(57)【要約】  本発明は、皮膚病理学的状態の治療に使用するための組成物であって、ナノ粒子を形成することができるポリマーと、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とを含む組成物に関する。この組成物は、ざ瘡及び／又はアトピー性皮膚炎の治療に特に適している。本発明は、ポリヘキサメチレンビグアニドの新規な使用にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚病理学的状態の治療に使用するための組成物であって、ナノ粒子を形成することができるポリマーと、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とを含む組成物。
【請求項２】
前記ポリマーが、直鎖状及び／若しくは分枝状若しくは環状のポリモノグアニド／ポリグアニジン、ポリビグアニド、それらの類似体又は誘導体を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリマーがポリヘキサメチレンビグアニドを含む請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ナノ粒子が前記抗炎症剤及び／若しくは鎮痛剤と共に、並びに／又は前記抗炎症剤及び／若しくは鎮痛剤の存在下で形成される請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗炎症剤が、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）を含む請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗炎症剤が、以下の、ラパマイシン、タクロリムス、イブプロフェン、シクロスポリン、ジクロフェナク、ナプロキセン並びにこれらの関連する誘導体及び塩から選択される１種以上を含む請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、緩衝剤、賦形剤、結合剤、油、水、乳化剤、グリセリン、酸化防止剤、防腐剤及び芳香剤のうちの１種以上の成分をさらに含む請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が局所医薬の形態にある請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記皮膚病理学的状態が、ざ瘡及び／若しくはアトピー性皮膚炎又は関連状態を含む請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、クリーム、軟膏剤、スプレー、粉末、泡沫又はムースの形態にある請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
皮膚病理学的状態の治療のための医薬の調製における、抗炎症剤及び／若しくは鎮痛剤を有する、又は抗炎症剤及び／若しくは鎮痛剤と会合する１以上のナノ粒子を形成するためのポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）の使用。
【請求項１２】
前記ナノ粒子が、罹患した皮膚病理学的領域への抗炎症剤及び／又は鎮痛剤のための送達用媒体として使用される請求項１１に記載のＰＨＭＢの使用。
【請求項１３】
前記皮膚病理学的状態が、ざ瘡及び／若しくはアトピー性皮膚炎又は関連状態を含む請求項１１又は請求項１２に記載のＰＨＭＢの使用。
【請求項１４】
前記抗炎症剤及び／又は鎮痛剤が非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）を含む請求項１１から請求項１３のいずれか１項に記載のＰＨＭＢの使用。
【請求項１５】
前記抗炎症剤及び／又は鎮痛剤が、以下の、ラパマイシン、タクロリムス、イブプロフェン、シクロスポリン、ジクロフェナク、ナプロキセン並びにこれらの関連する誘導体及び塩から選択される１種以上を含む請求項１１から請求項１４のいずれか１項に記載のＰＨＭＢの使用。
【請求項１６】
皮膚病理学的状態の治療のための組成物の製造方法であって、ナノ粒子の形成を可能にするのに好適な条件下で、ナノ粒子を形成することができるポリマーを抗炎症剤及び／又は鎮痛剤と混合する工程を備える方法。
【請求項１７】
前記方法が、請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の組成物を製造するために使用される請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ざ瘡、アトピー性皮膚炎及び他の関連する皮膚状態等の皮膚病理学的状態の局所的な治療のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ざ瘡障害は１５〜２５歳の人に最も多くみられる。ざ瘡の症状には、「黒色面疱」、「稗粒腫」、通常は顔や背中に現れる炎症性の斑点などがある。これらは、毛包内の過剰な脂腺分泌によって毛包が閉塞されると形成される。斑点は、その後、細菌に感染し、炎症を起こした嚢胞や膿疱になることがある。ざ瘡の症状は、軽症でごく少数の斑点のものから、永久的な瘢痕化をもたらすことがある深く炎症を起こして感染した斑点がたくさんある重症のものまでにわたる。
【０００３】
ざ瘡は、毛穴と呼ばれることが多い皮脂毛包の疾患である。各毛包の基底部には皮脂腺と呼ばれる腺があり、これは皮脂を産生する。皮脂は、皮膚を湿潤及び柔軟に保つ油性物質であり、通常の状況下では、毛包に沿って皮膚の表面に移動する。染みは、皮膚の表面に現れる約２〜３週間前に始まる。皮膚自体が新しくなるにつれて、古い細胞は死んで脱落する。細胞が不均一に放出され、皮脂と一緒に凝集すると、それは栓を形成する。通常は表面に排出される皮脂が詰まり、細菌が増殖し始める。蓄積した皮脂と相まって細菌が急速に増殖すると、毛包が肥大し、非炎症性の面疱と呼ばれる軽いざ瘡ができる。稗粒腫と黒色面疱の両方が「微小面疱」として始まり、次いで稗粒腫又は黒色面疱のいずれかである面疱と呼ばれる皮膚の染みになる。ざ瘡は、皮脂と、詰まった毛包内で増殖する細菌（アクネ菌、プロピオニバクテリウム・アクネス、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ａｃｎｅｓ）とが捕捉されたものである。皮脂腺は、顔面、胸部、背部、頸部及び頭皮に最も多く、従って、これらはざ瘡の最も一般的な部位である。ざ瘡の原因となる最も一般的な因子は、ホルモン、皮脂産生の増加、細菌（アクネ菌）、毛包内部の変化である。ざ瘡は、丘疹、膿疱、小結節と呼ばれる赤色の炎症型のざ瘡病変に進行することがある。
【０００４】
ざ瘡にはさまざまな種類があり、重症度は軽度から重度の外観を損なうものまでさまざまである。尋常性ざ瘡は、数種類の面疱を含む最も一般的な型のざ瘡である。これらのざ瘡病変には、黒色面疱、稗粒腫、丘疹、膿疱、小結節及び嚢胞が含まれる。
【０００５】
軽症から中等症の尋常性ざ瘡は、稗粒腫、黒色面疱、丘疹、膿疱を特徴とする。毛穴が完全に塞がれ、皮脂、細菌、死んだ皮膚細胞が皮膚表面の下に閉じ込められて表面に白い外観が生じると、稗粒腫が形成される。稗粒腫は、通常、黒色面疱よりもライフサイクルが速い。黒色面疱は、毛穴が部分的にしか塞がれておらず、捕捉された皮脂、細菌、及び死んだ皮膚細胞の一部がゆっくりと表面に排出できる場合に形成される。黒色は、皮膚自身の色素であるメラニンが空気中の酸素と反応する反応に起因する。黒色面疱は安定した構造になる傾向がある。黒色面疱は、しばしば、内容物が表面に非常にゆっくりと排出するので、透明化するのに長い時間がかかることがある。丘疹は、頭部のない小さな赤色の圧痛のある隆起部である。丘疹は、通常典型的な「面皰」と考えられるものの発達における最も初期の段階である。丘疹は、非炎症期と炎症期の間のざ瘡の進行の中間状態である。膿疱は稗粒腫に似ているが、炎症を起こし、白色又は黄色の中心を有する赤い円として現れる。
【０００６】
重症の尋常性ざ瘡は、小結節と嚢胞を特徴とする。結節性ざ瘡は、はるかに大きいざ瘡の斑点からなり、かなり痛みを伴い、ときには数か月間続くこともある。小結節は、皮膚の表面下の大きな硬い隆起である。瘢痕化は小結節でよくみられる。ざ瘡嚢胞は、小結節に似て現れることがあるが、膿で満たされており、差し渡し５ｍｍ以上の直径を有すると記載することができる。ざ瘡嚢胞は、痛みを伴うことがあり、嚢胞性ざ瘡では瘢痕化がよくみられる。
【０００７】
ざ瘡酒さは、上述の尋常性ざ瘡と同様に見えることがあり、これら２種類のざ瘡が混同されることもある。酒さは何百万人もの人に影響を及ぼすが、そのほとんどは３０歳以上である。ざ瘡酒さは、通常は頬、鼻、額及びあごに限局する赤い発疹として現れる。発赤はしばしば隆起、面皰、皮膚の染みを伴う。また、皮膚に血管がより見えるようになることもある。黒色面疱は酒さの一部ではない。それは女性に多いが、男性に見られると、より重症になることが多い。ざ瘡酒さは、未処置のまま放置すると、鼻の腫脹及び過剰な組織の成長を引き起こすことがあり、これは鼻瘤と呼ばれる状態である。
【０００８】
集簇性ざ瘡は尋常性ざ瘡の中で最も重症な型であり、男性に多い。集簇性ざ瘡は、多数の大きな病変を特徴とし、この大きな病変は、ときには広範な黒色面疱と共に合わせて現れる。集簇性ざ瘡は、皮膚に重度の回復不可能な損傷、外観を損なう瘢痕化を引き起こすことがある。それは、顔面、胸部、背部、臀部、上腕、及び大腿に見出される。集簇性ざ瘡の発症年齢は通常１８〜３０歳であり、その状態は長年活発に留まることができる。
【０００９】
電撃性ざ瘡は、通常は若年男性に発症する急性の集簇性ざ瘡である。重度の結節性嚢胞、しばしば潰瘍化したざ瘡の症状は明らかである。集簇性ざ瘡と同様に、極度の外観を損なう瘢痕化がよくみられる。電撃性ざ瘡は、発熱や関節痛も伴うという点で独特である。
【００１０】
グラム陰性菌性毛包炎は膿疱と嚢胞を特徴とする細菌感染症であり、尋常性ざ瘡の長期の抗生物質治療に起因する合併症として発生する可能性がある。これはまれな病態であり、男性対女性の有病率は不明である。
【００１１】
顔面膿皮症は重症の顔面ざ瘡であり、通常２０〜４０歳の、女性にのみ発症し、有痛性の大きな小結節、膿疱、及び瘢痕を残す可能性のある潰瘍（ただれ）を特徴とする。それは突然始まり、以前にざ瘡があったことのない女性の皮膚に起こることがある。顔面膿皮症は顔に限られており、通常１年以上持続しないが、非常に短時間で大きく傷つけることがある。
【００１２】
十代（青年期）のざ瘡：治療を必要とするほとんどのざ瘡症例は９〜１９歳の個体に発生する。男女児は同等に罹患しているが、その状態は通常、男児の方がより重症である。民族集団はざ瘡の素因はないが、油性の手入れ剤の使用のような特定の化粧慣行は、特定のパターンの病変をもたらし得る。青少年にざ瘡を引き起こす可能性のある内的要因には、内因性ホルモン（アンドロゲン、プロゲステロン）や特定の薬物（経口避妊薬、イソニアジド、フェニトイン、コルチコステロイド、リチウム含有化合物）等がある。外的要因には、皮膚細菌、とりわけアクネ菌；工業的化学物質（石油、動物油及び植物油）；油又はワックスを含有する化粧品；脂質性の日焼け止め剤又は日焼け調剤；及びヘッドバンド、肩パッド、又はヘルメットなどの物体からの局所圧力が含まれる。過剰な発汗や情動ストレスもざ瘡を悪化させる可能性がある。アンドロゲン（例えば、テストステロン）は皮脂腺の大きさを増大させ、ざ瘡を起こしやすい人では皮脂の産生を増大させる。女性では、月経周期中のエストロゲンの変動により、アンドロゲンに対する脂腺の感受性が変化する。思春期には、毛包の下にある皮膚細胞がより速く脱落し、増加したレベルの皮脂と混合し、毛穴が詰まる可能性を増加させる。
【００１３】
成人ざ瘡：成人の２０パーセント（２０％）が成人ざ瘡にかかり、そのほとんどが女性である。現代の仕事に関連するストレス、汚染、栄養不良及び化粧品不良が、主要な寄与因子に含まれる。成人ざ瘡の一般的な症例は、黒色面疱と稗粒腫からなり、他の症例は炎症性のざ瘡丘疹又は膿疱を発症した。
【００１４】
世界中のおよそ８５％の人が人生のある時点でざ瘡に罹患しており、任意の時点で１億３００万人以上がざ瘡に罹患している。米国ではおよそ１７００万人がざ瘡にかかり、毎年およそ５５０万人が受診する。
【００１５】
尋常性ざ瘡は西洋化した社会の人口の最大９５％に発生する。尋常性ざ瘡はほぼ万人の皮膚疾患であり、青年期の人口の７９％〜９５％が罹患する。２５歳以上の男女では、４０〜５４％にある程度の顔面ざ瘡が見られ、臨床的顔面ざ瘡は女性の１２％、男性の３％で中年期まで持続する（Ｃｏｒｄａｉｎ  Ｌ、Ｌｉｎｄｅｂｅｒｇ  Ｓ、Ｈｕｒｔａｄｏ  Ｍ、Ｈｉｌｌ  Ｋ、Ｅａｔｏｎ  Ｓ  Ｂ、Ｂｒａｎｄ−Ｍｉｌｌｅｒ  Ｊ．  Ａｃｎｅ  ｖｕｌｇａｒｉｓ：  ａ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｃｉｖｉｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００２  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；１３８（１２）：１５８４−９０）。
【００１６】
現在の薬物療法には、抗生物質、抗感染症薬、抗炎症薬、ホルモン療法、角質溶解薬、レチノイドなどの様々な局所投薬及び全身投薬が含まれる。市販薬には、過酸化ベンゾイル、サリチル酸、硫黄、レゾルシノールが含まれる。
【００１７】
過酸化ベンゾイル製剤は、ざ瘡原因菌を死滅させるのに非常に有効である。過酸化ベンゾイルは、１９３０年代に初めて使用され、それ自体がうまく機能することが証明されているので、ざ瘡治療の主流であり続けている。今日まで、過酸化ベンゾイルは、実際に、市販されている他の任意の薬物、処方又は他のものよりも良好にプロピオニバクテリウム・アクネス（アクネ菌）を死滅させる。過酸化ベンゾイルは、２．５％、５％及び１０％の非処方濃度で入手可能である。過酸化ベンゾイルを含めた多くの抗ざ瘡剤は、皮膚への高い流れ（フラックス）を有する。この浸透は、最初の塗布の際に有利であるが、皮膚におけるその後の迅速な拡散は、抗ざ瘡剤が、治療されるべきざ瘡病変から離れて拡散すること（「流出」として知られる現象）を意味する。ひいては、これは、ざ瘡病変の領域における抗ざ瘡剤の比較的短い滞留時間のため、抗ざ瘡剤の有効性が低下することを意味する。従って、ざ瘡病変の領域からの抗ざ瘡剤の流出を減少させる方法及びキットを手にすることが有利であろう。
【００１８】
現在、ざ瘡は多くの方法で治療されている。単純な抗菌性皮膚洗浄から、経口抗生物質及びレチノイドまで。これら２つの強力な治療レジメンに加えて、ざ瘡は局所抗生物質、サリチル酸ベースの医薬品、局所レチノイドで、女性では、経口避妊薬及びアゼライン酸で治療することもできる。これらの治療のうち、最も効果的なのはＧＰが処方した経口抗生物質である。抗生物質耐性が懸念されているが、レチノイドは、若年者において、とりわけうつ病、頭痛、乾燥肌などに関して深刻な安全性の懸念を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｃｏｒｄａｉｎ  Ｌ、Ｌｉｎｄｅｂｅｒｇ  Ｓ、Ｈｕｒｔａｄｏ  Ｍ、Ｈｉｌｌ  Ｋ、Ｅａｔｏｎ  Ｓ  Ｂ、Ｂｒａｎｄ−Ｍｉｌｌｅｒ  Ｊ．  Ａｃｎｅ  ｖｕｌｇａｒｉｓ：  ａ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｃｉｖｉｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００２  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；１３８（１２）：１５８４−９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ざ瘡及び／又はアトピー性皮膚炎の治療に関連する上記の問題のうちの１つ以上に対処することが本発明の目的である。ざ瘡及び／又はアトピー性皮膚炎の治療を提供することも本発明の目的である。さらに、抗炎症治療剤のより良好な浸透又は送達を可能にする治療を提供することが本発明の目的である。ざ瘡及び／又はアトピー性皮膚炎に関連する炎症も低減するであろう、規則的な使用に適した効果的な洗顔料を提供することも本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の第１の態様によれば、皮膚病理学的状態の治療に使用するための組成物であって、ナノ粒子を形成することができるポリマーと、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とを含む組成物が提供される。
【００２２】
本発明の第１の態様に関連して、皮膚病理学的状態の治療のための組成物であって、ナノ粒子を形成することができるポリマーと、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とを含む組成物が提供される。
【００２３】
本発明の第１の態様にさらに関連して、皮膚病理学的状態の治療（処置）のための医薬の製造又は調製における、ナノ粒子を形成することができるポリマーと、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とを含む組成物の使用が提供される。
【００２４】
上記ポリマーは、直鎖状及び／若しくは分枝状若しくは環状のポリモノグアニド／ポリグアニジン、ポリビグアニド、それらの類似体又は誘導体を含む。
【００２５】
ポリマー並びに抗炎症剤及び／又は鎮痛剤からナノ粒子を形成することにより、本発明者らは、有利にも、角質層への及び角質層を通る、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤の送達を高めることが可能であるということを見出した。
【００２６】
上記ポリマーは、直鎖状及び／若しくは分枝状若しくは環状のポリモノグアニド／ポリグアニジン、ポリビグアニド、それらの類似体又は誘導体を含むことが好ましい。この直鎖状及び／若しくは分枝状若しくは環状のポリモノグアニド／ポリグアニジン、ポリビグアニド、それらの類似体又は誘導体は、下記式１ａ又は式１ｂに従うものであってよく、それらの例は下記表Ａ及び表Ｂに提供されている。
【化１】
2021529797.tif 000002
上記式中、
「ｎ」は、上記ポリマーにおける繰り返し単位の数を指し、ｎは、２〜１０００、例えば２又は５から１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００又は９００まで変化することができ、
Ｇ１及びＧ２は、独立に、ビグアニド又はグアニジンを含むカチオン性基を表し、Ｌ１及びＬ２は、上記グアニドの窒素原子に直接結合されている。従って、上記ビグアニド基又はグアニジン基は、上記ポリマー骨格に不可欠である。このビグアニド基又はグアニジン基は、式１ａにおける側鎖部分ではない。
【００２７】
カチオン性基の例：
【化２】
2021529797.tif 000003
【００２８】
本発明では、Ｌ１及びＬ２は、上記ポリマー中のＧ１及びＧ２のカチオン性基の間の連結基である。Ｌ１及びＬ２は、独立に、Ｃ１〜Ｃ１４０個の炭素原子を含有する脂肪族基、例えばメチレン、エチレン、プロピレン、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９若しくはＣ１０；Ｃ１〜Ｃ１０、〜Ｃ２０、〜Ｃ３０、〜Ｃ４０、〜Ｃ５０  〜Ｃ６０、〜Ｃ７０、〜Ｃ８０、〜Ｃ９０、〜Ｃ１００、〜Ｃ１１０、〜Ｃ１２０、〜Ｃ１３０若しくは〜Ｃ１４０のアルキル等のアルキル基を表すことができるし、又はＬ１及びＬ２は、（独立に）Ｃ１〜Ｃ１４０（例えばＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９若しくはＣ１０；Ｃ１〜Ｃ１０、〜Ｃ２０、〜Ｃ３０、〜Ｃ４０、〜Ｃ５０  〜Ｃ６０、〜Ｃ７０、〜Ｃ８０、〜Ｃ９０、〜Ｃ１００、〜Ｃ１１０、〜Ｃ１２０、〜Ｃ１３０若しくは〜Ｃ１４０）の、脂環式ラジカル、複素環式ラジカル、芳香族ラジカル、アリールラジカル、アルキルアリールラジカル、アリールアルキルラジカル、オキシアルキレンラジカルであることができるし、又はＬ１及びＬ２は、（独立に）任意に１以上の、好ましくは１個の、酸素原子、窒素原子若しくは硫黄原子、官能基及び飽和若しくは不飽和の環状部分が介在していてもよいポリアルキレンラジカルであることができる。好適なＬ１及びＬ２の例は表Ａに列挙されている基である。
【００２９】
Ｌ１、Ｌ２、Ｇ１及びＧ２は、脂肪族ラジカル、脂環式ラジカル、複素環式ラジカル、アリールラジカル、アルカリールラジカル、及びオキシアルキレンラジカルを使用して修飾されたものであってもよい。
【００３０】
Ｎ及びＧ３は、好ましくは末端基である。典型的には、本発明における使用のポリマーは、末端アミノ（Ｎ）及びシアノグアニジン（Ｇ３）又はグアニジン（Ｇ３）末端基を有する。このような末端基は、脂肪族ラジカル、脂環式ラジカル、複素環式ラジカル、複素環式ラジカル、アリールラジカル、アルキルアリールラジカル、アリールアルキルラジカル、オキシアルキレンラジカルへの連結によって（例えば１，６−ジアミノヘキサン、１，６ジ（シアノグアニジノ）ヘキサン、１，６−ジグアニジノヘキサン、４−グアニジノ酪酸で）修飾されていてもよい。加えて、末端基は、受容体リガンド、デキストラン、シクロデキストリン、脂肪酸若しくは脂肪酸誘導体、コレステロール若しくはコレステロール誘導体又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）への連結によって修飾されていてもよい。任意に、上記ポリマーは、Ｎ及びＧ３の位置でグアニジン若しくはビグアニド若しくはシアノアミン若しくはアミン又はシアノグアニジンで終わることができるし、又はＮ位置でシアノアミン及びＧ３位置でシアノグアニジンで終わることができるし、又はＮ位置でグアニジン及びＧ３位置でシアノグアニドで終わることができるし、又はＧ３でＬ１アミン及びＮでシアノグアニジンで終わることができる。Ｇ３はＬ１−アミン、Ｌ２−シアノグアニジン又はＬ２−グアニジンであることができる。合成の際の重合の数（ｎ）又はポリマー鎖の切断及び副反応によっては、一例として上に記載したような末端基の不均一な混合物が生じうる。従って、Ｎ及びＧ３の基は、上記のように、不均一な混合物として相互変換／存在することができる。あるいは、Ｎ及びＧ３は存在しなくてもよく、上記ポリマーは環状であってもよく、この場合は、それぞれの末端のＬ１基及びＧ２基は互いに直接連結されている。
【００３１】
式１ｂでは、Ｘは存在してもよいし存在しなくてもよい。Ｌ３、Ｌ４及びＸは、「Ｌ１又はＬ２」について上に記載されたとおりである。従って、Ｌ３及びＬ４及びＸは、上記ポリマー中のＧ４及びＧ５のカチオン性基の間の連結基である。Ｌ３及びＬ４及びＸは、独立に、Ｃ１〜Ｃ１４０個の炭素原子を含有する脂肪族基、例えばメチレン、エチレン、プロピレン、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９若しくはＣ１０；Ｃ１〜Ｃ１０、〜Ｃ２０、〜Ｃ３０、〜Ｃ４０、〜Ｃ５０  〜Ｃ６０、〜Ｃ７０、〜Ｃ８０、〜Ｃ９０、〜Ｃ１００、〜Ｃ１１０、〜Ｃ１２０、〜Ｃ１３０若しくは〜Ｃ１４０のアルキル等のアルキル基を表すことができるし、又はＬ３及びＬ４及びＸは、独立に、Ｃ１〜Ｃ１４０（例えばＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９若しくはＣ１０；Ｃ１〜Ｃ１０、〜Ｃ２０、〜Ｃ３０、〜Ｃ４０、〜Ｃ５０  〜Ｃ６０、〜Ｃ７０、〜Ｃ８０、〜Ｃ９０、〜Ｃ１００、〜Ｃ１１０、〜Ｃ１２０、〜Ｃ１３０若しくは〜Ｃ１４０）の、脂環式ラジカル、複素環式ラジカル、芳香族ラジカル、アリールラジカル、アルキルアリールラジカル、アリールアルキルラジカル、オキシアルキレンラジカルであることができるし、又はＬ３及びＬ４及びＸは、独立に、任意に１以上の、好ましくは１個の、酸素原子、窒素原子若しくは硫黄原子、官能基及び飽和若しくは不飽和の環状部分が介在していてもよいポリアルキレンラジカルであることができる。好適なＬ３及びＬ４及びＸの例は表Ｂに列挙されている基である。
【００３２】
「Ｇ４」及び「Ｇ５」はカチオン性部分であり、同一であってもよいし異なっていてもよい。Ｇ４及びＧ５のうちの少なくとも１つは、ビグアニジン部分又はカルバモイルグアニジンであり、他方の部分は上記のとおり（ビグアニジン若しくはカルバモイルグアニジン）又はアミンであってよい。誤解を避けるために、式１ｂでは、カチオン性部分Ｇ４及びＧ５は、ただ１つのグアニジン基しか含有しないわけではない。例えば、Ｇ４及びＧ５は、典型的には、ただ１つのグアニジン基を含有するわけではない。このような化合物の例は、表Ｂに列挙されているように、ポリアリルビグアニド、ポリ（アリルビグアニジノ−ｃｏ−アリルアミン）、ポリ（アリルカルバモイルグアニジノ−ｃｏ−アリルアミン）、ポリビニルビグアニドである。
【００３３】
ポリアリルビグアニドの例は下に示されているとおりである。
【化３】
2021529797.tif 000004
【００３４】
ポリアリルビグアニジンの場合、Ｌ３及びＬ４は同一であり、Ｇ４及びＧ５は同様であり、従ってポリアリルビグアニドは、下記のように単純化できる。
【化４】
2021529797.tif 000005
【００３５】
ポリ（アリルカルバモイルグアニジノ−ｃｏ−アリルアミン）の例は下に示されているとおりである。
【化５】
2021529797.tif 000006
【００３６】
本発明において使用するためのポリマーは、一般に、それらと会合した対イオンを有する。好適な対イオンとしては、以下の、ハロゲン化物（例えば塩化物）、リン酸イオン、乳酸イオン、ホスホン酸イオン、スルホン酸イオン、アミノカルボン酸イオン、カルボン酸イオン、ヒドロキシカルボキン酸イオン、有機リン酸イオン、有機ホスホン酸イオン、有機スルホン酸イオン及び有機硫酸イオンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明において使用するためのポリマーは、異なる「ｎ」数のポリマーの不均一な混合物、又は標準的な精製方法によって精製された特定の「ｎ」数を含む均質な画分のいずれかであることができる。上記のように、上記ポリマーはまた、環状であってもよく、加えて、分岐していてもよい。
【００３８】
「ｎ」についての好ましい数としては、２〜２５０、２〜１００、２〜８０及び２〜５０が挙げられる。
【００３９】
【表１】
2021529797.tif 000007
【００４０】
【表２】
2021529797.tif 000008
【００４１】
【表３】
2021529797.tif 000009
【００４２】
本発明の方法において使用されるポリマーは、直鎖状、分枝状又はデンドリマー状の分子を含んでもよい。このポリマーは、直鎖状、分枝状又はデンドリマー状の分子の組み合わせを含んでもよい。このポリマーは、例えば、上記のように、式１ａ又は式１ｂの分子の１つ又は任意の組み合わせを含んでもよい。
【００４３】
例えば、上記ポリマーは、ポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）、ポリヘキサメチレンモノグアニド（ＰＨＭＧ）、ポリエチレンビグアニド（ＰＥＢ）、ポリテトラメチレンビグアニド（ＰＴＭＢ）又はポリエチレンヘキサメチレンビグアニド（ＰＥＨＭＢ）のうちの１以上を含むことができる。いくつかの例は、表Ａ及び表Ｂに列挙されている。
【００４４】
従って、上記ポリマーは、ポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）、ポリヘキサメチレンモノグアニド（ＰＨＭＧ）、ポリエチレンビグアニド（ＰＥＢ）、ポリテトラメチレンビグアニド（ＰＴＭＢ）、ポリエチレンヘキサメチレンビグアニド（ＰＥＨＭＢ）、ポリメチレンビグアニド（ＰＭＢ）、ポリ（アリルビグアニジノ−ｃｏ−アリルアミン）、ポリ（Ｎ−ビニルビグアニド）、ポリアリルビグアニドのうちの１以上の均一な又は不均一な混合物を含んでもよい。
【００４５】
上記ポリマーがポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）を含むことが最も好ましい。
【００４６】
１つの実施形態では、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤は、同じ活性医薬成分を含む。特定の抗炎症剤が鎮痛特性も有すると示されていることは、当業者には明らかであろう。他の実施形態では、当該組成物は、別個の抗炎症剤及び別個の鎮痛剤を含む。
【００４７】
上記抗炎症剤は、ステロイド系抗炎症剤（ＳＡＩＤ）及び非ステロイド系抗炎症剤を含めて、いくつかの異なる種類の抗炎症剤を含んでもよい。ある実施形態では、抗炎症剤が非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）を含むことが好ましい。そのようなＮＳＡＩＤは、以下のもののうちの１以上から選択されてもよい：アスピリン（Ａｎａｃｉｎ、Ａｓｃｒｉｐｔｉｎ、Ｂａｙｅｒ、Ｂｕｆｆｅｒｉｎ（バファリン）、Ｅｃｏｔｒｉｎ、Ｅｘｃｅｄｒｉｎ（エキセドリン））；コリン及びジサリチル酸マグネシウム（ＣＭＴ、Ｔｒｉｃｏｓａｌ、Ｔｒｉｌｉｓａｔｅ）；サリチル酸コリン（Ａｒｔｈｒｏｐａｎ）；セレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）；ジクロフェナクカリウム（Ｃａｔａｆｌａｍ（カタフラム））；ジクロフェナクナトリウム（Ｖｏｌｔａｒｅｎ（ボルタレン）、Ｖｏｌｔａｒｅｎ  ＸＲ）；ジクロフェナクナトリウム・ミソプロストール合剤（Ａｒｔｈｒｏｔｅｃ（オルソテック））；ジフルニサル（Ｄｏｌｏｂｉｄ）；エトドラク（Ｌｏｄｉｎｅ（ロジン）、Ｌｏｄｉｎｅ  ＸＬ）；フェノプロフェンカルシウム（Ｎａｌｆｏｎ）；フルルビプロフェン（Ａｎｓａｉｄ）；イブプロフェン（Ａｄｖｉｌ（アドビル）、Ｍｏｔｒｉｎ（モトリン）、Ｍｏｔｒｉｎ  ＩＢ、Ｎｕｐｒｉｎ）；インドメタシン（Ｉｎｄｏｃｉｎ、Ｉｎｄｏｃｉｎ  ＳＲ）；ケトプロフェン（Ａｃｔｒｏｎ、Ｏｒｕｄｉｓ（オルヂス）、Ｏｒｕｄｉｓ  ＫＴ、Ｏｒｕｖａｉｌ）；サリチル酸マグネシウム（Ａｒｔｈｒｉｔａｂ、Ｂａｙｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ、Ｄｏａｎ’ｓ  Ｐｉｌｌｓ、Ｍａｇａｎ、Ｍｏｂｉｄｉｎ、Ｍｏｂｏｇｅｓｉｃ）；メクロフェナム酸ナトリウム（Ｍｅｃｌｏｍｅｎ）；メフェナム酸（Ｐｏｎｓｔｅｌ）；メロキシカム（Ｍｏｂｉｃ（モービック））；ナブメトン（Ｒｅｌａｆｅｎ（レラフェン））；ナプロキセン（Ｎａｐｒｏｓｙｎ、Ｎａｐｒｅｌａｎ）；ナプロキセンナトリウム（Ａｌｅｖｅ、Ａｎａｐｒｏｘ）；オキサプロジン（Ｄａｙｐｒｏ）；ピロキシカム（Ｆｅｌｄｅｎｅ（フェルデン））；ロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ（バイオックス））；サルサラート（Ａｍｉｇｅｓｉｃ、Ａｎａｆｌｅｘ  ７５０、Ｄｉｓａｌｃｉｄ、Ｍａｒｔｈｒｉｔｉｃ、Ｍｏｎｏ−Ｇｅｓｉｃ、Ｓａｌｆｌｅｘ、Ｓａｌｓｉｔａｂ）；サリチル酸ナトリウム（種々のジェネリック）；スリンダク（Ｃｌｉｎｏｒｉｌ（クリノリル））；トルメチンナトリウム（Ｔｏｌｅｃｔｉｎ）；及びバルデコキシブ（Ｂｅｘｔｒａ）。
【００４８】
好ましくは、上記抗炎症剤及び／又は鎮痛剤は、以下の、ラパマイシン、タクロリムス、イブプロフェン、シクロスポリン、ジクロフェナク、ナプロキセン並びにこれらの関連する誘導体及び塩から選択される１以上を含む。
【００４９】
上記抗炎症剤及び／又は鎮痛剤がジクロフェナク並びにその関連する誘導体及び塩であることが最も好ましい。このジクロフェナクは、ジクロフェナクカリウム（Ｃａｔａｆｌａｍ）、ジクロフェナクナトリウム（Ｖｏｌｔａｒｅｎ、Ｖｏｌｔａｒｅｎ  ＸＲ）、又はジクロフェナク塩とミソプロストール（Ａｒｔｈｒｏｔｅｃブランドで市販されている）等の別の薬学的に活性な成分との合剤の形態であってもよい。
【００５０】
上記抗炎症剤及び／又は鎮痛剤がジクロフェナク並びにこの関連する誘導体及び塩を含む場合、平均直径は、５０〜２５０ｎｍのおよその範囲にあってもよい。好ましくは、上記ナノ粒子は１００〜２００ｎｍの範囲の平均直径を有し、より好ましくは上記ナノ粒子は１２５〜１７５ｎｍの範囲の平均直径を有し、最も好ましくは約１５０ｎｍの平均直径及び／又は約１３８ｎｍの平均モード径を有する。
【００５１】
上記ナノ粒子は、抗炎症剤と共に、及び／又はその存在下で形成されてもよい。上記ナノ粒子を形成するために種々の方法が使用されてよく、ナノ粒子は、ポリマーと抗炎症剤及び／又は鎮痛剤との複合体として形成されることが想定される。しかしながら、ポリマーナノ粒子は、独立して形成されて、次いで、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤がこのナノ粒子に吸収され又は付着するように、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とインキュベートされてもよい。あるいは、ナノ粒子は、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とのインキュベーション中に形成されてもよい。
【００５２】
当該組成物が以下の成分の１つ以上をさらに含み得ることは、当業者に明らかである：緩衝剤、賦形剤、結合剤、油、水、乳化剤、グリセリン、酸化防止剤、防腐剤及び芳香剤、又は局所クリーム、軟膏剤、スプレー、粉末、泡沫若しくはムースに通常見られる任意のさらなる成分。さらには、当該組成物は、スプレー装置と共に使用するためのペースト又は懸濁液などの多くの形態であることもできよう。好ましくは、当該組成物は、局所医薬の形態にある。
【００５３】
上記皮膚病理学的状態は、ざ瘡及び／若しくはアトピー性皮膚炎又は関連状態を含むことが好ましい。
【００５４】
本発明の別の態様によれば、皮膚病理学的状態の治療のための医薬の調製における、抗炎症剤及び／若しくは鎮痛剤を有する、又は抗炎症剤及び／若しくは鎮痛剤と会合する１以上のナノ粒子を形成するためのポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）の使用が提供される。
【００５５】
上記ナノ粒子は、罹患した皮膚病理学的領域への抗炎症剤及び／又は鎮痛剤のための送達用媒体（ビヒクル）として使用されてもよい。
【００５６】
上記皮膚病理学的状態は、ざ瘡及び／若しくはアトピー性皮膚炎又は関連状態を含むことが好ましい。
【００５７】
本発明のさらなる態様によれば、皮膚病理学的状態の治療のための組成物の製造方法であって、ナノ粒子の形成を可能にするのに好適な条件下で、ナノ粒子を形成することができるポリマーを抗炎症剤及び／又は鎮痛剤と混合する工程を備える方法が提供される。
【００５８】
当該方法は、本明細書において上記したような組成物を製造するために使用されることが好ましい。
【００５９】
本発明のさらなる態様によれば、ＰＨＭＢと抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とから形成されるナノ粒子又はナノ粒子結合体を含む、皮膚病理学的状態の治療に使用するための組成物が提供される。
【００６０】
本発明の関連する第１の態様では、皮膚病理学的状態の治療のための医薬の製造又は調製のための、ＰＨＭＢと抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とから形成されるナノ粒子又はナノ粒子複合体の使用が提供される。
【００６１】
ＰＨＭＢ（ポリヘキサメチレンビグアニド）は安全で有効な殺生物剤として知られており、消毒剤及び防腐剤として使用されている：米国特許第７８９７５５３号明細書、米国特許第４７５８５９５号明細書、米国特許出願公開第２００８２６１８４１号明細書；米国特許出願公開第２００４０００９１４４号明細書。ＰＨＭＢ及び関連分子は、有用な侵入促進剤であることも見出されている。驚くべきことに、ＰＨＭＢ（例えば）自体が、細菌、真菌及び哺乳動物細胞を含む広範囲の細胞に侵入することが観察された。より驚くべきことに、ＰＨＭＢ（例えば）は、広範囲の分子とナノ粒子を形成することができ、これらの分子をそのような細胞中に送達することができる（ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５２６）。最後に、核酸から小分子に及ぶ送達された分子は、細胞内で機能的であることが見出された。さらに、レチノイン酸及びビタミンＣ等のいくつかの天然物分子を用いて実施された研究により、その天然物に対する増強された安定化効果が実証されているため、この天然物はＰＨＭＢと組み合わせた場合に分解しにくい。
【００６２】
ここでは、本発明者らは、全体として、角質層への及び角質層を通る浸透を可能にするナノ粒子を形成するＰＨＭＢを用いた抗炎症剤及び／又は鎮痛剤の配合物の発明を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、例１で説明したような、ジクロフェナク及びＮａｎｏｃｉｎの配合物粒子サイズ（ｚ平均）対多分散性指数（ＰＤＩ）を示すグラフである。
【図２ａ】図２ａは、ＬＭ１０捕捉ジクロフェナク及びＰＨＭＢ粒子の画像である。
【図２ｂ】図２ｂは、例１で説明したような、２０％エタノール中のジクロフェナク／Ｎａｎｏｃｉｎ配合物に関する粒子集団対サイズのＬＭ１０プロファイルを示すグラフである。
【図３】図３は、例１で説明したような、脱水したジクロフェナクナノ粒子のＳＥＭ顕微鏡写真（１０ｋＶ、１０Ｋｘ倍率で画像化）を示す。
【図４】図４は、例１で説明したような、ＷＥＴＳＥＭカプセル中のナノ粒子の後方散乱画像（３０ｋＶ、４．６ｋｘ倍率で画像化）を示す。
【図５ａ】図５ａ〜ｄは、例１で説明したような菌叢アッセイの写真を示す。図５ａは、Ｎａｎｏｃｉｎに浸漬したディスクフィルタが培養液に添加されている表皮ブドウ球菌（Ｓ．エピデルミディス、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）菌叢アッセイを示す。Ｎａｎｏｃｉｎ濃度はｍｇ／ｍｌ単位である。ビヒクル（媒質）は２０％エタノールであった。
【図５ｂ】図５ａ〜ｄは、例１で説明したような菌叢アッセイの写真を示す。図５ｂは、Ｎａｎｏｃｉｎ（１ｍｇ／ｍｌ）単独又はＮａｎｏｃｉｎ−ＡＰＩ（１：１ｍｇ／ｍｌ）のいずれかに浸漬したディスクフィルタを用いて、３７℃で２４時間にわたって増殖させた表皮ブドウ球菌菌叢アッセイを示す。ビヒクルは２０％エタノールであった。
【図５ｃ】図５ａ〜ｄは、例１で説明したような菌叢アッセイの写真を示す。図５ｃは、Ｎａｎｏｃｉｎ又はジクロフェナクに浸漬したディスクフィルタ（１、０．５、０．３３、０．２５、０．２及び０．１ｍｇ／ｍｌのジクロフェナク。１ｍｇ／ｍｌのＮ−ｎａｎｏｃｉｎ）を伴うＰ．アクネス菌叢を示す。
【図５ｄ】図５ａ〜ｄは、例１で説明したような菌叢アッセイの写真を示す。図５ｄは、Ｎａｎｏｃｉｎ及びＮａｎｏｃｉｎ−ジクロフェナク配合物を伴うＰ．アクネス菌叢（一定の１ｍｇ／ｍｌのＮａｎｏｃｉｎ及び濃度が減少していくジクロフェナク）。
【図５ｅ】図５ｅ〜図５ｉは、例１で説明したような種々の配合物が存在するときのＰ．アクネス及び表皮ブドウ球菌の増殖を詳細に示すグラフを示す。図５ｅは、表皮ブドウ球菌に対するＡＰＩ及びｎａｎｏｃｉｎ（３０％エタノール中の１：１ｍｇ／ｍｌ）のＭＩＣを示すグラフである。
【図５ｆ】図５ｅ〜図５ｉは、例１で説明したような種々の配合物が存在するときのＰ．アクネス及び表皮ブドウ球菌の増殖を詳細に示すグラフを示す。図５ｆは、表皮ブドウ球菌に対するＡＰＩ及びｎａｎｏｃｉｎ（３０％エタノール中の１：１ｍｇ／ｍｌ）のＭＩＣを示すグラフである。
【図５ｇ】図５ｅ〜図５ｉは、例１で説明したような種々の配合物が存在するときのＰ．アクネス及び表皮ブドウ球菌の増殖を詳細に示すグラフを示す。図５ｇは、Ｐ．アクネスに対するＡＰＩ及びｎａｎｏｃｉｎ（３０％エタノール中の１：１ｍｇ／ｍｌ）のＭＩＣを示すグラフである。図５ｇは、Ｐ．アクネスに対するＡＰＩ及びｎａｎｏｃｉｎ（３０％エタノール中の１：１ｍｇ／ｍｌにおいて）のＭＩＣを示すグラフである。
【図５ｈ】図５ｅ〜図５ｉは、例１で説明したような種々の配合物が存在するときのＰ．アクネス及び表皮ブドウ球菌の増殖を詳細に示すグラフを示す。図５ｈは、Ｐ．アクネスに対するタクロリムス及びｎａｎｏｃｉｎ（２０％エタノール中の１：１ｍｇ／ｍｌ）のＭＩＣを示すグラフである。図５ｈは、Ｐ．アクネスに対するタクロリムス及びｎａｎｏｃｉｎ（２０％エタノール中の１：１ｍｇ／ｍｌ）のＭＩＣを示すグラフである。
【図５ｉ】図５ｅ〜図５ｉは、例１で説明したような種々の配合物が存在するときのＰ．アクネス及び表皮ブドウ球菌の増殖を詳細に示すグラフを示す。図５ｉは、表皮ブドウ球菌増殖に対するジクロフェナク及びｎａｎｏｃｉｎの効果を示すグラフである。
【図５ｊ】図５ｊは、表皮ブドウ球菌増殖に対するジクロフェナク及びｎａｎｏｃｉｎの効果を示すグラフである。
【図５ｋ】図５ｋは、表皮ブドウ球菌増殖に対するジクロフェナク及びｎａｎｏｃｉｎの効果を示すグラフである。図５ｋは、表皮ブドウ球菌の増殖に対するジクロフェナク及びｎａｎｏｃｉｎの効果を示すグラフである。
【図５ｌ】図５ｌは、Ｐ．アクネスの増殖に対するジクロフェナク及びｎａｎｏｃｉｎの効果を示すグラフである。
【図５ｍ】図５ｍは、Ｐ．アクネスの増殖に対するジクロフェナク及びＮａｎｏｃｉｎの効果を示すグラフである。
【図５ｎ】図５ｎは、Ｐ．アクネスの増殖に対するジクロフェナク及びＮａｎｏｃｉｎの効果を示すグラフである。
【図５ｏ】図５ｏは、Ｐ．アクネスの増殖に対するジクロフェナク及びｎａｎｏｃｉｎの効果を示すグラフである。
【図５ｐ】図５ｐは、Ｎａｎｏｃｉｎ対Ｐ．アクネス及びＰ．グラニュローサムを示すグラフである。
【図６】図６は、例１で説明したような、２時間、４時間及び２４時間の時間にわたるＴＮＦ−α、ＩＬ−８及びＩＬ−１α応答について検討したＬＰＳ用量（０〜１μｇ／ｍｌ）を示すグラフである。
【図７ａ】図７ａは、２時間、４時間及び２４時間にわたるＴＨＰ−１細胞におけるＬＰＳに対するＩＬ−８応答を示すグラフである。
【図７ｂ】図７ｂは、例１で説明したような、２時間、４時間及び２４時間にわたるＴＨＰ−１細胞におけるＬＰＳ刺激に対するＴＮＦ−ａ応答を示すグラフである。
【図８ａ】図８ａは、２４時間にわたるＬＰＳによるＴＨＰ−１細胞に対する刺激の後のすべてのＡＰＩの用量反応を伴うＩＬ−８レベルを示すグラフである。
【図８ｂ】図８ｂは、ＡＰＩの存在下（ここでは試料は１／５に希釈されている）でのＴＨＰ−１細胞に対する２４時間のＬＰＳ曝露後のＩＬ−８刺激を示すグラフである。
【図８ｃ】図８ｃは、１０μｇ／ｍｌ  ＬＰＳの存在下での種々の抗炎症剤（３０μｇ／ｍｌ）の２４時間インキュベーション後のＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−８の放出を示すグラフである（ＩＬ−８レベルは細胞数で規格化されている）。
【図８ｄ】図８ｄは、Ｎａｎｏｃｉｎを伴う及び伴わない種々のＡＰＩの存在下でのＴＨＰ−１細胞に対する２４時間のＬＰＳ曝露後のＩＬ−８刺激を示すグラフである。
【図８ｅ】図８ｅは、Ｎａｎｏｃｉｎ（１００μｇ／ｍｌ）を伴う及び伴わない３０μｇ／ｍｌの種々のＡＰＩの存在下でのＬＰＳ刺激ＴＨＰ−１細胞に対する２４時間インキュベーション後の生細胞の数を示すグラフである。
【図８ｆ】図８ｆは、２時間及び２４時間におけるＮａｎｏｃｉｎを用いた場合の経時的なＴＨＰ−１細胞生存率を示すグラフである。
【図９】図９は、例１で説明したような、Ｎａｎｏｃｉｎを伴う及び伴わないジクロフェナクの存在及び不存在下でのＬＰＳ刺激に対するＴＨＰ−１応答を示すグラフである（細胞数で規格化した後のＩＬ−８応答）。
【図１０】図１０は、例１で説明したような、ＩＬ−８分泌（応答順）を示すグラフである。
【図１１】図１１は、例１で説明したような、Ｎａｎｏｃｉｎを伴う及び伴わないジクロフェナクの存在及び不存在下でのＬＰＳ刺激に対するＴＨＰ−１応答を示すグラフである（細胞数で規格化した後のＴＮＦ−ａ応答）。
【図１２】図１２は、例１で説明したような、ＴＮＦ−α分泌（応答順）を示すグラフである。
【図１３】図１３は、例１で説明したような、ＮａＣｌ２試料強度を示すグラフである。
【図１４】図１４は、例１で説明したような、平均ＮａＣｌ２試料強度を示すグラフである。
【図１５】図１５は、例１で説明したような、ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ及びジクロフェナク単独の角質層への浸透を示す断面画像である。
【図１６】図１６は、例２で利用した化学イメージングのための試料調製の概略図を示す。
【図１７】図１７は、例２で利用した、断面分析対テープストリップ分析を示す。
【図１８】図１８は、例２で説明した、断面画像（Ｈ＆Ｅ染色後）の例を示す。
【図１９】図１９は、例２で説明した、ＡＰＩ＋ＮａｎｏｃｉｎについてのＴｏＦ−ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。
【図２０】図２０は、例２で説明した、タクロリムス＋ＮａｎｏｃｉｎについてのＴｏＦ−ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。
【図２１】図２１は、例２で説明した、ジクロフェナク＋ＮａｎｏｃｉｎについてのＴｏＦ−ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。
【図２２ａ】図２２ａ〜図２２ｃは、例２で説明したＡＰＩ＋テープストリップ分析を示すグラフを示す。図２２ａは、ポジティブスペクトル及びネガティブスペクトルにおけるシクロスポリン＋Ｎａｎｏｃｉｎを示す。
【図２２ｂ】図２２ａ〜図２２ｃは、例２で説明したＡＰＩ＋テープストリップ分析を示すグラフを示す。図２２ｂは、ポジティブスペクトル及びネガティブスペクトルにおけるラパマイシン＋Ｎａｎｏｃｉｎを示す。
【図２２ｃ】図２２ａ〜図２２ｃは、例２で説明したＡＰＩ＋テープストリップ分析を示すグラフを示す。図２２ｃは、ポジティブスペクトル及びネガティブスペクトルにおけるタクロリムス＋Ｎａｎｏｃｉｎを示す。
【図２３ａ】図２３ａ〜図２３ｃは、例２で説明したＡＰＩ＋ＦＩＴＣ−Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ分析の蛍光顕微鏡写真を示す。図２３ａは、対照ＴＳ１及びＴＳ２についての顕微鏡写真を示す。
【図２３ｂ】図２３ａ〜図２３ｃは、例２で説明したＡＰＩ＋ＦＩＴＣ−Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ分析の蛍光顕微鏡写真を示す。図２３ｂは、ＴＳ１及びＴＳ２に対するタクロリムス＋ＦＩＴＣ−Ｎａｎｏｃｉｎについての顕微鏡写真を示す。
【図２３ｃ】図２３ａ〜図２３ｃは、例２で説明したＡＰＩ＋ＦＩＴＣ−Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ分析の蛍光顕微鏡写真を示す。図２３ｃは、ＴＳ１及びＴＳ２に対するジクロフェナク＋ＦＩＴＣ−Ｎａｎｏｃｉｎについての顕微鏡写真を示す。
【図２４】図２４は、例２で説明した、３つのリピートとしてのジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ  ＴＳ１についてのＴｏＦ−ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。図２４は、例２で説明した、３つのリピートとしてのジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ  ＴＳ２についてのＴｏＦ−ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。
【図２５】図２５は、例２で説明した、３つのリピートとしてのジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ  ＴＳ２についてのＴｏＦ−ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。
【図２６】図２６は、例２で説明した、３つのリピートとしてのジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ  ＴＳ３についてのＴｏＦ−ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。
【図２７】図２７は、例２で説明した、３つのリピートとしてのジクロフェナクＴＳ１についてのＴｏＦ−ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。
【図２８】図２８は、例２で説明した、３つのリピートとしてのジクロフェナクＴＳ２についてのＴｏＦ−ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。
【図２９】図２９は、例２で説明した、３つのリピートとしてのジクロフェナクＴＳ３についてのＴｏＦ−ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。
【図３０（１）】図３０は、例２で説明した、ａ）対照試料（ブランク）１、ｂ）対照試料（ブランク）２、ｃ）ジクロフェナク試料１、ｄ）ジクロフェナク試料２、ｅ）ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ１、ｆ）ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ２、ｇ）ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ３、及びｈ）ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ４についてのＴｏＦ−ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。
【図３０（２）】図３０の続きである。
【図３０（３）】図３０の続きである。
【図３０（４）】図３０の続きである。
【図３１】図３１は、ヒト対ブタのジクロフェナク及びｎａｎｏｃｉｎの分布の％によるグラフを示す。試料は、ジクロフェナクの存在について定量ＬＣ−ＭＳにより分析された。各試料中で見出された薬物の割合は、フランツセルの上側チャンバーに施用された全量と比べて算出された（％）。
【図３２】図３２は、ヒトの皮膚の研究におけるシクロオキシゲナーゼ１の阻害を示すグラフである。シクロオキシゲナーゼ−１（Ｃｏｘ−１）阻害は、Ａｂｃａｍ（アブカム）製のアッセイキットを使用して製造業者の使用説明書に従って決定された。Ｃｏｘ−１の％阻害は、決定されて、平均のビヒクル単独処置に対して規格化された。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
本発明の実施形態は、これより以下の実験及び添付の図面を参照して、例としてのみ記載される。
【実施例】
【００６５】
例１  −  ざ瘡に対する治療的アプローチとしての抗炎症剤とＮａｎｏｃｉｎとの薬物再配合
背景
ざ瘡の治療法としてどれを進めるのが最良かを決定するために、研究プログラムを、Ｎａｎｏｃｉｎ（登録商標）（Ｔｅｃｒｅａ  Ｌｔｄ（テクレア）、英国）（ポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ））と配合したいくつかの抗炎症剤をスクリーニングするように選んだ。活性医薬成分（ＡＰＩ）／Ｎａｎｏｃｉｎ選択プロセスを以下の研究プログラムによって決定した。
・水及びエタノールのビヒクルの中での溶解度。
・粒子形成、サイズ及び品質に注目したときの選んだＡＰＩとＮａｎｏｃｉｎとの配合。
・注目する配合物のナノ粒子形成を確認するための電子顕微鏡観察の使用。
・ざ瘡に関連する細菌に対するｎａｎｏｃｉｎの抗菌活性の測定及びＡＰＩがこの効果に拮抗しないことの確認。
・ＡＰＩの抗炎症活性の測定及びｎａｎｏｃｉｎがこの効果に拮抗しないことの確認。
【００６６】
ＡＰＩを配合することが皮膚へのＡＰＩの送達を高めるか否かを判定するために、局所的皮膚塗布研究も使用した。
【００６７】
ざ瘡プログラムにおける初期スクリーニングのために、異なる分類の５種の抗炎症剤を選んだ。それらを下記表１に詳述する。
【００６８】
【表４】
2021529797.tif 000010
【００６９】
エタノール及び水の中の各化合物の溶解度を求めた。それを下記表２に示す。
【表５】
2021529797.tif 000011
【００７０】
この後、Ｃｅｌｃｏｘｉｂはその不溶性のためこのプログラムから脱落したが、イブプロフェン（水及びエタノールの中でより良好な溶解度を持つ非選択的なＣＯＸ阻害剤）を代わりのものとして試験した。
【００７１】
配合研究
ジクロフェナク（Ｄ）が最も可溶性であったので、ジクロフェナク（Ｄ）を最初にＮａｎｏｃｉｎと配合した。Ｎａｎｏｃｉｎに対するジクロフェナクの比（Ｄ：Ｎ）を試験し、比が異なると粒子サイズが変化することが示された。しかしながら、図１に示すように、多分散性指数（混合物中のナノ粒子サイズのばらつきの尺度）は、１：１ｍｇ／ｍｌの混合物においてのみ「良好」として報告された。
【００７２】
２０％エタノール中のジクロフェナクとＮａｎｏｃｉｎの１：１ｍｇ／ｍｌ比は不透明な溶液を生成した。これは最初は不溶性によると考えられたが、３０％エタノールビヒクルと水でも起こった。
【００７３】
上記複合配合物をＮａｎｏｓｉｇｈｔ  ＬＭ１０（ナノ粒子検出機）を通して処理したところ、この試料は明るすぎて読み取れなかったが、試料をフラッシュアウトする（流し出す）と多くのナノ粒子の兆候が見られた。この配合物は、走査することができるレベルのナノ粒子を得るために、１００対１に希釈する必要があった。この希釈でさえ、粒子の数は、数十億個／ｍｌで測定された（図２ａ参照）。
【００７４】
ＬＭ１０及びＤＬＳのデータから、この配合物の平均粒子サイズはおよそ１５０ｎｍであり、モード（ＬＭ１０から）は１３８ｎｍであることが示された。１：１ｍｇ／ｍｌ溶液の１：１００希釈で、粒子の数は７×１０９粒子／ｍｌであった。多分散性指数はＤＬＳで良好と記載された。個体数プロファイルは、図２ｂに見ることができる。
【００７５】
ジクロフェナク配合物のＥＭ分析
上記配合物を、ＥＭ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ（イーエム・サポート・システムズ）（英国）によって走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いても調べた。最初に、乾燥試料として金でコーティングし、ＷＥＴ  ＳＥＭも使用した。
【００７６】
図３に示した電子顕微鏡写真は、粒子が脱水後に１００〜３００ｎｍの間にあったことを示している。脱水過程で起こるナノ粒子間の架橋が存在したが、これは、一部には、ナノ粒子に形成されていない残渣ポリマーによっても引き起こされた可能性もあった。
【００７７】
上記ナノ粒子のＷＥＴＳＥＭイメージングは成功裏に完了し、画像が得られた。図４は、溶液中のナノ粒子の後方散乱画像を示す。予想されるように、ナノ粒子がポリマーのみからなり、より大きなコントラストを与えることができるより重い元素がないので、コントラストは非常に低かったが、しかしながら、個々の粒子を見ることができる。加えて、いくつかの凝集又はより密な領域が観察されたが、これは、遊離ポリマーの存在によるものであった可能性がある。この遊離ポリマーもまた帯電しており、カプセルの表面に引き付けられるであろう。
【００７８】
他のＡＰＩとの配合物
他のＡＰＩを０．３３：１ｍｇ／ｍｌ又は１：１ｍｇ／ｍｌ（ＡＰＩ：Ｎａｎｏｃｉｎ）の濃度でＮａｎｏｃｉｎと配合した場合、両方においてナノ粒子が形成される証拠があった。
【００７９】
下記表３は、０．３３：１ｍｇ／ｍｌ  ＡＰＩ：ＮａｎｏｃｉｎについてのＤＬＳデータを示す。
【００８０】
【表６】
2021529797.tif 000012
【００８１】
下記表４は、１：１ｍｇ／ｍｌ  ＡＰＩ：ＮａｎｏｃｉｎについてのＤＬＳデータを示す。
【００８２】
【表７】
2021529797.tif 000013
【００８３】
ＰＤＩはラパマイシンで高く、１：１ｍｇ／ｍｌのＤ：Ｎ配合物のみがこれと共に「良好」との報告を与えたが、０．３３：１ｍｇ／ｍｌでは与えなかった。
【００８４】
微生物学的検査
Ｎａｎｏｃｉｎと配合したＡＰＩについて、ざ瘡に関連する２種類の細菌株に対して試験を行った。スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（Ｓ．エピデルミディス、表皮ブドウ球菌）及び嫌気性のシュードモナス・アクネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｎｅｓ）（Ｐ．アクネス）。２種類のアッセイを実施した：（ｉ）配合物をＷｈａｔｍａｎフィルターディスク上にピペットで移し、次いで寒天上で増殖する上記細菌の乾燥菌叢に添加した細菌菌叢アッセイ；及び（ｉｉ）上記細菌を９６穴プレート中で増殖させた液体最小阻害濃度（ＭＩＣ）アッセイ。
【００８５】
細菌菌叢アッセイは、好気性条件下の場合と同様に、表皮ブドウ球菌で増殖するのがはるかに速く、より容易であった。寒天プレート上でのＰ．アクネスの増殖は遅く、カメラ上での捕捉が困難であった（しかし、眼で観察することは可能であった；図５ｃ及び図５ｄを参照のこと）。
【００８６】
菌叢アッセイは、阻害的な細菌増殖を検出することにおいては、液体ＭＩＣアッセイほど感度がなかった。このアッセイは、Ｎａｎｏｃｉｎが１ｍｇ／ｍｌまでの細菌増殖を妨げることを示した（図５ａ）（これは、液体ＭＩＣで観察されたものよりもはるかに高い濃度である）。
【００８７】
しかしながら、このアッセイは、Ｎａｎｏｃｉｎが１：１ｍｇ／ｍｌの比でＡＰＩと配合された場合、それらは、Ｎａｎｏｃｉｎが細菌増殖を阻害することに影響しないことを示した（図２ｂ）。
【００８８】
図５ａに示すように、３、２及び１（ｍｇ／ｍｌ）ディスク周辺の「ハロー」は、Ｎａｎｏｃｉｎによって引き起こされる細菌の増殖の阻害を示している。というのも、ビヒクル対照はそのような効果を示さないからである。
【００８９】
図５ｂに示すように、すべてのディスクの周りのハローは、Ｎａｎｏｃｉｎ単独と同様のサイズであり、これは、ＡＰＩが表皮ブドウ球菌増殖のＮａｎｏｃｉｎ阻害に影響を及ぼさないことを示す。ビヒクルのみは、ディスクの周りで完全な細菌増殖を有する。（Ｄ＝ジクロフェナク；Ｔ＝タクロリムス；Ｉ＝イブプロフェン；Ｒ＝ラパマイシン、Ｃ＝シクロスポリン；Ｎ＝Ｎａｎｏｃｉｎ）。
【００９０】
図５ｃは、Ｎａｎｏｃｉｎ単独ディスク（Ｎ；１ｍｇ／ｍｌ）の周りの透明寒天の「ハロー」を示し、これは細菌増殖の阻害を示すが、この細菌増殖の阻害はジクロフェナク（１、０．５、０．３３、０．２５、０．２、０．１ｍｇ／ｍｌ）又はビヒクル（ｖ、２０％エタノール）単独が存在する場合には見られない。
【００９１】
図５ｄは、ジクロフェナク：Ｎａｎｏｃｉｎの様々な比率を含有するフィルターディスクを取り囲む「ハロー」によって、Ｎａｎｏｃｉｎ単独のサークル（Ｎ；１ｍｇ／ｍｌ）と同様に、細菌増殖の阻害が見られることを示す。ビヒクル対照（Ｖ）では細菌阻害はなかった。
【００９２】
液体ＭＩＣアッセイ
液体ＭＩＣアッセイは、菌叢アッセイと同様に、Ｐ．アクネス（嫌気性チャンバー中で最低５日間）よりも表皮ブドウ球菌（２４時間）で増殖するのがはるかに速かった。しかしながら、両方からの結果は信頼性が高かった。
【００９３】
表皮ブドウ球菌では、ＮａｎｏｃｉｎのＭＩＣは０．３２μｇ／ｍｌであり、ＡＰＩ（Ｄ−ジクロフェナク；Ｔ−タクロリムス；Ｉ−イブプロフェン；Ｒ−ラパマイシン；Ｃ−シクロスポリン）をＮａｎｏｃｉｎと配合した場合、このＭＩＣは変化しなかった（図５ｅ及び図５ｆ）。
【００９４】
Ｐ．アクネスでは、ＮａｎｏｃｉｎのＭＩＣは０．６３μｇ／ｍｌであり、これはＡＰＩのいずれと配合したときでも変わらなかった。ＡＰＩのみでは抗菌活性はまったく示されず、細菌増殖に対するビヒクルの効果をなぞっただけであった（図５ｈのタクロリムス（Ｔ）は、典型的に、ＡＰＩのみの応答を示している）。
【００９５】
ジクロフェナクは粒子形成に関して興味深い知見を示していたので、ジクロフェナク及びＮａｎｏｃｉｎを用いた一連の配合物を液体ＭＩＣアッセイで試験した（Ｎａｎｏｃｉｎ及びジクロフェナクを用いた表皮ブドウ球菌増殖の結果を図５ｉ〜図５ｏに示す）。Ｎａｎｏｃｉｎ：ジクロフェナクのすべての比は両菌株でＮａｎｏｃｉｎのＭＩＣを変化させなかった。ジクロフェナク単独では、すべての濃度（５０〜５００μｇ／ｍｌ）において細菌の増殖阻害は全く見られなかった。
【００９６】
ざ瘡に関連するさらなる嫌気性細菌はシュードモナス・グラニュローサム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）（Ｐ．グラニュローサム、Ｐ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）であり、これを、ＮａｎｏｃｉｎのＭＩＣ（図５ｐに示されている結果）を確定するために、Ｐ．アクネスと並行してＮａｎｏｃｉｎに対して試験したが、ＡＰＩを用いてそれ以上には試験しなかった。Ｐ．グラニュローサムに対するＮａｎｏｃｉｎのＭＩＣは０．０８μｇ／ｍｌ  Ｎａｎｏｃｉｎであった。
【００９７】
下記表５は、液体ＭＩＣデータ（μｇ／ｍｌ）を示す。
【００９８】
【表８】
2021529797.tif 000014
【００９９】
炎症アッセイ
図６〜図７ｂは、ＴＨＰ−１細胞（ヒト単球細胞株）を用いて確立された抗炎症アッセイの結果を示す。リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激した後のサイトカイン（特にざ瘡炎症に関連するものであるＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＩＬ−１αに注目）の放出は、化合物がもつ抗炎症作用の潜在的能力を試験するための有効なモデル系である（参考文献１）。
【０１００】
アッセイのための条件を標準化するために、ＬＰＳ用量（０〜１μｇ／ｍｌ）を、２時間、４時間及び２４時間の時間にわたって、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８及びＩＬ−１α応答について調べた。その結果、ＩＬ−１αとＩＬ−８は２４時間後に最大の発現を示したが、ＴＮＦ−αは２〜４時間の間でより早期に応答した。このことは炎症カスケードで周知である。ＩＬ−８とＩＬ−１αはともに炎症反応の後期を示し、ＩＬ−８はより明瞭な応答曲線を示したので、ＩＬ−８はスクリーニング過程に進み、ＩＬ−１αは中止した。
【０１０１】
ＩＬ−８による応答に対するＡＰＩ用量範囲
各ＡＰＩの０〜３０μｇ／ｍｌの用量範囲をＴＨＰ−１細胞アッセイで試験した（図８ａ参照）。ラパマイシン、ジクロフェナク、シクロスポリン及びタクロリムスは、ＬＰＳ炎症反応の阻害においてイブプロフェンよりも強力であると思われた。タクロリムス及びシクロスポリンのＭＩＣは０．３μｇ／ｍｌであり、ジクロフェナク及びラパマイシンは１μｇ／ｍｌであった。
【０１０２】
その後、ＡＰＩを、Ｎａｎｏｃｉｎ配合を伴う及び伴わずに、３０μｇ／ｍｌのＡＰＩ及び１００μｇ／ｍｌのＮａｎｏｃｉｎの濃度で試験した。先に示したように、イブプロフェン（Ｉ）はＩＬ−８放出の減少にほとんど影響を及ぼさなかったが、他のＡＰＩは影響を及ぼした（図８ｂ）。
【０１０３】
図８ｂからの結果を各試料の細胞数で規格化し（図８ｃ）、これにより、タクロリムスを３０μｇ／ｍｌでより効果的な抗炎症剤として特定した。
【０１０４】
配合した試料及びＮａｎｏｃｉｎ単独を用いると、ＩＬ−８のレベルはほぼゼロに低下した（図８ｃ）が、これはＩＬ−８の放出を阻害したからではなく、Ｎａｎｏｃｉｎによる細胞死（図８ｄ）によるものであった。
【０１０５】
ＴＨＰ−１細胞は、Ｎａｎｏｃｉｎ濃度に敏感であるので、この細胞に対してＮａｎｏｃｉｎ用量を実施した（図８ｅ）。２時間後では１０μｇ／ｍｌの濃度で、２４時間後では１μｇ／ｍｌの濃度で、Ｎａｎｏｃｉｎは細胞生存率に有意な影響を及ぼした。
【０１０６】
図９〜図１２に示されるように、配合物を、細胞生存率に影響を及ぼさない十分に低い濃度のＮａｎｏｃｉｎで試験した。１：１ｍｇ／ｍｌ（Ｎａｎｏｃｉｎ：ＡＰＩ）を最初に２０％エタノール中で配合し、次いで、ストック配合物を無血清培地で希釈し、１μｇ／ｍｌ又は０．１μｇ／ｍｌの最終濃度で試験した。
【０１０７】
まとめ
両方のサイトカイン測定で、ジクロフェナク単独及びＮａｎｏｃｉｎ単独がＬＰＳ刺激性炎症反応を低下させることが示された。一緒に処方した場合、分泌されたサイトカインのレベルは、ＬＰＳ刺激応答よりも依然としてかなり少なかった。このデータは、Ｎａｎｏｃｉｎが単独である程度の抗炎症作用を有し得ることを示唆する。
【０１０８】
局所的皮膚研究
例２でより詳細に記載されているように、ブタの耳の皮膚を用いて、インビトロ浸透研究を実施した。
【０１０９】
実験的研究は、フランツ（Ｆｒａｎｚ）セル中で皮膚に種々の配合物を施用し、無限用量として２４時間それを放置することを含んだ。最初の配合物は２０％エタノール中の１ｍｇ／ｍｌのＮａｎｏｃｉｎと３００μｇ／ｍｌのＡＰＩであった。ＦＩＴＣ標識Ｎａｎｏｃｉｎを使用する同じ濃度の配合物も使用した。検出方法は、フランツセル方法１：完全ＯＣＴ包埋方法及び凍結切片化（Ｆｕｌｌ  ＯＣＴ  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｃｒｙｏ−Ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）；フランツセル方法２：部分ＯＣＴ包埋及び凍結切片化（Ｐａｒｔｉａｌ  ＯＣＴ  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｒｙｏ−Ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）；フランツセル方法３：部分ＯＣＴ包埋及びテープストリッピング（Ｐａｒｔｉａｌ  ＯＣＴ  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｐｅ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）；及び飛行時間型二次イオン質量分析（ＴｏＦ−ＳＩＭＳ）蛍光顕微鏡法により行った。
【０１１０】
簡単に述べると、この濃度では、角質層内に新たな二次イオンを有するＮａｎｏｃｉｎを配合したジクロフェナクを除いて、全ての方法でＡＰＩのいずれも検出できなかった。ジクロフェナクとｎａｎｏｃｉｎとの共配合物が、異なるフィンガープリントをもたらす化合物のイオン化パターンの実質的な変化を引き起こしていると仮定された。
【０１１１】
ジクロフェナクはシグナルの徴候を示しているので、既に皮膚治療に使用されている別のクラスの抗炎症剤としてタクロリムスを進行させることを決定し、次いでＩＳＡＣには、ＴｏＦ  ＳＩＭＳにおけるシグナルを改善するために、１：１ｍｇ／ｍｌ  ＡＰＩ：Ｎａｎｏｃｉｎとしてより高い用量の配合物を提供した。
【０１１２】
３つのジクロフェナク及び３つのジクロフェナク＋ｎａｎｏｃｉｎからの上から３つのテープストリップのＴｏＦ−ＳＩＭＳ分析は、上記組み合わせ配合物が、活性物のみでは浸透しない角質層の最上層への活性成分の浸透を誘発することを示唆しているように思われた。
【０１１３】
ここでは、ＣＮ−（皮膚化学のマーカー）とジクロフェナク（塩）のマーカーとして用いたＣｌ−、ＮａＣｌ２−及びＮａ２Ｃｌ３−の分布を提示する。これらは、２つの試料タイプと対照（ブランク）との間の分散を探すピーク検索に基づいて使用した。
【０１１４】
ＣＮ−マーカーは、皮膚組織の剥がしが成功し、この組織がそれぞれテープストリップ上に局在化されたことを示すために使用される。Ｃｌ−はある程度遍在していると見られ、限定的にしか本来の皮膚化学に関連しないが、ＮａＣｌ２−及びＮａ２Ｃｌ３−のイオンマーカーは、対照試料と比較して強い分散を示し、活性成分と相関しているように見える。それらは上記化合物の塩構造の論理的フラグメントである。
【０１１５】
ジクロフェナク＋ｎａｎｏｃｉｎをジクロフェナク単独の試料と比較すると、前者のすべての試料のテープストリップ１〜３にＮａＣｌ２−イオン及びＮａ２Ｃｌ３−イオンが不均一ではあるが実質的に存在しているが、後者のいずれにも存在しないと簡単に判断できる。Ｃｌ−は、両方の試料シリーズからの全てのテープストリップに存在するが、組み合わせ配合物において強度の顕著な増加を示す。
【０１１６】
すべての試料からのイオン強度データをプロットし、それぞれの群に結合することで、この主張が支持される。
【０１１７】
ジクロフェナクとｎａｎｏｃｉｎの結果の一例を図１５に示す。１ｍｇ／ｍｌのジクロフェナクと１ｍｇ／ｍｌのジクロフェナク＋ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎを比較したＴｏＦ−ＳＩＭＳ断面分析は、ｎａｎｏｃｉｎ配合物が角質層への（不均一に分布した）浸透を促進し、ジクロフェナクのみの配合物に関する浸透の証拠が減少したことを示唆することが分かった。
【０１１８】
部分包埋法による試料調製は、より良好な試料安定性（下にある軟骨を残す）を提供するようであり、画像解析に対するＯＣＴの影響を減少させた。
【０１１９】
ＣＮ−及びＰＯ２−を皮膚化学のマーカーとして使用し、Ｃｌ−、ＮａＣｌ２−及びＮａ２Ｃｌ３−をジクロフェナク（塩）のマーカーとして使用した。
【０１２０】
特に、対照試料は、角質層に蓄積されたこれらのマーカーの証拠を示さない。ジクロフェナク単独試料は、角質層領域、及び表皮全般において、これらのイオンの強度のわずかな上昇を示した。しかしながら、ジクロフェナク＋ｎａｎｏｃｉｎ試料は、角質層において有意な上昇を示し、強度において一貫性のない不均一なスパイクとして提示される。これらは、局在を確認するのに役立つＰＯ２−シグナルの抑制としばしば相関する。
【０１２１】
例２  −  浸透促進剤を伴う及び伴わない局所的に送達される活性医薬成分のインビトロ浸透評価
背景
これらの実験の目的は、浸透促進剤としてのＮａｎｏｃｉｎを伴う及び伴わない、ブタ皮膚切片上の選択された活性医薬成分（ＡＰＩ）の「インビトロ」浸透を評価することであった。
【０１２２】
実験中、ラパマイシン、タクロリムス、イブプロフェン、シクロスポリン及びジクロフェナクＡＰＩの局所送達及びその後の透過をモデル化するために、フランツセルプロトコルを開発することを計画した。次いで、これらのＡＰＩを、単独及び同時配合したＮａｎｏｃｉｎの両方でブタ皮膚に局所施用した。次いで、フランツセルから回収した皮膚切片を凍結ブロックし、続いて凍結切片を作製して、組織の断面スライスを得た。次いで、切片を飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴｏＦ−ＳＩＭＳ）及び蛍光顕微鏡法（ＦＭ）によって化学的に画像化し、ＡＰＩの位置を突き止め、それらが皮膚切片に浸透した程度を評価した。純物質としてのＡＰＩを表す二次イオンピークを、本プロジェクトの初期段階で特徴付けることにした。これらは、ＡＰＩ分布を特定するために最初に使用された。（追加の）ＦＩＴＣ標識ｎａｎｏｃｉｎ変形体を使用して、蛍光活性浸透促進剤を提供し、この蛍光活性浸透促進剤を、次いで、ＦＭによって検出して、配合物の範囲の浸透及び組織局在を決定することができた。蛍光ワークアップは、本プロジェクトの最初の部分で実施した。
【０１２３】
フランツセル方法１：完全ＯＣＴ包埋方法及び凍結切片化
フランツセル分析に用いたブタの耳は、地元の食肉処理場から入手した。屠殺されたブタの月齢は４〜６ケ月齢の間であった。耳を脱イオン水で洗浄し、外側の皮膚を下にある軟骨から注意深く取り外した。次いで、切除した皮膚を、使用するまで−２０℃で保存した。浸透実験に使用した全ての耳は、調達後６か月以内であった。
【０１２４】
フランツセルを設定する前に、室温及び室内圧力で上記皮膚を放置することによってその皮膚を解凍した。この場合、ブタ皮膚上の過剰な毛は、トリミングしなかった（濾胞送達を特定する能力を促進するために）。この皮膚切片を、直径３ｃｍのより小さな切片サイズに直接切断して、皮膚がフランツ拡散セルのドナーチャンバーとレセプターチャンバーとの間に装着され得ることを確実にした。
【０１２５】
レセプターチャンバーは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０％エタノール３ｍｌで満たされた。フランツセルを組み立てる際に、皮膚を３７℃水浴中で３０分間平衡化させた。これは、皮膚が生理的温度（３２℃）に到達することを確実にするために実施した。次いで、この皮膚を、所望のＡＰＩ配合物で処理した。
【０１２６】
２３時間後、過剰の配合物を皮膚から取り除き、非引っ掻き性のスポンジを用いて３％Ｔｅｅｐｏｌ（ティーポール）溶液で洗浄した。次いで、この皮膚切片を１ｃｍ×１ｃｍの正方形（処理した皮膚部位の有効面積に対応する）に切断した。次いで、この皮膚切片を、最適切断温度（ＯＣＴ）樹脂を含有するベースモールドに適合することができるように半分に切断した。この皮膚切片を、切片化したときに垂直断面が得られるように直立して配置した。ベースモールドを液体窒素浴中の冷却したアルミニウムブロック上に置き、ＯＣＴを硬化させた。次いで、このモールドを、断面にするまで−８０℃で保存した。次いで、画像解析のためにいくつかの断面スライスを生成するために、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ  ３０５０  Ｓクライオスタットを使用して、連続的断面切片化を行った。
【０１２７】
フランツセル方法２：部分ＯＣＴ包埋及び凍結切片化
ブタの皮膚を入手し、上記の方法１と同じ様式で予備調製を行った。耳を脱イオン水で洗浄し、次いで使用まで−２０℃で保存した。浸透実験に使用した全ての耳は、調達後６か月以内であった。この実験設定のために、軟骨に付着した内側皮膚を使用して、安定性が増強された切片を作製した。
【０１２８】
フランツセルを設定する前に、室温及び室内圧力で上記皮膚を放置することによってその皮膚を解凍した。ブタ皮膚上の過剰な毛は、（濾胞送達を特定する能力を促進するために）標準プロトコルに従ってここでもトリミングせず、皮膚切片は、フランツ拡散セルのドナーチャンバーとレセプターチャンバーとの間に装着するために、直径３ｃｍのより小さな切片に切断した。レセプターチャンバーは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０％エタノール３ｍｌで満たした。
【０１２９】
フランツセルを組み立てる際に、皮膚を３７℃水浴中で３０分間平衡化させた。これは、皮膚が生理的温度（３２℃）に到達することを確実にするために実施した。次いで、この皮膚を、選択した配合物で処理した。２３時間後、過剰の配合物を皮膚から取り除き、その切片を、非引っ掻き性のスポンジを使用して３％  Ｔｅｅｐｏｌ溶液で洗浄した。
【０１３０】
上記皮膚切片を１ｃｍ×１ｃｍの正方形（処理した皮膚部位面積に対応する）に切断した。次いで、この小さくした皮膚切片を半分に切断して液体窒素浴中の冷却されたアルミニウムブロック上に置き、皮膚固体を凍結した。次いで、切片化のための皮膚の部分がＯＣＴに埋め込まれないことを確実にする目的で、これらの凍結皮膚切片を、ＯＣＴを部分的に満たしたベースモールドに直立して配置した。
【０１３１】
次いで、上記皮膚切片を、断面にするまで−８０℃で保存した。凍結切片化は、２０μｍの厚さまでＬｅｉｃａ  ＣＭ  ３０５０  Ｓクライオスタットを使用して行った。得られた切片をガラス顕微鏡スライド上に移し、画像解析に進んだ。
【０１３２】
フランツセル方法３：部分ＯＣＴ包埋及びテープストリッピング
ブタの皮膚を入手し、処理後にフランツセルから試料を取り出すまで、方法１（上記）に記載したのと同じステップに従って、標準調製及びフランツセル処理を行った。
【０１３３】
試料をフランツセル抽出に続いて１ｃｍ×１ｃｍに切断したとき、その試料を標準化されたプロトコルに従って連続テープストリッピングに供した。粘着フィルムストリップを処理した皮膚領域に連続的に貼付し除去した。粘着テープをローラーを用いて皮膚上に押し付けて、皮膚表面を伸ばした。この方法に従って調製した各試料について、１５本のテープストリップ層を収集した。得られたテープストリップを画像解析に進行させた。
【０１３４】
飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴｏＦ−ＳＩＭＳ）
全てのＴｏＦ−ＳＩＭＳ試料切片分析は、以下のような操作パラメーターを用いて超高真空条件下でＴｏＦ−ＳＩＭＳ  ＩＶ機器（ＩＯＮ−ＴＯＦ  ＧｍｂＨ（イオン−トフ）、ミュンスター（Ｍｕｅｎｓｔｅｒ）、ドイツ）上で実施した。
・一次イオンビーム：ビスマス液体金属イオンガン（Ｂｉ３＋）  ２５ｋＶ（約１．０のパルスターゲット電流）
・スパッタイオンビーム：ＮＡ
・分析装置：単段リフレクトロン
・電荷補償：ｐＡ。低エネルギー電子（２０ｅＶ）
・データの取得及び分析：ＳｕｒｆａｃｅＬａｂ６ソフトウェア（ＩＯＮＴＯＦ  ＧｍｂＨ）を使用して実施した。
【０１３５】
イメージングに関する詳細
・分析した面積：５００μｍ×５００μｍの面積にわたってデータを取得した。
・解像度：２５６×２５６画素
・走査数：２０スキャン
【０１３６】
蛍光顕微鏡法
ＣｏｏｌＬＥＤ  ｐＥ−４０００蛍光照明、ｐＥ−１００明視野照明及びニコンプランフルオール（ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏｒ）１０ｘ（０．３０  ＮＡ）対物レンズを装着した倒立型ニコンＥｃｌｉｐｓｅ  Ｔ１及びＱＩＭＡＧＩＮＧ  ｏｐｔｉＭＯＳカメラを用いて、蛍光顕微鏡法用の試料断面を撮像した。蛍光は、４９０ｎｍでの励起によって、４１０〜５００（露光時間５０μｓ）、５００〜５５０（露光時間２００μｓ）、５５０〜６５０（露光時間２００μｓ）、６５０〜７５０（露光時間２００μｓ）の発光を収集することで捕捉した。１０μｓの露光時間で明視野を捕捉した。全ての蛍光画像及び明視野画像を１２ビット画像（０〜４０９５）に補正した。
【０１３７】
図１６は、化学イメージングのための試料調製を概略的に示し、図１７は、断面分析対テープストリップ分析を示す。図１８は、断面画像（Ｈ＆Ｅ染色後）の例を示す。
【０１３８】
実験計画
プロジェクトの開始時の実験計画は、以下の項目を調製し分析することであった。
１．  ＴｏＦ−ＳＩＭＳのためのＡＰＩ＋Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞  シクロスポリン＋Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞  イブプロフェン＋Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞  ラパマイシン＋Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞  タクロリムス＋Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞  ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ断面
２．  ＴｏＦ−ＳＩＭＳのためのＡＰＩ断面
＞  シクロスポリン断面
＞  イブプロフェン断面
＞  ラパマイシン断面
＞  タクロリムス断面
＞  ジクロフェナク断面
３．  ＦＭのためのＡＰＩ＋ＦＩＴＣ−Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞  シクロスポリン＋ＦＩＴＣ−Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞  イブプロフェン＋ＦＩＴＣ−Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞  ラパマイシン＋ＦＩＴＣ−Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞  タクロリムス＋ＦＩＴＣ−Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞  ジクロフェナク＋ＦＩＴＣ−Ｎａｎｏｃｉｎ断面
【０１３９】
ＴｏＦ−ＳＩＭＳ  ＡＰＩ＋Ｎａｎｏｃｉｎ断面分析
シクロスポリン＋Ｎａｎｏｃｉｎ試料はすべて角質層剥離を伴い不首尾であった。イブプロフェン＋Ｎａｎｏｃｉｎ試料はすべて角質層剥離を伴い不首尾であった。ラパマイシン＋Ｎａｎｏｃｉｎ（２つの試料は成功裏に調製した）の例示的なデータを図１９に示す。皮膚表面又は角質層内での活性ワークアップにおいて特定されたラパマイシンマーカーの証拠はなく、これは浸透を暗示し得る。しかしながら、これは、検出アッセイの感度に起因していた可能性がある。ほとんどの空間的分散を示すイオンはＯＣＴ及び皮膚化学に関連し、対照試料（ブランク）と一致した。ラパマイシンの完全な欠如（検出不能）が示唆された。
【０１４０】
タクロリムス＋Ｎａｎｏｃｉｎ
１つの試料は成功裏に調製され、１つの試料は重度の汚染のため除外した。データを図２０に示す。皮膚表面、又は角質層内でのＡＰＩワークアップにおいて、タクロリムスイオンマーカーの証拠は確認されず、これは浸透を暗示する。ほとんどの分散を示すイオンは、ここでも皮膚化学及びＯＣＴ媒体に関連しているようであり、対照試料（ブランク）と一致した。タクロリムスの完全な欠如（又は検出不能）が示唆された。
【０１４１】
ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ
２つの試料を成功裏に調製した。図２１にデータを示す。皮膚表面、又は角質層内でのＡＰＩワークアップにおいて特定されたジクロフェナクイオンマーカーの証拠はなく、これは浸透を暗示する。しかしながら、基準ワークアップでは見られなかった他のイオン（Ｃ１４Ｈ２７Ｏ２−、Ｃ１６Ｈ３１Ｏ２−、Ｃ１４Ｈ２９Ｏ８−及びＣ２２Ｈ４３Ｏ２−）を見ることができ、角質層への局在と一致する空間分散を実証する。これらのイオンは（２００〜４００ｍ／ｚ）の質量範囲にあると見られ、対照試料（未処理）には存在しなかった。これは、ｎａｎｏｃｉｎ−ジクロフェナクの共配合物が化合物化学のイオン化マトリックスに対して、著しく異なった二次イオンフィンガープリントを生成するのに十分な影響を与えるということを示唆している可能性がある。そうであるならば、この分析で見られるイオンは、ジクロフェナク−ｎａｎｏｃｉｎ複合体の浸透を反映している可能性があるが、これには研究をさらに広げる必要がある。
【０１４２】
ＡＰＩ＋ｎａｎｏｃｉｎ断面試料のＴｏＦ−ＳＩＭＳ分析は、いくつかの重要なポイントを強調した。
・この分析のためのブタの皮膚試料の調製の一貫性は不良であった。角質層の剥離は、持続的な問題であることが見出され、これらの処置を受けた試料の構造的完全性が低いことを特定した。従って、データは、全てのＡＰＩについて収集されたわけではない。
・リファレンスから特定された二次イオンマーカーに基づいて、ＡＰＩの局在化について成功裏に生成された試料について証拠を集めることはできなかった。
・しかしながら、ジクロフェナクの場合、注目する新しい二次イオンが角質層に関連することがコントラストサーチによって見られた。
・ジクロフェナクとｎａｎｏｃｉｎとの共配合物は、上記化合物のイオン化パターンの実質的な変化を引き起こし、これが異なるフィンガープリントをもたらすと仮定した。
・この仮定が妥当であれば、これらの新しいマーカーは、ジクロフェナクの皮膚への浸透を示唆している可能性がある。
・しかしながら、ＡＰＩ／ｎａｎｏｃｉｎの検出が検出限界を反映しているかどうかも不明である。
【０１４３】
ＴｏＦ−ＳＩＭＳテープストリップ分析
以下の実験は、ＡＰＩ／ｎａｎｏｃｉｎが検出可能であるべき分析領域を最大にし、検出の欠如が閾値の問題ではないことを確実にするために使用した。
＞  シクロスポリン＋Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ
＞  イブプロフェン＋Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ
＞  ラパマイシン＋Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ
＞  タクロリムス＋Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ
＞  ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ
【０１４４】
ＴｏＦ−ＳＩＭＳ  −  ＡＰＩ＋Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ分析
図２２ａは、シクロスポリン＋Ｎａｎｏｃｉｎの結果を示す。イブプロフェン＋Ｎａｎｏｃｉｎ試料はすべて角質層剥離を伴い不首尾であった。図２２ｂは、ラパマイシン＋Ｎａｎｏｃｉｎの結果を示す。図２２ｃは、タクロリムス＋Ｎａｎｏｃｉｎの結果を示す。ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ試料では、すべてが角質層剥離を伴い不首尾であった。
【０１４５】
ＡＰＩ−ｎａｎｏｃｉｎ処理テープストリップ試料のＴｏＦ−ＳＩＭＳ分析は、断面データと一致した。
・この分析のためのブタの皮膚試料の調製の一貫性は、ここでも問題であることが見出された。角質層の剥離は持続しており、これらの処置を受けた試料の構造的完全性が低いことを特定した。従って、データは、全てのＡＰＩについて収集されたわけではない。
・シクロスポリン、ラパマイシン及びタクロリムスの配合物（ｎａｎｏｃｉｎを伴う）について収集したデータは、Ｓ１．１で決定された代表的な二次イオンのイオン強度が、対照（ブランク試料）で見られるものとほぼ変わらないこと（テープストリップ１及び２において）を示した。
・これは、いかなる浸透についての証拠の欠如、及び上面での存在の証拠が限られている／全くないことを支持した。
【０１４６】
テープストリップの蛍光顕微鏡法
ＦＭイメージングがＴｏＦ−ＳＩＭＳデータと矛盾する明らかな浸透を示すかどうかを評価するために、２つのＡＰＩ（ジクロフェナク及びタクロリムス）ＦＩＴＣ−ｎａｎｏｃｉｎ試料を選択した。
＞  ジクロフェナク＋ＦＩＴＣ−ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ
＞  タクロリムス＋ＦＩＴＣ  ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ
【０１４７】
ＡＰＩ＋ＦＩＴＣ−Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ分析のデータを図２３ａ〜２３ｃに示す。処理後のＡＰＩ／ｎａｎｏｃｉｎ配合物を検出する能力の検討をサポートするために、ＦＩＴＣ標識ｎａｎｏｃｉｎ−ジクロフェナク及びタクロリムスで処理した皮膚試料を、フランツセル方法３（部分ＯＣＴ包埋とテープストリッピング）を用いて作製した。対照として作用するために、ブランク試料（処理なし）も調製した。
【０１４８】
テープで剥がした試料は、皮膚表面の側面図を提供し、この側面の図は、断面調製物に対して活性物（フルオロフォア）を検出する能力を最大にするはずである。
【０１４９】
収集したスタックからの上から３つのテープストリップ層（ＴＳ）をＦＭによってイメージングし、ｎａｎｏｃｉｎ−ＡＰＩ複合体の浸透がフルオロフォアの局在によって推測され評価され得るか否かを評価した。
【０１５０】
上記の例示的画像（ＴＳ１及びＴＳ２）及び収集された蛍光強度（ＦＩ）データは、タクロリムス及びジクロフェナク試料と比較して、対照試料上で見られた固有蛍光間に有意差がないことを示唆した。ジクロフェナク試料はＴＳ１（上面）により多くの蛍光を示すように視覚的には見えたが、これはＦＩによって統計的に有意であるとは特定されなかった。
【０１５１】
このデータは、皮膚表面に浸透又は存在する重要な成分（ＡＰＩ／ｎａｎｏｃｉｎ）の証拠がないというＴｏＦ−ＳＩＭＳテープストリップデータを支持した。
【０１５２】
ジクロフェナク対ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ高濃度濃度ＴｏＦ−ＳＩＭＳ分析
ジクロフェナクは、浸透の何らかの示唆を特定する（断面分析）ことができる唯一の活性成分であったので、ｎａｎｏｃｉｎを伴って及び伴わずに、このＡＰＩのみに焦点を当てることを決めた。検出効力を高めるために配合物中のＡＰＩの高められた濃度（１ｍｇ／ｍｌ）を使用することも決めた。
【０１５３】
さらには、試料調製の問題に対処し、皮膚切片の構造的完全性を改善する（剥離を回避する）ために、調整した調製方法を使用した。部分的包埋技術を使用することを可能にするのに十分な支持を提供するために、下にある軟骨に依然として付着した皮膚切片を使用した。これは、より堅牢な物理的構造を提供し、ＯＣＴ浸出及び画像解釈の複雑化に関する分析上の問題を低減する追加の利点も有した。
【０１５４】
これらの実験は以下のものを調べた。
＞  ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ
＞  ジクロフェナクテープストリップ
＞  ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞  ジクロフェナク断面
【０１５５】
図２４はＴｏＦ−ＳＩＭＳ  ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ  ＴＳ１（リピート１〜３）を示す。図２５はＴｏＦ−ＳＩＭＳジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ  ＴＳ２（リピート１〜３）を示す。図２６はＴｏＦ−ＳＩＭＳジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ  ＴＳ３（リピート１〜３）を示す。図２７はＴｏＦ−ＳＩＭＳジクロフェナクＴＳ１を示す。図２８はＴｏＦ−ＳＩＭＳジクロフェナクＴＳ２を示す。図２９はＴｏＦ−ＳＩＭＳジクロフェナクＴＳ３を示す。
【０１５６】
図１３及び１４は、テープストリップ分析実験で使用したＴｏＦ−ＳＩＭＳイオン強度比較を示す。
【０１５７】
観察
３種類のジクロフェナク及び３種類のジクロフェナク＋ｎａｎｏｃｉｎから得た上から３つのテープストリップ（テープ片）のＴｏＦ−ＳＩＭＳ分析は、組み合わせ配合物は、活性成分単独では浸透しない角質層の最上層への活性成分の浸透を誘発したことを示唆しているように思われた。
【０１５８】
ここでは、ＣＮ−（皮膚化学のマーカー）とジクロフェナク（塩）のマーカーとして用いたＣｌ−、ＮａＣｌ２−及びＮａ２Ｃｌ３−の分布を提示する。これらは、２つの試料タイプと対照（ブランク）との間の分散を探すピーク検索に基づいて使用した。
【０１５９】
ＣＮ−マーカーは、皮膚組織の剥がしが成功し、この組織がそれぞれテープストリップ上に局在化されたことを示すために使用される。Ｃｌ−はある程度遍在していると見られ、限定的にしか本来の皮膚化学に関連しないが、ＮａＣｌ２−及びＮａ２Ｃｌ３−のイオンマーカーは、対照試料と比較して強い分散を示し、活性成分と相関しているように見える。それらは上記化合物の塩構造の論理的フラグメントである。
【０１６０】
ジクロフェナク＋ｎａｎｏｃｉｎをジクロフェナク単独の試料と比較すると、前者のすべての試料のテープストリップ１〜３にＮａＣｌ２−イオン及びＮａ２Ｃｌ３−イオンが不均一ではあるが実質的に存在しているが、後者のいずれにも存在しないと簡単に判断できる。Ｃｌ−は、両方の試料シリーズからの全てのテープストリップに存在するが、組み合わせ配合物において強度の顕著な増加を示す。
【０１６１】
すべての試料からのイオン強度データをプロットし、それぞれの群に結合することで、この主張が支持される。
【０１６２】
図３０は、ジクロフェナク対ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎの結果を示す。
【０１６３】
１ｍｇ／ｍｌのジクロフェナクと１ｍｇ／ｍｌのジクロフェナク＋ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎを比較したＴｏＦ−ＳＩＭＳの断面分析は、ｎａｎｏｃｉｎ配合物が角質層への浸透を促進し（不均一に分布させ）、ジクロフェナクのみの配合物に関する浸透の証拠が減少したことを示唆することが分かった。
【０１６４】
部分包埋法による試料調製は、より良好な試料安定性（下にある軟骨を残す）を提供するようであり、画像解析に対するＯＣＴの影響を減少させた。
【０１６５】
ＣＮ−及びＰＯ２−を皮膚化学のマーカーとして使用し、Ｃｌ−、ＮａＣｌ２−及びＮａ２Ｃｌ３−をジクロフェナク（塩）のマーカーとして使用した。
【０１６６】
特に、対照試料は、角質層に蓄積されたこれらのマーカーの証拠を示さない。ジクロフェナク単独試料は、角質層領域、及び表皮全般において、これらのイオンの強度のわずかな上昇を示した。しかしながら、ジクロフェナク＋ｎａｎｏｃｉｎ試料は、角質層において有意な上昇を示し、強度において一貫性のない不均一なスパイクとして提示される。これらは、局在を確認するのに役立つＰＯ２−シグナルの抑制と相関することが多い。
【０１６７】
Ｎａｎｏｃｉｎの有無にかかわらず、シクロスポリン、イブプロフェン、ラパマイシン又はタクロリムスの浸透の証拠が認められなかったということは重要な知見ではあるが、これらのＡＰＩが皮膚試料中に検出されなかったことを意味する方法論の感度によるものであることを考慮しないわけにはいかない。テープストリッピング分析及びＴｏＦ−ＳＩＭＳイメージングにより、ｎａｎｏｃｉｎと共配合した場合のジクロフェナク浸透の増強を示すいくつかの証拠があった。
【０１６８】
まとめ
フランツセル実験法により、ＡＰＩ処理皮膚試料の全範囲を成功裏に生成した。しかしながら、その後の断面スライスへの試料の進行は、最も一般的には角質層の炎症及び剥離に起因するいくつかの試料の不備を伴い一貫性がないことが判明した。（ＦＩＴＣ標識されていない）ｎａｎｏｃｉｎ−ＡＰＩ配合物で処理した試料に対してＴｏＦ−ＳＩＭＳを用いて収集した初期データは、特定されたイオンマーカーを用いてＡＰＩもｎａｎｏｃｉｎも検出できないという証拠を提供しなかった。ＡＰＩ単独のＴｏＦ−ＳＩＭＳ及びＡＰＩ＋ＦＩＴＣ−Ｎａｎｏｃｉｎ  ＦＭを調べる実験は実施せず、このデータに基づいて方法調整を開始し、テープストリッピングを介して皮膚表面の何らかの横分析を行い、より大きな予想表面積を見た場合にイオンマーカーが検出され得るかどうかを確認した。
【０１６９】
断面スライスについての二次イオンデータセットのより高度なデータ分析も行った。この研究は、ジクロフェナク−Ｎａｎｏｃｉｎ試料切片が、角質層への（ブランク参照試料と比較して）独特の二次イオン局在のいくつかの証拠を示すことを強調した。これらのマーカー（質量範囲２００〜４００ｍ／ｚ）は、基準ワークアップからリストアップされた基準マーカーと一致しなかった。他のＡＰＩ系については、そのような証拠は見出されなかった。これは、ＮａｎｏｃｉｎとＡＰＩとの共配合物が、ＡＰＩ及びｎａｎｏｃｉｎ単独に対して異なる二次イオン構造をもたらす独特のイオン化マトリックスを生成していることを示唆した。
【０１７０】
ＦＩＴＣ標識のｎａｎｏｃｉｎ−ＡＰＩで処理した試料の蛍光顕微鏡画像は、皮膚の最初の３つのテープストリップ層内のフルオロフォアの証拠を示さなかった。このデータに基づいて追加の方法変更を開始し、ジクロフェナクに専ら焦点を当て、試料調製機構に変形例を使用して試料安定性を改善した。より高濃度（１ｍｇ／ｍｌ）のジクロフェナクを配合して、検出限界を確実に超えた。処理下の試料生存率を改善し、画像解析及び成分浸出に対するＯＣＴの影響を取り除くという良好な効果を得るために、軟骨に依然として付着した皮膚切片に対して部分包埋プロトコルを用いた。試料生存率は改善され、試料ロスは減少し、化学イメージング能力はＯＣＴ化学の影響を除去することによって改善された。断面スライス及びテープストリップの両方を、ジクロフェナク（単独）及びジクロフェナク＋ｎａｎｏｃｉｎで処理した試料を用いて調製した。
【０１７１】
これら２つの系のリピートのテープストリッピング分析は、ＴｏＦ−ＳＩＭＳ断面分析で特定された同じイオンの局在の差を示したが、ジクロフェナク構造に論理的に対応するより顕著な他のイオンマーカーも示した。テープストリップデータは、ｎａｎｏｃｉｎ配合変形例におけるＡＰＩの不均一な浸透を示唆し、ＡＰＩ単独系では全く浸透しないことを示唆する。これは主にジクロフェナク塩に関連するイオン（Ｃｌ−、ＮａＣｌ２−、Ｎａ２Ｃｌ３−）の使用に基づいていた。上記断面分析はこの主張を支持し、ｎａｎｏｃｉｎと同時配合した場合のジクロフェナク（上記に列挙した同じマーカーによる）の角質層への浸透を示唆する。角質層中のこれらのイオンの分布はいくらか不均一であり、強度のスパイクは特定の点に局在している。
【０１７２】
例３  −  ヒト皮膚研究
ヒト皮膚研究により、健常なヒトの皮膚へのＮＳＡＩＤ（ジクロフェナク）の薬物送達増強が確認された（図３１及び図３２を参照）。ヒトの腹部の皮膚は、健康なヒトドナーから倫理的に入手した。三連の皮膚ディスクを、表皮面を最上にして静的拡散セル（フランツセル）中に配置した。薬物溶液（ジクロフェナク単独、又はナノ粒子を形成するためにポリヘキサニドと配合したジクロフェナク）を、フランツセルの上側チャンバーに添加した。このフランツセルを完全に組み立て、次いで、３２℃で２４時間インキュベーションした後、分析した。この時点で、フランツセルを分解し、皮膚ディスクを取り出した。このディスクを洗浄し、ティッシュで軽くたたくことによって乾燥させた。次いで、皮膚の上層を、粘着テープを使用して３回連続して剥離した。試料は、フランツセルの上側チャンバー及び下側チャンバーからも採取した。
【０１７３】
全ての試料を、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＱＤａ質量検出器を使用する定量ＬＣ−ＭＳによってジクロフェナクの存在について分析した（図３１）。加えて、テープストリップからの試料について、Ａｂｃａｍから購入したインビトロアッセイを用いて、シクロオキシゲナーゼ−１（Ｃｏｘ−１）に対する阻害能を分析した（図３２）。
【０１７４】
２４時間では、レセプター液試料のいずれにおいても、ジクロフェナクはほとんど検出されず、これは、この時間で最小の薬物が皮膚を通過したことを示す。唯一の例外はジクロフェナク／ポリヘキサニド試料の１つについてであり、この試料では、かなりの量の施用した薬物がレセプター液中に見出された。しかしながら、これは、この１つの試料における皮膚ディスクを通過する流体の漏出によるものであった（図３１；ＤＮ１：１＿１）。
【０１７５】
ジクロフェナク単独で処理したディスクと比較して、ジクロフェナク／ポリヘキサニドで処理した試料は、ジクロフェナク単独で処理した皮膚と比較して、ジクロフェナク／ポリヘキサニド皮膚テープストリップからのより高い薬物濃度によって示されるように、皮膚の上層への薬物送達が有意に増強されたことを示した（図３１）。下記表６に要約するように、個々のテープストリップ中のジクロフェナク／ポリエキサニドで処理した試料：ジクロフェナク単独で処理した試料間の薬物の比は、各連続テープストリップで増加し、これは、皮膚の上層との薬物会合が増強されるだけでなく、皮膚への浸透が増強されることを示す。Ｃｏｘ−１アッセイは、これらの観察を確認し、さらに、ジクロフェナク／ポリヘキサニドで処理した試料からのテープストリップ中のジクロフェナクのレベルは、有意なＣｏｘ−１阻害を生じるのに十分であるが、ジクロフェナク単独で処理した試料中のレベルはそうではないことを実証した（図３２）。上側チャンバー内に残留する薬物の量の分析（図３１）も、ジクロフェナク／ポリヘキサニド溶液において、おそらく皮膚への浸透のために、薬物の大部分がチャンバーから失われたことを実証した。対照的に、施用した薬剤の大部分はジクロフェナク単独処理物の上側チャンバーに留まっていた。
【０１７６】
【表９】
2021529797.tif 000015
【０１７７】
皮膚のストリッピング後、テープストリップを５ｍｌのメタノールに懸濁し、ＬＣ−ＭＳによる分析の前にテープから薬物を可溶化した。
【０１７８】
これらの結果は、ジクロフェナクとポリヘキサニドとの配合後のヒト皮膚へのジクロフェナクの明瞭で増強された皮膚送達を実証する。
【０１７９】
上記の実施形態は、特許請求の範囲によって与えられる保護の範囲を限定することを意図するものではなく、むしろ、本発明をどのように実施することができるかの例を記載することを意図する。
【０１８０】
参考文献
１．  「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  ｔｅｓｔ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ａｇｅｎｔｓ．」  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５１：１２、２２５２−２２５６（２００５）  Ｕｍａ  Ｓｉｎｇｈら．
【図１】
2021529797.tif 000016
【図２ａ】
2021529797.tif 000017
【図２ｂ】
2021529797.tif 000018
【図３】
2021529797.tif 000019
【図４】
2021529797.tif 000020
【図５ａ】
2021529797.tif 000021
【図５ｂ】
2021529797.tif 000022
【図５ｃ】
2021529797.tif 000023
【図５ｄ】
2021529797.tif 000024
【図５ｅ】
2021529797.tif 000025
【図５ｆ】
2021529797.tif 000026
【図５ｇ】
2021529797.tif 000027
【図５ｈ】
2021529797.tif 000028
【図５ｉ】
2021529797.tif 000029
【図５ｊ】
2021529797.tif 000030
【図５ｋ】
2021529797.tif 000031
【図５ｌ】
2021529797.tif 000032
【図５ｍ】
2021529797.tif 000033
【図５ｎ】
2021529797.tif 000034
【図５ｏ】
2021529797.tif 000035
【図５ｐ】
2021529797.tif 000036
【図６】
2021529797.tif 000037
【図７ａ】
2021529797.tif 000038
【図７ｂ】
2021529797.tif 000039
【図８ａ】
2021529797.tif 000040
【図８ｂ】
2021529797.tif 000041
【図８ｃ】
2021529797.tif 000042
【図８ｄ】
2021529797.tif 000043
【図８ｅ】
2021529797.tif 000044
【図８ｆ】
2021529797.tif 000045
【図９】
2021529797.tif 000046
【図１０】
2021529797.tif 000047
【図１１】
2021529797.tif 000048
【図１２】
2021529797.tif 000049
【図１３】
2021529797.tif 000050
【図１４】
2021529797.tif 000051
【図１５】
2021529797.tif 000052
【図１６】
2021529797.tif 000053
【図１７】
2021529797.tif 000054
【図１８】
2021529797.tif 000055
【図１９】
2021529797.tif 000056
【図２０】
2021529797.tif 000057
【図２１】
2021529797.tif 000058
【図２２ａ】
2021529797.tif 000059
【図２２ｂ】
2021529797.tif 000060
【図２２ｃ】
2021529797.tif 000061
【図２３ａ】
2021529797.tif 000062
【図２３ｂ】
2021529797.tif 000063
【図２３ｃ】
2021529797.tif 000064
【図２４】
2021529797.tif 000065
【図２５】
2021529797.tif 000066
【図２６】
2021529797.tif 000067
【図２７】
2021529797.tif 000068
【図２８】
2021529797.tif 000069
【図２９】
2021529797.tif 000070
【図３０（１）】
2021529797.tif 000071
【図３０（２）】
2021529797.tif 000072
【図３０（３）】
2021529797.tif 000073
【図３０（４）】
2021529797.tif 000074
【図３１】
2021529797.tif 000075
【図３２】
2021529797.tif 000076
【国際調査報告】
2021529797.tif 000077
2021529797.tif 000078
2021529797.tif 000079