(57)【要約】  本発明は、細胞中へのおよび血液脳関門を超える薬剤の浸透を増強する人工的なターゲティング配列、この配列を含む組成物、ならびにこれらの使用方法の開発に基づく。ターテゲィング配列と、導入遺伝子（好ましくは、治療用導入遺伝子または診断用導入遺伝子）とを含むカプシドタンパク質を含むＡＡＶが本明細書で提供される。さらに、細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、この細胞と、本明細書で記載されているＡＡＶまたは融合タンパク質とを接触させることを含む方法が本明細書で提供される。【選択図】図３Ｃ−Ｄ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）；ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）；ＫＬＡＳＶＴ（配列番号８３）；またはＫＦＬＡＳＶＴ（配列番号８４）からの少なくとも４個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項２】
配列ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）；ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）；ＫＬＡＳＶＴ（配列番号８３）；またはＫＦＬＡＳＶＴ（配列番号８４）からの少なくとも５個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む請求項１に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項３】
配列ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）；ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）；ＫＬＡＳＶＴ（配列番号８３）；またはＫＦＬＡＳＶＴ（配列番号８４）からの少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む請求項１に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項４】
前記ＡＡＶは、ＡＡＶ９である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項５】
ＡＡＶ９  ＶＰ１を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項６】
配列番号８５のアミノ酸５８８および５８９に対応する位置にターゲティング配列が挿入されている、請求項５に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のカプシドタンパク質を含むＡＡＶ。
【請求項９】
導入遺伝子、好ましくは治療用導入遺伝子をさらに含む請求項８に記載のＡＡＶ。
【請求項１０】
Ｖ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］Ｌ（配列番号７９）、ＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］Ｌ（配列番号８０）、ＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］ＬＫ（配列番号８１）、またはＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］ＬＦＫ．（配列番号８２）を含むターゲティング配列。
【請求項１１】
前記ターゲティング配列は、ＶＰＡＬＲ（配列番号１）；ＶＳＡＬＫ（配列番号２）；ＴＶＰＡＬＲ（配列番号３）；ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）；ＴＶＰＭＬＫ（配列番号１２）；ＴＶＰＴＬＫ（配列番号１３）；ＦＴＶＳＡＬＫ（配列番号５）；ＬＴＶＳＡＬＫ（配列番号６）；ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）；ＴＶＰＡＬＦＲ（配列番号９）；ＴＶＰＭＬＦＫ（配列番号１０）、またはＴＶＰＴＬＦＫ（配列番号１１）を含む、請求項１０に記載のターゲティング配列。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のターゲティング配列と、異種配列とを含む融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１０または１１に記載のターゲティング配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項１４】
ＡＡＶ９  ＶＰ１を含む請求項１３に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項１５】
前記ターゲティング配列は、配列番号のアミノ酸５８８および５８９に対応する位置に挿入されている、請求項１４に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項１６】
請求項１０〜１６のいずれか一項に記載のターゲティング配列、融合タンパク質、またはＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸。
【請求項１７】
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のカプシドタンパク質を含むＡＡＶ。
【請求項１８】
導入遺伝子、好ましくは治療用導入遺伝子をさらに含む請求項１７に記載のＡＡＶ。
【請求項１９】
細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、前記細胞と、請求項１〜９、１７、または１８に記載のＡＡＶとを接触させることを含む方法。
【請求項２０】
前記細胞は、神経細胞（任意選択で後根神経節神経細胞）、星状膠細胞、心筋細胞、または筋細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞は、生きている対象中に存在する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象は、哺乳類対象である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞は、脳、脊髄、後根神経節、心臓、または筋肉、およびこれらの組み合わせから選択される組織中に存在する、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象は、神経変性疾患、てんかん；脳卒中；脊髄小脳失調症；キャナヴァン病；異染性白質ジストロフィー；脊髄性筋萎縮症；フリートライヒ運動失調症；Ｘ連鎖中心核ミオパチー；リソソーム蓄積症；バース症候群；デュシェンヌ型筋ジストロフィー；ウィルソン病；またはクリグラー・ナジャー症候群１型を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記神経変性疾患は、パーキンソン病；アルツハイマー病；ハンチントン病；筋萎縮性側索硬化症；および多発性硬化症である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象は、脳がんを有し、前記方法は、抗がん剤をコードするＡＡＶを投与することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗がん剤は、ＨＳＶ．ＴＫ１であり、前記方法は、ガンシクロビルを投与することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞は、前記対象の脳中に存在し、前記ＡＡＶを、非経口送達；脳内；または髄腔内送達により投与する、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記非経口送達は、静脈内送達、動脈内送達、皮下送達、腹腔内送達、または筋肉内送達による、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記髄腔内送達は、腰椎注射、大槽注射、または実質内注射による、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１８年７月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／６９６，４２２号の利益を主張する。前述の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、かつその全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年７月１１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、名称が２９６１８−０２００ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが５８，８３４バイトである。
【０００３】
血液脳関門を超える薬剤の浸透を増強する配列、この配列を含む組成物、およびこれらの使用方法が本明細書で記載される。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子治療薬等の治療薬の送達は、多くの病態の処置の開発への障害である。血液脳関門（ＢＢＢ）は、病態（例えば、神経変性疾患、例えばパーキンソン病；アルツハイマー病；ハンチントン病；筋萎縮性側索硬化症；および多発性硬化症）を処置するための哺乳類の中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達（特に、ヒト脳への送達）にとって重要な障害である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、細胞中へのおよび血液脳関門を超える薬剤の浸透を増強する人工的なターゲティング配列の開発に基づく。
【０００６】
したがって、配列ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）；ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）；ＫＬＡＳＶＴ（配列番号８３）；またはＫＦＬＡＳＶＴ（配列番号８４）からの少なくとも４個の連続するアミノ酸を含むターゲティング配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、操作されたＡＡＶカプシドタンパク質）が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、このＡＡＶカプシドタンパク質は、配列ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）；ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）；ＫＬＡＳＶＴ（配列番号８３）；またはＫＦＬＡＳＶＴ（配列番号８４）からの少なくとも５個の連続するアミノ酸を含むターゲティング配列を含む。いくつかの実施形態では、このＡＡＶカプシドタンパク質は、配列ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）；ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）；ＫＬＡＳＶＴ（配列番号８３）；またはＫＦＬＡＳＶＴ（配列番号８４）からの少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むターゲティング配列を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、このＡＡＶはＡＡＶ９であるが、当分野で既知の他のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、およびこれらのバリアント、ならびに当分野で既知であるかまたは本明細書で説明されている他のもの）も使用し得る。
【０００８】
いくつかの実施形態では、このＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９  ＶＰ１（例えば配列番号８５）を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、このターゲティング配列は、配列番号８５のアミノ酸５８８および５８９の間に対応する位置でカプシドタンパク質に挿入されている。
【００１０】
本明細書で記載されているターゲティング配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸もまた本明細書で提供される。
【００１１】
加えて、本明細書で記載されているターゲティング配列を含むカプシドタンパク質を含むＡＡＶが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、導入遺伝子、好ましくは治療用導入遺伝子または診断用導入遺伝子をさらに含む。治療用導入遺伝子として、例えば、タンパク質機能を回復させるｃＤＮＡ、遺伝子編集用のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡが挙げられ得る。
【００１２】
Ｖ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］Ｌ（配列番号７９）、ＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］Ｌ（配列番号８０）、ＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］ＬＫ（配列番号８１）、またはＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］ＬＦＫ．（配列番号８２）を含むターゲティング配列もまた本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、このターゲティング配列は、ＶＰＡＬＲ（配列番号１）；ＶＳＡＬＫ（配列番号２）；ＴＶＰＡＬＲ（配列番号３）；ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）；ＴＶＰＭＬＫ（配列番号１２）；ＴＶＰＴＬＫ（配列番号１３）；ＦＴＶＳＡＬＫ（配列番号５）；ＬＴＶＳＡＬＫ（配列番号６）；ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）；ＴＶＰＡＬＦＲ（配列番号９）；ＴＶＰＭＬＦＫ（配列番号１０）、またはＴＶＰＴＬＦＫ（配列番号１１）を含む。異種（例えば非ＡＡＶ  ＰＶ１）配列に連結されているターゲティング配列を含む融合タンパク質、およびターゲティング配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質（例えばＡＡＶ９  ＶＰ１）もまた提供される。いくつかの実施形態では、このターゲティング配列は、配列番号８５のアミノ酸５８８および５８９に対応する位置に挿入されている。
【００１３】
加えて、本明細書で記載されているターゲティング配列、融合タンパク質、またはＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸と、ターゲティング配列を含むカプシドタンパク質を含むＡＡＶが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、このＡＡＶは、導入遺伝子、好ましくは治療用導入遺伝子または診断用導入遺伝子をさらに含む。治療用導入遺伝子として、例えば、タンパク質機能を回復させるｃＤＮＡ、遺伝子編集用のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡが挙げられ得る。
【００１４】
さらに、細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、この細胞と、本明細書で記載されているＡＡＶまたは融合タンパク質とを接触させることを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、この細胞は、生きている対象（例えば哺乳類対象）中に存在する。いくつかの実施形態では、この細胞は、脳、脊髄、後根神経節、心臓、または筋肉、およびこれらの組み合わせから選択される組織中に存在する。いくつかの実施形態では、この細胞は、神経細胞（任意選択で後根神経節神経細胞）、星状膠細胞、心筋細胞、または筋細胞である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、この対象は、神経変性疾患、てんかん；脳卒中；脊髄小脳失調症；キャナヴァン病；異染性白質ジストロフィー；脊髄性筋萎縮症；フリートライヒ運動失調症；Ｘ連鎖中心核ミオパチー（X-linked centronuclear myopathy）；リソソーム蓄積症；バース症候群；デュシェンヌ型筋ジストロフィー；ウィルソン病；またはクリグラー・ナジャー症候群１型を有する。いくつかの実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン病；アルツハイマー病；ハンチントン病；筋萎縮性側索硬化症；および多発性硬化症である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、この対象は、脳がんを有し、この方法は、抗がん剤をコードするＡＡＶを投与することを含む。いくつかの実施形態では、この抗がん剤は、ＨＳＶ．ＴＫ１であり、この方法は、ガンシクロビルを投与することをさらに含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、この細胞は対象の脳中に存在し、このＡＡＶを、非経口送達（例えば、静脈内送達、動脈内送達、皮下送達、腹腔内送達、もしくは筋肉内送達による）；脳内；または髄腔内送達（例えば、腰椎注射、大槽注射、もしくは実質内注射による）により投与する。
【００１８】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書では、本発明での使用のための方法および材料が記載されているが、当分野で既知の他の適切な方法および材料も使用し得る。材料、方法、および例は一例にすぎず、限定することは意図されていない。本明細書で言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および図面ならびに特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）をそのカプシドに挿入することによるＡＡＶ９の操作の例示的な戦略を示す。図１Ａは、ＡＡＶ９ウイルスの３Ｄモデルである。アミノ酸５８８および５８９（ＶＰ１ナンバリング）の間でカプシドに挿入されている個々のＣＰＰは、受容体結合がおそらく起こる３倍軸で表示されるだろう。図１Ｂは、個々のＡＡＶの製造方法を示す。ｐＲＣ（操作されているかまたはされていない）、ｐヘルパー、およびｐＡＡＶを含む３種のプラスミドを、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトし、ＡＡＶを回収し、イオジキサノール勾配を使用して精製する。
【図２Ａ】低用量の候補ＡＡＶの静脈内投与後のマウス脳切片の代表的な画像およびその定量分析を示す。遺伝子背景が混在しているマウスを使用する。候補ＡＡＶは、挿入されたＣＰＰが異なるが（表３を参照されたい）、全てが、レポーターとして核赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現する。製造収率が低い候補ＡＡＶは、さらなるスクリーニングのために除外される。ＡＡＶの用量は、１匹の動物当たり１×１０１０ｖｇ（ウイルスゲノム）である。図２Ａ中の各白色の点は、ＲＦＰ標識細胞を表す。
【図２Ｂ】低用量の候補ＡＡＶの静脈内投与後のマウス脳切片の代表的な画像およびその定量分析を示す。遺伝子背景が混在しているマウスを使用する。候補ＡＡＶは、挿入されたＣＰＰが異なるが（表３を参照されたい）、全てが、レポーターとして核赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現する。製造収率が低い候補ＡＡＶは、さらなるスクリーニングのために除外される。ＡＡＶの用量は、１匹の動物当たり１×１０１０ｖｇ（ウイルスゲノム）である。図２Ｂでは、＊Ｐ＜０．０５、対ＡＡＶ９、ＡＮＯＶＡ。
【図２Ｃ】反復実験におけるＡＡＶ．ＣＰＰ．１１およびＡＡＶ．ＣＰＰ．１２の静脈内投与後のマウス脳切片の代表的な画像およびその定量分析を示す。ＡＡＶ．ＣＰＰ．１１およびＡＡＶ．ＣＰＰ．１２はそれぞれ、ＣＰＰ  ＢＩＰ１およびＣＰＰ  ＢＩＰ２を含む（表３を参照されたい）。ＡＡＶの用量は、１匹の動物当たり１×１０１１ｖｇまで増加している。候補ＡＡＶは、レポーターとして核赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現する。図２Ｃ中の各白色の点は、ＲＦＰ標識細胞を表す。
【図２Ｄ】反復実験におけるＡＡＶ．ＣＰＰ．１１およびＡＡＶ．ＣＰＰ．１２の静脈内投与後のマウス脳切片の代表的な画像およびその定量分析を示す。ＡＡＶ．ＣＰＰ．１１およびＡＡＶ．ＣＰＰ．１２はそれぞれ、ＣＰＰ  ＢＩＰ１およびＣＰＰ  ＢＩＰ２を含む（表３を参照されたい）。ＡＡＶの用量は、１匹の動物当たり１×１０１１ｖｇまで増加している。候補ＡＡＶは、レポーターとして核赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現する。図２Ｄでは、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、対ＡＡＶ９、ＡＮＯＶＡ。
【図３Ａ】より良好な脳形質導入に向けてＡＡＶ９をさらに操作するためのＢＩＰターゲティング配列の最適化を示す。（ＡＡＶ．ＣＰＰ．１１中のような）ＡＡＶ９をより効率的に脳に形質導入することを可能にするＢＩＰ１（ＶＰＡＬＲ、配列番号１）は、ラット中のタンパク質Ｋｕ７０に由来する。ヒト、マウス、およびラットのＫｕ７０タンパク質は、その正確なアミノ酸配列が異なる。ＡＡＶ．ＣＰＰ．１２中のようなＢＩＰ２（ＶＳＡＬＫ、配列番号２）は、ＢＩＰ１と関連する「合成」ペプチドである。さらなる操作は、最終的に操作されたＡＡＶの種特異性を最小限に抑えることを期待して、ＶＳＡＬＫ配列に焦点を当てている。新規のターゲティング配列を生成するために、目的のアミノ酸をＶＳＡＬＫ配列に追加し、他の場合では、個々のアミノ酸の位置を切り替える。スクリーニング用に新規の候補ＡＡＶを生成するために、全ての新規のＢＩＰ２由来配列をＡＡＶ９カプシドに再び挿入する。順に挙げられている配列は、配列番号６９、７０、７１、１〜６、７２、７、および８である。
【図３Ｂ】より多くの候補ＡＡＶの静脈内投与後のマウス脳切片の代表的な画像およびその定量分析を示す。全ての候補ＡＡＶは、レポーターとして核赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現する。ＡＡＶの用量は、１匹の動物当たり１×１０１１ｖｇである。図３Ｂ中の各白色の点は、ＲＦＰ標識細胞を表す。ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を、脳形質導入が頑強でありかつ広範囲であるトップヒットとして同定した。
【図３Ｃ−Ｄ】図３Ｃは、より多くの候補ＡＡＶの静脈内投与後のマウス脳切片の代表的な画像およびその定量分析を示す。全ての候補ＡＡＶは、レポーターとして核赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現する。ＡＡＶの用量は、１匹の動物当たり１×１０１１ｖｇである。ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を、脳形質導入が頑強でありかつ広範囲であるトップヒットとして同定した。図３Ｃでは、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、対ＡＡＶ９、ＡＮＯＶＡ。図３Ｄは、候補ＡＡＶの静脈内投与後の肝臓における形質導入効率の定量分析を示す。形質導入された肝臓細胞の割合を表す。ＡＡＶの用量は、１匹の動物当たり１×１０１１ｖｇである。＊＊＊Ｐ＜０．００１、対ＡＡＶ９、ＡＮＯＶＡ。
【図４Ａ−Ｂ】ヒト血液脳関門のインビトロでのスフェロイドモデルにおける選択された候補ＡＡＶのスクリーニングを示す。図４Ａは、表面で関門を形成するヒト微小血管内皮細胞と、スフェロイド内部のヒト周皮細胞および星状膠細胞とを含むスフェロイドを示す。候補ＡＡＶを、周辺の培地からスフェロイド内へと浸透して内部で細胞に形質導入する能力に関して評価した。図４Ｂは、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６、およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１で処理したスフェロイドの画像を示す。
【図４Ｃ−Ｄ】ヒト血液脳関門のインビトロでのスフェロイドモデルにおける選択された候補ＡＡＶのスクリーニングを示す。候補ＡＡＶを、周辺の培地からスフェロイド内へと浸透して内部で細胞に形質導入する能力に関して評価した。図４Ｃ〜４Ｄは、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６、およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１で処理したスフェロイドの画像を示す。
【図４Ｅ】ヒト血液脳関門のインビトロでのスフェロイドモデルにおける選択された候補ＡＡＶのスクリーニングを示す。図４Ｅは、様々なＡＡＶで処理されたスフェロイドの相対的なＲＦＰ強度を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、対ＡＡＶ９、ＡＮＯＶＡ。
【図５Ａ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ近交系マウスでのＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６、およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１の静脈内投与後の脳切片の代表的な画像およびその定量分析を示す。全ての候補ＡＡＶは、レポーターとして核赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現する。ＡＡＶの用量は、１匹の動物当たり１×１０１２ｖｇである。図５Ａ中の各白色の点は、ＲＦＰ標識細胞を表す。
【図５Ｂ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ近交系マウスでのＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６、およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１の静脈内投与後の脳切片の代表的な画像およびその定量分析を示す。全ての候補ＡＡＶは、レポーターとして核赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現する。ＡＡＶの用量は、１匹の動物当たり１×１０１２ｖｇである。図５Ｂでは、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ。
【図６Ａ】ＢＡＬＢ／ｃＪ近交系マウスでのＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６、およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１の静脈内投与後の脳切片の代表的な画像およびその定量分析を示す。全ての候補ＡＡＶは、レポーターとして核赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現する。ＡＡＶの用量は、１匹の動物当たり１×１０１２ｖｇである。図６Ａ中の各白色の点は、ＲＦＰ標識細胞を表す。
【図６Ｂ】ＢＡＬＢ／ｃＪ近交系マウスでのＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６、およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１の静脈内投与後の脳切片の代表的な画像およびその定量分析を示す。全ての候補ＡＡＶは、レポーターとして核赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現する。ＡＡＶの用量は、１匹の動物当たり１×１０１２ｖｇである。図６Ｂでは、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ。
【図７Ａ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ近交系マウスでの高用量のＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１の静脈内投与後の脳切片の代表的な画像およびその定量分析を示す。候補ＡＡＶは両方とも、レポーターとして核赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現する。ＡＡＶの用量は、１匹の動物当たり４×１０１２ｖｇである。図７Ａ中の各白色の点は、ＲＦＰ標識細胞を表す。
【図７Ｂ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ近交系マウスでの高用量のＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１の静脈内投与後の脳切片の代表的な画像およびその定量分析を示す。候補ＡＡＶは両方とも、レポーターとして核赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現する。ＡＡＶの用量は、１匹の動物当たり４×１０１２ｖｇである。図７Ｂでは、＊Ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔ検定。
【図８Ａ−１】ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１が、マウスの複数の脳領域（例えば、大脳皮質、中脳、および海馬）にわたり成熟神経細胞（ＮｅｕＮ抗体により標識されている）に形質導入することを示す。形質導入された神経細胞を、ＮｅｕＮ抗体およびＲＦＰで共標識する。成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢）に、４×１０１２ｖｇのＡＡＶを静脈内投与した。
【図８Ａ−２】図８Ａ−１の続きである。
【図８Ｂ】ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１がマウスの脊髄および運動神経細胞の標的化においてＡＡＶ９と比較して能力の増強を示すことを示す。新生仔マウス（生後１日）に、４×１０１０ｖｇのＡＡＶを静脈内投与した。脊髄の前角での運動神経細胞を、ＣＨＡＴ抗体染色を使用して可視化した。ＲＦＰシグナルおよびＣＨＡＴシグナルの共局在化は、運動神経細胞の特異的な形質導入を示唆する。
【図９Ａ】ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６が成体マウスの心臓の標的化においてＡＡＶ９と比較して能力の増強を示すことを示す。成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢）に、１×１０１１ｖｇのＡＡＶを静脈内投与した。全ＤＡＰＩ染色細胞に対するＲＦＰ標識細胞の割合を表す。＊Ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔ検定。
【図９Ｂ】ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６が成体マウスの骨格筋の標的化においてＡＡＶ９と比較して能力の増強を示すことを示す。成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢）に、１×１０１１ｖｇのＡＡＶを静脈内投与した。全ＤＡＰＩ染色細胞に対するＲＦＰ標識細胞の割合を表す。＊Ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔ検定。
【図９Ｃ】ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６が成体マウスの後根神経節（ＤＲＧ）の標的化においてＡＡＶ９と比較して能力の増強を示すことを示す。成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢）に、１×１０１１ｖｇのＡＡＶを静脈内投与した。全ＤＡＰＩ染色細胞に対するＲＦＰ標識細胞の割合を表す。＊Ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔ検定。
【図１０Ａ】ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１がＡＡＶ９と比較して非ヒト霊長類での静脈内投与後に一次視覚野の脳細胞に形質導入する能力の増強を示すことを示す。２×１０１３ｖｇ／ｋｇの（レポーター遺伝子としての）ＡＡＶｓ−ＣＡＧ−ＡＡＤＣを、既存の中和抗体が少ない３カ月齢のカニクイザルに静脈内注射した。ＡＡＶ形質導入細胞（黒色で示す）を、ＡＡＤＣに対する抗体染色を使用して可視化した。左のパネルの四角形の領域は、右側のパネルで拡大されている。ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６は、ＡＡＶ９と比べて有意に多くの細胞に形質導入した。ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１もＡＡＶ９と比べて多くの細胞に形質導入したが、その効果は、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６と比較してあまり明らかでなかった。
【図１０Ｂ】ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１がＡＡＶ９と比較して非ヒト霊長類での静脈内投与後に頭頂葉皮質の脳細胞に形質導入する能力の増強を示すことを示す。２×１０１３ｖｇ／ｋｇの（レポーター遺伝子としての）ＡＡＶｓ−ＣＡＧ−ＡＡＤＣを、既存の中和抗体が少ない３カ月齢のカニクイザルに静脈内注射した。ＡＡＶ形質導入細胞（黒色で示す）を、ＡＡＤＣに対する抗体染色を使用して可視化した。左のパネルの四角形の領域は、右側のパネルで拡大されている。ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６は、ＡＡＶ９と比べて有意に多くの細胞に形質導入した。ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１もＡＡＶ９と比べて多くの細胞に形質導入したが、その効果は、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６と比較してあまり明らかでなかった。
【図１０Ｃ】ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１がＡＡＶ９と比較して非ヒト霊長類での静脈内投与後に視床の脳細胞に形質導入する能力の増強を示すことを示す。２×１０１３ｖｇ／ｋｇの（レポーター遺伝子としての）ＡＡＶｓ−ＣＡＧ−ＡＡＤＣを、既存の中和抗体が少ない３カ月齢のカニクイザルに静脈内注射した。ＡＡＶ形質導入細胞（黒色で示す）を、ＡＡＤＣに対する抗体染色を使用して可視化した。左のパネルの四角形の領域は、右側のパネルで拡大されている。ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６は、ＡＡＶ９と比べて有意に多くの細胞に形質導入した。ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１もＡＡＶ９と比べて多くの細胞に形質導入したが、その効果は、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６と比較してあまり明らかでなかった。
【図１０Ｄ】ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１がＡＡＶ９と比較して非ヒト霊長類での静脈内投与後に小脳の脳細胞に形質導入する能力の増強を示すことを示す。２×１０１３ｖｇ／ｋｇの（レポーター遺伝子としての）ＡＡＶｓ−ＣＡＧ−ＡＡＤＣを、既存の中和抗体が少ない３カ月齢のカニクイザルに静脈内注射した。ＡＡＶ形質導入細胞（黒色で示す）を、ＡＡＤＣに対する抗体染色を使用して可視化した。左のパネルの四角形の領域は、右側のパネルで拡大されている。ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１は両方とも、ＡＡＶ９と比べて有意に多くの細胞に形質導入した。
【図１１】ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１がＬＹ６Ａに結合しないことを示す。ＬＹ６Ａは、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂおよびそのバリアント（例えば、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ（米国特許第９１０２９４９号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１６６９２６号明細書））の受容体として機能し、ある特定のマウス株でのＢＢＢの横断におけるＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢの頑強な効果を媒介する（Hordeaux et al. Mol Ther 2019 27(5):912-921；Huang et al. 2019, dx.doi.org/10.1101/538421）。培養された２９３細胞におけるマウスＬＹ６Ａの過剰発現により、細胞表面へのＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢの結合が有意に増加する（図１１Ａ）。逆に、ＬＹ６Ａの過剰発現により、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６、またはＡＡＶ．ＣＰＰ．２１に関するウイルス結合は増加しない（図１１Ｂ）。このことは、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６またはＡＡＶ．ＣＰＰ．２１が受容体としてＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢとＬＹ６Ａを共有しないことを示唆する。
【図１２Ａ】ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を使用して膠芽腫（ＧＢＭ）のマウスモードの脳腫瘍に治療用遺伝子を全身送達し得ることを示す。図１１Ａでは、静脈内投与されたＡＡＶ．ＣＰＰ．２１−Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙは、腫瘤（特に、腫瘍が拡がるフロンティア）を標的とすることが示された。
【図１２Ｂ】ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を使用して膠芽腫（ＧＢＭ）のマウスモードの脳腫瘍に治療用遺伝子を全身送達し得ることを示す。図１１Ｂでは、「自殺遺伝子」ＨＳＶ．ＴＫ１を全身送達するためのＡＡＶ．ＣＰＰ．２１の使用により、プロドラッグであるガンシクロビルと併用した場合に、脳腫瘤の縮小がもたらされる。ＨＳＶ．ＴＫ１は、その他の方法で「休眠」ガンシクロビルを腫瘍死滅剤へと変える。＊Ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔ検定。
【図１２Ｃ】ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を使用して膠芽腫（ＧＢＭ）のマウスモードの脳腫瘍に治療用遺伝子を全身送達し得ることを示す。図１１Ｃでは、「自殺遺伝子」ＨＳＶ．ＴＫ１を全身送達するためのＡＡＶ．ＣＰＰ．２１の使用により、プロドラッグであるガンシクロビルと併用した場合に、脳腫瘤の縮小がもたらされる。ＨＳＶ．ＴＫ１は、その他の方法で「休眠」ガンシクロビルを腫瘍死滅剤へと変える。＊Ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔ検定。
【図１３−１】成体マウス脳に局所注射された場合に、ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１は、ＡＡＶ９と比較して脳組織のより広範なかつ頑強な形質導入を生じることを示す。成体マウス（＞６週齢）でＡＡＶ（１×１０１１ｖｇ）の脳内注射を実施し、ＡＡＶ注射後３週間で脳組織を採取して調べた。＊＊Ｐ＜０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔ検定。
【図１３−２】図１３−１の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ＢＢＢを超える送達での困難さが、がんおよび神経変性障害等の脳障害を処置するための治療薬の開発の妨げになっている。脳、脊髄、および眼への治療用遺伝子の送達のための重要な研究および臨床ツールとして、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が浮上している（例えば、米国特許第９１０２９４９号明細書；同第９５８５９７１号明細書；および同第２０１７０１６６９２６号明細書を参照されたい）。しかしながら、ＡＡＶ９等の既存のＡＡＶは、ＢＢＢの横断効率が制限されているか、一部の非霊長類の種でしか機能しないかのいずれかである。
【００２２】
既知の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に基づく合理的な設計および標的化スクリーニング（例えば、Gomez et al., Bax-inhibiting peptides derived from Ku70 and cell-penetrating pentapeptides. Biochem. Soc. Trans. 2007;35(Pt 4):797-801を参照されたい）を介して、ＡＡＶのカプシドへと操作された場合に脳への遺伝子送達の効率を最大３桁まで改善するターゲティング配列が発見されている。この方法を使用して、膠芽腫の動物モデルにおいて腫瘍サイズを劇的に減少させるそのようなＡＡＶベクターの１つが操作により作製された。
【００２３】
ターゲティング配列
本方法により、例えば、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、もしくはＡＡＶ９）のカプシドに挿入された場合に、または化学的にもしくは融合タンパク質として発現により生物学的薬剤（例えば、抗体もしくは他の大きい生体分子）にコンジュゲートされた場合に、ＢＢＢを介した浸透を増強する多くの潜在的ターゲティングペプチドが同定された。
【００２４】
いくつかの実施形態では、このターゲティングペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸の配列を含む。いくつかの実施形態では、このアミノ酸配列は、配列ＶＰＡＬＲ（配列番号１）およびＶＳＡＬＫ（配列番号２）の少なくとも４個（例えば５個）の連続するアミノ酸を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、このターゲティングペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５の配列を含み、ここで
（ｉ）Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭの内の任意の４個の異なるアミノ酸であり；
（ｉｉ）Ｘ５は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥである（配列番号７３）。
【００２６】
いくつかの実施形態では、このターゲティングペプチドは、少なくとも６個のアミノ酸の配列を含む。いくつかの実施形態では、このアミノ酸配列は、配列ＴＶＰＡＬＲ（配列番号３）、ＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）、ＴＶＰＭＬＫ（配列番号１２）、およびＴＶＰＴＬＫ（配列番号１３）の少なくとも４個（例えば５個または６個）の連続するアミノ酸を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、このターゲティングペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６の配列を含み、
（ｉ）Ｘ１は、Ｔであり；
（ｉｉ）Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭの内の任意の４個の異なるアミノ酸であり；
（ｉｉｉ）Ｘ６は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥである（配列番号７４）。
【００２８】
いくつかの実施形態では、このターゲティングペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６の配列を含み、
（ｉ）Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭからの任意の４個の異なるアミノ酸であり；
（ｉｉ）Ｘ５は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥであり；
（ｉｉｉ）Ｘ６は、ＥまたはＤである（配列番号７５）。
【００２９】
いくつかの実施形態では、このターゲティングペプチドは、少なくとも７個のアミノ酸の配列を含む。いくつかの実施形態では、このアミノ酸配列は、配列ＦＴＶＳＡＬＫ（配列番号５）、ＬＴＶＳＡＬＫ（配列番号６）、ＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８）、ＴＶＰＡＬＦＲ（配列番号９）、ＴＶＰＭＬＦＫ（配列番号１０）、およびＴＶＰＴＬＦＫ（配列番号１１）の少なくとも４個（例えば、５個、６個、または７個）の連続するアミノ酸を含む。いくつかの他の実施形態では、このターゲティングペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７の配列を含み、
（ｉ）Ｘ１は、Ｆ、Ｌ、Ｗ、またはＹであり；
（ｉｉ）Ｘ２は、Ｔであり；
（ｉｉｉ）Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭの内の任意の４個の異なるアミノ酸であり；
（ｉｖ）Ｘ７は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥである（配列番号７６）。
【００３０】
いくつかの実施形態では、このターゲティングペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７の配列を含み、
（ｉ）Ｘ１は、Ｔであり；
（ｉｉ）Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭの内の任意の４個の異なるアミノ酸であり；
（ｉｉｉ）Ｘ６は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥであり；
（ｉｖ）Ｘ７は、ＥまたはＤである（配列番号７７）。
【００３１】
いくつかの実施形態では、このターゲティングペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７の配列を含み、
（ｉ）Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４は、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、またはＭの内の任意の４個の異なるアミノ酸であり；
（ｉｉ）Ｘ５は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、またはＥであり；
（ｉｉｉ）Ｘ６は、ＥまたはＤであり；
（ｉｖ）Ｘ７は、ＡまたはＩである（配列番号７８）。
【００３２】
いくつかの実施形態では、このターゲティングペプチドは、Ｖ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］Ｌ（配列番号７９）（大文字がある位置では、大文字が好ましい）の配列を含む。いくつかの実施形態では、このターゲティングペプチドは、ＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］Ｌ（配列番号８０）の配列を含む。いくつかの実施形態では、このターゲティングペプチドは、ＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］ＬＫ（配列番号８１）の配列を含む。いくつかの実施形態では、このターゲティングペプチドは、ＴＶ［Ｓ／ｐ］［Ａ／ｍ／ｔ／］ＬＦＫ．（配列番号８２）の配列を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、このターゲティングペプチドは、ＶＰＡＬＲ（配列番号１）またはＶＳＡＬＫ（配列番号２）からならない。
【００３４】
上述した５個、６個、または７個のアミノ酸の配列を含む具体例のアミノ酸配列を、表１に列挙する。
【００３５】
【表１−１】
2021530218.tif 000003
【００３６】
【表１−２】
2021530218.tif 000004
【００３７】
反転した配列を含むターゲティングペプチド（例えば、ＫＬＡＳＶＴ（配列番号８３）およびＫＦＬＡＳＶＴ（配列番号８４））も使用し得る。
【００３８】
本明細書で開示されているターゲティングペプチドを、ペプチド模倣物を製造するための当分野で既知の方法に従って改変し得る。例えば、Qvit et al., Drug Discov Today. 2017 Feb; 22(2): 454-462；Farhadi and Hashemian, Drug Des Devel Ther. 2018; 12: 1239-1254；Avan et al., Chem. Soc. Rev., 2014,43, 3575-3594；Pathak, et al., Indo American Journal of Pharmaceutical Research, 2015. 8；Kazmierski, W.M., ed., Peptidomimetics Protocols, Human Press (Totowa NJ 1998)；Goodman et al., eds., Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry: Synthesis of Peptides and Peptidomimetics, Thiele Verlag (New York 2003)；およびMayo et al., J. Biol. Chem., 278:45746 (2003)を参照されたい。いくつかの場合では、本明細書で開示されているペプチドおよび断片のこの改変ペプチド模倣バージョンは、非ペプチド模倣ペプチドと比較して、インビボでの安定性の増強を示す。
【００３９】
ペプチド模倣物を作製する方法は、ペプチド配列中のアミノ酸の内の１つまたは複数（例えば全て）を、Ｄ−アミノ酸鏡像異性体で置換することを含む。そのような配列は、本明細書では「レトロ（retro）」配列と称される。別の方法では、アミノ酸残基のＮ末端からＣ末端への順序が反転されており、その結果、元々のペプチドのＮ末端からＣ末端へのアミノ酸残基の順序が、改変されたペプチド模倣物ではＣ末端からＮ末端へのアミノ酸残基の順序となる。そのような配列は、「インベルソ」配列と称され得る。
【００４０】
ペプチド模倣物は、レトロバージョンおよびインベルソバージョンの両方であり得、即ち、本明細書で開示されているペプチドの「レトロ−インベルソ」バージョンであり得る。この新規のペプチド模倣物は、このペプチド模倣物でのＮ末端からＣ末端へのアミノ酸残基の順序が元々のペプチドでのＣ末端からＮ末端へのアミノ酸残基の順序と一致するように配置されたＤ−アミノ酸で構成され得る。
【００４１】
ペプチド模倣物を製造する他の方法は、ペプチド中の１個または複数個のアミノ酸残基を、このアミノ酸の化学的に区別されているが認識されている機能的類似体（即ち、人工アミノ酸類似体）で置き換えることを含む。人工アミノ酸類似体として、β−アミノ酸、β−置換β−アミノ酸（「β３−アミノ酸」）、アミノ酸の亜リン酸類似体（例えば、∀−アミノホスホン酸、および∀−アミノホスフィン酸）、ならびに非ペプチド結合を有するアミノ酸が挙げられる。人工アミノ酸を使用して、ペプチド模倣物（例えば、ペプチドオリゴマー（例えば、ペプトイドアミドもしくはエステル類似体）、β−ペプチド、環状ペプチド、オリゴ尿素、またはオリゴカルバメートペプチド；または複素環分子）を作製し得る。例示的なレトロ−インベルソターゲティングペプチド模倣物として、ＫＬＡＳＶＴおよびＫＦＬＡＳＶＴ（これらの配列は全てのＤ−アミノ酸を含む）が挙げられる。これらの配列を、例えばアミノ末端のビオチン化およびカルボキシ末端のアミド化により、改変し得る。
【００４２】
ＡＡＶ
本方法および本組成物での使用のためのウイルスベクターとして、本明細書で記載されているターゲティングペプチドと、任意選択の、標的組織中での発現のための導入遺伝子とを含む組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。
【００４３】
本方法での核酸の送達に有用な好ましいウイルスベクターシステムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、２５ｎｍのカプシドを有する小さい非エンベロープウイルスである。野生型ウイルスと関連していることが知られているかまたは示されている疾患はない。ＡＡＶは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する。ＡＡＶは、長期にわたるエピソーム導入遺伝子発現を示すことが示されており、ＡＡＶは、脳（特に神経細胞）において優れた導入遺伝子発現を示している。ＡＡＶのわずか３００個の塩基対を含むベクターを、パッケージ化して統合し得る。外来性ＤＮＡ用のスペースは、約４．７ｋｂに制限されている。ＡＡＶベクター（例えば、Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)で記載されているもの）を使用して、細胞にＤＮＡを導入し得る。ＡＡＶベクターを使用して、様々な核酸が様々な細胞型に導入されている（例えば、Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 (1984)；Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1985)；Wondisford et al., Mol. Endocrinol. 2:32-39 (1988)；Tratschin et al., J. Virol. 51:611-619 (1984)；およびFlotte et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790 (1993)を参照されたい）。多数の代替ＡＡＶバリアント（１００種超がクローニングされている）およびＡＡＶバリアントが、望ましい特性に基づいて同定されている。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３、またはＣＳｐ３であり；ＣＮＳでの使用の場合には、いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である。一例として、ＡＡＶ９は、血液脳関門をある程度効率的に横断することが示されている。本方法を使用して、本明細書で記載されているターゲティング配列のカプシドタンパク質への挿入（例えば、アミノ酸５８８および５８９の間でのＡＡＶ９カプシドタンパク質ＶＰ１への挿入）により、ＡＡＶカプシドを、ＢＢＢを超えるかまたは特定の組織への浸透を増加させるように遺伝子操作し得る。
【００４４】
例示的な野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質ＶＰ１（Ｑ６ＪＣ４０−１）配列は、下記の通りである。
【００４５】
【化１】
2021530218.tif 000005
【００４６】
したがって、本明細書で記載されているターゲティングペプチド配列の内の１つまたは複数を含むＡＡＶ（例えば、本明細書で記載されているターゲティング配列を含むカプシドタンパク質（例えば、配列番号１を含むカプシドタンパク質）を含むＡＡＶ）であって、ターゲティングペプチド配列は、例えばアミノ酸５８８および５８９の間で、この配列に挿入されている、ＡＡＶが本明細書で提供される。
【００４７】
いくつかの実施形態では、このＡＡＶはまた、導入遺伝子配列（即ち、異種配列）、例えば、例えば本明細書で記載されているかもしくは当分野で既知の治療薬をコードする導入遺伝子、またはレポータータンパク質、例えば、蛍光タンパク質、検出可能な生成物を生じる反応を触媒する酵素、または細胞表面抗原も含む。この導入遺伝子は、好ましくは、標的組織中でのこの導入遺伝子の発現を促進する／駆動する配列に連結されている。
【００４８】
治療薬としての使用のための例示的な導入遺伝子として、下記が挙げられる：神経細胞アポトーシス抑制タンパク質（ＮＡＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、膠細胞由来成長因子（ＧＤＮＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）、血液因子、例えば、β−グロビン、ヘモグロビン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、および凝固因子；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）；インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９等；成長因子、例えば、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、例えば、塩基性ＦＧＦおよび酸性ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ−９）、肝細胞腫由来成長因子（ＨＤＧＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）等；可溶性受容体、例えば、可溶性ＴＮＦ−α受容体、可溶性ＶＥＧＦ受容体、可溶性インターロイキン受容体（例えば、可溶性ＩＬ−１受容体および可溶性ＩＩ型ＩＬ−１受容体）、可溶性ガンマ／デルタＴ細胞受容体、可溶性受容体のリガンド結合断片等；酵素、例えば、α−グルコシダーゼ、イミグルセラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、およびアルグルセラーゼ；酵素アクチベータ、例えば、組織プラスミノーゲンアクチベータ；ケモカイン、例えば、ＩＰ−１０、インターフェロン−ガンマにより誘発されるモノカイン（Ｍｉｇ）、Ｇｒｏａ／ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＰＦ−４等；血管形成剤、例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ、例えば、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−２）、形質転換成長因子−ベータ、塩基性線維芽細胞成長因子、神経膠腫由来成長因子、アンジオゲニン、アンジオゲニン−２等；抗血管形成剤、例えば、可溶性ＶＥＧＦ受容体；タンパク質ワクチン；神経活性ペプチド、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ブラジキニン、コレシストキニン、ガストリン、セクレチン、オキシトシン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、ベータ−エンドルフィン、エンケファリン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、プロラクチン、ガラニン、成長ホルモン放出ホルモン、ボンベシン、ダイノルフィン、ワルファリン、ニューロテンシン、モチリン、甲状腺刺激ホルモン、神経ペプチドＹ、黄体ホルモン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、バソプレシン、アンジオテンシンＩＩ、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管作用性小腸ペプチド、睡眠ペプチド等；血栓溶解薬；心房性ナトリウム利尿ペプチド；リラキシン；グリア線維酸性タンパク質；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；ヒトアルファ−１アンチトリプシン；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；形質��換成長因子（ＴＧＦ）；組織因子；黄体ホルモン；マクロファージ活性化因子；腫瘍壊死因子（ＮＴＦ）；好中球走化性因子（ＮＣＦ）；神経成長因子；組織メタロプロテアーゼ阻害物質；血管作用性小腸ペプチド；アンジオゲニン；アンジオトロピン；フィブリン；ヒルジン；ＩＬ−１受容体アンタゴニスト等。目的のタンパク質のいくつかの他の例として、下記が挙げられる：毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；ニューロトロフィン３および４／５（ＮＴ−３および４／５）；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）；血友病関連の凝固タンパク質、例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子；ジストロフィンまたはミニ−ジストロフィン；リソソーム酸リパーゼ；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）；糖原病関連の酵素、例えば、グルコース−６−ホスファターゼ、酸性マルターゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、筋肉グリコーゲンホスホリラーゼ、肝臓グリコーゲンホスホリラーゼ、筋ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ（例えばＰＨＫＡ２）、グルコーストランスポーター（例えばＧＬＵＴ２）、アルドラーゼＡ、β−エノラーゼ、およびグリコーゲンシンターゼ；リソソーム酵素（例えば、ベータ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼＡ）；ならびにこれらの任意のバリアント。
【００４９】
この導入遺伝子はまた、抗体もコードし得、例えば、例えばＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連タンパク質−４；ＣＤ１５２）；ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子３；ＣＤ２２３）；ＴＩＭ−３（Ｔ−細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３；ＨＡＶＣＲ２）；ＴＩＧＩＴ（ＩｇドメインおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ−細胞免疫受容体）；Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＶＳＩＲ（Ｖ−セット免疫調節性受容体、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７Ｈ５、Ｃ１０ｏｒｆ５４としても知られる）；ＢＴＬＡ  ３０（Ｂ−およびＴ−リンパ球アテニュエータ、ＣＤ２７２）；ＧＡＲＰ（糖タンパク質Ａ反復；優性；ＰＶＲＩＧ（ＰＶＲ関連の免疫グロブリンドメイン含有）；またはＶＴＣＮ１（Ｖセットドメイン含有Ｔ細胞活性化阻害剤１、Ｂ７−Ｈ４としても知られる）への免疫チェックポイント阻害抗体もコードし得る。
【００５０】
他の導入遺伝子として、標的遺伝子の発現を変化させる／減少させる小さいまたは抑制性の核酸が挙げられ得、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、または遺伝子発現を変化させる長い非コードＲＮＡ（例えば、国際公開第２０１２０８７９８３号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１４０１４２１６０号明細書を参照されたい）、またはＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９／ｃａｓ１２ａ、およびガイドＲＮＡが挙げられ得る。
【００５１】
ウイルスはまた、導入遺伝子の発現を促進する１つまたは複数の配列も含み得、例えば、１つもしくは複数のプロモーター配列；エンハンサー配列、例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）もしくは３’ＵＴＲ；ポリアデニル化部位；ならびに／またはインスレーター配列も含み得る。いくつかの実施形態では、このプロモーターは、脳組織特異的プロモーターであり、例えば、神経細胞特異的プロモーターまたは膠細胞特異的プロモーターである。ある特定の実施形態では、このプロモーターは、下記から選択される遺伝子のプロモーターである：神経核（ＮｅｕＮ）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ＭｅＣＰ２、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ−１）、シナプシンＩ（ＳＹＮ）、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ、チューブリンアルファＩ、神経細胞特異的エノラーゼ、および血小板由来成長因子ベータ鎖。いくつかの実施形態では、このプロモーターは、ｐａｎ細胞型プロモーターであり、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ベータグルクロニダーゼ、（ＧＵＳＢ）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーターである。ウッドチャック肝炎ウイルス転写後反応エレメント（ＷＰＲＥ）も使用し得る。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶはまた、標的組織（例えばＣＮＳ）への送達を増加させる１つもしくは複数の追加の変異も有するか、または（例えば、Pulicherla et al. (2011) Mol Ther 19:1070-1078で記載されているような）組織外ターゲティングを減少させる１つもしくは複数の追加の変異（例えば、ＣＮＳ、心臓、もしくは筋肉への送達が意図されている場合に肝臓への送達を減少させる変異）も有するか、または例えばChen et al. (2008) Nat Med 15:1215-1218もしくはXu et al., (2005) Virology 341:203-214もしくは米国特許第９１０２９４９号明細書；同第９５８５９７１号明細書；および米国特許出願公開第２０１７０１６６９２６号明細書で記載されているような他のターゲティングペプチドの付加も有する。sfn.org/~/media/SfN/Documents/Short%20Courses/2011%20Short%20Course%20I/2011_SC1_Gray.ashxで入手可能なGray and Samulski (2011) “Vector design and considerations for CNS applications,” in Gene Vector Design and Application to Treat Nervous System Disorders ed. Glorioso J., editor. (Washington, DC: Society for Neuroscience; ) 1-9も参照されたい。
【００５３】
タグ／融合体としてのターゲティングペプチド
本明細書で記載されているターゲティングペプチドを使用して、ＢＢＢを超える他の（異種）分子の浸透も、例えば、この分子へのコンジュゲーションにより増加させ得るか、または例えば抗体もしくは他の大きい生体分子との融合タンパク質の一部としての発現により増加させ得る。これらとして、本明細書で記載されている治療薬またはレポーターおよび表２で列挙されているものに加えて、ゲノム編集タンパク質またはゲノム編集複合体（例えば、（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部で）本明細書で記載されているペプチドに融合した遺伝子編集タンパク質（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａ）を含むＴＡＬＥ、ＺＦＮ、塩基エディター（Base editor）、およびＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ、ならびにガイドＲＮＡ）が挙げられ得る。融合体／複合体は、Ｋｕ７０由来のあらゆる他の配列を含まず（例えば、異種非Ｋｕ７０配列を含む）、かつ天然では存在しない。
【００５４】
いくつかの実施形態では、非ＡＡＶ融合タンパク質の一部として使用されるターゲティング配列は、ＶＰＡＬＲ（配列番号１）またはＶＳＡＬＫ（配列番号２）を含まないか、またはからならない。
【００５５】
使用方法
本明細書で記載されている方法および組成物を使用して、任意の組成物（例えば、目的の配列）を組織（例えば、中枢神経系（脳）、心臓、筋肉、または後根神経節もしくは脊髄（末梢神経系））に送達し得る。いくつかの実施形態では、この方法は、特定の脳の領域（例えば、大脳皮質、小脳、海馬、黒質、扁桃体）への送達を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、神経細胞、星状膠細胞、膠細胞、または心筋細胞への送達を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、この方法および組成物（例えばＡＡＶ）を使用して、核酸配列を、疾患（例えば、ＣＮＳの疾患；例えば、米国特許第９１０２９４９号明細書；同第９５８５９７１号明細書；および米国特許出願公開第２０１７０１６６９２６号明細書を参照されたい）を有する対象に送達する。いくつかの実施形態では、この対象は、表２で列挙されている状態を有し、いくつかの実施形態では、ベクターを使用して、表２で列挙されている対応する疾患を処置するために、表２で列挙されている治療薬を送達する。この治療薬を、例えばウイルスベクターにより核酸として送達し得る（この核酸は、治療用タンパク質もしくは他の核酸（例えば、アンチセンスオリゴ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等をコードする）か、または本明細書で記載されているターゲティングペプチドとの融合タンパク質／複合体として送達し得る）。
【００５７】
【表２】
2021530218.tif 000006
【００５８】
いくつかの実施形態では、この組成物および方法を使用して、脳がんを処置する。脳がんとして、膠芽腫（例えば多形性膠芽腫（ＧＢＭ））、転移（例えば、肺がん、乳がん、黒色腫、または結腸がんから転移）、髄膜腫、下垂体腺腫、および聴神経腫瘍が挙げられる。この組成物は、下記の抗がん剤に連結されたターゲティングペプチドを含む：例えば、標的細胞中でアポトーシスを誘発する「自殺遺伝子」（例えば、ＨＳＶ．ＴＫ１、単純ヘルペスウイルスもしくは大腸菌（Escherichia coli）由来のシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、または大腸菌（Escherichia coli）プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）／フルダラビン；Krohne et al., Hepatology. 2001 Sep;34(3):511-8; Dey and Evans, “Suicide Gene Therapy by Herpes Simplex Virus-1 Thymidine Kinase (HSV-TK)” (2011) DOI: 10.5772/18544を参照されたい）、当分野で既知であるかまたは本明細書で記載されている免疫チェックポイント阻害抗体。例えば、本明細書で記載されているターゲティングペプチドを含むＡＡＶベクターを使用して、脳腫瘍に「自殺遺伝子」ＨＳＶ．ＴＫ１を送達し得る。ＨＳＶ．ＴＫ１は、それがなければ「休眠」しているガンシクロビルを腫瘍死滅剤へと変える。したがって、この方法は、本明細書で記載されているターゲティングペプチドを含みかつＨＳＶ．ＴＫ１をコードするＡＡＶ（例えばＡＡＶ９）と、プロドラッグガンシクロビルとを、脳がんと診断されている対象に全身（例えば静脈内）投与することを含み得る。
【００５９】
医薬組成物および投与方法
本明細書で記載されている方法は、活性成分として本ターゲティングペプチドを含む医薬組成物の使用を含む。
【００６０】
医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、文言「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合する生理食塩水、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。
【００６１】
医薬組成物は、典型的には、その意図された投与経路に適合するように製剤化されている。投与経路の例として、非経口投与が挙げられ、例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、または注射投与、または注入投与が挙げられる。そのため、送達は、全身または局所であり得る。
【００６２】
適切な医薬組成物を製剤化する方法は当分野で既知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005；およびDrugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)のシリーズの本を参照されたい。例えば、非経口投与に使用される溶液または懸濁液として、下記の成分が挙げられ得る：滅菌希釈剤、例えば、注射用の水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、および浸透圧の調整用の薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはブドウ糖。ｐＨを、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調整し得る。この非経口製剤を、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラス製のもしくはプラスチック製の複数回の用量のバイアルに封入し得る。
【００６３】
注射可能な使用に適した医薬組成物として、滅菌された水溶液（水溶性）または分散液と、滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末とが挙げられ得る。静脈内投与の場合、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬTM（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、この組成物は滅菌されてなければならず、かつ容易に注射可能である限りにおいて流体であるべきである。この組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、かつ細菌および真菌等の微生物による作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等、ならびにこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持し得る。微生物による作用の予防を、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等）により達成し得る。多くの場合では、この組成物に、等張剤（例えば、糖、多価アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウム）を含めることが好ましい。この注射可能な組成物の持続的吸収を、この組成物に、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることによりもたらし得る。
【００６４】
上記で列挙されている成分の内の１つまたは組み合わせと共に、適切な溶媒に、必要な量の活性化合物を組み入れ、必要に応じて、続いて滅菌ろ過することにより、滅菌された注射可能な溶液を調製し得る。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒体と上記で列挙されているものからの必要な他の成分とを含む滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、減圧乾燥および凍結乾燥であり、これらにより、予め滅菌ろ過した溶液から、活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。
【００６５】
一実施形態では、本治療用化合物を、この治療用化合物を身体からの迅速な排出から保護する担体（例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システム等の制御放出製剤）と共に調製する。生分解性で生体適合性のポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）を使用し得る。そのような製剤を、標準的な技術を使用して調製し得るか、または例えばＡｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に得ることができる。リポソーム懸濁液（細胞抗原に対するモノクローナル抗体により選択細胞にターゲティングされるリポソームを含む）も、薬学的に許容される担体として使用し得る。これらを、例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書で記載されているように、当業者に既知の方法に従って調製し得る。
【００６６】
本医薬組成物を、投与の指示書と一緒に、キット、容器、パック、またはディスペンサに含め得る。例えば、本明細書で記載されているターゲティングペプチドと、ＨＳＶ．ＴＫ１をコードする核酸とを含むＡＡＶを含む組成物を、ガンシクロビルと共にキットで提供し得る。
【実施例】
【００６７】
本発明を、特許請求の範囲で記載されている本発明の範囲を限定しない下記の実施例でさらに記載する。
【００６８】
材料および方法
下記の実施例では、下記の材料および方法を使用した。
【００６９】
１．カプシドバリアントの生成
カプシドバリアントプラスミドを生成するために、細胞透過性ペプチド（表３）をコードするＤＮＡ断片を合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、ＣｌｏｎｅＥＺシームレスクローニング技術（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用して、アミノ酸位置５８８および５８９（ＶＰ１アミノ酸ナンバリング）の間でＡＡＶ９  Ｒｅｐ−ｃａｐプラスミド（ｐＲＣ９）の骨格に挿入した。ＣＰＰ  ＢＩＰ１（ＶＰＡＬＲ、配列番号１）およびＢＩＰ２（ＶＳＡＬＫ、配列番号２）、ならびにこれらの誘導体（例えば、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６中のＴＶＳＡＬＫ（配列番号４）、およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１中のＴＶＳＡＬＦＫ（配列番号８））は、Ｋｕ７０タンパク質に由来しており、これらの配列を下記に記載する。
【００７０】
【化２】
2021530218.tif 000007
【００７１】
加えて、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６、およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１のＶＰ１タンパク質配列を下記に記載する。
【００７２】
【化３−１】
2021530218.tif 000008
【００７３】
【化３−２】
2021530218.tif 000009
【００７４】
２．組換えＡＡＶの製造
標準的な３プラスミド共トランスフェクションプロコトル（ｐＲＣプラスミド、ｐヘルパープラスミド、およびｐＡＡＶプラスミド）を使用して、組換えＡＡＶをパッケージングした。導入遺伝子（例えば、ユビキタスＥＦ１ａプロモーターにより駆動される核指向性ＲＦＰ  Ｈ２Ｂ−ｍＣｈｅｒｒｙ（nucleus-directed RFP H2B-mCherry））を有するｐＲＣ９（またはそのバリアント）、ｐヘルパー、およびｐＡＡＶを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。ｒＡＡＶベクターを、トランスフェクションの７２時間および１２０時間後に血清フリー培地から回収し、ならびにトランスフェクションの１２０時間後に細胞から回収した。この培地中のＡＡＶ粒子を、８％  ＰＥＧ−８０００（重量／体積）によるＰＥＧ沈殿法を使用して濃縮した。ウイルス粒子を含む細胞ペレットを再懸濁させ、超音波処理により溶解させた。ＰＥＧ沈殿および細胞溶解物から組み合わせウイルスベクターを、３０分にわたり３７℃でＤＮアーゼおよびＲＮアーゼにより処理し、次いで超遠心分離（ＶＴｉ  ５０ローター、４０，０００ｒ．ｐ．ｍ、１８℃、１時間）によるイオジキサノール勾配（１５％、２５％、４０％、および６０％）によって精製した。次いで、ｒＡＡＶを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎフィルタユニット（ＵＦＣ９１０００８、１００Ｋ  ＭＷＣＯ）を使用して濃縮し、０．００１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で製剤化した。
【００７５】
３．ＡＡＶ滴定
ウイルス力価を、定量ＰＣＲを使用してＤＮアーゼ耐性ゲノムコピーを測定することにより決定した。ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ＧＦＰをＰＶＵＩＩ（ＮＥＢ）で消化してプラスミドＩＴＲ用のフリー末端を生成し、標準曲線の生成に使用した。ウイルスサンプルをＤＮアーゼＩと共にインキュベートして夾雑ＤＮＡを除去し、続いて水酸化ナトリウム処理してウイルスカプシドを溶解させてウイルスゲノムを放出させた。定量ＰＣＲを、ＩＴＲフォワードプライマー５’−ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ（配列番号９１）およびＩＴＲリバースプライマー５’−ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ（配列番号９２）を使用して実施した。ベクター力価を、ｒＡＡＶ−２参照標準物質（ＲＳＭ、ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＶＲ−１６１６、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に対して正規化した。
【００７６】
４．マウスでのＡＡＶの投与
静脈内投与のために、滅菌生理食塩水（０．２ｍｌ）で希釈したＡＡＶを、成体マウス（６週齢超）で尾静脈注射により投与した。次いで、動物を３週間にわたり生存させた後、安楽死させて組織を採取した。脳内注射のために、ＰＢＳ（１０ｕｌ）で希釈したＡＡＶを、十字縫合から１．０ｍｍ右、０．３後方、２．６ｍｍ深さの座標に、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して注射した。全ての動物実験を、ＩＡＣＵＣにより承認されたＡＡＡＬＡＣ認定施設で実施した。
【００７７】
５．マウス組織の処理
麻酔した動物に、冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を経心的に灌流させ、続いて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を経心的に灌流させた。組織を、一晩４％ＰＦＡで後固定し、次いで、２日にわたり３０％ショ糖溶液に浸漬した後、ＯＣＴに埋め込んでスナップ凍結させた。典型的には、８０ｕｍ厚の脳切片を、自然蛍光の画像化のために切断し、４０ｕｍ厚の脳切片を、ＩＨＣのために切断した。
【００７８】
６．インビトロでのヒトＢＢＢスフェロイドモデル
熱い１％アガロース（重量／体積、５０ｕｌ）を９６ウェルプレートに入れて、冷却した／固化させた。次いで、このアガロースゲル上に、初代ヒト星状膠細胞（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ヒト脳微小血管周皮細胞（ＨＢＶＰ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、およびヒト脳微小血管内皮細胞（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３；Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を、１：１：１の比（各タイプ１５００個の細胞）で播種した。細胞を、４８〜７２時間にわたり５％ＣＯ２インキュベータ中において３７℃で培養して、多細胞ＢＢＢスフェロイドの自発的構築を可能にした。このスフェロイドの周辺では、ＢＢＢを模倣する多細胞による関門が形成されることが報告された。この培養培地にＡＡＶｓ−Ｈ２Ｂ−ｍＣｈｅｒｒｙを添加し、４日後に、全てのスフェロイドを、４％ＰＦＡを使用して固定し、Ｎｕｎｃ  Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ  薄ガラス８ウェルチャンバーカバーガラス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を使用して画像化した。このスフェロイド内のＲＦＰシグナルの強度を調べて、「リードアウト」として使用した。
【００７９】
７．非ヒト霊長類（ＮＨＰ）でのＡＡＶ投与
全てのＮＨＰ試験を、ＩＡＣＵＣにより承認されたＡＡＡＬＡＣ認定施設でＣＲＯにより実施した。カニクイザルを、ＡＡＶ９に対する中和抗体がほぼ存在しないかまたは存在しないかに関して予めスクリーニングした（＜１：５の力価）。ＰＢＳ／０．００１％Ｆ６８で希釈したＡＡＶを、蠕動ポンプを使用して（橈側皮静脈または大腿静脈を介して）静脈内注射した。３週間後、動物にＰＢＳを経心的に灌流させ、続いて４％ＰＦＡを経心的に灌流させた。次いで、組織を回収し、パラフィン埋め込みおよび切片化のために処理した。
【００８０】
８．免疫組織化学
１０％ロバ血清および２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳで希釈した一次抗体により、マウス組織切片のフローティング染色を実施した。使用した一次抗体として下記が挙げられる：ニワトリ抗ＧＦＰ（１：１０００）；ウサギ抗ＲＦＰ（１：１０００）；マウス抗ＮｅｕＮ（１：５００）；ラット抗ＧＦＡＰ（１：５００）；ヤギ抗ＧＦＡＰ（１：５００）；マウス抗ＣＤ３１（１：５００）。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７のフルオロフォアにコンジュゲートした二次抗体を、１：２００の希釈で、一次抗体の宿主種に対して適用した。
【００８１】
ＮＨＰ組織のパラフィン切片の場合には、ＤＡＢ染色を実施して、ＡＡＶ−ＡＡＤＣにより形質導入された細胞を可視化した。ウサギ抗ＡＡＤＣ抗体（１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、一次抗体として使用した。
【００８２】
９．ＡＡＶ結合アッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、５％ＣＯ２インキュベータ中において３７℃で培養した。１つのウェル当たり２５０，０００個の細胞の密度での２４ウェルプレートへのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の播種の１日後に、２００ｕｌのＤＭＥＭ（３１０５３０２８；Ｇｉｂｃｏ）、１ｕｇのＤＮＡプラスミド、および３ｕｇのＰＥＩのトランスフェクション混合物を使用して、この細胞に、ＬＹ６ＡのｃＤＮＡプラスミドを一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を氷上に置いて１０分にわたり冷却した。次いで、培地を、１００００のＭＯＩでｒＡＡＶｓ−ｍＣｈｅｒｒｙを含む５００ｕｌの氷冷血清フリーＤＭＥＭ培地に交換した。１時間にわたる氷上でのインキュベーション後、おそらくＡＡＶが表面に結合している細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、次いでゲノムＤＮＡを単離した。細胞に結合しているウイルス粒子を、ｍＣｈｅｒｒｙに特異的なプライマーによるｑＰＣＲを使用することにより定量し、参照としてヒトＧＣＧを使用してＨＥＫ２９３Ｔゲノムに対して正規化した。
【００８３】
１０．膠芽腫のマウスモデル
全ての実験を、Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌにてＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ  （ＩＡＣＵＣ）により承認されたプロトコルに従って実施した。２０＋／−１ｇ（Ｅｎｖｉｇｏ）の重量の同系免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを使用した。２μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させたＧＬ２６１−Ｌｕｃ（１００，０００個のマウス膠芽腫細胞）を、２６ゲージ針（８００７５；Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を備えた１０μｌのシリンジを使用して、頭蓋内に注射した。定位固定フレームを使用して、移植部位の位置を決めた（十字縫合からの座標（ｍｍ）：２右、０．５前方、大脳皮質への３．５の深さ）。７日後、２００ｕｌのＡＡＶ−ＨＳＶ−ＴＫ１（１Ｅ＋１２個のウイルスゲノム、ＩＶ）を１回投与し、ガンシクロビル（５０ｍｇ／ｋｇ）を１０日にわたり毎日投与した。
【００８４】
[実施例１]
ＡＡＶ９カプシドの改変
血液脳関門を横断する生体分子またはウイルスの浸透を増強するであろうペプチド配列を同定するために、ＡＡＶペプチドディスプレイ技術を使用した。表３で列挙されている個々の細胞透過性ペプチドを、図１Ａに示されているように、アミノ酸５８８および５８９（ＶＰ１ナンバリング）の間でＡＡＶ９カプシドに挿入した。この挿入を、ＡＡＶパッケージングのために共トランスフェクトされる３種のプラスミドの内の１つであるＲＣプラスミドを改変することにより実行し、図１Ｂは、この実験の例示的な模式図を示す。個々のＡＡＶバリアントを、別々に製造してスクリーニングした。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃１〜３を参照されたい。
【００８５】
【表３】
2021530218.tif 000010
【００８６】
[実施例２]
インビボでのスクリーニングの最初のラウンド
核ＲＦＰ（Ｈ２Ｂ−ＲＦＰ）を発現するＡＡＶを、Ｃ５７ＢＬ／６遺伝子背景およびＢＡＬＢ／ｃ遺伝子背景が混在している成体マウスに静脈内注射した。３週間後、脳組織を採取して切片化して、ＲＦＰ標識細胞を明らかにした（図２Ａおよび図２Ｃでの白色の点、それぞれ図２Ｂおよび図２Ｄで定量されている）。ＣＰＰ  ＢＩＰ１およびＢＩＰ２を、それぞれＡＡＶ．ＣＰＰ．１１およびＡＡＶ．ＣＰＰ．１２のカプシドに挿入した。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃４〜５を参照されたい。
【００８７】
[実施例３]
改変ＡＡＶ９カプシドの最適化
ＢＩＰターゲティング配列を最適化することにより、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１１およびＡＡＶ．ＣＰＰ．１２をさらに操作した。ＢＩＰインサートは、タンパク質Ｋｕ７０に由来した（完全な配列に関しては、図３Ａおよび材料／方法＃１を参照されたい）。「合成」起源であるＢＩＰ配列ＶＳＡＬＫを、操作ＡＡＶベクターの潜在的な種特異性を最小限に抑えるための研究焦点として選択した。ＡＡＶを製造し、ＡＡＶ９と比較して脳形質導入効率に関して別々に試験した（図３Ｂ〜Ｃを参照されたい）。レポーター遺伝子ＲＦＰを送達するいくつかのＡＡＶバリアントのＩＶ注射後３週間でのマウス肝臓における細胞形質導入の割合を、図３Ｄに示す。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃１〜５を参照されたい。
【００８８】
[実施例４]
インビトロモデル−ＢＢＢ浸透スクリーニング
ＡＡＶバリアントの一部を、インビトロでのスフェロイドＢＢＢモデルを使用して、ヒトＢＢＢを超える能力に関してスクリーニングした。このスフェロイドは、表面で関門を形成するヒト微小血管内皮細胞と、ヒト周皮細胞および星状膠細胞とを含む。レポーターとして核ＲＦＰを有するＡＡＶを、周囲の培地からこのスフェロイドの内部に浸透して内部で細胞に形質導入する能力に関して評価した。図４Ａは、実験の概要を示す。図４Ｂ〜Ｄは、ｗｔ  ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６、およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１それぞれの結果を示し、これらのおよび他のペプチドを図４Ｅで定量する。このモデルでは、ペプチド１１、１５、１６、および２１が、スフェロイドへの最大の浸透を引き起こした。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃６を参照されたい。
【００８９】
[実施例５]
インビボでのＢＢＢ浸透スクリーニング
実施例２に関して上述したように実施した実験において、インビボでのモデルでのさらなる評価のために、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を選択した。全てのＡＡＶが、レポーターとして核ＲＦＰを有した。両方とも、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ成体マウス（図５Ａでの脳切片における白色の点、図５Ｂで定量されている）およびＢＡＬＢ／ｃ成体マウス（図６Ａでの脳切片における白色の点、図６Ｂで定量されている）において、ＡＡＶ９と比較して、静脈内投与後に脳細胞に形質導入する能力の増強を示した。
【００９０】
高用量のＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１（１匹のマウス当たり４×１０１２ｖｇ、ＩＶ投与）により、マウスでは広範な脳形質導入がもたらされた。両方のＡＡＶが、レポーターとして核ＲＦＰを有した（図７Ａでの脳切片における白色の点、図７Ｂで定量されている）。
【００９１】
[実施例６]
改変ＡＡＶのインビボでの分布
図８Ａで示すように、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１は、マウスの複数の脳領域（例えば、大脳皮質、中脳、および海馬）にわたり、神経細胞（ＮｅｕＮ抗体により標識されている）を優先的に標的とした。両方のＡＡＶが、レポーターとして核ＲＦＰを有した。
【００９２】
ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１はまた、マウスの脊髄および運動神経細胞の標的化において、ＡＡＶ９と比較して能力の増強も示した。全てのＡＡＶがレポーターとして核ＲＦＰを有しており、新生仔マウスに静脈内投与した（４回×１０１０ｖｇ）。運動神経細胞を、ＣＨＡＴ抗体染色を使用して可視化した。図８ＢでのＲＦＰシグナルおよびＣＨＡＴシグナルの共局在化は、運動神経細胞の特異的な形質導入を示唆した。
【００９３】
マウスの様々な組織に形質導入するＡＡＶ−ＣＡＧ−Ｈ２Ｂ−ＲＦＰおよびＡＡＶ．ＣＰＰ．１６−ＣＡＧ−Ｈ２Ｂ−ＲＦＰの相対能力も評価した。１／１０１１ｖｇを静脈内注射した。形質導入された細胞の数を、ＤＡＰＩ核染色により標識された全細胞の数に対して正規化した。この結果は、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６が、マウスの心臓組織（図９Ａ）；骨格筋組織（図９Ｂ）、および後根神経節組織（図９Ｃ）の標的化において、ＡＡＶ９と比べて効率的であることを示した。
【００９４】
[実施例７]
非ヒト霊長類モデルでのＢＢＢ浸透
２×１０１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶｓ−ＣＡＧ−ＡＡＤＣ（レポーター遺伝子として）を、３カ月齢のカニクイザルに静脈内注射した。ＡＡＶ形質導入細胞（黒色で示す）を、ＡＡＤＣに対する抗体染色を使用して可視化した。図１０Ａ〜Ｄに示すように、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１は、ＡＡＶ９と比較して、非ヒト霊長類での静脈内投与後に脳組織に形質導入する能力の増強を示した。ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６は、一次視覚野（図１０Ａ）、頭頂葉皮質（図１０Ｂ）、視床（図１０Ｃ）、および小脳（図１０Ｄ）において、ｗｔ  ＡＡＶ９と比べて有意に多くの細胞に形質導入した。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃７〜８を参照されたい。
【００９５】
[実施例８]
ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６およびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１はＬＹ６Ａに結合しない
ＬＹ６ＡはＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢの受容体として機能し、ある特定のマウス株でのＢＢＢの横断におけるＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢの頑強な効果を媒介する。培養された２９３細胞におけるマウスＬＹ６Ａの過剰発現により、細胞表面へのＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢの結合が有意に増加した（図１１Ａを参照されたい）。逆に、ＬＹ６Ａの過剰発現により、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６、またはＡＡＶ．ＣＰＰ．２１に関するウイルス結合は増加しない（図１１Ｂを参照されたい）。このことは、ＡＡＶ．ＣＰＰ．１６またはＡＡＶ．ＣＰＰ．２１が受容体としてＬＹ６ＡをＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢと共有しないことを示唆する。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃９を参照されたい。
【００９６】
[実施例９]
ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を使用する脳への治療用タンパク質の送達
ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を使用して、脳腫瘍のマウスモデルにおいて「自殺遺伝子」ＨＳＶ．ＴＫ１を全身送達した。ＨＳＶ．ＴＫ１は、それがなければ「休眠」しているガンシクロビルを腫瘍死滅剤へと変える。静脈内投与されたＡＡＶ．ＣＰＰ．２１−Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ（図１２Ａ、左下および右中央のパネル）は、腫瘤（特に、腫瘍が拡がるフロンティア）を標的とすることが示された。図１２Ｂ〜Ｃに示すように、「自殺遺伝子」ＨＳＶ．ＴＫ１を全身送達するためのＡＡＶ．ＣＰＰ．２１の使用により、プロドラッグであるガンシクロビルと併用した場合に、脳腫瘤の縮小がもたらされた。これらの結果は、ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１を使用して脳腫瘍に治療用遺伝子を全身送達し得ることを示す。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃１０を参照されたい。
【００９７】
[実施例１０]
ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１の脳内投与
（例えば実施例２での）全身投与に加えて、本明細書で記載されているＡＡＶを、マウス脳に局所的に投与した。ＡＡＶ９−Ｈ２Ｂ−ＲＦＰおよびＡＡＶ．ＣＰＰ．２１−Ｈ２Ｂ−ＲＦＰの脳内注射（図１３）により、ＡＡＶ９で処置された脳切片と比較して、ＡＡＶ．ＣＰＰ．２１で処置された脳切片において広範なかつ高強度のＲＦＰシグナルが生じた。さらなる詳細に関しては、材料および方法＃４を参照されたい。
【００９８】
他の実施形態
本発明を、その詳細な説明と併せて記載しているが、上記の記載は、添付の特許請求の範囲により画定される本発明の範囲を例示することが意図されており限定することは意図されていないことを理解しなければならない。他の態様、利点、および改変は、下記の特許請求の範囲内である。
【図１】
2021530218.tif 000011
【図２Ａ】
2021530218.tif 000012
【図２Ｂ】
2021530218.tif 000013
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
2021530218.tif 000016
【図３Ｂ】
2021530218.tif 000017
【図３Ｃ−Ｄ】
2021530218.tif 000018
【図４Ａ−Ｂ】
2021530218.tif 000019
【図４Ｃ−Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2021530218.tif 000044
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