(57)【要約】  本発明は、インターロイキン−１２及びｃ−ｍｅｔを抑制するオリゴヌクレオチドを同時に発現する腫瘍殺傷アデノウイルス及びこれを含む抗腫瘍免疫性増進用組成物及び抗がん用組成物に関する。本発明は、がん遺伝子治療において、ＩＬ−１２の発現と同時に、ｃ−ｍｅｔ抑制効果を持つアデノウイルスシステムを最初に究明し、本発明のアデノウイルスシステムは、インターロイキン−１２を発現するとともに、ｃ−ｍｅｔを抑制して腫瘍環境で免疫機能を回復させて腫瘍の再形成、腫瘍成長抑制のような抗がん効果を増進させることができ、腫瘍の転移も抑制できるため、がんの治療に効果的に使用され得る。
2021529545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡに相補的であり、ｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子を含む、アデノウイルスシステム。
【請求項２】
前記インターロイキン−１２をコーディングする遺伝子は、ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）遺伝子配列及びＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）遺伝子配列を含むものである、請求項１に記載のアデノウイルスシステム。
【請求項３】
前記インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子は、ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）遺伝子配列とＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）遺伝子配列の間にリンカー配列またはＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）配列をさらに含むものである、請求項１に記載のアデノウイルスシステム。
【請求項４】
前記インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子は、アデノウイルスシステムでアデノウイルス遺伝子のＥ１Ｂ領域またはＥ３領域に挿入されたものである、請求項１に記載のアデノウイルスシステム。
【請求項５】
前記ｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、及びＣＲＩＳＰＲ用ガイドＲＮＡからなる群から選ばれた一つ以上である、請求項１に記載のアデノウイルスシステム。
【請求項６】
前記ｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドをコーディングする遺伝子は、アデノウイルスシステムでアデノウイルス遺伝子のＥ１Ｂ領域またはＥ３領域に挿入されたものである、請求項１に記載のアデノウイルスシステム。
【請求項７】
前記アデノウイルスシステムは、組換えアデノウイルスまたはアデノウイルスの組換えＤＮＡである、請求項１に記載のアデノウイルスシステム。
【請求項８】
前記ｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲ用ガイドＲＮＡである場合、前記アデノウイルスシステムは、Ｃａｓタンパク質を発現するヌクレオチド配列をさらに含むものである、請求項１に記載のアデノウイルスシステム。
【請求項９】
アデノウイルスシステムと結合された形態の生体適合性高分子をさらに含むものである、請求項１に記載のアデノウイルスシステム。
【請求項１０】
前記生体適合性高分子は、ＰＡＰＳ（ＰＥＩ−Ａｒｇ−ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ｍＰＥＧ−Ａｒｇ−ＰＥＩ）、ＰＰＳＡ（ｍＰＥＧ−ＰＥＩ−ｇ−Ａｒｇ−Ｓ−Ｓ−Ａｒｇ−ｇ−ＰＥＩ−ｍＰＥＧ）、ＰＩＣＩＯＮ（フェギル化されて酸化鉄ナノ粒子と架橋結合されたカテコール−グラフトされたポリＬリシン）、ＡＢＰ（アルギニングラフトされた生分解性高分子）、ＡＰＰ（フェギル化されてＰＴＸ−コンジュゲートされたポリマーミセル）、ＰＰＣＢＡ（ｍＰＥＧ−ｂ−Ｐｉｐ−ＣＢＡ）、ＰＰＡ（ＰＰＣＢＡ−ＰＥＩ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｅｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）、ポリラクチド（ｐｏｌｙ−ｌａｃｔｉｄｅ、ＰＬＡ）、ポリグリコライド（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ、ＰＧＡ）、ポリラクチドコグリコリド（ｐｏｌｙ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ、ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ｐｏｌｙ−ε−ｃａｒｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ、ＰＣＬ、）、ポリエチレンアミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅａｍｉｎｅ、ＰＥＩ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ＨＡ）、ゼラチン、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、及び血清アルブミンからなる群から選ばれたものである、請求項９に記載のアデノウイルスシステム。
【請求項１１】
請求項１ないし請求項１０のいずれか１項に記載のアデノウイルスシステムを含む、抗がん用組成物。
【請求項１２】
前記がんは胃がん、肺がん、非小細胞性肺がん、乳がん、卵巣がん、肝臓がん、気管支がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、膵臓がん、膀胱がん、大腸がん、結腸がん、子宮頸がん、骨がん、非小細胞性骨がん、血液がん、皮膚がん（黒色腫など）、頭頚部がん、子宮がん、直腸がん、肛門付近がん、結腸がん、卵管がん、子宮内膜がん、膣がん、陰門がん、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、食道がん、小腸がん、内分泌腺がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、腎臓または尿管がん、腎臓細胞がん腫、腎臓骨盤がん腫、倍数体がん（ｐｏｌｙｐｌｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、唾液腺がん、肉腫がん、仮性粘液腫、肝母細胞腫、精巣がん、膠芽腫、口唇がん、胚細胞腫瘍、基底細胞がん、多発性骨髄腫、胆のうがん、脈絡膜黒色腫、ファーター膨大部がん、腹膜がん、副腎がん、舌がん、小細胞がん、小児リンパ腫、神経芽細胞腫、十二指腸がん、尿管がん、星細胞腫、髄膜腫、腎盂がん、外陰がん、胸腺がん、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ、ＣＮＳ）腫瘍、１次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫及び脳下垂体腺腫である、請求項１１に記載の抗がん用組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、腫瘍内（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ）に投与されるものである、請求項１１に記載の抗がん用組成物。
【請求項１４】
請求項１ないし請求項１０のいずれか１項に記載のアデノウイルスシステムを含む抗腫瘍免疫性（ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）増進用組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、腫瘍内（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ）に投与されるものである、請求項１４に記載の抗腫瘍免疫性増進用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−１２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２、ＩＬ−１２）とＣ−ｍｅｔ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ｍｅｔ）の発現を抑制する核酸分子を同時に発現する組換えアデノウイルスを含む抗腫瘍または抗腫瘍免疫性増進組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍免疫治療は、全般的な体内の免疫機能を増強させることにより、腫瘍に対する免疫反応を誘導し、これによって腫瘍を治療する方法であって、これに対する研究が活発に行われている。しかし、がんが生成される段階は、ほとんど大部分の場合、免疫抑制環境が形成され、体内の免疫システムが活発に作用しても腫瘍を容易に除去することが困難になる。腫瘍細胞は、自ら多くの異常な抗原を発現させ、これらの抗原は、免疫監視（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）を通じて除去（ｅｆａｄｉｃａｔｉｏｎ）反応を起こし、体内の免疫システムが活発に作用しても腫瘍細胞が免疫監視を回避するようにする。また、このような現象が腫瘍細胞が生産する様々な因子（ｆａｃｔｏｒｓ）によって媒介されることが明らかになった。腫瘍組織は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）−β及びインターロイキン（ＩＬ）−１０のような免疫抑制分子を生産でき、免疫抑制された腫瘍において調節Ｔ細胞の浸透が現れるものと報告された。さらに、活性化されたＴ細胞によってＰＤ−１という抑制受容体の発現の刺激が続くほど増加するが、がん細胞の場合、ＰＤ−１と特異的に結合するリガンドであるＰＤ−Ｌ１を多量に発現して活性化されたＴ細胞を不活性化させて免疫反応を回避し、結果として腫瘍内の免疫抑制微細環境及び免疫寛容を誘導する。
【０００３】
最近の研究によりＴ細胞活性抑制に関与するＰＤ−１の免疫チェックポイント（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）を抑制できる阻害剤が強力な抗腫瘍免疫反応を誘導したことを証明した。結果として、免疫監視回避を克服することが免疫治療療法の主要な戦略となる。したがって、このような限界点を克服するための一つの方案として、免疫増進効果を持つサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）遺伝子を直接がん細胞に導入し、がん細胞からサイトカインを生成及び分泌させて抗腫瘍免疫反応誘導によるがん細胞特異的除去に関する研究が活発に行われている。現在まで抗腫瘍効果が報告された免疫増進サイトカイン遺伝子のうちインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、最も効果的かつ有望なサイトカインの一つである。
【０００４】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、ジスルフィド結合で連結された４０ｋＤａ及び３５ｋＤａサブユニットを含むヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ）タンパク質であって、活性化されたマクロファージ、単核球、樹状細胞、及び活性Ｂリンパ球のような抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ、ＡＰＣ）から分泌され、がん細胞を効果的に除去できる細胞性Ｔ細胞とＮＫ細胞に直接作用してこれらを活性化させ、ＩＦＮ−γの分泌を誘導するだけでなく、これらのがん細胞に対する殺傷能力も増強させる。ＩＬ−１２の局所的発現は、腫瘍細胞がＴ−細胞媒介細胞毒性に敏感に反応するようにし、結果として、腫瘍成長抑制及び体液性免疫（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）の構築をもたらす。
【０００５】
しかし、ＩＬ−１２の投与時、患者が受け入れられる容量を制限するサイトカイン−関連毒性が全身に現れる可能性があるため、ＩＬ−１２の臨床適用において困難性がある。また、免疫効果の全般的な下向き調節、患者の血清におけるＩＬ−１０の発現増加及びＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−βの発現減少によるＴｈ１からＴｈ２免疫へのＩＬ−１２分極化現象が現れており、このために反復的にＩＬ−１２を投与することになる場合も発生するため、このような臨床結果は、がんの治療のための単一治療剤としてのＩＬ−１２の限界を示す。
【０００６】
最近、がんの悪性度を反映する生物学的指標として成長因子とそれらの受容体に対する研究が進行中であり、このうちチロシンキナーゼ受容体ファミリー（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ）の一つであるｃ−ｍｅｔに対する研究が活発に行われている。ｃ−ｍｅｔは、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ／ＳＦ）の受容体として作用し、様々ながんにおいて過発現され、このような患者は、がんの治療予後が悪い場合がほとんどである。ｃ−ｍｅｔの過発現は、ＨＧＦ／ＳＦ−Ｍｅｔ信号伝達体系により細胞分裂（ｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）と細胞の運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を増進させ、細胞死滅を抑制するだけでなく、血管形成や細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）で浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）と転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）を誘導するなど、がんの悪性度を増加させる。このようなｃ−ｍｅｔの過発現によって誘導されるがん細胞の速い増殖及び転移は、免疫系のがん細胞除去速度を超えるため、免疫反応によって除去されにくい。さらに、腫瘍のサイズが大きくなるほど、腫瘍微小環境の免疫反応の中心おもりが抑制方向に激しく傾くため、単一治療法によりこれを制御するのは、さらに困難になり、抗腫瘍免疫治療によって向上した抗腫瘍効果を示すことが困難になる。
したがって、抗腫瘍免疫性を増加させてより優れた抗がん効果を持ちながら、投与量等による副作用のない抗がん治療法の開発は、依然として本技術分野において解決すべき課題として残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2016/115559
【特許文献２】WO2010/124188
【特許文献３】WO2012/075158
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記課題を解決するため、これに本発明者らは、抗腫瘍効果は優れていながらも、投与量を下げることができる治療ターゲットを開発しようと努力し、ＩＬ−１２とｃ−ｍｅｔをターゲットとする治療法を併用することにより、より効果的にがんを治療できる方法を提案する。本発明者らは、インターロイキン−１２を発現するとともに、ｃ−ｍｅｔの過発現を抑制できるアデノウイルスをがんの治療に活用する場合、各治療ターゲットを単独で使用する場合に比べて腫瘍を抑制し、免疫監視回避を克服してがんを治療するのにシナジー効果が得られることを確認し、本発明を完成した。
【０００９】
本明細書の全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として挿入され、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するため、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡに相補的であり、ｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子を含む遺伝子伝達体を提供することを目的とする。
【００１１】
本発明の他の目的は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする核酸配列と、ｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合し、ｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する核酸配列を含む遺伝子伝達体を含む薬剤学的組成物を提供するものである。
【００１２】
前記遺伝子伝達体は、アデノウイルスシステムであってもよく、前記アデノウイルスシステムは、組換えアデノウイルスまたはアデノウイルスの組換えＤＮＡであってもよい。
【００１３】
前記薬剤学的組成物は、抗がん用または抗腫瘍免疫性増進用組成物であってもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のインターロイキン−１２とＣ−ｍｅｔの発現を抑制する核酸分子を同時に発現するアデノウイルスシステムは、腫瘍環境で免疫機能を回復させて腫瘍の再形成、転移抑制、腫瘍の成長抑制のような抗がん効果を著しく増進させることができ、特に、２つの治療遺伝子を同時に発現させることにより、がんの治療において顕著なシナジー効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の一実施例によって構築されたアデノウイルスプラスミドＤＮＡの構造を示したものである。
【図２】図２は、本発明の一実施例によって構築されたアデノウイルスプラスミドＤＮＡが細胞内でマウスインターロイキン−１２（ｍＩＬ−１２）またはヒトインターロイキン−１２（ｈＩＬ−１２）を発現できることを確認したグラフである。
【図３】図３は、本発明の一実施例によって構築されたアデノウイルスが細胞内でインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の発現を高め、ｃ−ｍｅｔの発現を抑制させることを確認したグラフである。
【図４】図４は、本発明の一実施例によって構築されたＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスの構造を示す。
【図５】図５ａ及び５ｂは、マウス由来Ｂ１６−Ｆ１０とＣＴ２６細胞のそれぞれにおいて、本発明の一実施例によるＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによる生体内抗腫瘍効果を確認した結果である。
【図６】図６は、マウス由来Ｂ１６−Ｆ１０細胞において本発明の一実施例によるＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスｐＤＮＡ／ＰＰＡ複合体による生体内抗腫瘍効果を確認した結果である。
【図７】図７ａ及び７ｂは、ヒト肺がん細胞株Ｈ１９７５において本発明の一実施例によるＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによる細胞内ＩＬ−１２発現（図７ａ）及びｃ−ｍｅｔの発現抑制能（図７ｂ）を確認した結果である。
【図８】図８ａ及び８ｂは、ヒト肺がん細胞株Ｈ１９７５において本発明の一実施例によるＩＬ−１２及び／又はｓｈｃ−ｍｅｔを発現する抗がんアデノウイルスによるがん細胞殺傷能を正常酸素条件８ａと低酸素条件８ｂで確認した結果である。
【図９】図９ａ、９ｂ、９ｃ及び９ｄは、本発明の一実施例によるＩＬ−１２及び／又はｓｈｃ−ｍｅｔを発現する抗がんアデノウイルスによるＨＵＶＥＣ細胞の転移(９a及び９ｂ)と侵襲(９ｃ及び９ｄ)抑制効果を確認した結果である。
【図１０】図１０は、本発明の一実施例によるＩＬ−１２及び／又はｓｈｃ−ｍｅｔを発現する抗がんアデノウイルスによるＨＵＶＥＣ細胞のＥｎｄｏ−ＭＴ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｔｏ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）阻害による腫瘍細胞の転移抑制を確認した結果である。
【図１１】図１１は、本発明の一実施例によるＩＬ−１２及び／又はｓｈｃ−ｍｅｔを発現する抗がんアデノウイルスのヒト異種移植腫瘍モデル（Ｈ１９７５）において抗腫瘍効果を確認した結果である。
【図１２】図１２は、本発明の一実施例によってＩＬ−１２とｃ−ｍｅｔを標的とするガイドＲＮＡによるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを同時発現する遺伝子伝達体の構造を図式化したものである。
【図１３】図１３ａ、１３ｂ及び１３ｃは、本発明の一実施例によるＩＬ−１２とＬｂｃｐｆ１−ｃｒＭＥＴを同時発現する抗がんウイルスによる細胞内ＩＬ−１２発現（１３a）及びｃ−ｍｅｔ抑制(１３ｂ及び１３ｃ)効果を確認した結果である。
【図１４】図１４は、本発明の一実施例によるＩＬ−１２とＬｂｃｐｆ１−ｃｒＭＥＴを同時発現する抗がんウイルスのヒト異種移植腫瘍モデル（Ｈ１９７５）において抗腫瘍効果を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の一態様によって、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子を含む遺伝子伝達体を提供する。
【００１７】
本発明の他の態様によって、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子を含む遺伝子伝達体を含む抗がん用、がん細胞の抗転移用組成物、または抗腫瘍免疫性増進用薬学的組成物を提供する。
【００１８】
本発明のさらに他の態様によって、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子を含む遺伝子伝達体の抗がん剤としての用途を提供する。
【００１９】
本発明のさらに他の態様によって、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子を含む遺伝子伝達体またはこれを含む薬学的組成物を個体に投与することを含むがんを治療する方法を提供する。
【００２０】
本発明において「遺伝子伝達体」とは、遺伝子を細胞内に伝達するためのベクターシステムを意味するもので、本発明において特に記載のない限り、遺伝子伝達体、アデノウイルスベクター、アデノウイルスシステム、またはアデノウイルスベクターシステムは、同じ意味で用いられる。本発明のアデノウイルスシステムは、アデノウイルスとアデノウイルスのＤＮＡ（ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ）をすべて含む意味である。好ましくは、抗がんまたは抗腫瘍免疫性増進用として組み換えられた組換えアデノウイルスまたはアデノウイルスの組換えＤＮＡであってもよい。
【００２１】
前記アデノウイルスシステムは、アデノウイルスのゲノム配列を含んでもよく、これによって細胞内に伝達されたアデノウイルスまたは組換えＤＮＡからアデノウイルスが生成され、抗がんまたは抗腫瘍免疫効果を持つことができる。本発明では、ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔをそれぞれ発現する遺伝子がアデノウイルスゲノムに挿入されてアデノウイルスそのものまたはその組換えＤＮＡ形態で細胞に伝達され得るため、本発明の明細書全体においてアデノウイルスと称されるものは特に言及のない限り、組換えアデノウイルスとアデノウイルスの組換えＤＮＡをすべて含む意味である。
【００２２】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明のアデノウイルスシステムは、腫瘍でのみ特異的に増殖し、腫瘍細胞を選択的に殺傷できる腫瘍選択的殺傷アデノウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、ｏＡｄ）であってもよい。前記腫瘍選択的殺傷アデノウイルスは、本明細書において抗がんウイルス、ｏＡｄ、または腫瘍殺傷ウイルスなどの用語と相互交換的に使用されてもよい。腫瘍選択的殺傷アデノウイルスは、本発明の技術分野で用いられる通常の技術を通じて遺伝子的に変形されたものはすべて、本発明のアデノウイルスシステムに含まれる。一例として、がん細胞でのみ増殖できるようにアデノウイルスゲノムからＥ１Ａ及び／又はＥ１Ｂを除去して正常細胞で増殖できないようにしたり、がん細胞から分泌されるプロテアーゼを使用するようにウイルスタンパク質のターゲットシーケンスを変化させたり、がん細胞に存在する受容体（例：ＥＧＦＲ）に結合するために受容体リガンドを発現するようにウイルスゲノムにリガンドを発現する配列が挿入された変形であってもよい。
【００２３】
また、本発明の腫瘍選択的殺傷アデノウイルスは、がん細胞の殺傷能を向上させるため、細胞死滅がよく発生するようにＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入されるか、がん細胞に入って発現されて効果的に免疫反応が発生するようにＩＦＮ遺伝子が挿入されてもよい。
【００２４】
本発明で用いられる組換えアデノウイルスは、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞において作動可能なプロモーターを含む。本発明に適したプロモーターは、哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーターを含む。組換えアデノウイルスに挿入されるトランス遺伝子は、プロモーター−トランス遺伝子ポリＡ配列の発現カセットに挿入されることが好ましい。この場合、前記プロモーターとして、本発明の遺伝子発現調節配列（ＨＲＥ−ＴＥＲＴ、ＨＲＥ−Ｅ２Ｆ、ＨＲＥ−ＴＥＲＴ−Ｅ２Ｆ、ＨＲＥ−Ｅ２Ｆ−ＴＥＲＴ、ＨＲＥ−Ｅ２Ｆ−５ｍｙｃ−ＴＥＲＴ、ＨＲＥは、２つが繰り返されて含まれてもよい）または通常のプロモーターが用いられてもよい。
【００２５】
トランス遺伝子に結合される通常のプロモーターは、好ましくは、動物細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞で作動してトランス遺伝子の転写を調節できるものであって、哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーターを含み、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ  ｖｉｒｕｓ）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７.５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオニンプロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーター、ｉｎｄｕｃｉｂｌｅプロモーター、がん細胞特異的プロモーター（例えば、ＴＥＲＴプロモーター、ＰＳＡプロモーター、ＰＳＭＡプロモーター、ＣＥＡプロモーター、Ｅ２Ｆプロモーター及びＡＦＰプロモーター）及び組織特異的プロモーター（例えば、アルブミンプロモーター）を含むが、これに限定されるものではない。トランス遺伝子を発現させるための発現コンストラクトにおいて、トランス遺伝子のダウンストリームにポリアデニル化配列が結合されていることが好ましい。前記ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンターミネーター（Ｇｉｍｍｉ，Ｅ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：６９８３−６９９８（１９８９））、ＳＶ４０由来ポリアデニル化配列（Ｓｃｈｅｋ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：５３８６−５３９３（１９９２））、ＨＩＶ−１  ｐｏｌｙＡ（Ｋｌａｓｅｎｓ，Ｂ．Ｉ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１８７０−１８７６（１９９８））、β−グロビンｐｏｌｙＡ（Ｇｉｌ，Ａ.，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ４９：３９９−４０６（１９８７））、ＨＳＶ  ＴＫ  ｐｏｌｙＡ（Ｃｏｌｅ，Ｃ．Ｎ．  ａｎｄ  Ｔ．Ｐ．Ｓｔａｃｙ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２１０４−２１１３（１９８５））またはポリオーマウイルスｐｏｌｙＡ（Ｂａｔｔ，Ｄ．Ｂ  ａｎｄ  Ｇ．Ｇ．  Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４７８３−４７９０（１９９５））を含むが、これに限定されるものではない。
【００２６】
本発明で用いられる組換えアデノウイルスにおいてＩＬ−１２遺伝子配列及びｃ−ｍｅｔ抑制するＲＮＡを発現する配列は、プロモーターに作動的に連結されている。本明細書において、用語の「作動的に結合された」とは、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節することになる。
【００２７】
本発明の組換えアデノウイルスは、選択標識として抗生物質耐性遺伝子及びレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ルシフェラーゼ及びβ−グルクロニダーゼアーゼ）をさらに含んでもよい。前記抗生物質耐性遺伝子は、当業界で通常用いられる抗生物質耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子があり、好ましくは、ネオマイシン耐性遺伝子である。前記選択標識は、別途のプロモーターまたはＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）または２Ａシステムによって連結された発現システムによっても発現されることがあり、本発明で用いられるＩＲＥＳは、数種のウイルス及び細胞のＲＮＡsで発見される調節配列である（ＭｃＢｒａｔｎｅｙ  ｅｔ．ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：９６１（１９９３））。また、２Ａシステムは、単一のコーディング配列内の個々のタンパク質産物の効率的な調和発現（ｃｏｎｃｏｒｄａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を可能にする切断可能な小さな（１８−２２アミノ酸）ペプチドをコーディングする配列を意味する。例えば、口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ、Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎（ｅｑｕｉｎｅ  Ｒｈｉｎｉｔｉｓ）Ａウイルス、ブタテスコウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ）−１（Ｐ２Ａ）またはトセアアシグナウイルス（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ、Ｔ２Ａ）またはＳｚｙｍｃｚａｋ−Ｗｏｒｋｍａｎ、Ａ．など．「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ２Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」に説明されている２Ａシステムのうちのいずれかのような、ウイルスからの２Ａシステムが使用されてもよい。
【００２８】
本発明は、インターロイキン−１２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２、ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ｍｅｔ）のｍＲＮＡに相補的であり、ｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子をすべて含み、これを同時に発現させることにより、抗がん及び抗腫瘍免疫性増進にシナジー効果が得られることを技術的特徴とする。また、少量のＩＬ−１２投与にもかかわらず、優れた治療効果が得られ、従来のサイトカイン投与による副作用の問題も解決できるという点で本技術は、意義を持つ。
【００２９】
本発明の明細書において、用語の「インターロイキン−１２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２；ＩＬ−１２）」は、４０ｋＤａサブユニット（ｐ４０サブユニット）及び３５ｋＤａサブユニット（ｐ３５サブユニット）がジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）結合によって結合されてなるヘテロダイマーのサイトカインを意味する。ＩＬ−１２は、マクロファージのような抗原提示細胞によって生成されて活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞の細胞表面の受容体に結合する。前記ＩＬ−１２は、Ｔ細胞とＮＫ細胞の増殖を促進し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びマクロファージの細胞毒性効果を増進させ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＧＭ−ＣＳＦの生成を誘導し、Ｔｈ１細胞の活性化を誘導する作用をする。また、ＩＬ−１２は、Ｔｈ１クローン増殖の重要な共同刺激者として知られており、血清中におけるＩｇＧ２ａ抗体の生成を増加させることが知られている。本発明において、用語の「ｐ３５サブユニット」及び「ｐ４０サブユニット」とは、実施例に例示されたサブユニットだけでなく、それぞれのサブユニットの固有の機能を果たすことができるサブユニットのすべての類似体（ａｎａｌｏｇｕｅｓ）を含む。
【００３０】
本発明のアデノウイルスシステムは、ＩＬ−１２をコーディングする遺伝子を発現可能な形態で含み、腫瘍細胞に感染した後、ＩＬ−１２を分泌して、強力な抗腫瘍免疫反応を誘導する。
【００３１】
本発明のアデノウイルスシステムは、ＩＬ−１２を効率的に発現させるため、サブユニットとしてＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）とＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）を発現するＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）遺伝子及びＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）遺伝子を含んでもよい。また、前記２つのサブユニットを連結する役割を果たすようにＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）遺伝子配列及びＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）遺伝子配列との間にリンカー配列をさらに含んでもよく、またはタンパク質発現の効率を高めるため、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）配列をさらに含んでもよい。
【００３２】
前記リンカーは、２つの遺伝子の間に含まれてもよい任意の配列を意味し、本発明では、ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）遺伝子及びＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）遺伝子の間に含まれてもよい配列を意味する。これは、すでに遺伝子と遺伝子との間に挿入されてもよいものと知られている通常のリンカー配列または任意に設計された配列をすべて含み、ＩＬ−１２の発現に否定的な影響を与えたり、ＩＬ−１２の機能を損なわない場合、すべて本発明に含まれてもよい。一例として、配列番号１９の配列であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００３３】
本発明で用いられる「ＩＬ−１２Ａサブユニット（ｐ３５サブユニット）」のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＡＤ５６３８５に記載されたものであってもよい（もし、マウスｐ３５アミノ酸配列を発現しようとする場合には、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ３９２９２）。また、前記ＩＬ−１２Ａサブユニットをコーディングする配列としてＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１８０５６２に記載された配列のうちＣＤＳ（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に該当するヌクレオチド配列であってもよい（もし、マウス配列を用いる場合、Ｍ８６６７２に記載された配列のうちＣＤＳ配列を参照）。また、本発明の一実施例で使用された配列番号１または配列番号４の配列であってもよい（マウスの場合、配列番号７の配列）。
【００３４】
本発明で用いられる「ＩＬ−１２Ｂサブユニット（ｐ４０サブユニット）」のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＤ５６３８６に記載されたものであってもよい（もし、マウスｐ４０アミノ酸配列を発現する場合には、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ３９２９６）。また、前記ＩＬ−１２Ａサブユニットをコーディングする配列としてＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１８０５６に記載された配列のうちＣＤＳ（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に該当するヌクレオチド配列であってもよい（もし、マウス配列を用いる場合、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ８６６７１に記載された配列のうちＣＤＳ配列を参照）。また、本発明の一実施例で使用された配列番号２または配列番号５の配列であってもよい（マウスの場合、配列番号８の配列）。
【００３５】
本発明は、一実施例において、配列番号３または配列番号６のＩＬ−１２遺伝子を用いて腫瘍細胞でＩＬ−１２が発現されてもよく（マウスの場合、配列番号９）、特にｃ−ｍｅｔに対するＲＮＡと同時に発現させる場合、ＩＬ−１２の発現量が顕著に増加することを確認した。
【００３６】
本発明の明細書において、用語の「ｃ−ｍｅｔ」は、チロシンキナーゼ受容体ファミリー（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ）の一つであり、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ／ＳＦ）の受容体として作用し、様々ながんにおいて過発現され、ｃ−ｍｅｔの過発現が現れた患者は、がんの治療予後が悪い場合がほとんどである。本発明のＣ−ｍｅｔの遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  ｇｉ：４５５７７４６に記載されたｍＲＮＡの配列のうちＣＤＳ（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に該当するヌクレオチド配列であってもよい（もし、マウス配列を用いる場合、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｇｉ：１４６１９８６９５に記載された配列のうちＣＤＳ配列を参照）。
【００３７】
ｃ−ｍｅｔの過発現は、ＨＧＦ／ＳＦ−Ｍｅｔ信号伝達体系により細胞分裂（ｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）と細胞の運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を増加させ、細胞外基質に浸潤と転移を誘導してがんの悪性度を増加させる。したがって、がんの治療において、ｃ−ｍｅｔの発現抑制は、非常に重要な問題である。本発明は、ｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡに相補的であり、ｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを用いてｃ−ｍｅｔの発現を抑制し、特に、ＩＬ−１２と同時発現によってｃ−ｍｅｔの発現抑制が単独抑制群に比べて著しく向上し得ることを確認した。
【００３８】
一例として、本発明で用いられる抑制標的となるｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡは、配列番号１０に記載された配列であってもよい（マウスの場合、配列番号１１）。
【００３９】
前記ｃ−ｍｅｔ遺伝子に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＴＦＯｓ（ｔｒｉｐｌｅｘ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、及びＣＲＩＳＰＲ用ガイドＲＮＡからなる群から選ばれた一つ以上であってもよい。
【００４０】
ｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチド配列は、配列番号１０のｃ−ｍｅｔｍＲＮＡ配列の一部と同一または相補的な配列を含んでもよい。好ましくは、配列番号１０の配列において４つ以上の連続するヌクレオチドの配列と同一またはこれに相補的な配列を含んでもよい。
【００４１】
本発明の一実施例では、前記オリゴヌクレオチドとしてｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡに相補的な配列を含み、その発現を抑制できるｓｈＲＮＡを用いて腫瘍細胞においてｃ−ｍｅｔの発現を効果的に抑制させることができることを確認した。
【００４２】
本発明において、「ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ  ｏｒ  ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）」は、ヘアピン構造を持つ人工ＲＮＡ分子であって、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を介してターゲット遺伝子の発現を抑制するのに用いられる。ｓｈＲＮＡは、主にプラスミド、バクテリアまたはウイルスベクターを介して細胞内に運ばれる。ｓｈＲＮＡは、分解及び転換（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）の割合が比較的低いという利点がある。
【００４３】
本発明の一実施例において、ｃ−ｍｅｔの発現を抑制するｓｈＲＮＡとして配列番号１２（ヒト）または配列番号１４（マウス）の遺伝子によってコーディングされるｓｈＲＮＡである「Ｈｓｈｃ−ｍｅｔ（配列番号１３の配列を標的とする）」または「ｓｈｃ−ｍｅｔ（配列番号１５の配列を標的とする）」を用いて、本発明のウイルスシステムによってｃ−ｍｅｔの発現が効果的に抑制されることを確認した。
【００４４】
前記ｃ−ｍｅｔ遺伝子に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ用ガイドＲＮＡであってもよい。この場合、本発明の遺伝子伝達体は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムを発現する場合、Ｃａｓタンパク質を発現する配列をさらに含んでもよい。
【００４５】
本発明において、「ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステム」は、標的ＤＮＡ上に存在する特定の塩基配列を認識し、ＤＮＡを切断する制限酵素でＤＮＡを切断して遺伝子を矯正する技術を意味する。本発明では、アデノウイルスシステム内に標的遺伝子Ｃ−ｍｅｔに対するガイドＲＮＡを発現する配列を挿入して発現されたガイドＲＮＡが標的Ｃ−ｍｅｔに混成化結合すると、Ｃａｓタンパク質を用いて標的部位を切断してＣ−ｍｅｔの発現を抑制できるシステムを意味する。
【００４６】
特に言及のない限り、前記ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムを構築する方法、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムに用いられる制限酵素タンパク質の種類などは、本発明の技術分野で通常用いられる技術を用いることができる。
【００４７】
本発明で用いられるＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質であってもよい。本発明で用いられるＣａｓ９またはＣａｓ１２（Ｃａｓ１２ａまたはＣｐｆ１とも表記）タンパク質は、本発明の技術分野でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを具現するために通常用いられるＣａｓタンパク質であれば、制限されず用いられてもよい。また、前記Ｃａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質の具体的な種類は、一例として次の表１に示す通りであるが、これに限定されるものではなく、表１に記載された参考文献は、全体として本発明の明細書に含まれる。
【００４８】
【表１】
2021529545.tif 000003
【００４９】
前記Ｃｐｆ１は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一種類であって、Ｃｌａｓｓ２  Ｔｙｐｅ５  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに分類される。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９のように、単一のサブユニットエフェクターモジュール（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｏｄｕｌｅ）で作動するが、機能的にも若干の差があるため、Ｃａｓ９が遺伝子を切り取るためには、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とするのに対し、Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。Ｃａｓ９の場合、グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）の多いＰＡＭ(ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ−ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）がある部位の遺伝子を切り取るのに対し、Ｃｐｆ１は、チミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）が多い部位を効率的に切断し得る。また、Ｃｐｆ１は、遺伝子を切り取るとき、４〜５つのヌクレオチドオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を発生させる特徴を持つ。このような様々な特徴と構造的な差異のために、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９より作動効率はやや低くても、より高精度を示す。
【００５０】
本発明のＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムの発現のためのプロモーターは、本発明の技術分野においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに使用されるものであれば、制限されず使用されてもよい。一例として、タイプＩＩＩクラスのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを使用してもよい。または、Ｕ６プロモーターを使用してもよいが、この場合、通常用いられるＵ６プロモーターは、転写を開始するためにグアノシンヌクレオチドを必要とするため、Ｕ６プロモーターの使用は、ゲノム標的化部位をＧＮ１９ＮＧＧでさらに制限してもよい（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−８２６；  Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １２：３９３−３９４）。Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターも本発明のベクターシステムで用いられてもよい（Ａｄｈｙａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７８：１４７−１５１；Ｍｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：７０３５−７０５６；Ｐｌｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＲＮＡ  ４：１３１３−１３１７）。
【００５１】
本発明の一実施例では、前記オリゴヌクレオチドとして配列番号１０のヒトｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡから５５番目ないし７７番目のヌクレオチドを標的配列（配列番号１７）として、これに相補的に混成化されてもよいＣＲＩＳＰＲ用ガイドＲＮＡを発現する配列番号１６の遺伝子とＬｂｃｐｆ１を発現する配列番号１８の遺伝子が挿入されたアデノウイルスシステムを用いて、ｃｒＲＮＡ−ＬｂＣｐｆ１のＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムを介してｃ−ｍｅｔの発現を効果的に阻害できることを確認した。
【００５２】
本発明の一実施例では、本発明の図１３に示すように、ＬｂＣｐｆ１を発現する遺伝子配列を含む組換えアデノウイルスベクターを用いてＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムを発現させた。
【００５３】
本発明において用語の「相補的」とは、１００％相補的な場合だけでなく、ＲＮＡ干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）機序を介してｃ−ｍｅｔ遺伝子の発現を抑制できる程度の不完全な相補性も包括する意味であり、好ましくは、９０％の相補性、より好ましくは、９８％の相補性、最も好ましくは、１００％の相補性を意味する。本明細書において１００％相補性を表現する場合には、「完全相補的（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」と記載される。
【００５４】
本発明の一具現例によれば、本発明のアデノウイルスに含まれるｓｈＲＮＡ配列は、配列番号１０の一部の配列に相補的な配列を含み、好ましくは、配列番号１０のｃ−ｍｅｔ  ｍＲＮＡ配列のうち１９８７番目のヌクレオチドないし２００７番目のヌクレオチドの配列に相補的な配列を含む。
【００５５】
本発明の特定の具現例によれば、前記ｃ−ｍｅｔの発現を抑制できるオリゴヌクレオチドとして、ｓｈＲＮＡは、配列番号１２または配列番号１６の遺伝子によってコーディングされたものであってもよい（マウスの場合、配列番号１４の遺伝子）。
【００５６】
本発明で用いられる「遺伝子または遺伝子配列」は、本発明で提示する配列番号の各配列に対して実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）または実質的な類似性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を示す遺伝子配列も含むものと解釈される。前記実質的な同一性は、前記本発明の配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアライメントし、当業界で通常用いられるアルゴリズムを用いてアライメントされた配列を分析した場合に、７０％以上の相同性、好ましくは、８０％の相同性、より好ましくは、９０％の相同性、最も好ましくは、９５％の相同性を示す配列を意味する。前記実質的な類似性は、一つ以上の塩基の欠損または挿入のようなＩＬ−１２遺伝子配列の変化が組換えベクターシステムとの相同性組換えを最小化する本発明の目的に影響を及ぼさない変化を総称する。したがって、本発明のＩＬ−１２遺伝子配列は、例示された配列リストの配列に限定されず、本発明が目的とする最終生成物の活性に実質的に影響を及ぼさない限り、本発明の権利範囲に含まれると解釈される。
【００５７】
本発明のアデノウイルスシステムは、アデノウイルスのゲノム骨格を用いてがんの治療を達成し得る。アデノウイルスは、中間程度のゲノムサイズ、操作の利便性、高いタイター、広範囲な標的細胞及び優れた感染性のため、遺伝子伝達体として多く使用されている。ゲノムの両末端は、１００〜２００ｂｐのＩＴＰ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を含み、これはＤＮＡ複製及びパッケージングに必須的な構成である。ゲノムのＥ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）は、転写及及び宿主細胞遺伝子の転写を調節するタンパク質をコーディングする。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）は、ウイルスＤＮＡ複製に関与するタンパク質をコーディングする。アデノウイルスゲノムの小さな部分のみがｃｉｓで必要であると知られているため（Ｔｏｏｚａ，Ｊ.  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８１））アデノウイルスは、外来のＤＮＡ分子を運搬する能力を持つ。
【００５８】
本発明のアデノウイルスシステムのゲノムは、Ｅ１領域及びＥ３領域が欠失したものであってもよい。具体的には、本発明のアデノウイルスシステムは、Ｅ１Ａ遺伝子及び非活性化されたＥ１Ｂ１９遺伝子、非活性化されＥ１Ｂ５５遺伝子または非活性化されたＥ１Ｂ１９及びＥ１Ｂ５５遺伝子を含んでもよい。
【００５９】
本明細書において遺伝子に関連して用いられる用語の「非活性化」とは、その遺伝子の転写及び／又は解読が正常に行われず、その遺伝子によってコーディングされる正常なタンパク質の機能が現れないことを意味する。例えば、非活性化Ｅ１Ｂ１９遺伝子は、その遺伝子に変異（置換、付加、部分的欠失または全体的欠失）が発生して活性のＥ１Ｂ  １９ｋＤａタンパク質を生成できないことである。Ｅ１Ｂ１９が欠失した場合には、細胞枯死能を増加させることができ、Ｅ１Ｂ５５遺伝子が欠失した場合には、腫瘍細胞特異性を持たせる（参照：特許出願第２００２−２３７６０号）。本明細書において、遺伝子または配列に関連して用いられる用語の「欠失」とは、当該配列が完全に欠失したものだけでなく、部分的に欠失したものも含む意味を持つ。
【００６０】
本発明の組換えアデノウイルスは、ＥｌＡ遺伝子配列に位置したＲｂ結合部位をコーディングするヌクレオチド配列のうち４５番目のＧｌｕ残基がＧｌｙで置換された変異及び１２１−１２７番目のアミノ酸配列が全体的にＧｌｙに置換された変異を有するものであってもよい。
【００６１】
本発明の一具現例によれば、前記組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ａ部位を含み、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａが欠失しており、Ｅ３部位（ΔＥ３）が欠失したものであってもよい。Ｅ１Ａ遺伝子を含む組換えアデノウイルスは、複製可能な特性を持つようになる。前記ＩＬ−１２遺伝子及びｃ−ｍｅｔ発現抑制オリゴヌクレオチドは、それぞれアデノウイルスの欠失したＥ１及びＥ３部位に挿入されてもよい。
【００６２】
本発明のアデノウイルスシステムは、アデノウイルスまたはそのｖｉｒａｌ  ＤＮＡの細胞内伝達能を高めたり、細胞内に伝達されて残存時間などを増やすため、生体適合性高分子をさらに含んでもよい。具体的には、前記生体適合性高分子がアデノウイルスまたはアデノウイルスプラスミドＤＮＡと結合された形態で本発明のシステムに含まれてもよい。
【００６３】
前記生体適合性高分子は、本発明の技術分野において遺伝子の伝達のためのベクターシステムに使用されてもよいものであれば、すべて含まれてもよい。
【００６４】
一例として、本発明の生体適合性高分子は、（ａ）免疫反応回避性部位（ｅｓｃａｐａｂｌｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、（ｂ）電荷性部位（ｃｈａｒｇｅａｂｌｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ）及び（ｃ）ジスルフィド結合を含む生還元性部位（ｂｉｏｒｅｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ）を含むｐＨ敏感性及び生還元性高分子であってもよい。
【００６５】
前記（ａ）免疫反応回避性部位は、ポリマーが結合するウイルスが生体内免疫反応（細胞性免疫反応及び体液性免疫反応を含む）を回避できるように作用をする。前記免疫反応回避性部位に用いられる物質は、具体的に生体内免疫反応（細胞性免疫反応及び体液性免疫反応を含む）を回避できるポリマーであり、より具体的には、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリアルキレンオキサイド（例えば、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンまたはこれらの共重合体（ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド共重合体））、ポリフェニレンオキサイド、ＰＥＧとポリアルキレンオキサイドの共重合体、ポリ（メトキシエチルメタクリレート）、ポリ（メタクリロイルホスファチジルコリン）、過フッ化されたポリエーテル、デキストランまたはポリビニルピロリドンであり、より具体的には、ＰＥＧ、ポリアルキレンオキサイドまたはＰＥＧとポリアルキレンオキサイドの共重合体であり、さらに具体的にＰＥＧであってもよい。
【００６６】
前記（ｂ）電荷性部位（ｃｈａｒｇａｂｌｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ）は、生体内のｐＨ、具体的には、中性ｐＨ付近で前記高分子に正電荷を付与して負電荷性のウイルスの表面またはＤＮＡと相互作用によって結合できるようにしてもよい。または、ウイルス表面またはＤＮＡの電荷性によって前記と逆に負電荷性を高分子に付与してもよい。したがって、電荷性部位は、前記高分子に正電荷または負電荷を付与する物質を含み、例えば、負電荷を付与する場合には、カルボキシレート基、正電荷を付与する場合には、３次アミン基またはアミノ基を有する単量体が電荷性部位に用いられてもよい。
【００６７】
前記（ｃ）ジスルフィド結合を含む生還元性部位（ｂｉｏｒｅｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ）は、ジスルフィド結合を含む形態であれば、単量体の種類に制限されず、本発明に含まれてもよい。前記生還元性部位は、生体内の酸性環境下で還元されてジスルフィド結合がスルフヒドリル基に転換され、これによってポリマー構造の破砕が行われ、結局、ポリマー−ウイルス複合体またはポリマー−ＤＮＡ複合体から結合されているウイルス（ｎａｋｅｄ  ｖｉｒｕｓ）またはＤＮＡが放出されるようにする。
【００６８】
さらに他の例として、本発明の生体適合性高分子は、ポリマー、ナノ物質、デンドリマー、ハイドロゲルをすべて含んでもよい。好ましくは、ＰＡＰＳ（ＰＥＩ−Ａｒｇ−ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ｍＰＥＧ−Ａｒｇ−ＰＥＩ）、ＰＰＳＡ（ｍＰＥＧ−ＰＥＩ−ｇ−Ａｒｇ−Ｓ−Ｓ−Ａｒｇ−ｇ−ＰＥＩ−ｍＰＥＧ）、ＰＩＣＩＯＮ（フェギル化されて酸化鉄ナノ粒子と架橋結合されたカテコール−グラフトされたポリＬリシン（ＰＬＬ））、ＡＢＰ（アルギニングラフトされた生分解性高分子）、ＡＰＰ（フェギル化されてＰＴＸ−コンジュゲートされたポリマー型ミセル；ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ａｎｄ  ＰＴＸ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｅｌｌｅ）、ＰＰＣＢＡ（ｍＰＥＧ−ｂ−Ｐｉｐ−ＣＢＡ）、ＰＰＡ（ＰＰＣＢＡ−ＰＥＩ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｅｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ；ＰＥＧ）、ポリラクチド（ｐｏｌｙ−ｌａｃｔｉｄｅ、ＰＬＡ）、ポリグリコライド（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ；ＰＧＡ）、ポリラクチドコグリコリド（ｐｏｌｙ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ、ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ｐｏｌｙ−ε−ｃａｒｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ、ＰＣＬ）、ポリエチレンアミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅａｍｉｎｅ；ＰＥＩ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；ＨＡ）、ゼラチン、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、及び血清アルブミンからなる群から選ばれたものであってもよい。
【００６９】
前記ＰＡＰＳ高分子は、ＰＥＩ−Ａｒｇ−ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ｍＰＥＧ−Ａｒｇ−ＰＥＩで、次の構造式１の構造を持つ高分子であってもよい。
【００７０】
【化１】
2021529545.tif 000004
【００７１】
前記構造式１において、ｘとｙは、それぞれ独立して１〜５００の整数であってもよい。
【００７２】
前記ＰＰＳＡ高分子は、ｍＰＥＧ−ＰＥＩ−ｇ−Ａｒｇ−Ｓ−Ｓ−Ａｒｇ−ｇ−ＰＥＩ−ｍＰＥＧで、次の構造式２の構造を持つ高分子であってもよい。
【００７３】
【化２】
2021529545.tif 000005
【００７４】
前記構造式２において、ｎとｍは、それぞれ独立して１〜５００の整数であってもよい。
【００７５】
前記ＰＩＣＩＯＮは、フェギル化されて酸化鉄ナノ粒子と架橋結合されたカテコール−グラフトされたポリＬリシン（ＰＬＬ）で、次の構造式３のカテコール−グラフトされたポリＬリシンが酸化鉄粒子と架橋結合され、その表面にｍＰＥＧが改質された構造を持つものであってもよい。
【００７６】
【化３】
2021529545.tif 000006
【００７７】
前記構造式３において、ｎは、１〜５００の整数であってもよい。
【００７８】
前記ＡＢＰ高分子は、アルギニングラフトされた生分解性高分子（Ａｒｇｉｎｉｎ  ｇｒａｆｔｅｄ  ｂｉｏ−ｒｅｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ）で、次の構造式４の構造を持つ高分子であってもよい。
【００７９】
【化４】
2021529545.tif 000007
【００８０】
前記構造式４において、ｎは、１〜５００の整数であってもよい。
【００８１】
前記ＡＰＰは、フェギル化されてＰＴＸ−コンジュゲートされたポリマー型ミセル（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ａｎｄ  ＰＴＸ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｅｌｌｅ）を意味するもので、次の構造式５の構造を持つものであってもよい。
【００８２】
【化５】
2021529545.tif 000008
【００８３】
前記構造式５において、ｎとｍは、それぞれ独立して１〜５００の整数であってもよい。
【００８４】
前記ＰＰＣＢＡ高分子は、ｍＰＥＧ−ｂ−Ｐｉｐ−ＣＢＡで、ｐＨ敏感性及び生分解性高分子に属し、次の構造式６の構造を持つものであってもよい。
【００８５】
【化６】
2021529545.tif 000009
【００８６】
前記構造式６において、ｎとｍは、それぞれ独立して１〜５００の整数であってもよい。
【００８７】
前記ＰＰＡは、ＰＰＣＢＡ−ＰＥＩ−ＡｒｇｉｎｉｎｅでｐＨ敏感性及び生分解性高分子に属し、前記ＰＰＣＢＡにＰＥＩとアルギニンがより結合された形態の高分子であってもよい。次の構造式７の構造を持つものであってもよい。
【００８８】
【化７】
2021529545.tif 000010
【００８９】
前記構造式７において、ａ、ｂ及びｃは、それぞれ独立して１〜５００の整数であってもよい。一例として、aは１００〜２００、ｂは１〜１０、そして、ｃは１〜５の高分子、または、ａは１１３、ｂは６、そして、ｃは１である高分子であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００９０】
ポリエチレンアミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅａｍｉｎｅ、ＰＥＩ）は、構造式８の単量体が結合された線状または分枝状のポリエチレンアミンをすべて含んでもよい。
【００９１】
【化８】
2021529545.tif 000011
【００９２】
前記構造式８において、ｎは、１〜５００の整数であってもよい。
【００９３】
前記分枝状ポリエチレンアミンは、一般的な分枝状ポリエチレンアミンの他に、分子の鎖が一定の規則に従って中心から外側に向かって、規則的に３次元的に広がった形態のデンドリマーも含んでもよい。
【００９４】
【化９】
2021529545.tif 000012
【００９５】
構造式９は、分枝状ポリエチレンアミンの一例を示し、ｎは、１〜５００の整数であってもよい。
【００９６】
本発明の生分解性高分子は、エチレンアミンを単量体とする構造式８の高分子の一例としてデンドリマー高分子も含む。一例として、デンドリマー形態の分枝状ポリエチレンアミンは、構造式１０または構造式１１の高分子であってもよいが、これに限定されるものではない。構造式１１の高分子は、ポリ（アミドアミン）高分子で、ＰＡＭＡＭとも称される。
【００９７】
【化１０】
2021529545.tif 000013
【００９８】
【化１１】
2021529545.tif 000014
【００９９】
前記生体適合性高分子は、本発明の組換えアデノウイルスまたはウイルスＤＮＡと結合して細胞内に流入される効率を高め、個体内の安定性を高め、免疫原性を下げて目的部位にウイルスまたはウイルスＤＮＡの伝達効率を向上させることにより、本発明のアデノウイルスまたはウイルスＤＮＡによるがんの治療効果を顕著に上昇させることができる。
【０１００】
前記生体適合性高分子とアデノウイルスシステムは、静電気的相互作用（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）、イオン性相互作用または化学的結合により連結されてもよい。
【０１０１】
本発明の他の様態によれば、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする核酸配列と、ｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する核酸配列を含む遺伝子伝達体を含む薬学的組成物を提供する。前記組成物は、抗がん用組成物、がん細胞の抗転移用組成物、または抗腫瘍免疫性（ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）増進用組成物であってもよい。
【０１０２】
前記組成物は、本発明のアデノウイルスシステムを治療学的有効量で含んでもよい。また、前記組成物は、薬剤学的に許容される担体（ｃａｒｒｉｅｒ）をさらに含んでもよい。
【０１０３】
前記抗がん用組成物は、腫瘍細胞の生存、増殖及び／又は転移を抑制してがん細胞を増加させないか、がん細胞の死滅を誘導または促進させることを意味する。本発明の組換えアデノウイルスシステムまたはこれを含む組成物は、がん細胞の死滅を効果的に誘導し、転移を抑制し得る。
【０１０４】
前記がん細胞の抗転移用組成物は、がん細胞が移動を通じて転移されることを抑制する効果を持ち、例えば、がん細胞でＥＭＴを阻害して転移を抑制する効果を確認し得る。本発明の抗転移用組成物は、がん細胞の殺傷を通じた抗がん効果とがん細胞の転移抑制効果を同時に持つことができる。
【０１０５】
前記抗腫瘍免疫性増進用組成物は、腫瘍組織で生産される免疫抑制分子を用いた腫瘍の免疫監視回避を克服してがんを治療できるもので、抗がん用組成物に含まれる意味であり得る。特に、抗腫瘍免疫性組成物は、腫瘍組織において免疫細胞の不均衡を正常化し、ＩＬ−１２によってＴ  ｈｅｌｐｅｒ細胞の分化を誘導して細胞毒性Ｔリンパ球及び自然殺傷細胞の細胞毒性を活性化させることにより、抗がん免疫を増進させることができることを意味する。
【０１０６】
本発明の薬学的組成物は、ＩＬ−１２を発現してがん個体内で抗がん免疫を増進させる。また、Ｃ−ｍｅｔに対するｓｈＲＮＡを介してＣ−ｍｅｔの発現を抑制させてＩＬ−１２の機能をさらに増幅させることができる。本発明の一実施例において、ヒト由来のがん細胞を注入したマウスモデルにおいても本発明のＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔ同時発現アデノウイルスを注入した場合、顕著な抗がん効果及び腫瘍の転移効果を示すことを確認した。
【０１０７】
また、前記組成物は、標準治療（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｔｈｅｒａｐｙ）の治療効果増進のための補助治療用組成物であってもよく、他の抗がん剤、免疫関門抑制剤、免疫治療剤などを含む標準治療剤の効果を改善または向上させるための補助治療用組成物であってもよい。
【０１０８】
本発明の抗がん組成物は、上述した抗腫瘍免疫性増進組成物に含まれる組換えアデノウイルスを用いるため、この２つの間に共通の内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるため、その記載を省略する。
【０１０９】
本発明の一具現例によれば、前記がんは胃がん、肺がん、非小細胞性肺がん、乳がん、卵巣がん、肝臓がん、気管支がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、膵臓がん、膀胱がん、大腸がん、結腸がん、子宮頸がん、骨がん、非小細胞性骨がん、血液がん、皮膚がん（黒色腫など）、頭頚部がん、子宮がん、直腸がん、肛門付近がん、結腸がん、卵管がん、子宮内膜がん、膣がん、陰門がん、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、食道がん、小腸がん、内分泌腺がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、腎臓または尿管がん、腎臓細胞がん腫、腎臓骨盤がん腫、倍数体がん（ｐｏｌｙｐｌｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、唾液腺がん、肉腫がん、仮性粘液腫、肝母細胞腫、精巣がん、膠芽腫、口唇がん、胚細胞腫瘍、基底細胞がん、多発性骨髄腫、胆のうがん、脈絡膜黒色腫、ファーター膨大部がん、腹膜がん、副腎がん、舌がん、小細胞がん、小児リンパ腫、神経芽細胞腫、十二指腸がん、尿管がん、星細胞腫、髄膜腫、腎盂がん、外陰がん、胸腺がん、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ、ＣＮＳ）腫瘍、１次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫及び脳下垂体腺腫からなる群から選ばれるが、これに限定されるものではない。
【０１１０】
上述した本発明のすべての組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。本発明に用いられる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでもよい。適切な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【０１１１】
本発明の組成物は、経口または非経口で投与してもよい。非経口投与である場合には、腫瘍内（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ）注入、静脈内注入、皮内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、脊髄内注入、心臓内注入、胸郭内注入、動脈内注入、骨内注入、関節腔内注入、経皮投与などで投与してもよく、好ましくは、非経口投与である。
【０１１２】
また、前記組成物は、局所投与、または全身投与用であってもよい。
【０１１３】
本発明の一具現例によれば、本発明の抗腫瘍免疫性増進組成物は、好ましくは、腫瘍内に（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ）直接投与されて抗腫瘍免疫増進効果を持つことを確認した。
【０１１４】
本発明の組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に処方されることがある。本発明の薬剤学的組成物の１日の投与量は、例えば０.２−１０００ｍｇ／ｋｇである。しかし、有効成分の実際の投与量は、分化及び増殖しようとする対象組織細胞の量、投与経路、患者の体重、年齢及び性別などの様々な関連因子を考慮して決定してもよく、したがって、前記投与量は、いかなる形態でも本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１５】
本発明のさらに他の態様によって、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子を含む遺伝子伝達体の抗がん剤としての用途を提供する。本発明の遺伝子伝達体は、ＩＬ−１２とｃ−ｍｅｔを抑制するＲＮＡを同時に発現することにより、ＩＬ−１２による抗腫瘍免疫効果をより向上させるとともに、腫瘍の転移も抑制し得る。抗がん剤としての本発明の遺伝子伝達体の用途に対しては、重複した記載を避けるため、先の遺伝子伝達体または薬学的組成物に対する内容を準用する。
【０１１６】
本発明のさらに他の態様によって、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子を含む遺伝子伝達体またはこれを含む薬学的組成物を個体に投与することを含むがんを治療する方法を提供する。
【０１１７】
本発明の遺伝子伝達体は、ＩＬ−１２とｃ−ｍｅｔを抑制するＲＮＡを同時に発現することにより、ＩＬ−１２による抗腫瘍免疫効果をより向上させるとともに、腫瘍の転移も抑制できるため、がんの治療においてシナジー効果が得られる。抗がん剤としての本発明の治療方法に対しては、重複した記載を避けるため、先の遺伝子伝達体または薬学的組成物に対する内容を準用する。
【０１１８】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【実施例】
【０１１９】
実験の準備及び組換えベクターの製造
準備例１．細胞の入手及び培養
細胞培養培地として、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、Ｌ−グルタミン（２ｍｍｏｌ／Ｌ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、及びストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）が添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＲＰＭＩ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、またはＭｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用した。ＨＥＫ２９３（アデノウイルスＥ１部位を発現、ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）、Ｈ１９７５（ｈｕｍａｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）、及びＨａＫ（ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。ＨａＰ−Ｔ１（ｈａｍｓｔｅｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）は、Ｄｒ．Ｍａｓａｔｏ  Ａｂｅｉ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｉｂａｒａｋｉ，Ｊａｐａｎ）から分譲を受けた。すべての細胞株は、３７℃、５％ＣＯ２湿潤環境下で培養し、Ｈｏｅｓｃｈｓｔ染料、細胞培養及びＰＣＲを用いてマイコプラズマ陰性テストを行った。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、３７℃、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培地で培養した。
【０１２０】
製造例１．ＩＬ−１２及び／又はｓｈｃ−ｍｅｔを発現する腫瘍殺傷（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）アデノウイルスシステム構築
製造例１−１．ヒト由来ＩＬ−１２及びｓｈｃ−ｍｅｔを発現するｐＤＮＡ構築
Ａｄベクターを用いた抗腫瘍効果及び抗腫瘍免疫反応を確認するために、ｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤに基づいて抗腫瘍免疫遺伝子であるヒトインターロイキン−１２（ｈＩＬ−１２）及び／又はがん細胞の成長と分化に重要な役割を果たすｃ−ｍｅｔの発現を抑制するためのｃ−ｍｅｔに相補的に結合する短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ、以下、「ｓｈｃ−ｍｅｔ」という）を発現するように組換えられた２つの腫瘍殺傷（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）アデノウイルスのプラスミドＤＮＡ（Ａｄ  ｐＤＮＡまたはｏＡｄ  ｐＤＮＡという）を製造した（図１）:(ｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ及びｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ）。
【０１２１】
【表２】
2021529545.tif 000015
【０１２２】
製造例１−２．マウス由来ＩＬ−１２及びｓｈｃ−ｍｅｔ発現するポリマー−ウイルスＤＮＡ複合体の製造
また、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤに基づいてマウス由来のＩＬ−１２  ｐ３５（配列番号７）と、ＩＬ−１２  ｐ４０（配列番号８）を発現する遺伝子を挿入した。また、配列番号１１のマウスのｃ−ｍｅｔ遺伝子に対して４３９８番目ないし４４２２番目のヌクレオチドを標的配列（配列番号１５）とするｓｈＲＮＡを設計した。Ｃ−ＭＥＴ遺伝子に相補的に結合して遺伝子発現を抑制できるｓｈｃ−ｍｅｔを発現する配列番号１４のヌクレオチド配列が挿入されたＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔプラスミドＤＮＡを構築した。これをＰＰＡ（ＰＰＣＢＡ−ＰＥＩ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ）ポリマーと混合して結合させて、ｐＤＮＡ／ＰＰＡポリマー複合体を製造した。
【０１２３】
製造例２．ＩＬ−１２及び／又はｓｈｃ−ｍｅｔを発現する組換え腫瘍殺傷（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）アデノウイルスの構築
ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによる抗腫瘍効果及び抗腫瘍免疫反応を確認するために、抗がんアデノウイルスを作製した（図４、組換えアデノウイルスがヒト由来の配列を含む場合にＨｓｃＩＬ−１２、Ｈｓｈｃ−ｍｅｔに区分して表記）：
ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ：発現遺伝子を含まないＡｄベクター
ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｃＩＬ−１２：ＩＬ−１２のみ発現するＡｄベクター
ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｈｃ−ｍｅｔ：Ｃ−Ｍｅｔ遺伝子に対するｓｈＲＮＡを発現するＡｄベクター
ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ：ＩＬ−１２及びＣ−Ｍｅｔ遺伝子に対するｓｈＲＮＡを発現するＡｄベクター
【０１２４】
より具体的には、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤに基づいてヒト由来のＩＬ−１２  ｐ３５（配列番号１）と、ＩＬ−１２  ｐ４０（配列番号２）をそれぞれ発現する遺伝子を挿入した。また、配列番号１０のヒトｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡに対して、１９８７番目ないし２００７番目ヌクレオチドを標的配列（配列番号１３）とするｓｈＲＮＡを発現する配列番号１２の配列を挿入して組換えアデノウイルスベクターを作製した。
【０１２５】
また、前記と同様の方法でマウス由来のＩＬ−１２  ｐ３５（配列番号８）と、ＩＬ−１２  ｐ４０（配列番号９）を発現する遺伝子と配列番号１１のマウス由来のＣ−ＭＥＴ遺伝子の４３９８番目ないし４４２２番目のヌクレオチドを標的配列（配列番号１５）とし、これに相補的に結合して遺伝子発現を抑制できるｓｈｃ−ｍｅｔを発現する配列（配列番号１４）を挿入してＩＬ−１２とｓｈｃｍｅｔ同時発現アデノウイルスベクターをそれぞれ製造した。
【０１２６】
製造例３．動物モデル構築
３−１．ヒト異種移植肺がん腫瘍モデル
オリエントから購入したヌードマウスが６−８週齢であるとき、ヒト肺がん細胞株（Ｈ１９７５）を３×１０６ｃｅｌｌs／５０μＬでヌードマウスの皮下に注射した後、腫瘍のサイズが平均１００ｍｍ３となったとき、製造例１または２の抗がんアデノウイルスを投与して効果を確認した。
【０１２７】
３−２．マウス腫瘍モデル
Ｃ５７ＢＬ６（Ｂ１６−Ｆ１０  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ）は、大韓バイオリンク、ＢＡＬＢ／Ｃ（ＣＴ２６  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ）は、オリエントから購入して実験を行った。マウス６−８週齢であるとき、マウス皮膚がん細胞株（Ｂ１６−Ｆ１０）またはマウス胃がん細胞株（ＣＴ２６）を５×１０５ｃｅｌｌs／５０μＬでマウスの皮下に注射した後、腫瘍のサイズが平均１００ｍｍ３となったとき、製造例１または２の抗がんアデノウイルスを投与して、効果を確認した。
【０１２８】
試験例１．Ａｄ  ｐＤＮＡによる細胞内ｍＩＬ−１２及びｈＩＬ−１２発現確認
製造例１によって製造されたＡｄ  ｐＤＮＡによるヒトＩＬ−１２（ｈＩＬ−１２）遺伝子発現を確認するために、細胞内伝達効率の良いヒト胚腎臓細胞株である２９３ＡにｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ及びｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ  Ａｄ  ｐＤＮＡをリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）と常温で反応させた後、５０％分注された２９３Ａ細胞に処理後、７２時間目の細胞培養液を回収してｈＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡを行った。
【０１２９】
図２に示すように、実施例（ｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ  Ａｄ  ｐＤＮＡ；Ｐａｃ  Ｉ  ２個）によりｈＩＬ−１２が９７,５００±６,３８４ｐｇ／ｍＬで発現されたことを確認した。したがって、本実施例で作製されたＡｄ  ｐＤＮＡは、細胞内で治療遺伝子インターロイキン−１２の発現を効率的に誘導することを確認できた。
【０１３０】
試験例２．アデノウイルス（Ａｄ）ｐＤＮＡによる細胞内ＩＬ−１２及びｃ−ｍｅｔの同時発現確認
製造例１によって製造されたアデノウイルスｐＤＮＡの細胞内伝達効率を考慮し、２９３Ａ細胞株でｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ  Ａｄ  ｐＤＮＡによるｈＩＬ−１２の発現を確認したが、正常細胞である２９３Ａでは、ｃ−ｍｅｔが過発現しないため、ｃ−ｍｅｔ特異的ｓｈＲＮＡ発現によるｃ−ｍｅｔ発現抑制能を確認できなかった。
【０１３１】
したがって、実施例ｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ（Ｐａｃ  Ｉ  ２個）によるｃ−ｍｅｔの発現抑制能を検証するため、ｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔアデノウイルス（Ａｄ）を製造し、前記で製造したｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔアデノウイルス（Ａｄ）を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５０％分注されたｃ−ｍｅｔが過発現されるＡ５４９ヒト肺がん細胞株にウイルスを２０μＬ処理した後、４８時間目に細胞培養液を回収して感染させ、４８時間後、細胞培養液を回収してｈＩＬ−１２とｃ−ｍｅｔに対するＥＬＩＳＡを行った。いかなる処理もしないＡ５４９ヒト肺がん細胞株においてｈＩＬ−１２とｃ−ｍｅｔの発現量を対照群として使用した。
【０１３２】
図３に示すように、ｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ  ＡｄによってｈＩＬ−１２の発現（２３５,０００±２０,５１８ｐｇ／ｍＬ）が対照群（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）に対して増加し、対照群に対してｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ  Ａｄ処理群でｃ−ｍｅｔの発現が１.２倍減少されることを確認した。したがって、本発明で製造されたＡｄシステムによって治療遺伝子であるＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔの発現が効率的に誘導されることが分かる。
【０１３３】
試験例３．ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスの生体内抗腫瘍効果確認（ｍｏｕｓｅ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ）
製造例２によって製造された、マウスＩＬ−１２とマウスｃ−ｍｅｔ標的ｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによる抗がん治療効果を検証するため、マウスの皮膚がん細胞株であるＢ１６−Ｆ１０またはマウス胃がん細胞株であるＣＴ２６を用いてそれぞれの腫瘍モデルを構築し、抗腫瘍効果を確認した。
【０１３４】
マウス皮膚がん細胞株（Ｂ１６−Ｆ１０）またはマウス胃がん細胞株（ＣＴ２６）を５×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬでマウスの皮下に注射した後、腫瘍のサイズが平均１００ｍｍ３となったとき、ＰＢＳまたはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔをそれぞれ投与した。２日間隔で計３回腫瘍内に投与した後（１×１０１０ＶＰ）、腫瘍のサイズを測定して抗腫瘍効果を観察した。
【０１３５】
図５a及び図５ｂに示すように、２つのマウス腫瘍モデルにおいてＰＢＳ投与群の場合には腫瘍が急速に成長したが、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔを投与したすべての個体において腫瘍が完全に消えることを確認した。
【０１３６】
試験例４．ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスｐＤＮＡ／ＰＰＡ複合体の生体内抗腫瘍効果確認（ｍｏｕｓｅ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ）
製造例１−２によって製造されたＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ  ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ）とＰＰＡポリマー複合体（ｐＤＮＡ／ＰＰＡ）を製造し、抗がん治療の効果を確認した。具体的には、マウス皮膚がん細胞株であるＢ１６−Ｆ１０を用いて腫瘍モデルを構築し、抗腫瘍効果を確認した。マウス皮膚がん細胞株（Ｂ１６−Ｆ１０）を５×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬでマウスの皮下に注射した後、腫瘍のサイズが平均１００ｍｍ３となったとき、ＰＢＳとＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ  Ａｄ  ｐＤＮＡ／ＰＰＡ複合体をそれぞれマウスモデルに投与した。毎日計７回腫瘍内に投与した後、腫瘍のサイズを測定して抗腫瘍効果を観察した。
【０１３７】
図６に示すように、ＰＢＳ投与群の場合には、腫瘍のサイズが２５１４.７±２０２.１ｍｍ３まで成長したが、抗がんウイルスのｐＤＮＡ／ＰＰＡ複合体を投与したグループにおいて、すべて明確な抗腫瘍効果が確認できた。ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ  Ａｄ  ｐＤＮＡ／ＰＰＡ複合体投与群の平均腫瘍サイズは、１３８７.６±１７１.８ｍｍ３でＰＢＳ投与群に対して腫瘍のサイズが４４.８％減少されることを確認し、これはＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現するウイルスＤＮＡによっても向上した抗腫瘍効果が誘導されることを意味する。
【０１３８】
試験例５．ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによる細胞内ＩＬ−１２及びｓｈｃ−ｍｅｔ発現確認（Ｈｕｍａｎ）
ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによるｈｕｍａｎ  ＩＬ−１２またはｈｕｍａｎ  ｃ−Ｍｅｔ標的ｓｈｃ−Ｍｅｔの発現を確認するため、Ｈ１９７５ヒト肺がん細胞株に製造例２によって製造された組換えアデノウイルスＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｈｃ−ｍｅｔ、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２またはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔをそれぞれ２  ＭＯＩ（図７ｂ）または５  ＭＯＩ（図７ａ）ずつ処理して感染させた。４８時間経過後、細胞及び培養液を回収してｈｕｍａｎ  ＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡとｃ−Ｍｅｔウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）を行って各遺伝子の発現を確認した。
【０１３９】
図７ａに示すように、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２（３０６６.３±１６５.７ｐｇ／ｍｇ）とＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ（９４９２２.６±１８５.８ｐｇ／ｍｇ）組換えベクターの両方でｈｕｍａｎ  ＩＬ−１２が発現されることを確認した。
【０１４０】
また、図７ｂに示すように、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｈｃ−ｍｅｔまたはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ組み換えベクターで処理された細胞では、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ対照群に対してｃ−ｍｅｔの発現が抑制されることを確認した。したがって、本発明で作製された抗がんアデノウイルス組換えベクターに挿入された治療遺伝子ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔの発現が効率的に誘導されることが確認できる。
【０１４１】
試験例６．ヒト由来ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによるがん細胞殺傷能検証
ヒト由来のＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによるがん細胞殺傷能を確認するため、Ｈ１９７５ヒト肺がん細胞株に製造例２によって作製された抗がんアデノウイルスＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ；ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２；ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｈｃ−ｍｅｔ；またはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔをそれぞれ２、５、１０、２０、５０  ＭＯＩずつ感染させ、正常酸素条件（Ｎｏｒｍｏｘｉａ）と低酸素条件（Ｈｙｐｏｘｉａ）でアデノウイルスのがん細胞殺傷能を観察した。
【０１４２】
図８ａ及び８ｂに示すように、正常酸素条件と低酸素条件の両方でＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｈｃ−ｍｅｔ、またはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔのがん細胞殺傷能がウイルスの力価に比例して増加することを確認した。また、５０  ＭＯＩを感染させた条件で単独治療遺伝子処理群であるＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２またはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｈｃ−ｍｅｔのがん細胞殺傷能がＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤに対して増加したが、前記単独処理群に比べて同時発現群であるＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔが著しく向上されたがん細胞殺傷能を誘導した。これはＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔの同時発現が抗がん治療においてシナジー効果を持つことを意味する。
【０１４３】
試験例７．ヒト由来ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスのＨＵＶＥＣの転移（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）と侵襲（ｉｎｖａｓｉｏｎ）抑制能検証
がん細胞で発現されるＨＧＦは、血管内皮細胞におけるｃ−ｍｅｔ信号伝達体系を活性化させることにより、がん細胞の転移（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）及び侵襲（ｉｎｖａｓｉｏｎ）を増加させ、結果として非理想的な血管形成を誘導すると報告されている。したがって、ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスがＨＵＶＥＣの転移と侵襲能力を低下させることができるかを確認するため、次の実験を行った。
【０１４４】
Ｈ１９７５ヒト肺がん細胞株にＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｈｃ−ｍｅｔ、またはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔを感染させた後、上澄み液を回収して転移（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）及び侵襲（ｉｎｖａｓｉｏｎ）分析（ａｓｓａｙ）を行った。対照群として無処理培地（ｆｒｅｓｈ  ｍｅｄｉａ、５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ）と抗がんウイルスを感染させないがん細胞培養液（Ｈ１９７５−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ、Ｈ１９７５−ＣＭ）を使用した。
【０１４５】
図９ａ、９ｂ、９c及び９ｄに示すように、Ｈ１９７５−ＣＭ（抗がんウイルスを感染させないがん細胞の培養液）で無処理培地（ｆｒｅｓｈ  ｍｅｄｉａ）を処理したグループに対してＨＵＶＥＣの転移及び侵襲能力が増加することを確認した。一方、がん細胞にＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２またはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔを感染させた培養液を処理したグループの場合、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤを感染させたグループに対してＨＵＶＥＣの転移及び侵襲能力が減少され、特に、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔを感染させたがん細胞培養液では、ＨＵＶＥＣの転移及び侵襲能が著しく抑制されることを確認した。これはＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによってがん細胞で発現されるＨＧＦの量が効果的に抑制されることにより、結果としてＨＵＶＥＣの転移と侵襲能力を減少させるのにシナジー効果が得られることを意味する。
【０１４６】
試験例８．ヒト由来ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによる上皮−中間葉変異（Ｅｎｄｏ−ＭＴ）抑制効果確認
ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによって誘導される血管の正常化効果を検証するため、Ｈ１９７５ヒト肺がん細胞株にＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔ、またはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔを感染させた後に上澄み液を回収してＨＵＶＥＣ細胞を培養した後、上皮（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）または中間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）マーカーの発現変化をウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）を介して確認した。対照群として無処理培地（ｆｒｅｓｈ  ｍｅｄｉａ、５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ）と抗がんウイルスを感染させないがん細胞培養液を使用した。
【０１４７】
図１０に示すように、がん細胞にＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔまたはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔを感染させた培養液を処理したグループの場合、対照群（ｆｒｅｓｈ  ｍｅｄｉａ処理グループ）に比べて中間葉マーカー（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｍａｒｋｅｒ）であるＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎとａ−ＳＭＡの発現が減少され、そのなかでＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時に発現するアデノウイルスで処理された場合に、最も優れた発現減少効果が確認された。これはＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現の場合、ＨＵＶＥＣ細胞の転移と侵襲能を抑制する効果だけでなく、ｅｎｄｏ−ＭＴ移行（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を抑制して血管の正常化を誘導するのに優れた効果が得られることを示す結果である。
【０１４８】
試験例９．ヒト異種移植腫瘍モデルでＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスの生体内抗腫瘍効果確認
ヒト異種移植腫瘍モデル（ｈｕｍａｎ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ）において本発明のＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによる抗がん治療効果を検証するため、ヒト肺がん細胞株であるＨ１９７５を用いて腫瘍モデルを構築して抗腫瘍効果を確認した。
【０１４９】
ヒト異種移植腫瘍モデルは、具体的には、ヒト肺がん細胞株（Ｈ１９７５）を３×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬでヌードマウスの皮下に注射した後、腫瘍のサイズが平均１００ｍｍ３となったとき、ＰＢＳ、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔ、またはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔをそれぞれ投与した。２日間隔で計２回腫瘍内投与した後（５×１０６ｐｆｕ）、腫瘍のサイズを測定した。
【０１５０】
図１１に示すように、ＰＢＳ投与群の場合には、腫瘍が急速に成長したが、抗がんアデノウイルスを投与したグループにおいてすべて明確な抗腫瘍効果を確認できた。具体的には、ＰＢＳ投与群に対して腫瘍のサイズがＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤは８１.７％、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２は８５.５％、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔは９２.２％、そして、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔは９４.６％減少され、これにより単独処理群に比べてＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスを用いる場合、シナジー効果が得られることが分かる。
【０１５１】
試験例１０．ＩＬ−１２とＬｂｃｐｆ１−ｃｒＭＥＴを同時発現する抗がんアデノウイルスによる細胞内ＩＬ−１２発現及びｃ−ｍｅｔ発現減少確認
試験例１０−１．ＩＬ−１２とｃ−ｍｅｔ標的するクリスパーＲＮＡを同時に発現する抗がんアデノウイルスの構築
標的ＤＮＡを切断した後、細胞内復旧システムによって再び連結される過程で遺伝子矯正と望む変異を起こす３.５世代遺伝子ハサミ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）を用いたクリスパーＲＮＡシステム（Ｌｂｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ  ｓｙｓｔｅｍ）を構築して、本発明のアデノウイルスシステムでクリスパーシステムを用いた場合にも同じ効果を持つことができるかを確認した。ＩＬ−１２配列は、製造例２と同様の方法で組換えベクターに位置させたが、ＩＬ−１２のｐ３５コーディング配列（配列番号４）とＩＬ−１２のｐ４０をコーディングする配列（配列番号５）との間にＩＲＥＳコーディング配列（配列番号２０）を含む配列（配列番号６）を用いた（図１２においてＨＩＬ−１２と表記）。
【０１５２】
ｃ−ｍｅｔ標的（ｔａｒｇｅｔ）ガイドＲＮＡ配列の場合は、プログラムを用いて選定した後、バイオニクス会社に依頼してオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）を合成した後、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）によってクローニングを行った。ＲｄＢ−ＲＧＤアデノウイルスのＥ１部位にＣｐｆ１タンパク質コーディング遺伝子（配列番号１８）を挿入し、ガイドＲＮＡ（ｃｒｃ−ｍｅｔ）を発現する部位のアップストリームにＵ６プロモーターを位置させた。また、ＲｄＢ−ＲＧＤアデノウイルスのＥ３領域にＩＬ−１２コーディング配列及びＣ−ｍｅｔ標的ガイドＲＮＡを発現する配列（配列番号１６）を挿入してＩＬ−１２とＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムを同時発現する組換えアデノウイルスを構築した。ガイドＲＮＡは、配列番号１０のヒトｃ−ｍｅｔ配列から５５番目ないし７７番目のヌクレオチドを標的化するように設計した（図１２）。
【０１５３】
前記構築された組換えアデノウイルス発現されるガイドＲＮＡ（ｃｒｃｍｅｔ）が標的遺伝子の標的部位を認識して校正位置を指定すると、遺伝子ハサミＣｐｆ１が標的部位を切断して、ｃ−ｍｅｔを効果的に抑制できるのかを確認した。
【０１５４】
試験例１０−２．ＩＬ−１２とc−ｍｅｔ標的するクリスパーＲＮＡを同時に発現する抗がんアデノウイルスによるｃ−ｍｅｔ抑制効果確認
ＩＬ−１２とＬｂｃｐｆ１−ｃｒＭＥＴを同時発現する抗がんアデノウイルスによるヒト由来のＩＬ−１２発現またはＬｂｃｐｆ１−ｃｒＭＥＴシステムによるｃ−ｍｅｔの発現減少を確認するため、Ｈ１９７５ヒト肺がん細胞株に作製された抗がんアデノウイルス５  ＭＯＩまたは１００  ＭＯＩを感染させ、４８時間後、細胞及び培養液を回収してヒトＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡまたはｃ−Ｍｅｔウエスタンブロットを行った。
【０１５５】
図１３ａ、図１３ｂ、及び図１３ｃに示すように、ＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１／ＨｓｃＩＬ−１２とＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１／ＨｓｃＩＬ−１２−ｃｒＭＥＴを処理した群で、それぞれ９０００.０±６００.０ｐｇ／ｍＬと１７４００.０±１２００.０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２の発現が確認された。また、すべての抗がんウイルス処理群で、ｃ−ｍｅｔの発現が抑制されることを確認した。特に、ＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１／ＨｓｃＩＬ−１２−ｃｒＭＥＴによって最もｃ−ｍｅｔの発現が効果的に減少した。
【０１５６】
試験例１１．ヒト異種移植腫瘍モデルでＩＬ−１２とＬｂｃｐｆ１−ｃｒＭＥＴを同時発現する抗がんアデノウイルスの生体内抗腫瘍効果確認
ヒト異種移植腫瘍モデルにおいて、ｓｈＲＮＡではないＣＲＩＳＰＲによるｃ−ｍｅｔ発現の抑制がＩＬ−１２の発現と同時に具現できるかと、これによる抗がん効果を記載できるかを確認するための実験を行った。
【０１５７】
ＣＲＩＳＰＲによるｃ−ｍｅｔ発現抑制を確認するため、試験例１０−１により作製されたＬｂｃｐｆ１−ｃｒＭＥＴシステムを用いた。
【０１５８】
作製されたＩＬ−１２とＬｂｃｐｆ１−ｃｒＭＥＴを同時発現する抗がんアデノウイルスによる抗がん治療効果を検証するため、ヒト肺がん細胞株であるＨ１９７５を用いて腫瘍モデルを構築し、抗腫瘍効果を確認した。ヒト肺がん細胞株（Ｈ１９７５）を３×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬでヌードマウスの皮下に注射した後、腫瘍のサイズが平均９０ｍｍ３となったたとき、ＰＢＳ、ＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１、ＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１／ＨｓｃＩＬ−１２、またはＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１／ＨｓｃＩＬ−１２−ｃｒＭＥＴをそれぞれ投与した。２日間隔で計３回腫瘍内に投与した後（５×１０９ＶＰ）、腫瘍のサイズを測定して抗腫瘍効果を観察した。
【０１５９】
図１４に示すように、ＰＢＳ投与群の場合には、腫瘍のサイズが２５日目に１４８６.５±２２１.１ｍｍ３まで急激に成長したが、抗がんウイルスを投与したグループですべて明確な抗腫瘍効果が確認された。抗がんウイルス投与群の平均腫瘍のサイズは、それぞれ８７６.９±１４６.２ｍｍ３（ＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１）、７９２.０±２３０.３ｍｍ３（ＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１／ｓｃＩＬ−１２）、または５３５.６±１７２.６ｍｍ３（ＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１／ｓｃＩＬ−１２−ｃｒＭＥＴ）でＰＢＳ投与群に対して腫瘍のサイズが４１.０、４６.７または６４％減少され、特にＩＬ−１２と同時発現によりＣＲＩＳＰＲ方法を用いる場合、腫瘍のサイズが顕著に減少したところ、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いる場合にも２つの治療遺伝子によるシナジー効果が得られることを確認した。
【図１】
2021529545.tif 000016
【図２】
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【図３】
2021529545.tif 000018
【図４】
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【図５ａ】
2021529545.tif 000020
【図５ｂ】
2021529545.tif 000021
【図６】
2021529545.tif 000022
【図７ａ】
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【図７ｂ】
2021529545.tif 000024
【図８ａ】
2021529545.tif 000025
【図８ｂ】
2021529545.tif 000026
【図９ａ】
2021529545.tif 000027
【図９ｂ】
2021529545.tif 000028
【図９ｃ】
2021529545.tif 000029
【図９ｄ】
2021529545.tif 000030
【図１０】
2021529545.tif 000031
【図１１】
2021529545.tif 000032
【図１２】
2021529545.tif 000033
【図１３ａ】
2021529545.tif 000034
【図１３ｂ】
2021529545.tif 000035
【図１３ｃ】
2021529545.tif 000036
【図１４】
2021529545.tif 000037
【配列表】
2021529545000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月8日(2021.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−１２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２、ＩＬ−１２）とＣ−ｍｅｔ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ｍｅｔ）の発現を抑制する核酸分子を同時に発現する組換えアデノウイルスを含む抗腫瘍または抗腫瘍免疫性増進組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍免疫治療は、全般的な体内の免疫機能を増強させることにより、腫瘍に対する免疫反応を誘導し、これによって腫瘍を治療する方法であって、これに対する研究が活発に行われている。しかし、がんが生成される段階は、ほとんど大部分の場合、免疫抑制環境が形成され、体内の免疫システムが活発に作用しても腫瘍を容易に除去することが困難になる。腫瘍細胞は、自ら多くの異常な抗原を発現させ、これらの抗原は、免疫監視（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）を通じて除去（ｅｆａｄｉｃａｔｉｏｎ）反応を起こし、体内の免疫システムが活発に作用しても腫瘍細胞が免疫監視を回避するようにする。また、このような現象が腫瘍細胞が生産する様々な因子（ｆａｃｔｏｒｓ）によって媒介されることが明らかになった。腫瘍組織は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）−β及びインターロイキン（ＩＬ）−１０のような免疫抑制分子を生産でき、免疫抑制された腫瘍において調節Ｔ細胞の浸透が現れるものと報告された。さらに、活性化されたＴ細胞によってＰＤ−１という抑制受容体の発現の刺激が続くほど増加するが、がん細胞の場合、ＰＤ−１と特異的に結合するリガンドであるＰＤ−Ｌ１を多量に発現して活性化されたＴ細胞を不活性化させて免疫反応を回避し、結果として腫瘍内の免疫抑制微細環境及び免疫寛容を誘導する。
【０００３】
最近の研究によりＴ細胞活性抑制に関与するＰＤ−１の免疫チェックポイント（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）を抑制できる阻害剤が強力な抗腫瘍免疫反応を誘導したことを証明した。結果として、免疫監視回避を克服することが免疫治療療法の主要な戦略となる。したがって、このような限界点を克服するための一つの方案として、免疫増進効果を持つサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）遺伝子を直接がん細胞に導入し、がん細胞からサイトカインを生成及び分泌させて抗腫瘍免疫反応誘導によるがん細胞特異的除去に関する研究が活発に行われている。現在まで抗腫瘍効果が報告された免疫増進サイトカイン遺伝子のうちインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、最も効果的かつ有望なサイトカインの一つである。
【０００４】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、ジスルフィド結合で連結された４０ｋＤａ及び３５ｋＤａサブユニットを含むヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ）タンパク質であって、活性化されたマクロファージ、単核球、樹状細胞、及び活性Ｂリンパ球のような抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ、ＡＰＣ）から分泌され、がん細胞を効果的に除去できる細胞性Ｔ細胞とＮＫ細胞に直接作用してこれらを活性化させ、ＩＦＮ−γの分泌を誘導するだけでなく、これらのがん細胞に対する殺傷能力も増強させる。ＩＬ−１２の局所的発現は、腫瘍細胞がＴ−細胞媒介細胞毒性に敏感に反応するようにし、結果として、腫瘍成長抑制及び体液性免疫（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）の構築をもたらす。
【０００５】
しかし、ＩＬ−１２の投与時、患者が受け入れられる容量を制限するサイトカイン−関連毒性が全身に現れる可能性があるため、ＩＬ−１２の臨床適用において困難性がある。また、免疫効果の全般的な下向き調節、患者の血清におけるＩＬ−１０の発現増加及びＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−βの発現減少によるＴｈ１からＴｈ２免疫へのＩＬ−１２分極化現象が現れており、このために反復的にＩＬ−１２を投与することになる場合も発生するため、このような臨床結果は、がんの治療のための単一治療剤としてのＩＬ−１２の限界を示す。
【０００６】
最近、がんの悪性度を反映する生物学的指標として成長因子とそれらの受容体に対する研究が進行中であり、このうちチロシンキナーゼ受容体ファミリー（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ）の一つであるｃ−ｍｅｔに対する研究が活発に行われている。ｃ−ｍｅｔは、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ／ＳＦ）の受容体として作用し、様々ながんにおいて過発現され、このような患者は、がんの治療予後が悪い場合がほとんどである。ｃ−ｍｅｔの過発現は、ＨＧＦ／ＳＦ−Ｍｅｔ信号伝達体系により細胞分裂（ｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）と細胞の運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を増進させ、細胞死滅を抑制するだけでなく、血管形成や細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）で浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）と転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）を誘導するなど、がんの悪性度を増加させる。このようなｃ−ｍｅｔの過発現によって誘導されるがん細胞の速い増殖及び転移は、免疫系のがん細胞除去速度を超えるため、免疫反応によって除去されにくい。さらに、腫瘍のサイズが大きくなるほど、腫瘍微小環境の免疫反応の中心おもりが抑制方向に激しく傾くため、単一治療法によりこれを制御するのは、さらに困難になり、抗腫瘍免疫治療によって向上した抗腫瘍効果を示すことが困難になる。
したがって、抗腫瘍免疫性を増加させてより優れた抗がん効果を持ちながら、投与量等による副作用のない抗がん治療法の開発は、依然として本技術分野において解決すべき課題として残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2016/115559
【特許文献２】WO2010/124188
【特許文献３】WO2012/075158
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記課題を解決するため、これに本発明者らは、抗腫瘍効果は優れていながらも、投与量を下げることができる治療ターゲットを開発しようと努力し、ＩＬ−１２とｃ−ｍｅｔをターゲットとする治療法を併用することにより、より効果的にがんを治療できる方法を提案する。本発明者らは、インターロイキン−１２を発現するとともに、ｃ−ｍｅｔの過発現を抑制できるアデノウイルスをがんの治療に活用する場合、各治療ターゲットを単独で使用する場合に比べて腫瘍を抑制し、免疫監視回避を克服してがんを治療するのにシナジー効果が得られることを確認し、本発明を完成した。
【０００９】
本明細書の全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として挿入され、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するため、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡに相補的であり、ｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子を含む遺伝子伝達体を提供することを目的とする。
【００１１】
本発明の他の目的は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする核酸配列と、ｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合し、ｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する核酸配列を含む遺伝子伝達体を含む薬剤学的組成物を提供するものである。
【００１２】
前記遺伝子伝達体は、アデノウイルスシステムであってもよく、前記アデノウイルスシステムは、組換えアデノウイルスまたはアデノウイルスの組換えＤＮＡであってもよい。
【００１３】
前記薬剤学的組成物は、抗がん用または抗腫瘍免疫性増進用組成物であってもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のインターロイキン−１２とＣ−ｍｅｔの発現を抑制する核酸分子を同時に発現するアデノウイルスシステムは、腫瘍環境で免疫機能を回復させて腫瘍の再形成、転移抑制、腫瘍の成長抑制のような抗がん効果を著しく増進させることができ、特に、２つの治療遺伝子を同時に発現させることにより、がんの治療において顕著なシナジー効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の一実施例によって構築されたアデノウイルスプラスミドＤＮＡの構造を示したものである。
【図２】図２は、本発明の一実施例によって構築されたアデノウイルスプラスミドＤＮＡが細胞内でマウスインターロイキン−１２（ｍＩＬ−１２）またはヒトインターロイキン−１２（ｈＩＬ−１２）を発現できることを確認したグラフである。
【図３】図３は、本発明の一実施例によって構築されたアデノウイルスが細胞内でインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の発現を高め、ｃ−ｍｅｔの発現を抑制させることを確認したグラフである。
【図４】図４は、本発明の一実施例によって構築されたＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスの構造を示す。
【図５】図５ａ及び５ｂは、マウス由来Ｂ１６−Ｆ１０とＣＴ２６細胞のそれぞれにおいて、本発明の一実施例によるＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによる生体内抗腫瘍効果を確認した結果である。
【図６】図６は、マウス由来Ｂ１６−Ｆ１０細胞において本発明の一実施例によるＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスｐＤＮＡ／ＰＰＡ複合体による生体内抗腫瘍効果を確認した結果である。
【図７】図７ａ及び７ｂは、ヒト肺がん細胞株Ｈ１９７５において本発明の一実施例によるＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによる細胞内ＩＬ−１２発現（図７ａ）及びｃ−ｍｅｔの発現抑制能（図７ｂ）を確認した結果である。
【図８】図８ａ及び８ｂは、ヒト肺がん細胞株Ｈ１９７５において本発明の一実施例によるＩＬ−１２及び／又はｓｈｃ−ｍｅｔを発現する抗がんアデノウイルスによるがん細胞殺傷能を正常酸素条件８ａと低酸素条件８ｂで確認した結果である。
【図９】図９ａ、９ｂ、９ｃ及び９ｄは、本発明の一実施例によるＩＬ−１２及び／又はｓｈｃ−ｍｅｔを発現する抗がんアデノウイルスによるＨＵＶＥＣ細胞の転移(９a及び９ｂ)と侵襲(９ｃ及び９ｄ)抑制効果を確認した結果である。
【図１０】図１０は、本発明の一実施例によるＩＬ−１２及び／又はｓｈｃ−ｍｅｔを発現する抗がんアデノウイルスによるＨＵＶＥＣ細胞のＥｎｄｏ−ＭＴ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｔｏ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）阻害による腫瘍細胞の転移抑制を確認した結果である。
【図１１】図１１は、本発明の一実施例によるＩＬ−１２及び／又はｓｈｃ−ｍｅｔを発現する抗がんアデノウイルスのヒト異種移植腫瘍モデル（Ｈ１９７５）において抗腫瘍効果を確認した結果である。
【図１２】図１２は、本発明の一実施例によってＩＬ−１２とｃ−ｍｅｔを標的とするガイドＲＮＡによるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを同時発現する遺伝子伝達体の構造を図式化したものである。
【図１３】図１３ａ、１３ｂ及び１３ｃは、本発明の一実施例によるＩＬ−１２とＬｂｃｐｆ１−ｃｒＭＥＴを同時発現する抗がんウイルスによる細胞内ＩＬ−１２発現（１３a）及びｃ−ｍｅｔ抑制(１３ｂ及び１３ｃ)効果を確認した結果である。
【図１４】図１４は、本発明の一実施例によるＩＬ−１２とＬｂｃｐｆ１−ｃｒＭＥＴを同時発現する抗がんウイルスのヒト異種移植腫瘍モデル（Ｈ１９７５）において抗腫瘍効果を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の一態様によって、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子を含む遺伝子伝達体を提供する。
【００１７】
本発明の他の態様によって、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子を含む遺伝子伝達体を含む抗がん用、がん細胞の抗転移用組成物、または抗腫瘍免疫性増進用薬学的組成物を提供する。
【００１８】
本発明のさらに他の態様によって、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子を含む遺伝子伝達体の抗がん剤としての用途を提供する。
【００１９】
本発明のさらに他の態様によって、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子を含む遺伝子伝達体またはこれを含む薬学的組成物を個体に投与することを含むがんを治療する方法を提供する。
【００２０】
本発明において「遺伝子伝達体」とは、遺伝子を細胞内に伝達するためのベクターシステムを意味するもので、本発明において特に記載のない限り、遺伝子伝達体、アデノウイルスベクター、アデノウイルスシステム、またはアデノウイルスベクターシステムは、同じ意味で用いられる。本発明のアデノウイルスシステムは、アデノウイルスとアデノウイルスのＤＮＡ（ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ）をすべて含む意味である。好ましくは、抗がんまたは抗腫瘍免疫性増進用として組み換えられた組換えアデノウイルスまたはアデノウイルスの組換えＤＮＡであってもよい。
【００２１】
前記アデノウイルスシステムは、アデノウイルスのゲノム配列を含んでもよく、これによって細胞内に伝達されたアデノウイルスまたは組換えＤＮＡからアデノウイルスが生成され、抗がんまたは抗腫瘍免疫効果を持つことができる。本発明では、ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔをそれぞれ発現する遺伝子がアデノウイルスゲノムに挿入されてアデノウイルスそのものまたはその組換えＤＮＡ形態で細胞に伝達され得るため、本発明の明細書全体においてアデノウイルスと称されるものは特に言及のない限り、組換えアデノウイルスとアデノウイルスの組換えＤＮＡをすべて含む意味である。
【００２２】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明のアデノウイルスシステムは、腫瘍でのみ特異的に増殖し、腫瘍細胞を選択的に殺傷できる腫瘍選択的殺傷アデノウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、ｏＡｄ）であってもよい。前記腫瘍選択的殺傷アデノウイルスは、本明細書において抗がんウイルス、ｏＡｄ、または腫瘍殺傷ウイルスなどの用語と相互交換的に使用されてもよい。腫瘍選択的殺傷アデノウイルスは、本発明の技術分野で用いられる通常の技術を通じて遺伝子的に変形されたものはすべて、本発明のアデノウイルスシステムに含まれる。一例として、がん細胞でのみ増殖できるようにアデノウイルスゲノムからＥ１Ａ及び／又はＥ１Ｂを除去して正常細胞で増殖できないようにしたり、がん細胞から分泌されるプロテアーゼを使用するようにウイルスタンパク質のターゲットシーケンスを変化させたり、がん細胞に存在する受容体（例：ＥＧＦＲ）に結合するために受容体リガンドを発現するようにウイルスゲノムにリガンドを発現する配列が挿入された変形であってもよい。
【００２３】
また、本発明の腫瘍選択的殺傷アデノウイルスは、がん細胞の殺傷能を向上させるため、細胞死滅がよく発生するようにＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入されるか、がん細胞に入って発現されて効果的に免疫反応が発生するようにＩＦＮ遺伝子が挿入されてもよい。
【００２４】
本発明で用いられる組換えアデノウイルスは、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞において作動可能なプロモーターを含む。本発明に適したプロモーターは、哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーターを含む。組換えアデノウイルスに挿入されるトランス遺伝子は、プロモーター−トランス遺伝子ポリＡ配列の発現カセットに挿入されることが好ましい。この場合、前記プロモーターとして、本発明の遺伝子発現調節配列（ＨＲＥ−ＴＥＲＴ、ＨＲＥ−Ｅ２Ｆ、ＨＲＥ−ＴＥＲＴ−Ｅ２Ｆ、ＨＲＥ−Ｅ２Ｆ−ＴＥＲＴ、ＨＲＥ−Ｅ２Ｆ−５ｍｙｃ−ＴＥＲＴ、ＨＲＥは、２つが繰り返されて含まれてもよい）または通常のプロモーターが用いられてもよい。
【００２５】
トランス遺伝子に結合される通常のプロモーターは、好ましくは、動物細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞で作動してトランス遺伝子の転写を調節できるものであって、哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーターを含み、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ  ｖｉｒｕｓ）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７.５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオニンプロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーター、ｉｎｄｕｃｉｂｌｅプロモーター、がん細胞特異的プロモーター（例えば、ＴＥＲＴプロモーター、ＰＳＡプロモーター、ＰＳＭＡプロモーター、ＣＥＡプロモーター、Ｅ２Ｆプロモーター及びＡＦＰプロモーター）及び組織特異的プロモーター（例えば、アルブミンプロモーター）を含むが、これに限定されるものではない。トランス遺伝子を発現させるための発現コンストラクトにおいて、トランス遺伝子のダウンストリームにポリアデニル化配列が結合されていることが好ましい。前記ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンターミネーター（Ｇｉｍｍｉ，Ｅ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：６９８３−６９９８（１９８９））、ＳＶ４０由来ポリアデニル化配列（Ｓｃｈｅｋ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：５３８６−５３９３（１９９２））、ＨＩＶ−１  ｐｏｌｙＡ（Ｋｌａｓｅｎｓ，Ｂ．Ｉ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１８７０−１８７６（１９９８））、β−グロビンｐｏｌｙＡ（Ｇｉｌ，Ａ.，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ４９：３９９−４０６（１９８７））、ＨＳＶ  ＴＫ  ｐｏｌｙＡ（Ｃｏｌｅ，Ｃ．Ｎ．  ａｎｄ  Ｔ．Ｐ．Ｓｔａｃｙ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２１０４−２１１３（１９８５））またはポリオーマウイルスｐｏｌｙＡ（Ｂａｔｔ，Ｄ．Ｂ  ａｎｄ  Ｇ．Ｇ．  Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４７８３−４７９０（１９９５））を含むが、これに限定されるものではない。
【００２６】
本発明で用いられる組換えアデノウイルスにおいてＩＬ−１２遺伝子配列及びｃ−ｍｅｔ抑制するＲＮＡを発現する配列は、プロモーターに作動的に連結されている。本明細書において、用語の「作動的に結合された」とは、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節することになる。
【００２７】
本発明の組換えアデノウイルスは、選択標識として抗生物質耐性遺伝子及びレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ルシフェラーゼ及びβ−グルクロニダーゼアーゼ）をさらに含んでもよい。前記抗生物質耐性遺伝子は、当業界で通常用いられる抗生物質耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子があり、好ましくは、ネオマイシン耐性遺伝子である。前記選択標識は、別途のプロモーターまたはＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）または２Ａシステムによって連結された発現システムによっても発現されることがあり、本発明で用いられるＩＲＥＳは、数種のウイルス及び細胞のＲＮＡsで発見される調節配列である（ＭｃＢｒａｔｎｅｙ  ｅｔ．ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：９６１（１９９３））。また、２Ａシステムは、単一のコーディング配列内の個々のタンパク質産物の効率的な調和発現（ｃｏｎｃｏｒｄａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を可能にする切断可能な小さな（１８−２２アミノ酸）ペプチドをコーディングする配列を意味する。例えば、口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ、Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎（ｅｑｕｉｎｅ  Ｒｈｉｎｉｔｉｓ）Ａウイルス、ブタテスコウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ）−１（Ｐ２Ａ）またはトセアアシグナウイルス（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ、Ｔ２Ａ）またはＳｚｙｍｃｚａｋ−Ｗｏｒｋｍａｎ、Ａ．など．「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ２Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」に説明されている２Ａシステムのうちのいずれかのような、ウイルスからの２Ａシステムが使用されてもよい。
【００２８】
本発明は、インターロイキン−１２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２、ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ｍｅｔ）のｍＲＮＡに相補的であり、ｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子をすべて含み、これを同時に発現させることにより、抗がん及び抗腫瘍免疫性増進にシナジー効果が得られることを技術的特徴とする。また、少量のＩＬ−１２投与にもかかわらず、優れた治療効果が得られ、従来のサイトカイン投与による副作用の問題も解決できるという点で本技術は、意義を持つ。
【００２９】
本発明の明細書において、用語の「インターロイキン−１２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２；ＩＬ−１２）」は、４０ｋＤａサブユニット（ｐ４０サブユニット）及び３５ｋＤａサブユニット（ｐ３５サブユニット）がジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）結合によって結合されてなるヘテロダイマーのサイトカインを意味する。ＩＬ−１２は、マクロファージのような抗原提示細胞によって生成されて活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞の細胞表面の受容体に結合する。前記ＩＬ−１２は、Ｔ細胞とＮＫ細胞の増殖を促進し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びマクロファージの細胞毒性効果を増進させ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＧＭ−ＣＳＦの生成を誘導し、Ｔｈ１細胞の活性化を誘導する作用をする。また、ＩＬ−１２は、Ｔｈ１クローン増殖の重要な共同刺激者として知られており、血清中におけるＩｇＧ２ａ抗体の生成を増加させることが知られている。本発明において、用語の「ｐ３５サブユニット」及び「ｐ４０サブユニット」とは、実施例に例示されたサブユニットだけでなく、それぞれのサブユニットの固有の機能を果たすことができるサブユニットのすべての類似体（ａｎａｌｏｇｕｅｓ）を含む。
【００３０】
本発明のアデノウイルスシステムは、ＩＬ−１２をコーディングする遺伝子を発現可能な形態で含み、腫瘍細胞に感染した後、ＩＬ−１２を分泌して、強力な抗腫瘍免疫反応を誘導する。
【００３１】
本発明のアデノウイルスシステムは、ＩＬ−１２を効率的に発現させるため、サブユニットとしてＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）とＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）を発現するＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）遺伝子及びＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）遺伝子を含んでもよい。また、前記２つのサブユニットを連結する役割を果たすようにＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）遺伝子配列及びＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）遺伝子配列との間にリンカー配列をさらに含んでもよく、またはタンパク質発現の効率を高めるため、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）配列をさらに含んでもよい。
【００３２】
前記リンカーは、２つの遺伝子の間に含まれてもよい任意の配列を意味し、本発明では、ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）遺伝子及びＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）遺伝子の間に含まれてもよい配列を意味する。これは、すでに遺伝子と遺伝子との間に挿入されてもよいものと知られている通常のリンカー配列または任意に設計された配列をすべて含み、ＩＬ−１２の発現に否定的な影響を与えたり、ＩＬ−１２の機能を損なわない場合、すべて本発明に含まれてもよい。一例として、配列番号１９の配列であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００３３】
本発明で用いられる「ＩＬ−１２Ａサブユニット（ｐ３５サブユニット）」のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＡＤ５６３８５に記載されたものであってもよい（もし、マウスｐ３５アミノ酸配列を発現しようとする場合には、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ３９２９２）。また、前記ＩＬ−１２Ａサブユニットをコーディングする配列としてＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１８０５６２に記載された配列のうちＣＤＳ（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に該当するヌクレオチド配列であってもよい（もし、マウス配列を用いる場合、Ｍ８６６７２に記載された配列のうちＣＤＳ配列を参照）。また、本発明の一実施例で使用された配列番号１または配列番号４の配列であってもよい（マウスの場合、配列番号７の配列）。
【００３４】
本発明で用いられる「ＩＬ−１２Ｂサブユニット（ｐ４０サブユニット）」のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＤ５６３８６に記載されたものであってもよい（もし、マウスｐ４０アミノ酸配列を発現する場合には、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ３９２９６）。また、前記ＩＬ−１２Ｂサブユニットをコーディングする配列としてＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１８０５６３に記載された配列のうちＣＤＳ（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に該当するヌクレオチド配列であってもよい（もし、マウス配列を用いる場合、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ８６６７１に記載された配列のうちＣＤＳ配列を参照）。また、本発明の一実施例で使用された配列番号２または配列番号５の配列であってもよい（マウスの場合、配列番号８の配列）。
【００３５】
本発明は、一実施例において、配列番号３または配列番号６のＩＬ−１２遺伝子を用いて腫瘍細胞でＩＬ−１２が発現されてもよく（マウスの場合、配列番号９）、特にｃ−ｍｅｔに対するＲＮＡと同時に発現させる場合、ＩＬ−１２の発現量が顕著に増加することを確認した。
【００３６】
本発明の明細書において、用語の「ｃ−ｍｅｔ」は、チロシンキナーゼ受容体ファミリー（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ）の一つであり、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ／ＳＦ）の受容体として作用し、様々ながんにおいて過発現され、ｃ−ｍｅｔの過発現が現れた患者は、がんの治療予後が悪い場合がほとんどである。本発明のＣ−ｍｅｔの遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  ｇｉ：４５５７７４６に記載されたｍＲＮＡの配列のうちＣＤＳ（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に該当するヌクレオチド配列であってもよい（もし、マウス配列を用いる場合、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｇｉ：１４６１９８６９５に記載された配列のうちＣＤＳ配列を参照）。
【００３７】
ｃ−ｍｅｔの過発現は、ＨＧＦ／ＳＦ−Ｍｅｔ信号伝達体系により細胞分裂（ｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）と細胞の運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を増加させ、細胞外基質に浸潤と転移を誘導してがんの悪性度を増加させる。したがって、がんの治療において、ｃ−ｍｅｔの発現抑制は、非常に重要な問題である。本発明は、ｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡに相補的であり、ｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを用いてｃ−ｍｅｔの発現を抑制し、特に、ＩＬ−１２と同時発現によってｃ−ｍｅｔの発現抑制が単独抑制群に比べて著しく向上し得ることを確認した。
【００３８】
一例として、本発明で用いられる抑制標的となるｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡは、配列番号１０に記載された配列であってもよい（マウスの場合、配列番号１１）。
【００３９】
前記ｃ−ｍｅｔ遺伝子に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＴＦＯｓ（ｔｒｉｐｌｅｘ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、及びＣＲＩＳＰＲ用ガイドＲＮＡからなる群から選ばれた一つ以上であってもよい。
【００４０】
ｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチド配列は、配列番号１０のｃ−ｍｅｔｍＲＮＡ配列の一部と同一または相補的な配列を含んでもよい。好ましくは、配列番号１０の配列において４つ以上の連続するヌクレオチドの配列と同一またはこれに相補的な配列を含んでもよい。
【００４１】
本発明の一実施例では、前記オリゴヌクレオチドとしてｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡに相補的な配列を含み、その発現を抑制できるｓｈＲＮＡを用いて腫瘍細胞においてｃ−ｍｅｔの発現を効果的に抑制させることができることを確認した。
【００４２】
本発明において、「ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ  ｏｒ  ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）」は、ヘアピン構造を持つ人工ＲＮＡ分子であって、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を介してターゲット遺伝子の発現を抑制するのに用いられる。ｓｈＲＮＡは、主にプラスミド、バクテリアまたはウイルスベクターを介して細胞内に運ばれる。ｓｈＲＮＡは、分解及び転換（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）の割合が比較的低いという利点がある。
【００４３】
本発明の一実施例において、ｃ−ｍｅｔの発現を抑制するｓｈＲＮＡとして配列番号１２（ヒト）または配列番号１４（マウス）の遺伝子によってコーディングされるｓｈＲＮＡである「Ｈｓｈｃ−ｍｅｔ（配列番号１３の配列を標的とする）」または「ｓｈｃ−ｍｅｔ（配列番号１５の配列を標的とする）」を用いて、本発明のウイルスシステムによってｃ−ｍｅｔの発現が効果的に抑制されることを確認した。
【００４４】
前記ｃ−ｍｅｔ遺伝子に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ用ガイドＲＮＡであってもよい。この場合、本発明の遺伝子伝達体は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムを発現する場合、Ｃａｓタンパク質を発現する配列をさらに含んでもよい。
【００４５】
本発明において、「ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステム」は、標的ＤＮＡ上に存在する特定の塩基配列を認識し、ＤＮＡを切断する制限酵素でＤＮＡを切断して遺伝子を矯正する技術を意味する。本発明では、アデノウイルスシステム内に標的遺伝子Ｃ−ｍｅｔに対するガイドＲＮＡを発現する配列を挿入して発現されたガイドＲＮＡが標的Ｃ−ｍｅｔに混成化結合すると、Ｃａｓタンパク質を用いて標的部位を切断してＣ−ｍｅｔの発現を抑制できるシステムを意味する。
【００４６】
特に言及のない限り、前記ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムを構築する方法、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムに用いられる制限酵素タンパク質の種類などは、本発明の技術分野で通常用いられる技術を用いることができる。
【００４７】
本発明で用いられるＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質であってもよい。本発明で用いられるＣａｓ９またはＣａｓ１２（Ｃａｓ１２ａまたはＣｐｆ１とも表記）タンパク質は、本発明の技術分野でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを具現するために通常用いられるＣａｓタンパク質であれば、制限されず用いられてもよい。また、前記Ｃａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質の具体的な種類は、一例として次の表１に示す通りであるが、これに限定されるものではなく、表１に記載された参考文献は、全体として本発明の明細書に含まれる。
【００４８】
【表１】
2021529545.tif 000038
【００４９】
前記Ｃｐｆ１は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一種類であって、Ｃｌａｓｓ２  Ｔｙｐｅ５  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに分類される。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９のように、単一のサブユニットエフェクターモジュール（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｏｄｕｌｅ）で作動するが、機能的にも若干の差があるため、Ｃａｓ９が遺伝子を切り取るためには、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とするのに対し、Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。Ｃａｓ９の場合、グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）の多いＰＡＭ(ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ−ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）がある部位の遺伝子を切り取るのに対し、Ｃｐｆ１は、チミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）が多い部位を効率的に切断し得る。また、Ｃｐｆ１は、遺伝子を切り取るとき、４〜５つのヌクレオチドオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を発生させる特徴を持つ。このような様々な特徴と構造的な差異のために、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９より作動効率はやや低くても、より高精度を示す。
【００５０】
本発明のＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムの発現のためのプロモーターは、本発明の技術分野においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに使用されるものであれば、制限されず使用されてもよい。一例として、タイプＩＩＩクラスのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを使用してもよい。または、Ｕ６プロモーターを使用してもよいが、この場合、通常用いられるＵ６プロモーターは、転写を開始するためにグアノシンヌクレオチドを必要とするため、Ｕ６プロモーターの使用は、ゲノム標的化部位をＧＮ１９ＮＧＧでさらに制限してもよい（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−８２６；  Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １２：３９３−３９４）。Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターも本発明のベクターシステムで用いられてもよい（Ａｄｈｙａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７８：１４７−１５１；Ｍｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：７０３５−７０５６；Ｐｌｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＲＮＡ  ４：１３１３−１３１７）。
【００５１】
本発明の一実施例では、前記オリゴヌクレオチドとして配列番号１０のヒトｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡから５５番目ないし７７番目のヌクレオチドを標的配列（配列番号１７）として、これに相補的に混成化されてもよいＣＲＩＳＰＲ用ガイドＲＮＡを発現する配列番号１６の遺伝子とＬｂｃｐｆ１を発現する配列番号１８の遺伝子が挿入されたアデノウイルスシステムを用いて、ｃｒＲＮＡ−ＬｂＣｐｆ１のＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムを介してｃ−ｍｅｔの発現を効果的に阻害できることを確認した。
【００５２】
本発明の一実施例では、本発明の図１３に示すように、ＬｂＣｐｆ１を発現する遺伝子配列を含む組換えアデノウイルスベクターを用いてＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムを発現させた。
【００５３】
本発明において用語の「相補的」とは、１００％相補的な場合だけでなく、ＲＮＡ干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）機序を介してｃ−ｍｅｔ遺伝子の発現を抑制できる程度の不完全な相補性も包括する意味であり、好ましくは、９０％の相補性、より好ましくは、９８％の相補性、最も好ましくは、１００％の相補性を意味する。本明細書において１００％相補性を表現する場合には、「完全相補的（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」と記載される。
【００５４】
本発明の一具現例によれば、本発明のアデノウイルスに含まれるｓｈＲＮＡ配列は、配列番号１０の一部の配列に相補的な配列を含み、好ましくは、配列番号１０のｃ−ｍｅｔ  ｍＲＮＡ配列のうち１９８７番目のヌクレオチドないし２００７番目のヌクレオチドの配列に相補的な配列を含む。
【００５５】
本発明の特定の具現例によれば、前記ｃ−ｍｅｔの発現を抑制できるオリゴヌクレオチドとして、ｓｈＲＮＡは、配列番号１２または配列番号１６の遺伝子によってコーディングされたものであってもよい（マウスの場合、配列番号１４の遺伝子）。
【００５６】
本発明で用いられる「遺伝子または遺伝子配列」は、本発明で提示する配列番号の各配列に対して実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）または実質的な類似性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を示す遺伝子配列も含むものと解釈される。前記実質的な同一性は、前記本発明の配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアライメントし、当業界で通常用いられるアルゴリズムを用いてアライメントされた配列を分析した場合に、７０％以上の相同性、好ましくは、８０％の相同性、より好ましくは、９０％の相同性、最も好ましくは、９５％の相同性を示す配列を意味する。前記実質的な類似性は、一つ以上の塩基の欠損または挿入のようなＩＬ−１２遺伝子配列の変化が組換えベクターシステムとの相同性組換えを最小化する本発明の目的に影響を及ぼさない変化を総称する。したがって、本発明のＩＬ−１２遺伝子配列は、例示された配列リストの配列に限定されず、本発明が目的とする最終生成物の活性に実質的に影響を及ぼさない限り、本発明の権利範囲に含まれると解釈される。
【００５７】
本発明のアデノウイルスシステムは、アデノウイルスのゲノム骨格を用いてがんの治療を達成し得る。アデノウイルスは、中間程度のゲノムサイズ、操作の利便性、高いタイター、広範囲な標的細胞及び優れた感染性のため、遺伝子伝達体として多く使用されている。ゲノムの両末端は、１００〜２００ｂｐのＩＴＰ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を含み、これはＤＮＡ複製及びパッケージングに必須的な構成である。ゲノムのＥ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）は、転写及及び宿主細胞遺伝子の転写を調節するタンパク質をコーディングする。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）は、ウイルスＤＮＡ複製に関与するタンパク質をコーディングする。アデノウイルスゲノムの小さな部分のみがｃｉｓで必要であると知られているため（Ｔｏｏｚａ，Ｊ.  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８１））アデノウイルスは、外来のＤＮＡ分子を運搬する能力を持つ。
【００５８】
本発明のアデノウイルスシステムのゲノムは、Ｅ１領域及びＥ３領域が欠失したものであってもよい。具体的には、本発明のアデノウイルスシステムは、Ｅ１Ａ遺伝子及び非活性化されたＥ１Ｂ１９遺伝子、非活性化されＥ１Ｂ５５遺伝子または非活性化されたＥ１Ｂ１９及びＥ１Ｂ５５遺伝子を含んでもよい。
【００５９】
本明細書において遺伝子に関連して用いられる用語の「非活性化」とは、その遺伝子の転写及び／又は解読が正常に行われず、その遺伝子によってコーディングされる正常なタンパク質の機能が現れないことを意味する。例えば、非活性化Ｅ１Ｂ１９遺伝子は、その遺伝子に変異（置換、付加、部分的欠失または全体的欠失）が発生して活性のＥ１Ｂ  １９ｋＤａタンパク質を生成できないことである。Ｅ１Ｂ１９が欠失した場合には、細胞枯死能を増加させることができ、Ｅ１Ｂ５５遺伝子が欠失した場合には、腫瘍細胞特異性を持たせる（参照：特許出願第２００２−２３７６０号）。本明細書において、遺伝子または配列に関連して用いられる用語の「欠失」とは、当該配列が完全に欠失したものだけでなく、部分的に欠失したものも含む意味を持つ。
【００６０】
本発明の組換えアデノウイルスは、ＥｌＡ遺伝子配列に位置したＲｂ結合部位をコーディングするヌクレオチド配列のうち４５番目のＧｌｕ残基がＧｌｙで置換された変異及び１２１−１２７番目のアミノ酸配列が全体的にＧｌｙに置換された変異を有するものであってもよい。
【００６１】
本発明の一具現例によれば、前記組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ａ部位を含み、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａが欠失しており、Ｅ３部位（ΔＥ３）が欠失したものであってもよい。Ｅ１Ａ遺伝子を含む組換えアデノウイルスは、複製可能な特性を持つようになる。前記ＩＬ−１２遺伝子及びｃ−ｍｅｔ発現抑制オリゴヌクレオチドは、それぞれアデノウイルスの欠失したＥ１及びＥ３部位に挿入されてもよい。
【００６２】
本発明のアデノウイルスシステムは、アデノウイルスまたはそのｖｉｒａｌ  ＤＮＡの細胞内伝達能を高めたり、細胞内に伝達されて残存時間などを増やすため、生体適合性高分子をさらに含んでもよい。具体的には、前記生体適合性高分子がアデノウイルスまたはアデノウイルスプラスミドＤＮＡと結合された形態で本発明のシステムに含まれてもよい。
【００６３】
前記生体適合性高分子は、本発明の技術分野において遺伝子の伝達のためのベクターシステムに使用されてもよいものであれば、すべて含まれてもよい。
【００６４】
一例として、本発明の生体適合性高分子は、（ａ）免疫反応回避性部位（ｅｓｃａｐａｂｌｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、（ｂ）電荷性部位（ｃｈａｒｇｅａｂｌｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ）及び（ｃ）ジスルフィド結合を含む生還元性部位（ｂｉｏｒｅｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ）を含むｐＨ敏感性及び生還元性高分子であってもよい。
【００６５】
前記（ａ）免疫反応回避性部位は、ポリマーが結合するウイルスが生体内免疫反応（細胞性免疫反応及び体液性免疫反応を含む）を回避できるように作用をする。前記免疫反応回避性部位に用いられる物質は、具体的に生体内免疫反応（細胞性免疫反応及び体液性免疫反応を含む）を回避できるポリマーであり、より具体的には、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリアルキレンオキサイド（例えば、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンまたはこれらの共重合体（ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド共重合体））、ポリフェニレンオキサイド、ＰＥＧとポリアルキレンオキサイドの共重合体、ポリ（メトキシエチルメタクリレート）、ポリ（メタクリロイルホスファチジルコリン）、過フッ化されたポリエーテル、デキストランまたはポリビニルピロリドンであり、より具体的には、ＰＥＧ、ポリアルキレンオキサイドまたはＰＥＧとポリアルキレンオキサイドの共重合体であり、さらに具体的にＰＥＧであってもよい。
【００６６】
前記（ｂ）電荷性部位（ｃｈａｒｇａｂｌｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ）は、生体内のｐＨ、具体的には、中性ｐＨ付近で前記高分子に正電荷を付与して負電荷性のウイルスの表面またはＤＮＡと相互作用によって結合できるようにしてもよい。または、ウイルス表面またはＤＮＡの電荷性によって前記と逆に負電荷性を高分子に付与してもよい。したがって、電荷性部位は、前記高分子に正電荷または負電荷を付与する物質を含み、例えば、負電荷を付与する場合には、カルボキシレート基、正電荷を付与する場合には、３次アミン基またはアミノ基を有する単量体が電荷性部位に用いられてもよい。
【００６７】
前記（ｃ）ジスルフィド結合を含む生還元性部位（ｂｉｏｒｅｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ）は、ジスルフィド結合を含む形態であれば、単量体の種類に制限されず、本発明に含まれてもよい。前記生還元性部位は、生体内の酸性環境下で還元されてジスルフィド結合がスルフヒドリル基に転換され、これによってポリマー構造の破砕が行われ、結局、ポリマー−ウイルス複合体またはポリマー−ＤＮＡ複合体から結合されているウイルス（ｎａｋｅｄ  ｖｉｒｕｓ）またはＤＮＡが放出されるようにする。
【００６８】
さらに他の例として、本発明の生体適合性高分子は、ポリマー、ナノ物質、デンドリマー、ハイドロゲルをすべて含んでもよい。好ましくは、ＰＡＰＳ（ＰＥＩ−Ａｒｇ−ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ｍＰＥＧ−Ａｒｇ−ＰＥＩ）、ＰＰＳＡ（ｍＰＥＧ−ＰＥＩ−ｇ−Ａｒｇ−Ｓ−Ｓ−Ａｒｇ−ｇ−ＰＥＩ−ｍＰＥＧ）、ＰＩＣＩＯＮ（フェギル化されて酸化鉄ナノ粒子と架橋結合されたカテコール−グラフトされたポリＬリシン（ＰＬＬ））、ＡＢＰ（アルギニングラフトされた生分解性高分子）、ＡＰＰ（フェギル化されてＰＴＸ−コンジュゲートされたポリマー型ミセル；ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ａｎｄ  ＰＴＸ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｅｌｌｅ）、ＰＰＣＢＡ（ｍＰＥＧ−ｂ−Ｐｉｐ−ＣＢＡ）、ＰＰＡ（ＰＰＣＢＡ−ＰＥＩ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｅｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ；ＰＥＧ）、ポリラクチド（ｐｏｌｙ−ｌａｃｔｉｄｅ、ＰＬＡ）、ポリグリコライド（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ；ＰＧＡ）、ポリラクチドコグリコリド（ｐｏｌｙ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ、ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ｐｏｌｙ−ε−ｃａｒｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ、ＰＣＬ）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ；ＰＥＩ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；ＨＡ）、ゼラチン、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、及び血清アルブミンからなる群から選ばれたものであってもよい。
【００６９】
前記ＰＡＰＳ高分子は、ＰＥＩ−Ａｒｇ−ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ｍＰＥＧ−Ａｒｇ−ＰＥＩで、次の構造式１の構造を持つ高分子であってもよい。
【００７０】
【化１】
2021529545.tif 000039
【００７１】
前記構造式１において、ｘとｙは、それぞれ独立して１〜５００の整数であってもよい。
【００７２】
前記ＰＰＳＡ高分子は、ｍＰＥＧ−ＰＥＩ−ｇ−Ａｒｇ−Ｓ−Ｓ−Ａｒｇ−ｇ−ＰＥＩ−ｍＰＥＧで、次の構造式２の構造を持つ高分子であってもよい。
【００７３】
【化２】
2021529545.tif 000040
【００７４】
前記構造式２において、ｎとｍは、それぞれ独立して１〜５００の整数であってもよい。
【００７５】
前記ＰＩＣＩＯＮは、フェギル化されて酸化鉄ナノ粒子と架橋結合されたカテコール−グラフトされたポリＬリシン（ＰＬＬ）で、次の構造式３のカテコール−グラフトされたポリＬリシンが酸化鉄粒子と架橋結合され、その表面にｍＰＥＧが改質された構造を持つものであってもよい。
【００７６】
【化３】
2021529545.tif 000041
【００７７】
前記構造式３において、ｎは、１〜５００の整数であってもよい。
【００７８】
前記ＡＢＰ高分子は、アルギニングラフトされた生分解性高分子（Ａｒｇｉｎｉｎ  ｇｒａｆｔｅｄ  ｂｉｏ−ｒｅｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ）で、次の構造式４の構造を持つ高分子であってもよい。
【００７９】
【化４】
2021529545.tif 000042
【００８０】
前記構造式４において、ｎは、１〜５００の整数であってもよい。
【００８１】
前記ＡＰＰは、フェギル化されてＰＴＸ−コンジュゲートされたポリマー型ミセル（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ａｎｄ  ＰＴＸ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｅｌｌｅ）を意味するもので、次の構造式５の構造を持つものであってもよい。
【００８２】
【化５】
2021529545.tif 000043
【００８３】
前記構造式５において、ｎとｍは、それぞれ独立して１〜５００の整数であってもよい。
【００８４】
前記ＰＰＣＢＡ高分子は、ｍＰＥＧ−ｂ−Ｐｉｐ−ＣＢＡで、ｐＨ敏感性及び生分解性高分子に属し、次の構造式６の構造を持つものであってもよい。
【００８５】
【化６】
2021529545.tif 000044
【００８６】
前記構造式６において、ｎとｍは、それぞれ独立して１〜５００の整数であってもよい。
【００８７】
前記ＰＰＡは、ＰＰＣＢＡ−ＰＥＩ−ＡｒｇｉｎｉｎｅでｐＨ敏感性及び生分解性高分子に属し、前記ＰＰＣＢＡにＰＥＩとアルギニンがより結合された形態の高分子であってもよい。次の構造式７の構造を持つものであってもよい。
【００８８】
【化７】
2021529545.tif 000045
【００８９】
前記構造式７において、ａ、ｂ及びｃは、それぞれ独立して１〜５００の整数であってもよい。一例として、aは１００〜２００、ｂは１〜１０、そして、ｃは１〜５の高分子、または、ａは１１３、ｂは６、そして、ｃは１である高分子であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００９０】
ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）は、構造式８の単量体が結合された線状または分枝状のポリエチレンイミンをすべて含んでもよい。
【００９１】
【化８】
2021529545.tif 000046
【００９２】
前記構造式８において、ｎは、１〜５００の整数であってもよい。
【００９３】
前記分枝状ポリエチレンイミンは、一般的な分枝状ポリエチレンイミンの他に、分子の鎖が一定の規則に従って中心から外側に向かって、規則的に３次元的に広がった形態のデンドリマーも含んでもよい。
【００９４】
【化９】
2021529545.tif 000047
【００９５】
構造式９は、分枝状ポリエチレンイミンの一例を示し、ｎは、１〜５００の整数であってもよい。
【００９６】
本発明の生分解性高分子は、エチレンイミンを単量体とする構造式８の高分子の一例としてデンドリマー高分子も含む。一例として、デンドリマー形態の分枝状ポリエチレンイミンは、構造式１０または構造式１１の高分子であってもよいが、これに限定されるものではない。構造式１１の高分子は、ポリ（アミドイミン）高分子で、ＰＡＭＡＭとも称される。
【００９７】
【化１０】
2021529545.tif 000048
【００９８】
【化１１】
2021529545.tif 000049
【００９９】
前記生体適合性高分子は、本発明の組換えアデノウイルスまたはウイルスＤＮＡと結合して細胞内に流入される効率を高め、個体内の安定性を高め、免疫原性を下げて目的部位にウイルスまたはウイルスＤＮＡの伝達効率を向上させることにより、本発明のアデノウイルスまたはウイルスＤＮＡによるがんの治療効果を顕著に上昇させることができる。
【０１００】
前記生体適合性高分子とアデノウイルスシステムは、静電気的相互作用（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）、イオン性相互作用または化学的結合により連結されてもよい。
【０１０１】
本発明の他の様態によれば、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする核酸配列と、ｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する核酸配列を含む遺伝子伝達体を含む薬学的組成物を提供する。前記組成物は、抗がん用組成物、がん細胞の抗転移用組成物、または抗腫瘍免疫性（ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）増進用組成物であってもよい。
【０１０２】
前記組成物は、本発明のアデノウイルスシステムを治療学的有効量で含んでもよい。また、前記組成物は、薬剤学的に許容される担体（ｃａｒｒｉｅｒ）をさらに含んでもよい。
【０１０３】
前記抗がん用組成物は、腫瘍細胞の生存、増殖及び／又は転移を抑制してがん細胞を増加させないか、がん細胞の死滅を誘導または促進させることを意味する。本発明の組換えアデノウイルスシステムまたはこれを含む組成物は、がん細胞の死滅を効果的に誘導し、転移を抑制し得る。
【０１０４】
前記がん細胞の抗転移用組成物は、がん細胞が移動を通じて転移されることを抑制する効果を持ち、例えば、がん細胞でＥＭＴを阻害して転移を抑制する効果を確認し得る。本発明の抗転移用組成物は、がん細胞の殺傷を通じた抗がん効果とがん細胞の転移抑制効果を同時に持つことができる。
【０１０５】
前記抗腫瘍免疫性増進用組成物は、腫瘍組織で生産される免疫抑制分子を用いた腫瘍の免疫監視回避を克服してがんを治療できるもので、抗がん用組成物に含まれる意味であり得る。特に、抗腫瘍免疫性組成物は、腫瘍組織において免疫細胞の不均衡を正常化し、ＩＬ−１２によってＴ  ｈｅｌｐｅｒ細胞の分化を誘導して細胞毒性Ｔリンパ球及び自然殺傷細胞の細胞毒性を活性化させることにより、抗がん免疫を増進させることができることを意味する。
【０１０６】
本発明の薬学的組成物は、ＩＬ−１２を発現してがん個体内で抗がん免疫を増進させる。また、Ｃ−ｍｅｔに対するｓｈＲＮＡを介してＣ−ｍｅｔの発現を抑制させてＩＬ−１２の機能をさらに増幅させることができる。本発明の一実施例において、ヒト由来のがん細胞を注入したマウスモデルにおいても本発明のＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔ同時発現アデノウイルスを注入した場合、顕著な抗がん効果及び腫瘍の転移効果を示すことを確認した。
【０１０７】
また、前記組成物は、標準治療（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｔｈｅｒａｐｙ）の治療効果増進のための補助治療用組成物であってもよく、他の抗がん剤、免疫関門抑制剤、免疫治療剤などを含む標準治療剤の効果を改善または向上させるための補助治療用組成物であってもよい。
【０１０８】
本発明の抗がん組成物は、上述した抗腫瘍免疫性増進組成物に含まれる組換えアデノウイルスを用いるため、この２つの間に共通の内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるため、その記載を省略する。
【０１０９】
本発明の一具現例によれば、前記がんは胃がん、肺がん、非小細胞性肺がん、乳がん、卵巣がん、肝臓がん、気管支がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、膵臓がん、膀胱がん、大腸がん、結腸がん、子宮頸がん、骨がん、非小細胞性骨がん、血液がん、皮膚がん（黒色腫など）、頭頚部がん、子宮がん、直腸がん、肛門付近がん、結腸がん、卵管がん、子宮内膜がん、膣がん、陰門がん、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、食道がん、小腸がん、内分泌腺がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、腎臓または尿管がん、腎臓細胞がん腫、腎臓骨盤がん腫、倍数体がん（ｐｏｌｙｐｌｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、唾液腺がん、肉腫がん、仮性粘液腫、肝母細胞腫、精巣がん、膠芽腫、口唇がん、胚細胞腫瘍、基底細胞がん、多発性骨髄腫、胆のうがん、脈絡膜黒色腫、ファーター膨大部がん、腹膜がん、副腎がん、舌がん、小細胞がん、小児リンパ腫、神経芽細胞腫、十二指腸がん、尿管がん、星細胞腫、髄膜腫、腎盂がん、外陰がん、胸腺がん、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ、ＣＮＳ）腫瘍、１次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫及び脳下垂体腺腫からなる群から選ばれるが、これに限定されるものではない。
【０１１０】
上述した本発明のすべての組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。本発明に用いられる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでもよい。適切な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【０１１１】
本発明の組成物は、経口または非経口で投与してもよい。非経口投与である場合には、腫瘍内（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ）注入、静脈内注入、皮内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、脊髄内注入、心臓内注入、胸郭内注入、動脈内注入、骨内注入、関節腔内注入、経皮投与などで投与してもよく、好ましくは、非経口投与である。
【０１１２】
また、前記組成物は、局所投与、または全身投与用であってもよい。
【０１１３】
本発明の一具現例によれば、本発明の抗腫瘍免疫性増進組成物は、好ましくは、腫瘍内に（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ）直接投与されて抗腫瘍免疫増進効果を持つことを確認した。
【０１１４】
本発明の組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に処方されることがある。本発明の薬剤学的組成物の１日の投与量は、例えば０.２−１０００ｍｇ／ｋｇである。しかし、有効成分の実際の投与量は、分化及び増殖しようとする対象組織細胞の量、投与経路、患者の体重、年齢及び性別などの様々な関連因子を考慮して決定してもよく、したがって、前記投与量は、いかなる形態でも本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１５】
本発明のさらに他の態様によって、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子を含む遺伝子伝達体の抗がん剤としての用途を提供する。本発明の遺伝子伝達体は、ＩＬ−１２とｃ−ｍｅｔを抑制するＲＮＡを同時に発現することにより、ＩＬ−１２による抗腫瘍免疫効果をより向上させるとともに、腫瘍の転移も抑制し得る。抗がん剤としての本発明の遺伝子伝達体の用途に対しては、重複した記載を避けるため、先の遺伝子伝達体または薬学的組成物に対する内容を準用する。
【０１１６】
本発明のさらに他の態様によって、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコーディングする遺伝子及びｃ−ｍｅｔ遺伝子に相補的に結合してｃ−ｍｅｔの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを発現する遺伝子を含む遺伝子伝達体またはこれを含む薬学的組成物を個体に投与することを含むがんを治療する方法を提供する。
【０１１７】
本発明の遺伝子伝達体は、ＩＬ−１２とｃ−ｍｅｔを抑制するＲＮＡを同時に発現することにより、ＩＬ−１２による抗腫瘍免疫効果をより向上させるとともに、腫瘍の転移も抑制できるため、がんの治療においてシナジー効果が得られる。抗がん剤としての本発明の治療方法に対しては、重複した記載を避けるため、先の遺伝子伝達体または薬学的組成物に対する内容を準用する。
【０１１８】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【実施例】
【０１１９】
実験の準備及び組換えベクターの製造
準備例１．細胞の入手及び培養
細胞培養培地として、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、Ｌ−グルタミン（２ｍｍｏｌ／Ｌ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、及びストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）が添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＲＰＭＩ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、またはＭｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用した。ＨＥＫ２９３（アデノウイルスＥ１部位を発現、ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）、Ｈ１９７５（ｈｕｍａｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）、及びＨａＫ（ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。ＨａＰ−Ｔ１（ｈａｍｓｔｅｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）は、Ｄｒ．Ｍａｓａｔｏ  Ａｂｅｉ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｉｂａｒａｋｉ，Ｊａｐａｎ）から分譲を受けた。すべての細胞株は、３７℃、５％ＣＯ２湿潤環境下で培養し、Ｈｏｅｓｃｈｓｔ染料、細胞培養及びＰＣＲを用いてマイコプラズマ陰性テストを行った。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、３７℃、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培地で培養した。
【０１２０】
製造例１．ＩＬ−１２及び／又はｓｈｃ−ｍｅｔを発現する腫瘍殺傷（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）アデノウイルスシステム構築
製造例１−１．ヒト由来ＩＬ−１２及びｓｈｃ−ｍｅｔを発現するｐＤＮＡ構築
Ａｄベクターを用いた抗腫瘍効果及び抗腫瘍免疫反応を確認するために、ｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤに基づいて抗腫瘍免疫遺伝子であるヒトインターロイキン−１２（ｈＩＬ−１２）及び／又はがん細胞の成長と分化に重要な役割を果たすｃ−ｍｅｔの発現を抑制するためのｃ−ｍｅｔに相補的に結合する短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ、以下、「ｓｈｃ−ｍｅｔ」という）を発現するように組換えられた２つの腫瘍殺傷（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）アデノウイルスのプラスミドＤＮＡ（Ａｄ  ｐＤＮＡまたはｏＡｄ  ｐＤＮＡという）を製造した（図１）:(ｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ及びｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ）。
【０１２１】
【表２】
2021529545.tif 000050
【０１２２】
製造例１−２．マウス由来ＩＬ−１２及びｓｈｃ−ｍｅｔ発現するポリマー−ウイルスＤＮＡ複合体の製造
また、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤに基づいてマウス由来のＩＬ−１２  ｐ３５（配列番号７）と、ＩＬ−１２  ｐ４０（配列番号８）を発現する遺伝子を挿入した。また、配列番号１１のマウスのｃ−ｍｅｔ遺伝子に対して４３９８番目ないし４４２２番目のヌクレオチドを標的配列（配列番号１５）とするｓｈＲＮＡを設計した。Ｃ−ＭＥＴ遺伝子に相補的に結合して遺伝子発現を抑制できるｓｈｃ−ｍｅｔを発現する配列番号１４のヌクレオチド配列が挿入されたＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔプラスミドＤＮＡを構築した。これをＰＰＡ（ＰＰＣＢＡ−ＰＥＩ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ）ポリマーと混合して結合させて、ｐＤＮＡ／ＰＰＡポリマー複合体を製造した。
【０１２３】
製造例２．ＩＬ−１２及び／又はｓｈｃ−ｍｅｔを発現する組換え腫瘍殺傷（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）アデノウイルスの構築
ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによる抗腫瘍効果及び抗腫瘍免疫反応を確認するために、抗がんアデノウイルスを作製した（図４、組換えアデノウイルスがヒト由来の配列を含む場合にＨｓｃＩＬ−１２、Ｈｓｈｃ−ｍｅｔに区分して表記）：
ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ：発現遺伝子を含まないＡｄベクター
ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｃＩＬ−１２：ＩＬ−１２のみ発現するＡｄベクター
ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｈｃ−ｍｅｔ：Ｃ−Ｍｅｔ遺伝子に対するｓｈＲＮＡを発現するＡｄベクター
ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ：ＩＬ−１２及びＣ−Ｍｅｔ遺伝子に対するｓｈＲＮＡを発現するＡｄベクター
【０１２４】
より具体的には、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤに基づいてヒト由来のＩＬ−１２  ｐ３５（配列番号１）と、ＩＬ−１２  ｐ４０（配列番号２）をそれぞれ発現する遺伝子を挿入した。また、配列番号１０のヒトｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡに対して、１９８７番目ないし２００７番目ヌクレオチドを標的配列（配列番号１３）とするｓｈＲＮＡを発現する配列番号１２の配列を挿入して組換えアデノウイルスベクターを作製した。
【０１２５】
また、前記と同様の方法でマウス由来のＩＬ−１２  ｐ３５（配列番号８）と、ＩＬ−１２  ｐ４０（配列番号９）を発現する遺伝子と配列番号１１のマウス由来のＣ−ＭＥＴ遺伝子の４３９８番目ないし４４２２番目のヌクレオチドを標的配列（配列番号１５）とし、これに相補的に結合して遺伝子発現を抑制できるｓｈｃ−ｍｅｔを発現する配列（配列番号１４）を挿入してＩＬ−１２とｓｈｃｍｅｔ同時発現アデノウイルスベクターをそれぞれ製造した。
【０１２６】
製造例３．動物モデル構築
３−１．ヒト異種移植肺がん腫瘍モデル
オリエントから購入したヌードマウスが６−８週齢であるとき、ヒト肺がん細胞株（Ｈ１９７５）を３×１０６ｃｅｌｌs／５０μＬでヌードマウスの皮下に注射した後、腫瘍のサイズが平均１００ｍｍ３となったとき、製造例１または２の抗がんアデノウイルスを投与して効果を確認した。
【０１２７】
３−２．マウス腫瘍モデル
Ｃ５７ＢＬ６（Ｂ１６−Ｆ１０  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ）は、大韓バイオリンク、ＢＡＬＢ／Ｃ（ＣＴ２６  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ）は、オリエントから購入して実験を行った。マウス６−８週齢であるとき、マウス皮膚がん細胞株（Ｂ１６−Ｆ１０）またはマウス胃がん細胞株（ＣＴ２６）を５×１０５ｃｅｌｌs／５０μＬでマウスの皮下に注射した後、腫瘍のサイズが平均１００ｍｍ３となったとき、製造例１または２の抗がんアデノウイルスを投与して、効果を確認した。
【０１２８】
試験例１．Ａｄ  ｐＤＮＡによる細胞内ｍＩＬ−１２及びｈＩＬ−１２発現確認
製造例１によって製造されたＡｄ  ｐＤＮＡによるヒトＩＬ−１２（ｈＩＬ−１２）遺伝子発現を確認するために、細胞内伝達効率の良いヒト胚腎臓細胞株である２９３ＡにｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ及びｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ  Ａｄ  ｐＤＮＡをリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）と常温で反応させた後、５０％分注された２９３Ａ細胞に処理後、７２時間目の細胞培養液を回収してｈＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡを行った。
【０１２９】
図２に示すように、実施例（ｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ  Ａｄ  ｐＤＮＡ；Ｐａｃ  Ｉ  ２個）によりｈＩＬ−１２が９７,５００±６,３８４ｐｇ／ｍＬで発現されたことを確認した。したがって、本実施例で作製されたＡｄ  ｐＤＮＡは、細胞内で治療遺伝子インターロイキン−１２の発現を効率的に誘導することを確認できた。
【０１３０】
試験例２．アデノウイルス（Ａｄ）ｐＤＮＡによる細胞内ＩＬ−１２及びｃ−ｍｅｔの同時発現確認
製造例１によって製造されたアデノウイルスｐＤＮＡの細胞内伝達効率を考慮し、２９３Ａ細胞株でｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ  Ａｄ  ｐＤＮＡによるｈＩＬ−１２の発現を確認したが、正常細胞である２９３Ａでは、ｃ−ｍｅｔが過発現しないため、ｃ−ｍｅｔ特異的ｓｈＲＮＡ発現によるｃ−ｍｅｔ発現抑制能を確認できなかった。
【０１３１】
したがって、実施例ｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ（Ｐａｃ  Ｉ  ２個）によるｃ−ｍｅｔの発現抑制能を検証するため、ｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔアデノウイルス（Ａｄ）を製造し、前記で製造したｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔアデノウイルス（Ａｄ）を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５０％分注されたｃ−ｍｅｔが過発現されるＡ５４９ヒト肺がん細胞株にウイルスを２０μＬ処理した後、４８時間目に細胞培養液を回収して感染させ、４８時間後、細胞培養液を回収してｈＩＬ−１２とｃ−ｍｅｔに対するＥＬＩＳＡを行った。いかなる処理もしないＡ５４９ヒト肺がん細胞株においてｈＩＬ−１２とｃ−ｍｅｔの発現量を対照群として使用した。
【０１３２】
図３に示すように、ｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ  ＡｄによってｈＩＬ−１２の発現（２３５,０００±２０,５１８ｐｇ／ｍＬ）が対照群（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）に対して増加し、対照群に対してｍＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ  Ａｄ処理群でｃ−ｍｅｔの発現が１.２倍減少されることを確認した。したがって、本発明で製造されたＡｄシステムによって治療遺伝子であるＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔの発現が効率的に誘導されることが分かる。
【０１３３】
試験例３．ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスの生体内抗腫瘍効果確認（ｍｏｕｓｅ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ）
製造例２によって製造された、マウスＩＬ−１２とマウスｃ−ｍｅｔ標的ｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによる抗がん治療効果を検証するため、マウスの皮膚がん細胞株であるＢ１６−Ｆ１０またはマウス胃がん細胞株であるＣＴ２６を用いてそれぞれの腫瘍モデルを構築し、抗腫瘍効果を確認した。
【０１３４】
マウス皮膚がん細胞株（Ｂ１６−Ｆ１０）またはマウス胃がん細胞株（ＣＴ２６）を５×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬでマウスの皮下に注射した後、腫瘍のサイズが平均１００ｍｍ３となったとき、ＰＢＳまたはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔをそれぞれ投与した。２日間隔で計３回腫瘍内に投与した後（１×１０１０ＶＰ）、腫瘍のサイズを測定して抗腫瘍効果を観察した。
【０１３５】
図５a及び図５ｂに示すように、２つのマウス腫瘍モデルにおいてＰＢＳ投与群の場合には腫瘍が急速に成長したが、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔを投与したすべての個体において腫瘍が完全に消えることを確認した。
【０１３６】
試験例４．ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスｐＤＮＡ／ＰＰＡ複合体の生体内抗腫瘍効果確認（ｍｏｕｓｅ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ）
製造例１−２によって製造されたＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ  ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ）とＰＰＡポリマー複合体（ｐＤＮＡ／ＰＰＡ）を製造し、抗がん治療の効果を確認した。具体的には、マウス皮膚がん細胞株であるＢ１６−Ｆ１０を用いて腫瘍モデルを構築し、抗腫瘍効果を確認した。マウス皮膚がん細胞株（Ｂ１６−Ｆ１０）を５×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬでマウスの皮下に注射した後、腫瘍のサイズが平均１００ｍｍ３となったとき、ＰＢＳとＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ  Ａｄ  ｐＤＮＡ／ＰＰＡ複合体をそれぞれマウスモデルに投与した。毎日計７回腫瘍内に投与した後、腫瘍のサイズを測定して抗腫瘍効果を観察した。
【０１３７】
図６に示すように、ＰＢＳ投与群の場合には、腫瘍のサイズが２５１４.７±２０２.１ｍｍ３まで成長したが、抗がんウイルスのｐＤＮＡ／ＰＰＡ複合体を投与したグループにおいて、すべて明確な抗腫瘍効果が確認できた。ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ  Ａｄ  ｐＤＮＡ／ＰＰＡ複合体投与群の平均腫瘍サイズは、１３８７.６±１７１.８ｍｍ３でＰＢＳ投与群に対して腫瘍のサイズが４４.８％減少されることを確認し、これはＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現するウイルスＤＮＡによっても向上した抗腫瘍効果が誘導されることを意味する。
【０１３８】
試験例５．ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによる細胞内ＩＬ−１２及びｓｈｃ−ｍｅｔ発現確認（Ｈｕｍａｎ）
ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによるｈｕｍａｎ  ＩＬ−１２またはｈｕｍａｎ  ｃ−Ｍｅｔ標的ｓｈｃ−Ｍｅｔの発現を確認するため、Ｈ１９７５ヒト肺がん細胞株に製造例２によって製造された組換えアデノウイルスＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｈｃ−ｍｅｔ、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２またはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔをそれぞれ２  ＭＯＩ（図７ｂ）または５  ＭＯＩ（図７ａ）ずつ処理して感染させた。４８時間経過後、細胞及び培養液を回収してｈｕｍａｎ  ＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡとｃ−Ｍｅｔウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）を行って各遺伝子の発現を確認した。
【０１３９】
図７ａに示すように、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２（３０６６.３±１６５.７ｐｇ／ｍｇ）とＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ（９４９２２.６±１８５.８ｐｇ／ｍｇ）組換えベクターの両方でｈｕｍａｎ  ＩＬ−１２が発現されることを確認した。
【０１４０】
また、図７ｂに示すように、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｈｃ−ｍｅｔまたはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔ組み換えベクターで処理された細胞では、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ対照群に対してｃ−ｍｅｔの発現が抑制されることを確認した。したがって、本発明で作製された抗がんアデノウイルス組換えベクターに挿入された治療遺伝子ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔの発現が効率的に誘導されることが確認できる。
【０１４１】
試験例６．ヒト由来ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによるがん細胞殺傷能検証
ヒト由来のＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによるがん細胞殺傷能を確認するため、Ｈ１９７５ヒト肺がん細胞株に製造例２によって作製された抗がんアデノウイルスＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ；ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２；ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｈｃ−ｍｅｔ；またはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔをそれぞれ２、５、１０、２０、５０  ＭＯＩずつ感染させ、正常酸素条件（Ｎｏｒｍｏｘｉａ）と低酸素条件（Ｈｙｐｏｘｉａ）でアデノウイルスのがん細胞殺傷能を観察した。
【０１４２】
図８ａ及び８ｂに示すように、正常酸素条件と低酸素条件の両方でＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｈｃ−ｍｅｔ、またはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔのがん細胞殺傷能がウイルスの力価に比例して増加することを確認した。また、５０  ＭＯＩを感染させた条件で単独治療遺伝子処理群であるＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２またはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｈｃ−ｍｅｔのがん細胞殺傷能がＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤに対して増加したが、前記単独処理群に比べて同時発現群であるＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔが著しく向上されたがん細胞殺傷能を誘導した。これはＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔの同時発現が抗がん治療においてシナジー効果を持つことを意味する。
【０１４３】
試験例７．ヒト由来ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスのＨＵＶＥＣの転移（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）と侵襲（ｉｎｖａｓｉｏｎ）抑制能検証
がん細胞で発現されるＨＧＦは、血管内皮細胞におけるｃ−ｍｅｔ信号伝達体系を活性化させることにより、がん細胞の転移（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）及び侵襲（ｉｎｖａｓｉｏｎ）を増加させ、結果として非理想的な血管形成を誘導すると報告されている。したがって、ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスがＨＵＶＥＣの転移と侵襲能力を低下させることができるかを確認するため、次の実験を行った。
【０１４４】
Ｈ１９７５ヒト肺がん細胞株にＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｓｈｃ−ｍｅｔ、またはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ｈｓｃＩＬ−１２／ｓｈｃ−ｍｅｔを感染させた後、上澄み液を回収して転移（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）及び侵襲（ｉｎｖａｓｉｏｎ）分析（ａｓｓａｙ）を行った。対照群として無処理培地（ｆｒｅｓｈ  ｍｅｄｉａ、５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ）と抗がんウイルスを感染させないがん細胞培養液（Ｈ１９７５−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ、Ｈ１９７５−ＣＭ）を使用した。
【０１４５】
図９ａ、９ｂ、９c及び９ｄに示すように、Ｈ１９７５−ＣＭ（抗がんウイルスを感染させないがん細胞の培養液）で無処理培地（ｆｒｅｓｈ  ｍｅｄｉａ）を処理したグループに対してＨＵＶＥＣの転移及び侵襲能力が増加することを確認した。一方、がん細胞にＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２またはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔを感染させた培養液を処理したグループの場合、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤを感染させたグループに対してＨＵＶＥＣの転移及び侵襲能力が減少され、特に、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔを感染させたがん細胞培養液では、ＨＵＶＥＣの転移及び侵襲能が著しく抑制されることを確認した。これはＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによってがん細胞で発現されるＨＧＦの量が効果的に抑制されることにより、結果としてＨＵＶＥＣの転移と侵襲能力を減少させるのにシナジー効果が得られることを意味する。
【０１４６】
試験例８．ヒト由来ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによる上皮−中間葉変異（Ｅｎｄｏ−ＭＴ）抑制効果確認
ＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによって誘導される血管の正常化効果を検証するため、Ｈ１９７５ヒト肺がん細胞株にＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔ、またはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔを感染させた後に上澄み液を回収してＨＵＶＥＣ細胞を培養した後、上皮（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）または中間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）マーカーの発現変化をウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）を介して確認した。対照群として無処理培地（ｆｒｅｓｈ  ｍｅｄｉａ、５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ）と抗がんウイルスを感染させないがん細胞培養液を使用した。
【０１４７】
図１０に示すように、がん細胞にＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔまたはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔを感染させた培養液を処理したグループの場合、対照群（ｆｒｅｓｈ  ｍｅｄｉａ処理グループ）に比べて中間葉マーカー（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｍａｒｋｅｒ）であるＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎとａ−ＳＭＡの発現が減少され、そのなかでＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時に発現するアデノウイルスで処理された場合に、最も優れた発現減少効果が確認された。これはＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現の場合、ＨＵＶＥＣ細胞の転移と侵襲能を抑制する効果だけでなく、ｅｎｄｏ−ＭＴ移行（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を抑制して血管の正常化を誘導するのに優れた効果が得られることを示す結果である。
【０１４８】
試験例９．ヒト異種移植腫瘍モデルでＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスの生体内抗腫瘍効果確認
ヒト異種移植腫瘍モデル（ｈｕｍａｎ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ）において本発明のＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスによる抗がん治療効果を検証するため、ヒト肺がん細胞株であるＨ１９７５を用いて腫瘍モデルを構築して抗腫瘍効果を確認した。
【０１４９】
ヒト異種移植腫瘍モデルは、具体的には、ヒト肺がん細胞株（Ｈ１９７５）を３×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬでヌードマウスの皮下に注射した後、腫瘍のサイズが平均１００ｍｍ３となったとき、ＰＢＳ、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔ、またはＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔをそれぞれ投与した。２日間隔で計２回腫瘍内投与した後（５×１０６ｐｆｕ）、腫瘍のサイズを測定した。
【０１５０】
図１１に示すように、ＰＢＳ投与群の場合には、腫瘍が急速に成長したが、抗がんアデノウイルスを投与したグループにおいてすべて明確な抗腫瘍効果を確認できた。具体的には、ＰＢＳ投与群に対して腫瘍のサイズがＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤは８１.７％、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２は８５.５％、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔは９２.２％、そして、ＨＥ５ｃＴ−Ｒｄ１９−ＲＧＤ／ＨｓｃＩＬ−１２／Ｈｓｈｃ−ｍｅｔは９４.６％減少され、これにより単独処理群に比べてＩＬ−１２とｓｈｃ−ｍｅｔを同時発現する抗がんアデノウイルスを用いる場合、シナジー効果が得られることが分かる。
【０１５１】
試験例１０．ＩＬ−１２とＬｂｃｐｆ１−ｃｒＭＥＴを同時発現する抗がんアデノウイルスによる細胞内ＩＬ−１２発現及びｃ−ｍｅｔ発現減少確認
試験例１０−１．ＩＬ−１２とｃ−ｍｅｔ標的するクリスパーＲＮＡを同時に発現する抗がんアデノウイルスの構築
標的ＤＮＡを切断した後、細胞内復旧システムによって再び連結される過程で遺伝子矯正と望む変異を起こす３.５世代遺伝子ハサミ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）を用いたクリスパーＲＮＡシステム（Ｌｂｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ  ｓｙｓｔｅｍ）を構築して、本発明のアデノウイルスシステムでクリスパーシステムを用いた場合にも同じ効果を持つことができるかを確認した。ＩＬ−１２配列は、製造例２と同様の方法で組換えベクターに位置させたが、ＩＬ−１２のｐ３５コーディング配列（配列番号４）とＩＬ−１２のｐ４０をコーディングする配列（配列番号５）との間にＩＲＥＳコーディング配列（配列番号２０）を含む配列（配列番号６）を用いた（図１２においてＨＩＬ−１２と表記）。
【０１５２】
ｃ−ｍｅｔ標的（ｔａｒｇｅｔ）ガイドＲＮＡ配列の場合は、プログラムを用いて選定した後、バイオニクス会社に依頼してオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）を合成した後、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）によってクローニングを行った。ＲｄＢ−ＲＧＤアデノウイルスのＥ１部位にＣｐｆ１タンパク質コーディング遺伝子（配列番号１８）を挿入し、ガイドＲＮＡ（ｃｒｃ−ｍｅｔ）を発現する部位のアップストリームにＵ６プロモーターを位置させた。また、ＲｄＢ−ＲＧＤアデノウイルスのＥ３領域にＩＬ−１２コーディング配列及びＣ−ｍｅｔ標的ガイドＲＮＡを発現する配列（配列番号１６）を挿入してＩＬ−１２とＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムを同時発現する組換えアデノウイルスを構築した。ガイドＲＮＡは、配列番号１０のヒトｃ−ｍｅｔ配列から５５番目ないし７７番目のヌクレオチドを標的化するように設計した（図１２）。
【０１５３】
前記構築された組換えアデノウイルス発現されるガイドＲＮＡ（ｃｒｃｍｅｔ）が標的遺伝子の標的部位を認識して校正位置を指定すると、遺伝子ハサミＣｐｆ１が標的部位を切断して、ｃ−ｍｅｔを効果的に抑制できるのかを確認した。
【０１５４】
試験例１０−２．ＩＬ−１２とc−ｍｅｔ標的するクリスパーＲＮＡを同時に発現する抗がんアデノウイルスによるｃ−ｍｅｔ抑制効果確認
ＩＬ−１２とＬｂｃｐｆ１−ｃｒＭＥＴを同時発現する抗がんアデノウイルスによるヒト由来のＩＬ−１２発現またはＬｂｃｐｆ１−ｃｒＭＥＴシステムによるｃ−ｍｅｔの発現減少を確認するため、Ｈ１９７５ヒト肺がん細胞株に作製された抗がんアデノウイルス５  ＭＯＩまたは１００  ＭＯＩを感染させ、４８時間後、細胞及び培養液を回収してヒトＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡまたはｃ−Ｍｅｔウエスタンブロットを行った。
【０１５５】
図１３ａ、図１３ｂ、及び図１３ｃに示すように、ＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１／ＨｓｃＩＬ−１２とＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１／ＨｓｃＩＬ−１２−ｃｒＭＥＴを処理した群で、それぞれ９０００.０±６００.０ｐｇ／ｍＬと１７４００.０±１２００.０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２の発現が確認された。また、すべての抗がんウイルス処理群で、ｃ−ｍｅｔの発現が抑制されることを確認した。特に、ＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１／ＨｓｃＩＬ−１２−ｃｒＭＥＴによって最もｃ−ｍｅｔの発現が効果的に減少した。
【０１５６】
試験例１１．ヒト異種移植腫瘍モデルでＩＬ−１２とＬｂｃｐｆ１−ｃｒＭＥＴを同時発現する抗がんアデノウイルスの生体内抗腫瘍効果確認
ヒト異種移植腫瘍モデルにおいて、ｓｈＲＮＡではないＣＲＩＳＰＲによるｃ−ｍｅｔ発現の抑制がＩＬ−１２の発現と同時に具現できるかと、これによる抗がん効果を記載できるかを確認するための実験を行った。
【０１５７】
ＣＲＩＳＰＲによるｃ−ｍｅｔ発現抑制を確認するため、試験例１０−１により作製されたＬｂｃｐｆ１−ｃｒＭＥＴシステムを用いた。
【０１５８】
作製されたＩＬ−１２とＬｂｃｐｆ１−ｃｒＭＥＴを同時発現する抗がんアデノウイルスによる抗がん治療効果を検証するため、ヒト肺がん細胞株であるＨ１９７５を用いて腫瘍モデルを構築し、抗腫瘍効果を確認した。ヒト肺がん細胞株（Ｈ１９７５）を３×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬでヌードマウスの皮下に注射した後、腫瘍のサイズが平均９０ｍｍ３となったたとき、ＰＢＳ、ＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１、ＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１／ＨｓｃＩＬ−１２、またはＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１／ＨｓｃＩＬ−１２−ｃｒＭＥＴをそれぞれ投与した。２日間隔で計３回腫瘍内に投与した後（５×１０９ＶＰ）、腫瘍のサイズを測定して抗腫瘍効果を観察した。
【０１５９】
図１４に示すように、ＰＢＳ投与群の場合には、腫瘍のサイズが２５日目に１４８６.５±２２１.１ｍｍ３まで急激に成長したが、抗がんウイルスを投与したグループですべて明確な抗腫瘍効果が確認された。抗がんウイルス投与群の平均腫瘍のサイズは、それぞれ８７６.９±１４６.２ｍｍ３（ＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１）、７９２.０±２３０.３ｍｍ３（ＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１／ｓｃＩＬ−１２）、または５３５.６±１７２.６ｍｍ３（ＲｄＢ−ＲＧＤ／Ｌｂｃｐｆ１／ｓｃＩＬ−１２−ｃｒＭＥＴ）でＰＢＳ投与群に対して腫瘍のサイズが４１.０、４６.７または６４％減少され、特にＩＬ−１２と同時発現によりＣＲＩＳＰＲ方法を用いる場合、腫瘍のサイズが顕著に減少したところ、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いる場合にも２つの治療遺伝子によるシナジー効果が得られることを確認した。
【国際調査報告】
2021529545.tif 000051
2021529545.tif 000052
2021529545.tif 000053
2021529545.tif 000054