(57)【要約】本明細書に記載の技術は、アネキシンA1（ANXA1）のレベルまたは活性を低下させる物質の投与により、対象における細胞外小胞（EV）関連疾患または血管石灰化を処置する方法に関する。2021533163.tif 000014
2021533163.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象におけるアネキシンA1（ANXA1）のレベルまたは活性を低下させる物質を投与する工程を含む、対象における細胞外小胞（EV）関連疾患を処置する方法。
【請求項２】
EV関連疾患が、心臓弁膜症、血管疾患、関節リウマチ、神経変性疾患、自己免疫疾患、石灰沈着性大動脈弁疾患、糖尿病、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肺線維症、非アルコール性脂肪肝疾患、骨粗鬆症、アルツハイマー病、強皮症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、高コレステロール血症、がん、および肥満からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
それを必要とする対象におけるアネキシンA1（ANXA1）のレベルまたは活性を低下させる物質を投与する工程を含む、対象における血管石灰化を減少させる方法。
【請求項４】
対象が、心臓弁膜症、血管疾患、関節リウマチ、神経変性疾患、自己免疫疾患、石灰沈着性大動脈弁疾患、糖尿病、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肺線維症、非アルコール性脂肪肝疾患、骨粗鬆症、アルツハイマー病、強皮症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、高コレステロール血症、がん、および肥満からなる群より選択される疾患を有する、請求項3記載の方法。
【請求項５】
ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を細胞と接触させる工程を含む、細胞からの細胞外小胞（EV）の輸送を阻害または低減するための方法。
【請求項６】
細胞が、平滑筋細胞（SMC）、弁間質細胞（VIC）、乏突起神経膠腫細胞、内皮細胞、マクロファージ、単球、またはがん細胞である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記物質が、ANXA1のインヒビターである、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記物質が、低分子、核酸、ポリペプチド、抗体試薬、またはゲノム編集システムである、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
核酸が、阻害性核酸、サイレンシングRNA（siRNA）、マイクロRNA（miRNA）、またはショートヘアピンRNA（shRNA）である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
siRNA配列が、SEQ ID NO:1または2を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
抗体試薬が、抗ANXA1抗体試薬である、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
抗体試薬が、ANXA1中和抗体試薬である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
ANXA1中和抗体試薬が、N末端ANXA1中和抗体試薬である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
低分子が、カルシウムキレーターである、請求項8記載の方法。
【請求項１５】
カルシウムキレーターが、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記物質が、細胞外小胞へのANXA1ローディングを減少させる、請求項１〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
前記物質が、ダイナミン関連タンパク質1（DRP1）のインヒビターである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記物質が、mdivi-1であるかまたは阻害性核酸である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記物質が、ANXA1のN末端ドメインの切断を誘導する、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記物質が、プロテイナーゼ3またはHLEのアゴニストである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
対象が、哺乳動物である、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
対象が、ヒトである、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を投与する前に、対象の微小石灰化のレベルが上昇していることを示すアッセイの結果を受け取る工程を更に含む、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
対象のANXA1のレベルまたは活性が上昇していることを示すアッセイの結果を受け取る工程を更に含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
アッセイが、細胞外小胞石灰化アッセイ；小胞結合アッセイ；小胞繋留アッセイ；組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNAP）アッセイ；免疫組織化学アッセイ；質量分析法；プロテオミクス；走査型電子顕微鏡観察；および透過型電子顕微鏡観察からなる群より選択される、請求項23または24記載の方法。
【請求項２６】
生体サンプルが、血液、血管組織、または心臓弁組織である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
対象における細胞外小胞（EV）関連疾患の処置に使用するための、アネキシンA1（ANXA1）のレベルまたは活性を低下させる1つまたは複数の物質。
【請求項２８】
EV関連疾患が、心臓弁膜症、血管疾患、関節リウマチ、神経変性疾患、自己免疫疾患、石灰沈着性大動脈弁疾患、糖尿病、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肺線維症、非アルコール性脂肪肝疾患、骨粗鬆症、アルツハイマー病、強皮症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、高コレステロール血症、がん、および肥満からなる群より選択される、請求項27記載の1つまたは複数の物質。
【請求項２９】
対象における血管石灰化の減少に使用するための、アネキシンA1（ANXA1）のレベルまたは活性を低下させる1つまたは複数の物質。
【請求項３０】
対象が、心臓弁膜症、血管疾患、関節リウマチ、神経変性疾患、自己免疫疾患、石灰沈着性大動脈弁疾患、糖尿病、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肺線維症、非アルコール性脂肪肝疾患、骨粗鬆症、アルツハイマー病、強皮症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、高コレステロール血症、がん、および肥満からなる群より選択される疾患を有する、請求項29記載の1つまたは複数の物質。
【請求項３１】
ANXA1のインヒビターである、請求項27〜30のいずれか一項記載の1つまたは複数の物質。
【請求項３２】
低分子、核酸、ポリペプチド、抗体試薬、またはゲノム編集システムである、請求項27〜31のいずれか一項記載の1つまたは複数の物質。
【請求項３３】
核酸が、阻害性核酸、サイレンシングRNA（siRNA）、マイクロRNA（miRNA）、またはショートヘアピンRNA（shRNA）である、請求項32記載の1つまたは複数の物質。
【請求項３４】
siRNA配列が、SEQ ID NO:1または2を含む、請求項33記載の1つまたは複数の物質。
【請求項３５】
抗体試薬が、抗ANXA1抗体試薬である、請求項32記載の1つまたは複数の物質。
【請求項３６】
抗体試薬が、ANXA1中和抗体試薬である、請求項35記載の1つまたは複数の物質。
【請求項３７】
ANXA1中和抗体試薬が、N末端ANXA1中和抗体試薬である、請求項36記載の1つまたは複数の物質。
【請求項３８】
低分子が、カルシウムキレーターである、請求項32記載の1つまたは複数の物質。
【請求項３９】
カルシウムキレーターが、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）である、請求項38記載の1つまたは複数の物質。
【請求項４０】
細胞外小胞へのANXA1ローディングを減少させる、請求項27〜39のいずれか一項記載の1つまたは複数の物質。
【請求項４１】
ダイナミン関連タンパク質1（DRP1）のインヒビターである、請求項40記載の1つまたは複数の物質。
【請求項４２】
mdivi-1であるかまたは阻害性核酸である、請求項41記載の1つまたは複数の物質。
【請求項４３】
ANXA1のN末端ドメインの切断を誘導する、請求項27〜42のいずれか一項記載の1つまたは複数の物質。
【請求項４４】
プロテイナーゼ3またはHLEのアゴニストである、請求項43記載の1つまたは複数の物質。
【請求項４５】
対象が、哺乳動物である、請求項27〜44のいずれか一項記載の1つまたは複数の物質。
【請求項４６】
対象が、ヒトである、請求項45記載の1つまたは複数の物質。
【請求項４７】
微小石灰化のレベルが上昇していると判定された対象に投与される、請求項27〜46のいずれか一項記載の1つまたは複数の物質。
【請求項４８】
ANXA1のレベルまたは活性が上昇していると判定された対象に投与される、請求項27〜47のいずれか一項記載の1つまたは複数の物質。
【請求項４９】
前記判定が、細胞外小胞石灰化アッセイ；小胞結合アッセイ；小胞繋留アッセイ；組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNAP）アッセイ；免疫組織化学アッセイ；質量分析法；プロテオミクス；走査型電子顕微鏡観察；および透過型電子顕微鏡観察からなる群より選択されるアッセイを用いて行われる、請求項47または48記載の1つまたは複数の物質。
【請求項５０】
前記レベルが、生体サンプル中のレベルである、請求項47〜49のいずれか一項記載の1つまたは複数の物質。
【請求項５１】
生体サンプルが、血液、血管組織、または心臓弁組織である、請求項50記載の1つまたは複数の物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、35 U.S.C. § 119(e)の下、2018年8月7日に出願された米国仮出願第62／715，428号の恩典を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。2019年7月22日に作成されたASCIIのコピーは、043214-093330WOPT_SL.txtと命名され、サイズは119,910バイトである。
【０００３】
技術分野
本明細書において記載される技術は、例えば、細胞外小胞（EV）関連疾患における血管石灰化を処置するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
心血管細胞は、血管系において凝集し、微小石灰化を形成する細胞外小胞（EV）を分泌する。これら微小石灰化は、多数の疾患の病理に寄与し、アテローム硬化性プラーク破裂および心臓弁不全の両方を促進する。EV同士の結合および凝集を誘導する機序はこれまで同定されておらず、現在のところ、利用可能な抗石灰化薬物療法は存在しない。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本明細書において記載される通り、本発明者らは、EVの凝集がアネキシンA1（ANXA1）によって制御されていることを見出した。ANXA1の阻害は、EVの凝集に加えて石灰化を減少させる。したがって、石灰化に加えて、自己免疫疾患および神経変性疾患およびがんを含む多数のEV関連疾患を処置するための、ANXA1の阻害に関する方法および組成物が本明細書において提供される。
【０００６】
態様のうちのいずれかの一局面では、それを必要とする対象におけるアネキシンA1（ANXA1）のレベルまたは活性を低下させる物質を投与する工程を含む、対象における細胞外小胞（EV）関連疾患を処置する方法が、本明細書において記載される。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、EV関連疾患は、心臓弁膜症、血管疾患、関節リウマチ、神経変性疾患、自己免疫疾患、石灰沈着性大動脈弁疾患、糖尿病、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肺線維症、非アルコール性脂肪肝疾患、骨粗鬆症、アルツハイマー病、強皮症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、高コレステロール血症、がん、および肥満からなる群より選択される。
【０００７】
態様のうちのいずれかの一局面では、それを必要とする対象におけるアネキシンA1（ANXA1）のレベルまたは活性を低下させる物質を投与する工程を含む、対象における血管石灰化を減少させる方法が、本明細書において記載される。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、対象は、心臓弁膜症、血管疾患、関節リウマチ、神経変性疾患、自己免疫疾患、石灰沈着性大動脈弁疾患、糖尿病、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肺線維症、非アルコール性脂肪肝疾患、骨粗鬆症、アルツハイマー病、強皮症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、高コレステロール血症、がん、および肥満からなる群より選択される疾患を有する。
【０００８】
態様のうちのいずれかの一局面では、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を細胞と接触させる工程を含む、細胞からの細胞外小胞（EV）の輸送を阻害または低減するための方法が、本明細書において記載される。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、細胞は、平滑筋細胞（SMC）、弁間質細胞（VIC）、乏突起神経膠腫細胞、内皮細胞、マクロファージ、単球、またはがん細胞である。
【０００９】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、上記の物質は、ANXA1のインヒビターである。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、上記の物質は、低分子、核酸、ポリペプチド、抗体試薬、またはゲノム編集システムである。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、核酸は、阻害性核酸、サイレンシングRNA（siRNA）、マイクロRNA（miRNA）、またはショートヘアピンRNA（shRNA）である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、siRNA配列は、SEQ ID NO:1または2を含む。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、抗体試薬は、抗ANXA1抗体試薬である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、抗体試薬は、ANXA1中和抗体試薬である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ANXA1中和抗体試薬は、N末端ANXA1中和抗体試薬である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、低分子は、カルシウムキレーターである。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、カルシウムキレーターは、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）である。
【００１０】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、上記の物質は、細胞外小胞へのANXA1ローディングを減少させる。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、上記の物質は、ダイナミン関連タンパク質1（DRP1）のインヒビターである。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、上記の物質は、mdivi-1であるかまたは阻害性核酸である。
【００１１】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、上記の物質は、ANXA1のN末端ドメインの切断を誘導する。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、上記の物質は、プロテイナーゼ3またはHLEのアゴニストである。
【００１２】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、対象は、哺乳動物である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、対象は、ヒトである。
【００１３】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、方法は、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を投与する前に、対象の微小石灰化のレベルが上昇していることを示すアッセイの結果を受け取る工程を更に含む。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、方法は、対象のANXA1のレベルまたは活性が上昇していることを示すアッセイの結果を受け取る工程を更に含む。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、アッセイは、細胞外小胞石灰化アッセイ；小胞結合アッセイ；小胞繋留アッセイ；組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNAP）アッセイ；免疫組織化学アッセイ；質量分析法；プロテオミクス；走査型電子顕微鏡観察；および透過型電子顕微鏡観察からなる群より選択される。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、生体サンプルは、血液、血管組織、または心臓弁組織である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1A〜1Dは、ヒト心血管組織のSMCおよびVICが、凝集したEVをコラーゲン細胞外マトリックスに放出したことを実証する。（図1A）石灰化したヒト頸動脈組織におけるSMCおよび（図1B）石灰化したヒト大動脈弁組織におけるVICの、透過型電子顕微鏡画像（n＝3人のドナー、代表的な画像が示されている；スケールバー、500nm）。上のパネルにおける矢印は、原形質膜から出芽した可能性の高いEVを示し、下のパネルにおける矢印は、放出された可能性の高い多胞体を示す。（図1C）石灰化したヒト頸動脈および（図1D）石灰化したヒト大動脈弁組織における任意の細胞から離れたコラーゲン細胞外マトリックスにおける凝集したEV（矢印）（n＝3人のドナー、代表的な画像を示す；スケールバー、100nm）。
【図２】図2A〜2Cは、凝集し石灰化しているEVが、石灰化したヒト心血管組織における微小石灰化の前駆体である可能性が高いことを実証する。（図2A）ヒト頸動脈およびヒト大動脈弁組織におけるコラーゲン細胞外マトリックスにおける、凝集し石灰化しているEV（黒矢印は、膜ヒドロキシアパタイトが形成されているEVを示す）の透過型電子顕微鏡画像（n＝3人のドナー、代表的な画像を示す；スケールバー、200nm）。（図2B）ヒト頸動脈および（図2C）ヒト大動脈弁組織マトリックスにおける凝集した微小石灰化の密度依存性走査型電子顕微鏡画像；スケールバー、1μm（n＝5人のドナー、代表的な画像を示す）。
【図３Ａ】図3A〜3Cは、ヒト心血管EVタンパク質の組成が骨形成条件下で変化したことを実証する。（図3A）NMまたはOMで培養しプロテオミクス解析に使用した細胞からの馴化培地中のヒトのSMCおよびVICに由来するEVのサイズおよび存在量のナノ粒子追跡分析；データは3人のドナーからの平均±s.d.である。
【図３Ｂ】SMCおよびVICの馴化培地から単離しプロテオミクス解析に使用したEVの透過型電子顕微鏡画像（n＝3人のプールされたドナー、代表的な画像を示す）。
【図３Ｃ】ヒトのSMC（n＝9人のドナー）およびVIC（n＝7人のドナー）の馴化培地に由来するEVについてのプロテオミクスボルケーノプロット解析。対照NMと比較してOMで検出された総タンパク質分布の円グラフと共に、プロットは、増加した、非有意の、および減少したEVタンパク質の存在量を示す。
【図４】図4A〜4Bは、ヒトのSMCおよびVICに由来するEVが繋留タンパク質を含有していたことを実証する。（図4A）SMC（n＝9人のドナー）およびVIC（n＝7人のドナー）から得られたEVからのOMにおいて有意に変化したタンパク質に基づく、多く含まれる経路。SMCおよびVICに由来するEVに多く含まれる共有経路は、経路ネットワークに青色のノードで示され、隣接するヒートマップに収載されている。ネットワークにおける接続は、経路間で共通のタンパク質を示す（タンパク質が多いほど接続が太くなる）。ノードのサイズは、エンリッチメントの有意性に対応する（-log（q値）に比例）。（図4B）検出されたOMで増加したEVタンパク質のベン図、左端の円はSMCに由来するEV（n＝9人のドナー）で検出されたタンパク質を含み、右端の円はVICに由来するEV（n＝7人のドナー）で検出されたタンパク質を含む。SMCおよびVICに由来するEVの両方で検出され、いずれかまたは両方のOMで増加したアネキシンタンパク質（ANXA1、ANXA2、ANXA5、ANXA6、ANXA7）を、濃い文字列で示した。SMCに由来するEV（左端の丸）、VICに由来するEV（右端の丸）、またはSMCおよびVICに由来するEVの両方（重複している領域）のOMで検出され、増加した追加のタンパク質を、薄い文字列で示した。
【図５】図5A〜5Cは、石灰化したヒト心血管組織および繋留されたEVがANXA1を含有していたことを実証する。（図5A）石灰化した（紫色）ヒトの頸動脈および大動脈弁組織におけるANXA1の免疫組織化学的検査。スケールバー、20μm；n＝5人のドナー、代表的な画像を示す。（図5B）コラーゲンマトリックス（CNA35-OG488）における凝集した微小石灰化（OsteoSense）付近のヒトの頸動脈および大動脈弁組織のANXA1免疫蛍光。スケールバー、20μm；n＝5人のドナー、代表的な画像を示す。（図5C）コラーゲン細胞外マトリックス中の繋留されたEV（矢印）におけるANXA1免疫金標識（黒点）の石灰化したヒトの頸動脈および大動脈弁組織の透過型電子顕微鏡観察。スケールバー、100nm；n＝3人のドナー、代表的な画像を示す。
【図６Ａ】図6A〜6Cは、ANXA1のノックダウンによりヒトのSMCおよびVICの石灰化が減弱したことを実証する。（図6A）対照NMまたはOMで培養し対照siRNA（対照）またはANXA1 siRNA（ANXA1si）で処理した細胞からのヒトのSMCおよびVICのANXA1 mRNAレベルおよびANXA1タンパク質。データは、3人のドナーからの平均± s.d.である；***P＜0.001、**P＜0.01、*P＜0.05、ANOVAによって分析。
【図６Ｂ】対照siRNAまたはANXA1siを含むNMまたはOM中のヒトのSMCおよびVICにおけるTNAP活性；n＝3人のドナー、データは平均±s.d.である、****P＜0.0001、***P＜0.001、**P＜0.01、*P＜0.05、ANOVAによって分析。
【図６Ｃ】対照siRNAまたはANXA1siを含むNMまたはOMで培養したSMCおよびVICにおける微小石灰化（Osteosense染色；DAPI）の共焦点顕微鏡画像；n＝3人のドナー、データは平均±s.d.である、**P＜0.01、*P＜0.05、ANOVAによって分析。
【図７Ａ】図7A〜7Dは、カルシウムシグナル伝達の機能不全が、SMCおよびVICに由来するEVへのANXA1ローディングを増加させたことを実証する。（図7A）対照siRNA（対照）またはANXA1 siRNA（ANXA1si）を含む対照NMまたはOMで培養した細胞からの馴化培地におけるヒトのSMCおよびVICに由来するEVの存在量およびサイズ；n＝3人のドナー、データは平均値±s.d.である。
【図７Ｂ】ANXA1がEV表面に局在することを確認するための実験デザインを示すイラスト。EV表面上のANXA1を上清に放出させるためにEDTAで処理したヒトのSMCおよびVICに由来するEVからのANXA1ウェスタンブロット；n＝3人のドナー、データは平均値±s.d.である、*P＜0.05、t検定によって分析。
【図７Ｃ】対照siRNAまたはANXA1 siRNAを含むNMまたはOMで培養したSMCからのDRP1およびβ−アクチン（ローディング対照）タンパク質；n＝3人のドナー、データは平均±s.d.である、**P＜0.01、ANOVAによって分析。
【図７Ｄ】NM、OM、またはmdivi-1で処理したOM中のSMCに由来するEV上のANXA1およびフロチリン−1（ローディング対照）タンパク質；n＝3人のドナー、データは平均±s.d.である、*P＜0.05、ANOVAによって分析。
【図８Ａ】図8A〜8Dは、ANXA1が小胞を繋留し、その阻害が小胞の凝集を抑制したことを実証する。（図8A）DiR'の共焦点Zスタック画像；DiIC18(7) 1,1’-ジオクタデシル-3,3,3’,3’-テトラメチルインドトリカルボシアニンヨードで標識された、膨潤によって生成された小胞（X，Y平面、30μm、およびZ、10μm）および凝集した小胞の繋留部位（矢印）におけるANXA1-GFP結合（X，Y平面、32.4559μm、およびZ、19.2μm）；n＝3回の実験、代表的な画像を示す。
【図８Ｂ】ANXA1の時間および濃度依存性の小胞凝集；データは3回の実験からの平均±s.d.である。
【図８Ｃ】（図8C）EDTAおよび（図8D）N末端ANXA1中和抗体による小胞凝集の阻害。データは3回の実験からの平均±s.d.である；****P＜0.0001、ANOVAによって分析。
【図８Ｄ】図8Cの説明を参照のこと。
【図９】図9A〜9Bは、ANXA1の阻害により、3DコラーゲンヒドロゲルにおけるSMCおよびVICに由来するEVで生成される微小石灰化が抑制されたことを実証する。（図9A）3DコラーゲンヒドロゲルEV微小石灰化実験デザインを示すイラスト。対照siRNA（対照）またはANXA1 siRNA（ANXA1si）を含む馴化対照NMまたはOMにおいてヒトのSMCおよびVICに由来するEVを用いた3Dコラーゲンヒドロゲルにおける、EVで生じる微小石灰化；スケールバー、20μm、n＝3人のドナー、***P＜0.001、*P＜0.05、ANOVAによって分析。（図9B）3DコラーゲンヒドロゲルにおけるOM SMCおよびVICに由来するEV石灰化凝集体の超解像イメージング。SMCに由来するEV X、Y平面、3200nm、Z、800nm、およびVICに由来するEV X、10800nm、Y、9600、Z、4800；n＝3人のドナー、代表的な画像を示す。
【図１０】コラーゲン細胞外マトリックスにおける繋留されたEV（矢印）上のANXA1免疫金標識（黒点）の石灰化したヒト頸動脈組織の透過型電子顕微鏡観察を示す。スケールバー、100nm；n＝3人のドナー、代表的な画像を示し、図5Cに追加の画像が含まれる。
【図１１】コラーゲン細胞外マトリックスにおける繋留されたEV（矢印）上のANXA1免疫金標識（黒点）の石灰化したヒト大動脈弁組織の透過型電子顕微鏡観察を示す。スケールバー、100nm；n＝3人のドナー、代表的な画像を示し、図5Cに追加の画像が含まれる。
【図１２】図12A〜12Bは、石灰化していないおよび石灰化したヒトの頸動脈（図12A）および大動脈弁組織（図12）におけるANXA1免疫組織化学的検査を示す。スケールバー、50μm；n＝5人のドナー、3人のドナーを示し、図5Aに追加の画像が含まれる。
【図１３】石灰化していないおよび石灰化したヒト大動脈弁組織におけるアネキシンA1、A2、A5、A6、およびS100A11の非標識プロテオミクス解析のグラフを示す；n＝9人のドナー、S100A11は8/9の石灰化していないドナー組織および7/9の石灰化したドナー組織で検出され、ANXA1は9/9のドナーで検出され、ANXA2は9/9のドナーで検出され、ANXA5は9/9のドナーで検出され、ANXA6は5/9の石灰化していないドナー組織および1/9の石灰化した組織で検出された。
【図１４】図14A〜14Bは、ANXA1 siRNAによって、ANXA2、ANXA5、およびANXA6のmRNAレベルが変化しなかったことを実証する。対照NMまたはOMで培養し対照siRNA（対照）またはANXA1 siRNA（ANXA1si）で処理した細胞からの（図14A）ヒトのSMCおよび（図14B）VICのANXA2、ANXA5、およびANXA6のmRNAレベル。データは3人のドナーからの平均±s.d.である；*P＜0.05、ANOVAによって分析。
【図１５】図15A〜15Bは、GFP-ANXA1タンパク質の免疫精製および押出によって生成された小胞のナノ粒子追跡分析を示す。（図15A）ヒトANXA1−緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付きプラスミドでトランスフェクションされたHEK-293細胞のライブセル共焦点顕微鏡観察；スケールバー、50μm。ポリビニルアルコール膨潤によって生成されたホスファチジルセリン小胞に対するANXA1の結合の共焦点イメージングに使用された、溶出したANXA1−GFPタンパク質の免疫沈降ウェスタンブロット。（図15B）フィルター押出によって生成されたホスファチジルセリン小胞サイズのナノ粒子追跡分析；データは、5回の反復測定からの平均±s.d.である。
【図１６】ワーキングモデルの図を示す：ヒトのSMCまたはVICでは、石灰化条件によって、ミトコンドリアのカルシウム貯蔵と、アネキシンカルシウムチャネルを介してTNAP活性化を増加させるカルシウムシグナル伝達とが変化した。次いで、TNAPがEVにロードされると、EVの石灰化能が増大した。カルシウムシグナル伝達の変化によって、アネキシンが細胞膜上に局在し、ANXA1およびアネキシン関連タンパク質（S100カルシウム結合タンパク質）を含むアネキシンのEVへの取り込みが増加し、コラーゲン細胞外マトリックスに捕捉されたEVの繋留および凝集が促進された。次いで、凝集したEVは、ヒドロキシアパタイトの核となり、微小石灰化を形成した。ANXA1阻害により、TNAP活性およびEV繋留が抑制され、それによって、微小石灰化の形成が減弱した。
【図１７】ワーキングモデルモデルの図を示す。骨形成条件は、TNAPの活性化および細胞外小胞（EV）へのローディングを引き起こし（Goettschら、2016に示されている通り）、そして、アネキシンの輸送を変化させてEVの表面上のアネキシンを増加させるようにカルシウムのシグナル伝達を変化させ（Rogersら、2017に示されている通り）、その結果、微小石灰化の形成を促進するEVの繋留が増強される（Hutchesonら、2016に示されている通り）。アネキシンalの阻害により、TNAPの活性化および小胞の繋留が阻害されることによって石灰化の形成が減少する。
【図１８】ヒトの動脈および弁における石灰化の例示的な走査型電子顕微鏡画像を示す。画像の明瞭化のために、動脈画像は、コラーゲンおよび微小石灰化が現れる密度依存性の着色を用いることによって着色されている。これら画像は、小胞が組織の石灰化に寄与し得、ヒト組織において凝集していることを示す。石灰化したヒトの頸動脈および弁組織において細胞外小胞は繋留される。石灰化したヒト頸動脈および石灰化した大動脈弁組織におけるコラーゲン細胞外マトリックス中の凝集した小胞を示す代表的な電子顕微鏡画像；n＝3。骨形成培地で培養したヒト平滑筋細胞小胞では、アネキシンA1が増加する。対照培地および骨形成培地で培養したヒト冠動脈平滑筋細胞の細胞外小胞に分泌されたタンパク質のボルケーノプロット；対照培地と比較した骨形成培地の比率を示す。矢印はアネキシンalを示し、これは骨形成培地の小胞において有意に多く含まれる；n＝9。
【図１９】石灰化したヒトの動脈および弁組織の小胞がアネキシンalを含有することを実証する。ヒト心血管組織における代表的なIHCおよび陽性アネキシンA1染色（対照として二次のみ使用）、ならびに石灰化したヒトの大動脈弁および動脈組織におけるコラーゲン細胞外マトリックス中のアネキシンal免疫金で標識された凝集小胞を示す免疫金電子顕微鏡画像；n＝3〜5。
【図２０−１】図20は、アネキシンA1 siRNAがヒト平滑筋細胞および弁間質細胞の組織非特異的アルカリホスファターゼ活性を低下させたことを実証する。ヒト平滑筋細胞および弁間質細胞のsiRNAのノックダウンをウェスタンブロットおよびqPCRによって確認し、それに加えて、アネキシンal siRNAが他のアネキシンmRNAレベルを変化させなかったことを確認した；NM＝対照培地、OM＝骨形成培地。ヒトの冠動脈平滑筋細胞および弁間質細胞の組織非特異的アルカリホスファターゼ活性を14日目に測定した；n＝3。
【図２０−２】図20-1の説明を参照のこと。
【図２１】アネキシンA1 siRNAがヒト平滑筋細胞の石灰化を減少させたことを実証する。アネキシンal siRNAは、細胞外小胞（EV）の存在量もサイズも変化させなかった。アネキシンal siRNAは、3Dコラーゲンヒドロゲルにおいてヒト平滑筋細胞小胞が媒介する石灰化を抑制した。全ての条件の共焦点イメージングを示し、骨形成培地条件の微小石灰化について超解像を示す。アネキシンAl siRNAによる石灰化の減弱を示す、小胞が媒介する石灰化の3Dコラーゲン水素モデル。NM＝対照培地、OM＝骨形成培地、Scr siRNA＝対照siRNA、アネキシンal siRNA＝アネキシンalノックダウンsiRNA。14日目、細胞外小胞を含有するヒト冠動脈平滑筋細胞培地を無細胞3Dコラーゲンヒドロゲルに添加し、次いで、21日間培養し、その時点でCNAコラーゲンプローブによってコラーゲンを、そして、Osteosenseで石灰化を染色した；n＝3。
【図２２】アネキシンA1 siRNAがヒト弁間質の石灰化を減少させたことを示す。アネキシンal siRNAは、細胞外小胞（EV）の存在量もサイズも変化させなかった。アネキシンal siRNAは、3Dコラーゲンヒドロゲルにおいてヒト弁間質細胞小胞が媒介する石灰化を抑制した。全ての条件の共焦点イメージングを示し、そして、骨形成培地条件の微小石灰化について超解像を示す。アネキシンAl siRNAによる石灰化の減弱を示す、小胞が媒介する石灰化の3Dコラーゲン水素モデル。NM＝対照培地、OM＝骨形成培地、Scr siRNA＝対照siRNA、アネキシンal siRNA＝アネキシンalノックダウンsiRNA。14日目、細胞外小胞を含有するヒト弁間質細胞培地を無細胞3Dコラーゲンヒドロゲルに添加し、次いで、21日間培養し、その時点でCNAコラーゲンプローブによってコラーゲンを、そして、Osteosenseで石灰化を染色した；n＝3。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
本明細書に記載されている通り、本発明者らは、ANXA1が小胞の凝集および微小石灰化の形成に寄与することを見出した。したがって、ANXA1を阻害し、それによって、石灰化の機序を阻止することにより、石灰化、微小石灰化、および様々な血管／弁／心血管の病態を治療または予防する方法が本明細書において提供される。
【００１６】
注目すべきことに、今回の知見は、アテローム性動脈硬化症病変および石灰化の形成のプロセスが機序的に異なることを実証する。マウスのアテローム性動脈硬化症病変においてANXA1自体が治療効果を有し得る場合、ヒトの石灰化では、治療効果を有するのはANXA1の阻害である。マウスのアテローム性動脈硬化症病変に対するANXA1のこの効果は、好中球活性への影響に起因することが本明細書において検討される。このような効果はマウスに特有のものであるが、その理由は、ヒトのアテローム性動脈硬化症における好中球の関与の証拠がないためである。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本方法に従って処置される対象は、ヒト対象である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本方法に従って処置される対象は、アテローム性動脈硬化症および／またはアテローム硬化性病変を有しておらず、診断されてもいない。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本方法に従って処置される対象は、後期のアテローム性動脈硬化症および／またはアテローム硬化性病変を有しておらず、診断されてもいない。
【００１７】
態様のうちのいずれかの一局面では、それを必要とする対象におけるアネキシンA1（ANXA1）のレベルまたは活性を低下させる物質を投与する工程を含む、対象における細胞外小胞（EV）関連疾患を処置する方法が、本明細書において記載される。態様のうちのいずれかの一局面では、それを必要とする対象におけるアネキシンA1（ANXA1）のレベルまたは活性を低下させる物質を投与する工程を含む、対象における血管石灰化を減少させる方法が、本明細書において記載される。態様のうちのいずれかの一局面では、それを必要とする対象におけるアネキシンA1（ANXA1）のレベルまたは活性を低下させる物質を投与する工程を含む、対象における微小石灰化／石灰化を治療する、減少させる、または予防する方法が、本明細書において記載される。態様のうちのいずれかの一局面では、それを必要とする対象におけるアネキシンA1（ANXA1）のレベルまたは活性を低下させる物質を投与する工程を含む、対象におけるプラーク破裂を治療する、減少させる、または予防する方法が、本明細書において記載される。
【００１８】
本明細書において使用するとき、用語「細胞外小胞」とは、内部空間を取り囲む膜を含む細胞由来の小胞を指す。細胞外小胞という用語は、それが由来する細胞よりも小さな直径を有する全ての膜結合型小胞を含み、正常な生理学的および病理学的な条件下で分泌されるエクソソーム、微小粒子、および脱落微小胞を含むが、それに限定されるわけではない。典型的には、細胞外小胞は、直径20nm〜1000nmの範囲である。
【００１９】
本明細書において使用するとき、「アネキシンA1」または「ANXA1」とは、膜会合型リン脂質結合タンパク質を指す。ANXA1配列は、多数の種、例えば、ヒトANXA1（NCBI Gene ID:301）のmRNA（例えば、NCBI Ref Seq：NM_000700.3；SEQ ID NO:4）およびポリペプチドの配列（例えば、NCBI Ref Seq：NP_000691.1；SEQ ID NO:3）について当技術分野において公知である。
【００２０】
アネキシンA1（ANXA1）の活性のレベルを低下させる物質は、ANXA1の遺伝子または遺伝子産物と直接（すなわち物理的に）相互作用することによって（直接阻害）、または後にANXA1の遺伝子または遺伝子産物と相互作用する別の標的に直接作用することによって（間接阻害）、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる任意の物質であってよい。ANXA1のレベルは、細胞におけるANXA1のレベル、対象もしくは対象から得られたサンプルにおけるANXA1のレベル、および／またはEVにおけるANXA1のレベルであってよい。ANXA1の活性は、EVの凝集を引き起こすANXA1の能力、EV表面上におけるANXA1の存在、および／または石灰化／微小石灰化を誘導するANXA1の能力であってよい。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ANXA1の活性のレベルを低下させる物質および／またはANXA1のインヒビターは、ANXA1に特異的であり、例えば、ANXA3、ANXA4、ANXAA11、ANXAA2、ANXA5、および／またはANXA6を阻害しない。
【００２１】
用語「化合物」および「作用物質」は、通常は存在しないか、または細胞、組織、もしくは対象に投与および／または提供されるレベルでは存在しない任意の実体を指す。作用物質は、化学物質；有機または無機の低分子；シグナル伝達分子；核酸配列；核酸類似体；タンパク質；ペプチド；酵素；アプタマー；ペプチドミメティック、ペプチド誘導体、ペプチド類似体、抗体；細胞内抗体；生体高分子、細菌、植物、真菌、または動物の細胞または組織等の生体物質から作られた抽出物；天然または合成の組成物またはその機能的断片を含む群より選択され得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、作用物質は、合成および天然の非タンパク質性実体を含むがそれに限定されるわけではない任意の化学的物質、実体、または部分である。特定の態様では、作用物質は、化学的部分を有する低分子である。例えば、化学的部分は、マクロライド、レプトマイシン、および関連する天然物またはそれらの類似体を含む、置換されていないまたは置換されたアルキル、芳香族、またはヘテロシクリルの部分を含む。作用物質は、所望の活性および／もしくは特性を有することが知られていてもよく、または多様な化合物のライブラリから選択されてもよい。
【００２２】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、アネキシンA1（ANXA1）のレベルまたは活性を低下させる物質は、ANXA1のインヒビター、例えば、本明細書において上述したような直接的インヒビターである。本明細書において使用するとき、用語「インヒビター」とは、標的とする発現産物（例えば、標的をコードしているmRNA、または標的ポリペプチド）の発現および／または活性を、例えば、少なくとも10％以上、例えば、10％以上、50％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、または98％以上減少させることができる物質を指す。例えばANXA1のインヒビターの有効性、例えば、ANXA1のレベルおよび／または活性を減少させる能力は、例えば、ANXA1タンパク質（またはそのmRNA）のレベルを測定することによって判定することができる。所与のmRNAおよび／またはポリペプチドのレベルを測定するための方法は当業者に公知であり、例えば、RNAのレベルを求めるためには、プライマーを用いたRT-PCRを用いることができ、そして、ポリペプチドのレベルを求めるためには、抗体を用いたウエスタンブロッティングを用いることができる。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、インヒビターは、阻害性核酸；アプタマー；抗体試薬；抗体；または低分子であってよい。例えばANXA1の例示的なインヒビターは、低分子、核酸（例えば、阻害性核酸）、ポリペプチド、抗体試薬、またはゲノム編集システムを含み得る。
【００２３】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、例えばANXA1を阻害する物質は、阻害性核酸である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、所与の遺伝子の発現のインヒビターは、阻害性核酸であり得る。本明細書において使用するとき、「阻害性核酸」とは、標的の発現を阻害することができる核酸分子、例えば、二本鎖RNA（dsRNA）、阻害性RNA（iRNA）等を指す。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、阻害性核酸は、サイレンシングRNA（siRNA）、マイクロRNA（miRNA）、またはショートヘアピンRNA（shRNA）であり得る。
【００２４】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、iRNAは、SEQ ID NO:1（ANXA1 siRNA（Fisher Scientific, #4390824）；NCBI Ref Seq：NM_00245.3）またはSEQ ID NO:2（ANXA1 siRNA（Fisher Scientific, #4390825）；NCBI Ref Seq：NM_000700.3）の配列を含んでいてもよく、からなっていてもよく、またはから本質的になっていてもよい。当業者であれば、例えば、公的に利用可能なデザインツールを用いて、ANXA1の核酸配列（例えば、SEQ ID NO:4）を標的とするためのiRNA、siRNA、shRNA、またはmiRNAを更に設計することができるであろう。iRNA、siRNA、shRNA、またはmiRNAは、一般的に、Dharmacon（Layfayette, CO）またはSigma Aldrich（St. Louis, MO）等の企業を用いて作製される。
【００２５】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALENS、メガヌクレアーゼ、およびCRISPR/Casシステムを含むがそれに限定されるわけではない任意のゲノム編集システムを使用して、ANXA1をゲノムから枯渇させる。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、1つまたは複数のガイドRNAをコードしている核酸を細胞のゲノムに組み込むために使用されるゲノム編集システムは、CRISPR/Casシステムではなく；これは、少量のCas酵素／タンパク質を保持している細胞において望ましくない細胞死を防止することができる。また、Cas酵素またはsgRNAのいずれかを異なる誘導性プロモータの制御下でそれぞれ発現させ、それによって、それぞれを一時的に発現させてそのような干渉を防ぐことが本明細書において企図される。
【００２６】
1つまたは複数のsgRNAをコードしている核酸およびRNAガイドエンドヌクレアーゼをコードしている核酸をそれぞれインビボで投与する必要がある場合、具体的には、アデノウイルス随伴ベクター（AAV）の使用が企図される。ゲノム編集／断片化システム（例えば、sgRNA、RNAガイドエンドヌクレアーゼ）の両構成要素に同時に核酸を送達するための他のベクターは、レンチウイルスベクター、例えば、エプスタインバー、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、およびB型肝炎ウイルス（HBV）を含む。RNAガイドゲノム編集システムの構成要素のそれぞれ（例えば、sgRNAおよびエンドヌクレアーゼ）は、当技術分野において公知である通りまたは本明細書において記載されている通り、別々のベクターで送達され得る。
【００２７】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ANXA1のインヒビターは、抗ANXA1抗体試薬、例えば、ANXA1に特異的に結合する抗体試薬であってよい。本明細書において使用するとき、用語「抗体試薬」とは、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、そして、所与の抗原に特異的に結合するポリペプチドを指す。抗体試薬は、抗体または抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、抗体試薬は、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。例えば、抗体は、重（H）鎖可変領域（本明細書ではVHと略す）および軽（L）鎖可変領域（本明細書ではVLと略す）を含み得る。別の例では、抗体は、２つの重（H）鎖可変領域および２つの軽（L）鎖可変領域を含む。用語「抗体試薬」は、抗体の抗原結合断片（例えば、単鎖抗体、FabおよびsFabの断片、F(ab')2、Fd断片、Fv断片、scFv、およびドメイン抗体(dAb)断片、ならびに完全抗体を包含する。
【００２８】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、抗体試薬は、ANXA1中和抗体試薬、例えば、EVを繋留するANXA1の能力を阻害するかまたは低下させる抗体であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ANXA1中和抗体試薬は、本明細書における他の箇所に記載されているANXA1のN末端ドメインに結合するものである。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ANXA1中和抗体試薬は、ANXA1の残基1〜46（例えば、SEQ ID NO:3の残基1〜46）の一部または全部に結合するものである。
【００２９】
本明細書において記載される抗体試薬、例えば、抗ANXA1抗体またはANXA1中和抗体は、当技術分野において公知である。例えば、そのような試薬は、容易に商業的に入手可能である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される標的に特異的な（例えば、標的に特異的に結合する）抗体試薬は、表1に列挙される抗体のうちのいずれか1つの1つまたは複数（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ）のCDRを含む抗体試薬であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される標的および／またはマーカーに特異的な抗体試薬は、表1に列挙される抗体のうちのいずれか1つの6つのCDRを含む抗体試薬であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される標的に特異的な抗体試薬は、表1に列挙される抗体のうちのいずれか1つの3つの重鎖CDRを含む抗体試薬であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、記載される標的に特異的な抗体試薬は、表1に列挙される抗体のうちのいずれか1つの3つの軽鎖CDRを含む抗体試薬であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される標的に特異的な抗体試薬は、表1に列挙される抗体のうちのいずれか1つのVHおよび／またはVLのドメインを含む抗体試薬であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される標的に特異的な抗体試薬は、表1に列挙される抗体のうちのいずれか1つのVHおよびVLのドメインを含む抗体試薬であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される標的に特異的な抗体試薬は、表1に列挙される抗体試薬であり得る。このような抗体試薬は、具体的には、本明細書において記載される方法および／または組成物における使用が企図される。
【００３０】
【表１】
2021533163.tif 000003
2021533163.tif 000004
2021533163.tif 000005
【００３１】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される標的に特異的な（例えば、標的に特異的に結合する）抗体試薬は、表2に列挙される抗体のうちのいずれか1つの1つまたは複数（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ）のCDRを含む抗体試薬であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される標的および／またはマーカーに特異的な抗体試薬は、表2に列挙される抗体のうちのいずれか1つの6つのCDRを含む抗体試薬であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される標的に特異的な抗体試薬は、表2に列挙される抗体のうちのいずれか1つの3つの重鎖CDRを含む抗体試薬であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、記載される標的に特異的な抗体試薬は、表2に列挙される抗体のうちのいずれか1つの3つの軽鎖CDRを含む抗体試薬であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される標的に特異的な抗体試薬は、表2に列挙される抗体のうちのいずれか1つのVHおよび／またはVLのドメインを含む抗体試薬であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される標的に特異的な抗体試薬は、表2に列挙される抗体のうちのいずれか1つのVHおよびVLのドメインを含む抗体試薬であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される標的に特異的な抗体試薬は、表2に列挙される抗体試薬であり得る。このような抗体試薬は、具体的には、本明細書において記載される方法および／または組成物における使用が企図される。
【００３２】
【表２】
2021533163.tif 000006
【００３３】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ANXA1のインヒビターは、ANXA1のN末端ドメインの一部または全部がタンパク質の残りの部分から分離されるように、ANXA1を切断する（または切断を誘導する）物質であってよい。本明細書において使用するとき、ANXA1の「N末端ドメイン」とは、アネキシンドメインのN末端側にあるANXA1の部分、例えば、SEQ ID NO:3の残基1〜46を指す。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ANXA1のN末端ドメインは、SEQ ID NO:3の残基1〜11、1〜22、または1〜36を指す。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ANXA1の切断は、少なくともSEQ ID NO:3の残基1〜11をタンパク質の残りの部分から分離することを含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ANXA1の切断は、少なくともSEQ ID NO:3の残基1〜22をタンパク質の残りの部分から分離することを含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ANXA1の切断は、少なくともSEQ ID NO:3の残基1〜36をタンパク質の残りの部分から分離することを含み得る。これら配列のうちの1つまたは複数の切断は、プロテイナーゼ3および／またはHLEによって行うことができる（例えば、Vong et al. J Biol Chem 282:29998-30004 (2007)およびRescher et al. BBA 1763:1320-4 (2006)を参照；これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。したがって、幾つかの態様では、ANXA1のN末端ドメインの切断を誘導する物質は、プロテイナーゼ3またはHLEのアゴニストであり得る。
【００３４】
本明細書において使用するとき、「好中球発現エラスターゼ」、「HLE」、または「ELANE」とは、エラスチンおよびANXA1を標的とするプロテアーゼを指す。HLE配列は、多数の種、例えば、ヒトHLE（NCBI Gene ID:1991）のmRNA（例えば、NCBI Ref Seq：NM_001972.4；SEQ ID NO:5）およびポリペプチドの配列（例えば、NCBI Ref Seq：NP_001963.1；SEQ ID NO:6）について当技術分野において公知である。
【００３５】
本明細書において使用するとき、「プロテイナーゼ3」または「PRTN3」とは、ANXA1を標的とするプロテアーゼを指す。PRTN3配列は、多数の種、例えば、ヒトPRTN3（NCBI Gene ID:5657）のmRNA（例えば、NCBI Ref Seq：NM_002777.4；SEQ ID NO:7）およびポリペプチドの配列（例えば、NCBI Ref Seq：NP_002768.3；SEQ ID NO:8）について当技術分野において公知である。
【００３６】
本明細書において使用するとき、用語「アゴニスト」とは、標的の発現および／または活性を、少なくとも10％以上、例えば、10％以上、50％以上、100％以上、200％以上、500％以上、または1000％以上増加させる物質を指す。例えば、HLEまたはプロテイナーゼ3のアゴニストの有効性、例えば、標的のレベルおよび／または活性を増加させる能力は、例えば、標的の発現産物および／または標的の活性のレベルを測定することによって判定することができる。所与のmRNAおよび／またはポリペプチドのレベルを測定するための方法は、当業者に公知であり、例えば、RNAのレベルを求めるためには、プライマーを用いたRTPCRを用いることができ、そして、ポリペプチドのレベルを求めるためには、抗体を用いたウエスタンブロッティングを用いることができる。所与の標的に好適なプライマーは、例えば、この目的のために広く利用可能なソフトウェア（例えば、いずれもワールドワイドウェブ上で利用可能なPrimer3またはPrimerBank）を使用して、当業者であれば容易に同定することができる。プロテイナーゼ3およびHLEに対する抗体は、市販されている。標的の活性、例えば、ANXA1のN末端ドメインの切断レベルを測定するためのアッセイは、当技術分野において公知である（例えば、Vong et al. J Biol Chem 282:29998-30004 (2007)およびRescher et al. BBA 1763:1320-4 (2006)を参照；これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。所与のポリペプチド標的のアゴニストの非限定的な例は、標的ポリペプチドまたはそのバリアントもしくは機能的断片、および該ポリペプチドまたはそのバリアントもしくは機能的断片をコードしている核酸を含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、プロテイナーゼ3のアゴニストは、プロテイナーゼ3のポリペプチドまたはそのバリアントもしくは機能的断片、および／または該ポリペプチドまたはそのバリアントもしくは機能的断片をコードしている核酸である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、HLEのアゴニストは、HLEのポリペプチドまたはそのバリアントもしくは機能的断片、および／または該ポリペプチドまたはそのバリアントもしくは機能的断片をコードしている核酸である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、例えば、HLEまたはPRTN3のアゴニストは、HLEまたはPRTN3のポリペプチドであり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ポリペプチドアゴニストは、遺伝子操作されたおよび／または組換えのポリペプチドであり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ポリペプチドアゴニストは、ポリペプチドをコードしている核酸、例えば、その機能的断片であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、核酸は、ベクターによって含まれ得る。
【００３７】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、HLEまたはPRTN3のアゴニストは、ヒトのHLEまたはPRTN3のポリペプチドの配列、例えば、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:8を含むポリペプチドであり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、HLEまたはPRTN3のアゴニストは、ヒトのHLEまたはPRTN3のポリペプチドの配列、例えば、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:8から本質的になるポリペプチドであり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、HLEまたはPRTN3のアゴニストは、ヒトのHLEまたはPRTN3のポリペプチドの配列、例えば、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:8からなるポリペプチドであり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、HLEまたはPRTN3のアゴニストは、SEQ ID NO:6または8のうちの1つと少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも98％の同一性を有する参照配列を含み、そして、SEQ ID NO:6または8のうちの1つのポリペプチドのANXA1切断活性を保持しているポリペプチドであり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、アゴニストは、前述のHLEまたはPRTN3のポリペプチドのうちの1つをコードしている配列を含む核酸であり得る。
【００３８】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質は、カルシウムキレーターであり得る。カルシウムキレーターの非限定的な例は、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレングリコール四酢酸（EGTA）、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（HEEDTA）、ジアミノシクロヘキサン四酢酸（CDTA）、1,2-ビス（2-アミノフェノキシ）エタン-N,N,N’,N’-四酢酸（BAPTA）、DM-NITROPHEN（商標）、およびそれらの薬学的に許容される塩のうちの1つまたは複数を含む。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、カルシウムキレーターは、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）である。
【００３９】
作用物質は、細胞外小胞にロードされるANXA1の速度または量を低減することにより、ANXA1のレベルまたは活性を低下させることができる。本明細書に記載されている通り、このプロセスは、EVの起源である細胞内のカルシウムレベルによって少なくとも部分的に制御される。DRP1が媒介するミトコンドリアの分裂を阻害することによりミトコンドリアのカルシウム貯蔵が増加すると、細胞質カルシウム駆動型ANXA1輸送の抑制を介して細胞外小胞へのANXA1のローディングが減少する。DRP1阻害により、ミトコンドリアのカルシウム貯蔵が増加し、それによって、細胞のサイトゾルへのカルシウム放出が減少する。ミトコンドリアの分裂が媒介する細胞質への遊離カルシウムの放出は、カルシウム結合細胞質ANXA1をもたらす。細胞質ANXA1および関連するカルシウム結合タンパク質にカルシウムが結合すると、これらタンパク質の細胞外小胞表面への取り込みが増加し、そこで該タンパク質が小胞の凝集および微小石灰化の形成を誘導する。したがって、ミトロコンドリアカルシウムのレベルの上昇、ミトロコンドリアカルシウムの貯蔵の増加、および／または細胞質カルシウムの減少は、ANXA1のEVへのローディングを阻害する。このようなカルシウムレベルの変化は、例えば、ダイナミン関連タンパク質1（DRP1またはDNM1L）のインヒビター（例えば、NCBI Gene ID:10059；例示的なポリペプチド（NP_001265392.1、NP_001265393.1、NP_001265394.1、NP_001265395.1、NP_001317309.1、NP_005681.2、NP_036192.2、NP_036193.2（それぞれSEQ ID NO:9〜16））およびmRNA（NM_001278463.1、NM_001278464.1、NM_001278465.1、NM_001278466.1、NM_001330380.1、NM_005690.4、NM_012062.5、およびNM_012063.3（それぞれSEQ ID NO:17〜24））によって達成され得る。所与の標的遺伝子／タンパク質に好適な種類のインヒビターは、本明細書における他の箇所に記載されており、DRP1の直接的インヒビターにも等しく適用される。例えば、DRP1のインヒビターは、阻害性核酸、抗体試薬、および／または低分子であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ダイナミン関連タンパク質1（DRP1）インヒビターは、阻害性核酸、例えばsiRNAであるかまたはmdivi-1（式Iの化合物）である。
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【００４０】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、複数の作用物質、例えば、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる複数の物質、ANXA1の間接的および直接的なインヒビター、または複数の種類のANXA1の直接的インヒビターを対象または細胞に投与してもよい。本明細書において記載される種類および個々の物質の任意の組み合わせは本明細書において記載される方法における使用が企図される。組成物に関する局面では、本明細書において記載される組成物は、同様に、本明細書において記載される任意の2つまたはそれ以上の種類および／または個々の物質の組み合わせを含み得る。このような組み合わせは、混合物（例えば、単一の製剤）であってもよく、混合されるかまたは別々の製剤として投与／使用される複数の製剤を含むキットまたは包装であってもよい。
【００４１】
記載されている通り、EVは、例えば、血管系において凝集するおよび／または石灰化を誘導することによって、多数の疾患を促進し得る、引き起こし得る、または一因となり得る。異常なEVの産生および／または凝集によって引き起こされるまたは関連する疾患および病態を、本明細書において「細胞外小胞（EV）関連疾患」と称する。EV関連疾患の非限定的な例は、心臓弁膜症、血管疾患、関節リウマチ、神経変性疾患、自己免疫疾患、石灰沈着性大動脈弁疾患、糖尿病、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肺線維症、非アルコール性脂肪肝疾患、骨粗鬆症、アルツハイマー病、強皮症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、高コレステロール血症、がん、および肥満を含む。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される方法に従って処置される対象は、心臓弁膜症、血管疾患、関節リウマチ、神経変性疾患、自己免疫疾患、石灰沈着性大動脈弁疾患、糖尿病、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肺線維症、非アルコール性脂肪肝疾患、骨粗鬆症、アルツハイマー病、強皮症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、高コレステロール血症、がん、および肥満から選択される病態を有するか、または該病態を処置する必要がある。
【００４２】
態様のうちのいずれかの一局面では、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質をシステムと接触させるかまたは対象に投与する工程を含む、対象またはシステムにおいて細胞外小胞（EV）の凝集を阻害または低減するための方法が、本明細書において記載される。態様のうちのいずれかの一局面では、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を細胞と接触させる工程を含む、細胞からの細胞外小胞（EV）の輸送を阻害または低減するための方法が、本明細書において記載される。輸送を阻害または低減することは、細胞または細胞の集団から離れるEVの速度または数を低減することを含み得る。細胞は、エクスビボ、インビボ、またはインビトロであってよい。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、細胞は、平滑筋細胞（SMC）、弁間質細胞（VIC）、乏突起神経膠腫細胞、内皮細胞、マクロファージ、単球、またはがん細胞である。
【００４３】
幾つかの態様では、本明細書において記載される方法は、（例えば、心血管系において）石灰化を有するかまたは有すると診断された対象を、本明細書において記載される1つまたは複数の物質で処置することに関する。（例えば、骨以外の組織において）石灰化を有する対象は、石灰化を診断する現行の方法を用いて医師によって特定され得る。これら病態を特徴付け、そして、診断を支援する石灰化の症状および／または合併症は、当技術分野において周知であり、そして、心臓または循環機能の障害を含むが、それに限定されるわけではない。例えば石灰化の診断を支援することができる検査は、X線検査および／または超音波を含むが、それに限定されるわけではない。石灰化の家族歴または石灰化の危険因子への曝露（例えば、喫煙は脂質異常症である）も、対象が石灰化を有する可能性があるかどうかの判定または石灰化の診断に役立つ場合がある。
【００４４】
本明細書において説明する通り、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質は、石灰化または微小石灰化を低減または予防するのに特に有効である。したがって、局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される方法に従って処置される対象、例えば、EV関連疾患を有するかまたは有すると診断された対象は、EV関連疾患の診断に加えて、石灰化または微小石灰化を有する対象であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される方法は、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を投与する前に、対象の微小石灰化または石灰化のレベルが上昇していることを示すアッセイの結果を受け取る工程を更に含む。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される方法は、対象における微小石灰化または石灰化のレベルを決定するための試験またはアッセイを実施し、そして、レベルの上昇が検出された場合、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を投与する第1の工程を更に含む。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される方法は、対象における微小石灰化または石灰化のレベルを決定するための試験またはアッセイを実施し、そして、レベルの上昇が検出された場合、ANXA1のレベルもしくは活性を低下させる物質を投与するか、またはレベルの上昇が検出されなかった場合、ANXA1のレベルも活性も低下させないEV関連疾患を処置するための物質（例えば、スタチンまたは抗炎症剤）を投与する第1の工程を更に含む。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される方法は、対象における微小石灰化または石灰化のレベルを決定し、そして、レベルの上昇が検出された場合、ANXA1のレベルもしくは活性を低下させる物質を投与するか、またはレベルの上昇が検出されなかった場合、ANXA1のレベルも活性も低下させないEV関連疾患を処置するための物質（例えば、スタチンまたは抗炎症剤）を投与する第1の工程を更に含む。
【００４５】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、方法は、基準に対して石灰化／微小石灰化のレベルが上昇していると以前判定された対象に、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を投与する工程を含む。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、a）まず、対象における石灰化／微小石灰化のレベルを決定すること；そして、b）次に、石灰化／微小石灰化のレベルが基準に対して上昇していた場合、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象におけるEV関連疾患を処置する方法が、本明細書において記載される。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、対象の石灰化／微小石灰化のレベルが上昇しているかどうかを判定する工程は、i）任意で、対象からサンプルを得るかまたは得たこと、およびii）対象の石灰化／微小石灰化のレベルを決定／測定するために、対象から得られたサンプルまたは対象に対してアッセイ／試験を実施するかまたは実施したことを含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、対象の石灰化／微小石灰化のレベルが上昇しているかどうかを判定する工程は、対象における石灰化／微小石灰化のレベルを決定／測定するために、対象から得られたサンプルまたは対象に対してアッセイ／試験を実施するかまたは実施したことを含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、対象の石灰化／微小石灰化のレベルが上昇しているかどうかを判定する工程は、対象の石灰化／微小石灰化のレベルを決定／測定するために、対象から得られたサンプルまたは対象に対するアッセイ／試験を要求または依頼することを含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、対象の石灰化／微小石灰化のレベルが上昇しているかどうかを判定する工程は、対象の石灰化／微小石灰化のレベルを決定／測定するために、対象から得られたサンプルまたは対象に対するアッセイ／試験の結果を受け取る工程を含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、対象の石灰化／微小石灰化のレベルが上昇しているかどうかを判定する工程は、石灰化／微小石灰化のレベルが上昇している対象として対象を特定する報告書、結果、または他の手段を受け取ることを含み得る。
【００４６】
態様のうちのいずれかの一局面では、a）対象の石灰化／微小石灰化のレベルが上昇しているかどうかを判定すること；およびb）石灰化／微小石灰化のレベルが基準に対して上昇していた場合、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を対象に投与するように指示または命令することを含む、それを必要とする対象におけるEV関連疾患を処置する方法が、本明細書において記載される。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、対象の石灰化／微小石灰化のレベルが上昇しているかどうかを判定する工程は、i）任意で、対象からサンプルを得るかまたは得たこと、およびii）対象の石灰化／微小石灰化のレベルを決定／測定するために、対象から得られたサンプルまたは対象に対してアッセイ／試験を実施するかまたは実施したことを含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、対象の石灰化／微小石灰化のレベルが上昇しているかどうかを判定する工程は、対象における石灰化／微小石灰化のレベルを決定／測定するために、対象から得られたサンプルまたは対象に対してアッセイ／試験を実施するかまたは実施したことを含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、対象の石灰化／微小石灰化のレベルが上昇しているかどうかを判定する工程は、対象の石灰化／微小石灰化のレベルを決定／測定するために、対象から得られたサンプルまたは対象に対するアッセイ／試験を要求または依頼することを含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、特定の処置を対象に施すように指示または命令する工程は、アッセイ／試験の結果の報告書を提供することを含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、特定の処置を対象に施すように指示または命令する工程は、アッセイ／試験の結果の報告書を提供すること、および／またはアッセイ結果を考慮して処置を推奨することを含み得る。
【００４７】
対象の石灰化／微小石灰化のレベルを決定するための好適なアッセイは、X線検査、超音波、細胞外小胞石灰化アッセイ；小胞結合アッセイ；小胞繋留アッセイ；組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNAP）アッセイ；免疫組織化学アッセイ；質量分析法；プロテオミクス；走査型電子顕微鏡観察；および透過型電子顕微鏡観察を含み得る。幾つかの態様では、石灰化／微小石灰化のレベルは、対象から得られた生体サンプルにおけるレベルである。例示的で非限定的な生体サンプルは、血液、血管組織、または心臓弁組織を含む。
【００４８】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、標的のレベルの測定、および／または標的、例えば、発現産物（本明細書において記載される遺伝子のうちの1つの核酸またはポリペプチド）もしくは変異のレベルもしくは存在の検出は、変換を含み得る。本明細書において使用するとき、用語「変換する」または「変換」とは、物体または物質、例えば、生体サンプル、核酸、またはタンパク質を別の物質に変化させることを指す。変換は、物理的、生物学的、または化学的であってよい。例示的な物理的変換は、生体サンプルの前処理、例えば、分画遠心法による全血から血清への前処理を含むが、それに限定されるわけではない。生物学的／化学的な変換は、反応における少なくとも1つの酵素および／または化学試薬の作用を伴い得る。例えば、DNAサンプルを1つまたは複数の制限酵素によって消化して断片化してもよく、または断片化されたDNAサンプルに外因性分子をリガーゼによって連結させてもよい。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、DNAサンプルは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、酵素的複製を受けることができる。
【００４９】
標的分子、例えば、mRNAまたはポリペプチドの変換、測定、および／または検出は、対象から得られたサンプルに、標的に対して特異的な試薬（例えば、検出試薬）、例えば標的特異的試薬を接触させる工程を含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、標的特異的試薬は、検出可能に標識されている。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、標的特異的試薬は、検出可能なシグナルを生成することができる。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、標的特異的試薬は、標的分子が存在するときに検出可能なシグナルを生成する。
【００５０】
遺伝子発現産物を測定する方法は、当業者に公知である。このような遺伝子発現産物、例えば、タンパク質レベルを測定する方法は、抗体またはタンパク質結合剤等の検出試薬を用いたELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を含む。あるいは、標識された抗ペプチド抗体および他の種類の検出剤を対象に導入することにより、対象におけるペプチドを検出することもできる。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置が標準的なイメージング技術によって検出される検出可能なマーカーで標識され得る。
【００５１】
例えば、本明細書において記載される様々な標的に対する抗体が市販されており、そして、タンパク質発現レベル、例えば、抗ANXA1を測定するために本発明の目的のために使用することができる。あるいは、本明細書において記載される標的に対するアミノ酸配列は公知であり、そして、NCBIのウェブサイトで公的に利用可能であるので、当業者であれば、本明細書において記載される方法の目的のために、関心対象のこれらポリペプチドに対する自身の抗体を産生させることができる。本明細書において記載されるポリペプチドのアミノ酸配列には、ヒト、マウス、およびラット等の様々な種についてのNCBIアクセッション番号が割り当てられている。
【００５２】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、免疫組織化学（「IHC」）および免疫細胞化学（「ICC」）の技術を使用することができる。IHCは、組織切片に対する免疫化学の応用であり、一方、ICCは、例えば液体ベースの調製等の特定の細胞学的調製を受けた後の細胞や組織インプリントに対する免疫化学の応用である。免疫化学は、細胞の内部または表面上の分子を特異的に標的にするために抗体を使用する、抗体の使用に基づく技術の分類である。抗体は、典型的には、標的分子に遭遇した際に、生化学的反応を受け、それによって、色の変化を経験するマーカーを含有する。幾つかの例では、一次特異的抗体の適用に続いて、マーカー染色またはマーカーシグナルを含む二次抗体が適用される特定のプロトコルに、シグナル増幅を組み込んでもよい。
【００５３】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、アッセイは、ウェスタンブロット分析であってよい。あるいは、二次元ゲル電気泳動システムによってタンパク質を分離することもできる。二次元ゲル電気泳動は、当技術分野において周知であり、そして、典型的には、第1の次元に沿って等電点電気泳動を行い、続いて、第2の次元に沿ってSDS-PAGE電気泳動を行うことを伴う。また、これらの方法は、かなりの量の細胞物質を必要とする。2D SDS-PAGEゲルの解析は、ゲル上のタンパク質スポットの強度を求めることにより実施してもよく、免疫検出を用いて実施してもよい。他の態様では、質量分析法によってタンパク質サンプルを分析する。
【００５４】
免疫学的試験を本明細書において記載される方法およびアッセイと共に使用してもよく、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（RIA）、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、例えば、ラテックス凝集、補体固定アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、例えば、FIA（蛍光結合免疫アッセイ）、化学発光イムノアッセイ（CLIA）、電気化学発光イムノアッセイ（ECLIA、計数免疫アッセイ（CIA）、ラテラルフロー試験またはイムノアッセイ（LFIA）、磁気イムノアッセイ（MIA）、およびプロテインAイムノアッセイ等の技術を用いる競合的アッセイ系および非競合的アッセイ系を含む。このようなアッセイを実施するための方法は、当技術分野において公知であるが、ただし、適切な抗体試薬が利用可能である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、イムノアッセイは、定量的または半定量的なイムノアッセイであってよい。
【００５５】
イムノアッセイは、抗体（複数可）とその抗原との相互作用を使用して、生体サンプル、典型的には血液または血清等の流体サンプル中の物質の濃度を測定する生化学的試験である。このアッセイは、抗体とその抗原との高度に特異的な結合を利用する。本明細書において記載される方法およびアッセイでは、イムノアッセイにおいて標的ポリペプチドと本明細書において記載されるそれぞれのタンパク質もしくはタンパク質断片、または単離されたペプチド、または融合タンパク質との特異的結合が生じて、標的タンパク質／ペプチド複合体が形成される。次いで、当技術分野において公知の様々な方法によって複合体を検出する。また、イムノアッセイは、多くの場合、検出抗体の使用を伴う。
【００５６】
ELISA、酵素イムノアッセイ、またはEIAとも呼ばれる酵素結合免疫吸着アッセイは、サンプル中の抗体または抗原の存在を検出するために主に免疫学で使用される生化学的技術である。ELISAは、医学および植物病理学における診断ツールとして、また、様々な業界において品質管理のチェックにも使用されている。
【００５７】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、特定の所望の抗原（例えば、本明細書において記載される標的のいずれか）に対する特異性を有する少なくとも1つの抗体を伴うELISAを実施してもよい。既知の量のサンプルおよび/または抗原を固体支持体（通常、ポリスチレンマイクロタイタープレート）に固定化する。固定化は、非特異的（例えば、表面への吸着による）または特異的（例えば、表面に固定化された別の抗体を使用して抗原または一次抗体をキャプチャーする場合）のいずれであってもよい。抗原を固定化した後、検出抗体を添加して、抗原と複合体を形成させる。検出抗体は、酵素と共有結合的に連結してもよく、バイオコンジュゲーションを通して酵素に連結する二次抗体によってそれ自体検出されてもよい。各工程と工程との間に、特異的に結合していない任意のタンパク質または抗体を除去するために、典型的には、穏やかな洗剤溶液でプレートを洗浄する。最後の洗浄工程の後、サンプル中の抗原の量を示す可視シグナルを生じさせるために、酵素基質を添加することによってプレートを発色させる。以前のELISAでは発色基質を使用するが、最近のアッセイは、はるかに高感度の蛍光発生基質を利用する。
【００５８】
別の態様では、競合ELISAを使用する。標的ポリペプチドまたはその断片に対する精製抗体を、マルチウェルプレートの固相上にコーティングする、すなわち、固体表面にコンジュゲートさせる。また、いかなる固体支持体上にもコンジュゲートしていない第2のバッチの精製抗体も必要である。これらコンジュゲートしていない精製抗体を、検出目的のために標識する、例えば、検出可能なシグナルを生じさせるためにセイヨウワサビペルオキシダーゼで標識する。対象からのサンプル（例えば、血液サンプル）を、セイヨウワサビペルオキシダーゼで標識された抗体と共に既知の量の所望の抗原（例えば、既知の体積または濃度の標的ポリペプチドを含むサンプル）と混合し、次いで、コーティングされたウェルに混合物を添加して、競合的な組み合わせを形成する。インキュベーション後、サンプル中のポリペプチドレベルが高い場合、標識された抗体試薬−抗原の複合体が形成される。この複合体は溶液中では遊離しており、そして、洗い流すことができる。ウェルを洗浄して複合体を除去する。次いで、ウェル内のセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体の局在化のために、TMB（3,3’,5,5’-テトラメチルベンジデン）発色基質と共にインキュベーションする。サンプル中の標的ポリペプチドレベルが高い場合、色が変化しないか、またはほとんど色が変化しない。標的ポリペプチドがサンプル中にほとんどまたは全く存在しない場合、異なる複合体、すなわち固体支持体に結合している抗体試薬−標的ポリペプチドの複合体が形成される。この複合体はプレート上に固定化されており、そして、洗浄工程では洗い流されない。その後、TMBと共にインキュベーションすると、著しい色の変化が生じる。このような競合的なELSA試験は、特異的であり、高感度であり、再現性があり、そして、操作が簡単である。
【００５９】
他の異なる形態のELISAが存在し、これは当業者に周知である。ELISAのための当技術分野において公知の標準的な技術は、"Methods in Immunodiagnosis", 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980；およびOellerich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22:895-904に記載されている。これら参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６０】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、サンプル中のポリペプチドのレベルは、イムノクロマトグラフィーアッセイとしても知られているラテラルフローイムノアッセイ試験（LFIA）、またはストリップ試験によって検出することができる。LFIAは、流体サンプル中の抗原、例えば、ポリペプチドの存在（または非存在）を検出することを意図する単純な装置である。現在、家庭での検査、ポイントオブケア検査、または臨床検査のいずれかで使用するための医療診断用の多くのLFIA試験が存在する。LFIA試験は、毛細管作用を介して固体基材に沿って試験サンプルが流れるイムノアッセイの形態である。サンプルを試験ストリップに塗布した後、該サンプルは、サンプルと混ざり合うマイクロ粒子に結合している着色試薬（一般的には、試験標的抗原に特異的な抗体を含む）に遭遇し、そして、別の抗体または抗原で前処理されている基質遭遇ラインまたはゾーンに移行する。サンプル中に存在する標的ポリペプチドのレベルに応じて、着色試薬は、試験ラインまたはゾーンでキャプチャーされ、そして、結合することができる。LFIAは、本質的には、試験ストリップ形式またはディップスティック形式に適した1本の軸に沿って動作するように適合したイムノアッセイである。ストリップ試験は極めて汎用性が高く、そして、尿、血液、水、および／または均質化された組織サンプル等の流体サンプルから非常に広い範囲の抗原を検出するために、当業者によって容易に改変され得る。ストリップ試験は、ディップスティック試験としても知られており、その名称は、試験される流体サンプルに試験ストリップを「浸す」という文字通りの行為に由来している。LFIAストリップ試験は、使いやすく、最低限の訓練しか必要とせず、そして、現場においてその場で使用されるポイントオブケア試験（POCT）診断の構成要素として容易に含めることができる。LFIA試験は、競合的アッセイまたはサンドイッチアッセイのいずれかとして運用することができる。サンドイッチLFIAは、サンドイッチELISAに類似している。サンプルは、まず、標的抗原に対して産生された抗体で標識された着色粒子に遭遇する。試験ラインも同じ標的に対する抗体を含有するが、抗原上の異なるエピトープに結合し得る。試験ラインは、陽性サンプルでは着色バンドとして示される。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ラテラルフローイムノアッセイは、二重抗体サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、定量アッセイ、またはそれらの変形例であり得る。競合的LFIAは、競合的ELISAに類似している。サンプルは、まず、標的抗原または類似体で標識された着色粒子に遭遇する。試験ラインは、標的／その類似体に対する抗体を含有する。サンプル中の非標識抗原は、抗体上の結合部位をブロックし、着色粒子の取り込みを防ぐ。試験ラインは、陰性サンプルでは着色バンドとして示される。ラテラルフロー技術には多数の変形例が存在する。また、複数のキャプチャーゾーンを適用してマルチプレックス試験を作り出すことも可能である。
【００６１】
「ディップスティック」またはLFIA試験ストリップおよび他の固体支持体の使用は、多数の抗原バイオマーカーのためのイムノアッセイに関連して当技術分野において記載されている。その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,943,522号；同第6,485,982号；同第6,187,598号；同第5,770,460号；同第5,622,871号；同第6,565,808号、米国特許出願第10/278,676号；米国出願第09/579,673号および米国出願第10/717,082号は、このようなラテラルフロー試験装置の非限定的な例である。免疫化学的アッセイを介して可溶性抗原を検出するための「ディップスティック」技術の使用について記載している特許の例は、米国特許第4,444,880号、同第4,305,924号、および同第4,135,884号を含むが、それに限定されるわけではなく、これらは全体が参照により本明細書に組み入れられる。これら3つの特許の装置および方法は、スティック上の構成要素−抗原複合体を検出する前に、「ディップスティック」上に固定された構成要素に結合する可溶性抗原を含有する溶液に曝露される、「ディップスティック」上の固体表面に固定された第1の構成要素について広く記載している。本明細書において記載される抗体試薬を用いてポリペプチドを検出するために、この「ディップスティック」技術の教示を改変することは、当業者の技能の範囲内である。
【００６２】
サンプル中のポリペプチドのレベルを検出するために他の技術を使用することもできる。そのような技術の1つは、ウエスタンブロッティングを適合させたドットブロットである（Towbin et at., Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 (1979)）。ウェスタンブロットでは、ポリペプチドまたはその断片を洗剤および熱で解離させ、そして、SDS-PAGEゲル上で分離した後、ニトロセルロースまたはPVDFメンブレン等の固体支持体に転写してよい。メンブレンを、標的ポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体試薬と共にインキュベーションする。次いで、メンブレンを洗浄して、結合していないタンパク質および非特異的に結合しているタンパク質を除去する。次いで、検出可能に標識された酵素結合二次または検出抗体を使用して、試験されるサンプル中のポリペプチドの量を検出および評価することができる。ドットブロットは、ウエスタンブロッティングと同様に、支持体の規定の領域にタンパク質サンプルを固定化し、次いで、抗体および標識された二次抗体でプロービングする。いずれの形式でも、検出可能な標識からのシグナルの強度は、存在する酵素の量に対応し、したがって、ポリペプチドの量に対応する。レベルは、例えばデンシトメトリーによって定量することができる。
【００６３】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、標的のレベルは、非限定的な例として、ウェスタンブロット；免疫沈降；酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）；放射免疫アッセイ（RIA）；サンドイッチアッセイ；蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）；免疫組織学的染色；放射免疫学的アッセイ；免疫蛍光アッセイ；質量分析法、および／または免疫電気泳動アッセイによって測定することができる。
【００６４】
特定の態様では、本明細書において記載される遺伝子発現産物は、代わりに、本明細書において記載される遺伝子のメッセンジャーRNA（mRNA）の発現レベルを求めることによって決定することができる。このような分子は、血液サンプル等の生体サンプルから単離してもよく、由来していてもよく、または増幅してもよい。mRNA発現を検出するための技術は、当業者に公知であり、そして、PCR手技、RT-PCR、定量RT-PCRノーザンブロット解析、差次的遺伝子発現、RNAse保護アッセイ、マイクロアレイベースの解析、次世代シーケンシング；ハイブリダイゼーション法等を含み得るが、それに限定されるわけではない。
【００６５】
一般に、PCR手技は、（i）核酸のサンプルまたはライブラリ内の特定の遺伝子または配列にプライマーを配列特異的にハイブリダイゼーションさせ、（ii）その後、熱安定性DNAポリメラーゼを用いて複数ラウンドのアニーリング、伸長、および変性を伴う増幅を行い、そして、（iii）正しいサイズのバンドについてPCR産物をスクリーニングすることで構成される遺伝子増幅方法を説明する。使用されるプライマーは、重合を開始させるのに十分な長さおよび適切な配列のオリゴヌクレオチドであり、すなわち、各プライマーは、増幅されるべきゲノム遺伝子座の鎖に対して相補的であるように特異的に設計される。別の態様では、本明細書において記載される遺伝子発現産物のmRNAレベルは、逆転写（RT）PCRによって、および定量RT-PCR（QRT-PCR）またはリアルタイムPCR法によって決定することができる。RT-PCRおよびQRT-PCRの方法は、当技術分野において周知である。
【００６６】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、mRNAのレベルは、定量シーケンシング技術、例えば、定量次世代シーケンシング技術によって測定することができる。核酸配列のシーケンシングの方法は、当技術分野において周知である。簡単に説明すると、対象から得られたサンプルを、標的遺伝子配列に隣接する一本鎖核酸配列に特異的にハイブリダイズする1つまたは複数のプライマーに接触させることができ、そして、相補鎖が合成される。幾つかの次世代技術では、アダプター（二本鎖または一本鎖）がサンプル中の核酸分子にライゲーションし、そして、アダプターまたはアダプター適合性プライマーから合成が進行する。幾つかの第3世代の技術では、例えば、プローブのハイブリダイゼーションの位置およびパターンを決定することによって、またはセンサを通過する際に単一分子の1つもしくは複数の特徴（例えば、核酸分子がナノ細孔を通過する際の電場の変調）を測定することによって、配列を決定することができる。例示的なシーケンシング方法は、Sangerシーケンシング、ジデオキシ鎖終結、ハイスループットシーケンシング、次世代シーケンシング、454シーケンシング、SOLiDシーケンシング、ポロニーシーケンシング、Illuminaシーケンシング、Ion Torrentシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ナノポアシーケンシング、Helioscopeシーケンシング、一分子リアルタイムシーケンシング、RNAPシーケンシング等を含むが、それに限定されるわけではない。これらシーケンシング方法を実施するための方法およびプロトコルは、当技術分野において公知であり、例えば、“Next Generation Genome Sequencing” Ed. Michal Janitz, Wiley-VCH；“High-Throughput Next Generation Sequencing” Eds. Kwon and Ricke, Humanna Press, 2011；およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012)を参照；これらは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６７】
本明細書において記載される遺伝子の核酸配列には、ヒト、マウス、およびラット等の様々な種についてのNCBIアクセッション番号が割り当てられている。したがって、当業者は、それぞれの遺伝子のmRNAレベルを求めるために既知の配列に基づいて適切なプライマーを設計することができる。
【００６８】
核酸およびリボ核酸（RNA）の分子は、当技術分野において周知である多数の手技のいずれかを用いて特定の生体サンプルから単離することができ、選択される特定の単離手技は、特定の生体サンプルにとって適切である。例えば、凍結融解およびアルカリ溶解の手技は、固体材料から核酸分子を得るために有用であり得；加熱およびアルカリ溶解の手技は、尿から核酸分子を得るために有用であり得；そして、プロテイナーゼK抽出は、血液から核酸を得るために使用することができる（Roiff, A et al. PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer (1994)）。
【００６９】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される試薬（例えば、抗体試薬および／または核酸プローブ）のうちの1つまたは複数は、検出可能な標識を含み得る、および／または（例えば、化合物を検出可能な生成物に変換する反応を触媒することによって）検出可能なシグナルを生成する能力を有し得る。検出可能な標識は、例えば、光吸収色素、蛍光色素、または放射性標識を含み得る。検出可能な標識、それを検出する方法、およびそれを試薬（例えば、抗体および核酸プローブ）に組み込む方法は、当技術分野において周知である。
【００７０】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電磁的、放射化学的、または蛍光、化学蛍光、もしくは化学発光等の化学的な手段、あるいは他の適切な手段によって検出することができる標識を含み得る。本明細書において記載される方法で使用される検出可能な標識は、一次標識（標識が直接検出可能であるかまたは直接検出可能な部分を生成する部分を含む場合）または二次標識（例えば、二次抗体および三次抗体を使用する免疫学的標識において一般的であるように、検出可能な標識が別の部分に結合して検出可能なシグナルを生成する場合）であってよい。検出可能な標識は、共有結合的または非共有結合的手段によって試薬に連結することができる。あるいは、リガンド−受容体結合対配置を介して試薬への結合を達成する分子または他のこのような特異的認識分子を直接標識すること等により、検出可能な標識は連結することができる。検出可能な標識は、放射性同位体、生物発光化合物、発色団、抗体、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、および酵素を含み得るが、それに限定されるわけではない。
【００７１】
他の態様では、検出試薬は、蛍光化合物で標識される。蛍光標識された試薬を適当な波長の光に曝露したとき、蛍光によりその存在を検出することができる。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、検出可能な標識は、蛍光色素分子、またはフルオレセイン、フィコエリトリン、フィコシアニン、o−フタルデヒド、フルオレスカミン、Cy3（商標）、Cy5（商標）、アロフィコシアニン、Texas Red、ペリデニンクロロフィル、シアニン、フィコエリトリン-Cy5（商標）等のタンデムコンジュゲート、緑色蛍光タンパク質、ローダミン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびOregon Green（商標）、ローダミンおよび誘導体（例えば、Texas Redおよびテトラロージミンイソチオシネート（tetrarhodimine isothiocynate）（TRITC））、ビオチン、フィコエリトリン、AMCA、CyDyes（商標）、6−カルボキシフィオレセイン（carboxyfhiorescein）（略称FAMおよびFによって一般的に知られている）、6-カルボキシ-2’,4’,7’,4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、6−カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシフルオレセイン（JOEまたはJ）、N,N,N’,N’-テトラメチル-6カルボキシローダミン（TAMRAまたはT）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROXまたはR）、5-カルボキシローダミン-6G（R6G5またはG5）、6−カルボキシローダミン-6G（R6G6またはG6）、およびローダミン110を含むがそれに限定されるわけではないフルオロフォア；シアニン色素、例えば、Cy3、Cy5、およびCy7色素；クマリン、例えば、ウンベリフェロン；ベンズイミド色素、例えば、Hoechst 33258；フェナントリジン色素、例えば、Texas Red；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素、例えば、Cy3、Cy5等のシアニン色素；BODIPY色素およびキノリン色素であってよい。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、検出可能な標識は、3H、125I、35S、14C、32P、および33Pを含むがそれに限定されるわけではない放射標識であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、検出可能な標識は、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含むがそれに限定されるわけではない酵素であり得る。酵素標識は、例えば、化学発光シグナル、色シグナル、または蛍光シグナルを生成することができる。抗体試薬を検出可能に標識するために使用することが企図される酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ-V-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-VI-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼを含むが、それに限定されるわけではない。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、検出可能な標識は、ルシゲニン、ルミノール、ルシフェリン、イソルミノール、テロマティック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルを含むがそれに限定されるわけではない化学発光標識である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、検出可能な標識は、コロイド金または色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、およびラテックス）ビーズを含むがそれに限定されるわけではないスペクトル比色標識であり得る。
【００７２】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、検出試薬は、検出可能なタグ、例えば、c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5、HIS、またはビオチンで標識されてもよい。また、他の検出系、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン系を用いることもできる。この系では、関心対象のバイオマーカーに対して免疫反応性の（すなわち、特異的な）抗体がビオチン化される。バイオマーカーに結合しているビオチン化抗体の量は、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび発色基質を用いて決定される。このようなストレプトアビジンペルオキシダーゼ検出キットは、例えば、DAKO；Carpinteria, CAから市販されている。また、152Euまたはランタニド系列の他の金属等の蛍光発光金属を用いて試薬を検出可能に標識してもよい。これら金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）等の金属キレート化基を使用して試薬に結合することができる。
【００７３】
基準レベルよりも低いレベルは、基準レベルに対して少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、またはそれよりも少ない、低いレベルであり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、基準レベルよりも低いレベルは、基準レベルよりも統計的に有意に低いレベルであり得る。
【００７４】
基準レベルよりも高いレベルは、基準レベルよりも少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約100％、少なくとも約200％、少なくとも約300％、少なくとも約500％、またはそれよりも多い、高いレベルであり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、基準レベルよりも高いレベルは、基準レベルよりも統計的に有意に高いレベルであり得る。
【００７５】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、基準は、EV関連疾患を有していないもしくは有していると診断されていない、および／またはEV関連疾患の徴候もしくは症状を示していない対象の集団におけるレベルであり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、基準はまた、対照サンプル、対照対象、対照個体のプールされたサンプル、対照個体のプールにおけるレベル、またはそれに基づく数値もしくは数値範囲であってもよい。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、基準は、同じ対象またはより早い時点における対象から得られたサンプルにおけるレベルであってもよく、例えば、本明細書において記載される方法を使用して、所与の療法に対する対象の感受性または応答が経時的に変化しているかどうかを判定することができる。
【００７６】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、200個以下の他の遺伝子の発現産物のレベルが決定される。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、100個以下の他の遺伝子の発現産物のレベルが決定される。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、20個以下の他の遺伝子の発現産物のレベルが決定される。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、10個以下の他の遺伝子の発現産物のレベルが決定される。
【００７７】
前述の局面の幾つかの態様では、所与の遺伝子の発現レベルは、1つまたは複数の参照遺伝子または参照タンパク質の発現レベルに対して正規化され得る。
【００７８】
幾つかの態様では、基準レベルは、石灰化／微小石灰化のレベルが決定されるサンプル／対象と類似の年齢、性別、および他の人口統計学的パラメータの対象から得られたサンプルにおけるレベルであり得る。幾つかの態様では、試験サンプルおよび対照参照サンプルは、同じ種類のもの、すなわち、同じ生物学的源から得られ、そして、同じ組成、例えば、同じ数および種類の細胞を含むものである。
【００７９】
用語「サンプル」または「試験サンプル」は、本明細書で使用されるとき、生物有機体から採取または単離されたサンプル、例えば、対象からの血液または血漿のサンプルを意味する。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本発明は、生体サンプルの幾つかの例を包含する。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、生体サンプルは、細胞、または組織、または末梢血、または体液である。例示的な生体サンプルは、生検、腫瘍サンプル、生体液サンプル；血液；血清；血漿；尿；精液；粘液；組織生検；臓器生検；滑液；胆汁液；脳脊髄液；粘膜分泌物；滲出液；汗；唾液；および／または組織サンプル等を含むが、それに限定されるわけではない。この用語は、上述のサンプルの混合物も含む。また、用語「試験サンプル」は、未処理のまたは前処理（または前加工）された生体サンプルも含む。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、試験サンプルは、対象からの細胞を含み得る。試験サンプルは、対象からサンプルを採取することによって得ることができるが、以前に単離されたサンプル（例えば、事前の時点で単離された、および同一または別の人物によって単離された）を使用することによって達成することもできる。
【００８０】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、試験サンプルは、未処理の試験サンプルであってよい。本明細書において使用するとき、語句「未処理試験サンプル」とは、希釈および／または溶液への懸濁を除いていかなる事前のサンプル前処理も行っていない試験サンプルを指す。試験サンプルを処理するための例示的な方法は、遠心分離、濾過、超音波処理、均質化、加熱、凍結および解凍、ならびにそれらの組み合わせを含むが、それに限定されるわけではない。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、試験サンプルは、凍結試験サンプル、例えば、凍結組織であってよい。凍結サンプルは、本明細書において記載される方法、アッセイ、および系を利用する前に解凍してよい。解凍後、本明細書において記載される方法、アッセイ、および系に供される前に凍結サンプルを遠心分離してもよい。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、試験サンプルは、例えば、遠心分離し、そして、清澄化された試験サンプルを含む上清を回収することによる、清澄化された試験サンプルである。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、試験サンプルは、前加工された試験サンプル、例えば、遠心分離、濾過、解凍、精製、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される処理から得られた上清または濾液であってよい。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、化学的および／または生物学的試薬で試験サンプルを処理してもよい。化学的および／または生物学的試薬は、加工中に、その中に生体分子（例えば、核酸およびタンパク質）を含むサンプルの安定性を保護および／または維持するために使用することができる。1つの例示的な試薬は、プロテアーゼインヒビターであり、これは一般に、加工中にタンパク質の安定性を保護または維持するために使用される。当業者は、本明細書において記載される通り発現産物のレベルの決定に必要な生体サンプルの前加工に適切な方法およびプロセスを十分に認識している。
【００８１】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される方法、アッセイ、および系は、対象から試験サンプルを得るまたは得た工程を更に含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、対象はヒト対象であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、対象は、EV関連疾患の処置を必要とする（例えば、EV関連疾患を有するかまたは有すると診断された）対象、または本明細書の他の箇所に記載される通りEV関連疾患を発症するリスクがあるかまたは発症するリスクが増大している対象であり得る。
【００８２】
本明細書において記載される組成物および方法は、EV関連疾患および／または石灰化／微小石灰化を有するかまたは有すると診断された対象に施すことができる。幾つかの態様では、本明細書において記載される方法は、EV関連疾患および／または石灰化／微小石灰化の症状を軽減するために、有効量の本明細書において記載される組成物、例えば、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を対象に投与する工程を含む。本明細書において使用するとき、疾患の「症状を軽減する」とは、疾患に関連する任意の病態または症状を回復させることである。等価な未処理対照と比較したとき、このような減少は、任意の標準的な技術によって測定したとき、少なくとも5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％またはそれ以上である。本明細書において記載される組成物を対象に投与するための様々な手段は、当業者に公知である。このような方法は、経口、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアゾール）、肺、皮膚、局所、注射、または腫瘍内の投与を含み得るが、それに限定されるわけではない。投与は、局所であっても全身であってもよい。
【００８３】
用語「有効量」は、本明細書で使用されるとき、疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症状を軽減するために必要な、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質の量を指し、そして、所望の効果を提供するために十分な量の薬学的組成物に関する。したがって、用語「治療的有効量」は、典型的な対象に投与したときに特定の治療効果を提供するのに十分な、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質の量を指す。有効量は、本明細書において使用するとき、様々な状況において、疾患の症状の発現を遅らせる、症状疾患の経過を変化させる（例えば、疾患の症状の進行を減速させるが、それに限定されるわけではない）、または疾患の症状を逆行させるのに十分な量も含む。したがって、一般的に、正確な「有効量」を指定するのは実用的ではない。しかしながら、任意の所与の症例について、当業者はルーチンな実験のみを用いて適切な「有効量」を決定することができる。
【００８４】
有効量、毒性、および治療有効性は、例えば、LD50（集団の50％にとって致死性である用量）およびED50（集団の50％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手技によって決定することができる。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に依存して変動し得る。毒性作用と治療効果との間の用量比が、治療指数であり、比LD50／ED50として表すことができる。大きな治療指数を呈する組成物および方法が好ましい。治療的有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。また、細胞培養物または適切な動物モデルで決定されたIC50（すなわち、症状の半最大阻害を達成する活性薬剤濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて用量を定式化することもできる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投与量の効果は、好適なバイオアッセイ、例えば、特にEVレベルまたは石灰化についてのアッセイ等によってモニタリングすることができる。投与量は、医師によって決定され、そして、必要に応じて、観察された処置の効果に適するように調整され得る。
【００８５】
有効量、毒性、および治療有効性は、例えば、最小有効用量および／または最大耐容用量を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手技によって決定することができる。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に依存して変動し得る。治療的有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。また、最小有効用量と最大耐容用量との間の投与量範囲を達成するように、動物モデルにおいて用量を定式化することもできる。任意の特定の投与量の効果は、好適なバイオアッセイ、例えば、特に腫瘍の成長および／またはサイズについてのアッセイによってモニタリングすることができる。投与量は、医師によって決定され、そして、必要に応じて、観察された処置の効果に適するように調整され得る。
【００８６】
幾つかの態様では、本明細書において記載される技術は、本明細書において記載されるANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質、および任意で薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。幾つかの態様では、薬学的組成物の活性成分は、本明細書において記載されるANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を含む。幾つかの態様では、薬学的組成物の活性成分は、本明細書において記載されるANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質から本質的になる。幾つかの態様では、薬学的組成物の活性成分は、本明細書において記載されるANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質からなる。薬学的に許容される担体および希釈剤は、生理食塩水、水性バッファ溶液、溶媒、および／または分散媒を含む。このような担体および希釈剤の使用は、当技術分野において周知である。薬学的に許容される担体として機能し得る物質の幾つかの非限定的な例は、（1）乳糖、ブドウ糖、およびショ糖等の糖類；（2）コーンスターチおよびバレイショデンプン等のデンプン類；（3）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、および酢酸セルロース等のセルロースおよびその誘導体；（4）粉末状トラガカンス；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルク等の滑沢剤；（8）カカオバターおよび坐剤用ワックス等の賦形剤；（9）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油等の油類；（10）プロピレングリコール等のグリコール類；（11）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール（PEG）等のポリオール類；（12）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル類；（13）寒天；（14）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；（15）アルギン酸；（16）パイロジェンフリー水；（17）等張生理食塩水；（18）リンゲル溶液；（19）エチルアルコール；（20）pH緩衝溶液；（21）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリ酸無水物；（22）ポリペプチドおよびアミノ酸等の増量剤；（23）血清アルブミン、HDL、およびLDL等の血清成分；（22）エタノール等のC2〜C12アルコール；ならびに（23）薬学的製剤に使用される他の非毒性の適合性物質を含む。また、湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、着香料、香料、防腐剤、および酸化防止剤が製剤中に存在していてもよい。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」等の用語は、本明細書において互換的に使用される。幾つかの態様では、担体は、活性薬剤、例えば本明細書において記載されるANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質の分解を阻害する。
【００８７】
幾つかの態様では、本明細書において記載されるANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を含む薬学的組成物は、非経口剤形であってよい。非経口剤形の投与は、典型的には、汚染物質に対する患者の自然防御を迂回するので、非経口剤形は、好ましくは、患者に投与する前に無菌であるかまたは滅菌され得る。非経口剤形の例は、注射の準備が整った液剤、注射のために薬学的に許容されるビヒクルに溶解または懸濁される準備が整った乾燥製品、注射の準備が整った懸濁剤、および乳剤を含むが、それに限定されるわけではない。更に、DUROS（登録商標）タイプの剤形および用量ダンピングを含むがそれに限定されるわけではない制御放出性非経口剤形を、患者に投与するために調製することができる。
【００８８】
本明細書内に開示されるANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質の非経口剤形を提供するために使用することができる好適なビヒクルは、当業者に周知である。例は、非限定的に、滅菌水；注射用水USP；生理食塩水；グルコース溶液；塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、デキストロース注射剤、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射剤、ならびに乳酸加リンゲル注射剤等であるがそれに限定されるわけではない水性ビヒクル；エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコール等であるがそれに限定されるわけではない水混和性ビヒクル；ならびにコーン油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジル等であるが、それに限定されるわけではない非水性ビヒクルを含む。従来の制御放出性非経口剤形を含む、本明細書において開示される作用物質の薬学的に許容される塩の溶解度を変化させるかまたは調節する化合物を、本開示の非経口剤形に組み込んでもよい。
【００８９】
ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を含む薬学的組成物はまた、経口投与に好適であるように、例えば、錠剤（非限定的に分割錠またはコーティング錠を含む）、丸剤、カプレット、カプセル、チュアブル錠、粉末パケット、カシェ剤、トローチ剤、ウェハ剤、エアゾールスプレー、または例えば、シロップ剤、エリキシル剤、水性液体、非水性液体、水中油型エマルション、もしくは油中水型エマルション中の溶液もしくは懸濁液等であるがそれに限定されるわけではない液剤等であるが、それに限定されるわけではない、分離した剤形として製剤化してもよい。このような組成物は、開示される化合物の薬学的に許容される塩を所定の量含有し、そして、当業者に周知の調剤の方法によって調製することができる。一般的には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams, and Wilkins, Philadelphia PA. (2005)を参照。
【００９０】
従来の剤形は、一般的に、製剤から迅速にまたは即時に薬物を放出させる。薬物の薬理および薬物動態に依存して、従来の剤形を使用すると、患者の血液および他の組織における薬物の濃度が広く変動する場合がある。これら変動は、投与頻度、作用の発現、有効性の持続時間、治療域の血中レベルの維持、毒性、副作用等の多数のパラメータに影響を与え得る。有利なことに、薬物の作用の発現、作用の持続時間、治療濃度域内の血漿レベル、および血中ピークレベルを制御するために、制御放出性製剤を使用することができる。特に、薬物の毒性レベルを超えた場合はもちろん、薬物の過少投与（すなわち、最低治療レベルを下回る）からも生じ得る潜在的な有害作用および安全性に対する懸念を最小限に抑えながら、薬物の最大の有効度を確実に達成するようにするために、制御放出性または持続放出性の剤形または製剤を使用することができる。幾つかの態様では、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を持効性製剤で投与してよい。
【００９１】
制御放出性薬学的製品は、その非制御放出性対応物によって達成されるものを超えて薬物療法を改善するという共通の目標を有している。理想的には、医学的処置における最適に設計された制御放出性調製物の使用は、最小の原薬を使用して、最小量の時間で病態を治癒または制御することを特徴とする。制御放出性製剤の利点は、1）薬物の活性の延長；2）投与頻度の低下；3）患者のコンプライアンスの向上；4）合計薬物使用量の減少；5）局所的または全身的な副作用の低減；6）薬物の蓄積の最小化；7）血中レベルの変動の低減；8）処置の有効性の改善；9）薬物活性の増強または喪失の低減；および10）疾患または病態の制御の速度改善を含む。Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)。
【００９２】
ほとんどの制御放出性製剤は、速やかに所望の治療効果を生じさせる量の薬物（活性成分）を最初に放出し、そして、このレベルの治療効果または予防効果を長期間にわたって維持するために他の量の薬物を徐々に、そして、継続的に放出するように設計されている。体内でこの一定のレベルの薬物を維持するためには、代謝され、そして、体内から排出される薬物の量に置き換わる速度で剤形から薬物が放出されなければならない。活性成分の制御放出は、pH、イオン強度、浸透圧、温度、酵素、水、および他の生理学的な条件または化合物を含むがそれに限定されるわけではない様々な条件によって刺激することができる。
【００９３】
様々な公知の制御放出または持続放出性の剤形、製剤、および装置は、本開示の塩および組成物と共に使用するために適合させることができる。例としては、米国特許第3,845,770号；同第3,916,899号；同第3,536,809号；同第3,598,123号；同第4,008,719号；同第5674,533号；同第5,059,595号；同第5,591,767号；同第5,120,548号；同第5,073,543号；同第5,639,476号；同第5,354,556号；同第5,733,566号；および同第6,365,185 B1号に記載されているものを含むが、それに限定されるわけではなく、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み入れられる。これら剤形は、様々な比率で所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧系（例えば、OROS（登録商標）（Alza Corporation, Mountain View, Calif. USA)）、またはそれらの組み合わせを使用して、1つまたは複数の活性成分の徐放または制御放出を提供するために使用することができる。
【００９４】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載されるANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質は、単剤療法として投与され、例えば、EV関連疾患または石灰化／微小石灰化のための別の処置は、対象に施されない。
【００９５】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される方法は、第2の作用物質および／または処置を、例えば併用療法の一部として、対象に施す工程を更に含んでいてもよい。がんを有する対象のための第2の作用物質および／または処置の非限定的な例は、放射線療法、手術、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン、ボルテゾミブ、AMG479、ボリノスタット、リツキシマブ、テモゾロミド、ラパマイシン、ABT-737、PI-103；チオテパおよびCYTOXAN（登録商標）シクロホスファミド等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン等のアルキルスルホナート類；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパ等のアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチローロメラミン等のエチレンイミン類およびメチラメラミン類；アセトゲニン類（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシンの合成類似体を含む）；クリプトフィシン類（特にクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体KW-2189およびCB1-TM1を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード類；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン等のニトロスウレア類；エンジイン抗生物質等の抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特にカリチアマイシンガンマ1IおよびカリチアマイシンオメガI1（例えば、Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照）；ジネミシンAを含むジネミシン；クロドロナート等のビスホスホナート類；エスペラミシン；更にはネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ADRIAMYCIN（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、2-ピロリノ−ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンC等のマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）等の代謝拮抗物質；デノプテリン���メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート等の葉酸類似体；フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン等のプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスリジン等のピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン等の抗副腎剤；フロリン酸（frolinic acid）等の葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシンおよびアンサマイトシン等のマイタンシノイド類；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；2−エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, Oreg.）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；2,2’,2”-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、T-2トキシン、ベラキュリンA、ロリジンA、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばTAXOL（登録商標）パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology、Princeton、N.J.）、ABRAXANE（登録商標）クレモホールを含まないアルブミン処理されたパクリタキセルのナノ粒子製剤（American Pharmaceutical Partners、Schaumberg、Ill.)、およびTAXOTERE（登録商標）ドキセタキセル（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；GEMZAR（登録商標）ゲムシタビン；6−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン等の白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；NAVELBINE（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロナート；イリノテカン（Camptosar、CPT-11）（イリノテカンと5-FUおよびロイコボリンとの処置レジメンを含む）；トポイソメラーゼインヒビターRFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイン酸等のレチノイド類；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（LV）；オキサリプラチン処置レジメン（FOLFOX）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（Tykerb（登録商標））；細胞増殖を減少させるPKC−アルファ、Raf、H-Ras、EGFR（例えば、エルロチニブ（Tarceva（登録商標）））およびVEGF-Aのインヒビター、ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含み得る。更に、処置の方法は、放射線または放射線療法を使用するこ��を更に含んでいてもよい。更に、処置の方法は、外科的処置の使用を更に含んでいてもよい。
【００９６】
本明細書において記載される他の病態に対する治療剤は、当技術分野において周知であり、そして、例えば、FDA’s Orange Book（Approved Drug Products with Therapeutic Equivalence Evaluations）の現行版を参考にすることにより当業者であれば容易に特定することができる。
【００９７】
特定の態様では、本明細書において記載されるANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を含む組成物の有効用量を、患者に1回投与してよい。特定の態様では、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を含む組成物の有効用量を、患者に繰り返し投与してもよい。全身投与の場合、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を含む組成物の治療量、例えば、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、またはそれ以上を対象に投与してよい。
【００９８】
幾つかの態様では、初期の処置レジメンの後、より少ない頻度で処置を施してよい。例えば、3ヶ月間にわたって隔週で処置を施した後、6ヶ月間または1年間またはそれ以上にわたって1ヶ月に1回処置を繰り返してよい。本明細書において記載される方法に従った処置は、マーカーまたは病態の症状、例えば石灰化のレベルを、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、もしくは少なくとも90％、またはそれ以上低下させることができる。
【００９９】
本明細書において記載される組成物の投与量は、医師によって決定され、そして、必要に応じて、観察された処置の効果に適するように調整され得る。処置の持続時間および頻度に関して、熟練した臨床医は、処置がいつ治療的利益を提供するかを判断するため、そして、投与量を増加させるか減少させるか、投与頻度を増加させるか減少させるか、処置を中断するかどうか、処置を再開するかどうか、または処置レジメンに対して他の変更を行うかどうかを判断するために、対象をモニタリングするのが典型的である。投与スケジュールは、活性薬剤に対する対象の感受性等の多数の臨床的要因に応じて、1週間に1回から1日1回まで変動し得る。所望の用量または量の活性化を一度に施してもよく、または例えば、1日を通して適切な間隔で、一定期間にわたって分割用量、例えば、2〜4回の分割用量に分割して施してもよく、または他の適切なスケジュールで施してもよい。幾つかの態様では、投与は慢性的であってよく、例えば、数週間または数ヶ月間にわたって毎日、1回または複数回の投薬および／または処置を行ってよい。投薬および／または処置のスケジュールの例は、1週間、2週間、3週間、4週間、1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、5ヶ月間、もしくは6ヶ月間、またはそれ以上の期間にわたって、1日1回、1日2回、1日3回、または1日4回以上の投与である。ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を含む組成物は、例えば、5分間、10分間、15分間、20分間、または25分間等の期間にわたって投与してよい。
【０１００】
本明細書において記載される方法に従って、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を投与するための投与量範囲は、例えば、その物質の形態、その効力、および本明細書において記載される病態の症状、マーカー、または指標が低下することが望ましい程度、例えば、石灰化についての望ましい低下率に依存する。投与量は、有害な副作用を引き起こすほど多くてはならない。一般的に、投与量は、患者の年齢、状態、および性別によって異なり、そして、当業者が決定することができる。また、何らかの合併症の場合、個々の医師が投与量を調整することもできる。
【０１０１】
例えば、本明細書において記載される病態の処置におけるまたは本明細書において記載される応答（例えば、石灰化の減少）を誘導する、ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質の有効性は、熟練した臨床医によって決定され得る。しかしながら、本明細書において記載される病態の徴候または症状のうちの1つまたは複数が有益に変化した場合、他の臨床的に認められた症状が改善されたもしくは更には回復した場合、または例えば本明細書において記載される方法に従って処置した後に、所望の応答が例えば少なくとも10％誘導された場合、処置は、本明細書においてこの用語が使用されるとき、「有効な処置」とみなされる。有効性は、例えば、本明細書において記載される方法に従って処置される病態のマーカー、指標、症状、および／もしくは発生率、または適切な任意の他の測定可能なパラメータ、例えば石灰化を測定することによって評価することができる。有効性は、また、入院によって評価したときに悪化した個体の機能不全、または医学的介入の必要性（すなわち、病気の進行が停止する）によって測定することもできる。これら指標を測定する方法は、当業者に公知であるおよび／または本明細書に記載されている。処置は、個体または動物（幾つかの非限定的な例は、ヒトまたは動物を含む）における疾患の任意の処置を含み、そして、（1）疾患を阻害する、例えば、症状（例えば、疼痛または炎症）の悪化を防ぐ；または（2）疾患の重篤度を緩和する、例えば、症状を退行させることを含む。疾患を処置するための有効量とは、それを必要とする対象に投与したときに、その疾患に対して有効な処置（その用語は本明細書において定義される通りである）をもたらすのに十分な量を意味する。作用物質の有効性は、病態または所望の応答の身体的指標を評価することによって決定することができる。そのようなパラメータのうちのいずれか1つ、またはパラメータ任意の組み合わせを測定することにより、投与および/または処置の有効性をモニタリングすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。有効性は、本明細書において記載される病態の動物モデル、例えば、EV関連疾患および／または石灰化／微小石灰化の処置において評価することができる。実験動物モデルを使用するとき、例えば石灰化等のマーカーに統計的に有意な変化が観察されたときに処置の有効性が証明される。
【０１０２】
また、所与の投与量の組み合わせの有効性は、動物モデル、例えば、本明細書の実施例に記載されるマウスモデルにおいて評価することができる。
【０１０３】
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される幾つかの用語および語句の意味を以下に提供する。特に断らない限りまたは文脈から暗に示されていない限り、以下の用語および語句は、以下に提供される意味を含む。定義は、特定の態様の説明を支援するために提供され、そして、請求される発明を限定することを意図するものではないが、その理由は、本発明の範囲が、特許請求の範囲によってのみ限定されるためである。特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。当技術分野における用語の使用法と本明細書において提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、本明細書内に提供される定義を優先するものとする。
【０１０４】
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語は、ここに集められる。
【０１０５】
用語「減少」、「低下」、「低減」、または「阻害」は、全て、統計的に有意な量の減少を意味するために本明細書において使用される。幾つかの態様では、「低下」、「低減」、または「減少」、または「阻害」は、典型的には、基準レベル（例えば、所与の処置または物質の非存在下）と比較して少なくとも10％の減少を意味し、そして、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、またはそれ以上の減少を含み得る。本明細書において使用するとき、「低減」または「阻害」は、基準レベルと比較して完全な阻害も低減も包含しない。「完全な阻害」とは、基準レベルと比較して100％の阻害である。減少は、好ましくは、所与の障害を有しない個体にとって正常な範囲内であると許容されるレベルまで下げることができる。
【０１０６】
用語「増加」、「増大」、「増強」、または「活性化」は、全て、統計的に有意な量の増加を意味するために本明細書において使用される。幾つかの態様では、用語「増加」、「増大」、「増強」、または「活性化」は、基準レベルと比較して少なくとも10％の増加、例えば、少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％、もしくは100％以下の増加、または基準レベルと比較して10〜100％の任意の増加、または基準レベルと比較して、少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、もしくは2倍〜10倍、もしくはそれ以上の任意の増加、またはそれ以上を意味し得る。マーカーまたは症状に関連して、「増加」とは、そのようなレベルの統計的に有意な増加である。
【０１０７】
本明細書において使用するとき、「対象」とは、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜、または狩猟動物等の脊椎動物である。霊長類は、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルを含む。げっ歯類は、マウス、ラット、マーモット、フェレット、ウサギ、およびハムスターを含む。家畜および狩猟動物は、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ科の種、例えば、イエネコ、イヌ科の種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類の種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚類、例えば、マス、ナマズ、およびサケを含む。幾つかの態様では、対象は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。用語、「個体」、「患者」、および「対象」は、本明細書において互換的に使用される。
【０１０８】
好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであってよいが、これらの例に限定されるわけではない。ヒト以外の哺乳動物は、EV関連疾患および／または石灰化／微小石灰化の動物モデルを表す対象として有利に使用することができる。対象は、男性であっても女性であってもよい。
【０１０９】
対象は、処置を必要とする病態（例えば、EV関連疾患および／または石灰化／微小石灰化）またはそのような病態に関連する1つもしくは複数の合併症に罹患しているまたは有すると以前診断または特定されたことがあり、そして、任意で、病態または病態に関連する1つもしくは複数の合併症の処置を既に受けたことがあるものであってよい。あるいは、対象は、状態または病態に関連する1つもしくは複数の合併症を有するとそれまで診断されたことがないものであってもよい。例えば、対象は、病態または病態に関連する1つもしくは複数の合併症についての1つまたは複数の危険因子を呈している対象であってもよく、危険因子を呈していない対象であってもよい。
【０１１０】
特定の病態に対する処置を「必要とする対象」は、その病態を有する対象、その病態を有すると診断された対象、またはその病態を発症するリスクのある対象であってよい。
【０１１１】
本明細書において使用するとき、用語「低分子」とは、ペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、1モル当たり約10,000グラム未満の分子量を有する有機または無機の化合物（すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）、1モルあたり約5,000グラム未満の分子量を有する有機または無機の化合物、1モルあたり約1,000グラム未満の分子量を有する有機または無機の化合物、1モルあたり約500グラム未満の分子量を有する有機または無機の化合物、およびそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態を含み得るが、それに限定されるわけではない化学剤を指す。
【０１１２】
本明細書において使用するとき、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」とは、隣接する残基のα−アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに接続された一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書において互換的に使用される。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」とは、そのサイズまたは機能にかかわらず、修飾されたアミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化等）およびアミノ酸類似体を含む、アミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドに関連して使用されることが多く、一方、用語「ペプチド」は、小さなポリペプチドに関連して使用されることが多いが、当技術分野におけるこれら用語の用法は重複している。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、遺伝子産物およびその断片に言及するとき、本明細書において互換的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質は、遺伝子産物、天然のタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片および他の等価物、バリアント、断片、および前述の類似体を含む。
【０１１３】
本明細書において記載される様々な態様では、記載される特定のポリペプチドのいずれかのバリアント（天然に存在するかまたは存在しない）、対立遺伝子、ホモログ、保存的に改変されたバリアント、および／または保存的置換バリアントが包含されることが更に企図される。アミノ酸配列に関しては、当業者であれば、コードされている配列中の単一のアミノ酸またはわずかな比率のアミノ酸を変更する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、その変更の結果、アミノ酸が化学的に類似のアミノ酸で置換され、そして、ポリペプチドの所望の活性を保持している場合、「保存的に改変されたバリアント」であることを認識するであろう。このような保存的に改変されたバリアントは、多型バリアント、種間ホモログ、および本開示と一致する対立遺伝子に追加され、そして、これらを除外するものではない。
【０１１４】
例えば、ある脂肪族残基の別の脂肪族残基による置換（例えば、互いにIle、Val、Leu、またはAla）、またはある極性残基の別の極性残基による置換（例えば、LysとArgとの間、GluとAspとの間、またはGlnとAsnとの間）等、所与のアミノ酸を類似の生理化学的特徴を有する残基によって置き換えることができる。他のそのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特徴を有する領域全体の置換が周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、ネイティブポリペプチドまたは参照ポリペプチドの所望の活性および特異性が保持されていることを確認するために、本明細書において記載されるアッセイのいずれか1つにおいて試験することができる。
【０１１５】
アミノ酸は、その側鎖の特性における類似性に従ってグループ化することができる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)）：（1）非極性：Ala（A）、Val（V）、Leu（L）、Ile（I）、Pro（P）、Phe（F）、Trp（W）、Met（M）;（2）無電荷極性：Gly（G）、Ser（S）、Thr（T）、Cys（C）、Tyr（Y）、Asn（N）、Gln（Q）;（3）酸性：Asp（D）、Glu（E）;（4）塩基性；Lys（K）、Arg（R）、His（H）。あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分類することもできる：（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；（3）酸性：Asp、Glu；（4）塩基性：His、Lys、Arg；（5）鎖の配向に影響を与える残基：Gly、Pro；（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保存的置換は、これらクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。具体的な保存的置換は、例えば、AlaをGlyまたはSerに；ArgをLysに；AsnをGlnまたはHisに；AspをGluに；CysをSerに；GlnをAsnに；GluをAspに；GlyをAlaまたはProに；HisをAsnまたはGlnに；IleをLeuまたはValに；LeuをIleまたはValに；LysをArg、Gln、またはGluに；MetをLeu、Tyr、またはIleに；PheをMet、Leu、またはTyrに；SerをThrに；ThrをSerに；TrpをTyrに；TyrをTrpに；および／またはPheをVal、Ile、またはLeuに置換することを含む。
【０１１６】
幾つかの態様では、本明細書において記載されるポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードしている核酸）は、本明細書において記載されるアミノ酸配列のうちの1つの機能性断片であり得る。本明細書において使用するとき、「機能性断片」とは、本明細書において以下に記載されるアッセイに従って、野生型参照ポリペプチドの活性の少なくとも50％を保持しているペプチドの断片またはセグメントである。機能性断片は、本明細書において開示される配列の保存的置換を含み得る。
【０１１７】
幾つかの態様では、本明細書において記載されるポリペプチドは、本明細書において記載される配列のバリアントであってよい。幾つかの態様では、バリアントは、保存的に改変されたバリアントである。保存的置換バリアントは、例えば、ネイティブヌクレオチド配列の変異によって得ることができる。「バリアント」は、本明細書において言及するとき、ネイティブまたは参照のポリペプチドと実質的に相同であるが、1つまたは複数の欠失、挿入、または置換のためにネイティブまたは参照のポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。バリアントポリペプチドをコードしているDNA配列は、ネイティブまたは参照のDNA配列と比較したとき、ヌクレオチドの1つまたは複数の付加、欠失、または置換を含むが、活性を保持しているバリアントタンパク質またはその断片をコードしている配列を包含する。多種多様なPCRベースの部位特異的変異誘発アプローチは、当技術分野において公知であり、そして、当業者によって適用され得る。
【０１１８】
バリアントのアミノ酸またはDNAの配列は、ネイティブまたは参照の配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、またはそれ以上同一であり得る。ネイティブ配列と変異体配列との間の相同性の程度（同一性パーセント）は、例えば、ワールドワイドウェブ上でこの目的のために一般的に使用されている自由に利用可能なコンピュータプログラム（例えば、デフォルト設定のBLASTpまたはBLASTn）を使用して2つの配列を比較することによって決定することができる。
【０１１９】
ネイティブアミノ酸配列の変更は、当業者に公知の多数の技術のいずれかによって達成され得る。例えば、ネイティブ配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位に隣接する、変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座に変異を導入することができる。ライゲーション後、得られた再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する類似体をコードしている。あるいは、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発手技を使用して、必要な置換、欠失、または挿入に従って変更された特定のコドンを有する変更されたヌクレオチド配列を提供することができる。このような変更を行うための技術は非常によく確立されており、そして、例えば、Walder et al. (Gene 42:133, 1986)；Bauer et al. (Gene 37:73, 1985)；Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19)；Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981)；ならびに米国特許第4,518,584号および同第4,737,462号によって開示されているものを含み、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。また、ポリペプチドの適当な高次構造の維持には関与していない任意のシステイン残基も、分子の酸化的安定性を改善し、そして、異常な架橋を防ぐために、一般的にセリンで置換することができる。逆に、ポリペプチドの安定性を改善したり、オリゴマー化を促進したりするために、システイン結合（複数可）をポリペプチドに付加してもよい。
【０１２０】
本明細書において使用するとき、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子の免疫学的活性部分を指す。この用語はまた、2本の免疫グロブリン重鎖および2本の免疫グロブリン軽鎖で構成される抗体、ならびに完全長抗体およびその抗原結合部分を含む様々な形態を指し；例えば、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDRグラフト抗体、ヒト化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド連結Fv、scFv、単一ドメイン抗体（dAb）、ダイアボディ、多重特異的抗体、二重特異的抗体、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体、その機能的に活性なエピトープ結合部分、および／または二機能性ハイブリッド抗体を含む。各重鎖は、該重鎖の可変領域（ここではHCVRまたはVHと略す）および該重鎖の定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインCH1、CH2、およびCH3からなる。各軽鎖は、該軽鎖の可変領域（ここではLCVRまたはVLと略す）および該軽鎖の定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、CLドメインからなる。VHおよびVLの領域は、相補性決定領域（CDR）と称される超可変領域に更に分けることができ、そして、フレームワーク領域（FR）と称される保存領域が散在している。したがって、各VHおよびVLの領域は、N末端からC末端に向かって以下の順序で配置されている3つのCDRおよび4つのFR領域からなる：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。この構造は、当業者に周知である。
【０１２１】
抗体および／または抗体試薬は、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDRグラフト抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド連結Fv、scFv、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異的抗体、二重特異的抗体、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体、およびその機能的に活性なエピトープ結合部分を含み得る。
【０１２２】
本明細書において使用するとき、用語「ナノボディ」または単一ドメイン抗体（sdAb）は、ラクダおよびヒトコブラクダから得られた抗体の小さな単一可変ドメイン（VHH）を含む抗体を指す。ラマ種（アルパカ（Lama paccos）、ラマ（Lama glama）、およびビクーニャ（Lama vicugna））などの新世界のメンバーを含むラクダおよびヒトコブラクダ（Camelus baclrianusおよびCalelus dromaderius）科のメンバーから得られた抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性、およびヒト対象に対する抗原性に関して特徴付けられている。自然界でみられるこの科の哺乳動物からの特定のIgG抗体は、軽鎖を欠いており、したがって、他の動物からの抗体のような2本の重鎖および2本の軽鎖を有する典型的な4本の鎖の四次構造とは構造的に異なる。PCT/EP93/02214（1994年3月3日に公開されたWO94/04678；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照。
【０１２３】
VHHとして同定される小さな単一可変ドメインであるラクダ抗体の領域は、標的に対して高い親和性を有する小さなタンパク質を得るために遺伝子操作し、その結果「ラクダナノボディ」として知られている低分子量抗体由来タンパク質を得ることによって、得ることができる。米国特許第5,759,808号（1998年6月2日発行）を参照；Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261；Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788；Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448；Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62；およびLauwereys, M. et al. 1998 EMBO J. 17: 3512-3520も参照；これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ラクダ抗体および抗体断片の操作されたライブラリは、例えば、Ablynx, Ghent, Belgiumから市販されている。非ヒト起源の他の抗体と同様に、ラクダ抗体のアミノ酸配列を組換え的に変更して、よりヒト配列に類似した配列を得ることができる、すなわち、ナノボディを「ヒト化」することができる。このようにして、ラクダ抗体のヒトに対する天然の低い抗原性を更に低減することができる。
【０１２４】
ラクダナノボディは、ヒトIgG分子のおよそ10分の1の分子量を有し、そして、このタンパク質は、わずか数ナノメートルの物理的直径を有する。サイズが小さいことの1つの意義は、より大きな抗体タンパク質には機能的に見分けのつかない（invisible）抗原性部位に結合するラクダナノボディの能力である、すなわち、ラクダナノボディは、古典的な免疫学的技術を使用して、そうしなければ隠れている抗原を検出する試薬として、そして、見込みのある治療剤として有用である。したがって、サイズが小さいことの更に別の意義は、ラクダナノボディが、標的タンパク質の溝または狭い間隙における特異的部位に結合した結果として阻害することができ、したがって、古典的な抗体よりも古典的な低分子量薬物の機能により類似している能力を発揮できることである。低分子量およびコンパクトなサイズによって、更に、極めて熱安定性であり、極端なpHおよびタンパク質分解に対して安定性であり、そして、抗原性が低いラクダナノボディが得られる。2004年8月19日に公開された米国特許出願公開第20040161738号を参照；これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。これら特徴は、ヒトに対する抗原性の低さと相まって、大きな治療上の潜在力を示す。
【０１２５】
本明細書において使用するとき、用語「核酸」または「核酸配列」は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはこれらの類似体のユニットが組み込まれた任意の分子、好ましくはポリマー分子を指す。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一本鎖核酸は、変性した二本鎖DNAのうちの1本の核酸鎖であってもよい。あるいは、いかなる二本鎖DNAにも由来しない一本鎖核酸であってもよい。一局面では、核酸は、DNAであってよい。別の局面では、核酸は、RNAであってよい。好適なDNAは、例えば、ゲノムDNAまたはcDNAを含み得る。好適なRNAは、例えば、mRNAを含み得る。
【０１２６】
用語「発現」とは、適用可能な場合、例えば、転写、転写物のプロセシング、翻訳、ならびにタンパク質の折り畳み、修飾、およびプロセシングを含むがそれに限定されるわけではない、RNAおよびタンパク質の産生、ならびに必要に応じてタンパク質の分泌に関与する細胞プロセスを指す。発現とは、本発明の核酸断片（複数可）に由来するセンス（mRNA）またはアンチセンスのRNAの転写および安定な蓄積、ならびに／またはmRNAのポリペプチドへの翻訳を指し得る。
【０１２７】
本明細書において使用するとき、用語「iRNA」は、RNA（または本明細書において以下に記載する修飾核酸）を含有する物質であって、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）経路を介してRNA転写物の標的切断を媒介する物質を指す。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載されるiRNAは、標的、例えばANXA1の発現および／または活性の阻害を引き起こす。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、インヒビター（例えば、iRNA）を細胞に接触させた結果、細胞内の標的mRNAレベルは、iRNAが存在しない細胞内にみられる標的mRNAレベルの少なくとも約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、最大で100％、減少する。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、インヒビター（例えば、iRNA）を対象に投与した結果、対象における標的mRNAレベルは、iRNAが存在しない対象にみられる標的mRNAレベルの少なくとも約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、最大で100％、減少する。
【０１２８】
二本鎖RNA分子（dsRNA）は、RNA干渉（RNAi）として知られている高度に保存された調節機構において遺伝子発現をブロックすることが示されている。本明細書において記載される阻害性核酸は、30ヌクレオチド長以下、すなわち15〜30ヌクレオチド長、一般的には19〜24ヌクレオチド長の領域を有するRNA鎖（アンチセンス鎖）を含み得、この領域は、標的mRNA転写物の少なくとも一部に対して実質的に相補的である。これらiRNAを使用することにより、mRNA転写物を標的分解し、その結果、標的の発現および／または活性を低下させることが可能となる。
【０１２９】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、iRNAはdsRNAであってよい。dsRNAは、dsRNAが使用される条件下でハイブリダイゼーションして二重鎖構造を形成するのに十分に相補的な2本のRNA鎖を含む。dsRNAの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に対して実質的に相補的であり、そして、一般的には完全に相補的である、相補性の領域を含む。標的配列は、標的の発現中に形成されるmRNAの配列に由来していてよく、例えば、1つまたは複数のイントロン境界にまたがっていてよい。他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に対して相補的な領域を含み、その結果、好適な条件下で組み合わされたときに2本の鎖がハイブリダイゼーションし、そして、二重鎖構造を形成する。一般的には、二重鎖構造は、15塩基対以上30塩基対以下の長さであり、より一般的には、18塩基対以上25塩基対以下の長さであり、更により一般的には、19塩基対以上24塩基対以下の長さであり、そして、最も一般的には、19塩基対以上21塩基対以下の長さである。同様に、標的配列に対して相補性の領域は、15塩基対以上30塩基対以下の長さであり、より一般的には、18塩基対以上25塩基対以下の長さであり、更により一般的には、19塩基対以上24塩基対以下の長さであり、そして、最も一般的には、19塩基対以上21塩基対以下の長さのヌクレオチド長である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、dsRNAは、15ヌクレオチド以上20ヌクレオチド以下の長さであり、そして、他の態様では、dsRNAは、25ヌクレオチド以上30ヌクレオチド以下の長さである。当業者であれば認識する通り、切断の標的とされるRNAの標的領域は、ほとんどの場合、より大きなRNA分子、多くの場合mRNA分子の一部である。関連する場合、mRNA標的の「一部」は、RNAi指向性（RNAi-directed）切断（すなわち、RISC経路を介した切断）の基質となるのに十分な長さのmRNA標的の連続配列である。わずか9塩基対の二重鎖を有するdsRNAは、幾つかの状況下ではRNAi指向性RNA切断を媒介することができる。ほとんどの場合、標的は、少なくとも15ヌクレオチド長、好ましくは15〜30ヌクレオチド長になる。
【０１３０】
阻害性核酸の種類の例示的な態様は、例えば、当技術分野において周知であるsiRNA、shRNA、miRNA、および/またはamiRNAを含み得る。
【０１３１】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、iRNA、例えばdsRNAのRNAは、安定性または他の有益な特徴を増強するために化学的に修飾される。本明細書において記載される核酸は、参照により本明細書に組み入れられる“Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されているもの等の当技術分野において十分に確立された方法によって合成および／または修飾され得る。修飾は、例えば、（a）末端修飾、例えば、5'末端修飾（リン酸化、共役、逆連結等）3'末端修飾（共役、DNAヌクレオチド、逆連結等）、（b）塩基修飾、例えば、安定化塩基、脱安定化塩基、またはパートナーのより多くのレパートリーと塩基対をなす塩基による置換、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、または共役塩基、（c）糖修飾（例えば、2'位または4'位での）または糖の置換、ならびに（d）ホスホジエステル連結の修飾または置換を含む骨格修飾を含む。本明細書において記載される態様において有用なRNA化合物の具体例は、修飾された骨格を含むかまたは天然のヌクレオシド間連結を含まないRNAを含むが、それに限定されるわけではない。修飾された骨格を有するRNAは、特に、骨格にリン原子を有しないものを含む。本明細書の目的のために、そして時に当技術分野において言及される通り、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない修飾RNAも、オリゴヌクレオシドであるとみなされ得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、修飾されたRNAは、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を有する。
【０１３２】
修飾されたRNA骨格は、例えば、ホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'-アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを含むメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、3'-アミノホスホラミダートおよびアミノアルキルホスホラミダートを含むホスホラミダート、チオノホスホラミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の3'-5'連結を有するボラノホスファート、これらの2'-5'連結類似体、およびヌクレオシド単位の隣接する対が3'-5'から5'-3'または2'-5'から5'-2'に連結されている逆極性を有するもの）を含み得る。また、様々な塩、混合塩、および遊離酸の形態も含まれる。その中にリン原子を含まない修飾されたRNA骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または1つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホンの骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルの骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルの骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノの骨格；スルホナートおよびスルホンアミドの骨格；アミド骨格；混合されたN、O、S、およびCH2構成要素部分を有する他のもの、およびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド、特に--CH2--NH--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--［メチレン（メチルイミノ）骨格またはMMI骨格として知られている］、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--、および--N(CH3)--CH2--CH2--［ネイティブホスホジエステル骨格は、--O--P--O--CH2--として表される］を有するものを含む。
【０１３３】
iRNAにおける使用に好適であるまたは企図される他のRNAミメティックでは、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間連結、すなわち骨格の両方が、新たな基で置換されている。適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために、塩基単位は維持される。このような1つのオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているRNAミメティックは、ペプチド核酸（PNA）と称される。PNA化合物では、RNAの糖骨格が、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換されている。核酸塩基は保持され、そして、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合している。
【０１３４】
iRNAのRNAはまた、1つまたは複数のロックド核酸（LNA）を含むように修飾されてもよい。ロックド核酸は、リボース部分が2'炭素と4'炭素とを接続する追加の橋を含む修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。この構造は、3'-エンド構造の高次構造におけるリボースを有効に「ロック」する。ロックド核酸をsiRNAに付加すると、血清中のsiRNAの安定性が増大し、そして、オフターゲット効果が減少することが示されている（Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447；Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843；Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193）。
【０１３５】
修飾されたRNAはまた、1つまたは複数の置換された糖部分を含み得る。本明細書において記載されるiRNA、例えばdsRNAは、2'位に以下のうちの1つを含み得る：OH；F；O-、S-、もしくはN-アルキル；O-、S-、もしくはN-アルケニル；O-、S-、もしくはN-アルキニル；またはO-アルキル-O-アルキル（式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換のC1〜C10アルキルまたはC2〜C10のアルケニルおよびアルキニルであってよい）。例示的な好適な修飾は、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2（式中、nおよびmは、1〜約10である）を含む。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、dsRNAは、2'位に以下のうちの1つを含む：C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、O−アルカリールまたはO−アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、iRNAの薬物動態特性を改善するための基、またはiRNAの薬力学的特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、修飾は、2'メトキシエトキシ（2'-O--CH2CH2OCH3、2'-O-(2-メトキシエチル）または2'-MOEとしても知られている）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504)、すなわち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書において以下の実施例に記載される2'-DMAOEとしても知られているO(CH2)2ON(CH3)2基、および2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野では、2'-O-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2'-DMAEOEとしても知られている）、すなわち、本明細書において以下の実施例にも記載される2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2である。
【０１３６】
他の修飾は、2'-メトキシ（2'-OCH3）、2'-アミノプロポキシ（2'-OCH2CH2CH2NH2）、および2'-フルオロ（2'-F）を含む。iRNAのRNAにおける他の位置、特に3'末端ヌクレオチドにおける糖の3'位、または2'-5'連結dsRNAにおいて、および5'末端ヌクレオチドの5'位でも同様の修飾を行うことができる。iRNAはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分等の糖ミメティックを有していてもよい。
【０１３７】
阻害性核酸はまた、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修飾または置換を含んでいてもよい。本明細書において使用するとき、「未修飾」または「天然」の核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（A）およびグアニン（G）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（T）、シトシン（C）、およびウラシル（U）を含む。修飾された核酸塩基は、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン、および2-チオシトシンン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシン、およびチミン、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルアナル（anal）他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-ダアザアデニン（daazaadenine）、ならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニン等の他の合成および天然の核酸塩基を含む。これら核酸塩基のうちの特定のものは、本発明において注目される阻害性核酸の結合親和性を高めるために特に有用である。これらは、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、ならびに2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、および5-プロピニルシトシンを含むN-2、N-6、およびO-6置換プリンを含む。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6〜1.2℃だけ増加させることが示されており（Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)、そして、更により具体的には2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせられたとき、例示的な塩基置換である。
【０１３８】
上記の修飾された核酸、骨格、および核酸塩基の調製は、当技術分野において周知である。
【０１３９】
本発明において注目される阻害性核酸の別の修飾は、iRNAの活性、細胞内分布、薬物動態特性、または細胞内取り込みを増強する1つまたは複数のリガンド、部分またはコンジュゲートに阻害性核酸を化学的に連結させることを伴う。このような部分は、脂質部分、例えば、コレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., Biorg. Med. Chem.Let., 1994, 4:1053-1060）、チオエーテル、例えば、ベリル-S-トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309；Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res. 1992, 20:533-538）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118；Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330；Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロールもしくはトリエチル-アンモニウム-1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-ホスホナート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654；Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937）を含むが、それに限定されるわけではない。
【０１４０】
幾つかの態様では、本明細書において記載されるバイオマーカー（複数可）、標的（複数可）、または遺伝子／ポリペプチドの発現は、組織特異的である。幾つかの態様では、本明細書において記載されるバイオマーカー（複数可）、標的（複数可）、または遺伝子／ポリペプチドの発現は、広範囲（global）である。幾つかの態様では、本明細書において記載されるバイオマーカー（複数可）、標的（複数可）、または遺伝子／ポリペプチドの発現は、全身である。
【０１４１】
「発現産物」は、遺伝子から転写されたRNA、および遺伝子から転写されたmRNAの翻訳によって得られるポリペプチドを含む。用語「遺伝子」とは、適切な調節配列に機能的に連結されたとき、インビトロまたはインビボにおいてRNAに転写される核酸配列（DNA）を意味する。遺伝子は、コードされている領域に先立つ領域および続く領域、例えば、5’非翻訳（5’UTR）または「リーダー」の配列、および3’UTRまたは「トレイラー」の配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。
【０１４２】
「機能的に連結される」とは、このように記載される構成要素がその通常の機能を発揮するように構成されている、エレメントの配置を指す。したがって、コード配列に機能的に連結された制御エレメントは、コード配列の発現に影響を与えることができる。制御エレメントは、その発現を導くように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。したがって、例えば、プロモータ配列とコード配列との間に介在する未翻訳であるが転写されている配列が存在していてもよく、そして、プロモータ配列はそれでもコード配列に「機能的に連結されている」とみなしてよい。
【０１４３】
本発明の状況における「マーカー」とは、対照対象（例えば、健常対象）から採取された同等のサンプルと比較して、EV関連疾患および／または石灰化／微小石灰化を有する対象から採取されたサンプル中に異なって存在する分子、構造、または発現産物、例えば、核酸またはポリペプチドを指す。用語「バイオマーカー」は、用語「マーカー」と互換的に使用される。
【０１４４】
幾つかの態様では、本明細書において記載される方法は、少なくとも1つのマーカーのレベルを測定、検出、または決定することに関する。本明細書において使用するとき、用語「検出」または「測定」とは、サンプル中のアナライトの存在を示すために、例えば、プローブ、標識、または標的分子からのシグナルを観察することを意味する。検出には、特定の標識部分を検出するための当技術分野において公知の任意の方法を用いることができる。例示的な検出方法は、分光学的、蛍光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な方法を含むが、それに限定されるわけではない。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、測定は、定量的観察であってよい。
【０１４５】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載されるポリペプチド、核酸、または細胞を操作することができる。本明細書において使用するとき、「操作された」とは、人の手によってマニピュレーションされている局面を指す。例えば、ポリペプチドの少なくとも1つの局面、例えば、その配列が、自然界に存在する局面とは異なるように人の手によってマニピュレーションされている場合、ポリペプチドは「操作された」とみなされる。一般的な慣行であり、そして、当業者によって理解されているように、実際のマニピュレーションは先代の実体に対して行われたにもかかわらず、操作された細胞の後代は、典型的には、依然として「操作された」と称される。
【０１４６】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される物質は、外因性である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される物質は、異所性である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される物質は、内因性ではない。
【０１４７】
用語「外因性」とは、そのネイティブの源以外の細胞内に存在する物質を指す。用語「外因性」は、本明細書において使用するとき、通常はみられず、そして、細胞または生物に核酸またはポリペプチドを導入することが望まれる、そのような細胞または生物等の生物系に人の手が関与するプロセスによって導入された核酸（例えば、ポリペプチドをコードしている核酸）またはポリペプチドを指し得る。あるいは、「外因性」は、比較的少量でみられ、そして、例えば異所性の発現またはレベルを生じさせるために、細胞または生物中の核酸またはポリペプチドの量を増加させることが望まれる、細胞または生物等の生物系に人の手が関与するプロセスによって導入された核酸またはポリペプチドを指す場合もある。対照的に、用語「内因性」とは、生物系または細胞にとってネイティブな物質を指す。本明細書において使用するとき、「異所性」とは、異常な場所および／または量でみられる物質を指す。異所性物質は、所与の細胞内に通常みられるが、はるかに少ない量および／または異なる時点でみられる物質であり得る。また、異所性は、その天然環境において所与の細胞内で天然にはみられず、発現もしないポリペプチドまたは核酸等の物質も含む。
【０１４８】
幾つかの態様では、本明細書において記載されるポリペプチドをコードしている核酸または本明細書において記載される阻害性核酸は、ベクターに含まれる。本明細書において記載される局面のうちの幾つかでは、本明細書において記載される所与のポリペプチドをコードしている核酸配列またはその任意のモジュールは、ベクターに機能的に連結されている。用語「ベクター」は、本明細書において使用するとき、宿主細胞への送達または異なる宿主細胞間の伝達のために設計された核酸コンストラクトを指す。本明細書において使用するとき、ベクターは、ウイルスであっても非ウイルスであってもよい。用語「ベクター」は、適当な制御エレメントと会合した場合に複製が可能であり、そして、遺伝子配列を細胞に伝達することができる任意の遺伝要素を包含する。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン等を含み得るが、それに限定されるわけではない。
【０１４９】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ベクターは組換え体であり、例えば、少なくとも2つの異なる源を起源とする配列を含む。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ベクターは、少なくとも2つの異なる種を起源とする配列を含む。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ベクターは、少なくとも2つの異なる遺伝子を起源とする配列を含み、例えば、少なくとも1つの非ネイティブ（例えば、異種）遺伝子制御エレメント（例えば、プロモータ、サプレッサ、アクチベータ、エンハンサ、応答エレメント等）に機能的に連結された発現産物をコードしている融合タンパク質または核酸を含む。
【０１５０】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載されるベクターまたは核酸はコドン最適化されており、例えば、核酸配列のネイティブ、すなわち野生型の配列は、変更または操作された核酸が、ネイティブ／野生型配列と同じポリペプチド発現産物をコードしているが、所望の発現系において改善された効率で転写および／または翻訳されるような代替コドンを含むように変更または操作されている。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、発現系は、ネイティブ／野生型配列の源以外の生物（またはそのような生物から得られる細胞）である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載されるベクターおよび／または核酸配列は、哺乳動物または哺乳動物細胞、例えば、マウス、マウス細胞、またはヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載されるベクターおよび／または核酸配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載されるベクターおよび／または核酸配列は、酵母または酵母細胞における発現のためにコドン最適化されている。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載されるベクターおよび／または核酸配列は、細菌細胞における発現のためにコドン最適化されている。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載されるベクターおよび／または核酸配列は、大腸菌（E. coli）細胞における発現のためにコドン最適化されている。
【０１５１】
本明細書において使用するとき、用語「発現ベクター」は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からRNAまたはポリペプチドを発現させるベクターを指す。発現した配列は、多くの場合、細胞に対して異種であるが、必ずしもそうではない。発現ベクターは、追加のエレメントを含んでいてもよく、例えば、発現ベクターは、2つの複製系を有していてもよく、それによって、2つの生物、例えば、発現についてはヒト細胞、そして、クローニングおよび増幅については原核生物宿主において維持することが可能になる。
【０１５２】
本明細書において使用するとき、用語「ウイルスベクター」は、ウイルス起源の少なくとも1つのエレメントを含み、そして、ウイルスベクター粒子にパッケージングされる能力を有する核酸ベクターコンストラクトを指す。ウイルスベクターは、非必須のウイルス遺伝子の代わりに、本明細書において記載されるポリペプチドをコードしている核酸を含有し得る。ベクターおよび／または粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて任意の核酸を細胞に伝達する目的のために利用することができる。数多くの形態のウイルスベクターが当技術分野において公知である。
【０１５３】
本明細書において記載されるベクターは、幾つかの態様では、他の好適な組成物および療法と組み合わせることができることが理解されるべきである。いくつかの態様では、ベクターは、エピソーマルである。好適なエピソーマルベクターの使用は、高コピー数の染色体外DNAにおいて、対象における関心対象のヌクレオチドを維持し、それによって、染色体への組み込みの潜在的な影響を排除する手段を提供する。
【０１５４】
本明細書において使用するとき、用語「処置する」、「処置」、「処置している」、または「回復」とは、疾患または障害、例えばEV関連疾患および／または石灰化／微小石灰化に関連する病態の進行または重篤度を逆行、軽減、回復、阻害、減速、または中止することを目的とする治療的処置を指す。用語「処置する」とは、EV関連疾患に関連する病態、疾患、または障害の少なくとも1つの有害作用または症状を低減または軽減することを含む。一般的には、1つまたは複数の症状または臨床マーカーが減少した場合、処置は「有効」である。あるいは、疾患の進行が低減または停止した場合、処置は「有効」である。すなわち、「処置」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置しなかった場合に予測されるものと比較した症状の進行または悪化の休止または少なくとも減速も含む。有益なまたは望ましい臨床結果は、検出可能であろうと検出不可能であろうと、1つもしくは複数の症状の軽減、疾患の程度の減弱、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延もしくは減速、疾患状態の回復もしくは待機、（部分または完全）寛解、および／または死亡率の低下を含むが、それに限定されるわけではない。疾患の「処置」という用語は、疾患の症状または副作用の緩和（待機的処置を含む）も含む。
【０１５５】
本明細書において使用するとき、用語「薬学的組成物」は、例えば製薬業界で一般的に使用される担体などの薬学的に許容される担体と組み合わせた活性薬剤を指す。語句「薬学的に許容される」は、本明細書において、正しい医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに好適であり、合理的なベネフィット／リスク比に見合う化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために使用される。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、薬学的に許容される担体は、水以外の担体であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、薬学的に許容される担体は、クリーム、エマルジョン、ゲル、リポソーム、ナノ粒子、および／または軟膏であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、薬学的に許容される担体は、人工的なまたは操作された担体、例えば、活性成分が自然に生じることはみられない担体であり得る。
【０１５６】
本明細書において使用するとき、用語「投与」とは、本明細書において開示される化合物を所望の部位に少なくとも部分的に送達する方法または経路により、その物質を対象に配置することを指す。本明細書において開示される化合物を含む薬学的組成物は、対象において有効な処置をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。幾つかの態様では、投与は、ヒトの身体活動、例えば、注射、摂取の行為、塗布の行為、および／または送達用の装置もしくは機械の操作を含む。そのような活動は、例えば、医療専門家および／または処置される対象によって実施され得る。
【０１５７】
本明細書において使用するとき、「接触」とは、少なくとも1つの細胞に作用物質を送達または曝露するための任意の適切な手段を指す。例示的な送達方法は、細胞培養培地への直接送達、灌流、注射、または当業者に周知の他の送達方法を含むが、それに限定されるわけではない。幾つかの態様では、接触は、ヒトの身体活動、例えば、注射；分注、混合、および／もしくはデカンテーションの行為；ならびに／または送達用の装置もしくは機械の操作を含む。
【０１５８】
用語「統計的に有意」または「有意に」とは、統計的有意性を指し、そして、一般的には、標準偏差2つ分（2SD）以上の差を意味する。
【０１５９】
動作例または他の指定がある場合以外に、本明細書において使用される成分の量または反応条件を表す数字は全て、全ての例において用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。百分率に関連して使用されるとき、用語「約」は、±1％を意味し得る。
【０１６０】
本明細書において使用するとき、用語「含む」は、提示される規定の要素に加えて、他の要素が存在していてもよいことを意味する。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
【０１６１】
用語「からなる」は、態様の説明に列挙されていないいかなる要素も除いた、本明細書において記載される組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素を指す。
【０１６２】
本明細書において使用するとき、用語「本質的にからなる」とは、所与の態様に必要な要素を指す。この用語は、本発明の態様の基本的および新規のまたは機能的な特徴（複数可）に実質的に影響を与えない追加の要素の存在を許容する。
【０１６３】
本明細書において使用するとき、用語「対応する」とは、第1のポリペプチドもしくは核酸における数え上げられた位置のアミノ酸もしくはヌクレオチド、または第2のポリペプチドもしくは核酸における数え上げられたアミノ酸もしくはヌクレオチドと等価なアミノ酸もしくはヌクレオチドを指す。等価な数え上げられたアミノ酸またはヌクレオチドは、当技術分野において公知の相同性プログラム、例えばBLASTを用いて候補配列をアラインメントすることによって決定することができる。
【０１６４】
本明細書において使用するとき、用語「特異的結合」は、第1の実体が、非標的である第3の実体に結合するよりも高い特異性および親和性で第2の標的実体に結合する、2つの分子、化合物、細胞、および／または粒子間の化学的相互作用を指す。幾つかの態様では、特異的結合は、第2の標的実体に対する第1の実体の親和性が、第3の非標的実体に対する親和性よりも少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、またはそれ以上高いことを指し得る。所与の標的に特異的な試薬とは、使用されるアッセイの条件下でその標的に対して特異的な結合を呈するものである。
【０１６５】
単数形の用語「a」、「an」、および「the」は、特に文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という語は、特に文脈が明確に指示していない限り、「および」を含むことを意図する。本明細書において記載されるものと類似または等価な方法および材料をこの開示の実施または試験において用いることができるが、好適な方法および材料については以下に記載する。略語「e.g.」は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書では非限定的な例を示すために使用される。したがって、略語「e.g.」は、「例えば」と同義である。
【０１６６】
本明細書において開示される本発明の別の要素または態様のグループ化は、限定として解釈されるものではない。各グループのメンバーは、個別に、または本明細書においてみられるグループの他のメンバーまたは他の要素との任意の組み合わせで参照され、そして、請求され得る。便宜上および／または特許性の理由から、グループの1つまたは複数のメンバーをグループに含めてもよく、グループから削除してもよい。いずれかのそのような包含または削除が行われた場合、本明細書では、このようにして添付の特許請求の範囲で使用される全てのマーカッシュグループの書面による説明を満たすように修正されたグループを明細書が含むものとみなされる。
【０１６７】
特に本明細書で定義しない限り、本願に関連して使用される科学用語および技術用語は、この開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書において記載される具体的な方法論、プロトコル、および試薬等に限定されるものではなく、したがって、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される専門用語は、具体的な実施態様を説明する目的のためだけのものであり、そして、特許請求の範囲によってのみ規定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 20th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2018 (ISBN 0911910190, 978-0911910421)；Robert S. Porter et al.(eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908)；およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006；Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), W. W. Norton & Company, 2016 (ISBN 0815345054, 978-0815345053)；Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014  (ISBN-1449659055)；Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)；Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385)、Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005；およびCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.)John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)に見出すことができ、これらの内容は全て全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６８】
当業者であれば、使用される化学療法剤を容易に特定することができる（例えば、Physicians' Cancer Chemotherapy Drug Manual 2014, Edward Chu, Vincent T. DeVita Jr., Jones & Bartlett Learning；Principles of Cancer Therapy, Chapter 85 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 18th edition；Therapeutic Targeting of Cancer Cells: Era of Molecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology, Chs. 28-29 in Abeloff’s Clinical Oncology, 2013 Elsevier；およびFischer D S (ed): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 2003を参照）。
【０１６９】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される開示は、ヒトをクローニングするためのプロセスにも、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性を改変するためのプロセスにも、工業的もしくは商業的目的のためのヒト胚の使用にも、ヒトもしくは動物にいかなる実質的な医学的利益ももたらすことなく動物を苦しめる可能性がある動物の遺伝的同一性を改変するためのプロセスおよびそのようなプロセスから得られる動物にも関係しない。
【０１７０】
他の用語は、本発明の様々な局面の説明の中で本明細書において定義される。
【０１７１】
本願全体を通して引用される、参照文献、交付済み特許、公開済み特許出願、および同時係属中の特許出願を含む全ての特許および他の刊行物は、例えば、本明細書において記載される技術に関連して使用される可能性のある、そのような刊行物に記載される方法論を説明および開示する目的のために、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。これら刊行物は、本願の出願日前の開示のみについて提供される。これに関するいかなるものも、本発明者らが先行発明によってまたは任意の他の理由からこのような開示に先行する権利が与えられるものではないことを認めると解釈されるべきではない。これら文書の日付に関する記述または内容に関する表示は全て、出願人が入手可能な情報に基づくものであり、そして、これら文書の日付または内容の正確性についていかなる承認も与えるものではない。
【０１７２】
本開示の態様の説明は、網羅的であることを意図するものでもなく、開示される正確な形態に本開示を限定することを意図するものでもない。本開示の具体的な態様および例は、例示目的で本明細書において記載されるが、関連する技術分野の当業者であれば認識するように、本開示の範囲内で様々な等価な改変が可能である。例えば、方法の工程または機能は所与の順序で提示されるが、別の態様は、異なる順序で機能を発揮してもよく、または実質的に同時に機能が発揮されてもよい。本明細書において提供される開示の教示は、適宜、他の手技または方法に適用することができる。本明細書において記載される様々な態様は、更なる態様を提供するために組み合わせることができる。本開示の更なる態様を提供するために、必要に応じて、上記の参照文献および出願の組成物、機能、および概念を採用するように、本開示の局面を改変することができる。更に、生物学的機能等価性を考慮して、生物学的または化学的な作用の種類にも量にも影響を与えることなく、タンパク質の構造に幾つかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして本開示に対してこれらおよび他の変更を行うことができる。全てのこのような変形例が、添付の特許の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【０１７３】
前述の態様のうちのいずれかの特定の要素は、他の態様の要素と組み合わせたり、該要素を置き換えたりすることができる。更に、本開示の特定の態様に関連する利点をこれら態様の文脈で説明してきたが、他の態様がそのような利点を呈してもよく、そして、全ての態様が、必ずしも本開示の範囲内に収まるようにそのような利点を呈する必要はない。
【０１７４】
本明細書において記載される技術は、以下の実施例によって更に例示されるが、これらは、いかなる方法においても、更なる限定であると解釈されるべきではない。
【０１７５】
本明細書において記載される技術の幾つかの態様は、以下の番号を付したパラグラフのいずれかに従って定義することができる。
1.  それを必要とする対象におけるアネキシンA1（ANXA1）のレベルまたは活性を低下させる物質を投与する工程を含む、対象における細胞外小胞（EV）関連疾患を処置する方法。
2.  EV関連疾患が、心臓弁膜症、血管疾患、関節リウマチ、神経変性疾患、自己免疫疾患、石灰沈着性大動脈弁疾患、糖尿病、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肺線維症、非アルコール性脂肪肝疾患、骨粗鬆症、アルツハイマー病、強皮症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、高コレステロール血症、がん、および肥満からなる群より選択される、パラグラフ1の方法。
3.  それを必要とする対象におけるアネキシンA1（ANXA1）のレベルまたは活性を低下させる物質を投与する工程を含む、対象における血管石灰化を減少させる方法。
4.  対象が、心臓弁膜症、血管疾患、関節リウマチ、神経変性疾患、自己免疫疾患、石灰沈着性大動脈弁疾患、糖尿病、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肺線維症、非アルコール性脂肪肝疾患、骨粗鬆症、アルツハイマー病、強皮症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、高コレステロール血症、がん、および肥満からなる群より選択される疾患を有する、パラグラフ3の方法。
5.  ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を細胞と接触させる工程を含む、細胞からの細胞外小胞（EV）の輸送を阻害または低減するための方法。
6.  細胞が、平滑筋細胞（SMC）、弁間質細胞（VIC）、乏突起神経膠腫細胞、内皮細胞、マクロファージ、単球、またはがん細胞である、パラグラフ5の方法。
7.  前記物質が、ANXA1のインヒビターである、パラグラフ1〜6のいずれかの方法。
8.  前記物質が、低分子、核酸、ポリペプチド、抗体試薬、またはゲノム編集システムである、パラグラフ1〜7のいずれかの方法。
9.  核酸が、阻害性核酸、サイレンシングRNA（siRNA）、マイクロRNA（miRNA）、またはショートヘアピンRNA（shRNA）である、パラグラフ8の方法。
10.  siRNA配列が、SEQ ID NO:1または2を含む、パラグラフ9の方法。
11.  抗体試薬が、抗ANXA1抗体試薬である、パラグラフ8の方法。
12.  抗体試薬が、ANXA1中和抗体試薬である、パラグラフ11の方法。
13.  ANXA1中和抗体試薬が、N末端ANXA1中和抗体試薬である、パラグラフ12の方法。
14.  低分子が、カルシウムキレーターである、パラグラフ8の方法。
15.  カルシウムキレーターが、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）である、パラグラフ14の方法。
16.  前記物質が、細胞外小胞へのANXA1ローディングを減少させる、パラグラフ１〜15のいずれかの方法。
17.  前記物質が、ダイナミン関連タンパク質1（DRP1）のインヒビターである、パラグラフ16の方法。
18.  前記物質が、mdivi-1であるかまたは阻害性核酸である、パラグラフ17の方法。
19.  前記物質が、ANXA1のN末端ドメインの切断を誘導する、パラグラフ1〜18のいずれかの方法。
20.  前記物質が、プロテイナーゼ3またはHLEのアゴニストである、パラグラフ19の方法。
21.  対象が、哺乳動物である、パラグラフ1〜20のいずれかの方法。
22.  対象が、ヒトである、パラグラフ21の方法。
23.  ANXA1のレベルまたは活性を低下させる物質を投与する前に、対象の微小石灰化のレベルが上昇していることを示すアッセイの結果を受け取る工程を更に含む、パラグラフ1〜22のいずれかの方法。
24.  対象のANXA1のレベルまたは活性が上昇していることを示すアッセイの結果を受け取る工程を更に含む、パラグラフ23の方法。
25.  アッセイが、細胞外小胞石灰化アッセイ；小胞結合アッセイ；小胞繋留アッセイ；組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNAP）アッセイ；免疫組織化学アッセイ；質量分析法；プロテオミクス；走査型電子顕微鏡観察；および透過型電子顕微鏡観察からなる群より選択される、パラグラフ23または24の方法。
26.  生体サンプルが、血液、血管組織、または心臓弁組織である、パラグラフ25の方法。
27.  対象における細胞外小胞（EV）関連疾患の処置に使用するための、アネキシンA1（ANXA1）のレベルまたは活性を低下させる1つまたは複数の物質。
28.  EV関連疾患が、心臓弁膜症、血管疾患、関節リウマチ、神経変性疾患、自己免疫疾患、石灰沈着性大動脈弁疾患、糖尿病、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肺線維症、非アルコール性脂肪肝疾患、骨粗鬆症、アルツハイマー病、強皮症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、高コレステロール血症、がん、および肥満からなる群より選択される、パラグラフ27の1つまたは複数の物質。
29.  対象における血管石灰化の減少に使用するための、アネキシンA1（ANXA1）のレベルまたは活性を低下させる1つまたは複数の物質。
30.  対象が、心臓弁膜症、血管疾患、関節リウマチ、神経変性疾患、自己免疫疾患、石灰沈着性大動脈弁疾患、糖尿病、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肺線維症、非アルコール性脂肪肝疾患、骨粗鬆症、アルツハイマー病、強皮症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、高コレステロール血症、がん、および肥満からなる群より選択される疾患を有する、パラグラフ29の1つまたは複数の物質。
31.  ANXA1のインヒビターである、パラグラフ27〜30のいずれかの1つまたは複数の物質。
32.  低分子、核酸、ポリペプチド、抗体試薬、またはゲノム編集システムである、パラグラフ27〜31のいずれかの1つまたは複数の物質。
33.  核酸が、阻害性核酸、サイレンシングRNA（siRNA）、マイクロRNA（miRNA）、またはショートヘアピンRNA（shRNA）である、パラグラフ32の1つまたは複数の物質。
34.  siRNA配列が、SEQ ID NO:1または2を含む、パラグラフ33の1つまたは複数の物質。
35.  抗体試薬が、抗ANXA1抗体試薬である、パラグラフ32の1つまたは複数の物質。
36.  抗体試薬が、ANXA1中和抗体試薬である、パラグラフ35の1つまたは複数の物質。
37.  ANXA1中和抗体試薬が、N末端ANXA1中和抗体試薬である、パラグラフ36の1つまたは複数の物質。
38.  低分子が、カルシウムキレーターである、パラグラフ32の1つまたは複数の物質。
39.  カルシウムキレーターが、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）である、パラグラフ38の1つまたは複数の物質。
40.  細胞外小胞へのANXA1ローディングを減少させる、パラグラフ27〜39のいずれかの1つまたは複数の物質。
41.  ダイナミン関連タンパク質1（DRP1）のインヒビターである、パラグラフ40の1つまたは複数の物質。
42.  mdivi-1であるかまたは阻害性核酸である、パラグラフ41の1つまたは複数の物質。
43.  ANXA1のN末端ドメインの切断を誘導する、パラグラフ27〜42のいずれかの1つまたは複数の物質。
44.  プロテイナーゼ3またはHLEのアゴニストである、パラグラフ43の1つまたは複数の物質。
45.  対象が、哺乳動物である、パラグラフ27〜44のいずれかの1つまたは複数の物質。
46.  対象が、ヒトである、パラグラフ45の1つまたは複数の物質。
47.  微小石灰化のレベルが上昇していると判定された対象に投与される、パラグラフ27〜46のいずれかの1つまたは複数の物質。
48.  ANXA1のレベルまたは活性が上昇していると判定された対象に投与される、パラグラフ27〜47のいずれかの1つまたは複数の物質。
49.  前記判定が、細胞外小胞石灰化アッセイ；小胞結合アッセイ；小胞繋留アッセイ；組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNAP）アッセイ；免疫組織化学アッセイ；質量分析法；プロテオミクス；走査型電子顕微鏡観察；および透過型電子顕微鏡観察からなる群より選択されるアッセイを用いて行われる、パラグラフ47または48の1つまたは複数の物質。
50.  前記レベルが、生体サンプル中のレベルである、パラグラフ47〜49のいずれかの1つまたは複数の物質。
51.  生体サンプルが、血液、血管組織、または心臓弁組織である、パラグラフ50の1つまたは複数の物質。
【実施例】
【０１７６】
実施例1−アネキシンA1の繋留により、ヒト細胞外小胞が凝集し、心血管の石灰化が促進される
心血管細胞は細胞外小胞（EV）を分泌するが、このEVは細胞外マトリックスにおいて凝集し、アテローム硬化性プラーク破裂および心臓弁不全に関連する微小石灰化を形成する。心血管疾患および他のヒト疾患においてEVがどのように凝集するのかは不明である。著者らは、EVが繋留タンパク質を含有しており、これが心血管の石灰化につながる細胞外マトリックスにおける小胞の凝集を促進するという仮説を立てた。凝集したEVが発生する機序を同定するために、定量プロテオミクスおよび経路解析を使用し、それを通してヒトの動脈および大動脈弁の組織および細胞においてアネキシンA1（ANXA1）がEVを繋留することが判明した。ヒトANXA1を小胞に添加した結果、カルシウムキレート化またはANXA1中和抗体によって阻害される、時間および濃度依存性の凝集が生じた（n＝3、P＜0.0001）。アネキシンおよび関連するカルシウム結合タンパク質のEVへのローディングの増加の媒介におけるカルシウムシグナル伝達の変化の役割を裏付けるものとして、ミトコンドリア分裂およびダイナミン関連タンパク質1のインヒビターであるmdivi-1で処理すると、骨形成分化に誘導されるANXA1のEVへのローディングが抑制された（n＝3、P＜0.05）。更に、ANXA1をノックダウンすると、ヒトの動脈（n＝3、P＜0.01）および大動脈弁細胞（n＝3、P＜0.05）の石灰化、ならびに3Dコラーゲンヒドロゲルで培養したヒトの動脈（n＝3、P＜0.001）および弁（n＝3、P＜0.05）に由来するEVの石灰化凝集体が減弱した。本研究により、異所性微小石灰化形成においてANXA1およびEV凝集が生物学的および化学的に標的とすることが可能であることが明らかになった。より広くは、これら知見は、タンパク質が媒介する繋留が細胞内輸送小胞を超えて広がるという概念実証を提供するものである。EVの繋留は細胞とは無関係に細胞外マトリックスで生じ、そして、EVの繋留はヒトの心血管疾患と関連していることが実証される。EVの繋留が重大な心血管の病理を促進するという知見は、自己免疫疾患および神経変性疾患およびがんを含む他のEV関連疾患にも拡大することができる。
【０１７７】
実施例2−アネキシンA1の繋留により、ヒト細胞外小胞が凝集し、心血管の石灰化が促進される
心血管細胞は細胞外小胞（EV）を分泌するが、このEVは細胞外マトリックスにおいて凝集し、アテローム硬化性プラーク破裂および心臓弁不全に関連する微小石灰化を形成する。心血管疾患および他のヒト疾患においてEVがどのように凝集するのかは不明である。本発明者らは、EVが繋留タンパク質を含有しており、これが心血管の石灰化につながる細胞外マトリックスにおける小胞の凝集を促進するという仮説を立てた。凝集したEVが発生する機序を同定するために、定量プロテオミクスおよび経路解析を使用し、それを通してヒトの動脈および大動脈弁の組織および細胞においてアネキシンA1（ANXA1）がEVを繋留することが判明した。ヒトANXA1を小胞に添加した結果、カルシウムキレート化またはANXA1中和抗体によって有意に阻害される、時間および濃度依存性の凝集が生じた。アネキシンおよび関連するカルシウム結合タンパク質のEVへのローディングの増加の媒介におけるカルシウムシグナル伝達の変化の役割を裏付けるものとして、ミトコンドリア分裂およびダイナミン関連タンパク質1のインヒビターであるmdivi-1で処理すると、骨形成分化に誘導されるANXA1のEVへのローディングが抑制された。更に、ANXA1をノックダウンすると、ヒトの動脈および大動脈弁細胞の石灰化、ならびに3Dコラーゲンヒドロゲルで培養したヒトの動脈および弁に由来するEVの石灰化凝集体が減弱した。本研究により、異所性微小石灰化形成においてANXA1およびEV凝集が生物学的および化学的に標的とすることが可能であることが明らかになった。より広くは、これら知見は、タンパク質が媒介する繋留が細胞内輸送小胞を超えて広がるという概念実証を提供するものである。EVの繋留は細胞とは無関係に細胞外マトリックスで生じ、そして、EVの繋留はヒトの心血管疾患と関連していることが実証される。EVの繋留が重大な心血管の病理を促進するという知見は、自己免疫疾患および神経変性疾患およびがんを含む他のEV関連疾患にも拡大される。
【０１７８】
タンパク質は、輸送小胞を細胞膜に繋留させ、細胞内および細胞表面における小胞の輸送を調節する。本明細書において、タンパク質が媒介する小胞の繋留が、細胞内輸送に限定されず、そして、細胞外小胞（EV）が互いに繋留している細胞とは無関係に細胞外マトリックスにおいて生じることが実証される。このプロセスは、繋留がEVの凝集を促進するときに重要な病態生理学的機能を有し、これが微小石灰化の形成を駆動する。次に、微小石灰化は、プラーク破裂および大動脈弁不全を引き起こす。現在、利用可能な抗石灰化薬物療法は存在しない。これら知見は、EVの繋留に関する研究の一分野を切り拓くものであり、そして、心血管疾患、ならびに自己免疫疾患および神経変性疾患およびがんを含む他のヒトEV関連疾患におけるEV凝集を標的とする治療戦略の開発への道を開く。
【０１７９】
序論
細胞の成長および維持、神経伝達、ならびに調節されたインスリン分泌に関する細胞内および細胞間の膜小胞輸送については、かなりの分子的理解が得られている（1、2、3、4、5）。しかし、細胞外小胞（EV）と呼ばれる細胞の外側の小胞の病態生理学的な役割は、それほど明らかになっていない。細胞内では、小胞は、小胞および細胞膜タンパク質が膜接触部位での繋留を媒介する輸送体として機能し（6、7）、小胞および膜の融合を駆動する（8）。EVの繋留が細胞とは無関係に細胞外マトリックスで生じるかどうか、そして、EVの繋留がヒトの疾患、特に石灰化の発症にどのように寄与しているかは不明である。
【０１８０】
EVは骨、軟骨、および象牙質のミネラル化の十分に確立されたメディエータであり、カルシウムおよびリン酸の代謝の調節を介して作用する（9）。平滑筋細胞（SMC）および弁間質細胞（VIC）に由来するEVは、血管（10、11）および弁（12）の石灰化核形成部位として機能するので、微小石灰化は動脈プラーク破裂（13）および心臓弁不全（14）に寄与することから、EVが微小石灰化を発生させる機序は臨床上の大きな関心事である。心血管細胞は、凝集しミネラル化を促進するEVを分泌する（10）が、どのようにEVが凝集して異所性石灰化を発生させるのかは不明である。マトリックスのミネラル化に関与している確立されたEV積荷は、リン酸代謝酵素である組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNAP）、ならびにヒドロキシアパタイト鉱物の形成に関与するカルシウム輸送体として作用するアネキシンA2、A5、およびA6を含む（11、15、16、17）。アネキシンA5（ANXA5）は、軟骨におけるコラーゲンII型およびX型へのEVの結合に関与している（18）が、ヒトANXA5は、脂質膜を凝集させない（19）。細胞外マトリックスにおけるEV同士の結合および凝集を誘導する機序は同定されていない。本明細書では、石灰化におけるアネキシンの役割に加えて、EVの繋留および凝集におけるアネキシンの新たな機能的役割を実証する。
【０１８１】
心血管疾患に加えて、EVおよび異所性石灰化は、自己免疫疾患および神経変性疾患およびがんに関連している。がんでは、乏突起神経膠腫患者の最大90％において頭蓋内石灰化が生じる（20）。乏突起神経膠腫細胞は、悪性浸潤に寄与し得る細胞外マトリックス分解タンパク質を含有するEVを放出する（21）。アルツハイマー病を含む神経変性疾患では、細胞外マトリックスの変化も生じる。血管石灰化は、認知症およびアルツハイマー病のリスクの増加に関連している（22）。EVの分泌を化学的に阻害すると、アルツハイマー病に関連するアミロイドプラークが減少するが、一方、マウスの脳内にEVを注入すると、アミロイドβ凝集およびプラーク形成が促進される（23）。自己免疫疾患では、全身性硬化症患者のおよそ40％に異所性石灰化が観察される（24）。ヒトの全身性硬化症の血小板に由来するEVは、マウスにおいて炎症、マトリックスの変化、および線維化を誘導する（25）。本発明者らは、EVが細胞外凝集を促進する繋留タンパク質を含有し、これが心血管疾患およびおそらく他のEV関連疾患において石灰化の病理を駆動するという仮説を立てた。
【０１８２】
結果
ヒト心血管組織SMCおよびVICは、凝集し石灰化するEVを放出した。
石灰化しているEVの細胞起源を明らかにするために、一般的な心血管病理の例として、石灰化したヒトの頸動脈および大動脈弁組織におけるEVを調べた。電子顕微鏡を用いて、石灰化した動脈におけるSMCおよび石灰化した弁組織におけるVICを起源とするEVを観察した（図1Aおよび1B）。EVが原形質膜由来（26）およびエクソソーム経路由来（27）であることと一致して、ヒトの動脈組織SMCおよび大動脈弁組織VICでは、細胞膜の出芽および多小胞体の放出の両方を起源とするEVが観察された（図1Aおよび1B）。石灰化したヒトの動脈および弁組織の両方において、細胞外マトリックスにおけるコラーゲン線維とだけでなく、互いにも結合しているEVを含む、細胞とは無関係の凝集したEVも観察された（図1Cおよび1D）。心血管微小石灰化のEV起源と一致して、凝集し石灰化するEVは、石灰化したヒトの動脈および弁組織のコラーゲン細胞外マトリックス内に局在していた（図2A）。密度依存性走査型電子顕微鏡を用いて、患部のヒトの動脈および弁組織において球状の石灰化凝集体が観察され、これは、心血管微小石灰化のEV起源を更に裏付ける（図2Bおよび2C）。まとめると、これら結果は、ヒト動脈におけるSMCおよびヒト大動脈弁組織におけるVICは、ナノメートルサイズのEVを放出し、それが互いに結合することによってコラーゲン細胞外マトリックスにおいて凝集し、次いで、ミネラル化して、更に大きな異所性微小石灰化を形成することを実証する。
【０１８３】
ヒト心血管EVタンパク質の組成は、骨形成条件下で変化した。
EVタンパク質の石灰化への機構的寄与について調べるために、ヒトの血管および弁のEV組成が石灰化条件下で変化するかどうかについて評価した。マクロファージ（16）を含む他の細胞型も石灰化プロセスに寄与し得るが、正常対照培地（NM）および石灰化骨形成培地（OM）で培養した細胞の両方から得られたSMCおよびVICに由来するEVに着目した。これを行うために、無標識定量プロテオミクスを使用して、石灰化促進OMにおけるヒトの血管および弁の細胞のEVタンパク質組成を評価した。NMと比較してOMにおけるヒト冠動脈SMCおよび大動脈VICに由来するEVの存在量またはサイズ（約50〜300nmの範囲）について、ナノ粒子追跡分析によって差は測定されなかった（図3A）。電子顕微鏡を使用して、プロテオミクス出発物質がSMCおよびVICの両方からのEVで構成されていることを更に視覚的に確認した（図3B）。検出された863個のタンパク質のうち、OMで培養したヒトSMCに由来するEVでは103個が増加し、9個が減少した（図3C）。検出された549個のタンパク質のうち、OMにおけるヒトVICに由来するEVでは53個が増加し、29個が減少した（図3C）。フロチリン-1を含むEVマーカーを同定することを通してサンプル中のEVのエンリッチメントについて、プロテオミクスで更に確認した。定量プロテオミクスデータは、骨形成条件下における初代ヒトSMCおよびVIC EVではタンパク質組成が変化することを実証した。
【０１８４】
ヒトのSMCおよびVICに由来するEVは、繋留タンパク質を含有していた。
次に、ヒトのSMCおよびVICから得られたEVが、EVおよび石灰化凝集体、例えばヒト心血管組織で観察されるものを生成することができる繋留タンパク質を有しているかどうかについて調べた。定量経路解析（28）を実施して、ヒトEVプロテオミクスデータセットから繋留タンパク質候補に優先順位を付けた。OMにおけるヒトのSMCおよびVICに由来するEVは、馴化NMにおけるEVと比較して幾つかの経路が多く含まれることを示した（データは示さない）。比較解析によって、ヒトのSMCおよびVICのEVは、OMにおいて多く含まれる共有経路を有していることが明らかになった（図4A）。アネキシンは、これら多く含まれる共有経路のうちの幾つかに関連している。アネキシンA1（ANXA1）は、EVデータセットにおいて、多く含まれる「平滑筋収縮」経路で同定された（図4A）。「小胞が媒介する輸送」経路は、OMにおけるSMCおよびVICのEVにおいて多く含まれていた（.4A）。この経路にアネキシンを関連付けると、ANXA1は細胞内エンドソーム輸送を媒介する（29）。細胞質カルシウム経路の上昇に対する応答は、OMにおけるSMCおよびVICに由来するEVの両方において多く含まれていた（図4A）。ミトコンドリアダイナミクスおよび細胞内カルシウムシグナル伝達は、心血管石灰化において変化する（30）。アネキシンは、細胞質カルシウムに応答して原形質膜に会合し（31）、そこからEVにロードされ得、このことは、OMにおけるアネキシンEV調節におけるカルシウムシグナル伝達の変化の役割を示唆している。まとめると、ヒトのSMCおよびVICに由来するEVは、EVの繋留を促進し得るANXA1を含むアネキシンタンパク質を含有していることが、プロテオミクスおよび経路解析から明らかになった。
【０１８５】
EVの凝集の媒介におけるアネキシンの役割を評価するために、石灰化条件下のヒトのSMCおよびVICに由来するEVにおけるアネキシンおよび関連する結合タンパク質の存在量を比較した。アネキシンA3、A4、およびA11は、SMCおよびVICの両方のEVで検出されたが、OMでは変化しなかった。ANXA1は、OMにおけるSMCのEVで増加し、そして、VICのEVで検出された（図4B）。アネキシンに加えて、比較プロテオミクス解析によって、OMにおけるSMCおよびVICの両方のEVで検出された529個のうち16個のアップレギュレーションされたタンパク質が明らかになり、これにはANXA1のカルシウム依存性結合パートナーであるS100カルシウム結合タンパク質A11（S100A11）が含まれる（図4B）。アネキシン活性の促進におけるS100A11の役割を裏付けるものとして、HeLa細胞における適当なANXA1が媒介するエンドソーム輸送にはS100A11-ANXA1の複合体化が必要である（29）。アネキシンA2（ANXA2）、アネキシンA5（ANXA5）、およびアネキシンA7（ANXA7）は、ヒトのSMCのEVにおいて増加し、そして、ANXA5およびアネキシンA6（ANXA6）は、OMにおけるヒトのVICのEVにおいて増加した（図4B）。S100A9は、ANXA6に結合する（32）。S100A9は、OMにおけるSMCのEVにおいて増加した（図4B）。S100A9／ANXA5／ホスファチジルセリン複合体は、マクロファージEV石灰化を調節する（16）。しかし、アネキシンまたは他のタンパク質がEVの繋留および凝集を媒介するかどうかは不明である。ANXA5は、コラーゲンに結合するが（18）、ヒトANXA5は、脂質膜を繋留しない（19）；それにもかかわらず、他の幾つかのアネキシンはインビトロで合成された膜を凝集させる（19）。ANXA2およびANXA6は、一つには、組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNAP）活性を調節することもできる（15）カルシウムチャネルとして作用することにより、血管（11、15）および弁（33）の小胞が媒介する石灰化に関連している。TNAPは、骨形成分化の重要なメディエータであり、OMでは心血管細胞のEVにロードされる（17）。比較プロテオミクスデータは、ANXA1、ANXA2、ANXA6、ANXA7、および関連するS100カルシウム結合タンパク質が、OMにおいてEV繋留およびTNAP活性を促進し得ることを示す。この研究により、EVにおけるS100カルシウムおよびアネキシン結合タンパク質の増加もアネキシンの繋留活性を誘導し得ることから、ANXA1含量の増加の有り無し両方で、アネキシンが媒介する繋留および小胞凝集が生じ得ることが示された。ANXA1は、本発明者らによる経路解析において注目されたものであり、これまで血管または弁の石灰化を調節することが立証されたことがないため、ANXA1の機構的役割をEV繋留、凝集、および微小石灰化形成において評価した。
【０１８６】
ANXA1は、石灰化したヒト心血管組織のEVに局在した。
エクスビボでANXA1を局在化させるために、石灰化していないおよび石灰化したヒトの頸動脈および大動脈弁組織に対して免疫染色を実施した。石灰化したヒトの頸動脈および大動脈弁組織は、免疫反応性ANXA1を含有していた（図5A）。ヒトの頸動脈および大動脈弁の細胞外マトリックスでは凝集した微小石灰化の近傍にANXA1が存在することを、近赤外カルシウムトレーサー（OsteoSense680）（34）およびコラーゲンプローブCNA35-OG488（35）を用いたANXA1免疫蛍光を用いて確認した（図5B）。石灰化したヒト心血管組織におけるANXA1が媒介するEV繋留を評価するために、免疫金電子顕微鏡を用いた。石灰化したヒトの頸動脈および大動脈弁組織の両方が、繋留されたEVにおいてANXA1が多く含まれることを示した（図5C、図10、図11）。ANXA1は、石灰化していないヒトの動脈および弁組織においても観察された（図12Aおよび12B）。石灰化していない弁組織と比べて石灰化したヒト弁組織においてS100A11、ANXA1、ANXA2、ANXA5、またはANXA6の総存在量に有意差を示さなかった（図13）、既に報告されている非標的プロテオミクスデータセット（28）を用いて、石灰化したヒト心臓血管組織と石灰化していないヒト心臓血管組織との間でアネキシンの総存在量が変化しないことが確認された。これと一致して、ANXA1、ANXA2、およびANXA6のmRNAレベルは、NMと比較してOMで培養されたSMCまたはVICにおいて有意には変化しなかった（図6A、図14A、14B）。これらデータは、骨形成条件下でのEVにおけるアネキシンおよび関連する結合パートナーのタンパク質存在量の増加は、転写の変化ではなく、カルシウム結合タンパク質の輸送の変化に起因している可能性が最も高いことを示した。
【０１８７】
ANXA1のノックダウンによって、ヒトのSMCおよびVICの石灰化が減弱した。
心血管細胞の石灰化におけるANXA1の役割を評価するために、骨形成分化を受けたヒト心血管細胞においてANXA1をノックダウンした。初代ヒトSMCおよびVICでは、他のアネキシンのmRNAレベルは変化することなく（図14A、14B）、ANXA1のmRNAレベルおよびANXA1のタンパク質が有意に減少した（図6A）。TNAP活性のアネキシンカルシウムチャネル制御（15）を裏付けるものとして、ANXA1のsiRNAは、ヒトのSMCおよびVICにおいてOMが誘導するTNAP活性化を抑制した（図6B）。更に、ANXA1のsiRNAは、EVのサイズも存在量も変化させることなく（図7A）、培養されたヒトのSMCおよびVICにおいて近赤外カルシウムトレーサーで可視化された、OMにおける微小石灰化形成を減弱させた（図6C）。まとめると、このデータは、ANXA1がOMにおけるヒトのSMCおよびVICの石灰化の調節因子であることを実証する。
【０１８８】
ANXA1は、カルシウム依存性のヒト心血管EV繋留タンパク質である。
EV繋留タンパク質としてのANXA1を実証するために、幾つかのインビトロ生化学的アプローチを使用した。まず、EVをエチレンジアミン四酢酸（EDTA）と共にインキュベーションしてカルシウムをキレート化し、そして、表面に結合しているANXA1を放出させることにより、ANXA1がSMCおよびVICに由来するEVの両方の表面に局在し、したがって、EVを繋留できることを確認した。ヒトのSMCおよびVICに由来するEVにEDTAを添加すると、EVからのANXA1放出が増加した（図7B）。
【０１８９】
次に、このデータは、EVにおけるアネキシンおよび関連するカルシウム結合タンパク質の増加の媒介において、転写が変化するのではなく、輸送が変化することを裏付けるものであったので、本発明者らは、ANXA1のEVへのローディングのカルシウム調節を評価した。低分子インヒビターであるmdivi-1またはダイナミン関連タンパク質1（DRP1）のsiRNAによりDRP1を阻害すると、SMCおよびVICの石灰化が抑制され、ミトコンドリアの断片化が減少し、そして、OMにおける細胞内カルシウム貯蔵が増加した（30）。したがって、原形質膜へのアネキシンの輸送は細胞質カルシウム結合によって媒介されるので（31）、ミトコンドリアのカルシウム貯蔵の調節がアネキシンのEVへのローディングに影響を与え得るかどうかを試験した。OMにおいて培養したヒトSMCを概念実証モデルとして使用し、OMが、NM条件と比較して、ミトコンドリア分裂タンパク質であるDRP1を増加させることを確認した（図7C）。ANXA1のsiRNAは、DRP1タンパク質の存在量を変化させず（図7C）、このことは、ANXA1がカルシウムシグナル伝達のDRP1調節の下流で作用するという仮説を裏付ける。ミトコンドリア分裂インヒビターであるmdivi-1の添加により、OMにおけるANXA1のEVへのローディングの増加が抑制された（図7D）。まとめると、これらデータは、心血管の骨形成分化中に生じるもの等のカルシウム貯蔵の変化が、EVにおけるカルシウム結合タンパク質の増加につながることを実証する。
【０１９０】
次に、ANXA1の小胞繋留活性を2つの異なる方法を用いることによって検証した。アネキシンは、石灰化しているEVの膜に多く含まれているリン脂質であるホスファチジルセリンと結合する（11、16）。まず、ポリビニルアルコールでコーティングされたカバーガラス上でホスファチジルセリンを膨潤させることにより、共焦点顕微鏡を用いて可視化することができる小胞を生成した。緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付きヒトANXA1を免疫精製して、これらの膨潤により生成された小胞と共にインキュベーションした（図15B）。GFPタグ付きANXA1をホスファチジルセリン小胞と共にインキュベーションすると、繋留された小胞膜接触部位にANXA1が多く含まれていることが明らかになった（図15A）。
【０１９１】
ヒト心血管細胞のEVは一般的に直径およそ150nmであることから（10）、次に、組換えヒトANXA1が直径およそ150nmのホスファチジルセリン小胞を繋留および凝集させ得ることを確認した。第2の繋留アッセイでは、フィルター押出によってホスファチジルセリン小胞を生成し、そして、ナノ粒子追跡分析によって直径がおよそ150nmであることを確認した（図15B）。押出によって生成された小胞にヒトANXA1タンパク質を添加すると、時間および濃度の両方に依存する小胞凝集が生じ、これは96ウェルプレートリーダーを用いて濁度を測定することによって評価された（図15B）。アネキシンはカルシウムと結合するので、アネキシン膜相互作用のカルシウム調節およびカルシウムによって変化したEV電荷が、アネキシンが媒介するEV繋留に影響を与える可能性がある。ANXA1を添加していない小胞バッファ中1mmol/Lのカルシウムの生理学的レベル（36）では、小胞凝集が誘導されなかった（図15B）。この結果は、カルシウムの生理的レベルに加えて、アネキシン等の因子が小胞の繋留および凝集に必要であることを立証する。ANXA1が媒介する小胞の繋留のカルシウム依存性を実証するものとして、カルシウムキレーターであるエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を添加すると、ANXA1が媒介する小胞凝集が減弱した（図8C）。ANXA1の特異性を実証するものとして、N末端ANXA1中和抗体を添加しても、小胞凝集が抑制された（図8D）。まとめると、これらデータは、ANXA1がカルシウム依存性のヒト心血管EV繋留タンパク質であることを実証する。
【０１９２】
ANXA1のノックダウンによって、3Dコラーゲンヒドロゲルにおけるヒト心血管EVによって生成される微小石灰化が減弱した。
最後に、ANXA1のノックダウンによって、ヒトEVが媒介する微小石灰化形成を抑制できるかどうかを試験した。ANXA1のsiRNAは、馴化培地に放出されたヒトのSMCおよびVICのEVの存在量も大きさも変化させなかった（図7A）ので、後に繋留し、凝集し、そして、微小石灰化を形成する、分泌されたEVの捕捉にコラーゲンが関与している可能性が高い。このように、ANXA1ノックダウン後のEVの凝集および石灰化能を評価するために、EV由来の微小石灰化の形成および成長を研究するために以前使用した無細胞3Dコラーゲンヒドロゲル中でEVをインキュベーションした（10）。OMにおいて培養したヒトのSMCおよびVICに由来する馴化培地中のEVは、3Dコラーゲンヒドロゲルにおいて微小石灰化を生成したが、これはANXA1のsiRNAによって減弱した（図9A）。更に、超解像顕微鏡を用いることによって、EV繋留が、凝集した微小石灰化を形成させることが実証された。ヒトのSMCおよびVICの両方に由来するOM馴化培地EVで、石灰化した小胞凝集体が観察された（図9B）。まとめると、これらデータは、ANXA1がヒト心血管EVからの繋留、凝集、および微小石灰化の形成を促進することを実証する。
【０１９３】
考察
以下の新たな知見が本明細書において記載される：1）小胞の繋留は、細胞内輸送には限定されず、細胞とは無関係に細胞外マトリックスでも生じる；2）ヒト心血管組織は、細胞外マトリックスにおいてEV凝集を促進するANXA1を含む繋留タンパク質を含有するEVを生成する；3）ミトコンドリア分裂を阻害すると、OMにおいてANXA1のEVへのローディングが抑制された；4）ANXA1繋留を化学的および生物学的に阻害すると、小胞凝集が抑制された；5）ANXA1を阻害すると、2D細胞培養においてSMCおよびVICの石灰化が抑制され、そして、3DコラーゲンヒドロゲルにおいてSMCおよびVICに由来するEVの石灰化が抑制された。他の組織に由来するEVにも適用可能な、本知見のためのワーキングモデルが本明細書に提供される（図16）：骨形成条件は、カルシウムの貯蔵およびシグナル伝達を変化させ（30）、これが、アネキシンカルシウムチャネルを介してTNAP活性化を誘導し（15）、そして、TNAPのEVへのローディングを促進した（17）。カルシウムシグナル伝達の変化によって、細胞膜へのアネキシン輸送が増加して、アネキシンおよびアネキシン相互作用タンパク質のEVへの取り込みを引き起こした。EVは、コラーゲン細胞外マトリックスに捕捉される（10）。EVにおけるカルシウム結合タンパク質およびアネキシン相互作用タンパク質の増加が、EVアネキシン繋留を更に誘導する。コラーゲン細胞外マトリックスに捕捉されたEVは、ANXA1によって繋留され、これは、EVのミネラル化ならびに微小石灰化の形成および成長につながるEVの凝集を促進する。
【０１９４】
凝集体がどのようにして形成されるかを理解することは、物理科学から生物科学にまたがる基礎的な研究分野である。生物科学では、ナノメートルサイズのEVの凝集によって、本発明者らが患部のヒトの動脈および弁組織で観察したマイクロメートルサイズの球状異所性石灰化の起源が説明される。石灰化しているEVにおける繋留タンパク質を同定することにより、本発明者らは、石灰化を促進するEVの凝集がどのようにして生じるのかという機構的説明を提供する。タンパク質に駆動される繋留に加えて、EVの荷電状態を含む物理的変化が凝集において役割を果たしている可能性がある。EVは一般的に負に帯電しており、高度に負に帯電したEVは凝集を抑制する（37）。石灰化している心血管EVは、負の電荷を有するホスファチジルセリンが多く含まれることを示す（11、16）。生理学的なEV繋留におけるANXA1の役割を実証するものとして、ヒト血中の遊離イオン化カルシウムの生理学的濃度である1mmol/Lのカルシウムでは、ANXA1を添加していない場合、ホスファチジルセリン小胞の凝集が観察されなかった（36）。アネキシンおよび関連するS100カルシウム結合タンパク質は、超生理学的量の正に帯電したカルシウムイオンに結合して取り込むことにより、EVの負電荷を低下させて、EVの凝集能を増大させるように更に作用し得る。DRP1の阻害によって、SMCおよびVICの石灰化が減弱し、ミトコンドリアの断片化が抑制され、そして、OMにおける細胞内カルシウム貯蔵が増加した（30）。本研究は、DRP1および細胞カルシウムシグナル伝達がOMにおいてANXA1の輸送を調節していることを実証することによって、これらの結果について追加の機構的説明を提供する。ANXA1、ANXA2、ANXA5、ANXA6、およびANXA7は、遍在的に発現する（38）。アネキシンは、石灰化している心血管細胞に由来するEVにおいて増加することが示されているが（11、15、16、33）、EVにおいてアネキシン存在量をこのように誘導する因子を定義する機構的説明はなされていない。石灰化している心血管細胞においてアネキシン転写がアップレギュレーションされていない場合に、どのようにアネキシンおよび関連するカルシウム結合タンパク質がEVにおいて増加し、そして、疾患病理を駆動するかが、輸送の変化によって説明されることを本明細書において実証する。
【０１９５】
関連する関心対象として、マトリックス分解酵素がEVで検出され、そして、アミロイドβがヒトSMCに由来するEVで検出された。したがって、繋留されたEVは、アミロイドβの凝集およびアミロイドβプラークの形成を加速させる初期病理段階として、アルツハイマー病に関連するアミロイド播種に関与している可能性がある。
【０１９６】
アネキシン、すなわちANXA1の機能的役割が、かつて考えられていたよりも複雑であることを本明細書において実証する。本研究では、石灰化におけるアネキシンの十分に確立されている役割に、EVの繋留および凝集に関与するこれまで記載されていなかったANXA1の機能的役割を加える。本発明者らによる本研究よりも前には、細胞とは無関係なEVの繋留および凝集の促進におけるアネキシンまたは任意の他のタンパク質の役割、ならびに心血管石灰化の媒介におけるANXA1の役割は実証されていなかった。この凝集プロセスが生じる機序を理解することが、早期抗石灰化療法の開発につながる可能性がある。追加のタンパク質が細胞とは無関係にEVを凝集させるかどうかは不明である。テザリン（BST2とも呼ばれる）タンパク質は、液胞の酸性化およびオートファジーのインヒビターであるバフィロマイシンで処理されたHeLa細胞において、多小胞体を原形質膜に繋留させることができる（47）。オートファジーの阻害は、高リン酸塩が誘導するSMC石灰化においてEV放出を増加させることができる（48）。カルシウムストレスの増加に応答してEV放出が増加すると、石灰化が促進される（27）。本実験条件では、OMにおいてSMCおよびVICのEVは増加しなかったが、これは、骨形成分化が媒介する石灰化の駆動においてEVの量ではなくEVの積荷が変化することを裏付ける。OMにおけるSMCおよびVICに由来するEVでは、テザリンタンパク質の存在量の変化は検出されなかった。
【０１９７】
アネキシンは、アテローム性動脈硬化症マウスで実証されたANXA1炎症の消散（49）およびミクログリアのアミロイドβ貪食の誘導（46）を含む有益な機能を有するので、繋留阻害の橋渡し（translation）は些細なことではない。N末端ANXA1抗体で処理すると、ANXA1が媒介する小胞の繋留を抑制できることが見出された。また、ANXA1のN末端は、高コレステロール血症マウスにおけるANXA1の抗動脈硬化作用も媒介する（49）。炎症消散特性を促進すると同時に、EV凝集を阻害するためにANXA1切断を標的とすることにより、心血管疾患において追加の効果を付与することができる。ANXA1のN末端シグナルペプチドの切断および放出を増加させることは、これを達成するための方法の1つである。
【０１９８】
方法
ヒト組織
動脈内膜切除に由来するヒトアテローム硬化性頸動脈標本（Brigham and Women's Hospital Institutional Review Board protocol #1999P001348）、および剖検動脈試料は、Brigham and Women's Hospital（Institutional Review Board protocol #2013P002517/BWH）から入手した。ヒト大動脈弁組織は、弁置換を受けた患者から入手した（Institutional Review Board protocol #2011P001703）。この研究で使用したヒト組織については、書面によるインフォームドコンセントを得た。サンプルは、手術室から氷上で速やかに移送し、そして、外科的摘出から30分間以内に更に加工した。サンプルは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色により石灰化組織または非石灰化組織として目視評価した。近赤外ベースのビスホスホナートカルシウムトレーサーであるOsteoSense680（Perkin Elmer, Waltham, MA；1：100）と共に切片を室温で1時間インキュベーションすることにより、石灰化したサンプルを更に検証した。
【０１９９】
透過型電子顕微鏡観察
透過型電子顕微鏡観察は、JEOL（商標）1011電子顕微鏡を使用して、Membrane Biology Electron Microscopy CoreにおけるMassachusetts General Hospital Programで実施した。形態分析については、新鮮な単離されたヒト組織を外科的に切除した直後に採取し、そして、0.1Mカコジル酸ナトリウムバッファ中2％グルタルアルデヒドで固定した。組織を室温で24時間固定した。固定剤をデカンテーションし、組織を0.1Mカコジル酸ナトリウムバッファで3回すすいだ。免疫金電子顕微鏡観察については、0.1Mカコジル酸ナトリウムバッファ中0.2％グルタルアルデヒドを含む4.0％パラホルムアルデヒド中において組織を室温で24時間固定し、次いで、アネキシンA1（ANXA1）抗体（Abcam, Cambridge, MA, # ab214486）と共にインキュベーションした。EV分析については、馴化細胞培養培地を回収し、そして、1,500rpmで5分間遠心分離して細胞片を除去した。上清を回収し、そして、4℃で40分間、100,000gで超遠心分離（Optima MAX-XP（商標）、Beckman Coulter, Brae, CA）（TLA 120.2ロータ、Beckman Coulter）することにより、EVをペレット化した。EVペレットを0.1Mカコジル酸ナトリウムバッファ中2％グルタルアルデヒドで2時間固定し、0.1Mカコジル酸ナトリウムバッファで洗浄し、そして、ヒト組織と同様に加工した。
【０２００】
密度依存性走査型電子顕微鏡観察
密度依存性走査型電子顕微鏡観察は、既に記載されている通り（10）、University College Londonで実施した。簡潔に述べると、スライドガラス上のヒトの頸動脈または大動脈弁の切片を、カーボンテープを用いてアルミニウム製のサンプルホルダーに固定し、そして、各サンプルのすぐ周囲の領域に銀色ペイントを塗布した。次いで、サンプルを5nmカーボン（Quorum Technologies Turbo-Pumped Thermal Evaporators model K975X, Lewes, United Kingdom）でコーティングした。コーティング後、10kVで動作し、二次電子を記録するインレンズ検出器および後方散乱電子検出器の両方を備える走査型電子顕微鏡（SEM Zeiss VP）で、サンプルを撮像した。インレンズモードで領域を撮像し、その後、後方散乱モードで同じ領域を撮像することによって、画像を得た。積層画像においてAdobe Photoshop（商標）CC 2018を使用し、そして、インレンズ画像を緑色チャネルに割り当て、一方、後方散乱画像を赤色チャネルに割り当てた。
【０２０１】
初代細胞の培養
初代ヒト冠動脈SMCをPromocell（Heidelberg, Germany）から得て、上皮成長因子（0.5ng/mL）、インスリン（5μg/mL）塩基性線維芽細胞成長因子-B（2ng/mL）、および5％ウシ胎児血清を補充したSMC Growth Medium 2（Promocell）中で増殖させた。初代ヒトVICは、コラゲナーゼ消化を用いてヒト大動脈弁組織から得た（28、30）。組織由来のSMCは、FACSによりα平滑筋アクチン陽性であることが確認された（30）。組織由来のVICは、免疫組織化学的検査によりビメンチン陽性であることが確認された（28）。細胞を37℃（5％CO2、湿度90％）で培養し、継代数1〜5の間に使用した。完全にコンフルエントな対照SMCまたはVICを、10％FBSおよび1％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充した4.5g/LグルコースおよびL-グルタミンを含有するDMEM（Lonza、Walkersville、MD）において合計14〜21日間培養した（対照条件：通常培地と呼ばれる、NM）。以下を加えたNMであるOM中で14〜21日間培養した完全にコンフルエントな細胞において、SMCおよびVICの骨形成分化を誘導した：10nmol/Lデキサメタゾン、10mmol/L β−グリセリンリン酸、および100μmol/L L−アスコルビン酸2-リン酸（骨形成培地と呼ばれる、OM）。培地は3日間ごとに交換した。mdivi-1アッセイについては、本発明者らが以前に報告したものと同様の方法で細胞を処理した（30）。簡潔に述べると、ジメチルソウルホキシドビヒクル（dimethyl soulfoxide vehicle）（最終ビヒクル濃度0.01％）またはビヒクル対照（0.01％）中のmdivi-1（Sigma；50mol/L）を各培地交換中に細胞培養培地に添加し、細胞を14日間培養した。培養培地を細胞に添加する前に、mdivi-1を、この化合物が完全に可溶化するまで最大2分間激しくボルテックスし37℃で加熱する工程を繰り返すことにより、培養培地に可溶化させた。製造業者のプロトコルに従って全細胞溶解物およびTNAP酵素活性アッセイ（BioVision, Inc., Milpitas, CA）を用いて、14日間培養後に、組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNAP）活性を分析した。近赤外ベースのビスホスホナートカルシウムトレーサーであるOsteoSense680（1：100）と共に37℃（5％CO2、湿度90％）で24時間培養ウェルをインキュベーションすることにより、21日間培養後の細胞における石灰化を分析した。次いで、室温で15分間、4％パラホルムアルデヒド中で細胞を固定した。細胞数分析のための核染色は、製造業者のプロトコルに従って、DAPI（Fisher Scientific）を用いて行った。20nmol/L silencer select validated ANXA1 siRNA（Fisher Scientific, #4390824 assay ID s1382）または陰性対照であるsilencer select siRNA（Fisher Scientific #4390843）を用いることによってRNAのノックダウンを行い、そして、製造業者のプロトコルに従ってLipofectamine RNAi MAX（Fisher Scientific）を用いてトランスフェクションを行った。siRNAは実験開始時に添加し、サンプル採取まで3日間ごとに各培地を交換した。
【０２０２】
質量分析
培養液中で14日間細胞を処理した後に、馴化細胞培養培地を回収し、1,500rpmで5分間遠心分離して細胞片を除去した。上清を回収し、そして、4℃で40分間、100,000gで超遠心分離（Optima MAX-XP（商標）、Beckman Coulter, Brae, CA）（TLA 120.2ロータ、Beckman Coulter）することにより、EVをペレット化した。製造業者のプロトコル（PreOmics GmbH, Planegg/Martinsried, Germany）に従って、後続のタンパク質分解工程のために、PreOmics iST（商標）キットのLYSEバッファ10μLにペレットを懸濁させた。EASY-Spray（商標）Source（45℃で加熱）が前面に取り付けられかつEasy-nLC1000（商標）HPLCポンプ（Thermo Fisher Scientific）に接続されたOrbitrap（商標）Fusion Lumos質量分析計で、ペプチドサンプルを分析した。Acclaim PepMap RSLC C18トラップ分析カラム、75μm×20mm（プレカラム）およびEASY-Spray（商標）LCカラム、75μm×250mm（Thermo Fisher Scientific）の二重カラムセットアップにペプチドを供した。75分間5→21％溶媒B（アセトニトリル／0.1％ギ酸）、10分間21→30％溶媒B、続いて、10分間95％溶媒Bの分析勾配を300nL/分で実行した。溶媒Aは、水／0.1％ギ酸であった。アセトニトリルおよび水は、LC-MSグレードであった。Orbitrap分析機を120Kの分解能に設定し、そして、375〜1500m/zの走査範囲（60秒間の動的排除を有効にした）内の3秒のサイクルタイムにおけるトップNプリカーサーイオンを、衝突誘起解離（CID；衝突エネルギー、30％；単離域、1.6m/z；AGCターゲット、1.0e4）に供した。イオントラップアナライザーを、ペプチドシーケンシング（MS/MS）のための高速走査速度に設定した。Proteome Discoverer Package（バージョン2.2、Thermo Scientific）を介して、SEQUEST-HT探索アルゴリズムを使用して、ヒトUniProtデータベース（2014年8月01日にダウンロード）およびウシUniProtデータベース（2014年8月01日にダウンロード）に対してMS/MSデータを同時に検索した。VICおよびSMCのEVデータを別々に探索した。培養培地中の培地ウシ血清に由来するウシペプチドは、最終的な細胞外小胞タンパク質分析において除外した。10ppmのプレカーサー許容誤差域および0.6Daの断片許容誤差域を使用して、最大4つの誤切断を許容するソフトウェアにおいて、トリプシンを消化酵素として設定した。メチオニンの酸化を可変修飾として設定し、システインのカルバミドメチル化を固定修飾として設定した。Proteome Discovererによって提供されているPercolator（商標）を用いてペプチドの偽発見率を計算し、そして、1.0％の偽発見率に基づいてペプチドをフィルタリングした。所与のタンパク質群（マスタータンパク質）に割り当てられた、いかなる他のタンパク質群にも存在しないペプチドを、固有とみなして定量に使用した。各データセットにつき最低2つの固有のペプチドが含まれていた。MS1では検出されたが、サンプルごとにシークエンスが行われていないペプチド前駆体を定量するために、「Feature Mapper」ノードを有効にした。最大保持時間シフト10分および質量許容誤差10ppmでクロマトグラフィーアライメントを行った。特徴の関連付けおよびマッピングの設定は、保持時間の許容誤差が最低0分、質量の許容誤差が10ppm、そして、信号対雑音が最低5であった。前駆体ペプチドの存在量は、そのクロマトグラフィー強度に基づいており、そして、正規化には総ペプチド量を使用した。本発明者らにより既に報告されている非標的プロテオミクスデ���タセット（28）を用いて、アネキシンおよびS100A11について石灰化されたおよび石灰化されていないヒト弁組織プロテオミクスの評価を実施した。
【０２０３】
ネットワーク分析
生物学的経路における過剰出現についてプロテオミクスデータセットから得られた統計的に有意なタンパク質を超幾何分布検定によって検定することにより、経路エンリッチメント解析を行った。得られたP値を、偽発見率を制御してq値を得るためのベンジャミーニおよびホッホベルク法を用いて多重比較のために調整した。有意に多く含まれる経路（q値<0.05）のネットワーク表示では、ノードは経路を、そして、ノード間の接続（エッジ）は経路間で共有されているタンパク質を表す。ノードのサイズは、-log(q値)の単位で測定されたエンリッチメントの有意性に比例するようにした。エッジの太さは、以下の通り定義されるジャッカード指数の単位で、2つの接続された経路間で重複しているタンパク質の数に比例するようにした。
2021533163.tif 000008
（式中、SAおよびSBは、それぞれ経路Aおよび経路Bに属するプロテオミクスで検出されたタンパク質のセットである）。ジャッカード指数＜0.1のエッジは、明確にするために、可視化の際に破棄した。経路エンリッチメント解析については、KEGG、Biocarta、およびReactomeからの標準経路を考慮した。
【０２０４】
免疫組織化学的検査および免疫蛍光
組織から厚さ7μmの切片を切り出し、凍結切片をアセトン中で固定した。ドナーごとに2枚の切片を分析した。4％血清中でブロッキングした後、切片をANXA1抗体（Abcam #ab214486；1：4000）と共にインキュベーションした。免疫組織化学的検査については：次いで、切片をビオチン標識二次抗体（Vector Laboratories, Burlingame, CA）と共にインキュベーションし、続いて、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（KPL, Gaithersburg, MD）と共にインキュベーションし、そして、AEC溶液（Dako, Lexington, MA）中でインキュベーションした。免疫蛍光については：切片を、近赤外ベースのビスホスホナートカルシウムトレーサーであるOsteoSense680（商標）（1：100）と共に室温で1時間、そして、コラーゲンプローブであるCNA35-OG488（1：50）と共に室温で1時間インキュベーションした後、固定した。ANXA1抗体で処理したスライドを、Alexa Fluor 594標識二次抗体（Life Technologies, Carlsbad, CA；1：200）と共にインキュベーションした。共焦点顕微鏡A1（Nikon Instruments Inc. Melville, NY）を用いて免疫蛍光スライドを検査し、そして、全ての画像をElements 3.20ソフトウェア（Nikon Instruments Inc.）で加工した。
【０２０５】
アネキシン小胞結合
幾つかの変更を加えた、既に記載されているプロトコル（50）を使用して、巨大な単層小胞を生成した。簡潔に述べると、共焦点ベースのANXA1小胞結合アッセイのために、直径12mmの丸型カバーガラスを、水中5％ポリビニルアルコール（Millipore, Burlington, MA）でコーティングし、一晩乾燥させた。次いで、0.1％ DiR'；DiIC18(7) 1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物（Fisher Scientific）を含有するクロロホルム中10mg/mLホスファチジルセリン（Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL）20μLで、乾燥したスライドをコーティングし、真空下で乾燥させた。トリスバッファ（pH6）1mLを添加して、24ウェルプレートにおいて、コーティングされた丸型カバーガラスを被覆し、室温で1時間膨潤させることによって巨大な単層小胞を形成させた。スライドの直下にあるプレートを静かにタッピングすることによって、小胞をカバーガラスから剥離させた。HEK-293細胞（ATCC, Manassas, VA）をヒトANXA1-GFPプラスミド（OriGene, Rockville, MD, #RG201569）でトランスフェクションすることによって、ANXA1タグ付き緑色蛍光タンパク質（ANXA1-GFP）を得た。トランスフェクションされたHEK-293細胞をPierce IP溶解バッファ（Fisher Scientific）に溶解させ、そして、全タンパク質溶解物3mgをANXA1抗体（Abcam #ab214486）10μLおよびDynabead protein A（Thermo Fisher）50μLと共に4℃で一晩回転下でインキュベーションした。Dynabeadを溶解バッファで3回洗浄し、次いで、0.2mmol/Lグリシンを添加することによってANXA1-GFPを溶出させた。溶出したタンパク質をトリスバッファ（pH8）で希釈し、そして、使用するまで−80℃で保存した。小胞100μLをANXA1-GFP2μgおよび1mmol/L CaCl2（Sigma）と共に5分間インキュベーションし、次いで、Nikon共焦点顕微鏡で撮像した。ANXA1-GFPを添加していないサンプルではGFPシグナルが検出されないように、GFPレーザーの設定を調整した。
【０２０６】
小胞繋留アッセイ
96ウェルプレートリーダーフォーマットに調整するための変更を加えた、既に報告されているプロトコル（19）を使用することによって、小胞の繋留を評価した。フィルター押し出しにより、直径100nm程度の大きな単層小胞を生成した。簡潔に述べると、ホスファチジルセリン（Avanti Polar Lipids）2.5mgを、以下を含有するバッファ1mLに可溶化させた：10mmol/L Hepes（Sigma, St. Louis, MO）、100mmol/L NaCl（Sigma）、100μmol/Lエチレンジアミン四酢酸（Boston BioProducts, Ashland, MA）、pH6。0.1μmのポリカーボネート膜（Avanti Polar Lipids）を備える押出機に脂質混合物を10回通し、その間に脂質混合物は、外観が濁った状態から透明になった。正確なサイズおよび存在量について小胞を評価した後、NanoSightナノ粒子追跡分析によって使用した。組換えヒトANXA1（R&D Systems, Minneapolis, MN）50μgを、アッセイを実行したのと同じ日に作製したバッファ500μLに再懸濁させた：300mmol/Lスクロース（Sigma）、40mmol/L L−ヒスチジン一塩酸塩（Sigma）、1mmol/L CaCl2（Sigma）、0.5mmol/L MgCl2（Sigma）、pH6。96ウェルにおいて、0μg（「小胞のみ」と称される）から最大5μgの組換えANXA1を添加し（特に記載がない限り、1μgをアッセイに使用した）、そして、ANXA1タンパク質を再懸濁させるために使用したのと同じバッファを使用して体積を73μLにした。押出によって生成された小胞27μLを各ウェルに添加し、そして、SpectraMax M5 96ウェルプレートリーダー（Molecular Devices, San Jose, CA）において波長350で小胞の凝集を測定した。カルシウムキレート化については、0.48mmol/Lエチレンジアミン四酢酸をヒトANXA1タンパク質1μgと共に室温で5分間インキュベーションした後、押出によって生成された小胞を添加し、その後、20分間反応させ、次いで、プレートリーダーにおいて凝集を判定した。ANXA1中和抗体の評価については、ヒトANXA1のN末端アミノ酸1〜50領域に対応する合成ペプチド
2021533163.tif 000009
に対して設計されたN末端ANXA1抗体（Abcam、#ab33061）0.01〜1μgを、ヒトANXA1タンパク質1μgと共に5分間インキュベーションした後、押出によって生成された小胞を添加した。
【０２０７】
NanoSightナノ粒子追跡分析
NanoSight（商標）LM10（Malvern Instruments, Malvern, United Kingdom）ナノ粒子追跡分析によって、小胞の直径および粒子の存在量を求めた。各サンプルの平均および標準偏差を計算するために5回の実験を用いた。
【０２０８】
細胞外小胞石灰化アッセイ
3Dコラーゲンヒドロゲルを、既に記載されている通り鋳造した（10）。pH7〜8のラット尾コラーゲンI型（Corning, Corning, NY）を使用したが、その理由は、このpH範囲においてコラーゲンがヒドロゲルネットワークを形成するためである。コラーゲン溶液150μLを、チャンバカバーガラスのウェル（Fisher Scientific, LAB-TEK, #1.5ホウケイ酸塩）に添加し、そして、細胞培養インキュベーターで2時間固化させた。14日目のSMCまたはVIC馴化培地中のEV150μLをコラーゲンヒドロゲルに添加し、そして、37℃でインキュベーションし、合計21日間にわたって3日ごとに新たな14日目のEV馴化培地に交換した。撮像の前日に、OsteoSense680（Perkin Elmer；1：100）をコラーゲンヒドロゲルに添加し、そして、37℃で一晩インキュベーションした。撮像当日に、CNA35-OG488コラーゲンプローブ（1：400）を添加し、そして、37℃で1時間インキュベーションし、続いて、リン酸緩衝生理食塩水でゲルを洗浄した。
【０２０９】
石灰化の定量
共焦点顕微鏡A1（Nikon Instruments Inc.）において共焦点顕微鏡観察することによってEV凝集が媒介する石灰化を撮像し、そして、全ての画像をElements 3.20ソフトウェア（Nikon Instruments Inc.）で加工した。コラーゲンヒドロゲルにおける石灰化凝集体を撮像するために、Harvard Center for Biological Imagingにおいて構造照明顕微鏡観察（Zeiss ELYRA Super-Resolution）を実施した。正常および骨形成馴化培地処理の両方において、共焦点で得られた画像のImageJ（NIH）解析を用いて、石灰化およびコラーゲン染色の評価を実施した。まず、画像チャネルを色（赤、緑）によって分離し、そして、赤色染色（石灰化）または緑色染色（コラーゲン）の強度を赤色または緑色のチャネルのヒストグラムの積分としてImageJでコンピュータ処理した。定量のために各ウェルにおけるコラーゲン染色量に対して石灰化を正規化した。SMCおよびVICの石灰化の定量については、DAPI染色により定量した総細胞数を用いて正規化を行ったことを除いて、EVと同様の方法で石灰化を撮像し、そして、定量した。研究者らは、定量のための処理群について盲検化されていた。
【０２１０】
RNAおよびタンパク質の解析
TRIzol（Fisher Scientific）を用いてRNAを抽出し、そして、qScript cDNA Synthesis Kit（Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD）を用いてcDNAを作製した。以下のTaqmanプローブ（Fisher Scientific）を用いて定量PCRを実施した：Hs02758991_g1（GAPDH）；Hs00167549_m1（ANXA1）；Hs00743063_s1（ANXA2）；Hs00996187_m1（ANXA5）；Hs01049082_m1（ANXA6）。倍数変化をGAPDHに対して正規化し、そして、ΔΔCt法によって決定した。EDTA不含プロテアーゼインヒビター（Sigma）を含有するRIPAバッファ（Fisher Scientific）中で細胞を溶解させ、タンパク質溶解物20μgをロードし、そして、以下の抗体を用いることによって、ウェスタンブロット分析を実施した：ANXA1（Abcam #ab214486；1：1000）、DRP1（Abcam #ab56788；1：1000）、β−アクチン（Novus Biologicals LLC, Centennial, CO, #NB600-501；1：5000）、およびα−チューブリン（Abcam #ab15246；1：1000）。ヒトのSMCおよびVICのEVを単離することによって、ANXA1 EVの表面局在を評価した。馴化培地10mLを100,000gで40分間遠心分離し、そして、得られたEVペレットをPBSまたは0.48mmol/L EDTAを含有するPBSに再懸濁させ、そして、37℃で30分間インキュベーションした。100,000gで40分間、EVの2回目のペレット化を行った。上清を回収し、そして、ペレットをPBS100μLに再懸濁させた。サンプルを6×ローディングバッファ（Boston Bioproducts）と共にインキュベーションし、そして、10分間ボイルした後、ウェスタンブロットにより分析した。上清に放出されたANXA1は、EVの表面上にあると評価された。
【０２１１】
統計解析
PRISMソフトウェア（GraphPad, San Diego, CA）を用いて、適宜テューキーの多重比較検定またはt検定を伴うANOVAによってデータを分析した。棒グラフデータは平均±標準偏差（s.d.）としてプロットし、そして、個々のデータ点はドットポイントとして含めた。質量分析については、ベンジャミーニおよびホッホベルク法（偽発見率）を用いてP値を調整し、そして、ボルケーノプロットを用いて結果を可視化した。
【０２１２】
イラスト
イラストは、Microsoft PowerPointおよびMotifolioイラストレーションツールキット（Ellicott City, MD）を使用して作成した。
【０２１３】
参照文献
2021533163.tif 000010
2021533163.tif 000011
2021533163.tif 000012
2021533163.tif 000013
【０２１４】
実施例3
本開示は、アネキシンA1インヒビターの投与を通して血管および弁の石灰化を低減するための方法を特徴とする。アネキシンA1インヒビターを使用して、細胞外小胞の繋留および組織非特異的アルカリホスファターゼ活性の調節により、心血管石灰化を低減する。
【０２１５】
細胞外小胞（EV）は、プラーク破裂につながる可能性のある細胞外マトリックスの石灰化／微小石灰化に寄与する（Kelley-Arnold PNAS 2013）。EVは凝集し、ヒドロキシアパタイトの核となり、そして、微小石灰化を形成する（Hutcheson et al. Nature Materials 2016）。しかし、EVがどのように凝集するのかは不明である。EVの膜は繋留機能を有するタンパク質を含有し、このタンパク質が小胞の凝集を誘導し、そして、コラーゲンリッチなマトリックスにおいて微小石灰化を促進するという仮説を立てた。
【０２１６】
心臓弁置換（N=3）および頸動脈内膜切除手技（N=3）を受けた患者から石灰化組織を採取し、電子顕微鏡を用いて患部組織内の小胞を観察した。また、心臓弁置換（N=5）および頸動脈内膜切除（N=5）手技を受けた患者から石灰化組織を採取し、免疫組織化学によってアネキシンAlを染色した。初代ヒト心血管細胞を骨形成分化培地で培養し、アルカリホスホターゼ活性アッセイのために細胞タンパク質溶解物を回収した。骨形成分化培地で培養した初代ヒト平滑筋細胞（N=9）および弁間質細胞（N=3）からEVを単離し、ネットワーク解析と共に質量分析を使用して、膜繋留に関連するタンパク質を同定した。GFPタグ付き候補タンパク質を精製してタンパク質不含小胞と共にインキュベーションし、膜繋留活性について評価した。
【０２１７】
siRNAを使用して、初代ヒト心血管細胞における候補タンパク質をノックダウンし、アテローム動脈硬化性線維被膜の構造的特徴を模倣した無細胞三次元コラーゲンヒドロゲル中でEVをインキュベーションして、Osteosenseイメージングを使用して小胞石灰化の可能性を評価した。石灰化したヒト心血管組織は、凝集した小胞を含有しており、組織（免疫組織化的検査学によって評価）および組織小胞（免疫金電子顕微鏡観察によって評価）の両方がアネキシンAl染色で陽性であった。質量分析およびネットワーク解析により、アネキシンAlは、骨形成培地で処理した初代ヒト心血管細胞からのEVに多く含まれる膜繋留タンパク質であると同定された。アネキシンAl siRNAは、三次元コラーゲンヒドロゲルにおけるEVが媒介する石灰化を回復させ、初代ヒト心血管細胞（N=3）におけるアルカリホスホターゼ活性の誘導を減弱させた。
【０２１８】
小胞膜タンパク質、具体的にはアネキシンAlがEVを凝集させる機能を有することが見出され、これは、サブマイクロモルサイズの小胞からの心血管石灰化形成の起源についての説明を提供する。コラーゲンリッチなマトリックスは、心血管細胞から放出されたEVを捕捉することができ、EVは、次いで、小胞表面における膜結合タンパク質を介して凝集する。石灰化におけるアネキシンの役割は、これまで考えられていたよりも複雑である可能性があり、アネキシンAlは、小胞繋留および石灰化プロセスの開始において新たな機能を有する。
【０２１９】
血管および弁の石灰化を低減するための新規な方法が、本明細書において記載される。これは、心血管の石灰化、細胞外小胞の繋留、および心血管細胞アルカリホスホターゼ活性の調節におけるアネキシンAlの役割を実証した最初の報告である。A2、A5、およびA6を含む他のアネキシンは、恐らくカルシウム結合を通して、細胞外小胞の石灰化において役割を果たすことが既に報告されているが、心血管の石灰化におけるアネキシンAlの役割について報告した研究はない。更に、小胞の繋留の阻害または任意の他の手段によって細胞外小胞の凝集を防ぐ方法は報告されていない。小胞の繋留および凝集の減少、アルカリホスホターゼ活性の低下、ならびに小胞が媒介する石灰化の減弱につながるアネキシンA1の阻害を介して、血管および弁の石灰化を阻害するための新規手段が本明細書において提供される。
【０２２０】
アネキシンA1の機能を抑制／調節するためのインヒビターを生成することができ、そして、血管および弁の石灰化を低減するために使用することができる。アネキシンA1インヒビターの非限定的な例は、アネキシンA1の発現を阻害することができる分子、例えば、siRNA、アンチセンス分子、または遺伝子編集技術に加えて、アネキシンA1の活性、結合、または局在を調節する低分子を含む。本明細書において記載される方法は、薬学的に許容されるビヒクル中の有効量のアネキシンA1インヒビターを患者に投与する工程を含む。アネキシンA1インヒビターは、単独で、または1つもしくは複数の他の療法と組み合わせて投与される。
【０２２１】
実施例4
細胞外小胞（EV）は、プラーク破裂につながる可能性のある細胞外マトリックスの石灰化／微小石灰化に寄与する。EVの膜は繋留機能を有するタンパク質を含有し、このタンパク質が小胞の凝集を誘導し、そして、コラーゲンリッチなマトリックスにおいて石灰化を促進することが立証される。
【０２２２】
コラーゲンリッチなマトリックスは、心血管細胞から放出されたEVを捕捉することができ、これは、次いで、小胞表面における膜繋留タンパク質を介して凝集する。石灰化におけるアネキシンの役割は、これまで考えられていたよりも複雑である可能性があるが、それは、アネキシンAl（ANXA1）が、石灰化プロセスを開始させる小胞繋留およびTNAPの制御因子として機能するためである。図17は、ANXA1のこの役割のワーキングモデルを示す。
【０２２３】
EVは石灰化したヒト組織で凝集し、EV ANXA1は骨形成条件によって増加する（図18）。石灰化したヒトの組織および小胞はANXA1を含有する（図19）。
【０２２４】
ANXA1のsiRNAは、ヒトのVICおよびSMCにおける骨形成培地が誘導するTNAP活性を低下させ（図20）、ヒトSMC小胞が媒介する石灰化（図21）およびヒトVIC小胞が媒介する石灰化（図22）を抑制した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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