(57)【要約】  本発明は、リポソーム、リポソームを製造する方法、および細胞由来のリポソームにカーゴ分子をロードする方法に関する。本発明は、そのようなリポソーム自体、ならびに小分子、ＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）、生物活性タンパク質、ゲノム編集ツール（例えば、Ｃａｓ９）およびさまざまな障害を治療するための細胞への薬物などの、生物学的および治療的に活性なペイロード分子の輸送のための細胞輸送システムとしてのこれらのリポソームの使用に及ぶ。リポソームはまた、診断および治療用途の範囲で使用され得る。本発明は、細胞外小胞（ＥＶ）、エクソソームの集団を含むそのようなリポソームを含む医薬組成物、および融合タンパク質にまで及ぶ。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームを調製する方法であって、少なくとも１つの細胞を、以下の（ｉ）および（ｉｉ）：
（ｉ）孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片；
（ｉｉ）生物活性ペイロード分子に付着していてもよいシャトルタンパク質、
と接触させることを含み、
ここで、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片は、少なくとも１つの前記細胞のリン脂質二重層を介して孔を作製し、かつ、前記シャトルタンパク質は、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくはその変異体もしくは断片と相互作用し、それによって前記細胞内に内在化され、それによってリポソームを作製し、この際、前記シャトルタンパク質に生物活性ペイロード分子がロードされていてもよい、方法。
【請求項２】
前記リポソームを前記細胞から単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リポソームが小胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リポソームが、細胞外小胞（ＥＶ）、細胞内小胞、または管腔内小胞（ＩＬＶ）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記リポソームがエキソソームを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記リポソームが、１０ｎｍ〜５００ｎｍの間、または２０ｎｍ〜４００ｎｍの間、または３０ｎｍ〜３００ｎｍの間、または４０ｎｍ〜２００ｎｍの間、または５０ｎｍ〜１５０ｎｍの間、または６０ｎｍ〜１２０ｎｍの間の平均直径を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、哺乳動物またはヒトの細胞であってもよい生物学的細胞を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片が、非毒性タンパク質を含むか、または非毒性タンパク質に由来する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片が、炭疽菌またはリシンに由来する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片が、炭疽菌病原性因子保護抗原（ＰＡ）に由来する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片が炭疽菌８３または炭疽菌６３に由来する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片が、配列番号１、２、５〜１０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記シャトルタンパク質が、好ましくは生物活性ペイロード分子の、予備形成タンパク質の細孔を通る輸送を容易にするように構成される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記シャトルタンパク質が弱毒化された毒素タンパク質を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記シャトルタンパク質が炭疽菌由来の致死因子（ＬＦ）または浮腫因子（ＥＦ）である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記シャトルタンパク質が、配列番号１１に記載のアミノ酸配列またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記シャトルタンパク質がリンカータンパク質を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記弱毒化された毒素において、炭疽菌致死因子タンパク質毒素の１つまたは複数の毒性ドメインＩＩ〜ＩＶであってもよい少なくとも１つの毒素ドメインが、前記リンカータンパク質によって置き換えられている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リンカータンパク質が核酸結合ドメインを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸結合ドメインがサッカロミセス・セレビシエＧＡＬ４である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記シャトルタンパク質が、配列番号１２または１３に記載のアミノ酸配列またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物活性ペイロード分子が、細胞サイトゾル内、核内、細胞小器官または小胞もしくは液胞などの細胞内構造内、細胞表面脂質膜内あるいは細胞内脂質膜内で活性である治療的に活性な分子である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物活性化合物の分子量が１Ｄａ〜１０ＭＤａの間である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記生物活性分子が：
（ｉ）小分子、タンパク質、ヌクレオチド、ＤＮＡまたはＤＮＡ構築物、プラスミド、ＲＮＡまたはＲＮＡ構築物、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、あるいは、
（ｉｉ）タンパク質もしくは酵素またはその断片、ヌクレアーゼ、あるいは抗体またはその抗原結合断片などの大分子、
ある、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物活性ペイロード分子が、ヌクレアーゼであってもよく、好ましくはＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ＴＡＬＥＮ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼであるゲノム編集ツールを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記生物活性分子が、配列番号１４に記載のアミノ酸配列またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法により得られた、または得られ得るリポソーム。
【請求項２８】
管腔を取り囲むリン脂質二重層と、孔形成タンパク質またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片と、シャトルタンパク質と、を含む、リポソーム。
【請求項２９】
リポソームが請求項１〜２６のいずれか１項で定義される通りのリポソームである、請求項２８に記載のリポソーム。
【請求項３０】
治療または診断に使用するための、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項３１】
疾患の治療、予防、または改善に使用するための、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項３２】
治療される疾患が肥満、より好ましくはＦＭＯ５調節性肥満である、請求項３１に記載のリポソーム。
【請求項３３】
治療される疾患が、男性型脱毛症（ＡＧＡ）；にきび；酒さ様皮膚炎；および前立腺癌からなる群から選択されるプロスタグランジンＤ２調節性疾患である、請求項３１に記載のリポソーム。
【請求項３４】
ジカ熱（またはジカウイルス病）、エボラウイルス病、後天性免疫不全症候群（ヒト免疫不全ウイルス）、Ｓｔａｔ３応答性癌、Ｐ５３欠損癌、ウイルス介在性子宮頸癌（すなわち、ヒトパピローマウイルス）、家族性高コレステロール血症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、クローン病、または炎症性疾患、特に細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の過剰発現に関係する腸の炎症性疾患を治療、予防、または改善するために使用される、請求項３１に記載のリポソーム。
【請求項３５】
リポソームを作製するために使用される細胞が、治療される対象から得られたものである、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項３６】
健常な細胞が前記対象の幹細胞株から、または前記対象の標的組織から得られ、問題の臨床状態の治療に適した治療用化合物がロードされるリポソームの作製に使用される前に、培養で増殖される、請求項３５に記載のリポソーム。
【請求項３７】
前記対象から得られた細胞が、患者の生検からのものであってもよい健常な細胞を含まない、請求項３５に記載のリポソーム。
【請求項３８】
請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のリポソーム、および使用説明書を含むキット。
【請求項３９】
ゲノム編集技術で使用するための、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項４０】
請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のリポソームに（ｉ）ガイドＲＮＡおよび／または（ｉｉ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする遺伝子構築物をロードすること、ならびにロードされた前記リポソームを遺伝子編集療法において使用することを含む、ゲノム編集方法。
【請求項４１】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１、またはＴＡＬＥＮまたはジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）に付着した弱毒化毒素タンパク質を含む、シャトルタンパク質。
【請求項４３】
前記タンパク質が、配列番号１１に記載のアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、または実質的にそれらからなる、請求項４２に記載のシャトルタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソーム、特に、限定的ではないが、リポソームを生成する方法、および細胞由来のリポソームにカーゴ分子をロードする方法に関する。本発明は、前記リポソームそれ自体、および小分子、ＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、生物活性タンパク質、ゲノム編集ツール（Ｃａｓ９などのヌクレアーゼなど）、およびさまざまな障害を治療するための細胞への薬物などの生物学的および治療的に活性なペイロード分子のステルス輸送のための細胞輸送システムとしてのこれらのリポソームの使用に及ぶ。前記リポソームはまた、診断および治療用途の範囲で使用され得る。本発明は、細胞外小胞（ＥＶ）の集団を含む前記リポソームなどの、医薬組成物および融合タンパク質にまで及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
小分子および高分子量治療薬の両方の標的化された細胞内輸送および制御放出のための合成の、ナノスケールにおける、高度な薬物輸送システムが実証されている［１］。それらは、ナノ粒子システム、リポソーム、ヒドロゲル、エマルジョン、ミセル、および可溶性ポリマーベースのドラッグデリバリー技術を非網羅的に組み込んでいる［１］。近年、特定のタスクを実行するために進化した目立たないタンパク質ドメインを再結合する（つまり、治療薬の輸送を容易にする）生物学的システムを使用する可能性が注目されている［２］。これらの成果としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などの大きな膜不浸透性分子の標的化輸送を達成するために細胞内膜系をナビゲートするためのタンパク質毒素由来材料の使用が挙げられる［２］。細胞内コンパートメントバリアを通過する手段がない場合、これらの試薬（ＡＳＯ）の生体利用性が制限されるため、これは有用である［２］。
【０００３】
炭疽菌毒素（Ａｔｘ）などのタンパク質は、細胞内膜系を破壊して細胞質ゾルに接近するように進化してきた。これは、管腔内小胞（ＩＬＶ）、多小胞エンドソーム（ＭＶＥ）／多小胞体（ＭＶＢ）内、およびアポトーシス関連遺伝子２相互作用タンパク質Ｘ（ＡＬＩＸ）依存プロセス中のＭＶＥ／ＭＶＢの内境界膜間の逆融合イベントを介して行われる［３および４］。
【０００４】
ＡｔｘのＰＡオリゴマー（細孔）成分は、ＭＶＥ／ＭＶＢの内腔からＩＬＶの内腔への浮腫因子（ＥＦ）および致死因子（ＬＦ）の移動に関与する陽イオン選択性細孔であると文献で報告されている［６］。さらに、ＥＦとＬＦの両方が、ＰＡ６３ｎオリゴマーを通過するために、溶融球状遷移（つまり、展開）を受ける必要がある［７］。さらに、ＣＡＳ９はＰＡ細孔を通過しないことが公知となっている［８］。
【０００５】
さらに、ｓｉＲＮＡまたはＡＳＯの輸送中に細孔の乗換えが生じたという状況に応じた間接的な証拠のみが存在し［２］、これは、（特に高濃度のＰＡ８３タンパク質が使用されている場合）前記ＭＶＥ／ＭＶＢの内境界膜を越えて乗換えが生じているか［３］、前記ＭＶＥ／ＭＶＢ内境界膜が破裂していた可能性が常にあるためである。
【０００６】
ＬＦの触媒サブユニット（すなわちドメインＩＩ−ＩＶ）がＬＦから除去された場合、結果として生じる非毒性のＬＦトランケーション（ＬＦｎ）は、それに融合した選択的カーゴがＰＡ細孔を越えてサイトゾルに移動するのを促進するのに役立つことが示されている［２］。ＡＳＯを輸送するためのＰＡ８３およびＬＦｎ−ＧＡＬ４の使用、または細胞のサイトゾルにｓｉＲＮＡを輸送するためのＰＡ８３：：ＬＦｎ−ＰＫＲの使用は以前に報告されている［２］。
【０００７】
ＰＡ８３：ＬＦｎ−ＧＡＬ４またはＰＡ８３：：ＬＦｎ−ＰＫＲを介した核酸（およびタンパク質）のヌクレオサイトゾル輸送は、いくつかの理由で理想に達していない。第一に、このシステムを体系的に使用することにより、すなわち、ｉ．ｖ．投与後、カーゴ及びドラッグデリバリーシステムを生体防御に曝露する。この輸送技術の構成要素は免疫原性であることが知られているため（すなわち、ＰＡ８３およびＬＦｎ）［１１］、反復投与が必要な場合、これらの構築物の血漿滞留時間に制限があり得る。第二に、全身投与後の標的細胞への輸送中に、タンパク質輸送システムまたはそのカーゴが破壊される可能性もまたある。さらに、ＰＡ８３の内在化に関与する受容体の発現がほぼ遍在することが示されているため、特定の細胞集団への標的化輸送の余地はほとんど存在しない［１２］。最後に、ＡＳＯなどのポリアニオンの電荷によって引き起こされるＰＫ−ＰＤの制限の可能性、すなわち細網内皮系の細胞による血漿プールからの急速な除去の可能性をも考慮する必要があろう［１３］。
【０００８】
野生型ＬＦがＩＬＶ及びリポソーム（例えばエクソソーム）の両方で報告されており、ＥＲに貯蔵されたカルシウムの放出後にＩＬＶがリポソームとして細胞から分泌されることが知られていることを考慮すると［５］、組換えＬＦもまた、リポソームに捕捉またはロードされ得ることが本発明者らによって推論された。さらに、イオノフォア（例えば、イオノマイシン）を使用すると、必要に応じてＥＲカルシウムが放出され、リポソームとしてＩＬＶのエキソサイトーシスが引き起こされる。その結果、イオノマイシンは、以前にＡｔｘ由来のデリバリーシステムで処理された細胞から、カーゴを含むＩＬＶを一時的に捕捉するために使用された。次に、これにより、細胞培養培地に分泌されたカーゴをロードされたリポソームが単離された。
【０００９】
本発明は、先行技術に固有の１つまたは複数の問題に対処しようとしている。
【００１０】
本発明者らは、管腔内小胞（またはリポソーム）をロードするための新しい方法論を開発し、これは、膜不浸透性（治療用）カーゴ材料を含むエクソソームとして収集され得る。この戦略は、小胞の内腔に閉じ込められたカーゴに「ステルス」品質を与え、免疫系から貨物を保護し、血清または他の体液に関連する酵素による破壊からカーゴを保護する。本明細書に記載のリポソームは、管腔内内容物を酵素的破壊および免疫応答から保護し得て、輸送中の抗原性または酵素的に不安定な物質を保護する天然に存在するパラクリン輸送システムと呼ばれることが多い。また、細胞または組織を標的とする能力をも有する。
【発明の概要】
【００１１】
したがって、本発明の第１の態様では、リポソームを調製する方法が提供され、この方法は、少なくとも１つの細胞を、以下の（ｉ）および（ｉｉ）：  （ｉ）孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片；  （ｉｉ）生物活性ペイロード分子に付着していてもよいシャトルタンパク質、と接触させることを含み、  ここで、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片は、少なくとも１つの前記細胞のリン脂質二重層を介して孔を作製し、かつ、前記シャトルタンパク質は、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくはその変異体もしくは断片と相互作用し、それによって前記細胞内に内在化され、それによってリポソームを作製し、この際、前記シャトルタンパク質に生物活性ペイロード分子がロードされていてもよい。
【００１２】
有利なことに、本発明者らは、第１の態様の方法が、外側のリン脂質二重層によって囲まれるかまたはカプセル化される内側の管腔を含むリポソーム（本明細書では「エクソソーム」とも呼ばれる）の効率的な生成を可能にすることを実証した。図７は、本発明の方法の一実施形態を示している。図１に示すように、本発明者らは、標識シャトルタンパク質、好ましくは前記シャトルタンパク質に共有結合したフルオロフォア、最も好ましくはテキサスレッド標識ＬＦｎ−ＰＫＲが、孔形成タンパク質ＰＡ８３の存在下で、ＣＤ６３陽性の膜で区切られた構造内の管腔内小胞と結合し得ることを発見した。さらに、これらの管腔内小胞は、図２および図５に示すように単離され得る。いくつかの実施形態では、前記リポソームは、生物活性ペイロード分子またはカーゴ分子を首尾よくロードされ得て、次いで、標的細胞（例えば、特定の状態に苦しむ患者の細胞）によって取り込まれ得る。前記生物活性ペイロード分子またはカーゴ分子は、効果的な生物学的または治療的結果を生み出し得る（例えば、図６を参照のこと）。したがって、本発明者らは、リポソームの治療への応用を想定している。本発明者らはまた、生物活性ペイロード分子がシャトルタンパク質に結合し得るを示し、図３は、前記単離されたリポソームが、前記フルオロフォア、テキサスレッドで標識された生物活性ペイロード分子を含むという明確な証拠を提供する。図３では、前記生物活性ペイロード分子はヌクレアーゼタンパク質Ｃａｓ９であり、図４では、前記ペイロード分子はＴｅｘａｓＲｅｄなどの小分子である。
【００１３】
本発明の方法は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで実施され得る。好ましい実施形態では、この方法は、前記リポソームを前記細胞から単離することをさらに含む。前記シャトルタンパク質は、生物活性ペイロード分子に結合していなくてもよい。しかしながら、好ましい実施形態では、前記シャトルタンパク質は、共有結合または非共有結合のいずれかで、生物活性ペイロード分子に付着している。
【００１４】
本発明者らはまた、図６に示すように、前記孔形成タンパク質およびシャトルタンパク質を使用して、薬理学的に活性なｓｉＲＮＡを前記リポソームに首尾よくロードし得ることを実証した。本発明の方法を使用して、生物学的に活性なカーゴ化合物をリポソームにロードおよび輸送し得て、前記リポソームを単離し、使用して、前記カーゴをある細胞集団から他の集団に移動させ得る。したがって、これらのデータを考慮すると、第１の態様の方法によって生成された前記リポソームは、どの生物活性ペイロード分子が運ばれているかに応じて、広範囲の障害を治療するために使用され得ることは明らかである。
【００１５】
第２の態様によれば、第１の態様の方法によって得られた、またはそれによって得られ得るリポソームが提供される。
【００１６】
第３の態様によれば、管腔、孔形成タンパク質、または孔形成ドメインまたはその変異体または断片を取り囲むリン脂質二重層、およびシャトルタンパク質を含むリポソームが提供される。
【００１７】
本発明のリポソームは、疾患の治療、予防、もしくは改善、または診断において使用され得ることもまた想定される。
【００１８】
したがって、第４の態様によれば、治療または診断に使用するための、第２の態様または第３の態様のいずれかによるリポソームが提供される。
【００１９】
第５の態様によれば、疾患の治療、予防、または改善に使用するための、第２または第３の態様のいずれかによるリポソームが提供される。
【００２０】
第６の態様によれば、対象の疾患を治療、予防または改善する方法が提供され、前記治療を必要とする対象に、第２のまたは第３の態様のいずれかに従って、治療有効量のリポソームを投与することを含む方法が提供される。
【００２１】
具体的には、本発明者らは、前記リポソームが、ＦＭＯ５調節性肥満または男性型脱毛症の治療に有用であり得ることを想定している。したがって、１つの好ましい実施形態では、前記治療される疾患は、肥満、より好ましくはＦＭＯ５調節性肥満である。他の好ましい実施形態では、前記治療される疾患は、プロスタグランジンＤ２によって調節される。前記プロスタグランジンＤ２調節性疾患は、男性型脱毛症（ＡＧＡ）；にきび；酒さ様皮膚炎；及び前立腺癌からなるグループから選択され得る。
【００２２】
他の好ましい実施形態では、前記リポソームは、予防薬としての治療において有用であり得る。前記リポソームは、ジカ熱（またはジカウイルス病）、エボラウイルス病、後天性免疫不全症候群（ヒト免疫不全ウイルス）、Ｓｔａｔ３応答性癌、Ｐ５３欠損癌、ウイルス性媒介子宮頸癌（すなわち、ヒト乳頭腫ウイルス）、家族性高コレステロール血症、デュシェン筋ジストロフィー、脊髄筋萎縮症、クローン病、およびさまざまな炎症性疾患、特に細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の過剰発現に関与する腸の疾患の治療に使用され得るが、これらに限定されない。
【００２３】
第７の態様によると、対象の疾患を診断する方法が提供され、この方法は、試験対象から生物学的サンプルを取得し、サンプル中の細胞を使用して、第１の態様の方法を使用して診断用化合物をロードしたリポソームを生成することを含む。
【００２４】
一実施形態では、これは、疾患マーカーを有する前記リポソームのカーゴと疾患細胞との相互作用を介して、疾患の有無を報告し得るセラノスティック化合物をリポソームにロードすることを含む。
【００２５】
他の実施形態では、および実施例８に示されるように、患者細胞に由来しないリポソーム（例えば、培養間葉系幹細胞由来のリポソーム）には、セラノスティック化合物がロードされる。さらに他の実施形態では、患者ではなく細胞株に由来するリポソームが、それらに他のカーゴをロードすることによって治療薬として使用される。一実施形態では、疾患は、非患者由来のリポソームで治療され得る。一実施形態では、前記非患者由来のリポソームは、非患者細胞に由来する。他の実施形態では、前記非患者由来のリポソームは、幹細胞に由来する。次に、前記得られたリポソームは、免疫学的に悪影響を与えることなく、すなわち「ステルス」療法として患者に投与され得る。
【００２６】
第８の態様によると、第２または第３の態様のいずれかによるリポソーム、および使用説明書を含むキットが提供される。
【００２７】
前記リポソームは、細胞外小胞（ＥＶ）または細胞内小胞、または管腔内小胞（ＩＬＶ）であり得る小胞を含み得る。最も好ましくは、前記リポソームはエクソソームを含む。本明細書で言及される脂質構造は主に細胞外であるが、本発明はまた、リソソーム、エンドソームなどの実質的に細胞内の脂質二重層構造、ならびに真核生物および原核生物の両方の、他の細胞内脂質二重層構造、ならびにその中の小胞に及ぶと見なされるべきであることが当業者によって理解されるであろう。本発明はまた、人工小胞、人工リポソームおよび他の人工脂質二重層構造などの人工脂質二重層構造にも及ぶことが理解されよう。
【００２８】
一実施形態では、前記リポソームは、１０ｎｍ〜５００ｎｍの間の平均直径を有する。前記リポソームの寸法は、例えば、小角中性子散乱を使用して測定され得る［２］。好ましい実施形態では、前記リポソームは、２０ｎｍ〜４００ｎｍの間の平均直径を有する。より好ましい実施形態では、前記リポソームは、３０ｎｍ〜３００ｎｍの間の平均直径を有する。さらにより好ましい実施形態では、前記リポソームは、４０ｎｍ〜２００ｎｍの間の平均直径を有する。さらにより好ましい実施形態では、前記リポソームは、５０ｎｍ〜１５０ｎｍの間の平均直径を有する。最も好ましい実施形態では、前記リポソームは、６０ｎｍ〜１２０ｎｍの間の平均直径を有する。
【００２９】
好ましい実施形態では、前記リポソームは、孔形成タンパク質を有するリン脂質二重層、またはリン脂質二重層内のその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片を含む。前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片は、前記リン脂質二重層の幅全体に完全に延在し得るか、あるいは前記リン脂質二重層の幅全体に部分的にのみ延在し得る。孔形成タンパク質、または孔形成ドメインまたはその変異体または断片は、細胞の内腔に伸びることができ、および／またはそれは、細胞の細胞外空間に延在し得る。前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片は、リン脂質二重層にのみわたって延在し得て、細胞の内腔および／または細胞の細胞外空間には延在しない。
【００３０】
好ましくは、第１の態様の方法で使用される細胞は、生物学的細胞を含む。好ましくは、前記細胞は、最も好ましくはヒト細胞である哺乳動物細胞を含む。最も好ましくは、前記細胞は、治療されている対象から得られた細胞を含む。例えば、前記細胞は、対象から得られた健常ではない細胞、例えば生検から収集したものであり得る。あるいは、前記細胞は、幹細胞株から得られた細胞を含む。前記幹細胞株は間葉系細胞株であり得る。
【００３１】
１つの非限定的な例では、健常な細胞は、問題の臨床状態を治療するのに適切な治療化合物がロードされるリポソーム（例えば、エクソソーム）の生成に使用される前に、標的組織から収集され、培養で増殖され得る。これにより、前記リポソームが身体によって「非自己」として認識される可能性が最小限に抑えられる。前記リポソームを処理して、治療薬をロードするプロセスから残存し得る残留抗原性物質を除去する可能性もまたある。一実施形態では、前記収集される細胞は、健常な細胞を含み得る。代替の非限定的な例では、前記収集される細胞は、健常な細胞を含まない場合がある。
【００３２】
好ましくは、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片は、非毒性タンパク質を含むか、またはそれらに由来する。一実施形態では、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片はリシンである。
【００３３】
好ましい実施形態では、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片は、炭疽菌に由来する。好ましい実施形態では、前記孔形成タンパク質は、炭疽菌病原性因子保護抗原（ＰＡ）である。一実施形態では、前記孔形成タンパク質は炭疽菌ＰＡ８３である。一実施形態では、前記炭疽菌ＰＡ８３は、以下のように、本明細書で配列番号１として提供されるアミノ酸配列を有する：
ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＥＶＫＱＥＮＲＬＬＮＥＳＥＳＳＳＱＧＬＬＧＹＹＦＳＤＬＮＦＱＡＰＭＶＶＴＳＳＴＴＧＤＬＳＩＰＳＳＥＬＥＮＩＰＳＥＮＱＹＦＱＳＡＩＷＳＧＦＩＫＶＫＫＳＤＥＹＴＦＡＴＳＡＤＮＨＶＴＭＷＶＤＤＱＥＶＩＮＫＡＳＮＳＮＫＩＲＬＥＫＧＲＬＹＱＩＫＩＱＹＱＲＥＮＰＴＥＫＧＬＤＦＫＬＹＷＴＤＳＱＮＫＫＥＶＩＳＳＤＮＬＱＬＰＥＬＫＱＫＳＳＮＳＲＫＫＲＳＴＳＡＧＰＴＶＰＤＲＤＮＤＧＩＰＤＳＬＥＶＥＧＹＴＶＤＶＫＮＫＲＴＦＬＳＰＷＩＳＮＩＨＥＫＫＧＬＴＫＹＫＳＳＰＥＫＷＳＴＡＳＤＰＹＳＤＦＥＫＶＴＧＲＩＤＫＮＶＳＰＥＡＲＨＰＬＶＡＡＹＰＩＶＨＶＤＭＥＮＩＩＬＳＫＮＥＤＱＳＴＱＮＴＤＳＱＴＲＴＩＳＫＮＴＳＴＳＲＴＨＴＳＥＶＨＧＮＡＥＶＨＡＳＦＦＤＩＧＧＳＶＳＡＧＦＳＮＳＮＳＳＴＶＡＩＤＨＳＬＳＬＡＧＥＲＴＷＡＥＴＭＧＬＮＴＡＤＴＡＲＬＮＡＮＩＲＹＶＮＴＧＴＡＰＩＹＮＶＬＰＴＴＳＬＶＬＧＫＮＱＴＬＡＴＩＫＡＫＥＮＱＬＳＱＩＬＡＰＮＮＹＹＰＳＫＮＬＡＰＩＡＬＮＡＱＤＤＦＳＳＴＰＩＴＭＮＹＮＱＦＬＥＬＥＫＴＫＱＬＲＬＤＴＤＱＶＹＧＮＩＡＴＹＮＦＥＮＧＲＶＲＶＤＴＧＳＮＷＳＥＶＬＰＱＩＱＥＴＴＡＲＩＩＦＮＧＫＤＬＮＬＶＥＲＲＩＡＡＶＮＰＳＤＰＬＥＴＴＫＰＤＭＴＬＫＥＡＬＫＩＡＦＧＦＮＥＰＮＧＮＬＱＹＱＧＫＤＩＴＥＦＤＦＮＦＤＱＱＴＳＱＮＩＫＮＱＬＡＥＬＮＡＴＮＩＹＴＶＬＤＫＩＫＬＮＡＫＭＮＩＬＩＲＤＫＲＦＨＹＤＲＮＮＩＡＶＧＡＤＥＳＶＶＫＥＡＨＲＥＶＩＮＳＳＴＥＧＬＬＬＮＩＤＫＤＩＲＫＩＬＳＧＹＩＶＥＩＥＤＴＥＧＬＫＥＶＩＮＤＲＹＤＭＬＮＩＳＳＬＲＱＤＧＫＴＦＩＤＦＫＫＹＮＤＫＬＰＬＹＩＳＮＰＮＹＫＶＮＶＹＡＶＴＫＥＮＴＩＩＮＰＳＥＮＧＤＴＳＴＮＧＩＫＫＩＬＩＦＳＫＫＧＹＥＩＧ［配列番号１］
したがって、好ましくは、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる。
【００３４】
１つの好ましい実施形態では、前記炭疽菌ＰＡ８３は、以下のように本明細書で配列番号２として提供されるアミノ酸配列を有するＰＡ８３変異体（本明細書では「ＭＲＳＧ−６Ｈｉｓ−ＰＡ８３」と呼ばれる）を含む：
ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＥＶＫＱＥＮＲＬＬＮＥＳＥＳＳＳＱＧＬＬＧＹＹＦＳＤＬＮＦＱＡＰＭＶＶＴＳＳＴＴＧＤＬＳＩＰＳＳＥＬＥＮＩＰＳＥＮＱＹＦＱＳＡＩＷＳＧＦＩＫＶＫＫＳＤＥＹＴＦＡＴＳＡＤＮＨＶＴＭＷＶＤＤＱＥＶＩＮＫＡＳＮＳＮＫＩＲＬＥＫＧＲＬＹＱＩＫＩＱＹＱＲＥＮＰＴＥＫＧＬＤＦＫＬＹＷＴＤＳＱＮＫＫＥＶＩＳＳＤＮＬＱＬＰＥＬＫＱＫＳＳＮＳＲＫＫＲＳＴＳＡＧＰＴＶＰＤＲＤＮＤＧＩＰＤＳＬＥＶＥＧＹＴＶＤＶＫＮＫＲＴＦＬＳＰＷＩＳＮＩＨＥＫＫＧＬＴＫＹＫＳＳＰＥＫＷＳＴＡＳＤＰＹＳＤＦＥＫＶＴＧＲＩＤＫＮＶＳＰＥＡＲＨＰＬＶＡＡＹＰＩＶＨＶＤＭＥＮＩＩＬＳＫＮＥＤＱＳＴＱＮＴＤＳＱＴＲＴＩＳＫＮＴＳＴＳＲＴＨＴＳＥＶＨＧＮＡＥＶＨＡＳＦＦＤＩＧＧＳＶＳＡＧＦＳＮＳＮＳＳＴＶＡＩＤＨＳＬＳＬＡＧＥＲＴＷＡＥＴＭＧＬＮＴＡＤＴＡＲＬＮＡＮＩＲＹＶＮＴＧＴＡＰＩＹＮＶＬＰＴＴＳＬＶＬＧＫＮＱＴＬＡＴＩＫＡＫＥＮＱＬＳＱＩＬＡＰＮＮＹＹＰＳＫＮＬＡＰＩＡＬＮＡＱＤＤＦＳＳＴＰＩＴＭＮＹＮＱＦＬＥＬＥＫＴＫＱＬＲＬＤＴＤＱＶＹＧＮＩＡＴＹＮＦＥＮＧＲＶＲＶＤＴＧＳＮＷＳＥＶＬＰＱＩＱＥＴＴＡＲＩＩＦＮＧＫＤＬＮＬＶＥＲＲＩＡＡＶＮＰＳＤＰＬＥＴＴＫＰＤＭＴＬＫＥＡＬＫＩＡＦＧＦＮＥＰＮＧＮＬＱＹＱＧＫＤＩＴＥＦＤＦＮＦＤＱＱＴＳＱＮＩＫＮＱＬＡＥＬＮＡＴＮＩＹＴＶＬＤＫＩＫＬＮＡＫＭＮＩＬＩＲＤＫＲＦＨＹＤＲＮＮＩＡＶＧＡＤＥＳＶＶＫＥＡＨＲＥＶＩＮＳＳＴＥＧＬＬＬＮＩＤＫＤＩＲＫＩＬＳＧＹＩＶＥＩＥＤＴＥＧＬＫＥＶＩＮＤＲＹＤＭＬＮＩＳＳＬＲＱＤＧＫＴＦＩＤＦＫＫＹＮＤＫＬＰＬＹＩＳＮＰＮＹＫＶＮＶＹＡＶＴＫＥＮＴＩＩＮＰＳＥＮＧＤＴＳＴＮＧＩＫＫＩＬＩＦＳＫＫＧＹＥＩＧ［配列番号２］
したがって、好ましくは、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる。
【００３５】
配列番号２による前記ＰＡ８３変異体がＮ末端タグ付き変異体を含み、それにより前記タグがＭＲＳＧ−６Ｈを含み、以下のように本明細書で配列番号３として提供されるアミノ酸配列を有することを当業者は理解しよう：
ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨ［配列番号３］
６Ｈｉｓを含む代替タンパク質タグは、以下のように本明細書において配列番号４として提供される：
ＨＨＨＨＨＨ［配列番号４］
配列番号３および配列番号４に記載のＭＲＳＧ−６Ｈｉｓおよび６−Ｈｉｓタグは、本明細書に記載されるタンパク質のいずれかのＮ末端またはＣ末端に付加され得ることが当業者により理解され、かつ、そのような開示は、タグ付きおよびタグなしの両方のタンパク質変異体を保護することが理解されよう。
【００３６】
前記孔形成タンパク質は、炭疽菌ＰＡ６３などのオリゴマーへと形成され得る単一の実行ドメインまたはサブユニットを含み得ることが理解されるであろう。したがって、他の好ましい実施形態では、前記孔形成タンパク質は炭疽菌ＰＡ６３である。一実施形態では、前記炭疽菌ＰＡ６３は、以下のように本明細書で配列番号５として提供されるアミノ酸配列を有する：
ＳＴＳＡＧＰＴＶＰＤＲＤＮＤＧＩＰＤＳＬＥＶＥＧＹＴＶＤＶＫＮＫＲＴＦＬＳＰＷＩＳＮＩＨＥＫＫＧＬＴＫＹＫＳＳＰＥＫＷＳＴＡＳＤＰＹＳＤＦＥＫＶＴＧＲＩＤＫＮＶＳＰＥＡＲＨＰＬＶＡＡＹＰＩＶＨＶＤＭＥＮＩＩＬＳＫＮＥＤＱＳＴＱＮＴＤＳＱＴＲＴＩＳＫＮＴＳＴＳＲＴＨＴＳＥＶＨＧＮＡＥＶＨＡＳＦＦＤＩＧＧＳＶＳＡＧＦＳＮＳＮＳＳＴＶＡＩＤＨＳＬＳＬＡＧＥＲＴＷＡＥＴＭＧＬＮＴＡＤＴＡＲＬＮＡＮＩＲＹＶＮＴＧＴＡＰＩＹＮＶＬＰＴＴＳＬＶＬＧＫＮＱＴＬＡＴＩＫＡＫＥＮＱＬＳＱＩＬＡＰＮＮＹＹＰＳＫＮＬＡＰＩＡＬＮＡＱＤＤＦＳＳＴＰＩＴＭＮＹＮＱＦＬＥＬＥＫＴＫＱＬＲＬＤＴＤＱＶＹＧＮＩＡＴＹＮＦＥＮＧＲＶＲＶＤＴＧＳＮＷＳＥＶＬＰＱＩＱＥＴＴＡＲＩＩＦＮＧＫＤＬＮＬＶＥＲＲＩＡＡＶＮＰＳＤＰＬＥＴＴＫＰＤＭＴＬＫＥＡＬＫＩＡＦＧＦＮＥＰＮＧＮＬＱＹＱＧＫＤＩＴＥＦＤＦＮＦＤＱＱＴＳＱＮＩＫＮＱＬＡＥＬＮＡＴＮＩＹＴＶＬＤＫＩＫＬＮＡＫＭＮＩＬＩＲＤＫＲＦＨＹＤＲＮＮＩＡＶＧＡＤＥＳＶＶＫＥＡＨＲＥＶＩＮＳＳＴＥＧＬＬＬＮＩＤＫＤＩＲＫＩＬＳＧＹＩＶＥＩＥＤＴＥＧＬＫＥＶＩＮＤＲＹＤＭＬＮＩＳＳＬＲＱＤＧＫＴＦＩＤＦＫＫＹＮＤＫＬＰＬＹＩＳＮＰＮＹＫＶＮＶＹＡＶＴＫＥＮＴＩＩＮＰＳＥＮＧＤＴＳＴＮＧＩＫＫＩＬＩＦＳＫＫＧＹＥＩＧ［配列番号５］
したがって、好ましくは、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片は、配列番号５に記載のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる。
【００３７】
場合によっては、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片は、前記孔形成タンパク質の断片を含み得ることも理解されよう。例えば、前記孔形成タンパク質は、孔形成断片のみを残すように切り取られるか、または消化され得て、これらは例えば酵素による。したがって、一実施形態では、前記孔形成タンパク質は炭疽菌ＰＡ８３の断片であり、それによって前記細胞外ドメインが酵素により除去されている。他の実施形態では、前記孔形成タンパク質は炭疽菌ＰＡ６３の断片であり、それによって前記細胞外ドメインが酵素により除去されている。これらのタンパク質フラグメントの両方が、以下のように本明細書において配列番号６として提供されるアミノ酸配列を有することが当業者によって理解されるであろう：
ＶＨＶＤＭＥＮＩＩＬＳＫＮＥＤＱＳＴＱＮＴＤＳＱＴＲＴＩＳＫＮＴＳＴＳＲＴＨＴＳＥＶＨＧＮＡＥＶＨＡＳＦＦＤＩＧＧＳＶＳＡＧＦＳＮＳＮＳＳＴＶＡＩＤＨＳＬＳＬＡＧＥＲＴＷＡＥＴＭＧＬＮＴＡＤＴＡＲＬＮＡＮＩＲＹＶＮＴ［配列番号６］
したがって、好ましくは、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片は、配列番号６に記載のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる。
【００３８】
場合によっては、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片は、場合、孔形成タンパク質の突然変異体または変異体、例えば、天然タンパク質の１つまたは複数の残基が修飾されているものを含み得ることがさらに理解されよう。
【００３９】
したがって、さらなる実施形態では、前記孔形成タンパク質は、炭疽菌ＰＡ８３  Ｄ５１２Ｋ変異体であり、以下のように本明細書において配列番号７として提供されるアミノ酸配列を有する：
ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＥＶＫＱＥＮＲＬＬＮＥＳＥＳＳＳＱＧＬＬＧＹＹＦＳＤＬＮＦＱＡＰＭＶＶＴＳＳＴＴＧＤＬＳＩＰＳＳＥＬＥＮＩＰＳＥＮＱＹＦＱＳＡＩＷＳＧＦＩＫＶＫＫＳＤＥＹＴＦＡＴＳＡＤＮＨＶＴＭＷＶＤＤＱＥＶＩＮＫＡＳＮＳＮＫＩＲＬＥＫＧＲＬＹＱＩＫＩＱＹＱＲＥＮＰＴＥＫＧＬＤＦＫＬＹＷＴＤＳＱＮＫＫＥＶＩＳＳＤＮＬＱＬＰＥＬＫＱＫＳＳＮＳＲＫＫＲＳＴＳＡＧＰＴＶＰＤＲＤＮＤＧＩＰＤＳＬＥＶＥＧＹＴＶＤＶＫＮＫＲＴＦＬＳＰＷＩＳＮＩＨＥＫＫＧＬＴＫＹＫＳＳＰＥＫＷＳＴＡＳＤＰＹＳＤＦＥＫＶＴＧＲＩＤＫＮＶＳＰＥＡＲＨＰＬＶＡＡＹＰＩＶＨＶＤＭＥＮＩＩＬＳＫＮＥＤＱＳＴＱＮＴＤＳＱＴＲＴＩＳＫＮＴＳＴＳＲＴＨＴＳＥＶＨＧＮＡＥＶＨＡＳＦＦＤＩＧＧＳＶＳＡＧＦＳＮＳＮＳＳＴＶＡＩＤＨＳＬＳＬＡＧＥＲＴＷＡＥＴＭＧＬＮＴＡＤＴＡＲＬＮＡＮＩＲＹＶＮＴＧＴＡＰＩＹＮＶＬＰＴＴＳＬＶＬＧＫＮＱＴＬＡＴＩＫＡＫＥＮＱＬＳＱＩＬＡＰＮＮＹＹＰＳＫＮＬＡＰＩＡＬＮＡＱＤＤＦＳＳＴＰＩＴＭＮＹＮＱＦＬＥＬＥＫＴＫＱＬＲＬＤＴＤＱＶＹＧＮＩＡＴＹＮＦＥＮＧＲＶＲＶＤＴＧＳＮＷＳＥＶＬＰＱＩＱＥＴＴＡＲＩＩＦＮＧＫＤＬＮＬＶＥＲＲＩＡＡＶＮＰＳＫＰＬＥＴＴＫＰＤＭＴＬＫＥＡＬＫＩＡＦＧＦＮＥＰＮＧＮＬＱＹＱＧＫＤＩＴＥＦＤＦＮＦＤＱＱＴＳＱＮＩＫＮＱＬＡＥＬＮＡＴＮＩＹＴＶＬＤＫＩＫＬＮＡＫＭＮＩＬＩＲＤＫＲＦＨＹＤＲＮＮＩＡＶＧＡＤＥＳＶＶＫＥＡＨＲＥＶＩＮＳＳＴＥＧＬＬＬＮＩＤＫＤＩＲＫＩＬＳＧＹＩＶＥＩＥＤＴＥＧＬＫＥＶＩＮＤＲＹＤＭＬＮＩＳＳＬＲＱＤＧＫＴＦＩＤＦＫＫＹＮＤＫＬＰＬＹＩＳＮＰＮＹＫＶＮＶＹＡＶＴＫＥＮＴＩＩＮＰＳＥＮＧＤＴＳＴＮＧＩＫＫＩＬＩＦＳＫＫＧＹＥＩＧ［配列番号７］
したがって、好ましくは、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片は、配列番号７に記載のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる。
【００４０】
さらに他の実施形態では前記孔形成タンパク質は炭疽菌ＰＡ８３  Ｋ２４５Ｇ；Ｒ２５２Ｎ［１６］変異体であり、以下のように本明細書において配列番号８として提供されるアミノ酸配列を有する：
ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＥＶＫＱＥＮＲＬＬＮＥＳＥＳＳＳＱＧＬＬＧＹＹＦＳＤＬＮＦＱＡＰＭＶＶＴＳＳＴＴＧＤＬＳＩＰＳＳＥＬＥＮＩＰＳＥＮＱＹＦＱＳＡＩＷＳＧＦＩＫＶＫＫＳＤＥＹＴＦＡＴＳＡＤＮＨＶＴＭＷＶＤＤＱＥＶＩＮＫＡＳＮＳＮＫＩＲＬＥＫＧＲＬＹＱＩＫＩＱＹＱＲＥＮＰＴＥＫＧＬＤＦＫＬＹＷＴＤＳＱＮＫＫＥＶＩＳＳＤＮＬＱＬＰＥＬＫＱＫＳＳＮＳＲＫＫＲＳＴＳＡＧＰＴＶＰＤＲＤＮＤＧＩＰＤＳＬＥＶＥＧＹＴＶＤＶＫＮＫＲＴＦＬＳＰＷＩＳＮＩＨＥＫＫＧＬＴＫＹＫＳＳＰＥＫＷＳＴＡＳＤＰＹＳＤＦＥＫＶＴＧＲＩＤＧＮＶＳＰＥＡＮＨＰＬＶＡＡＹＰＩＶＨＶＤＭＥＮＩＩＬＳＫＮＥＤＱＳＴＱＮＴＤＳＱＴＲＴＩＳＫＮＴＳＴＳＲＴＨＴＳＥＶＨＧＮＡＥＶＨＡＳＦＦＤＩＧＧＳＶＳＡＧＦＳＮＳＮＳＳＴＶＡＩＤＨＳＬＳＬＡＧＥＲＴＷＡＥＴＭＧＬＮＴＡＤＴＡＲＬＮＡＮＩＲＹＶＮＴＧＴＡＰＩＹＮＶＬＰＴＴＳＬＶＬＧＫＮＱＴＬＡＴＩＫＡＫＥＮＱＬＳＱＩＬＡＰＮＮＹＹＰＳＫＮＬＡＰＩＡＬＮＡＱＤＤＦＳＳＴＰＩＴＭＮＹＮＱＦＬＥＬＥＫＴＫＱＬＲＬＤＴＤＱＶＹＧＮＩＡＴＹＮＦＥＮＧＲＶＲＶＤＴＧＳＮＷＳＥＶＬＰＱＩＱＥＴＴＡＲＩＩＦＮＧＫＤＬＮＬＶＥＲＲＩＡＡＶＮＰＳＤＰＬＥＴＴＫＰＤＭＴＬＫＥＡＬＫＩＡＦＧＦＮＥＰＮＧＮＬＱＹＱＧＫＤＩＴＥＦＤＦＮＦＤＱＱＴＳＱＮＩＫＮＱＬＡＥＬＮＡＴＮＩＹＴＶＬＤＫＩＫＬＮＡＫＭＮＩＬＩＲＤＫＲＦＨＹＤＲＮＮＩＡＶＧＡＤＥＳＶＶＫＥＡＨＲＥＶＩＮＳＳＴＥＧＬＬＬＮＩＤＫＤＩＲＫＩＬＳＧＹＩＶＥＩＥＤＴＥＧＬＫＥＶＩＮＤＲＹＤＭＬＮＩＳＳＬＲＱＤＧＫＴＦＩＤＦＫＫＹＮＤＫＬＰＬＹＩＳＮＰＮＹＫＶＮＶＹＡＶＴＫＥＮＴＩＩＮＰＳＥＮＧＤＴＳＴＮＧＩＫＫＩＬＩＦＳＫＫＧＹＥＩＧ［配列番号８］
したがって、好ましくは、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片は、配列番号８に記載のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる。
【００４１】
さらに他の実施形態では、前記孔形成タンパク質は炭疽菌ＰＡ８３  Ｋ２４５Ｎ；Ｒ２５２Ｓ［１６］変異体であり、以下のように本明細書において配列番号９として提供されるアミノ酸配列を有する：
ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＥＶＫＱＥＮＲＬＬＮＥＳＥＳＳＳＱＧＬＬＧＹＹＦＳＤＬＮＦＱＡＰＭＶＶＴＳＳＴＴＧＤＬＳＩＰＳＳＥＬＥＮＩＰＳＥＮＱＹＦＱＳＡＩＷＳＧＦＩＫＶＫＫＳＤＥＹＴＦＡＴＳＡＤＮＨＶＴＭＷＶＤＤＱＥＶＩＮＫＡＳＮＳＮＫＩＲＬＥＫＧＲＬＹＱＩＫＩＱＹＱＲＥＮＰＴＥＫＧＬＤＦＫＬＹＷＴＤＳＱＮＫＫＥＶＩＳＳＤＮＬＱＬＰＥＬＫＱＫＳＳＮＳＲＫＫＲＳＴＳＡＧＰＴＶＰＤＲＤＮＤＧＩＰＤＳＬＥＶＥＧＹＴＶＤＶＫＮＫＲＴＦＬＳＰＷＩＳＮＩＨＥＫＫＧＬＴＫＹＫＳＳＰＥＫＷＳＴＡＳＤＰＹＳＤＦＥＫＶＴＧＲＩＤＮＮＶＳＰＥＡＳＨＰＬＶＡＡＹＰＩＶＨＶＤＭＥＮＩＩＬＳＫＮＥＤＱＳＴＱＮＴＤＳＱＴＲＴＩＳＫＮＴＳＴＳＲＴＨＴＳＥＶＨＧＮＡＥＶＨＡＳＦＦＤＩＧＧＳＶＳＡＧＦＳＮＳＮＳＳＴＶＡＩＤＨＳＬＳＬＡＧＥＲＴＷＡＥＴＭＧＬＮＴＡＤＴＡＲＬＮＡＮＩＲＹＶＮＴＧＴＡＰＩＹＮＶＬＰＴＴＳＬＶＬＧＫＮＱＴＬＡＴＩＫＡＫＥＮＱＬＳＱＩＬＡＰＮＮＹＹＰＳＫＮＬＡＰＩＡＬＮＡＱＤＤＦＳＳＴＰＩＴＭＮＹＮＱＦＬＥＬＥＫＴＫＱＬＲＬＤＴＤＱＶＹＧＮＩＡＴＹＮＦＥＮＧＲＶＲＶＤＴＧＳＮＷＳＥＶＬＰＱＩＱＥＴＴＡＲＩＩＦＮＧＫＤＬＮＬＶＥＲＲＩＡＡＶＮＰＳＤＰＬＥＴＴＫＰＤＭＴＬＫＥＡＬＫＩＡＦＧＦＮＥＰＮＧＮＬＱＹＱＧＫＤＩＴＥＦＤＦＮＦＤＱＱＴＳＱＮＩＫＮＱＬＡＥＬＮＡＴＮＩＹＴＶＬＤＫＩＫＬＮＡＫＭＮＩＬＩＲＤＫＲＦＨＹＤＲＮＮＩＡＶＧＡＤＥＳＶＶＫＥＡＨＲＥＶＩＮＳＳＴＥＧＬＬＬＮＩＤＫＤＩＲＫＩＬＳＧＹＩＶＥＩＥＤＴＥＧＬＫＥＶＩＮＤＲＹＤＭＬＮＩＳＳＬＲＱＤＧＫＴＦＩＤＦＫＫＹＮＤＫＬＰＬＹＩＳＮＰＮＹＫＶＮＶＹＡＶＴＫＥＮＴＩＩＮＰＳＥＮＧＤＴＳＴＮＧＩＫＫＩＬＩＦＳＫＫＧＹＥＩＧ．［配列番号９］
したがって、好ましくは、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片は、配列番号９に記載のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる。
【００４２】
他の実施形態では、前記孔形成タンパク質は、ＰＡ６３膜貫通ドメインに代えて溶血素の膜貫通ドメイン［１７］を組み込んだ、以下のように本明細書で配列番号１０として提供されるアミノ酸配列を有する、炭疽菌ＰＡ８３−ＨＬハイブリッド分子を含む：
ＧＳＥＶＫＱＥＮＲＬＬＮＥＳＥＳＳＳＱＧＬＬＧＹＹＦＳＤＬＮＦＱＡＰＭＶＶＴＳＳＴＴＧＤＬＳＩＰＳＳＥＬＥＮＩＰＳＥＮＱＹＦＱＳＡＩＷＳＧＦＩＫＶＫＫＳＤＥＹＴＦＡＴＳＡＤＮＨＶＴＭＷＶＤＤＱＥＶＩＮＫＡＳＮＳＮＫＩＲＬＥＫＧＲＬＹＱＩＫＩＱＹＱＲＥＮＰＴＥＫＧＬＤＦＫＬＹＷＴＤＳＱＮＫＫＥＶＩＳＳＤＮＬＱＬＰＥＬＫＱＫＳＳＮＳＲＫＫＲＳＴＳＡＧＰＴＶＰＤＲＤＮＤＧＩＰＤＳＬＥＶＥＧＹＴＶＤＶＫＮＫＲＴＦＬＳＰＷＩＳＮＩＨＥＫＫＧＬＴＫＹＫＳＳＰＥＫＷＳＴＡＳＤＰＹＳＤＦＥＫＶＴＧＲＩＤＫＮＶＳＰＥＡＲＨＰＬＶＡＡＹＰＩＶＨＶＤＭＥＮＩＩＬＳＫＮＥＤＱＳＴＱＮＴＤＳＱＴＲＴＩＳＫＮＴＳＫＥＹＭＳＴＬＴＹＧＦＮＧＮＶＴＧＤＤＴＧＫＩＧＧＬＩＧＡＮＶＳＩＧＨＴＬＫＹＡＩＤＨＳＬＳＬＡＧＥＲＴＷＡＥＴＭＧＬＮＴＡＤＴＡＲＬＮＡＮＩＲＹＶＮＴＧＴＡＰＩＹＮＶＬＰＴＴＳＬＶＬＧＫＮＱＴＬＡＴＩＫＡＫＥＮＱＬＳＱＩＬＡＰＮＮＹＹＰＳＫＮＬＡＰＩＡＬＮＡＱＤＤＦＳＳＴＰＩＴＭＮＹＮＱＦＬＥＬＥＫＴＫＱＬＲＬＤＴＤＱＶＹＧＮＩＡＴＹＮＦＥＮＧＲＶＲＶＤＴＧＳＮＷＳＥＶＬＰＱＩＱＥＴＴＡＲＩＩＦＮＧＫＤＬＮＬＶＥＲＲＩＡＡＶＮＰＳＤＰＬＥＴＴＫＰＤＭＴＬＫＥＡＬＫＩＡＦＧＦＮＥＰＮＧＮＬＱＹＱＧＫＤＩＴＥＦＤＦＮＦＤＱＱＴＳＱＮＩＫＮＱＬＡＥＬＮＡＴＮＩＹＴＶＬＤＫＩＫＬＮＡＫＭＮＩＬＩＲＤＫＲＦＨＹＤＲＮＮＩＡＶＧＡＤＥＳＶＶＫＥＡＨＲＥＶＩＮＳＳＴＥＧＬＬＬＮＩＤＫＤＩＲＫＩＬＳＧＹＩＶＥＩＥＤＴＥＧＬＫＥＶＩＮＤＲＹＤＭＬＮＩＳＳＬＲＱＤＧＫＴＦＩＤＦＫＫＹＮＤＫＬＰＬＹＩＳＮＰＮＹＫＶＮＶＹＡＶＴＫＥＮＴＩＩＮＰＳＥＮＧＤＴＳＴＮＧＩＫＫＩＬＩＦＳＫＫＧＹＥＩＧ［配列番号１０］
したがって、好ましくは、前記孔形成タンパク質、またはその孔形成ドメインもしくは変異体もしくは断片は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる。
【００４３】
上記の実施形態は、孔形成タンパク質の例を表し、決して限定的または排他的ではないことが当業者によって理解されるであろう。前記孔形成タンパク質の他のフラグメント、突然変異体、または変異体もまた、本発明の範囲内にあることが理解されるであろう。
【００４４】
好ましい孔形成タンパク質の他の例としては、ＡｔｘのＰＡ８３またはＰＡ６３成分、記載されている八量体形成変異体などのＰＡ８３またはＰＡ６３の変異体［１６］、または記載されているＰＡ−α溶血素ハイブリッドなどのＰＡハイブリッド、または組換えストレプトライシンＯ（ＳＬＯ）もしくはα溶血素などの脂質二重層上の乗換えを仲介するように修飾された非Ａｔｘ孔形成タンパク質が挙げられる。
【００４５】
「シャトルタンパク質」という用語は、予備形成タンパク質の細孔を通る輸送を促進するように構成された、いずれかのタンパク質またはペプチドを指し得る。好ましい実施形態では、前記シャトルタンパク質は、前記細孔を通る生物活性ペイロード分子の輸送を容易にするように構成される。したがって、前記シャトルタンパク質は、好ましくは、エンドソームの内境界膜を細孔を通して通過し、ペイロードまたはカーゴを一緒に運び得る賦形剤である。前記ペイロードは、前記シャトルタンパク質と共有結合または非共有結合し得る。図７は、前記ペイロードを運ぶ前記シャトルタンパク質と孔形成タンパク質との間の相互作用を示している。
【００４６】
好ましくは、前記シャトルタンパク質は、弱毒化毒素タンパク質を含む。特に、前記シャトルタンパク質は、炭疽菌由来の致死因子（ＬＦ）または浮腫因子（ＥＦ）であり得る。一実施形態では、前記致死因子ドメインＩ（ＬＦｎ）は、以下のように本明細書で配列番号１１として提供されるアミノ酸配列を有する：
ＭＥＲＮＫＴＱＥＥＨＬＫＥＩＭＫＨＩＶＫＩＥＶＫＧＥＥＡＶＫＫＥＡＡＥＫＬＬＥＫＶＰＳＤＶＬＥＭＹＫＡＩＧＧＫＩＹＩＶＤＧＤＩＴＫＨＩＳＬＥＡＬＳＥＤＫＫＫＩＫＤＩＹＧＫＤＡＬＬＨＥＨＹＶＹＡＫＥＧＹＥＰＶＬＶＩＱＳＳＥＤＹＶＥＮＴＥＫＡＬＮＶＹＹＥＩＧＫＩＬＳＲＤＩＬＳＫＩＮＱＰＹＱＫＦＬＤＶＬＮＴＩＫＮＡＳＤＳＤＧＱＤＬＬＦＴＮＱＬＫＥＨＰＴＤＦＳＶＥＦＬＥＱＮＳＮＥＶＱＥＶＦＡＫＡＦＡＹＹＩＥＰＱＨＲＤＶＬＱＬＹＡＰＥＡＦＮＹＭＤＫＦＮＥＱＥＩＮＬＳ［配列番号１１］
したがって、好ましくは、前記シャトルタンパク質は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる。
【００４７】
好ましい実施形態では、前記シャトルタンパク質はまた、リンカータンパク質を含む。好ましくは、前記弱毒化毒素において、少なくとも１つの毒素ドメイン、例えば、炭疽菌致死因子タンパク質毒素の１つまたは複数の毒性ドメインＩＩ〜ＩＶが、前記リンカータンパク質によって置き換えられる。より好ましい実施形態では、前記リンカータンパク質は、核酸結合ドメインを含む。例えば、前記核酸結合ドメインは、以下のように本明細書で配列番号１２として提供されるアミノ酸配列を有するサッカロミセス・セレビシエＧＡＬ４（ＬＦｎと融合）であり得る：
ＭＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＭＥＲＮＫＴＱＥＥＨＬＫＥＩＭＫＨＩＶＫＩＥＶＫＧＥＥＡＶＫＫＥＡＡＥＫＬＬＥＫＶＰＳＤＶＬＥＭＹＫＡＩＧＧＫＩＹＩＶＤＧＤＩＴＫＨＩＳＬＥＡＬＳＥＤＫＫＫＩＫＤＩＹＧＫＤＡＬＬＨＥＨＹＶＹＡＫＥＧＹＥＰＶＬＶＩＱＳＳＥＤＹＶＥＮＴＥＫＡＬＮＶＹＹＥＩＧＫＩＬＳＲＤＩＬＳＫＩＮＱＰＹＱＫＦＬＤＶＬＮＴＩＫＮＡＳＤＳＤＧＱＤＬＬＦＴＮＱＬＫＥＨＰＴＤＦＳＶＥＦＬＥＱＮＳＮＥＶＱＥＶＦＡＫＡＦＡＹＹＩＥＰＱＨＲＤＶＬＱＬＹＡＰＥＡＦＮＹＭＤＫＦＮＥＱＥＩＮＬＳＭＫＬＬＳＳＩＥＱＡＣＤＩＣＲＬＫＫＬＫＣＳＫＥＫＰＫＣＡＫＣＬＫＮＮＷＥＣＲＹＳＰＫＴＫＲＳＰＬＴＲＡＨＬＴＥＶＥＳＲＬＥＲＬＥＱＬＦＬＬＩＦＰＲＥＤＬＤＭＩＬＫＭＤＳＬＱＤＩＫＡＬＬＴＧＬＦＶＱＤＮＶＮＫＤＡＶＴＤＲＬＡＳＶＥＴＤＭＰＬＴＬＲＱＨＲＩＳＡＴＳＳＳＥＥＳＳＮＫＧＱＲＱＬＴＶＳＨＨＨＨＨＨ［配列番号１２］
したがって、好ましくは、前記シャトルタンパク質は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる。
【００４８】
しかしながら、本発明者らは、ＬＦｎ−ＧＡＬ４は、規制されていない方法で非特異的に凝集する傾向があるため、使用が困難な場合があることを発見した。ＡＳＯ（ＲＮＡベースではなく本質的にＤＮＡベース）に結合するためのＬＦｎ−プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の使用は新規であり、本明細書においても初めて報告されている。ＬＦｎ−ＰＫＲは、ＬＦｎ−ＧＡＬ４と同じようにプラスミドＤＮＡのサイトゾルへの移行を促進することが示されていないことに注意する必要がある［９及び１０］。したがって、本発明者らはまた、ＰＫＲを上記の構築物中のＧＡＬ４に代えることによる、新規で改良された構築物を開発した。
【００４９】
本発明者らは、ＰＫＲがＧＡＬ４よりも安定なリンカータンパク質を形成し、それがＲＮＡおよびＡＳＯの二本鎖部分の両方に結合すると考えている。したがって、好ましい実施形態では、前記リンカータンパク質は、以下のように本明細書で配列番号１３として提供されるアミノ酸配列を有する、プロテインキナーゼＲまたはそのフラグメント、変異体、もしくは突然変異体を含む：
ＭＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＭＥＲＮＫＴＱＥＥＨＬＫＥＩＭＫＨＩＶＫＩＥＶＫＧＥＥＡＶＫＫＥＡＡＥＫＬＬＥＫＶＰＳＤＶＬＥＭＹＫＡＩＧＧＫＩＹＩＶＤＧＤＩＴＫＨＩＳＬＥＡＬＳＥＤＫＫＫＩＫＤＩＹＧＫＤＡＬＬＨＥＨＹＶＹＡＫＥＧＹＥＰＶＬＶＩＱＳＳＥＤＹＶＥＮＴＥＫＡＬＮＶＹＹＥＩＧＫＩＬＳＲＤＩＬＳＫＩＮＱＰＹＱＫＦＬＤＶＬＮＴＩＫＮＡＳＤＳＤＧＱＤＬＬＦＴＮＱＬＫＥＨＰＴＤＦＳＶＥＦＬＥＱＮＳＮＥＶＱＥＶＦＡＫＡＦＡＹＹＩＥＰＱＨＲＤＶＬＱＬＹＡＰＥＡＦＮＹＭＤＫＦＮＥＱＥＩＮＬＳＭＡＧＤＬＳＡＧＦＦＭＥＥＬＮＴＹＲＱＫＱＧＶＶＬＫＹＱＥＬＰＮＳＧＰＰＨＤＲＲＦＴＦＱＶＩＩＤＧＲＥＦＰＥＧＥＧＲＳＫＫＥＡＫＮＡＡＡＫＬＡＶＥＩＬＮＫＥＨＨＨＨＨＨ［配列番号１３］
したがって、好ましくは、前記シャトルタンパク質は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる。
【００５０】
本発明者らは、これが本発明の重要な態様であると考えている。
【００５１】
したがって、本発明の第９の態様によれば、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）に付着した弱毒化毒素タンパク質を含むシャトルタンパク質が提供される。
【００５２】
好ましくは、第９の態様によるシャトルタンパク質は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは変異体を含むか、または実質的にそれらからなる。
【００５３】
最も好ましい実施形態では、前記シャトルタンパク質は、生物活性ペイロード分子に結合されている。いくつかの実施形態では、前記結合は共有結合を含み得る。代替の実施形態では、前記結合は、非共有結合を含み得る。言い換えれば、前記ペイロードは、前記シャトルタンパク質と共有結合または非共有結合で結合され得る。前記生物活性ペイロード分子は、細胞質ゾル内、核内、細胞小器官または小胞もしくは液胞などの細胞内構造内、細胞表面脂質膜内、あるいは細胞表面脂質膜内または細胞内脂質膜で活性であり得る治療的に活性な分子であり得るが、これらに限定されない。前記生物活性ペイロード分子は、それ自体が活性であり得るが、これに限定されないか、または細胞内で活性化されるまで不活性であり得る。前記生物活性ペイロード分子はまた、限定的ではないが、細胞内で分解されて、活性または不活性成分を形成し得る。前記生物活性分子は、小分子、タンパク質、ＲＮＡ分子またはフラグメント、またはＤＮＡ構築物であり得るが、これらに限定されない。前記生物活性化合物の分子量は、１Ｄａ〜１０ＭＤａの間であり得る。
【００５４】
本発明者らは、前記リポソームが、好ましくは治療的に活性である小分子を効果的にロードし得ることを見出した。したがって、一実施形態では、前記生物活性ペイロード分子は、小分子を含む。前記小分子の分子量は１〜９００Ｄａであり得る。あるいは、前記小分子の分子量は、１００〜８００Ｄａ、２００〜７００Ｄａ、３００〜６００Ｄａ、または４００〜５００Ｄａであり得る。前記小分子は、アゴニスト特性またはアンタゴニスト特性を有する剤もしくは薬物であり得るが、これらに限定されないか、または染料もしくは蛍光分子であり得る。
【００５５】
本発明者らはまた、前記リポソームが、治療的に活性なまたは生物活性のあるタンパク質などの大きな分子を効果的にロードし得ることを見出した。したがって、代替の実施形態では、前記生物活性ペイロード分子は、タンパク質または酵素などの大きな分子を含む。好ましい実施形態では、前記タンパク質は酵素またはそのフラグメントを含む。さらなる実施形態では、前記タンパク質は、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、好ましくはモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗体模倣物もしくはアプタマーを含む。一実施形態では、前記生物活性ペイロード分子は、ＦａｂまたはｖＮＡＲを含む。
【００５６】
他の好ましい実施形態では、前記生物活性ペイロード分子は、以下のように本明細書において配列番号１５として提供されるアミノ酸配列を有する、ＬＦｎに結合したジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）鎖を含む：
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＡＧＧＨＧＤＶＧＭＨＶＫＥＫＥＫＮＫＤＥＮＫＲＫＤＥＥＲＮＫＴＱＥＥＨＬＫＥＩＭＫＨＩＶＫＩＥＶＫＧＥＥＡＶＫＫＥＡＡＥＫＬＬＥＫＶＰＳＤＶＬＥＭＹＫＡＩＧＧＫＩＹＩＶＤＧＤＩＴＫＨＩＳＬＥＡＬＳＥＤＫＫＫＩＫＤＩＹＧＫＤＡＬＬＨＥＨＹＶＹＡＫＥＧＹＥＰＶＬＶＩＱＳＳＥＤＹＶＥＮＴＥＫＡＬＮＶＹＹＥＩＧＫＩＬＳＲＤＩＬＳＫＩＮＱＰＹＱＫＦＬＤＶＬＮＴＩＫＮＡＳＤＳＤＧＱＤＬＬＦＴＮＱＬＫＥＨＰＴＤＦＳＶＥＦＬＥＱＮＳＮＥＶＱＥＶＦＡＫＡＦＡＹＹＩＥＰＱＨＲＤＶＬＱＬＹＡＰＥＡＦＮＹＭＤＫＦＮＥＱＥＩＮＬＳＡＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＡＤＤＶＶＤＳＳＫＳＦＶＭＥＮＦＳＳＹＨＧＴＫＰＧＹＶＤＳＩＱＫＧＩＱＫＰＫＳＧＴＱＧＮＹＤＤＤＷＫＧＦＹＳＴＤＮＫＹＤＡＡＧＹＳＶＤＮＥＮＰＬＳＧＫＡＧＧＶＶＫＶＴＹＰＧＬＴＫＶＬＡＬＫＶＤＮＡＥＴＩＫＫＥＬＧＬＳＬＴＥＰＬＭＥＱＶＧＴＥＥＦＩＫＲＦＧＤＧＡＳＲＶＶＬＳＬＰＦＡＥＧＳＳＳＶＥＹＩＮＮＷＥＱＡＫＡＬＳＶＥＬＥＩＮＦＥＴＲＧＫＲＧＱＤＡＭＹＥＹＭＡＱＡＣＡＧＮＲ［配列番号１５］
したがって、好ましくは、前記生物活性ペイロード分子は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる。
【００５７】
一実施形態では、前記生物活性ペイロード分子は、以下のように本明細書で配列番号１６として提供される核酸配列によってコードされる：
ａｔｇｇｇｃａｇｃａｇｃｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｃａｇｃａｇｃｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃｃｇｃｇｃｇｇｃａｇｃｃａｔａｔｇｇｃｇｇｇｃｇｇｔｃａｔｇｇｔｇａｔｇｔａｇｇｔａｔｇｃａｃｇｔａａａａｇａｇａａａｇａｇａａａａａｔａａａｇａｔｇａｇａａｔａａｇａｇａａａａｇａｔｇａａｇａａｃｇａａａｔａａａａｃａｃａｇｇａａｇａｇｃａｔｔｔａａａｇｇａａａｔｃａｔｇａａａｃａｃａｔｔｇｔａａａａａｔａｇａａｇｔａａａａｇｇｇｇａｇｇａａｇｃｔｇｔｔａａａａａａｇａｇｇｃａｇｃａｇａａａａｇｃｔａｃｔｔｇａｇａａａｇｔａｃｃａｔｃｔｇａｔｇｔｔｔｔａｇａｇａｔｇｔａｔａａａｇｃａａｔｔｇｇａｇｇａａａｇａｔａｔａｔａｔｔｇｔｇｇａｔｇｇｔｇａｔａｔｔａｃａａａａｃａｔａｔａｔｃｔｔｔａｇａａｇｃａｔｔａｔｃｔｇａａｇａｔａａｇａａａａａａａｔａａａａｇａｃａｔｔｔａｔｇｇｇａａａｇａｔｇｃｔｔｔａｔｔａｃａｔｇａａｃａｔｔａｔｇｔａｔａｔｇｃａａａａｇａａｇｇａｔａｔｇａａｃｃｃｇｔａｃｔｔｇｔａａｔｃｃａａｔｃｔｔｃｇｇａａｇａｔｔａｔｇｔａｇａａａａｔａｃｔｇａａａａｇｇｃａｃｔｇａａｃｇｔｔｔａｔｔａｔｇａａａｔａｇｇｔａａｇａｔａｔｔａｔｃａａｇｇｇａｔａｔｔｔｔａａｇｔａａａａｔｔａａｔｃａａｃｃａｔａｔｃａｇａａａｔｔｔｔｔａｇａｔｇｔａｔｔａａａｔａｃｃａｔｔａａａａａｔｇｃａｔｃｔｇａｔｔｃａｇａｔｇｇａｃａａｇａｔｃｔｔｔｔａｔｔｔａｃｔａａｔｃａｇｃｔｔａａｇｇａａｃａｔｃｃｃａｃａｇａｃｔｔｔｔｃｔｇｔａｇａａｔｔｃｔｔｇｇａａｃａａａａｔａｇｃａａｔｇａｇｇｔａｃａａｇａａｇｔａｔｔｔｇｃｇａａａｇｃｔｔｔｔｇｃａｔａｔｔａｔａｔｃｇａｇｃｃａｃａｇｃａｔｃｇｔｇａｔｇｔｔｔｔａｃａｇｃｔｔｔａｔｇｃａｃｃｇｇａａｇｃｔｔｔｔａａｔｔａｃａｔｇｇａｔａａａｔｔｔａａｃｇａａｃａａｇａａａｔａａａｔｃｔａｔｃｃｇｃｃａｔｇｇｇｃａｇｃｔｃｔｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｔｃｔｔｃｃｇｇｃｃｔｇｇｔｔｃｃａｃｇｔｇｇｔｇｃｔｇａｃｇａｃｇｔｔｇｔｔｇａｃｔｃｔｔｃｔａａａｔｃｔｔｔｃｇｔｔａｔｇｇａａａａｃｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔａｃｃａｃｇｇｔａｃｃａａａｃｃｇｇｇｔｔａｃｇｔｃｇａｃｔｃｔａｔｃｃａｇａａａｇｇｔａｔｃｃａｇａａｇｃｃｇａａａｔｃｔｇｇｔａｃｃｃａｇｇｇｔａａｃｔａｃｇａｃｇａｃｇａｃｔｇｇａａａｇｇｔｔｔｃｔａｃｔｃｔａｃｃｇａｃａａｃａａａｔａｃｇａｃｇｃｃｇｃｇｇｇｔｔａｃｔｃｔｇｔｔｇａｃａａｃｇａａａａｃｃｃｇｃｔｇｔｃｔｇｇｔａａａｇｃｔｇｇｔｇｇｔｇｔｔｇｔｔａａａｇｔｔａｃｃｔａｃｃｃｇｇｇｔｃｔｇａｃｃａａａｇｔｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇａａａｇｔｔｇａｃａａｃｇｃｔｇａａａｃｃａｔｃａａａａａａｇａａｃｔｇｇｇｔｃｔｃｔｃｔｃｔｇａｃｃｇａａｃｃｇｃｔｇａｔｇｇａａｃａｇｇｔｔｇｇｔａｃｃｇａａｇａａｔｔｃａｔｃａａａｃｇｔｔｔｃｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｃｔｔｃｔｃｇｔｇｔｔｇｔｔｃｔｇｔｃｔｃｔｇｃｃｇｔｔｃｇｃｔｇａｇｇｇｃｔｃｔｔｃｔｔｃｔｇｔｔｇａａｔａｃａｔｃａａｃａａｃｔｇｇｇａａｃａｇｇｃｔａａａｇｃｔｃｔｇｔｃｔｇｔｔｇａａｃｔｇｇａａａｔｃａａｃｔｔｃｇａａａｃｃｃｇｔｇｇｔａａａｃｇｔｇｇｃｃａｇｇａｃｇｃｔａｔｇｔａｃｇａａｔａｃａｔｇｇｃｔｃａｇｇｃｔｔｇｔｇｃａｇｇｔａａｃｃｇｔｔａａ［配列番号１６］
したがって、好ましくは、前記生物活性ペイロード分子は、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を含む核酸、またはその変異体もしくは断片によって実質的にコードされる。ペイロードとしてのＤＴＡの使用は、子宮頸癌などの癌の治療に特に役立つ。
【００５８】
本発明者らはさらに、リポソームに染料および蛍光分子、例えばテキサスレッド（例４）などの診断薬をロードさせ得ることを発見した。したがって、他の実施形態では、前記生物活性分子は診断ラベルである。前記生物活性分子は、診断時に染料または蛍光分子を含み得る。前記生物活性分子は、診断時にタンパク質（例えば、ＧＦＰ）、または小分子（例えば、テキサスレッド）を含み得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、前記生物活性ペイロード分子または成分はまた、セラノスティクス（すなわち、治療および診断の組み合わせの用途）において有用であり得る。
【００６０】
前記生物活性ペイロード分子は、ヌクレオチドを含み得て、これはＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【００６１】
本発明者らは、前記リポソーム（エキソソームなど）にアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を効果的にロードさせ得ることを発見した。したがって、一実施形態では、前記生物活性ペイロード分子は、ＡＳＯを含む。
【００６２】
一実施形態では、前記ＡＳＯは、以下のように本明細書で配列番号１７として提供される抗タンデム二量体トマトＡＳＯ配列を含み得る：
ＺＺＥ  ＯＺＥ  ＺＯＯ  ＦＯＥ  ＺＦＥ  ＺＦＥ  ＺＦＥ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＣＧＧ  ＣＡＴ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＣＧＧ  ＣＡＴ［配列番号１７］
他の実施形態では、前記ＡＳＯは、以下のように本明細書で配列番号１８として提供される抗タンデム二量体トマトＡＳＯ配列を含み得る：
ＺＺＥ  ＯＺＥ  ＺＯＯ  ＦＯＥ  ＺＦＥ  ＺＦＥ  ＺＦＥ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＴＧＡ  ＴＧＣ  ＣＧＧ  ＣＡＴ［配列番号１８］
したがって、好ましくは、前記ＡＳＯは、配列番号１７または１８に記載の核酸配列、またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる。例１０の表は、上記のホスホロチオエートコードを説明している。
【００６３】
本発明者らはまた、前記リポソーム（エキソソームなど）がＲＮＡ分子を効果的にロードし得ることを見出した。したがって、一実施形態では、前記生物活性ペイロード分子はＲＮＡを含む。好ましくは、前記生物活性ペイロード分子は、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（ゲノム編集で使用のため）、またはｓｎＲＮＡを含む。最も好ましくは、前記生物活性ペイロード分子は、ｓｉＲＮＡを含む。
【００６４】
他の実施形態では、前記生物活性ペイロード分子は、プラスミドなどのＤＮＡを含む。
【００６５】
実施例３に示されるように、本発明者らは、本発明のリポソームを使用して、遺伝子編集方法で使用するためのＣａｓ９などの遺伝子編集ヌクレアーゼを首尾よく運搬させ得る方法を示した。上記のように、本発明者らは、本発明のリポソーム内にゲノム編集ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９をカプセル化させ得て、したがって前記リポソームをゲノム編集技術で使用し得ることを実証した。また示されているように（例４、５および６を参照）、リポソーム（例えば、エクソソーム）内にＲＮＡ類似体とＲＮＡ結合タンパク質（ＬＦｎ−ＰＫＲ）の両方をトラップまたはロードさせ得る。その結果、ＲＮＡまたはＲＮＡ類似体の輸送が可能である。これは、リポソーム内のＣａｓ９およびＲＮＡの両方のトラップまたはロードを示すことを意味する。Ｃａｓ９は標的配列の特異性のためにガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を必要とするため、これらの態様の両方ともがＣａｓ９の有用性にとって重要である。
【００６６】
したがって、第１０の態様によれば、ゲノム編集技術で使用するための、第２の態様または第３の態様のいずれかによるリポソームが提供される。
【００６７】
第１１の態様によれば、第２または第３の態様によるリポソームに（ｉ）ガイドＲＮＡをロードすること；および／または（ｉｉ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする遺伝子構築物、および遺伝子編集療法においてロードされたリポソームを使用すること、を含むゲノム編集方法が提供される。
【００６８】
前記ゲノム編集法は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで実施され得ることが理解されよう。
【００６９】
したがって、一実施形態では、前記生物活性ペイロード分子は、ヌクレアーゼなどのゲノム編集ツールを含む。好ましい実施形態では、前記生物活性ペイロード分子は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１またはＴＡＬＥＮまたはジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。したがって、前記生物活性ペイロード分子は、患者の細胞内の転写干渉または転写活性化に使用され得る。
【００７０】
一実施形態では、前記ゲノム編集方法は、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼをコードする構築物を第２または第３の態様に従ってリポソームにロードすることを含み得る。前記構築物は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むプラスミドまたは発現ベクターであり得る。好ましい実施形態では、前記プラスミドはＣａｓ９をコードする。
【００７１】
他の実施形態によれば、編集される遺伝子配列を標的とするガイドＲＮＡを第２または第３の態様に従ってリポソームにロードすることを含むゲノム編集方法が提供される。
【００７２】
１つの好ましい実施形態では、前記生物活性分子は、Ｃａｓ９を含み、以下のように本明細書において配列番号１４として提供されるアミノ酸配列を有するＬＦｎに結合する：
ＭＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＭＥＲＮＫＴＱＥＥＨＬＫＥＩＭＫＨＩＶＫＩＥＶＫＧＥＥＡＶＫＫＥＡＡＥＫＬＬＥＫＶＰＳＤＶＬＥＭＹＫＡＩＧＧＫＩＹＩＶＤＧＤＩＴＫＨＩＳＬＥＡＬＳＥＤＫＫＫＩＫＤＩＹＧＫＤＡＬＬＨＥＨＹＶＹＡＫＥＧＹＥＰＶＬＶＩＱＳＳＥＤＹＶＥＮＴＥＫＡＬＮＶＹＹＥＩＧＫＩＬＳＲＤＩＬＳＫＩＮＱＰＹＱＫＦＬＤＶＬＮＴＩＫＮＡＳＤＳＤＧＱＤＬＬＦＴＮＱＬＫＥＨＰＴＤＦＳＶＥＦＬＥＱＮＳＮＥＶＱＥＶＦＡＫＡＦＡＹＹＩＥＰＱＨＲＤＶＬＱＬＹＡＰＥＡＦＮＹＭＤＫＦＮＥＱＥＩＮＬＳＬＥＶＬＦＱＧＰＭＫＲＮＹＩＬＧＬＤＩＧＩＴＳＶＧＹＧＩＩＤＹＥＴＲＤＶＩＤＡＧＶＲＬＦＫＥＡＮＶＥＮＮＥＧＲＲＳＫＲＧＡＲＲＬＫＲＲＲＲＨＲＩＱＲＶＫＫＬＬＦＤＹＮＬＬＴＤＨＳＥＬＳＧＩＮＰＹＥＡＲＶＫＧＬＳＱＫＬＳＥＥＥＦＳＡＡＬＬＨＬＡＫＲＲＧＶＨＮＶＮＥＶＥＥＤＴＧＮＥＬＳＴＫＥＱＩＳＲＮＳＫＡＬＥＥＫＹＶＡＥＬＱＬＥＲＬＫＫＤＧＥＶＲＧＳＩＮＲＦＫＴＳＤＹＶＫＥＡＫＱＬＬＫＶＱＫＡＹＨＱＬＤＱＳＦＩＤＴＹＩＤＬＬＥＴＲＲＴＹＹＥＧＰＧＥＧＳＰＦＧＷＫＤＩＫＥＷＹＥＭＬＭＧＨＣＴＹＦＰＥＥＬＲＳＶＫＹＡＹＮＡＤＬＹＮＡＬＮＤＬＮＮＬＶＩＴＲＤＥＮＥＫＬＥＹＹＥＫＦＱＩＩＥＮＶＦＫＱＫＫＫＰＴＬＫＱＩＡＫＥＩＬＶＮＥＥＤＩＫＧＹＲＶＴＳＴＧＫＰＥＦＴＮＬＫＶＹＨＤＩＫＤＩＴＡＲＫＥＩＩＥＮＡＥＬＬＤＱＩＡＫＩＬＴＩＹＱＳＳＥＤＩＱＥＥＬＴＮＬＮＳＥＬＴＱＥＥＩＥＱＩＳＮＬＫＧＹＴＧＴＨＮＬＳＬＫＡＩＮＬＩＬＤＥＬＷＨＴＮＤＮＱＩＡＩＦＮＲＬＫＬＶＰＫＫＶＤＬＳＱＱＫＥＩＰＴＴＬＶＤＤＦＩＬＳＰＶＶＫＲＳＦＩＱＳＩＫＶＩＮＡＩＩＫＫＹＧＬＰＮＤＩＩＩＥＬＡＲＥＫＮＳＫＤＡＱＫＭＩＮＥＭＱＫＲＮＲＱＴＮＥＲＩＥＥＩＩＲＴＴＧＫＥＮＡＫＹＬＩＥＫＩＫＬＨＤＭＱＥＧＫＣＬＹＳＬＥＡＩＰＬＥＤＬＬＮＮＰＦＮＹＥＶＤＨＩＩＰＲＳＶＳＦＤＮＳＦＮＮＫＶＬＶＫＱＥＥＮＳＫＫＧＮＲＴＰＦＱＹＬＳＳＳＤＳＫＩＳＹＥＴＦＫＫＨＩＬＮＬＡＫＧＫＧＲＩＳＫＴＫＫＥＹＬＬＥＥＲＤＩＮＲＦＳＶＱＫＤＦＩＮＲＮＬＶＤＴＲＹＡＴＲＧＬＭＮＬＬＲＳＹＦＲＶＮＮＬＤＶＫＶＫＳＩＮＧＧＦＴＳＦＬＲＲＫＷＫＦＫＫＥＲＮＫＧＹＫＨＨＡＥＤＡＬＩＩＡＮＡＤＦＩＦＫＥＷＫＫＬＤＫＡＫＫＶＭＥＮＱＭＦＥＥＫＱＡＥＳＭＰＥＩＥＴＥＱＥＹＫＥＩＦＩＴＰＨＱＩＫＨＩＫＤＦＫＤＹＫＹＳＨＲＶＤＫＫＰＮＲＥＬＩＮＤＴＬＹＳＴＲＫＤＤＫＧＮＴＬＩＶＮＮＬＮＧＬＹＤＫＤＮＤＫＬＫＫＬＩＮＫＳＰＥＫＬＬＭＹＨＨＤＰＱＴＹＱＫＬＫＬＩＭＥＱＹＧＤＥＫＮＰＬＹＫＹＹＥＥＴＧＮＹＬＴＫＹＳＫＫＤＮＧＰＶＩＫＫＩＫＹＹＧＮＫＬＮＡＨＬＤＩＴＤＤＹＰＮＳＲＮＫＶＶＫＬＳＬＫＰＹＲＦＤＶＹＬＤＮＧＶＹＫＦＶＴＶＫＮＬＤＶＩＫＫＥＮＹＹＥＶＮＳＫＣＹＥＥＡＫＫＬＫＫＩＳＮＱＡＥＦＩＡＳＦＹＮＮＤＬＩＫＩＮＧＥＬＹＲＶＩＧＶＮＮＤＬＬＮＲＩＥＶＮＭＩＤＩＴＹＲＥＹＬＥＮＭＮＤＫＲＰＰＲＩＩＫＴＩＡＳＫＴＱＳＩＫＫＹＳＴＤＩＬＧＮＬＹＥＶＫＳＫＫＨＰＱＩＩＫＫＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＥＮＬＹＦＱＧＨＨＨＨＨＨ．［配列番号１４］
したがって、好ましくは、前記生物活性分子は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含むか、または実質的にそれらからなる。
【００７３】
前記リポソームおよびリポソーム内にカプセル化された生物活性ペイロード分子は、障害（例えば、ＦＭＯ５調節性肥満、プロスタグランジン−Ｄ２、アンドロゲン性脱毛症、にきび、酒さ、前立腺癌、ジカ熱、エボラウイルス病、後天性免疫不全症候群、Ｓｔａｔ３応答性癌、Ｐ５３欠損癌、ウイルス介在性頸部癌、家族性高コレステロール血症、デュシェン筋ジストロフィー、脊髄などの調節疾患筋肉萎縮、クローネ病、およびさまざまな炎症性疾患）を治療、改善、もしくは予防するための単剤療法として使用され得る薬剤において、またはゲノム編集用ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）として使用され得ることが理解される。あるいは、本発明によるリポソームは、障害または障害の症状を治療、改善、または予防するための既知の治療法の補助として、またはそれらと組み合わせて使用され得る。
【００７４】
本発明によるリポソームは、特に、組成物が使用される方法に応じて、いくつかの異なる形態を有する組成物に組み合わせられ得る。したがって、例えば、前記組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液、または治療が必要な人または動物に投与され得る他の適切な形態のいずれかであり得る。本発明による薬剤の賦形剤は、それが与えられる対象によって十分に許容されるものであるべきことが理解されるであろう。
【００７５】
本発明によるリポソームはまた、徐放性または遅延放出装置内に組み込まれ得る。そのような装置は、例えば、皮膚の上または下に挿入され得て、前記薬剤は、数時間、数日、数週間、または数ヶ月にわたって放出され得る。前記装置は、少なくとも治療部位に隣接して配置され得る。そのような装置は、前記リポソームによる長期治療が必要であり、通常は頻繁な投与（例えば、少なくとも毎日の注射）を必要とする場合に特に有利であり得る。
【００７６】
リポソームの薬剤は、血流、神経、または治療を必要とする部位に直接注射することによって対象に投与され得る。注射は、静脈内（ボーラスまたは注入）または皮下（ボーラスまたは注入）、皮内（ボーラスまたは注入）、髄腔内（ボーラスまたは注入）、または硬膜外または脊髄タップ（ボーラスまたは注入）を介した脳脊髄液（ＣＳＦ）への注射であり得る。
【００７７】
必要とされるリポソームの量は、内側にカプセル化されたその生物活性ペイロード分子、ならびにその生物学的活性能および生物学的利用能によって決定され、これは、投与様式、リポソームおよび内側にカプセル化された生物活性ペイロード分子の物理化学的特性、ならびにそれが単剤療法または併用療法のどちらで使用されているかに依存することが理解されよう。投与の頻度はまた、治療される対象内のペイロード分子の半減期ならびに標的分子（すなわち、タンパク質）の半減期によって影響を受けるであろう。投与される最適な投与量は、当業者によって決定され得て、使用される特定のリポソームおよび特定の生物活性ペイロード分子、医薬組成物の強度、投与様式、および治療される障害または症状の進行によって変化する。対象の年齢、体重、性別、食事、および投与時間などの治療される特定の対象に応じた追加の要因により、投与量を調整する必要が生じる。
【００７８】
一般に、本発明によるペイロード分子の１日量は、０．００１μｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の間、または０．０１μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重の間であり得る。使用されるリポソームおよび生物活性ペイロード分子に応じて、特定の障害または特定の障害の症状を治療、改善、または予防するために使用される。
【００７９】
前記リポソームは、治療されている障害または症状の発症前、発症中、または発症後に投与され得る。  １日量は、単回投与（例えば、１日１回の注射または点鼻薬の吸入）として与えられ得る。あるいは、前記リポソームは、１日に２回以上の投与を必要とし得る。
【００８０】
一例として、前記リポソームは、０．０７μｇ〜７００ｍｇの間（すなわち、７０ｋｇの体重を想定）の２回（または治療される障害の重症度に応じて）の１日量として投与され得る。治療を受けている患者は、目覚めたときに最初の投与を行い、次に夕方に２回目の投与を行うか（２回投与レジームの場合）、その後３時間または４時間間隔で行い得る。あるいは、徐放装置を使用して、反復用量を投与する必要なしに、本発明によるリポソームの最適用量を患者に提供し得る。
【００８１】
製薬業界で従来から採用されている手順（例えば、インビボ実験、臨床試験など）などの既知の手順を使用して、本発明によるリポソームの特定の製剤、正確な治療レジメン（剤の１日量および投与頻度など）、またはリポソーム内にカプセル化された生物活性ペイロード分子の量を形成する。本発明者らは、本明細書に記載の方法によるリポソームのロードを提案したのは彼らが最初であると考えている。
【００８２】
第１３の態様によれば、第２または第３の態様によるリポソームと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
【００８３】
第１４の態様によれば、第１３の態様に従って医薬組成物を調製する方法が提供され、この方法は、第２または第３の態様のいずれかによるリポソームを薬学的に許容される賦形剤と接触させることを含む。
【００８４】
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、または家畜であり得る。したがって、本発明による組成物および薬剤は、いずれかの哺乳動物、例えば、家畜（例えば、馬）、ペットを治療するために使用され得るか、または他の獣医用途で使用され得る。しかしながら、最も好ましくは、前記対象は人間である。
【００８５】
前記リポソームおよびその中にカプセル化された生物活性ペイロード分子の「治療有効量」は、対象に投与されたときに、障害または障害の症状を治療するために必要とされる前述の量であるいずれかの量である。
【００８６】
例えば、使用物内にカプセル化されたリポソームおよび生物活性ペイロード分子の治療有効量は、約０．０１ｍｇ〜約８００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇであり得る。前記カプセル化されたリポソームおよび生物活性ペイロード分子の量は、約０．１ｍｇ〜約２５０ｍｇ、最も好ましくは約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇの量であることが好ましい。
【００８７】
本明細書で言及される「薬学的に許容される賦形剤」は、医薬組成物を処方するのに有用であることが当業者に知られている、いずれかの既知の化合物または既知の化合物の組み合わせである。
【００８８】
一実施形態では、前記薬学的に許容される賦形剤は固体であり得て、前記組成物は粉末または錠剤の形態であり得る。固体の薬学的に許容される賦形剤としては、香味料、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味料、防腐剤、染料、コーティング、または錠剤崩壊剤としても作用し得る１つまたは複数の物質が挙げられ得る。前記賦形剤はまた、カプセル化材料であり得る。前記薬学的に許容される賦形剤はまた、体内、例えば適切なカプセル化、例えば、腸内カプセル化を使用することにより、胃、血液、または他の内臓および構造においての制御放出のために構成され得る。粉末においては、前記賦形剤は、本発明による細かく分割された活性剤と混合されている細かく分割された固体である。錠剤においては、前記活性剤（例えば、本発明によるカプセル化されたリポソームおよび生物活性ペイロード分子）を、必要な圧縮特性を有する賦形剤と適切な比率で混合し、望ましい形状およびサイズに圧縮され得る。前記粉末および錠剤は、好ましくは、最大９９％の前記活性剤を含む。適切な固体賦形剤としては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス、およびイオン交換樹脂が挙げられる。他の実施形態では、前記医薬賦形剤はゲルであり得て、前記組成物はクリームなどの形態であり得る。
【００８９】
しかしながら、前記医薬賦形剤は液体であり得て、前記医薬組成物は溶液の形態である。前記液体賦形剤は、溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ、秘薬、および加圧組成物の調製に使用される。本発明によるリポソームは、水、有機溶媒、両方の混合物、または薬学的に許容される油脂などの薬学的に許容される液体賦形剤に溶解または懸濁され得る。前記液体賦形剤は、可溶化剤、乳化剤、緩衝液、防腐剤、甘味料、香味剤、懸濁剤、増粘剤、色、粘度調節剤、安定剤または浸透圧調節剤などの他の適切な医薬品添加物を含み得る。経口および非経口投与に適した液体賦形剤の例としては、水（上記のような添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含む）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）およびそれらの誘導体、ならびにオイル（例えば、分別されたココナッツオイルと落花生油）が挙げられる。非経口投与の場合、前記賦形剤は、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルであり得る。無菌液体賦形剤は、非経口投与用の無菌液体形態の組成物において有用である。加圧組成物用の前記液体賦形剤は、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴射剤であり得る。
【００９０】
無菌の溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、および特に皮下注射によって利用され得る。前記リポソームは、滅菌水、生理食塩水、または他の適切な滅菌注射媒体を使用して、投与時に溶解または懸濁され得る滅菌固体組成物として調製され得る。
【００９１】
本発明のリポソームは、他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノレート、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステルおよびエチレンオキシドと共重合したその無水物）などを含む滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与され得る。本発明によるリポソームはまた、液体または固体組成物の形態のいずれかで経口投与され得る。経口投与に適した組成物としては、ピル、カプセル、顆粒、錠剤、および粉末などの固体形態、ならびに溶液、シロップ、秘薬、および懸濁液などの液体形態が挙げられる。非経口投与に有用な形態としては、滅菌溶液、乳濁液、および懸濁液が挙げられる。あるいは、前記リポソームは、直腸に、例えば浣腸を介して、投与され得る。
【００９２】
本発明は、その変異体または断片を含む、本明細書で言及される配列のいずれかのアミノ酸または核酸配列を実質的に含む、いずれかの核酸もしくはペプチドまたは変異体、誘導体もしくは類似体に及ぶことが理解されよう。「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「変異体」および「フラグメント」という用語は、本明細書において言及された配列のいずれか１つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性、例えば、配列番号１〜１４として同定された配列と４０％の同一性を有する配列であり得る。
【００９３】
参照される配列のいずれかに対して６５％を超える、より好ましくは７０％を超える、さらにより好ましくは７５％を超える、さらにより好ましくは８０％を超える配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列も想定されている。好ましくは、前記アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、言及される配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９２％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％の同一性、そして最も好ましくは、本明細書で言及される配列のいずれかと、少なくとも９９％の同一性を有する。
【００９４】
当業者は、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性のパーセンテージを計算する方法を理解するであろう。  ２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性のパーセンテージを計算するには、最初に２つの配列のアラインメントを準備し、次に配列同一性値を計算する必要がある。前記２つの配列の同一性のパーセンテージは、以下に応じて異なる値をとり得る：（ｉ）配列をアラインメントするために使用される方法、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実装）、または３Ｄ比較からの構造アラインメント；および、（ｉｉ）アラインメント方法で使用されるパラメーター（ローカルアラインメントとグローバルアラインメントなど）、使用されるペアスコアマトリックス（ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）、ギャップペナルティ、例えば、関数形式と定数。
【００９５】
アラインメントを行った後、２つの配列間の同一性のパーセンテージを計算する多くの異なる方法がある。たとえば、ＩＤの数を次のように分類し得る：（ｉ）最短シーケンスの長さ；（ｉｉ）アライメントの長さ；（ｉｉｉ）シーケンスの平均の長さ；（ｉｖ）ギャップのない位置の数；または（ｖ）オーバーハングを除く同等の位置の数。さらに、同一性のパーセンテージも長さに強く依存することが理解されよう。したがって、配列のペアが短いほど、偶然に発生すると予想され得る配列同一性が高くなる。
【００９６】
したがって、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確な整列は複雑なプロセスであることが理解されよう。ポピュラーなマルチプルアラインメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ら，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，４６７３−４６８０；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，４８７６−４８８２）は、本発明によるタンパク質またはＤＮＡのマルチプルアラインメントを生成するための好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷの適切なパラメーターは以下の通りである：ＤＮＡアラインメントの場合：ギャップオープンペナルティ＝１５．０、ギャップエクステンションペナルティ＝６．６６、およびマトリックス＝アイデンティティ。
【００９７】
タンパク質アラインメントの場合：ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップエクステンションペナルティ＝０．２、およびマトリックス＝ゴネット。ＤＮＡおよびタンパク質アラインメントの場合：ＥＮＤＧＡＰ＝−１、およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者は、最適な配列アラインメントのためにこれらおよび他のパラメータを変更する必要があり得ることに気付くであろう。
【００９８】
好ましくは、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性パーセンテージの計算は、（Ｎ／Ｔ）＊１００のようなアラインメントから計算され得て、ここで、Ｎは、配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Ｔは比較した位置の総数であり、これはギャップを含み、かつ、オーバーハングを含んでも含まなくてもよい。好ましくは、オーバーハングは計算に含まれる。したがって、２つの配列間の同一性のパーセンテージを計算するための最も好ましい方法は、以下を含む：（ｉ）適切なパラメーターのセット、例えば上記のように、を使用してＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して配列アラインメントを準備すること；および、（ｉｉ）ＮおよびＴの値を次の式に挿入すること：−配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００。
【００９９】
類似の配列を同定するための代替の方法は、当業者に知られているであろう。例えば、実質的に類似のヌクレオチド配列は、厳密な条件下でＤＮＡ配列またはそれらの補体にハイブリダイズする配列によってコードされるであろう。厳密な条件により、本発明者らは、前記ヌクレオチドを約４５℃で３倍の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルター結合したＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズし、続いて約２０〜６５℃で０．２倍のＳＳＣ  ／  ０．１％ＳＤＳで少なくとも１回洗浄することを意味する。あるいは、実質的に類似のポリペプチドは、例えば、配列番号１〜１４に示される配列から少なくとも１つであるが、５、１０、２０、５０または１００未満のアミノ酸のみ異なり得る。
【０１００】
遺伝暗号の縮重により、本明細書に記載の核酸配列のいずれかは、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を与えることなく改変または変更して、その機能的変異体を提供し得ることは明らかである。適切なヌクレオチド変異体は、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変更された配列を有し、したがってサイレント（同義）変化を生じるものである。他の適切な変異体は、相同なヌクレオチド配列を有するが、配列のすべてまたは一部を含み、その配列は、それが置換するアミノ酸と同様の生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変更されて、保守的な変更を生成するものである。例えば、小さな非極性の疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、およびメチオニンが挙げられる。大きな非極性の疎水性アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。前記極性中性アミノ酸としては、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。前記正に帯電した（塩基性）アミノ酸としては、リジン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。前記負に帯電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸とグルタミン酸が挙げられる。したがって、どのアミノ酸を同様の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置き換え得るかが理解され、当業者は、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知っているであろう。
【０１０１】
本明細書に記載のすべての特徴（添付する特許請求の範囲、要約および図面を含む）、および／またはそのように開示されるいずれかの方法またはプロセスのすべてのステップは、少なくとも前記特徴および／またはステップのいくつかが相互に排他的である組み合わせを除いて、いずれかの組み合わせで上記の態様のいずれかと組み合わせられ得る。
【０１０２】
本発明をよりよく理解するために、そして本発明の実施形態がどのように実施され得るかを示すために、ここに、例として、添付の図を参照する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、光学顕微鏡（Ａｉｒｙｓｃａｎ検出器（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｌｔｄ）を介したＬＳＭ８８０）からの画像で、α−ＣＤ６３で染色されたＨｅＬａ細胞内の管腔内構造へのテキサスレッドラベルカーゴ（すなわち、テキサスレッドラベルＬＦｎ−ＰＫＲ）の局在を示している（３時間の追跡）。パネルは、テキサスレッドでラベル付けされたＬＦｎ−ＰＫＲ（中央）；α−ＣＤ６３（右）；及び重ね合わせた画像（左）を示している。
【図２】図２は、（Ｃｙ５）細胞マスクで染色されたＨｅＬａ細胞から単離されたリポソーム／エクソソームの画像である。
【図３】図３は、２つの異なる倍率を使用してＰＡ８３およびＴｅｘａｓＲｅｄで標識されたＬＦｎ−ＳａＣＡＳ９に曝露されたＨｅＬａ細胞からのエクソソーム調製物を示す光学顕微鏡からの画像である。
【図４】図４は、ＰＡ８３およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識ＬＦｎ−ＰＫＲ（パネルＡ）またはＰＡ８３およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識ＢＳＡ（パネルＢ、コントロール）に３時間さらしたＨｅｌａ細胞からのエクソソーム調製物の結果を示す画像である。
【図５】図５は、ＰＡ８３および以下のいずれかで調製したＴＣＡ沈殿リポソーム／エクソソームの結果である：ＴｅｘａｓＲｅｄ標識ＬＦｎ−ＳａＣＡＳ９、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識ＬＦｎ−ＰＫＲ、またはＴｅｘａｓＲｅｄ標識ＢＳＡ。
【図６】図６は、コントロールリポソーム／エクソソームで処理された細胞、およびβ−ガラクトシダーゼ翻訳を標的とするｓｉＲＮＡをロードしたリポソーム／エクソソームで処理された細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの生物学的活性である。
【図７】図７は、本発明のリポソーム（すなわち、エクソソーム）の細胞産生を示す概略図である。
【図８】図８は、ＨｅＬａ細胞とのインキュベーション前に過剰なトリプシン（ｎ＝３±ＳＥＭ）とともに３７℃で６０分間インキュベートした後、ＬＦｎ−ジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴＡ）をロードしたエクソソームの活性を示している。細胞生存率は、両方の場合で未処理のコントロールの約５５％である。
【図９】図９は、野生型ＰＡ８３、ＬＦｎＰＫＲ、および抗ＴｄＴｏｍアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をロードしたＨｅＬＡエクソソームおよび細胞外小胞画分の光子相関分光分析を示している。
【図１０】図１０は、強制八量体ＰＡ８３変異体、ＬＦｎＰＫＲおよび抗ＴｄＴｏｍアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をロードしたＨｅＬＡエクソソームおよび細胞外小胞画分の光子相関分光分析を示している。
【図１１】図１１は、エクソソーム処理の４８時間後のＨＥＫ２９３細胞の正規化されたβ−ガラクトシダーゼ発現を示している。
【図１２】図１２は、ＨＥＫ２９３細胞にα−ＧＦＰｓｉＲＮＡをロードしてＥｘｏＥａｓｙキットを使用して単離したＨｅＬａエクソソームをトランスフェクトした後のβ−ガラクトシダーゼ活性を示している。  ＰＡ：ＬＦ  ｎＰＫＲ：：５０ｎＭ  ｓｉＲＮＡで経時的に処理されたフィーダー細胞。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
実施例
本発明者らは、リポソーム（例えば、エクソソーム）を生成する新規の方法、および小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）、生物活性タンパク質、ゲノム編集ツール（例えば、ｃａｓ９）、およびさまざまな障害を治療するための細胞への薬物などの生物学的および治療的に活性なペイロード分子のステルス輸送のためのこれらのリポソームを含む新しい細胞輸送システムを開発した。
【０１０５】
図７を参照すると、本発明のリポソームが生成される４つの段階（以下に説明される）を要約する概略図が示されている。
【０１０６】
１．前記孔形成タンパク質（例えば、ＰＡ８３）は、細胞膜でオリゴマー化して孔を形成し、生物活性ペイロード分子（例えば、ｓｉＲＮＡまたはＣａｓ９またはＡＳＯなど）と相互作用していてもよい前記シャトルタンパク質（例えば、ＬＦｎまたはＰＫＲ）は、孔形成タンパク質と相互作用し、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ、それによってエンドサイトーシス小胞を形成する。
【０１０７】
２．エンドソーム選別輸送複合体（ＥＳＣＲＴ）機構では、孔形成タンパク質と、生物活性ペイロード分子に結合していてもよいシャトルタンパク質とがロードされたエンドサイトーシス小胞が、多小胞体（ＭＶＢ）に輸送され、そこでそのエンドサイトーシス小胞が管腔内小胞（ＩＬＶ）を形成する。
【０１０８】
３．アポトーシスに関連する遺伝子２相互作用タンパク質Ｘ（ＡＬＩＸ）依存プロセス中の、ＭＶＢ内のＩＬＶとＭＶＢの内境界膜との間の逆融合イベントにより、細胞内膜系が破壊され（これは通常、リソソームとの融合、およびＩＬＶの破壊を引き起こす）、サイトゾルにアクセスする。
【０１０９】
４．次に、孔形成タンパク質と、生物活性ペイロード分子が付着していてもよいシャトルタンパク質とがロードされたＩＬＶを含むＭＶＢは、孔形成タンパク質と、生物活性ペイロード分子が付着していてもよいシャトルタンパク質とを含むリポソーム／エクソソームから放出される。
【０１１０】
材料および方法
一般的な化学薬品、蛍光プローブおよび試薬
一般的な実験用試薬は、特に明記されていない限り、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｄｏｒｓｅｔ、英国）から入手した。Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＴｘＲ−ＳＥ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）から入手した。ダルベッコの最小必須培地、イーグル−最小必須培地、非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびグルタミン溶液はすべてＧｉｂｃｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐａｉｓｌｅｙ  ＵＫ）から、Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ溶液はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ  ＵＫ）から、イオノマイシンはＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（Ｄｏｒｓｅｔ、英国）から入手した。マウスモノクローナル抗ＣＤ６３はＡｂＣａｍからのものであり、モノクローナル抗Ｌａｍｐ２はＤＨＳＢ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ、ＩＡ、ＵＳＡ）からのものであった。Ａｌｅｘａｆｌｏｕｒ  ４８８標識ヤギ抗マウス抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ  ＵＫ）から入手した。ヤギ抗テキサスレッドモノクローナル抗体およびＨＲＰ標識ロバ抗ヤギ抗体はＶｅｃｔｏｒＬａｂｓから入手した。ｅｘｏＥａｓｙ  Ｍａｘｉキット（２０）（カタログ番号：７６０６４）はＱＩＡｇｅｎからのものであり、Ｔｏｔａｌ  ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ試薬（細胞培養培地から）（カタログ番号：４４７８３５９）（ＰＥＧ溶液）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ  ＵＫ）からのものであった。  ＳｔｅａｌｔｈＲＮＡｉＴＭｓｉＲＮＡＧＦＰ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（カタログ番号：１２９３５１４５）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ  ＵＫ）から入手し、２０μＭ溶液として提供された。
【０１１１】
エクソソームフリーメディア
ＦＣＳ中のウシリポソーム／エクソソームは、４℃で１８時間１８００００ｘｇで沈降させた。上澄みを収集し、無血清であるが完全な培地（ＭＥＭ）に加え、負圧下でフィルター滅菌（０．２μｍフィルター、Ｓａｒｔｏｒｕｓ）した。
【０１１２】
細胞培養
ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ２）およびＨＥＫ２９３（ＡＭＳＢＩＯ：ＳＣＯＯ８）細胞の培養および継代は、供給元の説明に従って実施した。顕微鏡検査用の細胞を、１×１０５細胞／ウェルの密度で滅菌カバースリップに播種した。固定、抗体ハイブリダイゼーションおよび検出については、以前に記載されたように実施した［２］。ＣＤ６３免疫染色細胞を冷メタノールで固定した。
【０１１３】
タンパク質の製造、分離および濃縮
タンパク質ＰＡ８３をコードするＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ８６４５７およびＡＡＴ９８４１４に基づく）は以前に記載されている［２］。ＬＦｎ−ＰＫＲは、ＢｉｏＢａｓｉｃ  Ｉｎｃ．（カナダ、オンタリオ州）によって、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＹ１５２３７（ＬＦｎの場合）およびＮＭ＿００２７５９（ＰＫＲの場合）を使用して合成された。ＬＦｎ−ＰＫＲをコードするオープンリーディングフレームは、［２］およびＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５１９１８で以前に説明されているように、細菌発現カセットｐＥＴ１５１／Ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）にサブクローニングされた。ＬＦｎ−黄色ブドウ球菌（Ｓａ）Ｃａｓ９およびＧＳＴ−ＰＡ６３をコードするプラスミドは、親プラスミドとしてｐＥＴ１５１細菌発現システムを使用してＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって合成された。使用したＧＳＴ配列はｐＧＥＸ３ｘからのものであり、ＳａＣＡＳ９配列はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＣＫ７４１７３．１からコドン最適化された（すなわち、配列番号１４）。Ｖ５エピトープタグおよび６ｘヒスチジンアフィニティータグの追加により、細菌溶解物からのタンパク質の免疫検出およびアフィニティー精製がなされた。
【０１１４】
ＬＦｎ−ＰＫＲおよびＰＡ８３は、大腸菌の培養液から約２ｍｇ／Ｌの収量で濃縮された（ＬＦｎ−ＳａＣａｓ９は約０．５ｍｇ／Ｌであった）。化学的に適切な大腸菌ＢＬ２１＊ＤＥ３ｐＬｙｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を使用して、１０ｎｇのプラスミドで形質転換し、２００μｇ／ｍＬアンピシリン（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）を含む２ｘＹＴで一晩培養し、１０００ｍＬの２ｘＹＴで３７℃、２００ｒｐｍにおいて３時間増殖させた。続いて、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、英国）を最終濃度が１ｍＭになるように添加し、さらに３時間インキュベートした。遠心分離（４℃で６分間６０００ｘｇ）によって調製された細菌ペレットを、１５０００ｐｓｉに設定されたフレンチプレス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペイズリー、英国）を使用して溶解した。ライセートを清澄化し（２００００ｘｇ、４℃で２０分間）、上澄みを６ｘヒスチジンアフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｔａｌｏｎ(R)レジン；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓａｉｎｔ−Ｇｅｒｍａｉｎ−ｅｎ−Ｌａｙｅ、フランス）に通した。６ｘＨｉｓ含有タンパク質は、ＰＢＳ中の１５０  ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）を使用して１ｍＬのフラクションで溶出した。タンパク質画分を純度と濃度について分析し、プールし、ＰＢＳに対して完全に透析し、最後にフィルター滅菌した（０．２μｍフィルター、Ｓａｒｔｏｒｕｓ）。最終的なタンパク質調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価し、クーマシー染色（純度を決定するため）および記載されている抗体を使用したウエスタンブロット分析に供した。
【０１１５】
プローブの合成と特性評価
ＬＦｎ−ＰＫＲ−ＴｘＲおよびＬＦｎ−ＳａＣａｓ９−ＴｘＲは、以前に説明された方法を使用して調製された［１４］。
【０１１６】
簡単に説明すると、ＴｘＲ−ＳＥ（５ｍｇ）をＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解した。２．５ｍＬのＰＢＳに、１００μＬのＴｘＲ溶液を約５ｍｇの組換えタンパク質に加え、２５℃で１時間暗所に置いた。生成物は、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ  Ｇｉｌｅｓ、ＵＫ）およびＰＢＳを溶離液として使用して精製し、０．５ｍＬの画分を収集した。次に、最も光学的に密度の高い画分を選択してプールし、ＬＦｎ−ＰＫＲ−ＴｘＲまたはＬＦｎ−ＳａＣａｓ９−ＴｘＲコンジュゲートのいずれかを得た。次に、蛍光コンジュゲートをフィルター滅菌し（０．２μｍフィルター、Ｓａｒｔｏｒｕｓ）、−８０℃で凍結した。
【０１１７】
エクソソームローディングのための細胞培養
細胞を１７５ｃｍ２のＴＣ処理ディッシュに播種し、標準的なインキュベーション条件下、すなわち５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２中３７℃で増殖させた。９０％のコンフルエンスで、細胞単層をＰＢＳで３回洗浄した後、エクソソームをロードした。
【０１１８】
リポソーム／エクソソームへのＬＦｎ−ＰＫＲ−ＴｘＲまたはＬＦｎ−ＳａＣａｓ９−ＴｘＲのロード
細胞をＰＡ８３（５０μｇ／ｍＬ）およびＬＦｎ−ＰＫＲ−ＴｘＲ（５０μｇ／ｍＬ）またはＬＦｎ−ＳａＣａｓ９−ＴｘＲ（５０μｇ／ｍＬ）とともに３ｍＬの無血清ＤＭＥＭで３７℃で１時間インキュベートした。  １時間後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含む５ｍＬのエクソソームフリーＤＭＥＭを最終容量８ｍＬになるように添加し、プレートを３７℃で３時間インキュベートした。
【０１１９】
リポソーム／エクソソームへのＬＦｎ−ＰＫＲ：：ｓｉＲＮＡのロード
ＬＦｎ−ＰＫＲ（５０μｇ／ｍＬ）は、ＰＡ８３（５０μｇ／ｍＬ）を添加する前に、無血清ＤＭＥＭでＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）と５分間インキュベートした。次に、混合物を細胞単層に加え、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含む５ｍＬのエクソソームフリーＤＭＥＭを最終容量８ｍＬになるように添加し、プレートを３７℃で３時間インキュベートした。
【０１２０】
リポソーム／エクソソームの単離
イオノマイシン（５０μＭ）を培地に添加し、標準条件下で３０分間インキュベートした。次に、培地を収集し、４℃で２分間１，５００ｘｇで遠心分離した後、細胞破片を沈殿させた。得られた上澄みを、凍結またはエクソソーム単離の前にフィルター滅菌（０．８μｍ、Ｓａｒｔｏｒｏｕｓ）しました。エクソソームの分離を、次の３つの方法のいずれかを使用して実行した。
【０１２１】
１．分画遠心分離
これは［１５］から変更された。簡単に説明すると、凍結濾過した馴化培地を氷上で解凍し、ＥＶを沈殿させるために１００００ｘｇに３０分間さらしました。次に、上澄みを４℃で７０分間１１０  ０００ｘｇにさらし、ペレットを１ｍＬのＰＢＳに収集した。次に、再懸濁されたペレットを、１０００００ｘｇで７０分間４℃で２回目の沈降にかけた。次に、得られたペレットを１０００μＬのエクソソームフリー培地に懸濁し、０．２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｕｓ）でろ過し、必要になるまで−２０℃で凍結保存した。
【０１２２】
２．ポリエチレングリコール沈殿による分離
簡単に説明すると、清澄化および濾過された細胞培養培地の量を推定し、これに、０．５容量の単離試薬を加えた。この調製物を４℃で一晩放置した。次に、混合物を１０，０００ｘｇで１時間４℃で遠心分離した。次に、得られたペレットを最終容量１０００μＬのエクソソームを含まない培地に懸濁し、必要になるまで−２０℃で凍結保存した。
【０１２３】
３．膜吸着による分離
これは、ＱＩＡｇｅｎｅｘｏＥａｓｙキットを製造元の仕様に従って使用して実行された。簡単に説明すると、８ｍＬのＸＰＢバッファーを細胞培養試薬と混合し、分離後、エクソソーム調製物から溶出（ＸＥ）バッファーを除去するための追加のステップを追加した。これは、溶出液を１１００００ｘｇで７０分間４℃で遠心分離することによって達成された。次に、得られたペレットを１０００μＬのエクソソームを含まない培地に懸濁し、必要になるまで−２０℃で凍結保存した。
【０１２４】
タンパク質の定量化
ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）アッセイは、ビシンコニン酸キット（ＢＣＡ−１）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｏｒｓｅｔ  ＵＫ）の仕様に従って実施し、保存前の最終的なエクソソームサンプルのタンパク質濃度を測定した。さらに、μｌｉｔｅ（ＢｉｏＤｒｏｐ  Ｉｎｃ．）装置を使用して、メーカーの推奨プロトコルに従って、それぞれＯＤ２６０およびＯＤ２８０でのＤＮＡおよびタンパク質濃度を測定した。
【０１２５】
顕微鏡検査
リポソーム／エクソソームの顕微鏡による視覚化は、等量のエクソソーム調製物を、Ｃｙ５フルオロフォア（カタログ番号Ｃ１００４６；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ペイズリー、英国）を組み込んだ等量の細胞マスク試薬と混合することによって行った。これにより、Ａｉｒｙｓｃａｎユニット（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｌｔｄ、ドイツ）を備えたＬＳＭ８８０レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して、蛍光下でリポソーム／エクソソームのイメージングがなされた。Ａｉｒｙｓｃａｎユニットの超解像機能により、リポソーム／エクソソームの解像が可能となった。テキサスレッドで標識されたタンパク質がロードされたリポソーム／エクソソームの場合、リポソーム／エクソソームは、ＬＳＭ８８０のＡｉｒｙｓｃａｎユニット（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｌｔｄ、ドイツ）の超解像機能を使用して直接視覚化された。どちらの場合も、Ｐｌａｎ−Ａｐ℃ｈｒｏｍａｔ  ６３ｘ  ／１．４０開口数オイルＤＩＣｆ／ＥＬＹＲＡ対物レンズが使用された。免疫染色は、前述のようにカバースリップ上で増殖させたパラホルムアルデヒド固定または冷（２０℃）メタノール固定細胞のいずれかで実施した。
【０１２６】
ｓｉＲＮＡ活性のアッセイ
ｓｉＲＮＡの輸送を評価するために、ＧＦＰに特異的なコントロールｓｉＲＮＡを購入した。これは、ＨＥＫ２９３（ＳＣＯＯ８）細胞で発現された安定して発現された導入遺伝子に対して向けられ、遺伝子活性を報告するための標準として使用された。無色の前駆体から不溶性の青色化合物へのｘ−ｇａｌの加水分解に関与する酵素であるベータガラクトシダーゼにインフレームで融合したＧＦＰを過剰発現したＨＥＫ２９３細胞を、６２０ｎｍで分光光度的に検出した。その結果、ベータガラクトシダーゼを介したＸ−ｇａｌ変換を測定することにより、ＧＦＰｓｉＲＮＡ活性をモニターすることができた。最後に、ベータガラクトシダーゼ活性は、タンパク質濃度に正規化した後（ＯＤ６２０）、未処理のコントロールのパーセンテージとして表された。
【０１２７】
遺伝子調節アッセイのための細胞培養
６ウェルプレートを使用して活性を評価した。細胞を５×１０５細胞／ウェル（ＨＥＫ２９３、ＡＭＳＢＩＯ）で播種し、処理前に５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２中３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１２８】
リポソーム／エクソソームの投与
細胞を２ｍＬの完全培地で希釈した２００μＬのエクソソーム調製物で処理した。この調製物をフィルター滅菌し（０．２μｍフィルター、Ｓａｒｔｏｒｕｓ）、その後、細胞と目的の時間（２４時間、４８時間、７２時間）インキュベートした。
【０１２９】
遺伝子調節の分析
培地を廃棄し、細胞単層を冷却したＰＢＳで３回注意深く洗浄した後、５００μＬのＲＩＰＡバッファー（Ｒ０２７８−５０ＭＬ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を各ウェルに添加した。氷上での１５分間のインキュベーション期間の後、各ウェルからの細胞溶解物を１０回吸引し、標識されたエッペンドルフにデカントした。２１，０００ｘｇで４℃で１０分間遠心分離した後、上澄みを新しいエッペンドルフに移し、ペレットを廃棄した。次に、１０μＬのライセートを９６ウェルプレートの１００μＬの２％ＢＣＡ試薬に加え、３７℃でインキュベートした。残りの４００μＬの上澄みを１２μｌのＸ−ｇａｌ（ＤＭＳＯ中５０ｍＭ）（Ｒ０４０４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と混合し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに移した。Ｘ−Ｇａｌ変換は、３７℃に設定された分光光度計を使用して、６２０ｎｍで経時的にアッセイされた（読み取りは５時間にわたって１５分ごとに行われた）。
【０１３０】
ウエスタンブロッティングおよびＴＣＡ沈殿
ウエスタンブロッティングおよび免疫検出は、製造元の指示に従ってミニテトラセル装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用して実行された。タンパク質の分離には、１０％（ｗ／ｖ）アクリルアミドゲルを使用し、２００Ｖで６０分間泳動した。ニトロセルロースメンブレンへの転写は、４００ｍＭで６０分間行った。０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０試薬を含むＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳溶液を使用して、４５分間ブロッキングを行った。抗体のハイブリダイゼーションは、メーカーが提案する抗体希釈液を使用して、振とう条件下で３７℃で６０分間３ｍＬで実施した。ＨＲＰ標識二次抗体の検出は、強化されたＥＣＬ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造元の指示に従って実行された。ゲルおよびブロットは、広範囲の染色済みタンパク質マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を実行することによって較正された。エクソソームタンパク質のＴＣＡ沈殿は、０．６倍量のＴＣＡをエクソソーム調製物に添加することによって実行された。次に、これを４℃で３０分間インキュベートした。次に、調製物を２１０００ｘｇで４℃で１０分間沈降させ、ペレットをアセトンで２回、同様に４℃で洗浄した。得られたペレットをＬａｅｍｍｌｉバッファーに溶解し、ウエスタンイムノブロッティングを行い、非還元条件下で抗ＬＡＭＰ２特異的一次抗体（ＤＨＳＢ、アイオワ大学、アイオワ州、米国）；または、メーカーが提案する希釈液を使用したテキサスレッド特異的一次抗体（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）のいずれかでプローブした。
【０１３１】
実施例１−リポソームは細胞に取り込まれる
図１に示すように、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄでラベル付けされたカーゴ（つまり、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄでラベル付けされたＬＦｎ−ＰＫＲ）は、ＨｅＬａ細胞内の管腔内構造に局在する。これらの管腔内構造はエクソソーム免疫マーカーＣＤ６３（ＬＡＭＰ３としても知られている）に対して陽性であるため、この管腔内シグナルは多小胞エンドソーム、すなわち後期エンドソーム内に存在し得る。これは、テキサスレッドで標識されたＬＦｎ−ＰＫＲが、ＰＡ８３で細胞に添加されると、細胞に添加されてから３時間後にＭＶＥ／ＭＶＢ内の管腔内膜を優先的に標識し得ることを示している。
【０１３２】
実施例２−リポソームは生理学的エクソソームと同様のサイズである
図２は、Ｈｅｌａ馴化培地から分離され、Ｃｙ５−Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｋで染色され、Ａｉｒｙｓｃａｎ検出器を使用して視覚化されたリポソーム／エクソソームが、エクソソームにほぼ適切なサイズ（６０〜１２０  ｎｍ）であることを示す本発明者の発見を示しています。このシステムの解像度の限界は、ｘ−ｙプレーンでは１２０ｎＭであることに注意のこと。ｅｘｏＥａｓｙキットから単離されたリポソーム／エキソソームも、プローブとしてＬＡＭＰ２を使用したイムノブロッティング分析の対象となり、予測されるように、バンドはエキソソーム調製物内にほぼ適切な分子量で見られる。これは、ｅｘｏＥａｓｙキットを使用して単離されたリポソーム／エクソソームがほぼ正しいサイズであるだけでなく、予測されるように十分に特徴付けられたエクソソーム免疫マーカーも含んでいたことを意味する。
【０１３３】
実施例３−リポソームにＣａｓ９をロードし得る
リポソーム／エクソソームには、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９、つまりＳａＣＡＳ９が効果的にロードされている。図３では、ＬＦｎ−ＳａＣＡＳ９からの赤色シグナルは、ＰＡ８３およびＴｅｘａｓＲｅｄで標識されたＬＦｎ−ＳａＣＡＳ９に曝露されたＨｅｌａ細胞からのエクソソーム調製物ではっきりと見られ得る。コントロールリポソーム／エクソソームＲｗｉｔｈ：ＰＡ８３なし、カーゴなし、または非転置カーゴ（ＢＳＡ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）は、焦点面を確認するためにセルマスクとインキュベートした場合でも赤い信号を生成しなかった（図３Ｂ）。
【０１３４】
実施例４−リポソームに小分子をロードし得る
リポソーム／エクソソームは、小分子を効果的にロードすることがさらに示されている。図４では、小分子であるＴｅｘａｓ  Ｒｅｄが、３時間後にＰＡ８３およびＴｅｘａｓＲｅｄで標識されたＬＦｎ−ＰＫＲまたはＰＡ８３に曝露されたＨｅｌａ細胞からのエクソソーム調製物に取り込まれることが示されている。ＴｅｘａｓＲｅｄでラベル付けされたＢＳＡをネガティブコントロールとして使用した。ここで、テキサスレッドで標識されたＬＦｎ−ＰＫＲは、リポソーム／エクソソームの細胞マスク陽性集団内で容易に検出され得るが、テキサスレッドで標識されたＢＳＡは検出され得ない。
【０１３５】
実施例５−ロードされたタンパク質が単離されたリポソームに存在する
図５は、ＰＡ８３およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識ＬＦｎ−ＳａＣＡＳ９、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識ＬＦｎ−ＰＫＲ、またはＴｅｘａｓＲｅｄ標識ＢＳＡのいずれかで調製したＴＣＡ沈殿リポソーム／エクソソームの結果を示している。ＰＡ８３  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄでラベル付けされたＬＦｎ−ＳａＣＡＳ９およびＰＡ８３  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄでラベル付けされたＬＦｎ−ＰＫＲ調製物から、ＴｅｘａｓＲｅｄがペレットにはっきりと見える。テキサスレッドは、「無処理」またはＰＡ８３およびＢＳＡ−テキサスレッドの「処理済み」コントロールでは容易に検出され得ない。同様に、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ特異的一次抗体を使用したイムノブロッティングおよび検出後、以前と同じＴＣＡ沈殿物から予測された分子量のタンパク質を標識するＴｅｘａｓＲｅｄが検出された。
【０１３６】
実施例６−ｓｉＲＮＡをロードしたリポソームは、タンパク質のダウンレギュレーションに効果的である
ｅｘｏＥａｓｙキットおよび分画遠心分離を使用して細胞培養培地から単離されたリポソーム／エクソソームの生物活性を図６に示す。ここでは、単位細胞タンパク質あたりのベータガラクトシダーゼ活性の低下が記録され、以下が示された：１）ｓｉＲＮＡをリポソーム／エクソソームおよび  ２）ｓｉＲＮＡをロードしたリポソーム／エクソソームの生物学的活性、すなわち、細胞の第２の集団のサイトゾルにｓｉＲＮＡを輸送するそれらの能力。
【０１３７】
実施例７−ジカウイルス感染の治療
理論的な例として、第１の態様の方法によって生成されたリポソームは、ジカウイルスに感染した患者を治療するために使用される。最初に、生検が患者に対して行われ、患者の多くの細胞が単離される。次に、第１の態様の方法を使用して細胞からリポソームを生成し、抗ジカウイルスｓｉＲＮＡをロードする。次に、抗ジカウイルスｓｉＲＮＡを含むリポソームが患者に投与され、エンドサイトーシスを介して特許細胞に取り込まれる。したがって、抗ジカウイルスｓｉＲＮＡは患者の細胞に存在し、ジカウイルスが患者の体内で増殖する能力は阻害される。
【０１３８】
実施例８−肥満の治療
他の理論的な例として、第１の態様の方法によって生成されたリポソームは、ＦＭＯ５調節性肥満に苦しんでいる患者を治療するために使用される。この例では、リポソームは、第１の態様の方法を使用して培養間葉系幹細胞から誘導され、抗ＦＭＯ５ｓｉＲＮＡがロードされる。次に、抗ＦＭＯ５  ｓｉＲＮＡを含むリポソームが患者に投与され、エンドサイトーシスを介して患者の細胞に取り込まれる。したがって、抗ＦＭＯ５  ｓｉＲＮＡは患者の細胞に存在し、ＦＭＯ５酵素はダウンレギュレートされ、患者はもはや肥満関連の症状を示さない。
【０１３９】
ディスカッション
本発明者らは、ＰＡ８３：：ＬＦｎ融合物を使用してリポソーム／エクソソームにロードした材料としては、低分子量共有結合複合体（すなわち、テキサスレッド）、ＬＦｎ−ＰＫＲ：：ｓｉＲＮＡ、ＬＦｎ−ＰＫＲと結合したテキサスレッド、ＬＦｎ−Ｇａｌ４：：ｅＧＦＰ−Ｒａｂ５およびＬＦｎ−ＳａＣＡＳ９と結合したテキサスレッドが挙げられる。その後、ここに提示されたデータは、ＬＦｎ融合タンパク質が（ＬＦまたはＥＦのみではない）選択的なカーゴを、エクソソームと呼ばれる生物学的に誘導されたステルスデリバリーシステムに輸送し得るという新しいアイデアを支持する。本明細書では、最初に、カーゴの過剰発現またはエクソソームの破壊なしにエクソソームのローディングを達成し得る方法論が開示され、この結論を裏付ける証拠が議論されている。
【０１４０】
図１は、テキサスレッドで標識されたＬＦｎ−ＰＫＲが、ＰＡ８３の存在下で、ＣＤ６３陽性の膜境界構造内の管腔内小胞と結合し得ることを示している。これらのデータは、ＬＦｎ−ＰＫＲが野生型ＬＦと同様の細胞質ゾル乗換え経路を使用するという仮説を支持している［３］。図２は、ＱＩＡｇｅｎ  ｅｘｏＥａｓｙキットを使用して、単離されたリポソーム／エクソソームの集団内のエキソソームマーカーＬＡＭＰ２の顕微鏡検査（膀胱サイズの測定）およびイムノブロッティング検出の両方を通じて、リポソーム／エクソソームの単離を検証する。このデータは、リポソーム／エクソソームが実際に単離されたことを示している。図３は、単離されたリポソーム／エクソソームがフルオロフォアＴｅｘａｓＲｅｄで標識されたカーゴタンパク質を含むという証拠を示している。この場合、カーゴタンパク質はＬＦｎ−ＳａＣＡＳ９であり、ＰＡトランスロカーゼ基質として機能する可能性は低いと以前に報告されている。ここで、ＬＦｎ−ＳａＣａｓ９は、単離されたリポソーム／エクソソームの集団内で記録されている。図４（パネルａ）は、この方法論を複製したもので、今回は異なるカーゴタンパク質：テキサスレッド標識ＬＦｎ−ＰＫＲを使用した場合にのみ再現性を示している。これはさらに、ＬＦｎ融合タンパク質のようなＰＡ細孔基質に共有結合した選択された小分子をリポソーム／エクソソームの集団に移動させるこのシステムの能力を示している。図４（パネルＢ）は、次のことを示すネガティブコントロールとして機能する：１）ＢＳＡラベル−テキサスレッドはＰＡトランスロカーゼ基質として機能しない、２）記録されたシグナルはテキサスレッドに固有であり、Ｃｙ５セルマスクチャネルからブリードの自家蛍光のいずれにも起因しない。
【０１４１】
図５は、単離されたリポソーム／エクソソームからのテキサスレッドシグナルがトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を使用して（つまり、タンパク質に結合させて）沈殿させ得ること、およびウエスタン分析後、それは予測された分子量であったことを示している。これは、タンパク質に損傷がなく、ＰＡ細孔移行後もテキサスレッドフルオロフォアと結合したままであることを示している。図６は、ＰＡおよびＬＦｎ−ＰＫＲを使用してリポソーム／エクソソームにｓｉＲＮＡをロードし得ること、およびこれらのリポソーム／エクソソームをｅｘｏＥａｓｙキットまたは分画遠心分離によって単離し得ることを示している。また、リポソーム／エクソソームが活性であり、レシピエント細胞融合能力があり、薬理学的に活性なｓｉＲＮＡを輸送し得ることをも示している。これは概念の実証、すなわち、説明されているエクソソームローディング方法を使用して、リポソーム／エクソソームにカーゴをロードし輸送し得ること、およびリポソーム／エクソソームを単離して、生物学的に活性なカーゴをある細胞集団から他の集団に移し得ることの実証である。これは、ｓｉＲＮＡ、遺伝子編集タンパク質、ｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、遺伝子および治療用タンパク質などの具現化された精密医療の３次ターゲティングとステルス輸送を容易にするために、この方法論を使用して、ｅｘｖｉｖｏで増殖した患者の細胞に由来するエクソソームに薬物をロードし得るという考えを支持する。
【０１４２】
リポソーム／エクソソームへの物質のローディングを最適化する試みにおいて、ＰＡ６３（ＰＡ６３−ＴＥＶ認識部位−ＧＳＴとして生成）、ＰＡ８３、ＰＡ８３  Ｄ５１２Ｋ、ＰＡ８３  ＧからＮ、およびＰＡ８３ＮからＳ［１６］についてもまた、リポソーム／エクソソームをロードする能力について調査された。最後に、溶血素の膜貫通ドメイン［１７］をＰＡ６３膜貫通ドメインの代わりに組み込んだＰＡ８３ハイブリッド分子を細菌発現カセット（ｐＥＴ１５１）にコード化し、カーゴの細孔輸送中のブラウン運動のラチェットの現象［６］に関連する速度限界に関してＰＡ８３膜貫通アセンブリの役割を調査するために構築も行った。
【０１４３】
実施例９
本発明者らは、使用したプラスミドを除いて、上記のようにＰＡ８３を使用して条件付き致死性カーゴＬＦｎ−ジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴＡ）をエクソソームにロードしたが、すなわち、そのプラスミドはＡｄｄｇｅｎｅ（ｐＥＴ−１５ｂ  ＬＦｎ−ＤＴＡ、Ａｄｄｇｅｎｅ番号１１０７５）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／１１０７５／）からのものであった。  
【０１４４】
エクソソームのローディング
ＬＦｎＤＴＡ−配列番号１５（タンパク質）および配列番号１６（ＤＮＡ）−をＨｅＬａ細胞とともに１０μｇ／ｍｌの濃度において、ならびに５０μｇ／ｍｌの配列番号２（ＰＡ８３）を５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２を含む加湿雰囲気において３７℃で４時間、インキュベートすることによって、エクソソームをロードした。この後、細胞をＰＢＳで洗浄し、無血清培地で５μＭイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ化学会社のカタログ番号Ｉ９６５７−１ＭＧ）とともにインキュベートした。次に、前述のように分画遠心分離を使用して、すぐに馴化された培地からエクソソームを単離した。
【０１４５】
トリプシン消化
エクソソーム調製物の半分に、５μｌの細胞培養トリプシン／ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号２５２０００５６）をエキソソームに添加し、ＰＢＳで容量を１００μｌに調整した。調製物の残りの半分に、ＰＢＳを１００μｌに加えた。次に、エクソソーム調製物を、エクソソーム調製物に含まれるＬＦｎＤＴＡの量を大幅に超える５μｇのＬＦｎＤＴＡを消化するのに十分であることがすでに実証されている条件下で６０分間インキュベートした。次に、エクソソームをトリプシンコントロール（非毒性であることが判明している）を含むＨｅＬａ細胞の培養物に添加し、２４時間後に細胞生存率をアッセイした。結果は、未処理のコントロールに対して正規化されたＤＴＡ活性（％）として表された（エクソソームを含むＬＦｎＤＴＡは細胞の約４５％を殺した）。
【０１４６】
結果
図８を参照すると、ＰＡ８３（すなわち配列番号２）を使用して最初にカーゴ（すなわちＬＦｎ−ジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴＡ）−配列番号１５および配列番号１６）がロードされたエクソソームは、その後、それらが外部酵素（すなわちトリプシン）の活性から保護されていることを示すために特徴付けられた。これらのデータは、子宮頸癌などの癌の治療に使用され得るＬＦｎＤＴＡをエクソソームに正常にロードし得ることを示している。
【０１４７】
実施例１０
この実施例では、本発明者らは、動的光散乱ＡＫＡ光子相関分光法を使用して、分画遠心分離を使用して単離されたエクソソームおよび細胞外小胞（ＥＶ）のサイズを特徴付けた。
【０１４８】
エクソソームのローディング
ＨｅＬａ細胞のエクソソームに、タンデムダイマートマトに特異的なプレハイブリダイズしたホスホロチオエート−ホスホジエステルハイブリッドアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を２００ｐＭｏｌ／ｍｌ（総ＡＳＯ）−配列番号１７および配列番号１８の濃度においてロードした。次の表は、ホスホロチオエートコード（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｗｅｂサイトから取得）を説明している。
【０１４９】
【表１】
2021533825.tif 000003
【０１５０】
これらのＡＳＯは、５０μｇ／ｍｌ  ＬＦｎＰＫＲおよび５０μｇ／ｍｌ配列番号２（ＰＡ８３）または５０μｇ／ｍｌＰＡ強制八量体変異体を使用してエクソソームにロードされた。この混合物を、無血清培地中のＨｅＬａ細胞とともに、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２を含む加湿雰囲気下で３７℃で４時間インキュベートした。培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、無血清培地で５μＭイオノマイシンと３０分間インキュベートした。
【０１５１】
エクソソームの単離
馴化培地は、最初に１．５ｋｘｇで２分間の遠心分離によって除去され、０．８ミクロンのフィルターでろ過された。フロースルーを１００００ｘｇで３０分間４℃で遠心分離した。最後に、エクソソームは、４℃で７０分間１１００００ｘｇで沈降させることにより単離され、ＰＢＳに再懸濁され、４℃で７０分間１１０，０００ｘｇで再沈降された。エクソソームはそれまで４℃で保存されていた。細胞培養に使用する場合、エクソソームを必要な量の無血清培地で希釈し、細胞とインキュベートする前に０．８μフィルターで再度ろ過した。
【０１５２】
結果
図９を参照すると、５０μｇ／ｍｌ  ＰＡ８３（配列番号２）および５０μｇ／ｍｌ  ＬＦｎＰＫＲ（配列番号１３）を使用して２００ｐＭｏｌ／ｍｌ抗タンデムダイマートマト（ＴｄＴｏｍ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をロードすると、エクソソームのサイズが予測されることが示された。
【０１５３】
図１０を参照すると、強制八量体ＰＡ８３変異体、すなわち、５０μｇ／ｍｌ  ＬＦｎＰＫＲ（配列番号１３）を有する２５μｇ／ｍｌ  ＰＡ８３  Ｄ５１２Ｋ（配列番号７）および２５μｇ／ｍｌ  ＰＡ８３  Ｋ２４５Ｇ；Ｒ２５２Ｎ（配列番号８）を使用して２００ｐＭｏｌ／ｍｌ抗ＴｄＴｏｍＡＳＯをロードした場合、エクソソームは予測したサイズを有することをも示された。これらのデータは、生成される膜画分がエクソソームおよびEVの予測サイズであることを示している。
【０１５４】
実施例１１
本発明者らは、活性ＡＳＯをロードしたエクソソームがそれらの薬理学的活性を保持するかどうかを試験した。
【０１５５】
エクソソームのローディング
ＨｅＬａ細胞を２００ｐＭｏｌ／ｍｌ抗ＴｄＴｏｍＡＳＯ（配列番号１７および配列番号１８）および５０μｇ／ｍｌ七量体（ＰＡ８３  -配列番号２）、または強制八量体ＰＡ８３変異体（すなわち２５μｇ／ｍｌ−配列番号７（ＰＡ８３  Ｄ５１２Ｋ）および２５μｇ／ｍｌ配列番号８（ＰＡ８３  Ｋ２４５Ｇ；Ｒ２５２Ｎ））および５０μｇ／ｍｌ配列番号１３（ＬＦｎＰＫＲ）とともにインキュベートすることにより、エクソソームをロードした。分離後、これらのＡＳＯをロードしたエクソソームは、ＧＦＰ融合β−ガラクトシダーゼを標的コードし、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＳＭＢＩＯのカタログ番号ＳＣ００８）において過剰発現されるタンデムダイマートマトをバイシストロン的に発現するｍＲＮＡに対してアンチセンス活性を示した。ＨＥＫ細胞（ウェルあたり約１ｘ１０６）を次の方法で処理した：５７μｇ［ＯＤ２８０で測定された総タンパク質］の七量体：：ＡＳＯエキソソームプレップまたは４２μｇ［ＯＤ２８０で測定された総タンパク質］の八量体：：ＡＳＯ。
【０１５６】
結果
図１１を参照すると、ＡＳＯがロードされたエクソソームは薬理活性を有することが示されている。これらのデータは、この方法論を使用してＡＳＯをエクソソームにロードし得ること、およびエクソソームが以下の（ｉ），（ｉｉ），（ｉｉｉ）および（ｉｖ）であることを示している：（ｉ）融合能力がある；（ｉｉ）ＡＳＯを含む；（ｉｉｉ）ＡＳＯが活性である；および、（ｉｖ）エクソソームを使用してＡＳＯを輸送し得る。これらのデータは、ＰＡの変異体を使用してエクソソームをロードし得ることも示している。
【０１５７】
実施例１２
エクソソームは、５０ｎＭステルスリポーター抗ＧＦＰｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１２９３５−１４５）、５０μｇ／ｍｌ  ＰＡ８３（配列番号２）および５０μｇ／ｍｌ  ＬＦｎＰＫＲ（配列番号１３）を無血清培地に再懸濁してロードした。エクソソームは、以前と同様に、すなわち、タンパク質：：ｓｉＲＮＡ混合物との４時間のインキュベーション、および無血清培地中の５μＭイオノマイシンとの３０分間のインキュベーションの後に、単離された。すべてのインキュベーションは３７℃で実施し、以前と同様にインキュベーションの間に細胞をＰＢＳで洗浄した。  ＱｉａｇｅｎのｅｘｏＥａｓｙキット（カタログ番号７６０６４）を使用してエクソソームを単離した。エクソソームをＰＢＳで洗浄し、以前と同様に（すなわち、４℃で７０分間１１００００ｘｇ）沈降させた後、５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。エクソソームを完全培地を使用して希釈し、ＧＦＰ融合ベータガラクトシダーゼおよびタンデムダイマートマト（ＡＳＭＢＩＯのカタログ番号ＳＣ００８）を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞に添加した。次に、細胞溶解物中のベータガラクトシダーゼ活性を、ＯＤ６２０でのＸ−ｇａｌ変換を経時的に測定し、変換を総細胞溶解物タンパク質濃度に正規化することによってアッセイした。
【０１５８】
図１２を参照すると、ＰＡ８３およびＬＦｎＰＫＲを使用してＨｅＬａ由来のエクソソームにロードされた抗ＧＦＰｓｉＲＮＡが薬理活性を有していることが理解され得る。これらのデータは、実施例１１のＡＳＯと同様に、ｓｉＲＮＡがエクソソームにおいてその活性を保持していることを示している。
【０１５９】
概要
本明細書に記載のリポソームの態様および実施形態の利点は、ＩＬＶ逆融合の前に、Ａｔｘ関連カーゴをロードしたＩＬＶをリポソーム（例えば、エクソソーム）として隔離することによって、先行技術に固有の１つまたは複数の問題に対処しようとすることにある。さらに、Ａｔｘ  ＰＡ６３と同じ機能を実行するが、組換え膜貫通配列を含む膜貫通配列の使用についても対処する。
【０１６０】
リポソーム／エクソソームは、管腔内の内容物を酵素による破壊および免疫応答から保護し得て、輸送中の抗原性または酵素的に不安定な物質を保護する、天然に存在するパラクリン輸送システムとしてよく言及される。野生型ＬＦがＩＬＶおよびリポソーム（例えば、エクソソーム）の両方で報告されており、ＥＲに保存されたカルシウムの放出後にＩＬＶがリポソーム（例えば、エクソソーム）として細胞から分泌されることが実証されていることを考慮すると［５］、組換えＬＦもまた、リポソーム（例えば、エクソソーム）にトラップまたはロードされ得ることが本発明者らによって推論された。さらに、イオノフォア（例えば、イオノマイシン）の使用は、要求に応じてＥＲカルシウムの放出を抑制し、リポソーム（例えば、エクソソーム）としてＩＬＶのエキソサイトーシスを引き起こす。その結果、イオノマイシンは、以前にＡｔｘ由来のデリバリーシステムで処理された細胞から、カーゴを含むＩＬＶを一時的に捕捉するために使用された。これにより、細胞培養培地に分泌されたカーゴをロードされたエクソソームの単離がなされた。Ａｔｘコンポーネント保護抗原（ＰＡ）８３またはＰＡ６３、致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ）は、リポソーム／エクソソームに局在することが報告されているにもかかわらず［４］、孔形成組換えタンパク質を使用した、リポソーム／エクソソーム内への関連分子（すなわち、ＬＦｎ−ＧＡＬ４、ＬＦｎ−ＰＫＲ、ＬＦｎ−ＰＫＲ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ｓｉＲＮＡ、ＣＡＳ９またはＣａｓ９−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）のローディングは、これまでに報告されていない。
【０１６１】
［参考文献］
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［４］Ａｂｒａｍｉ，  Ｌ．，  Ｂｒａｎｄｉ，  Ｌ．，  Ｍｏａｙｅｒｉ，  Ｍ．，  Ｂｒｏｗｎ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｋｒａｎｔｚ，  Ｂ．  Ａ．，  Ｌｅｐｐｌａ，  Ｓ．  Ｈ．，  ＆  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｏｏｔ，  Ｆ．  Ｇ．  （２０１３）．  Ｈｉｊａｃｋｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｂｏｄｉｅｓ  Ｅｎａｂｌｅｓ  Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  ａｎｄ  Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｏｎｇ−Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｈｒａｘ  Ｔｏｘｉｎ，  ５（４），  ９８６-９９６．
［５］Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ  Ｇ．，  Ｂｒｏｓｔｒｏｍ  Ｍ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｂｒｏｓｔｒｏｍ  Ｃ．  （１９９２）  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒ℃ｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｏｒｔ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２６７（６）；  ３９３２−３９３９．
［６］Ｂｌａｕｓｔｅｉｎ，  Ｒ．  Ｏ．，  Ｋｏｅｈｌｅｒ，  Ｔ．  Ｍ．，  Ｃｏｌｌｉｅｒ，  Ｒ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，  Ａ．  Ｐｒ℃．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６，  ２２０９−２２１３  （１９８９）．
［７］Ｂ．Ａ．  Ｋｒａｎｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｅｔｈａｌ  ａｎｄ  ｅｄｅｍａ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｎｔｈｒａｘ  ｔｏｘｉｎ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３４４  （３）  （２００４）  ７３９-７５６．
［８］Ａｕｇｅｒ  Ａ．，  Ｐａｒｋ  Ｍ．，  ＮｉｔｓｃｈｋｅＦ．，  ＭｉｎａｓｓｉａｎＬ．  Ｍ．，  ＢｅｉｌｈａｒｔｚＧ．  Ｌ．，  Ｍｉｎａｓｓｉａｎ  Ｂ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｍｅｌｎｙｋ  Ｒ．  Ａ．  （２０１５）  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｒｇｏ  ｉｎｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ．  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  ，  １２  （８），  ｐｐ  ２９６２-２９７１
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［１０］Ｇａｕｒ，  Ｒ．，  Ｇｕｐｔａ，  Ｐ．，  Ｇｏｙａｌ，  Ａ．，  Ｗｅｌｓ，  Ｗ．  ＆  Ｓｉｎｇｈ，  Ｙ．  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎｔｈｒａｘ  ｔｏｘｉｎ．  Ｂｉ℃ｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２９７，  １１２１-１１２７  （２００２）．
［１１］Ｂａｉｌｌｉｅ，  Ｌ  Ｗ．，  Ｈｕｗａｒ，  Ｔ．  Ｂ．，  Ｍｏｏｒｅ，  Ｓ．，  Ｍｅｌｌａｄｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ，  Ｇ．，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ｌ．，  Ｎｅｅｓｏｎ，  Ｂ．  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）．  Ａｎ  ａｎｔｈｒａｘ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｌｅｔｈａｌ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２８（４１），  ６７４０-６７４８．
［１２］Ｋｈａｎｄｉａ  Ｒ．，  Ｂｈａｔｉａ  Ｓ．，  Ｃｈａｎｕ  Ｋ．  Ｖ．，  Ｓｏｏｄ  Ｒ．  ａｎｄ  Ｄｈａｍａ  Ｋ．  （２０１４）．  Ａｎｔｈｒａｘ  Ｔｏｘｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ．  Ａｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，  ９：  ５９９−６０９．
［１３］Ｇｕｏ  Ｓ．  ＆  Ｈｕａｎｇ  Ｌ．  （２０１１）  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｅｓｃａｐｉｎｇ  ＲＥＳ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｓｏｍｅ：  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ７４２８９５．  ＤｏＩ：  １０．１１５５／２０１１／７４２８９５
［１４］Ｓ．  Ｃ．  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｓ．  Ｃ．  Ｗｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ，  Ｖ．  Ｐｏｕｐｏｎ，  Ｊ．  Ｐ．  Ｌｕｚｉｏ，  Ｒ．  Ｃ．  Ｐｉｐｅｒ．  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｌａｔｅ  ｖａｃｕｏｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅｓ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．  （２００４）  １５，  １１９７−１２１０．
［１５］Ｗｉｌｌｍｓ  Ｅ．，  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈ．  Ｊ．，  Ｍａｇｅｒ  Ｉ．，  Ｌｅｅ  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）  Ｃｅｌｌｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６：  ２２５１９．
［１６］Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｄ．Ｄ．，  Ｆａｔｔａｈ  Ｒ．  Ｊ．，  Ｃｒｏｗｎ  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｎｔｈｒａｘ  Ｔｏｘｉｎ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  Ｔｈａｔ  Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ  Ｆｏｒｍ  ℃ｔａｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２８８：  ９０５８−９０６５．
［１７］Ｋａｒｇｉｎｏｖ，  Ｖ．Ａ．，  Ｎｅｓｔｏｒｏｖｉｃｈ  Ｅ．Ｍ．，  Ｓｃｈｍｉｄｔｍａｎｎ，  Ｆ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｔ．  Ｍ．，  Ｙｏｈａｎｎｅｓ，  Ａ．，  Ｆａｈｍｉ  Ｎ．  Ｅ．，  Ｂｅｚｒｕｋｏｖ  Ｓ．  Ｍ．，，  ａｎｄ  Ｈｅｃｈｔ  Ｓ．  Ｍ．  （２００７）  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  α−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ａｎｄ  Ｂ．  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｌｅｔｈａｌ  Ｔｏｘｉｎ  ｂｙ  β−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．；  １５（１６）：  ５４２４-５４３１．
［１８］Ｆｅｌｄ  Ｇ．Ｋ．，  Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．  Ｊ．  ＆  Ｋｒａｎｔｚ  Ｂ．  Ａ．  （２０１２）  Ｒａｔｃｈｅｔｉｎｇ  ｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌ℃ａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｈｒａｘ  ｔｏｘｉｎ．  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ．  ２１：６０６-６２４．
【図１】
2021533825.tif 000004
【図２】
2021533825.tif 000005
【図３】
2021533825.tif 000006
【図４】
2021533825.tif 000007
【図５】
2021533825.tif 000008
【図６】
2021533825.tif 000009
【図７】
2021533825.tif 000010
【図８】
2021533825.tif 000011
【図９】
2021533825.tif 000012
【図１０】
2021533825.tif 000013
【図１１】
2021533825.tif 000014
【図１２】
2021533825.tif 000015
【配列表】
2021533825000001.app
【国際調査報告】
2021533825.tif 000016
2021533825.tif 000017
2021533825.tif 000018