(57)【要約】眼線維症および眼の線維化状態に関連する眼疾患または障害の処置における使用のための、ｍｉＲ−２９の二本鎖の化学的に修飾されたオリゴヌクレオチド模倣物を本明細書において提供する。一局面では、被験体における眼線維症を処置する方法が提供され、この方法は、治療有効量のｍｉＲ−２９模倣化合物を被験体に投与することを含み、上記ｍｉＲ−２９模倣化合物が、（ａ）成熟ｍｉＲ−２９ａ配列、成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列または成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列を含む２３〜２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および（ｂ）上記第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する２２〜２３リボヌクレオチドの第２の鎖を含み、上記第１の鎖が、上記第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有し、上記眼線維症が、網膜線維症、角膜線維症、結膜線維症または線維柱帯の線維症を含む。
2021505544.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における眼線維症を処置する方法であって、治療有効量のｍｉＲ−２９模倣化合物を被験体に投与することを含み、前記ｍｉＲ−２９模倣化合物が、
（ａ）成熟ｍｉＲ−２９ａ配列、成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列または成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列を含む２３〜２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および
（ｂ）前記第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する２２〜２３リボヌクレオチドの第２の鎖
を含み、前記第１の鎖が、前記第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有し、
前記眼線維症が、網膜線維症、角膜線維症、結膜線維症または線維柱帯の線維症を含む、方法。
【請求項２】
前記眼線維症が、糖尿病性網膜症、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、アメーバ感染症、眼外傷、角膜化学熱傷、熱による角膜熱傷、翼状片、緑内障、外科手術による外傷、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）および前部増殖性硝子体網膜症（前部ＰＶＲ）からなる群より選択される眼疾患または障害から生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験体における眼疾患または障害を処置する方法であって、治療有効量のｍｉＲ−２９模倣化合物を前記被験体に投与することを含み、前記ｍｉＲ−２９模倣化合物が、
（ａ）成熟ｍｉＲ−２９ａ配列、成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列または成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列を含む２３〜２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および
（ｂ）前記第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する２２〜２３リボヌクレオチドの第２の鎖
を含み、前記第１の鎖が、前記第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有し、
前記眼疾患または障害が、糖尿病性網膜症、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、アメーバ感染症、眼外傷、角膜化学熱傷、熱による角膜熱傷、翼状片、緑内障、外科手術による外傷、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）および前部増殖性硝子体網膜症（前部ＰＶＲ）からなる群より選択される、方法。
【請求項４】
前記眼疾患または障害が、網膜線維症、角膜線維症、結膜線維症または線維柱帯の線維症からなる群より選択される眼線維症を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ｍｉＲ−２９模倣化合物が、イオン導入、結膜下注射、翼状片への注射、線維柱帯ブレブの部位での注射、腱下注射、硝子体内注射を介して、前房内に、または局所的に投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記眼線維症が増殖性硝子体網膜症を含む、請求項１、２または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記眼線維症が、糖尿病性網膜症に関連する網膜線維症を含む、請求項１、２または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記眼線維症が、抗ＶＥＧＦ処置に関連する網膜線維症を含む、請求項１、２または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記眼線維症が、角膜の濁りまたは角膜瘢痕を含む、請求項１、２または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記眼線維症が角膜熱傷から生じる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記眼線維症が翼状片から生じる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記眼線維症がフックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）から生じる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記眼線維症が緑内障から生じる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記眼線維症が線維柱帯ブレブを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｍｉＲ−２９模倣化合物が角膜に局所的に投与される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｍｉＲ−２９模倣化合物が、液滴製剤で、前記角膜に局所的に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｍｉＲ−２９模倣化合物が、１日１回、１日２回、１日３回または１日４回、前記角膜に局所的に投与される、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｍｉＲ−２９模倣化合物が、最大で１週間、最大で２週間、最大で３週間、最大で４週間、または最大で２８日間、定期的に、局所的に投与される、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｍｉＲ−２９模倣化合物が、液滴製剤で投与される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｍｉＲ−２９模倣化合物が、週に１回、硝子体内注射を介して投与される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｍｉＲ−２９模倣化合物が、１か月間、定期的に、硝子体内注射を介して投与される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＦＮ１、ＭＭＰ２、ＣＴＧＦ、ＴＧＦＢ２および／またはＴＧＦＢ３の発現が低下する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｍｉＲ−２９模倣化合物が表２中に提示される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の鎖が、配列番号２、１８〜２１または３１〜３４から選択される配列を含み、前記第２の鎖が、配列番号１、８〜１０、１３〜１７または２８〜３０から選択される配列を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｍｉＲ−２９模倣化合物が、
（ａ）成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列を含む約２３〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖であって、配列番号２、１８〜２１および３１〜３４から選択される配列を含む第１の鎖；ならびに
（ｂ）前記第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する約２２〜約２５リボヌクレオチドの第２の鎖
を含み、前記第１の鎖が、前記第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｍｉＲ−２９模倣化合物が、
（ａ）成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列を含む約２３〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および
（ｂ）前記第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する約２２〜約２５リボヌクレオチドの第２の鎖
を含み、前記第１の鎖が、前記第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有し、前記第２の鎖が、配列番号１、８〜１０、１３〜１７および２８〜３０から選択される配列を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の鎖が、配列番号１９の配列を含み、前記第２の鎖が、配列番号１の配列を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の鎖が、配列番号１９の配列を含み、前記第２の鎖が、配列番号１５の配列を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の鎖が成熟ｍｉＲ−２９ａ配列を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｍｉＲ−２９模倣化合物が表１中に提示される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の鎖が、配列番号６、７または２７の配列を含み、前記第２の鎖が、配列番号３〜５または１１から選択される配列を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の鎖が、成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｍｉＲ−２９模倣化合物が表３中に提示される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の鎖が、配列番号２５、２６または３５の配列を含み、前記第２の鎖が、配列番号２２〜２４または１２から選択される配列を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
治療有効量の前記ｍｉＲ−２９模倣化合物が医薬組成物に含まれる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験体がヒトである、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記被験体が糖尿病を患っている、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記被験体が糖尿病性網膜症を患っている、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記被験体が加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を患っている、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験体が滲出型加齢性黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）を患っている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記被験体が抗ＶＥＧＦ治療を受けている、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月６日に出願された米国仮特許出願第６２／６９４，９３６号および２０１７年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／５９３，１９８号の利益を主張し、この両方は、それらの全体が、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、小さく、既知の配列を含むという点で、治療介入点としていくつかの利点を有する。単一のｍｉＲＮＡは生物学的経路内の多数の標的ｍＲＮＡを制御することができるので、ｍｉＲＮＡの調節により、遺伝子ネットワーク全体に影響を与え、複雑な疾患表現型を改変することが可能になる（van  Rooij  &  Olson,  2012）。
【０００３】
眼のホメオスタシスは、正常な脈管構造および細胞外マトリクスの存在に依存する。このようなホメオスタシスが、例えば、感染症、炎症または代謝病によって破壊されると、視覚機能が損なわれる。これらの状態の最終結果は、多くの場合、線維症である。線維症によって引き起こされる眼における高秩序組織構造の破壊は、視線の機械的破壊および／または生物学的な機能不全をもたらし得る（Friedlander  M.,  Journal  of  Clinical  Investigation.  2007;117(3):576-586）。
眼の線維化状態を有効に処置することができる介入に対する満たされていない医学的必要性が存在する。本明細書において、この必要性に対処する方法および組成物を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ  Ｍ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．（２００７）１１７（３）：５７６〜５８６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書において、眼の線維化状態の処置のための二本鎖ＲＮＡのｍｉＲ−２９模倣化合物（模倣物）を提供する。
【０００６】
第１の態様では、本開示は、被験体における眼線維症を処置する方法であって、治療有効量のｍｉＲ−２９模倣化合物を被験体に投与することを含み、ｍｉＲ−２９模倣化合物が、成熟ｍｉＲ−２９ａ配列、成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列または成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列を含む２３〜２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する２２〜２３リボヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖が、第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有する、方法を提供する。一部の実施形態では、眼線維症は、網膜線維症、角膜線維症、結膜線維症または線維柱帯の線維症を含む。
【０００７】
一部の実施形態では、眼線維症は、糖尿病性網膜症、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、アメーバ感染症、眼外傷、角膜化学熱傷、熱による角膜熱傷、翼状片、緑内障、外科手術による外傷、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）および前部増殖性硝子体網膜症（前部ＰＶＲ）からなる群より選択される眼疾患または障害から生じる。
【０００８】
第２の態様では、本開示は、被験体における眼疾患または障害を処置する方法であって、治療有効量のｍｉＲ−２９模倣化合物を被験体に投与することを含み、ｍｉＲ−２９模倣化合物が、成熟ｍｉＲ−２９ａ配列、成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列または成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列を含む２３〜２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する２２〜２３リボヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖が、第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有する、方法を提供する。一部の実施形態では、眼疾患または障害は、糖尿病性網膜症、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、アメーバ感染症、眼外傷、角膜化学熱傷、熱による角膜熱傷、翼状片、緑内障、外科手術による外傷、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）および前部増殖性硝子体網膜症（前部ＰＶＲ）からなる群より選択される。
【０００９】
一部の実施形態では、眼疾患または障害は、網膜線維症、角膜線維症、結膜線維症または線維柱帯の線維症からなる群より選択される眼線維症を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、イオン導入、結膜下注射、翼状片への注射、線維柱帯ブレブの部位での注射、腱下注射（ｓｕｂ−ｔｅｎｄｏｎ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、硝子体内注射を介して、前房内に（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌｌｙ）、または局所的に投与される。
【００１１】
一部の実施形態では、眼線維症は増殖性硝子体網膜症を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、眼線維症は、糖尿病性網膜症に関連する網膜線維症を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、眼線維症は、抗ＶＥＧＦ処置に関連する網膜線維症を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、眼線維症は、角膜の濁りまたは角膜瘢痕を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、眼線維症は角膜熱傷から生じる。
【００１６】
一部の実施形態では、眼線維症は翼状片から生じる。
【００１７】
一部の実施形態では、眼線維症はフックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）から生じる。
【００１８】
一部の実施形態では、眼線維症は緑内障から生じる。
【００１９】
一部の実施形態では、眼線維症は線維柱帯ブレブを含む。
【００２０】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は角膜に局所的に投与される。
【００２１】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、液滴製剤で、角膜に局所的に投与される。
【００２２】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、１日１回、１日２回、１日３回または１日４回、角膜に局所的に投与される。
【００２３】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、最大で１週間、最大で２週間、最大で３週間、最大で４週間、または最大で２８日間、定期的に、局所的に投与される。
【００２４】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、液滴製剤で投与される。
【００２５】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、週に１回、硝子体内注射を介して投与される。
【００２６】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、１か月間、定期的に、硝子体内注射を介して投与される。
【００２７】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は表２中に提示される。
【００２８】
一部の実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＦＮ１、ＭＭＰ２、ＣＴＧＦ、ＴＧＦＢ２および／またはＴＧＦＢ３の発現が低下する。
【００２９】
一部の実施形態では、第１の鎖は、配列番号２、１８〜２１または３１〜３４から選択される配列を含み、第２の鎖は、配列番号１、８〜１０、１３〜１７または２８〜３０から選択される配列を含む。
【００３０】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列を含む約２３〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖であって、配列番号２、１８〜２１および３１〜３４から選択される配列を含む第１の鎖；ならびに第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する約２２〜約２５リボヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖が、第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有する。
【００３１】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列を含む約２３〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する約２２〜約２５リボヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖が、第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有し、第２の鎖が、配列番号１、８〜１０、１３〜１７および２８〜３０から選択される配列を含む。
【００３２】
一部の実施形態では、第１の鎖は、配列番号１９の配列を含み、第２の鎖は、配列番号１の配列を含む。
【００３３】
一部の実施形態では、第１の鎖は、配列番号１９の配列を含み、第２の鎖は、配列番号１５の配列を含む。
【００３４】
一部の実施形態では、第１の鎖は成熟ｍｉＲ−２９ａ配列を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は表１中に提示される。
【００３６】
一部の実施形態では、第１の鎖は、配列番号６、７または２７の配列を含み、第２の鎖は、配列番号３〜５または１１から選択される配列を含む。
【００３７】
一部の実施形態では、第１の鎖は成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は表３中に提示される。
【００３９】
一部の実施形態では、第１の鎖は、配列番号２５、２６または３５の配列を含み、第２の鎖は、配列番号２２〜２４または１２から選択される配列を含む。
【００４０】
一部の実施形態では、治療有効量のｍｉＲ−２９模倣化合物は医薬組成物に含まれる。
【００４１】
一部の実施形態では、被験体はヒトである。
【００４２】
一部の実施形態では、被験体は糖尿病を患っている。
【００４３】
一部の実施形態では、被験体は糖尿病性網膜症を患っている。
【００４４】
一部の実施形態では、被験体は加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を患っている。
【００４５】
一部の実施形態では、被験体は滲出型加齢性黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）を患っている。
【００４６】
一部の実施形態では、被験体は抗ＶＥＧＦ治療を受けている。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】図１Ａは、ＮａＯＨの投与によって生じる角膜熱傷を示し、図１Ｂは、本開示の例示的なｍｉＲ−２９ｂ模倣物の眼への取り込みを示す。図１ＣはＤＡＰＩ核染色を示す。
【図１Ｂ−Ｃ】図１Ａは、ＮａＯＨの投与によって生じる角膜熱傷を示し、図１Ｂは、本開示の例示的なｍｉＲ−２９ｂ模倣物の眼への取り込みを示す。図１ＣはＤＡＰＩ核染色を示す。
【００４８】
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、眼における本開示の例示的なｍｉＲ−２９ｂ模倣物の生体内分布および薬物動態（ＰＫ）を示す。
【００４９】
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃおよび図３Ｄは、本開示の例示的なｍｉＲ−２９ｂ模倣物が、角膜熱傷後のｉｎ  ｖｉｖｏでの標的遺伝子発現を、複数の時点にわたって減少させることを示す。
【図３Ｃ−Ｄ】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃおよび図３Ｄは、本開示の例示的なｍｉＲ−２９ｂ模倣物が、角膜熱傷後のｉｎ  ｖｉｖｏでの標的遺伝子発現を、複数の時点にわたって減少させることを示す。
【００５０】
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、角膜傷害の４日後〜１４日後の間に採取された角膜の組織病理に対するｍｉＲ−２９ｂ模倣物の投与の効果を示す。
【００５１】
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、角膜傷害の後、アルファ−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の発現に対するｍｉＲ−２９ｂ模倣物の投与の効果を示す。
【００５２】
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、角膜の瘢痕および濁りに対するｍｉＲ−２９ｂ模倣物の投与の効果を示す。
【００５３】
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄは、本開示の例示的なｍｉＲ−２９ｂ模倣物の眼への取り込みを示す。
【図７Ｃ−Ｄ】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄは、本開示の例示的なｍｉＲ−２９ｂ模倣物の眼への取り込みを示す。
【００５４】
【図８Ａ】図８Ａおよび図８Ｂは、眼における本開示の例示的なｍｉＲ−２９ｂ模倣物の生体内分布および薬物動態（ＰＫ）を示す。
【図８Ｂ】図８Ａおよび図８Ｂは、眼における本開示の例示的なｍｉＲ−２９ｂ模倣物の生体内分布および薬物動態（ＰＫ）を示す。
【００５５】
【図９Ａ】図９Ａは、本開示の例示的なｍｉＲ−２９ｂ模倣物が増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの標的遺伝子発現を減少させることを示す。図９Ｂは、本開示の例示的なｍｉＲ−２９ｂ模倣物が糖尿病性網膜症におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの標的遺伝子発現を減少させることを示す。
【図９Ｂ】図９Ａは、本開示の例示的なｍｉＲ−２９ｂ模倣物が増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの標的遺伝子発現を減少させることを示す。図９Ｂは、本開示の例示的なｍｉＲ−２９ｂ模倣物が糖尿病性網膜症におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの標的遺伝子発現を減少させることを示す。
【００５６】
【図１０Ａ】図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃは、人工多能性由来網膜色素上皮（ｉＰＳ−ＲＰＥ）細胞および初代ヒト網膜色素上皮（ｈＲＰＥ）細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的遺伝子発現に対する例示的なｍｉＲ−２９ｂ模倣物の効果を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃは、人工多能性由来網膜色素上皮（ｉＰＳ−ＲＰＥ）細胞および初代ヒト網膜色素上皮（ｈＲＰＥ）細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的遺伝子発現に対する例示的なｍｉＲ−２９ｂ模倣物の効果を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃは、人工多能性由来網膜色素上皮（ｉＰＳ−ＲＰＥ）細胞および初代ヒト網膜色素上皮（ｈＲＰＥ）細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的遺伝子発現に対する例示的なｍｉＲ−２９ｂ模倣物の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本明細書において、眼の線維化状態、例えば、網膜線維症、角膜線維症、結膜線維症または線維柱帯の線維症の処置のための、二本鎖ＲＮＡのｍｉＲ−２９模倣化合物（模倣物）を提供する。
【００５８】
マイクロＲＮＡ模倣化合物
本開示によるマイクロＲＮＡ模倣化合物は、第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の鎖は、成熟ｍｉＲ−２９ａ配列、成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列または成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列を含み、第２の鎖は、第１の鎖と実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する。本開示全体を通して、「マイクロＲＮＡ模倣化合物」という用語は、「ｐｒｏｍｉＲ−２９」、「ｍｉＲ−２９アゴニスト」、「マイクロＲＮＡアゴニスト」、「マイクロＲＮＡ模倣物」、「ｍｉＲＮＡ模倣物」または「ｍｉＲ−２９模倣物」という用語と互換的に使用され得、「第１の鎖」という用語は、「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語と互換的に使用され得、「第２の鎖」という用語は、「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語と互換的に使用され得る。
【００５９】
一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖は、成熟ｍｉＲ−２９ａ、成熟ｍｉＲ−２９ｂまたは成熟ｍｉＲ−２９ｃの配列を含む約２３〜約２６ヌクレオチドを含み、第２の鎖は、第１の鎖と、部分的、実質的または完全に相補的な配列を含む約２２〜約２３ヌクレオチドを含む。各種の実施形態では、第１の鎖は、約２３、２４、２５または２６ヌクレオチドを含んでいてもよく、第２の鎖は、約２２または２３ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００６０】
マイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖および第２の鎖を形成するヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、およびこれらの組合せを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖および第２の鎖は、リボヌクレオチドおよび／または修飾されたリボヌクレオチドを含む。「修飾されたヌクレオチド」という用語は、修飾されていないヌクレオチドと比較して、核酸塩基および／または糖部分が修飾されているヌクレオチドを意味する。
【００６１】
ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣化合物は、その配列が成熟ｍｉＲ−２９ａ配列、成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列もしくは成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列のすべてまたは部分と同一である、第１の鎖またはアンチセンス鎖、およびその配列が第１の鎖の配列と約７０％〜約１００％相補的である第２の鎖またはセンス鎖を有する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖は、成熟した天然に存在するｍｉＲ−２９ａ配列、ｍｉＲ−２９ｂ配列またはｍｉＲ−２９ｃ配列の配列全体と、間のすべての整数を含めて、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である。ある特定の実施形態では、第１の鎖は、マウス、ヒトもしくはラットの、ｍｉＲ−２９ａ配列、ｍｉＲ−２９ｂ配列またはｍｉＲ−２９ｃ配列などの、成熟した天然に存在するｍｉＲＮＡの配列と、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるか、または少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。あるいは、第１の鎖は、配列アラインメントアルゴリズムおよび当技術分野で周知の方法によって比較して、成熟した天然に存在するｍｉＲＮＡと共通する、２０、２１、２２または２３のヌクレオチド位置を含み得る。
【００６２】
第１の鎖が、天然に存在するヌクレオチドの代わりに修飾されたヌクレオチドを含む場合であっても、第１の鎖の配列は、成熟ｍｉＲ−２９ａ、成熟ｍｉＲ−２９ｂまたは成熟ｍｉＲ−２９ｃの配列と同一であると考えられることが理解される。例えば、成熟した天然に存在するｍｉＲＮＡ配列が、特定の位置にシチジンヌクレオチドを含む場合、模倣化合物の第１の鎖は、対応する位置に２’−フルオロ−シチジンなどの修飾されたシチジンヌクレオチドを含んでいてもよく、または、成熟した天然に存在するｍｉＲＮＡ配列が特定の位置にウリジンヌクレオチドを含む場合、模倣化合物の第１の鎖のｍｉＲＮＡ領域は、対応する位置に２’−フルオロ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン、５−フルオロウラシルまたは４−チオウラシルなどの修飾されたウリジンヌクレオチドを含んでいてもよい。したがって、修飾されたヌクレオチドが、成熟した天然に存在するｍｉＲＮＡ配列に存在するヌクレオチドと同じ塩基対合能を有する限り、第１の鎖の配列は、成熟した天然に存在するｍｉＲＮＡ配列と同一であると考えられる。一部の実施形態では、第１の鎖は、５’末端残基の修飾を含んでいてもよい。例えば、第１の鎖は、５’末端モノホスフェートを有していてもよい。一部の他の実施形態では、第１の鎖は、５’末端モノホスフェートを含有しない。
【００６３】
一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物の第２の鎖は、第１の鎖の配列と部分的に相補的である。例えば、第２の鎖の配列は、第１の鎖の配列と、間のすべての値を含めて、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的である。一部の他の実施形態では、第２の鎖は、第１の鎖の配列と実質的に相補的である。例えば、第２の鎖は、第１の鎖の配列と、間のすべての値を含めて、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的である。さらに一部の他の実施形態では、第２の鎖の配列は、第１の鎖と完全に相補的であってもよい。ある特定の実施形態では、第２の鎖の相補的な領域の約１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチドが、第１の鎖と相補的であってもよい。
【００６４】
第２の鎖が、天然に存在するヌクレオチドの代わりに修飾されたヌクレオチドを含む場合であっても、第２の鎖の配列は、第１の鎖と相補的であると考えられることが理解される。例えば、第１の鎖の配列が特定の位置にグアノシンヌクレオチドを含む場合、第２の鎖は、対応する位置に２’−Ｏ−メチル−シチジンなどの修飾されたシチジンヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００６５】
一部の実施形態では、第２の鎖は、第１の鎖に対して、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのミスマッチを含む。すなわち、第１の鎖および第２の鎖の間で最大で１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つまでのヌクレオチドは、相補的でなくてもよい。一部の実施形態では、ミスマッチは連続しておらず、第２の鎖全体を通して分布している。別の実施形態では、ミスマッチは連続しており、バルジが作りだされていてもよい。一部の実施形態では、第２の鎖は、第１の鎖に対して、３つのミスマッチを含有する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ模倣物またはｍｉＲ−２９ｃ模倣物の第２の鎖は、第１の鎖に対して、（第２の鎖の）３’末端から４位、１３位および／または１６位にミスマッチを含有する。一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の第２の鎖は、第１の鎖に対して、（第２の鎖の）３’末端から４位、１３位および／または１６位にミスマッチを含有する。別の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の第２の鎖は、第１の鎖に対して、（第２の鎖の）３’末端から４位、９位、１０位、１１位、１３位および／または１６位にミスマッチを含有する。
【００６６】
一部の実施形態では、模倣化合物の第１の鎖および／または第２の鎖は、鎖の５’末端または３’末端にオーバーハングを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、第１の鎖は、３’オーバーハング、すなわち、第２の鎖に対して２重鎖領域を越えて伸長した一本鎖領域を含む。第１の鎖の３’オーバーハングは、約１ヌクレオチド〜約４ヌクレオチドの範囲であってもよい。ある特定の実施形態では、第１の鎖の３’オーバーハングは、１つまたは２つのヌクレオチドを含んでいてもよい。一部の実施形態では、第１の鎖に３’オーバーハングを含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって結合される。第１の鎖に３’オーバーハングを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドまたはこれらの組合せを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、第１の鎖中の３’オーバーハングは、２つのリボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第１の鎖の３’オーバーハングは、ホスホロチオエート結合を通して結合した２つのウリジンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第１の鎖はオーバーハングを含有していなくてもよい。
【００６７】
一部の実施形態では、本開示のｍｉＲ−２９模倣物の第２の鎖／センス鎖中のヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって結合され、第１の鎖／アンチセンス鎖中のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して互いに結合する３’末端における最後の３ヌクレオチドを除いて、ホスホジエステル結合によって結合される。
【００６８】
各種の実施形態では、本開示のｍｉＲ−２９模倣物は、修飾されたヌクレオチドを含む。例えば、一部の実施形態では、模倣物の第１の鎖は、１つまたは複数の２’−フルオロヌクレオチドを含む。別の実施形態では、第１の鎖は、いかなる修飾されたヌクレオチドも含んでいなくてもよい。一部の実施形態では、第２の鎖は、１つまたは複数の２’−Ｏ−メチルで修飾されたヌクレオチドを含む。
【００６９】
各種の実施形態では、本開示によるｍｉＲ−２９模倣物は、下記の表に列挙される第１の鎖および第２の鎖を含む。修飾の説明を表４に提示する。これらのｍｉＲ−２９模倣物は、国際公開第２０１６／０４０３７３号に前に記載されており、したがって、この出願は、２０１６年３月１７日に公開されたMontgomeryらによる国際公開第２０１６／０４０３７３号を、その全体を本明細書に参照により組み込む。
【表１】
2021505544.tif 000003
【表２】
2021505544.tif 000004
【表３】
2021505544.tif 000005
【表４】
2021505544.tif 000006
【００７０】
ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ模倣物は、配列番号２７を含む第１の鎖、および配列番号５を含む第２の鎖を含む。他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ模倣物は、配列番号７を含む第１の鎖、および配列番号５を含む第２の鎖を含む。
【００７１】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、配列番号１９を含む第１の鎖、および配列番号１を含む第２の鎖を含む。一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、配列番号２を含む第１の鎖、および配列番号１を含む第２の鎖を含む。さらに一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、配列番号１９を含む第１の鎖、および配列番号１５を含む第２の鎖を含む。さらに一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、配列番号３３を含む第１の鎖、および配列番号１を含む第２の鎖を含む。さらに一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、配列番号３４を含む第１の鎖、および配列番号１を含む第２の鎖を含む。さらに一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、配列番号１９を含む第１の鎖、および配列番号３０を含む第２の鎖を含む。
【００７２】
ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｃ模倣物は、配列番号３５を含む第１の鎖、および配列番号２４を含む第２の鎖を含む。他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｃ模倣物は、配列番号２６を含む第１の鎖、および配列番号２４を含む第２の鎖を含む。
【００７３】
ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、
（ａ）成熟ｍｉＲ−２９ａ配列、成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列または成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列を含む２３〜２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および
（ｂ）第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する２２〜２３リボヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖が、第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有する。
【００７４】
ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、
（ｃ）成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列を含む約２３〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖であって、配列番号２、１８〜２１および３１〜３４から選択される配列を含み第１の鎖；ならびに
（ｄ）第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する約２２〜約２５リボヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖が、第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有する。
【００７５】
ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、
（ａ）成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列を含む約２３〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および
（ｂ）第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する約２２〜約２５リボヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖が、第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有し、第２の鎖が、配列番号１、８〜１０、１３〜１７および２８〜３０から選択される配列を含む。
【００７６】
本開示のマイクロＲＮＡ模倣化合物において使用され得る修飾されたヌクレオチドは、塩基修飾または置換を有するヌクレオチドを含むことができる。ＲＮＡ中の天然の塩基または修飾されていない塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のシトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）である（ＤＮＡはチミン（Ｔ）を有する）。対照的に、修飾された塩基は、複素環塩基部分とも称され、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシンを含む）、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの、他の合成核酸塩基および天然核酸塩基が挙げられる。
【００７７】
一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣化合物は、修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有し得る。代表的な修飾された糖としては、炭素環式または非環式の糖、それらの２’位、３’位もしくは４’位の１つまたは複数に置換基を有する糖、および糖の１つまたは複数の水素原子の代わりに置換基を有する糖が挙げられる。ある特定の実施形態では、糖は、２’位に置換基を有することによって修飾される。追加の実施形態では、糖は、３’位に置換基を有することによって修飾される。他の実施形態では、糖は、４’位に置換基を有することによって修飾される。糖が、これらの位置の２つ以上に修飾を有していてもよいこと、または、ＲＮＡ分子が、１つの位置に糖修飾を有する１つもしくは複数のヌクレオチドを有していてもよく、異なる位置に糖修飾を有する１つもしくは複数のヌクレオチドも有していてもよいことも意図される。
【００７８】
ｍｉＲＮＡ模倣化合物において意図される糖修飾としては、限定されるものではないが、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択される置換基が挙げられ、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換もしくは無置換の、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびＣ２〜Ｃ１０アルキニルであってもよい。
【００７９】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ模倣化合物は、以下から選択される糖置換基を有する：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、または同様の置換基。一部の実施形態では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、これは、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知である）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。別の修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’−ＤＭＡＯＥおよび２’−ジメチルアミノエトキシエトキシとしても公知のＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（当技術分野において２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【００８０】
２’位（２’−）における糖置換基は、アラビノ（上）位、またはリボ（下）位にあってもよい。１つの２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。他の同様の修飾はまた、糖部分における他の位置、特に３’末端ヌクレオシドまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位に行われてもよい。
【００８１】
ある特定の実施形態では、糖修飾は、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−ハロ（例えば、２’−フルオロ、２’−クロロ、２’−ブロモ）、および４’チオ修飾である。例えば、一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ模倣化合物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物、またはｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物の第１の鎖は、１つまたは複数の２’フルオロヌクレオチドを含む。別の実施形態では、模倣化合物の第１の鎖は、修飾されたヌクレオチドを有さない。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ模倣化合物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物、またはｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物の第２の鎖は、１つまたは複数の２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドを含む。
【００８２】
本開示のマイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖および第２の鎖はまた、１つもしくは複数のホスホロチオエート結合、モルホリノ結合、またはホスホノカルボキシレート結合などの主鎖の修飾を含むことができる（例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６９３，１８７号および米国特許第７，０６７，６４１号を参照されたい）。例えば、一部の実施形態では、第１の鎖に３’オーバーハングを含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって結合される。
【００８３】
一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける送達および安定性を容易にするために、ステロイド（コレステロール）、ビタミン、脂肪酸、炭水化物もしくは配糖体、ペプチド、または他の低分子リガンドなどの担体分子とコンジュゲートする。好ましくは、担体分子は、マイクロＲＮＡ模倣化合物の第２の鎖と、その３’末端または５’末端で、リンカーまたはスペーサー基を通して付着する。各種の実施形態では、担体分子は、コレステロール、コレステロール誘導体、コール酸またはコール酸誘導体である。その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２０２，２２７号に開示されている担体分子の使用も想定される。ある特定の実施形態では、担体分子は、コレステロールであり、これは、第２の鎖の３’末端または５’末端に、少なくとも６炭素リンカーを通して付着する。一部の実施形態では、担体分子は、第２の鎖の３’末端に、６または９炭素リンカーを通して付着する。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。各種の実施形態では、リンカーは、実質的に直鎖状の炭化水素部分を含む。炭化水素部分は、約３〜約１５個の炭素原子を含んでいてもよく、エーテル結合またはチオエーテル結合などの、比較的非極性の基を通してコレステロールとコンジュゲートしていてもよい。ある特定の実施形態では、炭化水素リンカー／スペーサーは、必要に応じて置換されたＣ２〜Ｃ１５の飽和または不飽和炭化水素鎖（例えば、アルキレンまたはアルケニレン）を含む。その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国付与前公開第２０１２／０１２８７６１号に記載されている種々のリンカー／スペーサー基を、本開示において使用することができる。
【００８４】
使用の方法
各種の実施形態では、本開示は、それを必要とする被験体における眼の線維化状態を、処置する、回復させる、または予防する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載のｍｉＲ−２９ａ模倣物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物および／またはｍｉＲ−２９ｃ模倣物の少なくとも１つを被験体に投与することを含む、方法を提供する。ある特定の眼以外の線維化状態の処置におけるｍｉＲ−２９アゴニストの使用は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，４４０，６３６号に記載されている。
【００８５】
本開示のｍｉＲ−２９模倣物を使用して処置され得る眼の線維化状態としては、限定されるものではないが、網膜線維症、角膜線維症、結膜線維症または線維柱帯の線維症が挙げられる。一部の実施形態では、眼線維症は増殖性硝子体網膜症を含む。一部の実施形態では、眼線維症は、糖尿病性網膜症に関連する網膜線維症を含む。一部の実施形態では、眼線維症は、抗ＶＥＧＦ処置に関連する網膜線維症を含む。一部の実施形態では、眼線維症は、例えば、レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）または外傷後の、角膜の濁りまたは角膜瘢痕を含む。一部の実施形態では、眼線維症はＰＲＫから生じる。一部の実施形態では、眼線維症は外傷から生じる。一部の実施形態では、眼線維症は感染症から生じる。一部の実施形態では、眼線維症は、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症またはアメーバ感染症から生じる。一部の実施形態では、眼線維症は角膜移植から生じる。一部の実施形態では、眼線維症は角膜熱傷を含む。一部の実施形態では、角膜熱傷は熱による角膜熱傷を含む。一部の実施形態では、角膜熱傷は角膜化学熱傷を含む。一部の実施形態では、眼線維症は翼状片を含む。一部の実施形態では、眼線維症は緑内障を含む。一部の実施形態では、眼線維症は、ブレブの不全をもたらし得（外科的に生じさせた線維柱帯ブレブの部位で線維症を妨げて、それが封じられ閉じられるのを防げる）、緑内障の再発につながる、外科的に生じさせたブレブ（本明細書において、線維柱帯ブレブと称する）の線維症である。一部の実施形態では、眼線維症はフックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）を含む。一部の実施形態では、眼線維症は前部増殖性硝子体網膜症（前部ＰＶＲ）を含む。
【００８６】
一部の実施形態では、本開示は、被験体における眼疾患または障害を処置する方法であって、治療有効量のｍｉＲ−２９模倣化合物を被験体に投与することを含み、ｍｉＲ−２９模倣化合物が、成熟ｍｉＲ−２９ａ配列、成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列または成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列を含む２３〜２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する２２〜２３リボヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖が、第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有し、眼疾患または障害が、糖尿病性網膜症、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、アメーバ感染症、眼外傷、角膜化学熱傷、熱による角膜熱傷、翼状片、緑内障、外科手術による外傷、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）および前部増殖性硝子体網膜症（前部ＰＶＲ）からなる群より選択される、方法を提供する。一部の実施形態では、眼疾患または障害は、網膜線維症、角膜線維症、結膜線維症または線維柱帯の線維症からなる群より選択される眼線維症を含む。
【００８７】
一部の実施形態では、本開示のｍｉＲ−２９模倣物の投与は、被験体の細胞中で、１つもしくは複数の細胞外マトリクス遺伝子の発現または活性を低下させる。別の実施形態では、本開示のｍｉＲ−２９模倣物の投与は、被験体の細胞中で、１つもしくは複数のコラーゲン合成遺伝子の発現または活性を低下させる。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣物の投与は、皮膚の発生、角膜の発生、表皮の発生、外胚葉の発生、筋線維芽細胞の活性化および細胞のホメオスタシスに関与する、１つもしくは複数の遺伝子の発現または活性を上方制御する。各種の遺伝子の発現または活性が本開示のｍｉＲ−２９模倣物によって制御される被験体の細胞としては、線維芽細胞、角膜実質細胞、表皮細胞、上皮細胞および内皮細胞が挙げられる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣物の投与は、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＦＮ１、ＭＭＰ２、ＣＴＧＦ、ＴＧＦＢ２および／またはＴＧＦＢ３の発現を低下させる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣物の投与は、線維症に関連する炎症反応を下方制御する。一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣物の投与は、線維症の患者におけるＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＧＣＳＦおよびＴＮＦ−αなどの炎症促進性サイトカインのレベルを低下させる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣物の投与は、線維症の組織または器官における好中球、リンパ球、単球およびマクロファージなどの免疫エフェクター細胞の浸潤を低下させる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣物の投与は、上皮間葉転換を低下または阻害する。一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣物の投与は、筋線維芽細胞の分化を低下または阻害する。
【００８８】
ある特定の実施形態では、本開示は、眼細胞中で細胞外マトリクス遺伝子を制御する方法であって、細胞を本開示のｍｉＲ−２９模倣物と接触させることを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、眼細胞中でコラーゲン合成遺伝子を制御する方法であって、眼細胞を本開示のｍｉＲ−２９模倣物と接触させることを含む、方法を提供する。処置または接触の際に、ｍｉＲ−２９模倣物は、細胞外マトリクス遺伝子もしくはコラーゲン合成遺伝子の発現または活性を低下させる。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「被験体」または「患者」という用語は、限定されないが、ヒトおよび他の霊長類（例えば、チンパンジー、ならびに他の類人猿およびサル種）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）、飼い馴らされた哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（例えば、ウサギ、マウス、ラットおよびモルモットなどのげっ歯類）、ならびに鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽類、アヒル、ガチョウなどの飼い馴らされた鳥類、野生鳥類および狩猟鳥類）を含む、任意の脊椎動物を指す。一部の実施形態では、被験体は哺乳動物である。他の実施形態では、被験体はヒトである。
【００９０】
一部の実施形態では、被験体は糖尿病を患っている。一部の実施形態では、被験体は糖尿病性網膜症を患っている。一部の実施形態では、被験体は加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を患っている。一部の実施形態では、被験体は滲出型加齢性黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）を患っている。一部の実施形態では、被験体は、網膜線維症を起こす抗ＶＥＧＦ治療による糖尿病性網膜症について処置されている。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする被験体における糖尿病性網膜症のために使用される処置に関連する糖尿病性網膜症および／または網膜線維症を処置する方法であって、本開示のｍｉＲ−２９模倣物を被験体に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする被験体における糖尿病性網膜症を処置する方法であって、抗ＶＥＧＦ治療も被験体に投与しながら、同時、逐次的または断続的に、本開示のｍｉＲ−２９模倣物を被験体に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣物および抗ＶＥＧＦ治療は、硝子体内注射によって同時投与される。抗ＶＥＧＦ処置による糖尿病性網膜症の処置は、抗ＶＥＧＦ処置の反復注射が必要であってもよい。本発明のｍｉＲ−２９模倣物と抗ＶＥＧＦ治療の同時投与は、抗ＶＥＧＦ処置の単回もしくは反復注射に起因する、眼への損傷（限定されないが、眼線維症を含む）を、阻害、緩和または予防し得る。一部の実施形態では、本開示のｍｉＲ−２９模倣物は、他の眼治療薬と同時投与される。本発明のｍｉＲ−２９模倣物と他の眼治療薬の同時投与は、眼治療の単回もしくは反復注射に起因する、眼への損傷（限定されないが、眼線維症を含む）を、阻害、緩和または予防し得る。本開示の例示的な抗ＶＥＧＦ処置としては、限定されないが、抗ＶＥＧＦ抗血清、可溶性ＶＥＧＦ受容体、抗ＶＥＧＦアプタマー、ＶＥＧＦＲ１中和抗血清、抗ＶＥＧＦポリクローナル抗体、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体、および抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体または多重特異性抗体が挙げられる。さらなる例示的な抗ＶＥＧＦ処置としては、限定されないが、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）（フルオロウラシルおよびロイコボリンと組み合わせてもよい）；ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）、アフリベルセプト、ｚｉｖ−アフリベルセプトまたはブロルシズマブが挙げられる。
【００９１】
一部の実施形態では、本開示は、抗体、低分子薬物、生物学的薬物、アプタマーまたはウイルス（例えば、ウイルスベクター）による眼への処置に対して続発性の眼線維症を、処置、予防、減少または軽減する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、眼の手術を行う方法であって、眼の手術の前、間または後に、ｍｉＲ−２９模倣物を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、眼の手術は、レーザーによる眼の手術（例えば、ＬＡＳＩＫ）を含む。一部の実施形態では、眼の手術は、近視、遠視および乱視の矯正のための屈折矯正手術を含む。一部の実施形態では、眼の手術は、レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）を含む。一部の実施形態では、眼の手術は、網膜剥離の修復を含む。本開示のｍｉＲ−２９模倣物の投与は、限定されないが、高度異常、ドライアイ、ハロー、びまん性層状角膜炎、角膜瘢痕、前房内上皮増殖、脈絡膜血管新生、ぶどう膜炎および飛蚊症を含む、眼の手術の副作用を低下させる。一部の実施形態では、本開示は、眼の傷害を処置する方法であって、眼の傷害の１時間、２時間、５時間、１０時間または２４時間で、ｍｉＲ−２９模倣物を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、眼の傷害は、外傷性または偶発的な眼の傷害である。
【００９２】
本開示は、ｍｉＲ−２９アゴニスト（例えば、薬物またはｍｉＲ−２９模倣物）による眼線維症の処置の有効性を評価するための方法も提供する。例えば、一部の実施形態では、処置の有効性を評価するための方法は、ｍｉＲ−２９模倣物による処置の前に被験体の眼細胞における１つまたは複数の遺伝子の発現のレベルを決定するステップであって、１または複数の遺伝子が、ｍｉＲ−２９によって調節される遺伝子のセットから選択されるステップ、ｍｉＲ−２９模倣物による処置の後に被験体の細胞／線維化組織における同じ１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを決定するステップ、および処置の前後の発現レベルに基づいて、処置が効果があるか、効果が少ないか、または効果がないかを決定するステップとを含む。別の実施形態では、処置の前後の遺伝子の発現における、少なくとも１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍または４倍の差は、処置が有効であることを示す。
【００９３】
医薬組成物
本開示は、本開示によるｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂおよび／もしくはｍｉＲ−２９ｃの治療有効量の１つまたは複数のマイクロＲＮＡ模倣化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物も提供する。
【００９４】
一部の実施形態では、医薬組成物は、治療有効量のｍｉＲ−２９ａ模倣化合物および薬学的に許容される担体または賦形剤を含み、模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−２９ａ配列を含み、第２の鎖は第１の鎖と実質的に相補的である。別の実施形態では、医薬組成物は、治療有効量のｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物および薬学的に許容される担体または賦形剤を含み、模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列を含み、第２の鎖は第１の鎖と実質的に相補的である。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、治療有効量のｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物および薬学的に許容される担体または賦形剤を含み、模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列を含み、第２の鎖は第１の鎖と実質的に相補的である。
【００９５】
一部の実施形態では、医薬組成物は、治療有効量の少なくとも２つの本開示のマイクロＲＮＡ模倣化合物、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。例えば、医薬組成物は、ｍｉＲ−２９ａ模倣物およびｍｉＲ−２９ｂ模倣物の組合せ；ｍｉＲ−２９ａ模倣物およびｍｉＲ−２９ｃ模倣物の組合せ；またはｍｉＲ−２９ｂ模倣物およびｍｉＲ−２９ｃ模倣物の組合せを含んでいてもよい。あるいは、組成物は、同じマイクロＲＮＡの２つの模倣物を含んでいてもよい。さらに一部の他の実施形態では、本開示は、治療有効量の３つの本開示のマイクロＲＮＡ模倣化合物、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。例えば、医薬組成物は、ｍｉＲ−２９ａ模倣物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物およびｍｉＲ−２９ｃ模倣物の組合せを含んでいてもよい。
【００９６】
医薬組成物が少なくとも２つの本開示によるマイクロＲＮＡ模倣化合物を含む一部の実施形態では、第１および第２の模倣化合物、または第１、第２および第３の模倣化合物は、等モル濃度で存在していてもよい。約１：２、１：３、１：４、１：５、１：２：１、１：３：１、１：４：１、１：２：３、１：２：４などの他の混合比も、ｍｉＲ−２９ａ模倣化合物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物、およびｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物の少なくとも２つを含む医薬組成物を調製するために想定される。
【００９７】
本開示の活性化合物および組成物は、古典的な医薬調製物を含んでいてもよい。本開示によるこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の一般的な経路を介していてもよい。
【００９８】
本開示の別の実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−２９模倣物を含む組成物は、コンタクトレンズ、スポンジまたは他の材料などの医療デバイス用のコーティングとして製剤化されてもよい。
【００９９】
滅菌注射用溶液は、適量の活性化合物を、所望の任意の他の成分（例えば、上記で列挙する通り）と一緒に溶媒に組み入れ、続いて濾過滅菌することによって調製してもよい。一般に、分散物は、各種の滅菌された活性成分を、基本の分散媒、および例えば上記で列挙されている所望の他の成分を含有する、滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。
【０１００】
本開示の組成物は、一般に、中性または塩の形態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）、または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）に由来する酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）が挙げられる。タンパク質の遊離カルボキシル基と形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄）または有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）に由来するものであり得る。
【０１０１】
製剤化の際に、溶液は、好ましくは、投薬製剤と適合する様式で、治療的に有効であるような量で投与される。製剤は、注射用溶液、局所溶液、薬物放出デバイスまたは他のコーティングされた血管デバイスなどの各種の剤形で容易に投与することができる。詳細な実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、イオン導入、結膜下注射、翼状片への注射、線維柱帯ブレブの部位での注射、腱下注射、硝子体内注射を介した、前房内または局所的投与のために製剤化される。
【０１０２】
コロイド分散系、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソームおよびエキソソームを含む脂質に基づく系を、ｍｉＲ−２９ａ模倣化合物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物および／またはｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物のための送達ビヒクルとして使用してもよい。一部の実施形態では、本開示のｍｉＲ−２９模倣物は、リポソーム粒子に製剤化してもよい。
【０１０３】
本開示の核酸を標的組織に送達するために適切である市販の脂肪エマルジョンとしては、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄおよび他の同様の脂質エマルジョンが挙げられる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとしての使用のための好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工の膜小胞）である。このような系の調製および使用は当技術分野において周知である。例示的な製剤は、米国特許第５，９８１，５０５号；米国特許第６，２１７，９００号；米国特許第６，３８３，５１２号；米国特許第５，７８３，５６５号；米国特許第７，２０２，２２７号；米国特許第６，３７９，９６５号；米国特許第６，１２７，１７０号；米国特許第５，８３７，５３３号；米国特許第６，７４７，０１４号；および国際公開第０３／０９３４４９号にも開示されており、これらはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、送達のために使用されるリポソームは、米国付与前公開第２０１１００７６３２２号に詳細に記載されている、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）のような両性リポソームである。ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）上の表面電荷は完全に可逆的であり、これは、それらを核酸の送達のために特に適切なものにする。ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）は、注射を介して送達することができ、安定なままであり得、凝集体を含まず、かつ細胞膜を横切って核酸を送達することができる。
【０１０５】
一部の実施形態では、本開示のマイクロＲＮＡ模倣化合物または医薬組成物は、眼送達のために製剤化され、粉末、水溶液または点眼剤の形態であり得る。固形製剤は、ラクトースまたはデキストランなどの賦形剤を含有していてもよい。液体製剤は、エアロゾル、滴剤または定量噴霧剤の形態における使用のための水性または油性溶液であってもよい。
【０１０６】
一部の実施形態では、製剤は、リポソーム製剤、ナノ懸濁製剤またはマイクロ懸濁製剤である。
【０１０７】
一部の実施形態では、医薬組成物は、治療有効量のｍｉＲ−２９ａ模倣化合物および薬学的に許容される担体を含み、薬学的に許容される担体は、注射用蒸留水（ＷＦＩ）、０．９％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム、５ｍＭのリン酸緩衝液、１０ｍＭのリン酸緩衝液、２５ｍＭのリン酸緩衝液、５０ｍＭのリン酸緩衝液、８５ｍＭのリン酸緩衝液および１００ｍＭのリン酸緩衝液から選択される。一部の実施形態では、医薬組成物は、治療有効量のｍｉＲ−２９ａ模倣化合物および薬学的に許容される担体を含み、薬学的に許容される担体は、注射用蒸留水（ＷＦＩ）、１０ｍＭのリン酸緩衝液および８５ｍＭのリン酸緩衝液から選択される。
【０１０８】
一部の実施形態では、医薬組成物は、治療有効量のｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物および薬学的に許容される担体を含み、薬学的に許容される担体は、注射用蒸留水（ＷＦＩ）、０．９％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム、５ｍＭのリン酸緩衝液、１０ｍＭのリン酸緩衝液、２５ｍＭのリン酸緩衝液、５０ｍＭのリン酸緩衝液、８５ｍＭのリン酸緩衝液および１００ｍＭのリン酸緩衝液から選択される。一部の実施形態では、医薬組成物は、治療有効量のｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物および薬学的に許容される担体を含み、薬学的に許容される担体は、注射用蒸留水（ＷＦＩ）、１０ｍＭのリン酸緩衝液および８５ｍＭのリン酸緩衝液から選択される。
【０１０９】
一部の実施形態では、医薬組成物は、治療有効量のｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物および薬学的に許容される担体を含み、薬学的に許容される担体は、注射用蒸留水（ＷＦＩ）、０．９％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム、５ｍＭのリン酸緩衝液、１０ｍＭのリン酸緩衝液、２５ｍＭのリン酸緩衝液、５０ｍＭのリン酸緩衝液、８５ｍＭのリン酸緩衝液および１００ｍＭのリン酸緩衝液から選択される。一部の実施形態では、医薬組成物は、治療有効量のｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物および薬学的に許容される担体を含み、薬学的に許容される担体は、注射用蒸留水（ＷＦＩ）、１０ｍＭのリン酸緩衝液および８５ｍＭのリン酸緩衝液から選択される。
【０１１０】
一部の実施形態では、医薬組成物は、０．２ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬのｍｉＲ−２９模倣物を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、０．２ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ〜９０ｍｇ／ｍＬまたは９０ｍｇ／ｍＬ〜１２０ｍｇ／ｍＬのｍｉＲ−２９模倣物を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、０．２ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ〜７０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ〜９０ｍｇ／ｍＬまたは９０ｍｇ／ｍＬ〜１２０ｍｇ／ｍＬのｍｉＲ−２９模倣物を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約０．３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４０ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬのｍｉＲ−２９模倣物を含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、医薬組成物は、約１００ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約３．５ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬまたは０．３５ｍｇ／ｍＬのｍｉＲ−２９模倣物を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、約７０ｍｇ／ｍＬのｍｉＲ−２９模倣物を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、約３５ｍｇ／ｍＬのｍｉＲ−２９模倣物を含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、医薬組成物は４〜９のｐＨを有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５または約９のｐＨを有する。
【０１１３】
一部の実施形態では、医薬組成物は、併用療法として製剤化される。一部の実施形態では、医薬組成物は、本開示のｍｉＲ−２９模倣物、および限定されないが、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）、アフリベルセプト、ｚｉｖ−アフリベルセプトまたはブロルシズマブの１つまたは複数を含む、１つまたは複数の抗ＶＥＧＦ処置を含む。一部の実施形態では、併用療法は眼科用製剤である。一部の実施形態では、併用療法は、硝子体内注射のために製剤化される。一部の実施形態では、併用療法は、フルオロウラシルおよびロイコボリンの１つまたは両方をさらに含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、本開示のｍｉＲ−２９模倣物、および１つまたは複数の抗ＶＥＧＦ低分子薬物、例えば、ＰＦ−００３３７２１０を含む。
【０１１４】
一部の実施形態では、医薬組成物は、本開示のｍｉＲ−２９模倣物、および１つまたは複数のがん治療薬を含む。例えば、本開示は、本開示のｍｉＲ−２９模倣物および製剤化されたリツキシマブを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、眼内リンパ腫の処置または予防における使用のための医薬組成物を提供する。
【０１１５】
一部の実施形態では、医薬組成物は抗生物質を含む。抗生物質は、眼内炎または眼の他の感染性疾患の予防のための、抗ＶＥＧＦ処置および本開示のｍｉＲ−２９模倣物との３剤の組合せとして提供されてもよい。一部の実施形態では、本開示は、本開示のｍｉＲ−２９模倣物、および１つまたは複数の抗生物質、抗真菌剤、抗細菌剤もしくは抗ウイルス剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１１６】
一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くの本開示のｍｉＲ−２９模倣物を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、１つまたは複数の本開示のｍｉＲ−２９模倣物、および限定されないが、本明細書に開示されるもの以外のｍｉＲ−２９模倣物を含む、１つもしくは複数の他のマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ模倣物を含む。
【０１１７】
一部の実施形態では、本開示は、眼への治療剤の注射の前、間または後に、定期的に投与される、糖尿病性網膜症、ＡＭＤまたは滲出型ＡＭＤのための処置を受けている被験体における使用のための医薬組成物を提供する。本開示のｍｉＲ−２９模倣物、または本開示のｍｉＲ−２９模倣物を含む医薬組成物は、必要に応じて点眼薬として、必要に応じて使用のための指示が添付された、医療用または家庭用のキットで供給されてもよい。
【０１１８】
当業者は、送達ビヒクルを安定にし、標的の眼細胞による取り込みを可能にするために、適切な塩および緩衝液を利用することを望む場合がある。本開示の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解または分散されたｍｉＲ−２９模倣物（例えば、リポソームまたは他の複合体）を含む有効量の送達ビヒクルを含む。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という語句は、動物またはヒトに投与された場合に、有害な反応、アレルギー性反応または他の都合が悪い反応を生じさせない、分子実体および組成物を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」としては、ヒトに投与するために適切な医薬品などの医薬品の製剤化における使用のために許容される、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤、ならびに吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、本開示の活性成分と不適合性である場合を除いて、治療用組成物中でのその使用が意図される。組成物のポリヌクレオチドを不活化しなければ、補足的な活性成分を組成物に組み入れることもできる。
【０１１９】
投与および投薬
本明細書において提供される場合、１つまたは複数のｍｉＲ−２９模倣化合物は、眼線維症の処置のために投与される。一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、被験体の眼／眼細胞に直接投与される。一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、末梢に投与される。一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、イオン導入、結膜下注射、翼状片への注射、線維柱帯ブレブの部位での注射、腱下注射、硝子体内注射を介して、前房内に、または局所的に投与される。
【０１２０】
一部の実施形態では、医薬組成物は、滴剤、軟膏または懸濁剤を含む。一部の実施形態では、本開示は、投与の経路を含む、ｍｉＲ−２９模倣物、またはｍｉＲ−２９模倣物を含む医薬組成物を投与する方法であって、投与の経路が、局所投与、眼を薬物溶出コンタクトレンズと接触させること、結膜下注射、ブレブ内注射、前房内注射、前房内デポー剤（例えば、シリコンまたは他の材料の薬物包埋「シード」）、硝子体内注射、硝子体内デポー剤（例えば、シリコンまたは他の材料の薬物包埋「シード」）、およびイオン導入から選択される、方法を提供する。
【０１２１】
一部の実施形態では、本開示は、角膜線維症を処置する方法であって、局所投与もしくは眼を薬物溶出コンタクトレンズと接触させることを含めて、ｍｉＲ−２９模倣物、またはｍｉＲ−２９模倣物を含む医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は滴剤である。
【０１２２】
一部の実施形態では、本開示は、翼状片を処置する方法であって、局所投与もしくは結膜下注射を含めて、ｍｉＲ−２９模倣物、またはｍｉＲ−２９模倣物を含む医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は滴剤である。
【０１２３】
一部の実施形態では、本開示は、線維柱帯切除術のブレブを処置する方法であって、ブレブ内注射、結膜下注射もしくは局所投与を含めて、ｍｉＲ−２９模倣物、またはｍｉＲ−２９模倣物を含む医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は滴剤である。
【０１２４】
一部の実施形態では、本開示は、緑内障を処置する方法であって、結膜下注射、前房内注射もしくは前房内デポー剤を含めて、ｍｉＲ−２９模倣物、またはｍｉＲ−２９模倣物を含む医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、前房内デポー剤は、シリコンまたは他の薬学的に許容される材料の薬物包埋「シード」を含む。
【０１２５】
一部の実施形態では、本開示は、網膜線維症を処置する方法であって、硝子体内注射、硝子体内デポー剤もしくはイオン導入を含めて、ｍｉＲ−２９模倣物、またはｍｉＲ−２９模倣物を含む医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、硝子体内デポー剤は、シリコンまたは他の薬学的に許容される材料の薬物包埋シードを含む。
【０１２６】
一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のマイクロＲＮＡ模倣化合物は、同時であるが、別の組成物で投与されてもよく、同時とは、模倣化合物が、例えば、互いに約５分、１０分、２０分または３０分以内の短い期間内に与えられることを指す。一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ模倣化合物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物、および／またはｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物は、異なる時に、別の組成物で投与されてもよい。
【０１２７】
本開示は、追加の治療剤を、ｍｉＲ−２９ａ模倣化合物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物、および／またはｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物と一緒に投与することができる実施形態も包含する。一部の実施形態では、追加の治療剤は、第２の抗線維化剤である。追加の治療剤は、同時であるが別の製剤で投与されてもよく、逐次的に投与されてもよい。他の実施形態では、追加の治療剤は、ｍｉＲ−２９ａ模倣化合物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物、および／またはｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物の投与の前後の異なる時に投与されてもよい。臨床適用が意図される場合、医薬組成物は、意図された適用に適した形態で調製される。一般に、これは、発熱物質、ならびにヒトまたは動物に有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴い得る。
【０１２８】
一部の例示的な実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、角膜に局所的に投与される。一部の例示的な実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、例えば液滴製剤で、角膜に局所的に投与される。一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、例えば１日２回、または例えば１日４回、角膜に局所的に投与される。一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、例えば１日４回、角膜に局所的に投与される。
【０１２９】
一部の例示的な実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、最大で１週間、定期的に、局所的に投与される。一部の例示的な実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、最大で４週間、定期的に、局所的に投与される。一部の例示的な実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、１日２回、局所的に投与される。一部の例示的な実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、１日２回、最大で４週間、局所的に投与される。一部の例示的な実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、最大で２８日間、定期的に、局所的に投与される。一部の例示的な実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、１日２回、最大で２８日間、局所的に投与される。本開示全体を通して、１日１回、１日２回などの用語は、片側または両側投与の頻度を指し、すなわち、「１日２回」は、１つの眼に１日に２回または２つの眼に１日に２回のいずれかを指し、両方の眼に１日あたり１回投与することを指さないことが理解される。一般に、本開示の組成物は、両方の眼の処置が所望される場合、両側に投与され、１つの眼のみの処置が望まれる場合、片側に投与され、例えば、左の眼のみの眼の傷害の処置のためには、本開示の組成物は、左にのみ正しく投与される。
【０１３０】
一部の例示的な実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、液滴製剤で投与される。
【０１３１】
一部の例示的な実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、週に１回、硝子体内注射を介して投与される。
【０１３２】
一部の例示的な実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、１か月間、定期的に、硝子体内注射を介して投与される。
【０１３３】
本開示は、ウイルス遺伝子送達によってｍｉＲ−２９模倣物を投与するための、ベクター、医薬組成物および方法をさらに提供する。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。ＡＡＶベクターを介したヒト身体へのｍｉＲ−２９模倣物の送達は、例えば、Heller  et  al.  JCI  Insight.  2017  May  4;  2(9):  e93309、および国際公開第２０１７１８１０１１号に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が本明細書に組み込まれる。ＡＡＶベクターは、例えば、Lebherz  et  al.  J  Gene  Med.  2008  Apr;  10(4):  375-382に記載されているような、改善された眼の遺伝子移入のための血清型の使用によって、眼における使用のために適合し得る。
【０１３４】
本開示は、本明細書に記載の治療用のｍｉｒ−２９模倣物および組成物を含むキットをさらに提供する。本開示は、本明細書に記載の治療用組成物またはキットのいずれか１つを含む製造品も提供する。製造品の例は、バイアル（例えば、密封されたバイアル）を含む。
【０１３５】
実施形態の列挙
実施形態１．被験体における眼線維症を処置する方法であって、治療有効量のｍｉＲ−２９模倣化合物を被験体に投与することを含み、ｍｉＲ−２９模倣化合物が、
（ａ）成熟ｍｉＲ−２９ａ配列、成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列または成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列を含む２３〜２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および
（ｂ）第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する２２〜２３リボヌクレオチドの第２の鎖
を含み、第１の鎖が、第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有し、
眼線維症が、網膜線維症、角膜線維症、結膜線維症または線維柱帯の線維症を含む、方法。
【０１３６】
実施形態２．眼線維症が、糖尿病性網膜症、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、アメーバ感染症、眼外傷、角膜化学熱傷、熱による角膜熱傷、翼状片、緑内障、外科手術による外傷、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）および前部増殖性硝子体網膜症（前部ＰＶＲ）からなる群より選択される眼疾患または障害から生じる、実施形態１に記載の方法。
【０１３７】
実施形態３．被験体における眼疾患または障害を処置する方法であって、治療有効量のｍｉＲ−２９模倣化合物を被験体に投与することを含み、ｍｉＲ−２９模倣化合物が、
（ａ）成熟ｍｉＲ−２９ａ配列、成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列または成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列を含む２３〜２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および
（ｂ）第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する２２〜２３リボヌクレオチドの第２の鎖
を含み、第１の鎖が、第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有し、
眼疾患または障害が、糖尿病性網膜症、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、アメーバ感染症、眼外傷、角膜化学熱傷、熱による角膜熱傷、翼状片、緑内障、外科手術による外傷、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）および前部増殖性硝子体網膜症（前部ＰＶＲ）からなる群より選択される、方法。
【０１３８】
実施形態４．眼疾患または障害が、網膜線維症、角膜線維症、結膜線維症または線維柱帯の線維症からなる群より選択される眼線維症を含む、実施形態３に記載の方法。
【０１３９】
実施形態５．ｍｉＲ−２９模倣化合物が、イオン導入、結膜下注射、翼状片への注射、線維柱帯ブレブの部位での注射、腱下注射、硝子体内注射を介して、前房内に、または局所的に投与される、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【０１４０】
実施形態６．眼線維症が増殖性硝子体網膜症を含む、実施形態１、２または４のいずれか一項に記載の方法。
【０１４１】
実施形態７．眼線維症が、糖尿病性網膜症に関連する網膜線維症を含む、実施形態１、２または４のいずれか一項に記載の方法。
【０１４２】
実施形態８．眼線維症が、抗ＶＥＧＦ処置に関連する網膜線維症を含む、実施形態７に記載の方法。
【０１４３】
実施形態９．眼線維症が、角膜の濁りまたは角膜瘢痕を含む、実施形態１、２または４のいずれか一項に記載の方法。
【０１４４】
実施形態１０．眼線維症が角膜熱傷から生じる、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【０１４５】
実施形態１１．眼線維症が翼状片から生じる、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【０１４６】
実施形態１２．眼線維症がフックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）から生じる、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【０１４７】
実施形態１３．眼線維症が緑内障から生じる、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【０１４８】
実施形態１４．眼線維症が線維柱帯ブレブを含む、実施形態１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【０１４９】
実施形態１５．ｍｉＲ−２９模倣化合物が角膜に局所的に投与される、実施形態１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【０１５０】
実施形態１６．ｍｉＲ−２９模倣化合物が、液滴製剤で、角膜に局所的に投与される、実施形態１５に記載の方法。
【０１５１】
実施形態１７．ｍｉＲ−２９模倣化合物が、１日１回、１日２回、１日３回または１日４回、角膜に局所的に投与される、実施形態１５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【０１５２】
実施形態１８．ｍｉＲ−２９模倣化合物が、最大で１週間、最大で２週間、最大で３週間、最大で４週間、または最大で２８日間、定期的に、局所的に投与される、実施形態１５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【０１５３】
実施形態１９．ｍｉＲ−２９模倣化合物が、液滴製剤で投与される、実施形態１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【０１５４】
実施形態２０．ｍｉＲ−２９模倣化合物が、週に１回、硝子体内注射を介して投与される、実施形態１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【０１５５】
実施形態２１．ｍｉＲ−２９模倣化合物が、１か月間、定期的に、硝子体内注射を介して投与される、実施形態１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【０１５６】
実施形態２３．ｍｉＲ−２９模倣化合物が表２中に提示される、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【０１５７】
実施形態２２．ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＦＮ１、ＭＭＰ２、ＣＴＧＦ、ＴＧＦＢ２および／またはＴＧＦＢ３の発現が低下する、実施形態１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【０１５８】
実施形態２４．第１の鎖が、配列番号２、１８〜２１または３１〜３４から選択される配列を含み、第２の鎖が、配列番号１、８〜１０、１３〜１７または２８〜３０から選択される配列を含む、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【０１５９】
実施形態２５．ｍｉＲ−２９模倣化合物が、
（ａ）成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列を含む約２３〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖であって、配列番号２、１８〜２１および３１〜３４から選択される配列を含む第１の鎖；ならびに
（ｂ）第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する約２２〜約２５リボヌクレオチドの第２の鎖
を含み、第１の鎖が、第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有する、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【０１６０】
実施形態２６．ｍｉＲ−２９模倣化合物が、
（ａ）成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列を含む約２３〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および
（ｂ）第１の鎖に実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する約２２〜約２５リボヌクレオチドの第２の鎖
を含み、第１の鎖が、第２の鎖に対して３’ヌクレオチドオーバーハングを有し、第２の鎖が、配列番号１、８〜１０、１３〜１７および２８〜３０から選択される配列を含む、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【０１６１】
実施形態２７．第１の鎖が、配列番号１９の配列を含み、第２の鎖が、配列番号１の配列を含む、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【０１６２】
実施形態２８．第１の鎖が、配列番号１９の配列を含み、第２の鎖が、配列番号１５の配列を含む、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【０１６３】
実施形態２９．第１の鎖が成熟ｍｉＲ−２９ａ配列を含む、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【０１６４】
実施形態３０．ｍｉＲ−２９模倣化合物が表１中に提示される、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【０１６５】
実施形態３１．第１の鎖が、配列番号６、７または２７の配列を含み、第２の鎖が、配列番号３〜５または１１から選択される配列を含む、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【０１６６】
実施形態３２．第１の鎖が成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列を含む、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【０１６７】
実施形態３３．ｍｉＲ−２９模倣化合物が表３中に提示される、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【０１６８】
実施形態３４．第１の鎖が、配列番号２５、２６または３５の配列を含み、第２の鎖が、配列番号２２〜２４または１２から選択される配列を含む、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【０１６９】
実施形態３５．治療有効量のｍｉＲ−２９模倣化合物が医薬組成物に含まれる、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【０１７０】
実施形態３６．被験体がヒトである、実施形態１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【０１７１】
実施形態３７．被験体が糖尿病を患っている、実施形態３６に記載の方法。
【０１７２】
実施形態３８．被験体が糖尿病性網膜症を患っている、実施形態３６または３７に記載の方法。
【０１７３】
実施形態３９．被験体が加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を患っている、実施形態３６または３７に記載の方法。
【０１７４】
実施形態４０．被験体が滲出型加齢性黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）を患っている、実施形態３９に記載の方法。
【０１７５】
実施形態４１．被験体が抗ＶＥＧＦ治療を受けている、実施形態１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【０１７６】
本開示は、以下のさらなる実施例によってさらに説明し、これは、限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態に対して多くの変更を行うことができ、依然として、本開示の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解するべきである。
【０１７７】
本開示全体を通して参照されるすべての特許および非特許文献は、すべての目的に関してそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１７８】
（実施例１：角膜のアルカリ熱傷後のｍｉＲ−２９ｂ模倣物の導入）
アルカリ熱傷は角膜への損傷の代表である。これは、とりわけ、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、神経栄養性角膜炎、無菌性角膜炎、角膜外傷、および手術によって誘導される上皮破壊の代表である。アルカリ熱傷は、熱傷の７〜１４日後に細胞外マトリクス分子の発現の上方制御、ならびに熱傷の１０〜１４日後に肉眼的および組織学的の両方で角膜の濁りおよび瘢痕の出現を伴う、信頼できる経時変化を有することが知られている。
【０１７９】
方法
アルカリ熱傷：８〜１０週齢の雄スプラーグドーリーラットを、イソフルランで麻酔し、０．５％のプロパラカイン塩酸塩点眼液を、局所麻酔のために適用した。動物あたり１つの角膜を、０．５Ｎまたは１ＮのＮａＯＨの１０秒間の適用によるアルカリ熱傷、続いて生理食塩水のすすぎに供した。抗生物質の軟膏を、その後、感染症の予防のために、１日２回適用した。アルカリ熱傷を、熱傷の時にフルオレセイン染色によって、および／または熱傷の発生６時間後に組織学的に（ヘマトキシリンおよびエオシン染色）によって、動物のサブセットにおいて確認した。
【０１８０】
ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の局所投与：生理食塩水または二本鎖ｍｉＲ−２９ｂ模倣物（配列番号１／配列番号１９）を、液滴製剤（１滴あたり１０μＬ、滅菌生理食塩水中に１または７０ｍｇ／ｍＬのｍｉＲ−２９ｂ模倣物）でラットの角膜に局所的に投与した。滴剤を、１日４回で１日間、または１日２回で１〜２８日間、適用した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化オリゴの取り込み／分布を、共焦点顕微鏡によって評価した。
【０１８１】
ｍｉＲ−２９標的発現：総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、７日間、１０日間または１４日間の生理食塩水またはｍｉＲ−２９ｂ模倣物処置で処置されたアルカリ熱傷のラット角膜から抽出した。ｍｉＲ−２９標的およびｍｉＲ−２９ｂ模倣物の薬力学的バイオマーカー（ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＭＭＰ２、ＴＧＦＢ２および／またはＦＮ１）の発現を、７日目、１０日目および１４日目にｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの試薬）。薬物動態を、経時的に、全組織ホモジネートからの定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。
【０１８２】
組織病理学：４日間、７日間、１０日間もしくは１４日間、生理食塩水またはｍｉＲ−２９ｂ模倣物で処置されたアルカリ熱傷を受けた角膜を、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した。角膜上皮および角膜実質の厚さを、ヘマトキシリンおよびエオシン染色された切片からキャプチャーされた２０倍の画像を使用して（Ａｐｅｒｉｏ  ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェアを使用して）評価し、アルファ−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）陽性の筋線維芽細胞を、抗α−ＳＭＡ抗体で染色されたスライド、およびヘマトキシリン対比染色による比色定量用基質から定量化した（分析はＩｍａｇｅＪソフトウェアで行った）。
【０１８３】
臨床評価：１０日間、１４日間、２１日間または２８日間、生理食塩水またはｍｉＲ−２９ｂ模倣物で処置されたアルカリ熱傷を受けた角膜を、１〜５のスケールを使用して、角膜の濁りまたは角膜瘢痕について臨床的に評価し、ここで、１は正常な透明な角膜を表し、５は重度の瘢痕および／または濁りを有する角膜を表す（１＝なし、２＝最小、３＝軽度、４＝中程度、５＝重度）。
【０１８４】
これらの方法を複数の研究にわたって繰り返した。
【０１８５】
結果
アルカリ熱傷を、１ＮのＮａＯＨの投与によってラットあたり１つの眼に発生させた（図１Ａ）。局所的に適用されたＦＩＴＣ−ｍｉＲ−２９ｂ模倣物（１ｍｇ／ｍＬ）は、アルカリ熱傷を受けたラット角膜のすべての層に取り込まれ、角膜実質および角膜内皮が最も強く染色された（図１Ｂ）。同じ視野のＤＡＰＩ核染色も示す（図１Ｃ）。
【０１８６】
生理食塩水またはｍｉＲ−２９ｂ模倣物（７０ｍｇ／ｍＬ）を、角膜のアルカリ熱傷の発生後、１〜２８日間、局所（点眼）適用により、ラットに１日２回投与した。眼を最後の点眼剤の適用の６時間後に採取し、ｍｉＲ−２９ｂをｑＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。内因性のｍｉＲ−２９ｂレベルは、熱傷後大きく変化しなかった。反対に、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物で処置された眼は、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物処置の後、ｍｉＲ−２９ｂレベルの実質的な増加を示し、最大の取り込みは熱傷の発生直後に見られ（内因性を１７１７倍上回る）、より少ない取り込みは角膜上皮の再建後に見られる（７日目に内因性を１４倍上回る）（図２Ａ）。別の研究において、追加の時点で評価され（図２Ｂ）、同様の結果であった（検出されたｍｉＲ−２９ｂレベルは、１０日目に内因性を１１倍上回り、２８日目に内因性を１．７倍上回る）。
【０１８７】
発現の減少（ｐ＝０．０８３１）が、７日目に、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の処置で、複数のｍｉＲ−２９ｂ標的遺伝子について見られた（図３Ａ）。別の研究において、追加の時点で、遺伝子を評価した（図３Ｂ〜３Ｄ）。３つのパネルは、それぞれ、７日目、１０日目および１４日目の時点からのデータを示す。
【０１８８】
傷害の４日後〜１４日後の間に採取された角膜の組織病理学は、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物が、生理食塩水で処置された対照の熱傷を受けた眼に対して、上皮の厚さを増加させ、実質の厚さを減少させたことを示した（図４Ａ〜４Ｂ）。それぞれのパネルの破線は、正常な熱傷を受けていないラットの角膜の厚さを表す。
【０１８９】
アルファ−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）についての免疫組織化学分析を１４日目に行い、α−ＳＭＡ染色の減少が、生理食塩水で処置された熱傷を受けた眼と比較して、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物で処理された熱傷を受けた眼において観察された（図５Ａ）。データを図５Ｂにおいてグラフ化する。
【０１９０】
角膜瘢痕および濁りを、２つの別の研究において臨床的に評価し、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物による処置は、両方の研究における生理食塩水処置と比較して、アルカリ熱傷を受けた眼の角膜瘢痕および濁りの程度を有意に低下させることが分かった（図６Ａおよび図６Ｂ）。
【０１９１】
（実施例２：ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の生体内分布）
方法
ラット硝子体内投与：ラットをイソフルランで麻酔し、プロパラカインおよび生理食塩水またはｍｉＲ−２９ｂ模倣物を、硝子体に注射した（５μＬ、滅菌生理食塩水中に２．５または７０ｍｇ／ｍＬのｍｉＲ−２９ｂ模倣物）。硝子体内注射を眼あたり１回行った。
【０１９２】
ｍｉＲ−２９標的およびｍｉＲ−２９ｂ模倣物の薬力学的バイオマーカー（ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＭＭＰ２、ＴＧＦＢ２）の発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの試薬）。薬物動態を、経時的に、全組織ホモジネートからの定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。
【０１９３】
結果
ＦＩＴＣ−ｍｉＲ−２９ｂ模倣物（２．５ｍｇ／ｍＬ）は、硝子体内注射後、ＲＰＥ層を含むラットの網膜のすべての層に取り込まれた（図７Ａおよび図７Ｃ）。同じ切片のＤＡＰＩ核染色を図７Ｂおよび図７Ｄに示す。
【０１９４】
生理食塩水またはｍｉＲ−２９ｂ模倣物（７０ｍｇ／ｍＬ）を、傷害を受けていないラットの眼に硝子体内注射した。網膜およびＲＰＥ／強膜／脈絡膜を注射適用の１日後〜７日後の間にそれぞれの眼から解剖し、ｍｉＲ−２９ｂをｑＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。ｍｉＲ−２９ｂは、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物で処置された眼において非常に高レベルで検出され（網膜において内因性を１３７５３倍上回り、ＲＰＥ／強膜／脈絡膜において内因性を８５９５倍上回る）、７日目の時点まで持続した（網膜において内因性を１７２７倍上回り、ＲＰＥ／強膜／脈絡膜において内因性を１３４３倍上回る）（図８Ａおよび図８Ｂ）。
【０１９５】
（実施例３：増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）におけるｍｉＲ−２９ｂ模倣物の導入）
色素沈着したニュージーランドウサギは、結膜線維芽細胞の硝子体内注射の後、線維化応答を有することが知られており、原発性網膜剥離を生じさせる必要性なく、ヒト増殖性硝子体網膜症を再現する。
【０１９６】
方法
雄および雌の色素沈着したニュージーランドウサギ（１．６４〜２．２５ｋｇ）をケタミン／キシラジンで麻酔し、０．５％のプロパラカイン塩酸塩点眼液を、局所麻酔のために適用した。動物あたり１つの眼に、硝子体内に、平衡塩溶液（ＢＳＳ）に懸濁されたおよそ５×１０＾５のウサギ結膜線維芽細胞を１００μＬで１回注射した。
【０１９７】
ウサギをケタミン／キシラジンで麻酔し、プロパラカインおよびＢＳＳまたはｍｉＲ−２９ｂ模倣物を、硝子体に注射した（１００μＬ、ＢＳＳ中に１０ｍｇ／ｍＬのｍｉＲ−２９ｂ模倣物）。硝子体内注射を１か月間、週に１回行った。ＦＩＴＣ標識化オリゴの取り込み／分布を、共焦点顕微鏡によって評価した。
【０１９８】
ｍｉＲ−２９標的発現：総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＢＳＳまたはｍｉＲ−２９ｂ模倣物（１０ｍｇ／ｍＬ）で処置されたウサギ網膜から抽出した。ｍｉＲ−２９標的およびｍｉＲ−２９ｂ模倣物の薬力学的バイオマーカー（ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＭＭＰ２、ＴＧＦＢ２）の発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの試薬）。薬物動態を、経時的に、全組織ホモジネートからの定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。
【０１９９】
結果
ｍｉＲ−２９ｂ模倣物（１０ｍｇ／ｍＬ）またはＢＳＳを、増殖性硝子体網膜症の代表である、ウサギ結膜線維芽細胞（ＲＣＦ）の同種移植を受けたウサギの眼への毎週の硝子体内注射により投与した。総ＲＮＡを、ＲＣＦ注射の１か月後および最後の注射の１週間後に採取された網膜から単離し、ｍｉＲ−２９ｂ標的遺伝子の発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、複数のｍｉＲ−２９ｂ標的遺伝子の発現を有意に（ｐ＜０．０５）抑制した（図９Ａ）。
【０２００】
（実施例４：糖尿病性網膜症におけるｍｉＲ−２９ｂ模倣物の導入）
ストレプトゾトシンで処置されたラットは、長期にわたる高血糖症を伴うコントロールされていないＩ型糖尿病の代表であり、糖尿病の約１０週後に網膜に線維化変化を有することが示されている。これは、非ヒト霊長類などの大型動物の使用を必要とすることなく、糖尿病性網膜症の分子的および組織学的変化を再現する。
【０２０１】
方法
糖尿病性網膜症：糖尿病を、ＩＰ注射による６５ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンの投与によって、雄スプラーグドーリーラット（２５１〜３１５ｇ）において誘導した。注射の７２時間後、ラットは、それらの空腹時血糖値が＞３００ｍｇ／ｄＬであった場合に糖尿病と確認された。ラットは、飲用のための０．９％の生理食塩水、皮下液、および血糖値を３５０〜６５０ｍｇ／ｄＬの範囲に維持しながら動物の健康を維持するために必要な長時間作用型インスリンを含む栄養サポートを与えられた。糖尿病のラットは、合計で１１週間維持した。
【０２０２】
ラット硝子体内投与：ラットをイソフルランで麻酔し、プロパラカインおよび生理食塩水またはｍｉＲ−２９ｂ模倣物を、硝子体に注射した（５μＬ、滅菌生理食塩水中に２．５または７０ｍｇ／ｍＬのｍｉＲ−２９ｂ模倣物）。硝子体内注射を眼あたり週に１回、３週間行った。
【０２０３】
ｍｉＲ−２９標的発現：総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＢＳＳまたはｍｉＲ−２９ｂ模倣物（７０ｍｇ／ｍＬ）で処置されたラット網膜から抽出した。ｍｉＲ−２９標的およびｍｉＲ−２９ｂ模倣物の薬力学的バイオマーカー（ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＴＧＦ、ＭＭＰ２、ＴＧＦＢ２）の発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの試薬）。薬物動態を、経時的に、全組織ホモジネートからの定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。
【０２０４】
結果
ｍｉＲ−２９ｂ模倣物（７０ｍｇ／ｍＬ）または生理食塩水を、糖尿病性網膜症のモデルである持続した高血糖症を有するラットの眼への毎週の硝子体内注射によって投与した。総ＲＮＡを、糖尿病の誘導の１１週間後および最後の注射の１週間後に採取された網膜から単離し、ｍｉＲ−２９ｂ標的遺伝子の発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、このモデルにおいて、複数のｍｉＲ−２９ｂ標的遺伝子の発現を有意に（ｐ＜０．００１）抑制した（図９Ｂ）。
【０２０５】
（実施例５：ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞におけるｍｉＲ−２９ｂ模倣物のトランスフェクション）
方法
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価：ヒト人工多能性幹細胞由来網膜色素上皮細胞（ｉＰＳ−ＲＰＥ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）および初代ヒトＲＰＥ細胞（ｈＲＰＥ、Ｌｏｎｚａ）を製造者の指示の通り成長させた。ＲＰＥ細胞を、組換えヒトＴＧＦ−β１（ＴＧＦ−β１、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で処置し、および／またはＤｈａｒｍａｆｅｃｔ１トランスフェクション試薬を使用してｍｉＲ−２９ｂ模倣物で能動的にトランスフェクトした。総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）またはＴｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＴＧＦ−β１処置またはトランスフェクションの４８時間後に単離し、ｍｉＲ−２９標的遺伝子（ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＦＮ１）の発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの試薬）。
【０２０６】
結果
ＴＧＦ−β１（０．５〜５ｎｇ／ｍＬ）を添加し、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物（０．５〜２５ｎＭ）を、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞（図１０Ａおよび図１０Ｂ）またはｈＲＰＥ細胞（図１０Ｃ）に能動的にトランスフェクトした。総ＲＮＡを処置の４８時間後に抽出し、ｍｉＲ−２９ｂ標的遺伝子の発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。両方の細胞系において、ＴＧＦ−β１処置は、複数のｍｉＲ−２９ｂ標的遺伝子の発現を有意に上方制御した。加えて、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、ＴＧＦ−β１処置の存在および非存在下で、複数のｍｉＲ−２９ｂ標的遺伝子の発現を抑制した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ−Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ−Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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