(57)【要約】  ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ならびにＴ細胞前駆体およびＮＫ細胞前駆体などの免疫細胞におけるＡＲＩＤ５Ｂ発現を操縦して、インビボにおけるそれらの持続性および機能を増強する方法が本明細書において提供される。抗がん、抗ウイルス、および他の免疫療法のための、改変された免疫細胞およびそのような改変された細胞を含む組成物も本明細書において提供される。一部の実施形態において、免疫細胞を遺伝子改変してＡＲＩＤ５Ｂ発現を増加させ、ゆえに、冷凍および融解した後の、改変された細胞の持続性を向上させ、インビボ抗腫瘍効力を増加させ、生存率および機能性を増加させる。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型免疫細胞と比べて、ＡＴリッチ相互作用ドメイン５Ｂ（ＡＲＩＤ５Ｂ）の発現が増加した改変された免疫細胞の単離集団であって、前記改変された免疫細胞が、持続性の増加、解糖のレベルの増加、およびミトコンドリア酸化的代謝の増加のうちの１つまたは複数を呈する、改変された免疫細胞の単離集団。
【請求項２】
前記改変された免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはＮＫＴ（ナチュラルキラーＴ）細胞を含む、請求項１に記載の集団。
【請求項３】
前記ＮＫ細胞が、初代ＮＫ細胞またはＮＫ−９２細胞である、請求項２に記載の集団。
【請求項４】
前記ＮＫ細胞が、ＣＤ３-、ＴＣＲ-、ＣＤ５６+、およびＮＫｐ４６+である、請求項２に記載の集団。
【請求項５】
前記改変された免疫細胞が、幹細胞、造血幹もしくは造血前駆細胞、または前駆細胞からインビトロで分化する、請求項１に記載の集団。
【請求項６】
前記前駆細胞が、ＣＤ３４＋造血性内皮細胞、複能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ前駆細胞、またはＮＫＴ前駆細胞である、請求項５に記載の集団。
【請求項７】
前記改変された免疫細胞が、誘導多能性幹細胞からインビトロで分化する、請求項１に記載の集団。
【請求項８】
前記改変された免疫細胞が、少なくとも１つの遺伝子改変モダリティーを含む、請求項１に記載の集団。
【請求項９】
前記遺伝子改変モダリティーが、ＡＲＩＤ５Ｂポリペプチドをコードし、異種プロモーターに作動的に連結された組換え核酸を含む、請求項８に記載の集団。
【請求項１０】
前記遺伝子改変モダリティーが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む、請求項８に記載の集団。
【請求項１１】
前記改変された免疫細胞が、末梢血、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍から単離されるまたはそれらに含まれる免疫細胞からインビトロまたはエクスビボで産生される、請求項１に記載の集団。
【請求項１２】
前記改変された免疫細胞が、ＡＲＩＤ５Ｂ遺伝子発現を増加させる１種以上の作用物質とエクスビボで接触していない免疫細胞と比較して細胞におけるＡＲＩＤ５Ｂ遺伝子発現を増加させる１種以上の作用物質に免疫細胞を接触させることによって、インビトロまたはエクスビボで産生される、請求項１に記載の集団。
【請求項１３】
免疫細胞が、末梢血、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍から単離されるまたはそれらに含まれる、請求項１１に記載の集団。
【請求項１４】
前記改変された免疫細胞がヒトである、請求項１に記載の集団。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の改変された免疫細胞の集団、および許容される担体または賦形剤を含む、細胞組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の改変された免疫細胞の集団、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の改変された免疫細胞の集団を含む、対象における腫瘍を治療するための治療用組成物であって、前記改変された免疫細胞が、注射に適した薬学的に許容される媒体中に懸濁している、治療用組成物。
【請求項１８】
養子細胞療法を必要とする対象を治療する方法であって、治療上十分な量の請求項１７に記載の治療用組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記対象が、がん、固形腫瘍、自己免疫障害；血液悪性腫瘍；または、ＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、もしくはＢＫポリオーマウイルスと関連した感染症を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、乳がん、卵巣がん、脳腫瘍、前立腺がん、肺がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、膵臓がん、または肉腫を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が、骨髄破壊的もしくは骨髄非破壊的な化学療法または放射線療法を受けている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が骨髄ドナーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞療法が自家または同種異系である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／６７０，９６２号に対する優先権の利益を主張するものであり、それは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦支援による研究または開発に関する声明
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与されたＣＡ１１１４１２、ＨＬ１２２２１６、ＣＡ０６５４９３、およびＣＡ１９７２９２の下で政府援助により行われた。政府は、本発明におけるある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ発現がないことによって、ならびにＣＤ１６およびＣＤ５６表面抗原の発現によって特徴付けされる末梢血リンパ球のサブセットである。Ｔ細胞およびＢ細胞とは違って、ＮＫ細胞は、再構成された抗原特異的受容体を発現しない。その代わりに、ＮＫエフェクター機能（例えば、細胞傷害性、サイトカイン放出）は、それらの細胞標的上のリガンドを認識し得る、生殖系列コード受容体を通じて受け取られるシグナルの統合によって決定される。ＮＫ細胞は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）−クラスＩ分子を欠く標的細胞を感知しかつ殺傷し、ＮＫ細胞活性化受容体を介して活性化され、そのリガンドは、ストレスを受けた、形質転換された、または感染した細胞上に発現するが正常な細胞上には発現しない。このように、「正常な」細胞は、ＮＫ細胞殺傷に抵抗性がある。
【０００３】
ＮＫ細胞は、いくつかのメカニズムを通じて腫瘍細胞を直接殺傷し、下流の適応免疫応答の調節的制御を発揮し得るサイトカインを産生するため、ＮＫ細胞は、抗がん療法を含めた治療的適用にとって理想的なエフェクター細胞である。臨床的効力の報告にもかかわらず、注入されたＮＫ細胞がインビボで増大および持続することができないなど、いくつかの要因ががんの治療のためのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞免疫療法の適用を限定している。ＮＫ細胞は、およそ１０日間の概算半減期を有する自然リンパ球である。ＮＫ細胞の短い寿命は免疫療法の分野において課題を提示しており、ＮＫ細胞持続性の欠如はより高い再発率と関連している。本発明者らおよび他者による調査は、ヒトサイトメガロウイルス感染に応答して生じる「適応性」ＮＫ細胞の特定のサブセットが、何カ月間もおよびおそらく何年間も安定な頻度で持続するように見えることを示している。免疫療法のためのＮＫ細胞持続性をさらに向上させるために、従来のストラテジーは、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５Ｒ構築物のトランスジェニック発現を含んでいる。このアプローチは、ＮＫ細胞持続性を促進する潜在性を有するものの、調査は、抗腫瘍効力の向上を示唆するための、そのようなトランスジェニック細胞における代謝的または機能的変化を実証できていない。したがって、特に臨床的免疫療法適用のための、ＮＫ細胞機能および持続性を向上させる方法の必要性が当技術分野において依然として残る。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株、およびＮＫ前駆体におけるＡＲＩＤ５Ｂ発現を操縦して、インビボにおけるそれらの持続性および機能を増強する方法を提供することによって、前述の難点を克服する。抗がんおよび他の免疫療法のための、改変されたＮＫ細胞およびそのような改変された細胞を含む組成物も本明細書において提供される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞を遺伝子改変してＡＲＩＤ５Ｂ発現を増加させ、ゆえに抗腫瘍効力を増加させ、向上させる。
第１の態様において、野生型免疫細胞と比べて、ＡＴリッチ相互作用ドメイン５Ｂ（ＡＲＩＤ５Ｂ）の発現が増加した改変された免疫細胞の単離集団であって、改変された免疫細胞は、持続性の増加、解糖のレベルの増加、およびミトコンドリア酸化的代謝の増加のうちの１つまたは複数を呈する、改変された免疫細胞の単離集団が本明細書において提供される。改変された免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはＮＫＴ（ナチュラルキラーＴ）細胞を含み得る。ＮＫ細胞は、初代ＮＫ細胞またはＮＫ−９２細胞であり得る。ＮＫ細胞は、ＣＤ３-、ＴＣＲ-、ＣＤ５６+、およびＮＫｐ４６+であり得る。改変された免疫細胞は、幹細胞、造血幹もしくは前駆細胞、または前駆細胞からインビトロで分化し得る。前駆細胞は、ＣＤ３４＋造血性内皮細胞、複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ前駆細胞、またはＮＫＴ前駆細胞であり得る。改変された免疫細胞は、少なくとも１つの遺伝子改変モダリティーを含み得る。遺伝子改変モダリティーは、ＡＲＩＤ５Ｂポリペプチドをコードし、異種プロモーターに作動的に連結された組換え核酸を含み得る。遺伝子改変モダリティーは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含み得る。改変された免疫細胞は、末梢血、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍から単離されるまたはそこに含まれる免疫細胞からインビトロまたはエクスビボで産生され得る。改変された免疫細胞は、ＡＲＩＤ５Ｂ遺伝子発現を増加させる１つまたは複数の作用物質とエクスビボで接触していない免疫細胞と比較して、細胞におけるＡＲＩＤ５Ｂ遺伝子発現を増加させる１つまたは複数の作用物質に免疫細胞を接触させることによって、インビトロまたはエクスビボで産生され得る。免疫細胞は、末梢血、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍から単離され得るまたはそこに含まれ得る。
【０００５】
別の態様において、本明細書において記載される改変された免疫細胞の集団、および許容される担体または賦形剤を含む細胞組成物が本明細書において提供される。
本明細書において記載される改変された免疫細胞の集団、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物も本明細書において提供される。
さらなる態様において、本明細書において記載される改変された免疫細胞の集団を含む、患者における腫瘍を治療するための治療用組成物であって、改変された免疫細胞は、注射に適した媒体中に懸濁している治療用組成物が本明細書において提供される。
【０００６】
別の態様において、養子細胞療法を必要とする対象を治療する方法であって、本明細書において提供される治療用組成物の治療上十分な量を対象に投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。対象は、がん、固形腫瘍、自己免疫障害；血液悪性腫瘍；または、ＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、もしくはＢＫポリオーマウイルスと関連した感染症を有し得る。対象は、乳がん、卵巣がん、脳腫瘍、前立腺がん、肺がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、膵臓がん、または肉腫を有し得る。一部の場合には、対象は、骨髄破壊的または骨髄非破壊的（non-myeolablative）な化学療法または放射線療法を受けている。対象は骨髄ドナーであり得る。細胞療法は同種異系であり得る。
【０００７】
本発明の前述のおよび他の態様ならびに利点は、以下の説明から見えてくるであろう。説明では、その一部を形成し、本発明の好ましい実施形態が例示として示されている添付の図面への参照がなされる。しかしながら、そのような実施形態は、必ずしも本発明の全範囲を表すわけではなく、それゆえ、本発明の範囲を捉えるために特許請求の範囲および本明細書への参照がなされる。
本発明は、以下のその詳細な説明を考慮した場合に、よりよく理解され、上で示されるもの以外の特長、態様、および利点が明白になるであろう。そのような詳細な説明は、以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１Ａ‐１Ｉは、適応性ＮＫ細胞が、標準的ＮＫ細胞と比べて、より高い解糖およびミトコンドリア酸化的代謝を呈することを実証している。（ａ）５人のＨＣＭＶ血清陽性および５人のＨＣＭＶ血清陰性ドナーからの新しく単離されたＮＫ細胞における代謝機能を、Ｓｅａｈｏｒｓｅによって解析した。代表的なドナーに関するＯＣＲプロファイル、ならびに最大呼吸、ＡＴＰ関連呼吸、およびＳＲＣの平均が示されている。（ｂ）４人の血清陰性および４人の血清陽性ドナー由来のＮＫ細胞におけるＡＴＰの定量。（ｃ）代表的なドナーに関するＥＣＡＲプロファイル、ならびに最大解糖および解糖予備能（ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  ｒｅｓｅｒｖｅ）の平均。（ｄ）ＮＫ細胞を５人の血清陰性および５人の血清陽性ドナーから単離し、溶解およびＡＴＰ定量の前に、表示される阻害剤とともに１０分間インキュベートした。ビヒクル対照と比べた、各阻害剤に対するＡＴＰの倍減少が示されている。（ａ〜ｄ）結果は、２つの独立した実験からのものである。（ｅ）Ｓｅａｈｏｒｓｅ代謝読み取りと適応性ＮＫ細胞のパーセンテージとの間の関連性。対応のないスチューデントｔ検定を使用して、統計的有意性を判定した。（ｆ）３人の血清陽性ドナー由来の適応性および標準的ＮＫ細胞を選別し、Ｓｅａｈｏｒｓｅによって解析した。代表的なドナーからのＯＣＲプロファイル、ならびに最大呼吸、ＡＴＰ関連呼吸、およびＳＲＣの平均が示されている。（ｇ）代表的なドナー由来の標準的および適応性ＮＫ細胞のＥＣＡＲプロファイル、ならびに最大解糖および解糖予備能の平均が示されている。すべてのＯＣＲおよびＥＣＡＲ結果は、２つの独立した実験からのものである。（ｈ）５人の血清陽性ドナーからの選別された標準的ＮＫ細胞および適応性ＮＫ細胞におけるＡＴＰの定量。（ｉ）休止時、抗ＣＤ１６抗体での刺激後、およびＰＭＡ：イオノマイシンでの刺激後の、６人の血清陽性ドナー由来の単離されたＮＫ細胞における、２−ＮＢＤＧを使用したグルコース取り込みの測定。各条件におけるゲートをかけた標準的および適応性ＮＫ細胞における２−ＮＢＤＧ平均蛍光強度（ＭＦＩ）の平均が示されている。結果は、２つの独立した実験からのものである。対応のあるスチューデントｔ検定を使用して、統計的有意性を判定した。エラーバーはＳＥＭを表す。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．、有意でない。
【図２】図２Ａ‐２Ｇは、適応性ＮＫ細胞が、標準的ＮＫ細胞と比べて、より高いミトコンドリア膜電位およびＥＴＣ遺伝子の発現を有することを実証している。（Ａ）ＨＣＭＶ血清陰性およびＨＣＭＶ血清陽性ドナー由来のゲートをかけたＮＫ細胞上でのＣＤ５７およびＮＫＧ２Ｃ発現についての代表的なＦＡＣＳプロット。（Ｂ）５人のＨＣＭＶ血清陰性ドナーおよび５人のＨＣＭＶ血清陽性ドナーからの、表示されるＮＫ細胞サブセット内のＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色についての代表的なヒストグラムプロット（左のパネル）、およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ平均蛍光強度（ＭＦＩ）の累積データ（右のパネル）が示されている。（Ｃ）標準的および適応性ＮＫ細胞を、２つの独立した実験において２人のＨＣＭＶ血清陽性ドナーから単離されたＰＢＭＣから選別し、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒおよびＤＡＰＩ色素で染色し、共焦点顕微鏡法によって解析した。１人のドナーからの代表的な画像（左のパネル）、ならびに１８個の標準的ＮＫ細胞および２０個の適応性ＮＫ細胞からの累積ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ強度値（右のパネル）が示されている。（Ｄ）標準的および適応性ＮＫ細胞に関して、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ミトコンドリアＤＮＡのゲノムＤＮＡに対する比を判定した。適応性ＮＫ細胞に関するこの比は、倍差を判定するために従来的ＮＫ細胞に対して正規化されている。結果は、２つの独立した実験における４人のドナーからのものである。（Ｅ）ＨＣＭＶ血清陽性ドナー由来のＮＫ細胞の表示されるサブセットにおけるＣｅｌｌＲｏｘ染色についての代表的なＦＡＣＳヒストグラムプロット（左のパネル）、および２つの独立した実験における６人のドナーからのＣｅｌｌＲｏｘ  ＭＦＩ値についての累積データ（右のパネル）。（Ｆ）標準的および適応性ＮＫ細胞の表示されるサブセットを、３つの独立した実験において５人のＨＣＭＶ血清陽性ドナーから単離されたＰＢＭＣから選別し、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析に使用した。標準的および適応性ＮＫ細胞におけるミトコンドリアＡＴＰシンターゼ複合体および電子伝達鎖（ＥＴＣ）遺伝子に関する正規化された倍発現値についてのヒートマップが示されている。（Ｇ）標準的および適応性ＮＫ細胞の表示されるサブセットを、２つの独立した実験において４人のＨＣＭＶ血清陽性ドナーから単離されたＰＢＭＣから選別し、ｑＲＴ−ＰＣＲに使用した。すべての発現値を、ＡＣＴＢに対しておよびＣＤ３-ＣＤ５６dimＣＤ５７-ＮＫＧ２Ｃ-標準的ＮＫ細胞からの遺伝子発現値に対して正規化した。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍを表す。対応のあるスチューデントｔ検定を使用して、統計的有意性を判定した、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．、有意でない。
【図３】図３Ａ‐３Ｅは、ＡＲＩＤ５Ｂ発現が、適応性ＮＫ細胞において上昇することを実証している。（Ａ）ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットからの、ＡＲＩＤファミリーに属する遺伝子の平均正規化発現についてのヒートマップが示されている。（Ｂ）３人のＨＣＭＶ血清陽性ドナーから選別された、表示される標準的および適応性ＮＫ細胞サブセットにおけるＡＲＩＤ５Ｂ  ｍＲＮＡ発現についての累積ｑＲＴ−ＰＣＲデータ。すべての発現値をＡＣＴＢに対して正規化し、倍発現値を、ＣＤ３-ＣＤ５６dimＣＤ５７-ＮＫＧ２Ｃ-標準的ＮＫ細胞と比べて、各サブセットに対して判定した。結果は、２つの独立した実験からのものである。（Ｃ）ＲＮＡ−ｓｅｑリードのゲノムアラインメントを示した、代表的なドナーからのＲＮＡ−ｓｅｑデータについてのＳａｓｈｉｍｉプロット、およびＡＲＩＤ５Ｂ遺伝子座内のスプライス接合部。（Ｄ）標準的および適応性ＮＫ細胞を、２つの独立した実験において２人の血清陽性ドナーから選別した。ウェスタンブロットを、ＡＲＩＤ５Ｂおよびβ−アクチンに対する抗体を用いて実施した。１人のドナーからの代表的なブロット（左のパネル）、および両ドナーに対する密度測定による定量（右のパネル）が示されている。（Ｅ）４人のＨＣＭＶ血清陽性ドナーから選別された、表示される標準的および適応性ＮＫ細胞集団の全ゲノムメチル化プロファイリングから作出された、ＡＲＩＤ５Ｂ遺伝子座にわたるメチル化パターン。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍを表す。対応のあるスチューデントｔ検定を使用して、統計的有意性を判定した、*ｐ＜０．０５。
【図４】図４Ａ‐４Ｈは、ＡＲＩＤ５Ｂのノックダウンが、ミトコンドリア膜電位、酸化的ミトコンドリア代謝、およびＩＦＮ−γ産生の減少につながることを実証している。ＮＫ−９２細胞に、空対照ｐＬＫＯベクター、またはＡＲＩＤ５Ｂ特異的ｓｈＲＮＡを含有するｐＬＫＯベクターを形質導入した。（Ａ）対照およびｓｈＡＲＩＤ５Ｂ  ＮＫ−９２株におけるＡＲＩＤ５Ｂおよびβ−アクチンのウェスタンブロット（左のパネル）、ならびに密度測定による定量（右のパネル）。（Ｂ）各表示されるＮＫ−９２細胞株からの、代表的なＦＡＣＳプロット（左のパネル）およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  ＭＦＩ値の累積倍差（右のパネル）。実験を２回再現した。（Ｃ）表示されるＮＫ−９２細胞株をＤＡＰＩおよびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ色素で染色し、共焦点顕微鏡法によって可視化した。代表的な画像（左のパネル）、および１１個の個々の細胞から算出された累積ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ強度値（右のパネル）が示されている。結果は、２つの独立した再現からのものであり、両実験において同様の結果が観察された。（Ｄ）ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、各表示されるＮＫ−９２細胞株に関するミトコンドリアＤＮＡのゲノムＤＮＡに対する比を判定した。結果は、３つの独立した再現からのものである。（Ｅ）代表的な実験における対照およびｓｈＡＲＩＤ５Ｂ  ＮＫ−９２細胞株についてのＯＣＲプロファイル、ならびに最大呼吸、ＡＴＰ関連呼吸、および予備呼吸能の平均が示されている。（Ｆ）代表的な実験における表示されるＮＫ−９２細胞株に関するＥＣＡＲプロファイル、ならびに最大解糖および解糖予備能の平均が示されている。すべての累積ＯＣＲおよびＥＣＡＲ結果は、２回再現された。（Ｇ）対照およびｓｈＡＲＩＤ５Ｂ細胞株における生物発光によるＡＴＰレベルの定量。（Ｈ）ＮＫ細胞の機能的読み取りについてのＦＡＣＳ解析の前に、対照およびｓｈＡＲＩＤ５Ｂ  ＮＫ−９２細胞を、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８の有無で一晩培養した。ＮＫ−９２細胞によるＩＦＮ−γ発現の頻度についての代表的なＦＡＣＳプロットおよび累積データが示されている。ＧおよびＨに関しては、実験を２回再現した。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍを表す。対応のあるスチューデントｔ検定を使用して、統計的有意性を判定した、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．、有意でない。
【図５】図５Ａ‐５Ｄは、ＡＲＩＤ５Ｂのノックダウンが、生存および生存促進タンパク質ＢＣＬ−２の発現の低下につながることを実証している。（Ａ）ヨウ化プロピジウム染色（ＰＩ）による、対照およびｓｈＡＲＩＤ５Ｂ  ＮＫ−９２細胞の細胞周期解析。両ＮＫ−９２株に関する代表的なＦＡＣＳプロット（左のパネル）、および各細胞周期段階における細胞のパーセンテージの累積データ（右のパネル）が示されている。実験を２回再現した。（Ｂ）対照およびｓｈＡＲＩＤ５Ｂ  ＮＫ−９２細胞を等しい数で播き、培養下での２および３日後に生細胞数を数えた。両株に関する累積倍増大データが示されている。結果は、２つの独立した実験における４回の再現からのものである。（Ｃ）対照およびｓｈＡＲＩＤ５Ｂ  ＮＫ−９２細胞をアネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーによって解析した。リンパ球に対してゲートをかけた代表的なＦＡＣＳプロット（左のパネル）、および累積倍差（右のパネル）が示されている。（Ｄ）対照およびｓｈＡＲＩＤ５Ｂ  ＮＫ−９２細胞におけるＢＣＬ−２発現のウェスタンブロット解析。代表的なブロット（左のパネル）、および密度測定によって算出されたｓｈＡＲＩＤ５Ｂ  ＮＫ−９２細胞における倍減少（右のパネル）が示されている。ＣおよびＤに関しては、実験を２回再現した。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍを表す。対応のあるスチューデントｔ検定を使用して、統計的有意性を判定した、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．、有意でない。
【図６】図６Ａ‐６Ｇは、ＡＲＩＤ５Ｂの過剰発現が、ミトコンドリア膜電位、酸化的ミトコンドリア代謝、およびＩＦＮ−γ産生の増加をもたらすことを実証している。ＮＫ−９２細胞に、ＧＦＰを含有する対照ｐＣＤＨベクター、またはＧＦＰおよびＡＲＩＤ５Ｂバリアント２を含有するｐＣＤＨベクターを形質導入した。（Ａ）各選別されたＧＦＰ+  ＮＫ−９２細胞株におけるＡＲＩＤ５Ｂバリアント２およびβ−アクチンのウェスタンブロット（左のパネル）、ならびに密度測定による画像定量（右のパネル）。（Ｂ）ミトコンドリア膜電位を、対照およびＡＲＩＤ５Ｂバリアント２過剰発現ＮＫ−９２株からの選別されたＧＦＰ+細胞におけるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色およびＦＡＣＳ解析によって判定した。ベクター間のＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色の相対的倍差の累積データが示されている（右のパネル）。実験を２回再現した。（Ｃ）初代ＮＫ細胞に、対照またはＡＲＩＤ５Ｂバリアント２過剰発現ベクターを形質導入した。細胞を、形質導入の７２時間後に、ＧＦＰ発現およびミトコンドリア質量について解析した。ゲートをかけたＮＫ細胞における前方散乱（ＦＳＣ）に対するＧＦＰの代表的なＦＡＣＳプロット、およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒヒストグラムプロットが示されている（左のパネル）。ベクター間のＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色の相対的倍差についての４人のドナーからの累積データも示されている（右のパネル）。結果は、２つの独立した実験からのものである。両実験において同様の結果が観察された。（Ｄ）代表的な実験における対照およびＡＲＩＤ５Ｂバリアント２過剰発現ＮＫ−９２細胞株についてのＯＣＲプロファイル、ならびに最大呼吸、ＡＴＰ関連呼吸、および予備呼吸能（ＳＲＣ）の平均が示されている。（Ｅ）代表的な実験における表示されるＮＫ−９２細胞株に関するＥＣＡＲプロファイル、ならびに最大解糖および解糖予備能の平均が示されている。ＯＣＲおよびＥＣＡＲ実験を２回再現した。（Ｆ）３つの独立した再現における対照およびＡＲＩＤ５Ｂ過剰発現細胞株におけるＡＴＰの定量。（Ｇ）ＦＡＣＳ解析の前に、対照およびＡＲＩＤ５Ｂ過剰発現ＮＫ−９２細胞を、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８の有無で一晩培養した。ＮＫ−９２細胞によるＩＦＮ−γ発現の頻度についての代表的なＦＡＣＳプロットおよび累積データが示されている。実験を２回再現した。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍを表す。対応のあるスチューデントｔ検定を使用して、統計的有意性を判定した、*ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．、有意でない。
【図７】図７Ａ‐７Ｇは、ＡＲＩＤ５Ｂが、ＵＱＣＲＢ発現を直接調節することを実証している。（Ａ）標準的および適応性ＮＫ細胞を２人のＨＣＭＶ血清陽性ドナーから選別し、ＵＱＣＲＢタンパク質のウェスタンブロット解析に使用した（左のパネル）。密度測定による定量および倍差の判定も示されている（右のパネル）。（Ｂ）ｑＲＴ−ＰＣＲによる対照対ｓｈＡＲＩＤ５Ｂ  ＮＫ９２細胞における相対的ＵＱＣＲＢ  ｍＲＮＡ発現の判定。結果は、３つの独立した実験からのものである。（Ｃ）対照およびＡＲＩＤ５ＢノックダウンＮＫ−９２株におけるＵＱＣＲＢタンパク質発現のウェスタンブロット（左のパネル）、ならびに密度測定によって算出された相対的ＵＱＣＲＢ発現（右のパネル）。（Ｄ）ＵＱＣＲＢの上流近位プロモーター領域の配列（配列番号２５）が示されている。ＡＲＩＤ５Ｂに対する推定コア結合部位が太字で強調されている。ＵＱＣＲＢに対する転写開始部位（ＴＳＳ）も表示されている。（Ｅ）対照およびｓｈＡＲＩＤ５Ｂ  ＮＫ−９２細胞をＣｈＩＰアッセイに使用して、ＵＱＣＲＢのはるかに上流にある対照領域（−１７２８ｂｐ）へのおよび近位ＵＱＣＲＢプロモーター（−３５１ｂｐ）への、ポリメラーゼＩＩおよびＡＲＩＤ５Ｂ結合を査定した。ＣｈＩＰアッセイを、３つの独立した実験において５回繰り返した。結果は、インプットについてのパーセンテージとして示されている。（Ｆ）標準的および適応性ＮＫ細胞を、３人のＨＣＭＶ血清陽性ドナーの末梢血から選別した。選別された細胞をＣｈＩＰアッセイにおいて使用して、ＵＱＣＲＢのはるかに上流にある対照領域（−１７２８ｂｐ）へのおよび近位ＵＱＣＲＢプロモーター（−３５１ｂｐ）へのＡＲＩＤ５Ｂ結合を査定した。結果は、２つの独立した実験からのものである。（Ｇ）標準的および適応性ＮＫ細胞を、３人のＨＣＭＶ血清陽性ドナーから選別した。ＣｈＩＰアッセイを実施して、ＵＱＣＲＢのはるかに上流にある対照領域におけるおよび近位ＵＱＣＲＢプロモーター内のＨ３Ｋ９Ｍｅ２レベルを査定した。非特異的結合に対する対照として、対照アイソタイプＩｇＧ抗体がすべてのアッセイに含まれた。結果は、２つの独立した実験からのものである。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍを表す。対応のあるスチューデントｔ検定を使用して、統計的有意性を判定した、*ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．、有意でない。
【図８】図８Ａ‐８Ｆは、ＵＱＣＲＢのノックダウンが、ミトコンドリア膜電位、酸化的ミトコンドリア代謝、およびＩＦＮ−γ産生の減少につながることを実証している。ＮＫ−９２細胞に、ＵＱＣＲＢ特異的ｓｈＲＮＡを含有する空対照ｐＬＫＯ．１ベクターを形質導入した。（Ａ）対照ベクターおよびｓｈＵＱＣＲＢ  ＮＫ−９２株におけるＵＱＣＲＢおよびβ−アクチンタンパク質発現のウェスタンブロット（左のパネル）、ならびに密度測定による定量（右のパネル）。（Ｂ）各表示されるＮＫ−９２細胞株からの、代表的なＦＡＣＳプロット（左のパネル）、およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  ＭＦＩ値の累積倍差（右のパネル）。実験を２回再現した。（Ｃ）代表的な実験における対照およびｓｈＡＲＩＤ５Ｂ  ＮＫ−９２細胞株についてのＯＣＲプロファイル、ならびに最大呼吸、ＡＴＰ関連呼吸、および予備呼吸能（ＳＲＣ）の平均が示されている。（Ｄ）代表的な実験における表示されるＮＫ−９２細胞株に関するＥＣＡＲプロファイル、ならびに最大解糖および解糖予備能の平均が示されている。すべての累積ＯＣＲおよびＥＣＡＲ結果は、２回再現された。（Ｅ）対照ｐＬＫＯおよびｓｈＵＱＣＲＢ細胞株におけるＡＴＰレベルの定量。（Ｆ）ＮＫ細胞の機能的読み取りについてのＦＡＣＳ解析の前に、対照およびｓｈＵＱＣＲＢ  ＮＫ−９２細胞を、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８の有無で一晩培養した。ＮＫ−９２細胞によるＩＦＮ−γ発現の頻度についての代表的なＦＡＣＳプロットおよび累積データが示されている。（ＥおよびＦ）実験を２回再現した。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍを表す。対応のあるスチューデントｔ検定を使用して、統計的有意性を判定した、*ｐ＜０．０５。ｎ．ｓ．、有意でない。
【図９】新しいおよび以前に冷凍されたＮＫ細胞間のＯＣＲおよびＥＣＡＲプロファイルの比較を示している。ＰＢＭＣを、２人の健常ドナー由来の全血から単離した。ＣＤ３-ＣＤ５６+  ＮＫ細胞をごく一部のＰＢＭＣから単離し、Ｓｅａｈｏｒｓｅ解析に直ちに使用した。残りのＰＢＭＣを、速度制御された冷凍庫を使用して液体窒素中で冷凍した。３日後、細胞を融解し、一晩そのままの状態にした。次いで、ＮＫ細胞を単離し、Ｓｅａｈｏｒｓｅ解析の前に一晩そのままの状態にした。両ドナー由来の新しい対冷凍されたＮＫ細胞についてのＯＣＲおよびＥＣＡＲプロットが示されている。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図１０】ミトコンドリア生合成と関連した複数の遺伝子の発現の差がないことを実証している。標準的および適応性ＮＫ細胞の表示されるサブセットを、２つの独立した実験において５人のＨＣＭＶ血清陽性ドナーから単離されたＰＢＭＣから選別し、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析に使用した。ミトコンドリア生合成の促進における公知の関連性を有する遺伝子に関する、正規化されたｌｏｇＣＰＭ発現値のヒートマップが示されている。
【図１１】ＡＲＩＤ５Ｂノックダウンの検証、および３つのｓｈＡＲＩＤ５Ｂクローンを有するＮＫ−９２細胞におけるミトコンドリア電位の減少を実証している。ＡＲＩＤ５Ｂを標的にする３つの異なるｓｈＲＮＡとともに、２つの対照ベクター（ｐＬＫＯ空およびｓｈＧＦＰ）を、レンチウイルス形質導入によりＮＫ−９２細胞に形質導入した。各ベクターを発現する安定なＮＫ−９２細胞株を、ピューロマイシン選択によって作出した。（Ａ）β−アクチンとともに、各株におけるＡＲＩＤ５Ｂバリアント２のウェスタンブロット。（Ｂ）ｐＬＫＯ空対照と比較した、各ｓｈＡＲＩＤ５Ｂ  ＮＫ−９２細胞株におけるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色強度についてのＦＡＣＳ解析からのヒストグラムプロット。
【図１２】図１２Ａ‐１２Ｂは、ＡＲＩＤ５ＢおよびＵＱＣＲＢが、炎症性サイトカインによって、または活性化受容体を通じたシグナル伝達によって誘導されないことを実証している。（ａ）ＣＤ３-ＣＤ５６+  ＮＫ細胞を、３人のドナーの末梢血から単離した。ごく一部の細胞を直ちに溶解し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）のためにＲＮＡを収穫した。細胞の残りを、１ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５±５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２１、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１２、または抗ＣＤ１６抗体とともに培養した。最後の１６時間の間のみに添加されるＩＬ−１２を除いて、すべての試薬を培養の開始時に添加した。７２時間後に細胞を収穫し、ｑＲＴ−ＰＣＲのためにＲＮＡを収穫した。前培養と比べた、各培養条件におけるＡＲＩＤ５ＢおよびＵＱＣＲＢ転写産物倍発現の累積データが示されている。すべての値は、ＡＣＴＢに対して正規化されている。結果は、１回の実験からのものである。（ｂ）ＣＤ３-ＣＤ５６+  ＮＫ細胞を、５人のＨＣＭＶ血清陽性ドナーの末梢血から単離した。ごく一部の細胞を直ちに溶解し、ｑＲＴ−ＰＣＲのためにＲＮＡを収穫した。細胞の残りを、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５、およびＩｇＧアイソタイプ抗体または抗ＮＫＧ２Ｃアゴニスト抗体のいずれかとともに培養した。７２時間後に細胞を収穫し、ｑＲＴ−ＰＣＲのためにＲＮＡを収穫した。前培養と比べた、各培養条件におけるＡＲＩＤ５ＢおよびＵＱＣＲＢ転写産物倍発現の累積データが示されている。すべての値は、ＡＣＴＢに対して正規化されている。結果は、２つの独立した実験からのものである。各培養条件を前培養対照と比較することによって、統計的有意性を判定した。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍを表す。対応のあるｔ検定を使用して、統計的有意性を判定した、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１。
【図１３】標準的および適応性ＮＫ細胞間の差を示す代謝経路のＧＳＥＡを提示した表である。ＣＤ３−ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ５７＋ＮＫＧ２Ｃ−標準的ＮＫ細胞およびＣＤ３−ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ５７＋ＮＫＧ２Ｃ＋適応性ＮＫ細胞からのＲＮＡ−ｓｅｑデータを使用した経路解析を実施した。標準的および適応性ＮＫ細胞間で有意に（または、ほぼ有意に）異なった代謝経路に対する遺伝子セットが示されている。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（詳細な説明）
本明細書において提供される組成物および方法は、少なくとも一部には、インビボでの生存および機能を向上させる手段として、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＮＫ前駆体におけるミトコンドリア代謝を促進する手法についての本発明者らの開発に基づく。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒ導入遺伝子を導入することによってＮＫ細胞機能を増強させようとする先行する失敗した試みとは違って、本発明者らは、ＡＲＩＤ５Ｂ（ＡＴリッチ相互作用ドメイン含有タンパク質５Ｂ）のレベルの増加が、ＮＫ細胞の生存、ミトコンドリア代謝、およびインビボ機能を向上させると判定した。したがって、ＡＲＩＤ５Ｂ発現の増加のために改変されたＮＫ細胞、ＮＫ細胞持続性および機能を増加させる方法、ならびに本明細書において記載されるように改変されたＮＫ細胞をそれを必要とする対象に投与する向上した免疫療法が本明細書において提供される。
したがって、ＡＲＩＤ５Ｂ（ＡＴリッチ相互作用ドメイン含有タンパク質５Ｂ）の発現の増加のために改変されたヒト免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、他の骨髄性またはリンパ性サプレッサー細胞）および免疫前駆細胞（例えば、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞前駆体）が本明細書において提供される。改変された細胞に関して本明細書において使用される「改変された」という用語は、標的タンパク質または核酸の発現がモジュレートされている（例えば、増加している、減少している）操作された細胞を指す。一部の場合には、ヒトＡＲＩＤ５Ｂ遺伝子の発現の増加のために、免疫細胞を改変する。一部の場合には、免疫細胞を遺伝子改変する。他の場合には、遺伝子改変以外の手段によってＡＲＩＤ５Ｂの発現を上方調節する作用物質（例えば、タンパク質、サイトカイン、小分子）への曝露または接触によって、免疫細胞を改変する。
【００１０】
一部の実施形態において、改変された免疫細胞は、遺伝子操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラー細胞前駆体であり、遺伝子改変により、野生型ＮＫ細胞またはＮＫ細胞前駆体のものと比べて、改変されたＮＫ細胞またはＮＫ細胞前駆体におけるＡＴリッチ相互作用ドメイン５Ｂ（ＡＲＩＤ５Ｂ）遺伝子発現またはタンパク質発現が増加する。後に続く実施例において実証されるように、ＡＲＩＤ５Ｂの発現の増加は、野生型ＮＫ細胞または上で記載される遺伝子改変を含まないＮＫ細胞と比べた、ＮＫ細胞持続性の増加、解糖の増加、およびミトコンドリア酸化的代謝の増加と関連している。好ましくは、遺伝子操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＮＫ前駆細胞は、野生型ＮＫ細胞または同じ方式で改変されていないＮＫ細胞と比べて、持続性の増加を呈する。本明細書において使用するとき、「持続性」という用語は、好ましくは７日間を上回る期間、インビボまたはエクスビボで増大し得る安定な生細胞集団を確立する細胞の能力を指す。同種異系細胞療法の障壁の１つは、注入細胞が患者によって拒絶されることである。７〜１４日間またはそれよりも長い期間の注入細胞の保持は、患者転帰の向上と相関する。ＮＫ細胞持続性を向上させる従来の方法は、細胞傷害性リンパ球枯渇（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）療法を伴う。いかなる特定の理論または作用様式に拘束されることなく、ＮＫ細胞におけるＡＲＩＤ５Ｂ発現は、この障壁を克服することに寄与し得ると思われる。
【００１１】
本明細書において使用するとき、「遺伝子発現」とは、免疫細胞または免疫細胞を含む細胞の集団など、生物学的サンプルにおける遺伝子の発現の相対レベルおよび／または発現のパターンを指す。特定の実施形態において、免疫細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、または造血幹もしくは前駆細胞である。ＡＲＩＤ５Ｂなどの遺伝子の発現は、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはその組み合わせのレベルで測定され得る。一部の場合には、ＡＲＩＤ５Ｂの発現の増加は、ＡＲＩＤ５Ｂタンパク質のレベルで測定される。一部の場合には、ＡＲＩＤ５Ｂ遺伝子発現またはＡＲＩＤ５Ｂタンパク質発現のレベルは、野生型免疫細胞または本明細書において記載されるように改変されていない免疫細胞においてよりも複数倍（例えば、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００）高い。
【００１２】
本明細書において使用するとき、「ＮＫ細胞」とは、抗体の参加なしでおよびインビトロまたはインビボ感作なしで、組織培養細胞を溶解する能力を有する細胞傷害性エフェクター細胞を意味する。ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞と他のリンパ系細胞および赤血球系列または骨髄系列の細胞とを区別する細胞表面受容体またはタンパク質の存在によっても特徴付けされ得る、例えばBradshaw et al., Handbook of Cell Signaling (2003)を参照されたい。例示的なＮＫ細胞は、初代ＮＫ細胞、またはＮＫ細胞株の細胞（例えば、ＮＫ−９２細胞）である。一部の場合には、ＮＫ細胞は適応性ＮＫ細胞である。ヒトナチュラルキラー前駆細胞およびヒトＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋（ＣＤ５６陽性）であり、ＣＤ１６およびＮＫｐ４６の一方または両方についての発現に対して陽性であり得、ＴＣＲ複合体を欠き、ゆえにＣＤ３陰性である。一部の場合には、ＮＫ細胞は、以下の発現プロファイル：ＣＤ３−、ＴＣＲ−、ＣＤ５６＋、ＮＫｐ４６＋を有する。ＮＫ細胞は、以下のもの：ＮＫ１．１＋、ＣＤ３−、ＴＣＲαβ−、ＴＣＲδγ−、ＣＤ４−、ＣＤ８−、ＣＤ１９−、ＣＤ２５＋、ＣＤ４３＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ４９ｂ−、ＣＤ５１＋、ＣＤ９４＋、ＮＫＧ２Ｄ＋、Ｍａｃ−１−／低、Ｂ２２０−、ｃ−ｋｉｔ＋、パーフォリンＩ＋、グランザイムＢ＋、およびＮｏｔｃｈ−１＋のうちの１つまたは複数によって付加的に特徴付けされ得る。本明細書において使用するとき、「ＮＫ細胞前駆体」および「ＮＫ前駆細胞」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ＮＫ細胞への分化の能力がある細胞を指し、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−７、およびＳＣＦが共培養細胞において発現した場合にまたは成長培地に添加された場合にＮＫ細胞に分化する造血幹細胞（ＨＳＣ）を包含する。任意に、ＩＬ−２が供給され得る。本明細書において提供される組成物および方法に有用な細胞は、新しく単離された初代細胞であり得る、または初代細胞培養の冷凍されたアリコートから獲得され得る。ＮＫ前駆細胞は、血液、骨髄、臍帯血、細胞株から、または多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞（例えば、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞）の分化から獲得され得る。
【００１３】
一部の実施形態において、遺伝子改変以外の手段によってＡＲＩＤ５Ｂの発現を上方調節する作用物質（例えば、タンパク質、サイトカイン、小分子）への曝露または接触によって、免疫細胞を改変する。
【００１４】
一部の実施形態において、改変された免疫細胞は、遺伝子操作されたＴ細胞であり、遺伝子改変により、野生型Ｔ細胞と比べて、改変されたＴ細胞におけるＡＲＩＤ５Ｂ遺伝子産物またはポリペプチドの発現が増加する。本明細書において提供される方法に従った使用に適当なＴ細胞には、ヒト血液から獲得された単核細胞が含まれ、限定されることなく、末梢血単核リンパ球（ＰＢＬ）、骨髄由来単核細胞、および臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ）としても知られる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が含まれる。一部の場合には、Ｔ細胞は、リンパ節組織、骨髄、および／または脾細胞を含む生物学的サンプルから獲得される。対象の生物学的サンプルからＴ細胞を単離する任意の適当な方法が採用され得る。例えば、Ｔ細胞は、血液または白血球環境（例えば、白血球除去療法によって獲得される）から単離され得、分離され得、または別様に取り出され得、それによって、単離されたまたは分離されたＴ細胞は、それらがインビボで生じるところとは異なる物理的環境に存在する。「単離された」という用語は、任意の特定の程度の純度を暗示するわけではなく、純度の絶対レベルは重大ではない。当業者であれば、本明細書において提供される方法に従った使用のための適当なレベルの純度を容易に判定し得る。当業者であれば、ＰＢＭＣを単離するための多くの確立されたプロトコールに精通している。ヒト末梢血は、静脈穿刺を介して好都合に採取され得る。ＰＢＭＣの単離は、血液中の他の有形要素からリンパ球を分離するためのＦｉｃｏｌｌ（登録商標）−ハイパックまたはＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）などの密度勾配遠心分離技法を通常では採用する密度勾配分離プロトコールによって支援され得る。好ましくは、ＰＢＭＣ単離は、無菌条件下で実施される。代替的に、細胞エルトリエーション（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）法を採用して、単核細胞集団を分離し得る。細胞エルトリエーション法の利点には、無菌性および効率性が含まれる。
【００１５】
本明細書において使用するとき、「遺伝子改変（された）」および「遺伝子操作（された）」という用語は互換的に使用され、挿入に使用される方法にかかわらず、外因性ポリヌクレオチドを含む原核または真核細胞を指す。一部の場合には、ナチュラルキラー細胞またはＮＫ細胞前駆体は、（例えば、組換えＤＮＡ技術を使用して）人間の手によって創出されているもしくは改変されている天然に存在しない核酸分子を含むように改変されている、または（例えば、転写、翻訳などによって）そのような分子に由来する。外因性の、組換えの、合成の、および／または別様に改変されたポリヌクレオチドを含有するエフェクター細胞は、操作された細胞であると見なされる。一部の場合には、改変された細胞は、１種以上の組換え核酸を含有する。他の場合には、改変された細胞は、１種以上の合成のまたは遺伝子操作された核酸（例えば、その天然に存在する対応物に見い出される配列と比べて、少なくとも１つの人工的に創出された挿入、欠失、逆位、または置換を含有する核酸）を含有する。１種以上の外因性の、組換えの、合成の、および／または別様に改変された核酸を含む細胞は、遺伝子操作された細胞であると見なされ、ゆえに、任意の天然に存在する対応物に対して天然には存在しない。遺伝子操作された細胞を産生するための手順は、当技術分野において一般的に公知であり、参照により本明細書に組み込まれるSambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。
【００１６】
免疫細胞および免疫細胞前駆体は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボのいずれかで遺伝子操作され得、例えばレポーター構築物が導入され得る、または組換え核酸もしくは治療用遺伝子産物が導入され得るもしくは代替的に調節され得る。一部の場合には、組換え核酸または治療用遺伝子産物を導入する（例えば、形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどによって核酸の取り込みを達成する）ことによって、細胞を改変する。他の場合には、細胞の遺伝子に変異を導入することによって、細胞を改変する。挿入または欠失変異は、標準技法を使用して細胞に導入され得る。選択可能なマーカーをコードする核酸も細胞に導入され得る。一部の場合には、遺伝子改変された細胞を適切な条件下でインビトロで培養し、それによりそれらは、遺伝子発現の産物を発現することができるまたは発現産物を分泌することができる。
【００１７】
分子生物学の分野における当業者であれば、多種多様な発現システムのいずれかを使用して、組換えタンパク質またはタンパク質フラグメントを提供し得ることを理解するであろう。形質転換、トランスフェクション、または形質導入の方法、および発現ベクターの選定は、宿主システム、所望の安定性、および／または適当な制限エンドヌクレアーゼ部位の利用可能性に依存するであろう。形質転換およびトランスフェクションの方法は、例えばAusubel, et al., 1997に記載されており、発現ベクターは、例えばPouwels et al., 1985, Supp. 1987において提供されるもの、または当技術分野において公知のものから選定され得る。
一部の場合には、ＡＲＩＤ５Ｂポリペプチドをコードする組換え核酸を導入することによって、遺伝子改変された免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ前駆細胞）を産生する。組換え核酸は、ヒトＡＲＩＤ５Ｂポリペプチド、バリアント１（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０３２１９９．２）またはヒトＡＲＩＤ５Ｂポリペプチド、バリアント２（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１２４４６３８．１）をコードし得る。一部の場合には、結果として生じる改変された細胞が、ＡＲＩＤ５Ｂをコードする外因性核酸分子を含むように、細胞を遺伝子改変する。例えば、一部の場合には、ＮＫ細胞に、ヒトＡＲＩＤ５Ｂをコードする核酸分子を含む発現ベクターを安定的にトランスフェクトし、それによって、結果として生じるトランスフェクトされた細胞は、外因性ＡＲＩＤ５Ｂポリペプチドを発現する。一部の場合には、外因性核酸を異種プロモーターに作動的に連結する。１つの実施形態において、ＡＲＩＤ５Ｂ過剰発現は、誘導性発現システムを使用して達成される。
【００１８】
さらに、ヒトＡＲＩＤ５Ｂポリペプチドをコードする配列とは異なるポリヌクレオチド配列を有する、他の種由来のＡＲＩＤ５Ｂ遺伝子は、本発明の組成物および方法において有用であると企図される。一部の場合には、遺伝子改変された免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ前駆細胞）は、ＡＲＩＤ５Ｂバリアントポリヌクレオチドを発現する。「ＡＲＩＤ５Ｂバリアントポリヌクレオチド」または「ＡＲＩＤ５Ｂバリアントポリヌクレオチド配列」という用語は、（１）全長の天然ＡＲＩＤ５Ｂまたは全長ＡＲＩＤ５Ｂの他の任意のフラグメントをコードするポリヌクレオチド酸配列と少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性を有するＡＲＩＤ５Ｂポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を意味する。普通、ＡＲＩＤ５Ｂバリアントポリヌクレオチドは、全長の天然ＡＲＩＤ５Ｂをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、より好ましくは少なくとも約７１％〜９９％のポリヌクレオチド配列同一性、およびなお一層より好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、およびさらにより好ましくは９９％のポリヌクレオチド配列同一性を有するであろう。
【００１９】
ＡＲＩＤ５Ｂコードポリヌクレオチド配列に関する「ポリヌクレオチド配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインしおよび必要な場合にはギャップを導入して配列同一性最大パーセントを達成した後の、候補配列におけるポリヌクレオチドと同一である、目的のＡＲＩＤ５Ｂポリヌクレオチド配列におけるポリヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。アラインメントは、当技術分野において周知の様々な手法で；例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公に利用可能なソフトウェアを使用して達成され得る。２つ以上のアミノ酸または核酸配列間の配列相同性または同一性を判定するための技法およびソフトウェアは、当技術分野において周知である。ホモログ、オルソログ、およびパラログは、例えば対応する保存されたアミノ酸配列をコードし得る核酸配列を増幅する標的縮重プライマーを使用したＰＣＲを使用して同定され得る。加えて、ホモログ、オルソログ、およびパラログは、配列データベース、例えば発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースを使用した配列アラインメントによって同定され得る。
【００２０】
ヒトＡＲＩＤ５Ｂまたは他の哺乳類ＡＲＩＤ５Ｂホモログ、オルソログ、および／またはパラログを発現させるために使用される本発明の構築物は、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ前駆細胞）への導入のために調製され得、またはＮＫ前駆細胞の場合には、ＨＳＣは、宿主によって認識される複製システムを含み得、好ましくは、ＡＲＩＤ５Ｂをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結された転写および翻訳調節配列も含むであろう。ベクターは、自律複製ベクター、ウイルスもしくはファージベクター、転位因子、組み込み型ベクター、またはミニ染色体もしくは人工染色体などの染色体外因子であり得る。そのようなベクターは、当技術分野において周知の標準組換え技法によって調製され得る。例えば、Ausubel et al., 1992、Sambrook et al., 2001、および米国特許第５，８３７，４９２号を参照されたい。本明細書において使用するとき、「ベクター」という用語は、それが連結する別の核酸を増殖させ得る核酸分子を指す。当該用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入されている宿主細胞のゲノムに組み入れられたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動的に連結される核酸の発現を指揮し得る。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。「ベクター」という用語によって、導入遺伝子の発現を可能にする外因性遺伝物質が包含される。
【００２１】
一部の場合には、遺伝子操作された免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ前駆細胞）が１つまたは複数の付加的な遺伝子改変を含むように、本明細書において記載される方法を使用して細胞をさらに遺伝子改変することが有利であろう。例えば、遺伝子操作された免疫細胞は、外因性核酸の発現のための１つまたは複数の付加的な導入遺伝子をさらに含み得る。付加的にまたは代替的に、遺伝子操作された免疫細胞は、特定の遺伝子産物の発現をノックアウトする遺伝子変異をさらに含み得る。
一部の場合には、免疫受容体（例えば、組換え免疫受容体、変異したまたは天然に存在しない免疫受容体）をコードする外因性核酸を含むように、遺伝子操作された免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ前駆細胞）をさらに改変する。一部の場合には、外因性核酸はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする。例えば、一部の場合には、腫瘍ペプチドおよびＭＨＣを認識する抗原特異的Ｔ細胞受容体を発現するように免疫細胞を改変することが有利であろう。他の場合には、外因性核酸はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。本明細書において使用するとき、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内ドメインに作動的に連結された、抗体（例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ））の細胞外抗原結合ドメインを含む、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドを指す。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、「キメラ受容体」または「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と称されることもある。一般的に、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、目的の標的細胞の表面に発現した特定の抗原に対する特異性を有する。例えば、抗腫瘍細胞治療法に関して、例えば腫瘍特異的表面抗原に対する特異性を有するＣＡＲをコードする核酸をノックインするように細胞を操作し得る。
【００２２】
一部の場合には、特定のヒト対象の遺伝的相補体を有する免疫細胞を獲得することが有利であり得る。例えば、特定の哺乳類対象の特定の疾患または障害と関連したまたはそれにより生じる１つまたは複数の特異的表現型を呈する免疫細胞を獲得することが有利であり得る。そのような場合には、当技術分野において公知の方法に従って、特定のヒト対象の体細胞をリプログラミングすることによって、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を獲得する。例えば、Yu et al., Science 324(5928):797-801 (2009)；Chen et al., Nat. Methods 8(5):424-9 (2011)；Ebert et al., Nature 457(7227):277-80 (2009)；Howden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108(16):6537-42 (2011)を参照されたい。一部の場合には、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＮＫ細胞など、最終的な造血表現型を推測するために、対象からｉＰＳ細胞を獲得し、その後に対象特異的ｉＰＳ細胞を誘導することが有利であろう。
本明細書において使用するとき、「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」とは、起源のそれらの分化した体細胞に関して異なり得る、特異的セットの潜在性決定因子に関して異なり得る、およびそれらを単離するために使用される培養条件に関して異なり得るが、それにもかかわらず起源のそれらそれぞれの分化した体細胞と実質的に遺伝的に同一であり、胚性幹細胞などのより高い潜在性細胞と類似した特徴を呈示する、多能性細胞または多能性細胞の集団を意味する。例えば、Yu et al., Science 318:1917-1920 (2007)を参照されたい。
【００２３】
ｉＰＳ細胞にリプログラミングするための対象特異的体細胞は、生検または他の組織サンプリング法によって、目的の標的組織から獲得され得るまたは単離され得る。一部の場合には、体細胞リプログラミングの前に、対象特異的細胞をインビトロで操縦する。例えば、体細胞リプログラミングの前に、対象特異的細胞を、増大させ得る、分化させ得る、遺伝子改変し得る、ポリペプチド、核酸、もしくは他の因子に接触させ得る、凍結保存し得る、または別様に改変し得る。
一部の場合には、ｉＰＳ細胞を、改変されていないｉＰＳ細胞と比べてＡＲＩＤ５Ｂを過剰発現するように改変し、その後にインビトロで分化させて、ＮＫ細胞、Ｔ細胞（例えば、Ｔｒｅｇ）、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、ＮＫ前駆細胞、樹状細胞、抗腫瘍単球、および他の任意の造血細胞由来の細胞タイプなど、造血系に由来する系列の細胞を獲得する。本明細書において記載されるＡＲＩＤ５Ｂを過剰発現するように改変されたｉＰＳ細胞の分化を指揮する任意の適当なインビトロ方法を使用して、造血系に由来する系列の細胞を獲得し得る。例えば、ｉＰＳ細胞からＮＫ細胞を導き出すためのインビトロ方法は以前に記載されている。例えば、Knorr et al., Stem Cells Transl Med (2013); 2:274-283；Ng et al., Nat Protoc 2008; 3:768-776を参照されたい。
【００２４】
別の態様において、本明細書において記載される複数の遺伝子操作された免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ前駆細胞）、および許容される担体、希釈剤、または賦形剤（例えば、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはその組み合わせ）を含む、薬学的組成物などの細胞組成物が本明細書において提供される。そのような組成物を作製する手段は、当技術分野において記載されている（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed. (1980)を参照されたい）。好ましくは、組成物は、生きた生物への細胞の投与を容易にするように調製される。一部の場合には、薬学的組成物は、本明細書において記載される複数の遺伝子操作されたエフェクター細胞、および例えば平衡塩類溶液、好ましくはハンクス平衡塩類溶液、または正常生理食塩水を含む。一部の場合には、細胞組成物は、対象における腫瘍を治療するための治療用組成物である。そのような場合には、本開示の複数の遺伝子操作された細胞は、そのような治療を必要とする対象への投与（例えば、注射、注入）に適した媒体中に懸濁される。
【００２５】
臨床的適用における使用のための細胞調製物は、アメリカ食品医薬品局などの政府機関によって課された規制に従って獲得されなければならない。したがって、例示的な実施形態において、本明細書において提供される方法は、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＭＰ）、再生医療等製品の製造管理および品質管理の基準（Ｇｏｏｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＴＰ）、ならびに医薬品の安全性に関する非臨床試験実施基準（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＬＰ）に従って行われる。動物由来構成要素を含む試薬は使用されず、すべての試薬は、ＧＭＰに準拠している供給元から購入される。ヒト療法における使用のための細胞調製物の臨床製造の背景では、ＧＴＰが細胞ドナー同意、トレーサビリティ、および感染性疾患スクリーニングを管理し、一方でＧＭＰは、ヒト使用のための一貫して安全でかつ有効な産物を産生するための、施設、工程、試験、および実践に関連する。Lu et al. Stem Cells 27: 2126-2135 (2009)を参照されたい。適当な場合には、インフォームドコンセントが得られること；産物の安全性、生物活性、適当な投薬量、および効力が同調して調査されること；結果が統計的に有意であること；ならびに倫理指針が従われていることを確保するために、機関および施設内委員会による患者プロトコールの監督が想定される。
【００２６】
本明細書において提供される遺伝子操作された細胞および細胞組成物は、多様なインビトロ、エクスビボ、およびインビボ適用における使用に有利な特性を有する。例えば、本明細書において提供される細胞および細胞組成物のインビトロ使用には、限定されることなく、罹患標的細胞の表面に発現した抗原に基づいて罹患標的細胞を標的にすることが含まれる。標的細胞は、がん細胞（例えば、腫瘍細胞）、ウイルスもしくは細菌などの病原体に感染された細胞、自己免疫障害（例えば、１型糖尿病、ループス）と関連した細胞タイプ、またはアルツハイマー病、ＡＬＳ、もしくはハンチントン病などの神経変性疾患と関連した細胞タイプであり得る。また、細胞は、影響を受けていない細胞と比べて、細胞表面抗原の異常発現を有する影響を受けた細胞の他の任意の病態と関連した細胞タイプであり得る。
【００２７】
一部の場合には、本明細書において提供される遺伝子操作された細胞および細胞組成物は、凍結保存、零下温度での保管、および融解の後に有利な特性を呈する。本明細書において使用するとき、「凍結保存」という用語は、零下温度に冷却することによって細胞を保存することを指す。一部の場合には、凍結保存は、零下温度での保管および／または冷凍に伴う損傷、例えば氷晶形成に起因した細胞膜損傷から細胞を守る物質である凍結保護剤の存在または非存在下で行われる。一部の場合には、本開示の凍結保存されたおよび融解された改変された細胞は、ＡＲＩＤ５Ｂを過剰発現しない対照細胞と比べて、凍結保存および融解の後の生存率および機能の維持の向上を呈する。いかなる特定の理論または作用様式に拘束されることなく、ＡＲＩＤ５Ｂの過剰発現に応答して、改変された細胞において生じる１つまたは複数の代謝的変化は、凍結保存および使用のための融解の後の、そのような細胞の生存率および効率および機能の維持を向上させると思われる。例えば、ＡＲＩＤ５Ｂは、ミトコンドリア膜電位を増加させおよびＢＣＬ−２の発現を増加させることが知られており、その両方とも、冷凍および融解のストレス後の細胞生存を一般的に促進する。例えば、Stroh et al., The FASEB Journal 2002, DOI 10.1096/fj.02-0034fjeを参照されたい。
【００２８】
本明細書において提供される遺伝子操作された細胞および細胞組成物のエクスビボ使用には、限定されることなく、疾患標的細胞の表面に発現した抗原に基づいて同定された疾患標的細胞に対する、早期疾患検出およびコンパニオン診断的または治療的適用が含まれる。例えば、細胞は、がん免疫療法に対するコンパニオン治療法におけるエクスビボ適用に使用され得る。本開示の遺伝子操作された細胞および細胞組成物の他のエクスビボ適用には、限定されることなく、感染性疾患、自己免疫障害、神経変性障害、および影響を受けていない細胞と比べて細胞表面抗原の異常発現と関連した他の細胞ベースの病態を治療するための細胞療法に対するコンパニオン診断への適用が含まれる。
【００２９】
「エクスビボ」という用語は、一般的に、好ましくは天然条件の最小限の変更を有して、生物の外側の人工的環境において生きた組織の中でまたは上でなされる実験または測定など、生物の外側で行われる活動を指す。特定の実施形態において、「エクスビボ」手順は、生物から取り出され、通常無菌条件下で、典型的には数時間または最高で約２４時間、しかし状況に応じて最高で４８もしくは７２時間またはそれよりも長い期間を含めて、実験装置で培養された生きた細胞または組織を伴う。ある特定の実施形態において、そのような組織または細胞は、回収され得、冷凍され得、その後、エクスビボ処理のために融解され得る。生きた細胞または組織を使用した、数日間よりも長い期間続く組織培養実験または手順は、典型的には「インビトロ」であると見なされるが、とはいえある特定の実施形態において、この用語はエクスビボと互換的に使用され得る。
【００３０】
本明細書において使用される「核酸」および「核酸分子」という用語は、核酸塩基および酸性部分、例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーを含む化合物を指す。典型的に、ポリマー核酸、例えば３つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子は直鎖状分子であり、隣接ヌクレオチドは、ホスホジエステル連結を介して互いに連結している。一部の実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。一部の実施形態において、「核酸」は、３つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書において使用するとき、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、一続きの少なくとも３つのヌクレオチド）を指すために互換的に使用され得る。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを包含し、それは一本鎖または二本鎖であり得、合成され得または天然供給源から獲得され得（例えば、単離されるおよび／または精製される）、それは天然の、非天然の、または変更されたヌクレオチドを含有し得、および改変されていないオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見い出されるホスホジエステルの代わりにホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）連結またはホスホロチオエート連結など、天然の、非天然の、または変更されたヌクレオチド間連結を含有し得る。一部の実施形態において、核酸は、いかなる挿入、欠失、逆位、および／または置換も含まない。しかしながら、一部の例では、本明細書において述べられるように、核酸は、１つまたは複数の挿入、欠失、逆位、および／または置換を含むことが適切であり得る。一部の実施形態において、核酸は、ＣＡＲおよびポリヌクレオチドの機能に影響を及ぼさない、ならびに宿主細胞によって核酸の発現時に翻訳され得るまたは翻訳され得ない、付加的なアミノ酸配列をコードし得る。
【００３１】
核酸は、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 280-281 (1982)によって記載されるものを含めた、任意の適切な方法を使用して獲得され得る。一部の態様において、核酸は、米国特許出願公報第ＵＳ２００２／０１９０６６３号に記載されるように獲得される。生物学的サンプルから獲得された核酸は、典型的に、解析のための適切なフラグメントを産生するためにフラグメント化される。
本発明の核酸および／または他の部分は単離され得る。本明細書において使用するとき、「単離された」とは、全体においてまたは一部において、それが天然に存在する供給源に由来するまたは合成で作製されるかどうかにかかわらず、それか通常結び付いている構成要素の少なくとも一部からの分離を意味する。本発明の核酸および／または他の部分は精製され得る。本明細書において使用するとき、「精製された」とは、他の化合物または実体の大多数からの分離を意味する。化合物または部分は、部分的に精製され得るまたは実質的に精製され得る。純度は、質量測定による質量によって示され得、質量分析、ＨＰＬＣなどであるがそれらに限定されない多様な解析技法を使用して判定され得る。
【００３２】
「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ペプチド（アミド）結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。当該用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す。典型的に、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、少なくとも３アミノ酸長であろう。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々のタンパク質またはタンパク質の集合体を指し得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドにおけるアミノ酸の１つまたは複数は、例えば、コンジュゲーション、官能基化、または他の改変などのための、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、リンカーなどの化学的実体の付加によって改変され得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、単一分子でもあり得る、または多分子複合体であり得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するタンパク質またはペプチドの単にフラグメントだけであり得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在し得る、組換えであり得る、もしくは合成であり得る、またはその任意の組み合わせであり得る。タンパク質は、種々のドメイン、例えば核酸結合ドメインおよび核酸切断ドメインを含み得る。一部の実施形態において、タンパク質は、タンパク質性部分、例えば核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列、および有機化合物、例えば核酸切断剤として作用し得る化合物を含む。
【００３３】
方法
別の態様において、本明細書において提供される改変された免疫細胞を治療剤として使用して、疾患を治療するまたは予防する方法が本明細書において提供される。一部の場合には、それを必要とする対象における疾患（例えば、がん、ウイルス感染症）を治療する方法であって、野生型免疫細胞と比べて、ＡＲＩＤ５Ｂの発現が増加した改変された免疫細胞を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書において提供される。本明細書において使用するとき、「対象」、「患者」、および「個体」という用語は互換的に使用され、限定されることなく、ヒト、哺乳類、爬虫類、両生類、および魚類を含めた任意の脊椎動物を包含し得る。しかしながら、有利には、対象、患者、または個体は、ヒトなどの哺乳類、または飼い慣らされた哺乳類、例えばイヌ、ネコ、ウマなど、もしくは家畜、例えばウシ、ヒツジ、ブタなどの哺乳類である。例示的な実施形態において、対象はヒトである。
一部の場合には、本明細書において提供される方法が特に適切である対象は、骨髄破壊的または骨髄非破壊的な化学療法または放射線療法を受けている。他の場合には、対象は骨髄ドナーである。
【００３４】
本明細書において使用される「治療する」および「予防する」という用語、ならびにそれから派生する単語は、必ずしも１００％のまたは完全な治療または予防を暗示するわけではない。むしろ、当業者が潜在的有益性または治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療または予防がある。この点において、本方法は、哺乳類における疾患の任意の量の任意のレベルの治療または予防を提供し得る。さらに、本方法によって提供される治療または予防は、治療されているまたは予防されている疾患、例えばがんの１つまたは複数の病状または症状の治療または予防を含み得る。また、本明細書における目的上、「予防」は、疾患の発症、またはその症状もしくは病状を遅らせることを包含し得る。
本明細書において使用するとき、「それを必要とする」という語句は、治療的または予防的な方策が望ましい、対象の状態を示す。そのような状態には、がんまたはウイルス感染症などの疾患または病状を有する対象が含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。一部の場合には、対象は、血液悪性腫瘍（例えば、急性白血病、慢性白血病（骨髄性またはリンパ性）、リンパ腫（例えば、ホジキンまたは非ホジキン）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、または固形腫瘍（乳がん、卵巣がん、脳腫瘍、前立腺がん、肺がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、肉腫、または膵臓がん）などの非血液がんなどのがんを有する。他の対象は、感染症（例えば、ウイルス感染症、細菌感染症、または真菌感染症）によって引き起こされる障害を有し得る。一部の場合には、治療される対象となる感染症は、骨髄の幹または前駆細胞に損傷を引き起こすものである。
【００３５】
一部の場合には、方法は、野生型免疫細胞と比べて、ＡＲＩＤ５Ｂの発現が増加した改変された免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ前駆細胞）をそれを必要とする対象に投与するステップを含む。本明細書において記載されるように、そのような改変された免疫細胞は、ミトコンドリア膜電位の増加、ＩＦＮ−γ産生の増加のうちの１つまたは複数を呈し、それによって個体への投与は疾患を治療する。本明細書において記載されるように、改変された免疫細胞は、インビトロまたはエクスビボで産生され得る。外因性ＡＲＩＤ５Ｂを過剰発現するまたは発現する免疫細胞の増強した特性に起因して、そのような方法は、本明細書において記載される方法に従った治療の後に、寛解を達成するおよび／または寛解にとどまる患者の数を増加させることを含めて、従来の細胞療法の効力を増加させ得る。
一部の場合には、改変された免疫細胞は、本明細書において記載される改変された細胞および適切な担体、希釈剤、または賦形剤を含む組成物として、それを必要とする対象に投与される。対象に改変された免疫細胞を提供する任意の適当な方法が、本明細書において記載される方法に使用され得る。一部の場合には、対象に細胞を提供するための方法は、ヒト対象へのドナー由来免疫細胞の注入のための細胞および養子免疫療法に対する臨床プロトコールから適合され得る。一部の場合には、本発明によって提供される方法に適した適合した臨床プロトコールは、対象から免疫細胞を獲得するステップ、本明細書において記載されるように免疫細胞を改変するステップ、および改変された細胞を対象に注入して戻すステップを含む。
【００３６】
本明細書において提供される改変された免疫細胞組成物の投与は、限定されることなく、静脈内、腫瘍内、筋肉内、皮下、腹腔内、動脈内への、または輸入リンパ管への、非経口投与による、例えば注射もしくは注入による投与を含めた、任意の適当な経路によって投与され得る。細胞は他の細胞との混合物でもしくは別個に投与され得、例えば腫瘍内注射によって標的エリアに送達され得る、または細胞は静脈内に導入され得、標的エリアに移動させられ得る。
本方法の目的上、改変された免疫細胞またはそのような改変された細胞の集団が投与される場合、改変された免疫細胞は、対象（例えば、ヒト患者）に対して同種異系または自家である細胞であり得る。
一部の場合には、改変された免疫細胞が提供される対象を、増加した（例えば、向上した、より堅牢な）腫瘍クリアランスについてモニターするまたは査定する。したがって、本発明の方法は、がん療法に有用である。一部の場合には、改変された免疫細胞が提供される対象を、特定の抗原を発現する細胞のクリアランスについてモニターするまたは査定する。
【００３７】
製品
別の態様において、養子細胞療法を必要とする対象を治療するためのキットが本明細書において提供される。好ましくは、キットは、本開示において記載される、野生型免疫細胞と比べて、ＡＲＩＤ５Ｂの発現が増加した改変された免疫細胞を含む治療用組成物を含む。一部の場合には、改変された免疫細胞は、注射に適した薬学的に許容される媒体中で提供される。一部の場合には、改変された免疫細胞は、凍結保存された細胞として提供される。そのような場合には、キットは、凍結保存された細胞を融解するための、および／または養子細胞療法を必要とする対象に治療用組成物を投与するための取扱説明書をさらに含み得る。
別の態様において、好ましくは化学的に規定された培養条件下で、誘導多能性幹細胞などのヒト多能性幹細胞を遺伝子改変しおよび分化させることによって、野生型免疫細胞と比べて、ＡＴリッチ相互作用ドメイン５Ｂ（ＡＲＩＤ５Ｂ）の発現が増加した機能的な改変された免疫細胞を獲得するためのキットが本明細書において提供される。
【００３８】
別様に示されていない限り、それぞれ、任意の核酸配列は、５’から３’方向に左から右へ書かれており；アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に左から右へ書かれている。
本明細書において引用される、刊行物、特許、および特許出願を含めたすべての参考文献は、あたかも各参考文献が、参照により組み込まれることを個々にかつ具体的に示され、および本明細書においてその全体が明記されるかのようにと同程度に、参照により本明細書によって組み込まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用するとき、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈において別様にはっきりと記されていない限り、複数形の指示対象（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を含む。本明細書における「または」への任意の言及は、別様に記述されていない限り、「および／または」を包含することを意図される。
【００３９】
本明細書において使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」という用語は、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包含的でありまたは制約がなく、付加的な挙げられていないメンバー、要素、または方法ステップを除外しない。本明細書において使用される文言および専門用語は、説明の目的のためのものであり、限定的として見なされるべきではない。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、およびその変形の使用は、その後に列挙される項目および付加的な項目を包含することを目的とする。
本明細書において使用するとき、「約」は、記述された値の５％以内（記述された濃度域内、記述された時間枠の５％以内）を意味する。
本発明は、以下の非限定的な実施例を考慮するとより十分に理解されるであろう。
【実施例】
【００４０】
本開示において引用される各刊行物、特許、および特許公報は、参照してその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は、以下の実施例に限定されることを意図されないが、すべてのそのような改変および変形を、添付の特許請求の範囲の内に入るものとして包含する。
（実施例１）
ＡＲＩＤ５Ｂは、ヒト適応性ＮＫ細胞における代謝プログラミングを調節する
本発明者らの以前の仕事は、適応性の免疫学的特性を有するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、ヒトサイトメガロウイルスに応答して増大しおよび持続することを実証した。本実施例は、これらの細胞に固有の代謝過程を探り、適応性ＣＤ３-ＣＤ５６dimＣＤ５７+ＮＫＧ２Ｃ+  ＮＫ細胞が、増加した酸化的ミトコンドリア呼吸、ミトコンドリア膜電位、および予備呼吸能を含めた、リンパ球メモリーの代謝的特質を呈することを実証する。メカニズム的には、クロマチンを修飾する転写調節因子ＡＴリッチ相互作用ドメイン５Ｂ（ＡＲＩＤ５Ｂ）の短いアイソフォームが、適応性ＮＫ細胞においてＤＮＡ低メチル化を通じて選択的に誘導されることが判定された。ＮＫ細胞株（ＮＫ−９２）におけるＡＲＩＤ５Ｂのノックダウンは、減少したミトコンドリア酸化的代謝、ＥＴＣ遺伝子の発現、生存、およびＩＦＮ−γ産生につながった。逆に、ＮＫ−９２細胞におけるＡＲＩＤ５Ｂの過剰発現は、増加した酸化的代謝およびＩＦＮ−γ産生と関連した。さらに、ＡＲＩＤ５Ｂは、ＥＴＣ構成要素ユビキノン−シトクロムｃレダクターゼ結合タンパク質（ＵＱＣＲＢ）の発現を直接調節し、ＵＱＣＲＢノックダウンは、ＡＲＩＤ５Ｂノックダウンに関して観察された代謝的および機能的効果を表現型模写することがさらに判定された。したがって、これらのアッセイは、ＮＫ細胞代謝を調節することにおけるＡＲＩＤ５Ｂの重要な役割を実証する。
【００４１】
結果
ＨＣＭＶ血清陽性ドナー由来の適応性ＮＫ細胞は、標準的ＮＫ細胞と比べて、上昇した解糖代謝および酸化的代謝を呈する
ＨＣＭＶ感染に応答して生じおよび持続するＮＫ細胞において、どのように代謝が調節されるのかを調査するために、本発明者らは、ＨＣＭＶ血清陽性および血清陰性ドナーの末梢血からＣＤ３-ＣＤ５６+  ＮＫ細胞を単離し、オリゴマイシン（ＡＴＰ合成の阻害剤）、ＦＣＣＰ（電子伝達鎖ＥＴＣからのＡＴＰ合成を脱共役する）、ならびにそれぞれＥＴＣの複合体Ｉおよび複合体ＩＩＩに干渉するロテノンおよびアンチマイシンＡの添加後に、基礎状態でＯ2消費率（ＯＣＲ）を測定した（Gerencser et al., 2009）。本発明者らは、最大呼吸レベル、ＡＴＰ関連呼吸、およびＳＲＣが、ＨＣＭＶ血清陽性ドナー由来のＮＫ細胞において有意に上昇することを見い出した（図１Ａ）。ＯＸＰＨＯＳの測定における観察された増加が、バルクＣＤ３-ＣＤ５６+集団内の適応性ＣＤ３-ＣＤ５６dimＣＤ５７+ＮＫＧ２Ｃ+  ＮＫ細胞の頻度と関連するかどうかを判定するために、本発明者らは、試験したすべてのＨＣＭＶ血清陽性および血清陰性ドナー由来のＮＫ細胞を表現型判定した。予想通り、適応性ＮＫ細胞は、血清陰性ドナー（１．３２〜４．３３％；ｐ＝０．０３４）と比べて、より高い頻度でＨＣＭＶ血清陽性ドナーに存在した（７．５〜３２．１％）。最大呼吸、ＡＴＰ関連呼吸、およびＳＲＣの大きさと適応性ＮＫ細胞の頻度との間に強い相関が観察された（図１Ｅ）。
【００４２】
以前に公開されたように、同じアッセイにおいてＯＸＰＨＯＳ試薬とともにグルコースおよびピルベートを添加するＳｅａｈｏｒｓｅ技術の改変は、限定された細胞数からの代謝的読み取りを最大限に高め得（Marcais et al., 2014）、解糖の指標として初代ＮＫ細胞の細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を測定するために使用された。最大解糖および解糖予備能に関して、ＨＣＭＶ血清陽性および血清陰性ドナー由来のＮＫ細胞の間で統計的に有意な差は観察されなかった（図１Ｃ）。最大解糖および解糖予備能の大きさと適応性ＮＫ細胞の頻度との間で、より弱い相関が明らかであった（図１Ｅ）。本発明者らは、直接的ＡＴＰ定量アッセイにおいて、ＨＣＭＶ血清陰性ドナー由来のＮＫ細胞と比べて、適応性ＮＫ細胞増大を有するＨＣＭＶ血清陽性ドナー由来のＮＫ細胞においてより高いＡＴＰレベルも観察した（図１Ｂ）。
【００４３】
栄養源が、ＨＣＭＶ血清陽性ドナー由来のＮＫ細胞において観察されたＡＴＰレベルの増加を支持することを検討するために、ＨＣＭＶ血清陰性および血清陽性ドナー由来の前処理されたＮＫ細胞を、ＡＴＰ定量の前に、エトモキシル（ミトコンドリアへの脂肪酸輸送を遮断する）、２ＤＧ（解糖を遮断する）、およびＵＫ５０９９（ミトコンドリアへのピルベート輸送を遮断する）で処理した。エトモキシルまたは２ＤＧは、ＡＴＰレベルの観察された低下に影響を及ぼさなかった。しかしながら、ＵＫ５０９９前処理は、ＨＣＭＶ血清陽性ドナー由来のＮＫ細胞においてＡＴＰ産生のより実質的な減少を誘導し、グルコースのミトコンドリア利用が、適応性ＮＫ細胞の増強した代謝を支持することにおいて役割を担うことを示唆した（図１Ｄ）。
個別のＮＫ細胞サブセットにおける代謝応答を直接解析するために、本発明者らは、ＨＣＭＶ血清陽性ドナー由来の末梢血標準的ＮＫ細胞および適応性ＮＫ細胞を選別し、Ｓｅａｈｏｒｓｅアッセイを実施した。これらの実験において、本発明者らは、標準的ＮＫ細胞と比べて、最大呼吸、ＡＴＰ関連呼吸、およびＳＲＣの有意な上昇を有する、適応性ＮＫ細胞に対する著しく増強したＯＣＲプロファイルを観察した（図１Ｆ）。同様に、適応性ＮＫ細胞は、標準的ＮＫ細胞と比べて、上昇した最大解糖および解糖予備能を有する、より高いＥＣＡＲプロファイルを示した（図１Ｇ）。選別された標準的ＮＫ細胞と比べて、選別された適応性ＮＫ細胞においてより高いＡＴＰレベルも観察された（図１Ｈ）。解糖代謝に関して、単離された標準的および適応性ＮＫ細胞間の差を確認するために、本発明者らは、蛍光性グルコース類似体２−ＮＢＤＧを使用したグルコース取り込みアッセイを実施した。本発明者らは、ＣＤ１６による誘発ならびにＰＭＡ：イオノマイシンを使用した活性化に応答した、適応性ＮＫ細胞における有意により多くのグルコース取り込みを観察した（図１Ｉ）。注目すべきことに、Ｓｅａｈｏｒｓｅ実験は、新しく単離されたＮＫ細胞または以前に冷凍されていたＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を用いて実施された。直接比較において、最大呼吸は冷凍細胞においてより低かったが、全体的なＯＣＲおよびＥＣＡＲプロファイルは同程度であった（図９）。まとめると、これらのデータは、ＨＣＭＶ血清陽性ドナー由来の適応性ＮＫ細胞において、ミトコンドリア酸化的代謝および解糖の両方が増強されることを示唆する。
【００４４】
適応性ＮＫ細胞は、増加したミトコンドリア膜電位および電子伝達鎖の構成要素をコードする遺伝子の発現を呈示する
本発明者らの代謝解析からの最も際立った知見の１つは、ＨＣＭＶ血清陽性ドナー由来の適応性ＮＫ細胞におけるＳＲＣの劇的な増加であった。ＳＲＣは、基礎状態と比べて、ＡＴＰ合成脱共役剤ＦＣＣＰに応答して、ＥＴＣがどれくらい効率的にミトコンドリアマトリックスからのプロトンを膜間腔に往復させ得るかについての評価基準であり（Mookerjee et al.,2010）、労力またはストレスの増加に応答してエネルギーを産生する細胞の能力の反映であると見なされる（Nicholls, 2009）。ＳＲＣの上昇は、ミトコンドリア質量の増加およびＣＤ８+  Ｔ細胞におけるメモリー表現型と関連している（van der Windt et al., 2012, 2013）。ミトコンドリア膜電位の差が標準的および適応性ＮＫ細胞のサブセット間で明らかであるかどうかを判定するために、本発明者らは、ＨＣＭＶ血清陽性および血清陰性ドナーからＣＤ３-ＣＤ５６+  ＮＫ細胞を単離し、ミトコンドリア膜電位（Δψｍ）に依存する蛍光性細胞透過性色素であるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄとともに（Perry et al., 2011）、ＦＡＣＳ解析のためにＣＤ５７およびＮＫＧ２Ｃに対する蛍光コンジュゲート抗体を用いて染色した（図２Ａ）。本発明者らは、ＨＣＭＶ血清陰性および血清陽性ドナー由来の標準的ＣＤ３-ＣＤ５６dimＮＫＧ２Ｃ-  ＮＫ細胞サブセットにおいて、同程度の染色強度を観察した。対照的に、適応性ＮＫ細胞サブセットは、ミトコンドリア膜電位の増加を呈した（図２Ｂ）。この増加は、本発明者らが、標準的および適応性ＮＫ細胞を選別し、共焦点顕微鏡法によってミトコンドリアを解析した場合にも明らかであった（図２Ｃ）。本発明者らは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによるミトコンドリアＤＮＡの核ＤＮＡに対する比（ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ）の定量によって、適応性ＮＫ細胞におけるミトコンドリアレベルの増加を確認した。本発明者らは、適応性ＮＫ細胞におけるミトコンドリアＤＮＡ比の８１％の増加を観察した（図２Ｄ）。注目すべきことに、適応性ＮＫ細胞において、ＣｅｌｌＲｏｘ染色によって判定される、活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルの相対的増加は観察されなかった（図２Ｅ）。
【００４５】
適応性ＮＫ細胞におけるＯＸＰＨＯＳおよびミトコンドリア膜電位の観察された増加に関するより深い理解を得るために、本発明者らは、５人のＨＣＭＶ血清陽性ドナーの末梢血から標準的および適応性ＮＫ細胞サブセットを選別し、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析を実施した。興味深いことに、本発明者らは、適応性ＮＫ細胞サブセットにおいて、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ複合体および電子伝達鎖（ＥＴＣ）複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶの構成要素をコードする遺伝子の発現の増加の一貫したパターンを観察した（図２Ｆ）。このサブセットにおいて最も差異的に発現した遺伝子の中には、ＮＤＵＦＳ４、ＮＤＵＦＳ５、およびＮＤＵＦＢ５（ＥＴＣ複合体Ｉの構成要素をコードする）、ならびにＵＱＣＲＨおよびＵＱＣＲＢ（ＥＴＣ複合体ＩＩＩの構成要素をコードする）があった。本発明者らは、ＨＣＭＶ血清陽性ドナーから末梢血標準的および適応性ＮＫ細胞を選別し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施することによって、これらの遺伝子の差異的発現を検証した。本発明者らは、標準的ＮＫ細胞と比べて、適応性ＮＫ細胞におけるこれらの遺伝子のそれぞれの発現の統計的に有意な増加を観察した（図２Ｇ）。ＲＮＡ−ｓｅｑデータの遺伝子セット富化解析（Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＧＳＥＡ）も、以前の報告（Liu et al., 2017）と一致した、適応性ＮＫ細胞における脂質異化に関与する遺伝子の統計的に有意な富化、ならびにミトコンドリア生合成および脂肪酸代謝に関与する遺伝子の富化の傾向を示した（図１３）。まとめると、これらのデータは、適応性ＮＫ細胞に特徴的な固有の代謝プロファイルを立証する。
【００４６】
クロマチン修飾タンパク質ＡＲＩＤ５Ｂの発現は適応性ＮＫ細胞において誘導される
核内受容体スーパーファミリーのメンバーであるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）（Puigserver et al., 1998）、およびエストロゲン関連受容体（Huss et al., 2004）を含めた、いくつかの転写因子およびクロマチン修飾タンパク質が、ミトコンドリア生合成および細胞の酸化的代謝に関わっている。新しく単離されたＮＫ細胞からの遺伝子発現についての本発明者らのＲＮＡ−ｓｅｑ解析において、本発明者らは、標準的および適応性ＮＫ細胞サブセットを比較した場合に、ＰＰＡＲおよびＥＲＲファミリーメンバーの同程度の発現レベルを観察した。本発明者らは、ＹＹ１、ＭＹＣ、ＴＦＡＭ、ＴＦＢ２Ｍ、およびＴＦＢ１Ｍを含めた、ミトコンドリア生合成およびＯＸＰＨＯＳの公知の転写調節因子をコードする他の遺伝子の同程度の発現レベルも観察した（Larsson et al., 1998；Falkenberg et al., 2002；Li et al., 2005；Cunningham et al., 2007）（図１０）。しかしながら、本発明者らの解析は、標準的ＮＫ細胞に対して適応性ＮＫ細胞において特異的にＡＲＩＤ５Ｂのより高い発現を明らかにした（１．７倍、調整ｐ＝０．０１３）（図３Ａ）。ＡＲＩＤ５Ｂは、ＡＴリッチ相互作用ドメイン（ＡＲＩＤ）と呼ばれる固有のＤＮＡ結合ドメインを共有するタンパク質のファミリーに属する（Kortschak et al., 2000）。ノックアウトマウスは、低下した頻度で生存可能であり、著しく不良な成長を呈し、異常に痩せている（Lahoud et al., 2001；Whitson et al., 2003）。これらのマウスにおいて免疫系は徹底的には調査されていないものの、骨髄および胸腺細胞充実度の有意な減少を含めた、Ｂ細胞およびＴ細胞発生の異常が報告されている（Falkenberg et al., 2002）。ＡＲＩＤ５Ｂは、肝細胞における代謝の直接調節に（Baba et al., 2011）、ヒトＣＤ１４+血中単球における炎症および脂質代謝経路の直接調節に（Liu et al., 2017）、ならびにＦＴＯ遺伝子座の制御を通じた脂肪細胞代謝の調節に間接的に（Claussnitzer et al., 2015）これまでに関わっているため、本発明者らは、ＡＲＩＤ５Ｂが、ＮＫ細胞代謝を調節することにおける役割も担うという仮説を立てた。
【００４７】
ＨＣＭＶ血清陽性ドナー由来の標準的および適応性ＮＫ細胞の選別されたサブセットを使用して、適応性ＮＫ細胞におけるＡＲＩＤ５Ｂの発現の増加をｑＲＴ−ＰＣＲによって確認した（図３Ｂ）。２つのＡＲＩＤ５Ｂアイソフォームが以前に同定されている：転写産物バリアント１は、第１０番染色体上の１４９，４０２ｂｐに及ぶ１０個のエクソンからなり、転写産物バリアント２は、転写産物バリアント１のイントロン４内に位置する固有の第１のエクソンを有し、最後の６つのエクソンを共有する。標準的および適応性ＮＫ細胞における各アイソフォームのスプライス接合部および相対的発現を定量的に可視化するために、本発明者らは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒソフトウェアの中のＭｉｘｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｉｓｏｆｏｒｍｓパッケージを使用して、本発明者らのＲＮＡｓｅｑアラインメントデータのＳａｓｈｉｍｉプロットを創出した。本発明者らは、ＡＲＩＤ５Ｂ転写産物バリアント２が、適応性ＮＫ細胞において富化されることを見い出した（図３Ｃ）。タンパク質レベルでのＡＲＩＤ５Ｂバリアント発現を確認するために、本発明者らは、ＨＣＭＶ血清陽性ドナーから標準的ＮＫ細胞および適応性ＮＫ細胞を選別し、ＡＲＩＤ５Ｂに対するウェスタンブロットを実施した。面白いことに、標準的および適応性ＮＫ細胞の両方において、ＡＲＩＤ５Ｂバリアント２はバリアント１よりも豊富であった。両バリアントの発現は適応性ＮＫ細胞においてより高く、バリアント２が最も豊富であった（図３Ｄ）。
【００４８】
ＡＲＩＤ５Ｂ発現のパターンと関連した、適応性ＮＫ細胞における固有のエピジェネティックシグネチャーがあるかどうかを判定するために、本発明者らは、標準的および適応性ＮＫ細胞の選別されたサブセットを用いて以前に実施された本発明者らの全ゲノムＤＮＡメチル化アレイからのデータを調べた（Schlums et al., 2015）。ＡＲＩＤ５Ｂ転写産物バリアント１の上流にある５’領域および転写開始部位（ＴＳＳ）は、標準的および適応性ＮＫ細胞において同程度に低メチル化されているものの、本発明者らは、適応性ＮＫ細胞におけるＡＲＩＤ５Ｂ転写産物バリアント２の上流にある５’領域およびＴＳＳの選択的低メチル化を観察した（Ｐ＝２．３２×１０−１２；図３Ｅ）。まとめると、本発明者らのデータは、バリアント２の富化を有する、適応性ＮＫ細胞におけるＡＲＩＤ５Ｂの特異的誘導を示している。
【００４９】
ＡＲＩＤ５Ｂモジュレーションは、ＮＫ−９２細胞においてミトコンドリア膜電位、ミトコンドリア酸化的代謝、ＩＦＮ−γ産生、および生存に影響を与える
ＡＲＩＤ５ＢがＮＫ細胞代謝を促進するという仮説を試験するために、本発明者らは、ＮＫ−９２  ＮＫ細胞株におけるＡＲＩＤ５Ｂ発現をレンチウイルス形質導入によりノックダウンした。この方法によって、本発明者らは、ＡＲＩＤ５Ｂ発現の４０％の低下を達成することができた（図４Ａ）。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒによって定量されるミトコンドリア膜電位は、ＡＲＩＤ５ＢノックダウンＮＫ−９２細胞において３８％低下し（図４Ｂ）、細胞を共焦点顕微鏡法によって可視化した場合に同様の結果が観察された（図４Ｃ）。ＡＲＩＤ５Ｂを標的にする３つの異なるｓｈＲＮＡを形質導入されたＮＫ−９２細胞において、ミトコンドリア膜電位の減少が観察された（図１１Ａ〜１１Ｂ）。ＡＲＩＤ５Ｂノックダウンがミトコンドリアレベルに影響を及ぼすことをさらに確認するために、本発明者らは、ミトコンドリアＤＮＡの核ＤＮＡに対する比をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量し、この比がＡＲＩＤ５Ｂノックダウン細胞において３１％低下することを見い出した（図４Ｄ）。
【００５０】
次に、本発明者らは、ＡＲＩＤ５Ｂのノックダウンが代謝に対して影響を有するかどうかを判定しようと努めた。ＡＲＩＤ５Ｂノックダウン細胞に関して、最大呼吸、ＡＴＰ関連呼吸、およびＳＲＣの有意な低下が観察された（図４Ｅ）。対照的に、ＡＲＩＤ５Ｂノックダウン細胞のＥＣＡＲプロファイルによって判定される解糖において全体的な差は見られず、最大解糖および解糖予備能の両方とも、ＡＲＩＤ５Ｂノックダウン細胞および対照の間で同程度であった（図４Ｆ）。ＡＴＰレベルも、ＡＲＩＤ５Ｂノックダウン細胞および対照の間で同程度であった（図４Ｇ）。上昇したミトコンドリア質量、ＯＸＰＨＯＳ、およびＳＲＣは、優れたＴ細胞エフェクター機能と関連している（van der Windt et al., 2012, 2013；Buck et al., 2016）。ＡＲＩＤ５ＢノックダウンがＮＫ細胞機能に影響を与えるかどうかを判定するために、本発明者らは、対照およびＡＲＩＤ５ＢノックダウンＮＫ−９２細胞を、炎症性サイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−１８で一晩刺激して、ＩＦＮ−γ産生を誘導した。本発明者らは、ＡＲＩＤ５ＢノックダウンＮＫ−９２細胞によるＩＦＮ−γ産生の著しい欠損を観察した（図４Ｈ）。注目すべきことに、Ｋ５６２刺激アッセイにおいて、対照およびＡＲＩＤ５Ｂノックダウン細胞の間で、脱顆粒またはＴＮＦ産生の差は観察されなかった（示されず）。
【００５１】
Ｔ−ＡＬＬ細胞株の生存を支持することにおけるＡＲＩＤ５Ｂの役割が最近報告されている（Leong et al., 2017）。本発明者らは、ＡＲＩＤ５ＢがＮＫ細胞において同様の役割を担い得るという仮説を立てた。この仮説を試験するために、本発明者らは、ヨウ化プロピジウムを使用して細胞周期解析を実施し、Ｇ２における細胞の頻度の減少の傾向を有する対照と比べて、Ｇ１におけるＡＲＩＤ５Ｂノックダウン細胞の蓄積を見い出した（図５Ａ）。培養下での３日間にわたる生細胞数の解析は、ＡＲＩＤ５Ｂノックダウン細胞に対して有意に減少した成長速度を示した（図５Ｂ）。ＡＲＩＤ５Ｂノックダウン細胞の損なわれた成長が、生存の減少に起因し得るかどうかを判定するために、本発明者らは、アネキシンＶを使用して能動的アポトーシスを解析した。本発明者らは、アポトーシスを受けたＡＲＩＤ５Ｂノックダウン細胞のより高い頻度を観察した（図５Ｃ）。ミトコンドリア内膜タンパク質ＢＣＬ−２は、プログラム細胞死を遮断することにおいて主要な役割を担い（Sentman et al., 1991）、適応性ＮＫ細胞は上昇したレベルのＢＣＬ−２を発現する（Zhang et al., 2013）ことから、本発明者らは、対照およびＡＲＩＤ５Ｂノックダウン細胞におけるＢＣＬ−２発現をウェスタンブロットによって解析した。面白いことに、本発明者らは、ＡＲＩＤ５Ｂノックダウン細胞においてＢＣＬ−２発現の４４％の低下を観察した（図５Ｄ）。
【００５２】
ｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウン実験に加えて、本発明者らは、ＡＲＩＤ５Ｂバリアント２に対するオープンリーディングフレームＧＦＰカセットを含有するｐＣＤＨベクターを使用したレンチウイルス形質導入により、ＮＫ−９２細胞においてＡＲＩＤ５Ｂバリアント２を過剰発現もさせた。本発明者らは、空ベクター対照と比べて、過剰発現ベクターを形質導入された細胞においてＡＲＩＤ５Ｂの１．６２倍の増加を観察した（図６Ａ）。ＮＫ−９２細胞におけるＡＲＩＤ５Ｂ過剰発現は、ミトコンドリア膜電位の１．３１倍の増加をもたらした（図６Ｂ）。付加的に、本発明者らは、初代ＮＫ細胞に、対照およびＡＲＩＤ５Ｂ過剰発現ベクターを形質導入した。本発明者らは、ＡＲＩＤ５Ｂを過剰発現する細胞においてミトコンドリア膜電位の１．５７倍の増加を観察した（図６Ｃ）。ＡＲＩＤ５Ｂを過剰発現するＮＫ−９２細胞は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ解析によって判定される、より高い最大呼吸およびＳＲＣを呈したが（図６Ｄ）、解糖代謝（図６Ｅ）またはＡＴＰレベル（図６Ｆ）の統計的に有意な差は観察されなかった。機能的には、ＡＲＩＤ５Ｂ過剰発現細胞は、一晩のＩＬ−１２およびＩＬ−１８刺激に応答して、より高い頻度のＩＦＮ−γ産生を有した（図６Ｇ）。まとめると、これらのデータは、ＡＲＩＤ５Ｂが、ミトコンドリア膜電位、酸化的ミトコンドリア代謝、生存、およびＩＦＮ−γ産生に影響を与えることを示唆する。
【００５３】
ＡＲＩＤ５Ｂは電子伝達鎖複合体（ＥＴＣ）ＩＩＩ構成要素ＵＱＣＲＢの発現を直接調節し、ＵＱＣＲＢノックダウンはＡＲＩＤ５Ｂノックダウンの代謝的および機能的効果を表現型模写する
本発明者らのＲＮＡ−ｓｅｑデータの解析は、適応性ＮＫ細胞サブセットにおけるＥＴＣの構成要素をコードするいくつかの遺伝子のより高い発現のパターンを明らかにした（図２）。本発明者らは、ＡＲＩＤ５Ｂが、ＥＴＣ遺伝子の調節に直接的または間接的に関与し得るという仮説を立てた。この仮説を試験するために、本発明者らは、ＵＱＣＲＢをより詳細に調査することを選定した、なぜならそれが、本発明者らのＲＮＡ−ｓｅｑ解析において、全ＥＴＣ遺伝子の中で、標準的および適応性ＮＫ細胞間の差異的発現に対する最も高い統計的有意性を有したためである（１．４６倍、調整ｐ＝０．０３７）。ＵＱＣＲＢは、ミトコンドリア呼吸鎖における複合体ＩＩＩの核コード構成要素であり、それはＡＴＰ産生のための電子移動において必須の役割を担う（Haut et al., 2003）。適応性ＮＫ細胞におけるＵＱＣＲＢ発現の上昇を確認するために、本発明者らは、ＨＣＭＶ血清陽性ドナーから標準的および適応性ＮＫ細胞を選別し、ＵＱＣＲＢに対するウェスタンブロットを実施した。解析した両ドナー由来の細胞において、ＵＱＣＲＢタンパク質は適応性ＮＫ細胞において強く誘導された（１．９７倍）（図７Ａ）。本発明者らは、ｍＲＮＡ（図７Ｂ）およびタンパク質（図７Ｃ）レベルでの、ＡＲＩＤ５ＢノックダウンＮＫ−９２細胞におけるＵＱＣＲＢの発現の低下も確認した。
【００５４】
次に、本発明者らは、潜在的ＡＲＩＤ５Ｂ結合部位に対するＵＱＣＲＢ  ＴＳＳのすぐ上流にあるプロモーター領域を探した。ＡＲＩＤ５Ｂは、ＡＡＴＡ（Ｃ／Ｔ）コアコンセンサス配列に優先的に結合することが示されている（Whitson et al., 1999）。ＵＱＣＲＢのプロモーターにおいて３つのそのようなモチーフを同定した（図７Ｄ）。本発明者らは、次いで、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを実施して、ＵＱＣＲＢプロモーターへのポリメラーゼＩＩおよびＡＲＩＤ５Ｂ結合の両方を解析した。ＵＱＣＲＢ  ＴＳＳの１，７２８ｂｐ上流にある離れたＤＮＡ配列を、アッセイにおける結合特異性に対する対照として含んだ。本発明者らは、ポリメラーゼＩＩおよびＡＲＩＤ５Ｂの両方がＮＫ−９２細胞においてＵＱＣＲＢプロモーターに結合し、結合はＡＲＩＤ５Ｂノックダウンで実質的に弱まることを見い出した（図７Ｅ）。ＡＲＩＤ５Ｂが、初代適応性ＮＫ細胞においてＵＱＣＲＢプロモーター内で富化されるかどうかを判定するために、本発明者らは、標準的および適応性ＮＫ細胞を選別し、ＣｈＩＰアッセイを実施して、ＵＱＣＲＢの上流にある対照部位へのおよびＵＱＣＲＢプロモーターへのＡＲＩＤ５Ｂ結合を解析した。本発明者らは、標準的および適応性ＮＫ細胞の両方における、上流部位ではなくＵＱＣＲＢプロモーターへのＡＲＩＤ５Ｂ結合、ならびに適応性ＮＫ細胞におけるＡＲＩＤ５Ｂ結合の有意な富化を観察した（図７Ｆ）。ＡＲＩＤ５Ｂは、植物ホメオドメインフィンガー２（ＰＨＦ２）とのその相互作用を通じて遺伝子発現を促進する。ＡＲＩＤ５Ｂ−ＰＨＦ２複合体は、阻害性Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２ヒストン修飾を脱メチル化する特異的ヒストンデメチラーゼ複合体である（Baba et al., 2011）。ＵＱＣＲＢのプロモーター内のＨ３Ｋ９Ｍｅ２レベルがＡＲＩＤ５Ｂ結合およびＵＱＣＲＢ発現と逆相関するかどうかを判定するために、本発明者らは、初代標準的および適応性ＮＫ細胞を選別し、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２に特異的な抗体を用いてＣｈＩＰアッセイを実施した。本発明者らは、適応性ＮＫ細胞において、ＵＱＣＲＢプロモーターにおける有意により低いＨ３Ｋ９Ｍｅ２富化を観察した（図７Ｇ）。
【００５５】
ＡＲＩＤ５ＢによるＵＱＣＲＢ発現の直接調節を考慮して、本発明者らは、次に、ＵＱＣＲＢノックダウンの代謝的および機能的効果を判定しようと努めた。この目標のために、本発明者らは、ＮＫ−９２  ＮＫ細胞におけるＵＱＣＲＢ発現をレンチウイルス形質導入によりノックダウンした。この方法によって、本発明者らは、ＵＱＣＲＢ発現の３７％の低下を達成することができた（図８Ａ）。ミトコンドリア膜電位は、ＦＡＣＳによって解析した場合に、ＵＱＣＲＢノックダウンＮＫ−９２細胞において３３％低下した（図８Ｂ）。ＵＱＣＲＢノックダウン細胞に関して、最大呼吸およびＳＲＣの有意な低下が観察された（図８Ｃ）。対照的に、ＵＱＣＲＢノックダウン細胞において解糖の増加の傾向が観察されたが、とはいえＵＱＣＲＢノックダウン細胞および対照の間の最大解糖および解糖予備能の差は統計的に有意でなかった（図８Ｄ）。ＡＴＰレベルは、ＵＱＣＲＢノックダウン細胞および対照の間で同程度であった（図８Ｅ）。機能的には、本発明者らは、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８刺激に応答した、ＵＱＣＲＢノックダウンＮＫ−９２細胞によるＩＦＮ−γ産生の著しい欠損を観察した（図８Ｆ）。全体として、これらのデータは、ＡＲＩＤ５ＢがＵＱＣＲＢ発現を直接制御し、ＵＱＣＲＢのノックダウンがＡＲＩＤ５Ｂノックダウンを表現型模写することを示している。
【００５６】
考察
本発明者らは、代謝の増加が適応性ＮＫ細胞の増大および生存を支持するモデルを提案する。適応性ＮＫ細胞において観察される代謝の増強は、少なくとも一部には、ＡＲＩＤ５Ｂの発現の増加、およびＥＴＣ複合体ＩＩＩ遺伝子ＵＱＣＲＢを含めたＥＴＣの構成要素をコードする遺伝子のその誘導に依存するように見える。ＡＲＩＤ５Ｂノックダウンはアポトーシスの増加およびＢＣＬ−２発現の低下と関連していることから、ＡＲＩＤ５Ｂは、ＮＫ細胞生存において重大な役割を担うようにも見える。ミトコンドリアへのＢＣＬ−２局在は、ＥＴＣ活性の副産物であるＲＯＳの産生を妨げるため（Gimenez-Cassina and Danial, 2015）、適応性ＮＫ細胞におけるＢＣＬ−２の上昇は、酸化ストレスを抑えるために重要であり得る。ＡＲＩＤ５ＢがＢＣＬ−２および他の生存遺伝子を直接調節するかどうかは、さらなる検討を要する。
【００５７】
本明細書で提示されるノックダウンおよび過剰発現の調査に対する１つの注意事項は、代謝的および機能的解析において使用するのに十分に高い頻度で初代ＮＫ細胞に形質導入するまたはトランスフェクトすることの難しさに起因して、それらがＮＫ−９２細胞を使用して実施されたことである。ＮＫ−９２細胞は、すべての形質転換細胞と同じように、混乱させ得る重大な代謝的変更を有する。とはいえ、本発明者らのモデルは、呼吸鎖活性のリプレッサーであるＭＣＪ／ＤｎａＪＣ１５を欠くＣＤ８+  Ｔ細胞が、ＯＸＰＨＯＳの増加、より大きなミトコンドリア質量、サイトカイン除去中の生存の増強、ＩＦＮ−γを分泌する能力の増加、およびウイルス感染の優れた制御を呈することを示した以前の仕事（Champagne et al., 2016）と一致している。細胞傷害性リンパ球代謝に対するＡＲＩＤ５Ｂの代謝的および機能的効果は、ＭＪＣ／ＤｎａＪＣ１５喪失に関して報告されたものと非常に類似しているように見える。本発明者らの結果は、ＡＴＰ産生はそうではないが、ＥＴＣ活性がエフェクターメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ産生に必須であることを示した最近の仕事（Bantug et al., Immunity. 48:542-555.e6, 2018）とも一致している。本発明者らは、ＡＲＩＤ５Ｂが、ＥＴＣ遺伝子発現の制御によって、ＮＫ細胞代謝およびＩＦＮ−γ産生の態様を増強させ得ると結論付ける。
【００５８】
適応性ＮＫ細胞におけるＡＲＩＤ５Ｂの発現の増加、ならびにＯＸＰＨＯＳおよび生存を促進することにおけるＡＲＩＤ５Ｂの役割を示した本発明者らの結果を考慮すると、ＡＲＩＤ５Ｂは、ＴおよびＢ細胞メモリーサブセットにおける代謝および生存を制御することにおいて同様の役割を担う可能性がある。この考えを支持して、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ワールドワイドウェブでｉｍｍｇｅｎ．ｏｒｇを参照されたい）からの転写産物発現データは、非クラススイッチＢ細胞と比べて、成熟したクラススイッチＢ細胞におけるＡＲＩＤ５Ｂ発現の著しい増加を有する、ヒトＢ細胞成熟にわたるＡＲＩＤ５Ｂ発現の増加を示している。同様に、ＣＤ４+およびＣＤ８+セントラルおよびエフェクターメモリーＴ細胞の両方は、ナイーブサブセットと比べて、有意により高いＡＲＩＤ５Ｂ転写産物レベルを発現する。そのため、ＡＲＩＤ５Ｂの誘導は、細胞持続性および免疫学的メモリー形成を支持する一般的メカニズムを表し得る。
【００５９】
適応性ＮＫ細胞においてＡＲＩＤ５Ｂ発現がどのように誘導されるかは不明である。本発明者らは、ＮＫ細胞を炎症性サイトカイン（ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２）およびＣＤ１６またはＮＫＧ２Ｃアゴニスト抗体とともに培養する実験を実施したが、ＡＲＩＤ５Ｂの誘導を観察しなかった。実際には、ＡＲＩＤ５Ｂ転写産物発現レベルは、インビトロでの活性化中に減少した（図１２）。形質転換されたＴ細胞において、ＡＲＩＤ５Ｂは、発がん性転写因子のＴ細胞急性リンパ球性白血病１（ＴＡＬ１）の下流標的であり、急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞の生存および成長に要される（Leong et al, Genes Dev. 31:2343-2360）。ＴＡＬ１が初代リンパ球においてＡＲＩＤ５Ｂ発現を誘導し得るかどうかはまだ確定されていない。
【００６０】
まとめると、本発明者らの結果は、ＨＣＭＶ感染に応答して生じる適応性ＮＫ細胞が、免疫学的メモリーの規定された特徴を有するという見解を支持する。ＯＸＰＨＯＳ、ＳＲＣ、およびミトコンドリア質量の増加を含めたＴ細胞メモリーの特質も、ＨＣＭＶ血清陽性個体由来の適応性ＮＫ細胞において明らかである。本発明者らは、ＨＣＴレシピエントにおけるＨＣＭＶ再活性化後の適応性ＮＫ細胞の長期持続性、およびＩＦＮ−γを産生するそれらの増強した能力を促進し得る転写因子としてＡＲＩＤ５Ｂを同定する。さらに、本発明者らの結果は、ＡＲＩＤ５Ｂが、二次感染に対するリコール応答を支持するために重要な共通因子であり得ることを示唆する。ＡＲＩＤ５Ｂを増加させ、それゆえミトコンドリア機能およびＮＫ細胞持続性を増強させるストラテジーは、ＮＫ細胞免疫療法において治療的価値があり得る。
【００６１】
材料および方法
細胞供給源：健常な同意しているドナーから採取された、型判別されたＨＣＭＶ血清陽性およびＨＣＭＶ血清陰性血液産物は、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入された。すべてのサンプルは、受け取りの前に非特定化されており、ミネソタ大学における施設内審査委員会がこれらの調査を承認した。すべての研究は、ヘルシンキ宣言に従って行われた。すべての血液サンプルは、ドナー同意を有して採取された。
【００６２】
初代細胞単離、細胞株、および培養：ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｒｅｍｉｕｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、密度勾配遠心分離によって単離した。選別実験に関しては、Ｔ細胞およびＢ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９磁気ビーズ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して枯渇させた。表現型判定解析に関しては、ＮＫ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して陰性選択によって単離した。初代細胞を、サイトカインの非存在下において、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を補給されたＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で一晩培養した。ＮＫ−９２およびＫ５６２細胞をＡＴＣＣから獲得し、それらの取扱説明書に従って培養した。以下のサイトカインを培養実験において使用した：ＩＬ−１５（ＮＣＩ）、ＩＬ−２１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。プレートに結合した抗ＮＫＧ２Ｃアゴニスト抗体（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＪ．Ｐ．Ｈｏｕｃｈｉｎｓからの贈与）を一部の培養実験において使用した。
【００６３】
フローサイトメトリーおよび細胞選別：フローサイトメトリーに関しては、表面エピトープＣＤ３（ＯＫＴ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ５６（ＨＤＣＤ５６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ５７（ＮＫ−１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＮＫＧ２Ｃ（１３４５９１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＣＤ１０７ａ（Ｈ４Ａ３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する蛍光色素コンジュゲート抗体を使用した。細胞内ＥＡＴ−２を、ウサギポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ）、それに続いて蛍光色素コンジュゲート抗ウサギ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた二次染色を使用して染色した。サイトカインの細胞内染色を、ＩＦＮ−γ（Ｂ２７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＴＮＦ（ＭＡｂ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対する蛍光色素コンジュゲート抗体を使用して実施した。表現型判定解析に関しては、ＰＢＭＣまたは精製ＮＫ細胞を、ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを補給されたＰＢＳ）中のｆｉｘａｂｌｅ  ｄｅａｄ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、表示される抗体を用いて表面染色し、２％ホルムアルデヒド中で固定した。細胞内染色に関しては、細胞を０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）中で透過処理した。フローサイトメトリーデータをＬＳＲ  ＩＩ機器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ（ｖ１０、Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて解析した。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ、ＣｅｌｌＲｏｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、およびヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）染色を、製造業者の取扱説明書に従って実施した。選別実験に関しては、ＰＢＭＣを表示される抗体を用いて染色し、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ機器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で＞９５％純度に選別した。
【００６４】
Ｓｅａｈｏｒｓｅ代謝、ＡＴＰ定量、グルコース取り込み、およびアネキシンＶアッセイ：Ｓｅａｈｏｒｓｅアッセイを、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ  Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｔｅｓｔ  ＫｉｔおよびＳｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｔｏ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して解糖および酸化的ミトコンドリア代謝を同時に解析する修正を有して、製造業者の取扱説明書に従って実施した。簡潔には、ＮＫ細胞を洗浄し、グルコース不含培地（Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁した。ウェルあたり１×１０6個細胞を、ポリ−Ｌ−リジンをコーティングしたプレート上にスピンダウンした。バルクＰＢＭＣから単離されたＣＤ３-ＣＤ５６+  ＮＫ細胞および形質導入されたＮＫ−９２細胞を使用した実験のために、三連のウェルを設定した。グルコース、オリゴマイシン、フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、ピルビン酸ナトリウム、ロテノン、およびアンチマイシンＡを連続的に注射して、代謝機能を測定した。ＸＦe  ２４  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してプレートを解析した。選別された初代ＮＫ細胞を使用した実験に関しては、各集団からの５×１０5個細胞を三連のウェルに播き、ＸＦe  ９６  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、上記と同じプロトコールを使用して解析した。ＳＲＣ測定結果を、平均最大ＯＣＲ値−平均基礎ＯＣＲ値として算出した。ＡＴＰレベルを、平均基礎ＯＣＲ値−平均オリゴマイシン後ＯＣＲ値として算出した。解糖を、平均グルコース後ＥＣＡＲ値−平均基礎ＥＣＡＲ値として算出した。解糖予備能を、平均最大ＥＣＡＲ値−グルコース後ＥＣＡＲ値として算出した。グルコース取り込みアッセイに関しては、ＮＫ細胞を、５０μＭの最終濃度で蛍光標識グルコース類似体２−（Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２−デオキシグルコース（２−ＮＢＤＧ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する培地中で、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５のみ±抗ＣＤ１６抗体（１μｇ；３Ｇ８；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１時間、または±ＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μＭ）（Ｓｉｇｍａ）と１５分間培養した。ＡＴＰ定量アッセイに関しては、ウェルあたり１×１０2個ＮＫ細胞を、ＡＴＰ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＨＳ  ＩＩ（Ｓｉｇｍａ）を使用してアッセイし、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  ＰＲＯ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｅｃａｎ）で解析した。代謝阻害剤を使用したＡＴＰアッセイに関しては、細胞溶解およびＡＴＰ判定の前に、エトモキシル（４０μＭ）、２ＤＧ（５０ｍＭ）、およびＵＫ５０９９（５０ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）を１０分間添加した。細胞アポトーシス解析に関しては、細胞を、製造業者の取扱説明書に従って、アネキシンＶ  ＦＩＴＣおよびＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色した。
【００６５】
共焦点顕微鏡法：ミトコンドリア撮像実験に関しては、細胞を、製造業者の取扱説明書に従って、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色した。染色後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ  ２（Ｓｈａｎｄｏｎ）を用いてスライド上にスピンした。細胞を固定し、ＤＡＰＩ染色色素を有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）中に封入した。６０×油浸対物レンズを有するＦｌｕｏｖｉｅｗ  １０００共焦点走査ヘッドを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ正立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて画像を取得した。画像処理および蛍光強度定量を、Ｉｃｙオープンプラットフォームソフトウェア（ワールドワイドウェブでｉｃｙ．ｂｉｏｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ．ｏｒｇを参照されたい）を使用して実施した。
【００６６】
ＲＮＡ−ｓｅｑ実験：ＨＣＭＶ血清陽性ドナーの末梢血由来のＮＫ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ５７、およびＮＫＧ２Ｃの表面発現、ならびにＦｃεＲγ、ＥＡＴ−２、およびＳＹＫの細胞内発現についてＦＡＣＳによって解析した。高い適応性ＣＤ５６dimＣＤ５７+ＮＫＧ２Ｃ+  ＮＫ細胞頻度（全ＣＤ３-ＣＤ５６dim  ＮＫ細胞の≧１５％）、ならびにＮＫＧ２Ｃ+集団内に特異的なＦｃεＲγ、ＥＡＴ−２、および／またはＳＹＫの欠如に基づいて、５人のドナーを選択した。標準的ＣＤ３-ＣＤ５６dimＣＤ５７-ＮＫＧ２Ｃ-  ＮＫ細胞、標準的ＣＤ３-ＣＤ５６dimＣＤ５７+ＮＫＧ２Ｃ-  ＮＫ細胞、適応性ＣＤ３-ＣＤ５６dimＣＤ５７-ＮＫＧ２Ｃ+  ＮＫ細胞、および適応性ＣＤ３-ＣＤ５６dimＣＤ５７+ＮＫＧ２Ｃ+  ＮＫ細胞を選別した。ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。バーコード化ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  ｖ２ライブラリー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を創出し、ライブラリーを１００ｂｐのペアエンドとしてＨｉＳｅｑ  ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でシーケンシングした。ＳＴＡＲバージョン２．４．０ｄを使用して、ヒトゲノム参照ビルドＧＲＣｈ３７（ｈｇ１９）に対してＲＮＡ−ｓｅｑリードをアラインした。Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子アノテーションバージョン７５を、エクソン接合部サポートのための遺伝子移行フォーマット（ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｏｒｍａｔ）（ｇｔｆ）として提供した。各サンプルに対して、リードを遺伝子に割り当て、ＦｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ（ｓｕｂｒｅａｄパッケージバージョン１．４．５−ｐ１）を使用して要約した。生のリード数をＲ（バージョン３．２．０）に読み込ませ、Ｒ／バイオコンダクターｅｄｇｅＲパッケージにおいて実行されるＭ値正規化法のトリム平均による正規化に供し、分散をＲ／バイオコンダクターｌｉｍｍａパッケージからのｖｏｏｍを使用して正規化した。少なくとも２つのサンプルにおいて、少なくとも１００万あたり１カウント（ｃｏｕｎｔ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）（ＣＰＭ）のマッピングされたリードを有するすべての遺伝子をさらに解析した。Ｒ／バイオコンダクターｌｉｍｍａパッケージを使用して、差異的遺伝子発現を実施した。ＲＮＡ−ｓｅｑデータは、ＧＥＯ登録番号ＧＳＥ１１７６１４の下に見い出され得る。
【００６７】
ゲノムワイドＤＮＡメチル化解析：表示されるＮＫ細胞サブセットをＨＣＭＶ血清陽性ドナーの末梢血から選別し、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを抽出した。ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、非メチル化シトシンをウラシルに変換した。バイサルファイト変換されたＤＮＡを、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ４５０  ＢｅａｄＣｈｉｐプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて解析した。関連付けされた生データを用いた解析パイプラインについての包括的な説明は、以前に公開されている（Schlums et al., 2015. Immunity. 42:443-456）。
【００６８】
プラスミドおよびレトロウイルス形質導入：すべてのＡＲＩＤ５Ｂ  ｓｈＲＮＡ、ＵＱＣＲＢ  ｓｈＲＮＡ、および対照ベクター（ｐＬＫＯ．１）は、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入された。試験した３つのＡＲＩＤ５ＢクローンからのｓｈＲＮＡ標的配列は、クローン１０４０；５’−ＣＣＧＧＧＣＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＴＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＡＡＴＧＧＴＴＣＴＣＴＴＴＧＡＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号１）、クローン１２８１；５’−ＣＣＧＧＣＧＡＴＡＧＡＡＣＧＡＡＴＡＣＣＣＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＡＧＧＧＴＡＴＴＣＧＴＴＣＴＡＴＣＧＴＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号２）、およびクローン２８５３；５’−ＣＣＧＧＣＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＣＧＡＡＣＧＴＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＣＧＴＴＣＧＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＧＴＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号３）であった。試験したＵＱＣＲＢクローンからのｓｈＲＮＡ標的配列は、５’−ＣＣＧＧＣＣＴＡＡＡＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＣＣＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＧＧＴＣＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＴＡＧＧＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号４）であった。ＡＲＩＤ５Ｂバリアント２オープンリーディングフレームのカスタムｇＢｌｏｃｋ遺伝子フラグメント（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をｐＣＤＨベクター（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内に、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用した制限消化によってクローニングすることによって、ＡＲＩＤ５Ｂバリアント２過剰発現ベクターを創出し、１μｇ／μｌのポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、レンチウイルスパッケージングベクターとともに２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＡＲＩＤ５Ｂバリアント２に対する配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３２１９９）は、ＵＣＳＣゲノムブラウザーサイト（ワールドワイドウェブでｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕを参照されたい）でのＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９ゲノムアセンブリからのものであった。ウイルス粒子を含有する上清を使用して、スピン形質導入によりＮＫ−９２細胞または初代ＮＫ細胞に形質導入した。安定なＮＫ−９２株を、ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を用いて選択した。初代ＮＫ細胞を使用した形質導入実験に関しては、形質導入された細胞を、ＦＡＣＳ解析の前に、低濃度（１ｎｇ／ｍｌ）のＩＬ−１５中で４８時間培養した。
【００６９】
ウェスタンブロット：細胞を氷冷溶解バッファー中で溶解し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでランした。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、ＴＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）バッファー中５％ＢＳＡ中にて室温で１時間インキュベートした。次いで、膜を、ＴＴＢＳ中１：１０００の希釈のＡＣＴＢ（ｓｃ−４７７７８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＡＲＩＤ５Ｂ（ＮＢＰ１−８３６２２、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ＢＣＬ−２（ａｂ６９２、Ａｂｃａｍ）、またはＵＱＣＲＢ（ａｂ１９０３６０、Ａｂｃａｍ）に対する一次抗体とともに一晩インキュベートした。膜を洗浄し、１：２０００希釈の抗ウサギまたは抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ二次抗体とともに１時間インキュベートした。免疫反応性バンドを、ＥＣＬ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてＵＶＰイメージングシステムで撮像した。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所）を使用して、密度測定解析を実施した。
【００７０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ：遺伝子発現の定量に関しては、細胞をＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）中で溶解し、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｑＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。ミトコンドリアの核ＤＮＡに対する比を判定するためのｑＲＴ−ＰＣＲベースのアッセイを、以前に記載されるように実施した。遺伝子発現およびＤＮＡ定量の解析のために使用されたプライマー配列は、以下のとおりである。
【００７１】
ＡＣＴＢ順方向、５’−ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＡＴＣ  ＡＡ−３’（配列番号５）；ＡＣＴＢ逆方向、５’−ＡＣＡ  ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＡＣ−３’（配列番号６）；ＮＤＵＦＳ４順方向、５’−ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＡＣＡ  ＴＴＧ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＧＧ−３’（配列番号７）；ＮＤＵＦＳ４逆方向、５’−ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＣＡＣＡ−３’（配列番号８）；ＮＤＵＦＳ５順方向、５’−ＧＣＡ  ＧＣＧ  ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＡＡ−３’（配列番号９）；ＮＤＵＦＳ５逆方向、５’−ＣＴＴ  ＴＧＡ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＴＴＧ  ＴＣＧ−３’（配列番号１０）；ＮＤＵＦＢ５順方向、５’−ＣＴＣ  ＣＧＡ  ＡＡＧ  ＣＡＡ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＡＣ−３’（配列番号１１）；ＮＤＵＦＢ５逆方向、５’−ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＣＡ−３’（配列番号１２）；ＵＱＣＲＨ順方向、５’−ＣＣＡ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＣＴＴ  ＧＡＡＡ−３’（配列番号１３）；ＵＱＣＲＨ逆方向、５’−ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＧＴＡ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＡＡＡ  ＣＣＡ−３’（配列番号１４）；ＵＱＣＲＢ順方向、５’−ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＡＡＧＡ−３’（配列番号１５）；ＵＱＣＲＢ逆方向、５’−ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＡＡ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＣＡＴＴ−３’（配列番号１６）；ＵＱＣＲＢ−３５１ｂｐ  ＣｈＩＰ順方向、５’−ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＡＡ−３’（配列番号１７）；ＵＱＣＲＢ−３５１ｂｐ  ＣｈＩＰ逆方向、５’−ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＴＴＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＣＡ−３’（配列番号１８）；ＵＱＣＲＢ−１，７２８ｂｐ  ＣｈＩＰ順方向、５’−ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＡＣＴ  ＡＴＣ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＣＣＣ  ＴＡＡ  ＴＴＧ−３’（配列番号１９）；ＵＱＣＲＢ−１，７２８ｂｐ  ＣｈＩＰ逆方向、５’−ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＡＡＡ−３’（配列番号２０）；ミトコンドリアトランスファーＲＮＡ−Ｌｅｕ（ＵＲＲ）順方向、５’−ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＡＧＡ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＴ−３’（配列番号２１）；ミトコンドリアトランスファーＲＮＡ−Ｌｅｕ（ＵＲＲ）逆方向、５’−ＴＧＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＴＡ  ＴＧＴ  ＴＧＴ  ＴＡ−３’（配列番号２２）；Ｂ２Ｍ順方向、５’−ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＣＴＣ  ＣＡＴ  ＧＴＴ  ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＡＴＣＴ−３’（配列番号２３）；およびＢ２Ｍ逆方向、５’−ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＡＡＧＴ−３’（配列番号２４）。すべての遺伝子発現解析をＡＣＴＢに対して正規化した。
【００７２】
ＣｈＩＰ（クロマチン免疫沈降）アッセイ：２．５×１０6個のホルムアルデヒド固定細胞のアリコートを５０μｌの核単離バッファー（Ａｂｃａｍ）中に再懸濁した。１５Ｕ  ＭＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加しおよび３７℃で５分間インキュベートすることによって、クロマチンを消化した。ＥＤＴＡを添加して反応を停止させた。消化されたクロマチンを、ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を有する免疫沈降バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および５ｍＭ酪酸ナトリウム）中に希釈し、プロテインＧアガロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて４℃で１時間プレクリアした。プレクリアされたクロマチンを、ＡＲＩＤ５Ｂ（ＮＢＰ１−８３６２２、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ  ＣＴＤリピートＹＳＰＴＳＰＳ（配列番号２６）（ホスホＳ５；ａｂ５１３１；Ａｂｃａｍ）、またはヒストンＨ３（ジメチルＫ９；ａｂ１２２０；Ａｂｃａｍ）のいずれかに対する抗体とともに４℃で一晩免疫沈降した。サンプルを洗浄し、溶出し、架橋を６５℃での４時間のインキュベーションで逆転させた。ＤＮＡを沈降させ、ｑＲＴ−ＰＣＲによって解析した。
【００７３】
ＮＫ細胞エフェクター機能アッセイ：ＮＫ細胞脱顆粒の判定に関しては、ＡＲＩＤ５Ｂ  ｓｈＲＮＡおよび対照ＮＫ−９２細胞を、単独で、またはＫ５６２標的細胞と１：１比で４時間培養した。次いで、細胞を固定し、表面ＣＤ１０７ａ発現およびＩＦＮ−γの細胞内発現についてＦＡＣＳによって解析した。ＩＦＮ−γ産生の付加的な判定に関しては、細胞を、染色前に、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに一晩インキュベートした。
統計解析：ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ５．０）を用いて、統計値を算出した。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表現されている。群間の差は、スチューデントｔ検定によって判定された。＜０．０５のｐ値を統計的に有意であると見なした（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１）。
【００７４】
参考文献
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2021523717.tif 000007
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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