(57)【要約】  本発明は、ワクチン組成物、最も顕著にはワクチン組成物であって、抗原性構成要素が大きい、例えば５０ｋＤａを超えるか、または多量体である、すなわちサブユニットで構成される、前記ワクチン組成物に関する。こうした抗原性構成要素は、現在、それに対してワクチン接種が不可能である病原体由来の抗原性構成要素に相当しうるため、特に関心対象である。本発明は、抗原性構成要素をディスプレイする粒子を含む組成物であって、第一のペプチドタグを含む抗原性構成要素、および第二のペプチドタグを含む部分を含み、抗原性構成要素および部分が、前記の第一および第二のペプチドタグの間のイソペプチド結合を通じて連結されており、そして抗原性構成要素が５０ｋＤａを超えるか、または多量体性である、前記組成物に関する。【選択図】図４
2021523937.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原性構成要素をディスプレイする粒子を含む組成物であって：
ｉ）第一のペプチドタグを含む抗原性構成要素、および
ｉｉ）第二のペプチドタグを含む部分
を含み、
抗原性構成要素および部分が、前記の第一および第二のペプチドタグの間のイソペプチド結合を通じて連結され、そして抗原性構成要素が５０ｋＤａを超える
前記組成物。
【請求項２】
抗原性構成要素が、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１７０ｋＤａ、１８０ｋＤａ、１９０ｋＤａ、２００ｋＤａ、３００ｋＤａまたは４００ｋＤａより大きい、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抗原性構成要素が、単量体または多量体であり、随意に、多量体が、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体または十量体である、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
部分が、ウイルス、細菌、ワクチン接種のための多量体化足場、多量体化してウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成するタンパク質構成要素、ウイルス構造タンパク質、ナノ粒子を形成する多量体化ドメイン、合成ナノ粒子または合成ＶＬＰである、先行する請求項いずれかに記載の組成物。
【請求項５】
部分がＨＢｓＡｇである、先行する請求項いずれかに記載の組成物。
【請求項６】
第一および第二のペプチドタグが、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ対；ＳｎｏｏｐＴａｇまたはＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ対；ＲｒｇＡＴａｇ、ＲｒｇＡＴａｇ２またはＤｏｇＴａｇおよびＲｒｇＡＣａｔｃｈｅｒ対；ＩｓｏｐｅｐタグＰｉｌｉｎ−Ｃ対；ＩｓｏｐｅｐＴａｇ−ＮおよびＰｉｌｉｎ−Ｎ対；ＰｓＣｓＴａｇおよびＰｓＣｓＣａｔｃｈｅｒ対；ならびにＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅによって仲介されるＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＤｏｇＴａｇ対；あるいはその変異体、誘導体または修飾物の任意の１つより選択され、随意に、第一および第二のペプチドタグがＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ対である、先行する請求項いずれかに記載の組成物。
【請求項７】
抗原性構成要素がＨＣＭＶ五量体の免疫原性構成要素を含む、先行する請求項いずれかに記載の組成物。
【請求項８】
ＨＣＭＶ五量体の免疫原性構成要素が、ｇＨ、ｇＬ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０またはｐＵＬ１３１サブユニットの１つまたはそれより多くを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ＨＣＭＶ五量体の免疫原性構成要素が、ｇＨ、ｇＬ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１サブユニットのすべてを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ＨＣＭＶ五量体の免疫原性構成要素が、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）膜貫通ドメインを含むｇＨサブユニットを含む、請求項７〜請求項９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
ｇＨ、ｇＬ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１サブユニットが、それぞれ、配列番号２８、３１、３５、３３および３６に示すアミノ酸配列、またはその機能的同等物を有する、請求項８〜請求項１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
第一のペプチドタグが、ｇＨサブユニットに、好ましくはｇＨサブユニットのＣ末端に付着している、請求項８〜請求項１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
抗原性構成要素がＲＳＶ−Ｆタンパク質の免疫原性構成要素を含む、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
ＲＳＶ−Ｆタンパク質の免疫原性構成要素が、プレ融合Ｆタンパク質、随意に、安定化プレ融合Ｆタンパク質である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ＲＳＶプレ融合Ｆタンパク質の免疫原性構成要素がＦ１およびＦ２サブユニットの三量体を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＲＳＶ−Ｆタンパク質が、配列番号５０〜５８のいずれか１つに示す配列を有する、請求項１３〜１５に記載の組成物。
【請求項１７】
第一のペプチドタグが、プレ融合Ｆタンパク質のＣ末端に付着している、請求項１３〜１６に記載の組成物。
【請求項１８】
第一のペプチドタグがＳｐｙＴａｇである、先行する請求項いずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
ＳｐｙＴａｇが配列番号３０に示すアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ＳｐｙＴａｇがリンカーを通じて付着している、請求項１８または請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
リンカーが配列番号２９に示すアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
部分がＨＢｓＡｇであり、そして随意に、第二のペプチドタグがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである、先行する請求項いずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
第二のペプチドがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒであり、前記ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが配列番号３８に示すアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
部分がリンカー、好ましくは柔軟性リンカーを通じてＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに付着している、請求項２２または請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
リンカーが配列番号３９に示すアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
免疫原性またはワクチン組成物である、先行する請求項いずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
疾患の予防および／または治療において使用するための、請求項１〜２６のいずれかに記載の組成物を含むワクチン。
【請求項２８】
請求項１〜２６のいずれかにしたがった組成物を産生する方法であって：
−第一のペプチドタグへの第一のタンパク質の第一の遺伝子融合物をコードする第一の核酸を、第一の宿主細胞内に導入し；
−前記の第一の宿主細胞を、前記の第一の遺伝子融合物を発現するための条件下でインキュベーションし；
−第二のペプチドタグへの第二のタンパク質の第二の遺伝子融合物をコードする第二の核酸を、第二の宿主細胞内に導入し；
−前記の第二の宿主細胞を、前記の第二の遺伝子融合物を発現するための条件下でインキュベーションし；
−随意に、発現された構成要素を精製し；
−発現された構成要素を、第一のペプチドタグおよび第二のペプチドタグの間のイソペプチド結合の形成のための条件下でインキュベーションし；そして随意に、生じた組成物を精製する
工程を含む、前記方法。
【請求項２９】
第一のタンパク質が抗原性構成要素を含み、そして第二のタンパク質が部分を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
核酸分子が、配列番号２７〜４１のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする、請求項２８または請求項２９に記載の方法において使用するための核酸分子。
【請求項３１】
配列番号１２〜２６または４２〜４６のいずれかに示すヌクレオチド配列を有する、請求項３０に記載の核酸分子。
【請求項３２】
核酸分子が、配列番号５０〜５８のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする、請求項２８または請求項２９に記載の方法において使用するための核酸分子。
【請求項３３】
配列番号４７〜５５のいずれかに示すヌクレオチド配列を有する、請求項３２に記載の核酸分子。
【請求項３４】
請求項３０〜３３に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３５】
請求項３０〜３２に記載の核酸分子、または請求項３４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３６】
第一の免疫原性組成物を含む組成物、および随意に第二の免疫原性組成物を含む１つまたはそれより多いブースター組成物を含むキットであって、前記の第一および／または第二の免疫原性組成物が請求項１〜請求項２６のいずれかに記載の組成物を含む、前記キット。
【請求項３７】
請求項７〜１２のいずれかに記載の組成物を含む、ＨＣＭＶ感染の予防および／または治療において使用するためのワクチン。
【請求項３８】
請求項１３〜１７のいずれかに記載の組成物を含む、ＲＳＶ感染の予防および／または治療において使用するためのワクチン。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ワクチンは、感染性疾患と闘いそしてこれを根絶するための安全でそして有効な方法である。ワクチン開発は非常に成功してきているが、ワクチンが現在まったく存在しないまま残る疾患課題のリストがあり、これには、手強い免疫学的障害に相当する多くの重大な病原体が含まれる。一般的に、有効なワクチンは、リンパ節に輸送され、免疫反応を生じるために十分な時間そこに留まらなければならないと見なされる。
【０００２】
ワクチン開発は、必要な防御免疫反応を生じる一方で、こうした弱毒化株の使用に固有のリスクを回避することを目的として、弱毒化されたかまたは死んだ病原体の使用から、これらの病原体のより小さい抗原性構成要素の使用へと移行してきている。病原体構成要素（例えば病原体が細胞を感染させるために必要である構成要素）の免疫原性部位を発現する試みに対して重点的に努力がなされてきており、こうした構成要素は、簡単に言えば、巨大なまたは多数の構成要素の抗原の発現には技術的問題が伴うため、短い／小さいペプチドおよびタンパク質に制限されてきている。しかし、非常に短いまたは小さいペプチドを用いることに伴う潜在的な問題は、抗原的に可変性である病原体のリスクであり、こうした病原体は、抗原の特定のパートの変化を通じて、ワクチン接種によって誘導された免疫反応を逃れる。
【０００３】
巨大な／多数の構成要素の抗原の発現に関しては免疫学的な利点があり、これには、１つの病原体の多数の中和性エピトープに対する抗体の生成が可能になる能力が含まれる。しかし、適切な抗原性エピトープが維持され、そして有効な抗体反応の生成のために提示されるように複合体を形成しうる、１つまたはそれより多い巨大な抗原の発現は、非常に困難なままである。したがって、臨床的に有意な免疫反応を生じうる方式で、巨大な抗原および／または多数の構成要素の抗原を発現させるための改善された方法の必要性がなおある。
【０００４】
多数の抗原性構成要素に対する免疫反応を誘発するように設計された以前の組換えワクチンは、各々の構成要素が発現され、そして別々の粒子内に別個にパッケージングされることに頼るかいずれかであり、例えば、抗ＨＰＶワクチン、サーバリックスおよびガーダシルの場合、特定のＨＰＶ株の組換え主要カプシドＬ１タンパク質が別個に発現され、そしてウイルス様粒子（ＶＬＰ）として組み立てられ、その後、異なるタイプのＶＬＰがワクチン配合物に組み合わせられる。あるいは、多数の短いエピトープが選択され、そして単一の組換えワクチン（例えば多量体００１インフルエンザワクチン）に組み合わせられるが、まさにその性質のため、これらのエピトープは短い直鎖エピトープであり、三次元構造または再フォールディングに関与する製造上の複雑さを回避するために選択されており、そしてしたがって、能動的感染において免疫系に提示されるような天然病原体を代表するようには試みられていない。
【０００５】
例えば、β−ヘルペスヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ、ヒトヘルペスウイルス−５（ＨＨＶ−５）としてもまた知られる）は、新生児発達障害の主な原因ウイルスである。この遍在性のウイルスは、一般集団の６０％超に感染し、最初の感染は通常、軽症であるかまたは無症候性である。感染後、ウイルスは体内に潜在し続けるが、免疫低下した者（すなわちＨＩＶ患者、移植患者および化学療法を受けている者）または高齢者では深刻な疾患を引き起こしうる。ＨＣＭＶは、発展途上国において、先天異常の主な感染性の原因である。最大４人／２００人の赤ちゃんが先天性感染のためＨＣＭＶを持って生まれ、そしてこれらのうち最大１０％が長期の結果に苦しむ。ＨＣＭＶ感染はまた、成人において、高血圧およびアテローム性動脈硬化症と関連付けられてきている（Ｃｈｅｎｇら（２００９年５月）  Ｆｒｕｅｈ  Ｋ監修  ”Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ”．  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．  ５（５）：ｅ１０００４２７）。ＨＣＭＶはしたがって、公衆衛生の優先事項である。しかし、集中的な努力にもかかわらず、ＨＣＭＶワクチンの成功は現在まで達成されてきていない。
【０００６】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、感染した健康な成人およびより年長の小児においては、健康にほとんど害を引き起こさない別の遍在性ウイルスである。しかし、世界中で１歳未満の乳児の２番目に大きな死因であり、マラリアに次いで２番目である。該ウイルスは、世界中で、年間、概算１６０，０００件の死亡の原因である。このウイルスは、深刻な呼吸器感染を引き起こし、そして合併症には肺炎および細気管支炎が含まれる。高リスク群には、１歳未満の乳児および免疫低下患者、高齢者、ならびに心臓および肺状態を有する者が含まれる。やはり、長年の活発な研究および開発にも関わらず、ＲＳＶに対する現在認可されたワクチンは存在しない。
【０００７】
現在利用可能なワクチンがない、ＲＳＶおよびＨＣＭＶによって引き起こされるものなどの疾患に関しては、一般的に、ワクチン産生に対する現在のアプローチは望ましい有効性を示してきておらず、これは、こうした破局的な転帰を有する疾患に取り組むため、別のタイプのワクチンを提供する、大きな満たされていない必要性があることを示す。
【０００８】
近年、自発的なまたは補助されたアミド結合形成を可能にするための、いくつかの遺伝的にコードされた系が記載されてきている。例えば、ＳｐｙＴａｇは、２つの構成要素を混合した際、そのタンパク質パートナーＳｐｙＣａｔｃｈｅｒへの自発的および不可逆的イソペプチド結合が形成されるように操作されているペプチドである。タンパク質鎖内でのＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ構成要素の位置は、多様な位置であるように設計可能であり、そして広範囲のｐＨ、緩衝および温度条件下で反応する。ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ対、ならびにその変異体および誘導体は、ワクチン開発において用いられてきているが、今日まで、単純な抗原の提示にしか用いられてきていない。自発的なアミド結合形成を可能にするための、他の遺伝的にコードされた系には、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ；ＲｒｇＡＴａｇ／ＲｒｇＡＴａｇ２／ＤｏｇＴａｇおよびＲｒｇＡＣａｔｃｈｅｒ、ＩｓｏｐｅｐＴａｇ／ＩｓｏｐｅｐＴａｇ−ＮおよびＰｉｌｉｎ−ＣまたはＰｉｌｉｎ−Ｎ、ＰｓＣｓＴａｇおよびＰｓＣｓＣａｔｃｈｅｒ；ならびにＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＤｏｇＴａｇ（ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅによって仲介される）、ならびにこれらの系すべての変異体が含まれる。
【０００９】
本発明者らは、巨大な／多数の構成要素の抗原に対する反応を改善しうる、アミド結合形成を可能にするための遺伝的にコードされる系を用いて、ワクチン組成物における巨大な／多数の構成要素の抗原の使用が可能であることを立証した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎｇら（２００９年５月）  Ｆｒｕｅｈ  Ｋ監修  ”Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ”．  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．  ５（５）：ｅ１０００４２７
【発明の概要】
【００１１】
本発明の第一の側面において、タンパク質構成要素をディスプレイする粒子を含む組成物であって：
ｉ）  ｉ）第一のペプチドタグを含むタンパク質構成要素、および
ｉｉ）  ｉｉ）第二のペプチドタグを含む部分
を含み、
タンパク質構成要素および部分が、前記の第一および第二のペプチドタグの間のイソペプチド結合を通じて連結され、そしてタンパク質構成要素が５０ｋＤａを超える
前記組成物を提供する。
【００１２】
本発明の別の側面において、タンパク質構成要素をディスプレイする粒子を含む組成物であって：
ｉ）第一のペプチドタグを含むタンパク質構成要素、および
ｉｉ）第二のペプチドタグを含む部分
を含み、
タンパク質構成要素および部分が、前記の第一および第二のペプチドタグの間のイソペプチド結合を通じて連結され、そしてタンパク質構成要素が多量体性である
前記組成物を提供する。
【００１３】
タンパク質構成要素は任意の機能を有してもよく、例えば酵素であってもよいしまたは酵素特性を有してもよい。タンパク質構成要素は全長タンパク質であってもよいし、あるいは全長タンパク質の一部、セグメント、ドメインまたは一部切除物（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）であってもよい。タンパク質構成要素は、抗原または免疫原であってもよい。タンパク質構成要素はまた、抗原性構成要素と称されてもよい。
【００１４】
本発明の別の側面において、抗原性構成要素をディスプレイする粒子を含む組成物であって：
ｉｉｉ）第一のペプチドタグを含む抗原性構成要素、および
ｉｖ）第二のペプチドタグを含む部分
を含み、
抗原性構成要素および部分が、前記の第一および第二のペプチドタグの間のイソペプチド結合を通じて連結され、そして抗原性構成要素がおよそ５０ｋＤａを超える
前記組成物を提供する。
【００１５】
本発明の任意の側面のいくつかの態様において、タンパク質構成要素または抗原性構成要素は、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１７０ｋＤａ、１８０ｋＤａ、１９０ｋＤａまたはそれより大きい、例えば２００ｋＤａより大きい、３００ｋＤａより大きい、あるいは４００ｋＤａより大きいことも可能である。
【００１６】
多量体は、任意の数のサブユニットを含んでもよく、タンパク質または抗原性構成要素において、共有結合していてもまたはしていなくてもよい。多量体は、２〜２０のサブユニット、あるいは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多いサブユニットを含むことも可能である。あるいは、多量体は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体または十量体であることも可能である。多量体は任意の適切な病原体から形成されうるが、好ましくはウイルス多量体である。
【００１７】
巨大タンパク質構成要素、すなわち５０ｋＤａを超えるものまたは上述のようなものの限定されない例には、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来の五量体複合体（ＰＣ）およびｇＢ糖タンパク質、ＲＳＶ由来のＧおよびＦ糖タンパク質、インフルエンザＡウイルス由来の赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）Ｐｆｓ２３０、熱帯熱マラリア原虫ＣＳＰ、ヒトＨＥＲ２受容体、ＰＣＳＫ９、ＶＡＲ２ＣＳＡ、熱帯熱マラリア原虫ＲＩＰＲ、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）糖タンパク質Ｅ、狂犬病ウイルス糖タンパク質ならびにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ｇＨ／ｇＬ複合体が含まれる。
【００１８】
本発明の任意の側面のいくつかの態様において、タンパク質構成要素または抗原性構成要素は、単量体または多量体、例えば二量体、三量体、四量体または五量体であることも可能である。本発明の任意の側面のいくつかの態様において、タンパク質構成要素または抗原性構成要素はタンパク質またはペプチド複合体であることも可能である。
【００１９】
多量体抗原性構成要素の限定されない例には、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来の五量体複合体（ＰＣ）およびｇＢ三量体、ＲＳＶ由来のＧおよびＦ糖タンパク質、インフルエンザＡウイルス由来の赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原が含まれ、これらのいくつかは本明細書に記載される。他の例には、疾患病原体、例えばウイルス、細菌、真菌病原体、寄生虫または他の疾患媒介物の構成要素が含まれる。適切な多量体抗原性構成要素には、例えば、インフルエンザ（例えばインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）（例えばインフルエンザ三量体））、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）などのウイルスに由来するものが含まれる。
【００２０】
タンパク質構成要素を、遺伝子融合によって、第一のペプチドタグに付着させ、そして適切な細胞において組換え的に発現させることも可能である。翻訳後修飾、例えばグリコシル化を含む構成要素に関しては、真核または哺乳動物細胞株において組換えタンパク質を発現させることが好ましい可能性もありうる。
【００２１】
１つの態様において、「部分」は、該部分上で、タンパク質構成要素または抗原性構成要素がディスプレイされる、例えば免疫系に利用可能になることも可能である、構成要素である。１つの態様において、部分は多量体化して前記粒子を形成する。適切には、こうした部分は、ウイルス、細菌、ワクチン接種のための多量体化足場、または多量体化してＶＬＰ（ウイルス様粒子）を形成するタンパク質構成要素であることも可能である。適切には、部分は、バクテリオファージ、タバコモザイクウイルス粒子、アデノ随伴ウイルス様粒子（ＡＡＶＬＰ）、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）等の構成要素であることも可能である。１つの態様において、部分の多量体化（自己集合）がタンパク質構成要素または抗原性構成要素をディスプレイするための粒子を形成するように、部分はそれ自体、ウイルス、細菌等の構成要素である。１つの態様において、部分は、ウイルス構造タンパク質、例えばウイルスエンベロープまたはカプシドタンパク質または表面抗原であることも可能である。構造タンパク質の例には、インフルエンザウイルス由来のマトリックスＭ１タンパク質およびウイルスエンベロープＭ２タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス由来のＨＢｓＡｇ、大腸菌バクテリオファージＡＰ２０５ウイルスコートタンパク質（ＣＰ３）、ムンプス等を含む多様なウイルス由来の赤血球凝集素−ノイラミニダーゼが含まれる。適切なウイルス構造タンパク質が当業者に知られる。他の態様において、部分は、タンパク質またはペプチド、例えば多量体化ドメイン、例えばナノ粒子を形成するＩＭＸ３１３、またはコンピュータ由来粒子、例えばＭＩ３であることも可能である。さらなる態様において、部分は、合成ナノ粒子または合成ＶＬＰ、例えば金、リポペプチドまたはポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）ナノ粒子であることも可能である。他の適切な部分には、リポソームまたは外膜小胞が含まれることも可能である。適切には、第二のペプチドタグを含む部分は、第二のペプチドタグが付着する部分である。
【００２２】
ウイルス由来の構造表面抗原の使用が好ましい可能性もある。したがって、第二のペプチドタグを構造的表面抗原に付着させて、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形成を可能にし、該粒子に第二のペプチドタグを付着させるか、または該粒子が第二のペプチドタグをディスプレイする。ＶＬＰは非感染性自己集合ナノ粒子であり、そしてその反復性の分子的に定義された構築は、多価性を操作するため、特にワクチン接種のため、魅力的である。ＶＬＰは、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｂ型肝炎小分子表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含む）、パルボウイルス科（例えばアデノ随伴ウイルス）、レトロウイルス科（例えばＨＩＶ）、フラビウイルス科（例えばＣ型肝炎ウイルス）およびバクテリオファージ（例えばＱβ、ＡＰ２０５）を含む、非常に多様なウイルスファミリーの構成要素から産生されてきている。これらのいずれも、本発明の部分としての使用に適切でありうる。
【００２３】
第二のペプチドタグを、遺伝子融合を通じて部分に付着させることも可能である。この遺伝子融合は、単に末端に限定されるのではなく、配列中の任意の適切な点であることも可能である。当業者は、適切な細胞において、融合タンパク質を組換え的に発現可能であることを認識するであろう。
【００２４】
第二のペプチドタグは、あるいは、化学的コンジュゲート化によって、ディスプレイされるか、または部分に付着されることも可能である。これは、例えば、コンジュゲート化が実行可能であるように、反応性アミン基の存在を必要とするであろう。
【００２５】
したがって、１つの態様において、部分は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である。適切には、ＨＢｓＡｇは、本明細書に記載するような、配列番号４１に示すアミノ酸配列（またはその機能的同等物）を有する。
【００２６】
本発明の任意の側面の１つの態様において、タンパク質構成要素または抗原性構成要素は、ＨＣＭＶ五量体の免疫原性構成要素である。適切には、抗原性または免疫原性構成要素は、被験体、例えば患者内に導入した際に、その構成要素に対する免疫反応、例えば抗体反応を生じることが可能であるものである。したがって、「ＨＣＭＶ五量体の免疫原性構成要素」は、例えば、被験体において、抗ＨＣＭＶ抗体反応を生じることが可能な構成要素である。適切には、免疫原性構成要素は、ｇＨ、ｇＬ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１３１（ｐＵＬ１３１Ａとしてもまた知られる）より選択されるＨＣＭＶ五量体サブユニット構成要素の１つまたはそれより多く（少なくとも１つ）を含む。いくつかの態様において、免疫原性構成要素は、１つまたはそれより多いこれらの「ｐＵＬ」または「ＵＬ」構成要素を含む。他の態様において、免疫原性構成要素は、これらのｇＨまたはｇＬ構成要素の１つまたはそれより多くを含む。１つの態様において、免疫原性構成要素は、１つまたはそれより多い「ＵＬ」構成要素と、ｇＨまたはｇＬ構成要素より選択される１つまたはそれより多い構成要素の組み合わせを含む。本発明の別の態様において、ＨＣＭＶ五量体の免疫原性構成要素は、ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１サブユニットのすべてを含むＨＣＭＶ五量体である。適切には、ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１サブユニットは、タウン（Ｔｏｗｎｅ）（ＧＩ：２３９９０９３６６）、ＡＤ１６９（ＧＩ：２１９８７９６００）、トレド（Ｔｏｌｅｄｏ）（ＧＩ：２９０５６４３５８）およびマーリン（Ｍｅｒｌｉｎ）（ＧＩ：１５５５７３９５６）を含む、任意の既知のＨＣＭＶ株（実験室株および／または臨床単離体の両方を含む）由来のものに対応するアミノ酸配列、またはその機能的同等物を有する。機能的同等物によって、ある程度の相同性を共有し、そしていくつかのアミノ酸のみが異なるが、防御抗体を提供する抗原性サブユニットまたは五量体を形成可能である機能特性を保持するアミノ酸配列を意味する。構成要素ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａの適切な変異体が、例えば本明細書に援用されるＷＯ２０１４／００５９５９（４〜１０ページを参照されたい）に記載されている。好適には、ワクチンアプローチにおいて、ＨＣＭＶ五量体サブユニットを用いると、五量体アミノ酸配列レベルで、株間に高い度合いの相同性があるため、広範囲のＨＣＭＶウイルス株からの感染に対する免疫原性防御を提供可能である。
【００２７】
いくつかの態様において、抗原性構成要素は、疾患病原体の構成要素、あるいはそのベクターまたは一部に対応することも可能である。抗原性構成要素は、例えば、製造を容易にするため、膜貫通ドメインを欠いていてもよい。適切には、ＨＣＭＶ五量体において、例えば、ＨＣＭＶ五量体の免疫原性構成要素は、精製を容易にするため、宿主細胞におけるタンパク質産生中に、サブユニットが細胞上清内に分泌されるように、一部切除膜貫通ドメイン（この領域から１つまたはそれより多いアミノ酸を欠失させることによって、一部切除されている）を含む、ｇＨサブユニットを含む。
【００２８】
１つの態様において、ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａサブユニットは、それぞれ、配列番号２８、３１、３５、３３、３６に示すアミノ酸配列（またはその機能的同等物）を有する（示すシグナルペプチドを含むまたは含まない）。機能的同等物によって、ある程度の相同性を共有し、そしていくつかのアミノ酸のみが異なるが、例えば、防御抗体を提供する抗原性サブユニットまたは五量体を形成可能である機能特性を保持するアミノ酸配列を意味する。いくつかの態様において、機能的同等物は、関連するアミノ酸配列と７０％、８０％、９０％またはそれより高い相同性を共有することも可能である。別の態様において、ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａサブユニットは、配列番号１３、１６、２０、１８、２１に示すものなどの核酸配列、またはそのコドン最適化型（シグナルペプチドのコード配列を含むまたは含まない）によってコードされる。いくつかの態様において、ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａサブユニットの任意の１つは、シグナルペプチド、例えばその株の天然タンパク質上に存在するシグナルペプチド、シグナルペプチドの機能的同等物、またはＨＣＭＶの異なる株に由来するシグナルペプチドを有することも可能である。いくつかの態様において、ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａサブユニットの任意の１つは、異種タンパク質由来のシグナルペプチドを有することも可能である。シグナルペプチドの選択は、発現されたタンパク質を、特定の細胞性（または細胞外）位置にターゲティングするか、または他の機能性を与えるために決定されることも可能である。サブユニット（単数または複数）の発現後、シグナルペプチドは、用いた発現系の天然の細胞機構またはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかによって、酵素的に切断される（例えばシグナルペプチダーゼによって）ことも可能である。いくつかの態様において、ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａサブユニットの任意の１つは、シグナルペプチドを含まずに発現されることも可能である。いくつかの態様において、これらがより高い発現レベルを生じうる場合、イントロンを含む天然配列を用いることも可能である。適切には、ＵＬ１２８の天然核酸配列には２つのイントロンが含まれる。別の態様において、ＵＬ１３１Ａの核酸配列には１つのイントロンが含まれる。いくつかの態様において、イントロンを除去してもよい。いくつかの態様において、天然配列は、適切な発現系のため、コドン最適化されることも可能である。
【００２９】
本発明の任意の側面の１つの態様において、タンパク質構成要素または抗原性構成要素は、ＲＳＶウイルスの免疫原性構成要素、例えば付着糖タンパク質（Ｇタンパク質）または融合糖タンパク質（Ｆタンパク質）であり、これらはどちらも、感染初期を制御する。Ｇは、高グリコシル化された９０ｋＤａ  ＩＩ型膜内在性タンパク質であり、そしてプロテオグリカン上のヘパラン硫酸との相互作用のいずれかを通じた宿主細胞膜へのウイルス付着を仲介可能であり、そしてタンパク質構成要素の優れた候補である。
【００３０】
Ｆタンパク質は、膜内在性タンパク質であり、３つのＦ０単量体で構成され、Ｆ１およびＦ２サブユニットへの集合中にプロセシングされて、２つのジスルフィド結合によって共有連結される。Ｆタンパク質は、ＡおよびＢサブグループ両方に由来するＲＳＶ単離体間で非常に保存され、そしてアミノ酸配列は、９０％またはそれより高い同一性を示す。Ｆは、５０キロダルトン（ｋＤａ）カルボキシ末端Ｆ１断片および２０ｋＤａアミノ末端Ｆ２断片からなる、５７４アミノ酸のクラスＩ融合タンパク質であり；ヘテロ二量体の三量体を構成する。これは、２つのフューリン切断部位によって区別され、該部位は２７アミノ酸糖ペプチドを放出し、そしてＦ１アミノ末端で疎水性融合ペプチドを曝露する。Ｆ２には２つのＮ連結グリコシル化部位があり、そしてＦ１には１つしかない。Ｆ２およびＦ１の間の２５アミノ酸シグナルペプチドおよび２７アミノ酸糖ペプチドを除去した後、Ｆの残りの外部ドメインは４７２アミノ酸からなる。サブタイプＡおよびＢの間では、Ｆ外部ドメイン中、２５アミノ酸のみが異なる。
【００３１】
ＲＳＶ−Ｆタンパク質から抗原性組成物を発展させるため、いくつかの研究は、三量体であるプレ融合タンパク質の変異体を作製することに重点を置いてきている。変異体は、成熟プレ−Ｆの２つのサブユニットを一本鎖に遺伝子融合させることによって産生されてきている。Ｆ１に遺伝子融合したＦ２ならびに融合ペプチドおよびｐｅｐ２７領域両方の欠失を含むＤＳ−Ｃａｖ１変異体が作製されてきている。Ｆ２およびＦ１サブユニットの間のリンカーの相違は、免疫原性に影響を及ぼしていたようであり、そしてしたがって、変異体は異なるリンカーの選択を用いてもよい。天然ＲＳＶ−Ｆタンパク質配列は、寄託番号Ｐ０３４２０．１に見出されうる。
【００３２】
プレ融合Ｆタンパク質のいくつかの型が研究され、そして開発されてきており、そしてその結果、公表されてきている。これらのプレ融合三量体は、本発明における使用にすべて適している可能性がある。ＤＳ−Ｃａｖ１安定化融合糖タンパク質は、天然タンパク質に由来する。本明細書に援用されるＥＰ２２２２７１０もまた、ＲＳＶ−Ｆタンパク質ポリペプチドのＦ２ドメインおよびＦ１ドメイン、ならびに三量体化ドメインを含む、可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む、組換えＲＳＶ抗原を開示する。Ｋｒａｒｕｐら、Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１５；  ６：  ８１４３において、非常に安定なプレ融合ＲＳＶ−Ｆタンパク質が記載され、これもまた本明細書に援用される。
【００３３】
本明細書に援用されるＷＯ２０１４／１６０４６３は、プレ融合コンホメーションで安定化される単離組換えＲＳＶ−Ｆタンパク質、ならびに組換えＲＳＶ−Ｆタンパク質をコードする核酸分子を記載する。
【００３４】
本明細書に援用されるＷＯ２０１７／１７２８９０は、置換修飾プレ融合ＲＳＶ−Ｆタンパク質、および該タンパク質をコードする核酸を記載する。さらなる説明は、やはり本明細書に援用される、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１６  Ｓｅｐ；  ２３（９）：  ８１１−８２０，  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ，  Ｍ．  Ｇｏｒｄｏｎ  Ｊｏｙｃｅ，  Ｂａｏｓｈａｎ  Ｚｈａｎｇ，  Ｌｉ  Ｏｕ，  Ｍａｎ  Ｃｈｅｎ，  Ｇｗｏ−Ｙｕ  Ｃｈｕａｎｇ，  Ａｌｉａｋｓａｎｄｒ  Ｄｒｕｚ，  Ｗｉｎｇ−Ｐｕｉ  Ｋｏｎｇ，Ｙｅｎ−Ｔｉｎｇ  Ｌａｉ，  Ｅｍｉｌｙ  Ｊ．  Ｒｕｎｄｌｅｔ，  Ｙａｒｏｓｌａｖ  Ｔｓｙｂｏｖｓｋｙ，  Ｙｏｎｇｐｉｎｇ  Ｙａｎｇ，  Ｉｖｅｌｉｎ  Ｓ．  Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，  Ｍｉｋｌｏｓ  Ｇｕｔｔｍａｎ，  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｒ．  Ｌｅｅｓ，  Ｍａｒｉｅ  Ｐａｎｃｅｒａ，  Ｍａｌｌｉｋａ  Ｓａｓｔｒｙ，  Ｃｉｎｑｕｅ  Ｓｏｔｏ，  Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ  Ｂ．Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｊｏｎｅｓ，  Ｐａｕｌ  Ｖ．  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｇ．  Ｖａｎ  Ｇａｌｅｎ，  Ｕｌｒｉｃｈ  Ｂａｘａ，  Ｋｅｌｌｙ  Ｋ．  Ｌｅｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｒ．  Ｍａｓｃｏｌａ，  Ｂａｒｎｅｙ  Ｓ．  Ｇｒａｈａｍ，およびＰｅｔｅｒ  Ｄ．  Ｋｗｏｎｇに提供される。
【００３５】
Ｔ４フィブリチン三量体化ドメインに連結された組換えＦ２−Ｆ１外部ドメインプロトマーをコードする例示的な核酸配列は、寄託番号：ＬＰ８８４６１１．１、ＬＰ８８４６１０．１、ＬＰ８８４６０９．１およびＬＰ８８４６０８．１として入手可能である。
【００３６】
いくつかの態様において、タンパク質または抗原性構成要素は、疾患病原体の構成要素あるいはそのベクターまたは一部に対応することも可能である。抗原性構成要素は、例えば、製造を容易にするため、膜貫通ドメインを欠いていてもよい。適切には、ＲＳＶ−Ｆタンパク質またはそのプレ融合コンホメーションにおいて、例えばＦタンパク質の免疫原性構成要素は、精製を容易にするため、宿主細胞におけるタンパク質産生中に、サブユニットが細胞上清内に分泌されるように、一部切除膜貫通ドメイン（この領域から１つまたはそれより多いアミノ酸を欠失させることによって、一部切除されている）を含む、Ｆ２−Ｆ１サブユニットを含む。したがって、ＲＳＶ−Ｆタンパク質は機能性ＴＭドメインを欠く。あるいは、第一のペプチドタグを含む遺伝子融合は、実際、機能的膜貫通ドメインの存在に関わらず、Ｆタンパク質が膜中に存在することを防ぐことも可能である。
【００３７】
１つの態様において、プレ融合安定化サブユニットは、それぞれ、配列番号５０〜５８に示すアミノ酸配列（またはその機能的同等物）を有する。機能的同等物によって、ある程度の相同性を共有し、そしていくつかのアミノ酸のみが異なるが、例えば、防御抗体を提供する抗原性サブユニットを形成可能である機能特性を保持するアミノ酸配列を意味する。いくつかの態様において、機能的同等物は、関連するアミノ酸配列と７０％、８０％、９０％またはそれより高い相同性を共有することも可能である。１つの態様において、プレ融合安定化ＲＳＶ−Ｆ三量体には、異種三量体化ドメインが含まれなくてもよい。
【００３８】
タンパク質構成要素は、第一のペプチドタグを含む。組換え融合タンパク質を発現させることによって、この第一のペプチドタグをタンパク質構成要素に付着させてもよい。当業者は、適切な細胞系において組換えタンパク質を発現するため、ペプチド配列の遺伝子融合のための技術を知っている。翻訳後修飾、例えばグリコシル化を含む部分に関しては、真核または哺乳動物細胞株において組換えタンパク質を発現させることが好ましい。
【００３９】
好適に、イソペプチド結合を形成する第一のペプチドタグおよび第二のペプチドタグ、例えば本明細書に記載するようなＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ系を用いると、防御／中和／免疫原性効果を提供しうる、抗・抗原（例えば抗ＨＣＭＶ）抗体を生成可能であるような方式で、抗原が免疫系に提示されるような正しい編成および配向で、前記巨大抗原、例えばＶＬＰをディスプレイする部分上に、巨大および／または多量体抗原で「装飾」することが可能になる。可溶性抗原（巨大抗原、例えば多量体／五量体であっても）を用いてワクチン接種する伝統的なアプローチは、防御／中和／免疫原性効果を生じるにはより有効でない可能性がある。好適には、粒子、例えばＶＬＰまたはナノ粒子上の抗原（例えば多量体抗原）のディスプレイは、可溶性抗原とは対照的に、免疫反応をロバストに誘発可能である同一抗原の幾何的反復アレイの提示を生じる。「遊離」抗原に比較して、より大きなサイズのＶＬＰまたは他の適切な粒子はまた、より高い免疫原性効果を有しうる。さらに、多量体抗原、例えばＨＣＭＶ五量体のディスプレイの配向は、免疫原性に重要でありうる。粒子上の多量体抗原に付着するための、対形成するタグ、例えば本明細書に記載するようなＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ系の使用は、抗原が特定の好適な配向で粒子に付着することを可能にする。例えば、ＨＣＭＶの場合、ｇＨ／ｇＬサブユニットは、「ＵＬ」サブユニットよりも中和エピトープを有する可能性がより低い可能性もある。したがって、好適には、本発明は、例えば、「ＵＬ」サブユニットが粒子の外側に向かってディスプレイされ、そしてしたがって個体の免疫系により容易に利用可能であるように、粒子上のＨＣＭＶ五量体のディスプレイの配向が、第一のペプチドタグの適切な配置によって決定されることを可能にする。あるいは／さらに、抗原上の第一のペプチドタグの配置は、天然ウイルス上のものに対する抗原の類似の配向を生じるために決定されることも可能であり、それによって侵入性生ウイルスに対する免疫反応を誘導する可能性がより高い配向で抗原をディスプレイする粒子を、免疫系に提示する。
【００４０】
対照的に、ＶＬＰ上にタンパク質を提示するための伝統的なアプローチは化学連結を伴う可能性もあり、これは、こうした化学反応がよりランダムである可能性もあり、したがって、抗原の正しい（例えば免疫学的に好ましい）配向が確実には得られない可能性もあり、そして得られる連結反応のわずかな割合にしか相当しない可能性もあるという不利益を有する。さらに、化学コンジュゲート化に伴うプロセスは、適切な抗原提示のために必要な３Ｄ構造が維持されうる可能性を低くしうる。伝統的なアプローチのいくつかの不都合な点は、Ｂｒｕｎｅら  ２０１６；  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ６：１９２３４，  ＤＯＩ：  １０．１０３８／ｓｒｅｐ１９２３４、Ｂｒｕｎｅら  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１７，  ２８，  １５４４−１５５１、およびＬｅｎｅｇｈａｎら（２０１７）  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ，  ７：３８１１に記載される。
【００４１】
同様に、ウイルスコートタンパク質への抗原の遺伝子融合は、ミスフォールディングに伴う問題、および２つの構成要素両方に関して最適な発現条件を決定する際の問題のため、困難であり、そして時間が掛かることが立証されてきている。さらに、遺伝子融合は、正しいコンホメーションでの有効な発現を達成することが非常に困難であるため、巨大抗原または多構成要素抗原の発現には適切ではないであろう。
【００４２】
免疫原性であるようにタンパク質または抗原性構成要素を提示するため、天然タンパク質コンホメーションが維持され、そして随意に、適切であるならば、任意の翻訳後修飾が保持されるように、第一のペプチドタグの位置は、注意深く設計される必要がある。いくつかの抗原に関しては、グリコシル化の保持は、エピトープが提示される方式に影響を及ぼさないが、他のものに関しては、その維持または除去のいずれかが有効性を改善する。膜貫通タンパク質であるタンパク質構成要素に関しては、タンパク質構成要素の膜貫通部は、この配列が抗原性であるタンパク質構成要素のコンホメーションには関与せず、そして例えば、ワクチンにおいてはもはや必要とされない役割を提供するため、第一のペプチドタグを配置するための優れたターゲットを提供する。タンパク質構成要素に膜貫通タンパク質が含まれない場合、構成要素またはそのサブユニット（多量体の場合）のＣまたはＮ末端に第一のペプチドタグを融合することが有益である可能性もあるが、第一のペプチドタグはまた、配列の任意のパートに含まれることも可能である。あるいは、第一のペプチドタグを、タンパク質または抗原性構成要素上のループ中に配置することも可能でありうる。
【００４３】
免疫原性構成要素、例えばＨＣＭＶ五量体の免疫原性構成要素を提示するため、第一のペプチドタグの位置は、天然タンパク質コンホメーションが維持されるように、注意深く設計される必要がある。ＨＣＭＶに関して、１つの態様において、付着はｇＨサブユニットを通じ、適切にはｇＨサブユニットのＣ末端、またはｇＨサブユニットの膜貫通ドメイン（またはその部分）を通じる。五量体（または五量体の構成要素）のコンホメーションの維持に加えて、この合理的設計はまた、上に論じるように、粒子の外側に向けて、五量体のターゲット領域を提示する。本明細書において、ターゲット領域は、中和効果を持つ抗体を生じさせることが知られるタンパク質の部分であり、そしてまた、免疫原性部分とも称されうる。
【００４４】
免疫原性構成要素、例えばＲＳＶプレ融合Ｆタンパク質の免疫原性構成要素を提示するため、第一のペプチドタグの位置は、天然タンパク質コンホメーションが維持されるように、注意深く設計される必要がある。ＲＳＶ−Ｆプレ融合タンパク質に関して、１つの態様において、付着は、適切には、Ｆプレ融合のＣ末端を通じ、該融合をコードする核酸の３’端を通じる。プレ融合Ｆタンパク質（またはその構成要素）のコンホメーションの維持に加えて、この合理的設計はまた、上に論じるような粒子の外側に向けて、プレ融合Ｆタンパク質の最も中和性であるエピトープを提示する。同じ考慮は、Ｆタンパク質の任意の他の変形にも当てはまるであろう。Ｃ末端での第一のペプチドタグの包含は、免疫原性タンパク質構成要素を正しくフォールディングしたままにして、うまく働くことが、本発明者らによって立証されてきている。
【００４５】
１つの態様において、第一および第二のペプチドタグは、イソペプチド結合を形成可能なペプチドタグ／結合パートナー対のパーツである。このイソペプチド結合は、自発性であり、すなわち補助なしであるか、あるいは補助を必要とする、すなわちリガーゼまたは他のヘルパーを要する可能性もある。適切には、第一および第二のペプチドタグは、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ対である。適切には、第一および第二のペプチドタグは、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ；ＲｒｇＡＴａｇ／ＲｒｇＡＴａｇ２／ＤｏｇＴａｇおよびＲｒｇＡＣａｔｃｈｅｒ、ＩｓｏｐｅｐＴａｇ／ＩｓｏｐｅｐＴａｇ−ＮおよびＰｉｌｉｎ−ＣまたはＰｉｌｉｎ−Ｎ、ＰｓＣｓＴａｇおよびＰｓＣｓＣａｔｃｈｅｒ；ならびにＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＤｏｇＴａｇ（ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅによって仲介される）、ならびにこれらすべての系の変異体、誘導体または修飾物を含むリストより選択される。
【００４６】
適切には、第一のペプチドタグは、ペプチドタグ／結合パートナー対由来のペプチドタグ、例えばＳｐｙＴａｇであり、そして第二のペプチドタグは、結合パートナー、例えばＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである。別の態様において、第一のペプチドタグは、結合パートナー、例えばＳｐｙＣａｔｃｈｅｒであり、そして第二のペプチドタグは、ペプチドタグ／結合パートナー対由来のペプチドタグ構成要素、例えばＳｐｙＴａｇである。
【００４７】
適切には、第一のペプチドタグは、ペプチドタグ／結合パートナー対由来のペプチドタグ、例えばＳｎｏｏｐＴａｇであり、そして第二のペプチドタグは、結合パートナー、例えばＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒである。別の態様において、第一のペプチドタグは、結合パートナー、例えばＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒであり、そして第二のペプチドタグは、ペプチドタグ／結合パートナー対由来のペプチドタグ構成要素、例えばＳｎｏｏｐＴａｇである。したがって、第一のペプチドタグが、「タグ」または「キャッチャー」のいずれかであってもよく；第二のペプチドタグが、この対のパートナー、それぞれ「キャッチャー」または「タグ」であってもよいことがわかる。適切なペプチドタグ／結合パートナー対は、本明細書に援用される、ＷＯ２０１１／０９８７７、ＷＯ２０１６／１９３７４６、ＷＯ２０１８／１８９５１およびＷＯ２０１８／１９７８５４に詳細に記載される。
【００４８】
１つの態様において、タンパク質または抗原性構成要素は、第一のペプチドタグとして、ＳｐｙＴａｇ、ＳｎｏｏｐＴａｇ、ＲｒｇＡＴａｇ、ＲｒｇＡＴａｇ２、ＤｏｇＴａｇ、ＩｓｏｐｅｐＴａｇ、ＩｓｏｐｅｐＴａｇ−Ｎ、ＰｓＣｓＴａｇおよびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒの任意の１つに付着する。
【００４９】
第一のペプチドタグは、必要であれば、剛直でもまたは柔軟でもよいリンカーを通じて付着していることも可能である。当業者は、どのリンカーが適切であるか認識するであろう。
【００５０】
別の態様において、部分は、第二のペプチドタグとして、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＲｒｇＡＣａｔｃｈｅｒ、Ｐｉｌｉｎ−Ｃ、Ｐｉｌｉｎ−Ｎ、ＰｓＣｓＣａｔｃｈｅｒおよびＤｏｇＴａｇ（ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅによって仲介される）のいずれか１つに付着する。
【００５１】
部分は、以前論じられるように、合成多量体化プラットフォームを含む、任意の適切な部分であることも可能である。
第二のペプチドタグを、フォールディングし、そして適切なコンホメーションを形成する能力に影響を及ぼさない、部分中の任意の適切な位置に付着させることも可能である。遺伝子融合が好ましい可能性もある。部分のＣまたはＮ末端に第二のペプチドタグを含むことが好ましい可能性もあるが、第二のペプチドタグは、配列の任意の部分中にもまた含まれてもよい。あるいは、第二のペプチドタグを、部分のループ中に配置することも可能でありうる。例えば、ＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５のウイルスコートタンパク質（ＣＰ３）のＮ末端へのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの遺伝子融合が、Ｂｒｕｎｅら，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ６，  論文番号：  １９２３４（２０１６）に記載される。多量体化プラットフォームとして自己集合合成タンパク質を用いる代替融合が、Ｂｒｕｕｎら，  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，  ２０１８，  １２（９），  ｐｐ  ８８５５−８８６６に論じられる。あるいは、第二のペプチドタグを、化学コンジュゲート化を通じて付着させることも可能である。
【００５２】
第二のペプチドタグは、必要であれば、強固でもまたは柔軟でもよいリンカーを通じて付着していることも可能である。当業者は、どのリンカーが適切であるか認識するであろう。
【００５３】
１つの態様において、抗原性構成要素、例えばＨＣＭＶ五量体またはその免疫原性構成要素をＳｐｙＴａｇに付着させる。適切なＳｐｙＴａｇは、配列番号３０に示すアミノ酸配列を有する。
【００５４】
ＳｐａｙＴａｇは、リンカーを通じて付着していることも可能である。適切なリンカーには、配列番号２９に示すアミノ酸配列を有するリンカーが含まれる。
別の態様において、部分は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合パートナー（第二のペプチドタグ）に付着する。部分は、適切には、ＨＢｓＡｇであることも可能である。適切なＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、配列番号３８に示すアミノ酸配列を有する。１つの態様において、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、リンカーを通じて付着する。リンカーは、剛直性リンカーまたは柔軟性リンカーであることも可能であり、適切には、リンカーは、配列番号３９に示すアミノ酸配列を有する。
【００５５】
別の態様において、タンパク質組成物または抗原性組成物は、本発明の任意の側面または態様にしたがって、別の、好ましくは異なる、第一のペプチドタグを含むタンパク質を、さらに含む。
【００５６】
別の態様において、本発明の任意の側面または態様にしたがった組成物は、別の、好ましくは異なる、第一のペプチドタグを含む抗原、例えば別のＨＣＭＶ抗原を、さらに含む。適切には、他のＨＣＭＶ抗原は糖タンパク質Ｂである。適切には、糖タンパク質Ｂ配列は、例えばＷＯ２０１４／００５９５９に記載される。配列番号２１、２２、２３または３６を参照されたい。１つの態様において、組成物は、ＨＣＭＶ五量体および他のＨＣＭＶ抗原の両方をディスプレイする粒子（例えばＶＬＰ）を含む。
【００５７】
１つの態様において、組成物は、免疫原性組成物またはワクチン組成物である。好ましくは、前記免疫原性またはワクチン組成物は、個体への投与に際して、免疫反応、例えば抗体反応を誘導可能なものである。適切には、免疫反応は、防御免疫反応であることも可能である。適切な免疫原性組成物は、アジュバント、免疫刺激剤および／または薬学的に許容されうる賦形剤を含むさらなる構成要素をさらに含むことも可能である。
【００５８】
適切なアジュバントは、例えば、アルミニウム、ペプチド、スクアレン、リポソーム、水中油エマルジョンおよびサポニンに基づくことも可能であり、そしてこれには、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、ＭＦ５９、ＡＳ０１、マトリックスＭ、ムラミルジペプチドおよびＱｕｉｌＡが含まれることも可能である。油中水アジュバントもまた適切である。スクアレン−水中油エマルジョン、例えばＡｄｄａｖａｘＴＭが適切である。
【００５９】
したがって、本発明の別の側面または態様において、本発明にしたがった組成物を含む免疫原性またはワクチン組成物を提供する。適切には、ワクチン組成物は、免疫原性、好ましくは感染性病原体／ベクターからの免疫防御効果、例えばＨＣＭＶ感染からの中和効果を提供する、本発明にしたがった組成物のある量である、ワクチン用量を含む。適切には、ワクチン組成物は、感染性病原体／ベクターからの中和効果、例えばＲＳＶ感染からの中和効果を提供する、本発明にしたがった組成物のある量であるワクチン用量を含む。免疫原性組成物に対して生成された抗体、好ましくは、中和抗体は、例えば本明細書に記載するように、標準化ＥＬＩＳＡアッセイまたはマイクロ中和アッセイを含む、当業者によく知られる方法によって、検出し、そして測定することも可能である。
【００６０】
別の側面にしたがって：
ｉ）第一のペプチドタグを含む部分
ｉｉ）第二のペプチドタグを含むタンパク質
を含み、
前記の第一のペプチドタグおよび前記の第二のペプチドタグはイソペプチド結合を形成する
ＶＬＰを提供する。いくつかの態様において、部分はＨＢｓＡｇである。しかし、先に記載するように、任意の適切な部分を用いることも可能である。
【００６１】
適切には、第一のペプチドタグは、ペプチドタグ／結合パートナー対由来のペプチドタグ、例えばＳｐｙＴａｇであり、そして第二のペプチドタグは、結合パートナー、例えばＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである。別の態様において、第一のペプチドタグは、結合パートナー、例えばＳｐｙＣａｔｃｈｅｒであり、そして第二のペプチドタグは、ペプチドタグ／結合パートナー対由来のペプチドタグ、例えばＳｐｙＴａｇである。他の適切なペプチドタグ／結合パートナー対が本明細書に記載され、そして当業者に知られるであろう。適切には、第一および第二のペプチドタグは、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ；ＲｒｇＡＴａｇ／ＲｒｇＡＴａｇ２／ＤｏｇＴａｇおよびＲｒｇＡＣａｔｃｈｅｒ、ＩｓｏｐｅｐＴａｇ／ＩｓｏｐｅｐＴａｇ−ＮおよびＰｉｌｉｎ−ＣまたはＰｉｌｉｎ−Ｎ、ＰｓＣｓＴａｇおよびＰｓＣｓＣａｔｃｈｅｒ；ならびにＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＤｏｇＴａｇ（ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅによって仲介される）、ならびにこれらすべての系の変異体、誘導体または修飾物を含むリストより選択される。
【００６２】
適切には、第二のペプチドタグを含むタンパク質は、５０ｋＤａより大きいタンパク質またはペプチド複合体である。第二のペプチドタグを含むタンパク質は、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１５０ｋＤａまたは１６０ｋＤａ、１７０ｋＤａ、１８０ｋＤａ、１９０ｋＤａまたはそれより大きい、例えば２００ｋＤａより大きい、３００ｋＤａより大きい、あるいは４００ｋＤａより大きい、タンパク質またはペプチド複合体であることも可能である。
【００６３】
１つの態様において、第二のペプチドタグを含むタンパク質は、多量体タンパク質である。１つの態様において、第二のペプチドタグを含むタンパク質は、抗原、好ましくは多量体抗原である。適切には、多量体抗原は、本明細書に記載するようなＨＣＭＶ五量体であることも可能である。適切には、タンパク質は、ＲＳＶ−Ｆタンパク質またはその誘導体（例えばプレ融合Ｆタンパク質）であることも可能である。１つの態様において、第二のペプチドタグを含むタンパク質は、ＨＣＭＶ五量体の免疫原性構成要素である。本明細書に記載する通りであり、そして適切なリンカーおよびタグを含むＨＣＭＶ五量体（ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１）は、１６０ｋＤａを超える分子量を有する。他の適切な巨大または多量体タンパク質または抗原には、例えばインフルエンザウイルス、ＲＳＶ等のウイルスを含む、他の感染性病原体由来の抗原が含まれる。
【００６４】
好適には、この方法において、キャリアー（ＶＬＰ）として、ＨＢｓＡｇを用いることもまた、あるいは抗Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）反応とも記載される、抗ＨｅｐＢブーストを生じる可能性がある。
【００６５】
別の側面において：
ｉ）第一のペプチドタグを含むタンパク質
ｉｉ）第二のペプチドタグを含む部分
を含み、
前記の第一のペプチドタグおよび前記の第二のペプチドタグはイソペプチド結合を形成する
ＶＬＰを提供する。いくつかの態様において、部分はＨＢｓＡｇである。しかし、先に記載するように、任意の適切な部分を用いることも可能である。
【００６６】
適切には、第一のペプチドタグは、ペプチドタグ／結合パートナー対由来のペプチドタグ、例えばＳｐｙＴａｇであり、そして第二のペプチドタグは、結合パートナー、例えばＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである。別の態様において、第一のペプチドタグは、結合パートナー、例えばＳｐｙＣａｔｃｈｅｒであり、そして第二のペプチドタグは、ペプチドタグ／結合パートナー対由来のペプチドタグ構成要素、例えばＳｐｙＴａｇである。他の適切なペプチドタグ／結合パートナー対が本明細書に記載され、そして当業者に知られるであろう。適切には、第一および第二のペプチドタグは、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ；ＲｒｇＡＴａｇ／ＲｒｇＡＴａｇ２／ＤｏｇＴａｇおよびＲｒｇＡＣａｔｃｈｅｒ、ＩｓｏｐｅｐＴａｇ／ＩｓｏｐｅｐＴａｇ−ＮおよびＰｉｌｉｎ−ＣまたはＰｉｌｉｎ−Ｎ、ＰｓＣｓＴａｇおよびＰｓＣｓＣａｔｃｈｅｒ；ならびにＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＤｏｇＴａｇ（ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅによって仲介される）、ならびにこれらすべての系の変異体、誘導体または修飾物を含むリストより選択される。
【００６７】
適切には、第一のペプチドタグを含むタンパク質は、５０ｋＤａより大きいタンパク質またはペプチド複合体である。第一のペプチドタグを含むタンパク質は、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１５０ｋＤａまたは１６０ｋＤａあるいはそれより大きい、特に２００ｋＤａ、３００ｋＤａまたはさらに４００ｋＤａより大きい、タンパク質またはペプチド複合体であることも可能である。１つの態様において、第一のペプチドタグを含むタンパク質は、多量体タンパク質である。１つの態様において、第二のペプチドタグを含むタンパク質は、抗原、好ましくは多量体抗原である。適切には、多量体抗原は、本明細書に記載するようなＨＣＭＶ五量体であることも可能である。適切には、タンパク質は、ＲＳＶ−Ｆタンパク質またはその誘導体（例えばプレ融合Ｆタンパク質）であることも可能である。１つの態様において、第一のペプチドタグを含むタンパク質は、ＨＣＭＶ五量体の免疫原性構成要素である。本明細書に記載する通りであり、そして適切なリンカーおよびタグを含むＨＣＭＶ五量体（ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａ）は、１６０ｋＤａを超える分子量を有する。他の適切な巨大または多量体タンパク質または抗原には、例えばインフルエンザウイルス、ＲＳＶ等のウイルスを含む、他の感染性病原体由来の抗原が含まれる。
【００６８】
好適には、この方法において、キャリアー（ＶＬＰ）として、ＨＢｓＡｇを用いることもまた、抗ＨＢＶブーストを生じる可能性がある。
本発明の別の側面において、本明細書に記載するような、ＳｐｙＴａｇに連結されたＨＣＭＶ五量体を提供する。
【００６９】
本発明の別の側面にしたがって、本発明にしたがった組成物またはＶＬＰを産生するための方法であって：
−第一のペプチドタグへの第一のタンパク質の第一の遺伝子融合物をコードする第一の核酸を、第一の宿主細胞内に導入し；
−前記の第一の宿主細胞を、前記の第一の遺伝子融合物を発現するための条件下でインキュベーションし；随意に、発現された構成要素を精製し；
−第二のペプチドタグへの第二のタンパク質の第二の遺伝子融合物をコードする第二の核酸を、第二の宿主細胞内に導入し；
−前記の第二の宿主細胞を、前記の第二の遺伝子融合物を発現するための条件下でインキュベーションし；随意に、発現された構成要素を精製し；
−発現された構成要素を、第一のペプチドタグおよび第二のペプチドタグの間のイソペプチド結合の形成のための条件下でインキュベーションし；随意に、生じた組成物を精製する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００７０】
適切には、発現された構成要素は、イソペプチド結合を形成するために、ともにインキュベーションされる。イソペプチド結合の形成は、リガーゼまたは類似のものとの同時インキュベーションを必要とすることも可能である。
【００７１】
適切には、本発明にしたがって、組成物またはＶＬＰを産生する方法は、ＶＬＰ上にディスプレイされる抗原性構成要素を含む組成物を産生するためであることも可能である。
いくつかの態様において、「ＨＣＭＶ五量体の免疫原性構成要素」がＨＣＭＶ五量体全体を含む場合、ＨＣＭＶ五量体の構成要素の組換え産生は、五量体が形成されるとともに集合のために正しくフォールディングされるために、各サブユニットが正しい化学量論で発現されることを必要とする。これらの態様において、必要な五量体のパーツのみの複合体（例えばｇＨ／ｇＬ二量体および四量体、または５つのサブユニットのいずれか１つを欠く四量体）を、最終産物から排除する必要がある。好適には、本発明は、構成要素を別個に作製し、そして次いでこれらをコンジュゲート化する単純なアプローチを提供することにより、１つの系におけるワクチン構成要素のすべて（すなわちＨＢｓＡｇおよびＨＣＭＶ五量体の５つのサブユニット）を発現することによって、そうでなければ関連するであろう問題を克服する。したがって、１つの態様において、精製タグをＵＬ１３０（Ｈｏｆｍａｎｎら、ＤＯＩ  １０．１００２／ｂｉｔ  ２５６７０）上に取り込む。類似の原理は、他の免疫原性構成要素に適用可能であろう。
【００７２】
いくつかの態様において、「ＲＳＶ−Ｆタンパク質の免疫原性構成要素」が、Ｆタンパク質またはその誘導体全体を含む場合、Ｆタンパク質またはその誘導体の構成要素の組換え産生は、プレ融合Ｆタンパク質三量体を含む誘導体とともに、集合のため正しくフォールディングされることを必要とする。
【００７３】
適切には、方法は、ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ上でディスプレイされるＨＣＭＶ五量体を含む組成物を産生するためである。適切には、方法は、ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ上にディスプレイされるＲＳＶ−Ｆプレ融合Ｆタンパク質三量体を含む組成物を産生するためである。
【００７４】
本発明の別の側面において、疾患の予防および／または治療において使用するためのワクチンを提供する。適切には、前記ワクチンは、本発明の任意の側面または態様にしたがった組成物またはＶＬＰを含む。１つの態様において、疾患はＨＣＭＶ感染である。別の側面において、ＨＣＭＶ治療の予防法を提供する。適切には、ワクチンはヒトにおける使用のためである。適切には、ワクチンは、成人、例えば生殖年齢の女性または妊娠女性における使用のためである。別の側面において、本発明は、個体においてＨＣＭＶに関する免疫原性反応、例えば防御免疫反応を誘導する方法であって、本発明の任意の側面または態様にしたがった組成物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００７５】
本発明の別の側面において、薬剤として使用するための本発明の任意の側面にしたがった組成物を提供する。
本発明のさらなる側面において、ワクチン、好ましくはＨＣＭＶ感染の予防および／または治療において使用するためのワクチンとして使用するための、本発明の任意の側面にしたがった組成物を提供する。本発明にしたがって、薬剤またはワクチンとして使用するための組成物は、成人、例えば生殖年齢の女性または妊娠女性に投与されることも可能である。
【００７６】
別の側面において、本発明は、本発明にしたがった方法において使用するための核酸分子を提供する。１つの態様において、本発明にしたがった核酸分子は、配列番号２７〜４１のいずれかに示すようなアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。１つの態様において、本発明にしたがった核酸分子は、配列番号１２〜２６または４２〜４６のいずれかに示すような核酸配列を含む。
【００７７】
別の側面において、本発明は、配列番号２７〜４１に示すアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む、複数の核酸分子を提供する。１つの態様において、本発明の核酸分子には、配列番号１２〜２６または４２〜４６のいずれかに示すような配列を有するものが含まれる。
【００７８】
別の側面において、本発明は、本発明にしたがった方法において使用するための核酸分子を提供する。１つの態様において、本発明にしたがった核酸分子は、配列番号５０〜５８のいずれかに示すようなアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。１つの態様において、本発明にしたがった核酸分子は、配列番号４７〜５５のいずれかに示すような核酸配列を含む。
【００７９】
別の側面において、本発明は、配列番号５０〜５８に示すようなアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む、複数の核酸分子を提供する。１つの態様において、本発明の核酸分子には、配列番号４７〜５５のいずれかに示すような配列を有するものが含まれる。
【００８０】
別の側面において、本発明は、本発明にしたがった単数の核酸分子または複数の核酸分子を含むベクターを提供する。適切には、ベクターは、本発明にしたがった組成物の任意の構成要素のアミノ酸配列を発現するための発現ベクターである。
【００８１】
別の側面において、本発明は、本発明にしたがった組成物の構成要素を発現するための宿主細胞を提供する。適切な宿主細胞は、これらの構成要素の一過性または安定発現のためのものであることも可能である。ＣＭＶタンパク質を発現するための方法および宿主細胞は、例えば、どちらも本明細書に援用される、ＷＯ２０１４／００５９５９およびＷＯ２０１６／０６７２３９に記載される。いくつかの態様において、構成要素はグリコシル化されていることも可能である。
【００８２】
本発明の別の側面において、プライム−ブーストワクチン接種措置において使用するための、本発明にしたがった組成物を含むキットを提供する。適切には、前記キットは、本発明にしたがった第一の免疫原性組成物を含むプライム組成物、および本発明にしたがった第二の免疫原性組成物を含むブースト組成物を含むことも可能である。あるいは、単回または多数回用量ワクチン接種措置、すなわち１、２、３、４、５、６，７、８、９または１０用量を提供するキットを提供することも可能である。したがって、別の側面において、本発明は、およそ３週間間隔で適用される用量を含む投薬措置を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】非還元および還元条件下での精製五量体ＳｐｙＴａｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析。レーン１：サイズをｋＤａで示したＣｏｌｏｒＰｌｕｓプレ染色広範囲タンパク質ラダー；レーン２：非還元試料；レーン３：還元試料。Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色分析、非還元はゲルの左に、そして還元は右に、ＨＣＭＶ五量体構成要素の位置を示す。Ｂ）抗ＨＣＭＶ五量体抗体を用いたウェスタンブロット分析。
【図２】非還元（ＮＲ）および還元条件（Ｒ）下での精製ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析。Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色分析。Ｂ）抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析。
【図３】ｓ２００ｉｎｃｒｅａｓｅ３．２／３００カラムを用いたＨＰＬＣ分析。Ａ）１０μｌの精製ＨＣＭＶ五量体ＳｐｙＴａｇを装填し、そしてこれは単一ピークとして溶出された。Ｂ）１０μｌの精製ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇを装填し、そしてこれはカラムのボイド容量で単一主ピークとして溶出された。
【図４】還元条件下でのコンジュゲート化五量体−ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析。１：サイズをｋＤａで示したＣｏｌｏｒＰｌｕｓプレ染色広範囲タンパク質ラダー；２：コンジュゲート化；３：五量体−ＳｐｙＴａｇ；４：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇ。Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色分析。Ｂ）抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット。Ｃ）抗五量体ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット。
【図５】ｓ２００ｉｎｃｒｅａｓｅ３．２／３００カラムを用いたＨＰＬＣ分析。３０μｌのコンジュゲート化五量体−ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇを装填し、そしてこれはカラムのボイド容量で単一主ピークとして溶出された。
【図６】Ａｄｄａｖａｘでアジュバント化した、ＨＣＭＶ五量体−ＨＢｓＡｇワクチン対五量体タンパク質ワクチンの免疫原性、単回免疫後。可溶性タンパク質として、または五量体−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰとしてのいずれかで、ＢＡＬＢ／ｃマウスを１μｇまたは０．１μｇのＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇで免疫した。マウス血清から、標準化ＥＬＩＳＡによって、力価を測定した。線は平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す（ｎ＝１０）。ＨＣＭＶ五量体−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰで免疫したマウスは、ＨＣＭＶ五量体タンパク質のみで免疫したマウスに比較して、五量体で同等であるＶＬＰ用量が１０ｘ低い場合であっても、実質的により強い血清ＩｇＧ抗体反応を示す。
【図７】五量体タンパク質ワクチンに比較した、ＨＣＭＶ五量体−ＨＢｓＡｇワクチンで免疫したマウスの血清における中和活性。ワクチンをＡｄｄａｖａｘでアジュバント化し、そして１回（プライム後）または２回の免疫（ブースト後）後の反応を示す。ＡＤ１６９ｗｔ１３１株（機能的五量体をディスプレイする）に感染したＡＲＰＥ−１９細胞上で、ＮＴ５０を測定した。同じアッセイにおけるＣｙｔｏｇａｍおよび商業的に入手可能な中和抗ｇＨ  ｍＡｂ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓのＨＣＭＶ１６（５１Ｃ１））に関する中和力価を示す。
【図８】１回または２回の免疫後の、アジュバント化されていないＨＣＭＶ五量体−ＨＢｓＡｇワクチン対五量体タンパク質ワクチンの免疫原性。１μｇまたは０．１μｇのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇにコンジュゲート化されたＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇ（五量体−ＨＢｓＡｇ）、あるいは１μｇの五量体−ＳｐｙＴａｇタンパク質で、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。マウス血清由来の標準化ＥＬＩＳＡによって力価を測定した。線は平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す（ｎ＝１０）。ＨＣＭＶ五量体−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰで免疫したマウスは、ＨＣＭＶ五量体タンパク質のみで免疫したマウスに比較して、五量体で同等であるＶＬＰ用量が１０ｘ低い場合であっても、実質的により強い血清ＩｇＧ抗体反応を示す。
【図９】五量体タンパク質ワクチンに比較した、ＨＣＭＶ五量体−ＨＢｓＡｇワクチンで免疫したマウスの血清における中和活性。ワクチンはアジュバント化されず、そして１回（プライム後）または２回の免疫（ブースト後）後の反応を示す。ＡＤ１６９ｗｔ１３１株（機能的五量体をディスプレイする）に感染したＡＲＰＥ−１９細胞上で、ＮＴ５０を測定した。同じアッセイにおけるＣｙｔｏｇａｍおよび商業的に入手可能な中和抗ｇＨ  ｍＡｂ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓのＨＣＭＶ１６（５１Ｃ１））に関する中和力価を示す。
【図１０】非還元および還元条件下での精製ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析。Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色分析、レーン１：ＣｏｌｏｒＰｌｕｓプレ染色広範囲タンパク質ラダー；レーン２：非還元試料；レーン３：還元試料。Ｂ）抗ＲＳＶ−Ｆモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析、レーン１：ＣｏｌｏｒＰｌｕｓプレ染色広範囲タンパク質ラダー；レーン２：非還元試料；レーン３：還元試料。
【図１１】還元条件下でのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇとコンジュゲート化されたＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析。１：ＣｏｌｏｒＰｌｕｓプレ染色広範囲タンパク質ラダー；２：ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇ−−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇコンジュゲート、３：ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇ、４：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇ。Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色分析。Ｂ）抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット。Ｃ）抗ＲＳＶ−Ｆモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット。
【図１２】コンジュゲート化ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇ−−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇ（「Ｓｃ９−１０−ＨＢｓＡｇ」）対非コンジュゲート化ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇ（「Ｓｃ９−１０」）の免疫原性。アジュバント化されないかまたはＡｄｄａｖａｘＴＭでアジュバント化されたかいずれかの、１μｇのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇにコンジュゲート化されたＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇ（ＲＳＶ−Ｆ  ＶＬＰ）または１μｇのＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇタンパク質で、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
ウイルス様粒子
伝統的には、ワクチンアプローチは、弱毒化されたまたは死んだ全病原体を用いていたが、これは、適切な病原体由来のタンパク質を含む組換えサブユニットの使用によって置き換えられてきている。より最近は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を用いるアプローチが開発されてきている。ＶＬＰは、サイズ（およそ２０〜２００ｎｍ）、その形状およびその反復タンパク質配置がウイルスに似ているが、病原体由来のいかなる遺伝子材料も欠く粒子である。そのサイズのため、ＶＬＰはリンパ節により排出されやすく、抗原提示細胞による取り込みおよび提示に理想的となる。さらに、その反復構造は、補体固定およびＢ細胞受容体架橋を容易にする（Ｋｕｓｈｎｉｒら  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１２；  Ｖｏｌ  ３１（１）：５８−８３）。しかし、これらの作用機構は理論には制限されない。
【００８５】
ＨＣＭＶ
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ、ヒトヘルペスウイルス−５（ＨＨＶ−５）としてもまた知られる）は、大部分の成人が曝露されたことがあるウイルスであり、最初の感染は通常、単に軽症であるかまたは無症候性である。感染後、ウイルスは体内で潜在性であるが、免疫低下している者または高齢者においては、深刻な疾患を引き起こしうる。ＨＣＭＶはまた、発展途上国において、先天異常の主な感染性の原因である。最大４人／２００人の赤ちゃんが先天性感染のためＨＣＭＶを持って生まれ、そしてこれらのうち最大１０％が長期の結果に苦しむ。ＨＣＭＶ感染は、成人において、高血圧およびアテローム性動脈硬化症と関連付けられてきている（Ｃｈｅｎｇ  ら（２００９年５月）  Ｆｒｕｅｈ  Ｋ監修  ”Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ”．  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．  ５（５）：ｅ１０００４２７）。
【００８６】
ウイルスタンパク質ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａを含むＨＣＭＶの五量体複合体は、この複合体に対する抗体が、上皮細胞内へのウイルスの進入を中和するとともに、周産期のＨＣＭＶ伝染リスクを減少させることが可能であるという観察に基づいて、ＨＣＭＶの潜在的に有用なワクチンターゲットと同定されてきている。しかし、集中的な努力にもかかわらず、成功したＨＣＭＶワクチンは今日まで開発されてきていない。
【００８７】
ＨＣＭＶ五量体
臨床的単離体および実験室株を含むＨＣＭＶ株は、ゲノム配列が異なる。ＨＣＭＶ株には、マーリン（ＧＩ：１５５５７３９５６）、タウン（ＧＩ２３９９０９３６６）およびＡＤ１６９（ＧＩ：２１９８７９６００）、トレド（ＧＩ２９０５６４３５８）およびＴＢ４０／Ｅが含まれる。ＨＣＭＶは、多数の膜タンパク質およびタンパク質複合体を含有する。五量体タンパク質ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａは、上皮および内皮細胞のＨＣＭＶ感染に重要であり、エンドサイトーシス経路を通じると考えられる。この複合体の構成要素の他の組み合わせは、例えば線維芽細胞の感染に重要であると示されてきている。「ｐＵＬ」サブユニット／構成要素はまた、「ＵＬ」とも称され；「ｐＵＬ１３１」はまた、「ｐＵＬ１３１Ａ」および「ｐＵＬ１３１ａ」、または「ＵＬ１３１Ａ」とも称される。
【００８８】
多様なＨＣＭＶ株がＡＴＣＣに寄託されてきており、そして：マーリン（ＶＲ−１５９０）、タウン（ＶＲ−９７７）およびＡＤ１６９（ＶＲ−５３８）として見出されうる。ゲノム配列は、寄託番号：マーリン（ＡＹ４４６８９４．２）、タウン（ＧＯ１２１０４１．１）、ＡＤ１６９（ＦＪ５２７５６３．１）、トレド（ＧＵ３７７４２．２）およびＴＢ４０／Ｅ（ＫＦ２９７３３９．１）を通じて参照されうる。
【００８９】
ＲＳＶ
呼吸器合胞体ウイルスは、世界中で、小児における深刻な呼吸器疾患の主因である。５歳未満の小児、概算３４０万人が、深刻なＲＳＶ下気道感染で毎年入院し、生後６ケ月未満の小児において発生率が最高である。１歳未満の乳児において、そして発展途上国において、大部分の死亡が起こる。現在、防止および制御のためのオプションは限定されている。
【００９０】
ＲＳＶ−Ｆプレ融合三量体
Ｆ糖タンパク質は、Ｉ型ウイルス融合タンパク質である。ＲＳＶ  Ｆ前駆体（Ｆ０）は２つの部位でフューリン様プロテアーゼによって切断され、３つの断片を生じると考えられる。より短いＮ末端断片（Ｆ２）は、２つのジスルフィド結合によって、より大きいＣ末端断片（Ｆ１）に共有結合する。２７アミノ酸の介在する断片は、切断後に解離し、そして成熟タンパク質中には見られない。
【００９１】
先に論じるように、多くの安定化プレ融合Ｆ三量体が利用可能である。本明細書に提起する例において、これらのプレ融合三量体をコードする例示的配列は、配列番号４８、４８、５４および５５に見出される。ＳｐｙＴａｇとの融合を含む配列は、配列番号４７および５３として含まれる。アミノ酸配列は、プレ融合三量体に関しては配列番号５１、５２、５７および５８として示され、そしてＳｐｙＴａｇを含むものは配列番号４０および５６である。他の例示的な配列に本明細書で言及する。
【００９２】
タンパク質タグ／結合パートナー対
自発的なイソペプチド結合形成が可能であるタンパク質（いわゆる「イソペプチドタンパク質」）は、互いに共有結合し、そして不可逆的相互作用を提供するペプチドタグ／ポリペプチド結合パートナー対（すなわち２パーツリンカー）を発展させるために好適に用いられてきている（例えばどちらも本明細書に援用されるＷＯ２０１１／０９８７７２およびＷＯ  ２０１６／１９３７４６とともに、どちらも本明細書に援用されるＷＯ２０１８／１８９５１７およびＷＯ２０１８／１９７８５４を参照されたい）。これに関連して、自発的イソペプチド結合形成が可能なタンパク質は、ペプチドタグおよびペプチドタグのポリペプチド結合パートナーを提供する、別個の断片として発現されることも可能であり、ここで２つの断片は、イソペプチド結合形成によって、共有再構築が可能であり、それによって、ペプチドタグおよびそのポリペプチド結合パートナーに融合した分子または構成要素を連結する。ペプチドタグおよびそのポリペプチド結合パートナーによって形成されるイソペプチド結合は、非共有相互作用が、例えば、長時間（例えば数週間）に渡って、高温（少なくとも９５℃まで）、高圧で、または厳しい化学処理（例えばｐＨ２〜１１、有機溶媒、界面活性剤または変性剤）で、急速に解離するであろう条件下で安定である。
【００９３】
イソペプチド結合は、カルボキシル／カルボキサミドおよびアミノ基の間で形成されるアミド結合であり、ここで、カルボキシルまたはアミノ基の少なくとも１つは、タンパク質主鎖（タンパク質の骨格）の外側にある。こうした結合は、典型的な生物学的条件下では化学的に不可逆的であり、そしてこれらは大部分のプロテアーゼに耐性である。イソペプチド結合は、本質的に共有性であるため、これらは最強と測定されるタンパク質−タンパク質相互作用のいくつかを生じる。
【００９４】
簡潔には、２パーツリンカー、すなわちペプチドタグおよびそのポリペプチド結合パートナー（いわゆるペプチドタグ／結合パートナー対）は、イソペプチド結合を自発的に形成可能なタンパク質（イソペプチドタンパク質）に由来することも可能であり、ここで、タンパク質のドメインは、別個に発現されて、イソペプチド結合に関与する残基（例えばアスパラギン酸またはアスパラギン、あるいはリジン）の１つを含むペプチド「タグ」、ならびにイソペプチド結合に関与するもう一方の残基（例えばリジン、あるいはアスパラギン酸またはアスパラギン）およびイソペプチド結合を形成するために必要な少なくとも１つの他の残基（例えばグルタミン酸）を含むペプチドまたはポリペプチド結合パートナー（または「キャッチャー」）を産生する。ペプチドタグおよび結合パートナーの混合は、タグおよび結合パートナーの間のイソペプチド結合の自発的形成を生じる。したがって、ペプチドタグおよび結合パートナーを異なる分子または構成要素、例えばタンパク質内に別個に取り込むことによって、ペプチドタグおよび結合パートナーの間に形成されるイソペプチド結合を通じて、前記分子または構成要素を共有結合する、すなわちペプチドタグおよび結合パートナーを取り込んでいる分子または構成要素の間にリンカーを形成することが可能である。
【００９５】
イソペプチド結合の自発的形成は孤立していることも可能であり、そしていかなる他の実体も添加する必要がないことも可能である。いくつかのペプチドタグおよびタグパートナー対に関しては、イソペプチド結合を生成するために、ヘルパー実体、例えばリガーゼの存在が必要でありうる。
【００９６】
ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと称されるペプチドタグ／結合パートナー対（２パーツリンカー）は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＦｂａＢタンパク質（Ｚａｋｅｒｉら，  ２０１２，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０９，  Ｅ６９０−６９７）のＣｎａＢ２ドメインに由来し、そしてワクチン開発を含む多様な適用に用いられてきている（Ｂｒｕｎｅら，  ２０１６，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ６，  １９２３４；  Ｔｈｒａｎｅら，  ２０１６，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，  ３０）。
【００９７】
適切には、第一および第二のペプチドタグは、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと称されるペプチドタグ／結合対を形成する。適切には、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ構成要素は、「ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ」と比較して、Ｎ末端に２３のアミノ酸一部切除を有する、デルタＮ１（ΔＮ１）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである（Ｌｉ，  Ｌ．，  Ｆｉｅｒｅｒ，  Ｊ．  Ｏ．，  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，  Ｔ．  Ａ．  ＆  Ｈｏｗａｒｔｈ，  Ｍ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ  ａｎｄ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔａｇ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４２６，  ３０９−３１７（２０１４）に記載される通り）（配列番号３８）。
【００９８】
他の態様において、第一および第二のペプチドタグは、例えば、同時係属出願ＧＢ１７０６４３０．４に記載されるものなどの、イソペプチド結合形成に関する反応速度増加を示すＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの突然変異型であるペプチドタグ／結合対を形成する。いくつかの態様において、これらの突然変異型は、巨大タンパク質（例えば＞５０ｋＤａまたは＞１００ｋＤａ、例えば本明細書に記載するような＞１６０ｋＤａ  ＨＣＭＶ五量体タンパク質）の付着に、および／または緩慢な反応または立体障害が問題となりうる場合に、有用でありうる。
【００９９】
他の態様において、イソペプチドタンパク質には、例えばＷＯ  ２０１６／１９３７４６に記載されるＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒが含まれることも可能である。
【０１００】
いくつかの態様において、イソペプチドタンパク質の一方または両方は、ＮまたはＣ末端一部切除を有しながら、なお、イソペプチド結合の反応性を保持することも可能である。
【０１０１】
例示的な第一および第二のペプチドタグ対（ペプチドタグ／結合パートナー対；反応性対）は、例えば、ＷＯ２０１１／０９８７２２、ＷＯ２０１６／１９３７４６、ＧＢ１７０６４３０．４、ＧＢ１７０５７５０．６またはＬｉ，  Ｌ．ら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４２６，  ３０９−３１７  （２０１４）に記載され、以下の表に記載される。
【０１０２】
【表１】
2021523937.tif 000003
【０１０３】
結合対の変異体、誘導体および修飾物は、任意の適切な手段によって作製されてもよい。変異体、誘導体および機能的に有効な修飾物は、適切な結合パートナーとイソペプチド結合を形成する能力に関して同じ機能を保持する、アミノ酸付加、置換、改変または欠失を伴うことも可能である。
【０１０４】
いくつかの結合対に関しては、酵素などの第三の実体による仲介が必要である。例えばＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅは、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＤｏｇＴａｇの間の結合形成を仲介するために用いられうる。したがって、対形成は、リガーゼなどの酵素の補助を必要としうる。
【０１０５】
ＨＢｓＡｇ
「ＨＢｓＡｇ」によって、Ｂ型肝炎ウイルスに由来する表面抗原（ＨＢｓＡｇ）またはその一部を意味する。１つの態様において、ＨＢｓＡｇは、ＨＢｓＡｇのＮ末端、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ａｄｗ血清型）のＳタンパク質の２２６アミノ酸を含む、配列番号４１中に示すようなＨＢｓＡｇ配列を指すことも可能である。適切には、ＨＢｓＡｇには、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，  （１９７９）  ’Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ’  Ｎａｔｕｒｅ  ２８０：８１５−８１９に記載されるような、Ｂ型肝炎ウイルス（ａｄｗ血清型）プレＳ２タンパク質の４つのカルボキシ末端残基に相当する、４アミノ酸配列、Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ａｓｎが含まれる。ＨＢｓＡｇより形成されるＶＬＰは、Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ  ＨＢ（ｈｔｔｐｓ：／／ｖａｃｃｉｎｅｓ．ｐｒｏｃｏｎ．ｏｒｇ／ｓｏｕｒｃｅｆｉｌｅｓ／ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ＿ｐａｃｋａｇｅ＿ｉｎｓｅｒｔ．ｐｄｆ）、およびＥｎｅｒｇｉｘ  Ｂ（ｈｔｔｐｓ：／／ａｕ．ｇｓｋ．ｃｏｍ／ｍｅｄｉａ／２１７１９５／ｅｎｇｅｒｉｘ−ｂ＿ｐｉ＿００６＿ａｐｐｒｏｖｅｄ．ｐｄｆ）を含めて、Ｂ型肝炎に対する臨床的使用のために認可されてきている（Ｋｕｓｈｎｉｒら  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１２；  Ｖｏｌ  ３１（１）：５８−８３）。ＨＢｓＡｇはまた、フェーズＩＩＩ臨床試験を完了し、そして現在まで、最も進歩したマラリアワクチンである、前赤内期マラリアワクチンＲＴＳ，Ｓの基礎としても用いられてきている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｌａｒｉａｖａｃｃｉｎｅ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ／ｗｗｗ．ｍａｌａｒｉａｖａｃｃｉｎｅ．ｏｒｇ／ｆｉｌｅｓ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｐａｇｅ／ｆｉｌｅｓ／ＲＴＳＳ％２０ＦＡＱｓ＿ＦＩＮＡＬ．ｐｄｆ；  ＫａｓｌｏｗおよびＢｉｅｒｎａｕｘ，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１５，  Ｖｏｌ．  ３３（５２）：  ７４２５−７４３２）。
【０１０６】
リンカーの詳細
タンパク質（例えばＶＬＰおよび装飾抗原）の間の距離は、タンパク質中の抗原性エピトープの利用可能性、単数または複数のタンパク質の安定性に影響を有する可能性もあり、そしてまた、イソペプチド結合パートナー（例えばＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）のいずれかのアクセス可能性のため、コンジュゲート化効率にも影響を有する可能性もある。したがって、利用可能性、安定性、および／またはアクセス可能性を最適化するために適切な特性を持つリンカーを選択することも可能である。リンカーは、広く、柔軟性および剛直性サブタイプに下位分類されうる。
【０１０７】
柔軟性リンカー
連結されるドメインが動きを必要とする場合、柔軟性リンカーを用いてもよい。これらは通常、小分子非極性（例えばＧｌｙ）または極性（例えばＳｅｒ、Ｔｈｒ）アミノ酸からなり、ここで、小さなサイズであると柔軟性が提供される（Ｃｈｅｎら，  ２０１３  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  Ｏｃｔ  １５；  ６５（１０）：  １３５７−１３６９）。ＳｅｒまたはＴｈｒの付加は、溶液中での安定性維持を補助することも可能であり、そして長さの調節は、タンパク質の適切なフォールディングに影響を及ぼしうる（Ｃｈｅｎら、２０１３）。関連する実体に適した性質および長さを有する、任意の適切な柔軟性リンカーを用いてもよい。適切には、柔軟性リンカーには、こうしたタイプの２〜７０アミノ酸の間の組み合わせが含まれてもよい。
【０１０８】
例：
【０１０９】
【表２】
2021523937.tif 000004
【０１１０】
剛直性リンカー
いくつかの場合、剛直性リンカーはタンパク質分離の提供を補助しうるため、剛直性リンカーが好ましい可能性もある。剛直性リンカーは二次構造を有する。最も一般的な剛直性リンカーの１つは、αらせん構造を採用する（ＥＡＡＡＫ）ｎ（式中、ｎは反復の数である）である（Ａｒａｉら，  （２００１）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ａｕｇ；１４（８）：５２９−３２）。他の剛直性リンカーには、（ＸＰ）ｎ、式中、Ｘは、任意のアミノ酸であるが、優先的にＡｌａ（Ａ）、Ｌｙｓ（Ｋ）またはＧｌｕ（Ｅ）である、が含まれることも可能であり、ここでプロリンがコンホメーション上の束縛を提供する（Ｃｈｅｎら、２０１３）。
【０１１１】
他の適切なリンカーが、例えばＫｌｅｉｎら（２０１４）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．  Ｏｃｔ；  ２７（１０）：  ３２５−３３０によって記載される。関連する実体に適した性質および長さを有する、任意の適切な剛直性リンカーを用いてもよい。適切には、剛直性リンカーには、こうしたタイプの２〜７０アミノ酸の間の組み合わせが含まれてもよい。
【０１１２】
例：
【０１１３】
【表３】
2021523937.tif 000005
【０１１４】
宿主細胞および発現ベクター
適切には、本発明にしたがったタンパク質および組成物を産生する核酸の発現のための宿主細胞は、当業者に知られるであろう。
【０１１５】
１つの態様において、宿主細胞は、一過性発現に適しているであろう。別の態様において、宿主細胞は、安定細胞株を形成可能な細胞であろう。適切には、イソペプチド結合形成ペプチドタグを含むものを含めて、抗原性構成要素、例えばＨＣＭＶ五量体およびＲＳＶ−Ｆタンパク質をコードするコード配列は、１つの宿主細胞内に組み込まれるであろう。１つの態様において、五量体などの多量体のサブユニットをコードする核酸配列は各々、宿主細胞の、例えば５つすべてのプラスミド／ベクターでのトランスフェクションが、適切な条件下で培養された際、宿主細胞によって産生される五量体を生じるように、異なるプラスミド／ベクターに含まれるであろう。他の態様において、プラスミド／ベクターは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのプラスミドが導入可能であるように、１つまたはそれより多いコード配列の組み合わせを含みうる。あるいは、全タンパク質構成要素および第一のペプチドタグが、同じベクター上にコードされるように、全融合ペプチドコード配列を１つのベクター中で提供してもよい。
【０１１６】
１つの態様において、これらのベクターは、宿主細胞ゲノム内へのコード配列の安定組込みに用いられる。安定発現に適した宿主細胞には、哺乳動物細胞、例えばＨＥＫ細胞（ヒト胚性腎臓２９３細胞）またはＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を含む齧歯類細胞が含まれる。本発明にしたがった組成物のタンパク質構成要素の発現に適した哺乳動物細胞およびベクターは、当業者に知られ、そして例えばＷＯ２０１６／０６７２３９、１５〜１６ページ、およびＨｏｆｍａｎｎら，  （２０１５）  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ，  １１２（１２）：２５０５−２５１５に記載される。本発明にしたがった構成要素の発現のための例示的な安定構築物配列は、以下の実施例３に見出されうる。
【０１１７】
アフィニティ精製
いくつかの態様において、本発明にしたがった組成物の構成要素の発現に使用するための発現構築物には、アフィニティ精製などの精製を容易にする、単数または複数の「タグ」配列が含まれることも可能である。タンパク質構成要素および第一のペプチドタグを、産生した系から分離するため、任意の適切なタグ、例えばアフィニティタグを含めてもよい。組換えタンパク質産生の当業者は、精製目的で含めてもよい、ＨｉｓタグおよびＳｔｒｅｐタグなどの系を知っている。こうしたタグは、タンパク質精製を劇的に補助し、そして生物学的または生化学的活性に不都合に影響を及ぼすことはほとんどなく、そしてしたがって望ましい。適切なタグ配列には、Ｃ−タグ、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）、ストレプトアビジンタグ（Ｓｔｒｅｐ−タグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＦＬＡＧタグが含まれる。
【０１１８】
タンパク質構成要素および／または部分はどちらも、アフィニティ精製タグを含んでもよい。使用を容易にするため、これらは、一般的に、タンパク質のＣまたはＮ末端に遺伝子融合される。
【０１１９】
したがって、いくつかの態様において、例えば、ＨＣＭＶのｇＨ、ｇＬ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０、ｐＵＬ１３１Ａ（またはその断片）サブユニット、ＲＳＶプレ融合Ｆタンパク質、あるいはＨＢｓＡｇペプチド／タンパク質は、ＮまたはＣ末端に、精製を容易にするさらなるアミノ酸残基を含んでもよい。こうしたさらなるアミノ酸残基は、例えば、Ｈｉｓ−タグまたはＣ−タグなどのタグを含んでもよい。いくつかの態様において、Ｃ−タグは、よりきれいな精製を提供可能である。他の適切なタグ配列には、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓｔｒｅｐ−タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＦＬＡＧタグが含まれる。いくつかの態様において、タグが、例えば切断可能リンカーを用いることによって、精製後に切断されうる方式で、アミノ酸配列に連結されることも可能である。他の態様において、非アフィニティ精製法を用いることも可能である。
【０１２０】
他の態様において、ＲＳＶプレ融合Ｆタンパク質は、ＣまたはＮ末端に、精製を容易にするさらなるアミノ酸残基を含むことも可能である。本明細書に例示するように、ＲＳＶプレＦタンパク質は、アフィニティ精製用のＣ−タグを有する。
【０１２１】
第一および第二のペプチドタグ対のコンジュゲート化
第一および第二のペプチドタグ／結合パートナー／反応性対のコンジュゲート化を４℃で一晩行うことも可能である。あるいは、カップリング速度は、室温で増加すると予期されるため、コンジュゲート化反応を、室温で３〜４時間行うことも可能である。所定のカップリング反応のための最適な第一および第二の結合パートナー比は、各結合パートナーのサイズに依存する。例えば、ＶＬＰ単量体対抗原の１：１．５モル比がより小さい抗原（〜２０ｋＤａ）には十分である可能性もある一方、同じＶＬＰ単量体と組み合わせたより大きい抗原（＞１００ｋＤａ）に関しては、１：１質量比が十分である可能性もある。しかし、どちらの比も過剰な抗原（より小さい結合パートナー）を生じる。いかなる過剰な抗原も、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって、または透析によって除去可能である。透析は、ＳＥＣほど効率的ではないため、より小さい抗原により適している可能性もある。あるいは、すべての抗原がコンジュゲート化され、そしてしたがって下流精製が不要であるように、ＶＬＰ／粒子対抗原の比を最適化することも可能である。より低い濃度は反応速度を減少させうるため、およそ１ｍｇ／ｍｌの適切な最終タンパク質濃度がコンジュゲート化反応には最適である。中性ｐＨに近い広範囲の緩衝剤がカップリング／コンジュゲート化に適合する。コンジュゲート化緩衝液の標準的な選択は、ＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）である。いくつかの状況において、クエン酸緩衝液の１０ｘストック（４０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２）の添加を、Ｂｒｕｎｅら  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．（２０１６）に記載されるように用いることも可能である。
【０１２２】
薬学的組成物および使用
本発明の組成物をワクチンまたは免疫原性組成物内に取り込むことも可能である。適切には、ワクチンまたは免疫原性組成物は、免疫原用量で、本発明の粒子を含むであろう。
【０１２３】
薬学的組成物は、薬学的に許容されうるキャリアーとともに提供される、本発明記載の粒子または免疫原組成物を含むことも可能である。適切なキャリアーは当業者に周知である。１つの態様において、薬学的組成物は、緩衝剤、賦形剤またはキャリアーを含む。適切には、薬学的組成物は、組成物の安定性を維持するために適した賦形剤および配合物を含むことも可能である。適切には、配合物はアジュバントを含むことも可能である。１つの態様において、配合物は、ＡｄｄａＶａｘＴＭまたは類似のスクアレンに基づく水中油なのエマルジョンを、ＭＦ５９（登録商標）と類似の配合物とともに含むことも可能である。他の適切なアジュバントには、リポソームに基づくアジュバント、例えばマトリックスＭおよびＡＳ０１が含まれる。他の適切なアジュバントには、アルミニウムに基づく配合物、例えばＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）が含まれる。１つの態様において、配合物は、ＥＤＴＡを、例えば５ｍＭの濃度で含むことも可能である。適切な賦形剤または配合物は、粒子または免疫原性組成物の特性に応じる可能性もあり；例えば発現系の選択が、組成物のタンパク質の安定性、グリコシル化またはフォールディングに影響を及ぼす可能性もあり、これが次に、組成物の最適な配合に影響を及ぼす可能性もある。適切な賦形剤、配合物またはアジュバントの決定法は、当業者に知られるであろう。
【０１２４】
本発明の多様なさらなる側面および態様は、本開示を考慮すると、当業者には明らかであろう。
本明細書に言及するすべての文書は、その全体が本明細書に援用される。
【０１２５】
「および／または」は、本明細書において、他方を含むまたは含まない、２つの明記する特徴または構成要素の各々の特異的開示と解釈されるものとする。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、ちょうど、各々が本明細書に個々に示されるように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の特異的開示と解釈されるものとする。
【０１２６】
背景が別に指示しない限り、上記に示す特徴の説明および定義は、本発明のいかなる特定の側面または態様にも限定されず、そして記載するすべての側面および態様に等しく適用される。
【０１２７】
本発明は、いくつかの態様に言及して、例として記載されてきているが、本発明が開示する態様に限定されず、そして付随する請求項に定義するような本発明の範囲から逸脱することなく、別の態様が構築されうることが、当業者にはさらに認識されるであろう。
【０１２８】
「組換え」は、本明細書において、ポリヌクレオチドを記載する際、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、これはその起源または操作によって：（１）天然に会合するポリヌクレオチドのすべてまたは一部と会合せず、そして／または（２）天然に連結しているもの以外のポリヌクレオチドに連結されている。用語「組換え」は、本明細書において、タンパク質またはポリペプチドに関して、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。
【０１２９】
特に明記しない限り、工程を含むプロセスを、任意の適切な順序で行ってもよい。したがって、工程を任意の適切な順序で行ってもよい。
ポリペプチド配列間の配列同一性は、好ましくは、デフォルトパラメータ（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用い、ギャップオープニングペナルティ＝１０．０、およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５を用いる）を用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ広範囲整列アルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ  １９７０）を用いた対整列アルゴリズムによって決定される。このアルゴリズムは、好適に、ＥＭＢＯＳＳパッケージ中のｎｅｅｄｌｅツール中に実装される（Ｒｉｃｅ，  ＬｏｎｇｄｅｎおよびＢｌｅａｓｂｙ  ２０００）。本発明のポリペプチド配列の全長に渡って、配列同一性を計算すべきである。
【０１３０】
本明細書に言及する構成要素の任意の相同体は、典型的には機能的相同体であり、そして典型的には、タンパク質の適切な領域に少なくとも４０％相同である。既知の方法を用いて、相同性を測定することも可能である。例えば、ＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅは、相同性を計算するために使用可能なＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えばデフォルトセッティングで用いる）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，  ３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．  Ｆ．（１９９３）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ，  Ｆら（１９９０）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０に記載されるように、相同性を計算するかまたは配列を整列させることも可能である（典型的にはデフォルトセッティングで）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて、公的に入手可能である。
【０１３１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析を実行する；例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ５８７３−５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定値は、最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、第二の配列に第一の配列を比較した際の最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、配列は、別の配列と類似であると見なされる。
【０１３２】
変異ポリペプチドは、天然タンパク質に少なくとも４０％の同一性を有する配列を含む（または該配列からなる）。好ましい態様において、変異体配列は、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも４０、６０、１００、２００、３００、４００またはそれより多い隣接アミノ酸で、あるいはさらに変異体の全配列に渡って、天然タンパク質の特定の領域に対して、少なくとも５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であることも可能である。あるいは、変異体配列は、全長天然タンパク質に対して、少なくとも５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であることも可能である。典型的には、変異体配列は、天然タンパク質の適切な領域とは、少なくとも２、５、１０、２０、４０、５０または６０突然変異（各々は置換、挿入または欠失であってもよい）で、またはこれら未満で、異なる。本発明の変異体配列は、上述の配列の任意の長さに渡って、特定のパーセンテージ相同性値のいずれかと同じである、全長天然タンパク質の特定の領域とのパーセンテージ同一性を有してもよい（すなわち、少なくとも４０％、５５％、８０％または９０％、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％同一性を有してもよい）。
【０１３３】
タンパク質の変異体にはまた、一部切除も含まれる。変異体がなお機能性である限り、いかなる一部切除を用いてもよい。一部切除は、典型的には活性／機能に、特にイソペプチド結合の形成に非必須であり、そして／またはフォールディングされたタンパク質のコンホメーション、特に任意の免疫原性部位のフォールディングに影響を及ぼさない配列を除去するように作製されるであろう。一部切除はまた、構成要素の産生の容易さを改善するように選択されることも可能である。適切な一部切除は、ＮまたはＣ末端からの多様な長さの配列の体系的な一部切除によって、ルーチンに同定可能である。
【０１３４】
天然タンパク質の変異体には、天然タンパク質の特定の領域に関して、１つまたはそれより多い、例えば２、３、４、５〜１０、１０〜２０、２０〜４０またはそれより多いアミノ酸挿入、置換または欠失を有する突然変異体がさらに含まれる。欠失および挿入は、好ましくは抗原性領域の外側で作製される。挿入は、典型的には、天然タンパク質由来の配列のＮまたはＣ末端で、例えば組換え発現のために作製される。置換はまた、典型的には、活性／機能に非必須であり、そして／またはフォールディングされるタンパク質のコンホメーションに影響を及ぼさない領域中で作製される。こうした置換は、タンパク質の可溶性または他の特性を改善するために作製されうる。置換は、タンパク質の安定性を増加させるために作製されうる。
【０１３５】
置換は、好ましくは、１つまたはそれより多い保存的変化を導入し、こうした変化は、アミノ酸を、類似の化学構造、類似の化学特性または類似の側鎖体積の他のアミノ酸で置換する。導入されるアミノ酸は、これらが置換するアミノ酸に類似の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中和性または電荷を有してもよい。あるいは、保存的変化は、あらかじめ存在する芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入してもよい。保存的アミノ酸変化は、当該技術分野に周知である。
【０１３６】
誘導体は、親実体のあるパートの置換によって、親実体から生じるかまたは作製される実体である。
【実施例】
【０１３７】
〔実施例１〕
例示的な多量体−ＶＬＰ組成物（ＨＣＭＶ五量体−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ）の生成
ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２９３トランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｃｆｉｃ）および以下の配列をコードする５つの別個のプラスミドを用いて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞において、ＨＣＭＶ五量体を一過性に発現させた。以下に記載するＨＣＭＶ五量体は、グリコシル化を伴わずにおよそ１６２ｋＤａである（タグおよびリンカーを含むが、シグナルペプチドを含まない）。
【０１３８】
ヌクレオチド配列
ＨＣＭＶ五量体配列は、以下の適切な節に記載する２つの導入された突然変異（１つはｇＨ中、１つはＵＬ１２８中）を除いて、マーリン株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ４４６８９４．２；低継代（すなわち弱毒化）ＨＣＭＶ株）由来の天然配列（イントロンを含む）を発現した。
【０１３９】
ｇＨ−ＳｐｙＴａｇ−Ｈｉｓヌクレオチド配列（配列番号１２）
この配列（配列番号１２）において、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）合成のため、１１４６位にサイレント突然変異Ｃ＞Ａを導入し、これはこのヌクレオチド周囲の天然配列ＣＡＣＣＴＧＣに、潜在的に問題があると警告されたためであった。該構築物は：シグナルペプチド（ｎｔ  １〜６９）、外部ドメイン（ｎｔ  ７０〜２１５１）、膜貫通ドメイン（一部切除）（ｎｔ  ２１５２〜２１５７）（シグナルペプチド、外部ドメインおよび膜貫通ドメイン（一部切除）は、ともに、配列番号１３に示される）、リンカー（ｎｔ  ２１５８〜２１７５；配列番号１４）、ＳｐｙＴａｇ（ｎｔ  ２１７６〜２２１４；配列番号１５）、６ｘＨｉｓタグ（ｎｔ  ２２１５〜２２３２）、停止コドン（ｎｔ  ２２３３〜２２３５）を含む。ヌクレオチド１〜２１５７（配列番号１３）は、ｇＨコード配列に相当する。
【０１４０】
ｇＬヌクレオチド配列（配列番号１６）
この配列中：シグナルペプチド（ｎｔ  １〜９０）、外部ドメイン（ｎｔ  ９１〜８３４）、停止コドン（ｎｔ  ８３５〜８３７）。
【０１４１】
ＵＬ１３０−Ｃ−タグヌクレオチド配列（配列番号１７）
この配列中：シグナルペプチド（ｎｔ  １〜７５）、外部ドメイン（ｎｔ  ７６〜６４２）、リンカー（ｎｔ  ６４３〜６８７）、Ｃ−タグ（ｎｔ  ６８８〜６９９）、停止コドン（ｎｔ  ７００〜７０２）。
【０１４２】
ＵＬ１２８ヌクレオチド配列（配列番号２０）（天然配列中に存在する２つのイントロンを含む）
この配列中：シグナルペプチド（ｎｔ  １〜８１）、イントロン：ｎｔ  １６５〜２８７、ｎｔ  ４２３〜５４２、外部ドメインエクソン（ｎｔ  ８２〜１６４、ｎｔ  ２８８〜４２２、ｎｔ  ５４３〜７５６）、停止コドン（ｎｔ  ７５７〜７５９）。
【０１４３】
ヌクレオチド６３４にＴ＞Ｃ突然変異を導入した。Ｔ６３４ヌクレオチドは、マーリン株において、ＵＬ１２８の未成熟終結を引き起こすとして、ＧｅｎＢａｎｋファイル中に言及されており、そして本発明者らはしたがって、全長タンパク質の発現に復帰させるため、どの塩基を置換すべきか情報を提供する異なる株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＱ３９６６６２．１、株ＨＡＮ３８）由来の注釈を用いた。
【０１４４】
ＵＬ１３１Ａヌクレオチド配列（配列番号２１）（天然配列中に存在するイントロンを含む）
この配列中：シグナルペプチド（ｎｔ  １〜５４）、イントロン（ｎｔ  ２３７〜３４４）、外部ドメインエクソン（ｎｔ  ５５〜２３６、ｎｔ  ３４５〜４９５）、停止コドン（ｎｔ  ４９６〜４９８）。
【０１４５】
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇヌクレオチド配列（配列番号２２）
この配列中：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒデルタＮ１（ｎｔ  １〜２７６）、柔軟性リンカー（ｎｔ  ２７７〜３０３）、ＰＶＴＮリンカー（ｎｔ  ３０４〜３１５）、ＨＢｓＡｇ（ｎｔ  ３１６〜９９３）、Ｃ−タグ（ｎｔ  ９９４〜１００５）、停止コドン（ｎｔ  １００６〜１００８）。
【０１４６】
アミノ酸配列
上記ヌクレオチド配列の発現は、以下のアミノ酸配列を生じると予測される。
ｇＨ−ＳｐｙＴａｇ−Ｈｉｓアミノ酸配列（配列番号２７）
予測分子量８１．８５２ｋＤａ（シグナルペプチドを含まない）、８４．３６４ｋＤａ（シグナルペプチドを含む）。
【０１４７】
この配列中：シグナルペプチド（ａａ  １〜２３）、外部ドメイン（ａａ  ２４〜７１７）、膜貫通ドメイン（一部切除）（ａａ  ７８７〜７１９）（シグナルペプチド、外部ドメインおよび膜貫通ドメイン（一部切除）は、ともに、配列番号２８に示される）、リンカー（ａａ  ７２０〜７２５；配列番号２９）、ＳｐｙＴａｇ（ａａ  ７２６〜７３８；配列番号３０）、６ｘＨｉｓタグ（ａａ  ７３９〜７４４）。アミノ酸残基１〜７１９は、一部切除ＴＭドメインを含む天然マーリン株ｇＨアミノ酸配列に相当する（配列番号２８）。
【０１４８】
ｇＬアミノ酸配列（配列番号３１）
予測分子量２７．５２２ｋＤａ（シグナルペプチドを含まない）、３０．８１５ｋＤａ（シグナルペプチドを含む）。
【０１４９】
この配列中；シグナルペプチド（ａａ  １〜３０）、外部ドメイン（ａａ  ３１〜２７８）。アミノ酸残基１〜２７８は、天然マーリン株ｇＬアミノ酸配列に相当する。
ＵＬ１３０−Ｃ−タグアミノ酸配列（配列番号３２）
予測分子量２３．１６７ｋＤａ（シグナルペプチドを含まない）、２６．０８１ｋＤａ（シグナルペプチドを含む）。
【０１５０】
この配列中：シグナルペプチド（ａａ  １〜２５）、外部ドメイン（ａａ  ２６〜２１４）（シグナルペプチドおよび外部ドメインは、ともに、配列番号３３に示される）、リンカー（ａａ  ２１５〜２２９；配列番号３４）、Ｃ−タグ（ａａ  ２３０〜２３３）。アミノ酸残基１〜２１４は、天然マーリン株ＵＬ１３０アミノ酸配列に相当する。
【０１５１】
ＵＬ１２８アミノ酸配列（配列番号３５）
予測分子量１６．６５９ｋＤａ（シグナルペプチドを含まない）、１９．７１７ｋＤａ（シグナルペプチドを含む）。
【０１５２】
この配列中：シグナルペプチド（ａａ  １〜２７）、外部ドメイン（ａａ  ２８〜１７１）。アミノ酸残基１〜１７１は、天然マーリン株ＵＬ１２８アミノ酸配列に相当する。
ＵＬ１３１Ａアミノ酸配列（配列番号３６）
予測分子量１２．９８５ｋＤａ（シグナルペプチドを含まない）、１４．９８９ｋＤａ（シグナルペプチドを含む）。
【０１５３】
上記配列中：シグナルペプチド（ａａ  １〜１８）、外部ドメイン（ａａ  １９〜１２９）。アミノ酸残基１〜１２９は、天然マーリン株ＵＬ１３１Ａアミノ酸配列に相当する。
【０１５４】
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇアミノ酸配列（配列番号３７）
タグおよびリンカーを含む予測分子量、３６．８２４ｋＤａ。
この配列中：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒデルタＮ１（ａａ  １〜９２；配列番号３８）、柔軟性リンカー（ａａ  ９３〜１０１；配列番号３９）、ＰＶＴＮリンカー（ａａ  １０２〜１０５；配列番号４０）、ＨＢｓＡｇ（ａａ  １０６〜３３１；配列番号４１）、Ｃ−タグ（ａａ  ３３２〜３３５）。
【０１５５】
五量体の精製
五量体−ＳｐｙＴａｇはＥＸＰＩ２９３Ｆ細胞中で発現され、そして上清内に分泌された（ｇＨサブユニットからＴＭドメイン（の一部）を欠失させたため）。アフィニティ精製を用いてＨＣＭＶ五量体を精製する最初の試みは、Ｃ−タグを含むｇＨサブユニットの発現に頼るが、これはｇＨ／ｇＬヘテロホモ二量体ならびに五量体の単離を生じた。別の戦略において、ＵＬ１３０サブユニット（配列番号１７（ヌクレオチド）および配列番号３２（アミノ酸））にＣ−タグを付加して、Ｃ−タグアフィニティ精製（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびサイズ排除クロマトグラフィを用いた、上清からの五量体の精製を可能にした。五量体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した際、非還元および還元条件下で予期された通りに現れ（図１Ａ）、そして抗ＨＣＭＶ五量体抗体（Ｎａｔｉｖｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ＡｂＣＭＶ２４５０））と反応し（図１Ｂ）、〜１４ｋＤａで少量の混入物質のみが観察された。
【０１５６】
ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ単量体の精製
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇをピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中で発現させ、そして細胞ホモジネートから精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での還元条件下で、主なタンパク質バンドは、単量体の予期されるサイズ（およそ３７ｋＤａ）に対応し、さらに大きいバンドは、オリゴマー種の存在を示し、粒子の優れた架橋が起こっていることを示した（図２Ａ、レーン「Ｒ」）。非還元条件下で（レーン「ＮＲ」）、物質は、主に、ある程度のスメアとともにゲル上部に留まり、これは、ＶＬＰ粒子がよく形成され、そしてしたがってゲル内に完全に移動するには大きすぎることを示す（図２Ａ）。非還元および還元ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇは、どちらも、マウス抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（ＭＣＡ４６５８）より得た）と強く反応し（図２Ｂ）、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの存在が反応性エピトープに負に影響しないことを示した。ＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇは、どちらも、ｓ２００ｉｎｃｒｅａｓｅ  ３．２／３００カラム上でのＨＰＬＣサイズ排除分析によって評価された際、単一ピークとして溶出した（図３Ａ〜Ｂ）。ＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇは、〜４００ｋＤａで溶出し（図３Ａ）、これは予期されるよりも大きい。しかし、これは、五量体構造が球状ではなく、こうした場合、サイズ排除クロマトグラフィ中に、タンパク質の保持時間が改変されることが知られていることによって、説明されうる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇは、カラムのボイド体積中に溶出し、これは、粒子が適切に形成され、溶液中に単量体が検出不能であることを示す（図３Ｂ）。
【０１５７】
抗原−ＶＬＰコンジュゲート化
ＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇをＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇに、４℃で一晩コンジュゲート化し、ＨＣＭＶ−五量体でコーティングされたＨＢｓＡｇ  ＶＬＰを生じた。５ｍＭ  ＥＤＴＡを補充した、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水を含有する緩衝液（ＴＢＳ；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）をコンジュゲート化に用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析ならびにＨＰＬＣを用いて、コンジュゲート化を監視した。コンジュゲート化反応を、五量体−ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇのみのいずれかに比較すると、還元条件下で〜１３０ｋＤａの新規バンドの存在があり（図４Ａ、レーン２）、これはモノクローナル抗ＨＢｓＡｇ（図４Ｂ）およびポリクローナル抗ＨＣＭＶ五量体（図４Ｃ）抗体の両方と反応性であり、該バンドが、少なくともコンジュゲート化ＨＢｓＡｇ−ｇＨを含有することが示された。ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィによって分析した際、９７％は、コンジュゲート化ＨＣＭＶ五量体−ＨＢｓＡｇ単量体の予測されるサイズに対応する主ピーク中に溶出した（図５）。
【０１５８】
〔実施例２〕
ＨＣＭＶ−Ｓｐｙ−Ｔａｇ−−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ（アジュバント化）のｉｎ  ｖｉｖｏ試験
コンジュゲート化ＨＣＭＶ五量体−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ、ならびに非コンジュゲート化ＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇを、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた免疫スケジュール中で用いて、（ｉ）産生されたＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇの免疫原性を確認し、そして（ｉｉ）非コンジュゲート化ＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇ対コンジュゲート化ＨＣＭＶ五量体−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰの免疫原性を比較した。
【０１５９】
３週間間隔でのプライム−ブースト−ブーストのスケジュールを以下のように用いた：
第０日：免疫（プライム）；第２０日：尾採血；第２１日：免疫（ブースト１）；第４１日：尾採血；第４２日：免疫（ブースト２）；第６３日：心採血。
【０１６０】
免疫群は以下の通りであった。各群に関して、ｎ＝１０：
１）ＡｄｄａＶａｘＴＭ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）中の１μｇ  ＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇ
２）ＡｄｄａＶａｘＴＭ中の１μｇ  ＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇ−−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ（１μｇの五量体の同等物）
３）ＡｄｄａＶａｘＴＭ中のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ（群２中のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇの量に対して標準化）
４）ＡｄｄａＶａｘＴＭ中の０．１μｇ  ＨＣＭＶ五量体
５）ＡｄｄａＶａｘＴＭ中の０．１μｇ  ＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇ−−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ（０．１μｇの五量体の同等物）
６）ＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）
ＡｄｄａＶａｘＴＭは、アジュバント化インフルエンザワクチンに関して欧州で認可されているＭＦ５９（登録商標）に類似の配合物を含む、スクアレンに基づく水中油ナノエマルジョンである。スクアレン水中油エマルジョンは、細胞性（Ｔｈ１）および体液性（Ｔｈ２）免疫反応両方を誘発することが知られる。他の適切なアジュバントは、当業者に知られるであろう。
【０１６１】
ＥＬＩＳＡを用いて、免疫原性を評価した。ＨＣＭＶ五量体に対する標準化ＥＬＩＳＡを用いて、各群中に生じた抗血清の力価を決定した。プレートを５μｇ／ｍｌの五量体（ＳｐｙＴａｇを含まない）、５０μＬ／ウェルで一晩コーティングし；洗浄し；ミルクで１時間ブロッキングし；洗浄し；マウス血清（ＰＢＳ中のおよその希釈物）を１時間適用し；洗浄し；ヤギ抗マウス−アルカリホスファターゼ抗体（１：１０，０００）を１時間適用し；洗浄し；現像した。
【０１６２】
異なる用量の非コンジュゲート化（群１および４）およびコンジュゲート化ＨＣＭＶ五量体−ＨＢｓＡｇ（群２および５）の両方を含めて、コンジュゲート化ＨＣＭＶ五量体−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰワクチンおよび非コンジュゲート化ＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇの間の免疫原性の比較を可能にし、これにより、他のＨＣＭＶ五量体ワクチン（例えば可溶性五量体）に対する推定が可能になる。群３および６は陰性対照に相当する。
【０１６３】
各時点で、試料のＯＤ値を適切な希釈で読み取り、そして各プレート上で作製した標準曲線を用いてＥＬＩＳＡ単位を決定した。群１、２、４および５のプライム後に関する結果を示すデータを図６に示す。ＨＣＭＶ五量体−ＨＢｓＡｇ免疫マウスは、１μｇまたは０．１μｇ用量の非コンジュゲート化ＨＣＭＶ五量体で免疫したマウスに比較して、１μｇおよび０．１μｇ用量の両方を用いて、実質的により強い血清ＩｇＧ抗体反応を示す。やはり図６に示すように、群３および６のＥＬＩＳＡ単位は、このアッセイに関するベースラインを提供した。
【０１６４】
Ｗａｎｇら（Ｖａｃｃｉｎｅ  ３３（２０１５）  ７２５４−７２６１；  ＤＯＩ：  １０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１５．１０．１１０）に基づくマイクロ中和アッセイを用いて、生じた抗体の機能的活性を調べた。群１、２、４および５に関する中和力価を図７に示す。五量体−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰで免疫したマウス由来の血清は、五量体−ＳｐｙＴａｇタンパク質のみで免疫したマウスのものよりも、実質的により中和性である。
【０１６５】
〔実施例３〕
安定構築物配列
２つの安定構築物（Ｈｏｆｍａｎｎら，  （２０１５）  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ，  １１２（１２）：２５０５−２５１５より採用）を、ＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇの構成要素をＣＨＯ発現するために最適化した。ＨＣＭＶ五量体配列からイントロンを除去したが、シグナル配列を保持した。
【０１６６】
ＨＣＭＶ  ｇＨ−ＳｐｙＴａｇ／ｇＬ安定発現構築物
安定ベクター構築物ＨＣＭＶ−ｇＨ−（ＧＳＧ）２−ＳｐｙＴａｇ−Ｈｉｓ−ＩＲＥＳ−ｇＬを、それぞれ、ＥＶ７１  ＩＲＥＳの上流および下流に、ｇＨ−ＳｐｙＴａｇ−Ｈｉｓ構成要素（配列番号４２）およびｇＬ構成要素（配列番号４３）を含むよう設計した。この構築物中で用いるコード配列を以下に記載する。
【０１６７】
ヌクレオチド配列
ＥＶ７１  ＩＲＥＳ上流に挿入されたｇＨ−（ＧＳＧ）２−ＳｐｙＴａｇ−Ｈｉｓ（イントロンを含まない）（配列番号４２）
この配列中：シグナルペプチド（ｎｔ  １〜６９）、外部ドメイン（ｎｔ  ７０〜２１５１）、一部切除膜貫通ドメイン（ｎｔ  ２１５２〜２１５７）、（ＧＳＧ）２リンカー（ｎｔ  ２１５８〜２１７５）、ＳｐｙＴａｇ（ｎｔ  ２１７６〜２２１４）、Ｈｉｓ−タグ（ｎｔ  ２２１５〜２２３２）、停止コドン（ｎｔ  ２２３３〜２２３５）。
【０１６８】
ＥＶ７１  ＩＲＥＳ下流に挿入されたｇＬ（イントロンを含まない）（配列番号４３）
この配列中：シグナルペプチド（ｎｔ  １〜９０）、外部ドメイン（ｎｔ  ９１〜８３４）、停止コドン（ｎｔ  ８３５〜８３７）
ＨＣＭＶ  ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ安定発現構築物
安定構築物ＨＣＭＶ−ＵＬ１２８−ＩＲＥＳ−ＵＬ１３０−（Ｇ４Ｓ）３−Ｃ−タグ−ＩＲＥＳ−ＵＬ１３１Ａは、ＵＬ１２８構成要素（配列番号４４）、ＵＬ１３０構成要素（配列番号４５）およびＵＬ１３１Ａ構成要素（配列番号４６）を含むように設計された。ＵＬ１３０構成要素を、プラスミドの第一のＥＶ７１  ＩＲＥＳの後ろに挿入し、そしてＵＬ１３１Ａ構成要素を第二のＥＶ７１  ＩＲＥＳの後ろに挿入した。この構築物中で用いたコード配列を以下に記載する。
【０１６９】
ヌクレオチド配列
ＵＬ１２８（イントロンを含まない）（配列番号４４）
この配列中：シグナルペプチド（ｎｔ  １〜８１）、外部ドメイン（ｎｔ  ８２〜５１３）、停止コドン（ｎｔ  ５１４〜５１６）。
【０１７０】
ＵＬ１３０−（Ｇ４Ｓ）３−Ｃ−タグ（イントロンを含まない）（配列番号４５）
この配列中：シグナルペプチド（ｎｔ  １〜７５）、外部ドメイン（ｎｔ  ７６〜６４２）、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（ｎｔ  ６４３〜６８７）、Ｃタグ（ｎｔ  ６８８〜６９９）、停止コドン（ｎｔ  ７００〜７０２）。
【０１７１】
ＵＬ１３１Ａ（イントロンを含まない）（配列番号４６）
この配列中：シグナルペプチド（ｎｔ  １〜５４）、外部ドメイン（ｎｔ  ５５〜３８７）、停止コドン（ｎｔ  ３８８〜３９０）。
【０１７２】
〔実施例４〕
ＨＣＭＶ−ＳｐｙＴａｇ−−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇ（非アジュバント化）のｉｎ  ｖｉｖｏ試験
コンジュゲート化ＨＣＭＶ五量体−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ、ならびに非コンジュゲート化ＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇを、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた免疫スケジュール中で用いて、コンジュゲート化五量体−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ対非コンジュゲート化五量体−ＳｐｙＴａｇタンパク質の免疫原性をさらに研究した。
【０１７３】
３週間間隔でのプライム−ブースト−ブーストのスケジュールを以下のように用いた：
第０日：免疫（プライム）；第２０日：尾採血；第２１日：免疫（ブースト１）；第４１日：尾採血；第４２日：免疫（ブースト２）；第６３日：心採血。
【０１７４】
免疫群は以下の通りであった。各群に関して、ｎ＝１０：
１）１μｇ  非アジュバント化ＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇ
２）１μｇ  非アジュバント化ＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇ−−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ（１μｇの五量体の同等物）
３）０．１μｇ  非アジュバント化ＨＣＭＶ五量体−ＳｐｙＴａｇ−−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ（０．１μｇの五量体の同等物）
ＥＬＩＳＡを用いて、免疫原性を評価した。ＨＣＭＶ五量体に対する標準化ＥＬＩＳＡを用いて、各群中に生じた抗血清の力価を決定した。プレートを５μｇ／ｍｌの五量体（ＳｐｙＴａｇを含まない）、５０μＬ／ウェルで一晩コーティングし；洗浄し；ミルクで１時間ブロッキングし；洗浄し；マウス血清（ＰＢＳ中のおよその希釈物）を１時間適用し；洗浄し；ヤギ抗マウス−アルカリホスファターゼ抗体（１：１０，０００）を１時間適用し；洗浄し；現像した。
【０１７５】
各時点で、試料のＯＤ値を適切な希釈で読み取り、そして各プレート上で作製した標準曲線を用いてＥＬＩＳＡ単位を決定した。プライム後およびブースト後のデータを図８に示す。ＨＣＭＶ五量体−ＨＢｓＡｇ免疫マウスは、可溶性タンパク質としての１μｇのＨＣＭＶ五量体のみで免疫したマウスに比較して、１μｇおよび０．１μｇ用量の両方を用いて、実質的により強い血清ＩｇＧ抗体反応を示す。
【０１７６】
Ｗａｎｇら（２０１５）に基づくマイクロ中和アッセイを用いて、生じた抗体の機能的活性を調べた。プライム後およびブースト後の中和力価を図９に示す。非アジュバント化五量体−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰで免疫したマウス由来の血清は、非アジュバント化五量体−ＳｐｙＴａｇタンパク質のみで免疫したマウスのものよりも、実質的により中和性である。
【０１７７】
〔実施例５〕
ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇの発現および精製
抗原ＲＳＶ−Ｆ  Ｓｃ９−１０  ＤＳ−Ｃａｖ１  Ａ１４９Ｃ  Ｙ４５８Ｃ由来の配列をＳｐｙＴａｇに融合させて、ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇを生成し、そしてＥｘｐｉＣＨＯＴＭ発現系キットおよびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｃｆｉｃ）を用いて、プラスミドｐｃＤＮＡ３．４中のヌクレオチド配列、配列番号４７でＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞を一過性にトランスフェクションすることによって、発現させた。
【０１７８】
ＲＳＶ−Ｆ  Ｓｃ９−１０  ＤＳ−Ｃａｖ１  Ａ１４９Ｃ  Ｙ４５８Ｃ（国立衛生研究所）は、Ｊｏｙｃｅら（２０１６）（Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１６  Ｓｅｐ；  ２３（９）：  ８１１−８２０）に記載されるような呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（プレ融合ＲＳＶ−Ｆ）の変異体である。この変異体は、遺伝子連結Ｆサブユニットを含む融合（Ｆ）糖タンパク質のプレ融合安定化型であり、融合ペプチドは欠失し、Ｔ４フィブリチン三量体化モチーフ（ｆｏｌｄｏｎドメイン）を含み、そしてプロモーター間運動は、さらなるプロモーター間ジスルフィド結合（Ａ１４９Ｃ  Ｙ４５８Ｃ）によって安定化されている。
【０１７９】
ヌクレオチド配列
ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇ−Ｃタグヌクレオチド配列（配列番号４７）
Ｓｃ９−１０  ＤＳ−Ｃａｖ１  Ａ１４９Ｃ  Ｙ４５８Ｃの元来の配列を、トロンビン部位、６ｘＨｉｓ−タグおよびＳｔｒｅｐ−タグ（登録商標）ＩＩの欠失によって、３’で修飾した。これらの欠失ドメインを、リンカー−ＳｐｙＴａｇ−Ｃ−タグ配列で置換して、Ｓｃ９−１０  ＤＳ−Ｃａｖ１  Ａ１４９Ｃ  Ｙ４５８Ｃ（ｎｔ  １〜１５１５、シグナルペプチド（ｎｔ  １〜７５）、およびＴ４フィブリチンｆｏｌｄｏｎドメイン（ｎｔ  １４３５〜１５１５）を含む）、（ＧＳＧ）２リンカー（ｎｔ  １５１６〜１５３３；配列番号１４）、ＳｐｙＴａｇ（ｎｔ  １５３４〜１５７２；配列番号１５）、Ｃ−タグ（ｎｔ  １５７３〜１５８４）および停止コドン（ｎｔ  １５８５〜１５８７））を含む、１５８７ｎｔカセット（配列番号４７）を生じた。リンカー、ＳｐｙＴａｇ、Ｃ−タグおよび停止コドンを除いたＳｃ９−１０  ＤＳ−Ｃａｖ１  Ａ１４９Ｃ  Ｙ４５８Ｃヌクレオチド配列が配列番号４８に含まれる。シグナルペプチド、リンカー、ＳｐｙＴａｇまたはＣ−タグを除いたＳｃ９−１０  ＤＳ−Ｃａｖ１  Ａ１４９Ｃ  Ｙ４５８Ｃヌクレオチド酸（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｃｉｄ）配列が、配列番号４９に含まれる。
【０１８０】
アミノ酸配列
ヌクレオチド配列、配列番号４７の発現は、以下のドメイン：Ｓｃ９−１０  ＤＳ−Ｃａｖ１  Ａ１４９Ｃ  Ｙ４５８Ｃ（（ａａ  １〜５０５、シグナルペプチド（ａａ  １〜２５）およびｆｏｌｄｏｎドメイン（ａａ  ４７９〜５０５）を含む）、リンカー（ａａ  ５０６〜５１１；  配列番号２９）、Ｓｐｙタグ（ａａ  ５１２〜５２４；配列番号３０），  Ｃ−タグ（ａａ  ５２５〜５２８）を含むＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇ−Ｃタグアミノ酸配列（配列番号５０）を生じると予期された。タンパク質の予測分子量は、シグナルペプチドを含めて、５７．９ｋＤａ、シグナルペプチドを含まず、５５．３ｋＤａであった。リンカー、ＳｐｙＴａｇまたはＣ−タグを除いたＳｃ９−１０  ＤＳ−Ｃａｖ１  Ａ１４９Ｃ  Ｙ４５８Ｃアミノ酸配列は、配列番号５１に含まれる。シグナルペプチド、リンカー、ＳｐｙＴａｇまたはＣ−タグを除いたＳｃ９−１０  ＤＳ−Ｃａｖ１  Ａ１４９Ｃ  Ｙ４５８Ｃアミノ酸配列は、配列番号５２に含まれる。
【０１８１】
ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇの精製
ＲＳＦ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇ抗原は細胞から分泌され、そしてこれをＣ−タグアフィニティ精製およびサイズ排除クロマトグラフィを用いて、上清から精製した。ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した際、非還元および還元条件下で予期されるように出現し（図１０Ａ）、そして抗ＲＳＶ−Ｆ［２Ｆ７］モノクローナル抗体（ａｂ４３８１２；Ａｂｃａｍ）と反応した（図１０Ｂ）。
【０１８２】
ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ単量体の精製
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇ（ＶＬＰ単量体）を上記実施例１に記載するように調製し、そして精製した。図２もまた参照されたい。
【０１８３】
ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇへのコンジュゲート化
ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇを、４℃で一晩、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇにコンジュゲート化して、ＲＳＶ−Ｆ三量体でコーティングされたＨＢｓＡｇ  ＶＬＰを生じた（ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇ−−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇ）。Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水を含有する緩衝液（ＴＢＳ；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）をコンジュゲート化のために用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を用いて、コンジュゲート化を監視した（図１１）。コンジュゲート化反応を、ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇのみのいずれかに比較すると、還元条件下で〜１０５ｋＤａの新規バンド（レーン２）の存在があり（図１１Ａ）、これは抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（ＭＣＡ４６５８、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（図１１Ｂ）および抗ＲＳＶ−Ｆ［２Ｆ７］モノクローナル抗体（ａｂ４３８１２；Ａｂｃａｍ）（図１１Ｃ）の両方と反応性であり、該バンドが、コンジュゲート化ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇ−−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇを含有することが示された。
【０１８４】
〔実施例６〕
コンジュゲート化ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇ−−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇの免疫原性
ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた免疫スケジュールを設計して、産生されたＲＳＶ−Ｆ抗原の免疫原性を確認し、そしてコンジュゲート化ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇ−−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ対非コンジュゲート化ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇタンパク質の免疫原性を比較した。試料中のＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇの量に基づいて、群に投薬し、そして３週間間隔のプライム−ブーストスケジュールを選択して、最終時点をブースト免疫の２週間後とした。
【０１８５】
プライム後のＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇ−−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＨＢｓＡｇで免疫したマウスは、ワクチンがアジュバント化されていない（図６）か、またはＡｄｄａｖａｘＴＭとともに配合されている（図６）かに関わらず、ＲＳＶ−Ｆ−ＳｐｙＴａｇタンパク質のみで免疫されたマウスに比較して、実質的により強い血清ＩｇＧ抗体反応を示す。
【０１８６】
配列表
【０１８７】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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