(57)【要約】  本発明は、酵素利用ナノテクノロジーを用いた核酸の検出に関する。より具体的には、本発明は、2つの独立した酵素−DNAナノストラクチャー、すなわち、容易に調節可能な認識要素と感度の高い汎用シグナル生成要素、で構成される、標的認識と視覚的シグナル増幅が分離された集積回路を用いて、核酸を特異的に検出する方法および装置を提供する。
2021529540.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的核酸を検出する方法であって、
(a)核酸を含むサンプルを提供する工程；
(b)少なくとも1つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも1つの認識ナノストラクチャーとを含む組成物であって、前記認識ナノストラクチャーが、前記DNAポリメラーゼ酵素に特異的なDNAアプタマーを含み、前記DNAアプタマーが、保存配列領域と可変配列領域とを有し、前記可変配列領域が、前記サンプル中の標的核酸と相補的な少なくとも10個のヌクレオチドで構成される突出末端部分を含むことを特徴とする組成物を提供するか、
(c)少なくとも1つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも1つの認識ナノストラクチャーとを含む組成物であって、前記認識ナノストラクチャーが、前記DNAポリメラーゼ酵素に特異的なDNAアプタマーとインバーターオリゴヌクレオチドとを含み、前記アプタマーが、保存配列領域と可変配列領域とを有し、前記可変配列領域が、前記インバーターオリゴヌクレオチドの一部と相補的な少なくとも10個のヌクレオチドで構成された、前記インバーターオリゴヌクレオチドの一部と二本鎖を形成する突出末端部分を含み、前記インバーターオリゴヌクレオチドが、アプタマー−インバーター二本鎖より少なくとも1ヌクレオチド分長く、前記インバーターオリゴヌクレオチドが、前記サンプル中の標的核酸と相補的な10個より多い数のヌクレオチドを有することを特徴とする組成物を提供する工程；
(d)核酸を含む前記サンプルを、(b)または(c)の組成物と接触させることにより、
(i)標的核酸が、(b)のアプタマーの前記可変配列領域に結合した場合は、安定したアプタマー−DNAポリメラーゼ酵素複合体の形成が促進されてDNAポリメラーゼ酵素活性が阻害され、
(ii)標的核酸が、(c)のインバーターオリゴヌクレオチドに結合した場合は、前記認識ナノストラクチャーの不安定化により、前記DNAアプタマーによるDNAポリメラーゼ酵素の阻害が解除される工程；
(e)工程(d)の活性化DNAポリメラーゼ酵素と反応するセルフプライミング部分を含む、前記活性化DNAポリメラーゼ酵素に反応するシグナル生成ナノストラクチャーを提供する工程；
(f)標識オリゴヌクレオチド(dNTP)とシグナル発現試薬の存在下、前記シグナル生成ナノストラクチャーを、工程(d)の活性化DNAポリメラーゼ酵素と接触させることによって、前記活性化DNAポリメラーゼ酵素により、前記標識オリゴヌクレオチドが前記シグナル生成ナノストラクチャーに付加され、前記シグナル発現試薬が、前記セルフプライミング部分に導入された前記標識オリゴヌクレオチドと結合する工程；および
(g)シグナル発現を検出することにより、
(i)組成物(b)を用いた場合は、シグナル強度から、前記サンプル中に標的核酸が存在しないことが示され、
(ii)組成物(c)を用いた場合は、シグナル強度から、前記サンプル中に標的核酸が存在することが示される工程
を含む方法。
【請求項２】
対象における疾患を診断する方法であって、
(a)対象由来の、核酸を含むサンプルを提供する工程；
(b)少なくとも1つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも1つの認識ナノストラクチャーとを含む組成物であって、前記認識ナノストラクチャーが、前記DNAポリメラーゼ酵素に特異的なDNAアプタマーを含み、前記DNAアプタマーが、保存配列領域と可変配列領域とを有し、前記可変配列領域が、前記サンプル中の標的核酸と相補的な少なくとも10個のヌクレオチドで構成される突出末端部分を含むことを特徴とする組成物を提供するか、
(c)少なくとも1つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも1つの認識ナノストラクチャーとを含む組成物であって、前記認識ナノストラクチャーが、前記DNAポリメラーゼ酵素に特異的なDNAアプタマーとインバーターオリゴヌクレオチドとを含み、前記アプタマーが、保存配列領域と可変配列領域とを有し、前記可変配列領域が、前記インバーターオリゴヌクレオチドの一部と相補的な少なくとも10個のヌクレオチドで構成された、前記インバーターオリゴヌクレオチドの一部と二本鎖を形成する突出末端部分を含み、前記インバーターオリゴヌクレオチドが、アプタマー−インバーター二本鎖より少なくとも1ヌクレオチド分長く、前記インバーターオリゴヌクレオチドが、前記サンプル中の標的核酸と相補的な10個より多い数のヌクレオチドを有することを特徴とする組成物を提供する工程；
(d)核酸を含む前記サンプルを、(b)または(c)の組成物と接触させることにより、
(i)標的核酸が、(b)のアプタマーの前記可変配列領域に結合した場合は、安定したアプタマー−DNAポリメラーゼ酵素複合体の形成が促進されてDNAポリメラーゼ酵素活性が阻害され、
(ii)標的核酸が、(c)のインバーターオリゴヌクレオチドに結合した場合は、前記認識ナノストラクチャーの不安定化により、前記DNAアプタマーによるDNAポリメラーゼ酵素の阻害が解除される工程；
(e)工程(d)の活性化DNAポリメラーゼ酵素と反応するセルフプライミング部分を含む、前記活性化DNAポリメラーゼ酵素に反応するシグナル生成ナノストラクチャーを提供する工程；
(f)標識オリゴヌクレオチド(dNTP)とシグナル発現試薬の存在下、前記シグナル生成ナノストラクチャーを、工程(d)の活性化DNAポリメラーゼ酵素と接触させることによって、前記活性化DNAポリメラーゼ酵素により、前記標識オリゴヌクレオチドが前記シグナル生成ナノストラクチャーに付加され、前記シグナル発現試薬が、前記セルフプライミング部分に導入された前記標識オリゴヌクレオチドと結合する工程；
(g)シグナル発現を検出することにより、
(i)組成物(b)を用いた場合は、シグナル強度から、前記サンプル中に標的核酸が存在しないことが示され、
(ii)組成物(c)を用いた場合は、シグナル強度から、前記サンプル中に標的核酸が存在することが示される工程；および
(h)前記サンプル中で標的核酸の存在が確認された場合に、前記患者が疾患を有すると診断する工程
を含む方法。
【請求項３】
前記DNAアプタマーの保存配列領域が、5'-CAATGTACAGTATTG-3'(配列番号153)で示される核酸配列を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記インバーターオリゴヌクレオチドが、前記アプタマーの二本鎖領域より少なくとも1ヌクレオチド分長い、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記インバーターオリゴヌクレオチドが、約35〜45個のヌクレオチド、好ましくは約40個のヌクレオチドで構成されている、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記インバーターオリゴヌクレオチドの長さの約半分の領域が、アプタマー−インバーター二本鎖を形成し、残りの約半分の領域が突出末端部分を形成する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
多種同時検出用に、前記サンプル中の第1の認識ナノストラクチャーの標的核酸と異なる1つ以上の標的核酸と相補的な1つ以上の別の認識ナノストラクチャーを提供することをさらに含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
各認識ナノストラクチャーが、前記DNAアプタマーと前記インバーターオリゴヌクレオチドと前記DNAポリメラーゼ酵素とを特定の比率で組み合わせたものを含み、AND、OR、NOT、NANDおよびNORを含む群から選択される論理ゲートを形成する、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
各認識ナノストラクチャーのDNAアプタマーとインバーターオリゴヌクレオチドとDNAポリメラーゼ酵素の組み合わせの比率が、以下の群(i)〜(v)から選択される、請求項8に記載の方法。
(i)DNAアプタマー:インバーターオリゴヌクレオチド:DNAポリメラーゼ酵素の比率が1:1:0.5であるナノストラクチャーを2つ含み、AND論理ゲートを形成する。
(ii)DNAアプタマー:インバーターオリゴヌクレオチド:DNAポリメラーゼ酵素の比率が1:1:1であるナノストラクチャーを2つ含み、OR論理ゲートを形成する。
(iii)DNAアプタマー:インバーターオリゴヌクレオチド:DNAポリメラーゼ酵素の比率が1:0:1であるナノストラクチャーを1つ含み、NOT論理ゲートを形成する。
(iv)DNAアプタマー:インバーターオリゴヌクレオチド:DNAポリメラーゼ酵素の比率が1:0:1であるナノストラクチャーを2つ含み、NAND論理ゲートを形成する。
(v)DNAアプタマー:インバーターオリゴヌクレオチド:DNAポリメラーゼ酵素の比率が1:0:0.5であるナノストラクチャーを2つ含み、NOR論理ゲートを形成する。
【請求項１０】
前記シグナル生成ナノストラクチャーのセルフプライミング部分が、配列番号5に記載の核酸配列を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記dNTPの標識物質がビオチンである、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記シグナル発現試薬が、アビジンまたはその誘導体と酵素とを含む融合タンパク質および対応する基質を含み、
前記酵素が、以下に限定されないが、HRP、β−ラクタマーゼ、アミラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼを含む群から選択され、
前記基質が、以下に限定されないが、DAB、TMB、ABTS、ニトロセフィン、ルミノール、デンプンおよびヨウ素を含む群から選択され、
前記シグナルが、以下に限定されないが、比色、蛍光、発光または電気化学的変化として測定可能および定量可能である、
先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的が、ヒト以外もしくはヒトの疾患、遺伝子異型、法医学、株同定、環境汚染、および／または食品汚染に関連する少なくとも1つの核酸である、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的が、少なくとも1つの病原体核酸である、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
工程(a)の前に、前記サンプル中の標的核酸の増幅が行われる、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプル中の標的核酸の増幅が、非対称Nested PCRまたは等温増幅法により行われる、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出工程および前記シグナル生成工程が、物理的に分離されている、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出ナノストラクチャーおよび前記シグナル生成ナノストラクチャーが、支持体に取り付けられている、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記シグナル生成ナノストラクチャーが、ビーズと結合している、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出ナノストラクチャーおよび前記シグナル生成ナノストラクチャーが、マイクロ流体デバイスまたはラテラルフローデバイスに取り付けられている、請求項18または19に記載の方法。
【請求項２１】
工程d)〜g)、好ましくは工程a)〜g)が、16℃〜40℃の温度、好ましくは環境温度で行われる、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的核酸がHPVの核酸である、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
前記アプタマーオリゴヌクレオチドおよび前記インバーターオリゴヌクレオチドが、表2、表4または表5に記載のものから選択される、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
(i)少なくとも1つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも1つの認識ナノストラクチャーを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の組成物(b)または組成物(c)を、第1の位置に含み；
(ii)活性化DNAポリメラーゼ酵素と反応するセルフプライミング部分を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載のシグナル生成ナノストラクチャーが、第2の位置に取り付けられており；かつ
(iii)前記検出ナノストラクチャーとサンプル核酸を混合して、活性化された前記酵素を前記第2の位置へと送るように構成された中間ステージを含む、
デバイス。
【請求項２５】
マイクロ流体デバイスおよびラテラルフローデバイスを含む群から選択される、請求項24に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記デバイスが、マイクロ流体デバイスであって、
(i)シグナル生成ナノストラクチャーを固定するためのメンブレンが埋め込まれた基材と、1つ以上のアッセイカセットのそれぞれと前記第2の位置で流体連通する共通排出口とを含む、1つ以上のアッセイカセットを収容できるように構成された共通のシグナル生成カートリッジ；および
(ii)注入口と、少なくとも1つのDNAポリメラーゼ酵素と、少なくとも1つの認識ナノストラクチャーとを前記第1の位置に含み、前記第1の位置と前記第2の位置を流体連通する中間ステージマイクロチャネルを含む1つ以上のアッセイカセット
を含み、
前記中間ステージマイクロチャネルが、前記検出ナノストラクチャーとサンプル核酸を混合して、活性化された前記酵素を前記第2の位置へと送るように構成されており、
組み立てた前記デバイスの使用中は、セプタムを介した吸引により、前記サンプル注入口から前記共通排出口へと流体が移動する、マイクロ流体デバイスである、請求項24または25に記載のデバイス。
【請求項２７】
核酸検出キットであって、
(a)少なくとも1つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも1つの認識ナノストラクチャーとを含む組成物であって、前記認識ナノストラクチャーが、前記DNAポリメラーゼ酵素に特異的なDNAアプタマーを含み、前記DNAアプタマーが、保存配列領域と可変配列領域とを有し、前記可変配列領域が、標的核酸と相補的な少なくとも10個のヌクレオチドで構成される突出末端部分を含むことを特徴とする組成物；および／または
(b)少なくとも1つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも1つの認識ナノストラクチャーとを含む組成物であって、前記認識ナノストラクチャーが、前記DNAポリメラーゼ酵素に特異的なDNAアプタマーとインバーターオリゴヌクレオチドとを含み、前記アプタマーが、保存配列領域と可変配列領域とを有し、前記可変配列領域が、前記インバーターオリゴヌクレオチドの一部と相補的な少なくとも10個のヌクレオチドで構成された、前記インバーターオリゴヌクレオチドの一部と二本鎖を形成する突出末端部分を含み、前記インバーターオリゴヌクレオチドが、アプタマー−インバーター二本鎖より少なくとも1ヌクレオチド分長く、前記インバーターオリゴヌクレオチドが、標的核酸と相補的な10個より多い数のヌクレオチドを有することを特徴とする組成物；
を含み、さらに任意で、
(c)活性化DNAポリメラーゼ酵素と反応するセルフプライミング部分を含む、前記活性化DNAポリメラーゼ酵素に反応するシグナル生成ナノストラクチャー
を含んでもよく；
さらに任意で、
(d)標識ヌクレオチド(dNTP)およびシグナル発現試薬
を含んでもよく、
前記活性化DNAポリメラーゼ酵素により、前記標識ヌクレオチドが前記シグナル生成ナノストラクチャーに付加され、前記シグナル発現試薬が、前記セルフプライミング部分に導入された前記標識ヌクレオチドと結合する、核酸検出キット。
【請求項２８】
前記(a)〜(d)が、先行する請求項のいずれか1項に記載の通りである、請求項27に記載の核酸検出キット。
【請求項２９】
請求項24〜26のいずれか1項に記載のデバイスの一部を構成する、請求項27または28に記載の核酸検出キット。
【請求項３０】
前記アプタマーオリゴヌクレオチドおよび／または前記インバーターオリゴヌクレオチドのうち少なくとも1つが、天然の核酸に構造的修飾および／または化学的修飾が施されたものである、請求項27に記載の核酸検出キット。
【請求項３１】
前記構造的修飾および／または化学的修飾が、合成時における、蛍光性タグ、放射性タグ、ビオチン、5'テールなどのタグの付加、ホスホロチオエート(PS)結合の付加、2'-O-メチル化、および／またはホスホロアミダイトC3スペーサーの付加を含む群から選択される、請求項30に記載の核酸検出キット。
【請求項３２】
請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法における、請求項27〜31のいずれか1項に記載の核酸検出キットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素利用ナノテクノロジーを用いた核酸の検出に関する。より具体的には、本発明は、2つの独立した酵素−DNAナノストラクチャー、すなわち、容易に調節可能な認識要素と感度の高い汎用シグナル生成要素、で構成される、標的認識と視覚的シグナル増幅が分離された集積回路を用いて、核酸を特異的に検出する方法および装置を提供する。
【背景技術】
【０００２】
病原体の核酸検出は、感染症の診断や管理に幅広く利用されている。従来の病原体培養では、処理時間が長く(例えば、数日間を要する)、種特異的なプロトコール(例えば、細菌とウイルスとでは異なる)が必要であるため、それに代わる方法として、臨床検査施設では核酸技術を用いて感染症などに関する未知の分子情報を提供する機会が増えている[Niemz, A., Ferguson, T. M. & Boyle, D. S. Trends Biotechnol 29: 240-250 (2011); Nong, R. Y., et al., Expert Rev Proteomics 9: 21-32 (2012); Zumla, A. et al. Lancet Infect Dis 14: 1123-1135 (2014)]。例えば、核酸を利用したヒトパピローマウイルス(HPV)検査は、現在、子宮頸がん検査において不可欠である。HPVは、性感染症を引き起こす最も一般的なウイルスであり、子宮頸がんの主要な原因である[Crosbie, E. J., et al., Lancet 382: 889-899 (2013)]。HPVには、100種類を超えるサブタイプが存在し、そのうち15種類は悪性腫瘍リスクが高いと考えられている[Bouvard, V. et al. Lancet Oncol 10: 321-322 (2009)]。HPV感染症は地球規模の伝染病であり、多くの場合は良性であるが、HPV感染症から致死性の高い子宮頸がんへと進展する場合もある。この複雑な病因、発がんおよび疾患進行は、主に、1)HPVの特定の分子サブタイプによる感染と、2)感染の持続性、という2つの要因と関係がある[Bodily, J. & Laimins, L. Trends Microbiol 19: 33-39 (2011); Schiffman, M. et al. Nat Rev Dis Primers 2: 16086 (2016)]。
【０００３】
現在、病原体の核酸検出の実施は、大規模集中型の臨床検査施設にほぼ限られている。このように適用が限られている原因としては、慣用技術が非常に複雑でコストがかかることが挙げられる。HPVの検出に関しては、市販の検査では、主にポリメラーゼ連鎖反応(PCR、例えば、Cobas HPV)を利用して、特定のDNA標的を増幅し検出する[Rao, A. et al. J Clin Microbiol 51: 1478-1484 (2013); Cui, M. et al. J Clin Microbiol 52: 2210-2211 (2014)]。このような評価系では、PCRの熱サイクルや蛍光測定を行うために、大型の専用装置が必要なだけでなく、そのような操作を行う熟練した作業者も必要である。現在、熱サイクル用装置の必要性を軽減するために、改良された等温増幅法による検査が開発されているが、この検査には制限もある。例えば、ループ介在等温増幅法(LAMP)は、厳しい配列要件があり、一般化が難しい[Zhao, Y., et al., Chem Rev 115: 12491-12545 (2015)]。重要なことに、LAMPは、他の核酸増幅方法と同様に、(例えば、プライマーダイマー形成による)偽陽性が生じやすい。また、配列特異的なシグナル生成プローブ(例えば、蛍光性のTaqmanレポーター)を用いて検出精度を高めることは可能であるが、このようなプローブは高価であり、また実際に使用するには複雑さが伴う[Gardner, S. N., et al., J Clin Microbiol 41: 2417-2427 (2003)]。また、DNA標的ごとに、標的増幅時にDNA標的に結合してシグナルを生成する専用の配列特異的なプローブが必要であるため、この方法で多種同時解析や複雑な演算を行うとなれば、さらに費用がかさみ困難である[Juskowiak, B. Anal Bioanal Chem 399: 3157-3176 (2011)]。
【０００４】
モジュール方式の迅速かつ視覚的な核酸検出が行える分子プラットフォームが求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のテクノロジーは、標的核酸の増幅に依存せず、標的との直接的かつ独立したハイブリダイゼーションにより生成される視覚的シグナルを指数関数的に高めるものである。「核酸を視覚的同定するための酵素利用ナノテクノロジー(enVision)」と称する本発明は、2つの独立した酵素−DNAナノストラクチャー、すなわち、容易に調節可能な認識要素と感度の高い汎用シグナル生成要素、で構成される、標的認識と視覚的シグナル増幅が分離された集積回路からなる。DNAナノストラクチャーは、安定した3次元構造で多様な酵素活性を容易にし、密に充填されていても、最小限のクロストークで独立した作動が可能であるように設計できることから、機能的要素として選択した[Lee, H. et al. Nat Nanotechnol 7: 389-393 (2012); Wang, L., et al., Nucleic Acids Res 45: 12090-12099 (2017); Li, J., et al., Nat Chem 9: 1056-1067 (2017)]。
【０００６】
第1の態様において、下記の工程を含む、サンプル中の標的核酸を検出する方法が提供される：
(a)核酸を含むサンプルを提供する工程；
(b)少なくとも1つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも1つの認識ナノストラクチャーとを含む組成物であって、前記認識ナノストラクチャーが、前記DNAポリメラーゼ酵素に特異的なDNAアプタマーを含み、前記DNAアプタマーが、保存配列領域と可変配列領域とを有し、前記可変配列領域が、前記サンプル中の標的核酸と相補的な少なくとも10個のヌクレオチドで構成される突出末端部分を含むことを特徴とする組成物を提供するか、
(c)少なくとも1つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも1つの認識ナノストラクチャーとを含む組成物であって、前記認識ナノストラクチャーが、前記DNAポリメラーゼ酵素に特異的なDNAアプタマーとインバーターオリゴヌクレオチドとを含み、前記アプタマーが、保存配列領域と可変配列領域とを有し、前記可変配列領域が、前記インバーターオリゴヌクレオチドの一部と相補的な少なくとも10個のヌクレオチドで構成された、前記インバーターオリゴヌクレオチドの一部と二本鎖を形成する突出末端部分を含み、前記インバーターオリゴヌクレオチドが、アプタマー−インバーター二本鎖より少なくとも1ヌクレオチド分長く、それによりインバーター突出末端が形成され、前記インバーターオリゴヌクレオチドが、前記サンプル中の標的核酸と相補的な10個より多い数のヌクレオチドを有することを特徴とする組成物を提供する工程；
(d)核酸を含む前記サンプルを、(b)または(c)の組成物と接触させることにより、
(i)標的核酸が、(b)のアプタマーの前記可変配列領域に結合した場合は、安定したアプタマー−DNAポリメラーゼ酵素複合体の形成が促進されてDNAポリメラーゼ酵素活性が阻害され、
(ii)標的核酸が、(c)のインバーターオリゴヌクレオチドに結合した場合は、前記認識ナノストラクチャーの不安定化により、前記DNAアプタマーによるDNAポリメラーゼ酵素の阻害が解除される工程；
(e)工程(d)の活性化DNAポリメラーゼ酵素と反応するセルフプライミング部分を含む、前記活性化DNAポリメラーゼ酵素に反応するシグナル生成ナノストラクチャーを提供する工程；
(f)標識オリゴヌクレオチド(dNTP)とシグナル発現試薬の存在下、前記シグナル生成ナノストラクチャーを、工程(d)の活性化DNAポリメラーゼ酵素と接触させることによって、前記活性化DNAポリメラーゼ酵素により、前記標識オリゴヌクレオチドが前記シグナル生成ナノストラクチャーに付加され、前記シグナル発現試薬が、前記セルフプライミング部分に導入された前記標識オリゴヌクレオチドと結合する工程；および
(g)シグナル発現を検出することにより、
(i)組成物(b)を用いた場合は、シグナル強度から、前記サンプル中に標的核酸が存在しないことが示され、
(ii)組成物(c)を用いた場合は、シグナル強度から、前記サンプル中に標的核酸が存在することが示される工程。
【０００７】
いくつかの実施形態において、前記DNAポリメラーゼ酵素は、熱安定性DNAポリメラーゼであるTaqポリメラーゼである。Taqポリメラーゼは、この酵素が最初に単離された好熱性細菌テルムス・アクウァーティクス(Thermus aquaticus)にちなんで命名された。
【０００８】
いくつかの実施形態において、前記DNAアプタマーの保存配列領域は、核酸配列5'-CAATGTACAGTATTG-3'(配列番号153)を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、前記インバーターオリゴヌクレオチドは、前記アプタマーの二本鎖領域より少なくとも1ヌクレオチド分長い。好ましくは、前記インバーターオリゴヌクレオチドは、前記アプタマーの二本鎖領域の約2倍の長さである。
【００１０】
いくつかの実施形態において、前記インバーターオリゴヌクレオチドの長さの約半分の領域が、アプタマー−インバーター二本鎖を形成し、残りの約半分の領域が突出末端部分を形成する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明のいずれかの態様による方法は、2種同時検出用に、前記サンプル中の第1の認識ナノストラクチャーの標的核酸と異なる標的核酸と相補的な第2の認識ナノストラクチャーを提供することをさらに含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、前記方法は、マルチプレックス(多種同時)検出用に、前記サンプル中の認識ナノストラクチャーの標的核酸と異なる標的核酸と相補的なインバーター配列を有する別の認識ナノストラクチャーを提供する。多遺伝子座HPV検出に適したアプタマーオリゴヌクレオチド配列およびインバーターオリゴヌクレオチド配列の例を表4に示す。
【００１３】
いくつかの実施形態において、多様な標的核酸配列に対応するために、前記インバーターオリゴヌクレオチドの突出末端にミスマッチが導入されており、横断的検出に有用である。HPVの横断的検出に適したアプタマーオリゴヌクレオチド配列およびインバーターオリゴヌクレオチド配列の例を表2に示す。
【００１４】
いくつかの実施形態において、強力な配列特異性を付与するために、前記可変配列領域の二本鎖領域にミスマッチが導入されており、ウイルスのサブタイプ判定など、密接な関係にある複数の標的核酸のマルチプレックス(多種同時)検出に有用である。HPVのサブタイプ判定に適したアプタマーオリゴヌクレオチド配列およびインバーターオリゴヌクレオチド配列の例を表2に示す。
【００１５】
いくつかの実施形態において、前記方法は、マルチプレックス(多種同時)検出用に、サンプル中の第1の認識ナノストラクチャーの標的核酸と異なる1つ以上の標的核酸と相補的な1つ以上のさらなる認識ナノストラクチャーを提供することをさらに含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、各認識ナノストラクチャーは、前記DNAアプタマーと前記インバーターオリゴヌクレオチドと前記DNAポリメラーゼ酵素とを特定の比率で組み合わせたものを含み、AND、OR、NOT、NANDおよびNORを含む群から選択される論理ゲートを形成する。HPVの論理ゲート検出に適したアプタマーオリゴヌクレオチド配列およびインバーターオリゴヌクレオチド配列の例を表5に示す。
【００１７】
いくつかの実施形態において、認識ナノストラクチャーと、各認識ナノストラクチャーのDNAアプタマーとインバーターオリゴヌクレオチドとDNAポリメラーゼ酵素の比率との組み合わせは、以下の群(i)〜(v)から選択される。
(i)DNAアプタマー:インバーターオリゴヌクレオチド:DNAポリメラーゼ酵素の比率が1:1:0.5であるナノストラクチャーを2つ含み、AND論理ゲートを形成する。
(ii)DNAアプタマー:インバーターオリゴヌクレオチド:DNAポリメラーゼ酵素の比率が1:1:1であるナノストラクチャーを2つ含み、OR論理ゲートを形成する。
(iii)DNAアプタマー:インバーターオリゴヌクレオチド:DNAポリメラーゼ酵素の比率が1:0:1であるナノストラクチャーを1つ含み、NOT論理ゲートを形成する。
(iv)DNAアプタマー:インバーターオリゴヌクレオチド:DNAポリメラーゼ酵素の比率が1:0:1であるナノストラクチャーを2つ含み、NAND論理ゲートを形成する。
(v)DNAアプタマー:インバーターオリゴヌクレオチド:DNAポリメラーゼ酵素の比率が1:0:0.5であるナノストラクチャーを2つ含み、NOR論理ゲートを形成する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、上記の論理ゲート群(i)〜(v)の組み合わせにより2つより多い数の標的を検出できる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、上記の論理機能を用いて分子計算を行うことができる。例えば、OR機能は検出範囲を拡大し、かつ／またはAND機能は検出特異性を高める。
【００２０】
いくつかの実施形態において、前記シグナル生成ナノストラクチャーのセルフプライミング部分は、
5'-AGCAGGCAGTTACGGGCTGGTGCGATGAGAGACGCGGAGTGTGGCGGCC GGATAGTAATGACTGCGACCGGTGTACCAGTGGCGTGAGGCAGGTCGTGA GGCGGCGTACGTAGAGCGTTGAGCAGGATGCCAACAGTCGATCAGGACGA GTGCTAACGCATTGTCGATAGCTCAGCTGTCTGAGCTATCGACAATGCGTT-3'
(配列番号5)の核酸配列を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、前記標的は、DNA、RNA、PNAおよびその他の核酸アナログを含む群から選択される少なくとも1つの核酸である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、前記標的は、ヒト以外もしくはヒトの疾患、遺伝子異型、法医学、株同定、環境汚染、および／または食品汚染に関連する少なくとも1つの核酸である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、前記標的は病原体である。いくつかの実施形態において、前記病原体はウイルスである。ウイルスの一例として、本明細書に記載しているように、HPVが挙げられるが、これに限定されない。本発明の方法により、HPVの検出かつ／または特徴付けが可能である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、前記シグナル生成工程で用いられるdNTPの標識物質はビオチンである。
【００２５】
いくつかの実施形態において、前記シグナル発現試薬は、アビジンまたはその誘導体と酵素とを含む融合タンパク質および対応する基質を含む。前記酵素は、以下に限定されないが、HRP、β−ラクタマーゼ、アミラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼを含む群から選択される。前記基質は、以下に限定されないが、DAB、TMB、ABTS、ニトロセフィン、ルミノール、デンプンおよびヨウ素を含む群から選択される。前記シグナルは、以下に限定されないが、比色、蛍光、発光または電気化学的変化として測定可能および定量可能である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、工程(a)の前に、前記サンプル中の標的核酸の増幅が行われる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、前記サンプル中の標的核酸の増幅は、非対称Nested PCRまたは等温増幅法により行われる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、前記検出工程および前記シグナル生成工程は、物理的かつ／または空間的に分離されている。
【００２９】
いくつかの実施形態において、前記検出ナノストラクチャーおよび前記シグナル生成ナノストラクチャーは、支持体に取り付けられている。
【００３０】
いくつかの実施形態において、前記シグナル生成ナノストラクチャーは、ビーズと結合している。
【００３１】
いくつかの実施形態において、前記検出ナノストラクチャーおよび前記シグナル生成ナノストラクチャーは、マイクロ流体デバイスまたはラテラルフローデバイスに取り付けられている。
【００３２】
いくつかの実施形態において、前記方法の工程a)〜e)の1つ以上は、16℃〜40℃の温度で行われる。いくつかの実施形態において、工程d)〜g)は、16℃〜40℃の温度で行われる。
【００３３】
いくつかの好ましい実施形態において、前記方法の工程a)〜e)の1つ以上は、環境温度で行われる。いくつかの好ましい実施形態において、工程d)〜g)は、環境温度で行われる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、工程a)〜d)は、工程e)〜g)に依存しない。工程a)〜d)において、刺激により酵素活性を復活させるメカニズムとして、別のメカニズムを使用できる。別のメカニズムとしては、対応する阻害剤の近接による酵素阻害、温度変化、別のDNAザイムなどが含まれる。工程a)〜d)の活性化後、工程e)〜g)において、酵素活性を測定するメカニズムとして、別のメカニズムを用いて、異なる刺激を検出することも可能である。
【００３５】
本発明の別の一態様において、
5'-AGCAGGCAGTTACGGGCTGGTGCGATGAGAGACGCGGAGTGTGGCGGCC GGATAGTAATGACTGCGACCGGTGTACCAGTGGCGTGAGGCAGGTCGTGA GGCGGCGTACGTAGAGCGTTGAGCAGGATCCAACAGTCGATCAGGACGA GTGCTAACGCATTGTCGATAGCTCAGCTGTCTGAGCTATCGACAATGCGTT-3'
(配列番号5)の核酸配列を含むセルフプライミング部分を含む、単離されたシグナル生成ナノストラクチャー核酸が提供される。
【００３６】
本発明の別の一態様において、前述の組成物b)または組成物c)を、第1の位置に含み、前述のシグナル生成ナノストラクチャーが、第2の位置に取り付けられており、かつ前記検出ナノストラクチャーとサンプル核酸を混合して、活性化された前記酵素を前記第2の位置へと送るように構成された中間ステージを含む、デバイスが提供される。
【００３７】
いくつかの実施形態において、前記中間ステージは、前記第1の位置と前記第2の位置を連結する流体チャネルである。
【００３８】
上記のデバイスを用いることで、異なる酵素活性の継続時間の最適化などにより、サンプル中の特定の核酸を検出する本発明の方法の反応速度および感度が向上する。
【００３９】
本発明による別のデバイス構造は、前記検出ナノストラクチャーおよび前記シグナル生成ナノストラクチャーを第1の位置に含み、前記シグナル生成ナノストラクチャーが、前記第1の位置でビーズに結合して、前記検出ナノストラクチャーと混合され、その後、前記ビーズが、前記位置または第2の位置の所与の位置で捕捉されて、その所与の位置で前記酵素が活性化する。
【００４０】
いくつかの実施形態において、前記デバイスは、マイクロ流体デバイスおよびラテラルフローデバイスを含む群から選択される。
【００４１】
好ましくは、前記デバイスは、前述のマイクロ流体デバイスである。このようなデバイスの例を図1、図6および図7に示す。図1および図6に関して、いくつかの実施形態において、第1の位置は、分析対象のサンプルがマイクロ流体デバイスにロードされる場所であるとともに、あらかじめ装填されている検出ナノストラクチャーと接触する場所であってもよいことは理解されるであろう。次いで、前記サンプルと前記検出ナノストラクチャーが、中間の流体チャネルを通過しながら混合され、相互作用し合うことで、陽性検出によりポリメラーゼ酵素が活性化する。次いで、この活性化酵素は、固定化汎用シグナル生成ナノストラクチャーがあらかじめ装填されている第2の位置(反応チャンバー)に入り、そこで、重合反応により、標識オリゴヌクレオチドを含むシグナル生成分子が形成され、この導入された標識オリゴヌクレオチドとシグナル発現試薬が結合する。
【００４２】
本発明の別の一態様において、以下の(a)〜(d)を含む核酸検出キットが提供される。
(a)少なくとも1つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも1つの認識ナノストラクチャーとを含む組成物であって、前記認識ナノストラクチャーが、前記DNAポリメラーゼ酵素に特異的なDNAアプタマーを含み、前記DNAアプタマーが、保存配列領域と可変配列領域とを有し、前記可変配列領域が、標的核酸と相補的な少なくとも10個のヌクレオチドで構成される突出末端部分を含むことを特徴とする組成物；および／または
(b)少なくとも1つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも1つの認識ナノストラクチャーとを含む組成物であって、前記認識ナノストラクチャーが、前記DNAポリメラーゼ酵素に特異的なDNAアプタマーとインバーターオリゴヌクレオチドとを含み、前記アプタマーが、保存配列領域と可変配列領域とを有し、前記可変配列領域が、前記インバーターオリゴヌクレオチドの一部と相補的な少なくとも10個のヌクレオチドで構成された、前記インバーターオリゴヌクレオチドの一部と二本鎖を形成する突出末端部分を含み、前記インバーターオリゴヌクレオチドが、アプタマー−インバーター二本鎖より少なくとも1ヌクレオチド分長く、前記インバーターオリゴヌクレオチドが、標的核酸と相補的な10個より多い数のヌクレオチドを有することを特徴とする組成物；ならびに／または
(c)活性化DNAポリメラーゼ酵素と反応するセルフプライミング部分を含む、前記活性化DNAポリメラーゼ酵素に反応するシグナル生成ナノストラクチャー；ならびに／または
(d)標識オリゴヌクレオチド(dNTP)およびシグナル発現試薬
を含み、
前記活性化DNAポリメラーゼ酵素により、前記標識オリゴヌクレオチドが前記シグナル生成ナノストラクチャーに付加され、前記シグナル発現試薬が、前記セルフプライミング部分に導入された前記標識オリゴヌクレオチドと結合する、核酸検出キット。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本発明の核酸検出キットは、本発明のいずれかの態様に記載した前述の(a)〜(d)を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本発明の核酸検出キットは、本発明のいずれかの態様に記載した前述のデバイスの一部を構成する。
【００４５】
本発明の別の一態様において、以下の工程を含む、対象における疾患を診断する方法が提供される。
(a)対象由来の、核酸を含むサンプルを提供する工程；
(b)少なくとも1つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも1つの認識ナノストラクチャーとを含む組成物であって、前記認識ナノストラクチャーが、前記DNAポリメラーゼ酵素に特異的なDNAアプタマーを含み、前記DNAアプタマーが、保存配列領域と可変配列領域とを有し、前記可変配列領域が、前記サンプル中の標的核酸と相補的な少なくとも10個のヌクレオチドで構成される突出末端部分を含むことを特徴とする組成物を提供するか、
(c)少なくとも1つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも1つの認識ナノストラクチャーとを含む組成物であって、前記認識ナノストラクチャーが、前記DNAポリメラーゼ酵素に特異的なDNAアプタマーとインバーターオリゴヌクレオチドとを含み、前記アプタマーが、保存配列領域と可変配列領域とを有し、前記可変配列領域が、前記インバーターオリゴヌクレオチドの一部と相補的な少なくとも10個のヌクレオチドで構成された、前記インバーターオリゴヌクレオチドの一部と二本鎖を形成する突出末端部分を含み、前記インバーターオリゴヌクレオチドが、アプタマー−インバーター二本鎖より少なくとも1ヌクレオチド分長く、それによりインバーター突出末端が形成され、前記インバーターオリゴヌクレオチドが、前記サンプル中の標的核酸と相補的な10個より多い数のヌクレオチドを有することを特徴とする組成物を提供する工程；
(d)核酸を含む前記サンプルを、(b)または(c)の組成物と接触させることにより、
(i)標的核酸が、(b)のアプタマーの前記可変配列領域に結合した場合は、安定したアプタマー−DNAポリメラーゼ酵素複合体の形成が促進されてDNAポリメラーゼ酵素活性が阻害され、
(ii)標的核酸が、(c)のインバーターオリゴヌクレオチドに結合した場合は、前記認識ナノストラクチャーの不安定化により、前記DNAアプタマーによるDNAポリメラーゼ酵素の阻害が解除される工程；
(e)工程(d)の活性化DNAポリメラーゼ酵素と反応するセルフプライミング部分を含む、前記活性化DNAポリメラーゼ酵素に反応するシグナル生成ナノストラクチャーを提供する工程；
(f)標識オリゴヌクレオチド(dNTP)とシグナル発現試薬の存在下、前記シグナル生成ナノストラクチャーを、工程(d)の活性化DNAポリメラーゼ酵素と接触させることによって、前記活性化DNAポリメラーゼ酵素により、前記標識オリゴヌクレオチドが前記シグナル生成ナノストラクチャーに付加され、前記シグナル発現試薬が、前記セルフプライミング部分に導入された前記標識オリゴヌクレオチドと結合する工程；
(g)シグナル発現を検出することにより、
(i)組成物(b)を用いた場合は、シグナル強度から、前記サンプル中に標的核酸が存在しないことが示され、
(ii)組成物(c)を用いた場合は、シグナル強度から、前記サンプル中に標的核酸が存在することが示される工程；および
(h)前記サンプル中で標的核酸の存在が確認された場合に、前記対象が疾患を有すると診断する工程。
【００４６】
いくつかの実施形態において、前記疾患は、病原体に起因する疾患である。いくつかの実施形態において、前記疾患は、HPVに関連する疾患である。
【００４７】
いくつかの実施形態において、HPVは、表2、表4および表5に記載の1つ以上のアプタマーオリゴヌクレオチドおよび／またはインバーターオリゴヌクレオチドを用いて検出される。
【００４８】
本発明のいずれかの態様において、前記アプタマーオリゴヌクレオチド、前記インバーターオリゴヌクレオチドおよび／または前記シグナル生成ナノストラクチャーオリゴヌクレオチドのうち少なくとも1つは、天然の核酸に構造的修飾および／または化学的修飾が施されたものである。
【００４９】
いくつかの実施形態において、前記構造的修飾および／または化学的修飾は、合成時における、ホスホロチオエート(PS)結合の付加、2'-O-メチル化、ホスホラミダイトC3スペーサーの付加、およびアミノ基、チオール基、アクリダイト(acryldite)基もしくはアジド基などの5'付加を含む群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】モジュール方式の視覚的な病原体核酸検出法を示した図である。(a)enVisionシステムは、標的認識、標的非依存性シグナル生成および視覚的検出を可能にする複数の酵素−DNAナノストラクチャーからなる。これらのナノストラクチャーは、認識とシグナル生成が分離された設計になっている。認識ナノストラクチャーは、不活化作用を有するアプタマーとTaq DNAポリメラーゼで構成されるハイブリッド複合体である。この複合体は、相補的な標的DNAの存在下で解離し、それにより、ポリメラーゼ活性が活性化される。続いて、活性化ポリメラーゼにより、標的非依存的に、汎用セルフプライミングシグナル生成ナノストラクチャーが伸長される。修飾デオキシヌクレオチド(dNTP)の導入により、ホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)がシグナル生成ナノストラクチャー上に固定される。光学基質を加えると、酵素反応によって視覚的シグナルが増強される。このシグナルは、肉眼で確認でき、スマートフォンカメラで定量化することが可能である。写真(挿入図)は、標的DNAが存在しない場合(-)と様々な量の標的DNAが存在する場合(+)の、スマートフォンアプリケーション上に表示された実際の視覚的測定結果の例を示している。(b)enVisionマイクロ流体システムの模式図。このプラットフォームは、モジュール方式のenVision作業フローを補完するように設計されている。注入口に特定の認識ナノストラクチャーがあらかじめ装填された別個のアッセイカセットを、オンデマンドで共通のシグナル生成カートリッジに取り付けることができる。共通カートリッジは、汎用シグナル生成ナノストラクチャーを含み、この汎用シグナル生成ナノストラクチャーは、カートリッジに埋め込まれたメンブレンに固定されており、標的非依存性シグナル生成および視覚的検出に用いられる。カセットをスライドさせる方向を矢印で示す。(c)幅広い用途に対応したアッセイの集積化と同時並行処理を実現するために開発したマイクロ流体enVisionプロトタイプの写真。
【００５１】
【図２】enVisionを用いて核酸の定量化を行った結果である。(a)認識ナノストラクチャーの会合および活性。会合した状態の認識ナノストラクチャーを作製し、相補的な標的DNA配列またはスクランブル標的DNA配列とともにインキュべートして、ポリメラーゼの結合および活性を調べた。(上)分子結合のリアルタイムセンサーグラム。アプタマー固定化、ポリメラーゼの添加、標的DNA配列とのインキュベーションという一連の流れで操作を行った。バイオレイヤー干渉法により分子結合をリアルタイム(in situ)で観測して、ポリメラーゼとの結合を確認した。(下)各操作の終了時にTaqmanアッセイ(Taqmanプローブの5'エキソヌクレアーゼ分解による蛍光測定)を並行して行い、各時点でのポリメラーゼ活性を測定した。相補的な標的DNAとともにインキュベートすることで、ポリメラーゼ活性が完全に回復することに留意されたい。(b)シグナル生成ナノストラクチャー活性。比較実験において、セルフプライミングシグナル生成ナノストラクチャーと、同じサイズの線形テンプレートをそれぞれ同じ濃度の活性化DNAポリメラーゼで処理した。ポリメラーゼ活性は、最初のプライミング部位からの距離が異なるヌクレオチド位置に配置されたTaqmanプローブ(黒色中心を含む灰色の点で表示した位置に配置)の5'エキソヌクレアーゼ分解により測定した。(c)enVisionシステムの検出感度。検出限界(点線)は、既知量の標的DNAを滴定し、関連する視覚的シグナルを測定して決定した。視覚的シグナルはすべてスマートフォンで取得したものである。(d)様々な量の標的DNAを用いた場合のenVision測定と蛍光測定との相関。視覚的シグナルは、蛍光シグナルとよい一致を示し(R2 = 0.9828)、蛍光シグナルよりも広いダイナミックレンジを示した。測定はすべて3連で行った。データは平均±s.d.で示した。a.u. = 任意単位。
【００５２】
【図３】enVisionのプログラム性を示した図である。(a)プログラム可能な認識ナノストラクチャーの模式図。このハイブリッド構造は、DNAポリメラーゼ(Pol)と結合してこれを不活化する保存配列領域と、標的DNAと相補的な配列にすることが可能な可変領域(二本鎖部分及び突出末端部分)とからなる。この模式図は原寸に比例して描写したものではない。(b)可変領域における標的のミスマッチの効果。可変領域とのミスマッチ数を変化させて設計した合成DNA標的を、認識ナノストラクチャーとともにインキュベートした。すべてのシグナルは、相補的なDNA標的(ミスマッチ数0)のシグナルで補正したものである。二本鎖領域とのミスマッチにより、シグナルの有意な低下が見られた(*P＜0.05、**P＜0.005、***P＜0.0005、n.s. 有意差なし、スチューデントt検定)。(c)HPV横断的認識。HPVコンセンサスゲノムに基づいて、6種類のHPVサブタイプのDNA標的とのミスマッチを有する2つのHPV横断的認識ナノストラクチャーを作製した。この2つのHPV横断的認識ナノストラクチャーに含まれるミスマッチ数はそれぞれ異なる。すべてのミスマッチは、二本鎖領域および突出末端領域にマッピングされたものである。突出末端領域に多くのミスマッチを有するナノストラクチャー1は、(HPVの)横断的認識能力が高いことが示された。すべてのシグナルは、相補的なDNA標的(陽性)のシグナルで補正したものである。(d)特定のHPVサブタイプ判定用のenVision測定とqPCR測定との比較。HPVゲノムの高度可変領域に基づいて、感度の高い二本鎖領域の配列を変化させた特定のナノストラクチャーを作製した。各HPVサブタイプのDNA標的を、enVisionスマートフォンプラットフォームに表示された色強度(左)またはSYBR(登録商標)-Green qPCRシステムのカウント数(右)により測定した。すべてのシグナルは、適切なコントロール(すなわち、テンプレート非添加のコントロールとしての水)に対する相対値として得られたものである。各検出システムのシグナルは、アッセイ性能を比較できるように全体的に熱マップの形態で示してある。測定はすべて3連で行った。(b)および(c)のデータは平均±s.d.で示した。
【００５３】
【図４】多遺伝子座の検出に対応するマルチプレックス(多種同時)enVisionを示した図である。(a)HPVゲノムマップの新たなプローブ遺伝子座。HPVゲノムは、7つの早期発現(E)遺伝子および2つのカプシドタンパク質(L)遺伝子で構成されている。各HPVサブタイプのE1遺伝子座、L1遺伝子座およびL2遺伝子座を識別する新たなナノストラクチャー認識プローブを設計した。(b)検出範囲の広い、多遺伝子座検出マルチプレックス(多種同時)enVisionアッセイ。CaSki細胞由来ゲノムDNA(左、HPV16陽性)およびHeLa細胞由来ゲノムDNA(右、HPV18陽性)と、各遺伝子座(E1、L1およびL2)の認識プローブまたは3種類のプローブのプール(混合)を直接インキュベートして、各種細胞のHPVの感染状態を調べた。各プローブを単独で用いてアッセイを行った場合と比較すると、混合プローブを用いた方が、有意に高いシグナルが認められた(*P＜0.0005、n.s. 有意差なし、スチューデントt検定；n.d. 未検出)。すべてのシグナルは、混合プローブを用いた場合のシグナルで補正して、パーセンテージで示したものである。(c)各種細胞株を用いたHPVサブタイプ判定。各種細胞株から抽出したゲノムDNAを用いてマルチプレックス(多種同時)enVisionアッセイを直接行い、HPVサブタイプに関するプロファイリングを行った。この測定結果は、過去の文献で報告されているそれぞれの細胞株の公知のHPV感染とよい相関を示した(濃灰色：存在する、薄灰色：存在しない)。測定はすべて3連で行った。データは平均±s.d.で示した。
【００５４】
【図５】患者由来サンプルの分子プロファイリングを行った結果である。(a)臨床で採取した子宮頸管内膜ブラシサンプル(n = 35)を用いて、HPV 16およびHPV 18のシグナルを測定した。L1特異的シグナルを、臨床で用いられるゴールドスタンダード法と比較して示した。すべての臨床検体の多遺伝子座の測定結果については、図19を参照のこと。(b)HPV 16およびHPV 18のL1遺伝子座アッセイの受信者動作特性(ROC)曲線を用いて検出精度を調べた。Youden's Indexによるカットオフ値を用いた場合、HPV 16アッセイでは、感度が92.9%(13/14)、特異度が90.5%(19/21)であり、HPV 18アッセイでは、感度が83.3%(5/6)、特異度が100%(29/29)であった。(c)全患者に対して、遺伝子座別のHPV 16 enVisionアッセイ(L1遺伝子座アッセイ、L2遺伝子座アッセイおよびE1遺伝子座アッセイ)を行った。L1陽性患者(左)、L1陰性患者(右)のそれぞれの代表例を示す。L1陰性患者のサブセットでは、L2遺伝子座およびE1遺伝子座のアッセイを含めることで検出範囲が拡大し、従来検出不可能であった感染を確認できたことに留意されたい。これは、独立して実施したTaqman(登録商標)蛍光分析によっても検証されており、試験対象のすべての臨床検体において、Taqman(登録商標)蛍光分析結果とenVision分析結果は高い一致を示した(図20を参照)。測定はすべて3連で行った。データは平均±s.d.で示した。AUC値：濃度曲線下面積。
【００５５】
【図６】enVisionマイクロ流体プラットフォームの模式図を示した図である。(a)当該プラットフォームの立体分解図および(b)当該プラットフォームの側断面図。当該プラットフォームは、無比のアッセイカセットと共通のシグナル生成カートリッジとを含む。各アッセイカセットには、無比の認識ナノストラクチャーがあらかじめ装填されており、混合効率の向上のために蛇行形状のマイクロチャネルがさらに備えられている。共通カートリッジには、ポリカーボネートメンブレンが埋め込まれており、このメンブレンにシグナル生成ナノストラクチャーが固定されている。セプタムを介した吸引によりサンプル注入口から共通排出口へと移動する流体の流れを矢印で示す。
【００５６】
【図７】本発明のデバイスの操作の概略である。
【００５７】
【図８】認識ナノストラクチャーの活性を示した図である。(a)固定量のポリメラーゼ(5unit)に加える抑制性アプタマーの量を変化させて、抑制効果が最大になる認識ナノストラクチャー複合体を形成する最適比を調べた。(b)最適化されたナノストラクチャー複合体に、様々な量の相補的なDNA標的またはコントロールとして様々な量のスクランブルオリゴヌクレオチド配列を加えてインキュベートした。相補的な標的を加えた場合は、添加量に比例したポリメラーゼ活性の大きな増加(バー)がみられたが、スクランブルオリゴヌクレオチド配列を加えた場合は、無視できる程度の活性(ベースライン)しか見られなかったことに留意されたい(*P＜0.05、***P＜0.0005、****P＜<0.00005、スチューデントt検定)。測定はすべて3連で行った。データは平均±s.d.で示した。
【００５８】
【図９】シグナル生成ナノストラクチャーのアニーリングを示した図である。(a)ヘアピン構造のシグナル生成ナノストラクチャーとそれと同サイズの線形ナノストラクチャー(過剰量のプライマーとともに)を、室温で8%未変性ゲル電気泳動により分離した。各サンプルのプライミング分画と非プライミング分画のそれぞれのバンド強度を調べた(*****P＜0.000005、スチューデントt検定)。(b)セルフプライミングシグナル生成ナノストラクチャーとその線形ナノストラクチャーの融解曲線解析。反応温度を上げながら、SYBR(登録商標) Green蛍光強度を測定して、二本鎖DNAの解離特性を評価した。点線は、各核酸で観測された融点(Tm)を示す。セルフプライミングシグナル生成ナノストラクチャーは、その線形ナノストラクチャー(過剰量のプライマーとともに)より高いTm値を示した。測定はすべて3連で行った。(a)のデータは平均±s.d.で示した。
【００５９】
【図１０】視覚的測定と蛍光測定のそれぞれの結果を示した図である。(a)酵素反応の最適化。コントロール(水)と様々な量のDNA標的の存在下、DNAポリメラーゼ(DNA pol、上)とHRP(下)のリアルタイム活性を測定した。ポリメラーゼ活性は、Taqman(登録商標)アッセイ(Taqman(登録商標)プローブの5'エキソヌクレアーゼ分解による蛍光測定)により確認し、HRP活性は、スマートフォンでの強度測定により確認した。ポリメラーゼ活性は、「デバイスの操作」の工程1〜3に、HRP活性は、工程4に対応している(図7を参照)。この結果から、各酵素反応の最適時間は、それぞれ約20分と約3分と決定した。(b)enVision測定結果の例示画像(上)、各画像をグレースケールに変換したもの(中央)、およびグレースケールのピクセル強度の分布(下)。各スポット画像の平均ピクセル強度を用いて、シグナルの定量化および補正を行った。(c)enVisionシステムの視覚的検出感度。検出限界(点線)は、既知量の標的DNAを直接(非対称増幅を行わず)滴定し、室温にて、関連する視覚的シグナルをenVisionプラットフォームで測定して決定した。視覚的シグナルはすべてスマートフォンで取得したものである。(d)蛍光検出感度。検出限界(点線)は、認識ナノストラクチャーを用いて、既知量の標的DNAを直接滴定して決定した。ポリメラーゼ活性は、蛍光性Taqman(登録商標)プローブの5'エキソヌクレアーゼ分解により測定した。蛍光シグナルはすべて市販のqPCR蛍光検出器により取得したものである。測定はすべて3連で行った。データは平均±s.d.で示した。a.u. 任意単位。
【００６０】
【図１１】非対称Nested増幅を示した図である。(a)Nested増幅の模式図。微量サンプル中の一本鎖DNAを大量に増やすために、非対称Nested PCR増幅を行った。まず、同じ濃度の2つのプライマーを用いて、サンプルを指数関数的に増幅させ、次に、過剰量の片方のプライマーを用いて、直線的に増幅させた。(b)Nested非対称増幅の効率。合成したHPV 16配列を、(1)1pmole、(2)100fmole、(3)10fmole、(4)1fmole、(5)100amole、(6)10amoleおよび(7)1amole用いた場合、ならびに(8)テンプレート非添加コントロールを用いた場合の増幅産物を8%PAGEゲルで分析した。上の矢印は、サイズの大きい二本鎖産物を示し、下の矢印は、一本鎖産物に相当する。
【００６１】
【図１２】核酸配列に基づく増幅法(NASBA)を示した図である。(a)NASBAの模式図。まず、DNA標的をプライミングさせて、T7 RNAポリメラーゼによるRNA転写と一本鎖RNA増幅を行った。次に、RNA産物を逆転写してcDNAを生成し、RNAを分解して一本鎖DNA産物を得た。(b)NASBAの効率。合成したHPV 16配列を、(1)1pmole、(2)100fmole、(3)10fmole、(4)1fmole、(5)100amole、(6)10amoleおよび(7)1amole用いた場合、ならびに(8)テンプレート非添加コントロールを用いた場合の増幅産物を8%PAGEゲルで分析した。矢印は、予想されるDNA産物のサイズを示す。
【００６２】
【図１３】SYBR(登録商標) Green qPCR反応の融解曲線解析を示した図である。(a)HPV 6、(b)HPV 11、(c)HPV 16、(d)HPV 18、(e)HPV 31、(f)HPV 33、(g)HPV 58および(h)HPV 66の各配列のプライマーペアの融解曲線。各プライマーセットについて、標的テンプレート(破線)、別のHPVサブタイプ由来のオフターゲット(非標的)テンプレート(実線)、またはテンプレート非添加コントロール(水、一点鎖線)を用いて試験を行った。測定はすべて3連で行った。測定結果は平均蛍光強度の線グラフで示した。
【００６３】
【図１４】RNA直接検出を示した図である。開発したenVisionアッセイ(すなわち、HPV 16アッセイおよびHPV 18アッセイ)を用いて、各HPVサブタイプのDNA(左)およびRNA(右)の直接検出の検証を行った。いずれのRNA標的も、cDNA変換を行わずに直接用いた。標的は、相補的またはオフターゲット(非標的)を想定した。enVisionアッセイでは、RNA標的に対してもDNA標的と同程度のシグナルレベルが示され、一方、いずれの場合もオフターゲット(非標的)に対するシグナルはベースラインに近かったことから、enVisionアッセイは、特異的にRNA標的を直接検出できることが証明された。シグナルはすべて各アッセイの陽性DNAシグナルで補正し、相対的な比較を行った。測定はすべて3連で行った。データは平均±s.d.で示した。
【００６４】
【図１５】enVision論理ゲートを示した図である。認識ナノストラクチャーの組み合わせと、各ナノストラクチャーの構成要素(すなわち、アプタマー、インバーターおよびポリメラーゼ)の比率を変化させて、以下の論理演算をプログラムした：(a)ANDゲート、(b)ORゲート、(c)HPV 16用のNOTゲート、(d)HPV 18用のNOTゲート、(e)NANDゲート、および(f)NORゲート。設計した各ゲートに関して、それぞれの構成の作製に使用した構成要素を図示した(各パネルの右上)。HPV 16から単離したDNA標的(標的1)およびHPV 18から単離したDNA標的(標的2)を様々に組み合わせて、各ゲートの検証を行った。すべての標的の組み合わせおよび各組み合わせで予想される演算出力を、対応する真理値表にまとめて示した(各パネルの左下)。観測されたenVisionシグナルは、予想出力とよい一致を示した(各パネルの右下)。シグナルはすべて、前述したように適切なコントロール(標的非添加コントロール)で補正したものである。検出限界(すなわち、バックグラウンドシグナルよりもその標準偏差の3倍高い値)を超えた補正シグナルを真のシグナル(灰色バー)とし、それ以外の場合は、偽のシグナル(黒色バー)とした。測定はすべて3連で行った。データは平均±s.d.で示した。
【００６５】
【図１６】enVisionのORおよびANDの論理ゲートを用いて複数の標的の組み合わせの検出を行った結果である。認識ナノストラクチャーの組み合わせと、各ナノストラクチャーの構成要素(すなわち、アプタマー、インバーターおよびポリメラーゼ)の比率を変化させることにより、論理ゲートを用いて、複数の標的を同時検出した。測定はすべて3連で行った。データは平均±s.d.で示した。
【００６６】
【図１７】ゲノムDNAのマルチプレックス(多種同時)増幅を示した図である。CaSki細胞のゲノムDNAから得られた増幅産物の完全なゲル電気泳動図。HPV 16遺伝子座の各種プライマーの存在下で、ゲノムDNAを増幅した：(1)E1、(2)L1、(3)L2、(4)E1、L1およびL2の混合プライマー、ならびに(5)プライマーなし。レーン7には、15bp DNAラダーをロードした。矢印は50bpのバンドの位置を示す。
【００６７】
【図１８】ゲノムDNAのマルチプレックス(多種同時)enVision検出結果を示した図である。各細胞(上：CaSki、中央：HeLa、下：C33-a)のゲノムDNAを等量ずつ用意し、2種類のHPVサブタイプ(左：HPV 16、右：HPV 18)のそれぞれに特異的な認識ナノストラクチャーと各ゲノムDNAを直接インキュベートした。サンプルを、各認識ナノストラクチャー(すなわち、E1、L1およびL2)またはこれら3種類のナノストラクチャーが同時に存在するプール(混合)で処理した。シグナルはすべて、各HPVサブタイプで観測されたシグナルの最大値で補正し、パーセンテージで示したものである。マルチプレックス(多種同時)測定は、それぞれの細胞株の公知のHPV感染とよい相関が見られた(水平方向の灰色のバー：存在する、水平方向の白色のバー：存在しない)。単一遺伝子座測定では、感染陽性の見落しがある(例えば、HeLa細胞、HPV 18遺伝子座L2)ことに留意されたい。測定はすべて3連で行った。データは平均±s.d.で示した。
【００６８】
【図１９】enVisionとLAMPの設計および性能を比較した図である。(a)各HPVサブタイプのE1遺伝子座、L1遺伝子座およびL2遺伝子座の高度可変領域に見られるプローブ選択肢の比較。enVisionシステム(左)とLAMP(右)のプローブ選択肢を確認した。enVisionプラットフォームは、プローブ選択肢が多いだけでなく、分析した領域全体を網羅するものであった。(b)細胞由来ゲノムDNAのHPVサブタイプ判定におけるenVision(左)と上位のLAMPプライマーセット(右)の性能の比較。EnVisionでは、感度が83.3%(5/6)、特異度が100%(12/12)であり、LAMPでは、感度が50.0%(3/6)、特異度が75.0%(9/12)であった。公知の種々の感染細胞株を用いて、多遺伝子座測定を行った。シグナルはすべて、前述したように適切なコントロール(標的非添加コントロール)で補正したものである。公知の感染細胞の感染状態(水平方向の灰色のバー：存在する、水平方向の白色のバー：存在しない)に照らし合わせてみると、enVisionテクノロジーでは正確にHPVサブタイプ判定が行われていることに留意されたい。LAMPでは、顕著な偽陽性(例えば、CaSki細胞のHPV 18、HeLa細胞のHPV 16)が認められた。測定はすべて3連で行った。データは平均±s.d.で示した。
【００６９】
【図２０】臨床サンプルを用いてマルチプレックス(多種同時)enVision検出を行った結果である。臨床で採取した子宮頸管内膜ブラシサンプル(患者数n = 35)を用いて、検出範囲の広い、多遺伝子座enVisionアッセイ(E1、L1およびL2の同時検出)を行い、HPV 16(上パネル)とHPV 18(下パネル)の分子サブタイプ判定を試みた。測定はすべて3連で行った。データは平均±s.d.で示した。
【００７０】
【図２１】Taqman(登録商標)蛍光アッセイを用いて臨床的検証を行った結果である。HPV 16のE1遺伝子座、L1遺伝子座およびL2遺伝子座をそれぞれ検出するTaqman(登録商標)アッセイを設計した。臨床的検証アッセイはすべてqPCR解析で行った。各サンプルのGAPDH発現量で補正することにより相対定量を行った。得られたデータが、enVisionプラットフォームで検出されたシグナルとよい相関を示し、従来検出不可能であった感染を確認できていることに留意されたい(図5cを参照)。測定はすべて3連で行った。データは平均±s.d.で示した。
【００７１】
【図２２】二本鎖部分のヌクレオチド数が異なるアプタマーのDNAポリメラーゼ阻害効率を示した図である。阻害効率は、二本鎖部分のヌクレオチド数が約20個になると横ばい状態になる。測定はすべて3連で行った。データは平均±s.d.で示した。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
本発明には、複数の有利な点がある。第1の利点は、検知メカニズムである。本発明のテクノロジーでは、標的とのハイブリダイゼーションの直後に活性化が誘起され、顕著なシグナル増強への変換が起こる。本発明のテクノロジーでは、2つの酵素によるシグナル生成カスケード(例えば、DNAポリメラーゼおよびホースラディシュペルオキシダーゼ)を組み込むことで、2つの酵素の活性による、多様な標的の視覚的検出が可能となっている。enVisionプラットフォームでは、標的核酸の増幅を行わなくても、肉眼で確認でき、かつスマートフォンで定量可能な色測定結果が迅速に得られる。この検知メカニズムにより、本発明のテクノロジーを利用すれば、大規模な装置を使用しなくても、様々な種類の核酸(例えば、DNAおよびRNA、cDNAへの変換が不要)を正確に直接検出することができると考えられる。第2の利点は、アッセイのプログラム性である。本発明のテクノロジーでは、認識とシグナル生成が分離されていることで、モジュール方式の検出および幅広い用途に対応した集積化が可能である。プログラム可能な認識要素の1つの配列領域に変更を加えるだけで、容易に新規のアッセイを設計することができ、論理演算を行うように構成することができる。汎用シグナル生成要素は、すべての視覚的測定に用いることができる。enVisionテクノロジーを、自由に構成可能なマイクロ流体プラットフォームで実行することで、高い検出感度とプログラム性が実現できるため、感染細胞から得た多様な病原体核酸の視覚的なプロファイリングが室温にて可能になる。1回の反応で解析する遺伝子座を多重化することにより、様々なウイルス宿主ゲノム組込み遺伝子座を調べることができる、検出範囲の広いenVisionシステムをさらに開発した。臨床モデルとしてHPVを用いて、本発明のテクノロジーが、サブタイプ内の検出範囲を拡大させるとともにサブタイプ間のさらなる差別化を実現できることを示し、患者の子宮頸管内膜サンプルの感染の分子タイピングにおいて臨床的に有用であることを実証した。
【００７３】
本明細書に記載の参考文献は、便宜上、実施例の末尾に参考文献一覧として記した。このような参考文献の内容全体は、参考により本明細書に援用される。
【００７４】
定義
別段の定めがない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。明細書、実施例および添付の請求項で使用するいくつかの用語を便宜上ここにまとめて記す。
【００７５】
本明細書および添付の請求項において、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈上明らかに別段の解釈がなされる場合を除き、複数についての言及も含むことに留意されたい。したがって、例えば、「1つの標的配列(a target sequence)」についての言及は、複数の標的配列を包含するものであり、「1つの酵素(an enzyme)」についての言及は、1つ以上の酵素および当業者に公知のその等価物についての言及である。
【００７６】
本明細書において、用語「アプタマー」は、一本鎖のDNA分子または一本鎖のRNA分子を表す。アプタマーは、高い親和性および高い特異性で様々な分子に結合する。例えば、本明細書において、DNAアプタマーは、標的DNAの非存在下において、ポリメラーゼと強く結合してポリメラーゼ活性を阻害する。
【００７７】
語句「核酸」または「核酸配列」は、本明細書において、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドもしくはこれらのフラグメント；一本鎖、二本鎖のいずれであってもよく、センス鎖、アンチセンス鎖のいずれであってもよい、ゲノムDNA、ゲノムRNA、合成DNAもしくは合成RNA；ペプチド核酸(PNA)；またはDNA様の物質もしくはRNA様の物質を表す。
【００７８】
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも約6〜60個のヌクレオチド、好ましくは約15〜30個のヌクレオチド、最も好ましくは約20〜25個のヌクレオチドからなる核酸配列を表し、PCR増幅、ハイブリダイゼーションアッセイまたはマイクロアレイに使用可能な核酸配列を表す。本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は、用語「アンプリマー」、「プライマー」、「オリゴマー」および「プローブ」と実質的に同義であり、これらの用語は、一般に当技術分野で定義されている用語である。
【００７９】
本明細書において、用語「インバーター配列」または「インバーターオリゴヌクレオチド」は、標的核酸配列と相補的なオリゴヌクレオチドであって、一部が二本鎖を形成し、別の一部が突出末端を構成するオリゴヌクレオチドを表す。本明細書において、二本鎖配列および突出末端配列を構成する20個のヌクレオチドより長い配列が、DNAポリメラーゼ酵素と結合するアプタマーを安定化することにより、DNAポリメラーゼに対して強力な抑制作用を発揮することが示されている。この抑制作用は、環境温度で相補的な標的を存在させることで消失させることが可能である。インバーター配列の存在の有無により、認識要素の機能的状態(例えば、オン状態またはオフ状態)が決まる。インバーター配列の存在下では、標的によってポリメラーゼ活性はオン状態になり、インバーター配列の非存在下では、標的によってポリメラーゼ活性はオフ状態になりうる。図3aは、ポリメラーゼ、アプタマーおよびインバーターの配置を示す模式図である。
【００８０】
本明細書において、用語「可変配列領域」は、標的配列に対する配列特異性を決定する領域(すなわち、認識されうる標的配列を定める領域)を表す。インバーター配列、およびアプタマー配列の一部は、この可変配列領域に含まれる。この領域は、新たな標的を検出できるように変更することができる。インバーター配列を使用しない場合、「可変配列領域」は、標的核酸と相補的なアプタマーの突出末端部分を表す。
【００８１】
用語「サンプル」は、本明細書において、最も広い定義で使用される。例えば、以下に限定されないが、HPV 6、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33およびHPV 5などのHPVのゲノム配列の存在が疑われる生物学的サンプルとしては、体液；細胞抽出物、細胞から単離された染色体、細胞小器官もしくは膜；細胞；ゲノムDNA、RNAまたはcDNA(溶液中に含まれるもの、または固体担体と結合した状態のもの)；組織；組織印刷物(tissue print)などが含まれる。
【００８２】
本発明で使用されるオリゴヌクレオチドは、構造的修飾および／または化学的修飾が施されていてもよく、例えば、本発明の方法を実施する際に、ヌクレアーゼが含まれている可能性があるサンプル中で当該オリゴヌクレオチドの活性が長く持続するように修飾を施してもよく、キットの保存期間が長くなるように修飾を施してもよいことは理解されるであろう。したがって、本発明で使用されるアプタマー、インバーター、シグナル生成ナノストラクチャー、または任意のオリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブは、化学的に修飾されていてもよい。いくつかの実施形態において、前記構造的修飾および／または化学的修飾には、合成時における、蛍光性タグ、放射性タグ、ビオチン、5'テールなどのタグの付加、ホスホロチオエート(PS)結合の付加、2'-O-メチル化、および／またはホスホロアミダイトC3スペーサーの付加などが含まれる。
【００８３】
例えば、シグナル生成オリゴヌクレオチドは、付加反応により5'アミノ基による修飾が施されていてもよい。その他の付加修飾としては、チオール、アクリダイト、アジドなどによる5'末端への修飾が可能である。
【００８４】
本明細書において、用語「含む(comprising)」または「包含する(including)」は、提示した特徴、整数、工程または構成要素が記載の通りに存在することを規定すると解釈される用語であるが、1つ以上の特徴、整数、工程もしくは構成要素またはこれらの群の存在または付加を排除するものではない。しかし、本開示の文脈において、用語「含む(comprising)」または「包含する(including)」には、「からなる(consisting of)」も含まれる。「含む(comprising)」という語の変化形、例えば、「含む(comprise)」および「含む(comprises)」などは、相応に変化した意味を有する。「包含する(including)」という語の変化形である「包含する(include)」および「包含する(includes)」なども同様である。
【実施例】
【００８５】
具体的な記載のない当技術分野で公知の標準的な分子生物学手法については、概してGreen and Sambrook, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, New York (2012)の記載に従って実施した。
【００８６】
実施例1
方法
【００８７】
認識ナノストラクチャーの特性評価
すべての配列は表1〜7に記載されており、いずれも Integrated DNA Technologies(IDT)から購入した。認識ナノストラクチャーを調製するために、50mM NaCl、1.5mM MgCl2および50mM  Tris-HCl緩衝液(pH 8.5)からなる緩衝液に、DNAアプタマーとインバーターオリゴヌクレオチドを等モル比で加えて混合した。この混合物を95℃で5分間インキュベートした後、反応液が25℃になるまで0.1℃/sの速度でゆっくり冷却し、次いで、Taq DNAポリメラーゼ(GoTaq(登録商標)、Promega)を添加して、ハイブリッド複合体を形成させた。DNA標的の存在下における認識ナノストラクチャーの会合特性と活性特性を明らかにするために、この混合物に様々な濃度のオリゴヌクレオチドを添加した。この複合体の結合速度と解離速度を、バイオレイヤー干渉法(Pall Fortebio)によりリアルタイムで測定した。以下、簡潔に説明する。あらかじめ作製したビオチン標識アプタマーをストレプトアビジン標識干渉センサーに固定した。短時間の洗浄ステップを経て、Taqポリメラーゼを添加した。次いで、標的オリゴヌクレオチドを加えてインキュベートした。すべての結合データ(バイオレイヤーの光学厚さの変化)は、波長シフトとして連続的に測定したものである。さらに、Taqman(登録商標)プローブ(Applied Biosystems)の5'エキソヌクレアーゼ分解によるポリメラーゼ活性を測定した。Taqman(登録商標)プローブ存在下で、蛍光読取値を2分おきに取得し、記載の方法(後述のデータ補正を参照)で補正して、ポリメラーゼ活性を比較した。
【００８８】
シグナル生成ナノストラクチャーの特性評価
シグナル生成ナノストラクチャーの安定性を、2つの異なる方法で測定し、同じサイズの線形テンプレートと比較した。1つの方法としては、室温で2つの反応液(すなわち、ナノストラクチャーと線形テンプレート)をそれぞれアニールさせ、各反応液のプライミング画分と非プライミング画分について、それぞれゲル電気泳動で分析した。別の方法としては、融解曲線解析を行った。融解曲線解析では、オリゴヌクレオチドと、10,000倍希釈したSYBR(登録商標) Green I 色素(Invitrogen)を混合し、反応液を90℃に加熱した後、1.6℃/sの速度で45℃まで急速に冷却し、再び、0.075℃/sの速度で90℃までゆっくり加熱した。この間、インターカレートした色素の蛍光強度を記録した(Applied Biosystems)。さらに、シグナル生成ナノストラクチャーがポリメラーゼ活性を向上させる能力を有するか否かをTaqman(登録商標)解析により調べた。ポリメラーゼ活性は、最初のプライミング部位からの距離が異なるヌクレオチド位置に配置されたTaqman(登録商標)プローブ(Applied Biosystems)の5'エキソヌクレアーゼ分解により測定した。
【００８９】
enVisionデバイスの作製
4つのアッセイカセットと共通カートリッジとを含むenVisionデバイスのプロトタイプは、ポリジメチルシロキサン(PDMS、Dow Corning)とポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)でそれぞれ作製した。各アッセイカセットは、2つのPDMS薄片をプラズマ接合(50mTorr、50W、1分)により積層して作製した。SU-8フォトレジストとシリコンウエハ―を用いて、厚さ200μmの鍛造用金型を慣用のフォトリソグラフィーにより作製した。この鍛造用金型に未硬化PDMS(エラストマー基材と硬化剤との比率が10：1)を流し込み、反応チャンバーとマイクロチャネルを複製した。ポリマー硬化(75℃、30分)により、この2つのPDMS薄片を一体化させた。共通カートリッジは、CO2レーザーアブレーション(Universal Laser Systems)により作製した。孔径0.2μmの4枚のポリカーボネートメンブレン(Avanti Polar Lipids)を、2つのPMMA層の間に埋め込み、熱接合(125℃、30分)した。NanoPort(商標)アセンブリ(Upchurch Scientific)を、共通カートリッジの排出口に装着して流体連通を可能にした。
【００９０】
シグナル生成ナノストラクチャーの固定化
アミン修飾オリゴヌクレオチド(IDT)を官能化に用いた。アミン修飾オリゴヌクレオチドのマイクロ流体デバイスへの固定には、オリゴヌクレオチドが固定される表面積を大きくするために、ポリスチレンビーズを用いた。3μmのカルボン酸修飾ポリスチレンビーズ(Spherotech)をPBSバッファーで洗浄して、MESバッファー(Thermo Fisher Scientific)に再懸濁した。このビーズを、室温で15分間EDC/sulfo-NHS(Pierce Biotechnology)で活性化し、PBSバッファー中で過剰量の5'アミン修飾オリゴヌクレオチドとともに室温で2時間インキュベートした。反応後、ビーズを遠心分離により洗浄して、10mM Tris-EDTAバッファーに再懸濁した。
【００９１】
デバイスの作製
操作用デバイスを作製するために、ビーズに固定したシグナル生成ナノストラクチャーと、修飾dNTP反応液とを共通カートリッジ上で凍結乾燥した。デバイスはすべて凍結乾燥前にエタノールとPBSバッファーで洗浄した。以下、簡潔に説明する。dATP、dGTP、dTTP、および25%dCTP：75%ビオチン-16-アミノアリル-2'-dCTP(Trilink biotechnologies)を混合して、dNTP反応液の4mMストック液を調製した。50μgのDNA官能化ポリスチレンビーズ(3μm、上記方法で調製したもの)を、20μlのdNTP反応液とともにデバイスのポリカーボネートメンブレン上に導入し、30分間真空下で乾燥させた(Labconco FreeZone)。
【００９２】
enVisionプラットフォームの操作
操作工程は図7に示す。50mM NaCl、1.5mM MgCl2および50mM Tris-HCl(pH 8.5)を含むバッファーで調製した核酸サンプルを、会合した状態の認識ナノストラクチャーが装填された各アッセイカセットの注入口に添加した。次いで、アッセイカセットを、上記の方法で作製した共通のシグナル生成カートリッジに装着した。アッセイの最適化のために、シリンジポンプ(Harvard Instruments)を用いて共通カートリッジの排出口に陰圧をかけることで、4つすべてのアッセイカセットで並行して流体の移動を行った。反応液が蛇行チャネルを通ることで、効果的な混合とポリメラーゼの活性化が行われ(10μl/分、1分)、その後、反応液が反応チャンバーに入る。次いで、DNA官能化ポリスチレンビーズとdNTP反応液の存在下、反応液を20分間インキュベートした。その後、ビーズを過剰量のPBSバッファーで洗浄し(10μl/分、3分)、ストレプトアビジン-HRP(BD Biosciences、3分)と3,3'-ジアミノベンジジン基質(DAB、Thermo Fisher Scientific、3分)とともにインキュベートした。
【００９３】
enVision作業フローにおける重要な工程は、大部分はインキュベーションと洗浄であるため、正確な流量設定が不要な場合は、セプタム(Thermo Fisher)を介した吸引により陰圧をかけて流体を移動させた。すべての反応は室温で行い、適切なネガティブコントロールを含めて実施した。サンプルとコントロールの視覚的測定の結果は、モバイルスマートフォン(Samsung)で直接撮影した。カラー画像をグレースケールに変換し、各メンブレン上の、トラップされたシグナル生成DNAビーズを有する領域の黒色画素の平均強度から、シグナルの数値定量化を行った。
【００９４】
2021529540.tif 000003
【００９５】
2021529540.tif 000004
【００９６】
配列設計
HPVゲノム配列は、GenBankから以下の参照番号により取得した(HPV 6: AF092932.1, HPV 11: FR872717.1, HPV 16: K02718.1, HPV 18: AY262282.1, HPV 31: J04353.1, HPV 33: M12732.1, HPV 58: D90400.1, HPV 66: U31794.1)。Clustal Omegaソフトウェア[Sievers, F. et al. Mol Syst Biol 7: 539 (2011)]を用いて、マルチ配列アラインメントを行った。配列アラインメントの結果から、高度保存配列と高度可変配列を定めて、(HPVの)横断的認識ナノストラクチャーとサブタイプ特異的認識ナノストラクチャーをそれぞれ設計した。以下、簡潔に説明する。上流と下流に保存性が低い領域(20bp、共通でない塩基対が6未満)が隣接している高度保存領域(20bp、共通でない塩基対が3未満)を複数同定した。その中から最も保存性の高いモチーフを、独自のHPV横断的認識ナノストラクチャーの認識ドメインとして選択した。サブタイプ特異的認識ナノストラクチャーを設計するために、高度可変領域(40bp、共通の塩基対が12未満)を同定した。同様の方法で、HPVゲノムのL1遺伝子、L2遺伝子とE1遺伝子の可変領域を定め、検出範囲を拡大するために、各HPVサブタイプの遺伝子座特異的認識ナノストラクチャーを設計した。設計した配列はすべて表に記載されている。
【００９７】
ミスマッチの特性評価
認識ナノストラクチャーにおける二本鎖領域と突出末端領域のミスマッチ感度を評価するために、相補的なDNA標的に、2ヌクレオチド間隔で無作為に変異させた塩基対を導入し、enVisionプラットフォームを用いてシグナル変化を測定した。認識ナノストラクチャーのHPV横断的検出能力を調べるために、標的配列として、6種類のHPVサブタイプ(HPV 6、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33およびHPV 58)の配列と完全に相補的な配列(ポジティブコントロール)とを用いた。二本鎖領域および突出末端領域とのミスマッチヌクレオチドをそれぞれマッピングして、シグナル変化を測定した。
【００９８】
非対称増幅
サンプルが微量の場合には、非対称Nested PCR増幅により一本鎖DNAを調製した。増幅完了までの時間は1時間未満であった。2.5mM dNTPを含む1×GoTaq(登録商標)バッファーに、各0.8μMのフォワードプライマーとリバースプライマー(IDT)および5unitのGoTaq(登録商標)DNAポリメラーゼ(Promega)を加えたものを用いて、指数関数的な増幅を行った。その後、2.5mM dNTPを含む1×GoTaq(登録商標)バッファーに過剰量のリバースプライマーのみを加えたものを用いて、GoTaq(登録商標)DNAポリメラーゼ(Promega)の存在下、線形非対称PCR増幅を行った。すべての処理において、以下の熱サイクル条件を用いた：最初に95℃5分、続いて、95℃30秒および52℃60秒を35サイクル、最後に4℃で保持。PCR反応液をそのままその後の測定に使用した。
【００９９】
非対称等温増幅
核酸配列に基づく増幅法(NASBA)を採用して、非対称等温増幅を行った。全過程の完了までに要した時間は1時間未満であった。2.5mM dNTP、5mM NTP、6mM MgCl2、5mM DTTおよび15%DMSOを含む1×転写最適化バッファーに、各4μMのフォワードプライマーとリバースプライマー(IDT)、80unitのT7 RNAポリメラーゼ、1unitのRNase H、80unitのGoScript(商標)逆転写酵素および1unitのRNase阻害剤(Promega)を加えたものを準備した。これにサンプルを加えて、反応液を37℃で45分間維持した後、75℃に加熱して反応を停止させた。
【０１００】
SYBR(登録商標) qPCR比較
HPVのサブタイプ特異的な配列を用いて比較を行った。合成オリゴヌクレオチドのサブタイプ特異的な検出を、上記の方法と同様にして、enVisionプラットフォームを用いて行った。qPCR(Applied Biosystems)を実施するために、同じ標的配列を増幅する特定のPCRプライマーセットを各HPVサブタイプで設計した。以下、簡潔に説明する。2.5mM dNTPおよび各0.8μMのフォワードプライマーとリバースプライマーを含む1×GoTaq(登録商標)バッファー中で、100fmolの合成テンプレートを、5unitのGoTaq(登録商標)DNAポリメラーゼ(Promega)と混合し、以下の熱サイクルプロトコールを用いて反応を行った：50℃2分、95℃10分に続いて、95℃15秒および48℃1分を40サイクル。qPCR解析後、温度を50℃から95℃へと0.075℃/sの速度で徐々に上昇させて融解曲線分析を行い、非特異増幅を確認した。qPCR反応でプライマーダイマーが形成されていないことを確認するために、いずれのプライマーアッセイにおいても、テンプレート非添加コントロール(水)を用意した。qPCR閾値サイクル(Ct)シグナルは、それぞれのプライマーペア／テンプレートの組み合わせに応じて決定した。各qPCRプライマーアッセイにより得られたシグナルの補正は、当該アッセイで対象としたすべての標的全体に対して行い、アッセイの特異性を確認した。
【０１０１】
RNA直接検出
T7 RNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を用いて、RNA標的を調製した。以下、簡潔に説明する。DNAテンプレートをT7プロモータープライマー(表3)(1pmol)とアニールさせて、1×バッファー中でT7 RNAポリメラーゼとともに37℃で2時間インキュベートした。その後、2unitのRNase-Free DNase I(Promega)を加えて、41℃で20分間インキュベートした。0.3M酢酸ナトリウムを加えて、合成したRNAを沈殿させた。この混合物を1容量のイソプロパノールで処理して、4℃で1時間インキュベートした後、遠心分離を行った(12,000g、4℃、30分)。得られたペレットを冷却したエタノール(75%)で2回洗浄した後、先と同様に遠心分離を行い、室温で風乾した。ヌクレアーゼ不含水に溶解したRNAの最終濃度を吸光度測定(Nanodrop、Fisher Scientific)により求めた。1unitのSUPERase RNase阻害剤(SUPERase.In(商標)、Thermo Fisher)の存在下、調製したRNA標的をenVisionシステムに加えて、RNAの直接検出を試みた。検出およびデータ補正はすべて上記と同様に行った。
【０１０２】
enVision論理ゲートの構築
論理ゲートの構成および構成要素はすべて、図15および表5にそれぞれまとめて示す。以下、簡潔に説明する。会合した状態の認識ナノストラクチャーを用いて、AND、OR、NOT、NANDおよびNORの各機能を表した。各種ゲートの構築において、認識ナノストラクチャーの組み合わせと、各ハイブリッドナノストラクチャーにおける構成比(すなわち、DNAアプタマー:DNAインバーター:Taqポリメラーゼの比率)を変化させて、異なる演算機能をプログラムした。具体的に述べると、ANDゲートの調製には、構成比(1:1:0.5)で混合されている認識ナノストラクチャーを2つ用いた。ORゲートの調製には、 構成比が(1:1:1)の認識ナノストラクチャーを2つ用いた。NOTゲートの調製には、 構成比が(1:0:1)の認識ナノストラクチャーを1つ用いた。NANDゲートの調製には、 構成比が(1:0:1)の認識ナノストラクチャーを2つ用いた。NORゲートの調製には、 構成比が(1:0:0.5)の認識ナノストラクチャーを2つ用いた。認識ナノストラクチャーはすべて、先に記載した方法で会合状態にしたものである。すべての論理ゲートで、汎用シグナル生成ナノストラクチャーを共通で用いた。真理値表の記載の通りにDNA標的を様々に組み合わせたものを用いて、各ゲート構成の検証を行い、enVisionシグナルと予想される出力とを比較した。シグナルは上記と同様に補正した。検出閾値を上回る(すなわち、バックグラウンドシグナルの標準偏差の3倍を上回る)補正シグナルを、真のシグナルとし、これを満たさないシグナルは偽シグナルとした。
【０１０３】
細胞培養およびDNA抽出
ヒト細胞株はすべてATCCより入手した：CaSki(ATCC CRL-1550)、SiHa(ATCC HTB-35)、HeLa(ATCC CCL-2)、 PZ-HPV-7(ATCC CRL2221)。CaSki細胞の増殖にはRMPI-1640を用いた。SiHa、HeLaおよびC33-aの増殖には、10%FBSおよびペニシリン−ストレプトマイシン(Corning)を含むEagle最小必須培地(Eagle's Minimal Essential Medium)を用いた。PZ-HPV-7の増殖には、ウシ脳下垂体抽出物およびヒト組換え上皮増殖因子(ATCC)を含む角化細胞用無血清培地(Keratinocyte Serum Free Medium)を用いた。これらすべての細胞株を試験に用い、いずれもマイコプラズマ汚染は確認されなかった(MycoAlert(登録商標)マイコプラズマ検出キット、Lonza)。80%〜90%コンフルエントに達した細胞培養物から、DNeasy Blood & Tissue Kit(商標)(Qiagen)を用いて、メーカー推奨プロトコールに従いゲノムDNAを抽出した。
【０１０４】
LAMPとの比較
自動オンラインLAMPプライマー設計サーバー(PrimerExplorer.jp)をデフォルト設定で使用し[Tomita, N., et al., Nat Protoc 3: 877-882 (2008)]、「配列設計」のセクションで同定したのと同じHPVゲノムの可変領域に対して、可能なLAMP増幅プライマーを同定した。ソフトウェアで戻したLAMPプライマーセットの数と、同じ領域で設計したenVision認識ナノストラクチャーの数と比較した。次いで、機能性の検証を行うために、上位いくつかのLAMPプライマーセットの性能をenVisionシステムと比較した。LAMP増幅では1反応あたり、プライマーセットの各プライマー0.2μMおよび公知のHPV感染細胞株から抽出した精製ゲノムDNA100ngを用いた。この混合物を、6mM MgSO4および2.5mM dNTPを含む1×等温増幅バッファーII中で、8unitのBst 2.0 DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)と70℃で1時間インキュベートした。増幅産物をPCRクリーンアップスピンカラム(New England Biolabs)で精製して、ゲル電気泳動により定量化した。
【０１０５】
臨床サンプルの処理
BD SurePath(商標) liquid-based Pap test solutionで固定した、子宮頸管内膜ブラシサンプルを35名から収集した。QIAamp(登録商標) DNA FFPE Tissue Kit)(Qiagen)を用いて、変更を加えたプロトコールにより、収集した臨床サンプルからDNAを抽出した。以下、簡潔に説明する。ブラシ全体に2.5mlの滅菌PBSバッファー、2.5mlのバッファーATLおよび80μlのプロテイナーゼKをなじませてサンプルと混合し、56℃でインキュベートした。インキュベーション後、液を回収して90℃で1時間インキュベートした。各サンプルに3.5mlのバッファーALおよび3.5mlの100%エタノールを加えた。これを抽出カラムに通し、500μlのバッファーAW1および500μlのバッファーAW2で順次洗浄した。最終的にカラムを遠心分離により乾燥させ、DNAサンプルを50μlのバッファーATEで溶出した。抽出したゲノムDNAをそのまま、「enVisionプラットフォームの操作」に記載のアッセイに使用した。臨床サンプルが残っていた場合のみ、「非対称増幅」に記載の方法で処理した。すべての臨床サンプルにおいて、ハウスキーピング遺伝子であるGAPDHのTaqman(登録商標) PCR解析(Applied Biosystems)により、抽出したDNAの質を確認した。臨床サンプルの測定はすべて匿名で盲検法により行った。
【０１０６】
ゲル電気泳動
DNAサンプルを適量の6×ローディング色素(Thermo Fisher)で希釈し、8%ポリアクリルアミドゲルとTAEバッファー(Thermo Scientific)とを用いて100Vで電気泳動を行った。泳動後のゲルを、TAEバッファーで10,000倍希釈したSYBR(登録商標) Green Iで5分間染色し、ゲル撮影装置(Bio-Rad)で可視化した。得られたバンドの強度および面積(容積)を、ImageLab内蔵アルゴリズム(Bio-Rad)を用いて算出した。
【０１０７】
統計解析
測定はすべて3連で行い、データは平均±標準偏差で示した。有意性の検定はすべて両側スチューデントt検定で行った。サンプル間の比較においては、複数のサンプルペアそれぞれで検定を行い、得られたP値をBonferroni補正で調整して多重仮説検定を行った。調整後P値が<0.05である場合、有意差ありとした。患者のプロファイリングデータから、感度と(1−特異度)をプロットして、臨床研究用の受信者動作特性(ROC)曲線を作製し、濃度曲線下面積(AUC)の値を台形公式を用いて計算した。臨床報告(すなわち、Cobas HPV)を分類因子(真陽性および真陰性に分類)として用いた。各マーカーの最適閾値は、それぞれのROC曲線の左上部分(感度または特異度が100％)に最も近い点から設定した。検出感度、検出特異度および検出精度は標準式を用いて算出した。統計解析は、R-package(バージョン3.4.2)を用いて行った。
【０１０８】
実施例2
enVisionプラットフォーム
enVisionプラットフォームは、DNA標的の認識、標的非依存性シグナル増強および視覚的検出という3つの機能的な工程(図1a)を実行するための酵素利用DNAナノストラクチャーからなる。これらのナノストラクチャーは直交系列で設計されており、標的認識とシグナル増強は分離されている。認識工程において、認識要素は無比のハイブリッドナノストラクチャーであり、修飾DNAアプタマーとこれに結合したTaq DNAポリメラーゼからなる[Dang, C. & Jayasena, S. D. J Mol Biol 264: 268-278 (1996); Park, K. S. et al. Sci Adv 2: e1600300 (2016)]。標的DNAの非存在下では、このアプタマーはポリメラーゼと強く結合し、ポリメラーゼ活性を阻害する。相補的な標的DNAの存在下では、標的とのハイブリダイゼーションにより、ハイブリッド体が解離して、ポリメラーゼ活性が活性化される。シグナル生成工程において、活性化ポリメラーゼの作用により、標的非依存的に、汎用セルフプライミングナノストラクチャーが伸長される。シグナル生成ストラクチャーに修飾オリゴヌクレオチド(dNTP)が導入され、この修飾オリゴヌクレオチドにホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)が固定されると、酵素反応により肉眼で確認できる視覚的シグナルが生成され、この視覚的シグナルはスマートフォンで容易に定量化される。挿入図(図1a、右側)は、スマートフォンで撮影した実際のアッセイ出力の例を示したものである。
【０１０９】
enVisionアッセイの検出プログラム性およびモジュール性を補完するために、例えば、4つのアッセイカセットを保持できる、自由に構成可能なマイクロ流体プラットフォーム(図1b)を実装した。具体的には、2つの構成要素、すなわち、(i)個々に独立したアッセイカセットおよび(ii)共通のシグナル生成カートリッジを一体化した。各アッセイカセットには、特定のDNA認識ナノストラクチャーがあらかじめ装填されており、オンデマンドでプラグインが可能であるため、幅広い用途に対応したアッセイの集積化が可能である。共通のホルダーカートリッジは、汎用シグナル生成エレメントを含み、このシグナル生成エレメントは、ポリカーボネートメンブレンに固定されており、標的非依存性シグナル生成および視覚的検出に用いられる。流体の移動およびサンプルの混合は、マイクロチャネルの並列回路(図6)を通して行われ、カートリッジの共通排出口に陰圧をかけることで一斉に開始されるため、アッセイ操作(図7)を効率化することができる。図1cは、病原体DNA標的の臨床検出用に開発されたプロトタイプデバイスを示す。このようなシステムの区画化により、臨床応用における、アッセイのモジュール性が向上し(すなわち、オンデマンドで集積)、簡便に実行できる(すなわち、一様な表面固定化および一斉の流動開始)[Shao, H. et al. Nat Commun 6: 6999 (2015)]。
【０１１０】
実施例3
最適化された、核酸の視覚的定量アッセイ
機能的な認識要素としてのDNAナノストラクチャーおよびシグナル生成要素としてのDNAナノストラクチャーの性能を評価した。認識ナノストラクチャーにおいては、ポリメラーゼと修飾アプタマーを結合させて、ハイブリッド複合体を形成させた(図2a上段)。この最適化された複合体におけるポリメラーゼ活性は無視できる程度であった(図8a)。相補的な標的DNAの存在下では、ハイブリッド構造が解離し、ポリメラーゼ活性が完全に回復した(図2a下段)。相補的な標的が存在する場合のみ、強力なポリメラーゼ活性がもたらされ、スクランブルオリゴヌクレオチド配列の存在下では、ポリメラーゼ活性が無視できる程度であることから、この認識および活性化は高い配列特異性を示すことが分かった(図8b)。
【０１１１】
さらに、セルフプライミングナノストラクチャーとして、汎用認識要素を設計した。このストラクチャーは、ほぼ同サイズの線形テンプレートより、ポリメラーゼの占有率および活性が高かった(図2b)。これは、恐らく室温におけるプライミング効率の高さに起因すると考えられる(図9)。各ナノストラクチャーの会合の最適化および特性評価に使用した配列はすべて表1に記載されている。
【０１１２】
【表１】
2021529540.tif 000005
2021529540.tif 000006
【０１１３】
視覚的検出を可能にするために、活性化ポリメラーゼにより、シグナル生成ナノストラクチャーを伸長させ、ビオチン標識ヌクレオチド(ビオチン-16-AA-dCTP)を介してホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)を導入した。光学基質を加えると、HRP活性により、すぐに褐色沈殿物が生じた。滴定解析において、観測される色強度と標的DNAの量の増加に相関が見られた。スマートフォンカメラで撮影した画像から、この視覚的アッセイにおける標的DNAの検出限界(LOD)が0.260fmolであることが確認された(図10c)。また、このアッセイを室温で実施した場合の完了までに要した時間はわずか30分であった。効率的な非対称増幅(図11)を組み込むことにより、標的DNAのLODをさらに7.205amol(図2c)まで向上させることができた。また、核酸配列に基づく増幅法(NASBA)による非対称等温増幅[Pardee, K. et al. Cell 165: 1255-1266 (2016)]の採用によっても、実用性を高めることができた(図12)。増幅に使用したプライマーおよび標的はすべて表1に記載されている。検出感度は、その場でスマートフォンに示された測定結果により確認した。全過程(非対称増幅およびNASBAを含む)の完了までに要した時間は2時間未満であった。視覚的シグナルと標準的な蛍光シグナルとを相関させるために、FAMで修飾を施したヌクレオチドを用いて同様の実験を行った(図10d)。enVisionの視覚的アッセイは、蛍光シグナル飽和を説明するロジスティック関数とよい相関を示した(R2 = 0.983)(図2d)。蛍光測定は、DNA標的が高濃度になると飽和するが、enVisionプラットフォームは、蛍光測定よりダイナミックレンジが広く、同じ標的濃度でも識別可能で定量可能な視覚的シグナルが得られることが示された。このような視覚的ダイナミックレンジの拡大は、enVisionテクノロジーにおいて2つの酵素反応によるシグナル生成(すなわち、DNAポリメラーゼとHRPとが関与するカスケード)を採用したことによるものと考えられる。
【０１１４】
実施例4
enVisionのプログラム性
核酸の視覚的検出アッセイを設計するために、認識ナノストラクチャーのプログラム性を調べた。このハイブリッド構造は、折りたたまれた状態でDNAポリメラーゼと結合して該ポリメラーゼを阻害する保存配列領域と、標的DNAと相補的な配列にすることができる可変領域(すなわち、二本鎖部分および突出末端部分)とからなる(図3a)。認識ナノストラクチャーの可変領域に標的DNAとのミスマッチを導入したところ、配列ミスマッチに対する感度は、突出末端領域より二本鎖領域の方が高いことが確認された(図3b)。したがって、二本鎖領域は、強力な配列特異性を提供できる領域であり、突出末端領域は、(HPV)横断的検出に有用な特徴である配列多様性に対応できる領域である。
【０１１５】
この設計原則を、2つのHPV横断的認識ナノストラクチャーを作製して検証した(図3c)。2つのストラクチャーは、いずれもHPVコンセンサスゲノムをベースとして設計されたものであるが、それぞれが有する6種類のHPVサブタイプのDNA標的とのミスマッチの数は異なる(表2)。すべてのミスマッチ領域をマッピングしたところ、突出末端領域により多くのミスマッチを含むHPV横断的ナノストラクチャー1は、コンセンサスゲノムの(HPV)横断的検出能力が高いことが示された。二本鎖領域により多くのミスマッチを含むHPV横断的ナノストラクチャー2では、概してシグナルが低く、よって、アッセイの特異性の提供における二本鎖領域の重要性が示唆された。
【０１１６】
次に、HPVサブタイプ判定用の特異的ナノストラクチャーを設計した。HPVゲノムの高度可変領域を同定し、HPVの各サブタイプ(すなわち、HPV 6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 58およびHPV 66)を特異的に識別する認識ナノストラクチャーを新たに設計した(図3d、左)。感度の高い二本鎖領域に配列多様性が含まれるように設計した。慣用のqPCR解析には、標的の増幅・検出用の1組のプライマーセットが必要であるが、enVision認識ナノストラクチャーは、1つのプローブ配列(すなわち、可変領域)でその特異性が決定されるため、容易に適応させることができる。このプログラム性を利用して、新たなHPVサブタイプ判定用の特異的ナノストラクチャー(表2)を速やかに設計し、このナノストラクチャーをenVisionテクノロジーと組み合わせた。
【０１１７】
【表２】
2021529540.tif 000007
2021529540.tif 000008
【０１１８】
同じHPV DNA標的を検出するPCRプライマー(表3)を設計し、比較分析を行ったところ、enVisionプラットフォームは特異性が高く(図3d、左)、SYBR(登録商標) Greenを用いたqPCRでは、偽陽性がより多く生じた(図3d、右)。これは、qPCR解析における非特異的増幅が原因であると考えられる(図13)。重要なことには、検知メカニズムの違い(すなわち、enVisionの検出はハイブリダイゼーションにより活性化されるシグナル増強によるものであり、qPCRの検出は核酸標的増幅によるものである)により、enVisionテクノロジーは、逆転写（酵素互換性を保証するための、RNA標的のqPCR検出の必要条件）を行わずに、特定のHPV RNA標的を直接識別できることも明らかになった(図14)。RNA標的の転写に使用する配列はすべて表3に記載されている。
【０１１９】
【表３】
2021529540.tif 000009
2021529540.tif 000010
【０１２０】
実施例5
検出範囲拡大のためのマルチプレックス(多種同時)アッセイ
次に、検出範囲を拡大するために、マルチプレックス(多種同時)enVisionアッセイを、1つのチャンバーで同時に行うことが可能か否かを調べた。臨床的なHPVアッセイでは、通常、ウイルスゲノムの1つの領域(L1遺伝子座)の検出により感染確認を行っているが、ウイルスゲノムの一部が宿主細胞に組み込まれる可能性もあり、それによりがん性増殖が起こる場合がある[Williams, V. M., et al., Future Virol 6: 45-57 (2011); McBride, A. A. & Warburton, A. PLoS Pathog 13: e1006211 (2017)]。そこで、検出範囲を拡大することを目的として、HPVウイルスゲノムの非保存領域を用いて、E1遺伝子座、L1遺伝子座およびL2遺伝子座を検出するenVision認識ナノストラクチャーを設計した(図4a、表4)。
【０１２１】
【表４】
2021529540.tif 000011
2021529540.tif 000012
【０１２２】
これらのモジュール型の認識ナノストラクチャーを用いて、1つの反応チャンバーで各種論理ゲート(例えば、OR、AND、NOT、NANDおよびNOR)を構成することでプログラム可能な演算が容易にでき、DNA標的を様々に組み合わせた場合の視覚的な測定が可能であった(図15、表5)。また、モジュール型の認識ナノストラクチャーを用いて、このような様々な論理ゲートを構成することにより、複数の標的の検出を容易に行うことができる(図16、表2)。
【０１２３】
【表５】
2021529540.tif 000013
【０１２４】
検出範囲を拡大するために、各HPVサブタイプ(例えば、HPV 16およびHPV 18)において、遺伝子座特異的な3種類のナノストラクチャー(すなわち、E1遺伝子座、L1遺伝子座およびL2遺伝子座)を混合して、1つの反応系でOR論理ゲート構成を作製した。この検出範囲の広い、多遺伝子座HPV検出法の検証を、子宮頸がん細胞株のゲノムDNAを直接用いて行った。この細胞株は、独立して実施したPCR解析でも検証を行った(図17)。得られたデータから、E1、L1およびL2の各認識プローブで検出する方法より、マルチプレックス(多種同時)enVisionアッセイの方が、検出シグナルが高いことが確認された(図4b)。重要なことには、このマルチプレックス(多種同時)法では、真陽性の場合は有意なシグナル増強が見られ、陰性サンプルでは、バックグラウンドシグナルがわずかに変化するだけであった(図18)。
【０１２５】
次に、マルチプレックス(多種同時)enVisionアッセイを用いて、ヒト子宮頸がん細胞株でHPVのプロファイリングを行った(図4c)。実験はすべて室温で行い、前増幅処理は行わず、細胞のゲノムDNAを直接用いた。マルチプレックス(多種同時)enVision解析では、単一遺伝子座検出法と比べて、シグナル増強が向上するだけでなく、検出範囲が拡大されることで、細胞の感染状態およびサブタイプを正確に同定することができた(図18)。得られた測定結果は、出版されている文献[Adey, A. et al. Nature 500: 207-211 (2013); Meissner, J. D. J Gen Virol 80: 1725-1733 (1999); Yee, C., et al., Am J Pathol 119: 361-366 (1985)]の試験結果とよい相関が見られた：CaSki細胞およびSiHa細胞では、HPV 16のみで顕著なシグナルが見られ、HeLa細胞およびPZ-HPV-7細胞では、HPV 18のみで陽性シグナルが見られた。
【０１２６】
さらに、別の等温検出法、すなわちLAMPを基準として、ヒトがん細胞株のHPVプロファイリングに関するenVisionの性能を評価した。HPVゲノムの同じ可変領域(図4a)に関して、文献で公開されている基準[Tomita, N., et al., Nat Protoc 3: 877-882 (2008); Song, J. et al. Anal Chem 88: 7289-7294 (2016)]を適用し、各HPVサブタイプのE1遺伝子座、L1遺伝子座およびL2遺伝子座のLAMP用プライマーセットをそれぞれ設計した(詳細については「Methods」を参照のこと)。LAMPで使用した配列に関する情報はすべて表6に記載されている。
【０１２７】
【表６】
2021529540.tif 000014
2021529540.tif 000015
【０１２８】
LAMPではプライマーの選択肢が限定されるが、enVisionテクノロジーではプローブの選択幅が非常に広く、また、enVisionテクノロジーは、試験対象のすべてのサブタイプおよび遺伝子座を網羅できるものであった(図19a)。公知のHPV感染細胞株から単離したゲノムDNAを用いて、enVisionテクノロジーの性能を、上位のLAMPプライマーセットとの対比でさらに比較した(図19b)。enVisionテクノロジーでは、HPVのサブタイプ判定が正確になされたが、LAMPでは、偽陽性(例えば、CaSki細胞のHPV 18、HeLa細胞のHPV 16)が顕著に見られた。
【０１２９】
実施例6
臨床サンプルのHPVプロファイリング
HPV感染の検出およびサブタイプ判定におけるenVisionプラットフォームの臨床有用性を検証するために、2つの疑問に答えるべく実用可能性を検討した。(1)HPV感染の検出において、enVisionプラットフォームがどれくらい正確であるか。(2)アッセイの検出範囲を拡大することにより、従来検出不可能であった感染を確認できるか否か。
【０１３０】
臨床で採取した子宮頸管内膜ブラシサンプルを用いて、enVisionアッセイを行い、HPV感染状態を確認した。患者(n = 35)からサンプルを収集し、enVisionプラットフォームを用いて、患者のゲノムのHPV 16およびHPV 18のL1遺伝子座(図5a)の測定を行い、慣用のゴールドスタンダード法(すなわち、qPCR解析によりL1遺伝子座のみの検査を行うCobas HPV[Gardner, S. N., et al., J Clin Microbiol 41: 2417-2427 (2003)])と直接比較した。enVisionプラットフォームは、臨床報告と一致する高い検出精度を示した(HPV 16、AUC値 = 0.965；HPV 18、AUC値 = 0.944)(図5b)。
【０１３１】
さらに、この検出範囲の広い、多遺伝子座enVisionアッセイを用いて、上記と同じ臨床サンプルにおいて、L1遺伝子座に加えて、L2遺伝子座およびE1遺伝子座の組込みの有無を調べた(図20)。HPV 16 L1陽性の臨床サンプルで、その他の遺伝子座の検出を示す、増強した視覚的シグナルを観測した。興味深いことには、L1陰性サンプルのサブセットにおいて、検出範囲の広いenVisionシステムにより、特異的なL2遺伝子座および／またはE1遺伝子座の組込みが確認された(図5c)。さらにこの結果を、独立したTaqman(登録商標)蛍光分析(表4)を設計して検証した。試験対象のすべての臨床検体において、enVisionの結果と高い一致を示した(図21)。以上の結果から、マルチプレックス(多種同時)enVisionプラットフォームにより、検出範囲が拡大され、従来検出不可能であった感染も確認できることが示唆された。
【０１３２】
本明細書における公開済みであることが明らかな文献のリストまたは考察は、そのような文献が、従来技術の一部または一般常識であることを認めて記載しているものではない。
【０１３３】
考察
enVisionプラットフォームでは、一連の酵素利用DNAナノストラクチャーを組み込むことにより、肉眼で多様な病原体の核酸を高感度で幅広く検出することが可能である。enVisionは、核酸増幅法とは異なり、標的との直接的なハイブリダイゼーションおよび独立した視覚的シグナル増強による検出が特徴である。従って、このテクノロジーは、臨床応用に好適である。(1)カスケード状のシグナル増強により、(標的の増幅を行わずとも)標的とのハイブリダイゼーションにより、肉眼で確認できる高感度な色測定結果が迅速に得られる。アッセイは終始室温で実施可能であり、スマートフォンで容易に定量化できる。(2)DNAナノストラクチャーは、認識機能およびシグナル生成機能が効果的に分離されているため、プログラム可能な検出および論理演算が可能である。(3)マイクロ流体集積化により、アッセイのモジュール性が補完され、反応の高速化が可能である。enVisionプラットフォームは、臨床で用いられているゴールドスタンダード法やその他の等温検出法とは異なり、感度および特異性が高く、最小限の装置要件で幅広い性能(例えば、RNAの直接検出、論理演算およびアッセイのモジュール性)を備えている(表7)。
【０１３４】
【表７】
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【０１３５】
我々が開発したこのテクノロジーの科学的および臨床的な応用範囲は潜在的に広い。認識ナノストラクチャーは、様々な標的配列を同程度の効率で検出するという用途に、極めて低コストで容易に適応可能である(すなわち、慣用のプライマーまたは専用の化学的修飾レポーターのセットを新たに準備することなく、通常のヌクレオチドで構成される単一のプローブ配列のみを適応させればよい)。シグナル生成ナノストラクチャーは、汎用的なものであり、あらゆる標的配列に対して用いることができる。このようなモジュール性により、新規のアッセイ系を容易に開発できるだけでなく、プログラム可能な構成で分子計算を行うことができる。したがって、このテクノロジーは、免疫検出を回避するウイルスの急速な変異(すなわち、RNAウイルス)[Schotte, L. et al., Antimicrob Agents Chemother 59: 4695-4706 (2015)]や複数のウイルス−宿主ゲノム組込み[Cheung, J. L., et al., J Infect Dis 194: 1706-1712 (2006)]を調べるのに特に有用であると考えられる。臨床的な観点から言えば、enVisionテクノロジーは視覚的検出が可能で、装置要件も緩やかであることから、コミュニティーの診療所やリソースが限られた環境における現場での検出作業フローに好適である。
【０１３６】
さらに、技術的な改良を加えることで、現行のテクノロジーを向上させることが可能であると考えられる。第1に、現在の流体装置(すなわち、4つのアッセイカセット)に変更を加えて、さらに小型のチャンバーをより多数備えることができるようにすることは容易であると考えられる。現行の核酸処理はチップ外で行っているが、サンプル調製モジュールを追加で組み込むことにより、チップ上で核酸の抽出および処理が可能になり、プラットフォームの臨床有用性を向上させることも可能と考えられる[Adey, A. et al. Nature 500: 207-211 (2013)]。このような新たな設計により、複数の病原体核酸を、アレイ方式で視覚的に検出することが実用的に可能になるであろう。第2に、この現在の検出プラットフォームでは、スマートフォンと調整された照明システムを利用して、視覚的測定結果を撮影・分析している。スマートフォンが普及し、分析性能も向上していることから[Laksanasopin, T. et al. Sci Transl Med 7: 273re1 (2015); Nemiroski, A. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 111: 11984-11989 (2014); Paterson, A. S. et al. Lab Chip 17: 1051-1059 (2017)]、実際の用途のために、スマートフォンで直接さらなる画像補正および解析アルゴリズムを実行して、照明の差異に基づいた自動補正や色強度の定量化を行うことができる可能性がある。
【０１３７】
参考文献
1.  Adey, A. et al. The haplotype-resolved genome and epigenome of the aneuploid HeLa cancer cell line. Nature 500, 207-211 (2013).
2.  Bodily, J. & Laimins, L. A. Persistence of human papillomavirus infection: keys to malignant progression. Trends Microbiol 19, 33-39 (2011).
3.  Bouvard, V. et al. A review of human carcinogens--Part B: biological agents. Lancet Oncol 10, 321-322 (2009).
4.  Cheung, J. L., Lo, K. W., Cheung, T. H., Tang, J. W. & Chan, P. K. Viral load, E2 gene disruption status, and lineage of human papillomavirus type 16 infection in cervical neoplasia. J Infect Dis 194, 1706-1712 (2006).
5.  Crosbie, E. J., Einstein, M. H., Franceschi, S. & Kitchener, H. C. Human papillomavirus and cervical cancer. Lancet 382, 889-899 (2013).
6.  Cui, M. et al. Clinical performance of Roche Cobas 4800 HPV Test. J Clin Microbiol 52, 2210-2211 (2014).
7.  Dang, C. & Jayasena, S. D. Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. J Mol Biol 264, 268-278 (1996).
8.  Gardner, S. N., Kuczmarski, T. A., Vitalis, E. A. & Slezak, T. R. Limitations of TaqMan PCR for detecting divergent viral pathogens illustrated by hepatitis A, B, C, and E viruses and human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol 41, 2417-2427 (2003).
9.  Juskowiak, B. Nucleic acid-based fluorescent probes and their analytical potential. Anal Bioanal Chem 399, 3157-3176 (2011).
10.  Kang, L. N. et al. Optimal positive cutoff points for care HPV testing of clinician- and self-collected specimens in primary cervical cancer screening: an analysis from rural China. J Clin Microbiol 52, 1954-1961 (2014).
11.  Laksanasopin, T. et al. A smartphone dongle for diagnosis of infectious diseases at the point of care. Sci Transl Med 7, 273re1 (2015).
12.  Lee, H. et al. Molecularly self-assembled nucleic acid nanoparticles for targeted in vivo siRNA delivery. Nat Nanotechnol 7, 389-393 (2012).
13.  Lee, J. S., Song, J. J., Deaton, R. & Kim, J.-W. Assessing the Detection Capacity of Microarrays as Bio/Nanosensing Platforms. Biomed Res Int 2013, 8 (2013).
14.  Li, J., Green, A. A., Yan, H. & Fan, C. Engineering nucleic acid structures for programmable molecular circuitry and intracellular biocomputation. Nat Chem 9, 1056-1067 (2017).
15.  Lucchi, N. W. et al. Evaluation of the Illumigene Malaria LAMP: A Robust Molecular Diagnostic Tool for Malaria Parasites. Sci Rep 6, 36808 (2016).
16.  McBride, A. A. & Warburton, A. The role of integration in oncogenic progression of HPV-associated cancers. PLoS Pathog 13, e1006211 (2017).
17.  Meissner, J. D. Nucleotide sequences and further characterization of human papillomavirus DNA present in the CaSki, SiHa and HeLa cervical carcinoma cell lines. J Gen Virol 80, 1725-1733 (1999).
18.  Nemiroski, A. et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A 111, 11984-11989 (2014).
19.  Niemz, A., Ferguson, T. M. & Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol 29, 240-250 (2011).
20.  Nong, R. Y., Gu, J., Darmanis, S., Kamali-Moghaddam, M. & Landegren, U. DNA-assisted protein detection technologies. Expert Rev Proteomics 9, 21-32 (2012).
21.  Pardee, K. et al. Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell 165, 1255-1266 (2016).
22.  Park, K. S. et al. Rapid identification of health care-associated infections with an integrated fluorescence anisotropy system. Sci Adv 2, e1600300 (2016).
23.  Paterson, A. S. et al. A low-cost smartphone-based platform for highly sensitive point-of-care testing with persistent luminescent phosphors. Lab Chip 17, 1051-1059 (2017).
24.  Rao, A. et al. Development and Characterization of the cobas Human Papillomavirus Test. J Clin Microbiol 51, 1478-1484 (2013).
25.  Schiffman, M. et al. Carcinogenic human papillomavirus infection. Nat Rev Dis Primers 2, 16086 (2016).
26.  Schotte, L. et al. Characterization of Poliovirus Neutralization Escape Mutants of Single-Domain Antibody Fragments (VHHs). Antimicrob Agents Chemother 59, 4695-4706 (2015).
27.  Shao, H. et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nat Commun 6, 6999 (2015).
28.  Sievers, F. et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol 7, 539 (2011).
29.  Song, J. et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Anal Chem 88, 7289-7294 (2016).
30.  Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H. & Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc 3, 877-882 (2008).
31.  Wang, L., Meng, Z., Martina, F., Shao, H. & Shao, F. Fabrication of circular assemblies with DNA tetrahedrons: from static structures to a dynamic rotary motor. Nucleic Acids Res 45, 12090-12099 (2017).
32.  Williams, V. M., Filippova, M., Soto, U. & Duerksen-Hughes, P. J. HPV-DNA integration and carcinogenesis: putative roles for inflammation and oxidative stress. Future Virol 6, 45-57 (2011).
33.  Yee, C., Krishnan-Hewlett, I., Baker, C. C., Schlegel, R. & Howley, P. M. Presence and expression of human papillomavirus sequences in human cervical carcinoma cell lines. Am J Pathol 119, 361-366 (1985).
34.  Zhao, Y., Chen, F., Li, Q., Wang, L. & Fan, C. Isothermal Amplification of Nucleic Acids. Chem Rev 115, 12491-12545 (2015).
35.  Zumla, A. et al. Rapid point of care diagnostic tests for viral and bacterial respiratory tract infections--needs, advances, and future prospects. Lancet Infect Dis 14, 1123-1135 (2014).
【図１ａ】
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【図１ｂ−ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021529540.tif 000041
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