(57)【要約】  本発明は、ある特定の波数範囲、より具体的には、ある特定の特徴的な波数における、痰試料などの体液試料のフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）スペクトルを分析することに基づく、体液中のアルギネートオリゴマーを検出するための定性的方法および定量的方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度を求める方法であって、該方法は、
（ｉ）前記体液試料について、以下の波数範囲
（ａ）１５９６ｃｍ−１〜１６０６ｃｍ−１、
（ｂ）１４０７ｃｍ−１〜１４１７ｃｍ−１、
（ｃ）１１２０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１、
（ｄ）１０８１ｃｍ−１〜１０９１ｃｍ−１、
（ｅ）１０２３ｃｍ−１〜１０３３ｃｍ−１、および
（ｆ）９４３ｃｍ−１〜９５３ｃｍ−１
のうちの１つ以上から選択される１つ以上の波数における、１つ以上の正規化ＩＲ吸光度値、１つ以上の正規化ＩＲ透過率値、１つ以上の二次微分ＩＲ吸光度値、または１つ以上の二次微分ＩＲ透過率値を取得することと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で選択された前記１つ以上の波数について、様々な既知量の前記アルギネートオリゴマーを含有する複数の前記体液試料についての対応するＩＲ吸光度値、ＩＲ透過率値、二次微分ＩＲ吸光度値、または二次微分ＩＲ透過率値を提供することと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で提供された前記値における、ステップ（ｉ）で取得した前記値の相対位置を求めることによって、前記体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度を求めることと
を含む、方法。
【請求項２】
（ｉ）前記（ａ）の波数範囲は、１５９７ｃｍ−１〜１６０５ｃｍ−１、１５９８ｃｍ−１〜１６０４ｃｍ−１、１５９９ｃｍ−１〜１６０３ｃｍ−１、１６００ｃｍ−１〜１６０２ｃｍ−１、もしくは約１６０１ｃｍ−１であり、
（ｉｉ）前記（ｂ）の波数範囲は、１４０８ｃｍ−１〜１４１６ｃｍ−１、１４０９ｃｍ−１〜１４１５ｃｍ−１、１４１０ｃｍ−１〜１４１４ｃｍ−１、１４１１ｃｍ−１〜１４１３ｃｍ−１、もしくは約１４１２ｃｍ−１であり、
（ｉｉｉ）前記（ｃ）の波数範囲は、１１２１ｃｍ−１〜１１２９ｃｍ−１、１１２２ｃｍ−１〜１１２８ｃｍ−１、１１２３ｃｍ−１〜１１２７ｃｍ−１、１１２４ｃｍ−１〜１１２６ｃｍ−１、もしくは約１１２５ｃｍ−１であり、
（ｉｖ）前記（ｄ）の波数範囲は、１０８２ｃｍ−１〜１０９０ｃｍ−１、１０８３ｃｍ−１〜１０８９ｃｍ−１、１０８４ｃｍ−１〜１０８８ｃｍ−１、１０８５ｃｍ−１〜１０８７ｃｍ−１、もしくは約１０８６ｃｍ−１であり、
（ｖ）前記（ｅ）の波数範囲は、１０２４ｃｍ−１〜１０３２ｃｍ−１、１０２５ｃｍ−１〜１０３１ｃｍ−１、１０２６ｃｍ−１〜１０３０ｃｍ−１、１０２７ｃｍ−１〜１０２９ｃｍ−１、もしくは約１０２８ｃｍ−１であり、および／または
（ｖｉ）前記（ｆ）の波数範囲は、９４４ｃｍ−１〜９５２ｃｍ−１、９４５ｃｍ−１〜９５１ｃｍ−１、９４６ｃｍ−１〜９５０ｃｍ−１、９４７ｃｍ−１〜９４９ｃｍ−１、もしくは約９４８ｃｍ−１である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
様々な既知量の前記アルギネートオリゴマーを含有する複数の前記体液試料についての前記対応するＩＲ吸光度値、ＩＲ透過率値、二次微分ＩＲ吸光度値、または二次微分ＩＲ透過率値は、好都合には、表形式で、またはデータマトリックスとして、または、様々な既知量の前記アルギネートオリゴマーを含有する前記複数の体液試料それぞれにおける前記様々なアルギネートオリゴマー濃度を一方の次元に配置した、二次元デカルト座標系におけるデカルト座標として、配置される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
様々な既知量の前記アルギネートオリゴマーを含有する複数の前記体液試料についての前記対応するＩＲ吸光度値、ＩＲ透過率値、二次微分ＩＲ吸光度値、または二次微分ＩＲ透過率値は、様々な既知量の前記アルギネートオリゴマーを含有する前記複数の体液試料それぞれにおける前記アルギネートオリゴマー濃度を一方の軸に配置した検量線として提供される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＲ吸光度値、ＩＲ透過率値、二次微分ＩＲ吸光度値、または二次微分ＩＲ透過率値のうちの１つ以上は、前記波数範囲のうちの１つ以上を含む連続したＩＲスペクトル、好ましくは４０００ｃｍ−１〜４５０ｃｍ−１、１８００ｃｍ−１〜７００ｃｍ−１、１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１、または１１００ｃｍ−１〜１０００ｃｍ−１の連続したスペクトルの一部またはその複数の部分として提供される、請求項１から請求項４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度を求める方法であって、該方法は、
（ａ）（ｉ）  約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルである、前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルを取得することと、
（ａ）（ｉｉ）  前記体液試料についての第１のスペクトルが吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトルであり、または前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルが透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについての第１のＩＲスペクトルを提供することと、
（ａ）（ｉｉｉ）  前記体液試料についての前記第１のＩＲスペクトルおよび前記アルギネートオリゴマーについての前記第１のＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって第１の相関係数を求めることと、
（ａ）（ｉｖ）  様々な既知量の前記アルギネートオリゴマーを含有する複数の前記体液試料についての対応する相関係数を提供することと、
（ａ）（ｖ）  ステップ（ａ）（ｉｉｉ）で取得した前記第１の相関係数の、ステップ（ａ）（ｉｖ）の前記相関係数の中での相対位置を求めることによって、前記体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度を求めること、または
（ｂ）（ｉ）  約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記体液試料についての第２のＩＲスペクトルを取得することと、
（ｂ）（ｉｉ）  前記体液試料についての第２のスペクトルが吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトルであり、または前記体液試料についての第２のスペクトルが透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについての第２のＩＲスペクトルを提供することと、
（ｂ）（ｉｉｉ）  前記体液試料についての前記第２のＩＲスペクトルおよび前記アルギネートオリゴマーについての前記第２のＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって第２の相関係数を求めることと、
（ｂ）（ｉｖ）  様々な既知量の前記アルギネートオリゴマーを含有する複数の前記体液試料についての対応する相関係数を提供することと、
（ｂ）（ｖ）  ステップ（ｂ）（ｉｉｉ）で取得した前記第２の相関係数の、ステップ（ｂ）（ｉｖ）の前記相関係数の中での相対位置を求めることによって、前記体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度を求めることと
を含む、方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）（ｉｖ）またはステップ（ｂ）（ｉｖ）の前記対応する相関係数は、表形式で、またはデータマトリックスとして、または、様々な既知量の前記アルギネートオリゴマーを含有する前記複数の体液試料それぞれにおける前記アルギネートオリゴマー濃度を一方の次元に配置した、二次元デカルト座標系におけるデカルト座標として、配置される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）（ｉｖ）またはステップ（ｂ）（ｉｖ）の前記対応する相関係数は、様々な既知量の前記アルギネートオリゴマーを含有する前記複数の体液試料それぞれにおける前記アルギネートオリゴマー濃度を一方の軸に配置した検量線として提供される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度を求める方法であって、該方法は、
（ｉ）約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルである、前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルを取得することと、
（ｉｉ）約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記体液試料についての第２のＩＲスペクトルを取得することと、
（ｉｉｉ）前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルが吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトルであり、または前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルが透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについての第１のＩＲスペクトルを提供することと、
（ｉｖ）前記体液試料についての第２のＩＲスペクトルがＩＲ吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトルであり、または前記体液試料についての第２のＩＲスペクトルがＩＲ透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについての第２のＩＲスペクトルを提供することと、
（ｖ）前記体液試料についての前記第１のＩＲスペクトルおよび前記アルギネートオリゴマーについての前記第１のＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって第１の相関係数を求めることと、
（ｖｉ）前記体液試料についての前記第２のＩＲスペクトルおよび前記アルギネートオリゴマーについての前記第２のＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって第２の相関係数を求めることと、
（ｖｉｉ）様々な既知濃度のアルギネートオリゴマーを含有する複数の前記体液試料についての対応する第１の相関係数および第２の相関係数を、２次元または３次元のデカルト座標系におけるデカルト座標として提供することと、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の前記デカルト座標系における、ステップ（ｖ）およびステップ（ｖｉ）で取得した前記第１の相関係数および前記第２の相関係数を含むデカルト座標の相対位置を求めることによって、前記体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度を求めることと
を含む、方法。
【請求項１０】
体液試料中のアルギネートオリゴマーの有無を判定する方法であって、該方法は、
（ｉ）  約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルである、前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルを取得することと、
（ｉｉ）  約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記体液試料についての第２のＩＲスペクトルを取得することと、
（ｉｉｉ）  前記体液試料についての第１のスペクトルが吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトルであり、または前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルが透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについての第１のＩＲスペクトルを提供することと、
（ｉｖ）  前記体液試料についての第２のスペクトルが吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトルであり、または前記体液試料についての第２のスペクトルが透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについての第２のＩＲスペクトルを提供することと、
（ｖ）  前記体液試料についての前記第１のＩＲスペクトルおよび前記アルギネートオリゴマーについての前記第１のＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって第１の相関係数を求めることと、
（ｖｉ）  前記体液試料についての前記第２のＩＲスペクトルおよび前記アルギネートオリゴマーについての前記第２のＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって第２の相関係数を求めることと、
（ｖｉｉ）  アルギネートオリゴマーを含有する複数の前記体液試料についての対応する第１の相関係数および第２の相関係数と、かつアルギネートオリゴマーを含有しない複数の前記体液試料についての対応する第１の相関係数および第２の相関係数とを、２次元または３次元のデカルト座標系におけるデカルト座標として提供することと、
（ｖｉｉｉ）  ステップ（ｖｉｉ）の前記デカルト座標系における、ステップ（ｖ）およびステップ（ｖｉ）で取得した前記第１の相関係数および前記第２の相関係数を含むデカルト座標の相対位置を求めることによって、前記体液試料中のアルギネートオリゴマーの有無の判定を行うことであって、
（ａ）  ステップ（ｖ）およびステップ（ｖｉ）で取得した前記第１の相関係数および前記第２の相関係数を含む前記デカルト座標が、アルギネートオリゴマーを含有しない前記体液試料のデカルト座標と同位置に存在することが、前記試料がアルギネートオリゴマーを含有しないことを示し、
（ｂ）  ステップ（ｖ）およびステップ（ｖｉ）で取得した前記第１の相関係数および前記第２の相関係数を含む前記デカルト座標が、アルギネートオリゴマーを含有する前記体液試料のデカルト座標と同位置に存在することが、前記試料がアルギネートオリゴマーを含有することを示す、判定を行うことと
を含む、方法。
【請求項１１】
体液試料中のアルギネートオリゴマーの有無を判定する、請求項１０に記載の方法であって、該方法は、
（ｉ）  約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルである、前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルを取得することと、
（ｉｉ）  約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記体液試料についての第２のＩＲスペクトルを取得することと、
（ｉｉｉ）  前記体液試料についての第１のスペクトルが吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトルであり、または前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルが透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについての第１のＩＲスペクトルを提供することと、
（ｉｖ）  前記体液試料についての第２のスペクトルがＩＲ吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトルであり、または前記体液試料についての第２のスペクトルが透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについての第２のＩＲスペクトルを提供することと、
（ｖ）  前記体液試料についての前記第１のＩＲスペクトルおよび前記アルギネートオリゴマーについての前記第１のＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって第１の相関係数を求めることと、
（ｖｉ）  前記体液試料についての前記第２のＩＲスペクトルおよび前記アルギネートオリゴマーについての前記第２のＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって第２の相関係数を求めることと、
（ｖｉｉ）  線形予測モデルである式Ｉ
【数３】
2021533352.tif 000010
のＸとして、ステップ（ｖ）の前記第１の相関係数を入力し、Ｙの値を求めることと
を含み、
（ｖｉｉｉ）  Ｙの値がステップ（ｖｉ）の前記第２の相関係数以下であることが、前記アルギネートオリゴマーが前記体液試料中に存在することの指標となり、Ｙの値がステップ（ｖｉ）の前記第２の相関係数よりも大きいことが、前記アルギネートオリゴマーが前記体液試料中に存在しないことの指標となり、前記線形回帰モデルが、
（ａ）  前記アルギネートオリゴマーを含有する複数の前記体液試料および前記アルギネートオリゴマーを含有しない複数の前記体液試料についての、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する１つ以上の正規化ＩＲ吸収スペクトルまたは１つ以上の正規化ＩＲ透過スペクトルを取得すること、
（ｂ）  ステップ（ａ）のスペクトルがＩＲ吸収スペクトルである場合は、前記アルギネートオリゴマーについての、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトルを提供し、またはステップ（ａ）のスペクトルがＩＲ透過スペクトルである場合は、前記アルギネートオリゴマーについての、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルを提供すること、および
（ｃ）  ステップ（ａ）の前記ＩＲスペクトルおよびステップ（ｂ）の前記アルギネートオリゴマーについての前記ＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって、ステップ（ａ）の前記試料のそれぞれについて相関係数を少なくとも１つ求めることと、
（ｄ）  ステップ（ａ）の前記アルギネートオリゴマーを含有する前記複数の体液試料および前記アルギネートオリゴマーを含有しない前記複数の体液試料についての、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する１つ以上のＩＲ吸収スペクトルまたは１つ以上のＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルを取得すること、
（ｅ）  ステップ（ｄ）のスペクトルがＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトルである場合は、前記アルギネートオリゴマーについての、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトルを提供し、またはステップ（ｄ）のスペクトルがＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである場合は、前記アルギネートオリゴマーについての、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルを提供すること、および
（ｆ）  ステップ（ｄ）の前記ＩＲスペクトルを二次微分したスペクトルおよびステップ（ｅ）の前記アルギネートオリゴマーについての前記ＩＲスペクトルを二次微分したスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって、ステップ（ａ）の前記試料のそれぞれについてさらなる相関係数を少なくとも１つ求めることと、
（ｇ）  ステップ（ａ）の前記複数の試料のそれぞれについて、ステップ（ｆ）で求めた前記さらなる相関係数およびステップ（ｃ）で求めた前記相関係数を、二次元デカルト座標系におけるデカルト座標としてプロットすること、および
（ｈ）  前記アルギネートオリゴマーを含有する前記複数の体液試料のデカルト座標および前記アルギネートオリゴマーを含有しない前記複数の体液試料のデカルト座標の最適分離を求めて、前記線形回帰モデルＹ＝ｎＸ＋ｍ（式中、ｎおよびｍは定数であり、Ｘはステップ（ａ）の試料についてステップ（ｃ）で求める相関係数である）によって定義される分離閾値を得ることと
によって準備される、方法。
【請求項１２】
前記ノンパラメトリックな相関分析は、スピアマンの順位相関分析、ケンドールのタウ相関分析、および／または点双列相関分析である、請求項６から請求項１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
体液試料中のアルギネートオリゴマーの有無を判定する方法であって、該方法は、
（ｉ）約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記体液試料についての赤外（ＩＲ）スペクトルを取得することと、
（ｉｉ）前記体液試料についてのＩＲスペクトルが吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトルであり、または前記体液試料についてのＩＲスペクトルが透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルを提供することと、
（ｉｉｉ）前記体液試料についてのＩＲスペクトルと、前記アルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルとの比較を行うことであって、（ａ）前記アルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルと一致する前記体液試料についてのＩＲスペクトルが、前記アルギネートオリゴマーが前記体液試料中に存在することの指標となり、（ｂ）前記アルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルと一致しない前記体液試料についてのＩＲスペクトルが、前記アルギネートオリゴマーが前記体液試料中に存在しないことの指標となる、比較を行うことと
を含む、方法。
【請求項１４】
前記試料は、血液、脳脊髄液、糞便、胃液、リンパ、粘液、血漿、膿、唾液、血清、精液、汗、涙、膣分泌液、嘔吐物、尿、および創傷滲出液である、請求項１から請求項１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
前記粘液は、痰である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＩＲ吸光度値もしくはＩＲ透過率値、またはＩＲ吸収スペクトルもしくはＩＲ透過スペクトルは、フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光計によって、好ましくはＡＴＲ−ＦＴＩＲ分光計または透過ＦＴＩＲ分光計によって準備されてもよい、請求項１から請求項１５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１７】
前記正規化されたＩＲ吸光度値もしくは正規化されたＩＲ透過率値、または正規化されたＩＲ吸収スペクトルもしくは正規化されたＩＲ透過スペクトルは、最小最大正規化またはベクトル正規化によって正規化される、請求項１から請求項１２および請求項１４から請求項１７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１８】
正規化は、アミドＩ波数における吸光度または透過率に基づいて行われ、好ましくは、前記アミドＩ波数が、１６３５ｃｍ−１〜１６４５ｃｍ−１、１６３７ｃｍ−１〜１６４３ｃｍ−１、１６３９ｃｍ−１〜１６４１ｃｍ−１、または約１６４０ｃｍ−１である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験体は、感染症、菌血症、敗血症、敗血症性ショック、火傷、急性創傷、慢性創傷、上皮もしくは内皮の分泌物の減少もしくは抑制またはその分泌物クリアランスの低下もしくは抑制、ＣＯＰＤ、ＣＯＡＤ、ＣＯＡＰ、気管支炎、嚢胞性線維症、ＣＦＴＲ遺伝子変異によるヘテロ接合性、肺気腫、気管支拡張症、肺癌、喘息、肺炎、または洞炎のある被験体、あるいは医療機器を装着した被験体、あるいは抗凝固療法を必要とする被験体、あるいは喫煙者である、請求項１から請求項１８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２０】
前記アルギネートオリゴマーの平均分子量は、３５，０００ダルトン未満であり、好ましくは３０，０００ダルトン未満、２５，０００ダルトン未満、または２０，０００ダルトン未満である、請求項１から請求項１９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２１】
前記アルギネートオリゴマーの重合度（ＤＰ）または数平均重合度（ＤＰｎ）は、
（ｉ）４〜１００、４〜７５、４〜５０、４〜３５、４〜３０、４〜２５、４〜２２、４〜２０、４〜１８、４〜１６、または４〜１４、
（ｉｉ）５〜５０、５〜３５、５〜３０、５〜２５、５〜２２、５〜２０、５〜１８、５〜１６、または５〜１４、
（ｉｉｉ）６〜５０、６〜３５、６〜３０、６〜２５、６〜２２、６〜２０、６〜１８、６〜１６または６〜１４、あるいは
（ｉｖ）８〜５０、８〜３５、８〜３０、８〜２５、１０〜２５、１０〜２２、１０〜２０、１０〜１８、または１０〜１５
である、請求項１から請求項２６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２２】
前記アルギネートオリゴマーは、少なくとも７０％がＧ残基であるか、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％がＧ残基であり、好ましくは、前記アルギネートオリゴマーのＧ残基のうちの少なくとも８０％は、Ｇブロック内に配置されている、請求項１から請求項２１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２３】
前記アルギネートオリゴマーの数平均重合度は、５〜２０の範囲であり、グルロネート画分（ＦＧ）は、少なくとも０．８５であり、マンヌロネート画分（ＦＭ）は、０．１５以下である、請求項１から請求項２２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２４】
前記アルギネートオリゴマーは、少なくとも７０％がＭ残基であるか、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％がＭ残基であるか、または１００％がＭ残基であり、好ましくは、前記アルギネートオリゴマーのＭ残基のうちの少なくとも８０％は、Ｍブロック内に配置されている、請求項１から請求項２１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２５】
請求項１から請求項２４のいずれか一つに記載の方法を行うように構成された、好ましくは携帯型または手持ちサイズである、赤外分光計。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液中のアルギネートオリゴマーを検出する方法に関する。定性的方法および定量的方法のいずれもが提供される。アルギネートオリゴマーは、治療薬として提案されており、例えば、アルギネートオリゴマー治療法における投与法および／または薬物動態を判定し、モニターし、かつ評価するなど、このような薬品が投与される被験体の体内における、薬品の分布および／または量をモニターするのに、本発明の方法が用いられ得る。本発明の方法は、ある特定の波数範囲、より具体的には、ある特定の特徴的な波数における、痰試料などの体液試料のフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）スペクトルを分析することに基づく。
【背景技術】
【０００２】
アルギネートは、臨床用途（例えば、薬剤の担体として創傷被覆材に、また、抗胸焼け製剤に用いる）および非臨床用途（例えば、調理に用いる）のいずれにおいても多くの用途があることが見出された、天然多糖である。アルギネートは、β−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）および／またはそのＣ−５エピマーであるα−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）が（１−４）結合した直鎖ポリマーである。アルギネートの一次構造は、大きく変化し得る。Ｍ残基およびＧ残基は、Ｍ残基またはＧ残基が連続するホモポリマーブロックや、Ｍ残基およびＧ残基が交互に並ぶブロックとして組織化され、これらのブロック構造の間に単一のＭ残基又はＧ残基が見られることがある。アルギネート分子は、これらの構造のうちのいくつか、またはそのすべてを含み得、このような構造は、ポリマー全体に均一に分布しない場合もある。極端な場合、グルロン酸のホモポリマー（ポリグルロネート）又はマンヌロン酸のホモポリマー（ポリマンヌロネート）が存在する。
【０００３】
アルギネートは、典型的には、海産褐藻類（例えば、ダービリア属、レッソニア属、およびラミナリア属に属する何らかの種）や、緑膿菌およびアゾトバクター・ビネランジイといった細菌などの天然源から、大きな高分子量ポリマー（例えば、平均分子量が３００，０００ダルトン〜５００，０００ダルトンの範囲）として単離される。しかしながら、このような大きなアルギネートポリマーは、例えば、化学的加水分解または酵素加水分解により分解、または分割され、例えば３５，０００ダルトン未満の低分子量のアルギネート構造を産生し得るということが知られている。ＣＦおよび他の呼吸器疾患の治療に用いること（ＷＯ２００７／０３９７５４、ＷＯ２００８／１２５８２８、およびＷＯ２０１５／１２８４９５を参照）、またはバイオフィルム（ＷＯ２００９／０６８８４１）および多剤耐性菌（ＷＯ２０１０／１３９９５７）に対抗するために用いることが提案されたのは、この範囲の大きさのアルギネート分子（本明細書および当該技術分野においては、アルギネートオリゴマーと称する）である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００７／０３９７５４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００８／１２５８２８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１５／１２８４９５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００９／０６８８４１号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２０１０／１３９９５７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このようなアルギネートオリゴマーの用途のために、アルギネートオリゴマーが投与される被験体の体内における、アルギネートオリゴマーの量および分布をモニターする方法の必要性が生じている。このような手法は、個々の被験体毎に効果的かつ安全な投与法を決定し、被験体を治療する期間中、このような治療計画をモニターするのに有用である。また、このような手法は、アルギネートオリゴマーの薬物動態を分析するのにも有用であり、ひいては研究用途で用いられる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らは、これまでに、アルギネートオリゴマーが独特で再現性のある赤外（ＩＲ）スペクトルを有しており、驚くべきことに、痰などの体液のような複合的分子環境におけるアルギネートオリゴマーの有無を、精度良くかつ感度良く判定するのみならず、このような体液中のアルギネートオリゴマー濃度を、精度良くかつ感度良く求めるのに、このスペクトルが用いられ得るということを見出した。より具体的には、発明者らは、アルギネートオリゴマーが、特に１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数範囲において、特徴的で容易に検出可能なＩＲ吸収スペクトルまたはＩＲ透過スペクトルを有しており、このようなスペクトルと、１６０１±５ｃｍ−１、１４１２±５ｃｍ−１、１１２５±５ｃｍ−１、１０８６±５ｃｍ−１、１０２８±５ｃｍ−１、および９４８±５ｃｍ−１における各ＩＲ吸収値またはＩＲ透過値とによって、例えば体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度の情報などの特に有用な情報が提供され得るということを見出した。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、受診４回目（Ｖ４、プラセボ）および受診７回目（Ｖ７、治療）における患者２０８０１００１についての二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトル（１２００ｃｍ−１〜９５０ｃｍ−１）を、二次微分オリゴＧスペクトル（１２００ｃｍ−１〜９５０ｃｍ−１）と並べて示す。上図は、オリゴＧ治療後段階における二次微分スペクトル（実線）およびプラセボ治療後段階における二次微分スペクトル（破線）を示す。下図は、上図の治療後スペクトルとピークがよく一致しているオリゴＧについての二次微分スペクトルを示す。
【図２】図２は、患者の試料についての処理済生ＦＴＩＲ吸収スペクトルと、オリゴＧについての処理済生ＦＴＩＲ吸収スペクトルとの間の相関係数の分布を示す。スクリーニング試料（右下がりの斜線）；プラセボ試料（網目模様）；オリゴＧ治療後試料（右上がりの斜線）。
【図３】図３は、患者の試料についての二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルと、オリゴＧについての二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルとの間の相関係数の分布を示す。スクリーニング試料（右下がりの斜線）；プラセボ試料（網目模様）；オリゴＧ治療後試料（右上がりの斜線）。
【図４】図４は、生ＦＴＩＲ吸収スペクトルおよび二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルについての痰試料とオリゴＧとの間の相関係数をすべて同時に示す散布図である。黒い線は、治療段階の試料（黒菱形）と、プラセボ段階またはスクリーニング／０日目段階の試料（それぞれ、白菱形および白丸）とを最も適切に分離するものであり、オリゴＧの有無を予測する本発明の線形予測モデルの元となる（Ｙ＝−１．９６４３Ｘ＋１．７２８６）。
【図５】図５は、オリゴＧ（灰色）、コントロールのＣＦ痰（黒）、および０．０２％〜２０％まで漸進的に濃度を上昇させたオリゴＧとインキュベートしたＣＦ痰（短鎖線：０．０２％；一点長鎖線：０．０５％；中鎖線：０．１％；二点長鎖線：０．２％；点線：０．５％；長鎖線：１．０％；二点中鎖線：１．５％；超長鎖線：２．０％）について、ベクトル正規化し、ベースライン補正を行ったＦＴＩＲ吸収スペクトルの１８００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの範囲を示す。
【図６】図６は、オリゴＧ（灰色）、コントロールのＣＦ痰（黒）、および０．０２％〜２０％まで漸進的に濃度を上昇させたオリゴＧとインキュベートしたＣＦ痰（短鎖線：０．０２％；一点長鎖線：０．０５％；中鎖線：０．１％；二点長鎖線：０．２％；点線：０．５％；長鎖線：１．０％；二点中鎖線：１．５％；超長鎖線：２．０％）について、ベクトル正規化し、ベースライン補正を行ったＦＴＩＲ吸収スペクトルの１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの範囲を示す。
【図７】図７は、オリゴＧ（灰色）、コントロールのＣＦ痰（黒）、および０．０２％〜２０％まで漸進的に濃度を上昇させたオリゴＧとインキュベートしたＣＦ痰（短鎖線：０．０２％；一点長鎖線：０．０５％；中鎖線：０．１％；二点長鎖線：０．２％；点線：０．５％；長鎖線：１．０％；二点中鎖線：１．５％；超長鎖線：２．０％）について、二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルの１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの範囲を示す。
【図８】図８は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１６０１ｃｍ−１におけるＦＴＩＲ吸光度値を示す。
【図９】図９は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１４１２ｃｍ−１におけるＦＴＩＲ吸光度値を示す。
【図１０】図１０は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１１２５ｃｍ−１におけるＦＴＩＲ吸光度値を示す。
【図１１】図１１は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１０８６ｃｍ−１におけるＦＴＩＲ吸光度値を示す。
【図１２】図１２は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１０２８ｃｍ−１におけるＦＴＩＲ吸光度値を示す。
【図１３】図１３は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての９４８ｃｍ−１におけるＦＴＩＲ吸光度値を示す。
【図１４】図１４は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数における生ＦＴＩＲ吸収スペクトルと、オリゴＧについての１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数における生ＦＴＩＲ吸収スペクトルとの間の相関に関するスピアマンのロー値を示す。
【図１５】図１５は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数における二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルと、オリゴＧについての１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数における二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルとの間の相関に関するスピアマンのロー値を示す。
【図１６】図１６は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数における二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルと、オリゴＧについての１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数における二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルとの間の相関に関するスピアマンのロー値を、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数における生ＦＴＩＲ吸収スペクトルと、オリゴＧについての１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数における生ＦＴＩＲ吸収スペクトルとの間の相関に関するスピアマンのロー値に対してプロットしたものを示す。コントロール痰（ばつ印）；０％オリゴＧ（黒菱形）；０．０２％オリゴＧ（白四角）；０．０５％オリゴＧ（白菱形）；０．１％オリゴＧ（丸）；０．２％オリゴＧ（黒三角）；０．５％オリゴＧ（白三角）；１．０％オリゴＧ（逆三角）；１．５％オリゴＧ（黒四角）；２．０％オリゴＧ（黒丸）。データポイントは、オリゴＧ濃度に応じて集まっている。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
したがって、本発明は、第１の態様として、体液試料中のアルギネートオリゴマーの有無を判定する方法であって、該方法は、
（ｉ）約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記体液試料についての赤外（ＩＲ）スペクトルを取得することと、
（ｉｉ）前記体液試料についてのＩＲスペクトルが吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトルであり、前記体液試料についてのＩＲスペクトルが透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルを提供することと、
（ｉｉｉ）前記体液試料についてのＩＲスペクトルと、前記アルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルとの比較を行うことであって、（ａ）前記アルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルと一致する前記体液試料についてのＩＲスペクトルが、前記アルギネートオリゴマーが前記体液試料中に存在することの指標となり、（ｂ）前記アルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルと一致しない前記体液試料についてのＩＲスペクトルが、前記アルギネートオリゴマーが前記体液試料中に存在しないことの指標となる、比較を行うことと
を含む、方法を提供する。
【０００９】
当業者であれば、ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）を、任意の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいということをすぐに理解するであろう。
【００１０】
ＩＲ吸収スペクトルまたはＩＲ透過スペクトルは、複数の波数におけるＩＲ吸光度またはＩＲ透過率の一連の測定値である。本発明によると、複数の測定値は、約１２００ｃｍ−１の波数〜約９００ｃｍ−１の波数において得られるものであり、例えば１２００±２０ｃｍ−１、１２００±１５ｃｍ−１、１２００±１０ｃｍ−１、または１２００±５ｃｍ−１から、９００±２０ｃｍ−１、９００±１５ｃｍ−１、９００±１０ｃｍ−１、または９００±５ｃｍ−１、より具体的には、１２２０ｃｍ−１、１２１９ｃｍ−１、１２１８ｃｍ−１、１２１７ｃｍ−１、１２１６ｃｍ−１、１２１５ｃｍ−１、１２１４ｃｍ−１、１２１３ｃｍ−１、１２１２ｃｍ−１、１２１１ｃｍ−１、１２１０ｃｍ−１、１２０９ｃｍ−１、１２０８ｃｍ−１、１２０７ｃｍ−１、１２０６ｃｍ−１、１２０５ｃｍ−１、１２０４ｃｍ−１、１２０３ｃｍ−１、１２０１ｃｍ−１、１２００ｃｍ−１、１１９９ｃｍ−１、１１９８ｃｍ−１、１１９７ｃｍ−１、１１９６ｃｍ−１、１１９５ｃｍ−１、１１９４ｃｍ−１、１１９３ｃｍ−１、１１９２ｃｍ−１、１１９１ｃｍ−１、１１９０ｃｍ−１、１１８９ｃｍ−１、１１８８ｃｍ−１、１１８７ｃｍ−１、１１８６ｃｍ−１、１１８５ｃｍ−１、１１８４ｃｍ−１、１１８３ｃｍ−１、１１８２ｃｍ−１、１１８１ｃｍ−１、または１１８０ｃｍ−１の波数から、９２０ｃｍ−１、９１９ｃｍ−１、９１８ｃｍ−１、９１７ｃｍ−１、９１６ｃｍ−１、９１５ｃｍ−１、９１４ｃｍ−１、９１３ｃｍ−１、９１２ｃｍ−１、９１１ｃｍ−１、９１０ｃｍ−１、９０９ｃｍ−１、９０８ｃｍ−１、９０７ｃｍ−１、９０６ｃｍ−１、９０５ｃｍ−１、９０４ｃｍ−１、９０３ｃｍ−１、９０２ｃｍ−１、９０１ｃｍ−１、９００ｃｍ−１、８９９ｃｍ−１、８９８ｃｍ−１、８９７ｃｍ−１、８９６ｃｍ−１、８９５ｃｍ−１、８９４ｃｍ−１、８９３ｃｍ−１、８９２ｃｍ−１、８９１ｃｍ−１、８９０ｃｍ−１、８８９ｃｍ−１、８８８ｃｍ−１、８８７ｃｍ−１、８８６ｃｍ−１、８８５ｃｍ−１、８８４ｃｍ−１、８８３ｃｍ−１、８８２ｃｍ−１、８８１ｃｍ−１、または８８０ｃｍ−１の波数において得られるものである。これらの様々な範囲端点から派生するあらゆる範囲が、具体的に検討される。
【００１１】
本発明によると、スペクトルを構成する複数のＩＲ吸光度またはＩＲ透過率の測定値の数は、本明細書で説明するような、意味のある相関分析を可能にするのに十分な数である。測定値は、不連続な波数において、または波数間の不連続な点において、取得されてもよいし、複数の波数にわたる連続的な測定値であってもよいし、両者の組み合わせであってもよい。スペクトルは、不連続なものであってもよく、また測定値は、均等に離れていない波数において得られるものであってもよいし、均等に離れていない波数間の点において得られるものであってもよい。スペクトルは、本発明の波数範囲内に由来する部分として提供されてもよい。このような部分は、均等に離れている必要はない。他の実施形態において、スペクトルは、より広いスペクトルとして提供されてもよく、この場合、本発明の波数範囲に注目することで、適切な情報が得られる。ある実施形態において、選択される波数範囲は、有効なベースライン補正の計算を可能にし得るスペクトル領域を含む。
【００１２】
ＩＲスペクトルを二次微分したスペクトルは、基本となるＩＲ吸光度／ＩＲ透過率のデータに対して特定の数学的分解を行ったものであり、当業者であればよく知っており、慣行的に行うものであろう。要するに、スペクトル内の定義された波数領域、すなわちウインドウにわたって変化率を算出することによって、微分スペクトルが得られる。このウインドウは、スペクトルにわたって、段階的に移動する。サビツキー・ゴーレイのアルゴリズムを用いて、微分スペクトルを算出する際のパラメータを定義する。用途に応じて、異なる次数の微分スペクトルを算出することができる。二次微分スペクトルを算出することによって、広いピークを構成するより小さいピークの解像度が上昇する。典型的には、二次微分したスペクトルを含む微分スペクトルは、スペクトルを準備するのに用いた機器から直接得られたスペクトル、すなわち、慣行的なバックグラウンドの補正を超える実質的な処理を行っていないスペクトルから算出される。他の実施形態において、二次微分したスペクトルは、例えば導関数の次数を０としたサビツキー・ゴーレイのアルゴリズムを用いて、平滑化前演算を行ったＩＲ吸収スペクトル／ＩＲ透過スペクトルから算出されてもよい。
【００１３】
体液試料についてのＩＲスペクトルとアルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルとの比較を行うこと、およびこの２つの間の一致度を評価することは、定性的プロセスであってもよいし、半定量的プロセスであってもよいし、定量的プロセスであってもよい。
【００１４】
本発明の全般的な文脈において、あるＩＲスペクトルと別のＩＲスペクトルとが一致することは、当該ＩＲスペクトルと基準となるＩＲスペクトルとが類似している（例えば、実質的に、または本質的に、同一である）ことである。したがって、あるＩＲスペクトルが、基準となるＩＲスペクトルに類似している、またはそれと実質的に同じである、またはそれと同等である、またはそれに合致もしくは適合する場合、例えば統計的に類似しているまたは統計的に同等である場合、当該ＩＲスペクトルは基準となるＩＲスペクトルに一致している。
【００１５】
本発明のこの態様の実施に際して、アルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルがピークを有する波数において体液試料についてのＩＲスペクトルが１つ以上のピークを含む場合に、体液試料についてのＩＲスペクトルはアルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルに一致しているとみなしてもよい。好ましくは、アルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルがピークを有するすべての波数において、体液試料についてのＩＲスペクトルがピークを含む場合に、スペクトルが一致するとみなしてもよい。
【００１６】
一実施形態において、体液試料についてのＩＲスペクトルとアルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルとは、目視で、または類似の技術援用手段によって、比較される。他の実施形態において、体液試料についてのＩＲスペクトルとアルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルとを比較し、それらが一致しているかどうかを判定するステップが、数学的手法または統計的手法を用いて行われてもよく、これは、一般的に、ソフトウェアによって実行される（すなわち、コンピュータを用いて行われる）。体液試料についてのＩＲスペクトルとアルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルとが、どちらかと言えば統計的に類似しているかどうかが判定されてもよい。
【００１７】
このような比較および一致度の判定を行う統計的または数学的な方法は、当該技術分野において周知であり、広く用いられている。ある実施形態において、例えばスピアマンの順位相関分析、ケンドールのタウ相関分析、および／または点双列相関分析などの、ノンパラメトリックな相関分析が行われてもよい。ある実施形態において、スピアマンの順位相関分析が行われる。
【００１８】
アルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルは、典型的には、本発明の方法を行う前に準備されることが理解されるであろう。したがって、アルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルを「提供すること」は、いくつかの実施形態においては、あらかじめ準備された情報を、例えば既存のデータベースから提供することを意味してもよく、また他の実施形態においては、当該ＩＲスペクトルを本発明の方法の一部として準備するステップのことを意味してもよい。
【００１９】
本発明の方法は、体液試料がアルギネートオリゴマーを含有するかどうかの指標を提供する。したがって、本方法によって、アルギネートオリゴマーを含む体液試料と、アルギネートオリゴマーを含まない体液試料とが区別され得る。換言すると、本方法は、体液試料中のアルギネートオリゴマーを検出する方法とみなされ得る。さらに言えば、本発明の方法は、体液試料がアルギネートオリゴマーを含む「可能性を判定する」、「蓋然性を判定する」、「蓋然性を確認する」、または「蓋然性を評価する」方法とみなされ得る。以下から明らかであるように、このような評価の結果は、数字で表されてもよいし、グラフで表されてもよいし、図解されてもよい。ひいては、それぞれが、定性的であってもよいし、半定量的であってもよいし、定量的であってもよい。
【００２０】
別の態様において、本発明は、体液試料中のアルギネートオリゴマーの有無を判定する方法であって、該方法は、
（ｉ）約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルである、前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルを取得することと、
（ｉｉ）約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記体液試料についての第２のＩＲスペクトルを取得することと、
（ｉｉｉ）前記体液試料についての第１のスペクトルが吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトルであり、前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルが透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについての第１のＩＲスペクトルを提供することと、
（ｉｖ）前記体液試料についての第２のスペクトルが吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトルであり、前記体液試料についての第２のスペクトルが透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについての第２のＩＲスペクトルを提供することと、
（ｖ）前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルおよび前記アルギネートオリゴマーについての第１のＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって第１の相関係数を求めることと、
（ｖｉ）前記体液試料についての第２のＩＲスペクトルおよび前記アルギネートオリゴマーについての第２のＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって第２の相関係数を求めることと、
（ｖｉｉ）アルギネートオリゴマーを含有する複数の前記体液試料についての対応する第１の相関係数および第２の相関係数と、アルギネートオリゴマーを含有しない複数の前記体液試料についての対応する第１の相関係数および第２の相関係数とを、２次元または３次元のデカルト座標系におけるデカルト座標として提供することと、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の前記デカルト座標系における、ステップ（ｖ）およびステップ（ｖｉ）で取得した前記第１の相関係数および前記第２の相関係数を含むデカルト座標の相対位置を求めることによって、前記体液試料中のアルギネートオリゴマーの有無の判定を行うことであって、
（ａ）ステップ（ｖ）およびステップ（ｖｉ）で取得した前記第１の相関係数および前記第２の相関係数を含む前記デカルト座標が、アルギネートオリゴマーを含有しない前記体液試料のデカルト座標と同位置に存在することが、前記試料がアルギネートオリゴマーを含有しないことを示し、
（ｂ）ステップ（ｖ）およびステップ（ｖｉ）で取得した前記第１の相関係数および前記第２の相関係数を含む前記デカルト座標が、アルギネートオリゴマーを含有する前記体液試料のデカルト座標と同位置に存在することが、前記試料がアルギネートオリゴマーを含有することを示す、判定を行うことと
を含む、方法を提供する。
【００２１】
当業者であれば、ステップ（ｉ）からステップ（ｉｖ）およびステップ（ｖｉｉ）、ならびにステップ（ｖ）、ステップ（ｖｉ）およびステップ（ｖｉｉ）のそれぞれを、任意の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいということをすぐに理解するであろう。
【００２２】
アルギネートオリゴマーを含有する複数の体液試料についての対応する第１の相関係数および第２の相関係数を提供することは、ステップ（ｉ）からステップ（ｖｉ）にしたがって準備された相関係数と本質的には同様に、すなわち、同じノンパラメトリックな相関分析を用いて、準備された第１の相関係数および第２の相関係数を提供することを意味するが、アルギネートオリゴマーを含有しているかもしれないし含有していないかもしれない体液の検査試料を用いる代わりに、アルギネートオリゴマーを含有することがわかっている同等の体液試料が用いられるということが理解されるであろう。換言すると、正の基準および負の基準（正の対照および負の対照とも言う）となる体液試料を用いて、対応する第１の相関係数および第２の相関係数が準備される。当業者にとっては、基準となる試料（同等の試料）として用いられる体液試料が、本質的に同じ手法を用いて取得され、その後本質的には同様に保管および管理される検査試料と本質的に同じであるべき、すなわち同じ種類であるべきということは明らかであろう。また、当業者にとっては、基準となる試料に用いられるアルギネートオリゴマーと、検出しようとしているアルギネートオリゴマーとが本質的に同じである場合に、最も正確なモデルが準備されるということも、明らかであろう。
【００２３】
デカルト座標系は、二次元散布図（散布図グラフ）または三次元散布図（散布図グラフ）などのグラフ表示として提供されてもよいし、表形式で提供されてもよいし、データマトリックスとして提供されてもよいし、コンピュータに搭載されるコンピュータ可読形式として提供されてもよい。ある実施形態において、デカルト座標系は二次元系であり、第１の相関係数および第２の相関係数によって、座標が形成される。
【００２４】
検査試料に由来する座標が、実質的に、例えば本質的に、正の基準点の座標または負の基準点の座標の集合によって形成される最も外側の境界上またはその内側にある場合に、同位置に存在するとみなされ得る。これは、任意の適当な集団化分析法または集団化分析アルゴリズムによって判定されてもよい。
【００２５】
特定の実施形態において、アルギネートオリゴマーを含有していることがわかっている体液試料およびアルギネートオリゴマーを含有していないことがわかっている体液試料の対応する分析から生成された線形回帰モデルを適用することによって、同位置に存在することが判定される。したがって、ある実施形態において、本発明は、体液試料中のアルギネートオリゴマーの有無を判定する方法であって、該方法は、
（ｉ）約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルである、前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルを取得することと、
（ｉｉ）約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記体液試料についての第２のＩＲスペクトルを取得することと、
（ｉｉｉ）前記体液試料についての第１のスペクトルが吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトルであり、前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルが透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについての第１のＩＲスペクトルを提供することと、
（ｉｖ）前記体液試料についての第２のスペクトルがＩＲ吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトルであり、前記体液試料についての第２のスペクトルが透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについての第２のＩＲスペクトルを提供することと、
（ｖ）前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルおよび前記アルギネートオリゴマーについての第１のＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって第１の相関係数を求めることと、
（ｖｉ）前記体液試料についての第２のＩＲスペクトルおよび前記アルギネートオリゴマーについての第２のＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって第２の相関係数を求めることと、
（ｖｉｉ）線形予測モデルである式Ｉ
【００２６】
【数１】
2021533352.tif 000002
【００２７】
のＸとして、ステップ（ｖ）の前記第１の相関係数を入力し、Ｙの値を求めることと
を含み、
（ｖｉｉｉ）Ｙの値がステップ（ｖｉ）の前記第２の相関係数以下であることが、前記アルギネートオリゴマーが前記体液試料中に存在することの指標となり、Ｙの値がステップ（ｖｉ）の前記第２の相関係数よりも大きいことが、前記アルギネートオリゴマーが前記体液試料中に存在しないことの指標となり、前記線形回帰モデルが、
（ａ）前記アルギネートオリゴマーを含有する複数の前記体液試料および前記アルギネートオリゴマーを含有しない複数の前記体液試料についての、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する１つ以上の正規化ＩＲ吸収スペクトルまたは１つ以上の正規化ＩＲ透過スペクトルを取得すること、
（ｂ）ステップ（ａ）のスペクトルがＩＲ吸収スペクトルである場合は、前記アルギネートオリゴマーについての、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトルを提供し、ステップ（ａ）のスペクトルがＩＲ透過スペクトルである場合は、前記アルギネートオリゴマーについての、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルを提供すること、および
（ｃ）ステップ（ａ）の前記ＩＲスペクトルおよびステップ（ｂ）の前記アルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって、ステップ（ａ）の前記試料のそれぞれについて相関係数を少なくとも１つ求めることと、
（ｄ）ステップ（ａ）の前記アルギネートオリゴマーを含有する前記複数の体液試料および前記アルギネートオリゴマーを含有しない前記複数の体液試料についての、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する１つ以上のＩＲ吸収スペクトルまたは１つ以上のＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルを取得すること、
（ｅ）ステップ（ｄ）のスペクトルがＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトルである場合は、前記アルギネートオリゴマーについての、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトルを提供し、ステップ（ｄ）のスペクトルがＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである場合は、前記アルギネートオリゴマーについての、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルを提供すること、および
（ｆ）ステップ（ｄ）の前記ＩＲスペクトルを二次微分したスペクトルおよびステップ（ｅ）の前記アルギネートオリゴマーについての前記ＩＲスペクトルを二次微分したスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって、ステップ（ａ）の前記試料のそれぞれについてさらなる相関係数を少なくとも１つ求めることと、
（ｇ）ステップ（ａ）の前記複数の試料のそれぞれについて、ステップ（ｆ）で求めた前記さらなる相関係数およびステップ（ｃ）で求めた前記相関係数を、二次元デカルト座標系におけるデカルト座標としてプロットすること、および
（ｈ）前記アルギネートオリゴマーを含有する前記複数の体液試料のデカルト座標および前記アルギネートオリゴマーを含有しない前記複数の体液試料のデカルト座標の最適分離を求めて、前記線形回帰モデルＹ＝ｎＸ＋ｍ（式中、ｎおよびｍは定数であり、Ｘはステップ（ａ）の試料についてステップ（ｃ）で求める相関係数である）によって定義される分離閾値を得ることと
によって準備される、方法を提供する。
【００２８】
当業者であれば、ステップ（ｉ）からステップ（ｉｖ）、ステップ（ｖ）およびステップ（ｖｉ）、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）、ステップ（ｄ）およびステップ（ｅ）、ならびにステップ（ａ）からステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）からステップ（ｆ）のそれぞれを、任意の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいということをすぐに理解するであろう。
【００２９】
デカルト座標系は、散布図（散布図グラフ）などのグラフ表示として提供されてもよいし、表形式で提供されてもよいし、データマトリックスとして提供されてもよいし、コンピュータに搭載されるコンピュータ可読形式として提供されてもよい。
【００３０】
デカルトデータの最適分離は、任意の適当な手段によって行われてもよい。これは、適切なアルゴリズムを手動で適用することで行われてもよいし、または（for）コンピュータ援用手段によって行われてもよい。
【００３１】
より具体的な実施形態において、本方法は、ステップ（ｉ）からステップ（ｖｉｉｉ）までよりも前に、またはその後に、またはそれと同時に、ステップ（ａ）からステップ（ｈ）を行うことを含むが、これは必須ではなく、典型的には、本発明の方法とは別に、線形予測モデルが求められている。
【００３２】
当業者にとっては、線形予測モデルを準備するのに用いられる体液試料が、本質的に同じ手法を用いて取得され、その後本質的には同様に保管および管理される検査試料と本質的に同じであるべき、すなわち同じ種類であるべきということは明らかであろう。また、当業者にとっては、用いられるアルギネートオリゴマーと、検出しようとしているアルギネートオリゴマーとが本質的に同じである場合に、最も正確なモデルが準備されるということも、明らかであろう。
【００３３】
したがって、試料が、例えばＣＦ患者由来の痰などの痰であり、アルギネートオリゴマーが、９０％〜９５％のＧ残基を含む５個〜２０個のモノマー残基からなるアルギネートオリゴマー（ＤＰｎが１３である、または重量平均分子量が３２００Ｄａである、アルギネートオリゴマーと表現されてもよい）である場合に、線形予測モデルは、Ｙ＝−１．９６Ｘ＋１．７２となり得る。
【００３４】
他の実施形態において、線形回帰モデルによって定義された分離閾値から体液試料の座標のユークリッド距離を算出することによって、体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度が求められ（例えば、定量され）てもよい。
【００３５】
実施例に示すように、本発明の方法によって、８６％以下の感度および９０％以下の特異性で、すなわち、全体の精度として８８％以下の精度で、体液試料中のアルギネートオリゴマーの有無を検出し得る。したがって、ある実施形態において、体液試料中のアルギネートオリゴマーの有無を検出する本発明の方法の感度は、少なくとも７０％であり、例えば、少なくとも、７５％、８０％、８５％、または９０％である。他の実施形態において、体液試料中のアルギネートオリゴマーの有無を検出する本発明の方法の特異性は、少なくとも７５％であり、例えば、少なくとも、８０％、８５％、９０％、または９５％である。他の実施形態において、体液試料中のアルギネートオリゴマーの有無を検出する本発明の方法の全体の精度は、少なくとも７０％であり、例えば、少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％である。
【００３６】
本発明は、さらに、体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度を求める方法であって、該方法は、
（ａ）（ｉ）約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルである、前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルを取得することと、
（ａ）（ｉｉ）前記体液試料についての第１のスペクトルが吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトルであり、前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルが透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについての第１のＩＲスペクトルを提供することと、 
（ａ）（ｉｉｉ）前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルおよび前記アルギネートオリゴマーについての第１のＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって第１の相関係数を求めることと、
（ａ）（ｉｖ）様々な既知量の前記アルギネートオリゴマーを含有する複数の前記体液試料についての対応する相関係数を提供することと、
（ａ）（ｖ）ステップ（ａ）（ｉｉｉ）で取得した前記第１の相関係数の、ステップ（ａ）（ｉｖ）の前記相関係数の中での相対位置を求めることによって、前記体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度を求めることと
を含む、方法、または
（ｂ）（ｉ）約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記体液試料についての第２のＩＲスペクトルを取得することと、
（ｂ）（ｉｉ）前記体液試料についての第２のスペクトルが吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトルであり、前記体液試料についての第２のスペクトルが透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについての第２のＩＲスペクトルを提供することと、
（ｂ）（ｉｉｉ）前記体液試料についての第２のＩＲスペクトルおよび前記アルギネートオリゴマーについての第２のＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって第２の相関係数を求めることと、
（ｂ）（ｉｖ）様々な既知量の前記アルギネートオリゴマーを含有する複数の前記体液試料についての対応する相関係数を提供することと、
（ｂ）（ｖ）ステップ（ｂ）（ｉｉｉ）で取得した前記第２の相関係数の、ステップ（ｂ）（ｉｖ）の前記相関係数の中での相対位置を求めることによって、前記体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度を求めることと
を含む、方法を提供する。
【００３７】
当業者であれば、ステップ（ａ）（ｉ）およびステップ（ａ）（ｉｉ）、ステップ（ａ）（ｉｉｉ）およびステップ（ａ）（ｉｖ）、ステップ（ｂ）（ｉ）およびステップ（ｂ）（ｉｉ）、ならびにステップ（ｂ）（ｉｉｉ）およびステップ（ｂ）（ｉｖ）のそれぞれを、任意の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいということをすぐに理解するであろう。
【００３８】
本発明によると、「アルギネートオリゴマー濃度を求める」方法は、既知の体積の試料において「アルギネートオリゴマーの量を求める」方法、または「アルギネートオリゴマーレベルを求める」方法とみなされてもよい。このような方法は、試料におけるアルギネートオリゴマーの濃度／量を定量または測定する方法とみなされてもよい。他の実施形態においては、半定量的に求められてもよく、このような実施形態において、本方法は、試料におけるアルギネートオリゴマーの濃度／量を推定する方法とみなされてもよい。
【００３９】
本明細書において、様々な既知量のアルギネートオリゴマーを含有する複数の体液試料についての言及は、複数の体液試料であって、そのうちの少なくともいくつかが、異なる既知量のアルギネートオリゴマーをそれぞれ含有し、それによって、様々な既知量のアルギネートオリゴマーを共に提供する、複数の体液試料についての言及であるということが理解されるであろう。
【００４０】
様々な既知量のアルギネートオリゴマーを含有する複数の体液試料についての対応する相関係数を提供することは、ステップ（ａ）（ｉ）からステップ（ａ）（ｉｉｉ）またはステップ（ｂ）（ｉ）からステップ（ｂ）（ｉｉｉ）にしたがって準備された相関係数と本質的には同様に、すなわち、同じノンパラメトリックな相関分析を用いて、準備された相関係数を提供することを意味するが、濃度が未知であるアルギネートオリゴマーを含有する体液の検査試料を用いる代わりに、同等の体液試料であって、そのうちの少なくともいくつかが異なる既知濃度のアルギネートオリゴマーを含有している、体液試料が用いられるということも理解されるであろう。換言すると、基準（または正の対照）となる体液試料を用いて、対応する相関係数が準備される。当業者にとっては、基準となる試料（同等の試料）として用いられる体液試料が、本質的に同じ手法を用いて取得され、その後本質的には同様に保管および管理される検査試料と本質的に同じであるべき、すなわち同じ種類であるべきということは明らかであろう。また、当業者にとっては、基準となる試料に用いられるアルギネートオリゴマーと、検出しようとしているアルギネートオリゴマーとが本質的に同じである場合に、最も正確なモデルが準備されるということも、明らかであろう。
【００４１】
ある実施形態において、対応する相関係数は、好都合には、表形式で、またはデータマトリックス、すなわちデータ要素の二次元アレイとして、または、様々な既知量のアルギネートオリゴマーを含有する複数の体液試料それぞれにおける様々なアルギネートオリゴマー濃度を一方の次元に配置した、二次元デカルト座標系におけるデカルト座標として、配置される。散布図（散布図グラフ）などのグラフ表示であるデカルト座標系の使用は、人による分析には最も適当であり得るが、これは必須ではなく、他の実施形態において、上記の配置のコンピュータ可読形式が、コンピュータによる分析のために提供されてもよい。本明細書において用いられるデカルト座標系のグラフ表示を、単に、標準曲線または検量線と称してもよく、被検査試料のデカルト座標の、このような曲線上における位置は、検査試料におけるアルギネートオリゴマー濃度の指標となる。
【００４２】
本発明は、さらに、体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度を求める方法であって、該方法は、
（ｉ）約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルである、前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルを取得することと、 
（ｉｉ）約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトル、または約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記体液試料についての第２のＩＲスペクトルを取得することと、
（ｉｉｉ）前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルが吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ吸収スペクトルであり、前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルが透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来する正規化ＩＲ透過スペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについての第１のＩＲスペクトルを提供することと、
（ｉｖ）前記体液試料についての第２のＩＲスペクトルがＩＲ吸収スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ吸収スペクトルを二次微分したスペクトルであり、前記体液試料についての第２のＩＲスペクトルがＩＲ透過スペクトルである場合は、約１２００ｃｍ−１〜約９００ｃｍ−１までの波数範囲に由来するＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルである、前記アルギネートオリゴマーについての第２のＩＲスペクトルを提供することと、
（ｖ）前記体液試料についての第１のＩＲスペクトルおよび前記アルギネートオリゴマーについての第１のＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって第１の相関係数を求めることと、
（ｖｉ）前記体液試料についての第２のＩＲスペクトルおよび前記アルギネートオリゴマーについての第２のＩＲスペクトルに対してノンパラメトリックな相関分析を行うことによって第２の相関係数を求めることと、
（ｖｉｉ）様々な既知濃度のアルギネートオリゴマーを含有する複数の前記体液試料についての対応する第１の相関係数および第２の相関係数を、２次元または３次元のデカルト座標系におけるデカルト座標として提供することと、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の前記デカルト座標系における、ステップ（ｖ）およびステップ（ｖｉ）で取得した前記第１の相関係数および前記第２の相関係数を含むデカルト座標の相対位置を求めることによって、前記体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度を求めることと
を含む、方法を提供する。
【００４３】
当業者であれば、ステップ（ｉ）からステップ（ｉｖ）およびステップ（ｖｉｉ）、ステップ（ｖ）、ステップ（ｖｉ）およびステップ（ｖｉｉ）、ならびにステップ（ｖ）およびステップ（ｖｉ）のそれぞれを、任意の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいということをすぐに理解するであろう。
【００４４】
既に述べたように、本明細書において、様々な既知量のアルギネートオリゴマーを含有する複数の体液試料についての言及は、複数の体液試料であって、そのうちの少なくともいくつかが、異なる既知量のアルギネートオリゴマーをそれぞれ含有し、それによって、様々な既知量のアルギネートオリゴマーを共に提供する、複数の体液試料についての言及であるということが理解されるであろう。
【００４５】
様々な既知量のアルギネートオリゴマーを含有する複数の体液試料についての対応する第１の相関係数および第２の相関係数を提供することは、ステップ（ｉ）からステップ（ｖｉ）にしたがって準備された相関係数と本質的には同様に、すなわち、同じノンパラメトリックな相関分析を用いて、準備された第１の相関係数および第２の相関係数を提供することを意味するが、濃度が未知であるアルギネートオリゴマーを含有する体液の検査試料を用いる代わりに、同等の体液試料であって、そのうちの少なくともいくつかが異なる既知濃度のアルギネートオリゴマーを含有している、体液試料が用いられるということも理解されるであろう。換言すると、基準（または正の対照）となる体液試料を用いて、対応する第１の相関係数および第２の相関係数が準備される。当業者にとっては、基準となる試料（同等の試料）として用いられる体液試料が、本質的に同じ手法を用いて取得され、その後本質的には同様に保管および管理される検査試料と本質的に同じであるべき、すなわち同じ種類であるべきということは明らかであろう。また、当業者にとっては、基準となる試料に用いられるアルギネートオリゴマーと、検出しようとしているアルギネートオリゴマーとが本質的に同じである場合に、最も正確なモデルが準備されるということも、明らかであろう。
【００４６】
ある実施形態において、デカルト座標系は二次元系であり、第１の相関係数および第２の相関係数によって、座標が形成される。
【００４７】
ある実施形態において、対応する第１の相関係数および第２の相関係数のデカルト座標（coordinated）は、好都合には、二次元散布図（散布図グラフ）または三次元散布図（散布図グラフ）などのグラフ表示内に配置されるが、これは必須ではなく、他の実施形態において、コンピュータ可読形式が、コンピュータによる分析のために提供されてもよい。本明細書において用いられるデカルト座標系のグラフ表示を、単に、標準曲線または検量線と称してもよく、被検査試料のデカルト座標の、このような曲線上における位置は、検査試料におけるアルギネートオリゴマー濃度の指標となる。
【００４８】
本発明は、さらに、体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度を求める方法であって、該方法は、
（ｉ）前記体液試料について、以下の波数範囲
（ａ）１５９６ｃｍ−１〜１６０６ｃｍ−１、
（ｂ）１４０７ｃｍ−１〜１４１７ｃｍ−１、
（ｃ）１１２０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１、
（ｄ）１０８１ｃｍ−１〜１０９１ｃｍ−１、
（ｅ）１０２３ｃｍ−１〜１０３３ｃｍ−１、および
（ｆ）９４３ｃｍ−１〜９５３ｃｍ−１
のうちの１つ以上から選択される１つ以上の波数における、１つ以上の正規化ＩＲ吸光度値、１つ以上の正規化ＩＲ透過率値、１つ以上の二次微分ＩＲ吸光度値、または１つ以上の二次微分ＩＲ透過率値を取得することと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で選択された前記１つ以上の波数について、様々な既知量の前記アルギネートオリゴマーを含有する複数の前記体液試料についての対応するＩＲ吸光度値、ＩＲ透過率値、二次微分ＩＲ吸光度値、または二次微分ＩＲ透過率値を提供することと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で提供された前記値における、ステップ（ｉ）で取得した前記値の相対位置を求めることによって、前記体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度を求めることと
を含む、方法を提供する。
【００４９】
既に述べたように、本明細書において、様々な既知量のアルギネートオリゴマーを含有する複数の体液試料についての言及は、複数の体液試料であって、そのうちの少なくともいくつかが、異なる既知量のアルギネートオリゴマーをそれぞれ含有し、それによって、様々な既知量のアルギネートオリゴマーを共に提供する、複数の体液試料についての言及であるということが理解されるであろう。
【００５０】
様々な既知量のアルギネートオリゴマーを含有する複数の体液試料についての対応するＩＲ吸光度値、ＩＲ透過率値、二次微分ＩＲ吸光度値、または二次微分ＩＲ透過率値を提供することは、ステップ（ｉ）によるＩＲ吸光度値、ＩＲ透過率値、二次微分ＩＲ吸光度値、または二次微分ＩＲ透過率値と本質的に同様に準備されたＩＲ吸光度値、ＩＲ透過率値、二次微分ＩＲ吸光度値、または二次微分ＩＲ透過率値を提供することを意味するが、濃度が未知であるアルギネートオリゴマーを含有する体液の検査試料を用いる代わりに、同等の体液試料であって、そのうちの少なくともいくつかが異なる既知濃度のアルギネートオリゴマーを含有している、体液試料が用いられるということも理解されるであろう。換言すると、基準（正の対照ともいう）となる体液試料を用いて、対応するＩＲ吸光度値、ＩＲ透過率値、二次微分ＩＲ吸光度値、または二次微分ＩＲ透過率値が準備される。当業者にとっては、基準となる試料（同等の試料ともいう）として用いられる体液試料が、本質的に同じ手法を用いて採取され、その後本質的には同様に保管および管理される検査試料と本質的に同じであるべき、すなわち同じ種類であるべきということは明らかであろう。また、当業者にとっては、基準となる試料に用いられるアルギネートオリゴマーと、検出しようとしているアルギネートオリゴマーとが本質的に同じである場合に、最も正確なモデルが準備されるということも、明らかであろう。
【００５１】
様々な既知量のアルギネートオリゴマーを含有する複数の体液試料についての対応するＩＲ吸光度値、ＩＲ透過率値、二次微分ＩＲ吸光度値、または二次微分ＩＲ透過率値は、典型的には、本発明の方法を行う前に準備されることも理解されるであろう。したがって、様々な既知量のアルギネートオリゴマーを含有する複数の体液試料についての対応するＩＲ吸光度値、ＩＲ透過率値、二次微分ＩＲ吸光度値、または二次微分ＩＲ透過率値を「提供すること」は、いくつかの実施形態においては、あらかじめ準備された情報を、例えば既存のデータベースから提供することを意味してもよく、また他の実施形態においては、様々な既知量のアルギネートオリゴマーを含有する複数の体液試料についての対応するＩＲ吸光度値、ＩＲ透過率値、二次微分ＩＲ吸光度値、または二次微分ＩＲ透過率値を本発明の方法の一部として準備するステップのことを意味してもよい。
【００５２】
ある実施形態において、様々な既知量のアルギネートオリゴマーを含有する複数の体液試料についての対応するＩＲ吸光度値、ＩＲ透過率値、二次微分ＩＲ吸光度値、または二次微分ＩＲ透過率値は、好都合には、表形式で、またはデータマトリックス、すなわちデータ要素の二次元アレイとして、または、様々な既知量のアルギネートオリゴマーを含有する複数の体液試料それぞれにおける様々なアルギネートオリゴマー濃度を一方の次元に配置した、二次元デカルト座標系におけるデカルト座標として、配置される。散布図（散布図グラフ）などのグラフ表示であるデカルト座標系の使用は、人による分析には最も適当であり得るが、これは必須ではなく、他の実施形態において、上記の配置のコンピュータ可読形式が、コンピュータによる分析のために提供されてもよい。本明細書において用いられるデカルト座標系のグラフ表示を、単に、標準曲線または検量線と称してもよく、被検査試料のデカルト座標の、このような曲線上における位置は、検査試料におけるアルギネートオリゴマー濃度の指標となる。
【００５３】
ある実施形態において、（ａ）の波数範囲は、１５９７ｃｍ−１〜１６０５ｃｍ−１であってもよいし、１５９８ｃｍ−１〜１６０４ｃｍ−１であってもよいし、１５９９ｃｍ−１〜１６０３ｃｍ−１であってもよいし、１６００ｃｍ−１〜１６０２ｃｍ−１であってもよいし、約１６０１ｃｍ−１であってもよい。これらの様々な範囲端点から派生する他のあらゆる範囲が、具体的に検討される。
【００５４】
ある実施形態において、（ｂ）の波数範囲は、１４０８ｃｍ−１〜１４１６ｃｍ−１であってもよいし、１４０９ｃｍ−１〜１４１５ｃｍ−１であってもよいし、１４１０ｃｍ−１〜１４１４ｃｍ−１であってもよいし、１４１１ｃｍ−１〜１４１３ｃｍ−１であってもよいし、約１４１２ｃｍ−１であってもよい。これらの様々な範囲端点から派生する他のあらゆる範囲が、具体的に検討される。 
【００５５】
ある実施形態において、（ｃ）の波数範囲は、１１２１ｃｍ−１〜１１２９ｃｍ−１であってもよいし、１１２２ｃｍ−１〜１１２８ｃｍ−１であってもよいし、１１２３ｃｍ−１〜１１２７ｃｍ−１であってもよいし、１１２４ｃｍ−１〜１１２６ｃｍ−１であってもよいし、約１１２５ｃｍ−１であってもよい。これらの様々な範囲端点から派生する他のあらゆる範囲が、具体的に検討される。
【００５６】
ある実施形態において、（ｄ）の波数範囲は、１０８２ｃｍ−１〜１０９０ｃｍ−１であってもよいし、１０８３ｃｍ−１〜１０８９ｃｍ−１であってもよいし、１０８４ｃｍ−１〜１０８８ｃｍ−１であってもよいし、１０８５ｃｍ−１〜１０８７ｃｍ−１であってもよいし、約１０８６ｃｍ−１であってもよい。これらの様々な範囲端点から派生する他のあらゆる範囲が、具体的に検討される。
【００５７】
ある実施形態において、（ｅ）の波数範囲は、１０２４ｃｍ−１〜１０３２ｃｍ−１であってもよいし、１０２５ｃｍ−１〜１０３１ｃｍ−１であってもよいし、１０２６ｃｍ−１〜１０３０ｃｍ−１であってもよいし、１０２７ｃｍ−１〜１０２９ｃｍ−１であってもよいし、約１０２８ｃｍ−１であってもよい。これらの様々な範囲端点から派生する他のあらゆる範囲が、具体的に検討される。
【００５８】
ある実施形態において、（ｆ）の波数範囲は、９４４ｃｍ−１〜９５２ｃｍ−１であってもよいし、９４５ｃｍ−１〜９５１ｃｍ−１であってもよいし、９４６ｃｍ−１〜９５０ｃｍ−１であってもよいし、９４７ｃｍ−１〜９４９ｃｍ−１であってもよいし、約９４８ｃｍ−１であってもよい。これらの様々な範囲端点から派生する他のあらゆる範囲が、具体的に検討される。
【００５９】
ある実施形態において、本態様のステップ（ｉ）は、体液試料について、上記列挙した波数範囲のうちの２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またはすべてから選択された１つ以上の波数において、１つ以上の正規化ＩＲ吸光度値、１つ以上の正規化ＩＲ透過率値、１つ以上の二次微分ＩＲ吸光度値、または１つ以上の二次微分ＩＲ透過率値を取得することを含む。他の実施形態において、波数範囲（ｃ）から波数範囲（ｆ）のうちの１つ、２つ、３つ、または４つが用いられ、例えば（ｄ）および／または（ｅ）が用いられ、特に（ｅ）が用いられる。
【００６０】
本発明のこの態様のある実施形態において、上記列挙した波数範囲におけるＩＲ吸光度、ＩＲ透過率値、二次微分ＩＲ吸光度値、または二次微分ＩＲ透過率値のうちの１つ以上が、連続的なＩＲスペクトルの一部として、または上記列挙した波数範囲のうちの１つ以上を含む、連続的なＩＲスペクトルの複数の部分として、提供される。したがって、本方法は、各試料または各試料の複製物について、上記６つの範囲のうちの１つ以上を含む波数範囲にわたる、例えば４０００ｃｍ−１〜４５０ｃｍ−１の範囲にわたる、または１８００ｃｍ−１〜７００ｃｍ−１、１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１、もしくは１１００ｃｍ−１〜１０００ｃｍ−１などの、先の範囲のうちのより狭い範囲にわたる、ＩＲスペクトルを、準備または生成することによって行われてもよい。
【００６１】
本発明の方法が依拠する波数範囲におけるＩＲ吸収スペクトルまたはＩＲ透過スペクトル、およびＩＲ吸光度値またはＩＲ透過率値は、必要な１つまたは複数の波数範囲のＩＲ光を発生し、ＩＲ吸光度および／またはＩＲ透過率を測定することが可能な任意のＩＲ（赤外）分光計（あるいは、分光光度計ともいい、これらの用語は本明細書において交換可能に用いられる）によって準備されてもよい。分光計は、好ましくは携帯型であり、より好ましくは手持ちサイズである。単一装置を用いるのが好ましいが、これは必須ではない。好ましい実施形態において、フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光計が用いられるが、単色波長の吸光度または透過率を測定する装置が用いられてもよい。さらなる実施形態において、ＩＲ吸光度値／ＩＲ吸収スペクトルまたはＩＲ透過率値／ＩＲ透過スペクトルを準備することは、試料にＩＲ照射を行うために透過法または減衰全反射（ＡＴＲ）法を用いることを、少なくとも部分的に含んでいてもよい。しかしながら、本発明は、決して、ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分光計または透過ＦＴＩＲ分光計の使用に限定されるものではなく、例えば、拡散反射ＦＴＩＲ法を実行するために、拡散反射赤外フーリエ変換（ＤＲＩＦＴ）分光計が用いられてもよい。したがって、好ましい一実施形態では、ＩＲ吸光度値／ＩＲ吸収スペクトルおよび／またはＩＲ透過率値／ＩＲ透過スペクトルは、ＦＴＩＲ値／ＦＴＩＲスペクトルであり、より具体的には、ＡＴＲ−ＦＴＩＲ値／ＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトル、または透過ＦＴＩＲ値／透過ＦＴＩＲスペクトルである。携帯型で手持ちサイズのＩＲ分光計は、ＦＴＩＲ分光計を含むが、当該技術分野においてよく知られており、様々な製造業者から市販されている。体液試料を塗布または回収する使い捨ての試料容器または細片を用いるように構成されている装置を用いることが、有利な場合がある。
【００６２】
本発明の方法において、体液試料についてＩＲスペクトルまたはＩＲ吸光度値もしくはＩＲ透過率値を取得するステップは、独立して、正規化ＩＲ吸光度値／正規化ＩＲ吸収スペクトルまたは正規化ＩＲ透過率値／正規化ＩＲ透過スペクトルのうちの１つ以上を、体液検査試料から準備するステップをさらに含んでいてもよく、例えば、体液検査試料を、ＩＲ分光計、好ましくは、ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分光計、透過ＦＴＩＲ分光計、またはＤＲＩＦＴ分光計などのＦＴＩＲ分光計を用いて分析し、前記波数範囲のうちの１つ以上におけるＩＲ吸光度値／ＩＲ吸収スペクトルまたはＩＲ透過率値／ＩＲ透過スペクトルを１つ以上取得するステップを含んでいてもよい。その後、これらの値を、例えば以下で述べるように正規化する。
【００６３】
本発明の他の実施形態において、体液試料についてのＩＲスペクトルを取得するステップは、独立して、上述したようにＩＲスペクトルを二次微分したスペクトルを準備し得るステップを含んでいてもよい。またさらなる実施形態において、二次微分したスペクトルを準備するためのＩＲスペクトルを提供するステップは、さらに、ＩＲ吸収スペクトルまたはＩＲ透過スペクトルを１つ以上、体液検査試料から準備するステップを含んでいてもよく、例えば、体液検査試料を、ＩＲ分光計、好ましくは、ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分光計、透過ＦＴＩＲ分光計、またはＤＲＩＦＴ分光計などのＦＴＩＲ分光計を用いて分析し、前記波数範囲のうちの１つ以上におけるＩＲ吸収スペクトルまたはＩＲ透過スペクトルを１つ以上取得するステップを含んでいてもよい。
【００６４】
同様に、本発明の方法において、アルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルを提供するステップは、独立して、正規化ＩＲ吸収スペクトルまたは正規化ＩＲ透過スペクトルのうちの１つ以上を、アルギネートオリゴマー試料から準備するステップを含んでいてもよく、例えば、アルギネートオリゴマー試料を、ＩＲ分光計、好ましくは、ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分光計、透過ＦＴＩＲ分光計、またはＤＲＩＦＴ分光計などのＦＴＩＲ分光計を用いて分析し、前記波数範囲のうちの１つ以上におけるＩＲ吸収スペクトルまたはＩＲ透過スペクトルを１つ以上取得するステップを含んでいてもよい。その後、これらのスペクトルを、例えば以下で述べるように、正規化する。その後、上で述べたように、アルギネートオリゴマーについてのＩＲ吸収スペクトルまたはＩＲ透過スペクトルを二次微分したスペクトルを同様に準備してもよい。本発明によると、アルギネートオリゴマーについてのＩＲスペクトルを、アルギネートオリゴマーの０．２％ｗ／ｖ蒸留水溶液から準備してもよい。
【００６５】
前記ＩＲ吸光度値／ＩＲ吸収スペクトルまたはＩＲ透過率値／ＩＲ透過スペクトルの準備は、典型的には、取得した値／スペクトルに対してシステムの機器および他の構成要素が及ぼす影響を考慮して、内部バックグラウンドの測定値を減ずることを含む。例えば、試料非存在下でバックグラウンドの測定を行い（例えば、バックグラウンドスペクトルを作成することができる）、試料存在下における測定値（例えば、スペクトル）（すなわち、検査の測定値またはスペクトルまたは「試料」の測定値またはスペクトル）から減じてもよい。ある実施形態において、ＩＲ吸光度値／ＩＲ吸収スペクトルまたはＩＲ透過率値／ＩＲ透過スペクトルについての言及は、このようなバックグラウンドの補正を行ったスペクトル／値についての言及である。
【００６６】
ある試料について、その試料から分取した試料を１つ用いて、個別の測定値を複数求め、それらから前記ＩＲ吸光度値／ＩＲ吸収スペクトルまたはＩＲ透過率値／ＩＲ透過スペクトルを準備することが、さらに好都合である場合がある。換言すると、その試料から分取した１つの試料から、所与の波数もしくは選択した波数において、または所与の波数範囲において、複数の測定値が取得されてもよい。例えば、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、例えば、少なくとも、４つ、５つ、６つ、８つ、または１０個の測定値が取得されてもよい。これらの値は、所与の波数または波数範囲における平均値、あるいはある波数範囲についての平均スペクトルを得るために用いられてもよい。
【００６７】
他の実施形態において、試料の複数の複製物から、所与の波数もしくは選択した波数において、または所与の波数範囲において、または所与の波数範囲にわたって、少なくとも１つの測定値が取得される。例えば、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、例えば、少なくとも、４つ、５つ、６つ、８つ、または１０個の複製物から、少なくとも１つの測定値（例えば、上述したような）が取得されてもよい。これらの値は、所与の波数または波数範囲における平均値、あるいはある波数範囲についての平均スペクトルを得るために用いられてもよい。
【００６８】
前記個別の測定値／複製物は、類似性（または相違性）の尺度に基づいて選択（または除外）されてもよく、この場合、類似性が十分である（または、相違性がない）個別の測定値／複製物のみが選択される。適切な相違性の尺度は、スペクトル距離（Ｄ）、すなわち、（１−ピアソンの相関係数）×１０００であり、好ましい実施形態では、Ｄ値が１０以下、例えば、８以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１以下である複製物のみが選択される。
【００６９】
体液試料およびアルギネートオリゴマー試料についてのＩＲ吸光度値／ＩＲ吸収スペクトルまたはＩＲ透過率値／ＩＲ透過スペクトルの正規化は、最小最大正規化またはベクトル正規化などの、任意の好都合な統計手段によって実行されてもよい。さらなる波数（「正規化波数」）において吸光度値（または、適切な場合は、透過率値）を測定し、その後、比較されるスペクトルのすべてでさらなる波数における値が確実に等しくなるようにさらなる波数における値に対して行う必要がある重み付けを、残りの値／スペクトルの残りの部分に対して行うことが好都合な場合がある。好都合には、さらなる（正規化）波数は、本明細書に列挙された波数範囲外にあってもよい。ある実施形態では、前記さらなる（「正規化」）波数は、最大ＩＲ吸光度値または最小ＩＲ透過率値のピークを表す波数であり、例えば、アミドＩ波数、すなわち、約１６４０ｃｍ−１であって、例えば１６３５ｃｍ−１〜１６４５ｃｍ−１、好ましくは１６３７ｃｍ−１〜１６４３ｃｍ−１、または１６３９ｃｍ−１〜１６４１ｃｍ−１である。
【００７０】
ある実施形態において、ＩＲ吸光度値／ＩＲ吸収スペクトルまたはＩＲ透過率値／ＩＲ透過スペクトルは、最大吸光度（最小透過率）を２．０に設定し、最小吸光度（最大透過率）を０に設定して、０〜２．０のスケールで正規化される。しかしながら、当業者であれば、このようなスケールを別の次元のスケール（例えば、百分率スケールが用いられてもよい）、または追加的な逆（負の）スケールに変換することができるであろう。
【００７１】
他の実施形態において、ＩＲ吸収スペクトル／ＩＲ吸光度値またはＩＲ透過スペクトル／ＩＲ透過率値（例えば、バックグラウンド補正されたスペクトル／値）に対してベースライン補正を行って、実質的に曲線ではない、例えば本質的に平坦または水平である、ベースラインを得てもよく、それによって、ＩＲ吸収スペクトル／ＩＲ吸光度値またはＩＲ透過スペクトル／ＩＲ透過率値に対する、例えば比較分析／相関分析などの分析をより正確なものとすることができる。ＩＲ吸収スペクトル／ＩＲ吸光度値またはＩＲ透過スペクトル／ＩＲ透過率値を正規化しようとする場合、ベースライン補正は、典型的には正規化の前に行われるが、これは必須ではない。
【００７２】
本発明の方法のある実施形態において、ＩＲスペクトル／ＩＲ値は、ＩＲ吸収スペクトル／ＩＲ吸光度値である。
【００７３】
当業者であれば、試料についてのＩＲ吸光度およびＩＲ透過率は、式ＩＩの等式
【００７４】
【数２】
2021533352.tif 000003
【００７５】
によって関連付けられており、ＩＲ吸光度値／ＩＲ吸収スペクトルまたはＩＲ透過率値／ＩＲ透過スペクトルを取得または提供する本発明の方法のステップは、必要に応じて、ＩＲ吸光度値／ＩＲ吸収スペクトルまたはＩＲ透過率値／ＩＲ透過スペクトルを準備し、それぞれＩＲ透過率値／ＩＲ透過スペクトルまたはＩＲ吸光度値／ＩＲ吸収スペクトルに変換する中間ステップを包含するということが理解されるであろう。
【００７６】
本発明のこの態様の方法は、被験体から採取または単離された体液試料に対して行われる限りにおいて、インビトロの方法である。換言すると、本方法は、インビボでは行われない、つまり、被験体の体に対しては行われない。より具体的な態様では、本方法は、好ましくは非外科的または非侵襲的に、被験体から試料を採取または単離するステップをさらに含んでいてもよい。したがって、特に説明や指示がない限り、アルギネートオリゴマーを用いた被験体の治療（すなわち、本発明の方法を行う前または行った後に、アルギネートオリゴマーを投与するステップ）は、本発明の方法の一部ではない。
【００７７】
したがって、本発明の方法は、本方法を行うように構成されたプログラムを搭載するコンピュータ、システム、または機器上で行われてもよい。よって、本発明の方法は、コンピュータで実行される方法であってもよく、本発明は、本発明の方法またはその方法の特定のステップを行うように構成された、例えば、そのように適合されたプログラムを搭載する、コンピュータ、システム、または機器をさらに提供する。このシステムまたは機器は、さらに、好ましくは部分的または完全に自動化された様式で、本発明の波数範囲のうちの１つ以上におけるＩＲ吸収スペクトル／ＩＲ吸光度値またはＩＲ透過スペクトル／ＩＲ透過率値を準備するように適合されていてもよいし、そのためのステップ、例えば、本発明にしたがって用いられるＩＲスペクトルをもたらすステップ、を行うように適合されていてもよい。このシステムまたは機器は、さらに、二次微分ＩＲ吸収スペクトル／二次微分ＩＲ吸光度値または二次微分ＩＲ透過スペクトル／二次微分ＩＲ透過率値を準備するように適合されていてもよい。したがって、本発明は、本発明の方法またはその方法の特定のステップを行うように構成または適合された、例えば、そのように適合されたプログラムを搭載する、好ましくは携帯型または手持ちサイズの、ＩＲ分光計（例えば、ＦＴＩＲ分光計）を提供する。本発明は、前記プログラムを搭載するコンピュータ可読媒体、およびこのようなプログラム自体をさらに提供する。またさらなる態様において、本発明は、式Ｉと、本明細書において広く説明される方法および本明細書で挙げる本発明の特定の方法における式Ｉの使用とを提供する。
【００７８】
本発明の方法による結果（最終出力）は、当業者による理解および／またはさらなる解釈のために、コンピュータまたは人が読める媒体に提供されてもよいし、電子的またはその他の適切な手段によって伝達されてもよい。
【００７９】
体液（ｂｏｄｙ ｆｌｕｉｄ；ｂｏｄｉｌｙ ｆｌｕｉｄとも）は、人体または動物の身体によって産生される液であるとみなされる。体液試料は、人体または動物の身体から単離された体液の一部である。試料は、単離された際の形態で、体液を含んでいてもよいし、処理された形態（例えば、遠心分離、ろ過、クロマトグラフィによる分離、蒸発、または凍結乾燥などによって、固形物（例えば、細胞、細胞片、脂肪、食物粒子など）または水分を除去した形態）で、体液を含んでいてもよい。他の実施形態において、体液は、水または生理的緩衝剤などの水性溶媒で希釈されていてもよい。ある実施形態において、体液は、本質的に未変性の状態、すなわち天然状態で分析される。換言すると、体液試料は、被験体から体液を回収した際の形態で分析され得る。
【００８０】
体液としては、例えば、羊水、胆汁、血液、母乳、脳脊髄液、耳脂（耳垢）、乳糜、糜汁（chime）、内リンパ、糞便、女性射出液、胃液、液（例えば、水様液および硝子体液）、リンパ、粘液（例えば、痰および鼻漏）、囲心腔液、外リンパ、腹水、血漿、胸水、膿、唾液、皮脂（皮膚分泌脂）、血清、精液、痰、汗、涙、膣分泌液、嘔吐物、尿、および創傷滲出液が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。ある実施形態において、本発明にしたがって用いられる体液は、液体、すなわち、主に水性組成物である。他の実施形態において、本発明にしたがって用いられる体液は、血液、脳脊髄液、糞便、胃液、リンパ、粘液、血漿、膿、唾液、血清、精液、汗、涙、膣分泌液、嘔吐物、尿、および創傷滲出液から選択される。粘液（例えば、痰）が特に重要である。
【００８１】
「粘液」なる語は、本明細書では、最も広義に用いられて、哺乳動物の粘膜表面を覆う物質のことを指す。当該粘膜表面の位置および／またはその位置における病理過程もしくは宿主生物全体における病理過程に応じて、その位置に見られる粘液の構成物質は、変化し得る。最も基本的には、粘液は、上皮表面が分泌する、糖タンパク質のムチンおよび電解質からなるゲル状単純混合物とみなすことができる。生理学的環境では、この混合物は、より複雑になることが避けられず、細胞（微生物や、炎症細胞などの宿主由来の細胞）、細胞片、ウイルス、およびこのような細胞から分泌される生体分子（例えば、タンパク質、核酸、脂質、および多糖）などの他の生体物質が存在する。呼吸器系の粘液では、非生物的な微粒子（例えば、塵や煙）が、混合物中に存在する場合もある。健康な被験体では、ムチンマトリクスおよび他の生体物質からなるこのような異種混合物は、体内における正常な粘液クリアランスプロセスによって、効率的に除去される。しかしながら、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の機能不全を患う被験体（例えば、嚢胞性線維症を患う被験体）では、基本的なムチンマトリクス自体が機能不全となっており、そのため、効率的な除去に対して本質的に抵抗する。除去が低下するということは、ＣＦＴＲ機能不全を患う被験体の粘液では、健康な被験体の同等の粘液と比較して、大量の非ムチン成分が蓄積し得、ひいては、これによって、粘液除去の困難さがさらに悪化し、微生物の定着が増加することにより病理的影響がもたらされ得るということを意味する。したがって、「粘液」なる語は、この語が用いられる文脈に応じて、組成が異なる物質を指し得るが、これは、当該技術分野におけるこの語の用いられ方と完全に一致するものであり、当業者であれば、本発明の文脈におけるこの語の使用は、本質的に、粘膜表面に存在し得る粘液性物質を意味するということを認識し、かつ理解するであろう。対照的に、「痰」なる語は、本明細書では、具体的に、喀出された呼吸器系由来の粘液のことを指すために用いられる。
【００８２】
したがって、本発明の方法を行い得る粘液は、例えば本明細書に列挙される領域などの呼吸器系や、消化管、生殖器官、尿路、膵管、胆管に由来する粘液であってもよい。適切な粘液回収法は標的領域によるが、一般的には、痰の回収（気道）、拭き取り（例えば、鼻、口、喉、下部消化管、および下部女性生殖器官など）、ならびに内視鏡法などによる粘液生検および組織生検を挙げることができる。このような手法としては、食道胃十二指腸内視鏡法（食道、胃、および十二指腸）、小腸内視鏡法（小腸）、結腸内視鏡法（結腸）、Ｓ状結腸内視鏡法（大腸）、胆管内視鏡法（胆管および膵管）、直腸内視鏡法（直腸）、肛門内視鏡法（肛門）、直腸内視鏡法（肛門および直腸）、鼻内視鏡法（鼻／洞）、気管支内視鏡法（下気道）、耳内視鏡法（耳）、膀胱内視鏡法（尿路）、女性器内視鏡法（女性生殖器官）、膣内視鏡法（子宮頸管）、子宮内視鏡法（子宮）、卵管内視鏡法（卵管）、および腹腔内視鏡法（腹腔または骨盤腔）が挙げられる。しかしながら、試料は、好都合には痰である。痰の回収は、広く行われている手法であり、ただ被験体が、下気道から粘液を喀出する（すなわち、「咳をしながら吐き出す」）だけである。
【００８３】
被験体は、いずれのヒトまたは非ヒト動物の被験体であってもよいが、とりわけ、ヒト、または哺乳類、鳥類、両生類、魚類、および爬虫類から選択される非ヒト動物などの、非ヒト脊椎動物であってもよい。非ヒト動物は、家畜であってもよいし、飼育動物であってもよいし、商業的価値のある動物であってもよく、実験動物または動物園もしくは動物保護区域の動物が挙げられる。したがって、代表的な非ヒト動物としては、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、アヒル、およびガチョウが挙げられる。よって、本発明を獣医学的に用いることが包含される。被験体は、患者と見なされてもよい。
【００８４】
被験体は、いずれの年齢であってもよく、例えば、新生児であってもよいし、乳児であってもよいし、小児であってもよいし、児童であってもよいし、青年であってもよいし、成人であってもよい。ヒト被験体の場合、被験体は、少なくとも５歳であり、例えば、少なくとも、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１１歳、１２歳、１３歳、１４歳、１５歳、１６歳、１７歳、または１８歳である。
【００８５】
ある実施形態において、被験体は、感染症（例えば、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、または寄生虫感染症など）、菌血症、敗血症、敗血症性ショック、火傷、急性および／または慢性の創傷、上皮もしくは内皮の分泌物の（粘液、涙、唾液など）減少もしくは抑制および／またはその分泌物クリアランスの低下もしくは抑制のある被験体（例えば、粘膜組織上の繊毛機能が低下している被験体、および／または粘液の粘度が過度に高い被験体（喫煙者や、ＣＯＰＤ、ＣＯＡＤ、ＣＯＡＰ、気管支炎、嚢胞性線維症、ＣＦＴＲ遺伝子変異によるヘテロ接合性、肺気腫、気管支拡張症、肺癌、喘息、肺炎、または洞炎に罹患している被験体））、医療機器を装着した被験体、抗凝固療法を必要とする被験体（例えば、静脈血栓症、動脈血栓症、アテローム性動脈硬化症、静脈生着不全、動脈生着不全、脳卒中、心筋梗塞、肺塞栓症、または栓友病に罹患している被験体）である。
【００８６】
ある実施形態において、被験体は、ＣＦＴＲイオンチャネル機能不全に罹患しているヒトの患者であり、より具体的には、ＣＦＴＲ機能不全に伴う、異常な粘液および異常な粘液クリアランスなどの病的な表現型を有するヒトの患者である。特定の実施形態において、被験体は、ＣＦに罹患しているヒトの患者である。「ＣＦに罹患している（with CF）被験体」、ＣＦを患っている被験体」、「ＣＦに罹患している（having CF）被験体」、および「ＣＦ被験体」なる語は、同義であるとみなされ、本明細書において交換可能に用いられる。
【００８７】
上記の通り、アルギネートは、典型的には、平均分子量が少なくとも３５，０００ダルトンである、すなわち、モノマー残基がおよそ１７５個からおよそ１９０個である、ポリマーとして生じ、アルギネートオリゴマーは、アルギネートポリマー、一般的には天然のアルギネート、の分割（すなわち、サイズの縮小）によって得られる物質として定義され得る。したがって、アルギネートオリゴマーは、平均分子量が３５，０００ダルトン未満（すなわち、モノマー残基がおよそ１９０個未満またはおよそ１７５個未満）のアルギネートであるとみなすことができ、特に、平均分子量が３０，０００ダルトン未満（すなわち、モノマー残基がおよそ１７５個未満またはおよそ１５０個未満）、より具体的には、平均分子量が２５，０００ダルトン未満または２０，０００ダルトン未満（すなわち、モノマー残基がおよそ１３５個未満もしくは１２５個未満、またはおよそ１１０個未満もしくは１００個未満）のアルギネートであるとみなすことができる。
【００８８】
見方を変えると、通常、オリゴマーは、２つ以上のモノマー単位またはモノマー残基を、上記のサイズ制限まで含んでおり、本発明に係るアルギネートオリゴマーは、典型的には、２つから１００個のモノマー残基を含有し、より典型的には、３つ、４つ、５つ、または６つ以上１００個以下のモノマー残基を含有し、また、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以上７５個以下の残基を含んでいてもよいし、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以上５０個以下の残基を含んでいてもよいし、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以上４０個以下の残基を含んでいてもよいし、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以上３５個以下の残基を含んでいてもよいし、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以上３０個以下の残基を含有していてもよい。したがって、本発明に係るアルギネートオリゴマーの平均分子量は、典型的には、３５０ダルトン、５５０ダルトン、７００ダルトン、９００ダルトンもしくは１０００ダルトン以上２０，０００ダルトン以下、または３５０ダルトン、５５０ダルトン、７００ダルトン、９００ダルトンもしくは１０００ダルトン以上１５，０００ダルトン以下、または３５０ダルトン、５５０ダルトン、７００ダルトン、９００ダルトンもしくは１０００ダルトン以上１０，０００ダルトン以下、または３５０ダルトン、５５０ダルトン、７００ダルトン、９００ダルトンもしくは１０００ダルトン以上８０００ダルトン以下、または３５０ダルトン、５５０ダルトン、７００ダルトン、９００ダルトンもしくは１０００ダルトン以上７０００ダルトン以下、または３５０ダルトン、５５０ダルトン、７００ダルトン、９００ダルトンもしくは１０００ダルトン以上６，０００ダルトン以下である。
【００８９】
換言すると、アルギネートオリゴマーの重合度（ＤＰ）または数平均重合度（ＤＰｎ）は、２〜１００であってもよく、好ましくは２〜７５であってもよく、好ましくは２〜５０であってもよく、より好ましくは、２〜４０であってもよいし、２〜３５であってもよいし、２〜３０であってもよいし、２〜２８であってもよいし、２〜２５であってもよいし、２〜２２であってもよいし、２〜２０であってもよいし、２〜１８であってもよいし、２〜１７であってもよいし、２〜１５であってもよいし、２〜１２であってもよい。
【００９０】
他の代表的な範囲としては（残基数、ＤＰ、またはＤＰｎを問わず）、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１のうちのいずれか１つから、５０、４５、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、または１２のうちのいずれか１つまでの範囲が挙げられる。
【００９１】
他の代表的な範囲としては（残基数、ＤＰ、またはＤＰｎを問わず）、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のうちのいずれか１つから、５０、４５、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、または１６のうちのいずれか１つまでの範囲が挙げられる。
【００９２】
他の代表的な範囲としては（残基数、ＤＰ、またはＤＰｎを問わず）、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８のうちのいずれか１つから、５０、４５、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、または１９のうちのいずれか１つまでの範囲が挙げられる。
【００９３】
上記のように、アルギネートオリゴマーは、グルロネートもしくはグルロン酸（Ｇ）および／またはマンヌロネートもしくはマンヌロン酸（Ｍ）からなる残基あるいは単位を含有する（contain）（または含む（comprise））。本発明に係るアルギネートオリゴマーは、好ましくは、ウロネート残基／ウロン酸残基のみからまたは実質的にそれらのみからなり（すなわち、本質的にそれらからなり）、より具体的には、Ｇ残基および／もしくはＭ残基のみから、または実質的にそれらのみからなる。別表現では、本発明によるアルギネートオリゴマーにおいて、モノマー残基のうちの少なくとも８０％、より具体的には、少なくとも、８５％、９０％、９５％、または９９％が、ウロネート残基／ウロン酸残基であってもよいし、より具体的には、Ｇ残基および／またはＭ残基であってもよい。他の実施形態において、本発明に係るアルギネートオリゴマーは、他の残基または単位（例えば、他の糖残基、または、より具体的には、他のウロン酸残基／ウロネート残基）を含まない。
【００９４】
「Ｇ残基／Ｇ」および「Ｍ残基／Ｍ」、またはグルロン酸もしくはマンヌロン酸、またはグルロネートもしくはマンヌロネートについての言及は、グルロン酸／グルロネートおよびマンヌロン酸／マンヌロネート（具体的には、α−Ｌ−グルロン酸／グルロネートおよびβ−Ｄ−マンヌロン酸／マンヌロネート）についての言及として、交換可能に読まれるべきであり、さらに、利用可能な側鎖または基のうちの１つ以上が改変されているそれらの誘導体を含む。一般的な糖修飾基としては、アセチル基、硫酸基、アミノ基、デオキシ基、アルコール基、アルデヒド基、ケトン基、エステル基、および無水基が挙げられる。アルギネートオリゴマーは、荷電基（カルボキシル化グリカンまたはカルボキシメチル化グリカン）を加え、自由度を変化させる（例えば、過ヨウ素酸酸化によって）ために、化学的に改変されてもよい。
【００９５】
アルギネートオリゴマーは、直鎖であってもよいし、分岐していてもよいし、環状であってもよい。
【００９６】
より具体的には、好ましい実施形態において、アルギネートオリゴマーのモノマー残基のうちの少なくとも３０％は、Ｇ残基（すなわち、グルロネートまたはグルロン酸）である。換言すると、アルギネートオリゴマーは、少なくとも３０％のグルロネート残基（または、グルロン酸残基）を含有する。したがって、特定の実施形態は、３０％〜７０％のＧ（グルロネート）残基または７０％〜１００％のＧ（グルロネート）残基を有する（例えば、含有する）アルギネートオリゴマーを含む。したがって、本発明に係る代表的なアルギネートオリゴマーは、Ｇ残基を少なくとも７０％含有していてもよい（すなわち、アルギネートオリゴマーのモノマー残基のうち、少なくとも７０％がＧ残基となる）。
【００９７】
好ましくは、モノマー残基のうちの少なくとも５０％または少なくとも６０％が、より具体的には、少なくとも７０％または少なくとも７５％が、より一層具体的には、少なくとも、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、グルロネートである。一実施形態では、本発明に係るアルギネートオリゴマーは、オリゴグルロネート（すなわち、Ｇのホモオリゴマー、つまり１００％Ｇ）であってもよい。
【００９８】
さらなる実施形態では、上述したアルギネートオリゴマーは、Ｇ残基の大多数がいわゆるＧブロック内にあるような一次構造を有していてもよい。例えば、Ｇ残基のうちの、少なくとも、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、または９５％が、Ｇブロック内にあってもよい。Ｇブロックとは、少なくとも２つのＧ残基が連続した配列であり、例えば、少なくとも、３つ、４つ、５つ、または７つのＧ残基が連続している。
【００９９】
特に、Ｇ残基のうちの少なくとも９０％は、別のＧ残基と１−４結合していてもよい。より具体的には、アルギネートのＧ残基のうちの、少なくとも、９５％、９８％、または９９％は、別のＧ残基と１−４結合していてもよい。この２つのＧ残基の１−４結合は、別表現では、隣接するグルロン酸単位に結合したグルロン酸単位とすることができる。
【０１００】
適切なアルギネートオリゴマーは、ＷＯ２００７／０３９７５４、ＷＯ２００７／０３９７６０、ＷＯ２００８／１２５８２８、ＷＯ２００９／０６８８４１、およびＷＯ２０１５／１２８４９５で説明されており、これらの開示は、その全体が、参照により本明細書に明示的に援用される。
【０１０１】
ある実施形態において、アルギネートオリゴマーは、５個から２０個のモノマー残基からなるアルギネートオリゴマー（ＤＰｎが１３である、または重量平均分子量が３２００Ｄａである、アルギネートオリゴマーと表現してもよい）であり、そのうちの９０％〜９５％がＧ残基である。
【０１０２】
したがって、本発明に係るアルギネートオリゴマーの特定のクラスは、いわゆる「高Ｇ」オリゴマーまたは「Ｇブロック」オリゴマー、すなわち、Ｇ残基またはＧブロックの含有量が高いオリゴマーとして定義されるアルギネートオリゴマーである（例えば、モノマー残基のうちの少なくとも７０％がＧであり、好ましくはＧブロック内に配置されている）とみなされる。しかしながら、他の種類のアルギネートオリゴマー、特に、以下でさらに述べるような、「高Ｍ」オリゴマーもしくは「Ｍブロック」オリゴマー、またはＭＧブロックオリゴマーが、本発明にしたがって用いられてもよい（may also be used are also in accordance with the invention）。したがって、特に好ましいオリゴマーを代表するのは、単一モノマー種の割合が高く、この種のモノマーの大部分が、そのモノマー種の連続配列に存在している、アルギネートオリゴマーである。例えば、オリゴマーのモノマー残基のうちの少なくとも７０％が、別のＧ残基に１−４結合しているＧ残基であり、より好ましくは、オリゴマーのモノマー残基のうちの少なくとも７５％、最も好ましくは、少なくとも、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％が、別のＧ残基に１−４結合しているＧ残基である、オリゴマーである。
【０１０３】
他の実施形態では、本発明に係るアルギネートオリゴマーのモノマー残基のうちの少なくとも５０％、より具体的には、５０％超は、Ｍ残基（すなわち、マンヌロネートまたはマンヌロン酸）であってもよい。換言すると、本発明に係るアルギネートオリゴマーは、マンヌロネート残基（または、マンヌロン酸残基）を少なくとも５０％、あるいは５０％超、含有していてもよい。したがって、特定の実施形態は、５０％〜７０％のＭ残基（マンヌロネート残基）、または、例えば７０％〜１００％のＭ残基（マンヌロネート残基）を有する（例えば、含有する）アルギネートオリゴマーを含む。さらなる特定の実施形態は、７１％〜８５％のＭ残基、または８５％〜１００％のＭ残基を含有するオリゴマーを含む。したがって、本発明に係る代表的なアルギネートオリゴマーは、７０％超のＭ残基を含有する（すなわち、アルギネートオリゴマーのモノマー残基のうちの７０％超が、Ｍ残基となる）。
【０１０４】
他の実施形態では、モノマー残基のうちの少なくとも５０％または少なくとも６０％が、より具体的には、少なくとも７０％または少なくとも７５％が、より一層具体的には、少なくとも、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が、マンヌロネートである。一実施形態では、アルギネートオリゴマーは、オリゴマンヌロネート（すなわち、Ｍのホモオリゴマー、つまり１００％Ｍ）であってもよい。
【０１０５】
さらなる実施形態では、上述した本発明のアルギネートは、Ｍ残基の大多数がいわゆるＭブロック内にあるような一次構造を有していてもよい。例えば、Ｍ残基のうちの、少なくとも、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、または９５％が、Ｍブロック内にあってもよい。Ｍブロックとは、少なくとも２つのＭ残基が連続した配列であり、例えば、少なくとも、３つ、４つ、５つ、または７つのＭ残基が連続している。
【０１０６】
特に、Ｍ残基のうちの少なくとも９０％は、別のＭ残基と１−４結合していてもよい。より具体的には、アルギネートのＭ残基のうちの、少なくとも、９５％、９８％、または９９％は、別のＭ残基と１−４結合していてもよい。この２つのＭ残基の１−４結合は、別表現では、隣接するマンヌロン酸単位に結合したマンヌロン酸単位とすることができる。
【０１０７】
本発明に係る他のオリゴマーは、オリゴマーのモノマー残基のうちの少なくとも７０％が、別のＭ残基に１−４結合しているＭ残基であるか、または、より好ましくは、オリゴマーのモノマー残基のうちの、少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％が、別のＭ残基に１−４結合しているＭ残基である、アルギネートオリゴマーである。
【０１０８】
またさらなる実施形態において、本発明によるアルギネートオリゴマーは、Ｍ残基およびＧ残基が交互に並ぶ配列を含んでいてもよい。少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つのＭ残基およびＧ残基が交互に並ぶ配列は、ＭＧブロックを表す。したがって、本発明のアルギネートオリゴマーは、ＭＧブロックを含んでいてもよい。より具体的な表現では、ＭＧブロックはＧ残基およびＭ残基からなる、少なくとも３つの連続した残基の配列であり、連続配列の末端でない（内部）Ｇ残基のそれぞれは、Ｍ残基と１−４結合および４−１結合しており、連続配列の末端でない（内部）Ｍ残基のそれぞれは、Ｇ残基と１−４結合および４−１結合している。
【０１０９】
さらなる実施形態では、アルギネートオリゴマー中の少数ウロネート（すなわち、マンヌロネートまたはグルロネート）の大多数が、ＭＧブロック内に見出されてもよい。この実施形態では、ＭＧブロックアルギネートオリゴマー中の少数ウロネートモノマーのうちの、例えば、少なくとも、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、ＭＧブロック内に存在する。別の実施形態では、オリゴマー中のＧ残基およびＭ残基のうちの、少なくとも、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％、例えば１００％が、ＭＧブロック内に配置されるように、アルギネートオリゴマーを配置してもよい。
【０１１０】
本発明に係るＭＧブロック含有アルギネートオリゴマーは、少なくとも１％かつ１００％未満のグルロネート残基（またはグルロン酸残基）を含有していてもよいが、通常は、本発明に係るＭＧブロック含有アルギネートオリゴマーは、少なくとも３０％（あるいは、少なくとも、３５％、４０％、４５％、または５０％のＧ）かつ１００％未満のＧを含有する。したがって、特定の実施形態は、１％〜３０％のＧ残基（グルロネート残基）、３０％〜７０％のＧ残基（グルロネート残基）、または７０％〜９９％のＧ残基（グルロネート残基）を有する（例えば、含有する）ＭＧブロック含有アルギネートオリゴマーを含む。したがって、本発明に係る代表的なＭＧブロック含有アルギネートオリゴマーは、３０％超かつ７０％未満のＧ残基を含有していてもよい（すなわち、ＭＧブロックアルギネートオリゴマー中、モノマー残基のうちの３０％超かつ７０％未満が、Ｇ残基である）。
【０１１１】
より具体的には、本発明に係るＭＧブロック含有アルギネートオリゴマーにおいて、モノマー残基のうちの３０％超、より具体的には、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、または６５％超かつ、いずれの場合も７０％未満は、グルロネートである。あるいは、本発明に係るＭＧブロック含有アルギネートオリゴマーにおいて、モノマー残基のうちの７０％未満、より具体的には、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、または３５％未満かつ、いずれの場合も３０％超は、グルロネートである。これらの値の組み合わせから形成されるいずれの範囲が選択されてもよい。したがって、例えば、本発明に係るＭＧブロック含有アルギネートオリゴマーは、Ｇ残基を、例えば３５％〜６５％、４０％〜６０％、または４５％〜５５％の範囲で有し得る。
【０１１２】
別の実施形態では、本発明に係るＭＧブロック含有アルギネートオリゴマーは、Ｇ残基およびＭ残基をおよそ等量（例えば、比率が６５％Ｇ／３５％Ｍと３５％Ｇ／６５％Ｍとの間、例えば、６０％Ｇ／４０％Ｍと４０％Ｇ／６０％Ｍとの間、５５％Ｇ／４５％Ｍと４５％Ｇ／５５％Ｍとの間、５３％Ｇ／４７％Ｍと４７％Ｇ／５３％Ｍとの間、５１％Ｇ／４９％Ｍと４９％Ｇ／５１％Ｍとの間であり、例えば、約５０％Ｇおよび約５０％Ｍである）有していてもよく、これらの残基は，大部分、好ましくは完全にまたは可能な限り完全に、交互に並ぶＭＧパターン内に配置されている（例えば、Ｍ残基およびＧ残基のうちの、少なくとも５０％、または、少なくとも、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、または１００％が、交互に並ぶＭＧ配列内にある）。
【０１１３】
「Ｇ残基／Ｇ」および「Ｍ残基／Ｍ」、またはグルロン酸もしくはマンヌロン酸、またはグルロネートもしくはマンヌロネートについての言及は、グルロン酸／グルロネートおよびマンヌロン酸／マンヌロネート（具体的には、α−Ｌ−グルロン酸／グルロネートおよびβ−Ｄ−マンヌロン酸／マンヌロネート）についての言及として、交換可能に読まれるべきであり、さらに、利用可能な側鎖または基のうちの１つ以上が改変されているそれらの誘導体を含む。一般的な糖修飾基としては、アセチル基、硫酸基、アミノ基、デオキシ基、アルコール基、アルデヒド基、ケトン基、エステル基、および無水基が挙げられる。アルギネートオリゴマーは、荷電基（カルボキシル化グリカンまたはカルボキシメチル化グリカン）を加え、自由度を変化させる（例えば、過ヨウ素酸酸化によって）ために、化学的に改変されてもよい。他の実施形態において、アルギネートオリゴマーは、別の高分子（例えば、タンパク質、ペプチド、ポリエン、核酸、異なる多糖、脂質、小胞形成ポリマー）などの別要素に共役していてもよい。ある実施形態において、アルギネートオリゴマーは、ポリミキシンクラスの抗生物質（例えば、コリスチン）またはバシトラシンなどの、抗生物質に共役していてもよい。
【０１１４】
ある実施形態において、アルギネートオリゴマー治療法の投与法および／または薬物動態を判定、モニター、および評価するために、本発明の方法が用いられてもよい。このように、本発明は、アルギネートオリゴマー治療法の投与法および／または薬物動態を判定、モニター、および評価する方法であって、該方法は、アルギネートオリゴマー治療法の投与法および／または代謝を表す、被験体の内部または表面由来の体液試料に対して、本明細書で定義される本発明の方法を行うことを含む、方法を提供する。
【０１１５】
ある実施形態において、本発明の方法は、上述した方法の結果によって規定される量、形態、および／または投与経路によって、１つ以上のアルギネートオリゴマーを被験体またはその一部位に投与する、後ステップを含んでいてもよい。例えば、アルギネートオリゴマーが存在することを意図する被験体の一領域由来の体液試料において、アルギネートオリゴマーが検出されない場合、より多い量が、続けて投与されてもよいし、別の投与経路または追加的な投与経路によって続けて投与されてもよいし、被験体の異なる部位に続けて投与されてもよい。他の実施形態において、適切な標的部位において有効量のアルギネートオリゴマーが達成されているかを判定するために、本発明の方法が用いられてもよい。このような実施形態において、標的部位由来の体液試料、または標的部位を表す部位由来の体液試料が採取されて、この試料におけるアルギネートオリゴマーレベルが求められてもよい。標的部位において必要とされるアルギネートオリゴマーレベルに応じて、より多い、またはより少ない量が、被験体に続けて投与されてもよいし、別の投与経路または追加的な投与経路によって続けて投与されてもよいし、被験体の異なる部位に続けて投与されてもよい。
【０１１６】
したがって、本発明の方法は、本発明の方法の前に被験体に対して用いられた量、形態、または投与経路とは異なる量、形態、または投与経路によって、１つ以上のアルギネートオリゴマーを被験体またはその一部位に投与する、後ステップを含んでいてもよい。他の実施形態において、本発明の方法は、本発明の方法の前に被験体に対して用いられた量、形態、または投与経路と同じ量、形態、または投与経路によって、１つ以上のアルギネートオリゴマーを被験体またはその一部位に投与する、後ステップを含んでいてもよい。
【０１１７】
したがって、本発明は、さらに、アルギネートオリゴマー療法を必要とする被験体を治療する方法であって、該方法は、前記被験体由来の体液試料に対して、本明細書で定義されるように、体液試料中のアルギネートオリゴマーを検出する本発明の方法または体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度を求める本発明の方法を１つ以上行うことと、前記被験体に対して行った、体液試料中のアルギネートオリゴマーを検出する本発明の方法または体液試料におけるアルギネートオリゴマー濃度を求める本発明の方法の結果によって示される量、形態、または投与経路によって、前記被験体またはその一部位にアルギネートオリゴマーを投与することとを含む、方法を提供する。
【０１１８】
例えば続く治療ステップにおいて、アルギネートオリゴマー（または、複数のアルギネートオリゴマー）を被験体に投与することは、例えば呼吸器系、消化管、生殖器官、尿路、膵管、胆管、循環系、創傷、および医療機器の埋設部位などの被験体の標的領域において有効量を達成するために、アルギネートオリゴマーを被験体に投与する任意の好都合な手段によってなされてもよい。
【０１１９】
このような投与としては、局所送達経路、経腸（例えば、口腔、頬側、舌下、直腸）送達経路、腸管外（例えば、静脈内）送達経路による投与が挙げられ得る。その後のアルギネートオリゴマーの分布は、局所分布であってもよいし、全身分布であってもよい。当業者であれば、特定の標的領域または治療効果に合う適切な投与手段および体内分布を選択でき、当該技術分野において公知であり、広く文献に記載されている従来の方法のいずれかにしたがって、これらの投与経路および体内分布に適合する医薬組成物にアルギネートオリゴマーを配合することができるであろう。
【０１２０】
より具体的には、錠剤、丸剤、顆粒剤（例えば、カプセルに入っていないもの、またはカプセル入りのもの）、粉末剤（例えば、吸入可能乾燥粉末剤などの吸入可能粉末剤）、薬用ドロップ、小袋剤、カシェー剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、溶液剤、シロップ剤、エアロゾル（固体として、または液状媒体中で）、スプレー剤（例えば、鼻腔スプレー）、ネブライザー用組成物、軟膏、クリーム、膏薬、軟ゼラチンカプセルおよび硬ゼラチンカプセル、坐剤、膣座薬、滅菌済注射用溶液剤、ならびに滅菌包装済粉末剤などの従来の生薬製剤を製造するために、アルギネートオリゴマーは、個別に、または一緒に、場合によっては他の活性薬剤とともに、１つ以上の従来の担体、希釈剤、および／または賦形剤と混合されてもよい。滅菌済吸入可能組成物および滅菌済注射用組成物、特に、吸入可能乾燥粉末剤または吸入可能溶液剤が、特に注目される。
【０１２１】
下気道にアルギネートオリゴマーを投与するのに用いられる代表的な吸入可能粉末剤は、オリゴマーを、％ｗ／ｖまたは％ｗ／ｗで、９０％以下、例えば、８５％以下、８０％以下、７５％以下、または７０％以下、例えば、５０％〜９０％、５５％〜９０％、６０％〜９０％、６５％〜９０％、７０％〜９０％、７５％〜９０％、８０％〜９０％、８５％〜９０％、５０％〜８５％、５５％〜８５％、６０％〜８５％、６５％〜８５％、７０％〜８５％、７５％〜８５％、８０％〜８５％、５０％〜８０％、５５％〜８０％、６０％〜８０％、６５％〜８０％、７０％〜８０％、７５％〜８０％、５０％〜７０％、５５％〜７０％、６０％〜７０％、または６５％〜７０％、含有し、その残部は、賦形剤などの薬学的に許容される成分からなるものであってもよい。
【０１２２】
上気道にアルギネートオリゴマーを投与するのに用いられる代表的な吸入可能溶液剤は、典型的には滅菌済であり、オリゴマーを、６％〜２５％ｗ／ｖ、例えば、６％〜２０％ｗ／ｖ、６％〜１５％ｗ／ｖ、６％〜１０％ｗ／ｖ、８％〜２５％ｗ／ｖ、８％〜２０％ｗ／ｖ、８％〜１５％ｗ／ｖ、９％〜２５％ｗ／ｖ、９％〜２０％ｗ／ｖ、９％〜１５％ｗ／ｖ、１０％〜１５％ｗ／ｖ、１０％〜２０％ｗ／ｖ、１０％〜２５％ｗ／ｖ、１５％〜２０％ｗ／ｖ、または１５％〜２５％ｗ／ｖ、含有し、その残部は、賦形剤や水などの薬学的に許容される成分からなるものであってもよい。
【０１２３】
鼻または副鼻腔への投与のために、滅菌済の水性液状配合物および／または油性液状配合物（例えば、乳剤）が用いられてもよく、例えば、噴射剤を用いない鼻腔スプレー装置、または噴射剤支援型の鼻腔スプレー装置によって投与されてもよい。代表的な配合物は、オリゴマーを、％ｗ／ｖまたは％ｗ／ｗで、１％〜２５％、１％〜２０％、例えば、１％〜１５％、１％〜１０％、１％〜９％、１％〜８％、１％〜７%、あるいは１％〜６％、５％〜２５％、５％〜２０％、５％〜１５％、５％〜１０％、５％〜９％、５％〜８％、５％〜７％、５％〜６％、８％〜２５％、８％〜２０％、８％〜１５％、８％〜１０％、９％〜２５％、９％〜２０％、または９％〜１５％、含有し、その残部は、賦形剤や水などの薬学的に許容される成分からなるものであってもよい。
【０１２４】
全身分布を達成するためのアルギネートオリゴマーの静脈内投与用の代表的な溶液は、アルギネートオリゴマーを、％ｗ／ｖまたは％ｗ／ｗで、１％〜２５％以下、１％〜２０％以下、例えば、１％〜１５％、１％〜１０％、１％〜９％、１％〜８％、１％〜７%、あるいは１％〜６％、５％〜２５％、５％〜２０％、５％〜１５％、５％〜１０％、５％〜９％、５％〜８％、５％〜７％、５％〜６％、８％〜２５％、８％〜２０％、８％〜１５％、８％〜１０％、９％〜２５％、９％〜２０％、または９％〜１５％、含有し、その残部は、賦形剤や水などの薬学的に許容される成分からなるものであってもよい。
【０１２５】
アルギネートオリゴマーを全身投与するのに用いられる代表的な口内錠は、アルギネートオリゴマーを、％ｗ／ｖまたは％ｗ／ｗで、９９％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下、または８０％以下、例えば、５０％〜９５％、５５％〜９５％、６０％〜９５％、６５％〜９５％、７０％〜９５％、７５％〜９５％、８０％〜９５％、８５％〜９５％、９０％〜９５％、５０％〜９０％、５０％〜９０％、５５％〜９０％、６０％〜９０％、６５％〜９０％、７０％〜９０％、７５％〜９０％、８０％〜９０％、８５％〜９０％、５０％〜９０％、５５％〜８５％、６０％〜８０％、または６５％〜７５％、含有し、その残部は、賦形剤などの薬学的に許容される成分からなるものであってもよい。錠剤は、多層錠剤であってもよい。
【０１２６】
腸溶性錠剤が、アルギネートオリゴマーを下部消化管に投与するのに有効な場合もある。代表的な腸溶性錠剤は、オリゴマーを、％ｗ／ｖまたは％ｗ／ｗで、９５％以下、例えば、９０％以下、８５％以下、または８０％以下、例えば、５５％〜９０％、６０％〜９０％、６５％〜９０％、７０％〜９０％、７５％〜９０％、８０％〜９０％、８５％〜９０％、５５％〜８５％、６０％〜８５％、６５％〜８５％、７０％〜８５％、７５％〜８５％、８０％〜８５％、５０％〜８０％、５５％〜８０％、６０％〜８０％、６５％〜８０％、７０％〜８０％、または７５％〜８０％、含有し、その残部は、腸溶コーティング（例えば、脂肪酸、ワックス、シェラック、プラスチックおよび植物繊維などのポリマー）を含む薬学的に許容される賦形剤からなるものであってもよい。
【０１２７】
腸溶性顆粒剤が、アルギネートを下部消化管に投与するのに有効な場合もある。このような顆粒剤は、それ自体に腸溶コーティングが施されていてもよいし施されていなくてもよいカプセルに入った状態で提供されてもよい。代表的な腸溶性顆粒剤は、オリゴマーを、％ｗ／ｖまたは％ｗ／ｗで、９５％以下、例えば、９０％以下、８５％以下、または８０％以下、例えば、５５％〜９０％、６０％〜９０％、６５％〜９０％、７０％〜９０％、７５％〜９０％、８０％〜〜９０％、８５％〜９０％、５５％〜８５％、６０％〜８５％、６５％〜８５％、７０％〜８５％、７５％〜８５％、８０％〜８５％、５０％〜８０％、５５％〜８０％、６０％〜８０％、６５％〜８０％、７０％〜８０％、または７５％〜８０％、含有し、その残部は、腸溶コーティング（例えば、脂肪酸、ワックス、シェラック、プラスチックおよび植物繊維などのポリマー）を含む薬学的に許容される賦形剤からなるものであってもよい。
【０１２８】
アルギネートオリゴマーを女性生殖器官の下部に投与するのに、膣座薬が用いられてもよい。代表的な配合物は、オリゴマーを、％ｗ／ｖまたは％ｗ／ｗで、１％〜２５％、１％〜２０％、例えば、１％〜１５％、１％〜１０％、１％〜９％、１％〜８％、１％〜７％、１％〜６％、５％〜２５％、５％〜２０％、５％〜１５％、５％〜１０％、５％〜９％、５％〜８％、５％〜７％、５％〜６％、８％〜２５％、８％〜２０％、８％〜１５％、８％〜１０％、９％〜２５％、９％〜２０％、または９％〜１５％、含有し、その残部は、固体の賦形剤（例えば、パラフィンなど）を含む薬学的に許容される賦形剤からなるものであってもよい。
【０１２９】
アルギネートオリゴマーを消化管の下部へ投与するのに、直腸投与坐剤が用いられてもよい。代表的な配合物は、アルギネートオリゴマーを、０．１％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖ、例えば、０．１％ｗ／ｖ〜５％ｗ／ｖ、０．１％ｗ／ｖ〜２％ｗ／ｖ、０．１％ｗ／ｖ〜１％ｗ／ｖ、０．１％ｗ／ｖ〜０．８％ｗ／ｖ、０．１％ｗ／ｖ〜０．５％ｗ／ｖ、０．１％ｗ／ｖ〜０．２％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ〜５％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ〜２％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ〜１％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ〜０．８％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ〜０．５％ｗ／ｖ、０．５％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖ、０．５％ｗ／ｖ〜５％ｗ／ｖ、０．５％ｗ／ｖ〜２％ｗ／ｖ、０．５％ｗ／ｖ〜１％ｗ／ｖ、０．５％ｗ／ｖ〜０．８％ｗ／ｖ、０．８％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖ、０．８％ｗ／ｖ〜５％ｗ／ｖ、０．８％ｗ／ｖ〜２％ｗ／ｖ、０．８％ｗ／ｖ〜１％ｗ／ｖ、１％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖ、１％ｗ／ｖ〜５％ｗ／ｖ、１％ｗ／ｖ〜２％ｗ／ｖ、２％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖ、２％ｗ／ｖ〜５％ｗ／ｖ、または５％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖ、含有し、その残部は、固体の賦形剤を含む薬学的に許容される賦形剤からなるものであってもよい。
【０１３０】
「％ｗ／ｖ」（すなわち、「重量−体積百分率」）は、液体溶媒または半固体溶媒中の固体溶質の濃度について、通常用いられる表現である。１％ｗ／ｖは、溶媒１００ｍｌあたりの固体１グラムと同じ、２％ｗ／ｖは、溶媒１００ｍｌあたりの固体２ｇと同じ、などである。したがって、局所濃度は、ｇ／１００ｍｌ、１００ミリリットルあたり〜グラム、ｇ１００ｍｌ−１と表現されてもよい。１％ｗ／ｖは、溶媒１リットルあたりの固体１０グラムとも同じである。さらに、「％ｗ／ｗ」（すなわち、「重量−重量百分率」）は、固体中の化合物の量について、通常用いられる表現である。１％ｗ／ｗは、固体１００ｇあたりの化合物１グラムと同じ、２％ｗ／ｗは、固体１００ｇあたりの化合物２ｇと同じ、などである。したがって、％ｗ／ｗは、ｇ／１００ｇ、１００グラムあたり〜グラム、およびｇ １００ｇ−１と表現されてもよい。１％ｗ／ｗは、固体１キログラムあたりの化合物１０グラムとも同じである。当業者であれば、適切な変倍計算によって、本範囲の局所濃度範囲を、質量および体積のいずれかのＳＩ単位に換算して表現することができるということを理解するであろう。濃度の標準的でない尺度への変換も可能であり、当業者にとっては慣行的であろう。
【０１３１】
以下の限定しない実施例を参照して、本発明をさらに説明する。
【０１３２】
図１は、受診４回目（Ｖ４、プラセボ）および受診７回目（Ｖ７、治療）における患者２０８０１００１についての二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトル（１２００ｃｍ−１〜９５０ｃｍ−１）を、二次微分オリゴＧスペクトル（１２００ｃｍ−１〜９５０ｃｍ−１）と並べて示す。上図は、オリゴＧ治療後段階における二次微分スペクトル（実線）およびプラセボ治療後段階における二次微分スペクトル（破線）を示す。下図は、上図の治療後スペクトルとピークがよく一致しているオリゴＧについての二次微分スペクトルを示す。
【０１３３】
図２は、患者の試料についての処理済生ＦＴＩＲ吸収スペクトルと、オリゴＧについての処理済生ＦＴＩＲ吸収スペクトルとの間の相関係数の分布を示す。スクリーニング試料（右下がりの斜線）；プラセボ試料（網目模様）；オリゴＧ治療後試料（右上がりの斜線）。
【０１３４】
図３は、患者の試料についての二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルと、オリゴＧについての二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルとの間の相関係数の分布を示す。スクリーニング試料（右下がりの斜線）；プラセボ試料（網目模様）；オリゴＧ治療後試料（右上がりの斜線）。
【０１３５】
図４は、生ＦＴＩＲ吸収スペクトルおよび二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルについての痰試料とオリゴＧとの間の相関係数をすべて同時に示す散布図である。黒い線は、治療段階の試料（黒菱形）と、プラセボ段階またはスクリーニング／０日目段階の試料（それぞれ、白菱形および白丸）とを最も適切に分離するものであり、オリゴＧの有無を予測する本発明の線形予測モデルの元となる（Ｙ＝−１．９６４３Ｘ＋１．７２８６）。
【０１３６】
図５は、オリゴＧ（灰色）、コントロールのＣＦ痰（黒）、および０．０２％〜２０％まで漸進的に濃度を上昇させたオリゴＧとインキュベートしたＣＦ痰（短鎖線：０．０２％；一点長鎖線：０．０５％；中鎖線：０．１％；二点長鎖線：０．２％；点線：０．５％；長鎖線：１．０％；二点中鎖線：１．５％；超長鎖線：２．０％）について、ベクトル正規化し、ベースライン補正を行ったＦＴＩＲ吸収スペクトルの１８００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの範囲を示す。
【０１３７】
図６は、オリゴＧ（灰色）、コントロールのＣＦ痰（黒）、および０．０２％〜２０％まで漸進的に濃度を上昇させたオリゴＧとインキュベートしたＣＦ痰（短鎖線：０．０２％；一点長鎖線：０．０５％；中鎖線：０．１％；二点長鎖線：０．２％；点線：０．５％；長鎖線：１．０％；二点中鎖線：１．５％；超長鎖線：２．０％）について、ベクトル正規化し、ベースライン補正を行ったＦＴＩＲ吸収スペクトルの１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの範囲を示す。
【０１３８】
図７は、オリゴＧ（灰色）、コントロールのＣＦ痰（黒）、および０．０２％〜２０％まで漸進的に濃度を上昇させたオリゴＧとインキュベートしたＣＦ痰（短鎖線：０．０２％；一点長鎖線：０．０５％；中鎖線：０．１％；二点長鎖線：０．２％；点線：０．５％；長鎖線：１．０％；二点中鎖線：１．５％；超長鎖線：２．０％）について、二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルの１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの範囲を示す。
【０１３９】
図８は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１６０１ｃｍ−１におけるＦＴＩＲ吸光度値を示す。
【０１４０】
図９は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１４１２ｃｍ−１におけるＦＴＩＲ吸光度値を示す。
【０１４１】
図１０は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１１２５ｃｍ−１におけるＦＴＩＲ吸光度値を示す。
【０１４２】
図１１は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１０８６ｃｍ−１におけるＦＴＩＲ吸光度値を示す。
【０１４３】
図１２は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１０２８ｃｍ−１におけるＦＴＩＲ吸光度値を示す。
【０１４４】
図１３は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての９４８ｃｍ−１におけるＦＴＩＲ吸光度値を示す。
【０１４５】
図１４は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数における生ＦＴＩＲ吸収スペクトルと、オリゴＧについての１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数における生ＦＴＩＲ吸収スペクトルとの間の相関に関するスピアマンのロー値を示す。
【０１４６】
図１５は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数における二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルと、オリゴＧについての１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数における二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルとの間の相関に関するスピアマンのロー値を示す。
【０１４７】
図１６は、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数における二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルと、オリゴＧについての１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数における二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルとの間の相関に関するスピアマンのロー値を、オリゴＧ濃度を上昇させていったＣＦ痰試料についての１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数における生ＦＴＩＲ吸収スペクトルと、オリゴＧについての１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１までの波数における生ＦＴＩＲ吸収スペクトルとの間の相関に関するスピアマンのロー値に対してプロットしたものを示す。コントロール痰（ばつ印）；０％オリゴＧ（黒菱形）；０．０２％オリゴＧ（白四角）；０．０５％オリゴＧ（白菱形）；０．１％オリゴＧ（丸）；０．２％オリゴＧ（黒三角）；０．５％オリゴＧ（白三角）；１．０％オリゴＧ（逆三角）；１．５％オリゴＧ（黒四角）；２．０％オリゴＧ（黒丸）。データポイントは、オリゴＧ濃度に応じて集まっている。
【０１４８】
［実施例］
［実施例１−嚢胞性線維症患者の痰におけるオリゴＧのＦＴＩＲによる検出］
＜フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）＞
ハイスループットシステム（ＨＴＳ）モジュールを装備したブルカー・バーテックス・フーリエ変換ＩＲ（ＦＴＩＲ）（ブルカー・オプティクス社）を用いて、ＩＲスペクトルを得た。スペクトルの生成には、ＦＴＩＲ透過モードを用いた。すべての試料について、３μＬの痰を、全量が漏れなく確実にスポット上に存在するように、ピペットチップを用いて、直接、９６穴シリコンプレート上に注意深くスポットした。各試料を、室温でゆっくりと揮発させた。４０００ｃｍ−１〜４５０ｃｍ−１の波数範囲で、解像度を４ｃｍ−１として、１試料につき２４回スキャンを行い、その平均を赤外スペクトルとして収集した。この制御は、オプティクス・ユーザー・ソフトウェア（ＯＰＵＳ）バージョン７．０（ブルカー・オプティクス社）を用いて行った。１試料につき、設定した再現性で６つの複製物が生成されるまで、この処理を繰り返した。ＤＰが５〜２０（重量平均分子量が３２００Ｄａ）でＧ残基が９０％〜９５％であるアルギネートオリゴマー（オリゴＧ）について、蒸留水を用いたオリゴマーの０．２％（ｗ／ｖ）溶液と同じ手順にしたがって、赤外スペクトルを生成した。
【０１４９】
各試料のスペクトルを取得する前に、脱イオン水で希釈したイソプロピルアルコールを用いてシリコンプレートを十分に洗浄し、乾燥させた。スキャンを２４回行って、各試料について自動でバックグラウンドスペクトルを測定し、直後に取得した試料スペクトルから差し引いた。
【０１５０】
＜データ処理＞
ＯＰＵＳソフトウェア・バージョン７．０（ブルカー・オプティクス社）を用いて１８００ｃｍ−１〜９５０ｃｍ−１の間でベースラインを差し引くことで、得られた痰スペクトルの前処理を行った。各試料についての６つの複製物の間の再現性レベルを、相違の尺度であるスペクトル距離（Ｄ）を用いて、１８００ｃｍ−１〜９５０ｃｍ−１の領域について算出した。ここで、Ｄは、（１−ｒ）×１０００に等しく、ｒはピアソンの相関係数である。その他のスペクトルと比較した際に、Ｄ値が１０を越えるスペクトルについては、不適切な複製物とみなし、破棄することとした。スペクトルの比較はすべてＤ値が１０未満であり、高い再現性を示した。その後、６つの複製物に基づいて、各試料について平均スペクトルを算出した。ベクトル正規化を用いて、平均スペクトルを正規化した。これには、およそ１６４０ｃｍ−１のアミド１ピークの吸光度を、複数のスペクトルにわたって等しくする効果があり、これによってすべてのスペクトルの比較が可能となった。ＯＰＵＳソフトウェアを用いて９点サビツキー・ゴーレイ平滑化を行うことによって、すべての処理済み生スペクトルについて、二次微分スペクトルを算出した。
【０１５１】
＜統計解析＞
データ分析は、すべて、Ｒ統計プログラミング環境を用いて行った。「ｃｏｒ．ｔｅｓｔ」内のスピアマンの相関を用いて、痰の生スペクトルまたは二次微分スペクトルおよびオリゴＧスペクトルに対して相関分析を行った。初めに、すべてのデータについて、シャピロ・ウィルク検定を用いて正規性を評価した。
【０１５２】
＜患者＞
オリゴＧに関する第ＩＩｂ相試験に関わる１５人の患者から、痰試料を得た。すべての患者について、スクリーニング／０日目（治療前／プラセボ前）段階における試料、およびプラセボ段階またはオリゴＧ治療段階における少なくとも１つの試料を得た。
【０１５３】
＜赤外スペクトルデータ＞
すべての患者について、複数のスペクトルにわたって、様々な領域における赤外吸収が受診毎に変化することが観察された。また、１２００ｃｍ−１〜９５０ｃｍ−１までの赤外波数において、オリゴＧの吸収が強いこともわかったので、治療段階におけるオリゴＧの検出のために、この領域をさらに評価することにした。以下、スペクトルにおけるこの領域を「オリゴＧ領域」という。
【０１５４】
例として、患者２０８０１００１についてのオリゴＧ領域内の二次微分赤外スペクトルデータと、オリゴＧ標準赤外スペクトルとを、図１に示す。オリゴＧスペクトルと並べて治療後段階のスペクトルをグラフ分析することによって、オリゴＧのピークを目視で検出できることが示された。
【０１５５】
治療スペクトルをプラセボスペクトルまたは未治療スペクトルと区別する（すなわち、試料中にオリゴＧが存在しているのかを判定する）能力を最大化するために、生スペクトルおよび二次微分スペクトルの両方に対して相関分析を行い、二次元デカルトプロットにおいて相関係数を用いることで、それらの赤外プロファイルが標準オリゴＧスペクトルとどれだけ類似しているかに応じて試料を分類することとした。その後、このような類似性の二次元「マップ」を用いて、試料がオリゴＧを含有しているか否かを予測することができる単純線形モデルを開発した。
【０１５６】
＜治療後スペクトルおよび未治療スペクトルの相関分析＞
「オリゴＧ領域」内において、生吸収スペクトルおよび二次微分スペクトルの両方について、各試料スペクトルをオリゴＧ標準スペクトルと比較した。各例において、類似度を０と１との間で示す（係数が１の場合、同一であることを意味する）スピアマンの相関係数を算出した。各試料について、両方の場合の一連の相関係数を、表１の列５および列６に示す。
【０１５７】
【表１】
2021533352.tif 000004
【０１５８】
2021533352.tif 000005
【０１５９】
生スペクトル（図２）および二次微分スペクトル（図３）について、治療後段階、プラセボ段階、およびスクリーニング段階における試料のスピアマンのロー相関係数の分布を示す。二次微分スペクトルの方が、段階による差が大きいことがわかる。
【０１６０】
各試料について、生スペクトルの相関係数に対する二次微分スペクトルの相関係数についての散布図を作成し、治療後段階の試料が、プラセボ段階の試料およびスクリーニング／０日目段階の試料と比較してどのようであるかを可視化した。このような散布図は、試料スペクトルが標準オリゴＧスペクトルとどれほど類似しているか、またはどれほど異なっているかの「マップ」を表す。概して、治療試料由来の二次微分スペクトルは、生スペクトルよりも高い相関があるが、両方が予測モデルを生成するのに有用であり得るということが観察された。
【０１６１】
予測モデルを開発するために、単一の散布図を作成し、表１のすべての相関係数を同時にマッピングして示した（図４）。そして、生の相関係数および二次微分相関係数の両方を用いて、線形モデルを開発し、治療後試料およびプラセボ試料の分離を最適化した。視覚的には、このモデルは、図４の直線として表される。この直線上またはこれよりも上にある点は、オリゴＧを含有する試料であると予測され、この直線よりも下にある点は、オリゴＧを含有しない試料であると予測される。本モデルは、以下の数式に基づく。
【０１６２】
Ｙ＝−１．９６４３Ｘ＋１．７２８６
したがって、いずれの試料についても、オリゴＧが存在するかを予測するために、生吸収スペクトルとオリゴＧ標準スペクトルとの間の相関係数を「Ｘ」として数式に入力する。そして、得られる「Ｙ」の値を用いて、オリゴＧが存在するかを判定する。二次微分スペクトルとオリゴＧ標準スペクトルとの間の試料の相関係数が予測されたＹ以上であれば、本モデルはオリゴＧが存在すると予測する。
【０１６３】
その後、各試料について、吸収スペクトルの相関係数（表１の列５）を数式に入力することによって、本モデルの感度および特異性を求めた。次いで、予測されたＹ値を二次微分相関係数（表１の列６）と比較し、予測が正しいか否かを確認した。
【０１６４】
表１の列７に各例の予測を示し、列８に予測の精度を示す。本モデルが、オリゴＧは存在しないと間違って予測した例は、常に、時系列において２回目の治療のための受診時のものであった。
【０１６５】
表２Ａは、本予測モデルの感度および特異性を示す。オリゴＧの検出感度は、０．８６であり、一方、本モデルの全体的な特異性（すなわち、オリゴＧが存在しないと判定すること）は、０．７０であった。プラセボ試料のみを用いて算出した場合の感度は、０．７４であった。しかしながら、スクリーニング時のすべての被験体におけるオリゴＧの試験吸入を考慮に入れ、最初の治療期間において投与された際のオリゴＧの持ち越し効果と合わせると、全体的な試験の特異性は、０．９０まで上昇した（表２Ｂ）。
【０１６６】
【表２】
2021533352.tif 000006
【０１６７】
【表３】
2021533352.tif 000007
【０１６８】
＜考察＞
本研究の結果は、ＦＴＩＲによって、嚢胞性線維症患者由来の痰においてアルギネートオリゴマー（オリゴＧ）を識別することができたということを示している。端的には、これは、検査試料の二次微分ＦＴＩＲスペクトルをアルギネートオリゴマーの二次微分ＦＴＩＲスペクトルと比較することで行われ得る。単に、検査試料についての生ＦＴＩＲ吸収スペクトルおよび二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルと、標準アルギネートオリゴマーについての生ＦＴＩＲ吸収スペクトルおよび二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルとの間の相関を算出し、当該係数を単純線形式に適用することによって、アルギネートオリゴマーを検出することもできる。この手順は、簡易かつ迅速であり、単一試料スペクトルおよびライブラリ中の基準となるアルギネートスペクトルから、すべてのデータが生成される。本方法は、非侵襲的で、再現性があり、試料あたりの費用効率が高い。
【０１６９】
提案する予測モデルについて算出された感度値は、試験に供した試料のうちの８０％が、アルギネートオリゴマースペクトルが存在しているかを正確に示すことを示唆している。しかしながら、感度および特異性が顕著に高くなる場合があることを示唆する注目すべき例外もある。Ｖ２スクリーニング試料について、明らかに偽陽性である予測の比率が高いことは、Ｖ２スクリーニングのために受診した時点で、試験吸入としてアルギネートオリゴマーの単回投与をすでに受けていた患者が原因であると考えられる。すべてのスクリーニング試料がオリゴＧの存在を示したわけではないが、このことは、試験吸入がいかに効果的であったか、また痰試料の採取が吸入前後のどちらであったかということに原因があったのであろう。さらに、臨床試験におけるより広い臨床所見は、オリゴＧの効果が、オリゴＧ治療の中断後もよく維持されるということも示しており、このことは、オリゴＧが、痰や、今後吐き出される痰塊などに依然として存在し得るということを示唆している。したがって、オリゴＧが、洗浄段階終了時に、依然として痰に存在し得るということによって、プラセボ段階開始時に、Ｖ６試料においてオリゴＧを真陽性として検出したのであろう。このような効果を考慮に入れると、真の特異性は８０％を越えるものと考えられる。
【０１７０】
オリゴＧの検出に影響を及ぼすさらなる要因としては、患者のコンプライアンス（すなわち、患者が薬剤を正しく吸入しなかったり、服用を忘れたりすること）や、試料と標準オリゴＧとの間の相関を低くし得る大きな赤外ピークをスペクトルにもたらす他の「外来」分子（例えば、食物）が挙げられる。オリゴＧに類似している赤外プロファイルを生じさせる「外来」の競合する糖類が痰に存在することを原因として、結果が偽陽性となる場合もある。
【０１７１】
［実施例２−嚢胞性線維症患者の痰におけるオリゴＧ濃度のＦＴＩＲによる決定］
本実験の狙いは、ＣＦ患者の痰試料を、オリゴＧ濃度を上昇させつつ、オリゴＧとインキュベートし、オリゴＧ特異的な波数における吸光度を測定することであった。その後、オリゴＧ特異的な各波数における吸収の検量線を算出した。また、各スペクトルと、基準となるオリゴＧスペクトルとの間で、相関分析を行った。吸収の検量線および相関を、０．９５以上のＲ２値を示す多項式近似曲線を用いて以下に示すが、これは、ＦＴＩＲ分析によって、痰におけるオリゴＧ濃度を正確に推定することができるということを示している。
【０１７２】
＜方法＞
０％ｗ／ｖ〜２０％ｗ／ｖまでのオリゴＧ原液を調製し、１：１０（ＯＧ：痰）で希釈して、ＣＦ患者の痰とインキュベートした。表１に、原液濃度および痰におけるＯＧの最終濃度をすべて示す。３７℃で３０分間、ＯＧを痰とインキュベートした。
【０１７３】
【表４】
2021533352.tif 000008
【０１７４】
実施例１で説明した通りに、インキュベート後のＣＦ痰試料に対してＦＴＩＲ分析を行った。インキュベートしていないＣＦ痰をコントロール試料として用いた。複製スペクトル（ｎ＝３）を、ブルカー・アルファ・ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分光計を用いて取得した。正規化、ベースライン補正、および二次微分の計算を行うために、内蔵のＯＰＵＳスペクトル処理ツールを用いてスペクトルを処理した。
【０１７５】
＜吸光曲線＞
オリゴＧとインキュベートした痰のＩＲスペクトルを生成し、オリゴＧの主要な吸収ピークに対応するピーク位置における吸光度を、対応する痰中オリゴＧ濃度に対してプロットした（図８から図１３）。検討した、注目すべき波数を、表４に示す。
【０１７６】
【表５】
2021533352.tif 000009
【０１７７】
＜相関分析＞
オリゴＧとインキュベートしたＣＦ痰およびコントロールのＣＦ痰の各ＩＲスペクトルは、ノンパラメトリックな相関検定（スピアマンの検定）を用いると、基準となるオリゴＧスペクトルと相関していた。吸収スペクトルおよび二次微分スペクトルの両方が、対応するオリゴＧの吸収スペクトルおよび二次微分スペクトルと相関していた。オリゴＧスペクトルにおいて最も特徴のあるピークは、１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１のグリコーゲンリッチ領域に見出される。このため、相関分析においては、この領域に注目した。
【０１７８】
＜結果および考察＞
ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分光法は、ＣＦ痰におけるオリゴＧ濃度と、オリゴＧ特異的なＩＲ波数による吸収との間の関係を際立たせた。このように、ＦＴＩＲを用いて、未知のＣＦ患者の痰試料におけるオリゴＧ濃度を推定することができる。図５、図６、および図７に示すＩＲスペクトルは、オリゴＧが痰のＦＴＩＲスペクトルに及ぼす強い影響（affects）を実証しており、グリコーゲンリッチ領域（１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１）を含む１８００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１の波数にわたって、特に、オリゴＧに関連する波数（表４）近傍において、吸光度の上昇が観察される。また、インキュベートしていない痰スペクトルおよび０％のオリゴＧとインキュベートした痰スペクトルと比較して、オリゴＧとインキュベートした痰スペクトルにおいて、この領域におけるピークの上昇を観察することもできる。
【０１７９】
図８から図１３は、表４の各波数において、測定された相対吸光度が、痰試料におけるオリゴＧ濃度に比例することを示す。したがって、オリゴＧ濃度が未知である痰試料の場合、これらの波数におけるＩＲ吸光度を測定し、適切な図を用いてその試料におけるオリゴＧ濃度を求めることができるであろう。
【０１８０】
１２００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１の波数範囲におけるＦＴＩＲ吸収スペクトルの相関分析によって、生の痰スペクトルおよび二次微分した痰スペクトルをオリゴＧ基準スペクトルと比較した場合に、オリゴＧの濃度の上昇と、スピアマンのロー係数の上昇とがいかに対応するかが示される（図１４および図１５）。オリゴＧが０．０２％であっても相関の上昇を観察することができるが、これは、吸収スペクトル（片側ｐ＝０．０１４２）および二次微分スペクトル（片側ｐ＝０．０２７８）の両方について、９５％信頼水準において統計的に有意であることがわかった。また、その他すべての濃度についての相関係数が、インキュベートしていないコントロールの痰および０％のオリゴＧとインキュベートした痰とは統計的に有意に異なることがわかった（ｐ＜０．０５）。コントロールの痰および０％のオリゴＧとインキュベートした痰についての相関係数は、吸収スペクトルおよび二次微分スペクトルのいずれについても、９５％信頼水準において互いに統計的に有意に異なることはないということがわかった（吸収ｐ＝０．２２６１、二次微分ｐ＝０．６５８５）が、これは、観察された相違の原因は、実験条件ではないということを示している。
【０１８１】
したがって、オリゴＧ濃度が未知である痰試料の場合、これらの波数におけるＩＲ吸光度を測定し、生のＦＴＩＲ吸収スペクトルおよび／またはそれを二次微分したスペクトルと、対応するオリゴＧ由来のＦＴＩＲ吸収スペクトルとの相関を取り、適切な検量線を用いてその試料におけるオリゴＧ濃度を求めることが可能となるであろう。
【０１８２】
図１６は、さらに、オリゴＧを含有する痰由来の二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルおよびオリゴＧ由来の二次微分ＦＴＩＲ吸収スペクトルについての相関係数を、オリゴＧを含有する痰由来の生ＦＴＩＲ吸収スペクトルおよびオリゴＧ由来の生ＦＴＩＲ吸収スペクトルについての相関係数に対してプロットすると、データポイントが、オリゴＧ濃度にしたがって、異なるグループを形成するように集合するということを示す。したがって、オリゴＧ濃度が未知である痰試料の場合、これらの波数におけるＩＲ吸光度を測定し、生のＦＴＩＲ吸収スペクトルおよびそれを二次微分したスペクトルの両方と、対応するオリゴＧ由来のＦＴＩＲ吸収スペクトルとの相関を取り、そのようにして得られた相関係数の両方を用いて、このような図において試験データポイントがどの集合に対応するかを判定することでオリゴＧ濃度を求めることができるであろう。
【図１】
2021533352.tif 000011
【図２】
2021533352.tif 000012
【図３】
2021533352.tif 000013
【図４】
2021533352.tif 000014
【図５】
2021533352.tif 000015
【図６】
2021533352.tif 000016
【図７】
2021533352.tif 000017
【図８】
2021533352.tif 000018
【図９】
2021533352.tif 000019
【図１０】
2021533352.tif 000020
【図１１】
2021533352.tif 000021
【図１２】
2021533352.tif 000022
【図１３】
2021533352.tif 000023
【図１４】
2021533352.tif 000024
【図１５】
2021533352.tif 000025
【図１６】
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【国際調査報告】
2021533352.tif 000027
2021533352.tif 000028
2021533352.tif 000029