(57)【要約】本発明は、ヒトＦｃイプシロンＲ１アルファに結合する新規の全長ヒト抗体（単一特異性抗体）を提供する。本発明はまた、ＦｃイプシロンＲ１アルファおよびＣＤ３の両方に結合し、ＦｃイプシロンＲ１アルファを発現する細胞の存在下で、ＣＤ３複合体を介してＴ細胞を活性化する、新規の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）も提供する。本発明の二重特異性抗原結合分子は、上方制御または誘導されたＦｃイプシロンＲ１アルファ標的化免疫応答が望ましいかつ／または治療的に有益である疾患および障害の治療に有用である。例えば、本発明の二重特異性抗体は、アナフィラキシーを含むアレルギーの治療に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２５℃で、表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、約４７０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）値で、ヒトＦｃεＲ１αに結合するか、またはカニクイザルＦｃεＲ１αに結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
２５℃で、表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、約０．５４分超の解離半減期（ｔ１／２）でヒトＦｃεＲ１αに結合するか、または約０．６分超の解離半減期（ｔ１／２）でカニクイザルＦｃεＲ１αに結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体またはその抗原結合断片が、表１に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と、ヒトＦｃεＲ１αへの結合に対して競合する、請求項１〜２のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４】
前記参照抗体が、配列番号２／２６、１０／２６、および１８／２６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項３に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗体またはその抗原結合断片が、表１に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と同じヒトＦｃεＲ１α上のエピトープに結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２／２６、１０／２６、および１８／２６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と同じヒトＦｃεＲ１α上のエピトープに結合する、請求項５に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項７】
ヒトＦｃεＲ１αに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体または抗原結合断片が、（ａ）表１に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、（ｂ）表１に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲと、を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２／２６、１０／２６、および１８／２６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む、請求項７に記載の単離された抗体または抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体または抗原結合断片が、それぞれ配列番号４−６−８−２８−３０−３２、１２−１４−１６−２８−３０−３２、および２０−２２−２４−２８−３０−３２からなる群から選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項８に記載の単離された抗体または抗原結合断片。
【請求項１０】
ヒトＦｃεＲ１αに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号２、１０、および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２／２６、１０／２６、および１８／２６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１０に記載の単離された抗体または抗原結合断片。
【請求項１２】
ヒトＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトＦｃεＲ１αに結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子であって、前記第２の抗原結合ドメインが、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片に由来する、二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトおよび／またはカニクイザルＦｃεＲ１αに結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
前記抗原結合分子が、ヒトＣＤ３およびヒトＦｃεＲ１αの両方に結合し、約２０ｎＭ未満のＥＣ５０値でＦｃεＲ１αを発現する細胞のＴ細胞媒介性細胞死滅を誘導する、請求項１２または請求項１３に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
前記抗原結合分子が、ヒトＦｃεＲ１αを発現する対象におけるアレルギー反応を阻害する、請求項１２または請求項１３に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
前記抗原結合分子が、約４．９ｎＭ未満のＥＣ５０値でＣＤ３シグナル伝達を活性化する、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
前記第２の抗原結合ドメインが、２５℃で、インビトロ表面プラズモン共鳴結合アッセイで測定した場合、約４７０ｎＭ未満のＫＤ値で、特異的にヒトＦｃεＲ１αに結合するか、またはカニクイザルＦｃεＲ１αに結合する、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８】
前記第２の抗原結合ドメインが、２５℃で、インビトロ表面プラズモン共鳴結合アッセイで測定した場合、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、または約１００ｎＭ未満のＫＤ値で、ヒトＦｃεＲ１αに結合する、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１９】
ヒトＦｃεＲ１αに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号２、１０、および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）からの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）からの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含む、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０】
ヒトＦｃεＲ１αに結合する前記第２の抗原結合ドメインが、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含み、ＨＣＤＲ１が、配列番号４、１２、および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号６、１４、および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号８、１６、および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号２８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２１】
前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号４−６−８−２８−３０−３２、１２−１４−１６−２８−３０−３２、および２０−２２−２４−２８−３０−３２からなる群から選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項２０に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２２】
ヒトＦｃεＲ１αに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号２／２６、１０／２６、および１８／２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２３】
ヒトＣＤ３に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）からの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）からの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含む、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２４】
ヒトＣＤ３に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含み、ＨＣＤＲ１が、配列番号４４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号２８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項１２〜２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２５】
ヒトＣＤ３に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号４２／２６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１２〜２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２６】
単離された二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）配列番号４４、４６、および４８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号２８、３０、および３２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３ドメインと、を含む、第１の抗原結合ドメイン、ならびに（ｂ）配列番号４、６、および８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号２８、３０、および３２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３ドメインと、を含む、第２の抗原結合ドメイン、を含む、単離された二重特異性抗原結合分子。
【請求項２７】
単離された二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）配列番号４４、４６および４８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号２８、３０および３２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ドメインと、を含む第１の抗原結合ドメインであって、ヒトＣＲ３に結合する、第１の抗原結合ドメイン、ならびに（ｂ）配列番号１２、１４および１６のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号２８、３０および３２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ドメインと、を含む第２の抗原結合ドメインであって、ヒトＦｃεＲ１αに結合する、第２の抗原結合ドメイン、を含む、単離された二重特異性抗原結合分子。
【請求項２８】
単離された二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）配列番号４４、４６および４８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号２８、３０および３２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ドメインと、を含む第１の抗原結合ドメインであって、ヒトＣＤ３に結合する、第１の抗原結合ドメイン、ならびに（ｂ）配列番号２０、２２および２４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号２８、３０および３２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ドメインと、を含む第２の抗原結合ドメインであって、ヒトＦｃεＲ１αに結合する、第２の抗原結合ドメイン、を含む、単離された二重特異性抗原結合分子。
【請求項２９】
ＦｃεＲ１αへの結合に対して競合する、または参照抗体と同じＦｃεＲ１α上のエピトープに結合する、単離された二重特異性抗原結合分子であって、前記参照抗体が、配列番号４２／２６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む第１の抗原結合ドメインと、配列番号２／２６、１０／２６、および１８／２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む第２の抗原結合ドメインと、を含む、単離された二重特異性抗原結合分子。
【請求項３０】
ヒトＣＤ３への結合に対して競合する、または参照抗体と同じヒトＣＤ３上のエピトープに結合する、単離された二重特異性抗原結合分子であって、前記参照抗体が、配列番号４２／２６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む第１の抗原結合ドメインと、配列番号２／２６、１０／２６、または１８／２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む第２の抗原結合ドメインと、を含む、単離された二重特異性抗原結合分子。
【請求項３１】
前記抗体もしくはその抗原結合断片、または前記二重特異性抗原結合分子が、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の存在下で細胞表面に発現されるＦｃεＲ１αに結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項１２〜３０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３２】
二重特異性抗体である、請求項１２〜３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３３】
前記二重特異性抗体が、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含む、請求項３２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３４】
前記ヒトＩｇＧ重鎖定常領域が、アイソタイプＩｇＧ４である、請求項３３に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３５】
前記ヒトＩｇＧ重鎖定常領域が、アイソタイプＩｇＧ１である、請求項３３に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３６】
前記二重特異性抗体が、配列番号５６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３７】
前記二重特異性抗体が、配列番号５６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３８】
前記二重特異性抗体が、配列番号５６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号５４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３９】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項１２〜３８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードする、核酸分子。
【請求項４０】
請求項３９に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項４１】
請求項４０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項１２〜３８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含む、薬学的組成物。
【請求項４３】
抗体もしくはその抗原結合断片、または二重特異性抗原結合分子を産生する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項１２〜３８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子を、前記抗体もしくはその抗原結合断片、または二重特異性抗原結合分子の産生を可能にする条件下で発現する宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項４４】
対象におけるＦｃεＲ１αの発現および／またはシグナル伝達に関連する疾患または障害を治療するための方法であって、請求項４２に記載の薬学的組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４５】
ＦｃεＲ１αの発現および／またはシグナル伝達に関連する前記疾患または障害が、アレルギー、マスト細胞活性化障害、またはマスト細胞症である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記アレルギーが、アレルギー性喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎、慢性蕁麻疹、食物アレルギー、および花粉アレルギーからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記アレルギーが、アナフィラキシー性アレルギーである、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
第２の治療剤を、前記対象に投与することをさらに含む、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記第２の治療剤が、ＩｇＥアンタゴニスト、抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、コルチコステロイド、ロイコトリエンアンタゴニスト、マスト細胞阻害剤、気管支拡張剤、鬱血除去剤、エピネフリン、ＩＬ−４阻害剤、ＩＬ−４受容体阻害剤、ＩＬ−３３アンタゴニスト、ＩＬ−２５アンタゴニスト、形質細胞除去剤、およびＴＳＬＰアンタゴニストからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＦｃεＲ１αの発現および／またはシグナル伝達に関連する疾患または障害の治療における、請求項４２に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項５１】
前記疾患または障害が、アレルギー、マスト細胞活性化障害、またはマスト細胞症である、請求項５０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年８月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／７２１，９２１号に関し、その優先権を主張する。前述の出願の内容全体は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
本出願では、ファイル１０４８０ＷＯ０１＿１１８００３−４５３２０＿ＳＬ．ｔｘｔ（２０１９年８月２１日に作成、６７，３０７バイトを含む）としての配列表が、コンピュータ可読形態で提出され、参照により組み込まれる。
【０００３】
本発明は、ＦｃεＲ１αに特異的な抗体およびその抗原結合断片、ならびにそれらの使用方法に関する。本発明はまた、ＦｃεＲ１αおよびＣＤ３に結合する二重特異性抗原結合分子、ならびにそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＦｃεＲ１は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する高親和性Ｆｃ受容体であり、ＦｃεＲ１は、約１０−１０Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）値でＩｇＥに結合する。アレルゲン結合ＩｇＥによるＦｃεＲ１受容体の架橋は、細胞脱顆粒およびその後のアレルギー応答をもたらし、ＩｇＥの血清レベルは、ＦｃεＲ１と正に相関する。
【０００５】
ヒトＦｃεＲ１は、マスト細胞、好塩基球、単球、マクロファージ、ｍＤＣ、ｐＤＣ、ランゲルハンス細胞、好酸球、および血小板で発現する。マスト細胞および好塩基球は、ＩｇＥ受容体ＦｃεＲ１αのアレルゲン媒介架橋を介したアレルギーおよびアナフィラキシーに役割を果たす自然エフェクター細胞である。他の役割としては、創傷治癒および粘膜免疫が含まれる。
【０００６】
ヒト多量体細胞表面ＦｃεＲ１受容体には、四量体形態と三量体形態の２種類がある。四量体ヒトＦｃεＲ１は、α鎖、β鎖、およびホモ二量体のγ鎖（αβγ２）を含み、三量体ヒトＦｃεＲ１は、α鎖およびホモ二量体のγ鎖（αγ２）を含む。ＦｃεＲ１のα鎖は、単一のＩｇＥ抗体分子に結合するが、リガンド結合におけるβ鎖およびγ鎖の役割は報告されていない。
【０００７】
ヒトＦｃεＲ１は、ヒトおよびマウスの両方のＩｇＥに結合し、インターロイキン−４（ＩＬ−４）は、ヒトにおけるα鎖の発現を増強する。対照的に、マウスＦｃεＲ１は、四量体αβγ２アイソフォームのみを有し、マスト細胞および好塩基球で発現している。ＩＬ−４は、マウスＦｃεＲ１のα鎖の発現を増強しない。
【０００８】
ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）と共にＴ細胞上に発現されるホモ二量体またはヘテロ二量体抗原であり、Ｔ細胞活性化に必要とされる。機能的ＣＤ３は、４つの異なる鎖：イプシロン、ゼータ、デルタ、およびガンマのうちの２つの二量体会合から形成される。ＣＤ３の二量体配置は、ガンマ／イプシロン、デルタ／イプシロン、およびゼータ／ゼータを含む。ＣＤ３に対する抗体はＴ細胞上でＣＤ３をクラスター化し、それによってペプチド負荷ＭＨＣ分子によるＴＣＲの関与と同様の様式でＴ細胞活性化を引き起こすことが示されている。したがって、抗ＣＤ３抗体はＴ細胞の活性化を含む治療目的のために提案されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＦｃεＲ１αを標的化する抗原結合分子、ならびにＦｃεＲ１αおよびＣＤ３の両方に結合する二重特異性抗原結合分子は、ＦｃεＲ１αを発現する細胞を特異的に標的化し、Ｔ細胞媒介的に死滅させることが望まれる治療設定において有用であり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
第１の態様では、本発明は、ヒトＦｃεＲ１αに結合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。この態様による抗体は、とりわけ、ＦｃεＲ１αを発現する細胞を標的化するために有用である。本発明はまた、ヒトＦｃεＲ１αおよびヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体およびその抗原結合断片も提供する。この態様による二重特異性抗体は、とりわけ、ＣＤ３を発現するＴ細胞を標的化するため、およびＴ細胞活性化を刺激するために、例えば、ＦｃεＲ１αを発現する細胞のＴ細胞媒介性の死滅が有益または望ましい状況下で有用である。例えば、二重特異性抗体は、マスト細胞または好塩基球などの特定のＦｃεＲ１α発現細胞に、ＣＤ３媒介性のＴ細胞活性化を導くことができる。
【００１１】
本発明の例示的な抗ＦｃεＲ１α抗体を、本明細書の表１および２に列挙する。表１は、例示的な抗ＦｃεＲ１α抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、ならびに重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）、重鎖（ＨＣ）、および軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列識別子を示す。表２は、例示的な抗ＦｃεＲ１α抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣ、およびＬＣをコードする核酸分子の配列識別子を示す。
【００１２】
本発明は、抗体、またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００１３】
本発明はまた、抗体、またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００１４】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかと対をなす表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含む、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態によると、本発明は、表１に列挙される例示的な抗ＦｃεＲ１α抗体のいずれかに含まれるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号２／２６、１０／２６、または１８／２６（例えば、ｍＡｂ１７１１０、ｍＡｂ１７１１１、またはｍＡｂ１７１１２）のものである。
【００１５】
本発明はまた、抗体、またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００１６】
本発明はまた、抗体、またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００１７】
本発明はまた、抗体、またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００１８】
本発明はまた、抗体、またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）は、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００１９】
本発明はまた、抗体、またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００２０】
本発明はまた、抗体、またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００２１】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかと対をなす表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含む、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態によると、本発明は、表１に列挙される例示的な抗ＦｃεＲ１α抗体のいずれかに含まれるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号８／３２、１６／３２、または２４／３２（例えば、ｍＡｂ１７１１０、ｍＡｂ１７１１１、またはｍＡｂ１７１１２）のものである。
【００２２】
本発明はまた、表１に列挙される例示的な抗ＦｃεＲ１α抗体のいずれかに含まれる６つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）のセットを含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号４−６−８−２８−３０−３２、１２−１４−１６−２８−３０−３２、または２０−２２−２４−２８−３０−３２（例えば、ｍＡｂ１７１１０、ｍＡｂ１７１１１、またはｍＡｂ１７１１２）からなる群から選択される。
【００２３】
関連する実施形態では、本発明は、抗体またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙される例示的な抗ＦｃεＲ１α抗体のいずれかによって定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対に含まれる６つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）のセットを含む。例えば、本発明は、抗体またはその抗原結合断片を含み、配列番号２／２６、１０／２６、または１８／２６（例えば、ｍＡｂ１７１１０、ｍＡｂ１７１１１、またはｍＡｂ１７１１２）のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対に含まれるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを特定するための方法および技術は、当技術分野で既知であり、本明細書に開示される特定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを特定するために使用することができる。ＣＤＲの境界を特定するために使用することができる例示的規則には、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が含まれる。概して、Ｋａｂａｔ定義は、配列可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造ループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔアプローチとＣｈｏｔｈｉａアプローチとの間の折衷である。例えば、Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７）、およびＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９２６８−９２７２（１９８９）を参照されたい。公開データベースは、抗体内のＣＤＲ配列を特定するためにも利用可能である。
【００２４】
本発明はまた、抗ＦｃεＲ１α抗体またはその一部をコードする核酸分子も提供する。例えば、本発明は、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００２５】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００２６】
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００２７】
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００２８】
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００２９】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００３０】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００３１】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００３２】
本発明はまた、ＨＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ＨＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に列挙される例示的な抗ＦｃεＲ１α抗体のいずれかによって定義される通りである。
【００３３】
本発明はまた、ＬＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ＬＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含み、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に列挙される例示的な抗ＦｃεＲ１α抗体のいずれかによって定義される通りである。
【００３４】
本発明はまた、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子を提供し、ＨＣＶＲは、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、および表２に列挙されるＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。本発明のこの態様による特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは共に、表１に列挙される同じ抗ＦｃεＲ１α抗体に由来する。
【００３５】
本発明はまた、抗ＦｃεＲ１α抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組み換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子のいずれか、すなわち、表１に記載のＨＣＶＲ配列、ＬＣＶＲ配列、および／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターを含む。また、かかるベクターが導入された宿主細胞、ならびに抗体または抗体断片の産生を可能にする条件下で、宿主細胞を培養し、そのように産生された抗体および抗体断片を回収することによって、抗体またはその一部を産生する方法も含まれる。
【００３６】
本発明は、修飾グリコシル化パターンを有する抗ＦｃεＲ１α抗体を含む。一部の実施形態では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾、または、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増大させるためのオリゴ糖鎖上に存在するフルクトース部分を欠失している抗体が有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ  ２７７：２６７３３を参照）。他の用途において、ガラクトシル化の修飾は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を修飾するために行うことができる。
【００３７】
別の態様では、本発明は、ＦｃεＲ１αに特異的に結合する組換えヒト抗体またはその断片と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、抗ＦｃεＲ１α抗体と、第２の治療剤との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療剤は、抗ＦｃεＲ１α抗体と有利に組み合わされる任意の薬剤である。本発明の抗ＦｃεＲ１α抗体を伴う追加の併用療法および共製剤は、本明細書の他箇所に開示される。
【００３８】
別の態様では、本発明は、本発明の抗ＦｃεＲ１α抗体を使用して、ＦｃεＲ１α発現細胞（例えば、マスト細胞または好塩基球）を標的化／死滅するための治療方法を提供し、これらの治療方法は、本発明の抗ＦｃεＲ１α抗体を含む治療有効量の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。場合によっては、抗ＦｃεＲ１α抗体（またはその抗原結合断片）は、アレルギーを治療するために使用され得るか、または、限定されないが、ＡＤＣＣを増大させるための修飾Ｆｃドメイン（例えば、Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ  ２７７：２６７３３を参照）、放射免疫療法、抗体薬物複合体、またはＦｃεＲ１α発現細胞の死滅の効率を増大させるための他の方法を含む方法によってより細胞傷害性であるように修飾され得る。
【００３９】
本発明はまた、ＦｃεＲ１α発現細胞に関連するかまたはそれに起因する疾患または障害（例えば、アレルギー）の治療のための薬剤の製造における、本発明の抗ＦｃεＲ１α抗体の使用を含む。
【００４０】
さらに別の態様では、本発明は、例えば、イメージング試薬などの診断用途のための単一特異性抗ＦｃεＲ１α抗体を提供する。
【００４１】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＤ３抗体または抗体の抗原結合部分を使用して、Ｔ細胞活性化を刺激するための治療方法を提供し、これらの治療方法は、本発明の抗体を含む治療有効量の薬学的組成物を投与することを含む。
【００４２】
別の態様では、本発明は、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供し、２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、約２５０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で、ヒトＦｃεＲ１αに結合するか、またはカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＦｃεＲ１αに結合する。さらに別の態様では、本発明は、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供し、２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、約０．５４分超の解離半減期（ｔ１／２）でヒトＦｃεＲ１αに結合するか、または約０．６分超の解離半減期（ｔ１／２）でカニクイザルＦｃεＲ１αに結合する。
【００４３】
本発明はさらに、抗体または抗原結合断片を提供し、ヒトＦｃεＲ１αへの結合に対して、表１に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と競合する。別の態様では、本発明は、抗体または抗原結合断片を提供し、ヒトＦｃεＲ１αへの結合に対して、配列番号２／２６、１０／２６、および１８／２６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と競合する。
【００４４】
本発明はさらに、抗体または抗原結合断片を提供し、抗体またはその抗原結合断片は、表１に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体として、ヒトＦｃεＲ１α上の同じエピトープに結合する。別の態様では、抗体または抗原結合断片は、配列番号２／２６、１０／２６、および１８／２６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体として、ヒトＦｃεＲ１α上の同じエピトープに結合する。
【００４５】
本発明はさらに、ヒトＦｃεＲ１αに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、表１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、表１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲと、を含む。別の態様では、単離された抗体または抗原結合断片は、２／２６、１０／２６、および１８／２６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む。さらに別の態様では、単離された抗体または抗原結合断片は、それぞれ、配列番号４−６−８−２８−３０−３２、１２−１４−１６−２８−３０−３２、および２０−２２−２４−２８−３０−３２からなる群から選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む。
【００４６】
別の態様では、本発明は、ヒトＦｃεＲ１αに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、（ａ）配列番号２、１０、および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、（ｂ）アミノ酸配列番号２６を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、を含む。さらなる態様では、単離された抗体または抗原結合断片は、配列番号２／２６、１０／２６、および１８／２６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【００４７】
別の態様によると、本発明は、ＦｃεＲ１αおよびＣＤ３に結合する二重特異性抗原結合分子（例えば、抗体）を提供する。本明細書において、かかる二重特異性抗原結合分子はまた、「抗ＦｃεＲ１α／抗ＣＤ３二重特異性分子」、「抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性分子」、「抗ＦｃεＲ１α×ＣＤ３」、「抗ＣＤ３×ＦｃεＲ１α」、または「ＦｃεＲ１α×ＣＤ３  ｂｓＡｂ」とも呼ばれる。抗ＦｃεＲ１α／抗ＣＤ３二重特異性分子の抗ＦｃεＲ１α部分は、ＦｃεＲ１α（例えば、マスト細胞または好塩基球）を発現する細胞を標的化するのに有用であり、二重特異性分子の抗ＣＤ３部分は、Ｔ細胞を活性化するのに有用である。マスト細胞または好塩基球上のＦｃεＲ１αおよびＴ細胞上のＣＤ３の同時結合は、活性化Ｔ細胞によって標的マスト細胞または標的好塩基球の特異的死滅（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ）（細胞溶解）を促進する。したがって、本発明の抗ＦｃεＲ１α／抗ＣＤ３二重特異性分子は、とりわけ、ＦｃεＲ１α発現細胞に関連または起因する疾患および障害（例えば、アレルギー）を治療するために有用である。
【００４８】
本発明のこの態様による二重特異性抗原結合分子は、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、およびＦｃεＲ１αに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。本発明は、各抗原結合ドメインが、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と対をなす重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、抗ＦｃεＲ１α／抗ＣＤ３二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）を含む。本発明の特定の例示的な実施形態では、抗ＣＤ３抗原結合ドメインおよび抗ＦｃεＲ１α抗原結合ドメインの各々が、共通のＬＣＶＲと対をなす異なる別個のＨＣＶＲを含む。例えば、本明細書の実施例１に例証されるように、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体を構築し、第１の抗原結合ドメインは、それぞれ抗ＣＤ３抗体に由来するＨＣＶＲおよびＬＣＶＲと、ＦｃεＲ１αに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、第２の抗原結合ドメインは、同じＬＣＶＲと対をなす抗ＦｃεＲ１α抗体に由来するＨＣＶＲを含む。かかる実施形態では、第１および第２の抗原結合ドメインは、別個の抗ＣＤ３および抗ＦｃεＲ１αのＨＣＶＲを含むが、共通のＬＣＶＲを共有する。このＬＣＶＲのアミノ酸配列は、例えば、配列番号２６に示され、対応するＣＤＲのアミノ酸配列（すなわち、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）は、配列番号２８、３０および３２にそれぞれ示される。遺伝子改変マウスを使用して、２つの異なるヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントのうちの１つに由来する可変ドメインを含む同一の軽鎖と会合する２つの異なる重鎖を含む、完全ヒト型二重特異性抗原結合分子を産生することできる。あるいは、可変重鎖を１つの共通の軽鎖と対合させ、宿主細胞で組換え発現することができる。このため、本発明の抗体は、単一の再編成された軽鎖と会合する免疫グロブリン重鎖を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む。他の実施形態では、軽鎖は、ヒトＪκ５またはヒトＪκ１の遺伝子セグメントと再編成されたヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む（ＷＯ２０１７／０５３８５６、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４９】
本発明は、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性分子を提供し、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、２０１４年３月２７日に公開された米国公開第２０１４／００８８２９５号および２０１８年４月１２日に公開されたＷＯ２０１８／０６７３３１に記載されているように、ＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれか、ＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれか、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸対のいずれか、重鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ２−ＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか、または軽鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ２−ＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含む。
【００５０】
加えて、本発明は、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性分子を提供し、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表３に記載されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含む。また、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表１および３に記載されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含んでもよい。また、本発明は、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性分子を提供し、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表３に記載される重鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ２−ＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか、および／または本明細書の表１、および表３に記載される軽鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ２−ＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含む。
【００５１】
特定の実施形態によると、本発明は、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性分子を提供し、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表１に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００５２】
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性分子を提供し、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表１および３に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００５３】
本発明は、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性分子を提供し、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表３に記載されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列対を含む。
【００５４】
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性分子を提供し、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表３に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列と、本明細書の表１および３に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、を含む。
【００５５】
特定の実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表３に記載されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
【００５６】
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子を提供し、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表３に記載されるアミノ酸を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、表３に記載されるアミノ酸を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、表３に記載されるアミノ酸を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、本明細書の表１および３に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、本明細書の表１および３に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、本明細書の表１および３に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、を含む。
【００５７】
特定の非限定的で例示的な抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインを含み、それぞれ、本明細書の表３に記載されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む。
【００５８】
本発明はさらに、二重特異性抗原結合分子を提供し、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、表３に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）からの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、表１および３に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）からの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含む。
【００５９】
別の態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）からの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）からの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含む。
【００６０】
本発明はさらに、二重特異性抗原結合分子を提供し、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号４４−４６−４８−２８−３０−３２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３を含む。
【００６１】
さらなる態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号４２／２６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む。
【００６２】
より多くの実施形態では、本発明の例示的な抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子は、二重特異性抗原結合分子を含み、第１の抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ３に特異的に結合し、配列番号４４−４６−４８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲを含む。
【００６３】
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性分子を提供し、ＦｃεＲ１αに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号２、１０、および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００６４】
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性分子を提供し、ＦｃεＲ１αに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００６５】
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性分子を提供し、ＦｃεＲ１αに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号２／２６、１０／２６、および１８／２６からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列対を含む。
【００６６】
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性分子を提供し、ＦｃεＲ１αに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号８、１６、および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列と、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、を含む。
【００６７】
特定の実施形態では、ＦｃεＲ１αに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号８／３２、１６／３２、および２４／３２からなる群から選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
【００６８】
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子を提供し、ＦｃεＲ１αに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号４、１２、および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、配列番号６、１４、および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、配列番号８、１６、および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ3（ＨＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、を含む。
【００６９】
本発明の特定の非限定的で例示的な抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子は、それぞれ、配列番号４−６−８−２８−３０−３２、１２−１４−１６−２８−３０−３２、および２０−２２−２４−２８−３０−３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む、ＦｃεＲ１αに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。
【００７０】
関連する実施形態では、本発明は、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子を含み、ＦｃεＲ１αに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号２／２６、１０／２６、および１８／２６からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列に含まれる重鎖および軽鎖ＣＤＲドメインを含む。
【００７１】
別の態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、（ａ）それぞれ配列番号４４、４６、および４８のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号２８、３０、および３２のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と、を含む第１の抗原結合ドメインであって、ヒトＣＤ３に特異的に結合する、第１の抗原結合ドメイン、ならびに（ｂ）３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含む第２の抗原結合ドメインであって、ＨＣＤＲ１が、配列番号４、１２、および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号６、１４、および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号８、１６、および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号２８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合アームがヒトＦｃεＲ１αに特異的に結合する、第２の抗原結合ドメイン、を含む。
【００７２】
別の態様では、本発明は、ヒトＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトＦｃεＲ１αに結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合分子を提供し、第２の抗原結合ドメインは、本発明の抗ＦｃεＲ１α抗体のいずれか１つの抗体または抗原結合断片に由来する。さらなる態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトＦｃεＲ１αに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む。
【００７３】
本発明は、ヒトＣＤ３を発現するヒト細胞に結合する二重特異性抗原結合分子をさらに提供する。別の態様では、二重特異性抗原結合分子は、ヒトＦｃεＲ１αを発現するヒト細胞および／またはカニクイザルＦｃεＲ１αを発現する細胞に結合する。
【００７４】
別の態様では、本発明は、ヒトＦｃεＲ１αを発現する対象（例えば、マウス）においてアレルギー反応を阻害する二重特異性抗原結合分子を提供する。本発明はさらに、ヒトＦｃεＲ１αを発現する対象（例えば、マウス）において好塩基球または他のＦｃεＲ１α発現細胞を枯渇させる二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００７５】
別の態様では、本発明は、第２の抗原結合分子を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、ＩｇＥの存在下または不在下、２００を超える結合比でヒトＦｃεＲ１αを発現する標的細胞に特異的に結合するか、またはＩｇＥの存在下、１４０を超える結合比でカニクイザルＦｃεＲ１αに結合し、かかる結合比は、インビトロＦＡＣＳ結合アッセイにおいて測定される。
【００７６】
一部の実施形態では、抗原結合分子は、例えば、ＦｃεＲ１α発現細胞が好塩基球であるインビトロＴ細胞媒介性細胞死滅アッセイにおいて測定されるように、約２０ｎＭ未満のＥＣ５０値でＦｃεＲ１α発現のＴ細胞媒介性死滅を誘発する。
【００７７】
一部の用途では、第２の抗原結合ドメインは、２５℃でのインビトロ表面プラズモン共鳴結合アッセイで測定した場合、約４６７ｎＭ未満のＫＤ値で、ヒトまたはカニクイザルＦｃεＲ１αに結合する。一部の事例では、第２の抗原結合ドメインは、約４５０ｎＭ未満、約４００ｎＭ未満、約３５０ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満のＫＤ値で、ヒトＦｃεＲ１αおよびカニクイザルＦｃεＲ１αの各々に結合する。
【００７８】
特定の実施形態では、本発明の抗ＦｃεＲ１α抗体、その抗原結合断片、およびその二重特異性抗体は、生殖系列配列と親抗体配列との間の差に基づいて、親のアミノ酸残基を段階的に置換することによって作製された。
【００７９】
別の態様では、本発明は、ヒトＦｃεＲ１αへの結合に対して競合する、または参照抗体としてヒトＦｃεＲ１α上の同じエピトープに結合する、単離された二重特異性抗原結合分子を提供し、参照抗体は、配列番号４２／２６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む第１の抗原結合ドメインと、配列番号２／２６、１０／２６または１８／２６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む第２の抗原結合ドメインと、を含む。
【００８０】
別の態様では、本発明は、ヒトＣＤ３への結合に対して競合する、または参照抗体としてヒトＣＤ３上の同じエピトープに結合する、単離された二重特異性抗原結合分子を提供し、参照抗体は、配列番号４２／２６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む第１の抗原結合ドメインと、配列番号２／２６、１０／２６、または１８／２６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む第２の抗原結合ドメインと、を含む。
【００８１】
上記または本明細書で論じられる二重特異性抗原結合分子のいずれも、二重特異性抗体であり得る。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、アイソタイプＩｇＧ１である。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、アイソタイプＩｇＧ４である。様々な実施形態において、二重特異性抗体は、同じアイソタイプの野生型ヒンジと比較して、Ｆｃγ受容体結合を減少させるキメラヒンジを含む。
【００８２】
本発明はまた、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列対（ＨＣ／ＬＣ）を含む抗体、またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されるＬＣアミノ酸配列と対をなす表１に列挙されるＨＣアミノ酸配列のいずれかを含む。特定の実施形態によると、本発明は、表１に列挙される例示的な抗ＦｃεＲ１α抗体のいずれかに含まれるＨＣ／ＬＣアミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、ＨＣ／ＬＣアミノ酸配列対は、配列番号３４／４０、３６／４０、および３８／４０からなる群から選択される。
【００８３】
本発明はまた、二重特異性抗体またはその抗原結合断片を提供し、表７に列挙されるＨＣアミノ酸配列またはＬＣアミノ酸配列のいずれかを含む、第１の重鎖、第２の重鎖、および共通の軽鎖を含む。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む第１のＨＣと、配列番号５０、５２、および５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２のＨＣと、配列番号４０のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と、を含む。
【００８４】
一態様では、本発明は、抗ＦｃεＲ１α抗原結合分子または抗ＦｃεＲ１α／抗ＣＤ３二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含む、薬学的組成物を提供する。本発明は、対象におけるＦｃεＲ１α関連疾患、アレルギーまたはＩｇＥ関連疾患を治療するための方法をさらに提供し、対象に、抗ＦｃεＲ１α抗原結合分子または抗ＦｃεＲ１α／抗ＣＤ３二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む薬学的組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、アレルギーまたは他のＩｇＥ関連疾患は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、アナフィラキシー、アトピー性皮膚炎、慢性蕁麻疹、食物アレルギー、通年性アレルギー、薬物アレルギー、および花粉アレルギーからなる群から選択される。一実施形態では、アレルギーは、重度のアレルギーである。場合によっては、アレルギーは、アナフィラキシーをもたらす。特定の実施形態では、ＦｃεＲ１α関連疾患は、重度のアレルギー、マスト細胞活性化障害またはマスト細胞症を含む。特定の実施形態では、アレルギーを治療するための方法は、本明細書の他箇所に記載されるように、特定の用量で抗ＦｃεＲ１α抗原結合分子または抗ＦｃεＲ１α／抗ＣＤ３二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００８５】
別の態様では、本発明は、本明細書に開示される抗ＦｃεＲ１αおよび抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、本明細書の表２および４に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、ならびに表２および４に記載されるポリヌクレオチド配列のうちの２つ以上をその任意の機能的組み合わせまたは配置で含む核酸分子を含む。本発明の核酸を保有する組み換え発現ベクター、およびかかるベクターが導入された宿主細胞もまた、抗体の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって、および産生された抗体を回収することによって、抗体を産生する方法と同様に本発明に含まれる。
【００８６】
本発明は、表７に列挙される重鎖アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、表７に列挙される軽鎖アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。
【００８７】
本発明は、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子を含み、ＣＤ３に特異的に結合する前述の抗原結合ドメインのうちのいずれかが、ＦｃεＲ１αに特異的に結合する前述の抗原結合ドメインのいずれかと組み合わされ、連結され、または他の方法で関連付けられて、ＣＤ３およびＦｃεＲ１αに結合する二重特異性抗原結合分子を形成する。
【００８８】
本発明は、修飾グリコシル化パターンを有する抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子を含む。一部の用途では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾が有用であり、または、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増大させるためのオリゴ糖鎖上に存在するフルクトース部分を欠失している抗体が有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ  ２７７：２６７３３を参照）。他の用途において、ガラクトシル化の修飾は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を修飾するために行うことができる。
【００８９】
別の態様では、本発明は、薬学的組成物を提供し、本明細書に開示される抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容される担体と、を含む。関連する態様では、本発明は、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子と第２の治療剤との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療剤は、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子と有利に組み合わされる任意の薬剤である。抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子と有利に組み合わせることができる例示的な薬剤は、本明細書の他箇所で詳細に論じられている。
【００９０】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子を使用してＦｃεＲ１αを発現する細胞を標的化／死滅するための治療方法を提供し、これらの治療方法は、本発明の抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子を含む治療有効量の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。抗体またはその断片は、皮下、静脈内、皮膚内、腹腔内、経口、または筋肉内に投与され得る。特定の実施形態では、本発明の抗体は、対象の約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。特定の実施形態では、本発明の抗体は、１ｍｇ〜２５００ｍｇの抗体を含む用量で、それを必要とする対象に投与される。
【００９１】
本発明はまた、ＦｃεＲ１α発現細胞に関連または起因する疾患または障害の治療のための薬剤の製造における、本発明の抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子の使用を含む。
【００９２】
他の実施形態は、後述の詳細な説明の精査から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
本発明を説明する前に、本発明は、特定の方法および説明される実験条件が変わり得るので、かかる方法および条件に制限されないことは理解されることになっている。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを企図するものではないことも理解されるべきである。
【００９４】
別段定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」との表現は、９９および１０１、ならびにその間の全値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【００９５】
本明細書に説明されるものと類似のまたは等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書で言及される特許、出願、および非特許刊行物はすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９６】
定義
本明細書で使用される「ＣＤ３」という表現は、多分子Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の一部としてＴ細胞上に発現され、４つの受容体鎖：ＣＤ３−イプシロン、ＣＤ３−デルタ、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ３−ガンマのうち２つの会合から形成されるホモ二量体またはヘテロ二量体からなる抗原を指す。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、およびタンパク質断片についてのすべての言及は、非ヒト種由来であることが明確に特定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質断片のヒト型を指すことを意図している。したがって、「ＣＤ３」という表現は、非ヒト種、例えば「マウスＣＤ３」、「サルＣＤ３」などに由来するものとして特定されない限り、ヒトＣＤ３を意味する。ヒトＣＤ３−イプシロンは、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含み、ヒトＣＤ３−デルタは、配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３−ゼータは、配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３−ガンマは、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含む。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３に結合する抗体」または「抗ＣＤ３抗体」は、単一のＣＤ３サブユニット（例えば、イプシロン、デルタ、ガンマ、またはゼータ）を特異的に認識する抗体およびその抗原結合断片、ならびに２つのＣＤ３サブユニットの二量体複合体を特異的に認識する抗体およびその抗原結合断片（例えば、ガンマ／イプシロン、デルタ／イプシロン、およびゼータ／ゼータＣＤ３二量体）を含む。本発明の抗体および抗原結合断片は、可溶性ＣＤ３および／または細胞表面発現ＣＤ３に結合することができる。可溶性ＣＤ３には、天然ＣＤ３タンパク質、ならびに膜貫通ドメインを欠くかまたは細胞膜と会合していない、例えば単量体および二量体ＣＤ３構築物などの組換えＣＤ３タンパク質変異体が含まれる。
【００９８】
本明細書で使用される場合、表現「細胞表面発現ＣＤ３」は、インビトロまたはインビボで細胞表面上に発現される１つ以上のＣＤ３タンパク質（複数可）を意味し、ＣＤ３タンパク質の少なくとも一部は細胞膜の細胞外側に曝され、抗体の抗原結合部分に接近可能である。「細胞表面発現ＣＤ３」としては、細胞膜内の機能的Ｔ細胞受容体の中に含まれるＣＤ３タンパク質が挙げられる。「細胞表面発現ＣＤ３」という表現は、細胞の表面上のホモ二量体またはヘテロ二量体の一部として発現されるＣＤ３タンパク質（例えば、ガンマ／イプシロン、デルタ／イプシロン、およびゼータ／ゼータＣＤ３二量体）を含む。「細胞表面発現ＣＤ３」という表現はまた、他のＣＤ３鎖型なしで、細胞の表面上にそれ自体で発現するＣＤ３鎖（例えば、ＣＤ３−イプシロン、ＣＤ３−デルタ、またはＣＤ３−ガンマ）も含む。あるいは、「細胞表面発現ＣＤ３」は、通常ＣＤ３タンパク質を発現する細胞の表面上に発現されるＣＤ３タンパク質を含むかまたはそれからなることができる。あるいは、「細胞表面発現ＣＤ３」は、通常その表面にヒトＣＤ３を発現しないがその表面にＣＤ３を発現するように人工的に操作されている細胞の表面上に発現されるＣＤ３タンパク質を含むかまたはそれからなることができる。
【００９９】
本明細書で使用される「ＦｃεＲ１α」という表現は、ＩｇＥに対する高親和性Ｆｃ受容体（ＦｃεＲ１）のα鎖を指す。ＦｃεＲ１αは、ＩｇＥのＦｃεＲ１への結合に関与する。ＦｃεＲ１αは、マスト細胞、好塩基球、単球、マクロファージ、ｍＤＣ、ｐＤＣ、ランゲルハンス細胞、好酸球、および血小板で発現する。ヒトＦｃεＲ１αのアミノ酸配列は、配列番号６３として記載される。「ＦｃεＲ１α」という用語は、組換えＦｃεＲ１αタンパク質またはその断片を含む。この用語はまた、ＦｃεＲ１αタンパク質またはその断片が、例えば、ヒスチジンタグ、マウスもしくはヒトＦｃ、またはＲＯＲ１（例えば、配列番号５７もしくは５８）などのシグナル配列に結合したものも包含する。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「ＦｃεＲ１αに結合する抗体」または「抗ＦｃεＲ１α抗体」は、ＦｃεＲ１αを特異的に認識する抗体およびその抗原結合断片を含む。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「ＦｃεＲ１αの発現に関連する疾患または障害」という用語は、ＦｃεＲ１αの発現および／または活性（例えば、シグナル伝達）の阻害、ならびに／あるいはＦｃεＲ１αを発現する細胞の除去（ａｂｌａｔｉｏｎ）が、障害の症状および／または進行を軽減することが予想される任意の疾患または障害を含む。例えば、かかる疾患および障害としては、限定されないが、マスト細胞活性化障害、マスト細胞症、およびアレルギー（食物アレルギー、花粉アレルギー、ペットフケアレルギーなどが含まれるが、これらに限定されない）が挙げられる。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「アレルギー」という用語は、環境中の物質（アレルゲン）に対する免疫系の過敏性によって引き起こされる状態を指す。アレルギーとしては、アレルギー性喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎、慢性蕁麻疹、食物アレルギー、ペットフケアレルギー、および花粉アレルギーが挙げられるが、これらに限定されない。アレルギーの症状としては、蕁麻疹（例えば、じんましん）、血管浮腫、鼻炎、喘息、嘔吐、くしゃみ、鼻水、息切れ、副鼻腔炎、涙目、喘鳴、気管支痙攣、最大呼気流量の減少（ＰＥＦ）、胃腸障害、潮紅、唇の腫れ、舌の腫れ、血圧の低下、アナフィラキシー、ならびに臓器障害／不全が挙げられる得るが、これらに限定されない。一実施形態では、アレルギーは、アナフィラキシー性アレルギーであり、これは、死亡を引き起こし得る重篤な形態のアレルギーである。アナフィラキシーの症状としては、発疹、喉または舌の腫れ、気道の腫れ、息切れ、嘔吐、意識朦朧、低血圧などが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「アレルゲン」という用語は、感受性の個体においてアレルギー応答を刺激し得る任意の物質、化学物質、粒子または組成物を含む。アレルゲンは、例えば、乳製品（例えば、牛乳）、卵、セロリ、ゴマ、小麦、大豆、魚、貝、糖（例えば、アルファ−ガラクトースなどの肉に存在する糖）、ピーナッツ、他の豆類（例えば、豆、エンドウ豆、大豆など）、および木の実などの食品アイテムに含まれるか、またはそれらに由来し得る。あるいは、アレルゲンは、例えば、粉塵（例えば、チリダニを含む）、花粉、昆虫毒（例えば、ミツバチ、スズメバチ、カ、ヒアリなどの毒）、カビ、動物の毛皮、動物のフケ、ウール、ラテックス、金属（例えば、ニッケル）、家庭用洗剤、洗剤、薬剤、化粧品（例えば、香料など）、薬物（例えば、ペニシリン、スルホンアミド、サリチレートなど）、治療用モノクローナル抗体（例えば、セツキシマブ）、ブタクサ、草、およびカバノキなどの非食品アイテムに含まれてもよく、またはそれらに由来してもよい。例示的な花粉アレルゲンとしては、例えば、カバノキ花粉、スギ花粉、オーク花粉、ハンノキ花粉、シデ花粉、トチノキ花粉、ヤナギ花粉、ポプラ花粉、プランタヌス花粉、シナノキ花粉、オリーブ花粉、アシェジュニパー花粉、およびシチヨウジュ花粉などの樹木花粉が挙げられる。
【０１０４】
「抗原結合分子」という用語は、抗体および抗体の抗原結合断片を含み、例えば二重特異性抗体を含む。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の抗原（例えばＦｃεＲ１αまたはＣＤ３）に特異的に結合するかまたはそれと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、次の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４で、アミノ末端からカルボキシ末端へと配置される。本発明の異なる実施形態では、抗ＦｃεＲ１α抗体または抗ＣＤ３抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、または天然にもしくは人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
【０１０６】
本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、完全抗体分子の抗原結合断片を含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」および同様の用語は、本明細書で使用される場合、天然の、酵素処理で入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗体結合断片は、例えば、抗体可変ドメインおよび任意に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現に関連するタンパク質消化技術または組換え遺伝子操作技術などの任意の適切な標準的技術を使用して、完全抗体分子から誘導され得る。かかるＤＮＡは既知であり、および／または例えば市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを好適な配置へと配置するか、またはコドンを導入し、システイン残基を作成し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失などするために、化学的に、または分子生物学技術を使用することによって配列決定および操作され得る。
【０１０７】
抗原結合断片の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール型免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子も、本明細書で使用される「抗原結合断片」という表現に包含される。
【０１０８】
抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成物であり得、概して、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているかまたは１つ以上のフレームワーク配列とインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと結合したＶＨドメインを有する抗体結合断片において、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、任意の好適な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は二量体であり、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＬ二量体を含み得る。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを含み得る。
【０１０９】
特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合断片内に見出すことができる可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的で例示的な構成としては、（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬが挙げられる。上に列挙した例示的な立体配置のいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインの任意の立体配置において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結されていてもよく、または完全もしくは部分的ヒンジ領域もしくはリンカー領域によって連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の結合をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれより多数の）アミノ酸からなり得る。そのうえ、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いとのおよび／または１つ以上の単量体ＶＨドメインもしくはＶＬドメイン（例えば、ジスルフィド結合（複数可）により）との非共有結合において、上に列挙した可変ドメイン立体配置および定常ドメイン立体配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
【０１１０】
完全抗体分子と同様に、抗体結合断片は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含むことになっており、各可変ドメインは、別個の抗原へまたは同じ抗原上の異なるエピトープへ特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む任意の多重特異性抗体フォーマットは、当該技術分野で利用可能な通例の技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合断片との関連で使用に適合し得る。
【０１１１】
本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して機能し得る。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下における本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、それによって標的細胞の溶解をもたらす、細胞媒介性反応を指す。ＣＤＣおよびＡＤＣＣは、当技術分野において周知であり利用可能なアッセイを使用して測定することができる。（例えば、米国特許第５，５００，３６２号および第５，８２１，３３７号、ならびにＣｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６を参照されたい）。抗体の定常領域は、補体を固定して細胞依存性細胞傷害性を媒介する抗体の能力において重要である。したがって、抗体のアイソタイプは、その抗体が細胞傷害性を媒介することが望ましいかに基づいて選択され得る。
【０１１２】
本発明の特定の実施形態では、本発明の抗ＦｃεＲ１α単一特異性抗体または抗ＦｃεＲ１α／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒト抗体である。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが企図される。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突然変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列へと移植された抗体を含むことを意図するものではない。
【０１１３】
本発明の抗体は、一部の実施形態では、組換えヒト抗体であり得る。本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体など組換え手段によって調製、発現、作成または単離されるすべてのヒト抗体（後述）、組換え型コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（後述）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５を参照のこと）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作成、または単離された抗体を含むことを意図する。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニック動物が使用される場合は、インビボ体細胞変異誘発）を受け、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し関連してはいるが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
【０１１４】
ヒト抗体は、ヒンジの不均一性に関連する２つの形態で存在することができる。第１の形態において、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されている約１５０〜１６０ｋＤａの安定な四本鎖構築物を含む。第２の形態において、二量体は鎖間ジスルフィド結合を介して連結されておらず、共有結合した軽鎖および重鎖からなる約７５〜８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体）。これらの形態は、親和性精製後でさえも分離することが極めて困難とされている。
【０１１５】
様々な無傷のＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造上の相違によるが、それに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルまで第２の形態の出現を有意に減少させることができる（Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３０：１０５）。本発明は、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域に１つ以上の変異を有する抗体を包含し、例えば産生において、所望の抗体形態の収率を改善するのに望ましい場合がある。
【０１１６】
本発明の抗体は単離された抗体であり得る。本明細書で使用される「単離された抗体」は、同定された抗体、およびその天然環境の少なくとも１つの成分から分離および／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が天然に存在するかもしくは天然に産生される組織または細胞から分離または除去された抗体は、本発明の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体はまた、組換え細胞内の原位置の抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製または単離工程を受けている抗体である。特定の実施形態では、単離された抗体は他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【０１１７】
本発明はまた、ＦｃεＲ１αに結合するワンアーム抗体も含む。本明細書中で使用される場合、「ワンアーム抗体」とは、単一の抗体重鎖および単一の抗体軽鎖を含む抗原結合分子を意味する。本発明のワンアーム抗体は、表１に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかを含み得る。
【０１１８】
本明細書に開示される抗ＦｃεＲ１αまたは抗ＦｃεＲ１α／抗ＣＤ３抗体は、抗体が由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域において１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含み得る。かかる変異は、本明細書中に開示するアミノ酸配列を、例えば公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合断片を含み、ここで、１つ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）に変異し、もしくは別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）に変異し、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に変異する（かかる配列変化は本明細書ではまとめて、「生殖系列変異」と呼ばれる）。当業者は、本明細書に開示する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異またはこれらの組み合わせを含む多数の抗体および抗体結合断片を容易に産生することができる。特定の実施形態では、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基はすべて、抗体が由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと変異して戻される。他の実施形態では、ある特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基はＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、もしくは変異した残基はＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に認められ、または変異した残基は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内にのみ認められる。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）の１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へ変異する。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持され、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ変異する。一度得られると、１つ以上の生殖系列変異を含有する抗体および抗体結合断片は、結合特異性の改善、結合親和性の増加、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または増強（場合によって）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な様式で得られる抗体および抗体結合断片は、本発明の範囲内に包含される。
【０１１９】
本発明はまた、抗ＦｃεＲ１αまたは抗ＦｃεＲ１α／抗ＣＤ３抗体も含み、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む。例えば、本発明は、抗ＦｃεＲ１α抗体または抗ＦｃεＲ１α／抗ＣＤ３抗体を含み、本明細書の表１および３に記載のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、または４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する。
【０１２０】
「エピトープ」という用語は、パラトープとして既知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は２つ以上のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域へ結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体配座または線状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。特定の状況において、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
【０１２１】
「実質的な同一性」または「実質的に同一である」という用語は、核酸またはその断片を指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適に整列した場合、以下に考察するように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧａｐなど、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定される場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、特定の場合では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
【０１２２】
ポリペプチドへ適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似の」という用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないことになっている。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、配列同一性の割合または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照されたい。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。
【０１２３】
ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも呼ばれ、典型的には配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾へ割り当てられた類似の測定値を使用して類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメータと共に使用することができるＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上記）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、各々、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２を参照されたい。
【０１２４】
生殖系列変異
本明細書に開示される抗ＦｃεＲ１α抗体および／または抗ＣＤ３抗体は、抗体が由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖可変ドメインのフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域において、１つ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含む。
【０１２５】
本発明はまた、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合断片を含み、１つ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）へ変異されるか、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）へ変異されるか、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換へ変異され（本明細書では、かかる配列変化はまとめて「生殖系列変異」と呼ばれる）、ＦｃεＲ１αまたはＣＤ３抗原への望ましい結合特性を有する（例えば、抗ＣＤ３抗体のＣＤ３への結合が弱いか、または検出できない）。ＦｃεＲ１αを認識するいくつかのかかる例示的な抗体が、表１に記載されている。ＣＤ３を認識するいくつかのかかる例示的な抗体が、表３に記載されている。
【０１２６】
さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持され、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ変異する。一度得られると、１つ以上の生殖系列変異を含む抗体および抗体結合断片を、結合特異性の向上、結合親和性の弱さまたは低下、薬物動態特性の向上または増強、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性に関して試験することができる。本開示の指針を考慮してこの一般的な様式で得られた抗体および抗原結合断片は、本発明の範囲内に包含される。
【０１２７】
本発明はまた、抗ＦｃεＲ１α抗体を含み、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む。例えば、本発明は、抗ＣＤ３抗体を含み、本明細書の表１に記載されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、または４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する。本発明の抗体および二重特異性抗原結合分子は、個々の抗原結合ドメインが由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域において、１つ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含むが、ＦｃεＲ１αまたはＣＤ３への所望の結合は、維持または改善される（例えば、ＣＤ３抗原に対する抗ＣＤ３抗体の結合が弱いか、または検出できない）。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化することはなく、すなわち、アミノ酸置換で、所望の結合親和性が維持または改善され、抗ＦｃεＲ１αおよび／または抗ＣＤ３結合分子の場合、例えば、ＣＤ３抗原への抗ＣＤ３抗体の結合が弱いか、または検出されない。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的な置換とは、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。
【０１２８】
本発明はまた、ＨＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子も含み、本明細書に開示されるＨＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと実質的に同一であるが、ＦｃεＲ１αおよび／またはＣＤ３抗原への所望の特性は維持または改善される。アミノ酸配列意味する場合、「実質的な同一性」または「実質的に同一の」という用語は、２つのアミノ酸配列が、既定のギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％、または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、配列同一性の割合または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照されたい。
【０１２９】
ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも呼ばれ、典型的には配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾へ割り当てられた類似の測定値を使用して類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメータと共に使用することができるＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上記）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２を参照されたい。
【０１３０】
一度得られると、１つ以上の生殖系列変異を含有する抗原結合ドメインを、１つ以上のインビトロアッセイを利用して結合親和性の低下について試験する。特定の抗原を認識する抗体は、典型的には、抗原に対する高い（すなわち、強い）結合親和性について試験することによって、それらの目的のためにスクリーニングされるが、本発明の抗体は、弱い結合を示すか、または検出可能な結合を示さない。また、この一般的な様式で得られた１つ以上の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子は、本発明に包含され、結合活性駆動型のアレルギー療法として有利であることがわかる。
【０１３１】
例えば、改善された薬物動態特性および患者に対する低毒性の予期しない利益は、本明細書に記載の方法から実現され得る。
【０１３２】
抗体の結合特性
本明細書で使用される場合、抗体、免疫グロブリン、抗体結合断片、またはＦｃ含有タンパク質のいずれかが、例えば、細胞表面タンパク質またはその断片などの所定の抗原へ結合する文脈における「結合」という用語は、典型的には、最低２つの実体または抗体−抗原相互作用などの分子構造間の相互作用または会合を指す。
【０１３３】
例えば、結合親和性は、リガンドとしての抗原、分析物（または抗リガンド）としての抗体、Ｉｇ、抗体結合断片、またはＦｃ含有タンパク質を使用して、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００機器における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定される場合、典型的には、約１０−６Ｍ以下、例えば約１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ以下、例えば約１０−９Ｍ以下のＫＤ値に対応する。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）結合アッセイなどの細胞ベースの結合戦略もまた、日常的に使用されており、ＦＡＣＳデータは、放射性リガンド競合結合およびＳＰＲなどの他の方法とよく相関する（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，ＣＡ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７，２０１（２）：２２３−３１、Ｇｅｕｉｊｅｎ，ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５，３０２（１−２）：６８−７７）。
【０１３４】
したがって、本発明の抗体または抗原結合タンパク質は、非特異的抗原（例：ＢＳＡ、カゼイン）へ結合するその親和性よりも少なくとも１０倍低いＫＤ値に対応する親和性を有する所定の抗原または細胞表面分子に結合する。本発明によると、非特異的抗原よりも１０倍以下の低いＫＤ値に対応する抗体の親和性は、検出不可能な結合と見なすことができるが、かかる抗体は、本発明の二重特異性抗体を産生するための第２の抗原結合アームと対をなすことができる。
【０１３５】
「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数、または抗原に結合する抗体もしくは抗体結合断片の解離平衡定数を指す。ＫＤと結合親和性との間には逆の関係があり、したがって、ＫＤ値が小さいほど、親和性は高い、すなわちより強い。したがって、「より高い親和性」または「より強い親和性」という用語は、相互作用を形成するより高い能力、つまり、より小さいＫＤ値に関し、逆に「より低い親和性」または「より弱い親和性」という用語は、相互作用を形成するより低い能力、つまり、より大きなＫＤ値に関する。状況によっては、別の相互作用パートナー分子（例えば、抗原Ｙ）に対する分子（例えば、抗体）の結合親和性と比較して、その相互作用パートナー分子（例えば、抗原Ｘ）に対する特定の分子（例えば、抗体）のより高い結合親和性（またはＫＤ）は、より大きなＫＤ値（より低い、またはより弱い、親和性）を、より小さなＫＤ（より高い、またはより強い、親和性）で割ることによって決定される結合親和性の比として表すことができ、例えば、場合によって、５倍または１０倍より高い結合親和性として表すことができる。
【０１３６】
「ｋｄ」（ｓｅｃ−１または１／ｓ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数、または抗体もしくは抗体結合断片の解離速度定数を指す。その値はｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
【０１３７】
「ｋａ」（Ｍ−１×ｓｅｃ−１または１／Ｍ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度定数、または抗体もしくは抗体結合断片の会合速度定数を指す。
【０１３８】
「ＫＡ」（Ｍ−１または１／Ｍ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の会合平衡定数、または抗体もしくは抗体結合断片の会合平衡定数を指す。会合平衡定数は、ｋａをｋｄで割ることによって得られる。
【０１３９】
「ＥＣ５０」または「ＥＣ５０」という用語は、半最大有効濃度を指し、特定の曝露時間後にベースラインと最大値との間の中間の応答を誘導する抗体の濃度を含む。ＥＣ５０は本質的に、その最大効果の５０％が観察される抗体の濃度を表す。特定の実施形態では、ＥＣ５０値は、例えばＦＡＣＳ結合アッセイによって決定される場合、ＣＤ３またはアレルギー関連抗原を発現する細胞に対して最大半量の結合を与える本発明の抗体の濃度に等しい。したがって、低下したまたは弱い結合は、ＥＣ５０の増加、または最大半量の有効濃度値で観察される。
【０１４０】
一実施形態では、結合の低下は、最大半量の標的細胞への結合を可能にするＥＣ５０抗体濃度の増加として定義することができる。
【０１４１】
別の実施形態では、ＥＣ５０値は、Ｔ細胞の細胞毒性活性による標的細胞の最大半量の枯渇を誘発する本発明の抗体の濃度を表す。したがって、細胞傷害活性の増加（例えば、Ｔ細胞媒介性好塩基球死滅）は、ＥＣ５０の低下、または半最大有効濃度値で観察される。
【０１４２】
二重特異性抗原結合分子
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性または多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９、Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８−２４４を参照されたい。本発明の抗ＦｃεＲ１α単一特異性抗体または抗ＦｃεＲ１α／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結され得るか、またはそれと同時発現され得る。例えば、抗体またはその断片は、別の抗体または抗体断片などの１つ以上の他の分子実体に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合性会合などにより）機能的に連結されて、第２のまたは追加の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性抗体を生成することができる。
【０１４３】
本明細書の「抗ＣＤ３抗体」または「抗ＦｃεＲ１α抗体」という表現の使用は、単一特異性の抗ＣＤ３抗体または抗ＦｃεＲ１α抗体、ならびにＣＤ３結合アームおよびＦｃεＲ１α結合アームを含む二重特異性抗体の両方を含むことが意図される。したがって、本発明は、免疫グロブリンの一方のアームがヒトＣＤ３に結合し、免疫グロブリンの他方のアームがヒトＦｃεＲ１αに特異的である二重特異性抗体を含む。ＣＤ３結合アームは、本明細書の表３に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかを含み得る。
【０１４４】
特定の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、ヒトＣＤ３に結合し、ヒトＴ細胞活性化を誘導する。特定の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、ヒトＣＤ３に弱く結合し、ヒトＴ細胞活性化を誘導する。他の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、ヒトＣＤ３に弱く結合し、二重特異性抗体または多特異性抗体の文脈でマスト細胞および／または好塩基球の除去を誘導する。他の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、ヒトＣＤ３と弱く結合または会合するが、それでもその結合相互作用は、当該技術分野で既知のインビトロアッセイによって検出することができない。ＦｃεＲ１α結合アームは、本明細書の表１に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかを含み得る。
【０１４５】
特定の例示的な実施形態によると、本発明は、ＣＤ３およびＦｃεＲ１αに特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む。かかる分子は、本明細書において、例えば、「抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α」、または「抗ＣＤ３×ＦｃεＲ１α」、または「抗ＦｃεＲ１α／抗ＣＤ３」、または「抗ＦｃεＲ１α×ＣＤ３」、または「ＣＤ３×ＦｃεＲ１α」二重特異性分子、または「ＦｃεＲ１α×ＣＤ３」二重特異性分子、または他の類似の用語（例えば、抗ＦｃεＲ１α×抗ＣＤ３）と呼ばれることができる。
【０１４６】
本明細書で使用される「ＦｃεＲ１α」という用語は、非ヒト種（例えば、「マウスＦｃεＲ１α」、「サルＦｃεＲ１α」など）に由来するものとして指定されない限り、ヒトＦｃεＲ１αタンパク質を指す。ヒトＦｃεＲ１αタンパク質は、配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する。
【０１４７】
ＣＤ３およびＦｃεＲ１αに特異的に結合する前述の二重特異性抗原結合分子は、インビトロ親和性結合アッセイで測定した場合、約４０ｎＭ超のＫＤを示す弱い結合親和性を有するＣＤ３に結合する、抗ＣＤ３抗原結合分子を含むことができる。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」という表現は、単独で、または特定の抗原に特異的に結合する、１つ以上のさらなるＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域（ＦＲ）と組み合わせて少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むまたはそれからなるタンパク質、ポリペプチド、または分子複合体を意味する。特定の実施形態では、抗原結合分子は、それらの用語が本明細書の他所で定義されているように、抗体または抗体の断片である。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「二重特異性抗原結合分子」という表現は、少なくとも第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含むタンパク質、ポリペプチド、または分子複合体を意味する。二重特異性抗原結合分子内の各抗原結合ドメインは、単独で、または１つ以上の追加のＣＤＲおよび／またはＦＲと組み合わせて、特定の抗原に特異的に結合する少なくとも１つのＣＤＲを含む。本発明の文脈において、第１の抗原結合ドメインは第１の抗原（例えばＣＤ３）に特異的に結合し、第２の抗原結合ドメインは第２の異なる抗原（例えばＦｃεＲ１α）に特異的に結合する。
【０１５０】
本発明のある特定の例示的実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体の各抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＲ）を含む。第１および第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）の文脈において、第１の抗原結合ドメインのＣＤＲは、接頭辞「Ａ１」を付けて指定され、第２の抗原結合ドメインのＣＤＲは、接頭辞「Ａ２」を付けて指定され得る。したがって、第１の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書においてＡ１−ＨＣＤＲ１、Ａ１−ＨＣＤＲ２、およびＡ１−ＨＣＤＲ３と呼ばれてもよく、第２の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書においてＡ２−ＨＣＤＲ１、Ａ２−ＨＣＤＲ２、およびＡ２−ＨＣＤＲ３と呼ばれてもよい。
【０１５１】
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、互いに直接的または間接的に結合して、本発明の二重特異性抗原結合分子を形成し得る。あるいは、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、それぞれ別々の多量体化ドメインに連結されていてもよい。１つの多量体化ドメインと別の多量体化ドメインとの会合は、２つの抗原結合ドメイン間の会合を促進し、それによって二重特異性抗原結合分子を形成する。本明細書で使用される場合、「多量体化ドメイン」は、同一または類似の構造または構成の第２の多量体化ドメインと会合する能力を有する任意の高分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸である。例えば、多量体化ドメインは、免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体化成分の非限定的な例は、免疫グロブリンのＦｃ部分（ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む）、例えばアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択されるＩｇＧのＦｃドメイン、ならびに各アイソタイプ群内のアロタイプである。
【０１５２】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、典型的には２つの多量体化ドメイン、例えば、それぞれ別々の抗体重鎖の一部である２つのＦｃドメインを含む。第１および第２の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４などの同じＩｇＧのアイソタイプであってもよい。あるいは、第１および第２の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４などの異なるＩｇＧアイソタイプのものであり得る。
【０１５３】
特定の実施形態では、多量体化ドメインは、Ｆｃ断片または少なくとも１つのシステイン残基を含有する長さが１〜約２００アミノ酸のアミノ酸配列である。他の実施形態では、多量体化ドメインはシステイン残基、または短いシステイン含有ペプチドである。他の多量体化ドメインには、ロイシンジッパー、ヘリックスループヘリックス、またはコイルドコイルモチーフを含むかまたはそれらからなるペプチドまたはポリペプチドが含まれる。
【０１５４】
任意の二重特異性抗体フォーマットまたは技術を使用して、本発明の二重特異性抗原結合分子を作製することができる。例えば、第１の抗原結合特異性を有する抗体またはその断片は、第２の抗原結合性を有する他の抗体または抗体断片などの１つ以上の他の分子実体に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合などにより）機能的に連結されて、二重特異性抗原結合分子を生成することができる。本発明の文脈において使用できる特定の例示的な二重特異性フォーマットには、例えば、ｓｃＦｖ系フォーマットまたはダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、Ｑｕａｄｒｏｍａ、ノブズ−イントゥ−ホールズ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）、共通の軽鎖（例えば、ノブズ−イントゥ−ホールズを備えた共通の軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用型Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性フォーマットが含まれるが、これらに限定されない（上述のフォーマットの総説については、例えば、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ  ４：６，１−１１、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）。
【０１５５】
本発明の二重特異性抗原結合分子との関連で、多量体化ドメイン、例えば、Ｆｃドメインは、野生型の、天然に存在するＦｃドメインと比較して、１つ以上のアミノ酸変化（例えば、挿入、欠失、または置換）を含んでもよい。例えば、本発明は、ＦｃとＦｃＲｎとの間の修飾された結合相互作用（例えば、増強または減少）を有する改変Ｆｃドメインをもたらす、Ｆｃドメイン中の１つ以上の修飾を含む二重特異性抗原結合分子を含む。一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、ＣＨ２またはＣＨ３領域に修飾を含み、この修飾は酸性環境（例えば、ｐＨ範囲約５．５〜約６．０のエンドソーム内）において、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を高める。かかるＦｃ修飾の非限定的な例としては、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾、あるいは４２８位および／または４３３位（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／または４３４位（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）での修飾、あるいは２５０位および／または４２８位の修飾、あるいは３０７位または３０８位（例えば、ＦまたはＰ）および４３４位での修飾が挙げられる。一実施形態では、修飾は４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の修飾、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾、２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の修飾、２５０Ｑおよび４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、３０７および／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。
【０１５６】
本発明はまた、第１のＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇＣＨ３ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を含み、第１および第２のＩｇＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸ほど互いに異なっており、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、アミノ酸の相違を欠失する二重特異性抗体と比較して、プロテインＡへの二重特異性抗体の結合を低減させる。一実施形態では、第１のＩｇＣＨ３ドメインはプロテインＡを結合し、第２のＩｇＣＨ３ドメインはＨ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる、ＥＵ番号付けではＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を低減または消失させる変異を含有する。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによるものであり、ＥＵではＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。例えば、米国特許第８，５８６，７１３号を参照されたい。第２のＣＨ３内で見出され得るさらなる修飾には、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵによればＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵによればＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）、ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵによればＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が含まれる。
【０１５７】
特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプに由来するＦｃ配列を組み合わせたキメラであり得る。例えば、キメラＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４のＣＨ２領域に由来するＣＨ２配列の一部または全部、およびヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４に由来するＣＨ３配列の一部または全部を含むことができる。キメラＦｃドメインはまた、キメラヒンジ領域を含み得る。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列と組み合わせた、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」配列を含むことができる。本明細書に記載の抗原結合分子のいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの特定の例は、Ｎ末端からＣ末端へ、［ＩｇＧ４ＣＨ１］−［ＩｇＧ４上部ヒンジ］−［ＩｇＧ２下部ヒンジ］−［ＩｇＧ４ＣＨ２］−［ＩｇＧ４ＣＨ３］を含む。本明細書に記載の抗原結合分子のいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの別の例は、Ｎ末端からＣ末端へ、［ＩｇＧ１ＣＨ１］−［ＩｇＧ１上方ヒンジ］−［ＩｇＧ２下方ヒンジ］−［ＩｇＧ４ＣＨ２］−［ＩｇＧ１ＣＨ３］を含む。本発明の抗原結合分子のいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインのこれらおよび他の例は、２０１４年８月２８日に公開された米国特許公開第２０１４／０２４３５０４号に記載されており、その全体が本明細書に組み込まれる。これらの一般的な構造配置を有するキメラＦｃドメイン、およびその変異体は、Ｆｃ受容体結合を変えてしまうことができ、そのことがＦｃエフェクター機能に影響を及ぼす。
【０１５８】
特定の実施形態では、本発明は、抗体重鎖を提供し、重鎖定常領域（ＣＨ）領域が、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、または配列番号５６のうちのいずれか１つと、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域（ＣＨ）領域は、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、および配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１５９】
配列変異体
本明細書の抗体および二重特異性抗原結合分子は、個々の抗原結合ドメインが由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含み得る。かかる変異は、本明細書中に開示するアミノ酸配列を、例えば公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明の抗原結合分子は、本明細書に開示する例示的なアミノ酸配列のいずれかに由来する抗原結合ドメインを含んでもよく、１つ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）へ、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）へ、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換へ変異する（かかる配列変化はまとめて、「生殖系列変異」と本明細書で呼ばれる）。当業者は、本明細書に開示する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異またはこれらの組み合わせを含む多数の抗体および抗体結合断片を容易に産生することができる。特定の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基は全て、抗原結合ドメインが本来由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと再び突然変異する。他の実施形態では、ある特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基はＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、もしくは変異した残基はＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に認められ、または変異した残基は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内にのみ認められる。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）の１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗原結合ドメインが本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へ変異する。さらに、抗原結合ドメインは、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異のいずれかの組み合わせを含有してもよく、例えば、特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は維持され、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ変異する。一度得られると、１つ以上の生殖系列変異を含有する抗原結合ドメインは、結合特異性の改善、結合親和性の増大、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または増強（場合によって）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な様式で得られた１つ以上の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子は、本発明の範囲内に包含される。
【０１６０】
本発明はまた、一方または両方の抗原結合ドメインが、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む、抗原結合分子を含む。例えば、本発明は、本明細書に開示するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、または４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を含む。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないことになっている。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。
【０１６１】
本発明はまた、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと実質的に同一であるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を含む。アミノ酸配列意味する場合、「実質的な同一性」または「実質的に同一の」という用語は、２つのアミノ酸配列が、既定のギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％、または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、配列同一性の割合または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照されたい。
【０１６２】
ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも呼ばれ、典型的には配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾へ割り当てられた類似の測定値を使用して類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメータと共に使用することができるＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上記）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、各々、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２を参照されたい。
【０１６３】
ｐＨ依存的結合
本発明は、ｐＨ依存性の結合特徴を有する、抗ＦｃεＲ１α抗体、および抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子を含む。例えば、本発明の抗抗ＦｃεＲ１α抗体は、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＦｃεＲ１αへの結合の低減を呈し得る。あるいは、本発明の抗ＦｃεＲ１α抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでＦｃεＲ１αへの増強された結合を示し得る。「酸性ｐＨ」という表現は、約６．２未満、例えば、約６．０、５．９５、５、９、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０以下のｐＨ値を含む。本明細書で使用される場合、「中性ｐＨ」という表現は、約７．０〜約７．４のｐＨを意味する。「中性ｐＨ」という表現は、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、および７．４のｐＨ値を含む。
【０１６４】
場合によっては、「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで．．．低減した結合」は、中性ｐＨでその抗原に結合する抗体のＫＤ値に対する酸性ｐＨでその抗原に結合する抗体のＫＤ値の比に関して表される（またはその逆）。例えば、抗体またはその抗原結合断片が、約３．０以上の酸性／中性ＫＤ比を呈する場合、本発明の目的で、抗体またはその抗原結合断片は、「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＦｃεＲ１αに対して低減した結合」を呈すると見なされ得る。特定の例示的な実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片の酸性／中性ＫＤ比は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．０、またはそれ以上であり得る。
【０１６５】
ｐＨ依存性結合特性を有する抗体は、例えば、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨで特定の抗原への結合の低下（または増強）について抗体の集団をスクリーニングすることによって得ることができる。さらに、アミノ酸レベルでの抗原結合ドメインの修飾は、ｐＨ依存的特徴を有する抗体を産生し得る。例えば、抗原結合ドメイン（例えばＣＤＲ内）の１つ以上のアミノ酸をヒスチジン残基で置換することにより、中性ｐＨに対して酸性ｐＨで抗原結合が低下した抗体を得ることができる。
【０１６６】
Ｆｃ変異体を含む抗体
本発明の特定の実施形態によると、抗ＦｃεＲ１α抗体、および抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子が提供され、例えば、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強または減少させる１つ以上の変異を含むＦｃドメインを含む。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に変異を含む抗体を含み、変異（複数可）は、酸性環境においてＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲のエンドソームにおいて）。かかる変異は、動物に投与したときに抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。かかるＦｃ修飾の非限定的な例としては、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾、あるいは４２８位および／または４３３位（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／または４３４位（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）での修飾、あるいは２５０位および／または４２８位の修飾、あるいは３０７位または３０８位（例えば、ＦまたはＰ）および４３４位での修飾が挙げられる。一実施形態では、修飾は４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の修飾、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾、２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の修飾、２５０Ｑおよび４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、３０７および／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。
【０１６７】
例えば、本発明は、抗ＦｃεＲ１α抗体、および抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子を含み、２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）、２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）、４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）、ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される１つ以上の変異対もしくは変異群を含むＦｃドメインを含む。前述のＦｃドメイン変異、および本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異のすべての可能な組み合わせが、本発明の範囲内で熟慮される。
【０１６８】
抗体および二重特異性抗原結合分子の生物学的特性
特定の実施形態によると、本発明は、抗体および抗体の抗原結合断片を含み、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイ形式を使用して、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約３０３ｎＭ未満のＫＤでヒトＦｃεＲ１αに結合する（例えば、２５℃で）、または約４６７ｎＭ未満のＫＤでカニクイザルＦｃεＲ１αに結合する（例えば、２５℃で）。特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイ形式、または実質的に類似のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約４００ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約４５０ｎＭ未満、約４００ｎＭ未満、約３５０ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、または約１００ｎＭ未満のＫＤで、ヒトもしくはカニクイザルＦｃεＲ１αに結合する。本発明は、二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）を含み、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイ形式（例えば、ｍＡｂ捕捉または抗原捕捉形式）、または実質的に類似のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約４６７ｎＭ未満のＫＤで、ヒトもしくはカニクイザルＦｃεＲ１αに結合する。
【０１６９】
本発明はまた、抗体およびその抗原結合断片を含み、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイ形式、または実質的に類似のアッセイを使用して、２５℃での表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約０．２分超または約０．５分超の解離半減期（ｔ１／２）で、ヒトＦｃεＲ１αに結合し、あるいは約０．３分超または約０．６分超の解離半減期（ｔ１／２）で、カニクイザルＦｃεＲ１αに結合する。本発明は、二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）を含み、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイ形式、または実質的に類似のアッセイを使用して、２５℃での表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約０．５４分超または葯１．１分超のＫＤで、ヒトもしくはカニクイザルＦｃεＲ１αに結合する。
【０１７０】
本発明はまた、抗体およびその抗原結合断片も含み、実施例４に記載されるフローサイトメトリーに基づく検出アッセイ、または実質的に類似のアッセイによって決定した場合、ヒトまたはカニクイザルＦｃεＲ１αを発現するヒト細胞株（例えば、ヒトまたはカニクイザルＦｃεＲ１αを発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞）に特異的に結合する。
【０１７１】
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子を含み、（ａ）ＩｇＥの不在下または存在下で細胞表面に発現するＦｃεＲ１αへの結合（例えば、実施例４を参照）、（ｂ）ＦｃεＲ１α発現細胞の存在下でヒトＣＤ３シグナル伝達を活性化する（例えば、実施例５を参照）、（ｃ）インビトロでＦｃεＲ１α発現細胞のＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導する（例えば、実施例６を参照）、（ｄ）インビトロで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）集団における好塩基球のＴ細胞媒介性死滅を誘導する（例えば、実施例６を参照）、（ｅ）ヒトＦｃεＲ１αを発現するマウスにおけるアレルゲン誘導性マスト細胞脱顆粒（例えば、アナフィラキシー）を遮断する（例えば、実施例７を参照）、および（ｆ）ヒトＦｃεＲ１αを発現するマウスにおける脾臓好塩基球を枯渇させる（例えば、実施例７を参照）、からなる群から選択される１つ以上の特徴を示す。
【０１７２】
本発明は、高い親和性を有するヒトＣＤ３に結合する抗体およびその抗原結合断片を含む。本発明はまた、治療状況および所望される特定の標的化特性に応じて、中程度または低い親和性を有するヒトＣＤ３に結合する抗体およびその抗原結合断片を含む。本発明はまた、検出不可能な親和性を有するヒトＣＤ３に結合する抗体およびその抗原結合断片を含む。例えば、一方のアームがＣＤ３に結合し、別のアームが標的抗原（例えば、ＦｃεＲ１α）に結合する二重特異性抗原結合分子の文脈では、抗ＣＤ３アームがＣＤ３と中程度もしくは低い親和性で結合するか、または親和性がない一方で、標的抗原結合アームが高い親和性で標的抗原に結合することが望ましい場合がある。この様式において、標的抗原を発現する細胞への抗原結合分子の優先的標的化は、一般的／非標的化ＣＤ３結合およびそれに付随する結果として生じる有害な副作用を回避しながら達成され得る。
【０１７３】
本発明は、ヒトＣＤ３およびヒトＦｃεＲ１αに同時に結合することができる二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）を含む。ＣＤ３を発現する細胞と相互作用する結合アームは、適切なインビトロ結合アッセイで測定した場合に、弱から検出不可能な結合を有し得る。二重特異性抗原結合分子がＣＤ３および／またはＦｃεＲ１αを発現する細胞に結合する程度は、本明細書の実施例４に例示されるように、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって評価することができる。
【０１７４】
例えば、本発明は、抗体、抗体結合断片、およびその二重特異性抗体を含み、ＦｃεＲ１αを発現しないがＣＤ３を発現するヒト細胞株、霊長類Ｔ細胞（例えば、カニクイザル末梢血単核細胞［ＰＢＭＣ］）、および／またはＦｃεＲ１α発現細胞に特異的に結合する。
【０１７５】
本発明は、弱い（すなわち低い）親和性またはさらに検出不可能な親和性を有するヒトＣＤ３に結合する抗体、その抗体結合断片、およびその二重特異性抗体を含む。
【０１７６】
本発明は、抗体、抗体結合断片、およびその二重特異性抗体を含み、弱い（すなわち、低い）親和性、またはさらに検出不可能な親和性で、サル（カニクイザル）ＣＤ３に結合する。
【０１７７】
本発明は、ヒトＣＤ３に結合してＴ細胞活性化を誘導する抗体、その抗体結合断片、およびその二重特異性抗体を含む。
【０１７８】
本発明は、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子を含み、対象においてアレルギー応答を阻害する、および／またはＦｃεＲ１α発現細胞を枯渇することができる（例えば、受動皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）またはフローサイトメトリベースのアッセイ、または実質的に類似のアッセイにおける実施例７を参照）。例えば、特定の実施形態によると、抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子が提供され、２５ｍｇ／ｋｇの二重特異性抗原結合分子を対象に単回投与すると、対象においてＦｃεＲ１α発現細胞の数の減少がもたらされる（例えば、脾臓好塩基球の数が有意に減少する）。
【０１７９】
エピトープマッピングおよび関連技術
本発明の抗原結合分子が結合するＣＤ３および／またはＦｃεＲ１α上のエピトープは、ＣＤ３またはＦｃεＲ１αタンパク質の３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上）のアミノ酸の単一の連続する配列からなっていてもよい。あるいは、エピトープは、ＣＤ３またはＦｃεＲ１αの複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなっていてもよい。本発明の抗体は、単一のＣＤ３鎖内に含まれるアミノ酸（例えば、ＣＤ３−イプシロン、ＣＤ３−デルタ、またはＣＤ３−ガンマ）と相互作用し得るか、または２つ以上の異なるＣＤ３鎖上のアミノ酸と相互作用し得る。本発明で使用する場合、「エピトープ」という用語は、パラトープとして既知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は２つ以上のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域へ結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体配座または線状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。ある特定の状況において、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
【０１８０】
当業者に既知の種々の技術を使用して、抗体の抗原結合ドメインがポリペプチドまたはタンパク質内にある「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定することができる。例示的な技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．，ＮＹ）に記載されているアッセイ、アラニンスキャニング変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３−４６３）、およびペプチド切断分析が挙げられる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出、および抗原の化学修飾などの方法を採用することができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：４８７−４９６）。抗体の抗原結合ドメインが相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために用いることができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的にいえば、水素／重水素交換法は、関心対象のタンパク質を重水素標識した後、抗体を重水素標識タンパク質へ結合させることを包含する。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移して、抗体によって保護されている残基（重水素標識されたままである）を除くすべての残基で水素−重水素交換を生じさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析へ供し、それにより、抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７（２）：２５２−２５９、Ｅｎｇｅｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ−２６５Ａに記載されている。抗原／抗体複合体のＸ線結晶解析もまた、エピトープマッピング目的に使用してもよい。
【０１８１】
本発明はさらに、本明細書に記載の特定の例示的な抗体のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＦｃεＲ１α抗体を含む（例えば、本明細書の表１に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）。同様に、本発明はまた、ＦｃεＲ１αへの結合に対して本明細書に記載の特定の例示的な抗体のいずれかと競合する抗ＦｃεＲ１α抗体を含む（例えば、本明細書の表１に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）。
【０１８２】
本発明はまた、二重特異性抗原結合分子を含み、ヒトＣＤ３および／またはカニクイザルＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトまたはカニクイザルＦｃεＲ１αに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、第１の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の特定の例示的なＣＤ３特異的抗原結合ドメインのいずれかと同じＣＤ３上のエピトープに結合し、かつ／または第２の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の特定の例示的なＦｃεＲ１α特異的抗原結合ドメインのいずれかと同じＦｃεＲ１α上のエピトープに結合する。
【０１８３】
同様に、本発明はまた、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトＦｃεＲ１αに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む二重特異性抗原結合分子を含み、第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ３への結合に対して、本明細書に記載の特定の例示的なＣＤ３特異的抗原結合ドメインのいずれかと競合し、かつ／または第２の抗原結合ドメインは、ＦｃεＲ１αへの結合に対して、本明細書に記載の特定の例示的なＦｃεＲ１α特異的抗原結合ドメインのいずれかと競合する。
【０１８４】
特定の抗原結合分子（例えば、抗体）またはその抗原結合ドメインが、本発明の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合するか、または結合するために本発明の参照抗原結合分子と競合するかどうかは、当技術分野で既知の常法を使用して容易に決定できる。例えば、試験抗体が本発明の参照二重特異性抗原結合分子と同じＦｃεＲ１α（またはＣＤ３）上のエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照二重特異性分子を、最初にＦｃεＲ１αタンパク質（またはＣＤ３タンパク質）に結合させる。次に、ＦｃεＲ１α（またはＣＤ３）分子に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が、参照二重特異性抗原結合分子に飽和結合した後で、ＦｃεＲ１α（またはＣＤ３）に結合することができる場合、試験抗体は、参照二重特異性抗原結合分子とは異なるＦｃεＲ１α（またはＣＤ３）のエピトープに結合すると結論付けることができる。一方、試験抗体が、参照二重特異性抗原結合分子に飽和結合した後で、ＦｃεＲ１α（またはＣＤ３）分子に結合することができない場合、試験抗体は、本発明の参照二重特異性抗原結合分子が結合したエピトープと同じＦｃεＲ１α（またはＣＤ３）のエピトープに結合している可能性がある。次に、試験抗体の結合の観察された欠失が、実際に、参照二重特異性抗原結合分子と同じエピトープへの結合によるものであるか、それとも立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠失の原因であるのかを確認するために、さらなる通例の実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を実施することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、または当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的な抗体結合アッセイを使用して実施することができる。本発明の特定の実施形態によると、例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍過剰量の一方の抗原結合タンパク質が、競合結合アッセイでの測定で少なくとも５０％、しかし、好ましくは７５％、９０％、またはさらに９９％他方の結合を阻害する場合、２つの抗原結合タンパク質は、同一（または重複）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５−１５０２を参照されたい）あるいは、一方の抗原結合タンパク質の結合を低減または排除する抗原における本質的にすべてのアミノ酸変異が、もう一方の結合を低減または排除する場合、２つの抗原結合タンパク質は同じエピトープと結合すると見なされる。一方の抗原結合タンパク質の結合を減少または排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の結合を減少または排除する場合、２つの抗原結合タンパク質は「重複エピトープ」を有するとみなされる。
【０１８５】
抗体またはその抗原結合ドメインが、結合について、参照抗原結合分子と競合するかどうかを決定するために、上に記載の結合方法を、２つの方向性で実施する。第１の方向性では、参照抗原結合分子を飽和条件下でＦｃεＲ１α（またはＣＤ３）分子に結合させた後、試験抗体のＦｃεＲ１α（またはＣＤ３）分子への結合を評価する。第２の方向性では、試験抗体を飽和条件下でＦｃεＲ１α（またはＣＤ３）分子に結合させた後、参照抗原結合分子のＦｃεＲ１α（またはＣＤ３）分子への結合を評価する。両方の方向性において、第１の（飽和）抗原結合分子のみがＦｃεＲ１α（またはＣＤ３）分子に結合することができる場合、試験抗体および参照抗原結合分子は、ＦｃεＲ１α（またはＣＤ３）への結合に対して競合すると結論付けられる。当業者によって認識されるように、参照抗原結合分子との結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープへ結合するわけではないが、重複しているまたは隣接しているエピトープに結合することによって、参照抗体の結合を立体的に遮断し得る。
【０１８６】
抗原結合ドメインの調製および二重特異性分子の調製
特定の抗原に特異的な抗原結合ドメインは、当技術分野で既知の任意の抗体産生技術によって調製することができる。一度得られれば、２つの異なる抗原（例えば、ＣＤ３およびＦｃεＲ１α）に特異的な２つの異なる抗原結合ドメインを互いに対して適切に配置して、常法を使用して本発明の二重特異性抗原結合分子を産生することができる。（本発明の二重特異性抗原結合分子を構築するために使用できる例示的な二重特異性抗体フォーマットの考察は、本明細書の他所に提供される）。特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子の１つ以上の個々の構成要素（例えば、重鎖および軽鎖）は、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト型抗体に由来する。かかる抗体を作製するための方法は当技術分野において周知である。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子の１つ以上の重鎖および／または軽鎖は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術を使用して調製することができる。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術（または任意の他のヒト抗体生成技術）を使用して、特定の抗原（例えば、ＣＤ３またはＦｃεＲ１α）に対する高親和性キメラ抗体が、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有して最初に単離される。抗体を、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付けし選択する。マウス定常領域は、所望のヒト定常領域と置換されて、本発明の二重特異性抗原結合分子に組み込まれ得る完全ヒト型重鎖および／または軽鎖を生成する。
【０１８７】
遺伝子操作された動物は、ヒト二重特異性抗原結合分子を作製するために使用し得る。例えば、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変配列を再編成および発現することができない、遺伝子改変マウスを使うことができ、マウスは、内在性マウスカッパ遺伝子座のマウスカッパ定常遺伝子に作動可能に連結されているヒト免疫グロブリン配列によってコードされる１つまたは２つのヒト軽鎖可変ドメインのみを発現する。かかる遺伝子改変マウスを使用して、２つの異なるヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントのうちの１つに由来する可変ドメインを含む同一の軽鎖と会合する２つの異なる重鎖を含む完全ヒト型二重特異性抗原結合分子を産生することできる。（例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４を参照されたい）。完全ヒト型とは、抗体またはその抗原結合断片もしくは免疫グロブリンドメインの各ポリペプチドの全長にわたるヒト型配列に由来するＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含む、抗体、またはその抗原結合断片もしくは免疫グロブリンドメインを指す。いくつかの例において、完全ヒト型配列は、ヒトに対して内因性のタンパク質に由来する。他の例において、完全ヒト型タンパク質またはタンパク質配列は、各成分配列がヒト型配列に由来するキメラ配列を含む。いずれの理論にも縛られないが、キメラタンパク質またはキメラ配列は、一般に、例えば任意の野生型ヒト免疫グロブリン領域またはドメインと比較して、成分配列の接合部における免疫原性エピトープの作成を最小にするように設計される。
【０１８８】
生物学的等価物
本発明は、本明細書に開示される例示的な分子のものとは異なるが、ＣＤ３および／またはＦｃεＲ１αに結合する能力を保持するアミノ酸配列を有する抗原結合分子を包含する。かかる変異体抗体は、親配列と比較してアミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、説明された二重特異性抗原結合分子の生物学的活性とは本質的に等価である生物学的活性を示す。
【０１８９】
本発明は、本明細書に記載の例示的な抗原結合分子のいずれかと生物学的に等価な抗原結合分子を含む。２つの抗原結合タンパク質または抗体は、例えば、それらが類似の実験条件下で単回用量または複数回用量のいずれかで同じモル用量で投与された場合に、吸収速度および吸収の程度が有意差を示さない医薬的等価物または医薬的選択肢である場合、生物学的等価物とみなされる。これらの吸収の程度は等価であるが吸収速度は等価ではなく、吸収速度におけるかかる差が意図的、かつ標識に反映されているので生物学的に等価とみなされ得る場合、いくつかの抗原結合タンパク質は、等価物または薬学的選択肢とみなされることになっており、例えば長期使用に及ぼす有効な身体薬剤濃度の達成に必須ではなく、試験した特定の薬剤製品にとって医学的に有意ではないとみなされる。
【０１９０】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらの安全性、純度、および有効性において臨床的に有意性のある差がない場合、生物学的に等価である。
【０１９１】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性の減退を含む有害作用のリスクの期待される上昇なしで参照生成物と生物学的生成物の間での切り替えなしで持続される療法と比較して、患者を１回以上切り替えられることができる場合、生物学的に等価である。
【０１９２】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、使用条件（複数可）についての共通の機序または作用機序によって、かかる機序が既知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。
【０１９３】
生物学的等価性は、インビボおよびインビトロの方法によって実証され得る。生物学的等価性測定法には、例えば、（ａ）抗体またはその代謝産物の濃度が血液、血漿、血清または他の生物学的流体中で時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボでの試験、（ｂ）ヒトインビボ生物学的利用能データと相関した、このデータを合理的に予測しているインビトロ試験、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果が時間の関数として測定されるヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験、および（ｄ）抗原結合タンパク質の安全性、効能、または生物学的利用能もしくは生物学的等価性を確立する、十分に管理された臨床試験が含まれる。
【０１９４】
本明細書に示す例示的な二重特異性抗原結合分子の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基もしくは配列の種々の置換を生じること、または生物活性に必要とされない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失することによって構築され得る。例えば、生物学的活性にとって必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失または他のアミノ酸で置換することができる。他の文脈において、生物学的等価な抗原結合タンパク質は、分子のグリコシル化特性を修飾するアミノ酸変化、例えばグリコシル化を排除または除去する変異を含む、本明細書に記載の例示的な二重特異性抗原結合分子の変異体を含み得る。
【０１９５】
種の選択性および種の交差反応性
本発明の特定の実施形態によると、ヒトＣＤ３に結合する抗原結合分子が提供される。また、ヒトＦｃεＲ１αに結合する抗原結合分子も提供される。本発明はまた、ＣＤ３もしくは１つ以上の非ヒト種由来のＣＤ３に結合する抗原結合分子、および／またはヒトＦｃεＲ１αもしくは１つ以上の非ヒト種（例えば、カニクイザル）由来のＦｃεＲ１αに結合する抗原結合分子を含む。
【０１９６】
本発明の特定の例示的な実施形態によると、抗原結合分子が提供され、ヒトＣＤ３および／またはヒトＦｃεＲ１αに結合し、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、カニクイザルまたはチンパンジーのＣＤ３および／またはＦｃεＲ１αのうちの１つ以上に結合できるか、または結合できない。例えば、本発明の特定の例示的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ヒトＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトまたはカニクイザルＦｃεＲ１αに結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む。
【０１９７】
治療用製剤および投与
本発明は、本発明の抗原結合分子を含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、適切な担体、賦形剤、および改善された移動、送達、耐性などをもたらす他の薬剤と共に製剤化される。多くの適切な製剤は、すべての製薬化学者に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡなど）を含有する脂質（カチオン性またはアニオン性）、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト、水中油エマルションおよび油中水エマルション、エマルションカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１も参照されたい。
【０１９８】
患者に投与される抗原結合分子の用量は、患者の年齢および大きさ、標的疾患、病態、投与経路などに応じて変わり得る。好ましい用量は、典型的には体重または体表面積に従って計算される。本発明の二重特異性抗原結合分子が成人患者の治療目的に使用される場合、本発明の二重特異性抗原結合分子を、通常、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、約０．１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、または約５〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で、静脈内投与することが有利であり得る。病態の重症度に応じて、治療の頻度および期間を調整することができる。二重特異性抗原結合分子を投与するための有効投与量およびスケジュールは経験的に決定され、例えば、患者の経過を定期的な評価によってモニターし、それに応じて用量を調整することができる。さらに、投与量の種間スケーリングは、当技術分野において周知の方法を使用して実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
【０１９９】
種々の送達系は既知であり、本発明の薬学的組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルにおける封入、変異ウイルスを発現することのできる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスである（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照されたい）。導入方法には、皮内経路、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入もしくはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚内層（ｌｉｎｉｎｇｓ）（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収による任意の好都合な経路によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身または局所であり得る。
【０２００】
本発明の薬学的組成物は、標準的な針および注射器を用いて皮下にまたは静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本発明の薬学的組成物を送達する上での適用を容易に有する。かかるペン送達デバイスは、再利用可能または使い捨て可能であり得る。再利用可能なペン送達デバイスは、概して、薬学的組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。一度、カートリッジ内の薬学的組成物がすべて投与され、カートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄することができ、薬学的組成物を含有する新しいカートリッジと容易に交換することができる。次に、ペン送達デバイスは再利用することができる。使い捨てのペン送達デバイスにおいて、交換可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスは、このデバイス内の貯蔵器の中に保持された薬学的組成物が事前に充填されている。一度、貯蔵器が薬学的組成物に関して空になると、デバイス全体が廃棄される。
【０２０１】
数多くの再利用可能なペン送達デバイスおよび自動注射送達デバイスは、本発明の薬学的組成物の皮下送達における用途を有する。例としては、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ｐｅｎ（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５（商標）ｐｅｎ、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ｐｅｎ、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ｐｅｎ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ，ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ｐｅｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されず、ほんの数種類しか挙げていない。本発明の薬学的組成物の皮下送達での用途を有する使い捨てペン送達装置の例としては、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注射器（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）およびＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  ＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０２】
ある特定の状況において、薬学的組成物は、徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ，上記；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。さらに別の実施形態において、徐放系を組成物の標的の近傍に配置することができ、それによって全身用量のほんの一部のみが必要となる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，上記，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８を参照されたい）。他の徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３による総説で論じられている。
【０２０３】
注射可能な調製物には、静脈内注射、皮下注射、皮内注射および筋肉内注射、点滴注入などのための剤形が含まれ得る。これらの注射可能な調製物は、公的に既知の方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射用に従来通り使用される滅菌水性媒体または油性媒体中に上述の抗体またはその塩を溶解、懸濁または乳化させることによって調製され得る。注入用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース含有等張液、および他の補助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。油性媒体として、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが使用され、ベンジルベンゾエート、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。このように調製された注射は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
【０２０４】
有益なことに、上記に記載される経口または非経口での使用のための薬学的組成物は、有効成分の用量に適合するために好適な単位用量の投薬形態へと調製される。かかる単位用量の剤形には、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射（アンプル）、坐薬などが含まれる。前述の含有される抗体の量は概して、単位用量の剤形あたり約５〜約５００ｍｇであり、特に注射の形態では、前述の抗体は、約５〜約１００ｍｇで、他の剤形については約１０〜約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
【０２０５】
抗原結合分子の治療的使用
本発明は、抗ＦｃεＲ１α抗体もしくはその抗原結合断片、またはＣＤ３およびＦｃεＲ１αに特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む治療用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を含む。治療用組成物は、本明細書に開示される抗体または二重特異性抗原結合分子のいずれかと薬学的に許容される担体または希釈剤とを含み得る。本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という表現は、マスト細胞活性化障害、マスト細胞症またはアレルギーなどのＦｃεＲ１α関連疾患または障害のうちの１つ以上の症状または徴候を示すヒトまたは非ヒト動物（例えば、任意の種類のアレルギーに罹患している対象、または任意のアレルギー反応を示す対象）、あるいは、その他ＦｃεＲ１α活性の阻害もしくは低減またはＦｃεＲ１α＋細胞の枯渇（例えば、アナフィラキシー）から恩恵を受ける者、を意味する。
【０２０６】
本発明の抗体および二重特異性抗原結合分子（およびそれを含む治療用組成物）は、とりわけ、免疫応答の刺激、活性化および／または標的化が有益である任意の疾患または障害の治療に有用である。特に、本発明の抗ＦｃεＲ１α抗体または抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子は、ＦｃεＲ１αの発現もしくは活性、またはＦｃεＲ１α＋細胞の増殖に関連するかまたはそれによって媒介される任意の疾患または障害の治療、予防、および／または寛解に使用され得る。本発明の治療方法が達成される作用機序は、エフェクター細胞の存在下で、例えば、ＣＤＣ、アポトーシス、ＡＤＣＣ、食作用、またはこれらの機序のうちの２つ以上の組み合わせによるＦｃεＲ１αを発現する細胞の死滅を含む。本発明の二重特異性抗原結合分子を使用して阻害または死滅させることができるＦｃεＲ１αを発現する細胞には、例えば、マスト細胞および／または好塩基球が含まれる。
【０２０７】
本発明の抗原結合分子は、例えば、マスト細胞活性化障害（マスト細胞活性化症候群など）、マスト細胞症、またはアレルギー喘息、花粉症、アナフィラキシー、アトピー性皮膚炎、慢性蕁麻疹、食物アレルギー、および花粉アレルギーを含むアレルギーを含む、ＩｇＥまたはＦｃεＲ１αの発現に関連する疾患または障害を治療するために使用され得る。アレルギーは、本明細書の他箇所に列挙されるように、１つ以上のアレルゲンへの曝露によって引き起こされ得る。本発明の特定の実施形態によると、抗ＦｃεＲ１α抗体または抗ＦｃεＲ１α／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重度のアレルギーに罹患している患者を治療するのに有用である。本発明の他の関連する実施形態によると、本明細書に開示される抗ＦｃεＲ１α抗体または抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子を、アナフィラキシーに罹患している患者に投与することを含む方法が提供される。アレルギー反応試験などの当該技術分野において既知の分析／診断方法を使用して、患者がアナフィラキシーに罹患しているかどうかを確かめることができる。
【０２０８】
特定の態様によると、本発明は、ＦｃεＲ１α発現に関連する疾患または障害（例えば、アナフィラキシー）を治療するための方法を提供し、対象が重度のアレルギーであると決定された後、本明細書の他箇所に記載の抗ＦｃεＲ１αまたは二重特異性抗原結合分子のうちの１つ以上を、対象に投与することを含む。例えば、本発明は、アレルギーを治療するための方法を含み、対象が他の療法（例えば、抗ヒスタミン療法）を受けてから１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、もしくは４週間、２カ月、４カ月、６カ月、８カ月、１年、またはそれ以上後に、抗ＦｃεＲ１α抗体または抗ＣＤ３／抗ＦｃεＲ１α二重特異性抗原結合分子を、患者に投与することを含む。
【０２０９】
併用療法および製剤
本発明は、本明細書に記載の例示的な抗体および二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。本発明の抗原結合分子と組み合わせることができる、または組み合わせて投与することができる例示的な追加の治療剤としては、例えば、ＩｇＥアンタゴニスト（例えば、オマリズマブなどの抗ＩｇＥ抗体）、またはＩｇＥの小分子阻害剤（例えば、ダーピンＥ２＿７６などのダーピン）、ＩＬ−２５阻害剤、ＩＬ−４阻害剤、ＩＬ−４受容体阻害剤（例えば、デュピルマブなどの抗ＩＬ−４Ｒ抗体）、ＩＬ−３３阻害剤（例えば、抗ＩＬ−３３抗体）、形質細胞除去剤（ａｂｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、ＢＣＭＡｘＣＤ３二重特異性抗体）、およびＴＳＬＰ阻害剤が挙げられる。特定の実施形態では、形質細胞除去剤は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）標的化剤、プロテアソーム阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）阻害剤、およびＡ増殖誘導リガンドの阻害剤（ＡＰＲＩＬ、ＣＤ２５６）からなる群から選択される。一実施形態では、ＢＣＭＡ標的化剤は、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、ＢＣＭＡに対するキメラ抗原受容体、および細胞傷害性薬物にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体からなる群から選択される。
【０２１０】
本発明の抗原結合分子と組み合わせて有益に投与され得る他の薬剤としては、抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、コルチコイド、エピネフリン、気管支拡張剤、鬱血除去剤、ロイコトリエンアンタゴニスト、またはマスト細胞阻害剤（例えば、クロモグリク酸ナトリウム）を含むアレルギー治療剤が挙げられる。
【０２１１】
本発明はまた、本明細書で言及された抗原結合分子およびＩｇＥもしくはＦｃεＲ１αの阻害剤のうちのいずれかを含む治療剤の組み合せを含み、阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ナノボディ、または抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ断片、または、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、最小認識単位などの他の操作された分子）である。本発明の抗原結合分子は、抗ウイルス薬、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイドおよび／またはＮＳＡＩＤと組み合わせて投与および／または同時製剤することもできる。
【０２１２】
追加の治療活性成分は（複数可）、本発明の抗原結合分子の投与の直前、同時に、または直後に投与してもよい。（本開示の目的のために、かかる投与計画は、追加の治療活性成分と「組み合わせて」抗原結合分子を投与することと見なされる。）
【０２１３】
本発明には、本発明の抗原結合分子が、本明細書の他所に記載の追加の治療活性成分（複数可）の１つ以上と同時製剤された薬学的組成物が含まれる。
【０２１４】
投与レジメン
本発明の特定の実施形態によると、複数回用量の抗原結合分子（例えば、ＦｃεＲ１α抗体、またはＦｃεＲ１αおよびＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子）を、所定のタイムコースわたって対象に投与することができる。本発明のこの態様による方法は、複数回用量の本発明の抗原結合分子を、対象に逐次投与することを含む。本明細書で使用される場合、「連続的に投与すること」は、抗原結合分子の各用量が、異なる時点、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日間、数週間または数か月間）によって分けられた異なる日に対象へ投与されることを意味する。本発明には、抗原結合分子の単回の一次用量と、それに続く抗原結合分子の１回以上の二次用量、次いで場合により抗原結合分子の１回以上の三次用量を患者へ連続的に投与することを含む方法が含まれる。
【０２１５】
「一次用量」、「二次用量」、および「三次用量」という用語は、本発明の抗原結合分子の投与の時系列を指す。したがって、「一次用量」とは、治療様式の開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも呼ばれる）であり、「二次用量」とは、一次用量後に投与される用量であり、「三次用量」とは、二次用量後に投与される用量である。一次用量、二次用量、および三次用量はすべて、同じ量の抗原結合分子を含有し得るが、概して、投与頻度に関して互いに異なり得る。しかしながら、特定の実施形態では、一次用量、二次用量および／または三次用量に含有される抗原結合分子の量は、治療経過の間、互いに異なる（例えば、適宜上下に調整される）。特定の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、または５回）の用量が治療レジメンの開始時において「負荷用量（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｏｓｅ）」として投与され、続いてより低い頻度に基づいて投与される後続用量（例えば、「維持用量」）が投与される。
【０２１６】
本発明のある例示的な実施形態において、各二次用量および／または三次用量は、直前の用量の１〜２６（例えば、１、１と１／２、２、２と１／２、３、３と１／２、４、４と１／２、５、５と１／２、６、６と１／２、７、７と１／２、８、８と１／２、９、９と１／２、１０、１０と１／２、１１、１１と１／２、１２、１２と１／２、１３、１３と１／２、１４、１４と１／２、１５、１５と１／２、１６、１６と１／２、１７、１７と１／２、１８、１８と１／２、１９、１９と１／２、２０、２０と１／２、２１、２１と１／２、２２、２２と１／２、２３、２３と１／２、２４、２４と１／２、２５、２５と１／２、２６、２６と１／２、またはそれ以上）週間後に投与される。「直前の用量」という句は、本明細書で使用される場合、一連の複数回投与において、抗原結合分子の用量を意味し、これは、介入用量のない直後の用量の投与の前に患者へ投与される。
【０２１７】
本発明のこの態様による方法は、任意の回数の二次用量および／または三次用量の抗原結合分子（例えば、ＦｃεＲ１α抗体、またはＦｃεＲ１αおよびＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子）を患者に投与することを含んでもよい。例えば、特定の実施形態では、単回の二次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の二次用量が患者に投与される。同様に、特定の実施形態では、単回の三次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の三次用量が患者に投与される。
【０２１８】
複数回の二次用量を伴う実施形態において、各二次用量は他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各二次用量は、直前の用量の１〜２週間後に患者に投与されてもよい。同様に、複数の三次用量を含む実施形態において、各三次用量は他の三次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各三次用量は、直前の用量の２〜４週間後に患者に投与されてもよい。あるいは、二次用量および／または三次用量が患者へ投与される頻度は、治療計画の経過にわたって変動し得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療経過の間に調整され得る。
【０２１９】
一実施形態では、抗原結合分子（例えば、ＦｃεＲ１α抗体、またはＦｃεＲ１αおよびＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子）を、体重に基づく用量として対象に投与する。「体重に基づく用量」（例えば、ｍｇ／ｋｇ単位の用量）は、対象の体重に応じて変化する、抗体もしくはその抗原結合断片または二重特異性抗原結合分子の用量である。
【０２２０】
別の実施形態では、抗体もしくはその抗原結合断片または二重特異性抗原結合分子を、固定用量として対象に投与する。「固定用量」（例えば、ｍｇ単位の用量）は、抗体もしくはその抗原結合断片または二重特異性抗原結合分子の一用量が、体重などの任意の特定の対象に関連する因子にかかわらず、すべての対象に使用されることを意味する。特定の一実施形態では、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片または二重特異性抗原結合分子の固定用量は、所定の体重または年齢に基づく。
【０２２１】
一般に、本発明の抗原結合分子の好適な用量は、レシピエントの体重１キログラムあたり約０．００１〜約２００．０ｍｇの範囲、概して、体重１キログラムあたり約１〜５０ｍｇの範囲であり得る。例えば、抗体もしくはその抗原結合断片または二重特異性抗原結合分子は、単回用量あたり約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。列挙された値の中間の値および範囲も、本発明の一部であることが意図される。
【０２２２】
一部の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、約１ｍｇ〜約２５００ｍｇの固定用量として投与される。一部の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、約１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２５ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３７５ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２５ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４７５ｍｇ、約５００ｍｇ、約５２５ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５７５ｍｇ、約６００ｍｇ、約６２５ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６７５ｍｇ、約７００ｍｇ、約７２５ｍｇ、約７５０ｍｇ、約７７５ｍｇ、約８００ｍｇ、約８２５ｍｇ、約８５０ｍｇ、約８７５ｍｇ、約９００ｍｇ、約９２５ｍｇ、約９５０ｍｇ、約９７５ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約２０００ｍｇ、または約２５００ｍｇの固定用量として投与される。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
【０２２３】
抗体の診断的使用
本発明の抗ＦｃεＲ１α抗体はまた、例えば診断目的のために、試料中のＦｃεＲ１α、またはＦｃεＲ１α発現細胞を検出および／または測定するために使用してもよい。例えば、抗ＦｃεＲ１α抗体またはその断片を使用して、ＦｃεＲ１αの異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現、発現の欠如など）を特徴とする病態または疾患を診断してよい。ＦｃεＲ１αについての例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を本発明の抗ＦｃεＲ１α抗体と接触させることを含んでもよく、抗ＦｃεＲ１α抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識されている。あるいは、非標識抗ＦｃεＲ１α抗体は、それ自体が検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて、診断用途において使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓもしくは１２５Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアナートもしくはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分、またはアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。本発明の抗ＦｃεＲ１α抗体の別の例示的な診断用途は、対象においてマスト細胞、好塩基球、または他のＦｃεＲ１α発現細胞を非侵襲的に識別および追跡する目的のための（例えば、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージング）、８９Ｚｒ−デスフェリオキサミン標識などの８９Ｚｒで標識された抗体を含む（例えば、Ｔａｖａｒｅ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１６  Ｊａｎ  １；７６（１）：７３−８２；  ａｎｄ  Ａｚａｄ，ＢＢ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６  Ｍａｒ  １５；７（１１）：１２３４４−５８を参照されたい）。試料中のＦｃεＲ１αを検出または測定するために使用することができる具体的で例示的なアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が含まれる。
【０２２４】
本発明によるＦｃεＲ１α診断アッセイにおいて使用することができる試料には、正常な条件または病理学的条件下で、検出可能な量のＦｃεＲ１αタンパク質またはその断片を含有する、患者から得ることのできる任意の組織または体液試料が含まれる。一般に、健常な患者（例えば、異常なＦｃεＲ１αのレベルまたは活性に関連した疾患または病態に罹患していない患者）から得られた特定の試料中のＦｃεＲ１αのレベルは、ＦｃεＲ１αのベースラインレベルまたは標準レベルを最初に確立するために測定されるであろう。次いで、このＦｃεＲ１αのベースラインレベルを、ＦｃεＲ１α関連疾患（例えば、アレルギーの患者）または病態を有することが疑われる個体から得られた試料において測定されたＦｃεＲ１αのレベルと比較することができる。
【実施例】
【０２２５】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を限定することを企図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はしてきたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。別段示されない限り、部分は重量部分であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
【０２２６】
実施例１．抗体の生成
抗ＦｃεＲ１α抗体の生成
抗ＦｃεＲ１α抗体は、遺伝子改変マウスをヒトＦｃεＲ１α抗原（例えば、ｈＦｃεＲ１α、配列番号６３）で免疫することによって、またはヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子操作マウスをヒトＦｃεＲ１α抗原で免疫することによって得られた。
【０２２７】
免疫後、各マウスから脾細胞を採取し、（１）マウス骨髄腫細胞と融合して、それらの生存を維持し、ハイブリドーマ細胞を形成して、ＦｃεＲ１α特異性についてスクリーニングするか、または（２）反応性抗体（抗原陽性Ｂ細胞）に結合しそれを識別する選別試薬としてヒトＦｃεＲ１α断片を使用して、Ｂ細胞を選別するかのいずれかを行った（ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１に記載の通り）。
【０２２８】
ヒト可変領域およびマウス定常領域を有するＦｃεＲ１αに対するキメラ抗体を、最初に単離した。抗体を、親和性、選択性などを含む望ましい特徴について特徴付けし選択する。必要ならば、マウス定常領域を所望のヒト定常領域、例えば、野生型または改変されたＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域と置換して、完全ヒト抗ＦｃεＲ１α抗体を生成した。選択された定常領域は特異的用途に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合特徴および標的特異性特徴は、可変領域に存在する。
【０２２９】
本実施例の方法に従って生成された例示的な抗ＦｃεＲ１α抗体のある特定の生物学的特性を、以下に記載される実施例において詳細に説明する。
【０２３０】
抗ＣＤ３抗体の生成
抗ＣＤ３抗体は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／０５３８５６に記載されているように生成された。本発明に従って、二重特異性抗ＣＤ３／ＦｃεＲ１α抗体を産生するために、例示的な抗ＣＤ３抗体を選択した。本発明による二重特異性抗体の調製に使用するための他の抗ＣＤ３抗体は、例えば、ＷＯ２０１４／０４７２３１に見出すことができる。
【０２３１】
この実施例の方法に従って生成された例示的な抗ＣＤ３抗体の特定の生物学的特性が、本明細書の実施例において詳細に説明される。
【０２３２】
ＦｃεＲ１αおよびＣＤ３に結合する二重特異性抗体の生成
本発明は、ＣＤ３およびＦｃεＲ１αに結合する二重特異性抗原結合分子を提供し、かかる二重特異性抗原結合分子はまた、本明細書において「抗ＦｃεＲ１α／抗ＣＤ３二重特異性分子」または「抗ＦｃεＲ１α×ＣＤ３二重特異性分子」とも呼ばれる。抗ＦｃεＲ１α／抗ＣＤ３二重特異性分子の抗ＦｃεＲ１α部分は、ＦｃεＲ１αを発現する細胞を標的化するのに有用であり、二重特異性分子の抗ＣＤ３部分は、Ｔ細胞を活性化するのに有用である。細胞上のＦｃεＲ１αおよびＴ細胞上のＣＤ３の同時結合は、活性化Ｔ細胞によって標的ＦｃεＲ１α発現細胞の特異的死滅（細胞溶解）を促進する。
【０２３３】
抗ＦｃεＲ１α特異的結合ドメインおよび抗ＣＤ３特異的結合ドメインを含む二重特異性抗体を、標準的な方法を用いて構築し、抗ＦｃεＲ１α抗原結合ドメインおよび抗ＣＤ３抗原結合ドメインがそれぞれ共通のＬＣＶＲと対をなす異なる別個のＨＣＶＲを含む。例示された二重特異性抗体では、これらの分子は、抗ＣＤ３抗体からの重鎖、抗ＦｃεＲ１α抗体からの重鎖、および抗ＣＤ３抗体からの共通の軽鎖を利用して構築された（ＷＯ２０１７／０５３８５６）。他の例では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３抗体からの重鎖、抗ＦｃεＲ１α抗体からの重鎖、および抗ＣＤ３抗体からの軽鎖もしくは抗ＦｃεＲ１α抗体からの軽鎖または乱雑であるかもしくは様々な重鎖アームと効果的に対合することが既知である任意の他の軽鎖、を利用して構築され得る。二重特異性抗体の任意の成分が由来する抗ＦｃεＲ１α抗体および抗ＣＤ３抗体は、時には、親抗体と呼ばれることもある。
【０２３４】
以下の実施例に記載される二重特異性抗体は、抗ＣＤ３結合アーム、および抗ＦｃεＲ１α結合アームを含む。ＩｇＧ４Ｆｃドメイン（ｂｓＡｂ２４９１９Ｄ、ｂｓＡｂ２４９２０Ｄ、およびｂｓＡｂ２４９２１Ｄ）を有する例示的な二重特異性抗体を製造した。
【０２３５】
構築した様々な抗ＦｃεＲ１α×ＣＤ３二重特異性抗体の抗原結合ドメインの構成部分の概要を、表５に示す。
【０２３６】
実施例２．重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
表１は、本発明の選択された抗ＦｃεＲ１α抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域（ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ）、ＣＤＲならびに重鎖ならびに軽鎖（ＨＣおよびＬＣ）のアミノ酸配列識別子を示す。対応する核酸配列識別子を表２に示す。
【表１】
2021533806.tif 000002
【表２】
2021533806.tif 000003
【０２３７】
表３は、本発明の例示的な抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域（ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ）、ならびにＣＤＲならびに重鎖および軽鎖（ＨＣおよびＬＣ）のアミノ酸配列識別子を示す。対応する核酸配列識別子を表４に示す。
【表３】
2021533806.tif 000004
【表４】
2021533806.tif 000005
【０２３８】
構築した様々な抗ＦｃεＲ１α×ＣＤ３二重特異性抗体の構成部分の概要を、表５に示す。表６、７、および８に、二重特異性抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＣＤＲ、ならびに重鎖および軽鎖配列識別子を列挙する。
【表５】
2021533806.tif 000006
【表６】
2021533806.tif 000007
【表７】
2021533806.tif 000008
【表８】
2021533806.tif 000009
【０２３９】
実施例３．ヒトモノクローナル抗ＦｃεＲ１α単一特異性抗体および抗ＦｃεＲ１α１６×ＣＤ３二重特異性抗体の表面プラズモン共鳴から導かれた結合親和性および動力学定数
精製された抗ＦｃεＲ１αモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびＣＤ３×ＦｃεＲ１α二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）に結合するヒトまたはカニクイザルＦｃεＲ１αエクトドメインの平衡解離定数（ＫＤ）は、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＳＰＲ−Ｂｉａｃｏｒｅ）Ｂｉａｃｏｒｅ８ｋを使用して決定した。すべての結合研究は、２５℃および３７℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ−ＥＴ）の泳動用緩衝液中で行われた。
【０２４０】
ＢｉａｃｏｒｅＣＭ４センサーの表面を、最初にモノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体とのアミンカップリングによって誘導体化して、およそ５００〜９００ＲＵの抗ＦｃεＲ１αモノクローナル抗体または抗ＣＤ３×ＦｃεＲ１α二重特異性モノクローナル抗体を捕捉した。製造元によって定義されるように、１ＲＵ（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｎｉｔ、応答ユニット）は、１ｍｍ２あたり１ｐｇのタンパク質を表す。ヒトおよびカニクイザルＦｃεＲ１α試薬のエクトドメインを、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−６ｘＨｉｓタグ−ｈＦｃεＲ１α．ＭＭＨ（配列番号５７）およびｍｆＦｃεＲ１α．ＭＭＨ（配列番号５８）を用いて発現させた。異なる濃度のＦｃεＲ１α試薬を、ＨＢＳ−ＥＴ泳動緩衝液（６００ｎＭ〜７．４ｎＭ、３倍ごとの段階希釈）中で調製し、３０μＬ／分の流量で、抗ヒトＦｃで捕捉された抗ＦｃεＲ１αモノクローナル抗体または抗ＣＤ３ｘＦｃεＲ１α二重特異性モノクローナル抗体の表面上に１分間注入した。結合したＦｃεＲ１α試薬の解離を、ＨＢＳ−ＥＴ泳動緩衝液中で４分間モニタリングした。会合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ８ｋ評価ソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサグラムを物質移動限界を用いて１：１結合モデルにあてはめることによって決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、動的速度定数から以下のように計算した：
【数１】
2021533806.tif 000010
【０２４１】
２５℃および３７℃での本発明の異なる例示的な抗ＦｃεＲ１αモノクローナル抗体または抗ＣＤ３ｘＦｃεＲ１α二重特異性モノクローナル抗体に結合する、ｈＦｃεＲ１α．ＭＭＨおよびｍｆＦｃεＲ１α．ＭＭＨの結合動力学パラメータを、表９〜表１２に示す。
【表９】
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【表１０】
2021533806.tif 000012
【表１１】
2021533806.tif 000013
【表１２】
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【０２４２】
表９に示すように、２５℃で、本発明の例示的な抗ＦｃεＲ１αモノクローナル抗体または抗ＣＤ３×ＦｃεＲ１α二重特異性抗体は、１２７ｎＭ〜３０３ｎＭの範囲のＫＤ値でｈＦｃεＲ１α．ＭＭＨに結合した。表１０に示すように、３７℃で、本発明の例示的な抗ＦｃεＲ１αモノクローナル抗体または抗ＣＤ３×ＦｃεＲ１α二重特異性抗体は、４４４ｎＭ〜１．５５ｕＭの範囲のＫＤ値でｈＦｃεＲ１α．ＭＭＨに結合した。
【０２４３】
表１１に示すように、２５℃で、本発明の例示的な抗ＦｃεＲ１αモノクローナル抗体または抗ＣＤ３×ＦｃεＲ１α二重特異性抗体は、１９５ｎＭ〜４６７ｎＭの範囲のＫＤ値でｍｆＦｃεＲ１α．ＭＭＨに結合した。表１２に示すように、３７℃で、本発明の例示的な抗ＦｃεＲ１αモノクローナル抗体または抗ＣＤ３×ＦｃεＲ１α二重特異性抗体は、３３０ｎＭ〜３．３５ｕＭの範囲のＫＤ値でｍｆＦｃεＲ１α．ＭＭＨに結合した。
【０２４４】
実施例４．ＪｕｒｋａｔおよびＨＥＫ２９３細胞で発現したＦｃεＲ１αに特異的に結合する抗ＦｃεＲ１αｘＣＤ３二重特異性抗体
抗ＦｃεＲ１αモノクローナル抗体および抗ＦｃεＲ１αｘＣＤ３二重特異性抗体によって細胞で発現される抗原への結合を評価するために、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−ＬｕｃおよびＨＥＫ２９３／ｈＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γ細胞を用いてフローサイトメトリー実験を行った。Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ細胞は、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）応答エレメントの核因子の転写制御下で、ルシフェラーゼレポーターを安定的に発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞である。ＨＥＫ２９３／ｈＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γ細胞は、ヒトＦｃεＲ１α、ＦｃεＲ１β、およびＦｃεＲ１γを安定的に発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞である。サル（カニクイザル、ｍｆ）ＦｃεＲ１α（受託番号ＸＰ＿００５５４１３７０．１のアミノ酸４〜２６０、８１位のアラニンがトリプトファンに変化）への結合を試験するために、ｍｆＦｃεＲ１αを、ヒトＦｃεＲ１βおよびＦｃεＲ１γと共にＨＥＫ２９３において安定的に発現させた。得られた細胞株（以下、ＨＥＫ２９３／ｍｆＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γと呼ばれる）は単離され、１０％ＦＢＳ、１×ＮＥＡＡ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン、１μｇ／ｍＬのピューロマイシン、１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ、および５００μｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸塩を補充したＤＭＥＭ培地中で維持された。試薬情報は、次のとおりである：ＤＭＥＭ培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＣＲＬ−１５７３）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｅｒａｄｉｇｍ、カタログ番号１５００−５００）、１００Ｘペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３７８−０１６）、１００Ｘ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９０３４）、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（商標）選択的抗生物質（Ｇ４１８硫酸塩）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１８１１−０９８）、ハイグロマイシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号４０００４９）、ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−８８３３）。
【０２４５】
フローサイトメトリー分析のために、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３／ｈＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γおよびＨＥＫ２９３／ｍｆＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γ細胞を、酵素遊離解離緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号Ｓ−００４）を使用して解離した後に収集し、細胞を、７０ｎＭのヒトＩｇＥの有無で、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋なし、（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９２４０）、２％ＦＢＳを含む）中、氷上で３０分間プレインキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−ｌｕｃ細胞も収集した。次いで、７０ｎＭの濃度の抗体を、４℃で３０分間、１×１０６細胞／ウェルの各細胞型に添加した。一次抗体とインキュベーションした後、細胞を、氷上で３０分間、１．３μｇ／ｍｌのアロフィコシアニン（ＡＰＣ）がコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−１３６−１７０）で染色した。細胞をＢＤ  ＣｙｔｏＦｉｘ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号５５４６５５）を使用して固定し、Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６（ＢＤ）またはＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。すべての細胞株について、未染色の対照および二次抗体単独の対照も試験し、試料を、製造元のプロトコルに従って、Ｆａｒ  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏ生存色素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ＃Ｌ１０１２０）を使用して生存率を評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０．０．８、ＦｌｏｗＪｏ）を使用して結果を分析して、生存細胞の蛍光の幾何平均を決定し、結合比を、非染色のそれぞれの細胞のＭＦＩによって正規化された実験条件の平均蛍光強度（ＭＦＩ）で計算した。表１３および１４に、結果を要約した。
【表１３】
2021533806.tif 000015
【表１４】
2021533806.tif 000016
【０２４６】
表１３に示すように、例示的な抗ＦｃεＲ１αｘＣＤ３二重特異性抗体ｂｓＡｂ２４９１９Ｄ、ｂｓＡｂ２４９２０Ｄ、およびｂｓＡｂ２４９２１Ｄは、７０ｎＭのヒトＩｇＥの有無で、ＨＥＫ２９３／ｈＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γ細胞で発現されたヒトＦｃεＲ１αに対する結合を示し（結合比が２０１〜２９５）、また、Ｊｕｒｋａｔ細胞で発現されたヒトＣＤ３に対する結合を示した（結合比が４８〜９４）。本発明の例示的な二重特異性抗体は、ＦｃεＲ１受容体のないＨＥＫ２９３に対して最小限の結合を示した（結合比が２〜１１）。抗ＦｃεＲ１α抗体は、７０ｎＭのヒトＩｇＥの有無で、ＨＥＫ２９３／ｈＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γ細胞に対する結合を示し（結合比が１３６〜３９６）、７０ｎＭのヒトＩｇＥの存在下、ＨＥＫ２９３またはＪｕｒｋａｔ細胞に対する結合比は１〜８であった。アイソタイプ対照抗体は、いずれの細胞にも結合を示さず、二次単独対照が、１の結合比を示した。
【０２４７】
表１４に示すように、例示的な抗ＦｃεＲ１αｘＣＤ３ε二重特異性抗体ｂｓＡｂ２４９１９Ｄ、ｂｓＡｂ２４９２０Ｄ、およびｂｓＡｂ２４９２１Ｄは、７０ｎＭのヒトＩｇＥの有無で、ＨＥＫ２９３／ｍｆＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γ細胞で発現されたサル（カニクイザル）ＦｃεＲ１αに対する結合を示した（結合比が１４２〜２８４）。本発明の例示的な二重特異性抗体は、ＦｃεＲ１受容体のないＨＥＫ２９３細胞に対して最小限の結合を示した（結合比が１〜２）。本発明の例示的な抗ＦｃεＲ１α抗体は、７０ｎＭのヒトＩｇＥの有無で、ＨＥＫ２９３／ｍｆＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γ細胞に対して結合を示したが（結合比が１０１〜２７９）、ＨＥＫ２９３には結合しなかった。アイソタイプ対照抗体は、いずれの細胞にも結合を示さず、二次単独対照が、１の結合比を示した。
【０２４８】
実施例５．抗ＦｃεＲ１α×ＣＤ３二重特異性抗体によるヒトＣＤ３シグナル伝達の活性化
ＦｃεＲ１α発現細胞の存在下で、抗ＦｃεＲ１α×ＣＤ３ε二重特異性抗体によるヒトＣＤ３シグナル伝達の活性化を評価するために、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−ｌｕｃ細胞およびＨＥＫ２９３／ｈＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γ細胞を用いてバイオアッセイを行った。安定な細胞株が開発された。ヒトＴリンパ球細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞株は、ＣＤ３媒介性Ｔ細胞受容体シグナル伝達を実証するために利用されてきた（Ａｂｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｒａｄｉｇｍ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４  Ａｐｒ；４（４）：３０１−８）。活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）応答エレメントの核因子の転写制御下で、ルシフェラーゼレポーターを安定的に発現するように、Ｊｕｒｋａｔ細胞を操作した。得られた細胞株（以下、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−Ｌｕｃと呼ばれる）を単離し、１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン、および１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９１６０）中で維持した。さらに、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトして、ヒトＦｃεＲ１α（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１２３１９−１のアミノ酸１〜２５７）、ＦｃεＲ１β（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ０１３６２−１のアミノ酸１〜２４４）およびＦｃεＲ１γ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ３０２７３−１のアミノ酸１〜８６）を安定的に発現させた。得られた細胞株（以下、ＨＥＫ２９３／ｈＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γと呼ばれる）を単離し、１０％ＦＢＳ、１ＸＮＥＡＡ、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン、１μｇ／ｍＬピューロマイシン、１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ、および５００μｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸塩を補充したＤＭＥＭ培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号９０３３）中で維持した。
【０２４９】
バイオアッセイを行って、本発明の例示的な抗ＦｃεＲ１αｘＣＤ３ε二重特異性抗体によってＣＤ３シグナル伝達を測定した。バイオアッセイでは、ＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３／ｈＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γ細胞を、アッセイ緩衝液（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９１６０））中に１０ｎＭのヒトＩｇＥが有無のアッセイ緩衝液中で、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１０，０００細胞で、５％ＣＯ２中、３７℃で３０分間播種した。インキュベーション後、５０，０００個のＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−ｌｕｃ細胞と共に、段階希釈された本発明の例示的な抗ＦｃεＲ１α×ＣＤ３二重特異性抗体、本発明の例示的な抗ＦｃεＲ１α抗体、または１００ｎＭ〜２ｐＭの範囲の濃度のアイソタイプ対照抗体、加えて緩衝液のみを含む試料（抗体なし）を播種した。５％ＣＯ２中、３７℃で５．５時間後、ＯｎｅＧｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ６０３１）およびＶｉｃｔｏｒ（商標）Ｘマルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を、Ｐｒｉｓｍ（商標）６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いた非線形回帰（４パラメータロジスティクス）を使用して分析して、ＥＣ５０値を得た。活性化倍率は、抗体なしの平均ＲＬＵによって正規化された抗体の最高濃度の平均ＲＬＵ（相対光単位、ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ）で計算した。結果を、表１５に要約する。
【表１５】
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【０２５０】
表１５に示すように、本発明の例示的な抗ＦｃεＲ１α×ＣＤ３二重特異性抗体、ｂｓＡｂ２４９１９Ｄ、ｂｓＡｂ２４９２０Ｄ、およびｂｓＡｂ２４９２１Ｄは、ＣＤ３シグナル伝達の活性化を示し、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−ｌｕｃ細胞では、ＨＥＫ２９３／ｈＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γ細胞の存在下、ヒトＩｇＥがない場合、ＥＣ５０値が２３０ｐＭ〜６８０ｐＭの範囲であり、１０ｎＭのヒトＩｇＥがある場合、ＥＣ５０値が１．１ｎＭ〜４．９ｎＭの範囲であった。最も高い活性化は、ｂｓＡｂ２４９１９Ｄにより達成され、１０ｎＭのＩｇＥの有無にかかわらず、３２倍活性化された。本発明の例示的な二重特異性抗体は、ＦｃεＲ１受容体のないＨＥＫ２９３の存在下で最小限の活性化を示し、活性化倍率が１〜３の範囲であった。抗ＦｃεＲ１α抗体およびアイソタイプ対照抗体では活性化が示されず、試験したいずれの条件でも、活性化倍率は１倍であった。
【０２５１】
実施例６．インビトロ死滅アッセイにおける抗ＦｃεＲ１α×抗ＣＤ３二重特異性抗体の効果
２つの別個の実験を使用して、インビトロでのＦｃεＲ１α発現細胞のＴ細胞媒介性死滅の誘発における、本発明の例示的な抗ＦｃεＲ１α×抗ＣＤ３二重特異性抗体（ｂｓＡｂ２４９１９Ｄ、ｂｓＡｂ２４９２０Ｄ、およびｂｓＡｂ２４９２１Ｄ）の有効性を決定した。１つの実験では、操作されたＨＥＫ２９３／ｈＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γ細胞を標的として使用し、一方、第２の実験では、全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）集団内の初代ヒト好塩基球を標的として使用した。両方の事例では、同様のプロトコルを使用して、死滅アッセイの前にＴ細胞を活性化した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、まず、ＲｏｓｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮カクテルキット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５０６３）を使用して、ヒト白血球パック（ｌｅｕｋｏｐａｃｋｓ、ＮＹ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ）から単離し、ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１１３２Ｄ）と共に培養して、Ｔ細胞の活性化を誘導した。培養の２〜３日目に、磁気分離を使用してビーズを除去し、Ｔ細胞を培養した。一実施例では（ＨＥＫ２９３／ｈＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γ標的細胞と共に使用する場合）、Ｔ細胞を培養中で５日間維持し、そのときに、ＩＬ−２を３００Ｕ／ｍｌで添加して、生存および成長を促進させ、ＩＬ−２を添加して２日後にＴ細胞を使用した。第２の実施例では（ＰＢＭＣ標的細胞と共に使用する場合）、細胞は、ビーズ除去後１日間培養中に維持し、次いで、死滅アッセイに使用した。両方の事例では、活性化Ｔ細胞を、死滅アッセイを設定する前に、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｃ３４５５４）で標識し、結果の分析中に細胞の除去を可能にした。
【０２５２】
ＨＥＫ２９３／ｈＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γ標的細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する際の、本発明の例示的な抗ＦｃεＲ１α×抗ＣＤ３二重特異性抗体の有効性を決定するために、読み取り（ｒｅａｄｏｕｔ）としてアポトーシスカスケードの２つの媒介体（切断カスパーゼ３および切断ＰＡＲＰ）の検出を使用する、死滅アッセイを使用した。死滅アッセイを設定するために、活性化されたＴ細胞を、Ｔ細胞あたり１０個の標的細胞の割合で標的細胞と混合し、次いで９６ウェルプレートに播種した。最終濃度が１００ｎＭ〜１０．２４ｆＭの範囲の５倍ごとの段階抗体希釈液をウェルに添加し、細胞を、３７℃で一晩インキュベートして、Ｔ細胞媒介死滅を起こさせた。抗体には、本発明の例示的な抗ＦｃεＲ１α／ＣＤ３二重特異性抗体およびアイソタイプ対照抗体が含まれた。インキュベーション後、細胞を回収し、予温したＢＤ  ｃｙｔｏｆｉｘ（カタログ番号５５４６５５）に３７℃で１０分間再懸濁した。次いで、細胞を、ＭＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９１−２２１）中で２回洗浄し、氷冷メタノールに再懸濁し、−２０℃で少なくとも３０分間または一晩インキュベートすることによって透過性にした。透過処理後、ＭＡＣＳ緩衝液を細胞に添加して、１０分間細胞を再水和させ、続いてＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、細胞をＦｃ遮断抗体（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１４−９１６１−７３）でインキュベートし、続いて、Ａｌｅｘａ−６４７コンジュゲート抗切断カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号９６０２Ｓ）およびＰＥコンジュゲート抗切断ＰＡＲＰ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５２９３３）を含む抗体カクテルで染色した。カスパーゼ３およびＰＡＲＰの切断は、細胞傷害性溶解顆粒をＣＤ８＋Ｔ細胞から標的に送達した後に開始されるアポトーシスカスケードの活性化において必須のステップである。したがって、これらの切断タンパク質の特異的検出は、死滅の読み取りとして機能する。染色後、細胞を洗浄し、ＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ器具（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して取得した。死滅細胞をＣＦＳＥ−として特定し、この集団内のアポトーシス細胞を、切断カスパーゼ３＋および切断ＰＡＲＰ＋として特定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータ分析を行った。得られたデータポイントを、Ｘ＝Ｌｏｇ（Ｘ）の方程式を使用して変換し、変換されたデータを線形回帰分析に供し、シグモイドの用量反応曲線に適合させた。この分析から、ＥＣ８０（最大有効濃度の８０％、特定の曝露時間後にベースラインと最大値との間で８０％の応答を誘導する抗体の濃度を含む）および上位応答が導出された。
【０２５３】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）集団内で初代好塩基球のＴ細胞媒介性死滅を誘発する際の、本発明の例示的な抗ＦｃεＲ１αｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体の有効性を決定するために、残りのＰＢＭＣ集団に対するこれらの細胞の定量に基づくアッセイを使用した。Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号１７−１４４０−０３）精製によってドナー血液から新鮮なＰＢＭＣを得て、操作されたＨＥＫ２９３／ｈＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γ標的細胞について上で記載した同様の形式で、活性化Ｔ細胞と抗体希釈液を混合した。一晩インキュベーションした後、細胞を回収し、生／死細胞マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｌ３４９６２）、続いてＦｃ遮断抗体とインキュベーションし、ＡＰＣコンジュゲート抗ＨＬＡ−ＤＲ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５９８６６）およびＢＵＶ３９５コンジュゲート抗ＣＤ１２３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６４１９５）抗体を含む抗体混合物で染色した。次いで、細胞を、ＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＰＢＳ中で１：４に希釈したＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘを含む溶液中で１５分間固定した。細胞を、ＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ器具中に取得した。死細胞は、ＣＦＳＥで以前に標識されていた外因性の活性化Ｔ細胞と同様に、生／死細胞マーカーを使用して分析から除外した。残りの生ＰＢＭＣ集団内の好塩基球を、ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ−として特定した。
【０２５４】
Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータ分析を行った。得られたデータポイントを、Ｘ＝Ｌｏｇ（Ｘ）の方程式を使用して変換し、変換されたデータを線形回帰分析に供し、シグモイドの用量反応曲線に適合させた。ＥＣ５０は、この分析から導出された。好塩基球の最大減少率は、次の式を使用して計算した。
１００−（１００×抗体用量が最も高い試料中の好塩基球のパーセント）／（全てのアイソタイプ対照試料中の好塩基球の平均パーセント）。
【０２５５】
表１６は、本発明の各例示的な二重特異性抗体（ｂｓＡｂ２４９１９Ｄ、ｂｓＡｂ２４９２０Ｄ、およびｂｓＡｂ２４９２１Ｄ）の存在下での切断カスパーゼ３および切断ＰＡＲＰ二重陽性ＨＥＫ２９３／ｈＦｃεＲ１α／ｈＦｃεＲ１β／ｈＦｃεＲ１γ標的細胞の用量依存的増加を要約しており、ＥＣ８０は、それぞれ、３．４５６×１０−１１Ｍ、１．２６４×１０−１０Ｍ、および６．１２８×１０−１１Ｍである。このアッセイは、アポトーシスの初期段階を捕捉することに基づくため、細胞が完全に死滅する前にアッセイを停止し、ｂｓＡｂ２４９１９Ｄ、ｂｓＡｂ２４９２０Ｄ、およびｂｓＡｂ２４９２１Ｄでインキュベートした細胞について、アポトーシスマーカーについての染色で陽性の細胞の最大パーセントは、それぞれ、５６．０４、５６．４８、および５５．８３であった。特に、Ｔ細胞を、抗体の不在下で標的細胞と一緒にインキュベートした場合、単独でインキュベートした標的細胞と比較して、両方のアポトーシスマーカーについて陽性の標的細胞の割合の増加は、観察されなかった。言い換えれば、Ｔ細胞を、アイソタイプ対照抗体のみの存在下で標的細胞と一緒にインキュベートした場合、アポトーシスの誘導は観察されない。
【表１６】
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【０２５６】
表１７は、本発明の例示的な二重特異性抗体（ｂｓＡｂ２４９１９Ｄ、ｂｓＡｂ２４９２０Ｄ、およびｂｓＡｂ２４９２１Ｄ）の存在下での総ＰＢＭＣ標的集団内の好塩基球の用量依存的減少を要約しており、ＥＣ５０は、それぞれ、３．７４８×１０−９Ｍ、２．００３×１０−８Ｍ、および４．００３×１０−９Ｍである。好塩基球は、すべてのアイソタイプ処理試料中のＰＢＭＣ内の好塩基球の平均パーセントと比較して、ｂｓＡｂ２４９１９Ｄ、ｂｓＡｂ２４９２０Ｄ、およびｂｓＡｂ２４９２１Ｄの最も高い用量は、それぞれ９０．５７％、８０．１％、および９０．９２％減少した。
【表１７】
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【０２５７】
実施例７．抗ＦｃεＲ１α×ＣＤ３二重特異性抗体のインビボ有効性
インビボモデルおよび脾臓好塩基球枯渇における受動皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）における抗ＦｃεＲ１α×抗ＣＤ３二重特異性抗体の効果を調べた。
【０２５８】
アレルゲン誘発性マスト細胞脱顆粒の遮断について本発明の抗ＦｃεＲ１α×ＣＤ３二重特異性抗体の有効性を決定するために、受動皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）のインビボモデルを使用した。ＰＣＡモデルは、１型過敏症を評価し、耳組織における局所マスト細胞活性化誘導血管透過性を測定する（Ｇｉｌｆｉｌｌａｎ，Ａ．Ｍ．＆  Ｔｋａｃｚｙｋ，Ｃ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｆｏｒ  ｍａｓｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，２１８−２３０（２００６））。このモデルは、アレルギー患者からのアレルゲン特異的血清を、ヒト高親和性ＩｇＥ受容体であるＦｃεＲ１αを発現するマウスの皮膚の局所領域に皮内注射して、続いて、アレルゲンを色素と共に静脈内注射することを伴う。アレルギー反応は、感作部位での毛細血管の拡張および血管透過性の上昇を引き起こし、この部位で色素の優先的な蓄積がもたらされる。色素は、組織から抽出され、分光測定で定量され得る。
【０２５９】
ＰＣＡアッセイの場合、最初、ＦｃεＲ１αおよびＣＤ３についてヒト化されたマウスの群（実験あたりｎ≧５）に、アイソタイプ対照抗体または本発明の３つの例示的なＦｃεＲ１α×ＣＤ３二重特異性抗体のうちの１つのいずれかを、２５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射した。抗体投与の５日後、マウスに、ネコアレルギー個体由来の血清（ＩｇＥ力価５８５、ＰＢＳで１：５に希釈）を耳に注射した。翌日、マウスに、０．５％（ｗ／ｖ）のエバンスブルー色素（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｅ２１２９）を含む１ＸＰＢＳ中に溶解した１μｇ／ｍＬのＦｅｌ  Ｄ１（Ｉｎｄｏｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈ、ＬＴＮ−ＦＤ１−１）の溶液を、静脈内投与した（マウス１匹あたり１００μＬ）。抗原投与の１時間後、マウスを屠殺し、耳および脾臓を切除し、収集した。
【０２６０】
耳を１ｍＬのホルムアミドに入れ、続いて５０℃で３日間インキュベートして、エバンスブルー色素を抽出した。次いで、耳組織を、ホルムアミドから除去し、ブロットして余分な液体を除去し、秤量した。各ホルムアミド抽出物の２００マイクロリットルのアリコートを、２重で９６ウェルプレートに移した。得られた上清の吸光度を、６２０ｎｍで測定した。測定された光学密度を、検量線を使用してエバンスブルー色素濃度に変換し、１ミリグラムの耳組織あたりのエバンスブルー色素のナノグラムとして表される。表１８は、各群の平均値±標準偏差を示す。
【０２６１】
好塩基球の頻度を評価するために、フローサイトメトリーに基づくアッセイを使用した。赤血球を溶解した後、採取した脾臓から単一細胞懸濁液を調製した（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｒ７７５７）。次いで、細胞を生／死細胞マーカーで染色し、続いて、ＢＵＶ３９５コンジュゲート抗Ｂ２２０（ＢＤ、カタログ番号５６３７９３）、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ４（ＢＤ、カタログ番号５５３０３１）、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ８（ＢＤ、カタログ番号５５７６６７）、およびＰＥＣｙ７コンジュゲートＣＤ４９ｂ（ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ、カタログ番号２５−５９７１−８２）を含有する抗体混合物で抗体染色した。染色後、細胞を、ＭＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１３０−０９１−２２１）で２回洗浄し、ＰＢＳで１：４に希釈したＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ（カタログ番号５５４６５５）を用いて１５分間固定し、次いでＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、４度で保存した。取得した日に、細胞を、ＢＤ  Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液（カタログ番号５５４７２３）中で２回洗浄し、細胞内ＦｃεＲ１αを、ｅＦｌｕｏｒ４５０コンジュゲート抗ＦｃεＲ１α（ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ、カタログ番号４８−５８９９−４２）で染色した。次いで、細胞を、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ器具に取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。好塩基球を、Ｂ２２０−ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ４９＋ＦｃεＲ１α＋として特定した。個々の抗体投与マウスにおける好塩基球の減少率は、次の式で計算した。１００−（脾臓好塩基球のパーセント／アイソタイプ群の脾臓好塩基球の平均パーセント）。ここで、脾臓好塩基球のパーセントは、脾臓のすべての生存細胞と比較して計算される。結果を、表１９に示す。
【０２６２】
エバンスブルー色素の血管外漏出は、抗体が投与されなかったマウスの耳、またはアイソタイプ対照抗体が投与されたマウスの耳で観察され、平均色素定量は、それぞれ８４．０６ｎｇ／ｍｇおよび８２．０５ｎｇ／ｍｇであった（ｎｇ／ｍｇは、組織１ｍｇあたりのエバンスブルー色素のナノグラムを指す）。表１８は、本発明の例示的な抗ＦｃεＲ１α×ＣＤ３二重特異性抗体（ｂｓＡｂ２４９１９ＤおよびｂｓＡｂ２４９２１Ｄ）のＰＣＡモデルにおける有効性を示し、アイソタイプ対照と比較した場合、これらの抗体で処理された群における血管外漏出の有意な低減を示す。アイソタイプ対照と比較して、ｂｓＡｂ２４９２０Ｄで処理された群では、色素の血管外漏出の減少に対する統計的に有意な傾向が観察されなかった。示されるように、ｂｓＡｂ２４９１９ＤおよびｂｓＡｂ２４９２１Ｄは、アイソタイプ対照と比較して、Ｆｅｌ  Ｄ１による感作およびその後の負荷に対する受動皮膚インビボモデルにおけるマスト細胞の脱顆粒を遮断し、それぞれ７４．６４ｎｇ／ｍｇおよび７５．２６ｎｇ／ｍｇの色素の血管外漏出の有意な減少を示し、一方、ｂｓＡｂ２４９２０Ｄでは４８．５６ｎｇ／ｍｇのより控えめな減少が観察された。統計的有意性は、以下のように決定された。まず、すべての群の正規性を、シャピロ・ウィルク正規性検定で検定した。すべての群のデータが正規分布していたため、ブラウン・フォーサイス検定を用いて、群間の標準偏差の違いを判定する一元配置ＡＮＯＶＡ分析を適用した。有意に異なる標準偏差が観察されたため、ダンの多重比較検定の代わりにノンパラメトリックのクラスカル・ウォリス検定を行い、グループ間の統計的有意性を決定した。
【０２６３】
抗体が投与されなかったマウス由来の脾臓は、全生存細胞と比べて平均で０．９１％の好塩基球を含有することが見出されたが、アイソタイプ対照抗体が投与されたマウス由来の脾臓は、平均で０．７１％の好塩基球を含有した。表１９は、上に記載のＰＣＡ実験からの同じマウスにおいて脾臓好塩基球を枯渇させる際の、本発明の例示的なＦｃεＲ１α×ＣＤ３二重特異性抗体（ｂｓＡｂ２４９１９Ｄ、ｂｓＡｂ２４９２０Ｄ、およびｂｓＡｂ２４９２１Ｄ）の有効性を示す。示されるように、３つの抗体のうちのいずれかで処理されたマウスは、脾臓好塩基球の減少を示した。この低減は、抗体が投与されなかったマウスと比較して、３つすべての抗体について有意であったが、この低減は、アイソタイプ対照抗体を投与した群と比較した場合、ｂｓＡｂ２４９１９Ｄで処理されたマウスに対してのみ統計的に有意であった。ｂｓＡｂ２４９１９Ｄ、ｂｓＡｂ２４９２０ＤおよびｂｓＡｂ２４９２１Ｄで処理されたマウスは、アイソタイプ群と比較して、それぞれ、９６％、９３％および９２％の好塩基球の減少を示した。統計的有意性は、以下のように決定された。最初に、シャピロ・ウィルク正規性検定を行い、すべてのデータ群が正規分布していることが分かった。したがって、一元配置ＡＮＯＶＡ分析を適用し、ブラウン・フォーサイス検定を使用して、グループ間の標準偏差の違いを検定した。この検定では、有意に異なる標準偏差が観察されたため、ダンの多重比較検定の代わりに、ノンパラメトリックのクラスカル・ウォリス検定を行い、グループ間の統計的有意性を決定した。
【表１８】
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【表１９】
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【０２６４】
ＰＣＡおよび好塩基球枯渇アッセイの両方について、本発明の例示的な抗ＦｃεＲ１αｘＣＤ３二重特異性抗体を使用して、ＦｃεＲ１αを発現する細胞の除去をより低い用量で達成した。ｂｓＡｂ２４９１９ＤおよびｂｓＡｂ２４９２１Ｄは、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇのより低い用量で繰り返された実験において、ＰＣＡ応答の統計的に有意な阻害および好塩基球の有意な減少を示した（データは示さず）。ＰＣＡおよび好塩基球枯渇アッセイの両方において、ｂｓＡｂ２４９１９ＤおよびｂｓＡｂ２４９２１Ｄの両方について、有効性は、５ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの用量で同様である（データは示さず）。
【０２６５】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な変更が前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。かかる変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【配列表】
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【国際調査報告】
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