(57)【要約】本明細書中で実証されるように、肝臓を形質導入し、ＡＤＫ６抗体による肝臓の形質導入の中和を減少させた改変組換えＡＡＶ６ベクターを提供する。したがって、本発明の実施形態は、中和を回避する肝臓向性ｒＡＡＶ６ベクターに関する。本発明の１つの態様では、ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応するＳ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｈ２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、およびＴ５８９からなる群から選択される１またはそれを超えるアミノ酸残基での置換を含む改変組換えＡＡＶ６ベクターであって、前述のｒＡＡＶ６ベクターは、肝臓を形質導入し、前述の１またはそれを超える置換を欠くｒＡＡＶ６ベクターと比較して、ＡＤＫ６抗体による肝臓の形質導入の中和を減少させた、改変組換えＡＡＶ６ベクターを提供する。
2021519612.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応するＳ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｈ２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、およびＴ５８９からなる群から選択される１またはそれを超えるアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む改変組換えＡＡＶ６ベクターであって、前記ｒＡＡＶ６ベクターは、肝臓を形質導入し、前記１またはそれを超える置換を欠く前記ｒＡＡＶ６ベクターと比較して、ＡＤＫ６抗体による肝臓の形質導入の中和を減少させた、改変組換えＡＡＶ６ベクター。
【請求項２】
ＡＡＶ６  ＶＰ１のアミノ酸５３１に対応するアミノ酸部位にリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）をさらに含む、請求項１に記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
【請求項３】
アミノ酸５３１にＫを含む、請求項２に記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
【請求項４】
アミノ酸５３１にＲを含む、請求項２に記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
【請求項５】
前記１またはそれを超えるアミノ酸のうちの少なくとも２つが置換されている、請求項１〜３のいずれかに記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
【請求項６】
前記１またはそれを超えるアミノ酸のうちの少なくとも３つが置換されている、請求項１〜４のいずれかに記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
【請求項７】
前記１またはそれを超えるアミノ酸のうちの少なくとも４つが置換されている、請求項１〜５のいずれかに記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
【請求項８】
前記１またはそれを超えるアミノ酸のうちの少なくとも５つが置換されている、請求項１〜６のいずれかに記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
【請求項９】
前記１またはそれを超えるアミノ酸のうちの少なくとも６つが置換されている、請求項１〜７のいずれかに記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
【請求項１０】
前記１またはそれを超えるアミノ酸のうちの少なくとも７つが置換されている、請求項１〜８のいずれかに記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
【請求項１１】
前記１またはそれを超える置換が保存的置換を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
【請求項１２】
前記１またはそれを超える置換が非保存的置換を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
【請求項１３】
ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応するＮ４４７、Ｓ４７２、Ｖ４７３、Ｎ５００、Ｔ５０２、およびＷ５０３からなる群から選択される、シアル酸に結合する少なくとも１つのアミノ酸の置換をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
【請求項１４】
ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応する２６２〜２７２；３８２〜３８６、４４５〜４５７、４５９、４６９〜４７３、４８８〜４８９、４９４〜４９６、４９９〜５１５、５７１〜５７９、５８４〜５８９、および５９３〜５９５からなる群から選択されるアミノ酸の１またはそれを超える改変領域をさらに含み、ここで、前記１またはそれを超える改変領域中の少なくとも１またはそれを超えるアミノ酸が置換されている、請求項１〜１２のいずれかに記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
【請求項１５】
ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応するＳ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｈ２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、およびＴ５８９からなる群から選択される１またはそれを超えるアミノ酸残基での置換を含む改変組換えＡＡＶ６ベクターであって、前記ｒＡＡＶ６ベクターは、肝臓を形質導入し、前記１またはそれを超える置換を欠く前記ｒＡＡＶ６ベクターと比較して、ＡＤＫ６抗体による形質導入の中和を減少させた、改変組換えＡＡＶ６ベクター。
【請求項１６】
ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応する２６２〜２７２；３８２〜３８６、４４５〜４５７、４５９、４６９〜４７３、４８８〜４８９、４９４〜４９６、４９９〜５１５、５７１〜５７９、５８４〜５８９、および５９３〜５９５からなる群から選択されるアミノ酸の１またはそれを超える改変領域を含む改変ｒＡＡＶ６ベクターであって、ここで、前記１またはそれを超える改変領域中の少なくとも１またはそれを超えるアミノ酸が置換されており、前記ｒＡＡＶ６ベクターは、肝臓を形質導入し、前記１またはそれを超える置換を欠く前記ｒＡＡＶ６ベクターと比較して、ＡＤＫ６抗体による肝臓の形質導入の中和を減少させた、改変ｒＡＡＶ６ベクター。
【請求項１７】
ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応するＫ５３１を含む、請求項１５に記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
【請求項１８】
ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応するＲ５３１を含む、請求項１５に記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
【請求項１９】
４５６〜４５９；４９２〜４９９；および５８８〜５９７からなる群から選択される１またはそれを超えるアミノ酸領域でのアミノ酸置換をさらに含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
【請求項２０】
４５６〜４９９のＳＥＥＲ（配列番号２）、４９２〜４９９のＴＰＧＧＮＡＴＲ（配列番号３）；５８８〜５９７のＤＬＤＰＫＡＴＥＶＥ（配列番号４）からなる群から選択される１またはそれを超える前記アミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
【請求項２１】
非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較して、非改変ｒＡＡＶ６ウイルスに対するヒト抗血清による肝臓形質導入の中和を減少させた、請求項１〜１９のいずれかに記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
【請求項２２】
非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較して、非改変ｒＡＡＶ６ウイルスに対するマウス抗血清によって測定される肝臓形質導入の中和を減少させた、請求項１〜１９のいずれかに記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
【請求項２３】
非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較して、非改変ｒＡＡＶ６ウイルスに対するアカゲザル抗血清によって測定される肝臓形質導入の中和を減少させた、請求項１〜１９のいずれかに記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
【請求項２４】
肝臓向性を保持し、かつＡＤＫ６抗体による中和を減少させるＡＡＶ６ビリオンを同定する方法であって、
ａ．飽和変異誘発ＡＡＶ６ライブラリーであって、ここで、Ｓ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｈ２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、およびＴ５８９からなる群から選択されるアミノ酸の各々が、２０種の異なる天然または非天然のアミノ酸の各々と全てまたは全てより少ない位置の任意の組み合わせで置換されており、前記ＡＡＶ６がＫ５３１またはＲ５３１のいずれかを含む、飽和変異誘発ＡＡＶ６ライブラリーを生成すること；および
ｂ．肝臓の細胞（例えば、肝細胞）または組織を前記ｒＡＡＶ６ライブラリーで感染させることによって複数ラウンドの進化を行うこと；および
ｃ．前記対応する非改変ＡＡＶ６ビリオンと比較してＡＤＫ６または抗血清による少なくとも１０％の中和の減少をスクリーニングすること
を含む、方法。
【請求項２５】
シアル酸結合の喪失をスクリーニングすることをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
シアル酸結合の存在をスクリーニングすることをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
肝臓向性を保持し、かつＡＤＫ６抗体による中和を減少させるＡＡＶ６ビリオンを同定する方法であって、
ａ．２６２〜２７２；３８２〜３８６、４４５〜４５７、４５９、４６９〜４７３、４８８〜４８９、４９４〜４９６、４９９〜５１５、５７１〜５７９、５８４〜５８９、および５９３〜５９５からなる群から選択されるアミノ酸の１またはそれを超える改変領域の飽和変異誘発ライブラリーであって、ここで、前記１またはそれを超える領域が、２０種の異なる天然または非天然のアミノ酸の各々で、全てまたは全てより少ない位置の任意の組み合わせにおいて置換されており、前記ＡＡＶ６がＫ５３１またはＲ５３１のいずれかを含む、飽和変異誘発ライブラリーを生成すること；および
ｂ．肝臓の細胞（例えば、肝細胞）または組織を前記ｒＡＡＶ６ライブラリーで感染させることによって複数ラウンドの進化を行うこと；および
ｃ．前記対応する非改変ＡＡＶ６ビリオンと比較してＡＤＫ６または抗血清による少なくとも１０％の中和の減少をスクリーニングすること
を含む、方法。
【請求項２８】
シアル酸結合の喪失をスクリーニングすることをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
シアル酸結合の存在をスクリーニングすることをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ＡＤＫ６抗体による中和を減少させ、肝臓を形質導入する、請求項２４〜２７のいずれかに記載の方法によって得られた改変ｒＡＡＶ６ベクター。
【請求項３１】
非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較して、非改変ｒＡＡＶ６ウイルスに対するヒト抗血清による肝臓形質導入の中和を少なくとも１０％減少させた、請求項２８に記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
【請求項３２】
非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較して、非改変ｒＡＡＶ６ウイルスに対するマウス抗血清による肝臓形質導入の中和を少なくとも１０％減少させた、請求項２８に記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
【請求項３３】
非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較して、非改変ｒＡＡＶ６ウイルスに対するアカゲザル抗血清による肝臓形質導入の中和を少なくとも１０％減少させた、請求項２８に記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本国際出願は、３５米国特許法第１１９条（ｅ）の下で２０１８年３月２９日提出の米国特許仮出願第６２／６４９，６９１号（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）の利益を主張する。
配列表
【０００２】
本出願は、配列表を含んでおり、この配列表は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体が本明細書中で参考として援用される。２０１９年３月２５日に作成した前述のＡＳＣＩＩコピーの名称は０４６１９２−０９１９２０ＷＯＰＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは８，２９４バイトである。
【０００３】
本発明の実施形態は、中和を回避する肝臓向性ｒＡＡＶ６ベクターに関する。
【背景技術】
【０００４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子療法のためのベクターとして使用される非病原性依存性パルボウイルスである。複数の血清型およびバリアントが同定されており、いくつかが臨床試験で使用されている。臨床試験においてＡＡＶベクターの治療効果が得られているが、ＡＡＶベクターの主な課題の１つは、ナイーブ被験体（以前にウイルスに暴露されていない被験体）を処置する必要があること、および免疫応答のためにベクターを再投与することができないことである。したがって、免疫応答を回避することができ、かつ特定の組織に遺伝子を効率的に送達および発現させることができる遺伝子療法ベクターを開発することが当該分野で必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の１つの態様では、ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応するＳ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｈ２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、およびＴ５８９からなる群から選択される１またはそれを超えるアミノ酸残基での置換を含む改変組換えＡＡＶ６ベクターであって、前述のｒＡＡＶ６ベクターは、肝臓を形質導入し、前述の１またはそれを超える置換を欠くｒＡＡＶ６ベクターと比較して、ＡＤＫ６抗体による肝臓の形質導入の中和を減少させた、改変組換えＡＡＶ６ベクターを提供する。１つの実施形態では、改変ＡＡＶ６ベクターはまた、アミノ酸５３１（ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリング）にリジン（Ｋ）を含む。１つの実施形態では、改変ＡＡＶ６ベクターは、ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応するアミノ酸５３１にアルギニン（Ｒ）を含む。アミノ酸５３１にＫまたはＲが存在する一定の実施形態では、１またはそれを超えるアミノ酸のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つが置換されている。上記の一定の実施形態では、１またはそれを超える置換は、保存的アミノ酸置換を含む。一定の実施形態では、１またはそれを超える置換は、非保存的置換を含む。
【０００６】
本明細書中に記載の１つの実施形態では、改変ｒＡＡＶ６ベクターは、ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応する２６２〜２７２；３８２〜３８６、４４５〜４５７、４５９、４６９〜４７３、４８８〜４８９、４９４〜４９６、４９９〜５１５、５７１〜５７９、５８４〜５８９、および５９３〜５９５からなる群から選択されるアミノ酸の１またはそれを超える改変領域をさらに含み、ここで、１またはそれを超える改変領域中の少なくとも１またはそれを超えるアミノ酸が置換されている。配列番号１はＡＡＶ６  ＶＰ１を示す。したがって、ＡＡＶ６  ＶＰ１に対応するＳ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｉ−１２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、Ｔ５８９、およびＫ５３１またはＲ５３１は、それぞれ、配列番号１のＳ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｈ２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、Ｔ４８９および、ＫまたはＲ５３１である。
【０００７】
別の態様では、（ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応する）２６２〜２７２；３８２〜３８６、４４５〜４５７、４５９、４６９〜４７３、４８８〜４８９、４９４〜４９６、４９９〜５１５、５７１〜５７９、５８４〜５８９、および５９３〜５９５からなる群から選択されるアミノ酸の１またはそれを超える改変領域を含む改変ｒＡＡＶ６ベクターであって、ここで、１またはそれを超える改変領域中の少なくとも１またはそれを超えるアミノ酸が置換されており、ｒＡＡＶ６ベクターは、肝臓を形質導入し、１またはそれを超える置換を欠くｒＡＡＶ６ベクターと比較して、ＡＤＫ６抗体による肝臓の形質導入の中和を減少させた、改変ｒＡＡＶ６ベクターを提供する。
【０００８】
別では、（ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応する）２６９〜２７２；４４５〜４５０；４６９〜４７１；４９３；５０１〜５１５；５８４〜５８７からなる群から選択されるアミノ酸の１またはそれを超える改変領域を含む改変ｒＡＡＶ６ベクターであって、ここで、１またはそれを超える改変領域中の少なくとも１またはそれを超えるアミノ酸が置換されており、ｒＡＡＶ６ベクターは、肝臓を形質導入し、１またはそれを超える置換を欠くｒＡＡＶ６ベクターと比較して、ＡＤＫ６抗体による肝臓の形質導入の中和を減少させた、改変ｒＡＡＶ６ベクターを提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のいずれかの態様では、改変ｒＡＡＶ６ベクターは、Ｋ５３１、またはＲ５３１を含む。
【００１０】
本明細書中に記載の各態様のいくつかの実施形態では、改変ｒＡＡＶ６ベクターは、Ｎ４４７、Ｓ４７２、Ｖ４７３、Ｎ５００、Ｔ５０２、およびＷ５０３からなる群から選択される、シアル酸に結合する１またはそれを超えるアミノ酸の置換をさらに含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の各態様では、改変ｒＡＡＶ６ベクターは、４５６〜４５９；４９２〜４９９；および５８８〜５９７からなる群から選択される１またはそれを超えるアミノ酸領域でのアミノ酸置換を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の各態様では、改変ｒＡＡＶ６ベクターは、４５６〜４９９のＳＥＥＲ（配列番号２）、４９２〜４９９のＴＰＧＧＮＡＴＲ（配列番号３）；５８８〜５９７のＤＬＤＰＫＡＴＥＶＥ（配列番号４）からなる群から選択される１またはそれを超えるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の各態様では、改変ｒＡＡＶ６ベクターは、非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較して、非改変ｒＡＡＶ６に対するヒト抗血清による肝臓形質導入の中和を減少させた。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の各態様では、改変ｒＡＡＶ６ベクターは、非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較して、非改変ｒＡＡＶ６に対するマウス抗血清による肝臓形質導入の中和を減少させた。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の各態様では、改変ｒＡＡＶ６ベクターは、非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較して、非改変ｒＡＡＶ６に対するアカゲザル抗血清による肝臓形質導入の中和を減少させた。
【００１６】
別の態様では、肝臓向性を保持し、かつＡＤＫ６抗体による中和を減少させたＡＡＶ６ビリオンを単離する方法を提供する。本方法は、飽和変異誘発ＡＡＶ６ライブラリーであって、ここで、Ｓ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｈ２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、およびＴ５８９からなる群から選択されるアミノ酸の各々が、２０種の異なる天然または非天然のアミノ酸の各々で、全てまたは全てより少ない位置の任意の組み合わせにおいて置換されている、飽和変異誘発ＡＡＶ６ライブラリーを生成すること；および肝臓の細胞（例えば、肝細胞）または組織を前述のｒＡＡＶ６ライブラリーで感染させることによって複数ラウンドの進化を行うこと；およびＡＤＫ６または野生型ｒＡＡＶ６抗血清による中和の減少をスクリーニングすることを含む。上記の１つの実施形態では、ライブラリーのｒＡＡＶ６は、Ｋ５３１またはＲ５３１のいずれかを含む。１つの実施形態では、本方法は、（例えば、カラムクロマトグラフィによって）シアル酸結合の喪失をスクリーニングすることをさらに含む。１つの実施形態では、本方法は、（例えば、カラムクロマトグラフィによって）シアル酸結合の存在をスクリーニングすることをさらに含む。
【００１７】
別の態様では、肝臓向性を保持し、かつＡＤＫ６抗体などのＡＡＶ６中和抗体による中和を減少させるＡＡＶ６ビリオンを同定する方法を提供する。本方法は、２６２〜２７２；３８２〜３８６、４４５〜４５７、４５９、４６９〜４７３、４８８〜４８９、４９４〜４９６、４９９〜５１５、５７１〜５７９、５８４〜５８９、および５９３〜５９５からなる群から選択されるアミノ酸の１またはそれを超える改変領域の飽和変異誘発ライブラリーであって、ここで、前述の１またはそれを超える領域が、２０種の異なる天然または非天然のアミノ酸の各々で、全てまたは全てより少ない位置の任意の組み合わせにおいて置換されている、飽和変異誘発ライブラリーを生成すること；および肝臓の細胞（例えば、肝細胞）または組織を前述のｒＡＡＶ６ライブラリーで感染させることによって複数ラウンドの進化を行うこと；および野生型ｒＡＡＶ６に対するＡＤＫ６または抗血清による中和の減少をスクリーニングすることを含む。１つの実施形態では、ライブラリーのｒＡＡＶ６は、Ｋ５３１またはＲ５３１のいずれかを含む。改変ｒＡＡＶ６ベクターは、ＡＤＫ６抗体による中和を減少させ、有意に肝臓を形質導入する。一定の実施形態では、改変ｒＡＡＶ６ベクターは、非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較した非改変ｒＡＡＶ６（例えば、野生型ウイルス）に対するヒト抗血清による肝臓形質導入の中和を減少させた。一定の実施形態では、改変ｒＡＡＶ６ベクターは、非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較した非改変ｒＡＡＶ６（例えば、野生型ウイルス）に対する他の種（マウス、アカゲザル、イヌなど）の抗血清による肝臓形質導入の中和を減少させた。
【００１８】
本明細書中に記載の改変ｒＡＡＶ６ベクターを投与することを含む、被験体に導入遺伝子を送達する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】図１は、ＡＡＶ６−ＡＤＫ６  ＦＡｂ複合体のＣｒｙｏ−ＥＭおよび画像再構成。図１Ａは、ＡＡＶ６−ＡＤＫ６キャプシド−ＦＡｂ複合体のクライオ電子顕微鏡写真の例。キャプシド表面からの突起は、ＦＡｂ装飾を示す。図１Ｂは、ＡＡＶ６−ＡＤＫ６構造について分解能に対してプロットしたフーリエシェル相関（ＦＳＣプロット）。ＦＳＣ０．５および０．１４３での推定分解能はそれぞれ１６および１３Åである。図１Ｃは、正二十面体の２回軸に沿って表示したクライオ電子顕微鏡により再構成されたＡＡＡＶ６−ＡＤＫ６  Ｆａｂ複合体構造の表面密度図。キャプシド密度をＦＡｂと共に示す。右：複合体の密度地図の拡大画像およびキャプシド（灰色）およびＦＡｂ（桃色）の合体させた擬似原子モデル。残基Ｋ５３１を青色で示し、ラベリングしている。図１Ｄは、ＡＡＶ６キャプシド表面の画像（灰色）であって、それぞれ、推定ＦＡｂ接触残基を鮮桃色で示し、閉鎖残基（テキスト中に定義の通り）を淡桃色で示し、閉鎖領域内のＫ５３１およびＬ５８４を青色（塩基性）および黄色（疎水性）で示している。１つの５回軸および２つの３回軸（その間に１つの２回軸を含む）を境界とするウイルス非対称単位を、大きな黒色の三角で示す。２、３、および５回軸を、それぞれ、楕円形、三角形、および五角形で示す。図１Ｅは、ウイルス非対称単位内の残基の二次元「ロードマップ」投影図。画像を、図１Ｃ〜１Ｅのパネルについて、それぞれＣｈｉｍｅｒａプログラム（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎら、２００４）、ＰｙＭｏｌプログラム（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ，２０１７）、およびＲＩＶＥＭプログラム（Ｘｉａｏ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｍａｎｎ，２００７）によって作成した。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【図１−４】同上。
【００２０】
【図２】図２は、ＷＴおよびバリアントのＡＡＶ１ベクターおよびＡＡＶ６ベクターの産生および精製。図２Ａは、ＡＡＶ１とＡＡＶ６との間で異なる表面アミノ酸＋内部残基６４２の残基の位置およびタイプ。図２Ｂは、ＷＴおよびバリアントのＡＡＶ１およびＡＡＶ６ベクターの陰性染色したＥＭ。スケールバーを、最初のＥＭ画像上に白色で示す。図２Ｃは、ＷＴおよびバリアントのＡＡＶ１およびＡＡＶ６ベクターについてｑＰＣＲによって決定した精製ベクターゲノム力価の定量。
【００２１】
【図３−１】図３は、ＡＤＫ６の結合および中和アッセイ。図３Ａは、Ｂ１（ＶＰ１／２／３共通領域のＣ末端の線状エピトープを認識する）（上）およびＡＤＫ６（ネイティブキャプシドを認識する）によって検出された変性させたＷＴおよびバリアントのＡＡＶ１およびＡＡＶ６ベクターのイムノブロット。ＡＤＫ６は、ＡＡＶ６と特異的に相互作用し、この相互作用は、変異ＡＡＶ６−Ｋ５３１Ｅで喪失されており、ＡＡＶ１−Ｅ５３１Ｋで修復されている。図３Ｂおよび図３Ｃは、ＡＤＫ６の存在下でのＡＡＶ１およびＡＡＶ６のＷＴおよびバリアントのそれぞれの中和アッセイ。形質導入を、抗体濃度ゼロでのＷＴウイルスのルシフェラーゼシグナルに対して正規化する。
【図３−２】同上。
【００２２】
【図４−１】図４は、ＡＡＶ６の機能的表面。図４Ａおよび図４Ｂは、ＡＡＶ６のそれぞれキャプシド表面および二次元「ロードマップ」投影。それぞれ塩基性残基、極性残基、および疎水性残基についてのＳＩＡおよびＨＳ受容体結合残基を示す。図１と同様にウイルス非対称単位を示す。パネル図４Ａおよび図４Ｂの画像を、それぞれＰｙＭｏｌプログラム（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ，２０１７）およびＲＩＶＥＭプログラム（Ｘｉａｏ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｍａｎｎ，２００７）で作成した。
【図４−２】同上。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の実施形態を、本発明の代表的な実施形態を示す添付の図面を参照してここに説明する。しかし、本発明を異なる形態で具体化することができ、本発明が本明細書中に記載の実施形態に制限されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態を提供することで、本開示が完璧かつ完全となり、本発明の範囲が当業者に完全に伝達される。
【００２４】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。本発明の説明で使用される用語法は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明が制限されることを意図しない。本明細書中で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。
【００２５】
本発明の説明および添付の実施形態で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数形も含まれることを意図する。
【００２６】
また、本明細書中で使用される場合、「および／または」は、１またはそれを超える列挙された関連する項目のありとあらゆる可能な組み合わせを指し、かつ包含し、ならびに、選択肢（「または」）で解釈されるときの組み合わせの欠如を指し、かつ包含する。
【００２７】
さらに、本発明の化合物または薬剤の量、用量、時間、および温度などの測定可能な値について言及する場合に本明細書中で使用される用語「約」は、指定した量の＋／−２０％、＋／−１０％、＋／−５％、＋／−１％、＋／−０．５％、さらに＋／−０．１％の変動を含むことを意味する。
【００２８】
本明細書中で使用される用語「向性」は、一定の細胞または組織へのウイルスの優先的侵入、必要に応じたその後の細胞内でのウイルスゲノムによって運搬された配列（複数可）の発現（例えば、組換えウイルスについては、目的の異種核酸（複数可）の発現）（例えば、転写および、必要に応じて、翻訳）を指す。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「全身向性」および「生体内分布」は、本発明のウイルスキャプシドまたはベクターが全身の組織（例えば、脳、肺、骨格筋、心臓、肝臓、腎臓、および／または膵臓）に向性を示し、形質導入することができることを示す。本発明の一定の実施形態では、中枢神経系（例えば、脳、神経細胞など）の全身形質導入が認められる。他の実施形態では、心筋組織の全身形質導入が達成される。本明細書中の一定の実施形態では、改変ベクターは、異なる全身向性または異なる生体内分布プロフィールを示し得、改変されていない親ウイルスと比較して特定の組織での形質導入が増強された選択的向性を示し得る。一定の実施形態では、生体内分布プロフィールは実質的に同一であるが、ベクターを受け入れた一定の組織で形質導入が増強される。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「選択的向性」または「特異的向性」は、一定の標的細胞および／または一定の組織へのウイルスベクターの送達および／または特異的形質導入を意味する。１つの実施形態では、改変ベクターは、親ウイルスと異なる選択的向性を示す。
【００３１】
別段の指示がない限り、「効率的向性」または類似の用語を、適切な対照を参照して決定することができる（例えば、それぞれ対照（非改変ウイルスベクター）の形質導入または向性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、またはそれを超える）。
【００３２】
一定の実施形態では、改変ベクターが、適切な対照（非改変親ベクターなど）を参照して、標的組織に対して「効率的に形質導入しない」または「効率的向性を持たない」または類似の用語である。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、肝臓、腎臓、生殖腺、および／または生殖細胞に対して効率的に形質導入しない（すなわち、効率的向性を持たない）。特定の実施形態では、組織（複数可）（例えば、生殖細胞、肝臓など）への望ましくない形質導入は、所望の標的組織（複数可）（例えば、骨格筋、横隔膜筋、心筋、および／または中枢神経系の細胞など）の形質導入レベルの９０％未満、または８０％未満、または６０％未満、または５０％未満、２０％またはそれ未満、１０％またはそれ未満、５％またはそれ未満である。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、組換えパルボウイルスによる細胞の「形質導入」は、パルボウイルス粒子への核酸の組み込みおよびその後のＤＮＡを転写することができる細胞への移入による細胞への遺伝子材料の移入を指す。
【００３４】
別段の指示がない限り、「形質導入の増強」は、表示のベクターの改変前の親ｒＡＡＶベクターと比較した統計的に有意な量の形質導入の増加を指す。
【００３５】
同様に、別段の指示がない限り、「形質導入の減少」は、表示のベクターの改変前の親ｒＡＡＶベクターと比較した統計的に有意な量の形質導入の減少を指す。「形質導入の中和の減少」は、中和抗体（例えば、ＡＤＫ６またはＡＤＫ１など）によって示される形質導入阻害の減少を指す。減少は、中和抗体（すなわち、例えば抗血清の）存在下で非改変ｒＡＡＶ６を用いて認められる形質導入の阻害と比較して統計的に有意な量の減少である。したがって、形質導入阻害の減少は、中和抗体または特定の抗血清の存在下での親ベクター（非改変）と比較した中和抗体の存在下での形質導入の増強である。中和を、本明細書中に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって評価することができる。
【００３６】
用語「処置する」、「処置すること」、または「〜の処置」（およびその文法上のバリエーション）は、被験体の状態の重症度が低下するか、少なくとも部分的に改善するか、安定化すること、および／または少なくとも１つの臨床症状がいくらか緩和するか、軽減するか、低下するか、安定化すること、および／または疾患もしくは障害の進行が遅延することを意味する。
【００３７】
用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」（およびその文法上のバリエーション）は、処置を行わない場合と比較した被験体における疾患、障害、および／もしくは臨床症状（複数可）の発症の予防および／もしくは遅延、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは臨床症状（複数可）の発症の重症度の低下を指す。一定の実施形態では、予防は完全な予防（例えば、疾患、障害、および／もしくは臨床症状（複数可）が完全に存在しないこと）であり得る。予防はまた、被験体における疾患、障害、および／もしくは臨床症状（複数可）の発生ならびに／または発生の重症度が本発明の非存在下で生じる場合よりも実質的に低いような部分的な予防であり得る。
【００３８】
本明細書中で使用される「処置有効」量は、被験体にいくらかの改善または利益をもたらすのに十分な量である。他で言及される「処置有効」量は、被験体における少なくとも１つの臨床症状をいくらか緩和、軽減、低下、または安定化させる量である。当業者は、被験体にいくらか有益である限り、治療効果は完全であったり治癒的であったりする必要がないことを認識する。一定の実施形態では、処置は治癒的ではない。
【００３９】
本明細書中で使用される「予防有効」量は、本発明の方法の非存在下で生じる場合と比較して、被験体における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発症を予防および／もしくは遅延させ、ならびに／または被験体における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発症の重症度を低下および／もしくは遅延させるのに十分な量である。当業者は、被験体にいくらか予防上有益である限り、予防レベルは完全である必要がないと認識する。
【００４０】
「異種ヌクレオチド配列」または「異種核酸」は、ウイルス中に天然に存在しない配列である。１つの実施形態では、異種核酸は、治療ポリペプチドをコードする読み取り枠を含む。１つの実施形態では、異種核酸配列は、非コードＤＮＡまたはＲＮＡである。１つの実施形態では、異種核酸は、目的の非翻訳治療ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡまたは小さいヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、もしくはリボザイム、またはそのフラグメント（すなわち、例えば、ＣＲＩＳＰＥＲ編集のためのｓｇＲＮＡまたは他の遺伝子編集分子（例えば、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ））をコードする。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の方法および組成物は、ＣＲＩＳＰＲｉ（ＣＲＩＳＰＲ干渉）システムおよび／もしくはＣＲＩＳＰＲａ（ＣＲＩＳＰＲ活性化）システムを含むことができ、ならびに／またはこれらを宿主細胞に送達させるために使用することができる。ＣＲＩＳＰＲｉシステムおよびＣＲＩＳＰＲａシステムは、二本鎖切断（ＤＳＢ）できない不活化ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を含む。
【００４１】
ＣＲＩＳＰＲａは、さらなる転写活性化ドメインを動員するｇＲＮＡをさらに含むことができる。ＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａのためのｓｇＲＮＡ設計は、当該分野で公知である（例えば、Ｈｏｒｌｂｅｃｋら．ｅＬｉｆｅ．５，ｅ１９７６０（２０１６）；Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｃｅｌｌ．１５９，６４７−６６１（２０１４）；およびＺａｌａｔａｎら、Ｃｅｌｌ．１６０，３３９−３５０（２０１５）（それぞれその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。所与の標的のためのＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａ適合ｓｇＲＮＡを商業的に入手することもできる（例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ；Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯを参照のこと）。ＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａのさらなる説明は、例えば、Ｑｉら、Ｃｅｌｌ．１５２，１１７３−１１８３（２０１３）；Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｃｅｌｌ．１５４，４４２−４５１（２０１３）；Ｃｈｅｎｇら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３，１１６３−１１７１（２０１３）；Ｔａｎｅｎｂａｕｍら．Ｃｅｌｌ．１５９，６３５−６４６（２０１４）；Ｋｏｎｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ．５１７，５８３−５８８（２０１５）；Ｃｈａｖｅｚら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１２，３２６−３２８（２０１５）；Ｌｉｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５５（２０１７）；およびＧｏｙａｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１６）（それぞれその全体が本明細書中で参考として援用される）で見出され得る。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」または「遺伝子送達ベクター」は、核酸送達ビヒクルとして機能するウイルス粒子を指し、ベクターゲノム（例えば、ＡＡＶキャプシド内にパッケージングされたウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ））を含む。あるいは、いくつかの文脈において、用語「ベクター」は、ベクターゲノム／ｖＤＮＡのみを指すために使用され得る。
【００４３】
「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、１またはそれを超える異種ヌクレオチド配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、一般に、ウイルスを生成するのにシスに作用する１４５塩基の末端反復（複数可）（ＴＲ（複数可））のみを必要とする。全ての他のウイルス配列は不必要であり、トランスに供給され得る（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージングされ得る導入遺伝子のサイズを最大にするために最小のＴＲ配列（複数可）のみを保持する。構造タンパク質および非構造タンパク質をコードする配列は、（例えば、プラスミドなどのベクターから、またはパッケージング細胞内への配列の安定な組み込みによって）トランスに提供され得る。ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ  ＴＲ配列、合成ＴＲ配列、または他のパルボウイルスＴＲ配列）、必要に応じて２つのＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ  ＴＲ）を含み、ＴＲ配列は、典型的には、異種ヌクレオチド配列（複数可）の５’末端および３’末端に存在するであろうが、これらの末端に連続している必要はない。ＴＲは、相互に同一であり得るか、異なり得る。
【００４４】
用語「末端反復」または「ＴＲ」には、ヘアピン構造を形成し、逆位末端配列（Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，４７８，７４５号に記載の「二重Ｄ配列」など）として機能する任意のウイルス末端反復および合成配列が含まれる。自律パルボウイルスおよびＡＡＶのキャプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ  Ｎ．ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章および７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）にさらにより詳細に記載されている。ＡＡＶ２（Ｘｉｅら、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１０４０５−１０）、ＡＡＶ４（Ｐａｄｒｏｎら、（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７−５８）、ＡＡＶ５（Ｗａｌｔｅｒｓら、（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：３３６１−７１）、ならびにＣＰＶ（Ｘｉｅら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：４９７−５２０およびＴｓａｏら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１４５６−６４）の結晶構造の記載も参照のこと。
【００４５】
「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ  ＴＲ」は、任意のＡＡＶ（血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１が含まれるが、これらに限定されない）または現在公知であるか、後に発見される任意の他のＡＡＶに由来し得る。少なくとも１つの末端反復が所望の機能（例えば、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、および／またはプロウイルスレスキューなど）を媒介する（機能的ＴＲ）限り、ＡＡＶ末端反復は、野生型末端反復配列を有する必要はない（例えば、野生型配列を、挿入、欠失、短縮、またはミスセンス変異によって変化させることができる）。当業者は、機能的ＴＲの複製で機能を果たすＲｅｐタンパク質を選択することを理解している。
【００４６】
本発明の方法で使用される改変ｒＡＡＶ６ベクターはまた、例えば、国際特許出願ＷＯ００／２８００４号；ＷＯ０３／０８９６１２号；およびＣｈａｏら、（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：６１９（これらの開示全体が本明細書中で参考として援用される）に記載の「ハイブリッド」パルボウイルス（例えば、ｒＡＡＶゲノムが本明細書中に記載のＡＡＶキャプシドタンパク質と異なるパルボウイルスまたは血清型に由来する）であり得る。
【００４７】
本発明の方法で使用される改変ウイルスベクターは、さらに、国際特許出願ＷＯ０１／９２５５１号（その開示全体が本明細書中で参考として援用される）に記載の二本鎖パルボウイルス粒子であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、異種核酸を保有する二本鎖（二重鎖）ゲノムを、本発明のウイルスキャプシド中にパッケージングすることができる。
【００４８】
本明細書中で使用される用語「〜を含むこと」または「〜を含む」は、本発明に不可欠である組成物、方法、およびその各成分（複数可）に関して使用されるが、不可欠であるかどうかに無関係に不特定の要素を含む余地がある。
【００４９】
本明細書中で使用される用語「〜から本質的になる」は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、本発明の実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。
【００５０】
用語「〜からなる」は、実施形態の記載において引用されていないいかなる要素も排除した、本明細書中に記載の組成物、方法、およびその各成分を指す。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、コード配列の発現に必要とされる制御配列が、コード配列に関してＤＮＡ分子内のコード配列の発現に適切な位置に配置されていることを意味する。この同一の定義は、時折、発現ベクター内のコード配列および転写調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、および終結エレメント）の配置に適用される。
【００５２】
例えば、２６２〜２７２；３８２〜３８６、４４５〜４５７、４５９、４６９〜４７３、４８８〜４８９、４９４〜４９６、４９９〜５１５、５７１〜５７９、５８４〜５８９、および５９３〜５９５（ＶＰ１  ＡＡＶ６のアミノ酸）からなる群から選択されるアミノ酸の１またはそれを超える改変領域内にアミノ酸置換を含む改変ｒＡＡＶ６ベクターを本明細書中に提供する。これらの各領域内のアミノ酸置換（複数可）は、前述の領域内に存在する全ての位置の置換を任意の組み合わせで含むことができるか、全てより少ない位置の任意の組み合わせで含むことができ、例えば、それにより、それぞれ、アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５．．．などが得られ（領域内のアミノ酸数に依存する）、ここで、Ｘは、配列番号１（野生型ＡＡＶ６のＶＰ１）の位置に通常は存在するアミノ酸以外の２０のアミノ酸の任意のアミノ酸である。
【００５３】
アミノ酸置換（例えば、Ｓ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｈ２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、およびＴ５８９（ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリング）からなる群から選択される１またはそれを超えるアミノ酸残基の置換）を含むｒＡＡＶ６ベクターも本明細書中に提供し、ここで、前述のｒＡＡＶ６ベクターは、肝臓を形質導入し、前述の１またはそれを超える置換を欠くｒＡＡＶ６ベクターと比較して、ＡＤＫ６抗体による肝臓の形質導入の中和を減少させた。改変ｒＡＡＶ６ベクターは、これらの位置の各々の置換を任意の組み合わせで含むことができるか、全てより少ない位置の任意の組み合わせで含むことができ、例えば、それにより、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７…またはそれ未満のアミノ酸配列、例えば、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６；Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５；Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４；Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｘ１−Ｘ２；またはＸ１が得られ、ここで、Ｘは、配列番号１（野生型ＡＡＶ６のＶＰ１）の位置に通常は存在するアミノ酸以外の任意のアミノ酸である。
【００５４】
したがって、アミノ酸置換は、保存的または非保存的アミノ酸置換であり得る。一定の実施形態では、アミノ酸置換は、非天然アミノ酸のアミノ酸置換であり得る。
【００５５】
本発明の実施形態のウイルスキャプシドおよびｒＡＡＶ６ウイルスベクターを、当該分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、バキュロウイルス（Ｂｒｏｗｎら、（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９８：４７７−４８８）または哺乳動物細胞からの発現によって産生することができる。
【００５６】
本発明の実施形態のｒＡＡＶ６キャプシドタンパク質の改変は、「選択的」改変である。このアプローチは、ＡＡＶ血清型の間でサブユニットの全体または大ドメインを交換する以前の研究とは対照的である（例えば、国際特許出願ＷＯ００／２８００４号およびＨａｕｃｋら、（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７７：２７６８−２７７４を参照のこと）。特定の実施形態では、「選択的」改変により、特定の領域（例えば、２６２〜２７２；３８２〜３８６、４４５〜４５７、４５９、４６９〜４７３、４８８〜４８９、４９４〜４９６、４９９〜５１５、５７１〜５７９、５８４〜５８９、および５９３〜５９５（ＶＰ１  ＡＡＶ６のアミノ酸）内の約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または３個未満の連続するアミノ酸の置換がもたらされる。一定の実施形態では、特定の領域内の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、または全てのアミノ酸が置換される。１つの実施形態では、アミノ酸領域は、２６９〜２７２；４４５〜４５０；４６９〜４７１；４９３；５０１〜５１５；５８４〜５８７（ＶＰ１  ＡＡＶ６ナンバリング）からなる群から選択される。選択された改変には、１またはそれを超える特定のアミノ酸領域、ならびにＳ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｈ２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、およびＴ５８９（ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリング）での１またはそれを超える単一のアミノ酸置換が含まれ得る。本明細書中に記載のように、本発明の実施形態の選択された改変により、ＡＤＫ６抗体による中和を減少させ、肝臓の有意な形質導入を保持する；これは肝臓向性である。
【００５７】
本発明の１つの態様では、ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応するＳ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｈ２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、およびＴ５８９からなる群から選択される１またはそれを超えるアミノ酸残基での置換を含む改変組換えＡＡＶ６ベクターであって、前述のｒＡＡＶ６ベクターは、肝臓を形質導入し、前述の１またはそれを超える置換を欠くｒＡＡＶ６ベクターと比較して、ＡＤＫ６抗体による肝臓の形質導入の中和を減少させた、改変組換えＡＡＶ６ベクターを提供する。１つの実施形態では、改変ＡＡＶ６ベクターはまた、アミノ酸５３１（ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリング）にリジン（Ｋ）を含む。１つの実施形態では、改変ＡＡＶ６ベクターは、ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応するアミノ酸５３１にアルギニン（R）を含む。アミノ酸５３１にＫまたはＲが存在する一定の実施形態では、１またはそれを超えるアミノ酸のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つが置換されている。上記の一定の実施形態では、１またはそれを超える置換は、保存的アミノ酸置換を含む。一定の実施形態では、１またはそれを超える置換は、非保存的置換を含む。
【００５８】
本明細書中に記載の１つの実施形態では、改変ｒＡＡＶ６ベクターは、ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応する２６２〜２７２；３８２〜３８６、４４５〜４５７、４５９、４６９〜４７３、４８８〜４８９、４９４〜４９６、４９９〜５１５、５７１〜５７９、５８４〜５８９、および５９３〜５９５からなる群から選択されるアミノ酸の１またはそれを超える改変領域をさらに含み、ここで、１またはそれを超える改変領域中の少なくとも１またはそれを超えるアミノ酸が置換されている。配列番号１はＡＡＶ６  ＶＰ１を示す。したがって、ＡＡＶ６  ＶＰ１に対応するＳ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｉ−１２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、Ｔ５８９、およびＫ５３１またはＲ５３１は、それぞれ、配列番号１のＳ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｈ２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、Ｔ４８９および、ＫまたはＲ５３１である。
【００５９】
別の態様では、（ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応する）２６２〜２７２；３８２〜３８６、４４５〜４５７、４５９、４６９〜４７３、４８８〜４８９、４９４〜４９６、４９９〜５１５、５７１〜５７９、５８４〜５８９、および５９３〜５９５からなる群から選択されるアミノ酸の１またはそれを超える改変領域を含む改変ｒＡＡＶ６ベクターであって、ここで、１またはそれを超える改変領域中の少なくとも１またはそれを超えるアミノ酸が置換されており、ｒＡＡＶ６ベクターは、肝臓を形質導入し、１またはそれを超える置換を欠くｒＡＡＶ６ベクターと比較して、ＡＤＫ６抗体による肝臓の形質導入の中和を減少させた、改変ｒＡＡＶ６ベクターを提供する。
【００６０】
別では、（ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応する）２６９〜２７２；４４５〜４５０；４６９〜４７１；４９３；５０１〜５１５；５８４〜５８７からなる群から選択されるアミノ酸の１またはそれを超える改変領域を含む改変ｒＡＡＶ６ベクターであって、ここで、１またはそれを超える改変領域中の少なくとも１またはそれを超えるアミノ酸が置換されており、ｒＡＡＶ６ベクターは、肝臓を形質導入し、１またはそれを超える置換を欠くｒＡＡＶ６ベクターと比較して、ＡＤＫ６抗体による肝臓の形質導入の中和を減少させた、改変ｒＡＡＶ６ベクターを提供する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のいずれかの態様では、改変ｒＡＡＶ６ベクターは、Ｋ５３１、またはＲ５３１を含む。
【００６２】
本明細書中に記載の各態様のいくつかの実施形態では、改変ｒＡＡＶ６ベクターは、Ｎ４４７、Ｓ４７２、Ｖ４７３、Ｎ５００、Ｔ５０２、およびＷ５０３からなる群から選択される、シアル酸に結合する１またはそれを超えるアミノ酸の置換をさらに含む。
【００６３】
本発明の改変キャプシドタンパク質およびキャプシドは、現在知られているか、その後に同定される任意の他の改変（例えば、ターゲティングペプチド）をさらに含むことができる。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のキャプシドタンパク質、ウイルスキャプシド、またはベクターは、本発明のキャプシドタンパク質、ウイルスキャプシド、またはベクターが由来するＡＡＶ６の形質導入効率と比較して形質導入効率が等価であり得るか増強され得る。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のキャプシドタンパク質、ウイルスキャプシド、またはベクターは、本発明のキャプシドタンパク質、ウイルスキャプシド、またはベクターが由来するＡＡＶ６の形質導入効率と比較して形質導入効率が低下し得る。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のキャプシドタンパク質、ウイルスキャプシド、またはベクターは、本発明のキャプシドタンパク質、ウイルスキャプシド、またはベクターが由来するＡＡＶ血清型の向性と比較して向性が等価であり得るか増強され得る。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のキャプシドタンパク質、ウイルスキャプシド、またはベクターは、本発明のキャプシドタンパク質、ウイルスキャプシド、またはベクターが由来するＡＡＶ６の向性と比較して向性が変化し得るか、異なり得る。
【００６５】
本発明の方法で使用される改変ｒＡＡＶベクターは、異種核酸が被験体に送達されたときに疾患に関して治療効果を有する異種核酸（例えば、導入遺伝子、または遺伝子編集核酸）をさらに含むことができる。治療核酸を、プロモーター（構成性、細胞特異性、または誘導性）に作動可能に連結することができる。この様式では、治療核酸を被験体においてｉｎ  ｖｉｖｏで産生することができる。被験体が核酸産物を欠くので、または被験体内での治療核酸の産生がいくらかの治療効果を付与するので、治療核酸を必要とする被験体を選択することができる。
【００６６】
当業者は、本明細書中に記載の方法および当業者に周知の方法を使用して、目的の任意の治療異種核酸を保有するｒＡＡＶベクターを容易に構築することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９）を参照のこと）。種々の遺伝子のヌクレオチドおよびタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド配列は以前に開示されており、当業者に公知のコンピュータ化されたデータベースに見出すことができる。かかるデータベースの１つは、国立生物工学情報センターのＧｅｎｂａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。これらの公知の遺伝子のコート領域を、増幅させ、本明細書中に開示のｒＡＡＶ核酸テンプレートにクローン化することができる。１つの実施形態では、異種核酸は、治療ポリペプチドをコードする。本発明の実施形態はまた、改変ベクターの投与によって疾患を処置または予防する方法に関する。
【００６７】
改変パルボウイルスベクターはまた、宿主染色体上の遺伝子座との相同性を共有し、かつこの遺伝子座を組換える異種ヌクレオチド配列を含み得る。このアプローチを、例えば、宿主細胞における遺伝的欠陥を修正するために利用することができる。当業者は、目的の異種ヌクレオチド配列（複数可）が適切な調節配列と作動可能に関連し得ることを理解するであろう。例えば、異種核酸は、発現調節エレメント（転写／翻訳調節シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、およびエンハンサーなど）と作動可能に関連し得る。誘導性発現調節エレメントは、異種核酸配列（複数可）の過剰発現を制御することが望まれる適用において好ましい。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的プロモーター／エンハンサーエレメントであり得、平滑筋に特異的なもの（例えば、血管平滑筋細胞特異的）および内皮細胞に特異的なもの（例えば、血管内皮細胞特異的）が含まれる。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントには、ホルモン誘導性エレメントおよび金属誘導性エレメントが含まれる。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントには、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６−誘導性プロモーター、エクジソン−誘導性プロモーター、ラパマイシン−誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーター、ＦＫ５０６、またはＦＫ１０１２が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
ベクターの産生
【００６９】
組換えベクターの産生方法は、当業者に周知である。別段の指示がある場合を除き、当業者に公知の標準的な方法を、ｒＡＡＶ構築物、改変キャプシドタンパク質ＤＮＡ配列（ｃａｐ）、ＡＡＶのｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列を発現するパッケージングベクター、一過性および安定にトランスフェクトされたパッケージング細胞の構築のために使用することができる。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）；Ｆ．Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬら．ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。さらなる代替法として、本発明の改変ｒＡＡＶ−２ウイルスベクターを、例えば、Ｕｒａｂｅら、（２００２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３：１９３５−４３に記載のようにｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶテンプレートを送達させるためにバキュロウイルスベクターを使用して、昆虫細胞中に産生することができる。
【００７０】
例えば、ｒＡＡＶについて、ｒＡＡＶベクターを、ｉ）異種核酸配列および少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ  ＴＲ配列）を含む核酸テンプレートおよびｉｉ）核酸テンプレートの複製およびＡＡＶキャプシドへのキャプシド形成に十分なＡＡＶ配列（例えば、本明細書中に記載の改変ＡＡＶキャプシドをコードするＡＡＶｒｅｐ配列およびＡＡＶｃａｐ配列）を細胞に提供することによって産生することができる。核酸テンプレートは、少なくとも１つの機能的ＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含むことができ、異種核酸配列（複数可）の５’および３’側に存在するが、それらはそれに直接隣接している必要はない２つのＩＴＲに複製することができる。
【００７１】
核酸テンプレートならびにＡＡＶのｒｅｐ配列およびｃａｐ配列を、改変レトロウイルス（例えば、ＡＡＶまたは他のパルボウイルス）キャプシド内にパッケージングされた核酸テンプレートを含む組換えウイルスベクターが細胞内で産生されるような条件下で（例えば、ヘルパー機能の存在下で、例えば、ＡｄまたはＨＳＶ）提供する。ウイルスベクターを、培地から回収し、および／または細胞の溶解によって回収することができる。
【００７２】
当該分野で公知の任意の適切な細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞など）を産生のために使用することができる。
【００７３】
本発明の組換え核酸および／またはウイルスベクターに異なる特徴を付与するために、ＴＲを改変すること（例えば、短縮すること、置換、欠失、付加によって変異させることなど）ができる。例えば、類似のベクターの増殖（propagation）、パッケージング、および形質導入の機能を提供する非ＡＡＶ末端反復配列（他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ−１９）の非ＡＡＶ末端反復配列）を、本発明のベクターで使用することができる。本発明のいくつかの実施形態では、ＴＲを、非ＡＡＶ末端反復配列部分で改変することができる。本発明の他の実施形態では、ＴＲを、ＳＶ４０複製起点としての機能を果たすＳＶ４０ヘアピン配列などの非パルボウイルス末端反復で置換することができる。これらは、改変ＴＲの限定された例のみを表し、他のかかる改変が当業者に公知である。
【００７４】
治療核酸
【００７５】
本明細書中に記載の改変ベクターを、目的の治療異種核酸（例えば、治療用の導入遺伝子または非コード核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ））をコードするベクターの組織への投与による処置または予防に感受性を示す任意の疾患の処置のために使用することができる。遺伝子療法に適切な導入遺伝子は、当業者に周知である。例えば、本明細書中に記載の変化したベクターは、導入遺伝子を送達および使用することができる（米国特許第６，５４７，０９９；６，５０６，５５９号；および同第４，７６６，０７２号；米国特許出願公開第２００２０００６６６４号；同第２００３０１５３５１９号；同第２００３０１３９３６３号；ならびにＰＣＴ公開出願ＷＯ０１／６８８３６号およびＷＯ０３／０１０１８０号に記載の導入遺伝子、ならびに、例えば、ＷＯ２０１７／１５２１４９号のｍｉＲＮＡおよび他の導入遺伝子（これらの各々全体が本明細書中で参考として援用される）が含まれるが、これらに限定されない）。
【００７６】
１つの実施形態では、治療導入遺伝子は、成長因子、インターロイキン、インターフェロン、抗アポトーシス因子、サイトカイン、抗糖尿病因子、抗アポトーシス因子、凝固因子，および抗腫瘍因子（例えば、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、Ｇ−ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴナドトロピン、ＩＦＮ、ＩＦＧ−１、Ｍ−ＣＳＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＥＤＦ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−Ｂ２、ＴＮＦ、プロラクチン、ソマトトロピン、ＸＩＡＰ１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０（１８７Ａ）、ウイルスのＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６  ＩＬ−１７、およびＩＬ−１８）からなる群から選択される。
【００７７】
１つの実施形態では、治療異種核酸は、遺伝子の発現の欠如または機能障害に関連する。例えば、治療導入遺伝子および関連する病態の例を以下に列挙する；グルコース−６−ホスファターゼ（グリコーゲン貯蔵欠損症１Ａ型に関連）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Ｐｅｐｃｋ欠損症に関連）；ガラクトース−１リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ガラクトース血症に関連）；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（フェニルケトン尿症に関連）；分枝鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（カエデシロップ尿症に関連）；フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（チロシン血症１型に関連）；メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（メチルマロン酸血症に関連）；中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（中鎖アセチルＣｏＡ欠損症に関連）；オルニチントランスカルバミラーゼ（オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症に関連）；アルギニノコハク酸シンテターゼ（シトルリン血症に関連）；低密度リポタンパク質受容体タンパク質（家族性高コレステロール血症に関連）；ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｃｏｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（クリグラー・ナジャー病に関連）；アデノシンデアミナーゼ（重症複合型免疫不全症に関連）；ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（痛風およびレッシュ・ナイハン症候群（Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙａｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）に関連）；ビオチニダーゼ（ビオチニダーゼ欠損症に関連）；β−グルコセレブロシダーゼ（ゴーシェ病に関連）；β−グルクロニダーゼ（スライ症候群に関連）；ペルオキシソーム膜タンパク質７０ｋＤａ（ツェルウェーガー症候群に関連）；ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（急性間欠性ポルフィリン症に関連）；α−１抗トリプシン（α−１アンチトリプシン欠損症（気腫）の処置用）；エリスロポエチン（サラセミアまたは腎不全に起因する貧血の処置用）；血管内皮成長因子、アンギオポエチン−１、および線維芽細胞成長因子（虚血性疾患の処置用）；トロンボモジュリンおよび組織因子経路阻害剤（例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症、または塞栓症で認められる閉塞血管の処置用）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（パーキンソン病の処置用）；βアドレナリン作動性受容体、ホスホランバンのアンチセンスまたは変異体形態、筋小胞体（小胞体）アデノシントリホスファターゼ−２（ＳＥＲＣＡ２）、および心臓アデニリルシクラーゼ（鬱血性心不全の処置用）；ｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子（種々のがんの処置用）；種々のインターロイキンのうちの１つなどのサイトカイン（炎症性障害および免疫障害およびがんの処置用）；ジストロフィンまたはミニジストロフィンおよびユートロフィンまたはミニユートロフィン（筋ジストロフィの処置用）；およびインスリン（糖尿病の処置用）。
【００７８】
１つの実施形態では、治療異種核酸は、ＣＮＳに関連する疾患または障害に関連する遺伝子（例えば、ＤＲＤ２、ＧＲＩＡｌ、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＮ１、ＳＬＣｌＡｌ、ＳＹＰ、ＳＹＴｌ、ＣＨＲＮＡ７、３Ｒｔａｕ／４ｒＴＵＳ、ＡＰＰ、ＢＡＸ、ＢＣＬ−２、ＧＲＩＫ１、ＧＦＡＰ、ＩＬ−１、ＡＧＥＲ（アルツハイマー病に関連）；ＵＣＨ−Ｌ１、ＳＫＰ１、ＥＧＬＮ１、Ｎｕｒｒ−１、ＢＤＮＦ、ＴｒｋＢ、ｇｓｔｍｌ、Ｓ１０６ｐ（パーキンソン病に関連）；ＩＴ１５、ＰＲＮＰ、ＪＰＨ３、ＴＢＰ、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、アトロフィン１、ＦＴＬ、ＴＩＴＦ−１（ハンチントン病に関連）；ＦＸＮ（フリードライヒ運動失調症（Ｆｒｅｉｄｒｉｃｈ’ｓ  ａｔａｘｉａ）に関連）；ＡＳＰＡ（カナヴァン病に関連）；ＤＭＤ（筋ジストロフィに関連）；およびＳＭＮ１、ＵＢＥ１、ＤＹＮＣ１Ｈ１（脊髄性筋萎縮症に関連））である。
【００７９】
１つの実施形態では、治療異種核酸は、心血管系に関連する疾患または障害に関連する遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＳＤＦ−１、コネキシン４０、コネキシン４３、ＳＣＮ４ａ、ＨＩＦｌａ、ＳＥＲＣａ２ａ、ＡＤＣＹ１、およびＡＤＣＹ６）である。
【００８０】
１つの実施形態では、治療異種核酸は、肺系に関連する疾患または障害に関連する遺伝子（ＣＦＴＲ、Ａ  ＡＴ、ＴＮＦａ、ＴＧＦｐｌ、ＳＦＴＰＡ１、ＳＦＴＰＡ２、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣ、ＨＰＳ１、ＨＰＳ３、ＨＰＳ４、ＡＤＴＢ３Ａ、ＩＬＩＡ、ＩＬ１Ｂ、ＬＴＡ、ＩＬ６、ＣＸＣＲ１、およびＣＸＣＲ２）である。
【００８１】
１つの実施形態では、治療異種核酸は、肝臓に関連する疾患または障害に関連する遺伝子（例えば、ａｌ−ＡＴ、ＨＦＥ、ＡＴＰ７Ｂ、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ＦＡＨ）、グルコース−６−ホスファターゼ、ＮＣＡＮ、ＧＣＫＲ、ＬＹＰＬＡＬ１、ＰＮＰＬＡ３、レシチンコレステロールアセチルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、およびＧ６ＰＣ）である。
【００８２】
１つの実施形態では、治療異種核酸は、腎臓に関連する疾患または障害に関連する遺伝子（例えば、ＰＫＤ１、ＰＫＤ２、ＰＫＨＤ１、ＮＰＨＳ１、ＮＰＨＳ２、ＰＬＣＥ１、ＣＤ２ＡＰ、ＬＡＭＢ２、ＴＲＰＣ６、ＷＴ１、ＬＭＸ１Ｂ、ＳＭＡＲＣＡＬ１、ＣＯＱ２、ＰＤＳＳ２、ＳＣＡＲＢ３、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ４Ａ６、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＦＯＸ１Ｃ、ＲＥＴ、ＵＰＫ３Ａ、ＢＭＰ４、ＳＩＸ２、ＣＤＣ５Ｌ、ＵＳＦ２、ＲＯＢ０２、ＳＬＩＴ２、ＥＹＡ１、ＭＹＯＧ、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＦＲＡＳ１、ＦＲＥＭ２、ＧＡＴＡ３、ＫＡＬＩ、ＰＡＸ２、ＴＣＦ２、およびＳＡＬＬ１）である。
【００８３】
１つの実施形態では、治療異種核酸は、眼に関連する疾患または障害または眼疾患に関連する遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＣＥＰ２９０、ＣＦＨ、Ｃ３、ＭＴ−ＮＤ２、ＡＲＭＳ２、ＴＩＭＰ３、ＣＡＭＫ４、ＦＭＮ１、ＲＨＯ、ＵＳＨ２Ａ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＴＭＣＯ、ＳＩＸ１、ＳＩＸ６、ＬＲＰ１２、ＺＦＰＭ２、ＴＢＫ１、ＧＡＬＣ、ミオシリン、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、オプチニューリン、およびＣＤＫＮ２Ｂ）である。
【００８４】
１つの実施形態では、治療異種核酸は、血液、例えば、赤血球、例えば、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）に関連する疾患または障害に関連する遺伝子である。
【００８５】
１つの実施形態では、治療異種核酸は、アポトーシスに関連する遺伝子である。
【００８６】
１つの実施形態では、治療異種核酸は、腫瘍抑制因子である。
【００８７】
したがって、異種治療ヌクレオチド配列を保有する本明細書中に記載の改変ベクターを投与することを含む、疾患を処置する方法を本明細書中に提供する。処置すべき疾患の非限定的な例には、例えば、軟骨無形性症、色盲、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ番号１０２７００）、副腎白質ジストロフィ、エカルディ症候群、α−１アンチトリプシン欠損症、αサラセミア、アンドロゲン不応症候群、アペール症候群、不整脈原性右心室異形成、毛細血管拡張性運動失調（ataxia telangictasia）、バルト症候群、βサラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナヴァン病、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉性形成異常、ファンコニー貧血、進行性骨化性線維形成異常（ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症（ｇａｌａｃｔｏｓｅｍｉｓ）、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、ヘモクロマトーシス、β−グロビンの６番目のコドンのヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ血症、クラインフェルター症候群（Ｋｌｉｎｅｆｌｅｔｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、クラッベ病、ランガー・ギーディオン症候群、白血球接着不全（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ番号１１６９２０）、白質ジストロフィ、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖体沈着症（ＭＰＳ）、爪・膝蓋骨症候群、腎性尿崩症（ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎｓｉｐｄｉｕｓ）、神経線維腫症、ニーマン・ピック病（Ｎｅｉｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  ｄｉｓｅａｓｅ）、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダー・ウィリ症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンスタイン・テイビ症候群、サンフィリッポ症候群、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、シュバッハマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス・マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ヴィスコット・オールドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ増殖性症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ番号３０８２４０）が含まれる。標的化組み込みによって処置することができるさらなる例示的な疾患には、後天性免疫不全、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病、およびテイ・サックス病）、ムコ多糖体沈着症（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃａｈｉｄｏｓｉｓ）（例えば、ハンター病、ハーラー病）、異常血色素症（例えば、鎌状赤血球症、ＨｂＣ、α−サラセミア、β−サラセミア）、および血友病が含まれる。
【００８８】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体に溶解または分散された有効量の１またはそれを超える改変ｒＡＡＶウイルスベクター（複数可）またはさらなる薬剤（複数可）を含む。句「薬学的にまたは薬理学的に許容され得る」は、例えば、適宜、ヒトなどの動物に投与したときに有害性、アレルギー性を示さず、他の望ましくない反応、生物学的影響を生じない分子実体および組成物を指す。
【００８９】
少なくとも１つの改変ｒＡＡＶベクターまたはさらなる有効成分を含む医薬組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０（本明細書中で参考として援用される）に例示されるように、本開示を考慮して当業者に公知である。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与については、調製物が、米国ＦＤＡのＯｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓまたは他国の等価な政府規制によって要求されるような無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の基準を満たすべきであることが理解される。
【００９０】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」には、当業者に公知のように、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩類、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素、ならびにこれらの類似の材料および組み合わせが含まれる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９−１３２９（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。いずれの従来の担体も有効成分と不適合である範囲を除いて、治療組成物または医薬組成物におけるその使用が意図される。
【００９１】
改変ｒＡＡＶベクターおよび／またはさらなる薬剤（複数可）を含む医薬組成物は、固体、液体、またはエアロゾル形態のいずれで投与されるのか、そして注射などの投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて異なるタイプの担体を活用することができる。医薬組成物を、静脈内、皮内、動脈内、移植片内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、経口、局所、局部、吸入（例えば、エアゾール吸入）、注射、注入、連続注入、標的細胞を直接浸す局所灌流（例えば、自家組織移植片において）、カテーテルを介して、洗浄（lavage）を介して、クリームで、脂質組成物で（例えば、リポソーム）、または当業者に公知であるような任意の他の方法もしくは前述の任意の組み合わせによって投与することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０を参照のこと）。
【００９２】
改変ベクターおよび／または薬剤を、遊離塩基、中性、または塩の形態で医薬組成物に製剤化することができる。薬学的に許容され得る塩には、酸付加塩（例えば、タンパク質組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、または、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル酸などの有機酸で形成されるもの）が含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは水酸化第二鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカインなどの有機塩基に由来し得る。
【００９３】
投与実行者は、日常的な手順を使用して、個別の被験体のための医薬組成物中の有効成分（複数可）の濃度および適切な用量（複数可）を決定する。一定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物（例えば、改変ｒＡＡＶベクター、治療剤）を含み得る。他の実施形態では、活性化合物は、単位の重量の約２％〜約７５％または約２５％〜約６０％（例えば、これらの間の任意の範囲）を含み得る。
【００９４】
本発明の方法の１つの態様では、異種核酸は、例えば、組織の移植または植え込みによって被験体に改変細胞を投与するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで脈管構造または脈管組織の細胞に送達される。ウイルス粒子を、標準的な形質導入法にしたがって適切な感染多重度で細胞に適切に導入することができる。投与するためのウイルスの力価は、標的細胞のタイプおよび数、ならびに特定のウイルスベクターに応じて変動し得、当業者が過度の実験を行うことなく決定することができる。１つの実施形態では、１０２感染単位、または少なくとも約１０３感染単位、または少なくとも約１０５感染単位が細胞に導入される。
【００９５】
本明細書中で使用される「治療有効」量は、被験体にいくらかの改善または利益をもたらすのに十分な量である。他で言及される「治療有効」量は、被験体における少なくとも１つの臨床症状をいくらか緩和、軽減、または低下させる量である。当業者は、被験体にいくらか有益である限り、治療効果は完全であったり治癒的であったりする必要がないことを認識する。一定の実施形態では、治療有効量は治癒的ではない。
【００９６】
当該分野で公知の任意の手段によって本発明のウイルスベクターの投与を必要とするヒト被験体または動物へ投与することができる。好ましくは、ウイルスベクターは、薬学的に許容され得る担体中で治療有効用量で送達される。１つの実施形態では、ベクターは、改変ベクターをコーティングしたステントまたは改変ベクターを含むステントによって投与される。脈管構造へのベクターの送達のためのデリバリーシースは、米国特許出願公開第２００４０１９３１３７号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００９７】
被験体へのウイルスベクターの投与量は、投与様式、処置すべき疾患または状態、各被験体の状態、送達すべき特定の治療核酸に依存し、日常的様式で決定することができる。治療効果を得るための例示的な用量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、またはそれを超える形質転換単位、およびその中で導き出せる任意の整数、およびその中で導き出せる任意の範囲のウイルス力価を送達させる用量である。１つの実施形態では、投与用量は約１０８〜１０１３形質転換単位である。１つの実施形態では、投与用量は約１０３〜１０８形質転換単位である。
【００９８】
ベクターゲノム／キログラム体重（ｖｇ／ｋｇ）の用量の単位での特定の治療効果を得るために必要な改変ビリオンの用量は、いくつかの要因に基づいて変動し、要因には以下が含まれるが、これらに限定されない：改変ビリオンの投与経路、治療効果を得るために必要な核酸（非翻訳ＲＮＡまたはタンパク質をコードする）の発現レベル、処置される特定の疾患または障害、ビリオンに対する宿主免疫応答、発現産物に対する宿主免疫応答、および異種核酸産物の安定性。当業者は、前述の要因および当該分野で周知の他の要因に基づいて特定の疾患または障害を有する患者を処置するための組換えビリオンの用量範囲を容易に決定することができる。
【００９９】
特定の実施形態では、毎週、毎月、または毎年などに１回を超える投与（例えば、２回、３回、４回、またはそれを超える投与）を使用することができる。
【０１００】
注射剤を、従来の形態で（液体の液剤または懸濁剤、注射前に液体で液剤または懸濁剤になるのに適切な固体の形態、または乳剤のいずれかとして）調製することができる。ベクターを、局所または全身に送達させることができる。１つの実施形態では、ベクターをデポーまたは徐放製剤で投与する。さらに、ウイルスベクターを、外科的に植え込み可能なマトリックスに接着させて送達させることができる（例えば、米国特許出願公開第２００４−００１３６４５−Ａ１号に記載）。
【０１０１】
本明細書中に開示の改変パルボウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクターまたは他のパルボウイルス）を、被験体が吸入するウイルスベクターから構成される吸入可能な粒子のエアロゾル懸濁液の投与によって投与することができる。吸入可能な粒子は、液体または固体であり得る。ウイルスベクターを含む固体粒子のエアロゾルを、当業者に公知の圧力駆動型エアロゾルネブライザーまたは超音波式ネブライザーなどを用いた任意の適切な手段によって生成することができる。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照のこと。ウイルスベクターを含む固体粒子のエアロゾルを、薬学分野で公知の技術によって任意の固体粒子医薬のエアロゾル生成器を用いて同様に生成することができる。
【０１０２】
１つの実施形態では、米国特許第６，１７７，４０３号に記載され、本明細書中で参考として援用される温熱四肢灌流を使用して、分離した四肢の脈管構造中に改変ｒＡＡＶベクターを送達させることもできる。
【０１０３】
１つの実施形態では、脈管構造の組織に微多孔膜から形成された膨張性バルーンと流体連通したカテーテルを挿入し、前述のカテーテルを介して目的の遺伝子を含むベクターを含む溶液を送達させることによって、本発明の改変ベクターを脈管構造の組織に投与する（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１００８８９号（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０１０４】
一定の実施形態では、本発明の改変組換えベクターの有効性を増加させるために、本発明の方法を、血管疾患または血管障害の処置に有効な別の薬剤の投与または他の手順と組み合わせることが望ましい場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、従来の治療または薬剤（薬理学的治療剤、外科的手技、またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない）をベクター投与と組み合わせることができることが意図される。非限定的な例では、治療上の利点は、血管組織における高血圧の低下、または医学的手技もしくは外科的手技中などに生じる血管または心血管への介入後の再狭窄の減少を含む。
【０１０５】
このプロセスは、薬剤（複数可）およびベクターを、同時（例えば、実質的に同時）または細胞、組織、もしくは被験体へのベクターおよび薬剤の個別投与が所望の治療上の利点を生じる時間内に投与することを含み得る。改変ベクターおよび１またはそれを超える薬剤の両方を含む単一の薬理学的製剤を投与することができるか、一方の製剤がベクターを含み、他方の製剤が１またはそれを超える薬剤を含む２またはそれを超える個別の製剤を被験体に投与することができる。一定の実施形態では、薬剤は、免疫応答を低下させる薬剤（例えば、ＴＬＲ−９阻害剤、ｃＧＡＳ阻害剤、またはラパマイシン）である。
【０１０６】
改変ベクターを、他の薬剤（複数可）の投与前に、それと共投与して、および／またはそれを投与してから数分間から数週間までの間隔をあけた後に投与することができる。ベクターおよび他の薬剤（複数可）を細胞、組織、または被験体に個別に適用する実施形態では、一般に、ベクターおよび薬剤（複数可）が依然として細胞、組織、または被験体に対して有利な組み合わせ効果を発揮することができるように、各送達の時間の間に有効期間が切れないようにするはずである。
【０１０７】
薬理学的治療剤の投与、投与方法、および投与量などは、当業者に周知であり（例えば、「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」、「Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、および「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、Ｅｌｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」（関連部分が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）、本開示を考慮して本発明を組み合わせることができる。処置される被験体の状態に依存して、投与量のいくらかの変動が必然的に生じる。投与担当者は、任意の事象において、個別の被験体に適切な用量を判定し、かかる個別の判定は、当業者の技術の範囲内にある。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本出願は、以下のパラグラフのうちのいずれかで定義され得る：
１．ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応するＳ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｈ２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、およびＴ５８９からなる群から選択される１またはそれを超えるアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む改変組換えＡＡＶ６ベクターであって、前述のｒＡＡＶ６ベクターは、肝臓を形質導入し、前述の１またはそれを超える置換を欠くｒＡＡＶ６ベクターと比較して、ＡＤＫ６抗体による肝臓の形質導入の中和を減少させた、改変組換えＡＡＶ６ベクター。
２．ＡＡＶ６  ＶＰ１のアミノ酸５３１に対応するアミノ酸部位にリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）をさらに含む、パラグラフ１に記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
３．アミノ酸５３１にＫを含む、パラグラフ２に記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
４．アミノ酸５３１にＲを含む、パラグラフ２に記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
５．１またはそれを超えるアミノ酸のうちの少なくとも２つが置換されている、パラグラフ１〜３のいずれかに記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
６．１またはそれを超えるアミノ酸のうちの少なくとも３つが置換されている、パラグラフ１〜４のいずれかに記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
７．１またはそれを超えるアミノ酸のうちの少なくとも４つが置換されている、パラグラフ１〜５のいずれかに記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
８．１またはそれを超えるアミノ酸のうちの少なくとも５つが置換されている、パラグラフ１〜６のいずれかに記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
９．１またはそれを超えるアミノ酸のうちの少なくとも６つが置換されている、パラグラフ１〜７のいずれかに記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
１０．１またはそれを超えるアミノ酸のうちの少なくとも７つが置換されている、パラグラフ１〜８のいずれかに記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
１１．１またはそれを超える置換が保存的置換を含む、パラグラフ１〜９のいずれかに記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
１２．１またはそれを超える置換が非保存的置換を含む、パラグラフ１〜９のいずれかに記載の改変ＡＡＶ６ベクター。
１３．ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応するＮ４４７、Ｓ４７２、Ｖ４７３、Ｎ５００、Ｔ５０２、およびＷ５０３からなる群から選択される、シアル酸に結合する少なくとも１つのアミノ酸の置換をさらに含む、パラグラフ１〜１１のいずれかに記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
１４．ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応する２６２〜２７２；３８２〜３８６、４４５〜４５７、４５９、４６９〜４７３、４８８〜４８９、４９４〜４９６、４９９〜５１５、５７１〜５７９、５８４〜５８９、および５９３〜５９５からなる群から選択されるアミノ酸の１またはそれを超える改変領域をさらに含み、ここで、前述の１またはそれを超える改変領域中の少なくとも１またはそれを超えるアミノ酸が置換されている、パラグラフ１〜１２のいずれかに記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
１５．ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応するＳ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｈ２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、およびＴ５８９からなる群から選択される１またはそれを超えるアミノ酸残基での置換を含む改変組換えＡＡＶ６ベクターであって、前述のｒＡＡＶ６ベクターは、肝臓を形質導入し、前述の１またはそれを超える置換を欠くｒＡＡＶ６ベクターと比較して、ＡＤＫ６抗体による形質導入の中和を減少させた、改変組換えＡＡＶ６ベクター。
１６．ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応する２６２〜２７２；３８２〜３８６、４４５〜４５７、４５９、４６９〜４７３、４８８〜４８９、４９４〜４９６、４９９〜５１５、５７１〜５７９、５８４〜５８９、および５９３〜５９５からなる群から選択されるアミノ酸の１またはそれを超える改変領域を含む改変ｒＡＡＶ６ベクターであって、ここで、前述の１またはそれを超える改変領域中の少なくとも１またはそれを超えるアミノ酸が置換されており、前述のｒＡＡＶ６ベクターは、肝臓を形質導入し、前述の１またはそれを超える置換を欠くｒＡＡＶ６ベクターと比較して、ＡＤＫ６抗体による肝臓の形質導入の中和を減少させた、改変ｒＡＡＶ６ベクター。
１７．ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応するＫ５３１を含む、パラグラフ１５に記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
１８．ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリングに対応するＲ５３１を含む、パラグラフ１５に記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
１９．４５６〜４５９；４９２〜４９９；および５８８〜５９７からなる群から選択される１またはそれを超えるアミノ酸領域でのアミノ酸置換をさらに含む、パラグラフ１〜１７のいずれかに記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
２０．４５６〜４９９のＳＥＥＲ（配列番号２）、４９２〜４９９のＴＰＧＧＮＡＴＲ（配列番号３）；５８８〜５９７のＤＬＤＰＫＡＴＥＶＥ（配列番号４）からなる群から選択される１またはそれを超える前述のアミノ酸配列を含む、パラグラフ１〜１８のいずれかに記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
２１．非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較して、非改変ｒＡＡＶ６ウイルスに対するヒト抗血清による肝臓形質導入の中和を減少させた、パラグラフ１〜１９のいずれかに記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
２２．非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較して、非改変ｒＡＡＶ６ウイルスに対するマウス抗血清によって測定される肝臓形質導入の中和を減少させた、パラグラフ１〜１９のいずれかに記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
２３．非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較して、非改変ｒＡＡＶ６ウイルスに対するアカゲザル抗血清によって測定される肝臓形質導入の中和を減少させた、パラグラフ１〜１９のいずれかに記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
２４．肝臓向性を保持し、かつＡＤＫ６抗体による中和を減少させるＡＡＶ６ビリオンを同定する方法であって、
ａ．飽和変異誘発ＡＡＶ６ライブラリーであって、ここで、Ｓ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｈ２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、およびＴ５８９からなる群から選択されるアミノ酸の各々が、２０種の異なる天然または非天然のアミノ酸の各々で、全てまたは全てより少ない位置の任意の組み合わせにおいて置換されており、前述のＡＡＶ６がＫ５３１またはＲ５３１のいずれかを含む、飽和変異誘発ＡＡＶ６ライブラリーを生成すること；および
ｂ．肝臓の細胞（例えば、肝細胞）または組織を前述のｒＡＡＶ６ライブラリーで感染させることによって複数ラウンドの進化を行うこと；および
ｃ．前述の対応する非改変ＡＡＶ６ビリオンと比較してＡＤＫ６または抗血清による少なくとも１０％の中和の減少（reduced neutralization by of at least 10% ADK6 or anti-sera）をスクリーニングすること
を含む、方法。
２５．シアル酸結合の喪失をスクリーニングすることをさらに含む、パラグラフ２３に記載の方法。
２６．シアル酸結合の存在をスクリーニングすることをさらに含む、パラグラフ２３に記載の方法。
２７．肝臓向性を保持し、かつＡＤＫ６抗体による中和を減少させるＡＡＶ６ビリオンを同定する方法であって、
ａ．２６２〜２７２；３８２〜３８６、４４５〜４５７、４５９、４６９〜４７３、４８８〜４８９、４９４〜４９６、４９９〜５１５、５７１〜５７９、５８４〜５８９、および５９３〜５９５からなる群から選択されるアミノ酸の１またはそれを超える改変領域の飽和変異誘発ライブラリーであって、ここで、前述の１またはそれを超える領域が、２０種の異なる天然または非天然のアミノ酸の各々と全てまたは全てより少ない位置の任意の組み合わせで置換されており、前述のＡＡＶ６がＫ５３１またはＲ５３１のいずれかを含む、飽和変異誘発ライブラリーを生成すること；および
ｂ．肝臓の細胞（例えば、肝細胞）または組織を前述のｒＡＡＶ６ライブラリーで感染させることによって複数ラウンドの進化を行うこと；および
ｃ．前述の対応する非改変ＡＡＶ６ビリオンと比較してＡＤＫ６または抗血清による少なくとも１０％の中和の減少をスクリーニングすること
を含む、方法。
２８．シアル酸結合の喪失をスクリーニングすることをさらに含む、パラグラフ２７に記載の方法。
２９．シアル酸結合の存在をスクリーニングすることをさらに含む、パラグラフ２７に記載の方法。
３０．ＡＤＫ６抗体による中和を減少させ、肝臓を形質導入する、請求項２４〜２７のいずれかに記載の方法によって得られた改変ｒＡＡＶ６ベクター。
３１．非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較して、非改変ｒＡＡＶ６ウイルスに対するヒト抗血清による肝臓形質導入の中和を少なくとも１０％減少させた、パラグラフ２８に記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
３２．非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較して、非改変ｒＡＡＶ６ウイルスに対するマウス抗血清による肝臓形質導入の中和を少なくとも１０％減少させた、パラグラフ２８に記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
３３．非改変ｒＡＡＶ６ベクターの中和と比較して、非改変ｒＡＡＶ６ウイルスに対するアカゲザル抗血清による肝臓形質導入の中和を少なくとも１０％減少させた、パラグラフ２８に記載の改変ｒＡＡＶ６ベクター。
【０１０９】
本明細書を通して、例えば、本明細書の表および実施例内の本明細書中に引用された全ての文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１１０】
以下に示した実施例を、当業者へのさらなる手引として提供し、これらの実施例は、決して本発明を制限すると解釈されない。
【実施例】
【０１１１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝的障害の処置のためのベクターとして開発されている。しかし、既存の抗体は、ＡＡＶ遺伝子送達系の有効性を最適にすることを著しく制限させる。免疫応答を回避する能力を有するようにベクターを操作する試みには、これらの相互作用およびその変化に重要なウイルスキャプシド上の残基の同定が含まれる。ここでは、ＡＡＶ１とは密接に関連しないＡＡＶ６によるモノクローナル抗体ＡＤＫ６認識の決定因子としてＫ５３１を同定している。ＡＡＶ６  ＡＤＫ６複合体の構造をクライオ電子顕微鏡法によって決定し、フットプリントを細胞ベースのアッセイによって確認した。ＡＤＫ６フットプリントは、以前に同定されたＡＡＶ抗原性領域と重複し、不可欠な細胞表面グリカン結合部位を遮断することによって中和する。したがって、この研究により、キャプシド機能を維持することができる宿主免疫回避ＡＡＶベクターのデザインをガイドすることができるＡＡＶ−抗体情報の利用可能な範囲が広がる。
【０１１２】
実施例１  ＡＡＶ６−ＡＤＫ６複合体のクライオ電子顕微鏡法による再構成。分解能１６Å（ＦＳＣ０．５）で決定されたＡＡＶ６：ＡＤＫ６  ＦＡｂ複合体のクライオＥＭ再構成は、ＡＡＶ６キャプシド表面の２回軸を横切る３回軸突起（3-fold protrusion）の側面に結合したＡＤＫ６  ＦＡｂを示し、これは２価の結合が示唆される（図１Ａ〜Ｃ）。この所見と一致して、インタクトなＡＤＫ６  ＩｇＧ（非切断）との複合体は、Ｆｃについて密度に秩序のないＦＡｂのみと類似の構造を示した（データ示さず）。ＡＡＶ６キャプシド上のＡＤＫ６結合部位は、他のＡＡＶによって利用される共通の抗原部位内にある（３回軸突起および２／５回軸壁（the2/5-fold wall））（Ｔｓｅｎｇら、２０１５）。これらのエピトープは、配列および構造の多様性が高い領域であり、受容体認識およびＡＡＶによる形質導入に重要であることを示す。ＣＣ０．９３で再構成した密度マップにフィッティングされた擬似原子モデルにおけるＡＡＶ６とＡＤＫ６  ＦＡｂとの間の推定接触残基を（図１Ｃ〜Ｅ）に示す。
【０１１３】
ＰＤＢｅＰＩＳＡプログラムによって同定された合体したＡＤＫ６  ＦＡｂモデルの残基と接触するＡＡＶ６キャプシド表面残基は、Ｓ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｈ２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、およびＴ５８９である。残基Ｓ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、およびＨ２７２は、１つの３回軸対称関連単量体上に存在し、Ｑ４５７は第２の３回軸関連単量体上に存在し、残基Ｓ５８８およびＴ５８９は、第３の３回軸対称関連単量体上に存在する。さらに、ＡＤＫ６  Ｆａｂフットプリントは、モデルで推測される接触残基の周囲の他の残基に対して閉鎖している：２６２〜２７２、３８２〜３８６、４４５〜４５７、４５９、４６９〜４７３、４８８〜４８９、４９４〜４９６、４９９〜５１５、５２８〜５３４、５７１〜５７９、５８４〜５８９、および５９３〜５９５。有意には、ＡＡＶ１とＡＡＶ６との間で異なる残基のうちの２つ（５３１および５８４）は、閉鎖領域内に存在する（図１ＤおよびＥ）。ＡＡＶ６のみがＡＤＫ６に結合し、ＡＡＶ１は結合しない（Ｓｏｎｎｔａｇら、２０１１）。したがって、フットプリントは、ＡＡＶ６：ＡＤＫ６相互作用の特異性が５３１、５８４、またはその両方によって決定されることを意味していた。
【０１１４】
実施例２  相互交換的なＡＡＶ１ベクターおよびＡＡＶ６ベクターは、キャプシドアセンブリ、ゲノム力価、および形質導入効率が野生型に匹敵する。ＡＶＢカラムクロマトグラフィによって精製されたＡＡＶ１バリアントおよびＡＡＶ６バリアントは、陰性染色ＥＭによって可視化されたときにアセンブリされたキャプシドを示し（図２Ｂ）、１０１０〜１０１３ｖｇ／ｍｌの範囲の封入ゲノム力価を有しており、これはＷＴウイルスに匹敵していた（図２Ｃ）。キャプシドの内面が変化したＡＡＶ６−Ｈ６４２Ｎバリアントも、ＷＴに匹敵するレベルでキャプシドをアセンブリし、ゲノムを封入した。ＷＴおよびバリアントの形質導入表現型を、抗体の非存在下で比較した。ＷＴウイルスと比較したＡＡＶ１バリアントの形質導入効率は約１６０％であり、一方で、ＡＡＶ６バリアントでは約９５（ＡＡＶ６−Ｖ５９８Ａについて）から１６０％（ＡＡＶ６−Ｌ５８４Ｆについて）の範囲であった。ＷＴ  ＡＡＶ６と比較したＡＡＶ６−Ｋ５３１Ｅの形質導入効率は約１２０％であった。これらの所見により、変異がキャプシドアセンブリ、ゲノムパッケージング、形質導入効率に有意な影響を及ぼさないことが確認された。
【０１１５】
実施例３  ＡＡＶ６  Ｋ５３１は、ＡＤＫ６認識を担う。ＡＤＫ６でのＡＡＶ１およびＡＡＶ６のイムノブロットにより、ＡＤＫ６によるＡＡＶ６の認識およびＡＡＶ１による回避が確認された（図３Ａ）。ＡＤＫ６は、残基タイプがＡＡＶ１からＡＡＶ６にスイッチされたＥからＫへの変化を有するバリアントＡＡＶ１−Ｅ５３１Ｋを認識するが、第２の閉鎖位置でＬからＦにスイッチされたＡＡＶ１−Ｆ５８４は認識しないことが重要である。この所見により、ＡＡＶ６−Ｋ５３１がＡＤＫ６認識の決定因子であることが同定された。この結論と一致して、ＡＤＫ６は、ＡＡＶ６−Ｌ５８４ＦおよびＡＡＶ６−Ｈ６４２Ｎを認識するが、ＡＡＶ６−Ｋ５３１Ｅを認識しない（図３Ａ）。ＡＡＶ１およびＡＡＶ１−Ｆ５８４ＬはＡＤＫ６を回避する一方で、ＡＡＶ１−Ｅ５３１Ｋは、ＦＡｂ分子／キャプシドのモル比約１５でＡＤＫ６によって中和される（図３Ｂ）。これの結合部位占有率はたった２５％である。ＡＤＫ６は、ＡＡＶ６およびＡＡＶ６−Ｌ５８４Ｆ（これもＦＡｂ分子／キャプシドのモル比約１５）、ＡＡＶ６−Ｖ５９８Ａ（ＦＡｂ分子のモル比約２０）、およびＡＡＶ６−Ｈ６４２Ｎ（ＦＡｂ分子のモル比約６０）の形質導入を約５０％阻害する（図３Ｃ）。他方では、ＡＡＶ６−Ｋ５３１Ｅは、ＦＡｂ分子／キャプシドのモル比１２０まで（ＶＰ結合部位あたり２ＦＡｂ分子の飽和）抗体認識を回避する（図３Ｃ）。これらの所見により、ＡＡＶ６に対するＡＤＫ６の特異性の決定因子としてのＫ５３１の役割が確認され、ＦＡｂ残基と直接接触しない場合があるが、ウイルス−抗体相互作用におけるフットプリントの一部であるというキャプシド残基の重要な寄与が強調される。
【０１１６】
実施例４  ＡＤＫ６結合は、ＡＡＶ６グリカン結合を立体的に妨害すると予想され、以前に定義されたエピトープと重複するフットプリントを有する。ＡＡＶ６は、細胞感染のためにＨＳおよびＳＩＡの両方を利用する二重グリカン受容体結合血清型である（Ｈｕａｎｇら、２０１６；Ｗｕら、２００６）。ＡＤＫ６フットプリントは、そのＨＳ結合を担うことが報告されているＫ５３１に加えて、以前に構造的にマッピングされたＳＩＡグリカン受容体結合部位を含むＡＡＶ６キャプシド表面の広域を網羅する（図４Ａおよび４Ｂ）（Ｈｕａｎｇら、２０１３；Ｗｕら、２００６）。ＡＤＫ６がＡＡＶ６による形質導入を遮断する能力は、ＡＤＫ６がおそらく両方のグリカン相互作用の立体障害によってＡＡＶ６感染を侵入段階で中和することを示す。ＳＩＡ相互作用の遮断は、３回軸領域の上部にＡＤＫ６フットプリント領域を共有するというＡＡＶ１およびＡＡＶ６のＡＤＫ１ａ中和について提唱された機序に類似する（Ｈｕａｎｇら、２０１６；Ｔｓｅｎｇ  ａｎｄ  Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ，２０１４）。この機序は、ＡＡＶ２のＡ２０中和およびＡＡＶ８のＡＤＫ８中和について報告された機序とは異なる（Ｇｕｒｄａら、２０１２；Ｈｕｔｔｎｅｒら、２００３；ＭｃＣｒａｗら、２０１２；Ｔｓｅｎｇら、２０１５）。これらの抗体は、侵入後段階で中和すると提唱されており、Ａ２０は核内で作用し、ＡＤＫ８は核侵入を遮断し、それにより、核周囲に蓄積される。ＡＡＶ８細胞表面のグリカン受容体は知られていないが、ＡＡＶ２は、３回軸（２／−５回回軸壁に存在するＡ２０フットプリントとは異なる領域）のそのＨＳ受容体に結合することが重要である（ＭｃＣｒａｗら、２０１２）。
【０１１７】
ＡＡＶ６上のＡＤＫ６フットプリントは、他のＡＡＶ−抗体相互作用（ＡＡＶ８−ＡＤＫ８、ＡＡＶ１−ＡＤＫ１ａが含まれる）について以前にマッピングされたもの、ならびに３回軸突起および２／５回軸壁上のＡＡＶ１−５Ｈ７、ＡＡＶ６−５Ｈ７、およびＡＡＶ２−Ａ２０の領域と重複する（Ｇｕｒｄａら、２０１２；Ｔｓｅｎｇ  ａｎｄ  Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ，２０１４；Ｔｓｅｎｇら、２０１５；Ｔｓｅｎｇら、２０１６）。したがって、この構造は、ＡＡＶについて蓄積された抗原フットプリントの情報ライブラリーに追加され、ＡＡＶベクターの再投与中に既存の宿主免疫応答を回避する能力を有するＡＡＶベクターの生成技術に関する情報が伝えられるであろう。
【０１１８】
構造の組み合わせ、部位特異的変異誘発、および細胞結合アッセイを使用した本研究により、単一の残基Ｋ５３１が密接に関連するＡＡＶ１とＡＡＶ６との間に抗原選択性を付与するものとして、単一の残基Ｋ５３１を同定した。有意には、承認されたＡＡＶ１ベースのリポタンパク質リパーゼ遺伝子ベクターの反復処置には、類似の形質導入特性を有する抗原バリアントを使用する必要がある。ＡＡＶ１／６の５３１位が免疫回避特性を付与することができるという所見は、これらの患者に今後使用するためのＡＡＶ１操作ならびにさらなるＡＡＶ１ベクターおよびＡＡＶ６ベクターの開発の際に与えることができる情報である。
【０１１９】
方法
【０１２０】
ＡＡＶ６ウイルス様粒子の産生および精製。バキュロウイルス／ＳＦ９発現系を使用したＡＡＶ６ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生および精製は、以前に記載されている（ＤｉＭａｔｔｉａら、２００５；Ｍｉｌｌｅｒら、２００６；Ｎｇら、２０１０）。簡潔に述べれば、ＡＡＶ６のＶＰ２およびＶＰ３を発現するためのＤＮＡを含む遺伝子をパッケージングするバキュロウイルスを、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムを製造者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にしたがって使用して作製し、このウイルスを使用してＳＦ９細胞に感染させた。感染由来の細胞ペレットを、ＴＮＴＭ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に再懸濁し、凍結融解を３回行い、ここで、２回目の融解後に３７℃でベンゾナーゼ（ｅｎｚｏｎａｓｅ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）処理を行い、ＪＡ−２０ローター中、１０，０００ｒｐｍにて４℃で２０分間の遠心分離によって清澄化した。上清を２０％スクロースクッション（ＴＮＴＭ緩衝液中のスクロース（ｗ／ｖ））上にロードし、試料を、Ｔｉ７０ローターで４５，０００ｒｐｍにて４℃で３時間遠心分離した。上清を破棄し、ペレットをＴＮＴＭに再懸濁し、４℃で一晩撹拌した。再懸濁したペレットを、５−４０％（ｗ／ｖ）スクロース段階勾配にロードし、試料を、ＳＷ４１ローター中、３５，０００ｒｐｍにて４℃で３時間遠心分離した。ＶＬＰを含む画分を分画によって回収し、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１５ｍＭ  ＮａＣｌ）中に透析し、試料を使用前にイオン交換クロマトグラフィによってさらに精製した。
【０１２１】
１ｍｌ陰イオン交換樹脂（Ｑカラム，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化した。試料をカラム上に流速０．５ｍｌ／分でロードし、カラムを１０カラム体積（ＣＶ）の緩衝液Ａで洗浄し、試料を、５ＣＶの０−１００％緩衝液Ｂの勾配を用いて溶出した（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、２００２）。５００マイクロリットルの画分を回収し、スクリーニングしてＡＡＶ６  ＶＰを含む画分を同定した。これらの画分をプールし、緩衝液をＰＢＳと交換し、１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析し、陰性染色電子顕微鏡法（ＥＭ）によて純度およびキャプシドの完全性をそれぞれチェックした。
【０１２２】
ＡＤＫ６  ＩｇＧ抗体の精製。ＡＤＫ６免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を、以前に記載のようにＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂで産生させた（Ｋｕｃｋら、２００７；Ｔｓｅｎｇら、２０１６）。ＡＤＫ６ハイブリドーマ上清をＰＢＳで１：５に希釈し、１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐプロテインＧ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、１０ＣＶのＰＢＳで洗浄し、０．５ｍｌのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）で溶出し、５０μｌの中和緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０））で中和した。精製したＩｇＧを２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡに緩衝液交換し、パパイン切断のために濃縮した。
【０１２３】
ＡＤＫ６抗体断片（ＦＡｂ）の生成および精製。システインＨＣｌを、使用直前にパパイン消化緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に添加した。濃縮ＩｇＧを、固定パパイン（Ｐｉｅｒｃｅ）と酵素：基質比１：１６０にて３７℃で１６時間インキュベートした。等体積のパパイン停止緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を添加して、切断プロセスを停止させ、混合物を１５００×ｇで２分間遠心分離して、固定パパインから試料を分離した。ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にてＦＡｂを未消化ＩｇＧおよび断片結晶化可能（Ｆｃ）フラグメントから分離した。
【０１２４】
ＦＡｂを洗浄および通過画分に回収し、ＰＢＳに緩衝液交換し、使用のために濃縮した。
【０１２５】
ＡＡＶ６−ＡＤＫ６  ＦＡｂ複合体の形成。濃度１ｍｇ／ｍｌのＡＡＶ６  ＶＬＰおよび濃度１ｍｇ／ｍｌのＡＤＫ６  ＦＡｂを、ＦＡｂ：ＶＰ結合部位のモル比１：１および２：１で混合し、混合物を４℃で１時間インキュベートした。複合体を、Ｓｐｉｒｉｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＦＥＩ）での陰性染色ＥＭによって試験してＦＡｂによるキャプシド装飾を確認後、ｃｒｙｏ−ＥＭデータ収集のためにガラス化した。
【０１２６】
ＡＡＶ６−ＡＤＫ６  ＦＡｂ複合体のｃｒｙｏ−ＥＭデータ収集。３マイクロリットルのＡＡＶ６−ＡＤＫ６  Ｆａｂ複合体混合物を、使用１分前にグロー放電したＣ−Ｆｌａｔ穴あきカーボングリッド（ＣＦ−２／２−４Ｃ−５０，Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐｓ  Ｉｎｃ．）にロードし、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ  Ｍａｒｋ  ＩＶ（ＦＥＩ）における液化エタン中でのプランジ凍結によってガラス化した。凍結したグリッドを液体窒素に移し、次いで、２００ｋＶで操作するＦＥＩ  Ｔｅｃｈｎａｉ  ＴＦ２０透過型電子顕微鏡に移した。クライオ顕微鏡写真を、デフォーカス範囲２．５〜３．０μｍおよび総電子線量２０ｅ−／Å２／画像を使用して収集した。３６枚の顕微鏡写真を、Ｇａｔａｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｓｃａｎ  ４０００  ＣＣＤカメラをステップサイズ１．８２Å／ピクセルで用いて収集した。
【０１２７】
ＡＡＶ６−ＡＤＫ６  ＦＡｂ複合体のＣｒｙｏ−ＥＭおよび画像再構成。ＲｏｂＥＭソフトウェアパッケージ（ワールド・ワイド・ウェブ上のｃｒｙｏＥＭ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｐｒｏｇｒａｍｓ．ｓｈｔｍで入手可能）を使用して、各顕微鏡写真から装飾されたＡＡＶ６  ＶＬＰ（複合体化）粒子を抽出した。各顕微鏡写真のデフォーカスレベルを、ＡＵＴＯ３ＤＥＭアプリケーション（Ｙａｎら、２００７ａ；Ｙａｎら、２００７ｂ）に組み込まれたＣＴＦＦＩＮＤ３アプリケーション（Ｍｉｎｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｒｉｇｏｒｉｅｆｆ，２００３）を使用して推定した。ＡＵＴＯ３ＤＥＭソフトウェアパッケージ内の「ａｕｔｏｐｐ」サブルーチンを使用して、選択された粒子を前処理して汚れを除去し、直線勾配を補正し、正規化し、その画像をアポダイズし、同一のアプリケーション（Ｙａｎら、２００７ａ）を使用して、各粒子の原点および配向を検索およびその精密化を開始するために、分解能約２５Åでの初期モデルを生成した。最初の１０サイクルの検索および精密化後、データセットを、精密化された粒子中心および配向の情報を用いて「リボックス」および「リセンター」し、画像を、コントラスト伝達関数（ＣＴＦ）における位相反転の影響を相殺するように補正し、その後にＡＵＴＯ３ＤＥＭ内でさらなる精密化サイクルも実施した（Ｙａｎら、２００７ｂ）。最終分解能を、閾値０．５のフーリエシェル相関（ＦＳＣ）によって決定した（ｖａｎ  Ｈｅｅｌ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｔｚ，２００５）。再構成マップの画像を、Ｃｈｉｍｅｒａソフトウェアパッケージ（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎら、２００４）を使用して示した。
【０１２８】
擬似原子モデルのフィッティングおよびＡＤＫ６抗体フットプリントの同定。
【０１２９】
ＡＡＶ６の６０塩基長ＶＰ３キャプシド座標を、Ｖｉｐｅｒｄｂオンラインサーバ（ワールド・ワイド・ウェブ上のｖｉｐｅｒｄｂ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／で利用可能）を使用したＯｌｉｇｏｍｅｒ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒのサブルーチンを使用した正二十面体の行列乗算（Ｃａｒｒｉｌｌｏ−Ｔｒｉｐｐら、２００９）によってＡＡＶ６結晶構造（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ  ＩＤ番号３ＯＡＨ）から作成した。Ｃｈｉｍｅｒａプログラム（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎら、２００４）を使用した剛体の回転および平行移動によって、座標をｃｒｙｏ−ＥＭで再構成した複合体の密度マップにフィッティングした。この６０塩基長を、相関係数（ＣＣ）０．９４で合体させた。モデルをＦＡｂ密度に構築することができるように、ＡＡＶ６−ＡＤＫ６複合体マップから合体した６０塩基長モデルについて作成した縮尺密度マップ（scaled density map）を差し引いた差分マップを作成した。一般的なＦＡｂ構造（ＰＤＢ  ＩＤ番号２ＦＢＪ）を、Ｃｈｉｍｅｒａプログラム（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎら、２００４）を使用して、基準ＡＡＶ６  ＶＰ３単量体（鎖Ａ）と相互作用するＦＡｂを示す、得られた正の差分密度マップにフィッティングした。基準単量体の座標を、合体した６０塩基長から抽出し、これを合体したＦａｂモデルと共に用い、Ｖｉｐｅｒｄｂ（ワールド・ワイド・ウェブ上のｖｉｐｅｒｄｂ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／で利用可能）を使用して６０塩基長を作成した（Ｃａｒｒｉｌｌｏ−Ｔｒｉｐｐら、２００９）。次いで、この複合体６０塩基長を、再構成した複合体の密度マップに再度合体させると、ＣＣは０．９３で類似した。ＡＡＶ６キャプシドとＡＤＫ６  ＦＡｂとの間の相互作用残基を決定するために、ＰＤＢｅＰＩＳＡ（ワールド・ワイド・ウェブ上のｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｍｓｄ−ｓｒｖ／ｐｒｏｔ＿ｉｎｔ／で利用可能）（Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ  ａｎｄ  Ｈｅｎｒｉｃｋ，２００７）およびＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙら、２０１０）ソフトウェアパッケージを使用した。フィッティングした複合体の座標の画像を、ＰｙＭｏｌプログラム（ワールド・ワイド・ウェブ上のｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ／で利用可能）（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ，２０１７）を使用して作成した。
【０１３０】
組換え野生型およびバリアントＡＡＶ１ベクターおよびＡＡＶ６ベクターの産生および精製。ＡＡＶ６によるＡＤＫ６認識（ＡＡＶ１では認識されない）のための必須残基の決定因子を同定するために、組換えの野生型（ＷＴ）ＡＡＶ１（ｒＡＡＶ１）およびＡＡＶ６（ｒＡＡＶ６）、ならびにＡＤＫ６フットプリント内に存在する等価なキャプシド表面アミノ酸の５３１位および５８４位（それぞれ、ＡＡＶ６ではＫおよびＦ、ＡＡＶ１ではＥおよびＬ）での相互交換的な単一部位特異的バリアント、ならびにＡＡＶ６−Ｖ５９８Ａを、ＡＤＫ６の存在下でのネイティブイムノブロットおよび感染性による試験のために作製した。異なる非フットプリント残基（キャプシド内面）のネガティブコントロールおよびアミノ酸置換の存在下でのＡＡＶ６キャプシドアセンブリについてのコントロールとして、試験のために相互交換的ＡＡＶ６−Ｈ６４２Ｎバリアントも作製した。これらのバリアントを、それぞれＡＡＶ１およびＡＡＶ６についてｐＸＲ１バックグラウンドおよびｐＸＲ６バックグラウンドで以前に記載のように作製した（Ｗｕら、２００６）。
【０１３１】
ＷＴおよびバリアントのｒＡＡＶ１ベクターおよびｒＡＡＶ６ベクターを産生するために、７０％コンフルエンシーのＨＥＫ２９３細胞の単層を、１５ｃｍプレートあたり１９０μｌのポリエチレンイミン（１ｍｇ／ｍｌ）を使用して、１８μｇのＷＴおよび変異体ｐＸＲＡＡＶ１プラスミドおよびｐＸＲＡＡＶ６プラスミド、１８μｇのｐＴＲ−ＵＦ３−ルシフェラーゼ（ＡＡＶ２逆位末端配列の間にルシフェラーゼ遺伝子を有する）、および５４μｇのヘルパープラスミドｐＸＸ６で三重にトランスフェクトした。１０枚の１５ｃｍプレートを、各ベクターでトランスフェクトし、その後に５％ＣＯ２の存在下にて３７℃で７２時間インキュベートした。トランスフェクション後、細胞を回収し、１１００×ｇで１５分間遠心分離した。各ベクターの上清を１０％ＰＥＧ８０００（Ｆｉｓｈｅｒ）で沈殿させ、細胞ペレットを１０ｍｌ  ＴＤ緩衝液（１×ＰＢＳ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および２．５ｍＭ  ＫＣｌ（ｐＨ７．４））に再懸濁し、３回凍結融解して細胞からウイルスを放出させた。ＴＤ緩衝液に再懸濁したＰＥＧ沈殿ウイルスおよび再懸濁した細胞ライセートの両方をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で３７℃で１時間処理し、その後にＪＡ−２０ローター中、１０，０００ｒｐｍにて４℃で２０分間の遠心分離によって清澄化した。ゲノムを含むベクターを、段階的Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ勾配（ｒａｄｉｅｎｔ）によって空のキャプシドから分離した（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、２００２）。簡潔に述べれば、清澄化した上清を、１５−６０％の段階的Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ勾配にロードした。４０／６０％界面またはベクターを含む画分を回収し、１０×ＴＤ緩衝液で希釈した。ゲノムを含むベクターを、ＡＶＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）アフィニティカラムクロマトグラフィ（Ｍｉｅｔｚｓｃｈら、２０１４）によってさらに精製した。１ｍｌ  ＡＶＢカラムを１０ｍｌ  ＴＤ緩衝液で平衡化し、希釈したベクターを含む画分を、１ｍｌ／分でロードした。精製したベクターを１０ｍｌまたは１０ＣＶの溶出緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ２．５）および０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５ｍｌ画分）で溶出した。溶出画分を５０μｌ中和緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０））で希釈した。精製されたベクターを、ＰＢＳ緩衝液に交換し、ＵＶ分光分析およびｑＰＣＲによって定量した。
【０１３２】
ネイティブイムノブロット。ＡＡＶ６のＡＤＫ６との相互作用および抗体によるＡＡＶ１認識の欠如を確認し、キャプシド抗体結合に重要な特異的残基（複数可）をさらに描写するために、精製されたｒＡＡＶ１ベクターおよびｒＡＡＶ６ベクターならびに単一残基バリアント（ｒＡＡＶ１−Ｅ５３１Ｋ、ｒＡＡＶ１−Ｆ５８４Ｌ、ｒＡＡＶ６−Ｋ５３１Ｅ、ｒＡＡＶ６−Ｌ５８４Ｆ、ｒＡＡＶ６−Ｈ６４２Ｎベクター（図２Ａ））を、ＡＤＫ６を使用したネイティブイムノブロットによって探索した。１００ｎｇの精製されたインタクトなベクターを、ニトロセルロースメンブレンにロードした。メンブレンを、５％ミルク（ｗ／ｖ）を含むＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎでブロッキングし（１時間）、その後に１：３０００に希釈したＡＤＫ６（０．５ｍｇ／ｍｌ）と１時間インキュベートした。ｒＡＡＶ−ＡＤＫ６複合体を、１：５０００に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗マウス二次抗体で探索した。最後に、メンブレンを化学発光を用いて探索し、Ｋｏｄａｋフィルム上で検出した。フィルム画像をＧｅｌ  Ｄｏｃ（Ｂｉｏｒａｄ）で出力した。ポジティブコントロールとして１００ｎｇのｒＡＡＶベクターを１００℃で５分間ボイルし、試料をニトロセルロースメンブレン上にロードした。次いで、試料を、ｒＡＡＶ１  ＶＰおよびｒＡＡＶ６  ＶＰのＣ末端を認識するＢ１抗体で探索した。このＣ末端エピトープは、キャプシドが変性されるときにのみ利用可能である（Ｗｏｂｕｓら、２０００）。
【０１３３】
中和アッセイ。ＷＴおよびバリアントのｒＡＡＶベクターへのＡＤＫ６の結合がｉｎ  ｖｉｔｒｏで中和されるかどうかを判定するために、以前に記載のように（Ｔｓｅｎｇら．、２０１５）、精製したベクターを使用して、抗体の存在下でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を感染させた。簡潔に述べれば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレート中に１．２５×１０４細胞／ウェルで２４時間播種して、７０％コンフルエンシーに到達させた。精製したＷＴベクターおよび変異体ベクター（２．５×１０９ウイルスゲノム（ｖｇ））を、ＰＢＳ中ウイルス粒子：ＡＤＫ６  ＩｇＧの分子比１：０、１：１５、１：３０、１：６０、１：９０、および１：１２０で、最終体積３０μｌの非補充ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中にて３７℃で１時間インキュベートした。このインキュベーション期間後、培地を細胞から吸引し、複合体試料を、１０％ＦＢＳならびに１％抗生物質および抗有糸分裂剤（ＡＢＡＭ）を補充した７０μｌのＤＭＥＭに添加し、混合物を細胞に添加した。細胞を、５％ＣＯ２の存在下にて３７℃で４８時間インキュベートした。細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、溶解し、製造者の指示に従ったルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって形質導入レベルを決定した。
【０１３４】
実施例１〜４の参考文献
【化１】
2021519612.tif 000003
【化２】
2021519612.tif 000004
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【０１３５】
実施例５  中和を回避し、肝臓向性を保持するさらなる改変ｒＡＡＶ６ベクターのためのＡＡＶキャプシドライブラリーの飽和変異誘発生成。
【０１３６】
ＡＡＶライブラリーは、アミノ酸残基Ｓ２６４、Ｇ２６６、Ｎ２６９、Ｈ２７２、Ｑ４５７、Ｓ５８８、およびＴ５８９（ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリング）、および／または記載の改変すべき領域内（例えば、２６２〜２７２；３８２〜３８６、４４５〜４５７、４５９、４６９〜４７３、４８８〜４８９、４９４〜４９６、４９９〜５１５、５７１〜５７９、５８４〜５８９、および５９３〜５９５（ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリング））の飽和変異誘発によって操作される。アミノ酸置換のすべての組み合わせ。簡潔に述べれば、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリについて、隣接オリゴと少なくとも１５〜２０ｎｔの重複する相同性を含む平均長７０ヌクレオチドのオリゴが生成される。これらのオリゴは、異なる改変領域をコードするゲノムアミノ酸領域内に縮重ヌクレオチド（ＮＫ）を含む。プラスミドライブラリーを、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を製造者の指示にしたがって使用した複数のオリゴのｉｎ  ｖｉｔｒｏアセンブリによって生成する。アセンブリした断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して１０サイクルＰＣＲ増幅するか、ｐＴＲ−ＡＡＶ６プラスミドのＢｓｐＥＩ制限部位とＳｂｆｌ制限部位との間に直接クローン化する。プラスミドｐＴＲ−ＡＡＶ６＊＊は、４９０位および４９１位（ＡＡＶ６  ＶＰ１ナンバリング）に部位特異的変異誘発（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）によって導入された２つの終止コドンを有するＡＡＶ２  ＲｅｐおよびＡＡＶ６  Ｃａｐをコードする遺伝子を含む。構築物全体は、ＡＡＶ２逆位末端配列（ＩＴＲ）に挟まれていて、ヘルパーウイルスの共感染の際に偽型ＡＡＶ６ライブラリーのパッケージングおよび複製が可能になる。異なるライブラリー内への野生型ＡＡＶ６の混入を減少させるために、ＡＡＶ６キャプシド遺伝子をライブラリークローニングの前に組み込むことに言及することは注目すべきである。次いで、ライゲーション反応物を濃縮し、エタノール沈殿によって精製した。精製されたライゲーション産物を、ＤＨ  １０Ｂ  ｅｌｅｃｔｒｏＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に電気穿孔し、細菌懸濁培養由来のバイアスを回避するために複数の５２４５ｍｍ２バイオアッセイ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に直接プレーティングする。ｐＴＲ−ＡＡＶ６ライブラリー由来のプラスミドＤＮＡを、Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してＬＢ寒天プレート上で成長させたプールコロニーから精製する。
【０１３７】
改変ｒＡＡＶ株の定向進化。
【０１３８】
等量（各１５ｕｇ）の各ｐＴＲ−ＡＡＶ６ライブラリーおよびＡｄヘルパープラスミド（ｐＸＸ６８０）を、ＰＥＩを使用した各１５０ｍｍ皿上の７０〜８０％コンフルエンシーの肝臓細胞（または、いくつかの実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞）にトランスフェクトして、すべての組み合わせのウイルスライブラリーを生成した。ＡＡＶライブラリーを、標準的な手順を使用して精製する。ＭＢ１１４細胞を１００ｍｍ組織培養皿に一晩播種して６０〜７０％コンフルエンスに到達させた後、１０００〜１０，０００の範囲のＭＯＩでＡＡＶライブラリーを接種した。形質導入２４時間後、マウスアデノウイルス（ＡＴＣＣ）ＭＡＶ−１をヘルパーウイルスとして添加して、ＡＡＶ複製を促進する。ＭＡＶ−１での感染６日後に（５０％ＣＰＥ）、上清を回収し、７日目にＤＮアーゼＩ耐性ベクターゲノムを定量した。次いで、複製しているＡＡＶ株および各感染ラウンドから得たＭＡＶ−１を含む培地を、合計で５ラウンドの進化のためのその後の各サイクルの接種材料として使用する。異なる順序および組み合わせの新規に進化した抗原フットプリントを含むＡＡＶキャプシドライブラリーを用いて、類似の様式でその後の進化の反復ラウンドを行う。
【０１３９】
新規に進化したＡＡＶ株の同定。
【０１４０】
親および進化したＡＡＶ６飽和ライブラリーの配列多様性を分析するために、ＤＮアーゼＩ耐性ベクターゲノムを培地から単離し、プライマー５’−ＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮｃａｇａａｃｔｃａａａａｔｃａｇｔｃｃｇｇａａｇｔ−３’（配列番号５）および５’−ＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮｇｃｃａｇｇｔａａｔｇｃｔｃｃｃａｔａｇｃ−３’（配列番号６）を使用した１０〜１８サイクルのＱ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）によって増幅させる。多重化のためのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ配列決定アダプターを、Ｐ５およびＰ７プライマーと共にＱ５ポリメラーゼを使用した２ラウンドのＰＣＲを介して付加した。各ＰＣＲラウンド後、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＰＣＲ  Ｍｉｃｒｏキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して産物を精製した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してアンプリコンの質を検証し、Ｑｕｂｉｔ分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して濃度を定量した。次いで、製造者の指示にしたがってＭｉＳｅｑ  ３００  Ｋｉｔ  ｖ２での配列決定のためのライブラリーを調製し、ＭｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定する。
【０１４１】
配列決定データの解析。脱多重化の読み取り値を、カスタムＰｅｒｌスクリプトによって解析する。簡潔に述べれば、未加工の配列決定ファイルを、目的の変異誘発領域について探索し、この領域内の異なるヌクレオチド配列の頻度をカウントし、各ライブラリーについて順位をつける。ヌクレオチド配列も翻訳し、これらのアミノ酸配列を同様にカウントし、順位をつける。次いで、ライブラリー間のアミノ酸配列の頻度を、Ｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓパッケージｖ３．２．４でプロットした。
各ライブラリー由来の選択されたクローンを特徴づけるために、ＤＮアーゼＩ耐性ベクターゲノムを培地から単離し、ＢｓｐＥＩ部位およびＳｂｆｌ部位に隣接するプライマーを使用したＰｈｕｓｉｏｎ  Ｉ  ＩＦ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）によって増幅させる。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＴＯＰＯクローニングベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）にサブクローン化し、標準的なＳａｎｇｅｒ配列決定のために発送した（Ｅｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。固有の配列を、ＢｓｐＥＩ部位およびＳｂｆｌ部位を使用してＡＡＶヘルパープラスミドバックボーン（ｐＸＲ）にサブクローン化する。固有の組換えＡＡＶ６バリアントを、上記の標準的なｒＡＡＶ産生プロトコールにしたがって産生する。
【０１４２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗体および血清中和アッセイ。
【０１４３】
２５マイクロリットルの抗体または抗血清（例えば、ＡＤＫ６抗体またはＡＡＶ１中和抗体）を、組織培養用の処理された黒色のガラス底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中で組換えＡＡＶ６ベクター（ＭＯＩ１，０００〜１０，０００）を含む等体積と混合し、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートする。次いで、５０μ１の培地中の合計５×１０４個の肝臓細胞（いくつかの実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞）を各ウェルに添加し、プレートを５％ＣＯ２下にて３７℃で４８時間インキュベートする。次いで、細胞を、２５μｌの１×受動的溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて室温で３０分間溶解する。ルシフェラーゼ活性を、２５μｌのルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の添加直後にＶｉｃｔｏｒ３マルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で測定する。全ての読み取り値を、抗体／抗血清で処置しない対照に対して正規化する。ｓｓＣＢＡ−Ｌｕｃ導入遺伝子をパッケージングしている組換えＡＡＶベクターをＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓで予め希釈し、このアッセイで利用する。
【０１４４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ抗体中和アッセイ。６〜８齢の雌ＢＡｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｙ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）の各後肢に、１：５００、１：５０、および１：５に希釈した異なるモノクローナル抗体、例えば、ＡＤＫ６およびＡＡＶ１中和抗体（例えば、４Ｅ４、５Ｈ７、およびＡＤＫｌａ）と予め混合したＣＢＡ−Ｌｕｃをパッケージングしている２×ｌ０１０個のＡＡＶを最終体積２０μｌで筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射する。注射４週間後に、ルシフェラーゼ活性を、マウスあたり１７５μｌのｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｄ−ルシフェリン（１２０ｍｇ／ｋｇ  Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ，Ｐｉｎｅｔｏｐ，ＡＺ）の腹腔内（ＬＰ．）注射の５分後にＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して測定する。ルシフェラーゼ活性を光子／秒／ｃｍ２／ｓｒとして測定し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ３．２ソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して分析する。
【０１４５】
免疫（ＡＡＶ６抗血清）による抗ＡＡＶ６マウス血清の生成。２０μｌＰＢＳ中の１×１０ｖｇのｗｔＡＡＶ６を、６〜８齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの各後肢に筋肉内注射する。全血を、注射４週間後に心穿刺によって採取し、標準的な凝固および遠心分離プロトコールを使用して血清を単離した。簡潔に述べれば、マウスの血液を室温で３０分間凝固させ、２０００ｇにて４℃で１０分間遠心分離する。全血清を５５℃で１５分間熱不活化し、−８０℃で保存する。
【０１４６】
マウスにおけるＡＡＶバリアントのｉｎ  ｖｉｖｏ特徴づけ。１×１０１１ｖｇの用量の、ｓｃＣＢｈ−ＧＦＰ導入遺伝子カセットをパッケージングしているＡＡＶベクターを含む２００μｌのＰＢＳを、Ｃ５７／Ｂ１６マウスに尾静脈を介して静脈内（ｌ．Ｖ．）注射する。マウスを注射３週間後に屠殺し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳを灌流する。複数の臓器（心臓、脳、肝臓、および腎臓が含まれる）を採取する。組織をビブラトームＶＴ１２００Ｓ（Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｌｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって５０μｍの薄切片にし、以前に記載の標準的な免疫組織化学３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色手順を使用してＧＦＰを染色する。３匹の異なるマウス由来の臓器あたり少なくとも３切片を、スライドスキャニングのために提出する。生体分布分析のために、１×１０１１ｖｇの、ｓｓＣＢＡ−ＬｕｃをパッケージングしているＡＡＶベクターを、前のＢａｌｂ／Ｃマウスに記載のようにＩ．Ｖ．注射する。注射２週間後にマウスを屠殺し、ＰＢＳで１回灌流する。複数の臓器（心臓、脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、および筋肉が含まれる）を採取した。ＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の指示にしたがって使用して、ＤＮＡを採取した。ベクターゲノムのコピー数を、ルシフェラーゼ導入遺伝子プライマー５’−ＣＣＴＴＣＧＣＴＴＣ  ＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＡＣ−３’（配列番号７）および５’−ＡＡＡＡＧＣ  ＡＣＴＣＴＧＡＴＴＧＡＣＡＡＡＴＡＣ−３’（配列番号８）を使用して、前述のように使用した定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって決定する。ウイルスゲノムのコピー数を、各サンプル中のマウスゲノムＤＮＡに対して正規化する。組織試料も、３回の４５ｓパルスのために周波数２０ｈｚでＱｉａｇｅｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＬｙｓｅｒＩＩを使用した１×ＰＬＢ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中での均質化によって、ルシフェラーゼ活性アッセイのために処理する。ホモジネートをスピンダウンし、２０μｌの上清を５０μｌのルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と混合し、Ｖｉｃｔｏｒ３マルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ．ＭＡ）を使用して直ちに測定した。
【０１４７】
４〜５ラウンドの進化を経た後の上記の飽和ライブラリーが、ヘパラン硫酸への結合能力を保持し、肝臓を形質導入し、依然として固有にＡＤＫ６抗体による中和を減少させたｒＡＡＶ６ビリオンを生成することが期待される。これらの改変ベクターはまた、ＡＤＫ１および他の交差反応性中和抗体による中和を減少させることが公知の改変アミノ酸領域と組み合わされるため、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの中和を回避する一方で、肝臓形質導入が保持される。
【０１４８】
配列
ＡＡＶ６キャプシドタンパク質ＶＰ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ΛΛΒ９５４５０）（配列番号１）
【化７】
2021519612.tif 000009
【０１４９】
表１：ＡＡＶ６に特異的な抗体
【表１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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