(57)【要約】本開示は、ｇＤＮＡの突然変異を修正または誘導する、ドナーポリヌクレオチド、ゲノム編集系、方法およびキットを提供する。本開示は、ゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異（例えば、有害または病因突然変異）を、ｇＤＮＡのヌクレオチド配列の所望の変更をもたらし、エクソン定義をモジュレートし、それによって、編集されたｇＤＮＡから転写されたＲＮＡ転写物（例えば、プレｍＲＮＡ）の所望の変更の組入れをもたらす、ゲノム編集組成物および方法により、特に、本明細書に記載のドナーポリヌクレオチドの使用により、修正または誘導することができるという発見に、少なくとも一部は基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子の突然変異を修正または誘導し、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを構成する、ヌクレオチド配列を５’から３’に含む第１の鎖と、
（ｉｉ）前記第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
前記ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって前記突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記突然変異が、置換、ミスセンス、ナンセンス、挿入、欠失またはフレームシフト突然変異である、請求項１に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記突然変異が、エクソンにある、請求項１または２に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記突然変異が、置換、挿入または欠失であり、前記突然変異が、イントロンにある、請求項１または２に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記突然変異が、ｇＤＮＡのスプライシングシグナルの近位にある、請求項１〜３のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記突然変異が、ｇＤＮＡの３’スプライス部位の近位にある、請求項５に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記突然変異が、ｇＤＮＡの５’スプライス部位の近位にある、請求項５に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記突然変異が、ｇＤＮＡのスプライシングシグナルにある、請求項４に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記突然変異が、ｇＤＮＡの３’スプライス部位にある、請求項８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記突然変異が、ｇＤＮＡの５’スプライス部位にある、請求項８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記突然変異が、ポリピリミジントラクトにある、請求項８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記突然変異が、分岐点配列にある、請求項８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記突然変異が、タンパク質コード突然変異である、請求項１〜３、または５〜７のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記突然変異が、疾患に関連している、または疾患の原因となる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１５】
イントロン配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記突然変異を修正するイントロン配列を含む、請求項１、２、４、８〜１２、または１４のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１７】
エクソン配列を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）天然のまたは増強された３’スプライス部位、
（ｂ）天然のまたは増強された５’スプライス部位、
（ｃ）ポリピリミジントラクト、
（ｄ）分岐点、
（ｅ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｆ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｇ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｈ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された３’スプライス部位である、請求項１８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された５’スプライス部位である、請求項１８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、ポリピリミジントラクトである、請求項１８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、分岐点である、請求項１８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）である、請求項１８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）である、請求項１８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）である、請求項１８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）である、請求項１８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された３’スプライス部位とポリピリミジントラクトとを含む組合せである、請求項１８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項２８】
前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点とを含む組合せである、請求項１８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項２９】
細胞内のｇＤＮＡ分子の突然変異を修正または誘導する非複製型ｄｓＤＮＡ分子を含み、かつ前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、ドナーポリヌクレオチドであって、前記ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢへの双方向挿入用に構成されており、前記ドナーポリヌクレオチドが、
（ｉ）第１の分岐点配列と前記ｇＤＮＡの前記突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列とを構成するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖と、
（ｉｉ）第２の分岐点配列と前記ｇＤＮＡの前記突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列とを構成するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖と
を含み、前記第２の鎖が、前記第１の鎖に相補的であり、
前記ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、前記ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、（ｉ）センス鎖を含み、それによって、前記突然変異を修正し、前記１つまたは複数のスプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、前記ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、（ｉｉ）センス鎖を含み、それによって、前記突然変異を修正し、前記１つまたは複数のスプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項３０】
前記第１および第２の分岐点配列が、どちらかの鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致し、前記第１の分岐点配列のヌクレオチド配列と第２の分岐点配列のヌクレオチド配列が相補的である、請求項２９に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項３１】
前記分岐点コンセンサス配列が、ＹＴＮＡＹ（配列番号４９）（式中、Ｙは、シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）核酸塩基のどちらかを含むヌクレオチドであり、Ｎは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチドである）である、請求項３０に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項３２】
前記第１の分岐点配列が、ＴＡＴＴＡＡＣ（配列番号５０）である、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項３３】
前記第２の分岐点配列が、ＧＴＴＡＡＴＡ（配列番号５１）である、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項３４】
前記第２の分岐点配列が、ＴＡＣＴＧＡＣ（配列番号５２）である、請求項２９または３１に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項３５】
ポリピリミジントラクトを含む第２のスプライシングシグナルを含み、前記第１の鎖が、前記第１の分岐点配列の下流に位置する第１のポリピリミジントラクトを含み、前記第２の鎖が、前記第２の分岐点配列の下流に位置する第２のポリピリミジントラクトを含む、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前記第１および第２のポリピリミジントラクトを含むヌクレオチド配列が各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、前記ヌクレオチド配列が、約１００％、約９０％〜１００％、または約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である、請求項３５に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記ポリピリミジントラクトを含む前記ヌクレオチド配列が、ＴＴＴＴＴＴＴＣＴ（配列番号５３）である、請求項３５または３６に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記ポリピリミジントラクトを含む前記ヌクレオチド配列が、ＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴ（配列番号５４）である、請求項３５または３６に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記ポリピリミジントラクトを含む前記ヌクレオチド配列が、ＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣ（配列番号５５）である、請求項３５または３６に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記第１の分岐点配列および前記第１のポリピリミジントラクトが、互いに隣接している、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項４１】
前記第２の分岐点配列および前記第２のポリピリミジントラクトが、互いに隣接している、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項４２】
第３のスプライシングシグナルを含み、前記第３のスプライシングシグナルが、３’スプライス部位を含み、前記第１の鎖が、前記第１のポリピリミジントラクトの下流に位置する第１の３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列を含み、第２の鎖が、前記第２のポリピリミジントラクトの下流に位置する第２の３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列を含む、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項４３】
前記第１および第２の３’スプライス部位が、ヌクレオチド配列ＹＡＧを含み、Ｙが、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチドである、請求項４２に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項４４】
コード配列を含み、前記第１の鎖が、第１のコード配列を含み、前記第２の鎖が、第２のコード配列を含み、前記ｇＤＮＡの前記突然変異を修正する前記第１のヌクレオチド配列が、前記第１のコード配列を構成し、前記ｇＤＮＡの前記突然変異を修正する前記第２のヌクレオチド配列が、前記第２のコード配列を構成し、前記第１のコード配列が、前記第１の３’スプライス部位の下流に位置し、前記第２のコード配列が、前記第２の３’スプライス部位の下流に位置する、請求項４２〜４３に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項４５】
前記第１および第２のコード配列を含むヌクレオチド配列が、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む、請求項４４に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項４６】
（ｉ）および（ｉｉ）を構成する前記コード配列および／またはスプライシングシグナルが、自己アニーリングを低減させるために同一でも相補的でもない、請求項４４または４５に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項４７】
アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含む１つまたは複数のデリミター配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、長さ約１〜４０、約１〜３０、約１〜２０、約１〜１５、約１〜１０、約３０、約２０、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２または１ヌクレオチドである、前記請求項のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項４８】
前記１つまたは複数のデリミター配列が、前記第１の分岐点配列と前記第２の分岐点配列の間に位置する、請求項４７に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項４９】
前記１つまたは複数のデリミター配列が、前記第１の分岐点配列と前記第１のポリピリミジントラクトの間に位置する、請求項４７に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項５０】
前記１つまたは複数のデリミター配列が、前記第２の分岐点と前記第２のポリピリミジントラクトの間に位置する、請求項４７に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項５１】
前記ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢへの双方向挿入用に構成されており、前記ドナーポリヌクレオチドが、どちらかの配向で前記ＤＳＢに挿入されたとき、前記第１のスプライシングシグナル、必要に応じて、前記第２のスプライシングシグナル、必要に応じて、前記第３のスプライシングシグナルおよびコード配列が、センス鎖を構成し、それによって、前記突然変異を修正し、１つまたは複数のスプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御する、請求項２９〜５０のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項５２】
細胞内のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子の突然変異を修正または誘導する非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含み、かつ前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、ドナーポリヌクレオチドであって、前記ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢへの双方向挿入用に構成されており、前記ドナーポリヌクレオチドが、
（ｉ）第１の５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列と前記ｇＤＮＡの前記突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第１の鎖と、
（ｉｉ）第２の５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列と前記ｇＤＮＡの前記突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第２の鎖と
を含み、前記第２の鎖が、前記第１の鎖に相補的であり、
前記ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、（ｉ）センス鎖を含み、それによって、前記突然変異を修正し、前記１つまたは複数のスプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、（ｉｉ）センス鎖を含み、それによって、前記突然変異を修正し、前記１つまたは複数のスプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項５３】
前記第１の鎖が、第１のコード配列を含み、前記第２の鎖が、第２のコード配列を含み、前記第１のコード配列が、前記第１の５’スプライス部位の上流に位置し、前記第２のコード配列が、前記第２の５’スプライス部位の上流に位置し、前記第１および第２の鎖の前記コード配列が、自己アニーリングを低減させるために相補的でない（または１、２、３、４もしくはそれより多くのミスマッチを含む）、請求項５２に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項５４】
アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含むデリミター配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、長さ約１〜４０、約１〜３０、約１〜２０、約１〜１５、約１〜１０、約３０、約２０、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２または１ヌクレオチドである、請求項５２または５３に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項５５】
前記デリミター配列が、前記第１の５’スプライス部位と前記第２の５’スプライス部位の間に位置する、請求項５４に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項５６】
前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＤＳＢへの双方向挿入用に構成されており、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、前記第１の５’スプライス部位および第１のコード配列が、センス鎖を構成し、それによって、前記突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、前記第２の５’スプライス部位および第２のコード配列が、センス鎖を構成し、それによって、前記突然変異を修正し、１つまたは複数のスプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御する、請求項５２〜５５のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項５７】
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、前記病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、前記第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、前記エクソン配列が、前記突然変異を修正し、前記第１の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）前記第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型ｄｓＤＮＡ分子を含むドナーポリヌクレオチドであって、
前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）天然のまたは増強された３’スプライス部位、
（ｂ）ポリピリミジントラクト、
（ｃ）分岐点、
（ｄ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｅ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｆ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｇ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択され、
前記ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって前記突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項５８】
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、前記病因突然変異が、５’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、前記第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、前記エクソン配列が、前記突然変異を修正し、前記第１の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）前記第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）天然のまたは増強された５’スプライス部位、
（ｂ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｃ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｄ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｅ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択され、
前記ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって前記突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項５９】
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、前記病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、前記第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、前記エクソン配列が、前記突然変異を修正し、前記第１の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、少なくとも１つのスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された３’スプライス部位である、第１の鎖と、
（ｉｉ）前記第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
前記ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって前記突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項６０】
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、前記病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、前記第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、前記エクソン配列が、前記突然変異を修正し、前記第１の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された３’スプライス部位とポリピリミジントラクトとの組合せである、第１の鎖と、
（ｉｉ）前記第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
前記ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって前記突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項６１】
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、前記病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、前記第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、前記エクソン配列が、前記突然変異を修正し、前記第１の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点との組合せである、第１の鎖と、
（ｉｉ）前記第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
前記ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって前記突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項６２】
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、前記病因突然変異が、３’スプライス部位にあり、前記第１の鎖が、イントロン配列、必要に応じて、エクソン配列を含み、前記イントロン配列が、前記突然変異を修正し、前記第１の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）前記第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）ポリピリミジントラクト、
（ｂ）分岐点、
（ｃ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｄ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｅ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｆ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択され、
前記ドナーポリヌクレオチドが、約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００であり、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって前記突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項６３】
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、前記病因突然変異が、５’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、ドナーポリヌクレオチドが、イントロン配列およびエクソン配列を含み、前記エクソン配列が、前記突然変異を修正し、前記第１の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、少なくとも１つのスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された５’スプライス部位である、第１の鎖と、
（ｉｉ）前記第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
前記ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって前記突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項６４】
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、前記病因突然変異が、５’スプライス部位にあり、前記第１の鎖が、イントロン配列、必要に応じて、エクソン配列を含み、前記イントロン配列が、前記突然変異を修正し、前記第１の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）前記第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｂ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｃ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｄ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択され、
前記ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって前記突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項６５】
前記ＤＳＢへの前記ドナーポリヌクレオチドの挿入が、前記ｇＤＮＡ中に前記エクソン配列を含むエクソンの形成をもたらす、請求項５７〜６１、６３または６４のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項６６】
前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、前記突然変異を修正する前記エクソン配列を含む前記エクソンのｍＲＮＡへの組入れを方向付ける、請求項６５に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項６７】
前記ドナーポリヌクレオチドの前記挿入が、前記イントロン配列を含むイントロンの形成をもたらし、前記イントロン配列が、前記突然変異を修正する、請求項６４に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項６８】
第１の鎖と前記第１の鎖に相補的な第２の鎖とを含む非複製型ｄｓＤＮＡ分子を含むドナーポリヌクレオチドであって、前記第１の鎖が、細胞内のｇＤＮＡ分子の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を５’から３’に含み、前記病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、前記第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、前記エクソン配列が、前記突然変異を修正し、前記第１の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、前記第１の鎖が、式：
５’−［Ｂ］ａ−［Ｓ１］ｂ−［Ｐ］ｃ−［Ｓ２］ｄ−Ｘ−Ｅ−３’
（式中、
（ｉ）Ｂは、存在する場合、前記ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含む分岐点配列であり、Ｂは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ａは、その値がＢを構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ａ＝０または５〜７であり、
（ｉｉ）Ｐは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含むポリピリミジントラクトであり、ｃは、その値がＰを構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃ＝９〜２０であり、Ｐを構成するヌクレオチド配列は、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、
（ｉｉｉ）Ｅは、前記突然変異を修正するヌクレオチド配列を含むエクソン配列であり、前記ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、
（ｉｖ）Ｘは、３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列であり、
（ｖ）Ｓ１およびＳ２は、どちらかが存在する場合、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｂおよびｄは、各々、その値が前記デリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂおよびｄ＝０〜２０である）
を含み、
前記ドナーポリヌクレオチドが、約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００であり、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢへの定方向挿入用に構成されており、前記ドナーポリヌクレオチドが前記ＤＳＢに挿入されたとき、存在する場合Ｂ、Ｐ、存在する場合Ｘ、および存在する場合Ｅが、センス鎖を構成し、存在する場合Ｂ、Ｐ、および存在する場合Ｘが、１つまたは複数のスプライシングシグナルを構成し、それによって、前記突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して、前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、ＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入された前記ＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項６９】
第１の鎖と第２の鎖とを含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、前記第２の鎖が、前記第１の鎖に相補的であり、前記第１の鎖が、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を５’から３’に含み、前記病因突然変異が、５’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、前記第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、前記エクソン配列が、前記突然変異を修正し、前記第１の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、
前記第１の鎖が、式：
５’−Ｅ−Ｙ−Ｉ−３’
（式中、
（ｉ）Ｅは、前記突然変異を修正するヌクレオチド配列を含むエクソン配列であり、前記ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、
（ｉｉ）Ｙは、５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列であり、
（ｉｉｉ）Ｉは、存在する場合、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチドを含むイントロン配列を構成する）
を含み、
前記ドナーポリヌクレオチドが、約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００であり、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への定方向挿入用に構成されており、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＤＳＢに挿入されたとき、存在する場合Ｅ、Ｙ、および存在する場合Ｉが、センス鎖を構成し、Ｙが、前記１つまたは複数のスプライシングシグナルを構成し、それによって、前記突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項７０】
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、前記病因突然変異が、３’スプライス部位の近位にあり、前記第１の鎖が、第１のイントロン配列を含み、前記第１のイントロン配列が、前記突然変異を修正し、前記第１の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、前記病因突然変異が、３’スプライス部位の近位にあり、前記第２の鎖が、第２のイントロン配列を含み、前記第２のイントロン配列が、前記突然変異を修正し、前記第２の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む非複製型ｄｓＤＮＡ分子を含むドナーポリヌクレオチドであって、前記第２の鎖が、前記第１の鎖に相補的であり、前記第１の鎖および前記第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｐ１］ａ−［Ｓ１］ｂ−［Ｂ］ｃ−［Ｓ２］ｄ−［Ｐ２］ｅ−３’
（式中、
（ａ）Ｂは、前記ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含む分岐点配列を含み、Ｂは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ｃは、その値がＢを構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃ＝５〜７であり、
（ｂ）Ｐ１およびＰ２は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を各々が含むポリピリミジントラクトであり、ａおよびｅは、その値がＰ１およびＰ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ａ＝９〜２０およびｃ＝９〜２０であり、Ｐ１およびＰ２を構成する前記ヌクレオチド配列は、各々、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、Ｐ１は、Ｐ２に対して、逆方向の配向であり、前記ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｓ１およびＳ２は、どちらかが存在する場合、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｂおよびｄは、各々、その値が前記デリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂおよびｄ＝０〜２０である）
を含み、
前記ドナーポリヌクレオチドが、約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００であり、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、ＢおよびＰ２が、センス鎖を構成し、ＢおよびＰ２が、第１および第２のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、前記突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、ＢおよびＰ１が、センス鎖を構成し、ＢおよびＰ２が、前記第１および第２のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、前記突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項７１】
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、前記病因突然変異が、３’スプライス部位の近位にあり、前記第１の鎖が、第１のイントロン配列を含み、前記第１のイントロン配列が、前記突然変異を修正し、前記第１の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、前記病因突然変異が、３’スプライス部位の近位にあり、前記第２の鎖が、第２のイントロン配列を含み、前記第２のイントロン配列が、前記突然変異を修正し、前記第２の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、前記第２の鎖が、前記第１の鎖に相補的であり、前記第１の鎖および前記第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｐ１］ａ−［Ｓ１］ｂ−［Ｂ１］ｃ−［Ｓ２］ｄ−［Ｂ２］ｅ−［Ｓ３］ｆ−［Ｐ２］ｇ−３’
（式中、
（ａ）存在する場合Ｂ１、およびＢ２は、各々、分岐点配列であり、Ｂ２は、前記ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含み、存在する場合Ｂ１を含む前記分岐点配列は、Ｂ２を含む分岐点配列に対して、逆方向の配向であり、前記ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、Ｂ１およびＢ２は、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ｃおよびｅは、その値がＢ１およびＢ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃ＝０または５〜７であり、ｅ＝５〜７であり、
（ｂ）Ｐ１およびＰ２は、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を各々が含むポリピリミジントラクトであり、ａおよびｇは、その値がＰ１およびＰ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ａ＝９〜２０およびｇ＝９〜２０であり、Ｐ１およびＰ２を構成する前記ヌクレオチド配列は、各々、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、Ｐ１は、Ｐ２に対して、逆方向の配向であり、前記ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、いずれかが存在する場合、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｂ、ｄおよびｆは、各々、その値が前記デリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂおよびｆ＝１〜２０であり、ｄ＝１〜４０である）
を含み、
前記ドナーポリヌクレオチドが、約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００であり、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、Ｂ２およびＰ２が、センス鎖を構成し、Ｂ２およびＰ２が、第１および第２のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、前記突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、Ｂ１およびＰ１が、センス鎖を構成し、Ｂ１およびＰ１が、第１および第２のスプライシングシグナルをそれぞれ提供し、それによって、前記突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項７２】
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、前記病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、前記第１の鎖が、第１のイントロン配列および第１のエクソン配列を含み、前記第１のエクソン配列が、前記突然変異を修正し、前記第１の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、前記病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、前記第２の鎖が、第２のイントロン配列および第２のエクソン配列を含み、前記第２のエクソン配列が、前記突然変異を修正し、前記第２の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、前記第２の鎖が、前記第１の鎖に相補的であり、前記第１の鎖および前記第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｅ１］ａ−Ｘ１−［Ｐ１］ｂ−［Ｓ１］ｃ−［Ｂ］ｄ−［Ｓ２］ｅ−［Ｐ２］ｆ−Ｘ２−［Ｅ２］ｇ−３’
（式中、
（ａ）Ｂは、前記ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含む分岐点配列であり、Ｂは、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ｄは、その値がＢを構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｄ＝５〜７であり、
（ｂ）Ｐ１およびＰ２は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を各々が含むポリピリミジントラクトであり、ｂおよびｆは、その値がＰ１およびＰ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂ＝９〜２０およびｆ＝９〜２０であり、Ｐ１およびＰ２を構成する前記ヌクレオチド配列は、各々、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、Ｐ１は、Ｐ２に対して、逆方向の配向であり、前記ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｅ１およびＥ２は、各々、前記突然変異を修正するヌクレオチド配列を各々が含むエクソン配列であり、前記ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、ａおよびｇは、その値がＥ１およびＥ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、Ｅ１を含む前記エクソン配列は、Ｅ２を含む前記エクソン配列に対して、逆方向の配向であり、前記ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、Ｅ１を構成する前記ヌクレオチド配列とＥ２を構成する前記ヌクレオチド配列は、相補的でなく、
（ｄ）Ｘ１およびＸ２は、各々、３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列であり、Ｘ１を構成する前記ヌクレオチド配列は、Ｘ２を構成する前記ヌクレオチド配列に対して、逆方向の配向であり、逆鎖上にあり、
（ｅ）Ｓ１およびＳ２は、どちらかが存在する場合、各々、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｃおよびｅは、各々、その値が前記デリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃおよびｅ＝１〜２０である）
を含み、
前記ドナーポリヌクレオチドが、約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００であり、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、Ｂ、Ｐ２、Ｅ２およびＸ２および    が、センス鎖を構成し、Ｂ、Ｐ２およびＸ２が、第１、第２および第３のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、前記突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、Ｂ、Ｐ１、Ｅ１およびＸ１が、センス鎖を構成し、Ｂ、Ｐ１およびＸ１が、第１、第２および第３のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、前記突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項７３】
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、前記病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、前記第１の鎖が、第１のイントロン配列および第１のエクソン配列を含み、前記第１のエクソン配列が、前記突然変異を修正し、前記第１の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、前記病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、前記第２の鎖が、第２のイントロン配列および第２のエクソン配列を含み、前記第２のエクソン配列が、前記突然変異を修正し、前記第２の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、前記第２の鎖が、前記第１の鎖に相補的であり、
前記第１の鎖および前記第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｅ１］ａ−Ｘ１−［Ｐ１］ｂ−［Ｓ１］ｃ−［Ｂ１］ｄ−［Ｓ２］ｅ−［Ｂ２］ｆ−［Ｓ３］ｇ−［Ｐ２］ｈ−Ｘ２−［Ｅ２］ｉ−３’
（式中、
（ａ）存在する場合Ｂ１、およびＢ２は、各々、分岐点配列であり、Ｂ２は、前記ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含み、存在する場合Ｂ１を含む前記分岐点配列は、Ｂ２を含む前記分岐点配列に対して、逆方向の配向であり、前記ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、Ｂ１およびＢ２は、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ｄおよびｆは、その値がＢ１およびＢ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｄおよびｆ＝５〜７であり、
（ｂ）Ｐ１およびＰ２は、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を各々が含むポリピリミジントラクトであり、ｂおよびｈは、その値がＰ１およびＰ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂ＝９〜２０およびｈ＝９〜２０であり、Ｐ１およびＰ２を構成する前記ヌクレオチド配列は、各々、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、Ｐ１は、Ｐ２に対して、逆方向の配向であり、前記ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｅ１およびＥ２は、各々、前記突然変異を修正するヌクレオチド配列を各々が含むエクソン配列であり、前記ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、ａおよびｉは、その値がＥ１およびＥ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、Ｅ１を含む前記エクソン配列は、Ｅ２を含む前記エクソン配列に対して、逆方向の配向であり、逆鎖上にあり、Ｅ１を構成する前記ヌクレオチド配列とＥ２を構成する前記ヌクレオチド配列は、相補的でなく、
（ｄ）Ｘ１およびＸ２各々は、３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列を含み、Ｘ１の前記ヌクレオチド配列は、Ｘ２の前記ヌクレオチド配列に対して、逆方向の配向であり、前記ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｅ）Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、いずれかが存在する場合、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｃ、ｅおよびｇは、各々、その値が前記デリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃおよびｇ＝１〜２０であり、ｅ＝１〜４０である）
を含み、
前記ドナーポリヌクレオチドが、約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００であり、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、Ｂ２、Ｐ２、Ｅ２およびＸ２が、センス鎖を構成し、Ｂ２、Ｐ２およびＸ２が、第１、第２および第３のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、前記突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、Ｂ１、Ｐ１、Ｅ１およびＸ１が、センス鎖を構成し、Ｂ１、Ｐ１およびＸ１が、第１、第２および第３のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、前記突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項７４】
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、前記病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、前記第１の鎖が、第１のイントロン配列および第１のエクソン配列を含み、前記第１のエクソン配列が、前記突然変異を修正し、前記第１の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、前記病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、前記第２の鎖が、第２のイントロン配列および第２のエクソン配列を含み、前記第２のエクソン配列が、前記突然変異を修正し、前記第２の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、前記第２の鎖が、前記第１の鎖に相補的であり、
前記第１の鎖および前記第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｅ１］ａ−Ｙ１−［Ｓ１］ｂ−Ｙ２−［Ｅ２］ｃ−３’
（式中、
（ａ）Ｅ１およびＥ２各々は、前記突然変異を修正するヌクレオチド配列を各々が含むエクソン配列であり、前記ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｔ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、ａおよびｃは、その値がＥ１およびＥ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、Ｅ１を含む前記エクソン配列は、Ｅ２を含む前記エクソン配列に対して、逆方向の配向であり、逆鎖上にあり、Ｅ１を構成する前記ヌクレオチド配列とＥ２を構成する前記ヌクレオチド配列は、相補的でなく、
（ｂ）Ｙ１およびＹ２各々は、５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列を含み、Ｙ１の前記ヌクレオチド配列は、Ｙ２の前記ヌクレオチド配列に対して、逆方向の配向であり、前記ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｓ１は、存在する場合、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｂは、その値が前記デリミター配列を構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂ＝１＝５０である）
を含み、
前記ドナーポリヌクレオチドが、約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００であり、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、Ｅ２およびＹ２が、センス鎖を構成し、Ｅ２が、前記スプライシングシグナルを構成し、それによって、前記突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、Ｅ１およびＹ１が、センス鎖を構成し、Ｅ１が、前記スプライシングシグナルを構成し、それによって、前記突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項７５】
前記センス鎖を構成する前記エクソン配列が、前記突然変異を修正する、請求項６８、６９、７２〜７４のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項７６】
前記センス鎖を構成する３’スプライス部位を構成する前記ヌクレオチド配列が、前記突然変異を修正する、請求項６８、７２または７３のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項７７】
前記センス鎖を構成する５’スプライス部位を構成する前記ヌクレオチド配列が、前記突然変異を修正する、請求項６９または７４のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項７８】
前記センス鎖を構成するポリピリミジントラクトを構成する前記ヌクレオチド配列が、前記突然変異を修正する、請求項６８、７０〜７２、または７３のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項７９】
前記センス鎖を構成する分岐点配列を構成する前記ヌクレオチド配列が、前記突然変異を修正する、請求項６８、７０〜７２、または７３のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項８０】
前記ドナーポリヌクレオチドの各鎖の最も５’側のヌクレオチドが、５’リン酸基を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項８１】
長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである、前記請求項のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項８２】
長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである、前記請求項のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項８３】
長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである、前記請求項のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項８４】
長さ約５０〜６０ヌクレオチドである、請求項８３に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項８５】
長さ４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０ヌクレオチドである、前記請求項のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項８６】
長さ５０ヌクレオチドである、請求項８５に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項８７】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項８８】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項８７に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項８９】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９ポリペプチド（ＳｐＣａｓ９）を含む、請求項８８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項９０】
天然ヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項９１】
１つまたは複数の非天然および／または改変ヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項９２】
前記１つまたは複数の非天然および／または改変ヌクレオチが、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである、請求項９１に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項９３】
１つまたは複数の骨格改変を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項９４】
前記１つまたは複数の骨格改変が、ホスホロチオエートである、請求項９３に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項９５】
２つの平滑末端を含む、請求項１〜９４のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項９６】
１つの平滑末端を含み、オーバーハング（例えば、５’または３’オーバーハング）を含む１つの末端を含む、請求項１〜９４のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項９７】
前記ヌクレオチド配列が、前記部位特異的ヌクレアーゼによる前記ドナーポリヌクレオチドの認識および切断を防止する１つまたは複数のヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項９８】
前記疾患が、糖原病１ａ型（ＧＳＤ１ａ）である、前記請求項のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項９９】
前記突然変異が、ヒト第１７染色体ｑ２１上のヒトＧ６ＰＣ遺伝子に位置する、請求項９８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１００】
前記Ｇ６ＰＣ遺伝子の前記突然変異が、ヒトＧ６ＰＣタンパク質におけるＲ８３Ｃ、Ｒ８３ＨまたはＥ１１０Ｋアミノ酸置換をもたらす、請求項９９に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
前記Ｇ６ＰＣ遺伝子の前記突然変異が、前記ヒトＧ６ＰＣタンパク質におけるＲ８３Ｃアミノ酸置換をもたらす、請求項１００に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
前記Ｇ６ＰＣ遺伝子の前記突然変異が、前記ヒトＧ６ＰＣタンパク質におけるＲ８３Ｈアミノ酸置換をもたらす、請求項１００に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１０３】
前記Ｇ６ＰＣ遺伝子の前記突然変異が、前記ヒトＧ６ＰＣタンパク質におけるＥ１１０Ｋアミノ酸置換をもたらす、請求項１００に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
細胞内のｇＤＮＡ分子の糖原病１ａ型の原因となる突然変異を修正するヌクレオチド配列を含む非複製型ｄｓＤＮＡ分子を含むドナーポリヌクレオチドであって、
前記突然変異が、ヒト第１７染色体ｑ２１上のヒトＧ６ＰＣ遺伝子に位置し、アミノ酸置換Ｒ８３ＣまたはＲ８３Ｈをもたらし、前記ドナーポリヌクレオチドが、
（ｉ）前記突然変異を修正するエクソン配列を含むヌクレオチド配列であって、前記エクソン配列が、前記Ｇ６ＰＣ遺伝子の８３位のコドンに対応するアルギニン（Ｒ）をコードするコドンを含む、ヌクレオチド配列と、前記ｇＤＮＡ分子から転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含むヌクレオチド配列であって、前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点配列との組合せである、ヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第１の鎖と、
（ｉｉ）前記第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含み、
前記ドナーポリヌクレオチドが、長さ約４０〜７０ヌクレオチドであり、２つの平滑末端を含み、前記ドナーポリヌクレオチドの各鎖の最も５’側のヌクレオチドが、５’リン酸部分を含み、前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、ＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、前記ドナーポリヌクレオチドの前記挿入により、前記ｇＤＮＡ中に前記突然変異を修正する前記エクソン配列を含むエクソンが形成され、前記スプライシングシグナルが、ｍＲＮＡへの前記エクソンの組入れを方向付け、それによって前記突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
前記分岐点配列が、ヌクレオチド配列ＴＴＣＡＴを含み、前記ポリピリミジントラクトが、ヌクレオチド配列ＣＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴを含み、前記３’スプライス部位が、ヌクレオチド配列ＴＡＧを含み、前記エクソン配列が、ヌクレオチド配列ＧＡＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＣＴＴＡＣＴを含む、請求項１０４に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
前記ドナーポリヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列が、配列番号３０（ＣＨ３４  ５４−０）で示される、請求項９８〜１０５のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
前記ドナーポリヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列が、配列番号２０（ＣＨ３２  ５０−０）で示される、請求項９８〜１０５のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
前記疾患が、ポンペ病である、請求項１〜９７のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
前記突然変異が、ヒト第１７染色体ｑ２５．３上のヒトグルコシダーゼアルファ（ＧＡＡ）遺伝子に位置する、請求項１０８に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１１０】
ＧＡＡのスプライシングシグナルの前記突然変異が、第２エクソンを欠いているＧＡＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写物、および／または１つもしくは複数の隠れたスプライス部位の活性化をもたらす、請求項１０９に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
細胞内のｇＤＮＡ分子のポンペ病１ａ型の原因となる突然変異を修正するヌクレオチド配列を含む非複製型ｄｓＤＮＡ分子を含むドナーポリヌクレオチドであって、ＧＡＡのスプライシングシグナルの前記突然変異が、第２エクソンを欠いているＧＡＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写物、および／または１つもしくは複数の隠れたスプライス部位の活性化をもたらし、前記ドナーポリヌクレオチドが、
（ｉ）前記突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、前記第１の鎖が第１のイントロン配列を含み、前記第１のイントロン配列が、前記突然変異を修正し、前記第１の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点配列との組合せを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）第２のイントロン配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、前記第２のイントロン配列が、前記突然変異を修正し、前記第２の鎖が、前記ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、前記１つまたは複数のスプライシングシグナルが、３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点配列との組合せを含む、第２の鎖と
を含み、前記第２の鎖が、前記第１の鎖に相補的であり、
前記ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、２つの平滑末端を含み、前記ドナーポリヌクレオチドの各鎖の最も５’側のヌクレオチドが、５’リン酸部分を含み、前記ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて前記細胞に導入されたとき、ＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、前記ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢ切断への双方向挿入用に構成されており、どちらの方向にせよ挿入により、３’スプライス部位と、ポリピリミジントラクトと、前記突然変異を修正する分岐点配列とが形成され、前記スプライシングシグナルが、ｍＲＮＡへの第２エクソンの組入れを方向付け、それによって前記突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチド。
【請求項１１２】
前記ドナーポリヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列が、配列番号６３（ＧＡＡ  ５０−０）で示される、請求項１０８〜１１１のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド。
【請求項１１３】
細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正する系であって、以下の成分：
（ａ）請求項１〜１１２のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド、
（ｂ）１つまたは複数のｇＲＮＡ分子、および
（ｃ）部位特異的ヌクレアーゼ
を含み、
前記系が細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記部位特異的ヌクレアーゼにより前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって前記突然変異を修正する、系。
【請求項１１４】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ｍＲＮＡによりコードされる、請求項１１３に記載の系。
【請求項１１５】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ポリペプチドである、請求項１１３に記載の系。
【請求項１１６】
前記１つまたは複数のｇＲＮＡ分子および前記部位特異的ヌクレアーゼが、リボ核タンパク質を含む、請求項１１５に記載の系。
【請求項１１７】
部位特異的ヌクレアーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項１１３〜１１６のいずれか一項に記載の系。
【請求項１１８】
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）またはそのホモログ、誘導体もしくは改変バージョンである、請求項１１７に記載の系。
【請求項１１９】
前記１つまたは複数のｇＲＮＡ分子が、骨格改変、糖改変、改変ヌクレオシド間結合、または改変もしくは非天然核酸塩基からなる群から選択される改変を含む、請求項１１３〜１１８のいずれか一項に記載の系。
【請求項１２０】
前記１つまたは複数のｇＲＮＡ分子が、骨格改変を含む、請求項１１９に記載の系。
【請求項１２１】
前記骨格改変が、ホスホロチオエート改変である、請求項１２０に記載の系。
【請求項１２２】
前記ドナーポリヌクレオチド、前記ｇＲＮＡ分子および前記部位特異的ヌクレアーゼが、リポソームまたは脂質ナノ粒子で個々に製剤化または共製剤化される、請求項１１３〜１２１のいずれか一項に記載の系。
【請求項１２３】
前記ドナーポリヌクレオチド、前記ｇＲＮＡ分子および前記部位特異的ヌクレアーゼが、リポソームまたは脂質ナノ粒子で個々に製剤化される、請求項１２２に記載の系。
【請求項１２４】
前記ドナーポリヌクレオチド、前記ｇＲＮＡ分子および前記部位特異的ヌクレアーゼが、リポソームまたは脂質ナノ粒子で共製剤化される、請求項１２２に記載の系。
【請求項１２５】
前記ｇＲＮＡの前記ヌクレオチド配列が、配列番号１０７（ＣＨ３２  突然変異型ＣＴＸ１  ｓｇＲＮＡ）で示される配列を含む、請求項１１３〜１２４のいずれか一項に記載の系。
【請求項１２６】
前記ｇＲＮＡの前記ヌクレオチド配列が、配列番号１０８（ＣＨ３４  突然変異型ＣＴＸ１  ｓｇＲＮＡ）で示される配列を含む、請求項１１３〜１２４のいずれか一項に記載の系。
【請求項１２７】
前記ｇＲＮＡの前記ヌクレオチド配列が、配列番号９３（突然変異型ＧＡＡ  ｓｇＲＮＡスペーサー）で示される配列を含む、請求項１１３〜１２４のいずれか一項に記載の系。
【請求項１２８】
請求項１〜１１２のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド、または請求項１１３〜１２７のいずれか一項に記載の系を含む、細胞。
【請求項１２９】
分裂または非分裂細胞である、請求項１２８に記載の細胞。
【請求項１３０】
分裂細胞である、請求項１２９に記載の細胞。
【請求項１３１】
非分裂細胞である、請求項１２９に記載の細胞。
【請求項１３２】
患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１２８に記載の細胞。
【請求項１３３】
初代肝細胞である、請求項１２８に記載の細胞。
【請求項１３４】
請求項１〜１１２のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチドと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１３５】
請求項１１３〜１２７のいずれか一項に記載の系と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１３６】
請求項１２８〜１３３のいずれか一項に記載の細胞と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１３７】
細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正することによる、疾患を有する患者の処置であって、前記患者から細胞を単離するステップ、前記細胞を前記ドナーポリヌクレオチド、前記系または前記医薬組成物と接触させるステップを含み、前記ドナーポリヌクレオチド、前記系または前記医薬組成物が前記細胞と接触したとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位にある位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断に挿入し、それによって前記突然変異を修正する、処置において使用するための、請求項１〜１１２のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド、請求項１１３〜１２７のいずれか一項に記載の系、または請求項１３４〜１３６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３８】
細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正することによる、疾患を有する患者の処置であって、前記患者に前記ドナーポリヌクレオチド、前記系または前記医薬組成物の有効量を投与するステップを含み、前記ドナーポリヌクレオチド、系または組成物が投与されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位にある位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断に挿入し、それによって前記突然変異を修正する、処置において使用するための、請求項１〜１１２のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド、請求項１１３〜１２７のいずれか一項に記載の系、または請求項１３４〜１３６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３９】
細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正することによる、疾患を有する患者の処置のための医薬／処置の際の医薬を製造するための、請求項１〜１１２のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド、請求項１１３〜１２７のいずれか一項に記載の系、または請求項１３４〜１３６のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１４０】
細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正する方法であって、前記細胞を、請求項１〜１１２のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド、請求項１１３〜１２７のいずれか一項に記載の系、または請求項１３４〜１３６のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させるステップを含み、前記ドナーポリヌクレオチド、系または組成物が前記細胞と接触したとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位にある位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断に挿入し、それによって前記突然変異を修正する、方法。
【請求項１４１】
細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正することにより疾患を有する患者を処置する方法であって、前記患者から細胞を単離するステップ、前記細胞を、請求項１〜１１２のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド、請求項１１３〜１２７のいずれか一項に記載の系、または請求項１３４〜１３６のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させるステップを含み、前記ドナーポリヌクレオチド、系または組成物が前記細胞と接触したとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位にある位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断に挿入し、それによって前記突然変異を修正する、方法。
【請求項１４２】
細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正することにより疾患を有する患者を処置する方法であって、前記患者に、請求項１〜１１２のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド、請求項１１３〜１２７のいずれか一項に記載の系、または請求項１３４〜１３６のいずれか一項に記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを含み、前記ドナーポリヌクレオチド、系または組成物が投与されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路修復経路が、前記ドナーポリヌクレオチドを、前記ｇＤＮＡの前記突然変異の近位にある位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断に挿入し、それによって前記突然変異を修正する、方法。
【請求項１４３】
前記細胞が、患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１４０または１４１に記載の方法。
【請求項１４４】
前記細胞が、肝細胞である、請求項１４０または１４１に記載の方法。
【請求項１４５】
修正された突然変異を含む前記ｉＰＳＣを分化させて分化した細胞にするステップ、および前記分化した細胞を患者に移植するステップをさらに含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４６】
処置が、挿入されたドナーポリヌクレオチドを含む前記ゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）から転写されたｍＲＮＡの翻訳をもたらし、前記翻訳が、前記疾患を緩和する、または前記疾患の原因にも一因にもならない、翻訳産物（タンパク質）の形成をもたらす、請求項１４０〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正するための、請求項１〜１１２のいずれか一項に記載のドナーポリヌクレオチド、請求項１１３〜１２７のいずれか一項に記載の系、または請求項１３４〜１３６のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む容器と、使用説明書を含む添付文書とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連情報
本願は、２０１８年６月２８日に出願した米国仮出願第６２／６９１，５７３号の利益を請求するものである。上述の仮特許出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
設計された外因性ＤＮＡ修復鋳型分子と組み合わせた、プログラム可能なおよび／または操作されたヌクレアーゼを使用するゲノム編集療法が、例えば、ウイルス感染症（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ３：ｅ１８６）、酵素欠損症（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１６）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３４（３）：３２８−３３３）、および遺伝性ミオパチー（Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４５：１１８４−１１８８；  Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１：４００−４０３；  Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１：４０７−４１１）などの、難治性疾患を処置するために開発された。ゲノムを治療上の標的とする手法は、多くの場合、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路に依拠し、この経路は、外因性一本鎖または二本鎖ＤＮＡ修復鋳型（例えば、ドナーポリヌクレオチド）を使用して導入された二本鎖切断（ＤＳＢ）の正確なゲノム修復を可能にするが、多くの場合、非分裂細胞（例えば、Ｇ１期細胞）では高度に抑制される（Ｏｒｔｈｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２８（７５８２）：４２２−６）。生物医学研究のこの分野における急速な進歩、および臨床応用の可能性にもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療目的での導入遺伝子または他のポリヌクレオチドの標的組込みは、現行の方法が、特に、大部分の成体組織を構成する非分裂細胞に対して、効果がないので、依然として困難である。
【０００３】
外因性供給源（例えば、操作されたヌクレアーゼ）によりゲノムに誘導されたＤＳＢは、ＨＤＲ経路および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路などの、二本鎖切断修復（ＤＳＢＲ）機序により、細胞内で修復され得る。標準ＨＤＲ経路は、実行のために相同姉妹染色分体を必要とするので、標準ＨＤＲ経路が分裂細胞（例えば、Ｓ期の細胞）において動作することは公知であるが、ＮＨＥＪ経路は、分裂細胞と非分裂細胞の両方において機能することができ、細胞周期に依存しない（Ｉｙａｍａ  ＆  Ｗｉｌｓｏｎ  （２０１３）  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  １２（８），  ６２０−６３６）。ＨＤＲ経路とは対照的に、ＮＨＥＪ修復経路は、外因性ＤＮＡ修復鋳型（例えば、ドナーポリヌクレオチド）を利用しないゲノム編集手法であって、ＤＳＢ部位における１つまたは複数のヌクレオチドの確率的挿入または欠失（「インデル」）の形成に方向付けられ、その結果、例えば、コード配列の翻訳リーディングフレームまたはプロモーターもしくはエンハンサーのトランス作用因子の結合部位が破壊されることになる、ゲノム編集手法で、使用されることが多い。
【０００４】
遺伝子異常は、非常に多くの疾患の病因の重要な基礎として広く認識されているが、治療的標的ゲノム編集ができないことまたは非効率的であることが、多様な遺伝性障害の処置の開発に対する技術的障壁となっている。したがって、ゲノム、特に、非分裂細胞のゲノムを治療上の標的とする新しい手法が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ３：ｅ１８６
【非特許文献２】Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１６）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３４（３）：３２８−３３３
【非特許文献３】Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４５：１１８４−１１８８；  Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１：４００−４０３
【非特許文献４】Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１：４０７−４１１
【非特許文献５】Ｏｒｔｈｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２８（７５８２）：４２２−６
【非特許文献６】Ｉｙａｍａ  ＆  Ｗｉｌｓｏｎ  （２０１３）  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  １２（８），  ６２０−６３６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
正確なプレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）スプライシングは、的確なタンパク質発現に必要不可欠である。脊椎動物遺伝子構造は、比較的長いイントロンおよび短い内部エクソンからなることが多い。理論により拘束されるものではないが、エクソン定義モデルは、イントロンにわたってではなくエクソンにわたって対合しているスプライス部位を仮定し、大きいイントロンを有するプレｍＲＮＡでは、スプライシング機構が、エクソンの方向性（すなわち、上流に３’スプライス部位および下流に５’スプライス部位）で一対の近接スプライス部位について検索すると仮定する（Ｂｅｒｇｅｔ  （１９９５）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：２４１１−２４１４）。スプライシング機構による、エクソンを包囲する比較的短い（５０〜３００ヌクレオチド）領域における一対のスプライス部位の認識は、イントロン内にランダムに分布している隠れたイントロンスプライス部位の認識頻度を低下させ、したがって、スプライシングの正確度を上昇させる。非常に多くの病因突然変異が、エクソン内に位置すること（例えば、タンパク質コード突然変異）またはイントロン内に位置すること（例えば、スプライシングシグナル突然変異）は公知であり、これらは、タンパク質産生または機能の異常につながり、最終的には疾患をもたらし得るかまたは疾患の一因となり得る。
【０００７】
本開示は、ゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異（例えば、有害または病因突然変異）を、ｇＤＮＡのヌクレオチド配列の所望の変更をもたらし、エクソン定義をモジュレートし、それによって、編集されたｇＤＮＡから転写されたＲＮＡ転写物（例えば、プレｍＲＮＡ）の所望の変更の組入れをもたらす、ゲノム編集組成物および方法により、特に、本明細書に記載のドナーポリヌクレオチドの使用により、修正または誘導することができるという発見に、少なくとも一部は基づく。したがって、本開示は、部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）によりｇＤＮＡに導入された二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するために使用されたとき、修正または誘導される突然変異の近位の１つまたは複数のスプライシングシグナルの組込みによって突然変異を修正または誘導し、エクソン定義をモジュレートする、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドは、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）の突然変異を修正する所望の変更と、スプライス部位認識をモジュレートするように機能する１つまたは複数のスプライシングシグナルとを含むヌクレオチド配列を含むように設計される。一部の実施形態では、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドは、所望の変更と、エクソン定義をモジュレートするように機能する１つまたは複数のスプライシングシグナルとを含む、したがって、所望の変更を転写産物（例えば、プレｍＲＮＡ）に組み込むように細胞のスプライシング機構を方向付ける、ヌクレオチド配列を含むように設計される。
【０００８】
本開示は、ｇＤＮＡの突然変異（例えば、病因突然変異）を、突然変異の近位の生成されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＤＳＢに直鎖状の二本鎖ＤＮＡドナーポリヌクレオチドを挿入することにより、修正または誘導する方法であって、細胞法、ｅｘ  ｖｉｖｏ法およびｉｎ  ｖｉｖｏ法を含む方法も提供する。活発に分裂している細胞は、ＨＤＲ経路とＮＨＥＪ経路の両方を使用してＤＮＡ損傷を修復することができるが、非分裂細胞は、主としてＮＨＥＪ経路を使用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の使用は、外因性ＤＮＡポリヌクレオチドがライゲーションまたは挿入されるようなＮＨＥＪ経路によって修復され得る部位特異的ＤＮＡ切断の、分裂細胞または非分裂細胞のゲノムＤＮＡへの導入を可能にする。一部の実施形態では、本開示のドナーポリヌクレオチドは、突然変異を修正または誘導もし、１つまたは複数のスプライシングシグナルを含みもし、それによって、所望のエクソン（例えば、修正された突然変異を含むエクソン）についてのエクソン定義を確立することおよび／または望ましくないエクソン（例えば、病因突然変異を含むエクソン）についてのエクソン定義を破壊することにより所望のＲＮＡプロセシング事象の発生を促進する、ヌクレオチド配列を含む。そのような方法を行うための組成物、系およびキットも、本明細書で提供される。そのような方法により生産される細胞も、提供される。
【０００９】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子の突然変異を修正または誘導するヌクレオチド配列と、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含むヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００１０】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子の突然変異を修正または誘導するヌクレオチド配列と、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含むヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００１１】
一部の実施形態では、突然変異は、置換、ミスセンス、ナンセンス、挿入、欠失またはフレームシフト突然変異である。一部の実施形態では、突然変異は、置換突然変異である。一部の実施形態では、突然変異は、ミスセンス突然変異である。一部の実施形態では、突然変異は、ナンセンス突然変異である。一部の実施形態では、突然変異は、挿入突然変異である。一部の実施形態では、突然変異は、欠失突然変異である。一部の実施形態では、突然変異は、フレームシフト突然変異である。
【００１２】
一部の実施形態では、突然変異は、エクソンにある。一部の実施形態では、突然変異は、置換、挿入または欠失であり、突然変異は、イントロンにある。一部の実施形態では、突然変異は、イントロンに位置する置換突然変異である。一部の実施形態では、突然変異は、イントロンに位置する挿入突然変異である。一部の実施形態では、突然変異は、イントロンに位置する欠失突然変異である。
【００１３】
一部の実施形態では、突然変異は、ｇＤＮＡのスプライシングシグナルの近位にある。一部の実施形態では、突然変異は、ｇＤＮＡの３’スプライス部位の近位にある。一部の実施形態では、突然変異は、ｇＤＮＡの５’スプライス部位の近位にある。一部の実施形態では、突然変異は、ｇＤＮＡのスプライシングシグナルにある。一部の実施形態では、突然変異は、ｇＤＮＡの３’スプライス部位にある。一部の実施形態では、突然変異は、ｇＤＮＡの５’スプライス部位にある。一部の実施形態では、突然変異は、ポリピリミジントラクトにある。一部の実施形態では、突然変異は、分岐点配列にある。一部の実施形態では、突然変異は、タンパク質コード突然変異である。一部の実施形態では、突然変異は、疾患に関連している、または疾患の原因となる。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドは、イントロン配列を含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、突然変異を修正する。
【００１５】
一部の実施形態では、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドは、エクソン配列を含む。一部の実施形態では、エクソン配列は、突然変異を修正する。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドは、
（ａ）天然のまたは増強された３’スプライス部位、
（ｂ）天然のまたは増強された５’スプライス部位、
（ｃ）ポリピリミジントラクト、
（ｄ）分岐点、
（ｅ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｆ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｇ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｈ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択される１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む。
【００１７】
一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、天然のまたは増強された３’スプライス部位である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、天然の３’スプライス部位である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、増強された３’スプライス部位である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、天然のまたは増強された５’スプライス部位である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、天然の５’スプライス部位である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、増強された３’スプライス部位である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、ポリピリミジントラクトである。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、分岐点である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、分岐点を含むヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、天然のまたは増強された３’スプライス部位とポリピリミジントラクトとを含む組合せである。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、天然のまたは増強された３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点とを含む組合せである。
【００１８】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子の突然変異を修正または誘導する非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）と、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルとを含むドナーポリヌクレオチドであって、ドナーポリヌクレオチドが、分岐点配列を含む第１のスプライシングシグナルを含み、ドナーポリヌクレオチドが、
（ｉ）第１の分岐点配列を含むヌクレオチド配列とｇＤＮＡの突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第１の鎖と、
（ｉｉ）第２の分岐点配列を含むヌクレオチド配列とｇＤＮＡの突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第２の鎖と
を含み、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、第１のスプライシングシグナルを含むヌクレオチド配列は、どちらかの鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致し、第１の分岐点配列のヌクレオチド配列と第２の分岐点配列のヌクレオチド配列は、相補的である。
【００１９】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００２０】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子の突然変異を修正または誘導する非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）と、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルとを含むドナーポリヌクレオチドであって、ドナーポリヌクレオチドが、分岐点配列を含む第１のスプライシングシグナルを含み、ドナーポリヌクレオチドが、
（ｉ）第１の分岐点配列を含むヌクレオチド配列とｇＤＮＡの突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第１の鎖と、
（ｉｉ）第２の分岐点配列を含むヌクレオチド配列とｇＤＮＡの突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第２の鎖と
を含み、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、第１のスプライシングシグナルを含むヌクレオチド配列は、どちらかの鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致し、第１の分岐点配列のヌクレオチド配列と第２の分岐点配列のヌクレオチド配列は、相補的である。
【００２１】
一部の実施形態では、分岐点コンセンサス配列は、ＹＴＮＡＹ（配列番号４９）（式中、Ｙは、シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）核酸塩基のどちらかを含むヌクレオチドであり、Ｎは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチドである）である。一部の実施形態では、Ｙは、シトシン（Ｃ）を含む。一部の実施形態では、Ｙは、チミン（Ｔ）を含む。一部の実施形態では、Ｎは、アデニン（Ａ）を含む。一部の実施形態では、Ｎは、グアニン（Ｇ）を含む。一部の実施形態では、Ｎは、チミン（Ｔ）を含む。一部の実施形態では、Ｎは、シトシン（Ｃ）を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、第１の分岐点配列は、ＴＡＴＴＡＡＣ（配列番号５０）である。
【００２３】
一部の実施形態では、第２の分岐点配列は、ＧＴＴＡＡＴＡ（配列番号５１）である。
【００２４】
一部の実施形態では、第２の分岐点配列は、ＴＡＣＴＧＡＣ（配列番号５２）である。
【００２５】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ポリピリミジントラクトを含む第２のスプライシングシグナルを含み、第１の鎖は、第１の分岐点配列の下流に位置する第１のポリピリミジントラクトを含み、第２の鎖は、第２の分岐点配列の下流に位置する第２のポリピリミジントラクトを含む。一部の実施形態では、第１および第２のポリピリミジントラクトを含むヌクレオチド配列は各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、ヌクレオチド配列は、約１００％、約９０％〜１００％、または約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。
【００２６】
一部の実施形態では、ポリピリミジントラクトを含むヌクレオチド配列は、ＴＴＴＴＴＴＴＣＴ（配列番号５３）である。一部の実施形態では、ポリピリミジントラクトを含むヌクレオチド配列は、ＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴ（配列番号５４）である。一部の実施形態では、ポリピリミジントラクトを含むヌクレオチド配列は、ＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣ（配列番号５５）である。
【００２７】
一部の実施形態では、第１の分岐点配列および第１のポリピリミジントラクトは、互いに隣接している。一部の実施形態では、第２の分岐点配列および第２のポリピリミジントラクトは、互いに隣接している。
【００２８】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、第３のスプライシングシグナルを含み、第３のスプライシングシグナルは、３’スプライス部位を含み、第１の鎖は、第１のポリピリミジントラクトの下流に位置する第１の３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列を含み、第２の鎖は、第２のポリピリミジントラクトの下流に位置する第２の３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１および第２の３’スプライス部位は、ヌクレオチド配列ＹＡＧを含み、式中のＹは、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｙは、チミン（Ｔ）を含む。一部の実施形態では、Ｙは、シトシン（Ｃ）を含む。
【００２９】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、コード配列を含み、第１の鎖は、第１のコード配列を含み、第２の鎖は、第２のコード配列を含み、ｇＤＮＡの突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列は、第１のコード配列を構成し、ｇＤＮＡの突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列は、第２のコード配列を構成し、第１のコード配列は、第１の３’スプライス部位の下流に位置し、第２のコード配列は、第２の３’スプライス部位の下流に位置する。一部の実施形態では、第１および第２のコード配列を含むヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む。一部の実施形態では、（ｉ）および（ｉｉ）を含むコード配列は、自己アニーリングを低減させるために同一でも、相補的でもない。
【００３０】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含む１つまたは複数のデリミター配列を含み、ヌクレオチド配列は、長さ約１〜４０、約１〜３０、約１〜２０、約１〜１５、約１〜１０、約３０、約２０、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２または１ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約１〜４０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約１〜３０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約１〜２０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約１〜１５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約１〜１０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約３０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約２０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約１０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約９ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約８ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約７ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約６ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約４ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約３ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約２ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列を含むヌクレオチド配列は、長さ約１ヌクレオチドである。
【００３１】
一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列は、第１の分岐点配列と第２の分岐点配列の間に位置する。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列は、第１の分岐点配列と第１のポリピリミジントラクトの間に位置する。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列は、第２の分岐点と第２のポリピリミジントラクトの間に位置する。
【００３２】
一部の実施形態では、本開示は、ＤＳＢへの双方向挿入用に構成されているドナーポリヌクレオチドであって、ドナーポリヌクレオチドが、どちらかの配向でＤＳＢに挿入されたとき、第１のスプライシングシグナルおよび第２のスプライシングシグナル、必要に応じて、第３のスプライシングシグナルおよびコード配列が、センス鎖を構成し、それによって、突然変異を修正し、１つまたは複数のスプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【００３３】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子の突然変異を修正または誘導する非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）とｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルとを含むドナーポリヌクレオチドであって、
ドナーポリヌクレオチドが、
（ｉ）第１の５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列とｇＤＮＡの突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第１の鎖と、
（ｉｉ）第２の５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列とｇＤＮＡの突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第２の鎖と
を含み、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、第１の鎖は、第１のコード配列を含み、第２の鎖は、第２のコード配列を含み、第１のコード配列は、第１の５’スプライス部位の上流に位置し、第２のコード配列は、第２の５’スプライス部位の上流に位置し、第１の鎖のコード配列と第２の鎖のコード配列は、自己アニーリングを低減させるために相補的でない（または１、２、３、４もしくはそれより多くのミスマッチを含む）。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含むデリミター配列を含み、ヌクレオチド配列は、第１の５’スプライス部位と第２の５’スプライス部位の間に位置する長さ約１〜４０、約１〜３０、約１〜２０、約１〜１５、約１〜１０、約３０、約２０、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２または１ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＳＢへの双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、第１の５’スプライス部位および第１のコード配列は、センス鎖を構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、第２の５’スプライス部位および第２のコード配列は、センス鎖を構成し、それによって、突然変異を修正し、１つまたは複数のスプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００３４】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子の突然変異を修正または誘導する非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）とｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルとを含むドナーポリヌクレオチドであって、ドナーポリヌクレオチドが、
（ｉ）第１の５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列とｇＤＮＡの突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第１の鎖と、
（ｉｉ）第２の５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列とｇＤＮＡの突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第２の鎖と
を含み、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、第１の鎖は、第１のコード配列を含み、第２の鎖は、第２のコード配列を含み、第１のコード配列は、第１の５’スプライス部位の上流に位置し、第２のコード配列は、第２の５’スプライス部位の上流に位置し、第１の鎖のコード配列と第２の鎖のコード配列は、自己アニーリングを低減させるために相補的でない（または１、２、３、４もしくはそれより多くのミスマッチを含む）。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含むデリミター配列を含み、ヌクレオチド配列は、第１の５’スプライス部位と第２の５’スプライス部位の間に位置する長さ約１〜４０、約１〜３０、約１〜２０、約１〜１５、約１〜１０、約３０、約２０、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２または１ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＳＢへの双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、第１の５’スプライス部位および第１のコード配列は、センス鎖を構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、第２の５’スプライス部位および第２のコード配列は、センス鎖を構成し、それによって、突然変異を修正し、１つまたは複数のスプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御する。
【００３５】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）天然のまたは増強された３’スプライス部位、
（ｂ）ポリピリミジントラクト、
（ｃ）分岐点、
（ｄ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｅ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｆ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｇ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択され、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、天然のまたは増強された３’スプライス部位である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、ポリピリミジントラクトである。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、分岐点である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）である。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００３６】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）天然のまたは増強された３’スプライス部位、
（ｂ）ポリピリミジントラクト、
（ｃ）分岐点、
（ｄ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｅ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｆ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｇ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択され、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、天然のまたは増強された３’スプライス部位である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、ポリピリミジントラクトである。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、分岐点である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）である。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００３７】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、５’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）天然のまたは増強された５’スプライス部位、
（ｂ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｃ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｄ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｅ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択され、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、天然のまたは増強された５’スプライス部位である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、ポリピリミジントラクトである。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、分岐点である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）である。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００３８】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、５’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）天然のまたは増強された５’スプライス部位、
（ｂ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｃ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｄ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｅ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択され、ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、天然のまたは増強された５’スプライス部位である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、ポリピリミジントラクトである。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、分岐点である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）である。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００３９】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、少なくとも１つのスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された３’スプライス部位である、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００４０】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、少なくとも１つのスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された３’スプライス部位である、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００４１】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、１つまたは複数のスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された３’スプライス部位とポリピリミジントラクトとの組合せである、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００４２】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、１つまたは複数のスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された３’スプライス部位とポリピリミジントラクトとの組合せである、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００４３】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、１つまたは複数のスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点との組合せである、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００４４】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、１つまたは複数のスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点との組合せである、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００４５】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が３’スプライス部位にあり、第１の鎖が、イントロン配列、必要に応じて、エクソン配列を含み、イントロン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）ポリピリミジントラクト、
（ｂ）分岐点、
（ｃ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｄ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｅ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｆ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択され、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、ポリピリミジントラクトである。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、分岐点である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）である。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００４６】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位にあり、第１の鎖が、イントロン配列、必要に応じて、エクソン配列を含み、イントロン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）ポリピリミジントラクト、
（ｂ）分岐点、
（ｃ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｄ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｅ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｆ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択され、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、ポリピリミジントラクトである。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、分岐点である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）である。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００４７】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、５’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、ドナーポリヌクレオチドが、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、少なくとも１つのスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された５’スプライス部位である、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００４８】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、５’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、ドナーポリヌクレオチドが、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、少なくとも１つのスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された５’スプライス部位である、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００４９】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、５’スプライス部位にあり、第１の鎖が、イントロン配列、必要に応じて、エクソン配列を含み、イントロン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｂ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｃ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｄ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択され、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）である。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００５０】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、５’スプライス部位にあり、第１の鎖が、イントロン配列、必要に応じて、エクソン配列を含み、イントロン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｂ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｃ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｄ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択され、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）である。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００５１】
一部の実施形態では、ＤＳＢへのドナーポリヌクレオチドの挿入は、ｇＤＮＡ中にエクソン配列を含むエクソンの形成をもたらす。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、突然変異を修正するエクソン配列を含むエクソンのｍＲＮＡへの組入れを方向付ける。
【００５２】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの挿入は、イントロン配列を含むイントロンの形成をもたらし、イントロン配列が、突然変異を修正する。
【００５３】
一部の実施形態では、本開示は、第１の鎖と第２の鎖とを含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、第１の鎖が、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を５’から３’に含み、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、第１の鎖が、式：
５’−［Ｂ］ａ−［Ｓ１］ｂ−［Ｐ］ｃ−［Ｓ２］ｄ−Ｘ−Ｅ−３’
（式中、
（ｉ）Ｂは、存在する場合、ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含む分岐点配列であり、Ｂは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ａは、その値がＢを構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ａ＝０または５〜７であり、
（ｉｉ）Ｐは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含むポリピリミジントラクトであり、ｃは、その値がＰを構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃ＝９〜２０であり、Ｐを構成するヌクレオチド配列は、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、
（ｉｉｉ）Ｅは、突然変異を修正するヌクレオチド配列を含むエクソン配列であり、ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、
（ｉｖ）Ｘは、３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列であり、
（ｖ）Ｓ１およびＳ２は、どちらかが存在する場合、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｂおよびｄは、各々、その値がデリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂおよびｄ＝０〜２０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への定方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに挿入されたとき、存在する場合Ｂ、Ｐ、存在する場合Ｘ、および存在する場合Ｅが、センス鎖を構成し、存在する場合Ｂ、Ｐ、および存在する場合Ｘが、１つまたは複数のスプライシングシグナルを構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【００５４】
一部の実施形態では、Ｂは、存在する。一部の実施形態では、Ｂは、非存在である。一部の実施形態では、ａ＝０。一部の実施形態では、ａ＝５〜７。一部の実施形態では、ａ＝５。一部の実施形態では、ａ＝６。一部の実施形態では、ａ＝７。一部の実施形態では、Ｐを構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐを構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐを構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、ｃ＝９。一部の実施形態では、ｃ＝１０。一部の実施形態では、ｃ＝１１。一部の実施形態では、ｃ＝１２。一部の実施形態では、ｃ＝１３。一部の実施形態では、ｃ＝１４。一部の実施形態では、ｃ＝１５。一部の実施形態では、ｃ＝１６。一部の実施形態では、ｃ＝１７。一部の実施形態では、ｃ＝１８。一部の実施形態では、ｃ＝１９。一部の実施形態では、ｃ＝２０。一部の実施形態では、Ｓ１は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ１は、非存在である。一部の実施形態では、Ｓ２は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ２は、非存在である。一部の実施形態では、ｂ＝０。一部の実施形態では、ｂ＝１。一部の実施形態では、ｂ＝２。一部の実施形態では、ｂ＝３。一部の実施形態では、ｂ＝４。一部の実施形態では、ｂ＝５。一部の実施形態では、ｂ＝６。一部の実施形態では、ｂ＝７。一部の実施形態では、ｂ＝８。一部の実施形態では、ｂ＝９。一部の実施形態では、ｂ＝１０。一部の実施形態では、ｂ＝１１。一部の実施形態では、ｂ＝１２。一部の実施形態では、ｂ＝１３。一部の実施形態では、ｂ＝１４。一部の実施形態では、ｂ＝１５。一部の実施形態では、ｂ＝１６。一部の実施形態では、ｂ＝１７。一部の実施形態では、ｂ＝１８。一部の実施形態では、ｂ＝１９。一部の実施形態では、ｂ＝２０。一部の実施形態では、ｄ＝０。一部の実施形態では、ｄ＝１。一部の実施形態では、ｄ＝２。一部の実施形態では、ｄ＝３。一部の実施形態では、ｄ＝４。一部の実施形態では、ｄ＝５。一部の実施形態では、ｄ＝６。一部の実施形態では、ｄ＝７。一部の実施形態では、ｄ＝８。一部の実施形態では、ｄ＝９。一部の実施形態では、ｄ＝１０。一部の実施形態では、ｄ＝１１。一部の実施形態では、ｄ＝１２。一部の実施形態では、ｄ＝１３。一部の実施形態では、ｄ＝１４。一部の実施形態では、ｄ＝１５。一部の実施形態では、ｄ＝１６。一部の実施形態では、ｄ＝１７。一部の実施形態では、ｄ＝１８。一部の実施形態では、ｄ＝１９。一部の実施形態では、ｄ＝２０。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００５５】
一部の実施形態では、本開示は、第１の鎖と第２の鎖とを含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、第１の鎖が、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を５’から３’に含み、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、第１の鎖が、式：
５’−［Ｂ］ａ−［Ｓ１］ｂ−［Ｐ］ｃ−［Ｓ２］ｄ−Ｘ−Ｅ−３’
（式中、
（ｉ）Ｂは、存在する場合、ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含む分岐点配列であり、Ｂは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ａは、その値がＢを構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ａ＝０または５〜７であり、
（ｉｉ）Ｐは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含むポリピリミジントラクトであり、ｃは、その値がＰを構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃ＝９〜２０であり、Ｐを構成するヌクレオチド配列は、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、
（ｉｉｉ）Ｅは、突然変異を修正するヌクレオチド配列を含むエクソン配列であり、ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、
（ｉｖ）Ｘは、３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列であり、
（ｖ）Ｓ１およびＳ２は、どちらかが存在する場合、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｂおよびｄは、各々、その値がデリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂおよびｄ＝０〜２０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への定方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに挿入されたとき、存在する場合Ｂ、Ｐ、存在する場合Ｘ、および存在する場合Ｅが、センス鎖を構成し、存在する場合Ｂ、Ｐ、および存在する場合Ｘが、１つまたは複数のスプライシングシグナルを構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【００５６】
一部の実施形態では、Ｂは、存在する。一部の実施形態では、Ｂは、非存在である。一部の実施形態では、ａ＝０。一部の実施形態では、ａ＝５〜７。一部の実施形態では、ａ＝５。一部の実施形態では、ａ＝６。一部の実施形態では、ａ＝７。一部の実施形態では、Ｐを構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐを構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐを構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、ｃ＝９。一部の実施形態では、ｃ＝１０。一部の実施形態では、ｃ＝１１。一部の実施形態では、ｃ＝１２。一部の実施形態では、ｃ＝１３。一部の実施形態では、ｃ＝１４。一部の実施形態では、ｃ＝１５。一部の実施形態では、ｃ＝１６。一部の実施形態では、ｃ＝１７。一部の実施形態では、ｃ＝１８。一部の実施形態では、ｃ＝１９。一部の実施形態では、ｃ＝２０。一部の実施形態では、Ｓ１は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ１は、非存在である。一部の実施形態では、Ｓ２は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ２は、非存在である。一部の実施形態では、ｂ＝０。一部の実施形態では、ｂ＝１。一部の実施形態では、ｂ＝２。一部の実施形態では、ｂ＝３。一部の実施形態では、ｂ＝４。一部の実施形態では、ｂ＝５。一部の実施形態では、ｂ＝６。一部の実施形態では、ｂ＝７。一部の実施形態では、ｂ＝８。一部の実施形態では、ｂ＝９。一部の実施形態では、ｂ＝１０。一部の実施形態では、ｂ＝１１。一部の実施形態では、ｂ＝１２。一部の実施形態では、ｂ＝１３。一部の実施形態では、ｂ＝１４。一部の実施形態では、ｂ＝１５。一部の実施形態では、ｂ＝１６。一部の実施形態では、ｂ＝１７。一部の実施形態では、ｂ＝１８。一部の実施形態では、ｂ＝１９。一部の実施形態では、ｂ＝２０。一部の実施形態では、ｄ＝０。一部の実施形態では、ｄ＝１。一部の実施形態では、ｄ＝２。一部の実施形態では、ｄ＝３。一部の実施形態では、ｄ＝４。一部の実施形態では、ｄ＝５。一部の実施形態では、ｄ＝６。一部の実施形態では、ｄ＝７。一部の実施形態では、ｄ＝８。一部の実施形態では、ｄ＝９。一部の実施形態では、ｄ＝１０。一部の実施形態では、ｄ＝１１。一部の実施形態では、ｄ＝１２。一部の実施形態では、ｄ＝１３。一部の実施形態では、ｄ＝１４。一部の実施形態では、ｄ＝１５。一部の実施形態では、ｄ＝１６。一部の実施形態では、ｄ＝１７。一部の実施形態では、ｄ＝１８。一部の実施形態では、ｄ＝１９。一部の実施形態では、ｄ＝２０。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００５７】
一部の実施形態では、本開示は、第１の鎖と第２の鎖とを含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、第１の鎖が、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を５’から３’に含み、病因突然変異が、５’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、
第１の鎖が、式：
５’−Ｅ−Ｙ−Ｉ−３’
（式中、
（ｉ）Ｅは、突然変異を修正するヌクレオチド配列を含むエクソン配列であり、ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、
（ｉｉ）Ｙは、５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列であり、
（ｉｉｉ）Ｉは、存在する場合、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチドを含むイントロン配列を構成する）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への定方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに挿入されたとき、存在する場合Ｅ、Ｙ、および存在する場合Ｉが、センス鎖を構成し、Ｙが、１つまたは複数のスプライシングシグナルを構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、Ｅは、存在する。一部の実施形態ではＥは、非存在である。一部の実施形態では、Ｉは、存在する。一部の実施形態では、Ｉは、非存在である。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００５８】
一部の実施形態では、本開示は、第１の鎖と第２の鎖とを含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、第１の鎖が、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を５’から３’に含み、病因突然変異が、５’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、
第１の鎖が、式：
５’−Ｅ−Ｙ−Ｉ−３’
（式中、
（ｉ）Ｅは、突然変異を修正するヌクレオチド配列を含むエクソン配列であり、ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、
（ｉｉ）Ｙは、５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列であり、
（ｉｉｉ）Ｉは、存在する場合、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチドを含むイントロン配列を構成する）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への定方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに挿入されたとき、存在する場合Ｅ、Ｙ、および存在する場合Ｉが、センス鎖を構成し、Ｙが、１つまたは複数のスプライシングシグナルを構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、Ｅは、存在する。一部の実施形態ではＥは、非存在である。一部の実施形態では、Ｉは、存在する。一部の実施形態では、Ｉは、非存在である。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００５９】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位にあり、第１の鎖が、第１のイントロン配列を含み、第１のイントロン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位にあり、第２の鎖が、第２のイントロン配列を含み、第２のイントロン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、第１の鎖および第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｐ１］ａ−［Ｓ１］ｂ−［Ｂ］ｃ−［Ｓ２］ｄ−［Ｐ２］ｅ−３’
（式中、
（ａ）Ｂは、ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含む分岐点配列を含み、Ｂは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ｃは、その値がＢを構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃ＝５〜７であり、
（ｂ）Ｐ１およびＰ２は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を各々が含むポリピリミジントラクトであり、ａおよびｅは、その値がＰ１およびＰ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ａ＝９〜２０およびｅ＝９〜２０であり、Ｐ１およびＰ２を構成するヌクレオチド配列は、各々、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、Ｐ１は、Ｐ２に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｓ１およびＳ２は、どちらかが存在する場合、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｂおよびｄは、各々、その値がデリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂおよびｄ＝０〜２０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、ＢおよびＰ２が、センス鎖を構成し、ＢおよびＰ２が、第１および第２のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、ＢおよびＰ１が、センス鎖を構成し、ＢおよびＰ２が、第１および第２のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【００６０】
一部の実施形態では、ｃ＝５。一部の実施形態では、ｃ＝６。一部の実施形態では、ｃ＝７。一部の実施形態では、ａ＝９。一部の実施形態では、ａ＝１０。一部の実施形態では、ａ＝１１。一部の実施形態では、ａ＝１２。一部の実施形態では、ａ＝１３。一部の実施形態では、ａ＝１４。一部の実施形態では、ａ＝１５。一部の実施形態では、ａ＝１６。一部の実施形態では、ａ＝１７。一部の実施形態では、ａ＝１８。一部の実施形態では、ａ＝１９。一部の実施形態では、ａ＝２０。一部の実施形態では、ｅ＝９。一部の実施形態では、ｅ＝１０。一部の実施形態では、ｅ＝１１。一部の実施形態では、ｅ＝１２。一部の実施形態では、ｅ＝１３。一部の実施形態では、ｅ＝１４。一部の実施形態では、ｅ＝１５。一部の実施形態では、ｅ＝１６。一部の実施形態では、ｅ＝１７。一部の実施形態では、ｅ＝１８。一部の実施形態では、ｅ＝１９。一部の実施形態では、ｅ＝２０。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｓ１は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ１は、非存在である。一部の実施形態では、Ｓ２は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ２は、非存在である。一部の実施形態では、ｂ＝０。一部の実施形態では、ｂ＝１。一部の実施形態では、ｂ＝２。一部の実施形態では、ｂ＝３。一部の実施形態では、ｂ＝４。一部の実施形態では、ｂ＝５。一部の実施形態では、ｂ＝６。一部の実施形態では、ｂ＝７。一部の実施形態では、ｂ＝８。一部の実施形態では、ｂ＝９。一部の実施形態では、ｂ＝１０。一部の実施形態では、ｂ＝１１。一部の実施形態では、ｂ＝１２。一部の実施形態では、ｂ＝１３。一部の実施形態では、ｂ＝１４。一部の実施形態では、ｂ＝１５。一部の実施形態では、ｂ＝１６。一部の実施形態では、ｂ＝１７。一部の実施形態では、ｂ＝１８。一部の実施形態では、ｂ＝１９。一部の実施形態では、ｂ＝２０。一部の実施形態では、ｄ＝０。一部の実施形態では、ｄ＝１。一部の実施形態では、ｄ＝２。一部の実施形態では、ｄ＝３。一部の実施形態では、ｄ＝４。一部の実施形態では、ｄ＝５。一部の実施形態では、ｄ＝６。一部の実施形態では、ｄ＝７。一部の実施形態では、ｄ＝８。一部の実施形態では、ｄ＝９。一部の実施形態では、ｄ＝１０。一部の実施形態では、ｄ＝１１。一部の実施形態では、ｄ＝１２。一部の実施形態では、ｄ＝１３。一部の実施形態では、ｄ＝１４。一部の実施形態では、ｄ＝１５。一部の実施形態では、ｄ＝１６。一部の実施形態では、ｄ＝１７。一部の実施形態では、ｄ＝１８。一部の実施形態では、ｄ＝１９。一部の実施形態では、ｄ＝２０。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００６１】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位にあり、第１の鎖が、第１のイントロン配列を含み、第１のイントロン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位にあり、第２の鎖が、第２のイントロン配列を含み、第２のイントロン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、第１の鎖および第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｐ１］ａ−［Ｓ１］ｂ−［Ｂ］ｃ−［Ｓ２］ｄ−［Ｐ２］ｅ−３’
（式中、
（ａ）Ｂは、ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含む分岐点配列を含み、Ｂは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ｃは、その値がＢを構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃ＝５〜７であり、
（ｂ）Ｐ１およびＰ２は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を各々が含むポリピリミジントラクトであり、ａおよびｅは、その値がＰ１およびＰ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ａ＝９〜２０およびｅ＝９〜２０であり、Ｐ１およびＰ２を構成するヌクレオチド配列は、各々、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、Ｐ１は、Ｐ２に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｓ１およびＳ２は、どちらかが存在する場合、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｂおよびｄは、各々、その値がデリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂおよびｄ＝０〜２０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、ＢおよびＰ２が、センス鎖を構成し、ＢおよびＰ２が、第１および第２のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、ＢおよびＰ１が、センス鎖を構成し、ＢおよびＰ２が、第１および第２のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【００６２】
一部の実施形態では、ｃ＝５。一部の実施形態では、ｃ＝６。一部の実施形態では、ｃ＝７。一部の実施形態では、ａ＝９。一部の実施形態では、ａ＝１０。一部の実施形態では、ａ＝１１。一部の実施形態では、ａ＝１２。一部の実施形態では、ａ＝１３。一部の実施形態では、ａ＝１４。一部の実施形態では、ａ＝１５。一部の実施形態では、ａ＝１６。一部の実施形態では、ａ＝１７。一部の実施形態では、ａ＝１８。一部の実施形態では、ａ＝１９。一部の実施形態では、ａ＝２０。一部の実施形態では、ｅ＝９。一部の実施形態では、ｅ＝１０。一部の実施形態では、ｅ＝１１。一部の実施形態では、ｅ＝１２。一部の実施形態では、ｅ＝１３。一部の実施形態では、ｅ＝１４。一部の実施形態では、ｅ＝１５。一部の実施形態では、ｅ＝１６。一部の実施形態では、ｅ＝１７。一部の実施形態では、ｅ＝１８。一部の実施形態では、ｅ＝１９。一部の実施形態では、ｅ＝２０。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｓ１は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ１は、非存在である。一部の実施形態では、Ｓ２は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ２は、非存在である。一部の実施形態では、ｂ＝０。一部の実施形態では、ｂ＝１。一部の実施形態では、ｂ＝２。一部の実施形態では、ｂ＝３。一部の実施形態では、ｂ＝４。一部の実施形態では、ｂ＝５。一部の実施形態では、ｂ＝６。一部の実施形態では、ｂ＝７。一部の実施形態では、ｂ＝８。一部の実施形態では、ｂ＝９。一部の実施形態では、ｂ＝１０。一部の実施形態では、ｂ＝１１。一部の実施形態では、ｂ＝１２。一部の実施形態では、ｂ＝１３。一部の実施形態では、ｂ＝１４。一部の実施形態では、ｂ＝１５。一部の実施形態では、ｂ＝１６。一部の実施形態では、ｂ＝１７。一部の実施形態では、ｂ＝１８。一部の実施形態では、ｂ＝１９。一部の実施形態では、ｂ＝２０。一部の実施形態では、ｄ＝０。一部の実施形態では、ｄ＝１。一部の実施形態では、ｄ＝２。一部の実施形態では、ｄ＝３。一部の実施形態では、ｄ＝４。一部の実施形態では、ｄ＝５。一部の実施形態では、ｄ＝６。一部の実施形態では、ｄ＝７。一部の実施形態では、ｄ＝８。一部の実施形態では、ｄ＝９。一部の実施形態では、ｄ＝１０。一部の実施形態では、ｄ＝１１。一部の実施形態では、ｄ＝１２。一部の実施形態では、ｄ＝１３。一部の実施形態では、ｄ＝１４。一部の実施形態では、ｄ＝１５。一部の実施形態では、ｄ＝１６。一部の実施形態では、ｄ＝１７。一部の実施形態では、ｄ＝１８。一部の実施形態では、ｄ＝１９。一部の実施形態では、ｄ＝２０。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００６３】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位にあり、第１の鎖が、第１のイントロン配列を含み、第１のイントロン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位にあり、第２の鎖が、第２のイントロン配列を含み、第２のイントロン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、第１の鎖および第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｐ１］ａ−［Ｓ１］ｂ−［Ｂ１］ｃ−［Ｓ２］ｄ−［Ｂ２］ｅ−［Ｓ３］ｆ−［Ｐ２］ｇ−３’
（式中、
（ａ）存在する場合Ｂ１、およびＢ２は、各々、分岐点配列であり、Ｂ２は、ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含み、存在する場合Ｂ１を含む分岐点配列は、Ｂ２を含む分岐点配列に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、Ｂ１およびＢ２は、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ｃおよびｅは、その値がＢ１およびＢ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃ＝０または５〜７であり、ｅ＝５〜７であり、
（ｂ）Ｐ１およびＰ２は、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を各々が含むポリピリミジントラクトであり、ａおよびｇは、その値がＰ１およびＰ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ａ＝９〜２０およびｇ＝９〜２０であり、Ｐ１およびＰ２を構成するヌクレオチド配列は、各々、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、Ｐ１は、Ｐ２に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、いずれかが存在する場合、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｂ、ｄおよびｆは、各々、その値がデリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂおよびｆ＝０または１〜２０であり、ｄ＝０または１〜４０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、Ｂ２およびＰ２が、センス鎖を構成し、Ｂ２およびＰ２が、第１および第２のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、Ｂ１およびＰ１が、センス鎖を構成し、Ｂ１およびＰ１が、第１および第２のスプライシングシグナルをそれぞれ提供し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【００６４】
一部の実施形態では、Ｂ１は、存在する。一部の実施形態では、Ｂ１は、非存在である。一部の実施形態では、ｃ＝０。一部の実施形態では、ｃ＝５〜７。一部の実施形態では、ｃ＝５。一部の実施形態では、ｃ＝６。一部の実施形態では、ｃ＝７。一部の実施形態では、ｅ＝５。一部の実施形態では、ｅ＝６。一部の実施形態では、ｅ＝７。一部の実施形態では、ａ＝９。一部の実施形態では、ａ＝１０。一部の実施形態では、ａ＝１１。一部の実施形態では、ａ＝１２。一部の実施形態では、ａ＝１３。一部の実施形態では、ａ＝１４。一部の実施形態では、ａ＝１５。一部の実施形態では、ａ＝１６。一部の実施形態では、ａ＝１７。一部の実施形態では、ａ＝１８。一部の実施形態では、ａ＝１９。一部の実施形態では、ａ＝２０。一部の実施形態では、ｇ＝９。一部の実施形態では、ｇ＝１０。一部の実施形態では、ｇ＝１１。一部の実施形態では、ｇ＝１２。一部の実施形態では、ｇ＝１３。一部の実施形態では、ｇ＝１４。一部の実施形態では、ｇ＝１５。一部の実施形態では、ｇ＝１６。一部の実施形態では、ｇ＝１７。一部の実施形態では、ｇ＝１８。一部の実施形態では、ｇ＝１９。一部の実施形態では、ｇ＝２０。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｓ１は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ１は、非存在である。一部の実施形態では、Ｓ２は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ２は、非存在である。一部の実施形態では、Ｓ３は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ３は、非存在である。一部の実施形態では、ｂ＝０。一部の実施形態では、ｂ＝１。一部の実施形態では、ｂ＝２。一部の実施形態では、ｂ＝３。一部の実施形態では、ｂ＝４。一部の実施形態では、ｂ＝５。一部の実施形態では、ｂ＝６。一部の実施形態では、ｂ＝７。一部の実施形態では、ｂ＝８。一部の実施形態では、ｂ＝９。一部の実施形態では、ｂ＝１０。一部の実施形態では、ｂ＝１１。一部の実施形態では、ｂ＝１２。一部の実施形態では、ｂ＝１３。一部の実施形態では、ｂ＝１４。一部の実施形態では、ｂ＝１５。一部の実施形態では、ｂ＝１６。一部の実施形態では、ｂ＝１７。一部の実施形態では、ｂ＝１８。一部の実施形態では、ｂ＝１９。一部の実施形態では、ｂ＝２０。一部の実施形態では、ｆ＝０。一部の実施形態では、ｆ＝１。一部の実施形態では、ｆ＝２。一部の実施形態では、ｆ＝３。一部の実施形態では、ｆ＝４。一部の実施形態では、ｆ＝５。一部の実施形態では、ｆ＝６。一部の実施形態では、ｆ＝７。一部の実施形態では、ｆ＝８。一部の実施形態では、ｆ＝９。一部の実施形態では、ｆ＝１０。一部の実施形態では、ｆ＝１１。一部の実施形態では、ｆ＝１２。一部の実施形態では、ｆ＝１３。一部の実施形態では、ｆ＝１４。一部の実施形態では、ｆ＝１５。一部の実施形態では、ｆ＝１６。一部の実施形態では、ｆ＝１７。一部の実施形態では、ｆ＝１８。一部の実施形態では、ｆ＝１９。一部の実施形態では、ｆ＝２０。一部の実施形態では、ｄ＝０。一部の実施形態では、ｄ＝１。一部の実施形態では、ｄ＝２。一部の実施形態では、ｄ＝３。一部の実施形態では、ｄ＝４。一部の実施形態では、ｄ＝５。一部の実施形態では、ｄ＝６。一部の実施形態では、ｄ＝７。一部の実施形態では、ｄ＝８。一部の実施形態では、ｄ＝９。一部の実施形態では、ｄ＝１０。一部の実施形態では、ｄ＝１１。一部の実施形態では、ｄ＝１２。一部の実施形態では、ｄ＝１３。一部の実施形態では、ｄ＝１４。一部の実施形態では、ｄ＝１５。一部の実施形態では、ｄ＝１６。一部の実施形態では、ｄ＝１７。一部の実施形態では、ｄ＝１８。一部の実施形態では、ｄ＝１９。一部の実施形態では、ｄ＝２０。一部の実施形態では、ｄ＝２１。一部の実施形態では、ｄ＝２２。一部の実施形態では、ｄ＝２３。一部の実施形態では、ｄ＝２４。一部の実施形態では、ｄ＝２５。一部の実施形態では、ｄ＝２６。一部の実施形態では、ｄ＝２７。一部の実施形態では、ｄ＝２８。一部の実施形態では、ｄ＝２９。一部の実施形態では、ｄ＝３０。一部の実施形態では、ｄ＝３１。一部の実施形態では、ｄ＝３２。一部の実施形態では、ｄ＝３３。一部の実施形態では、ｄ＝３４。一部の実施形態では、ｄ＝３５。一部の実施形態では、ｄ＝３６。一部の実施形態では、ｄ＝３７。一部の実施形態では、ｄ＝３８。一部の実施形態では、ｄ＝３９。一部の実施形態では、ｄ＝４０。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００６５】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位にあり、第１の鎖が、第１のイントロン配列を含み、第１のイントロン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位にあり、第２の鎖が、第２のイントロン配列を含み、第２のイントロン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、第１の鎖および第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｐ１］ａ−［Ｓ１］ｂ−［Ｂ１］ｃ−［Ｓ２］ｄ−［Ｂ２］ｅ−［Ｓ３］ｆ−［Ｐ２］ｇ−３’
（式中、
（ａ）存在する場合Ｂ１、およびＢ２は、各々、分岐点配列であり、Ｂ２は、ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含み、存在する場合Ｂ１を含む分岐点配列は、Ｂ２を含む分岐点配列に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、Ｂ１およびＢ２は、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ｃおよびｅは、その値がＢ１およびＢ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃ＝０または５〜７であり、ｅ＝５〜７であり、
（ｂ）Ｐ１およびＰ２は、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を各々が含むポリピリミジントラクトであり、ａおよびｇは、その値がＰ１およびＰ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ａ＝９〜２０およびｇ＝９〜２０であり、Ｐ１およびＰ２を構成するヌクレオチド配列は、各々、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、Ｐ１は、Ｐ２に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、いずれかが存在する場合、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｂ、ｄおよびｆは、各々、その値がデリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂおよびｆ＝０または１〜２０であり、ｄ＝０または１〜４０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、Ｂ２およびＰ２が、センス鎖を構成し、Ｂ２およびＰ２が、第１および第２のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、Ｂ１およびＰ１が、センス鎖を構成し、Ｂ１およびＰ１が、第１および第２のスプライシングシグナルをそれぞれ提供し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【００６６】
一部の実施形態では、Ｂ１は、存在する。一部の実施形態では、Ｂ１は、非存在である。一部の実施形態では、ｃ＝０。一部の実施形態では、ｃ＝５〜７。一部の実施形態では、ｃ＝５。一部の実施形態では、ｃ＝６。一部の実施形態では、ｃ＝７。一部の実施形態では、ｅ＝５。一部の実施形態では、ｅ＝６。一部の実施形態では、ｅ＝７。一部の実施形態では、ａ＝９。一部の実施形態では、ａ＝１０。一部の実施形態では、ａ＝１１。一部の実施形態では、ａ＝１２。一部の実施形態では、ａ＝１３。一部の実施形態では、ａ＝１４。一部の実施形態では、ａ＝１５。一部の実施形態では、ａ＝１６。一部の実施形態では、ａ＝１７。一部の実施形態では、ａ＝１８。一部の実施形態では、ａ＝１９。一部の実施形態では、ａ＝２０。一部の実施形態では、ｇ＝９。一部の実施形態では、ｇ＝１０。一部の実施形態では、ｇ＝１１。一部の実施形態では、ｇ＝１２。一部の実施形態では、ｇ＝１３。一部の実施形態では、ｇ＝１４。一部の実施形態では、ｇ＝１５。一部の実施形態では、ｇ＝１６。一部の実施形態では、ｇ＝１７。一部の実施形態では、ｇ＝１８。一部の実施形態では、ｇ＝１９。一部の実施形態では、ｇ＝２０。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｓ１は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ１は、非存在である。一部の実施形態では、Ｓ２は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ２は、非存在である。一部の実施形態では、Ｓ３は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ３は、非存在である。一部の実施形態では、ｂ＝０。一部の実施形態では、ｂ＝１。一部の実施形態では、ｂ＝２。一部の実施形態では、ｂ＝３。一部の実施形態では、ｂ＝４。一部の実施形態では、ｂ＝５。一部の実施形態では、ｂ＝６。一部の実施形態では、ｂ＝７。一部の実施形態では、ｂ＝８。一部の実施形態では、ｂ＝９。一部の実施形態では、ｂ＝１０。一部の実施形態では、ｂ＝１１。一部の実施形態では、ｂ＝１２。一部の実施形態では、ｂ＝１３。一部の実施形態では、ｂ＝１４。一部の実施形態では、ｂ＝１５。一部の実施形態では、ｂ＝１６。一部の実施形態では、ｂ＝１７。一部の実施形態では、ｂ＝１８。一部の実施形態では、ｂ＝１９。一部の実施形態では、ｂ＝２０。一部の実施形態では、ｆ＝０。一部の実施形態では、ｆ＝１。一部の実施形態では、ｆ＝２。一部の実施形態では、ｆ＝３。一部の実施形態では、ｆ＝４。一部の実施形態では、ｆ＝５。一部の実施形態では、ｆ＝６。一部の実施形態では、ｆ＝７。一部の実施形態では、ｆ＝８。一部の実施形態では、ｆ＝９。一部の実施形態では、ｆ＝１０。一部の実施形態では、ｆ＝１１。一部の実施形態では、ｆ＝１２。一部の実施形態では、ｆ＝１３。一部の実施形態では、ｆ＝１４。一部の実施形態では、ｆ＝１５。一部の実施形態では、ｆ＝１６。一部の実施形態では、ｆ＝１７。一部の実施形態では、ｆ＝１８。一部の実施形態では、ｆ＝１９。一部の実施形態では、ｆ＝２０。一部の実施形態では、ｄ＝０。一部の実施形態では、ｄ＝１。一部の実施形態では、ｄ＝２。一部の実施形態では、ｄ＝３。一部の実施形態では、ｄ＝４。一部の実施形態では、ｄ＝５。一部の実施形態では、ｄ＝６。一部の実施形態では、ｄ＝７。一部の実施形態では、ｄ＝８。一部の実施形態では、ｄ＝９。一部の実施形態では、ｄ＝１０。一部の実施形態では、ｄ＝１１。一部の実施形態では、ｄ＝１２。一部の実施形態では、ｄ＝１３。一部の実施形態では、ｄ＝１４。一部の実施形態では、ｄ＝１５。一部の実施形態では、ｄ＝１６。一部の実施形態では、ｄ＝１７。一部の実施形態では、ｄ＝１８。一部の実施形態では、ｄ＝１９。一部の実施形態では、ｄ＝２０。一部の実施形態では、ｄ＝２１。一部の実施形態では、ｄ＝２２。一部の実施形態では、ｄ＝２３。一部の実施形態では、ｄ＝２４。一部の実施形態では、ｄ＝２５。一部の実施形態では、ｄ＝２６。一部の実施形態では、ｄ＝２７。一部の実施形態では、ｄ＝２８。一部の実施形態では、ｄ＝２９。一部の実施形態では、ｄ＝３０。一部の実施形態では、ｄ＝３１。一部の実施形態では、ｄ＝３２。一部の実施形態では、ｄ＝３３。一部の実施形態では、ｄ＝３４。一部の実施形態では、ｄ＝３５。一部の実施形態では、ｄ＝３６。一部の実施形態では、ｄ＝３７。一部の実施形態では、ｄ＝３８。一部の実施形態では、ｄ＝３９。一部の実施形態では、ｄ＝４０。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００６７】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、第１のイントロン配列および第１のエクソン配列を含み、第１のエクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第２の鎖が、第２のイントロン配列および第２のエクソン配列を含み、第２のエクソン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、第１の鎖および第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｅ１］ａ−Ｘ１−［Ｐ１］ｂ−［Ｓ１］ｃ−［Ｂ］ｄ−［Ｓ２］ｅ−［Ｐ２］ｆ−Ｘ２−［Ｅ２］ｇ−３’
（式中、
（ａ）Ｂは、ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含む分岐点配列であり、Ｂは、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ｄは、その値がＢを構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｄ＝５〜７であり、
（ｂ）Ｐ１およびＰ２は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を各々が含むポリピリミジントラクトであり、ｂおよびｆは、その値がＰ１およびＰ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂ＝９〜２０およびｆ＝９〜２０であり、Ｐ１およびＰ２を構成するヌクレオチド配列は、各々、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、Ｐ１は、Ｐ２に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｅ１およびＥ２は、各々、突然変異を修正するヌクレオチド配列を各々が含むエクソン配列であり、ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、ａおよびｇは、その値がＥ１およびＥ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、Ｅ１を含むエクソン配列は、Ｅ２を含むエクソン配列に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、Ｅ１を構成するヌクレオチド配列とＥ２を構成するヌクレオチド配列は、相補的でなく、
（ｄ）Ｘ１およびＸ２は、各々、３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列であり、Ｘ１を構成するヌクレオチド配列は、Ｘ２を構成するヌクレオチド配列に対して、逆方向の配向であり、逆鎖上にあり、
（ｅ）Ｓ１およびＳ２は、どちらかが存在する場合、各々、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｃおよびｅは、各々、その値がデリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃ＝０または１〜２０およびｅ＝０または１〜２０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、Ｂ、Ｐ２、Ｅ２およびＸ２および    が、センス鎖を構成し、Ｂ、Ｐ２およびＸ２が、第１、第２および第３のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、Ｂ、Ｐ１、Ｅ１およびＸ１が、センス鎖を構成し、Ｂ、Ｐ１およびＸ１が、第１、第２および第３のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【００６８】
一部の実施形態では、ｄ＝５。一部の実施形態では、ｄ＝６。一部の実施形態では、ｄ＝７。一部の実施形態では、ｂ＝９。一部の実施形態では、ｂ＝１０。一部の実施形態では、ｂ＝１１。一部の実施形態では、ｂ＝１２。一部の実施形態では、ｂ＝１３。一部の実施形態では、ｂ＝１４。一部の実施形態では、ｂ＝１５。一部の実施形態では、ｂ＝１６。一部の実施形態では、ｂ＝１７。一部の実施形態では、ｂ＝１８。一部の実施形態では、ｂ＝１９。一部の実施形態では、ｂ＝２０。一部の実施形態では、ｆ＝９。一部の実施形態では、ｆ＝１０。一部の実施形態では、ｆ＝１１。一部の実施形態では、ｆ＝１２。一部の実施形態では、ｆ＝１３。一部の実施形態では、ｆ＝１４。一部の実施形態では、ｆ＝１５。一部の実施形態では、ｆ＝１６。一部の実施形態では、ｆ＝１７。一部の実施形態では、ｆ＝１８。一部の実施形態では、ｆ＝１９。一部の実施形態では、ｆ＝２０。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｓ１は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ１は、非存在である。一部の実施形態では、Ｓ２は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ２は、非存在である。一部の実施形態では、ｃ＝０。一部の実施形態では、ｃ＝１。一部の実施形態では、ｃ＝２。一部の実施形態では、ｃ＝３。一部の実施形態では、ｃ＝４。一部の実施形態では、ｃ＝５。一部の実施形態では、ｃ＝６。一部の実施形態では、ｃ＝７。一部の実施形態では、ｃ＝８。一部の実施形態では、ｃ＝９。一部の実施形態では、ｃ＝１０。一部の実施形態では、ｃ＝１１。一部の実施形態では、ｃ＝１２。一部の実施形態では、ｃ＝１３。一部の実施形態では、ｃ＝１４。一部の実施形態では、ｃ＝１５。一部の実施形態では、ｃ＝１６。一部の実施形態では、ｃ＝１７。一部の実施形態では、ｃ＝１８。一部の実施形態では、ｃ＝１９。一部の実施形態では、ｃ＝２０。一部の実施形態では、ｅ＝０。一部の実施形態では、ｅ＝１。一部の実施形態では、ｅ＝２。一部の実施形態では、ｅ＝３。一部の実施形態では、ｅ＝４。一部の実施形態では、ｅ＝５。一部の実施形態では、ｅ＝６。一部の実施形態では、ｅ＝７。一部の実施形態では、ｅ＝８。一部の実施形態では、ｅ＝９。一部の実施形態では、ｅ＝１０。一部の実施形態では、ｅ＝１１。一部の実施形態では、ｅ＝１２。一部の実施形態では、ｅ＝１３。一部の実施形態では、ｅ＝１４。一部の実施形態では、ｅ＝１５。一部の実施形態では、ｅ＝１６。一部の実施形態では、ｅ＝１７。一部の実施形態では、ｅ＝１８。一部の実施形態では、ｅ＝１９。一部の実施形態では、ｅ＝２０。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００６９】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、第１のイントロン配列および第１のエクソン配列を含み、第１のエクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第２の鎖が、第２のイントロン配列および第２のエクソン配列を含み、第２のエクソン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、第１の鎖および第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｅ１］ａ−Ｘ１−［Ｐ１］ｂ−［Ｓ１］ｃ−［Ｂ］ｄ−［Ｓ２］ｅ−［Ｐ２］ｆ−Ｘ２−［Ｅ２］ｇ−３’
（式中、
（ａ）Ｂは、ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含む分岐点配列であり、Ｂは、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ｄは、その値がＢを構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｄ＝５〜７であり、
（ｂ）Ｐ１およびＰ２は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を各々が含むポリピリミジントラクトであり、ｂおよびｆは、その値がＰ１およびＰ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂ＝９〜２０およびｆ＝９〜２０であり、Ｐ１およびＰ２を構成するヌクレオチド配列は、各々、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、Ｐ１は、Ｐ２に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｅ１およびＥ２は、各々、突然変異を修正するヌクレオチド配列を各々が含むエクソン配列であり、ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、ａおよびｇは、その値がＥ１およびＥ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、Ｅ１を含むエクソン配列は、Ｅ２を含むエクソン配列に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、Ｅ１を構成するヌクレオチド配列とＥ２を構成するヌクレオチド配列は、相補的でなく、
（ｄ）Ｘ１およびＸ２は、各々、３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列であり、Ｘ１を構成するヌクレオチド配列は、Ｘ２を構成するヌクレオチド配列に対して、逆方向の配向であり、逆鎖上にあり、
（ｅ）Ｓ１およびＳ２は、どちらかが存在する場合、各々、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｃおよびｅは、各々、その値がデリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃ＝０または１〜２０およびｅ＝０または１〜２０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、Ｂ、Ｐ２、Ｅ２およびＸ２および    が、センス鎖を構成し、Ｂ、Ｐ２およびＸ２が、第１、第２および第３のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、Ｂ、Ｐ１、Ｅ１およびＸ１が、センス鎖を構成し、Ｂ、Ｐ１およびＸ１が、第１、第２および第３のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【００７０】
一部の実施形態では、ｄ＝５。一部の実施形態では、ｄ＝６。一部の実施形態では、ｄ＝７。一部の実施形態では、ｂ＝９。一部の実施形態では、ｂ＝１０。一部の実施形態では、ｂ＝１１。一部の実施形態では、ｂ＝１２。一部の実施形態では、ｂ＝１３。一部の実施形態では、ｂ＝１４。一部の実施形態では、ｂ＝１５。一部の実施形態では、ｂ＝１６。一部の実施形態では、ｂ＝１７。一部の実施形態では、ｂ＝１８。一部の実施形態では、ｂ＝１９。一部の実施形態では、ｂ＝２０。一部の実施形態では、ｆ＝９。一部の実施形態では、ｆ＝１０。一部の実施形態では、ｆ＝１１。一部の実施形態では、ｆ＝１２。一部の実施形態では、ｆ＝１３。一部の実施形態では、ｆ＝１４。一部の実施形態では、ｆ＝１５。一部の実施形態では、ｆ＝１６。一部の実施形態では、ｆ＝１７。一部の実施形態では、ｆ＝１８。一部の実施形態では、ｆ＝１９。一部の実施形態では、ｆ＝２０。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｓ１は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ１は、非存在である。一部の実施形態では、Ｓ２は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ２は、非存在である。一部の実施形態では、ｃ＝０。一部の実施形態では、ｃ＝１。一部の実施形態では、ｃ＝２。一部の実施形態では、ｃ＝３。一部の実施形態では、ｃ＝４。一部の実施形態では、ｃ＝５。一部の実施形態では、ｃ＝６。一部の実施形態では、ｃ＝７。一部の実施形態では、ｃ＝８。一部の実施形態では、ｃ＝９。一部の実施形態では、ｃ＝１０。一部の実施形態では、ｃ＝１１。一部の実施形態では、ｃ＝１２。一部の実施形態では、ｃ＝１３。一部の実施形態では、ｃ＝１４。一部の実施形態では、ｃ＝１５。一部の実施形態では、ｃ＝１６。一部の実施形態では、ｃ＝１７。一部の実施形態では、ｃ＝１８。一部の実施形態では、ｃ＝１９。一部の実施形態では、ｃ＝２０。一部の実施形態では、ｅ＝０。一部の実施形態では、ｅ＝１。一部の実施形態では、ｅ＝２。一部の実施形態では、ｅ＝３。一部の実施形態では、ｅ＝４。一部の実施形態では、ｅ＝５。一部の実施形態では、ｅ＝６。一部の実施形態では、ｅ＝７。一部の実施形態では、ｅ＝８。一部の実施形態では、ｅ＝９。一部の実施形態では、ｅ＝１０。一部の実施形態では、ｅ＝１１。一部の実施形態では、ｅ＝１２。一部の実施形態では、ｅ＝１３。一部の実施形態では、ｅ＝１４。一部の実施形態では、ｅ＝１５。一部の実施形態では、ｅ＝１６。一部の実施形態では、ｅ＝１７。一部の実施形態では、ｅ＝１８。一部の実施形態では、ｅ＝１９。一部の実施形態では、ｅ＝２０。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００７１】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、第１のイントロン配列および第１のエクソン配列を含み、第１のエクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第２の鎖が、第２のイントロン配列および第２のエクソン配列を含み、第２のエクソン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、
第１の鎖および第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｅ１］ａ−Ｘ１−［Ｐ１］ｂ−［Ｓ１］ｃ−［Ｂ１］ｄ−［Ｓ２］ｅ−［Ｂ２］ｆ−［Ｓ３］ｇ−［Ｐ２］ｈ−Ｘ２−［Ｅ２］ｉ−３’
（式中、
（ａ）存在する場合Ｂ１、およびＢ２は、各々、分岐点配列であり、Ｂ２は、ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含み、存在する場合Ｂ１を含む分岐点配列は、Ｂ２を含む分岐点配列に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、Ｂ１およびＢ２は、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ｄおよびｆは、その値がＢ１およびＢ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｄおよびｆ＝５〜７であり、
（ｂ）Ｐ１およびＰ２は、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を各々が含むポリピリミジントラクトであり、ｂおよびｈは、その値がＰ１およびＰ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂ＝９〜２０およびｈ＝９〜２０であり、Ｐ１およびＰ２を構成するヌクレオチド配列は、各々、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、Ｐ１は、Ｐ２に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｅ１およびＥ２は、各々、突然変異を修正するヌクレオチド配列を各々が含むエクソン配列であり、ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、ａおよびｉは、その値がＥ１およびＥ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、Ｅ１を含むエクソン配列は、Ｅ２を含むエクソン配列に対して、逆方向の配向であり、逆鎖上にあり、Ｅ１を構成するヌクレオチド配列とＥ２を構成するヌクレオチド配列は、相補的でなく、
（ｄ）Ｘ１およびＸ２各々は、３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列を含み、Ｘ１のヌクレオチド配列は、Ｘ２のヌクレオチド配列に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｅ）Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、いずれかが存在する場合、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｃ、ｅおよびｇは、各々、その値がデリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃ＝０または１〜２０およびｇ＝０または１〜２０であり、ｅ＝０または１〜４０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、Ｂ２、Ｐ２、Ｅ２およびＸ２が、センス鎖を構成し、Ｂ２、Ｐ２およびＸ２が、第１、第２および第３のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、Ｂ１、Ｐ１、Ｅ１およびＸ１が、センス鎖を構成し、Ｂ１、Ｐ１およびＸ１が、第１、第２および第３のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【００７２】
一部の実施形態では、Ｂ１は、存在する。一部の実施形態では、Ｂ１は、非存在である。一部の実施形態では、ｄ＝５。一部の実施形態では、ｄ＝６。一部の実施形態では、ｄ＝７。一部の実施形態では、ｆ＝５。一部の実施形態では、ｆ＝６。一部の実施形態では、ｆ＝７。一部の実施形態では、ｂ＝９。一部の実施形態では、ｂ＝１０。一部の実施形態では、ｂ＝１１。一部の実施形態では、ｂ＝１２。一部の実施形態では、ｂ＝１３。一部の実施形態では、ｂ＝１４。一部の実施形態では、ｂ＝１５。一部の実施形態では、ｂ＝１６。一部の実施形態では、ｂ＝１７。一部の実施形態では、ｂ＝１８。一部の実施形態では、ｂ＝１９。一部の実施形態では、ｂ＝２０。一部の実施形態では、ｈ＝９。一部の実施形態では、ｈ＝１０。一部の実施形態では、ｈ＝１１。一部の実施形態では、ｈ＝１２。一部の実施形態では、ｈ＝１３。一部の実施形態では、ｈ＝１４。一部の実施形態では、ｈ＝１５。一部の実施形態では、ｈ＝１６。一部の実施形態では、ｈ＝１７。一部の実施形態では、ｈ＝１８。一部の実施形態では、ｈ＝１９。一部の実施形態では、ｈ＝２０。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｓ１は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ１は、非存在である。一部の実施形態では、Ｓ２は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ２は、非存在である。一部の実施形態では、Ｓ３は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ３は、非存在である。一部の実施形態では、ｃ＝０。一部の実施形態では、ｃ＝１。一部の実施形態では、ｃ＝２。一部の実施形態では、ｃ＝３。一部の実施形態では、ｃ＝４。一部の実施形態では、ｃ＝５。一部の実施形態では、ｃ＝６。一部の実施形態では、ｃ＝７。一部の実施形態では、ｃ＝８。一部の実施形態では、ｃ＝９。一部の実施形態では、ｃ＝１０。一部の実施形態では、ｃ＝１１。一部の実施形態では、ｃ＝１２。一部の実施形態では、ｃ＝１３。一部の実施形態では、ｃ＝１４。一部の実施形態では、ｃ＝１５。一部の実施形態では、ｃ＝１６。一部の実施形態では、ｃ＝１７。一部の実施形態では、ｃ＝１８。一部の実施形態では、ｃ＝１９。一部の実施形態では、ｃ＝２０。一部の実施形態では、ｇ＝０。一部の実施形態では、ｇ＝１。一部の実施形態では、ｇ＝２。一部の実施形態では、ｇ＝３。一部の実施形態では、ｇ＝４。一部の実施形態では、ｇ＝５。一部の実施形態では、ｇ＝６。一部の実施形態では、ｇ＝７。一部の実施形態では、ｇ＝８。一部の実施形態では、ｇ＝９。一部の実施形態では、ｇ＝１０。一部の実施形態では、ｇ＝１１。一部の実施形態では、ｇ＝１２。一部の実施形態では、ｇ＝１３。一部の実施形態では、ｇ＝１４。一部の実施形態では、ｇ＝１５。一部の実施形態では、ｇ＝１６。一部の実施形態では、ｇ＝１７。一部の実施形態では、ｇ＝１８。一部の実施形態では、ｇ＝１９。一部の実施形態では、ｇ＝２０。一部の実施形態では、ｅ＝０。一部の実施形態では、ｅ＝１。一部の実施形態では、ｅ＝２。一部の実施形態では、ｅ＝３。一部の実施形態では、ｅ＝４。一部の実施形態では、ｅ＝５。一部の実施形態では、ｅ＝６。一部の実施形態では、ｅ＝７。一部の実施形態では、ｅ＝８。一部の実施形態では、ｅ＝９。一部の実施形態では、ｅ＝１０。一部の実施形態では、ｅ＝１１。一部の実施形態では、ｅ＝１２。一部の実施形態では、ｅ＝１３。一部の実施形態では、ｅ＝１４。一部の実施形態では、ｅ＝１５。一部の実施形態では、ｅ＝１６。一部の実施形態では、ｅ＝１７。一部の実施形態では、ｅ＝１８。一部の実施形態では、ｅ＝１９。一部の実施形態では、ｅ＝２０。一部の実施形態では、ｅ＝２１。一部の実施形態では、ｅ＝２２。一部の実施形態では、ｅ＝２３。一部の実施形態では、ｅ＝２４。一部の実施形態では、ｅ＝２５。一部の実施形態では、ｅ＝２６。一部の実施形態では、ｅ＝２７。一部の実施形態では、ｅ＝２８。一部の実施形態では、ｅ＝２９。一部の実施形態では、ｅ＝３０。一部の実施形態では、ｅ＝３１。一部の実施形態では、ｅ＝３２。一部の実施形態では、ｅ＝３３。一部の実施形態では、ｅ＝３４。一部の実施形態では、ｅ＝３５。一部の実施形態では、ｅ＝３６。一部の実施形態では、ｅ＝３７。一部の実施形態では、ｅ＝３８。一部の実施形態では、ｅ＝３９。一部の実施形態では、ｅ＝４０。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００７３】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、第１のイントロン配列および第１のエクソン配列を含み、第１のエクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第２の鎖が、第２のイントロン配列および第２のエクソン配列を含み、第２のエクソン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、
第１の鎖および第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｅ１］ａ−Ｘ１−［Ｐ１］ｂ−［Ｓ１］ｃ−［Ｂ１］ｄ−［Ｓ２］ｅ−［Ｂ２］ｆ−［Ｓ３］ｇ−［Ｐ２］ｈ−Ｘ２−［Ｅ２］ｉ−３’
（式中、
（ａ）存在する場合Ｂ１、およびＢ２は、各々、分岐点配列であり、Ｂ２は、ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含み、存在する場合Ｂ１を含む分岐点配列は、Ｂ２を含む分岐点配列に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、Ｂ１およびＢ２は、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ｄおよびｆは、その値がＢ１およびＢ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｄおよびｆ＝５〜７であり、
（ｂ）Ｐ１およびＰ２は、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を各々が含むポリピリミジントラクトであり、ｂおよびｈは、その値がＰ１およびＰ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂ＝９〜２０およびｈ＝９〜２０であり、Ｐ１およびＰ２を構成するヌクレオチド配列は、各々、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、Ｐ１は、Ｐ２に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｅ１およびＥ２は、各々、突然変異を修正するヌクレオチド配列を各々が含むエクソン配列であり、ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、ａおよびｉは、その値がＥ１およびＥ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、Ｅ１を含むエクソン配列は、Ｅ２を含むエクソン配列に対して、逆方向の配向であり、逆鎖上にあり、Ｅ１を構成するヌクレオチド配列とＥ２を構成するヌクレオチド配列は、相補的でなく、
（ｄ）Ｘ１およびＸ２各々は、３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列を含み、Ｘ１のヌクレオチド配列は、Ｘ２のヌクレオチド配列に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｅ）Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、いずれかが存在する場合、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｃ、ｅおよびｇは、各々、その値がデリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃ＝０または１〜２０およびｇ＝０または１〜２０であり、ｅ＝０または１〜４０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、Ｂ２、Ｐ２、Ｅ２およびＸ２が、センス鎖を構成し、Ｂ２、Ｐ２およびＸ２が、第１、第２および第３のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、Ｂ１、Ｐ１、Ｅ１およびＸ１が、センス鎖を構成し、Ｂ１、Ｐ１およびＸ１が、第１、第２および第３のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【００７４】
一部の実施形態では、Ｂ１は、存在する。一部の実施形態では、Ｂ１は、非存在である。一部の実施形態では、ｄ＝５。一部の実施形態では、ｄ＝６。一部の実施形態では、ｄ＝７。一部の実施形態では、ｆ＝５。一部の実施形態では、ｆ＝６。一部の実施形態では、ｆ＝７。一部の実施形態では、ｂ＝９。一部の実施形態では、ｂ＝１０。一部の実施形態では、ｂ＝１１。一部の実施形態では、ｂ＝１２。一部の実施形態では、ｂ＝１３。一部の実施形態では、ｂ＝１４。一部の実施形態では、ｂ＝１５。一部の実施形態では、ｂ＝１６。一部の実施形態では、ｂ＝１７。一部の実施形態では、ｂ＝１８。一部の実施形態では、ｂ＝１９。一部の実施形態では、ｂ＝２０。一部の実施形態では、ｈ＝９。一部の実施形態では、ｈ＝１０。一部の実施形態では、ｈ＝１１。一部の実施形態では、ｈ＝１２。一部の実施形態では、ｈ＝１３。一部の実施形態では、ｈ＝１４。一部の実施形態では、ｈ＝１５。一部の実施形態では、ｈ＝１６。一部の実施形態では、ｈ＝１７。一部の実施形態では、ｈ＝１８。一部の実施形態では、ｈ＝１９。一部の実施形態では、ｈ＝２０。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ１を構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約９０％〜１００％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｐ２を構成するヌクレオチド配列は、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｓ１は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ１は、非存在である。一部の実施形態では、Ｓ２は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ２は、非存在である。一部の実施形態では、Ｓ３は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ３は、非存在である。一部の実施形態では、ｃ＝０。一部の実施形態では、ｃ＝１。一部の実施形態では、ｃ＝２。一部の実施形態では、ｃ＝３。一部の実施形態では、ｃ＝４。一部の実施形態では、ｃ＝５。一部の実施形態では、ｃ＝６。一部の実施形態では、ｃ＝７。一部の実施形態では、ｃ＝８。一部の実施形態では、ｃ＝９。一部の実施形態では、ｃ＝１０。一部の実施形態では、ｃ＝１１。一部の実施形態では、ｃ＝１２。一部の実施形態では、ｃ＝１３。一部の実施形態では、ｃ＝１４。一部の実施形態では、ｃ＝１５。一部の実施形態では、ｃ＝１６。一部の実施形態では、ｃ＝１７。一部の実施形態では、ｃ＝１８。一部の実施形態では、ｃ＝１９。一部の実施形態では、ｃ＝２０。一部の実施形態では、ｇ＝０。一部の実施形態では、ｇ＝１。一部の実施形態では、ｇ＝２。一部の実施形態では、ｇ＝３。一部の実施形態では、ｇ＝４。一部の実施形態では、ｇ＝５。一部の実施形態では、ｇ＝６。一部の実施形態では、ｇ＝７。一部の実施形態では、ｇ＝８。一部の実施形態では、ｇ＝９。一部の実施形態では、ｇ＝１０。一部の実施形態では、ｇ＝１１。一部の実施形態では、ｇ＝１２。一部の実施形態では、ｇ＝１３。一部の実施形態では、ｇ＝１４。一部の実施形態では、ｇ＝１５。一部の実施形態では、ｇ＝１６。一部の実施形態では、ｇ＝１７。一部の実施形態では、ｇ＝１８。一部の実施形態では、ｇ＝１９。一部の実施形態では、ｇ＝２０。一部の実施形態では、ｅ＝０。一部の実施形態では、ｅ＝１。一部の実施形態では、ｅ＝２。一部の実施形態では、ｅ＝３。一部の実施形態では、ｅ＝４。一部の実施形態では、ｅ＝５。一部の実施形態では、ｅ＝６。一部の実施形態では、ｅ＝７。一部の実施形態では、ｅ＝８。一部の実施形態では、ｅ＝９。一部の実施形態では、ｅ＝１０。一部の実施形態では、ｅ＝１１。一部の実施形態では、ｅ＝１２。一部の実施形態では、ｅ＝１３。一部の実施形態では、ｅ＝１４。一部の実施形態では、ｅ＝１５。一部の実施形態では、ｅ＝１６。一部の実施形態では、ｅ＝１７。一部の実施形態では、ｅ＝１８。一部の実施形態では、ｅ＝１９。一部の実施形態では、ｅ＝２０。一部の実施形態では、ｅ＝２１。一部の実施形態では、ｅ＝２２。一部の実施形態では、ｅ＝２３。一部の実施形態では、ｅ＝２４。一部の実施形態では、ｅ＝２５。一部の実施形態では、ｅ＝２６。一部の実施形態では、ｅ＝２７。一部の実施形態では、ｅ＝２８。一部の実施形態では、ｅ＝２９。一部の実施形態では、ｅ＝３０。一部の実施形態では、ｅ＝３１。一部の実施形態では、ｅ＝３２。一部の実施形態では、ｅ＝３３。一部の実施形態では、ｅ＝３４。一部の実施形態では、ｅ＝３５。一部の実施形態では、ｅ＝３６。一部の実施形態では、ｅ＝３７。一部の実施形態では、ｅ＝３８。一部の実施形態では、ｅ＝３９。一部の実施形態では、ｅ＝４０。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００７５】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、第１のイントロン配列および第１のエクソン配列を含み、第１のエクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第２の鎖が、第２のイントロン配列および第２のエクソン配列を含み、第２のエクソン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、
第１の鎖および第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｅ１］ａ−Ｙ１−［Ｓ１］ｂ−Ｙ２−［Ｅ２］ｃ−３’
（式中、
（ａ）Ｅ１およびＥ２各々は、突然変異を修正するヌクレオチド配列を各々が含むエクソン配列であり、ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｔ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、ａおよびｃは、その値がＥ１およびＥ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、Ｅ１を含むエクソン配列は、Ｅ２を含むエクソン配列に対して、逆方向の配向であり、逆鎖上にあり、Ｅ１を構成するヌクレオチド配列とＥ２を構成するヌクレオチド配列は、相補的でなく、
（ｂ）Ｙ１およびＹ２各々は、５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列を含み、Ｙ１のヌクレオチド配列は、Ｙ２のヌクレオチド配列に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｓ１は、存在する場合、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｂは、その値がデリミター配列を構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂ＝０または１〜５０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、Ｅ２およびＹ２が、センス鎖を構成し、Ｅ２が、スプライシングシグナルを構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、Ｅ１およびＹ１が、センス鎖を構成し、Ｅ１が、スプライシングシグナルを構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【００７６】
一部の実施形態では、Ｓ１は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ１は、非存在である。一部の実施形態では、ｂ＝０。一部の実施形態では、ｂ＝１。一部の実施形態では、ｂ＝２。一部の実施形態では、ｂ＝３。一部の実施形態では、ｂ＝４。一部の実施形態では、ｂ＝５。一部の実施形態では、ｂ＝６。一部の実施形態では、ｂ＝７。一部の実施形態では、ｂ＝８。一部の実施形態では、ｂ＝９。一部の実施形態では、ｂ＝１０。一部の実施形態では、ｂ＝１１。一部の実施形態では、ｂ＝１２。一部の実施形態では、ｂ＝１３。一部の実施形態では、ｂ＝１４。一部の実施形態では、ｂ＝１５。一部の実施形態では、ｂ＝１６。一部の実施形態では、ｂ＝１７。一部の実施形態では、ｂ＝１８。一部の実施形態では、ｂ＝１９。一部の実施形態では、ｂ＝２０。一部の実施形態では、ｂ＝２１。一部の実施形態では、ｂ＝２２。一部の実施形態では、ｂ＝２３。一部の実施形態では、ｂ＝２４。一部の実施形態では、ｂ＝２５。一部の実施形態では、ｂ＝２６。一部の実施形態では、ｂ＝２７。一部の実施形態では、ｂ＝２８。一部の実施形態では、ｂ＝２９。一部の実施形態では、ｂ＝３０。一部の実施形態では、ｂ＝３１。一部の実施形態では、ｂ＝３２。一部の実施形態では、ｂ＝３３。一部の実施形態では、ｂ＝３４。一部の実施形態では、ｂ＝３５。一部の実施形態では、ｂ＝３６。一部の実施形態では、ｂ＝３７。一部の実施形態では、ｂ＝３８。一部の実施形態では、ｂ＝３９。一部の実施形態では、ｂ＝４０。一部の実施形態では、ｂ＝４１。一部の実施形態では、ｂ＝４２。一部の実施形態では、ｂ＝４３。一部の実施形態では、ｂ＝４４。一部の実施形態では、ｂ＝４５。一部の実施形態では、ｂ＝４６。一部の実施形態では、ｂ＝４７。一部の実施形態では、ｂ＝４８。一部の実施形態では、ｂ＝４９。一部の実施形態では、ｂ＝５０。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００、約１０〜３００、または約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。
【００７７】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、第１のイントロン配列および第１のエクソン配列を含み、第１のエクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第２の鎖が、第２のイントロン配列および第２のエクソン配列を含み、第２のエクソン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、
第１の鎖および第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｅ１］ａ−Ｙ１−［Ｓ１］ｂ−Ｙ２−［Ｅ２］ｃ−３’
（式中、
（ａ）Ｅ１およびＥ２各々は、突然変異を修正するヌクレオチド配列を各々が含むエクソン配列であり、ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｔ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、ａおよびｃは、その値がＥ１およびＥ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、Ｅ１を含むエクソン配列は、Ｅ２を含むエクソン配列に対して、逆方向の配向であり、逆鎖上にあり、Ｅ１を構成するヌクレオチド配列とＥ２を構成するヌクレオチド配列は、相補的でなく、
（ｂ）Ｙ１およびＹ２各々は、５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列を含み、Ｙ１のヌクレオチド配列は、Ｙ２のヌクレオチド配列に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｓ１は、存在する場合、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｂは、その値がデリミター配列を構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂ＝０または１〜５０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、Ｅ２およびＹ２が、センス鎖を構成し、Ｅ２が、スプライシングシグナルを構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、Ｅ１およびＹ１が、センス鎖を構成し、Ｅ１が、スプライシングシグナルを構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【００７８】
一部の実施形態では、Ｓ１は、存在する。一部の実施形態では、Ｓ１は、非存在である。一部の実施形態では、ｂ＝０。一部の実施形態では、ｂ＝１。一部の実施形態では、ｂ＝２。一部の実施形態では、ｂ＝３。一部の実施形態では、ｂ＝４。一部の実施形態では、ｂ＝５。一部の実施形態では、ｂ＝６。一部の実施形態では、ｂ＝７。一部の実施形態では、ｂ＝８。一部の実施形態では、ｂ＝９。一部の実施形態では、ｂ＝１０。一部の実施形態では、ｂ＝１１。一部の実施形態では、ｂ＝１２。一部の実施形態では、ｂ＝１３。一部の実施形態では、ｂ＝１４。一部の実施形態では、ｂ＝１５。一部の実施形態では、ｂ＝１６。一部の実施形態では、ｂ＝１７。一部の実施形態では、ｂ＝１８。一部の実施形態では、ｂ＝１９。一部の実施形態では、ｂ＝２０。一部の実施形態では、ｂ＝２１。一部の実施形態では、ｂ＝２２。一部の実施形態では、ｂ＝２３。一部の実施形態では、ｂ＝２４。一部の実施形態では、ｂ＝２５。一部の実施形態では、ｂ＝２６。一部の実施形態では、ｂ＝２７。一部の実施形態では、ｂ＝２８。一部の実施形態では、ｂ＝２９。一部の実施形態では、ｂ＝３０。一部の実施形態では、ｂ＝３１。一部の実施形態では、ｂ＝３２。一部の実施形態では、ｂ＝３３。一部の実施形態では、ｂ＝３４。一部の実施形態では、ｂ＝３５。一部の実施形態では、ｂ＝３６。一部の実施形態では、ｂ＝３７。一部の実施形態では、ｂ＝３８。一部の実施形態では、ｂ＝３９。一部の実施形態では、ｂ＝４０。一部の実施形態では、ｂ＝４１。一部の実施形態では、ｂ＝４２。一部の実施形態では、ｂ＝４３。一部の実施形態では、ｂ＝４４。一部の実施形態では、ｂ＝４５。一部の実施形態では、ｂ＝４６。一部の実施形態では、ｂ＝４７。一部の実施形態では、ｂ＝４８。一部の実施形態では、ｂ＝４９。一部の実施形態では、ｂ＝５０。
【００７９】
一部の実施形態では、センス鎖を構成するエクソン配列は、突然変異を修正する。一部の実施形態では、センス鎖を構成する３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列は、突然変異を修正する。一部の実施形態では、センス鎖を構成する５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列は、突然変異を修正する。一部の実施形態では、センス鎖を構成するポリピリミジントラクトを含むヌクレオチド配列は、突然変異を修正する。一部の実施形態では、センス鎖を構成する分岐点配列を含むヌクレオチド配列は、突然変異を修正する。
【００８０】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの最も５’側のヌクレオチドは、５’リン酸基を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜７０ヌクレオチドまたは約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４１ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４２ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４３ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４４ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４６ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４７ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４９ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４２ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５１ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５２ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５３ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５４ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５６ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５７ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５８ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５９ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ６０ヌクレオチドである。
【００８１】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、天然ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非天然および／または改変ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の非天然および／または改変ヌクレオチは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、１つまたは複数の骨格改変を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の骨格改変は、ホスホロチオエートである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、２つの平滑末端を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、１つの平滑末端を含み、オーバーハング（例えば、５’または３’オーバーハング）を含む１つの末端を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、部位特異的ヌクレアーゼによるドナーポリヌクレオチドの認識および切断を防止する１つまたは複数のヌクレオチドを含む。
【００８２】
一部の実施形態では、疾患は、糖原病１ａ型（ＧＳＤ１ａ）である。一部の実施形態では、突然変異は、ヒト第１７染色体ｑ２１上のヒトＧ６ＰＣ遺伝子に位置する。一部の実施形態では、Ｇ６ＰＣ遺伝子の突然変異は、ヒトＧ６ＰＣタンパク質におけるＲ８３Ｃ、Ｒ８３ＨまたはＥ１１０Ｋアミノ酸置換をもたらす。一部の実施形態では、Ｇ６ＰＣ遺伝子の突然変異は、ヒトＧ６ＰＣタンパク質におけるＲ８３Ｃアミノ酸置換をもたらす。一部の実施形態では、Ｇ６ＰＣ遺伝子の突然変異は、ヒトＧ６ＰＣタンパク質におけるＲ８３Ｈアミノ酸置換をもたらす。一部の実施形態では、Ｇ６ＰＣ遺伝子の突然変異は、ヒトＧ６ＰＣタンパク質におけるＥ１１０Ｋアミノ酸置換をもたらす。
【００８３】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の糖原病１ａ型の原因となる突然変異を修正するヌクレオチド配列を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、突然変異が、ヒト第１７染色体ｑ２１上のヒトＧ６ＰＣ遺伝子に位置し、アミノ酸置換Ｒ８３ＣまたはＲ８３Ｈをもたらし、ドナーポリヌクレオチドが、
（ｉ）突然変異を修正するエクソン配列を含むヌクレオチド配列であって、エクソン配列が、Ｇ６ＰＣ遺伝子の８３位のコドンに対応するアルギニン（Ｒ）をコードするコドンを含む、ヌクレオチド配列と、ゲノムＤＮＡ分子から転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含むヌクレオチド配列であって、１つまたは複数のスプライシングシグナルが、３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点配列との組合せである、ヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約４０〜７０ヌクレオチドであり、２つの平滑末端を含み、ドナーポリヌクレオチドの各鎖の最も５’側のヌクレオチドが、５’リン酸部分を含み、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、ドナーポリヌクレオチドの挿入は、ｇＤＮＡ中に突然変異を修正するエクソン配列を含むエクソンの形成をもたらし、スプライシングシグナルが、ｍＲＮＡへのエクソンの組入れを方向付け、それによって突然変異を修正する、
ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、分岐点配列は、ヌクレオチド配列ＴＴＣＡＴを含み、ポリピリミジントラクトは、ヌクレオチド配列ＣＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴを含み、３’スプライス部位は、ヌクレオチド配列ＴＡＧを含み、エクソン配列は、ヌクレオチド配列ＧＡＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＣＴＴＡＣＴを含む。
【００８４】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３０（ＣＨ３４  ５４−０）で示される。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号２０（ＣＨ３２  ５０−０）で示される。
【００８５】
一部の実施形態では、疾患は、ポンペ病である。一部の実施形態では、突然変異は、ヒト第１７染色体ｑ２５．３上のヒトグルコシダーゼアルファ（ＧＡＡ）遺伝子に位置する。一部の実施形態では、突然変異は、ＧＡＡのスプライシングシグナルにあり、この突然変異が、第２エクソンを欠いているＧＡＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写物、および／または１つもしくは複数の隠れたスプライス部位の活性化をもたらす。
【００８６】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のｇＤＮＡ分子のポンペ病の原因となる突然変異を修正するヌクレオチド配列を含む非複製型ｄｓＤＮＡ分子を含むドナーポリヌクレオチドであって、突然変異が、ＧＡＡのスプライシングシグナルにあり、この突然変異が、第２エクソンを欠いているＧＡＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写物、および／または１つもしくは複数の隠れたスプライス部位の活性化をもたらし、ドナーポリヌクレオチドが、
（ｉ）突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、第１の鎖が、第１のイントロン配列を含み、第１のイントロン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、１つまたは複数のスプライシングシグナルが、３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点配列との組合せを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）第２のイントロン配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、第２のイントロン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、１つまたは複数のスプライシングシグナルが、３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点配列との組合せを含む、第２の鎖と
を含み、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、２つの平滑末端を含み、ドナーポリヌクレオチドの各鎖の最も５’側のヌクレオチドが、５’リン酸部分を含み、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、ＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢ切断への双方向挿入用に構成されており、どちらの方向にせよ挿入により、３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと突然変異を修正する分岐点配列とが形成され、スプライシングシグナルが、ｍＲＮＡへの第２エクソンの組入れを方向付け、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【００８７】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号６３（ＧＡＡ＿５０−０）で示される。
【００８８】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正する系であって、以下の成分：
（ａ）上述のドナーポリヌクレオチドのいずれか１つ、
（ｂ）１つまたは複数のｇＲＮＡ分子、および
（ｃ）部位特異的ヌクレアーゼ
を含み、
系が細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、系を提供する。一部の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡによりコードされる。一部の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、ポリペプチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のｇＲＮＡ分子、および部位特異的ヌクレアーゼは、リボ核タンパク質を含む。一部の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）またはそのホモログ、誘導体もしくは改変バージョンである。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）またはそのホモログ、誘導体もしくは改変バージョンである。
【００８９】
一部の実施形態では、１つまたは複数のｇＲＮＡ分子は、骨格改変、糖改変、改変ヌクレオシド間結合、または改変もしくは非天然核酸塩基からなる群から選択される改変を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のｇＲＮＡ分子は、骨格改変を含む。一部の実施形態では、骨格改変は、ホスホロチオエート改変を含む。
【００９０】
本開示により提供される系についての一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、ｇＲＮＡ分子および部位特異的ヌクレアーゼは、リポソームまたは脂質ナノ粒子で個々に製剤化または共製剤化される。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、ｇＲＮＡ分子および部位特異的ヌクレアーゼは、リポソームまたは脂質ナノ粒子で個々に製剤化される。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、ｇＲＮＡ分子および部位特異的ヌクレアーゼは、リポソームまたは脂質ナノ粒子で共製剤化される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１０７（ＣＨ３２  突然変異型ＣＴＸ１  ｓｇＲＮＡスペーサー）で示される配列を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１０８（ＣＨ３４  突然変異型ＣＴＸ１  ｓｇＲＮＡスペーサー）で示される配列を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１２７（突然変異型ＧＡＡ  ｓｇＲＮＡスペーサー）で示される配列を含む。
【００９１】
一部の実施形態では、本開示は、上述のドナーポリヌクレオチドまたは系のいずれか１つを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、分裂または非分裂細胞である。一部の実施形態では、細胞は、分裂細胞である。一部の実施形態では、細胞は、非分裂細胞である。一部の実施形態では、細胞は、患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。一部の実施形態では、細胞は、初代肝細胞である。
【００９２】
一部の態様では、本開示は、上述のドナーポリヌクレオチドのいずれか１つと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、上述の系のいずれか１つと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、上述の細胞のいずれか１つと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００９３】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正することによる疾患を有する患者の処置に使用するための上述のドナーポリヌクレオチド、系または医薬組成物のいずれか１つであって、処置が、患者から細胞を単離するステップ、細胞をドナーポリヌクレオチド、系または医薬組成物と接触させるステップを含み、ドナーポリヌクレオチド、系または医薬組成物が細胞と接触したとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、ｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断に挿入し、それによって突然変異を修正する、上述のドナーポリヌクレオチド、系または医薬組成物のいずれか１つを提供する。
【００９４】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正することによる疾患を有する患者の処置に使用するための上述のドナーポリヌクレオチド、系または医薬組成物のいずれか１つであって、処置が、ドナーポリヌクレオチド、系または医薬組成物の有効量を患者に投与するステップを含み、ドナーポリヌクレオチド、系または組成物が投与されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、ｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断に挿入し、それによって突然変異を修正する、上述のドナーポリヌクレオチド、系または医薬組成物のいずれか１つを提供する。
【００９５】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正する方法であって、細胞を、上述のドナーポリヌクレオチド、系または医薬組成物のいずれか１つと接触させるステップを含み、ドナーポリヌクレオチド、系または組成物が細胞と接触したとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、ｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断に挿入し、それによって突然変異を修正する、方法を提供する。
【００９６】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正することにより疾患を有する患者を処置する方法であって、患者から細胞を単離するステップ、細胞を、上述のドナーポリヌクレオチド、系または医薬組成物のいずれか１つと接触させるステップを含み、ドナーポリヌクレオチド、系または組成物が細胞と接触したとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、ｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断に挿入し、それによって突然変異を修正する、方法を提供する。
【００９７】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正することにより疾患を有する患者を処置する方法であって、上述のドナーポリヌクレオチド、系または医薬組成物のいずれか１つの有効量を患者に投与するステップを含み、ドナーポリヌクレオチド、系または組成物が投与されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、ｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断に挿入し、それによって突然変異を修正する、方法を提供する。（ｉｎ  ｖｉｖｏ）。
【００９８】
本開示により提供される方法についての一部の実施形態では、細胞は、患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。一部の実施形態では、細胞は、肝細胞である。本開示により提供される方法についての一部の実施形態では、方法は、修正された突然変異を含むｉＰＳＣを分化させて分化した細胞にするステップ、および分化した細胞を患者に移植するステップをさらに含む。
【００９９】
本開示により提供される方法についての一部の実施形態では、処置は、挿入されたドナーポリヌクレオチドを含むゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）から転写されたｍＲＮＡの翻訳をもたらし、この翻訳は、疾患を緩和する、または疾患の原因にも一因にもならない、翻訳産物（タンパク質）の形成をもたらす。
【０１００】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正するための、上述のドナーポリヌクレオチド、系または医薬組成物のいずれか１つを含む容器と、使用説明書を含む添付文書とを含む、キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、標的核酸の内在性遺伝子座およびドナーポリヌクレオチドの挿入後の遺伝子座を示す概略図を提供する。スプライスシグナル、スプライス部位、イントロンおよびエクソンの相対位置が示されている。
【０１０２】
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により判定したときの標的遺伝子（Ｇ６ＰＣ第２エクソン）へのドナーポリヌクレオチドのＮＨＥＪ媒介挿入を示す、ドナーポリヌクレオチドによりコードされる特異的ヌクレオチド変化（例えば、修正的編集）に対応する全シークエンシングリードのパーセンテージを示すドットプロットを提供する。図２Ａ〜２Ｃは、３つの異なるｇＲＮＡにより誘導されたＧ６ＰＣ第２エクソンゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）遺伝子座におけるＤＳＢの修正的編集のパーセンテージを示す。
【０１０３】
【図３】図３は、Ｇ６ＰＣ第２エクソンｇＤＮＡ遺伝子座（ＤＮＡ）のＣＨ３４  ｓｇＲＮＡ標的部位へのドナーポリヌクレオチドのＮＨＥＪ媒介挿入の結果として生じる修正的編集のパーセンテージを示す折れ線グラフを提供する。追加のスプライシングシグナルとＯＲＦのヌクレオチド変化とを含有するドナーポリヌクレオチドの挿入は、Ｇ６ＰＣ  ＤＮＡの修正的編集をもたらし（黒色の線）、所望の予測編集を含有するｍＲＮＡを生じさせるＧ６ＰＣ遺伝子の転写ももたらす（灰色の線）。修正的編集レベルが、使用されるドナーポリヌクレオチドの量（ドナーのｎｇ）の関数であることも、示されている。
【０１０４】
【図４】図４Ａは、ドナーポリヌクレオチドとｍＲＮＡコードＣａｓ９とＧ６ＰＣ標的化ｇＲＮＡとを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で処置されたマウスの肝臓細胞のＧ６ＰＣ第２エクソンｇＤＮＡ遺伝子座へのドナーポリヌクレオチドのＮＨＥＪ媒介挿入の結果として生じる修正的編集に対応する全シークエンシングリードのパーセンテージを示すドットプロットを提供する。図４Ｂは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡとドナーポリヌクレオチドとＧ６ＰＣ標的化ｇＲＮＡとを含むＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後のドナーポリヌクレオチドの完全ＮＨＥＪ媒介挿入の結果として生じるｇＤＮＡおよび転写ｍＲＮＡの修正的編集のパーセンテージを示すドットプロットを提供する。
【０１０５】
【図５】図５は、双方向性ドナーポリヌクレオチドの設計を記載する概略図を提供する。ドナーは、順方向または逆方向のどちらかの方向でＤＮＡ  ＤＳＢに挿入されたときにスプライシング配列を組み込むように設計されている。
【０１０６】
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、ＧＡＡ遺伝子への挿入のための双方向性ドナーポリヌクレオチドの設計を記載する概略図を提供する。図６Ａは、ｄｓＯＤＮドナーポリヌクレオチドのセンスおよびアンチセンス鎖におけるスプライシングシグナルを示す。図６Ｂは、ｄｓＯＤＮドナーが、ＧＡＡ切断部位に順方向または逆方向のどちらで挿入されるかを問わない所望のスプライシングシグナルの挿入を示す。
【０１０７】
【図７】図７Ａおよび図７Ｃは、Ｇ６ＰＣ（図７Ａ）またはＧＡＡ遺伝子（図７Ｃ）において誘導されたＤＳＢに順方向で挿入されたときの、修正的編集をコードする一方向性ドナーポリヌクレオチドで処理された細胞における修正的編集のパーセンテージを示す棒グラフを提供する。図７Ｂおよび図７Ｄは、Ｇ６ＰＣ（図７Ｂ）またはＧＡＡ遺伝子（図７Ｄ）において誘導されたＤＳＢに順方向または逆方向のどちらかで挿入されたときの、修正的編集をコードする双方向性ドナーポリヌクレオチドで処理された細胞における修正的編集のパーセンテージを示す棒グラフを提供する。
【０１０８】
【図８】図８は、初代ヒト肝細胞のＧＡＡ遺伝子において誘導されたＤＳＢへの５０ｎｔ双方向性ドナーの挿入の結果として生じる修正的編集のパーセンテージを示す棒グラフを提供する。ドナーの完全順方向挿入、完全逆方向挿入、および併せた総合的な完全挿入の結果として得た全配列リードのパーセンテージが示されている。
【０１０９】
【図９】図９は、Ｈｕｈ−７細胞のＧＡＡ遺伝子において誘導されたＤＳＢへの多様な長さの双方向性ドナーの挿入の結果として生じる修正的編集のパーセンテージを示す折れ線グラフを提供する。順方向での挿入（例えば、完全挿入）または逆方向での挿入（例えば、完全逆位挿入）ばかりでなく総合的な挿入の結果として生じる修正的編集のパーセンテージが示されている。
【０１１０】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、ポンペ病を有する患者に由来する線維芽細胞のＧＡＡ遺伝子において誘導されたＤＳＢへの双方向性ドナーの挿入の結果として生じる修正的編集のパーセンテージを示す棒グラフを提供する。図１０Ａには、ＮＧＳにより判定して、ドナーポリヌクレオチドによりコードされる修正的編集を有するｇＤＮＡの配列リードのパーセンテージが示されている。図１０Ｂには、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により判定して、第２エクソンを欠いているｍＲＮＡ転写物の量に対して正規化された第２エクソンをコードするｍＲＮＡ転写物の定量化が示されている。図１０Ｃには、ＮＧＳにより判定して、模擬トランスフェクト細胞と比較した、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡがトランスフェクトされ、ドナーポリヌクレオチドがトランスフェクトされたかまたはされていない細胞における第２エクソンをコードする配列リードの数の増加パーセントが示されている。
【発明を実施するための形態】
【０１１１】
ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復の主要経路は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路および相同組換え修復（ＨＤＲ）経路（例えば、相同組換えまたはＨＲとしても公知）である。部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）を使用して標的遺伝子において部位特異的ＤＳＢを誘導することにより、相同ドナーポリヌクレオチドを鋳型として使用してＨＤＲ修復により遺伝子編集を導入することができる。しかし、ＨＤＲ修復は、特に非分裂細胞では、非効率的である。したがって、ＮＨＥＪ修復を使用してドナーポリヌクレオチドにより提供される所望の遺伝子編集を誘導する方法は、非分裂細胞と分裂細胞両方の編集に有利である。本開示は、ＮＨＥＪ修復経路を使用して部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）により標的遺伝子において誘導されたＤＳＢに挿入するドナーポリヌクレオチドの設計に、少なくとも一部は基づく。ドナーポリヌクレオチドは、異常なタンパク質産生または機能をもたらす、エクソン内に位置する病因突然変異（例えば、タンパク質コード突然変異）とイントロン内に位置する病因突然変異（例えば、スプライシングシグナル突然変異）の両方を修正するための、標的遺伝子ＤＳＢへのＮＨＥＪ媒介挿入のために設計される。したがって、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）のヌクレオチド配列の所望の変更を提供し、および／またはエクソン定義をモジュレートし、それによって、編集されたｇＤＮＡから転写されるＲＮＡ転写物（例えば、プレｍＲＮＡ）に所望の変更が組み入れられる結果となる、ドナーポリヌクレオチドを含む方法および組成物が、本明細書で提供される。
ゲノム編集
【０１１２】
ゲノム編集は、ゲノムのヌクレオチド配列を、好ましくは正確な、望ましいおよび／または所定の方法で、編集するまたは変化させるプロセスを一般に指す。本明細書に記載されるゲノム編集の組成物、系および方法の例は、ゲノム内の正確な標的位置でＤＮＡを切断する（ｃｕｔ）または切断する（ｃｌｅａｖｅ）ことによってＤＮＡに二本鎖切断（ｂｒｅａｋ）（ＤＳＢ）を生じさせるために、部位特異的ヌクレアーゼを使用する。そのような切断は、相同組換え修復（ＨＤＲ）および／または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復などの、内在性ＤＮＡ修復経路により修復され得る（例えば、Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１  （２）：１２１−３１を参照されたい）。非分裂細胞における効率的ゲノム編集の大きな障害の１つは、相同組換え修復（ＨＤＲ）の欠如である。ＨＤＲのない非分裂細胞は、ゲノム内で起こる二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するために非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に依拠する。ＤＳＢのＮＨＥＪ媒介ＤＮＡ修復の結果は、ＤＳＢの的確な修復を含むこともあり、または１つもしくは複数のヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの欠失もしくは挿入を含むこともある。
ドナーポリヌクレオチド
【０１１３】
ヒトにおけるエクソン定義は、イントロンにわたってではなくエクソンにわたって対合されるスプライス部位により決定される。分岐点配列、ポリピリミジントラクト、ならびにエクソンおよびイントロンスプライシングエンハンサーおよびサイレンサーを含むがこれらに限定されない、他のスプライシングシグナルもまた、成熟ｍＲＮＡを形成するためのエクソン同士の適切なスプライシングに寄与する。プレｍＲＮＡスプライシング中に、スプライシング機構は、エクソンの方向性（すなわち、上流に３’スプライス部位および下流に５’スプライス部位）で一対の近接スプライス部位について検索する（Ｂｅｒｇｅｔ  （１９９５）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：２４１１−２４１４）。
【０１１４】
したがって、本開示は、ＤＳＢへの挿入時に、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）の突然変異を修正または誘導するドナーポリヌクレオチドであって、スプライシング機構が、一部はエクソン定義のモジュレーションにより、転写産物（例えば、プレｍＲＮＡ）に修正された突然変異を組み込む（または突然変異を誘導する）ことを可能にする、スプライシングシグナル（例えば、１つまたは複数のスプライシングシグナル）を含む、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドは、部位特異的ヌクレアーゼにより標的核酸に導入された二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するために細胞のＮＨＥＪ機構により認識および使用され、このＤＳＢの修復によって、ドナーポリヌクレオチドは標的核酸に挿入されることになる。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＳＢへの一方向挿入用に構成される。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＳＢへの双方向挿入用に構成される。
一方向性ドナーポリヌクレオチド
【０１１５】
一部の実施形態では、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドは、細胞内のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子の突然変異を修正または誘導するヌクレオチド配列と、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含むヌクレオチド配列とを含む、直鎖状の非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）であって、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、直鎖状の非複製型ｄｓＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、第１および第２のＤＮＡ鎖から構成され、第２のＤＮＡ鎖は、第１のＤＮＡ鎖に相補的であるヌクレオチド配列を含む。
【０１１６】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、突然変異を修正または誘導するヌクレオチド配列を含み、突然変異を修正または誘導するヌクレオチド配列は、単一のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、突然変異を修正または誘導するヌクレオチド配列は、２つまたはそれより多くのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、突然変異を修正または誘導するヌクレオチド配列は、コドンを含む。一部の実施形態では、突然変異を修正または誘導するヌクレオチド配列は、１つまたは複数のコドンを含む。一部の実施形態では、突然変異を修正または誘導するヌクレオチド配列は、エクソン配列を構成する。
【０１１７】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、突然変異を修正または誘導するヌクレオチド配列を含み、突然変異を修正または誘導するヌクレオチド配列は、イントロン配列を構成する。一部の実施形態では、突然変異を修正または誘導するヌクレオチド配列は、スプライシングシグナルを構成する。
【０１１８】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド配列は、標的核酸の内在性配列と同一であるか、または実質的に同一である（少なくとも１つのヌクレオチド相違を有する）。一部の実施形態では、内在性配列は、細胞のゲノム配列を含む。一部の実施形態では、内在性配列は、染色体配列または染色体外配列を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド配列は、細胞内のＤＳＢにあるかまたはその付近にある内在性配列の一部分と実質的に同一である（少なくとも１つのヌクレオチド相違／変化を含む）配列を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドでの標的核酸分子の修復は、標的核酸分子の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換をもたらす。一部の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質の１つまたは複数のアミノ酸変化をもたらす。一部の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換は、標的遺伝子から発現されるＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチド変化をもたらす。一部の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換は、標的遺伝子の発現レベルを変更する。一部の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換は、標的遺伝子の発現の増加または減少をもたらす。一部の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換は、遺伝子ノックダウンをもたらす。一部の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換は、遺伝子ノックアウトをもたらす。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドでの標的核酸分子の修復によって、エクソン配列、イントロン配列、転写制御配列、翻訳制御配列、スプライシングシグナルを構成する配列、または標的遺伝子の非コード配列が置き換えられることになる。
【０１１９】
ドナーポリヌクレオチドは、ｇＤＮＡの突然変異を修正または誘導するのに適した長さのものである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００またはそれを超えるヌクレオチドを含む。一部の実施形態（例えば、非相同末端結合により媒介される挿入のような、切断された核酸にドナーポリヌクレオチドが組み込まれる本明細書に記載のもの）では、ドナーポリヌクレオチドは、相同アームを有さない。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約２０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約３０〜７０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４６、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４１ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４２ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４３ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４４ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４６ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４７ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４８ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ４９ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５１ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５２ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５３ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５４ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５６ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５７ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５８ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ５９ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さ６０ヌクレオチドである。
【０１２０】
一部の実施形態では、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドは、イントロン配列を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ｇＤＮＡの突然変異を修正または誘導するイントロン配列を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、エクソン配列を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ｇＤＮＡの突然変異を修正または誘導するエクソン配列を含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドは、ドナーポリヌクレオチドが挿入されるｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシング（例えば、スプライシング）を制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む。
【０１２２】
一部の実施形態では、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドは、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシング（例えば、スプライシング）を制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、
（ａ）天然のまたは増強された３’スプライス部位、
（ｂ）天然のまたは増強された５’スプライス部位、
（ｃ）ポリピリミジントラクト、
（ｄ）分岐点、
（ｅ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｆ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｇ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｈ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択される。
【０１２３】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、天然のまたは増強された３’スプライス部位を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、天然に存在する３’スプライス部位を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、増強された３’スプライス部位を含む。天然の３’スプライス部位は、天然に存在する３’スプライス部位である。一部の実施形態では、天然の３’スプライス部位のヌクレオチド配列は、ドナーポリヌクレオチド挿入部位にあるかまたはその付近にある３’スプライス部位のヌクレオチド配列と同一であるか、または実質的に同一である（少なくとも１つのヌクレオチド相違を有する）。増強された３’スプライス部位は、３’スプライス部位のコンセンサス配列と同一であるかまたは実質的に同一である（少なくとも１つのヌクレオチド相違を有する）ヌクレオチド配列を含むスプライス部位である。３’スプライス部位のコンセンサス配列は、ヌクレオチド配列ＹＡＧであり、この式中のＹは、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチドである。例えば、Ｒｅｅｄ  （１９８９）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ３（１２Ｂ）：２１１３−２１２３を参照されたく、これは、哺乳動物における３’スプライス部位配列の構成をさらに説明している。
【０１２４】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、天然のまたは増強された５’スプライス部位を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、天然の５’スプライス部位を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、増強された５’スプライス部位を含む。一部の実施形態では、天然の５’スプライス部位は、天然に存在する５’スプライス部位である。一部の実施形態では、天然の５’スプライス部位のヌクレオチド配列は、ドナーポリヌクレオチド挿入部位にあるかまたはその付近にある５’スプライス部位のヌクレオチド配列と同一であるか、または実質的に同一である（少なくとも１つのヌクレオチド相違を有する）。一部の実施形態では、増強された５’スプライス部位は、５’スプライス部位のコンセンサス配列と同一であるかまたは実質的に同一である（少なくとも１つのヌクレオチド相違を有する）ヌクレオチド配列を含むスプライス部位である。５’スプライス部位のコンセンサス配列は、ヌクレオチド配列ＧＴＲＡＧであり、この式中のＲは、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチドである。
【０１２５】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ポリピリミジントラクトを含む。ポリピリミジントラクトは、プレｍＲＮＡスプライシングの際にイントロン除去を方向付けるシス作用性配列エレメントである。ポリピリミジントラクトの漸進的欠失は、的確なラリアット形成、スプライソソーム構築およびスプライシングを消失させることが判明している。研究により、連続するウリジンを含有するピリミジントラクトが強力なピリミジントラクトであることが示されている（Ｃｏｏｌｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５（４）：８８８−８９６）。一部の実施形態では、ポリピリミジントラクトは、長さ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリピリミジントラクトは、長さ１６ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリピリミジントラクトは、長さ１３ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリピリミジントラクトは、ヌクレオチド配列ＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴ（配列番号５４）を含む。一部の実施形態では、ポリピリミジントラクトは、長さ９ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリピリミジントラクトは、ヌクレオチド配列ＴＴＴＴＴＴＴＣＴ（配列番号５３）を含む。
【０１２６】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、分岐点を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、分岐点を含むヌクレオチド配列を含む。高等真核生物では、プレｍＲＮＡスプライシングは、分岐点配列（ＢＰＳ）と、ポリピリミジントラクト（ＰＰＴ）と、５’および３’スプライス部位と、エクソン／イントロンスプライシングエンハンサー／サイレンサーとから構成されている、縮重性スプライシングシスエレメントにより媒介され、プレｍＲＮＡは、スプライソソームにより媒介される２つの逐次的トランスエステル化反応でスプライシングされる。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、分岐点コンセンサス配列と同一であるかまたは実質的に同一である（少なくとも１つのヌクレオチド相違を有する）ヌクレオチド配列を含む分岐点を含む。一部の実施形態では、分岐点コンセンサス配列は、ＹＴＮＡＹ（式中、Ｙ＝ＣまたはＴ、およびＮ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）（配列番号４９）である。一部の実施形態では、分岐点配列は、ＴＡＴＴＡＡＣ（配列番号５０）である。一部の実施形態では、分岐点配列は、ＧＴＴＡＡＴＡ（配列番号５１）である。一部の実施形態では、分岐点配列は、ＴＡＣＴＧＡＣ（配列番号５２）である。
【０１２７】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）（例えば、Ｂｌｅｎｃｏｗｅ  （２０００）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２５（３）：１０６−１１０を参照されたい）を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２３（１）：６１−７０を参照されたい）を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１２）  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９（１０）：１０４４−１０５２を参照されたい）を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）（例えば、Ｃａｒｓｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０（１９）：７３８８−７４００を参照されたい）を含む。
【０１２８】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、天然のまたは増強された３’スプライス部位とポリピリミジントラクトとを含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、天然のまたは増強された３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点とを含む。
【０１２９】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）天然のまたは増強された３’スプライス部位、
（ｂ）ポリピリミジントラクト、
（ｃ）分岐点、
（ｄ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｅ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｆ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｇ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択され、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【０１３０】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、５’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）天然のまたは増強された５’スプライス部位、
（ｂ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｃ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｄ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｅ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択され、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【０１３１】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、少なくとも１つのスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された３’スプライス部位である、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【０１３２】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、１つまたは複数のスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された３’スプライス部位とポリピリミジントラクトとの組合せである、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【０１３３】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、１つまたは複数のスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点との組合せである、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【０１３４】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位にあり、第１の鎖が、イントロン配列、必要に応じて、エクソン配列を含み、イントロン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）ポリピリミジントラクト、
（ｂ）分岐点、
（ｃ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｄ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｅ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｆ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択され、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【０１３５】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、５’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、ドナーポリヌクレオチドが、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、少なくとも１つのスプライシングシグナルが、天然のまたは増強された５’スプライス部位である、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【０１３６】
一部の実施形態では、ＤＳＢへのドナーポリヌクレオチドの挿入は、ｇＤＮＡ中にエクソン配列を含むエクソンの形成をもたらす。一部の実施形態では、１つまたは複数のスプライシングシグナルは、エクソン配列を含むエクソンのｍＲＮＡへの組入れを方向付ける。
【０１３７】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、５’スプライス部位にあり、第１の鎖が、イントロン配列、必要に応じて、エクソン配列を含み、イントロン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、
１つまたは複数のスプライシングシグナルが、
（ａ）エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、
（ｂ）イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、
（ｃ）エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、
（ｄ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択され、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【０１３８】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの挿入は、イントロン配列を含むイントロンの形成をもたらし、イントロン配列が、突然変異を修正する。
【０１３９】
一部の実施形態では、本開示は、第１の鎖と第２の鎖とを含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、第１の鎖が、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を５’から３’に含み、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、第１の鎖が、式：
５’−［Ｂ］ａ−［Ｓ１］ｂ−［Ｐ］ｃ−［Ｓ２］ｄ−Ｘ−Ｅ−３’
（式中、
（ｉ）Ｂは、存在する場合、ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含む分岐点配列であり、Ｂは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ａは、その値がＢを構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ａ＝０または５〜７であり、
（ｉｉ）Ｐは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含むポリピリミジントラクトであり、ｃは、その値がＰを構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃ＝９〜２０であり、Ｐを構成するヌクレオチド配列は、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、
（ｉｉｉ）Ｅは、突然変異を修正するヌクレオチド配列を含むエクソン配列であり、ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、
（ｉｖ）Ｘは、３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列であり、
（ｖ）Ｓ１およびＳ２は、どちらかが存在する場合、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｂおよびｄは、各々、その値がデリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂおよびｄ＝０〜２０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への定方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに挿入されたとき、存在する場合Ｂ、Ｐ、存在する場合Ｘ、および存在する場合Ｅが、センス鎖を構成し、存在する場合Ｂ、Ｐ、および存在する場合Ｘが、１つまたは複数のスプライシングシグナルを構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【０１４０】
一部の実施形態では、本開示は、第１の鎖と第２の鎖とを含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、第１の鎖が、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を５’から３’に含み、病因突然変異が、５’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、イントロン配列およびエクソン配列を含み、エクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、
第１の鎖が、式：
５’−Ｅ−Ｙ−Ｉ−３’
（式中、
（ｉ）Ｅは、突然変異を修正するヌクレオチド配列を含むエクソン配列であり、ヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、
（ｉｉ）Ｙは、５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列であり、
（ｉｉｉ）Ｉは、存在する場合、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチドを含むイントロン配列を構成する）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への定方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドがＤＳＢに挿入されたとき、存在する場合Ｅ、Ｙ、および存在する場合Ｉが、センス鎖を構成し、Ｙが、１つまたは複数のスプライシングシグナルを構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
双方向性ドナーポリヌクレオチド
【０１４１】
一部の実施形態では、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドは、２つの遊離ＤＮＡ末端を含む直鎖状ｄｓＤＮＡ分子である。しかるが故に、細胞のＮＨＥＪ機構によるＤＳＢへのドナーポリヌクレオチドの挿入は、順方向および逆方向である２つの配向のうちの一方で起こり得る。したがって、一部の態様では、本開示は、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡに導入されたＤＳＢへの双方向挿入用に構成されているドナーポリヌクレオチドであって、ドナーポリヌクレオチドが、どちらかの配向でＤＳＢに挿入されたとき、細胞内のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子の突然変異を修正または誘導し、１つまたは複数のスプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【０１４２】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、分岐点配列を含む第１のスプライシングシグナルを含み、ドナーポリヌクレオチドは、
（ｉ）第１の分岐点配列を含むヌクレオチド配列とｇＤＮＡの突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第１の鎖と、
（ｉｉ）第２の分岐点配列を含むヌクレオチド配列とｇＤＮＡの突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第２の鎖と
を含み、第２の鎖は、第１の鎖に相補的であり、
ドナーポリヌクレオチドは、約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００であり、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、第１の分岐点配列および第２の分岐点配列のヌクレオチド配列は、分岐点コンセンサス配列と一致し、第１の分岐点配列のヌクレオチド配列と第２の分岐点配列のヌクレオチド配列は、相補的である。一部の実施形態では、分岐点コンセンサス配列は、ＹＴＮＡＹ（配列番号４９）（式中、Ｙは、シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）核酸塩基のどちらかを含むヌクレオチドであり、Ｎは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチドである）である。一部の実施形態では、第１の分岐点配列は、ＴＡＴＴＡＡＣ（配列番号５０）である。一部の実施形態では、第２の分岐点配列は、ＧＴＴＡＡＴＡ（配列番号５１）である。一部の実施形態では、第２の分岐点配列は、ＴＡＣＴＧＡＣ（配列番号５２）である。
【０１４３】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ポリピリミジントラクトを含む第２のスプライシングシグナルを含み、第１の鎖は、第１の分岐点配列の下流に位置する第１のポリピリミジントラクトを含み、第２の鎖は、第２の分岐点配列の下流に位置する第２のポリピリミジントラクトを含む。
【０１４４】
一部の実施形態では、第１および第２のポリピリミジントラクトを含むヌクレオチド配列は各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含み、ヌクレオチド配列は、約１００％、約９０％〜１００％、または約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基である。一部の実施形態では、ポリピリミジントラクトを含むヌクレオチド配列は、ＴＴＴＴＴＴＴＣＴ（配列番号５３）である。一部の実施形態では、ポリピリミジントラクトを含むヌクレオチド配列は、ＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴ（配列番号５４）である。一部の実施形態では、ポリピリミジントラクトを含むヌクレオチド配列は、ＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣ（配列番号５５）である。
【０１４５】
一部の実施形態では、第１の分岐点配列および第１のポリピリミジントラクトは、互いに隣接している。一部の実施形態では、第２の分岐点配列および第２のポリピリミジントラクトは、互いに隣接している。
【０１４６】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、３’スプライス部位を含む第３のスプライシングシグナルを含み、第１の鎖は、第１のポリピリミジントラクトの下流に位置する第１の３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列を含み、第２の鎖は、第２のポリピリミジントラクトの下流に位置する第２の３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１および第２の３’スプライス部位は、ヌクレオチド配列ＹＡＧを含み、この式中のＹは、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチドである。
【０１４７】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、コード配列を含み、第１の鎖は、第１のコード配列を含み、第２の鎖は、第２のコード配列を含み、ｇＤＮＡの突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列は、第１のコード配列を構成し、ｇＤＮＡの突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列は、第２のコード配列を構成し、第１のコード配列は、第１の３’スプライス部位の下流に位置し、第２のコード配列は、第２の３’スプライス部位の下流に位置する。一部の実施形態では、第１および第２のコード配列を含むヌクレオチド配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む。一部の実施形態では、（ｉ）および（ｉｉ）を含むコード配列および／またはスプライシングシグナルは、自己アニーリングを低減させるために同一でも、相補的でもない。
【０１４８】
一部の実施形態では、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含む１つまたは複数のデリミター配列を含み、ヌクレオチド配列は、長さ約１〜４０、約１〜３０、約１〜２０、約１〜１５、約１〜１０、約３０、約２０、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２または１ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列は、第１の分岐点配列と第２の分岐点配列の間に位置する。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列は、第１の分岐点配列と第１のポリピリミジントラクトの間に位置する。一部の実施形態では、１つまたは複数のデリミター配列は、第２の分岐点と第２のポリピリミジントラクトの間に位置する。
【０１４９】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡに導入されたＤＳＢへの双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、どちらかの配向でＤＳＢに挿入されたとき、第１のスプライシングシグナルおよび第２のスプライシングシグナル、必要に応じて、第３のスプライシングおよびコード配列が、センス鎖を構成し、それによって、突然変異を修正し、１つまたは複数のスプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御する。
【０１５０】
一部の実施形態では、本開示は、５’スプライス部位を含む１つまたは複数のスプライシングシグナルを含むドナーポリヌクレオチドであって、ドナーポリヌクレオチドが、
（ｉ）第１の５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列とｇＤＮＡの突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第１の鎖と、
（ｉｉ）第２の５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列とｇＤＮＡの突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第２の鎖と
を含み、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、
ドナーポリヌクレオチドが、約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００であり、長さ約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドである、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、第１の鎖は、第１のコード配列を含み、第２の鎖は、第２のコード配列を含み、第１のコード配列は、第１の５’スプライス部位の上流に位置し、第２のコード配列は、第２の５’スプライス部位の上流に位置し、第１の鎖のコード配列と第２の鎖のコード配列は、自己アニーリングを低減させるために相補的でない（または１、２、３、４もしくはそれより多くのミスマッチを含む）。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、第１の５’スプライス部位と第２の５’スプライス部位の間にデリミター配列を含み、デリミター配列は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、長さ約１〜４０、約１〜３０、約１〜２０、約１〜１５、約１〜１０、約３０、約２０、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２または１ヌクレオチドである。
【０１５１】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＳＢへの双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、第１の５’スプライス部位および第１のコード配列は、センス鎖を構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、第２の５’スプライス部位および第２のコード配列は、センス鎖を構成し、それによって、突然変異を修正し、１つまたは複数のスプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御する。
【０１５２】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位にあり、第１の鎖が、第１のイントロン配列を含み、第１のイントロン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位にあり、第２の鎖が、第２のイントロン配列を含み、第２のイントロン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含み、第２の鎖は、第１の鎖に相補的であり、第１の鎖および第２の鎖各々は、式：
５’−［Ｐ１］ａ−［Ｓ１］ｂ−［Ｂ］ｃ−［Ｓ２］ｄ−［Ｐ２］ｅ−３’
（式中、
（ａ）Ｂは、ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含む分岐点配列を含み、Ｂは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ｃは、その値がＢを構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃ＝５〜７であり、
（ｂ）Ｐ１およびＰ２は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を各々が含むポリピリミジントラクトであり、ａおよびｅは、その値がＰ１およびＰ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ａ＝９〜２０およびｃ＝９〜２０であり、Ｐ１およびＰ２を構成するヌクレオチド配列は、各々、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、Ｐ１は、Ｐ２に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｓ１およびＳ２は、どちらかが存在する場合、各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｂおよびｄは、各々、その値がデリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂおよびｄ＝０〜２０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、ＢおよびＰ２は、センス鎖を構成し、ＢおよびＰ２は、第１および第２のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供して、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、ＢおよびＰ１は、センス鎖を構成し、ＢおよびＰ２は、第１および第２のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する。
【０１５３】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位にあり、第１の鎖が、第１のイントロン配列を含み、第１のイントロン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位にあり、第２の鎖が、第２のイントロン配列を含み、第２のイントロン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含み、第２の鎖は、第１の鎖に相補的であり、第１の鎖および第２の鎖各々は、式：
５’−［Ｐ１］ａ−［Ｓ１］ｂ−［Ｂ１］ｃ−［Ｓ２］ｄ−［Ｂ２］ｅ−［Ｓ３］ｆ−［Ｐ２］ｇ−３’
（式中、
（ａ）存在する場合Ｂ１、およびＢ２は、各々、分岐点配列であり、Ｂ２は、ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含み、存在する場合Ｂ１を含む分岐点配列は、Ｂ２を含む分岐点配列に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、Ｂ１およびＢ２は、各々、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ｃおよびｅは、その値がＢ１およびＢ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃ＝０または５〜７であり、ｅ＝５〜７であり、
（ｂ）Ｐ１およびＰ２は、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を各々が含むポリピリミジントラクトであり、ａおよびｇは、その値がＰ１およびＰ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ａ＝９〜２０およびｇ＝９〜２０であり、Ｐ１およびＰ２を構成するヌクレオチド配列は、各々、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、Ｐ１は、Ｐ２に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、いずれかが存在する場合、各々、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｂ、ｄおよびｆは、各々、その値がデリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂおよびｆ＝１〜２０であり、ｄ＝１〜４０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、Ｂ２およびＰ２は、センス鎖を構成し、Ｂ２およびＰ２は、第１および第２のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、Ｂ１およびＰ１は、センス鎖を構成し、Ｂ１およびＰ１は、第１および第２のスプライシングシグナルをそれぞれ提供し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する。
【０１５４】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、第１のイントロン配列および第１のエクソン配列を含み、第１のエクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第２の鎖が、第２のイントロン配列および第２のエクソン配列を含み、第２のエクソン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含み、第２の鎖は、第１の鎖に相補的であり、第１の鎖および第２の鎖各々は、式：
５’−［Ｅ１］ａ−Ｘ１−［Ｐ１］ｂ−［Ｓ１］ｃ−［Ｂ］ｄ−［Ｓ２］ｅ−［Ｐ２］ｆ−Ｘ２−［Ｅ２］ｇ−３’
（式中、
（ａ）Ｂは、ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含む分岐点配列であり、Ｂは、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ｄは、その値がＢを構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｄ＝５〜７であり、
（ｂ）Ｐ１およびＰ２は、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を各々が含むポリピリミジントラクトであり、ｂおよびｆは、その値がＰ１およびＰ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂ＝９〜２０およびｆ＝９〜２０であり、Ｐ１およびＰ２を構成するヌクレオチド配列は、各々、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、Ｐ１は、Ｐ２に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｅ１およびＥ２は、各々、突然変異を修正するヌクレオチド配列を各々が含むエクソン配列であり、ヌクレオチド配列は、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含み、ａおよびｇは、その値がＥ１およびＥ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、Ｅ１を含むエクソン配列は、Ｅ２を含むエクソン配列に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、Ｅ１を構成するヌクレオチド配列とＥ２を構成するヌクレオチド配列は、相補的でなく、
（ｄ）Ｘ１およびＸ２は、各々、３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列であり、Ｘ１を構成するヌクレオチド配列は、Ｘ２を構成するヌクレオチド配列に対して、逆方向の配向であり、逆鎖上にあり、
（ｅ）Ｓ１およびＳ２は、どちらかが存在する場合、各々、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｃおよびｅは、各々、その値がデリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃおよびｅ＝１〜２０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドは、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、Ｂ、Ｐ２、Ｅ２およびＸ２および    は、センス鎖を構成し、Ｂ、Ｐ２およびＸ２は、第１、第２および第３のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、Ｂ、Ｐ１、Ｅ１およびＸ１は、センス鎖を構成し、Ｂ、Ｐ１およびＸ１は、第１、第２および第３のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路は、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する。
【０１５５】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、第１のイントロン配列および第１のエクソン配列を含み、第１のエクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第２の鎖が、第２のイントロン配列および第２のエクソン配列を含み、第２のエクソン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、
第１の鎖および第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｅ１］ａ−Ｘ１−［Ｐ１］ｂ−［Ｓ１］ｃ−［Ｂ１］ｄ−［Ｓ２］ｅ−［Ｂ２］ｆ−［Ｓ３］ｇ−［Ｐ２］ｈ−Ｘ２−［Ｅ２］ｉ−３’
（式中、
（ａ）存在する場合Ｂ１、およびＢ２は、各々、分岐点配列であり、Ｂ２は、ドナーポリヌクレオチドの各鎖上の分岐点コンセンサス配列と一致するヌクレオチド配列を含み、存在する場合Ｂ１を含む分岐点配列は、Ｂ２を含む分岐点配列に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、Ｂ１およびＢ２は、各々、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含み、ｄおよびｆは、その値がＢ１およびＢ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｄおよびｆ＝５〜７であり、
（ｂ）Ｐ１およびＰ２は、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含むヌクレオチド配列を各々が含むポリピリミジントラクトであり、ｂおよびｈは、その値がＰ１およびＰ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂ＝９〜２０およびｈ＝９〜２０であり、Ｐ１およびＰ２を構成するヌクレオチド配列は、各々、約１００％、約９０％〜１００％、約８０％〜９０％ピリミジン核酸塩基であり、Ｐ１は、Ｐ２に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｅ１およびＥ２は、各々、突然変異を修正するヌクレオチド配列を各々が含むエクソン配列であり、ヌクレオチド配列は、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含み、ａおよびｉは、その値がＥ１およびＥ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、Ｅ１を含むエクソン配列は、Ｅ２を含むエクソン配列に対して、逆方向の配向であり、逆鎖上にあり、Ｅ１を構成するヌクレオチド配列とＥ２を構成するヌクレオチド配列は、相補的でなく、
（ｄ）Ｘ１およびＸ２各々は、３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列を含み、Ｘ１のヌクレオチド配列は、Ｘ２のヌクレオチド配列に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｅ）Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、いずれかが存在する場合、各々、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｃ、ｅおよびｇは、各々、その値がデリミター配列をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｃおよびｇ＝１〜２０であり、ｅ＝１〜４０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、Ｂ２、Ｐ２、Ｅ２およびＸ２が、センス鎖を構成し、Ｂ２、Ｐ２およびＸ２が、第１、第２および第３のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、Ｂ１、Ｐ１、Ｅ１およびＸ１が、センス鎖を構成し、Ｂ１、Ｐ１およびＸ１が、第１、第２および第３のスプライシングシグナルをそれぞれ構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【０１５６】
一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の病因突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第１の鎖が、第１のイントロン配列および第１のエクソン配列を含み、第１のエクソン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正する第２のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、病因突然変異が、３’スプライス部位の近位のタンパク質コード突然変異であり、第２の鎖が、第２のイントロン配列および第２のエクソン配列を含み、第２のエクソン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含む、第２の鎖と
を含む、非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、
第１の鎖および第２の鎖各々が、式：
５’−［Ｅ１］ａ−Ｙ１−［Ｓ１］ｂ−Ｙ２−［Ｅ２］ｃ−３’
（式中、
（ａ）Ｅ１およびＥ２各々は、突然変異を修正するヌクレオチド配列を各々が含むエクソン配列であり、ヌクレオチド配列は、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含み、ａおよびｃは、その値がＥ１およびＥ２をそれぞれ構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、Ｅ１を含むエクソン配列は、Ｅ２を含むエクソン配列に対して、逆方向の配向であり、逆鎖上にあり、Ｅ１を構成するヌクレオチド配列とＥ２を構成するヌクレオチド配列は、相補的でなく、
（ｂ）Ｙ１およびＹ２各々は、５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列を含み、Ｙ１のヌクレオチド配列は、Ｙ２のヌクレオチド配列に対して、逆方向の配向であり、ドナーポリヌクレオチドの逆鎖上にあり、
（ｃ）Ｓ１は、存在する場合、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含むデリミター配列であり、ｂは、その値がデリミター配列を構成するヌクレオチドの数を示す整数であり、ｂ＝１＝５０である）
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）への双方向挿入用に構成されており、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第１の配向で挿入されたとき、Ｅ２およびＹ２が、センス鎖を構成し、Ｅ２が、スプライシングシグナルを構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢに第２の配向で挿入されたとき、Ｅ１およびＹ１が、センス鎖を構成し、Ｅ１が、スプライシングシグナルを構成し、それによって、突然変異を修正し、スプライシングシグナルを提供してｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御し、
ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【０１５７】
一部の実施形態では、センス鎖を構成するエクソン配列は、突然変異を修正する。一部の実施形態では、センス鎖を構成する３’スプライス部位を含むヌクレオチド配列は、突然変異を修正する。一部の実施形態では、センス鎖を構成する５’スプライス部位を含むヌクレオチド配列は、突然変異を修正する。一部の実施形態では、センス鎖を構成するポリピリミジントラクトを含むヌクレオチド配列は、突然変異を修正する。一部の実施形態では、センス鎖を構成する分岐点配列を含むヌクレオチド配列は、突然変異を修正する。
【０１５８】
一部の実施形態では、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドのいずれかについての各鎖の最も５’側のヌクレオチドは、５’リン酸基を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、２つの平滑末端を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、１つの平滑末端を含み、オーバーハング（例えば、５’または３’オーバーハング）を含む１つの末端を含む。
【０１５９】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、部位特異的ヌクレアーゼによるドナーポリヌクレオチドの認識および切断を防止する１つまたは複数のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
【０１６０】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の糖原病１ａ型の原因となる突然変異を修正するヌクレオチド配列を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、突然変異が、ヒト第１７染色体ｑ２１上のヒトＧ６ＰＣ遺伝子に位置し、アミノ酸置換Ｒ８３ＣまたはＲ８３Ｈをもたらし、ドナーポリヌクレオチドが、
（ｉ）突然変異を修正するエクソン配列を含むヌクレオチド配列であって、エクソン配列が、Ｇ６ＰＣ遺伝子の８３位のコドンに対応するアルギニン（Ｒ）をコードするコドンを含む、ヌクレオチド配列と、ゲノムＤＮＡ分子から転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含むヌクレオチド配列であって、１つまたは複数のスプライシングシグナルが、３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点配列との組合せである、ヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約４０〜７０ヌクレオチドであり、２つの平滑末端を含み、ドナーポリヌクレオチドの各鎖の最も５’側のヌクレオチドが、５’リン酸部分を含み、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、ドナーポリヌクレオチドの挿入は、ｇＤＮＡ中に突然変異を修正するエクソン配列を含むエクソンの形成をもたらし、スプライシングシグナルが、ｍＲＮＡへのエクソンの組入れを方向付け、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、分岐点配列は、ヌクレオチド配列ＴＴＣＡＴを含み、ポリピリミジントラクトは、ヌクレオチド配列ＣＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴを含み、３’スプライス部位は、ヌクレオチド配列ＴＡＧを含み、エクソン配列は、ヌクレオチド配列ＧＡＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＣＴＴＡＣＴを含む。
【０１６１】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３０（ＣＨ３４  ５４−０）で示される。
【０１６２】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号２０（ＣＨ３２  ５０−０）で示される。
ドナーポリヌクレオチドを作製および試験する方法
【０１６３】
本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の適切なＤＮＡ合成方法および手段により生産される。ＤＮＡ合成は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子の自然なまたは人工的な作出である。用語ＤＮＡ合成は、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ生合成（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＤＮＡ増幅）、酵素的ＤＮＡ合成（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ増幅）または化学的ＤＮＡ合成を指す。
【０１６４】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの各鎖は、オリゴヌクレオチド合成により生産される。オリゴヌクレオチド合成は、被定義化学構造（配列）を有する一本鎖核酸の比較的短い断片または鎖の化学合成である。オリゴヌクレオチド合成の方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｒｅｅｓｅ  （２００５）  Ｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３（２１）：３８５１を参照されたい）。次いで、２本の鎖を一緒にアリーリングして、または二重鎖にして、ドナーポリヌクレオチドを形成することができる。
【０１６５】
一部の態様では、ＤＳＢへのドナーポリヌクレオチドの挿入は、当技術分野において公知の適切な方法により判定される。例えば、挿入事象後、ＤＳＢ部位に隣接するＰＣＲプライマーを使用して生成されたＰＣＲアンプリコンのヌクレオチド配列は、ドナーポリヌクレオチドを含むヌクレオチド配列の存在について解析される。ドナーポリヌクレオチド配列の存在または非存在についてＰＣＲアンプリコンを解析してＤＳＢへのドナーポリヌクレオチド挿入の程度を判定するために、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術が使用される。さらに、各ドナーポリヌクレオチドは、２つのどちらの配向でも挿入することができる直鎖状ｄｓＤＮＡ分子であるので、ＮＧＳ解析を使用して、両方向のドナーポリヌクレオチドの挿入の程度を判定することができる。
【０１６６】
一部の態様では、ドナーポリヌクレオチドの挿入、および突然変異を修正するその能力は、ドナーポリヌクレオチドが挿入されるｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡのヌクレオチド配列解析により判定される。挿入されたドナーポリヌクレオチドを含有するｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡは、当技術分野において公知の適切な方法により解析される。例えば、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドもしくは系で処置されたまたはそのようなドナーポリヌクレオチドもしくは系と接触した細胞から抽出されたｍＲＮＡの変換は、ｃＤＮＡに酵素的に変換され、このｃＤＮＡが、修正された突然変異を含むｍＲＮＡ分子の程度を判定するためにＮＧＳ解析によりさらに解析される。
【０１６７】
他の態様では、ドナーポリヌクレオチドの挿入、および突然変異を修正するその能力は、ドナーポリヌクレオチドが挿入されるｇＤＮＡから転写されるｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドのタンパク質配列解析により判定される。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ｇＤＮＡ分子を含む遺伝子のアミノ酸変化を生じさせる、エクソンへのコドンの組込みによって、突然変異を修正または誘導し、挿入されたドナーポリヌクレオチドを含有する遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳が、アミノ酸変化を含むポリペプチドを生じさせる。ポリペプチドのアミノ酸変化は、サンガーシークエンシング、質量分析、ポリペプチドの酵素活性を測定する機能アッセイ、またはアミノ酸変化に反応する抗体を使用する免疫ブロット法を含むがこれらに限定されない、技術を使用するタンパク質配列解析によって判定される。
ドナーポリヌクレオチドの使用
ＤＮＡ修復経路
【０１６８】
細胞におけるＤＮＡ切断（例えば、ＤＳＢ）の修復は、主として２つのＤＮＡ修復経路、すなわち、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路および相同組換え修復（ＨＤＲ）経路によって果たされる。
【０１６９】
ＮＨＥＪ中に、Ｋｕ７０／８０ヘテロ二量体は、ＤＮＡ末端に結合し、ＤＮＡプロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）を動員する（Ｃａｎｎａｎ  ＆  Ｐｅｄｅｒｓｏｎ  （２０１５）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２３１：３−１４）。結合すると、ＤＮＡ−ＰＫは、それ自体の触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）を活性化し、エンドヌクレアーゼであるアルテミン（ＳＮＭ１ｃとしても公知）をさらに参加させる。ＤＳＢのサブセットでは、アルテミンは、過剰な一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を除去し、基質を生成し、この基質がＤＮＡリガーゼＩＶによりライゲーションされることになる。ＮＨＥＪによるＤＮＡ修復は、標準ＤＮＡ−ＰＫｃｓ／Ｋｕ７０／８０複合体による配列相同性に依存しない平滑末端ライゲーション機序を伴う。細胞周期中に、主としてＧ０／Ｇ１およびＧ２に、ＮＨＥＪが起こる（Ｃｈｉｒｕｖｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ５：ａ０１２７５７）。ＨＤＲは主としてＳおよびＧ２期で機能するが、ＮＨＥＪは、Ｇ０およびＧ１で活性の唯一のＤＳＢ修復経路であり、複製関連ＤＳＢの修復において大きな役割を果たすことが、現在の研究により示されている（Ｋａｒａｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１２）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４７：３２０−３２９；Ｌｉ  ａｎｄ  Ｘｕ  （２０１６）  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ  ４８（７）：６４１−６４６）。ＨＤＲとは異なり、ＮＨＥＪは、分裂細胞だけでなく、分裂細胞と非分裂細胞の両方で活性であり、例えば眼、脳、膵臓または心臓の細胞などの、非分裂成熟細胞のゲノム編集に基づいた治療の開発を可能にする。
【０１７０】
ＨＤＲによるＤＮＡ修復中に、ＤＳＢ末端は、主としてＭＲＥ１１−ＲＡＤ５０−ＮＢＳ１（ＭＲＮ）複合体により、切除されて３’ｓｓＤＮＡテールを露出する（Ｈｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１０）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ４４：  １１３−１３９）。生理条件下で、隣接姉妹染色分体が修復鋳型として使用され、相同配列をもたらすことになり、ｓｓＤＮＡは、リコンビナーゼＲａｄ５１により媒介されて鋳型に侵入し、無傷の鎖に置き換わってＤループを形成することになる。Ｄループ伸長の後に分岐点が移動してダブルホリデイジャンクションを生じさせ、これらの分割により修復サイクルが完了する。ＨＤＲは、誤りがちなポリメラーゼを必要とすることが多いが、通常は誤りがないと見なされる（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｘｕ  （２０１６）  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ  ４８（７）：６４１−６４６）。
【０１７１】
第３の修復機序は、遺伝的結果が、小さい欠失および挿入が切断部位で起こり得るという点でＮＨＥＪと類似している、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）であり、これは「代替ＮＨＥＪ」とも呼ばれる。ＭＭＥＪは、より好適なＤＮＡ末端結合修復結果につながるようにＤＮＡ切断部位に隣接する少数のヌクレオチドの相同配列を使用し、最近の報告により、このプロセスの分子機序がさらに解明された（Ｃｈｏ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５１８：１７４−１７６；Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５１８，  ２５４−２５７；Ｃｅｃｃａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２８，  ２５８−２６２）。
突然変異を修正または誘導するためのドナーポリヌクレオチドの使用
【０１７２】
一部の実施形態では、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドは、標的核酸（例えば、ｇＤＮＡ）の本明細書に記載されるものなどの部位特異的ヌクレアーゼにより誘導された切断部位（例えば、ＤＳＢ）へのドナーポリヌクレオチドの挿入により細胞内のｇＤＮＡの突然変異を修正または誘導するために使用される。一部の実施形態では、細胞のＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復機序は、ドナーポリヌクレオチドを使用することによって、ドナーポリヌクレオチドをＤＳＢに挿入し、ドナーポリヌクレオチドのヌクレオチド配列をｇＤＮＡに付加させて、ＤＳＢを修復する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正するヌクレオチド配列を含み、かつｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含むヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、突然変異の近位の位置に挿入され、それによって突然変異を修正する。一部の実施形態では、突然変異は、置換、ミスセンス、ナンセンス、挿入、欠失またはフレームシフト突然変異である。一部の実施形態では、突然変異は、エクソンにある。一部の実施形態では、突然変異は、置換、挿入または欠失であり、イントロンに位置する。一部の実施形態では、突然変異は、ｇＤＮＡのスプライシングシグナルの近位にある。一部の実施形態では、突然変異は、ｇＤＮＡの３’スプライス部位の近位にある。一部の実施形態では、突然変異は、ｇＤＮＡの５’スプライス部位の近位にある。一部の実施形態では、突然変異は、スプライシングシグナルにあるか、またはｇＤＮＡのスプライシングシグナルを構成する配列にある。一部の実施形態では、突然変異は、ｇＤＮＡの３’スプライス部位にある。一部の実施形態では、突然変異は、ｇＤＮＡの５’スプライス部位にある。一部の実施形態では、突然変異は、ポリピリミジントラクトにある。一部の実施形態では、突然変異は、分岐点配列にある。一部の実施形態では、突然変異は、タンパク質コード突然変異である。一部の実施形態では、突然変異は、疾患に関連している、または疾患の原因となる。
【０１７３】
一部の実施形態では、細胞内のｇＤＮＡの病因突然変異を修正するヌクレオチド配列は、分岐点配列を構成する。一部の実施形態では、疾患を修正するヌクレオチド配列は、ポリピリミジントラクトを構成する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復によりＤＳＢに挿入される。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部分は、ＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復により標的核酸切断部位に挿入される。ある特定の態様では、ＮＨＥＪ修復による標的核酸へのドナーポリヌクレオチドの挿入は、例えば、内在性遺伝子配列の、突然変異、欠失、変更、組込み、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子標識、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、転座および／または遺伝子突然変異をもたらし得る。
【０１７４】
一部の実施形態では、病因突然変異は、疾患糖原病１ａ型（ＧＳＤ１ａ）の原因となる。一部の実施形態では、病因突然変異は、ヒト第１７染色体ｑ２１上のヒトＧ６ＰＣ遺伝子に位置する。一部の実施形態では、病因突然変異は、Ｇ６ＰＣ遺伝子に位置し、ヒトＧ６ＰＣタンパク質におけるＲ８３Ｃ、Ｒ８３ＨまたはＥ１１０Ｋアミノ酸置換をもたらす。一部の実施形態では、Ｇ６ＰＣ遺伝子の病因突然変異は、ヒトＧ６ＰＣタンパク質におけるＲ８３Ｃアミノ酸置換をもたらす。一部の実施形態では、Ｇ６ＰＣ遺伝子の病因突然変異は、ヒトＧ６ＰＣタンパク質におけるＲ８３Ｈアミノ酸置換をもたらす。
【０１７５】
一部の実施形態では、Ｇ６ＰＣ遺伝子の病因突然変異は、ヒトＧ６ＰＣタンパク質におけるＥ１１０Ｋアミノ酸置換をもたらす。一部の実施形態では、本開示は、部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）により細胞内の標的核酸分子（例えば、ｇＤＮＡ）に導入されたＤＳＢを修復するために使用されるドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、標的核酸分子におけるＤＳＢを修復するために細胞の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路により使用される。一部の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。本明細書に記載される部位特異的ヌクレアーゼは、細胞内の標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）にＤＳＢを導入することができる。部位特異的ヌクレアーゼにより誘導される、細胞のゲノムＤＮＡへのＤＳＢの導入は、本明細書に記載されるものなどの内在性ＤＮＡ修復経路を刺激することになる。対照的に、ＮＨＥＪによるＤＳＢの修復は、非分裂細胞で起こるが、修復のために相同ポリヌクレオチド配列の使用を必要としない。しかし、ＮＨＥＪ経路を使用して、修復中にＤＳＢにポリヌクレオチド（例えば、ドナーポリヌクレオチド）を挿入することができる。
【０１７６】
したがって、一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の糖原病１ａ型の原因となる突然変異を修正するヌクレオチド配列を含む非複製型二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）を含むドナーポリヌクレオチドであって、突然変異が、ヒト第１７染色体ｑ２１上のヒトＧ６ＰＣ遺伝子に位置し、アミノ酸置換Ｒ８３ＣまたはＲ８３Ｈをもたらし、ドナーポリヌクレオチドが、
（ｉ）突然変異を修正するエクソン配列を含むヌクレオチド配列であって、エクソン配列が、Ｇ６ＰＣ遺伝子の８３位のコドンに対応するアルギニン（Ｒ）をコードするコドンを含む、ヌクレオチド配列と、ゲノムＤＮＡ分子から転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含むヌクレオチド配列であって、１つまたは複数のスプライシングシグナルが、３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点配列との組合せである、ヌクレオチド配列とを、５’から３’に含む第１の鎖と、
（ｉｉ）第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の鎖と
を含み、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約４０〜７０ヌクレオチドであり、２つの平滑末端を含み、ドナーポリヌクレオチドの各鎖の最も５’側のヌクレオチドが、５’リン酸部分を含み、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に挿入し、ドナーポリヌクレオチドの挿入が、ｇＤＮＡ中に突然変異を修正するエクソン配列を含むエクソンの形成をもたらし、スプライシングシグナルが、ｍＲＮＡへのエクソンの組入れを方向付け、それによって突然変異を修正する、
ドナーポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、分岐点配列は、ヌクレオチド配列ＴＴＣＡＴを含み、ポリピリミジントラクトは、ヌクレオチド配列ＣＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴを含み、３’スプライス部位は、ヌクレオチド配列ＴＡＧを含み、エクソン配列は、ヌクレオチド配列ＧＡＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＣＴＴＡＣＴを含む。
【０１７７】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３０（ＣＨ３４  ５４−０）で示される。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号２０（ＣＨ３２  ５０−０）で示される。
【０１７８】
一部の実施形態では、病因突然変異は、疾患ポンペ病の原因となる。一部の実施形態では、病因突然変異は、ヒト第１７染色体ｑ２５．３上のヒトグルコシダーゼアルファ（ＧＡＡ）遺伝子に位置する。一部の実施形態では、突然変異は、ＧＡＡのスプライシングシグナルにあり、これは、第２エクソンを欠いているＧＡＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写物をもたらす。一部の実施形態では、突然変異は、ＧＡＡのスプライシングシグナルにあり、これは、１つまたは複数の隠れたスプライス部位の活性化をもたらす。隠れたスプライス部位は、スプライシングシグナルをコードするｍＲＮＡであり、スプライソソームと相互作用する可能性があるが、通常は、機能性タンパク質産物を生成するためのｍＲＮＡスプライシングには使用されない。遺伝子の突然変異は、異常なタンパク質産物を生じさせる結果となる隠れたスプライシングシグナルを活性化することがある。
【０１７９】
したがって、一部の実施形態では、本開示は、細胞内のｇＤＮＡ分子のポンペ病の原因となる突然変異を修正するヌクレオチド配列を含む非複製型ｄｓＤＮＡ分子を含むドナーポリヌクレオチドであって、突然変異が、ＧＡＡのスプライシングシグナルにあり、この突然変異が、第２エクソンを欠いているＧＡＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写物、および／または１つもしくは複数の隠れたスプライス部位の活性化をもたらし、ドナーポリヌクレオチドが、
（ｉ）突然変異を修正する第１のヌクレオチド配列を、５’から３’に含む第１の鎖であって、第１の鎖が、第１のイントロン配列を含み、第１のイントロン配列が、突然変異を修正し、第１の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、１つまたは複数のスプライシングシグナルが、３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点配列との組合せを含む、第１の鎖と、
（ｉｉ）第２のイントロン配列を、５’から３’に含む第２の鎖であって、第２のイントロン配列が、突然変異を修正し、第２の鎖が、ｇＤＮＡから転写されたプレｍＲＮＡのプロセシングを制御するための１つまたは複数のスプライシングシグナルを含み、１つまたは複数のスプライシングシグナルが、３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと分岐点配列との組合せを含む、第２の鎖と
を含み、第２の鎖が、第１の鎖に相補的であり、
ドナーポリヌクレオチドが、長さ約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約２０〜８０、約３０〜７０、または約４０〜６０ヌクレオチドであり、２つの平滑末端を含み、ドナーポリヌクレオチドの各鎖の最も５’側のヌクレオチドが、５’リン酸部分を含み、ドナーポリヌクレオチドが、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入されたとき、ＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼによりｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入されたＤＳＢに挿入し、ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢ切断への双方向挿入用に構成されており、どちらの方向にせよ挿入により、３’スプライス部位とポリピリミジントラクトと突然変異を修正する分岐点配列とが形成され、スプライシングシグナルが、ｍＲＮＡへの第２エクソンの組入れを方向付け、それによって突然変異を修正する、ドナーポリヌクレオチドを提供する。
【０１８０】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号６３（ＧＡＡ  ５０−０）で示される。
【０１８１】
したがって、一部の実施形態では、単一のドナーポリヌクレオチド、または同じドナーポリヌクレオチドの複数のコピーが、提供される。他の実施形態では、修復が２つまたはそれより多くの標的部位で起こり得るように、２つまたはそれより多くのドナーポリヌクレオチドが提供される。例えば、異なるドナーポリヌクレオチドが、細胞内の単一の遺伝子または細胞内の２つの異なる遺伝子を修復するために提供される。一部の実施形態では、異なるドナーポリヌクレオチドが、独立したコピー数で提供される。
【０１８２】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により媒介される挿入時に標的核酸に組み込まれる。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド配列には、切断部位の付近の核酸配列との類似性がない。一部の実施形態では、単一のドナーポリヌクレオチド、または同じドナーポリヌクレオチドの複数のコピーが、提供される。他の実施形態では、異なる配列を有する２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドが、非相同末端結合により２つまたはそれより多くの部位に挿入される。一部の実施形態では、異なるドナーポリヌクレオチドが、独立したコピー数で提供される。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系
【０１８３】
天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ある種の獲得免疫を原核生物に提供する遺伝的防御系である。ＣＲＩＳＰＲは、例えば、原核生物に感染したまたは原核生物を攻撃したウイルスにより、細胞に以前に曝露された外来ＤＮＡと類似しているＤＮＡ（スペーサーＤＮＡ）の断片を含有する細菌または古細菌のゲノムに見られるＤＮＡ配列のファミリーである、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）の略語である。ＤＮＡのこれらの断片は、例えばその後の攻撃中に類似のウイルスからの、再導入時に類似の外来ＤＮＡを検出し、破壊するために、原核生物により使用される。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の転写は、外来、外因性ＤＮＡを認識することおよび切断することができるＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質と会合し、それを標的化するスペーサー配列を含む、ＲＮＡ分子の形成をもたらす。非常に多くのタイプおよびクラスのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が記載されている（例えば、Ｋｏｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１７）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３７：６７−７８を参照されたい）。
【０１８４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の操作されたバージョンが、他の種からの細胞のゲノムＤＮＡを突然変異させるまたは編集するために非常に多くの形式で開発されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用する一般的な手法は、細胞のゲノムＤＮＡの骨格の正確な、標的化可能な位置でのＤＮＡ切断事象（例えば、一本鎖または二本鎖切断（ＳＳＢまたはＤＳＢ）の形成）を生じさせる結果となる、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と組み合わせての部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）の異種発現または細胞への導入を含む。ＤＮＡ切断事象が細胞により修復される方法によって、ＤＮＡヌクレオチドまたは配列（例えば、遺伝子）の付加、除去または改変（置換）によりゲノムを編集する機会が得られる。
Ｃａｓヌクレアーゼ
【０１８５】
一部の実施形態では、本開示は、部位特異的ヌクレアーゼを含む組成物および系（例えば、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）であって、部位特異的ヌクレアーゼがＣａｓヌクレアーゼである、組成物および系を提供する。Ｃａｓヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と相互作用する少なくとも１つのドメインを含み得る。加えて、Ｃａｓヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡにより標的配列に方向付けられる。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼと相互作用し、Ｃａｓヌクレアーゼが標的配列に方向付けられると標的配列を切断することができるように標的配列とも相互作用する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的配列に対する切断特異性を与え、Ｃａｓヌクレアーゼは、あらゆる目的に対応するものであり、様々な標的配列を切断するために様々なガイドＲＮＡと対にされる。
【０１８６】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型の系に由来する成分を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座についての最新の分類体系は、Ｉ〜ＶまたはＶＩ型を有するクラス１およびクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を定義している（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  １３（１１）：７２２−３６；Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，  ６０：３８５−３９７）。クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、単一タンパク質エフェクターを有する。ＩＩ、ＶおよびＶＩ型のＣａｓタンパク質は、単一タンパク質、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり、本明細書では「クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼ」と呼ばれる。クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼは、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２およびＣ２ｃ３タンパク質を含む。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）  Ｃｅｌｌ  １６３：１−１３）は、Ｃａｓ９と相同であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する。
【０１８７】
一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からのもの（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系からのＣａｓ９タンパク質）である。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からのもの（単一タンパク質Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質）である。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１ファミリーのタンパク質は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素であり、それらを、本明細書でさらに説明されるように、適切なガイドＲＮＡを設計することによって所望の核酸標的を切断するように方向付けることができる。
【０１８８】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系成分は、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、またはＩＩＣ型の系からのものである。Ｃａｓ９およびそのオルソログが包含される。Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたは他の成分が由来する非限定的な例示的種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、またはＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａが挙げられる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓからのもの（ＳｐＣａｓ９）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのもの（ＳｔＣａｓ９）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓからのもの（ＮｍＣａｓ９）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓからのもの（ＳａＣａｓ９）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉからのもの（ＣｊＣａｓ９）である。
【０１８９】
一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、１つより多くのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、少なくとも１つのＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃｐｆ１）および少なくとも１つのＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９）を含み得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的配列にＤＳＢを導入する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、１つだけの機能的ヌクレアーゼドメインを含有するように改変される。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインの１つが、その核酸切断活性を低下させるように突然変異または完全にもしくは部分的に欠失されるように、改変される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、機能的ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有しないように改変される。他の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、機能的ＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含有しないように改変される。ヌクレアーゼドメインの１つだけが機能的である一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、一本鎖切断（「ニック」）を標的配列に導入することができるニッカーゼである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼヌクレアーゼドメイン内の保存アミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を低下または変更するために置換される。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼニッカーゼは、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにアミノ酸置換を含む。ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼに基づく）が挙げられる。一部の実施形態では、ニッカーゼは、ＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにアミノ酸置換を含む。ＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、およびＤ９８６Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼに基づく）が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるヌクレアーゼ系は、ニッカーゼと、標的配列のセンスおよびアンチセンス鎖にそれぞれ相補的である一対のガイドＲＮＡとを含む。ガイドＲＮＡは、ニッカーゼを、標的配列の両方の鎖を標的とし、そこにニックを生じさせること（すなわち、ダブルニッキング）によりＤＳＢを導入するように、方向付ける。タンパク質の１つのドメインまたは領域が、異なるタンパク質の一部分によって置換されている、キメラＣａｓ９ヌクレアーゼが、使用される。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１などの異なるヌクレアーゼからのドメインで置換されている。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、改変ヌクレアーゼである。
【０１９０】
代替実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からのものである。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のカスケード複合体の成分である。例えば、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ３ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
【０１９１】
操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、少なくとも２つの成分：１）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子および２）Ｃａｓヌクレアーゼを含み、これらが相互作用してｇＲＮＡ／Ｃａｓヌクレアーゼ複合体を形成する。ｇＲＮＡは、ヌクレオチド配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列とを含む「スペーサー」と呼ばれるユーザー定義標的化ドメインを少なくとも含む。操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、特定の標的配列に相補的方式で結合することができるヌクレオチド配列を有するスペーサーを含むｇＲＮＡを生成することにより、ｇＲＮＡ／Ｃａｓヌクレアーゼ複合体は、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ分子）内の目的の特定の標的配列に標的化される。したがって、スペーサーが、ｇＲＮＡ／Ｃａｓヌクレアーゼ複合体の標的化機能を提供する。
【０１９２】
天然に存在するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、「ｇＲＮＡ」は、２本のＲＮＡ鎖：１）スペーサーとＣＲＩＳＰＲ反復配列とを含むＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および２）トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）から構成される。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含むｃｒＲＮＡの部分とｔｒａｃｒＲＮＡの一部分とがハイブリダイズして、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を形成し、この二重鎖がＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）と相互作用する。本明細書で使用される場合、用語「スプリットｇＲＮＡ」または「モジュラーｇＲＮＡ」は、２本のＲＮＡ鎖を含むｇＲＮＡ分子であって、第１のＲＮＡ鎖が、ｃｒＲＮＡ機能および／または構造を含み、第２のＲＮＡ鎖が、ｔｒａｃｒＲＮＡ機能および／または構造を含み、第１のＲＮＡ鎖と第２のＲＮＡ鎖が部分的にハイブリダイズしている、ｇＲＮＡ分子を指す。
【０１９３】
したがって、一部の実施形態では、本開示により提供されるｇＲＮＡは、２つのＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、スプリットｇＲＮＡである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、モジュラーｇＲＮＡである。一部の実施形態では、スプリットｇＲＮＡは、スペーサーおよび第１の相補性領域を、５’から３’に含む第１の鎖と、第２の相補性領域および必要に応じてテールドメインを、５’から３’に含む第２の鎖とを含む。
【０１９４】
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ分子）上の標的配列に相補的である配列に相補的であり、それとハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含む、スペーサーを含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一部分に相補的であり、それとハイブリダイズする、領域を含む。
【０１９５】
一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の全てまたは一部分を含み得る。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの短縮化または改変バリアントを含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡの長さは、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に依存し得る。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、長さ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００を超えるヌクレオチドを含み得る。ある特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、長さ少なくとも２６ヌクレオチドである。追加の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、長さ少なくとも４０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、例えば、１つもしくは複数のヘアピンもしくはステム−ループ構造、または１つもしくは複数のバルジ構造などの、ある特定の二次構造を含み得る。
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）
【０１９６】
操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、多くの場合、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを、これらの成分間にリンカーを付加させることにより化合させて、本明細書で「シングルガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれる単一のＲＮＡ分子にする。理論により拘束されるものではないが、二重鎖ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと同様に、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成し、Ｃａｓヌクレアーゼを標的配列に誘導し、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）の切断のためにＣａｓヌクレアーゼを活性化することになる。したがって、一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、作動可能に連結されているｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに共有結合で連結されているｃｒＲＮＡを含み得る。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、リンカーを介して共有結合で連結されている。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの間の塩基対合によるステム−ループ構造を含み得る。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、スペーサー、第１の相補性領域、連結ドメイン、第２の相補性領域、および必要に応じてテールドメインを、５’から３’に含む。
スペーサー
【０１９７】
一部の実施形態では、本開示により提供されるｇＲＮＡは、スペーサー配列を含む。スペーサー配列は、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の標的部位を定義する配列である。標的核酸は、一方の鎖がＰＡＭ配列に隣接する標的配列を含み、「ＰＡＭ鎖」と呼ばれ、第２の鎖が、「非ＰＡＭ鎖」と呼ばれ、ＰＡＭ鎖および標的配列に相補的である、二本鎖分子である。ｇＲＮＡスペーサーと標的配列の両方が、標的核酸の非ＰＡＭ鎖に相補的である。ｇＲＮＡスペーサー配列は、相補鎖（例えば、標的核酸／標的部位の非ＰＡＭ鎖）とハイブリダイズする。一部の実施形態では、スペーサーは、Ｃａｓヌクレアーゼを標的核酸に標的化するために、標的配列（例えば、非ＰＡＭ鎖）の相補鎖に十分に相補的である。一部の実施形態では、スペーサーは、標的核酸の非ＰＡＭ鎖に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相補的である。一部の実施形態では、スペーサーは、標的核酸の非ＰＡＭ鎖に１００％相補的である。一部の実施形態では、スペーサーは、標的核酸の非ＰＡＭ鎖と相補的でない１、２、３、４、５、６またはそれより多くのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、スペーサーは、標的核酸の非ＰＡＭ鎖と相補的でない１つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、スペーサーは、標的核酸の非ＰＡＭ鎖と相補的でない２つのヌクレオチドを含む。
【０１９８】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡの最も５’側のヌクレオチドは、スペーサーの最も５’側のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、スペーサーは、ｃｒＲＮＡの５’末端に位置する。一部の実施形態では、スペーサーは、ｓｇＲＮＡの５’末端に位置する。一部の実施形態では、スペーサーは、長さ約１５〜５０、約２０〜４５、約２５〜４０、または約３０〜３５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、スペーサーは、長さ約１９〜２２ヌクレオチドである。一部の実施形態では、スペーサーは、長さ約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、スペーサーは、長さ１９ヌクレオチドである。一部の実施形態では、スペーサーは、長さ２０ヌクレオチドであり、一部の実施形態では、スペーサーは、長さ２１ヌクレオチドである。
【０１９９】
一部の実施形態では、標的配列およびＰＡＭのヌクレオチド配列は、式５’Ｎ１９〜２１−Ｎ−Ｒ−Ｇ−３’（配列番号５９）（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｒは、核酸塩基アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）を含むヌクレオチドであり、３つの３’末端核酸、Ｎ−Ｒ−Ｇは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＰＡＭを表す）を含む。一部の実施形態では、スペーサーのヌクレオチド配列は、コンピュータプログラムを使用して設計または選択される。コンピュータプログラムは、予測融解温度、二次構造形成、予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、クロマチン接近可能性、％ＧＣ、ゲノム発生の頻度（例えば、同一もしくは同様であるが、ミスマッチ、挿入もしくは欠失の結果として１つもしくは複数のスポットにおいて異なる配列の）、メチル化状態、および／またはＳＮＰの存在などの、変数を使用し得る。
【０２００】
一部の実施形態では、スペーサーは、本明細書に記載されるものなどの、少なくとも１つまたは複数の改変ヌクレオチドを含む。本開示は、核酸塩基ウラシル（Ｕ）を含み得るスペーサーを含むｇＲＮＡ分子を提供するが、核酸塩基ウラシル（Ｕ）を含むスペーサーを含むｇＲＮＡをコードするいずれのＤＮＡも、対応する位置に核酸塩基チミン（Ｔ）を含むことになる。
ｇＲＮＡを作製する方法
【０２０１】
本開示のｇＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）、合成および／もしくは化学合成方法、またはこれらの組合せを含むがそれらに限定されない、当技術分野において利用可能な適切な手段により生産される。酵素的（ＩＶＴ）、固相、液相、組み合わせた合成方法、小領域合成、およびライゲーション方法が、利用される。一実施形態では、ｇＲＮＡは、ＩＶＴ酵素的合成方法を使用して作製される。ＩＶＴによりポリヌクレオチドを作製する方法は、当技術分野において公知であり、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３００６２に記載されている。したがって、本開示は、本明細書に記載されるｇＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写するために使用されるポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ、構築物およびベクターも含む。
【０２０２】
一部の態様では、非天然改変核酸塩基が、合成中または合成後にポリヌクレオチド、例えばｇＲＮＡ、に導入される。ある特定の実施形態では、改変は、ヌクレオシド間結合、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖に対するものである。特定の実施形態では、改変は、化学合成を用いてまたはポリメラーゼ酵素を用いて、ポリヌクレオチドの末端に導入される。改変核酸およびそれらの合成の例は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９において開示されている。改変ポリヌクレオチドの合成は、Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．  ７６，  ９９−１３４  （１９９８）にも記載されている。
【０２０３】
一部の態様では、酵素的または化学的ライゲーション方法が、ポリヌクレオチドまたはそれらの領域を、異なる機能的部分、例えば、標的化剤または送達剤、蛍光標識、脂質、ナノ粒子などとコンジュゲートさせるために使用される。ポリヌクレオチドおよび改変ポリヌクレオチドのコンジュゲートは、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．  １（３），  １６５−１８７  （１９９０）において概説されている。
【０２０４】
本発明のある特定の実施形態は、本明細書に記載されるｇＲＮＡをコードする核酸、例えばベクターも提供する。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ分子である。他の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、核酸は、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からの反復配列の全てまたは一部分が隣接しているスペーサーを含む。一部の実施形態では、核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、２つの別個の核酸によりコードされる。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、単一の核酸によりコードされる。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、単一の核酸の両方の鎖によりコードされる。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、単一の核酸の同じ鎖によりコードされる。
【０２０５】
一部の実施形態では、本開示により提供されるｇＲＮＡは、当技術分野において記載されている任意の手段により化学合成される（例えば、ＷＯ／２００５／０１２４８を参照されたい）。化学合成手順は増え続けているが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、これはＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避する）などの手順によるそのようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長がおよそ１００ヌクレオチドを超えて有意に増加するとより困難になる傾向がある。より長い長さのＲＮＡを生成するために使用される１つの手法は、互いにライゲーションされている２つまたはそれより多くの分子を生産することである。
【０２０６】
一部の実施形態では、本開示により提供されるｇＲＮＡは、酵素的方法（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写、ＩＶＴ）により合成される。
【０２０７】
様々なタイプのＲＮＡ改変、例えば、当技術分野において記載されているような、安定性を向上させる、自然免疫応答の尤度もしくは程度を低下させる、および／または他の特質を向上させる改変を、ＲＮＡの化学合成および／または酵素的生成中または後に導入することができる。
【０２０８】
ある特定の実施形態では、１つより多くのガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系と共に使用することができる。各ガイドＲＮＡは、異なる標的化配列を含有することができ、したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、１つより多くの標的核酸を切断する。一部の実施形態では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、同じまたは異なる特性、例えば、Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体内での活性または安定性を有し得る。１つより多くのガイドＲＮＡが使用される場合、各ガイドＲＮＡを同じベクターにまたは異なるベクターにコードすることができる。１つより多くのガイドＲＮＡの発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同じである、または異なる。
【０２０９】
ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的化配列（例えば、スペーサー配列）によって目的の任意の配列を標的化することができる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列と標的核酸分子の標的配列との間の相補性度は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列と、標的核酸分子上の標的配列は、１００％相補的である。他の実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列と、標的核酸分子上の標的配列は、少なくとも１つのミスマッチを含有し得る。例えば、ガイドＲＮＡの標的化配列と、標的核酸分子上の標的配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のミスマッチを含有し得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列と、標的核酸分子上の標的配列は、１〜６のミスマッチを含有し得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列と、標的核酸分子上の標的配列は、５または６のミスマッチを含有し得る。
【０２１０】
標的化配列の長さは、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系および成分に依存し得る。例えば、異なる細菌種からの異なるＣａｓ９タンパク質は、様々な最適な標的化配列長を有する。したがって、標的化配列は、長さ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または５０を超えるヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、標的化配列は、長さ１８〜２４ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、標的化配列は、長さ１９〜２１ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、標的化配列は、長さ２０ヌクレオチドを含み得る。
【０２１１】
本開示の一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を形成し得る。ガイドＲＮＡは、標的核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ分子）上の標的配列にＣａｓタンパク質を誘導することができ、そこで、Ｃａｓタンパク質は標的核酸を切断する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、Ｃｐｆ１／ガイドＲＮＡ複合体である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体である。
操作されたヌクレアーゼ
【０２１２】
追加の実施形態では、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドは、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて使用され、部位特異的ヌクレアーゼは、操作されたヌクレアーゼである。例示的な操作されたヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ）、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびメガＴＡＬである。
【０２１３】
天然に存在するメガヌクレアーゼは、約１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識および切断することができ、一般に５つのファミリーに分類される。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、ＨＮＨファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリー、およびＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫファミリーから選択される。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、その同起源の標的配列以外の配列を認識し、それに結合するように、操作される。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、異種ヌクレアーゼドメインに融合される。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼなどのメガヌクレアーゼは、「メガＴＡＬ」タンパク質などのハイブリッドタンパク質を作出するために、ＴＡＬモジュールに融合される。メガＴＡＬタンパク質は、メガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインとＴＡＬモジュール両方の標的配列を認識することによる改善されたＤＮＡ標的化特異性を有する。
【０２１４】
ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（「ジンクフィンガー」または「ＺＦ」）とヌクレアーゼドメインとを含む融合タンパク質である。天然に存在する各ＺＦは、３つの連続する塩基対（ＤＮＡトリプレット）に結合することができ、ＺＦリピートは、ＤＮＡ標的配列を認識するように、および十分な親和性を提供するように、組み合わせられる。したがって、操作されたＺＦリピートは、例えば９、１２、１５または１８ｂｐなどの、より長いＤＮＡ配列を認識するように組み合わせられる。一部の実施形態では、ＺＦＮは、制限エンドヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメインに融合したＺＦを含む。例えば、制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ヌクレアーゼが活性になるために二量体化したときのものなどの二量体化ドメインを含み、ＺＦリピートとヌクレアーゼドメインとを含む一対のＺＦＮは、（文献ではスペーサーと呼ばれることもある）相互接続配列が間にある、ＤＮＡ分子の両方の鎖上の各ＺＦリピートにより認識される２つの半分の標的配列を含む標的配列を標的化するために、設計される。例えば、相互接続配列は、長さ５〜７ｂｐである。対のＺＦＮ両方が結合すると、ヌクレアーゼドメインは二量体化し、相互接続配列内にＤＳＢを導入することができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインの二量体化ドメインは、二量体化を促進するためにノブ−イントゥ−ホールモチーフを含む。例えば、ＺＦＮは、ＦｏｋＩの二量体化ドメインにノブ−イントゥ−ホールモチーフを含む。
【０２１５】
ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインは、通常は、可変数の３４または３５アミノ酸リピート（「モジュール」または「ＴＡＬモジュール」）を含み、各モジュールが、単一ＤＮＡ塩基対、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣに結合する。各モジュールの１２および１３位の隣接残基（「反復可変二残基」またはＲＶＤ）は、モジュールが結合する単一ＤＮＡ塩基対を指定する。Ｇを認識するために使用されるモジュールは、Ａに対する親和性も有し得るが、ＴＡＬＥＮは、特定の標的配列を認識するＤＮＡ結合ドメインのカスタマイズを非常に単純化する単純な認識コード−４つの塩基各々について１つのモジュール−の恩恵を受ける。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、制限エンドヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、活性になるために二量体化することができ、一対のＴＡＬＥＮは、相互接続配列が間にある、ＤＮＡ分子の両方の鎖上の各ＤＮＡ結合ドメインにより認識される２つの半分の標的配列を含む標的配列を標的化するために、設計される。例えば、半分の標的配列各々は、１０〜２０ｂｐの範囲であり、相互接続配列は、長さ１２〜１９ｂｐである。対のＴＡＬＥＮ両方が結合すると、ヌクレアーゼドメインは二量体化し、相互接続配列内にＤＳＢを導入することができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインの二量体化ドメインは、二量体化を促進するためにノブ−イントゥ−ホールモチーフを含み得る。例えば、ＴＡＬＥＮは、ＦｏｋＩの二量体化ドメインにノブ−イントゥ−ホールモチーフを含み得る。
改変ヌクレアーゼ
【０２１６】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、その野生型対応物から必要に応じて改変される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、少なくとも１つの異種タンパク質ドメインと融合される。少なくとも１つのタンパク質ドメインは、ヌクレアーゼのＮ末端に、Ｃ末端に、または内部位置に位置する。一部の実施形態では、２つまたはそれより多くの異種タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ上の１つまたは複数の位置にある。
【０２１７】
一部の実施形態では、タンパク質ドメインは、細胞の核へのヌクレアーゼの輸送を助長することができる。例えば、タンパク質ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、１〜１０のＮＬＳと融合される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、１〜５のＮＬＳと融合される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、１つのＮＬＳと融合される。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、１つより多くのＮＬＳと融合される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、２、３、４または５つのＮＬＳと融合される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、２つのＮＬＳと融合される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、３つのＮＬＳと融合される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＮＬＳと融合されない。一部の実施形態では、ＮＬＳは、例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳ、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５６）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号５７）などの、単節型配列であり得る。一部の実施形態では、ＮＬＳは、例えば、ヌクレオプラスミンのＮＬＳ、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号５８）などの、双節型配列である。一部の実施形態では、ＮＬＳは、その野生型対応物から遺伝子改変される。
【０２１８】
一部の実施形態では、タンパク質ドメインは、ヌクレアーゼの細胞内半減期を変更することができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼの半減期を増加させることができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼの半減期は、低減される。一部の実施形態では、実体は、ヌクレアーゼの安定性を増加させることができる。一部の実施形態では、実体は、ヌクレアーゼの安定性を低下させることができる。一部の実施形態では、タンパク質ドメインは、タンパク質分解のためのシグナルペプチドとして作用する。一部の実施形態では、タンパク質分解は、例えば、プロテアソーム、リソソームプロテアーゼ、またはカルパインプロテアーゼなどの、タンパク質分解酵素により媒介される。一部の実施形態では、タンパク質ドメインは、ＰＥＳＴ配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖の付加により改変される。一部の実施形態では、ユビキチンは、ユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）である。ユビキチン様タンパク質の非限定的な例としては、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン交差反応性タンパク質（ＵＣＲＰ、これはインターフェロン刺激遺伝子−１５（ＩＳＧ１５）としても公知）、ユビキチン関連修飾因子−１（ＵＲＭ１）、神経前駆細胞に発現され発生的に下方制御されるタンパク質−８（ＮＥＤＤ８、これはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではＲｕｂ  １とも呼ばれる）、ヒト白血球抗原Ｆ関連（ＦＡＴ１０）、オートファジー−８（ＡＴＧ８）および−１２（ＡＴＧ１２）、Ｆａｕユビキチン様タンパク質（ＦＵＢ１）、膜繋留ＵＢＬ（ＭＵＢ）、ユビキチンフォールド修飾因子−１（ＵＦＭ１）、ならびにユビキチン様タンパク質−５（ＵＢＬＳ）が挙げられる。
【０２１９】
一部の実施形態では、タンパク質ドメインは、マーカードメインである。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、エピトープタグ、およびレポーター遺伝子配列が挙げられる。一部の実施形態では、マーカードメインは、蛍光タンパク質である。適する蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）およびオレンジ蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）または任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。他の実施形態では、マーカードメインは、精製タグおよび／またはエピトープタグである。非限定的な例示的タグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデム親和性精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、６×Ｈｉｓ（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号６０）、ビオチンカルボキシルキャリアープロテイン（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。非限定的な例示的レポーター遺伝子としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質が挙げられる。
【０２２０】
追加の実施形態では、タンパク質ドメインは、ヌクレアーゼを特定の細胞小器官、細胞型、組織または臓器に標的化することができる。
【０２２１】
さらなる実施形態では、タンパク質ドメインは、エフェクタードメインである。ヌクレアーゼがその標的核酸に方向付けられると、例えば、Ｃａｓ９タンパク質が、ガイドＲＮＡにより標的核酸に方向付けられると、エフェクタードメインは、標的核酸を改変することができ、または標的核酸に影響を与えることができる。一部の実施形態では、エフェクタードメインは、核酸結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、エピジェネティック改変ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写リプレッサードメインから選択される。
【０２２２】
本発明のある特定の実施形態は、ベクター上に備えられた本明細書に記載されるヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）をコードする核酸も提供する。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ分子である。他の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸は、ｍＲＮＡ分子である。ある特定の実施形態では、核酸は、Ｃａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡである。
【０２２３】
一部の実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸は、１つまたは複数の真核細胞型における効率的発現用に最適化されたコドンである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸は、１つまたは複数の哺乳動物細胞における効率的発現用に最適化されたコドンである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸は、ヒト細胞における効率的発現用に最適化されたコドンである。コドン使用頻度表およびコドン最適化アルゴリズムを含むコドン最適化方法は、当技術分野において利用可能である。
標的部位
【０２２４】
一部の実施形態では、本明細書に記載される部位特異的ヌクレアーゼは、標的核酸分子に方向付けられ、それを切断する（例えば、それにＤＳＢを導入する）。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡにより標的核酸分子（ｇＤＮＡ）の標的部位に方向付けられ、そこで、ガイドＲＮＡが標的配列の相補鎖とハイブリダイズし、Ｃａｓヌクレアーゼが標的核酸を標的部位で切断する。一部の実施形態では、標的配列の相補鎖は、ガイドＲＮＡの標的化配列（例えば、スペーサー配列）に相補的である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列と標的配列のその対応する相補鎖との間の相補性度は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％である。一部の実施形態では、標的配列の相補鎖と、ガイドＲＮＡの標的化配列は、１００％相補的である。他の実施形態では、標的配列の相補鎖と、ガイドＲＮＡの標的化配列は、少なくとも１つのミスマッチを含有する。例えば、標的配列の相補鎖と、ガイドＲＮＡの標的化配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のミスマッチを含有する。一部の実施形態では、標的配列の相補鎖と、ガイドＲＮＡの標的化配列は、１〜６のミスマッチを含有する。一部の実施形態では、標的配列の相補鎖と、ガイドＲＮＡの標的化配列は、５または６のミスマッチを含有する。
【０２２５】
標的配列の長さは、使用されるヌクレアーゼ系に依存し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の標的配列は、長さ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または５０を超えるヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的配列は、長さ１８〜２４ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的配列は、長さ１９〜２１ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的配列は、長さ２０ヌクレオチドを含む。ニッカーゼが使用される場合、標的配列は、ＤＮＡ分子の両方の鎖上の一対のニッカーゼにより認識される一対の標的配列を含む。
【０２２６】
一部の実施形態では、メガヌクレアーゼの標的配列は、長さ１２〜４０またはそれを超えるヌクレオチドを含む。ＺＦＮが使用される場合、標的配列は、相互接続配列が間にある、ＤＮＡ分子の両方の鎖上の一対のＺＦＮにより認識される２つの半分の標的配列を含む。一部の実施形態では、ＺＦＮの半分の標的配列各々は、独立して、長さ９、１２、１５、１８またはそれを超えるヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＺＦＮの相互接続配列は、長さ４〜２０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＺＦＮの相互接続配列は、長さ５〜７ヌクレオチドを含む。
【０２２７】
ＴＡＬＥＮが使用される場合、標的配列は、相互接続配列が間にある、ＤＮＡ分子の両方の鎖上の一対のＴＡＬＥＮにより認識される２つの半分の標的配列を含む。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮの半分の標的配列各々は、独立して、長さ１０〜２０またはそれを超えるヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮの相互接続配列は、長さ４〜２０ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮの相互接続配列は、長さ１２〜１９ヌクレオチドを含み得る。
【０２２８】
標的核酸分子は、細胞にとって内在性または外因性である、任意のＤＮＡ分子である。本明細書で使用される場合、用語「内在性配列」は、細胞に本来備わっている配列を指す。一部の実施形態では、標的核酸分子は、細胞からのまたは細胞内のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子または染色体である。一部の実施形態では、標的核酸分子の標的配列は、細胞からのまたは細胞内のゲノム配列である。他の実施形態では、細胞は、真核細胞である。一部の実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、真核細胞は、げっ歯動物細胞であり得る。一部の実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞であり得る。さらなる実施形態では、標的配列は、ウイルス配列であり得る。さらに他の実施形態では、標的配列は、合成された配列であり得る。一部の実施形態では、標的配列は、ヒト染色体などの真核生物染色体上にあり得る。
【０２２９】
一部の実施形態では、標的配列は、遺伝子のコード配列、遺伝子のイントロン配列、遺伝子の転写制御配列、遺伝子の翻訳制御配列、または遺伝子間の非コード配列に位置し得る。一部の実施形態では、遺伝子は、タンパク質コード遺伝子であり得る。他の実施形態では、遺伝子は、ノンコーディングＲＮＡ遺伝子であり得る。一部の実施形態では、標的配列は、疾患関連遺伝子の全てまたは一部分を含み得る。
【０２３０】
一部の実施形態では、標的配列は、足場部位または遺伝子座制御領域などの、クロマチン構成の態様を制御するゲノム内の非遺伝子機能部位に位置し得る。一部の実施形態では、標的配列は、遺伝子セーフハーバー部位、すなわち、安全な遺伝子改変を助長する遺伝子座であり得る。
【０２３１】
一部の実施形態では、標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体により認識される短い配列であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接していることがある。一部の実施形態では、ＰＡＭは、標的配列の３’末端のヌクレオチドに隣接していることもあり、または標的配列の３’末端の１、２、３もしくは４ヌクレオチド以内にあることもある。ＰＡＭの長さおよび配列は、使用されるＣａｓ９タンパク質に依存し得る。例えば、ＰＡＭは、参照により本明細書に組み込まれるＲａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ，  ５２０：１８６−１９１  （２０１５）の図１において開示されているものを含む、特異的Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９オルソログのコンセンサスまたは特定のＰＡＭ配列から選択することができる。一部の実施形態では、ＰＡＭは、長さ２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドを含み得る。非限定的な例示的ＰＡＭ配列としては、ＮＧＧ（ＳｐＣａｓ９  ＷＴ、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ、二量体ｄＣａｓ９−Ｆｏｋ１、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９  Ｋ８５５Ａ、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１））、ＮＧＡＮまたはＮＧＮＧ（ＳｐＣａｓ９  ＶＱＲバリアント）、ＮＧＡＧ（ＳｐＣａｓ９  ＥＱＲバリアント）、ＮＧＣＧ（ＳｐＣａｓ９  ＶＲＥＲバリアント）、ＮＡＡＧ（ＳｐＣａｓ９  ＱＱＲ１バリアント）、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＮ（ＳａＣａｓ９）、ＮＮＮＲＲＴ（ＫＫＨ  ＳａＣａｓ９）、ＮＮＮＮＲＹＡＣ（ＣｊＣａｓ９）、ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、ＮＡＡＡＡＣ（ＴｄＣａｓ９）、ＮＧＧＮＧ（Ｓｔ３Ｃａｓ９）、ＮＧ（ＦｎＣａｓ９）、ＮＡＡＡＡＮ（ＴｄＣａｓ９）、ＮＮＡＡＡＡＷ（ＳｔＣａｓ９）、ＮＮＮＮＡＣＡ（ＣｊＣａｓ９）、ＧＮＮＮＣＮＮＡ（ＰｍＣａｓ９）、およびＮＮＮＮＧＡＴＴ（ＮｍＣａｓ９）が挙げられる（例えば、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９−８２３；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３：１２９３−１２９８；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２３：４８１−４８５；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１６）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２９：４９０−４９５；Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３２：５６９−５７６；Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１：８４−８８；Ａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１６）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６１：８９５−９０２；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１７）  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍ  ８：１４５００；Ｆｏｎｆａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４２：２５７７−２５９０；Ｇａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１０）  Ｎａｔｕｒｅ  ４６８：６７−７１；Ｍａｇａｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１２）  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４０９１３；Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３）  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０（１１）：１１１６−１１２１を参照されたい）（ここでのＮは、任意のヌクレオチドと定義され、Ｗは、ＡまたはＴのどちらかと定義され、Ｒは、プリン（Ａ）または（Ｇ）と定義され、Ｙは、ピリミジン（Ｃ）または（Ｔ）と定義される）。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧである。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＮＧＡＮである。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＮＧＮＧである。一部の実施形態では、ＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴである。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧＮＧである。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＮＮＡＡＡＡＷであり得る。
ゲノム編集のための系
【０２３２】
一部の態様では、本開示は、ゲノムＤＮＡ分子の突然変異を修正するための系を提供する。一部の実施形態では、系は、部位特異的ヌクレアーゼ、必要に応じてｇＲＮＡ、およびドナーポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載のものを含む。本開示の一部の実施形態では、系は、操作されたヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、系は、部位特異的ヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を構成する。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を構成するガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡである。
改変ドナーポリヌクレオチド
【０２３３】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、細胞内への送達および細胞内での安定性に適した化学構造を備えている。さらに、一部の実施形態では、本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチドの薬物動態、生体内分布、バイオアベイラビリティおよび／または有効性の制御に有用である化学構造が提供される。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチドは、改変されていることがあり、例えば、改変糖部分、改変ヌクレオシド間結合、改変ヌクレオシド、改変ヌクレオチドおよび／またはこれらの組合せを含み得る。加えて、改変ドナーポリヌクレオチドは、以下の特性のうちの１つまたは複数を示すことができ、免疫刺激性でなく、ヌクレアーゼ耐性であり、未改変ドナーポリヌクレオチドと比較して改善された細胞取込みを有し、および／または細胞もしくは哺乳動物にとって毒性でない。
【０２３４】
ヌクレオチドおよびヌクレオシド改変は、それらが組み込まれるポリヌクレオチド（例えば、ドナーポリヌクレオチド）を、ネイティブポリヌクレオチドよりヌクレアーゼ消化に対する耐性が高いものにすることが示されており、これらの改変ポリヌクレオチドは、未改変ポリヌクレオチドより長時間、無傷で生き残ることが示されている。改変オリゴヌクレオチドの具体的な例としては、改変された骨格（すなわち、改変ヌクレオシド間結合）、例えば、ホスホロチオエート、リン酸トリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖間結合を含むものが挙げられる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格；ヘテロ原子骨格、例えば、メチレン（メチルイミノ）もしくはＭＭＩ骨格；アミド骨格（例えば、Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｅ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  １９９５，  ２８：３６６−３７４を参照されたい）；モルホリノ骨格（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号を参照されたい）；またはペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（ポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格が、ポリアミド骨格で置換されており、ヌクレオチドが、ポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接もしくは間接的に結合している；Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，  ２５４，  １４９７を参照されたい）を有し得る。リン含有改変結合としては、ホスホロチオエート；キラルホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；リン酸トリエステル；アミノアルキルリン酸トリエステル；メチルホスホネート、ならびに３’アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート；ホスフィネート；３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含む、ホスホロアミデート；チオノホスホロアミデート；チオノアルキルホスホネート；チオノアルキルリン酸トリエステル；ならびに正規３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体；ならびにヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’と５’−３’または２’−５’と５’−２’で結合されている、逆の方向性を有するものが挙げられるが、それらに限定されない；米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５０３１２７２．１、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、および同第５，６２５，０５０号を参照されたい。
【０２３５】
モルホリノに基づくオリゴマー化合物は、Ｄｗａｉｎｅ  Ａ．  Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｒ．  Ｃｏｒｅｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００２，  ４１（１４），  ４５０３−４５１０）；Ｇｅｎｅｓｉｓ，  ｖｏｌｕｍｅ  ３０，  ｉｓｓｕｅ  ３，  ２００１；Ｈｅａｓｍａｎ，  Ｊ．，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００２，  ２４３，  ２０９−２１４；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２０００，  ２６，  ２１６−２２０；Ｌａｃｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ２０００，  ９７，  ９５９１−９５９６；および１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号に記載されている。一部の実施形態では、モルホリノに基づくオリゴマー化合物は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）（例えば、Ｉｖｅｒｓｏｎ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  ３：２３５−２３８，  ２００１；およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．，  １２：３５４−３６４，  ２０１０に記載されているような）である。
【０２３６】
シクロへキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣体は、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，  ２０００，  １２２，  ８５９５−８６０２に記載されている。
【０２３７】
リン原子を内部に含まない改変オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルの混合型ヌクレオシド間結合、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する他のもの、を有するものを含む；米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号および同第５，６７７，４３９号を参照されたく、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３８】
一部の実施形態では、本開示のドナーポリヌクレオチドは、改変（例えば、ヌクレオチド改変）の組込みなどにより、核酸分解に対して安定化される。一部の実施形態では、本開示のドナーポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列の５’および／または３’末端にホスホロチオエート、少なくとも第１、第２および／または第３のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、本開示のドナーポリヌクレオチドは、１つまたは複数の２’改変ヌクレオチド、例えば、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を含む。一部の実施形態では、本開示のドナーポリヌクレオチドは、ホスホロチオエートおよび本明細書に記載の２’改変ヌクレオチドを含む。
【０２３９】
本明細書に記載される改変化学構造のいずれかを互いに組み合わせることができ、その１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれより多くの異なるタイプの改変を同じ分子に含めることができる。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または改変を含む。
ｍＲＮＡ成分
【０２４０】
一部の実施形態では、本開示により提供される系は、ｍＲＮＡによりコードされる操作されたヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、本開示により提供される組成物は、ヌクレアーゼ系を構成するヌクレアーゼがｍＲＮＡによりコードされる、ヌクレアーゼ系を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然に存在するまたは天然に存在しないｍＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、下で説明されるような１つまたは複数の改変核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むことがあり、その場合、「改変ｍＲＮＡ」と呼ばれることがある。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）、および／またはコード領域（例えば、オープンリーディングフレーム）を含み得る。ｍＲＮＡは、数十（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００）、数百（例えば、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００もしくは９００）または数千（例えば、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００）の塩基対を含む、任意の適切な数の塩基対を含み得る。核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの任意の数（例えば、全て、一部、またはゼロ）が、標準種の置換された、改変された、そうでなければ天然に存在しない類似体であり得る。ある特定の実施形態では、特定の核酸塩基タイプの全てが、改変されることがある。一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡは、５’キャップ構造、連鎖停止ヌクレオチド、必要に応じてコザックもしくはコザック様配列（コザックコンセンサス配列としても公知）、ステム−ループ、ポリＡ配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。
【０２４１】
５’キャップ構造またはキャップ種は、リンカーにより結合された２つのヌクレオシド部分を含む化合物であり、天然に存在するキャップ、天然に存在しないキャップもしくはキャップ類似体、またはアンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）から選択され得る。キャップ種は、１つまたは複数の改変ヌクレオシドおよび／またはリンカー部分を含み得る。例えば、天然ｍＲＮＡキャップは、５’位に三リン酸結合により結合されている、グアニンヌクレオチドおよび７位がメチル化されているグアニン（Ｇ）ヌクレオチド、例えば、一般にｍ７ＧｐｐｐＧと記載される、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含み得る。キャップ種は、アンチリバースキャップ類似体であることもある。可能なキャップ種の非限定的なリストには、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ、ｍ７３’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ２７，Ｏ３’ＧｐｐｐＧ、ｍ２７，Ｏ３’ＧｐｐｐｐＧ、ｍ２７，Ｏ２’ＧｐｐｐｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ、ｍ７３’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ２７，Ｏ３’ＧｐｐｐＧ、ｍ２７，Ｏ３’ＧｐｐｐｐＧ、およびｍ２７，Ｏ２’ＧｐｐｐｐＧが含まれる。
【０２４２】
ｍＲＮＡは、その代わりにまたは加えて、連鎖停止ヌクレオシドを含むことがある。例えば、連鎖停止ヌクレオシドは、それらの糖基の２’および／または３’位が脱酸素化されたヌクレオシドを含み得る。そのような種としては、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、ならびに２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、例えば、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシンおよび２’，３’−ジデオキシチミンを挙げることができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡへの、例えばその３’末端への、連鎖停止ヌクレオチドの組込みは、例えば、国際特許公開番号ＷＯ２０１３／１０３６５９に記載されているように、ｍＲＮＡの安定化をもたらすことができる。
【０２４３】
ｍＲＮＡは、その代わりにまたは加えて、ヒストンステムループなどの、ステムループを含むことがある。ステムループは、２、３、４、５、６、７、８、またはそれより多くのヌクレオチド塩基対を含み得る。例えば、ステムループは、４、５、６、７または８ヌクレオチド塩基対を含み得る。ステムループは、ｍＲＮＡの任意の領域に位置し得る。例えば、ステムループは、非翻訳領域（５’非翻訳領域もしくは３’非翻訳領域）、コード領域、またはポリＡ配列もしくはテールの中に位置することもあり、前に位置することもあり、または後に位置することもある。一部の実施形態では、ステムループは、翻訳の開始、翻訳効率および／または転写終結などの、ｍＲＮＡの１つまたは複数の機能に影響を与え得る。
【０２４４】
ｍＲＮＡは、その代わりにまたは加えて、ポリＡ配列および／またはポリアデニル化シグナルを含むことがある。ポリＡ配列は、アデニンヌクレオチドまたはその類似体もしくは誘導体から全面的にまたは主に構成され得る。ポリＡ配列は、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に隣接して位置するテールであり得る。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、ｍＲＮＡの核外輸送、翻訳および／または安定性に影響を与え得る。
改変ＲＮＡ
【０２４５】
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｍＲＮＡ）は、１つまたは複数の改変核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはヌクレオシド間結合を含む。一部の実施形態では、改変ｍＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡは、参照未改変ｍＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡと比較してこの改変ｍＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡが導入される細胞の、安定性の向上、細胞内保持、翻訳の向上、および／または自然免疫応答の実質的誘導の欠如を含む、有用な特性を有し得る。したがって、改変ｍＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡの使用は、タンパク質産生効率、核酸の細胞内保持を向上させることがあり、免疫原性の低下を有することもある。
【０２４６】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡは、１つまたは複数（例えば、１、２、３または４つ）の異なる改変核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはヌクレオシド間結合を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡは、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれより多く）の異なる改変核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、改変ｇＲＮＡは、このｇＲＮＡが導入される細胞において、対応する未改変ｇＲＮＡと比較して分解の低減を有し得る。一部の実施形態では、改変ｍＲＮＡは、このｍＲＮＡが導入される細胞において、対応する未改変ｍＲＮＡと比較して分解の低減を有し得る。
【０２４７】
一部の実施形態では、改変核酸塩基は、改変ウラシルである。改変ウラシルを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、プソイドウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有する）、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン��２’−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、および５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、および５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）］ウリジンが挙げられる。
【０２４８】
一部の実施形態では、改変核酸塩基は、改変シトシンである。改変シトシンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−アラ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、および２’−ＯＨ−アラ−シチジンが挙げられる。
【０２４９】
一部の実施形態では、改変核酸塩基は、改変アデニンである。改変アデニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、□−チオ−アデノシン、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイル−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、およびＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）−アデノシンが挙げられる。
【０２５０】
一部の実施形態では、改変核酸塩基は、改変グアニンである。改変グアニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、□−チオ−グアノシン、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ）、不十分に修飾されたヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−キューオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ１Ｉｍ）、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、Ｏ６−メチル−グアノシン、２’−Ｆ−アラ−グアノシン、および２’−Ｆ−グアノシンが挙げられる。
【０２５１】
一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡは、上述の改変核酸塩基の１つまたは複数についての組合せ（例えば、上述の改変核酸塩基の２、３または４つについての組合せ）を含む。
【０２５２】
一部の実施形態では、改変核酸塩基は、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５−メトキシウリジン、または２’−Ｏ−メチルウリジンである。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、上述の改変核酸塩基の１つまたは複数についての組合せ（例えば、上述の改変核酸塩基の２、３または４つについての組合せ）を含む。一実施形態では、改変核酸塩基は、Ｎ１−メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）であり、本開示のｍＲＮＡは、Ｎ１−メチルプソイド（ｍ１ψ）で完全に改変されている。一部の実施形態では、Ｎ１−メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）は、ｍＲＮＡ中のウラシルの７５〜１００％に相当する。一部の実施形態では、Ｎ１−メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）は、ｍＲＮＡ中のウラシルの１００％に相当する。
【０２５３】
一部の実施形態では、改変核酸塩基は、改変シトシンである。改変シトシンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジンが挙げられる。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、上述の改変核酸塩基の１つまたは複数についての組合せ（例えば、上述の改変核酸塩基の２、３または４つについての組合せ）を含む。
【０２５４】
一部の実施形態では、改変核酸塩基は、改変アデニンである。改変アデニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、７−デアザ−アデニン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）が挙げられる。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、上述の改変核酸塩基の１つまたは複数についての組合せ（例えば、上述の改変核酸塩基の２、３または４つについての組合せ）を含む。
【０２５５】
一部の実施形態では、改変核酸塩基は、改変グアニンである。改変グアニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７−デアザ−グアノシン、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシンが挙げられる。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、上述の改変核酸塩基の１つまたは複数についての組合せ（例えば、上述の改変核酸塩基の２、３または４つについての組合せ）を含む。
【０２５６】
一部の実施形態では、改変核酸塩基は、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、プソイドウリジン（ψ）、α−チオ−グアノシン、またはα−チオ−アデノシンである。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、上述の改変核酸塩基の１つまたは複数についての組合せ（例えば、上述の改変核酸塩基の２、３または４つについての組合せ）を含む。
【０２５７】
ある特定の実施形態では、本開示のｍＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡは、特定の改変について均一に改変される（すなわち、完全に改変される、全配列を通して改変される）。例えば、ｍＲＮＡをＮ１−メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）で均一に改変することができ、これは、ｍＲＮＡ配列中の全てのウリジンまたは全てのシトシンヌクレオシドが、Ｎ１−メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）で置換されることを意味する。同様に、本開示のｍＲＮＡを、配列中に存在する任意のタイプのヌクレオシド残基について、上で示したものなどの改変残基での置換により均一に改変することができる。
【０２５８】
一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、コード領域（例えば、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム）が改変され得る。他の実施形態では、ｍＲＮＡは、コード領域以外の領域が改変され得る。例えば、一部の実施形態では、どちらかまたは両方が１つまたは複数の異なるヌクレオシド改変を独立して含有し得る、５’−ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲが提供される。そのような実施形態では、ヌクレオシド改変は、コード領域にも存在することがある。
リボ核タンパク質
【０２５９】
ある特定の態様では、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）およびゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）は、各々が細胞または対象に別々に投与され得る。ある特定の態様では、部位特異的ポリペプチドは、１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、または１つもしくは複数のｓｇＲＮＡと事前に複合体化され得る。そのような事前に複合体化された物質は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として公知である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ系は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ系は、ｇＲＮＡとの複合体の状態の精製されたＣａｓ９タンパク質を含むＣａｓ９  ＲＮＰを含む。Ｃａｓ９タンパク質を当技術分野において公知の任意の手段により発現させることおよび精製することができる。リボ核タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築され、それを、当技術分野において公知の標準的な電気穿孔またはトランスフェクション技術を使用して細胞に直接送達することができる。
ベクター
【０２６０】
一部の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）およびドナーポリヌクレオチドは、１つまたは複数のベクターにより提供され得る。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡベクターであり得る。一部の実施形態では、ベクターは、環状であり得る。他の実施形態では、ベクターは、直鎖状であり得る。非限定的な例示的ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、ミニ染色体、トランスポゾン、ウイルスベクター、および発現ベクターが挙げられる。
【０２６１】
一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、ウイルスベクターをその野生型対応物から遺伝子改変することができる。例えば、ウイルスベクターは、クローニングを助長するために、またはベクターの１つもしくは複数の特性を変化させるために、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換を含み得る。そのような特性としては、パッケージング能力、形質導入効率、免疫原性、ゲノム組込み、複製、転写および翻訳を挙げることができる。一部の実施形態では、ウイルスが、より大きいサイズを有する外因性配列をパッケージングすることができるように、ウイルスゲノムの一部分を欠失させることができる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、形質導入効率の向上を有することができる。一部の実施形態では、宿主におけるウイルスにより誘導される免疫応答を低減させることができる。一部の実施形態では、宿主ゲノムへのウイルス配列の組込みを促進するウイルス遺伝子（例えば、インテグラーゼなど）を、ウイルスが組み込まれないように突然変異させることができる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、複製欠損型であり得る。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ベクター上のコード配列の発現を駆動するために外因性転写または翻訳制御配列を含み得る。一部の実施形態では、ウイルスは、ヘルパー依存性であり得る。例えば、ウイルスは、ベクターの増幅およびウイルス粒子へのパッケージングに必要とされるウイルス成分（例えば、ウイルスタンパク質）を供給するために、１つまたは複数のヘルパーウイルスを必要とすることがある。そのような場合、ウイルス成分をコードする１つまたは複数のベクターを含む、１つまたは複数のヘルパー成分を、本明細書に記載されるベクター系と共に宿主細胞に導入することができる。他の実施形態では、ウイルスは、ヘルパーフリーであり得る。例えば、ウイルスは、一切のヘルパーウイルスなしにベクターを増幅およびパッケージングすることができることがある。一部の実施形態では、本明細書に記載されるベクター系は、ウイルス増幅およびパッケージングに必要とされるウイルス成分もコードし得る。
【０２６２】
非限定的な例示的ウイルスベクターとしては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター、バクテリオファージＴ４、バキュロウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターが挙げられる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターであり得る。他の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、レンチウイルスは、非組込み型であり得る。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、アデノウイルスは、そのパッケージング能力を増大させるために５’および３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）ならびにパッケージングシグナル（Ψ）以外の全てのコードウイルス領域がウイルスから欠失されている、高クローニング能または「ガットレス」アデノウイルスであり得る。さらに他の実施形態では、ウイルスベクターは、ＨＳＶ−１ベクターであり得る。一部の実施形態では、ＨＳＶ−１に基づくベクターは、ヘルパー依存性であり、他の実施形態では、それは、ヘルパー非依存性である。例えば、パッケージング配列のみを保持するアンプリコンベクターは、パッケージングのための構造成分を有するヘルパーウイルスを必要とするが、非必須ウイルス機能を除去する３０ｋｂ欠失ＨＳＶ−１ベクターは、ヘルパーウイルスを必要としない。追加の実施形態では、ウイルスベクターは、バクテリオファージＴ４であり得る。一部の実施形態では、バクテリオファージＴ４は、ウイルスの頭部を空にすると、任意の直鎖状または環状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子をパッケージングすることが可能であり得る。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、バキュロウイルスベクターであり得る。なおさらなる実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであり得る。より小さいクローニング能を有するＡＡＶまたはレンチウイルスベクターを使用する実施形態では、本明細書で開示のベクター系の全ての成分を送達するために１つより多くのベクターを使用することが必要であることがある。例えば、１つのＡＡＶベクターは、Ｃａｓ９タンパク質をコードする配列を含有することがあり、その一方で、第２のＡＡＶベクターは、１つまたは複数のガイド配列とドナーポリヌクレオチドの１つまたは複数のコピーとを含有することがある。
【０２６３】
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、特定の組織または細胞型を標的化するために改変され得る。例えば、ウイルス表面タンパク質は、その天然細胞表面受容体に結合するウイルスタンパク質を減少または消失させるように変更され得る。表面タンパク質が、所望の細胞型に特異的な受容体と相互作用するように操作されることもある。ウイルスベクターは、限定されたまたは再指向された親和性を含む、変更された宿主親和性を有し得る。ある特定の操作されたウイルスベクターは、例えば、ＷＯ２０１１１３０７４９［ＨＳＶ］、ＷＯ２０１５００９９５２［ＨＳＶ］、米国特許第５，８１７，４９１号［レトロウイルス］、ＷＯ２０１４１３５９９８［Ｔ４］、およびＷＯ２０１１１２５０５４［Ｔ４］に記載されている。一部の実施形態では、ベクターは、細胞における１つまたは複数のコード配列の発現を駆動することができることがある。一部の実施形態では、細胞は、例えば、酵母、植物、昆虫または哺乳動物細胞などの、真核細胞であり得る。一部の実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞であり得る。一部の実施形態では、真核細胞は、げっ歯動物細胞であり得る。一部の実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞であり得る。異なる種類の細胞における発現を駆動するのに適したプロモーターは、当技術分野において公知である。一部の実施形態では、プロモーターは、野生型であり得る。他の実施形態では、プロモーターは、より効率的なまたは効果的な発現のために改変され得る。さらに他の実施形態では、プロモーターは、短縮化され得るが、その機能をなお保持し得る。例えば、プロモーターは、通常のサイズを有することもあり、またはウイルスへのベクターの適切なパッケージングに適している低減されたサイズを有することもある。
【０２６４】
一部の実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、ベクター系は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の１つのコピーを含み得る。他の実施形態では、ベクター系は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の１つより多くのコピーを含み得る。一部の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写または翻訳制御配列に作動可能に連結され得る。一部の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結され得る。一部の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写または翻訳制御配列に作動可能に連結され得る。
【０２６５】
一部の実施形態では、プロモーターは、構成的、誘導性または組織特異的であり得る。一部の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。非限定的な例示的構成的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、サルウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期（ＭＬＰ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子−アルファ（ＥＦ１α）プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、これらの機能的断片、または前述のもののいずれかの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであり得る。一部の実施形態では、プロモーターは、短縮型ＣＭＶプロモーターであり得る。他の実施形態では、プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターであり得る。一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。非限定的な例示的誘導性プロモーターとしては、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質またはアルコールにより誘導され得るものが挙げられる。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、例えばＴｅｔ−Ｏｎ（登録商標）プロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの、低い基礎（非誘導）発現レベルを有するものであり得る。一部の実施形態では、プロモーターは、組織特異プロモーターであり得る。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、排他的にまたは主に肝臓組織に発現される。非限定的な例示的組織特異的プロモーターとしては、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ−１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ−１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ−２プロモーター、ＩＮＦ−βプロモーター、Ｍｂプロモーター、Ｎｐｈｓｌプロモーター、ＯＧ−２プロモーター、ＳＰ−Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、およびＷＡＳＰプロモーターが挙げられる。
【０２６６】
一部の実施形態では、ベクターによりコードされるヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質などの、Ｃａｓタンパク質であり得る。ベクター系は、本明細書に記載されるガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクターをさらに含み得る。一部の実施形態では、ベクター系は、ガイドＲＮＡの１つのコピーを含み得る。他の実施形態では、ベクター系は、ガイドＲＮＡの１つより多くのコピーを含み得る。１つより多くのガイドＲＮＡを伴う実施形態では、ガイドＲＮＡは、非同一であり得、したがって、それらは、異なる標的配列を標的にするか、または他の異なる特性、例えば、Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体内での活性もしくは安定性を有し得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写または翻訳制御配列に作動可能に連結され得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結され得る。一部の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）により認識され得る。Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの非限定的な例としては、Ｕ６、Ｈ１およびｔＲＮＡプロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトＵ６プロモーターに作動可能に連結され得る。他の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトＨ１プロモーターに作動可能に連結され得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトｔＲＮＡプロモーターに作動可能に連結され得る。１つより多くのガイドＲＮＡを伴う実施形態では、発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同じであることもあり、または異なることもある。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド、およびガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチドを、同じベクター上に備えることができる。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド、およびｔｒａｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチドを、同じプロモーターにより駆動することができる。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを転写して単一転写物にすることができる。例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを単一転写物からプロセシングして二重分子ガイドＲＮＡを形成することができる。あるいは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを転写して単分子ガイドＲＮＡにすることができる。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを同じベクター上のそれらの対応するプロモーターにより駆動することができる。さらに他の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、異なるベクターによりコードされ得る。
【０２６７】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む同じベクター上に位置し得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現およびＣａｓ９タンパク質の発現は、異なるプロモーターにより駆動され得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現は、Ｃａｓ９タンパク質の発現を駆動する同じプロモーターにより駆動され得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質転写物は、単一転写物内に含有され得る。例えば、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質転写物の非翻訳領域（ＵＴＲ）内にあり得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質転写物の５’ＵＴＲ内にあり得る。他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質転写物の３’ＵＴＲ内にあり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質転写物の細胞内半減期を、３’ＵＴＲ内にガイドＲＮＡを含有することおよびそれによってその３’ＵＴＲの長さを短縮することにより、低減させることができる。追加の実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質転写物のイントロン内にあり得る。一部の実施形態では、適切なスプライス部位が、ガイドＲＮＡが位置するイントロンに、ガイドＲＮＡが、転写物から適切にスプライスされるように付加され得る。一部の実施形態では、同じベクター上のごく近位でのＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡの発現は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のより効率的な形成を助長し得る。
【０２６８】
一部の実施形態では、ベクター系は、本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチドを含むベクターをさらに含み得る。一部の実施形態では、ベクター系は、ドナーポリヌクレオチドの１つのコピーを含み得る。他の実施形態では、ベクター系は、ドナーポリヌクレオチドの１つより多くのコピーを含み得る。一部の実施形態では、ベクター系は、ドナーポリヌクレオチドの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くのコピーを含み得る。ドナーポリヌクレオチドの複数のコピーは、同じまたは異なるベクター上に位置し得る。ドナーポリヌクレオチドの複数のコピーは、互いに隣接していることもあり、または他のヌクレオチド配列もしくはベクターエレメントにより隔てられていることもある。
【０２６９】
ベクター系は、１〜３つのベクターを含み得る。一部の実施形態では、ベクター系は、１つの単一ベクターを含み得る。他の実施形態では、ベクター系は、２つのベクターを含み得る。追加の実施形態では、ベクター系は、３つのベクターを含み得る。異なるガイドＲＮＡもしくはドナーポリヌクレオチドが多重化に使用される場合、またはガイドＲＮＡもしくはドナーポリヌクレオチドの複数のコピーが使用される場合、ベクター系は、３つより多くのベクターを含み得る。
【０２７０】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、およびドナーポリヌクレオチドは、同じまたは別個のベクター上に位置し得る。一部の実施形態では、これらの配列の全てが、同じベクター上に位置し得る。一部の実施形態では、２つまたはそれより多くの配列が、同じベクター上に位置し得る。配列は、ベクター上で同じまたは異なる方向におよび任意の順序で配向され得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、同じベクター上に位置し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびドナーポリヌクレオチドは、同じベクター上に位置し得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、およびドナーポリヌクレオチドは、同じベクター上に位置し得る。一部の実施形態では、ベクター系は、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のベクター、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とドナーポリヌクレオチドとを含む第２のベクターを含み得る。
ナノ粒子組成物
【０２７１】
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチド、系、または系の成分を含む、ナノ粒子組成物（例えば、脂質ナノ粒子、ＬＮＰ）を提供する。本開示のドナーポリヌクレオチド、系、または系の成分は、対象（例えば、突然変異を有する患者）に送達されたときにそれらの細胞取込みを助長するおよび／またはそれらが分解しないように保護するために、ナノ粒子または他の送達媒体（例えば、高分子ナノ粒子）で個々にまたは一緒に組み合わせて製剤化され得る。実例となるナノ粒子は、Ｐａｎｙａｍ  ＆  Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ  （２００３）  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５５：３２９−３４７およびＰｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ．  ２：７５１−７６０に記載されている。
【０２７２】
ナノ粒子は、包囲している界面層を含めてサイズが通常は１ナノメートル〜１００乃至５００ナノメートル（ｎｍ）の間の範囲である超微粒子であって、サイズ関連またはサイズ依存的特性を示すことが多い超微粒子である。ナノ粒子組成物は無数にあり、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）およびリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、直径５００ｎｍまたはそれ未満である脂質二重層を有するリポソームであり得る。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、１つまたは複数の脂質二重層を含む小胞である。ある特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、水性区画により隔てられた２つまたはそれより多くの同心円状の二重層を含む。脂質二重層を官能化することおよび／または互いに架橋させることができる。脂質二重層は、１つまたは複数のリガンド、タンパク質またはチャネルを含むことができる。
【０２７３】
ナノ粒子組成物を様々な方法で特徴付けることができる。例えば、顕微鏡観察（例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査電子顕微鏡観察）を使用して、ナノ粒子組成物の形態およびサイズ分布を調査することができる。動的光散乱または電位差測定（例えば、電位差滴定）を使用して、ゼータ電位を測定することができる。動的光散乱を利用して粒径を決定することもできる。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）などの計器を使用して、粒径、多分散指数およびゼータ電位などの、ナノ粒子組成物の複数の特徴を測定することもできる。
【０２７４】
ナノ粒子のサイズは、これに限定されないが炎症などの、生体反応を弱めるのに役立つことができ、またはポリヌクレオチドの生物学的効果を増大させることができる。ナノ粒子のサイズが生体内分布、免疫応答および細胞取込みを変化させることもある。
【０２７５】
本明細書で使用される場合、ナノ粒子組成物の文脈での「サイズ」または「平均サイズ」は、ナノ粒子組成物の平均直径を指す。
【０２７６】
一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、約１０〜約１００ｎｍ、例えば、これらに限定されないが、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍおよび／または約９０〜約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子で製剤化される。
【０２７７】
一実施形態では、ナノ粒子は、約１０〜５００ｎｍの直径を有する。一実施形態では、ナノ粒子は、１００ｎｍより大きい、１５０ｎｍより大きい、２００ｎｍより大きい、２５０ｎｍより大きい、３００ｎｍより大きい、３５０ｎｍより大きい、４００ｎｍより大きい、４５０ｎｍより大きい、５００ｎｍより大きい、５５０ｎｍより大きい、６００ｎｍより大きい、６５０ｎｍより大きい、７００ｎｍより大きい、７５０ｎｍより大きい、８００ｎｍより大きい、８５０ｎｍより大きい、９００ｎｍより大きい、９５０ｎｍより大きいまたは１０００ｎｍより大きい直径を有する。
【０２７８】
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物の最大寸法は、１μｍまたはそれ未満（例えば、１μｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、またはそれ未満）である。
【０２７９】
ナノ粒子組成物は、比較的均質であり得る。多分散指数を使用して、ナノ粒子組成物の均質性、例えば、ナノ粒子組成物の粒径分布を示すことができる。小さい（例えば、０．３未満の）多分散指数は、狭い粒径分布を一般に示す。ナノ粒子組成物は、約０〜約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５の多分散指数を有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるナノ粒子組成物の多分散指数は、約０．１０〜約０．２０であり得る。
【０２８０】
ナノ粒子組成物のゼータ電位を使用して、組成物の界面動電位を示すことができる。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷を説明することができる。より高電荷の種は、細胞、組織および体内の他の要素と望ましくない相互作用をし得るので、正または負の比較的低い電荷を有するナノ粒子組成物が一般に望ましい。一部の実施形態では、本明細書で開示されるナノ粒子組成物のゼータ電位は、約−１０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約１０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約−５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ〜約＋１０ｍＶであり得る。
【０２８１】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約０ｍＶ〜約２０ｍＶ、約０ｍＶ〜約１０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約１０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約２０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約２０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約３０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約４０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約６０ｍＶ、および約４０ｍＶ〜約５０ｍＶであり得る。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約１５ｍＶ〜約４５ｍＶ、約２０ｍＶ〜約４０ｍＶ、および約２５ｍＶ〜約３５ｍＶであり得る。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ、約２０ｍＶ、約３０ｍＶ、約４０ｍＶ、約５０ｍＶ、約６０ｍＶ、約７０ｍＶ、約８０ｍＶ、約９０ｍＶ、および約１００ｍＶであり得る。
【０２８２】
一部の実施形態では、ナノ粒子のｐＫａは、約５〜８である。一部の実施形態では、ナノ粒子のｐＫａは、約５である。一部の実施形態では、ナノ粒子のｐＫａは、約６である。一部の実施形態では、ナノ粒子のｐＫａは、約７である。一部の実施形態では、ナノ粒子のｐＫａは、約８である。
【０２８３】
ポリヌクレオチドの「カプセル化効率」という用語は、提供された最初の量に対する、調製後のナノ粒子組成物によってカプセル化されるまたは調製後のナノ粒子組成物に別様に付随するポリヌクレオチドの量を記述するものである。本明細書で使用される場合、「カプセル化」は、完全な、実質的なまたは部分的な封入、閉じ込め、包囲または内包を指すことができる。
【０２８４】
カプセル化効率は、望ましくは高い（例えば、１００％に近い）。カプセル化効率は、例えば、１つまたは複数の有機溶媒または界面活性剤でナノ粒子組成物を破壊する前と破壊した後のナノ粒子組成物を含有する溶液中のポリヌクレオチドの量を比較することにより、測定することができる。
【０２８５】
蛍光を使用して、溶液中の遊離ポリヌクレオチドの量を測定することができる。本明細書に記載されるナノ粒子組成物について、ポリヌクレオチドのカプセル化効率は、少なくとも５０％、例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり得る。一部の実施形態では、カプセル化効率は、少なくとも８０％であり得る。ある特定の実施形態では、カプセル化効率は、少なくとも９０％であり得る。
【０２８６】
ある特定の実施形態では、本開示のドナーポリヌクレオチドまたは系は、ナノ粒子内にカプセル化される。一部の実施形態では、単一ヌクレオチド配列を含む１つまたは複数のドナーポリヌクレオチドが、ナノ粒子内にカプセル化される。一部の実施形態では、異なるヌクレオチド配列含む１つまたは複数のドナーポリヌクレオチドが、ナノ粒子内にカプセル化される。
【０２８７】
一部の実施形態では、本開示の系は、ナノ粒子内にカプセル化される。一部の実施形態では、本開示の系の１つまたは複数の成分は、個々にナノ粒子内にカプセル化される。一部の実施形態では、本開示の系の各成分は、個々にナノ粒子内にカプセル化される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡが、ナノ粒子内にカプセル化される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするｍＲＮＡが、ナノ粒子内にカプセル化される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ、およびヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするｍＲＮＡが、ナノ粒子内にカプセル化される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするｍＲＮＡ、およびドナーポリヌクレオチドが、ナノ粒子内にカプセル化される。
脂質ナノ粒子
【０２８８】
特定の実施形態では、ナノ粒子は、脂質を含む。脂質ナノ粒子は、リポソームおよびミセルを含むが、これらに限定されない。カチオン性および／もしくはイオン化可能な脂質、アニオン性脂質、中性脂質、両親媒性脂質、複合脂質（例えば、ＰＥＧ化脂質）、ならびに／または構造脂質を含む、いくつかの脂質のいずれが存在してもよい。そのような脂質を単独でまたは組み合わせて使用することができる。
【０２８９】
一部の態様では、ドナーポリヌクレオチド、系、または系の１つもしくは複数の成分、例えば、本明細書に記載されるものは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を構成する。本明細書に記載されるＬＮＰの各々は、本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチド、系、または系の任意の１つもしくは複数の成分のいずれかについての製剤として使用され得る。
カチオン性／イオン化可能な脂質
【０２９０】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性および／またはイオン化可能な脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、「イオン化可能な脂質」は、当技術分野におけるその通常の意味を有するものであり、１つまたは複数の荷電部分を含む脂質を指すことができる。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、正に荷電していることもあり、または負に荷電していることもある。イオン化可能な脂質は、正に荷電していることがあり、その場合、「カチオン性脂質」と呼ばれることがある。ある特定の実施形態では、イオン化可能な脂質分子は、アミン基を含むことがあり、イオン化可能なアミノ脂質と呼ばれることがある。本明細書で使用される場合、「荷電部分」は、形式電子電荷、例えば、一価（＋１または−１）、二価（＋２または−２）、三価（＋３または−３）などを有する、化学的部分である。荷電部分は、アニオン性である（すなわち、負に荷電している）こともあり、またはカチオン性である（すなわち、正に荷電している）こともある。正荷電部分の例としては、アミン基（例えば、第一級、第二級および／または第三級アミン）、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基、およびイミダゾリウム（ｉｍｉｄｉｚｏｌｉｕｍ）基が挙げられる。特定の実施形態では、荷電部分は、アミン基を含む。負荷電基またはその前駆体の例としては、カルボン酸基、スルホン酸基、硫酸基、ホスホン酸基、リン酸基、ヒドロキシル基などが挙げられる。荷電部分の電荷は、一部の場合には環境条件によって異なることがあり、例えば、ｐＨの変化は、その部分の電荷を変えることがあり、および／またはその部分を荷電状態もしくは非荷電状態にならせることもある。一般に、分子の電荷密度を所望に応じて選択することができる。
【０２９１】
用語「荷電」または「荷電部分」が分子上の「部分的負電荷」または「部分的正電荷」を指さないことを理解されたい。用語「部分的負電荷」および「部分的正電荷」には、当技術分野におけるその通常の意味が与えられる。「部分的負電荷」は、電子密度が結合の一方の原子の方に引っ張られて、その原子上に部分的負電荷が生じるように分極される結合を官能基が含む場合に生じ得る。当業者には、一般に、このようにして分極され得る結合が分かるであろう。
【０２９２】
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、当技術分野において「イオン化可能なカチオン性脂質」と呼ばれることがある、イオン化可能なアミノ脂質である。一実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、リンカー構造によって接続されている、正荷電親水性頭部と疎水性尾部を有し得る。これらに加えて、イオン化可能な脂質は、環状アミン基を含む脂質であることもある。
【０２９３】
一実施形態では、イオン化可能な脂質は、これらに限定されないが、国際公開番号ＷＯ２０１３０８６３５４およびＷＯ２０１３１１６１２６に記載されているイオン化可能な脂質から、選択することができる。
【０２９４】
さらに別の実施形態では、イオン化可能な脂質は、これに限定されないが、米国特許第７，４０４，９６９号の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＸＸＩＩから、選択することができる。
【０２９５】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８）のカチオン性および／またはイオン化可能な脂質を含み得る。そのようなカチオン性および／またはイオン化可能な脂質は、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタナミン（ＫＬ１０）、Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタナミン（ＫＬ２２）、１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）、Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ」）、３−β−（Ｎ−−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アンモニウムトリフルオロアセテート（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）、およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）を含むが、これらに限定されない。
【０２９６】
加えて、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む）、およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む）などの、カチオン性および／またはイオン化可能な脂質のいくつかの市販調製物を、使用することができる。ＫＬ１０、ＫＬ２２およびＫＬ２５は、例えば、米国特許第８，６９１，７５０号に記載されている。
アニオン性脂質
【０２９７】
本開示の脂質ナノ粒子での使用に適するアニオン性脂質は、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−ｄｏｄｅｃａｎｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌｏａｍｉｎｅ）、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、および中性脂質に結合された他のアニオン性修飾基を含むが、これらに限定されない。
中性脂質
【０２９８】
本開示の脂質ナノ粒子での使用に適する中性脂質（非荷電脂質と双性イオン性脂質の両方を含む）は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、ステロール（例えば、コレステロール）およびセレブロシドを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、コレステロールを含む。様々な鎖長および飽和度の様々なアシル鎖基を有する脂質が入手可能であり、または周知の技術によりそれらを単離もしくは合成することができる。加えて、飽和および不飽和脂肪酸鎖および環状領域の混合物を有する脂質を使用することができる。一部の実施形態では、本開示で使用される中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、または任意の関連ホスファチジルコリンである。一部の実施形態では、中性脂質は、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、またはセリンおよびイノシトールなどの他の頭部基を有するリン脂質で構成されていることがある。
両親媒性脂質
【０２９９】
一部の実施形態では、両親媒性脂質が本開示のナノ粒子に含まれる。本開示のナノ粒子での使用に適する例示的な両親媒性脂質は、スフィンゴ脂質、リン脂質、脂肪酸およびアミノ脂質を含むが、これらに限定されない。
【０３００】
本明細書で開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つもしくは複数のリン脂質、例えば、１つもしくは複数の飽和もしくは（多価）不飽和リン脂質、またはこれらの組合せを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分と１つまたは複数の脂肪酸部分とを含む。
【０３０１】
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２−リソホスファチジルコリン、およびスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択することができる。
【０３０２】
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ−リノレイン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択することができる。
【０３０３】
特定の両親媒性脂質は、膜への融合を助長することができる。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つまたは複数の負荷電リン脂質と相互作用することができる。膜へのリン脂質の融合は、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つまたは複数の要素（例えば、治療剤）による膜の通過を可能にし、それによって、例えば、標的組織への１つまたは複数の要素の送達を可能にすることができる。
【０３０４】
分岐、酸化、環化およびアルキンを含む修飾および置換を有する天然種を含む非天然両親媒性脂質種も企図される。例えば、リン脂質を、１つまたは複数のアルキン（例えば、１つまたは複数の二重結合が三重結合で置換されているアルケニル基）で官能化することまたはそのようなアルキンに架橋させることができる。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドへの曝露時に銅触媒付加環化を受けることができる。そのような反応は、膜透過もしくは細胞認識を助長するためのナノ粒子組成物の脂質二重層の官能化に、または標的化部分もしくはイメージング部分（例えば、色素）などの有用な成分へのナノ粒子組成物のコンジュゲーションに、有用であり得る。
【０３０５】
リン脂質は、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジン酸を含むが、これらに限定されない。リン脂質は、スフィンゴミエリンなどのリンスフィンゴ脂質も含む。
【０３０６】
他のリンを欠く化合物、例えば、スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ−アシルオキシ酸も、使用することができる。加えて、そのような両親媒性脂質を、トリグリセリドおよびステロールなどの他の脂質と容易に混合することができる。
ＰＥＧ化脂質
【０３０７】
脂質ナノ粒子組成物の脂質成分は、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質などの、ポリエチレングリコールを含む１つまたは複数の分子を含み得る。そのような種は、代替的にＰＥＧ化脂質と呼ばれることがある。ＰＥＧ化脂質（ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質としても公知）は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、およびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールからなる非限定的な群から選択することができる。例えば、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。
【０３０８】
一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ  ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ−ＤＭＧは、次の構造を有する：
【化１】
2021529518.tif 000002
【０３０９】
一実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、国際公開番号ＷＯ２０１２０９９７５５に記載されているＰＥＧ化脂質であり得る。本明細書に記載されるこれらの例示的ＰＥＧ脂質のいずれかを、ＰＥＧ鎖上にヒドロキシル基を含むように修飾することができる。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ＯＨ脂質である。本明細書で一般に定義されるように、「ＰＥＧ−ＯＨ脂質」（本明細書では「ヒドロキシ−ＰＥＧ化脂質」とも呼ばれる）は、脂質上に１つまたは複数のヒドロキシル（−ＯＨ）基を有するＰＥＧ化脂質である。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ−ＯＨ脂質は、ＰＥＧ鎖上に１つまたは複数のヒドロキシル基を含む。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ−ＯＨまたはヒドロキシ−ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に−ＯＨ基を含む。可能なもの各々が、本発明の別個の実施形態に相当する。一部の実施形態では、ＰＥＧ鎖の長さは、約２５０、約５００、約１０００、約２０００、約３０００、約５０００、約１００００のエチレンオキシド単位を含む。
構造脂質
【０３１０】
本明細書で開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つまたは複数の構造脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、用語「構造脂質」は、ステロールを指し、ステロール部分を含有する脂質も指す。
【０３１１】
脂質ナノ粒子への構造脂質の組込みは、粒子中の他の脂質の凝集の軽減に役立ち得る。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ−トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、およびこれらの混合物を、それらに限定されないが、含む群から選択することができる。一部の実施形態では、構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義される場合、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドのサブグループである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールの類似体である。
標的化部分
【０３１２】
ある特定の実施形態では、細胞型および／または組織型に特異的である標的化部分を使用して本開示のナノ粒子、例えば脂質ナノ粒子、を標的化することが望ましい。一部の実施形態では、標的化部分を使用してナノ粒子を特定の細胞、組織および／または臓器に標的化することができる。特定の実施形態では、ナノ粒子は、標的化部分を含む。例示的な非限定的標的化部分としては、リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質、ビタミン（例えば、リボフラビン）、および抗体（例えば、完全長抗体、抗体断片（例えば、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）２断片）、単一ドメイン抗体、ラクダ科動物抗体およびそれらの断片、ヒト抗体およびそれらの断片、モノクローナル抗体、ならびに多特異性抗体（例えば、二特異性抗体））が挙げられる。一部の実施形態では、標的化部分は、ポリペプチドであり得る。標的化部分は、ポリペプチド（例えば、ペプチドもしくはタンパク質）全体を含むこともあり、またはその断片を含むこともある。標的化部分は、標的化部分が標的、例えば細胞表面受容体、との相互作用に利用可能であるように、ナノ粒子の外面に通常は位置する。例えば、Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｇ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ４２（５）：４３９−６２，  ２００３およびＡｂｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １２：１−３，  ２００２に記載されているものを含む、様々な異なる標的化部分および方法が、当技術分野では公知であり、利用可能である。
【０３１３】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（例えば、リポソーム）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖などの親水性ポリマー鎖の表面コーティングを含み得る（例えば、Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １２３７：  ９９−１０８，  １９９５；ＤｅＦｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １１８：  ６１０１−６１０４，  １９９６；Ｂｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１４９：  １８０−１８４，１９９３；Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２：  ３２１−３３４，  １９９２；米国特許第５，０１３，５５６号；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４：  ２９６−２９９，  １９９３；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５３：  ７１−７４，  １９９４；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，  ｉｎ  Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ９  （Ｌａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｅｄｓ）  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  Ｆｌａ．，  １９９５を参照されたい）。１つの手法では、脂質ナノ粒子を標的化するための標的化部分は、ナノ粒子を形成する脂質の極性頭部基に連結される。別の手法では、標的化部分は、親水性ポリマーコーティングを形成するＰＥＧ鎖の遠位端に結合される（例えば、Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２：  ３２１−３３４，  １９９２；Ｋｉｒｐｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３８８：  １１５−１１８，  １９９６を参照されたい）。
【０３１４】
標的化部分（単数または複数）をカップリングするための標準的な方法を使用することができる。例えば、標的化部分の結合のために活性化され得るホスファチジルエタノールアミン、または誘導体化された親油性化合物、例えば脂質誘導体化ブレオマイシンを使用することができる。抗体で標的化されたリポソームを、例えばプロテインＡを含むリポソームを使用して、構築することができる（例えば、Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６５：１６３３７−１６３４２，  １９９０およびＬｅｏｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），  ８７：２４４８−２４５１，  １９９０を参照されたい）。抗体コンジュゲーションの他の例は、米国特許第６，０２７，７２６号に開示されている。標的化部分の例としては、新生物または腫瘍に関連する抗原を含む、細胞成分に特異的である他のポリペプチドも挙げることができる。標的化部分として使用されるポリペプチドは、共有結合によってリポソームに結合させることができる（例えば、Ｈｅａｔｈ，  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，  １４９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１１−１１９  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９８７）を参照されたい）。他の標的化方法は、ビオチン−アビジン系を含む。
【０３１５】
一部の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、肝細胞、結腸細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜表層細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞（原発性腫瘍細胞および転移性腫瘍細胞を含む）を含むがこれらに限定されない細胞に脂質ナノ粒子を標的化する、標的化部分を含む。特定の実施形態では、標的化部分は、脂質ナノ粒子を肝細胞に標的化する。
脂質様物質
【０３１６】
本明細書に記載される脂質ナノ粒子は、脂質様物質に基づくことがある。脂質様物質の合成は、詳しく記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、ポリヌクレオチドの送達に特に適している（Ｍａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  ２０１０  ２１：１４４８−１４５４；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．２０１０  ２６７：９−２１；Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８  ２６：５６１−５６９；Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２０１０  １０７：１８６４−１８６９；Ｓｉｅｇｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２０１１  １０８：１２９９６−３００１を参照されたい）。
【０３１７】
本発明によれば、これらの脂質様物質を含有する複合体、ミセル、リポソームまたは粒子（例えば、ナノ粒子）を調製することができ、したがって、それらの複合体、ミセル、リポソームまたは粒子は、例えば、局所的または全身性投与経路による注射後、ドナーポリヌクレオチドのｇＤＮＡへの挿入によって判定して、ドナーポリヌクレオチドまたは系の有効な送達をもたらすことができる。脂質様物質複合体を含む医薬組成物を、本明細書で開示される様々な手段により投与することができる。
【０３１８】
筋肉内または皮下経路用の最適化脂質様物質製剤の特徴は、標的細胞型、および細胞外基質を通って血流に拡散する製剤の能力に依存して、有意に異なり得る。内皮小孔のサイズのため１５０ｎｍ未満の粒径が有効な肝細胞送達に望ましい可能性がある（例えば、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  １７：８７２−８７９を参照されたい）が、内皮細胞、骨髄性細胞および筋肉細胞を含むがこれらに限定されない他の細胞型に製剤を送達するための脂質様物質オリゴヌクレオチドの使用は、同様のサイズ制限を受けない可能性がある。
【０３１９】
一態様、単球などの骨髄性細胞への有効な送達、では、脂質様物質製剤は、同様の成分モル比を有し得る。異なる比の、脂質様物質と、中性脂質（例えば、ジアシルホスファチジルコリン）、コレステロール、ＰＥＧ化脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ）および脂肪酸（例えば、オメガ−３脂肪酸）をこれらに限定されないが含む他の成分とを使用して、肝細胞、骨髄性細胞、筋肉細胞などをこれらに限定されないが含む異なる細胞型への送達用にドナーポリヌクレオチドまたは系の製剤を最適化することができる。例示的な脂質様物質としては、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００（ビタミンおよび誘導体を含む）、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡおよびこれらの類似体が挙げられるが、それらに限定されない。皮下または筋肉内送達のどちらかによる細胞（例えば、これらに限定されないが、脂肪細胞および筋肉細胞）への核酸の局所的送達のための脂質様物質製剤の使用は、全身性送達に必要とされ得る製剤成分、したがって脂質様物質およびドナーポリヌクレオチドまたは系を含み得る製剤成分の全てを、必ずしも必要としないこともある。
【０３２０】
さらなる実施形態では、異なる脂質様物質の組合せを使用して、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドまたは系の有効性を改善することができる。
【０３２１】
本開示によれば、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチドまたは系は、細胞への添加の前に、ドナーポリヌクレオチド、または系、または系の個々の成分を脂質様物質と規定の比で混合することにより、製剤化され得る。ｉｎ  ｖｉｖｏ製剤は、全身の循環を助長するための特別成分の添加を必要とすることがある。粒子の形成後、本開示により提供されるドナーポリヌクレオチド、系、または系の個々の成分が添加され、複合体と一体化させられる。カプセル化効率は、標準的色素排除アッセイを使用して判定される。
【０３２２】
本開示のドナーポリヌクレオチドおよび／または系のｉｎ  ｖｉｖｏ送達は、製剤組成、粒子ＰＥＧ化の性質、負荷度、オリゴヌクレオチドの脂質に対する比、および生物物理学的パラメーター、例えば粒径、を含むがこれらに限定されない、多くのパラメーターによる影響を受け得る（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００９  １７：８７２−８７９）。例として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質のアンカー鎖長の小さい変化が、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性に有意な影響を与える結果となることがある。ペンタ［３−（１−ラウリルアミノプロピオニル）］−トリエチレンテトラミン塩酸塩（ＴＥＴＡ−５ＬＡＰ、別名９８Ｎ１２−５；Ｍｕｒｕｇａｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４０１：６１  （２０１０）を参照されたい）、Ｃ１２−２００（誘導体およびバリアントを含む）、ＭＤ１、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡおよびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡを含むがこれらに限定されない、異なる脂質様物質を有する製剤を、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性について試験することができる。本明細書で「９８Ｎ１２−５」と呼ばれる脂質様物質は、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００９  １７：８７２−８７９により開示されている。本明細書で「Ｃ１２−２００」と呼ばれる脂質様物質は、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２０１０  １０７：１８６４−１８６９およびＬｉｕ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  ２０１０  ６６９−６７０により開示されている。
【０３２３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでｇＤＮＡのヌクレオチド配列を変更する（例えば、突然変異を修正または誘導する）、脂質様物質配合ドナーポリヌクレオチドまたは系の能力を、当技術分野において公知のまたは本明細書に記載される任意の技術（例えば、次世代ＤＮＡシークエンシング）により判定することができる。
他の成分
【０３２４】
本明細書で開示されるナノ粒子は、上記のものに加えて１つまたは複数の成分を含むことができる。例えば、脂質組成物は、１つまたは複数の透過性亢進分子、炭水化物、ポリマー、表面変更剤（例えば、界面活性剤）または他の成分を含むことができる。例えば、透過性亢進分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号により記載されている分子であり得る。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）および多糖（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体および類似体）を含み得る。
医薬組成物
【０３２５】
本開示は、ドナーポリヌクレオチド、ｇＲＮＡ、およびＣａｓ９タンパク質を、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤と組み合わせて含む、医薬組成物を含む。特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子内にカプセル化される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ナノ粒子内にカプセル化される。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、ＳｐＣａｓ９）は、ナノ粒子内にカプセル化される。特定の実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、またはＣａｓヌクレアーゼをカプセル化するナノ粒子が、医薬組成物に存在する。様々な実施形態では、医薬組成物に存在する１つまたは複数のｍＲＮＡは、ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子内にカプセル化される。特定の実施形態では、第１のｍＲＮＡの第２のｍＲＮＡに対するモル比は、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１、約１０：１、約２５：１、または約５０：１である。特定の実施形態では、第１のｍＲＮＡの第２のｍＲＮＡに対するモル比は、より大きい。
【０３２６】
一部の実施形態では、脂質組成物とドナーポリヌクレオチドの間の比は、約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１または６０：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。一部の実施形態では、脂質組成物のポリヌクレオチドに対するｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１または約１５：１である。
【０３２７】
一実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド（例えば、ドナーポリヌクレオチド）を５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１もしくは７０：１の脂質：ポリヌクレオチド重量比で、またはこれらの比の範囲のいずれか、例えば、これらに限定されないが、５：１〜約１０：１、約５：１〜約１５：１、約５：１〜約２０：１、約５：１〜約２５：１、約５：１〜約３０：１、約５：１〜約３５：１、約５：１〜約４０：１、約５：１〜約４５：１、約５：１〜約５０：１、約５：１〜約５５：１、約５：１〜約６０：１、約５：１〜約７０：１、約１０：１〜約１５：１、約１０：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１、約１０：１〜約３０：１、約１０：１〜約３５：１、約１０：１〜約４０：１、約１０：１〜約４５：１、約１０：１〜約５０：１、約１０：１〜約５５：１、約１０：１〜約６０：１、約１０：１〜約７０：１、約１５：１〜約２０：１、約１５：１〜約２５：１、約１５：１〜約３０：１、約１５：１〜約３５：１、約１５：１〜約４０：１、約１５：１〜約４５：１、約１５：１〜約５０：１、約１５：１〜約５５：１、約１５：１〜約６０：１もしくは約１５：１〜約７０：１で、含み得る。
【０３２８】
一実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチドを、およそ０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、例えば、これらに限定されないが、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌの濃度または２．０ｍｇ／ｍｌより高い濃度で含み得る。
処置方法
【０３２９】
ゲノムＤＮＡ分子の突然変異を修正することにより疾患を有する患者を処置する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチド、系、ベクターまたは医薬組成物を細胞に導入するステップを含み得る。一部の実施形態では、方法は、それを必要としている対象（例えば、突然変異に起因する疾患を有する患者）にドナーポリヌクレオチド、系、ベクターまたは医薬組成物を投与するステップを含み得る。
【０３３０】
本開示の実施形態は、細胞内の標的核酸分子（ゲノムＤＮＡ）を編集する方法を包含する。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチドを細胞に導入するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞を本明細書に記載される医薬組成物と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、方法は、標的編集核酸分子を含む安定した細胞系を生成するステップを含む。一部の実施形態では、細胞は、真核細胞である。真核細胞の非限定的な例としては、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、無脊椎動物からの細胞、脊椎動物からの細胞、哺乳動物細胞、齧歯動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、およびヒト細胞が挙げられる。一部の実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞であり得る。一部の実施形態では、真核細胞は、げっ歯動物細胞であり得る。一部の実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞であり得る。同様に、標的配列は、任意のそのような細胞からのものまたは任意のそのような細胞内のものであり得る。
【０３３１】
本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチド、系、ベクターまたは医薬組成物は、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、せん断駆動細胞透過、細胞膜透過性ペプチドへの融合に続いての細胞接触、マイクロインジェクション、およびナノ粒子媒介送達などの、当技術分野において公知の任意の方法によって細胞に導入することができる。一部の実施形態では、ベクター系をウイルス感染によって細胞に導入することができる。一部の実施形態では、ベクター系をバクテリオファージ感染によって細胞に導入することができる。
【０３３２】
本発明の実施形態は、本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチド、系、ベクターまたは医薬組成物での患者の処置も包含する。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチド、系、ベクターまたは医薬組成物を患者に投与するステップを含み得る。方法を単独療法として使用することができ、または当技術分野において利用可能な他の療法と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、患者は、疾患関連遺伝子の突然変異（例えば、挿入、欠失、置換、染色体転座など）を有し得る。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、系、ベクターまたは医薬組成物の投与によって、患者の疾患関連遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換を含む突然変異が生じることになり得る。ある特定の実施形態は、患者の疾患関連遺伝子の突然変異を修復する方法を含み得る。一部の実施形態では、突然変異は、疾患関連遺伝子から発現されるタンパク質の１つまたは複数のアミノ酸変化をもたらし得る。一部の実施形態では、突然変異は、疾患関連遺伝子から発現されるＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチド変化をもたらし得る。一部の実施形態では、突然変異は、疾患関連遺伝子の発現レベルを変更し得る。一部の実施形態では、突然変異は、遺伝子の発現増加または減少をもたらし得る。一部の実施形態では、突然変異は、患者の遺伝子ノックダウンをもたらし得る。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、系、ベクターまたは医薬組成物の投与によって、患者の疾患関連遺伝子の突然変異が修正されることになり得る。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、系、ベクターまたは医薬組成物の投与によって、患者の遺伝子ノックアウトが生じることになり得る。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、系、ベクターまたは医薬組成物系の投与によって、疾患関連遺伝子のエクソン配列、イントロン配列、転写制御配列、翻訳制御配列または非コード配列が置換されることになり得る。
【０３３３】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、系、ベクターまたは医薬組成物の投与によって、患者のゲノムＤＮＡに外因性配列（例えば、ドナーポリヌクレオチド配列）が組み込まれることになり得る。一部の実施形態では、外因性配列は、外因性プロモーター配列に作動可能に連結されたタンパク質またはＲＮＡコード配列を含むことができ、したがって、外因性配列が患者のゲノムＤＮＡに組み込まれると、患者は、組み込まれた配列によりコードされるタンパク質またはＲＮＡを発現することができる。外因性配列は、補足または代替タンパク質コードまたは非コード配列を提供し得る。例えば、ドナーポリヌクレオチド、系、ベクターまたは医薬組成物の投与によって、患者の疾患関連遺伝子の突然変異部分が置換されることになり得る。一部の実施形態では、突然変異部分は、疾患関連遺伝子のエクソンを含み得る。他の実施形態では、外因性配列の組込みによって、組み込まれた配列が、患者のゲノムＤＮＡ上に存在する内在性プロモーター配列から発現されることになり得る。例えば、ドナーポリヌクレオチド、系、ベクターまたは医薬組成物の投与によって、患者の突然変異を是正するための疾患関連遺伝子の機能的遺伝子産物が供給されることになり得る。さらに他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、系、ベクターまたは医薬組成物の投与によって、患者のゲノムＤＮＡにエクソン配列、イントロン配列、転写制御配列、翻訳制御配列または非コード配列が組み込まれることになり得る。
【０３３４】
本発明の追加の実施形態は、組織特異的に患者を処置する方法も包含する。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載の組織特異的プロモーターを含むドナーポリヌクレオチド、系、ベクターまたは医薬組成物を患者に投与するステップを含み得る。方法による処置に適した組織の非限定的な例としては、免疫系、ニューロン、筋肉、膵臓、血液、腎臓、骨、肺、皮膚、肝臓および乳房組織が挙げられる。
【０３３５】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正する方法であって、細胞を、本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチド、本開示によるドナーポリヌクレオチドとｇＲＮＡと部位特異的ヌクレアーゼとを含む系、または本明細書に記載される医薬組成物と接触させるステップを含み、ドナーポリヌクレオチド、系または組成物が細胞と接触したとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、ｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断に挿入し、それによって突然変異を修正する方法を提供する。
【０３３６】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正することにより疾患を有する患者を処置する方法であって、患者から細胞を単離するステップ、細胞を、本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチド、本開示によるドナーポリヌクレオチドとｇＲＮＡと部位特異的ヌクレアーゼとを含む系、または本明細書に記載される医薬組成物と接触させるステップを含み、ドナーポリヌクレオチド、系または組成物が細胞と接触したとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、ｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断に挿入し、それによって突然変異を修正する、方法を提供する。
【０３３７】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正することにより疾患を有する患者を処置する方法であって、本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチドの、本開示によるドナーポリヌクレオチドとｇＲＮＡと部位特異的ヌクレアーゼとを含む系の、または本明細書に記載される医薬組成物の有効量を、患者に投与するステップを含み、ドナーポリヌクレオチド、系または組成物が投与されたとき、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路が、ドナーポリヌクレオチドを、ｇＤＮＡの突然変異の近位の位置に導入された二本鎖ＤＮＡ切断に挿入し、それによって突然変異を修正する、方法を提供する。
【０３３８】
一部の実施形態では、細胞は、患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。一部の実施形態では、細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、方法は、修正された突然変異を含むｉＰＳＣを分化させて分化した細胞にするステップ、および分化した細胞を患者に移植するステップをさらに含む。一部の実施形態では、処置は、挿入されたドナーポリヌクレオチドを含むゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）から転写されたｍＲＮＡの翻訳をもたらし、この翻訳は、疾患を緩和する、または疾患の原因にも一因にもならない、翻訳産物（タンパク質）の形成をもたらす。
キット
【０３３９】
本発明は、本明細書で開示されるような、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドと１つもしくは複数のｇＲＮＡ分子と部位特異的ヌクレアーゼとを含む系、またはドナーポリヌクレオチドを含むか系を含むかもしくは系で編集された細胞を含む医薬組成物、および使用説明書を含む、キットを提供する。キットは、適切な容器内に、ドナーポリヌクレオチド、系または医薬組成物、１つまたは複数の対照、ならびに様々な緩衝剤、試薬、酵素および当技術分野において周知の他の標準的な成分を含み得る。ある特定の実施形態は、本明細書で開示されるドナーポリヌクレオチドと共に、対象における疾患もしくは障害を処置するためにまたは疾患もしくは障害の進行を遅らせるためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系で使用するための説明書を有する、キットを含む。一部の態様では、ドナーポリヌクレオチド、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の残りの成分は、別個のバイアルで提供される。
【０３４０】
一部の態様では、本開示は、本明細書で開示されるドナーポリヌクレオチド、系または医薬組成物を入れることができる容器を含むキットを提供し、前記容器は、少なくとも１つのバイアル、ウェル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器または他の容器手段を含む。追加の成分が提供される場合、キットは、この成分を入れることができる追加の容器を含有することができる。容器および／またはキットは、使用説明および／または警告が書かれたラベル付けを含むことができる。
【０３４１】
一部の態様では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正する際に／修正するために使用するための、本明細書で開示されるドナーポリヌクレオチド、系または医薬組成物と、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の成分と組み合わせて投与するための説明書を含む添付文書とを含むキットであって、突然変異の修正が、突然変異の結果として生じた対象における疾患もしくは障害を処置するためにまたはそのような疾患もしくは障害の進行を遅らせるために使用される、キットを提供する。
【０３４２】
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のゲノムＤＮＡ分子（ｇＤＮＡ）の突然変異を修正するための、本明細書で開示されるドナーポリヌクレオチド、系または医薬組成物を含む容器と、使用説明書を含む添付文書とを含む、キットを提供する。
定義
【０３４３】
本特許請求の範囲および明細書で使用される用語は、別段の定めがない限り、下に示す通りに定義される。親特許仮出願において使用された用語と直接矛盾する場合、本願で使用される用語が優先されるものとする。
【０３４４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈による別段の明白な指図がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。さらに、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数形の用語は、複数形のものを含むものとし、複数形の用語は、単数形のものを含むものとする。
【０３４５】
約：本明細書で使用される場合、用語「約」（あるいは「およそ」）は、当業者には理解され、それが使用される文脈に依存してある程度変わるであろう。「約」は、それが使用されている文脈から考えて当業者に明白でないこの用語の使用がある場合、特定の値のプラスまたはマイナス１０％までを意味することになる。
【０３４６】
アミノ酸：本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸はもちろん、天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体も指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによりコードされているもの、ならびに後で改変されているアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基と結合しているａ炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する、化合物を指す。
【０３４７】
アミノ酸は、本明細書では、それらの一般に公知の３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨されている１文字記号、どちらかによって言及され得る。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般に受け入れられている１文字コードによって言及され得る。
【０３４８】
アミノ酸置換：本明細書で使用される場合、「アミノ酸置換」は、所定のアミノ酸配列（出発ポリペプチドのアミノ酸配列）中の少なくとも１つの既存アミノ酸残基の、第２の異なる「代替」アミノ酸残基での置き換えを指す。「アミノ酸挿入」は、所定のアミノ酸配列への少なくとも１つの追加のアミノ酸の組込みを指す。挿入は、１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入から通常はなるであろうが、より大きい「ペプチド挿入」、例えば、約３〜約５またはさらには最大約１０、１５もしくは２０のアミノ酸残基の挿入を行うこともできる。挿入される残基は、上で開示されたように、天然に存在することもあり、または天然に存在しないこともある。「アミノ酸欠失」は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指す。
【０３４９】
塩基組成：本明細書で使用される場合、用語「塩基組成」は、グアニン＋シトシンまたはチミン（またはウラシル）＋アデニン核酸塩基からなる核酸の全塩基の割合を指す。
【０３５０】
塩基対：本明細書で使用される場合、用語「塩基対」は、特異的水素結合の形成によって相互作用する、相対する相補的なポリヌクレオチド鎖上、または同じ鎖の領域上の、２つの核酸塩基を指す。本明細書で使用される場合、「相補的塩基対合」と同義的に使用される「ワトソン−クリック塩基対合」は、プリンが常にピリミジンと結合し、したがって、ＤＮＡ分子中で、核酸塩基アデニン（Ａ）がチミン（Ｔ）と相補的塩基対を形成し、グアニン（Ｇ）が、シトシン（Ｃ）と相補的塩基対を形成する、一連の塩基対合則を指す。ＲＮＡ分子では、チミンは、チミン（Ｔ）と同様にアデニン（Ａ）と相補的塩基対を形成するウラシル（Ｕ）に置き換えられる。相補的塩基対は、水素結合によって互いに結合しており、水素結合の数は塩基対間で異なる。当技術分野において公知であるように、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）塩基対は、三（３）つの水素結合により結合されており、アデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）塩基対は、二（２）つの水素結合により結合されている。
【０３５１】
これらの規則に従わない塩基対合相互作用が、天然、非天然および合成核酸で起こることがあり、本明細書では「非ワトソン−クリック塩基対合」または代替的に「非標準塩基対合」と呼ばれる。「ゆらぎ塩基対」は、ワトソン−クリック塩基対規則に従わないＲＮＡ分子中の２核酸塩基間の対合である。例えば、イノシンは、グアニンに構造的に類似しているが２−アミノ基がない、ヌクレオシドである。イノシンは、４つの天然核酸塩基の各々と２つの水素結合を形成することができ（Ｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：５２６３−５２６７）、研究者により「ユニバーサル」塩基として使用されることが多く、「ユニバーサル」塩基とは、それが、あらゆる天然に存在するまたは標準塩基と塩基対合することができることを意味する。４つの主要ゆらぎ塩基対は、グアニン−ウラシル（Ｇ−Ｕ）塩基対、ヒポキサンチン−ウラシル（Ｉ−Ｕ）塩基対、ヒポキサンチン−アデニン（Ｉ−Ａ）塩基対、およびヒポキサンチン−シトシン（Ｉ−Ｃ）塩基対である。核酸命名法の一貫性を維持するために、「Ｉ」は、ヒポキサンチンがイノシンの核酸塩基であるので、ヒポキサンチンに使用され、そうでなければ命名法は、核酸塩基の名称およびそれらの対応するヌクレオシドに従う（例えば、「Ｇ」は、グアニンとグアノシンの両方に使用され、デオキシグアノシンにも使用される）。ゆらぎ塩基対の熱力学的安定性は、ワトソン−クリック塩基対の熱力学的安定性に匹敵する。ゆらぎ塩基対は、ＲＮＡ分子における二次構造の形成に関与する。
【０３５２】
コドン：本明細書で使用される場合、用語「コドン」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子中の遺伝コードの単位を一緒に形成する３ヌクレオチドの配列を指す。コドンは、翻訳が開始する最初のヌクレオチドによって操作的に定義され、「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）として公知である一連の連続したヌクレオチドトリプレットのフレームを設定する。例えば、文字列ＧＧＧＡＡＡＣＣＣは、最初の位置から読むと、コドンＧＧＧ、ＡＡＡ、およびＣＣＣを含有し、２番目の位置から読むと、ＧＧＡおよびＡＡＣを含有し、３番目の位置から読むと、ＧＡＡおよびＡＣＣを含有する。したがって、その５’→３’方向で読まれるあらゆる核酸配列は、明確に異なる可能性があるアミノ酸配列（所与の例では、それぞれ、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ａｓｎ、またはＧｌｕ−Ｔｈｒ）を各々が生じさせる、３つのリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、６つの可能性のあるリーディングフレーム、一方の鎖上の順方向の配向での３つおよび逆鎖上の逆方向での３つ、を定義する二本鎖である。ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、通常は配列中の最初のＡＵＧコドンである開始コドンによって概して定義される。
【０３５３】
突然変異を修正または誘導する：本明細書で使用される場合、用語「突然変異を修正または誘導する」は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子を含むヌクレオチド配列に、このｇＤＮＡ分子の誘導された二本鎖切断（ＤＳＢ）へのドナーポリヌクレオチドの挿入時に、所望の変更を組み込み、それによってｇＤＮＡのヌクレオチド配列を変化させる、本明細書に記載のものなどの、ドナーポリヌクレオチドの機能を指す。
【０３５４】
用語「突然変異を修正する」は、突然変異（例えば、欠失突然変異または病因突然変異）を含むｇＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチドの、突然変異が所望通りに復帰されるまたは変わるような変化をもたらす、ドナーポリヌクレオチドによる所望の変更の組込みを指す。修正する突然変異の同定は、突然変異を含むことが分かっているまたは含む疑いがあるｇＤＮＡのヌクレオチド配列と野生型ｇＤＮＡのヌクレオチド配列の比較により決定され得る。
【０３５５】
用語「突然変異を誘導する」は、ｇＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチドの、ｇＤＮＡが所望通りに突然変異するような変化をもたらす、ドナーポリヌクレオチドによる所望の変更の組込みを指す。ドナーポリヌクレオチドにより誘導される突然変異は、当技術分野において公知の任意のタイプの突然変異であり得る。一部の実施形態では、突然変異の誘導は、治療のためのものであり、または治療効果をもたらす。
【０３５６】
共有結合で連結した／された：本明細書で使用される場合、用語「共有結合で連結した／された」（あるいは、「コンジュゲートした／された」、「連結した／された」「結合した／された」、「融合した／された」、または「繋留した／された」）は、２つまたはそれより多くの部分に関して使用されるとき、それらの部分が、化学的コンジュゲーション、組換え技術または酵素活性を含むいかなる手段によるにせよ、それらの部分が物理的に会合した状態のままであるために十分なほど安定している構造を、その構造が使用される条件下、例えば生理条件下で形成するように、直接、または連結剤として役立つ１つもしくは複数の部分を介して、互いに物理的に会合または接続されていることを意味する。
【０３５７】
相補的：本明細書で使用される場合、用語「相補的」または「相補性」は、２本のポリヌクレオチド鎖、または同じポリヌクレオチド鎖の領域を構成するヌクレオチド配列と、鎖または領域を含む二重鎖の形成の間の関係であって、２本の鎖または領域間の連続する塩基対合の程度が二重鎖構造の生成に十分である関係を指す。アデニン（Ａ）がチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）と特異的水素結合を形成する、すなわち「塩基対合する」、ことは公知である。同様に、シトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）と塩基対合することは公知である。非標準核酸塩基（例えば、イノシン）が天然塩基と水素結合することができることも公知である。ポリヌクレオチドの第１の鎖またはその領域、部分もしくは断片を構成する、ヌクレオチドの配列は、同じもしくは異なる核酸の第２の鎖またはその領域、部分もしくは断片を構成する、ヌクレオチドの配列に対して、第１および第２の鎖が逆平行の形で配置されたときに２鎖間の塩基対合の程度が、二重鎖構造を、その二重鎖構造が使用される条件（例えば、細胞内の生理条件）下で維持するものである場合、「十分に相補的」であると言われる。ポリヌクレオチドの相補鎖または領域が、非相補的である幾つかの塩基対を含むことがあることは、理解されるはずである。相補性は、ポリヌクレオチドを構成する核酸塩基の一部しか塩基対合則に従ってマッチしない場合、「部分的」であり得る。または、核酸間に「完全」相補性または「完全な」相補性が存在することがある。ポリヌクレオチド鎖または領域間の相補性度は、鎖または領域間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して有意な影響を与えるが、２つの相補的ポリヌクレオチドがあらゆるヌクレオチド位置で塩基対合する必要はない。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに１００％または「完全に」相補的であり、したがって、あらゆるヌクレオチド位置で塩基対合を形成する。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、１００％相補的でなく（例えば、９０％、または８０％、または７０％相補的であり）、１つまたは複数のヌクレオチド位置にミスマッチヌクレオチドを含有する。完璧な相補性が望ましいことが多いが、一部の実施形態は、１つまたは複数、しかし好ましくは６、５、４、３、２または１つのミスマッチを含み得る。
【０３５８】
接触すること／させること：本明細書で使用される場合、用語「接触すること／させること」は、２つまたはそれより多くの実体間の物理的接続を確立することを意味する。例えば、細胞を作用因子（例えば、本開示の、ＲＮＡ、脂質ナノ粒子組成物、または他の医薬組成物）と接触させることは、細胞および作用因子が、物理的接続を共有するようにされることを意味する。細胞を外部の実体とｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ両方で接触させる方法は、生物学技術分野において周知である。本開示の例示的実施形態では、哺乳動物細胞を組成物（例えば、本開示の、単離されたＲＮＡ、ナノ粒子、または医薬組成物）と接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。例えば、脂質ナノ粒子組成物と、生物（例えば、哺乳動物）内に配置されていることがある細胞（例えば、哺乳動物細胞）とを接触させることを、任意の適する投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内および皮下投与を含む、生物への非経口投与）によって行うことができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで存在する細胞については、組成物（例えば、脂質ナノ粒子または単離されたＲＮＡ）および細胞は、例えば、組成物を細胞の培養培地に添加することにより、接触させることができ、トランスフェクションを伴うまたはもたらすことがある。さらに、１つより多くの細胞に作用因子が接触することがある。
【０３５９】
変性：本明細書で使用される場合、用語「変性」は、二次および／または三次核酸構造の喪失（例えば、以前にアニーリングされた鎖の分離）が生じる結果となる、核酸中の塩基対合しているヌクレオチド間の水素結合が破壊されるプロセスを指す。変性は、核酸への外部物質、エネルギーまたは生化学プロセスの適用によって起こることがある。
【０３６０】
二本鎖切断：本明細書で使用される場合、用語「二本鎖切断」（ＤＳＢ）は、ＤＮＡ分子の２本の相補鎖が切断され（ｂｒｏｋｅｎ）または切断され（ｃｌｅａｖｅｄ）、その結果、２つの遊離ＤＮＡ末端（ｅｎｄｓ）または末端（ｔｅｒｍｉｎｉ）が生じたときに生成される、ＤＮＡ損傷を指す。ＤＳＢは、外界からの刺激（例えば、照射、化学剤、もしくはＵＶ線）への曝露によって生じることもあり、または意図的に（例えば、操作されたヌクレアーゼによって）および定義された生物学的目的（例えば、突然変異を修正するためのドナーポリヌクレオチドの挿入）のために生成されることもある。
【０３６１】
平滑末端：本明細書で使用される場合、用語「平滑末端」、「平滑末端化された」は、二重鎖を構成する両方の相補鎖の少なくとも一方の末端が塩基対で終わる、二重鎖または二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）の末端の構造を指す。したがって、二重鎖を構成するどちらの鎖も、他方より末端からさらに伸びてはいない。
【０３６２】
二重鎖：本明細書で使用される場合、用語「二重鎖」は、二本鎖ポリヌクレオチドの相補鎖により形成される構造、またはそれ自体に折り重なる一本鎖ポリヌクレオチドの相補領域により形成される構造を指す。核酸の二重鎖構造は、塩基対合相互作用により互いに結合する、またはハイブリダイズする、相補的ヌクレオチド配列の結果として生じる。
【０３６３】
ＥＣ５０：本明細書で使用される場合、用語「ＥＣ５０」は、最大応答の５０％である、すなわち、最大応答とベースラインとの中間である応答を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイのどちらかで誘導する組成物の濃度を指す。
【０３６４】
有効用量：本明細書で使用される場合、用語「有効用量」または「有効投薬量」は、所望の効果を達成するのにまたは少なくともある程度達成するのに十分な量と定義される。
【０３６５】
ゲノム編集：本明細書で使用される場合、用語ゲノム編集は、ゲノムのヌクレオチド配列を、好ましくは正確なまたは所定の方法で、編集するまたは変化させるプロセスを一般に指す。本明細書に記載されるゲノム編集方法の例には、部位特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムＤＮＡをゲノム内の正確な標的位置または配列で切断する方法であって、それによって、標的配列内にＤＮＡ切断（例えば、ＤＳＢ）を生じさせ、ＤＮＡ切断を修復し、その結果、ＤＮＡ切断部位におけるまたはその付近における修復されたゲノムのヌクレオチド配列が変化してしまう、方法が含まれる。
【０３６６】
二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）は、相同組換え修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの、天然の内因性細胞プロセスによって修復され得る、および定期的に修復される（例えば、Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１（２）：１２１−１３１を参照されたい）。
【０３６７】
ＨＤＲによるＤＮＡ修復は、ＤＳＢに隣接している配列と相同であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド（多くの場合、「修復鋳型」または「ドナー鋳型」と呼ばれる）を利用する。ＨＤＲ機序によるＤＮＡ修復は、修復鋳型と切断されたゲノムＤＮＡ分子の間の相同組換えを伴う。修復鋳型を、それらがゲノムＤＮＡ分子にヌクレオチドを挿入するように、またはゲノムＤＮＡ分子中のヌクレオチドを欠失させるように、またはゲノムＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を変化させるように、設計することができる。
【０３６８】
ＮＨＥＪ機序は、ＤＳＢの結果として生じるＤＮＡ末端を互いに直接結合またはライゲーションすることによってＤＳＢを修復することができる。ＮＨＥＪによるＤＳＢの修復は、１つまたは複数のヌクレオチドのランダムな挿入または欠失（すなわち、インデル）を伴い得る。ＮＨＥＪによるＤＮＡ修復のこの態様は、ゲノム編集方法において遺伝子発現を妨げるために利用されることが多い。ＮＨＥＪは、相同性に依存しない方法で切断部位に外因性ポリヌクレオチドを挿入することによりＤＳＢを修復することもできる。
【０３６９】
第３の修復機序は、遺伝的結果が、小さい欠失および挿入が切断部位で起こり得るＮＨＥＪと類似している、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）であり、これは「代替ＮＨＥＪ」とも呼ばれる。ＭＭＥＪは、より好適なＤＮＡ末端結合修復結果につながるようにＤＮＡ切断部位に隣接する少数の塩基対の相同配列を使用する（例えば、Ｃｈｏ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，  （２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５１８，  １７４−１７６；Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ５１８，  ２５４−５７  （２０１５）；Ｃｅｃｃａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ５２８，  ２５８−６２  （２０１５）を参照されたい）。一部の事例では、ＤＮＡ切断部位における潜在的マイクロホモロジーの解析に基づいて起こり得る修復成果を予測することが可能であり得る。上述のＤＮＡ修復機序の各々をゲノム編集方法において使用して、所望されるゲノムの変更を生じさせることができる。ゲノム編集プロセスの第１のステップは、標的配列内の所期の突然変異または変更の部位のできる限り近くに概して１つまたは２つのＤＮＡ切断を生じさせることである。これは、本明細書で説明および例証されるように、部位特異的ヌクレアーゼの使用によって果たされ得る。
【０３７０】
部位特異的ヌクレアーゼ：本明細書で使用される場合、用語「部位特異的ヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ分子（例えば、ゲノムＤＮＡ分子）中の特定の標的部位（すなわち、標的ヌクレオチド配列）を認識してそのＤＮＡ分子中の特定の部位で、その部位の付近で、またはその部位内でＤＮＡ切断（例えば、ＤＳＢ）を生じさせるようにプログラムまたは操作され得る、ヌクレアーゼの幾つかの明確に異なるクラスのうちの１つを指す。部位特異的ヌクレアーゼは、本明細書に記載されるものなどの、ゲノム編集方法において有用である。部位特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼとも呼ばれる）、および他のヌクレアーゼを含むが、これらに限定されない（例えば、Ｈａｆｅｚ  ａｎｄ  Ｈａｕｓｎｅｒ，  Ｇｅｎｏｍｅ  ５５，  ５５３−６９  （２０１２）；Ｃａｒｒｏｌｌ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ８３，  ４０９−３９  （２０１４）；Ｇｕｐｔａ  ａｎｄ  Ｍｕｓｕｎｕｒｕ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２４，  ４１５４−６１  （２０１４）；およびＣｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，  上掲を参照されたい）。これらは、それらがＤＮＡに結合し、標的化された部位特異的ＤＮＡ切断を生じさせる方法が、主として異なる。当技術分野において公知の部位特異的ヌクレアーゼは、一本鎖切断（ＳＳＢ）またはＤＳＢを生じさせることができる。本発明では、「部位特異的ヌクレアーゼ」への本開示の言及は、ＤＳＢを生じさせるヌクレアーゼを指す。ＤＳＢを出じさせた後、ＮＨＥＪまたはＨＤＲの本質的に同じ天然の細胞ＤＮＡ修復機序が、所望の遺伝子改変を果たすために選出される。したがって、部位特異的ヌクレアーゼを使用するゲノム編集技術または系を使用して、本明細書に記載される遺伝的結果および治療結果を達成することができることが企図される。
【０３７１】
必要としている：本明細書で使用される場合、「予防を必要としている」、「処置を必要としている」、または「それを必要としている」対象は、適切な医師（例えば、ヒトの場合、医者、看護師、または診療看護師；非ヒト哺乳動物の場合、獣医）の判断により、所与の処置の恩恵を合理的に受けることになる者を指す。
【０３７２】
挿入：本明細書で使用される場合「挿入」または「付加」は、参照配列、例えば、天然に存在する分子に見られる配列、と比較して分子への１つまたは複数のアミノ酸残基またはヌクレオチドの付加をそれぞれ生じさせる結果となる、アミノ酸またはヌクレオチド配列の変化を指す。
【０３７３】
イントロン：本明細書で使用される場合、用語「イントロン」は、最終ＲＮＡ産物（例えば、ｍＲＮＡ）の成熟中にＲＮＡスプライシング機序により除去される、遺伝子内の任意のヌクレオチド配列を指す。イントロンは、遺伝子内のＤＮＡ配列と、ＲＮＡ転写物（例えば、プレｍＲＮＡ）中の対応する配列の両方を指す。ＲＮＡスプライシング後の最終成熟ＲＮＡ中で互いに結合してる配列が「エクソン」である。本明細書で使用される場合、用語「イントロン配列」は、イントロンまたはイントロンの一部分を含むヌクレオチド配列を指す。イントロンは、大部分の真核生物の遺伝子に見られ、タンパク質、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を生成するものを含む広範な遺伝子内に位置し得る。タンパク質がイントロン含有遺伝子から生成されるとき、ＲＮＡスプライシングが、転写に続くかつ翻訳に先行するＲＮＡプロセシング経路の一部として起こる。
【０３７４】
脂質：本明細書で使用される場合、用語「脂質」は、疎水性または両親媒性を有する小分子を指す。脂質は、天然に存在することもあり、または合成のものであることもある。脂質のクラスの例としては、脂肪、蝋、ステロール含有代謝物、ビタミン、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、およびポリケチド、およびプレノール脂質が挙げられるが、これらに限定されない。一部の事例では、一部の脂質の両親媒性は、それらを、水性媒体中でリポソーム、小胞または膜を形成するように導く。
【０３７５】
局所投与：本明細書で使用される場合、「局所投与」または「局所送達」は、組成物または薬剤のその所期の標的組織または部位への血管系による輸送に依拠しない送達を指す。例えば、組成物は、組成物もしくは薬剤の注射もしくは移植により、または組成物もしくは薬剤を含有するデバイスの注射もしくは移植により、送達され得る。標的組織または部位の近傍への局所送達後、組成物もしくは薬剤、またはその１つもしくは複数の成分は、所期の標的組織または部位に拡散し得る。
【０３７６】
改変した／された：本明細書で使用される場合、「改変した／された」または「改変」は、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ、の改変の結果として生じる、変化した状態または構造の変化を指す。ポリヌクレオチドは、化学的に、構造的に、および／または機能的に、を含む、様々な方法で改変され得る。例えば、本開示のＤＮＡ分子は、生物活性を提供する化学的に改変された塩基の組込みにより、改変され得る。一実施形態では、ＤＮＡは、例えば、それが天然核酸塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）に関する場合、非天然のまたは化学的に改変された塩基、ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入により改変される。
【０３７７】
ｍＲＮＡ：本明細書で使用される場合、「ｍＲＮＡ」は、メッセンジャーリボ核酸を指す。ｍＲＮＡは、天然に存在することもあり、または天然に存在しないこともあり、または合成のものであることもある。例えば、ｍＲＮＡは、１つまたは複数の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはリンカーなどの、改変されたおよび／または天然に存在しない成分を含むことがある。ｍＲＮＡは、キャップ構造、５’転写リーダー、５’非翻訳領域、開始コドン、オープンリーディングフレーム、停止コドン、連鎖停止ヌクレオシド、ステム−ループ、ヘアピン、ポリＡ配列、ポリアデニル化シグナル、および／または１つもしくは複数のシス調節エレメントを含むことがある。ｍＲＮＡは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し得る。ｍＲＮＡの翻訳、例えば、哺乳動物細胞内のｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳は、ポリペプチドを産生し得る。旧来、天然ｍＲＮＡ分子の基本成分は、コード領域、５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’キャップおよびポリＡ配列を少なくとも含む。
【０３７８】
天然に存在する：本明細書で使用される場合、物体に適用される場合の用語「天然に存在する」は、物体を自然界で見出すことができることを指す。例えば、生物（ウイルスを含む）に存在し、自然界の供給源から単離することができ、研究室で人間によって意図的に改変されていない、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列（例えば、スプライス部位）またはその成分、例えばアミノ酸もしくはヌクレオチドは、天然に存在する。
【０３７９】
非相同末端結合：本明細書で使用される場合、用語「非相同末端結合」は、ＤＮＡにおける二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復する経路を指す。ＮＨＥＪは、修復を誘導するために相同配列を必要とする相同組換え修復（ＨＤＲ）とは対照的に、相同鋳型を必要とせずにＤＮＡ末端が直接ライゲーションされるため、「非相同」と言われる。
【０３８０】
非複製の：本明細書で使用される場合、用語「非複製の」は、細胞または生物内で複製することができないことのような、ＤＮＡ分子の特徴を指す。ある特定のＤＮＡ分子（例えば、プラスミド、ウイルスゲノム）は、細胞または生物によりコピーまたは複製される能力をＤＮＡ分子に付与する配列エレメント（例えば、複製基点）を含有する。用語「非複製の」は、そのような配列エレメントを含有しないＤＮＡ分子を含意する。
【０３８１】
核酸：本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、一本鎖形態または二本鎖形態どちらかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーまたはオリゴマーを指す。特別な限定がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。ヌクレオチドのポリマーは、「ポリヌクレオチド」と呼ばれる。本開示の例示的な核酸またはポリヌクレオチドとしては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒性ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、これは、β−Ｄ−リボ配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−ＬＮＡ、および２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡを含む）またはこれらのハイブリッドが挙げられるが、それらに限定されない。
【０３８２】
本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、未改変ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成されていることがある。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ；一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ；一本鎖および二本鎖ＲＮＡ；ならびに一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ；一本鎖もしくはより典型的には二本鎖であり得るまたは一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子で、構成されていることがある。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、またはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む、三本鎖領域で構成されていることがある。ポリヌクレオチドは、安定性のためにまたは他の理由のために改変された、１つまたは複数の改変塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含有することもある。「改変」塩基は、例えば、トリチル化塩基を含む。「改変ヌクレオシド」は、例えば、イノシンを含み、およびチミンがＲＮＡに見られるまたはＲＮＡを構成する場合にはチミンを含む。様々な改変をＤＮＡおよびＲＮＡに加えることができ、したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的にまたは代謝的に改変された形態を包含する。
【０３８３】
核酸構造：本明細書で使用される場合、用語「核酸構造」は、核酸（例えば、ＲＮＡ）を構成する核酸塩基の原子、化学成分、エレメント、モチーフおよび／もしく配列の配置もしくは構成を指し、ならびに／または核酸の二次元もしくは三次元状態を指すこともある。したがって、用語「ＲＮＡ構造」は、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）を構成する核酸塩基の原子、化学成分、エレメント、モチーフおよび／もしくは配列の配置もしくは構成を指し、ならびに／またはＲＮＡ分子の二次元および／もしくは三次元状態を指すこともある。核酸構造を、構成の複雑性の増加に基づいて本明細書では「分子構造」、「一次構造」、「二次構造」および「三次構造」と呼ばれる４つの構成的カテゴリーにさらに画定することができる。
【０３８４】
核酸塩基：本明細書で使用される場合、用語「核酸塩基」（あるいは、「ヌクレオチド塩基」または「窒素含有塩基」）は、改善された特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学的安定性）を核酸またはその一部分もしくはセグメントに付与する、天然に存在するプリンおよびピリミジンの任意の誘導体または類似体を含む、核酸に見られるプリンまたはピリミジン複素環式化合物を指す。アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルは、天然核酸に主に見られる主要または標準核酸塩基である。他の天然、非天然、非標準および／または合成核酸塩基を、本明細書に開示されるものなどの核酸に組み込むことができる。
【０３８５】
ヌクレオシド／ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド」は、核酸塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体もしくは類似体に共有結合で連結された糖分子（例えば、ＲＮＡ中のリボース、またはＤＮＡ中のデオキシリボース）を含有する化合物またはその誘導体もしくは類似体を指す。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、リン酸基に共有結合で連結されたヌクレオシドを指す。本明細書で使用される場合、用語「リボヌクレオシド」は、リボースと核酸塩基とを含むヌクレオシド（例えば、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、ウリジン（Ｕ）またはイノシン（Ｉ））を指す。
【０３８６】
作動可能に連結した／された：本明細書で使用される場合、核酸、またはその断片もしくは一部分、例えばポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドは、それが、別の核酸配列またはその断片もしくは一部分と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結された」ものである。
【０３８７】
ポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、同義的に使用され、天然に存在する塩基、糖および糖間（骨格）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーの一本鎖または二本鎖ポリマーまたはオリゴマーを指す。用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、同様に機能する、天然に存在しない塩基、糖および糖間（骨格）結合またはそれらの一部分を含むポリマーおよびオリゴマーも含む。用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を包含するので、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列のいずれの特定の長さにも限定されない。短いポリヌクレオチドは、当技術分野では「オリゴヌクレオチド」と通常は呼ばれる。本開示に関して、そのような改変または置換ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、改変が、細胞取込み向上および／またはヌクレアーゼの存在下での安定性増加を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の望ましいまたは有益な生物学的特性または活性を増加させるので、ネイティブ形態より好ましいことが多い。一部の実施形態では、本開示のアゴニストは、１つもしくは複数の有益な特性を付与する、または生物活性を増加させる（例えば、ヌクレアーゼ耐性増加、細胞への取込み増加、二重鎖安定性増加、標的ポリペプチドに対する結合親和性増加）、改変ヌクレオチドの少なくとも１つの領域を含有するポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを含む。
【０３８８】
パリンドローム配列：本明細書で使用される場合、用語「パリンドローム配列」（あるいは「パリンドローム」）は、自己相補的であるヌクレオチドの配列であって、５’から３’への方向でのヌクレオチド配列が、５’から３’に読まれたときのその相補鎖を構成するヌクレオチドの配列と同じである、配列を指す。例えば、配列５’−ＡＣＣＴＡＧＧＴ−３’は、その相補配列３’−ＴＧＧＡＴＣＣＡ−５’が５’から３’方向に読まれたときに元の配列と同じであるので、パリンドローム配列である。対照的に、配列５’−ＡＧＴＧＧＣＴＧ−３’は、その相補配列３’−ＴＣＡＣＣＧＡＣ−５’が５’から３’方向に読まれたときに元の配列と同じでないので、パリンドローム配列ではない。
【０３８９】
非経口投与：本明細書で使用される場合、「非経口投与」、「非経口投与した／された」、および他の文法的に等価の句は、通常は注射による、腸内および局部的投与以外の投与方法を指し、限定ではないが、静脈内、鼻腔内、眼内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、脳内、頭蓋内、頸動脈内および胸骨内注射および注入を含む。
【０３９０】
同一性パーセント：本明細書で使用される場合、２つまたはそれより多くの核酸またはポリペプチド配列の文脈での用語「同一性パーセント」は、下で説明される配列比較アルゴリズムの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮもしくは当業者が利用可能な他のアルゴリズム）を使用して測定してまたは目視検査により測定して、比較し、最大に一致するようにアラインメントしたとき、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の指定パーセンテージを有する２つまたはそれより多くの配列または部分配列を指す。用途に依存して、「同一性パーセント」は、比較することになる配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在することもあり、または、代替的に、比較すべき２配列の完全長にわたって存在することもある。配列比較のために、通常は、１つの配列が、試験配列を比較する参照配列としての役割を果す。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、部分配列座標を必要に応じて指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。すると、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。２配列間の同一性パーセントは、２配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れて、それらの配列により共有される同一位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）。２配列間の配列比較および同一性パーセントの決定は、下記の非限定的な例で説明されるような数学的アルゴリズムを使用して遂行することができる。
【０３９１】
比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２  （１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．    ４８：４４３  （１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  （１９８８）の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータインプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓの、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または目視検査（例えば、全体的にＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  上掲を参照されたい）により、行うことができる。
【０３９２】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントの決定に適しているアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０  （１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトを通して公的に入手できる。２ヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのギャッププログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）を使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列と４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重みと、１、２、３、４、５または６の長さ重みとを使用して、決定することができる。２ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，  ４：１１−１７  （１９８９））のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０残基重み表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して決定することもできる。加えて、２アミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （４８）：４４４−４５３  （１９７０））アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のどちらかと、１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重みと、１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用して、決定することができる。
【０３９３】
本開示の核酸およびタンパク質配列は、例えば関連配列を同定するために、公開データベースの検索を行うための「クエリ配列」としてさらに使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行って、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行って、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためのギャップ付きアラインメントを達成するために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されているような、ギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【０３９４】
薬学的に許容される：本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、正当な医学的判断の範囲内で、人間および動物の組織、臓器および／または体液と接触する使用に適しており、過度の毒性も、刺激も、アレルギー反応も、他の問題も合併症も伴わず、妥当な損益比に見合っている、化合物、材料、組成物および／または剤形を指す。
【０３９５】
薬学的に許容される担体：本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを指し、これらを含む。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を含み得る（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ６６：１−１９を参照されたい）。
【０３９６】
ホスフェート：本明細書で使用される場合の用語「ホスフェート」は、リン酸の塩またはエステルを意味する。ポリホスフェートは、酸素原子を共有することにより互いに連結されている４面体ＰＯ４（リン酸）構造単位から形成される、高分子オキシアニオンの塩またはエステルである。本明細書で使用される場合、用語「ジホスフェート」は、２つのリン酸構造単位を含むポリホスフェートを指す。本明細書で使用される場合、用語「トリホスフェート」は、３つのリン酸構造単位を含むポリホスフェートを指す。
【０３９７】
ホスフェート生物学的等価体：本明細書で使用される場合、用語「ホスフェート生物学的等価体」（あるいは「ホスフェート模倣体」）は、ホスフェートと同様の物理的または化学的特性を有する化学的置換基または化学基であって、二リン酸および三リン酸部分を含む、ホスフェートと同様の生物学的特性を広く生じさせる化学的置換基または化学基を指す。薬物設計において、ある生物学的等価体を別の生物学的等価体と交換する目的は、化学構造を有意に変化させることなく化合物の所望の生物学的または物理的特性を向上させることである。生物学的等価体の使用は、創薬において広く普及しており、例えば、親化合物またはリード化合物の毒性を低下させるために、バイオアベイラビリティを変化させるために、または活性もしくは代謝を改良するために使用される（例えば、Ｒｙｅ  ａｎｄ  Ｂａｅｌｌ  （２００５）  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １２（２６）：３１２７−３１４１；Ｅｌｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１２）  ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍ  ３（７）：７３５−７５１を参照されたい）。
【０３９８】
ポリペプチド：本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために同義的に使用される。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーばかりでなく、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【０３９９】
予防すること：本明細書で使用される場合、状態に関して使用されるときの用語「予防すること」または「予防する」は、対象において、組成物を受けていない対象と比較して、医学的状態の症状の頻度を低下させるまたは症状の開始を遅らせる、組成物の投与を指す。
【０４００】
精製された／される：本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるタンパク質（抗体または断片）のいずれかに適用される場合の用語「精製した／された」または「単離した／された」は、天然に付随する成分（例えば、タンパク質または他の天然に存在する生体分子もしくは有機分子）、例えば、タンパク質を発現する原核生物における他のタンパク質、脂質および核酸から、分離または精製されたポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチドは、それが試料中の全タンパク質の少なくとも６０（例えば、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７または９９）重量％を占める場合、精製されている。
【０４０１】
センス鎖：本明細書で使用される場合、用語「センス鎖」または「コード鎖」は、５’から３’への方向性を有する二本鎖ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）内のセグメントを指し、セグメントから転写されたｍＲＮＡと同じヌクレオチド配列を有する。転写産物は、ｍＲＮＡ中の、ＤＮＡではチミンがあるに位置に、ウラシルが組み込まれることになることを除いて、センス鎖のものと同一であるヌクレオチドの配列を含有する、プレｍＲＮＡ転写物である。センス鎖は、３’から５’に向かう、ＤＮＡのアンチセンス鎖、または鋳型鎖に、相補的である。
【０４０２】
ＲＮＡスプライシング：本明細書で使用される場合、用語「スプライシング」（あるいは「ＲＮＡスプライシング」）は、細胞内での新生メッセンジャーＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）転写物の成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へのプロセシングまたは編集を指す。プレｍＲＮＡなどの新生ＲＮＡ転写物は、イントロンとエクソンの両方から構成される。スプライシング反応中に、イントロンは、新生ＲＮＡ転写物から除去され、エクソンは、互いにライゲーションされる。核にコードされた遺伝子については、ＲＮＡ（例えば、プレｍＲＮＡ）の転写中または転写直後のどちらかに核内でスプライシングが起こる。スプライシングは、新生ＲＮＡ転写物に含有されるシス作用性スプライシングシグナルを認識するスプライソソーム、ｓｎＲＮＰの複合体、によって触媒される一連の反応中に実行される。スプライソソームにより認識される標準スプライシングシグナルは、５’スプライス部位、分岐点、ポリピリミジントラクトおよび３’スプライス部位を含む。ヒト分岐点コンセンサス配列は、ＹＴＮＡＹ（ＲＮＡではＹＵＮＡＹ）（式中、下線付きのアデニン（Ａ）は、分岐点であり、「Ｙ」は、ピリミジン核酸塩基（シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ））の存在を示し、Ｎは、任意の核酸塩基を含むヌクレオチドの存在を示す）である（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６（７）：２２５７−２２６７）。スプライシングが起こる生化学的機序は、当技術分野において十分に説明されている。用語「スプライシングシグナル」、「ＲＮＡスプライシングシグナル」または「スプライシングモチーフ」は、細胞のスプライシング機序により認識される一次転写物（例えば、プレｍＲＮＡ）中のヌクレオチド配列を指す。イントロンは、「スプライス部位」と呼ばれるスプライシングシグナルでの認識および切断により、一次転写物（例えば、プレｍＲＮＡ）から除去される。これらの部位は、イントロンの５’および３’末端に位置し、本明細書では「５’スプライス部位」および「３’スプライス部位」と呼ばれる。最も一般的には、除去されるイントロンＲＮＡ配列は、その５’末端のジヌクレオチドＧＵで始まり、その３’末端のＡＧで終わる。５’または３’スプライス部位内の保存ヌクレオチドの１つについての変化または突然変異がスプライシングの阻害をもたらすので、これらのコンセンサス配列は、必要不可欠であることが公知である。ＤＮＡ中の３’スプライス部位のコンセンサス配列は、ＹＡＧ（式中、Ｙは、ＣまたはＴである）である。ＤＮＡ中の５’スプライス部位のコンセンサス配列は、ＧＴＲＡＧ（式中、Ｒは、ＡまたはＧである）である。
【０４０３】
イントロンの３’末端から１０〜１００ヌクレオチド上流のどこかに位置する、「分岐点」として公知のスプライシングシグナル。分岐点は、常にアデニンを含有するが、それ以外は大まかに保存される。分岐点コンセンサス配列は、ＹＴＮＡＹ（式中、Ｙは、ピリミジンを示し、Ｎは、任意のヌクレオチドを示し、Ｔは、チミンを含むヌクレオチドを示し、Ａは、アデニンを含むヌクレオチドを示す）である。
【０４０４】
「ポリピリミジントラクト」として公知のスプライシングシグナルは、スプライシング機序またはスプライソソーム（転写後改変プロセス中のＲＮＡスプライシングの実行に特化したタンパク質複合体）の構築を促進する、プレｍＲＮＡ内の領域を構成する。ポリピリミジントラクトは、ピリミジンヌクレオチド、特にウラシル、を多く含み、通常は１５〜２０塩基対長であり、スプライシングされるイントロンの３’末端の約１〜４０塩基対手前に位置する。
【０４０５】
スプライソソームとつながっている他の例示的なスプライシングシグナルとしては、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、エクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）およびイントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。スプライシングが、エクソン（ＥＳＥおよびＥＳＳ）およびイントロン（ＩＳＥおよびＩＳＳ）のヌクレオチド配列に埋め込まれているＥＳＥ、ＥＳＳ、ＩＳＥおよびＩＳＳによってある程度促進または影響されることは、公知である（例えば、Ｍｅｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ９：３６９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｃｅｌｌ  １１９：８３１−８４５；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａ．，  （２０１２）  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９（１０）：１０４４−１０５２；Ｈａｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３）  ＲＮＡ  ４：２４７−２６６を参照されたい）。
【０４０６】
対象：本明細書で使用される場合、用語「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。例えば、本発明の方法および組成物を使用して、障害（例えば、遺伝性障害）を有する対象を処置することができる。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【０４０７】
治療剤：本明細書で使用される場合、用語「治療剤」は、対象に投与されたとき、治療効果、診断効果および／もしくは予防効果がある、ならびに／または所望の生物学的および／もしくは薬理学的効果を発揮する、任意の薬剤を指す。
【０４０８】
治療有効量：本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」または「治療有効用量」、または本明細書で使用される同様の用語は、例えば、状態または疾患、および疾患に既に罹患している患者におけるその合併症を少なくともある程度抑えること（例えば、がんの１つまたは複数の症状の改善）などの、所望の生物学的または医学的応答を惹起することになる薬剤の量を意味するように意図されている。この使用に有効な量は、処置されることになる障害の重症度、および患者自身の免疫系の一般的状態に依存することになる。
【０４０９】
処置する：本明細書で使用される場合の用語「処置する」、「処置すること」、および「処置」は、本明細書に記載される治療的手段を指す。「処置」の方法は、障害もしくは再発性障害の１つもしくは複数の症状を治癒させる、遅らせる、前記症状の重症度を低下させる、または前記症状を寛解させるために、あるいは対象の生存期間を、そのような処置の非存在下で予想される生存期間を超えて延長するために、そのような処置を必要としている対象への本開示の組成物の投与を利用する。
【０４１０】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。好ましい方法および材料が下で説明されるが、本明細書に記載されるものと同様または等価の方法および材料も本開示の方法および組成物の実施または試験の際に使用することができる。
均等物および範囲
【０４１１】
当業者は、日常的な実験以上のものを使用することなく、本明細書に記載される特定の実施形態の多くの均等物を認識することまたは突き止めることができるであろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されるように意図されておらず、添付の特許請求の範囲に示される通りである。
【０４１２】
請求項での「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、そうでない旨の指示がない限り、またはそうでないことが文脈上明らかでない限り、１つまたは１つより多くを意味し得る。ある群の１つまたは複数のメンバー間に「または」を含む請求項または説明は、そうでない旨の指示がない限り、またはそうでないことが文脈上明らかでない限り、群メンバーの１つ、１つより多く、または全てが、所与の産物またはプロセスに存在する、利用される、または別様に関連している場合に成立すると考えられる。本開示は、群の正確に１つのメンバーが、所与の産物またはプロセスに存在する、利用される、または別様に関連している実施形態を含む。本開示は、群メンバーの１つより多くまたは全てが、所与の産物またはプロセスに存在する、利用される、または別様に関連している実施形態を含む。さらに、本開示は、列挙される請求項の１つまたは複数からの１つまたは複数の制限、要素、条項、記述用語などが別の請求項に導入される全ての変形形態、組合せおよび順列を包含することを、理解されたい。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項を、同じ基本請求項に従属する任意の他の請求項に見られる１つまたは複数の制限を含むように変更することができる。さらに、請求項が、組成物を記載するものである場合、別段の指示がない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、本明細書で開示される目的のいずれかのために組成物を使用する方法が含まれること、および本明細書で開示される作製方法のいずれかまたは当技術分野において公知の他の方法に従って組成物を作製する方法が含まれることを、理解されたい。
【０４１３】
要素が、例えばマーカッシュ群形式で、リストとして提示される場合、要素の各部分群も開示されること、および任意の要素が群から除去されることがあることを、理解されたい。一般に、本発明、または本発明の態様が、特定の要素、特徴などを含むと言われる場合、本発明または本発明の態様のある特定の実施形態は、そのような要素、特徴などからなるかまたは本質的になることを、理解されたい。簡潔にするために、これらの実施形態は、本明細書ではこれらの言葉で具体的に示されていない。
【０４１４】
用語「含むこと」は、開放的であるように意図されており、追加の要素またはステップの包含を、要求しないが、許容することにも留意されたい。したがって、用語「含むこと」が本明細書で使用されるとき、用語「からなること」も包含され、開示される。
【０４１５】
範囲が与えられる場合、端点が含まれる。さらに、別段の指示がない限り、または文脈上および当業者の理解からそうでないことが明らかでない限り、範囲として表される値は、本発明の種々の実施形態に関して述べられる範囲内の、文脈による別段の明確な規定がない限りその範囲の下限の単位の１０分の１までの、任意の特定の値または部分範囲をとることができることを、理解されたい。
【０４１６】
加えて、先行技術の範囲に含まれる本発明のいずれの特定の実施形態も請求項のいずれか１または複数から明示的に除外され得ることを理解されたい。そのような実施形態は、当業者に公知であると見なされるため、除外が本明細書に明示的に示されない場合であっても除外され得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、それによってコードされる任意の核酸またはタンパク質；任意の産生方法；任意の使用方法など）は、先行技術の存在に関係してであるか否かを問わず、任意の理由により、任意の１つまたは複数の請求項から除外され得る。
【０４１７】
すべての引用出典、例えば、本明細書に引用される参考文献、公表文献、データベース、データベースエントリー、および技術は、引用が明確に述べられてない場合であっても、参照により本願に組み込まれる。引用出典の記述と本願の記述が矛盾する場合、本願の記述が優先されるものとする。
【実施例】
【０４１８】
本開示は、以下の実施例を参照することによってさらに十分に理解されるであろう。しかし、これらの実施例を、本発明の範囲を限定するもの見なすべきではない。本明細書に記載する実施例および実施形態が、例証を目的とするものに過ぎないこと、ならびにそれらを考慮して様々な修飾形態または変更形態が当業者に示唆されることになり、そのような修飾形態または変更形態が本願の趣旨および権限、ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることになることは、理解される。
（実施例１）
エクソン定義をモジュレートするためのおよびｇＤＮＡ分子の突然変異を修正するためのドナーポリヌクレオチドの設計
【０４１９】
ＲＮＡスプライシングは、転写されたＲＮＡのｍＲＮＡへのプロセシングを、イントロンの除去およびエクソンの結合により可能にする、全ての真核生物間で共有されるプロセスである。エクソンが小さく、イントロンが大きい、脊椎動物などの高等真核生物では、スプライシング機構は、認識の単位としてエクソンを使用する。エクソン定義と呼ばれる、エクソン全体にわたってスプライス部位を認識し、対合させるこのプロセスによって、脊椎動物内部エクソンに見られる狭いサイズ分布（１３４ｎｔの平均サイズ）が説明される。３’スプライス部位と５’スプライス部位の間の距離は、エクソンの正確な認識および組入れに必要不可欠である。以前の研究によって、スプライソソーム形成およびエクソン定義がイントロンおよびエクソンのサイズによる影響を受けることが示されている。ｃＤＮＡ配列を使用して構成的内部エクソンの３’スプライス部位と５’スプライス部位の間の距離を＞３００ｎｔに拡大すると、エクソンを定義するスプライソソームの能力の効率の悪さのため、エクソン認識が不良になることが示されている（Ｓｔｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３（２６）：１５０８１−１５０８５）。
エクソン定義をモジュレートするための、および１つまたは複数のヌクレオチドを変化させることによりｇＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列を変更する（例えば、エクソンまたはイントロンの突然変異を修正または誘導する）ための、ドナーポリヌクレオチドの有効性を判定するために、ドナーポリヌクレオチドを設計した。ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも次の基準に基づいて設計した：変更するための（例えば、突然変異を修正または誘導するための）ヌクレオチド配列の選択、およびスプライス部位認識またはエクソン定義をモジュレートするための１つまたは複数のスプライシングシグナルの選択。スプライシングシグナルは、分岐点、ポリピリミジントラクト、３’スプライス部位、５’スプライス部位、エクソンもしくはイントロンスプライシングエンハンサーもしくはサイレンサーのうちの少なくとも１つもしくは複数、またはこれらの組合せを含む。
【０４２０】
ｇＤＮＡへの挿入時に、ｇＤＮＡヌクレオチド配列を所望通りに変更する（例えば、突然変異を修正または誘導する）１つまたは複数のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を、ドナーポリヌクレオチドの第１の部分またはセグメントが含み、所望の変更された配列を含むヌクレオチドの最終ｍＲＮＡ転写物への正確な組入れに必要な１つまたは複数のスプライシングシグナルを、ドナーポリヌクレオチドの第２の部分またはセグメントが含む。例えば、ｇＤＮＡヌクレオチド配列は、ドナーポリヌクレオチドによって、発現される遺伝子の特定の突然変異を修正または誘導するように、およびそれに付随して、修正または誘導された突然変異をｍＲＮＡに確実に転写するのに必要な１つまたは複数のスプライシングシグナルを提供するように変更される。ドナーポリヌクレオチドを細胞に導入し、細胞のＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復機構が、ドナーポリヌクレオチドを、部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）によりｇＤＮＡに導入されたＤＳＢに挿入する効率、および変更されたヌクレオチド配列がｍＲＮＡに転写される効率を判定する。
【０４２１】
例えば、ドナーポリヌクレオチドのセンス鎖を示す図１の概略図に示されているように、部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を使用して病因突然変異の付近に導入した二本鎖切断（ＤＳＢ）への挿入によりエクソンの有害または病因突然変異（Ｘにより示されている）を修正するように、ドナーポリヌクレオチドを設計する。突然変異を修正する１つまたは複数のヌクレオチド（＊により示されている）を含み、かつ１つまたは複数のスプライシングシグナル（例えば、３’スプライス部位、ポリピリミジントラクト、および／または分岐点）を含む、ドナーポリヌクレオチド（黒で示されている）のＮＨＥＪ媒介挿入によって、ＤＳＢを修復する。ＤＳＢへのドナーポリヌクレオチドの挿入は、エクソンの２つの潜在的３’スプライス部位を有する遺伝子を生成する。
【０４２２】
理論により拘束されるものではないが、ドナーポリヌクレオチドの挿入は、一つには、上流（内在性）３’スプライス部位と次に利用可能な５’スプライス部位の間のヌクレオチド（／／で示されている）の数を増加させることにより、エクソン定義に関与する上流（内在性）３’スプライス部位の能力を有効に阻害または破壊する。ドナーポリヌクレオチドの挿入後、スプライシング機構は、内在性３’および５’スプライス部位を、エクソンを定義する対として認識しない。その代わりに、スプライシング機構は、ドナーポリヌクレオチドを構成する新しい３’スプライス部位（黒で示されている）と次に利用可能な５’スプライス部位とを、これらのスプライス部位はＲＮＡスプライシングのエクソン定義理論と一致しているような位置にあるので、エクソンを定義するスプライス部位の対として認識する。さらに、突然変異を修正する１つまたは複数のヌクレオチド（＊により示されている）の近位かつ上流の新しい３’スプライス部位（および必要に応じて追加のスプライシングシグナル）の存在によって、修正された突然変異とｍＲＮＡ転写物へのその組込みとをコードするエクソンが定義されることになる。
（実施例２）
ＮＨＥＪによりＤＳＢに挿入されたドナーポリヌクレオチドはｇＤＮＡヌクレオチド配列を変更し、エクソンにコドン変化を導入する
【０４２３】
以前の研究は、ＨＤＲによりＤＳＢを修復するためのドナーポリヌクレオチドの使用によるゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の突然変異の修正は、非分裂細胞より分裂細胞でのほうが高率で起こることを示した（データを示さない）。ＨＤＲ修復は、非分裂細胞（例えば、細胞周期のＧ０またはＧ１期の細胞）では非効率的であることが多いが、ＮＨＥＪ修復経路は、分裂細胞でも非分裂細胞でも活性ＤＳＢ修復経路を維持する。したがって、ＤＳＢへのドナーポリヌクレオチドの挿入のためのＮＨＥＪ修復経路の活用は、分裂細胞と非分裂細胞の両方における突然変異の部位特異的修正の導入に理想的である。ドナーポリヌクレオチドが、ＤＳＢの修復のためにドナーポリヌクレオチドを一方向に配向させる相同性アームを含む、ＨＤＲによるＤＳＢの修復のためのドナーポリヌクレオチドの使用とは異なり、ＮＨＥＪ修復機序によりドナーポリヌクレオチドを使用するＤＳＢの修復は、２つの配向、順方向または逆方向、のうちの一方でのＤＳＢへのドナーポリヌクレオチドの挿入をもたらすことができる。細胞が、ドナーポリヌクレオチドを使用してＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復機序によってｇＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＤＳＢを修復し、ｇＤＮＡのヌクレオチド配列を所望通りに変更する能力を評価するために、肝細胞由来の分裂細胞のｇＤＮＡに所望の変更（例えば、修正的編集）をもたらす配向でのドナーポリヌクレオチドのＮＨＥＪ媒介挿入（相同組換えによるドナーポリヌクレオチドの組込みではなく）を判定した。
【０４２４】
所望のヌクレオチド配列変更の組込みに有効である配向でのＤＳＢへのドナーポリヌクレオチドのＮＨＥＪ媒介挿入を本明細書では「修正的編集」または「修正的挿入」と呼ぶ。「修正的挿入」は、修正されたＤＳＢの周囲のｇＤＮＡ配列へのまたは挿入されたドナーポリヌクレオチド（例えば、ドナーポリヌクレオチドが、途切れなくｇＤＮＡ  ＤＳＢに挿入されている）の末端への突然変異の導入なしに、挿入が果たされる、「完全挿入」を含む。「修正的挿入」は、１つまたは複数の小さい突然変異が、修正されたＤＳＢの周囲のｇＤＮＡの配列内で、挿入されたドナーポリヌクレオチドの末端で、または挿入されたドナーポリヌクレオチド内の内部配列で起こるが、所望のヌクレオチド配列変更（例えば、ドナーポリヌクレオチドによりコードされる遺伝子修正および／またはスプライシングシグナル）をコードするｇＤＮＡ配列をなお生じさせる、ＮＨＥＪ媒介挿入も含む。
【０４２５】
コードエクソン内の疾患の原因となることが公知の位置にヌクレオチド変化を導入するために、実施例１で示した基準に基づいてドナーポリヌクレオチドを設計した。コドン変化の導入によるヌクレオチド配列の変更は、コードエクソンの病因突然変異の修正に有用である。例えば、グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット（Ｇ６ＰＣ）遺伝子の第２エクソンのＲ８３Ｃ突然変異が、ヒトにおける糖原病１ａ型（ＧＳＤ１ａ）の原因となることは公知である。ＧＳＤ１ａをもたらすＲ８３Ｃ突然変異を修正するための治療的手法は、Ｇ６ＰＣポリペプチドのＣ８３Ｒ復帰をもたらす第２エクソンのコドン変化を導入すること、およびＧ６ＰＣポリペプチドをコードするｍＲＮＡへの復帰突然変異型コドンの組入れを方向付けるための１つまたは複数のスプライシングシグナルを提供することである。Ｒ８３Ｃ突然変異を修正するためのこの治療戦略を検証する原理の証明として、Ｇ６ＰＣ遺伝子の第２エクソンのヌクレオチド配列を変更するようにドナーポリヌクレオチドを設計し、Ｒ８３Ｃ突然変異を野生型Ｇ６ＰＣ遺伝子の第２エクソンに導入した。これは、ヒトＧ６ＰＣポリペプチドのＲ８３に対応する野生型Ｇ６ＰＣ遺伝子のアルギニン（Ｒ）コドン（ＣＧＴ）を病因システイン（Ｃ）コドン（ＴＧＣ）に突然変異させたドナーポリヌクレオチドを設計し、試験することにより行った。
【０４２６】
手短に述べると、グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット（Ｇ６ＰＣ）遺伝子の第２エクソンに特異的なスペーサーを含むシングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（ｓｇＲＮＡ  ＣＨ３２、配列番号６；ｓｇＲＮＡ  ＣＨ３２スペーサー、配列番号８１；Ｇ６ＰＣ標的遺伝子配列＋ＰＡＭ、配列番号８２）を選択した。ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅ）結合と２’−Ｏ−メチルヌクレオチド残基とを有する改変ｓｇＲＮＡを使用して、所望の標的遺伝子ＤＳＢを生成することができる。長さ２５〜１２５ヌクレオチドの二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）であるドナーポリヌクレオチドであって、２つの配列エレメント：（１）Ｇ６ＰＣポリペプチドの８３位に対応する第２エクソンのオープンリーディングフレームに単一コドン変化を含むエクソン配列、および（２）単独での３’スプライス部位、またはポリピリミジントラクトと組み合わせての３’スプライス部位、または分岐点とさらに組み合わせての３’スプライス部位のいずれかから選択される１つまたは複数のスプライシングシグナル（表１に示す通り）、を含むドナーポリヌクレオチドを作製した。
【０４２７】
ＣＨ３２  ｓｇＲＮＡの標的遺伝子配列を表４に示し、ＣＨ３２  ｓｇＲＮＡスペーサー配列を表３に示し、ＣＨ３２  ｓｇＲＮＡ配列を表２に示す。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列の始点の３ヌクレオチド上流にＤＳＢを形成する。ｄｓＯＤＮドナーポリヌクレオチドによりコードされるエクソン配列は、ＰＡＭ配列の始点から３ヌクレオチド下流の標的遺伝子配列とオーバーラップしており、所望のスプライシングシグナルを有し、コードされたＴＧＣ突然変異でのエクソン配列の回復された、そのようなｄｓＯＤＮドナーポリヌクレオチドが、切断部位に挿入される。
【０４２８】
ｓｇＲＮＡおよび各ドナーポリヌクレオチドを、ＳｐＣａｓ９を構成的に発現するＨｕＨ−７細胞（肝細胞由来の細胞癌細胞系）にトランスフェクトした。並行して、カチオン性リポソームを含むトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（商標）；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してｓｇＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドをＨｕＨ−７細胞にトランスフェクトした。９６ウェルプレートにおける細胞の各ウェルを、３４ｎｇのｓｇＲＮＡと、２００ｎｇのｄｓＤＮＡドナーポリヌクレオチドと、製造業者（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ）により推奨された量のトランスフェクション試薬とを含有する５０μｌ溶液でトランスフェクトした。
【０４２９】
表１に示すような、漸増長（２５〜１２５）のドナーポリヌクレオチドであって、１つまたは複数のスプライシングシグナル配列を含むドナーポリヌクレオチドを、試験した。トランスフェクションの４８時間後に、トランスフェクトされたＨｕＨ−７細胞からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、市販のＤＮＡ抽出キット（ＰｒｅｐＧｅｍ；Ｚｙｇｅｍ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ）を製造業者の説明書に従って使用して単離した。ドナーポリヌクレオチドが、ＣＨ３２  ｓｇＲＮＡ：ｓｐＣａｓ９複合体により生成されたＤＳＢ（ＣＨ３２標的部位、配列番号８２）にＮＨＥＪによって挿入されたかどうかを判定するために、単離されたｇＤＮＡからＰＣＲアンプリコンを生成し、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって解析した。ＮＧＳシークエンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑマシン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で最大３００ｎｔのペアエンドランを使用して行った。試料を標準的なデュアルバーコーディングにより識別した。ＰＣＲの限定サイクル第１ラウンドは、ＣＨ３２標的部位の周囲の約８００ｂｐ領域に対応するアンプリコンを増幅した。第２ラウンドは、前に生成したアンプリコンを使用し、ＣＨ３２標的部位に隣接する約２００ｂｐのシークエンシングすべきコアアンプリコンを生成した。ＮＧＳに必要なアダプターをＰＣＲの最終（第３）ラウンドで付加させた。
【０４３０】
コアアンプリコンのペアエンドシークエンシング後、得られたＦＡＳＴＱファイルを解析して挿入率を判定した。手短に述べると、ＰＡＮＤＡｓｅｑプログラム（Ｍａｓｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１２）  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １３：３１）を使用してリードの末端を結合し、ＦＡＳＴＸ−Ｔｏｏｌｋｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｈａｎｎｏｎｌａｂ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ｆａｓｔｘ＿ｔｏｏｌｋｉｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に備えられているＦＡＳＴＱ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｆｉｌｔｅｒプログラムを使用して品質不良リードを同定し、除去した。同一リードを表にし、プールし、次いで、ＣＨ３２切断部位へのドナーポリヌクレオチド全体の挿入の結果として生じる予測配列について検索した。ドナーポリヌクレオチドを示す予測５’および３’接合部両方とエクソン２の単一コドン変化とを示すシークエンシングリードを修正的挿入について陽性と見なし、これらを全配列リードと比較した。結果を表１に修正的挿入％として示す。
表１．  Ｇ６ＰＣ遺伝子のコドン変化を導入するための一方向性ｄｓＯＤＮドナーポリヌクレオチド
【表１−１】
2021529518.tif 000003
【表１−２】
2021529518.tif 000004
表２．  Ｇ６ＰＣ遺伝子における部位特異的ＤＳＢを方向付けるためのｓｇＲＮＡ配列
【表２】
2021529518.tif 000005
表３．ｇＲＮＡスペーサー配列
【表３】
2021529518.tif 000006
表４．  Ｇ６ＰＣ遺伝子におけるｓｇＲＮＡ標的遺伝子配列
【表４−１】
2021529518.tif 000007
【表４−２】
2021529518.tif 000008
【０４３１】
結果は、ドナーポリヌクレオチドを分裂細胞のＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復機序によりＣａｓ９媒介ＤＳＢの部位に正確に挿入することができ、したがって、ｇＤＮＡ中の特定の位置のヌクレオチド配列を所望通りに変更することが可能になることを実証する。加えて、データは、これらの条件下での挿入のためのドナーポリヌクレオチド長の下限および上限が、それぞれ、長さ約２５ｎｔおよび長さ約７５ｎｔであること、ならびに試験したものからの、修正的編集の挿入に最適なドナーポリヌクレオチド長が、長さ約５０ｎｔであることを示唆する。
【０４３２】
ｇＤＮＡの所望のヌクレオチド配列変更をもたらすようにＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復機序によってｇＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＤＳＢにドナーポリヌクレオチドを挿入する細胞の能力に対するドナーポリヌクレオチド長およびｇＲＮＡ標的部位の位置の効果をさらに評価するために、Ｇ６ＰＣ第２エクソンに特異的な３つの異なるｓｇＲＮＡを、表２に示した通り選択した（ＣＨ３２  ｓｇＲＮＡ（配列番号６）、ＣＨ３４  ｓｇＲＮＡ（配列番号７）、およびＣＨ３６  ｓｇＲＮＡ（配列番号８）；各ｇＲＮＡは、表４に示した標的遺伝子配列を有するＧ６ＰＣ第２エクソン内の異なる部位を標的化する）。
【０４３３】
ｓｇＲＮＡを様々な長さのドナーポリヌクレオチド（表５に示す通り）と組み合わせ、肝細胞由来の分裂細胞のゲノムＤＮＡ中の異なる位置にドナーポリヌクレオチドを挿入する能力を判定した。手短に述べると、ＳｐＣａｓ９を構成的に発現するＨｕＨ−７細胞に、Ｇ６ＰＣ第２エクソンに特異的な３つの異なるｓｇＲＮＡ（表５中のＣＨ３２  ｓｇＲＮＡ、ＣＨ３４  ｓｇＲＮＡおよびＣＨ３６  ｓｇＲＮＡ）を上記の通りトランスフェクトした。ｓｇＲＮＡを、各々が、３’スプライス部位とＧ６ＰＣ遺伝子の第２エクソンのＲのＣへの単一アミノ酸変化を生じさせるように設計したエクソン配列とを少なくとも含む、対応するドナーポリヌクレオチドと共に、コトランスフェクトした。上記の通りのトランスフェクション後、ＳｐＣａｓ９との複合体の状態の対応するｓｇＲＮＡ各々により生成されたＤＳＢへのドナーポリヌクレオチドの挿入を評価した。ｓｇＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を表２および表５にそれぞれ示す。トランスフェクションの４８時間後、細胞を処理してｇＤＮＡを得、ドナーポリヌクレオチドによりコードされる修正的編集を含む全配列リードのパーセンテージを上記の通りＮＧＳ解析により判定した。
表５．  Ｇ６ＰＣ遺伝子のコドン変化を導入するためのｄｓＯＤＮドナーポリヌクレオチドの配列
【表５−１】
2021529518.tif 000009
【表５−２】
2021529518.tif 000010
【０４３４】
図２Ａ〜２Ｃは、Ｃａｓ９および配列番号６（図２Ａ）、配列番号７（図２Ｂ）または配列番号８（図２Ｃ）により示されるｓｇＲＮＡによってＧ６ＰＣ遺伝子に導入されたＤＳＢへのドナーポリヌクレオチドｄｓＯＤＮのＮＨＥＪ媒介挿入後の修正的編集パーセンテージを示す、上記の通り判定した修正的挿入パーセンテージを示す。図２Ａ〜２Ｃに示されているデータは、ｇＤＮＡへの被験ドナーポリヌクレオチドの挿入が、単一ｓｇＲＮＡに限定されず、標的部位に関係なく起こることを実証する。加えて、結果は、長さ７０ヌクレオチドであるかまたはそれより長いドナーポリヌクレオチドが、認識できる頻度でＤＳＢに挿入されないことを示し、これは、これらの条件下でのＤＳＢへの挿入のためのドナーポリヌクレオチド長の上限が、表１に示した結果と一致して、長さ約７０ヌクレオチドであることをさらに示唆する。しかし、その後の研究では、下で詳述するように、より長い長さを有するｄｓＯＤＮドナーポリヌクレオチドを５０ｎｔ  ｄｓＯＤＮに匹敵する効率でＤＳＢに挿入することが可能になった。実施例でさらに説明するように、より長い長さのｄｓＯＤＮドナーポリヌクレオチドの挿入の効率性は、ｓｇＲＮＡ、標的とする遺伝子座、およびｄｓＯＤＮ試薬の調製に依存し得る。
（実施例３）
非分裂性初代ヒト肝細胞のＧ６ＰＣ遺伝子へのドナーポリヌクレオチドの挿入はＧ６ＰＣプレｍＲＮＡスプライシングをモジュレートする
【０４３５】
Ｇ６ＰＣを発現する非分裂性初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）内のＧ６ＰＣプレｍＲＮＡのスプライシングに対するＧ６ＰＣ遺伝子座へのドナーポリヌクレオチドの挿入の効果を評価するために、分裂性ＨｕＨ−７細胞への最高挿入レベルが得られたＣＨ３４＿５４−０ドナーポリヌクレオチド（ＣＨ３４＿５４−０；配列番号３０）を選択し、試験した。ＣＨ３４＿５４−０ドナーポリヌクレオチドは、挿入時に第２エクソンコード領域のアミノ酸変化（Ｒ８３Ｃ）を生じさせるコドンを含むＧ６ＰＣ第２エクソンの５’末端に対応するエクソン配列と並置された３’スプライス部位をコードするイントロン配列を含む。
【０４３６】
手短に述べると、２４ウェルプレートでマウス線維芽細胞との共培養中のＰＨＨに、ＳｐＣａｓ９をコードするｍＲＮＡ（６００ｎｇ）とＧ６ＰＣ第２エクソンを標的とするｓｇＲＮＡ（ＣＨ３４；配列番号７；２００ｎｇ）とを含むトランスフェクション溶液中の様々な濃度のＣＨ３４＿５４−０をトランスフェクトした。様々な濃度のｄｓＯＤＮドナーポリヌクレオチド（０．５６ｎｇから１０ｎｇまで）を試験した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬を、製造業者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）により推奨された通りに使用して細胞のトランスフェクションを促進した。トランスフェクションの４８時間後、ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）に従って使用して、全ＲＮＡおよびｇＤＮＡを同時に単離した。ｍＲＮＡの遺伝子変化の組込みを測定するために、Ｇ６ＰＣ第１エクソンおよび第３エクソンに特異的なＰＣＲプライマーを使用してＮＧＳ解析用のｃＤＮＡアンプリコンを作出して、コード領域のアミノ酸変化（Ｒ８３Ｃ）をコードするＧ６ＰＣ第２エクソンを含むｃＤＮＡアンプリコンのパーセンテージ（修正的編集％）を判定した。細胞を処理してｇＤＮＡを得、ＮＧＳ解析により解析してドナーポリヌクレオチドの修正的挿入の％をも判定した。修正的編集について陽性であった（すなわち、適切なスプライスシグナルおよび所望のヌクレオチド変化を有する）配列リードを全配列リードと比較して修正的編集のパーセントを判定した。
【０４３７】
図３は、Ｇ６ＰＣ第２エクソンｇＤＮＡ遺伝子座（ＤＮＡ）のＣＨ３４  ｓｇＲＮＡ標的部位（配列番号８４）へのドナーポリヌクレオチドのＮＨＥＪ媒介挿入の結果として生じる修正的編集のパーセンテージ（上記の通り判定した）を示す。追加のスプライシングシグナルとＯＲＦのヌクレオチド変化とを含有するドナーポリヌクレオチドの挿入は、Ｇ６ＰＣ  ＤＮＡの修正的編集をもたらし（黒色の線）、予測された遺伝子編集を含有するｍＲＮＡを発現するＧ６ＰＣ遺伝子ももたらす（灰色の線）。修正的編集レベルが、存在するドナーポリヌクレオチドの量（ドナーのｎｇ）の関数であることも示されている。ＤＮＡレベルで、データは、ドナーポリヌクレオチドの挿入の用量依存的増加を実証し、試験した最高濃度で、Ｇ６ＰＣ対立遺伝子のおよそ１０％が、非分裂性初代ヒト肝細胞のＣａｓ９媒介ＤＳＢに正確に挿入されたドナーポリヌクレオチドを有したことを実証する。これは、相同ドナーポリヌクレオチドおよびＨＤＲに基づく修復手法を使用する遺伝子修正と比較して、細胞における修正的編集事象のパーセンテージの１５倍を超える増加に相当する。以前に、ＨＤＲアプローチは、非分裂細胞で約０．５％の修正的編集しか達成しなかった（データを示さない）。加えて、最高濃度のドナーをトランスフェクトした細胞は、成熟Ｇ６ＰＣ  ＲＮＡの場合と同様の修正的編集レベル（＞１５％；図３）も示した。これらのデータは、Ｇ６ＰＣ遺伝子の特異的Ｃａｓ９媒介ＤＳＢへのＣＨ３４＿５４−０ドナーポリヌクレオチドの挿入が、成熟Ｇ６ＰＣ  ｍＲＮＡへの変更されたポリヌクレオチド配列（すなわち、所望のコドン変化）の組入れを用量依存的にもたらすことを実証する。
（実施例４）
ドナーポリヌクレオチドで処置したマウスはＧ６ＰＣプレｍＲＮＡスプライシングをｉｎ  ｖｉｖｏでモジュレートする
【０４３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧ６ＰＣ遺伝子座へのドナーポリヌクレオチドのＮＨＥＪ媒介挿入および修正的編集の効果を評価するために、ＳｐＣａｓ９をコードするｍＲＮＡ、マウスＧ６ＰＣ第２エクソンを標的とするｓｇＲＮＡ（マウスＣＨ３４；配列番号７）、および実施例２で説明したＣＨ３４＿５４−０ドナーポリヌクレオチド（配列番号３０）でマウスを処置した。
【０４３９】
手短に述べると、脂質様物質に基づくナノ粒子（ＬＮＰ）を、ＣＨ３４  ｓｇＲＮＡのマウスホモログ（マウスＣＨ３４；配列番号８９）、ＳｐＣａｓ９をコードするｍＲＮＡ、またはドナーポリヌクレオチドＣＨ３４＿５４−０（配列番号３０）を含有するように、個々に製剤化した。ＬＮＰは、ｓｇＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドを各々２０：１の核酸：脂質比で含有するように、別々に製剤化し、次いで、ＬＮＰを混合した後、注射により投与した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、６〜８週齢、１群当たり５匹）の尾静脈に次の３つの処置剤のうちの１つを注射した：ＰＢＳ；０．５ｍｇ／ｋｇのマウスＣＨ３４  ｇＲＮＡ  ＬＮＰと０．５ｍｇ／ｋｇのＳｐＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＮＰの両方を含有するＬＮＰ混合物；または０．５ｍｇ／ｋｇのマウスＣＨ３４  ｇＲＮＡ  ＬＮＰと０．５ｍｇ／ｋｇのＳｐＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＮＰと０．５ｍｇ／ｋｇのＣＨ３４＿５４−０ドナーポリヌクレオチドＬＮＰとを含有するＬＮＰ混合物。注射の９６時間後、マウスの肝臓を採取し、ｇＤＮＡを抽出し、ＮＧＳ解析を行い、実施例３で説明したように修正的編集を判定した。
【０４４０】
図４Ａは、示したようなドナーポリヌクレオチドのＮＨＥＪ媒介挿入の結果として生じた修正的編集のパーセンテージ（上記の通り判定した）を示す。加えて、別の実験で、ドナーポリヌクレオチドの完全挿入の結果として生じる修正的編集パーセンテージを、実施例２で説明したように、ｇＤＮＡおよびｍＲＮＡ転写物の両方で判定した。修正的編集レベルの増加が、図４Ｂに示されているようなｇＤＮＡおよびｍＲＮＡ転写物のレベルで見られた。注目すべきことに、修正的編集の組込みは、ｍＲＮＡ転写物のレベルで増加される。異なる発現レベルおよびパターンを有するように見える、ある割合の肝細胞が、複数の核を細胞ごとに有することは公知である（Ｋｒｅｕｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ８：８６２）。理論により拘束されるものではないが、ｇＤＮＡの修正は、Ｇ６ＰＣのより転写活性の高い対立遺伝子において増進され得ると考えられる。転写活性が高いｇＤＮＡのみが遺伝子編集された場合、標的遺伝子をコードし、かつ修正的編集を含む、ｇＤＮＡのパーセンテージのほうが、修正的編集をコードする対応するｍＲＮＡのパーセンテージより低くなる。図４Ａ〜４Ｂに示されているデータは、ＬＮＰが３つすべての成分を送達することができること、およびドナーポリヌクレオチドのＮＨＥＪ媒介挿入が、マウス肝臓細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏで起こり、その結果、所望の遺伝子編集（すなわち、修正的編集）が生じることになることを実証する。
（実施例５）
双方向性ドナーポリヌクレオチドは肝細胞由来の細胞におけるＧ６ＰＣまたはＧＡＡのＮＨＥＪ媒介挿入および修正を改善する
【０４４１】
実施例１〜４で説明したドナーポリヌクレオチドは、ドナーポリヌクレオチドを単一（順方向）の配向で挿入したときに修正的編集をもたらすように設計した。しかし、ＮＨＥＪ修復経路によりＤＳＢに挿入されるドナーポリヌクレオチド（例えば、ドナーｄｓＯＤＮ）が順方向で挿入されることもあり、または逆方向で挿入されることもあることから、ドナーポリヌクレオチドが挿入される方向に関係なく所望の遺伝子編集およびスプライシングシグナルが組み込まれるのが理想的である。それ故、図５に示されているように、順方向の配向または逆方向の配向のどちらで挿入された場合も修正的編集および所望のスプライシングシグナルをコードすることになる双方向性ドナーポリヌクレオチドを設計した。
【０４４２】
肝細胞由来の細胞における双方向性ポリヌクレオチドの有効性を判定するために、突然変異したときにポンペ病に関連するＧ６ＰＣ遺伝子またはＧＡＡ遺伝子のどちらかへの双方向挿入のための一群のドナーポリヌクレオチドを設計した。ＧＡＡ遺伝子の突然変異は、イントロンで起こり、スプライシングに影響を与えるので、ピリミジントラクトおよび分岐点を有するドナーポリヌクレオチド設計した。分岐点を、ドナーが順方向の配向または逆方向の配向のどちらで挿入されたとしても機能するように、特異的に設計した。Ｇ６ＰＣドナーポリヌクレオチドは、突然変異を修正するためにエクソン配列を必要とするので、ＣＨ４２＿２５−０ドナーの長さでは双方向性ドナーを使用することができず、そのためこのドナーは、一方向の様式でしか挿入されない。
【０４４３】
成人発症ポンペ病（ＩＶＳ  １（−１３Ｔ＞Ｇ））に関連する最もよく見られる突然変異を含有する領域を標的とするｓｇＲＮＡであるＧＡＡ−５  ｓｇＲＮＡ（配列番号６１）を選択した。これを表６に示す。ＩＶＳ  １（−１３Ｔ＞Ｇ）突然変異は、ＧＡＡ遺伝子の第２エクソンのピリミジントラクトを破壊する。この破壊は、第２エクソンのスキッピング、およびＧＡＡ遺伝子発現と遺伝子産物の酵素的活性とにマイナスの影響を与える隠れたスプライス部位の活性化につながる。表６に示すＧＡＡ−５  ｓｇＲＮＡは、この突然変異が起こる野生型ＧＡＡ遺伝子の領域（配列番号６１）を標的とする。
表６．  ＧＡＡ遺伝子の部位特異的ＤＳＢを方向付けるｇＲＮＡ
【表６】
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【０４４４】
ＧＡＡ遺伝子への挿入のために設計した双方向性ドナーｄｓＯＤＮを表７に示す。５’から３’への方向で、ドナーｄｓＯＤＮ配列は、ポリピリミジントラクトの逆相補配列ＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣ（配列番号５５）、必要に応じて、分岐点配列の逆相補配列ＴＡＣＴＧＡＣ（配列番号５２）、分岐点配列ＴＡＴＴＡＡＣ、およびポリピリミジントラクトＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴ（配列番号５４）を含んだ。ＹＡＧ／Ｇ（式中、Ｙは、チミンまたはシトシンであり、エクソンとイントロン間の境界を示す）によりコードされる３’スプライス部位が、ｇＤＮＡ中に位置する。分岐点配列とポリピリミジントラクトとを含む双方向性ドナーの挿入は、ｇＤＮＡの３’スプライス部位での的確なスプライシングを可能にする。例として、配列番号６３により示される５０ｎｔ  ｄｓＯＤＮのセンスおよびアンチセンス配列を図６Ａに示す。５０ｎｔ  ｄｓＯＤＮが順方向または逆方向のどちらで挿入されるかに関わらず、得られる遺伝子は、図６Ｂに示されているように所望の修正的編集（例えば、分岐点配列および修正されたポリピリミジントラクトの組込み）をコードする。
【０４４５】
注目すべきことに、ｄｓＯＤＮドナーの設計では、順方向でコードされるスプライシングシグナルは、逆方向でコードされる同等のスプライシングシグナルと同じ配列をコードしない。例えば、順方向でコードされるポリピリミジントラクトＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴ（配列番号５４）は、逆方向のポリピリミジントラクト（ｔｒａｃ）ＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣ（配列番号５５）とは異なるが、両方が、ポリピリミジントラクトコンセンサス配列と一致する。理論により拘束されるものではないが、この設計エレメントの目的は、挿入を妨げ得るｄｓＯＤＮの自己アニーリング、またはｄｓＯＤＮが挿入された遺伝子から転写されるｍＲＮＡの自己アニーリングを回避することである。ｍＲＮＡのそのような自己アニーリングは、不良なｍＲＮＡ発現レベルをもたらし得る。したがって、順方向の所与のスプライシングシグナルに対して、逆方向の同等のスプライシングシグナルは、異なる配列を有するが、両方が、転写されたｍＲＮＡのスプライシングを達成するのに必要な所与のスプライシングシグナルのコンセンサス配列と一致する。
表７．  ＧＡＡ遺伝子へのスプライシングシグナルの挿入のための双方向性ｄｓＯＤＮドナーポリヌクレオチド
【表７】
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＊  ＣＨ４２  ２５−０は、一方向性ドナーポリヌクレオチドとして設計した。
【０４４６】
ｓｇＲＮＡとＧ６ＰＣ遺伝子へのＮＨＥＪ媒介挿入のための二方向性ドナーポリヌクレオチド（一方向性対照であるｃｈ４２  ２５−０を除く）との組合せを表２および表８にそれぞれ示す。Ｇ６ＰＣ遺伝子の第２エクソンの３’末端付近の誘導された切断部位への挿入時にＧ６ＰＣ遺伝子の上流５’スプライス部位および野生型エクソンコード配列を組み込むように、双方向性ドナーｄｓＯＤＮを設計した。５’から３’への方向で、エクソンコード配列、５’スプライス部位、５’スプライス部位の逆相補配列ＧＴＧＡＧＴ（配列番号ＸＸ）、およびエクソンコード配列の逆相補配列を含むように、双方向性ドナーｄｓＯＤＮを設計した。ドナーｄｓＯＤＮが順方向で挿入されるのか、逆方向で挿入されるのかに関わらず、得られる遺伝子は、所望の修正的編集（例えば、５’スプライス部位の上流にエクソンコード配列）をコードする。
表８．  Ｇ６ＰＣ遺伝子のコドン変化を導入するための双方向ｄｓＯＤＮドナーポリヌクレオチド
【表８−１】
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【表８−２】
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【０４４７】
ＧＡＡまたはＧ６ＰＣ遺伝子へのどちらかの配向（順方向または逆方向）での挿入パーセントを判定した。手短に述べると、ＨｕＨ−７細胞に、実施例２で説明したように、２０ｎｇのドナーポリヌクレオチド、ｓｇＲＮＡ、およびＳｐＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを、独立してトランスフェクトした。Ｈｕｈ−７細胞はＳｐＣａｓ９を発現するが、編集効率を改善するためにＨｕｈ−７細胞にＳｐＣａｓ９をコードするｍＲＮＡをさらにトランスフェクトした。ＮＧＳ解析および修正的挿入パーセントの判定は、上記の通りに判定した。
【０４４８】
図７Ａ〜７Ｄは、Ｈｕｈ−７細胞のＧ６ＰＣまたはＧＡＡを標的とする双方向性ドナーポリヌクレオチドについての修正的編集のパーセンテージを示す。結果は、ドナーポリヌクレオチドの双方向性が修正的挿入のパーセンテージを劇的に増加させることを示す。
【０４４９】
図７Ａおよび図７Ｃは、ドナーポリヌクレオチドがＧ６ＰＣ遺伝子（図７Ａ）およびＧＡＡ遺伝子（図７Ｃ）に順方向（一方向性ドナーポリヌクレオチドと同様）で挿入されたときの修正的編集のパーセンテージを示す。さらに、図７Ｂおよび図７Ｄは、修正的挿入のパーセンテージが双方向挿入（順方向または逆方向のどちらかでの挿入）に伴って有意に増加することを実証する。双方向性ポリヌクレオチドは、２５〜７５ヌクレオチドの間の長さで有意な挿入を示し、５０ヌクレオチドが最高挿入率を示した。双方向性５０−０ドナーポリヌクレオチドは、全般的に、最高の修正的挿入パーセントを示した。実施例１〜３で観察された修正的挿入と一致して、有意な修正的編集レベルが、上で示した標的ガイドとは明確に異なるｓｇＲＮＡ（例えば、ＣＨ４２  ｓｇＲＮＡ；図７Ａ〜７Ｂ）を有するＧ６ＰＣ遺伝子、またはヒトＧＡＡ遺伝子（図７Ｃ〜７Ｄ）のどちらかを標的とする２５〜７５ｎｔと最大１００ｎｔの間の長さの双方向性ドナーポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞で観察された。
【０４５０】
ＧＡＡ遺伝子への５０ｎｔ双方向性ドナーの挿入レベルをさらに評価して、逆方向に対する順方向での挿入の結果として生じる修正的編集のパーセンテージを判定した。野生型ＧＡＡ遺伝子座の標的配列（配列番号６１）、ｓｐＣａｓ９をコードするｍＲＮＡ、および配列番号６３により示される５０ｎｔ双方向性ドナー（例えば、ｄｓＯＤＮ）に特異的なｓｇＲＮＡをＰＨＨ細胞にトラスフェクトした。トランスフェクション後４８時間の時点で、ＧＡＡ遺伝子の配列を実施例２で説明したようにＮＧＳにより判定した。順方向または逆方向のどちらかでの完全挿入の結果として生じる全配列リードのパーセンテージを判定した。図８に示されているように、順方向または逆方向のどちらかでの挿入は、順方向での挿入により誘導される修正的編集レベルのほうがわずかに高いが、同等であることが判明した。
【０４５１】
挿入の効率は、ドナーポリヌクレオチドの長さに依存することが観察されたので、表６の配列番号６１により示されるｓｇＲＮＡによってＧＡＡ遺伝子において誘導された部位特異的ＤＳＢへの挿入についてのこの依存性を評価するためにさらなる研究を行った。長さ２５ｎｔ〜長さ１００ｎｔの範囲の５ｎｔずつ長さが異なるドナーｄｓＯＤＮを調製した。これらは、表７に記載した配列、および長さを変えた追加の配列を含む。設計し、評価したドナーｄｓＯＤＮの配列を、表９に示す。ＧＡＡ遺伝子座への完全ＮＨＥＪ媒介挿入を、上で説明したようにＨｕＨ−７細胞で評価した。興味深いことに、図７Ｄに示されているようなＧＡＡ遺伝子への双方向性ドナーの挿入について観察された効果とは対照的に、より長いドナーｄｓＯＤＮ（例えば、＞５０ｎｔ）は、より短いｄｓＯＤＮ（例えば、５０ｎｔ）と同様の挿入効果を有することが観察された。実際、図９に示されているように、１００ｎｔドナーｄｓＯＤＮは、５０ｎｔドナーｄｓＯＤＮと同様のレベルの総合的な挿入（例えば、順方向または逆方向のどちらかでの完全挿入）を誘導した。重要な差は、ｄｓＯＤＮ試薬を生成するために使用した供給業者であった（図７Ｄに示されている挿入を生じさせるために使用したｄｓＯＤＮは、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手し、図９に示されている挿入を生じさせるために使用したｄｓＯＤＮは、ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手した）。このように、長い長さ（例えば、５０ｎｔより長い長さ）のドナーｄｓＯＤＮについて高効率挿入が達成される。しかし、理論により拘束されるものではないが、長い長さ（例えば、５０ｎｔより長い長さ）のドナーｄｓＯＤＮの挿入効率は、ドナーポリヌクレオチド試薬の品質、編集されることになる特定の遺伝子座、および／またはｇＲＮＡに基づいて選択される特定の切断部位に依存し得る。
表９．  ＮＨＥＪ媒介挿入のための双方向性ドナーポリヌクレオチド
【表９−１】
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【表９−２】
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（実施例６）
双方向性ドナーポリヌクレオチドは、ポンペ病を有する患者に由来する線維芽細胞のＧＡＡ遺伝子へのＮＨＥＪ媒介挿入を改善する
【０４５２】
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡによりＧＡＡ遺伝子座において誘導されたＤＳＢへの双方向性ドナーポリヌクレオチド（例えば、ｄｓＯＤＮ）のＮＨＥＪ媒介挿入の効率を、ポンペ病を有する患者に由来する線維芽細胞でさらに評価した。細胞を細胞培養培地に播種し、突然変異型ＧＡＡ対立遺伝子を標的とするｇＲＮＡ（配列番号９４）、ｓｐＣａｓ９をコードするｍＲＮＡ、および５０ｎｔ双方向性ドナーｄｓＯＤＮ（配列番号６３）をそれらの細胞に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間の時点で、ｇＤＮＡを細胞から単離し、実施例２で説明したようにＮＧＳによる配列解析に付した。順方向または逆方向のどちらかでのｄｓＯＤＮの完全挿入を含む全配列リードのパーセンテージを判定した。ＧＡＡ遺伝子座へのｄｓＯＤＮの総合的な完全挿入の結果として生じる修正的編集のパーセンテージを図１０Ａに示す。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡとｄｓＯＤＮの両方のトランスフェクションは、単独でのＣａｓ９／ｇＲＮＡの対照と比較して高レベル（１５％を超える修正的編集）をもたらした。
【０４５３】
加えて、全ＲＮＡをトランスフェクト細胞から単離し、ｑＰＣＲおよびＮＧＳを使用して修正的編集について評価した。ｑＰＣＲによる修正的編集の定量に、２セットのｑＰＣＲプローブを使用した。１セットは、第２エクソンを含むＧＡＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写物を認識し、その一方で、第２のセットは、第２エクソンを欠いているＧＡＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写物を認識した。第２エクソンを欠いているｍＲＮＡのレベルに対する、第２エクソンを含むｍＲＮＡのレベルを、ｑＰＣＲにより判定した。エクソン組入れのためのΔΔＣｔを図１０Ｂに示す。ｄｓＯＤＮをトランスフェクトした細胞は、突然変異型ＧＡＡ遺伝子から転写されたｍＲＮＡへの第２エクソンの組入れが向上した。これは、転写レベルでのＧＡＡ遺伝子の修正増加を示す。このことを、ＧＡＡ遺伝子から転写されたｍＲＮＡを、ＮＧＳを使用してシークエンシングすることによりさらに裏づけた。図１０Ｃに示されているように、模擬トランスフェクト細胞（例えば、未処置細胞）の転写物と比較して第２エクソンを含む転写物のパーセント増加は、ドナーｄｓＯＤＮをトランスフェクトした細胞のほうが高かった。まとめると、これらの結果は、ヒト細胞のＧＡＡ遺伝子のスプライシング突然変異の修正のための双方向性ドナーＤＮＡの使用の正当性を立証する。
配列表
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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【表１０−７】
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【表１０−８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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