(57)【要約】本発明は、ペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）の経口送達用の医薬組成物に関する。特に本発明は、小腸におけるＰＰＳの吸収を改善し、結腸における副作用を低減又は消失させることを目的とする、ナノ粒子形態のＰＰＳと適切なポリマーとの組成物を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペントサンポリ硫酸ナトリウムとキトサンとの複合体のナノ粒子を含む経口組成物。
【請求項２】
ナノ粒子が、８０〜２２０nmの間の直径を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
キトサンが、７８〜９９％の間の脱アセチル化度及び３０〜４００kDaの間に含まれる分子量を有する、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
２０重量％未満の非複合体化ペントサンポリ硫酸ナトリウムを含有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５】
錠剤、硬カプセル剤、顆粒剤若しくは散剤、液剤の用時調製用の散剤、液剤、又はシロップ剤の形態の、請求項１〜４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６】
間質性膀胱炎の処置に使用するための、請求項１〜５記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）の経口送達用の医薬組成物に関する。特に本発明は、小腸におけるＰＰＳの吸収を改善し、結腸における副作用を低減又は消失させることを目的とする、ナノ粒子形態のＰＰＳと適切なポリマーとの組成物を開示する。
【０００２】
技術水準
ペントサンポリ硫酸ナトリウムは、ヘパリン及びグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に化学的及び構造的に類似する半合成硫酸化多糖である。これは間質性膀胱炎（ＩＣ）の患者における抗炎症薬として使用され、尿路上皮を覆う、損傷したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）層を修復して、バリアの損傷部における透過性を低減し、尿からの毒素が尿路上皮を刺激するのを防止する。これはまた、結合組織及び粘膜マスト細胞の阻害を通じて炎症応答及びヒスタミン分泌を低減することもできる。
【０００３】
ペントサンポリ硫酸ナトリウムは、経口投与されると、患者によるその受け入れを強く制限するいくつかの副作用を伴う。これらの副作用は、主として上部消化管における薬物の吸収不良が原因であり；この結果として、結腸粘膜への顕著な薬物曝露が生じ、結果として主に下痢及び出血に代表される有害作用を有する。
【０００４】
ＥＰ２１０１７９９は、とりわけ、結合組織の損傷に関連する炎症を予防又は治療するためのＰＰＳの使用を開示している。特定の製剤化アプローチは、この文書に請求も記載もされていない。
【０００５】
ＡＵ２０１２２８４０４８Ｂ２は、ＰＰＳなどの非抗凝固性の硫酸化多糖（ＮＡＳＰ）の使用により血液凝固を強化するための方法を開示している。その目標は、ＮＡＳＰ及び消化管上皮バリアの透過促進剤を含有する製剤を経口投与した場合の薬物吸収を増加させることによって達成される。キトサンは、０．３〜３％の濃度範囲で促進剤として記載されている。
【０００６】
ＵＳ２０１７１８９４４３は、経口投与した場合に腸管吸収を改善するために透過促進剤を含有するＰＰＳの投与のための医薬組成物を開示している。キトサンは、該促進剤の中で引用されていない。
【０００７】
国際公開公報第２０１６１９１６９８号は、鎌状赤血球症の処置のためのＰＰＳを含有する錠剤を開示している。特定の製剤化アプローチは、この文書に言及されていない。
【０００８】
国際公開公報第２０１６１９９１６１号は、膀胱出口部閉塞の処置のための、ＰＰＳとアルファアドレナリン遮断薬との両方を含有する錠剤製剤（特定の特徴を有しない）を開示している。
【０００９】
ナノ粒子薬物送達システムは、薬物を送達するために使用されるナノ担体である。他の形態の薬物担体と比較して、ナノ粒子は、バイオアベイラビリティー、低減した酵素分解、毒性又は副作用の点で多くの利点を有する。水不溶性複合体を形成させるために逆荷電した多糖の間の相互作用が一般に利用される（A. Nakayama and K. Shinoda J. Colloidal and Interface Sciences, 55, 1976, 126-132）。
【００１０】
例として、Grabovac及びBernkop-Schnurchは、ステムブロメラインとの複合体形成により低分子量ヘパリンの腸管膜透過性を改善することを提唱した（V. Grabovac and A. Bernkop-Schnurch Int. J. Pharm 326, 2006, 153-159）。
【００１１】
ナノ粒子を生じることができるポリマーの中で、キトサンは、陰イオン性活性成分と相互作用することが潜在的に可能な、もっとも有望な陽イオン性ポリマーのように見える。例えばキトサンは、高分子電解質複合体形成によりヘパリンとナノ粒子を形成すると提唱されている（Z. Liu et al. J. Biomed Mat. Res Part A; S. Boddoi et al. Biomacromolecules 10, 2009, 1402-1409）。
【００１２】
キトサン（ＣＳ）は、安全であることが証明されているポリカチオン性で無毒の粘膜付着性ポリマーである。これは、粘膜表面に付着して上皮細胞の間の密着結合を開くことができ、したがって、薬物の吸収を潜在的に改善することができる。これは、送達システムと膜上皮との間の相互作用の延長を可能にし、粘液／上皮層内へのより効率的な薬物拡散を促進する。
【００１３】
H. Abdel-Haq及びE. Bossuは、キトサンがＰＰＳと複合体を形成する能力を実証したが（J. Chromatography A 1257, 2012, 125-130）、該複合体の形成のための特定の条件を開示しなかった。開示された複合体の治療応用は記載されていない。
【００１４】
Raspagniら（J. Controlled Release 148, 2010, e112-e124）は、薬物のイオン向性ゲル化及びインビトロ放出によるＰＰＳとキトサンとの間の複合体形成に関する予備研究を記載した。彼らは、ＰＰＳとキトサンとの間の０．５：１、１．２：１、２．２：１の重量比に基づく局所（膣）適用のためのゲル形態の組成物を提唱した。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＰＰＳの血漿中濃度時間曲線である。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、ペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）とキトサンとの複合体のナノ粒子を含む経口組成物に関する。本発明の組成物は、好ましくは錠剤、硬カプセル剤、分包の顆粒剤又は散剤、液剤又はシロップ剤の用時調製用の散剤の形態である。ナノ粒子は、ＰＰＳとキトサンのイオン化可能な官能基との間のイオン相互作用による溶液中での自己集合により得られる。水溶液中のそのような相互作用の結果として、分子量、置換度、出発溶液中の濃度などのポリマーの特徴及びパラメータのみならず、製造工程のパラメータに寸法が依存する粒子の自然形成が生じる。動的光散乱法により測定される８０から２２０nmの間の直径を好ましくは有する本発明のナノ粒子は、遊離薬物の拡散よりもナノ粒子全体のエンドサイトーシスにより上皮細胞膜を通過して活性成分を運ぶことができる安定な分子間複合体の形態で上部腸管の上皮を直接透過する（A. Dube et al. Chitosan nanoparticles enhance the intestinal absorption of the green tea catechins (+)-catechin and (-)-epigallocatechin gallate, Eur. J. Phar, Sci. 41, 2019-225, 2010）。このように、大腸に達する未吸収の薬物量は有意に低減し、結腸の刺激は低下する。この特徴は、吸収改善の結果として、投与された用量が顕著に低減することを可能にする。
【００１７】
本発明の製剤は、典型的には、１〜１０mg/mLに含まれる濃度のＰＰＳ水溶液から出発して調製される。ｐＨが３〜５．５の範囲のキトサンの酸性水溶液が該ＰＰＳ溶液中に滴下される。該キトサン溶液の調製のために使用される酸は、塩酸、硫酸、グルタミン酸、乳酸、アスコルビン酸、又は溶液中のポリマーを１〜６．５mg/mLの範囲の濃度にすることができる任意の他の生理学的に許容される酸より選択され得る。
【００１８】
ＰＰＳ溶液とキトサン溶液との比は、両方の溶液が濃度１mg/mLの場合、３：６ v/v〜５：１．５の範囲であり、より好ましくは４：５v/vである。両方のポリアニオンのより高い濃度では、５：１．５、５：２、５：３、５：４v/vなどの異なる比が好ましい。
【００１９】
キトサン溶液を添加する間、ＰＰＳ溶液は撹拌し続けられる。該撹拌は、パドル、プロペラ、マグネチックスターラ、ターボディスペンサ、又は高い分散度を得るために適した任意の他の種類の混合装置を用いて得ることができる。パドル、プロペラ又はマグネチックスターラが使用される場合、回転は３００〜１５００回転／分の間、好ましくは４００〜１２００の間、より好ましくは５００〜１０００rpmの間に保たれ、一方、ターボディスペンサの場合、ロータの好ましい速度は８０００〜３００００rpmの範囲である。
【００２０】
分散工程は、２０〜６０℃、好ましくは２５〜５０℃の間の範囲の温度、より好ましくは４０℃で実行される。
【００２１】
２つの構成成分の初濃度が１mg/mLよりも高い場合、ナノ粒子の寸法を関心対象の径に低減するためにさらなる調製段階が必要である。この段階は、高圧均質化処理、ナノ粉砕、又はナノ粒子の寸法を機械的に低減することができる任意の他の工程などの工程の使用を意味する。
【００２２】
この段階は、ナノ懸濁液を高いＰＰＳ濃度で調製することを可能にし、したがって、ナノ懸濁液から流動性粉末へのその後の変換に必要な時間及びエネルギー量を顕著に低減するので、本発明の可能性のある工業的活用のために特に重要である。
【００２３】
高圧均質化処理が用いられる場合、５００bar〜１５００bar、より好ましくは１２００barの圧で所望の範囲の粒子を得ることができる。工程の温度は、４０〜６０℃、好ましくは４０〜５０℃の間の範囲であり得、より好ましくは４０℃である。均質化サイクルの数は、５〜５０、より好ましくは１０〜４０の範囲であり得、より好ましくは３５である。
【００２４】
８０〜２２０nmに含まれるサイズを有するPPSとキトサンとの複合体のナノ粒子は、７８〜９９％の間、好ましくは８５〜９７％の間、より好ましくは９２〜９６％の間の脱アセチル化度、及び３０〜４００kDaの間、好ましくは６５〜３００kDaの間、より好ましくは６７〜２００kDaの間に含まれる分子量（数平均分子質量）を有するキトサンから得られる。
【００２５】
本発明のナノ粒子は、ＰＰＳとキトサンとの特に高度の複合体形成によって特徴づけられる。ＰＰＳ溶液とキトサン溶液との間の相互作用によって本発明により得られたナノ懸濁液中の複合体形成していないＰＰＳは、ナノ懸濁液中のＰＰＳの名目用量に対して２０重量％未満である。上述の態様は、一方の側で製剤中のＰＰＳがすべてナノ粒子形態であることにより、小腸の上皮を通過して完全に輸送できることを保証し、他方の側で、ナノ粒子の一部が腸管吸収不全を回避する場合、結腸に達する遊離ＰＰＳがないので、２倍重要である。実際に、ナノ粒子は酸性溶液中で形成するので、キトサンの溶解特性を考慮する場合、粒子の溶解度積は結腸のやや塩基性の環境でより一層低いという結果になる。
【００２６】
次に、得られた均質化ナノ懸濁液は、フリーズドライ、スプレードライ、又は固体担体上の分散／吸収のいずれかによって流動性粉末に変換される。すべての場合で、ナノ懸濁液は胃腸液などの水性液体中のナノ粒子の再分散を促進することができる薬学的に許容し得る増量剤（bulking agent）と混合される。
【００２７】
増量剤は、デキストロース、グルコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、ラフィノース、トレハロースなどの糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリオール、セルロースなどのポリマー、デキストリンなどのオリゴマー、リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、ベントナイト、カオリンなどの無機塩であり得る。
【００２８】
懸濁液の体積と増量剤の量との間の比は、広い区間内で変動する場合があり、当業者によって共通の一般知識に従って容易に決定されるであろう。
【００２９】
次に、結果として生じる流動性粉末が標準的な工程により固体剤形に変換されて、錠剤、硬カプセル剤、顆粒剤若しくは散剤、液剤の用時調製用の散剤、液剤、又はシロップ剤が得られる。本発明のナノ粒子は、治療量のＰＰＳを提供する用量、典型的にはＰＰＳの５０〜２００mgの範囲で投与される。
【００３０】
本発明のナノ粒子の吸収は、I. Hubatsch, E. Ragnarrson, P. Artursson in “Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers”, Nature Protocols vol. 2 n. 9, 2007, 2111-2119及びMeunier V et al., in “The human intestinal epithelial cell line Caco-2; pharmacological and pharmacokinetic applications” Cell Biol Toxicol. 1995 Aug;11(3-4):187-94によって開示された方法に従って、Ｃａｃｏ−２細胞の単層を用いるインビトロ浸透試験によって評価されてもよい。
【００３１】
本発明の製剤からのＰＰＳのバイオアベイラビリティーは、非製剤化ＰＰＳの溶液と比較して粉末分散物の強制経口投与を受けたラットにおいて評価することができる。
【００３２】
粒子径に対する種々のキトサン分子量、脱アセチル化度、濃度及び工程パラメータの効果を以下の実施例に報告する。
【実施例１】
【００３３】
T10 basic Ultra-Turrax分散機（IKA, ドイツ）を用いる１６８００rpmの一定撹拌下、濃度１mg/mLのＰＰＳ溶液の体積8mLを、異なる濃度（０．５〜５mg/mLの範囲）を有するキトサン９５／５０（脱アセチル化度９７％、分子量１５０kDa、HMC、ドイツ）の溶液１０mLに滴下した。混合段階を４０℃で２分間実行した。
【００３４】
形成した粒子の粒子径（Ｚ平均粒子径（mean zeta average））及び粒子径分布（多分散指数、ＰＤＩ）を動的光散乱法（Zetasizer, Malvern Instrument, UK）によって測定した。
【００３５】
得られたデータを表１に報告する。
【００３６】
表１：T10 basic Ultra-Turrax分散機を用いて１６８００rpmで得られた粒子のキトサン溶液濃度に対する粒子径および粒子径分布
【表１】
2021529205.tif 000002
【００３７】
粒子径及び粒子径分布はキトサン溶液の濃度と共に増加する。採用された撹拌条件を用いて、≦１mg/mLのキトサン濃度で関心対象の径区間（＜２２０nm）の粒子を得ることができることを観察することができる。
【実施例２】
【００３８】
T10 basic Ultra-Turrax分散機（IKA, ドイツ）を用いる１６８００rpmの一定撹拌下、濃度１mg/mLのＰＰＳ溶液の体積８mLを、濃度１mg/mLを有するキトサン７５／５０（脱アセチル化度７６％、分子量１２８０kDa、HMC、ドイツ）の溶液１０mLに滴下した。混合段階を４０℃で２分間実行した。
【００３９】
混合すると、μm範囲の粒子からなる固体沈殿が得られた。
【実施例３】
【００４０】
Ｃ−Ｍａｇマグネチックスターラ（IKA, ドイツ）を用いる２００〜９５０rpmの範囲の可変磁気撹拌下、濃度１mg/mLのＰＰＳ溶液の体積１６mLを、濃度１mg/mLを有するキトサン９５／５０（脱アセチル化度９７％、分子量１５０kDa、HMC、ドイツ）の溶液２０mLに滴下した。混合段階を４０℃で３分間実行した。
【００４１】
形成した粒子の粒子径（Ｚ平均粒子径）及び粒子径分布（多分散指数、ＰＤＩ）を動的光散乱法（Zetasizer, Malvern Instrument, UK）によって測定した。
【００４２】
得られたデータを表２に報告する。
【００４３】
表２：１mg/mLのキトサン溶液から出発してマグネチックスターラを用いて可変撹拌速度で得られた粒子の粒子径及び粒子径分布
【表２】
2021529205.tif 000003
【００４４】
撹拌速度の増加と共に粒子径は減少し、多分散指数も同様に減少する。
【００４５】
関心対象の径区間内（＜２２０nm）の粒子は、１mg/mL ＰＰＳ溶液から出発して３００rpmよりも高い磁気撹拌で得ることができる。
【実施例４】
【００４６】
T10 basic Ultra-Turrax分散機（IKA, ドイツ）を用いる８００〜２５６００rpmの範囲の可変ロータ回転下、濃度１mg/mLのＰＰＳ溶液の体積１２mLを、濃度１mg/mLを有するキトサン９５／５０（脱アセチル化度９７％、分子量１５０kDa、HMC、ドイツ）の溶液１５mLに滴下した。混合段階を４０℃で２分間実行した。
【００４７】
形成した粒子の粒子径（Ｚ平均粒子径）及び粒子径分布（多分散指数、ＰＤＩ）を動的光散乱法（Zetasizer, Malvern Instrument, UK）によって測定した。
【００４８】
得られたデータを表３に報告する。
【００４９】
表３：濃度１mg/mLを有するキトサン溶液から出発してT10 basic Ultra-Turrax分散機を用いて８０００〜２５６００rpmで得られた粒子の粒子径及び粒子径分布
【表３】
2021529205.tif 000004
【００５０】
撹拌速度の増加と共に粒子径は減少し、多分散指数も同様に減少する。
【００５１】
関心対象の径区間内（＜２２０nm）の粒子が、試験された撹拌速度の全範囲で得られた。
【実施例５】
【００５２】
T10 basic Ultra-Turrax分散機（IKA, ドイツ）を用いる１６８００rpmの一定撹拌下、濃度１mg/mLのＰＰＳ溶液の体積８mLを、異なる濃度（０．５〜５mg/mL範囲）を有するChitoClear（登録商標）ＴＭ１５６０（脱アセチル化度８０％、分子量６６kDa、Primex、アイスランド）の溶液１０mLに滴下した。混合段階を４０℃で２分間実行した。
【００５３】
形成した粒子の粒子径（Ｚ平均粒子径）及び粒子径分布（多分散指数、ＰＤＩ）を動的光散乱法（Zetasizer, Malvern Instrument, UK）によって測定した。
【００５４】
得られたデータを表４に報告する。
【００５５】
表４：キトサン溶液の濃度に対する、T10 basic Ultra-Turrax分散機を用いて１６８００rpmで得られた粒子の粒子径及び粒子径分布
【表４】
2021529205.tif 000005
【００５６】
粒子径のみならず粒子径分布は、キトサン溶液の濃度と共に増加する。関心対象の径区間内（＜２２０nm）の粒子がキトサン濃度≦１mg/mLで得られることを観察することができる。
【実施例６】
【００５７】
T10 basic Ultra-Turrax分散機（IKA, ドイツ）を用いる１６８００rpmの定常撹拌下、濃度１mg/mLのＰＰＳ溶液の体積８mLを、異なる濃度（０．５〜２mg/mLの範囲）を有するChitoClear（登録商標）ＴＭ１８５４（脱アセチル化度６０％、分子量５２９kDa、Primex、アイスランド）の溶液 １０mLに滴下した。混合段階を４０℃で２分間実行した。
【００５８】
形成した粒子の粒子径（Ｚ平均粒子径）及び粒子径分布（多分散指数、ＰＤＩ）を動的光散乱法（Zetasizer, Malvern Instrument, UK）によって測定した。
【００５９】
得られたデータを表５に報告する。
【００６０】
表５：キトサン溶液の濃度に対する、T10 basic Ultra-Turrax分散機を用いて１６８００rpmで得られた粒子の粒子径及び粒子径分布
【表５】
2021529205.tif 000006
【００６１】
高分子量及び低脱アセチル化度のこのキトサンを用いて関心対象の径区間内（＜２２０nm）の粒子を得ることができない。
【実施例７】
【００６２】
T25 basic Ultra-Turrax分散機（IKA, ドイツ）を用いる８０００〜３００００rpmの範囲の可変ロータ回転下、濃度６．５mg/mLのＰＰＳ溶液の体積７１．５mLを、濃度６．５mg/mLを有するキトサン９５／５０（脱アセチル化度９７％、分子量１５０kDa、HMC、ドイツ）の溶液２８．５mLに滴下した。混合段階を４０℃で１０分間実行し、次にナノ懸濁液をさらに１０分間撹拌し続けた。
【００６３】
形成した粒子の粒子径（Ｚ平均粒子径）及び粒子径分布（多分散指数、ＰＤＩ）を動的光散乱法（Zetasizer, Malvern Instrument, UK）によって測定した。
【００６４】
すべての粒子は、関心対象の範囲から外れた直径、すなわち２２０nmよりも大きな直径を示した。
【実施例８】
【００６５】
T25 basic Ultra-Turrax分散機（IKA, ドイツ）を用いる８０００〜３００００rpmの範囲の可変ロータ回転下、濃度６．５mg/mLのＰＰＳ溶液の体積６２．５mLを、キトサン９５／５０（脱アセチル化度９７％、分子量１５０kDa、HMC、ドイツ）の溶液 ３７．５mLに滴下した。混合段階を４０℃で１０分間実行し、次にナノ懸濁液をさらに１０分間撹拌し続けた。
【００６６】
形成した粒子の粒子径（Ｚ平均粒子径）及び粒子径分布（多分散指数、ＰＤＩ）を動的光散乱法（Zetasizer, Malvern Instrument, UK）によって測定した。
【００６７】
すべての粒子が１μmよりも大きな直径を示したので、関心対象の径区間内（＜２２０nm）の粒子は得られなかった。
【実施例９】
【００６８】
比較のために、ＰＰＳ溶液をキトサン９５／５０溶液（脱アセチル化度９７％、分子量１５０kDa、HMC、ドイツ）中に添加することによって、Raspagniら（J. Controlled Release 148, 2010, e112-e124）による教示に従うイオン誘起型ゲル化によりＰＰＳ−キトサンゲルを調製した。キトサン溶液（５０mg/mL）及びＰＰＳ溶液（１０mg/mL）の濃度を一定に保った；ＰＰＳとキトサンとの間の３つの異なる重量比、すなわち０．５：１、１：１及び２：１を採用した。
【００６９】
９５００rpmの連続撹拌下（T8 basic Ultra-Turrax分散機、IKA、ドイツ）、ＰＰＳ溶液（２．５、５、又は１０mL）を０．５mL/minの一定速度でキトサン溶液 １０mLに滴下した。
【００７０】
３つのケースのすべてでナノ粒子もマイクロ粒子も形成せずに粘性ゲルが得られた。
【実施例１０】
【００７１】
T25 basic Ultra-Turrax分散機（IKA, ドイツ）を用いる８０００〜３００００rpmの範囲の可変ロータ回転下、濃度４．５mg/mLのキトサン９５／５０（脱アセチル化度９７％、分子量１５０kDa、HMC、ドイツ）の溶液の体積２８．５mLを、濃度８．５mg/mLを有するＰＰＳ溶液 ７１．５mLに滴下した（ＰＰＳとキトサンとの間の比は４．７４：１ w/w又は５：２ v/v）。混合段階を４０℃で１０分間実行し、次にナノ懸濁液をさらに１０分間撹拌し続けた。
【００７２】
次に得られたナノ懸濁液を、１２００bar、３５サイクルでホモジナイズした（High-Pressure Homogenizer, GEA Niro Soavi, イタリア）。
【００７３】
形成した粒子の粒子径（Ｚ平均粒子径）及び粒子径分布（多分散指数、ＰＤＩ）を動的光散乱法（Zetasizer, Malvern Instrument, UK）によって測定した。
【００７４】
得られた粒子は、２０１±３．１nmの径及び０．１８６±０．０１のＰＤＩを示した。
【実施例１１】
【００７５】
T25 basic Ultra-Turrax分散機（IKA, ドイツ）を用いる８０００〜３００００rpmの範囲の可変ロータ回転下、濃度４．５mg/mLのキトサン９５／５０（脱アセチル化度９７％、分子量１５０kDa、HMC、ドイツ）溶液の体積２３mLを、濃度１０mg/mLを有するＰＰＳ溶液 ７７mLに滴下した（ＰＰＳとキトサンとの間の比は、７．４４：１ w/w又は５：１．５ v/v）。混合段階を４０℃で１０分間実行し、次にナノ懸濁液をさらに１０分間撹拌し続けた。
【００７６】
得られたナノ懸濁液を１２００bar、３５サイクルでホモジナイズした（High-Pressure Homogenizer, GEA Niro Soavi, イタリア）。
【００７７】
形成した粒子の粒子径（Ｚ平均粒子径）及び粒子径分布（多分散指数、ＰＤＩ）を動的光散乱法（Zetasizer, Malvern Instrument, UK）によって測定した。
【００７８】
得られたナノ粒子は、結果として２０４．１±４．３nmであり、０．１９１±０．０１のＰＤＩであった。
【実施例１２】
【００７９】
１mg/mLのPPＳ濃度で実施例１と同様にナノ懸濁液を調製した。
【００８０】
溶液中の遊離（複合体を形成していない）ＰＰＳ量を定量することによってナノ粒子中のＰＰＳとキトサンとの複合体形成度を決定した。孔径０．１μｍのフィルタを通してナノ懸濁液を濾過した。濾過された上清中の遊離ＰＰＳ量をエレクトロスプレーイオン化質量分析（4000 Qtrap, ABSciex, USA）によって測定した。
【００８１】
複合体形成したＰＰＳを：
【００８２】
【数１】
2021529205.tif 000007
として計算した。
【００８３】
複合体形成したＰＰＳの量は、結果としてナノ粒子中のＰＰＳの名目用量の９９．６±０．１４％であった。
【実施例１３】
【００８４】
ナノ懸濁液を８．５mg/mLのＰＰＳ濃度で実施例９と同様に調製した。
【００８５】
溶液中の遊離（複合体形成していない）ＰＰＳ量を定量することによってナノ粒子中のＰＰＳとキトサンとの複合体形成度を決定した。孔径０．１μmを有するフィルタを通してナノ懸濁液を濾過した。濾過された上清中の遊離ＰＰＳ量をエレクトロスプレーイオン化質量分析（4000 Qtrap, ABSciex, USA）によって測定した。
【００８６】
複合体形成したＰＰＳを：
【００８７】
【数２】
2021529205.tif 000008
として計算した。
【００８８】
複合体形成したＰＰＳの量は、結果としてナノ懸濁液中のＰＰＳの名目用量の≧８０％であった。
【実施例１４】
【００８９】
濃度４．６４mg/mLを有するＰＰＳ水溶液 １mL（形態Ｉ）又はＰＰＳ／キトサンナノ懸濁液 １mL（ＰＰＳ濃度４．６４mg/mL）の経口投与後のラットにおいて実行されたインビボ薬物動態試験で血漿中濃度時間曲線を評価した。ナノ懸濁液では、ナノ粒子の製造のために使用されたＰＰＳ溶液（６．５mg/mL）の体積とキトサン溶液（６．５mg/mL）の体積との間の比は５：２(v/v)であった。
【００９０】
得られた血漿中濃度時間曲線を図１に報告する。
【００９１】
ナノ粒子製剤についての曲線下面積は２５９３min μgmL-1であり、ＰＰＳ溶液については１３０６min μgmL-1であった。ＰＰＳ溶液で処置されたラットと比較して、ナノ粒子で処置されたラットの方が高いｔｍａｘ（６０分と比べて１２０分）も観察された。この値は、約２００％という相対バイオアベイラビリティーをもたらした。
【実施例１５】
【００９２】
実施例１１と同様に調製したナノ懸濁液にマンニトール（Perlitol（登録商標）200SD, Roquette, フランス）をＰＰＳ重量に対して３：１の比で添加する。マンニトールが完全に溶解した後、１mm直径のスプレーノズルを備えるBuechi B290装置を用いて懸濁液をスプレー乾燥する。適用される乾燥条件は：
入口温度  １４０℃；
気流  ６００L/時間;
懸濁液供給速度  ２mL/min;
アスピレータ  ３５m3/時間
である。
【００９３】
得られた粉末をさらに使用する前にコレクタ中に１５分間放置する。
【実施例１６】
【００９４】
実施例１０と同様に調製したナノ懸濁液にマンニトール（Perlitol（登録商標）200SD, Roquette, フランス）をＰＰＳ重量に対して３：１の比で添加する。マンニトールが完全に溶解した後、懸濁液をガラス製円筒形容器に注ぎ、直ちに凍結乾燥器（Alpha 2-4, Martin Christ, ドイツ）のチャンバ内に入れ、次に温度を−４０℃に下げ、この値を１時間保って懸濁液の完全凍結を確実にする。その後、チャンバ内の圧を０．１mbarに低下させる。次に、２時間でプレート温度を−５℃に上げ、この値を１２時間保つ（一次乾燥）。その後、３時間で圧を０．０１mbarに低下させ、温度を５℃に上げることによって二次乾燥を行う。これらの条件を６時間一定に保つ。次に、通気弁を開けることによってチャンバの圧を環境値（１０００mbar）に上げる。試料を回収し、さらに使用するまで保存する。
【実施例１７】
【００９５】
ゼラチン硬カプセルサイズ０号  −  量組成
実施例１５と同様の粉末          ４１３．４４mg
結晶セルロース                  ９０mg 
ステアリン酸マグネシウム        ２．５mg
【図１】
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【国際調査報告】
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