて、更に実験が実施された。
【００４６】
この研究のため、ケラチン生成細胞が、９６−ウェル  プレートの中に希釈されて播種された。２４時間後、標準的な培地は様々なカルシウム濃度の培地に代替された。２４時間後、生体染色色素（ＭＴＴ、３−（４、５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２、５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物）の各々の転換によって、生細胞の数が定量された。
【００４７】
図３は、ケラチン生成細胞の増殖実験を示す。培地のカルシウム含有量の変化が、部分的に増殖を速める結果となった。Ｎ＝６＋ＳＥＭ
【００４８】
これは、標準的培地で培養された細胞と比較して、増殖率の増加が可能であることを示した。それゆえ、標準的培地がスクラッチアッセイにおける補足のための基礎として選択された。なぜなら、増殖促進を示せるために培地の消耗が必要ではないから。標準的培地はまた、対照としても用いられる。追加対照として、ウシ血清アルブミン（ＦＢＳ）が、それが内包する増殖因子がケラチン生成細胞の増殖を促進し、別の基準を提供することが期待されるので、標準的培地に加えられた。
【００４９】
図４及び図５は、誘起された引っ掻き傷の無細胞領域の６時間後や２４時間後を示す。測定値は、各処理群の開始領域のパーセンテージとして表された。線は、対照（＝標準的培地）のレベルを示す。棒が小さい程、掻き傷、すなわち無細胞領域が細胞で速く再生された。各処理群について、３通りの濃度が、３つの別個の培養で試験された（Ｎ＝３）＋ＳＥＭ。
【００５０】
６時間後、なんら有意の増加はまだ達成されておらず、処理群の違いはほんの僅かである。２４時間後、葉酸溶液が標準的培地よりも増殖を促進していて、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）対照のようであることが明らかになった。葉酸塩クリームは、２種の高濃度において、驚異的に増殖を阻害した。最高濃度では培地の死滅にまでも至った（棒が見えない）。最高濃度に関する予備試験後に、僅かな毒性しか観察されなかったので、これは予期せぬことであった。損傷によって引き起こされたストレスが、培養物の感受性を増大するようなので、これはおそらく方法論の問題である。葉酸塩溶液が、同様に、増殖を促進する。際立つことは、Ｌ−ＦＴＨＦジアルギニン（グリーン）が、修復の投与量依存的な反転現象を促進したことである。しかしながら、この違いは有意では無いので、この結果は偶然起こったのかもしれない。
【００５１】
全体として、処理群の間における損傷領域の増殖の相違は重要ではない。この相違は、おそらく、三組の処理群の間の比較的大きな変異に起因したものであろう。
【００５２】
図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｃは、Ｌ−ＭＴＨＦ０．１％に関して撮られた、左から順に０時間、６時間後及び２４時間後の写真を示す。引かれた線は、解析プログラム用に限定された開放創傷面を示す。６時間後、どの面も成長しすぎるということなく、２４時間後には、無細胞領域を表すのが困難になる。
【実施例３】
【００５３】
生物学的利用能
皮膚のような組織における生理学的利用能を試験するために、初代ヒトケラチン生成細胞から作られた再構築皮膚モデル（トロイスドルフのＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨのｅｐｉＣＳ、製品番号ＣＳ−１００１）が使用された。このモデルは、ヒト皮膚に非常によく似たバリアを示す。このモデルは、化粧品原料の腐食作用や刺激作用の認可判定のためのテストモデルとして正規に使用されている。皮膚モデルは、消費者による使用を意図しているので、通常、最終製品を用いて処理される。とは言っても、過剰摂取を回避するため、被験製品を用いて処理する前に、皮膚モデルの耐用性が評価される。
【００５４】
皮膚モデルは、上述したような多孔性膜上で培養された。増殖する細胞は、（皮膚モデルを有する）頂端区画を（栄養培地を有する）基部区画から分離する。頂端区画から基部区画への大量輸送は、このようにして、細胞を通してほぼ独占的に可能である。この唯一の代替法は傍細胞拡散であるが、機能上密着結合のため、僅かの分子について、それも非常に限られた範囲内で可能なだけである。製品の生理学的利用能を判定するため、使用前に、抵抗測定法によって、バリアの漏れが検査された。前述の頂端部分と基底部分の間の電気抵抗が平均以下であるモデルは、実験には使用されない。次に、適当な皮膚モデルが、被験製品を用いて局所的に処理される。４時間後、８時間後及び８時間後、葉酸塩の有無及び濃度を調べるために、培地のサンプルがモデルの基底部に取られた。各被験製品及び対照は、それぞれの３回の反復試験の濃度で試験される。研究は、２つの別個のランからの結果が得られるまで繰り返された。培地サンプル中の葉酸塩含有量の量定は、２４時間の値の分析で開始された。これらは既に葉酸塩を含有していたので、必要であれば、取込みの動きをイメージできるように、更なる時点が引き続き検査された。
【００５５】
培地のサンプルは、商用サービス提供者に向けて確立されたＪＣ／ＭＳ法（高速液体クロマトグラフ質量分析法）によって実施された。この方法の感度は、１ｎｍｏｌ／Ｌの範囲内である。調査を始める前に、本方法の妥当性を評価できるように、実行可能性の試算又は予備試験が実施された。本方法の感度は、バイオアベイラビリティーの分析に十分であることが証明された。
【００５６】
予備実験では、実施例２で記述されたのと同様の可溶化された被験物質が、３つの皮膚モデルそれぞれに局所的に適用された。３つのモデルには１００μＬだけの水が適用された。皮膚モデルの面積は、各々０．６ｃｍ２である。２４時間の培養後、培地のサンプルはモデルから除去され、予備分析用に凍結された。次に、モデルは、洗浄され、モデル中の生細胞の数を定量するため、生体染色色素（レサズリン）とともに培養された。これは、処理が細胞に負の作用となるか否かを判定するために実施された。もちろん、これは皮膚モデルのバリア機能を損ねることもあると思われる。
【００５７】
図６及び図７は、１００μＬの被験物質または水を用いて２４時間局所的処理した後の皮膚モデル細胞の相対的活力を示す。生体染色色素（レサズリン）の蛍光値は、対照標準（＝１００％）を基準として正規化された。各ランの結果はＮ＝３＋ＳＥＭを用いた。
【００５８】
皮膚モデルの生育性は、ラン中の処理によって不利な影響を受けないことが判明した。３つの被験物質で処理することにより、対照と比較して、生育性が僅かに上がったようにさえ見える。第２の行程では、葉酸塩クリームを用いた処理に従う、対照の８６％といった、生育性の僅かな減少が観察される。しかし、この低い度合いの減少は、毒性があるとはみなされない。このように、皮膚モデルの生育性は、処理によって有意に影響を受けることはなかった。従って、皮膚モデルのバリア機能は損なわれないと仮定されるべきである。故に、モデルは原液またはクリームを用いて２４時間処理され得た。モデルが被験物質で１５分間だけ処理される０ＥＣＤのＴＧ４３９による刺激性試験と比較すると、２４時間にわたる処理ははるかに挑戦的である。上述したように、試験された溶液及びクリームについては、ヒト皮膚に対して非常に優れた親和性が仮定されうる。
【００５９】
いくつかの被験サンプルの予備解析は、解析中、隔離コラムに問題を起こすかもしれないような、非常に強い葉酸塩シグナルが測定され得たことを示したので、解析の前に、被験サンプルの希釈が必要となった。加えて、局所的に適用される量を各々５０μＬに減らされた。更に、本試験では、下方コンパートメントは（葉酸を含有する）媒質で満たされたのではなく、１ｍＬの（葉酸を含有しない）ハンクス平衡塩溶液で満たされた。被験物質を用いた全２４時間の培養に続き、皮膚モデルは再びレサズリンを加えて培養された。おそらく減少したと思われるモデルの活力を定量できるように、である。本試験では、２つの独立した経路が達成された。
【００６０】
Ｌ−ＭＨＴＨＦジ コリンを用いて培養された後、培地中に量定されたメチル葉酸のピークが検定線の外にあった（図９、１１、１３、１６及び２１）。これは、また、２４時間後のホルミル葉酸濃度にも当てはまる（図１４、１７及び２２）。これらのピークは補間されているにもかかわらず、その絶対値は不確実であると考えられる。しかしながら、それらが非常に高い値であるのは確実であると思われる。
【００６１】
第１分析ランにおいて測定されたサンプルのいくつかについては、ホルミル葉酸含有は考慮されていない（４時間及び２４時間のファーストラウンド）。したがって、これらのサンプルは、ホルミル葉酸含有量データを有さないか、又は、ワンパスデータのみを有する。
【００６２】
図８Ａ、８Ｂ及び９は、ラン中の皮膚モデル下のコンパートメント中の葉酸又はメチル葉酸の濃度の量定を示す。図８Ｂでは、図８Ａの棒が異なる尺度で表示されている。どちらにしても１００μＬの溶液が分析された。Ｎ＝３＋ＳＥＭ。
【００６３】
処理群の皮膚モデルは、葉酸レリースの点ではほとんど違いがない。これとは対照的に、メチル葉酸濃度においては、モデル間に大きな違いが測定されている。Ｌ−ＭＴＨＦジコリンで補完されたモデル間では、Ｌ−ＦＴＨＦ又は葉酸塩クリームで補完されたモデルにおけるよりも有意に高い濃度が測定された。葉酸濃度と大きな値に計測されたメチル葉酸濃度との間の違いは、特に大きい（図９）。
【００６４】
図１０Ａ、１０Ｂ及び１１は、第２ラウンドにおける皮膚モデル下のコンパートメント中の葉酸又はメチル葉酸の濃度の量定を示す。どの場合も１００μｌの溶液が分析された。Ｎ＝３＋ＳＥＭ。
【００６５】
４時間後、両ランとも、区画中の葉酸濃度が極めて類似していることを示している（図８Ａ、８Ｂ及び１０）。この培地は、被験物質で処理する前に、栄養分を供給された複数の葉酸モデルを含有したので、ここで得られた値は、細胞から漸次的に解放される培地の残液から、部分的に常に派生していると仮定される。より多くの葉酸塩が局所的に提供されるので。モデル間の葉酸濃度は、４時間後比較的類似していることから、栄養補助とは、明らかに独立している。ここで示された小さな相違（図８、８Ｂ及び１０Ａ、１０Ｂ）は有意ではない（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５．０４を通した分散分析）。これとは対照的に、処理の４時間後、モデル間で緩衝剤中のメチル葉酸の値が非常に相違していることが分る（図９及び１１）。この結果に基づき、葉酸塩製剤の様々な生理学的利用能が読み取れる。葉酸塩クリームは液体製品の１０分の１の濃度であるが、受皮区画中のメチル葉酸濃度は６分の１乃至７分の１であるだけである。
【００６６】
図１２Ａ、１２Ｂ、１３及び１４は、第１ランの８時間後の、皮膚区画中の葉酸、メチル葉酸、ホルミル葉酸濃度の測定値を示す。各ケースで１００μＬの溶液が分析された。Ｎ＝３＋ＳＥＭ。
【００６７】
図１５Ａ、１５Ｂ、１６及び１７は、第２ランの８時間後の、皮膚モデル中の葉酸、メチル葉酸、ホルミル葉酸濃度の測定値を示す。各ケースで１００μＬの溶液が分析された。Ｎ＝３＋ＳＥＭ。
【００６８】
８時間後、皮膚モデル区画中の葉酸濃度は、４時間後の値をほぼ上回らない（図８Ａ、８Ｂ及び１０と比較して図１２、１５）。これとは対照的に、メチル葉酸値は少なくとも部分的に明らかな増加を示している（図１３及び１４）。Ｌ−ＭＴＨＦジコリンは最も高い濃度を起こす。受容区画（基礎の）中のホルミル葉酸濃度は、葉酸クリーム、Ｌ−ＦＴＨＦカルシウム及びＬ−ＦＴＨＦジアルギニン（図１４及び１７）補充後、Ｌ−ＭＴＨＦジコリン（図１３及び１７）１６）補充後のメチル葉酸濃度と同等である。ホルミル葉酸はＬ−ＭＴＨＦ後のサンプルには見出し得ない。ホルミル葉酸はメチル葉酸からは、又はエネルギー消費代謝経路を通してだけでは、形成され得ない。
【００６９】
図１８Ａ、１８Ｂ及び１９は、第１ラウンドの２４時間後の皮膚モデル下の区画中の葉酸、メチル葉酸濃度の測定値を示す。各ケースで１００μＬの溶液が分析された。Ｎ＝３＋ＳＥＭ。
【００７０】
図２０Ａ、２０Ｂ、２１及び２２は、第２ラウンドの２４時間後の皮膚モデル区画中の葉酸、メチル葉酸、ホルミル葉酸濃度の測定値を示す。各ケースで１００μＬの溶液が分析された。Ｎ＝３＋ＳＥＭ。
【００７１】
２４時間後（図１８Ａ、１８Ｂ、２０Ａ及び２０Ｂ）、葉酸濃度（一部）もメチル葉酸濃度も、双方とも４時間後及び８時間後より高い。Ｌ−ＦＴＨＦカルシウムで処理された皮膚モデル間の葉酸濃度は、その他の皮膚モデル間の濃度の２倍である。それは、順に同様である。しかし、葉酸濃度は、測定されたメチル葉酸及びホルミル葉酸濃度と比較すると、無視して良い。メチル葉酸のレベルでの相違が極めて高い（図１９及び２１）。Ｌ−ＭＴＨＦ下のサンプルからのピークが最高標準より有意に高かった。また、Ｌ−ＦＴＨＦカルシウムで処理したモデル間のメチル葉酸濃度が比較的高い。Ｌ−ＦＴＨＦジ アルギニンで処理したモデル間の溶液濃度はこの約半分であり、葉酸塩クリームが１０８ｎｍｏｌ／Ｌの最低値（制御不能）を生み出している。濃度は再び４時間後より有意に高くなっている（葉酸塩クリーム約３ｎｍｏｌ／Ｌ）（図１９及び２１）。ホルミル葉酸はメチル葉酸からは作れないし、エネルギー消費代謝経路を通してだけ作ることもできないので、ホルミル葉酸は、Ｌ−ＭＴＨＦジコリン後のサンプル中には検出できない（図２２）。他方、他の全てのサンプル（対照を例外として）においては容易に測定できる。
【００７２】
生理学的利用能の研究の始めに、５０μｌの溶液（２５ｍｇ／ｍｌ又は６０ｍｍｏｌ／ｌ）及び５０μｌのクリーム（２．５ｍｇ／ｍｌ又は６ｍｍｏｌ／Ｌ）が適用された。下側区画では、１ｍＬのＨＢＳＳ（ハンクの平衡塩溶液）がそれぞれ最初に充填された。上記の図に示された結果は、この緩衝剤の１００μＬの部分標本から定量したものである。
【００７３】
頂端区画では、３μｍｏｌの葉酸塩（溶液）又は０．３μｍｏｌの葉酸塩が補充されている（５０μＬ中）。
【００７４】
基礎区画では、２４時間後に、最大限約２００ｎｍｏｌ／ＬのＬ−ＦＴＨＦカルシウムを葉酸塩に補充した。２４時間補充後に、葉酸塩クリーム２９ｎｍｏｌ／Ｌについて定量された。
【００７５】
メチル葉酸塩が、最大１２０μｍｏｌ／Ｌ（２４時間Ｌ−ＭＴＨＦ）計測された。２４時間補充後に、４７ｎｍｏｌ／Ｌの葉酸塩クリームについて定量された。
【００７６】
ホルミル葉酸塩が、最大１５０μｍｏｌ／Ｌ（２４時間Ｌ−ＦＴＨＦカルシウム）計測された。この時点で、３０．２１μｍｏｌ／Ｌの葉酸クリームについて計測された。
【００７７】
これらの掻皮評価分析において、様々な葉酸塩製剤の補充が２４時間後に人工的創傷の修復を有意に促進した。この研究は未処理の対照との比較で原始上皮細胞の単層細胞叢で実施された。
【００７８】
製剤からのメチル葉酸塩又はホルミル葉酸塩の生理学的利用能は、再生皮膚モデルの補充後に説明することが可能であった。局所的に提供された葉酸誘導体は、モデルの組織を通して輸送され、細胞によって一部代謝される。局所的に提供されたホルミル葉酸塩の一部はメチル葉酸塩に代謝され、他の一部は組織を通して輸送される。逆に、局所的に提供された蟻酸メチルは、それ自体として皮膚モデルの組織を通して輸送され、ホルミル葉酸塩に代謝されることはない。摂取効果は、輸送と記述されたが、ホルミル葉酸塩に関しては、純粋な葉酸塩溶液（Ｌ−ＦＴＨＦカルシウム）からよりも葉酸塩クリームからの方が２倍優れている。葉酸は、また、皮膚モデルの基礎区画でも定量された。しかし、測定された濃度はメチル葉酸塩やホルミル葉酸塩よりはるかに低かった。このように、測定された葉酸はおそらく皮膚モデルの成長のために使用された培地に由来するものと思われ、実験行程中に細胞によって再び解放されると思われる。
【実施例４】
【００７９】
更なる実験で、カルシウムレボロイコボリンが皮膚を透過することが可能か、否かが検査された。浸透深度はラマン分光法によって定量された。測定装置は、６０ｘオイル・イマージョン・レンズとＲｉｖｅｒＤ  Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ社の評価用ソフトウエアＳｋｉｎＴｏｏｌｓを装備した反転ラマン分光装置３５１０であった。測定方法は、１適用につき１０側面像、１測定点につき５秒間の測定時間、２μｍの７ステップ、４μｍの４ステップ、４００乃至１８００ｃｍ−１のスペクトル域、７８５ｎｍのレーザー励起波長であった。信号は、様々な皮膚及び装置に特有のスペクトル（周波数域）を有するソフトウエアＳｋｉｎＴｏｏｌｓで生成された。ユーザーは、独自のスペクトルをライブラリーに加えることができる。評価は、ＣＬＰ法（最小二乗法）を介して行われる。信号は、ケラチンのフィット係数に正規化されたフィット係数として出力される。
【００８０】
結果を数量表示するために、標準列で検量されなければならない（Ｔａｂ  １及びＴａｂ  ２を参照せよ。）。最初に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の感度が定量され、質量濃度ＢＳＡ  ｉｎ  ｇ／ｍｌがＢＳＡのフィット係数にプロットされる。固定したゼロを有する直線回帰は勾配Ｓを与える。この活性物質については、モル濃度がｍｏｌ／ｍｌで、ＢＳＡフィット係数を掛けた薬物係数に対してプロットされる。これは有効成分の勾配ＳＡを与える。勾配に関して、いわゆる薬物の数量化要因が増大され得る（ＳＡ／Ｓ＝Ｃ）。要因Ｃを掛けると、活性物質のフィット係数は、単位ｍｍｏｌ／ｇのケラチンの定量値となる。
【００８１】
分析システムのケラチンに対する感度を測定するための標準例は次のとおりである。
【００８２】
Ｔａｂ  １
【表４】
2021529198.tif 000005
【００８３】
カルシウムレボロイコボリンの定量化係数を測定するための標準列は次のとおりである。
【００８４】
Ｔａｂ  ２
【表５】
2021529198.tif 000006
【００８５】
被験者の皮膚への薬物又はプラセボ（グルコン酸ナトリウム）の適用が次のように実施された。２０μＬがアレルギーパッチにピペットで移され、被験者の前腕に３０、６０、１２０及び２４０分間貼り付けられた。適用時間の最後にアレルギーパッチは取り外された。ラマンプロフィールを決定する前に、処理された皮膚領域は乾いたペーパータオルで擦られた。
【００８６】
測定されたフィット係数ｆｉ及び数量化要因Ｃｉが次の表に掲載されている。
【表６】
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【００８７】
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の勾配Ｓ及び勾配ＳＡ並びに有効物質の数量化係数Ｃｉは次のとおりである。
【表７】
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【００８８】
図２３は、適用時間が３０乃至２４０分間のカルシウムレボロイコボリンのプロフィールを示す。皮膚の上層５μｍ及びより深層において、カルシウムレボロイコボリン濃度が増加する傾向がある。しかし、個々のプロフィールの標準偏差−ここには示されていないが−は、大きい。
【００８９】
以下の表は、領域ごとの皮膚に浸透した活性物質量の測定値を示す。プロフィールは皮膚表面から３０μｍの深さまで評価された。経時的にカルシウムレボロイコボリン濃度が増加する傾向にある。適用量と比較して、皮膚中の有効成分の比率は、２４０時間の適用では１０％である。
【表８】
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【００９０】
実施例１に記載した葉酸塩含有クリームが、それぞれ異なる皮膚の問題、すなわち神経皮膚炎や乾癬を患っている５名の患者の治療に使用された。２１日に及ぶ治療の過程で症状は大きく減じた。一人の患者は禿髪性毛包炎を患っており、数年間にわたり従来の治療を受けてきた。葉酸塩クリームによる３週間にわたる治療でほぼ完全に症状が退行し、図２４に示すように、皮膚治癒に繋がった。９か月間に至るまで再発せず、皮膚は正常な外見を保った。
【００９１】
神経皮膚炎を患っている子供が本発明による葉酸塩製剤を用いて３週間にわたり治療された。この治療中に症状は減じ、皮膚は完治した。治療をやめた後も再発しなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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2021529198.tif 000044
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