(57)【要約】  本発明において、リボ核酸（ＲＮＡ）分子と、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールを含む脂質混合物と、酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）と、を含むリポソームが提供される。本発明において、リボ核酸（ＲＮＡ）分子と、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールを含む脂質混合物と、を含むリポソームも提供され、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールは、約３：１のＤＯＴＡＰ：コレステロール質量比で脂質混合物中に存在する。リポソームを含む関連細胞、細胞の集団、および組成物も提供される。リポソームの作製方法およびリポソームの使用方法がさらに提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボ核酸（ＲＮＡ）分子と、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールを含む脂質混合物と、酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）と、を含むリポソーム。
【請求項２】
コア中の各ＩＯＮＰが、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍの直径を有する、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
各ＩＯＮＰが、直径または約６０ｎｍ〜約１４０ｎｍを有する、請求項２に記載のリポソーム。
【請求項４】
前記ＩＯＮＰの質量が、総リポソーム質量の約１％〜約３０％である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項５】
前記ＩＯＮＰの前記質量が、前記総リポソーム質量の約５％〜約２５％、任意選択的に、前記総リポソーム質量の約１０％〜約１５％である、請求項４に記載のリポソーム。
【請求項６】
前記ＩＯＮＰの前記質量が、前記総リポソーム質量の約１２％±３％である、請求項５に記載のリポソーム。
【請求項７】
前記ＤＯＴＡＰおよびコレステロールが、約３：１のＤＯＴＡＰ：コレステロール質量比で前記脂質混合物中に存在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項８】
前記ＩＯＮＰが、前記リポソームの前記コア中に存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項９】
前記ＩＯＮＰが、前記リポソーム全体に分散している、請求項１〜８のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項１０】
リボ核酸（ＲＮＡ）分子と、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールを含む脂質混合物と、を含むリポソームであって、前記ＤＯＴＡＰおよびコレステロールは、約３：１のＤＯＴＡＰ：コレステロール質量比で前記脂質混合物中に存在する、リポソーム。
【請求項１１】
約８０ｎｍ〜約５００ｎｍの直径、任意選択的に、約９０ｎｍ〜約３００ｎｍの直径を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項１２】
約２０ｍＶ〜約５０ｍＶの全体的な表面正味電荷、任意選択的に、約４０ｍＶ〜約５０ｍＶの全体的な表面正味電荷を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項１３】
前記コレステロールが、前記脂質混合物の前記総脂質質量の１２％超、３７％未満である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項１４】
前記コレステロールが、前記脂質混合物の前記総脂質質量の約１５％〜約３５％、任意選択的に、前記脂質混合物の前記総脂質質量の約２０％〜約３０％である、請求項１３に記載のリポソーム。
【請求項１５】
前記コレステロールが、前記脂質混合物の前記総脂質質量の約２５％±３％である、請求項１４に記載のリポソーム。
【請求項１６】
前記ＤＯＴＡＰが、前記脂質混合物の前記総脂質質量の少なくとも５０％、任意選択的に、前記脂質混合物の前記総脂質質量の約６３％〜約８８％である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項１７】
前記ＤＯＴＡＰが、前記脂質混合物の前記総脂質質量の約７５％±５％である、請求項１６に記載のリポソーム。
【請求項１８】
前記脂質混合物が、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールとは異なる第３の脂質を含む場合、前記第３の脂質が、前記脂質混合物の前記総脂質質量の約１０％未満、または約５％未満である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項１９】
前記脂質混合物が、本質的にＤＯＴＡＰおよびコレステロールからなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項２０】
１５０μｇのリポソームあたり約１０μｇ未満または約１０μｇのＲＮＡ分子を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項２１】
前記ＲＮＡ分子が、タンパク質をコードするか、またはアンチセンス分子である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項２２】
前記タンパク質が、腫瘍抗原、サイトカイン、または共刺激分子からなる群から選択される、請求項２１に記載のリポソーム。
【請求項２３】
前記ＲＮＡ分子が、アンチセンス分子であり、前記アンチセンス分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２１に記載のリポソーム。
【請求項２４】
ＲＮＡ分子の混合物を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項２５】
前記ＲＮＡ分子の混合物が、ヒト由来の細胞から単離されたＲＮＡである、請求項２４に記載のリポソーム。
【請求項２６】
前記ヒトが、腫瘍を有し、前記ＲＮＡの混合物が、前記ヒトの前記腫瘍から単離されたＲＮＡであり、任意選択的に、前記腫瘍が、悪性脳腫瘍であり、任意選択的に、膠芽腫、髄芽腫、びまん性内在性橋膠腫、または中枢神経系への転移性浸潤を伴う末梢腫瘍である、請求項２５に記載のリポソーム。
【請求項２７】
ＩＯＮＰをさらに含む、請求項１０〜２６のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項２８】
コア中の各ＩＯＮＰが、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍ、任意選択的に、約６０ｎｍ〜約１４０ｎｍの直径を有する、請求項２７に記載のリポソーム。
【請求項２９】
前記ＩＯＮＰの前記質量が、前記総リポソーム質量の約１％〜約３０％、任意選択的に、前記総リポソーム質量の約５％〜約２５％、任意選択的に、前記総リポソーム質量の約１０％〜約１５％である、請求項２７または２８に記載のリポソーム。
【請求項３０】
前記ＩＯＮＰの前記質量が、前記総リポソーム質量の約１２％±３％である、請求項２９に記載のリポソーム。
【請求項３１】
前記ＩＯＮＰが、前記リポソームのコア中に存在する、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項３２】
前記ＩＯＮＰが、前記リポソーム全体に分散している、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項３３】
リポソームの作製方法であって、（Ａ）ＤＯＴＡＰおよびコレステロールを約３：１のＤＯＴＡＰ：コレステロール質量比で混合して、脂質混合物を形成することと、（Ｂ）前記脂質混合物を乾燥させることと、（Ｃ）前記脂質混合物を再水和溶液で再水和して、再水和脂質混合物を形成することと、（Ｄ）前記再水和脂質混合物を約４０℃超の温度でインキュベートし、前記再水和脂質混合物を断続的にボルテックスして、リポソームを形成することと、を含む、方法。
【請求項３４】
ステップ（Ｄ）後に前記リポソームを１２時間超インキュベートすることをさらに含み、任意選択的に、前記リポソームを約２０℃〜約３０℃または約２℃〜約６℃で１２時間超インキュベートすることをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
（ｉ）前記リポソームを超音波処理すること、および／または前記リポソームを少なくとも１５０ｎｍのフィルターを通して濾過することであって、任意選択的に、前記リポソームは、２００ｎｍフィルターおよび／または４５０ｎｍフィルターを通して濾過される、超音波処理および／または濾過することと、（ｉｉ）前記リポソームをＲＮＡ分子とインキュベートすることと、をさらに含む、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記リポソームが、４５０ｎｍフィルターおよび２００ｎｍフィルターを通して濾過され、任意選択的に、前記リポソームが、４５０ｎｍフィルター、続いて２００ｎｍフィルターを通して順次濾過される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
（ｉ）約７．５ｍｇ±０．７５ｍｇのＤＯＴＡＰおよび約２．５ｍｇ±０．２５ｍｇのコレステロールを混合して、前記脂質混合物を形成する、（ｉｉ）ＤＯＴＡＰおよびコレステロールをクロロホルムに溶解して、前記脂質混合物を形成する、（ｉｉｉ）窒素ガスを使用して、前記脂質混合物を乾燥させる、（ｉｖ）前記再水和溶液が緩衝液であり、任意選択的に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である、（ｖ）前記再水和脂質混合物を水浴中で約５０℃の温度でインキュベートし、約１０分ごとにボルテックスして、リポソームを形成する、（ｖｉ）またはそれらの組み合わせである、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記脂質混合物または前記再水和溶液は、酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）をさらに含み、または、前記方法は、前記脂質混合物または前記再水和溶液にＩＯＮＰを添加することをさらに含み、任意選択的に、各ＩＯＮＰは、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍ、任意選択的に、約６０ｎｍ〜約１４０ｎｍまたは約１０ｎｍ〜約３０ｎｍの直径を有する、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記脂質混合物または再水和溶液は、１０ｍｇの脂質混合物あたり少なくとも約１μｇのＩＯＮＰ、１０ｍｇの脂質混合物あたり少なくとも約１００μｇのＩＯＮＰ、１０ｍｇの脂質混合物あたり少なくとも約１ｍｇのＩＯＮＰ、または１０ｍｇの脂質混合物あたり少なくとも約１．５ｍｇのＩＯＮＰを含み、任意選択的に、前記脂質混合物または再水和溶液は、１０ｍｇの脂質混合物あたり約５ｍｇ以下のＩＯＮＰを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記リポソームをＲＮＡ分子とインキュベートすることを含み、任意選択的に、（ｉ）前記リポソームの約７５μｇの脂質ごとに約５μｇのＲＮＡ分子をインキュベートする、（ｉｉ）前記方法は、約１：１５のＲＮＡ分子：ＤＯＴＡＰ質量比で前記リポソームをＲＮＡ分子とインキュベートすることを含む、（ｉｉｉ）前記リポソームがＩＯＮＰを含む場合、約１５０μｇのリポソームごとに約１０μｇのＲＮＡ分子をインキュベートする、または（ｉｖ）それらの組み合わせである、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３３〜４０のいずれか一項に記載の方法により作製されたリポソーム。
【請求項４２】
請求項１〜３２および４１のいずれか一項に記載のリポソームを含む細胞。
【請求項４３】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）、任意選択的に、樹状細胞（ＤＣ）である、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４４】
細胞の集団であって、前記集団の少なくとも５０％が、請求項４２または４３のいずれか一項に記載の細胞である、細胞の集団。
【請求項４５】
請求項１〜３２および４１のいずれか一項に記載のリポソーム、請求項４２または４３の細胞、請求項４４に記載の細胞の集団、またはそれらの任意の組み合わせ、ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤、を含む組成物。
【請求項４６】
複数のリポソームを含み、前記リポソームの少なくとも５０％が約１００ｎｍ〜約２５０ｎｍの直径を有する、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
請求項１〜３２および４１のいずれか一項に記載のリポソームと細胞をインキュベートすることを含む、ＲＮＡ分子を細胞に送達する方法。
【請求項４８】
前記細胞が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、任意選択的に、樹状細胞（ＤＣ）である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記リポソームが、ＩＯＮＰを含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が、磁場、任意選択的に、静磁場または振動磁場の存在下で、前記リポソームとインキュベートされる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞が、磁場の存在下で、約２時間未満または約１時間未満の時間、前記リポソームとインキュベートされ、任意選択的に、前記細胞が、磁場の存在下で、約３０分±１０分間、前記リポソームとインキュベートされる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
疾患を有する対象を治療する方法であって、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の方法により、前記対象の細胞にＲＮＡ分子を送達することを含む、方法。
【請求項５３】
ＲＮＡ分子が、エクスビボで前記細胞に送達され、前記細胞が、前記対象に投与される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
疾患を有する対象を治療する方法であって、前記対象の前記疾患を治療するのに有効な量で、請求項４５または４６に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５５】
前記疾患が、癌であり、任意選択的に、前記癌が、血液脳関門を越えて位置する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記対象が、脳に位置する腫瘍を有する、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記腫瘍が、低悪性度神経膠腫または高悪性度神経膠腫、例えば、グレードＩＩＩ星状細胞腫または膠芽腫、髄芽腫またはびまん性内在性橋膠腫である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物が、リポソームを含む、請求項５４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物が、前記対象に静脈内投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記組成物が、前記リポソームを含む細胞を含む、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記リポソームを含む前記細胞を含む前記組成物が、前記対象に皮内投与され、任意選択的に、前記組成物が、前記対象の鼠径部に皮内投与される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞が、ＡＰＣ、任意選択的に、樹状細胞（ＤＣ）である、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＤＣが、前記対象から得られたＷＢＣから単離される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記リポソームの前記ＲＮＡ分子が、腫瘍抗原をコードし、および／または腫瘍細胞から単離され、任意選択的に、前記腫瘍細胞が、前記対象の腫瘍の細胞である、請求項４７〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記リポソームが、ＩＯＮＰを含み、前記方法が、前記対象内の前記リポソームを含む前記細胞の遊走を追跡することをさらに含む、請求項４７〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記追跡が、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含み、任意選択的に、前記追跡が、前記対象の１つ以上のリンパ節、任意選択的に、前記鼠径部リンパ節、に対してＭＲＩを行うことを含み、任意選択的に、ＭＲＩが、前記組成物または前記細胞の投与前および投与後の前記リンパ節に対して行われる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ＩＯＮＰを含むリポソームでトランスフェクトされたＤＣを含む前記リンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度を、対照の未処置リンパ節の前記Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度と、比較することを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
ＭＲＩを介して前記対象のリンパ節サイズを測定することを含み、任意選択的に、ＩＯＮＰを含むリポソームでトランスフェクトされたＤＣを含む前記リンパ節の前記リンパ節サイズを比較することを含み、リンパ節が、前記対照の未処置リンパ節のリンパ節サイズと比較される、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
対象においてリンパ節への樹状細胞（ＤＣ）の遊走を追跡する方法であって、（ｉ）請求項５２〜６８のいずれか一項に記載の方法に従って、前記対象を治療することであって、前記細胞がＤＣであり、前記リポソームがＩＯＮＰを含む、治療することと、（ｉｉ）前記対象の１つ以上のリンパ節に対して核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を行うことと、を含む、方法。
【請求項７０】
１つ以上のリンパ節の前記Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度を決定することを含み、対照の未処置リンパ節の前記Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度と比較して、Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度の減少を示すリンパ節は、ＤＣが遊走したリンパ節を表す、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
１つ以上のリンパ節が、前記対象の前記鼠径部リンパ節であり、任意選択的に、前記組成物が、前記対象の前記鼠径部に皮内投与される、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記組成物または前記細胞の投与前および投与後に、前記リンパ節に対してＭＲＩを行い、任意選択的に、投与前および投与約４８時間後、ならびに任意選択的に、投与約７２時間後にＭＲＩを行う、請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
ＩＯＮＰを含むリポソームでトランスフェクトされたＤＣを含む前記リンパ節の前記Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度を、対照の未処置リンパ節の前記Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度と、比較することを含む、請求項６９〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
ＭＲＩを介して前記対象のリンパ節サイズを測定することを含み、任意選択的に、ＩＯＮＰを含むリポソームでトランスフェクトされたＤＣを含む前記リンパ節の前記リンパ節サイズを、前記対照の未処置リンパ節の前記リンパ節サイズと、比較することを含む、請求項６９〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
対象における樹状細胞（ＤＣ）ワクチン接種療法に対する対象の治療応答を決定する方法であって、（ｉ）請求項５２〜６８のいずれか一項に記載の方法に従って、前記対象を治療することであって、前記細胞がＤＣであり、前記リポソームがＩＯＮＰを含む、治療することと、（ｉｉ）請求項６９〜７４のいずれか一項の記載に従って、リンパ節へのＤＣ遊走を追跡することであって、処置リンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度が減少した場合、前記ＤＣワクチン接種療法が、前記対象において正の治療応答をもたらすと決定される、追跡することと、を含む、方法。
【請求項７６】
前記正の治療応答が、療法の投与後少なくとも４週間の前記対象の無増悪期間および全生存期間の延長を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記正の治療応答が、療法の投与後少なくとも８〜１２週間の前記対象の無増悪期間および全生存期間の延長を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
対象における樹状細胞（ＤＣ）ワクチン接種療法に対する治療応答をモニタリングする方法であって、第１時点および第２時点で、請求項６９〜７４のいずれか一項の記載に従って、リンパ節へのＤＣ遊走を追跡することを含み、前記第２時点での処置リンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度が、前記第１時点での前記処置リンパ節の前記Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度と比較して、減少する場合、ＤＣワクチン接種療法に対する前記治療応答が有効である、方法。
【請求項７９】
腫瘍、任意選択的に、脳腫瘍の微小環境中の細胞にＲＮＡを送達する方法であって、請求項４５または４６に記載の組成物を、静脈内投与することを含み、前記組成物が、前記リポソームを含む、方法。
【請求項８０】
前記リポソームが、免疫チェックポイント経路のタンパク質、任意選択的に、ＰＤＬ１を標的とするｓｉＲＮＡを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記微小環境中の前記細胞が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、任意選択的に、腫瘍関連マクロファージである、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項８２】
脳腫瘍の微小環境における抗原提示細胞を活性化する方法であって、請求項４５または４６に記載の組成物を、静脈内投与することを含み、前記組成物が、前記リポソームを含む、方法。
【請求項８３】
対象におけるリンパ節への樹状細胞（ＤＣ）遊走を増加させる方法であって、前記リンパ節へのＤＣ遊走を増加させるのに有効な量で、請求項４５または４６に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項８４】
対象における腫瘍または癌に対する免疫応答を増強する方法であって、前記対象における前記免疫応答を増強するのに有効な量で、請求項４５または４６に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月８日に出願された米国仮特許出願第６２／６６８，６０８号の優先権を主張し、その内容の全体が参照により援用される。
【０００２】
助成金の開示
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたＣＡ１９５５６３の下で、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明におけるある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
癌ワクチンは、個別化された癌免疫療法への有望なアプローチであるが、治療に対する患者の応答における有意義なバイオマーカーの欠如は、それらの開発を制限する。無作為化二重盲検プラセボ対照試験では、ＲＮＡ−パルス状樹状細胞（ＤＣ）は、神経膠芽腫を有する患者において、無進行生存期間および全生存期間を延長することが報告された（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ５１９：３６６−３６９（２０１５））。さらに、ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングによって評価されたリンパ節へのＤＣ遊走は、臨床結果と強く相関することが実証された。この知見は、ＤＣワクチンに応答するための新規なイメージングバイオマーカーを提供することができるが、放射性標識細胞の核医学に基づくイメージングの複雑さおよび規制要件は、この技術の広範な利用を制限する。したがって、当技術分野では、放射能を用いずにリンパ節へのＤＣ遊走を追跡する方法、およびワクチン接種応答を改善するために遊走を増強する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書において、リンパ節へのＤＣ遊走を増強し、インビボでのＤＣ遊走のＭＲＩに基づく追跡を可能にする、二機能性ＲＮＡ負荷ナノ粒子（ＲＮＡ−ＮＰ）の開発につながるデータが、初めて提示される。したがって、本開示は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子と、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールを含む脂質混合物とを含むリポソームを提供する。様々な実施形態では、リポソームは酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）を含む。様々な態様では、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールは、約３：１のＤＯＴＡＰ：コレステロール質量比で脂質混合物中に存在する。本開示のリポソームの様々な利点を、以下でさらに詳細に説明する。
【０００５】
本開示はまた、本開示のリポソームを含む細胞、例えば、本開示のリポソームを含む免疫細胞（例えば、抗原提示細胞、樹状細胞）を提供する。様々な態様では、細胞は、リポソームでトランスフェクトされる。様々な例では、細胞は、本開示のリポソームを、エンドサイトーシスまたはピノサイトーシスによって取り込んでいる。本開示のリポソームを含む細胞は、細胞によってリポソームが取り込まれるいずれの特定のメカニズムにも限定されない。また、細胞の集団も提供され、集団の少なくとも５０％は、本開示のリポソームを含む細胞、例えば、本開示のリポソームでトランスフェクトされた細胞、である。
【０００６】
本開示はさらに、組成物を提供し、本開示の、リポソーム、細胞（例えば、樹状細胞）、または細胞の集団、あるいはそれらの任意の組み合わせ、および薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む。
【０００７】
本開示はさらに、リポソームを作製する方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、（Ａ）ＤＯＴＡＰおよびコレステロールを約３：１のＤＯＴＡＰ：コレステロール質量比で混合して、脂質混合物を形成することと、（Ｂ）脂質混合物を乾燥することと、（Ｃ）脂質混合物を再水和溶液で再水和して、再水和脂質混合物を形成することと、（Ｄ）再水和脂質混合物を約４０℃超の温度でインキュベートし、再水和脂質混合物を断続的にボルテックスしてリポソームを形成することと、を含む。本開示の方法によって作製されたリポソームも提供される。本開示の方法によって作製されたリポソームを含む（例えば、トランスフェクトされた）細胞が、本明細書でさらに提供される。また、細胞の集団も提供され、集団の少なくとも５０％は、本開示の方法によって作製されたリポソームを含む（例えば、トランスフェクトされた）細胞である。本開示は、本開示の方法によって作製されたリポソーム、リポソームを含む細胞、または本明細書に記載の細胞集団、またはそれらの任意の組み合わせ、ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む、組成物を提供する。
【０００８】
本開示は、さらに、細胞にＲＮＡ分子を送達する方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、細胞を本開示のリポソームとインキュベートすることを含む。様々な態様では、細胞は、免疫細胞である。様々な例では、免疫細胞は、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞である。様々な態様では、免疫細胞は、腫瘍微小環境、例えば、脳腫瘍の腫瘍環境に位置する。一部の態様における本開示のリポソームは、免疫細胞を活性化する。様々な例では、ＲＮＡ分子は、免疫チェックポイント経路のタンパク質を標的とするアンチセンス分子、例えば、ｓｉＲＮＡである。例えば、免疫チェックポイント経路のタンパク質は、ＰＤＬ１であってもよい。したがって、様々な態様では、ＰＤＬ１を標的とするｓｉＲＮＡは、微小環境の免疫細胞に送達される。特定の理論に拘束されることなく、リポソームは、微小環境の免疫細胞を活性化し、免疫チェックポイント経路のタンパク質の発現を減少させて、腫瘍に対する免疫応答を増強する。様々な態様では、ＲＮＡ分子は、タンパク質、例えば、腫瘍抗原をコードする。様々な態様では、ＲＮＡ分子は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡである。
【０００９】
本開示により、疾患を有する対象を治療する方法が提供される。例示的な実施形態では、本方法は、細胞にＲＮＡ分子を送達する本開示の方法によって、対象の細胞にＲＮＡ分子を送達することを含む。他の例示的な実施形態では、本方法は、本明細書に記載のリポソーム、細胞、細胞の集団、またはそれらの任意の組み合わせを含む本開示の組成物を、対象における疾患の治療に有効な量で投与することを含む。
【００１０】
本開示はさらに、対象における腫瘍または癌に対する免疫応答を増強する方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、対象における免疫応答を増強するのに有効な量で、本開示のリポソームを対象に投与することを含む。例示的な態様では、増強された免疫応答は、樹状細胞の活性化の増加によって明らかであり、これは、例えば、ＤＣ活性化に関連する遺伝子の発現の増強、ＤＣの表面上の共刺激分子の発現の増強、抗ウイルス性サイトカイン（例えば、ＩＦＮα）の産生の増加、Ｔ細胞刺激の増加（例えば、活性化ＤＣとの接触時のＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生の増加によって示される）、リンパ節への遊走の増加、および腫瘍増殖の阻害の増強、によって実証される。したがって、本開示は、ＤＣの活性化を増加させるか、またはＤＣを活性化する方法を、さらに提供する。例示的な実施形態では、本方法は、ＤＣの活性化を増加させるのに有効な量で、またはＤＣを活性化するのに有効な量で、本開示のリポソームを対象に投与することを含む。したがって、本開示はまた、抗ウイルス性サイトカイン（例えば、ＩＦＮα）の産生を増加させる方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、対象において抗ウイルス性サイトカインの産生を増加させるのに有効な量で、本開示のリポソームを対象に投与することを含む。さらに、対象においてＴ細胞刺激を増加させる方法が提供される。例示的な実施形態では、本方法は、対象においてＴ細胞刺激を増加させるのに有効な量で、本開示のリポソームを対象に投与することを含む。様々な態様では、Ｔ細胞刺激の増加は、ＩＦＮ−γのＴ細胞産生の増加から明らかである。本開示はさらに、ＩＦＮ−γのＴ細胞産生を増加させる方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、Ｔ細胞を、本開示の樹状細胞（ＤＣ）と接触させることを含み、任意選択的に、リポソームは、ＩＯＮＰを含み、ＤＣは、磁場の存在下でリポソームでトランスフェクトされる。さらに、対象においてリンパ節への樹状細胞（ＤＣ）の遊走を増加させる方法が、本明細書で提供される。例示的な実施形態では、本方法は、リンパ節へのＤＣ遊走を増加させるのに有効な量で、本開示の組成物を対象に投与することを含む。腫瘍増殖を阻害する方法が、本明細書でさらに提供される。例示的な実施形態では、本方法は、対象において腫瘍増殖を阻害するのに有効な量で、本開示のリポソームを対象に投与することを含む。
【００１１】
本開示はまた、対象においてリンパ節への樹状細胞（ＤＣ）の遊走を追跡する方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、（ｉ）本開示の治療方法に従って、対象を治療することであって、細胞がＤＣであり、リポソームがＩＯＮＰを含む、治療することと、（ｉｉ）対象の１つ以上のリンパ節で核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を行うことと、を含む。例示的な態様では、本方法は、１つ以上のリンパ節のＴ２＊強調（Ｔ２＊ｗｅｉｇｈｔｅｄ）ＭＲＩ強度を決定することを含み、対照の未処置リンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と比較して、Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度の減少を示すリンパ節は、ＤＣが遊走したリンパ節を表す。例示的な実施形態では、対象においてリンパ節へのＤＣ遊走を追跡する方法は、対象から得られたＤＣを本開示のリポソームとインキュベートし、リポソームを含むＤＣを対象に投与することを含む。本方法は、対象へのＤＣの投与に続いて、対象の１つ以上のリンパ節に対してＭＲＩを行うことをさらに含む。様々な態様では、ＭＲＩは、投与後約２日で行われる。本明細書でさらに説明されるように、一部の態様における方法は、処置リンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度を測定し、Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度を、対象にＤＣを投与する前の強度と比較することを含む。様々な例では、Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度の減少は、ＤＣ投与の正の結果（例えば、正の治療応答）に関連する。したがって、対象における樹状細胞（ＤＣ）ワクチン接種療法に対する対象の治療応答を決定する方法が、本開示により提供される。例示的な実施形態では、本方法は、（ｉ）本開示の治療方法に従って、対象を治療することであって、細胞がＤＣであり、リポソームがＩＯＮＰを含む、治療することと、（ｉｉ）ＤＣ遊走を追跡する本開示の方法に従って、リンパ節へのＤＣ遊走を追跡することであって、処置リンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度が減少する場合、ＤＣワクチン接種療法が対象において正の治療応答をもたらすと決定される、追跡することと、を含む。
【００１２】
本開示はまた、対象における樹状細胞（ＤＣ）ワクチン接種療法に対する治療応答をモニタリングする方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、第１時点および第２時点でのリンパ節へのＤＣ遊走を追跡する本開示の方法に従って、リンパ節へのＤＣ遊走を追跡することを含み、第２時点での処置リンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度が、第１時点での処置リンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と比較して減少する場合に、ＤＣワクチン接種療法に対する治療応答が有効である。
【００１３】
本開示は、腫瘍、任意選択的に、脳腫瘍、の微小環境内の細胞にＲＮＡを送達する方法を提供し、本開示の組成物を静脈内投与することを含み、組成物は、リポソームを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】異なる量のコレステロールを含むリポソームを含有するＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣのパーセンテージのグラフである。
【図１Ｂ】０％コレステロール（Ｓｔｄ−ＲＮＡ−ＮＰ）または２５％コレステロール（Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰ）を含むリポソームによって送達されたＲＮＡが負荷された樹状細胞の％のグラフである。
【図１Ｃ】０％コレステロール（Ｓｔｄ−ＲＮＡ−ＮＰ）または２５％コレステロール（Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰ）を含むリポソームによって送達されたＲＮＡが負荷された生存樹状細胞の％のグラフである。
【図１Ｄ】０％コレステロールおよび腫瘍由来ＲＮＡを含むリポソーム（Ｓｔｄ−ＲＮＡ−ＮＰ  ＤＣ）でトランスフェクトされた樹状細胞、または２５％コレステロールおよび腫瘍由来ＲＮＡリポソームを含むリポソーム（Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰ  ＤＣ）でトランスフェクトされた樹状細胞、とインキュベートされたＴ細胞によって生成されたＩＦＮγのグラフである。対照として、トランスフェクトされていないＤＣ（未処置ＤＣ）およびＴ細胞を、この実験で使用した。
【図２Ａ】皮質の免疫蛍光画像である。
【図２Ｂ】腫瘍の免疫蛍光画像である。
【図２Ｃ】ＫＲ１５８Ｂ−ルシフェラーゼ腫瘍を有し、２５％コレステロールを含むリポソーム（Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰ）、０％コレステロールを有するリポソーム（ＲＮＡ−ＮＰ）、ＲＮＡのみを注射したマウス、または未処置のマウスの脳腫瘍におけるＣｙ５＋細胞のグラフである。
【図２Ｄ】ＧＬ２６１腫瘍を有し、２５％コレステロールを含むリポソーム（Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰ）、０％コレステロールを有するリポソーム（ＲＮＡ−ＮＰ）を注射したマウス、または未処置のマウスの脳腫瘍におけるＣｙ５＋細胞のグラフである。
【図３】ＫＲ１５８Ｂ−ルシフェラーゼ腫瘍を有し、１％、１２．５％、２５％、または３７％のコレステロールを含むリポソームを注射したマウスの腫瘍におけるＣｙ３＋細胞のグラフであり、コレステロール含有量の関数としてプロットされている。
【図４】腫瘍または皮質の一連の蛍光顕微鏡画像であり、ＣＤ３１蛍光抗体（左の列）またはＣｙ３標識ＲＮＡ（中央の列）を含むリポソームで染色された画像、あるいは重ね合わせた画像（右の列）である。
【図５Ａ】２５％コレステロールを含むリポソーム（Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰ）、０％コレステロールを有するリポソーム（ＲＮＡ−ＮＰ）、ＲＮＡのみを注射したマウス、または未処置のマウスの脳腫瘍におけるＣｙ５＋ＣＤ４５＋細胞のグラフである。
【図５Ｂ】２５％コレステロール（Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰ）または０％コレステロール（ＲＮＡ−ＮＰ）を含むリポソームを注射したマウスの脳腫瘍におけるＣｙ５＋であるＣＤ４５＋細胞の％のグラフである。
【図５Ｃ】２５％コレステロールを含むリポソーム（Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰ）、または０％コレステロールを有するリポソーム（ＲＮＡ−ＮＰ）を注射したマウスの脳腫瘍におけるＣｙ５＋であるＭＨＣクラスＩＩ＋ＣＤ４５＋細胞のグラフである。
【図６Ａ】２５％コレステロールを含むリポソーム（Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰ）、０％コレステロールを有するリポソーム（ＲＮＡ−ＮＰ）、未処置またはＲＮＡのみ（Ｃｙ５）を注射したマウスの肺におけるＣｙ５＋細胞のグラフである。
【図６Ｂ】２５％コレステロールを含むリポソーム（Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰ）、０％コレステロールを有するリポソーム（ＲＮＡ−ＮＰ）、未処置またはＲＮＡのみ（Ｃｙ５）を注射したマウスの脾臓におけるＣｙ５＋細胞のグラフである。
【図６Ｃ】２５％コレステロールを含むリポソーム（Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰ）、０％コレステロールを有するリポソーム（ＲＮＡ−ＮＰ）、未処置またはＲＮＡのみ（Ｃｙ５）を注射したマウスの肝臓におけるＣｙ５＋細胞のグラフである。
【図６Ｄ】２５％コレステロールを含むリポソーム（Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰ、〇）、０％コレステロールを有するリポソーム（ＲＮＡ−ＮＰ、□）を注射したマウスの脳腫瘍におけるＣｙ５＋細胞のグラフであり、肺におけるＣｙ５＋細胞の関数としてプロットされている。
【図６Ｅ】２５％コレステロールを含むリポソーム（Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰ、〇）、または０％コレステロールを有するリポソーム（ＲＮＡ−ＮＰ、□）を注射したマウスの脳腫瘍におけるＣｙ５＋細胞のグラフであり、脾臓におけるＣｙ５＋細胞の関数としてプロットされている。
【図６Ｆ】２５％コレステロールを含むリポソーム（Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰ、〇）、または０％コレステロールを有するリポソーム（ＲＮＡ−ＮＰ、□）を注射したマウスの脳腫瘍におけるＣｙ５＋細胞のグラフであり、肝臓におけるＣｙ５＋細胞の関数としてプロットされている。
【図７Ａ】酸化鉄ナノ粒子を含むリポソームを作製するための基本的なステップの概略図である。
【図７Ｂ】酸化鉄リポソームのクライオ−ＴＥＭ画像である。
【図７Ｃ】粒子径の関数としてプロットされた粒子の濃度のグラフである。
【図７Ｄ】アガロースゲルの画像であり、様々な量の酸化鉄を含有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、ウェルに負荷されている。この画像では、明るいバンドは、非結合ｍＲＮＡの存在を示している。カラムにバンドが存在しないことは、すべてのＲＮＡが、その粒子製剤によって結合されたことを示している。
【図７Ｅ】酸化鉄を有する（ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ）または酸化鉄なし（ＲＮＡ−ＮＰ）の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ＲＮＡを含むリポソーム、酸化鉄粒子のみ、ナノ粒子のみでトランスフェクトされた細胞、または未処置の細胞の％のグラフである。
【図７Ｆ】酸化鉄およびコレステロール（Ｃｈｏｌ−ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ）または酸化鉄を含むがコレステロールを含まない（ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ）リポソームでトランスフェクトされたＤＣの％のグラフである。
【図７Ｇ】Ｃｙ３標識ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰでトランスフェクトされたＤＣの明視野像である。
【図７Ｈ】Ｃｙ３標識ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰでトランスフェクトされたＤＣの蛍光画像である。
【図７Ｉ】コレステロールおよび異なる量のカルボキシル化酸化鉄ナノ粒子を含むリポソームを含有するＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣのパーセンテージのグラフである。
【図８Ａ】磁場の存在下（磁石）または不存下（磁石なし）で、酸化鉄リポソームを含有するＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣのパーセンテージのグラフである。
【図８Ｂ】磁場の存在下で、様々な量の酸化鉄を有する酸化鉄リポソームを含有するＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣのパーセンテージのグラフである。
【図８Ｃ】３０分間の磁場の存在下（３０分間＋磁石）、または３０分間の磁場の不在下（３０分間）、あるいは一晩の磁場の不在下（１８時間）で、磁性リポソームを含有するＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣのパーセンテージのグラフである。
【図８Ｄ】磁気分離器上に３０分間配置されたＤＣを含む管の写真であり、磁場が最大である管の側面に引き付けられた細胞の目に見える塊を示す。
【図８Ｅ】磁場の存在下（静的磁石）または不在下（磁石なし）で、磁性リポソームとインキュベートされたＣｙ５＋陽性骨髄ＤＣの％のグラフである。
【図８Ｆ】３０分間の磁場の存在下（静的磁石）、または３０分間の磁場の不在下（磁石なし）、あるいは一晩の磁場の不在下（磁石なし、一晩）で、ＩＯリポソームを含有するＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣのパーセンテージのグラフである。
【図９Ａ】ＲＮＡを負荷した磁性リポソームが、サイトカイン産生に対する効果を示す経路の図である。
【図９Ｂ】ＧＦＰ  ＲＮＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏ）でエレクトロポレーションされたＤＣ、ＲＮＡ−およびＩＯ負荷リポソーム（ＧＦＰ  ｍＲＮＡ＋ＮＰ）とインキュベートされたＤＣ、未処置または単にナノ粒子（ＮＰのみ）で処置されたＤＣ、により産生されたＩＦＮαのグラフである。
【図９Ｃ】ＲＮＡ負荷リポソームとインキュベートされたＤＣで刺激されたＴ細胞または未刺激Ｔ細胞により産生されたＩＦＮγのグラフである。
【図９Ｄ】エレクトロポレーション（左）またはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（右）を介して、Ｃｙ３標識ＯＶＡ  ＲＮＡ（１８時間）またはＣｙ３標識ＧＦＰ  ＲＮＡが負荷されたＤｓＲｅｄ  ＤＣを注射されたマウスのリンパ節におけるＤｓＲｅｄ＋細胞の、１８、４８または７２時間後のグラフである。
【図１０Ａ】イメージングパラメータの各セットについての、ＴＲ／ＴＥが２０７／１７であるＴ２＊強調画像、およびＴ２＿ＲＡＲＥ強調画像における、処置および未処置リンパ節の代表的な画像である。
【図１０Ｂ】図１０Ａのデータの定量化である。
【図１０Ｃ】脂肪飽和を用いたＴ２＊強調画像における強度の相対変化に対してプロットされた各リンパ節における細胞の数のグラフである。
【図１０Ｄ】リンパ節サイズの平均相対変化のグラフである。
【図１１Ａ】未処置のマウスまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたマウスにおける腫瘍移植後の日数の関数としてプロットされた、腫瘍サイズのグラフである。
【図１１Ｂ】未処置のマウスまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたマウスを応答者と非応答者の２つのグループに分けて腫瘍移植後の日数の関数としてプロットされた、腫瘍サイズのグラフである。
【図１１Ｃ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたマウスにおける２７日目の応答者および非応答者の腫瘍サイズのグラフである。
【図１１Ｄ】ＩＯ  ＲＮＡ  ＮＰで処置されたマウスにおける２日目の応答者および非応答者のＴ２＊脂肪抑制（Ｔ２＊ｆａｔｓａｔ）画像強度のグラフである。
【図１１Ｅ】生存率と相関しなかったシーケンスの表である。
【図１１Ｆ】２７日目の腫瘍体積の関数としてプロットされた、２日目のＴ２＊脂肪抑制画像強度のグラフである。
【図１２Ａ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、ｍＲＮＡを脳腫瘍に送達することを示している。図１２Ａは、Ｃｙ３標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰを注射して２４時間後の、ＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ腫瘍の代表的な免疫蛍光顕微鏡画像である。図１２Ｂ〜１２Ｃは、Ｃｙ５標識リポソームを注射して２４時間後の、頭蓋内ＫＲ１５８ｂ（図１２Ｂ）またはＧＬ２６１（図１２Ｃ）腫瘍における、Ｃｙ５標識ＲＮＡのフローサイトメトリーに基づく定量化のグラフである。図１２Ｄは、様々な量のコレステロールを含むＲＮＡ−ＮＰでワクチン接種した後の、脳腫瘍へのＲＮＡ送達のグラフである。
【図１２Ｂ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、ｍＲＮＡを脳腫瘍に送達することを示している。図１２Ａは、Ｃｙ３標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰを注射して２４時間後の、ＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ腫瘍の代表的な免疫蛍光顕微鏡画像である。図１２Ｂ〜１２Ｃは、Ｃｙ５標識リポソームを注射して２４時間後の、頭蓋内ＫＲ１５８ｂ（図１２Ｂ）またはＧＬ２６１（図１２Ｃ）腫瘍における、Ｃｙ５標識ＲＮＡのフローサイトメトリーに基づく定量化のグラフである。図１２Ｄは、様々な量のコレステロールを含むＲＮＡ−ＮＰでワクチン接種した後の、脳腫瘍へのＲＮＡ送達のグラフである。
【図１２Ｃ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、ｍＲＮＡを脳腫瘍に送達することを示している。図１２Ａは、Ｃｙ３標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰを注射して２４時間後の、ＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ腫瘍の代表的な免疫蛍光顕微鏡画像である。図１２Ｂ〜１２Ｃは、Ｃｙ５標識リポソームを注射して２４時間後の、頭蓋内ＫＲ１５８ｂ（図１２Ｂ）またはＧＬ２６１（図１２Ｃ）腫瘍における、Ｃｙ５標識ＲＮＡのフローサイトメトリーに基づく定量化のグラフである。図１２Ｄは、様々な量のコレステロールを含むＲＮＡ−ＮＰでワクチン接種した後の、脳腫瘍へのＲＮＡ送達のグラフである。
【図１２Ｄ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、ｍＲＮＡを脳腫瘍に送達することを示している。図１２Ａは、Ｃｙ３標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰを注射して２４時間後の、ＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ腫瘍の代表的な免疫蛍光顕微鏡画像である。図１２Ｂ〜１２Ｃは、Ｃｙ５標識リポソームを注射して２４時間後の、頭蓋内ＫＲ１５８ｂ（図１２Ｂ）またはＧＬ２６１（図１２Ｃ）腫瘍における、Ｃｙ５標識ＲＮＡのフローサイトメトリーに基づく定量化のグラフである。図１２Ｄは、様々な量のコレステロールを含むＲＮＡ−ＮＰでワクチン接種した後の、脳腫瘍へのＲＮＡ送達のグラフである。
【図１３Ａ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、血管周囲のＴＡＭにトランスフェクトすることを示している。図１３Ａは、Ｃｙ３標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたマウスのＫＲ１５ｂ腫瘍および皮質の代表的な免疫蛍光画像である。図１３Ｂ〜１３Ｈは、蛍光標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでワクチン接種された、またはされていない腫瘍のフローサイトメトリーのグラフである。データは、頭蓋内ＧＬ２６１（１３Ｂ、１３Ｄ、１３Ｆ、１３Ｈ）またはＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ（１３Ｃ、１３Ｅ、１３Ｇ）を有するマウスの、未処置腫瘍、処置腫瘍（Ｃｈｏｌ（バルク））、および処置腫瘍内のＲＮＡ＋細胞（Ｃｈｏｌ（ＲＮＡ＋））についての、ＣＤ４５＋である全細胞のパーセンテージ（図１３Ｂ、１３Ｃ）、マクロファージであるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｄ〜１３Ｅ）、抗原提示細胞であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｆ〜Ｇ）およびＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ／６Ｃ＋であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｈ）として示されている。
【図１３Ｂ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、血管周囲のＴＡＭにトランスフェクトすることを示している。図１３Ａは、Ｃｙ３標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたマウスのＫＲ１５ｂ腫瘍および皮質の代表的な免疫蛍光画像である。図１３Ｂ〜１３Ｈは、蛍光標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでワクチン接種された、またはされていない腫瘍のフローサイトメトリーのグラフである。データは、頭蓋内ＧＬ２６１（１３Ｂ、１３Ｄ、１３Ｆ、１３Ｈ）またはＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ（１３Ｃ、１３Ｅ、１３Ｇ）を有するマウスの、未処置腫瘍、処置腫瘍（Ｃｈｏｌ（バルク））、および処置腫瘍内のＲＮＡ＋細胞（Ｃｈｏｌ（ＲＮＡ＋））についての、ＣＤ４５＋である全細胞のパーセンテージ（図１３Ｂ、１３Ｃ）、マクロファージであるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｄ〜１３Ｅ）、抗原提示細胞であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｆ〜Ｇ）およびＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ／６Ｃ＋であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｈ）として示されている。
【図１３Ｃ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、血管周囲のＴＡＭにトランスフェクトすることを示している。図１３Ａは、Ｃｙ３標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたマウスのＫＲ１５ｂ腫瘍および皮質の代表的な免疫蛍光画像である。図１３Ｂ〜１３Ｈは、蛍光標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでワクチン接種された、またはされていない腫瘍のフローサイトメトリーのグラフである。データは、頭蓋内ＧＬ２６１（１３Ｂ、１３Ｄ、１３Ｆ、１３Ｈ）またはＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ（１３Ｃ、１３Ｅ、１３Ｇ）を有するマウスの、未処置腫瘍、処置腫瘍（Ｃｈｏｌ（バルク））、および処置腫瘍内のＲＮＡ＋細胞（Ｃｈｏｌ（ＲＮＡ＋））についての、ＣＤ４５＋である全細胞のパーセンテージ（図１３Ｂ、１３Ｃ）、マクロファージであるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｄ〜１３Ｅ）、抗原提示細胞であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｆ〜Ｇ）およびＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ／６Ｃ＋であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｈ）として示されている。
【図１３Ｄ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、血管周囲のＴＡＭにトランスフェクトすることを示している。図１３Ａは、Ｃｙ３標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたマウスのＫＲ１５ｂ腫瘍および皮質の代表的な免疫蛍光画像である。図１３Ｂ〜１３Ｈは、蛍光標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでワクチン接種された、またはされていない腫瘍のフローサイトメトリーのグラフである。データは、頭蓋内ＧＬ２６１（１３Ｂ、１３Ｄ、１３Ｆ、１３Ｈ）またはＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ（１３Ｃ、１３Ｅ、１３Ｇ）を有するマウスの、未処置腫瘍、処置腫瘍（Ｃｈｏｌ（バルク））、および処置腫瘍内のＲＮＡ＋細胞（Ｃｈｏｌ（ＲＮＡ＋））についての、ＣＤ４５＋である全細胞のパーセンテージ（図１３Ｂ、１３Ｃ）、マクロファージであるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｄ〜１３Ｅ）、抗原提示細胞であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｆ〜Ｇ）およびＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ／６Ｃ＋であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｈ）として示されている。
【図１３Ｅ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、血管周囲のＴＡＭにトランスフェクトすることを示している。図１３Ａは、Ｃｙ３標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたマウスのＫＲ１５ｂ腫瘍および皮質の代表的な免疫蛍光画像である。図１３Ｂ〜１３Ｈは、蛍光標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでワクチン接種された、またはされていない腫瘍のフローサイトメトリーのグラフである。データは、頭蓋内ＧＬ２６１（１３Ｂ、１３Ｄ、１３Ｆ、１３Ｈ）またはＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ（１３Ｃ、１３Ｅ、１３Ｇ）を有するマウスの、未処置腫瘍、処置腫瘍（Ｃｈｏｌ（バルク））、および処置腫瘍内のＲＮＡ＋細胞（Ｃｈｏｌ（ＲＮＡ＋））についての、ＣＤ４５＋である全細胞のパーセンテージ（図１３Ｂ、１３Ｃ）、マクロファージであるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｄ〜１３Ｅ）、抗原提示細胞であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｆ〜Ｇ）およびＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ／６Ｃ＋であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｈ）として示されている。
【図１３Ｆ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、血管周囲のＴＡＭにトランスフェクトすることを示している。図１３Ａは、Ｃｙ３標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたマウスのＫＲ１５ｂ腫瘍および皮質の代表的な免疫蛍光画像である。図１３Ｂ〜１３Ｈは、蛍光標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでワクチン接種された、またはされていない腫瘍のフローサイトメトリーのグラフである。データは、頭蓋内ＧＬ２６１（１３Ｂ、１３Ｄ、１３Ｆ、１３Ｈ）またはＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ（１３Ｃ、１３Ｅ、１３Ｇ）を有するマウスの、未処置腫瘍、処置腫瘍（Ｃｈｏｌ（バルク））、および処置腫瘍内のＲＮＡ＋細胞（Ｃｈｏｌ（ＲＮＡ＋））についての、ＣＤ４５＋である全細胞のパーセンテージ（図１３Ｂ、１３Ｃ）、マクロファージであるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｄ〜１３Ｅ）、抗原提示細胞であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｆ〜Ｇ）およびＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ／６Ｃ＋であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｈ）として示されている。
【図１３Ｇ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、血管周囲のＴＡＭにトランスフェクトすることを示している。図１３Ａは、Ｃｙ３標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたマウスのＫＲ１５ｂ腫瘍および皮質の代表的な免疫蛍光画像である。図１３Ｂ〜１３Ｈは、蛍光標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでワクチン接種された、またはされていない腫瘍のフローサイトメトリーのグラフである。データは、頭蓋内ＧＬ２６１（１３Ｂ、１３Ｄ、１３Ｆ、１３Ｈ）またはＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ（１３Ｃ、１３Ｅ、１３Ｇ）を有するマウスの、未処置腫瘍、処置腫瘍（Ｃｈｏｌ（バルク））、および処置腫瘍内のＲＮＡ＋細胞（Ｃｈｏｌ（ＲＮＡ＋））についての、ＣＤ４５＋である全細胞のパーセンテージ（図１３Ｂ、１３Ｃ）、マクロファージであるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｄ〜１３Ｅ）、抗原提示細胞であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｆ〜Ｇ）およびＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ／６Ｃ＋であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｈ）として示されている。
【図１３Ｈ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、血管周囲のＴＡＭにトランスフェクトすることを示している。図１３Ａは、Ｃｙ３標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたマウスのＫＲ１５ｂ腫瘍および皮質の代表的な免疫蛍光画像である。図１３Ｂ〜１３Ｈは、蛍光標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでワクチン接種された、またはされていない腫瘍のフローサイトメトリーのグラフである。データは、頭蓋内ＧＬ２６１（１３Ｂ、１３Ｄ、１３Ｆ、１３Ｈ）またはＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ（１３Ｃ、１３Ｅ、１３Ｇ）を有するマウスの、未処置腫瘍、処置腫瘍（Ｃｈｏｌ（バルク））、および処置腫瘍内のＲＮＡ＋細胞（Ｃｈｏｌ（ＲＮＡ＋））についての、ＣＤ４５＋である全細胞のパーセンテージ（図１３Ｂ、１３Ｃ）、マクロファージであるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｄ〜１３Ｅ）、抗原提示細胞であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｆ〜Ｇ）およびＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ／６Ｃ＋であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１３Ｈ）として示されている。
【図１４Ａ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、脳腫瘍においてＣＤ４５＋細胞を活性化することを示している。図１４Ａ〜１４Ｄは、ワクチン接種して２４時間後の、頭蓋内ＫＲ１５８ｂ腫瘍における抗原提示細胞上の活性化マーカーのフローサイトメトリーのグラフである。図１４Ａ、Ｆ４／８０＋ＣＤ４５＋でのＭＨＣＩＩ発現、図１４Ｂ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ４５＋細胞でのＣＤ８０発現、図１４Ｃ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ４５＋細胞でのＣＤ８６発現。
【図１４Ｂ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、脳腫瘍においてＣＤ４５＋細胞を活性化することを示している。図１４Ａ〜１４Ｄは、ワクチン接種して２４時間後の、頭蓋内ＫＲ１５８ｂ腫瘍における抗原提示細胞上の活性化マーカーのフローサイトメトリーのグラフである。図１４Ａ、Ｆ４／８０＋ＣＤ４５＋でのＭＨＣＩＩ発現、図１４Ｂ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ４５＋細胞でのＣＤ８０発現、図１４Ｃ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ４５＋細胞でのＣＤ８６発現。
【図１４Ｃ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、脳腫瘍においてＣＤ４５＋細胞を活性化することを示している。図１４Ａ〜１４Ｄは、ワクチン接種して２４時間後の、頭蓋内ＫＲ１５８ｂ腫瘍における抗原提示細胞上の活性化マーカーのフローサイトメトリーのグラフである。図１４Ａ、Ｆ４／８０＋ＣＤ４５＋でのＭＨＣＩＩ発現、図１４Ｂ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ４５＋細胞でのＣＤ８０発現、図１４Ｃ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ４５＋細胞でのＣＤ８６発現。
【図１５Ａ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、ＰＤＬ１ｓｉＲＮＡを脳腫瘍に送達することを示している。図１５Ａ〜１５Ｂ、ＧＦＰ  ｍＲＮＡおよびＰＤＬ１を標的とするｓｉＲＮＡを有するＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでＤＣ２．４をトランスフェクションして４８時間後の、ＧＦＰ（１５Ａ）およびＰＤＬ１（１５Ｂ）の発現。図１５Ｃ、Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰを静脈内注射して２４時間後の、ＫＲ１５８ｂ脳腫瘍におけるＣｙ５標識ＰＤＬ１−ｓｉＲＮＡの取り込み。図１５Ｄ〜１５Ｆ、ＭＨＣＩＩ、Ｆ４／８０、およびＣＤ１１ｂおよびＬｙ６Ｇ／６Ｃ（ＭＤＳＣ）の発現によって、トランスフェクトされた細胞を特徴付けるフローサイトメトリー。
【図１５Ｂ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、ＰＤＬ１ｓｉＲＮＡを脳腫瘍に送達することを示している。図１５Ａ〜１５Ｂ、ＧＦＰ  ｍＲＮＡおよびＰＤＬ１を標的とするｓｉＲＮＡを有するＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでＤＣ２．４をトランスフェクションして４８時間後の、ＧＦＰ（１５Ａ）およびＰＤＬ１（１５Ｂ）の発現。図１５Ｃ、Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰを静脈内注射して２４時間後の、ＫＲ１５８ｂ脳腫瘍におけるＣｙ５標識ＰＤＬ１−ｓｉＲＮＡの取り込み。図１５Ｄ〜１５Ｆ、ＭＨＣＩＩ、Ｆ４／８０、およびＣＤ１１ｂおよびＬｙ６Ｇ／６Ｃ（ＭＤＳＣ）の発現によって、トランスフェクトされた細胞を特徴付けるフローサイトメトリー。
【図１５Ｃ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、ＰＤＬ１ｓｉＲＮＡを脳腫瘍に送達することを示している。図１５Ａ〜１５Ｂ、ＧＦＰ  ｍＲＮＡおよびＰＤＬ１を標的とするｓｉＲＮＡを有するＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでＤＣ２．４をトランスフェクションして４８時間後の、ＧＦＰ（１５Ａ）およびＰＤＬ１（１５Ｂ）の発現。図１５Ｃ、Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰを静脈内注射して２４時間後の、ＫＲ１５８ｂ脳腫瘍におけるＣｙ５標識ＰＤＬ１−ｓｉＲＮＡの取り込み。図１５Ｄ〜１５Ｆ、ＭＨＣＩＩ、Ｆ４／８０、およびＣＤ１１ｂおよびＬｙ６Ｇ／６Ｃ（ＭＤＳＣ）の発現によって、トランスフェクトされた細胞を特徴付けるフローサイトメトリー。
【図１５Ｄ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、ＰＤＬ１ｓｉＲＮＡを脳腫瘍に送達することを示している。図１５Ａ〜１５Ｂ、ＧＦＰ  ｍＲＮＡおよびＰＤＬ１を標的とするｓｉＲＮＡを有するＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでＤＣ２．４をトランスフェクションして４８時間後の、ＧＦＰ（１５Ａ）およびＰＤＬ１（１５Ｂ）の発現。図１５Ｃ、Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰを静脈内注射して２４時間後の、ＫＲ１５８ｂ脳腫瘍におけるＣｙ５標識ＰＤＬ１−ｓｉＲＮＡの取り込み。図１５Ｄ〜１５Ｆ、ＭＨＣＩＩ、Ｆ４／８０、およびＣＤ１１ｂおよびＬｙ６Ｇ／６Ｃ（ＭＤＳＣ）の発現によって、トランスフェクトされた細胞を特徴付けるフローサイトメトリー。
【図１５Ｅ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、ＰＤＬ１ｓｉＲＮＡを脳腫瘍に送達することを示している。図１５Ａ〜１５Ｂ、ＧＦＰ  ｍＲＮＡおよびＰＤＬ１を標的とするｓｉＲＮＡを有するＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでＤＣ２．４をトランスフェクションして４８時間後の、ＧＦＰ（１５Ａ）およびＰＤＬ１（１５Ｂ）の発現。図１５Ｃ、Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰを静脈内注射して２４時間後の、ＫＲ１５８ｂ脳腫瘍におけるＣｙ５標識ＰＤＬ１−ｓｉＲＮＡの取り込み。図１５Ｄ〜１５Ｆ、ＭＨＣＩＩ、Ｆ４／８０、およびＣＤ１１ｂおよびＬｙ６Ｇ／６Ｃ（ＭＤＳＣ）の発現によって、トランスフェクトされた細胞を特徴付けるフローサイトメトリー。
【図１５Ｆ】Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、ＰＤＬ１ｓｉＲＮＡを脳腫瘍に送達することを示している。図１５Ａ〜１５Ｂ、ＧＦＰ  ｍＲＮＡおよびＰＤＬ１を標的とするｓｉＲＮＡを有するＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでＤＣ２．４をトランスフェクションして４８時間後の、ＧＦＰ（１５Ａ）およびＰＤＬ１（１５Ｂ）の発現。図１５Ｃ、Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰを静脈内注射して２４時間後の、ＫＲ１５８ｂ脳腫瘍におけるＣｙ５標識ＰＤＬ１−ｓｉＲＮＡの取り込み。図１５Ｄ〜１５Ｆ、ＭＨＣＩＩ、Ｆ４／８０、およびＣＤ１１ｂおよびＬｙ６Ｇ／６Ｃ（ＭＤＳＣ）の発現によって、トランスフェクトされた細胞を特徴付けるフローサイトメトリー。
【図１５Ｇ】ＫＬｕｃ脳腫瘍において、ｓｉＰＤＬ１がＰＤＬ１の発現を減少させることを示している。図１５Ｇ〜１５Ｉ、ｓｉＰＤＬ１を有するＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでワクチン接種して２４時間後の、ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋細胞でのＰＤＬ１発現。図１５Ｊ、ｓｉＰＤＬ１を有するＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰで１日３回のワクチン接種を終えて２４時間後の、頭蓋内ＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ腫瘍中のＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ／６Ｃ＋細胞（ＭＤＳＣ）でのＰＤＬ１発現。
【図１５Ｈ】ＫＬｕｃ脳腫瘍において、ｓｉＰＤＬ１がＰＤＬ１の発現を減少させることを示している。図１５Ｇ〜１５Ｉ、ｓｉＰＤＬ１を有するＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでワクチン接種して２４時間後の、ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋細胞でのＰＤＬ１発現。図１５Ｊ、ｓｉＰＤＬ１を有するＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰで１日３回のワクチン接種を終えて２４時間後の、頭蓋内ＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ腫瘍中のＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ／６Ｃ＋細胞（ＭＤＳＣ）でのＰＤＬ１発現。
【図１５Ｉ】ＫＬｕｃ脳腫瘍において、ｓｉＰＤＬ１がＰＤＬ１の発現を減少させることを示している。図１５Ｇ〜１５Ｉ、ｓｉＰＤＬ１を有するＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでワクチン接種して２４時間後の、ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋細胞でのＰＤＬ１発現。図１５Ｊ、ｓｉＰＤＬ１を有するＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰで１日３回のワクチン接種を終えて２４時間後の、頭蓋内ＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ腫瘍中のＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ／６Ｃ＋細胞（ＭＤＳＣ）でのＰＤＬ１発現。
【図１５Ｊ】ＫＬｕｃ脳腫瘍において、ｓｉＰＤＬ１がＰＤＬ１の発現を減少させることを示している。図１５Ｇ〜１５Ｉ、ｓｉＰＤＬ１を有するＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰでワクチン接種して２４時間後の、ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋細胞でのＰＤＬ１発現。図１５Ｊ、ｓｉＰＤＬ１を有するＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰで１日３回のワクチン接種を終えて２４時間後の、頭蓋内ＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ腫瘍中のＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ／６Ｃ＋細胞（ＭＤＳＣ）でのＰＤＬ１発現。
【図１６】市販のＩＯＮＰおよび腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ送達およびＤＣ活性化に例外的な能力を有する以前に翻訳された脂質の組み合わせと、組み合わせることによって、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが生成されたことを示す模式図である。磁場の存在下または不在下で、これらの粒子をＤＣとインキュベーションすると、ＲＮＡ発現の劇的な変化と抗原特異的Ｔ細胞を刺激する増強された能力とを特徴とする、著しいＤＣ活性化がもたらされた。ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰは、マウス腫瘍モデルにおける生存率と直接相関するリンパ節へのＤＣ遊走のＭＲＩに基づく検出を可能にした。
【図１７Ａ】酸化鉄を負荷したＲＮＡナノ粒子の開発および特性評価を示している。図１７Ａ、酸化鉄（ＩＯ）を有するまたは有さないＲＮＡ−ＮＰの代表的なクライオ−ＴＥＭ。図１７Ｂ、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔによって評価された、ＩＯ（１００μｇ  ＩＯ：１ｍｇ脂質）を有するおよび有さないＲＮＡ−ＮＰのサイズ分布。図１７Ｃ、ＳＱＵＩＤ磁力計で評価された、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（１００μｇ  ＩＯ：１ｍｇ脂質）の飽和磁化。図１７Ｄ、異なる脂質：ＲＮＡ比で、ＲＮＡと１５分間インキュベーションした後の、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰの異なる製剤（脂質ｍｇあたりの各製剤におけるＩＯＮＰの質量として標識されている）に結合したＲＮＡを実証する、アガロースゲル電気泳動。図１７Ｅ、様々な量の酸化鉄を含有するＲＮＡ−ＮＰのＲＮＡ結合能力。グラフ上の数値は、一元配置分散分析とテューキーの検定から得られたｐ値であり、グループあたりｎ＝４である。図１７Ｆ、フローサイトメトリーにより評価された、ＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＤＣ２．４の生存率（ｎ＝３）。図１７Ｇ、フローサイトメトリーにより評価された、ＲＮＡ−ＮＰと一晩インキュベーションした後の、ＤＣ２．４によるＣｙ５標識ＲＮＡの取り込み（ｎ＝３）。
【図１７Ｂ】酸化鉄を負荷したＲＮＡナノ粒子の開発および特性評価を示している。図１７Ａ、酸化鉄（ＩＯ）を有するまたは有さないＲＮＡ−ＮＰの代表的なクライオ−ＴＥＭ。図１７Ｂ、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔによって評価された、ＩＯ（１００μｇ  ＩＯ：１ｍｇ脂質）を有するおよび有さないＲＮＡ−ＮＰのサイズ分布。図１７Ｃ、ＳＱＵＩＤ磁力計で評価された、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（１００μｇ  ＩＯ：１ｍｇ脂質）の飽和磁化。図１７Ｄ、異なる脂質：ＲＮＡ比で、ＲＮＡと１５分間インキュベーションした後の、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰの異なる製剤（脂質ｍｇあたりの各製剤におけるＩＯＮＰの質量として標識されている）に結合したＲＮＡを実証する、アガロースゲル電気泳動。図１７Ｅ、様々な量の酸化鉄を含有するＲＮＡ−ＮＰのＲＮＡ結合能力。グラフ上の数値は、一元配置分散分析とテューキーの検定から得られたｐ値であり、グループあたりｎ＝４である。図１７Ｆ、フローサイトメトリーにより評価された、ＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＤＣ２．４の生存率（ｎ＝３）。図１７Ｇ、フローサイトメトリーにより評価された、ＲＮＡ−ＮＰと一晩インキュベーションした後の、ＤＣ２．４によるＣｙ５標識ＲＮＡの取り込み（ｎ＝３）。
【図１７Ｃ】酸化鉄を負荷したＲＮＡナノ粒子の開発および特性評価を示している。図１７Ａ、酸化鉄（ＩＯ）を有するまたは有さないＲＮＡ−ＮＰの代表的なクライオ−ＴＥＭ。図１７Ｂ、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔによって評価された、ＩＯ（１００μｇ  ＩＯ：１ｍｇ脂質）を有するおよび有さないＲＮＡ−ＮＰのサイズ分布。図１７Ｃ、ＳＱＵＩＤ磁力計で評価された、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（１００μｇ  ＩＯ：１ｍｇ脂質）の飽和磁化。図１７Ｄ、異なる脂質：ＲＮＡ比で、ＲＮＡと１５分間インキュベーションした後の、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰの異なる製剤（脂質ｍｇあたりの各製剤におけるＩＯＮＰの質量として標識されている）に結合したＲＮＡを実証する、アガロースゲル電気泳動。図１７Ｅ、様々な量の酸化鉄を含有するＲＮＡ−ＮＰのＲＮＡ結合能力。グラフ上の数値は、一元配置分散分析とテューキーの検定から得られたｐ値であり、グループあたりｎ＝４である。図１７Ｆ、フローサイトメトリーにより評価された、ＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＤＣ２．４の生存率（ｎ＝３）。図１７Ｇ、フローサイトメトリーにより評価された、ＲＮＡ−ＮＰと一晩インキュベーションした後の、ＤＣ２．４によるＣｙ５標識ＲＮＡの取り込み（ｎ＝３）。
【図１７Ｄ】酸化鉄を負荷したＲＮＡナノ粒子の開発および特性評価を示している。図１７Ａ、酸化鉄（ＩＯ）を有するまたは有さないＲＮＡ−ＮＰの代表的なクライオ−ＴＥＭ。図１７Ｂ、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔによって評価された、ＩＯ（１００μｇ  ＩＯ：１ｍｇ脂質）を有するおよび有さないＲＮＡ−ＮＰのサイズ分布。図１７Ｃ、ＳＱＵＩＤ磁力計で評価された、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（１００μｇ  ＩＯ：１ｍｇ脂質）の飽和磁化。図１７Ｄ、異なる脂質：ＲＮＡ比で、ＲＮＡと１５分間インキュベーションした後の、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰの異なる製剤（脂質ｍｇあたりの各製剤におけるＩＯＮＰの質量として標識されている）に結合したＲＮＡを実証する、アガロースゲル電気泳動。図１７Ｅ、様々な量の酸化鉄を含有するＲＮＡ−ＮＰのＲＮＡ結合能力。グラフ上の数値は、一元配置分散分析とテューキーの検定から得られたｐ値であり、グループあたりｎ＝４である。図１７Ｆ、フローサイトメトリーにより評価された、ＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＤＣ２．４の生存率（ｎ＝３）。図１７Ｇ、フローサイトメトリーにより評価された、ＲＮＡ−ＮＰと一晩インキュベーションした後の、ＤＣ２．４によるＣｙ５標識ＲＮＡの取り込み（ｎ＝３）。
【図１７Ｅ−１７Ｆ】酸化鉄を負荷したＲＮＡナノ粒子の開発および特性評価を示している。図１７Ａ、酸化鉄（ＩＯ）を有するまたは有さないＲＮＡ−ＮＰの代表的なクライオ−ＴＥＭ。図１７Ｂ、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔによって評価された、ＩＯ（１００μｇ  ＩＯ：１ｍｇ脂質）を有するおよび有さないＲＮＡ−ＮＰのサイズ分布。図１７Ｃ、ＳＱＵＩＤ磁力計で評価された、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（１００μｇ  ＩＯ：１ｍｇ脂質）の飽和磁化。図１７Ｄ、異なる脂質：ＲＮＡ比で、ＲＮＡと１５分間インキュベーションした後の、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰの異なる製剤（脂質ｍｇあたりの各製剤におけるＩＯＮＰの質量として標識されている）に結合したＲＮＡを実証する、アガロースゲル電気泳動。図１７Ｅ、様々な量の酸化鉄を含有するＲＮＡ−ＮＰのＲＮＡ結合能力。グラフ上の数値は、一元配置分散分析とテューキーの検定から得られたｐ値であり、グループあたりｎ＝４である。図１７Ｆ、フローサイトメトリーにより評価された、ＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＤＣ２．４の生存率（ｎ＝３）。図１７Ｇ、フローサイトメトリーにより評価された、ＲＮＡ−ＮＰと一晩インキュベーションした後の、ＤＣ２．４によるＣｙ５標識ＲＮＡの取り込み（ｎ＝３）。
【図１７Ｇ】酸化鉄を負荷したＲＮＡナノ粒子の開発および特性評価を示している。図１７Ａ、酸化鉄（ＩＯ）を有するまたは有さないＲＮＡ−ＮＰの代表的なクライオ−ＴＥＭ。図１７Ｂ、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔによって評価された、ＩＯ（１００μｇ  ＩＯ：１ｍｇ脂質）を有するおよび有さないＲＮＡ−ＮＰのサイズ分布。図１７Ｃ、ＳＱＵＩＤ磁力計で評価された、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（１００μｇ  ＩＯ：１ｍｇ脂質）の飽和磁化。図１７Ｄ、異なる脂質：ＲＮＡ比で、ＲＮＡと１５分間インキュベーションした後の、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰの異なる製剤（脂質ｍｇあたりの各製剤におけるＩＯＮＰの質量として標識されている）に結合したＲＮＡを実証する、アガロースゲル電気泳動。図１７Ｅ、様々な量の酸化鉄を含有するＲＮＡ−ＮＰのＲＮＡ結合能力。グラフ上の数値は、一元配置分散分析とテューキーの検定から得られたｐ値であり、グループあたりｎ＝４である。図１７Ｆ、フローサイトメトリーにより評価された、ＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＤＣ２．４の生存率（ｎ＝３）。図１７Ｇ、フローサイトメトリーにより評価された、ＲＮＡ−ＮＰと一晩インキュベーションした後の、ＤＣ２．４によるＣｙ５標識ＲＮＡの取り込み（ｎ＝３）。
【図１８Ａ】酸化鉄が、樹状細胞のトランスフェクションおよび活性化を増強することを示している。図１８Ａ、脂質１ｍｇあたり様々な量の酸化鉄で合成されたＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＤＣ２．４におけるＧＦＰ発現の代表的な画像。図１８Ｂ、フローサイトメトリーを用いた（ａ）からのトランスフェクション効率の定量化。統計分析には、ピアソンの相関とテューキーの検定を使用した分散分析を使用した。図１８Ｃ、酸化鉄を含まない、リポソーム内にカプセル化された酸化鉄（ＩＯ−リポソーム）、またはリポソームの外側の培地に添加された酸化鉄、を有するＧＦＰ−ＲＮＡ負荷リポソームでトランスフェクションした後の、ＢＭＤＣ中の蛍光。統計分析には、テューキーの検定を伴う分散分析を使用した。図１８Ｄ〜１８Ｅ、ＲＮＡ−ＮＰまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡ  ＲＮＡが負荷されたＤＣを、ＯＴ１マウス由来のナイーブ脾細胞（ｄ）または抗原を経験したＯＶＡ  Ｔ細胞（ｅ）と組み合わせた２日間の共培養後に、産生されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。図１８Ｆ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートした後のＤＣ２．４におけるトランスフェクション効率。統計分析には、ピアソンの相関係数を使用した。図１８Ｇ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートして２４時間後の、ＢＭＤＣの生存率。図１８Ｈ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（１００μｇ  ＩＯＮＰ：１ｍｇ脂質）と、いずれか３０分間インキュベーションした後の、あるいは磁場の不在下で、一晩インキュベーションした後の、ＢＭＤＣにおけるＧＦＰ発現。統計分析には、テューキーの検定を伴う一元配置分散分析を使用した。図１８Ｉ、磁場の存在下で、いずれか一晩または３０分間、抗原ナイーブＯＴ１  Ｔ細胞とＯＶＡ  ｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたＢＭＤＣとの共培養の２日間に産生された、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。すべての実験で、ｎ＝３であり、エラーバーは平均からの標準偏差を表し、数値は、適宜、両側の対応のない２群のｔ検定またはテューキーの検定から計算されたＰ値である。図１８Ａ〜１８Ｃおよび１８Ｆ〜１８Ｉの結果は、それぞれ、少なくとも２回の反復実験を表している。ｎｓ＝有意差なし。
【図１８Ｂ】酸化鉄が、樹状細胞のトランスフェクションおよび活性化を増強することを示している。図１８Ａ、脂質１ｍｇあたり様々な量の酸化鉄で合成されたＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＤＣ２．４におけるＧＦＰ発現の代表的な画像。図１８Ｂ、フローサイトメトリーを用いた（ａ）からのトランスフェクション効率の定量化。統計分析には、ピアソンの相関とテューキーの検定を使用した分散分析を使用した。図１８Ｃ、酸化鉄を含まない、リポソーム内にカプセル化された酸化鉄（ＩＯ−リポソーム）、またはリポソームの外側の培地に添加された酸化鉄、を有するＧＦＰ−ＲＮＡ負荷リポソームでトランスフェクションした後の、ＢＭＤＣ中の蛍光。統計分析には、テューキーの検定を伴う分散分析を使用した。図１８Ｄ〜１８Ｅ、ＲＮＡ−ＮＰまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡ  ＲＮＡが負荷されたＤＣを、ＯＴ１マウス由来のナイーブ脾細胞（ｄ）または抗原を経験したＯＶＡ  Ｔ細胞（ｅ）と組み合わせた２日間の共培養後に、産生されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。図１８Ｆ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートした後のＤＣ２．４におけるトランスフェクション効率。統計分析には、ピアソンの相関係数を使用した。図１８Ｇ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートして２４時間後の、ＢＭＤＣの生存率。図１８Ｈ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（１００μｇ  ＩＯＮＰ：１ｍｇ脂質）と、いずれか３０分間インキュベーションした後の、あるいは磁場の不在下で、一晩インキュベーションした後の、ＢＭＤＣにおけるＧＦＰ発現。統計分析には、テューキーの検定を伴う一元配置分散分析を使用した。図１８Ｉ、磁場の存在下で、いずれか一晩または３０分間、抗原ナイーブＯＴ１  Ｔ細胞とＯＶＡ  ｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたＢＭＤＣとの共培養の２日間に産生された、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。すべての実験で、ｎ＝３であり、エラーバーは平均からの標準偏差を表し、数値は、適宜、両側の対応のない２群のｔ検定またはテューキーの検定から計算されたＰ値である。図１８Ａ〜１８Ｃおよび１８Ｆ〜１８Ｉの結果は、それぞれ、少なくとも２回の反復実験を表している。ｎｓ＝有意差なし。
【図１８Ｃ】酸化鉄が、樹状細胞のトランスフェクションおよび活性化を増強することを示している。図１８Ａ、脂質１ｍｇあたり様々な量の酸化鉄で合成されたＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＤＣ２．４におけるＧＦＰ発現の代表的な画像。図１８Ｂ、フローサイトメトリーを用いた（ａ）からのトランスフェクション効率の定量化。統計分析には、ピアソンの相関とテューキーの検定を使用した分散分析を使用した。図１８Ｃ、酸化鉄を含まない、リポソーム内にカプセル化された酸化鉄（ＩＯ−リポソーム）、またはリポソームの外側の培地に添加された酸化鉄、を有するＧＦＰ−ＲＮＡ負荷リポソームでトランスフェクションした後の、ＢＭＤＣ中の蛍光。統計分析には、テューキーの検定を伴う分散分析を使用した。図１８Ｄ〜１８Ｅ、ＲＮＡ−ＮＰまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡ  ＲＮＡが負荷されたＤＣを、ＯＴ１マウス由来のナイーブ脾細胞（ｄ）または抗原を経験したＯＶＡ  Ｔ細胞（ｅ）と組み合わせた２日間の共培養後に、産生されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。図１８Ｆ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートした後のＤＣ２．４におけるトランスフェクション効率。統計分析には、ピアソンの相関係数を使用した。図１８Ｇ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートして２４時間後の、ＢＭＤＣの生存率。図１８Ｈ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（１００μｇ  ＩＯＮＰ：１ｍｇ脂質）と、いずれか３０分間インキュベーションした後の、あるいは磁場の不在下で、一晩インキュベーションした後の、ＢＭＤＣにおけるＧＦＰ発現。統計分析には、テューキーの検定を伴う一元配置分散分析を使用した。図１８Ｉ、磁場の存在下で、いずれか一晩または３０分間、抗原ナイーブＯＴ１  Ｔ細胞とＯＶＡ  ｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたＢＭＤＣとの共培養の２日間に産生された、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。すべての実験で、ｎ＝３であり、エラーバーは平均からの標準偏差を表し、数値は、適宜、両側の対応のない２群のｔ検定またはテューキーの検定から計算されたＰ値である。図１８Ａ〜１８Ｃおよび１８Ｆ〜１８Ｉの結果は、それぞれ、少なくとも２回の反復実験を表している。ｎｓ＝有意差なし。
【図１８Ｄ】酸化鉄が、樹状細胞のトランスフェクションおよび活性化を増強することを示している。図１８Ａ、脂質１ｍｇあたり様々な量の酸化鉄で合成されたＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＤＣ２．４におけるＧＦＰ発現の代表的な画像。図１８Ｂ、フローサイトメトリーを用いた（ａ）からのトランスフェクション効率の定量化。統計分析には、ピアソンの相関とテューキーの検定を使用した分散分析を使用した。図１８Ｃ、酸化鉄を含まない、リポソーム内にカプセル化された酸化鉄（ＩＯ−リポソーム）、またはリポソームの外側の培地に添加された酸化鉄、を有するＧＦＰ−ＲＮＡ負荷リポソームでトランスフェクションした後の、ＢＭＤＣ中の蛍光。統計分析には、テューキーの検定を伴う分散分析を使用した。図１８Ｄ〜１８Ｅ、ＲＮＡ−ＮＰまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡ  ＲＮＡが負荷されたＤＣを、ＯＴ１マウス由来のナイーブ脾細胞（ｄ）または抗原を経験したＯＶＡ  Ｔ細胞（ｅ）と組み合わせた２日間の共培養後に、産生されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。図１８Ｆ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートした後のＤＣ２．４におけるトランスフェクション効率。統計分析には、ピアソンの相関係数を使用した。図１８Ｇ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートして２４時間後の、ＢＭＤＣの生存率。図１８Ｈ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（１００μｇ  ＩＯＮＰ：１ｍｇ脂質）と、いずれか３０分間インキュベーションした後の、あるいは磁場の不在下で、一晩インキュベーションした後の、ＢＭＤＣにおけるＧＦＰ発現。統計分析には、テューキーの検定を伴う一元配置分散分析を使用した。図１８Ｉ、磁場の存在下で、いずれか一晩または３０分間、抗原ナイーブＯＴ１  Ｔ細胞とＯＶＡ  ｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたＢＭＤＣとの共培養の２日間に産生された、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。すべての実験で、ｎ＝３であり、エラーバーは平均からの標準偏差を表し、数値は、適宜、両側の対応のない２群のｔ検定またはテューキーの検定から計算されたＰ値である。図１８Ａ〜１８Ｃおよび１８Ｆ〜１８Ｉの結果は、それぞれ、少なくとも２回の反復実験を表している。ｎｓ＝有意差なし。
【図１８Ｅ】酸化鉄が、樹状細胞のトランスフェクションおよび活性化を増強することを示している。図１８Ａ、脂質１ｍｇあたり様々な量の酸化鉄で合成されたＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＤＣ２．４におけるＧＦＰ発現の代表的な画像。図１８Ｂ、フローサイトメトリーを用いた（ａ）からのトランスフェクション効率の定量化。統計分析には、ピアソンの相関とテューキーの検定を使用した分散分析を使用した。図１８Ｃ、酸化鉄を含まない、リポソーム内にカプセル化された酸化鉄（ＩＯ−リポソーム）、またはリポソームの外側の培地に添加された酸化鉄、を有するＧＦＰ−ＲＮＡ負荷リポソームでトランスフェクションした後の、ＢＭＤＣ中の蛍光。統計分析には、テューキーの検定を伴う分散分析を使用した。図１８Ｄ〜１８Ｅ、ＲＮＡ−ＮＰまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡ  ＲＮＡが負荷されたＤＣを、ＯＴ１マウス由来のナイーブ脾細胞（ｄ）または抗原を経験したＯＶＡ  Ｔ細胞（ｅ）と組み合わせた２日間の共培養後に、産生されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。図１８Ｆ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートした後のＤＣ２．４におけるトランスフェクション効率。統計分析には、ピアソンの相関係数を使用した。図１８Ｇ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートして２４時間後の、ＢＭＤＣの生存率。図１８Ｈ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（１００μｇ  ＩＯＮＰ：１ｍｇ脂質）と、いずれか３０分間インキュベーションした後の、あるいは磁場の不在下で、一晩インキュベーションした後の、ＢＭＤＣにおけるＧＦＰ発現。統計分析には、テューキーの検定を伴う一元配置分散分析を使用した。図１８Ｉ、磁場の存在下で、いずれか一晩または３０分間、抗原ナイーブＯＴ１  Ｔ細胞とＯＶＡ  ｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたＢＭＤＣとの共培養の２日間に産生された、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。すべての実験で、ｎ＝３であり、エラーバーは平均からの標準偏差を表し、数値は、適宜、両側の対応のない２群のｔ検定またはテューキーの検定から計算されたＰ値である。図１８Ａ〜１８Ｃおよび１８Ｆ〜１８Ｉの結果は、それぞれ、少なくとも２回の反復実験を表している。ｎｓ＝有意差なし。
【図１８Ｆ】酸化鉄が、樹状細胞のトランスフェクションおよび活性化を増強することを示している。図１８Ａ、脂質１ｍｇあたり様々な量の酸化鉄で合成されたＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＤＣ２．４におけるＧＦＰ発現の代表的な画像。図１８Ｂ、フローサイトメトリーを用いた（ａ）からのトランスフェクション効率の定量化。統計分析には、ピアソンの相関とテューキーの検定を使用した分散分析を使用した。図１８Ｃ、酸化鉄を含まない、リポソーム内にカプセル化された酸化鉄（ＩＯ−リポソーム）、またはリポソームの外側の培地に添加された酸化鉄、を有するＧＦＰ−ＲＮＡ負荷リポソームでトランスフェクションした後の、ＢＭＤＣ中の蛍光。統計分析には、テューキーの検定を伴う分散分析を使用した。図１８Ｄ〜１８Ｅ、ＲＮＡ−ＮＰまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡ  ＲＮＡが負荷されたＤＣを、ＯＴ１マウス由来のナイーブ脾細胞（ｄ）または抗原を経験したＯＶＡ  Ｔ細胞（ｅ）と組み合わせた２日間の共培養後に、産生されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。図１８Ｆ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートした後のＤＣ２．４におけるトランスフェクション効率。統計分析には、ピアソンの相関係数を使用した。図１８Ｇ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートして２４時間後の、ＢＭＤＣの生存率。図１８Ｈ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（１００μｇ  ＩＯＮＰ：１ｍｇ脂質）と、いずれか３０分間インキュベーションした後の、あるいは磁場の不在下で、一晩インキュベーションした後の、ＢＭＤＣにおけるＧＦＰ発現。統計分析には、テューキーの検定を伴う一元配置分散分析を使用した。図１８Ｉ、磁場の存在下で、いずれか一晩または３０分間、抗原ナイーブＯＴ１  Ｔ細胞とＯＶＡ  ｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたＢＭＤＣとの共培養の２日間に産生された、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。すべての実験で、ｎ＝３であり、エラーバーは平均からの標準偏差を表し、数値は、適宜、両側の対応のない２群のｔ検定またはテューキーの検定から計算されたＰ値である。図１８Ａ〜１８Ｃおよび１８Ｆ〜１８Ｉの結果は、それぞれ、少なくとも２回の反復実験を表している。ｎｓ＝有意差なし。
【図１８Ｇ】酸化鉄が、樹状細胞のトランスフェクションおよび活性化を増強することを示している。図１８Ａ、脂質１ｍｇあたり様々な量の酸化鉄で合成されたＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＤＣ２．４におけるＧＦＰ発現の代表的な画像。図１８Ｂ、フローサイトメトリーを用いた（ａ）からのトランスフェクション効率の定量化。統計分析には、ピアソンの相関とテューキーの検定を使用した分散分析を使用した。図１８Ｃ、酸化鉄を含まない、リポソーム内にカプセル化された酸化鉄（ＩＯ−リポソーム）、またはリポソームの外側の培地に添加された酸化鉄、を有するＧＦＰ−ＲＮＡ負荷リポソームでトランスフェクションした後の、ＢＭＤＣ中の蛍光。統計分析には、テューキーの検定を伴う分散分析を使用した。図１８Ｄ〜１８Ｅ、ＲＮＡ−ＮＰまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡ  ＲＮＡが負荷されたＤＣを、ＯＴ１マウス由来のナイーブ脾細胞（ｄ）または抗原を経験したＯＶＡ  Ｔ細胞（ｅ）と組み合わせた２日間の共培養後に、産生されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。図１８Ｆ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートした後のＤＣ２．４におけるトランスフェクション効率。統計分析には、ピアソンの相関係数を使用した。図１８Ｇ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートして２４時間後の、ＢＭＤＣの生存率。図１８Ｈ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（１００μｇ  ＩＯＮＰ：１ｍｇ脂質）と、いずれか３０分間インキュベーションした後の、あるいは磁場の不在下で、一晩インキュベーションした後の、ＢＭＤＣにおけるＧＦＰ発現。統計分析には、テューキーの検定を伴う一元配置分散分析を使用した。図１８Ｉ、磁場の存在下で、いずれか一晩または３０分間、抗原ナイーブＯＴ１  Ｔ細胞とＯＶＡ  ｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたＢＭＤＣとの共培養の２日間に産生された、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。すべての実験で、ｎ＝３であり、エラーバーは平均からの標準偏差を表し、数値は、適宜、両側の対応のない２群のｔ検定またはテューキーの検定から計算されたＰ値である。図１８Ａ〜１８Ｃおよび１８Ｆ〜１８Ｉの結果は、それぞれ、少なくとも２回の反復実験を表している。ｎｓ＝有意差なし。
【図１８Ｈ】酸化鉄が、樹状細胞のトランスフェクションおよび活性化を増強することを示している。図１８Ａ、脂質１ｍｇあたり様々な量の酸化鉄で合成されたＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＤＣ２．４におけるＧＦＰ発現の代表的な画像。図１８Ｂ、フローサイトメトリーを用いた（ａ）からのトランスフェクション効率の定量化。統計分析には、ピアソンの相関とテューキーの検定を使用した分散分析を使用した。図１８Ｃ、酸化鉄を含まない、リポソーム内にカプセル化された酸化鉄（ＩＯ−リポソーム）、またはリポソームの外側の培地に添加された酸化鉄、を有するＧＦＰ−ＲＮＡ負荷リポソームでトランスフェクションした後の、ＢＭＤＣ中の蛍光。統計分析には、テューキーの検定を伴う分散分析を使用した。図１８Ｄ〜１８Ｅ、ＲＮＡ−ＮＰまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡ  ＲＮＡが負荷されたＤＣを、ＯＴ１マウス由来のナイーブ脾細胞（ｄ）または抗原を経験したＯＶＡ  Ｔ細胞（ｅ）と組み合わせた２日間の共培養後に、産生されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。図１８Ｆ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートした後のＤＣ２．４におけるトランスフェクション効率。統計分析には、ピアソンの相関係数を使用した。図１８Ｇ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートして２４時間後の、ＢＭＤＣの生存率。図１８Ｈ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（１００μｇ  ＩＯＮＰ：１ｍｇ脂質）と、いずれか３０分間インキュベーションした後の、あるいは磁場の不在下で、一晩インキュベーションした後の、ＢＭＤＣにおけるＧＦＰ発現。統計分析には、テューキーの検定を伴う一元配置分散分析を使用した。図１８Ｉ、磁場の存在下で、いずれか一晩または３０分間、抗原ナイーブＯＴ１  Ｔ細胞とＯＶＡ  ｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたＢＭＤＣとの共培養の２日間に産生された、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。すべての実験で、ｎ＝３であり、エラーバーは平均からの標準偏差を表し、数値は、適宜、両側の対応のない２群のｔ検定またはテューキーの検定から計算されたＰ値である。図１８Ａ〜１８Ｃおよび１８Ｆ〜１８Ｉの結果は、それぞれ、少なくとも２回の反復実験を表している。ｎｓ＝有意差なし。
【図１８Ｉ】酸化鉄が、樹状細胞のトランスフェクションおよび活性化を増強することを示している。図１８Ａ、脂質１ｍｇあたり様々な量の酸化鉄で合成されたＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＤＣ２．４におけるＧＦＰ発現の代表的な画像。図１８Ｂ、フローサイトメトリーを用いた（ａ）からのトランスフェクション効率の定量化。統計分析には、ピアソンの相関とテューキーの検定を使用した分散分析を使用した。図１８Ｃ、酸化鉄を含まない、リポソーム内にカプセル化された酸化鉄（ＩＯ−リポソーム）、またはリポソームの外側の培地に添加された酸化鉄、を有するＧＦＰ−ＲＮＡ負荷リポソームでトランスフェクションした後の、ＢＭＤＣ中の蛍光。統計分析には、テューキーの検定を伴う分散分析を使用した。図１８Ｄ〜１８Ｅ、ＲＮＡ−ＮＰまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡ  ＲＮＡが負荷されたＤＣを、ＯＴ１マウス由来のナイーブ脾細胞（ｄ）または抗原を経験したＯＶＡ  Ｔ細胞（ｅ）と組み合わせた２日間の共培養後に、産生されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。図１８Ｆ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートした後のＤＣ２．４におけるトランスフェクション効率。統計分析には、ピアソンの相関係数を使用した。図１８Ｇ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと３０分間インキュベートして２４時間後の、ＢＭＤＣの生存率。図１８Ｈ、磁場の存在下または不在下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（１００μｇ  ＩＯＮＰ：１ｍｇ脂質）と、いずれか３０分間インキュベーションした後の、あるいは磁場の不在下で、一晩インキュベーションした後の、ＢＭＤＣにおけるＧＦＰ発現。統計分析には、テューキーの検定を伴う一元配置分散分析を使用した。図１８Ｉ、磁場の存在下で、いずれか一晩または３０分間、抗原ナイーブＯＴ１  Ｔ細胞とＯＶＡ  ｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置されたＢＭＤＣとの共培養の２日間に産生された、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ。すべての実験で、ｎ＝３であり、エラーバーは平均からの標準偏差を表し、数値は、適宜、両側の対応のない２群のｔ検定またはテューキーの検定から計算されたＰ値である。図１８Ａ〜１８Ｃおよび１８Ｆ〜１８Ｉの結果は、それぞれ、少なくとも２回の反復実験を表している。ｎｓ＝有意差なし。
【図１９Ａ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、エレクトロポレーションと比較して、ＤＣ活性化および遊走を増強することを示している。図１９Ａ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（ｎ＝３）を介してＧＦＰ  ＲＮＡでＢＭＤＣをトランスフェクションして２４時間後の、代表的なフローサイトメトリープロット（左）、トランスフェクション効率（中央）および幾何平均蛍光強度（右）。図１９Ｂ、Ｃｙ３標識ＲＮＡ−ＮＰと一晩インキュベートしたＤＣ２．４の蛍光顕微鏡画像。図１９Ｃ、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ、エレクトロポレーション、または培地のみで処置して２４時間後の、ＢＭＤＣにおけるＲＮＡ発現を比較するヒートマップ。図１９Ｄ〜１９Ｅ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置して２４時間後の、ＢＭＤＣについての、フローサイトメトリーにより評価された活性化の表現型マーカー（図１９Ｄ）およびＥＬＩＳＡにより評価されたＩＦＮ−α放出（図１９Ｅ）。統計分析には、一元配置分散分析およびテューキーの検定を使用した。図１９Ｆ、皮内注射後の様々な時点でのＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ負荷ＢＭＤＣのＶＤＬＮへの遊走。統計分析は、ウィルコクソンのマッチドペア順位和検定（ｎ＞４）またはスチューデントの対応のあるｔ検定（ｎ＜４）で完了した。図１９Ｇ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡ  ｍＲＮＡでパルスした５００，０００個のＢＭＤＣ、および１０，０００，０００個のナイーブＯＴ１  Ｔ細胞で単回ワクチン接種した後の、皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスにおける腫瘍増殖（未処置：ｎ＝６、エレクトロポレーション：ｎ＝６、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ：ｎ＝１３）。データは、２つの独立した実験からプールされている。統計分析には、二元配置分散分析を使用した。図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｄ〜１９Ｇの結果は、少なくとも２回の反復実験を表している。グラフ上の数値はＰ値である
【図１９Ｂ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、エレクトロポレーションと比較して、ＤＣ活性化および遊走を増強することを示している。図１９Ａ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（ｎ＝３）を介してＧＦＰ  ＲＮＡでＢＭＤＣをトランスフェクションして２４時間後の、代表的なフローサイトメトリープロット（左）、トランスフェクション効率（中央）および幾何平均蛍光強度（右）。図１９Ｂ、Ｃｙ３標識ＲＮＡ−ＮＰと一晩インキュベートしたＤＣ２．４の蛍光顕微鏡画像。図１９Ｃ、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ、エレクトロポレーション、または培地のみで処置して２４時間後の、ＢＭＤＣにおけるＲＮＡ発現を比較するヒートマップ。図１９Ｄ〜１９Ｅ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置して２４時間後の、ＢＭＤＣについての、フローサイトメトリーにより評価された活性化の表現型マーカー（図１９Ｄ）およびＥＬＩＳＡにより評価されたＩＦＮ−α放出（図１９Ｅ）。統計分析には、一元配置分散分析およびテューキーの検定を使用した。図１９Ｆ、皮内注射後の様々な時点でのＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ負荷ＢＭＤＣのＶＤＬＮへの遊走。統計分析は、ウィルコクソンのマッチドペア順位和検定（ｎ＞４）またはスチューデントの対応のあるｔ検定（ｎ＜４）で完了した。図１９Ｇ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡ  ｍＲＮＡでパルスした５００，０００個のＢＭＤＣ、および１０，０００，０００個のナイーブＯＴ１  Ｔ細胞で単回ワクチン接種した後の、皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスにおける腫瘍増殖（未処置：ｎ＝６、エレクトロポレーション：ｎ＝６、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ：ｎ＝１３）。データは、２つの独立した実験からプールされている。統計分析には、二元配置分散分析を使用した。図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｄ〜１９Ｇの結果は、少なくとも２回の反復実験を表している。グラフ上の数値はＰ値である
【図１９Ｃ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、エレクトロポレーションと比較して、ＤＣ活性化および遊走を増強することを示している。図１９Ａ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（ｎ＝３）を介してＧＦＰ  ＲＮＡでＢＭＤＣをトランスフェクションして２４時間後の、代表的なフローサイトメトリープロット（左）、トランスフェクション効率（中央）および幾何平均蛍光強度（右）。図１９Ｂ、Ｃｙ３標識ＲＮＡ−ＮＰと一晩インキュベートしたＤＣ２．４の蛍光顕微鏡画像。図１９Ｃ、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ、エレクトロポレーション、または培地のみで処置して２４時間後の、ＢＭＤＣにおけるＲＮＡ発現を比較するヒートマップ。図１９Ｄ〜１９Ｅ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置して２４時間後の、ＢＭＤＣについての、フローサイトメトリーにより評価された活性化の表現型マーカー（図１９Ｄ）およびＥＬＩＳＡにより評価されたＩＦＮ−α放出（図１９Ｅ）。統計分析には、一元配置分散分析およびテューキーの検定を使用した。図１９Ｆ、皮内注射後の様々な時点でのＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ負荷ＢＭＤＣのＶＤＬＮへの遊走。統計分析は、ウィルコクソンのマッチドペア順位和検定（ｎ＞４）またはスチューデントの対応のあるｔ検定（ｎ＜４）で完了した。図１９Ｇ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡ  ｍＲＮＡでパルスした５００，０００個のＢＭＤＣ、および１０，０００，０００個のナイーブＯＴ１  Ｔ細胞で単回ワクチン接種した後の、皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスにおける腫瘍増殖（未処置：ｎ＝６、エレクトロポレーション：ｎ＝６、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ：ｎ＝１３）。データは、２つの独立した実験からプールされている。統計分析には、二元配置分散分析を使用した。図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｄ〜１９Ｇの結果は、少なくとも２回の反復実験を表している。グラフ上の数値はＰ値である
【図１９Ｄ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、エレクトロポレーションと比較して、ＤＣ活性化および遊走を増強することを示している。図１９Ａ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（ｎ＝３）を介してＧＦＰ  ＲＮＡでＢＭＤＣをトランスフェクションして２４時間後の、代表的なフローサイトメトリープロット（左）、トランスフェクション効率（中央）および幾何平均蛍光強度（右）。図１９Ｂ、Ｃｙ３標識ＲＮＡ−ＮＰと一晩インキュベートしたＤＣ２．４の蛍光顕微鏡画像。図１９Ｃ、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ、エレクトロポレーション、または培地のみで処置して２４時間後の、ＢＭＤＣにおけるＲＮＡ発現を比較するヒートマップ。図１９Ｄ〜１９Ｅ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置して２４時間後の、ＢＭＤＣについての、フローサイトメトリーにより評価された活性化の表現型マーカー（図１９Ｄ）およびＥＬＩＳＡにより評価されたＩＦＮ−α放出（図１９Ｅ）。統計分析には、一元配置分散分析およびテューキーの検定を使用した。図１９Ｆ、皮内注射後の様々な時点でのＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ負荷ＢＭＤＣのＶＤＬＮへの遊走。統計分析は、ウィルコクソンのマッチドペア順位和検定（ｎ＞４）またはスチューデントの対応のあるｔ検定（ｎ＜４）で完了した。図１９Ｇ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡ  ｍＲＮＡでパルスした５００，０００個のＢＭＤＣ、および１０，０００，０００個のナイーブＯＴ１  Ｔ細胞で単回ワクチン接種した後の、皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスにおける腫瘍増殖（未処置：ｎ＝６、エレクトロポレーション：ｎ＝６、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ：ｎ＝１３）。データは、２つの独立した実験からプールされている。統計分析には、二元配置分散分析を使用した。図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｄ〜１９Ｇの結果は、少なくとも２回の反復実験を表している。グラフ上の数値はＰ値である
【図１９Ｅ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、エレクトロポレーションと比較して、ＤＣ活性化および遊走を増強することを示している。図１９Ａ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（ｎ＝３）を介してＧＦＰ  ＲＮＡでＢＭＤＣをトランスフェクションして２４時間後の、代表的なフローサイトメトリープロット（左）、トランスフェクション効率（中央）および幾何平均蛍光強度（右）。図１９Ｂ、Ｃｙ３標識ＲＮＡ−ＮＰと一晩インキュベートしたＤＣ２．４の蛍光顕微鏡画像。図１９Ｃ、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ、エレクトロポレーション、または培地のみで処置して２４時間後の、ＢＭＤＣにおけるＲＮＡ発現を比較するヒートマップ。図１９Ｄ〜１９Ｅ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置して２４時間後の、ＢＭＤＣについての、フローサイトメトリーにより評価された活性化の表現型マーカー（図１９Ｄ）およびＥＬＩＳＡにより評価されたＩＦＮ−α放出（図１９Ｅ）。統計分析には、一元配置分散分析およびテューキーの検定を使用した。図１９Ｆ、皮内注射後の様々な時点でのＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ負荷ＢＭＤＣのＶＤＬＮへの遊走。統計分析は、ウィルコクソンのマッチドペア順位和検定（ｎ＞４）またはスチューデントの対応のあるｔ検定（ｎ＜４）で完了した。図１９Ｇ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡ  ｍＲＮＡでパルスした５００，０００個のＢＭＤＣ、および１０，０００，０００個のナイーブＯＴ１  Ｔ細胞で単回ワクチン接種した後の、皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスにおける腫瘍増殖（未処置：ｎ＝６、エレクトロポレーション：ｎ＝６、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ：ｎ＝１３）。データは、２つの独立した実験からプールされている。統計分析には、二元配置分散分析を使用した。図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｄ〜１９Ｇの結果は、少なくとも２回の反復実験を表している。グラフ上の数値はＰ値である
【図１９Ｆ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、エレクトロポレーションと比較して、ＤＣ活性化および遊走を増強することを示している。図１９Ａ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（ｎ＝３）を介してＧＦＰ  ＲＮＡでＢＭＤＣをトランスフェクションして２４時間後の、代表的なフローサイトメトリープロット（左）、トランスフェクション効率（中央）および幾何平均蛍光強度（右）。図１９Ｂ、Ｃｙ３標識ＲＮＡ−ＮＰと一晩インキュベートしたＤＣ２．４の蛍光顕微鏡画像。図１９Ｃ、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ、エレクトロポレーション、または培地のみで処置して２４時間後の、ＢＭＤＣにおけるＲＮＡ発現を比較するヒートマップ。図１９Ｄ〜１９Ｅ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置して２４時間後の、ＢＭＤＣについての、フローサイトメトリーにより評価された活性化の表現型マーカー（図１９Ｄ）およびＥＬＩＳＡにより評価されたＩＦＮ−α放出（図１９Ｅ）。統計分析には、一元配置分散分析およびテューキーの検定を使用した。図１９Ｆ、皮内注射後の様々な時点でのＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ負荷ＢＭＤＣのＶＤＬＮへの遊走。統計分析は、ウィルコクソンのマッチドペア順位和検定（ｎ＞４）またはスチューデントの対応のあるｔ検定（ｎ＜４）で完了した。図１９Ｇ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡ  ｍＲＮＡでパルスした５００，０００個のＢＭＤＣ、および１０，０００，０００個のナイーブＯＴ１  Ｔ細胞で単回ワクチン接種した後の、皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスにおける腫瘍増殖（未処置：ｎ＝６、エレクトロポレーション：ｎ＝６、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ：ｎ＝１３）。データは、２つの独立した実験からプールされている。統計分析には、二元配置分散分析を使用した。図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｄ〜１９Ｇの結果は、少なくとも２回の反復実験を表している。グラフ上の数値はＰ値である
【図１９Ｇ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、エレクトロポレーションと比較して、ＤＣ活性化および遊走を増強することを示している。図１９Ａ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（ｎ＝３）を介してＧＦＰ  ＲＮＡでＢＭＤＣをトランスフェクションして２４時間後の、代表的なフローサイトメトリープロット（左）、トランスフェクション効率（中央）および幾何平均蛍光強度（右）。図１９Ｂ、Ｃｙ３標識ＲＮＡ−ＮＰと一晩インキュベートしたＤＣ２．４の蛍光顕微鏡画像。図１９Ｃ、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ、エレクトロポレーション、または培地のみで処置して２４時間後の、ＢＭＤＣにおけるＲＮＡ発現を比較するヒートマップ。図１９Ｄ〜１９Ｅ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置して２４時間後の、ＢＭＤＣについての、フローサイトメトリーにより評価された活性化の表現型マーカー（図１９Ｄ）およびＥＬＩＳＡにより評価されたＩＦＮ−α放出（図１９Ｅ）。統計分析には、一元配置分散分析およびテューキーの検定を使用した。図１９Ｆ、皮内注射後の様々な時点でのＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ負荷ＢＭＤＣのＶＤＬＮへの遊走。統計分析は、ウィルコクソンのマッチドペア順位和検定（ｎ＞４）またはスチューデントの対応のあるｔ検定（ｎ＜４）で完了した。図１９Ｇ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡ  ｍＲＮＡでパルスした５００，０００個のＢＭＤＣ、および１０，０００，０００個のナイーブＯＴ１  Ｔ細胞で単回ワクチン接種した後の、皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスにおける腫瘍増殖（未処置：ｎ＝６、エレクトロポレーション：ｎ＝６、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ：ｎ＝１３）。データは、２つの独立した実験からプールされている。統計分析には、二元配置分散分析を使用した。図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｄ〜１９Ｇの結果は、少なくとも２回の反復実験を表している。グラフ上の数値はＰ値である
【図２０Ａ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、ＭＲＩによる定量的な細胞追跡を可能にすることを示している。図２０Ａ、左鼠径部にＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ負荷ＤｓＲｅｄ＋  ＤＣをワクチン接種して４８時間後の、Ｔ２＊強調ＭＲＩ画像。黄色の境界線は、処置（右）側と未処置（左）側のリンパ節を示す。図２０Ｂ、リンパ節におけるＤｓＲｅｄ＋細胞でのゲーティングを実証する例示的なフローサイトメトリープロット。図２０Ｃ、処置および未処置リンパ節との間の相対リンパ節サイズの相関、ならびにそのリンパ節におけるＤＣの絶対数。データは、２つの独立した実験から組み合わされている。図２０Ｄ、処置および未処置のリンパ節における相対Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度と標識細胞の絶対数との相関。データは、２回の反復実験を表している。ｐ値とｒ値は、ピアソン相関から導出されている。
【図２０Ｂ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、ＭＲＩによる定量的な細胞追跡を可能にすることを示している。図２０Ａ、左鼠径部にＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ負荷ＤｓＲｅｄ＋  ＤＣをワクチン接種して４８時間後の、Ｔ２＊強調ＭＲＩ画像。黄色の境界線は、処置（右）側と未処置（左）側のリンパ節を示す。図２０Ｂ、リンパ節におけるＤｓＲｅｄ＋細胞でのゲーティングを実証する例示的なフローサイトメトリープロット。図２０Ｃ、処置および未処置リンパ節との間の相対リンパ節サイズの相関、ならびにそのリンパ節におけるＤＣの絶対数。データは、２つの独立した実験から組み合わされている。図２０Ｄ、処置および未処置のリンパ節における相対Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度と標識細胞の絶対数との相関。データは、２回の反復実験を表している。ｐ値とｒ値は、ピアソン相関から導出されている。
【図２０Ｃ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、ＭＲＩによる定量的な細胞追跡を可能にすることを示している。図２０Ａ、左鼠径部にＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ負荷ＤｓＲｅｄ＋  ＤＣをワクチン接種して４８時間後の、Ｔ２＊強調ＭＲＩ画像。黄色の境界線は、処置（右）側と未処置（左）側のリンパ節を示す。図２０Ｂ、リンパ節におけるＤｓＲｅｄ＋細胞でのゲーティングを実証する例示的なフローサイトメトリープロット。図２０Ｃ、処置および未処置リンパ節との間の相対リンパ節サイズの相関、ならびにそのリンパ節におけるＤＣの絶対数。データは、２つの独立した実験から組み合わされている。図２０Ｄ、処置および未処置のリンパ節における相対Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度と標識細胞の絶対数との相関。データは、２回の反復実験を表している。ｐ値とｒ値は、ピアソン相関から導出されている。
【図２０Ｄ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、ＭＲＩによる定量的な細胞追跡を可能にすることを示している。図２０Ａ、左鼠径部にＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ負荷ＤｓＲｅｄ＋  ＤＣをワクチン接種して４８時間後の、Ｔ２＊強調ＭＲＩ画像。黄色の境界線は、処置（右）側と未処置（左）側のリンパ節を示す。図２０Ｂ、リンパ節におけるＤｓＲｅｄ＋細胞でのゲーティングを実証する例示的なフローサイトメトリープロット。図２０Ｃ、処置および未処置リンパ節との間の相対リンパ節サイズの相関、ならびにそのリンパ節におけるＤＣの絶対数。データは、２つの独立した実験から組み合わされている。図２０Ｄ、処置および未処置のリンパ節における相対Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度と標識細胞の絶対数との相関。データは、２回の反復実験を表している。ｐ値とｒ値は、ピアソン相関から導出されている。
【図２１Ａ】ＭＲＩで検出されたＤＣ遊走が、ＤＣワクチンに対する応答を予測することを示している。皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスは、オボアルブミンｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷したＢＭＤＣで処置された。図２１Ａ、処置マウス（ｎ＝７）と未処置マウス（ｎ＝５）との間の経時的な腫瘍増殖。グラフ上の数値は、対応のないスチューデントのｔ検定により計算されたＰ値である。経時的な腫瘍増殖の比較は、二元配置分散分析で評価されている。図２１Ｂ、「応答者」と「非応答者」に分けられた、個々の処置された腫瘍増殖。図２１Ｃ、２日目と２７日目の腫瘍サイズでの未処置リンパ節と比較した処置リンパ節における、ＭＲＩ検出リンパ節強度の相対変化の相関（相対ＬＮ強度）。点線は、リンパ節相対ＭＲＩ強度の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルを示している。下位２５パーセンタイルにおける相対ＶＤＬＮ強度により示される大幅なＭＲＩ予測ＤＣ遊走を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｅおよび図２１ＥのＸであり、中央の５０パーセンタイルにおける中程度のＶＤＬＮ強度を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｄおよび図２１Ｅの点であり、上位７５パーセンタイルにおける高いＶＤＬＮ強度を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｄおよび図２１Ｅの四角である。図２１Ｄ〜２１Ｅ、２日目のＭＲＩ検出ＤＣ遊走と、腫瘍サイズ（ｄ）および生存率（ｎ＝１０）（ｅ）との相関。グラフｃ〜ｅの数値は、ピアソンの相関係数（ｒ）とＰ値（ｐ）を表している。図２１Ｆ〜２１Ｈ、ワクチン接種後２日目のＭＲＩ強度によって分離された複数の時点での、個々の腫瘍増殖曲線（図２１Ｆ）、要約データ（図２１Ｇ）、および腫瘍サイズ。グラフ上の数値は、分散分析（図２１Ｇ）および両側の対応のないｔ検定（図２１Ｈ）から計算されたｐ値である。
【図２１Ｂ】ＭＲＩで検出されたＤＣ遊走が、ＤＣワクチンに対する応答を予測することを示している。皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスは、オボアルブミンｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷したＢＭＤＣで処置された。図２１Ａ、処置マウス（ｎ＝７）と未処置マウス（ｎ＝５）との間の経時的な腫瘍増殖。グラフ上の数値は、対応のないスチューデントのｔ検定により計算されたＰ値である。経時的な腫瘍増殖の比較は、二元配置分散分析で評価されている。図２１Ｂ、「応答者」と「非応答者」に分けられた、個々の処置された腫瘍増殖。図２１Ｃ、２日目と２７日目の腫瘍サイズでの未処置リンパ節と比較した処置リンパ節における、ＭＲＩ検出リンパ節強度の相対変化の相関（相対ＬＮ強度）。点線は、リンパ節相対ＭＲＩ強度の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルを示している。下位２５パーセンタイルにおける相対ＶＤＬＮ強度により示される大幅なＭＲＩ予測ＤＣ遊走を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｅおよび図２１ＥのＸであり、中央の５０パーセンタイルにおける中程度のＶＤＬＮ強度を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｄおよび図２１Ｅの点であり、上位７５パーセンタイルにおける高いＶＤＬＮ強度を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｄおよび図２１Ｅの四角である。図２１Ｄ〜２１Ｅ、２日目のＭＲＩ検出ＤＣ遊走と、腫瘍サイズ（ｄ）および生存率（ｎ＝１０）（ｅ）との相関。グラフｃ〜ｅの数値は、ピアソンの相関係数（ｒ）とＰ値（ｐ）を表している。図２１Ｆ〜２１Ｈ、ワクチン接種後２日目のＭＲＩ強度によって分離された複数の時点での、個々の腫瘍増殖曲線（図２１Ｆ）、要約データ（図２１Ｇ）、および腫瘍サイズ。グラフ上の数値は、分散分析（図２１Ｇ）および両側の対応のないｔ検定（図２１Ｈ）から計算されたｐ値である。
【図２１Ｃ】ＭＲＩで検出されたＤＣ遊走が、ＤＣワクチンに対する応答を予測することを示している。皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスは、オボアルブミンｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷したＢＭＤＣで処置された。図２１Ａ、処置マウス（ｎ＝７）と未処置マウス（ｎ＝５）との間の経時的な腫瘍増殖。グラフ上の数値は、対応のないスチューデントのｔ検定により計算されたＰ値である。経時的な腫瘍増殖の比較は、二元配置分散分析で評価されている。図２１Ｂ、「応答者」と「非応答者」に分けられた、個々の処置された腫瘍増殖。図２１Ｃ、２日目と２７日目の腫瘍サイズでの未処置リンパ節と比較した処置リンパ節における、ＭＲＩ検出リンパ節強度の相対変化の相関（相対ＬＮ強度）。点線は、リンパ節相対ＭＲＩ強度の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルを示している。下位２５パーセンタイルにおける相対ＶＤＬＮ強度により示される大幅なＭＲＩ予測ＤＣ遊走を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｅおよび図２１ＥのＸであり、中央の５０パーセンタイルにおける中程度のＶＤＬＮ強度を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｄおよび図２１Ｅの点であり、上位７５パーセンタイルにおける高いＶＤＬＮ強度を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｄおよび図２１Ｅの四角である。図２１Ｄ〜２１Ｅ、２日目のＭＲＩ検出ＤＣ遊走と、腫瘍サイズ（ｄ）および生存率（ｎ＝１０）（ｅ）との相関。グラフｃ〜ｅの数値は、ピアソンの相関係数（ｒ）とＰ値（ｐ）を表している。図２１Ｆ〜２１Ｈ、ワクチン接種後２日目のＭＲＩ強度によって分離された複数の時点での、個々の腫瘍増殖曲線（図２１Ｆ）、要約データ（図２１Ｇ）、および腫瘍サイズ。グラフ上の数値は、分散分析（図２１Ｇ）および両側の対応のないｔ検定（図２１Ｈ）から計算されたｐ値である。
【図２１Ｄ】ＭＲＩで検出されたＤＣ遊走が、ＤＣワクチンに対する応答を予測することを示している。皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスは、オボアルブミンｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷したＢＭＤＣで処置された。図２１Ａ、処置マウス（ｎ＝７）と未処置マウス（ｎ＝５）との間の経時的な腫瘍増殖。グラフ上の数値は、対応のないスチューデントのｔ検定により計算されたＰ値である。経時的な腫瘍増殖の比較は、二元配置分散分析で評価されている。図２１Ｂ、「応答者」と「非応答者」に分けられた、個々の処置された腫瘍増殖。図２１Ｃ、２日目と２７日目の腫瘍サイズでの未処置リンパ節と比較した処置リンパ節における、ＭＲＩ検出リンパ節強度の相対変化の相関（相対ＬＮ強度）。点線は、リンパ節相対ＭＲＩ強度の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルを示している。下位２５パーセンタイルにおける相対ＶＤＬＮ強度により示される大幅なＭＲＩ予測ＤＣ遊走を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｅおよび図２１ＥのＸであり、中央の５０パーセンタイルにおける中程度のＶＤＬＮ強度を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｄおよび図２１Ｅの点であり、上位７５パーセンタイルにおける高いＶＤＬＮ強度を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｄおよび図２１Ｅの四角である。図２１Ｄ〜２１Ｅ、２日目のＭＲＩ検出ＤＣ遊走と、腫瘍サイズ（ｄ）および生存率（ｎ＝１０）（ｅ）との相関。グラフｃ〜ｅの数値は、ピアソンの相関係数（ｒ）とＰ値（ｐ）を表している。図２１Ｆ〜２１Ｈ、ワクチン接種後２日目のＭＲＩ強度によって分離された複数の時点での、個々の腫瘍増殖曲線（図２１Ｆ）、要約データ（図２１Ｇ）、および腫瘍サイズ。グラフ上の数値は、分散分析（図２１Ｇ）および両側の対応のないｔ検定（図２１Ｈ）から計算されたｐ値である。
【図２１Ｅ】ＭＲＩで検出されたＤＣ遊走が、ＤＣワクチンに対する応答を予測することを示している。皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスは、オボアルブミンｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷したＢＭＤＣで処置された。図２１Ａ、処置マウス（ｎ＝７）と未処置マウス（ｎ＝５）との間の経時的な腫瘍増殖。グラフ上の数値は、対応のないスチューデントのｔ検定により計算されたＰ値である。経時的な腫瘍増殖の比較は、二元配置分散分析で評価されている。図２１Ｂ、「応答者」と「非応答者」に分けられた、個々の処置された腫瘍増殖。図２１Ｃ、２日目と２７日目の腫瘍サイズでの未処置リンパ節と比較した処置リンパ節における、ＭＲＩ検出リンパ節強度の相対変化の相関（相対ＬＮ強度）。点線は、リンパ節相対ＭＲＩ強度の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルを示している。下位２５パーセンタイルにおける相対ＶＤＬＮ強度により示される大幅なＭＲＩ予測ＤＣ遊走を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｅおよび図２１ＥのＸであり、中央の５０パーセンタイルにおける中程度のＶＤＬＮ強度を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｄおよび図２１Ｅの点であり、上位７５パーセンタイルにおける高いＶＤＬＮ強度を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｄおよび図２１Ｅの四角である。図２１Ｄ〜２１Ｅ、２日目のＭＲＩ検出ＤＣ遊走と、腫瘍サイズ（ｄ）および生存率（ｎ＝１０）（ｅ）との相関。グラフｃ〜ｅの数値は、ピアソンの相関係数（ｒ）とＰ値（ｐ）を表している。図２１Ｆ〜２１Ｈ、ワクチン接種後２日目のＭＲＩ強度によって分離された複数の時点での、個々の腫瘍増殖曲線（図２１Ｆ）、要約データ（図２１Ｇ）、および腫瘍サイズ。グラフ上の数値は、分散分析（図２１Ｇ）および両側の対応のないｔ検定（図２１Ｈ）から計算されたｐ値である。
【図２１Ｆ】ＭＲＩで検出されたＤＣ遊走が、ＤＣワクチンに対する応答を予測することを示している。皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスは、オボアルブミンｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷したＢＭＤＣで処置された。図２１Ａ、処置マウス（ｎ＝７）と未処置マウス（ｎ＝５）との間の経時的な腫瘍増殖。グラフ上の数値は、対応のないスチューデントのｔ検定により計算されたＰ値である。経時的な腫瘍増殖の比較は、二元配置分散分析で評価されている。図２１Ｂ、「応答者」と「非応答者」に分けられた、個々の処置された腫瘍増殖。図２１Ｃ、２日目と２７日目の腫瘍サイズでの未処置リンパ節と比較した処置リンパ節における、ＭＲＩ検出リンパ節強度の相対変化の相関（相対ＬＮ強度）。点線は、リンパ節相対ＭＲＩ強度の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルを示している。下位２５パーセンタイルにおける相対ＶＤＬＮ強度により示される大幅なＭＲＩ予測ＤＣ遊走を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｅおよび図２１ＥのＸであり、中央の５０パーセンタイルにおける中程度のＶＤＬＮ強度を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｄおよび図２１Ｅの点であり、上位７５パーセンタイルにおける高いＶＤＬＮ強度を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｄおよび図２１Ｅの四角である。図２１Ｄ〜２１Ｅ、２日目のＭＲＩ検出ＤＣ遊走と、腫瘍サイズ（ｄ）および生存率（ｎ＝１０）（ｅ）との相関。グラフｃ〜ｅの数値は、ピアソンの相関係数（ｒ）とＰ値（ｐ）を表している。図２１Ｆ〜２１Ｈ、ワクチン接種後２日目のＭＲＩ強度によって分離された複数の時点での、個々の腫瘍増殖曲線（図２１Ｆ）、要約データ（図２１Ｇ）、および腫瘍サイズ。グラフ上の数値は、分散分析（図２１Ｇ）および両側の対応のないｔ検定（図２１Ｈ）から計算されたｐ値である。
【図２１Ｇ】ＭＲＩで検出されたＤＣ遊走が、ＤＣワクチンに対する応答を予測することを示している。皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスは、オボアルブミンｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷したＢＭＤＣで処置された。図２１Ａ、処置マウス（ｎ＝７）と未処置マウス（ｎ＝５）との間の経時的な腫瘍増殖。グラフ上の数値は、対応のないスチューデントのｔ検定により計算されたＰ値である。経時的な腫瘍増殖の比較は、二元配置分散分析で評価されている。図２１Ｂ、「応答者」と「非応答者」に分けられた、個々の処置された腫瘍増殖。図２１Ｃ、２日目と２７日目の腫瘍サイズでの未処置リンパ節と比較した処置リンパ節における、ＭＲＩ検出リンパ節強度の相対変化の相関（相対ＬＮ強度）。点線は、リンパ節相対ＭＲＩ強度の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルを示している。下位２５パーセンタイルにおける相対ＶＤＬＮ強度により示される大幅なＭＲＩ予測ＤＣ遊走を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｅおよび図２１ＥのＸであり、中央の５０パーセンタイルにおける中程度のＶＤＬＮ強度を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｄおよび図２１Ｅの点であり、上位７５パーセンタイルにおける高いＶＤＬＮ強度を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｄおよび図２１Ｅの四角である。図２１Ｄ〜２１Ｅ、２日目のＭＲＩ検出ＤＣ遊走と、腫瘍サイズ（ｄ）および生存率（ｎ＝１０）（ｅ）との相関。グラフｃ〜ｅの数値は、ピアソンの相関係数（ｒ）とＰ値（ｐ）を表している。図２１Ｆ〜２１Ｈ、ワクチン接種後２日目のＭＲＩ強度によって分離された複数の時点での、個々の腫瘍増殖曲線（図２１Ｆ）、要約データ（図２１Ｇ）、および腫瘍サイズ。グラフ上の数値は、分散分析（図２１Ｇ）および両側の対応のないｔ検定（図２１Ｈ）から計算されたｐ値である。
【図２１Ｈ】ＭＲＩで検出されたＤＣ遊走が、ＤＣワクチンに対する応答を予測することを示している。皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスは、オボアルブミンｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷したＢＭＤＣで処置された。図２１Ａ、処置マウス（ｎ＝７）と未処置マウス（ｎ＝５）との間の経時的な腫瘍増殖。グラフ上の数値は、対応のないスチューデントのｔ検定により計算されたＰ値である。経時的な腫瘍増殖の比較は、二元配置分散分析で評価されている。図２１Ｂ、「応答者」と「非応答者」に分けられた、個々の処置された腫瘍増殖。図２１Ｃ、２日目と２７日目の腫瘍サイズでの未処置リンパ節と比較した処置リンパ節における、ＭＲＩ検出リンパ節強度の相対変化の相関（相対ＬＮ強度）。点線は、リンパ節相対ＭＲＩ強度の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルを示している。下位２５パーセンタイルにおける相対ＶＤＬＮ強度により示される大幅なＭＲＩ予測ＤＣ遊走を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｅおよび図２１ＥのＸであり、中央の５０パーセンタイルにおける中程度のＶＤＬＮ強度を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｄおよび図２１Ｅの点であり、上位７５パーセンタイルにおける高いＶＤＬＮ強度を有するマウスからのデータポイントは、図２１Ｄおよび図２１Ｅの四角である。図２１Ｄ〜２１Ｅ、２日目のＭＲＩ検出ＤＣ遊走と、腫瘍サイズ（ｄ）および生存率（ｎ＝１０）（ｅ）との相関。グラフｃ〜ｅの数値は、ピアソンの相関係数（ｒ）とＰ値（ｐ）を表している。図２１Ｆ〜２１Ｈ、ワクチン接種後２日目のＭＲＩ強度によって分離された複数の時点での、個々の腫瘍増殖曲線（図２１Ｆ）、要約データ（図２１Ｇ）、および腫瘍サイズ。グラフ上の数値は、分散分析（図２１Ｇ）および両側の対応のないｔ検定（図２１Ｈ）から計算されたｐ値である。
【図２２Ａ】ワクチン後２日目のＭＲＩ検出ＤＣ遊走が、治療用ＤＣワクチンの抗腫瘍効果を予測することを示している。図２２Ａ、処置スケジュールの概略図。マウスは、外側腹部に１，０００，０００個のＢ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞の皮下注射を受けた。５日目に、マウスは、ＯＶＡ  ＲＮＡを有する１０−ＲＮＡ−ＮＰを負荷した５００，０００個のＢＭＤＣの皮内（ｉ．ｄ．）注射と、１０，０００，０００個のＯＴ１  Ｔ細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）注射を受けた。２日後にマウスをＭＲＩでイメージングし、腫瘍増殖と生存を追跡した。図２２Ｂ、死亡前のすべての処置マウス（ｎ＝９）についての、個々の腫瘍増殖曲線（左）および要約データ（右）。図２２Ｃ〜２２Ｄ、２日目のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と、１４日目（ｃ）および１７日目（図２２Ｄ）の腫瘍サイズとの相関。点線は、リンパ節相対ＭＲＩ強度の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルを示している。図２２Ｅ、すべての処置マウスの死亡を通した個々の腫瘍増殖曲線（左）および要約データ（右）。グラフの数値は、有意性について、二元配置分散分析を使用して計算されたｐ値である。図２２Ｆ、２日目のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と生存率の相関。図２２Ｇ、すべての処置されたマウスの生存曲線。グラフ上の数値は、対数順位検定を使用して計算されたｐ値である。図２２Ｃ、２２Ｄ、および２２ＦのＰ値とｒ値は、ピアソン相関から導出されている。
【図２２Ｂ】ワクチン後２日目のＭＲＩ検出ＤＣ遊走が、治療用ＤＣワクチンの抗腫瘍効果を予測することを示している。図２２Ａ、処置スケジュールの概略図。マウスは、外側腹部に１，０００，０００個のＢ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞の皮下注射を受けた。５日目に、マウスは、ＯＶＡ  ＲＮＡを有する１０−ＲＮＡ−ＮＰを負荷した５００，０００個のＢＭＤＣの皮内（ｉ．ｄ．）注射と、１０，０００，０００個のＯＴ１  Ｔ細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）注射を受けた。２日後にマウスをＭＲＩでイメージングし、腫瘍増殖と生存を追跡した。図２２Ｂ、死亡前のすべての処置マウス（ｎ＝９）についての、個々の腫瘍増殖曲線（左）および要約データ（右）。図２２Ｃ〜２２Ｄ、２日目のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と、１４日目（ｃ）および１７日目（図２２Ｄ）の腫瘍サイズとの相関。点線は、リンパ節相対ＭＲＩ強度の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルを示している。図２２Ｅ、すべての処置マウスの死亡を通した個々の腫瘍増殖曲線（左）および要約データ（右）。グラフの数値は、有意性について、二元配置分散分析を使用して計算されたｐ値である。図２２Ｆ、２日目のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と生存率の相関。図２２Ｇ、すべての処置されたマウスの生存曲線。グラフ上の数値は、対数順位検定を使用して計算されたｐ値である。図２２Ｃ、２２Ｄ、および２２ＦのＰ値とｒ値は、ピアソン相関から導出されている。
【図２２Ｃ】ワクチン後２日目のＭＲＩ検出ＤＣ遊走が、治療用ＤＣワクチンの抗腫瘍効果を予測することを示している。図２２Ａ、処置スケジュールの概略図。マウスは、外側腹部に１，０００，０００個のＢ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞の皮下注射を受けた。５日目に、マウスは、ＯＶＡ  ＲＮＡを有する１０−ＲＮＡ−ＮＰを負荷した５００，０００個のＢＭＤＣの皮内（ｉ．ｄ．）注射と、１０，０００，０００個のＯＴ１  Ｔ細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）注射を受けた。２日後にマウスをＭＲＩでイメージングし、腫瘍増殖と生存を追跡した。図２２Ｂ、死亡前のすべての処置マウス（ｎ＝９）についての、個々の腫瘍増殖曲線（左）および要約データ（右）。図２２Ｃ〜２２Ｄ、２日目のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と、１４日目（ｃ）および１７日目（図２２Ｄ）の腫瘍サイズとの相関。点線は、リンパ節相対ＭＲＩ強度の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルを示している。図２２Ｅ、すべての処置マウスの死亡を通した個々の腫瘍増殖曲線（左）および要約データ（右）。グラフの数値は、有意性について、二元配置分散分析を使用して計算されたｐ値である。図２２Ｆ、２日目のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と生存率の相関。図２２Ｇ、すべての処置されたマウスの生存曲線。グラフ上の数値は、対数順位検定を使用して計算されたｐ値である。図２２Ｃ、２２Ｄ、および２２ＦのＰ値とｒ値は、ピアソン相関から導出されている。
【図２２Ｄ】ワクチン後２日目のＭＲＩ検出ＤＣ遊走が、治療用ＤＣワクチンの抗腫瘍効果を予測することを示している。図２２Ａ、処置スケジュールの概略図。マウスは、外側腹部に１，０００，０００個のＢ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞の皮下注射を受けた。５日目に、マウスは、ＯＶＡ  ＲＮＡを有する１０−ＲＮＡ−ＮＰを負荷した５００，０００個のＢＭＤＣの皮内（ｉ．ｄ．）注射と、１０，０００，０００個のＯＴ１  Ｔ細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）注射を受けた。２日後にマウスをＭＲＩでイメージングし、腫瘍増殖と生存を追跡した。図２２Ｂ、死亡前のすべての処置マウス（ｎ＝９）についての、個々の腫瘍増殖曲線（左）および要約データ（右）。図２２Ｃ〜２２Ｄ、２日目のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と、１４日目（ｃ）および１７日目（図２２Ｄ）の腫瘍サイズとの相関。点線は、リンパ節相対ＭＲＩ強度の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルを示している。図２２Ｅ、すべての処置マウスの死亡を通した個々の腫瘍増殖曲線（左）および要約データ（右）。グラフの数値は、有意性について、二元配置分散分析を使用して計算されたｐ値である。図２２Ｆ、２日目のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と生存率の相関。図２２Ｇ、すべての処置されたマウスの生存曲線。グラフ上の数値は、対数順位検定を使用して計算されたｐ値である。図２２Ｃ、２２Ｄ、および２２ＦのＰ値とｒ値は、ピアソン相関から導出されている。
【図２２Ｅ】ワクチン後２日目のＭＲＩ検出ＤＣ遊走が、治療用ＤＣワクチンの抗腫瘍効果を予測することを示している。図２２Ａ、処置スケジュールの概略図。マウスは、外側腹部に１，０００，０００個のＢ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞の皮下注射を受けた。５日目に、マウスは、ＯＶＡ  ＲＮＡを有する１０−ＲＮＡ−ＮＰを負荷した５００，０００個のＢＭＤＣの皮内（ｉ．ｄ．）注射と、１０，０００，０００個のＯＴ１  Ｔ細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）注射を受けた。２日後にマウスをＭＲＩでイメージングし、腫瘍増殖と生存を追跡した。図２２Ｂ、死亡前のすべての処置マウス（ｎ＝９）についての、個々の腫瘍増殖曲線（左）および要約データ（右）。図２２Ｃ〜２２Ｄ、２日目のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と、１４日目（ｃ）および１７日目（図２２Ｄ）の腫瘍サイズとの相関。点線は、リンパ節相対ＭＲＩ強度の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルを示している。図２２Ｅ、すべての処置マウスの死亡を通した個々の腫瘍増殖曲線（左）および要約データ（右）。グラフの数値は、有意性について、二元配置分散分析を使用して計算されたｐ値である。図２２Ｆ、２日目のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と生存率の相関。図２２Ｇ、すべての処置されたマウスの生存曲線。グラフ上の数値は、対数順位検定を使用して計算されたｐ値である。図２２Ｃ、２２Ｄ、および２２ＦのＰ値とｒ値は、ピアソン相関から導出されている。
【図２２Ｆ】ワクチン後２日目のＭＲＩ検出ＤＣ遊走が、治療用ＤＣワクチンの抗腫瘍効果を予測することを示している。図２２Ａ、処置スケジュールの概略図。マウスは、外側腹部に１，０００，０００個のＢ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞の皮下注射を受けた。５日目に、マウスは、ＯＶＡ  ＲＮＡを有する１０−ＲＮＡ−ＮＰを負荷した５００，０００個のＢＭＤＣの皮内（ｉ．ｄ．）注射と、１０，０００，０００個のＯＴ１  Ｔ細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）注射を受けた。２日後にマウスをＭＲＩでイメージングし、腫瘍増殖と生存を追跡した。図２２Ｂ、死亡前のすべての処置マウス（ｎ＝９）についての、個々の腫瘍増殖曲線（左）および要約データ（右）。図２２Ｃ〜２２Ｄ、２日目のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と、１４日目（ｃ）および１７日目（図２２Ｄ）の腫瘍サイズとの相関。点線は、リンパ節相対ＭＲＩ強度の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルを示している。図２２Ｅ、すべての処置マウスの死亡を通した個々の腫瘍増殖曲線（左）および要約データ（右）。グラフの数値は、有意性について、二元配置分散分析を使用して計算されたｐ値である。図２２Ｆ、２日目のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と生存率の相関。図２２Ｇ、すべての処置されたマウスの生存曲線。グラフ上の数値は、対数順位検定を使用して計算されたｐ値である。図２２Ｃ、２２Ｄ、および２２ＦのＰ値とｒ値は、ピアソン相関から導出されている。
【図２２Ｇ】ワクチン後２日目のＭＲＩ検出ＤＣ遊走が、治療用ＤＣワクチンの抗腫瘍効果を予測することを示している。図２２Ａ、処置スケジュールの概略図。マウスは、外側腹部に１，０００，０００個のＢ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞の皮下注射を受けた。５日目に、マウスは、ＯＶＡ  ＲＮＡを有する１０−ＲＮＡ−ＮＰを負荷した５００，０００個のＢＭＤＣの皮内（ｉ．ｄ．）注射と、１０，０００，０００個のＯＴ１  Ｔ細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）注射を受けた。２日後にマウスをＭＲＩでイメージングし、腫瘍増殖と生存を追跡した。図２２Ｂ、死亡前のすべての処置マウス（ｎ＝９）についての、個々の腫瘍増殖曲線（左）および要約データ（右）。図２２Ｃ〜２２Ｄ、２日目のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と、１４日目（ｃ）および１７日目（図２２Ｄ）の腫瘍サイズとの相関。点線は、リンパ節相対ＭＲＩ強度の２５パーセンタイルと７５パーセンタイルを示している。図２２Ｅ、すべての処置マウスの死亡を通した個々の腫瘍増殖曲線（左）および要約データ（右）。グラフの数値は、有意性について、二元配置分散分析を使用して計算されたｐ値である。図２２Ｆ、２日目のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と生存率の相関。図２２Ｇ、すべての処置されたマウスの生存曲線。グラフ上の数値は、対数順位検定を使用して計算されたｐ値である。図２２Ｃ、２２Ｄ、および２２ＦのＰ値とｒ値は、ピアソン相関から導出されている。
【図２３】未処置マウス、またはＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰ、ＲＮＡ−ＮＰ、もしくはＣｙ５標識ＲＮＡのみで処置されたマウスの、肺（上段）、脾臓（中段）、または肝臓（下段）で検出された、Ｃｙ５＋細胞（左列）、またはＣＤ４５＋ＭＨＣクラスＩＩ＋Ｃｙ５＋細胞（右列）の一連のグラフである。
【図２４】未処置マウス、またはＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰもしくはＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ−ＮＰで処置されたマウスについての、％ＧＦＰ（左）または％ＰＤＬ１（右）の一対のグラフである。
【図２５Ａ】翻訳可能なナノ粒子がトランスフェクトされ、ＤＣを活性化することを示している。図２５Ａ、各ＲＮＡを負荷した粒子と２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣにおけるＧＦＰ発現。図２５Ｂ、各粒子構築物と２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣでのＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の共発現。図２５Ｃ、各構築物と２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣの生存率。図２５Ｄ、ＢＭＤＣにＯＶＡ  ＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷し、ＯＶＡ特異的ＯＴ１  Ｔ細胞とインキュベートした。Ｔ細胞の活性化は、ＥＬＩＳＡにより評価されたＩＦＮ−γとして示されている。図２５Ｅ、ＤＯＴＡＰのスコアに正規化された各製剤について、生存率、トランスフェクション効率、活性化、およびＴ細胞刺激の平均値の積として計算された相対活性化スコア。
【図２５Ｂ】翻訳可能なナノ粒子がトランスフェクトされ、ＤＣを活性化することを示している。図２５Ａ、各ＲＮＡを負荷した粒子と２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣにおけるＧＦＰ発現。図２５Ｂ、各粒子構築物と２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣでのＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の共発現。図２５Ｃ、各構築物と２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣの生存率。図２５Ｄ、ＢＭＤＣにＯＶＡ  ＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷し、ＯＶＡ特異的ＯＴ１  Ｔ細胞とインキュベートした。Ｔ細胞の活性化は、ＥＬＩＳＡにより評価されたＩＦＮ−γとして示されている。図２５Ｅ、ＤＯＴＡＰのスコアに正規化された各製剤について、生存率、トランスフェクション効率、活性化、およびＴ細胞刺激の平均値の積として計算された相対活性化スコア。
【図２５Ｃ】翻訳可能なナノ粒子がトランスフェクトされ、ＤＣを活性化することを示している。図２５Ａ、各ＲＮＡを負荷した粒子と２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣにおけるＧＦＰ発現。図２５Ｂ、各粒子構築物と２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣでのＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の共発現。図２５Ｃ、各構築物と２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣの生存率。図２５Ｄ、ＢＭＤＣにＯＶＡ  ＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷し、ＯＶＡ特異的ＯＴ１  Ｔ細胞とインキュベートした。Ｔ細胞の活性化は、ＥＬＩＳＡにより評価されたＩＦＮ−γとして示されている。図２５Ｅ、ＤＯＴＡＰのスコアに正規化された各製剤について、生存率、トランスフェクション効率、活性化、およびＴ細胞刺激の平均値の積として計算された相対活性化スコア。
【図２５Ｄ】翻訳可能なナノ粒子がトランスフェクトされ、ＤＣを活性化することを示している。図２５Ａ、各ＲＮＡを負荷した粒子と２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣにおけるＧＦＰ発現。図２５Ｂ、各粒子構築物と２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣでのＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の共発現。図２５Ｃ、各構築物と２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣの生存率。図２５Ｄ、ＢＭＤＣにＯＶＡ  ＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷し、ＯＶＡ特異的ＯＴ１  Ｔ細胞とインキュベートした。Ｔ細胞の活性化は、ＥＬＩＳＡにより評価されたＩＦＮ−γとして示されている。図２５Ｅ、ＤＯＴＡＰのスコアに正規化された各製剤について、生存率、トランスフェクション効率、活性化、およびＴ細胞刺激の平均値の積として計算された相対活性化スコア。
【図２５Ｅ】翻訳可能なナノ粒子がトランスフェクトされ、ＤＣを活性化することを示している。図２５Ａ、各ＲＮＡを負荷した粒子と２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣにおけるＧＦＰ発現。図２５Ｂ、各粒子構築物と２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣでのＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の共発現。図２５Ｃ、各構築物と２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣの生存率。図２５Ｄ、ＢＭＤＣにＯＶＡ  ＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷し、ＯＶＡ特異的ＯＴ１  Ｔ細胞とインキュベートした。Ｔ細胞の活性化は、ＥＬＩＳＡにより評価されたＩＦＮ−γとして示されている。図２５Ｅ、ＤＯＴＡＰのスコアに正規化された各製剤について、生存率、トランスフェクション効率、活性化、およびＴ細胞刺激の平均値の積として計算された相対活性化スコア。
【図２６Ａ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、抗原特異的なＤＣ活性化を誘導することを示している。図２６Ａ、ゲーティング戦略。陽性集団は、蛍光マイナス１（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ、ＦＭＯ）対照を使用して選択された。図２６Ｂ、ＲＮＡ−ＮＰまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣでのＣＤ８６の発現およびＣＤ８０とＣＤ８６の共発現。データは、幾何平均蛍光強度およびパーセンテージとしてプロットされている。統計比較には、一元配置分散分析およびテューキーの検定を使用した。グラフ上の数値は、Ｐ値である。図２６Ｃ、ＢＭＤＣに、ＯＶＡ  ＲＮＡまたはＧＦＰ  ＲＮＡのいずれかを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷し、ＯＶＡ特異的ＯＴ１  Ｔ細胞とインキュベートした。Ｔ細胞の活性化は、ＥＬＩＳＡにより評価されたＩＦＮ−γとして示されている。
【図２６Ｂ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、抗原特異的なＤＣ活性化を誘導することを示している。図２６Ａ、ゲーティング戦略。陽性集団は、蛍光マイナス１（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ、ＦＭＯ）対照を使用して選択された。図２６Ｂ、ＲＮＡ−ＮＰまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣでのＣＤ８６の発現およびＣＤ８０とＣＤ８６の共発現。データは、幾何平均蛍光強度およびパーセンテージとしてプロットされている。統計比較には、一元配置分散分析およびテューキーの検定を使用した。グラフ上の数値は、Ｐ値である。図２６Ｃ、ＢＭＤＣに、ＯＶＡ  ＲＮＡまたはＧＦＰ  ＲＮＡのいずれかを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷し、ＯＶＡ特異的ＯＴ１  Ｔ細胞とインキュベートした。Ｔ細胞の活性化は、ＥＬＩＳＡにより評価されたＩＦＮ−γとして示されている。
【図２６Ｃ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、抗原特異的なＤＣ活性化を誘導することを示している。図２６Ａ、ゲーティング戦略。陽性集団は、蛍光マイナス１（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ、ＦＭＯ）対照を使用して選択された。図２６Ｂ、ＲＮＡ−ＮＰまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰと２４時間インキュベーションした後の、ＢＭＤＣでのＣＤ８６の発現およびＣＤ８０とＣＤ８６の共発現。データは、幾何平均蛍光強度およびパーセンテージとしてプロットされている。統計比較には、一元配置分散分析およびテューキーの検定を使用した。グラフ上の数値は、Ｐ値である。図２６Ｃ、ＢＭＤＣに、ＯＶＡ  ＲＮＡまたはＧＦＰ  ＲＮＡのいずれかを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷し、ＯＶＡ特異的ＯＴ１  Ｔ細胞とインキュベートした。Ｔ細胞の活性化は、ＥＬＩＳＡにより評価されたＩＦＮ−γとして示されている。
【図２７−１】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、抗ウイルス遺伝子セットの発現を誘導することを示している。ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰまたはエレクトロポレーションのいずれかを介してＧＦＰ  ｍＲＮＡで処置して２４時間後の、初代ＢＭＤＣにおけるＲＮＡの取り込みおよびプロセシングに関連する８つの遺伝子セットの遺伝子セットエンリッチメントプロット。
【図２７−２】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、抗ウイルス遺伝子セットの発現を誘導することを示している。ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰまたはエレクトロポレーションのいずれかを介してＧＦＰ  ｍＲＮＡで処置して２４時間後の、初代ＢＭＤＣにおけるＲＮＡの取り込みおよびプロセシングに関連する８つの遺伝子セットの遺伝子セットエンリッチメントプロット。
【図２７−３】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、抗ウイルス遺伝子セットの発現を誘導することを示している。ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰまたはエレクトロポレーションのいずれかを介してＧＦＰ  ｍＲＮＡで処置して２４時間後の、初代ＢＭＤＣにおけるＲＮＡの取り込みおよびプロセシングに関連する８つの遺伝子セットの遺伝子セットエンリッチメントプロット。
【図２７−４】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、抗ウイルス遺伝子セットの発現を誘導することを示している。ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰまたはエレクトロポレーションのいずれかを介してＧＦＰ  ｍＲＮＡで処置して２４時間後の、初代ＢＭＤＣにおけるＲＮＡの取り込みおよびプロセシングに関連する８つの遺伝子セットの遺伝子セットエンリッチメントプロット。
【図２８Ａ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、ＢＭＤＣの活性化を増強することを示している。図２８Ａ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置して２４時間後の、フローサイトメトリーにより評価されたＢＭＤＣでの活性化の表現型マーカー。データは、幾何平均蛍光強度として表されている。統計分析には、一元配置分散分析およびテューキーの検定を使用した。図２８Ｂ、自動セルカウンターにより評価された、エレクトロポレーション、またはＲＮＡ−ＮＰもしくはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰとインキュベーションして２４時間後の、ＢＭＤＣ生存率。
【図２８Ｂ】ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、ＢＭＤＣの活性化を増強することを示している。図２８Ａ、エレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処置して２４時間後の、フローサイトメトリーにより評価されたＢＭＤＣでの活性化の表現型マーカー。データは、幾何平均蛍光強度として表されている。統計分析には、一元配置分散分析およびテューキーの検定を使用した。図２８Ｂ、自動セルカウンターにより評価された、エレクトロポレーション、またはＲＮＡ−ＮＰもしくはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰとインキュベーションして２４時間後の、ＢＭＤＣ生存率。
【図２９Ａ】脂質ライブラリの要約データを示す表である。特に断らない限り、リポソームは、列挙された成分から１：１の比率で形成された。各粒子構築物について、ＧＦＰ  ｍＲＮＡを有するＢＭＤＣとインキュベーションして２４時間後に、またはＯＶＡでトランスフェクトされたＢＭＤＣをＯＶＡ特異的ＯＴ１  Ｔ細胞とインキュベーションして４８時間後に得られた要約データを示す。活性化スコアは、トランスフェクトされた細胞（ＧＦＰ（％））、活性化された細胞（ＣＤ４０＋ＣＤ８０＋ＣＤ８６＋（％））、生存率（％）、およびＴ細胞刺激能力（ＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍＬ））の積として計算されている。相対活性化スコアは、（活性化スコア試料）／（活性化スコアＤＯＴＡＰ）として計算されている。ＤＯＴＡＰ＝１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、Ｃｈｏｌ＝コレステロール、ＤＯＰＥ＝１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、ＤＭＰＣ＝１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＰＰＣ＝１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＯＴＭＡ＝１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン。＊リポソームＭＰＬは、コレステロール：ＤＭＰＧ：ＤＰＰＣ：ＭＬＡの比率が５．２：１．１：８．７：０．１５の脂質とアジュバントモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）の混合物である。
【図２９Ｂ】酸化鉄を負荷したＲＮＡナノ粒子の特性評価を示す表である。ゼータ電位およびサイズ（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔで測定）は、平均＋／−標準偏差として表示されている。結果は、各ゼータ電位について３回の反復実験、および各サイズについて４回測定した代表的な要約データである。サイズ測定は、リポソームに結合したＲＮＡを用いて完了した。ゼータ電位は、ＲＮＡを含まないリポソームについて測定された。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、リンパ節へのＤＣ遊走を増強し、広く利用可能なＭＲＩに基づくイメージングモダリティを使用してインビボでの遊走を追跡する、二機能性ＲＮＡ負荷ナノ粒子（ＲＮＡ−ＮＰ）の開発につながるデータが、初めて提示される。本明細書に記載されるように、酸化鉄ナノ粒子コアを有するカチオン性リポソームを、ｍＲＮＡとインキュベートした。得られた酸化鉄負荷ＲＮＡ−ＮＰ（ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ）を使用して、磁場の存在下、エクスビボで、ＤｓＲｅｄ＋ＤＣをトランスフェクトした。ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ負荷ＤＣを、次いでＣ５７Ｂｌ６マウスに皮内注射し、Ｔ２＊強調１１Ｔ  ＭＲＩで非侵襲的に追跡した。ＭＲＩ強度は、酸化鉄含有量のプルシアンブルー染色と、および各リンパ節のＤｓＲｅｄ＋細胞の絶対数のフローサイトメトリーと、相関していた。ＲＮＡ−ＮＰ中に酸化鉄が存在しても、サイズ、電荷、ＲＮＡ結合能力、およびＤＣのトランスフェクションを含む粒子特性は、有意に変化しなかった。さらに、ＲＮＡ−ＮＰ内に酸化鉄を含めることで、外部磁場の適用を通して、磁気的に増強されたＲＮＡ送達およびトランスフェクション効率が可能になった。ＲＮＡエレクトロポレーションと比較して、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ負荷は、抗ウイルス性サイトカイン（ＩＦＮ−α）の産生とリンパ節へのＤＣ遊走を増強した。ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰはまた、Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度の減少、およびＭＲＩで検出されたリンパ節サイズの増加ももたらし、処置リンパ節の酸化鉄負荷細胞の数と直接相関した。ワクチン接種の２日後に測定されたＴ２＊強調ＭＲＩ強度は、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍増殖の阻害と相関した。これらのデータは、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、ＤＣ活性化を増強し、ＭＲＩによる非侵襲的な細胞追跡を可能にすることを示唆している。特定の理論に拘束されることなく、これらのデータは、抗腫瘍免疫応答を予測し、ワクチンの有効性のバイオマーカーとしてＭＲＩで検出されたＤＣ遊走を使用するための、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰの使用を支持する。
【００１６】
リポソーム、細胞、および組成物
本開示は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子と、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールを含む脂質混合物と、を含むリポソームを提供する。様々な実施形態では、リポソームは、ＲＮＡ分子と、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールを含む脂質混合物と、酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）と、を含み、任意選択的に、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールは、約３：１のＤＯＴＡＰ：コレステロール質量比で脂質混合物中に存在する。様々な実施形態では、本開示のリポソームは、ＲＮＡ分子、ならびにＤＯＴＡＰおよびコレステロールを含む脂質混合物を含み、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールは、約３：１のＤＯＴＡＰ：コレステロール質量比で脂質混合物中に存在する。本明細書で使用される場合、「ＤＯＴＡＰ」という用語は、Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ−１−プロピル）トリメチルアンモニウムメチルサルフェートを意味する。
【００１７】
例示的な態様では、リポソームは、約８０ｎｍ〜約５００ｎｍの直径を有し、例えば、約８０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約４００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約３５０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約２５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍである。例示的な態様では、リポソームは、約９０ｎｍ〜約３００ｎｍの直径を有し、例えば、約１００ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約１１０ｎｍ±５ｎｍ、約１１５ｎｍ±５ｎｍ、約１２０ｎｍ±５ｎｍ、約１２５ｎｍ±５ｎｍ、約１３０ｎｍ±５ｎｍ、約１３５ｎｍ±５ｎｍ、約１４０ｎｍ±５ｎｍ、約１４５ｎｍ±５ｎｍ、約１５０ｎｍ±５ｎｍ、約１５５ｎｍ±５ｎｍ、約１６０ｎｍ±５ｎｍ、約１６５ｎｍ±５ｎｍ、約１７０ｎｍ±５ｎｍ、約１７５ｎｍ±５ｎｍ、約１８０ｎｍ±５ｎｍ、約１９０ｎｍ±５ｎｍ、約２００ｎｍ±５ｎｍ、約２１０ｎｍ±５ｎｍ、約２２０ｎｍ±５ｎｍ、約２３０ｎｍ±５ｎｍ、約２４０ｎｍ±５ｎｍ、約２５０ｎｍ±５ｎｍ、約２６０ｎｍ±５ｎｍ、約２７０ｎｍ±５ｎｍ、約２８０ｎｍ±５ｎｍ、約２９０ｎｍ±５ｎｍ、約３００ｎｍ±５ｎｍである。例示的な態様では、リポソームは、約２０ｍＶ〜約５０ｍＶの全体的な表面正味電荷を有する（例えば、約２０ｍＶ〜約４５ｍＶ、約２０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約３５ｍＶ、約２０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約２５ｍＶ、約２５ｍＶ〜約５０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約３５ｍＶ〜約５０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約５０ｍＶ、または約４５ｍＶ〜約５０ｍＶ。例示的な態様では、リポソームは、約４０ｍＶ〜約５０ｍＶの全体的な表面正味電荷を有する。
【００１８】
例示的な態様では、コレステロールの質量は、本開示のリポソームの脂質混合物の総脂質質量の１２％超、３７％未満である。例えば、コレステロールの質量は、総脂質質量の１５％超、３５％未満である。例示的な態様では、コレステロールの質量は、脂質混合物の総脂質質量の約１５％〜約３０％である。例示的な態様では、コレステロールの質量は、脂質混合物の総脂質質量の約２０％〜約３０％である。例示的な態様では、コレステロールの質量は、脂質混合物の総脂質質量の約２５％±３％である。例示的な態様では、ＤＯＴＡＰの質量は、脂質混合物の総脂質質量の少なくとも５０％である。例えば、ＤＯＴＡＰの質量は、脂質混合物の総脂質質量の約６３％〜約８８％である。例示的な例では、ＤＯＴＡＰの質量は、脂質混合物の総脂質質量の約７５％±５％である。一部の態様では、脂質混合物が、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールとは異なる第３の脂質を含む場合、第３の脂質の質量は、脂質混合物の総脂質質量の約１０％未満、任意選択的に、脂質混合物の総脂質質量の約５％未満約、４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満である。特定の態様では、脂質混合物は、本質的にＤＯＴＡＰおよびコレステロールからなる。
【００１９】
例示的な態様では、リポソームは、一本鎖または二本鎖、合成または天然源から得られたもの（例えば、単離および／または精製された）であり得るＲＮＡ分子（または「ＲＮＡ」）を含み、天然、非天然または改変されたヌクレオチドを含有することができ、天然、非天然または改変されたヌクレオチド間結合を含有することができる。例示的な態様では、核酸分子は、１つ以上の修飾ヌクレオチド、例えば、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリドメ、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ−置換アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアンモメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケノシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラチル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリン、などを含む。例示的な態様では、ＲＮＡは、天然に存在するＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のヌクレオチド間に見出されるホスホジエステル結合の代わりに、ホスホロアミデート結合またはホスホロチオエート結合などの、１つ以上の非天然または改変されたヌクレオチド間結合を含む。例示的な態様では、ＲＮＡは、挿入、欠失、反転、および／または置換を含まない。しかし、本明細書で議論されるように、場合によっては、ＲＮＡが１つ以上の挿入、欠失、反転、および／または置換を含むことが好適であり得る。一部の態様では、ＲＮＡ分子は、イントロンを欠く成熟ｍＲＮＡまたはプロセシングされたｍＲＮＡである。例示的な態様では、ＲＮＡ分子は、５’キャップ、ポリ（Ａ）テール、または両方の組み合わせを含む。様々な態様における５’キャップは、７−メチルグアニレートを含み、５’対５’の三リン酸結合を介してＲＮＡ分子の５’末端に結合している。様々な態様では、５’キャップは化学付加反応を介してＲＮＡ分子に付加されている。例示的な実施形態では、ＲＮＡ分子は、当該技術分野で既知の手順を使用して、化学合成および／または酵素的ライゲーション反応に基づいて構築される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）を参照されたい。様々な態様では、ＲＮＡ分子はインビトロ転写技術を介して細胞外で産生される。様々な態様では、ＲＮＡ分子はインビトロ転写によって産生される合成ＲＮＡ分子である。
【００２０】
例示的な態様では、リポソームは、１５０μｇの脂質混合物あたり約１０μｇ未満または約１０μｇのＲＮＡ分子を含む。例示的な態様では、リポソームは、約１０μｇのＲＮＡを約１５０μｇのリポソームとインキュベートすることによって作製される。別の態様では、リポソームは、脂質混合物の質量あたりより多くのＲＮＡ分子を含む。例えば、リポソームは、１５０μｇのリポソームあたり１０μｇ超のＲＮＡ分子を含んでもよい。場合によっては、リポソームは、１５０μｇのリポソームまたは脂質混合物あたり１５μｇ超のＲＮＡ分子を含む。一部の態様では、ＲＮＡ分子は、タンパク質をコードするか、またはアンチセンス分子である。タンパク質は、一部の態様では、腫瘍抗原、共刺激性分子、サイトカイン、増殖因子、リンホカイン、（例えば、腫瘍転移を阻害するのに有効なサイトカインおよび増殖因子、少なくとも１つの細胞集団に対して抗増殖効果を有することが示されているサイトカインまたは増殖因子を含む）からなる群から選択される。このようなサイトカイン、リンホカイン、増殖因子、または他の造血因子としては：Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦα、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポエチンが含まれるが、これらに限定されない。本明細書における使用のための追加の増殖因子としては、アンジオゲニン、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体αサブユニット、サイトカイン誘導性好中球走化因子１、サイトカイン誘導性好中球、走化因子２α、サイトカイン誘導性好中球走化因子２β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮由来好中球誘引物質、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子神経増殖因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子β、ト���ンスフォーミング増殖因子β１、トランスフォーミング増殖因子β１．２、トランスフォーミング増殖因子β２、トランスフォーミング増殖因子β３、トランスフォーミング増殖因子β５、潜在性トランスフォーミング増殖因子β１、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質Ｉ、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質ＩＩ、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体、ならびにキメラタンパク質およびその生物学的または免疫学的に活性な断片が挙げられる。例示的な態様では、腫瘍抗原は、ウイルスタンパク質に由来する抗原、点突然変異に由来する抗原、または癌−生殖系列遺伝子によってコードされる抗原である。例示的な態様では、腫瘍抗原は、ｐｐ６５、ｐ５３、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＭＡＧＥＡ、ＭＡＧＥＢ、ＭＡＧＥＣ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＬＡＧＥ／ＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ、チロシナーゼ、ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ｇｐ７５／ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ−１、ＨＥＲ２／ＮＥＵ、ＷＴ１である。例示的な態様では、共刺激性分子は、ＣＤ８０およびＣＤ８６からなる群から選択される。
【００２１】
特定の例では、ＲＮＡ分子は、アンチセンス分子をコードするか、アンチセンス分子であり、任意選択的に、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。アンチセンス分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介するものであり得る。当業者に既知であるように、ＲＮＡｉは、植物および動物における遺伝子調節の遍在的な機構であり、標的ｍＲＮＡが、配列特異的な様式で分解される（Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，４８５−４９０（２００１）、Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，１２，２２５−２３２（２００２）、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６−８１１（１９９８）、Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３（２０００））。天然ＲＮＡ分解プロセスは、ｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼＤｉｃｅｒによって開始され、長鎖ｄｓＲＮＡ前駆体を２１〜２５ヌクレオチド長の二本鎖断片への切断を促進し、低分子干渉ＲＮＡと称される（ｓｉＲＮＡ；短鎖干渉ＲＮＡとしても知られている）（Ｚａｍｏｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１０１，２５−３３（２０００）、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，１８８−２００（２００１）、Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３−２９６（２０００）、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３−３６６（２００１）。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを認識して切断する大きなタンパク質複合体に組み込まれる（Ｎｙｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９−３２１（２００１）。哺乳動物細胞へのｄｓＲＮＡの導入は、効率的なＤｉｃｅｒ媒介性のｓｉＲＮＡ生成にはつながらず、したがって、ＲＮＡｉを誘導しないことが報告されている（Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２５２，９５−１０５（２０００）、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４７９，７９−８２（２０００））。様々な哺乳動物細胞におけるトランスフェクトされたおよび内因性遺伝子の発現を阻害する合成２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二重鎖を導入することによって、細胞でのｓｉＲＮＡの成熟におけるＤｉｃｅｒの必要性を回避することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８（２００１））。
【００２２】
これに関して、一部の態様におけるＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉを媒介し、一部の態様では、タンパク質の発現を阻害するのに特異的なｓｉＲＮＡ分子である。本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡｉを誘導または媒介することができる約１０〜約５０ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含むＲＮＡ（またはＲＮＡ類似体）を指す。例示的な実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１５〜約３０ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）または約２０〜約２５ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、例えば、２１〜２３ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含む。ｓｉＲＮＡは、二本鎖または一本鎖、好ましくは二本鎖であり得る。
【００２３】
代替的な態様では、ＲＮＡ分子は、代替的に、タンパク質の発現を阻害するのに特異的な短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。本明細書で使用される「ｓｈＲＮＡ」という用語は、一本鎖ＲＮＡが、部分的にパリンドローム塩基配列を含有し、その中で二本鎖構造（すなわち、ヘアピン構造）を形成する、約２０以上の塩基対の分子を指す。ｓｈＲＮＡは、ヘアピン構造に折り畳まれたｓｉＲＮＡ（またはｓｉＲＮＡ類似体）であり得る。ｓｈＲＮＡは、典型的には、ヘアピンの約２１ヌクレオチドアンチセンスおよびセンス部分、約２〜約６ヌクレオチド長の非ループ側の任意選択的なオーバーハング、および、例えば約３〜１０ヌクレオチド長であり得るループ部分、を含む約４５〜約６０ヌクレオチドを含む。ｓｈＲＮＡは、化学的に合成することができる。あるいは、ｓｈＲＮＡは、ＤＮＡ配列のセンス鎖とアンチセンス鎖を逆方向に連結し、ＤＮＡを鋳型として使用してＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロでＲＮＡを合成することによって、産生することができる。
【００２４】
いかなる理論または機構に拘束されることを望むものではないが、ｓｈＲＮＡが細胞に導入された後、ｓｈＲＮＡは、約２０塩基以上（例えば、代表的には、２１、２２、２３塩基）に分解され、ＲＮＡｉを引き起こし、阻害効果をもたらす。したがって、ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡｉを誘発するため、本開示の有効な構成要素として使用され得る。ｓｈＲＮＡは、好ましくは３’突出末端を有してもよい。二本鎖部分の長さは、特に限定されないが、好ましくは１０ヌクレオチド以上、より好ましくは２０ヌクレオチド以上である。ここで、３’−突出末端は、好ましくはＤＮＡであり、より好ましくは、長さが少なくとも２ヌクレオチドのＤＮＡであり、さらに好ましくは、長さが２〜４ヌクレオチドのＤＮＡである。
【００２５】
例示的な態様では、アンチセンス分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ」という用語は、翻訳抑制または標的分解を介して遺伝子発現をサイレンシングするためにｍＲＮＡ分子と塩基対を形成する小さな（例えば、１５〜２２ヌクレオチド）非コードＲＮＡ分子を指す。マイクロＲＮＡおよびその治療上の可能性は、当該技術分野において報告されている。例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，ＭｉｃｒｏＲＮＡ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｎｏｖａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ，２０１１、Ｂａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌａｍｍｅｒｓ，“Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ”  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ  ５２−５５（Ｍａｒｃｈ  ２０１１）を参照されたい。
【００２６】
特定の例では、ＲＮＡ分子は、アンチセンス分子であり、任意選択的に、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡであり、免疫チェックポイント経路のタンパク質を標的として、発現を減少させる。様々な態様では、免疫チェックポイント経路のタンパク質は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＣＤ１１２、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、または共刺激受容体：ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４１ＢＢ、またはＧＩＴＲである。免疫チェックポイント経路のタンパク質は、特定の例では、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、またはＴＩＭ３である。免疫チェックポイントシグナル伝達経路は、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １２（４）：２５２−２６４（２０１２）に概説されている。
【００２７】
例示的な例では、リポソームは、ＲＮＡ分子、例えば、ヒト由来の細胞から単離されたＲＮＡ、の混合物を含む。一部の態様では、ヒトは、腫瘍を有し、ＲＮＡの混合物は、ヒトの腫瘍から単離されたＲＮＡである。例示的な態様では、ヒトは、癌、任意選択的に、本明細書に記載の任意の癌を有する。任意選択的に、ＲＮＡが単離される腫瘍は、神経膠腫、（限定されないが、膠芽腫を含む）、髄芽腫、びまん性内在性橋膠腫、または中枢神経系への転移性浸潤を伴う末梢腫瘍（例えば、黒色腫または乳癌）からなる群から選択される。例示的な態様では、ＲＮＡが単離される腫瘍は、癌の腫瘍、例えば、本明細書に記載のこれらの癌のいずれかである。
【００２８】
本開示の例示的な態様では、リポソームは、酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）をさらに含む。任意選択的に、ＩＯＮＰは、リポソームのコア中に存在する。例示的な態様では、ＩＯＮＰを含むリポソームは、ＩＯＮＰを含むために磁性である。したがって、一部の態様では、ＩＯＮＰを含むリポソームは、「磁性リポソーム」または「マグネトリポソーム」と呼ばれる。特定の例では、ＩＯＮＰは、総リポソーム質量の約１％〜約２０％、例えば、約５％〜約２０％、約１０％〜約２０％、約１５％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％、約１％〜約５％である。一部の態様におけるＩＯＮＰは、総リポソーム質量の約５％〜約１５％である。一部の例では、ＩＯＮＰはリポソームの総質量の約１２％±３％である。コア中の各ＩＯＮＰは、例示的な態様では、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍの直径を有する。一部の例では、各ＩＯＮＰは、または約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１７０ｎｍ、約１８０ｎｍ、約１９０ｎｍ、約２００ｎｍ、または約６０ｎｍ〜約１４０ｎｍの直径を有する（例えば、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１３０ｎｍ、または約１４０ｎｍ）。例示的な態様では、各ＩＯＮＰは、約１３０ｎｍ±５ｎｍの直径を有する。
【００２９】
本開示のリポソームを含む（例えば、トランスフェクトされた）細胞が、本明細書でさらに提供される。例示的な態様では、細胞は、本開示のリポソームを含有することができる任意のタイプの細胞である。一部の態様における細胞は、真核細胞、例えば、植物、動物、真菌、または藻類である。代替的な態様では、細胞は、原核細胞、例えば、細菌または原生動物である。例示的な態様では、細胞は、培養細胞である。代替的な態様では、細胞は、初代細胞、すなわち、生物（例えば、ヒト）から直接単離された、初代細胞である。細胞は、接着細胞または浮遊細胞、すなわち浮遊状態で増殖する細胞であってもよい。例示的な態様における細胞は、哺乳動物細胞である。最も好ましくは、細胞は、ヒト細胞である。細胞は、任意の細胞型であり得、任意の型の組織に由来し得、任意の発達段階であり得る。例示的な態様では、リポソームを含む細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。本明細書で使用される場合、「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、特定のＴ細胞による認識のために抗原をプロセシングし、提示することによって、細胞の免疫応答を媒介する免疫細胞を指す。例示的な態様では、ＡＰＣは、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、またはＢ細胞である。例示的な態様では、ＡＰＣは、樹状細胞（ＤＣ）である。例示的な態様では、細胞が、対象、例えば、ヒトに投与される場合、細胞は、対象に対して自己由来である。例示的な例では、免疫細胞は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）である。
【００３０】
また、本開示により提供される細胞の集団は、集団の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、本開示のリポソームを含む（例えば、トランスフェクトされた）細胞である。一部の態様における細胞の集団は、不均一な細胞集団であり、あるいは、一部の態様では、実質的に均一な集団であり、その集団は、本開示のリポソームを含む細胞を主に含む。
【００３１】
本明細書において、本開示のリポソーム、本開示のリポソームを含む細胞、本開示の細胞の集団、またはそれらの任意の組み合わせ、および薬学的に許容される担体、賦形剤もしくは希釈剤、を含む組成物が提供される。例示的な態様では、組成物は、ヒトへの投与を意図した医薬組成物である。例示的な態様では、組成物は、無菌組成物である。例示的な例では、組成物は、本開示の複数のリポソームを含む。任意選択的に、複数のリポソームの少なくとも５０％は、約１００ｎｍ〜約２５０ｎｍの直径を有し、任意選択的に、ＩＯＮＰを含むコアを有する。
【００３２】
例示的な態様では、本開示の組成物は、リポソーム、リポソームを含む細胞、または細胞の集団以外の、追加の成分を含んでもよい。組成物は、様々な態様では、例えば、酸性化剤、添加剤、吸着剤、エアロゾル噴射剤、空気置換剤、アルカリ化剤、固化防止剤、抗凝固剤、抗菌保存剤、抗酸化剤、防腐剤、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、洗浄剤、希釈剤、消毒剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、染料、軟化剤、乳化剤、乳化安定剤、充填剤、被膜形成剤、風味増強剤、香味剤、流動促進剤、ゲル化剤、顆粒化剤、保湿剤、潤滑剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏、油性媒体、有機基剤、パスティル基剤、顔料、可塑剤、研磨剤、保存剤、封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定化剤、坐剤基剤、界面活性剤、界面活性剤、懸濁剤、甘味剤、治療剤、増粘剤、張化剤、毒性剤、増粘剤、吸水剤、水混和性共溶媒、水軟化剤、または湿潤剤、を含む、任意の薬学的に許容される成分を含む。例えば、以下を参照されたい、ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２０００）、その全体が参照により援用される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）、その全体が参照により援用される。
【００３３】
本開示の組成物は、非経口および皮下を含む、任意の許容可能な経路による投与に好適であり得る。他の経路としては、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、節内および脾臓内が挙げられる。例示的な態様では、組成物がリポソーム（リポソームを含む細胞ではない）を含む場合、組成物は、全身（例えば、静脈内）投与に好適である。例示的な態様では、組成物がリポソームを含む（細胞外のリポソームではない）細胞を含む場合、組成物は皮内投与に好適である。
【００３４】
組成物が対象への投与を意図した形態である場合、それは、意図した投与部位と等張であるようにすることができる。例えば、溶液が非経口投与を意図した形態である場合、それは血液と等張であり得る。組成物は、典型的には無菌である。特定の実施形態では、これは、滅菌濾過膜を介した濾過によって達成され得る。特定の実施形態では、非経口組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液バッグ、または皮下注射針によって穿刺可能なストッパを有するバイアル、またはプレフィルド注射器、に入れられる。特定の実施形態では、組成物は、調製済の形態、または投与前に再構成または希釈される形態（例えば、凍結乾燥された）のいずれかで保存され得る。
【００３５】
製造方法
本開示は、リポソームを作製する方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、（Ａ）ＤＯＴＡＰおよびコレステロールを約３：１のＤＯＴＡＰ：コレステロール質量比で混合して、脂質混合物を形成することと、（Ｂ）脂質混合物を乾燥することと、（Ｃ）脂質混合物を再水和溶液で再水和して、再水和された脂質混合物を形成することと、（Ｄ）再水和脂質混合物を約４０℃超の温度でインキュベートし、再水和脂質混合物を断続的にボルテックスしてリポソームを形成することと、を含む。例示的な態様では、本方法は、ステップ（Ｄ）後、リポソームを１２時間以上インキュベートすることをさらに含み、任意選択的に、リポソームを超音波処理することをさらに含む。例示的な態様では、本方法は、ステップ（Ｄ）後、約２０℃〜約３０℃または約２℃〜約４℃で、リポソームを１２時間以上インキュベートすることをさらに含む。典型的な例では、本方法は、少なくとも１５０ｎｍのフィルターを通してリポソームを濾過することをさらに含み、任意選択的に、リポソームは、２００ｎｍフィルターおよび／または４５０ｎｍフィルターを通して濾過される。一部の態様では、リポソームは、４５０ｎｍフィルターおよび２００ｎｍフィルターを通して濾過され、任意選択的に、リポソームは、４５０ｎｍフィルター、続いて２００ｎｍフィルターを通して順次濾過される。例示的な例では、本方法は、リポソームをＲＮＡ分子とインキュベートすることをさらに含む。一部の態様では、本方法は、約７．５μｇ±０．７５μｇのＤＯＴＡＰおよび約２．５μｇ±０．２５μｇのコレステロールを混合して、脂質混合物を形成することを含む。一部の態様では、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールをクロロホルムに溶解して、脂質混合物を形成する。一部の態様では、窒素ガスを使用して、脂質混合物を乾燥させる。例示的な態様における再水和溶液は、緩衝剤、任意選択的に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。例示的な例では、再水和された脂質混合物を、水浴中で約５０℃の温度でインキュベートし、約１０分毎にボルテックスしてリポソームを形成する。例示的な態様では、脂質混合物または再水和溶液は、酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）をさらに含む。任意選択的に、再水和溶液は、カルボキシル化酸化鉄ナノ粒子の溶液を含み、各カルボキシル化酸化鉄ナノ粒子は、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍの直径を有する。例示的な例では、本方法は、ＩＯＮＰを脂質混合物または再水和溶液に添加することをさらに含む。一部の態様では、各ＩＯＮＰは、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍの直径を有する。任意選択的に、各ＩＯＮＰは、約６０ｎｍ〜約１４０ｎｍまたは約１０ｎｍ〜約３０ｎｍの直径を有する。一部の態様では、脂質混合物または再水和溶液は、１０ｍｇの脂質混合物あたり少なくとも約１μｇのＩＯＮＰ、１０ｍｇの脂質混合物あたり少なくとも約１００μｇのＩＯＮＰ、１０ｍｇの脂質混合物あたり少なくとも約１ｍｇのＩＯＮＰ、または１０ｍｇの脂質混合物あたり少なくとも約１．５ｍｇのＩＯＮＰを含み、任意選択的に、脂質混合物または再水和溶液は、１０ｍｇの脂質混合物あたり約５ｍｇ以下のＩＯＮＰを含む。一部の例では、本方法は、リポソームをＲＮＡ分子とインキュベートすることを��む。一部の態様におけるＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるもののいずれかであり、例えば、腫瘍抗原、サイトカイン、アンチセンス分子をコードするＲＮＡ分子である。一部の例では、ＲＮＡ分子は、対象から得られた腫瘍細胞について単離される。一部の態様では、約５μｇのＲＮＡ分子は、リポソームの約７５μｇの脂質ごとにインキュベートされる。一部の態様では、本方法は、リポソームをＲＮＡ分子と、約１：１５のＲＮＡ分子：ＤＯＴＡＰ質量比でインキュベートすることを含む。例示的な例では、リポソームがＩＯＮＰを含む場合、約１０μｇのＲＮＡ分子は、約１５０μｇのリポソームごとにインキュベートされる。
【００３６】
本明細書に記載のリポソームを作製する方法のいずれかによって作製されたリポソームは、本開示によって提供される。リポソームは、細胞をトランスフェクトするために使用してもよい。したがって、本明細書に記載のリポソームを作製する方法のいずれかによって作製されたリポソームを含む（例えば、トランスフェクトされた）細胞が、本開示により提供される。例示的な例では、細胞は、本明細書に記載の細胞のいずれかであり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むが、これに限定されない。例示的な例では、細胞は樹状細胞（ＤＣ）である。例示的な実施形態では、細胞は、細胞集団の一部である。したがって、本明細書に記載のリポソームを作製する方法のいずれかによって作製されたリポソームを含む（トランスフェクトされた）細胞を含む細胞の集団が提供される。一部の態様では、細胞集団の少なくとも５０％は、リポソームを含む（例えば、トランスフェクトされた）細胞である。
【００３７】
本明細書に記載のリポソームを作製する方法のいずれかによって作製されたリポソーム、リポソームを含む細胞、リポソームを含む細胞を含む細胞の集団、またはそれらの任意の組み合わせ、ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤、を含む組成物も、本明細書に提供される。例示的な態様では、組成物は、上記の組成物に従ってもよい。一部の態様では、組成物は、複数のリポソームを含み、リポソームの少なくとも５０％は、約１００ｎｍ〜約２５０ｎｍの直径を有する。
【００３８】
使用方法
本明細書に示されるように、ＲＮＡエレクトロポレーションと比較して、ＩＯＮＰおよびＲＮＡを含む本開示の磁性リポソームは、抗ウイルス性サイトカイン（ＩＦＮ−α）の産生を増強し、リンパ節へのＤＣ遊走を引き起こした。このようなリポソームはまた、Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度の減少、および処置リンパ節における酸化鉄負荷細胞の数と直接相関するＭＲＩ検出リンパ節サイズの増加をもたらした。これらのデータは、ＩＯＮＰおよびＲＮＡを含む本開示の磁性リポソームが、ＤＣの活性化を増強し、ＭＲＩによる非侵襲的細胞追跡を可能にすることを示唆している。特定の理論に拘束されることなく、これらのデータは、抗腫瘍免疫応答を予測し、ワクチン有効性のバイオマーカーとしてＭＲＩ検出ＤＣ遊走を使用するための、ＩＯＮＰおよびＲＮＡを含む本開示の磁性リポソームの使用を支持する。
【００３９】
本明細書において、腫瘍、例えば、脳腫瘍の細胞にＲＮＡを送達する方法が提供され、本開示の組成物を静脈内投与することを含み、組成物は、リポソームを含む。また、腫瘍、任意選択的に、脳腫瘍の微小環境中の細胞にＲＮＡを送達する方法も本明細書で提供される。例示的な実施形態では、本方法は、本開示の組成物を静脈内投与することを含み、組成物は、リポソームを含む。一部の態様では、リポソームは、免疫チェックポイント経路のタンパク質、任意選択的に、ＰＤＬ１を標的とするｓｉＲＮＡを含む。様々な態様では、微小環境中の細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、任意選択的に、腫瘍関連マクロファージである。本開示はまた、脳腫瘍微小環境において抗原提示細胞を活性化する方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、本開示の組成物を静脈内投与することを含み、組成物は、リポソームを含む。
【００４０】
本開示は、ＲＮＡ分子を細胞に送達する方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子と、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールを含む脂質混合物とを含むリポソームと、細胞をインキュベートすることを含み、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールは、約３：１のＤＯＴＡＰ：コレステロール質量比で脂質混合物中に存在する。例示的な態様では、リポソームは、本明細書に記載されるＩＯＮＰを含む。例示的な例では、細胞は、磁場の存在下で、リポソームとインキュベートされる。例示的な態様では、磁場は、静磁場である。例示的な態様では、磁場は、振動磁場である。例示的な態様では、磁場は、約１００ｍＴの強度を有する磁場である。例示的な例では、細胞は、磁場の存在下で、約２時間未満または約１時間未満の時間、リポソームとインキュベートされ、任意選択的に、細胞は、磁場の存在下で、約３０分間±１０分間、リポソームとインキュベートされる。例示的な例では、細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、任意選択的に、樹状細胞（ＤＣ）である。様々な例で、ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）は、対象か得られる。特定の態様では、ＲＮＡ分子は、対象、例えば、ヒトから得られた腫瘍細胞から単離される。特定の態様では、ＲＮＡ分子は、アンチセンス分子であり、目的のタンパク質を標的として発現を減少させる。例示的な態様では、ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子であり、免疫チェックポイント経路のタンパク質を標的とする。免疫チェックポイント経路の好適なタンパク質は、当該技術分野で既知であり、本明細書にも記載されている。様々な例では、ｓｉＲＮＡは、ＰＤＬ１を標的とする。
【００４１】
ＲＮＡが細胞に送達されると、細胞は、疾患の治療のために対象に投与され得る。したがって、本開示は、疾患を有する対象を治療する方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、ＲＮＡ分子を細胞に送達する上記の方法に従って、ＲＮＡ分子を対象の細胞に送達することを含む。一部の態様では、ＲＮＡ分子は、エクスビボで細胞に送達され、細胞は、対象に投与される。あるいは、本方法は、リポソームを対象に直接投与することを含む。例示的な実施形態では、疾患を有する対象を治療する方法は、対象において疾患を治療するのに有効な量で、本開示の組成物を投与することを含む。例示的な態様では、疾患は癌であり、一部の態様では、癌は、血液脳関門を越えて位置し、および／または対象は脳に位置する腫瘍を有する。一部の態様では、腫瘍は、神経膠腫、低悪性度神経膠腫または高悪性度神経膠腫、具体的には、グレードＩＩＩの星状細胞腫または神経膠芽腫である。あるいは、腫瘍は、髄芽腫またはびまん性内在性橋神経膠腫であり得る。別の実施例では、腫瘍は、非中枢神経系腫瘍、例えば、乳癌、黒色腫、または肺癌からの転移性浸潤であり得る。例示的な態様では、組成物は、リポソームを含み、任意選択的に、リポソームを含む組成物は、対象に静脈内投与される。代替的な態様では、組成物は、リポソームでトランスフェクトされた細胞を含む。任意選択的に、組成物の細胞は、ＡＰＣであり、任意選択的に、ＤＣである。例示的な態様では、リポソームを含む細胞を含む組成物は、対象に皮内投与され、任意選択的に、組成物は、対象の鼠径部に皮内投与される。例示的な例では、ＤＣは、対象から得られた白血球（ＷＢＣ）から単離され、任意選択的に、ＷＢＣは、白血球除去を介して得られる。一部の態様では、ＲＮＡ分子は腫瘍抗原をコードする。一部の態様では、ＲＮＡ分子は、腫瘍細胞から単離され、例えば、腫瘍細胞は、対象の腫瘍の細胞である。例示的な態様におけるリポソームは、ＩＯＮＰを含み、本方法は、対象内のリポソームを含む細胞の遊走を追跡することをさらに含む。例示的な態様における追跡は、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む。例えば、追跡は、対象の１つ以上のリンパ節に対してＭＲＩを行うことを含み、任意選択的に、組成物または細胞の投与前および投与後に、リンパ節に対してＭＲＩを行う。例示的な態様では、治療の方法は、ＩＯＮＰを含むリポソームでトランスフェクトされたＤＣを含むリンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度を、対照の未処置リンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と比較することを含む。本方法は、任意選択的に、ＭＲＩを介して、対象のリンパ節サイズを測定することを含む。また、任意選択的に、本方法は、ＩＯＮＰを含むリポソームでトランスフェクトされたＤＣを含むリンパ節のリンパ節サイズを、対照の未処置リンパ節のリンパ節サイズと比較することを含む。
【００４２】
「治療する」、「治療すること」、「治療」という用語は、本明細書に記載の炎症性障害に関連する事象、疾患または状態の臨床症状、兆候または進行のいずれかを、部分的または完全に、一時的または永続的に排除、低減、抑制、または寛解することを指す。関連分野で認識されているように、治療剤として使用される薬物は、所与の病状の重症度を低減する可能性があるが、有用な治療剤と見なされるために、疾患のすべての兆候を消失させる必要はない。同様に、予防的に投与される治療は、実行可能な予防剤を構成するために、症状の発症を防ぐのに完全に効果的である必要はない。単に疾患の影響を低減する（例えば、症状の数や重症度を低減する、別の治療の有効性を高める、または別の有益な効果を生み出すことにより）、または対象において疾患が発症または悪化する可能性を低減することで、十分である。本発明の一実施形態は、治療の有効性を決定するための方法に関し、特定の障害の重症度を反映する指標のベースラインを超える持続的な改善を誘導するのに十分な量および時間で、患者に治療剤を投与することを含む。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語、ならびにそれに関連する言葉は、必ずしも１００％または完全な治療を意味するものではない。むしろ、様々な程度の治療があり、当業者は、潜在的な利益または治療効果を有するものとして認識している。この点で、本開示の癌を治療する方法は、任意の量または任意のレベルの治療を提供することができる。さらに、本方法によって提供される治療は、治療される疾患の１つ以上の状態または症状または徴候の治療を含み得る。例えば、本開示の治療方法は、疾患の１つ以上の症状を抑制し得る。また、本開示の方法によって提供される治療は、疾患の進行を遅らせることを包含し得る。「治療する」という用語はまた、疾患の予防的治療を包含する。したがって、本開示の方法によって提供される治療は、予防的に治療される疾患の発症または再発を遅延することができる。例示的な態様では、本方法は、疾患の発症を、１日、２日、４日、６日、８日、１０日、１５日、３０日、２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１年、２年、４年、またはそれ以上遅延させる。予防的治療は、治療される疾患のリスクを低減することを包含する。例示的な態様では、本方法は、疾患のリスクを、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上、低減する。
【００４４】
前述の方法に関して、リポソームまたはそれを含む組成物を、一部の態様では、対象に全身投与される。任意選択的に、本方法は、非経口投与によるリポソームまたは組成物の投与を含む。様々な例では、リポソームまたは組成物は、対象に静脈内投与される。
【００４５】
様々な態様では、リポソームまたは組成物は、例えば、毎日（１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回）、週３回、週２回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、毎週、隔週、３週間毎、毎月、または隔月、を含む任意のレジメンに従って投与される。様々な態様では、リポソームまたは組成物は、週１回対象に投与される。
【００４６】
「治療上有効量」という用語は、疾患または障害に関連する疾患の症状または徴候を改善または軽減するのに有効な治療剤の量を指す。
【００４７】
例示的な態様では、疾患の治療は、対象において疾患に対する免疫応答を増強することによって達成される。したがって、本開示は、対象において、疾患、例えば、腫瘍または癌に対する免疫応答を増強する方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、疾患、例えば腫瘍または癌に対する対象の免疫応答を増強するのに有効な量で、本開示のリポソームを対象に投与することを含む。例示的な態様では、増強された免疫応答は、樹状細胞の活性化の増加によって明らかであり、これは、例えば、ＤＣ活性化に関連する遺伝子の発現の増強、ＤＣの表面上の共刺激分子の発現の増強、抗ウイルス性サイトカイン（例えば、ＩＦＮα）の産生の増加、Ｔ細胞刺激の増加（例えば、活性化ＤＣとの接触時のＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生の増加によって示される）、リンパ節への遊走の増加、および腫瘍増殖の阻害の増強、によって実証される。したがって、本開示は、ＤＣの活性化を増加させるか、またはＤＣを活性化する方法を、さらに提供する。例示的な実施形態では、本方法は、ＤＣの活性化を増加させるのに有効な量で、またはＤＣを活性化するのに有効な量で、本開示のリポソームを対象に投与することを含む。したがって、本開示はまた、抗ウイルス性サイトカイン（例えば、ＩＦＮα）の産生を増加させる方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、対象において抗ウイルス性サイトカインの産生を増加させるのに有効な量で、本開示のリポソームを対象に投与することを含む。さらに、対象においてＴ細胞刺激を増加させる方法が提供される。例示的な実施形態では、本方法は、対象においてＴ細胞刺激を増加させるのに有効な量で、本開示のリポソームを対象に投与することを含む。様々な態様では、Ｔ細胞刺激の増加は、ＩＦＮ−γのＴ細胞産生の増加から明らかである。本開示はさらに、ＩＦＮ−γのＴ細胞産生を増加させる方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、Ｔ細胞を、本開示の樹状細胞（ＤＣ）と接触させることを含み、任意選択的に、リポソームは、ＩＯＮＰを含み、ＤＣは、磁場の存在下でリポソームでトランスフェクトされる。対象においてリンパ節への樹状細胞（ＤＣ）の遊走を増加させる方法がさらに提供される。例示的な実施形態では、本方法は、リンパ節へのＤＣ遊走を増加させるのに有効な量で、本開示の組成物を対象に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「増加する」という用語およびそれから派生する語は、１００％または完全な増加ではない場合がある。むしろ、様々な程度の増加または増強があり、当業者は、潜在的な利益または治療効果を有するものとして認識している。例示的な実施形態では、本開示の方法により提供される増加または増強は、少なくともまたは約１０％の増加または増強（例えば、少なくともまたは約２０％の増加または増強、少なくともまたは約３０％の増加または増強、少なくともまたは約４０％の増加または増強、少なくともまたは約５０％の増加または増強、少なくともまたは約６０％の増加または増強、少なくともまたは約７０％の増加または増強、少なくともまたは約８０％の増加または増強、少なくともまたは約９０％の増加または増強、少なくともまたは約９５％の増加または増強、少なくとも��たは約９８％の増加または増強）である。
【００４８】
本開示はさらに、対象のリンパ節への樹状細胞（ＤＣ）の遊走を増加させる方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、リンパ節へのＤＣ遊走を増加させるのに有効な量で、本開示の組成物を対象に投与することを含む。本開示はさらに、対象において樹状細胞（ＤＣ）を活性化する方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、対象においてＤＣを活性化するのに有効な量で、本開示の組成物を対象に投与することを含む。様々な例では、ＤＣは、腫瘍増殖の優れた阻害をもたらす。したがって、本開示は、対象において腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、対象において腫瘍増殖を阻害するのに有効な量で、本開示のリポソームを対象に投与することを含む。様々な態様では、本方法は、対象においてＤＣを活性化するのに有効な量で、本開示の組成物を対象に投与することを含む。これらの方法の様々な態様では、本方法は、対象から得られたＤＣを本開示のリポソームとインキュベートし、リポソームを含むＤＣを対象に投与することを含む。様々な例における方法は、ＭＲＩを使用して、対象においてリンパ節へのリポソームを含むＤＣの遊走を追跡することを含む。様々な実施形態におけるＤＣの追跡を使用して、リポソームを含むＤＣを用いた療法に対する対象の応答を予測することができる。本明細書で使用される場合、「阻害する」という用語およびそれから派生する語は、１００％または完全な阻害ではない場合がある。むしろ、様々な程度の阻害があり、当業者は、潜在的な利益または治療効果を有するものとして認識している。例示的な実施形態では、本開示の方法によって提供される阻害は、少なくともまたは約１０％の阻害（例えば、少なくともまたは約２０％の阻害、少なくともまたは約３０％の阻害、少なくともまたは約４０％の阻害、少なくともまたは約５０％の阻害、少なくともまたは約６０％の阻害、少なくともまたは約７０％の阻害、少なくともまたは約８０％の阻害、少なくともまたは約９０％の阻害、少なくともまたは約９５％の阻害、少なくともまたは約９８％の阻害）である。
【００４９】
対象のリンパ節への樹状細胞（ＤＣ）の遊走を追跡する方法が、本開示によって提供される。例示的な実施形態では、本方法は、（ｉ）本明細書に記載される疾患を有する対象を治療する本開示の方法に従って、対象を治療することであって、細胞がＤＣであり、リポソームがＩＯＮＰを含む、治療することと、（ｉｉ）対象の１つ以上のリンパ節に対して核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を行うことと、を含む。例示的な態様では、本方法は、１つ以上のリンパ節のＴ２＊強調（Ｔ２＊ｗｅｉｇｈｔｅｄ）ＭＲＩ強度を決定することを含み、対照の未処置リンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と比較して、Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度の減少を示すリンパ節は、ＤＣが遊走したリンパ節を表す。特定の態様では、１つ以上のリンパ節は、対象の鼠径部リンパ節であり、任意選択的に、組成物は、対象の鼠径部に皮内投与される。例示的な例では、ＭＲＩは、組成物または細胞の投与前および投与後にリンパ節で行われ、任意選択的に、ＭＲＩは、投与前および投与約４８時間後に行われ、任意選択的に、投与約７２時間後に行われる。一部の態様では、本方法は、ＩＯＮＰを含むリポソームでトランスフェクトされたＤＣを含むリンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度を、対照の未処置リンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と比較することを含む。例示的な態様では、本方法は、ＭＲＩを介して対象のリンパ節サイズを測定することを含み、任意選択的に、ＩＯＮＰを含むリポソームでトランスフェクトされたＤＣを含むリンパ節のリンパ節サイズを、対照の未治療のリンパ節のリンパ節サイズと比較することをさらに含む。
【００５０】
本開示により、対象における樹状細胞（ＤＣ）のワクチン接種療法に対する対象の治療応答を決定する方法も提供される。例示的な実施形態では、本方法は、（ｉ）本開示の治療方法に従って、対象を治療することであって、細胞がＤＣであり、リポソームがＩＯＮＰを含む、治療することと、（ｉｉ）ＤＣ遊走を追跡する本開示の方法のいずれかに従って、リンパ節へのＤＣ遊走を追跡することと、を含む。一部の態様では、処置リンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度が減少した場合、ＤＣワクチン接種療法が、対象において正の治療応答をもたらすと決定される。例示的な例では、正の治療応答は、療法の投与後少なくとも４週間の対象の無増悪期間および全生存期間の延長を含む。一部の態様では、正の治療応答は、療法の投与後少なくとも８〜１２週間の対象の無増悪期間および全生存期間の延長を含む。
【００５１】
本開示はまた、対象における樹状細胞（ＤＣ）ワクチン接種療法に対する治療応答をモニタリングする方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、第１時点および第２時点で本開示の追跡方法のいずれか一つに従って、リンパ節へのＤＣ遊走を追跡することを含み、第２時点での処置リンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度が、第１時点での処置リンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度と比較して減少する場合、ＤＣワクチン接種療法に対する治療応答が有効である。
【００５２】
また、ＩＦＮ−γのＴ細胞産生を増加させる方法が提供され、本開示のリポソームを含むかまたはそれでトランスフェクトされた本開示の樹状細胞（ＤＣ）とＴ細胞を接触させることを含み、任意選択的に、リポソームは、ＩＯＮＰを含み、ＤＣは、磁場の存在下で、リポソームでトランスフェクトされる。
【００５３】
癌
本明細書に開示される方法によって治療可能な癌は、任意の癌、例えば、リンパ系または血流を通じて身体の他の部分に広がる可能性のある異常かつ制御されない細胞分裂によって引き起こされる任意の悪性増殖または腫瘍であり得る。一部の実施形態では、癌は、インテグリンおよびＧタンパク質αサブユニットが細胞の表面に発現される癌である。
【００５４】
一部の態様における癌は、急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨癌、脳癌、乳癌、肛門癌、肛門管癌、または肛門直腸癌、眼癌、肝内胆管癌、関節の癌、頚部癌、胆嚢癌、または胸膜の癌、鼻、鼻腔、または中耳の癌、口腔の癌、外陰部癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵癌、腹膜、大網、および腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ））、小腸癌、軟部組織癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、および膀胱癌、からなる群から選択されるものである。特定の態様では、癌は、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌および食道癌、膵癌、胃腸癌、胃癌、乳癌、子宮内膜癌および大腸癌、肝細胞癌、膠芽腫、膀胱癌、肺癌、例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、細気管支肺胞癌、からなる群から選択される。
【００５５】
対象
代表的実施形態では、本開示の方法の対象は、マウスおよびハムスターなどの齧歯目の哺乳動物、およびウサギなどのロゴモルファ目の哺乳動物、ネコ科の動物（ネコ）およびイヌ科の動物（イヌ）を含むネコ目の哺乳動物、ウシ科の動物（ウシ）およびイノシシ科の動物（ブタ）を含む偶蹄目の哺乳動物、またはウマ科の動物（ウマ）を含む奇蹄目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない。一部の態様では、哺乳動物は、霊長目、Ｃｅｂｏｉｄ目またはＳｉｍｏｉｄ目（サル）に属するか、または真猿亜目（ヒトおよび類人猿）に属する。代表的な態様では、哺乳動物は、ヒトである。一部の態様では、ヒトは、１８歳以上の成人である。一部の態様では、ヒトは、１７歳以下の子供である。
【００５６】
このように一般的に記載される本発明は、例示として提供され、本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【００５７】
実施例１
この実施例は、本開示のコレステロール含有リポソームを作製する例示的な方法、および樹状細胞（ＤＣ）へのＲＮＡ送達のためのその使用を実証する。
【００５８】
ＤＣへのＲＮＡ送達に非常に効率的なコレステロール含有リポソームを作製するために、一連の実験が行われた。コレステロールを含まない対照リポソームは、Ｓａｙｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６（１）：ｅ１２５６５２７（２０１７）に本質的に記載されているように作製された。
【００５９】
リポソームは、様々な薄膜再水和技術を使用して、様々な量のコレステロールで作製された。各製剤には、合計１０ｍｇの脂質が含まれた。作製された組成の概要を以下の表に示す。
【００６０】
【表１】
2021523145.tif 000002
【００６１】
簡単には、各組成について、ＤＯＴＡＰおよびコレステロール（またはＤＯＴＡＰのみ）をクロロホルムに溶解し、ホウケイ酸ガラス管に加えた。クロロホルムを窒素ガス（Ｎ２）で蒸発させ、次いで窒素なしで蒸発させた後、ＰＢＳで再水和した。次に、粒子を２ｍＬのＰＢＳで再水和し、５０℃の水浴でインキュベートし、１０分ごとにボルテックスして、１時間、リポソームを形成させた。次に、リポソームを、室温で一晩放置した。翌日、リポソームを室温で５分間超音波処理し、４５０ｎｍフィルター、続いて２００ｎｍフィルターで濾過した。
【００６２】
コレステロールを含有するリポソームのトランスフェクション効率を、フローサイトメトリーでＤＣ２．４と呼ばれる樹状細胞の不死化細胞株を使用してコレステロールを欠くリポソームのトランスフェクション効率と比較した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＲＮＡ（ＧＦＰ  ＲＮＡ）は、緩衝液中で約７５μｇのリポソームを約５μｇのＲＮＡとインキュベートすることによって、各タイプのリポソームに負荷した。混合物を、室温で１５〜２０分間維持して、ＲＮＡを負荷したＤＯＴＡＰリポソームを形成させた。細胞のトランスフェクションについては、約２７μｇのＲＮＡ負荷ＤＯＴＡＰリポソームを、約２００，０００個のＤＣ２．４細胞と一晩インキュベートした。ＧＦＰ陽性（ＧＦＰ＋）細胞の割合は、フローサイトメトリーを介して評価した。簡単には、トランスフェクトされた細胞を、ＰＢＳで洗浄した後、約３００μＬの０．０５％トリプシンを加えた。５分後、血清含有培地を使用してトリプシンを中和し、細胞を、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）チューブに移した。これらの細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒでのＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析のために、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
【００６３】
図１Ａに示すように、ＤＯＴＡＰリポソームにコレステロールを添加すると、細胞トランセクションのレベルが大幅に増強した。フローサイトメトリーで測定したところ、１２〜３７％のコレステロールを含むリポソームは、ＧＦＰ＋細胞の少なくとも３倍の増加が得られた。最高レベルの細胞トランスフェクションは、２５％コレステロール含有量で配合されたリポソームで得られたが、３７％コレステロール含有量で配合されたリポソームを使用した細胞トランスフェクションのレベルも、コレステロールを欠くリポソームよりも有意に大きかった。２５％のコレステロール含有量を含有するリポソームを、その後の研究に使用した。
【００６４】
別の実験では、ＧＦＰ  ＲＮＡをＡｒｃｔｕｒｕｓＴｕｒｂｏラベリングキットを介してＣｙ５で標識し、本質的に上記のように作製した０％または２５％のコレステロールを、ＤＯＴＡＰリポソームに組み込んだ。リポソームを、ＤＣ２．４樹状細胞と一晩インキュベートし、フローサイトメトリーを介して分析した。コレステロールを含有するリポソーム（Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰ）は、生存率を減少させることなく、標準的なＲＮＡ−リポソームよりも有意に高い割合の細胞にＲＮＡを送達した（図１Ｂおよび１Ｃ）。
【００６５】
マウス神経膠腫細胞株から単離されたＲＮＡを負荷した初代骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）を使用して、コレステロールを含有するリポソームのトランスフェクション効率を、コレステロールを欠くリポソームのトランスフェクション効率と比較した。簡単には、腫瘍細胞からの全腫瘍由来ＲＮＡ（ＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ）は、市販のＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造元の説明書に基づいて単離した。本質的に上記のように作製された０％または２５％コレステロールのいずれかを含むリポソームに、ＫＲ１５８Ｂ−ルシフェラーゼ腫瘍細胞からのＲＮＡを負荷した。次いで、これらの細胞を、他のワクチン接種された動物由来のＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ特異的Ｔ細胞と２日間インキュベートした。４８時間後、Ｔ細胞活性化の特徴としてのＩＦＮ−γ産生を評価するために、上清を収集した。ＩＦＮ−γ産生は、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＢＭＳ６０６）を介して、製造元の説明書に従って決定した。
【００６６】
図１Ｄに示すように、コレステロール含有リポソームは、Ｔ細胞からより多くのＩＦＮ−γ産生を誘発し、コレステロール負荷リポソームが、Ｔ細胞応答を活性化する主要なＤＣ機能を増加させたことを示している。
【００６７】
これらの結果は、コレステロールを含むリポソームが、コレステロールを含まないリポソームと比較して、より高い効率で、ＲＮＡを細胞に送達することを示している。データは、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールの質量比が３：１で、リポソームの優れたトランスフェクション効率がもたらされ、非常に効率的にＤＣをトランスフェクトすることができ、トランスフェクトされたＤＣが、次いでＴ細胞を活性化してＩＦＮγを産生することを示している。ここに提示された結果は、Ｔ細胞を活性化するためのＤＣワクチン接種戦略の一部としての、コレステロール含有リポソームの臨床的な有用性を示唆する。
【００６８】
実施例２
この例は、コレステロール含有リポソームが、脳腫瘍の免疫細胞を標的とし得ることを示している。
【００６９】
０％コレステロールまたは２５％コレステロール（３：１のＤＯＴＡＰ：コレステロール比でＤＯＴＡＰで作製された）を有するリポソームは、実施例１に記載されるように作製された。リポソームに、オボアルブミンをコードするＣｙ３またはＣｙ５標識ＲＮＡ（ＯＶＡ  ＲＮＡ）を負荷し、ＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ腫瘍を有するマウスに静脈内注射した。ＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼは、テモゾロミドおよび放射線耐性のマウス神経膠腫株であり、周囲の脳組織への浸潤を含むヒト神経膠芽腫の特徴的な所見を再現している。２４時間後、３匹のマウスから脳を抽出し、免疫蛍光イメージングのために保存した。図２Ａは、皮質の免疫蛍光画像を表し、図２Ｂは、腫瘍の免疫蛍光画像を表す。腫瘍を別個のセットのマウスから抽出し、各腫瘍のＣｙ５標識細胞の数を、フローサイトメトリーを介して分析した。未処置のマウスおよびＣｙ５標識ＲＮＡのみで処置されたマウスは、陰性対照として機能した。図２Ｃに示すように、脳腫瘍におけるＣｙ５＋細胞の数は、コレステロールを含有するリポソームで最も多かった。
【００７０】
異なる脳腫瘍モデルを試験した。２５％コレステロールを含むまたは含まないＲＮＡ−リポソーム（３：１のＤＯＴＡＰ：コレステロール比でＤＯＴＡＰで作製）にＣｙ５標識ＲＮＡを負荷し、ＧＬ２６１腫瘍を有するマウスに静脈内注射した。ＧＬ２６１は、ヒト膠芽腫を表す治療モデルとして一般的に使用されるマウス膠肉腫である。２４時間後、腫瘍を採取して、フローサイトメトリーでＣｙ５標識細胞の数を評価した。ＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ腫瘍を有するマウスの場合と同様に、コレステロールを有するリポソームのみが、Ｃｙ３またはＣｙ５で標識されたｍＲＮＡをＧＬ２６１腫瘍中の細胞に送達した（図２Ｄ）。これらの結果は、脳腫瘍のすぐ周囲の領域にあるこれらの標準的な免疫抑制細胞を操作できることを示唆しており、それによって、これらのリポソームを使用したワクチン接種戦略に前例のない利点を提供するため、重要であった。
【００７１】
様々な量のコレステロール（０％、１２．５％、２５％、または３７％）を含むＤＯＴＡＰリポソームを、上記のように作製し、Ｃｙ３標識ＯＶＡ  ＲＮＡを負荷した。次に、ＲＮＡ負荷リポソームを、ＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ腫瘍を有するＣ５７Ｂｌ６マウスに静脈内注射した。マウスから腫瘍を２４時間後に採取し、フローサイトメトリーで評価した。図３に示すように、リポソーム中のコレステロールの量には、明確な依存性があった。２５％のコレステロールを負荷したリポソームは、腫瘍中で最高量のＣｙ３＋細胞を示した。
【００７２】
特定の細胞型にＲＮＡを送達するリポソームの傾向を決定するために、さらなる研究を行った。図２Ｃのマウス由来の脳腫瘍スライスは、内皮細胞マーカーＣＤ３１に対する免疫蛍光抗体で染色した。次に、蛍光顕微鏡で画像を撮影して、送達されたＲＮＡと内皮血管との間の関係を評価した。図４に示すように、コレステロールを含有するＲＮＡ負荷リポソームは、ＣＤ３１を発現する細胞と正確に共局在しなかった。これらの結果は、ＲＮＡが血管を取り巻く細胞に送達されるが、内皮細胞自体には送達されないことを示唆している。
【００７３】
注射時にリポソームが標的とした細胞を特徴付けるために、さらなる実験を行った。Ｃ５７Ｂｌ６マウスは、１０，０００個のＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ細胞の頭蓋内注射を受けた。３週間後、マウスは２５％コレステロールと７５％ＤＯＴＡＰから構成され、Ｃｙ５標識ＲＮＡを負荷したリポソームの静脈内注射を受けた。翌日、腫瘍を切除し、パパインで解離し、単一細胞懸濁液へと濾し、ＦＡＣＳ緩衝液中で、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｄｙｅ（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌ１０１１９）およびＣＤ４５の抗体（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＭＨＣＩＩの抗体（ＦＩＴＣ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で、フローサイトメトリー用に染色した。次いで、細胞を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで評価した。図５Ａ〜５Ｃに示すように、コレステロールを含有するＲＮＡ負荷リポソームは、脳腫瘍のＣＤ４５＋細胞にほぼ独占的に見出された。さらに、これらの細胞の約半分が、ＭＨＣクラスＩＩ陽性であった。この実験は、ＧＬ６１腫瘍で繰り返され、ほぼ同じ結果が得られた。ＣＤ４５は骨髄由来細胞の普遍的なマーカーであり、ＭＨＣＩＩは抗原提示細胞にのみ見られる抗原提示機構の不可欠な部分であるため、この証拠は、コレステロールを有するＲＮＡリポソームが、脳腫瘍の免疫細胞（その約半分が、ＭＨＣＩＩ＋抗原提示細胞である）にＲＮＡを効率的に送達することを示している。ＣＤ４５区画は、腫瘍増殖が抗腫瘍免疫応答を阻害することを支持するために採用されていることが知られているため、いずれかのＣＤ４５＋集団へのＲＮＡ送達は治療の観点から興味深いものである。腫瘍中のＭＨＣＩＩ＋抗原提示細胞は、抗原特異的免疫寛容を誘導すると考えられているが、ＭＨＣＩＩ−細胞には、サイトカインを産生し、抗腫瘍免疫応答をさらに阻害する共制御分子を発現することが知られている、骨髄由来サプレッサー細胞が含まれる。
【００７４】
この増強されたＲＮＡ送達が脳腫瘍に特異的であるかどうかを評価するために、コレステロール含有するＲＮＡ負荷リポソームが、末梢器官へのＲＮＡ送達も増強するかどうかを調べるための研究を実施した。Ｃ５７Ｂｌ６マウスは、２５質量％のコレステロールを有するＣｙ５標識ＲＮＡリポソームの静脈内注射を受けた。脾臓、肝臓、および肺を、２４時間で切除し、単細胞懸濁液へと濾し、溶解し、フローサイトメトリー用にＣＤ４５（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）およびＭＨＣＩＩ（ＦＩＴＣ）で染色した。図６Ａ〜６Ｃに示すように、コレステロールを含有するＲＮＡ負荷リポソームは、０％のコレステロールを含有するＲＮＡ負荷リポソームよりも、肝臓のＣＤ４５＋細胞でより多く見出された。肺と脾臓では、コレステロールを含有するＲＮＡ負荷リポソームは、０％のコレステロールを含有するＲＮＡ負荷リポソームとほぼ同程度であることがわかった。これらの末梢器官のそれぞれにおけるＲＮＡの取り込みを、脳腫瘍（６Ｄ〜Ｆ）における取り込みに対してプロットした。この分析では、１つの臓器への取り込みと脳腫瘍への取り込みとの間の直接的な関係から、両方の部位での取り込みに類似するまたは関連するメカニズムが示唆されるであろう。いずれの場合も、その臓器への取り込みと脳腫瘍への取り込みとの間に有意な関係はなかったた。これらのデータは、脳腫瘍におけるコレステロール含有ＲＮＡ−リポソームの取り込みが、コレステロール含有ＲＮＡ−リポソームが、肺、脾臓、または肝臓に取り込まれるメカニズムとは異なるメカニズムを通して起こることを示唆している。これらのデータはまた、コレステロール含有ＲＮＡ−リポソームが、肺および肝臓の腫瘍を治療するためのワクチンとして魅力的な候補であることを示唆している。
【００７５】
実施例３
この実施例は、本開示の磁性リポソームを作製するプロセスを実証する。
【００７６】
酸化鉄（ＩＯ）を負荷したＤＯＴＡＰリポソームを樹状細胞（ＤＣ）へのＲＮＡ送達に有用にし、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）の造影剤として有用にすることを目的とした、いくつかの実験を設計および実施した。
【００７７】
実施例１に記載の対照リポソームを作製するためのプロトコルは、酸化鉄を含むように修正された。最初の一連の実験では、クロロホルム中の出発物質を超音波処理し、再水和物質で再水和した後、超音波処理した。表１に、ＩＯを負荷したＤＯＴＡＰリポソームを作製するために試験した様々な材料と条件の詳細を示す。ＩＯは、社内で作製され、オレイン酸でコーティングされている。実験＃１〜５の場合、ＤＯＴＡＰは、少なくとも３５０μｇの濃度で存在し、出発物質には、クロロホルム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、およびオレイン酸中に１つ以上のＩＯが含まれていた。実験＃６〜７の場合、４５μｇのＤＯＴＡＰと１０μＬの３０ｍｇ／ｍＬ  ＩＯ溶液が出発物質であった。実験＃８および９では、ＤＯＴＡＰが唯一の出発物質であり、実験１０では、ＤＯＴＡＰはまったく含まれなかった。実験＃１〜７の場合、酸化鉄が出発物質であった。実験＃８−１０では、酸化鉄を再水和物質として使用した。
【００７８】
【表２】
2021523145.tif 000003
【００７９】
得られた粒子を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で分析した。実験＃１〜５の場合、ＴＥＭ画像は、酸化鉄が、リポソームではなく、オレイン酸に含まれていることを示した。実験＃６の場合、酸化鉄は、リポソームの外側に存在した。実験＃７の場合、多くのリポソームには、ＩＯが、ほとんどまたはまったくなかった。実験＃８−１０の場合、ＩＯを有するリポソームが作製されなかった。
【００８０】
２番目の一連の実験では、異なるソースから作製されたＤＯＴＡＰとＩＯが使用された。いくつかの実験では、オレイン酸が出発物質であった。表２に、ＩＯを負荷したＤＯＴＡＰリポソームを作製するために試験した様々な物質の詳細を示す。これらの各実験の条件は、実験＃２と同じであった。得られた粒子を、ＴＥＭを介して分析した。
【００８１】
【表３】
2021523145.tif 000004
【００８２】
実験＃１１〜１５のそれぞれで、リポソームは、ＴＥＭで検出されなかった。実験＃１６の場合、リポソームと酸化鉄粒子が、別々の実体として検出された。
【００８３】
３番目の一連の実験では、出発物質を超音波処理し、精製蒸留水で再水和し、１０分ごとに超音波処理しながら５０℃で１時間インキュベートした。次いで、粒子を一晩放置した後、５分間超音波処理し、続いて４５０ｎｍのＷｈａｔｍａｎフィルターおよび２００ｎｍのＰＡＬＬフィルターで濾過した。ＩＯは、出発物質として、または再水和物質として添加され、あるいは濾過後に添加された。表３に、ＩＯを負荷したＤＯＴＡＰリポソームを作製するために試験した様々な物質の詳細を示す。得られた粒子を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で分析した。
【００８４】
【表４】
2021523145.tif 000005
【００８５】
実験＃１７〜２０の場合、５μｇのＲＮＡを、７５μｇの各リポソーム組成の試料に加えた。次いで、これらのＲＮＡ負荷リポソームを、電気泳動ゲルに負荷し、８０ｍＶの電圧で泳動して、非結合ＲＮＡの量を評価した。次いで、これらのＲＮＡ負荷リポソームをクライオＴＥＭで評価して、酸化鉄がリポソーム内に結合しているかどうかを判定した。実験＃２０からのリポソームで、非結合ＲＮＡが同定された。実験＃１７〜１９の場合、各粒子構築物は、ＲＮＡと結合したが、リポソーム中にＩＯが検出されなかった。
【００８６】
４番目の一連の実験では、様々な量のＰＥＧ化酸化鉄ナノ粒子（直径１０ｎｍ、２００μｇ、４００μｇ、１  ｍｇ、または１．５ｍｇ）または４００μｇのフェラヘム（ＦＨ）を脂質ケーキに加えた。ＦＨは、３０ｎｍのデキストランでコーティングされたＩＯナノ粒子からなる造影剤である。表４に、使用した物質の詳細を示す。
【００８７】
【表５】
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【００８８】
実験＃２５〜２６の場合、リポソームは効率的なＲＮＡ結合能力とトランスフェクション効率を示した。しかし、ＩＯナノ粒子は、リポソーム内に検出されなかった。実験＃２７〜２８の場合、リポソームは、トランスフェクション効率が低いことを実証した。
【００８９】
５番目の一連の実験では、リポソームを、クロロホルム中の酸化鉄と混合し（実験３０〜３１）、４ｍＬの室温のＰＢＳで再水和するか、クロロホルム相で酸化鉄なしで放置し、１００μＬのＰＢＳ中で２．５ｍｇの市販のＩＯナノ粒子で再水和した。すべての試料を、５５℃の開始温度で１時間超音波処理し、次いで室温で一晩放置した後、４５０ｎｍＷｈａｔｍａｎフィルターおよび２００ｎｍのＰＡＬＬフィルターで濾過した。表５に、使用した物質の詳細を示す。
【００９０】
【表６】
2021523145.tif 000007
【００９１】
実験＃２９では、酸化鉄は、リポソームの外側で検出された。実験＃３０〜３１では、酸化鉄の大量の凝集体が検出された。
【００９２】
６番目の一連の実験では、７．５ｍｇのＤＯＴＡＰと２．５ｍｇのコレステロールを含む脂質ケーキを、ＩＯナノ粒子を含む溶液で再水和した。１つの実験では、２ｍｇのカルボキシル化ＩＯナノ粒子（直径１０ｎｍ）を使用した。３つの実験では、様々な量の１３０ｎｍカルボキシル化酸化鉄ナノ粒子（ＮａｎｏＭａｇ）を使用して、リポソームコア内に様々な量の酸化鉄を含むリポソームを作製した。脂質ケーキを２ｍｇのカルボキシル化１０ｎｍ酸化鉄ナノ粒子または１０μｇ、１００μｇ、または１ｍｇのＮａｎｏＭａｇで再水和することによって形成されたリポソームは、Ｓａｙｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６（１）：ｅ１２５６５２７（２０１５）に記載されたプロトコルに従って、ＲＮＡ結合およびトランスフェクション効率について試験した。４セットのリポソームは、すべてＲＮＡに結合し、細胞をトランスフェクトすることができた。１ｍｇのＩＯＮＰを有するリポソームは、最高レベルのトランスフェクション効率を示した。これらのリポソームは、クライオ−ＴＥＭによってリポソーム内にＩＯを有することが示され、有利なことに、これらのリポソームは、腫瘍モデルにおいて抗腫瘍免疫を刺激した。
【００９３】
実施例４
この実施例は、磁性リポソームを作製する例示的な方法およびその特徴付けを実証する。
【００９４】
カチオン性リポソームは、実施例１に記載の薄膜再水和技術のバリエーションを使用して生成した。図７Ａに、基本的なステップの概略図を示す。技術の１つのバリエーションでは、酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）がステップ３に追加されている。簡単には、７．５ｍｇのＤＯＴＡＰと２．５ｍｇのコレステロールをクロロホルムに溶解し、ホウケイ酸ガラス管に加えた（ステップ１）。クロロホルムをＮ２で蒸発させ（ステップ２）、１時間乾燥させた後、高密度の酸化鉄溶液（２００μＬ／ｍＬの５ｍｇのＮａｎｏＭａｇ（登録商標））で再水和した（ステップ３）。次いで、粒子を、５０℃の水浴でインキュベートし、１０分ごとにボルテックスして１時間、リポソームを形成させた。次に、リポソームを、室温で一晩放置した。翌日、リポソームを、室温で５分間超音波処理し、４５０ｎｍおよび２００ｎｍフィルターで濾過した（ステップ４）。
【００９５】
技術の２番目のバリエーションでは、ステップ１で、ＩＯを加えた。簡単には、７．５ｍｇのＤＯＴＡＰと２．５ｍｇのコレステロールを、オレイン酸でコーティングされた酸化鉄とともにクロロホルムに溶解し、ホウケイ酸ガラス管に加えた（ステップ１）。クロロホルムをＮ２で蒸発させ（ステップ２）、１時間乾燥させた後、ＰＢＳで再水和した（ステップ３）。次いで、粒子を、５０℃の水浴でインキュベートし、１０分ごとにボルテックスして１時間、リポソームを形成させた。次に、リポソームを、室温で一晩放置した。翌日、リポソームを、室温で５分間超音波処理し、４５０ｎｍおよび２００ｎｍフィルターで濾過した（ステップ４）。
【００９６】
最も有効なナノ粒子は、再水和ステップ（ステップ３）中にカルボキシル化酸化鉄ナノ粒子を加えるステップを含む方法で作製されることが判明し、高密度（≧１ｍｇ／ｍＬ）の酸化鉄ナノ粒子の溶液（ＰＢＳの代わりに）が、再水和物質として使用された。ステップ１でカルボキシル化酸化鉄ナノ粒子を添加することを含むプロセスでも、ステップ３でＩＯを添加した場合と比較して、程度は低いものの、効果的なナノ粒子が生成された。
【００９７】
上記の方法で生成された磁性リポソームに、ＧＦＰ  ＲＮＡを、５μｇＲＮＡ：７５ｕｇ脂質比で負荷した。リポソームを、ＮａｎｏｓｉｇｈｔＮＳ３００機器で分析した。これらの磁性リポソームは、クライオ−ＴＥＭによってリポソーム内にＩＯを有することが示され（図７Ｂ）、主に１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲にあるように見え、３７０での別の隆起は、複数の粒子の凝集を示している可能性がある（図７Ｃ）。したがって、磁性リポソームは、確かにナノ粒子（ＮＰ）であることが確認された。本開示を通して、酸化鉄−ＲＮＡナノ粒子（ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ）は、磁性リポソームと同義である。
【００９８】
ＩＯＮＰの１ｍｇ／ｍＬ以上の溶液を再水和物質として使用した上記の方法、または実施例３に記載の方法、によって生成されたＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰに、ＧＦＰ  ＲＮＡを、５μｇＲＮＡ：７５μｇ脂質比で負荷した。各リポソームを、１％アガロースゲルのウェルに加えた。図７Ｄに示すように、各条件でバンドの不在は、すべての方法で、これらの条件で負荷されたＲＮＡが１００％結合するリポソームが得られたことを示している。
【００９９】
酸化鉄を含むまたは含まないＲＮＡ−ＮＰを使用して、ＤＣ２．４をＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクトした。ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰは、酸化鉄を含まない標準的なＲＮＡ−ＮＰのトランスフェクション効率よりも高い、有意なトランスフェクション効率を示した（図７Ｅ）。
【０１００】
ＩＯとコレステロールを負荷したＲＮＡ−ＮＰ（Ｃｈｏｌ−ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ）を使用してＤＣ２．４をトランスフェクトし、標準的なＩＯを負荷したＲＮＡ−ＮＰ（０％コレステロール）と比較した。ＧＦＰ＋細胞をフローサイトメトリーで測定した。図７Ｆに示すように、コレステロールの存在は、コレステロールを含まないＩＯを負荷したＮＰと比較して、トランスフェクション効率を２倍以上に向上させた。この結果は、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールの比率が３：１の場合、酸化鉄を負荷したリポソームに、最適なトランスフェクション効率を提供することを示している。トランスフェクトされたＤＣの明視野画像を撮影した（図７Ｇ）。トランスフェクトされたＤＣの蛍光イメージングを行い（図７Ｈ）、ＤＣの核周囲領域にＣｙ３標識ＲＮＡが存在することが実証された。この領域への局在化は、酸化鉄またはコレステロール含有量に関係なく発生するように見えた。
【０１０１】
様々な量のカルボキシル化ＩＯ（直径１３０ｎｍ）を除いて、ＩＯ負荷リポソームは、上記のように作製した。脂質（１０ｍｇ、７．５ｍｇＤＯＴＡＰおよび２．５ｍｇコレステロール）を様々な量のカルボキシル化酸化鉄（２００μｇ、４００μｇ、１ｍｇ、または１．５ｍｇ）とともにコロロフォームに再水和して、最終酸化鉄含有量が０．５μｇ／ｕＬ、１μｇ／ｕＬ、２．５μｇ／ｕＬまたは３．７５μｇ／ｕＬの粒子を得た。これらの粒子に、Ｃｙ５標識ＧＦＰ  ＲＮＡを負荷し、ＤＣ２．４をトランスフェクトするのに使用した。２４時間でのフローサイトメトリーは、酸化鉄含有量が増加すると、トランスフェクション効率を増加することを示した（図７Ｉ）。この増強は、どの細胞タイプについても今まで報告されたことはなく、この観察結果は、細胞、例えば、ＤＣのトランスフェクションを増強するための酸化鉄負荷リポソームの新規の用途を支持し得る。
【０１０２】
実施例５
この実施例は、磁性リポソームに対する磁場の効果を示している。
【０１０３】
磁性リポソームがＲＮＡを細胞に送達する能力に対する、１０１ｍＴの磁場の効果を試験した。実施例１に記載のように、いずれか０％または２５％のコレステロールを有する磁性リポソームに、ＧＦＰ  ＲＮＡを負荷した。ＧＦＰ  ＲＮＡを負荷した磁性リポソームを、磁場の存在下または不在下で、ＤＣ２．４樹状細胞と３０分間インキュベートした。１セットの細胞では、ＭａｇｎｅＦｅｃｔ−Ｎａｎｏ  ＩＩ  ２４ウェルマグネットアレイによって生成された磁場の不在下で、ＲＮＡ負荷磁性リポソームを、ＤＣ２．４樹状細胞と一晩インキュベートした。３０分後、粒子を含有する培地を除去し、新鮮な培地と交換した。遺伝子送達は、２４時間でのフローサイトメトリーにより、ＧＦＰの発現として評価された。図８Ａに示すように、ＧＦＰ＋ＤＣの数は、磁場が存在しない場合と比較して、磁場が存在する場合の方がより多かった。これらのデータは、磁場を使用してＤＣへのＲＮＡ送達を増強できることを支持する。
【０１０４】
１０ｍｇの脂質あたり、様々な量の酸化鉄（０μｇ、１０μｇ、１００μｇ１０００μｇ）で合成されたコレステロール負荷磁性リポソームに、Ｃｙ５標識ＧＦＰ  ＲＮＡを負荷した。次いで、ＲＮＡを負荷した磁性リポソームを使用して、静磁場の存在下で、ＤＣ２．４樹状細胞を３０分間トランスフェクトした。図８Ｂに示すように、リポソーム内の酸化鉄の存在は、用量依存的に％ＧＦＰ＋ＤＣを増加させた。最小量のＩＯは、％ＧＦＰ＋ＤＣにおいて２倍の差をもたらし、最大量のＩＯは、％トランスフェクト細胞において５倍の増加をもたらした。これらのデータは、酸化鉄含有量が、磁場への応答性と、それに続く樹状細胞のトランスフェクションとを、増強することを支持する。
【０１０５】
磁性リポソーム（１０ｍｇの脂質あたり１ｍｇのＩＯ）に、Ｃｙ３標識ＲＮＡを負荷し、続いて磁場の存在下または不在下でＤＣ２．４樹状細胞と３０分間、または磁場の不在下で一晩インキュベートした。ＧＦＰ＋細胞の％を決定するために、磁気曝露の２４時間後に、フローサイトメトリーを行った。図８Ｃに示すように、％ＧＦＰ＋細胞は、磁場の不在下で、ＩＯ不含リポソームに一晩（１８時間）曝露した細胞で最も高かった。ただし、リポソームがＩＯを含み、ＲＮＡと細胞のインキュベーション期間中に磁場にさらされた場合、同じレベルのトランスフェクションは、ごく一部の時間（３０分）でしか得られなかった。これらの結果は、磁性リポソームのトランスフェクション効率が、磁場の存在下で６倍高かったことを示唆している。カチオン性リポソームとの一晩のインキュベーションは、細胞毒性と関連していることから、時間の大幅な短縮（３０分対１８時間）は重要である。したがって、ＲＮＡと細胞のインキュベーション時間を９５％超短縮することで、患者一人あたりで産生されるトランスフェクトされた細胞の数が増加するものと考えられる。
【０１０６】
細胞内の酸化鉄の存在は、磁場で細胞を操作するさらなる機会を提供する。この手法の１つの用途は、酸化鉄ナノ粒子を取り込んだ細胞と、取り込んでいない細胞とを区別することである。この用途を試験するために、上に記載のように、ＢＭＤＣを、ＲＮＡ負荷マグネトリポソームと一晩インキュベートした。１８時間後、ＤＣをエッペンドルフチューブに移し、３７℃で３０分間磁気分離器に置いた。図８Ｄに見られるように、ＢＭＤＣの目に見える塊が、磁場強度が最大であるエッペンドルフチューブの側面に引き付けられた。
【０１０７】
初代骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）は、臨床研究で使用される患者由来樹状細胞よりも代表的である。ある研究では、磁性リポソームを使用した細胞トランスフェクション効率に対する磁場の効果を、初代ＢＭＤＣを使用して試験した。１ｍｇのＩＯ（１０質量％）を有するまたは有さない、３：１のＤＯＴＡＰ：コレステロール比でＤＯＴＡＰおよびコレステロールを含むリポソームに、Ｃｙ５標識ＧＦＰ  ＲＮＡを負荷した。次いで、ＲＮＡ負荷リポソームを、初代ＢＭＤＣとともに、磁場の存在下または不在下で３０分間、または磁場の不在下で一晩インキュベートした。図８Ｅに示すように、細胞を磁場の存在下でＲＮＡとインキュベートした場合、標識されたＢＭＤＣの割合がより高かった。フローサイトメトリーによって評価されたＧＦＰ発現、および、図８Ｆに示すように、静的磁石の存在下でＩＯを含むリポソームでトランスフェクトされた初代ＢＭＤＣ細胞は、ＩＯを欠くリポソームまたはＩＯを含むが磁石の不在下でインキュベートされたリポソームでトランスフェクトされた細胞と比較して、％ＧＦＰ＋細胞がほぼ２倍の増加をもたらした。これらの結果は、磁場の存在下での酸化鉄負荷ナノ粒子を３０分間インキュベーションした場合、その磁場の不在下で一晩インキュベーションした場合と比較して、トランスフェクション効率で１００％の増加が十分に達成されることを示している。
【０１０８】
実施例６
この実施例は、ＲＮＡ負荷磁性リポソームが、ＤＣの活性化とリンパ節への遊走を刺激することを示している。
【０１０９】
樹状細胞は、抗ウイルス性免疫応答の重要な要素である。これらの細胞の主な役割の１つは、ウイルス感染の特徴である外来核酸の感受に応答してＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−β）を産生することである。これらの抗原経験（ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄ）ＤＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞にウイルス抗原を提示する。共刺激分子の存在下でＤＣ上の抗原に結合するＴ細胞は、刺激されてＩＦＮ−γを放出する。図９Ａに、これらの経路の図を示す。
【０１１０】
これらのサイトカイン刺激経路を考慮して、２４ウェルプレートに、１．３３μｇのＲＮＡ：２５μｇのリポソーム：２００，０００個の細胞の比率で、ＧＦＰ  ＲＮＡが負荷されたリポソーム（ＧＦＰ  ｍＲＮＡ＋ＮＰ）とインキュベートしたＤＣ、ＧＦＰ  ＲＮＡでエレクトロポレーションしたＤＣ（エレクトロ）、ＲＮＡが負荷されていないリポソームとインキュベートしたＤＣ、および未処置のＤＣ、によるＩＦＮ−αの放出を測定した。インキュベーションを開始して２０時間後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡで、ＩＦＮ−αの産生を分析した。図９Ｂに示すように、ＩＦＮ−αのレベルは、ＤＣを、ＧＦＰ−ＲＮＡ負荷リポソームとインキュベートしたときに最も高くなった。磁性リポソームで得られたＩＦＮ−α産生のこの増加は、同様のワクチン接種モデルで抗腫瘍免疫応答に不可欠であることが示されているように、臨床上で関連性がある。
【０１１１】
ＲＮＡ−ＮＰ負荷ＤＣのＴ細胞刺激能力を試験するために、オボアルブミン特異的ＯＴ１トランスジェニックＴ細胞を、オボアルブミンＲＮＡを有する磁性リポソームを負荷したＢＭＤＣとインキュベートした。４８時間後に上清を除去し、ＥＬＩＳＡを実行して、これらの細胞からのＩＦＮ−γの放出を評価した。図９Ｃに示すように、磁性リポソームを負荷したＢＭＤＣは、Ｔ細胞の活性化を誘導した。
【０１１２】
膠芽腫を有するヒトにおける以前の研究は、ＲＮＡがパルスされた樹状細胞のリンパ節への遊走が、良好な免疫化と直接相関することを示している（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５１９：３６６−３６９（２０１５））。したがって、現在の至適基準であるＤＣトランスフェクション技術（エレクトロポレーション）と比較して、樹状細胞の遊走能力に対する磁性リポソームの効果を評価しようとした。ナイーブＯＴ１（１８時間の時点）またはＣ５７Ｂｌ６マウス（４８時間および７２時間の時点）は、エレクトロポレーションまたは磁性リポソーム（反対側に）を介して、ＯＶＡ  ＲＮＡ（１８時間）またはＣｙ３標識ＧＦＰ  ＲＮＡ（４８時間および７２時間）が負荷されたＤｓＲｅｄＤＣの皮内注射を受けた。両側のリンパ節を１８、４８、または７２時間で採取し、コラゲナーゼで解離した。次いで、フローサイトメトリーを実行して、各動物の各リンパ節に遊走した細胞の数を定量化した。図９Ｄに示すように、磁性リポソームが負荷された樹状細胞は、ＤＣにＲＮＡをエレクトロポレーションした場合のリンパ節（ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ、ＬＮ）へのＤＣ遊走と比較して、ＬＮへの遊走が、２日目で８０％超、３日目で２５％超、増強された。この増強された遊走能力は、マグネトリポソームが負荷されたＤＣが、エレクトロポレーションされたＤＣとは根本的に異なり、抗腫瘍免疫応答に対して特有の利点を提供できることを示唆している。
【０１１３】
この実施例は、磁性リポソームが、ＤＣ活性化を増強できることを示した。
【０１１４】
実施例７
この実施例は、磁性リポソームが、ＭＲＩに基づく細胞追跡を可能にすることを示している。
【０１１５】
マグネトリポソームにＯＶＡ  ＲＮＡを負荷し、ＢＭＤＣとインキュベートした。次いで、これらのＤＣを、Ｃ５７Ｂｌ６マウスの左鼠径部に皮内注射した。４８時間後、これらのマウスは、様々なＭＲＩイメージングシーケンスを使用して、１１ＴのＭＲＩでイメージングされた。これらのシーケンスには、Ｔ２＊強調シーケンス：繰り返し時間（ＴＲ）／エコー時間（ＴＥ）比が、脂肪飽和がある場合とない場合で９０／３、脂肪飽和がある場合で３５００／１２、脂肪飽和がある場合で２０７／１７、および脂肪がある場合で９０／５、ならびにＴ２  ＲＡＲＥ強調シーケンス：ＴＲ／ＴＥが、脂肪飽和がある場合とない場合で５００／１４、が含まれた。これらの画像シーケンスのすべてのスライスで、リンパ節の周囲に領域が描画された。ＴＲ／ＴＥが２０７／１７であるＴ２＊強調画像、およびイメージングパラメータの各セットのＴ２＿ＲＡＲＥ強調画像における、処置リンパ節と未処置リンパ節との間の強度の変化が、図１０Ａでは、代表的な画像で表示され、図１０Ｂでは、定量化されている。画像とデータは、処置されたリンパ節におけるＴ２＊強調画像のシグナル強度の減少を示すもので、酸化鉄の予想される効果である。
【０１１６】
イメージング後、リンパ節を採取し、ＤｓＲｅｄ＋細胞についてフローサイトメトリーで分析した。次いで、各リンパ節の細胞の数を、脂肪飽和を伴うＴ２＊強調画像における強度の相対変化（図１０Ｃ）、および上記の異なるイメージングシーケンスにわたって未処置リンパ節と比較したリンパ節サイズの平均相対変化（図１０Ｄ）、に対してプロットした。リンパ節サイズの平均増加を決定するとき、各鼠径部リンパ節（処置および未処置）の体積は、各ＭＲＩスライスの各リンパ節周囲の目的の領域を描くことによって見出した。次に、ＩｍａｇｅＪを使用して、これらの各スライスの面積を計算した。これらの領域に、各スライスの幅を乗算して、そのスライスの体積を決定した。次いで、これらの体積は、リンパ節を含有するその画像セット内のすべてのスライスについて合計され、各イメージングシーケンスのＭＲＩ検出リンパ節の体積が生成された。次いで、各シーケンスのリンパ節サイズの相対的な変化は、処置リンパ節の体積を、各シーケンスの反対側の未処置リンパ節の体積で除算することによって見出した。次いで、リンパ節サイズの全体的な平均変化は、上記の７つのイメージングシーケンスにわたって計算されたリンパ節体積のすべての相対変化の平均を取ることによって求めた。
【０１１７】
図１０Ｃおよび１０Ｄに示すように、各リンパ節の酸化鉄負荷樹状細胞の数と、Ｔ２＊強調ＭＲＩ画像の強度（１０Ｃ）およびリンパ節サイズ（１０Ｄ）との間には、明らかな定量的関係があった。相関関係は、驚くほど信頼できるように見えた。リンパ節への樹状細胞の遊走を定量化する以前の試みでは、シグナル対ノイズ比の比較的複雑な計算または「ボイドボリューム」内の強度の比較が必要であった（ｄｅ  Ｃｈｉｃｋｅｒａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；２４（１）：２９−４１．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｉｎｔｉｍｍ／ｄｘｒ０９５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２２１９０５７６、およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２７４（１）：１９２−２００  ｄｏｉ：１０．１１４８／ｒａｄｉｏｌ．１４１３２１７２）。
【０１１８】
Ｔ２＊強調ＭＲＩ強度とリンパ節サイズの両方が、流入領域リンパ節であるワクチン接種部位におけるマグネトリポソーム負荷樹状細胞の数と、直接相関しているという知見は、比較的未熟な観察者が非常に単純な分析技術を用いてワクチン接種戦略の成功率を評価できることから、著しい進歩である。さらに、他には樹状細胞の遊走とＭＲＩ出力との間の関係が示されているが、ＤＣに抗原を送達し、それらのＤＣを活性化し、ＭＲＩに基づくこれらの細胞の追跡を可能にし得る多機能粒子を利用したものはない。したがって、本明細書に記載の磁性リポソームは、（１）ＲＮＡを高効率でＤＣに送達し、（２）ＤＣを活性化してＩＦＮαを放出させ、（３）外部磁場の適用によりトランスフェクション効率の増強を可能にし、（４）リンパ節への樹状細胞の遊走を半定量的に評価するためにＭＲＩシグナルに十分な変化を生成する、能力を有する最初の多機能粒子である。線形回帰を使用して最適な線を生成し、ピアソンの相関を使用して、適合度を計算した。ここでは、カウントされた細胞とＭＲＩ強度との間の関係を評価するｐ値として表示している。
【０１１９】
実施例８
この実施例は、ＭＲＩで検出されたＤＣの遊走が、腫瘍増殖の抑制を予測することを示している。
【０１２０】
Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、０日目に１，０００，０００個の細胞の皮下投与を介して、Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍を投与した。同日、マウスは、オボアルブミン（ＯＶＡ）をコードするＲＮＡを有する５００，０００個の骨髄由来樹状細胞を、２，０００，０００個の細胞ごとに１０ｕｇのＲＮＡに対して１５０μｇの磁性リポソームの比率で皮内注射を受け、および１０，０００，０００個のＯＴ１  Ｔ細胞を静脈内注射を受けた。２日後、実施例７に記載の６つのＭＲＩシーケンスの特有なセットを使用して、マウスを１１Ｔ  ＭＲＩで画像化した。
【０１２１】
最初の実験では、腫瘍を有するＣ５７Ｂｌ６マウスを、上記のように処置するか、処置せずに放置した。腫瘍増殖を２０日以上測定し、その結果を図１１Ａに示す。この図に示すように、腫瘍サイズは、未処置マウスと比較して、ＯＶＡ  ＲＮＡを含む磁性リポソームを負荷したＢＭＤＣで処置されたマウスの方がかなり小さかった。
【０１２２】
２番目の実験では、腫瘍を有するＣ５７Ｂｌ６マウスを、上記のように処置し、腫瘍増殖を３０日間測定した（図１１Ｂ）。腫瘍が急速に増殖したマウスのサブセットを「非応答者」に指定し、腫瘍が増殖しなかったサブセットを「応答者」に指定した。図１１Ｃに示すように、応答者と非応答者は、２７日目に有意に異なる腫瘍体積を示した。図１１Ｄは、これらのマウスの２日目のＭＲＩシーケンスの分析を示している。図１１Ｄに示すように、ＭＲＩシーケンスは、２つのグループ間で、Ｔ２＊脂肪抑制画像強度に有意差があることを示している。この分析に使用したＴ２＊脂肪抑制シーケンスは一意である。理論的に類似した他の６つのシーケンスを評価したが、２日目のＭＲＩ強度と腫瘍増殖との間に定量的な関係を提供するものはなかった。例えば、図１１Ｅを参照されたい。２７日目の腫瘍体積を、２日目のＭＲＩ強度に対してプロットすると、有意な線形関係が示された。これを、図１１Ｆに示す。
【０１２３】
これらのデータは、磁性リポソームが、処置２日後の樹状細胞遊走のＭＲＩに基づく検出を可能にし、処置４週間後にどのマウスが処置に応答するのかを正確に予測することを示唆している。これは、多機能粒子による腫瘍増殖の抑制とＭＲＩ強度との相関関係の最初の実証である。ＭＲＩの予測効果は、他の１つのグループによってのみ示されている（Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｌｉ  Ｗ，Ｐｒｏｃｉｓｓｉ  Ｄ，Ｌｉ  Ｋ，Ｓｈｅｕ  ＡＹ，Ｇｏｒｄｏｎ  ＡＣ，Ｇｕｏ  Ｙ，Ｋｈａｚａｉｅ  Ｋ，Ｈｕａｎ  Ｙ，Ｈａｎ  Ｇ，Ｌａｒｓｏｎ  ＡＣ．Ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ：ＭＲ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｏｄｅｌ．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ．２０１５；２７４（１）：１９２−２００．ｄｏｉ：１０．１１４８／ｒａｄｉｏｌ．１４１３２１７２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２５２２２０６６；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４３１４１１７）。ただし、このグループは、前後の画像のシグナル対ノイズ比に依存する、あまり直接的なアプローチを使用していなかった。このグループも、多機能粒子を使用していなかった。本明細書に記載の単純化された方法は、単純だが特有のＭＲＩシーケンスを使用して、同じ動物のワクチン未接種のリンパ節に対する定量化および比較を可能にする。
【０１２４】
実施例９
この実施例は、本開示の磁性リポソームを含むＤＣワクチンでヒト患者を治療する方法、および治療に対する応答を予測する方法を実証する。
【０１２５】
酸化鉄を負荷した磁性リポソームは、実施例７Ｂに本質的に記載されているように作製される。癌患者から腫瘍を切除し、腫瘍細胞からＲＮＡを単離する。次いで、ＲＮＡを、ｃＤＮＡライブラリへの逆転写、ＰＣＲを用いたそのｃＤＮＡライブラリへの増幅、およびインビトロ転写、を介して増幅し、実施例８に本質的に記載されるように、磁性リポソームに負荷した。別の実施形態では、特定の腫瘍関連抗原をコードするＲＮＡを生成し、実施例８に本質的に記載されるように、磁性リポソームに負荷した。白血球は、白血球アフェレーシスを介して、同じ癌患者から分離した。ＷＢＣを、ＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦで処置すると、樹状細胞を生成する。ＤＣは、実施例８に本質的に記載されるように、ＲＮＡとともに調製された磁性リポソームが負荷される。ＲＮＡを有する磁性リポソームを含む約２ｘ１０７個の樹状細胞が、患者の鼠径部に皮内注射される。エコー時間が５ミリ秒のＴ２＊強調画像を含む様々なＭＲＩ画像は、ワクチン接種の直前、およびワクチン接種の２４、４８、および７２時間後に撮影される。
【０１２６】
治療の前後に得られたＭＲＩを使用して、各患者のリンパ節サイズとＴ２＊強調リンパ節強度の変化を決定する。次に、実施例８に記載されるように、ＩｍａｇｅＪで処理するために、各鼠径部リンパ節周囲の目的の領域が描画される。簡単には、７つのイメージングシーケンスにわたる平均リンパ節体積と、処置後１、２、および３日目のＴ２＊強調画像上のリンパ節内の平均強度を、悪性神経膠腫を有する患者の無増悪期間と全生存期間に対してプロットする。次いで、リンパ節のサイズまたは低強度と、無増悪期間または全生存期間との間の強い相関を使用して、ワクチン接種から数日以内の治療に対する患者の応答を予測する。
【０１２７】
実施例１０
この実施例は、免疫調節核酸を、末梢および悪性脳腫瘍内の免疫細胞に送達する方法を示している。
【０１２８】
悪性脳腫瘍を有する患者は、原発腫瘍部位の外科的切除または生検を受ける。その腫瘍由来のＲＮＡは、実施例９に記載されるように、単離および増幅される。腫瘍抗原をコードする増幅されたｍＲＮＡは、２５ｕｇのＲＮＡ：３７５ｕｇのリポソームの比率で、約７５％ＤＯＴＡＰと２５％コレステロールで構成されたリポソームに結合する。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍関連抗原に特異的なｍＲＮＡを含み、任意選択的に、サイトメガロウイルス抗原ｐｐ６５を含む。別の実施形態では、ＲＮＡは、免疫調節タンパク質、例えば、ＣＤ８６のような共刺激分子、ＣＣＬ３のような走化性因子、または顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような活性化サイトカインをコードするｍＲＮＡを含む。別の実施形態では、ＲＮＡは、トランスフェクトされた細胞の免疫機能を調節するように設計されたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ送達の免疫調節標的の例は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）である。別の実施形態では、ＲＮＡは、免疫機能を活性化または阻害するのに有用な他の核酸を含む。別の実施形態では、ＲＮＡは、併用療法において上記に列挙されたＲＮＡ構築物のうちの２つ以上を含む。例えば、腫瘍に由来するｍＲＮＡは、ＰＤＬ１のｓｉＲＮＡの有無を問わずｐｐ６５ｍＲＮＡと組み合わされる。別の実施形態では、リポソームは、１０ｍｇの脂質あたり１ｍｇの酸化鉄を含む。次いで、これらのリポソームを、定期的に患者に静脈内注射する。一実施形態では、この間隔は、６回の注射の場合は週に２回、さらに６回の注射の場合は月に２回、または疾患が進行するまでである。別の実施形態では、患者は、連続的なワクチンで異なるＲＮＡ構築物を受容する。例えば、患者は、腫瘍由来のｍＲＮＡを負荷したリポソームを３週間受容し、次いで、腫瘍由来のｍＲＮＡとＰＤＬ１  ｓｉＲＮＡを隔月で６回注射する。
【０１２９】
酸化鉄を含有するリポソームでワクチン接種された患者の場合、ワクチン接種前と接種２４時間後に、Ｔ２＊強調ＭＲＩシーケンスが取得される。ワクチン接種前後のＭＲＩ強度の変化を、無増悪期間と全生存期間に対してプロットして、ＭＲＩで検出された脳腫瘍への粒子の局在が、治療に対する患者の応答と相関するかどうかを評価する。
【０１３０】
実施例１１
この実施例は、粒子の局在化に対する脂質組成の効果とＲＮＡが負荷された細胞の特徴付けを示している。
【０１３１】
本発明者らは、以前、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを負荷したカチオン性リポソーム（ＲＮＡ−ＮＰ）が、黒色腫の前臨床モデルで皮下および頭蓋内腫瘍を排除するのに十分な、末梢器官で強力な免疫活性化を誘導したことを報告した９，１０。しかし、これらの粒子は、正電荷のために主として肺に蓄積する（図２４）９。この肺への取り込みを回避するために、リポソーム表面の正電荷の濃縮を減少させる試みとして、コレステロールを含むように脂質組成を修飾した。この修飾は、肺と脾臓への粒子の局在を変えることはできなかったが、肝臓へのＲＮＡ−ＮＰの局在を増加させた（図２３）。次いで、頭蓋内ＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼ、放射線療法、化学療法、およびチェックポイント阻害剤耐性マウス神経膠腫株を用いて、マウスにおける粒子の局在を試験した。驚くべきことに、リポソームの注射２４時間後の免疫蛍光顕微鏡法で、これらの修飾リポソームは、脳腫瘍に蓄積したが、周囲の正常な皮質には蓄積しなかったことが明らかになった（図１２Ａ）。しかし、コレステロールを含まないリポソームは、いずれの領域にも蓄積しなかった。
【０１３２】
この結果に興味を抱き、この観察を繰り返し、動物のより大きなコホートで、フローサイトメトリーを使用して、ＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼとＧＬ２６１における粒子の取り込みを定量化した。本発明者らは、コレステロールの存在で、両方の腫瘍においてリポソームの取り込みが増強され（図１２Ｂ〜Ｃ）、この効果が、２５質量％のコレステロール濃度で、最も顕著であることを発見した（図１２Ｄ）。まとめると、この証拠は、コレステロールを有するリポソームが、免疫調節核酸を、脳腫瘍に誘導するための単純なツールであり得ることを示している。
【０１３３】
本発明者らは、次いで、脳腫瘍でＲＮＡが負荷された細胞の特徴付けをしようとした。リポソームは、正常な脳ではなく腫瘍にのみ蓄積するため、腫瘍関連の血管内皮に浸潤している可能性があると仮定した。ＲＮＡが負荷された細胞は、脳腫瘍の内皮の近くにロアライズしたが、免疫蛍光顕微鏡法とフローサイトメトリーの両方で、これらの細胞がＣＤ３１を欠いていることが示された（図２Ａ）。しかし、約５０％のＣＤ４５＋であったバルク腫瘍とは対照的に、ＧＬ２６１とＫＲ１５８ｂの両方のＲＮＡ標識細胞は、ほぼ１００％がＣＤ４５＋であった（図１３Ｂ、Ｃ）。さらに、ＫＲ１５８ｂおよびＧＬ２６１におけるＲＮＡ標識ＣＤ４５＋細胞は、不均衡に、Ｆ４／８０＋、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｂ＋、およびＬｙ６Ｇ／６Ｃ＋であった（図１３Ｄ〜Ｇ）。この興味深い結果は、Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）で構成される脳腫瘍微小環境中の抗原提示細胞に、核酸を直接送達していることを示唆している。
【０１３４】
実施例１２
この実施例は、ＲＮＡが負荷された細胞に対するＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰの効果を実証する。
【０１３５】
ＴＡＭは、抗腫瘍免疫応答を抑制することが知られているが、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の発現増加を特徴とする抗腫瘍表現型へと再プログラムすることができる（６，１１）。本発明者らは、ＲＮＡ−ＮＰが末梢器官の自然免疫細胞を活性化することを以前に示したので、次に、これらのリポソームが、脳腫瘍微小環境中のＴＡＭも活性化できるかどうかを評価した。本発明者らは、再びリポソームに蛍光標識ｍＲＮＡを負荷し、これらをマウスに全身的に注射した。本発明者らは、２４時間後、Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰを取り込んだＦ４／８０＋細胞が、ＭＨＣＩＩの発現を有意に上方制御することを見出した（図１４Ａ）。さらに、本発明者らは、これらのＣｙ５標識ＭＨＣＩＩ＋細胞も、高レベルのＣＤ８０およびＣＤ８６を発現していることを見出した（図１４Ｂ、Ｃ）。興味深いことに、本発明者らはまた、ＲＮＡを含有しないバルク集団中のＴＡＭでのＣＤ８０の増加を見出した。
【０１３６】
実施例１３
この実施例は、Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰによるＰＤＬ１  ｓｉＲＮＡの送達を示している。
【０１３７】
この仮説を試験するために、Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰを細胞特異的チェックポイント遮断剤と組み合わせようとした。最初に、公開された文献から抗ＰＤＬ１  ｓｉＲＮＡのライブラリを生成し、トランスフェクション効率を損なうことなく、トランスフェクション後２、３、および４日目のＤＣにおけるＰＤＬ１の発現を抑制する能力についてスクリーニングした。このスクリーニングを通して、ＧＦＰ発現を減少させることなく、ＰＤＬ１の発現を有意に減少させるｓｉＲＮＡ種（ｓｉＰＤＬ１）を同定した（図２４）。
【０１３８】
次いで、Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、このｓｉＲＮＡを頭蓋内脳腫瘍に送達できるかどうかを試験した。ｍＲＮＡを送達する我々の結果を支持するように、Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰが、頭蓋内腫瘍中のＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋細胞へのＣｙ３標識ｓｉＲＮＡの送達を有意に増加させることを、本発明者らは見出した（図１５Ａ〜Ｃ）。ｍＲＮＡが負荷された細胞と同様に、これらの細胞の多くは、ＡＰＣマーカーＭＨＣＩＩ、Ｆ４／８０、およびＣＤ１１ｂを発現していた（図１５Ｄ〜Ｆ）。
【０１３９】
本発明者らは、次いで、これらの細胞でのＰＤＬ１発現について染色することによって、Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰにより送達されたｓｉＲＮＡが、機能的に活性であるかどうかを試験した。これらの実験では、対照として非コードｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＴＲＬ）を利用した。ｓｉＰＤＬ１を有するＣｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰの単回注射で、未処置腫瘍中の細胞、および処置腫瘍のバルク（ｂｕｌｋ、大部分）の細胞と比較して、ｓｉＲＮＡを負荷した抗原提示細胞でのＰＤＬ１発現が減少していることがわかった（図１５Ｇ〜Ｉ）。本発明者らは、次いで、この効果が、追加の投与で拡大され得ることを実証した。本発明者らは、Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰを介したｓｉＰＤＬ１の１日３回の投与は、未処置細胞（未処置：６０．０６＋／−２２．２４、Ｃｙ５＋ｓｉＰＤＬ１：１６．７＋／−１９．２３、ｐ＝０．０２５５）、腫瘍におけるバルクの細胞（バルク：４５．８２＋／−１７．０４、Ｃｙ５＋ｓｉＰＤＬ１：１６．７＋／−１９．２３、ｐ＝０．０４７）、および対照ｓｉＲＮＡで処置された細胞（ＣＴＲＬ：７７．１４＋／−２８、Ｃｙ５＋ｓｉＰＤＬ１：１６．７＋／−１９．２３、ｐ＝０．００８１）と比較して、トランスフェクトされたＭＤＳＣでのＰＤＬ１発現を、劇的に減少させることがわかった（図１５Ｊ）。まとめると、この証拠は、Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰを使用して、腫瘍内免疫細胞を活性化し、免疫調節核酸で細胞の挙動を改変できることを示している（図１５Ｋ）。
【０１４０】
実施例１４
この実施例は、実施例１１〜１３の実験で使用された材料と方法を示している。
【０１４１】
ＲＮＡの調製と標識：ＧＦＰとＯＶＡのｍＲＮＡは、前述のように、インビトロ転写を介して生成した１２。ＰＤＬ１とＣＴＲＬのｓｉＲＮＡは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。核酸のラベリングは、製造元の説明書（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って、Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｔｕｒｂｏ  ＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔｓを使用して完了した。
【０１４２】
細胞培養：ＤＣ２．４とＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼは、デューク大学のＪｏｈｎ  Ｓａｍｐｓｏｎ氏からの好意的な寄贈による１３。ＧＬ２６１は、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。ＤＣ２．４とＫＲ１５８ｂ−ルシフェラーゼは、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したピルビン酸を含む高グルコースＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。ＧＬ２６１は、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ＦＢＳ、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２で培養した。
【０１４３】
ＲＮＡ−ＮＰの合成：（１）リポソームの合成：リポソームは、以前に記載されているように調製した１２。簡単には、脱水したＤＯＴＡＰおよびコレステロール７０００００Ｐ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）をクロロホルムに懸濁し、ＤＯＴＡＰ：コレステロール比が、４：０、３．５：０．５、３：１、または２．５：１．５で混合した。次に、クロロホルムを、窒素の存在下で蒸発させた。次いで、脂質ケーキを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２．５ｍｇ／ｍＬの濃度にし、１０分ごとにボルテックスしながら１時間、５０℃で加熱し、室温で一晩放置した。次いで、脂質を、５分間超音波処理し、４５０および２００ｎｍフィルター（それぞれＷｈａｔｍａｎおよびＰＡＬＬ）で濾過した。（２）ＲＮＡ−ＮＰ複合体の形成：Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ−ＮＰは、ＲＮＡ−ＮＰについて前述のように調製した１２。簡単には、３７５ｕｇの脂質を、マウスあたり２５ｕｇのｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと組み合わせ、注射の前に１５分間インキュベートした。
【０１４４】
インビトロトランスフェクション：ＤＣ２．４を、２４ウェルプレートに、ウェルあたり１００，０００細胞でプレーティングした。２４時間後、ＲＮＡ−ＮＰを、ウェルあたり１．６６７ｕｇのｍＲＮＡで、ウェルに加えた。トランスフェクションは、２４、４８、７２、および９６時間にフローサイトメトリーで評価した。
【０１４５】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。動物処置は、フロリダ大学の動物実験委員会（ＵＦＩＡＣＵＣ２０１６０７９６６）によって承認された。
【０１４６】
フローサイトメトリー分析：フローサイトメトリーは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの抗体を使用して、ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ−ＩＩを使用して行った。インビトロ実験では、ＤＣを回収し、ＰＢＳで洗浄し、２０分間染色した。次いで、試料を、ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に懸濁した。細胞カウントと生存率は、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で評価した。インビボ実験については、リンパ節を、冷ＰＢＳに採取し、かみそりの刃でさいの目に切り、パパインで３７℃で２０分間消化した後、７０μｍセルストレーナーで濾過し、ＰＢＳで洗浄し、適切な抗体で２０分間染色した。フロー分析の直前に、カウントビーズを各チューブに加えた。
【０１４７】
免疫蛍光法：頭蓋内脳腫瘍を有するマウスを犠牲にし、蛍光標識ＲＮＡ−ＮＰを注射して２４時間後に、ＰＢＳと４％ホルマリンで灌流した。次に、脳を採取し、４％ホルマリンで固定し、４％ショ糖溶液に一晩移し、ＰＢＳに保存した。ＬｅｉｃａＲＭ２２３５ミクロトームでスライスを完成させた。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０倒立型蛍光顕微鏡で、画像を撮影した。
【０１４８】
統計分析：データは、平均±標準偏差として表されている。スチューデントのｔ検定が、統計分析に使用されている。対応のあるｔ検定は、対応のあるデータに使用されている。分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン８を使用して行った。
引用文献：以下の参考文献は、実施例１１〜１４の全体を通して引用されている。（１）Ｈｉｌｆ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｖｅｌｙ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ  ｆｏｒ  ｎｅｗｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ  ５６５，２４０−２４５（２０１９）；（２）Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｔ．Ｎ．＆  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８，６９−７４（２０１５）；（３）Ｇｒｏｂｎｅｒ，Ｓ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５５５，３２１−３２７（２０１８）；（４）Ｃｈａｒｌｅｓ，Ｎ．Ａ．，Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｅ．Ｃ．，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ，Ｒ．，Ｇｌａｓｓ，Ｒ．＆  Ｋｅｔｔｅｎｍａｎｎ，Ｈ．Ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｇｌｉａ  ５９，１１６９−１１８０（２０１１）；（５）Ｌｅｗｉｓ，Ｃ．Ｅ．＆  Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｗ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６，６０５−６１２（２００６）；（６）Ｐｏｏｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｓａｒｋａｒ，Ｓ．，Ｙｏｎｇ，Ｖ．Ｗ．＆  Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．Ｐ．Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．Ｂｒａｉｎ  １４０，１５４８−１５６０（２０１７）；（７）Ｍｏｒａｎｔｚ，Ｒ．Ａ．，Ｗｏｏｄ，Ｇ．Ｗ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｍ．，Ｃｌａｒｋ，Ｍ．＆  Ｇｏｌｌａｈｏｎ，Ｋ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｐａｒｔ  ２：ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ５０，３０５−３１１（１９７９）；（８）Ａｂｂｏｔｔ，Ｎ．Ｊ．，Ｒｏｎｎｂａｃｋ，Ｌ．＆  Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｅ．Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ７，４１−５３（２００６）；（９）Ｓａｙｏｕｒ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ＲＮＡ−ｌｏａｄｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，ｅ１２５６５２７（２０１７）；（１０）Ｓａｙｏｕｒ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｔｕｍｏｒ  ＲＮＡ  Ｌｏａｄｅｄ  Ｌｉｐｉｄ−Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｐｒｉｍｅ  ｔｈｅ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｍｉｌｉｅｕ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ（２０１８）；（１１）Ｍ��ｓｓｅｒ，Ｄ．Ｍ．＆  Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊ．Ｐ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８，９５８−９６９（２００８）；（１２）Ｓａｙｏｕｒ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ＲＮＡ−ｌｏａｄｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，００−００（２０１６）；（１３）Ｓｈｅｎ，Ｚ．，Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｇ．，Ｄｒａｎｏｆｆ，Ｇ．＆  Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．Ｃｌｏｎｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｂｏｔｈ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８，２７２３−２７３０（１９９７）．
【０１４９】
実施例１５
この実施例は、樹状細胞（ＤＣ）を活性化する磁性ナノ粒子が、ＭＲＩによる抗腫瘍応答の早期予測を可能にすることを示している。
【０１５０】
要約：癌ワクチンは、患者のサブセットで、抗腫瘍応答を惹起するが、治療応答を予測するための臨床的に有意義なバイオマーカーの欠如で、それらの開発が制限されている。ここで、本発明者らは、強力な抗腫瘍免疫を開始させ、治療応答の初期のＭＲＩに基づくイメージングバイオマーカーとして機能する、多機能なＲＮＡ負荷磁性リポソームを設計する。これらの粒子は、エレクトロポレーションよりも効果的にＤＣを活性化し、治療モデルにおける腫瘍増殖の優れた阻害をもたらす。酸化鉄の含有で、ＤＣトランスフェクションが増強され、ＭＲＩでＤＣ遊走の追跡が可能になる。本発明者らは、リンパ節でのＴ２＊強調ＭＲＩの低強度は、ＤＣの輸送と強く相関し、抗腫瘍応答の早期予測因子であることを示す。前臨床腫瘍モデルでは、ワクチン接種の２日後に特定されたＭＲＩ予測の「応答者」は、治療後２〜５週間で有意により小さい腫瘍を有し、ＭＲＩ予測の「非応答者」よりも１００％長く延命した。したがって、これらの研究は、強力な抗腫瘍免疫応答を生成し、ＭＲＩによる個々の治療結果を予測するためのシンプルで拡張可能なナノ粒子製剤を提供する。
【０１５１】
癌免疫療法は、従来の治療が何ら利益ももたらさない状況で、印象的な腫瘍退縮をもたらした１。しかし、最も効果的な免疫療法戦略でさえ、患者のほんのサブセットの生存を延長する２〜６。複数の治療前バイオマーカーは免疫療法に対して感受性であることが示唆されているが、現在、臨床応答を予測する強力なマーカーは存在しない７〜９。有望な癌免疫療法の将来的な開発には、腫瘍が進行する前に、応答患者と非応答患者を区別するための動的バイオマーカーが必要になる９。
【０１５２】
本発明者らは以前、ワクチン接種のわずか２日後のインジウム１１１標識ＤＣのＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングによって評価されたワクチン部位の流入領域リンパ節（ＶＤＬＮ）へのＤＣ遊走が、ＲＮＡパルスＤＣワクチンで治療されたＧＢＭ患者の全生存の初期バイオマーカーを提供する可能性があることを示した１０。しかしながら、ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴの放射性細胞標識は煩雑であり、臨床現場で広く利用できない１１。このバイオマーカーの臨床評価には、追加の細胞処理なしでＤＣ遊走を高感度で追跡するための広く利用可能な方法が必要になる。ＭＲＩは、広く利用可能なイメージング手法であり、ヒトにおいて多数の細胞を定性的に追跡するために使用されているが、リンパ節への細胞遊走のＭＲＩに基づく定量化は依然として困難である１２〜１８。
【０１５３】
さらに、エレクトロポレーションは、臨床試験でＤＣにＲＮＡを送達するために広く使用されているが１０，１９〜２３、エレクトロポレーションの免疫刺激的置換は、治療効果をさらに高める可能性がある。ナノ材料は、非ウイルス性のｍＲＮＡ送達に関して魅力的であるが２４、大規模な臨床グレードの製造が複雑であるため、クリニックに普及するナノ粒子はほとんどない７，２５，２６。ここで、本発明者らは、ＤＣをＲＮＡで効率的にトランスフェクトし、著しいＤＣ活性化を刺激し、ＤＣワクチンに対する抗腫瘍応答のバイオマーカーとして、ＭＲＩ検出ＤＣ遊走を確立する、以前に翻訳された材料に基づく拡張可能な多機能ナノリポソームでこの制限を克服する（図１６）。
【０１５４】
この研究では、最初に、ヒトにおいて証明された安全性プロファイルを有する脂質粒子のライブラリをスクリーニングして、インビトロでのＤＣ活性化に最適化された脂質ナノ粒子製剤を開発する。本発明者らは、次いで、酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）のＴ２ＭＲＩコントラスト増強効果と、これらの免疫刺激性ＲＮＡ負荷カチオン性ナノリポソーム（ＲＮＡ−のＮＰ）を組み合わせる。得られた酸化鉄を負荷したＲＮＡ−ＮＰ（ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ）は、ＲＮＡをＤＣに送達し、それらのＤＣを活性化し、ＭＲＩによる腫瘍退縮の予測を可能にする。本発明者らは、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、エレクトロポレーションと比較して、ＤＣにおける遺伝子発現プロファイルを劇的に変化させ、共刺激マーカーの発現の増加、炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−α）の産生、リンパ節への遊走の促進、をもたらすことを見出した。重要なことに、本発明者らはまた、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介して腫瘍抗原をコードするＲＮＡを負荷したＤＣが、ＲＮＡでエレクトロポレーションされたＤＣでは利益がもたらされない治療モデルにおいて、腫瘍増殖を阻害することも実証する。ＩＯＮＰ負荷ＤＣによる定性的なＭＲＩ変化を実証する以前の研究とは対照的に１３，２７〜２９、本発明者らは、そこで、ＭＲＩで検出されたＤＣ輸送が、マウス腫瘍モデルにおいて、腫瘍増殖の長期阻害と生存を予測することを実証する。ワクチン接種の２日後の処置リンパ節におけるＴ２＊強調ＭＲＩ強度の大幅な減少は、ワクチン接種して２〜５週間後の腫瘍サイズの減少と強く相関し、この変化を有さない処置マウスと比較して、生存期間中央値で１００％の増加を予測する。まとめると、我々の発見は、これらのＤＣ活性化ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、腫瘍増殖の強力な阻害を刺激し、広く利用可能なイメージング手法でＤＣワクチンに対する抗腫瘍応答の早期予測を可能にすることを示している。
【０１５５】
免疫刺激性酸化鉄を負荷したリポソームの設計：本発明者らは、最初に、ｍＲＮＡをＤＣに送達し、ＭＲＩでそれらの動きを追跡するための、単純で翻訳可能な方法を開発しようとした。ＩＯＮＰは、臨床的有用性が証明されているため、魅力的なＭＲＩ造影剤であるが、前臨床現場でのＲＮＡ送達のためにＩＯＮＰを最適化する現在の方法では、ヒトにおいて確かな安全記録がないポリマー（例：ポリエチレンイミン）を利用している。カチオン性リポソームは、単純で拡張可能な合成と、動物およびヒトでの好ましい安全性プロファイルにより、臨床現場でのｍＲＮＡ送達に魅力的な薬剤であるが３０〜３２、臨床評価における現在の脂質ナノ粒子組成物は、インビボでの標的化ｍＲＮＡ送達に最適化されているが、ＤＣの活性化には最適化されていない３０，３２〜３４。さらに、インビトロでのＤＣ活性化のためのカチオン性リポソームを開発する以前の試みは、機能的結果（例えば、トランスフェクトされたＤＣが抗原特異的Ｔ細胞を活性化する能力）の代わりに、活性化マーカーの発現に評価を限定した３５。ここで、本発明者らは、臨床試験で確立された安全性プロファイルを伴う市販の材料を使用して脂質ナノ粒子のライブラリを作製し７、基本的な試験（つまり、トランスフェクション効率、生存率）と機能的な試験の両方を使用して、インビトロで骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）をトランスフェクトし、活性化する、それらの能力を評価した（図２９Ａ）。これを行うために、本発明者らは、ＢＭＤＣトランスフェクション、生存率、共刺激マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０）の発現、およびインビトロでの抗原特異的Ｔ細胞を刺激する能力、に基づくスコアリングシステムを開発した（図２５Ａ〜２５Ｅ）。本発明者らは、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）リポソームに、コレステロールを含めると、マウスＤＣのトランスフェクションと活性化に最も効果的な粒子が生成され、コレステロールを含まないＤＯＴＡＰリポソームよりも、活性化スコアが１８倍高いことを見出した（図２５Ａ〜２５Ｅ）。
【０１５６】
本発明者らは、次いで、市販のＩＯＮＰを、これらのＤＣ活性化カチオン性リポソームに組み込んで、合成の複雑性を著しく増加させることなく、ＭＲＩ追跡を可能にする方法を開発した。本発明者らは、カチオン性リポソームが、正に帯電した内部を持っているため、粒子形成中に負に帯電したＩＯＮＰを加えると、固体酸化鉄コアを有するリポソームを生成することができると考えた。したがって、本発明者らは、カチオン性脂質を様々な濃度のカルボキシル化ＩＯＮＰ（１ｍｇの脂質あたり０、１、１０、１００、または１５０ｕｇのＩＯＮＰ）で再水和し、得られたリポソームをｍＲＮＡとインキュベートして、ＩＯＮＰなし（ＲＮＡ−ＮＰ）またはＩＯＮＰあり（ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ）のＲＮＡリポプレックスを生成した。ＩＯＮＰの含有により、クライオ−ＴＥＭにより、明瞭な脂質二重層とＩＯＮＰの固体コアを有する１００〜３００ｎｍのリポソームが形成された（図１７ａ）。リポソーム内のＩＯＮＰカプセル化と一致して、粒子サイズ（０ｕｇ：２０７．９±６７．２ｎｍ、１００ｕｇ：２０８．７±９２．３ｎｍ）および電荷（０ｕｇ：４４．１±４．５ｍｅＶ、１００ｕｇ：４０．２±７．５８ｍｅＶ）は、ＩＯＮＰ含有量とは関係なく、一致したままであった（図１７ｂ、図２９Ｂ）。しかし、酸化鉄を含む粒子は、実質的な磁気特性を示した（飽和磁化＝２３３９３８Ａ／ｍ）（図１７ｃ）。
【０１５７】
本発明者らは、次いで、ＩＯＮＰの含有が、ＲＮＡの結合と送達を妨げるかどうかを試験した。実験条件下で、すべての粒子は、利用可能なＲＮＡと１００％結合し（脂質：ＲＮＡ比が１５：１）（図１７ｄ）、過剰ＲＮＡの条件では、粒子は、ＩＯＮＰ含有量が増加すると、わずかに高いＲＮＡ結合能力を示した（０ｕｇ：０．３６μｇＲＮＡ／μｇ脂質、１００μｇ：０．５４μｇＲＮＡ／μｇ脂質、ｐ＝０．００１０）（図１７ｅ）。重要なことに、粒子を、ＤＣ３６の不死化細胞株であるＤＣ２．４と一晩インキュベートすると、さらにより多量のＩＯＮＰを含有しても、毒性が増加せず（図１７ｆ）、ＲＮＡ送達が減少しない（図１７ｇ）ことが実証された。まとめると、この証拠は、負に帯電したＩＯＮＰの存在下でカチオン性脂質を再水和すると、ＩＯＮＰの磁気特性とカチオン性リポソームのＲＮＡ結合能力とを備えた、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが生成されることを示唆している。
【０１５８】
ＩＯＮＰは、ＤＣトランスフェクションと活性化を増加させる：次に、ＩＯＮＰが、トランスフェクション効率とＤＣ活性化を阻害しないことを確認しようとした。興味深いことに、蛍光画像とフローサイトメトリーでは、ＤＣの不死化細胞株であるＤＣ２．４（０ｕｇ：１０．６％、１５０ｕｇ：３３．０％、ｐ＝０．０００９；ピアソンｒ＝０．８６９６、ｐ＝０．０５４）（図１８ａ〜ｂ）、および初代ＢＭＤＣ（０ｕｇ：７．０％、１００ｕｇ：９．９％、ｐ＝０．００１）（図１８ｃ）の酸化鉄含有量の増加に伴う、粒子のトランスフェクション効率の用量依存的な増加が明らかになった。しかし、以前にカチオン性リポソームと複合体を形成していなかった非結合ＩＯＮＰを添加しても、利益はもたらされなかった（ＲＮＡ−ＮＰ：７．０％±０．９６、ＲＮＡ−ＮＰｓ＋ＩＯＮＰ：５．８％±０．０５、ｐ＝０．２４４）（図１８ｃ）。これらの結果は、ＩＯＮＰは、トランスフェクション効率を高めるが、リポソーム内に組み込まれた場合のみであることを示唆している。
【０１５９】
本発明者らは、次いで、このトランスフェクションの増加が、ＤＣの活性化と機能の増強を伴っているかどうかを評価した。ＲＮＡ−ＮＰは、炎症性サイトカインＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦで得られる発現を超えて、共刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現をわずかに増加させたが、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰは、ＣＤ８６の発現および両方の分子の共発現をさらに増強した（図２６Ａ〜２６Ｃ）。本発明者らは、ＩＯＮＰがより活性化したＤＣ表現型に寄与するというこの示唆を考慮して、ＤＣ機能に対するＩＯＮＰの影響を評価した。骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）は、オボアルブミン（ＯＶＡ）をコードするｍＲＮＡを有するＲＮＡ−ＮＰまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処理し、ナイーブＯＶＡ特異的ＯＴ１  Ｔ細胞または抗原経験ＯＶＡ  Ｔ細胞とインキュベートした。両方の粒子構築物は、４８時間でのＩＦＮ−γ産生によって測定されるように、大幅なＴ細胞の活性化を誘導したが、ＲＮＡ−ＮＰ内のＩＯＮＰの含有により、抗原経験Ｔ細胞の活性化（ＲＮＡ−ＮＰ  ＤＣ：２６１１．８±６７．０６ｐｇ／ｍＬ、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ  ＤＣ：３６５３．５±２１６．８ｐｇ／ｍＬ、ｐ＝０．００１４）（図１８ｄ）およびナイーブＴ細胞のプライミングが（ＲＮＡ−ＮＰ  ＤＣ：３１９．０±４１．２９ｐｇ／ｍＬ、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ  ＤＣ：８７４．６±２３．９ｐｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０００１）（図１８ｅ）、抗原特異的な様式で、有意に増強された（図２６Ａ〜２６Ｃ）。これらの予想外の結果は、リポソームにＩＯＮＰを含めると、ＢＭＤＣの活性化と抗腫瘍Ｔ細胞応答のプライミングが増強されることを示している。本発明者らは、次に、ＩＯＮＰ媒介ＤＣトランスフェクションが、外部磁場の適用で、さらに増強され得るかどうかを評価した３７，３８。磁場を加えると、リポソーム内のＩＯＮＰの濃度に依存する様式で、ＤＣのトランスフェクション効率が増強され（図１８ｆ）、ＩＯＮＰの最高試験濃度でのトランスフェクション効率を、生存率を損なうことなく、倍増させた（−磁石：５．８±０．７％、＋磁石：１０．３±０．９％、ｐ＝０．００１４）（図１８ｇ〜ｈ）。重要なことに、磁場の影響下で、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰとの３０分間のインキュベーションは、初代ＢＭＤＣとの一晩のインキュベーションと比較して、２倍のトランスフェクション効率をもたらし（一晩：５．５±０．９７％、３０分＋磁石：１０．３±０．８５％、ｐ＝０．００１０）（図１８ｈ）、同等のＴ細胞プライミング能力につながった（一晩：３６５３．５±２１６．８ｐｇ／ｍＬ、３０分＋磁石：３０７０．４±５３６．１ｐｇ／ｍＬ、ｐ＝０．１６）（図１８ｉ）。したがって、磁場を使用して、高レベルのトランスフェクション効率を維持しながら、トランスフェクション時間を大幅に短縮することができる。
【０１６０】
ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰは、エレクトロポレーションよりも効果的にＤＣを活性化する。リポソームを介したＲＮＡ送達は、インビボで強力なＤＣ活性化をもたらすものの７，３０，３１、エレクトロポレーションは、他の非ウイルス性トランスフェクション法と比較して、そのトランスフェクション効率の高さのために（ＢＭＤＣの６０〜８０％）、臨床現場では、エクスビボでＤＣにＲＮＡを送達するための好ましい技術であり続けている１０，１９〜２３，３９，４０。実際、エレクトロポレーションは、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰよりも高い割合のＢＭＤＣをトランスフェクトした（エレクトロポレーション：８１．１％、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ：１７．７３３％、ｐ＜０．０００１）（図１９ａ）。しかし、エレクトロポレーションは、エンドソームおよびファゴリソソームでの天然の抗原プロセシングを回避することにより、ＤＣ活性化に寄与するパターン認識受容体を迂回する４１〜４３。これらのトランスフェクション法における明らかな違いは、Ｃｙ３標識ＲＮＡの送達後のＤＣの蛍光顕微鏡で明らかになる（図１９ｂ）。ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰによって送達されたＲＮＡは、エンドソームおよびファゴリソソームと一致する明るい細胞内区画にクラスター化されるが、エレクトロポレーションによって送達されたＲＮＡは、サイトゾル全体に希薄化している（図１９ｂ）。本発明者らは、この自然な抗原の取り込みにより、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、エレクトロポレーションよりも効果的に、ＤＣを活性化させているものと仮定した。この仮説を試験するために、遺伝子発現、共刺激分子のアップレギュレーション、炎症性サイトカインの分泌、リンパ節への細胞遊走、および抗腫瘍免疫応答を含むＤＣ活性化に対する、エレクトロポレーションおよびＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介したトランスフェクションの効果を評価した。
【０１６１】
本発明者らは、最初に、各トランスフェクション法が遺伝子発現に与える影響を評価した。ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処理されたＢＭＤＣは、未処理またはエレクトロポレーションと比較して、２４時間後のＲＮＡ発現プロファイルに有意な変化を示し（図１９ｃ）、抗ウイルス防御、Ｉ型インターフェロンの産生、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達、および抗原のプロセシングと提示に関連する遺伝子セットの発現の増強が含まれた（図２７）。フローサイトメトリーにより、両方の処理で、共刺激分子の発現が増加したが、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰは、これらのマーカーのより高い共発現を誘導した（図１９ｄ、図２８Ａ〜２８Ｂ）。次に、この活性化表現型が、ＩＦＮ−α分泌の増加を伴うかどうかを評価した。ＩＦＮ−αは、全身性のＲＮＡ−ＮＰに対する抗腫瘍免疫応答を開始するために必要であることを、我々および他が、以前に示した３０，３１。我々のＲＮＡシーケンスデータから、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、ＩＦＮ−αの産生を増加させることが見出された（ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ  ＤＣ：１３．１±３．４ｐｇ；未処置ＤＣ：７．６±１．３ｐｇ、ｐ＝０．０３６９）（図１９ｅ）。対照的に、エレクトロポレーションでは、対照と比較して、ＩＦＮ−αの産生が有意に減少しなかった（エレクトロポレーションされたＤＣ：４．４５±１．１ｐｇ、未処理のＤＣ７．６±１．０ｐｇ、ｐ＝０．２８７９）（図１９ｅ）。この結果は、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、エレクトロポレーションされた細胞には存在しない、ＩＦＮ−α依存性の抗腫瘍免疫応答を刺激することを示唆する。
【０１６２】
本発明者らは以前、ＶＤＬＮへのＲＮＡ負荷ＤＣワクチンの増強された遊走が、ＧＢＭを有する患者で生存率の改善と相関することを、盲検および無作為パイロット臨床治験で報告している１０。したがって、本発明者らは、ＤＣがＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の条件で調製される我々の臨床プロトコルのマウスモデルにおいて、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰまたはエレクトロポレーションで負荷されたＤＣの遊走能力を比較した１０。この実験では、各マウスは、ＲＮＡエレクトロポレーションまたはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処理されたＤｓＲｅｄ＋ＤＣの、反対側皮内注射を受けた。３つの別々の実験で、それぞれ異なる時点を評価すると、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが負荷されたＤＣは、エレクトロポレーションで処理されたＤＣよりも、効率的にリンパ節に遊走した（１８時間：ｐ＝０．００３、ｎ＝３、２４時間：ｐ＝０．０３１３、ｎ＝６；、および７２時間：ｐ＝０．１６、ｎ＝２）（図１９ｆ）。
【０１６３】
本発明者らは、次いで、確立された腫瘍モデルにおける腫瘍増殖の阻害に対するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰとエレクトロポレーションの影響を評価した。本発明者らは、腫瘍接種の５日後に、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＯＶＡｍＲＮＡを負荷したＤＣを単回ワクチン接種すると、皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍の増殖が有意に阻害されることを見出した（ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ対未処置：ｐ＝０．００５７、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ対エレクトロポレーション：ｐ＝０．００４４）（図１９ｇ）。対照的に、ＯＶＡ  ＲＮＡのエレクトロポレーションで処理されたＤＣは、治療効果を提供しなかった（エレクトロポレーション対未処置：ｐ＝０．８）（図１９ｇ）。
【０１６４】
まとめると、本発明者らは、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、免疫関連遺伝子シグネチャー、共刺激分子の発現、炎症性サイトカイン（ＩＦＮ−α）の分泌、およびリンパ節への遊走の促進を特徴とする、強力なＤＣ活性化を誘導することを実証した。このＤＣ活性化は、ＲＮＡのエレクトロポレーションが利益をもたらさない治療モデルで、腫瘍増殖を阻害するのに十分である。これらの結果は、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、ＤＣワクチンのためのエレクトロポレーションの有望な代替手段であることを示唆している。
【０１６５】
ＭＲＩによる細胞追跡：本発明者らは、次に、ＭＲＩによるＤＣ追跡のための、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰの有用性を評価しようとした。ＤｓＲｅｄ＋ＢＭＤＣを、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰで処理し、ナイーブマウスの鼠径部に皮内注射した。２日後、ＭＲＩ画像から、複数の画像パラメータにわたって、処置リンパ節の体積に目に見える増加が明らかになった（図２０ａ）。フローサイトメトリー（図２０ｂ）は、反対側の未処置リンパ節と比較して、ＶＤＬＮのサイズにおける相対増加が、処置リンパ節のＤｓＲｅｄ＋細胞の絶対数と強く相関していることを明らかにした（ｒ＝０．９１３４、ｐ＜０．０００１）（図２０ｃ）。さらに、最適化されたＴ２＊強調ＭＲＩシーケンスは、高濃度の酸化鉄と一致する反対側の未処置リンパ節と比較して、ＶＤＬＮの強度の減少を検出した（ＶＤＬＮの相対強度）。ＭＲＩ強度のこれらの減少は、処置リンパ節の絶対細胞数と強く相関していた（ｒ＝−０．６８４２、ｐ＝０．０６１３）（図２０ｄ）。この結果は、ＭＲＩが、高濃度および低濃度のＩＯＮＰ負荷ＤＣを有するリンパ節を区別する能力を実証する。
【０１６６】
微小残存病変および確立された腫瘍モデルの条件における抗腫瘍応答の早期バイオマーカーとして、ＭＲＩは、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが、強力なＤＣ活性化を刺激し、リンパ節でのＭＲＩ強度に一貫した変化をもたらすことを示したことから、本発明者らは、抗腫瘍免疫応答を予測するためのバイオマーカーとして、ＭＲＩで検出されるＤＣ遊走の有用性を評価した。本発明者らは、最初に、ワクチン接種によって様々な抗腫瘍応答をもたらす微小残存病変（ＭＲＤ）のモデルを開発した。腫瘍移植の同じ日に、ＯＶＡ  ｍＲＮＡを有するＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰが負荷されたＤＣの皮内注射は、未処置の対照と比較して、皮下Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍の増殖を有意に阻害した（１９日目：ｐ＝０．０３７６、２３日目：ｐ＝０．０３５１、２５日目：ｐ＝０．０３２８）（図２１ａ）。しかしながら、処置されたマウスは、不均一な腫瘍増殖の阻害を示した（図２１ｂ）。これらの違いは、２７日目で顕著になり、マウスのサブセットには明らかな腫瘍があり、他のマウスには腫瘍がなかった（図２１ｂ）。２日目のＭＲＩ画像の比較により、「応答者」は「非応答者」と比較して、未処置リンパ節に対する処置リンパ節のＴ２＊強調ＭＲＩ強度が顕著に減少し、処置リンパ節における酸化鉄負荷ＤＣの濃度の増加と一致することが明らかになった（ｒ＝０．９３２４、ｐ＝０．０２０９）（図２１ｃ）。このバイオマーカーの予測値は、その後の実験で確認され、処置の２日後のＴ２＊強調ＭＲＩ強度の減少が、２７日目の腫瘍サイズ（ｒ＝０．６５７７、ｐ＝０．０５４２）（図２１ｄ）、および全生存期間（ｒ＝−０．６９５７、ｐ＝０．０３７４）（図２１ｅ）の両方と直接相関することが実証された。
【０１６７】
次に、処置リンパ節のＭＲＩ強度を使用して、処置マウスを意味のあるグループに分けて、治療結果を予測できるかどうかを評価した。本発明者らは、下位２５パーセンタイルのＭＲＩ−強度によって示される高いＤＣ遊走を有するマウスが、上位７５パーセンタイルの強度を有するマウスよりも、有意に小さい腫瘍を有していたことを、分析を通して（Ｐ＝０．０１３１）（図２１ｆ〜ｇ）、ならびに１７日目（ｐ＝０．００８６）、２２日目（ｐ＝０．０２５６）、および２６日目（ｐ＝０．０１１８）を含む個々の日日において（図２１ｈ）、見出した。これらの結果は、処置２日後にＭＲＩで検出されたＤＣ遊走が、抗腫瘍免疫応答の早期動的バイオマーカーであるという強力な証拠を提供する。
【０１６８】
ＭＲＤモデルでの有用性を確立した後、確立された腫瘍の条件で、ＭＲＩ検出ＤＣ遊走の予測能力を調べた。この実験では、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを負荷したＤＣで処置する前に、すべてのマウスに触知可能な皮下腫瘍があった（図２２ａ）。ここでは、はるかに速い腫瘍増殖が観察されたが、ＤＣワクチン接種に応答するコホートでは依然として不均一な有効性が記録された（図２２ｂ）。ワクチン接種の２日後に取られたＭＲＩと腫瘍増殖曲線との相関では、処置リンパ節の強度の初期の減少が、腫瘍増殖の将来の阻害と強く相関することが再び明らかになった（１４日目の腫瘍サイズ：ｒ＝０．７２３５、ｐ＝０．０２７６、１７日目の腫瘍サイズ：ｒ＝０．７３２３、ｐ＝０．０２４８）（図２２ｃ、図２２ｄ）。処置リンパ節でＴ２＊強調ＭＲＩ強度が高いマウスでは、かなりの腫瘍があったが、強度が低いマウスでは腫瘍がなかった。この証拠は、ワクチン接種のわずか２日後のＭＲＩイメージングが、ＤＣワクチンに対するその後の抗腫瘍免疫応答を予測するのに十分な感度があることを示唆している。
【０１６９】
本発明者らは、次いで、これらの動物を引き続き観察して、ＭＲＩ検出ＤＣ遊走が、より臨床的に関連する結果である生存率を予測するかどうかを判断した。注目すべきことに、処置リンパ節における２日目のＭＲＩ強度は、腫瘍増殖の長期阻害と強く相関し（中央５０％対下位２５パーセンタイル：ｐ＝０．００２３、上位７５パーセンタイル番目下位２５パーセンタイル：ｐ＝０．０００１）および生存率と強く相関した（ｒ＝−０．８５５７、ｐ＝０．００３３）（図２２ｅ、２２ｆ）。２日目の２５パーセンタイル未満の相対ＭＲＩ強度で明らかにされたリンパ節への大幅なＤＣ遊走を有するマウスは、中央５０パーセンタイルのＭＲＩ強度で示された中程度のＤＣ遊走を有するマウスよりも、有意に長く生存し（ｐ＝０．０３３８、対数順位解析）、上位７５パーセンタイルの相対ＭＲＩ強度で示されたＤＣ遊走を欠くマウスの２倍長く生存した（ｐ＝０．０８９６、対数順位解析）（上位２５パーセンタイル：２５±７．０日、中央５０％：３４±２．０４９日、下位２５パーセンタイル：５２．５±３．５日）（図２２ｇ）。これらの結果は、ＤＣ追跡のＭＲＩイメージングを、ワクチン接種のわずか２日後に、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ負荷ＤＣワクチンに対する長期抗腫瘍応答を識別するための相関性が高いバイオマーカーとして使用することができることを示す。
【０１７０】
実施例１６
この実施例は、実施例１５で使用された材料と方法を実証する。
【０１７１】
粒子の特性評価：サイズ：ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを冷ＰＢＳで２０００倍に希釈し、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定した。粒子サイズは、試料ごとに５回の取得、取得ごとに６０秒を使用して、１４００フレーム超から計算された。データは、ＮＴＡ３．３  Ｄｅｖ  Ｂｕｉｌｄ  ３．３．１０４（カメラタイプ：ｓＣＭＯＳ）を使用して処理した。選択したプロットとデータは、各粒子構築物の４つの独立したバッチを表している。電荷：ゼータ電位は、Ｎｉｃｏｍｐ  ＺＬＳＺ３０００で評価した。報告される測定値は、３つの独立したバッチを表す各粒子の５サイクルの平均である。磁性：磁性の測定は、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｅｓｉｇｎ  ＭＰＭＳ−３超伝導量子干渉素子（ＳＱＵＩＤ）磁力計を使用して行った。粒子を調製し、２．５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ中で分析した。磁化曲線は、４Ｋ〜３４５Ｋの様々な温度で１０  Ｏｅ（０．８ｋＡ／ｍ）の磁場を適用することによって得られた。ＲＮＡ結合：リポソームに、ＲＮＡを、リポソーム：ＲＮＡ比が１５：１、１０：１、５：１、１：１、または０：１で負荷し、１５分間インキュベートしてリポソームを形成させた後、ＲＮＡ負荷緩衝液で染色した。次いで、２０ｕＬのＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを、１％アガロースゲルの各ウェルに負荷し、８０Ｖで２０分間電気泳動した。遊離ＲＮＡは、ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）およびＩｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して評価した。各粒子の相対ＲＮＡ結合容量は次のように計算した：結合ＲＮＡ（％）＊トータルＲＮＡ（ｕｇ）、ここで、「結合ＲＮＡ」は、１−（試料バンド強度／ＲＮＡのみバンド強度）として計算されている。低温電子顕微鏡法：低温透過型電子顕微鏡法（クライオ−ＴＥＭ）の試料調製は、フロリダ大学のＩｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＥｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｃｏｒｅで行われた。３マイクロリットルアリコートの懸濁リポソームをＣ−ｆｌａｔ  ｈｏｌｅｙ  ｃａｒｂｏｎ  ｇｒｉｄ（Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐｓ  Ｉｎｃ．）に適用し、コントロールチャンバー内で、湿度約９０％、４℃で動作するＶｉｔｒｏｂｏｔ（商標）Ｍａｒｋ  ＩＶ（ＦＥＩ  Ｃｏ．）を使用してガラス化した。ガラス化した試料を液体窒素下で保存し、イメージングのためにＧａｔａｎクライオホルダー（モデル６２６／７０）に移した。試料は、低線量条件（約２０ｅ／Å２）を使用して２００ｋＶの電圧で動作するＴｅｃｎａｉ（ＦＥＩ  Ｃｏ．）Ｇ２Ｆ２０−ＴＷＩＮ透過型電子顕微鏡で、４ｋｘ４ｋ  ＣＣＤカメラ（Ｇａｔａｎ  Ｉｎｃ．）を使用して検査した。
【０１７２】
ＲＮＡの調製と標識緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とＯＶＡ  ＲＮＡは、前述のように生成された３１。単離したＲＮＡは、市販のＡｒｃｔｕｒｕｓ  Ｔｕｒｂｏ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）使用して、製造元の説明書に従って、Ｃｙ３およびＣｙ５色素で標識した。
【０１７３】
細胞培養ＤＣ２．４は、不死化樹状細胞株であり、デューク大学のＪｏｈｎ  Ｓａｍｐｓｏｎ氏から好意的に寄贈された３６。Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡは、ニワトリオボアルブミン遺伝子（ＯＶＡ）を発現するマウス黒色腫細胞株であり、Ｍａｙｏ  ＣｌｉｎｉｃのＲｉｃｈａｒｄ  Ｇ．Ｖｉｌｅ博士から好意的な寄贈で入手した。両方の細胞型は、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したピルビン酸を含む高グルコースＤＭＥＭ中で培養した。
【０１７４】
ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰの合成  リポソーム合成：リポソームは、以前に記載されたように調製した３１。簡単には、カチオン性リポソームのＤＯＴＡＰは、Ａｖａｎｔｉ，Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、ＵＳＡ）から脱水形態で入手した。２５〜１００ｍｇの脱水リポソームを、クロロホルム中で、３：１のＤＯＴＡＰ：コレステロールの比率でコレステロール７０００００Ｐ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）と混合した。クロロホルムを、窒素ガスチャンバーで蒸発させ、脂質の薄層を得た。次いで、この脂質を、ＰＢＳで２．５ｍｇ／ｍＬに再水和した。ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰの場合、脂質ケーキは、代わりに１０ｍｇ／ｍＬの高濃度のカルボキシル化ＩＯＮＰ（ＮａｎｏＭａｇ）の高密度溶液で再水和した後、ＤＰＢＳで２．５ｍｇ脂質／ｍＬにした。再水和したリポソームを、次いで５０℃の水浴に入れ、１０分ごとに１時間ボルテックスした。次いで、リポソームを、室温で一晩保存した後、ボルテックスし、バスソニケーターに５分間入れ、０．４５μｍシリンジフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐｕｒａｄｉｓｃ）を通して濾過し、その後、０．２０μｍシリンジフィルター（Ｓｕｐｏｒ膜を有するＰＡＬＬ  Ａｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルター）で濾過した。ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ複合体の形成：ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰは、ＲＮＡ−ＮＰについて前述したように調製した３１。ＰＢＳ緩衝液中の１５０μｇのＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ（２，０００，０００個の細胞あたり）に、１０μｇのｍＲＮＡを加えた。混合物を、室温で１５分間インキュベートして、複合体形成を確かめた後、ＤＣに添加した。
【０１７５】
ＤＣのＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰトランスフェクション  一晩のトランスフェクション：ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを、１６０ｕｇのＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ：２，０００，０００個のＤＣで、培養中のＤＣに加えた。３０分間のトランスフェクション：ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを加える前に、１００ｒｃｆで１分間の遠心分離によって、ＤＣを、２４ウェルプレートの底に引き下ろした。粒子は、ネオジウム鉄ボロン（Ｎｄ２Ｆｅ１４Ｂ）永久磁気ディスクによって生成された磁場の存在下または不在下で、３０分間媒体に放置された。３０分後、プレートを再び１００ｒｃｆで１分間遠心分離した後、ＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを除去し、新鮮な培地と交換した。
【０１７６】
マウスＣ５７Ｂｌ／６、ＯＴ１トランスジェニック（Ｃ５７Ｂｌ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｊ）およびＤｓＲｅｄ（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＤｓＲｅｄ＊ＭＳＴ）１Ｎａｇｙ／Ｊ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。動物処置は、フロリダ大学の動物実験委員会（ＵＦＩＡＣＵＣ２０１６０７９６６）によって承認された。
【０１７７】
樹状細胞の生成  ＤＣは、以前に確立された方法に基づいて、マウス骨髄から単離された５０。簡単には、脛骨と大腿骨をＣ５７Ｂｌ／６またはＤｓＲｅｄマウスから採取し、血清含有培地を含む２５ゲージの注射器を使用して骨髄を洗い流した。赤血球を１０ｍＬのＰｈａｒｍｌｙｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で溶解した後、単核細胞を、完全ＤＣ培地（ＲＰＭＩ−１６４０、５％ＦＢＳ、１ＭのＨＥＰＥＳ［ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］、５５ｍＭのｂ−メルカプトエタノール［ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］、１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム［ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］、１０ｍＭの非必須アミノ酸［ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］、２００ｍＭのＬ−グルタミン［ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］、１０ｍｇのＧＭ−ＣＳＦ［Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ］、１０ｍｇのＩＬ４［Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ］、１％ペニシリン／ストレプトマイシン［ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］）に懸濁した。次いで、細胞を、３ｍＬ／ウェルの総容量、８×１０５細胞／ｍＬの濃度で、６ウェルプレートで培養した。非付着性細胞は廃棄し、培地は３日目に交換した。７日目に、非付着性細胞を収集し、５ｍＬ／皿の総容量で、１０６細胞／ｍＬの密度で、１００ｍｍの培養皿に再プレーティングした。２４時間後、非付着性細胞を収集し、エレクトロポレーション、ＲＮＡのみ、ＲＮＡ−ＮＰ、またはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してｍＲＮＡをトランスフェクトし、一晩放置した。
【０１７８】
Ｔ細胞の生成  ナイーブＯＶＡ特異的Ｔ細胞：ＯＶＡペプチドエピトープ２５７〜２６４に特異的なＴ細胞は、ＯＴ１トランスジェニックマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｊ）の脾臓から生成された。ＯＴ１脾細胞は、ＲＢＣの溶解により分離し、共培養または処置においてすぐに使用できるように、ＰＢＳに懸濁した。抗原経験Ｔ細胞：抗原経験Ｔ細胞は、前述のように調製した４。簡単には、Ｃ５７Ｂｌ６マウスは、ＯＶＡパルスＤＣによる皮内ワクチン接種を受けた。ワクチン接種の１週間後、これらのマウス由来の脾細胞を単離し、４，０００，０００：４００，０００の脾細胞：ＤＣ比で、ＩＬ−２を含むＴ細胞培地中で、ＯＶＡパルスＢＭＤＣとともに５日間培養した。活性化されたＴ細胞は、コンフルエンスに達してから、新しいウェルに分けられた。
【０１７９】
共培養アッセイ  ＤＣは、エレクトロポレーション、共培養（ＲＮＡ−のみ）、ＲＮＡ−ＮＰ、またはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介して、ＯＶＡまたはＧＦＰ  ｍＲＮＡでトランスフェクトされた。２４時間後、処理されたＤＣを、９６ウェルプレートで、４００，０００：４０，０００のＴ細胞：ＤＣ比で、ナイーブＯＴ１脾細胞または抗原経験ＯＶＡ  Ｔ細胞と共培養した。４８時間後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡでインターフェロン−γ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を評価した。
【０１８０】
フローサイトメトリー分析：フローサイトメトリーは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの抗体を使用して、ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ−ＩＩを使用して行った。インビトロ実験では、ＤＣを回収し、ＰＢＳで洗浄し、２０分間染色した。次いで、試料を、ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に懸濁した。細胞カウントと生存率は、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で評価した。インビボ実験については、リンパ節を、冷ＰＢＳに採取し、かみそりの刃でさいの目に切り、パパインで３７℃で２０分間消化した後、７０μｍセルストレーナーで濾過し、ＰＢＳで洗浄し、適切な抗体で２０分間染色した。フロー分析の直前に、カウントビーズを各チューブに加えた。
【０１８１】
ＭＲＩイメージングと分析画像取得：ＭＲＩイメージングは、鼠径部にＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰ負荷ＤＣを皮内注射して１８〜７２時間後に、ＵＦＡＭＲＩＳ施設で、特注の３０ｍｍＩＤ直交バードケージ送受信ボリュームコイルを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ３ＨＤコンソールとＰａｒａｖｉｓｉｏｎ６．０１ソフトウェアを搭載した１１Ｔ  ＭＲＩマグネット（Ｍａｇｎｅｘ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１．１Ｔ／４０ｃｍボア）で行った。マウスは、イソフルラン麻酔下でイメージングし、ＵＦＩＡＣＵＣ２０１６０７９６６に従って、体温と呼吸の連続測定を介してモニタリングした。体温を維持するために、温度制御温水ヒータからの循環温水を使用した。画像サイズが１９２ｘ１９２、視野が２５．０８ｍｍｘ２５．９２１ｍｍ、切片厚が１．０ｍｍで、様々な画像パラメータについて６切片の２次元ＭＲＩシーケンスを、呼吸同期を使用して収集した。Ｔ２＊強調画像は、リンパ節の低強度のＩＯＮＰ依存性変化を評価するために、次のパラメータを使用して収集した：繰り返し時間（ＴＲ）＝９０ミリ秒、エコー時間（ＴＥ）＝５ミリ秒、フリップ角＝１０°（脂肪飽和あり）。リンパ節のサイズを評価するために、一連の他の５つのイメージングシーケンスを取得した。シーケンス１（Ｔ２＊）：ＴＲ＝９０ミリ秒、ＴＥ＝３ミリ秒、フリップ角＝１０°。シーケンス２（Ｔ２＊、脂肪飽和あり）：ＴＲ＝９０ミリ秒、ＴＥ＝３ミリ秒、フリップ角＝１０°、脂肪飽和。シーケンス３（Ｔ２＿４０７／１７）：ＴＲ＝４０７．２０４ミリ秒、ＴＥ＝１７ミリ秒、エコー間隔＝４．２５、ＲＡＲＥファクター＝４、脂肪飽和あり。シーケンス４（Ｔ２、脂肪飽和）：ＴＲ＝５００ミリ秒、ＴＥ＝１４ミリ秒、エコー間隔＝７ミリ秒、ＲＡＲＥファクター＝４。シーケンス５（Ｔ２）：ＴＲ＝３０００ミリ秒、ＴＥ＝２８ミリ秒、エコー間隔＝３ミリ秒、ＲＡＲＥファクター＝８、脂肪飽和あり。
【０１８２】
画像分析：画像分析はＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して完了した。処置グループを知らされていない研究者は、リンパ節が現れたスライスごとに、各リンパ節周囲の関心領域を、手動で作成した。各リンパ節のＭＲＩ強度は、Ｔ２＊強調ＭＲＩシーケンスでリンパ節が現れたすべてのスライスにわたるリンパ節の強度の平均として計算された。リンパ節の体積は、スライスの厚さ（１ｍｍ）と各スライスの各リンパ節の合計面積の積として計算された（例：Ｖ＝スライスの厚さ＊（面積スライス１＋面積スライス２＋面積スライス３…＋面積スライスｎ））。相対的なサイズは、処置リンパ節の体積を反対側の未処置リンパ節の体積で割ることによって、各イメージングシーケンスについて計算した。相対体積は、６つのイメージングシーケンスすべてについて計算され、イメージングシーケンスにわたる平均相対体積として報告された。相対強度は、Ｔ２＊強調ＭＲＩ画像について、処置リンパ節のＭＲＩ強度を未処置リンパ節のＭＲＩ強度で割ることによって計算した。
【０１８３】
治療モデル  腫瘍移植：Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞を、０．０５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いて回収し、血清含有培地で１回洗浄し、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）で１回洗浄した。細胞ペレットを、１０７細胞／ｍＬの濃度でＤＰＢＳに再懸濁した。１，０００，０００個のＢ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞を、イソフルランで麻酔したＣ５７Ｂｌ／６マウスの左側腹部に、２５ゲージの注射器で皮下注射した。皮下腫瘍は、ＷＥＳＴＷＡＲＤ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃａｌｉｐｅｒを使用して、２〜４日ごとに測定した。人道的エンドポイントに達した皮下腫瘍を有する動物は、安楽死させた。養子細胞療法：ナイーブまたは抗原経験Ｔ細胞を、上記のように生成し、１００，０００，０００／ｍＬでＰＢＳに懸濁し、マウス１匹あたり１００ｕＬで癌を有するマウスに注射した。ＤＣワクチン：上記のように調製されたＲＮＡパルスＤＣを収集し、１×１０７細胞／ｍＬの最終濃度でＰＢＳに懸濁した。各処置マウスの鼠径部に、５０μＬを皮内投与した。
【０１８４】
免疫蛍光ＤＣ２．４を、Ｃｙ３標識ｍＲＮＡとインキュベーションして２４時間後、ＰＢＳ中でイメージングした。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０倒立型蛍光顕微鏡で、画像を撮影した。
【０１８５】
遺伝子発現分析ＢＭＤＣは、２，０００，０００個の細胞あたり１０μｇのｍＲＮＡで、エレクトロポレーション、ＲＮＡ−ＮＰ、またはＩＯ−ＲＮＡ−ＮＰを介してＧＦＰ  ｍＲＮＡをトランスフェクションしてから２４時間後に、処置グループごとに３つの独立した試料から回収した。次に、製造元の説明書に従って、市販のＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｕｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０４）を使用して各試料からＲＮＡを単離し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用して純度を分析した。ＲＮＡは、フロリダ大学Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＩＣＢＲ）のＩｌｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡ配列決定ライブラリ（ポリＡ）を使用して、方向性配列決定用に調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ３０００を使用して、２レーンで１００サイクルのペアエンドＲＮＡシーケンスを完了した。遺伝子セットエンリッチメントは、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｇｅｎｅｐａｔｔｅｒｎ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ）から入手可能な遺伝子セットエンリッチメント分析（ＧＳＥＡ）ソフトウェアを使用して評価された。エンドソームでのＲＮＡの取り込みがｔｏｌｌ様受容体依存性のＤＣ活性化表現型を開始するという仮説に基づいて、Ｃ７  ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃＳｉｇｎａｔｕｒｅｓ遺伝子セットコレクションから、９つの遺伝子セットを選択した。
【０１８６】
統計分析データは、インビトロ実験については平均±標準偏差、および腫瘍増殖実験については平均±標準誤差として、要約されている。対応のないデータは、両側の対応のないスチューデントのｔ検定、または多重比較のためのテューキーの検定を伴う分散分析で分析されている。対応のあるデータは、ｎ＞３の実験についてウィルコクソンマッチドペア順位和検定と、ｎ≦３の場合は両側の対応のあるスチューデントのｔ検定で分析されている。経時的な腫瘍増殖は、二元配置分散分析で測定されている。生存率は、対数順位検定で測定されている。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン６を使用して行った。統計的有意性は、ｐ＜０．０５として定義した。線形相関は、ピアソンの相関係数で評価された。
【０１８７】
引用文献：以下の参考文献は、実施例１５および１６全体で引用されている。（１）Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７，４５５０−４５５７（２０１１）；（２）Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３３，１８８９−１８９４（２０１５）；（３）ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １６，２１９−２３３（２０１６）；（４）Ｇａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７２，２０１８−２０２８（２０１５）；（５）Ｌａｒｋｉｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７３，２３−３４（２０１５）；（６）Ｈｅｌｌｍａｎｎ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １８，３１−４１（２０１７）；（７）Ｇｒｉｐｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，００−００（２０１７）．（８）Ｎｉｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １４，６５５−６６８（２０１７）；（９）Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓ，Ｗ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １６，２６４−２７２（２０１７）；（１０）Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５１９，３６６−３６９（２０１５）；（１１）Ｓｒｉｎｉｖａｓ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６２，１０８０−１０９３（２０１０）；（１２）ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，Ｉ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３，１４０７−１４１３（２００５）；（１３）Ｖｅｒｄｉｊｋ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２０，９７８−９８４（２００７）；（１４）Ｎｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３２，６２５４−６２６３（２０１１）；（１５）Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６，６７５−６８２（２０１１）；（１６）Ｍｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６，２６３３−２６４０（２０１１）；（１７）ｄｅ  Ｃｈｉｃｋｅｒａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４，２９−４１（２０１２）；（１８）Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２７４，１９２−２００（２０１５）；（１９）Ｂａｔｉｃｈ，Ｋ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２３，１８９８−１９０９（２０１７）；（２０）Ａｎｇｕｉｌｌｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １３０，１７１３−１７２１（２０１７）；（２１）Ｗｉｌｇｅｎｈｏｆ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３４，１３３０−１３３８（２０１６）；（２２）Ｂｏｌ，Ｋ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４，ｅ１０１９１９７（２０１５）；（２３）Ａａｒｎｔｚｅｎ，Ｅ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８，５４６０−５４７０（２０１２）；（２４）Ｐｈｕａ，Ｋ．Ｋ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ６，７７１５−７７２９（２０１４）；（２５）Ａｎｓｅｌｍｏ，Ａ．Ｃ．＆  Ｍｉｔｒａｇｏｔ���ｉ，Ｓ．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃ．Ｂｉｏｅｎｇ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  １，１０−２９（２０１６）；（２６）Ｓｈｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １７，２０−３７（２０１７）；（２７）ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，Ｉ．Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２３，１４０７−１４１３（２００５）；（２８）Ａｈｒｅｎｓ，Ｅ．Ｔ．＆  Ｂｕｌｔｅ，Ｊ．Ｗ．Ｍ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３，７５５−７６３（２０１３）；（２９）Ｂｕｌｔｅ，Ｊ．Ｗ．Ｍ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌｏｇｙ  １９３，３１４−３２５（２００９）；（３０）Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５３４，３９６−４０１（２０１６）；（３１）Ｓａｙｏｕｒ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，００−００（２０１６）；（３２）Ｓａｙｏｕｒ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ（２０１８）；（３３）Ｋａｕｆｆｍａｎ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １５，７３００−７３０６（２０１５）；（３４）Ｓａｙｏｕｒ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，ｅ１２５６５２７（２０１７）；（３５）Ｓｏｅｍａ，Ｐ．Ｃ．，Ｗｉｌｌｅｍｓ，Ｇ．Ｊ．，Ｊｉｓｋｏｏｔ，Ｗ．，Ａｍｏｒｉｊ，Ｊ．Ｐ．＆  Ｋｅｒｓｔｅｎ，Ｇ．Ｆ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ  ９４，４２７−４３５（２０１５）；（３６）Ｓｈｅｎ，Ｚ．，Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｇ．，Ｄｒａｎｏｆｆ，Ｇ．＆  Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８，２７２３−２７３０（１９９７）．（３７）Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９，１０２−１０９（２００２）．（３８）Ｍａｈ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ６，１０６−１１２（２００２）．（３９）Ｇｉｌｂｏａ，Ｅ．＆  Ｖｉｅｗｅｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １９９，２５１−２６３（２００４）；（４０）Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ，Ｖ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ９８，４９−５６（２００１）；（４１）Ｂｌａｓｉｕｓ，Ａ．Ｌ．＆  Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３２，３０５−３１５（２０１０）；（４２）Ｃｒｏｚａｔ，Ｋ．＆  Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１，６８３５−６８３６（２００４）；（４３）ｄｅ  Ｌｉｍａ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１６，１０３−１０９（１９９９）；（４４）Ｌｉｍ，Ｙ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｍａｌｌ  ４，１６４０−１６４５（２００８）；（４５）Ｊｉｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  ６，２０００−２０１４（２０１６）；（４６）Ｍａｃｋａｙ，Ｐ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７，４８９−４９６（２０１１）；（４７）Ｗａｎｇ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４９，８０−９２  ｅ８７（２０１８）；（４８）Ｚａｎｇａｎｅｈ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１，９８６−９９４（２０１６）；（４９）Ｒａｇｅｌｌｅ，Ｈ．，Ｄａｎｈｉｅｒ，Ｆ．，Ｐｒｅａｔ，Ｖ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  １４，８５１−８６４（２０１７）；（５０）Ｆｌｏｒｅｓ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４，ｅ９９４３７４（２０１５）．
【０１８８】
本明細書において援用される、刊行物、特許出願および特許を含む、すべての参考文献は、各々の参考文献が参照により組み入れられるように個々にかつ具体的に示されかつその全体が本明細書に記載されているのと同程度まで、参考として本明細書に組み込まれる。
【０１８９】
本開示を説明する文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」ならびに同様の指示物は、本明細書に別の記述がなければ、または明らかに文脈と矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する」は、別途注記のない限り、開放型専門用語として解釈されるべきである（すなわち、「〜を含むがこれらに限定されない」を意味する）。
【０１９０】
本明細書において特に指定のない限り、本明細書中の値の範囲の記載は、その範囲および各端点に入る各々の別個の値を個々に指す略記方法として役立つことを意図したものであるにすぎず、各々の別個の値および各端点は、それが本明細書中に個々に記載されているかのように本明細書に組み入れられる。
【０１９１】
本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書において特に指定のない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。特に要求されない限り、本明細書中に提供されるあらゆる例、または例示的な言葉（例えば「など」）の使用は、本開示をより上手く説明することを意図したものにすぎず、本開示の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書における言語は、本開示の実施に不可欠な任意の非請求要素を示すと解釈されるべきではない。
【０１９２】
本開示を実施するための発明者に知られている最良の形態を含む、本開示の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態の変形形態は、前述の説明を読むことで当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がそのような変形形態を適切に使用することを期待し、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で本開示が実施されることを意図する。したがって、本開示は、適用法で許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題のすべての改変および同等物を含む。さらに、本明細書において特に指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、すべての可能な変形形態における上記要素の任意の組み合わせが本開示に包含される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１５Ｉ】
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【図１５Ｊ】
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【図１５Ｋ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ−１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１８Ｉ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２１Ｇ】
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【図２１Ｈ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２７−４】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【国際調査報告】
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