(57)【要約】アクチビン様キナーゼ４及び／または５受容体（ＡＬＫ４／５）への結合及び／またはそれの活性化を増強する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーを含む成長分化因子９（ＧＤＦ９）タンパク質を含む、顆粒膜細胞の増殖及び分化を促進することが可能な薬剤が開示される。薬剤は、好ましくは、成熟ダイマー形態（例えば、同じ修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーの２つのモノマーを含む）及び／またはプロ／成熟複合体形態で提供される。薬剤は、とりわけ、生殖補助技術に使用されるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの卵母細胞成熟を促進するのに適し得る。【選択図】図１
2021523161.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒膜細胞の増殖及び分化を促進することが可能な薬剤であって、前記薬剤が、アクチビン様キナーゼ４及び／または５受容体（ＡＬＫ４／５）への結合及び／またはそれの活性化を増強する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーを含む成長分化因子９（ＧＤＦ９）タンパク質を含む、前記薬剤。
【請求項２】
成熟ダイマー形態の、請求項１の薬剤。
【請求項３】
プロ／成熟複合体形態の、請求項１の薬剤。
【請求項４】
前記ＧＤＦ９タンパク質が、同じ修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーの２つのモノマーを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項５】
前記修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマー（複数可）が、ヒトＧＤＦ９（ｈＧＤＦ９）に由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項６】
前記修飾ｈＧＤＦ９ポリペプチドモノマー（複数可）がさらに、Ｇ３９１Ｒアミノ酸置換を含む、請求項５に記載の薬剤。
【請求項７】
ＡＬＫ４／５のへの結合及び／またはそれの活性化を増強する前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、（前記ヒト野生型配列由来の）３６３位、３６６位、及び３６９位、または他のＧＤＦ９タンパク質の対応する位置からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸位置の置換から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項８】
ＡＬＫ４／５への結合及び／またはそれの活性化を増強する前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、以下のアミノ酸置換：
（ｉ）Ｓ３６３Ｒ、Ｓ３６３Ｋ、またはＳ３６３Ｈ、
（ｉｉ）Ｋ３６６Ｇ、Ｋ３６６Ａ、Ｋ３６６Ｖ、Ｋ３６６Ｉ、Ｋ３６６Ｌ、またはＫ３６６Ｍ、及び
（ｉｉｉ）Ｎ３６９Ｈ、Ｎ３６９Ｋ、またはＮ３６９Ｒ
から選択される、請求項７に記載の薬剤。
【請求項９】
前記修飾ｈＧＤＦ９ポリペプチドモノマー（複数可）が、以下のアミノ酸置換群：
（ｉ）Ｓ３６３Ｒ、Ｓ３６３Ｋ、またはＳ３６３Ｈ、
（ｉｉ）Ｋ３６６Ｇ、Ｋ３６６Ａ、Ｋ３６６Ｖ、Ｋ３６６Ｉ、Ｋ３６６Ｌ、またはＫ３６６Ｍ、
（ｉｉｉ）Ｎ３６９Ｈ、Ｎ３６９Ｋ、またはＮ３６９Ｒ、及び
（ｉｖ）Ｔ４３１Ｍ、Ｔ４３１Ｓ、またはＴ４３１Ｃ
のそれぞれからのアミノ酸置換を含む、請求項７の薬剤。
【請求項１０】
薬剤であって、ヒトＧＤＦ９（ｈＧＤＦ９）に由来する修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーを含む成長分化因子９（ＧＤＦ９）タンパク質を含み、以下のアミノ酸置換：Ｋ３６６Ｇ、Ｋ３６６Ａ、Ｋ３６６Ｖ、Ｋ３６６Ｉ、Ｋ３６６Ｌ、及びＫ３６６Ｍのうちの少なくとも１つを含む、前記薬剤。
【請求項１１】
前記修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーが、Ｋ３６６Ｇアミノ酸置換を含む、請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１２】
前記修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーがさらに、
（ｉ）Ｓ３６３Ｒ、Ｓ３６３Ｋ、またはＳ３６３Ｈ、及び
（ｉｉ）Ｎ３６９Ｈ、Ｎ３６９Ｋ、またはＮ３６９Ｒ
から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１０または１１に記載の薬剤。
【請求項１３】
前記修飾ｈＧＤＦ９ポリペプチドモノマーが、以下のアミノ酸置換群：
（ｉ）Ｓ３６３Ｒ、Ｓ３６３Ｋ、またはＳ３６３Ｈ、
（ｉｉ）Ｋ３６６Ｇ、Ｋ３６６Ａ、Ｋ３６６Ｖ、Ｋ３６６Ｉ、Ｋ３６６Ｌ、またはＫ３６６Ｍ、
（ｉｉｉ）Ｎ３６９Ｈ、Ｎ３６９Ｋ、またはＮ３６９Ｒ、及び
（ｉｖ）Ｔ４３１Ｍ、Ｔ４３１Ｓ、またはＴ４３１Ｃ
のそれぞれからのアミノ酸置換を含む、請求項１０または１１に記載の薬剤。
【請求項１４】
前記修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーがさらに、アミノ酸置換Ｇ３９１Ｒを含む、請求項１０または１１に記載の薬剤。
【請求項１５】
前記修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーが、以下のアミノ酸置換：Ｓ３６３Ｒ、Ｋ３６６Ｇ、Ｎ３６９Ｈ、及びＧ３９１Ｒを含む、請求項１０または１１の薬剤。
【請求項１６】
前記修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーが、以下のアミノ酸置換：Ｓ３６３Ｒ、Ｋ３６６Ｇ、Ｎ３６９Ｈ、Ｔ４３１Ｍ、及びＧ３９１Ｒを含む、請求項１０または１１に記載の薬剤。
【請求項１７】
前記ＧＤＦ９タンパク質が、前記同じ修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーの２つのモノマーを含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１８】
前記修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーがさらに、Ｓ３９６Ｃ及び／またはＳ４１８Ｃアミノ酸置換（複数可）を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１９】
前記薬剤が、単離形態で提供される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項２０】
組成物であって、任意に、薬理学的に許容される担体及び／または賦形剤と組み合わせた、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の薬剤を含む、前記組成物。
【請求項２１】
顆粒膜細胞の増殖及び分化を促進する方法であって、前記方法が、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬剤または請求項２０に記載の組成物の有効量と、顆粒膜細胞を接触させることを含む、前記方法。
【請求項２２】
顆粒膜細胞の増殖及び分化を促進するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬剤または請求項２０に記載の組成物の使用。
【請求項２３】
顆粒膜細胞の増殖及び分化を促進するための組成物の製造における、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬剤の使用。
【請求項２４】
卵母細胞の成熟を促進する方法であって、前記方法が、未成熟卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬剤または請求項２０に記載の組成物の有効量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２５】
前記方法が、卵母細胞成熟に有利な条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記ＣＯＣを培養することを含み、前記ＣＯＣを、好適な時点（複数可）で、前記培地に請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬剤または請求項２０に記載の組成物を添加することにより、前記薬剤または組成物と接触させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記時点が、前記薬剤または組成物が前記培地に添加される時点は、卵母細胞成熟の後期胞状期に相当する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＯＣが、ヒトＣＯＣである、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
卵母細胞成熟を促進するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬剤または請求項２０に記載の組成物の薬剤の使用。
【請求項２９】
卵母細胞成熟を促進するための、組成物の製造における請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、妊孕性の分野及び不妊症を処置するための方法に関する。特に、本開示は、とりわけ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで卵母細胞の成熟を促進するのに適し得る新規の薬剤及び方法に関する。
【０００２】
先行文献
本出願は、２０１８年５月９日に出願された「妊孕性を高めるための薬剤及び方法」という名称のオーストラリア仮特許出願第２０１８９０１５７９号からの優先権を主張し、この内容の全体が本明細書で参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
女性の不妊症の原因は多数あるが、主に広く、排卵障害、卵管の損傷（卵管性不妊症）、及び子宮または子宮頸部の原因、例えば、子宮内膜症に関連する。
【０００４】
排卵障害が不妊症カップルの約２５％における不妊症の原因であることが推定されている（妊孕性の問題を有する人々に対する評価及び処置、Ｒｏｙａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｉａｎｓ  ＆  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｉｓｔｓ（Ｌｏｎｄｏｎ），Ｆｅｂ  ２０１３を参照のこと）。排卵障害は、通常不十分または不完全な濾胞形成から生じる稀発排卵または無排卵を特徴し、その結果、卵巣の成熟卵胞からの卵母細胞の排出（すなわち、排卵）に至らないか、または極稀に至る。一般的な原因は、視床下部及び下垂体からの生殖ホルモン（すなわち、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ））の調節異常に関連する多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）及び視床下部機能障害を含む。しかし、加えて、卵母細胞自体は、卵胞成長の調節及び促進、それによる、２つの重要な卵母細胞由来の成長因子、すなわち、成長分化因子９（ＧＤＦ９）及び骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）の産生によるそれ自体の発育、に重要な役割を果たすことも知られる。これらの２つの成長因子は、両方ともにＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するが、主に顆粒膜細胞の支持に作用するようであるが（それらは、卵胞発育及び卵母細胞成熟の調整に役割を果たす細胞の増殖及び卵丘細胞への分化を生じさせる（Ｆａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１０））が、卵巣機能に正確な役割、特に、濾胞形成は未だ完全に解明されていない。それにもかかわらず、少なくとも女性では、それぞれの遺伝子のヘテロ接合型変異が原発性卵巣不全（ＰＯＩ）を有する女性に見出されている（Ｄｉ  Ｐａｓｑｕａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４；Ｐａｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１７；Ｄｉｘｉｔ  ｅｔ  ａｌ．２００５）ので、ＧＤＦ９及びＢＭＰ１５の両方が正常な卵巣機能に必須であり、それにより、これらの成長因子の異常なレベルが障害及び濾胞形成不全に関連づけられると考えられる。
【０００５】
ＧＤＦ９及びＢＭＰ１５の役割に関するさらなる研究により、とりわけ、以下のことがわかっている。
（ｉ）女性では、ｈＧＤＦ９自体が潜在的（すなわち、不活性）である一方、マウスでは、ｍＧＤＦ９が、Ｓｍａ及びＭａｄ関連タンパク質（Ｓｍａｄ）−２／３シグナリングを用量依存的に誘導することが可能であることがわかっている（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。
（ｉｉ）顆粒膜細胞がヒツジＧＤＦ９（ｏＧＤＦ９）単独で処置される場合、明らかな生物学的な影響はないが、ヒツジＢＭＰ１５（ｏＢＭＰ１５）で共処置される場合、顆粒膜細胞は、増殖及び分化し（ＭｃＮａｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．２００５）、これらの効果は、ＡＬＫ４／５／７キナーゼ阻害薬の使用によりブロックされる時、Ｓｍａｄ−２／３シグナル伝達により媒介されるようである（ＭｃＩｎｔｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．２００８）、
（ｉｉｉ）ｈＢＭＰ１５は、ＡＬＫ６の活性化を介したＳｍａｄ−１／５／８シグナル伝達を用量依存的に誘導することが可能である（Ａｌ−Ｍｕｓａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）が、ｈＢＭＰ１５処置は単独で、顆粒膜細胞増殖の卵丘膨張または刺激に関連する遺伝子の発現を誘導しない（Ｍｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）、
（ｉｖ）ｈＧＤＦ９：ｈＢＭＰ１５ヘテロダイマーを用いる顆粒膜細胞の処置は、卵丘膨張関連遺伝子の発現に劇的な増加をもたらし、これは、ＡＬＫ４／５／７阻害薬で遮断することができ、これは、主に、ＡＬＫ２／３／６阻害薬の存在により影響を受けない（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。
【０００６】
後者の知見は、特に、ｈＢＭＰ１５によるＳｍａｄ−１／５／８シグナル伝達の活性化が、２次的な役割にすぎず、その主な役割が、ｈＧＤＦ９の活性化であることを示すという点で興味深い。実に、ＢＭＰ１５の唯一の役割は、卵丘膨張を促進する目的でＳｍａｄ−２／３シグナル伝達をより強力に活性化するために、現在クムリンとして知られるＧＤＦ９と共にヘテロダイマーを形成することであり得ると考えられる（上掲のＰｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ；上掲のＭｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．）。卵丘細胞膨張アッセイとの比較試験は、マウスＧＤＦ９：ＢＭＰ１５ヘテロダイマーが、マウスＧＤＦ９ホモダイマーよりも約１０〜３０倍活性であること、及びヒトＧＤＦ９：ＢＭＰ１５ヘテロダイマーが、ＢＭＰ１５ホモダイマーよりも驚くほど１０００〜３０００倍活性であること（ｈＧＤＦ９が潜在的であることを想起される）を示している（上掲のＰｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）。
【０００７】
クムリン（ＧＤＦ９：ＢＭＰ１５ヘテロダイマー）が非常に生物活性であり且つ（例えば、卵母細胞成熟を促進する重要な役割のための）顆粒膜細胞を刺激するために使用された強力なＳｍａｄ−２／３シグナル伝達を介して卵胞発育及び卵母細胞成熟を促進するように見えること（上掲のＭｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．）を認めると、この分子が、女性及び他の雌の哺乳動物の妊孕性を改善するための重要な関与を有し得ると考えられる。この点に関しては、それが生殖補助技術（ＡＲＴ）において有益であり得るかどうかを判定するために、クムリンを用いる一部の研究が行われており、初期の実験により、ブタ卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟（ＩＶＭ）中で使用される場合、プロ−クムリン（すなわち、ＧＤＦ９及びＢＭＰ１５のプロ／成熟ヘテロダイマー複合体）が胚発育を増強させることが示されている（上掲のＭｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．）。
【０００８】
ＩＶＭは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）と組み合わせて使用される生殖補助技術の一種である。２つの方法の主な違いは、卵巣を刺激するための外因性ホルモンの使用である。つまり、従来のＩＶＦは、ｉｎ  ｖｉｖｏで卵母細胞を成熟させる外因性ゴナドトロピンを使用する過剰刺激を含み、この後、成熟ＣＯＣが収集され、卵母細胞（複数可）を受精させる。対照的に、ＩＶＭは、外因性ゴナドトロピンの最小限の使用を必要とするか、または使用を必要としない。むしろ、未成熟ＣＯＣを放出するために、胞状期の小さな卵胞が収集及び穿刺される。次に、ＣＯＣは、卵母細胞成熟に有利な条件下で２４〜４０時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、この後、卵母細胞（複数可）を受精させる。卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）を発症するリスクがほぼ完全に取り除かれ、ＩＶＭは、通常良好な妊娠の進展に影響を与える多くの臨床症状に対処する可能性を有する。例えば、ＩＶＦの前にｅｘ  ｖｉｖｏで多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）に起こる異常な卵胞発育を修正するために、または破壊的がん治療の前に妊孕性温存方策の一部として保存された未成熟卵母細胞を利用する場合（Ｓｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。さらに、ＩＶＭは、ヒトへの使用のみに制限されない。これは、商業的に望ましい特性を有する牛及び羊の飼育など、農業に有益な成果を有する家畜の飼育に受け入れられ、利用される技術である。
【０００９】
しかし、現在まで、ＩＶＭは、従来のＩＶＦで現在達成される成功率よりも低いので、主流の臨床使用には入っていない（Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ  ２０１１）。ＩＶＭ添加剤としてのヒトプロ−クムリンの使用は、現在の成功率を改善するための効果的な出発点を提供し得るが（上掲のＭｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．）、残念ながら、その広範な使用に必要なこのタンパク質の組み換え産生は、現在、多数の要因により悪化する。
【００１０】
まず、ｈＧＤＦ９及びｈＢＭＰ１５の両方の共発現は、一部の制限を有する。つまり、ｈＧＤＦ９及びｈＢＭＰ１５をコードする２つの組み換えプラスミドで宿主発現細胞を同時トランスフェクトすると、ｈＧＤＦ９及びｈＢＭＰ１５が単独で発現される場合と比較して、２つのタンパク質の発現レベルが低下し、それにより、簡単に大量に生成する能力が抑制される。細胞の分布及びトランスフェクション効率にも基づいて、同時トランスフェクションはまた多くの場合、ＧＤＦ９ホモダイマー、ＢＭＰ１５ホモダイマー、及び所望のクムリンヘテロダイマーを含む複雑な混合物の生成をもたらす。これら３つのダイマー形態の全てのモノマータンパク質は、非共有結合であるので、クムリン調製物中の各ダイマーの比率は、容易に決定することはできず（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、モノマーの成熟成分タンパク質へのダイマー分離がもたらされる）、これまでのところ、ｈＧＤＦ９及びｈＢＭＰ１５の両方を含有する共精製調製物中のプロ−クムリンの存在をうまく確認することがわかっている唯一の方法は、Ｓｍａｄ−２／３活性を評価することである（上掲のＭｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．）。これにより、第２の複雑な要因がもたらされる；以下の実施例に示されるように、プロ−クムリンの様々な調製物（すなわち、バッチ）は、ＧＤＦ９濃度で評価される場合、効力が異なる。これは、プロ−クムリン対プロ−ＧＤＦ９ホモダイマーの様々な比を含有するバッチに大いに原因がある可能性があり、それ故、強力なプロ−クムリン調製物を作製するために、プロ−ＧＤＦ９ホモダイマーよりもプロ−クムリン形成を好むように最初にｈＧＤＦ９及びｈＢＭＰ１５の比を最適化する必要があるように思われる。しかし、さらに、マウスにおいて、ｍＢＭＰ１５が５倍増加すると、閉鎖性胞状卵胞数が増加し、続いて、非周期性の早期発症が報告されている（ＭｃＭａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００８）ので、プロ−ＢＭＰ１５ホモダイマーにより引き起こされ得る任意の過剰なＳｍａｄ−１／５／８シグナル伝達が、卵胞の健康状態に悪影響を与え得るので、プロ−ＢＭＰ１５ホモダイマーの形成を制限することも重要であり得る。従って、プロ−ＢＭＰ１５ホモダイマーが有意に存在するリスクは、クムリンの調製及びＡＲＴでの潜在的な使用におけるさらに複雑な要因である。
【００１１】
したがって、有意且つ一貫した量のプロ−クムリンまたはクムリンタンパク質（好ましくは、ＧＤＦ９及び／またはＢＭＰ１５ホモダイマーを含まないか、またはそれを最小量含む）を含むクムリン調製物を生成する現実的な方法、または、別途、ＩＶＭなどの生殖補助技術におけるクムリン活性の使用を調査及び作製するための代替アプローチを進展させる必要がある。
【発明の概要】
【００１２】
本開示の第１の態様によれば、顆粒膜細胞の増殖及び分化を促進することが可能な薬剤が提供され、該薬剤は、アクチビン様キナーゼ４及び／または５受容体（ＡＬＫ４／５）への結合及び／またはそれの活性化を増強する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーを含む成長分化因子−９（ＧＤＦ９）タンパク質を含む。
【００１３】
修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーが、好ましくは、ヒトＧＤＦ９（ｈＧＤＦ９）に由来し、好ましくは、以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む：
（ｉ）Ｓ３６３Ｒ、Ｓ３６３Ｋ、またはＳ３６３Ｈ、
（ｉｉ）Ｋ３６６Ｇ、Ｋ３６６Ａ、Ｋ３６６Ｖ、Ｋ３６６Ｉ、Ｋ３６６Ｌ、またはＫ３６６Ｍ、及び
（ｉｉｉ）Ｎ３６９Ｈ、Ｎ３６９Ｋ、またはＮ３６９Ｒ。
【００１４】
第２の態様では、本開示は、任意に、薬理学的に許容される担体（例えば、溶媒及び／もしくは緩衝液）及び／または賦形剤と組み合わせた第１の態様の薬剤を含む組成物、好ましくは、水性組成物を提供する。
【００１５】
第３の態様では、本開示は、顆粒膜細胞の増殖及び分化を促進する方法（好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで）を提供し、該方法は、顆粒膜細胞を有効量の第１の態様の薬剤または第２の態様の組成物と接触させることを含む。
【００１６】
関連する第４の態様では、本開示は、顆粒膜細胞の増殖及び分化を促進するための第１の態様の薬剤または第２の態様の組成物の使用を提供する。
【００１７】
さらに、第５の態様では、本開示は、顆粒膜細胞の増殖及び分化を促進するための組成物の製造における第１の態様の薬剤の使用を提供する。
【００１８】
さらに、第６の態様では、本開示は、（好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで）卵母細胞の成熟を促進する方法を提供し、該方法は、卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を有効量の第１の態様の薬剤または第２の態様の組成物と接触させることを含む。
【００１９】
第７の態様では、本開示は、卵母細胞の成熟を促進するための第１の態様の薬剤または第２の態様の組成物の使用を提供する。
【００２０】
第８の態様では、本開示は、卵母細胞の成熟を促進するための組成物の製造における第１の態様の薬剤の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】示された予想される１型受容体結合部位を有する成熟ヒトクムリン及び成熟ヒトＧＤＦ９のリボンプロット分子モデル（「リスト」内；各モノマーのリストは、αヘリックス領域により形成される）を示す：（Ａ）ヒトクムリン−ＧＤＦ９（暗い）及びＢＭＰ１５（明るい）モノマーは両方とも、成熟クムリンの１型受容体結合部位の形成に寄与し、各モノマーの反対側は、クムリンタンパク質の両側に２つの異なる１型受容体結合部位を形成する。これは、両方のＳｍａｄシグナル伝達経路を活性化するという特徴をクムリンに付与し；クムリンは、Ｓｍａｄ−２／３シグナル伝達経路を適度に活性化するために、１つのＡＬＫ６受容体を使用し、より重要なことに、反対部位は、Ｓｍａｄ−１／５／８シグナル伝達経路を強力に活性化するために、高親和性でＡＬＫ４／５に結合する。（Ｂ）ヒトＧＤＦ９−成熟ＧＤＦ９ホモダイマーの両方のモノマーは、タンパク質のいずれかの側で同一である１型受容体結合部位の形成に寄与する。プロペプチドから分離される場合、これらの部位は、Ｓｍａｄ−２／３シグナル伝達経路を穏やかに活性化するために、非常に低い親和性でＡＬＫ４／５に結合する。以下に記載されるように、タンパク質の予想される１型受容体結合部位における３つのアミノ酸（星）の置換により、高い親和性を有する２つのＡＬＫ４／５結合部位が生じたことがわかった。上掲のＭｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．から修正された図。
【図２】成熟ｈＧＤＦ９及び成熟ｈＢＭＰ１５ポリペプチド（すなわち、成熟ドメイン）のＣ末端部分のアミノ酸配列アラインメントを提供する。配列は、５９％同一である。ｈＧＤＦ９による１型受容体結合に関与すると予測されるアミノ酸が示される。下線のアミノ酸は、モノマー１（リスト）の予想される１型受容体結合部位を示す。下線太字のアミノ酸は、予想されるモノマー２の１型受容体結合部位を示す（「フィンガー」；フィンガー１及び２は、モノマー構造内のβシートから形成される）。高親和性でＡＬＫ４／５に結合するクムリンの部位は、ｈＢＭＰ１５のリスト（モノマー１）及びｈＧＤＦ９のフィンガー（モノマー２）で構成されると予測される。リスト内のｈＧＤＦ９及びｈＢＭＰ１５間に５つのアミノ酸の差異がある。ｈＧＤＦ９の番号付けを使用すると、これらは、Ｓ３６３Ｒ、Ｋ３６６Ｇ、Ｎ３６９Ｈ、Ｔ４３１Ｍ、及びＤ４４５Ｇである（灰色の網掛けで強調される）。モノマー２のリストには、１つのアミノ酸の差異がある；ｈＧＤＦ９のグリシン３９１と相同な位置に、ｈＢＭＰ１５は、アルギニンを含有する（アスタリスクで強調される）。
【図３】様々な成熟ｈＧＤＦ９変異型タンパク質の産生結果を提供する。示されるクムリン様ＧＤＦ９タンパク質は、以下「クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）」と呼ばれるものであり、アミノ酸置換Ｓ３６３Ｒ、Ｋ３６６Ｇ、Ｎ３６９Ｈ、及びＧ３９１Ｒを組み込む。他の発現された変異型タンパク質は、以下の置換（複数可）Ｔ４３１Ｍ及びＤ４４５Ｇの一方または両方をさらに含んでいた。
【図４】Ｃｏ−ＩＭＡＣ精製後のクムリン様ＧＤＦ９（変異体１）のタンパク質回収実験の結果を提供するウェスタンブロットを示す。レーンの内容は、以下の表３で詳述される。クムリン様ＧＤＦ９の大部分を、０．３３モルのイミダゾールを含有する画分に溶出した。
【図５】プロ−ＧＤＦ９、クムリン、及びクムリン様ＧＤＦ９タンパク質調製物のＳｍａｄ−２／３活性を示すグラフ結果を示す：（Ａ）非共有結合性プロ／成熟複合体（プロ−ＧＤＦ９）としてのｈＧＤＦ９は、潜在的である。独立して生成されたプロ−ＢＭＰ１５を等濃度で添加しても、違いはなかった（すなわち、Ｓｍａｄ−２／３シグナル伝達応答性プロモーターにより誘導されるルシフェラーゼレポータータンパク質の発現は増加しなかった）；（Ａ及びＢ）プロ−クムリンは、用量依存的にルシフェラーゼレポータータンパク質の発現を増加させた。結果はまた、様々なプロ−クムリン調製物のＳｍａｄ−２／３活性は、様々な調製物が様々な比を含有する潜在的なプロ−ＧＤＦ９ホモダイマー及びプロ−ＢＭＰ１５ホモダイマーも含有するので、変動することを示した。対照的に、クムリン様ＧＤＦ９は、均質な調製物であり、プロ−クムリンよりも強力且つ高度にＳｍａｄ−２／３シグナル伝達を一貫して誘導することがわかった；（Ｃ）種々のクムリン様ＧＤＦ９タンパク質を使用する実験は、変異体１及び変異体２が、プロ−クムリン及び「共有結合プロ−クムリン」（すなわち、ＧＤＦ９及びＢＭＰ１５モノマー中の導入されたシステイン残基を介してのＣｙｓ−Ｃｙｓ結合により架橋されたＧＤＦ９及びＢＭＰ１５モノマーを含むプロ−クムリンタンパク質；上掲のＭｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．）よりも有意に高いレベルのルシフェラーゼレポータータンパク質の発現を示したことを示した。
【図６】クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）タンパク質及び市販の組み換えｈＢＭＰ１５タンパク質が示されるＳｍａｄ−１／５／８活性のアッセイ結果を提供する。ｒｈＢＭＰ１５は、Ｓｍａｄ−１／５／８シグナル伝達応答性プロモーターの活性化により誘導されるルシフェラーゼレポータータンパク質の発現を用量依存的に増加させることができる。対照的に、クムリン様ＧＤＦ９タンパク質は、Ｓｍａｄ−１／５／８活性を全く示さなかった。
【図７】ｍＧＤＦ９、ｈＧＤＦ９、及びｈＧＤＦ９（Ｇ３９１Ｒ）変異体のＳｍａｄ−２／３活性のアッセイ結果を提供する；（Ａ）ｍＧＤＦ９及びｈＧＤＦ９−ｍＧＤＦ９は、Ｓｍａｄ−２／３シグナル伝達応答性プロモーターにより誘導されるルシフェラーゼレポータータンパク質の発現を強力且つ用量依存的に増加させることができるが、野生型成熟ｈＧＤＦ９ホモダイマーは、高濃度でも不活性である；（Ｂ）ｈＧＤＦ９及びｈＧＤＦ９（Ｇ３９１Ｒ）変異体−ｈＧＤＦ９の残基３９１のグリシンをｍＧＤＦ９のアルギニンで置換すること（Ｇ３９１Ｒ）により、ｍＧＤＦ９のＩ型受容体結合部位を模倣すると、ｈＧＤＦ９の潜在性が克服される。これは、Ｓｍａｄ−２／３シグナル伝達応答性プロモーターにより誘導されるルシフェラーゼレポータータンパク質の発現により示される。上掲のＳｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．から修正された図。
【図８】様々な成熟「クムリン様」ｈＧＤＦ９変異体の発現レベルの比較のウェスタンブロットを示す。図で「クムリン様ＧＤＦ９」と示されるクムリン様ＧＤＦ９（変異体１）変異体は、Ｇ３９１Ｒ変異、ならびにＳ３６３Ｒ、Ｋ３６６Ｇ、及びＮ３６９Ｈ変異を含有する。この変異体は、野生型ｈＧＤＦ９と比較した場合、発現の増加を示した。Ｓ３６３Ｒ変異の逆転は、発現のわずかな減少を引き起こしたが、Ｋ３６６Ｇ変異の逆転は、野生型ｈＧＤＦ９より低いレベルへの発現の実質的な減少を引き起こした。対照的に、Ｎ３６９Ｈ変異の逆転は、発現のわずかな増加を引き起こすことがわかった。
【図９】ｈＧＤＦ９（図ではプロ−ＧＤＦ９と称される）、ｈＧＤＦ９（Ｇ３９１Ｒ）変異体（図ではプロ−ＧＤＦ９＿Ｇ３９１Ｒと称される）、クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）変異体、及びクムリン様ＧＤＦ９（変異体１）変異体に見られる逆転変異を含む３つのクムリン様ｈＧＤＦ９変異体のＳｍａｄ−２／３活性のアッセイ結果を提供する。（Ａ）及び（Ｂ）は、異なるタンパク質調製物を使用する２つの代表的なアッセイの結果を示す。Ｎ３６９Ｈ変異の逆転は、試験された低用量（３．１ｎｇ／ｍＬ〜２５ｎｇ／ｍＬ）で活性に影響を与えなかったが、５０ｎｇ／ｍＬで最大応答に影響を及ぼした。
【図１０】顆粒膜細胞（ＧＣ）増殖アッセイの結果を提供し、マウスの顆粒膜細胞を種々の量のプロ−クムリン様ＧＤＦ９（変異体２）で処置した。［３Ｈ］−チミジンの取り込みにより測定される細胞増殖は、ＧＣをプロ−クムリン様ＧＤＦ９で処置すると、用量依存的に細胞の増殖が促進されることを示した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドモノマーの構造は、「リスト」の内側部分及び「パーム」の内側部分間の相互作用を通じて形成する機能的（すなわち、活性）成熟ダイマーを有する開いた手に例えられている。リスト領域は、成熟ダイマーのモノマーの両方からのアミノ酸から構築される１型受容体結合部位を形成する。成熟ヒトクムリンタンパク質の構造モデリング（図１Ａを参照のこと）は、この分子上の１型受容体結合部位が、ｈＧＤＦ９及びｈＢＭＰ１５ホモダイマーに見られるものと異なること（上掲のＭｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．）、ならびに、これにより、クムリンが上述の卵丘細胞膨張アッセイにおける高レベルの活性をもたらす高親和性でＡＬＫ４／５に結合する理由を説明することが明らかであることを示す。クムリンの産生とは対照的に、比較的大量のプロ−ＧＤＦ９を非常に容易に産生することが可能であったことを見出す本出願人は、プロ−ＧＤＦ９ホモダイマー、クムリンのものと同じまたは類似のリスト領域（すなわち、Ｉ型結合部位）への導入を試みることにより、クムリンの産生の問題を克服しようとした。
【００２３】
したがって、本開示の第１の態様では、顆粒膜細胞の増殖及び分化を促進することが可能な薬剤が提供され、該薬剤は、アクチビン様キナーゼ４及び／または５受容体（ＡＬＫ４／５）への結合及び／またはそれの活性化を増強する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーを含む成長分化因子−９（ＧＤＦ９）タンパク質を含む。
【００２４】
ＧＤＦ９遺伝子は、哺乳動物種にわたって高度に相同であり、非常に類似したサイズのタンパク質をコードする。例えば、ヒトＧＤＦ９遺伝子によりコードされるタンパク質は、４５４アミノ酸（ＡＡ）長であり、シグナルペプチド（ａａ１〜２９）、四塩基タンパク質分解プロセシング部位で終端処理されたプロペプチド（ａａ３０〜３１８）（ＲＨＲＲ）、それに続く、１３５アミノ酸成熟ポリペプチド（ａａ３１９〜４５４）から構成される（ＭｃＧｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。同様に、未成熟な（すなわち、前処理された）マウスＧＤＦ９タンパク質は、４４１アミノ酸長であり、シグナルペプチド（ａａ１〜２９）、ＲＲＲＲタンパク質分解プロセシング部位で終結するプロペプチド（ａａ３０〜３０６）、及び１３５アミノ酸成熟ポリペプチド（ａａ３０７〜４４１）（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ＆  Ｌｅｅ  １９９３）；ならびに未成熟ヒツジＧＤＦ９タンパク質は、４５３アミノ酸長であり、シグナルペプチド（ａａ１〜２７）、ＲＨＲＲタンパク質分解プロセシング部位で終結するプロペプチド（ａａ２８〜３１８）、及び１３５アミノ酸成熟ポリペプチド（ａａ３１９〜４５３）を含む。別の例では、未成熟ウシＧＤＦ９タンパク質も４５３アミノ酸長であり、シグナルペプチド（ａａ１〜２５）、ＲＨＲＲタンパク質分解プロセシング部位で終結するプロペプチド（ａａ２６−３１８）、及び１３５アミノ酸成熟ポリペプチド（ａａ３１９〜４５３）を含む。
【００２５】
他のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーと同様に、ＧＤＦ９のプロペプチドは、成熟ポリペプチドを含む成熟生物学的に活性なダイマータンパク質（Ｇｒａｙ  ＆  Ｍａｓｏｎ  １９９０）の正確なフォールディング、ダイマー化、プロセシング、及び分泌を誘導する上で重要な役割を果たす。しかし、やや異常に、２つの成熟ポリペプチドモノマーは、（すなわち、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合により）共有結合され、さらに、（例えば、フリン様プロテアーゼによる）プロペプチドの切断及び細胞からの分泌後に、プロペプチドは、成熟ポリペプチドと非共有結合的に関連したままであり、それにより、非共有結合のプロ／成熟複合体を形成する。これは、ＢＭＰ１５及びクムリンにあてはまるとも考えられる（上掲のＭｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．）が、ＢＭＰ１５及びクムリンの場合、一部の点で、プロペプチドが、受容体にそれぞれの成熟ダイマータンパク質を提示することにおいて支援していることが明らかであり、プロペプチドが置換され、シグナル伝達を刺激する成熟ダイマータンパク質が残る。
【００２６】
したがって、当業者らに周知のように、「プロ−ＧＤＦ９」は、ＧＤＦ９のプロ／成熟ダイマー複合体を指すが、「ＧＤＦ９」は、２つの成熟ポリペプチドモノマーを含む（すなわち、プロペプチドを含まない）ダイマータンパク質を指す。同様に、「プロ−ＢＭＰ１５」は、ＢＭＰ１５のプロ／成熟ダイマー複合体を指すが、「ＢＭＰ１５」は、プロペプチドを欠く２つの成熟ＢＭＰ１５ポリペプチドモノマーを含むダイマータンパク質を指す。また、「プロ−クムリン」は、ＧＤＦ９及びＢＭＰ１５のプロ／成熟ヘテロダイマー複合体を指すが、「クムリン」は、成熟ＧＤＦ９ポリペプチドモノマー及び成熟ＢＭＰ１５ポリペプチドモノマーを含む（すなわち、それぞれのプロペプチドを含まない）ヘテロダイマータンパク質を指す。
【００２７】
第１の態様による薬剤は、以下に一括して、「クムリン様」と呼ばれ、またはより具体的には「クムリン様ＧＤＦ９」もしくは「プロ−クムリン様ＧＤＦ９」と呼ばれ、「クムリン様ＧＤＦ９」は、２つの成熟ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーを含む（すなわち、プロペプチドを含まない）ダイマータンパク質を指し、これの少なくとも１つは、「修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマー」である。これは、ポリペプチドが、アクチビン様キナーゼ４及び／または５受容体（ＡＬＫ４／５）への結合及び／またはそれの活性化を増強する少なくとも１つのアミノ酸置換を含むためであり、「プロ−クムリン様ＧＤＦ９」は、そのようなタンパク質のプロ／成熟ダイマー複合体形態を指す。プロ−クムリン様ＧＤＦ９及びクムリン様ＧＤＦ９分子が、１つまたは２つの修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマー（複数可）を含み得ることが当業者らにより理解されるであろう。
【００２８】
分子が、たった１つの修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーを含み、他のＧＤＦ９ポリペプチドモノマーは、野生型配列（例えば、以下に配列番号１と示されるものなどのヒト野生型ＧＤＦ９成熟配列、もしくは以下に配列番号２と示されるものなどのマウス野生型ＧＤＦ９成熟配列）、または単一の「活性化」アミノ酸置換を組み込む野生型配列（例えば、３９１位もしくはそれに相当する位置にＧｌｙ→Ａｒｇ置換を組み込むヒト野生型ＧＤＦ９配列）のものであり得る。そのような分子は、ヘテロダイマーと考えられ得る。
配列番号１：
ＧＱＥＴＶＳＳＥＬＫＫＰＬＧＰＡＳＦＮＬＳＥＹＦＲＱＦＬＬＰＱＮＥＣＥＬＨＤＦＲＬＳＦＳ
ＱＬＫＷＤＮＷＩＶＡＰＨＲＹＮＰＲＹＣＫＧＤＣＰＲＡＶＧＨＲＹＧＳＰＶＨＴＭＶＱＮＩＩＹ
ＥＫＬＤＳＳＶＰＲＰＳＣＶＰＡＫＹＳＰＬＳＶＬＴＩＥＰＤＧＳＩＡＹＫＥＹＥＤＭＩＡＴＫＣ
ＴＣＲ
配列番号２：
ＧＱＫＡＩＲＳＥＡＫＧＰＬＬＴＡＳＦＮＬＳＥＹＦＫＱＦＬＦＰＱＮＥＣＥＬＨＤＦＲＬＳＦＳ
ＱＬＫＷＤＮＷＩＶＡＰＨＲＹＮＰＲＹＣＫＧＤＣＰＲＡＶＲＨＲＹＧＳＰＶＨＴＭＶＱＮＩＩＹ
ＥＫＬＤＰＳＶＰＲＰＳＣＶＰＧＫＹＳＰＬＳＶＬＴＩＥＰＤＧＳＩＡＹＫＥＹＥＤＭＩＡＴＲＣ
ＴＣＲ
【００２９】
他方では、分子が２つの修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーを含む場合、２つの修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーは、同じであっても異なっていてもよいことが理解されるべきである。同じ修飾ＧＤＦ９ポリペプチドのモノマーを含む分子は、ホモダイマーであるが、２つの異なる修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーを含む分子は、ヘテロダイマーと考えられ得る。
【００３０】
好ましくは、第１の態様の薬剤は、同じ修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーの２つのモノマー（すなわち、ホモダイマー）を含むＧＤＦ９タンパク質を含む。
【００３１】
修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマー（複数可）は、好ましくは、配列番号１として示されるアミノ酸配列を有する野生型ｈＧＤＦ９などのヒトＧＤＦ９（ｈＧＤＦ９）に由来するが、別途他の哺乳動物種のＧＤＦ９タンパク質に由来し得る（例えば、マウスＧＤＦ９（ｍＧＤＦ９）、ヒツジＧＤＦ９（ｏＧＤＦ９）、及びウシＧＤＦ９（ｂＧＤＦ９））。
【００３２】
修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマー（複数可）は、アクチビン様キナーゼ４及び／または５受容体（ＡＬＫ４／５）への結合及び／またはそれの活性化を増強する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。ＡＬＫ４／５への結合及び／またはそれの活性化の増強は、対応する野生型ＧＤＦ９またはプロ−ＧＤＦ９タンパク質を参照して決定されてもよい。次に、例えば、第１の態様の薬剤は、修飾マウスＧＤＦ９ポリペプチドモノマー（複数可）を含む場合、アミノ酸置換（複数可）は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び以下の実施例に記載のルシフェラーゼ系アッセイなどの好適なＳｍａｄ−２／３応答性レポーター発現アッセイを含む当業者らに既知の好適な親和性及び／または活性アッセイのいずれかを使用するマウスプロ−ＧＤＦ９またはｍＧＤＦ９に対する比較試験により、ＡＬＫ４／５への結合及び／またはそれの活性の増強のために評価されてもよい。他方では、第１の態様の薬剤は、潜在的ＧＤＦ９タンパク質（例えば、ヒトＧＤＦ９）から開発された修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマー（複数可）を含み、次に、アミノ酸置換（複数可）は、関連種（例えば、以下の実施例に記載される単一の活性化アミノ酸置換を組み込むもの）からの「活性化」プロ−ＧＤＦ９またはＧＤＦ９を比較試験することにより、ＡＬＫ４／５への結合及び／またはそれの活性化の増強について評価され得る。ＡＬＫ４／５への結合の増強は、結合（例えば、親和性）の増加の同定により決定されてもよく、ＡＬＫ４／５の活性化の増強は、Ｓｍａｄ−２／３シングルの増加の同定により決定されてもよい（これは、好適なＳｍａｄ−２／３応答性レポーター構築物からレポーターの発現の増加により観察され得る）。
【００３３】
好ましくは、第１の態様による薬剤は、ＡＬＫ６受容体に結合する能力、及び／またはＡＬＫ６を活性化して、Ｓｍａｄ−１／５／８シグナル伝達をもたらす能力を欠いている。これは、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び好適なＳｍａｄ−１／５／８応答性レポーター発現アッセイを含む、当業者らに既知の好適な親和性及び／または以下の実施例に記載のルシフェラーゼ系アッセイなど活性アッセイのいずれかを使用することにより、評価されてもよい。
【００３４】
好ましくは、修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーは、「フィンガー１」内の１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、これは、ｈＧＤＦ９では、例えば、アミノ酸３５４〜３８１位に及ぶ。より好ましくは、修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーは、３６３位、３６６位、及び３６９位（ヒト野生型配列から）または他のＧＤＦ９タンパク質の対応する位置からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含む。
（例えば、マウス野生型配列の３５０位、３５３位、及び３５６位）。当業者らは、例えば、ヒト野生型配列の他の関連ＧＤＦ９タンパク質配列とのＢＬＡＳＴアラインメントを使用することにより、「対応する位置」を容易に同定し得る。アミノ酸置換（複数可）は、Ｘ→Ｚ置換であり得、Ｘが、特定の配列位置の「野生型」アミノ酸であり、Ｚが、他の任意のアミノ酸であるが、好ましくは、遺伝コードによりコードされた２０（２０）標準アミノ酸から選択されるものである。しかし、Ｚは、例えば、特定のＮα−アルキルアミノ酸（例えば、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）及びＮ−メチルアラニン）、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）などの他のアミノ酸、アミノイソ酪酸、３−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、オルニチン、シトルリン、アミノ−オキシセリン、ホモアルギニン、アミノスベリン酸ならびにβ−２−及びβ−３−ナフチララニン、環置換フェニルアラニン（Ｐｈｅ）アナログ（例えば、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、メチル−フェニルアラニン、及びホスホノ−フェニルアラニン）、ホスホ−チロシン（ｐＴｙｒ）、セレノシステイン、及びセレノメチオニンなどの非標準アミノ酸であってよい。しかし、好ましくは、Ｚは、ＢＭＰ１５タンパク質の対応する位置に存在するアミノ酸、または、別途、ＢＭＰ１５タンパク質の対応する位置に存在するものと類似のアミノ酸であろう。当業者らは、関連するＧＤＦ９及びＢＭＰ１５タンパク質の成熟ポリペプチド配列のＢＬＡＳＴアラインメントを使用することにより、「ＢＭＰ１５タンパク質の対応する位置」を容易に同定し得る。したがって、例えば、ｈＧＤＦ９及びｈＢＭＰ１５の成熟ポリペプチド間のＢＬＡＳＴアラインメントにより、ｈＧＤＦ９の３６３位、３６６位、及び３６９位が、３０１位、３０４位、及び３０７位にｈＢＭＰ１５の対応する位置を有することを容易に同定し得る。ｈＢＭＰの３０１位、３０４位、及び３０７位のアミノ酸は、それぞれ、アルギニン、グリシン、及びヒスチジンである。したがって、一部の好ましい実施形態では、修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーは、以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む修飾ｈＧＤＦ９ポリペプチドモノマーである：Ｓ３６３Ｒ（すなわち、３６３位でのＳｅｒ→Ａｒｇ置換）、Ｋ３６６Ｇ（すなわち、３６６位でのＬｙｓ→Ｇｌｙ置換）、及びＮ３６９Ｈ（すなわち、３６９位でのＡｓｎ→Ｈｉｓ置換）。しかし、ＢＭＰ１５の関連する位置に見られるものと類似している他のアミノ酸との置換（複数可）も行われてもよい。例えば、ｈＧＤＦ９の３６３位のセリンをアルギニンで置換する代わりに、リジンなどの同様のアミノ酸、またはアルギニンの保存的置換であると考えられるアミノ酸が、代わりに置換されてもよい。
【００３５】
一部の好ましい実施形態では、修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーは、以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む修飾ｈＧＤＦ９ポリペプチドモノマーである：
（ｉ）Ｓ３６３Ｒ、Ｓ３６３Ｋ、またはＳ３６３Ｈ、
（ｉｉ）Ｋ３６６Ｇ、Ｋ３６６Ａ、Ｋ３６６Ｖ、Ｋ３６６Ｉ、Ｋ３６６Ｌ、またはＫ３６６Ｍ、及び
（ｉｉｉ）Ｎ３６９Ｈ、Ｎ３６９Ｋ、またはＮ３６９Ｒ。
【００３６】
一部のさらに好ましい実施形態では、修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーは、以下のアミノ酸置換群のそれぞれからのアミノ酸置換を含む修飾ｈＧＤＦ９ポリペプチドモノマーである：
（ｉ）Ｓ３６３Ｒ、Ｓ３６３Ｋ、またはＳ３６３Ｈ、
（ｉｉ）Ｋ３６６Ｇ、Ｋ３６６Ａ、Ｋ３６６Ｖ、Ｋ３６６Ｉ、Ｋ３６６Ｌ、またはＫ３６６Ｍ、
（ｉｉｉ）Ｎ３６９Ｈ、Ｎ３６９Ｋ、またはＮ３６９Ｒ、及び
（ｉｖ）Ｔ４３１Ｍ、Ｔ４３１Ｓ、またはＴ４３１Ｃ。
【００３７】
好ましくは、修飾ｈＧＤＦ９ポリペプチドモノマーは、以下のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含むであろう：Ｋ３６６Ｇ、Ｋ３６６Ａ、Ｋ３６６Ｖ、Ｋ３６６Ｉ、Ｋ３６６Ｌ、及びＫ３６６Ｍ。最も好ましくは、修飾ｈＧＤＦ９ポリペプチドモノマーは、少なくともアミノ酸置換Ｋ３６６Ｇを含むであろう。
【００３８】
さらに、一部の好ましい実施形態では、修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマー（複数可）は、薬剤の２つのモノマーのジスルフィド架橋（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合）を達成するためにシステイン残基を導入するためのアミノ酸置換を含んでもよい。このように架橋された薬剤は、（例えば、ＡＬＫ４／５への結合及び／またはそれの活性化を増強することによる）安定性及び／または活性のレベルの改善を示し得る。そのような置換のうちの１つの好適な例は、修飾ｈＧＤＦ９ポリペプチドモノマー中のＳ４１８Ｃである（上掲のＭｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．）。しかし、２つのモノマーが、カルボキシル基及びアミン基を結合する１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミドの使用など、モノマー間に１つ以上の共有結合を形成する他の化学的架橋手法により、別途架橋され得ることも、当業者らは理解するであろう。
【００３９】
また、修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマー（複数可）は、さらに別の付加的なアミノ酸置換、または（例えば、プロ−ＧＤＦまたはＧＤＦ９タンパク質の天然に存在する多様体に存在し得るような）付加（複数可）もしくは欠失（複数可）などの他の配列変動を含み得るか、あるいは、導入されていてもよく、好ましくは、ポリペプチドの機能を実質的に変化させない（例えば、さらなるアミノ酸置換（複数可）の追加にもかかわらず、ポリペプチドは、ＡＬＫ４／５への結合及びそれの活性化の能力を維持する）ことも、当業者らは理解するであろう。そのような変動（複数可）は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ；Ｄ、Ｅ；Ｎ、Ｑ；Ｓ、Ｔ；Ｋ、Ｒ、Ｈ；Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ；及びＰ、Ｎα−アルキルアミノ酸などの１つ以上の保存的アミノ酸置換を含み得る。他の置換は、１つ以上のＬ−アミノ酸（複数可）のＤ−アミノ酸（複数可）との置換を含み得る。組み換え手法による成熟ポリペプチドの産生の結果であり得るので、特定のアミノ酸付加の例は、ポリペプチドのＮ末端へのメチオニン（Ｍ）残基の付加である。例えば、Ｎ末端またはＣ末端配列に行われ得る他の付加は、短いアミノ酸配列の付加（例えば、２〜１０アミノ酸長）または生物学的利用能の改善、タンパク質回収、もしくは発現（例えば、融合パートナー）などの種々の付加機能もしくは特性を与える長いアミノ酸配列（例えば、１１以上のアミノ酸）を含んでもよい。
【００４０】
上記にかかわらず、修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーは、追加的または代替的に、翻訳後プロセシングなどの自然のプロセスにより、または当業者らに周知の手法などの化学修飾手法により修飾されている（例えば、ペグ化）アミノ酸配列を含み得る。そのような修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及び／またはＮ末端及び／またはＣ末端内を含む、ポリペプチドのどこでも生じ得る。同じタイプの修飾が、ポリペプチドのいくつかの部位で同じ程度または異なる程度で存在し得ることもまた理解されるであろう。さらに、存在し得る他の修飾は、例えば、フルオレセインイソチオシアナート（５−ＦＩＴＣ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−Ｆａｍ）、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン］（５，６−ＴＡＭＲＡ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）、シアニン染料、近赤外染料、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、２−（４，７−ビス（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−オキソエチル）−１，４，７−トリアゾナン−１−イル）酢酸（ＮＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）などの生化学的タグまたはキレーターを結合するためのＮ末端スペーサー／リンカー部分、例えば、β−アラニン、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（「ミニ−ＰＥＧ（商標）」）、及び１１−アミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン酸（「ミニＰＥＧ３（商標）」）の付加を含む。
【００４１】
好ましくは、第１の態様の薬剤は、単離形態で提供される。
【００４２】
第１の態様の薬剤は、当業者らに周知の合成または組み換え手法を使用して生成されてもよい。薬剤がヘテロダイマーである場合（すなわち、薬剤が、２つの異なる修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーを含む場合）、モノマーは、ダイマーの形成を可能にするために、別々に生成され、次に、単に一緒に加えられてもよい。しかし、２つのポリペプチドモノマーは、組み換え手法を使用して共発現されることが好ましい。
【００４３】
第１の態様の薬剤は、顆粒膜細胞の増殖及び分化を促進することが可能である。そのようなものであるから、上記のように、顆粒膜細胞の卵丘細胞への増殖及び分化が卵胞発育及び卵母細胞成熟を促進するので、薬剤が、ＩＶＭなどのＡＲＴでの使用に適し得る。さらに、プロ−クムリンが卵母細胞発育を促進することが観察されている（上掲のＭｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．）ので、特に、プロ／成熟複合体形態（すなわち、プロ−クムリン様ＧＤＦ９）の場合、薬剤は、卵母細胞の成熟に直接影響を与え得、これは、順次、胚発育及び胎児の生存が改善され得る卵母細胞の収量の向上及び／または卵母細胞の質の向上をもたらし得る。ＡＲＴに使用するために、薬剤は、好適な組成物に製剤化されてもよい。
【００４４】
したがって、第２の態様では、本開示は、任意に、薬理学的に許容される担体（例えば、溶媒及び／もしくは緩衝液）及び／または賦形剤と組み合わせた第１の態様の薬剤を含む組成物、好ましくは、水性組成物を提供する。
【００４５】
組成物はさらに、１つ以上の他の有益な物質を含んでもよい。好適な有益な物質の例としては、卵母細胞発育及び成熟を促進し得る環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）モジュレーターが挙げられる（Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。
【００４６】
第３の態様では、本開示は、顆粒膜細胞の増殖及び分化を促進する方法（好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで）を提供し、該方法は、顆粒膜細胞を有効量の第１の態様の薬剤または第２の態様の組成物と接触させることを含む。
【００４７】
関連する第４の態様では、本開示は、顆粒膜細胞の増殖及び分化を促進するための第１の態様の薬剤または第２の態様の組成物の使用を提供する。
【００４８】
さらに、第５の態様では、本開示は、顆粒膜細胞の増殖及び分化を促進するための組成物の製造における第１の態様の薬剤の使用を提供する。
【００４９】
第６の態様では、本開示は、（好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの）卵母細胞成熟を促進する方法を提供し、該方法は、有効量の第１の態様の薬剤または第２の態様の組成物と、未成熟卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を接触させることを含む。
【００５０】
好ましくは、第６の態様の方法は、卵母細胞成熟に有利な条件下で（例えば、疑似生理学的卵母細胞成熟（ＳＰＯＭ）（Ａｌｂｕｚ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）などの当業者らに既知のＩＶＭプロトコールのいずれかに従って）で、例えば、２４〜４０時間の期間、ＣＯＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することを含み、好適な時点（複数可）で培地に薬剤または組成物を添加することにより、ＣＯＣを薬剤または組成物と接触させる。好ましくは、薬剤または組成物が培地に添加される時点は、卵母細胞成熟の後期（複数可）、例えば、後期胞状期に相当するであろう（Ｏｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。
【００５１】
好ましくは、ＣＯＣは、ヒトＣＯＣである。
【００５２】
一部の実施形態では、ＣＯＣは、ＰＣＯＳもしくはＰＯＩに罹患する女性、（視床下部機能障害に関連するような）既存の生殖問題を有する他の女性、またはがんからの寛解もしくは回復中の女性（すなわち、従来のＩＶＦで使用される外因性ゴナドトロピンの投与が望ましくない可能性がある）から収集されている。さらに、一部の実施形態では、ＣＯＣは、破壊的ながん治療の前に妊孕性温存方策の一部として保存されているものである。
【００５３】
第６の態様の方法による卵母細胞の成熟後、標準ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精プロトコール（例えば、卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ））に従って、卵母細胞を受精させ得、受精卵母細胞をレシピエント雌に移植するか、または移植後に適切なストレージに入れる。
【００５４】
第７の態様では、本開示は、卵母細胞の成熟を促進するための第１の態様の薬剤または第２の態様の組成物の使用を提供する。
【００５５】
第８の態様では、本開示は、卵母細胞の成熟を促進するための組成物の製造における第１の態様の薬剤の使用を提供する。
【００５６】
上記のように、本開示の薬剤は、当業者らに周知の組み換え手法を使用して生成されてもよい。したがって、本発明のさらなる態様では、本発明は、修飾ＧＤＦ９ポリペプチドモノマーをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子（好ましくは、単離形態で）を提供する。さらに別の態様では、本開示は、そのようなポリヌクレオチド分子を含むクローニングまたは発現ベクターを提供する。さらに、さらに別の態様では、本開示は、ポリヌクレオチドまたはクローニングまたは発現ベクターを含む宿主細胞（例えば、好適な真核細胞）を提供し、該宿主細胞が、例えば、培養中で薬剤を発現することができる。
【００５７】
本開示の薬剤及び方法（複数可）は、以下の非限定例（複数可）及び添付の図により、以下でさらに説明される。
【実施例】
【００５８】
実施例１  「リスト」領域にアミノ酸置換を有するｈＧＤＦ９変異体の産生
ＢＬＡＳＴアラインメントを使用してクムリンのｈＧＤＦ９及びｈＢＭＰ１５タンパク質の成熟ドメインのアミノ酸配列を比較すると、それらが５９％同一であることがわかった（図２）。次に、ｈＧＤＦ９及びｈＢＭＰ１５のＩ型受容体結合部位を同定するために、ＧＤＦ９、ＢＭＰ１５、及び既知の構造を有する他のリガンド間の配列相同性の評価を実施した（Ｍｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。ＡＬＫ４／５に対して高い親和性を有すると考えられるクムリンの領域（上掲のＭｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．）を考慮すると、ｈＧＤＦ９及びｈＢＭＰ１５は、５アミノ酸だけ異なることが観察された（図２）。ｈＧＤＦ９の番号付けを使用すると、これらは、Ｓ３６３Ｒ、Ｋ３６６Ｇ、Ｎ３６９Ｈ、Ｔ４３１Ｍ、及びＤ４４５Ｇである。
【００５９】
次に、ＢＭＰ１５由来のアミノ酸残基のうちの１つ以上を導入することにより、多数の変異体ＧＤＦ９タンパク質を設計及び生成して、成熟ｈＧＤＦ９ホモダイマーが、より「クムリン様」であるように作製することができる（すなわち、ＡＬＫ４／５に対してより高い親和性を達成するように修飾することができる）かどうかを判定した。種々の変異型タンパク質は、以下の表１にまとめられる。全ての変異型タンパク質は、ｈＧＤＦ９活性の潜在性を克服／改善するＧ３９１Ｒ置換を組み込んだ（実施例２を参照のこと）。
【００６０】
【表１】
2021523161.tif 000003
【００６１】
材料及び方法
変異導入
哺乳動物発現ベクターｐＥＦ−ＩＲＥＳ内に含有される、修飾ｈＧＤＦ９  ＤＮＡ配列（ｈＧＤＦ９＿Ｈｉｓ−８；本明細書では「野生型ｈＧＤＦ９」とも呼ばれる）をコードするコドン最適化発現カセットに変異を導入することにより、変異型ＧＤＦ９タンパク質を産生した（上掲のＭｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．）。この修飾ｈＧＤＦ９  ＤＮＡ配列は、５’末端にラット血清アルブミンシグナル配列をコードする配列、それに続く、ＧＤＦ９プロペプチドのＮ末端にＨｉｓ−８タグ及びＳｔｒｅｐＩＩエピトープタグを提供する配列を含んでいた。さらに、ｈＧＤＦ９＿Ｈｉｓ−８は、通常のＲＨＲＲ四塩基タンパク質分解プロセシング部位をＲＲＲＲと置換する配列が含まれていた。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンタクララ）を使用して、必要な変異を導入した。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＦ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）を使用したオーバーラップ伸長ＰＣＲにより、その後のＧＤＦ９変異ｃＤＮＡの変更を実施し、制限部位のＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ間のｐＥＦ１α−ＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号６３１９７０；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）多重クローニング部位Ａに変異型ＰＣＲ産物をライゲーションした。各構築物では、ｈＧＤＦ９  ｃＤＮＡカセット全体をＤＮＡ配列決定により確認した。ｈＧＤＦ９＿Ｈｉｓ−８の変異導入に使用されるプライマーが表２に示される。
【００６２】
【表２】
2021523161.tif 000004
【００６３】
産生及び精製
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）−ＭＡＸを使用して、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を一過性トランスフェクションした後に、野生型及び変異型ｈＧＤＦ９タンパク質の産生を評価した（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、米国ペンシルベニア州ウォリントン）。簡単に言うと、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに８×１０５細胞／ウェルでプレーティングした。野生型または変異型ｈＧＤＦ９＿ｐＥＦ１α−ＩＲＥＳＤＮＡ（２．５μｇ／ウェル）をＰＥＩと１０分間組み合わせた。ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を細胞に直接添加し、新しいＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地と交換する前に、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州カールスバッド）培地中で、５％のＣＯ２、３７℃で４時間インキュベートした。２４時間後、７２時間培地を産生培地［ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）：Ｌ−グルタミン、０．０２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．００５％のヘパリンを含有するＦ１２培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）］と交換した。Ｎａｎｏｓｅｐマイクロコンセントレーター（１０ｋＤａ；Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニューヨーク州ポートワシントン）を使用して、馴化培地を５倍濃縮した。１０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）上の還元試料をＥＣＬハイボンドメンブレン（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ、英国バッキンガムシャー州チャルフォントセントジャイルズ）に転写したウェスタンブロッティングにより、培地中のＧＤＦ９発現を評価した。ｍＡｂ５３／１（１：５０００）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｒｏｏｋｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、英国オックスフォード・ヘディントン）、全ての哺乳動物成熟ＧＤＦ９タンパク質のＣ末端に対する４アミノ酸配列（ＥＰＤＧ；ｈＧＤＦ９のａａ４３３〜４３６）に特異的な抗体で、ブロットを一晩プローブした（Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。この後に、Ｌｕｍｉ−ｌｉｇｈｔ化学発光試薬（Ｒｏｃｈｅ、スイス・バーゼル）を使用して検出する２次抗体である西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（１：１０，０００）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が続く。事前に染色されたタンパク質標準ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、分子量（ＭＷ）サイズを評価した。
【００６４】
上記の条件に従って、一度に複数の６ウェルプレートを単一の構築物と共にトランスフェクトすることにより、野生型及び変異型ｈＧＤＦ９タンパク質の大規模産生を達成した。別々のトランスフェクションとして、各ウェルを処置し、ｈＧＤＦ９変異型トランスフェクト細胞由来の馴化培地が、７２時間のインキュベーション後にプールした。次に、馴化培地を遠心分離し、濃縮し（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州ビルリカ）、結合緩衝液（５０ｍＭのリン酸緩衝液、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。次に、濃縮された媒体を、ＨｉｓＰｕｒ（商標）コバルト樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（Ｃｏ−ＩＭＡＣ）にかけた。次に、溶出緩衝液（５０ｍＭのリン酸緩衝液、３００ｍＭのＮａＣｌ、３３３ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）を使用して、結合ｈＧＤＦ９をＣｏ−ＩＭＡＣ樹脂から溶出させた。製造者の使用説明書に従って、２ｍＬの３．５Ｋ  ＭＷのカットオフＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）ＭＩＮＩ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、結合緩衝液に対して透析することにより、イミダゾールをＣｏ−ＩＭＡＣ精製ｈＧＤＦ９から除去した。参照として組み換えｈＧＤＦ９（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．、米国ミネソタ州ミネアポリス）を使用するウェスタンブロットにより、精製プロセス全体にわたるｈＧＤＦ９タンパク質の回収率及び質量推定値を決定した。
【００６５】
活性試験
選択ｈＧＤＦ９変異型タンパク質の活性を試験するために、ＣＯＶ４３４顆粒膜細胞腫瘍株の細胞を、Ｓｍａｄ−２／３応答性ルシフェラーゼレポーター（ｐＡ３−Ｌｕｘ）（Ｎａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）及び転写因子ＦＡＳＴ２（Ｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）でトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、用量範囲（１．６ｎｇ／ｍＬ〜２５ｎｇ／ｍＬ）のプロ−ＧＤＦ９、プロ−ＧＤＦ９及び等量のプロ−ＢＭＰ１５、プロ−クムリン、または成熟ｈＧＤＦ９変異型タンパク質で約２０時間処置した。基質Ｄ−ルシフェリンの添加直後に、発光を測定することにより、ルシフェラーゼタンパク質の発現を評価した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）。クムリン処置の濃度は、調製物中のＧＤＦ９成熟ドメインの量に基づいていた。
【００６６】
結果
ｈＧＤＦ９変異体の発現
ＰＣＲベースの部位特異的変異導入を使用して、ｈＢＭＰ１５からの置換アミノ酸の所望の配列変異を有するｈＧＤＦ９発現カセットを生成した。ｈＧＤＦ９変異体の発現を評価するために、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を一過性トランスフェクトした。馴化培地を収集し、５Ｘ濃縮し、ＧＤＦ９成熟ペプチド（ｍＡＢ  ５３／１）に特異的な抗体を用いる還元条件下でウェスタンブロッティングにより試験した（図３）。アミノ酸置換Ｓ３６３Ｒ、Ｋ３６６Ｇ、Ｎ３６９Ｈ、及びＧ３９１Ｒを含む「クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）」として表１に指定された変異型ＧＤＦ９タンパク質は、野生型ｈＧＤＦ９よりも実質的に高く発現されることがわかった。ｈＢＭＰ１５由来の後続のアミノ酸の付加（すなわち、さらなるアミノ酸置換Ｔ４３１Ｍ及びＤ４４５Ｇの導入）は、発現に負の影響を与えることがわかった。それ故、「変異体１」（Ｓ３６３Ｒ、Ｋ３６６Ｇ、Ｎ３６９Ｈ、及びＧ３９１Ｒ）を初期活性試験のために選択した。
【００６７】
ｈＧＤＦ９変異体の精製
クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）の濃縮及び精製調製物を生成するために、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の８ｘ６ウェルプレートを一過性トランスフェクトすることにより、大規模産生を実施した。次に、馴化培地をブールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して約１ｍｌに濃縮し、この後に、結合緩衝液を使用して、それを最大最終容積５ｍＬにした。濃縮馴化培地を、約０．５ｍＬのＨｉｓＰｕｒ（商標）コバルトレジンを含有するカラム中で、ローリングしながら室温で約２時間インキュベートした。未結合のタンパク質を収集し、カラムを４ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。結合タンパク質を溶出させるために、ＨｉｓＰｕｒ（商標）コバルトレジンを、０．３３モルのイミダゾールを含有する３ｍＬのＰＢＳ中で、ローリングしながら室温で２時間インキュベートした。次に、結合したままの任意のタンパク質を溶出させるために、ＨｉｓＰｕｒ（商標）コバルトレジンを、０．５モルのイミダゾールを含有する３ｍＬのＰＢＳ中で、ローリングしながら室温で１時間インキュベートした。このステップを、１モルのイミダゾールを含有するＰＢＳで再度繰り返した。ｍＡｂ  ５３／１（１：５０００）でプローブしたウェスタンブロット（図４）により、回収率を評価した。Ｃｏ−ＩＭＡＣ画分を含有するゲルレーンに、２０μＬ（試料１０μＬ＋２Ｘの還元色素１０μＬ）をロードした。レーンの内容は、表３のとおりである。
【００６８】
０．３３モルのイミダゾールを含有する画分に、クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）タンパク質の大部分を溶出させ、この画分を透析して、イミダゾールを除去した。透析後、参照として組み換えｈＧＤＦ９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したウェスタンブロットにより、タンパク質の濃度を決定した。精製クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）タンパク質の最終濃度は、８．３ｎｇ／μＬであった。
【００６９】
【表３】
2021523161.tif 000005
【００７０】
活性試験
クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）タンパク質を使用した３つの代表的な実験の結果を図５に示す。プロ−ＧＤＦ９単独で処置した後に、または等濃度の独立して産生されたプロ−ＢＭＰ１５で同時処理した時に、ルシフェラーゼ応答をベースラインレベルに維持することがわかった（図５Ａ）。他方では、プロ−クムリンタンパク質は、ルシフェラーゼ応答を用量依存的に増加させ、異なるバッチ間で異なる効力と最大応答が観察された（図５Ａ及び５Ｂ）。クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）タンパク質は、最高用量（２５ｎｇ／ｍＬ）で高い最大応答を一貫して生じたが、また、試験された低用量（すなわち、１．６ｎｇ／ｍＬ〜１２．５ｎｇ／ｍＬ）でより強力であった（図５Ａ及び５Ｂ）が、ルシフェラーゼ応答をクムリン様ＧＤＦ９（変異体２）と比較するさらなる実験では、Ｔ４３１Ｍ置換をさらに含むことでより大きな応答を達成することができることがわかった（図５Ｃ）。
【００７１】
別のルシフェラーゼアッセイでは、Ｓｍａｄ−１／５／８シグナル伝達に応答するプロモーターを有するプラスミド（Ｋｏｒｃｈｙｎｓｋｙｉ及びｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ  ２００２）をＣＯＶ４３４顆粒膜細胞腫瘍株にトランスフェクトした。次に、トランスフェクト細胞を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ｒｈＢＭＰ１５）から市販されている、用量範囲（０．６３ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ）のクムリン様ＧＤＦ９（変異体１）タンパク質または成熟組み換えヒトＢＭＰ１５で約２０時間処置した。クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）タンパク質は、プロモーターを活性化する能力を示さなかったが、ｒｈＢＭＰ１５は、ルシフェラーゼレポーターの発現を用量依存的に増加させたことが観察された。代表的な実験の結果は、図６に示される。
【００７２】
考察
より高い「クムリン様」活性（すなわち、ＡＬＫ４／５に対するより高い親和性）をホモダイマーに与えることが期待されるアミノ酸置換を組み込む変異型成熟ｈＧＤＦ９タンパク質を発現させた。Ｓ３６３Ｒ、Ｋ３６６Ｇ、Ｎ３６９Ｈ、及びＧ３９１Ｒ置換を組み込むクムリン様ＧＤＦ９（変異体１）と称される１つの特定の変異体は、単独またはＢＭＰ１５と組み合わせて発現した場合、ｈＧＤＦ９よりも実質的に高く発現することがわかった。この変異体は、プロ−クムリンよりも、Ｃｏ−ＩＭＡＣ及び透析の標準的な精製レジームを使用して、より容易に回収することができることもわかった。したがって、本開示によるクムリン様ＧＤＦ９タンパク質は、プロ−クムリンよりも産生にかなりの利点を提供するように現れる。さらに、この例で説明される発現及び精製により濃縮最終調製物がもたらされたので、クムリン様ＧＤＦ９タンパク質は、女性の不妊症の処置などの潜在的な用途に、より少ない調製量の使用を可能にすべきである（例えば、培地に添加した場合、調製量を減らすことで、緩衝液または不純物の添加によるいかなる有害な影響も制限し得る）。
【００７３】
本開示のクムリン様ＧＤＦ９タンパク質はまた、Ｓｍａｄ−２／３シグナル伝達経路を過剰活性化する能力を有する代表的な例（すなわち、クムリン様ＧＤＦ９（変異体１））と共に、優れたクムリン様活性を示す。実際には、本実施例に記載のＳｍａｄ−２／３応答性ＣＯＶ４３４のルシフェラーゼアッセイでは、このクムリン様ＧＤＦ９タンパク質は、プロ−クムリンと同様に、おおよそ２倍作用することを証明した。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、成熟クムリンがＡＬＫ４／５に対し高い親和性を有する１つの受容体結合部位及びＡＬＫ６に対し親和性を有する別の部位を有する（図１Ａ）が、ＧＤＦ９ホモダイマーが、分子の反対側に２つのＡＬＫ４／５結合部位を有する（図１Ｂ）という事実が原因であると考えられる。したがって、タンパク質をより「クムリン様」にするようにＧＤＦ９のＩ型受容体結合部位にアミノ酸置換を導入することにより、２つの高親和性ＡＬＫ４／５結合部位が、クムリン様ＧＤＦ９ホモダイマーに作成されていると考えられる。したがって、クムリンが、１つのＡＬＫ４／５受容体を高度に活性化する一方、本開示によるクムリン様ＧＤＦ９タンパク質は、２つのＡＬＫ４／５受容体を活性化し、それにより、Ｓｍａｄ−２／３シグナル伝達のレベルを２倍にする。
【００７４】
さらに、プロ−クムリン調製物が、強力な実質的なバッチ間変動を示したが、クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）タンパク質の様々なバッチは、活性なホモダイマーの均質の調製物であり、一貫した且つ信頼できるレベルの有効性を提供したことが観察された。
【００７５】
実施例２  Ｇ３９１Ｒ置換を有するｈＧＤＦ９変異体の産生
高い親和性でＡＬＫ４／５と結合するクムリンの部位は、ｈＢＭＰ１５（モノマー１）のリスト領域及びｈＧＤＦ９（モノマー２）のフィンガーからなることが予測される。モノマー２のリスト内では、１つのアミノ酸差異があることが観察された；つまり、ｈＧＤＦ９の３９１位に、グリシン残基があるが、ｈＢＭＰ１５の対応する位置（すなわち、３２９位）はアルギニンを含有する（この残基が、アスタリスクで強調される図２を参照のこと）。特に、活性の低いマウスＢＭＰ１５及び潜在的なヒツジＢＭＰ１５が、対応する位置のアルギニンを欠いているので、この位置のアルギニンは、活性ＢＭＰ１５分子（ホモダイマーまたはヘテロダイマーの両方）の重要な特徴であり得ると考えられた（上掲のＡｌ−Ｍｕｓａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．）。クムリンでは、対応する位置におけるアルギニンは、活性に必要とされないが、ＧＤＦ９ホモダイマーの活性に必須である可能性があり（上掲のＰｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１４；Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）；成熟マウスＧＤＦ９（活性である）は、３９１位にアルギニンを含むことは注目に値する。
【００７６】
材料及び方法
変異導入
本明細書に記載のｈＧＤＦ９変異体のために、実施例１に記載の方法で、Ｇ３９１Ｒ置換をもたらす変異を導入することにより、変異型ｈＧＤＦ９タンパク質を産生した。
【００７７】
産生及び精製
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のトランスフェクション及び固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（Ｃｏ−ＩＭＡＣ）を使用して、実施例１に記載されたものと同様の方法で、ｈＧＤＦ９（Ｇ３９１Ｒ）変異体の発現及び精製を行った。
【００７８】
活性試験
実施例１に記載のＳｍａｄ−２／３応答性ルシフェラーゼレポーター及びアッセイを使用して、野生型成熟ｈＧＤＦ９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び成熟マウスＧＤＦ９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に、ｈＧＤＦ９（Ｇ３９１Ｒ）変異体の活性を試験した。基質Ｄ−ルシフェリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の添加直後の発光を測定することにより、ルシフェラーゼタンパク質の発現を評価した。
【００７９】
結果
ｈＧＤＦ９（Ｇ３９１Ｒ）変異体のＳｍａｄ−２／３活性試験の結果は、図７に示される。ｍＧＤＦ９は、ルシフェラーゼレポータータンパク質の発現を強力に且つ用量依存的に増加させることが観察された。対照的に、成熟ｈＧＤＦ９は、高濃度でもＳｍａｄ−２／３活性を示さない
（例えば、１００ｎｇ／ｍｌを超える）。
【００８０】
考察
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍＧＤＦ９は、主に、Ｉ型受容体アクチビン受容体様キナーゼ−５（ＡＬＫ５）及びＢＭＰＲ２を介するＳｍａｄ−２／３のリン酸化により、生物学的活性を発揮することが示されている（Ｍａｚｅｒｂｏｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２００４；Ｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。これは、卵丘膨張に必須である遺伝子の発現を強力に誘導し、これは、良好な排卵及び受精が依存する重要なプロセスである（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。ｍＧＤＦ９とは対照的に、ヒトＧＤＦ９（ｈＧＤＦ９）は、Ｎ末端プロペプチドと非共有結合したＣ末端成熟ドメインからなる潜在的複合体（図１Ｂ）として分泌される（上掲のＳｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）。２つの種の成熟タンパク質間の重要な差異の１つは、残基３９１にあり、これは、Ｉ型受容体結合部位内にあると予測され；つまり、ｈＧＤＦ９では、この残基は、グリシンであるが、ｍＧＤＦ９では、上記のような３９１位にアルギニンがあり、ｈＢＭＰ１５の対応する位置にも見られる。この実施例に示されるように、単一の「活性化」アミノ酸置換は、このタンパク質の潜在性を克服するために、ヒトＧＤＦ９成熟ポリペプチド配列に対して行われてもよく、つまり、Ｇ３９１残基をアルギニンと置換することにより、ｈＧＤＦ９タンパク質は、Ｓｍａｄ−２／３シグナル伝達を誘導させるために活性化することができる。
【００８１】
実施例３  クムリン様活性を有するさらなるｈＧＤＦ９変異体の産生及び分析
実施例１に記載のクムリン様ＧＤＦ９（変異体１）タンパク質変異体は、４つの変異（すなわち、Ｓ３６３Ｒ、Ｋ３６６Ｇ、Ｎ３６９Ｈ、及びＧ３９１Ｒ）を含む。非常に活発であることがわかったが、４つの変異全てが、高められた活性に実際に必要であったかどうかは不明であった。換言すれば、３つの「ＢＭＰ１５残基」（すなわち、Ｓ３６３Ｒ、Ｋ３６６Ｇ、またはＮ３６９Ｈ）のうちの１つだけが、観察された高められた活性の原因であり得ると考えられた。３つの変異の一方のみが必要とされた場合は、他の２つのうちの一方または両方が、活性に対する抑制効果を有し得ることも信頼できそうであった。それ故、Ｓ３６３Ｒ、Ｋ３６６Ｇ、またはＮ３６９Ｈ変異のそれぞれの必要性を分析し、且つより高いレベルの活性がこれらの変異のうちの１つまたは２つを逆転させることにより達成され得るかどうかを判定するために、実験を行った。
【００８２】
材料及び方法
変異導入
Ｇ３９１Ｒ変異及びＲ３６３Ｓ、Ｇ３６６Ｋ、及びＨ３６９Ｎから選択された１つの「逆転」変異を組み込む変異型ｈＧＤＦ９タンパク質を実施例１に記載の方法で調製した。要約すると、ＰＣＲベースの部位特異的変異導入を使用して、ｈＢＭＰ１５からの１つの変異が逆転されている３つの異なるクムリン様ＧＤＦ９発現カセットを生成した。使用されるプライマーは、表４に示される。変異体を、クムリン様ＧＤＦ９  Ｒ３６３Ｓ、クムリン様ＧＤＦ９  Ｇ３６６Ｋ、及びクムリン様ＧＤＦ９  Ｈ３６９Ｎと名付けた。明確にするために、クムリン様ＧＤＦ９  Ｒ３６３Ｓは、クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）変異体に含まれるＧ３９１Ｒ、Ｋ３６６Ｇ、及びＮ３６９Ｈ変異体を保持し；クムリン様ＧＤＦ９  Ｇ３６６Ｋは、クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）変異体に含まれるＧ３９１Ｒ、Ｓ３６３Ｒ、及びＮ３６９Ｈ変異を保持し；クムリン様ＧＤＦ９  Ｈ３６９Ｎは、クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）変異体に含まれるＧ３９１Ｒ、Ｓ３６３Ｒ、及びＫ３６６Ｇ変異を保持していた。
【００８３】
【表４】
2021523161.tif 000006
【００８４】
産生及び精製
実施例１に記載されるように、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のトランスフェクション及び固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（Ｃｏ−ＩＭＡＣ）を使用して、ｈＧＤＦ９変異体の発現及び精製を行った。
【００８５】
活性試験
実施例１に記載のＳｍａｄ−２／３応答性ルシフェラーゼレポーター及びアッセイを使用して、野生型プロ−ｈＧＤＦ９及びｈＧＤＦ９  Ｇ３９１Ｒ変異体（実施例２）と共に、ｈＧＤＦ９変異体の活性を試験した。基質Ｄ−ルシフェリンの添加直後に発光を測定することにより、ルシフェラーゼタンパク質の発現を評価した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
【００８６】
結果
逆転変異を有するｈＧＤＦ９変異体の発現
異なるクムリン様ＧＤＦ９変異体の発現を評価するために、馴化培地をトランスフェクトＨＥＫ−２９３Ｔ細胞培養物から収集し、５Ｘ濃縮し、ＧＤＦ９成熟タンパク質に特異的な抗体を用いる還元条件下でウェスタンブロッティングにより試験した（ｍＡＢ  ５３／１；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｒｏｏｋｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。結果は、図８に示される。クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）タンパク質のＳ３６３Ｒ変異を「逆転させる」と、発現がわずかに減少するが、Ｋ３６６Ｇ変異を逆転させると、発現がさらにレベルまで大幅に減少した。対照的に、Ｎ３６９Ｈ変異の逆転は、発現のわずかな増加を引き起こした。
【００８７】
活性試験
逆転変異を有する全てのｈＧＤＦ９変異体を、Ｃｏ−ＩＭＡＣで精製し、Ｓｍａｄ−２／３応答性ルシフェラーゼレポーター（ｐＡ３−Ｌｕｘ）及び転写因子ＦＡＳＴ２でトランスフェクトされたＣＯＶ４３４顆粒膜細胞を使用して活性について評価した。トランスフェクト細胞を、用量範囲（３．１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ）の野生型プロ−ｈＧＤＦ９、プロ−ＧＤＦ９＿Ｇ３９１Ｒ、及び様々なプロ−クムリン様ＧＤＦ９多様体で約２０時間処置した。基質Ｄ−ルシフェリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の添加直後の発光を測定することにより、ルシフェラーゼタンパク質の発現を評価した。結果は、図９に示される。実施例１で観察されたように、プロ−クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）は、ルシフェラーゼレポータータンパク質の発現を用量依存的に増加させた。Ｈ３６９変異を野生型ｈＧＤＦ９のＮ３６９に逆転させると、試験された低用量（３．１ｎｇ／ｍＬ〜２５ｎｇ／ｍＬ）で活性レベルに影響を与えなかったが、５０ｎｇ／ｍＬで最大応答に影響を及ぼした（すなわち、それは、クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）タンパク質と比較して約１０％の活性の低減を引き起こした）。他方では、Ｓ３６３Ｒ及びＫ３６６Ｇのいずれかの変異を逆転させると、活性及び最大応答においてより実質的な低下を引き起こした（特に、２５ｎｇ／ｍＬ以上の高用量で顕著である）。
【００８８】
考察
クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）変異型タンパク質からの活性及び最大応答を達成するために、Ｓ３６３Ｒ、Ｋ３６６Ｇ、及びＮ３６９Ｈアミノ酸置換の３つ全て（ＢＭＰ１５に見られる）が必要とされることがわかった。これらのうち、発現及び活性の両方に寄与する最も重要な変異を、Ｋ３６６Ｇと同定した。これが逆転している変異体（すなわち、プロ−クムリン様ＧＤＦ９＿Ｇ３６６Ｋ）は、発現の実質的な低減を示した。より重要なことに、プロ−クムリン様ＧＤＦ９＿Ｇ３６６Ｋ変異体は、元の変異体１形態の半分未満の効力を示した。Ｓ３６３Ｒ変異の逆転は、発現及び活性の軽度の減少をもたらすこともわかった。それ故、この変異は、クムリン様ＧＤＦ９変異体１タンパク質の良好な発現及び活性特性にも寄与すると考えられる。
【００８９】
Ｎ３６９Ｈ変異（プロ−クムリン様ＧＤＦ９＿Ｈ３６９Ｎ）の逆転は、発現のわずかな増加をもたらし、この変異が実際に発現に悪影響を及ぼしていることを示唆する。しかし、より重要なことに、プロ−クムリン様ＧＤＦ９＿Ｈ３６９Ｎ変異体は、非常に活性が高いことが観察された。実際には、試験されたほとんどの用量（３．１ｎｇ／ｍＬ〜２５ｎｇ／ｍＬ）で、このタンパク質は、プロ−クムリン様ＧＤＦ９（変異体１）タンパク質と同等のレベルの活性を示し、試験された最高用量（５０ｎｇ／ｍＬ）でのみ、プロ−クムリン様ＧＤＦ９＿Ｈ３６９Ｎは、同じレベルの活性を提供することができなかった。それにもかかわらず、プロ−クムリン様ＧＤＦ９＿Ｈ３６９Ｎは依然として、本明細書に記載されるような用途（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟（ＩＶＭ））に適し得ると考えられ、プロ−クムリンがブタ卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）のＩＶＭ結果を改善する能力に、使用される用量が２０ｎｇ／ｍＬまたは１００ｎｇ／ｍＬであるかどうかにかかわらず、有意差はなく（上掲のＭｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．）、ＩＶＭ中の用量の影響は、０〜２０ｎｇ／ｍＬのみで関連する可能性があることが示唆される。
【００９０】
実施例４  卵母細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟（ＩＶＭ）におけるプロ−クムリン様ＧＤＦ９の使用
卵胞発育及び卵母細胞成熟ならびに特性（卵母細胞発育能力）を促進するために本開示によるプロ−クムリン様ＧＤＦ９を使用する可能性は、顆粒膜細胞増殖アッセイにより、ならびに、卵母細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟（ＩＶＭ）期中の卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）の処置、それに続く、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精及び胚培養ならびにその後の胚盤胞の収量及び質の評価により、評価することができる。
【００９１】
材料及び方法
顆粒膜細胞（ＧＣ）増殖アッセイ
以前に記載された標準的な手順を使用して、マウス顆粒膜細胞［３Ｈ］−チミジン取り込みアッセイを実施した（Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。簡単に言うと、壁ＧＣを、ゴナドトロピンプライミングの４４〜４６時間後にＣ５７Ｂｌ／６マウスから収集した。次に、１８時間の処置（すなわち、１．５６ｎｇ／ｍｌ、３．１２５ｎｇ／ｍｌ、６．２５ｎｇ／ｍｌ、及び１２．５ｎｇ／ｍｌのプロ−クムリン様ＧＤＦ９（変異体２））で、続いて、さらに６時間、１５．４ｋＢｑ［３Ｈ］−チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；米国マサチューセッツ州ウォルサム）で、２×１０５細胞／ｍｌのタンパク質不含培地中、５％ＣＯ２中、３７℃で、細胞を培養した。細胞ＤＮＡ合成の指標としてＭｉｃｒｏｂｅｔａマイクロプレートカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、顆粒膜細胞［３Ｈ］−チミジンの取り込みを評価した。
【００９２】
ウシＩＶＭ
１０％の仔ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；米国カリフォルニア州カールスバッド）及び４ｍｇ／ｍＬの脂肪酸不含ウシ血清アルブミン（ＦＡＦ−ＢＳＡ；ＭＰ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ；米国カリフォルニア州サンタアナ）が補充されたＨＥＰＥＳ緩衝組織培地１９９（ＴＣＭ  １９９）において屠殺場由来の卵巣の胞状卵胞から、ウシ卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を収集した。無傷の卵丘ベストメント及び均質な細胞質を有するＣＯＣを選択し、５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシン、５０ｍｇ／ｍＬのヘパリン、及び４ｍｇ／ｍＬのＦＡＦ−ＢＳＡが補充されたＨＥＰＥＳ−ＴＣＭ−１９９で洗浄し、続いて、ＨＥＰＥＳ−ＴＣＭ１９９で２回洗浄した。次に、５％のＣＯ２及び２０％のＯ２下、３８．５℃で、Ｎｕｎｃ４ウェルディッシュ中の胚グレード鉱油下で、０．１ＩＵ／ｍＬのｈＣＧ（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＳＡ；独国ダルムシュタット）、１ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトＦＳＨ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；オランダ・オス）、１μＭのシステアミン、１０％（ｗ／ｖ）のＦＣＳ、及び４ｍｇ／ｍＬのＦＡＦ−ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ；米国マサチューセッツ州ウォルサム）が補充された重炭酸塩緩衝ＴＣＭ１９９中で、ＣＯＣをまとめて２４時間成熟させた（各群が、ビヒクル（対照）、または５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、もしくは１００ｎｇ／ｍｌのプロ−クムリン様ＧＤＦ９（変異体２）で処置される）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟後に、空気中５％のＣＯ２下、３８．５℃で、９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の鉱油下、アミノ酸（５０μＬ）が補充されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精培地中の最終濃度１×１０６／ｍＬの単一の種雄牛（Ｓｅｍｅｘ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ；Ｍｅｌｔｏｎ、オーストラリア・ヴィクトリア州）の精子を用いて、卵母細胞（１ウェル当たりｎ＝２０）を受精した。２３時間後に、仮の接合子を回収し、卵丘細胞を手で剥ぎ取り、アミノ酸及び４ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（１ウェル当たり５００μＬ）が補充された合成卵管液（ＳＯＦ）培地を含有するＮｕｎｃ４ウェルディッシュ（１ウェル当たりｎ＝２０）に、得られた胚を移す。次に、胚は、５％のＯ２及び６％のＣＯ２下３８．５℃で６０時間、モジュラーインキュベーター中で培養されてもよい。
【００９３】
結果及び考察
顆粒膜細胞（ＧＣ）増殖アッセイ
マウスＧＣ増殖アッセイで得られた結果を図１０に示す。結果は、プロ−クムリン様ＧＤＦ９によるＧＣの処置が用量依存的に細胞の増殖を促進することを示した。
【００９４】
ウシＩＶＭ
ウシＣＯＣの処置から得られた予備的な結果が以下の表５に示される。特に、１００ｎｇ／ｍｌの場合、結果は、ＣＯＣをプロ−クムリン様ＧＤＦ９で処置すると、卵母細胞受精の頻度（％卵母細胞受精）及び５日目にコンパクション卵母細胞数（％コンパクション卵母細胞）が改善されることを示す。プロ−クムリン様ＧＤＦ９を用いる処置が、ＩＶＭの後続の段階で形成された胚盤胞数（％胚盤胞）及び孵化胚盤胞（％孵化胚盤胞）も改善することが示されることも予想される。
【００９５】
【表５】
2021523161.tif 000007
【００９６】
続く明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって、文脈に別途要求のない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という単語ならびに「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの語尾変化は、述べられた整数または整数の群を含むが、他の任意の整数または整数の群を除外しないことを意味すると理解されるであろう。
【００９７】
本明細書における任意の先行技術への言及は、そのような先行技術が一般的な共通知識の一部を形成するあらゆる形態の提案の承認でなく、それと解釈されるべきではない。
【００９８】
本開示の薬剤または方法（複数可）は、記載されたその特定の形態または用途に限定されないことが当業者らにより理解されるであろう。本開示の薬剤または方法（複数可）は、本明細書に説明または記載される特定の要素及び／または特徴に関して、好ましい実施形態（複数可）のいずれかに限定されない。薬剤及び方法（複数可）はまた、本開示の範囲から逸脱することなく、多数の再変性、修正、及び置き換えの対象となってもよい。
【００９９】
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ＭｃＩｎｔｏｓｈ  ＣＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ７９（５）：８８９−８９６（２００８）．
ＭｃＭａｈｏｎ  ＨＥ  ｅｔ  ａｌ．，１４９（６）：２８０７−２８１５（２００８）．
ＭｃＮａｔｔｙ  ＫＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １２９（４）：４７３−４８０（２００５）．
ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ＡＣ  ａｎｄ  ＳＪ  Ｌｅｅ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８（５）：３４４４−３４４９（１９９３）．
Ｍｉ  ＬＺ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１２（１２）：３７１０−３７１５（２０１５）．
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Ｎａｇａｒａｊａｎ  ＲＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（４７）：３３４１２−３３４１８（１９９９）．
Ｏｔｓｕｋａ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ９１（１１）：４７１３−４７１６（２０１１）．
Ｐａｔｉｎｏ  ＬＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ  Ｍｅｔａｂ  １０２（３）：１００９−１０１９（２０１７）．
Ｐｅｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１０（８）：Ｅ７７６−Ｅ７８５（２０１３）．
Ｐｅｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ９１（６）：７（２０１４）．
Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５３（３）：１３０１−１３１０（２０１２）．
Ｓｍｉｔｚ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｍｅｄ  ２９（１）：２４−３７（２０１１）．
Ｓｕｇｉｍｕｒａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ４０３：１３９−１４９（２０１５）．
Ｖａｎｄｅｒｈｙｄｅｎ  ＢＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １４０：３０１７−３１７（１９９０）．
Ｖｉｔｔ  ＵＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６７（２）：４７３−４８０（２００２）．
Ｙｏｓｈｉｏｋａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ  ５４：２０８−２１３（２００８）．
【図１】
2021523161.tif 000008
【図２】
2021523161.tif 000009
【図３】
2021523161.tif 000010
【図４】
2021523161.tif 000011
【図５】
2021523161.tif 000012
【図６】
2021523161.tif 000013
【図７】
2021523161.tif 000014
【図８】
2021523161.tif 000015
【図９】
2021523161.tif 000016
【図１０】
2021523161.tif 000017
【配列表】
2021523161000001.app
【国際調査報告】
2021523161.tif 000018
2021523161.tif 000019
2021523161.tif 000020