(57)【要約】本発明は、斬新なAXLを標的とするモノクローナル抗体および抗体-薬物複合体を公開する。また、本発明は、前記抗体、抗体-薬物複合体を製造する方法を公開する。本発明のAXL抗体は効率的に、高特異的に精製されたヒトAXLタンパク質および多くの腫瘍細胞の表面のAXLに結合することができ、前記ヒト化抗体は同様に高い親和力および低い免疫原性を有し、前記AXL抗体-薬物複合体はAXL高発現の腫瘍に顕著な抗腫瘍作用を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の重鎖可変領域であって、以下の3つの相補性決定領域CDR：
配列番号1で示されるCDR1、
配列番号2で示されるCDR2、および
配列番号3で示されるCDR3、
あるいは、
配列番号9で示されるCDR1、
配列番号10で示されるCDR2、および
配列番号11で示されるCDR3、
あるいは、
配列番号17で示されるCDR1、
配列番号18で示されるCDR2、および
配列番号19で示されるCDR3を含み、
ここで、上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換がありながら、AXL結合親和力を維持する誘導配列を含む重鎖可変領域。
【請求項２】
請求項1に記載の重鎖可変領域を有することを特徴とする抗体の重鎖。
【請求項３】
抗体の軽鎖可変領域であって、以下の3つの相補性決定領域CDR：
配列番号4で示されるCDR1'、
配列番号5で示されるCDR2'、および
配列番号6で示されるCDR3'、
あるいは、
配列番号12で示されるCDR1'、
配列番号13で示されるCDR2'、および
配列番号14で示されるCDR3'、
あるいは、
配列番号20で示されるCDR1'、
配列番号21で示されるCDR2'、および
配列番号22で示されるCDR3'を含み、
ここで、上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換がありながら、AXL結合親和力を維持する誘導配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項４】
請求項3に記載の軽鎖可変領域を有することを特徴とする抗体の軽鎖。
【請求項５】
（1） 請求項1に記載の重鎖可変領域、および/または
（2） 請求項3に記載の軽鎖可変領域
あるいは、請求項2に記載の重鎖、および/また請求項4に記載の軽鎖を有することを特徴とする抗体。
【請求項６】
（i） 請求項1に記載の重鎖可変領域、請求項2に記載の重鎖、請求項3に記載の軽鎖可変領域、請求項4に記載の軽鎖、または請求項5に記載の抗体、ならびに
（ii） 任意の発現および/または精製を補助するタグ配列
を有することを特徴とする組み換えタンパク質。
【請求項７】
CAR構築物であって、前記のCAR構築物のモノクローナル抗体抗原結合領域scFV断片はAXLと特異的に結合する結合領域で、かつ前記scFvは請求項1に記載の重鎖可変領域および請求項3に記載の軽鎖可変領域を有することを特徴とするCAR構築物。
【請求項８】
外来の請求項7に記載のCAR構築物を発現することを特徴とする組み換え免疫細胞。
【請求項９】
（a） 請求項1に記載の重鎖可変領域、請求項2に記載の重鎖、請求項3に記載の軽鎖可変領域、請求項4に記載の軽鎖、または請求項5に記載の抗体、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる抗体部分と、
（b） 検出可能なマーカー、細胞毒性薬物、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分とカップリングするカップリング部分とを含み、
好ましくは、前記の抗体部分と前記のカップリング部分は化学結合またはリンカーを介してカップリングしており、
より好ましくは、前記のリンカー（LU）は、4-(N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボンスクシンイミドエステル（MCC)、マレイミドカプロイル（MC)、6-マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（mc-val-cit-PAB） 、CL2Aおよび二置換マレイミド系リンカーからなる群から選ばれる
ことを特徴とする抗体薬物複合体。
【請求項１０】
（a）検出試薬、検出プレートまたはキットの製造、ならびに/あるいは（b）AXL関連疾患を予防および/または治療する薬物の製造に使用されることを特徴とする請求項1に記載の重鎖可変領域、請求項2に記載の重鎖、請求項3に記載の軽鎖可変領域、請求項4に記載の軽鎖、または請求項5に記載の抗体、請求項6に記載の組み換えタンパク質、請求項8に記載の免疫細胞、請求項9に記載の抗体薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物の分野に関し、より具体的に、AXLを標的とする抗体および抗体薬物複合体（ADC）、その製造方法と使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
AXLはは受容体チロシンキナーゼのサブファミリーであるTAM ファミリーのメンバーの一つで、TAM ファミリーはTyro-3、AxlおよびMerを含み、これらのリガンドはいずれも増殖停止特異的遺伝子6（Gas6）によってコードされるタンパク質分子である。AXLはGas6に結合すると活性化されることにより、その下流、たとえばPI3K/AKT、RAS/ERKおよびβ-カテニン/TCFなどのシグナル伝達経路を活性化させることで、細胞の増殖、アポトーシス、走化、接着や認識などの多くの生理機能を調節する。
【０００３】
研究では、AXLが多くの癌で活性化して発現する状態を示し、たとえば肺癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌および腎臓癌などの多くの腫瘍組織で、腫瘍細胞の上皮間葉転換、血管新生、アポトーシスおよび免疫調節などの多くの機序に関与し、そして予後不良（Cancer Cell 2015, 27:533-46）および多くの場合における薬剤耐性（Oncotarget 2015, 6:15321-31；Cancer Res. 2013, 19:279-90）に関連し、EGFR阻害剤による治療が困難な肺癌（Nat. Genet. 2012, 44:852-60）、PI3K阻害剤耐性の頭頸部癌（Cancer Cell 2015, 27:533-46）、抗HER2耐性の乳癌（Biochem Soc Trans. 2014, 42:822-30）、スニチニブ耐性の腎臓癌（Oncogene 2016, 35:2687-97）およびALK阻害剤耐性の神経芽細胞腫（Oncogene 2016, 35:3681-91）が含まれる。また、AXLの発現は従来の化学療法および放射線療法の獲得性薬剤耐性に関連する（Theranostics 2016, 6:1205-19）。AXLを抑制すると、薬剤耐性の細胞の細胞毒性薬物および標的阻害剤に対する感受性が増強する（Nat. Commun. 2016, 7:13898）。
AXLの腫瘍の標的治療における重要性から、そして潜在的な薬物の標的として、より多く良い特性を有するAXLに特異的に結合する抗体を研究・開発することが期待されている。
【０００４】
本発明者の初期の研究でも、正常組織と比べ、AXLは腫瘍組織、特に高侵襲で高転移の基底様および/またはトリプルネガティブ乳癌、転移性肺癌、膵臓腺癌などで異常に活性化して発現し、そしてほかの標的と比べ、AXLを標的とする抗体は迅速かつ大量に取り込まれることが見出され、AXLがより好適な抗体-薬物複合体（antibody-drug conjugate、ADC）の開発の標的になる可能性があることがわかる。しかし、現在、世界中、特に国内において、高特異性のヒトAXLに対する抗体薬物複合体が欠けている。
【０００５】
抗体薬物複合体は、一般的に、抗体または抗体系リガンド、小分子薬物、およびリガンドと薬物をカップリングさせるリンカーという3つの部分からなる。現在、臨床試験に入った抗体薬物複合体の構造では、高活性の細胞毒性薬物は、通常、リンカーを介してリガンドの表面のリシン残基、または抗体ヒンジ領域のシステイン残基（鎖間ジスルフィド結合部分から還元されたもの）に連結し、最適な薬物/リガンド比（DAR）は2〜4である。抗体の表面の大量のリシン残基（80個超）およびカップリング反応の非選択性によって、カップリングの数および部位の不確定性が生じ、さらに生成する抗体薬物複合体の不均一性につながる。ジェンマブ社によって1種類のAXLを標的とする抗体複合体が報告され（CN201580045131.4）、従来のカップリング技術に基づいた抗体薬物複合体でもある。
【０００６】
また、抗体薬物複合体は作用機序が簡単に見えるが、一つの抗体薬物複合体が安全で有効な薬物になるかというのは非常に複雑で予測不能で、多くの要素、たとえば以下のことによる。
【０００７】
1）標的の特性：標的が有効に取り込まれるか、標的の発現レベル、標的が癌細胞と正常細胞で十分な発現レベルの差があるか、標的が細胞外部分に分泌されるか離脱して血液に入るか。
2）モノクローナル抗体の特性：モノクローナル抗体の標的に対する特異性が十分か（ほかのタンパク質と交差反応がない）、モノクローナル抗体の安定性および標的に結合した後の取り込み速度および程度など。
3）リンカーの特性：リンカーは血液中で十分に安定することが必要で、同時にリンカーはADCに連結する薬物の数および領域・部位のいずれによっても変わり、最終的にADC薬物全体の安性性および有効性の変化につながる。
【０００８】
よって、ADC薬物の研究・開発に大量の実験の模索および検証が必要で、その安全性および有効性は実験前に予測することができないことがわかる。
【０００９】
上記のように、本分野では、親和力が高く、免疫原性が低く、安定性が良いAXLを標的とする抗体および抗体薬物複合体の開発が切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ヒト由来AXLを標的とする抗体であって、AXLの生物活性を阻害し、腫瘍の生長と転移の活性を抑制し、抗腫瘍治療の薬剤耐性の発生を減少させる抗体を提供する。
【００１１】
また、本発明は、AXLを標的とする抗体薬物複合体であって、AXL高発現の腫瘍細胞に顕著な抗腫瘍作用を有する抗体薬物複合体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第一の側面では、抗体の重鎖可変領域であって、以下の3つの相補性決定領域CDR：
配列番号1で示されるCDR1、
配列番号2で示されるCDR2、および
配列番号3で示されるCDR3、
あるいは、
配列番号9で示されるCDR1、
配列番号10で示されるCDR2、および
配列番号11で示されるCDR3、
あるいは、
配列番号17で示されるCDR1、
配列番号18で示されるCDR2、および
配列番号19で示されるCDR3を含み、
ここで、上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換がありながら、AXL結合親和力を維持する誘導配列を含む重鎖可変領域を提供する。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は、以下の相補性決定領域：
配列番号1、配列番号2、配列番号3で示されるmAb002cの重鎖相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、あるいは
配列番号9、配列番号10、配列番号11で示されるmAb005cの重鎖相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、あるいは
配列番号17、配列番号18、配列番号19で示されるmAb001cの重鎖相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3を含む。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は、さらに、ヒト由来のFR領域またはマウス由来のFR領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号7で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号15で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号23で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号25、配列番号26、配列番号27で示されるアミノ酸配列を有する。
【００１４】
本発明の第二の側面では、抗体の重鎖であって、本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域を有する重鎖を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体の重鎖は、さらに、重鎖定常領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記の重鎖定常領域は、ヒト由来のもの、マウス由来のものまたはウサギ由来のものである。
【００１５】
本発明の第三の側面では、抗体の軽鎖可変領域であって、以下の3つの相補性決定領域CDR：
あるいは、
配列番号4で示されるCDR1'、
配列番号5で示されるCDR2'、および
配列番号6で示されるCDR3'、
あるいは、
配列番号12で示されるCDR1'、
配列番号13で示されるCDR2'、および
配列番号14で示されるCDR3'、
あるいは、
配列番号20で示されるCDR1'、
配列番号21で示されるCDR2'、および
配列番号22で示されるCDR3'を含み、
ここで、上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換がありながら、AXL結合親和力を維持する誘導配列を含む軽鎖可変領域を提供する。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は、以下の相補性決定領域：
配列番号4、配列番号5、配列番号6で示されるmAb002cの軽鎖相補性決定領域LCDR1、LCDR2、LCDR3、あるいは
配列番号12、配列番号13、配列番号14で示されるmAb005cの軽鎖相補性決定領域LCDR1、LCDR2、LCDR3、あるいは
配列番号20、配列番号21、配列番号22で示されるmAb001cの軽鎖相補性決定領域LCDR1、LCDR2、LCDR3を含む。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は、さらに、ヒト由来のFR領域またはマウス由来のFR領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号8で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号16で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号24で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35で示されるアミノ酸配列を有する。
【００１７】
本発明の第四の側面では、抗体の軽鎖であって、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域を有する軽鎖を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体の軽鎖は、さらに、軽鎖定常領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記の軽鎖定常領域は、ヒト由来のもの、マウス由来のものまたはウサギ由来のものである。
【００１８】
本発明の第五の側面では、
（1） 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、および/または
（2） 本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、
あるいは、本発明の第二の側面に記載の重鎖、および/または本発明の第四の側面に記載の軽鎖
を有する抗体を提供する。
【００１９】
もう一つの好適な例において、前記抗体は、動物由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはこれらの組み合わせから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記ヒト化抗体のCDR領域は、1、2、または3個のアミノ酸の変化を含む。
もう一つの好適な例において、前記の動物はヒト以外の哺乳動物、好ましくはマウス、ヒツジ、ウサギである。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は二本鎖抗体、または一本鎖抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体はモノクローナル抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は部分的にまたは全部ヒト化したモノクローナル抗体である。
もう一つの好適な例において、前記付加、欠失、修飾および/または置換のアミノ酸の数は、元のアミノ酸配列のアミノ酸の合計の40％以下、好ましくは20％以下、より好ましくは10％以下である。
【００２０】
もう一つの好適な例において、前記付加、欠失、修飾および/または置換のアミノ酸の数は、1〜7個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1個である。
もう一つの好適な例において、前記少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た配列は、相同性が少なくとも80％のアミノ酸配列である。
もう一つの好適な例において、前記少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た誘導配列は、細胞表面のAXLタンパク質または組み換えAXLタンパク質を抑制する機能を有する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は、薬物複合体の形態である。
もう一つの好適な例において、前記抗体は、AXL（たとえばヒトAXLタンパク質の細胞外領域、AXL-ECD）に対する親和力EC50が0.04〜0.5 nM、好ましくは0.04〜0.1 nM、より好ましくは0.04〜0.05 nMである。
もう一つの好適な例において、前記抗体は、腫瘍細胞の表面のAXLに対する親和力EC50が0.1〜1.5 nM、好ましくは0.1〜1 nM、より好ましくは0.1〜0.2 nMである。
もう一つの好適な例において、前記抗体-薬物複合体（AXL-ADC）は、AXL高発現の腫瘍
細胞に対する毒性作用IC50が0.01〜1 nM、好ましくは0.01〜0.1 nM、より好ましくは0.01〜0.05 nMである。
【００２１】
本発明の第六の側面では、
（i） 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、ならびに
（ii） 任意の発現および/または精製を補助するタグ配列
を有する組み換えタンパク質を提供する。
もう一つの好適な例において、前記のタグ配列は6Hisタグを含む。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質（またはポリペプチド）は融合タンパク質を含む。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は、単量体、二量体、または多量体である。
【００２２】
本発明の第七の側面では、CAR構築物であって、前記のCAR構築物のモノクローナル抗体抗原結合領域scFV断片はAXLと特異的に結合する結合領域で、かつ前記scFvは本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域および本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域を有するCAR構築物を提供する。
【００２３】
本発明の第八の側面では、外来の本発明の第七の側面に記載のCAR構築物を発現する組み換え免疫細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、NK細胞、T細胞からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、ヒト由来のものまたはヒト以外の哺乳動物（たとえばマウス）由来のものである。
【００２４】
本発明の第九の側面では、
（a） 請求項1に記載の重鎖可変領域、請求項2に記載の重鎖、請求項3に記載の軽鎖可変領域、請求項4に記載の軽鎖、または請求項5に記載の抗体、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる抗体部分と、
（b） 検出可能なマーカー、細胞毒性薬物、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分とカップリングするカップリング部分と
を含む抗体薬物複合体を提供する。
【００２５】
もう一つの好適な例において、前記抗体薬物複合体ADCは以下の分子式で表される。
【化１】
2021530436.tif 000002
（ただし、
Abは抗ALX抗体である。
LUはリンカーである。
Dは薬物である。
そして、下付き文字pは1〜10、好ましくは1〜8から選ばれる値である。）
【００２６】
もう一つの好適な例において、前記のカップリング部分（D）は細胞毒性薬物で、かつ前記の細胞毒性薬物は、微小管標的薬および/またはDNA標的薬および/またはトポイソメラーゼ阻害剤である。
もう一つの好適な例において、前記の微小管標的薬は、モノメチルオーリスタチンE（MMAE）、モノメチルオーリスタチンF（MMAF）、マイタンシン誘導体（DM1）およびツブリシンからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記のDNA標的薬は、デュオカルマイシン、ピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン（PBD）からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記のトポイソメラーゼ阻害剤は、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトセシン（SN38）、エキサテカン（Exatecan）およびその類似体からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の抗体部分と前記のカップリング部分は化学結合またはリンカーを介してカップリングしている。
もう一つの好適な例において、前記のリンカー（LU）は、4-(N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボンスクシンイミドエステル（MCC)、マレイミドカプロイル（MC)、6-マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（mc-val-cit-PAB） 、CL2A（US20140170063、CN201480041766.2）および二置換マレイミド系リンカー（CN201611093699.6、CN201711169847.2）からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記抗体薬物複合体は、AXL高発現の腫瘍細胞に対する毒性作用IC50が0.01〜1 nM、好ましくは0.01〜0.1 nM、より好ましくは0.01〜0.05 nMである。
【００２７】
本発明の第十の側面では、（a）検出試薬、検出プレートまたはキットの製造、ならびに/あるいは（b）AXL関連疾患を予防および/または治療する薬物の製造に使用される、本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質、本発明の第八の側面に記載の免疫細胞、本発明の第九の側面に記載の抗体薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分の使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記検出試薬、検出プレートまたはキットは、
（1）サンプルにおけるAXLタンパク質の検出、および/または
（2）腫瘍細胞における内因性のAXLタンパク質の検出、および/または
（3）AXLタンパク質を発現する腫瘍細胞の検出
に使用される。
もう一つの好適な例において、前記の検出試薬、検出プレートまたはキットは、AXL関連疾患の診断に使用される。
もう一つの好適な例において、前記の薬物は、AXL高発現の腫瘍、腫瘍の遷移、または腫瘍の薬剤耐性の治療または予防に使用される。
もう一つの好適な例において、前記の腫瘍の薬剤耐性は、腫瘍免疫治療薬の薬剤耐性、腫瘍標的治療薬の薬剤耐性、通常の腫瘍化学治療の薬剤耐性、放射線治療の非感受性を含む。
【００２８】
もう一つの好適な例において、前記の薬物は、
（a） 特異的に腫瘍細胞、および/または腫瘍微環境における免疫/ストローマ細胞のAXLに結合すること、
（b） 腫瘍/腫瘍微環境で過剰活性化したAXL生物機能を抑制すること、
（c） 腫瘍細胞の遷移または転移を抑制すること、
（d） 腫瘍の生長を抑制し、併用時の抗腫瘤治療効果を向上させること、
（e） 抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）
からなる群から選ばれることに使用される。
もう一つの好適な例において、前記AXL関連疾患は、癌、自己免疫疾患、代謝関連疾患、感染疾患、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の癌は、固形腫瘍、血液癌を含む。
もう一つの好適な例において、前記の癌は、AXL高発現の腫瘍である。
もう一つの好適な例において、前記のAXL高発現の腫瘍は、乳癌、肺癌、膵臓腺癌、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、脳膠細胞腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の癌は、薬剤耐性の腫瘍である。
もう一つの好適な例において、前記のAXL高発現の腫瘍とは、腫瘍組織におけるAXL転写物および/またはタンパク質のレベルL1と正常組織における転写物および/またはタンパク質のレベルL0の比が、L1/L0≧2、好ましくは≧3である。
もう一つの好適な例において、前記代謝関連疾患は、糖尿病、食事性肥満および脂肪炎症を含む。
もう一つの好適な例において、前記感染疾患は、細菌およびウイルスの感染を含む。
【００２９】
本発明の第十一の側面では、
（i）  本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質、本発明の第八の側面に記載の免疫細胞、本発明の第九の側面に記載の抗体薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分と、
（ii）  薬学的に許容される担体と
を含む薬物組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は液体製剤である。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は注射剤である。
【００３０】
本発明の第十二の側面では、
（1） 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、あるいは
（2） 本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質、
（3） 本発明の第七の側面に記載のCAR構築物
からなる群から選ばれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３１】
本発明の第十三の側面では、本発明の第十二の側面に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
もう一つの好適な例において、前記のベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス、たとえばアデノウイルス、レトロウイルス、またはほかのベクターを含む。
【００３２】
本発明の第十四の側面では、遺伝子工学化された宿主細胞であって、本発明の第十三の側面に記載のベクターを含むか、あるいはゲノムに本発明の第十二の側面に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた宿主細胞を提供する。
【００３３】
本発明の第十五の側面では、体外でサンプルにおけるAXLを検出（診断的なものまたは非診断的なものを含む）する方法であって、
（1）  体外において、前記サンプルを本発明の第五の側面に記載の抗体と接触させる工程、
（2）  抗原-抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルにAXLが存在することを意味する工程
を含む方法を提供する。
【００３４】
本発明の第十六の側面では、下地シート（支持プレート）と、本発明の第五の側面に記載の抗体または本発明の第九の側面に記載の免疫複合体を含有する測定バーとを含む検出プレートを提供する。
【００３５】
本発明の第十七の側面では、
（1）  本発明の第五の側面に記載の抗体を含有する第一の容器、および/または
（2）  本発明の第五の側面に記載の抗体に対する二次抗体を含有する第二の容器を含むか、
あるいは、本発明の第十六の側面に記載の検出プレートを含む
キットを提供する。
【００３６】
本発明の第十八の側面では、組み換えポリペプチドの製造方法であって、
（a） 発現に適切な条件において、本発明の第十四の側面に記載の宿主細胞を培養する工程、
（b） 培養物から、本発明の第五の側面に記載の抗体または本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質である、組み換えポリペプチドを単離する工程
を含む方法を提供する。
【００３７】
本発明の第十九の側面では、AXL関連疾患を治療する方法であって、必要な対象に本発明の第五の側面に記載の抗体、前記抗体の抗体-薬物複合体、または前記抗体を発現するCAR-T細胞、またはこれらの組み合わせを施用する工程を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の方法は、さらに、必要な対象にほかの薬物または治療方法を併用して治療する工程を含む。
もう一つの好適な例において、前記のほかの薬物または治療方法は、抗腫瘍免疫治療薬、腫瘍標的治療薬、腫瘍化学治療、腫瘍放射線治療を含む。
もう一つの好適な例において、前記の抗腫瘍免疫治療薬は、PD-1、PD-L1モノクローナル抗体を含む。
【００３８】
本発明の第二十の側面では、キメラ抗体を製造する方法であって、
本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域および/または本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列をヒト抗体の定常領域のヌクレオチド配列を含有する発現ベクターにクローニングした後、動物細胞に形質移入することによってヒト-マウスキメラ抗体を発現させる工程を含む方法を提供する。
【００３９】
本発明の第二十一の側面では、ヒト化抗体を製造する方法であって、
本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域および/または本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域におけるCDR領域のヌクレオチド配列をヒト由来抗体のFR領域を含有するヌクレオチド配列の鋳型に導入し、さらにそれをヒト抗体の定常領域を含有する発現ベクターにクローニングした後、動物細胞に形質移入することによってヒト化抗体を発現させる工程を含む方法を提供する。
【００４０】
本発明の第二十二の側面では、腫瘍細胞の生長および遷移を抑制する方法であって、必要な対象に本発明の第五の側面に記載の抗体、前記抗体の抗体-薬物複合体、または前記抗体を発現するCAR-T細胞、またはこれらの組み合わせを施用する工程を含む方法を提供する。
【００４１】
本発明の第二十三の側面では、モデル動物の体内における腫瘍の生長を抑制する方法であって、必要な対象に本発明の第五の側面に記載の抗体、前記抗体の抗体-薬物複合体、または前記抗体を発現するCAR-T細胞を施用する工程を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記薬物は単独で投与してよく、腫瘍免疫療法、腫瘍標的薬物、細胞毒性薬物、放射線治療を含む手段と併用してもよい。
【００４２】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好ましい技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図1は本発明の抗ヒトAXL抗体の発見である。図1Aは蛍光活性化セルソーター（FACS）によるオリジナルに発見された抗ヒトAXLモノクローナル抗体（オリジナルハイブリドーマ、original hybridoma）の培養上清のヒト由来AXL高発現のMDA-MB-231（AXL-P）、AXL低発現のMDA-MB-453（AXL-N）の乳癌細胞に対する結合活性の検出である。図1Bは6つのモノクローナル抗体の番号（mAb001、mAb002、mAb003、mAb004、mAb005、mAb006）および精製された抗体のサブタイプに対する同定である。
【図２】図2はPCRによって増幅されたmAb001、mAb002、mAb005、mAb006の重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）の断片のアガロースゲル電気泳動の結果の図である。VH/VL断片は配列決定後、ヒト-マウスキメラ抗体の発現ベクターのクローニングおよび組み立てに使用された。
【図３】図3はHEK293T細胞によって発現される4つのヒト-マウスキメラ抗体（chimeric antibody）mAb001c、mAb002c、mAb005c、mAb006cがさらにMabSelectTM SuReTMカラムによる精製スペクトルである。
【図４】図4はELISAによるヒト-マウスキメラ抗体mAb001c、mAb002c、mAb005c、mAb006cのAXL-ECDに対する結合親和力（Binding affinity EC50）の測定である。
【図５】図5はイムノブロット実験（ウエスタンブロット、Western blot）による検出で示された乳癌（MDA231、Hs587T、MDA453）、肺癌（NCI-H1299、Calu-1、NCI-H460）、膵臓腺癌（SW1990、Capan-2、Panc-1、Capan-2）の細胞株におけるAXLタンパク質の発現レベルである。
【図６】図6は複数の腫瘍細胞株（乳癌、肺癌、脳膠細胞腫、メラノーマ）とヒト正常組織におけるAXL mRNAの発現レベル（−アクチンとの比）の分析比較である。
【図７】図7は51株のヒト乳癌細胞株の遺伝子発現データベース（Neve RMら, Cancer Cell 2006; 10:515-27）におけるAXL mRNAの高侵襲で高転移の基底型（Basal-type）対管腔型（Luminal-type）の乳癌細胞株における発現レベルの分析である。
【図８】図8はCCLEデータベースにおける上皮性対間質性肺癌細胞株におけるAXL mRNAの発現レベルの分析である。
【図９】図9はmAb002c(5/mL)のAXL高発現（NCI-H1299、LCLC-103H、CaLu-1、MDA-MB-231、 Hs578T）または低発現（MDA-MB-453）の腫瘍細胞の表面のAXLに対する結合レベルである。
【図１０】図10はキメラ抗体mAb001c、mAb002c、mAb005c、mAb006cのMDA-MB-231の細胞表面のAXLに対する結合親和力（Binding affinity EC50）の検出結果で、1×105 細胞を示された濃度勾配の抗体と混合し、1時間インキュベートした後、フローサイトメーター（FACSCalibur）によってFACS検出による分析を行った。
【図１１】図11はキメラ抗体mAb001c、mAb002c、mAb005cのNCI-H1299の細胞表面のAXLに対する結合親和力（Binding affinity EC50）の検出結果で、1×105 細胞を示された濃度勾配の抗体と混合し、1時間インキュベートした後、フローサイトメーター（FACSAria II）によってFACS検出による分析を行った。
【図１２】図12はELISAによるヒト化抗体系列Hu002-1〜Hu002-24のAXL-ECDに対する結合親和力（Binding affinity EC50）の検出である。
【図１３】図13はヒト化抗体系列Hu002-1〜Hu002-24のMDA-MB-231の細胞表面のAXLに対する結合親和力（Binding affinity EC50）の検出結果で、1×105 細胞を示された濃度勾配の抗体と混合し、1時間インキュベートした後、フローサイトメーター（FACSCalibur）によってFACS検出による分析を行った。
【図１４】図14はヒト化抗体系列Hu002-1〜Hu002-5のLCLC-103Hの細胞表面のAXLに対する結合親和力（Binding affinity EC50）の検出結果で、1×105 細胞を示された濃度勾配の抗体と混合し、1時間インキュベートした後、フローサイトメーターによってFACS検出による分析を行った。
【図１５】図15はHu002-2とMDA-MB-231細胞の結合による細胞内におけるリソソームへの取り込み（Internalization）である。前記抗体（5g/mL）を細胞と4℃で1時間、または37℃で4時間インキュベートした後の共焦点レーザー顕微鏡における観察結果である。
【図１６】図16はLCLC-103H細胞をHu002-2またはHu002-2-BL20-MMAEで24または48時間処理した後、イムノブロット（ウエスタンブロット、Western blot）によるAXLタンパク質の発現に対する抑制作用の検出である。
【図１７】図17は抗体薬物複合体AXL107-vc-MMAEの疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）のグラフである。
【図１８】図18は抗体薬物複合体AXL107-BL20-MMAEの疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）のグラフである。
【図１９】図19はモノクローナル抗体AXL107の質量分析グラフである。
【図２０】図20は抗体薬物複合体AXL107-vc-MMAEの質量分析グラフである。
【図２１】図21は抗体薬物複合体AXL107-BL20-MMAEの質量分析グラフである。
【図２２】図22は抗体薬物複合体mAb002c-vc-MMAEの疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）のグラフである。
【図２３】図23は抗体薬物複合体mAb002c-BL20-MMAEの疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）のグラフである。
【図２４】図24はモノクローナル抗体mAb002cの質量分析グラフである。
【図２５】図25は抗体薬物複合体mAb002c-vc-MMAEの質量分析グラフである。
【図２６】図26は抗体薬物複合体mAb002c-BL20-MMAEの質量分析グラフである。
【図２７】図27は抗体薬物複合体Hu002-2-BL20-MMAEの疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）のグラフである。
【図２８】図28は抗体薬物複合体Hu002-2-BL20-MMAEの質量分析グラフである。
【図２９】図29はヒト化モノクローナル抗体Hu002-2の質量分析グラフである。
【図３０】図30はmAb002c-ADC、AXL107-ADCのMDA-MB-453細胞の体外増殖に対する抑制活性（IC50）の検出結果である。
【図３１】図31はmAb002c-ADC、AXL107-ADCのMDA-MB-231細胞の体外増殖に対する抑制活性（IC50）の検出結果である。
【図３２】図32はmAb002c-ADC、AXL107-ADCのHs578T細胞の体外増殖に対する抑制活性（IC50）の検出結果である。
【図３３】図33はmAb002c-ADC、AXL107-ADCのCalu-1細胞の体外増殖に対する抑制活性（IC50）の検出結果である。
【図３４】図34はmAb002c-ADC、AXL107-ADCのLCLC-103H細胞の体外増殖に対する抑制活性（IC50）の検出結果である。
【図３５】図35はmAb002c-ADC、AXL107-ADCのU87MG細胞の体外増殖に対する抑制活性（IC50）の検出結果である。
【図３６】図36はヒト化Hu002系列抗体がBL20-MMAEとカップリングしたADCのMDA-MB-231細胞の体外増殖に対する抑制活性（IC50）の検出結果である。
【図３７】図37はヒト化Hu002系列抗体がBL20-MMAEとカップリングしたADCのHs578T細胞の体外増殖に対する抑制活性（IC50）の検出結果である。
【図３８】図38はヒト化Hu002系列抗体がBL20-MMAEとカップリングしたADCのU87MG細胞の体外増殖に対する抑制活性（IC50）の検出結果である。
【図３９】図39はヒト化Hu002系列抗体がBL20-MMAEとカップリングしたADCのLCLC-103H細胞の体外増殖に対する抑制活性（IC50）の検出結果である。
【図４０】図40はキメラ抗体mAb002c抗体がそれぞれvc-MMAE、BL20-MMAEとカップリングしたADC（いずれも5 mg/kg）のU87MG脳膠細胞腫モデルにおける体内抗腫瘍薬効で、結果からBL20-MMAEがvc-MMAEよりも優れた体内治療効果を有することが示された。
【図４１】図41はヒト化Hu002-1、Hu002-4抗体がBL20-MMAE（3 mg/kg）、AXL107-vc-MMAE（3 mg/kg）)とカップリングしたもののU87MG脳膠細胞腫モデルにおける体内抗腫瘍薬効である。
【図４２】図42はヒト化Hu002-2、Hu002-5抗体がそれぞれBL20-MMAEとカップリングしたADC（3 mg/kg、週に1回で計2回）のU87MG脳膠細胞腫モデルにおける体内抗腫瘍薬効である。
【図４３】図43はヒト化Hu002-1、Hu002-4抗体がそれぞれBL20-MMAEとカップリングしたADC（3 mg/kg、1 mg/kg、週に1回で計2回）のLCLC-103H肺癌モデルにおける体内抗腫瘍薬効である。
【図４４】図44はヒト化Hu002-2、Hu002-5抗体がそれぞれBL20-MMAEとカップリングしたADC（3 mg/kg、1 mg/kg、週に1回で計2回）のLCLC-103H肺癌モデルにおける体内抗腫瘍薬効である。
【図４５】図45はヒト化Hu002-1、Hu002-2、Hu002-5抗体がそれぞれBL20-MMAEとカップリングしたADC（いずれも1 mg/kg、週に1回で計2回）のLCLC-103H肺癌モデルにおける体内抗腫瘍薬効である。
【図４６】図46はヒト化Hu002-2、Hu002-5抗体がそれぞれBL20-MMAEとカップリングしたADC（1 mg/kg、0.5 mg/kg）およびAXL107-vc-MMAE（1 mg/kg）の週に1回で計2回の投与後のLCLC-103H肺癌モデルにおける体内抗腫瘍薬効である。
【図４７】図47はヒト化Hu002-2-BL20-MMAE（5 mg/kg、単回投与）がLCLC-103H大体積腫瘍（投与開始時の体積800mm3）に対して腫瘍を消退された結果である。
【図４８】図48はヒト化Hu002-2-BL20-MMAE（10 mg/kg、単回投与）がLCLC-103H大体積腫瘍（投与開始時の体積1800mm3）に対して腫瘍を消退された結果である。
【図４９】図49はHu002-2のHEK293Tにマウス由来AXLタンパク質を一過性発現させた後の結合活性のFACSによる検出で、ヒト由来のAXL、Hu002-2またはAXL107がマウス由来AXLに対してわずかな結合活性を示した。
【図５０】図50はHu002-2のカニクイザルAXLに対する結合親和力である。図50Aはイムノブロット実験（ウエスタンブロット、Western blot）によるHEK293TにサルAXLベクターを一過性形質転換させて24時間後のタンパク質発現レベルの検出で、図50BはHEK293TにサルAXLを一過性発現させて24時間後細胞を収集し、FACSによって検出されたHu002-2に結合する結合親和力（Binding affinity EC50）である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
具体的な実施形態
本発明者は幅広く深く研究し、大量のスクリーニングを行ったところ、意外に、6つの抗AXLモノクローナル抗体を得たが、それぞれmAb001〜mAb006と名付けた。活性測定の結果から、mAb001（IgG1-κ）、mAb002（IgG1-κ）、mAb005（IgG1-κ）、mAb006（IgG2b-κ）を選択してヒト-マウスキメラ抗体を構築し、それぞれmAb001c、mAb002c、mAb005c、mAb006cと名付けた。さらに上記抗体を測定した結果は以下の通りである。
【００４５】
1．前記のキメラ抗体はいずれも高度に特異的にAXL抗原に結合することができ、ELISAによるそのEC50はそれぞれ0.092nM、0.073nM、0.103nM、0.101nMであった。
2．前記のキメラ抗体は複数株のAXL高発現の腫瘍細胞に対して極めて高い結合親和力を有し、FACSによるそのEC50が0.174nM〜1.5nMで、遺伝子の配列決定でmAb006cとmAb005cの相補性決定領域（CDR）が高度に重なることが示されたため、mAb006cに対する後続の研究が中止された。
3．mAb002cに基づいて設計された一連のヒト化抗体はより高いAXLタンパク質に対する結合親和力および細胞に対する結合親和力を有し、ELISAによるそのEC50が0.045nM〜0.08nMで、FACSによるそのEC50が0.09nM〜0.14nMであった。
4．前記抗体の薬物複合体（ADC）は優れた特性を有し、すなわち、AXL正常発現の細胞には顕著な毒性・副作用がないが、AXL高発現の腫瘍細胞には非常に高い殺傷活性を有し、細胞増殖抑制のIC50値は0.01nM〜0.07nMであった。
5．本発明の新規なリンカーによって得られたAXL-ADC製品は、均一性が高く、体内外における安定性をさらに向上させるという優勢を有する。
6．本発明に係る好適な抗体および抗体-薬物複合体は既存技術と比べてより良く、より持続できる体内抗腫瘍治療効果を有する。
これに基づき、本発明を完成させた。
【００４６】
抗体
本明細書で用いられるように、用語「抗体」または「免疫グロブリン」は同様な構造特徴を持つ、約150000ダルトンのヘテロテトラマーの糖タンパク質で、2つの同じ軽鎖（L）と2つの同じ重鎖（H）からなるものである。各軽鎖は、重鎖に1つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプによるものである。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、1つの末端に可変領域（VH）を有し、その先に多数の定常領域を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（VL）を有し、他方の末端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の一つ目の定常領域と、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対向している。特殊なアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変領域の間に界面を形成している。
【００４７】
本明細書で用いられるように、用語の「可変」とは、抗体において可変領域のある部分が配列で異なっており、これによって各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性が構成されることを指す。しかし、可変性は、均一に抗体の可変領域全体に分布しているわけではない。軽鎖と重鎖の可変領域における相補性決定領域（CDR）または超可変領域と呼ばれる3つの断片に集中している。可変領域において、比較的に保存的な部分は、フレームワーク領域（FR）FRと呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域に、それぞれ、基本的にβシート構造となっており、連結ループを形成する3つのCDRで連結され、場合によって部分βシート構造となる4つのFR領域が含まれる。各鎖におけるCDRは、FR領域で密接し、かつ他方の鎖のCDRと一緒に抗体の抗原結合部位（Kabatら、NIH Publ. No. 91-3242, 卷I，647-669頁（1991）を参照する）を形成している。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、たとえば抗体の抗体依存細胞毒性に参与するなどの異なるエフェクター機能を示す。
【００４８】
脊椎動物の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常領域のアミノ酸配列に基づき、明らかに異なる二種類（κおよびλと呼ばれる）のいずれかに分類することができる。免疫グロブリンは、重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づき、異なるクラスに分類することができる。免疫グロブリンには、主として5つのクラス、すなわち、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、そのうちのいくつかは、さらに、サブクラス（アイソタイプ）、たとえばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAおよびIgA2に分類することができる。異なるクラスの免疫グロブリンの重鎖の定常領域に応じて、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。各クラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構造は本分野の技術者熟知である。
【００４９】
一般的に、抗体の抗原結合特性は、重鎖および軽鎖の可変領域に位置する3つの特定の領域によって特徴付けられ、可変領域（CDR）と呼ばれ、4つのフレームワーク領域（FR）に分かれ、4つのFRのアミノ酸配列が比較的に保存され、直接結合反応に関与しない。これらのCDRは環状構造を形成し、その中のFRで形成されるβシートによって空間構造上で近づき、重鎖におけるCDRおよび相応の軽鎖におけるCDRが抗体の抗原結合部位を構成する。同類の抗体のアミノ酸配列の比較によってどのアミノ酸がFRあるいはCDR領域を構成するか確認することができる。
【００５０】
本発明は、完全の抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体の断片または抗体とほかの配列からなる融合タンパク質も含む。そのため、本発明は、さらに、前記抗体の断片、誘導体および類似体を含む。
【００５１】
本発明において、抗体は当業者に熟知の技術によって製造されるマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または全ヒト抗体を含む。組み換え抗体、たとえばキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、ヒトの部分および非ヒトの部分を含み、標準のDNA組み換え技術によって得ることができ、いずれも有用な抗体である。キメラ抗体は一つの分子で、そのうちの異なる部分が異なる動物種由来で、たとえばマウス由来のモノクローナル抗体の可変領域、およびヒト免疫グロブリンの定常領域を有するキメラ抗体である（たとえば米国特許4,816,567および米国特許4,816,397を参照するが、ここで引用の形によって全体として本明細書に取り入れる）。ヒト化抗体とはヒト以外の種由来の抗体分子で、一つまたは複数のヒト以外の種由来の相補性決定領域（CDR）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する（米国特許5,585,089を参照するが、ここで引用の形によって全体として本明細書に取り入れる）。これらのキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、本分野で熟知されるDNA組み換え技術によって製造することができる。
【００５２】
本発明において、抗体は、単特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多重特異性でもよい。
【００５３】
本発明において、本発明の抗体は、さらにその保存的変異体を含み、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較すると、10個以下、好ましくは8個以下、より好ましくは5個以下、最も好ましくは3個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸で置換されてなるポリペプチドをいう。これらの保存的突然変異のポリペプチドは、表Aのようにアミノ酸の置換を行って生成することが好ましい。
【００５４】
【表１】
2021530436.tif 000003
【００５５】
抗AXL抗体
本発明は、3種類のAXLを標的とする高特異性で高親和力の抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖は重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列を、前記軽鎖は軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列を含有する抗体を提供する。
【００５６】
好ましくは、重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列、軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列は以下のポリペプチド配列を有するHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含む。 
【００５７】
a1）HCDR1は配列番号1：DFYIN、配列番号9:SYYIH、または配列番号17：SGYWSである。
a2）HCDR2は配列番号2：WIYPGSGNTKYNEKFKG，配列番号10:WIYPGSDNTKYNEKFKD、または配列番号18：YMTYSGATYYNPSLKSである。
a3）HCDR3は配列番号3：STGFFDY、配列番号11：NYYDYDGGTWFPYまたは配列番号19：GGNSYFFDYである。
a4）LCDR1は配列番号4：SASSSIGYMY、配列番号12：RASQDINYYLN、または配列番号20：RASENIYSNLAである。
a5）LCDR2は配列番号5：LTSNLAS、配列番号13：YTSRLHS、または配列番号21：AATNLADである。
a6）LCDR3はH配列番号6：QQWSSNPPT、配列番号14：QQGNTLPWT、または配列番号22：QHFWGTPLTである。
a7）上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列が少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た、AXL結合親和力を有する配列。
【００５８】
もう一つの好適な例において、前記少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た配列は、好適に、相同性が少なくとも80％、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列である。
【００５９】
好ましくは、前記の抗体は細胞表面のAXLタンパク質および組み換えCD73タンパク質の酵素機能を抑制し、迅速に細胞によって取り込まれてリソソームに入ることができる。
【００６０】
本発明の抗体は二本鎖または一本鎖抗体でもよく、そして動物由来抗体、キメラ抗体、ヒト-動物キメラ抗体、好ましくはヒト化抗体、より好ましくは全ヒト化抗体から選ばれてもよい。
【００６１】
本発明に係る抗体の誘導体は、一本鎖抗体、およびまたは抗体断片、たとえばFab、Fab'、(Fab')2あるいは当該分野におけるほかの既知の抗体の誘導体など、ならびにIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM抗体またはほかのサブタイプの抗体のうちの任意の一つまたは複数でもよい。
ここで、前記動物は、哺乳動物、たとえばマウスが好ましい。
【００６２】
本発明の抗体は、ヒトAXLを標的とするキメラ抗体、ヒト化抗体、CDR接木および/または修飾の抗体でもよい。
【００６３】
本発明の一つの好適な実施例において、上記配列番号1〜3、配列番号9〜11、配列番号17〜19のうちの任意の一つまたは複数の配列、あるいはこれらが少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た、AXL結合親和力を有する配列は、重鎖可変領域（VH）のCDR領域に位置する。
【００６４】
本発明の一つの好適な実施例において、上記配列番号4〜6、配列番号12〜14、配列番号20〜22のうちの任意の一つまたは複数の配列、あるいはこれらが少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た、CD73結合親和力を有する配列は、軽鎖可変領域（VL）のCDR領域に位置する。
【００６５】
本発明の一つのより好適な実施例において、VH CDR1、CDR2、CDR3はそれぞれ独立に配列番号1、配列番号2、配列番号3、または配列番号9、配列番号10、配列番号11、または配列番号17、配列番号18、配列番号19のうちの任意の一つまたは複数の配列、あるいはこれらが少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た、AXL結合親和力を有する配列から、VL CDR1、CDR2、CDR3はそれぞれ独立に配列番号4、配列番号5、配列番号6、または配列番号12、配列番号13、配列番号14、または配列番号20、配列番号21、配列番号22のうちの任意の一つまたは複数の配列、あるいはこれらが少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た、AXL結合親和力を有する配列から選ばれる。
【００６６】
本発明の上記内容において、前記付加、欠失、修飾および/または置換のアミノ酸の数は、好ましくは元のアミノ酸配列のアミノ酸の合計の40％以下、より好ましくは35％以下、より好ましくは1〜33％、より好ましくは5〜30％、より好ましくは10〜25％、より好ましくは15〜20％である。
【００６７】
本発明の上記内容において、より好適に、前記付加、欠失、修飾および/または置換のアミノ酸の数は、1〜7個、より好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個でもよい。
【００６８】
もう一つの好適な例において、前記の抗体はオリジナルなマウス由来抗体mAb001、mAb002、mAb003、mAb004、mAb005、mAb006である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体はヒト-マウスキメラ抗体mAb001c、mAb002c、mAb005c、mAb006cである。
もう一つの好適な例において、前記の抗体はヒト化抗体Hu002c-1、Hu002c-2、Hu002c-3、Hu002c-4、Hu002c-5、Hu002c-6、Hu002c-7、Hu002c-8、Hu002c-9、Hu002c-10、Hu002c-11、Hu002c-12、Hu002c-13、Hu002c-14、Hu002c-15、Hu002c-16、Hu002c-17、Hu002c-18、Hu002c-19、Hu002c-20、Hu002c-21、Hu002c-22、Hu002c-23、Hu002c-24である。
【００６９】
本発明の3種類の抗体は、併用してもよく、CAR構築物、CAR構築物を含む組み換え免疫細胞、抗体薬物複合体などの構築に使用してもよく、（a）検出試薬、検出プレートまたはキットの製造、ならびに/あるいは（b）AXL関連疾患を予防および/または治療する薬物の製造に使用してもよい。
【００７０】
本発明の配列表に係る各配列が表す意味は下記表Bの通りである。
【表２】
2021530436.tif 000004
【００７１】
また、本発明はサルAXLタンパク質配列およびマウスAXLタンパク質配列に関し、Genebank IDはそれぞれXP_014979499.1（サル）およびGenebank ID: NP_033491.2（マウス）である。
【００７２】
抗体の製造
本発明の抗体またはその断片のDNA分子の配列は、通常の技術で、たとえば、PCR増幅  あるいはゲノムライブラリースクリーニングなどの方法によって得ることができる。また、軽鎖および重鎖のコード配列を一体に融合し、一本鎖抗体を形成してもよい。
【００７３】
関連の配列を獲得すれば、組み換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。
【００７４】
また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成してもよい。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。
【００７５】
現在、前記の本発明の抗体（またはその断片、あるいはその誘導体）をコードするDNA配列を全部化学合成で得ることがすでに可能である。さらに、このDNA配列を本分野で周知の各種の既知のDNA分子（あるいはベクターなど）や細胞に導入してもよい。また、化学合成で本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。
【００７６】
さらに、本発明は、上記の適当なDNA配列および適当なプロモーターあるいは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように、適当な宿主細胞の形質転換に用いることができる。
【００７７】
宿主細胞は、原核細胞、たとえば細菌細胞、あるいは、低等真核細胞、たとえば酵母細胞、あるいは、高等真核細胞、たとえば哺乳動物細胞でもよい。好適な動物細胞は、CHO-S、HEK-293細胞を含むが、これらに限定されない。
【００７８】
通常、本発明の抗体の発現に適切な条件で、形質転換で得られた宿主細胞を培養する。そして、通常のグロブリンの精製工程、例えばプロテインA-Sepharose、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーなどの本分野の技術者に熟知の通常の分離精製手段で精製し、本発明のの抗体を得る。
【００７９】
得られたモノクローナル抗体は、通常の手段で同定することができる。たとえば、モノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、あるいは体外結合試験（たとえば放射免疫測定（RIA）または酵素結合免疫吸着測定（ELISA））で測定することができる。モノクローナル抗体の結合親和力は、例えばMunson等, Anal. Biochem.,107:220(1980)のScatchard分析で測定することができる。
【００８０】
本発明の抗体は、細胞内又は細胞膜において発現し、或いは細胞外に分泌することができる。必要であれば、その物理・化学的特性およびほかの特性を利用して各種の単離方法で組み換えタンパク質を単離・精製することができる。これらの方法は、本分野の技術者に熟知である。これらの方法の例として、通用の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心、浸透圧ショック、超音波処理、超遠心、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）及びほかの各種の液体クロマトグラフィー技術、並びにこれらの方法の組合せを含むが、これらに限定されない。
【００８１】
抗体-薬物複合体
また、本発明は本発明の抗体に基づいた抗体薬物複合体（antibody-drug conjugate、ADC）を提供する。
【００８２】
典型的に、前記抗体薬物複合体は前記抗体、およびエフェクター分子を含み、前記抗体と前記エフェクター分子がカップリング、好ましくは化学的にカップリングしている。ここで、前記エフェクター分子は治療活性を有する薬物が好ましい。また、前記エフェクター分子は毒素タンパク質、化学治療薬、小分子薬物または放射性核種のうちの一つまたは複数でもよい。
【００８３】
本発明の抗体と前記エフェクター分子の間はカップリング剤によってカップリングしてもよい。前記のカップリング剤の例は、非選択性カップリング剤、カルボキシ基を利用するカップリング剤、ペプチド鎖、ジスルフィド結合を利用するカップリング剤のうちの任意の一つまたは複数でもよい。前記非選択性カップリング剤とは、エフェクター分子と抗体を共役結合させて連結する化合物、たとえばグルタルアルデヒドなどである。前記カルボキシ基を利用するカップリング剤は、シスアコニット酸無水物系カップリング剤（たとえばシスアコニット酸無水物）、アシルヒドラゾン系カップリング剤（カップリング部位はアシルヒドラゾンである）のうちの任意の一つまたは複数でもよい。
【００８４】
抗体における一部の残基（たとえばCysやLysなど）は多くの機能基との連結に使用され、イメージング試薬（たとえば発色基や蛍光基）、診断試薬（たとえばMRI造影剤や放射性同位元素）、安定剤（たとえばエチレングリコール重合体）および治療剤を含む。抗体は機能剤にカップリングして抗体-機能剤の複合体を形成してもよい。機能剤（たとえば薬物、検出試薬、安定剤）は抗体にカップリング（共役結合）されている。機能剤は直接、またはリンカーを介して間接に抗体に連結してもよい。
【００８５】
抗体は薬物がカップリングすることによって抗体薬物複合体（ADC）になってもよい。典型的に、ADCは薬物と抗体の間に位置するリンカーを含む。リンカーは分解できるリンカーでもよく、分解できないリンカーでもよい。分解できるリンカーは、典型的に、細胞内の環境において分解しやすく、たとえば目的の部位で分解することにより、薬物が抗体から放出される。適切な分解できるリンカーは、たとえば、細胞内におけるプロテアーゼ（たとえばリソソームプロテアーゼやエンドソームプロテアーゼ）によって分解できるペプチジル含有リンカーを含む酵素によって分解されるリンカー、あるいはグルクロニダーゼによって分解できるグルクロン酸含有リンカーのような糖リンカーを含む。ペプチジルリンカーは、たとえばジペプチド、たとえばバリン-シトルリン、フェニルアラニン-リシンやバリン-アラニンを含んでもよい。ほかの適切な分解できるリンカーは、たとえば、pH感受性リンカー（たとえばpHが5.5未満になると加水分解するリンカー、たとえばヒドラゾンリンカー）および還元条件において分解できるリンカー（ジスルフィド結合リンカー）を含む。分解できないリンカーは典型的に抗体がプロテアーゼによって加水分解される条件において薬物を放出する。
【００８６】
抗体に連結する前、リンカーはあるアミノ酸残基と反応できる活性反応基を有し、連結は活性反応基を介して実現する。チオール基に特異的な活性反応基が好ましく、たとえばマレイミド系化合物、ハロゲン化アミド（たとえばヨウ化、臭化または塩化のもの）、ハロゲン化エステル（たとえばヨウ化、臭化または塩化のもの）、ハロゲン化メチルケトン（たとえばヨウ化、臭化または塩化のもの）、ハロゲン化ベンジル（たとえばヨウ化、臭化または塩化のもの）、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、水銀誘導体、たとえば3,6-ジ(水銀メチル)ジオキサン（対イオンは酢酸イオン、塩素イオンまたは硝酸イオンである）、およびポリメチレンジメチルスルフィドチオスルホネートを含む。リンカーは、たとえば、チオスクシンイミドを介して抗体に連結したマレイミドを含んでもよい。
【００８７】
薬物は任意の細胞毒性薬物、細胞生長を抑制する薬物または免疫抑制薬物でもよい。実施形態において、リンカーは抗体と薬物を連結し、薬物はリンカーと結合できる機能性基を有する。たとえば、薬物はリンカーと結合できるアミノ基、カルボキシ基、チオール基、ヒドロキシ基、またはケトン基を有してもよい。薬物が直接リンカーに連結する場合、薬物は抗体に連結する前、反応する活性基を有する。
【００８８】
有用な薬物の種類は、たとえば、抗チューブリン薬、DNA副溝結合試薬、DNA複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸拮抗薬、抗代謝薬、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどを含む。特に有用な細胞毒性薬物系の例は、たとえば、DNA副溝結合試薬、DNAアルキル化試薬、およびチューブリン阻害剤を含み、典型的な細胞毒性薬物は、たとえばオーリスタチン（auristatin）、カンプトテシン（camptothecin）、デュオカルマイシン（duocarmycin）、エトポシド（etoposide）、メイタンシン（maytansine）およびメイタンシノイド（maytansinoid）（たとえばDM1やDM4）、タキサン（taxane）、ベンゾジアゼピン系（benzodiazepine）またはベンゾジアゼピン含有薬物（benzodiazepine containing drug）（たとえばピロロ[1,4]ベンゾジアゼピン系（PBDs）、インドリノベンゾジアゼピン系（indolinobenzodiazepines）およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン系（oxazolidinobenzodiazepines））およびビンカアルカロイド(vinca alkaloid)、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトセシン（SN38）、エキサテカン（Exatecan）およびその類似体を含む。
【００８９】
本発明において、薬物-リンカーは一つの簡単な工程でADCの形成に使用することができる。別の実施形態において、二機能性リンカー化合物は二工程または多工程の方法でADCの形成に使用することができる。たとえば、システイン残基が第一の工程でリンカーの反応活性部分と反応し、そして後の工程で、リンカーにおける機能性基が薬物と反応することで、ADCになる。
【００９０】
通常、特異的に薬物部分における適切な反応活性基と反応しやすいように、リンカーにおける機能性基を選択する。非限定的な例として、アジ化合物に基づいた部分は特異的な薬物部分における反応性アルキニル基との反応に使用することができる。薬物はアジ基とアルキニル基の間の1,3-双極子を介して付加することで、リンカーに共役結合する。ほかの有用な機能性基は、たとえばケトン類およびアルデヒド類（ヒドラジド類およびアルコキシアミンとの反応に適する）、ホスフィン（アジ基との反応に適する）、イソシアネートおよびイソチオシアネート（アミン類およびアルコール類との反応に適する）、および活性化したエステル類、たとえばN-ヒドロキシスクシンイミドエステル（アミン類およびアルコール類との反応に適する）を含む。これらおよびほかの連結手段は、たとえば「生物カップリング技術」、第二版（Elsevier）に記載されるように、当業者に熟知されている。当業者には、薬物部分およびリンカーの選択性反応について、相補対の反応活性機能基を選択する場合、当該相補対のいずれでも、リンカーにも薬物にも使用することができる。
【００９１】
また、本発明は、ADCを製造する方法であって、さらに、抗体を薬物-リンカー化合物と、抗体複合体（ADC）の形成に足りる条件において結合させる工程を含んでもよい方法を提供する。
【００９２】
一部の実施形態において、本発明の方法は、抗体-リンカー複合体の形成に足りる条件において、抗体を二機能性リンカー化合物と結合させる工程を含む。これらの実施形態において、本発明の方法は、さらに、薬物部分がリンカーを介して抗体に共役結合するのに足りる条件において、抗体リンカー複合体を薬物部分と結合させる工程を含む。
【００９３】
一部の実施形態において、抗体薬物複合体ADCは以下の分子式で表される。
【化２】
2021530436.tif 000005
【００９４】
（ただし、
Abは抗体である。
LUはリンカーである。
Dは薬物である。
そして、下付き文字pは1〜8から選ばれる値である。）
【００９５】
AXL抗体-薬物複合体
本発明は、抗体-薬物複合体に関し、より具体的に、治療への使用を有するAXL抗体-薬物複合体に関する。特定のリンカーを介して抗AXL抗体を化学治療薬または小分子毒素とカップリングさせることができる。また、本発明は、抗AXL抗体-薬物抱合体によって哺乳動物の細胞または関連する病理的状況を治療する方法に関する。
【００９６】
抗体の表面の大量のリシン残基（80個超）およびカップリング反応の非選択性によって、カップリングの数および部位の不確定性が生じ、さらに生成する抗体薬物複合体の不均一性につながる。たとえば、T-DM1(平均DAR値：3.5)のDAR値の分布は0〜8である。同様に、抗体ヒンジ領域の鎖間ジスルフィド結合は4対しかないが、最低な平均DAR値（2〜4）の要求に達するには、部分的に鎖間ジスルフィド結合を還元させる必要がある。既存の還元剤（DTT、TCEP等）は選択的に鎖間ジスルフィド結合を還元させることができないため、生成する複合体も均一な産物ではなく、複数の成分からなり、その主要成分のDAR値は0、2、4、6、8で、各特定のDAR値に相応する成分のいずれにも連結部位の違いによって形成する異性体が存在する。抗体薬物複合体製品の不均一性は各構成成分の間で薬物動態学の性質、力価および毒性の不均一性につながる。たとえば、高いDAR値を有する成分は体内においてより速く排出され、そしてより高い毒性につながる。
【００９７】
以上のカップリング技術に存在する問題に対し、簡単な化学的方法によって既存の抗体に対する特定部位のカップリングを実現させることができると、大量の手間とコストが節約されるため、より魅力的である。中では、ポリセリックス・リミテッド社によって出願されたCN200480019814.4、Igenica Biotherapeutics社によって出願されたWO2014197871A2、ソレント・セラピューティクス社によって出願されたCN201380025774.3、上海新理念生物医薬科技有限公司によって出願されたCN201310025021.4などを含む、関連する研究がすでに行われている。しかしながら、上記技術では、カップリング試薬の合成経路が長い、カップリング試薬の化学的安定性が良くない、抗体複合体の電気泳動パターンが混乱しているため、カップリング過程において副反応が存在する可能性がある、既存の方案では体内循環の過程におけるチオール基交換（逆マイケル付加反応）が解決されていないといった問題が存在する。
【００９８】
ジェンマブ社によって1種類のAXLを標的とする抗体複合体が報告され（CN201580045131.4）、従来のカップリング技術に基づいた抗体薬物複合体でもある。
【００９９】
以上のカップリング技術に存在する問題に対し、簡単な化学的方法によってAXLを標的とする抗体-薬物複合体に対する特定部位のカップリングを実現させることができると、薬物の均一性が向上し、プロセスと品質管理の面において大量の手間とコストが節約され、しかも複合体の安定性、薬効および安全性などの薬らしさを向上させることができる。
【０１００】
本発明では、新規なリンカー構造（発明者によって初期で開発された新規な二置換マレイミド系リンカーCN201611093699.6、CN201711169847.2）を、AXLを標的とする抗体のカップリングに使用し、当該リンカーは全部/部分的に抗体の軽鎖-重鎖および重鎖-軽鎖のジスルフィド結合が還元されたシステインのチオール基にクロスカップリングすることができ、そしてこのようなカップリング方法によって得られるAXLを標的とする抗体薬物複合体は、従来の抗体薬物複合体よりも、より狭い薬物/抗体比（DAR）の分布を有する。当該二置換マレイミド系リンカーを有するAXL抗体-薬物複合体の構造は式Ia、Ibで表される。
【０１０１】
【化３】
2021530436.tif 000006
【化４】
2021530436.tif 000007
【０１０２】
（ただし、
Ar'は、置換または無置換のC6〜C10アリーレン基、置換または無置換の5〜12員ヘテロアリーレン基からなる群から選ばれる。
L1はAr'基に連結した-O(CH2CH2O)n-で、ここで、nは1〜20から選ばれる任意の整数である。
L2は化学結合、またはAA-PAB構造で、ここで、AAは2〜4個のアミノ酸からなるポリペプチド断片で、PABはp-アミノベンジルカルバモイル基である。
CTDはアミド結合を介してL2に結合した細胞毒性系小分子薬物である。
mは3.8〜4.2である。
AbはAXLを標的とする抗体である。）
【０１０３】
本発明は、カップリング方法であって、毒素小分子を特定のリンカーを介してAXLを標的とする抗体にカップリングさせ、抗体の親和性を変えずに大幅に腫瘍細胞に対する殺傷力を向上させる方法を提供する。
【０１０４】
本発明は、ジアリールチオマレイミド単位および一つのカップリング基を含むリンカーまたはカップリング試薬を提供する。ジアリールチオマレイミド単位は抗体鎖間のチオール基（還元後）の架橋に、カップリング基は小分子薬物または薬物-リンカー単位とのカップリングに使用される。当該ジアリールチオマレイミド単位と抗体における開放のシステイン-システインのジスルフィド結合の2つの硫黄原子の二座結合（bidentate binding）のため、これらのADCは均質で単座リンカーを含有するADCよりも強い安定性を有する。そのため、向上した体内における半減期を有し、全身性放出の細胞毒素の量を減少し、そして単座リンカーのADCよりも安全な薬物性質を有する。
【０１０５】
一方、生成する薬物-リンカー単位は当該リンカーを介して抗体とカップリングし、部分的に鎖間で架橋した複合体が生成する。従来の抗体薬物複合体と比べ、本発明の方法によって製造される抗体薬物複合体の薬物/抗体比（DAR）の分布がより狭いことで、大幅に製品の均一性および薬理学特性の均一性を向上させる。当該抗体薬物複合体は目的の細胞群、たとえば腫瘍細胞を標的に薬物を送達することに使用できる。抗体薬物複合体は特異的に細胞表面のタンパク質に結合し、生成する結合物が細胞内に取り込まれる。細胞内において、薬物は活性薬物の形態で放出して効果を果たす。抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗原と結合できる抗体断片、または抗体Fc融合タンパク質、またはタンパク質を含む。「薬物」は高活性薬物で（定義の部分を参照する）、一部の場合、薬物はポリエチレングリコールでもよい。
【０１０６】
本発明によって提供されるカップリング製品は、混合物ではあるが、従来の手段によってカップリングした抗体薬物複合体と比べ、そのDAR分布の範囲が狭い。その平均DAR値は4近くで、最適な抗体薬物複合体の平均DAR値（2〜4）の範囲に近い。また、カップリング製品はネイキッド抗体（DAR=0）を含有しないことが極めて少なく、この成分は細胞毒性による殺傷に貢献しない。同時に、カップリング製品は重度カップリング製品（DAR=8）も含有せず、低DARの成分よりも、この成分の体内における消失速度が速い。そのため、本発明によって提供される抗体薬物複合体の製品は非均一性が大幅に改善された。
【０１０７】
AXL抗体-薬物複合体の製造
抗体薬物複合体の製造経路は以下の通りである。抗体の鎖間ジスルフィド結合が還元され、2n個（たとえば8個）のチオール基が生成する。本発明の置換マレイミド系リンカー-薬物複合体（式Icの化合物）は還元された抗体のチオール基とカップリングし、相応する抗体薬物複合体が生成し、そのうち、当該抗体薬物複合体に以下に示される一つまたは二つの形態が存在する。
【０１０８】
【化５】
2021530436.tif 000008
【０１０９】
ここで、前記の式Icの化合物は、以下の群から選ばれる：
【化６】
2021530436.tif 000009
【化７】
2021530436.tif 000010
【０１１０】
一つの典型的な製造方法は、抗体原液を反応緩衝液で2〜10mg/mLになるように希釈し、140〜200倍の過剰量モル比のジチオトレイトール（DTT）を入れるか、または6.0〜20倍の過剰量モル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を入れ、反応液を10〜35℃で2〜48時間撹拌すること、ここで、前記反応緩衝液は、50mM リン酸二水素カリウム-水酸化ナトリウム(KH2PO4-NaOH)/150mM 塩化ナトリウム(NaCl)/1mM ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH 6-9；50mM リン酸水素二ナトリウム-クエン酸/150mM 塩化ナトリウム(NaCl)/1mM ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH 6-9；50mM ホウ酸-ホウ砂/150mM 塩化ナトリウム(NaCl)/1mM ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH 6-9；50mM ヒスチジン-水酸化ナトリウム/150mM 塩化ナトリウム(NaCl)/1mM ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH 6-9およびPBS//1mM ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH 6-9という比率で調製される緩衝液でもよいことを含む。
【０１１１】
上記反応液を0〜10℃に冷却し、DTTで還元する場合、還元反応が完了した後、脱塩カラムまたは限外ろ過によって過剰量のDTTを除去する必要があり、さらに置換マレイミド系化合物（予め10mg/mlでアセトニトリル(ACN)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド(DMF)またはジエチルアセトアミド(DMA)に溶解させたもの）を反応液における有機溶媒の体積比が15％以下になるように入れ、0〜37℃で2〜4時間撹拌しながらカップリング反応させる。TCEPで還元する場合、残ったTCEPを除去することなく、そのまま置換マレイミド系化合物を入れてカップリングさせることができる。
【０１１２】
脱塩カラムによってカップリング反応混合物をコハク酸ナトリウム/NaCl緩衝液またはヒスチジン-酢酸/ショ糖ゲルでろ過して精製し、UV280紫外吸収値によってピークサンプルを収集する。または数回限外ろ過する。その後、ろ過によって除菌し、得られる産物を低温で保存する。好適な温度は-100〜60℃で、ろ過装置の孔径は0.15〜0.3μmが好ましい。
【０１１３】
得られる抗体薬物複合体の薬物抗体比（DAR）は比較的に均一である。本発明の異なるマレイミドリンカー（リンカー断片）を使用する場合、ADC産物の均一性が非常に高い（通常、DAR優位産物（たとえばDARが約4のもの）はすべてのADCの少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％またはそれ以上を占める）。DARがある程度ばらつくADCについて、均一性がより良いサンプルが必要な場合、さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）、分子排除クロマトグラフィー（SEC）、イオン交換クロマトグラフィー（IEC）によって分離・精製してもよいが、これらの方法に限定されない。
【０１１４】
薬物組成物および施用方法
本発明によって提供される抗体-薬物複合体は特定の細胞群を標的とし、細胞表面の特異的なタンパク質（抗原）に結合することにより、結合物の取り込みまたは薬物の浸入によって薬物を活性形態で細胞内に放出させることができるため、本発明の抗体-薬物複合体は目的の疾患の治療に使用することが可能で、前記の抗体-薬物複合体は治療有効量で適切な経路を介して被験者（たとえばヒト）に投与することができる。治療が必要な被験者は特定の抗原の活性または発現量に関連する疾患に罹患するというリスク、または疑いがある患者でもよい。このような患者は通常の健康診断によって同定することができる。
【０１１５】
既知の医学分野の当業者は、疾患の治療しようとする種類または疾患の部位によって、通常の方法を被験者への薬物組成物の投与に使用することができる。この組成物はほかの通常の経路、たとえば、経口投与、胃腸外投与、噴霧吸入、局所、直腸、経鼻、口腔、膣または埋め込みによって投与することができる。本明細書で用いられる用語「胃腸外」は皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病巣内および脳内注射または輸液技術を含む。また、それを注射可能な保存手段、たとえば1か月以上、3か月以上、または6か月以上の保存で注射可能または生分解可能な材料や方法を用いる主題に使用することができる。
【０１１６】
注射組成物は様々な担体、たとえば植物油、ジメチルアセトアミド（dimethylactamide）、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）を含有してもよい。静脈内注射について、水溶性抗体は点滴の手段により、抗体および生理的に許容される賦形剤を含有する薬物製剤を輸液投与することができる。生理的に許容される賦形剤は、たとえば、5％ブドウ糖、0.9％食塩水、リンガー溶液またはほかの適切な賦形剤を含んでもよい。筋肉内製剤、たとえば、抗体の一つの適切な可溶性塩の形態の無菌製剤には、溶解と使用可能な薬用賦形剤として、たとえば水または注射液、0.9％食塩水、または5％ブドウ糖溶液が挙げられる。
【０１１７】
本発明の抗体-薬物複合体で治療する場合、本分野の通常の方法によって送達することができる。たとえば、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解可能なナノカプセル、または生物粘着性ミクロスフェアによって細胞に導入することができる。あるいは、前記核酸またはベクターは現場で直接注射または輸液ポンプによって送達することができる。ほかの方法は、複合体および生分解可能な重合体を使用する様々な送達およびベクターシステムを含む。
【０１１８】
本発明の薬物組成物は、安全有効量の本発明の抗体-薬物複合体および薬学的に許容される担体を含む。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合せを含むが、これらに限定されない。通常、薬物製剤は、投与様態に応じるべきであるため、本発明の薬物組成物は、溶液剤の形態にしてもよく、たとえば生理食塩水あるいはグルコースおよび他の助剤を含む水溶液を使用し通常の方法で製造することができる。前記の薬物組成物は、無菌条件で製造することが好ましい。活性成分の給与量は治療有効量である。
【０１１９】
本発明に記載の抗体-薬物複合体の有効量は、投与の様態と治療しようとする疾患の重篤度などによって変更することができる。好適な有効量の選択は、当業者がいろいろな要素によって決めることができる（たとえば臨床試験による）。前記の要素は、前記の二重機能抗体複合体の薬物動態学のパラメーター、例えば生物的利用率、代謝、半減期など、患者の治療しようとする疾患の重篤度、患者の体重、患者の免疫状況、投与の経路などを含むが、これらに限定されない。通常、本発明の抗体-薬物複合体は、毎日0.0001mg〜50 mg/kg動物体重（好ましくは0.001mg〜10 mg/kg動物体重）の投与量で投与する場合、満足できる効果が得られる。たとえば、治療状況の切望によって、毎日数回に分けた投与量、または比率的に減少する投与量で投与することができる。
【０１２０】
局所投与のための本発明の化合物の剤形は、軟膏剤、散剤、湿布剤、噴霧剤や吸入剤を含む。活性成分は、無菌条件で生理学的に許容される担体および任意の防腐剤、緩衝剤、または必要よって駆出剤と一緒に混合される。
【０１２１】
本発明の化合物は、単独で投与してもよいし、あるいは他の薬学的に許容される治療剤と併用して投与してもよい。
【０１２２】
薬物組成物を使用する場合、安全な有効量の本発明の化合物を治療の必要のある哺乳動物(たとえばヒト)に使用し、使用の際の用量は薬学上で効果があるとされる投与量で、体重60 kgのヒトの場合、毎日の投与量は、通常1〜2000mg、好ましくは5〜500mgである。勿論、具体的な投与量は、さらに投与の様態、患者の健康状況などの要素を考えるべきで、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。
【０１２３】
検出用途およびキット
本発明の抗体またはそのADCは検出に有用で、たとえば検体を検出することによって診断情報を提供することができる。
【０１２４】
本発明において、使用される検体（サンプル）は細胞、組織検体および生検標本を含む。本発明で用いられる用語「生検」は当業者に既知のすべての種類の生検を含む。そのため、本発明で使用される生検は、たとえば腫瘍の切除検体、内視鏡方法あるいは器官の穿刺または針刺しによって調製された組織検体を含む。
【０１２５】
本発明で使用される検体は固定または保存された細胞または組織検体を含む。
また、本発明は、本発明の抗体（またはその断片）を含有するキットを提供するが、本発明の一つの好適な例において、前記のキットはさらに容器、使用説明書、緩衝液などを含む。好適な例において、本発明の抗体は検出プレートに固定されてもよい。
【０１２６】
応用
本発明は、本発明の用途、たとえば診断製剤の製造、あるいはAXL関連疾患を予防および/または治療する薬物の製造に使用される用途を提供する。前記AXL関連疾患は、腫瘍の発生、生長および/または転移、腫瘍薬剤耐性疾患、炎症、代謝関連疾患などを含む。
【０１２７】
本発明の抗体、ADCまたはCAR-Tなどの使用は、以下のものを含むが、これらに限定されない。
【０１２８】
（i）腫瘍、特にAXL高発現の腫瘍の発生、生長および/または転移を診断、予防および/または治療する。前記腫瘍は、乳癌（たとえばトリプルネガティブ乳癌）、肺癌（たとえば非小細胞肺癌）、膵臓腺癌、悪性脳膠細胞腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、腎臓癌、結直腸癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、白血病、骨髄癌、血管肉腫など、特にトリプルネガティブ乳癌、非小細胞肺癌、膵臓腺癌、悪性脳膠細胞腫、より好ましくはトリプルネガティブ乳癌および/または非小細胞肺癌を含むが、これらに限定されない。
【０１２９】
（ii）自己免疫疾患を診断、予防および/または治療する。前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、Ｉ型糖尿病、乾癬、多発性硬化症を含むが、これらに限定されない。
【０１３０】
（iii）炎症を診断、予防および/または治療する。前記炎症は、リウマチ性関節炎、骨関節炎、強直性脊椎炎、痛風、ライター症候群、乾癬性関節炎、感染性関節炎、結核性関節炎、ウイルス性関節炎、真菌性関節炎、糸球体性腎炎、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、急性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症を含むが、これらに限定されない。
【０１３１】
（iv）代謝関連疾患を診断、予防および/または治療する。前記代謝関連疾患は、糖尿病、食事性肥満および脂肪炎症を含むが、これらに限定されない。
【０１３２】
本発明の主な利点は以下の通りである。
１、本発明に係る抗体は新規で優れた生物活性を有し、具体的に、前記の好適な抗体は高いAXL親和力（ELISA測定によるそのEC50は0.04〜0.05nMである)を有する。また、前記の好適な抗体は腫瘍細胞の表面のAXLに良い結合親和力を有し(FACS測定によるそのEC50は0.07〜0.14nMである)、AXLを標的とする治療抗体として有用である。
２、本発明に係るヒト化抗体はマウス由来抗体に相当するか、それ以上の活性のみならず、より低い免疫原性を有する。
【０１３３】
３、本発明に係る抗体-薬物複合体（ADC）は特異的にAXLに依存する抗腫瘍活性を有し、前記の好適なヒト化抗体の薬物複合体（ADC）はAXL正常発現の細胞には顕著な毒性・副作用がないが、AXL高発現の腫瘍細胞には非常に高い殺傷活性を有し、細胞増殖抑制試験で測定されたそのIC50値は0.01nM〜0.05nMであった。
４、本発明によって提供される新規なリンカーは、簡単な化学方法によってAXLを標的とする抗体とカップリングすることができ、従来のカップリング手段と比べ、このようなリンカーで得られるAXL抗体薬物複合体はDAR値の分布が非常に狭いため、生成する製品は均一性が高く、得られる複合体における単一の分布の成分（DAR：4）が80％以上で、複合体の体外腫瘍細胞増殖の抑制活性は従来のmcVC-PAB複合体よりも生物学活性、安全性などの薬らしさの面においてある程度向上または維持する。
【０１３４】
５、本発明はマレイミドのジスルフィド鎖の橋架けによってより良い安定性を有し、Ar'部位に置換基を導入することによってマレイミドの開環・加水分解の反応速度を調節してマレイミドの開環後の環化・二次加水分解反応を緩和さることができ、体内においてスルフィド交換反応および開環後の環化・二次加水分解反応が生じにくく、さらにAXL抗体-薬物複合体の体外と体内の安定性を強化させる。
６、既存技術のAXL07-vc-MMAEと比べ、本発明の好適な抗体および抗体-薬物複合体はより優れた体外および体内の抗腫瘍治療効果を有する。
【０１３５】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。細胞株は通常の市販品で、またはATCCから購入され、プラスミドはいずれも市販品であった。
【実施例】
【０１３６】
実施例1  ヒトAXLを標的とするモノクローナル抗体の発見と製造
工程１  ハイブリドーマ細胞の製造：
まず、ヒトAXLタンパク質の細胞外領域（AXL-ECD）を抗原として製造した。NCBI：NP_068713.2アミノ酸の33番目から449番目を参照し、遺伝子クローニング技術および哺乳動物ベクター発現系によって炭素末端ポリヒスチジンタグ（C-terminus polyhistidine-tagged）が付いた抗原を得たが、具体的なアミノ酸配列は以下の通りである(配列番号36)：
QAEESPFVGNPGNITGARGLTGTLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILELADSTQTQVPLGEDEQDDWIVVSQLRITSLQLSDTGQYQCLVFLGHQTFVSQPGYVGLEGLPYFLEEPEDRTVAANTPFNLSCQAQGPPEPVDLLWLQDAVPLATAPGHGPQRSLHVPGLNKTSSFSCEAHNAKGVTTSRTATITVLPQQPRNLHLVSRQPTELEVAWTPGLSGIYPLTHCTLQAVLSDDGMGIQAGEPDPPEEPLTSQASVPPHQLRLGSLHPHTPYHIRVACTSSQGPSSWTHWLPVETPEGVPLGPPENISATRNGSQAFVHWQEPRAPLQGTLLGYRLAYQGQDTPEVLMDIGLRQEVTLELQGDGSVSNLTVCVAAYTAAGDGPWSLPVPLEAWRPGQAQPVHQLVKEPSTPAFSWPHHHHHHHHHH
【０１３７】
上記HEK293T細胞で発現・製造されたヒトAXL細胞外領域のタンパク質によってBalb/cマウスを免疫させ、使用量は50μg/匹で、免疫脾臓細胞を製造した。良いタイミングでマウス骨髄腫細胞（SP2/0）製造して細胞を飼育して融合に備えた。
上記3種類の細胞を準備できたら、PEGを介して免疫脾臓細胞とSP2/0細胞を融合させ、PEGを除去し、飼育細胞を含有するHAT完全培地で再懸濁させ、96ウェルプレートに接種して培養し、ELISA/FACS法によって陽性ウェルをスクリーニングした。最後に、さらに陽性ウェルの細胞に対して有限希釈法によってクローン化培養を行い、ELISAまたはFACSによって力価が高く、形態が良く、単一クローンで生長する細胞をスクリーニングし、続いて連続3回の陽性クローン率がすべて100％になるまでサブクローニングによるスクリーニングを行い、当該細胞株に対して増幅培養およびライブラリー構築が行えるようになった。
【０１３８】
工程２  ヒトAXLを標的とするマウス由来モノクローナル抗体の精製：
工程１でスクリーニングされたハイブリドーマ細胞をローラーボトルにおいて14日増幅培養した後、細胞の培養上清を収集し、0.22μmろ膜でろ過した後、得られた培養上清を一定の速度で予め平衡化されたプロテインA樹脂カラムに入れ、そして0.1M Tris-HCl（pH=8.0、1.5M NaCl含有）でカラムを平衡化した。その後、0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液で平衡カラムを溶離し、溶離液を収集して定量し、SDS-PAGE電気泳動、SEC-HPLCおよび内毒素検出を行った。得られた精製抗体を分けて-80℃で凍結保存して使用に備えた。
【０１３９】
工程３  ヒトAXLを標的とするマウス由来モノクローナル抗体の生物活性および特異性の確認：
スクリーニングを繰り返し、選ばれた6つのハイブリドーマモノクローナル抗体に対して生物活性および標的特異性の測定を行った。図1Aに示すように、蛍光活性化セルソーター（FACS）によって単一クローン細胞培養液の上清を検出したところ、6つのモノクローナル抗体はいずれも特異的にヒト由来AXL高発現のMDA-MB-231細胞（AXL-P）には結合することができたが、CD73低発現のMDA-MB-453細胞（AXL-N）には顕著な結合活性がなかった。図1Bに示すように、精製された抗体サンプルでサブタイプの検出を行ったところ、mAb001〜mAb005はいずれもIgG1/kと、mAb006はIgG2b/kと同定された。
【０１４０】
工程４  精製された抗体サンプルを使用し、勾配希釈後、ELISAによって検出したところ、表-1に示すように、mAb001〜mAb006はAXL-ECDに優れた結合親和力を有し、中では、mAb001、mAb002、mAb005、mAb006のEC50はいずれも＜0.1nMであった。
【表３】
2021530436.tif 000011
【０１４１】
実施例2  抗体の配列決定、相補性決定領域（CDR）の同定
優れた特異性および親和力から、優先的にmAb001、mAb002、mAb005、mAb006を選んで配列決定を行った。プライマーを設計して通常のPCR技術によって重鎖（VH）、軽鎖（VL）の可変領域の断片（図2を参照する）を増幅し、ベクターにクローニングし、配列決定した。通常の配列決定およびKabatデータベース（http://www.bioinf.org.uk）を使用した分析により、以下の重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列、相補性決定領域（CDR）の情報を得た（下線「＿」で示されたのはCDR-1/2/3のアミノ酸配列である）。遺伝子配列決定を行ったところ、mAb006cのCDR配列はmAb005cに高度に類似し、以下は単独で示さない。
【０１４２】
配列番号7 mAb002の重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列
QIQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYPFTDFYINWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDTAVYFCARSTGFFDYWGQGTTLTVSS
配列番号15 mAb005の重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列 
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYYIHWVQQRPGQGLEWIGWIYPGSDNTKYNEKFKDKATLTADTSSGTAYMQLSSLTSDDSAVFYCARNYYDYDGGTWFPYWGQGTLVTVSA
配列番号23 mAb001の重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列
AVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWSWIRKFPGNKLESMGYMTYSGATYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTPEDTATYYCARGGNSYFFDYWGQGTTLTVSS
配列番号8 mAb002の軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列
QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSIGYMYWYQQKPRSSPKSWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGAGTKLELK
配列番号16 mAb005の軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDINYYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSRVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK
配列番号24 mAb001の軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQLKQGKSPHLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKIISLQSEDFGTYYCQHFWGTPLTFGAGTKLELK 
【０１４３】
実施例3  ヒト-マウスキメラ抗体の製造
遺伝子組み換え技術によって3組の可変領域の配列（配列番号7、配列番号15、配列番号23、配列番号8、配列番号16、配列番号24を参照する）をヒトIgG1重鎖定常領域およびκ鎖定常領域を含有するベクターにクローニングし、配列決定で間違いがないと確認されたら、形質移入技術および哺乳動物発現系（FreeStyleTM293T細胞）によって構築されたキメラ型抗体を発現させて精製し（図3を参照する）、得られたヒト-マウスキメラ型抗体の番号、重鎖および軽鎖の構成を表-2に示す。同様の方法によって発明特許出願CN201580045131.4で公開されたヒト化抗体AXL07を製造して対照とした。
【表４】
2021530436.tif 000012
【０１４４】
実施例4  キメラ抗体のヒトAXLタンパク質に対する親和力のELISA測定
コーティング液でAXLタンパク質の細胞外領域（AXL-ECD）を1μg/mLになるように希釈し、ELISAプレートを100μL/ウェル、4℃で一晩コーティングした。残った抗原を洗い流し、1％BSAで室温で2hブロッキングした後、3倍勾配で希釈された各モノクローナル抗体を100  L/ウェルで入れ、室温で1hインキュベートした。結合しなかった抗体を洗い流し、適切な濃度で西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗マウスの二次抗体を100μL/ウェルで入れ、室温で0.5hインキュベートした。結合しなかった二次抗体を洗い流し、TMB呈色液を入れて約15min反応させ、1N HCLを50μL/ウェルで入れ、呈色反応を停止させた後、450nmにおける吸光度を測定し、そしてデータを分析した。
検出結果は図4に示すように、mAb001c、mAb002c、mAb005c、mAb006cはAXL-ECDに対して強い親和性を有し、具体的なEC50値を表-2に示したが、mAb002cのAXL-ECDに対する親和力は対照抗体AXL107よりもやや高かった。
【表５】
2021530436.tif 000013
【０１４５】
実施例5  AXLタンパク質の多くの腫瘍細胞における高発現
複数の異なる分子の種類の乳癌細胞株（MDA-MB-231、Hs578T、MDA-MB-453）、肺癌細胞株（NCI-H1299、Calu-1、NCI-H460）、膵臓腺癌細胞株（SW1990、Capan-2、Panc-1、Canpan-1）に対し、細胞の全タンパク質を調製し、精確に定量した後、イムノブロット試験（ウエスタンブロット、Western blot）によってAXLタンパク質の発現レベルを検出した。結果は図5に示すように、AXLタンパク質は検出された乳癌、肺癌、膵臓腺癌細胞株の多くでは異常な活性化・発現を示した。
【０１４６】
実施例6  ヒト腫瘍と正常組織の遺伝子発現のデータベース分析
CCLE（Cancer cell line encyclopedia、癌細胞株エンサイクロペディア）データベース、G-Tex（ヒト正常組織）データベース、および51株のヒト乳癌細胞株のデータベース（Neve RMら, Cancer Cell 2006; 10:515-27）の遺伝子発現の情報をダウンロードし、ヒト正常組織の発現状況に対する腫瘍株の群（たとえば乳癌、肺癌、脳膠細胞腫、メラノーマ）におけるAXL mRNAレベルを分析した。また、本実施例では、異なる分子の種類の乳癌（たとえば：管腔型対基底型）、異なる悪性程度の肺癌（たとえば：上皮性対間質性）におけるAXL mRNAの発現レベルを比較して分析した。
結果は図6に示すように、CCLEデータベースおよびG-Texデータベースを比較すると、高侵襲性の乳癌、肺癌、膠細胞腫およびメラノーマの細胞株は平均AXL mRNA発現レベルが顕著に正常組織よりも高い。本発明のAXL3を標的とする抗体は、トリプルネガティブ乳癌、肺癌、膠細胞腫を診断、予防および治療する使用においてより顕著な効果がある。       
結果は図7に示すように、管腔型（Luminal-type）乳癌細胞株と比べ、高侵襲で高転移の基底型（Basal-type）乳癌細胞株は平均AXL mRNA発現レベルが官腔型よりも顕著に高く、かつ統計学的に有意である。臨床において「トリプルネガティブ」乳癌は主に基底型乳癌由来のものであることから、本発明のAXLを標的とする抗体は、トリプルネガティブ乳癌を診断、予防および治療する使用においてより顕著な効果がある。
結果は図8に示すように、低転移性/上皮性（EMT-low）肺癌細胞株と比べ、高転移性/間質性（EMT-high）肺癌細胞株は平均AXL mRNA発現レベルが顕著に高くなり、かつ統計学的に有意である。高転移性肺癌は臨床において薬剤耐性で、予後不良であることが多いことから、本発明のAXLを標的とする抗体は、高転移で、薬剤耐性の末期肺癌を診断および治療する使用においてより顕著な効果がある。
【０１４７】
実施例7  FACSによる腫瘍細胞の表面のAXLタンパク質とキメラ抗体の特異的結合の検出
AXL高発現の非小細胞肺癌細胞NCI-H1299、LCLC-103H、Calu-1、高発現のトリプルネガティブ乳癌細胞MDA-MB-231、Hs578Tとともに、AXL低発現の乳癌細胞MDA-MB-453を標的細胞として使用し、キメラ抗体mAb002cの細胞表面のAXLに対する結合状況を測定した。3×105個の腫瘍細胞を抗体と均一に混合した後（最終濃度5μg/mL）、4℃で1hインキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄して結合しなかった一次抗体を除去し、さらに200μL（2μg/mL）のPEで標識された二次抗体を入れて4℃で30minインキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄して結合しなかった二次抗体を除去し、最後に細胞を200μLのPBSに再懸濁させ、フローサイトメーターFACSCaliburによって被験抗体の細胞表面のAXLに対する結合親和力（Binding affinity）を、または同一の抗体濃度において異なる腫瘍細胞に対する合計結合蛍光強度（MFI）を測定した。
測定結果は図9に示すように、キメラ抗体mAb002cはAXL高発現の腫瘍細胞を特異的に認識して結合し、結合率の蛍光強度の順序はNCI-H1299、LCLC-103H、MDA-MB-231、Hs578Tの順で、AXL低発現の腫瘍細胞MDA-MB-453は極めて弱い結合蛍光強度を示した。NCI-H1299、LCLC-103Hと抗体の結合率（MFI）をMDA-MB-453と抗体の結合率と比較すると、mAb002cの結合率の差がそれぞれ127倍と91倍であった。
【０１４８】
実施例8  キメラ抗体の腫瘍細胞の表面のAXLに対する結合親和力の測定
AXL高発現のトリプルネガティブ乳癌細胞MDA-MB-231を標的細胞として使用し、100μLの3倍勾配で200nMから0.091nMに希釈された被験抗体を一次抗体とし、それぞれ100μLのRPMI-1640無血清培地に懸濁させた1×105個のMDA-MB-231と均一に混合した後、4℃で1hインキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄して結合しなかった一次抗体を除去し、さらに標的細胞を200μLの2μg/mLのPEで標識された二次抗体と4℃で30minインキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄して結合しなかった二次抗体を除去し、最後に細胞を200μLのPBSに再懸濁させ、フローサイトメーターFACSCaliburによって被験抗体の細胞表面のAXLに対する結合親和力（Binding affinity）を測定した。
測定結果は図-10、表-4に示すように、mAb001c、mAb002c、mAb005c、mAb006cはMDA-MB-231に対して強い親和性を有し、中でも、mAb002cのMDA-MB-231細胞に対する親和力は顕著に対照抗体AXL107よりも高かった。
【表６】
2021530436.tif 000014
【０１４９】
AXL高発現の肺癌細胞NCI-H1299を標的細胞として使用し、100μLの3倍勾配希釈された被験抗体を一次抗体として100μLのRPMI-1640無血清培地に懸濁させた1×105個のNCI-H1299と均一に混合し、操作方法は上記と同様に、最後に細胞を200μLのPBSに再懸濁させ、フローサイトメーターFACSAria IIによって被験抗体の細胞表面のAXLに対する結合親和力（Binding affinity）を測定した。
測定結果は図-11、表-5に示すように、mAb001c、mAb002c、mAb005c、mAb006cはNCI-H1299に対して強い親和性を有し、中でも、mAb002cのNCI-H1299細胞に対する親和力は顕著に対照抗体AXL107よりも高かった。
【表７】
2021530436.tif 000015
【０１５０】
実施例9  ヒト化抗体の製造
Germlineデータベースから検索してmAb002cの非CDR領域に最もマッチするヒト化鋳型を選択した後、ヒト由来鋳型のCDR領域の代わりに抗体のCDR領域を選ばれたヒト化鋳型に導入し、さらたIgG1の定常領域と組み換え、同時にマウス由来抗体の3次元構造を元に、残基を包埋し、CDR領域と直接相互作用がある残基、およびVLとVHの配座に大きく影響する残基に対して復帰突然変異を行った。
具体的に、mAb002cのヒト化を行って3つのヒト化重鎖の可変領域（配列番号25、配列番号26、配列番号27）、および8つのヒト化軽鎖の可変領域（配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35）を得た。
【０１５１】
配列番号25 mAb002_VHg0 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTDFYINWVRQAPGQGLEWMGWIYPGSGNTKYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSTGFFDYWGQGTLVTVSS
配列番号26 mAb002_VHg1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTDFYINWVRQAPGQGLEWMGWIYPGSGNTKYNEKFKGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSTGFFDYWGQGTLVTVSS
配列番号27 mAb002_VHg2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTDFYINWVKQAPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSTGFFDYWGQGTLVTVSS
配列番号28 mAb002_VKg0 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSIGYMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPPTFGQGTKLEIK
配列番号29 mAb002_VKg1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSIGYMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPPTFGQGTKLEIK
配列番号30 mAb002_VKg2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSIGYMYWYQQKPGQSPRSLIYLTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPPTFGQGTKLEIK
配列番号31 mAb002_VKg3 QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSIGYMYWYQQKPGQSPRSLIYLTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPPTFGQGTKLEIK
配列番号32 mAb002_VKg4 EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSASSSIGYMYWYQQKPDQSPKLLIKLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGQGTKLEIK
配列番号33 mAb002_VKg5 EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSASSSIGYMYWYQQKPDQSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGQGTKLEIK
配列番号34 mAb002_VKg6 EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSASSSIGYMYWYQQKPDQSPKSLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGQGTKLEIK
配列番号35 mAb002_VKg7 QIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSASSSIGYMYWYQQKPDQSPKSLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGQGTKLEIK
【０１５２】
遺伝子組み換え技術によって設計されったヒト化可変領域の配列をヒトIgG1重鎖定常領域およびκ鎖定常領域を含有するベクターにクローニングし、配列決定で間違いがないと確認されたら、形質移入技術および哺乳動物発現系（FreeStyleTM 293T細胞）によって構築されたヒト化抗体を発現させた。それぞれこれらのヒト化の重鎖および軽鎖を組み合わせて発現させ、最終的にmAb002c群で24のヒト化抗体を得たが、各抗体の相応する重鎖および軽鎖の組み合わせを表-6に示す。
【表８】
2021530436.tif 000016
【０１５３】
実施例10  ヒト化抗体のAXL-ECDに対する結合親和力
表-6における24のヒト化抗体を勾配希釈し、ELISA法によってそのAXL-ECDタンパク質に対する親和力を測定したが、実験方法は実施例4を参照する。
実験結果は図12、表-7に示すように、 前記ヒト化抗体Hu002c-1〜Hu002c-24はいずれもAXL-ECDタンパク質に対して強い結合親和力を有し、EC50値が0.043nM〜0.082nMであった。 
【表９】
2021530436.tif 000017
【０１５４】
実施例11  ヒト化抗体の腫瘍細胞のAXLに対する結合親和力
表-6における24のヒト化抗体を勾配希釈し、フローサイトメーターによってそのMDA-MB-231細胞の表面のAXLに対する親和力を測定したが、実験方法は実施例8を参照する。
実験結果は図13、表-8に示すように、 前記ヒト化抗体はMDA-MB-231細胞の表面のAXLに対して高い親和活性を有し、EC50値が0.073nM〜0.17nMで、その親和力がいずれも対照AXL107（0.43nM）よりも高いことが示された。
【表１０】
2021530436.tif 000018
表-6における4つのヒト化抗体を勾配希釈し、フローサイトメーターによってそのLCLC-103H細胞の表面のAXLに対する親和力を測定したが、実験方法は実施例8を参照する。
実験結果は図14に示すように、 前記ヒト化抗体Hu002-1、Hu002-2、Hu002-4、Hu002-5はLCLC-103H細胞の表面のAXLに対して高い親和活性を有し、EC50値がそれぞれ0.28nM、0.37nM、0.49nM、0.36nMで、その親和力がいずれも対照AXL107（0.80nM）よりも高いことが示された。
【０１５５】
実施例12  ヒト化抗体と腫瘍細胞の結合による細胞内におけるリソソームへの取り込み 
AXL高発現の乳癌細胞株MDA-MB-231を標的細胞として使用し、50％の密度でMDA-MB-231細胞を共焦点レーザーシャーレに敷いて16 h培養した後、5μg/mL（10％ウシ胎児血清含有1640培地に希釈された）のAXLヒト化抗体Hu002-2を入れ、それぞれ37℃で4時間または4℃で1時間（対照として）インキュベートし、PBSで3回洗浄して細胞と結合しなかった抗体を除去し、4％のパラホルムアルデヒド（PBSに希釈された）で室温で30min固定した。PBSで3回洗浄し、0.4％ Triton X-100（PBSに希釈された）で室温で細胞を10min透過処理した。PBSで3回洗浄した後、LAMP-2（ウサギ抗ヒト）抗体を37℃の条件において1hインキュベートし、細胞リソソームの位置を標識した。PBSで結合しなかった抗体を洗い流し、37℃でR-PEで標識されたヒツジ抗ヒト二次抗体およびAlexa 488二次抗体を30 minインキュベートした。PBSで結合しなかった二次抗体を洗い流し、DAPIで10min染色して細胞核の位置を標識した後、蛍光顕微鏡（Leica、20×）によって抗体の取り込み状況を検出した。
結果は図15に示すように、Hu002-2は迅速かつ大幅にMDA-MB-231細胞によってリソソームに取り込まれた。当該結果から、本発明の抗体は抗体-薬物複合体（ADC）の製造に適することが示され、AXL-ADCは良いADC薬物特性を有し、広域で高特異性のAXL陽性腫瘍を標的とする治療薬に有用であるという将来性が示唆された。
【０１５６】
実施例13  ヒト化抗体と腫瘍細胞の結合による腫瘍AXLタンパク質の発現レベルの低下 
AXL高発現の肺癌細胞LCLC-103Hを標的細胞として使用し、16％コンフルエンスで12ウェルプレートに敷いた。壁付着から16時間後、それぞれPBS、2μg/mLのサブタイプ対照hIgG1、Hu002-2、または抗体-薬物複合体（ADC）Hu002-2-BL20-MMAE（下記実施例15で製造された）を含有する無血清培地に置換し、それぞれ2つのウェルを設けた。それぞれ24時間と48時間のタンパク質サンプルを収集した。イムノブロット法によって細胞におけるAXLタンパク質の発現量の変化を検出した。
結果は図16に示すように、PBSまたはhIgG1を投与した後、細胞全体のAXL発現量に顕著な変化がなかったが、Hu002-2またはそのADCを投与した後、LCLC-103H細胞におけるAXLの発現が顕著に下方調節され、抗体またはADCが細胞に結合して取り込まれた後、リソソームにおいて分解されることによると考えられる。
【０１５７】
実施例14  AXL107-vc-MMAE、AXL107-BL20-MMAEの製造
AXLを標的とするヒト化抗体AXL107原液にPBS/EDTA（pH=7.4）緩衝液をその濃度が20 mg/mlになるように入れた後、2.6 eqのTCEPで25℃で2時間還元させ、取り出した後、氷の上に置いて冷却し、精製せずにそのまま6.0 eqのmc-VC-PAB-MMAE（上海皓元化学から購入され、予めDMAに溶解させた）を入れ、0℃で1時間反応させ、システインを入れて反応を停止させた。G25脱塩カラムによって過剰量の小分子を除去し、そして20mM クエン酸-クエン酸ナトリウム/6％ショ糖、pH 6.6の緩衝液に置換し、孔径0.22μmのろ過装置によって除菌し、-80℃で保存したが、得られた抗体複合体をAXL107-vc-MMAEと名付けた。
結果は図17、19、20に示すように、ヒト化抗体AXL107の質量分析グラフ（図19）とその抗体複合体AXL107-vc-MMAEのHICおよび質量分析グラフ（図17、図20）のいずれからも、抗体AXL107がカップリング反応した後、抗体複合体AXL107-vc-MMAEになり、複合体の分子量が予測値に合致し、平均DAR値が約4.0であったことが示された。
AXL107原液を50mM リン酸二水素ナトリウム-リン酸水素二ナトリウム（NaH2PO4-Na2HPO4）/150mM 塩化ナトリウム（NaCl）/2mM エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、pH 7.0の反応緩衝液に置換し、その濃度が10mg/mLになるようにし、10倍過剰量のモル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を入れ、反応液を25℃で4時間撹拌した。G25脱塩カラムによって過剰量のTCEPを除去した後、得られた還元抗体を収集して適量のジエチルアセトアミド（DMA）を入れ、さらに6倍過剰量のモル比の化合物Ic-4（10mg/mlで予めDMAに溶解させたもの）を反応系におけるDMAの体積比が10％以下になるように入れ、20℃で2.0時間撹拌しながらカップリングさせた。脱塩カラムによってカップリング反応混合物をpH 7.5のTris-塩酸/ショ糖ゲルでろ過して精製し、UV280紫外吸収値によってピークサンプルを収集する。その後、孔径0.22μmのろ過装置によって除菌し、-80℃で保存したが、得られた抗体複合体をAXL107-BL20-MMAEと名付けた。
結果は図18、19、21に示すように、ヒト化抗体AXL107の質量分析グラフ（図19）とその抗体複合体AXL107-BL20-MMAEのHICおよび質量分析グラフ（図18、図21）のいずれからも、抗体AXL107がカップリング反応した後、抗体複合体AXL107-BL20-MMAEになり、複合体の分子量が予測値に合致し、DARが約4.0であったことが示された。
【０１５８】
実施例15  mAb002c-vc-MMAE、mAb002c-BL20-MMAE、ヒト化抗体系列Hu002-BL20-MMAEの製造
AXLを標的とするキメラ抗体mAb002c原液にPBS/EDTA（pH=7.4）緩衝液をその濃度が20 mg/mlになるように入れた後、2.6 eqのTCEPで25℃で2時間還元させ、取り出した後、氷の上に置いて冷却し、精製せずにそのまま6.0 eqのmc-VC-PAB-MMAE（上海皓元化学から購入され、予めDMAに溶解させた）を入れ、0℃で1時間反応させ、システインを入れて反応を停止させた。G25脱塩カラムによって過剰量の小分子を除去し、そして20mM クエン酸-クエン酸ナトリウム/6％ショ糖、pH 6.6の緩衝液に置換し、孔径0.22μmのろ過装置によって除菌し、-80℃で保存したが、得られた抗体複合体をmAb002c-vc-MMAEと名付けた。
結果は図22、24、25に示すように、ヒト化抗体mAb002cの質量分析グラフ（図24）とその抗体複合体mAb002c-vc-MMAEのHICおよび質量分析グラフ（図22、図25）のいずれからも、抗体mAb002cがカップリング反応した後、抗体複合体mAb002c-vc-MMAEになり、複合体の分子量が予測値に合致し、平均DAR値が約4.0であったことが示された。
mAb002c原液を50mM リン酸二水素ナトリウム-リン酸水素二ナトリウム（NaH2PO4-Na2HPO4）/150mM 塩化ナトリウム（NaCl）/2mM エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、pH 7.0の反応緩衝液に置換し、その濃度が10mg/mLになるようにし、10倍過剰量のモル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を入れ、反応液を25℃で4時間撹拌した。G25脱塩カラムによって過剰量のTCEPを除去した後、得られた還元抗体を収集して適量のジエチルアセトアミド（DMA）を入れ、さらに6倍過剰量のモル比の化合物Ic-4（10mg/mlで予めDMAに溶解させたもの）を反応系におけるDMAの体積比が10％以下になるように入れ、20℃で2.0時間撹拌しながらカップリングさせた。脱塩カラムによってカップリング反応混合物をpH 7.5のTris-塩酸/ショ糖ゲルでろ過して精製し、UV280紫外吸収値によってピークサンプルを収集する。その後、孔径0.22μmのろ過装置によって除菌し、-80℃で保存したが、得られた抗体複合体をmAb002c-BL20-MMAEと名付けた。
【０１５９】
結果は図23、24、26に示すように、抗体mAb002cの質量分析グラフ（図24）とその抗体複合体mAb002c-BL20-MMAEのHICおよび質量分析グラフ（図23、図26）のいずれからも、抗体mAb002cがカップリング反応した後、抗体複合体mAb002c-BL20-MMAEになり、複合体の分子量が予測値に合致し、DARが約4.0であったことが示された。
ヒト化系列抗体Hu002-BL20-MMAEの製造方法は上記mAb002c-BL20-MMAEの製造方法と同様である。ヒト化抗体Hu002-2-BL20-MMAEを例とすると、結果は図27、28、29に示すように、抗体Hu002-2の質量分析グラフ（図52）とその抗体複合体Hu002-2-BL20-MMAEのHICおよび質量分析グラフ（図27、図28）のいずれからも、抗体Hu002-2がカップリング反応した後、抗体複合体Hu002-2-BL20-MMAEになり、複合体の分子量が予測値に合致し、DARが約4.0であったことが示された。
【０１６０】
実施例16  AXL抗体-薬物複合体（AXL-ADC）のAXL高発現のトリプルネガティブ乳癌細胞、肺癌細胞および脳膠細胞腫細胞に対する体外抗腫瘍活性
本実施例で使用された細胞系は米国培養細胞系統保存機関（ATCC）または中国科学院細胞ライブラリーから購入され、相応する説明に従って培養され、MDA-MB-453、MDA-MB-231、Hs578T、Calu-1、NCI-H1299、LCLC-103H、NCI-H292、NCI-H441、NCI-H2228、NCI-H460、U87MGが含まれる。
細胞増殖試験：対数増殖期にある上記細胞を、それぞれ600〜2500個細胞/ウェルの密度（細胞の増殖速度による）で96ウェル細胞培養プレートに150μL/ウェルで接種し、37℃、5％ CO2で4〜12時間培養した後、それぞれ異なる濃度のAXL-ADCを入れ、各薬物濃度に2〜4個の重複ウェル、および相応する溶媒対照とブランク対照のウェルを設け、5〜6日作用させた後、培養液を捨て、MTS反応液（Promegaから購入、cat# G3581）を100μL/ウェルで入れ、37℃で所定の色の深さになるまで反応させた後、マルチラベルプレートリーダー（BioTek Synergy II）によって各群の細胞活力を測定し（OD490nm）、そして生存率=(OD投与-ODブランク)/(OD対照-ODブランク)×100％という式で細胞生存率を計算した。各増殖試験は独立して3〜4回繰り返した。GraphPad Prism 5ソフトによって上記データを分析し、そしてそれぞれ薬物の異なる細胞株におけるIC50値を計算した。
【０１６１】
実験結果から、本発明のAXL抗体-薬物複合体mAb002c-vc-MMAE、mAb002c-BL20-MMAEは高いAXL標的特異的細胞毒活性を有し、すなわち、AXL低発現のMDA-MB-453細胞には顕著な増殖抑制作用がなかったが（図30）、AXL高発現のトリプルネガティブ乳癌MDA-MB-231（図31）、Hs578T（図32）、肺癌Calu-1（図33）、LCLC-103H（図34）および膠細胞腫U87MG（図35）の細胞のいずれにも強い増殖抑制活性を示し、IC50値が 0.03nM〜0.07nMであった(表-9)ことが示された。そして、本発明の抗体-薬物複合体mAb002c-vc-MMAE、mAb002c-BL20-MMAEはAXL高発現の各腫瘍細胞に対する抑制活性が顕著に対照抗体-薬物複合体AXL107-vc-MMAE、AXL107-BL20-MMAEよりも強かった。
【表１１】
2021530436.tif 000019
【０１６２】
実施例17  ヒト化AXL-ADCの体外抗腫瘍活性
同様に実施例16の検出方法を参照し、本発明のAXLヒト化系列抗体-薬物複合体Hu002-1/2/4/5/7/16-BL20-MMAEは高いAXL標的特異的細胞毒活性を有し、すなわち、AXL低発現のMDA-MB-453細胞には顕著な増殖抑制作用がなかったが、AXL高発現のトリプルネガティブ乳癌MDA-MB-231（図36）、Hs578T（図37）、膠細胞腫U87MG（図38）および肺癌LCLC-103Hおよび（図39）の細胞のいずれにも強い増殖抑制活性を示し、IC50値が 0.013nM〜0.05nMであった(表-10)ことが示された。
【表１２】
2021530436.tif 000020
【０１６３】
実施例18  AXL-ADC体内抗腫瘍活性
それぞれ200μLの5×106個のU87MG、LCLC-103Hを含有する細胞懸濁液を雌免疫欠陥マウス（Balb/c nude、6〜8週齢）の背中の皮下に接種した。腫瘍体積が100〜300 mm3に生長し、かつ顕著な腫瘍生長が観察できるようになったら、腫瘍体積の大きさおよびヌードマウスの体重によってランダムに群分けを行い（n=6〜8）、それぞれ25 mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kgの投与量で、週に1回尾静脈から投与し、計2週間投与した。同時に、hIgG1-BL20-MMAEを陰性対照として設けた。週に2〜3回腫瘍体積およびヌードマウスの体重を測定して記録することによって腫瘍の生長曲線を描いた。実験終了後、実験データを統計して分析し、腫瘍生長曲線およびヌードマウス体重変化曲線を作り、手術によって皮下移植腫を取り出して重量を量り、ここで、腫瘍体積（V）の計算式はV= L x W2/2で、ここで、L、Wはそれぞれ腫瘍の長さ、幅を表す。
【０１６４】
キメラ抗体mAb002c、4つの好適なヒト化抗体Hu002-1、Hu002-2、Hu002-4、Hu002-5をそれぞれvc-MMAEまたはBL20-MMAEとカップリングさせ、同時に既存技術によるAXL107-vc-MMAEと比較して体内抗腫瘍活性を評価した。ヒト化AXL-ADCの製造は実施例15を参照する。
図40に示すように、U87MG腫瘍モデルにおいて、投与量が5mg/kgのmAb002c-BL20-MMAEまたはmAb002c-vc-MMAEは投与期間で抗腫瘍効果が非常顕著で、しかも類似したが、投与停止から3週間後、mAb002c-vc-MMAE群では、すでに腫瘍生長の回復が見られ、その腫瘍抑制効果が顕著にmAb002c-BL20-MMAE群よりも低かったから、BL20-MMAEリンカーが体内においてより優位であることが示された。
図41、図42に示すように、U87MG腫瘍モデルにおいて、投与量が3mg/kgの4つの好適なヒト化AXL-ADCおよびAXL107-vc-MMAEで体内における薬効を検出したところ、いずれも優れた抗腫瘍活性を有し、そして本発明の好適なAXL-ADCはAXL107-vc-MMAEよりも顕著な体内腫瘍治療効果を与えることが観察された。
【０１６５】
以上に記載の3回のU87MG体内薬効試験の結果をまとめて統計した（表-11）。
【表１３】
2021530436.tif 000021
【０１６６】
図43、図44に示すように、LCLC-103H腫瘍モデルにおいて、本発明の4つの好適なAXL-ADCは投与量が3mg/kg、1mg/kgの場合いずれも投与量に依存する治療効果を示し、かつ顕著な腫瘍消退につながり、これによってLCLC-103H腫瘍がAXL-ADCによる治療に高度の感受性を有することが示された。
図45に示すように、LCLC-103H腫瘍の重複試験において、投与量が1mg/kgのHu002-1-BL20-MMAE、Hu002-2-BL20-MMAE、Hu002-5-BL20-MMAE投与した後、いずれも顕著な腫瘍消退につながり、そして中でも、Hu002-2-BL20-MMAEは腫瘍に対する消退効果が最も顕著であった。
【０１６７】
以上に記載の3回のLCLC-103H体内薬効試験の結果をまとめて統計した（表-12）。
【表１４】
2021530436.tif 000022
【０１６８】
図46、表-13に示すように、LCLC-103Hのもう一つの重複試験において、投与量が1mg/kgの Hu002-2-BL20-MMAE、Hu002-5-BL20-MMAEは腫瘍消退を誘導できると再び確認され、その効果が顕著に同投与量のAXL107-vc-MMAEよりも優れた。同時に、0.5mg/kgのHu002-2-BL20-MMAEもある程度の腫瘍抑制効果を有した。
【表１５】
2021530436.tif 000023
【０１６９】
実施例19  ヒト化AXL-ADCの大体積腫瘍に対する消退活性
LCLC-103H肺癌のAXL-ADCに対する高度な感受性に基づき、本実施例では、AXL-ADCの特大体積腫瘍に対する活性を研究した。腫瘍が体積1000〜2000mm3まで生長したら投与して治療し、腫瘍生長に対する抑制または腫瘍消退の状況を観察したが、試験方法は実施例18を参照する。
結果は図47に示すように、LCLC-103H腫瘍は体内で体積が800 mm3に生長したら単回で投与量が5mg/kgのHu002-2-BL20-MMAEを投与し、治療の34日目に腫瘍がすでに完全に消退した。
結果は図48に示すように、同様に、LCLC-103H腫瘍は体内で体積が1800 mm3に生長したら単回で投与量が10mg/kgのHu002-2-BL20-MMAEを投与し、治療の20日目に腫瘍消退率が＞90％になったことが見られた。
【０１７０】
実施例20  ヒト化AXL抗体のマウスAXLおよびカニクイザルAXLに対する結合活性の測定
1．サルAXLの全長タンパク質配列（Genebank ID: XP_014979499.1、894アミノ酸）、マウスAXLの全長タンパク質配列（Genebank ID: NP_033491.2、888アミノ酸）を使用した。具体的なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号39、配列番号40で示された。
2．人工合成されたカニクイザル、マウスの全長遺伝子配列を哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1に構築し、陽性発現ベクタープラスミドを製造した。
3．HEK293T細胞を選択し、密度50％でシャーレに敷いた。37℃で一晩培養した後、そのコンフルエンスが約80％になり、リポソームLipo2000(Invitrogen)で2μgの上記で製造されたサル/マウスAXLベクタープラスミドを一過性形質移入させた。形質移入から24時間後、それぞれタンパク質を収集してイムノブロット（ウエスタンブロット、Western blot）分析に使用し、同時に細胞を収集してFACSによるHu002-2とHEK293T細胞表面のサル/マウスAXLの結合活性の検出に使用した。FACS検出の試験方法は実施例8を参照する。
結果は図49に示すように、AXLヒト化抗体Hu002-2は対照抗体AXL107の作用に類似し、HEK-293T表面のマウスAXLに対する結合能力が劣り、抗体の最高濃度（200nM）でも結合の飽和レベルに達していなかった。
結果は図50に示すように、イムノブロット法によってサルAXLの一過性形質移入効率およびヒト化抗体Hu002-2のそれに対する結合能力が検証された（図50A）。同時に、FACS検出によって、Hu002-2はHEK-293T細胞表面のカニクイザルAXLに優れた結合親和力を有し、EC50が0.135nMであったことが示され（図50B）、この結果によってカニクイザルを臨床前研究モデルに使用してHu002系列抗体の毒性、薬物動態学および毒物動態学を評価する合理性が支持された。
【０１７１】
実施例21  前記抗体、抗体-薬物複合体と既存技術の比較
発明特許出願番号CN201580045131で公開されたAXL107抗体の重鎖、軽鎖の可変領域の配列（VH/VL）から、その重鎖、軽鎖の可変領域を人工合成してヒトIgG1重鎖定常領域およびκ鎖定常領域を含有するベクターにクローニングし、配列決定で間違いがないと確認されたら、FreeStyleTM 293T細胞系において発現および精製してAXL107を得た後、それをAXL107の抗体-薬物複合体にした（実施例14）。AXL107、AXL107-vc-MMAE、AXL107-BL20-MMAEを参照薬物として本発明の研究に加えた。
AXL107-重鎖可変領域（VH）配列番号37
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSTTSGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKIWIAFDIWGQGTMVTV
AXL107-軽鎖可変領域（VL）配列番号38
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPYTFGQGTKLEIK
【０１７２】
比較試験の活性の結果を下記にまとめた。
１、結果は表-3、表-4、表-5、表-7、表-8に示すように、AXL107と比べ、本発明のmAb005cはそれに相当する標的親和力を有するが、mAb002cおよびそのヒト化Hu002系列のいくつかの抗体はより高い腫瘍細胞AXLの親和力を有し、より高い腫瘍抑制活性が期待される。
２、結果は表-9、表-10に示すように、より高い腫瘍細胞親和力から、mAb002c-vc-MMAE、mAb002c-BL20-MMAE、および相応するヒト化Hu002抗体で製造されたAXL-ADCはいずれもより強いAXL標的特異的体外抗腫瘍作用を有する。
３、結果は表-11（図41）、表-13（図46）に示すように、体外における結果に一致し、本発明の好適なヒト化AXL-ADCのいくつかは体内において優れた抗腫瘍効果を有し、その活性が既存技術によるAXL107-vc-MMAEよりも優れた。
４、結果は図23、図26に示すように、mAb002c-BL20-MMAEは既存技術によるAXL107-vc-MMAE(図17、図20)よりも高い物質均一性を有し、単一分布の成分（DAR4）が90％以上を占める。
５、さらなる腫瘍体内薬効試験では、直接BL20-MMAE、vc-MMAリンカーの治療効果を比較した結果、BL20-MMAEがvc-MMAEよりも優れたことが示された（図40、表-11）。
【０１７３】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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