(57)【要約】  本開示は、一般に、非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体の非天然外部ドメインに特異的に結合するＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１−α２ドメインを含むポリペプチドであって、異種分子がＮＫＧ２Ｄリガンドの改変１−２ドメインに結合しているポリペプチドの産生に関する。本開示はさらに、ポリペプチド、およびいくつかの実施態様において抗体または抗体のフラグメントを含む異種分子に結合したＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１−α２ドメインに関する。本開示はまた、ＮＫＧ２Ｄリガンドの非天然および天然型へのそれぞれ増強および減少した結合の組み合わせを提供するように操作されたＮＫＧ２Ｄ受容体の改変形態に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然α１−α２ドメインに対する少なくとも８０％の同一性を含む天然ＮＫＧ２Ｄリガンド分子の非天然改変α１−α２ドメインであって、改変α１−α２ドメインは天然α１−α２ドメインの５より多いアミノ酸が置換されており、改変は非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体外部ドメインに対するその結合親和性を増加させ、非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体の外部ドメインは、少なくとも１つの天然ＮＫＧ２Ｄリガンドに対して、前記少なくとも天然ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する天然ＮＫＧ２Ｄ受容体外部ドメインの親和性より低い親和性を有する、非天然改変α１−α２ドメイン。
【請求項２】
前記少なくとも１つの天然ＮＫＧ２Ｄリガンドが、配列番号１〜９のいずれか１つである、請求項１に記載の非天然改変α１−α２ドメイン。
【請求項３】
天然α１−α２ドメインから置換されるアミノ酸が、配列番号４の８位、８０位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、および１５９位の３つ以上におけるものである、請求項１に記載の非天然改変α１−α２ドメイン。
【請求項４】
配列番号１１１、１１３、１１５および１１７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の非天然改変α１−α２ドメイン。
【請求項５】
前記非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体外部ドメインが配列番号１７のアミノ酸配列を含むが、その中で配列番号１７の７５位および１２２位におけるチロシンの両方が別のアミノ酸で置換されている、請求項１に記載の非天然改変α１−α２ドメイン。
【請求項６】
７５位におけるチロシンを置換するアミノ酸がアラニンであり、かつ１２２位におけるチロシンを置換するアミノ酸がフェニルアラニンである、請求項５に記載の非天然改変α１−α２ドメイン。
【請求項７】
結合した原子または結合した異種分子をさらに含み、それによって二重特異性分子が作製される、請求項１に記載の非天然改変α１−α２ドメイン。
【請求項８】
前記異種分子がペプチドまたはポリペプチドである、請求項７に記載の非天然改変α１−α２ドメイン。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、抗体、抗体フラグメント、サイトカイン、リンホカイン、またはホルモンである、請求項８に記載の非天然改変α１−α２ドメイン。
【請求項１０】
前記異種分子が、オリゴ糖、デンドリマー、ノッチン、ホルモン、核酸、または脂質である、請求項７に記載の非天然改変α１−α２ドメイン。
【請求項１１】
請求項１に記載の非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体外部ドメインが結合されている哺乳動物細胞。
【請求項１２】
前記哺乳動物細胞がリンパ球またはマクロファージである、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１３】
前記哺乳動物細胞がヒトリンパ球またはヒトマクロファージである、請求項１２に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１４】
前記非天然改変α１−α２ドメインが、結合された非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体外部ドメインを有する哺乳動物細胞と接触するときに、前記原子または異種分子が前記哺乳動物細胞に送達される、請求項７に記載の非天然改変α１−α２ドメイン。
【請求項１５】
非天然ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインを発現する細胞の増強された活性化を示し、その結果、細胞に送達された天然ＮＫＧ２Ｄリガンドまたは天然もしくはネイティブα１−α２ドメインを有する二重特異性分子が示すより高い標的細胞傷害能力を示す細胞をもたらす、請求項１４に記載の非天然改変α１−α２ドメイン。
【請求項１６】
天然ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインを発現する細胞の活性化より高い非天然ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインを発現する細胞の活性化を示し、その結果、天然ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインを発現する細胞が示すより高い標的細胞傷害能力を示す非天然ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインを発現する細胞をもたらす、請求項１４に記載の非天然改変α１−α２ドメイン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本出願は、一般に、非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体の非天然外部ドメインに特異的に結合するＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１−α２ドメインを含むポリペプチドであって、異種分子がＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１−α２ドメインに結合しているポリペプチドの産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景情報
ＮＫＧ２Ｄは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および特定のＴ細胞の表面上にＩＩ型ホモダイマー内在性タンパク質として発現される活性化受容体である。主に、ストレスを受けている細胞の表面上で発現されているその８つの天然リガンドの１つに結合したときに、ＮＫＧ２ＤはＮＫ細胞を活性化して、ストレスを受けた細胞を傷害し、または、Ｔ細胞上の場合、リガンドに占有されたＮＫＧ２ＤはＴ細胞を同時刺激して、そのエフェクター機能を実行する。ヒト天然ＮＫＧ２Ｄの外部ドメイン、その可溶性天然リガンドのいくつか、および、いくつかの場合、可溶性リガンドおよび受容体外部ドメインの結合複合体について、三次元構造が解明されている。ＮＫＧ２Ｄリガンドのモノマーα１−α２ドメインは、天然ＮＫＧ２Ｄホモダイマーの２つの外部ドメインに特異的に結合する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、ポリペプチド、いくつかの実施態様において抗体または抗体のフラグメントを含む異種分子に結合したＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１−α２ドメインに関する。本発明はまた、ＮＫＧ２Ｄリガンドの非天然および天然型へのそれぞれ増強および減少した結合の組み合わせを提供するように操作されたＮＫＧ２Ｄ受容体の改変形態に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１Ａ】ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ（配列番号１８）およびＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ（配列番号２５）非天然バリアントとの天然ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ外部ドメイン（配列番号１７）のアラインメント。Ｙ１５２およびＹ１９９の位置を示し、そして非天然バリアント中に存在する変異残基を灰色で強調する。
【図１Ｂ】天然／野生型ＵＬＢＰ２のα１−α２ドメイン（配列番号４）およびＵＬＢＰ２の非天然バリアント（ＵＬＢＰ２．Ｒ８０Ｗ（配列番号１０８）を含む）のアラインメント。非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡまたはＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ受容体への非天然ＵＬＢＰ２バリアントの結合に重要な残基を灰色で強調する。ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ（ＵＬＢＰ２．Ｓ３、配列番号１２７）またはＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ（ＵＬＢＰ２．Ｃ、配列番号１１１；ＵＬＢＰ２．Ｒ、配列番号１１３；ＵＬＰＢ２．ＡＡ、配列番号１１５；およびＵＬＢＰ２．ＡＢ、配列番号１１７）に結合する直交性バリアントについて探索したＭ１５４−Ｆ１５９領域および残基Ｒ８０の位置を示す。
【図２】候補非天然Ｆｃ−ｅＮＫＧ２Ｄバリアント変異ならびに図３および４に示すサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定されたタンパク質凝集特性の概要。
【図３】Ａｋｔａ  ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム上で分析した非天然Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー比較。適正にアセンブルされた材料の移動は、より高い体積で溶出される分離した対称的なピークによって例示され、一方、凝集した材料はより低い体積でより早く溶出された。改変の部位および性質を、アミノ酸番号Ｙ１５２、Ｙ１９９、または両方（図の上部から開始して、配列番号４８、４３、４２、５８、４１、および４０）によって示す。
【図４】１つまたは２つのアミノ酸変化を有する非天然Ｆｃ−ｅＮＫＧ２Ｄバリアントのサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを、Ａｋｔａ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬカラム上で分析した。適正にアセンブルされた材料の移動は、より高い体積で溶出される分離した対称的なピークによって例示され、一方、凝集した材料（低振幅のブロードなピークまたは一連のピークによって特徴付けられる）はより低い体積で溶出された。括弧内の文字は、それぞれ１５２位および１９９位におけるアミノ酸を表す（上部から順に、配列番号５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、および４０）。
【図５】ＭＩＣｗｅｄ−ＭｉｃＡｂｏｄｙまたはＭＩＣ２５−ＭｉｃＡｂｏｄｙのいずれかによる野生型ＮＫＧ２Ｄ結合に対して規準化されたｅＮＫＧ２Ｄバリアントの飽和百分率（Ｒｍａｘ）。野生型Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄおよび各々のＦｃ−ｅＮＫＧ２Ｄ受容体をＡＨＣバイオセンサー上に捕捉し、次いで２０ｎＭのトラスツズマブ特異的ＭｉｃＡｂｏｄｙに曝露した。解離速度をモニターし、そしてＦｃ−ｅＮＫＧ２Ｄ融合物のＲｍａｘ値を順位付けした。試験しなかったサンプル（ｎｔ）は、激しい凝集、または発現されたかもしくはＳＥＣ分画後に回収された材料の不十分な量のいずかに起因した。
【図６】Ｆｃ−ｅＮＫＧ２Ｄ候補へのＵＬＢＰ２野生型、ＭＩＣｗｅｄ−およびＭＩＣ２５−リツキシマブＭｉｃＡｂｏｄｙのＥＬＩＳＡ結合。キーを図の上部に示すが、曲線の多くは重なっているので、各々のグラフにおいて個々の曲線にラベルも付した。
【図７】図４に示すＦｃ−ｅＮＫＧ２Ｄ  ＥＬＩＳＡについてのＥＣ５０値（ｎＭ）。ｎｔ＝試験せず；ｎｂ＝結合なし、または３００ｎＭでさえ非常に低い結合で、ＥＣ５０値算出されず。
【図８】野生型リガンドへのｅＮＫＧ２Ｄバリアントの結合。野生型リガンド（全てＦｃ融合物フォーマット）をＯｃｔｅｔ  ＡＨＣバイオセンサー上に捕捉し、そしてＦｃ融合物としての天然ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄ．Ｙ１５２Ａ、またはｅＮＫＧ２Ｄ５（Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆ）の各々を３００ｎＭから０．４１ｎＭまでタイトレートした。最大結合応答をＯｃｔｅｔによって定量した（各々グラフについて縦軸が異なることに留意のこと）。
【図９】スポットＥＬＩＳＡによって確認した、天然ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔに対比してＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへの選択的結合を有するファージクローンをもたらしたＵＬＢＰ２内の組み合わせ変異のサブセット。変異を、選択されたファージの中での出現頻度によって順位付けした。
【図１０】Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへの選択的結合およびＦｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔへの低下または消失した結合を確認するための個別のファージバリアントのタイトレーションＥＬＩＳＡ。変異を図１１において詳述する。
【図１１】リツキシマブ−ＭｉｃＡｂｏｄｙフォーマットのＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ選択されたＵＬＢＰ２バリアントの特異性は、定量的ＥＬＩＳＡにより、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへのその結合を保持した。各々のＵＬＢＰ２バリアントの特異的アミノ酸改変を、Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ融合物に対比したＦｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ融合物へのその結合の比として示す。ＵＬＢＰ２のアミノ酸残基の位置は図１Ｂのものである。
【図１２】Ｙ１５２Ａ特異的ファージクローンをもたらした、ＵＬＢＰ２．Ｒ８０Ｗ（図１Ｂ；配列番号１０８）の表示するアミノ酸位置における、選択された変異。
【図１３】ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ、およびＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに結合する４つの非天然α１−α２  ＵＬＢＰ２バリアントＭｉｃＡｂｏｄｙのＥＬＩＳＡデータ。Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄバリアントを捕捉物質として使用した。ＭｉｃＡｂｏｄｙをＨＲＰ結合抗ヒトκ中でタイトレートし、そしてそれを用いて検出した。
【図１４−１】ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、およびＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド−ＭＨＣＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣ４．０  Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡスーパータイプ代表に対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４〜１５９）を上流および下流の９残基とともに入れ（合計２４残基）、９マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩポケットに結合し（％順位＜０．５を有するとして定義される）、それゆえ提示される強い見込みを有すると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する（％順位＜２）。さらなる詳細については実施例５本文を参照のこと。
【図１４−２】ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、およびＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド−ＭＨＣＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣ４．０  Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡスーパータイプ代表に対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４〜１５９）を上流および下流の９残基とともに入れ（合計２４残基）、９マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩポケットに結合し（％順位＜０．５を有するとして定義される）、それゆえ提示される強い見込みを有すると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する（％順位＜２）。さらなる詳細については実施例５本文を参照のこと。
【図１５−１】ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、およびＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ  ２．３  Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４〜１５９）を上流および下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
【図１５−２】ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、およびＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ  ２．３  Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４〜１５９）を上流および下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
【図１５−３】ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、およびＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ  ２．３  Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４〜１５９）を上流および下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
【図１５−４】ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、およびＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ  ２．３  Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４〜１５９）を上流および下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
【図１５−５】ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、およびＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ  ２．３  Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４〜１５９）を上流および下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
【図１５−６】ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、およびＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ  ２．３  Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４〜１５９）を上流および下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
【図１５−７】ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、およびＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ  ２．３  Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４〜１５９）を上流および下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
【図１５−８】ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、およびＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ  ２．３  Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４〜１５９）を上流および下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
【図１５−９】ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、およびＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ  ２．３  Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４〜１５９）を上流および下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
【図１５−１０】ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、およびＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ  ２．３  Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４〜１５９）を上流および下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
【図１５−１１】ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、およびＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ  ２．３  Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４〜１５９）を上流および下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
【図１５−１２】ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、およびＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ  ２．３  Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４〜１５９）を上流および下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
【図１６】天然ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ、およびＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへの、ＵＬＢＰ２．ｗｔ（野生型）、ＵＬＢＰ２．Ｒ８０Ｗ（野生型ＮＫＧ２Ｄに対する増強された親和性を有する）、ＵＬＰＢ２．Ｓ３（ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ選択された直交性バリアント）、またはＵＬＢＰ２．Ｒ（ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ選択された直交性バリアント）を含むリツキシマブ−ＭｉｃＡｂｏｄｙのＥＬＩＳＡ測定された結合。図１６Ａ：ＥＬＩＳＡ曲線。より高い濃度でのいくつかのアッセイについての４５８ｎｍ吸収の低下は、ＴＭＢ−Ｕｌｔｒａ  ＥＬＩＳＡ発色試薬の沈殿に起因して、より高い濃度の高親和性係合物についてしばしば見られるアーチファクトである。図１６Ｂ：図１６Ａにおける曲線に基づいてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにおいて決定されたＥＣ５０値（ｎＭで報告する）。ｎｄ＝増加した濃度と結合との間の関係の欠如に起因して決定されず。
【図１７】形質導入されていないかまたは、ＣＤ８ａヒンジ／膜貫通ドメインならびに細胞内４−１ＢＢおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインからなるＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ、もしくはＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ  ＣＡＲ構築物を用いて形質導入されたかのいずれかのＣＤ８エフェクター細胞を用いたインビトロ細胞溶解アッセイ。標的細胞にカルセインを前負荷し、そして漸増するエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でエフェクター細胞に曝露した。放出されたカルセインを５時間後に定量した。図１７Ａ：ＨｅＬａ細胞の細胞溶解。図１７Ｂ：表面ＵＬＢＰ１を過剰発現するようにトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の溶解。図１７Ｃ：その表面上に非天然ＵＬＢＰ２．Ｒを発現するＨｅＬａ細胞の細胞溶解。エラーバーは、実験における技術的複製物の標準偏差に対応する。
【図１８】ＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ  ＣＤ８  Ｔ細胞による腫瘍株のＭｉｃＡｂｏｄｙ指図細胞溶解。図１８Ａ：Ｒａｍｏｓ細胞（リツキシマブの標的であるＣＤ２０を発現する）にカルセインを前負荷し、そして漸増濃度のＵＬＢＰ２．Ｓ２またはＵＬＢＰ２．Ｒリツキシマブ−Ｍｉｃａｂｏｄｙのいずれかとともに２０：１のＥ：Ｔ比でＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ−またはＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ−ＣＡＲ細胞に曝露した。２時間の共インキュベーションの後に細胞溶解のレベルを定量した。図１８Ｂ：ヒトＨｅｒ２を発現するようにトランスフェクトしたマウス腫瘍株ＣＴ２６を、Ｒａｍｏｓ細胞と並行して細胞溶解標的として使用した。ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ−ＣＡＲ  ＣＤ８  Ｔ細胞に飽和濃度（５ｎＭ）のリツキシマブ−ＵＬＢＰ２．Ｒ、トラスツズマブ−ＵＬＢＰ２．Ｒ、または２つのＭｉｃＡｂｏｄｙの等モル混合物を前付与した。非結合ＭｉｃＡｂｏｄｙを洗浄によって除去し、そしてＣＤ８細胞を標的細胞に２つの異なるＥ：Ｔ比で添加した。２時間後に細胞溶解を測定した。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
発明の詳細な説明
免疫系のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および特定の（ＣＤ８＋αβおよびγδ）Ｔ細胞は、ヒトおよび他の哺乳動物において、新生物および感染細胞に対する第一線の生得的な防御として重要な役割を有している（Cerwenka, A., and L.L. Lanier. 2001. NK cells, viruses and cancer. Nat. Rev. Immunol. 1:41-49）。ＮＫ細胞および特定のＴ細胞は、標的細胞の認識および病態細胞に対する生得的な防御の活性化を担う顕著なホモダイマー表面免疫受容体であるＮＫＧ２Ｄをその表面上に示す（Lanier, LL, 1998. NK cell receptors.  Ann. Rev. Immunol. 16: 359-393; Houchins JP et al. 1991. DNA sequence analysis of NKG2, a family of related cDNA clones encoding type II integral membrane proteins on human NK cells. J. Exp. Med. 173: 1017-1020; Bauer, S et al., 1999.  Activation of NK cells and T cells by NKG2D, a receptor for stress-inducible MICA.  Science 285: 727-730）。ヒトＮＫＧ２Ｄ分子は、その８つの異なる同族リガンドに結合するＣ型レクチン様細胞外（外部）ドメインを有しており、最も研究されているリガンドは８４％配列同一または相同のモノマーＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ（主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ鎖関連糖タンパク質（ＭＩＣ）の多型アナログ）である（Weis et al. 1998. The C-type lectin superfamily of the immune system. Immunol. Rev. 163: 19-34; Bahram et al. 1994. A second lineage of mammalian MHC class I genes. PNAS 91:6259-6263; Bahram et al. 1996a. Nucleotide sequence of the human MHC class I MICA gene. Immunogenetics 44: 80-81; Bahram and Spies TA. 1996. Nucleotide sequence of human MHC class I MICB cDNA. Immunogenetics 43: 230-233）。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの非病態的発現は、腸上皮、ケラチノサイト、内皮細胞および単球に制限されているが、これらのＭＩＣタンパク質の異常な表面発現が、増殖、酸化および熱ショックのような多くの型の細胞ストレスに応答して生じ、そして細胞に病態的として印を付す（Groh et al. 1996. Cell stress-regulated human MHC class I gene expressed in GI epithelium. PNAS 93: 12445-12450; Groh et al. 1998. Recognition of stress-induced MHC molecules by intestinal γδ T cells. Science 279: 1737-1740; Zwirner et al. 1999. Differential expression of MICA by endothelial cells, fibroblasts, keratinocytes and monocytes. Human Immunol. 60: 323-330）。ＭＩＣタンパク質の病態的発現はまた、いくつかの自己免疫疾患に関与しているようである（Ravetch, JV and Lanier LL. 2000. Immune Inhibitory Receptors. Science 290: 84-89; Burgess, SJ. 2008. Immunol. Res. 40: 18-34）。多型ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢのようなＮＫＧ２Ｄリガンドの差次的調節は、所望されない攻撃から健常細胞を依然として防御しながら広範な緊急の合図を同定しそれに応答するための手段を免疫系に提供するために重要である（Stephens HA, (2001) MICA and MICB genes: can the enigma of their polymorphism be resolved? Trends Immunol. 22: 378-85; Spies, T. 2008. Regulation of NKG2D ligands: a purposeful but delicate affair. Nature Immunol. 9: 1013-1015）。
【０００６】
ウイルス感染は、ＭＩＣタンパク質発現の一般的な誘導因子であり、ＮＫまたはＴ細胞の攻撃のためにウイルス感染細胞を同定する（Groh et al. 1998; Groh et al. 2001. Co-stimulation of CD8+ αβT cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2: 255-260; Cerwenka, A., and L.L. Lanier. 2001）。事実、その宿主細胞上でのそのような攻撃を回避するために、サイトメガロウイルスおよび他のウイルスは、自然免疫系による標的化から逃避するために、それが感染する細胞の表面上でのＭＩＣタンパク質の発現を防止する進化した機構を有する（Lodoen, M., K. Ogasawara, J.A. Hamerman, H. Arase, J.P. Houchins, E.S. Mocarski, and L.L. Lanier. 2003.  NKG2D-mediated NK cell protection against cytomegalovirus is impaired by gp40 modulation of RAE-1 molecules.  J. Exp. Med. 197:1245-1253; Stern-Ginossar et al., (2007) Host immune system gene targeting by viral miRNA. Science 317: 376-381; Stern-Ginossar et al., (2008) Human microRNAs regulate stress-induced immune responses mediated by the receptor NKG2D. Nature Immunology 9: 1065-73; Slavuljica, I A Busche, M Babic , M Mitrovic, I Gasparovic, D Cekinovic, E Markova Car, EP Pugel, A Cikovic, VJ Lisnic, WJ Britt, U Koszinowski, M Messerle, A Krmpotic and S Jonjic. 2010. Recombinant mouse cytomegalovirus expressing a ligand for the NKG2D receptor is attenuated and has improved vaccine properties. J. Clin. Invest. 120: 4532-4545）。
【０００７】
ＭＩＣタンパク質の発現は多くの腫瘍細胞上でも誘導され、そこでその存在は、ＮＫ細胞による標的化および溶解に対してそれを感受性にし得る。驚くべきことではなく、ＭＩＣタンパク質発現の不全は、それによって多くの悪性細胞（例えば、肺ガンおよびグリオブラストーマ脳ガンのもの）が自然免疫系から逃避し得る１つの手段を構成する（Busche, A et al. 2006, NK cell mediated rejection of experimental human lung cancer by genetic over expression of MHC class I chain-related gene A. Human Gene Therapy 17: 135-146; Doubrovina, ES, MM Doubrovin, E Vider, RB Sisson, RJ O'Reilly, B Dupont, and YM Vyas, 2003. Evasion from NK Cell Immunity by MHC Class I Chain-Related Molecules Expressing Colon Adenocarcinoma (2003) J. Immunology 6891-99; Friese, M. et al. 2003. MICA/NKG2D-mediated immunogene therapy of experimental gliomas. Cancer Research 63: 8996-9006; Fuertes, MB,  MV Girart, LL Molinero, CI Domaica, LE Rossi, MM Barrio, J Mordoh, GA Rabinovich and NW Zwirner. (2008) Intracellular Retention of the NKG2D Ligand MHC Class I Chain-Related Gene A in Human Melanomas Confers Immune Privilege and Prevents NK Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Immunology, 180: 4606 -4614）。
【０００８】
ＮＫＧ２Ｄに結合したヒトＭＩＣＡの高分解能構造が解明されており、それによってＭＩＣＡのα３ドメインがＮＫＧ２Ｄとの直接的な相互作用を有しないことが実証されている（Li et al. 2001. Complex structure of the activating immunoreceptor NKG2D and its MHC class I-like ligand MICA. Nature Immunol. 2: 443-451; Protein Data Bank accession code 1HYR）。ＭＩＣＡのα３ドメインは、ＭＩＣＢのもののように、短い可動性のリンカーペプチドによってα１−α２プラットフォームドメインに連結されており、そしてそれ自体はプラットフォームとＭＩＣ発現細胞の表面との間の「スペーサー」として天然に配置されている。ヒトＭＩＣＡおよびＭＩＣＢα３ドメインの三次元構造はほぼ同一であり（９４Ｃ−αα’ｓ上二乗平均平方根距離＜１Å）、そして機能的に互換的である（Holmes et al. 2001. Structural Studies of Allelic Diversity of the MHC Class I Homolog MICB, a Stress-Inducible Ligand for the Activating Immunoreceptor NKG2D. J Immunol. 169: 1395-1400）。
【０００９】
天然α１−α２ドメインより高い親和性で天然ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体に結合するように改変されたＮＫＧ２Ｄリガンドの特定の非天然α１−α２ドメインが記載されている（Candice S. E. Lengyel, Lindsey J. Willis, Patrick Mann, David Baker, Tanja Kortemme, Roland K. Strong and Benjamin J. McFarland. Mutations Designed to Destabilize the Receptor-Bound Conformation Increase MICA-NKG2D Association Rate and Affinity. Journal of Biological Chemistry Vol. 282, no. 42, pp. 30658-30666, 2007; Samuel H. Henager, Melissa A. Hale, Nicholas J. Maurice, Erin C. Dunnington, Carter J. Swanson, Megan J. Peterson,Joseph J. Ban, David J. Culpepper, Luke D. Davies, Lisa K. Sanders, and Benjamin J. McFarland. Combining different design strategies for rational affinity maturation of the MICA-NKG2D interface. Protein Science 2012 VOL 21:1396-1402）。本明細書において、本発明者らは、非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合するように改変されたＮＫＧ２Ｄリガンドの非天然α１−α２ドメインを記載し、それ自体は２つの特異的部位において変異されており、その各々はヒトＮＫＧ２Ｄリガンドの全ての現在知られている天然α１−α２ドメインへの結合の低下または喪失を単独でもたらす（David J. Culpepper, Michael K. Maddox, Andrew B. Caldwell, and Benjamin J. McFarland. Systematic mutation and thermodynamic analysis of central tyrosine pairs in polyspecific NKG2D receptor interactions. (Mol Immunol. 2011 January; 48(4): 516-523）。
【００１０】
本発明は、（ａ）特異的に改変された非天然α１−α２ドメインおよび（ｂ）特異的に標的化する異種分子（限定するものではないが、異種ペプチドまたはポリペプチドを含む）を含む二重特異性分子を作製した。二重特異性分子はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に結合することができ、ここでＣＡＲの受容体は、それが天然α１−α２ドメインに結合するよりも高い親和性でその同族改変α１−α２ドメインに結合する非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体外部ドメインを含む。二重特異性分子の第２の特異性は、それ自体のそれぞれの標的分子に特異的に結合する異種構成要素を含む。次いで、そのようなＣＡＲおよび同族二重特異性分子を含む免疫系の遺伝子操作された細胞は、既知の重篤な全身毒性、抗原逃避、ならびに現在のＣＡＲ−ＴおよびＣＡＲ−ＮＫ細胞療法の限定的かつ制御されない持続性を含む不利益の多くを克服することができる（Kalos M, Levine, BL, Porter, DL, Katz, S, Grupp, SA, Bagg, A and June, C.. T Cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med 2011;3:95ra73; Morgan RA, Yang JC, Kitano M, Dudley ME, Laurencot CM, Rosenberg SA. Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2. Mol Ther 2010, 18:843-851）。
【００１１】
Ｔ細胞およびＮＫ細胞を、遺伝子移入技術を使用して、抗体から取得された結合ドメインによってＴ細胞に新たな抗原特性を付与する膜貫通シグナル伝達受容体をその表面上に直接的かつ安定に発現するように改変することができる（Saar Gill & Carl H. June. Going viral: chimeric antigen receptor T cell therapy for hematological malignancies. Immunological Reviews 2015. Vol. 263: 68-89; Wolfgang Glienke, Ruth Esser, Christoph Priesner, Julia D. Suerth, Axel Schambach, Winfried S. Wels, Manuel Grez, Stephan Kloess, Lubomir Arseniev and Ulrike Koehl. 2015. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front. Pharmacol. doi: 10.3389/fphar.2015.00021）。そのようなキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）は、特異的抗体の抗原認識ドメインと、ＣＤ３−ζ鎖の細胞内ドメイン（これは、内在性Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）からのシグナルの主要なトランスミッターである）とを、同時刺激分子（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、またはＯＸ４０）由来の細胞質ポリペプチド配列とともに単一のキメラタンパク質に組み合わせる、このアプローチの応用である。そのように構築されたＣＡＲは、内在性Ｔ細胞受容体と同様に、しかし主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）非依存的に、標的にされた抗原の結合に際してＴ細胞活性化を誘発することができる。
【００１２】
本明細書において使用する場合、「可溶性ＭＩＣタンパク質」、「可溶性ＭＩＣＡ」および「可溶性ＭＩＣＢ」は、ＭＩＣタンパク質のα１、α２、およびα３ドメインを含むが、膜貫通または細胞内ドメインを含まないＭＩＣタンパク質を指す。ＮＫＧ２ＤリガンドであるＵＬＢＰ１〜６は、天然にはα３ドメインを有しない（Cerwenka A, Lanier LL. 2004. NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi:10.1034/j.1399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652）。ＮＫＧ２Ｄリガンドの「α１−α２ドメイン」は、ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合するリガンドのタンパク質ドメインを指す。
【００１３】
いくつかの実施態様において、本発明の非天然ＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質のα１−α２ドメインは、ＮＫＧ２Ｄリガンドのネイティブまたは天然α１−α２ドメインに対して少なくとも８０％同一または相同である（ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、およびＯＭＣＰについてそれぞれ配列番号１〜９）。他の実施態様において、改変α１−α２ドメインは、ＮＫＧ２Ｄリガンドのネイティブまたは天然α１−α２ドメインに対して少なくとも８５％同一である。さらに他の実施態様において、改変α１−α２ドメインは、天然ＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質のネイティブまたは天然α１−α２ドメインに対して少なくとも９０％同一であり、かつ非天然ＮＫＧ２Ｄに結合する。
【００１４】
好ましくは、本発明の非天然ＭＩＣタンパク質の改変または非天然α１−α２ドメインは、ＯＭＰＣのネイティブもしくは天然α１−α２ドメイン（配列番号９）、または８つの既知のヒトＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質（配列番号１〜８）の１つに対して少なくとも８０％同一または相同であり、かつ非天然ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインに結合する。いくつかの実施態様において、非天然α１−α２ドメインは、ＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質のネイティブまたは天然α１−α２ドメインに対して少なくとも８５％同一であり、かつ非天然ＮＫＧ２Ｄに結合する。他の実施態様において、非天然α１−α２プラットフォームドメインは、ヒト天然α１−α２ドメインタンパク質のネイティブまたは天然α１−α２プラットフォームに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつ非天然ＮＫＧ２Ｄに結合する。
【００１５】
いくつかの実施態様において、可溶性ＭＩＣタンパク質の精製を補助するために、異種分子タグを可溶性ＭＩＣタンパク質の非天然α１−α２ドメインのＮ末端またはＣ末端に融合してもよい。タグ配列としては、ペプチド、例えば、ポリヒスチジン、ｍｙｃペプチド、ＦＬＡＧタグ、ストレプトアビジン様タグ、または小分子、例えばビオチンが挙げられる。そのようなタグを、当業者に公知の方法によってＭＩＣ分子の単離後に除去してもよい。
【００１６】
本発明の他の実施態様において、ＮＫＧ２Ｄリガンドのα１−α２ドメインにおける特異的変異を行って、非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合し、それ自体は天然ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する低下した親和性を有するように操作されている非天然α１−α２ドメインを作製することができる。これを、例えば、遺伝子操作を通して行うことができる。そのように改変された非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体を使用して、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、または他の免疫系の細胞の表面上に、本発明の非天然α１−α２ドメインを含む分子に優先的に結合し、それによって活性化されることができるＮＫＧ２Ｄベースのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製することができる。非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体と本発明のその同族非天然ＮＫＧ２Ｄリガンドとのこれらの対は、下記のように、現在のＣＡＲ−Ｔ細胞およびＣＡＲ−ＮＫ細胞と比較して、ガンおよびウイルス感染の処置のために重要な安全性、効力、および製造有利性を提供する。
【００１７】
ＣＡＲを用いたＴ細胞の操作はガンのための養子Ｔ細胞療法に対する有望なアプローチとして登場し、そして多くの異なる分子を標的にするＣＡＲがＣＡＲ−Ｔ細胞において悪性腫瘍のための治療薬として試験されている（Porter DL, Levine BL, Kalos M, Bagg A, June CH., 2011. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365:725-733.）。顕著な臨床効力が、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞の養子移入を受けた数百人の患者において観察されているが、特異的抗原を標的にするためのＣＡＲのカスタム操作、患者からの自己Ｔ細胞の単離、個人別のＣＡＲを発現させるための自己Ｔ細胞の遺伝子操作、インビトロでの改変細胞の拡大、およびその産生の品質管理のプロセスは、全て煩雑かつ高価であった。
【００１８】
一旦自己ＣＡＲ−Ｔ細胞がドナー患者中に注入して戻されると、インビボでのその拡大を制御することはできず、効力との用量反応関係を実証しない「生存療法（living therapy）」と称されるものを生み出す（Gill & June, 2015）。さらに、ＣＡＲ−Ｔ細胞からの腫瘍の逃避が、腫瘍細胞上の抗原喪失を通して生じ得る（Stephan A. Grupp, M.D., Ph.D., Michael Kalos, Ph.D., David Barrett, M.D., Ph.D., Richard Aplenc, M.D., Ph.D., David L. Porter, M.D., Susan R. Rheingold, M.D., David T. Teachey, M.D., Anne Chew, Ph.D., Bernd Hauck, Ph.D., J. Fraser Wright, Ph.D., Michael C. Milone, M.D., Ph.D., Bruce L. Levine, Ph.D., and Carl H. June, M.D. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells for Acute Lymphoid Leukemia. N Engl J Med 2013;368:1509-1518）。この逃避経路には、異なって標的化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を用いる逐次的治療によって、または２つ以上の特異性のＣＡＲを含むＴ細胞産物の初回注入によって取り組むことができるが、そのような工程は、製造プロセス、品質管理および費用をかなりさらに拡大させる。
【００１９】
単鎖抗体結合ドメイン（ｓｃＦｖ）を用いて腫瘍を標的にするＣＡＲ−Ｔ細胞に加えて、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンド結合ドメインを用いるＣＡＲ−Ｔ細胞が、動物において、そして最近ヒトにおいて研究されている（Sentman CL, Meehan KR. NKG2D CARs as cell therapy for cancer. Cancer J. 2014 Mar-Apr;20(2):156-9. doi: 10.1097/PPO.0000000000000029; Manfred Lehner, Gabriel Gotz, Julia Proff, Niels Schaft, Jan Dorrie, Florian Full, Armin Ensser, Yves A. Muller, Adelheid Cerwenka, Hinrich Abken, Ornella Parolini, Peter F. Ambros, Heinrich Kovar, Wolfgang Holter. Redirecting T Cells to Ewing's Sarcoma Family of Tumors by a Chimeric NKG2D Receptor Expressed by Lentiviral Transduction or mRNA Transfection. Research Article | published 15 Feb 2012 | PLOS ONE 10.1371/journal.pone.0031210; www.clinicaltrials.gov NCT02203825）。ＮＫＧ２Ｄリガンド発現はストレスを受けた細胞（例えば、腫瘍細胞）の表面上で増加するので、このファミリーの天然ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ガン免疫療法のための標的としてかなりの関心を持たれている（Spear P, Wu MR, Sentman ML, Sentman CL. NKG2D ligands as therapeutic targets. Cancer Immun. 2013 May 1;13:8.; Song DG, Ye Q, Santoro S, Fang C, Best A, Powell DJ Jr., Chimeric NKG2D CAR-expressing T cell-mediated attack of human ovarian cancer is enhanced by histone deacetylase inhibition. Hum Gene Ther. 2013 Mar;24(3):295-305）。１つのＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲは、完全長ＮＫＧ２Ｄ受容体とＣＤ３ζとの融合物であった（ＮＫＧ２Ｄζ）；別のものは、ＣＤ２８由来の膜貫通および細胞内ドメインならびにＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインから構成される第２世代ＣＡＲスキャフォールドに融合されたＮＫＧ２Ｄの外部ドメインのみを有するものであった（ＮＫＧ２Ｄ２８ζ）。ＮＫＧ２Ｄの活性化はＤＡＰ１０の存在に依存するので、ＤＡＰ１０がＮＫＧ２Ｄζと同時発現されるＣＡＲ−Ｔ細胞もまた構築された（ＮＫＧ２Ｄζ１０）。上記のＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲのいずれかを発現するＴ細胞は、ＮＫＧ２Ｄリガンド刺激に応答してＩＦＮγおよびＴＮＦαを産生し、そしてＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する腫瘍標的をインビトロで効率的に傷害した（Heather VanSeggelen, Joanne A. Hammill, Anna Dvorkin-Gheva, Daniela G.M. Tantalo, Jacek M. Kwiecien, Galina F. Denisova, Brian Rabinovich, Yonghong Wan, Jonathan L. Bramson, T cells engineered with chimeric antigen receptors targeting NKG2D ligands display lethal toxicity in mice, Molecular Therapy 2015 Oct; 23(20):1600-10; doi:10.1038/mt.2015.119）。広範囲の腫瘍サブタイプに対するＮＫ細胞の細胞傷害性能力もまた、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζに基づくＣＡＲの発現によって顕著に増強され得た（Yu-Hsiang Chang, John Connolly, Noriko Shimasaki, Kousaku Mimura, Koji Kono, and Dario Campana. Chimeric Receptor with NKG2D Specificity Enhances Natural Killer Cell Activation and Killing of Tumor Cells. Cancer Res; 73(6) March 15, 2013）。
【００２０】
しかし、同系マウス宿主中への注入の後、天然ＮＫＧ２Ｄ受容体の天然リガンドに結合し、それによって活性化されるこれらのＣＡＲ−Ｔ構築物を用いて、有意な毒性が生じた。弱った身体状態、曲がった姿勢、呼吸困難、および低下した深部体温を含む毒性の徴候が、非処置対照マウスと比較して、ＮＫＧ２ＤベースのＣＡＲ−Ｔ細胞を用いて処置された腫瘍有りおよび腫瘍無しのマウスにおいて観察された。ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲ−Ｔ細胞毒性の重篤度は変動しており、ＮＫＧ２Ｄζ１０は重篤に毒性であり、ＮＫＧ２Ｄ２８ζは中程度の毒性を示し、そしてＮＫＧ２Ｄζは耐容可能であった。マウスが、ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲのいずれかを発現するＴ細胞の養子移入の前に化学療法を受けた場合、毒性の臨床症状および死亡率は悪化した（VanSeggelen et al. 2015）。化学療法および放射線照射は、その他の点で健常な組織の上にＮＫＧ２Ｄリガンドを誘導することが知られている（Xiulong Xu, Geetha S Rao, Veronika Groh, Thomas Spies, Paolo Gattuso, Howard L Kaufman, Janet Plate and Richard A Prinz.  Major histocompatibility complex class I-related chain A/B (MICA/B) expression in tumor tissue and serum of pancreatic cancer: Role of uric acid accumulation in gemcitabine-induced MICA/B expression. BMC Cancer 2011, 11:194  doi:10.1186/1471-2407-11-194; Gannage M, Buzyn A, Bogiatzi SI, Lambert M, Soumelis V, Dal Cortivo L, Cavazzana-Calvo M, Brousse N, Caillat-Zucman Induction of NKG2D ligands by gamma radiation and tumor necrosis factor-alpha may participate in the tissue damage during acute graft-versus-host disease. Transplantation. 2008 Mar 27;85(6):911-5. doi: 10.1097/TP.0b013e31816691ef.）。さらなる特徴付けによって、毒性が、全身性サイトカインストームおよび肺内での致死レベルの炎症と同時に起こることが明らかにされた。これらのデータは、標的化免疫療法のために天然ＮＫＧ２Ｄリガンドを使用する場合には非常に注意しなければならないことを警告し、そしてそのようなリガンドを標的にするＣＡＲ（特に強く活性化するＣＡＲ）のＴ細胞発現はインビボで有害であり得ることを実証する（VanSeggelen et al. 2015）。
【００２１】
天然ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合しないかまたは弱くのみ結合する非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体の外部ドメインを含むＣＡＲ−ＴまたはＣＡＲ−ＮＫ細胞は、上記の形態の活性化に供されず、従って、天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に基づくＣＡＲを発現する細胞ほど毒素産生性でない。さらに、細胞上の非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体の外部ドメインは、可溶性フォーマットのまたは骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）上の天然ＮＫＧ２Ｄリガンドによるダウンレギュレーションに供されない（Deng W, Gowen BG, Zhang L, Wang L, Lau S, Iannello A, Xu J, Rovis TL, Xiong N,Raulet DH, 2015. Antitumor immunity. A shed NKG2D ligand that promotes natural killer cell activation and tumor rejection. Science. 2015 Apr 3;348(6230):136-9. doi: 10.1126/science.1258867. Epub 2015 Mar 5）。しかし、非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体の外部ドメインを有するそのようなＣＡＲ細胞が、本発明の同族非天然α１−α２ドメイン、およびその意図される標的を見出しそしてそれに結合したその異種標的化モチーフと、二重特異性分子によって係合させられると、ＣＡＲは活性化され、そしてＣＡＲ細胞のエフェクター機能が発現される。
【００２２】
非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体外部ドメインを含むＣＡＲ−ＴまたはＣＡＲ−ＮＫ細胞のサイトカイン放出および細胞溶解活性は、同族非天然α１−α２ドメインを含む係合した二重特異性分子（ここで、二重特異性分子は、一連のその標的にも係合している）の存在下以外では開始されないので、その活性化を、二重特異性分子（これは、バイオ医薬として、当該分野でよく知られた薬物動態および薬力学を示す）の投与によって制御することができる。有害事象が発生する場合には、医師は、現在行われているような注入されたＣＡＲ細胞を破壊するための誘導自殺機構を配備しなければならないというよりむしろ、単に、投与される二重特異性分子の投与計画を修正することができる（Monica Casucci and Attilio Bondanza. Suicide Gene Therapy to Increase the Safety of Chimeric Antigen Receptor-Redirected T Lymphocytes. J Cancer. 2011; 2: 378-382）。さらに、異なる特異的標的化モチーフを有するそのような二重特異性分子を、同時にまたは逐次的に投与して、複数の異なる自己ＣＡＲ細胞を作製、拡大および注入しなければならないことはなしに、標的抗原喪失の結果としての腫瘍耐性および逃避への取り組みを補助することができる（Gill & June, 2015）。全てのＣＡＲ構築を全てのＣＡＲ細胞について同一にすることができ、そして標的化特異性は、単純に、投与される本発明の二重特異性分子の標的化モチーフによって決定されるので、ＣＡＲ細胞製造プロセスは単純化され、より高価でなくなる。
【００２３】
ＮＫＧ２Ｄリガンドの非天然α１−α２ドメインへの結合のための候補である親またはレシピエントタンパク質またはポリペプチドの例としては、限定するものではないが、抗体、Ｉｇ折りたたみ構造またはＩｇドメインを含むタンパク質（天然分子をリクルートするかまたは天然分子をリクルートしないかもしくは天然分子に結合しない改変Ｆｃドメインを含む）、グロブリン、アルブミン、フィブロネクチンおよびフィブロネクチンドメイン、インテグリン、蛍光タンパク質、酵素、外膜タンパク質、受容体タンパク質、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体、ウイルス抗原、ウイルスカプシド、細胞受容体に対するウイルスリガンド、ヒストン、ホルモン、サイトカインおよび改変サイトカイン（例えば、インターロイキン）、ノッチン、環状ペプチドまたはポリペプチド、主要組織適合性（ＭＨＣ）ファミリータンパク質、ＭＩＣタンパク質、レクチン、およびレクチンのリガンドが挙げられる。多糖、デンドリマー、ポリグリコール、ペプチドグリカン、抗生物質、およびポリケチドのような非タンパク質分子を結合させて、ＮＫＧ２Ｄリガンドのα１−α２ドメインを改変することも可能である。
【００２４】
このように、本発明は、これらの現在の認識されている困難性の多くを克服しながら、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞、およびＣＡＲ−マクロファージ様細胞を用いるガンの管理に対するこの顕著で非常に有望な免疫学的アプローチの多様性および実用性を拡大する。
【００２５】
本明細書において使用する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、互換的に使用され；そして「異種分子」、「異種ペプチド」、「異種配列」または「異種原子」は、対象分子と物理的に結合して天然または通常には見出されない、それぞれ、分子、ペプチド、核酸もしくはアミノ酸配列、または原子である。本明細書において使用する場合、「非天然」および「改変」は互換的に使用される。本明細書において使用する場合、「天然」、「ネイティブ」、および「野生型」は互換的に使用され、そして「ＮＫＧ２Ｄ」および「ＮＫＧ２Ｄ受容体」は互換的に使用される。本明細書において用語「抗体」は、それが所望の生物学的活性を示す限り、最も広い意味で使用され、そしてモノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを具体的にカバーする。「抗体フラグメント」は、抗体の部分（好ましくはその抗原結合領域を含む）を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメントおよび挿入可能Ｆｖ（insertible Fv）；ダイアボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。「抗体フラグメント」は、抗体のＦｃ部分も含み得る。
【００２６】
「含む（including）」、「含む（containing）」および「によって特徴付けられる」と互換的に使用される用語「含む（comprising）」は、包括的なまたは制限のない語であり、そして追加の記載されていない要素または方法工程を排除しない。用語「からなる」は、クレームにおいて特定されていないいかなる要素、工程、または成分をも排除する。用語「本質的にからなる」は、クレームの範囲を、特定された材料または工程およびクレームされた発明の基本的な新規の特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。本開示は、これらの用語の各々の範囲に対応する本発明の組成物および方法の実施態様を意図する。従って、記載された要素または工程を含む組成物または方法は、その中で組成物または方法が、本質的にそれらの要素または工程からなるかまたはそれらの要素または工程からなる特定の実施態様を意図する。
【００２７】
本明細書において引用される全ての参考文献は、以前に特定して組み込まれているか否かにかかわらず、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。本明細書において使用する場合、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ａｎｙ」は各々、単数形および複数形の両方を含むことが意図される。
【００２８】
本発明をここで十分に記載したが、それを、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そして過度な実験なしに、広範な同等のパラメーター、濃度、および条件内で実施できることを当業者は認識する。本発明をその特定の実施態様に関連して記載したが、さらなる改変が可能であることが理解される。本出願は、一般に、本発明の原理に従った、そして本発明が関係し、そして上述の本質的な特徴が適用され得る技術分野内で既知のまたは慣習的な実行の範囲内にある本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用、または応用をカバーすることを意図する。
【実施例】
【００２９】
改変ＮＫＧ２Ｄ受容体外部ドメインおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１−α２ドメイン
実施例１．不活性ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインを作製するためのヒトＮＫＧ２Ｄ受容体のチロシン１５２のアラニンへの（Ｙ１５２Ａ）およびチロシン１９９のフェニルアラニンへの（Ｙ１９９Ｆ）の改変
ヒトＮＫＧ２Ｄにおけるチロシン１５２またはチロシン１９９（ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインの７５位および１２２位と同等）における変異（図１Ａ、配列番号１７）が天然リガンドＭＩＣＡへの結合を大いに低下させ得ることが他者によって実証されている（David J. Culpepper, Michael K. Maddox, Andrew B. Caldwell, and Benjamin J. McFarland. Systematic mutation and thermodynamic analysis of central tyrosine pairs in polyspecific NKG2D receptor interactions. Mol Immunol. 2011 January; 48(4): 516-523）。本発明者らは、いずれかのチロシン残基の変異はＮＫＧ２Ｄがその天然リガンドに結合する能力に大いに影響を及ぼすが、チロシン１５２（Ｙ１５２）およびチロシン１９９（Ｙ１９９）の両方における同時変異は全てのネイティブリガンドを係合させる受容体の能力を実質的に消失させるであろうと推論した。それゆえ、本発明者らは、いかなる天然リガンドをも係合させることができない単一および二重両方の変異バリアントを同定する目的で、個別のおよび組み合わせのＹ１５２およびＹ１９９置換の探索およびその生化学的挙動に関するそれらの特徴付けに努めた。良好に発現およびアセンブルもされるバリアントに特に着目した。なぜならこれらは、分析のためにより容易に産生され得る不活性リガンドであることを意味したからである。
【００３０】
天然ＮＫＧ２Ｄ（野生型）外部ドメイン（ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ、配列番号１７）および候補非天然ＮＫＧ２Ｄバリアント外部ドメイン（配列番号１８〜３５）（「操作ＮＫＧ２Ｄ」または「ｅＮＫＧ２Ｄ」とも称する）を、短い第Ｘａ因子認識可能Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇリンカーを介して、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｆａｂドメインなし）のＣ末端への融合物としてクローン化した（配列番号３８）。それらを互換的にＦｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔまたはＮＫＧ２Ｄ．ｗｔおよびＦｃ−ｅＮＫＧ２ＤまたはｅＮＫＧ２Ｄという（配列番号４０〜５８）。ＭＨＣＩシグナル配列（配列番号３６および３７）、リンカーを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号３９）、およびＮＫＧ２Ｄ外部ドメインバリアント（配列番号５９〜７７）に対応するｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Integrated DNA Technologies, San Diego, CA）を合成し、そしてｐＤ２６１０−Ｖ１２（ATUM, Newark, CA）中に挿入した。Ｙ１５２、Ｙ１９９、またはＹ１５２／Ｙ１９９変異の組み合わせにおける置換を探索するＤＮＡ構築物（図２）を、Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）において一過性に発現させ、そして分泌されたタンパク質をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（cat. no. 20334, Pierce Biotechnology, Rockford, IL）によって精製した。溶出された材料をＡｋｔａ  Ｐｕｒ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって特徴付け、そして適正にアセンブルされたサイズが適切な材料を、アッセイに含める前に凝集物ピークから分画および単離した。
【００３１】
精製されたＮＫＧ２Ｄ．Ｙ１９９Ａ−Ｆｃ融合物のＳＥＣ特徴付けによって、優勢に凝集された材料の組成が明らかとなった（図３）。比較として、天然Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ融合物およびＦｃ−ＮＫＧ２Ｄ．Ｙ１５２Ａ融合物材料の両方を、より迅速に移動する凝集物から容易に区別される分離した非凝集ピークによって区別した。凝集に対するＹ１９９Ａ変異の効果は、Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ａ二重変異Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ融合バリアントにおいても明白であった。このことは、それがタンパク質ミスフォールディングに対する主要な影響を有することを示す（図３）。ＮＫＧ２ＤバリアントにおいてＹ１５２変異の任意の組み合わせとともにＹ１９９Ａを含めるこの態様は、それゆえ、その後の操作努力に必要な材料の産生についての課題を提示し、細胞表面上でのアセンブリおよび提示についての懸念を起こした。結果として、より強固な分子を生じるように組み合わされ得るＹ１５２およびＹ１９９における他の置換を探索する努力をした。ｅＮＫＧ２Ｄ組み合わせＹ１５２およびＹ１９９変異体候補をＦｃ融合物として検討し、図２に詳述した。さらに、全ての精製および発現されたＦｃ−ｅＮＫＧ２Ｄ融合物候補をＳＥＣによってプロファイリングし、そのクロマトグラムによって、変動するレベルの凝集体形成が明らかとなった（図２〜４）。残基１５２において探索した単一アミノ酸置換の中で、アラニン、セリン、スレオニン、およびバリンの全てはＦｃ−ＮＫＧ２Ｄ分子のアセンブリに影響を及ぼさなかったが、Ｙ１５２−ロイシン（Ｙ１５２Ｌ）は、高度に凝集した材料をもたらした。アラニンと同様に、グルタミン酸もアスパラギン酸も１９９位において耐容されなかったが、フェニルアラニンのみが凝集体形成を中程度に増加させた。探索した変異の組み合わせのうち、Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆ、Ｙ１５２Ｓ／Ｙ１９９Ｆ、Ｙ１５２Ｔ／Ｙ１９９Ｆ、およびＹ１５２Ｆ／Ｙ１９９Ｆは所望のダイマー形成に負に影響を及ぼすことはなかったが、他の組み合わせは凝集の増加をもたらした（図２〜４）。
【００３２】
実施例２：非天然ＮＫＧ２Ｄリガンドバリアントを用いた抗体ベースの二重特異性分子「ＭｉｃＡｂｏｄｙ」の生成
ヒトＩｇＧ１に融合した非天然ＭｉｃＡバリアントを生成するために、例えば、ＭＩＣｗｅｄ（配列番号７９）およびＭＩＣ２５（配列番号８１）のα１−α２ドメインをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを、ヒトＩｇＧ１の、Ｃ末端κ軽鎖（配列番号８４）への融合のためのＡＰＴＳＳＳＧＧＧＧＳリンカー、またはＣ末端重鎖（配列番号８２）への融合のためのＧＧＧＳリンカーのいずれかをコードするポリヌクレオチドもまた導入するプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。さらに、重鎖のＣＨ２ドメイン中に、全てのＦｃγＲ受容体への結合を低下させ、従って、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を消失させる２つの変異、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ（Ｋａｂａｔ番号付け）を導入した（Shields et al., 2001 JBC, 276:6591-6604）。ＧＰＩ結合なしの野生型ＵＬＢＰ２（ＵＬＢＰ２．ｗｔ）のα１−α２ドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号１２）を同様にクローン化し、そしてリンカーおよびＩｇＧ１重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡポリヌクレオチドと融合させた。これらの二重特異性抗体（単数で「ＭｉｃＡｂｏｄｙ（商標）」、複数で「ＭｉｃＡｂｏｄｉｅｓ」と称する）は、融合α１−α２ドメインについて二価である。ｅＮＫＧ２Ｄ操作を探索する目的でＭｉｃＡｂｏｄｙを生成するために使用した抗体の例としては、限定するものではないが、トラスツズマブ（配列番号９４および９６）ならびにリツキシマブ（配列番号９８および１００）が挙げられ、これらをその後それぞれ「トラスツズマブ−ＭｉｃＡｂｏｄｙ」（例えば、配列番号１０２および１０４）ならびに「リツキシマブ−ＭｉｃＡｂｏｄｙ」（例えば、配列番号１０６）と称した。融合構築物を、Ｇｉｂｓｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA）を介して個別にｐＤ２６１０−Ｖ１２（ATUM, Newark, CA）中に挿入した。特異的抗原を認識する所定の抗体のために、重鎖をコードするプラスミドおよび天然または非天然いずれかのＮＫＧ２Ｄリガンドに融合した軽鎖をコードするプラスミドを、Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）における一過性発現のために同時トランスフェクトした。あるいは、天然または非天然いずれかのＮＫＧ２Ｄリガンドに融合した重鎖をコードするプラスミドおよび軽鎖のためのプラスミドを同時トランスフェクトした。分泌された二重特異性抗体をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（cat. no. 20334, Pierce Biotechnology, Rockford, IL）によって精製し、溶出された材料をＡｋｔａ  Ｐｕｒ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって特徴付けし、そして必要に応じて分画を行った。さらに、融合重鎖および融合軽鎖種の予想分子量を確認するために、精製されたサンプルに対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。
【００３３】
実施例３：野生型ＮＫＧ２Ｄへの増強された結合を有する、天然ＮＫＧ２Ｄ結合リガンドまたは非天然リガンドのいずれかに結合できない改変ＮＫＧ２Ｄバリアントの同定
天然（野生型）ＮＫＧ２Ｄおよび非天然ｅＮＫＧ２Ｄタンパク質の細胞外ドメインへのα１−α２バリアントの結合親和性を、プレートベースのＥＬＩＳＡ法を使用して分析した。ＳＥＣ分画された天然Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄおよび非天然Ｆｃ−ｅＮＫＧ２Ｄ融合物の各々を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中１μｇ／ｍＬのコーティング濃度を使用して、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルプレート（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）の別々のウェル上に一晩４℃でコートした。プレートを３回ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）中で２０〜２２℃で洗浄し、そしてＰＢＳ中０．５％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ−Ｂ）を用いて２時間２０〜２２℃でブロッキングした。ＭｉｃＡｂｏｄｙを、プレートに結合した天然または非天然Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ融合物に対して６０分間２０〜２２℃でＰＢＳ／０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−ＢＴ）中でタイトレートし、３回ＰＢＳ−Ｔで２０〜２２℃で洗浄し、結合した二重特異性タンパク質をＰＢＳ−ＢＴ中のＨＲＰ結合抗ヒトκ（Abcam, Cambridge MA）を使用して検出し、１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を用いて発色させた。ＵＬＢＰ２．ｗｔリツキシマブ−ＭｉｃＡｂｏｄｙ（配列番号９８および１０６）の結合は、野生型ＮＫＧ２ＤとｅＮＫＧ２Ｄバリアントとを、後者に対する結合の低下で判別し、そしてリガンドバリアント（ＭＩＣｗｅｄ（配列番号９６および１０２）ならびにＭＩＣ２５（配列番号９６および１０４））は、リガンド結合が消滅したｅＮＫＧ２Ｄバリアントの同定においてより厳密であった。３つ全ての二重特異性リガンドに対する各々のｅＮＫＧ２Ｄバリアントについての結合挙動によって、野生型およびバリアントリガンドの結合における最大の低下を導いたＮＫＧ２Ｄ改変の組み合わせが明らかとなり、そしてリード不活性ＮＫＧ２Ｄバリアントの選択が可能になった。
【００３４】
ｅＮＫＧ２Ｄバリアントのリガンドへの結合のさらなる生物物理学的分析もまた、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔシステムを使用したＢｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）（全てForteBio LLC, Fremont, CA）を用いて行った。これらの実験のために、ヒトＮＫＧ２ＤリガンドであるＭＩＣＡ−Ｆｃ、ＭＩＣＢ−Ｆｃ、ＵＬＢＰ１−Ｆｃ、ＵＬＢＰ２−Ｆｃ、ＵＬＢＰ３−Ｆｃ、およびＵＬＢＰ４−ＦｃをR&D Systems, Inc.（Minneapolis, MN）から購入した。ＭｉｃＡｂｏｄｙフォーマットのリガンドを、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃキャプチャー（ＡＨＣ）バイオセンサーチップ上に捕捉した。ベースラインを確立した後、チップを、３００ｎＭ〜０．４１ｎＭの範囲のＦｃ−ｅＮＫＧ２Ｄ融合タンパク質のタイトレーションシリーズに曝露し、そして会合／解離速度をモニターした（全ての工程をＰＢＳ−ＢＴ中で行った）。その後、Ｆｃ−ｅＮＫＧ２Ｄ融合タンパク質をＡＨＣチップ上に捕捉し、そしてＭｉｃＡｂｏｄｙをタイトレートして、結合速度を特徴付けた。
【００３５】
ＭＩＣｗｅｄまたはＭＩＣ２５のいずれかへの天然ＮＫＧ２Ｄの結合によって定義される最大応答を決定するために、天然Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ融合物をＡＨＣバイオセンサー上に捕捉し、そして２０ｎＭのトラスツズマブ−ＭＩＣｗｅｄまたは２０ｎＭのトラスツズマブ−ＭＩＣ２５  ＭｉｃＡｂｏｄｙを２分間インキュベートし、次いで解離速度を３０秒間観察した。次いで、同じ条件下での結合分析を、捕捉物質としてＦｃ−ｅＮＫＧ２Ｄ融合受容体を用いて行い、各々のｅＮＫＧ２Ｄについての結合レベルを、Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔによって確立された最大結合応答の百分率として順位付けした（図５）。ＭＩＣｗｅｄについては、Ｙ１９９Ｆ以外の全ての単一変異Ｆｃ−ｅＮＫＧ２Ｄバリアントの応答は５０％に減少した。Ｙ１９９Ｆは１００％の結合応答を維持した。しかし、全ての二重変異Ｆｃ−ｅＮＫＧ２ＤバリアントはＭＩＣｗｅｄへの結合を完全に失った。ＭＩＣ２５については、全ての単一変異Ｆｃ−ｅＮＫＧ２ＤバリアントおよびＹ１５２Ｖ／Ｙ１９９Ｆは、野生型Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ結合と比較して１００％の結合応答を維持した。しかし、Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆ、Ｙ１５２Ｓ／Ｙ１９９Ｆ、およびＹ１５２Ｔ／Ｙ１９９Ｆを含む二重変異Ｆｃ−ｅＮＫＧ２Ｄバリアントのいくつかについて結合は５０％に低下した。
【００３６】
捕捉物質としてＦｃ−ｅＮＫＧ２Ｄ融合物を用いるＥＬＩＳＡアッセイを、３００ｎＭで開始してタイトレートしたＵＬＢＰ２．ｗｔ、ＭＩＣｗｅｄ、ＭＩＣ２５  ＭｉｃＡｂｏｄｙを用いて行った（図６）。可能な場合、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してＥＣ５０値を算出した（図７）。天然ＮＫＧ２Ｄは、ＵＬＢＰ２、ＭＩＣｗｅｄ、およびＭＩＣ２５ベースのＭｉｃＡｂｏｄｙに、それぞれ１．４、０．００７、および０．００５ｎＭのＫｄ値として算出される親和性で結合した。全ての単一変異ｅＮＫＧ２Ｄ候補についてＵＬＢＰ２およびＭＩＣｗｅｄ  ＭｉｃＡｂｏｄｙに対する親和性は減少したが、ｅＮＫＧ２Ｄ候補へのＭＩＣ２５の結合は保持された。しかし、全ての二重変異ｅＮＫＧ２Ｄ候補は、Ｍｉｃａｂｏｄｙフォーマットの３つ全てのリガンド（ＵＬＢＰ２、ＭＩＣｗｅｄ、およびＭＩＣ２５）への、消失したかまたは有意に低下した結合を有していた。
【００３７】
ｅＮＫＧ２ＤバリアントであるｅＮＫＧ２Ｄ５（Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆ）、ｅＮＫＧ２Ｄ７（Ｙ１５２Ｓ／Ｙ１９９Ｆ）、ｅＮＫＧ２Ｄ８（Ｙ１５２Ｔ／Ｙ１９９Ｆ）、およびｅＮＫＧ２Ｄ９（Ｙ１５２Ｖ／Ｙ１９９Ｆ）は、Ｏｃｔｅｔ分析およびＥＬＩＳＡの両方によって、ＵＬＢＰ２、ＭＩＣｗｅｄ、およびＭＩＣ２５ベースのＭｉｃＡｂｏｄｙへの、低下または消失した結合を有していた（図５および７）。さらに、ｅＮＫＧ２Ｄ５、７、および８は最小量の凝集を有しており、このことは、２９３Ｔ発現に際してのより強固なタンパク質アセンブリを示唆する（図２）。ｅＮＫＧ２Ｄ５（配列番号４８）を、Ｏｃｔｅｔ  ＡＨＣチップ上に捕捉されたＭｉｃＡｂｏｄｙとしての野生型リガンドへの結合についてより厳密に検討した。単一変異Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ．Ｙ１５２Ａ（配列番号４１）は、天然（配列番号４０）ＮＫＧ２Ｄと比較して、全ての天然リガンドへの低下した結合を有していた（図８）。ｅＮＫＧ２Ｄ５（Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆ）の結合についての応答曲線は、Ｙ１５２Ａ  ｅＮＫＧ２Ｄと比較してさらに低下した。ｅＮＫＧ２Ｄ５（Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆ、以降「ＡＦ」または「ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ」という）を、それについて同族選択的、直交性、非天然リガンドを操作するためのリードＮＫＧ２Ｄバリアントとして選択した。
【００３８】
実施例４：非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ外部ドメインへの選択的結合を有する直交性非天然α１−α２ドメインの構築
本発明者らは、Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ  ＡＦ（配列番号４８）受容体への選択的結合を示す直交性非天然α１−α２ドメインを操作するために、ファージディスプレイを用いた。出発点として、天然野生型ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ）外部ドメインに対する高い親和性を有する非天然ＵＬＢＰ２．Ｒ８０Ｗ  α１−α２ドメイン（図１Ｂ；配列番号１０８）を、さらなる変異誘発およびファージディスプレイによるスクリーニングのための親ドメインとして選択した。ジスルフィド結合の潜在性を除くためにさらにＣ８Ｓ変異を有するＵＬＢＰ２．Ｒ８０Ｗのα１−α２ドメイン（配列番号１０８）について合成ＤＮＡライブラリーを生成した。結合状態で天然ＮＫＧ２Ｄ受容体上のＹ１５２位およびＹ１９９位に近接して配置されるリガンドのアミノ酸残基のコドンをＮＮＫコドンに置換した；ライブラリーは１５４〜１５９位におけるＮＮＫコドンからなった（図１Ｂ、配列番号１１０）。ライブラリーを、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩマイナーコートタンパク質への融合物としてクローン化し、そして変異誘発されたα１−α２ドメインバリアントを提示するファージ粒子を標準的な方法に従ってＳＳ３２０  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中で産生した（Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C., and Barbas, C. F., 3rd. (2011)）。これらのα１−α２ファージディスプレイライブラリーを、非ビオチン化天然Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ競合タンパク質の存在下でビオチン化Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦタンパク質に結合したファージクローンを選択的に捕捉することによって、非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ受容体に対する高結合親和性についてソートした。非ビオチン化天然Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄの濃度を漸増させながら競合選択を複数回繰り返すことによって選択的クローンを富化した。
【００３９】
４回の選択の後、ファージクローンを個別に９６ウェルフォーマットで整列させ、スポットＥＬＩＳＡを行って、ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔに対比しての、プレート結合した非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへの優先的差次的結合を確認した。結合したファージを、ビオチン化Ｍ１３ファージコートタンパク質モノクローナル抗体Ｅ１（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）、ストレプトアビジンーＨＲＰ検出（R&D Systems, Minneapolis, MN）、および１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ発色（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）を用いて検出した。各々のクローンについてのスポットＥＬＩＳＡシグナルを、ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ結合ファージに対するＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ結合ファージの比として表した。１４以上の比を有するファージを配列決定して、ＮＮＫ変異誘発領域内の特異的変異を同定した。図９は、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに選択的に結合した各々のα１−α２ファージバリアントについての選択されたアミノ酸残基を示す。同じ配列を表す複数のクローンが同定された場合、ＥＬＩＳＡシグナルの比をプロットし、そしてファージクローンの一貫性をデータポイントのクラスタリングによって確認した（データは示さず）。
【００４０】
ＥＬＩＳＡにおいて同定されたバリアントの３０個を個別の単独培養において拡大して、ファージの高力価マイクロバッチを生成した。精製ファージ濃度をＯＤ２６８＝０．５に規準化し、次いでプレート結合したＦｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦまたはＦｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔに対する１：３希釈シリーズに供し、ファージ検出およびＥＬＩＳＡ発色を上記のように行った。このようにしてアッセイした３０個のバリアントの全ては、アッセイしたファージの最高濃度においてさえ、ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔにほとんど〜全く結合せず、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへの選択的結合を一貫して示した（図１０）。選択されたファージはまた、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦとＮＫＧ２Ｄ．ｗｔとの間で最大半量の結合を達成するファージ濃度の２以上の対数のシフトを示した。
【００４１】
ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ選択的α１−α２ドメインバリアントが抗体融合物の文脈で特異的結合特性を保持していることを確認するために、２１個のバリアント（図１１、例えば、配列番号１１１〜１１８）をリツキシマブ抗体の軽鎖へのＡＰＴＳＳＳＧＧＧＧＳリンカーを有するＣ末端融合物としてクローン化した（配列番号１１９〜１２６）。得られた融合物を、Ｇｉｂｓｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA）を介して哺乳動物発現ベクターｐＤ２６１０−Ｖ１２（ATUM, Newark, CA）中にクローン化し、対合した完全なＩｇＧ抗体として、親抗体の重鎖（配列番号９９）とともに同時発現させた。一過性発現を製造業者のプロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３（商標）細胞（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）において行い、そして標準的なプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（cat. no. 20334, Pierce Biotechnology, Rockford, IL）を使用して精製した。非天然Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦおよび天然Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔへの各バリアントＵＬＢＰ２  α１−α２抗体融合物の結合を測定するＥＬＩＳＡによって、天然ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔと比較して有意に高いＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに向けたその結合親和性が実証された（図１１）。まとめると、これらのデータは、非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ受容体への高親和性結合、および天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に対する有意に低下した結合親和性を有する非天然直交性α１−α２ドメインの発明を実証する。さらに、これらの直交性α１−α２ドメインの抗体ポリペプチドへの融合物は、その選択的結合特性を保持しており、そしてこれを、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の文脈において、特異的抗原に向けて非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ受容体を再方向付けするために使用した。
【００４２】
実施例５：一方または他方に選択的に結合することによって非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体バリアントを判別できる非天然ＮＫＧ２Ｄリガンドの同定
ＮＫＧ２Ｄ．Ｙ１５２Ａ（以降ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡという）受容体への選択的結合を有する直交性非天然α１−α２ドメインを操作するためのファージディスプレイを、上記のように出発点として非天然ＵＬＢＰ２．Ｒ８０Ｗ  α１−α２ドメイン（配列番号１０８）を用いて行った。α１−α２ファージディスプレイライブラリーを、非ビオチン化天然Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ（配列番号４０）競合タンパク質の存在下でビオチン化Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ（配列番号４１）タンパク質に結合したファージクローンを選択的に捕捉することによって、非天然Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ受容体に対する高結合親和性についてパニングした。さらなるファージクローン検証研究によって、Ｆｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔに対比してＦｃ−ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡに優先的な結合を有するバリアントが同定された（図１２）。例えば、ＵＬＢＰ２．Ｓ３（配列番号１２７）は、ＥＬＩＳＡおよびＯｃｔｅｔ分析（両方ともモノマーのＨｉｓタグ付加および二重特異性抗体融合フォーマットで）によって、天然ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔと比較して非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡへの選択的結合を一貫して示した。このことは、非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体（実施例４におけるＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに対して、この場合はＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ）への高親和性結合を有する非天然直交性α１−α２ドメインの発明の異なる形態を表す。さらに、直交性α１−α２ドメインの抗体ポリペプチドへの融合物は、その選択的結合特性を保持しており、そしてこれを、抗体のような融合異種ペプチドによって決定される特異的分子に向けて非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体を選択的に再方向付けするために使用した。
【００４３】
ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡへの選択的結合を有する非天然α１−α２ドメイン（ＵＬＢＰ２．Ｓ３、配列番号１２７）およびＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへの選択的結合を有する非天然α１−α２ドメインが、これら２つの非天然受容体バリアントを判別することができるかどうかを決定するために、タイトレーションＥＬＩＳＡを行った。ＮＫＧＤ２．ＡＦに結合した、２１個の選択されたα１−α２バリアントの全てを、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡに対比したＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへの結合について直接比較した。これらのうち、４つが、ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔへの結合不能、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに対する強い親和性、およびＮＫＧ２Ｄ．ＡＦと比較して大いに低下したか（１５〜２０倍）または消失したＮＫＧ２Ｄ．ＹＡへの結合の特性を示した（図１３）。また、これら４つの非天然ＵＬＢＰ２  α１−α２バリアント（ＵＬＢＰ２．Ｃ、ＵＬＢＰ２．Ｒ、ＵＬＢＰ２．ＡＡ、およびＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１１、１１３、１１５、および１１７））を、野生型ＵＬＢＰ２ペプチド配列（配列番号４）と比較しての予測免疫原性プロファイルの変化について、ＮｅｔＭＨＣ４．０  Ｓｅｒｖｅｒ（９マーペプチド分析を用いる全てのＨＬＡスーパータイプ代表に対してクエリーするペプチド−ＭＨＣクラスＩ結合用；http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/）およびＮｅｔＭＨＣＩＩ  ２．３  Ｓｅｒｖｅｒ（１５マーペプチド分析を用いるＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰハロタイプに対してクエリーするペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ結合用；http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/）（両方のアルゴリズムはTechnical University of Denmarkによって開発された（http://www.bioinformatics.dtu.dk/; Andreatta M and Nielsen M, Gapped sequence alignment using artificial neural networks: application to the MHC class I system, 2016 Bioinformatics, 32:511, PMID: 26515819; Jensen KK, Andreatta M, Marcatili P, Buus S, Greenbaum JA, Yan Z, Sette A, Peters B, and Nielsen M, Improved methods for predicting peptide binding affinity to MHC class I molecules, 2018 Immunology, PMID: 29315598））を使用して検討した。ＵＬＢＰ２．Ｃ、ＵＬＢＰ２．Ｒ、およびＵＬＢＰ２．ＡＢに組み込まれた変異は予測免疫原性を増加させなかったが、ＵＬＰＢ２．ＡＡの予測免疫原性は少しのハロタイプについてわずかに増加した（図１４および１５）。ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに対するＵＬＢＰ２．Ｒの特異性およびその予測免疫原性の欠如の結果として、ＵＬＢＰ２．ＲをさらなるＥＬＩＳＡ分析のために選択して、その結合挙動を、ＵＬＢＰ２．Ｓ３（ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ選択された非天然直交性リガンド）、ＵＬＢＰ２．Ｒ８０Ｗ（野生型ＮＫＧ２Ｄに対する増強された親和性を有する非天然リガンド）、および野生型ＵＬＢＰ２（ＵＬＢＰ２．ｗｔ）のものと直接比較した。４つのリツキシマブ−ＭｉｃＡｂｏｄｙ試薬（それぞれ、ＵＬＢＰ２．Ｒ、ＵＬＢＰ２．Ｓ３、ＵＬＢＰ２．Ｒ８０Ｗ、およびＵＬＢＰ２．ｗｔについて重鎖および軽鎖として配列番号９８および１２１、９８および１２９、１３１および１００、ならびに９８および１０６）を、野生型ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ）ならびに２つの不活性非天然バリアントＮＫＧ２Ｄ．ＹＡおよびＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに対してアッセイした（図１６Ａおよび１６Ｂ）。データは、ＭｉｃＡｂｏｄｙとしてのＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ選択されたバリアントＵＬ��Ｐ２．Ｓ３は、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡに高親和性で結合するが、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦまたは天然ＮＫＧ２Ｄを係合させないことを実証した。さらに、ＭｉｃＡｂｏｄｙフォーマットのＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ選択されたバリアントＵＬＢＰ２．Ｒは、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに高親和性で結合したが、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡまたは天然ＮＫＧ２Ｄを係合させなかった。これらの結果は、ＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣリガンド軸の探索、および新規で選択的な非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体とそのそれぞれの同族非天然ＭＩＣリガンド結合パートナーとの特有の対の開発の、非常に大きな可能性を実証する。
【００４４】
実施例６：非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ外部ドメインを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞の標的化および傷害活性は異種標的化ポリペプチドに融合された直交性α１−α２ドメインによって制御される
ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を選択的に制御する手段が、毒性の軽減および腫瘍に対する効力改善のために非常に求められている（Gill and June, 前出）。ＣＤ１６の外部ドメイン（これは、次いで、治療用モノクローナル抗体のＦｃドメインを介して係合されて、ＣＡＲ−Ｔ標的化の抗体ベースの制御を可能にする）を使用してＣＡＲを開発する試みが以前になされた（Chang et al., 前出）。しかし、ＣＤ１６ベースのＣＡＲ−Ｔ細胞は血液および組織中のほぼ全ての内在性抗体分子を認識し得、そしてこれらの細胞を制御するために使用される治療用抗体は、ＮＫ細胞、ＰＭＮ、単球およびマクロファージ上の内在性ＣＤ１６受容体からの競合に遭遇する。これらの特徴の両方は、それぞれオフ腫瘍（off-tumor）毒性および乏しい薬物動態の問題に寄与する。
【００４５】
天然ＮＫＧ２Ｄリガンドは、特定の健常組織および多くのストレスを受けた組織上に存在し、現在のＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲアプローチを使用した毒性に非常に大きなリスクを生み出している（VanSeggelen et al. 2015）。Ｙ１５２Ａ非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体は非天然α１−α２ドメインＮＫＧ２Ｄリガンドに特異的に結合し、それによって非天然ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲの活性が、本発明のＮＫＧ２Ｄリガンドの非天然α１−α２ドメインを含む二重特異性タンパク質を使用して選択的に制御され得る手段の例を構成する。
【００４６】
本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄの改変Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆ（「ＡＦ」）外部ドメイン（これは、全ての天然ＮＫＧ２ＤリガンドまたはＹ１５２Ａ改変ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ）に直交性および同族の以前に記載された非天然α１−α２ドメインへの結合を欠く）を含む受容体を用いてＣＡＲ−Ｔ細胞を操作した。本発明の同族非天然α１−α２ドメインは、非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ外部ドメインに高親和性で結合し、そして天然ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインおよびＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ外部ドメインへの結合を回避した。従って、天然ＮＫＧ２Ｄおよび非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡと比較して非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ外部ドメインに対する強い選択性を示した操作したα１−α２ドメインは、非天然ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲ受容体、または本発明の非天然α１−α２ドメインによって選択的に係合され得る非天然ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインに融合された任意の受容体もしくはタンパク質の選択的制御のための理想的な系を表す。本発明はさらに、各々が明白に異なる細胞内ドメインを用いてシグナル伝達する、２つの異なるＣＡＲ（１つはＮＫＧ２Ｄ．ＹＡを含み、他方はＮＫＧ２Ｄ．ＡＦを含む）を発現する単一細胞を可能にする。これらの異なるＣＡＲは、それぞれの同族直交性ＭｉｃＡｂｏｄｙまたは別の非抗体融合ポリペプチドへの細胞外曝露による細胞の活性の独立した二重制御を有する。
【００４７】
非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ外部ドメインを配置したキメラ受容体を用いて構築されたＣＡＲ−Ｔ細胞の選択的制御を実証するために、本発明者らは、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ構築物を使用した以前の研究（Campana特許第８，３９９，６４５号）に基づき、それぞれのＮＫＧ２Ｄ外部ドメインをＣＡＲのＣＤ８ヒンジ領域に融合して、天然ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ（配列番号１３５）、非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ（配列番号１３７）、または非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ（配列番号１３９）外部ドメインのいずれかを用いてＣＡＲを構築した（配列番号１５１、１５３、１５５）。これらの構築物（配列番号１５２、１５４、１５６）をレンチウイルスベクター中にクローン化し、そしてレンチウイルス形質導入を使用して初代ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現させた。ＨｅＬａ細胞はその表面上に構成的にアップレギュレートされたレベルのＭＩＣリガンド（ＭＩＣＡ，ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ３、およびＵＬＢＰ２／５／６（これを確認するために使用した抗体はこれら３つのＵＬＢＰを区別することができない；Ｈｕｍａｎ  ＵＬＢＰ−２／５／６  Ａｎｔｉｂｏｄｙ, R&D Systems, Minneapolis, MN）を含む）を有する。ＨｅＬａ細胞を、その表面上に天然ＵＬＢＰ１またはＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ選択されたバリアントＵＬＢＰ２．Ｒのいずれかをも過剰発現するようにトランスフェクトし、そしてこれらの細胞をインビトロ傷害アッセイのための標的として使用した。ＨｅＬａ標的細胞にカルセインを前負荷し、ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ−ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ−ＣＡＲ、または  ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ−ＣＡＲ  ＣＤ８細胞に、漸増するエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で５時間曝露し、その後、上清中に放出されたカルセインの量を定量し、界面活性剤処理に際して放出された総カルセインに対して規準化した（図１７Ａ〜１７Ｃ）。ＨｅＬａ細胞の表面上に天然に発現される上昇したレベルのＭＩＣリガンドに起因して、ＣＡＲとして天然ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ）を発現するＣＤ８細胞は、この過剰発現された天然リガンドを介してＨｅＬａ細胞を係合させ、そして細胞溶解をもたらした。しかし、ＮＫＧＤ．ＹＡ−およびＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ−ＣＡＲ形質導入したＣＤ８細胞は両方とも、高Ｅ：Ｔ比でさえ天然ＨｅＬａ細胞の非常に少しの溶解しか示さなかった（非形質導入ＣＤ８  Ｔ細胞と同等の活性レベル）。ＵＬＢＰ１をＨｅＬａ細胞の表面上で過剰発現させた場合、ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ−ＣＡＲ  ＣＤ８  Ｔ細胞のみがそれを有意に溶解させた。ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ−ＣＡＲ細胞について高いＥ：Ｔ比でいくらかのさらなる傷害が存在するが、これはＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ−ＣＡＲ細胞については存在せず、このことは、二重変異Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆが、単一Ｙ１５２Ａ変異よりも、ＮＫＧ２Ｄをいっそう不活性にすることを示す。ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ選択された非天然ＵＬＢＰ２．Ｒを過剰発現するＨｅＬａ細胞において、ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ−ＣＡＲ細胞は溶解を指図し（内在性ＭＩＣリガンドの認識に起因して）、一方、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ−ＣＡＲ細胞は、受容体およびその選択的リガンドの係合と一致して、有意なレベルの溶解を指図した。
【００４８】
ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ−またはＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ−ＣＡＲ細胞のいずれかの溶解が、適切な同族標的化ＭｉｃＡｂｏｄｙによってのみ指図され得ることを実証するために、Ｒａｍｏｓ細胞を、非天然ＵＬＢＰ２．Ｓ３またはＵＬＢＰ２．Ｒ直交性リガンドのいずれかに結合したリツキシマブベースのＭｉｃＡｂｏｄｙと組み合わせて、細胞溶解の標的として使用した。図１８Ａにおいて実証されるように、リツキシマブ−ＵＬＢＰ２．Ｓ３  ＭｉｃＡｂｏｄｙは、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ−ＣＡＲ  ＣＤ８細胞の細胞傷害活性を指図することができたが、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ−ＣＡＲ細胞の細胞傷害活性を指図することはできず、一方、リツキシマブ−ＵＬＢＰ２．Ｒ  ＭｉｃＡｂｏｄｙは、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ−ＣＡＲ細胞の活性を指図することができたが、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ−ＣＡＲ細胞の活性を指図することはできなかった。このことは、２つの非天然ＵＬＢＰ２バリアントの、それについてそれらが優先的なパートナーとして操作されたその同族非天然ＮＫＧ２Ｄバリアントについての選択性をさらに実証する。ＭｉｃＡｂｏｄｙの抗体部分の特異性を実証するために、ＭｉｃＡｂｏｄｙの飽和総濃度の、リツキシマブ−ＵＬＢＰ２．Ｒ、トラスツズマブ−ＵＬＢＰ２．Ｒ（それぞれ、配列番号９５および１３３、重鎖および軽鎖）、または２つの等モルの組み合わせのいずれかとのインキュベーションによって前付与されたＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ−ＣＡＲ  ＣＤ８細胞を用いて、インビトロ傷害アッセイを行った。非結合ＭｉｃＡｂｏｄｙを洗浄によって除去した後、カルセインを前負荷したＲａｍｏｓ細胞（リツキシマブの標的であるＣＤ２０を発現する）またはＣＴ２６−Ｈｅｒ２（ヒトＨｅｒ２を発現するようにトランスフェクトされたマウス細胞株）のいずれかにＣＤ８細胞を供した。２つの異なるＥ：Ｔ比での２時間のインキュベーションの後、放出されたカルセインの量を定量した。図１８Ｂに示すように、細胞にリツキシマブ−ＭｉｃＡｂｏｄｙを前付与した場合、Ｒａｍｏｓ細胞のみが溶解され、一方、トラスツズマブ−ＭｉｃＡｂｏｄｙはＣＴ２６−Ｈｅｒ２細胞に対してのみ細胞溶解活性を指図した。しかし、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ−ＣＡＲ  ＣＤ８細胞にリツキシマブ−およびトラスツズマブ−ＵＬＢＰ２．Ｒ  ＭｉｃＡｂｏｄｙの両方を同時に前付与した場合、両方の標的細胞株は溶解され、このことは、これらのＣＡＲ細胞が（受容体とリガンドとの間で操作された選択的で特権を与えられたパートナリングによって）容易に多重化され、それによって異なる腫瘍標的を同時に係合させるよう指図されたことを実証する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【図１５−８】
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【図１５−９】
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【図１５−１０】
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【図１５−１１】
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【図１５−１２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021519287.tif 000034
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