(57)【要約】  本発明は、基準タンパク質からの１又は複数のアミノ酸の置き換えを有するアミノ酸配列を含み、基準タンパク質と比較して、少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する、修飾タンパク質、及び食品産業におけるその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基準タンパク質からの１又は複数のアミノ酸の置き換えを有するアミノ酸配列を含む修飾タンパク質であって、前記修飾タンパク質は、前記基準タンパク質と比較して、少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する、修飾タンパク質。
【請求項２】
前記基準タンパク質からの少なくとも２つのアミノ酸の置き換えを含む、請求項１に記載の修飾タンパク質。
【請求項３】
前記少なくとも２つのアミノ酸の置き換えが、前記基準タンパク質の表面上、又は前記基準タンパク質のコア中に位置する、請求項１又は２に記載の修飾タンパク質。
【請求項４】
基準タンパク質との４０％〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む修飾タンパク質であって、前記修飾タンパク質は、前記基準タンパク質と比較して、少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する、修飾タンパク質。
【請求項５】
前記基準タンパク質と９０％〜９９％の同一性を有する、請求項４に記載の修飾タンパク質。
【請求項６】
Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｕｎｉｔ（ＲＥＵ）で与えられる−１９０よりも低いエネルギーを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項７】
前記少なくとも１つの食品関連特性が、甘味度、甘味動態、マスキング効果、味増強、及び異味のうちの少なくとも１つである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項８】
前記基準タンパク質と比較して少なくとも１．５倍に増加された甘味度閾値を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項９】
前記基準タンパク質と比較して少なくとも６倍に増加された甘味度閾値を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項１０】
前記基準タンパク質と比較して、以下のうちの少なくとも１つ：（１）増加された熱安定性、（２）増加されたｐＨ安定性、（３）増加された溶解性、及び（４）増加された保存寿命安定性、を特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項１１】
前記基準タンパク質と比較して増加された熱安定性を特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項１２】
前記基準タンパク質が、モネリン、ＭＮＥＩ、タウマチン、ミラクリン、クルクリン、ブラゼイン、及びマビンリンから成る群より選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項１３】
前記基準タンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４から成る群より選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項１４】
前記基準タンパク質が、配列番号５に示すタンパク質である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項１５】
配列番号５に示すアミノ酸配列を含み、配列番号５の残基Ｅ２、Ｅ２３、及びＹ６５に少なくとも３つのアミノ酸置換を有する修飾タンパク質であって、前記修飾タンパク質は、配列番号５と比較して改善された甘味度を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項１６】
前記少なくとも３つのアミノ酸置換のうちの少なくとも１つが、Ｅ２Ｎ、Ｅ２Ｄ、Ｅ２Ｑ、Ｅ２Ｒ、Ｅ２Ｋ、Ｅ２３Ｎ、Ｅ２３Ｄ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｒ、Ｅ２３Ｋ、Ｙ６５Ｆ、Ｙ６５Ｗ、Ｙ６５Ｈ、Ｙ６５Ｖ、Ｙ６５Ｉ、Ｙ６５Ｌ、Ｙ６５Ｍ、Ｙ６５Ｃ、Ｙ６５Ａ、Ｙ６５Ｔ、Ｙ６５Ｓ、Ｙ６５Ｐ、Ｙ６５Ｇ、Ｙ６５Ｋ、及びＹ６５Ｒから成る群より選択される、請求項１５に記載の修飾タンパク質。
【請求項１７】
前記少なくとも３つのアミノ酸置換のうちの少なくとも１つが、Ｅ２Ｎ、Ｅ２３Ｖ、Ｅ２３Ａ、Ｙ６５Ｋ、及びＹ６５Ｒから成る群より選択される、請求項１５に記載の修飾タンパク質。
【請求項１８】
配列番号１６及び配列番号１７に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項１９】
配列番号５に示すアミノ酸配列を含み、配列番号５の残基Ｅ２、Ｅ２３、及びＹ６５に少なくとも３つのアミノ酸置換を含む修飾タンパク質であって、前記修飾タンパク質は、配列番号５と比較して、少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する、修飾タンパク質。
【請求項２０】
ＲＥＵで与えられる−１９０からＲＥＵで与えられる約−２０４．６のエネルギーを有する、請求項１９に記載の修飾タンパク質。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの食品関連特性が、甘味度、甘味動態、マスキング効果、味増強、又は異味のうちの少なくとも１つである、請求項１９又は２０に記載の修飾タンパク質。
【請求項２２】
前記基準タンパク質と比較して少なくとも２倍に増加された甘味度閾値を有する、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項２３】
前記基準タンパク質と比較して増加された熱構造安定性を特徴とする、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項２４】
前記少なくとも３つのアミノ酸置換のうちの少なくとも１つが、Ｅ２Ｎ、Ｅ２Ｄ、Ｅ２Ｑ、Ｅ２Ｒ、Ｅ２Ｋ、Ｅ２３Ｎ、Ｅ２３Ｄ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｒ、Ｅ２３Ｋ、Ｙ６５Ｆ、Ｙ６５Ｗ、Ｙ６５Ｈ、Ｙ６５Ｖ、Ｙ６５Ｉ、Ｙ６５Ｌ、Ｙ６５Ｍ、Ｙ６５Ｃ、Ｙ６５Ａ、Ｙ６５Ｔ、Ｙ６５Ｓ、Ｙ６５Ｐ、Ｙ６５Ｇ、Ｙ６５Ｋ、及びＹ６５Ｒから成る群より選択される、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項２５】
前記少なくとも３つのアミノ酸置換のうちの少なくとも１つが、Ｅ２Ｎ、Ｅ２３Ｖ、Ｅ２３Ａ、Ｙ６５Ｋ、及びＹ６５Ｒから成る群より選択される、請求項２４に記載の修飾タンパク質。
【請求項２６】
配列番号１６及び配列番号１７に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項２７】
経口送達用の製品の製造に用いるための、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項２８】
前記製品が、食品製品、補助食品製品、又は医薬品である、請求項２７に記載の修飾タンパク質。
【請求項２９】
風味調整剤又は風味増強剤として用いるための、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項３０】
甘味剤として用いるための、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の修飾タンパク質。
【請求項３１】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の修飾タンパク質を含む食品製品。
【請求項３２】
少なくとも１つの食品成分を含む、請求項３１に記載の食品製品。
【請求項３３】
前記食品成分が、人工風味剤、食品添加物、食用色素、保存剤、又は糖添加物のうちの少なくとも１つである、請求項３２に記載の食品製品。
【請求項３４】
前記食品成分が、ステビアである、請求項３２に記載の食品製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、味及び風味タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
本開示の主題に対する背景として関連すると見なされる参考文献を以下に列挙する。
英国特許第２１２３６７２号
国際公開第８４０２４５０号
Leone, S. et al. Sweeter and stronger: enhancing sweetness and stability of the single chain monellin MNEI through molecular design. Sci. Rep. 6, 34045; doi: 10.1038/srep34045 (2016)
Masuda, T. et al. A Hypersweet Protein: Removal of The Specific Negative Charge at Asp21 Enhances Thaumatin Sweetness. Sci. Rep. 6, 20255; doi: 10.1038/srep20255 (2016)
Samish I.,S, MacDermaid CM.,S, Perez-Aguilar JMP., Saven JG.PI, (2011). Theoretical and Computational Protein Design. Annu Rev Phys Chem 62:129-149
Samish I., (Editor), Computational Protein Design (2017), Methods in Molecular Biology, Springer Protocols, Humana Press.
Zhao, Meng & Xu, Xiangqun & Liu, Bo. (2018). Structure basis of the improved sweetness and thermostability of a unique double-sites single-chain sweet-tasting protein monellin (MNEI) mutant. Biochimie. 154;
Zheng W., et al. (2018) Expression, purification and characterization of a novel double-sites mutant of the single-chain sweet-tasting protein monellin (MNEI) with both improved sweetness and stability. Protein Expr Purif., 143:52-56.
Pica A., et al (2018) pH driven fibrillar aggregation of the super-sweet protein Y65R-MNEI: A step-by-step structural analysis. Biochim Biophys Acta Gen Subj., 1862:808-815.
【０００３】
甘味市場は、糖及び高フルクトースシロップが独占しており、人工甘味剤、並びにステビア及びラカンカの抽出物を例とする天然源由来の甘味剤を含む他の甘味剤が占める市場のシェアは１０％未満である。
【０００４】
英国特許第２１２３６７２号には、様々な飲料、口内洗浄剤に、又は医薬品ベースに、所望に応じて食用酸又は増量剤と一緒に組み込まれた、タウマチン及びモネリンなどの甘味タンパク質、並びに弱酸性ポリサッカリドガムについて記載されている。
【０００５】
国際公開第８４０２４５０号には、ガムベース、甘味剤、及び風味剤を含むチューイングガム組成物の表面へのタウマチン又はモネリンの適用について記載されている。
【０００６】
Leone, S. et al.、Zhao et al.、Zheng W., et al.、及びPica A., et alには、ＭＮＥＩの変異体について記載されている。
【０００７】
Masuda, T. et al.には、超甘味タウマチン誘導体が記載されている。
【０００８】
Samish I.,S., et al (2011)及び(2017)に記載されているように、タンパク質の設計のための計算機ツールが、改善された特定の特徴を有するタンパク質を設計する際の代替的な信頼性の高い方法として登場した。
【発明の概要】
【０００９】
いくつかの態様によると、本開示は、基準タンパク質からの１又は複数のアミノ酸の置き換えを有するアミノ酸配列を含む修飾タンパク質を提供し、修飾タンパク質は、基準タンパク質と比較して、少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する。いくつかの実施形態によると、修飾タンパク質は、基準タンパク質からの少なくとも２つのアミノ酸の置き換えを含む。
【００１０】
いくつかの態様によると、本開示は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含み、配列番号５の残基Ｅ２、Ｅ２３、及びＹ６５に少なくとも３つのアミノ酸置換を含む修飾タンパク質を提供し、修飾タンパク質は、配列番号５と比較して、少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する。
【００１１】
いくつかの態様によると、本開示は、基準タンパク質からの１又は複数のアミノ酸の置き換えを有するアミノ酸配列を含む修飾タンパク質を含む食品製品を提供し、修飾タンパク質は、基準タンパク質と比較して、少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する。いくつかの実施形態によると、修飾タンパク質は、基準タンパク質からの少なくとも２つのアミノ酸の置き換えを含む。
【００１２】
いくつかの態様によると、本開示は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含み、配列番号５の残基Ｅ２、Ｅ２３、及びＹ６５に少なくとも３つのアミノ酸置換を含む修飾タンパク質を含む修飾タンパク質を含む食品製品を提供し、修飾タンパク質は、配列番号５と比較して、少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する。
【００１３】
本明細書で開示される主題をより良く理解するために、及びそれを実際に行うことができる方法を例示するために、実施形態を、単なる限定されない例として、添付の図面を参照しながら以降で記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＭＮＥＩ及びＭＮＥＩベース修飾タンパク質の甘味平均スコアを示すヒストグラムである。
【図２】図２は、ＭＮＥＩ及びＭＮＥＩベース修飾タンパク質の甘味平均スコアを示すヒストグラムである。
【図３】図３は、ピキア（pichia）株での発現実験のアクリルアミドゲルである。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、ＴＡＳ１Ｒ２及びＴＡＳ１Ｒ３にドッキングするタウマチンの３つの受容体結合部位の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
人工低カロリー甘味剤は、市販されており、一部は、副作用があることが知られている。例えば、サッカリンは、カロリー又は炭水化物なしで食品及び飲料を甘くするために広く用いられてきたが、その使用は、膀胱癌の発症と関連付けられた。したがって、一方では最適な感覚プロファイルを提供し、他方では食品製品及び飲料での使用に適している、現在入手可能である人工低カロリー甘味剤の考え得る代替品が求められている。
【００１６】
本開示は、新規な甘味タンパク質及び新規な味調整タンパク質に関し、既知の甘味剤に対して改善された特性を呈する新規なタンパク質が得られる結果となる最適化法、例えば計算機による方法に基づいている。
【００１７】
驚くべきことに、本発明者らは、既知のタンパク質（本明細書において、「基準タンパク質」と称する）のアミノ酸配列に様々な特定の置換を導入することによって、基準タンパク質と比較して少なくとも１つの改善された特性を有する新規なタンパク質が得られる結果となることを見出した。新規なタンパク質の少なくとも１つの改善された特性が、食品及び飲料用途での修飾タンパク質の適格性及び利用において非常に重要であり得ることが示唆された。
【００１８】
具体的には、以下の実施例に示されるように、新規なタンパク質（本明細書において、「修飾タンパク質」又は「改造タンパク質」と称する）は、それらの基準タンパク質と比較して、改善された感覚プロファイル及び／又は熱安定性を呈した。本明細書で述べる感覚プロファイルは、味覚プロファイル（例：甘味度、後味、及び残味（lingering））に関する。
【００１９】
したがって、本開示は、その最も広い態様において、基準タンパク質のアミノ酸配列に少なくとも１つのアミノ酸の置き換え（置換）を有するアミノ酸配列を含む修飾タンパク質に関し、修飾タンパク質は、基準タンパク質と比較して、少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質のアミノ酸配列に少なくとも２つのアミノ酸の置き換え（置換）を、場合によっては３つのアミノ酸の置き換え（置換）を有するアミノ酸配列を含む修飾タンパク質。
【００２１】
少なくとも１つの改善された食品関連特性は、修飾タンパク質を食品及び飲料用途において適格なものとすることができる特性を包含し、風味、テクスチャ、味、甘味閾値、甘味レベル、甘味プロファイル、感覚プロファイル、甘味動態（sweetness kinetics）、安定性（構造及び機能）、耐熱性、食品マトリクスへの適合性、保存寿命、他の風味のマスキング及び／又は増強、異味、味の開始、残味、味の丸み、又は糖様の味などである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの食品関連特性は、感覚に影響を与える特性である。「感覚に影響を与える特性」の用語は、本明細書で用いられる場合、例えば味覚によって特定される、感覚的印象の変化を意味する。感覚に影響を与える特性としては、例えば、甘味度（糖様の風味）などの甘味プロファイル、甘味動態（開始時間、残味時間、味継続時間）、異味がないこと、及び他の味のマスキング又は増強、異味（例：金属味）が挙げられる。例えば、改善された特性は、甘味の増加、開始時間の短縮、又は残味の減少と関連する。
【００２３】
少なくとも１つの特性が感覚に影響を与える特性であるいくつかの実施形態によると、修飾タンパク質は、代替糖と見なすことができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの食品関連特性は、甘味度、開始時間の短縮、又は残味の減少のうちの少なくとも１つである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの食品関連特性は、安定性である。いくつかの実施形態では、安定性は、熱安定性、より長い保存寿命、低ｐＨに対する安定性、塩濃度安定性、イオン強度安定性、又は脂肪含有若しくはタンパク質含有マトリックス中での安定性のうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの食品関連特性は、熱安定性である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの食品関連特性は、増加された保存寿命安定性である。例えば、修飾タンパク質は、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、及びさらには１年間にわたって安定であり得る。
【００２６】
上記で詳細に述べたように、修飾タンパク質は、少なくとも１つの追加の食品成分と組み合わせて用いられ得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの食品関連特性は、修飾タンパク質と少なくとも１つの食品成分との間の相乗効果に関し得る。食品成分の限定されない例としては、人工若しくは天然の風味剤、食品添加物、食用色素、保存剤、又は追加の糖添加物が挙げられる。食品成分は、味マスキング効果又は味増強効果を有し得る。
【００２７】
本明細書で述べるように、基準タンパク質は、味調整タンパク質、及び／又は味増強タンパク質、及び／又は味タンパク質、特には甘味タンパク質である。味調整タンパク質は、水及び酸味物質を例とする甘くない物質に甘味を誘発する。本明細書で用いられる場合、味タンパク質は、味受容体と結合して味覚を引き起こすことが知られている。本明細書で用いられる場合、甘味タンパク質は、甘味受容体と結合して甘味の知覚を引き起こすことが知られている。甘味受容体の限定されない例としては、Ｉ型味受容体メンバー１（ＴＡＳ１Ｒ１、ヒト遺伝子のためのＵｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ：ＴＳ１Ｒ１＿ＨＵＭＡＮ）、Ｉ型味受容体メンバー２（ＴＡＳ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ２、ＴＲ２、ＵｎｉＰｒｏｔ−Ｑ８ＴＥ２３）、Ｉ型味受容体メンバー３（ＴＡＳ１Ｒ３、Ｔ１Ｒ３、ＵｎｉＰｒｏｔ−Ｑ７ＲＴＸ０）が挙げられる。
【００２８】
基準タンパク質は、様々な長さであってよい。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、少なくとも４５のアミノ酸、少なくとも８０のアミノ酸、少なくとも１００のアミノ酸、少なくとも２５８のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、４５アミノ酸、５０アミノ酸、５４アミノ酸、９７アミノ酸、１００アミノ酸、１５８アミノ酸、２２０アミノ酸、２３５アミノ酸、２５８アミノ酸の長さを有する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、天然のタンパク質である。いくつかの他の実施形態では、基準タンパク質は、熱帯植物などの植物に見られる。植物の限定されない例としては、カッパリス・マサイカイ（capparis masaikai）、オウブリ（oubli）、セレンディピティベリー、カテンフェ（katemfe）、ミラクルフルーツベリー、又はレンバ（lemba）のうちの少なくとも１つが挙げられる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、基準甘味タンパク質は、タウマチン、モネリン、ミラクリン、クルクリン、ブラゼイン、及びマビンリンから成る群より選択される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、基準甘味タンパク質は、タウマチンである。
【００３２】
いくつかの実施形態では、基準甘味タンパク質は、モネリンである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、タウマチン−１（ＧｅｎＢａｎｋエントリー番号Ｐ０２８８３；配列番号１）である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、タウマチン−２（ＧｅｎＢａｎｋエントリー番号Ｐ０２８８４；配列番号２）である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、Ａ鎖（ＧｅｎＢａｎｋエントリー番号Ｐ０２８８１；配列番号３）とＢ鎖（ＧｅｎＢａｎｋエントリー番号Ｐ０２８８２；配列番号４）とから成るモネリンである。
【００３５】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、ミラクリン（ＧｅｎＢａｎｋエントリー番号Ｐ１３０８７；配列番号６）である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、クルクリン−１  ＧｅｎＢａｎｋエントリー番号Ｐ１９６６７；配列番号７）、又はクルクリン−２（ＧｅｎＢａｎｋエントリー番号Ｑ６Ｆ４９５；配列番号８）である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、ブラゼイン（デフェンシン様タンパク質としても知られる）（ＧｅｎＢａｎｋエントリー番号Ｐ５６５５２；配列番号９）である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、マビンリンＩ／甘味タンパク質マビンリン−１（ＧｅｎＢａｎｋエントリー番号Ｐ８０３５１；配列番号１０）、マビンリンＩＩ（甘味タンパク質マビンリン−２としても知られる）（ＧｅｎＢａｎｋエントリー番号Ｐ３０２３３；配列番号１１）、マビンリンＩＩＩ（甘味タンパク質マビンリン−３としても知られる）（ＧｅｎＢａｎｋエントリー番号Ｐ８０３５２；配列番号１２）、マビンリンＩＶ（甘味タンパク質マビンリン−４としても知られる）（ＧｅｎＢａｎｋエントリー番号Ｐ８０３５３；配列番号１３）、又はマビンリン−１  Ａ鎖（ＧｅｎＢａｎｋエントリー番号Ｂ９ＳＡ３５；配列番号１４）である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、自然には見られない配列であり、したがって、人工タンパク質又は合成タンパク質又は遺伝子操作タンパク質と称される。合成タンパク質は、天然タンパク質のアミノ酸配列の全体又は一部（タンパク質のポリペプチド鎖のすべて又は一部）、又はその一部を含んでいてよい。例えば、基準タンパク質は、天然タンパク質に対応する単一のポリペプチド鎖が得られる結果となる天然タンパク質の結合修飾を含んでいてよく、それによって、野生型タンパク質の少なくとも２つのポリペプチド鎖が、他のアミノ酸によって共有結合される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、ＭＮＥＩとして知られる修飾モネリンタンパク質である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、単鎖モネリン（ＭＮＥＩ）タンパク質（配列番号５）である。
【００４２】
新規な修飾タンパク質は、様々な方法によって設計することができる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、タンパク質の設計は、計算機ツールを用いることによって、又は専門家のタンパク質設計及び構造生物学的方法によって行われ、例えば、以下でさらに記載するように、部位特異的変異誘発、タンパク質遺伝子操作、又は定向進化である。本発明者らは、基準風味タンパク質の配列データ、基準風味タンパク質の構造データ、並びに／又は基準風味タンパク質と配列及び／若しくは構造の特徴に基準風味タンパク質に対する局所的な又は全体的な類似性を有する他の風味タンパク質との進化データ、に基づく計算方法を開発した。開発し、本明細書で適用した計算機による方法の能力により、本発明者らは、エネルギー的に有利であり、したがって改善された熱安定性、ハロゲン安定性、ｐＨ安定性、保存寿命、フォールディング、及び溶解性の特徴を有することが予測される特定のアミノ酸置換を有するタンパク質を設計することができた。具体的には、計算機によるタンパク質設計（ＣＰＤ）を適用して、必ずしも受容体に対する官能性結合部位ではない基準タンパク質の構造及び／又は配列内の特定の部位にフォーカスした。加えて、ＣＰＤの使用により、本発明者らは、必要とされる改善された特徴に適合する所与のセットのアミノ酸に置換を限定することが可能となった。所与のセットのアミノ酸は、入力データ、すなわち、ＣＰＤに掛けられるタンパク質の領域、及び出力データ、すなわち、得られる修飾タンパク質に存在可能とされるアミノ酸の位置及び種類の両方である。
【００４４】
例えば、ＣＰＤを用いることにより、「非理想」アミノ酸（疎水性コア内の親水性アミノ酸又は外部表面領域中の疎水性アミノ酸など）を、「理想」アミノ酸（外部表面領域中の親水性アミノ酸及び疎水性コア内の疎水性アミノ酸など）に置き換えることが可能である。
【００４５】
理論に束縛されるものではないが、外部表面領域中の疎水性アミノ酸を外部表面領域中の親水性アミノ酸に置換することが、口腔との非特異的な結合を低減し、残留する後味感を減少させることが本発明者らによって示唆された。
【００４６】
本明細書において開発された方法は、タンパク質構造の全体としてのエネルギーを低下させることになるアミノ酸置換を例とする「安定化置換」を捜すことを含む。全体としてのエネルギーは、本技術分野で公知のアルゴリズムの適用によって算出することができる。そのようなアルゴリズムの限定されない例としては、Ｒｏｓｅｔｔａ、ＯＳＰＲＥＹ（M. Hallen, J. Martin, et al., Journal of Computational Chemistry 2018; 39(30): 2494-2507  又はＥｎＣｏＭ（Frappier V, Chartier M, Najmanovich RJ. Nucleic Acids Res. 2015; 43(W1): W395-400）が挙げられる。これらのＣＰＤ法では、進化的配列及び構造的コンセンサス（structural consensus）、常温及び高温分子動力学（ＭＤ）、相関変異解析（ＣＭＡ）、目視検査、さらにはキャビティの分析、疎水性パッチ、満たされていない水素結合（unsatisfied hydrogen bonds）などの直交法のアレイによってフォーカスとフィルタリングを行う。
【００４７】
アミノ酸置換は、以下の考慮に基づいている：（ａ）表面静電ポテンシャル及び表面の疎水性パッチ（がないこと）、（ｂ）タンパク質の等電点（ｐＩ）を特定の範囲内に維持すること、（ｃ）タンパク質内キャビティの分析、（ｄ）高温動力学における相関変異解析、基準振動解析、及び根平均二乗揺らぎ（ＲＭＳＦ）を含む動的安定性、（ｅ）置換のエネルギー特性のエンタルピー及び／又はエントロピー成分、（ｆ）特定の置換の視覚化、（ｇ）関連するタンパク質のファミリー中で許容されるアミノ酸の種類；キュレーションされた多重整列（curated multiple sequence alignment）（ＭＳＡ）の進化的保存解析によって反映、（ｈ）低擬似エネルギーＣＰＤ計算に反映される置換の頻度。
【００４８】
計算機による方法は、以下の工程の１又は複数を含む。
【００４９】
（１）多重整列（ＭＳＡ）．この工程では、ターゲットの基準タンパク質に対する類似性を有する配列及び／又はタンパク質が公共のデータベースで検索される。この検索に基づいて、多重整列（ＭＳＡ）が行われ、保存率が算出される。それに基づいて、行われるべきＣＰＤのレベルに関する判断が成される。非保存位置では、すべてのアミノ酸（システインを含んでも又は含まなくても）がＣＰＤ時に許容されるが、より保存された位置については、ＣＰＤは、見出された特性に類似の特性（例：電荷、サイズなど）を有する残基に限定される。この工程は、物理的知識及び保存データに基づいて、置換を各置換位置に限定することを含む。
【００５０】
（２）タンパク質機能解析．この工程では、既知の影響（活性、構造、結合などに対する）を有する置換のデータベースが、これまでの知識を用いて構築される。安定性及び／又は機能を妨害することがこれまでの知識に基づいて既知である置換、さらには隣接する位置（例：これらの位置から０．５〜１ｎｍの距離）は、ＣＰＤ時に制限され、置換されない。
【００５１】
（３）ＣＰＤ．この工程は、ＲＯＳＥＴＴＡ、ＯＳＰＲＥＹ、ＳＣＷＲＬなどの指定のソフトウェアによって行われる。確定的ＣＰＤが行われる前に、基準タンパク質の３Ｄ構造／モデルのエネルギーが最小化される。各基準タンパク質について、複数のモデルが考慮される。
【００５２】
（４）選択：最も低いエネルギーを有するタンパク質のモデルが集められる。ＭＳＡをこれらのモデルに対して計算機で計算し、保存配列が決定される。生化学的及び生物物理的な予備知識に基づいて、置換のサブセットが選択される。これらのサブセットは、ＣＰＤ時に高い頻度で出現する１又は複数の位置での置き換えを表している。各サブセットは、次に、タンパク質の３Ｄ構造上でモデル化され、エネルギーが最小化される。次に、最もエネルギーの低いサブセットが、さらなる計算機による及び実験による確認のために選択される。
【００５３】
ＣＰＤに用いられる考慮事項のうちの１つは、受容体結合部位、並びに結合領域及びその近傍のアミノ酸を置換するかどうかの決定である。味受容体に対する結合において重要であるタンパク質中のアミノ酸残基の決定は、一般的に、様々なアミノ酸の単一点置換によって行われ得る。本明細書の実施例において詳述するように、本発明者らは、味受容体の推定結合部位を同定するために、計算機による解析を用いた。本発明者らは、基準タンパク質及び修飾タンパク質と結合する味受容体中のいくつかの新規な結合部位を識別した。
【００５４】
修飾タンパク質は、基準タンパク質（アミノ酸配列）に基づいており、このため、修飾タンパク質に関して本明細書で述べるいずれの特徴／特性／特性決定も、対応する基準タンパク質と比較して提供されることには留意されたい。
【００５５】
本明細書で述べるように、修飾タンパク質は、基準タンパク質（基準アミノ酸配列）と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準タンパク質（基準アミノ酸配列）と比較して、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８のアミノ酸置換を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準タンパク質（基準アミノ酸配列）と比較して、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８のアミノ酸置換を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準タンパク質（基準アミノ酸配列）と比較して、１〜２０のアミノ酸置換を含み、場合によっては２〜１０のアミノ酸置換、場合によっては３〜１０のアミノ酸置換、場合によっては３〜６のアミノ酸置換を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４から成る群より選択される基準タンパク質（基準アミノ酸配列）と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８のアミノ酸置換を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号５に示す基準タンパク質と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８のアミノ酸置換を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号５に示す基準タンパク質と比較して、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８のアミノ酸置換を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号１に示す基準タンパク質と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８のアミノ酸置換を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号１に示す基準タンパク質と比較して、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８のアミノ酸置換を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質のアミノ酸配列に対して４０％〜９９％の同一性であるアミノ酸配列を含む修飾タンパク質。いくつかの実施形態では、基準アミノ酸配列に対して９０％〜９９％の同一性であるアミノ酸配列を含む修飾タンパク質。
【００６５】
いくつかの実施形態では、基準アミノ酸配列に対して６０％〜９０％の同一性であるアミノ酸配列を含む修飾タンパク質。いくつかの実施形態では、基準アミノ酸配列に対して７０％〜９０％の同一性であるアミノ酸配列を含む修飾タンパク質。
【００６６】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４から成る群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４から成る群より選択されるアミノ酸配列と、６０％〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４から成る群より選択されるアミノ酸配列と、９０％〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列と、９０％〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列と、８０％〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７３】
２つ以上のアミノ酸配列間での同一性％は、最大の対応で比較及び整列された場合のその２つ以上の配列に対して決定される。本開示の文脈において、同一性％を有するとして本明細書に記載される配列（アミノ酸）は、同一性が算出された対象である基準配列と同じ機能／活性を有するものと見なされる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質のアミノ酸配列に対して４０％〜９９％の類似性であるアミノ酸配列を含む修飾タンパク質。いくつかの実施形態では、基準アミノ酸配列に対して９０％〜９９％類似しているアミノ酸配列を含む修飾タンパク質。
【００７５】
いくつかの実施形態では、基準アミノ酸配列に対して６０％〜９０％類似しているアミノ酸配列を含む修飾タンパク質。いくつかの実施形態では、基準アミノ酸配列に対して７０％〜９０％類似しているアミノ酸配列を含む修飾タンパク質。
【００７６】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４から成る群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４から成る群より選択されるアミノ酸配列と、６０％〜９９％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４から成る群より選択されるアミノ酸配列と、９０％〜９９％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列と、９０％〜９９％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列と、８０％〜９９％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８３】
本明細書で用いられる場合、配列類似性又は配列相同性は、ロイシンとイソロイシンとを例とする、類似の物理化学的特性を有する保存されたアミノ酸の量（％）を意味する。
【００８４】
配列同一性の決定において、ギャップはカウントされず、配列同一性は、２つのうちの短い方の配列に対するものである。これに関連して、基準タンパク質（アミノ酸配列）の長さが、修飾タンパク質（アミノ酸配列）と同じであってよく、又は修飾タンパク質（アミノ酸配列）と異なっていてもよいことには留意されたい。
【００８５】
「アミノ酸配列」及び／又は「ポリペプチド鎖」の用語は、アミノ酸配列又はポリペプチド鎖を有するタンパク質を表すために用いられる。このため、「基準タンパク質」の用語は、「基準アミノ酸配列」の用語と同等であり、「修飾タンパク質」の用語は、「修飾アミノ酸配列」の用語と同等である。「アミノ酸配列」及び／又は「ポリペプチド鎖」の用語は、３Ｄ構造を有する配列並びに３Ｄ構造を有しない配列を包含することには留意されたい。
【００８６】
計算機による最適化プロセスの一部として、修飾タンパク質は、計算機による生物情報学的解析又は構造的生物学的解析後のアミノ酸配列の大量の出力集団から、エネルギー的考慮に基づいて選択されてよく、すなわち、エネルギーの低い配列が選択されてよい。
【００８７】
エネルギーの計算は、アミノ酸配列全体に対して適用されてよく、又は別の選択肢として、アミノ酸全体の中の異なる領域若しくは選択されたアミノ酸に限定されてもよい。後者の場合（異なる領域又は選択されたアミノ酸）、その情報は、タンパク質全体に対する測定量を得るために、一体化されてよい。
【００８８】
アミノ酸配列（例：修飾タンパク質）の各々の計算は、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｕｎｉｔ（ＲＥＵ）を用いることなどによって、物理学に基づいたポテンシャル及び統計学に基づいたポテンシャルを組み合わせることによって行われてよい。Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｕｎｉｔ（ＲＥＵ）は、タンパク質構造の計算機によるモデル化及び解析のためのアルゴリズムパケージであるＲｏｓｅｔｔａソフトウェアのアルゴリズムである。Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェアは、新しいタンパク質設計、酵素設計、リガンドドッキング、並びに生物学的高分子及び高分子複合体の構造予測を含む、計算生物学における著しい科学的進歩を可能とするものである。Ｒｏｓｅｔｔａエネルギー関数は、実際のいずれの物理的エネルギーユニットとも適合しない物理学及び統計学に基づいたポテンシャルの組み合わせである。Ｒｏｓｅｔｔａエネルギーは、任意スケールであり、ＲＥＵ（「Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｕｎｉｔ」に応じて）と称される場合がある。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＲＥＵは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むタンパク質配列全体に対して算出されてよい。いくつかの他の実施形態では、ＲＥＵは、タンパク質配列全体の、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む少なくとも１つの領域に対して算出されてよい。いくつかの他の実施形態では、ＲＥＵは、タンパク質配列全体における少なくとも１つのアミノ酸置換に対して算出されてよい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−１９０よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる約−１９０のエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる約−１９５のエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−１９５よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−１９６よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−１９７よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−１９８よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる約−１９８のエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−１９８．４よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−２００よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−２０６．４よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−２１０よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−２１４．６よりも低いエネルギーを有する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−２７０．１１よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−３００よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−３５０よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−４００よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−４１０よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−４１８よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−４２０よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−４３０よりも低いエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−４３３よりも低いエネルギーを有する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−１９０からＲＥＵで与えられる約−２１４．６のエネルギーを有する。いくつかの他の実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−１９５からＲＥＵで与えられる約−２１４．６のエネルギーを有する。いくつかの他の実施形態では、修飾タンパク質は、ＲＥＵで与えられる−１９７からＲＥＵで与えられる約−２１４．６のエネルギーを有する。
【００９３】
本明細書で述べるように、修飾タンパク質は、タンパク質の様々な領域でのアミノ酸置換の結果であり得る。「タンパク質の領域」とは、本明細書で用いられる場合、タンパク質配列（アミノ酸配列）又はタンパク質構造の一部であるアミノ酸配列又は構造モチーフを意味する。タンパク質領域の限定されない例としては、タンパク質表面、タンパク質コア、タンパク質ループ領域、二次構造キャップ領域、ジスルフィド領域、結合部位領域、リンカー領域、疎水性パッチ領域、又はタンパク質疎水性領域が挙げられる。
【００９４】
基準タンパク質中のアミノ酸置換は、特定のタンパク質領域又は配列に限定されない。アミノ酸置換を含み得る基準タンパク質の領域は、基準タンパク質表面、基準タンパク質疎水性コア、又はループ領域、二次構造のエッジ（二次構造キャップ領域とも称される）、ジスルフィド領域、結合部位領域、リンカー領域、疎水性パッチ領域と称される基準タンパク質領域が挙げられ得る。
【００９５】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、基準タンパク質構造及び／又は配列の中の限られた領域内で置換されてよい。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、表面領域で置換されてよい。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、コア領域で置換されてよい。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、ジスルフィド結合が置換されてよい。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、ループ領域で置換されてよい。いくつかの実施形態では、２つ以上のアミノ酸の置き換えが、基準タンパク質の表面上に位置している。
【００９６】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、基準タンパク質の受容体に対する予測される又は既知の結合部位に隣接する領域ではない限られた領域で置換されてよい。この文脈において、「隣接する」とは、結合面から４〜７Åであることを意味し得る。
【００９７】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、基準タンパク質構造及び／又は配列の中の異なる領域で置換されてよい。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、少なくとも表面領域、コア領域、ジスルフィド結合の領域、又はループ領域、及びこれらのいずれかの組み合わせで置換されてよい。
【００９８】
タンパク質表面領域とは、本明細書で用いられる場合、溶媒に対して部分的に又は完全に露出した領域である（ＳＡＳＡ−溶媒露出表面積）。タンパク質コア領域とは、本明細書で用いられる場合、アミノ酸に対してＳＡＳＡ（溶媒露出表面積）が５０％未満、内部コアの場合は２０％未満である、溶媒に対して露出していない領域である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準アミノ酸配列の表面領域と比較して、表面領域において１０％〜９９％、場合によって２０％〜９９％、場合によって３０％〜９９％、場合によって４０％〜９９％、場合によって５０％〜９０％、場合によって４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準アミノ酸配列の表面領域と比較して、表面領域において１０％〜９９％、場合によって２０％〜９９％、場合によって３０％〜９９％、場合によって４０％〜９９％、場合によって５０％〜９０％、場合によって４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準アミノ酸配列の疎水性コア（疎水性パッチ）領域と比較して、疎水性コア（疎水性パッチ）領域において１０％〜９９％、場合によって２０％〜９９％、場合によって３０％〜９９％、場合によって４０％〜９９％、場合によって５０％〜９０％、場合によって４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準アミノ酸配列の疎水性コア（疎水性パッチ）領域と比較して、疎水性コア（疎水性パッチ）領域において１０％〜９９％、場合によって２０％〜９９％、場合によって３０％〜９９％、場合によって４０％〜９９％、場合によって５０％〜９０％、場合によって４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準アミノ酸配列の表面領域と比較して、表面領域において３〜４０のアミノ酸置換、４〜３０、５〜３０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準アミノ酸配列の表面領域と比較して、表面領域において少なくとも１、２、３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、又は３０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準アミノ酸配列のコア領域と比較して、コア領域において２０％、３０％、５０％、８０％、９０％、９５％、９８％の同一性であるアミノ酸配列を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準アミノ酸配列のコア領域と比較して、コア領域において２０％、３０％、５０％、８０％、９０％、９５％、９８％の類似性であるアミノ酸配列を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準アミノ酸配列のコア領域と比較して、コア領域において１〜５のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準アミノ酸配列中の受容体と結合する領域と比較して、受容体と結合する領域（受容体結合部位）において９０％、９５％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準アミノ酸配列中の受容体結合部位と比較して、受容体結合部位において９０％、９５％、９９％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質の受容体結合部位は、修飾タンパク質において置換されていない。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、ジスルフィド結合の少なくとも１つが除去され、それらの周辺領域は、除去されたジスルフィド結合の各々の周辺で８〜２０の置換によって再設計される。
【０１１２】
アミノ酸は、本明細書において、それらの一般的に知られている三文字表記によって、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）が推奨する一文字表記によって言及され得る。アミノ酸置換（置き換え）とは、本明細書で用いられる場合、あるアミノ酸から異なるアミノ酸への変化を意味する。これは、典型的には、基準アミノ酸の代わりに他のアミノ酸をコードするようにコドン配列を変化させる、非同義ミスセンス変異によって引き起こされるＤＮＡ配列における点変異に起因する。アミノ酸の置き換えは、タンパク質の機能又は構造に対する影響を有する可能性があり、これは、一般的に、置き換えられたアミノ酸が類似している又は類似していない度合い、さらには配列又は構造中でのそれらの位置に依存する。例えば、アミノ酸置換は、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、かさ高さ（又は柔軟性）、ベータ分岐、芳香族性、特定の結合相互作用（水素結合、塩架橋、極性及び非極性相互作用）を付与する能力、ｐＫ、糖と結合する能力、及び他の翻訳語修飾の類似性、並びに／又は関与する残基の両親媒性に基づいて行われ得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、保存的な置き換えであってよい。そのような置き換えは、アミノ酸を類似の特性を呈する別のアミノ酸に変更することを包含する。保存的なアミノ酸の置き換え（保存的なアミノ酸の「置換」又は保存的なアミノ酸の変異とも称される）は、任意のアミノ酸を類似の生化学的、構造的、及び／又は化学的特性を有する異なるアミノ酸に変更するタンパク質におけるアミノ酸の置き換えである。
【０１１４】
例えば、アミノ酸は、その構造、及びその側鎖（Ｒ基）の一般的な化学的特性に基づいて、６つの主要な種類に分類することができる。
【０１１５】
脂肪族：イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）；
ヒドロキシル又は硫黄／セレン含有：セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、スレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）；
環状：プロリン（Ｐ）
芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
塩基性：ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）
酸性及びそのアミド：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。
【０１１６】
加えて、以下の群の各々は、互いに保存的置換である他の例示的なアミノ酸を含有する：
１）非常に小さい：アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）負電荷：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）極性（アミド化カルボキシル側鎖）：アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）正に荷電：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
６）芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、及び場合によってはさらにヒスチジン（Ｈ）；
７）小さい極性：セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
８）硫黄含有：システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
９）小さい：アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）
１０）ベータ分岐：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、及び場合によってはさらにスレオニン（Ｔ）；
１１）極性：アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）。
【０１１７】
しかしながら、各々がアミノ酸の特性の異なる態様を強調する数多くのアミノ酸インデックスを得るアミノ酸の数多くのクラスターが存在し、例として、アミノ酸インデックスデータベースの何百というそのようなインデックスを参照されたいhttps://www.genome.jp/aaindex/。したがって、保存的な置き換えのいくつかが、舌に対する非特異的な結合又は他の感覚プロファイルの態様を例とする、食品飲料産業での工業的使用に対するタンパク質の適格性にとって重要である他の特徴を実際に表す場合がある。
【０１１８】
加えて、追加の保存性分析は、以下に基づいており、
−  非極性「疎水性」アミノ酸は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アルギニン（Ｒ）、及びリジン（Ｋ）から成る群より選択され；
−  「極性」アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）から成る群より選択され；
−  「正に荷電した」アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、及びヒスチジン（Ｈ）から成る群より選択され、並びに
−  「酸性」アミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、及びグルタミン（Ｑ）から成る群より選択される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、置き換えは、ラジカルな置き換えである。ラジカルな置き換え（置換）は、アミノ酸を、異なる特性を有する別のアミノ酸に交換することである。
【０１２０】
基準タンパク質と修飾タンパク質との間の配列類似性及び／又は配列同一性の度合いは、一般的に、修飾タンパク質の特性に影響を与え得る。例えば、数の多い置換は、結合動態、フォールディング動態、溶解性、熱安定性、ハロゲン安定性、ｐＨ安定性、保存寿命、非水性粒子との結合（例：食品マトリックス中のタンパク質若しくは脂肪、又は口腔中の疎水性領域）、３Ｄ構造、さらにはその活性及び関連する特性に影響を与え得る。開発され、本明細書で適用される計算機による方法は、改善された修飾タンパク質が得られる結果となる置換のための推定アミノ酸残基に対する充分な理解を提供する。
【０１２１】
いくつかの態様によると、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩである。以下の例１に示されるように、ＣＰＤ解析から、置換において重要であると提案されるいくつかのアミノ酸置換が明らかとなった。
【０１２２】
したがって、いくつかの態様によると、本開示は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含み、少なくとも１つのアミノ酸を含む修飾タンパク質に関し、修飾タンパク質は、配列番号５と比較して、少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｅ２である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｉ８である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｆ１１である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｎ１４である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｇ１６である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｋ１７である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｆ１８である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｖ２０である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｄ２１である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｅ２３である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｑ２８である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｒ３１である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｔ３３である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｎ３５である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｃ４１である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｌ６２である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｖ６４である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｙ６５である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｓ６７である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ａ７３である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｒ８４である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、Ｆ８９である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、以下のアミノ酸、Ｅ２、Ｉ８、Ｆ１１、Ｎ１４、Ｇ１６、Ｋ１７、Ｆ１８、Ｖ２０、Ｄ２１、Ｅ２３、Ｑ２８、Ｒ３１、Ｔ３３、Ｎ３５、Ｃ４１、Ｌ６２、Ｖ６４、Ｓ６７、Ａ７３、Ｒ８４、又はＦ８９のうちの少なくとも１つである。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、保存的置換である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ラジカルな置換である。いくつかの実施形態では、２つ以上のアミノ酸が置換される。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｅ２の極性無荷電アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｅ２Ｓ、Ｅ３Ｔ、Ｅ２Ｎ、又はＥ２Ｑを含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｉ８の極性無荷電アミノ酸又は疎水性アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｉ８Ｔ又はＩ８Ｖを含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｆ１１の荷電アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｆ１１Ｄ又はＦ１１Ｅを含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｎ１４の荷電アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｎ１４Ｋ又はＮ１４Ｅを含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｇ１６の疎水性アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｇ１６Ａを含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｋ１７の荷電アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｋ１７Ｅ又はＫ１７Ｒを含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｆ１８の荷電アミノ酸又は疎水性アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｆ１８Ｄを含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｖ２０の疎水性アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｖ２０Ａを含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｄ２１の荷電アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｄ２１Ｋ、Ｄ２１Ｒ、又はＤ２１Ｅを含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｅ２３の極性無荷電アミノ酸又は疎水性アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｅ２３Ｔ又はＥ２３Ａを含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｑ２８の荷電アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｑ２８Ｋを含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｒ３１の疎水性アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｒ３１Ｖを含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｔ３３の疎水性アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｔ３３Ｖを含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｎ３５の疎水性アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｎ３５Ｖを含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｃ４１の荷電アミノ酸又は極性無荷電アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｃ４１Ｒ又はＣ４１Ｓを含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｌ６２の荷電アミノ酸又は極性無荷電アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｌ６２Ｉを含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｖ６４  Ｌ６２の荷電アミノ酸又は極性無荷電アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｖ６４Ｆを含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｙ６５の少なくとも１つの置換を含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｓ６７の極性無荷電アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｓ６７Ｎを含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ａ７３の疎水性アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ａ７３Ｇを含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｒ８４の疎水性アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｒ８４Ｌを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、Ｆ８９の極性無荷電アミノ酸への少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、少なくとも１つの置換Ｆ８９Ｓを含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＭＮＥＩであり、置換されるべきアミノ酸は、以下のアミノ酸、Ｅ２、Ｉ８、Ｆ１１、Ｎ１４、Ｇ１６、Ｋ１７、Ｆ１８、Ｖ２０、Ｄ２１、Ｅ２３、Ｑ２８、Ｒ３１、Ｔ３３、Ｎ３５、Ｃ４１、Ｌ６２、Ｖ６４、Ｓ６７、Ａ７３、Ｒ８４、又はＦ８９のうちの少なくとも１つである。
【０１４８】
複数変異を含むＭＮＥＩにおけるアミノ酸置換は、既に報告されている。例えば、Zheng et alは、甘味及び安定性が改善された新規な二重変異ＭＮＥＩベースタンパク質を報告した。具体的には、Zheng et alは、ＭＮＥＩにおける単一置換Ｅ２Ｎが、３倍の甘味の改善、及び安定性の僅かな低下をもたらす結果となったことを示した。Zheng et alは、さらに、Ｅ２Ｎ置換に加えて、さらなる置換Ｅ２３Ａ又はＹ６５Ｒを導入することが（例：Ｅ２Ｎ／Ｅ２３Ａ、Ｅ２Ｎ／Ｙ６５Ｒ）、甘味に影響を与えないことも示した。
【０１４９】
上記で述べたように、アミノ酸Ｅ２３は、ＣＰＤ解析の過程で、タンパク質安定性にとって重要であることが識別された。したがって、比較的埋没しているＭＮＥＩの２３位の荷電グルタミン酸（Ｅ２３）が、疎水性アミノ酸に置き換えられた。
【０１５０】
以下の例において本明細書でさらに示されるように、Ｅ２、Ｅ２３、及びＹ６５の位置のアミノ酸での３つの置換を含む修飾タンパク質では、驚くべきことに、６〜７倍改善された甘味、並びに感覚プロファイル及び他の成分（ステビアなどの他の甘味剤を含む）との相乗効果などの考え得る他の改善された特性が得られる結果となった。理論に束縛されるものではないが、三重置換は、修飾タンパク質において、甘味に対して相乗効果をもたらす結果となることが示唆された。以下でさらに示されるように、Ｅ２、Ｅ２３、及びＹ６５の位置のアミノ酸での３つの置換を含む修飾タンパク質は、ＭＮＥＩと同じ範囲内のＲＥＵを有し、このことは、置換が安定性に干渉しないことをこのＲＥＵが示していることを示唆している。
【０１５１】
したがって、いくつかの態様によると、本開示は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含み、配列番号５の残基Ｅ２、Ｅ２３、及びＹ６５に少なくとも３つのアミノ酸置換を含む修飾タンパク質に関し、修飾タンパク質は、配列番号５と比較して、少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する。
【０１５２】
そのような実施形態によると、基準タンパク質は、配列番号５に示すＭＮＥＩであり、設計タンパク質は、配列番号５のアミノ酸Ｅ２、Ｅ２３、及びＹ６５に少なくとも３つの置換を含むことは理解されたい。
【０１５３】
アミノ酸Ｅ２、Ｅ２３、及びＹ６５の各々は、いかなるアミノ酸によって置換されてもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸（残基）Ｅ２でのアミノ酸置換は、Ｅ２Ｒ、Ｅ２Ｈ、Ｅ２Ｋ、Ｅ２Ｄ、Ｅ２Ｓ、Ｅ２Ｔ、Ｅ２Ｎ、Ｅ２Ｑ、Ｅ２Ｃ、Ｅ２Ｇ、Ｅ２Ｐ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｖ、Ｅ２Ｉ、Ｅ２Ｌ、Ｅ２Ｍ、Ｅ２Ｆ、Ｅ２Ｙ、Ｅ２Ｗのいずれか１つであってよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸（残基）Ｅ２３でのアミノ酸置換は、Ｅ２３Ｒ、Ｅ２３Ｈ、Ｅ２３Ｋ、Ｅ２３Ｄ、Ｅ２３Ｓ、Ｅ２３Ｔ、Ｅ２３Ｎ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｃ、Ｅ２３Ｇ、Ｅ２３Ｐ、Ｅ２３Ａ、Ｅ２３Ｖ、Ｅ２３Ｉ、Ｅ２３Ｌ、Ｅ２３Ｍ、Ｅ２３Ｆ、Ｅ２３Ｙ、Ｅ２３Ｗのいずれか１つであってよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸（残基）Ｙ６５でのアミノ酸置換は、Ｙ６５Ｒ、Ｙ６５Ｈ、Ｙ６５Ｋ、Ｙ６５Ｄ、Ｙ６５Ｅ、Ｙ６５Ｓ、Ｙ６５Ｔ、Ｙ６５Ｎ、Ｙ６５Ｑ、Ｙ６５Ｃ、Ｙ６５Ｇ、Ｙ６５Ｐ、Ｙ６５Ａ、Ｙ６５Ｖ、Ｙ６５Ｉ、Ｙ６５Ｌ、Ｙ６５Ｍ、Ｙ６５Ｆ、及びＹ６５Ｗのいずれか１つであってよい。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ＭＮＥＩである基準タンパク質における少なくとも３つのアミノ酸置換のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つが、保存的置換である。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、置換されるべき少なくとも３つのアミノ酸のうちの少なくとも１つは、アミノ酸Ｅ２であり、荷電残基に、所望に応じて負に荷電したアミノ酸に、置換される。いくつかの実施形態では、置換されるべき少なくとも３つのアミノ酸のうちの少なくとも１つは、アミノ酸Ｅ２であり、酸性残基に置換される。いくつかの実施形態では、置換されるべき少なくとも３つのアミノ酸のうちの少なくとも１つは、アミノ酸Ｅ２であり、極性残基に置換される。いくつかの実施形態では、置換されるべき少なくとも３つのアミノ酸のうちの少なくとも１つは、Ｅ２Ｎ、Ｅ２Ｄ、Ｅ２Ｑ、Ｅ２Ｒ、又はＥ２Ｋである。いくつかの実施形態では、置換されるべき少なくとも３つのアミノ酸のうちの少なくとも１つは、Ｅ２Ｎ、Ｅ２Ｄ、又はＥ２Ｑである。いくつかの実施形態では、置換されるべき少なくとも３つのアミノ酸のうちの少なくとも１つは、Ｅ２Ｎである。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、置換されるべき少なくとも３つのアミノ酸のうちの少なくとも１つは、アミノ酸Ｅ２３であり、荷電残基に、所望に応じて負に荷電したアミノ酸に、置換される。いくつかの実施形態では、置換されるべき少なくとも３つのアミノ酸のうちの少なくとも１つは、アミノ酸Ｅ２３であり、酸性残基に置換される。いくつかの実施形態では、置換されるべき少なくとも３つのアミノ酸のうちの少なくとも１つは、アミノ酸Ｅ２３であり、極性残基に置換される。いくつかの実施形態では、置換されるべき少なくとも３つのアミノ酸のうちの少なくとも１つは、Ｅ２３Ｎ、Ｅ２３Ｄ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｒ、又はＥ２３Ｋである。いくつかの実施形態では、置換されるべき少なくとも３つのアミノ酸のうちの少なくとも１つは、Ｅ２３Ｎ、Ｅ２３Ｄ、又はＥ２３Ｑである。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、置換されるべき少なくとも３つのアミノ酸のうちの少なくとも１つは、アミノ酸Ｙ６５であり、芳香族残基に置換される。いくつかの実施形態では、置換されるべき少なくとも３つのアミノ酸のうちの少なくとも１つは、アミノ酸Ｙ６５であり、非極性疎水性残基に置換される。いくつかの実施形態では、置換されるべき少なくとも３つのアミノ酸のうちの少なくとも１つは、Ｙ６５Ｆ、Ｙ６５Ｗ、Ｙ６５Ｈ、Ｙ６５Ｖ、Ｙ６５Ｉ、Ｙ６５Ｌ、Ｙ６５Ｍ、Ｙ６５Ｃ、Ｙ６５Ａ、Ｙ６５Ｔ、Ｙ６５Ｓ、Ｙ６５Ｐ、Ｙ６５Ｇ、Ｙ６５Ｋ、及びＹ６５Ｒである。いくつかの実施形態では、置換されるべき少なくとも３つのアミノ酸のうちの少なくとも１つは、Ｙ６５Ｋ及びＹ６５Ｒである。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、ＭＮＥＩであり、少なくとも３つのアミノ酸置換のうちの少なくとも１つは、Ｅ２Ｎ、Ｅ２Ｄ、Ｅ２Ｑ、Ｅ２Ｒ、Ｅ２Ｋ、Ｅ２３Ｎ、Ｅ２３Ｄ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２３Ｒ、Ｅ２３Ｋ、Ｙ６５Ｆ、Ｙ６５Ｗ、Ｙ６５Ｈ、Ｙ６５Ｖ、Ｙ６５Ｉ、Ｙ６５Ｌ、Ｙ６５Ｍ、Ｙ６５Ｃ、Ｙ６５Ａ、Ｙ６５Ｔ、Ｙ６５Ｓ、Ｙ６５Ｐ、Ｙ６５Ｇ、Ｙ６５Ｋ、及びＹ６５Ｒから成る群より選択される。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、ＭＮＥＩであり、少なくとも３つの置換は、Ｅ２Ｎ、Ｅ２３Ｖ、Ｅ２３Ａ、Ｙ６５Ｋ、及びＹ６５Ｒから成る群より選択される。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、ＭＮＥＩであり、少なくとも３つの置換は、Ｅ２Ｎ、Ｅ２３Ｖ、及びＹ６５Ｋである。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、ＭＮＥＩであり、少なくとも３つの置換は、Ｅ２Ｎ、Ｅ２３Ａ、及びＹ６５Ｒである。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する：ＧＮＷＥＩＩＤＩＧＰＦＴＱＮＬＧＫＦＡＶＤＥＶＮＫＩＧＱＹＧＲＬＴＦＮＫＶＩＲＰＣＭＫＫＴＩＹＥＮＥＧＦＲＥＩＫＧＹＥＹＱＬＹＶＫＡＳＤＫＬＦＲＡＤＩＳＥＤＹＫＴＲＧＲＫＬＬＲＦＮＧＰＶＰＰＰ（配列番号１６）。配列番号１６は、本明細書において、ＤＭ０８と称する。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する：ＧＮＷＥＩＩＤＩＧＰＦＴＱＮＬＧＫＦＡＶＤＥＡＮＫＩＧＱＹＧＲＬＴＦＮＫＶＩＲＰＣＭＫＫＴＩＹＥＮＥＧＦＲＥＩＫＧＹＥＹＱＬＹＶＲＡＳＤＫＬＦＲＡＤＩＳＥＤＹＫＴＲＧＲＫＬＬＲＦＮＧＰＶＰＰＰ（配列番号１７）。配列番号１７は、本明細書において、ＤＭ０９と称する。
【０１６４】
いくつかの態様によると、基準タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。以下の例２に示されるように、ＣＰＤ解析から、置換において重要であると提案されるいくつかのアミノ酸置換が明らかとなった。
【０１６５】
したがって、いくつかの態様によると、本開示は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含み、少なくとも１つのアミノ酸を含む修飾タンパク質に関し、修飾タンパク質は、配列番号１と比較して、少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、置換されるべきアミノ酸は、以下のアミノ酸、Ａ１、Ｔ２、Ｆ３、Ｅ４、Ｖ、Ｒ８、Ｓ１０、Ｑ３０、Ｎ３２、Ｓ３３、Ｅ３５、Ｓ３６、Ｗ３７、Ｔ３８、Ｉ３９、Ｎ４０、Ａ５２、Ａ８８、Ｎ９３、Ｉ１００、Ｎ１０４、Ｍ１１２、Ｎ１１３、Ｆ１１４、Ｓ１１５、Ｔ１１７、Ｔ１１８、Ｒ１１９、Ｖ１２４、Ｒ１２５、Ａ１２７、Ａ１２８、Ｄ１２９、Ｖ１３１、Ｇ１３２、Ｑ１３３、Ａ１３６、Ｋ１３７、Ｋ１３９、Ａ１４０、Ｇ１４２、Ａ１４８、Ｆ１５２、Ｔ１５４、Ｙ１５７、Ｇ１６５、Ｐ１６６、Ｅ１６８、Ｙ１６９、Ｒ１７１、Ｌ１７６、Ｄ１７９、Ｖ１９１、Ｓ１９６、Ｓ１９７、Ｎ１９８、Ｒ２００、Ｔ２０２、Ｔ２０６、又はＡ２０７のうちの少なくとも１つである。
【０１６７】
本明細書で述べるように、本明細書で述べる修飾タンパク質は、改善された食品関連特性を有する。たんぱく質の甘味度（糖様の風味）などの甘味プロファイル、異味がないこと、開始時間の短縮、及び修飾タンパク質の残味の減少は、本技術分野で知られている公知のいかなる味試験によって特定されてもよい。例えば、スクロース又は他の甘味剤の甘味との比較は、味パネルによって行うことができ、甘味度は、以下の例で詳述するようにスコア付けすることができる。
【０１６８】
比較は、例えば甘味の知覚を引き起こすのに必要な最小濃度を特定することによる、スクロースなどの既知の甘味剤と比較した修飾タンパク質の閾値を決定することによって、又は甘味プロファイル、甘味開始時間、残味、口当たり、後味、異味、及び不要な味のマスキングなどの特性を含む甘味プロファイルの評価によって成されてよい。
【０１６９】
本明細書で用いられる場合、甘味に影響を与える特性、の用語は、約０．２８ｍｇ／Ｌ以上の甘味閾値、約１〜２０秒間、場合によっては２〜１８秒間、場合によっては２〜４秒間の甘味継続時間、のうちの少なくとも１つによって決定される甘味知覚を包含する。
【０１７０】
基準タンパク質に類似する修飾タンパク質は、甘味受容体と結合する。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、重量基準で糖よりも３００〜１６０００倍高い知覚甘味閾値を有する。
【０１７２】
感覚プロファイルは、通常は経時での味強度を示すガウス分布である、すなわち、開始時間（味を感じるまでの時間）、味継続時間、及び残味の時間（ガウス分布のテール部に相当）である味動態を含む。さらなる特徴としては、異味（例：他の受容体との結合に起因）、味の丸み、金属味及び他の付属的な味（side-tastes）、他の成分との相乗効果（例：ステビアなど、他の風味又はその不要な味のマスキング及び増強）などが挙げられる。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準タンパク質と比較して以下のうちの少なくとも１つが同等又は改善されていることを特徴とする：（１）構造的熱安定性、（２）機能的熱安定性、（３）ｐＨ安定性、（４）水中若しくは部分水性環境中（例：脂肪含有食品）での溶解性、又は（５）保存寿命安定性。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準タンパク質と比較して同等又は改善された構造的熱安定性を有する。
【０１７５】
「構造的熱安定性」又は「熱安定性」の用語は、本明細書で用いられる場合、修飾タンパク質が、基準タンパク質よりも高い温度でその３Ｄ構造を維持する能力を意味する。タンパク質の３Ｄ構造安定性は、本技術分野で公知のいかなる方法で測定されてもよく、円二色性（ＣＤ）、又は示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）若しくは示差走査熱量測定（ＤＳＣ）などの熱シフトアッセイなどである。タンパク質の３Ｄ構造は、タンパク質の機能に対して影響を有し得る。特には、食品及び飲料製品の場合に必要とされる保存寿命及び熱安定性は、構造的熱安定性に関連する場合があり、様々な測定可能値から成り、例えば、低温殺菌は、様々なプロトコルによって適用されてよく、非常に短い時間の間タンパク質構造を維持する耐熱性と関連している。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準タンパク質と比較して同等又は高い機能的熱安定性を有する。「機能的熱安定性」の用語は、本明細書で用いられる場合、修飾タンパク質が、基準タンパク質と比較して高い温度への曝露後にその機能を維持する能力を意味する。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、本明細書における修飾タンパク質は、より高い温度で、又は制限され得る時間にわたるより高い温度への曝露後に、甘味効果を維持することができる。言い換えると、製品を、室温を超える温度に、場合によっては５０℃までの、場合によっては１００℃までの、又はさらには１５０℃までの温度に曝露した後、甘味プロファイル又は感覚プロファイルに感知される変化が存在しない。タンパク質の機能、例えば甘味は、知覚試験によって測定され得る。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準タンパク質と比較して同等又は高いｐＨ安定性を有する。ｐＨ安定性は、基準タンパク質と比較してより広いｐＨ範囲での修飾タンパク質の安定性を意味し、すなわち、修飾タンパク質は、製品を３〜８の任意のｐＨに、場合によっては４〜８のｐＨに曝露した後、３Ｄ構造及び／又は機能を維持する。例えば、コーラなどの炭酸飲料は、２．３〜２．５のｐＨを有し、このｐＨでは、甘味タンパク質の一部は、安定ではなく、直ちに、又は飲料の通常の保存寿命よりも短い時間の後、機能を喪失する。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準タンパク質と比較して高い溶解性を有する。溶解性は、脂肪含有食品など、水性、部分水性、又は非水性環境中であり得る。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準タンパク質と比較して改善された保存寿命を有する。改善された保存寿命とは、製品を１５０℃までのいずれかの温度に、場合によっては４℃〜１５０°、又は１００°までのいずれかの温度に曝露した後、組成物を含む製品の甘味（機能）の感知される変化又は物理的な劣化（例：色変化、相分離など）が発生しないことを意味する。
【０１８１】
いくつかの他の実施形態では、修飾タンパク質は、基準タンパク質と比較して以下のうちの少なくとも１つが同等又は改善されていることを特徴とする：（１）フォールディング動態、（２）タンパク質の翻訳語修飾（例：グリコシル化）パターンが、基準タンパク質と比較して異なる、（３）ジスルフィド結合の数が、基準タンパク質と比較して少ない。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、基準タンパク質と比較して同等又は高いフォールディング動態を有する。すなわち、アンフォールド又は部分フォールド構造からのタンパク質のフォールディング速度が、より速い（例えば分子動力学によってインシリコで評価、又は生体外若しくは生体内の方法での実験によって評価）。あるいは、より速いフォールディング動態は、例えば変性剤滴定（例：塩化グアニジニウム及び／又は高濃度尿素）又は他の方法による変性実験におけるより遅いアンフォールディング動態も意味する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、評価した宿主生物中において、基準タンパク質と比較して同等又は高い発現量を特徴とする。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、７．８〜８．４のＰＩ値を有する。
【０１８５】
甘味を、さらには考え得る他の味の効果（不要な味のマスキング、後味の減少、残味の減少、異味の減少、残味開始の減少、うまみ）を特徴とする本明細書で述べる修飾タンパク質は、経口送達のための製品の製造における甘味剤として用いることができる。
【０１８６】
修飾タンパク質は、風味調整剤又は風味増強剤として用いることができる。
【０１８７】
本明細書で述べるタンパク質は、経口製品として用いるためのものである。いくつかの実施形態では、製品は、食品製品、補助食品製品、又は医薬品である。製品の製造において、本明細書で述べるタンパク質は、いかなる食品グレードの添加剤と組み合わされてもよい。食品製品は、いかなる固体乾燥形態で提供され、用いられてもよく、限定されないが、微細粉末、凍結乾燥物、顆粒、錠剤などが挙げられる。いくつかの実施形態では、組成物は、液体の形態で、例えば水への溶質として（水溶液）、提供される。
【０１８８】
タンパク質を含む製品は、様々な用途を有し得る。これには、限定されないが（以下の各々は、本開示の別々の実施形態を構成する）、食品及び飲料産業（ソフトドリンク、すぐに飲める飲料、シロップ、機能性ドリンク、スポーツドリンクなど）における、乳製品産業、すなわち、乳製品、ヨーグルト、及びプリンにおける、医薬品産業における、自然療法産業、栄養補助食品産業、及び他のヘルスケア製品（例：歯磨き粉、マウスウォッシュ）における、キャンディ及びガム産業における、又は賦形剤若しくは添加剤として風味調整組成物の使用を必要とする他のいずれかの用途における、甘味剤、風味剤、増強剤、又はマスキング剤としての使用が含まれる。
【０１８９】
製品は、追加の食品成分を含んでよい。いくつかの実施形態では、食品成分は、甘味剤、例えばステビアである。以下の例に示されるように、本明細書で述べる修飾タンパク質とステビアとの組み合わせは、相乗効果を生み出した。したがって、いくつかの実施形態では、製品は、配列番号１６又は配列番号１７で示す少なくとも１つの修飾タンパク質とステビアとを含む。
【０１９０】
本発明に従う修飾タンパク質は、本技術分野で公知のいかなる方法によって製造されてもよく、例えば、タンパク質の製造は、合成によって、遺伝子組み換えＤＮＡ技術によって、又は発酵槽を介する微生物での若しくは植物での若しくは植物カルスでの若しくは他のバイオリアクターでのタンパク質産生によって行われてよいことには留意されたい。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、大腸菌などの細菌中で産生されてよい。いくつかの他の実施形態では、修飾タンパク質は、サッカロミセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）又はピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母菌によって産生されてよい。いくつかの実施形態では、選択されたアミノ酸配列のＤＮＡ配列は、ＲＮＡ及びＤＮＡレベルで最適化される。ＲＮＡレベルでは、これは、リボソームへの素早い挿入を確実とするために、ＲＮＡ二次構造を最小限とすることを含む。ＤＮＡレベルでは、これは、宿主生物に対するコドン最適化を含む（ＲＮＡレベルの最適化を考慮）。コドン出現頻度最適化によって、発現される各アミノ酸に対して、宿主生物中で最も豊富なｔＲＮＡの優先的な使用が得られる。
【０１９１】
上記に関して、与えられる場合、例えば１０％、５０％、１２０％、５００％などのパーセントの値は、「倍率変化」の値、すなわち、それぞれ０．１、０．５、１．２、５などと交換可能であることは理解されたい。
【０１９２】
本明細書で用いられるすべての科学用語及び技術用語は、特に断りのない限り、本技術分野において一般的に用いられる意味を有する。本明細書で与えられる定義は、本明細書において頻繁に用いられるある特定の用語の理解を促進するためのものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１９３】
本明細書で用いられる場合、「約」の用語は、±１０％を意味する。「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「含む（includes）」、「含んでいる（including）」、「有している（having）」の用語、及びこれらの活用形は、「含んでいるが限定されない」を意味する。「本質的に成る」の用語は、組成物、方法、又は構造が、追加の成分、工程、及び／又は部分を含んでよいが、但し、その追加の成分、工程、及び／又は部分が、請求される組成物、方法、又は構造の基本的で新規な特徴を実質的に変化させない場合のみであることを意味する。本明細書で用いられる場合、「約」の用語は、１％まで、より詳細には５％、より詳細には１０％、より詳細には１５％、場合によっては２０％まで、言及される値よりも上又は下へ逸脱してもよい値を示しており、その逸脱範囲は、連続する範囲を構成する整数値、及び該当する場合は非整数値も含む。
【０１９４】
本明細書及び添付の請求項で用いられる場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、内容からそうでないことが明らかに示されていない限り、複数の指示対象も含むことには留意されたい。
【実施例】
【０１９５】
限定されない例
例１−ＭＮＥＩベースタンパク質の設計及び特性決定
例１Ａ：ＭＮＥＩベースタンパク質の設計
ＭＮＥＩベースタンパク質の設計は、以下のようにして行った：一本鎖モネリン、ＭＮＥＩは、９６のアミノ酸から成り、分子量が約１１ｋＤ、ｐＩが約８．７であるポリペプチドである。ＭＮＥＩは、配列番号５として示す。
【０１９６】
計算機による方法
上記で述べたように、計算機及び専門家による解析から、低減された配列空間が得られ、これはさらに、計算機によって、又は専門家によって、又は実験によって、又はこれらの方法の組み合わせによってさらに解析することができる。そのような解析は、個々のアミノ酸に、アミノ酸のクラスターに、又は他の組み合わせに対して適用することができる。
【０１９７】
ＣＰＤプロセスの過程で、アミノ酸の置き換えが、受容体との結合部位の一部となりにくい特定領域で可能とされ、例えば、タンパク質のコアを形成するヘリックス及びベータシートの非露出側の周囲である。ＲＯＳＥＴＴＡを実行して、１６０Ｋのモデルという結果を得た。すべてのモデルのエネルギーを描画すると、結果のグラフは、ロジット関数の形態を有する。ロジット関数（対数オッズとしても知られる）は、オッズｐ／（１−ｐ）の対数であり、ここでｐは、確率である。それは、Ｓ字状の「ロジスティック」関数の逆関数である。
【０１９８】
さらなる解析のために、５Ｋの最も低いモデルを選択した。ＲＥＵの関数として置き換え（ＭＮＥＩと比較した）の数をプロットすると、ガウス分布が得られ、集団は正規分布であり、さらなる解析に対して有効であることが示された。
【０１９９】
表１は、基準タンパク質配列全体に広がっている特定の残基に対して行ったＣＰＤから、ＭＮＥＩの二次構造要素のすべてに広がるアルファ−ヘリックス、ベータ−シート、及びループでの置き換えが提案されたことを示す。
【０２００】
重要なことには、普通ではない（non-trivial）置き換えが識別された。例えば、Ｖ６４Ｆの置き換えは、ベータ−シートに非ベータ−シートアミノ酸を導入した。ベータ−シート領域でのほとんどの置き換えは、その三次構造を保護するために、ベータ−シートアミノ酸に対してである。
【０２０１】
表１から、ほとんどの埋没した位置において、ＣＰＤの提案は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、又はＶａｌなどの疎水性残基への置き換えであることも分かる。そのような置き換えは、タンパク質のコアを安定化させる可能性が高いと考えられ、したがって、安定性及び保存寿命を向上させる。しかしながら、ＣＰＤの結果が、極性又は荷電残基への置き換え（例：Ｎ１４Ｋ）であるケースが少し存在する。そのような置き換えは、ＭＮＥＩのコアを安定化させる可能性は低いと考えられる。注意深く調べたところ、そのような驚くべき置き換えは、他の残基又は水分子との水素結合を形成する可能性が高いと考えられる。
【０２０２】
表面の完全に又は部分的に露出した位置は、ほとんどが、水と相互作用してＭＮＥＩを安定化することができる極性又は荷電残基に置き換えられる。しかし、ＣＰＤが、Ｒ８４Ｌを例とする疎水性残基への置き換えを提案する予想外のケースがある。そのようなケースは、予想外かつ独特であり、ＭＮＥＩの３Ｄ構造を調べることによっては説明されない可能性が高いと考えられる。
2021522307.tif 000002
【０２０３】
加えて、ＣＰＤプロセスの過程で、タンパク質の解析後に特定のアミノ酸が選択され、アミノ酸Ｅ２３が、安定性にとって重要な残基であることが識別された。このアミノ酸単独の又は組み合わせての寄与を、ＣＰＤで試験した。表２は、そのような解析のＲＥＵ値を示す。
2021522307.tif 000003
【０２０４】
表３は、上記で詳述したように設計した修飾ＭＮＥＩベースタンパク質（改造タンパク質）を示す。
2021522307.tif 000004
【０２０５】
タンパク質は、１Ｌの高密度発酵で発現させ、イオン交換クロマトグラフィ、及びそれに続くサイズ排除クロマトグラフィによって＞９０％まで精製した。
【０２０６】
表４は、新規な改造タンパク質の構造的特性決定を示す。
2021522307.tif 000005
【０２０７】
例１Ｂ：ソフトドリンクモデル溶液中での改造ＭＮＥＩベースタンパク質に対する甘味閾値の感覚評価
本実験の目的は、新規なＭＮＥＩベースタンパク質及びＭＮＥＩの甘味閾値を評価すること、並びに新規なタンパク質ＤＭ０８及びＤＭ１０の味閾値を算出することであった。
【０２０８】
方法：
本明細書で述べるＭＮＥＩベースタンパク質のスクロースと比較した甘味度は、典型的には、１：７００〜１：１６０００の範囲内である。したがって、比較のために、ＭＮＥＩベースタンパク質及びＭＮＥＩ（基準タンパク質として）の溶液を、まず１：１０００に希釈し、必要に応じてさらに希釈した。一般的に、ほとんどの人にとってのソフトドリンクにおける糖の甘味閾値は、０．３２％〜１．０％である。ＭＮＥＩベースタンパク質及びＭＮＥＩ（基準タンパク質として）の濃度の計算を、しかるべく行った。
【０２０９】
本実験で用いた溶液を、表５に詳細に示す。溶液の調製は以下のようにして行った。各溶液について、ある量の甘味剤（スクロース／ＭＮＥＩ／改造（修飾）タンパク質；詳細は表１を参照）を、表３に示すように添加し、この溶液を、水で１００ｇに仕上げた（１％の糖に相当する甘味剤を得るために）。各溶液の２０ｍｌをテイスティングカップに注ぎ、各サンプルを、盲検試験のために表５に従ってマーキングした。
2021522307.tif 000006
【０２１０】
試験手順：
調製した溶液の各々に対する甘味閾値を評価するために、二重盲検味試験を行った。試験したサンプルには、ＭＮＥＩ、２つのＭＮＥＩ改造タンパク質（ＤＭ０８及びＤＭ１０）、スクロース、及びミネラル水を含めた。味試験の直前に、タンパク質のストック溶液をミネラル水（ｐＨ６．９）で希釈することによって一連の濃度を調製した（表３）。このセッションには、３０〜５０歳の男性２名女性３名の計５名の健康な評価者が参加し、このうち３名は熟練したテイスターであった。
【０２１１】
２０ｍｌのサンプルを、糖溶液と比較してランダムに試験した。各試験の前に、評価者には、口を水でゆすぐこと、及び残留する味がなくなるまで中間的な味のクラッカーを食べることを求めた。試験溶液を少なくとも１０秒間口に含んだ。次に、評価者は、自身の応答に従い、甘さの知覚なしを０、非常に甘いを１０とする０〜１０でサンプルをスコア付けした。
【０２１２】
甘味感知の閾値は、テイスターがサンプルを甘いと認識した最低濃度として定義した。甘味度は、スクロースに対して報告する。
【０２１３】
結果と考察
ほとんどの参加者は、０．５％のスクロース溶液を甘いと認識し、平均スコアは０．６３±０．６であった。１％のスクロース溶液の平均スコアは、１．２５±０．９であり、直線的な用量応答が示された（データ示さず）。
【０２１４】
ＭＮＥＩに対しても類似のパターンが観察され：希釈率１：４０００、１：２０００、及び１：１０００に対してそれぞれ、０．６８±０．２、０．９８±０．４、及び２．２±１．０であった。これらの結果は、ＭＮＥＩの甘味閾値が１：２０００に近く、１０Ｂｘ知覚を模倣する甘味度は約２０００であることを示した。
【０２１５】
ＭＮＥＩ改造タンパク質ＤＭ０８に関して、１：１２０００〜１：１０００の希釈範囲内でやはり直線的な用量応答曲線が示され、甘味閾値は約１：１２０００であり、１０Ｂｘ知覚を模倣する甘味度は約１００００であることを示した。
【０２１６】
ＭＮＥＩ改造タンパク質ＤＭ１０も、直線的な曲線を呈し、甘味閾値は１：１０００に近く、１０Ｂｘ知覚を模倣する甘味度は約１０００であった。
【０２１７】
図１は、上記で述べた溶液の甘味平均スコアの概要を示す。
【０２１８】
例１Ｃ：ＭＮＥＩ溶液に対する甘味閾値の感覚評価
本実験の目的は、甘味ＭＮＥＩベース改造タンパク質を特性決定すること、及び甘いとして感知又は認識することができる甘味剤の最低濃度として定義される甘味閾値を評価することである。本実験では、新規な改造ＭＮＥＩベースタンパク質ＤＭ０９、ＤＭ１１、及びＤＭ１２の味閾値を試験した。
【０２１９】
方法：
上記で記載したように、糖と比較した甘味タンパク質の甘味度は、食品組成に応じて異なり、典型的には、１：７００〜１：３０００の範囲内である。したがって、甘味タンパク質溶液を、まず１：１０００に希釈し、必要に応じてさらに希釈した。
【０２２０】
ほとんどの人にとってのソフトドリンクにおける糖の甘味閾値は、０．３２％〜１．０％である。ＭＮＥＩ濃度及びＭＮＥＩベースタンパク質の計算を、しかるべく行った。
【０２２１】
本実験で用いた溶液を、表４に詳細に示す。溶液の調製は以下のようにして行った。各溶液について、ある量の甘味剤（スクロース／ＭＮＥＩ／改造タンパク質；詳細は表１を参照）を、表６に示すように添加し、この溶液を、水で１００ｇに仕上げた（１％の糖に相当する甘味剤を得るために）。各溶液の２０ｍｌをテイスティングカップに注ぎ、各サンプルを、盲検試験のために表６に従ってマーキングした。
2021522307.tif 000007
【０２２２】
試験手順：
調製した溶液の各々に対する甘味閾値を評価するために、二重盲検味試験を行った。試験したサンプルには、ＭＮＥＩ、２つのＭＮＥＩ改造タンパク質（ＤＭ０９、ＤＭ１１、及びＤＭ１２）、スクロース、及びミネラル水を含めた。味試験の直前に、タンパク質のストック溶液をミネラル水（ｐＨ６．９）で希釈することによって一連の濃度を調製した（表６）。このセッションには、３０〜７５歳の男性５名女性１名の計６名の健康な評価者が参加し、このうち半分は熟練したテイスターであった
【０２２３】
甘味感知の閾値は、テイスターがサンプルを甘いと認識した最低濃度として定義した。甘味度は、スクロースに対して報告する。
【０２２４】
２０ｍｌのサンプルを、糖溶液と比較してランダムに試験した。各試験の前に、評価者には、口を水でゆすぐこと、及び残留する味がなくなるまで中間的な味のクラッカーを食べることを求めた。試験溶液を少なくとも１０秒間口に含んだ。次に、評価者は、自身の応答に従い、甘さの知覚なしを０、非常に甘いを１０とする０〜１０でサンプルをスコア付けした。
【０２２５】
甘味感知の閾値は、テイスターがサンプルを甘いと認識した最低濃度として定義した。甘味度は、スクロースに対して報告する。
【０２２６】
結果と考察
水の甘味（コントロール）は、０．５±０．８の平均値で感知された。値がゼロではないことは、前のサンプルの残味の影響に起因する可能性がある。すべての参加者は、０．５％のスクロース溶液を甘いと認識し、平均スコアは１．９±０．９であった。１％のスクロース溶液の平均スコアは、３．８±１．９であり、直線的な用量応答が示された（図１）。
【０２２７】
ＭＮＥＩに対しても類似のパターンが観察され：希釈率１：２０００、１：１０００、及び１：５００に対してそれぞれ、１．０±０．７、２．５±１．４、及び４．７±３．２であった。これらの結果は、ＭＮＥＩの甘味閾値が１：１０００〜１：２０００であり、１０Ｂｘの糖溶液に匹敵する約１０００の甘味度であることを示す。
【０２２８】
モネリンの改造タンパク質ＤＭ１１に関して、希釈率１：５００、１：１０００、及び１：２０００に対してそれぞれ、０．０±０．０、０．３±０．８、及び０．４±０．９のサンプルスコアから示されるように、甘味度は５００未満であると考えられる。モネリンの改造タンパク質ＤＭ１２は、すべての希釈率に対して１．０に類似の値を呈し、顕著な用量応答はなかった。
【０２２９】
モネリンの改造タンパク質ＤＭ０９は、直線的な用量応答曲線を示し、甘味閾値は約１：１６０００であり、１０Ｂｘ糖溶液を模倣する甘味度は１６０００〜８０００であることを示している。
【０２３０】
結果を図２に示す。
【０２３１】
例１Ｄ：ＭＮＥＩ及びＭＮＥＩ改造タンパク質の甘味度
上記の最適化に基づいて、ＤＭ０８及びＤＭ０９の甘味度、後味、及び残味効果を、表７に示すように、ＭＮＥＩ及びさらなる甘味剤と比較して試験した。試験方法は、６名の熟練参加者で、タンパク質を各々の糖溶液と比較する盲検試験を含んでいた。
2021522307.tif 000008
【０２３２】
分かるように、ＭＮＥＩと比較して、ＭＮＥＩ改造タンパク質の甘味度が高い。試験した実験において、ＭＮＥＩ及びＭＮＥＩ修飾タンパク質ＤＭ０８の甘味閾値は、重量基準で糖の１００００倍高く、ＤＭ０９では、糖の１５０００倍高いことには留意されたい。非直線的な用量応答が示され、ＤＭ０８に対する８０ＢＸ知覚での甘味度が、糖の３５００倍高く、ＤＭ０９では、糖の４０００倍高いことを示している。
【０２３３】
さらに、６名の参加者で、糖溶液と比較した様々な組み合わせの盲検試験で相乗効果を試験した（表８）。
2021522307.tif 000009
【０２３４】
ＭＮＥＩ改造タンパク質（ＤＭ０８／ＤＭ０９とステビア（ＲＥＢ  Ａ））との間の相乗効果が、１．０：１．０〜０．１：１．０のステビア／ＭＮＥＩ比の範囲内で、以下のように示された。
【０２３５】
−  ステビア＋ＭＮＥＩ改造タンパク質ＤＭ０８及びＤＭ０９の甘味強度は、加算した値よりも高かった。
【０２３６】
−  ＭＮＥＩ改造タンパク質とステビアとの組み合わせは、開始の遅延、並びに全体としての残味及び他の後味を低減した。
【０２３７】
さらなる組み合わせを、６名の参加者で、様々な組み合わせの糖溶液に対する盲検比較によって試験した。
【０２３８】
表９  ８．００ＢＸ知覚（３．００ＢＸ糖添加）での味プロファイルを示す（ステビア：ＭＮＥＩ改造タンパク質比  ０．１：１．０）−ＭＮＥＩ改造タンパク質とステビアとの間の糖の存在下での相乗効果
2021522307.tif 000010
【０２３９】
試験したサンプルはすべて、糖（３０Ｂｘ）の存在下で、開始の遅延の低減並びに残味及び他の後味の低減を伴うより良好な味性能を呈した。
【０２４０】
ステビア／ＤＭ０８のブレンド（Ｅ及びＧ）は、その糖のような味プロファイルで際立っている。
2021522307.tif 000011
【０２４１】
示されるように、試験したすべての修飾タンパク質は、同等又は改善された甘味を呈することが見出され、さらには、ＤＭ１２によって明らかにされた甘味をＭＮＥＩと類似のレベルまで出現させ、ＤＭ０９では、少なくとも同等又は改善された融解温度であった。
【０２４２】
例２−タウマチンベースタンパク質の設計
例２Ａ−タウマチンベースタンパク質の設計
タウマチンベースタンパク質の設計を、基準タンパク質として配列番号１に基づいて行った。
【０２４３】
計算機による方法
ＣＰＤプロセスの過程で、可能とされた唯一の置き換えは、タンパク質のコアを形成するヘリックス及びベータシートの非露出側の周囲である。ＲＯＳＥＴＴＡを実行して、７１Ｋ以上のモデルという結果を得た。すべてのモデルのエネルギーを描画すると、結果のグラフは、ロジット関数の形態を有する。ロジット関数（対数オッズとしても知られる）は、オッズｐ／（１−ｐ）の対数であり、ここでｐは、確率である。それは、Ｓ字状の「ロジスティック」関数の逆関数である。
【０２４４】
さらなる解析のために、５Ｋの最も低いモデルを選択した。ＲＥＵの関数として置き換えの数をプロットすると、ガウス分布が得られ、集団は正規分布であり、さらなる解析に対して有効であることが示された。ＣＰＤの結果は、見ることができる（エラー！参照元が見つからない）。
2021522307.tif 000012
2021522307.tif 000013
【０２４５】
例２Ｂ：タウマチン修飾タンパク質のピキア・パストリス（現在はコマガタエラ・ファフィ（Komagataella phaffi）と称される）中での発現
６種類のタウマチン変異体を、２つの異なる誘導系、すなわち、メタノール誘導発現及びグルコース誘導発現を用いて、酵母菌Ｐ．パストリスからの発現及び分泌について試験した。配列及び発現系は、以下の表１２に示す。
2021522307.tif 000014
【０２４６】
発現を、Ｘ３３又はＬＰ１ピキア株で試験し、続いてゼオシン（５００〜１０００μｇ／ｍｌ）によるエレクトロポレーション及び選別を行った。結果の例を図３に示しており、これは、アクリルアミドゲルで分離された条件培地を示している。選択されたコロニーからの条件培地を、アクリアミドゲルエレクトロポレーションで分離し、銀染色によって検出した。コスマチン（Cosmatin）（レーン２〜７）が、２２ｋＤａｌの正しい分子量で検出されている（矢印）。分泌は、アミラーゼ（Ｔ８−１）又はアルファ接合因子（２）シグナル配列によって誘導される。レーン１−同じ条件下でのタウマチン発現、分泌はタウマチン「プレ」シグナル配列（ＭＡＡＴＴＣＦＦＦＬＦＰＦＬＬＬＬＴＬＳＲＡ）によって誘導。
【０２４７】
実験は、Ｘ−３３、ＧＳ１１５、及びＬＰ１を含む３つの異なる宿主生物株で行った。発現系には、メタノール誘導（プロモーターＡＯＸ１を使用、Ｘ３３、ＧＳ１１５、及びＬＰ１株で試験）及びグルコース誘導（プロモーターＧ１−３を使用、ＬＰ１及びＧＳ１１５株で試験）の両方を含めた。
【０２４８】
異なるシグナルペプチドをスクリーニングした。ＡＯＸ１の場合、これらには、ａアミラーゼ、アルファＫ、アルファＴ、グルコアミラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、キラープロ（killerpro）、リゾチーム、アルブミン、及びプレ−タウマチンが含まれる。Ｇ１−３の場合、これらには、プレ−タウマチン、ＬＳＰ１、ＬＳＰ２、及びアルファＭＦが含まれる。
【０２４９】
タウマチンの場合、ＣＰＤソフトウェアで最も低い擬似エネルギースコアを受けたものは、５４の置換を含んでいた。しかし、数多くの直交法による交差検証の後、実験室で発現されたいくつかの修飾タンパク質は、３及び２２の置換を含んでいた。直交法は、計算機誘導モデル内さらにはそのタンパク質の進化ファミリー内での配列及び構造保存、疎水性パッチの解析、キャビティ、動的高温及び低温動力学（例えば、分子動力学によって評価）、視覚化、既知の変異体などの約７２０００モデルとの対応、並びに擬似エネルギー（スコアリング関数）分布、を含む。各モデルは、異なる配列であり、すべての擬似エネルギーは、入力（野生型）タンパク質よりも低い。５０００の最低擬似エネルギーモデルにフォーカス：擬似エネルギー対置換の数（直交法によるスコアリング及び確認前の計算機の出力）。
【０２５０】
例３：受容体結合部位の特性決定
少なくとも以下のアミノ酸を含む受容体結合部位の特性決定であって、Ａは、ＴＡＳ１Ｒ２（ヒト由来）に対応し、Ｂは、ＴＡＳ１Ｒ３（ヒト由来）に対応し、番号は、対応する配列中の対応する残基（アミノ酸）に対応する。
2021522307.tif 000015
2021522307.tif 000016
【０２５１】
加えて、少なくとも以下のアミノ酸を含む受容体結合部位であって、Ａは、ＴＡＳ１Ｒ２（ヒト由来）に対応し、Ｂは、ＴＡＳ１Ｒ３（ヒト由来）に対応し、番号は、対応する配列中の対応する残基（アミノ酸）に対応する（表１４）。
2021522307.tif 000017
2021522307.tif 000018
【０２５２】
少なくとも以下のアミノ酸を含む受容体結合部位であって、Ａは、ＴＡＳ１Ｒ２（ヒト由来）に対応し、Ｂは、ＴＡＳ１Ｒ３（ヒト由来）に対応し、番号は、対応する配列中の対応する残基（アミノ酸）に対応する（表１５）。
2021522307.tif 000019
2021522307.tif 000020
【０２５３】
図４Ａ〜４Ｃは、提案された結合部位の図を示す。タウマチンの受容体へのドッキングをシミュレーションすると、受容体上に高い確率の３つの結合部位が見出された。シミュレーションの過程において、数多くのドッキング予測実験を行い、低エネルギーの結果をクラスター化する。図４Ａ〜４Ｃは、３つの部位、及びこれらの部位上でのタウマチンのクラスター化を示す。
【図１】
2021522307.tif 000021
【図２】
2021522307.tif 000022
【図３】
2021522307.tif 000023
【図４Ａ】
2021522307.tif 000024
【図４Ｂ】
2021522307.tif 000025
【図４Ｃ】
2021522307.tif 000026
【配列表】
2021522307000001.app
【国際調査報告】
2021522307.tif 000027
2021522307.tif 000028
2021522307.tif 000029
2021522307.tif 000030