(57)【要約】  本開示の側面は、網膜色素変性症を処置するのに有用な方法および組成物に関する。いくつかの側面において、本開示は、対象における内在性ＲＨＯ遺伝子の一方または両方のアレル（例えば、網膜色素変性症に関連する変異型ｒｈｏアレル）の発現を低減するために、干渉ＲＮＡを対象に送達するための組成物および方法を提供する。いくつかの態様において、干渉ＲＮＡに耐性のある置換ＲＨＯコード配列もまた、対象に送達される。
2021525531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヌクレオチド配列ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡ（配列番号１）を含むセンス鎖、
ｂ）ヌクレオチド配列ＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣ（配列番号２）を含むアンチセンス鎖、および
ヌクレオチド配列ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号３）を含むループ、
を含む、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）。
【請求項２】
ヌクレオチド配列：ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡＵＵＣＡＡＧＡＧＡＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣ（配列番号４）を含む、請求項１に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のｓｈＲＮＡをコードする、ベクター。
【請求項４】
ｓｈＲＮＡによって標的化される配列を含まない組換えＲＨＯコード配列をさらに含む、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
組換えＲＨＯコード配列が、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
組換えＲＨＯコード配列が、配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項４または５に記載のベクター。
【請求項７】
組換えＲＨＯコード配列が、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項９】
ベクターが、配列番号６のヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
ベクターがプラスミドである、請求項３〜９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１】
ベクターがウイルスベクターである、請求項３〜９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２】
ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
ｒＡＡＶベクターが自己相補的である、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のｒＡＡＶベクターを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子。
【請求項１５】
ｒＡＡＶウイルス粒子が、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）ウイルス粒子である、請求項１４に記載のｒＡＡＶ粒子。
【請求項１６】
請求項１もしくは２に記載のｓｈＲＮＡ、請求項３〜１３のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１４もしくは１５に記載のｒＡＡＶ粒子、および薬学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項１７】
対象におけるＲＨＯ発現を調節する方法であって、請求項１６に記載の組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
対象における網膜色素変性症を処置する方法であって、請求項１６に記載の組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
対象がヒト対象である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
網膜色素変性症の処置に使用するための、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
網膜色素変性症を処置する医薬の製造に使用するための、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２２】
網膜色素変性症の処置における、請求項１６に記載の組成物の使用。
【請求項２３】
網膜色素変性症を処置するための医薬の製造における、請求項１６に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
短ヘアピン酸（ｓｈＲＮＡ）分子であって、以下：
ａ）次の配列セットの１つを含むセンス鎖およびアンチセンス鎖：
ｉ）ヌクレオチド配列ＣＵＧＣＣＵＡＣＡＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵ（配列番号２１）を含むセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＵＧＵＡＧＧＣＡＧ（配列番号２２）を含むアンチセンス鎖；
ｉｉ）ヌクレオチド配列ＣＣＵＡＣＡＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵＧＡＵ（配列番号２３）を含むセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＡＵＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＵＧＵＡＧＧ（配列番号２４）を含むアンチセンス鎖；
ｉｉｉ）ヌクレオチド配列ＧＣＡＵＧＧＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＵ（配列番号２５）を含むセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＡＣＣＡＵＧＡＵＧＡＵＧＡＣＣＡＵＧＣ（配列番号２６）を含むアンチセンス鎖；または
ｉｖ）ヌクレオチド配列ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡ（配列番号１）を含むセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣ（配列番号２）を含むアンチセンス鎖；および
ｂ）ヌクレオチド配列ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号３）を含むループ；
を含む、前記短ヘアピン酸（ｓｈＲＮＡ）分子。
【請求項２５】
請求項２４に記載のｓｈＲＮＡをコードする、ベクター。
【請求項２６】
ｓｈＲＮＡによって標的化される配列を含まない組換えＲＨＯコード配列をさらに含む、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
組換えＲＨＯコード配列が、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
組換えＲＨＯコード配列が、配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項２６または２７に記載のベクター。
【請求項２９】
組換えＲＨＯコード配列が、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
ベクターがプラスミドである、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３１】
ベクターがウイルスベクターである、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３２】
ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
ｒＡＡＶベクターが自己相補的である、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
請求項３２または３３に記載のｒＡＡＶベクターを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子。
【請求項３５】
ｒＡＡＶウイルス粒子が、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）ウイルス粒子である、請求項３４に記載のｒＡＡＶ粒子。
【請求項３６】
請求項２４に記載のｓｈＲＮＡ、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載のベクター、または請求項３４もしくは３５に記載のｒＡＡＶ粒子、および薬学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項３７】
対象におけるＲＨＯ発現を調節する方法であって、請求項３６に記載の組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３８】
対象における網膜色素変性症を処置する方法であって、請求項３６に記載の組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３９】
対象がヒト対象である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
網膜色素変性症の処置に使用するための、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４１】
網膜色素変性症を処置する医薬の製造に使用するための、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４２】
網膜色素変性症の処置における、請求項３６に記載の組成物の使用。
【請求項４３】
網膜色素変性症を処置するための医薬の製造における、請求項３６に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年６月１日に出願された米国仮出願第62/679,585号および２０１９年２月２２日に出願された米国仮出願第62/809,539号の出願日の利益を主張し、それぞれの内容全体は参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
常染色体優性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）は、１２，０００人に１人が罹患する失明病である。これらの個体のかなりの割合が、網膜の光受容細胞の集光性色素タンパク質であるロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）に変異を有する。いずれかの親からの変異遺伝子の継承が網膜変性および最終的な失明をもたらすため、この疾患は優性である。ＲＨＯで特定された１００以上の異なる変異が失明につながる。現在、ａｄＲＰに対して承認された薬物療法または遺伝子治療法はない。したがって、ａｄＲＰおよび関連する状態のありとあらゆる原因に関連する効果的な処置の選択肢が必要である。
【発明の開示】
【０００３】
概要
本開示の側面は、対象（例えば、ヒト）における網膜色素変性症（例えば、優性網膜色素変性症）を処置するための組成物および方法に関する。いくつかの態様において、対象（例えば、ヒト）のロドプシン遺伝子（ＲＨＯ遺伝子）の一方または両方のアレルは、対象（例えば、網膜色素変性症を有する対象、例えば優性網膜色素変性症を有するヒト）に短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を投与することにより、サイレンシングされる。いくつかの態様において、置換ＲＨＯコード配列はまた、対象に投与されて、機能的ＲＨＯタンパク質を提供し、例えば光受容体機能を対象に回復させる。いくつかの態様において、置換ＲＨＯコード配列は、置換遺伝子を干渉ＲＮＡの効果に対して耐性にする内在性遺伝子アレル（単数または複数）と比較して、１つ以上のヌクレオチド置換を有する。いくつかの態様において、置換ＲＨＯコード配列は、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）の置換を含み、ｓｈＲＮＡによって媒介される分解に対して遺伝子を耐性にする（「硬化」とも呼ばれる）、ヒトＲＨＯコード配列（例えば、野生型ヒトＲＨＯコード配列）である。
いくつかの側面において、本開示は、ヌクレオチド配列ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡ（配列番号１）を含むセンス鎖、ヌクレオチド配列ＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣ（配列番号２）を含むアンチセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号３）を含むループ、を含む、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を提供する。
【０００４】
いくつかの側面において、本開示は、ヌクレオチド配列ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡ（配列番号１）を含むセンス鎖、ヌクレオチド配列ＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣ（配列番号２）を含むアンチセンス鎖、およびループを含む、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を提供する。ループは９つのヌクレオチドからなっていてもよい。
いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、ヌクレオチド配列：ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡＵＵＣＡＡＧＡＧＡＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣ（配列番号４）を含む。いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡＵＵＣＡＡＧＡＧＡＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣ（配列番号４）からなる。いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、ヌクレオチド配列：ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡＵＵＣＡＡＧＡＧＡＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣＵＵ（配列番号３６）を含む。いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡＵＵＣＡＡＧＡＧＡＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣＵＵ（配列番号３６）からなる。
【０００５】
いくつかの側面において、本開示は、以下を含む、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を提供する：ａ）以下の配列のセットの１つを含むセンス鎖およびアンチセンス鎖：ｉ）ヌクレオチド配列ＣＵＧＣＣＵＡＣＡＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵ（配列番号２１）を含むセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＵＧＵＡＧＧＣＡＧ（配列番号２２）を含むアンチセンス鎖；ｉｉ）ヌクレオチド配列ＣＣＵＡＣＡＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵＧＡＵ（配列番号２３）を含むセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＡＵＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＵＧＵＡＧＧ（配列番号２４）を含むアンチセンス鎖；ｉｉｉ）ヌクレオチド配列ＧＣＡＵＧＧＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＵ（配列番号２５）を含むセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＡＣＣＡＵＧＡＵＧＡＵＧＡＣＣＡＵＧＣ（配列番号２６）を含むアンチセンス鎖；またはｉｖ）ヌクレオチド配列ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡ（配列番号１）を含むセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣ（配列番号２）を含むアンチセンス鎖；および、ｂ）ヌクレオチド配列ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号３）を含むループ。
【０００６】
いくつかの側面において、本開示は、以下を含む、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を提供する：ａ）以下の配列のセットの１つを含むセンス鎖およびアンチセンス鎖：ｉ）ヌクレオチド配列ＣＵＧＣＣＵＡＣＡＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵ（配列番号２１）を含むセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＵＧＵＡＧＧＣＡＧ（配列番号２２）を含むアンチセンス鎖；ｉｉ）ヌクレオチド配列ＣＣＵＡＣＡＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵＧＡＵ（配列番号２３）を含むセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＡＵＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＵＧＵＡＧＧ（配列番号２４）を含むアンチセンス鎖；ｉｉｉ）ヌクレオチド配列ＧＣＡＵＧＧＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＵ（配列番号２５）を含むセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＡＣＣＡＵＧＡＵＧＡＵＧＡＣＣＡＵＧＣ（配列番号２６）を含むアンチセンス鎖；またはｉｖ）ヌクレオチド配列ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡ（配列番号１）を含むセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣ（配列番号２）を含むアンチセンス鎖；および、ｂ）９つのヌクレオチドからなるループ。
【０００７】
いくつかの態様において、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子は、以下のヌクレオチド配列の１つを含むか、またはそれからなる：ＣＵＧＣＣＵＡＣＡＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＵＧＵＡＧＧＣＡＧ（配列番号２７）；ＣＣＵＡＣＡＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵＧＡＵＵＵＣＡＡＧＡＧＡＡＵＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＵＧＵＡＧＧ（配列番号２８）；ＧＣＡＵＧＧＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＵＵＵＣＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＵＧＡＵＧＡＵＧＡＣＣＡＵＧＣ（配列番号２９）；またはＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡＵＵＣＡＡＧＡＧＡＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣ（配列番号４）。いくつかの態様において、短ヘアピン酸（ｓｈＲＮＡ）分子は、以下のヌクレオチド配列の１つを含むか、またはそれからなる：ＣＵＧＣＣＵＡＣＡＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵＵＵＣＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＵＧＵＡＧＧＣＡＧＵＵ（配列番号３７）；ＣＣＵＡＣＡＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵＧＡＵＵＵＣＡＡＧＡＧＡＡＵＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＵＧＵＡＧＧＵＵ（配列番号３８）；ＧＣＡＵＧＧＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＵＵＵＣＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＵＧＡＵＧＡＵＧＡＣＣＡＵＧＣＵＵ（配列番号３９）；またはＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡＵＵＣＡＡＧＡＧＡＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣＵＵ（配列番号３６）。
【０００８】
他の側面において、本開示は、上記の態様のいずれか１つまたは本明細書に別に記載のｓｈＲＮＡをコードする、ベクターを提供する。いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡコード配列は、プロモーター、例えば、ヒトＨ１ ＲＮＡプロモーターに、作動可能に連結されている。
いくつかの態様において、ベクターはさらに、ｓｈＲＮＡによって標的とされる配列を含まない、組換えＲＨＯコード配列を含む。いくつかの態様において、組換えＲＨＯコード配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの態様において、組換えＲＨＯコード配列は、配列番号５のヌクレオチド配列と、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一である、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、組換えＲＨＯコード配列は、配列番号５のヌクレオチド配列と、１、２、３、４、５、または５〜１０ヌクレオチド異なる、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、組換えＲＨＯコード配列は、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、組換えＲＨＯコード配列は、プロモーター、例えばヒトオプシン近位プロモーターに、作動可能に連結されている。いくつかの態様において、ベクターはプラスミドである。いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは自己相補的である。
【０００９】
他の側面において、本開示は、配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるヌクレオチド配列を含む、ベクターを提供する。いくつかの態様において、組換えＲＨＯコード配列は、配列番号６のヌクレオチド配列と１、２、３、４、５、または５〜１０ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ベクターは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ベクターはプラスミドである。いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは自己相補的である。
さらに他の側面において、本開示は、上記または本明細書に別に記載のｒＡＡＶベクターのいずれか１つを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を提供する。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ血清型５（ｒＡＡＶ５）粒子である。
【００１０】
他の側面において、本開示は、上記または本明細書に別に記載のｓｈＲＮＡ、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子のいずれか１つ、および薬学的に許容し得る担体を含む、組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、対象（例えば、ヒト対象）におけるＲＨＯ発現を調節する方法を提供し、方法は、対象に組成物を投与することを含む。いくつかの態様において、本開示は、対象（例えば、ヒト対象）における網膜色素変性症を処置する方法を提供し、方法は、対象に組成物を投与することを含む。いくつかの態様において、対象は哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、げっ歯類またはイヌである。いくつかの態様において、哺乳動物はヒト（例えば、網膜色素変性症、例えば優性網膜色素変性症を有しているかまたは有することが知られている、例えば有すると診断された、ヒト）である。いくつかの態様において、組成物は、網膜色素変性症の処置に使用するためのものである。いくつかの態様において、組成物は、網膜色素変性症を処置するための医薬の製造に使用するためのものである。
これらおよび他の側面は、以下の図面、例、および特許請求の範囲に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本開示の特定の側面をさらに実証するために含まれており、本開示は、これらの図面の１つ以上を本明細書に提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせて参照することにより、よりよく理解することができる。図面に示されているデータは、決して本開示の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【００１２】
【図１Ａ−１Ｈ】図１Ａ〜１Ｈは、ヒトロドプシン（ＲＨＯ）の野生型（ＷＴ）、Ｐ２３Ｈ、Ｔ１７Ｍ、およびｓｈＲＮＡ８２０耐性（ＲＨＯ８２０）バリアントの、ｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウンを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＷＴ、Ｐ２３Ｈ、Ｔ１７Ｍ、またはｓｈＲＮＡ８２０耐性（ＲＨＯ８２０）ヒトＲＨＯのいずれかを発現するプラスミド、およびＣ末端ｔｕｒｂｏＧＦＰタグ（ＲＨＯ−ｔＧＦＰ）、ならびに空のＤＮＡ（ｓｈＲＮＡなし）、対照ｓｈＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ１３１、ｓｈＲＮＡ１３４、またはｓｈＲＮＡ８２０のいずれかをコードするｒＡＡＶ２プラスミド（レーンラベルで示される）をトランスフェクトした。ＤＮＡトランスフェクションなしの対照も含めた。（図１Ａ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｇ）ｔｕｒｂｏＧＦＰタグおよび負荷対照としてのβチューブリンについてプローブされたトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から単離したタンパク質試料の免疫ブロット。（図１Ｂ、１Ｄ、１Ｆ、１Ｈ）ＲＨＯ−ＧＦＰの単量体型（上段）およびＲＨＯ−ＧＦＰの単量体および凝集型（下段）の、相対的定量化。各ウエスタンブロットの最初のレーンは、Li-CorのChameleon Duo Pre-stained Protein Ladderを含む。バーは３つの技術的複製の平均値を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。ｎｓ．＝有意性なし、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【００１３】
【図２Ａ−２Ｈ】図２Ａ〜２Ｈは、野生型（ＷＴ）の網膜でのｓｈＲＮＡ８２０によるロドプシンの抑制を示す。（図２Ａ〜２Ｃ）１×１０１１（図２Ｂ）および５×１０１１ｖｇ／ｍＬ（図２Ｃ）の力価でのｓｃＡＡＶ２／５−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０の注射後７〜８週間の、代表的なＷＴの眼からのin vivoイメージング結果を、注射なしの対照（図２Ａ）と比較したものである。示されているのは、ＯＣＴスキャン（左）、正規化された内節／外節（ＩＳ／ＯＳ）強度トポグラフィー（中央）、および外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さトポグラフィー（右）である。点線、注射ブレブ境界。矢印、左側に示されているＯＣＴの位置。（図２Ｄ、２Ｅ）様々な力価を注射した１０の眼における、注射ブレブ内（水平線の影付き円、上部パネル）および注射なしの対照の位置（対角線の影付き円、下部パネル）でサンプリングされた、正規化されたＩＳ／ＯＳ強度（図２Ｄ）およびＯＮＬ厚さ（図２Ｅ）。記号は、３３〜９５の試料のグループ平均（±ＳＤ）を表す（図１２を参照）。破線は、注射なしの対照眼の同じ網膜位置でサンプリングされたそれぞれのパラメータの、９９パーセンタイル限界を示す。下向き矢印は、検出可能な効果への移行に対応する力価を推定する。（図２Ｆ）ヘマトキシリン／エオシン染色（上段）およびロドプシン（ＲＨＯ）免疫標識した網膜凍結切片の顕微鏡写真で、処置あり（Ｔｘ；１〜１０×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価範囲）領域および未処置（ＵｎＴｘ）領域における、注射後７〜８週間のＯＮＬおよび外節（ＯＳ）の形態を示す。（図２Ｇ）１〜５０×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価で処置したＷＴイヌの網膜の概略図であり、注射後７〜８週間のロドプシン（ＲＮＡおよびタンパク質）発現の定量化に使用した神経網膜パンチの位置を示す。破線、ブレブ境界；点描領域：タペート領域。（図２Ｈ）異なるベクター力価を注射した眼の未処置領域で測定されたレベルのパーセンテージとしての、処置網膜領域に残る内在性イヌ科ＲＨＯ ＲＮＡのレベルの定量化。代表的な免疫ブロットおよび、異なるベクター力価を注射した眼の未処置領域で測定されたレベルのパーセンテージとしての、処置網膜領域に残る内在性イヌ科ＲＨＯタンパク質のレベルの定量化。N282-OD等のラベルは動物と眼を示す。ＯＳａｓＯＤの指定は、比較のために左眼が右眼として表示されることを意味する。
【００１４】
【図３Ａ−３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、ＲＨＯ変異網膜におけるｓｈＲＮＡ８２０によるロドプシンの抑制を示す。（図３Ａ）ｓｃＡＡＶ２／５−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０を１〜１０×１０１１ｖｇ／ｍＬの力価で注射した４つのＲＨＯ変異のイヌの眼の眼底の概略図であり、注射後８〜１０週間でのロドプシン（ＲＮＡおよびタンパク質）の発現の定量化に使用した神経網膜パンチの位置を示す。破線、ブレブ境界；点描領域：タペート領域。（図３Ｂ）異なる力価を注射した眼の未処置領域で測定されたレベルのパーセンテージとしての、処置網膜領域に残る内在性イヌ科ＲＨＯ ＲＮＡのレベルの定量化。代表的な免疫ブロットおよび、１〜５０×１０１１ｖｇ／ｍＬの力価を注射した眼の未処置領域で測定されたレベルのパーセンテージとしての、処置網膜領域に残る内在性イヌ科ＲＨＯタンパク質のレベルの定量化。（図３Ｃ）１〜１０×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価で処置した４つのＲＨＯ変異のイヌの眼における、露光後２週間（注射後８〜１０週間）の外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さトポグラフィー。点線、ブレブ境界；破線、ＯＮＬ救出境界。挿入図、有意性のマップであり、網膜領域をＯＮＬの厚さ（左）およびＩＳ／ＯＳ強度（右）の値と共に、ポイント毎に注射なし対照の９９パーセンタイル信頼区間と比較して示す。（図３Ｄ）Ｈ＆Ｅ染色（上段）およびロドプシン（ＲＨＯ）／ヒト錐体アレスチン（ｈＣＡ）共免疫標識の、網膜凍結切片の顕微鏡写真であり、処置（Ｔｘ；１〜１０×１０１１ｖｇ／ｍＬの力価範囲）および（図３Ｃ）に示されている同じ眼の未処置（ＵｎＴｘ）領域における、露光後２週間（注射後８〜１０週間）の、ＯＮＬおよび外節（ＯＳ）の形態を示す。
【００１５】
【図４Ａ−４Ｇ】図４Ａ〜４Ｇは、ロドプシンの単一ベクターによる抑制および置換が、ＲＨＯ変異網膜における網膜変性を防止することを示す。（図４Ａ〜４Ｂ）ｓｃＡＡＶ２／５−ｈＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０を５×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価で注射した２つのＲＨＯ変異眼における、注射後／露光前（注射後）および露光後２週間（ＬＥ後）の、外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さトポグラフィー。点線、ブレブ境界；破線、ＯＮＬ救出境界。挿入図、図３Ａ〜３Ｅに記載の有意性のマップ。（図４Ｃ〜４Ｄ）ロドプシン（ＲＨＯ）／ヒト錐体アレスチン（ｈＣＡ）共免疫標識の網膜凍結切片であり、（図４Ａ〜４Ｂ）に示される同じ眼の処置および未処置（ＵｎＴｘ）領域におけるＯＮＬおよび外節（ＯＳ）の形態を示す。（図４Ｅ）５×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価を注射した４つのＲＨＯ変異のイヌの眼の眼底の概略図であり、ロドプシン（ＲＮＡおよびタンパク質）発現の定量化に使用した神経網膜パンチの位置を示す。破線、ブレブ境界；点描領域：タペート領域。（図４Ｆ）注射した眼の未処置領域で測定されたレベルのパーセンテージとしての、処置網膜領域に残る内在性イヌ科ＲＨＯ ＲＮＡのレベルの定量化。（図４Ｇ）注射した眼の未処置領域で測定された内在性イヌ科ＲＨＯの生理学的レベルのパーセンテージとしての、処置網膜領域に存在する外在性ヒトＲＨＯ ＲＮＡ（ＲＨＯ８２０）のレベルの定量化。代表的な免疫ブロットおよび、注射した眼の未処置領域で測定されたレベルのパーセンテージとしての、処置網膜領域に残る総（内在性イヌ科およびＲＨＯ８２０）ＲＨＯタンパク質のレベルの定量化。
【００１６】
【図５Ａ−５Ｄ】図５Ａ〜５Ｄは、最大５週間までロドプシンの抑制と置換を組み合わせた単一ベクターで処置したＲＨＯ変異網膜における、網膜の構造および機能の保護を示す。（図５Ａ）上段、２匹のＲＨＯ変異イヌの片方の眼（ＢＳＳを注射した眼の反対側の眼）における、ｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０（５×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価）の注射の時点、露光（ＬＥ１〜ＬＥ４）、ＯＣＴイメージングおよびＥＲＧセッションを示すタイムライン。下段、ｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０を注射した眼の、注射前、注射後１１週間（ＬＥ１の直前）、ＬＥ１後１．５週間、およびＬＥ４後２．１週間の、代表的な外顆粒層（ＯＮＬ）厚さのマップ。破線、ＯＮＬ救出境界。視神経頭（黒丸）および主要血管（黒実線）、タペート境界（灰色実線）、および中心窩様領域（楕円）が重なっている（中段）。挿入図、図３Ａ〜３Ｅに記載の有意性のマップ。（図５Ｂ）ｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０を注射した２つのＲＨＯ変異眼の処置領域内のＯＮＬ厚さおよびＩＳ／ＯＳ強度の定量化のためにサンプリングされた、網膜の位置を示す概略図（左）。注射なしの対照と比較した、注射した眼におけるＯＮＬ厚さ（中央）およびＩＳ／ＯＳ強度（右）の平均（±ＳＤ）の差の縦方向の定量化。水平の破線は、ＷＴの変動の限界（＋／−３ＳＤ）を表す。（図５Ｃ）片方の眼にｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０（実線）を、および反対側の眼にＢＳＳ（破線）を注射したＲＨＯ変異イヌの４回の露光セッションそれぞれの約２週間後に、杆体（−１．７ ｌｏｇ ｃｄ．ｓ．ｍ−２）、混合杆体−錐体（０．５１ ｌｏｇ ｃｄ．ｓ．ｍ−２）の代表的なＥＲＧトレースは暗順応を、および単一刺激（０．５１ ｌｏｇ ｃｄ．ｓ．ｍ−２）または２９Ｈｚの錐体フリッカー（０．２６ ｌｏｇ ｃｄ．ｓ．ｍ−２）に対する錐体応答は明順応を記録した。（図５Ｄ）片方の眼にｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０（水平線陰影）を、および反対側の眼にＢＳＳ（対角線陰影）を、（図５Ｃ）に示したのと同様の時点で注射した２匹のＲＨＯ変異イヌにおける、混合杆体−錐体ａ波およびｂ波（上パネル）、および錐体１Ｈｚおよび２９Ｈｚのフリッカー応答（下パネル）の最大振幅の縦方向の定量化。
【００１７】
【図６】図６は、導入遺伝子プラスミドＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ８２０−ＲＨＯ８２０の図を示す。
【図７】図７は、既知の変異および欠失の部位（Athanasiou, et al.（１５）のレビューに基づく）および本研究で評価したｓｈＲＮＡおよびリボザイムノックダウン試薬の標的部位を示す、ヒトロドプシンのアミノ酸配列を示す。
【図８】図８は、ハンマーヘッド型リボザイム５２５（Ｒｚ５２５）によるヒトロドプシンｍＲＮＡの消化を示す。Ｒｚ５２５を発現するプラスミドで同時トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞においてルシフェラーゼアッセイにより測定された、野生型（白いバー）または耐性／硬化（対角線の影付きバー）ＲＨＯ転写産物のレベル。結果は、リボザイムを欠くプラスミドでの同時トランスフェクション後に測定した同じ融合転写産物に対して、正規化された（黒いバー）。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。スチューデントｔ検定による野生型ＲＨＯと比較した耐性／硬化ＲＨＯについて、＊＝Ｐ＜０．０５。
【図９Ａ−９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、ＷＴイヌ科網膜におけるＲｚ５２５によるＲＨＯ発現の抑制を示す。（図９Ａ）２０または５０×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価で網膜下にＡＡＶ２／５−Ｒｚ５２５を注射したＲＨＯ ＷＴイヌの網膜の概略図であり、イヌ科ロドプシン（ＲＮＡおよびタンパク質）発現の定量化に使用した神経網膜パンチの位置を示す。破線、ブレブ境界；点描領域：タペート領域。（図９Ｂ）未処置（ＵｎＴｘ）領域で測定されたレベルのパーセンテージとしての、処置（Ｔｘ）網膜領域（５０×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価で注射）に残る内在性イヌ科ＲＨＯ ＲＮＡのレベルの定量化。（図９Ｃ）代表的な免疫ブロット（上）および、２０または５０×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価を注射した眼の未処置領域で測定されたレベルのパーセンテージとしての、処置網膜領域に残る内在性イヌ科ＲＨＯタンパク質のレベル（上）の定量化。ＯＳａｓＯＤの指定は、比較のために左眼が右眼として表示されることを意味する。
【００１８】
【図１０Ａ−１０Ｅ】図１０Ａ〜１０Ｅは、ＲＨＯ変異イヌ科網膜におけるＲｚ５２５によるＲＨＯ発現の抑制を示す。（図１０Ａ）ＢＳＳまたはＡＡＶ２／５−Ｒｚ５２５を２０または１００×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価で注射したＲＨＯ変異イヌの網膜の概略図であり、イヌ科のロドプシン（ＲＮＡおよびタンパク質）発現の定量化に使用した神経網膜パンチの位置を示す。破線、ブレブ境界；点描領域：タペート領域。（図１０Ｂ）ＢＳＳまたはＡＡＶ２／５−Ｒｚ５２５を２０または１００×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価で注射した眼の未処置領域で測定されたレベルのパーセンテージとしての、処置網膜領域に残る内在性イヌ科ＲＨＯ ＲＮＡのレベルの定量化。（図１０Ｃ）代表的な免疫ブロット（上）および、ＢＳＳまたはＡＡＶ２／５−Ｒｚ５２５を２０または１００×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価で注射した眼の未処置領域で測定されたレベルのパーセンテージとしての、処置網膜領域に残る内在性イヌ科ＲＨＯタンパク質のレベルの定量化（下）。（図１０Ｄ）ＡＡＶ２／５−Ｒｚ５２５を２０または１００×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価で８週間前に注射した２つのＲＨＯ変異イヌの眼における、露光後２週間（ＬＥ後）のＯＮＬ厚さのトポグラフィー。点線、ブレブ境界；破線、ＯＮＬ救出境界。（図１０Ｅ）８週間前に１００×１０１１ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ２／５−Ｒｚ５２５で処置したＲＨＯ変異イヌの両方の網膜におけるＮＩＲ ｃＳＬＯイメージング（左上および左下のパネル）に見られる多病巣性の暗い病変部（白い矢印）は、ＯＣＴ Ｂスキャン上の、網膜下腔およびＲＰＥ／脈絡膜に位置する反射率の増加した限局性結節（白い矢印）（右上のパネル）、および組織学上の、限局性炎症細胞浸潤（右下のパネル）に対応する。網膜の分離は、ＯＣＴ Ｂスキャン（白い矢じり）で見られる。破線、ブレブ境界；点線はＯＣＴ Ｂスキャンの位置を表す。ＯＳａｓＯＤの指定は、比較のために左眼が右眼として表示されることを意味する。
【００１９】
【図１１Ａ−１１Ｃ】１１Ａ〜１１Ｃは、ＷＴイヌ科網膜におけるｓｈＲＮＡ１３１によるＲＨＯ発現の非効率的な抑制を示す。（図１１Ａ）ｓｃＡＡＶ２／５−ｓｈＲＮＡ１３１を１０または５０×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価で注射したＲＨＯ ＷＴイヌの眼底の略図であり、注射後８週間でのイヌ科のロドプシン（ＲＮＡおよびタンパク質）発現の定量化に使用した神経網膜パンチの位置を示す。破線、ブレブ境界；点描領域：タペート領域。（図１１Ｂ）１０または５０×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価を注射した眼の未処置領域で測定されたレベルのパーセンテージとしての、処置網膜領域に残る内在性イヌ科ＲＨＯ ＲＮＡのレベルの定量化。（図１１Ｃ）代表的な免疫ブロットおよび、１０または５０×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価を注射した眼の未処置領域で測定されたレベルのパーセンテージとしての、処置網膜領域に残る内在性イヌ科ＲＨＯタンパク質のレベルの定量化。ＯＳａｓＯＤの指定は、比較のために左眼が右眼として表示されることを意味する。
【図１２】図１２は、１×から５０×１０１１ｖｇ／ｍＬまでの力価の範囲にわたってｓｃＡＡＶ２／５−ｓｈＲＮＡ８２０を注射した１０個のＲＨＯ ＷＴ眼すべての個々のトポグラフィー結果を示す。ＯＮＬ厚さ（左）、正規化ＩＳ／ＯＳ強度（中央）、および定量化のためにブレブの内側（右側の四角と周囲の点線）および外側（左側の四角）で選択された位置（右）。２１９４−ＯＤ等のラベルは、個々の動物と眼を示す。比較しやすいように、すべての眼は同等の右眼として表示する。ＯＳａｓＯＤの指定は、比較のために左眼が右眼として表示されることを意味する。
【００２０】
【図１３Ａ−１３Ｇ】図１３Ａ〜１３Ｇは、ロドプシンの、２つの別個のベクターによる抑制および置換：杆体の不完全な保護およびＲＨＯ変異眼における網膜毒性を示す。（図１３Ａ〜１３Ｃ）５×１０１１ｖｇ／ｍＬのｓｃＡＡＶ２／５−ｓｈＲＮＡ８２０と５×１０１１ｖｇ／ｍＬのｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０を同時注射した（処置１：１）ＲＨＯ変異眼における、露光（ＬＥ）に対する網膜保護の、ＯＣＴイメージングおよび組織学的分析。（図１３Ａ）注射の７週間後／露光前（注射後）および露光後４週間（ＬＥ後）のＯＮＬ厚さトポグラフィー、点線、ブレブ境界；白色矢印、下のパネルに示されたＯＣＴ Ｂスキャンの位置。（図１３Ｂ）ロドプシン（Ｒｈｏ）／ヒト錐体アレスチン（ｈＣＡ）で共免疫標識された網膜凍結切片であり、（図１３Ａ）に示されたのと同じ眼の処置および未処置（ＵｎＴｘ）領域における外顆粒層（ＯＮＬ）および外節（ＯＳ）の形態を示す。（図１３Ｃ）最大の救出効果を示す、処置領域内で撮影されたＨ＆Ｅ染色網膜顕微鏡写真。（図１３Ｄ〜１３Ｆ）５×１０１１ｖｇ／ｍＬのｓｃＡＡＶ２／５−ｓｈＲＮＡ８２０と１０×１０１１ｖｇ／ｍＬのｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０を同時注射した（処置１：２）ＲＨＯ変異眼における、（図１３Ａ〜１３Ｃ）と同様の分析。（図１３Ｄ）ＯＮＬの厚さのトポグラフィー。点線、ブレブ境界；破線、ＯＮＬ救出境界。白色矢印は、下のパネルに示されるＯＣＴ Ｂスキャンの位置に対応する；ＯＣＴ Ｂスキャンの白色矢印は、血管周囲の肥厚と反射率の増加を示す。（図１３Ｅ）二重蛍光ＩＨＣ（ロドプシン；ヒト錐体アレスチン）。（図１３Ｆ）処置領域内で撮影されたＨ＆Ｅ染色網膜顕微鏡写真であり、限定されたＯＮＬ救出および血管周囲細胞浸潤の重度の病変を示す（矢印）。（図１３Ｇ）５×１０１１ｖｇ／ｍＬのｓｃＡＡＶ２／５−ｓｈＲＮＡ８２０と１０×１０１１ｖｇ／ｍＬのｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０を同時注射した（処置１：２）が、露光はされなかったＲＨＯ変異眼における、注射後１１週間のＯＣＴイメージング。点線、ブレブ境界；灰色および白色矢印は、単一のＯＣＴ Ｂスキャンの位置を示す（右パネル）。ＯＳａｓＯＤの指定は、比較のために左眼が右眼として表示されることを意味する。
【００２１】
【図１４Ａ−１４Ｄ】図１４Ａ〜１４Ｄは、ロドプシンの単一ベクターによる抑制および置換が、ＲＨＯ変異網膜における網膜変性を防止することを示す（図４Ａ〜４Ｈへの追加データ）。（図１４Ａ〜１４Ｂ）５×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価でｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０を注射した２つのＲＨＯ変異イヌの眼における、注射後／露光前（注射後）および露光後２週間（ＬＥ後）の、ＯＮＬ厚さトポグラフィー。点線、ブレブ境界；破線、ＯＮＬ救出境界。挿入図、ＯＮＬ厚さ（上）とＩＳ／ＯＳ強度（下）の値を持つ網膜領域を示す有意差マップを、注射なしの対照の９９パーセンタイル信頼区間とポイントごとに比較した。（図１４Ｃ〜１４Ｄ）ロドプシン（Ｒｈｏ）／ヒト錐体アレスチン（ｈＣＡ）で共免疫標識された網膜凍結切片であり、（図１４Ａ〜１４Ｂ）に示されるものと同一の眼の処置および未処置（ＵｎＴｘ）領域における、外顆粒層（ＯＮＬ）および外節（ＯＳ）の形態を示す。ＯＳａｓＯＤの指定は比較のために左眼が右眼として表示されることを意味する。
【００２２】
【図１５Ａ−１５Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｃは、周囲照明の異なる条件下で飼育されたＲＨＯ変異（ＲＨＯＴ４Ｒ／＋）イヌにおける、疾患の自然経過を示す。（図１５Ａ、１５Ｂ）周期的な暗赤色光（図１５Ａ）または周期的な標準白色犬舎照明（図１５Ｂ）の下で飼育された代表的なイヌの、疑色ＯＮＬトポグラフィー。すべての眼は同等の右眼として表示される。視神経頭（黒丸）および主要血管（白線）、タペート境界（灰色線）、および中心窩様領域（楕円）が重ね合わされている。（図１５Ｃ）概略図、ＯＮＬ厚さの定量化のために５つの網膜領域で選択された位置。Ｃ、中央；ＳＴ、上側頭；ＳＮ、鼻上；ＩＴ、下側頭；およびＩＮ、鼻下。ＯＮＬ厚さのプロットは、サンプリングされたすべての個々の位置における年齢の関数としての、同じ位置における平均正常値との差として示される。破線は、正常変動の９９パーセンタイルの区切り。
【００２３】
【図１６Ａ−１６Ｅ】図１６Ａ〜１６Ｅは、研究で使用された組換えＡＡＶ２／５ベクター構築物を示す。（図１６Ａ）ネズミ科、イヌ科およびヒトＲＨＯ ｍＲＮＡを切断するように設計されたハンマーヘッド型リボザイム（Ｒｚ５２５）の発現を駆動するマウスオプシン近位プロモーター（ｍＯＰ）を保有する、一本鎖ＡＡＶ。（図１６Ｂ）イヌ科およびヒトＲＨＯ ｍＲＮＡを切断するように設計された短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１３１）の発現を駆動するＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｈ１）を保有する、自己相補的ＡＡＶ。（図１６Ｃ）イヌ科およびヒトＲＨＯ ｍＲＮＡを切断するように設計された短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ８２０）の発現を駆動するＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｈ１）を保有する、自己相補的ＡＡＶ。（図１６Ｄ）ｓｈＲＮＡ８２０による抑制に耐性であるように設計された置換ヒトＲＨＯ ｍＲＮＡ（ＲＨＯ８２０）の発現を駆動するヒトオプシンプロモーターを保有する、自己相補的ＡＡＶ。（図１６Ｅ）ノックダウン試薬ｓｈＲＮＡ８２０およびヒト耐性置換ＲＨＯ８２０の両方を保有する自己相補的ＡＡＶ。ＴＲ：ＡＡＶ２逆方向末端反復；ｍＴＲ：変異ＴＲ；ｗｔＴＲ：野生型ＴＲ；ＳＶ４０ ＳＤ／ＳＡ：シミアンウイルス４０に由来するスプライスドナー／アクセプター要素；ｈｐ Ｒｚ：ヘアピンリボザイム；ＳＶ４０ｐＡ：ＳＶ４０由来のポリアデニル化末端シグナル；ＨＳＶ ＴＫ ｐｒｏ：ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーター；Ｎｅｏ Ｒ：ネオマイシン耐性遺伝子；ｂＧＨ ｐＡ：ウシ成長ホルモンのポリアデニル化末端シグナル；ｈＧＦＰ：ヒト化ＧＦＰ。
【００２４】
【図１７】図１７は、イヌにおけるＡＡＶ療法の長期研究の実験計画の図解である。未処置のＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌ網膜に急性網膜変性を引き起こす反復ＬＥイベントに対して、光受容体の安定した構造的（ＯＣＴおよびＩＨＣによる評価）および機能的（ＥＲＧによる評価）保護を与える、ｓｃＡＡＶ２／５−ｈＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０の能力を、４匹のＲＨＯ変異イヌにおいて評価した。各イヌの右眼（ＯＤ）に１５０μＬのＡＡＶ構築物を５×１０１１ｖｇ／ｍＬの力価で網膜下注射し、一方反対側の左眼（ＯＳ）に同量の平衡塩類溶液（ＢＳＳ）を網膜下注射した。ＰＩ：注射後；ＬＥ：露光；ＯＣＴ：光コヒーレンストモグラフィー；ＥＲＧ：網膜電図検査；ＩＨＣ：免疫組織化学。
【図１８Ａ−１８Ｄ】図１８Ａ〜１８Ｄは、片方の眼にｓｃＡＡＶ２／５−ｈＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０（点線）を、および反対側の眼にＢＳＳ（実線）を注射したＲＨＯ変異イヌの４回の露光セッションそれぞれの約２週間後に、杆体（−１．７ｌｏｇ ｃｄ．ｓｍ-２、図１８Ａ）、混合杆体−錐体（０．５１ｌｏｇ ｃｄ．ｓｍ-２、図１８Ｂ）の代表的なＥＲＧトレースは暗順応を記録し、単一刺激（０．５１ｌｏｇ ｃｄ．ｓｍ-２、図１８Ｃ）または２９Ｈｚ錐体フリッカー（０．２６ｌｏｇ ｃｄ．ｓｍ-２、図１８Ｄ）に対する錐体応答は、明順応を記録したことを示す。
【００２５】
【図１９Ａ−１９Ｃ】図１９Ａ〜１９Ｃは、片方の眼にｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０（水平線の陰影）を、反対側の眼にＢＳＳ（対角線の陰影）を図１８Ａ〜１８Ｄに示すのと同様の時点で注射した４匹のＲＨＯ変異イヌにおける、杆体ｂ波（図１９Ａ）、混合杆体−錐体ａ波およびｂ波（図１９Ｂ）、ならびに錐体１Ｈｚおよび２９Ｈｚフリッカー応答（図１９Ｃ）の最大振幅の縦方向の定量化を示す。ＡＡＶ：ｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０。
【図２０Ａ−２０Ｄ】図２０Ａ〜２０Ｄは、注射前（pre-inj.）、注射後１２週間（最初の露光イベントの前）、および注射後５０週間（４回めの露光イベントの２週間後）における、４つのＲＨＯ変異イヌそれぞれの外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さマップおよび、内節−外節（ＩＳ／ＯＳ）の強度マップを示す。
【図２１】図２１は、ＲＨＯ変異イヌからのロドプシン（ＲＨＯ）／ヒト錐体アレスチン（ｈＣＡ）共免疫標識の網膜凍結切片であり、同じ眼の未処置および処置領域における外顆粒層（ＯＮＬ）および外節（ＯＳ）の形態を示す。ＯＮＬの厚さマップ（下の画像）は、上の画像に示されている網膜の未処置領域と処置領域のおおよその位置（アスタリスク）を示す。
【００２６】
【図２２】図２２は、ｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０またはＡＡＶ２／５−ＧＦＰで処置したマウスにおける、外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さのＯＣＴ測定値を示す。Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、片方の眼をＡＡＶ２／５−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０のいずれかで処置し、ＯＮＬ厚さを様々な間隔で分析した：ａ）処置前（「Pre」）、ｂ）注射の１か月後、ｃ）注射の２か月後、またはｄ）注射の３か月後。
【図２３】図２３は、片方の眼にｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０（円および破線）またはＡＡＶ２／５−ＧＦＰ（四角および実線）を注射したＰ２３Ｈ ＲＨＯマウスにおける、杆体および混合杆体−錐体のａ波およびｂ波の最大振幅の縦方向の定量化を示す。これらの２つの群のマウスを、様々な強度（−２０デシベル（ｄＢ）、−１０ｄＢ、および０ｄＢ）の短い閃光に暴露した。これらのマウスの電気的反応を、注射の１か月後、２か月後、および３か月後に分析した。
【図２４】図２４は、サイズ分画後の、ｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０でのトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞で発現される最も頻度の高い短ｍＲＮＡの配列を示す。
【図２５】図２５は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞で発現された短ｍＲＮＡのトップ「ヒット」のコンセンサス配列を示す。矢印で示されるように、ＲＮＡ分子の５２％は３’末端に２つの余分なウリジンを有していた。ＲＮＡ分子の７３％におけるガイド鎖（ＵＡＧ）の５’末端の配列は、予測されたものと同等であった。
【００２７】
詳細な説明
本出願の側面は、対象（例えば、優性網膜色素変性症を有するヒト対象などの、優性網膜色素変性症を有する対象）における網膜色素変性症を処置するのに有用な、方法および組成物を提供する。
いくつかの態様において、ヒト、イヌ、および／またはマウスのロドプシン（ＲＨＯ）ｍＲＮＡを標的とする短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が提供される。いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡ（配列番号１）を含むセンス鎖、ヌクレオチド配列ＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣ（配列番号２）を含むアンチセンス鎖、およびループ配列を含む。いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、配列番号１の配列と１、２、または３ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含むセンス鎖、および配列番号２の配列と１、２、または３ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様において、ループは、５から１０ヌクレオチドの長さを有する配列を含む。特定の態様において、ループは、９ヌクレオチドの長さを有する配列を含む。いくつかの態様において、ループは、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号３）を含む。特定の態様において、ループは配列番号３である。特定の態様において、ループは、配列番号３の配列と１または２ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含む。
【００２８】
いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡ（配列番号１）を含むセンス鎖、ヌクレオチド配列ＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣ（配列番号２）を含むアンチセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号３）を含むループを含む。いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡ（配列番号１）を含むセンス鎖、ヌクレオチド配列ＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣＵＵ（配列番号１０）を含むアンチセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号３）を含むループを含む。いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、配列番号１の配列と１、２、または３ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含むセンス鎖；配列番号１０の配列と１、２、または３ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖；配列番号３の配列と１または２ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含むループを含む。
【００２９】
いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、以下に示す配列番号４の配列を含むか、またはそれからなる。
ｓｈＲＮＡ８２０配列：ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡＵＵＣＡＡＧＡＧＡＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣ（配列番号４）
いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、配列番号４の配列と１、２、または３ヌクレオチド異なるクレオチド配列を含む。
【００３０】
特定の態様において、ｓｈＲＮＡは、以下の配列のセットの１つを含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む：ｉ）ヌクレオチド配列ＣＵＧＣＣＵＡＣＡＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵ（配列番号２１）を含むセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＵＧＵＡＧＧＣＡＧ（配列番号：２２）を含むアンチセンス鎖；ｉｉ）ヌクレオチド配列ＣＣＵＡＣＡＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵＧＡＵ（配列番号２３）を含むセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＡＵＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＵＧＵＡＧＧ（配列番号２４）を含むアンチセンス鎖；ｉｉｉ）ヌクレオチド配列ＧＣＡＵＧＧＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＵ（配列番号２５）を含むセンス鎖、およびヌクレオチド配列ＡＣＣＡＵＧＡＵＧＡＵＧＡＣＣＡＵＧＣ（配列番号２６）を含むアンチセンス鎖。
他の態様において、ｓｈＲＮＡは以下を含む：ｉ）配列番号２１と１、２、または３ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含むセンス鎖、および配列番号２２と１、２、または３ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖；ｉｉ）配列番号２３と１、２、または３ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含むセンス鎖、および配列番号２４と１、２、または３ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖；または、ｉｉｉ）配列番号２５と１、２、または３ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含むセンス鎖、および配列番号２６と１、２、または３ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖。
【００３１】
いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、プロモーター（例えば、ヒトＨ１ＲＮＡプロモーター）によって駆動されるｓｈＲＮＡとしてのベクターを使用して、送達され得る。いくつかの態様において、ベクターはプラスミドである。いくつかの態様において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターである。いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡをコードするベクター配列は、配列ＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡＧＡＡＴＧＣＣＡＣ（配列番号９）を含む。いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡ発現を駆動するプロモーターは、配列：ＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＣＴＣＧＧＡＴＣＣ（配列番号８）と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの態様において、前記ベクターは、正常な（例えば、野生型）ロドプシンタンパク質をコードするが、ベクターによって発現されるｓｈＲＮＡの作用に耐性がある、コード配列を含む。
【００３２】
いくつかの態様において、本明細書に記載のｓｈＲＮＡに硬化される通常の（例えば、野生型）ロドプシン（ＲＨＯ）コード配列は、ヒトＲＨＯ遺伝子に基づく配列を有することができる（例えば、アクセッション番号NG_009115.1に示される配列を有する）。いくつかの態様において、通常のＲＨＯコード配列は、コード配列によって発現されるｍＲＮＡを本明細書に記載のようにｓｈＲＮＡに対して耐性にする、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の変異を含むように修飾される。いくつかの態様において、ＲＨＯコード配列は、本明細書に記載のようにｓｈＲＮＡに耐性であり得る配列ＧＴＧＧＣＴＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡ（配列番号１１）を含む。いくつかの態様において、ＲＨＯコード配列は、以下の配列番号５と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。
【００３３】
ＲＨＯ８２０配列：
ＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＧＧＣＣＴＴＣＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＣＡＣＧＧＧＴＣＡＧＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＧＡＡＴＧＧＣＡＣＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＡＡＣＴＴＣＴＡＣＧＴＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＧＣＧＡＣＧＧＧＴＧＴＧＧＴＡＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＴＣＧＡＧＴＡＣＣＣＡＣＡＧＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＧＡＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＣＴＣＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＣＡＣＧＣＣＴＣＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＣＴＡＧＣＣＧＴＧＧＣＴＧＡＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧＧＴＣＣＴＡＧＧＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＡＣＡＣＣＴＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＡＣＴＴＣＧＴＣＴＴＣＧＧＧＣＣＣＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＴＴＴＧＧＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＴＧＣＣＣＴＧＴＧＧＴＣＣＴＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＴＡＡＧＣＣＣＡＴＧＡＧＣＡＡＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＧＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＡＣＣＴＧＧＧＴＣＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＣＣＴＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＡＣＴＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＴＡＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＴＣＧＴＧＴＧＧＡＡＴＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＡＣＧＣＴＣＡＡＧＣＣＧＧＡＧＧＴＣＡＡＣＡＡＣＧＡＧＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＴＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＣＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＴＧＡＴＴＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＣＣＣＧＣＡＴＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＣＧＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＣＣＴＡＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＣＴＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＧＧＴＣＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＣＣＡＴＣＣＣＡＧＣＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＡＡＣＣＣＴＧＴＣＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＣＡＴＧＣＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＡＧＡＣＧＧＡＧＡＣＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＡＡＧＡＣＣＴＧＣＣＴＡＧＧＡＣＴＣＴＧＴＧＧＣＣＧＡＣＴＡＴＡＧＧＣＧＴＣＴＣＣＣＡＴＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＧ（配列番号５）
【００３４】
いくつかの態様において、ＲＨＯコード配列は、プロモーター（例えば、ヒトオプシン近位プロモーター）によって駆動される。いくつかの態様において、プロモーターは、以下の配列番号７と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。
ヒトオプシン近位プロモーター配列：
ＣＣＴＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＣＡＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＧＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＧＡＡＣＧＡＡＣＡＧＧＴＡＡＧＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＡＣＧＡＧＡＴＧＡＧＡＧＡＣＴＧＧＧＡＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＡＧＧＡＣＡＴＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＴＧＧＴＣＣＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＣＣＣＡＧＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＡＡＧＴＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴＡＧＧＧＧＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＴＡＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＡＴＴＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＧＧＡＴＴＡＡＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＡＴＴＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴＡＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＴＣＡＣＴＴＴＡＴＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＧＴＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＧＧＣＣＴＴＣＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＣＡＣＧＧＧＴＣＡＧＣＣＡＣＡ（配列番号７）
【００３５】
いくつかの態様において、本明細書に記載のベクターは、以下の配列番号６と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。
ｓｃＡＡＶ２／５−ｈＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０構築物配列：
ＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＴＡＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＣＴＣＴＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＴＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＣＡＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＧＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＧＡＡＣＧＡＡＣＡＧＧＴＡＡＧＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＡＣＧＡＧＡＴＧＡＧＡＧＡＣＴＧＧＧＡＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＡＧＧＡＣＡＴＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＴＧＧＴＣＣＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＣＣＣＡＧＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＡＡＧＴＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴＡＧＧＧＧＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＴＡＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＡＴＴＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＧＧＡＴＴＡＡＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＡＴＴＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴＡＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＴＣＡＣＴＴＴＡＴＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＧＴＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＧＧＣＣＴＴＣＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＣＡＣＧＧＧＴＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＴＣＧＡＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＣＴＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＴＡＴＴＴＣＡＧＧＴＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＡＡＴＣＡＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴＧＣＣＴＴＴＡＣＴＴＣＴＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＧＧＡＡＧＴＧＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＡＴＴＧＴＡＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＧＧＣＣＴＴＣＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＣＡＣＧＧＧＴＣＡＧＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＧＡＡＴＧＧＣＡＣＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＡＡＣＴＴＣＴＡＣＧＴＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＧＣＧＡＣＧＧＧＴＧＴＧＧＴＡＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＴＣＧＡＧＴＡＣＣＣＡＣＡＧＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＧＡＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＣＴＣＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＣＡＣＧＣＣＴＣＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＣＴＡＧＣＣＧＴＧＧＣＴＧＡＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧＧＴＣＣＴＡＧＧＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＡＣＡＣＣＴＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＡＣＴＴＣＧＴＣＴＴＣＧＧＧＣＣＣＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＴＴＴＧＧＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＴＧＣＣＣＴＧＴＧＧＴＣＣＴＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＴＡＡＧＣＣＣＡＴＧＡＧＣＡＡＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＧＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＡＣＣＴＧＧＧＴＣＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＣＣＴＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＡＣＴＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＴＡＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＴＣＧＴＧＴＧＧＡＡＴＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＡＣＧＣＴＣＡＡＧＣＣＧＧＡＧＧＴＣＡＡＣＡＡＣＧＡＧＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＴＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＣＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＴＧＡＴＴＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＣＣＣＧＣＡＴＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＣＧＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＣＣＴＡＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＣＴＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＧＧＴＣＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＣＣＡＴＣＣＣＡＧＣＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＡＡＣＣＣＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＣＡＴＧＣＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＡＧＡＣＧＧＡＧＡＣＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＡＡＧＡＣＣＴＧＣＣＴＡＧＧＡＣＴＣＴＧＴＧＧＣＣＧＡＣＴＡＴＡＧＧＣＧＴＣＴＣＣＣＡＴＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡＣＣＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＡＧＴＣＧＡＣＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡＧＡＡＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＧＡＣＡＴＴＧＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＡＡＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＣＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＣＴＣＧＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴＧ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【００３６】
本開示の側面は、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター（例えば、ｓｈＲＮＡおよび／または置換ＲＨＯをコードする）を様々な組織、器官、および／または細胞に送達するための、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子に関する。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、本明細書に記載のようなキャプシドタンパク質、例えばＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子内に含まれるベクターは、目的のＲＮＡ（例えば、配列番号４の配列を含むｓｈＲＮＡ）をコードし、置換ＲＨＯコード配列（例えば、配列番号５の配列を含むもの）を含む。
ｒＡＡＶ粒子内に含まれる組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、少なくとも、（ａ）１つ以上の異種核酸領域（例えば、ｓｈＲＮＡおよび／またはＲＨＯタンパク質をコードするもの）および（ｂ）１つ以上の異種核酸領域に隣接する逆末端反復（ＩＴＲ）配列（例えば、野生型ＩＴＲ配列または操作されたＩＴＲ配列）を含む１つ以上の領域、を含み得る。いくつかの態様において、異種核酸領域は、目的のＲＮＡ（例えば、配列番号４の配列を含むｓｈＲＮＡ）をコードし、置換ＲＨＯコード配列（例えば、配列番号５の配列を含むもの）を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、サイズが４ｋｂから５ｋｂの間である（例えば、サイズが４．２から４．７ｋｂ）。このｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ５キャプシドなどのウイルスキャプシドによってキャプシド化され得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは一本鎖である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは二本鎖である。いくつかの態様において、二本鎖ｒＡＡＶベクターは、例えば、ベクターの別の領域に相補的であるベクターの領域を含み、ベクターの二本鎖の形成を開始する、自己相補的ベクターであり得る。
【００３７】
ｒＡＡＶ粒子は、任意の誘導体または偽型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２／１、２／５、２／８、または２／９）を含む、任意のＡＡＶ血清型であり得る。本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶ粒子の血清型は、キャプシドタンパク質の血清型を指す。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子はＡＡＶ５である。誘導体および偽型の非限定的な例は、以下を含む：ｒＡＡＶ２／１、ｒＡＡＶ２／５、ｒＡＡＶ２／８、ｒＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２−ＡＡＶ３ハイブリッド、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．１４、ＡＡＶ３ａ／３ｂ、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ−ＨＳＣ１５、ＡＡＶ−ＨＳＣ１７、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＣＨｔ−Ｐ６、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ−ＨＳＣ１５／１７、ＡＡＶＭ４１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ６（Ｙ４４５Ｆ／Ｙ７３１Ｆ）、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ−ＨＡＥ１／２、ＡＡＶクローン３２／８３、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ２（Ｙ−＞Ｆ）、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２．１５、ＡＡＶ２．４、ＡＡＶＭ４１、およびＡＡＶｒ３．４５。かかるＡＡＶ血清型および誘導体／偽型、ならびにかかる誘導体／偽型を生成する方法は、当技術分野で知られている（例えば、Mol Ther. 2012 Apr;20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Epub 2012 Jan 24.  The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJを参照）。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、（ａ）１つの血清型（例えば、ＡＡＶ２）からのＩＴＲを含む核酸ベクター、および（ｂ）別の血清型（例えば、ＡＡＶ５）に由来するキャプシドタンパク質からなるキャプシド、を含む、偽型ｒＡＡＶ粒子である。偽型ｒＡＡＶベクターを作製および使用するための方法は、当技術分野で知られている（例えば、Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001；Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000；Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002；およびAuricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001を参照)。
【００３８】
ｒＡＡＶ粒子およびｒＡＡＶベクターを産生する方法も当技術分野で知られており、市販されている（例えば、Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167；および米国特許公開番号US2007/0015238およびUS20120322861、これらは参照により本明細書に組み込まれる；ならびにATCCおよびCell Biolabs, Inc.から入手可能なプラスミドおよびキット）。例えば、ｒＡＡＶベクターを含有するプラスミドは、例えば、ｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする）およびｃａｐ遺伝子（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３（本明細書に記載の修飾ＶＰ３領域を含む）をコードする）を含む１つ以上のヘルパープラスミドと、組み合わせることができ、およびｒＡＡＶ粒子をパッケージングし、続いて精製することができるように、プロデューサー細胞株にトランスフェクトすることができる。
【００３９】
いくつかの態様において、１つ以上のヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子（例えば、本明細書に記載のｒＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする）を含む第１のヘルパープラスミド、およびＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、およびＶＡ遺伝子を含む第２のヘルパープラスミドを含む。いくつかの態様において、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ５に由来するｒｅｐ遺伝子であり、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ５に由来し、本明細書に記載の修飾キャプシドタンパク質を産生するための遺伝子への修飾を含み得る。ヘルパープラスミド、およびかかるプラスミドを作製する方法は当技術分野で知られており、市販されている（例えば、ｐＤＭ、ｐＤＧ、ｐＤＰ１ｒｓ、ｐＤＰ２ｒｓ、ｐＤＰ３ｒｓ、ｐＤＰ４ｒｓ、ｐＤＰ５ｒｓ、ｐＤＰ６ｒｓ、ｐＤＧ（Ｒ４８４Ｅ／Ｒ５８５Ｅ）を参照；およびｐＤＰ８．ａｐｅプラスミドはPlasmidFactory, Bielefeld, Germanyからであり；他の製品とサービスは、以下から入手可能である：Vector Biolabs, Philadelphia, PA；Cellbiolabs, San Diego, CA；Agilent Technologies, Santa Clara, Ca；およびAddgene, Cambridge, MA; pxx6；Grimm et al. (1998), Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adenoassociated Virus Vectors, Human Gene Therapy, Vol. 9, 2745-2760；Kern, A. et al. (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol. 77, 11072-11081.；Grimm et al. (2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy, Vol. 7, 839-850；Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296-5303；およびMoullier, P. and Snyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards, Molecular Therapy, Vol. 16, 1185-1188)。
【００４０】
次に、例示的非限定的なｒＡＡＶ粒子生成方法について説明する。１つ以上のヘルパープラスミドが生成または取得され、これは、目的のＡＡＶ血清型のｒｅｐおよびｃａｐ ＯＲＦならびに、ネイティブプロモーターの転写制御下にあるアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子を含む。キャップＯＲＦはまた、本明細書に記載されるように、修飾キャプシドタンパク質を生成するための１つ以上の修飾も含み得る。ＨＥＫ２９３細胞（ATCC（登録商標）から入手可能）は、ＣａＰＯ４媒介性トランスフェクション、脂質、またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの高分子分子を介して、ヘルパープラスミド（単数または複数）および本明細書に記載の核酸ベクターを含有するプラスミドによりトランスフェクトされる。次に、ＨＥＫ２９３細胞を少なくとも６０時間インキュベートして、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする。代替的に、別の例では、Ｓｆ９ベースのプロデューサー安定細胞株を、核酸ベクターを含む単一の組換えバキュロウイルスに感染させる。さらなる代替として、別の例では、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ細胞株を、核酸ベクターを含むＨＳＶに、および任意に、本明細書に記載のｒｅｐおよびｃａｐＯＲＦを含む１つ以上のヘルパーＨＳＶ、ならびにそれらのネイティブプロモーターの転写制御下にあるアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子に、感染させる。次に、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、またはＳｆ９細胞を少なくとも６０時間インキュベートして、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする。次いでｒＡＡＶ粒子は、当技術分野で知られているかまたは本明細書に記載の任意の方法を使用して、例えば、イオジキサノールステップ勾配、ＣｓＣｌ勾配、クロマトグラフィー、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によって、精製することができる。
【００４１】
本開示はまた、本明細書に記載のｓｈＲＮＡ、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を含む宿主細胞を企図する。かかる宿主細胞は哺乳動物宿主細胞を含み、ヒト宿主細胞が好ましく、例えば、細胞または組織培養において単離され得る。いくつかの態様において、宿主細胞は眼の細胞である。
本開示はまた、ｓｈＲＮＡ、ベクター、ｒＡＡＶ粒子、および本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子による宿主細胞の感染または本明細書に記載の構築物によるトランスフェクションの後に発現されるｍＲＮＡを含む、宿主細胞を企図する。特定の態様において、本明細書で提供される宿主細胞は、自然界に見られるものとは異なる短いｍＲＮＡ配列を含む。特定の態様において、宿主細胞は、配列番号４０〜４６のいずれか１つと少なくとも９５％または９９．５％の配列同一性を有する短いｍＲＮＡ配列を含む。宿主細胞は、配列番号４０〜４６のいずれか１つの配列を含む短いｍＲＮＡ配列を含み得る。かかる宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞を含み、ヒト宿主細胞が好ましく、例えば、細胞または組織培養において単離され得る。いくつかの態様において、宿主細胞は眼の細胞である。
例示的な哺乳動物細胞には、ヒト細胞、げっ歯類細胞、およびイヌ科細胞が含まれる。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、ヒト（例えば、網膜色素変性症、例えば優性網膜色素変性症を有するか、または有することが知られている、例えば有すると診断されたヒト）に由来する。
【００４２】
いくつかの態様において、本明細書に記載のｓｈＲＮＡ、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子、および任意に薬学的に許容し得る担体を含む組成物が提供される。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、処置を必要とする対象に投与することができる。いくつかの態様において、対象は、脳および／または眼の１つ以上の状態、疾患、または障害（例えば、優性網膜色素変性症などの網膜色素変性症）を有するか、または有することが疑われる。いくつかの態様において、対象は、本明細書に開示される１つ以上の状態、疾患、および障害（例えば、優性網膜色素変性症などの網膜色素変性症）を有するか、または有することが疑われる。いくつかの態様において、対象は、１つ以上の内在性変異ｒｈｏアレル（例えば、眼または網膜の疾患または障害に関連するか、またはそれを引き起こす）を有する。いくつかの態様において、対象は、少なくとも１つの優性変異ｒｈｏアレル（例えば、優性網膜色素変性症を引き起こすもの）を有する。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は非ヒト霊長類である。非ヒト霊長類の対象の非限定的な例には、マカク（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）、マーモセット、タマリン、クモザル、フクロウモンキー、ベルベットモンキー、リスザル、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、およびオランウータンが含まれる。他の例示的な対象には、イヌやネコなどの飼いならされた動物；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリなどの家畜；およびマウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの他の動物が含まれる。
【００４３】
いくつかの態様において、細胞または対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の用量は、１０６〜１０１４粒子／ｍＬまたは１０３〜１０１５粒子／ｍＬの範囲のオーダー、または、例えば約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、もしくは１０１４粒子／ｍＬなどのいずれかの範囲についてそれらの間の任意の値であり得る。一態様において、１０１３粒子／ｍＬを超えるｒＡＡＶ粒子が投与される。いくつかの態様において、対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の用量は、１０６〜１０１４のベクターゲノム（ｖｇｓ）／ｍＬまたは１０３〜１０１５ｖｇｓ／ｍＬの範囲のオーダー、または、例えば約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、もしくは１０１４ｖｇｓ／ｍＬなどのいずれかの範囲についてそれらの間の任意の値であり得る。一態様において、１０１３ｖｇｓ／ｍＬを超えるｒＡＡＶ粒子が投与される。ｒＡＡＶ粒子は、単回投与として投与するか、または処置されている特定の疾患または障害の治療を達成するために必要とされ得る２つ以上の投与に分割することができる。いくつかの態様において、０．０００１ｍＬ〜１０ｍＬ（例えば、０．０００１ｍＬ、０．００１ｍＬ、０．０１ｍＬ、０．１ｍＬ、１ｍＬ、１０ｍＬ）が、１つの用量で対象に送達される。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子力価は、１×１０１０〜５×１０１３ｖｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子力価は、１×１０１０、２．５×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、２．５×１０１１、５×１０１１、１×１０１２、２．５×１０１２、５×１０１２、１×１０１３、２．５×１０１３、または５×１０１３ｖｇ／ｍＬであり得る。いくつかの態様において、粒子力価は、１×１０１０ｖｇ／ｍＬ未満である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子力価は、１×１０１５ｖｇ／ｍＬより大きい。一態様において、ｒＡＡＶ粒子力価は、５×１０１３ｖｇｓ／ｍＬより大きい。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、本明細書にさらに記載される方法（例えば、網膜下または硝子体内）を介して投与される。
【００４４】
ｒＡＡＶ粒子は、単回投与として投与するか、または処置されている特定の疾患または障害の治療を達成するために必要とされ得る２つ以上の投与に分割することができる。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、数日または数週間の期間にわたって投与される。いくつかの態様において、本出願に記載の１〜５００マイクロリットルの組成物（例えば、ｒＡＡＶ粒子を含む）が、対象の片方または両方の眼に投与される。例えば、いくつかの態様において、約１、約１０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、または約５００マイクロリットルを各眼に投与することができる。しかしながら、いくつかの態様において、より少ないまたはより多い量を投与可能であることを理解されたい。
いくつかの態様において、本明細書に開示されるｒＡＡＶ粒子、組成物、および処置方法は、対象の杆体光受容体の構造の完全性を保持し、ＯＮＬ厚さを保持し、および／または眼への単回投与後の対象における網膜の構造および機能に対して、少なくとも約１２週間、少なくとも約１８週間、少なくとも約２４週間、少なくとも約３０週間、少なくとも約３６週間、少なくとも約４２週間、少なくとも約４８週間、少なくとも約５４週間、または少なくとも約６０週間、変性からの保護を与える。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示される１つ以上のｒＡＡＶベースの組成物の製剤であって、細胞または動物への投与のために薬学的に許容し得る溶液中、単独で、または１つ以上の他の治療法と組み合わせた、特に、人間の細胞、組織、および人間に影響を与える病気の治療のための、前記製剤を提供する。
【００４５】
必要に応じて、ｒＡＡＶ粒子または核酸ベクターは、他の薬剤、例えば、タンパク質またはポリペプチドまたは様々な薬学的に活性な薬剤と組み合わせて、例えば治療用ポリペプチド、生物学的に活性な断片、またはそれらのバリアントの１つ以上の全身投与または局所投与などにより、投与することができる。実際、追加の薬剤が標的細胞または宿主組織との接触に対して重大な悪影響を引き起こさない場合には、含まれ得る他の成分に実質的に制限はない。したがってｒＡＡＶ粒子は、特定の場合に必要とされるように、様々な他の薬剤と共に送達され得る。かかる組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、あるいは本明細書に記載のように化学的に合成され得る。
薬学的に許容し得る賦形剤および担体溶液の処方は当業者に周知であり、本明細書に記載の特定の組成物を、例えば経口、非経口、静脈内、鼻腔内、関節内、および筋肉内の投与および処方を含む様々な処置レジメンにおいて使用するための、適切な投薬および処置レジメンの開発も同様である。
【００４６】
典型的には、これらの製剤は、少なくとも約０．１％の治療剤（例えば、ｒＡＡＶ粒子）またはそれ以上を含み得るが、有効成分のパーセンテージは当然ながら変化し得、そして便利には、全製剤の重量または体積の約１または２％および約７０％または８０％以上の間であり得る。当然のことながら、各治療上有用な組成物中の治療剤（単数または複数）（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の量は、適切な用量が化合物の任意の所与の単位用量中に得られるように調製することができる。溶解性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命、ならびに他の薬理学的考察などの要因は、かかる医薬製剤を調製する当業者によって企図され、したがって、様々な投薬量および処置レジメンが望ましくなり得る。
特定の状況において、本明細書に記載のｓｈＲＮＡ、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を、本明細書に開示される適切に処方された医薬組成物中で、皮下、眼内、硝子体内、非経口、皮下、静脈内、脳室内、筋肉内、髄腔内、経口、腹腔内、経口もしくは経鼻吸入、または直接注射による１つ以上の細胞、組織、もしくは臓器への直接注射のいずれかで、送達することが望ましい。
【００４７】
注射可能な使用に適した組成物（例えば、本明細書に記載のｓｈＲＮＡ、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を含む）の医薬形態には、滅菌水溶液または分散液が含まれる。いくつかの態様において、形態は、容易な注射針通過能力（syringability）が存在する程度まで無菌かつ流動性である。いくつかの態様において、形態は、製造および貯蔵の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保持される。担体は、例えば、水、生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／または植物油を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。
「担体」という用語は、本明細書に記載のｓｈＲＮＡ、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子が共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。かかる医薬担体は、水および油などの無菌液体であることができ、例えば鉱油などの石油、ピーナッツ油、大豆油、およびゴマ油などの植物油、動物油、または合成由来の油を含む。生理食塩水およびデキストロースおよびグリセロール水溶液も液体担体として使用することができる。
【００４８】
本開示の組成物は、様々な経路を介して眼に送達することができる。それらは、眼内に、眼への局所適用によって、または例えば硝子体（硝子体内注射）もしくは網膜下（網膜下注射）の光受容体間空間への眼内注射によって、送達され得る。いくつかの態様において、それらは杆体光受容細胞に送達される。代替的に、それらは、眼の周囲の組織への挿入または注射によって局所的に送達され得る。それらは、経口経路を介して、または皮下、静脈内、または筋肉内注射によって全身的に送達され得る。代替的に、それらは、カテーテルまたはインプラントによって送達され得、かかるインプラントは、多孔質、非多孔性、またはゼラチン状の材料でできており、これにはシラスティック膜または繊維などの膜、生分解性ポリマー、またはタンパク質性材料が含まれる。それらは状態の発症前に、例えば、眼の手術中、または病的状態の発症直後、または急性もしくは長期の状態の発生中に、その発生を防ぐために、投与することができる。
【００４９】
例えば、注射可能な水溶液の投与のために、溶液を必要に応じて適切に緩衝し、液体希釈剤を最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にすることができる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、硝子体内、皮下および腹腔内投与に特に適する。これに関連して、使用することができる無菌の水性媒体は、本開示に照らして当業者に知られているであろう。たとえば、１回の投与量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下注射液に加えるか、提案された注射部位に注射することができる（たとえば、"Remington’s Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照）。処置される対象の状態に応じて、投与量にいくらかの変動が必然的に生じる。いずれにせよ、投与の責任者は、個々の対象に適切な用量を決定する。さらにヒトへの投与の場合、製剤は、無菌性、発熱性、およびFDA Office of Biologicsの基準などで要求される一般的な安全性と純度の基準を満たす必要がある。
【００５０】
滅菌注射液は、本明細書に記載のｓｈＲＮＡ、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を、必要に応じて上に列挙した他のいくつかの成分とともに適切な溶媒に必要な量で組み込んだ後、濾過滅菌することによって調製できる。一般に分散液は、様々な滅菌された有効成分を、基本的な分散媒体および上に列挙されたものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって、調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これにより、有効成分の粉末に加えて、それらの以前に滅菌濾過された溶液から任意の追加の所望の成分が得られる。
組成物（例えば、本明細書に記載のｓｈＲＮＡ、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を含む）の量およびかかる組成物の投与時間は、本教示の利益を有する当業者の範囲内である。しかしながら、開示された組成物の治療有効量の投与は、例えば、かかる処置を受けている患者に治療上の利益を提供するのに十分な数のｒＡＡＶ粒子の単回注射などの単回投与によって達成され得る。代替的に、状況によっては、かかる組成物の投与を監督する開業医によって決定され得るように、比較的短い期間または比較的長い期間のいずれかにわたって、組成物の複数または連続的な投与を提供することが、望ましい場合がある。
【００５１】
いくつかの態様において、杆体細胞は、細胞のロドプシン遺伝子発現のサイレンシングの際に構造的に無傷のままであり、および／または生存可能である。いくつかの態様において、細胞のロドプシン遺伝子発現がサイレンシングされている杆体細胞は、通常はロドプシンを含むであろう短い外節を有する。いくつかの態様において、外節の長さは、外因的に添加された（硬化された）ロドプシン遺伝子を使用して維持または回復され得（例えば、部分的または完全に）、その発現は、本出願に記載の組成物を使用するサイレンシングに耐性がある。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物の、網膜色素変性症（例えば、優性網膜色素変性症）を有する対象への投与は、対象における杆体光受容体の構造の完全性を保持し、ＯＮＬの厚さを保持し、および／または、少なくとも約１２週間、少なくとも約１８週間、少なくとも約２４週間、少なくとも約３０週間、少なくとも約３６週間、少なくとも約４２週間、または少なくとも約４８週間、少なくとも約５４週間、または少なくとも約６０週間、対象の網膜の構造と機能に変性からの保護を与える。
【００５２】
本明細書で使用する用語として、疾患を「処置する」とは、対象が経験する疾患または障害（例えば、網膜色素変性症）の少なくとも１つの徴候または症状の、頻度または重症度を軽減することを意味する。上記の組成物は、典型的には、有効量、すなわち望ましい結果を生み出すことができる量で対象に投与される。望ましい結果は、投与される活性剤に依存する。例えば、ｒＡＡＶ粒子の有効量は、異種核酸を宿主器官、組織、または細胞に移動し得る粒子の量であり得る。
本開示の方法で利用される組成物の毒性および有効性は、ＬＤ５０（集団の５０％に致死である用量）を決定するために培養細胞または実験動物のいずれかを使用する、標準的な製薬手順によって決定することができる。毒性と有効性の用量比である治療指数は、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す組成物が好ましい。毒性副作用を示すものを使用してもよいが、かかる副作用の潜在的な損傷を最小限に抑える送達システムを設計するよう、注意する必要がある。本明細書に記載の組成物の投与量は、一般に、毒性がほとんどまたはまったくないＥＤ５０を含む範囲内にある。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
【００５３】
さらなる詳細なしに、当業者は、上記の説明に基づいて、本開示を最大限に利用することができると考えられる。したがって以下の特定の態様は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる方法であれ、本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用されるすべての刊行物は、本明細書で参照される目的または主題のために、参照により組み込まれる。
【実施例】
【００５４】
例１
遺伝性網膜変性症は、光受容細胞または網膜色素上皮に影響を及ぼし失明を招く２５０を超える遺伝子の変異によって引き起こされる。常染色体劣性およびＸ連鎖性網膜変性症については、臨床試験の数の増加、および先天性失明の形態に対する最初の遺伝子治療の最近の商業化によって証明されるように、遺伝子治療の分野で重要な進歩が達成されている。しかし、ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子の１５０を超える変異によって引き起こされる常染色体優性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）の最も一般的な形態の処置法を開発するための多大な努力にもかかわらず、診療への移行は行き詰まっている。ここでは、変異非依存の様式でヒト（およびイヌ科）ＲＨＯを標的とする非常に効率的な新規の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が初めて同定された。単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにおいて、このｓｈＲＮＡを、ＲＮＡ干渉に耐性を持たせたヒトＲＨＯ置換ｃＤＮＡと組み合わせ、この構築物（以下「ｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０」と呼ぶ、図６参照）を、ＲＨＯ−ａｄＲＰの天然に存在するイヌ科モデルで試験した。網膜下ベクター注射は、内在性イヌ科ＲＨＯ ＲＮＡのほぼ完全な抑制をもたらし、一方、ヒトＲＨＯ置換ｃＤＮＡは、正常なＲＨＯタンパク質レベルの最大３０％をもたらした。非侵襲的網膜イメージングは、処置領域において光受容体が網膜変性から完全に保護されていることを示した。組織病理学は、杆体外節における正常な光受容体構造およびＲＨＯ発現の維持を確認した。網膜イメージングおよび網膜電図検査による長期（＞８ヶ月）のフォローアップは、安定した構造的および機能的保持を示した。臨床的に関連のある大型動物モデルにおけるこの遺伝子治療の有効性は、ＲＨＯ−ａｄＲＰの患者を処置するための道を開く。
【００５５】
過去２０年間で臨床試験に参加する遺伝子治療の数が急増し（１、２）、近年、これらのうち少数が、中国、ヨーロッパ、および米国の規制当局から販売承認を受けている（３）。これらの試験の大部分は、がん、心血管、および遺伝性の単一遺伝子疾患を対象としている（１）。遺伝性の単一遺伝子疾患に対する戦略は、必然的に疾患のメカニズムに基づく。多くの機能喪失型変異については、戦略は遺伝子増強（gene augmentation）である（４）。優性阻害効果（ドミナントネガティブ効果）を引き起こす変異の場合、遺伝子増強は、変異産物の有害作用を希釈することにより、いくらかの治療上の利益ももたらし得る（５、６）。しかし、毒性機能獲得をもたらす変異の場合、調査されている戦略には、遺伝子の除去またはＤＮＡレベルでの欠陥の修正（例：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集）、転写抑制、およびＲＮＡノックダウン／抑制（７、８）が含まれる。
【００５６】
２５０を超える遺伝子の変異が、遺伝性網膜疾患を引き起こすことが知られており（sph.uth.edu/retnet/）、遺伝子治療のアプローチは、網膜へのアクセスが容易であるためにかなり進歩している。遺伝子増強の臨床試験は現在、少なくとも６つの常染色体劣性網膜疾患、３つのＸ連鎖性網膜疾患、および１つの母性遺伝性ミトコンドリア網膜疾患について進行中である（９）。常染色体優性網膜疾患の試験はなく、その最も一般的なものは、ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子の変異によって引き起こされる常染色体優性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）である（１０〜１４）。同定された１５０を超えるＲＨＯ変異について、主にin vitroの所見に基づくいくつかの推定病原性メカニズムが提案されており（レビューについては１５、１６を参照）、それでもＲＨＯ−ａｄＲＰ患者の表現型の詳細な特徴は、２つの主要なカテゴリーと一致している（１７〜１９）。クラスＡ変異の患者は、幼少期から杆体が重度に失われているため、現実的な治療アプローチは錐体生存の延長に向けられるべきである。一方、クラスＢ変異の患者は、一部の網膜領域または網膜全体で成人後期まで数十年生存する杆体を有することができ、残っている杆体を救出し、二次錐体細胞の喪失を防ぐことを目的とした遺伝子治療の恩恵を受けることができる（２０）。
【００５７】
過去２０年間、ＲＨＯ−ａｄＲＰの遺伝子治療の取り組みは、特定の変異アレルの発現を低下させること（２１〜２８）、または変異非依存の戦略の開発に焦点を合わせてきた。後者の戦略は、変異体と野生型（ＷＴ）ＲＨＯタンパク質の両方の発現をノックダウンすること（２９〜３９）と、ＷＴタンパク質をコードする耐性ＲＨＯ ｃＤＮＡを置換として提供すること（４０〜４３）を組み合わせる。耐性は、標的部位内の縮重／ゆらぎヌクレオチドでのコドン修飾によって付与され、ノックダウン試薬とのハイブリダイゼーションを防ぐ。かかる変異非依存の「ノックダウンと置換」戦略は、個々のＲＨＯ変異の複数の遺伝子治療の開発に固有の技術的および経済的課題を回避しつつ、ＲＨＯ−ａｄＲＰの高いアレルの不均一性に対処することを目的としている。２つの別々の（４２）または単一のＡＡＶベクター（４１、４３）のいずれかを使用した２つの成分の網膜同時送達は、別々の研究グループによりトランスジェニックマウスで調査された。しかし、進行中の杆体変性の完全な予防または阻止は達成されなかった。
ここでは、変異非依存の様式でヒトＲＨＯを標的とする、非常に効果的な短ヘアピンＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ８２０が同定された。耐性型のヒトＲＨＯと組み合わせて、単一の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子に同時パッケージ化すると、二重のノックダウン機能と置換機能を備えたこの構築物は、ＲＨＯ−ａｄＲＰの自然発生イヌ科モデルにおける網膜変性に対する、長期的な保護を提供した。
【００５８】
結果
野生型ロドプシンのｓｈＲＮＡ８２０による最適抑制
以前に同定された（３３）ハンマーヘッド型リボザイム（Ｒｚ５２５）を含む４つのノックダウン試薬、およびイヌ科とヒトのＲＨＯの異なる相同領域を標的とする３つの新規なｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１３１、ｓｈＲＮＡ１３４、ｓｈＲＮＡ８２０）（図７）を、初めにin vitroアッセイでスクリーニングした。ＲＨＯ発現のサイレンシングは、in vitroで（図８）、ならびにＷＴ（図９Ａ〜９Ｃ；表１、グループＣ）およびＲＨＯ変異の両方のイヌ科の眼（図１０Ａ〜１０Ｃ；表１、グループＦ）において、Ｒｚ５２５により非常に効果的であった。しかしながら、ＲＨＯ発現のほぼ完全な抑制を達成するのに必要なＡＡＶ２／５−Ｒｚ５２５の高いウイルス力価に関連する、重度の網膜合併症のために（以下の結果および図１０Ｄ〜１０Ｅ）、Ｒｚ５２５のさらなる開発は中止された。ｓｈＲＮＡのin vitroスクリーニングは、ｓｈＲＮＡ１３１がＷＴヒトＲＨＯタンパク質の約５０％の減少のみをもたらし（図１Ａ、１Ｂ）、変異型ヒトＲＨＯ Ｐ２３Ｈ（図１Ｃ、１Ｄ）およびＴ１７Ｍ（図１Ｅ、１Ｆ）の抑制には失敗したことを示した。さらに、注射されたイヌ科のＷＴ眼におけるＲＨＯ発現の抑制は、限定的であった（以下の結果、図１１Ａ〜１１Ｃ、表１、グループＢ）。
in vitroでＷＴおよび変異（Ｐ２３ＨおよびＴ１７Ｍ）両方のヒトＲＨＯタンパク質の発現を抑制する最も強力なｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ８２０であった（図１Ａ〜１Ｆ）。並行して、ｓｈＲＮＡ８２０の標的部位内の縮重／ゆらぎ位置に４つの変化したヌクレオチドを含むヒトＲＨＯのコドン修飾形態であるＲＨＯ８２０は、ｓｈＲＮＡ８２０抑制に耐性であることが確認された（図１Ｇ、１Ｈ）。ｓｈＲＮＡ８２０が変異非依存の様式でＲＨＯを標的とすることが確認されると、ＷＴおよびＲＨＯ変異イヌにおけるさらなる評価のためのリードノックダウン試薬として選択された。
【００５９】
ｓｈＲＮＡ８２０の検証は最初にＷＴイヌで行われて、ＲＨＯの発現が大幅に減少され得、同時に外節（ここではＲＨＯが主要なシグナル伝達および構造タンパク質であるが、杆体光受容体の残りの細胞コンパートメントに主要なストレスまたは変性はない）でのみ予想される変化が発生するところの、力価を決定した。網膜下注射は、１０匹のＷＴイヌ科の眼に、１×〜５０×１０１１ｖｇ／ｍＬの範囲のＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ８２０力価で実施した（表１、グループＡ）。処置した眼は、注射後７〜８週間で、網膜構造の生体内スペクトル領域光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）イメージングによって評価し、注射なしの対照眼と比較した。代表的な注射なしのＷＴ眼では、ＯＣＴによる上網膜の断面イメージングにより、異なる網膜層に対応する低散乱層と高散乱層が明らかになった（図２Ａ、左）（４４）。光受容体核が存在する外顆粒層の厚さ（ＯＮＬ）、および内節−外節（ＩＳ／ＯＳ）接合部の近くで発生する後方散乱強度が、この研究の主な関心事であった（図２Ａ、左）。ＩＳ／ＯＳ強度は、外節の長さ、配置、および空間密度の変化に敏感であると予想されるため、外節の状態の非侵襲的な代理測度として使用可能である。注射なしのＷＴの正規化ＩＳ／ＯＳ強度トポグラフィーは、均一となる傾向がある（図２Ａ、中央の列）。注射なしのＷＴ眼のＯＮＬ厚さトポグラフィーも比較的均一であり、網膜中心上部側頭（central retina supero-temporal）から視神経頭（ＯＮＨ）では値が徐々に大きくなり、上網膜と下網膜の非タペート領域では値が徐々に小さくなった（図２Ａ、右の列）。１×１０１１ｖｇ／ｍＬ（図２Ｂ）または５×１０１１ｖｇ／ｍＬ（図２Ｃ）のベクターを注射した眼によって代表される低力価および中力価の注射は、注射領域と隣接する非注射領域との間に質的な構造変化を示さなかった。
【００６０】
ＲＨＯノックダウンの構造的影響が検出可能だが軽度である最適な力価を定義するために、網膜の位置を体系的にサンプリングした（図１２）。２つの最低力価（１×および２．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ）の注射位置の大部分は、ＩＳ／ＯＳ強度およびＯＮＬ厚さに関して、注射なしの対照眼と同等であった（図２Ｄ、２Ｅ、上部パネル）。対照的に、２つの最高力価（１０×１０１１および５０×１０１１ｖｇ／ｍＬ）の注射位置の大部分は、ＲＨＯノックダウン（図２Ｄ）から予想されるＩＳ／ＯＳ強度の低下と、光受容体ストレスを示唆するいくらかのＯＮＬの肥厚（図２Ｅ）を示した。検出可能な変化への移行は、５×１０１１〜８×１０１１ｖｇ／ｍＬの間で発生し（図２Ｄ、２Ｅ、矢印）、潜在的な最適力価の範囲を示唆する。すべての力価で処置された眼における注射なし部位の位置の大部分は、注射なしの眼から期待される結果と一致し、ＲＨＯノックダウンの効果の、網膜下注射領域への局在化を確認する（図２Ｄ、２Ｅ、下のパネル）。
【００６１】
動物は注射後７〜８週間で人道的に安楽死させ、１×〜１０×１０１１ｖｇ／ｍＬの範囲の力価で処置した４つの眼を、組織学およびロドプシン免疫組織化学のために処理した（図２Ｆ）。各眼の処置領域と未処置領域の間にＯＮＬ厚さの明らかな質的な違いは見られず、高いウイルス力価のＯＣＴイメージングで見られるＯＮＬの肥厚は、細胞増殖ではなく、細胞間または細胞内の腫れ（組織固定後は検出できない）の結果である可能性が高いことを示唆している。杆体オプシン免疫標識の顕著な減少に関連する外節構造の喪失が、１０×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価ベクターで処置した領域で見られた。５×１０１１ｖｇ／ｍＬでは、同じ眼の未処置領域と比較した場合、処置領域において、外節の短縮と杆体オプシン免疫標識の減少が見られた。２つの最低力価（１×および２．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ）では外節が保持され、杆体オプシンの免疫標識は処置領域と未処置領域で同等であった。１×１０１１〜５０×１０１１ｖｇ／ｍＬの範囲の力価を注射した残りの６つの眼（図２Ｇ）を使用して、ＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ８２０の、ＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方で内在性イヌ科ＲＨＯの発現を低下させる効率を評価した。絶対ＲＮＡ定量化（図２Ｈ）では、非常に低レベルのＲＨＯ転写物（未処置領域で見られるものの０〜３％）が、５０×１０１１から５×１０１１ｖｇ／ｍＬまでの範囲の力価を注射した眼の処置領域において示された。より低い力価（１×１０１１〜２．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ）では、ノックダウン効率が低下し、通常のＲＨＯ ＲＮＡレベルの２２〜７４％が処置領域に残っている。免疫ブロットの処置領域に存続するＲＨＯタンパク質の定量化は、用量依存的効果を明らかにし（図２Ｈ）、２つの最高力価（５０×１０１１および１０×１０１１ｖｇ／ｍＬ）で処置された眼では検出できないレベルであり、５×１０１１ｖｇ／ｍＬで処置された眼で１５％、および２つの最低力価では＞４７％であった。
【００６２】
これらの研究は、ｓｈＲＮＡ８２０の網膜下ＡＡＶベクター送達が、ＷＴイヌ科ＲＨＯの非常に効率的なサイレンシングを達成できることを示し、５×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価が、主要な光受容体ストレスまたは変性を生じることなく、杆体光受容体で高度に発現する構造タンパク質のノックダウン間の、最適なバランスを提供し得ることを示唆した。
表１：イヌで実施した実験手順の要約
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【００６３】
表１（続き）。
【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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光：周期的環境（１２時間オン、１２時間オフ）の暗赤色または白色照明；LE：露光プロトコル；OD：右眼；OS：左眼；F：雌；M：雄；IVit：硝子体内；subRPE：網膜色素上皮の下；cSLO：共焦点走査型レーザー検眼鏡検査；OCT：光コヒーレンストモグラフィー；ＲＮＡ／タンパク質：ロドプシンのＲＮＡおよびタンパク質レベルの定量化；ＥＲＧ：網膜電図検査；H&E：ヘマトキシリンおよびエオシン染色による組織学；IHC：免疫組織化学。
【００６４】
変異ＲＨＯのｓｈＲＮＡ８２０による抑制
ＷＴと変異ＲＨＯアレルの両方を発現するヘテロ接合変異網膜におけるｓｈＲＮＡ８２０の効率を検証するために、ＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ８２０の網膜下注射を、一定範囲の力価（１×１０１１〜１０×１０１１ｖｇ／ｍＬ）にわたり１０個のＲＨＯ変異眼において実施し、これを注射後８〜１０週間追跡した（表１、グループＤ、Ｅ）。ＲＨＯ変異イヌの網膜は光に非常に敏感であるため（４５〜４８）、動物は誕生から研究終了まで暗赤色光の下で飼育し、外科的介入は赤外線照明の下で行った（４９）。ＲＮＡおよびタンパク質レベルでのＲＨＯノックダウン効率の定量化のために、４つの眼を使用した（図３Ａ；表１、グループＤ）。ＷＴ動物の場合と同様に、１０×１０１１ｖｇ／ｍＬの力価で、処置領域におけるＲＨＯ ＲＮＡおよびタンパク質発現の完全なサイレンシングがあった（図３Ｂ）。ＲＨＯ発現の同様の欠如は、より低い力価（５×１０１１ｖｇ／ｍＬ）でも達成された。ただしこの結果の解釈は、この眼の処置領域に限定されたＯＮＬ厚さの部分的な損失を明らかにするＯＣＴイメージングによって混乱した。ＲＨＯの持続的な発現は、より低い力価（１×１０１１および２．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ）で見られた。
【００６５】
次に、ノックダウンのみで光受容体の変性を抑えることができるかどうかを評価した。４つのＲＨＯ変異眼の別のセット（表１、グループＥ）にも、同じ範囲の力価のＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ８２０を注射したが、注射後６〜８週間において、このイヌ科モデルで急性網膜変性を引き起こすことが知られている中程度の強度の白色光に１分間曝露した（４６〜４８）。露光の２週間後、１０×１０１１および５×１０１１ｖｇ／ｍＬの力価を注射した眼は、処置領域に対応するＯＮＬ保持の明確な領域を示した（図３Ｃ）。処置領域の外では重度の網膜変性があり、ノックダウンのみによって達成される光受容体の実質的な救済を実証した。ＲＨＯのノックダウンから予想されるＩＳ／ＯＳ強度の異常があった。また、最高力価（１０×１０１１ｖｇ／ｍＬ）を注射した眼は、軽度の光受容体ストレスを意味するＯＮＬの肥厚を示した。２つの最低力価（２．５×１０１１ｖｇ／ｍＬおよび１×１０１１ｖｇ／ｍＬ）を注射した眼は、処置領域でのＯＮＬ保持がないことに限定されていた（図３Ｃ）。これらの眼の組織学的分析（図３Ｄ）は、in vivo網膜イメージングの結果を確認した。内節の短縮、外節構造の喪失、および２つの最高力価の注射後の杆体オプシン免疫標識の低下を伴う、ＯＮＬ保持があった。２．５×１０１１ｖｇ／ｍＬの力価では、ＯＮＬを保持する小さな島を除いて、処置領域内で重度のＯＮＬの菲薄化が見られた。最も低い（１×１０１１ｖｇ／ｍＬ）力価は、露光に対する保護を与えなかった。この眼では、処置領域のＯＮＬは未処置領域のＯＮＬに似ていた；それは、まれな残存杆体細胞体と杆体オプシン陽性の破片を伴う、単一列の錐体細胞体に限定されていた。
【００６６】
これらの知見を総合すると、ｓｈＲＮＡ８２０はin vivoでＷＴおよびＴ４Ｒアレルの両方を抑制でき、５×１０１１〜１０×１０１１ｖｇ／ｍＬの範囲のＡＡＶ２／５−ｓｈＲＮＡ８２０力価は、光受容細胞（外節ではない）に、ＲＨＯ変異網膜における網膜変性からの保護をもたらすことを確認する。この部分的な保護効果は、内節と杆体光受容細胞体を無傷に保ちつつ、杆体の外節の脱構築につながる効率的なＲＨＯ抑制に起因する可能性がある。光感知する外節を保持している機能的な杆体を保持しつつ、網膜を変異ＲＨＯが駆動する変性から保護することの必要性は、内在性イヌ科ＲＨＯ（ＷＴおよび変異体）の抑制が、ｓｈＲＨＡ８２０に耐性を持つヒトＲＨＯ ｃＤＮＡ（ＲＨＯ８２０）の発現で補完できるかどうかの調査につながった。
【００６７】
抑制と置換の組み合わせ
二重ベクター−二重機能戦略
最初に、２ベクター戦略の試験を、上記で使用したＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ８２０を、ヒトオプシンプロモーターの制御下で耐性ヒトＲＨＯ ｃＤＮＡ（ＲＨＯ８２０）を保有する同様のＡＡＶ２／５血清型（ＡＡＶ−ＲＨＯ８２０）と共に同時注射することによって実施した。２つのＲＨＯ変異眼に両方のベクターの同様の力価（５×１０１１ｖｇ／ｍＬ）を同時注射し（処置１：１）、他の２つの変異眼に５×１０１１ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ８２０と１０×１０１１ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ−ＲＨＯ８２０を同時注射した（処置１：２）（表１、グループＧ）。各処置グループの片方の眼は、注射後７週間、露光プロトコルに暴露し、４つすべての眼を４週間後にＯＣＴによりイメージングした。処置１：１を受けた露光された眼において、いくらかのＯＮＬ保持があったが、処置された領域の大部分において正常な厚さに達しなかった（図１３Ａ）。最大のＯＮＬ保持を有する領域ではいくらかの杆体外節の保存があり、ＲＨＯ８２０との置換によって与えられる有益な結果を示唆した（図１３Ｂ、１３Ｃ）。部分的なＯＮＬ保護は、処置１：２を受け光に暴露された眼でも発生した；しかしながら、単核炎症細胞（図１３Ｆ）の重度の血管周囲および網膜内浸潤に起因する、異常に増加した網膜内部の厚さが処置領域で見られた（図１３Ｄ）。さらに、杆体外節の破壊が存在した（図１３Ｅ）。同様の所見が、対側のシールドされた眼のＯＣＴによって観察され（処置１：２）、これには、限局性網膜剥離、血管周囲および網膜下細胞浸潤の徴候が含まれた（図１３Ｇ）。この２ベクター戦略の結果は、ノックダウンと置換機能の組み合わせの有益な効果を示した。それにもかかわらず、不完全な杆体保護があり、処置は重度の網膜合併症をもたらした。これらの制限を回避するために、ノックダウン（ｓｈＲＮＡ８２０）要素と耐性置換（ＲＨＯ８２０）要素を組み合わせた単一のＡＡＶベクターが開発された。この代替戦略により、より低いウイルス量で光受容体の同時形質導入を確実にし、したがって網膜変性からのより良い保護と改善された安全性を達成する、との仮説が立てられた。
【００６８】
単一ベクター−二重機能戦略
ＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ８２０−ＲＨＯ８２０の網膜下注射を、８つのＲＨＯ変異眼に以前に決定された５×１０１１ｖｇ／ｍＬの最適力価で実施した（表１、グループＨ）。処置された動物は、露光プロトコルに注射後７週間（ｎ＝２眼）または１３週間（ｎ＝２眼）供され、急性網膜変性の予防における単一ベクターアプローチの有効性を決定した。４つの眼すべてにおいて、露光後２週間、ＯＮＬの厚さが実質的に保持された（図４Ａ、４Ｂ；図１４Ａ、１４Ｂ）。最も重要なことは、４つの眼すべてが処置領域に検出可能なＩＳ／ＯＳ信号を有していたことである。ＩＨＣによる光受容体の構造分析（図４Ｃ、４Ｄ；図１４Ｃ、１４Ｄ）は、in vivoの結果を確認した：処置領域において、正常な数の光受容体細胞体がＯＮＬに保持され、杆体外節が検出された。細長い杆体外節の保持は、錐体の内節および外節の形態の改善と関連していた。同様の用量のＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ８２０−ＲＨＯ８２０を注射したが光に暴露はしなかった４つの対側眼を、同様の時点（注射後９週間および１３週間）で収集し、処置および未処置領域におけるＲＨＯ ＲＮＡおよびタンパク質の定量化のために処理した（図４Ｅ）。予想通り、注射後９週間のイヌ科ＲＨＯ ＲＮＡ（図４Ｆ）は、２つの眼の処置領域でかなり減少した（未処置領域に見られるものの１５〜１６％）。注射後１３週間で処理した２つの眼では、残留するイヌ科ＲＨＯ ＲＮＡのレベルがさらに低下した（未処置領域の１〜２％）。注射後９週間で収集された２つの眼におけるヒトＲＨＯ８２０導入遺伝子転写物レベル（図４Ｇ）は、未処置領域で測定されたイヌ科ＲＨＯレベルの５〜９％であった。より遅い注射後１３週間の時点で、ヒトＲＨＯ８２０ ＲＮＡのレベルはかなり高かった（未処置領域で測定されたイヌ科ＲＨＯレベルの１１８％から１３２％）。タンパク質レベル（図４Ｇ）では、総（内在性イヌ科およびヒト）ＲＨＯタンパク質の測定値は同様の時間的傾向を示し、１３週間で、注射後９週間（１８〜１９％）より高いＲＨＯタンパク質レベル（未処置領域のイヌＲＨＯレベルの３１〜３３％）を示した。まとめると、これらの結果は、ＲＨＯノックダウンとＲＨＯ置換機能の両方を組み合わせた単一のウイルスベクターが、内節と外節を含む杆体光受容体の構造全体の完全性を効果的に保持できること、および耐性ＲＨＯ導入遺伝子の発現レベルが、ベクターの送達後数週間上昇し続けることを、確認する。
【００６９】
網膜の構造と機能の、単一ベクター処置による３７週間の保持
単一ベクター戦略の長期安定性および、ＲＨＯ変異眼を変性から保護するその能力を評価するために、２匹のＲＨＯ変異イヌに、ＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ８２０−ＲＨＯ８２０を以前に決定された５×１０１１ｖｇ／ｍＬの最適力価で片眼に網膜下注射し、反対側の眼には同量の平衡塩類溶液（ＢＳＳ）を注射した（表１、グループＩ）。４つの眼すべては、注射後１１、１５、２５、３５週間に繰り返し光に暴露した。ＯＣＴイメージングは、注射前、ならびに各露光の直前、および約２週間後に実施した（図５Ａ、上段、タイムライン）。最初の露光後、処置領域内で光受容体が完全に保持され、この劇的な処置効果は、注射後３７週間、３回の追加の露光後にも持続した（図５Ａ、下の列）。２つのＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ８２０−ＲＨＯ８２０注射眼の処置領域からサンプリングされた網膜位置（図５Ｂ、左）で実施した定量分析は、注射後のＯＮＬ厚さのわずかな増加を示し、これは１２週間近くでピークに達し、その後３７週までに徐々に正常レベルに戻った（図５Ｂ、中央）。ＩＳ／ＯＳ信号は、処置領域内のすべての時点で検出可能なままであった。ＩＳ／ＯＳ強度のわずかな減少があり、これも１２週間近くでピークに達し、その後、注射後３７週間までに徐々に正常レベルに戻った（図５Ｂ、右）。
【００７０】
網膜電図検査（ＥＲＧ）測定は、網膜機能を評価するために、各露光の２．１〜２．４週間後に実施した（図５Ａ、上段、タイムライン）。定性的に、ＥＲＧは、ＡＡＶ-ｓｈＲＮＡ８２０-ＲＨＯ８２０で処置した眼において、ＲＨＯ変異イヌの反対側のＢＳＳ注射した眼（図５Ｃ、破線のトレース）に対して、一貫してより良好な杆体および錐体媒介機能を示した（図５Ｃ、実線のトレース）；実質的なＥＲＧ非対称性が、ベクターとＢＳＳで処置した眼の間に存在し、非対称性は各露光後に増加した（図５Ｃ）。定量的に、杆体が優勢なＥＲＧトレースの振幅は、おそらく処置領域の外側の末梢網膜で発生する継続的な光受容体変性のために、ＡＡＶおよびＢＳＳ注射眼の両方で時間とともに減少する傾向を示した（図５Ｄ、上部パネル）。錐体機能は、４回の露光が介在する注射後３７週間を通して、全体的により安定しているように見えた（図５Ｄ、下のパネル）。重要なことには、各時点で、処置した眼において杆体および錐体の反応が実質的により大きかった。
これらの結果は、ＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ８２０−ＲＨＯ８２０が杆体光受容体の構造全体の完全性を保持し、そうでなければ未処置のＲＨＯ変異眼で急速に発生する変性から最大３７週間の網膜構造と機能の保護を与えることを示す。
【００７１】
イヌ科ＲＨＯのＲｚ５２５による抑制
ＷＴヒトＲＨＯの発現を低下させることがin vitroアッセイで示されたハンマーヘッド型リボザイム（Ｒｚ５２５）（図８）を、ＡＡＶ２／５ベクターにパッケージ化し、２０および５０×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価で３つのＷＴイヌ科の眼に網膜下注射した（図９Ａ）。ＡＡＶ２／５−Ｒｚ５２５の、ＲＮＡレベルで内在性イヌ科ＲＨＯの発現を低下させる効率を、最高力価（５０×１０１１ｖｇ／ｍＬ）を注射した眼でのみ測定した。処置領域では、ＲＮＡレベルでＲＨＯ発現が完全にサイレンシングされ（図９Ｂ）、一方ＲＨＯのタンパク質レベルは〜３０％に減少した（図９Ｃ）。２０×１０１１ｖｇ／ｍｌを注射した２つの眼では、処置領域に残る内在性イヌ科ＲＨＯタンパク質のレベルがより高かった（４７および６４％）（図９Ｃ）。
【００７２】
続いて、Ｒｚ５２５の試験を、ＡＡＶ２／５−Ｒｚ５２５を２０×１０１１（３眼）または１００×１０１１ｖｇ／ｍＬ（２眼）のいずれかで網膜下注射した５つのヘテロ接合ＲＨＯ変異眼（表１、グループＦ）で実施した。追加の変異眼にはＢＳＳを注射し、陰性対照として使用した。注射後８週間において、ＲＨＯ発現の顕著なサイレンシングが、ＲＮＡ（１３％残留）およびタンパク質（０．１％残留）レベルの両方で、最高の力価（１００×１０１１ｖｇ／ｍＬ）によるＥＭ３９６−ＯＤの処置領域において見られた（図１０Ａ〜１０Ｃ）。しかしながらこの処置は、ＯＣＴイメージングによって検出された網膜下腔における網膜剥離および細胞浸潤の徴候と関連し（図１０Ｅ、上段）、同様の力価を注射した僚眼（ＥＭ３９６−ＯＳ）における組織学によって確認された（図１０Ｅ、下の列）。より低い２０×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価を注射した２つの眼は、処置領域内に残るより多くの内在性イヌ科ＲＨＯを、ＲＮＡレベル（３９および６６％）およびタンパク質レベル（３６および６７％）の両方で有していた（図１０Ａ〜１０Ｃ）。これらのレベルのＲＨＯ抑制が光誘発性網膜変性からの保護を与えるのに十分であるかどうかを評価するために、ＡＡＶ２／５−Ｒｚ５２５を２０および１００×１０１１ｖｇ／ｍＬで注射した２つの変異ＲＨＯ眼を、注射後６週間光に曝露し、ＯＣＴによって画像化した。露光の２週間後、１００×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価を注射した眼には、処置領域内にＯＮＬ保持の領域がいくつか存在した；しかし、より低い力価（２０×１０１１ｖｇ／ｍＬ）を注射した眼では、かかる救出は見られなかった（図１０Ｄ）。
【００７３】
これらの結果は、ＲＨＯのほぼ完全なノックダウンが、Ｒｚ５２５によって達成できること、およびＲＨＯタンパク質発現の低下が、ＲＨＯ−ａｄＲＰのイヌ科モデルにおける光誘発性網膜変性に対するある程度の保護と関連していることを示した。それでも、保護は、網膜炎／脈絡網膜炎の重篤な兆候に関連する高いウイルス量を注射した場合にのみ、達成ですることができた。
表２：ＷＴ ＲＨＯの標的部位およびｈＲＨＯ８２０のコドン修飾耐性部位でのコドン頻度（１０００あたり）（Codon Usage Database, kazusa.or.jp/codon/に基づく）。
【表２】
2021525531.tif 000009
【００７４】
ｓｈＲＮＡ１３１によるＷＴイヌ科ＲＨＯの限定的抑制
細胞培養においてＷＴヒトＲＨＯの発現を低下させることが示されたノックダウン試薬（ｓｈＲＮＡ１３１）（図１Ａ〜１Ｈ）を、ＡＡＶ２／５ベクターにパッケージ化し、２つのＷＴイヌ科の眼に１０および５０×１０１１ｖｇ／ｍＬ力価で網膜下注射した（図１１Ａ；表１、グループＢ）。ＡＡＶ２／５−ｓｈＲＮＡ１３１の、内在性イヌ科ＲＨＯの発現を低下させる効率は、ＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方で限定されていた。最高力価（５０×１０１１ｖｇ／ｍＬ）でも、内在性イヌ科ＲＨＯ ＲＮＡの正常レベルの５０％（図１１Ｂ）および内在性イヌ科ＲＨＯタンパク質の７０％（図１１Ｃ）が、処置領域内に注射後８週間残っていた。その結果、ＲＨＯ抑制の潜在的候補としてのｓｈＲＮＡ１３１の使用に関する、イヌにおけるさらなる調査は追求されなかった。
【００７５】
ＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０の、ＲＨＯ−ａｄＲＰのイヌ科Ｔ４Ｒモデルでの反復露光による網膜変性発症の予防における長期有効性
ＡＡＶ２／５ベクターの５０週間にわたる有効性を、変異型ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌ科で評価した。未処置のＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌの網膜における光誘発性網膜変性に対する安定した保護を光受容体に付与するベクターの能力を、ＯＣＴおよびＩＨＣによって構造的に評価し、ＥＲＧによって機能的に評価した。注射後１２、２４、３６、および４８週間で、これらのイヌの網膜に急性の露光イベントを負荷した。ＯＣＴおよびＥＲＧ検査は、研究の過程で実施した。実験の終了時（注射後５０週間）に、網膜組織をＩＨＣ用に処理した。実験計画の実例を図１７に示す。
ＥＲＧ測定は、ＢＳＳよりもＡＡＶで処置された眼で、有意に優れた杆体および錐体媒介機能を示した。図１８Ａ〜１８Ｄは、ｓｃＡＡＶ２／５−ｈＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０（点線）を片方の眼に、および反対側の眼にＢＳＳ（実線）を注射したイヌの各露光イベントの約２週間後に、杆体（−１．７ ｌｏｇ ｃｄ．ｓｍ−２）、混合杆体−錐体（０．５１ ｌｏｇ ｃｄ．ｓｍ−２）の代表的なＥＲＧトレースは暗順応を記録し、単一刺激（０．５１ ｌｏｇ ｃｄ．ｓｍ−２）または２９Ｈｚの錐体フリッカー（０．２６ ｌｏｇ ｃｄ．ｓｍ−２）に対する錐体応答は明順応を記録したことを示す。
【００７６】
４匹のＲＨＯ変異イヌに、片方の眼にｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０（水平線の陰影）を、反対側の眼にＢＳＳ（対角線の陰影）を、示されように同様の時点で注射した。杆体ｂ波、混合杆体−錐体ａ波およびｂ波、ならびに錐体１Ｈｚおよび２９Ｈｚフリッカー応答の最大振幅の縦方向の定量化を、図１９Ａ〜１９Ｃに示す。光受容体からの電気的応答はａ波と呼ばれ、網膜の双極細胞からの電気的応答はｂ波と呼ばれる。
ＯＣＴ分析は、ＡＡＶ処置領域で外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さが保持されていることを示したが、一方で処置領域の外側においてもＢＳＳ処置領域においても、保護は見られなかった。in vivoの結果は、ＯＮＬおよび杆体と錐体の両方の内節および外節の保持を示した組織学／ＩＨＣによって確認された。ＲＨＯ変異イヌのそれぞれについて、ＯＮＬ厚さマップおよび内節−外節（ＩＳ／ＯＳ）強度マップが、図２０Ａ〜２０Ｄに注射前（pre-inj.）、注射後１２週間（最初の露光イベントの前）、および注射後５０週間（４番目の露光イベントの２週間後）において示されている。
【００７７】
ＲＨＯ変異イヌからのロドプシン（ＲＨＯ）／ヒト錐体アレスチン（ｈＣＡ）共免疫標識網膜凍結切片は、同じ眼の未処置および処置領域の外顆粒層（ＯＮＬ）および外節（ＯＳ）の形態を示す（図２１を参照）。図２１の下部パネルのＯＮＬ厚さマップは、上部パネルに示される網膜の未処置および処置領域のおおよその位置（アスタリスク）を示す。参考のために、眼の処置領域と未処置領域の間の遷移ゾーンも示す。
結果は、ＡＡＶ２／５−ｈＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０構築物が、ＲＨＯ−ａｄＲＰのイヌ科モデルにおいて、注射後５０週間までの光誘発性網膜変性に対して光受容体の安定した構造的保護を与えることを示す。結果はさらに、ＡＡＶ２／５−ｈＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０構築物が、ＲＨＯ−ａｄＲＰのイヌ科モデルにおいて、注射後５０週間までの光誘発性網膜変性に対する光受容体の安定した機能的（網膜電図検査）保護を与えることを示す。これらの結果は、上で実証された保護の安定性が１３週間延長されたことを示し、処置領域における杆体および錐体の構造的保持を確認する。
【００７８】
考察
常染色体優性疾患の遺伝子治療開発への多大な努力にもかかわらず（５０）、アンチセンス技術（ＡＳＯ、ｓｉＲＮＡ）を含む２つのみが臨床試験段階に達しており、これらは網膜表現型のない全身性疾患に対するものである（NCT01041222；NCT02363946）。変異非依存性の遺伝子ノックダウンと置換アプローチの開発は、毒性機能獲得型変異に起因する優性遺伝性の全身性および網膜疾患の処置のため、および／または高い変異不均一性を回避するために検討されてきた（４０〜４３、５１、５２）。臨床治療法の開発を遅らせた可能性が高い重要な課題は、十分な耐性置換を提供しつつ、変異性およびＷＴ内在性タンパク質の両方の減少レベルをうまく微調整する必要があることである（５３）。ここでは、ＲＨＯ−ａｄＲＰの自然発生形態および大型動物モデルにおいて、この二重機能戦略が長期的な光受容体の救済を効果的に提供できることが示されている。さらに、ノックダウン成分および置換成分の両方が同一ウイルスベクターで同時送達される場合、別々に送達される場合よりも有効性が向上し、安全性プロファイルが向上することが示されている。
【００７９】
ＲＨＯ−ａｄＲＰの自然発生大型動物モデルにおける遺伝子治療有効性の迅速評価
遺伝子増強、変異依存性ＲＨＯ抑制、および変異非依存性ＲＨＯノックダウンと置換を含む遺伝的アプローチは、これまでＲＨＯ−ａｄＲＰのトランスジェニック動物モデルでのみ試験されてきた。これらには、ｈＰ２３Ｈマウス（５、４１、４３）、ｈＰ３４７Ｓマウス（３６、３８、４２、５４）およびｍＰ２３Ｈ（１および３行目）ラット（２２、２３、２５、２６、３３）が含まれる。内在性ＲＨＯコピー数に対する変異導入遺伝子の比率が異なる動物モデルを使用すると、これらの研究間での光受容体の救出結果の比較が複雑になり、ヒトＲＨＯ−ａｄＲＰ網膜におけるそれらの潜在的な効率を推定できなくなる。最近では、同レベルのネズミ科Ｐ２３ＨおよびＷＴ ＲＨＯを発現するＰ２３Ｈオプシンノックインマウスが生成された（５５）。しかしこのモデルは、イヌ科とヒトのＲＨＯ ＲＮＡにおけるｓｈＲＮＡ８２０の標的部位がマウスでは保存されないために、本研究では役に立たなかったであろう。
【００８０】
将来のヒト臨床試験の文脈においてこれらの研究の予測値を高めるために、ＲＨＯ−ａｄＲＰの唯一の自然発生モデルであるＲＨＯ Ｔ４Ｒ変異イヌが使用された（５６）。ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌは、人間サイズの眼の翻訳価値、およびクラスＢ患者との表現型の類似性（５６）に加えて、等量の変異ＲＨＯタンパク質とＷＴＲＨＯタンパク質を発現する（５７）。両者は杆体外節（５７）への正常なトラフィックを形成し、生存初めの２年以内に光受容体喪失の進行領域が下側頭（図１５Ａ〜１５Ｃ）および網膜中心部（５６）で検出されるまで、正常な網膜構造および機能を維持する。ＲＨＯ−ａｄＲＰの他のモデル（４７）で認識され、クラスＢ患者（１９、４５、５８〜６０）で疑われる光に対する感受性は、イヌ科のＲＨＯ Ｔ４Ｒモデルで十分に特徴付けられている（４５）。この光感受性を利用した露光プロトコルが以前に開発されて、光受容体の急速かつ同期した喪失を実験的に引き起こし、自然の病気の経過を加速した（４６）。ＲＨＯ変異の（だがＷＴではない）イヌは、臨床患者の設定で遭遇する強度レベルを使用した急性（１分）露光後２週間以内に、中央から末梢網膜中部の杆体の完全な喪失を生じる（４７、４８）。ここでは、この「疾患加速」アプローチを使用して、ＲＨＯ変異体の杆体変性の予防に対する遺伝子治療介入の効果の、迅速な読み出しを得た。
【００８１】
ＲＨＯ抑制：強力なノックダウン成分の必要性
いくつかの動物モデル研究からの証拠は、毒性機能獲得メカニズムが、Ｐ２３Ｈ（５５、６１、６２）、Ｔ１７Ｍ（６３、６４）およびＴ４Ｒ／Ｔ４Ｋ（４５、６４）を含む多くのＲＨＯ変異に関連していることを示唆している。この毒性は、ＲＨＯ変異イヌを含む多くのＲＨＯ−ａｄＲＰモデルにおいて光に暴露されると悪化し得る（４７）。したがって、通常の周囲照明下では、Ｔ４Ｒ変異は、退色すると毒性が高いが発色団に結合すると安定するタンパク質を生成し（５７）、杆体を効率的に保護するには変異転写物を大幅にノックダウンする必要があると考えられた。この研究では、３つのｓｈＲＮＡとハンマーヘッド型リボザイムを含むいくつかのＲＨＯノックダウン試薬の効率を調べ、ＲＨＯの発現を抑制可能な最も強力な試薬を特定することを目的とした。ＲＨＯ変異イヌで試験されたＲｚ５２５は、内在性イヌ科ＲＨＯタンパク質の６４％の減少をもたらし、これは、光誘発性網膜変性からの保護を与えるのに十分ではなかった（図１０Ｃ〜１０Ｄ）。このことは、ＲＨＯの生理学的レベルの１８％という低い残存量がヘテロ接合変異網膜に疾患を引き起こすのに十分であったために、天然の変異Ｔ４Ｒタンパク質の高い毒性を確認し、より効率的な抑制を達成する必要性を主張した。ＲＨＯタンパク質の完全な抑制がＲｚ５２５で得られた場合、ある程度のＯＮＬ救出が観察されたが、高いウイルス力価（１０１３ｖｇ／ｍＬ）の必要性は、重度の網膜炎症と関連していた（図１０Ｃ〜１０Ｅ）。これらの結果に基づいて、in vitroおよびＷＴイヌでのスクリーニングと試験の後に同定された最も効率的なｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ８２０）のみを、その後変異体で評価した。結果は、ＲＨＯタンパク質発現の完全な抑制が達成された場合にのみ、最適な救出が起こったことを確認したが、ＲＨＯの８６％のノックダウンは部分的な保護しか提供しなかった（図３Ｃ〜３Ｄ）。これまでに報告された最も効率的なノックダウン試薬のいくつかは、ヒトＲＨＯ ＲＮＡの９０〜９５％抑制を達成したが、これらの結果はＦＡＣＳで選別された形質導入杆体で得られた（３６、４１）。ここで、残留するＲＨＯ ＲＮＡおよびタンパク質のレベルは、形質導入された杆体の濃縮された集団からではなく、処置領域内で収集された神経網膜の生検パンチから意図的に測定された。結果は、ＲＨＯ変異網膜におけるＲＨＯメッセージおよび生成物の完全なノックダウンを示し（図３Ｂ〜３Ｃ）、ｓｈＲＮＡ８２０が非常に強力であるだけでなく、杆体形質導入効率も非常に高かったことを示唆している。重要なことに、これは５×１０１１ｖｇ／ｍＬという低いＡＡＶ２／５力価で達成され、これは、イヌの網膜で十分に許容される力価の範囲内であることが以前に示されている（４４、６５、６６）。ＷＴおよびＲＨＯ変異のイヌにおけるＲＨＯタンパク質発現のほぼ完全な抑制は、他に報告された杆体外節構造の崩壊と同様に、ＯＳの喪失と関連していた（３６、５４）。ＲＨＯの抑制がＯＮＬ厚さのいかなる減少とも関連しないことに注意することが重要であり、杆体がｓｈＲＮＡ８２０の投与後少なくとも１０週間は生存可能であることを示唆する。この間隔は、外節の脱構築を防止するかまたは外節の再生を開始するのに十分なタンパク質を生成するための、耐性ＲＨＯ置換成分の同時発現用のウィンドウを提供する。
【００８２】
ＲＨＯの置換：どれだけで十分か／過剰か？
ロドプシンのわずか２３％の過剰発現がトランスジェニックマウスに網膜毒性を引き起こすことが示されているため（６７、６８）、ＲＨＯ遺伝子補充戦略に対する厳格な規制が求められている。しかし網膜変性は、ＲＨＯ遺伝子増強がｈＰ２３Ｈ ＲＨＯ＋／−、ｍＲＨＯ＋／−トランスジェニックマウスに出生後送達された場合には、観察されなかった。この遺伝的構成により、ＲＨＯ ＲＮＡが２倍に増加し、ＲＨＯタンパク質が５８％増加し、処置後最大６か月間、構造的および機能的両方の杆体が生じた（５）。これらの明らかに矛盾する結果は、成熟した杆体が発達中の光受容体よりも高レベルのＲＨＯ過剰発現を許容する可能性を示唆する。本研究において、遺伝子増強はＲＨＯ変異イヌで考慮されなかったが、これは、Ｔ４Ｒ変異の非常に高い毒性機能獲得のためのみでなく、この戦略が、１つの変異（ｈＰ２３Ｈ）および１つのＷＴ（ｍＲＨＯ）アレルを持つｈＰ２３Ｈ ＲＨＯ＋／−、ｍＲＨＯ＋／−トランスジェニックマウスにおいて試験された場合に、保護を与えることができなかったからである（４３）。代わりに、耐性ＲＨＯ ｃＤＮＡ（ＲＨＯ８２０）との置換を、ｓｈＲＮＡ８２０媒介性ＲＨＯ抑制と共に評価した。ＡＡＶ２／５−ｓｈＲＮＡ８２０−ＲＨＯ８２０を９週間前に注射した変異網膜の処置領域では、未処置領域（図４Ｈ）に見られるものの１８％という低い総ＲＨＯタンパク質レベルが、杆体外節構造を保持するのに十分であった（図４Ｃ、図１４Ｃ）。２つの追加の注射された眼からの網膜を４週間後（注射後１３週間）に処理した場合、より高いタンパク質の量（未処置領域の最大３３％）が測定され（図４Ｈ）、これは外節形成も維持した（図４Ｄ、１４Ｄ）。これらの所見は、ＲＨＯ置換の動態が抑制よりも遅いこと、およびＲＨＯ発現の最大レベルには処置後数週間まで到達しない可能性があることを示唆している。
【００８３】
ノックダウンと置換を単一のベクターに組み合わせると、２ベクターアプローチよりも最適な効率と安全性の向上を実現する
同じウイルスベクター内にノックダウン試薬と置換試薬を同時パッケージ化する、以前の取り組みは、ＯＮＬ厚さの短期（注射後１０日）の保持を提供したが、ｈＰ２３Ｈ ＲＨＯ＋／−、ｍＲＨＯ＋／−トランスジェニックマウスにおける杆体外節構造の救出には失敗した（４１）。これにより、ノックダウン試薬と置換試薬を別々にパッケージ化して２つのベクターの異なる比率を同時投与し、ＲＨＯの抑制と置換のレベルをより適切に制御できる、２ベクターアプローチを検討した。この戦略は、ｈＰ３４７Ｓ ＲＨＯ＋／−、ｍＲＨＯ＋／−トランスジェニックマウスにおいて、ＯＮＬ厚さ、杆体外節構造、およびＥＲＧ機能の保持を達成したが、効果は持続しなかった（４２）。本研究では、ＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ８２０およびＡＡＶ-ＲＨＯ８２０の同時注射は、露光に対するある程度の保護をもたらしたが、それでも、おそらく投与されたより高いウイルス用量の組み合わせのために、重度の網膜炎症の兆候が観察された（図１３Ａ〜１３Ｇ）。この所見は、マウスモデルで以前に首尾よく評価された単一ベクター二重機能戦略の追求につながった（４３）。ヒトＨ１ ＲＮＡおよびヒトオプシン近位プロモーターによってそれぞれ駆動されるＳｈＲＮＡ８２０およびＲＨＯ８２０は、組換えＡＡＶカセットの容量限界内に首尾よくパッケージ化された。この構築物の効率は非常に高く、注射後１３週間で内在性イヌ科ＲＨＯ ＲＮＡの約９８．５％の抑制、および正常に匹敵するレベルでのヒトＲＨＯ８２０の発現を達成した。それでも、タンパク質レベルでは、置換は通常レベルの約３分の１のみをもたらした。ＲＮＡレベルとタンパク質レベルの間のこの不一致は、耐性ＲＨＯ８２０ｃＤＮＡを生成するためにゆらぎ／縮重部位に導入された同義コドン修飾がその翻訳効率に影響を与えた可能性を含む、いくつかの要因によって説明し得る。ｓｈＲＮＡ８２０のＲＨＯ標的部位における４つの修飾コドンのコドン頻度の分析は、イヌとヒトの両方で、２つのコドンの頻度の増加、他の２つのコドンの頻度の減少、および４つすべてを組み合わせた場合の全体的な減少を示した（表２）。特に組織特異的な高度に発現された遺伝子において、コドンの使用と相対的なｔＲＮＡ存在量との間に相関が見出されたので（６９）、より低い頻度の２つのコドンを導入すると、ＲＨＯ８２０翻訳の速度が低下した可能性がある（７０）。したがって、置換遺伝子の修飾の数を減らすことにより、ロドプシン発現の改善が可能になり得る。ｓｉＲＮＡとｍＲＮＡの間の単一のミスマッチは、ＲＩＳＣを介した切断部位の近くでミスマッチが発生した場合、ＲＮＡサイレンシングをブロックするのに十分となり得る（７１）。コドンバイアスとは無関係の別の考えられる説明は、ＲＨＯ抑制の動態がＲＨＯ置換のそれよりも速いことかもしれない。ベクターで使用されるＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、より強力なＵ６プロモーターよりも安全であると考えられており、これにより、非常に高レベルのｓｈＲＮＡ発現がもたらされ、潜在的に、内在性ｍｉＲＮＡのプロセシングシステムが飽和状態になる。それにもかかわらずＨ１ ＲＮＡは豊富に発現され、ここで使用されるプロモーターは、試験されたすべての細胞型��機能する（７２、７３）。これは、注射後９週間で内在性ＲＨＯ ＲＮＡレベルの顕著な低下（約８４％）があり、一方、ＲＨＯ８２０ ＲＮＡレベルは正常の５〜９％にしか達しなかった理由を説明し得る（図４Ｆ〜４Ｇ）。免疫組織化学的分析により、構造的に保持されたＯＳにＲＨＯタンパク質が存在することが明らかとなったが、ＩＳ／ＯＳの完全性の新しい代理マーカーであるＩＳ／ＯＳ強度の網膜ＯＣＴイメージングでは、信号は検出可能ではあるが、注射後９および１３週間で減少したことを示した（図４Ａ〜４Ｂ、図１４〜１４Ｂ）。４つの急性露光イベントを受けたＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ８２０−ＲＨＯ８２０で処置された２匹のＲＨＯ変異イヌの縦断的分析は、ＩＳ／ＯＳ強度の同様の低下を示し、該強度は注射後約１２週間でピークに達し、その後３７週間までにゆっくりとほぼ完全に回復した。注射後の早い時点と遅い時点で網膜構造を調べることを目的とした進行中の研究は、杆体の外節が最初に脱構築され、続いて耐性ＲＨＯ８２０タンパク質で構成されるディスク材料で徐々に再構築されるかどうか、または十分なレベルのＲＨＯ８２０が、外節の短縮を防ぐのに十分早い段階で生成されるかどうかについて、告げるであろう。
【００８４】
機能評価
杆体の成功した完全な保護は、ただ１回のイベント後に中央から中末梢網膜（mid-peripheral retina）における杆体の完全な喪失を引き起こす急性の露光を繰り返し受けた変異体に、ＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ８２０−ＲＨＯ８２０を網膜下に単回注射した後、長期間（５０週間／１１．５ヶ月）にわたって達成された。実質的に改善されたＥＲＧ応答は、ＡＡＶ処置を受けた眼ですべての時点で一貫して見られた。錐体を介したＥＲＧ応答は安定していたが、杆体が優勢なＥＲＧ機能のわずかな低下が認められた。ＡＡＶを介した遺伝子治療を注射されたイヌにおける他の研究（７４、７５）で見られたＯＮＬ厚さのわずかな増加も、ここで処置領域において観察され、軽度の網膜ストレスによる細胞内または細胞間の膨潤を反映している可能性がある。露光前にＢＳＳを注射した眼も、標準または暗赤色の周期的照明下で飼育された注射なしのＲＨＯ変異イヌの自然病歴も、ＯＮＬの異常な肥厚の証拠を示さなかったため、一時的で軽度のＯＮＬ肥厚はベクターに関連する可能性が高い（図１５Ａ〜１５Ｃ）。ＯＮＬ厚さが通常の注射前の値に戻ったことで、観察されたＥＲＧの低下が処置領域内の光受容体の喪失に関連しているという仮説が除外された。代わりに、機能低下は、累積露光後の未処置の末梢網膜に位置する杆体の追加の喪失によって説明される可能性があり、この仮説は、反対側のＢＳＳ注射眼に見られる杆体優位のＥＲＧ振幅の同様の低下と一致している。
要約すると、二重ＲＨＯノックダウンと置換機能を備えた新しい単一ベクターが開発され、これは、ＲＨＯ−ａｄＲＰの自然発生の大型動物モデルで特定された毒性機能獲得を伴うクラスＢ ＲＨＯ変異に対する、杆体の完全かつ長期的な保護を提供する。この非常に効率的な変異非依存戦略は、クラスＢ変異を有するすべてのＲＨＯ−ａｄＲＰ患者に共通の遺伝子治療が、達成可能な目標になるという希望を高める。
【００８５】
例２：構築物はマウスの網膜変性を防ぐことができる
ＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ８２０−ＲＨＯ８２０構築物は、ＲＨＯ−ａｄＲＰのマウスモデルにおいて、網膜変性に対する長期的な保護を提供した。
ヒトＰ２３Ｈ ＲＨＯのトランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６マウスは、明るい光への暴露なしで暗赤色の照明が存在する場合でも、変異ロドプシン遺伝子の存在により網膜変性を生じる（３３、３４、４３）。この遺伝子型のマウスを１ヶ月齢で、片方の眼へのＡＡＶ２／５−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０いずれかの網膜下注射により処置した。マウスの２つのグループを様々な間隔で分析した：ａ）処置前、ｂ）注射後１か月、ｃ）注射後２か月、およびｄ）注射後３か月。網膜下注射は一時的な網膜剥離を誘発し、これは最終的には解消した。反対側の眼は処置しなかった。
ＯＣＴ分析をＰ２３Ｈ ＲＨＯマウスで３か月間毎月の間隔で実施し、ベクター処置の外顆粒層（ＯＮＬ）厚さに対する効果を決定した。ＯＮＬ厚さは、処置前と比較して、注射後２か月および３か月で大幅に減少した。さらに、ｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０による処置は、すべての注射後の間隔において、ＡＡＶ２／５−ＧＦＰ処置と比較して統計的に有意なＯＮＬ厚さの保持をもたらした（図２２を参照）。
【００８６】
全体として、３０匹のＰ２３Ｈマウスは、ｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０で成功して処置され、一方２６匹のマウスはＡＡＶ２／５−ＧＦＰで成功して処置された。テューキーの多重比較検定で決定され下の表３に示すように、ｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０処置は、ＡＡＶ２／５−ＧＦＰ処置と比較して、Ｐ２３Ｈ ＲＨＯマウスの網膜構造の統計的に有意な程度の保護をもたらした。
暗順応網膜電図検査分析は、Ｐ２３Ｈ ＲＨＯマウスの同じ処置グループで、３か月間毎月の間隔で実施した。様々な強度（−２０デシベル、−１０デシベル、０デシベル）の短時間の閃光に対するこれらのマウスの角膜電気応答を、角膜電極を使用して測定した。各間隔での杆体ａ波とｂ波（−２０ｄＢと−１０ｄＢの閃光への応答）および混合杆体と錐体のａ波とｂ波（０ｄＢ閃光への応答）の最大振幅の縦方向の定量化を、図２３に示す。
スチューデントｔ検定で決定され下の表４に示すように、ｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０処置は、ＡＡＶ２／５−ＧＦＰ処置と比較して、注射後３か月のＰ２３Ｈ ＲＨＯマウスの網膜機能に、統計的に有意な程度の保護をもたらした（「ｎｓ」＝有意性なし）。
これらの結果は、ＡＡＶ２／５−ｈＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０構築物が、ＲＨＯ−ａｄＲＰのマウスモデルにおける網膜変性に対する光受容体の安定した構造的保護を与えることを示す。結果はさらに、この構築物が、このマウスモデルにおける網膜変性に対して光受容体の安定した機能的（網膜電図検査）保護を与えることを示す。
【００８７】
表３
【表３】
2021525531.tif 000010
【００８８】
表４
【表４】
2021525531.tif 000011
【００８９】
例３：ベクター構築物から発現されたｍＲＮＡ配列の分析
ＡＡＶ構築物に由来する短いｍＲＮＡ配列の種類を決定するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｓｃＡＡＶ２／５−ＲＨＯ８２０−ｓｈＲＮＡ８２０構築物をトランスフェクトした。４８時間後、総ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをサイズ分画し、短いＲＮＡ配列をＲＮＡ配列決定に供した。ｓｈＲＮＡ８２０に由来する配列を持つＲＮＡ分子を分析して、それらのサイズならびに５’および３’末端を決定した（図２４を参照）。
配列決定読み取りの要約を図２５に示す。ＲＮＡ分子の７３％におけるガイド鎖（ＵＡＧ）の５’末端の配列は、予想される配列と等しかった。分子の１３％は、５’末端で１ヌクレオチド短縮されていた。５２％は３’末端に２つの余分なウリジンを有したが、１０％は３’末端に１つの余分なウリジンを有した。分子の１３％は、３’末端に余分なＵＵＡコドンを有した。配列番号４０〜４６は、ｓｈＲＮＡ８２０に由来する最も頻度の高い短いＲＮＡの配列として提供されている（両方の鎖からのトップヒット）。
ほとんどのｓｈＲＮＡは５’末端で予測されたように処理されており、３’末端にいくつかの余分なヌクレオチドが存在した。
【００９０】
意義
多くの遺伝子増強戦略が、遺伝性網膜失明の処置のために臨床試験に入っている。常染色体優性疾患の遺伝子治療は、アレルの不均一性や変異遺伝子をサイレンシングする潜在的必要性などを含む、重大な障害に直面している。ここでは、原因遺伝子のノックダウンと耐性野生型コピーによるその置換とを組み合わせた単一の遺伝子治療ベクターが、常染色体優性網膜色素変性症のイヌ科およびマウスモデルにおける光受容細胞死および失明を防ぎ得ることを示す。
【００９１】
材料および方法
ＨＥＫ２９３Ｔ（ATCC, Manassas, VA）細胞（３３）で実施されたin vitroアッセイを使用して、ハンマーヘッド型リボザイム（Ｒｚ５２５）および３つの短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１３１、ｓｈＲＮＡ１３４、およびｓｈＲＮＡ８２０）の、ＷＴおよび変異（Ｐ２３Ｈ、Ｔ１７Ｍ）ヒトＲＨＯ発現の抑制における効率をスクリーニングした（７６）。自己相補的（７７）および非自己相補的ＡＡＶベクターを、トリプルプラスミドＤＮＡトランスフェクションによって血清型５（７８）にパッケージ化し、これらを以前に公開された方法に従って精製した（７９、８０）。ＤＮａｓｅ耐性ベクターゲノムの力価は、リアルタイムＰＣＲによって標準と比較して測定した；純度は銀染色ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検証し、無菌性とエンドトキシンの不在が確認され、アリコートを使用前に−８０℃で保存した。ＷＴおよびＲＨＯ変異イヌ（４５、５６）を使用して、最も強力なノックダウン試薬を単独で（Ｒｚ５２５、ｓｈＲＮＡ８２０）またはコドン修飾の耐性ヒトＲＨＯ ｃＤＮＡ（ＲＨＯ８２０）と組み合わせて（ｓｈＲＮＡ８２０）保有するＡＡＶ２／５ベクターの、網膜下注射に対する反応を評価した（図１６Ａ〜１６Ｅ）。ＲＨＯの抑制と置換の効果の評価は、正面（en face）および断面のin vivo網膜イメージング、網膜電図検査、ＲＨＯタンパク質およびＲＮＡレベルの定量化、および網膜組織切片の形態学的評価によって行った（７４、８１〜８３）。露光パラダイム（４６〜４８）を使用して、ＲＨＯ変異イヌの自然な疾患経過を加速し、網膜下に送達されたＡＡＶ構築物が網膜変性の発症を予防したかどうかを迅速に評価した。すべてのイヌは、Pennsylvania Retinal Disease Studies Facility（ＲＤＳＦ）で飼育し維持した。研究は、国立衛生研究所のGuide for the Care and Use of Laboratory Animals、およびＵＳＤＡのAnimal Welfare Act and Animal Welfare Regulationsに厳密に従って実施され、ＡＲＶＯのUse of Animals in Ophthalmic and Vision Researchに準拠した。プロトコルは施設内動物管理使用委員会によって承認された。方法論の詳細を以下に示す。
【００９２】
リボザイム切断アッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（CRL-11268, ATCC, Manassas, VA）に、ＳＶ４０プロモーターによって発現されるウミシイタケルシフェラーゼに結合された、野生型または耐性（硬化）いずれかのヒトＲＨＯ ｃＤＮＡの１００ヌクレオチド標的領域を発現する二重ルシフェラーゼプラスミドpsiCHECK-2（商標）（Promega, Madison, Wi）をトランスフェクトした。ＲＨＯ転写物レベルは、ルシフェラーゼアッセイによって６回繰り返して測定した。ルシフェラーゼプラスミドは、ｔＲＮＡｖａｌプロモーターからＲｚ５２５を発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。結果は、リボザイムを欠くプラスミドでの同時トランスフェクション後に測定された同じ融合転写物に対して正規化した。
【００９３】
ＲＨＯ−ｔＧＦＰおよびＲＨＯ８２０−ｔＧＦＰ発現プラスミドの生成
ＣＭＶプロモーター、Ｃ末端ｔｕｒｂｏＧＦＰタグを有するヒトＷＴ−ＲＨＯオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、およびＢＧＨ−ＰｏｌｙＡシグナル（アンピシリン耐性およびネオマイシン耐性遺伝子もコードする）を含むプラスミドを使用して、ＲＨＯをin vitroで発現させた。ＣＭＶ−ｈＲＨＯ−ｔｕｒｂｏＧＦＰ−ＢＧＨ−ＰｏｌｙＡプラスミドのＰ２３Ｈ ＲＨＯ、Ｔ１７Ｍ ＲＨＯ、およびＲＨＯ８２０バージョンは、Q5（登録商標）Site-Directed Mutagenesis Kit（New England Biosciences, Ipswich, MA., USA）を使用して、ここで説明するＰＣＲパラメータを除き、製造元の指示に従って作成した。Ｐ２３Ｈ ＲＨＯバージョンを生成するために、ＣＭＶ−ｈＲＨＯ−ｔｕｒｂｏＧＦＰ−ＢＧＨ−ＰｏｌｙＡプラスミドのｈＲＨＯ ＯＲＦの２３番目のコドンを、次のプライマーを使用してＣＣＣからＣＡＣに変更した：フォワード−ＣＡＣＡＣＣＣＧＴＣＧＣＡＴＴＧＧＡ（配列番号３０）、およびリバース−ＧＴＡＣＧＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＧＡＧＴＡＣ（配列番号３１）。ＲＨＯ８２０バージョンを作成するために、ＣＭＶ−ｈＲＨＯ−ｔｕｒｂｏＧＦＰ−ＢＧＨ−ＰｏｌｙＡプラスミドのｈＲＨＯ ＯＲＦのヌクレオチド８１６〜８２５を、以下のプライマーを使用して、ＡＴＴＣＴＡＣＡＴＣ（配列番号３２）からＴＴＴＴＴＡＴＡＴＡ（配列番号３３）に変更した：フォワード：ＡＴＡＴＡＴＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＡＣ（配列番号３４）、およびリバース：ＡＡＡＡＡＧＣＣＡ ＣＧＣＴＧＧＣＧＴＡＧＧＧＣ（配列番号３５）。ＰＣＲ反応パラメータは次のとおりである：９８℃で３０秒間の初期変性、２５サイクルの変性（９８℃で１０秒間、３０秒間アニーリング、７２℃で５分間の伸長）、７２℃で２分間の最終伸長。Ｐ２３Ｈ ＲＨＯおよびＲＨＯ８２０ＰＣＲ反応に使用したアニーリング温度は、それぞれ６８℃および７２℃であった。２５μｇのＣＭＶ−ｈＲＨＯ−ｔｕｒｂｏＧＦＰ−ＢＧＨ−ＰｏｌｙＡプラスミドを各反応のテンプレートとして使用した。ＡＡＶ−Ｔ１７Ｍ−ＧＦＰは、Marina Gorbatyuk博士からのギフトであった（７６）。
【００９４】
ＲＨＯのｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンのin vitroスクリーニング
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ATCC）を１２ウェルプレートに播種し、翌日、細胞が７０〜９０％のコンフルエンシーに達したときにトランスフェクトした。各ウェルに、野生型ヒトＲＨＯ、ヒトＰ２３Ｈ ＲＨＯ、ヒトＴ１７Ｍ ＲＨＯ、またはＲＨＯ８２０（４つのサイレントコドン修飾によりｓｈＲＮＡ８２０分解に耐性を持たせたヒトＲＨＯ）のいずれかを発現する５００ｎｇのＣＭＶ−ｈＲＨＯ−ｔｕｒｂｏＧＦＰ−ＢＧＨ−ＰｏｌｙＡプラスミドは、アンチセンスＧＦＰスタッファー配列および、対照Ｈ１−ｓｈＲＮＡカセット、オンターゲット（１３１、１３４、または８２０）Ｈ１−ｓｈＲＮＡカセット、または（空の）Ｈ１−ｓｈＲＮＡカセットのいずれかを含有する、１μｇの自己相補的ｒＡＡＶ２プラスミドで一時的に同時トランスフェクトした。各同時トランスフェクション条件は３回実施した。ＤＮＡ対ポリエチレンイミン（１ｍｇ／ｍＬのＰＥＩ；Polysciences Inc, Warrington, PA., USA）の比１μｇ：３μＬを使用して、各ウェルが４．５μＬのＰＥＩを受け取るようにした。細胞を５％ＣＯ２と共に３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を吸引し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、３，０００ｘｇで遠心分離してペレット化した。次に、ＰＢＳを除去し、細胞を再懸濁し、ＰＢＳ中０．２３Ｍのスクロース１５０μＬで超音波処理した。５０μＬのローディングバッファー（２００ｍＭのTris−Ｃｌ、ｐＨ６．８＋４００ｍＭのＤＴＴ＋８％ＳＤＳ＋４０％グリセロール＋ブロモフェノールブルー）を各試料に適用し、ピペッティングにより混合した。試料を室温で３０分間インキュベーションした後、２８ゲージのインスリンシリンジに通して、同時抽出したＤＮＡを剪断した。各試料の総タンパク質濃度は、Pierce（商標）の６６０ｎｍタンパク質アッセイ試薬とPierceイオン界面活性剤適合性試薬（Thermo Fisher, Waltham, MA., USA）を使用して測定した。各ウェルに負荷された総タンパク質の量（１５〜２０μｇ）は、各実験内で一定であった。試料は、Li-COR Chameleonラダー（Li-Cor, Lincoln, NE, USA）に隣接する１０％のMini-PROTEAN（登録商標）TGX（商標）Precast Protein Gels（Biorad, Hercules, CA., USA）に流し（run）、InvitrogenのiBlotシステム（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を製造元の指示に従って使用して、iBlot PVDF転送スタックに移した。膜を、メタノールで５分間インキュベートし、ｄｉＨ２Ｏで３回洗浄し、Odysseyブロッキング緩衝液（Li-Cor, Lincoln, NE, USA）で室温で１時間ブロックした。次に膜を、ブロッキング緩衝液中でマウス抗ｔｕｒｂｏＧＦＰ（１：２０００；Origene, Rockville, MD, USA）およびウサギ抗β−チューブリン（１：５０００；Millipore, Burlington, MA, USA）と４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳ中の０．１％Tween20で３回洗浄した後、IRDye 800CWロバ抗ウサギおよびIRDye 680RDヤギ抗マウス（両方とも１：５，０００；Li-Cor, Lincoln, NE, USA）で室温で４５分間インキュベートした。膜を、ＰＢＳ中の０．１％Tween20で３回洗浄し、Odyssey CLxシステム（Li-Cor, Lincoln, NE, USA）で画像化した。バンド強度はImageJソフトウェアで測定した。ＲＨＯ−ＧＦＰの予測される単量体型のバンド強度を測定するために、約６５ｋＤａに現れる顕著なバンドの周りにボックスを描画したが、凝集型は、最高分子量マーカー（���６０ｋＤａ）から５０ｋＤａのすぐ下の可視バンドまで描画したボックスを使用して測定した。ＲＨＯのバンド強度は、β−チューブリンのバンド強度を測定して除算することにより、負荷に対して補正した。値は相対強度として報告され、これは各試料の補正されたバンド強度を対照ｓｈＲＮＡ条件に対して平均補正されたバンド強度で除算して算出した。統計的有意性は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較検定によって決定した。
【００９５】
ＡＡＶベクターの調製
２型末端反復（ＴＲ）を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、Zolotukhin et al. (2002)に記載のように、血清型５キャプシドにパッケージ化した（７９）。ＡＡＶ５キャプシドは、網膜下注射後の光受容細胞の効率的な形質導入を可能にする（７８）。
ヒトおよびイヌ科のロドプシンを置換なしでノックダウンするように設計されたベクターは、マウスＲｈｏ遺伝子（GenBank M55171.2）の４８８ｂｐ領域（位置９１６〜１３９６）および逆配向にクローン化されたヒト化ＧＦＰ遺伝子を含有していた。この配向は、ＧＦＰの過剰発現なしでＡＡＶを効率的にパッケージ化するためのスペーサーを提供するために、使用された。ＲＮＡ置換ベクターでのＲＨＯ発現のために、ヒトＲＨＯ遺伝子（GenBankアクセッション番号NG_009115.1）からの５３６ｂｐ領域（位置４５４７〜５０８３）を、ヒトロドプシン近位プロモーター（ｈＯＰ）として使用した。プロモーターの後にはＳＶ４０の１６３合成イントロン（ＳＤ／ＳＡ）が続き、これはヒトＲＨＯｃＤＮＡのＲＨＯ ５’ＵＴＲの１２５塩基対（１０４６ｎｔ）、またはｓｈＲＮＡ８２０に耐性のあるコドン修飾バージョン（ＲＨＯ８２０）に先行した（下記参照）。これには、ＳＶ４０からのポリアデニル化シグナルが続いた。
【表５】
2021525531.tif 000012
【００９６】
ｓｈＲＮＡセンスおよびアンチセンス配列を以下に示す；これらはそれぞれ、ループ配列ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号３）に結合されている。
【表６】
2021525531.tif 000013
【００９７】
ｓｈＲＮＡ発現用のＡＡＶ２／５ベクターを自己相補的ＡＡＶ（７７）としてパッケージ化し、ｓｈＲＮＡの発現はヒトＨ１ ＲＮＡプロモーター（GenBank X16612.1；ヌクレオチド２７６〜３７８）によって指示した。ｓｈＲＮＡには、９ヌクレオチドループ（ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、配列ＴＴＣＡＡＧＡＧＡによってコードされる）によって結合された１９ｂｐの二本鎖配列が含まれていた。ロドプシン置換なしのｓｈＲＮＡ送達を目的としたベクターの場合、効率的なパッケージ化には、ＡＡＶの末端反復配列間に少なくとも２．２ｋｂのＤＮＡを維持する必要があった。これらのベクターでは、ヒト化ＧＦＰの配列（８０）が、マウスオプシン近位プロモーターまたはヒトオプシン近位プロモーターのいずれかの後ろに逆向きに挿入された（上記を参照）。ハンマーヘッド型リボザイムＲｚ５２５の発現に使用されるベクター、ｐＭＯＰＳ５００ＮｅｗＨｐＲｚ５２５は、マウス近位ロドプシンプロモーターを用いて、リボザイムカセットの発現を駆動した。これはGorbatyuk et al. 2007により記述された（３３）。
ｓｈＲＮＡ８２０と、標的配列にサイレント変異を導入することによってｓｈＲＮＡ８２０に耐性を持たせたヒトロドプシンｃＤＮＡ（ＲＨＯ８２０）の両方を、自己相補的ＡＡＶ２／５として一緒にパッケージ化した。高効率のＫＤ試薬（ｓｈＲＮＡ８２０）の文脈で杆体の外節構造を保持するか、またはこれを迅速に再形成するために、自己相補的な構築物を選択して、ＲＨＯの置換（ＲＨＯ８２０との）速度を加速した。
【００９８】
動物
すべてのイヌはペンシルベニア大学のRetinal Disease Studies Facility（ＲＤＳＦ）で飼育され、維持された。研究は、国立衛生研究所のGuide for the Care and Use of Laboratory Animals、およびＵＳＤＡのAnimal Welfare Act and Animal Welfare Regulationsの推奨事項に厳密に従って実施され、Use of Animals in Ophthalmic and Vision Researchに関するＡＲＶＯ声明に準拠した。プロトコルはペンシルベニア大学の施設内動物管理使用委員会により承認された。
すべての正常な（ＷＴイヌ）は、標準的な犬舎の周期的（１２時間オン、１２時間オフ）白色光照明（「標準」イヌの眼のレベルで１７５〜３５０ルクス）の下で飼育された。研究されたすべてのＲＨＯ変異イヌは、Ｔ４Ｒ変異アレルについてヘテロ接合性であり、本文ではＲＨＯ変異体と呼ばれ、表１および図ではヘテロ接合性を強調するためにＲＨＯＴ４Ｒ／＋と呼ばれている。３匹を除くすべての変異ＲＨＯイヌは、環境白色光によって引き起こされる網膜変性の加速を防ぐために、誕生から終了まで周期的な暗赤色照明（「標準」イヌの眼のレベルで９〜２０ルクス）の下で飼育された。すべての網膜電図検査および非侵襲的画像診断手順、ならびに網膜下注射は、前述のように全身麻酔下で実施した（４４、７４、８１）。眼組織は、安楽死溶液（Euthasol；Virbac）の静脈注射による安楽死後に採取し、動物の福祉を改善し不快感を最小限に抑えるためにあらゆる努力を行った。１４匹の正常（ＷＴ）イヌからの２１眼、および２１匹の変異ＲＨＯイヌからの４０眼が含まれていた（表１）。
【００９９】
網膜下注射
ＢＳＳまたはベクターの網膜下注射は、手術用顕微鏡（Zeiss OPMI 6；Carl Zeiss Inc, Oberkochen, Germany）および以前に報告された網膜下カニューレを使用した接触硝子体切除レンズによる直接視覚化の下で実施した（６５）。ＲＨＯ変異イヌの場合、暗赤色照明を手術室に設置し、網膜下注射を、手術用顕微鏡の光路に配置された赤外線バンドパスフィルター（(RT-830；Hoya Optics, Inc, Fremont, California）、および前述のように２つの顕微鏡アイピースに取り付けられた単眼赤外線イメージインテンシファイア（Owl Nitemare Third generation：BE Meyers & Co, Inc, Redmond, Washington）を使用して、近赤外線下で行った（４９）。この暗視装置により、外科医は光感受性ＲＨＯ変異イヌへの網膜下注射を、外科的光誘発性網膜変性を引き起こすことなく実施できる（４９）。約１５０ｕＬ容量の網膜下注射に成功すると、網膜表面の約１５％を覆うブレブが生じた。網膜下ブレブの位置は、各注射の直後に記録した。これは、正常のイヌでは眼底写真（Retcam shuttle, Clarity Medical Systems, Pleasanton, CA）により、およびＲＨＯ変異イヌでは、注射前に捕捉された近赤外線ｃＳＬＯ合成画像上のブレブの描画により、実施した。
【０１００】
露光による網膜疾患の実験的加速
急性露光プロトコルを以前に記載のように使用して（４６〜４８）、光感受性ＲＨＯ変異イヌの網膜変性を予防する、ウイルスベクター構築物の効率を評価した（４５）。この手順のすべてのステップは、暗赤色光の照明下で実施した。瞳孔を１％トロピカミドと１％フェニレフリンで拡張し（３回、両眼で３０分間隔）、全身麻酔をプロポフォール（４ｍｇ／ｋｇ）ＩＶで導入し、吸入麻酔（イソフルラン）で維持した。全身麻酔によって誘発される眼球の腹側回転を防ぐために、球後生理食塩水注射（５〜１０ｍｌ）を実施して、眼を一次注視位置に再配置した。１ｍＷ／ｃｍ２の角膜放射照度（ルミノメーターで測定；International Light Technologies, Peabody, MA, USA）での白色光（６５００Ｋ）への１分間の曝露を、ＥＲＧシステム（Espion, Diagnosys LLC）からの単眼ガンツフェルド刺激装置（ColorBurst; Diagnosys LLC, Lowell, MA, USA）を用いて実施した。対側の眼の露光手順の間、露光されなかった眼は黒い写真用布で遮蔽した。
【０１０１】
in vivo光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）イメージングおよび分析
正面および網膜断面のイメージングは、上記の全身吸入麻酔下のイヌを使用して実施した。近赤外照明（８２０ｎｍ）による反射率の重複する正面画像を、直径３０°および５５°のレンズを使用して取得し（Spectralis HRA+OCT, Heidelberg, Germany）、視神経、網膜血管、注射ブレブの境界、網膜切開部位および他の局所的変化などの眼底の特徴を描写した。カスタムプログラム（MatLab 7.5；The MathWorks, Natick, MA）を使用して、個々の写真を網膜全体のパノラマにデジタルステッチした。２つの方法を使用して、注射ブレブをパノラマ画像にオーバーレイした。ＷＴの眼では、手術時に撮影したブレブの写真を登録し、ブレブ境界を転送した。ＲＨＯ変異眼では、手術時に描かれたブレブのスケッチをパノラマ画像に転送した。
【０１０２】
スペクトル領域光コヒーレンストモグラフィー（ＳＤ−ＯＣＴ）は、線形スキャンとラスタースキャン（Spectralis HRA+OCT, Heidelberg, Germany）を使用して実施した。重複（３０°×２０°）ラスタースキャンを記録して、網膜の広い領域をカバーした。ＯＣＴデータ取得後の処理は、カスタムプログラム（MatLab 7.5; The MathWorks, Natick, MA）を用いて実施した。網膜全体のトポグラフィー分析では、各ラスタースキャンの統合された後方散乱強度を使用して、網膜全体のパノラマに表示される網膜の特徴に対する正確な位置と方向を特定した。登録されたすべてのラスタースキャンを形成する個々の縦方向反射率プロファイル（ＬＲＰ）を、視神経を中心とする直交座標系の規則的な間隔のビン（１°×１°）に割り当てた；各ビンのＬＲＰを調整して平均した。各ＬＲＰに沿った後方散乱信号の強度と傾きの情報を手動で評価して、ＯＮＬを定義する２つの境界をセグメント化した。１つの境界は、外網状層（ＯＰＬ）ピークの遠位移行であった。もう１つの境界は、外境界膜（ＥＬＭ）のピークであった。検出可能なＥＬＭピークのない重度網膜変性がある場所では、２番目のＯＮＬ境界を、ＲＰＥピークへの最も近位移行に位置させた。さらに、正規化されたＩＳ／ＯＳ後方散乱強度は、ＯＰＬ境界に対して硝子体側（vitreal）の５つの軸方向試料の平均後方散乱強度を、ＥＬＭ境界に対して強膜側（scleral）の５つの軸方向試料の平均後方散乱強度から差し引くことによって計算した；後者にはＩＳ／ＯＳピークが含まれていた（４４、７４）。ＩＳ／ＯＳ強度は、後者の妥協（compromise）によりＩＳ／ＯＳ信号をＲＰＥ／タペート信号から区別できなくなったため、保持された内節および外節長の領域にのみマッピングした。注射なしの対照眼からのトポグラフィー結果は、ＯＮＨの中心およびイヌ科の中心窩によって登録され（８３）、９９パーセンタイル信頼区間を定義する対照の変動のマップが生成された。注射した眼は、有意変化のマップを生成するために、位置ごとに対照信頼区間と比較した。
【０１０３】
網膜電図検査（ＥＲＧ）の記録と分析
イヌには、アトロピンとアセプロマジンの皮下注射で事前に薬剤を負荷し、その瞳孔はアトロピン（１％）、トロピカミド（１％）、フェニレフリン（１０％）で拡張した。静脈内プロポフォールによる誘導後、イヌを全身吸入麻酔（イソフルラン）下で維持し、その脈拍数、酸素飽和度、および体温を、手順全体を通して一定であるかどうかモニタリングした。フルフィールド閃光網膜電図検査は、前述のように（４４、７４）両眼で、ColorDome刺激装置（MatLab 7.5; The MathWorks, Natick, MA）のＬＥＤ刺激を備えた特注のガンツフェルトドームを使用して実施した。暗順応の２０分後、増加強度（−３．７４から０．５１ ｌｏｇ ｃｄ．ｍ−２）の単一の４ｍｓ白色閃光刺激に対する、杆体および混合杆体−錐体媒介性応答（平均４回）を記録した。５分間の白色光順応（１．５３ ｌｏｇ ｃｄ．ｍ−２）に続いて、一連の単一閃光（−２．７４から０．５１ ｌｏｇ ｃｄ．ｍ−２）および２９．４Ｈｚフリッカー（平均２０回；−２．７４〜０．２６ ｌｏｇ ｃｄ．ｍ−２）の刺激に対する、錐体媒介性の信号（平均１０回）を記録した。波形はデジタルローパス（５０Ｈｚ）フィルターで処理し、必要に応じて録音ノイズを低減した。暗順応の混合杆体−錐体ＥＲＧのａ波およびｂ波の振幅、および明順応の単一閃光および２９．４Ｈｚの錐体フリッカーのピークツーピーク振幅を測定した。
【０１０４】
網膜組織学および免疫組織化学
安楽死および除核に続いて、(眼)球を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で３時間固定し、続いて２％ＰＦＡで２４時間固定し、トリミングし、１５〜３０％スクロース／ＰＢＳ溶液で凍結保護し、以前に報告されたように最適な切断温度媒体に埋め込みんだ（８１）。未処置、境界、および処置済み／ブレブ領域を含む厚さ１０マイクロメートルの連続切片を、クライオスタット（Microm HM550；Thermo Fisher Scientific, Kalamazoo, MI）で切断した。以前に報告されたようにＨ＆Ｅ染色によって識別された血管ランドマークを使用して、正面ｃＳＬＯ画像の血管パターン上の網膜凍結切片の正確な位置を決定した（４４、７４、８１）。連続切片を、一次抗体と細胞特異的マーカーで免疫標識した：杆体オプシン（カタログ番号MAB5316；１：２００希釈；EMD Millipore, Billerica, MA）、ヤギ抗ヒト錐体アレスチン（W. Beltran, Univ. of Pennsylvania；１：１００）。抗原−抗体複合体は、蛍光色素標識二次抗体（Alexa Fluor、１：２００; Molecular Probes, Kalamazoo, MI）で視覚化し、Hoechst 33342核染色（Molecular Probes）を使用して細胞核を標識した。Ｈ＆Ｅ染色切片を広視野顕微鏡（Axioplan；Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA）で検査し、画像をデジタル捕捉し（Spot 4.0 camera; Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI）、表示用にグラフィックプログラムにインポートした（Illustrator; Adobe, San Jose, CA）。蛍光免疫組織化学用のラベル付き切片を、共焦点顕微鏡（Leica TCS SP5；Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL）で検査し、デジタル画像を撮影し、Leica Application suiteプログラムを使用して処理し、グラフィックプログラム（Illustrator；Adobe）にインポートした。
【０１０５】
ＲＨＯ ＲＮＡおよびタンパク質定量化のための網膜組織サンプリング
後部カップの除核と分離の直後に、処置および未処置の神経網膜領域からの３ｍｍ生検パンチを個別にクライオバイアルに収集し、液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。ＲＨＯ変異イヌの場合、網膜サンプリングは暗赤色照明の下で実施した。
【０１０６】
ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
全ＲＮＡは、神経網膜のパンチから、Direct-zol RNA Miniprep Kit（Zymo Research, Irvine, CA）を使用して抽出した。ｃＤＮＡは、全ＲＮＡから、High Capacity RNA to cDNAキット（Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用し製造元の推奨に従って調製した。
【０１０７】
網膜におけるイヌ科およびヒトのＲＨＯ転写産物の絶対定量化
同一網膜試料における内在性イヌ科および外在性ヒトＲＨＯ転写産物の比率を効率的に決定するために、特定のプライマーペアが設計されている：イヌ科（フォワード：５’−ＡＣＡＡＧＡＣＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＣＧＣ（配列番号１７）；リバース：５’−ＴＣＡＴＧＧＧＣＧＴＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣ（配列番号１８））、およびヒトＲＨＯ（フォワード：５’−ＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＣＴＣＡＣＧＣＴＣＴＡ（配列番号１９）；リバース：５’−ＴＡＧＧＴＴＧＡＧＣＡＧＧＡＴＧＴＡＧＴＴＧＡＧＡ（配列番号２０））。SYBRグリーンプラットフォームを、０．１５μＭのプライマー濃度を用いる分析に使用した。リアルタイムＰＣＲは、Applied Biosystemsの7500 Real-Time PCR Systemの９６ウェルマイクロウェルプレートで総量２５μＬで実施した。すべてのＰＣＲは、０．１ｎｇのＤＮＡａｓｅ処理ＲＮＡから生成されたｃＤＮＡを使用して実施した。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、イヌ科およびヒトのＲＨＯを表す個々のアンプリコンの絶対標準曲線の作成に使用した。テンプレートのコピー数は、前述のように計算した（８２）。検量線のダイナミックレンジは、１０３〜１０７分子であった。増幅データは、7500ソフトウェアバージョン2.0.1（Applied Biosystems）で分析した。
【０１０８】
ロドプシンタンパク質の定量化：
タンパク質網膜抽出物は、処置および未処置の神経網膜領域から（ＲＨＯ変異イヌについては暗赤色照明下で）収集された３ｍｍの生検パンチから調製した。０．２３Ｍスクロース、２ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのTris HCl、ｐＨ７．４、およびプロテアーゼ阻害剤（Halt Protease阻害カクテル、カタログ番号87786、Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を含有する緩衝液で超音波処理した後、試料を遠心分離し、上清中の総タンパク質濃度をブラッドフォード法で測定した。各試料からの総タンパク質１μｇを、８〜１６％Tris Glycineゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA）で分離し、ニトロセルロース膜（iBLOT, Invitrogen）に移し、抗ロドプシン抗体（MAB5316、１：１０００希釈、EMD Millipore, Billerica, MA）および抗ヒストンＨ３抗体（ab1791、１：３０００希釈、EMD Millipore, Billerica, MA）を使用して免疫ブロットした。タンパク質バンドは、赤外線標識二次抗体（IRDye680およびIRDye800、Licor）とのインキュベーション後、デジタルイメージングシステム（Odyssey Fc, Licor, Lincoln, NE）で視覚化した。ロドプシンタンパク質の量は、正規化のためにヒストンＨ３バンドを使用して、Licor Image Studio v4.0ソフトウェアで定量化した。
【０１０９】
参考文献
【表７−１】
2021525531.tif 000014
【表７−２】
2021525531.tif 000015
【表７−３】
2021525531.tif 000016
【表７−４】
2021525531.tif 000017
【表７−５】
2021525531.tif 000018
【表７−６】
2021525531.tif 000019
【表７−７】
2021525531.tif 000020
【表７−８】
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【０１１０】
その他の態様
本明細書に開示されているすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。この仕様で開示されている各特徴は、同一、同等、または同様の目的を果たす代替的特徴で置き換えることができる。したがって、特に明記しない限り、開示されている各特徴は、同等または類似の特徴の一般的なシリーズの例にすぎない。
上記の説明から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、開示を様々な使用法および条件に適合させるために様々な変更および修正を行うことができる。したがって、他の態様も特許請求の範囲内にある。
【０１１１】
均等物
いくつかの本発明の態様が本明細書に記載および図示されているが、当業者は、機能を実行するための、および／または結果および／または記載される１つ以上の利点を得るための、様々な他の手段および／または構造を容易に想定し、およびかかる変形および／または修正のそれぞれは、本明細書に記載される本発明の態様の範囲内であると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成が、本発明の教示が使用される特定の１つ以上の用途に依存することを、容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の態様と同等のものを多く認識し、または通常の実験のみを使用して確認することができる。したがって、前述の態様は例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびそれに相当する範囲内において、本発明の態様は、具体的に記載および請求される以外の方法でも実施できることを理解されたい。本開示の本発明の態様は、本明細書に記載の個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の各々を対象とする。さらに、２つ以上のかかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０１１２】
本明細書で定義され使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書内の定義、および／または定義された用語の通常の意味を支配すると理解されるべきである。
本明細書に開示されるすべての参考文献、特許、および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては、文書全体が包含され得る。
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「a」および「an」は、明確に逆が示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
本明細書および特許請求の範囲で使用される「および／または」という節は、そのように結合された要素、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および/または」でリストされた複数の要素は、同じ様式で解釈する必要があり、すなわち、そのように結合された要素の「1つ以上」である。「および／または」節によって具体的に識別される要素以外の他の要素が、具体的に識別される要素に関連するかどうかにかかわらず、任意に存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などの制約なしのオープンエンドの言語と組み合わせて使用される場合、一態様ではＡのみを指す（任意にＢ以外の要素を含む）ことができ；別の態様では、Ｂのみを指す（任意にＡ以外の要素を含む）ことができ；さらに別の態様では、ＡおよびＢの両方を指す（任意に他の要素を含む）ことができる；など。
【０１１３】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。たとえば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「および/または」は、包括的であると解釈されるものとする、すなわち、要素の数またはリストの、そして任意に、リストされていない追加の項目の、少なくとも1つを含むだけでなく、複数をも含むと解釈される。「ただ１つ」または「正確に１つ」などの、または特許請求の範囲で使用される場合は「からなる」などの、逆が明確に示される用語のみが、多数の要素または要素のリストの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「いずれか」、「の１つ」、「の1つのみ」、または「正確に1つ」などの排他性の用語が前についている場合、排他的な代替案を示すものとしてのみ、解釈されるものとする（すなわち、「いずれか一方だが、両方ではない」）。クレームで使用される場合の「本質的にからなる」は、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
【０１１４】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関連する「少なくとも１つ」という節は、要素のリストの任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、ただし、要素のリスト内に具体的にリストされているすべての要素それぞれの少なくとも1つを含む必要はなく、要素のリスト内の要素の組み合わせを除外するものでもない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が参照する要素のリスト内で具体的に識別される要素以外の要素が、具体的に識別される要素に関連するかどうかにかかわらず、任意に存在することを許容する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、以下を指すことがえきる：一態様では、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＡを含み、Ｂは存在しない（および任意にＢ以外の要素を含む）；別の態様では、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＢを含み、Ａは存在しない（および任意にＡ以外の要素を含む）；さらに別の態様では、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＡ、および少なくとも１つ、任意に２つ以上のＢを含む（および任意に他の要素を含む）；など。
逆が明確に示されない限り、複数のステップまたは行為を含む本明細書で請求される方法において、方法のステップまたは行為の順序は必ずしも、方法のステップまたは行為が記載されている順序に限定されないことも、理解されたい。
【０１１５】
特許請求の範囲および上記の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「保有する」、「有する」、「含有する」、「関与する」、「保持する」、「構成される」などのすべての移行句等は、オープンエンドであること、すなわち、含むがこれに限定されないことを意味すると理解されるべきである。米国特許庁特許審査手続マニュアルのセクション2111.03に記載されているように、「からなる」および「本質的に〜からなる」の移行句のみが、それぞれクローズドまたはセミクローズドの移行句であるものとする。オープンエンドの移行句（例えば、「含む」）を使用して本文書に記載された態様も、代替の態様においては、オープンエンド移行句によって記述された特徴「からなる」および「本質的に〜からなる」として企図されることを理解されたい。例えば、本開示が「ＡおよびＢを含む組成物」を記載する場合、本開示はまた、代替の態様「ＡおよびＢからなる組成物」および「本質的にＡおよびＢからなる組成物」も企図する。
【図１Ａ−Ｄ】
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【図１Ｅ−Ｈ】
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【図２Ａ−Ｃ】
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【図２Ｄ−Ｆ】
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【図２ＧＨ１】
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【図２Ｈ２】
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【図３ＡＢ】
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【図３ＣＤ】
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【図４ＡＢ】
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【図４Ｃ−Ｅ】
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【図４ＦＧ】
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【図５Ａ】
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【図５ＢＣ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ−Ｃ】
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【図１０ＤＥ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｃ】
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【図１３ＤＥ】
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【図１３ＦＧ】
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【図１４ＡＢ】
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【図１４ＣＤ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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