(57)【要約】  本発明は、親細胞の色素、好ましくは蛍光色素を用いた染色に基づく、ハイブリッド生物の同定方法に関する。好適な色素は、スクシニミジルエステルカップリング色素である。本発明は、さらに、色素を用いて標識された、結果として得られるハイブリッド生物、好ましくは種間ハイブリッド生物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリッド生物を同定する方法であって、
（ａ）第１及び第２の親生物から細胞を提供し、
前記第１及び第２の生物が、交配適合性を有し、
前記第１の親生物が、前記第２の親生物と異なり、
前記第２の親生物ではなく前記第１の親生物が、栄養要求性マーカーを有し、
（ｂ）蛍光色素を用いて前記第２の親生物からの細胞を標識し、
（ｃ）前記第１の親からの細胞を、標識された前記第２の親からの細胞と、前記第１及び／又は前記第２の親生物の最適増殖温度を少なくとも５℃下回る温度でハイブリッド化させ、
（ｄ）栄養要求性の標識された細胞としてハイブリッド生物を同定する、
方法。
【請求項２】
ハイブリッド生物を同定する方法において、
−色素Ａを用いて第１の親生物からの細胞を標識し、
−色素Ｂを用いて第２の親生物からの細胞を標識し、
前記第１の親生物が、前記第２の親生物と異なり、
前記第１及び第２の親生物が、交配適合性を有し、
色素Ａと色素Ｂが蛍光色素であり、かつ色素Ａは色素Ｂと異なり、
色素Ａを用いて標識された細胞が、色素Ｂを用いて標識された細胞から区別され得、
−標識された前記第１の親生物からの細胞を、標識された前記第２の親生物からの細胞と、前記第１及び／又は前記第２の親生物の最適増殖温度を少なくとも５℃下回る温度でハイブリッド化させ、
−二重標識された細胞としてハイブリッド生物を同定する、
方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、
前記第１及び／又は前記第２の親生物からの前記細胞が、発芽後に標識された配偶子又は胞子である、方法。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法において、
前記第１又は前記第２の親生物からの前記細胞が、ディプロイドである、方法。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法において、
前記第１及び第２の親生物が、微生物である、方法。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法において、
前記第１及び第２の親生物が、酵母、好ましくはサッカロミセス・センス・ストリクト酵母である、方法。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法において、
前記第１及び第２の親生物が、異なる種であり、得られたハイブリッドが、種間ハイブリッドである、方法。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法において、
ハイブリッド生物の同定が、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により実施される、方法。
【請求項９】
請求項２から８までのいずれか一項に記載の方法において、
二重標識された細胞の同定の後に、単一標識された細胞からの前記二重標識された細胞の単離が行われる、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、
単離後の前記二重標識された細胞が、ハイブリッド生物を二重標識された細胞として同定し、単一標識された細胞から前記二重標識された細胞を単離する第２のラウンドに供される、方法。
【請求項１１】
請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法において、
色素Ａ及び色素Ｂのうちの少なくとも１つが、スクシニミジルエステルカップリング色素である、方法。
【請求項１２】
色素Ａ及び色素Ｂを用いて標識されたハイブリッド生物。
【請求項１３】
請求項１２に記載のハイブリッド生物において、
前記ハイブリッド生物は、種間ハイブリッドである、ハイブリッド生物。
【請求項１４】
請求項１２または１３のハイブリッド生物において、
前記ハイブリッド生物は、酵母である、ハイブリッド生物。
【請求項１５】
請求項１２から１４までのいずれか一項に記載のハイブリッド生物において、
前記ハイブリッド生物は、サッカロミセス・セレビシエ親株と、Ｓ．ユーバヤヌス親株との間の交配体の子孫である、ハイブリッド生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物、特に微生物、例えば酵母等の分野に関する。より具体的には、本発明は、ハイブリッド生物、特に稀少交配事象等により生み出された種間ハイブリッドの生成及び同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母は、ビール醸造［Ｋｒｏｇｅｒｕｓら、２０１７．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０１：６５−７８］、ワイン製造［Ｍａｒｓｉｔ及びＤｅｑｕｉｎ、２０１５．ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  １５：７２］、バイオ医薬品タンパク質の製造［Ｎｉｅｌｓｅｎ、２０１３．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ  ４：２０７−２１１］、並びに第１及び第２世代バイオ燃料の合成［Ｂａｌａｔ、２０１１．Ｅｎｅｒｇｙ  Ｃｏｎｖ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ５２：８５８−８７５；Ｊａｎｓｅｎら、２０１７．ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  １７：ｆｏｘ０４４］を含む様々な生物工学産業において幅広く使用されている。サッカロミセス・センス・ストリクト（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｎｓｕ  ｓｔｒｉｃｔｏ）複合体は、９個の異なる種を包含する：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．パラドキサス（Ｓ．ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、Ｓ．カリオカヌス（Ｓ．ｃａｒｉｏｃａｎｕｓ）、Ｓ．ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｓ．ミカタエ（Ｓ．ｍｉｋａｔａｅ）、Ｓ．クドリアブゼビ（Ｓ．ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、Ｓ．アルボリコラ（Ｓ．ａｒｂｏｒｉｃｏｌａ）、Ｓ．ユーバヤヌス（Ｓ．ｅｕｂａｙａｎｕｓ）、及び最近発見されたＳ．ジュレイ（Ｓ．Ｊｕｒｅｉ）［Ｈｉｔｔｉｎｇｅｒ、２０１３．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ２９：３０９−３１７；Ｎａｓｅｅｂら、２０１７．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６７：２０４６−２０５２］。異なるサッカロミセス種の間に接合後障壁が存在するが、それは種の間の種間交配は可能であるが、非結実性（ｓｔｅｒｉｌｅ）の子孫が生ずることを意味する［Ｇｒｅｉｇら、２００２．Ｐｒｏｃ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｌｏｎｄｏｎ  Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２６９：１１６７−１１７１；Ｈｏｕら、２０１４．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ  ２４：１１５３−１１５９］。いくつかの種間ハイブリッドが、多様な自然環境において、例えばスズメバチ（Ｗａｓｐ）の消化管内等に見出されるものの［Ｓｔｅｆａｎｉｎｉら、２０１６．ＰＮＡＳ  １１３：２２４７−２２５１］、サッカロミセスハイブリッドは、飼育環境において最も一般的に見出され、様々な工業的発酵プロセスで使用されている［Ｂｏｙｎｔｏｎ及びＧｒｅｉｇ、２０１４．Ｙｅａｓｔ、３１：４４９−４６２；Ｇｏｒｔｅｒ  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら、２０１７．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８３：ｅ０３２０６−１６］。例えば、より大規模な醸造は、Ｓ．セレビシエとＳ．ユーバヤナウスとの間のハイブリッドであるＳ．パストリアヌス（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）を用いて実施されるが［Ｌｉｂｋｉｎｄら、２０１１．ＰＮＡＳ  １０８：１４５３９−１４５４４］、Ｓ．パストリアヌスは、Ｓ．セレビシエの発酵能力及び糖利用と、Ｓ．ユーバヤナウスの低温許容性とを併せ持つ［Ｈｅｂｌｙら、２０１５．ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  １５：ｆｏｖ００５］。Ｓ．セレビシエ、Ｓ．クドリアブゼビ、及びＳ．ウバルムの間の様々な二重及び三重ハイブリッドがワイン醸造物から単離され��おり、芳香の生成において重要な役割を演じているものと思われる［Ｇｏｎｚａｌｅｚら、２００６．ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  ６：１２２１−１２３４］。飼育化されたサッカロミセス株の遺伝的変異に対するハイブリッド化の別の重要な寄与は、遺伝子の浸透性交雑であり、種間ハイブリッド化と、後続する親株の１つを用いた戻し交配のラウンドにより引き起こされる。そのような浸透性交雑は、多くの飼育化されたサッカロミセス株において一般的であり、また例えばサイダー醸造用のＳ．ウバルム株、及びワイン醸造用のＳ．セレビシエ株の異なる表現型に寄与する［Ｎａｕｍｏｖａら、２０１１．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １６２：２０４−２１３；Ｄｕｎｎら、２０１２．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２２：９０８−９２４］。
【０００３】
１つのハイブリッド内で２つ又はそれよりも多くのサッカロミセスゲノムが組み合わさると、その結果、相乗的効果である「ヘテロシス（ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ）」又は「雑種強勢（ｈｙｂｒｉｄ  ｖｉｇｏｒ）」と呼ばれる現象が一般的に生じ、ハイブリッドが、特定の環境において、その親のいずれかよりも良好に働くのを可能にする［Ｓｈａｐｉｒａら、２０１４．Ｈｅｒｅｄｉｔｙ  １１３：３１６］。従って、標的を定めたサッカロミセス酵母のハイブリッド化が、工業用途のための新たな、又は改善した表現型を備える菌株を生成するのに一般的に使用される。例えば、研究室製のＳ．セレビシエ×Ｓ．ユーバヤヌスハイブリッドは、その親株よりも高い耐寒性、及びオリゴ糖消費［Ｈｅｂｌｙら、２０１５．ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  １５：ｆｏｖ００５］、異なるフレーバープロファイル［Ｓｔｅｅｎｓｅｌｓら、２０１４．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８０：６９６５−６９７５］、高い発酵速度、及び高いエタノール力価［Ｋｒｏｇｅｒｕｓら、２０１５．Ｊ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４２：７６９−７７８］を示した。天然に存在するハイブリッドに加えて、自然界では単離されていない新規の種間ハイブリッド、例えばＳ．セレビシエ×Ｓ．パラドキサスハイブリッド［Ｂｅｌｌｏｎら、２０１１．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９１：６０３−６１２］、Ｓ．セレビシエ×Ｓ．ミカタエハイブリッド［Ｂｅｌｌｏｎら、２０１３．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ６２０５３；Ｎｉｋｕｌｉｎら、２０１８．Ｙｅａｓｔ  ３５：１１３−１２７］、Ｓ．セレビシエ×Ｓ．アルボリコラハイブリッド［Ｎｉｋｕｌｉｎら、２０１８．Ｙｅａｓｔ  ３５：１１３−１２７］、及びＳ．セレビシエ×Ｓ．ウバルムハイブリッド［Ｂｅｌｌｏｎら、２０１５．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９９：８５９７−８６０９；Ｌｏｐａｎｄｉｃら、２０１６．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １００：６３３１−６３４３］等が創出された。これらのハイブリッドは、両方の親株の特性を併せ持ち、その結果、発酵飲料業界からバイオ燃料の製造に及ぶ用途で利用され得る、新たな表現型多様性をもたらした［Ｐｅｒｉｓら、２０１７．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  １０：７８］。
【０００４】
ヘテロシスは、いまだ十分に理解されていない複雑な現象である。染色体コピー数の量［Ｇｏｒｔｅｒ  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら、２０１７．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８３：ｅ０３２０６−１６；Ｋｒｏｇｅｒｕｓら、２０１６．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １００：７２０３−７２２２］、異なる優性及び劣性の対立遺伝子の間の相互作用、並びにエピスタティック相互作用［Ｓｈａｐｉｒａら、２０１４．Ｈｅｒｅｄｉｔｙ  １１３：３１６］を含む、複数の要因の組み合わせにより引き起こされる可能性が極めて高い。得られた表現型は、必ずしも不明確であるとは限らない。優性で通常より複雑な表現型、例えば低温許容性又はフロキュレーション（Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）等は、親株の１つから通常完全に受け継がれる一方［Ｈｅｂｌｙら、２０１５．ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  １５：ｆｏｖ００５；Ｃｏｌｏｒｅｔｔｉら、２００６．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２３：６７２−６７６］、フレーバー化合物及びその他の二次代謝物の場合、ハイブリッドは、その親株により生成される濃度の平均付近の濃度を一般的に生成する［Ｋｒｏｇｅｒｕｓら、２０１５．Ｊ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４２：７６９−７７８；Ｂｅｌｌｏｎら、２０１１．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９１：６０３−６１２］。ヘテロシスは、種間ハイブリッド化で使用される親種だけでなく、使用される特定の株にも依存し、異系交雑の表現型の予測をよりいっそう困難にしている。例えば、異なる親株からなる、研究室製のＳ．セレビシエ×Ｓ．ユーバヤヌスハイブリッドは、特徴的な発酵特性及びフレーバープロファイルを示す［Ｋｒｏｇｅｒｕｓら、２０１７．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  １６：６６；Ｍｅｒｔｅｎｓら、２０１５．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８１：８２０２−８２１４］。結果的に、工業的に意義のあるハイブリッドの生成は、最適な特性を有する菌株を見つけるために、できるだけ多くのハイブリッドが生成及びスクリーニングされなければならない試行錯誤プロセスに立脚する［Ｓｔｅｅｎｓｅｌｓら、２０１４．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３８：９４７−９９５］。従って、新しい効率的なハイスループットスクリーニング戦略を開発することで、工業的用途において有望なハイブリッドの生成が単純化及び能率化し得る。
【０００５】
接合前障壁を有さない種からなる種間ハイブリッドは、種内交配と同様に取得可能である。ハイブリッドは、反対の交配型のハプロイド株の交配により、又は、反対の交配型を有さない菌株であって交配型遺伝子座内でヘテロ接合性が自然発生的に喪失しているものの間での稀少交配により形成される［Ｓｔｅｅｎｓｅｌｓら、２０１４．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３８：９４７−９９５］。種間ハイブリッド化の発生率は比較的低い。ハイブリッド化の頻度は、胞子間交配について１．５〜３．６％［Ｋｒｏｇｅｒｕｓら、２０１６．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １００：７２０３−７２２２；Ｍｅｒｔｅｎｓら、２０１５．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８１：８２０２−８２１４］から、稀少交配については１×１０−６〜１×１０−７ほどに低い頻度［Ｋｒｏｇｅｒｕｓら、２０１７．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  １６：６６；Ｇｕｎｇｅ及びＮａｋａｔｏｍｉ、１９７２．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７０：４１−５８］の範囲で報告されている。種間交配がそのように低頻度で生ずるので、交配培養物の大多数は、交配前親細胞及び交配後非ハイブリッド細胞から構成され、所望のハイブリッドの単離を困難なものとしている。種間ハイブリッド化の効率は、様々な方法、例えば交配を可能にする交配型の切り替えの発生率を増加させる誘導可能なＨＯ−エンドヌクレアーゼの発現等により改善可能である［Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、２０１６．Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｂｉｏｌ  ８９：１０−１７］。ハイブリッドが交配培養物内で取得される場合には、非ハイブリッド細胞よりもハイブッド化した細胞に有利に働く条件下での増殖により交配培養物から単離可能である。これは、両親株の相補的表現型を利用することにより、例えば３７℃において増殖することができるＳ．セレビシエ株と、特定の糖をより効率的に発酵可能である、又は低ｐＨにおいて増殖することができるその他のサッカロミセス種とを交配させることにより達成可能である［Ｂｉｚａｊら、２０１２．ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  １２：４５６−４６５］。そのような選択法は、例えば栄養要求性又は耐性等を有するものを得る又は排除することで容易に選択可能である親株内に選択可能な表現型を導入することにより大幅に単純化可能である。そのようなマーカーの導入は遺伝子改変を使用して容易に実現されるが［Ｈｅｂｌｙら、２０１５．ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  １５：ｆｏｖ００５；Ｐｉｏｔｒｏｗｓｋｉら、２０１２．  ＢＭＣ  Ｅｖｏｌｕｔ  Ｂｉｏｌ  １２：４６；ｄａ  Ｓｉｌｖａら、２０１５．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  １０：ｅ０１２３８３４］、このプロセスは時間がかかる可能性があり、また顧客許容性及び法令問題により、食品関連の工業的用途においてはほとんど用いられない［Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ及びＧａｔｔｏ、２０１５．Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ６：８４２−８５１］。結果として、種間ハイブリッドの構築物は、相補的栄養要求性が既に存在する菌株を交配させること、及び選択培地上でそのハイブリッドを選択することに主に立脚する。栄養要求性は自然発生する可能性があり［Ｍａｇａｌｈａｅｓら、２０１７．Ｊ  Ｉｎｄｕｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４４：１２０３−１２１３；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚら、２０１５．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７０：４４１−４４９］、又は栄養要求性株に有利に働く条件下での研究室での進化により、遺伝子工学技術を一切用いずに取得可能であり［Ｋｒｏｇｅｒｕｓら、２０１５．Ｊ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４２：７６９−７７８；Ｐｅｒｅｚ−Ｔｒａｖｅｓら、２０１２．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １５６：１０２−１１１；Ｓｃａｎｎｅｌｌら、２０１１．Ｇｅｎｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｇｅｎｅｔ  １：１１−２５］、したがってこれは、信頼性のある非ＧＭＯ技術である。しかしながら、栄養要求性が親株毎に取得されなければならず、また栄養要求性突然変異の発生頻度は低いので、交配に必要とされる栄養要求性突然変異体の取得は、時間及び労働集約的である［Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、２０１６．  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｂｉｏｌ  ８９：１０−１７］。更に、多くの工業的に意義のあるサッカロミセス株は、ポリプロイド又はアニュプロイドであり、栄養要求性突然変異体の生成を複雑にしている［Ｇｏｒｔｅｒ  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら、２０１７．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８３：ｅ０３２０６−１６；Ｐｅｒｅｚ−Ｔｒａｖｅｓら、２０１２．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １５６：１０２−１１１；Ｂｅｌｌ，１９９８．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６４：１６６９−１６７２］。
【０００６】
全体として、事前の遺伝子改変又は冗長な手順を伴わない任意の株間の交配から得られたハイブリッドを選択するハイスループットな方法は、一般的に種間交配、及び特に工業的に意義のあるハイブリッドであるサッカロミセス株の生成を大幅に単純化する。蛍光物質は、遺伝子工学を必要としない単純且つ簡潔な手順により、任意の細胞を標識するのに使用可能であるので、蛍光色素は洗練された解決策をここに提供する。好ましい色素が生存能力に与える影響は限定的である。親株の両方について異なる蛍光物質を使用するとき、ハイブリッド細胞は、二重に染色されたものとして識別可能であり、また蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して単離され得る。１９９４年において、サッカロミセス・セレビシエ及びサッカロミコプシス・フィブリゲラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｇｅｒａ）株のプロトプラストが蛍光標識され、融合され、二重染色された細胞がＦＡＣＳによりソーティングされた［Ｋａｔｓｕｒａｇｉら、１９９４．Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９：９２−９４］。この技術を使用して、３，６００個の生存能力のある潜在的融合体が、９，８００，０００個のプロトプラストのプール品からソーティングされ、そのうちの少なくとも１つはハイブリッドであることが確認された。しかしながら、プロトプラスト融合はＧＭＯ技術と考えられるので［Ｋｒｏｇｅｒｕｓら、２０１７．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０１：６５−７８］、その適用は、食品及び飲料産業においては排除される。
【０００７】
１９９８年において、２つのヘテロタリックなハプロイドのＳ．セレビシエ酵母が、異なる蛍光染色剤を用いて標識され、その後相互に交配され、そして二重染色された細胞についてＦＡＣＳを使用して富化された［Ｂｅｌｌ、１９９８．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６４：１６６９−１６７２］。２回の連続するソーティングラウンドにおいて、培養物は３３％の交配細胞から９６％の交配細胞（３倍弱の富化）まで富化された。著者らは、ディプロイドの工業的Ｓ．セレビシエ株およびハプロイドのＳ．セレビシエ株であって、ヒスチジン及びトリプトファンについて栄養要求性を有しＬａｃＺマーカーが組み込まれたものを交配するのに同一の方法を適用した。２×１０６個を超える細胞を含有するプール品から２回の連続するソーティングラウンドを行った後、５０個の二重染色された細胞のうち３個が、ヒスチジン及びトリプトファンに対するその原栄養性、ＬａｃＺ活性、並びにＰＣＲフィンガープリントによりハイブリッドとして同定されたが、但しデータは示さていない。更に、顕微鏡下でソーティングされた細胞を観察すると、ソーティングされた集団は交配された親細胞及び非交配親細胞の細胞クラスターから構成されたことが示された。従って、二重染色された細胞は単一の細胞でなく、ハイブリッドと一致するＰＣＲフィンガープリントを合わせて有する、又は選択培地の圧力下でハイブリッド化した親細胞のクラスターであることは除外されない。単一の交配細胞と細胞クラスターとを区別できないことから、ソーティング前の交配細胞の３３％という例外的な頻度が説明される可能性があり、またソーティングされた細胞内に混合集団が生じた可能性がある。この混合集団は、マーカーを有する株が使用されるときは問題ではないが、マーカーを含まない株が使用されるときには、ハイブリッド細胞を同定することは不可能なとなる。ソーティング前の稀少交配事象の初期頻度は不明であるので、富化係数を決定することはできない。種内交配は、種間ハイブリッド化よりも高い発生率を有するが［Ｍｏｒａｌｅｓ及びＤｕｊｏｎ、２０１２．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ７６：７２１−７３９］、マーカーを含まない種内交配に対するこの方法は、十分高い富化係数が達成可能な場合には、種間ハイブリッドを生成し得る。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ハイブリッド生物を同定する方法であって、第１及び第２の親生物からの細胞を提供することであって、第１及び第２の生物が交配適合性を有し、第１の親生物が第２の親生物と異なり、当該第２の親生物ではなく当該第１の親生物が栄養要求性マーカーを有することと、蛍光色素を用いて第２の親生物からの細胞を標識することと、第１の親からの細胞を、標識された第２の親からの細胞と、第１及び／又は第２の親生物の最適増殖温度を少なくとも５℃下回る温度でハイブリッド化させることと、栄養要求性の標識された細胞としてハイブリッド生物を同定することとを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明は、ハイブリッド生物を同定する方法であって、色素Ａを用いて第１の親生物からの細胞を標識することと、色素Ｂを用いて第２の親生物からの細胞を標識することであって、第１の親生物が、第２の親生物と同一であるか又は異なり、第１及び第２の生物が交配適合性を有し、色素Ａと色素Ｂが蛍光色素であり、色素Ａは色素Ｂと異なり、色素Ａを用いて標識された細胞が、色素Ｂを用いて標識された細胞から区別され得ることと、標識された第１の親からの細胞を、標識された第２の親からの細胞と、第１及び／又は第２の親生物の最適増殖温度を少なくとも５℃下回る温度でハイブリッド化させることと、二重標識された細胞としてハイブリッド生物を同定することとを含む方法を更に提供する。
【００１０】
第１及び／又は第２の親生物からの上記細胞は、好ましくは配偶子又は胞子である。より具体的には、第１及び／又は第２の親生物からの細胞は、発芽の後に標識された配偶子又は胞子である。特に酵母では、配偶子はハプロイド胞子とも呼ばれ、適切な条件において有糸分裂細胞周期に入り得る。配偶子、特にハプロイド胞子の標識は、細胞が発芽後に標識された場合には劇的に改善することが判明した。
【００１１】
第１又は第２の親生物からの上記細胞は、好ましくはポリプロイド、例えばディプロイド、トリプロイド、テトラプロイド、ペンタプロイド、又はアニュプロイド等、好ましくはディプロイドである。
【００１２】
第１及び第２の親生物は、好ましくは微生物、より好ましくは酵母、好ましくはサッカロミセス・センス・ストリクト酵母である。
【００１３】
本発明の好ましい方法では、第１及び第２の生物は、異なる種であり、及び得られたハイブリッドは、種間ハイブリッドである。
【００１４】
本発明の方法におけるハイブリッド生物の同定は、好ましくは蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により実施される。
【００１５】
本発明の好ましい方法では、二重標識された細胞の同定の後に、単一標識された細胞からの二重標識された細胞の単離が行われる。上記単離後の二重標識された細胞は、好ましくはハイブリッド生物を二重標識された細胞として同定し、及び単一標識された細胞から二重標識された細胞を単離する第２のラウンドに供される。上記第２のラウンドは、単離後の二重標識された細胞を培養した後に実施され得る。
【００１６】
蛍光色素Ａ及びＢのうちの少なくとも１つは、スクシニミジルエステルカップリング色素であり、好ましくは蛍光色素Ａ及びＢの両方は、スクシニミジルエステルカップリング色素であることが好ましい。
【００１７】
本発明は、色素Ａ及び色素Ｂを用いて標識されたハイブリッド生物を更に提供する。上記ハイブリッド生物は、好ましくは種間ハイブリッドである。上記ハイブリッド生物は、好ましくは酵母、より好ましくはサッカロミセス・セレビシエ親株とＳ．ユーバヤヌス親株との交配体の子孫である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】図１は、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ａ（ＭＡＴａ  ＵＲＡ３  ｈｉｓ３−Δ１  ｌｅｕ２−３，１１２ｔｒｐ１−２８９）×ＩＭＫ４３９（ＭＡＴαＨＩＳ３  ＴＲＰ１  ＬＥＵ２  ｕｒａ３Δ：：ＫａｎＭＸ）の種内交配の分析及び検証を示す図である。（Ａ）交配前及び交配後１８、２４、及び４２時間における未染色のＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ａ、ＣＦＳＥを用いて染色されたＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ａ、及びＶｉｏｌｅｔを用いて染色されたＩＭＫ４３９の蛍光強度のコンタープロット。各プロットについて細胞１００，０００個を分析し、各細胞のグリーン及びバイオレットの蛍光強度を示す。細胞をソーティングするのにゲート化されたエリアを使用し、各ゲートの事象発生率を割合（％）として示す。
【図１−２】図１は、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ａ（ＭＡＴａ  ＵＲＡ３  ｈｉｓ３−Δ１  ｌｅｕ２−３，１１２ｔｒｐ１−２８９）×ＩＭＫ４３９（ＭＡＴαＨＩＳ３  ＴＲＰ１  ＬＥＵ２  ｕｒａ３Δ：：ＫａｎＭＸ）の種内交配の分析及び検証を示す図である。（Ｂ）ＦＡＣＳによりソーティングされた異なる集団を対象とする、合成最少培地において増殖することができる細胞の割合（％）。交配した細胞の量は、ＹＰＤ上で増殖し、合成最少（ＳＭ）培地においてもやはり増殖することができる生存細胞の割合として決定される。（Ｃ）二重染色された集団（Ｃ＋Ｖ＋）からソーティングされた接合子細胞の顕微鏡画像（４００×）。ソーティング後の二重染色された細胞の最大１０％がこのような生理学を有した一方、残りの細胞は、正常な発芽生理を有した。（Ｄ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ａ×ＩＭＫ４３９交配体の倍数性評価。ＣＥＮ．ＰＫ１２２（ディプロイド）、ＩＭＫ４３９（ハプロイド）、及び推定交配細胞のＤＮＡ含有量を、ＤＮＡ染色及びフローサイトメトリーにより測定した。ディプロイドゲノム含有量、ハプロイドゲノム含有量、及び両者の混合物により、コロニーの３つの代表的なグラフ（左から右）を表わす。
【図２】図２は、Ｓ．ユーバヤヌスとＳ．セレビシエとの間の交配の最適化、及び推定ハイブリッドの単離を示す図である。（Ａ）ＹＰＤ及びＹＰＴ上で交配してから３０時間後の染色されたＣＢＳ１２３５７及びＩＭＫ４３９細胞の蛍光強度のコンタープロット。各プロットについて細胞１００，０００個を分析し、各細胞のグリーン及びバイオレットの蛍光強度を示す。細胞をソーティングするのにゲート化されたエリアを使用し、各ゲートの事象発生率を割合（％）として示す。（Ｂ）ＹＰＴ及びＹＰＤ上でインキュベートしてから３．５、７、２４、及び３０時間後の二重染色された集団中に存在するハイブリッドの割合（％）。割合（％）を、ＳＭ＋Ｇ４１８上で増殖することができる単一セルソーティングされたコロニーの量として計算する。（Ｃ）Ｓ．ユーバヤヌスＣＢＳ１２３５７及びＳ．セレビシエＩＭＫ４３９の胞子−細胞間の種間ハイブリッド化のためのプロトコール内の最適化されたパラメーターの概要。
【図３−１】図３は、ＣＢＳ１２３５７（Ｓ．ユーバヤヌス、胞子形成後）×ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＭＡＴａ）とＡＳ２．４９４０（Ｓ．ユーバヤヌス、胞子形成後）×Ａｌｅ２８（Ｓ．セレビシエ、胞子形成後）とのマーカーを含まない種間交配の分析及び検証を示す図である。（Ａ）ＣＢＳ１２３５７（ＣＦＳＥ染色後）×ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（Ｖｉｏｌｅｔ染色後）とＡＳ２．４９４０（ＣＦＳＥ染色後）×Ａｌｅ２８（Ｖｉｏｌｅｔ染色後）との間の交配培養物において測定された蛍光強度のコンタープロット。各プロットについて細胞１００，０００個を分析し、各集団のグリーン及びバイオレットの蛍光強度を示す。細胞をソーティングするのにゲート化されたエリアを使用し、各ゲートの事象発生率を割合（％）として図に示す。（Ｂ）構築されたマーカーを含まないハイブリッドの倍数性評価。ＣＥＮ．ＰＫ１２２（ディプロイド、レッド）、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ハプロイド、グリーン）、及びＰＣＲ確認されたハイブリッド（色付き）のＤＮＡ含有量を、ＤＮＡ染色及びフローサイトメトリーにより測定した。
【図３−２】図３は、ＣＢＳ１２３５７（Ｓ．ユーバヤヌス、胞子形成後）×ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＭＡＴａ）とＡＳ２．４９４０（Ｓ．ユーバヤヌス、胞子形成後）×Ａｌｅ２８（Ｓ．セレビシエ、胞子形成後）とのマーカーを含まない種間交配の分析及び検証を示す図である。（Ｃ）ＣＢＳ１２３５７×ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ、及びＡＳ２．４９４０×Ａｌｅ２８ハイブリッド化培養物に由来する二重染色された集団の単一細胞の単離物において、Ｓ．ユーバヤヌス及びＳ．セレビシエマーカー遺伝子の存在を確認するためのマルチプレックスコロニーＰＣＲ。ＣＢＳ１２３５７×ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄについて代表的な例を示し、全体で２２個の単離物を試験した。親株の単一細胞の単離物をコントロールとして、ハイブリッド株ＩＭＳ０４０８（Ｓ．セレビシエ×Ｓ．ユーバヤヌス）のゲノムＤＮＡと共に含めた。Ｌ：Ｇｅｎｅｒｕｌｅｒ  ５０ｂｐ  ＤＮＡラダー。矢印はハイブリッドを示し、数字は異なる単一細胞の単離物に対応する。
【図４−１】図４は、ＦＡＣＳ分析により測定された二重染色後の集団からソーティングされ、異なる倍数性を有する、ＣＦＳＥ染色されたＳ．ユーバヤヌス細胞と近赤外染色されたＳ．セレビシエ細胞との間のハイブリッド化について、その蛍光顕微鏡画像（６３０×）を示す図である。上段から下段：ＣＢＳ１２３５７（Ｓ．ユーバヤヌス、胞子形成後）×ＩＭＫ４３９（Ｓ．セレビシエ、ＭＡＴα  ｕｒａ３Δ：：ＫａｎＭＸ）、ＣＢＳ１２３５７（胞子形成後）×ＩＭＸ１４７１（Ｓ．セレビシエ、ＭＡＴａ／α  ｕｒａ３Δ：：ＫａｎＭＸ／ｕｒａ３Δ：：ＫａｎＭＸ）。
【図４−２】図４は、ＦＡＣＳ分析により測定された二重染色後の集団からソーティングされ、異なる倍数性を有する、ＣＦＳＥ染色されたＳ．ユーバヤヌス細胞と近赤外染色されたＳ．セレビシエ細胞との間のハイブリッド化について、その蛍光顕微鏡画像（６３０×）を示す図である。上段から下段：ＣＢＳ１２３５７（ディプロイド）×ＩＭＫ４３９、及びＣＢＳ１２３５７（ディプロイド）×ＩＭＸ１４７１。
【図５−１】図５は、富化されていない交配培養物に由来し異なる倍数性を有する、ＣＦＳＥ染色されたＳ．ユーバヤヌスと近赤外染色されたＳ．セレビシエ細胞との間のハイブリッド化について、その蛍光顕微鏡画像（６３０×）を示す図である。上段から下段：ＣＢＳ１２３５７（Ｓ．ユーバヤヌス、胞子形成後）×ＩＭＫ４３９（Ｓ．セレビシエ、ＭＡＴα  ｕｒａ３Δ：：ＫａｎＭＸ）、ＣＢＳ１２３５７（胞子形成後）×ＩＭＸ１４７１（Ｓ．セレビシエ、ＭＡＴａ／α  ｕｒａ３Δ：：ＫａｎＭＸ／ｕｒａ３Δ：：ＫａｎＭＸ）。
【図５−２】図５は、富化されていない交配培養物に由来し異なる倍数性を有する、ＣＦＳＥ染色されたＳ．ユーバヤヌスと近赤外染色されたＳ．セレビシエ細胞との間のハイブリッド化について、その蛍光顕微鏡画像（６３０×）を示す図である。上段から下段：ＣＢＳ１２３５７（ディプロイド）×ＩＭＫ４３９、及びＣＢＳ１２３５７（ディプロイド）×ＩＭＸ１４７１。
【図６−１】図６は、ＩＭＫ４３９（Ｓ．セレビシエ、ＭＡＴα  ｕｒａ３Δ：：ＫａｎＭＸ）をＩＭＫ４４０（Ｓ．セレビシエ、ＭＡＴα  ｕｒａ３Δ：：ＫａｎＭＸ）と交配させることによる、ＩＭＸ１４７１の構築及び検証を示す図である。（Ａ）ＹＰＤ上での３０時間の交配後における、染色後のＩＭＫ４３９（ＣＦＳＥ）及びＩＭＫ４４０（近赤外）細胞の蛍光強度のコンタープロット。細胞１００，０００個を分析し、各細胞についてグリーン及びレッドの蛍光強度を示す。細胞をソーティングするのにゲート化されたエリアを使用し、各ゲートの事象発生率を割合（％）として示す。（Ｂ）ＩＭＫ４３９×ＩＭＫ４４０交配培養物に由来する二重染色された集団について、その単一細胞の単離物におけるＭＡＴａ及びＭＡＴαの存在を確認するためのマルチプレックスコロニーＰＣＲ。交配型を、プライマー１１、１２、及び１３を用いて決定した（補足表１）。Ｌ：Ｇｅｎｅｒｕｌｅｒ  ５０ｂｐ  ＤＮＡラダー、矢印は交配細胞を示し、数字は異なる単一細胞の単離物に対応する。（Ｃ）合成最少培地（ＳＭ）、ＳＭ＋Ｇ４１８、及びＳＭ＋Ｇ４１８＋ウラシル上に播種することによる、ＩＭＫ４３９及びＩＭＸ１４７１における遺伝マーカーの存在の検証。（Ｄ）ＩＭＸ１４７１の胞子形成能力を示す顕微鏡画像（４００×）。
【図６−２】図６は、ＩＭＫ４３９（Ｓ．セレビシエ、ＭＡＴα  ｕｒａ３Δ：：ＫａｎＭＸ）をＩＭＫ４４０（Ｓ．セレビシエ、ＭＡＴα  ｕｒａ３Δ：：ＫａｎＭＸ）と交配させることによる、ＩＭＸ１４７１の構築及び検証を示す図である。（Ｅ）交配後のＩＭＫ４３９×ＩＭＫ４４０細胞の倍数性評価。ＣＥＮ．ＰＫ１２２（ディプロイド）、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ａ（ハプロイド）、及び交配細胞のＤＮＡ含有量を、ＤＮＡ染色及びフローサイトメトリーにより測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
用語「ハイブリッド」又は「ハイブリッド生物」とは、本明細書で使用されるように、異なる変種（ｖａｒｉｅｔｉｅｓ）、種、又は属の２つの生物のゲノムを組み合わせた結果である生物を指す。ハイブリッドは、好ましくは性的交配の結果であり、ハイブリッド生物は、異なる性の２つの細胞、例えば異なる交配型の２つの細胞、好ましくは２つの配偶子等が融合した結果であることを意味する。
【００２０】
用語「種間ハイブリッド」とは、本明細書で使用されるように、異なる種又は属の２つの生物のゲノムを組み合わせた結果である生物を指す。
【００２１】
用語「第１の親生物」及び「第２の親生物」とは、本明細書で使用されるように、異なる変種、種、又は属の２つの生物を指す。当該２つの生物は、ハイブリッド化適合性を有する。
【００２２】
用語「ハイブリッド化適合性を有する」とは、本明細書で使用されるように、交配可能、好ましくは性的に交配可能である２つの生物を指す。２つの生物が酵母生物であるとき、用語「交配適合性を有する」が使用され得るが、その用語は、用語「ハイブリッド化適合性を有する」に等しい。
【００２３】
用語「色素Ａ」及び「色素Ｂ」とは、細胞を染色するのに使用可能である異なる蛍光色素を指す。
【００２４】
用語「最適増殖温度」とは、本明細書で使用されるように、第１の親生物及び第２の親生物からの細胞が最適に増殖する温度を指し、細胞は全細胞周期を最速で完了することを意味する。ほとんどの植物、藻類、及び酵母は、１０℃〜５０℃、好ましくは１５〜４０℃、例えば１８℃〜２５℃等、より具体的には２０℃〜２２℃の最適増殖温度を有する。
【００２５】
用語「栄養要求性マーカー」とは、本明細書で使用されるように、生合成で使用される必須の代謝物、特にモノマーに向かう代謝経路において重要な酵素をコードするマーカー遺伝子を指す。例としてサッカロミセス・セレビシエ内のピリミジン生合成において必須の酵素であるオロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼをコードするＵＲＡ３遺伝子が挙げられる。同様に、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、及びＭＥＴ１５マーカー遺伝子は、アミノ酸であるヒスチジン、ロイシン、トリプトファン、及びメチオニンそれぞれの新規合成にとって必須の酵素をコードする。栄養要求性マーカーが存在すれば、対応する必須代謝物が存在しなくても細胞の増殖が可能になる。
【００２６】
用語「配偶子」とは、本明細書で使用されるように、受精期間中に別のハプロイド細胞と融合し得るハプロイド細胞を指す。当該ハプロイド細胞は、減数分裂と呼ばれる減数性の細胞分裂プロセスに起因する。ほとんどの生物は、２つの形態学的に異なる種類の配偶子を有する。酵母を含むいくつかの生物は、形態学的に同一種類の配偶子を有するが、しかしながら交配型領域と呼ばれる１つ又は複数の遺伝子座における対立遺伝子発現が異なる。ほとんどの植物、藻類、及び酵母生物は、ディプロイドステージとハプロイドステージの間で循環することができる。
【００２７】
用語「ディプロイド」とは、本明細書で使用されるように、２セットの染色体からなる細胞又は生物を指す。１セット目の染色体は一方の親から得られる一方、２セット目の染色体は、通常第２の親から得られる。用語「ディプロイド」は、ハプロイドと呼ばれる１セットの染色体を有する細胞及び生物から、並びにポリプロイドと呼ばれる複数セットの染色体を有する細胞及び生物から、２セットの染色体を有する細胞及び生物を区別するのに使用される。ポリプロイド細胞及び生物として、トリプロイド、テトラプロイド、ペンタプロイド、ヘキサプロイド、及びオクタプロイド細胞及び生物が挙げられる。
【００２８】
用語「アニュプロイド」とは、本明細書で使用されるように、必ずしもすべての染色体がコピー数を同じくして存在するわけではない細胞又は生物を指す。従って、染色体組は、当業者にとって公知のように、完全な染色体セットの定義された数、例えばｎ、２ｎ、３ｎ、又は４ｎ等として表すことができない。染色体異数性の語は、ユープロイド細胞とは対照的に、細胞又は生物内に異常な数の染色体が存在することを指す。アニュプロイド細胞は、染色体の余剰部分を欠いたり、また有したりし得る、又は１つ若しくは複数の染色体を欠いたり、また１つ若しくは複数の染色体の余剰を有したりし得る。
【００２９】
用語「発芽」とは、本明細書で使用されるように、種子又は配偶子が栄養（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｌｙ）増殖する能力を回復するプロセスであって、多細胞構造又は有糸分裂増殖による細胞複製を引き起こすプロセスを指す。発芽の最も一般的な例は、種子から幼芽への発芽過程である。更に、胞子から胞子発芽体（ｓｐｏｒｅｌｉｎｇ）、例えば真菌胞子からの菌糸の胞子等の増殖も、発芽と呼ばれる。更に、真菌胞子がその胞子壁から脱皮し、そして正常な代謝活性を回復する、例えば酵母において生ずるプロセスは、発芽とも呼ばれる。発芽は、多くの場合、温度、湿度、酸素供給量、及び時に明暗のような条件に依存する。
【００３０】
用語「微生物」とは、本明細書で使用されるように、単細胞又は多細胞真核生物、例えば酵母を含む菌類や、藻類等の原生生物を指す。ほとんどの微生物は単細胞である。
【００３１】
用語「酵母」とは、本明細書で使用されるように、菌界のメンバーとして分類される、真核生物の単細胞微生物を指す。最も好ましい酵母は、サッカロミセス・センス・ストリクト複合体である。サッカロミセス・センス・ストリクト複合体は、現在のところ９個の異なる種を包含する：サッカロミセス・セレビシエ、Ｓ．パラドキサス、Ｓ．カリオカヌス、Ｓ．ウバルム、Ｓ．ミカタエ、Ｓ．クドリアブゼビ、Ｓ．アルボリコラ、Ｓ．ユーバヤヌス、及び最近発見されたＳ．ジュレイ［Ｈｉｔｔｉｎｇｅｒ、２０１３．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ２９：３０９−３１７；Ｎａｓｅｅｂら、２０１７．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６７：２０４６−２０５２］。
【００３２】
細胞
生物の細胞は、例えばペプトン／酵母エキスを含む好適な培地、又は合成培地において増殖し得る。必要であれば、特定の遺伝マーカーの存在下で増殖が可能な好適な化合物、例えばＧ４１８（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−５−アミノ−６−［（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，６Ｓ）−４，６−ジアミノ−３−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−５−メチル−４−メチルアミノオキサン−２−イル］オキシ−２−ヒドロキシシクロヘキシル］オキシ−２−（１−ヒドロキシエチル）オキサン−３，４−ジオール）が、そのような化合物に対して抵抗性の細胞を特別に増殖させるために添加され得る。
【００３３】
ホモタリックなディプロイド細胞、特にホモタリックなディプロイド酵母細胞は、好ましくは、ハプロイド配偶子を取得するために、染色及び交配前に胞子形成及び発芽する。代替案として、ディプロイド細胞は染色されてもよく、またディプロイドとして直接交配されてもよい。
【００３４】
胞子形成では、細胞は、例えば濾過及び／又は遠心分離により単離され、例えばリン酸緩衝生理食塩水を用いて、又は滅菌水を用いて洗浄され、並びに胞子形成培地、例えば所与の生物に依存して、ＫＯＨの添加によりｐＨ＝７に調整され、及びアデニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、及び／又はウラシルが補充された１％（ｗ／ｖ）酢酸カリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）ラフィノース中で再懸濁され得る。胞子形成では呼吸作用要求性が高いので、細胞は、好ましくは十分な通気を可能にするプレート又はチューブ内でインキュベートされる。
【００３５】
胞子形成は、少なくとも４８時間、好ましくは４８〜９６時間、好ましくは約７２時間、１５〜２５℃、好ましくは約２０℃において実施される。細胞は、好ましくは胞子形成期間中に、約２００ＲＰＭにおいて振盪される。
【００３６】
胞子形成後、胞子は、当業者にとって公知のように単離され得る。胞子の胞子形成及び単離に関する好適なプロトコールは、Ｂｅｃｋｍａｎ及びＰａｙｎｅ、１９８３．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ  ７３：２８６−２８９；Ｅｌ−Ｇｈｏｌｌら、１９８２．Ｃａｎ  Ｊ  Ｂｏｔａｎｙ  ６０：８６２−８６８；Ｗａｎｇら、２０１６．Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６：２４９２３；Ａｌａｎｉら、１９９０．Ｃｅｌｌ  ６１：４１９−４３６を含め、公知である。
【００３７】
発芽では、胞子は、好ましくは好適な培地、好ましくは富栄養培地、例えばＹＰＤ等において、少なくとも１時間、例えば２〜１０時間、好ましくは約５時間インキュベートされる。胞子はインキュベーション期間中に撹拌されることが好ましい。インキュベーションは、好ましくは最適増殖温度、例えば２０〜３５℃、好ましくは約３０℃の温度である。
【００３８】
細胞の染色
第１及び第２生物の細胞は、細胞染色蛍光色素を用いて染色される。当該細胞染色色素は、好ましくは無毒性であり、またイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）及び／又はイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において、蛍光色素を用いて細胞を恒久的に標識するのに適する。当該細胞の染色又は細胞の標識は、好ましくは細胞形態及び／又は細胞生理に影響を及ぼさない。
【００３９】
当該細胞の標識は、直接的又は間接的な標識により実施され得る。間接的な標識には、例えば蛍光色素を用いて標識された二次抗体の使用、及びタグ化された化合物、例えばタグ化されたタンパク質であって、それに対して蛍光標識された色素を含む抗体が使用されるものの使用が含まれる。
【００４０】
標識化は、好ましくは直接的である。標識化は、好ましくは、タンパク質の一級アミン（Ｒ−ＮＨ２）や、アミン修飾されたオリゴヌクレオチド、及びその他のアミン含有分子を標識することにより実施される。
【００４１】
この場合、色素を細胞内リジン残基及びその他のアミン供給源にカップリングさせるために、色素は、好ましくはスクシニミジル基、好ましくはスクシニミジルエステルを含む。更なる好ましい色素として、チオール反応性色素であって、蛍光標識が、例えばヨードアセトアミド、マレイミド、ベンジルハロゲン化物（ｂｅｎｚｙｌｉｃ  ｈａｌｉｄｅ）、又はブロモメチルケトンとカップリングしているものが挙げられる。更に、ホールセルパッチクランピング法、イオン導入法、飲作用胞の浸透圧溶解法により細胞に導入され得る極性の色素、例えばＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＣＨ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅヒドラジド、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒヒドラジド、及びビオシチン等を含む微量注入可能な色素、並びに／或いは侵襲的技術、例えば微量注射、ホールセルパッチクランピング法、スクレープ負荷、微粒子銃、エレクトロポレーション、又は浸透圧ショック等により細胞に負荷され得る蛍光デキストランコンジュゲート若しくは蛍光マイクロスフェアが、本発明の方法において細胞を染色するのに使用可能である。
【００４２】
当該蛍光標識は、好ましくはＡｂｚ（アントラニリル、２−アミノベンゾイル）、Ｎ−Ｍｅ−Ａｂｚ（Ｎ−メチル−アントラニリル、Ｎ−メチル−２−アミノベンゾイル）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）、６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＡＭＲＡ（カルボキシテトラメチルローダミン）、Ｍｃａ（７−メトキシクマリニル−４−アセチル）、ＡＭＣＡ又はＡｍｃ（アミノメチルクマリンアセテート）、ダンシル（５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニル）、ＥＤＡＮＳ（５−［（２−アミノエチル）アミノ］ナフタレン−１−スルホン酸）、Ａｔｔｏ（例えば、Ａｔｔｏ４６５、Ａｔｔｏ４８８、Ａｔｔｏ４９５、Ａｔｔｏ５５０、Ａｔｔｏ６４７）、Ｃｙ３（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−（（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１，３，３−トリメチルインドリン−２−イリデン）プロプ−１−エン−１−イル）−３Ｈ−インドール−１−イウム塩化物）、トリスルホネート化Ｃｙ５を含むＣｙ５（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１，３，３−トリメチルインドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−３Ｈ−インドリウム塩化物）、及びＣｙ７（１−（５−カルボキシペンチル）−２−［７−（１−エチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ヘプタ−１，３，５−トリエン−１−イル］−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート）を含むシアニン（Ｃｙ）色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５３２、Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６３３、Ａｌｅｘａ６４７）、Ｂｏｄｉｐｙ（例えば、Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）ＦＬ）、Ｄｙｌｉｇｈｔ（例えば、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ５５０）、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ（エチレンジアミン又は６−アミノ−２−（２−アミノ−エチル）−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−５，８−ジスルホン酸）、並びにその誘導体から選択される。
【００４３】
第１の生物の細胞は、本明細書において以後色素Ａと呼ばれる第１の色素を用いて標識され得る一方、第２の生物の細胞は、本明細書において以後色素Ｂと呼ばれる第２の色素を用いて標識され得る。色素Ａ及び色素Ｂは蛍光色素であり、色素Ａは色素Ｂとは異なる。更に、色素Ａを用いて標識された細胞は、好ましくは、例えば励起及び／又は発光スペクトルが異なる色素を利用することにより、色素Ｂを用いて標識された細胞から区別可能である。本発明の方法において使用可能である好適な色素は、単色光源、好ましくはレーザーにより、より好ましくは紫外レーザー（約３５５ｎｍ）、バイオレットレーザー（約４０５ｎｍ）、ブルーレーザー（約４８８ｎｍ）、又はレッドレーザー（約６４０ｎｍ）により励起可能である。例えば、色素Ａは、約６３０ｎｍのレッドレーザーを用いて励起され、そして約６６１ｎｍにおいて発光する色素であり得る一方、色素Ｂは、約４９２ｎｍのブルーレーザーを用いて励起され、そして約５１７ｎｍにおいて発光する色素である。
【００４４】
好ましい色素の組み合わせには、好ましくはスペクトルのオーバーラップがない２つのエミッションフィルター（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ）により、好ましくは蛍光補正する必要がなく、明確に測定可能な色素が含まれ、より好ましくはスペクトルのオーバーラップを最低限に抑えるために、２つの異なるレーザー、例えばバイオレットレーザー（約４０５ｎｍ）、ブルーレーザー（約４８８ｎｍ）、又はレッドレーザー（約６４０ｎｍ）等を用いて励起可能である色素が含まれることは当業者にとって明白である。好ましい組み合わせであって、色素Ａを用いて染色される細胞の同定及び色素Ｂを用いて染色される細胞からの単離を可能にするものは、バイオレットレーザー及びブルーレーザーを用いて、バイオレットレーザー及びレッドレーザーを用いて、又はブルーレーザー及びレッドレーザーを用いて励起可能である蛍光色素である。
【００４５】
色素Ａ及び色素Ｂは、好ましくは、色素Ａのみ及び色素Ｂのみを有する細胞と区別して、色素Ａ及び色素Ｂの両方を有する細胞を同定及び単離することも可能にする色素である。この場合、好ましい色素として、約６３０ｎｍのレッドレーザーを用いて励起され、そして約６６１ｎｍにおいて発光する色素、及び約４９２ｎｍのブルーレーザーを用いて励起され、そして約５１７ｎｍにおいて発光する色素が挙げられる。
【００４６】
細胞の染色は、当技術分野において公知の方法により実施可能である。例えば、生物の細胞は、色素、好ましくはスクシニミジルエステルカップリング色素と共に、好ましくは０．１時間〜１日、好ましくは１０分〜オーバーナイトの期間、インキュベートされ得る。細胞は、例えば濾過又は遠心分離により濃縮され、平衡電解質溶液中でのインキュベーションが後続することが好ましい。
【００４７】
染色は、好ましくは細胞増殖を防止するために低下した温度で実施される。従って、染色は、好ましくは２０℃未満、好ましくは５℃〜１５℃、より好ましくは１０℃〜１３℃、最も好ましくは約１２℃の温度で実施される。温度を低下させることにより、細胞分裂の時間はより長くなる。
【００４８】
染色、及び染色された細胞の更なる交配及び処理は、好ましくは光量が低下した条件下、好ましくは暗い中で実施される。
【００４９】
細胞のハイブリッド化
細胞の融合を通じてハイブリッド生物を生み出すことは、ハイブリッド化と呼ばれる。細胞が、イン・ビトロ条件下でハイブリッド化した体細胞である場合には、体細胞性のハイブリッド化（ｓｏｍａｔｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）という用語が適用され得る。
【００５０】
イン・ビトロでの体細胞のハイブリッド化は、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｂａｒｓｋｉ（Ｂａｒｓｋｉら、１９６０．Ｃ  Ｒ  Ｈｅｂｄ  Ｓｅａｎｃｅｓ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２５１：１８２５−７）のグループにより最初に発見された。自然発生的なハイブリッド化は稀である。染色された親生物のハイブリッド化は、例えばポリエチレングリコールを用いて化学的に、又は不活性化されたウイルス、例えばセンダイウイルスを用いて誘発され得る。種間ハイブリッドを含む、ハイブリッドを生成するためのプロトコールが知られている。そのようなプロトコールの例は、例えば、Ｇｒｏｓｓｅｒら、１９９６．Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  ９２：５７７−５８２；Ｋｉｓａｋａら、１９９８．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  １７：３６２−３６７；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、２００２．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  １２５：３１７−３２４中に存在する。
【００５１】
親生物が酵母である場合には、ハイブリッド化又は交配は、染色された親細胞を富栄養培地、例えば１％（ｗ／ｗ）酵母エキス、２％（ｗ／ｗ）ペプトン、及び２％（ｗ／ｗ）グルコース内でインキュベートすることにより実施され得る。
【００５２】
ハイブリッド化では、例えば濾過又は遠心分離し、その後適切な培地中で細胞をインキュベートすることにより、染色細胞を相互に緊密接触させる場合もある。
【００５３】
ハイブリッド化は、好ましくは、過剰の細胞増殖を防止するために、親生物の最適増殖温度を下回る温度で実施される。温度を低下させることにより、細胞分裂により長い時間がかかる一方、ハイブリッド化はそれほど影響を受けない。従って、より高い温度におけるハイブリッド化と比較したとき、得られた細胞のより多くの割合がハイブリッド細胞である。親生物の最適増殖温度を少なくとも５℃下回るハイブリッド化温度が、色素による染色の喪失を制限し、また第１の親生物と第２の親生物との間のハイブリッド化に起因する稀な種間ハイブリッドの同定を実現することが判明した。
【００５４】
第１及び／又は第２の親生物の最適増殖温度を少なくとも５℃下回る温度は、好ましくは１８℃未満、好ましくは５℃〜１５℃、より好ましくは１０℃〜１３℃、最も好ましくは約１２℃である。当業者は、例えば異なる複数の温度において植物、藻類、及び／又は酵母の細胞を増殖させることにより、通常の最適増殖温度を有さない植物、藻類、及び／又は酵母の最適増殖温度を確実に決定することができる。
【００５５】
細胞のハイブリッド化は、当業者にとって明白であるように、好ましくは蛍光色素のブリーチングを防止するために暗い中で実施される。
【００５６】
ハイブリッド化は、好ましくは第１及び第２の親生物の細胞を、暗い中で、最適増殖温度を少なくとも５℃下回る温度で、少なくとも２時間、好ましくは２〜４８時間、例えば１２時間、１６時間、２４時間、及び３６時間等、静的にインキュベートすることにより実施される。好ましい期間はオーバーナイトであり、ルーチン的には約１６時間である。
【００５７】
細胞の単離
第１及び第２の親生物の細胞をハイブリッド化した後、ハイブリッド細胞、例えば種間ハイブリッド細胞等が同定され、そして第１及び第２の親生物から分離される。第１の親生物からの細胞は蛍光色素Ａで染色され、また第２の親生物からの細胞は色素Ｂで染色されるので、ハイブリッド細胞、例えば種間ハイブリッド細胞等は、色素Ａ及び色素Ｂの両方を用いて染色することに基づいて単離され得る。例えば、第１の親の細胞がカルボキシフルオレセインで染色され、及び第２の親の細胞はＦａｒ  Ｒｅｄで染色される場合、ハイブリッド細胞は、約６３０ｎｍのレッドレーザーを用いて励起されるとき、約６６１ｎｍにおいて発光し、また約４９２ｎｍのブルーレーザーを用いて励起されるとき、約５１７ｎｍにおいて発光するので、ハイブリッド細胞は目視可能である。
【００５８】
そのような二重染色されたハイブリッド細胞は、当技術分野において知られている任意の方法により、単一の染色細胞から単離可能である。例えば、マイクロマニピュレーターを備えた顕微鏡が、二重標識されたハイブリッド細胞を同定及び単離するのに使用され得る。
【００５９】
二重標識された細胞をソーティングする好ましい方法は、フローサイトメトリー技術、例えば蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）等を含む。ＦＡＣＳは、細胞の形態を前方散乱及び側方散乱により同時に分析可能であるという更なる長所を有する。染色パターン及び前方／側方散乱に基づき、ソーティングゲートは、ソーティングされる細胞の種類を決定するために設定可能である。ゲート化された単一細胞は、個別容器、例えばマルチウェルプレートのウェル、例えば９６ウェルマイクロタイタープレート等内で単離可能である。
【００６０】
単一ハイブリッド細胞を単離した後、該細胞は個別容器内で増殖し得る。ゲート化された細胞が、第１及び第２の親が密接に結びついた細胞を含み、二重染色された単一の細胞としてスコア化された偽陽性ハイブリッド細胞を含まないようにするため、単離後の二重標識された細胞は、二重標識された細胞としてハイブリッド生物を同定し、そして単一標識された細胞から二重標識された細胞を単離する第２ラウンドに供され得る。この第２ラウンドで使用される色素は、ハイブリッド生物が単一標識された細胞から二重標識された細胞として単離可能である限り、第１ラウンドで使用される色素と同一であっても、またそれとは異なってもよい。
【００６１】
ハイブリッド生物を同定する第２ラウンドの前に、結びついた細胞は、当業者にとって知られているように、例えば界面活性剤と共に細胞をインキュベートすること、及び／又は細胞を超音波処理若しくはボルテックス処理することにより引き離され得る。更に、細胞は、キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸、界面活性剤、並びに／又はチモリアーゼ及び／若しくはリチカーゼ等の酵素の存在下でインキュベートされ得る。
【００６２】
代替的に又は加えて、細胞の倍数性が、例えばフロー式又はレーザー走査式の細胞数計測により決定され得る。そのような方法は、蛍光色素による細胞の標識に立脚し、ＤＮＡを化学量論的に染色し、従ってＤＮＡ含有量を正確に報告するものと期待される。分析目的では、細胞の一部分が、界面活性剤及び／又は定着剤、例えばメタノール若しくはエタノール等により透過処理され、ＤＮＡ特異的蛍光色素を用いて標識され得る。例えば、細胞のサンプルは、例えばエタノールを使用して固定され得るが、また例えばＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社Ｓ７０２０）等の核酸染色剤で染色され得る。好ましくは、細胞膜の先天的な透過性に起因して、生存細胞中に侵入することができる蛍光色素、例えばＶｙｂｒａｎｔ（商標）ｄｙｅｃｙｃｌｅ（商標）色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が使用される。サンプルの蛍光は、ＤＮＡ結合蛍光染色剤の検出に適するレーザー及びエミッションフィルターを使用して、フローサイトメーター上で決定され得る。好適な条件は、４８８ｎｍレーザーによる励起、及びバンド幅が３０ｎｍの５３３バンドパスフィルターを通過する発光の検出であり得る。第１及び第２の親生物の倍数性の合計であるような、期待される倍数性を有する細胞がソーティングされ得る。例えば、第１の親生物がハプロイド（１Ｎ）であり、及び第２の親生物がディプロイド（２Ｎ）であるとき、ハイブリッド生物は３Ｎとしてスコア化され得る。
【００６３】
説明を明確化し、簡潔にするために、同一の又は分離した実施形態の一部としていくつかの特性が本明細書に記載されているが、しかしながら本発明の範囲は、記載されている特性の全部又は一部の組み合わせを有する実施形態を含み得るものと認識される。
【実施例】
【００６４】
実施例１
材料及び方法
菌株、培地、及び培養
この試験で使用されるＳ．セレビシエ及びＳ．ユーバヤヌス株は、表１に記載されている。菌株を、１０ｇ  Ｌ−１の酵母エキス及び２０ｇ  Ｌ−１のペプトンを含有し、ＹＰＤについて２０ｇ  Ｌ−１のグルコース、及びＹＰＴについて２０ｇ  Ｌ−１のトレハロースが補充された複合培地（ＹＰ）内でルーチン的に増殖させた。２０ｇ  Ｌ−１のグルコース、３ｇ  Ｌ−１のＫＨ２ＰＯ４、５．０ｇ  Ｌ−１の（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５ｇ  Ｌ−１のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｍＬ  Ｌ−１の微量元素溶液及び１ｍＬ  Ｌ−１のビタミン溶液を含有する合成培地（ＳＭ）をこれまでの記載に従い調製し［Ｖｅｒｄｕｙｎら、１９９２．Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７］、そしてｐＨを２ＭのＫＯＨを使用して６．０に設定した。０．２ｇ  Ｌ−１のＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）が補充されたＳＭ培地であって、硫酸アンモニウムがＧ４１８を妨害するため（ＮＨ４）２ＳＯ４を１ｇ  Ｌ−１のグルタミン酸一ナトリウムに置き換えたものに対応するＳＭ＋Ｇ４１８内で、ＫａｎＭＸマーカーに対する選択を実施した［Ｃｈｅｎｇら、２０００．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：ｅ１０８−ｅ１０８］。固体培地では、２０ｇ  Ｌ−１の寒天を培地に添加した。酢酸を使用してｐＨが７．０に設定された２％の酢酸カリウムを含有する胞子形成培地内で胞子形成を実施した［Ｂａｈａｌｕｌら、  ２０１０．Ｙｅａｓｔ  ２７：９９９−１００３］。サッカロミセス株を、ＹＰＤにおいて、５００ｍＬ丸底振盪フラスコ中、１００ｍＬのワーキングボリュームで、又は５０ｍＬのＧｒｅｉｎｅｒ  Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｔｏｐ  Ｔｕｂｅ中、３０ｍＬのワーキングボリュームで増殖させた。Ｓ．セレビシエ及びＳ．ユーバヤヌス培養物を、Ｉｎｎｏｖａ（登録商標）４４インキュベーターシェイカー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、ナイメーヘン、オランダ）内で、それぞれ３０℃及び２０℃、２００ＲＰＭにて増殖させた。指数関数的に増殖している振盪フラスコ培養物へのグリセロール（３０％ｖ／ｖ）の添加により凍結ストックを調製し、そして１ｍＬの一定分量で−８０℃において無菌的に保管した。
【００６５】
サッカロミセス培養物の染色
染色では、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｆａｒ  Ｒｅｄ蛍光色素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）を、製造業者の勧告に基づき調製した。培養物を、培養物１ｍＬ当たり２μＬのＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）色素で染色し、そして暗い中で、１２℃及び２００ＲＰＭ、オーバーナイトでインキュベートした。酵母エキス及びペプトンに結合することによるあらゆる残存色素を取り除くために、着色した培養物を、ＹＰ培地を用いて２回洗浄した。
【００６６】
種内交配
種内交配実験では、２つのヘテロタリックなハプロイドであるＳ．セレビシエ株を、中対数増殖期まで増殖させた。記載されている通り、培養物を洗浄し、そして無菌のＩｓｏｔｏｎ  ＩＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、Ｗｏｅｒｄｅｎ、ＮＬ）中でおよそ細胞１０６個ｍＬ−１の最終細胞密度まで稀釈し、そしてＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥで染色した。２つの染色された培養物を、１つのＧｒｅｉｎｅｒチューブ内に共に注入することにより交配させた。細胞を、ＹＰＴ中でペレット化及び再懸濁した。交配培養物をエッペンドルフチューブに移し、そして細胞の近接を高め、より効率的に交配させるために短時間遠心分離した（２０００ｇ、１分）。その後、ＦＡＣＳ分析まで、交配培養物を、暗い中、１２℃において静的にインキュベートした。
【００６７】
種間交配及び稀少交配
ホモタリックなディプロイド株を、ホモタリックなハプロイド配偶子又は他方の種のヘテロタリックなハプロイド細胞と容易に交配し得るハプロイド配偶子を取得するため、胞子形成及び発芽させた後、染色し、交配させた。稀少交配では、ディプロイド株を、上記の通り処置し、又は染色し、及びディプロイドとして直接交配させた。胞子形成では、１０ｍＬの静止期培養物をスピンダウンし、無菌の脱塩水で洗浄し、そして胞子形成は呼吸作用要求性が高いので、５０ｍＬ  Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｔｏｐ  Ｔｕｂｅ内の９ｍＬの胞子形成培地中で再懸濁して十分な通気を確保した［Ｓｈｅｒｍａｎ、１９６３．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４８：３７５］。胞子形成培養物を、２０℃及び２００ＲＰＭで少なくとも７２時間インキュベートした。子嚢の存在を顕微鏡検査を使用して決定した。既定的には、軽微な改変を施したＨｅｒｍａｎ及びＲｉｎｅの記載に従い、胞子を単離した［Ｈｅｒｍａｎ及びＲｉｎｅ、１９９７．ＥＭＢＯ  Ｊ  １６：６１７１−６１８１］。要するに、胞子をペレット化し（１０００ｇ、５分）、軟化バッファー（１０ｍＭのジチオスレイトール、１００ｍＭのトリス−ＳＯ４、Ｈ２ＳＯ４を用いてｐＨを９．４に設定）中で再懸濁し、そして３０℃で１０分間インキュベートした。脱塩水を使用して細胞を洗浄し、０．８ｇＬ−１のチモリアーゼ２０−Ｔ（ＡＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．社、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、英国）を含むスフェロプラスト化バッファー（２．１Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを７．２に設定）中で再懸濁し、そして３０℃、オーバーナイトでインキュベートした。インキュベーション後、培養物をペレット化し（１０００ｇ、１０分）、脱塩水を使用して洗浄し、そして０．５％のトリトンＸ−１００中で再懸濁した。氷上に保持しながら、５０Ｈｚ、６ミクロンの振幅でおよそ１５秒間、胞子を超音波処理した。プロトコールの初期の最適化期間中は、チモリアーゼステップのみを使用する短縮版プロトコールについてもテストした。胞子の単離を、顕微鏡を使用して確認し、そして単離した子嚢胞子を４℃で保管したか、又は速やかに使用した。発芽では、ＹＰＤを用いて胞子を既定的に１回洗浄し、その後２０ｍＬのＹＰＤ中でおよそ細胞１０６個ｍＬ−１の濃度まで再懸濁した。発芽培養物を、３０℃、２００ＲＰＭにおいて５時間、１００ｍＬ丸底フラスコ中でインキュベートした。ＹＰＤの代わりに２％のグルコース、およびＹＰＤ上、異なる回数での発芽を使用するプロトコールを、種間ハイブリッド化の初期の最適化期間中にテストした。既定的には、ハプロイドのＳ．ユーバヤヌス及びＳ．セレビシエ株を洗浄し、無菌のＩｓｏｔｏｎ  ＩＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）中でおよそ細胞個１０６ｍＬ−１の最終細胞密度まで稀釈し、そしてＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥを用いて記載の通り染色した。稀少交配では、およそ細胞２０×１０６個ｍＬ−１の最終細胞密度を使用し、そして細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｆａｒ  Ｒｅｄ及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥで記載の通り染色した。２つの染色された���養物を、１つのＧｒｅｉｎｅｒチューブ内に共に注入することにより交配させた。細胞をペレット化し、そしてＹＰＤ中で再懸濁した。交配培養物をエッペンドルフチューブに移し、そして細胞の近接性を高め、より効率的に交配させるために、短時間遠心分離した（２０００ｇ、１分）。交配培養物を、ＦＡＣＳ分析まで、暗い中、１２℃において静的にインキュベートした。
【００６８】
ＦＡＣＳ分析及びソーティング
ＦＡＣＳ分析及びソーティングするための培養物を無菌のＩｓｏｔｏｎ  ＩＩ中で稀釈し、そして短時間ボルテックス処理して細胞凝集物を破壊した。稀少交配では、５０ｍＭのＥＤＴＡを添加して、無性のフロキュレーションを残らず破壊した。培養物を、３５５ｎｍ、４４５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、及び６４０ｎｍレーザー、並びに７０μｍノズルを備えたＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩ  ＳＯＲＰ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、米国）上で分析し、そして濾過されたＦＡＣＳＦｌｏｗ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて操作した。サイトメーターの性能が適正であることを、対応するＣＳ＆Ｔ  Ｂｅａｄ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてＣＳＴサイクルを稼働させることにより、各実験に先立ち評価した。ソーティングするためのドロップディレイを、Ａｃｃｕｄｒｏｐ  Ｂｅａｄ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてＡｕｔｏ  Ｄｒｏｐ  Ｄｅｌａｙサイクルを稼働させることにより決定した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ蛍光を３５５ｎｍレーザーにより励起し、そしてバンド幅が５０ｎｍの４５０ｎｍバンドパスフィルターを通じて発光を検出し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥを４８８ｎｍレーザーにより励起し、そしてバンド幅が３０ｎｍの５４５ｎｍバンドパスフィルターを通じて発光を検出し、並びにＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｆａｒ  Ｒｅｄを６４０ｎｍレーザーにより励起し、そしてバンド幅が６０ｎｍの７８０ｎｍバンドパスフィルターを通じて発光を検出した。Ｖｉｏｌｅｔに対するＣＦＳＥプロット又はＦａｒ  Ｒｅｄに対するＣＦＳＥプロット上で、交配培養物の蛍光を分析した。側方散乱（ＳＳＣ）に対して前方散乱（ＦＳＣ）をプロットすることにより、細胞の形態を分析した。測定毎に、少なくとも１００，０００事象を分析した。ソーティングされる細胞の種類を決定するために、これらのプロット上でソーティング領域（「ゲート」）を設定した。ゲート化された単一細胞を、イールドマスク０、ピュアリティーマスク３２、及びフェーズマスク１６に対応する「単一細胞」ソーティングマスクを使用して、ＹＰＤを含有する９６ウェルマイクロタイタープレート中でソーティングした。必要な場合には、増殖時、エタノール火炎滅菌済み９６ピンレプリケーターを使用して、選択培地（ＳＭ又はＳＭ＋Ｇ４１８）を含む９６ウェルプレートに対して、コロニーをレプリカ播種した。ＦＡＣＳデータを、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（バージョン３．０５２３０、ＦｌｏｗＪｏ社、ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、米国）を使用して分析した。
【００６９】
生存能力の決定
生存率又は交配効率が低い培養物の生存率又は交配効率を決定するために、ポアソン統計学を使用した。ポアソン統計学によれば、各ウェル中で設定された数のソーティング後の細胞から現れる生存コロニーの確率は数学的に決定可能であるが（式１）、ここで式中、Ｐは、コロニー出現の確率の推定であり、またλは１ウェル当たりの生存細胞の割合である［Ｄｕｂｅら、２００８．ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ３：ｅ２８７６５０］。
【数１】
2021523709.tif 000002
式１
【００７０】
ハイブリッド細胞の合計割合（％）は、従ってλにウェル（Ｗ）の量を掛け算したものとして定義され、真の陽性の補正後の量をもたらす。これは、全集団に占めるハイブリッドの収率を決定するために、ソーティングされた細胞の量により除算される（式２）。
％ハイブリッド＝（λ＊Ｗ）／（ソーティングされた全細胞）
式２
【００７１】
生存率が高い実験では、各ウェルにおいて１つの細胞のみがソーティングされるので、１つのウェル内で複数事象が生ずる確率についてポアソン補正は適用されなかった（式１）。ここでは、コロニーの量をカウントし、そしてソーティングされた細胞の量で除算することにより、生存率（％）を計算した。
【００７２】
画像化
Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｚ１（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ社、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）を使用して細胞を画像化した。蛍光画像化では、異なる蛍光物質について異なるフィルターセットを使用しながら、キセノンランプで細胞を励起した。１つの蛍光物質から他方のチャンネルへのブリードスルーが最低限に抑えられるように、フィルターセットを選択した。バンド幅が２０ｎｍの４７０ｎｍバンドパス励起フィルター及びバンド幅が２５ｎｍの５４０ｎｍエミッションフィルターを含有するＧＦＰフィルターセット（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ社）を通じて、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥからの蛍光を画像化した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｆａｒ  Ｒｅｄを、バンド幅が３０ｎｍの６４０ｎｍバンドパス励起フィルター、及びバンド幅が５０ｎｍの６９０ｎｍエミッションフィルターを含有するＣｙ５フィルターセット（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ社）を通じて画像化した。ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  ＳＥ６４（Ｒｅｌ．４．９．１．Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ社、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）及びＦＩＪＩを使用して画像を処理した［Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎら、２０１２．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：６７６−６８２］。
【００７３】
フローサイトメトリーによる倍数性の決定
倍数性の決定では、これまでの記載に従い、エタノールを使用してサンプルを固定した［Ｈｅｂｌｙら、２０１５．ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  １５：ｆｏｖ００５］。記載されている通りに［Ｈａａｓｅ及びＲｅｅｄ、２００２．Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  １：１１７−１２１］、但しいくつかの軽微な改変を施して、ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社Ｓ７０２０）による細胞の染色を実施した。細胞を、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）中で洗浄し、そして１００μＬのＲＮａｓｅ溶液（５０ｍＭのトリス−Ｃｌに溶解した１ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ  Ａ）中に再懸濁した。既定的には、１００μＬの細胞を、１ｍＬのＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ溶液に添加した。大量のサンプルを処理するとき、ＰＩＰＥＴＭＡＮ（登録商標）Ｍマルチチャンネル電動ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ社、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ、米国）と共に、９６ウェルマイクロタイタープレート内でのハイスループットプロトコールを使用した。この改変されたプロトコールでは、１５０μＬの７０％エタノールを添加することにより、１００μＬのサンプルを固定し、そして最終ステップでは、２０μＬのサンプルを１８０μＬのＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ溶液に添加した。未染色コントロールをサンプル毎に含めた。サンプルの蛍光を、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６  ＣＳａｍｐｌｅｒ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）上で測定した。フローサイトメーターの４８８ｎｍレーザーを用いて蛍光物質を励起し、そしてバンド幅が３０ｎｍの５３３バンドパスフィルターを通じて発光を検出した。倍数性データを、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（バージョン３．０５２３０、ＦｌｏｗＪｏ社）を使用して分析した。
【００７４】
ＰＣＲによる種間ハイブリッドの同定
Ｓ．セレビシエ及びＳ．ユーバヤヌスに由来する遺伝物質の存在を、ＰＣＲにより確認した。水、プライマー、及び２Ｘ  ＤｒｅａｍＴａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）を含有するマスター混合物を調製した。Ｓ．セレビシエ（８５７０＆８５７１、表３を参照）及びＳ．ユーバヤヌス（８５７２＆８５７３、表３）に対して特異的なプライマー［Ｍｕｉｒら、２０１１．ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  １１：５５２−５６３；Ｐｅｎｇｅｌｌｙ及びＷｈｅａｌｓ、２０１３．ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  １３：１５６−１６１５３］を、各プライマーについて０．２５ｍＭの最終濃縮まで添加した。２μＬの液体培養物を２μＬのＮａＯＨ中、９９℃において１５分間沸騰させることにより、ＤＮＡを単離した。１８μＬのＰＣＲマスター混合物をテンプレートＤＮＡに添加した。ＤｒｅａｍＴａｑを用いたＰＣＲのためのサイクリングパラメーターは以下の通りであった：９５℃において２分間の初期変性、次に３５回の９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で１分間のＰＣＲサイクル、７２℃で１０分間の最終期間で終了。同一のプロトコールを使用して、但し交配型に対して特異的なプライマーを使用して、交配型を決定した（表３）。ＰＣＲ反応を、Ｔｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ（登録商標）リキッドハンドラー（Ｔｅｃａｎ社、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、スイス）を使用して、又はＰＩＰＥＴＭＡＮ（登録商標）Ｍマルチチャンネル電動ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ社）を用いて調製した。ＰＣＲ産物を、０．５×ＴＢＥバッファー（４５ｍＭのトリス−ホウ酸塩、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）中、ＳＥＲＶＡ  ＤＮＡ  Ｓｔａｉｎ  Ｇ（Ｓｅｒｖａ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ＧｍｂＨ社、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を用いて染色された２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上、１００Ｖでおよそ３０分間分離した。ゲルを、ＩｎＧｅｎｉｕｓ  ＬＨＲ  Ｇｅｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｙｎｇｅｎｅ社、Ｂａｎｇａｌｏｒｅ、インド）を使用して画像化した。
【００７５】
結果
ＦＡＣＳを使用する交配培養物からの種内ハイブリッドの単離
種内交配は、種間交配よりも効率的に生ずるので、２つのヘテロタリックなＳ．セレビシエハプロイド株を交配させることにより、染色、交配、及びソーティングに関する機能的プロトコールを開発した。コンプリメンタリー（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）な栄養要求性を有する２つの菌株を交配させると、その結果、合成最少培地（ＳＭ）上で増殖することができる原栄養性の交配したディプロイドをもたらし、サンプル中の交配した細胞についてその割合の容易且つ正確な測定を可能にした。菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ａ（ＭＡＴａ、Ｈｉｓ−、Ｌｙｓ−、Ｔｒｐ−）及びＩＭＫ４３９（ＭＡＴα、Ｕｒａ−）をＣＦＳＥ及びＶｉｏｌｅｔ色素でそれぞれ染色し、その後交配させた。細胞１個当たりの色素の濃度は各分裂期間中に稀釈され、その結果、細胞１個当たりの蛍光シグナル強度の減少を経時的に引き起こす。この蛍光の喪失を最低限に抑えるために、交配培養物をＹＰＴ中、１２℃でインキュベートした。Ｓ．セレビシエはこの条件下ではゆっくりと増殖するためである。細胞より放出された蛍光をＦＡＣＳ上で異なる時点において測定した。染色前、交配前の染色後、並びに交配から１８時間、２４時間、及び４２時間後（図１Ａ）である。交配したと推定される細胞に対応する、二重染色を呈する事象周辺に、ゲーティングエリアを設定し、そして存在する栄養要求性マーカーについて、そのあらゆる選択圧を防止するために、このゲーティングエリア内の事象を、ＹＰＤを含有する９６ウェルプレート上でソーティングした。ＦＡＣＳ分析は、１８時間後、０．９０％の割合の交配培養物が、二重染色されたことを示した。この数字は２４時間後に２．６５％、そして交配から４２時間後には５．２５％まで増加した（図１Ａ）。顕微鏡下、「ｓｈｍｏｏ」形態が二重染色された集団に認められたが（図１Ｃ）、それはサッカロミセス接合体に特徴的であり［Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８８．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５２：５３６］、またこの集団中に交配細胞が存在することを確認する。二重染色された細胞、単一染色された細胞、及び全培養物の単一細胞のソーティングされたコロニーを、合成最少培地内で増殖するその能力についてテストした。二重染色された集団のうち、７４〜８２％が選択培地内で増殖することができ、交配の成功を示している（図１Ｂ）。全交配培養物からの細胞のうち４％のみが選択培地内で増殖し、交配した細胞が二重染色された集団において２０倍富化したことを示している。フローサイトメトリーにより、二重染色された集団からの１０個のコロニーについて倍数性を決定し、３種類の倍数性、ハプロイド細胞、ディプロイド細胞、及び両者の混合物を同定した（図１Ｄ）。これまでの観察に基づき［Ｂｅｌｌ、１９９８．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６４：１６６９−１６７２］、これらの結果は、二重染色された事象は、交配した細胞だけではなく、染色細胞の凝集物からも構成されることを示唆した。交配細胞は多くの場合凝集物を形成し、又は交配中に分裂するので［Ｌｉｐｋｅ及びＫｕｒｊａｎ、１９９２、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５６：１８０−１９４］、二重染色された事象の単一細胞の単離��、交配した細胞のみを取得するのに必要である。凝集が観測されたにもかかわらず、選択培地上で増殖することができる細胞の割合は、二重染色された集団において約２０倍まで改善し、そして交配した細胞は、ＳＭ上に播種することによる交配及び倍数性の検証により１８時間後には容易に取得可能であった。
【００７６】
ＦＡＣＳを使用する交配培養物からの種間ハイブリッドの単離
開発された染色及びソーティングプロトコールが、交配培養物から種間ハイブリッドを単離するのにもやはり適用可能か調査するために、ディプロイド野生型Ｓ．ユーバヤヌス株ＣＢＳ１２３５７を、ハプロイドのＳ．セレビシエ株ＩＭＫ４３９と交配させた（ＭＡＴα、ｕｒａ３Δ：：ＫａｎＭＸ）。これらの株のハイブリッド細胞は、ウラシル原栄養性及びＧ４１８に対する耐性に起因して、容易に同定可能なはずである。Ｓ．ユーバヤヌスＣＢＳ１２３５７はホモタリックなディプロイドであるので、染色及び交配前に胞子形成及び胞子の単離が必要であった。ホモタリックなディプロイドから得られた胞子はホモディプロイド化することができるので、種間交配と競合する自己交配を最低限に抑えるために、子嚢内での胞子の効率的な分離が必要とされる。従って、子嚢細胞壁を消化するための２つのプロトコールを、（ｉ）チモリアーゼを使用して、及び（ｉｉ）チモリアーゼ消化に加えて界面活性剤トリトンＸ−１００を使用してテストしたが［Ｈｅｒｍａｎ及びＲｉｎｅ、１９９７．ＥＭＢＯ  Ｊ  １６：６１７１−６１８１］、後者は胞子の分離に改善をもたらした（データ図示せず）。更に、ＦＡＣＳ分析から、Ｓ．ユーバヤヌス細胞のおよそ半分が、染色完了後、蛍光性でなかったことが立証された（データ図示せず）。発芽期間中に胞子の細胞壁が失われる。胞子細胞壁の不透過性を前提とすれば、胞子染色後に蛍光色素の多くを含有する可能性がある。発芽期間中のその細胞壁喪失は、蛍光の喪失が観測されたことを説明し得る。従って、異なる複数のインキュベーション時間において、２％のグルコース及びＹＰＤ中で発芽をテストすることにより、染色前に使用される最適な発芽法を開発した。ＹＰＤ内での発芽から５時間後、最初の有意な増殖が認められ、種内交配はなおも最低限度であったものの、発芽に十分な時間が経過したことを示している（データ図示せず）。最後に、唯一の炭素源としてトレハロースを用いたときにＳ．ユーバヤヌスが増殖又は交配する能力については不明である。従って、ＹＰＤ培地内でのＣＦＳＥで染色されたＳ．ユーバヤヌスＣＢＳ１２３５７の発芽した細胞と、Ｖｉｏｌｅｔ色素で染色されたＳ．セレビシエ株ＩＭＫ４３９のハプロイド細胞との交配を、ＹＰＴ培地内でのこれらの菌株の交配と比較した。ハイブリッドの量を、ＦＡＣＳを使用して二重染色された集団をソーティングすること（図２Ａ）、及び選択培地に対してレプリカ播種することにより経時的に評価した。７時間後、ＹＰＴ及びＹＰＤ上での両交配培養物の二重染色された集団のうち、１％がハイブリッドであることが判明した。ＹＰＴ上での交配はハイブリッドの数について増加を引き起こさなかったが、ＹＰＤ上でインキュベートした二重染色された集団内のハイブリッドの量は、ハイブリッド化から２４時間後、１８％まで増加し、そして３０時間後も一定に保たれた（図２Ｂ）。ゲート化なしのソーティング後の細胞の９６ウェルマイクロタイタープレート全体を、選択培地に対してレプリカ播種した後、増殖を認めなかったが、それは交配培養物内には０．３％未満しかハイブリッドが存在しなかったことを示唆した。これは、培養物は、二重染色された細胞をＦＡＣＳソーティング���るための最適化されたプロトコールを使用することにより、種間ハイブリッドについて少なくとも７０倍富化したことを意味する（図２Ｃ）。これは、ＦＡＣＳを使用して細胞を染色及びソーティングする方法は、種間ハイブリッドの富化に適用され得ること、及びＹＰＤ培地上で２４〜３０時間交配させると、二重染色された集団が生じ、その５個のうち１個が真正なハイブリッドであったことを示唆する。
【００７７】
マーカーを含まない種間ハイブリッドの生成
以前の実験では、ＦＡＣＳによるソーティングを行い、その二重染色された集団内にハイブリッドが存在することを、選択培地上での増殖により検証した。しかしながら、相補的で選択可能な表現型を有する親株は、必ずしも利用可能又は適用可能ではない。従って、親株の選択可能な表現型の存在に依存しないスクリーニング法が好ましい。選択可能な表現型を有さないハイブリッドは、ＰＣＲによる親株の種固有遺伝子の増幅［Ｍｕｉｒら、２０１１．ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  １１：５５２−５６３；Ｐｅｎｇｅｌｌｙ及びＷｈｅａｌｓ、２０１３．ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  １３：１５６−１６１］、及び細胞の倍数性の評価により同定することができる。しかしながら、そのようなスクリーニング法はスループットが限定されており、１つ又は複数のハイブリッドを同定するためにスクリーニングされなければならない細胞の量が合理的な量に保たれるような、ハイブリッドの頻度が高いサンプルにおいて有効であるに過ぎない。ＩＭＫ４３９とＣＢＳ１２３５７の胞子とを交配するとき、取得された細胞の２０％が、ハイブリッド表現型に対応する表現型を有し、従ってハイブリッドを見つけるためには約５個の細胞がスクリーニングされなければならないこととなる。Ｓ．ユーバヤヌス及びＳ．セレビシエに対して特異的なプライマーの対を使用するマルチプレックスＰＣＲに基づき、推定ハイブリッドについてスクリーニングする可能性をテストするために、マーカーを含まないＳ．ユーバヤヌス及びＳ．セレビシエを交配させた。これまでに開発されたＰＣＲ法を使用し、プライマー８５７０及び８５７１を用いたとき、Ｓ．セレビシエのゲノムＤＮＡの存在下で１５０ｂｐの断片、プライマー８５７２及び８５７３を用いたとき、Ｓ．ユーバヤヌスのゲノムＤＮＡの存在下で２２８ｂｐの断片が得られた（表３）。このＰＣＲは、ハイブリッドを２つの種の混合集団から区別することができないので、単一のコロニー単離物がテストされたことを保証するために、最初にソーティングされた二重染色した細胞を繁殖させた後、第２の単一細胞ソーティングステップを実施した。更に、倍数性が均一であれば、第２のソーティングを行わないで観察されたような混合集団は存在しなかったことを立証するので、ソーティングされた細胞の倍数性をＤＮＡ染色及びフローサイトメトリーを用いて決定した（図１Ｄ）。高スクリーニングスループットを保証するために、スクリーニングが９６ウェルマイクロタイタープレート中で自動化及び実行可能なように、マルチプレックスＰＣＲプロトコール及び倍数性決定プロトコールを設計した。マーカーを含まない種間ハイブリッドを生成し、スクリーニングする方法の案をテストするために、２つの交配体を作製した。胞子形成したＣＢＳ１２３５７を用いて種間ハイブリッドを生成するこれまでの実験を、Ｓ．セレビシエ親株として、遺伝的に改変されたＩＭＫ４３９を、マーカーを含まない研究室株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＭＡＴａ）に置き換えて繰り返した。並行して、提示された方法が、新規の工業的に意義がある可能性のあるハイブリッドを生成するためにやはり適用可能であるか調査するために、２つの工業的に意義のある株間の交配を実施した。工業的な菌株は、多くの場合より複雑なアニュプロイドゲノムを有し、その胞子形成は不十分であり、その結果、ハイブリッド化率は、研究室株を使用する種間ハイブリッドについて観測される場合よりも低くなる［Ｓｔｅｅｎｓｅｌｓら、２０１４．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３８：９４７−９９５］。Ｓ．ユーバヤヌス株ＡＳ２．４９４０（Ｊ．Ｂｉｎｇの好意により供与された［Ｂｉｎｇら、２０１４．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ  ２４：Ｒ３８０−Ｒ３８１］）を、Ｓ．セレビシエの工業的なエール−型株であるＡｌｅ２８と交配させた。両株はディプロイドであり、従って両者をこれまでに考察された最適化プロトコールを使用して胞子形成及び発芽させて、ハプロイド配偶子を取得した（図２Ｃ）。ＣＢＳ１２３５７（Ｓ．ユーバヤヌス、胞子形成後、ＣＦＳＥ）を、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（Ｓ．セレビシエ、ＭＡＴａ、Ｖｉｏｌｅｔ）と交配させ、ＡＳ２．４９４０（Ｓ．ユーバヤヌス、胞子形成後、ＣＦＳＥ）をＡｌｅ２８（Ｓ．セレビシエ、胞子形成後、Ｖｉｏｌｅｔ）と交配させ、そして二重染色された集団を両交配培養物からソーティングした（図３Ａ）。ソーティングされた細胞を繁殖させ、そして各コロニーの単一細胞を再度ソーティングして単一細胞の単離物を取得した。ＣＢＳ１２３５７×ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄの交配では、２２個の単一細胞の単離物を取得し、そしてこれらの単離物の種について評価を行い、２つの単離物が真正なハイブリッドであることを明らかにした（ＩＭＨ００１及びＩＭＨ００２、図３Ｂ）。ＡＳ２．４９４０×Ａｌｅ２８の交配では、３４個の単一細胞の単離物を取得し、そのうちの５個をハイブリッドとして同定した（ＩＭＨ００３−ＩＭＨ００７、図３Ｂ）。従って、ＣＢＳ１２３５７とＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄとの間の交配から得られた９％の細胞、及びＡＳ２．４９４０とＡｌｅ２８との間の交配から得られた１５％の細胞がハイブリッドであった。フローサイトメトリーによりＤＮＡ含有量を決定し、これらのハイブリッドは、アニュプロイドであったＩＭＨ００７を除いてディプロイドであることが示された（図３Ｃ）。二重染色された集団内のハイブリッドの頻度は、遺伝マーカーを内包する株を使用して決定された頻度と同一範囲内にあり、ハイブリッドはＰＣＲを使用してスクリーニングすることにより成功裏に同定され、本試験に記載されているプロトコールを使用する種間交配により取得された、マーカーを含まないハイブリッドを同定する可能性を実証した。
【００７８】
稀少交配による種間ハイブリッドの生成
工業プロセスで使用されるハイブリッドの多くは、ポリプロイド又はアニュプロイドであり、またこの倍数性は、これらの株が示す工業的に意義のある表現型に寄与する可能性がある。そのような株は、より高い倍数性を有する株を交配することにより構築可能である。しかしながら、反対の交配型の株に限り相互に交配可能であるに過ぎず、またディプロイド株は交配型ａ／αを有するので、自然発生的な交配型の切り替えが生ずるときに限り交配が生ずる可能性があり、ホモ接合性ａ／ａ又はα／α交配型をもたらす。この型の交配の頻度は、１０−６〜１０−８であることが報告されており［Ｇｕｎｇｅ及びＮａｋａｔｏｍｉ、１９７２．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７０：４１−５８］、従って稀少交配と呼ばれている。この研究で考察される技術は、交配した細胞について、培養物を成功裏に富化することが明らかにされているので、ハプロイド及びディプロイドであるＳ．ユーバヤヌス及びＳ．セレビシエ株の間で異なる交配を行わせることにより生じた、このような極めて稀な交配事象を単離するのに、富化が十分有意であるか調査した。稀少交配頻度を容易に測定できるようにするために、株ＩＭＫ４３９を、ハプロイドのＳ．セレビシエ親株として使用した（ＭＡＴα  ｕｒａ３Δ：：ＫａｎＭＸ）。同一の選択可能な表現型を使用してディプロイドのＳ．セレビシエ染色体組を有する株を取得するために、ディプロイド株ＩＭＸ１４７１を、以前の記載に従い、ＣＦＳＥで染色したＩＭＫ４３９（Ｓ．セレビシエ、ＭＡＴα）と、新しい色素のＦａｒ  Ｒｅｄで染色したＩＭＫ４４０（Ｓ．セレビシエ、ＭＡＴａ）との間の種内交配により構築した。二重染色された細胞をソーティングし、そしてオーバーナイトでインキュベーション後、各ウェルからの単一細胞を再度ソーティングした。ソーティングされた細胞の交配型を決定するために、プライマー１２、１３、及び１４（表３）を使用してＰＣＲを実施し、そして倍数性、胞子形成能力、及びウラシル栄養要求性の有無、及びＫａｎＭＸマーカーについてテストした（図６）。ＭＡＴａ／ＭＡＴαであった単離物のうちの１つは、あるディプロイドゲノム含有量を有し、正常な胞子形成効率を示し、そして適正で選択可能な表現型がＩＭＸ１４７１（ＭＡＴａ／ａ、ｕｒａ３Δ：：ＫａｎＭＸ／ｕｒａ３Δ：：ＫａｎＭＸ）としてストックされ、そしてディプロイドのＳ．セレビシエ親株として使用された。ディプロイドとして、又は胞子形成及び発芽後にハプロイドとして、ＣＢＳ１２３５７をＳ．ユーバヤヌス親株として使用した。
【００７９】
これまでの実験では、ＣＦＳＥ染色された集団とＶｉｏｌｅｔ染色された集団の分離は、最適とは言えなかった；Ｖｉｏｌｅｔ蛍光強度は比較的低く、またＣＦＳＥにより放出される蛍光と若干オーバーラップしていた。稀少交配事象の頻度は低いので、単一染色された集団と二重染色された集団の明確な分離が必須である。ＣＦＳＥ染色された親株とＦａｒ  Ｒｅｄ染色された親株との交配により、株ＩＭＸ１４７１を構築すると、Ｆａｒ  Ｒｅｄ色素はＶｉｏｌｅｔ色素よりも強い蛍光シグナルを有し、異なる集団を明確に分離することが判明した（図６）。従って、Ｖｉｏｌｅｔ色素を、スペクトルの赤色部分において光を放出するＦａｒ  Ｒｅｄに交換した。Ｓ．ユーバヤヌス親株をＣＦＳＥで、Ｓ．セレビシエ親株をＦａｒ  Ｒｅｄで染色した。ＣＢＳ１２３５７（胞子形成後、１ｎ）×ＩＭＫ４３９（１ｎ）、ＣＢＳ１２３５７（胞子形成後、１ｎ）×ＩＭＸ１４７１（２ｎ）、ＣＢＳ１２３５７（２ｎ）×ＩＭＫ４３９（１ｎ）、及びＣＢＳ１２３５７（２ｎ）×ＩＭＸ１４７１（２ｎ）の、４つの異なる交配体を作製した。ＣＦＳＥ染色した細胞及びＦａｒ  Ｒｅｄ染色した細胞のあらゆる無性的な凝集を防止するために、ＥＤＴＡを交配前に添加した［Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９８８．Ｃａｎａｄ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３４：１１０５−１１０７］。各交配培養物におけるハイブリッド細胞の頻度を、ＳＭ＋Ｇ４１８プレート上に固定量の交配培養物を播種すること及びコロニーを計測することにより評価した。並行して、ＦＡＣＳにより交配培養物を分析し、そしてソーティング後のハイブリッド細胞の頻度を決定するために、二重染色された集団をソーティングし、ＳＭ＋Ｇ４１８に対してレプリカ播種した。ハイブリッド細胞についてその低い頻度を定量化できるようにするために、ウェルを、１、１０、又は１００個の二重染色された細胞でイノキュレーションし、そしてポアソン統計学を使用して頻度を計算した。ソーティングされていないハプロイド×ハプロイド種間交配培養物では、細胞４×１０５個中約１個が２４時間後、選択培地内で増殖したが、１６８時間後には３×１０４個中１個まで増加した。この培養物に由来するソーティング後の二重染色された細胞において、発生率は平均３×１０２個中１個まで増加し、平均７００の富化係数に対応し、時間が経過しても比較的一定に留まった（表２）。ディプロイドのＳ．ユーバヤヌスとハプロイドのＳ．セレビシエとの間のソーティングされていない交配培養物では、２４時間後、播種した細胞のいずれも選択培地中で増殖しなかったが、しかしながらハイブリッド細胞の頻度は、１６８時間後には４．７×１０６中、最大１個まで増加した。この培養物に由来するソーティング後の二重染色された細胞では、発生率は平均２．４×１０−３中１個まで増加し、平均６００の富化係数に対応する。ハプロイドのＳ．ユーバヤヌスとディプロイドのＳ．セレビシエとの間のソーティングされていない交配培養物では、１０−７個中、約１個が、選択培地内で増殖した。９６時間後、ＦＡＣＳを用いて二重染色された細胞をソーティングすると、ハイブリッド細胞の比率は約５５０倍増加し、その結果、ハイブリッド細胞の頻度は４．３×１０−４となっ���。ディプロイド×ディプロイド交配では、すべての細胞を播種しても、細胞２０×１０７個のプール品からたった１個のハイブリッドしか得られず、細胞２５，６６４個をＦＡＣＳソーティングしても１個も取得されなかった。全体として、稀少交配は、ハプロイド株とディプロイド株との間で可能であったが、交配した細胞は、交配培養物及び二重染色された細胞のいずれにおいても非常に低い頻度で存在した。二重染色された細胞をソーティングすることにより取得されたハイブリッド細胞の頻度は正常な交配よりもかなり低いので、ディプロイドのＣＢＳ１２３５７×ハプロイドのＩＭＫ４３９交配について細胞約４００個、及びその他の交配ではいっそう多くの細胞がソーティングされる必要がある。Ｆａｒ  Ｒｅｄ色素及びＣＦＳＥ色素は、スペクトルがオーバーラップすることなく顕微鏡下で画像化可能であり、従って各交配の組み合わせについて、そのソーティングされていない、二重染色された細胞をガラススライド上でソーティングし、そして蛍光顕微鏡検査を使用して検査した。二重蛍光細胞が、４つの交配培養物のすべてにおいて、またほとんど又は全く希少交配事象が単離されない培養物内でも観測された（図４）。若干の均質に二重蛍光性の細胞も、均質に単一染色された細胞と共に認められたものの、ＣＦＳＥ及びＦａｒ  Ｒｅｄの両者の蛍光は、出芽細胞の一部又は細胞のクラスターに通常局在化した。酵母の出芽及び交配は対称的に生じないので、染色剤がどのように娘細胞に伝達されるかは不明であり、従ってこの二重蛍光が、交配時に染色剤のクロスオーバーにより引き起こされるのか、又は別の原因を有するのかは不明である。このような二重染色された事象は、単一染色された細胞を一般的に含む富化されていない交配培養物に稀に認められた（図５）。これは、二重染色された集団をＦＡＣＳソーティングすると、必ずしもそのすべてが生存性のハイブリッドではない可能性はあるものの、二重染色された細胞について確かに富化させることを示唆する。
【００８０】
【表１】
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【００８１】
【表２】
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【００８２】
【表３】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【国際調査報告】
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