(57)【要約】  ３−フコシルラクトースから本質的になる噴霧乾燥粉末を製造するための方法、噴霧乾燥粉末、栄養組成物を製造するためのその使用、および噴霧乾燥粉末を含む栄養組成物が開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物発酵により生成された３−フコシルラクトースから本質的になる噴霧乾燥粉末。
【請求項２】
少なくとも８０ｗｔ％、少なくとも８５ｗｔ％、少なくとも９０ｗｔ％、少なくとも９３ｗｔ％、少なくとも９５ｗｔ％、または少なくとも９８ｗｔ％の３−フコシルラクトースを含有する、請求項１に記載の噴霧乾燥粉末。
【請求項３】
３−フコシルラクトースが、非晶質形態で存在する、請求項１または２に記載の噴霧乾燥粉末。
【請求項４】
１５ｗｔ％以下の水、好ましくは１０ｗｔ％以下の水、より好ましくは７ｗｔ％以下の水、最も好ましくは５ｗｔ％以下の水を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の噴霧乾燥粉末。
【請求項５】
遺伝子操作微生物、および遺伝子操作微生物に由来する核酸分子を含まない、請求項１から４のいずれか一項に記載の噴霧乾燥粉末。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の噴霧乾燥粉末を製造するための方法であって、
ａ）発酵ブロスから３−フコシルラクトースを精製する工程と；
ｂ）工程ａ）の３−フコシルラクトースを含む水溶液を用意する工程と；
ｃ）工程ｂ）の溶液を噴霧乾燥に供する工程と
を含む方法。
【請求項７】
発酵ブロスから３−フコシルラクトースを精製する工程（工程ａ）が、
ｉ）発酵ブロスから微生物細胞を除去して、清澄化プロセス流を得る工程；
ｉｉ）清澄化プロセス流を少なくとも１回の限外濾過に供する工程；
ｉｉｉ）清澄化プロセス流をカチオン交換樹脂で少なくとも１回、および／もしくはアニオン交換樹脂で少なくとも１回処理する工程；
ｉｖ）清澄化プロセス流を少なくとも１回のナノ濾過および／もしくは透析濾過に供する工程；
ｖ）清澄化プロセス流を少なくとも１回の電気透析に供する工程；
ｖｉ）清澄化プロセス流を活性チャコールで少なくとも１回処理する工程；ならびに／または
ｖｉｉ）清澄化プロセス流を少なくとも１回結晶化および／もしくは沈殿工程に供する工程
の１つまたは複数を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記水溶液が、少なくとも２０％（ｗ／ｖ）、３０％（ｗ／ｖ）、３５％（ｗ／ｖ）、および最大４５％（ｗ／ｖ）、５０％（ｗ／ｖ）、６０％（ｗ／ｖ）の量の３−フコシルラクトースを含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
３−フコシルラクトース含有水溶液が、少なくとも１１０℃、好ましくは少なくとも１２０℃、より好ましくは少なくとも１２５℃、および１５０℃未満、好ましくは１４０℃未満、より好ましくは１３５℃未満のノズル温度で噴霧乾燥される、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
３−フコシルラクトース含有水溶液が、少なくとも６０℃、好ましくは少なくとも６５℃、および８０℃未満、好ましくは７０℃未満の出口温度で噴霧乾燥される、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
栄養組成物、好ましくは乳児用フォーミュラを製造するための、請求項１から５のいずれか一項に記載の噴霧乾燥粉末の使用。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれか一項に記載の噴霧乾燥粉末を含有する栄養組成物。
【請求項１３】
少なくとも１種の追加のＨＭＯをさらに含有し、前記少なくとも１種の追加のＨＭＯは、中性ＨＭＯまたはシアリル化ＨＭＯである、請求項１２に記載の栄養組成物。
【請求項１４】
少なくとも１種の中性ＨＭＯが、２’−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースおよびラクト−Ｎ−フコペンタオースＩからなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の栄養組成物。
【請求項１５】
少なくとも１種のシアリル化ＨＭＯが、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、シアリルラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＳＴ）−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃおよびジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースからなる群から選択される、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項１６】
少なくとも１種のプロバイオティクス微生物を含む、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトミルクオリゴ糖の調製物に関する。より詳細には、本発明は、ヒトミルクオリゴ糖の固体調製物、および前記ヒトミルクオリゴ糖の固体調製物を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト母乳は、相当量の炭水化物を含有する。これらの炭水化物は、Ｌ−フコースおよびＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）等の単糖を含む。二糖であるラクトースもまた、ヒト母乳中に存在する。ラクトースに加えて、１リットルのヒト母乳は、最大２０ｇ／Ｌのオリゴ糖、いわゆる「ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）」を含有する。ＨＭＯは、ヒト母乳の３番目に豊富な構成成分である。ヒトミルク中には、１５０を超える構造的に異なるオリゴ糖が存在すると推定される。ヒトミルクは通常、１０〜１３種の間の主要なＨＭＯを含有しており、これらは、１リットル当たり数百ミリグラムから数グラムの濃度で存在する（Ｔｈｕｒｌら（２０１７）、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ７５（１１）９２０〜９３３）。ＨＭＯは、１つまたは複数のシアル酸部分を含有する中性ＨＭＯおよび酸性ＨＭＯを含む。最も知られているＨＭＯを表１に示す。これらのオリゴ糖の構造的複雑性および豊富さは、ヒトミルクに特有であり、例えば乳畜等の他の哺乳動物のミルクには見られない。
【０００３】
ＨＭＯはヒトによって消化されないため、これらの糖の生理学的役割は、ここ数十年にわたり調査されている。ＨＭＯのプレバイオティクス効果は、１００年以上前に発見された。ＨＭＯは、有益な細菌を供給することによりヒト腸内微生物叢を調整することができる。ＨＭＯのいくつかの他の機能的効果、特に新生児の発育に対するそれらの効果がここ数年間調査された。ＨＭＯは、細菌およびウイルス病原体による感染のリスクを低減するためのデコイとして機能することが知られており、これは細胞表面糖タンパク質に結合することによってヒト細胞に接着する。さらに、様々なＨＭＯが抗炎症効果を有し、免疫修飾物質として機能する。したがって、ＨＭＯが食品アレルギーの発生のリスクを低減することが提示された。新生児の脳の発達に対するシアリル化ＨＭＯの好ましい効果が激しく議論されている（「Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｌｋ，Ｏｒｉｇｉｎｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｉｌｋ−ｂｏｒｎｅ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０１７）、編集者：ＭｃＧｕｉｒｅ  Ｍ．、ＭｃＧｕｉｒｅ  Ｍ．およびＢｏｄｅ  Ｌ．において考察されている）。
【０００４】
１つのＨＭＯは、３−フコシルラクトース（Ｇａｌ（β１−４）［Ｆｕｃ（β１−３）］Ｇｌｃ））である。３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）は、１９５８年に初めてミルクから単離され、また、１９７７年に初めて妊娠中および授乳期の血液型Ｏ型の非分泌型女性の尿から単離された。３−フコシルラクトースは、乳児の胃腸管における酵素加水分解に抵抗性である。３−フコシルラクトースは、大腸に到達してそこで吸収され、細菌により代謝されると仮定される。
【０００５】
ミルクで育てられた乳児に対するＨＭＯの有益な効果を利用するための第１の工程は、乳児用フォーミュラに個々のＨＭＯを添加することである。しかしながら、構造的に異なるＨＭＯの組合せは、その元の源であるヒトミルクにより類似した効果を有し、またこれは個々のＨＭＯによってはもたらすことができないため、乳児用フォーミュラに構造的に異なるＨＭＯの組合せを補足するほうが良い。
【０００６】
乳児用フォーミュラを補足するための個々のＨＭＯの供給が限られていることから、まずＨＭＯの化学合成、続いて精製された酵素を使用した生体触媒アプローチが開発された。今日では、遺伝子操作細菌細胞の発酵を使用して、様々なＨＭＯが商業規模で生成されている（ＷＯ２０１５／１５０３２８Ａ１、ＷＯ２０１７／０４３３８２Ａ１、ＷＯ２０１０／０７０１０４Ａ１、ＷＯ２０１２／０９７９５０Ａ１）。細菌細胞により合成されるＨＭＯは、ヒト用食品、特に乳児用食品に使用され得るようにＨＭＯの実質的に純粋な調製物を得るために、発酵ブロスまたは細胞分解物から精製され得る。
【０００７】
その精製中、３−フコシルラクトースは通常、液体プロセス流の形態で存在する。精製とともに、プロセス流中の３−フコシルラクトースの濃度は増加する。しかしながら、３−フコシルラクトースの水溶液は、細菌または真菌の汚染に対して非常に脆弱である。したがって、微生物増殖が不可能であるように、含水量が低い乾燥生成物として３−フコシルラクトースを提供することが好ましい。
【０００８】
典型的には、糖は、結晶化により固体形態で得られる。個々のＨＭＯの結晶化は、３−フコシルラクトースに関して（ＷＯ２０１４／０７５６８０Ａ）、２’−フコシルラクトースに関して（ＷＯ２０１１／１５０９３９Ａ）、ジ−フコシルラクトースに関して（ＷＯ２０１６／０８６９４７Ａ）、ラクト−Ｎ−テトラオースに関して（ＷＯ２０１７／１０１９５３Ａ）、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースに関して（ＷＯ２０１４／０９４７８３Ａ）記載されている。ＨＭＯの結晶化は、アルコール、主にエタノールもしくはメタノール等の有機溶媒、または氷酢酸等の有機酸の使用を伴う。しかしながら、固体形態の最終生成物を得る方法における最後の工程としてＨＭＯを結晶化させるために有機溶媒を使用することは、ＨＭＯが食品成分として使用される場合には適切ではない。さらに、有機溶媒は、環境およびそれを取り扱う全ての人物に有害である。したがって、有機溶媒の使用には、労働上の安全対策および適切な廃棄が必要であり、これにより有機溶媒の使用は費用を要するようになる。したがって、固体形態のＨＭＯを提供するためのＨＭＯの結晶化は、工業規模でのＨＭＯの生成における欠点とみなされるべきである。
【０００９】
したがって、ＨＭＯの工業規模生成に適用可能であり、前記ＨＭＯの固体調製物を提供するための精製スキームの最後に有機溶媒の使用を伴わない、固体形態のＨＭＯ、特に３−フコシルラクトースを提供する方法が望ましい。
【００１０】
この問題は、精製ＨＭＯから本質的になる粉末を提供するための方法により解決され、前記方法は、ＨＭＯを含有する水溶液の噴霧乾燥を含む。
【発明の概要】
【００１１】
第１の態様において、３−フコシルラクトースから本質的になる噴霧乾燥粉末が提供され、方法が提供される。
第２の態様において、３−フコシルラクトースから本質的になる噴霧乾燥粉末を製造するための方法が提供される。
【００１２】
第３の態様において、栄養組成物を製造するための３−フコシルラクトースから本質的になる噴霧乾燥粉末の使用が提供される。
第４の態様において、３−フコシルラクトースから本質的になる噴霧乾燥粉末を含む栄養組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】噴霧乾燥３−フコシルラクトースの粉末Ｘ線回折の結果を示すグラフである。
【図２】噴霧乾燥ラクト−Ｎ−テトラオースの粉末Ｘ線回折の結果を示すグラフである。
【図３】噴霧乾燥６’−シアリルラクトースの粉末Ｘ線回折の結果を示すグラフである。
【図４】噴霧乾燥３’−シアリルラクトースの粉末Ｘ線回折の結果を示すグラフである。
【図５】２’−フコシルラクトースおよびラクト−Ｎ−テトラオースの噴霧乾燥混合物の粉末Ｘ線回折の結果を示すグラフである。
【図６】２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、３’−シアリルラクトース、および６’−シアリルラクトースの噴霧乾燥混合物の粉末Ｘ線回折の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
第１の態様によれば、微生物発酵により生成された３−フコシルラクトースから本質的になる噴霧乾燥粉末が提供される。
３−フコシルラクトースは、本明細書で以下に記載される微生物発酵により生成される。「から本質的になる」という用語は、本明細書において使用される場合、噴霧乾燥粉末が、３−フコシルラクトースと、任意選択で、３−フコシルラクトースの生成のための微生物発酵中に生成されるが、微生物発酵から得られたプロセス流から除去されていない可能性がある副生成物とからなることを意味する。「から本質的になる」という用語は、少なくとも８０ｗｔ％、少なくとも８５ｗｔ％、少なくとも９０ｗｔ％、少なくとも９３ｗｔ％、少なくとも９５ｗｔ％、または少なくとも９８ｗｔ％の３−フコシルラクトースからなる噴霧乾燥粉末を含む。
【００１５】
追加および／または代替の実施形態において、３−フコシルラクトースは、噴霧乾燥粉末中に非晶質形態で存在する。
追加および／または代替の実施形態において、噴霧乾燥粉末は、１５ｗｔ％以下の水、好ましくは１０ｗｔ％以下の水、より好ましくは７ｗｔ％以下の水、最も好ましくは５ｗｔ％以下の水を含有する。
【００１６】
追加および／または代替の実施形態において、噴霧乾燥粉末は、遺伝子操作微生物、および遺伝子操作微生物由来の核酸分子を含まない。
第２の態様によれば、微生物発酵により生成された３−フコシルラクトースから本質的になる噴霧乾燥粉末を製造するための方法が提供される。方法は、
ａ）発酵ブロスから３−フコシルラクトースを精製する工程と；
ｂ）工程ａ）の３−フコシルラクトースの水溶液を用意する工程と；
ｃ）工程ｂ）の溶液を噴霧乾燥に供する工程と
を含む。
【００１７】
追加および／または代替の実施形態において、発酵ブロスから３−フコシルラクトースを精製する工程は、
ｉ）発酵ブロスから微生物細胞を除去して、清澄化プロセス流を得る工程；
ｉｉ）清澄化プロセス流を少なくとも１回の限外濾過に供する工程；
ｉｉｉ）清澄化プロセス流をカチオン交換樹脂で少なくとも１回、および／もしくはアニオン交換樹脂で少なくとも１回処理する工程；
ｉｖ）清澄化プロセス流を少なくとも１回のナノ濾過に供する工程；
ｖ）清澄化プロセス流を少なくとも１回の電気透析に供する工程；
ｖｉ）清澄化プロセス流を活性チャコールで少なくとも１回処理する工程；ならびに／または
ｖｉｉ）清澄化プロセス流を少なくとも１回結晶化および／もしくは沈殿工程に供する工程
の１つまたは複数を含む。
【００１８】
３−フコシルラクトースは、微生物発酵により生成され得、３−フコシルラクトースを合成することができる遺伝子操作微生物が、培養培地（発酵ブロス）中で、および前記遺伝子操作微生物による３−フコシルラクトースの合成を許容する条件下で培養される。微生物発酵により生成された３−フコシルラクトースの精製は、発酵ブロスから微生物細胞を分離して、細胞を本質的に含まず、３−フコシルラクトースを含有する清澄化プロセス流を得る工程を含む。この工程は、所望のオリゴ糖を精製する方法の第１の工程である。
【００１９】
発酵ブロスから微生物細胞を分離するための好適な方法は遠心分離を含み、微生物細胞はペレットとして得られ、発酵ブロスは上清として得られる。追加および／または代替の実施形態において、微生物細胞は、濾過を用いることにより発酵ブロスから分離される。発酵ブロスから細胞を分離するための好適な濾過方法は、精密濾過および限外濾過を含む。
【００２０】
そのような精密濾過は、粒子含有流体が特殊な細孔サイズの膜に通されて流体から粒子が分離される、物理的濾過プロセスである。「精密濾過」という用語は、本明細書において使用される場合、発酵ブロスから細胞が分離される物理的濾過プロセスを指す。
【００２１】
限外濾過は膜濾過の１種であり、根本的な違いはない。限外濾過では、圧力または濃度勾配等の力が、半透膜を介した分離をもたらす。細胞、懸濁固体および高分子量の溶質は、いわゆる保持物中に保持され、一方水および低分子量溶質、例えば所望のシアリル化オリゴ糖は、膜を通過して透過液（濾液）中に入る。
【００２２】
限外濾過膜は、使用される膜の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）により定義される。限外濾過は、クロスフローまたはデッドエンドモードで適用される。
典型的には、微生物細胞は、３−フコシルラクトースを細胞内で合成し、それを発酵ブロス中に分泌する。このようにして生成された３−フコシルラクトースは、最終的には発酵ブロス中にあり、これが次いで本明細書で以降に記載されるように３−フコシルラクトースの精製のためのさらなるプロセス工程に供される。
【００２３】
方法は、微生物発酵により生成された３−フコシルラクトースの精製に使用されるが、この方法はまた、ｉｎ−ｖｉｔｒｏでの酵素触媒により生成された３−フコシルラクトースを精製するために使用されてもよい。３−フコシルラクトースは、生体触媒反応の最後に反応混合物から精製され得る。この反応混合物は、清澄化プロセス流として精製のプロセスに供される。
【００２４】
清澄化プロセス流は、３−フコシルラクトース、ならびに副生成物および望ましくない不純物、例えば単糖、二糖、望ましくないオリゴ糖副生成物、イオン、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質および／または核酸を含む。
【００２５】
追加および／または代替の実施形態において、３−フコシルラクトースを精製するための方法は、清澄化プロセス流から正電荷を有する化合物を除去するために、少なくとも１回のカチオン交換処理の工程を含む。
【００２６】
正電荷を有する化合物を除去するための好適なカチオン交換樹脂は、Ｌｅｗａｔｉｔ  Ｓ２５６８（Ｈ＋）（Ｌａｎｘｅｓｓ  ＡＧ、ケルン、ＤＥ）を含む。
追加および／または代替の実施形態において、３−フコシルラクトースを精製するための方法は、清澄化プロセス流から望ましくない負電荷を有する化合物を除去するために、アニオン交換処理の工程を含む。
【００２７】
好適なアニオン交換樹脂は、Ｌｅｗａｔｉｔ  Ｓ６３６８Ａ、Ｌｅｗａｔｉｔ  Ｓ４２６８、Ｌｅｗａｔｉｔ  Ｓ５５２８、Ｌｅｗａｔｉｔ  Ｓ６３６８Ａ（Ｌａｎｘｅｓｓ  ＡＧ、ケルン、ＤＥ）、Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ  １ｘ２（メッシュ２００〜４００）、Ｄｏｗｅｘ  １ｘ８（メッシュ１００〜２００）、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ＣＧＡ  １００ｘ４（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  ＧｍｂＨ、ラーティンゲン、ＤＥ）、Ｄｏｗ  Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＦＰＡ５１（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＭＩ、ＵＳＡ）を含む。
【００２８】
追加および／または代替の実施形態において、３−フコシルラクトースを精製するための方法は、より低分子量の不純物を除去し、所望のオリゴ糖を濃縮するために、ナノ濾過および／または透析濾過工程を含む。
【００２９】
透析濾過は、膜透過性成分を除去（洗浄）するために溶液に新鮮な水を添加することを含む。透析濾過は、１つまたは複数の種が効率的に保持され、他の種は膜透過性である適切な膜を使用することによって、その分子サイズおよび電荷に基づいて成分を分離するために使用され得る。特に、ナノ濾過膜を使用した透析濾過は、小分子および塩等の低分子量化合物の分離に効果的である。ナノ濾過膜は通常、１５０〜１０００ダルトンの範囲内の分子量カットオフを有する。ナノ濾過は、酪農業において乳清の濃縮および脱ミネラル化のために広く使用される。
【００３０】
ナノ濾過および／または透析濾過のための好適な膜は、Ｄｏｗ  Ｆｉｌｍｔｅｃ  ＮＦ２７０−４０４０、Ｔｒｉｓｅｐ  ４０４０−ＸＮ４５−ＴＳＦ（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ  ＧｍｂＨ、ヴィースバーデン、ＤＥ）、ＧＥ４０４０Ｆ３０およびＧＨ４０４０Ｆ５０（ＧＥ  Ｗａｔｅｒ  ＆  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ラーティンゲン、ＤＥ）を含む。
【００３１】
ナノ濾過膜を使用した透析濾過は、オリゴ糖含有溶液の電気透析処理の前に著しい量の夾雑物を除去するための前処理として効率的であることが判明した。ＨＭＯの精製中の濃縮および透析濾過のためのナノ濾過膜の使用は、より低いエネルギーおよび処理コスト、ならびに低減された熱曝露に起因するより良好な製品品質をもたらし、メイラード反応およびアルドール反応の低減につながる。
【００３２】
追加および／または代替の実施形態において、３−フコシルラクトースを精製するための方法は、少なくとも１回の電気透析工程を含む。
電気透析（ＥＤ）は、透析および電気分解を組み合わせたものであり、半透膜を通したその選択的エレクトロマイグレーションに基づく溶液中のイオンの分離または濃縮に使用され得る。
【００３３】
電気透析の基本原理は、直流発電機に接続された、イオン伝導のために電解質に浸漬された電極の対を備える電解槽からなる。直流発電機の陽極に接続された電極はアノードであり、陰極に接続された電極はカソードである。次いで電解液は電流の流れを担うが、これは、それぞれアノードおよびカソードに向かう陰イオンおよび陽イオンの移動から生じる。電気透析に使用される膜は、本質的に、負電荷基または正電荷基を有する多孔質イオン交換樹脂のシートであり、したがってそれぞれカチオン膜またはアニオン膜と記述される。イオン交換膜は、通常、ジビニルベンゼンと架橋された好適な官能基（例えばカチオン膜の場合スルホン酸基、またはアニオン膜の場合四級アンモニウム基）を保持するポリスチレンで作製される。電解質は、例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウムまたはスルファミン酸であってもよい。次いで、イオンが枯渇している流れが、イオンが高濃度化されている流れから十分に分離される（２つの溶液はまた、希釈物（イオンが枯渇している）および濃縮物（イオンが高濃度化されている）と呼ばれる）ように、アニオン膜およびカチオン膜が２つの電極ブロック間のフィルタプレスのように平行となる様式で電気透析積層体が組み立てられる。電気透析プロセスの中心は膜積層体であり、これは、２つの電極間に設置されるスペーサーで隔てられたいくつかのアニオン交換膜およびカチオン交換膜からなる。直流電流を印加することにより、アニオンおよびカチオンは、膜を介して電極に移動する。
【００３４】
追加および／または代替の実施形態において、３−フコシルラクトースを精製するための方法は、疑似床移動（ＳＭＢ）クロマトグラフィー等の連続クロマトグラフィーの工程をさらに含む。
【００３５】
疑似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーは、石油化学工業および鉱業で始まった。今日では、ＳＭＢクロマトグラフィーは、製薬産業によりラセミ混合物から鏡像異性体を単離するために使用されている。大規模ＳＭＢクロマトグラフィーは、フルクトース−グルコース溶液からの単糖フルクトースの分離に、およびテンサイまたはサトウキビシロップからの二糖スクロースの分離にすでに使用されている。
【００３６】
糖を分離するために使用されるＳＭＢプロセスは、例えば、カルシウム充填架橋ポリスチレン樹脂、重亜硫酸塩形態のアニオン樹脂（Ｂｅｃｈｔｈｏｌｄ  Ｍ．ら、Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｇｅｎｉｅｕｒ  Ｔｅｃｈｎｉｋ、２０１０、８２、６５〜７５）、または水素形態のポリスチレンゲル強酸カチオン樹脂（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  ＰＣＲ８３３Ｈ）（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ、Ｂａｌａ  Ｃｙｎｗｙｄ、ＵＳＡ）を使用する。
【００３７】
連続動作モード、移動相のリサイクル、および大型カラムサイズを使用する可能性を考慮して、ＳＭＢシステムは、原則的に、数百トンの生産量を達成するように拡張され得る。
【００３８】
疑似移動床クロマトグラフィーのプロセス工程は、このプロセス工程により所望のオリゴ糖に構造的に密接に関連したオリゴ糖のさらなる除去が可能になるという点で有利である。
【００３９】
追加および／または代替の実施形態において、３−フコシルラクトースを精製するための方法は、プロセス流から着色剤等の汚染物質を除去するための、プロセス流の活性チャコールでの処理を含む。
【００４０】
追加および／または代替の実施形態において、３−フコシルラクトースを精製するための方法は、清澄化プロセス流からの３−フコシルラクトースの結晶化または沈殿の少なくとも１つの工程を含む。プロセス流からの３−フコシルラクトースの結晶化または沈殿は、３−フコシルラクトースを含むプロセス流に、水と混和性の好適な量の有機溶媒を添加することにより行うことができる。有機溶媒は、Ｃ１〜Ｃ６−アルコールおよびＣ１〜Ｃ４−炭素酸からなる群から選択され得る。
【００４１】
追加および／または代替の実施形態において、３−フコシルラクトースを精製するための方法は、好ましくは３ｋＤａフィルタまたは６ｋＤａフィルタを通したプロセス流の濾過による、無菌濾過および／またはエンドトキシン除去の工程を含む。
【００４２】
追加および／または代替の実施形態において、３−フコシルラクトース（３−ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓ）を精製するための方法は、プロセス流中の３−フコシルラクトースの濃度を増加させる工程を含む。プロセス流中の３−フコシルラクトースの濃度は、プロセス流を真空蒸発、逆浸透またはナノ濾過（例えば２０Å以下のサイズ排除限界を有するナノ濾過膜によるナノ濾過）に供することにより増加され得る。あるいは、結晶化または沈殿した３−フコシルラクトースを水に溶解し、所望の濃度の３−フコシルラクトースを有する３−フコシルラクトースの溶液を得る。
【００４３】
追加および／または代替の実施形態において、得られるプロセス流は、２０ｇ／Ｌ以上、２５ｇ／Ｌ以上、３０ｇ／Ｌ以上、４０ｇ／Ｌ以上、６０ｇ／Ｌ以上、１００ｇ／Ｌ以上、２００ｇ／Ｌ以上、またはさらに３００ｇ／Ｌ以上の濃度の３−フコシルラクトースを含む水溶液である。
【００４４】
追加および／または代替の実施形態において、水溶液は、溶液中の乾燥物質／溶質の重量に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の純度の３−フコシルラクトースを含む。
【００４５】
精製３−フコシルラクトースを含む得られた濃縮物は、適切な条件下で保存され得る。
３−フコシルラクトースを精製するための方法は、コスト効率的であり、スケールアップが容易であり、数トン規模の製造方法の基礎として好適である。
【００４６】
３−フコシルラクトースを精製するための方法はまた、水溶液が遺伝子操作微生物、および遺伝子操作微生物由来の核酸分子を含まないという点で有利である。さらに、水溶液は、タンパク質を含まない。タンパク質を完全に除去すると、潜在的消費者にアレルギーをもたらすリスクが排除される。
【００４７】
噴霧乾燥粉末を製造するための方法は、３−フコシルラクトースを含む水溶液を提供する工程を含む。
追加および／または代替の実施形態において、水溶液は、少なくとも２０％（ｗ／ｖ）、３０％（ｗ／ｖ）、３５％（ｗ／ｖ）、および最大４５％（ｗ／ｖ）、５０％（ｗ／ｖ）、６０％（ｗ／ｖ）の量の３−フコシルラクトースを含有する。
【００４８】
追加および／または代替の実施形態において、水溶液は、溶液中の乾燥物質／溶質の重量に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の純度の３−フコシルラクトースを含有する。
【００４９】
追加および／または代替の実施形態において、水溶液は、遺伝子操作微生物、遺伝子操作微生物由来の核酸分子、およびタンパク質を含まない。
噴霧乾燥粉末の製造方法において、３−フコシルラクトース含有水溶液は、噴霧乾燥に供される。
【００５０】
噴霧乾燥は、乾燥粉末を得るための方法であり、目的の物質（すなわち３−フコシルラクトース）を含む溶液は、まず液滴として噴霧され、これが高温空気により急速に乾燥される。噴霧乾燥は非常に速く、乾燥させる物質の高温への曝露は極めて短期間である。
【００５１】
追加および／または代替の実施形態において、発酵ブロスまたはプロセス流から精製された３−フコシルラクトース含有水溶液は、少なくとも１１０℃、好ましくは少なくとも１２０℃、より好ましくは少なくとも１２５℃、および１５０℃未満、好ましくは１４０℃未満、より好ましくは１３５℃未満のノズル温度で噴霧乾燥される。
【００５２】
追加および／または代替の実施形態において、発酵ブロスまたはプロセス流から精製された３−フコシルラクトース含有水溶液は、少なくとも６０℃、好ましくは少なくとも６５℃、および８０℃未満、好ましくは７０℃未満の出口温度で噴霧乾燥される。特に好ましい実施形態において、３−フコシルラクトース含有水溶液は、約６８℃〜約７０℃のノズル温度で噴霧乾燥される。
【００５３】
３−フコシルラクトース（３−ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｓｅ）含有水溶液の噴霧乾燥は、低吸湿性の粉末を提供し、３−フコシルラクトースは非晶質形態で存在し、粒子サイズは均一である。
【００５４】
第３の態様によれば、栄養組成物を製造するための、プロセス流から精製された３−フコシルラクトース含有噴霧乾燥粉末の使用が提供される。３−フコシルラクトースから本質的になる噴霧乾燥粉末は、ヒトによる消費に好適であり、したがって、医薬製剤、乳児用フォーミュラ、乳飲料または健康補助食品等のヒトによる消費用の調製物中に含めることができる。
【００５５】
第４の態様によれば、第２の態様に従って製造された第１の態様に記載の噴霧乾燥粉末を含有する栄養組成物が提供される。
追加および／または代替の実施形態において、栄養組成物は、３−フコシルラクトースではない少なくとも１種の追加のＨＭＯを含有する。少なくとも１種の追加のＨＭＯは、好ましくは２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）、ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、およびラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）からなる群から選択される中性ＨＭＯであってもよい。追加および／または代替の実施形態において、少なくとも１種の追加のＨＭＯは、好ましくは３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）、６’−シアリルラクトース（６’−ＳＬ）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＳＴ）−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃおよびジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース（ＤＳＬＮＴ）からなる群から選択されるシアリル化ＨＭＯであってもよい。
【００５６】
追加および／または代替の実施形態において、栄養組成物は、Ｎｅｕ５Ａｃ、２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰＩ、３’−ＳＬ、６’−ＳＬ、シアル酸およびＬ−フコースから本質的になる混合物を含む。好ましい量の前記化合物のそれぞれを含む栄養組成物を、表１に示す。
【００５７】
【表１】
2021505170.tif 000003
【００５８】
表１の２列目による組成は、直接消費のための最終的乳児用フォーミュラが表１の３列目に指定された濃度の混合物の化合物を含有し得るように、乳児用フォーミュラを補足するのに特に有利である。
【００５９】
追加および／または代替の実施形態において、栄養組成物は、１つまたは複数の追加の成分を含有する。上記１つまたは複数の追加の成分は、油、脂肪および脂肪酸（例えばオリーブ油、ヒマワリ油、ココナッツ油、ナッツ油、菜種油、パーム油、アマニ油、魚油、リノレン酸、大豆油等）、炭水化物（例えばグルコース、フルクトース、ラクトース、マルトデキストリン、デンプン、スクロース、イノシトール等）、タンパク質（無脂肪乳、乳清、カゼイン（任意の乳畜由来）、または大豆からのもの）、ビタミン（Ａ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ビオチン、葉酸、ナイアシン、コリン）、ミネラルおよび微量元素（ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、リン、マグネシウム、鉄、亜鉛、マンガン、フッ化物、セレン、ヨウ素、銅）からなる群から選択される。
【００６０】
好ましい実施形態において、噴霧乾燥ヒトミルクオリゴ糖またはヒトミルクオリゴ糖の混合物またはヒトミルクオリゴ糖と機能性単糖との混合物またはヒトミルクオリゴ糖と他の繊維との混合物を含む栄養組成物は、規則（ＥＵ）２０１６／１２７および／または連邦規制基準（ＵＳＡ）Ｔｉｔｌｅ  ２１  １０７．１００（栄養物仕様）に記載の組成要件に適合する乳児用フォーミュラである。乳児用フォーミュラの代表的組成を、表２および３に示す。
【００６１】
【表２】
2021505170.tif 000004
【００６２】
【表３−１】
2021505170.tif 000005
【００６３】
【表３−２】
2021505170.tif 000006
【００６４】
追加および／または代替の実施形態において、栄養組成物はまた、微生物、好ましくはプロバイオティクス微生物を含む。乳児用食品用途では、好ましい微生物は、健康なヒトの微生物叢から得られる、またはそれに見出すことができる。好ましくは、これらに限定されないが、微生物は、ビフィドバクテリウム属、ラクトバチルス属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、ペプトストレプトコッカス属、ロイコノストック属、クロストリジウム属、ユーバクテリウム属、ベイロネラ属、フソバクテリウム属、バクテロイデス属、プレボテラ属、エシェリキア属、プロピオニバクテリウム属およびサッカロミセス属から選択される。追加および／または代替の実施形態において、微生物は、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、Ｂ．アニマリス、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．インファンティス、Ｂ．ラクティス、Ｂ．ロンガム；エンテロコッカス・フェシウム；大腸菌；クリベロマイセス・マルキシアヌス；ラクトバチルス・アシドフィルス、Ｌ．ブルガリカス、Ｌ．カゼイ、Ｌ．クリスパタス、Ｌ．ファーメンタム、Ｌ．ガセリ、Ｌ．ヘルヴェティクス、Ｌ．ジョンソニイ、Ｌ．パラカゼイ、Ｌ．プランタラム、Ｌ．ロイテリ、Ｌ．ラムノサス、Ｌ．サリバリウス、Ｌ．サケイ；ラクトコッカス・ラクティス（亜種であるラクティス、クレモリスおよびジアセチラクティスを含むがこれらに限定されない）；ロイコノストック・メセンテロイデス（亜種であるメセンテロイデスを含むがこれに限定されない）；ペディオコッカス・アシディラクティシ、Ｐ．ペントサス；プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ、Ｐ．フロイデンライヒｓｓｐ．シェルマニー；スタフィロコッカス・カルノーサス；ならびにストレプトコッカス・サーモフィルスからなる群から選択される。
【００６５】
生体の組合せに加えて、栄養組成物はまた、死細胞培養物を含んでもよい。プロバイオティクスの分野において、死滅細胞培養物が使用される場合がある（例えば間欠滅菌された（ｔｙｎｄａｌｉｚｅｄ）細菌）。これらの死滅培養物は、タンパク質、ペプチド、オリゴ糖、細胞外壁断片および天然生成物を提供し、免疫系の短期刺激をもたらし得る。
【００６６】
特にＨＭＯの存在下で栄養組成物中にプロバイオティクス微生物を含めることは、健康な腸内微生物叢の確立も促進するという点で特に有利である。
追加および／または代替の実施形態において、栄養組成物はまた、ガラクト−オリゴ糖（ＧＯＳ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、イヌリンまたはそれらの組合せ等のプレバイオティクスを含む。
【００６７】
栄養組成物は、これらに限定されないが、粉末、顆粒、フレーク、ペレットまたはそれらの組合せを含む固体形態で存在する。
追加の実施形態において、栄養組成物は、医薬製剤、乳児用フォーミュラ、乳飲料および健康補助食品からなる群から選択される。
【００６８】
医薬製剤として、栄養組成物は、認知能力を改善するために、特に注意力、学習および／または記憶を改善するために使用され得る。
具体的な実施形態に関して、および図面を参照しながら本発明を説明するが、本発明はそれに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、明細書および特許請求の範囲における第１、第２等の用語は、類似の要素間を区別するために使用され、必ずしも、時間的、空間的、ランク付けまたは任意の他の様式での順序を説明するものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で互換的であること、および本明細書に記載の本発明の実施形態は、本明細書に記載または例示されるもの以外の順序で機能し得ることを理解されたい。
【００６９】
「含む」という用語は、特許請求の範囲において使用される場合、その後に列挙される手段に制限されるものとして解釈されるべきではなく、他の要素または工程を除外しないことに留意されたい。したがってこれは、参照されるような述べられた特徴、整数、工程または構成要素の存在を指定するものであるが、１つまたは複数の他の特徴、整数、工程もしくは構成要素、またはそれらの群の存在または追加を除外しないものとして解釈されるべきである。したがって、「手段ＡおよびＢを含むデバイス」という表現の範囲は、構成要素ＡおよびＢのみからなるデバイスに限定されるべきではない。これは、本発明に関して、デバイスの唯一の関連する構成要素がＡおよびＢであることを意味する。
【００７０】
本明細書全体にわたる「一実施形態」または「実施形態」という言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所での「一実施形態において」または「実施形態において」という語句の出現は、必ずしも常に同じ実施形態を指すわけではない。さらに、本開示から当業者に明らかであるように、特定の特徴、構造または特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わされてもよい。
【００７１】
同様に、本発明の代表的な実施形態の説明において、本発明の様々な特徴が、単一の実施形態、図、またはその説明において、開示の簡素化、および様々な本発明の態様の１つまたは複数の理解の容易化のために、一緒にまとめられる場合があることを理解されたい。この開示の方法は、請求される発明が各請求項において明示的に列挙されるものより多くの特徴を必要とすることの意図を反映するものとして解釈されるべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映するように、本発明の態様は、任意の上記の開示された実施形態の全ての特徴より少ない特徴を必要とし得る。したがって、詳細な説明に続く特許請求の範囲はこの詳細な説明に明示的に組み込まれ、各請求項は、本発明の別個の実施形態として独立している。
【００７２】
さらに、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴を含み、他の特徴は含まないが、異なる実施形態の特徴の組合せは、本発明の範囲内であることを意図し、当業者に理解されるように、異なる実施形態を形成する。例えば、以下の特許請求の範囲において、請求される実施形態のいずれも、任意の組合せとして使用され得る。
【００７３】
さらに、実施形態のいくつかは、本明細書において、コンピュータシステムのプロセッサによって、または機能を実行する他の手段によって実装され得る方法または方法の要素の組合せとして説明される。したがって、そのような方法または方法の要素を実行するために必要な命令を有するプロセッサは、方法または方法の要素を実行するための手段を形成する。さらに、装置実施形態の本明細書に記載の要素は、本発明を実行するための要素によって行われる機能を実行するための手段の例である。
【００７４】
本明細書に記載の説明および図面において、数多くの具体的な詳細が記載される。しかしながら、本発明の実施形態は、これらの具体的な詳細なしで実践されてもよい。他の場合において、周知の方法、構造および技術は、説明および図面の理解を容易にするために詳細には示されていない。
【００７５】
ここで、本発明のいくつかの実施形態の詳細な説明により本発明を説明する。本発明の精神または技術的利点から逸脱せずに、本発明の他の実施形態が当業者の知識に従って構成され得るが、本発明は添付の特許請求の範囲の用語によってのみ制限されることは明白である。
【実施例】
【００７６】
実施例１
発酵ブロスからの２’−フコシルラクトースの精製
欧州特許出願第１６１９６４８６．１号に記載のように、遺伝子修飾大腸菌株を使用した発酵による２’−フコシルラクトースの生成を行った。ＷＯ２０１５／１０６９４３Ａ１に記載のように、濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ナノ濾過、透析濾過または電気透析、およびチャコールでの処理によって２’−フコシルラクトースを発酵ブロスから精製した。得られた２’−フコシルラクトース含有溶液を噴霧乾燥に供すると、安定な固体生成物が得られた。
【００７７】
実施例２
発酵ブロスからの３−フコシルラクトースの精製
欧州特許出願第１６１９６４８６．１号に記載のように、遺伝子修飾大腸菌株を使用した発酵により３−フコシルラクトースを生成した。
【００７８】
限外濾過（０．０５μｍカットオフ）（ＣＵＴ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、エルクラート、ドイツ）に続いて１５０ｋＤａのＭＷＣＯを有するクロスフローフィルタ（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ、ヴィースバーデン、ドイツ）で濾過することにより、培養培地から細胞を分離した。約３０ｇ／Ｌの３−フコシルラクトースを含有する無細胞発酵培地を、Ｈ＋形態の強カチオン性イオン交換体（Ｌｅｗａｔｉｔ  Ｓ２５６８（Ｌａｎｘｅｓｓ、ケルン、ドイツ））に通過させ、正電荷を有する夾雑物を除去した。その後、水酸化ナトリウムを使用して溶液をｐＨ７．０に設定し、塩化物形態のアニオン性イオン交換体（Ｌｅｗａｔｉｔ  Ｓ６３６８Ａ、Ｌａｎｘｅｓｓ）に適用した。イオン交換体は共に、２００Ｌの体積で使用した。第２の濾過（１５０ｋＤａ；Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ、ヴィースバーデン、ドイツ）の後、粒子を含まない溶液を、Ｆｉｌｍｔｅｃｈ  ＮＦ２７０膜（Ｄｏｗ、ミッドランド、ＵＳＡ）を使用したナノ濾過により５倍、および真空蒸発により２．５倍濃縮した。約１５ｍＳｃｍ−１の導電率を有する濃縮溶液を濾過し（１０ｋＤａ；Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ、ヴィースバーデン、ドイツ）、活性炭チャコール（ＣＡＳ：７４４０−４４−０、Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、カールスルーエ、ドイツ）で浄化し、電気透析により脱イオン化した。そのために、以下の膜を含むＰＣ−Ｃｅｌｌ  Ｅ２００膜積層体を有するＰＣ−Ｃｅｌｌ  ＢＥＤ  １−３電気透析装置（ＰＣ−Ｃｅｌｌ、ホイスヴァイラー、ドイツ）を使用した：カチオン交換膜ＣＥＭ：ＰＣ  ＳＫおよびアニオン膜ＡＥＭ：ＰＣＡｃｉｄ６０。０．２５Ｍのスルファミン酸をプロセスの電解質として使用した。メイラード反応により生じた褐色変色、および発酵プロセス由来のアルドール生成物を低減するために、Ｎａ＋およびＣｌ−形態の上述と同じイオン交換材料を使用して、ただし５０Ｌの体積で２回目のイオン交換クロマトグラフィーを行った。蒸発により糖溶液を濃縮した後、前述のＰＣ−Ｃｅｌｌ  ＢＥＤ  １−３を使用した電気透析により導電率は再び４ｍＳｃｍ−１から０．４ｍＳｃｍ−１以下に低減した。さらなる脱色のために、溶液を活性チャコール（ＣＡＳ：７４４０−４４−０、Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、カールスルーエ、ドイツ）と混合し、濾過によりほぼ無色の溶液を得た。
【００７９】
実施例３
発酵ブロスからのラクト−Ｎ−テトラオースの精製
ラクト−Ｎ−テトラオースのｉｎ  ｖｉｖｏ合成に必須であるゲノムに組み込まれた遺伝子、すなわちＮ−アセチルグルコサミングリコシルトランスフェラーゼ（髄膜炎菌ＭＣ５８からのｌｇｔＡ）、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（サルモネラ菌Salmonella enterica亜種サラメ血清型ＧｒｅｅｎｓｉｄｅからのｗｂｄＯ）、大腸菌Ｋ１２からのｌａｃＹ、共に大腸菌Ｋ１２からのＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼｇａｌＥおよびＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼｇａｌＵを有する遺伝子修飾大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｌａｃＺ株を使用して、ラクト−Ｎ−テトラオースの発酵生成を行った。さらに、グルコサミン−６−ホスフェートシンターゼをコードするｇａｌＳ遺伝子を過剰発現させた。ラクト−Ｎ−テトラオースの発酵生成のために、炭素源として２％グルコースを含む規定無機塩培地中で株を増殖させた。必要に応じて消泡剤を添加した。２５％アンモニア溶液を使用してｐＨを制御した。２１６ｇｌ−１のラクトース原液から１５ｍＭの最終濃度までラクトースを段階的に添加し、培養培地中のラクトース濃度を発酵プロセスの間一定に保持した。副生成物としてのプロセス中の残留ラクトースおよびラクト−Ｎ−トリオースＩＩの蓄積は、発酵槽に添加された第２の大腸菌株により加水分解された。この株は、機能性ベータ−ラクタマーゼ、ベータ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４からのｂｂｈＩ）、および単糖の分解のための機能性ｇａｌ−オペロンを発現した（ＥＰ２８４５９０５Ａ）。
【００８０】
細胞を発酵ブロスから分離し、ラクト−Ｎ−テトラオース含有流体を、実施例２に記載の手順に従って、質量収支により決定される７５〜８０％の純度まで精製した。
非効率的な酵素分解および代謝により生じる汚染炭水化物副生成物を、ＷＯ２０１５／０４９３３１に従い、疑似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーを使用したクロマトグラフィーにより除去した。あるいは、イソプロパノールを用いた結晶化によりラクト−Ｎ−テトラオースを精製した。結晶化のために、ラクト−Ｎ−テトラオース含有溶液を蒸発により２０％の濃度まで濃縮し、噴霧乾燥した。ＮＵＢＩＬＯＳＡ  ＬＴＣ−ＧＭＰ噴霧乾燥機（ＮＵＢＩＬＯＳＡ、コンスタンツ、ドイツ）を使用して、溶液を窒素流下で１３０℃の入口温度の噴霧乾燥機ノズルに通過させながら、生成物流を６７℃〜６８℃の出口温度を維持するように制御した。
【００８１】
固体材料を、イソプロパノールおよび水の混合物（３：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ））に、１２Ｌのイソプロパノール／水中に１ｋｇの粉末の比率で添加した。懸濁液を激しく撹拌し、次いで不溶性ラクト−Ｎ−テトラオースを濾過し、４０℃で乾燥させた。７３〜８９％の純度の材料で開始して、結晶化ラクト−Ｎ−テトラオースは、約９５％まで、８５％の回収率で精製された。糖を水中に２５％の濃度まで溶解し、６ｋＤａフィルタ（Ｐａｌｌ  Ｍｉｃｒｏｚａ限外濾過モジュールＳＩＰ−２０１３、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ドライアイヒ、ドイツ）および０．２μｍ無菌フィルタに順次通した。上述の条件下で無菌材料を噴霧乾燥することにより、固体材料が得られた。
【００８２】
実施例４
発酵ブロスからの３’−および６’−シアリルラクトースの精製
３’−シアリルラクトースおよび６’−シアリルラクトースの生成のために、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｌａｃＺ株を使用した。株は、共通の遺伝子修飾を有していた：大腸菌からのグルコサミン−６−ホスフェートシンターゼＧｌｍＳ、シネコシスティスｓｐ．からのＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼＳｌｒ１９７５、サッカロミセス・セレビシエからのグルコサミン６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼＧｎａ１、大腸菌からのホスホエノールピルベートシンターゼＰｐｓＡ、共にカンピロバクター・ジェジュニからのＮ−アセチルノイラミネートシンターゼＮｅｕＢおよびＣＭＰ−シアル酸シンテターゼＮｅｕＡの染色体構成的発現。さらに、大腸菌からのラクトースパーミアーゼＬａｃＹ、大腸菌ＷからのｃｓｃＢ（スクロースパーミアーゼ）、ｃｓｃＫ（フルクトキナーゼ）、ｃｓｃＡ（スクロースヒドロラーゼ）、およびｃｓｃＲ（転写制御因子）をコードする遺伝子、ならびに大腸菌Ｋ１２からの遺伝子ｇａｌＥ（ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ）、ｇａｌＴ（ガラクトース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ）、ｇａｌＫ（ガラクトキナーゼ）、およびｇａｌＭ（ガラクトース−１−エピメラーゼ）からなる機能性ｇａｌ−オペロンを、ＢＬ２１株のゲノム内に組み込み、構成的に発現させた。
【００８３】
３’−シアリルラクトースを合成する株は、ビブリオｓｐ．ＪＴ−ＦＡＪ−１６からのアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ遺伝子を保有し、一方６’−シアリルラクトース生成株は、フォトバクテリウム・レイオグナチＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９からのアルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼｐｌｓＴ６を含む。
【００８４】
炭素源として２％スクロースを含有する規定された無機塩培地中で、シアリルラクトース生成株を増殖させた。供給回分段階で供給されるスクロース供給物（５００ｇｌ−１）に、８ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、微量元素、および５ｇｌ−１のＮＨ４Ｃｌを補足した。
【００８５】
シアリルラクトース形成のために、２１６ｇｌ−１のラクトース供給物を使用した。アンモニア溶液（２５％ｖ／ｖ）を使用することによりｐＨを制御した。供給回分発酵は、一定の通気および撹拌下で３０℃で行った。発酵の最後に残留ラクトースを除去するために、β−ガラクトシダーゼを発酵槽に添加した。得られた単糖を、生成株により代謝させた。
【００８６】
次いで、細胞を含まない液体をイオン交換クロマトグラフィーにより脱イオン化した。まず、Ｈ＋形態の２００Ｌの体積の強カチオン交換体（Ｌｅｗａｔｉｔ  Ｓ２５６８（Ｌａｎｘｅｓｓ、ケルン、ドイツ））でカチオン性夾雑物を除去した。ＮａＯＨを使用して、得られた溶液のｐＨを７．０に設定した。第２の工程において、塩化物形態の強アニオン交換体Ｌｅｗａｔｉｔ  Ｓ６３６８Ｓ（Ｌａｎｘｅｓｓ、ケルン、ドイツ）を使用して、アニオン性イオンおよび望ましくない着色剤を溶液から除去した。イオン交換体は、２００Ｌの床容積を有していた。クロスフローフィルタ（１５０ｋＤａカットオフ）（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ、ヴィースバーデン、ドイツ）での第２の濾過工程を使用して、溶液の酸性化に由来する沈殿物を除去した。糖の濃縮のために、Ｄｏｗ  ＦＩＬＭＴＥＣＨ  ＮＦ２７０−４０４０（Ｉｎａｑｕａ、メンヒェングラートバッハ、ドイツ）で、または代替としてＴｒｉｓｅｐ  ４０４０−ＸＮ４５−ＴＳＦ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（０．５ｋＤａカットオフ）（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ、ヴィースバーデン、ドイツ）で溶液をナノ濾過した。後者を使用して、発酵プロセスに由来し、シアリルラクトース溶液を汚染する単糖Ｎ−アセチルグルコサミンを生成物から分離した。次いで、濃縮シアリルラクトース溶液を活性チャコール（ＣＡＳ：７４４０−４４−０、Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、カールスルーエ、ドイツ）で処理して、メイラード反応生成物およびアルドール反応生成物等の着色剤を除去した。シアル酸およびＮ−アセチルグルコスミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓｍｉｎｅ）等の発酵プロセスに由来する副生成物からシアリルラクトースを分離するために、１ｋＤａカットオフ膜ＧＥ４０４０Ｆ３０（ＧＥ  ｗａｔｅｒ  ＆  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ラーティンゲン、ドイツ）により溶液を濾過し、０．６〜０．８ｍＳｃｍ−１の導電率まで透析濾過した。希釈溶液をロータリーエバポレーターで約３００ｇ／Ｌの濃度まで濃縮した。最後のクロマトグラフィー分離において、他の汚染糖、例えばジ−シアリルラクトースを除去した。そのために、濃縮溶液をアセテート形態の弱アニオンイオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＦＰＡ５１、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミシガン、ＵＳＡ）に適用した。シアリルラクトースが樹脂に結合するのは稀であり、ジ−シアリルラクトースが吸着される。したがって、シアリルラクトースは１０ｍＭの酢酸アンモニウムで溶出され、ジ−シアリルラクトースは１Ｍの酢酸アンモニウムで溶出される。酢酸アンモニウムの除去のために、シアリルラクトースを１０倍過剰のエタノールで沈殿させた。固体分画を濾過し、乾燥させた。
【００８７】
２０％のシアリルラクトース溶液を６ｋＤａフィルタ（Ｐａｌｌ  Ｍｉｃｒｏｚａ限外濾過モジュールＳＩＰ−２０１３、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ドライアイヒ、ドイツ）および０．２μｍ無菌フィルタに順次通すことにより、生成物を最終処理した。
【００８８】
Ｂｕｃｈｉ噴霧乾燥機（Ｂｕｃｈｉ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｅｒ  Ｂ−２９０）（Ｂｕｃｈｉ、エッセン、ドイツ）を使用し、以下のパラメータを適用して溶液の一部を噴霧乾燥した：入口温度１３０℃、出口温度６７℃〜７１℃、ガス流量６７０Ｌ／時、アスピレータ１００％。
【００８９】
噴霧乾燥した６’−シアリルラクトースは９１％の純度を有し、一方３’−シアリルラクトース材料は９３％の純度を有していた。
実施例５
ＨＭＯ混合物の調製
ＨＭＯの混合物を、固体生成物から調製した。そのために、単一ＨＭＯを噴霧乾燥し、粉末を混合した。ＨＭＯ混合物Ｉは、２’−フコシルラクトースおよびラクト−Ｎ−テトラオースを７０％対３０％の比率で含み、ＨＭＯ混合物ＩＩは、２’−フコシルラクトース（５２％）、３−フコシルラクトース（１３％）、ラクト−Ｎ−テトラオース（２６％）、３’−シアリルラクトース（４％）および６’−シアリルラクトース（５％）を含んでいた。混合粉末を２０％の糖の溶液まで水に溶解し、再び実施例４に記載のようにＢｕｃｈｉ噴霧乾燥機を使用して噴霧乾燥した。
【００９０】
実施例６
噴霧乾燥ヒトミルクオリゴ糖の特性決定
６．１  示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ８２１ｅ（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ、ギーセン、ドイツ）で示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、噴霧乾燥ヒトミルクオリゴ糖、すなわち３−フコシルラクトース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、およびヒトミルクオリゴ糖の噴霧乾燥混合物、２’−フコシルラクトース／ラクト−Ｎ−テトラオースの混合物（ＨＭＯ混合物Ｉ）、および２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリルラクトースの混合物（ＨＭＯ混合物ＩＩ）のそれぞれの熱イベントを決定した。
【００９１】
Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ８２１ｅ（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ、ギーセン、ドイツ）を使用して、噴霧乾燥生成物の熱イベント（ガラス転移温度（Ｔｇ）、さらなる発熱および吸熱イベント）を決定した。
【００９２】
約２５ｍｇの噴霧乾燥ヒトミルクオリゴ糖を、クリンプされたＡｌるつぼ（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ、ギーセン、ドイツ）内で分析した。試料を１０Ｋ／分で０℃に冷却し、１０Ｋ／分の走査速度で１００℃に再加熱した。第２の加熱サイクルで試料を０℃に冷却した後、試料を１５０℃に再加熱した。加熱走査中のベースラインの吸熱シフトの中点が、ガラス転移温度（Ｔｇ）とみなされた。発熱および吸熱ピークは、イベントのピーク温度および正規化エネルギーを用いて報告される。
【００９３】
全試料の第１の加熱走査では、約４８〜５８℃の範囲内の主な段階的転移により明らかである、全熱流量における主要なガラス転移イベントが示され、試料のほとんどにおいて、第１の加熱走査において観察された主要なガラス転移イベントは、第２の加熱走査で再び発生した。ＤＳＣ分析の結果を図４に要約する。
【００９４】
【表４】
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【００９５】
３−フコシルラクトースの場合、第１の加熱走査におけるＴｇ後に吸熱緩和ピークが検出された。ラクト−Ｎ−テトラオースの場合、他の試料と比較して、第２の加熱走査においてはるかに高い約７９℃のＴｇが検出された。これは、約８９℃（−６．０４Ｊ／ｇ）での第１の加熱走査中の吸熱イベントにより引き起こされ得る。３−フコシルラクトースの場合と同様、６’−シアリルラクトースの場合も、Ｔｇの後に吸熱緩和ピークが検出されたが、この試料ではさらに７７℃（−０．２２Ｊ／ｇ）で吸熱イベントが生じた。３’−シアリルラクトースおよびＨＭＯ混合物Ｉでは吸熱イベントは検出されなかったが、ＨＭＯ混合物ＩＩの場合、第１の加熱走査中の吸熱イベントは７９℃（０．３４Ｊ／ｇ）であった。
【００９６】
６．２  粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）
広角粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）を使用して、凍結乾燥生成物の形態を精査した。銅アノード（４５ｋＶ、４０ｍＡ、０．１５４ｎｍの波長でＫα１発光）およびＰＩＸｃｅｌ３Ｄ検出器を備えたＸ線回折計Ｅｍｐｙｒｅａｎ（Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ、アルメロ、オランダ）を使用した。約１００ｍｇの噴霧乾燥試料を、反射モードで、５〜４５°の２θ角範囲内、０．０４°の２θステップサイズ、およびステップ当たり１００秒のカウント時間で分析した。
【００９７】
全ての単一オリゴ糖ならびにＨＭＯ混合物ＩおよびＩＩは、完全に非晶質の状態を示した（図１〜６）。ラクト−Ｎ−テトラオースの場合、第２の（非晶質）信号が９〜１０°付近に検出された。
【００９８】
６．３  レーザ回折
レーザ回折により粉末粒子サイズを評価した。システムは、同心円状に配置されたセンサ素子のアレイによって散乱光および回折光を検出する。次いで、ソフトウェアアルゴリズムが、異なるセンサ素子に到達する光強度値のｚ値を計算することによって粒子カウントを近似する。分析は、ＳＡＬＤ−７５００  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｓｉｚｅｒ  （株式会社島津製作所、京都、日本）定量レーザ回折システム（ｑＬＤ）を使用して実行された。
【００９９】
少量（スパチュラ先端）の各試料を２ｍｌのイソオクタンに分散させ、超音波処理により５分間均質化した。分散液をイソオクタンで満たされたバッチセル内に移し、手動モードで分析した。
【０１００】
データ取得設定は以下の通りであった：測定毎の信号平均化カウント：１２８、信号蓄積カウント：３、および間隔：２秒。
測定前に、システムをイソオクタンでゼロ調整した。各試料分散液を３回測定したが、平均値および標準偏差が報告される。ソフトウェアＷＩＮＧ  ＳＡＬＤ  ＩＩバージョンＶ３．１を使用してデータを評価した。試料の屈折率は未知であったため、糖（二糖）粒子の屈折率（１．５３０）をサイズ分布プロファイルの決定に使用した。平均および中央直径のサイズ値が報告される。
【０１０１】
全ての試料の平均粒子サイズは非常に類似していたが、ＨＭＯ混合物ＩＩについては若干低い値が測定された。粒子サイズ特性を表５に要約する。さらに、粒子サイズ分布は、試料の全てに対して単一主要サイズの集団の存在を示した。
【０１０２】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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