(57)【要約】本発明は、ヒト癌胎児性抗原ＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ４７に結合する二重特異性抗体、このような二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド、およびベクター、ならびにこのようなポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。本発明はさらに、このような抗体を選択および生産するための方法、ならびに疾患単剤療法および組み合わせの処置においてこのような抗体を使用する方法を提供する。上記二重特異性抗体は、高い有効性と、低い毒性、低い免疫原性および好ましい薬物動態特性とを併せ持つ。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、二重特異性抗体。
【請求項２】
糖操作されていない同じ二重特異性抗体と比較して減少した数のフコース残基を有するように糖操作されたＦｃ領域を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
前記第１の結合部分が、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合する、請求項１または請求項２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
前記第１の結合部分が、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＥＡＣＡＭ６に平衡して特異的に結合する、請求項３に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＥＡＣＡＭ６への結合のＥＣ５０値が３倍未満異なる（平衡結合）、請求項４に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
ａ）前記第１の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲとして配列番号１１２のＣＤＲＬ１、配列番号１１３のＣＤＲＬ２および配列番号１１４のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含み、ならびに
ｂ）前記第２の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲとして配列番号２８のＣＤＲＬ１、配列番号２９のＣＤＲＬ２および配列番号３０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
前記第１の結合部分が、アミノ酸３５〜１４４のＣＥＡＣＡＭ５のＩｇ様Ｖタイプドメインに結合することを特徴とする、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
ＣＥＡＣＡＭ５への結合について、ＶＫおよびＶＨドメインとして配列番号１００および１０１の配列のＶＫおよびＶＨを含む抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体ＳＭ３Ｅと競合することを特徴とする、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
ＣＥＡＣＡＭ５への結合について、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体ＳＭ３Ｅ、ＶＬおよびＶＨドメインとして配列番号１０２および１０３の配列のＶＬおよびＶＨを含むＭＥＤＩ、ＶＫおよびＶＨドメインとして配列番号１１０および１１１の配列のＶＫおよびＶＨを含むラベツズマブ（Ｌａｂ）、ＶＫおよびＶＨドメインとして配列番号１０４および１０５の配列のＶＫおよびＶＨを含むＳＡＲ、ＶＫおよびＶＨドメインとして配列番号１０８および１０９の配列のＶＫおよびＶＨを含むＴ８６．６６、ＶＫおよびＶＨドメインとして配列番号１０６および１０７の配列のＶＫおよびＶＨを含むＣＨ１Ａ１Ａのいずれとも競合しない、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１０】
前記二重特異性抗体の食作用指数曲線のＥＣ５０値が、同じ実験条件下および１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの存在下における参照抗体Ｋ２ＡＣ２２のＥ５０値の０．１〜３倍の範囲内である、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
前記二重特異性抗体のＭＫＮ４５細胞の食作用のＥＣ５０値が、同じ実験条件下および１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの存在下における参照抗体Ｋ２ＡＣ２２のＥ５０値の０．１〜１０倍の範囲内であることを特徴とする、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの存在下では、イメージングベースのアッセイで測定された食作用指数の最大が、同じ実験条件下におけるヒトＩｇＧなしの食作用と比較して０．７倍超減少しないことを特徴とする、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
前記ＥＣ５０範囲が、０．２〜３．０、０．３〜３．０、０．５〜２．５または１．０〜２．５である、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
食作用の前記ＥＣ５０値が、前記食作用指数曲線のＥＣ５０値として測定される、請求項１０または請求項１１に記載の二重特異性抗体。
【請求項１５】
１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの存在下では、前記二重特異性抗体の最大食作用指数が、同じ実験条件下およびヒトＩｇＧの追加なしで測定された前記最大食作用指数と比較して７倍超減少しない、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１６】
ａ）前記第１の結合部分が、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１３のヒトラムダタイプの軽鎖定常ドメインとを含み、前記第２の結合部分が、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号７のＣＤＲＬ１、配列番号８に含まれるＡｌａ  Ａｌａ  ＳｅｒのＣＤＲＬ２および配列番号９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、または
ｂ）前記第１の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１３のヒトラムダタイプの軽鎖定常ドメインとを含み、前記第２の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２８のＣＤＲＬ１、配列番号２９のＣＤＲＬ２および配列番号３０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１７】
ａ）前記第１の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号３１、３２および３３；配列番号３４、３５および３６、配列番号３７、３８および３９、配列番号４０、４１および４２、配列番号４３、４４および４５、配列番号４６、４７および４８、配列番号４９、５０および５１、配列番号５２、５３および５４、配列番号５５、５６および５７、配列番号５８、５９および６０、配列番号６１、６２および６３、配列番号１１２、１１３および１１４からなる群より選択されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の組み合わせを含む軽鎖可変領域とを含み、ならびに
ｂ）前記第２の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲとして配列番号２８のＣＤＲＬ１、配列番号２９のＣＤＲＬ２および配列番号３０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１８】
前記第１の結合部分において、軽鎖定常ドメインとして配列番号１３のヒトラムダタイプドメインを含むことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１９】
ａ）前記第１の結合部分が、配列番号４の重鎖可変領域（ＶＨ）と、
配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４および配列番号１１５からなるＶＬＣＬ領域に含まれるＶＬの群より選択される軽鎖可変領域とを含み、ならびに
ｂ）前記第２の結合部分が、配列番号４の重鎖可変領域と、配列番号１０の軽鎖可変領域とを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２０】
ａ）前記第１の結合部分が、配列番号５の重鎖と、
配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４および配列番号１１５からなる群より選択される軽鎖とを含み、
ｂ）前記第２の結合部分が、配列番号５の重鎖可変領域と、配列番号１１の軽鎖可変領域とを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２１】
前記第１の結合部分について一価であり、前記第２の結合部分について一価である、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２２】
定常および可変フレームワーク領域配列がヒトのものである、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２３】
前記第１および第２の結合部分がそれぞれ、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２４】
ヒトＩｇＧ１タイプである、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２５】
全長抗体である、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２６】
ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する前記第１の結合部分が、カッパ軽鎖可変ドメインおよびラムダ軽鎖定常ドメインを含み、ＣＤ４７に特異的に結合する前記第２の結合部分が、カッパ軽鎖可変ドメインおよびカッパ軽鎖定常ドメインを含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２７】
ＣＥＡＣＡＭ５に特異的な前記第１の結合部分が、ラムダ軽鎖可変ドメインおよびラムダ軽鎖定常ドメインを含み、ＣＤ４７に特異的な前記第２の結合部分が、カッパ軽鎖可変ドメインおよびカッパ軽鎖定常ドメインを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２８】
完全ヒト二重特異性ＩｇＧ１フォーマットである、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２９】
タイプ１またはタイプ２のκλ二重特異性抗体であり、共通重鎖（ｃＨＣ）を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項３０】
１００ｎＭ〜６００ｎＭの結合親和性でヒトＣＤ４７に結合することを特徴とする、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項３１】
１〜２００ｎＭのＥＣ５０値でＭＫＮ−４５細胞に結合する、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項３２】
１〜５０ｎＭのＥＣ５０値でＭＫＮ−４５細胞に結合する、請求項３１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３３】
５０〜１００ｎＭのＥＣ５０値でＭＫＮ−４５細胞に結合する、請求項３１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３４】
１００〜２００ｎＭのＥＣ５０値でＭＫＮ−４５細胞に結合する、請求項３１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３５】
前記二重特異性抗体による、ヒトマクロファージの存在下におけるＭＫＮ−４５細胞の前記食作用指数曲線の前記ＥＣ５０が、２００ｎｇ／ｍｌ可溶性ＣＥＡＣＡＭ５の存在下では、可溶性ＣＥＡＣＡＭ５なしで測定されたＥＣ５０と比較して高い濃度の方向に４倍超シフトせず、および／または前記食作用指数曲線の最大が、２００ｎｇ／ｍＬ  ＣＥＡＣＡＭ５の追加により１０％もしくはそれを超えて、１５％もしくはそれを超えてもしくは２０％もしくはそれを超えて減少しない、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項３６】
ＭＫＮ−４５細胞への前記二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０が、２００ｎｇ／ｍｌ可溶性ＣＥＡＣＡＭ５の存在下では、可溶性ＣＥＡＣＡＭ５なしで測定されたＥＣ５０と比較して高い濃度の方向に２倍超シフトしない、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項３７】
ヒトＣＥＡＣＡＭ１と交差反応しない、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項３８】
１〜５０ｎＭのＥＣ５０値で、組換えＣＨＯ細胞ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−６１（商標））上において発現されたヒトＣＥＡＣＡＭ６に結合する、請求項３に記載の二重特異性抗体。
【請求項３９】
前記ＣＥＡＣＡＭ６陰性ＣＨＯ細胞が、ヒトＣＥＡＣＡＭ６のｃＤＮＡを含有するベクターでトランスフェクトされる、請求項３８に記載の二重特異性抗体。
【請求項４０】
ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域を含む３００ｎＭの濃度のモノクローナル抗体が、ＭＫＮ−４５細胞へのＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０をより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項４１】
ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３εに特異的に結合する二重特異性抗体であって、重鎖として配列番号９７および９８の重鎖と、軽鎖として配列番号９６および９９の軽鎖とを含む３００ｎＭの濃度の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への前記ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体の前記結合曲線の前記ＥＣ５０をより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項４２】
ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３εに特異的に結合する二重特異性抗体であって、重鎖および軽鎖として配列番号９２〜９５のアミノ酸配列を含む３０ｎＭの濃度の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への前記ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体の前記結合曲線の前記ＥＣ５０をより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項４３】
ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３εに特異的に結合する二重特異性抗体であって、重鎖および軽鎖として配列番号９２〜９５のアミノ酸配列の鎖を含む３０ｎＭの濃度の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への前記ＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体の前記食作用指数曲線の前記ＥＣ５０をより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項４４】
ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３εに特異的に結合する二重特異性抗体であって、重鎖および軽鎖として配列番号９６〜９９のアミノ酸配列を含む３００ｎＭの濃度の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への前記ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体の前記食作用指数曲線の前記ＥＣ５０をより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項４５】
前記第１の結合部分の重鎖としておよび前記第２の結合部分の重鎖として共通重鎖（ｃＨＣ）を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項４６】
各結合部分の前記共通重鎖が、ＣＤＲとして配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３または配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含むことを特徴とする、請求項４５に記載の二重特異性抗体。
【請求項４７】
各結合部分の前記共通重鎖が、共通可変重ドメイン（ｃＶＨ）として配列番号４を含むことを特徴とする、請求項４５に記載の二重特異性抗体。
【請求項４８】
配列番号５、配列番号２３および配列番号２４からなる群より選択される共通重鎖（ｃＨＣ）を含むことを特徴とする、請求項４５に記載の二重特異性抗体。
【請求項４９】
配列番号５の前記共通重鎖が、配列番号６に示されている核酸配列によりコードされる、請求項４８に記載の二重特異性抗体。
【請求項５０】
前記第２の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む共通重鎖と、ＣＤＲとして配列番号７のＣＤＲＬ１、配列番号８に含まれるＡｌａ  Ａｌａ  ＳｅｒのＣＤＲＬ２および配列番号９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖（ＬＣ）とを含むか、またはＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む共通重鎖と、ＣＤＲとして配列番号２８のＣＤＲＬ１、配列番号２９のＣＤＲＬ２および配列番号３０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５１】
前記第２の結合部分が、可変重ドメイン（ｃＶＨ）として配列番号４を含む重鎖と、配列番号１０の可変軽ドメイン（ＶＬ）とを含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５２】
前記第２の結合部分が、配列番号５の重鎖（ｃＨＣ）と、配列番号１１の軽鎖（ＣＬ）とを含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５３】
前記第２の結合部分が、配列番号２３の重鎖（ｃＨＣ）と、配列番号１１の軽鎖（ＣＬ）とを含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５４】
前記第２の結合部分が、配列番号２４の重鎖（ｃＨＣ）と、配列番号１１の軽鎖（ＣＬ）とを含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５５】
配列番号１１の前記軽鎖（ＣＬ）が、配列番号１２に示されている核酸配列によりコードされる、請求項５２〜５４のいずれかに記載の二重特異性抗体。
【請求項５６】
ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合し、配列番号１３の軽鎖定常ドメインを含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５７】
０．１〜１０ｎＭのＩＣ５０で、ＭＫＮ−４５細胞上のＣＤ４７（ＳＩＲＰα、ＣＤ１７２ａ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ７８３２４）間の相互作用を阻害する、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５８】
ヒトマクロファージによる、ＣＥＡＣＡＭ５発現腫瘍細胞株ＭＫＮ−４５の前記食作用指数曲線（イメージングベースのアッセイ）の１０ｎＭ未満のＥＣ５０値を特徴とする、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５９】
ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合するが、ＭＫＮ−４５腫瘍細胞上のＣＥＡＣＡＭ５への結合について、ＭＡＢ  ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１と競合しない、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６０】
ＭＫＮ−４５細胞への前記結合の前記ＥＣ５０値（１〜２００ｎＭのＥＣ５０）が、３００ｎＭの濃度のＭＡＢ  ＣＥＡもしくはＣＥＡ−ＴＣＢの存在下で、または３０ｎＭの濃度のＣＥＡ−ＴＣＢ１の存在下で３倍未満増加する、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６１】
Ｂ６Ｈ１２．２を用いた同じアッセイで測定されたＥＣ５０と比較して１００倍またはそれよりも高いＲＢＣ食作用のＥＣ５０を有する、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６２】
最大２００μｇ／ｍＬの濃度で有意な血小板活性化を示さない、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６３】
改変オリゴ糖を有するＦｃ領域を有するように糖操作されている、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６４】
前記糖操作された二重特異性抗体が、同じ実験条件下で測定された場合に、糖操作されていない前記同じ二重特異性抗体と比較して、前記イメージングベースのアッセイにより測定された前記食作用指数曲線の少なくとも３倍低いＥＣ５０値を有する、請求項６３に記載の二重特異性抗体。
【請求項６５】
前記食作用指数の前記ＥＣ５０が、５〜１０倍低いかまたは１０〜３０倍低い、請求項６４に記載の二重特異性抗体。
【請求項６６】
糖操作されていない前記二重特異性抗体と比較して減少した数のフコース残基を有するように改変されたＦｃ領域を有する、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６７】
糖操作されていない前記二重特異性抗体と比較して増加した割合の二分岐型オリゴ糖を有するように糖操作されたＦｃ領域を有する、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６８】
前記二分岐型オリゴ糖が主に二分岐型複合体である、請求項６９に記載の二重特異性抗体。
【請求項６９】
糖操作されていない前記二重特異性抗体と比較して増加した割合の前記二重特異性抗体の前記Ｆｃ領域中の二分岐型非フコシル化型オリゴ糖を有するように糖操作されている、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７０】
糖操作されていない前記二重特異性抗体と比較して増加した前記Ｆｃ領域中のＧＩｃＮＡｃ残基対フコース残基比を有するように糖操作されている、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７１】
前記二分岐型非フコシル化型オリゴ糖が主にハイブリッド形態である、請求項７０に記載の二重特異性抗体。
【請求項７２】
前記二分岐型非フコシル化型オリゴ糖が主に複合体タイプである、請求項７０に記載の二重特異性抗体。
【請求項７３】
前記Ｎ結合型オリゴ糖の５０％〜１００％が非フコシル化型であるＦｃ領域を有する、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７４】
前記Ｎ結合型オリゴ糖の５０％〜１００％が二分岐型であるＦｃ領域を有する、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７５】
前記Ｎ結合型オリゴ糖の８０％〜１００％が二分岐型および非フコシル化型であるＦｃ領域を有する、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７６】
糖操作されており、前記糖操作された抗体により誘導された前記濃度ＡＤＣＣ曲線（最大および／またはＥＣ５０）が、糖操作されていない前記同じ二重特異性抗体により誘導されたＡＤＣＣと比較して少なくとも１．２倍増加している、前述の請求項１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７７】
ＡＤＣＣ曲線のＡＤＣＣ最大および／またはＥＣ５０値が１．２〜２．０倍増加している、請求項７６に記載の二重特異性抗体。
【請求項７８】
同じ実験条件下で測定された場合に、糖操作されていない前記同じ二重特異性抗体と比較して、前記イメージングベースのアッセイにより測定された前記食作用指数曲線の少なくとも３倍低いＥＣ５０値を有する、請求項２〜７７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７９】
前記食作用指数の前記ＥＣ５０が５〜１０倍低い、請求項７８に記載の二重特異性抗体。
【請求項８０】
前記食作用指数の前記ＥＣ５０が１０〜３０倍低い、請求項７８に記載の二重特異性抗体。
【請求項８１】
前記糖操作された抗体により誘導されてフローサイトメトリーにより決定された最大ＡＤＣＰ機能が、糖操作されていない前記同じ二重特異性抗体により誘導されたＡＤＣＰと比較して少なくとも１．２倍増加している、請求項２〜８０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項８２】
前記ＡＤＣＰが１．２〜２．０倍増加している、請求項８０に記載の二重特異性抗体。
【請求項８３】
一置換Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ、二置換Ｉ３３２ＥおよびＧ２３６Ａ、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ、Ｓ２３９ＤおよびＧ２３６Ａならびに三置換Ｓ３２９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＧ２３６Ａからなる群より選択される前記Ｆｃ領域中の１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項８４】
糖操作されていない前記同じ二重特異性抗体と比較して減少した数のフコース残基を有するように糖操作されたＦｃ領域を有する、請求項８３ｓに記載の二重特異性抗体。
【請求項８５】
前記アミノ酸置換抗体により誘導されたＡＤＣＣ曲線の前記最大および／またはＥＣ５０値が、前記Ｆｃ領域中の前記アミノ酸置換をいずれも含まない前記二重特異性抗体により誘導されたＡＤＣＣと比較して少なくとも１．２倍増加している、請求項８３または８４に記載の二重特異性抗体。
【請求項８６】
ＡＤＣＣが１．２〜２．０倍増加している、請求項８５に記載の二重特異性抗体。
【請求項８７】
前記Ｆｃ領域中の前記置換を含む前記二重特異性抗体が、同じ実験条件下で測定された場合に、Ｆｃ領域中の前記アミノ酸置換をいずれも含まない前記同じ二重特異性抗体と比較して、前記イメージングベースのアッセイにより測定された前記食作用指数曲線の少なくとも３倍低いＥＣ５０値を有する、請求項８３〜８６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項８８】
前記食作用指数の前記ＥＣ５０が５〜１０倍低い、請求項８７に記載の二重特異性抗体。
【請求項８９】
前記食作用指数の前記ＥＣ５０が１０〜３０倍低い、請求項８７に記載の二重特異性抗体。
【請求項９０】
前記Ｆｃ領域中の前記置換を含む前記二重特異性抗体が、前記アミノ酸置換抗体により誘導されてフローサイトメトリーにより決定された最大食作用が、前記Ｆｃ領域中の前記アミノ酸置換をいずれも含まない前記抗体により誘導された最大食作用と比較して少なくとも１．２倍増加していることを特徴とする、請求項８３〜８９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９１】
前記ＡＤＣＰが１．２〜２．０倍増加している、請求項９０に記載の二重特異性抗体。
【請求項９２】
前記Ｆｃ領域中の前記置換を含む前記二重特異性抗体が、同じ実験条件下で測定された場合に、Ｆｃ領域中の前記アミノ酸置換をいずれも含まない前記同じ二重特異性抗体と比較して、前記イメージングベースのアッセイにより測定された前記食作用指数曲線の少なくとも３倍低いＥＣ５０値を有する、請求項８３〜９１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９３】
前記食作用指数の価ＥＣ５０が５〜１０倍低い、請求項９２に記載の二重特異性抗体。
【請求項９４】
前記Ｆｃ領域中の前記Ｎ結合型オリゴ糖の５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％または８０％〜１００％が非フコシル化型である、請求項２〜９３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９５】
前記Ｆｃ領域中の前記Ｎ結合型オリゴ糖の５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％または８０％〜１００％が二分岐型である、請求項２〜９４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９６】
前記Ｆｃ領域中の前記Ｎ結合型オリゴ糖の５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％または８０％〜１００％が二分岐型非フコシル化型である、請求項２〜９５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９７】
前記糖操作された二重特異性抗体が、共通重鎖として配列番号５を含む糖操作されていない前記二重特異性抗体と比較して増加したエフェクター機能を含む、請求項２〜９６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９８】
以下のエフェクター機能：
ａ．ＦｃγＲへの増加した結合親和性、
ｂ．増加した抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を含むマクロファージの増加した結合、
ｃ．増加した抗体媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を含むＮＫ細胞の増加した結合、および
ｄ．単球への増加した結合
の１つまたはそれよりも多くの増加を示す、請求項９７に記載の二重特異性抗体。
【請求項９９】
前記イメージングベースの食作用アッセイへの１ｍｇ／ｍＬのｈｕ  ＩｇＧの前記追加が、前記濃度／食作用指数曲線の前記最大の０．９倍未満の減少および／またはより高い濃度の方向への前記ＥＣ５０の３倍未満のシフトを引き起こす、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１００】
カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５と交差反応する、前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１０１】
前述の請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
請求項１０１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１０３】
請求項１０２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０４】
本発明の二重特異性抗体の生産のための方法であって、
ａ）前記二重特異性抗体の生産を可能にする条件下で、請求項１０３に記載の宿主細胞を培養すること、および
ｂ）前記抗体を単離すること
を含む、方法。
【請求項１０５】
前記抗体が、ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ４７に特異的に結合することができる、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
請求項２〜１００のいずれか一項に記載の糖操作された二重特異性抗体を生産するための方法であって、
ａ）前記二重特異性抗体の生産を可能にする条件であって、前記二重特異性抗体の前記Ｆｃ領域上に存在するオリゴ糖の改変を可能にする条件下で、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように糖操作された宿主細胞を培養すること；および
ｂ）ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ４７に特異的に結合することができる前記糖操作された二重特異性抗体を単離すること
を含む、方法。
【請求項１０７】
宿主細胞において請求項２〜１００のいずれか一項に記載の糖操作された二重特異性抗体を生産するための方法であって、
ａ）前記二重特異性抗体の生産を可能にする条件であって、前記二重特異性抗体の前記Ｆｃ領域上に存在するオリゴ糖の改変を可能にする条件下で、ＦＵＴ８遺伝子の標的破壊により糖操作された宿主細胞を培養すること、および
ｂ）ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ４７に特異的に結合することができる前記糖操作された二重特異性抗体を単離すること
を含む、方法。
【請求項１０８】
宿主細胞において請求項８３〜９３のいずれか一項に記載のＦｃ置換二重特異性抗体を生産するための方法であって、
ａ）前記二重特異性抗体の生産を可能にする条件下で、前記Ｆｃ置換二重特異性抗体をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を培養すること、および
ｂ）ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ４７に特異的に結合することができる前記Ｆｃ置換二重特異性抗体を単離すること
を含む、方法。
【請求項１０９】
腫瘍細胞の細胞溶解を誘導する方法であって、前記腫瘍細胞を、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と接触させることを含む、方法。
【請求項１１０】
前記腫瘍細胞がヒト腫瘍細胞である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記腫瘍細胞が患者中にある、請求項１０９または請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記腫瘍細胞が、結腸直腸癌細胞、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）細胞、胃癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、またはＣＥＡＣＡＭ５を発現する別の腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１０９〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体を処置する方法であって、前記被験体に治療有効量の請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を投与することを含む、方法。
【請求項１１４】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の生存期間を増加させる方法であって、前記被験体に治療有効量の請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を投与することを含む、方法。
【請求項１１５】
前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌または乳癌であることを特徴とする、請求項１１３または請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
化学療法および／または放射線療法と組み合わせて前記二重特異性抗体をヒト被験体に投与する、請求項１０９〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体を処置するための方法であって、前記被験体に治療有効量の請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を投与することを含み、前記二重特異性抗体の食作用のＥＣ５０値が、同じ実験条件下および１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの存在下における参照抗体Ｋ２ＡＣ２２のＥ５０値の０．１〜３倍の範囲内であることを特徴とする、方法。
【請求項１１８】
前記ＥＣ５０範囲が、０．２〜３．０、０．３〜３．０、０．５〜２．５または１．０〜２．５である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記二重特異性抗体が、１００ｎＭ〜６００ｎＭの結合親和性でヒトＣＤ４７に結合することを特徴とする、請求項１０９〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体を処置する方法において使用するための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、前記方法が、前記被験体に治療有効量の本発明の二重特異性抗体を投与することを含み、前記二重特異性抗体の食作用のＥＣ５０値が、同じ実験条件下および１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの存在下における参照抗体Ｋ２ＡＣ２２のＥ５０値の０．１〜３倍の範囲内であることを特徴とする、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２１】
前記ＥＣ５０範囲が、０．２〜３．０、０．３〜３．０、０．５〜２．５または１．０〜２．５である、請求項１２０に記載の使用のための二重特異性抗体。
【請求項１２２】
１００ｎＭ〜６００ｎＭの結合親和性でヒトＣＤ４７に結合することを特徴とする、請求項１２０または請求項１２１に記載の使用のための二重特異性抗体。
【請求項１２３】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体を処置するための医薬の製造における、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
【請求項１２４】
前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌および乳癌からなる群より選択される、請求項１２３に記載の二重特異性抗体の使用。
【請求項１２５】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分と、ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２６】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置のために、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分と、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３εのエピトープに特異的に結合する第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２７】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において、ＣＥＡ−ＴＣＢおよび／またはＣＥＡ−ＴＣＢ１と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２８】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置のために、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３εのエピトープに特異的に結合する第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２９】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において、第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、前記本発明の二重特異性抗体が前記第２の二重特異性抗体と競合しない、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３０】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において、ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１と競合しないことを特徴とする、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３１】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において、ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１と競合する、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３２】
ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号８８の重鎖可変領域および配列番号８９の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第４の結合部分であって、配列番号９０の重鎖可変領域および配列番号９１の軽鎖可変領域を含む第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３３】
本発明の二重特異性抗体および前記第２の二重特異性抗体が、６〜１５日間隔で前記被験体に交互に投与されることを特徴とする、請求項１２５〜１３２のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体。
【請求項１３４】
本発明の二重特異性抗体および前記第２の二重特異性抗体が、６〜１５日間隔で前記被験体に同時に投与されることを特徴とする、請求項１２５〜１３２のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体。
【請求項１３５】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３εのエピトープに特異的に結合する第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、３００ｎＭの濃度の前記第２の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の前記食作用指数曲線の前記ＥＣ５０の前記ＥＣ５０をより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３６】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号８８の重鎖可変領域および配列番号８９の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第４の結合部分であって、配列番号９０の重鎖可変領域および配列番号９１の軽鎖可変領域を含む第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、３００ｎＭの濃度の前記第２の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の前記結合曲線の前記ＥＣ５０をより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３７】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において、ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、３００ｎＭの濃度の前記ＣＥＡ−ＴＣＢまたは３０ｎＭの濃度のＣＥＡ−ＴＣＢ１が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の前記結合曲線の前記ＥＣ５０をより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３８】
前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌および乳癌である、請求項１２５〜１３７のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体。
【請求項１３９】
前記二重特異性抗体および前記第２の二重特異性抗体が、例えばＭＫＮ−４５腫瘍細胞と、同じヒトドナー由来のヒトマクロファージおよびＴ細胞とを含有するアッセイにおいて、腫瘍細胞の相加的な％殺傷を示す、請求項１２５〜１３８のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体。
【請求項１４０】
前記二重特異性抗体および前記第２の二重特異性抗体が、例えばＭＫＮ−４５腫瘍細胞と、同じヒトドナー由来のヒトマクロファージおよびＴ細胞とを含有するアッセイにおいて、腫瘍細胞の相乗的な％殺傷を示す、請求項１２５〜１３８のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体。
【請求項１４１】
請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む組成物であって、前記二重特異性抗体が第２の二重特異性抗体と競合しないことを特徴とし、前記組成物が、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において使用するためのものである、組成物。
【請求項１４２】
請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む組成物であって、前記二重特異性抗体が、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３εのエピトープに特異的に結合する第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と競合しないことを特徴とし、前記組成物が、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において使用するためのものである、組成物。
【請求項１４３】
請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む組成物であって、前記二重特異性抗体が、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号８８の重鎖可変領域および配列番号８９の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第４の結合部分であって、配列番号９０の重鎖可変領域および配列番号９１の軽鎖可変領域を含む第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と競合しないことを特徴とし、前記組成物が、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において使用するためのものである、組成物。
【請求項１４４】
前記二重特異性抗体がＣＥＡ−ＴＣＢおよび／またはＣＥＡ−ＴＣＢ１と競合しないことを特徴とする、請求項１４１〜１４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４５】
腫瘍を有するヒト患者の処置のための方法であって、有効量の請求項１〜１００のいずれか一項に記載のＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体と、ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３に対する第２の二重特異性抗体とを前記ヒト患者に投与することを含み、続いて、
（ｉ）前記患者に０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、さらなる実施形態では１．０〜２０．０ｍｇ／ｋｇの用量の前記第２の抗ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ３抗体を例えば４〜１２週間にわたって毎週投与すること、
（ｉｉ）前記患者に前記第２の抗体を１週間に１回（ｑ１）、２週間に１回（ｑ２ｗ）、３週間に１回（ｑ３ｗ）または必要に応じて４週間に１回（ｑ４ｗ）投与すること、
（ｉｉｉ）これらの４〜１２週間後に、および前記抗ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ３抗体のさらに２または３または４消失半減期後に、前記患者に１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量の本発明の抗体を投与すること、
（ｉｖ）前記患者に本発明の前記抗体を１週間に１回（ｑ１）、２週間に１回（ｑ２ｗ）、３週間に１回（ｑ３ｗ）または必要に応じて４週間に１回（ｑ４ｗ）投与すること、前記ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体の２または３または４消失半減期待機すること、および必要に応じて、ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ３二重特異性抗体投与とそれに続くＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体投与の前記サイクルを反復し、必要に応じてそのサイクルを再び反復すること
を含む、方法。
【請求項１４６】
前記腫瘍が癌である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４８】
前記癌が、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する固形癌である、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４９】
前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌または乳癌である、請求項１４６または請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記第２の抗体がＣＥＡ−ＴＣＢである、請求項１４５〜１４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５１】
前記第２の抗体がＣＥＡ−ＴＣＢ１である、請求項１４５〜１４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体および前記第２の二重特異性抗体が競合的である、請求項１４５〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
腫瘍を有するヒト患者の処置のための方法であって、有効量の請求項１〜１００のいずれか一項に記載のＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体と、ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３に対する第２の二重特異性抗体とを投与することを含む、方法。
【請求項１５４】
前記ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体ならびに前記ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３抗体が競合的ではない、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記抗体を同時に投与する、請求項１５３または請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記患者にほぼ同じ時間に０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの前記ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ３二重特異性抗体および１〜２０ｍｇ／ｋｇの前記ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体の用量で投与し、続いて、１週間に１回（ｑ１ｗ）または２週間に１回（ｑ２ｗ）または３週間に１回（ｑ３ｗ）または必要に応じて４週間に１回（ｑ４ｗ）の頻度でこれらの組み合わせ投与を１回またはそれを超えて行う、請求項１５３〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ３二重特異性抗体を０．５〜１０ｍｇ／ｋｇで投与する、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記腫瘍が癌である、請求項１５３〜１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１５３〜１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記癌が、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する固形癌である、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６１】
前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌または乳癌である、請求項１５８または請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記第２の抗体がＣＥＡ−ＴＣＢである、請求項１５３〜１６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記第２の抗体がＣＥＡ−ＴＣＢ１である、請求項１５３〜１６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記二重特異性抗体および前記第２の二重特異性抗体が相加的な有効性を示す、請求項１４５〜１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記二重特異性抗体および前記第２の二重特異性抗体が相乗的な有効性を示す、請求項１４５〜１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と、薬学的に許容され得る賦形剤または担体とを含む医薬組成物。
【請求項１６７】
医薬として使用するための、請求項１６６に記載の医薬組成物。
【請求項１６８】
固形腫瘍障害の処置における医薬として使用するための、請求項１６６または請求項１６７に記載の医薬組成物。
【請求項１６９】
結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、胃癌、膵臓癌または乳癌の処置における医薬として使用するための、請求項１６６または請求項１６７に記載の医薬組成物。
【請求項１７０】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３εのエピトープに特異的に結合する第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の第１の二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、３００ｎＭの濃度の前記第２の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への前記第１の二重特異性抗体の前記結合曲線の前記ＥＣ５０をより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない、医薬組成物。
【請求項１７１】
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号８８の重鎖可変領域および配列番号８９の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第４の結合部分であって、配列番号９０の重鎖可変領域および配列番号９１の軽鎖可変領域を含む第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の第１の二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、３０ｎＭの濃度の前記第２の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への前記第１の二重特異性抗体の前記結合曲線の前記ＥＣ５０をより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない、医薬組成物。
【請求項１７２】
前記第２の二重特異性抗体が、前記結合曲線の前記ＥＣ５０をより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない、請求項１７１に記載の医薬組成物。
【請求項１７３】
前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌または乳癌である、請求項１６６〜１７２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７４】
医薬組成物の製造のための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１７５】
医薬組成物の製造のための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容され得る賦形剤または担体との使用。
【請求項１７６】
固形腫瘍障害の処置における医薬の製造のための、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１７７】
結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、胃癌、膵臓癌または乳癌の処置における、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１７８】
腫瘍細胞の細胞溶解を誘導する方法であって、前記腫瘍細胞を、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と接触させることを含む、方法。
【請求項１７９】
前記腫瘍細胞が、結腸直腸癌細胞、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、胃癌細胞、膵臓癌細胞または乳癌細胞である、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
前記細胞溶解が、前記二重特異性抗体の抗体依存性細胞食作用および／または抗体依存性細胞傷害により誘導される、請求項１７８および１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
ＣＥＡＣＡＭ５を異常発現する癌を有する被験体を処置する方法であって、前記被験体に治療有効量の請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を投与することを含む、方法。
【請求項１８２】
ＣＥＡＣＡＭ５を異常発現する癌を有する被験体を処置する方法であって、前記被験体に、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ３に結合する第２の二重特異性抗体と組み合わせて治療有効量の請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を投与することを含む、方法。
【請求項１８３】
競合的ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ３およびＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体を逐次に／交互に投与する、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ３およびＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７二重特異性抗体が競合的ではないかまたは最小限に競合的であるにすぎない場合、前記２つの二重特異性抗体を逐次にまたは並行して／同時に投与する、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８５】
前記二重特異性抗体および前記第２の二重特異性抗体が相加的な有効性を示す、請求項１８２〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８６】
前記二重特異性抗体および前記第２の二重特異性抗体が相乗的な有効性を示す、請求項１８２〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８７】
ＣＥＡＣＡＭ５を異常発現する癌を有する被験体の無進行生存および／または全生存期間を増加させる方法であって、前記被験体に治療有効量の請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を投与することを含む、方法。
【請求項１８８】
前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌または乳癌、またはＣＥＡＣＡＭ５を発現する別の癌である、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
化学療法および／または放射線療法と組み合わせて前記二重特異性抗体を投与する、請求項１７８〜１８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
前記被験体が、結腸直腸癌または肺癌または胃癌または膵臓癌または乳癌、またはＣＥＡＣＡＭ５を発現する別の癌を患っている患者である、請求項１７８〜１８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９１】
ＣＥＡＣＡＭ５を異常発現する癌を有する被験体を処置する方法であって、前記被験体に、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ３イプシロンに対する第２の二重特異性抗体と組み合わせて治療有効量の請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を投与することを含む、方法。
【請求項１９２】
前記二重特異性抗体および前記第２の二重特異性抗体が相加的な有効性を示す、請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
前記二重特異性抗体および前記第２の二重特異性抗体が相乗的な有効性を示す、請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９４】
ＣＥＡＣＡＭ５を異常発現する癌を有する被験体の無進行生存期間および／または全生存期間を増加させる方法であって、前記被験体に治療有効量の請求項１〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を投与することを含む、方法。
【請求項１９５】
前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌または乳癌である、請求項１９１〜１９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９６】
化学療法または放射線療法と組み合わせて前記二重特異性抗体を投与する、請求項１９１〜１９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９７】
前記被験体が、結腸直腸癌または肺癌または胃癌または膵臓癌または乳癌、またはＣＥＡＣＡＭ５を発現する別の癌を有する癌患者である、請求項１９１〜１９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９８】
請求項１７８〜１９７のいずれか一項に記載の処置方法における、請求項１〜９９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
【請求項１９９】
前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌および乳癌からなる群より選択される、請求項１９８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願と共に提出された電子的に提出された配列表（「４１３０＿００２ＰＣ０８＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、１２２，７０９バイト、２０１９年５月３１日作成）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒト癌胎児性抗原ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）およびヒトＣＤ４７に結合する二重特異性抗体（ＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体）に関する。加えて、本発明は、このような二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド、およびベクター、ならびにこのようなポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。本発明はさらに、このような抗体を選択および生産するための方法、ならびに疾患の処置においてこのような抗体を使用する方法に関する。本発明はまた、特にＣＥＡｘＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）および／またはＰＤ−１もしくはＰＤ−Ｌ１の阻害剤を用いた単剤療法および併用療法におけるＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体の治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒトＣＥＡファミリーは２９個の遺伝子を含有し、このうちの１８個（ＣＥＡサブグループに属する７個、および妊娠特異的糖タンパク質サブグループに属する１１個）が発現される。いくつかのＣＥＡサブグループメンバーは、細胞接着特性を有すると考えられる。ＣＥＡは、自然免疫において役割を果たすと考えられる（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ  Ｓ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．９（２）：６７−８１（１９９９））。癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５またはＣＤ６６ｅ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０６７３１）は、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）ファミリーのメンバーおよび腫瘍関連抗原である（Ｇｏｌｄ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１２１：４３９−４６２，１９６５；Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ  Ｎ．Ｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，２０：２１９７−２２０７，２００２）。ＣＥＡＣＡＭ６（ＣＤ６６ｃ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ４０１９９）もまた、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ファミリーに属する。研究目的で、診断ツールとして、および治療目的で、ＣＥＡに対して複数のモノクローナル抗体が作成されている（例えば、国際公開第２０１２１１７００２号（その全体が参照により組み込まれる）を参照のこと、実施例８ｆ）も参照のこと）。可溶性ＣＥＡ（本出願では脱落ＣＥＡまたはｓＣＥＡとも称される）は、確立された腫瘍マーカーである。癌患者の血漿中のレベルは、いくつかの場合では１０００ｎｇ／ｍｌを超え得るが、健常個体における血漿中濃度は１０ｎｇ／ｍｌ未満である（例えば、Ｓａｎｄｌｅｒ  Ｂら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９，１９（５Ｂ），４２２９−３３）。Ｈａｏ  Ｃ．，Ｚｈａｎｇ  Ｇ．ａｎｄ  Ｌ．ｉｎ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１９）は、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌および胃癌では、かなりの割合の患者で１００〜２５０ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ血漿濃度が見られ得ることを報告している。これらの癌が局所進行性および／または転移性である場合、このような高レベルが特に観察される。Ｗａｎｅｂｏら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９７８）によれば、再発性／転移性結腸癌の２１％は、１００ｎｇ／ｍｌを超えるｓＣＥＡを有する。Ｈｏｈｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｓｕｒｇｅｒｙ（１９９４）は、ステージデューク４および肝転移の結腸直腸患者では、患者の２６％が、５０ｎｇ／ｍＬを超えるｓＣＥＡを有することを報告している。Ｊｕｒｇｅｎｓｍｅｒｉｅｒら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２０１３）は、転移性結腸直腸癌を患っている数百人の患者を用いたかなり大規模な研究において、これらの患者の２４％または２５％でｓＣＥＡが２２５ｎｇ／ｍＬを超えることを報告している。可溶性ＣＥＡは、腫瘍細胞上のＣＥＡへの結合について、治療用抗ＣＥＡ抗体と競合し得、抗ＣＥＡ抗体の有効性の減少を引き起こす可能性がある。癌患者、例えば結腸直腸癌患者の大多数では、これは、１００〜２５０ｎｇ／ｍｌのｓＣＥＡ血漿濃度までの可溶性ＣＥＡに対する限定的な交差反応性を有する抗ＣＥＡ抗体を使用することにより回避され得る。
【０００４】
マウスモノクローナル抗体ＰＲ１Ａ３は、ＮＳ１（Ｐ３／ＮＳｌ／Ｉ−Ａｇ−４−ｌ）骨髄腫細胞と、正常結腸直腸上皮で免疫化されたマウス由来の脾臓細胞との融合により作成された。Ｒｉｃｈｍａｎ  Ｐ．Ｉ．ａｎｄ  Ｂｏｄｍｅｒ  Ｗ．Ｆ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３９：３１７−３２８，１９８７は、マウスモノクローナル抗体ＰＲ１Ａ３について記載している。ＰＲ１Ａ３のエピトープマッピングは、抗体がＣＥＡ分子のＢ３ドメインおよびＧＰＩアンカーをターゲティングすることを示している（Ｄｕｒｂｉｎ  Ｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４３１３−４３１７，１９９４）。その結果、ＰＲ１Ａ３抗体は膜結合ＣＥＡに主に結合し、癌患者の血流に見られ得る可溶性ＣＥＡ型に結合しない。ＰＲ１Ａ３により結合されるエピトープは立体配座エピトープであり、線状エピトープではない（Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，４７（１９９９）２９９−０６）。ヒト化ＰＲ１Ａ３（ｈＰＲ１Ａ３）抗体は、例えば、Ｃｏｎａｇｈｈａｎ  Ｐ．Ｊら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９８（２００８）１２１７−１２２５および国際公開第２０１２１１７００２号（その全体が参照により組み込まれる）に記載されている。
【０００５】
ヒトＰＤ−１軸アンタゴニストと抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせにより癌を処置するための方法は、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号および国際公開第２０１７１１８６５７号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）に記載されており、臨床結果は、ＡＳＣＯカンファレンス２０１７で発表された（Ｔａｂｅｒｎｅｒｏら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３５，２０１７（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ  ３００２））。免疫チェックポイント経路の２つまたはそれを超える異なる標的に結合する免疫チェックポイントアンタゴニストと、ＣＥＡおよびＴ細胞表面抗原に結合するＴ細胞再誘導剤とを投与することにより腫瘍を処置する方法は、国際公開第２０１５１１２５３４号に記載されている。単一ドメイン抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体とウレアーゼとのコンジュゲートは、現在臨床試験中である（ＮＣＴ０２３０９８９２；国際公開第２０１６１１６９０７号）。ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６および顆粒球に結合するクラスＩ抗体は、米国特許出願公開第２０１１００６４６５３号に記載されている。
【０００６】
技術水準に記載されている抗ＣＤ３ε抗体はＳＰ３４である（Ｙａｎｇ  ＳＪ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６）１３７；１０９７−１１００）。ＳＰ３４は、霊長類およびヒトＣＤ３の両方と反応する。ＳＰ３４はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能である。技術水準に記載されているさらなる抗ＣＤ３抗体はＵＣＨＴ−１である（国際公開第２００００４１４７４号を参照のこと）。技術水準に記載されているさらなる抗ＣＤ３抗体はＢＣ−３である（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ＧｖＨＤ，Ａｎａｓｅｔｔｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５４：８４４（１９９２））。ＳＰ３４は、ＣＤ３のε鎖上にのみ存在するエピトープを認識するのに対して（Ｓａｌｍｅｒｏｎら、（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３０４７を参照のこと）、ＵＣＨＴ−１およびＢＣ−３は、ε鎖およびγ鎖の両方が寄与するエピトープを認識するという点で、ＳＰ−３４は、ＵＣＨＴ−１およびＢＣ−３とは異なる。抗ＣＤ３抗体もまた、国際公開第２００７０４２２６１号、国際公開第２００８１１９５６５号、国際公開第２００８１１９５６６号、国際公開第２００８１１９５６７号、国際公開第２０１００３７８３６号、国際公開第２０１００３７８３７号、国際公開第２０１００３７８３８号および米国特許第８２３６３０８号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）に記載されている。ＣＥＡに特異的な結合部分と、ＣＤ３εに特異的な結合部分とを含む二重特異性抗体は、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号（その全体が参照により組み込まれる）に記載されている。
【０００７】
ヒトＣＤ４７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ０８７２２（ＣＤ４７＿ＨＵＭＡＮ；ＩＡＰ）は、リガンドのトロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）およびシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα；ＣＤ１７２ａ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ７８３２４）に結合する膜貫通タンパク質であり、免疫系、特にマクロファージに対して「ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ」シグナルとして作用し得る。ＣＤ４７は、アポトーシス、増殖、接着および遊走を含む広範な細胞プロセスに関与する。さらに、それは、免疫および血管新生反応において重要な役割を果たす。ＣＤ４７は、異なる腫瘍細胞において過剰発現される。ＣＤ４７に対する抗体は技術水準に記載されており、いくつかは、腫瘍処置のための治療剤として臨床試験中である（Ｗｅｉｓｋｏｐｆ  Ｋ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ７６（２０１７）１００−１０９；Ｈｕａｎｇ  Ｙら、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｄｉｓ  ２０１７；９（２）：Ｅ１６８−Ｅ１７４。ＣＤ４７に結合するＩｇＧ１サブクラスの抗体は、Ｆｃ依存的に血小板の枯渇およびヘモグロビンの赤血球ＲＢＣの減少をもたらし得る（例えば、米国特許出願公開第２０１４０１４０９８９号を参照のこと）。この有害効果を回避するために、国際公開第２０１７１９６７９３号では、抗ＣＤ４７抗体のＩｇＧ４サブクラスの突然変異体型（ＦｃｙＲ結合を減少させるためにＳ２２８Ｐ突然変異およびＬ２３５Ｅ突然変異を有するＩｇＧ４ＰＥ）が記載されている。大幅に減少したＦｃｙＲ結合およびエフェクター機能を有するこのような抗ＣＤ４７抗体は、このような血小板枯渇をもたらさない。ＣＤ４７およびＣＤ２０に対する単一ドメイン二重特異性抗体は、ｖｏｎ  Ｂｏｍｍｅｌ  ＰＥら、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ．７（２０１８）ｅ３８６３６１およびＰｉｃｃｉｏｎｅ  ＥＣら、ｍＡｂｓ  ７（２０１５）９４６−９５６により記載されている。Ｄｈｅｉｌｌｙ  Ｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａ．２５（２０１７）５２３−５３３（国際公開第２０１４０８７２４８号も参照のこと）は、ＣＤ１９およびＣＤ４７に対する二重特異性抗体について記載している。ＣＤ１９およびＣＤ４７に対する二重特異性抗体であって、配列番号５の共通重鎖と、配列番号１０の可変軽ドメインＶＬとを含む二重特異性抗体は、国際公開第２０１４０８７２４８号（その全体が参照により組み込まれる）に記載されている。
【０００８】
ヒトＦｃＲＩ（ＣＤ６４）は、単球／マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）に限定され、好中球および肥満細胞上では誘導的に発現される；ｈＦｃ  ＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）はすべての骨髄細胞上において発現されるが、リンパ球上では発現されない；ｈＦｃ  ＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は、循環Ｂ細胞および好塩基球上でのみ高発現され（Ｌ．Ｃａｓｓａｒｄ，Ｆ．Ｊｏｅｎｓｓｏｎ，Ｓ．Ａｒｎａｕｄ，Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９（２０１２（２９９５−３００６）、単球の２０％および好中球の４％では低発現され、組織マクロファージおよびＤＣ上において発現されるが、肥満細胞上では発現されない。ｈＦｃ  ＲＩＩＣ（ＣＤ３２Ｃ）は、ＮＫ細胞、単球および好中球上において発現される。ｈＦｃ  ＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）は、ＮＫ細胞および単球／マクロファージ上において発現される；ｈＦｃ  ＲＩＩＩＢ  ＣＤ１６Ｂ）は、好中球上と、最近実証されているように一部の好塩基球上とにおいて発現される。これらの発現パターンは、ｈＦｃ  ＲＩＩＡが、肥満細胞、好塩基球、好中球および好酸球により構成的に発現される唯一の活性化ＩｇＧ受容体であることを強調している（Ｂｒｕｈｎｓ  Ｐ．，Ｂｌｏｏｄ  １１９（２０１２）５６４０）。ＩｇＧの各サブクラスの生物学的活性はほとんど不明である。ヒトでは、ＩｇＧ受容体（ＦｃγＲ）が非常に多い。それらは、高親和性および低親和性受容体を含む。高親和性および低親和性ＦｃγＲは両方とも、高いアビディティでＩｇＧ免疫複合体に結合するが、高親和性ＦｃγＲのみが単量体ＩｇＧに結合する。ヒトでは、１つの高親和性ＩｇＧ受容体ｈＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）と、２つの低親和性ＩｇＧ受容体ファミリーｈＦｃγＲＩＩＡ、ＩＩＢおよびＩＩＣ（ＣＤ３２）ならびにｈＦｃγＲＩＩＩＡおよびＩＩＩＢ（ＣＤ１６）がある。ｈＦｃγＲＩおよびｈＦｃγＲＩＩＩＡはＦｃγＲ関連活性化受容体であり、ｈＦｃγＲＩＩＡおよびｈＦｃγＲＩＩＣは単一ドメイン活性化受容体であり、ｈＦｃγＲＩＩＢは単一ドメイン阻害受容体であり、ｈＦｃγＲＩＩＩＢは、その機能が不明なＧＰＩアンカー型受容体である（Ｂｒｕｈｎｓ  Ｐ．Ｂｌｏｏｄ  １１３（２００９）３７１６）。いくつかの研究グループは、重鎖グリコシル化に１，６−フコースを欠く抗体が、ＦｃγＲＩＩＩ受容体への増強した結合親和性と、増加したＡＤＣＣ活性とを有することを実証している（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌら、（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，２６７３３−２６７４０．；（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．８，８）。加えて、ＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合親和性とＡＤＣＣ活性との間の相関関係が立証されている（Ｏｋａｚａｋｉ，Ａら、（２００４）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６，１２３９−１２４９；Ｄａｌｌ’Ｏｚｚｏ，２００４）。ＩｇＧ分子は、そのＦｃ領域中に２つのＮ結合型オリゴ糖（各重鎖に１つ）を有する。任意の糖タンパク質と同様に、抗体は、同じポリペプチド骨格を共有するが、グリコシル化部位に付着した異なるオリゴ糖を有する糖型の集団として産生される。血清ＩｇＧのＦｃ領域に通常見られるオリゴ糖は、複雑な二分岐タイプのものであり（Ｗｏｒｍａｌｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１３０−３８（１９９７）、低レベルの末端シアル酸および二分岐型Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）と、様々な程度の末端ガラクトシル化およびコアフコシル化とを有する。いくつかの研究は、ＦｃｙＲ結合に必要な最小炭水化物構造がオリゴ糖コア内にあることを示唆している。Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３−６９（１９９６）。グリカン部分に減少したフコース含有量を有する抗体は、通常のフコシル化型抗体と比較して高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示す（Ｎｉｗａ  Ｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６４，２１２７−３３，２００４）。低／非フコース抗体の増強したＡＤＣＣの背後にある機構は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）へのその増加した親和性である。フコース付加に関与する遺伝子（α１，６−フコシルトランスフェラーゼ；ＦＵＴ８）の両対立遺伝子をノックアウトした細胞株は、米国特許第６９４６２９２号、米国特許第７４２５４４６号、米国特許第８０６７２３２号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ．ｃｏｍに記載されている。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）（二分岐型オリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼ）の過剰発現は、操作されたＣＨＯ細胞により産生される抗体のインビトロＡＤＣＣ活性を有意に増加させる。（Ｕｍａｎａ，Ｐら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９）、国際公開第１９９９５４３４２号、米国特許出願公開第２００３０１７５８８４号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる））。Ｆｃドメイン内の突然変異もまた、異なるＦｃ受容体へのＦｃドメインの結合特性を変化させ得る（国際公開第２００４０６３３５１号、国際公開第２００４０９９２４９号；国際公開第２００５０１８６６９号、国際公開第２００５０６３８１５号、国際公開第２００５１１０４７４号、国際公開第２００５０５６７５９号、国際公開第２００５０９２９２５号、国際公開第２００５０１８５７２号、国際公開第２００６０１９４４７号、国際公開第２００６１１６２６０号、国際公開第２００６０２３４２０−号、国際公開第２００６０４７３５０号、国際公開第２００６０８５９６７号、国際公開第２００６１０５３３８号、国際公開第２００７０２１８４１号、国際公開第２００７００８９４３号、国際公開第２００７０２４２４９号、国際公開第２００７０４１６３５号、国際公開第２００７０４８０７７号、国際公開第２００７０４４６１６号、国際公開第２００７１０６７０７号、国際公開第２００８０２２１５２号、国際公開第２００８１４０６０３号、国際公開第２００８０３６６８８号、国際公開第２００８０９１７９８号、国際公開第２００８０９１９５４号、国際公開第２００８０９２１１７号、国際公開第２００８０９８１１５号、国際公開第２００８１２１１６０号、国際公開第２００８１５０４９４号、国際公開第２０１００３３７３６号、国際公開第２０１４１１３５１０号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる））。
【０００９】
血液悪性腫瘍の処置において、かなりの進歩がなされている。これは、いくつかのタイプの進行性固形腫瘍の処置においてなされた進歩とは対照的である。その多くがかなり高頻度の進行性腫瘍タイプの無進行生存（ＰＦＳ）および全生存（ＯＳ）は、化学療法の組み合わせパートナーとして、例えばＶＥＧＦＲまたはＥＲＧＦＲに対するモノクローナル抗体を用いたおよび用いない新たな化学療法スキームによりある程度改善された。しかし、過去数年間において、進行性／転移性固形腫瘍の多くについて、薬物療法の進歩は限定的であった。多くの期待が癌免疫療法に寄せられており、限定的であるが確かな成功がある。腫瘍は、Ｔエフェクター細胞およびマクロファージのような他の免疫細胞による破壊からそれらの細胞を保護する手段を発達させる。過去１０年間の癌免疫療法は、Ｔ細胞を再び適合させて癌細胞に対してそれらを再誘導することに確かにかなりの焦点を当てており、成功している。最も顕著な例は、特定の免疫チェックポイントの阻害剤／活性化因子である。例えば、ＰＤ−１軸アンタゴニストのようなチェックポイント阻害剤は、Ｔエフェクター細胞を再活性化して特定の固形癌と闘うことが示されている。しかし、すべての固形腫瘍タイプが反応性であるわけではなく、反応性のものにおいてさえ、例えば、抗ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１抗体による処置からの関連利益を有する患者は、多くの場合、５０％よりもかなり少ない。
【００１０】
ＣＡＲ  Ｔ細胞による養子Ｔ細胞療法およびさらにはＴ細胞二重特異性抗体による治療は、血液悪性腫瘍において有望な臨床結果をもたらした。しかし、様々な固形腫瘍において養子Ｔ細胞療法、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞を用いた臨床研究は、大部分は奏効率を示さなかったか、またはごくわずかな奏効率を示した（例えば、Ｘｕら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１７，１７，１０９９−１１０６）。
【００１１】
米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号および国際公開第２０１７０５５３８９号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）は、ＣＥＡｘＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体について記載している。米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号からの１つの抗体および国際公開第２０１７０５５３８９号からの１つは両方とも臨床開発中である（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖを参照のこと；ＮＣＴ３８６６２３９のＲＯ６９５８６８８およびＮＣＴ０３５３９４８４のＲＯ７１７２５０８）。これらのＴ細胞二重特異性抗体は、ＣＥＡｘＣＤ３の異なるエピトープに結合し、異なる腫瘍細胞殺傷効力を有する。ヒトＴ細胞を用いたインビトロアッセイにおける腫瘍細胞殺傷に関して、国際公開第２０１７０５３８９号に記載されている最も強力なＣＥＡｘＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体は、ＲＯ６９５８６８８／シビサタマブ（ＣＥＡ−ＴＣＢ）よりも１０〜１００倍またはそれを超えて強力である。
【００１２】
最近まで、進行性固形腫瘍を有する患者においてＴ細胞二重特異性抗体ＴＡＡｘＣＤ３（ＴＡＡ＝腫瘍関連抗原）を用いた臨床試験の結果は期待外れであった。しかし、ＣＥＡｘＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体ＣＥＡ−ＴＣＢ（ＲＯ６９５８６８８／シビサタマブ、例えばＢａｃａｃら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２２（１３），３２８６−９７（２０１６）；および米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号を参照のこと）に関する予備第１相の結果がＡＳＣＯ２０１７で発表され、単剤療法の進行性結腸直腸癌患者において部分奏効および安定疾患が示されている（Ｊ．Ｔａｂｅｒｎｅｒｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３５，２０１７（ｓｕｐｐｌ．Ａｂｓｔｒ．３００２））。臨床活性用量では、シビサタマブについては、例えば３００Ｎｍの血漿濃度が達成された。ＣＥＡ−ＴＣＢをＰＤ−Ｌ１阻害抗体と組み合わせた場合、より多くの部分奏効および安定疾患が発生した。これらのデータは、進行性固形腫瘍では、ＣＥＡ−ＴＣＢを用いて有効性を達成し得ることを示している。しかし、単剤療法およびさらにはＰＤ−Ｌ１阻害剤との組み合わせでは、患者の大部分が依然として進行中であり、反応している者は、せいぜい部分奏効および安定疾患を示したが、完全奏効は達成されていない。より良好な結果を得るための１つのアプローチは、Ｔ細胞二重特異性抗体にＰＤ−１チェックポイント軸の阻害剤を追加するだけではなく、さらなるチェックポイント阻害剤またはアゴニストを追加することであり得る。しかしこれまでのところ、本発明者らの知る限り、このような組み合わせアプローチに関する有望な臨床データはない。進行性固形腫瘍内におけるＴ細胞の限定的なアベイラビリティは確かに、Ｔ細胞二重特異性抗体＋ＰＤ−１軸阻害剤および／またはＴ細胞の他のチェックポイント阻害剤もしくはアゴニストを用いて達成可能な有効性を制限する重要な機構である。
【００１３】
Ｔ細胞二重特異性抗体とＰＤ−１軸阻害剤との組み合わせに、進行性固形腫瘍の腫瘍細胞に対してＴ細胞を再誘導することを目的とする別の治療剤を追加することに代えて、他の免疫細胞、特にマクロファージまたはマクロファージおよびナチュラルキラーＮＫ細胞を腫瘍細胞に再誘導する治療剤を追加することがより成功する可能性がある。本発明は、単剤療法として、または例えばＴ細胞二重特異性抗体および／もしくはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害抗体と組み合わせて、マクロファージおよびさらにはＮＫ細胞をＣＥＡ発現固形腫瘍に対して再誘導する二重特異性抗体を取り扱う。
【００１４】
固形腫瘍におけるＣＡＲ  Ｔ細胞を用いた期待外れの結果には簡単な説明があり得る−固形腫瘍に浸透してその中に分布するＣＡＲ  Ｔ細胞の数は全く十分ではない。血液悪性腫瘍の大部分では、これは確かに異なる；ＣＡＲ  Ｔ細胞は腫瘍細胞に十分にアクセスし得るが、これは、これらの悪性腫瘍における有効性が、固形腫瘍における期待外れの有効性と比較して高いという違いを説明している。加えて、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、大部分が強力に免疫抑制的である腫瘍微小環境（ＴＭＥ）により大幅に抑制され得る。
治療において使用されるモノクローナル抗体およびさらには二重特異性抗体は、様々な有害効果を引き起こし得る。重要な毒性問題はサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）であり、これは、例えばアレムツズマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、リツキシマブおよびＣＤ１９ｘＣＤ３二重特異性抗体ブリナツモマブによる治療において見られた。抗ＣＤ４７抗体による処置は、抗ＣＤ４７抗体媒介性食作用後に炎症促進性サイトカインの量の増加を誘導することも見出された（例えば、米国特許出願公開第２０１６０１４４００９号を参照のこと）。ｗｔ  ＩｇＧ１  Ｆｃを有する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の公知の有害事象は、赤血球ＲＢＣ食作用／溶解および血小板活性化の増加である（例えば、図８および１０において、ｗｔ  ＩｇＧ１  Ｆｃを保有する抗ＣＤ４７抗体Ｂ６Ｈ１２．２により誘導されるＲＢＣ食作用および血小板活性化を参照のこと）。
本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ４７に特異的に結合する二重特異性抗体であって、固形腫瘍の処置について指定された二重特異性抗体を提供する。これらの二重特異性抗体は、高い有効性と、低い毒性、低い免疫原性および好ましい薬物動態特性とを併せ持つ。本発明の二重特異性抗体は、免疫細胞、特にマクロファージおよびＮＫ細胞の関与により、最適化ＡＤＣＰ（抗体依存性細胞食作用）およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）を主に介してそれらの抗腫瘍細胞効果を誘導する。本発明はまた、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ４７に特異的に結合する二重特異性抗体であって、ＲＯ６９５８６８８、ＲＯ７１７２５０８および例えば以下に記載される他のＣＥＡｘＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体のようなＣＥＡｘＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体との併用処置について指定され、ヒトマクロファージの存在下でＭＫＮ−４５のような腫瘍細胞の強力な食作用を示す二重特異性抗体を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１１７００２号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１４／０２４２０７９号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１７／１１８６５７号
【特許文献４】国際公開第２０１５／１１２５３４号
【特許文献５】国際公開第２０１６／１１６９０７号
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１１／００６４６５３号明細書
【特許文献７】国際公開第２０００／０４１４７４号
【特許文献８】国際公開第２００７／０４２２６１号
【特許文献９】国際公開第２００８／１１９５６５号
【特許文献１０】国際公開第２００８／１１９５６６号
【特許文献１１】国際公開第２００８／１１９５６７号
【特許文献１２】国際公開第２０１０／０３７８３６号
【特許文献１３】国際公開第２０１０／０３７８３７号
【特許文献１４】国際公開第２０１０／０３７８３８号
【特許文献１５】米国特許第８２３６３０８号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２０１４／０１４０９８９号明細書
【特許文献１７】国際公開第２０１７／１９６７９３号
【特許文献１８】国際公開第２０１４／０８７２４８号
【特許文献１９】米国特許第６９４６２９２号明細書
【特許文献２０】米国特許第７４２５４４６号明細書
【特許文献２１】米国特許第８０６７２３２号明細書
【特許文献２２】国際公開第１９９９／５４３４２号
【特許文献２３】米国特許出願公開第２００３／０１７５８８４号明細書
【特許文献２４】国際公開第２００４／０６３３５１号
【特許文献２５】国際公開第２００４／０９９２４９号
【特許文献２６】国際公開第２００５／０１８６６９号
【特許文献２７】国際公開第２００５／０６３８１５号
【特許文献２８】国際公開第２００５／１１０４７４号
【特許文献２９】国際公開第２００５／０５６７５９号
【特許文献３０】国際公開第２００５／０９２９２５号
【特許文献３１】国際公開第２００５／０１８５７２号
【特許文献３２】国際公開第２００６／０１９４４７号
【特許文献３３】国際公開第２００６／１１６２６０号
【特許文献３４】国際公開第２００６／０２３４２０号
【特許文献３５】国際公開第２００６／０４７３５０号
【特許文献３６】国際公開第２００６／０８５９６７号
【特許文献３７】国際公開第２００６／１０５３３８号
【特許文献３８】国際公開第２００７／０２１８４１号
【特許文献３９】国際公開第２００７／００８９４３号
【特許文献４０】国際公開第２００７／０２４２４９号
【特許文献４１】国際公開第２００７／０４１６３５号
【特許文献４２】国際公開第２００７／０４８０７７号
【特許文献４３】国際公開第２００７／０４４６１６号
【特許文献４４】国際公開第２００７／１０６７０７号
【特許文献４５】国際公開第２００８／０２２１５２号
【特許文献４６】国際公開第２００８／１４０６０３号
【特許文献４７】国際公開第２００８／０３６６８８号
【特許文献４８】国際公開第２００８／０９１７９８号
【特許文献４９】国際公開第２００８／０９１９５４号
【特許文献５０】国際公開第２００８／０９２１１７号
【特許文献５１】国際公開第２００８／０９８１１５号
【特許文献５２】国際公開第２００８／１２１１６０号
【特許文献５３】国際公開第２００８／１５０４９４号
【特許文献５４】国際公開第２０１０／０３３７３６号
【特許文献５５】国際公開第２０１４／１１３５１０号
【特許文献５６】国際公開第２０１７／０５５３８９号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ  Ｓ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．９（２）：６７−８１（１９９９）
【非特許文献２】Ｇｏｌｄ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１２１：４３９−４６２，１９６５
【非特許文献３】Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ  Ｎ．Ｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，２０：２１９７−２２０７，２００２
【非特許文献４】Ｓａｎｄｌｅｒ  Ｂら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９，１９（５Ｂ），４２２９−３３
【非特許文献５】Ｈａｏ  Ｃ．，Ｚｈａｎｇ  Ｇ．ａｎｄ  Ｌ．ｉｎ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１９）
【非特許文献６】Ｒｉｃｈｍａｎ  Ｐ．Ｉ．ａｎｄ  Ｂｏｄｍｅｒ  Ｗ．Ｆ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３９：３１７−３２８，１９８７
【非特許文献７】Ｄｕｒｂｉｎ  Ｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４３１３−４３１７，１９９４
【非特許文献８】Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，４７（１９９９）２９９−０６
【非特許文献９】Ｃｏｎａｇｈｈａｎ  Ｐ．Ｊら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９８（２００８）１２１７−１２２５
【非特許文献１０】Ｔａｂｅｒｎｅｒｏら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３５，２０１７
【非特許文献１１】Ｙａｎｇ  ＳＪ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６）１３７；１０９７−１１００
【非特許文献１２】Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ＧｖＨＤ，Ａｎａｓｅｔｔｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５４：８４４（１９９２）
【非特許文献１３】Ｗｅｉｓｋｏｐｆ  Ｋ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ７６（２０１７）１００−１０９
【非特許文献１４】Ｈｕａｎｇ  Ｙら、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｄｉｓ  ２０１７；９（２）：Ｅ１６８−Ｅ１７４
【非特許文献１５】ｖｏｎ  Ｂｏｍｍｅｌ  ＰＥら、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ．７（２０１８）ｅ３８６３６１
【非特許文献１６】Ｐｉｃｃｉｏｎｅ  ＥＣら、ｍＡｂｓ  ７（２０１５）９４６−９５６
【非特許文献１７】Ｄｈｅｉｌｌｙ  Ｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａ．２５（２０１７）５２３−５３３
【非特許文献１８】Ｌ．Ｃａｓｓａｒｄ，Ｆ．Ｊｏｅｎｓｓｏｎ，Ｓ．Ａｒｎａｕｄ，Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９（２０１２（２９９５−３００６）
【非特許文献１９】Ｂｒｕｈｎｓ  Ｐ．，Ｂｌｏｏｄ  １１９（２０１２）５６４０
【非特許文献２０】Ｂｒｕｈｎｓ  Ｐ．Ｂｌｏｏｄ  １１３（２００９）３７１６
【非特許文献２１】Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌら、（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，２６７３３−２６７４０．；（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．８，８
【非特許文献２２】Ｏｋａｚａｋｉ，Ａら、（２００４）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６，１２３９−１２４９
【非特許文献２３】Ｗｏｒｍａｌｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１３０−３８（１９９７）
【非特許文献２４】Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３−６９（１９９６）
【非特許文献２５】Ｎｉｗａ  Ｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６４，２１２７−３３，２００４
【非特許文献２６】Ｕｍａｎａ，Ｐら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９）
【非特許文献２７】Ｘｕら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１７，１７，１０９９−１１０６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
一実施形態では、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５（さらに「ＣＥＡ」とも称される）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７（さらに「ＣＤ４７」とも称される）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体（さらに「Ｍａｂ  ＣＥＡｘＣＤ４７」または「ＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体」とも称される）に関する。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ４７に特異的に結合する二重特異性抗体であって、Ｆｃ領域が、糖操作されていない以外は同じ二重特異性抗体と比較して減少した数のフコース残基を有するように糖操作されていることを特徴とする二重特異性抗体に関する。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、第１の結合部分でヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合し、第２の結合部分でヒトＣＤ４７に特異的に結合することを特徴とする二重特異性抗体を提供する。一実施形態では、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＥＡＣＡＭ６に平衡して特異的に結合する二重特異性抗体ＣＥＡｘＣＤ４７に関する。一実施形態では、二重特異性抗体は、ヒト組換えＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６に結合することを特徴とし、ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６への結合のＥＣ５０値が３倍未満異なることを特徴とする（平衡結合、平衡して結合、表５を参照のこと）。結合は、ストレプトアビジン／ビオチンベースのＥＬＩＳＡで測定される（実施例８ｆを参照のこと）。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、第１の結合部分でヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合し、第２の結合部分でヒトＣＤ４７に特異的に結合する二重特異性抗体であって、
ａ）前記第１の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲとして配列番号１１２のＣＤＲＬ１、配列番号１１３のＣＤＲＬ２および配列番号１１４のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含み、ならびに
ｂ）前記第２の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲとして配列番号２８のＣＤＲＬ１、配列番号２９のＣＤＲＬ２および配列番号３０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする二重特異性抗体を提供する。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ４７に特異的に結合する二重特異性抗体であって、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含み、前記第１の結合部分が、アミノ酸３５〜１４４のＣＥＡＣＡＭ５のＩｇ様Ｖタイプドメインに結合することを特徴とする二重特異性抗体に関する。
【００２２】
一実施形態では、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ４７に特異的に結合する二重特異性抗体であって、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含み、ＣＥＡＣＡＭ５への結合について、ＶＫおよびＶＨドメインとして配列番号１００および１０１の配列のＶＫおよびＶＨを含む抗ＣＥＡ抗体ＳＭ３Ｅと競合することを特徴とする二重特異性抗体に関する。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ４７に特異的に結合する二重特異性抗体であって、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含み、ＣＥＡＣＡＭ５への結合について、抗ＣＥＡ抗体ＳＭ３Ｅ、ＶＬおよびＶＨドメインとして配列番号１０２および１０３の配列のＶＬおよびＶＨを含むＭＥＤＩ、ＶＫおよびＶＨドメインとして配列番号１１０および１１１の配列のＶＫおよびＶＨを含むラベツズマブ（Ｌａｂ）、ＶＫおよびＶＨドメインとして配列番号１０４および１０５の配列のＶＫおよびＶＨを含むＳＡＲ、ＶＫおよびＶＨドメインとして配列番号１０８および１０９の配列のＶＫおよびＶＨを含むＴ８６．６６、ＶＫおよびＶＨドメインとして配列番号１０６および１０７の配列のＶＫおよびＶＨを含むＣＨ１Ａ１Ａと競合しないことを特徴とする二重特異性抗体に関する。
【００２４】
一実施形態では、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ４７に特異的に結合する二重特異性抗体であって、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含み、前記二重特異性抗体の食作用指数曲線のＥＣ５０値が、同じ実験条件下および１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの存在下または１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧなしの場合における参照抗体Ｋ２ＡＣ２２のＥ５０値の０．１〜３倍の範囲内であることを特徴とする二重特異性抗体に関する。さらなる実施形態では、範囲は、０．２〜３．０、０．３〜３．０、０．５〜２．５または１．０〜２．５である。食作用のＥＣ５０値は、食作用指数曲線のＥＣ５０値として測定される（イメージングベースの食作用アッセイ、実施例９および図１２および表３を参照のこと）。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ４７に特異的に結合する二重特異性抗体であって、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含み、１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの存在下では、前記二重特異性抗体の最大食作用指数（実施例９．２を参照のこと；ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）ベースのアッセイ）が、ヒトＩｇＧが追加されない以外は同じ実験条件下で測定された前記最大食作用指数と比較して３０％またはそれを超えて減少しない（例えば、図１７を参照のこと）ことを特徴とする二重特異性抗体に関する。
【００２６】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含むことを特徴とし、
ａ）第１の結合部分が、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１３のヒトラムダタイプの軽鎖定常ドメインとを含み、
第２の結合部分が、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号７のＣＤＲＬ１、配列番号８に含まれるＡｌａ  Ａｌａ  ＳｅｒのＣＤＲＬ２および配列番号９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、または
ｂ）第１の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１３のヒトラムダタイプの軽鎖定常ドメインとを含み、第２の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２８のＣＤＲＬ１、配列番号２９のＣＤＲＬ２および配列番号３０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする。
【００２７】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含むことを特徴とし、
ａ）第１の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号３１、３２および３３；配列番号３４、３５および３６、配列番号３７、３８および３９、配列番号４０、４１および４２、配列番号４３、４４および４５、配列番号４６、４７および４８、配列番号４９、５０および５１、配列番号５２、５３および５４、配列番号５５、５６および５７、配列番号５８、５９および６０、配列番号６１、６２および６３、配列番号１１２、１１３および１１４からなる群より選択されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の組み合わせを含む軽鎖可変領域とを含み、ならびに
ｂ）第２の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲとして配列番号２８のＣＤＲＬ１、配列番号２９のＣＤＲＬ２および配列番号３０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする。
【００２８】
一実施形態では、二重特異性抗体は、第１の結合部分において、軽鎖定常ドメインとして配列番号１３のヒトラムダタイプドメインを含むことを特徴とする。
【００２９】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含むことを特徴とし、
ａ）第１の結合部分が、配列番号４の重鎖可変領域（ＶＨ）と、
配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４および配列番号１１５からなるＶＬＣＬ領域に含まれるＶＬの群より選択される軽鎖可変領域とを含み、ならびに
ｂ）第２の結合部分が、配列番号４の重鎖可変領域と、配列番号１０の軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする。
【００３０】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含むことを特徴とし、
ａ）第１の結合部分が、配列番号５の重鎖と、
配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４および配列番号１１５からなる群より選択される軽鎖とを含み、
ｂ）第２の結合部分が、配列番号５の重鎖可変領域と、配列番号１１の軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする。
【００３１】
一実施形態では、二重特異性抗体は、第１の結合部分について一価であり、第２の結合部分について一価であることを特徴とする。
【００３２】
一実施形態では、定常および可変フレームワーク領域配列はヒトのものである。
【００３３】
一実施形態では、二重特異性抗体は、第１および第２の結合部分がそれぞれ、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含むことを特徴とする。一実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧ１タイプのものであることを特徴とする。一実施形態では、二重特異性抗体は全長抗体である。
【００３４】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＥＡに特異的に結合する第１の結合部分であって、カッパ軽鎖可変ドメインおよびラムダ軽鎖定常ドメインを含む第１の結合部分と、ＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分であって、カッパ軽鎖可変ドメインおよびカッパ軽鎖定常ドメインを含む第２の結合部分とを含むことを特徴とする（κλ二重特異性抗体、κλボディ、タイプ１）。
【００３５】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＥＡに特異的な第１の結合部分であって、ラムダ軽鎖可変ドメインおよびラムダ軽鎖定常ドメインを含む第１の結合部分と、ＣＤ４７に特異的な第２の結合部分であって、カッパ軽鎖可変ドメインおよびカッパ軽鎖定常ドメインを含む第２の結合部分とを含むことを特徴とする（κλ二重特異性抗体、κλボディ、タイプ２）。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、完全ヒト二重特異性ＩｇＧ（特に、ＩｇＧ１）フォーマットのものであり、加えて、タイプ１またはタイプ２のκλ二重特異性抗体である。
【００３６】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、タイプ１またはタイプ２のκλ二重特異性抗体であり、共通重鎖（ｃＨＣ）を含むことを特徴とする。
【００３７】
一実施形態では、二重特異性抗体は、１００ｎＭ〜６００ｎＭの結合親和性で、一実施形態では１００ｎＭ〜５００ｎＭの結合親和性でヒトＣＤ４７に結合することを特徴とする。
【００３８】
一実施形態では、二重特異性抗体は、１〜２００ｎＭのＥＣ５０値でＭＫＮ−４５細胞に結合することを特徴とする。一実施形態では、二重特異性抗体は、１〜５０ｎＭのＥＣ５０値でＭＫＮ−４５細胞に結合することを特徴とする。一実施形態では、二重特異性抗体は、５０〜１００ｎＭのＥＣ５０値でＭＫＮ−４５細胞に結合することを特徴とする。一実施形態では、二重特異性抗体は、１００〜２００ｎＭのＥＣ５０値でＭＫＮ−４５細胞に結合することを特徴とする。
【００３９】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、前記二重特異性抗体による、ヒトマクロファージの存在下におけるＭＫＮ−４５細胞の食作用の達成可能な最大食作用指数が、５０００ｎｇ／ｍｌ可溶性ＣＥＡの存在下では、可溶性ＣＥＡなしで測定された食作用指数と比較して２０％超減少しないことを特徴とする。
【００４０】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、前記二重特異性抗体による、ヒトマクロファージの存在下におけるＭＫＮ−４５細胞の食作用指数曲線のＥＣ５０が、２００ｎｇ／ｍｌ可溶性ＣＥＡの存在下では、可溶性ＣＥＡなしで測定されたＥＣ５０と比較して高い濃度の方向に４倍超シフトせず、および／または食作用指数曲線の最大が、２００ｎｇ／ｍＬ  ｓＣＥＡの追加により１０％もしくはそれを超えて、１５％もしくはそれを超えてもしくは２０％もしくはそれを超えて減少しないことを特徴とする（例えば、図２０Ｂを参照のこと）。
【００４１】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＭＫＮ−４５細胞への前記二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０が、２００ｎｇ／ｍｌ可溶性ＣＥＡの存在下では、可溶性ＣＥＡなしで測定されたＥＣ５０と比較して高い濃度の方向に２倍超シフトしないことを特徴とする（例えば、図２０Ａを参照のこと）。
【００４２】
一実施形態では、二重特異性抗体は、それがヒトＣＥＡＣＡＭ１と交差反応しないことを特徴とする。
【００４３】
一実施形態では、二重特異性抗体は、１〜５０ｎＭのＥＣ５０値で、組換えＣＨＯ細胞ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−６１（商標））上において発現されたヒトＣＥＡＣＡＭ６に結合することを特徴とする（ＣＥＡＣＡＭ６陰性ＣＨＯ細胞は、ＣＥＡＣＡＭ６タンパク質を発現させるためにヒトＣＥＡＣＡＭ６のｃＤＮＡを含有するベクターでトランスフェクトされる）。
【００４４】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合するモノクローナル抗体（さらにＭＡＢ  ＣＥＡとも称される）であって、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域を含む３００ｎＭの濃度のモノクローナル抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせないことを特徴とする。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３εに特異的に結合する二重特異性抗体（さらにＣＥＡ−ＴＣＢとも称される）であって、重鎖として配列番号９７および９８の重鎖と、軽鎖として配列番号９６および９９の軽鎖とを含む３００ｎＭの濃度の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせないことを特徴とする。このような場合、本発明の二重特異性抗体およびＣＥＡ−ＴＣＢは「競合的ではない」として定義され、前記ＣＥＡへの結合を有意に妨害せずにＣＥＡに同時に結合することができると考えられる。
【００４５】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３εに特異的に結合する二重特異性抗体（さらにＣＥＡ−ＴＣＢ１とも称される）であって、重鎖および軽鎖として配列番号９２〜９５のアミノ酸配列の鎖を含む３０ｎＭの濃度の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせないことを特徴とする。このような場合、本発明の二重特異性抗体およびＣＥＡ−ＴＣＢ１は「競合的ではない」として定義され、前記ＣＥＡへの結合を有意に妨害せずにＣＥＡに同時に結合することができると考えられる。このような場合、本発明の二重特異性抗体ならびにＭＡＢ  ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＴＣＢおよび／またはＣＥＡ−ＴＣＢ１は「競合的ではない」として定義され、前記ＣＥＡへのそれらの結合を有意に妨害せずにＣＥＡに同時に結合することができると考えられる。
【００４６】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３εに特異的に結合する二重特異性抗体（さらにＣＥＡ−ＴＣＢ１とも称される）であって、重鎖および軽鎖として配列番号９２〜９５のアミノ酸配列の鎖を含む３０ｎＭの濃度の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の食作用指数曲線のＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせないことを特徴とする。このような場合、本発明の二重特異性抗体およびＣＥＡ−ＴＣＢ１は「競合的ではない」として定義され、前記ＣＥＡへのそれらの結合を有意に妨害せずにＣＥＡに同時に結合することができると考えられるので、治療レベルの両薬物が腫瘍組織中に同時に存在する場合であっても、影響を受けない食作用に対するその効果（ＣＥＡｘＣＤ４７）およびさらには影響を受けないＴ細胞活性化に対するその効果（ＣＥＡｘＴＣＢ１）を生じさせ得る（図１８を参照のこと）。
【００４７】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３εに特異的に結合する二重特異性抗体（さらにＣＥＡ−ＴＣＢとも称される）であって、重鎖および軽鎖として配列番号９６〜９９のアミノ酸配列の鎖を含む３００ｎＭの濃度の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の食作用指数曲線のＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせないことを特徴とする。このような場合、本発明の二重特異性抗体およびＣＥＡ−ＴＣＢは「競合的ではない」として定義され、前記ＣＥＡへのそれらの結合を有意に妨害せずにＣＥＡに同時に結合することができると考えられるので、治療レベルの両薬物が腫瘍組織中に同時に存在する場合であっても、影響を受けない食作用に対するその効果（ＣＥＡｘＣＤ４７）およびさらには影響を受けないＴ細胞活性化に対するその効果（ＣＥＡ−ＴＣＢ）を生じさせ得る（図１８を参照のこと）。これは、ＣＥＡ−ＴＣＢ／ＴＣＢ１と本発明のＣＥＡｘＣＤ４７との併用処置を容易にする（図１８を参照のこと）。
【００４８】
配列番号８８〜９９の配列は、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号または国際公開第２０１７０５５３８９号にしたがう。
【００４９】
一実施形態では、ＣＥＡ−ＴＣＢおよびＣＥＡ−ＴＣＢ１のようなＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせた本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体は、例えば、ＭＫＮ−４５腫瘍細胞と、同じボランティアヒトドナー由来のヒトマクロファージおよびＴ細胞とを含有するアッセイにおいて、腫瘍細胞の少なくとも相加的なまたはさらには相乗的な％殺傷を示す（図１９ＡおよびＢを参照のこと）。
【００５０】
一実施形態では、二重特異性抗体は、第１の結合部分の重鎖としておよび第２の結合部分の重鎖として共通重鎖（ｃＨＣ）を含むことを特徴とする。一実施形態では、二重特異性抗体は、各結合部分の前記共通重鎖が、ＣＤＲとして配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３または配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含むことを特徴とする。一実施形態では、二重特異性抗体は、各結合部分の前記共通重鎖が、共通可変重ドメイン（ｃＶＨ）として配列番号４を含むことを特徴とする。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、配列番号５、配列番号２３および配列番号２４からなる群より選択される共通重鎖（ｃＨＣ）を含むことを特徴とする。一実施形態では、配列番号５の共通重鎖は、配列番号６に示されている核酸配列によりコードされる。
【００５１】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＤ４７に特異的な第２の結合部分として、ＣＤＲとして配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む共通重鎖と、ＣＤＲとして配列番号７のＣＤＲＬ１、配列番号８に含まれるＡｌａ  Ａｌａ  ＳｅｒのＣＤＲＬ２および配列番号９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖（ＬＣ）とを含むか、またはＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む共通重鎖と、ＣＤＲとして配列番号２８のＣＤＲＬ１、配列番号２９のＣＤＲＬ２および配列番号３０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖（ＬＣ）とを含むことを特徴とする。
【００５２】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、第２の結合部分として、可変重ドメイン（ｃＶＨ）として配列番号４を含む重鎖と、配列番号１０の可変軽ドメイン（ＶＬ）とを含むことを特徴とする。
【００５３】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、第２の結合部分として、配列番号５を含む重鎖（ｃＨＣ）と、配列番号１１の軽鎖（ＣＬ）とを含むことを特徴とする。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、第２の結合部分として、配列番号２３を含む重鎖（ｃＨＣ）と、配列番号１１の軽鎖（ＣＬ）とを含むことを特徴とする。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、第２の結合部分として、配列番号２４を含む重鎖（ｃＨＣ）と、配列番号１１の軽鎖（ＣＬ）とを含むことを特徴とする。一実施形態では、配列番号１１の軽鎖（ＬＣ）は、配列番号１２に示されている核酸配列によりコードされる。
【００５４】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＥＡに特異的に結合し、配列番号１３の軽鎖定常ドメインを含むことを特徴とする。
【００５５】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、０．１〜１０ｎＭのＩＣ５０で、ＭＫＮ−４５細胞上のＣＤ４７間の相互作用を阻害することを特徴とする。ＳＩＲＰα（ＳＩＲＰα、ＣＤ１７２ａ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ７８３２４）は、２００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用される（Ｈｉｓタグ付き可溶性ＳＩＲＰアルファ）。アッセイの詳細は実施例８（ＣＤ４７抗体のＳＩＲＰα遮断活性）に記載されており、結果は表２に示されている。
【００５６】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、１０ｎＭ未満の二重特異性抗体のＥＣ５０におけるヒトマクロファージによるＭＫＮ−４５細胞のようなＣＥＡ発現腫瘍細胞株の濃度依存的食作用（ＡＤＣＰ）を特徴とする。ＡＤＣＰは、通常は１：３のＥ：Ｔ比で、イメージングによる食作用指数（ＥＣ５０または最大）として本発明にしたがって測定される（ヒトマクロファージ；標的細胞（腫瘍細胞）；例えば、図１２、１５および１６を参照のこと）。図３Ｂにおける結果は、１：１のＥ：Ｔを用いて得られたものである。アッセイの詳細は実施例９．２に記載されている。
【００５７】
さらなる情報については、１０ｎＭ未満の二重特異性抗体のＥＣ５０におけるヒトマクロファージによるＭＫＮ−４５細胞のようなＣＥＡ発現腫瘍細胞株の食作用（ＡＤＣＰ）。ＡＤＣＰはまた、例えば３：１のＥ：Ｔ比で、フローサイトメトリーにより測定され得る（ヒトマクロファージ；標的細胞（腫瘍細胞）；例えば、図３Ａを参照のこと）。アッセイの詳細は実施例９（１．フローサイトメトリーベースのＡＤＣＰアッセイ）に記載されている。
【００５８】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合するが、ＭＫＮ−４５のような腫瘍細胞上のＣＥＡＣＡＭ５への結合について、ＭＡＢ  ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＴＣＢおよび／またはＣＥＡ−ＴＣＢ１と競合しないことを特徴とする。
【００５９】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＭＫＮ−４５細胞への結合のＥＣ５０値（１〜２００ｎＭのＥＣ５０）が、３００ｎＭの濃度のＭＡＢ  ＣＥＡもしくはＣＥＡ−ＴＣＢの追加により、または３０ｎＭの濃度のＣＥＡ−ＴＣＢ１の追加により３倍未満増加することを特徴とする（競合なし）。
【００６０】
一実施形態では、本発明のＣＥＡｘＣＤ４７抗体は、Ｂ６Ｈ１２．２を用いた同じアッセイ（実施例１５）で測定されたＥＣ５０と比較して１００倍またはそれよりも高いＲＢＣ食作用のＥＣ５０を示す。
【００６１】
一実施形態では、（アフコシル化の有無にかかわらずｗｔ  ＩｇＧ１  Ｆｃを保有する）本発明のＣＥＡｘＣＤ４７抗体は、最大２００μｇ／ｍＬの濃度で有意な血小板活性化を示さない（ＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２については、実施例１５および実施例１５で言及されている結果を参照のこと）。
【００６２】
別の実施形態では、本発明は、改変オリゴ糖を有するＦｃ領域を有するように本発明の糖操作された二重特異性抗体に関する。驚くべきことに、このような本発明の糖操作された二重特異性抗体は、同じ実験条件下で測定された場合に、糖操作されていない同じ（親）二重特異性抗体よりも、イメージングベースのアッセイにより測定された食作用指数曲線の少なくとも３倍低いＥＣ５０値を特徴とすることが見出された。一実施形態では、食作用指数のＥＣ５０は、５〜１０倍低いかまたは１０〜３０倍低い）。一実施形態では、Ｆｃ領域は、糖操作されていない以外は同じ二重特異性抗体と比較して減少した数のフコース残基を有するように改変されている。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、糖操作されていない二重特異性抗体と比較して増加した割合の二分岐型オリゴ糖を有する。さらに別の実施形態では、二分岐型オリゴ糖は、主に二分岐型複合体である。別の実施形態では、本発明の糖操作された抗原結合分子は、糖操作されていない二重特異性抗体と比較して増加した割合の前記二重特異性抗体のＦｃ領域中の二分岐型非フコシル化型オリゴ糖を有する。あるいは、本発明の二重特異性抗体は、糖操作されていない二重特異性抗体と比較して増加したＦｃ領域中のＧＩｃＮＡｃ残基対フコース残基比を有し得る。一実施形態では、二分岐型非フコシル化型オリゴ糖は、主にハイブリッド形態である。あるいは、二分岐型非フコシル化型オリゴ糖は、主に複合体タイプである。
【００６３】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、Ｆｃ領域中のＮ結合型オリゴ糖の５０％〜１００％が非フコシル化型であることを特徴とする。
【００６４】
一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃ領域中のＮ結合型オリゴ糖の５０％〜１００％が二分岐型であることを特徴とする。
【００６５】
一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃ領域中のＮ結合型オリゴ糖の８０％〜１００％が二分岐型および非フコシル化型であることを特徴とする。
【００６６】
一実施形態では、二重特異性抗体は、前記糖操作された抗体により誘導された濃度／ＡＤＣＣ曲線（ＡＤＣＣのＥＣ５０の減少または最大の増加（図１３および１４を参照のこと）が、糖操作されていない以外は同じ二重特異性抗体により誘導されたＡＤＣＣと比較して少なくとも１．２倍増加していることを特徴とする。一実施形態では、ＡＤＣＣは、１．２〜２．０倍増加している。
【００６７】
一実施形態では、二重特異性抗体は、同じ実験条件下で測定された場合に、糖操作されていない以外は同じ（親）二重特異性抗体と比較して、イメージングベースのアッセイにより測定された食作用指数曲線の少なくとも３倍低いＥＣ５０値を特徴とする。一実施形態では、食作用指数のＥＣ５０は、５〜１０倍低いかまたは１０〜３０倍低い。
【００６８】
一実施形態では、二重特異性抗体は、前記糖操作された抗体により誘導されてフローサイトメトリーにより測定された最大食作用指数が、糖操作されていない以外は同じ二重特異性抗体により誘導された最大食作用指数と比較して少なくとも１．２倍増加していることを特徴とする。一実施形態では、最大食作用指数は、１．２〜２．０倍増加している。
【００６９】
一実施形態では、二重特異性抗体は、前記糖操作された抗体により誘導されてイメージングにより測定された最大食作用指数が、糖操作されていない以外は同じ二重特異性抗体により誘導された最大食作用指数と比較して少なくとも１．２倍増加していることを特徴とする。一実施形態では、最大食作用指数は、１．２〜２．０倍増加している。
【００７０】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、一置換Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ、二置換Ｉ３３２ＥおよびＧ２３６Ａ、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ、Ｓ２３９ＤおよびＧ２３６Ａならびに三置換Ｓ３２９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＧ２３６Ａからなる群より選択されるＦｃ領域中の１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換（「Ｆｃアミノ酸置換」）を含むことを特徴とする。
【００７１】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、一置換Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ、二置換Ｉ３３２ＥおよびＧ２３６Ａ、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ、Ｓ２３９ＤおよびＧ２３６Ａならびに三置換Ｓ３２９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＧ２３６Ａからなる群より選択されるＦｃ領域中の１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換と、糖操作されていない以外は同じ二重特異性抗体と比較して減少した数のフコース残基を有するように糖操作されたＦｃ領域とを含むことを特徴とする。
【００７２】
一実施形態では、Ｆｃ領域中の前記置換を含む二重特異性抗体は、前記アミノ酸置換抗体により誘導された濃度／ＡＤＣＣ曲線（ＡＤＣＣのＥＣ５０の減少または最大の増加が、Ｆｃ領域中の前記アミノ酸置換をいずれも含まない前記抗体により誘導されたＡＤＣＣと比較して少なくとも１．２倍増加していることを特徴とする。一実施形態では、ＡＤＣＣは、１．２〜２．０倍増加している。
【００７３】
一実施形態では、Ｆｃ領域中の前記置換を含む二重特異性抗体は、同じ実験条件下で測定された場合に、Ｆｃ領域中の前記アミノ酸置換をいずれも含まない同じ（親）二重特異性抗体と比較して、イメージングベースのアッセイにより測定された食作用指数曲線の少なくとも３倍低いＥＣ５０値を特徴とする。一実施形態では、食作用指数のＥＣ５０は、５〜１０倍低いかまたは１０〜３０倍低い。
【００７４】
一実施形態では、Ｆｃ領域中の前記置換を含む二重特異性抗体は、前記アミノ酸置換抗体により誘導されてフローサイトメトリーにより決定された最大食作用（ＡＤＣＰ）が、Ｆｃ領域中の前記アミノ酸置換をいずれも含まない前記抗体により誘導されたＡＤＣＰと比較して少なくとも１．２倍増加していることを特徴とする。一実施形態では、ＡＤＣＰは、１．２〜２．０倍増加している。一実施形態では、Ｆｃ領域中の前記置換を含む二重特異性抗体は、前記アミノ酸置換抗体により誘導されてイメージングにより決定された最大食作用指数が、Ｆｃ領域中の前記アミノ酸置換をいずれも含まない前記抗体により誘導されたＡＤＣＰと比較して少なくとも１．２倍増加していることを特徴とする。一実施形態では、ＡＤＣＰは、１．２〜２．０倍増加している。
【００７５】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、Ｆｃ領域中のＮ結合型オリゴ糖の５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％または８０％〜１００％が非フコシル化型であることを特徴とする。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、Ｆｃ領域中のＮ結合型オリゴ糖の５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％または８０％〜１００％が二分岐型であることを特徴とする。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、Ｆｃ領域中のＮ結合型オリゴ糖の５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％または８０％〜１００％が二分岐型非フコシル化型であることを特徴とする。
【００７６】
一実施形態では、糖操作された二重特異性抗体は、共通重鎖として配列番号５を含む糖操作されていない二重特異性抗体（以下で定義される標準的な条件でＣＨＯ  Ｋ１細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−６１（商標）で産生された親二重特異性抗体）と比較して増加したエフェクター機能を含む。
【００７７】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、前記糖操作された二重特異性抗体が、１つまたはそれを超える増加したエフェクター機能、例えばＦｃγＲへの増加した結合親和性、マクロファージの増加した結合（増加した抗体依存性細胞食作用；ＡＤＣＰ）、ＮＫ細胞の増加した結合（増加した抗体媒介性細胞傷害；ＡＤＣＣ）、および単球への増加した結合からなる群より選択されるものを含むことを特徴とする。
【００７８】
抗ＣＤ４７モノクローナル抗体ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４について測定された濃度／食作用指数曲線（２０１４年から臨床試験で試験、例えばｃｌｉｎｔｒｉａｌ．ｇｏｖを参照のこと）は、１ｍｇ／ｍＬの生理学的濃度で追加されたｈｕＩｇＧをアッセイに追加することにより大きく減少する（イメージングベースのアッセイで測定された食作用曲線のＥＣ５０の増加および最大の減少、例えば図１７を参照のこと）。
【００７９】
驚くべきことに、本発明のＣＥＡｘＣＤ４７抗体は、ＥＣ５０の３倍未満のわずかなシフトのみを示し、ヒトＩｇＧが追加された場合に、濃度／食作用指数曲線の最大の有意な減少を示さない（表４を参照のこと）。
【００８０】
一実施形態では、本発明のＣＥＡｘＣＤ４７抗体は、イメージングベースの食作用アッセイへの１ｍｇ／ｍＬのｈｕ  ＩｇＧの追加が、濃度／食作用指数曲線の最大の０．９倍未満の減少および／またはより高い濃度の方向へのＥＣ５０の３倍未満のシフトを引き起こすことを特徴とする（表４を参照のこと）。
【００８１】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の二重特異性抗体をコードすることを特徴とする単離されたポリヌクレオチドである。
【００８２】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。
【００８３】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞である。
【００８４】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の二重特異性抗体の生産のための方法であって、
ａ）本発明の前記抗体の生産を可能にする条件下で、前記二重特異性抗体をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を培養すること、および
ｂ）ＣＥＡおよびＣＤ４７に特異的に結合することができる前記抗体を単離すること
を含むことを特徴とする方法である。
【００８５】
一実施形態では、本発明は、宿主細胞において本発明の糖操作された二重特異性抗体を生産するための方法であって、
ａ）本発明の前記二重特異性抗体の生産を可能にする条件であって、前記二重特異性抗体のＦｃ領域上に存在するオリゴ糖の改変を可能にする条件下で、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように糖操作された宿主細胞を培養すること；および
ｂ）ＣＥＡおよびＣＤ４７に特異的に結合することができる前記糖操作された二重特異性抗体を単離すること
を含む方法を含むことを特徴とする。
【００８６】
一実施形態では、本発明は、宿主細胞において糖操作された二重特異性抗体を生産するための方法であって、
ａ）本発明の前記二重特異性抗体の生産を可能にする条件であって、前記二重特異性抗体のＦｃ領域上に存在するオリゴ糖の改変を可能にする条件下で、ＦＵＴ８遺伝子の標的破壊により糖操作された宿主細胞を培養すること、および
ｂ）ＣＥＡおよびＣＤ４７に特異的に結合することができる前記糖操作された二重特異性抗体を単離すること
を含む方法を含むことを特徴とする。
【００８７】
一実施形態では、本発明は、宿主細胞において本発明のＦｃ置換二重特異性抗体を生産するための方法であって、
ａ）前記二重特異性抗体の生産を可能にする条件下で、本発明のＦｃ置換二重特異性抗体をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を培養すること、および
ｂ）ＣＥＡおよびＣＤ４７に特異的に結合することができる前記Ｆｃ置換二重特異性抗体を単離すること
を含む方法を含むことを特徴とする。
【００８８】
本発明のさらなる実施形態は、腫瘍細胞の細胞溶解を誘導する方法であって、前記腫瘍細胞を本発明の二重特異性抗体と接触させることを含む方法である。腫瘍細胞は、好ましくは患者中のヒト腫瘍細胞である。
【００８９】
本発明のさらなる実施形態は、腫瘍細胞が、結腸直腸癌細胞、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）細胞、胃癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、またはＣＥＡを発現する別の腫瘍細胞であることを特徴とする本発明の方法である。
【００９０】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体を処置する方法であって、前記被験体に治療有効量の本発明の二重特異性抗体を投与することを含む方法である。
【００９１】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の生存期間を増加させる方法であって、前記被験体に治療有効量の本発明の二重特異性抗体を投与することを含む方法である。
【００９２】
本発明のさらなる実施形態は、前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌または乳房であることを特徴とする本発明の方法である。
【００９３】
本発明のさらなる実施形態は、化学療法または放射線療法と組み合わせて本発明の二重特異性抗体をヒト被験体に投与することを特徴とする本発明の方法である。
【００９４】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体を処置する方法であって、前記被験体に治療有効量の本発明の二重特異性抗体を投与することを含み、前記二重特異性抗体の食作用のＥＣ５０値が、同じ実験条件下ならびに１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの存在下および／または１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧなしの場合における参照抗体Ｋ２ＡＣ２２のＥ５０値の０．１〜３倍の範囲内であることを特徴とする方法である。さらなる実施形態では、範囲は、０．２〜３．０、０．３〜３．０、０．５〜２．５または１．０〜２．５である。一実施形態では、二重特異性抗体は、１００ｎＭ〜６００ｎＭの結合親和性で、一実施形態では１００ｎＭ〜５００ｎＭの結合親和性でヒトＣＤ４７に結合することを特徴とする。
【００９５】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体を処置する方法における本発明の二重特異性抗体の使用であって、前記方法が、前記被験体に治療有効量の本発明の二重特異性抗体を投与することを含み、前記二重特異性抗体の食作用のＥＣ５０値が、同じ実験条件下ならびに１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの存在下および／または１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧなしの場合における参照抗体Ｋ２ＡＣ２２のＥ５０値の０．１〜３倍の範囲内であることを特徴とする使用である。さらなる実施形態では、範囲は、０．２〜３．０、０．３〜３．０、０．５〜２．５または１．０〜２．５である。一実施形態では、二重特異性抗体は、１００ｎＭ〜６００ｎＭの結合親和性で、一実施形態では１００ｎＭ〜５００ｎＭの結合親和性でヒトＣＤ４７に結合することを特徴とする。
【００９６】
図１３〜１７から分かるように、本発明の抗体のＡＤＣＣおよびＡＤＣＰ／食作用指数値は、１ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌまたはさらにはそれよりも高いヒトＩｇＧがほとんどの患者に存在する）により影響を受けないか、または少ない程度に影響を受けるにすぎないのに対して、技術水準の抗ＣＤ４７抗体（ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４）については、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰ値は、１ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧの存在下で大きく減少する。
【００９７】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体を処置するための医薬の製造における本発明の二重特異性抗体の使用である。
【００９８】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の医薬の製造における本発明の二重特異性抗体の使用であって、癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌および乳癌からなる群より選択されることを特徴とする使用である。
【００９９】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の処置において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分と、ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための本発明の二重特異性抗体である。本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の処置において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分と、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３εのエピトープに特異的に結合する第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための本発明の二重特異性抗体である。
【０１００】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の処置において、ＣＥＡ−ＴＣＢおよび／またはＣＥＡ／ＴＣＢ１と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための本発明の二重特異性抗体である。
【０１０１】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の処置において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３εのエピトープに特異的に結合する第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための本発明の二重特異性抗体である。本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の処置において、前記第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための本発明の二重特異性抗体であって、前記第２の二重特異性抗体と競合しないことを特徴とする本発明の二重特異性抗体である。
【０１０２】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の処置において、ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための本発明の二重特異性抗体であって、前記ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１と競合しないことを特徴とする本発明の二重特異性抗体である。
【０１０３】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の処置において、ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための本発明の二重特異性抗体であって、前記ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１と競合することを特徴とする本発明の二重特異性抗体である。
【０１０４】
本発明のさらなる実施形態は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号８８の重鎖可変領域および配列番号８９の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第４の結合部分であって、配列番号９０の重鎖可変領域および配列番号９１の軽鎖可変領域を含む第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための本発明の二重特異性抗体である。
【０１０５】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の二重特異性抗体および第２の二重特異性抗体が、６〜１５日間隔で前記被験体に交互に投与されることを特徴とする、本発明の使用のための本発明の二重特異性抗体である。
【０１０６】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の二重特異性抗体および第２の二重特異性抗体が、６〜１５日間隔で前記被験体に同時に投与されることを特徴とする、本発明の使用のための本発明の二重特異性抗体である。
【０１０７】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の処置において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３εのエピトープに特異的に結合する第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含む本発明の第１の二重特異性抗体であって、３００ｎＭの濃度の前記第２の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の食作用指数曲線のＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない本発明の第１の二重特異性抗体である。
【０１０８】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の処置において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号８８の重鎖可変領域および配列番号８９の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第４の結合部分であって、配列番号９０の重鎖可変領域および配列番号９１の軽鎖可変領域を含む第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含む本発明の第１の二重特異性抗体であって、３０ｎＭの濃度の前記第２の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない本発明の第１の二重特異性抗体である。
【０１０９】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の処置において、ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための本発明の第１の二重特異性抗体であって、３００ｎＭの濃度の前記ＣＥＡ−ＴＣＢまたは３０ｎＭの濃度のＣＥＡ−ＴＣＢ１が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない本発明の第１の二重特異性抗体である。
【０１１０】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の使用のための、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、本発明のヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含む本発明の第１の二重特異性抗体であって、前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌および乳癌であることを特徴とする本発明の第１の二重特異性抗体である。
【０１１１】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の二重特異性抗体を含む組成物であって、上記で定義される前記第２の二重特異性抗体と競合しないことを特徴とし、前記組成物が、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の処置において使用するためのものである組成物である。
【０１１２】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の二重特異性抗体を含む組成物であって、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３εのエピトープに特異的に結合する第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と競合しないことを特徴とし、前記組成物が、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の処置において使用するためのものである組成物である。
【０１１３】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の二重特異性抗体を含む組成物であって、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号８８の重鎖可変領域および配列番号８９の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第４の結合部分であって、配列番号９０の重鎖可変領域および配列番号９１の軽鎖可変領域を含む第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と競合しないことを特徴とし、前記組成物が、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の処置において使用するためのものである組成物である。本発明のさらなる実施形態は、本発明の二重特異性抗体を含む組成物であって、ＣＥＡ−ＴＣＢおよび／またはＣＥＡ−ＴＣＢ１と競合しないことを特徴とする組成物である。
【０１１４】
本発明のさらなる実施形態は、腫瘍（癌）、特に固形腫瘍、特にＣＥＡを発現する固形癌、特に結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌および乳癌と診断されたヒト患者の処置のための方法であって、有効量の本発明の二重特異性抗体と、ＣＥＡおよびＣＤ３に対する上記第２の二重特異性抗体（一実施形態では、ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１）とを前記ヒト患者に投与することを含み、続いて、
前記患者に０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、さらなる実施形態では０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、さらなる実施形態では１〜２ｍｇ／ｋｇの用量の前記第２の抗ＣＥＡｘＣＤ３抗体を例えば４〜１２週間にわたって毎週投与すること、
前記患者に前記第２の抗体を１週間に１回（ｑ１）、２週間に１回（ｑ２ｗ）、３週間に１回（ｑ３ｗ）または必要に応じて４週間に１回（ｑ４ｗ）投与すること、
これらの４〜１２週間後に、および前記抗ＣＥＡｘＣＤ３抗体のさらに２または３または４消失半減期後に、前記患者に０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量の本発明の抗体を投与すること、
前記患者に本発明の前記抗体を１週間に１回（ｑ１）、２週間に１回（ｑ２ｗ）、３週間に１回（ｑ３ｗ）または必要に応じて４週間に１回（ｑ４ｗ）投与すること、本発明の前記抗体の２または３または４消失半減期待機すること、および必要に応じて、ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体投与とそれに続くＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体投与の前記サイクルを反復し、必要に応じてそのサイクルを再び反復すること
を含む方法である。
【０１１５】
この「交互」方法は、本発明の抗体および第２の二重特異性抗体が競合的である場合に適用される。
【０１１６】
本発明の前記ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体およびＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体が競合的ではない場合、２つの二重特異性抗体はまた、患者が、並行して両二重特異性抗体の治療的に有効な血漿および組織濃度を経験する方法（「同時方法」）で投与され得、例えば、患者にほぼ同じ時間に０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、さらなる実施形態では０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、さらなる実施形態では１〜２ｍｇ／ｋｇの用量のＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体および１〜２０ｍｇ／ｋｇの本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体を投与し、続いて、１週間に１回（ｑ１ｗ）または２週間に１回（ｑ２ｗ）または３週間に１回（ｑ３ｗ）または必要に応じて４週間に１回（ｑ４ｗ）の頻度でこれらの組み合わせ投与を１回またはそれを超えて行う。
【０１１７】
「ｑ１ｗ」という用語は、１週間に１回の投与を意味し；ｑ２ｗは、２週間ごとの投与を意味する、など。
【０１１８】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の抗体と、薬学的に許容され得る賦形剤または担体とを含む医薬組成物である。
【０１１９】
本発明のさらに好ましい実施形態は、医薬として使用するための、本発明の抗体を含む医薬組成物である。
【０１２０】
本発明のさらに好ましい実施形態は、固形腫瘍障害の処置における医薬として使用するための、本発明の抗体を含む医薬組成物である。
【０１２１】
本発明のさらに好ましい実施形態は、結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、胃癌、膵臓癌または乳癌の処置における医薬として使用するための、本発明の抗体を含む医薬組成物である。
【０１２２】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の処置において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３εのエピトープに特異的に結合する第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、本発明の二重特異性抗体を含む組成物であって、３００ｎＭの濃度の前記第２の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない組成物である。
【０１２３】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の処置において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号８８の重鎖可変領域および配列番号８９の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第４の結合部分であって、配列番号９０の重鎖可変領域および配列番号９１の軽鎖可変領域を含む第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、本発明の二重特異性抗体を含む組成物であって、３０ｎＭの濃度の前記第２の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０をより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない組成物である。
【０１２４】
本発明のさらなる実施形態は、癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌または乳癌であることを特徴とする本発明の組成物である。
【０１２５】
本発明のさらなる実施形態は、医薬組成物の製造のための本発明の抗体の使用である。
【０１２６】
本発明のさらなる実施形態は、医薬組成物の製造のための、本発明の抗体と、薬学的に許容され得る賦形剤または担体との使用である。
【０１２７】
本発明のさらなる実施形態は、固形腫瘍障害の処置における医薬の製造のための本発明の抗体の使用である。
【０１２８】
本発明のさらなる実施形態は、結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、胃癌、膵臓癌または乳癌の処置における本発明の抗体の使用である。
【０１２９】
本発明の別の態様は、腫瘍細胞の細胞溶解を誘導する方法であって、前記腫瘍細胞を、上記実施形態のいずれかの二重特異性抗体と接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、結腸直腸癌細胞、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、胃癌細胞、膵臓癌細胞または乳癌細胞である。
【０１３０】
一実施形態では、細胞溶解は、二重特異性抗体の抗体依存性細胞食作用および／または抗体依存性細胞傷害により誘導される。
【０１３１】
本発明の別の態様は、ＣＥＡを異常発現する癌を有する被験体を処置する方法であって、前記被験体に治療有効量の上記実施形態のいずれかの二重特異性抗体を投与することを含む方法を提供する。
【０１３２】
本発明の別の態様は、ＣＥＡを異常発現する癌を有する被験体を処置する方法であって、前記被験体に、ヒトＣＥＡおよびヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体と組み合わせて治療有効量の上記実施形態のいずれかの二重特異性抗体を投与することを含む方法を提供する。ＣＥＡｘＣＤ４７抗体およびＣＥＡｘＣＤ３抗体が競合的である場合、それらは、腫瘍細胞の表面上のＣＥＡ受容体について競合し、各組み合わせパートナーの受容体の占有率および有効性は、それらの結合親和性およびそれらの血漿濃度に依存するので予測困難であり、さらには、２つの薬物の濃度が異なる消失半減期または体からのクリアランスを有する場合には経時的に変化する。したがって、競合的ＣＥＡｘＣＤ３およびＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体を逐次に（交互に）与えるべきである。ＣＥＡｘＣＤ３およびＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体が競合的ではないかまたは最小限に競合的であるにすぎない場合、それらを逐次にだけではなく並行して（同時に）も与え得るが、これは、ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体によるＴ細胞の係合を介した、およびそれと同時にＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体によるマクロファージの係合を介した腫瘍細胞殺傷が相加的であるか、または相乗的でさえあり得るので、非常に有益であり得、これは、両薬物を並行して与えると有効性が増加することを意味する。
【０１３３】
本発明の別の態様は、ＣＥＡを異常発現する癌を有する被験体の無進行生存および／または全生存期間を増加させる方法であって、前記被験体に治療有効量の上記実施形態のいずれかの二重特異性抗体を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、癌は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌または乳癌、またはＣＥＡを発現する別の癌である。
【０１３４】
これらの方法の特定の実施形態では、二重特異性抗体は、化学療法または放射線療法と組み合わせて投与される。一実施形態では、被験体は、結腸直腸癌または肺癌または胃癌または膵臓癌または乳癌、またはＣＥＡを発現する別の癌を患っている患者である。
【０１３５】
本発明の別の態様は、ＣＥＡを異常発現する癌を有する被験体を処置する方法であって、前記被験体に、ヒトＣＥＡおよびヒトＣＤ３イプシロンに対する二重特異性抗体と組み合わせて治療有効量の上記実施形態のいずれかの二重特異性抗体を投与することを含む方法を提供する。
【０１３６】
本発明の別の態様は、ＣＥＡを異常発現する癌を有する被験体の無進行生存期間および／または全生存期間を増加させる方法であって、前記被験体に治療有効量の上記実施形態のいずれかの二重特異性抗体を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、癌は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌または乳癌である。
【０１３７】
これらの方法の特定の実施形態では、二重特異性抗体は、化学療法または放射線療法と組み合わせて投与される。一実施形態では、被験体は、結腸直腸癌または肺癌または胃癌または膵臓癌または乳癌、またはＣＥＡを発現する別の癌を有する癌患者である。
【０１３８】
本発明の別の実施形態は、上記処置方法のいずれかのための本発明の二重特異性抗体の使用を提供する。一実施形態では、癌は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌および乳癌からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１は、本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体の一般的な分子フォーマットを示す；完全ヒトＩｇＧ１構造はＩｇＧモノクローナル抗体と区別不可能であり、免疫原性および抗薬物抗体ＡＤＡ形成を最小化するためのａａ架橋を有しない；共通重鎖（配列表を参照のこと）；ＣＤ４７結合部分におけるカッパ軽鎖（ＣＬおよびＶＬ）（配列表を参照のこと）；ＣＥＡ結合部分におけるラムダＣＬ（配列表を参照のこと）およびＣＥＡ結合部分におけるラムダまたはカッパＶＬ（Ａ）；ＡＤＣＰおよびＡＤＣＣを増加させるためのＦｃの糖操作（低フコース）またはａａ突然変異またはその両方（Ｂ）。
【０１４０】
【図２】図２は、表面上にＴＡＡおよびＣＤ４７を保有する腫瘍細胞へのＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体の結合を示す。１〜５０ｎＭのＥＣ５０によるＴＡＡｘＣＤ４７の結合（実線。本発明の様々なＣＥＡｘＣＤ４７抗体の結合曲線については、図１１も参照のこと）；破線は、例えば、可溶性ＣＥＡによる結合曲線の例示的かつ概略的な潜在的シフトを示す。具体的なデータについては、例えば、ＭＫＮ−４５細胞へのＫ２ＡＣ５および２２のような本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体の結合曲線に対する２００ｎｇ／ｍＬ可溶性ＣＥＡの影響を示す図２０Ａを参照のこと。
【０１４１】
【図３Ａ】図３Ａは、本発明のＣＤ４７結合アームを保有するＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体、対応するＣＤ４７およびＴＡＡ一価抗体、ならびに高親和性抗ＴＡＡ（ＭＳＬＮ）モノクローナル抗体アマツキシマブを用いた、（ＣＥＡおよびメソセリンＭＳＬＮのような他のＴＡＡを発現する）ヒト膵臓癌細胞株ＨＰＡＣの（フローサイトメトリーにより評価して食作用の％として表した）食作用の濃度依存的増加を示す。すべての抗体は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ部分を有する。二重特異性抗体は、最も高い食作用を示す。
【０１４２】
【図３Ｂ】図３Ｂは、様々な抗体により誘導された（ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔアッセイにより評価して食作用指数として表した）食作用の濃度依存的増加を示す；曲線１：ＴＡＡまたはＣＤ４７に結合しない対照ｈＩｇＧ１；曲線２：野生型ｈＩｇＧ１  Ｆｃを有するＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体；曲線３：野生型ｈＩｇＧ１を有する抗ＣＤ４７抗体Ｂ６Ｈ１２．２；曲線４：ｈＩｇＧ１  Ｆｃ部分にＤＥＡ  ａａ置換（Ｓ３２９Ｄ、Ｉ３３２ＥおよびＧ２３６Ａ）を有するＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体。最も強い食作用は、ＤＥＡ突然変異Ｆｃを有するＴＡＡｘＣＤ４７で達成された。
【０１４３】
【図４】図４は、標的細胞として肺癌ＮＣＩ−Ｈ２２６癌細胞を使用して、すべてが同じ本発明のＣＤ４７結合アームを保有する様々なＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体（ＴＡＡはメソセリンＭＳＬＮ）の（Ｃｒ５１＋アッセイを用いて評価して％特異的殺傷として表した）ＡＤＣＣ用量反応曲線の例を示す（ｈｕボランティアＰＢＭＣ対腫瘍細胞は５０：１）。すべての二重特異性抗体は、高親和性抗ＴＡＡモノクローナル抗体アマツキシマブ、抗ＭＳＬＮ  ｍＡｂよりも強いＡＤＣＣを示す。
【０１４４】
【図５】図５は、標的細胞として肺癌ＮＣＩ−Ｈ２２６癌細胞を使用して、野生型Ｆｃを有するＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体、ＤＥＡ突然変異を保有するＦｃを有する対応するＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体、高親和性抗ＴＡＡモノクローナル抗体（この図のＴＡＡはＣＥＡではない）、およびヒトＩｇＧ１対照抗体の（Ｃｒ５１＋アッセイを使用して評価して％特異的殺傷として表した）ＡＤＣＣ用量反応曲線を示す（エフェクター対腫瘍細胞は５０：１）。最も強いＡＤＣＣは、ＤＥＡ突然変異を保有する二重特異性抗体で観察された。
【０１４５】
【図６】図６は、ＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体（実線）および対応する抗ＣＤ４７一価抗体（破線）による、ＣＥＡ（ＴＡＡ）を共発現するＭＫＮ−４５細胞上において発現されたＣＤ４７への可溶性ＳＩＲＰアルファ結合の濃度依存的遮断を示す。二重特異性抗体のより高い遮断効力は、標的細胞へのより強力な結合およびＣＤ４７のＴＡＡ共係合依存的遮断によるものである。
【０１４６】
【図７Ａ】図７Ａは、２００μｇ／ｍＬの以下の抗体と共にインキュベートしたヒト全血中のサイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦαの放出を示す：陰性対照としてのＥｒｂｉｔｕｘ、陽性対照としての抗ＣＤ５２抗体Ｃａｍｐａｔｈ、および異なるＦｃ領域以外は同一の抗原結合領域を有する３つの二重特異性抗体（左から右へ）：野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、ＤＥＡ突然変異（Ｓ３２９ＤおよびＩ３３２Ｅ）を有するＩｇＧ１  Ｆｃ、ＤＥ突然変異を有するＩｇＧ１  Ｆｃ。ｂｉＡｂ  ＣＤ４７ｌｏおよびＣＤ４７ｌｏは、同じＣＤ４７ｘＴＡＡ二重特異性抗体を指す。ＤＥＡ突然変異を保有する二重特異性抗体で観察されたＩＦＮγおよびＴＮＦα放出は、野生型Ｆｃを有する二重特異性抗体のものよりも高くない。
【０１４７】
【図７Ｂ】図７Ｂは、２００μｇ／ｍＬの以下の抗体と共にインキュベートしたヒト全血中のサイトカインＩＬ−６およびＩＬ−８の放出を示す：陰性対照としてのＥｒｂｉｔｕｘ、陽性対照としての抗ＣＤ５２抗体Ｃａｍｐａｔｈ、および異なるＦｃ領域以外は同一の抗原結合領域を有する３つの二重特異性抗体（左から右へ）：野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、ＤＥＡ突然変異を有するＩｇＧ１  Ｆｃ、ＤＥ突然変異を有するＩｇＧ１  Ｆｃ。ｂｉＡｂ  ＣＤ４７ｌｏおよびＣＤ４７ｌｏは、同じＣＤ４７ｘＴＡＡ二重特異性抗体を指す。ＤＥまたはＤＥＡ突然変異を保有する二重特異性抗体で観察されたＩＬ−６およびＩＬ−８放出は、野生型Ｆｃを有する二重特異性抗体のものよりも高くない。
【０１４８】
【図８】図８は、様々な抗体により誘導されるモノクローナル抗ＣＤ４７抗体の主な「抗原シンク」である赤血球（ＲＢＣ）（細胞表面上において２０’０００〜２５’０００個のＣＤ４７分子を発現するあらゆるＲＢＣ）の濃度依存的食作用を示す：野生型Ｆｃを有する抗ＣＤ４７  ｈｕＩｇＧ１抗体Ｂ６Ｈ１２．１２、野生型Ｆｃを有するＣＤ４７ｘＴＡＡ二重特異性抗体、およびＤＥＡ突然変異を保有するＦｃを有する同じＣＤ４７ｘＴＡＡ二重特異性抗体。Ｂ６Ｈ１２は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ（約０．０７〜０．７ｎＭ）の濃度でＲＢＣ食作用を示すが、野生型ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃを有するＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体は、最大２０００００ｎｇ／ｍｌ（約１３５０ｎＭ）の濃度でＲＢＣ食作用を示さない；ＤＥＡ突然変異を保有するＦｃ部分を有する以外は同じ二重特異性抗体は、１０００ｎｇ／ｍｌ（約７ｎＭ）を超える濃度で、野生型Ｆｃと比較して増加したＲＢＣの食作用を示し、これは依然として、抗ＣＤ４７  ｈｕＩｇＧ１抗体Ｂ６Ｈ１２のものよりも２〜２．５ｌｏｇ高い。
【０１４９】
【図９】図９は、対照ｈＩｇＧ１抗体またはＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体（最初の２週間については３０ｍｇ／ｋｇ、および最後の２週間については１００ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの静脈内注入を週４回受けた非ヒト霊長類（ＮＨＰ；カニクイザル）における赤血球数および血小板数を示す。高い曝露にもかかわらず、ＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体では、血液学的な数の有意な減少は観察されなかった（３０ｍｇ／ｋｇにおける２回目の投与終了時のＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体血漿濃度は約５００ｎＭであった）。
【０１５０】
【図１０】図１０は、異なる濃度（０〜２００μｇ／ｍＬ）の示されている抗体とのヒト全血のインキュベーションにより誘導された（フローサイトメトリーにより評価して％ＣＤ６２Ｐ発現として表した）インビトロ血小板活性化を示す。２μｇ／ｍｌおよびそれよりも高い場合に血小板活性化を誘導するＢ６Ｈ１２−ｈＩｇＧ１とは対照的に、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃを有するＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体は、最も高い試験濃度（２００μｇ／ｍＬ）であっても血小板活性化を誘導しない。ＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２も試験したところ、ｗｔ  ＩｇＧ１  Ｆｃを有するバージョンおよびアフコシル化バージョンは、２０μｇ／ｍＬまで有意な血小板活性化を示さなかった（実施例１５を参照のこと）。
【０１５１】
【図１１】図１１ＡおよびＢは、対応する抗ＣＤ４７一価抗体と比較した、本発明のＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体の濃度依存的結合を示す。ＣＤ４７およびＣＥＡを発現する標的細胞（ＭＫＮ−４５）への結合をＦＡＣＳにより評価した。図１１Ａは、ビン１に分類された抗体を示し、ＭＫＮ−４５細胞への結合は、ＳＭ３Ｅ抗体により８０％超阻害された；図１１Ｂは、ビン２に分類された抗体を示し、ＭＫＮ−４５細胞への結合は、抗ＣＥＡ抗体ＳＭ３Ｅ、ＭＥＤＩ、Ｔ８４．６６、ＳＡＲ、ＬａｂおよびＣＨ１Ａ１Ａにより阻害されなかった（２０％未満）。
【０１５２】
【図１２】図１２は、対応する抗ＣＤ４７一価抗体と比較した、異なる濃度の異なるＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体（Ｋ２ＡＣ５、Ｋ２ＡＣ２２、Ｋ２ＡＣ２３、Ｋ２ＡＣ２５、Ｋ２ＡＣ２６、Ｋ２ＡＣ２７、Ｋ２ＡＣ２８およびＫ２ＡＣ２９）により誘導されたＭＫＮ−４５細胞の（ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔアッセイにより評価して食作用指数として表した）食作用の濃度依存的増加を示す。この実験では、各試験抗体について、１ｍｇ／ｍＬのｈＩｇＧ（ヒト免疫グロブリン）を追加する。この実験で確立されたＥＣ５０値は０．２〜２０μｇ／ｍｌに含まれ、最大食作用指数（１０μｇ／ｍＬ）は３２．５％〜６９％の範囲である（試験した個々のＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体のデータの要約については、実施例の章の表３を参照のこと）。
【０１５３】
【図１３】図１３および１４は、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分またはアフコシル化Ｆｃ部分のいずれかを有する２つの選択した本発明のＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体（Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２）および対応するＣＤ４７一価抗体により誘導された（ＬＤＨ放出アッセイを使用して評価してＭＫＮ４５癌細胞の％特異的溶解として表した）ＡＤＣＣの濃度依存的増加を示す。比較のために、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４（米国特許出願公開第２０１６０３３３０９３号に記載されているヒトＩｇＧ４  Ｆｃ部分を有する５Ｆ９）の配列同一類似体をランした。１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの非存在下（図１３）または存在下（図１４）で、実験を実施した。両実験条件では、アフコシル化Ｆｃを有する抗体バージョンは、対応する野生型Ｆｃ担持バージョンと比較して高い溶解／殺傷活性を誘導する（アフコシル化Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２二重特異性抗体のＥＣ５０は、ｗｔバージョンと比較して５〜９倍低い）。
【図１４】図１３および１４は、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分またはアフコシル化Ｆｃ部分のいずれかを有する２つの選択した本発明のＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体（Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２）および対応するＣＤ４７一価抗体により誘導された（ＬＤＨ放出アッセイを使用して評価してＭＫＮ４５癌細胞の％特異的溶解として表した）ＡＤＣＣの濃度依存的増加を示す。比較のために、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４（米国特許出願公開第２０１６０３３３０９３号に記載されているヒトＩｇＧ４  Ｆｃ部分を有する５Ｆ９）の配列同一類似体をランした。１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの非存在下（図１３）または存在下（図１４）で、実験を実施した。両実験条件では、アフコシル化Ｆｃを有する抗体バージョンは、対応する野生型Ｆｃ担持バージョンと比較して高い溶解／殺傷活性を誘導する（アフコシル化Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２二重特異性抗体のＥＣ５０は、ｗｔバージョンと比較して５〜９倍低い）。
【０１５４】
【図１５】図１５および図１６は、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分またはアフコシル化Ｆｃ部分のいずれかを担持するＫ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２  ＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体により誘導された（イメージングベースのアッセイＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔを用いて評価して食作用指数として表した）食作用の濃度依存的増加を示す。比較のために、（野生型ｈＩｇＧ１  Ｆｃを有する）対応するＣＤ４７一価抗体および抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４の配列同一類似体（５Ｆ９）をランした。１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの非存在下（図１５）または存在下（図１６）のいずれかで、実験を実施した。両実験条件では、アフコシル化Ｆｃを有する二重特異性抗体バージョンは、対応する野生型Ｆｃ担持バージョンと比較して高い食作用効力を示す（アフコシル化Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２二重特異性抗体のＥＣ５０は、ｗｔバージョンと比較して３〜１０倍低い）。
【図１６】図１５および図１６は、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分またはアフコシル化Ｆｃ部分のいずれかを担持するＫ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２  ＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体により誘導された（イメージングベースのアッセイＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔを用いて評価して食作用指数として表した）食作用の濃度依存的増加を示す。比較のために、（野生型ｈＩｇＧ１  Ｆｃを有する）対応するＣＤ４７一価抗体および抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４の配列同一類似体（５Ｆ９）をランした。１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの非存在下（図１５）または存在下（図１６）のいずれかで、実験を実施した。両実験条件では、アフコシル化Ｆｃを有する二重特異性抗体バージョンは、対応する野生型Ｆｃ担持バージョンと比較して高い食作用効力を示す（アフコシル化Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２二重特異性抗体のＥＣ５０は、ｗｔバージョンと比較して３〜１０倍低い）。
【０１５５】
【図１７】図１７は、１ｍｇ／ｍｌのヒトＩｇＧの存在下または非存在下で、２つの選択したＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体（すなわち、Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２）により誘導された（イメージングベースの（ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ）を用いて評価して食作用指数として表した）食作用の濃度依存的増加を示す。比較のために、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４（米国特許出願公開第２０１６０３３３０９３号に記載されているヒトＩｇＧ４  Ｆｃ部分を担持する５Ｆ９）の配列同一類似体をランした。１ｍｇ／ｍＬヒトＩｇＧの追加（これは、ヒトではＩｇＧの生理学的血漿濃度よりもさらに低い）は、ＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体の効力（すなわち、ＥＣ５０）にわずかな影響を与えるが、ｍＡｂ  ５Ｆ９により駆動される活性は劇的に損なわれる（ＥＣ５０および最大食作用）。
【０１５６】
【図１８】図１８は、Ｋ２ＡＣ２２  ＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体により誘導された（イメージングベースのアッセイ（ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ）を用いて評価して食作用指数として表した）食作用に対するＴ細胞再ターゲティングＣＥＡ−ＴＣＢ１（３０ｎＭ）およびＣＥＡ−ＴＣＢ（３００ｎＭ）二重特異性抗体（ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体ＣＥＡ−ＴＣＢ：ＲＯ６９５８６８８／シビサタマブ、例えばＢａｃａｃら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２２（１３），３２８６−９７（２０１６）および米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号を参照のこと；ＣＥＡ−ＴＣＢ１：国際公開第２０１７０５５３８９号より）の効果を示す。比較のために、Ｔ細胞再ターゲティング二重特異性抗体、ＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体および対応するＣＤ４７一価抗体を単独で試験した。ＣＥＡ−ＴＣＢもＣＥＡ−ＴＣＢ１も、Ｋ２ＡＣ２２の食作用における濃度依存的活性を損なわない。
【０１５７】
【図１９Ａ】図１９は、ＣＥＡ−ＴＣＢ単独または無関係なｈＩｇＧ１対照と比較した、単独のまたは０．１６ｎＭもしくは０．８ｎＭのＣＥＡ−ＴＣＢと組み合わせた２つの用量（すなわち、０．３７μｇ／ｍＬまたは１．１μｇ／ｍＬ）の２つの選択した本発明のＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体（Ｋ２ＡＣ５（図１９Ａ）およびＫ２ＡＣ２２（図１９Ｂ）による（同じヒトボランティアドナーから得られたＰＢＭＣおよびマクロファージを追加した）混合アッセイにおけるＭＫＮ４５癌細胞の（発光により評価して殺傷の％として表した）殺傷を示す。（Ａ）ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体ＣＥＡ−ＴＣＢ（配列番号９６〜９９）とＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体Ｋ２ＡＣ５との組み合わせの少なくとも相加的な効果；（Ｂ）ＣＥＡ−ＴＣＢ＋Ｋ２ＡＣ２２についても、少なくとも相加的な効果。
【０１５８】
【図１９Ｂ】図１９は、ＣＥＡ−ＴＣＢ単独または無関係なｈＩｇＧ１対照と比較した、単独のまたは０．１６ｎＭもしくは０．８ｎＭのＣＥＡ−ＴＣＢと組み合わせた２つの用量（すなわち、０．３７μｇ／ｍＬまたは１．１μｇ／ｍＬ）の２つの選択した本発明のＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体（Ｋ２ＡＣ５（図１９Ａ）およびＫ２ＡＣ２２（図１９Ｂ）による（同じヒトボランティアドナーから得られたＰＢＭＣおよびマクロファージを追加した）混合アッセイにおけるＭＫＮ４５癌細胞の（発光により評価して殺傷の％として表した）殺傷を示す。（Ａ）ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体ＣＥＡ−ＴＣＢ（配列番号９６〜９９）とＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体Ｋ２ＡＣ５との組み合わせの少なくとも相加的な効果；（Ｂ）ＣＥＡ−ＴＣＢ＋Ｋ２ＡＣ２２についても、少なくとも相加的な効果。
【０１５９】
【図２０】図２０は、２００ｎｇ／ｍＬの脱落ＣＥＡの存在下または非存在下における（イメージングベースのアッセイ（ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ）を用いて評価して食作用指数として表した）結合（２０Ａ）および食作用（２０Ｂ）に対するＣＥＡｘＣＤ４７抗体Ｋ２ＡＣ５および２２の濃度依存的効果を示す。両ＣＥＡｘＣＤ４７抗体の結合曲線に対する２００ｎｇ／ｍＬ可溶性ＣＥＡの有意な影響はない。最大食作用に対する可溶性ＣＥＡの有意な効果はなく、ＥＣ５０は４倍未満シフトする。
【０１６０】
【図２１】図２１Ａは、対応する抗ＣＤ４７一価抗体および無関係なｈＩｇＧ１対照と比較した、ＭＫＮ−４５細胞への本発明のＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体の濃度依存的結合を示す。Ｋ２ＡＣ３９は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＥＡＣＡＭ６と交差反応性のＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体候補であるが；Ｋ２ＡＣ２２はＣＥＡＣＡＭ６と交差反応しない。ＣＤ４７、ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６を発現する標的細胞（ＭＫＮ−４５）への結合をＦＡＣＳにより評価した。図２１Ｂは、対応する抗ＣＤ４７一価抗体および無関係なｈＩｇＧ１対照と比較した、２つの異なるＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体（Ｋ２ＡＣ２２およびＫ２ＡＣ３９）により誘導されたＭＫＮ−４５細胞の（イメージングベースのアッセイ（ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ）により評価して食作用指数として表した）食作用の濃度依存的増加を示す。Ｋ２ＡＣ３９は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＥＡＣＡＭ６と交差反応性のＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体候補であるが；Ｋ２ＡＣ２２はＣＥＡＣＡＭ６と交差反応しない。この実験では、１ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧを追加する。Ｋ２ＡＣ３９は、Ｋ２ＡＣ２２と比較して高いＭＫＮ４５細胞の食作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１６１】
発明の詳細な説明
以下のように特に定義がない限り、本明細書では、当技術分野で一般に使用されるように用語を使用する。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「抗原結合部分、結合部分」という用語は、その最も広い意味で、ＣＥＡ、ＣＤ４７およびＣＤ３などの抗原決定基に特異的に結合する抗体の部分を指す。
【０１６３】
より具体的には、本明細書で使用される場合、膜結合ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５と同じ）またはＣＤ４７に結合する結合部分は、ＣＥＡまたはＣＤ４７、より具体的には細胞表面または膜結合ＣＥＡまたはＣＤ４７に特異的に結合する。したがって、各結合部分は、ＣＥＡまたはＣＤ４７のいずれかに結合する。「特異的に結合する、に特異的な、に結合する」は、結合が抗原に選択的であり、望ましくないまたは非特異的な相互作用と区別され得ることを意味する。いくつかの実施形態では、非関連非標的タンパク質への抗標的抗体の結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により測定される場合、前記標的への抗体の結合よりも約１０倍、好ましくは＞１００倍未満である。標的は、本明細書で議論されるタンパク質、例えばＣＥＡ、ＣＤ４７およびＣＤ３εである。一実施形態では、ＣＥＡ結合部分は、ＣＥＡＣＡＭ６にさらに結合する。
【０１６４】
「ＣＥＡ、ＣＤ４７に特異的に結合する、ＣＥＡ、ＣＤ４７に結合する、ＣＥＡ、ＣＤ４７に特異的な」は、一実施形態では、ＣＥＡおよびＣＤ４７を発現する腫瘍細胞のターゲティングにおいて抗体が治療剤として有用であるような十分な親和性で、標的ＣＥＡおよびＣＤ４７に結合することができる抗体、例えば二重特異性抗体を指す。「のＥＣ５０値でＭＫＮ−４５細胞に結合する」という用語は、試験される二重特異性抗体濃度が、３００ｎＭの濃度の抗ＣＤ４７抗体Ｂ６Ｈ１２．２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ−９７７１（商標）、本明細書ではＢ６Ｈ１２とも称される）の存在下で０．１〜１０００ｎＭであるアッセイ条件を指す。
【０１６５】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＥＡＣＡＭ５に結合する。
【０１６６】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む抗体を指す。一実施形態では、抗体は全長抗体である。本明細書で使用される場合、「抗体重鎖」という用語は、全長抗体について定義される可変領域および定常領域からなる抗体重鎖を指す。本明細書で使用される場合、「抗体軽鎖」という用語は、全長抗体について定義される可変領域および定常領域からなる抗体軽鎖を指す。
【０１６７】
「全長抗体」という用語は、２つの「全長抗体重鎖」および２つの「全長抗体軽鎖」からなる抗体を表す。「全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）および抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）からなるポリペプチドであり、ＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３と略される。「全長抗体軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなるポリペプチドであり、ＶＬ−ＣＬと略される。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、κ（カッパ）またはλ（ラムダ）であり得る。２つの全長抗体ドメインは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間および全長抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して互いに連結される。典型的な全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような天然抗体である。本発明の全長抗体は、一実施形態ではヒトＩｇＧ１タイプのものであり、さらなる一実施形態では以下で定義されるようにＦｃ部分中に１つもしくはそれを超えるアミノ酸置換を含み、および／またはＡｓｎ２９７で糖操作されている。本発明の全長抗体は、それぞれがＶＨとＶＬとの対により形成される２つの結合部分であって、一方がＣＥＡに結合し、他方がＣＤ４７に結合する２つの結合部分を含む。
【０１６８】
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非隣接抗原結合部位（抗原結合領域としても公知である）を表す。ＣＤＲは「超可変領域」とも称され、その用語は、本明細書では、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して、「ＣＤＲ」という用語と互換的に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）により記載されており、それらにおける定義は、互いに比較した場合に重複するまたは一部のアミノ酸残基を含む。ＩＧおよびＴＲのＦＲ−ＩＭＧＴおよびＣＤＲ−ＩＭＧＴ領域の定義は、“ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｌｌ  ＩＧ  ａｎｄ  ＴＲ  Ｖ−ＲＥＧＩＯＮｓ  ｏｆ  ａｌｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ：ｉｎｔｅｒｅｓｔ  ｆｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３）に基づいており、再配置ＣＤＲ３−ＩＭＧＴおよびＦＲ４−ＩＭＧＴについては、“ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｖ−ＤＯＭＡＩＮ  ａｎｄ  Ｖ−ＬＩＫＥ−ＤＯＭＡＩＮ”（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３））に基づいている。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のＣＤＲを指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義および使用される用語の範囲内にあると意図される。ＩＭＧＴおよびＫａｂａｔにより定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、以下の配列表に記載されている。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列およびサイズに応じて変動する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかをルーチンに決定し得る。本明細書で使用される場合、「配列番号ｘのＣＤＲＬ１を含む」という用語は、言及される可変軽鎖のＣＤＲＬ１部分が配列番号ｘのものである（ＣＤＲＬ１として配列番号ｘのＣＤＲＬ１を含む）ことを指す。これは他のＣＤＲにも当てはまる。
【０１６９】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域；Ｆｃドメイン」という用語は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を指す；ＩｇＧ１抗体の場合、Ｃ末端領域は−ＣＨ２−ＣＨ３を含む（上記を参照のこと）。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域中の境界はわずかに変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで広がるとして定義される。
【０１７０】
定常領域は技術水準で周知であり、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａにより記載されている（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（２０００）２１４−２１８；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２（１９７５）２７８５−２７８８を参照のこと）。
【０１７１】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定基を含む。特定の実施形態では、「エピトープ」は、分子の化学的に活性な表面基、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルを含み、特定の実施形態では、特定の三次元構造特徴およびまたは特定の電荷特徴を有し得る。エピトープは、抗体が結合する標的の領域である。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５のＮ末端ドメイン（アミノ酸３５〜１４４のＩｇ様Ｖタイプドメイン、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０６７３１）に結合する。ＣＥＡＣＡＭ５へのＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体の結合位置は、エピトープビニングを介して達成される。エピトープビニングでは、ペアワイズコンビナトリアル方式で抗体を試験し、同じ結合領域について競合する抗体をビンに一緒にグループ化する。競合試験は、本明細書では、技術水準にしたがって、および本明細書に記載されているように抗ＣＥＡ抗体を用いて実施される。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５への結合について、参照抗体ＳＭ３Ｅと競合する（ビン１）。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５への結合について、参照抗体ＳＭ３Ｅ、ＭＥＤＩ、Ｔ８４．６６、ＳＡＲ、ＬａｂおよびＣＨ１Ａ１Ａと競合しない（ビン２）。競合は、０．５μｇ／ｍｌの濃度のビオチン化ヒトＣＥＡＣＡＭ５を固定化し、１０μｇ／ｍｌの参照と共にインキュベートするアッセイにより測定される。本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体のＣＥＡＣＡＭ５結合部分を含むＣＥＡＣＡＭ５抗体を０．２μｇ／ｍｌ、室温で１時間追加する。プレートを洗浄し、結合したＣＥＡＣＡＭ５  ｍＡｂを検出する。
【０１７２】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５のＢ３ドメインおよびＧＰＩアンカーに結合する。本発明の一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域を含む抗ＣＥＡ抗体（ＭＡＢ  ＣＥＡ）と同じエピトープに結合する。
【０１７３】
本明細書で使用される場合、「共通重鎖（ｃＨＣ）」という用語は、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）および抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）からなるポリペプチドを指し、ＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３と略される。本発明の二重特異性抗体に適切な共通重鎖は、国際公開第２０１２０２３０５３号、国際公開第２０１３０８８２５９号、国際公開第２０１４０８７２４８号および国際公開第２０１６１５６５３７号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）に記載されている抗ＣＤ４７抗体の重鎖である。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体のｃＨＣは、軽鎖ＣＤＲとして配列番号１のＣＤＲＬ１、配列番号２のＣＤＲＬ２および配列番号３のＣＤＲＬ３と、重鎖ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３とを含む。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体のｃＨＣは、重鎖可変領域ＶＨとして配列番号４のＶＨ領域を含む。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体のｃＨＣは、配列番号５のものである。一実施形態では、本発明の抗体は、ｃＨＣを含むκλ二重特異性抗体である（κλボディ）。
【０１７４】
「κλボディフォーマットは、標準的なＩｇＧ分子と区別不可能な二重特異性抗体であって、標準的なモノクローナル抗体と区別不可能な特徴を有する二重特異性抗体のアフィニティー精製を可能にし（例えば、国際公開第２０１３０８８２５９号、国際公開第２０１２０２３０５３号を参照のこと）、患者において免疫原性の可能性がないかまたは低いことを約束する。
【０１７５】
共通重鎖を含む本発明の二重特異性抗体は、例えば、国際公開第２０１２０２３０５３号（その全体が参照により組み込まれる）にしたがって作製され得る。国際公開第２０１２０２３０５３号に記載されている方法は、ヒト免疫グロブリンと構造が同一の二重特異性抗体を生成する。このタイプの分子は、２コピーのユニークな重鎖ポリペプチドと、定常カッパドメインに融合された第１の軽鎖可変領域と、定常ラムダドメインに融合された第２の軽鎖可変領域とから構成される。一方の結合部位はＣＥＡへの特異性を示し、他方の部位はＣＤ４７への特異性を示し、それぞれに対して重鎖および各軽鎖が寄与する。軽鎖可変領域は、ラムダまたはカッパファミリーのものであり得、好ましくは、それぞれラムダおよびカッパ定常ドメインに融合される。これは、非天然ポリペプチド結合の生成を回避するために好ましい。しかしながら、第１の特異性については、カッパ軽鎖可変ドメインを定常ラムダドメインに融合することにより、または第２の特異性については、ラムダ軽鎖可変ドメインを定常カッパドメインに融合することにより、本発明の二重特異性抗体を得ることも可能である。その場合、他の軽鎖は常に、完全にカッパ（ＶＬおよびＣＬ）または完全にラムダである。国際公開第２０１２０２３０５３号に記載されている二重特異性抗体は「κλボディ」である。このκλ−ボディフォーマットは、標準的なモノクローナル抗体と区別不可能な特徴を有する標準的なＩｇＧ分子と区別不可能な二重特異性抗体のアフィニティー精製を可能にするので、例えば、アミノ酸架橋または他の非天然エレメントを含む以前のフォーマットと比較して好ましい。
【０１７６】
前記方法の必須工程は、異なる抗原特異性を有する（それぞれが可変軽ドメインおよび可変重ドメインにより含まれる）２つの抗体Ｆｖ領域であって、同じ重鎖可変ドメインを共有する２つの抗体Ｆｖ領域の同定である。モノクローナル抗体およびその断片の生成について、多数の方法が記載されている。（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ，ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｄ，１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと）。完全ヒト抗体は、ＣＤＲ１および２を含む軽鎖および重鎖の両方の配列がヒト遺伝子から生じた抗体分子である。ＣＤＲ３領域はヒト起源のものでもよいし、または合成手段により設計されてもよい。このような抗体は、「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と称される。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照のこと）；およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５  Ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６を参照のこと）を使用して、ヒトモノクローナル抗体を生産することにより調製され得る。ヒトモノクローナル抗体が利用され得、ヒトハイブリドーマを使用することにより（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０を参照のこと）、またはエプスタインバーウイルスでヒトＢ細胞をインビトロで形質転換することにより（Ｃｏｌｅら、前掲を参照のこと）生産され得る。
【０１７７】
本明細書で使用される場合、「ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５」という用語は、細胞表面糖タンパク質および腫瘍関連抗原（Ｇｏｌｄ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１２１：４３９−４６２，１９６５；Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ  ＮＬ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，２０：２１９７−２２０７，２００２）であるヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ，ＣＥＡＣＡＭ−５またはＣＤ６６ｅ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０６７３１）を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＥＡＣＡＭ６」という用語は、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）ファミリーのメンバーでもあるヒトＣＥＡＣＡＭ６（ＣＤ６６ｃ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ４０１９９）を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＥＡＣＡＭ１」という用語は、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）ファミリーのメンバーでもあるヒトＣＥＡＣＡＭ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ１３６８８（ＣＥＡＭ１＿ＨＵＭＡＮ）を指す。さらなる情報およびＣＥＡファミリーの他のメンバーに関する情報については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇに見られ得る。
【０１７８】
本明細書で使用される場合、「ＭＡＢ  ＣＥＡ」という用語は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を指す。本明細書で使用される場合、「ＭＡＢ  ＣＥＡ１」という用語は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号８８の重鎖可変領域および配列番号８９の軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を指す。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＭＡＢ  ＣＥＡ、ＭＡＢ  ＣＥＡ１、ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１と競合する；さらなる実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＭＡＢ  ＣＥＡ、ＭＡＢ  ＣＥＡ１、ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１と競合しない。ＭＡＢ  ＣＥＡおよび前記可変鎖は、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号（米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号（その全体が参照により組み込まれる）の配列番号２１および２７）に記載されている。ＭＡＢ  ＣＥＡのＶＨおよびＶＬを含む二重特異性抗ＣＥＡｘ抗ＣＤ３ε抗体（ＣＥＡ−ＴＣＢ）は、Ｂａｃａｃら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２２（１３），３２８６−９７（２０１６））に記載されている。ＭＡＢ  ＣＥＡ１のＶＨおよびＶＬを含むさらなる二重特異性ＣＥＡｘＣＤ３  Ｍａｂ（ＣＥＡ−ＴＣＢ１）は、電荷改変（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー、ヒト化ＣＥＡバインダーにおける電荷改変）を有する分子Ｂ「逆２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ」として国際公開第２０１７０５５３８９号に記載されている（国際公開第２０１７０５５３８９号（その全体が参照により組み込まれる）の図３Ｂおよび配列番号３４、３６〜３８を参照のこと）。一実施形態で本明細書で使用される場合、「二重特異性ＣＥＡｘＣＤ３抗体」は、抗体ＣＥＡ−ＴＣＢまたは抗体ＣＥＡ−ＴＣＢ１を指す。
【０１７９】
「本明細書で使用される場合、「ＣＤ４７に特異的に結合する、ＣＤ４７に結合する、ＣＤ４７結合部分」という用語は、本発明の二重特異性抗体の文脈では、ＣＤ４７に対する特異性を指す。ＣＤ４７は複数回膜貫通タンパク質であり、３つの細胞外ドメイン（アミノ酸１９〜１４１、１９８〜２０７および２５７〜２６８；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ０８７２２を参照のこと）を含む。本明細書で使用される場合、「ＣＤ４７への結合親和性」という用語は、ＳＰＲにより測定される。
【０１８０】
一実施形態では、ＣＤ４７への本発明の二重特異性抗体の結合は、前記細胞外ドメインの１つまたはそれよりも多くを介して起こる。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ヒトＣＤ４７とヒトＳＩＲＰαとの間の相互作用を阻害する。
【０１８１】
本明細書で使用される場合、「ＣＥＡに特異的に結合する、ＣＥＡに結合する、ＣＥＡ結合部分」という用語は、本発明の二重特異性抗体の文脈では、細胞の表面上のＣＥＡＣＡＭ５に対する特異性を指す。細胞上のＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）への結合は、好ましくは、細胞当たり２００．０００〜６００．０００個のＣＥＡコピーを含む胃腺癌ＭＫＮ−４５細胞を用いて測定される。本発明の抗体の濃度は、上記で定義されるＭＫＮ−４５細胞への結合について得られたＥＣ５０値に関して適切な範囲で変動する。本発明の二重特異性抗体は、このような細胞膜結合ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合し、さらなる実施形態では、患者の血液／血漿中に見られるような濃度の可溶性ＣＥＡＣＡＭ５に結合しないかまたは最小限に結合するにすぎず、すなわち、このような濃度の可溶性ＣＥＡは、本発明の二重特異性抗体の有効性に影響を及ぼさないかまたは最小限に影響を及ぼすにすぎない。これは、記載されるように、本発明の二重特異性抗体によるＭＫＮ−４５細胞の食作用に対する可溶性ＣＥＡの影響により測定される。
【０１８２】
本明細書で使用される場合、「膜結合ヒトＣＥＡ」という用語は、細胞の膜部分にまたは細胞の表面、特に腫瘍細胞の表面に結合したヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を指す。「膜結合ヒトＣＥＡ」という用語は、特定の状況では、細胞の膜に結合していないが、本発明の抗体が結合する膜結合ＣＥＡエピトープを保存するように構築されたＣＥＡを指し得る。
【０１８３】
本明細書で使用される場合、「可溶性ＣＥＡＣＡＭ５に対する実質的な交差反応性なし、可溶性ＣＥＡＣＡＭ５に結合しない」という用語は、本発明の二重特異性抗体の文脈では、このような抗体が、特に膜結合ＣＥＡＣＡＭ５と比較した場合に、可溶性ＣＥＡＣＡＭ５への関連結合を示さないことを指す。このような非結合は、以下に記載されるようにＭＫＮ−４５細胞を用いた食作用アッセイにおける二重特異性抗体の食作用活性に対する可溶性ＣＥＡの低い影響、好ましくは食作用指数のイメージングベースの測定により間接的に決定され得、実施例９を参照のこと）。したがって、可溶性ＣＥＡＣＡＭ５に対する実質的な交差反応性なしは、前記二重特異性抗体による、ヒトマクロファージの存在下におけるＭＫＮ−４５細胞の食作用の達成可能な最大食作用指数（二重特異性抗体ＣＥＡｘＣＤ４７の典型的な濃度−食作用指数曲線および達成可能な最大食作用指数は、例えば、図１２、１５、１６、１７、２０Ａに示されており、アッセイは実施例９．２で説明されている）が、２００ｎｇ／ｍｌ可溶性ＣＥＡを食作用アッセイに追加した場合に２０％超減少しないことを意味する。あるいは、濃度−食作用指数曲線のＥＣ５０のシフトが決定され得る。２００ｎｇ／ｍｌ可溶性ＣＥＡの追加は、このＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない。あるいは、細胞上のＣＥＡへの本発明の二重特異性抗体の結合に対する可溶性ＣＥＡの影響がないかまたは最小限であることは、フローサイトメトリーにより測定された結合曲線（このような結合曲線は図２０Ｂに示されている）に対する可溶性ＣＥＡの影響により予想される。フローサイトメトリーアッセイへの２００ｎｇ／ｍｌ可溶性ＣＥＡの追加は、結合曲線またはＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない。
【０１８４】
「可溶性ＣＥＡ、脱落ＣＥＡ、ｓＣＥＡ」という用語は、細胞膜または細胞表面（例えば、腫瘍細胞表面）に結合していないかまたはそれから切断されたＣＥＡＣＡＭ５を指す。可溶性ＣＥＡは、例えば、癌を有する被験体の血流中に見られ得る。ＣＥＡが細胞膜から脱落すると、ＧＰＩアンカーが破壊され、ＣＥＡＣＡＭ５はコンフォメーション変化を受け、これが、本発明の抗体への可溶性ＣＥＡの結合を防止または少なくとも弱化し得ると想定される。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、「ＣＥＡＣＡＭ６に対する交差反応性、ＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合する、ＣＥＡＣＡＭ６に結合する、ＣＥＡＣＡＭ６結合部分」という用語は、本発明の二重特異性抗体の文脈では、本発明の二重特異性抗体が細胞の表面（膜）上のＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６を特異的に認識することを指す。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、膜結合ＣＥＡへの結合と比較した場合に、膜結合ＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合する。所定の本発明の二重特異性抗体による細胞表面上のＣＥＡＣＡＭ６受容体に対するＣＥＡＣＡＭ５受容体の占有率は、ＣＥＡＣＡＭ５またはＣＥＡＣＡＭ６に対する結合親和性に依存し、例えば、ＳＰＲによりこれらの結合親和性を測定すれば容易に計算され得る。
【０１８６】
特定の実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する抗体は、癌胎児性抗原関連細胞接着タンパク質、例えばＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７およびＣＥＡＣＡＭ８に結合しない。特定の実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する抗体はまた、同様のＥＣ５０でＣＥＡＣＡＭ６に結合する。
【０１８７】
本明細書で使用される場合、「ＣＥＡＣＡＭ１および／またはＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７およびＣＥＡＣＡＭ８に対する実質的な交差反応性なし、前記ＣＥＡＣＡＭに結合しない」という用語は、本発明の二重特異性抗体の文脈では、このような抗体が、膜結合ＣＥＡＣＡＭ５と比較した場合に、治療血漿濃度（１〜１０００ｎＭ）で前記膜結合ＣＥＡＣＡＭへのいかなる関連結合も示さないことを指す。ＣＥＡＣＡＭ１および／またはＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６およびＣＥＡＣＡＭ８への非結合は、前記ＣＥＡＣＡＭを発現する組換えＣＨＯ細胞への結合曲線のフローサイトメトリーベースの測定により決定され得、ＣＥＡＣＡＭ３および／またはＣＥＡＣＡＭ４およびＣＥＡＣＡＭ７への非結合は、前記ＣＥＡＣＡＭを発現する組換えＰＥＡＫ細胞への結合曲線の測定により、または組換えＣＥＡＣＡＭタンパク質への結合を測定するＥＬＩＳＡアッセイにより決定され得る。本明細書で使用される場合、本明細書で言及される化合物（例えば、ヒトＩｇＧ）「に結合しない、への非結合」という用語もまた、例えば、このような無関係な結合または非交差反応性を指す。例えば、ＥＬＩＳＡでは、このような非関連化合物のＯＤ値は、検出限界のものとほぼ等しい。
【０１８８】
本明細書で使用される場合、「ヒトＣＥＡおよびヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体、ＣＥＡｘＣＤ３  Ｍａｂ」という用語は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３εに結合する二重特異性抗体を意味する。このような抗体は、例えば、「ＣＥＡ−ＴＣＢ」および「ＣＥＡ−ＴＣＢ１」である。本明細書で使用される場合、「ＣＥＡ−ＴＣＢ」は、配列番号１、２、２１および２２として米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号（その全体が参照により組み込まれる）に記載されるＣＥＡおよびＣＤ３に結合する二重特異性抗体を指す。ＣＥＡ−ＴＣＢのアミノ酸配列はまた、本発明の配列番号９６〜９９として記載されている。本明細書で使用される場合、「ＣＥＡ−ＴＣＢ１」は、電荷改変（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー、ヒト化ＣＥＡバインダーにおける電荷改変；国際公開第２０１７０５５３８９号（その全体が参照により組み込まれる）の図３Ｂ、配列番号３４、３６〜３８）を有する「逆２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ」フォーマットの分子Ｂを指す。ＣＥＡ−ＴＣＢ１のアミノ酸配列は、本発明の配列番号９２〜９５として記載されている。さらなるＣＥＡｘＣＤ３  Ｍａｂは、国際公開第２００７０７１４２６号、国際公開第２０１３０１２４１４号、国際公開第２０１５１１２５３４号、国際公開第２０１７１１８６７５号、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号および国際公開第２０１７０５５３８９号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）に記載されている。さらなるＣＥＡｘＣＤ３  ＭａｂはＲＯ６９５８６８８である（例えば、Ｂａｃａｃら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２２（１３），３２８６−９７（２０１６）を参照のこと。一実施形態では、前記ＣＥＡｘＣＤ３  Ｍａｂは競合的であり、および／またはＭＡＢ  ＣＥＡと同じヒトＣＥＡＣＡＭ５のエピトープに結合する。一実施形態では、前記ＣＥＡｘＣＤ３  Ｍａｂは競合的であり、および／またはＭＡＢ  ＣＥＡ１と同じヒトＣＥＡＣＡＭ５のエピトープに結合する。
【０１８９】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３  Ｍａｂ、ＣＤ３に対する抗体」は、ヒトＣＤ３ε（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）を指す。「ＣＤ３εに対する抗体、抗ＣＤ３ε抗体」という用語は、ＣＤ３εに特異的に結合する抗体に関する。一実施形態では、ＣＤ３εに対する抗体は、抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．５６５９８３）と同じエピトープに特異的に結合する。一実施形態では、ＣＤ３εに対する抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３εのエピトープに特異的に結合する。一実施形態では、ＣＤ３εに対する抗体はヒトＣＤ３εに特異的に結合し、配列番号９０の重鎖可変領域および配列番号９１の軽鎖可変領域を含む。
【０１９０】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＭＫＮ−４５細胞上に提示されるＣＥＡへの結合について、ＣＥＡ−ＴＣＢおよび／またはＣＥＡ−ＴＣＢ１と競合しない。したがって、３００ｎＭ（ＣＥＡ−ＴＣＢ）または３０ｎＭ（ＣＥＡ−ＴＣＢ１）の濃度のＣＥＡ−ＴＣＢは、ＭＫＮ−４５細胞に対する本発明の前記二重特異性抗体の食作用指数曲線のＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない。
【０１９１】
３００ｎＭは、治療有効用量のＣＥＡ−ＴＣＢで患者血漿中で測定された濃度である（（Ｊ．Ｔａｂｅｒｎｅｒｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３５，２０１７（ｓｕｐｐｌ．Ａｂｓｔｒ．３００２））。ＣＥＡ−ＴＣＢ１は、前臨床試験ではＣＥＡ−ＴＣＢよりも約１０〜１００倍強力であるので（結合親和性、腫瘍細胞溶解、国際公開第２０１７０５５３８９号）、ＥＣ５０のシフトは３０ｎＭで試験される。
【０１９２】
結合の競合は、ＭＫＮ−４５細胞への結合曲線のフローサイトメトリーベースの測定およびこの結合曲線のＥＣ５０の決定により決定され得る（例えば、このような結合曲線については、図２および図１１を参照のこと）。非競合は、３００ｎＭのＭＡＢ  ＣＥＡまたはＣＥＡ−ＴＣＢがアッセイに追加された場合に、ＥＣ５０が一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍未満シフトすることを意味する。３００ｎＭは、ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体（ＣＥＡ−ＴＣＢ）の治療活性用量／血漿濃度の範囲内の濃度である（Ｊ．Ｔａｂｅｒｎｅｒｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３５，２０１７（ｓｕｐｐｌ．Ａｂｓｔｒ．３００２））。ＭＡＢ  ＣＥＡ１またはＣＥＡ−ＴＣＢ１による非競合は、３０ｎＭのＭＡＢ  ＣＥＡ１またはＣＥＡ−ＴＣＢ１がアッセイに追加された場合に、ＥＣ５０が３倍未満シフトすることを意味する。
【０１９３】
結合の競合は、ＭＫＮ−４５細胞への結合曲線のフローサイトメトリーベースの測定およびこの結合曲線のＥＣ５０の決定により決定され得る（このような結合曲線については、図２および図１１を参照のこと）。非競合は、３００ｎＭのＭＡＢ  ＣＥＡまたはＣＥＡ−ＴＣＢがアッセイに追加された場合に、ＥＣ５０が３倍未満変化することを意味する。３００ｎＭは、ＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体（ＣＥＡ−ＴＣＢ）の治療活性用量／血漿濃度の範囲内の濃度である（Ｊ．Ｔａｂｅｒｎｅｒｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３５，２０１７（ｓｕｐｐｌ．Ａｂｓｔｒ．３００２））。
【０１９４】
ＭＡＢ  ＣＥＡ１またはＣＥＡ−ＴＣＢ１による非競合は、３０ｎＭのＭＡＢ  ＣＥＡ１またはＣＥＡ−ＴＣＢ１がアッセイに追加された場合に、ＥＣ５０が３倍未満変化することを意味する。
【０１９５】
本明細書で使用される場合、「非競合的」という用語は、３００ｎＭ（ＭＡＢ−ＣＥＡ、ＣＥＡ−ＴＣＢ）または３０ｎＭ（ＭＡＢ  ＣＥＡ１、ＣＥＡ−ＴＣＢ１）の濃度の第２の抗体（ＭＡＢ  ＣＥＡ、ＭＡＢ  ＣＥＡ１、またはＣＥＡｘＣＤ３εに対する二重特異性抗体、例えばＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１）が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせないことを意味する。本明細書で使用される場合、「競合的」という用語は、３００ｎＭまたは３０ｎＭ（ＭＡＢ  ＣＥＡ１またはＣＥＡ−ＴＣＢ１）の濃度の第２の抗体（ＭＡＢ  ＣＥＡ、ＭＡＢ  ＣＥＡ１、またはＣＥＡｘＣＤ３εに対する二重特異性抗体、例えばＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１）が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０をより高い濃度の方向に３倍超、好ましくは５倍超シフトさせることを意味する。
【０１９６】
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非隣接抗原結合部位（抗原結合領域としても公知である）を表す。ＣＤＲは「超可変領域」とも称され、その用語は、本明細書では、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して、「ＣＤＲ」という用語と互換的に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）により記載されている。Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列のナンバリングシステムを定義した。当業者は、配列それ自体以外のいかなる実験データにも依拠せずに、「Ｋａｂａｔナンバリング」のこのシステムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当て得る。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）により示されているナンバリングシステムを指す。特に指定がない限り、本発明の二重特異性抗体における特定のアミノ酸残基位置のナンバリングへの言及は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにしたがう。
【０１９７】
本明細書で使用される場合、「ＡＤＣＰ」という用語は、抗体依存性細胞媒介性食作用を指す。
【０１９８】
本明細書で使用される場合、本発明の「食作用、食作用のＥＣ５０値、食作用の最大、食作用指数」は、「イメージング」によりＭＫＮ−４５細胞を用いて測定された食作用を指す。例えば、１：１もしくは１：３のエフェクター（マクロファージ）：標的（腫瘍）細胞比によるインキュベーションを用いた、またはリードアウトとして「食作用指数」（イメージングにより決定したＡＤＣＰ）を用いた適切なイメージング方法は、実施例９に記載されている。図３Ｂは、０．１またはさらにそれよりも低いものから約５００ｎＭの試験濃度範囲の二重特異性ＴＡＡｘＣＤ４７抗体で決定した達成可能な最大食作用指数を示す。図１２、１５および１６は、本発明のＫ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２による二重特異性抗体のＡＤＣＰの結果を示す。本明細書で使用される場合、「前記二重特異性抗体の食作用」は、前記抗体により引き起こされた／誘導された食作用を意味する。抗体Ｋ２ＡＣ２２は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含み、それにより、第１の結合部分は、配列番号５の重鎖および配列番号６５の軽鎖を含み、第２の結合部分は、配列番号５の重鎖および配列番号１１の軽鎖を含む。抗体Ｋ２ＡＣ５は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含み、それにより、第１の結合部分は、配列番号５の重鎖および配列番号６４の軽鎖を含み、第２の結合部分は、配列番号５の重鎖および配列番号１１の軽鎖を含む。抗体Ｋ２ＡＣ１０、Ｋ２ＡＣ１３  Ｋ２ＡＣ１８、Ｋ２ＡＣ２３、Ｋ２ＡＣ２５、Ｋ２ＡＣ２６、Ｋ２ＡＣ２７、Ｋ２ＡＣ２８、Ｋ２ＡＣ２９は、同じ重鎖および第２の結合部分軽鎖を含むが、第１の結合部分軽鎖が異なる（表１、配列表を参照のこと）。
【０１９９】
食作用分野に関するさらなる詳細について、食作用はまた、フローサイトメトリーベースの方法により、例えば、３：１のヒトマクロファージ対標的／腫瘍細胞比で、％食作用として測定され得る（「フローサイトメトリーにより決定したＡＤＣＰ」）（一価ＴＡＡおよびＣＤ４７抗体ならびにＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体の濃度からの％食作用の依存性については、実施例９および図３Ａを参照のこと）。
【０２００】
「ヒトＩｇＧ、ｈＩｇＧ」という用語は、ＣＤ４７およびＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合しないヒト免疫グロブリンＩｇＧ（Ｂｉｏ−ｒａｄ．ｃｏｍ社製）の市販の臨床グレードの均一な調製物を指す。
【０２０１】
ＣＨＯ細胞において産生される抗体は、典型的には、二分岐型Ｎ−アセチルグルコサミン（二分岐型ＧｌｃＮＡｃ）が非常に少ないかまたは欠如しており、コアフコシル化レベルが高い複雑な二分岐構造を有する。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの過剰発現は、抗体上に存在する二分岐型ＧｌｃＮＡｃの割合を増加させて、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を改善するために使用されている。ＲＮＡｉおよび遺伝子欠失技術もまた、抗体上のフコースを減少させまたは排除して、ＡＤＣＣ活性を劇的に増加させるために使用されている（Ｄａｖｉｓ  Ｊら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００１；７４：２８８−２９４；Ｓａｂａ  ＪＡら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２；３０５：１６−３１；Ｋａｎｄａ  Ｙら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７；１３０：３００−３１０；Ｍｏｒｉ  Ｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００４；８８：９０１−９０８）。
【０２０２】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は糖操作されている。一実施形態では、本発明の糖操作された二重特異性抗体は、配列番号５に含まれるＦｃ部分を含む二重特異性抗体（親抗体）であって、標準的な条件（１０００ｍｌ容器、温度３７℃、ｐＨ７．０、インペラー速度８０ｒｐｍ、最小溶存酸素３０％；培養時間１４日間）でＣＨＯ  Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−６１（商標））における産生によるグリコシル化を含む二重特異性抗体（親抗体）と比較して増加したＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ活性（食作用指数の減少したＥＣ５０および／またはより高い最大）を有する。
【０２０３】
より具体的な実施形態では、ＡＤＣＣの増加（ＥＣ５０の減少および／または最大の増加）は、前記親抗体と比較して１．２〜２．０またはさらには少なくとも２．０倍である（例えば、図１３および１４を参照のこと）。
【０２０４】
より具体的な実施形態では、ＡＤＣＰの増加（食作用指数曲線のＥＣ５０の減少）は、前記親抗体と比較して少なくとも３もしくはさらには５倍またはそれを超える（例えば、図１５および１６を参照のこと）。
【０２０５】
本明細書で使用される場合、「ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチド、ＧｎＴＩＩＩ」という用語は、Ｎ結合型オリゴ糖のトリマンノシルコアのβ結合マンノシドへのβ−１−４結合におけるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の付加を触媒することができるポリペプチド、例えばβ−１，４−マンノシル−糖タンパク質４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１４４）を指す。
【０２０６】
本明細書で使用される場合、「ＦＵＴ８」という用語は、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．４．１．６８）を指す。
【０２０７】
本明細書で使用される場合、「エフェクター機能、Ｆｃ媒介性細胞傷害」という用語は、抗体のＦｃ領域（ネイティブ配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、限定されないが、Ｆｃ受容体結合親和性、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体のダウンレギュレーションなどが挙げられる。このような免疫機構は、「ヒト免疫エフェクター細胞」による「標的細胞」の溶解につながる。
【０２０８】
本明細書で使用される場合、「糖操作された抗体」という用語は、親抗体と比較して減少した量の、通常はアミノ酸Ａｓｎ２９７で前記抗体のＦｃ領域に付着したフコシル化型および／または二分岐型オリゴ糖を含む本発明の二重特異性抗体を指す。
【０２０９】
本明細書で使用される場合、糖操作の文脈における「親抗体、親二重特異性抗体」という用語は、糖操作された抗体と同じアミノ酸組成を含むが糖操作されていない本発明の二重特異性抗体を指す。このような比較のために、親抗体および糖操作された抗体は同じ宿主細胞において産生されるが、第１の場合では、糖操作されていない宿主細胞において産生され、第２の場合では、ＦＵＴ８遺伝子の標的破壊により操作されたか、または標準的な条件下でＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより操作された以外は同じ宿主細胞において産生される（上記を参照のこと）。
【０２１０】
本明細書で使用される場合、「ヒト免疫エフェクター細胞」という用語は、それらが抗原結合分子またはＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域に結合してエフェクター機能を実行することを通じて、それらの表面上にＦｃ受容体をディスプレイする白血球の集団を指す。このような集団としては、限定されないが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／またはマクロファージが挙げられ得る。
【０２１１】
本明細書で使用される場合、「増加したＦｃ媒介性細胞傷害」という用語は、標的細胞を取り囲む培地中で、所定の時間に、所定の濃度の本発明の二重特異性抗体で、上記で定義されるＦｃ媒介性細胞傷害の機構により溶解される「標的細胞」の数の増加、および／または標的細胞を取り囲む培地中で、所定の時間に、Ｆｃ媒介性細胞傷害の機構により、所定の数の「標的細胞」の溶解を達成するために必要な本発明の二重特異性抗体の濃度の減少のいずれかとして定義される。Ｆｃ媒介性細胞傷害の増加は、本明細書に記載される方法により、変化したグリコシル化パターンを有するように（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、ＧｎＴＩＩＩ、または他のグリコシルトランスフェラーゼまたはＦＵＴ８破壊を発現するように）操作された宿主細胞により産生されていない以外は、同じ標準条件を使用して同じタイプの宿主細胞により産生された同じ本発明の二重特異性抗体により媒介される細胞傷害に対するものである。
【０２１２】
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、技術水準から公知の適切な方法で、本発明の抗体の重鎖および軽鎖を含む１つまたはそれを超えるベクターを指す。
【０２１３】
本明細書で使用される場合、「ＦＵＴ８遺伝子の標的破壊により操作された宿主細胞」は、本発明の抗体を発現することができる宿主細胞であって、加えて、例えば米国特許第８０６７２３２号、米国特許第７４２５４４６号、米国特許第６９４６２９２号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）およびＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  Ｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．；８７（２００４）６１４−６２２に記載されているようにＦＵＴ８遺伝子の標的破壊により糖操作されることができる宿主細胞を指す。このような宿主細胞において発現される本発明の抗体は、Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する還元末端を含むＦｃ領域に結合した複合Ｎ−グリコシド結合糖鎖を含むＦｃ領域を含み、前記糖鎖は、糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位に結合したフコースを含有しない。
【０２１４】
本発明はさらに、宿主細胞により産生される、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％または９０％〜１００％の非フコシル化を含むことを特徴とする本発明の二重特異性抗体の生産のための方法であって、前記宿主細胞において、本発明の二重特異性抗体をコードする核酸、およびグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、またはこのような核酸を含むベクターを発現させることを含む方法を対象とする。グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する遺伝子としては、（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）、ａ−マンノシダーゼＩＩ（Ｍａｎｌｌ）、（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）およびβ（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）が挙げられる。一実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する遺伝子の組み合わせが、宿主細胞において発現される（例えば、ＧｎＴＩＩＩおよびＭａｎＩＩ）。同様に、前記方法はまた、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊または別様に不活性化された宿主細胞（例えば、ａｌ−６コアフコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の活性がノックアウトされた宿主細胞）における、二重特異性抗体をコードする１つまたはそれを超えるポリヌクレオチドの発現を包含する。別の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、グリコシル化パターンを改変するためにＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに発現する宿主細胞において産生され得る。特定の実施形態では、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、ゴルジ内在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドである。別の好ましい実施形態では、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する宿主細胞における本発明の二重特異性抗体の発現は、増加したＦｃ受容体結合親和性および増加したエフェクター機能を有する二重特異性抗体をもたらす。
【０２１５】
本発明はさらに、宿主細胞により産生される、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％または９０％〜１００％の非フコシル化を含むことを特徴とする本発明の二重特異性抗体の生産のための方法であって、前記宿主細胞において、本発明の二重特異性抗体および破壊ＦＵＴ８遺伝子をコードする核酸を発現させることを含む方法を対象とする。
【０２１６】
一実施形態では、本発明の宿主細胞により産生される変化したグリコシル化を有する二重特異性抗体は、（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現による）宿主細胞の改変の結果として、増加したＦｃ受容体結合親和性および／または増加したエフェクター機能を示す。好ましくは、増加したＦｃ受容体結合親和性は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体などのＦｃγ活性化受容体への増加した結合である。
【０２１７】
一実施形態では、非フコシル化型オリゴ糖のパーセンテージは、５０％〜１００％、具体的には６０％〜１００％、７０％〜１００％、より具体的には８０％〜１００％である。非フコシル化型オリゴ糖は、ハイブリッドまたは複合体タイプのものであり得る。さらに別の実施形態では、本発明の方法により生産される二重特異性抗体は、本発明の方法によるそのオリゴ糖の改変の結果として、増加した割合のＦｃ領域中の二分岐型オリゴ糖を有する。一実施形態では、二分岐型オリゴ糖のパーセンテージは、５０％〜１００％、具体的には５０％、６０％〜７０％、より具体的には８０％である。特に好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞および方法により生産される二重特異性抗体は、増加した割合のＦｃ領域中の二分岐型非フコシル化型オリゴ糖を有する。二分岐型非フコシル化型オリゴ糖は、ハイブリッドまたは複合体のいずれかであり得る。
【０２１８】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の二重特異性抗体を生成するように操作され得る任意の種類の細胞系をカバーする。一実施形態では、宿主細胞は、改変糖型を有する抗原結合分子の生産を可能にするように操作される。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有する増加したレベルの１つまたはそれを超えるポリペプチドを発現するようにさらに操作されている。宿主細胞としては、培養細胞、例えば哺乳動物培養細胞、例えばＣＨＯ細胞（上記を参照のこと）、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞および植物細胞、さらにほんの数例を挙げると、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物または培養植物もしくは動物組織内に含まれる細胞が挙げられる。本発明の糖操作された二重特異性抗体の生産するための宿主細胞は、例えば、米国特許第６６０２６８４号、米国特許出願公開第２００４０２４１８１７号、米国特許出願公開第２００３０１７５８８４号および国際公開第２００４０６５５４０号に記載されている。あるいは、本発明の二重特異性抗体は、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、欧州特許出願公開第１１７６１９５号、国際公開第２００３０８４５７０号、国際公開第２００３０８５１１９号および米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００４／０９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／１３２１４０号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）に開示されている技術にしたがって、減少したＦｃ領域中のフコース残基を有するように糖操作され得る。本発明の糖操作された二重特異性抗体はまた、改変糖タンパク質、例えば国際公開第２００３／０５６９１４号、国際公開第２００４／０５７００２号および国際公開第２００４／０２４９２７号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）に記載されているものを産生する発現系において生産され得る。
【０２１９】
本発明のさらなる実施形態では、本発明の抗体は、一置換Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ、二置換Ｉ３３２ＥおよびＧ２３６Ａ、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ（「ＤＥ置換」）、Ｓ２３９ＤおよびＧ２３６Ａ、ならびに三置換Ｓ３２９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＧ２３６Ａ（「ＤＥＡ置換」）からなる群より選択される１つまたは２つまたは３つのＦｃ領域中のアミノ酸置換（「Ｆｃアミノ酸置換」）を含む；（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ＪＯら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．７（２００８）２５１７−２５２７）。重鎖のカウントが異なるので、これらのアミノ酸番号は、＋／−１、２または３アミノ酸異なり得るが、３つすべてについて同じシフトである。配列番号５の重鎖の場合、１つのアミノ酸シフトがあるので、Ｓ３２９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＧ２３６Ａは、Ｓ３２８ＤおよびＩ３３１ＥおよびＧ２３５Ａを表す。ＤＥ置換を有する配列番号５は配列番号２３に示されており、ＤＥＡ置換を有する配列番号５は配列番号２４に示されている。二重特異性抗体のＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ活性は、Ｆｃ部分のこのようなアミノ酸改変により増加され得る。
【０２２０】
本明細書で使用される場合、Ｆｃ置換の文脈における「親抗体、親二重特異性抗体」という用語は、Ｆｃ置換抗体と同じアミノ酸組成を含むが、前記置換を有しない本発明の二重特異性抗体を指す。このような比較のために、親抗体およびＦｃ置換抗体は、糖操作された抗体の場合と同様に、同じ条件下で同じ宿主細胞において生産されるが、第１の場合では、Ｆｃ置換を有しない宿主細胞において生産され、第２の場合では、このようなＦｃ置換を有する以外は同じ宿主細胞において生産される。有用な宿主細胞株は、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１である。
【０２２１】
本明細書で使用される場合、Ｆｃ置換を含む本発明の糖操作された二重特異性抗体の文脈における「親抗体、親二重特異性抗体」という用語、したがって、このような親抗体は、Ｆｃ置換抗体と同じアミノ酸組成を含むが、前記置換を有しない糖操作されていない各二重特異性抗体である。
【０２２２】
本発明のさらなる実施形態では、二重特異性抗体のＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ活性は、Ｆｃ部分の糖操作と組み合わせたＦｃ部分のアミノ酸置換により、各親抗体のＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ活性と比較して増加される。
【０２２３】
したがって、一実施形態では、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ４７に特異的に結合する二重特異性抗体であって、一置換Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ、二置換Ｉ３３２ＥおよびＧ２３６Ａ、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ、三置換Ｓ３２９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＧ２３６Ａからなる群より選択される１つまたは２つまたは３つのＦｃ領域中のアミノ酸置換（「Ｆｃアミノ酸置換」）を含み、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％または９０％〜１００％のＦｃ部分の非フコシル化を含むことを特徴とする二重特異性抗体を含む。
【０２２４】
実施例９は、ＡＤＣＣ活性およびさらにはＡＤＣＰ活性の決定に使用されるアッセイについて記載している。
【０２２５】
ＡＤＣＣは、以下のようにインビトロＡＤＣＣアッセイにより測定され得る：
１）アッセイは、二重特異性抗体のＣＥＡ結合領域により認識されるＣＥＡを発現することが公知の標的細胞を使用する；
２）アッセイは、エフェクター細胞として、ランダムに選択された健常ドナーの血液から単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用する；
３）アッセイは、以下のプロトコールにしたがって行われる：
ｉ）標準的な密度遠心分離手順を使用してＰＢＭＣを単離し、ＲＰＭＩ細胞培養培地に細胞６．２５×１０６個／ｍｌで懸濁する；
ｉｉ）標準的な組織培養方法により標的細胞を成長させ、９０％よりも高い生存率で対数増殖期から回収し、ＲＰＭＩ細胞培養培地で洗浄し、１×１０６個の細胞について１００マイクロキュリーの５１Ｃｒで標識し、細胞培養培地で２回洗浄し、細胞０．２５×１０６個／ｍｌの密度で細胞培養培地に再懸濁する；
ｉｉｉ）２０マイクロリットルの上記最終標的細胞懸濁液を９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移す；
ｉｖ）細胞培養培地で二重特異性抗体を４０００ｎｇ／ｍｌから０．１２ｎｇ／ｍｌに系列希釈し、２０マイクロリットルの得られた抗体溶液を９６ウェルマイクロタイタープレート中の標的細胞に追加し、上記全濃度範囲をカバーする様々な抗体濃度を３回反復で試験する；
ｖ）最大放出（ＭＲ）対照については、標識標的細胞を含有するプレート中の３つのさらなるウェルに、二重特異性抗体溶液（上記ポイントｉｖ）に代えて５０マイクロリットルの５％（Ｖ／Ｖ）非イオン性界面活性剤水溶液（Ｔｒｉｔｏｎ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を入れる；
ｖｉ）自然放出（ＳＲ）対照については、標識標的細胞を含有するプレート中の３つのさらなるウェルに、二重特異性抗体溶液（上記ポイントｉｖ）に代えて２０マイクロリットルのＲＰＭＩ細胞培養培地を入れる；
ｖｉｉ）次いで、９６ウェルマイクロタイタープレートを５０×ｇで１分間遠心分離し、４℃で１時間インキュベートする；
ｖｉｉｉ）４０マイクロリットルのＰＢＭＣ懸濁液（上記ポイントｉ）を各ウェルに追加して、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比を５０：１にし、プレートを５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃のインキュベーター中に４時間置く；
ｉｘ）各ウェルから無細胞上清を回収し、ガンマカウンターを使用して実験放出放射能（ＥＲ）を定量する；
ｘ）式（ＥＲ−ＭＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００（式中、ＥＲは、その抗体濃度について定量された平均放射能（上記ポイントｉｘを参照のこと）であり、ＭＲは、ＭＲ対照（上記ポイントｖを参照のこと）について定量された平均放射能（上記ポイントｉｘを参照のこと）であり、ＳＲは、ＳＲ対照（上記ポイントｖｉを参照のこと）について定量された平均放射能（上記ポイントｉｘを参照のこと）である）にしたがって、各二重特異性抗体濃度について、特異的溶解のパーセンテージを計算する。
【０２２６】
本明細書で使用される場合、「増加したＡＤＣＣ」は、上記二重特異性抗体試験濃度範囲内で観察された特異的溶解の最大パーセンテージの増加、および／または上記二重特異性抗体試験濃度範囲内で観察された特異的溶解の最大パーセンテージの半分を達成するために必要な二重特異性抗体の濃度（ＥＣ５０）の減少のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの増加は、ＧｎＴＩＩＩを過剰発現するように操作された宿主細胞により、またはＦＵＴ８遺伝子の標的破壊により操作された宿主細胞により産生されていない以外は、同じ標準的な生産、精製、製剤化および保存方法を使用して同じタイプの宿主細胞により産生された同じ二重特異性抗体（「親抗体」）により媒介された、上記アッセイを用いて測定されたＡＤＣＣに対するものである。Ｆｃ中のアミノ酸置換の場合、ＡＤＣＣの増加は、置換を保有しない親二重特異性抗体を用いて測定されたＡＤＣＣに対するものである。Ｆｃ部分中のアミノ酸置換を含む糖操作された二重特異性抗体の場合、ＡＤＣＣの増加は、置換を保有しない糖操作されていない親二重特異性抗体を用いて測定されたＡＤＣＣに対するものである。
【０２２７】
抗ＣＥＡ抗原結合分子を使用する治療用途および方法
本発明のＣＥＡＣＡＭｘＣＤ４７二重特異性抗体は、単剤療法において、または特にＣＥＡ−ＴＣＢもしくはＣＥＡ−ＴＣＢ１のようなＣＥＡｘＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体および／もしくはＰＤ−１軸アンタゴニストとの併用療法において、主に腫瘍細胞のマクロファージ媒介性食作用による固形腫瘍の処置のために最適化される。本発明の抗体およびＣＥＡｘＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体は、以下に記載されるように投与され得る。
【０２２８】
特定の実施形態では、疾患または固形腫瘍は、限定されないが、結腸直腸腫瘍、非小細胞肺腫瘍、胃腫瘍、膵臓腫瘍および乳房腫瘍の群を含む、ＣＥＡを発現またはさらには過剰発現する癌である。特定の実施形態では、腫瘍は結腸直腸腫瘍である。本明細書に記載されるすべての治療用途の使用方法、使用、組み合わせなどは、特にこれらの腫瘍／疾患の処置のための実施形態である。
【０２２９】
本発明者らは、本発明の抗体が、ＡＤＡの中和または有効性の喪失により、低いＡＤＡ形成能を示すかもしくはＡＤＡ形成能を示さず、または曝露の喪失を示すことを認識する。
【０２３０】
一実施形態では、本発明は、インビボで癌腫（癌、腫瘍、例えばヒト癌腫）、特にＣＥＡ発現腫瘍を処置する方法を提供する。この方法は、被験体に、本発明の二重特異性抗体を含有する医薬有効量の組成物を投与することを含む。「被験体」は、ヒト被験体、一実施形態では、癌／腫瘍／癌腫を患っている患者を意味する。
【０２３１】
様々な腫瘍実体、特に結腸直腸癌腫、膵臓腺癌、胃癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頸部癌腫、子宮癌および膀胱癌などでは、ＣＥＡ発現は一般に非常に高い。胃腸管における健常な正常腺上皮では、ＣＥＡは、細胞の頂端表面上において偏向パターンで主に発現される。この偏向発現パターンは、全身投与される抗ＣＥＡ単一特異性または二重特異性抗体によるアクセス可能性を制限するので、潜在的な毒性を制限する。本発明の抗体の低親和性ＣＤ４７結合と一緒に、これは、本発明の抗体によるこのような正常細胞の食作用の欠如または制限につながる。胃腸および他の悪性腫瘍の細胞では、この偏向発現パターンは喪失する。ＣＥＡは、癌細胞の細胞表面全体にわたって等しく発現されるが、これは、癌細胞が、正常健常細胞よりも本発明の抗体にはるかに良好にアクセス可能であり、本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体により、または上記組み合わせにより選択的に殺傷され得ることを意味する。
【０２３２】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、進行性固形腫瘍、一実施形態ではＣＥＡ発現腫瘍の処置のための単剤療法において使用され得る。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、同時、別個または逐次の組み合わせでＣＥＡｘＣＤ３  Ｍａｂと組み合わせて使用される。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、同時、別個または逐次の組み合わせでＣＥＡｘＣＤ３  Ｍａｂおよび／またはＰＤ−１軸アンタゴニストと組み合わせて使用される。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、同時、別個または逐次の組み合わせでＰＤ−１軸アンタゴニストと組み合わせて使用される。このようなＰＤ−１軸アンタゴニストは、例えば、国際公開第２０１７１１８６７５号に記載されている。このような組み合わせは、マクロファージおよびＴ細胞により固形癌を攻撃する。２つのＣＥＡｘＣＤ３  Ｍａｂが臨床開発中である（ＣＥＡ−ＴＣＢおよびＣＥＡ−ＴＣＢ１；ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖを参照のこと；ＮＣＴ３８６６２３９のＲＯ６９５８６８８およびＮＣＴ０３５３９４８４のＲＯ７１７２５０８）。ＭＥＤＩ−５６５は臨床開発中であったが、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖにおいて進行中の臨床試験を特定することができなかった。一実施形態では、ＣＥＡおよびＣＤ３に対する二重特異性抗体として、抗体ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１が使用される。
【０２３３】
ＣＥＡ−ＴＣＢで使用されるＣＥＡへのバインダーは、抗ＣＥＡ抗体ＰＲ１Ａ３に由来する（例えば、欧州特許第２６８１２４４号を参照のこと）。この抗体は、ＣＥＡのいわゆるＢ３ドメインに結合する。ＣＥＡ−ＴＣＢは、ＣＥＡに対する低いｎＭ結合親和性を有し、高用量で有効性を示す（用量および患者当たり４０〜６００ｍｇ；（例えば、Ｊ．Ｔａｂｅｒｎｅｒｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３５，２０１７（ｓｕｐｐｌ．Ａｂｓｔｒ．３００２）を参照のこと）。これらの用量では、細胞表面上のほぼすべてのＣＥＡ標的がＣＥＡ−ＴＣＢにより占有される。ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１とＣＥＡｘＣＤ４７との組み合わせは、同時に両薬物の治療血漿レベルを生成し、両薬物がＣＥＡ抗原に対して非競合的である場合には、最良の結果（相加的またはさらには相乗的）を達成する。
【０２３４】
本明細書で使用される場合、本発明の抗体と、ヒトＣＥＡおよびヒトＣＤ３εに結合する第２の二重特異性抗体との「組み合わせ、同時、別個または逐次の組み合わせ」という用語は、２つの抗体（または、本発明の抗体とＣＥＡｘＣＤ３  ＭａｂとＰＤ−１軸アンタゴニストとの組み合わせの場合には、３つの抗体）の別個または一緒のいずれかの任意の投与を指し、例えば別個、逐次、同時、併用、時間差または交互投与において併用療法の利益を得るために設計された適切な投与レジメンの一部として、２つまたは３つの抗体が投与される。したがって、２つまたは３つの抗体は、同じ医薬組成物の一部として、または別個の医薬組成物のいずれかで投与され得る。本発明の抗体は、第２の二重特異性抗体の投与の前に、それと同時にまたはその後にまたはそれらのいくつかの組み合わせで投与され得る。例えば、標準的な処置過程中に本発明の抗体が反復間隔で患者に投与される場合、第２の二重特異性抗体は、本発明の抗体の各投与の前に、それと同時にもしくはその後にもしくはそれらのいくつかの組み合わせで、または本発明の抗体による処置に関連して異なる間隔で、または本発明の抗体による処置過程の前に、その間の任意の時点にもしくはその後に単回投与で投与され得る。一実施形態では、本発明の抗体および第２の二重特異性抗体は、一実施形態では、本発明の抗体および第２の抗体の投与の間の６〜１５日間の間隔で交互投与で投与される。このような交互投与では、第１の用量は、本発明の抗体または第２の抗体であり得る。
【０２３５】
「ＰＤ−１軸アンタゴニスト」という用語は、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を指す。抗ＰＤ−１抗体は、例えば、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、ＭＫ−３４７５）、ニボルマブ、ピジリズマブ、ランブロリズマブ、ＭＥＤＩ−０６８０、ＰＤＲ００１およびＲＥＧＮ２８１０である。抗ＰＤ−１抗体は、例えば、５国際公開第２００８１５６７１号、国際公開第２０１３１７３２２３号、国際公開第２０１５０２６６３４号、米国特許第７５２１０５１号、米国特許第８００８４４９号、米国特許第８３５４５０９号、国際公開第２００９１１４３３５号、国際公開第２０１５０２６６３４号、国際公開第２００８１５６７１２号、国際公開第２０１５０２６６３４号、国際公開第２００３０９９１９６号、国際公開第２００９１０１６１１号、国際公開第２０１０／０２７４２３号、国際公開第２０１０／０２７８２７号、国際公開第２０１０／０２７８２８号、国際公開第２００８／１５６７１２号および国際公開第２００８／１５６７１２号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）に記載されている。
【０２３６】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、アテゾリズマブ、ＭＤＸ−１  １０５、デュルバルマブおよびアベルマブである。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、国際公開第２０１５０２６６３４号、国際公開第２０１３／０１９９０６号、国際公開第２０１００７７６３４号、米国特許第８３８３７９６号、国際公開第２０１００７７６３４号、国際公開第２００７００５８７４号および国際公開第２０１６００７２３５号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）に記載されている。
【０２３７】
本発明の抗体および第２の二重特異性抗体の併用投与に関して、両化合物は、１つの単一剤形で、または別個の剤形で、例えば２つの異なるもしくは同一の剤形で存在し得る。
【０２３８】
本発明の抗体および第２の抗体がＣＥＡＣＡＭ５に関して競合しない場合、一実施形態では、医師が所望する場合には、両抗体は同時投与され得る。本発明の抗体および第２の抗体がＣＥＡＣＡＭ５に関して競合する場合、一実施形態では、両抗体は交互投与で投与される。
【０２３９】
本発明の抗体は、典型的には、当技術分野で公知のように、患者が処置されている癌の（有効性および安全性の両方の観点から）最も有効な処置を提供する投与レジメンで患者に投与される。好ましくは、腫瘍細胞は、Ｔ細胞およびマクロファージにより同時に攻撃され、このアプローチの完全な治療可能性を達成するために、ＣＥＡ−ＣＤ３およびＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体は、細胞表面上のＣＥＡへの結合に関して非競合的でなければならない。
【０２４０】
上記のように、投与される抗体の量および本発明の抗体の投与のタイミングは、処置されている患者のタイプ（例えば、性別、年齢、体重）および症状、処置されている疾患または症状の重症度、ならびに投与経路に依存し得る。例えば、本発明の抗体および第２の抗体は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日／週の範囲の用量で、単回もしくは分割投与で、または連続注入により患者に投与され得る。一実施形態では、本発明の抗体および第２の抗体はそれぞれ、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で患者に投与される。いくつかの場合では、上記範囲の下限未満の投与量レベルが適切であり得るが、他の場合では、いかなる有害な副作用も引き起こさずにさらに高い用量が用いられ得る。
【０２４１】
本明細書で使用される場合、「抗体の半減期」という用語は、例えば、実施例１７に記載されているように、通常の薬物動態アッセイで測定された場合の前記抗体の半減期を指す。本発明の抗体と、ＣＥＡおよびＣＤ３に対する第２の二重特異性抗体とは、３〜１４日間の消失半減期を有する。
【０２４２】
別の態様では、本発明はまた、疾患、特にＣＥＡが発現される、特に同じ細胞タイプの正常組織と比較してＣＥＡが異常発現される（例えば、細胞表面上において異なるパターンで過剰発現または発現される）細胞増殖障害の処置における本発明の二重特異性抗体の使用を対象とする。このような障害としては、限定されないが、結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、胃癌、膵臓癌および乳癌が挙げられる。ＣＥＡ発現レベルは、当技術分野で公知の方法により（例えば、免疫組織化学アッセイ、免疫蛍光アッセイ、免疫酵素アッセイ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイなどを介して）決定され得る。
【０２４３】
一態様では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＥＡを発現するインビボまたはインビトロの細胞をターゲティングするために使用され得る。本発明の二重特異性抗体は、腫瘍細胞のＡＤＣＰおよびＡＤＣＣの誘導を介した腫瘍形成の予防、腫瘍の根絶および腫瘍成長または転移の阻害において特に有用である。本発明の二重特異性抗体は、ＣＥＡを発現する任意の腫瘍を処置するために使用され得る。本発明の二重特異性抗体で処置され得る特定の悪性腫瘍としては、限定されないが、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌および乳癌が挙げられる。
【０２４４】
本発明の二重特異性抗体は、薬学的に許容され得る剤形、例えばボーラスとして静脈内的に、または筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所もしくは吸入経路による一定期間にわたる連続注入によりヒトに投与され得るものを含む以下で議論されているもので、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。本発明の二重特異性抗体はまた、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内または病変周囲経路により適切に投与されて、局所的および全身的な治療効果を発揮する。
【０２４５】
疾患の処置について、本発明の二重特異性抗体の適切な投与量は、処置すべき疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、以前の治療、患者の病歴および抗体に対する反応、ならびに主治医の裁量に依存する。本発明の二重特異性抗体は、一度にまたは一連の処置にわたって患者に適切に投与される。本発明は、ＣＥＡを発現する腫瘍細胞を選択的に殺傷するための方法を提供する。
【０２４６】
前記方法は、本発明の二重特異性抗体と前記腫瘍細胞との相互作用を含む。これらの腫瘍細胞は、結腸直腸癌腫、非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）、胃癌腫、膵臓癌腫および乳癌腫を含むヒト癌腫に由来し得る。
【０２４７】
別の態様では、本発明は、異常なＣＥＡ発現に関する疾患を処置するための医薬の製造のための本発明の二重特異性抗体の使用を対象とする。特定の実施形態では、疾患は、限定されないが、結腸直腸腫瘍、非小細胞肺腫瘍、胃腫瘍、膵臓腫瘍および乳房腫瘍を含む、ＣＥＡを発現またはさらには過剰発現する癌である。特定の実施形態では、腫瘍は結腸直腸腫瘍である。
【０２４８】
組成物、製剤、投与量および投与経路
一態様では、本発明は、本発明の二重特異性抗体と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物を対象とする。本発明はさらに、癌などの疾患の処置の方法における、または癌などの疾患の処置のための医薬の製造におけるこのような医薬組成物の使用を対象とする。具体的には、本発明は、疾患の処置のための、より具体的には癌の処置のための方法であって、治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を対象とする。
【０２４９】
一態様では、本発明は、上記で定義されるように、ヒト癌腫、腫瘍を処置するための医薬組成物、組み合わせおよび方法を包含する。例えば、本発明は、ヒト癌腫の処置において使用するための医薬組成物であって、医薬有効量の本発明の抗体と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物を含む。
【０２５０】
本発明の二重特異性抗体組成物は、限定されないが、静脈内、腹腔内、経口、リンパ内または直接腫瘍内投与を含む従来の投与様式を使用して投与され得る。静脈内投与または皮下投与が好ましい。
【０２５１】
本発明の一態様では、本発明の二重特異性抗体を含有する治療製剤は、所望の純度を有する抗体を任意の薬学的に許容され得る担体、賦形剤または安定剤と混合することにより（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））、凍結乾燥製剤または液体製剤の形態で保存のために調製される。許容され得る担体、賦形剤または安定剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントに非毒性である。インビボ投与に使用すべき製剤は滅菌のものでなければならない。これは、滅菌濾過膜による濾過により容易に達成される。本発明の医薬組成物のための最も有効な投与様式および投与レジメンは、疾患の重症度および経過、患者の症状および処置に対する反応、ならびに処置医師の判断に依存する。したがって、組成物の投与量は、均一な用量であり得るか、または個々の患者、例えば体重に適合され得る。それにもかかわらず、本発明の組成物の有効用量は、一般に、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。
【０２５２】
本発明の二重特異性抗体は、１５０ｋＤ／モルの大きさの分子量を有する。一実施形態では、それらはＦｃ部分を保有する。患者における消失半減期は３〜１４日間の範囲内である。この半減期は、限定されないが、１日に１回、１週間に１回または２週間ごとに１回の投与を可能にする。
【０２５３】
本発明の二重特異性抗体およびそれらの各組成物は、限定されないが、液体溶液または懸濁液、錠剤、ピル、粉末、坐剤、ポリマーマイクロカプセルまたは微小胞、リポソームおよび注射液または注入液を含む様々な剤形であり得る。好ましい形態は、投与様式および治療用途に依存する。
【０２５４】
本発明の二重特異性抗体を含む組成物は、良好な医療行為と合う方法で製剤化、投薬および投与される。この文脈における考慮要因としては、処置されている特定の疾患または障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、疾患または障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医者に公知の他の要因が挙げられる。
【０２５５】
製品
本発明の別の態様では、上記障害の処置、予防および／または診断に有用な材料を含有する製品が提供される。製品は、容器と、容器の上のまたはそれに付随するラベルまたは添付文書とを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、輸液バッグなどが挙げられる。容器は、様々な材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成され得る。容器は、それ自体により、または別の組成物と組み合わせて症状を処置、予防および／もしくは診断するために有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有する輸液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の二重特異性抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択した症状を処置するために使用されることを示す。また、製品は、（ａ）組成物がその中に含まれる第１の容器であって、前記組成物が本発明の二重特異性抗体を含む第１の容器；および（ｂ）組成物がその中に含まれる第２の容器であって、前記組成物がさらなる細胞毒性剤または他の治療剤を含む第２の容器を含み得る。本発明のこの実施形態における製品は、組成物が特定の症状を処置するために使用され得ることを示す添付文書をさらに含み得る。あるいはまたは加えて、製品は、薬学的に許容され得るバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む第２の（または第３の）容器をさらに含み得る。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針およびシリンジを含む商業的および利用者的な観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【０２５６】
発明のさらなる実施形態
以下の実施形態では、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ４７に特異的に結合する二重特異性抗体が記載される。
【０２５７】
１．ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、二重特異性抗体。
【０２５８】
２．Ｆｃ領域が、糖操作されていない以外は同じ二重特異性抗体と比較して減少した数のフコース残基を有するように糖操作されていることを特徴とする、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
【０２５９】
３．前記第１の結合部分が、アミノ酸３５〜１４４のＣＥＡＣＡＭ５のＩｇ様Ｖタイプドメインに結合することを特徴とする、実施形態１または２に記載の二重特異性抗体。
【０２６０】
４．前記二重特異性抗体が、ＣＥＡＣＡＭ５への結合について抗体ＳＭ３Ｅと競合することを特徴とする、実施形態１〜３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２６１】
５．前記二重特異性抗体が、抗体ＳＭ３Ｅ、ＭＥＤＩ、ＬＡＢ、ＳＡＲ、Ｔ８６．６６、ＣＨ１Ａ１Ａと競合しないことを特徴とする、実施形態１〜３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２６２】
６．前記二重特異性抗体の食作用のＥＣ５０値が、同じ実験条件下および１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの存在下または１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧなしの場合における参照抗体Ｋ２ＡＣ２２のＥ５０値の０．１〜１０倍の範囲内であることを特徴とする、実施形態１〜５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２６３】
７．１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの存在下では、イメージングベースのアッセイで測定された食作用指数の最大が、同じ実験条件下におけるヒトＩｇＧなしの食作用と比較して３０％超減少しないことを特徴とする、実施形態１〜６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２６４】
８．前記第１の結合部分について一価であり、前記第２の結合部分について一価であることを特徴とする、実施形態１〜７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２６５】
９．前記第１および第２の結合部分がそれぞれ、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含むことを特徴とする、実施形態１〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２６６】
１０．ヒトＩｇＧ１タイプのものであることを特徴とする、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２６７】
１１．定常および可変フレームワーク領域配列がヒトまたはヒト起源のものであることを特徴とする、実施形態１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２６８】
１２．全長抗体であることを特徴とする、実施形態１〜１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２６９】
１３．ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分であって、カッパ軽鎖可変ドメインおよびラムダ軽鎖定常ドメインを含む第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分であって、カッパ軽鎖可変ドメインおよびカッパ軽鎖定常ドメインを含む第２の結合部分とを含むことを特徴とする、実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２７０】
１４．ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分であって、ラムダ軽鎖可変ドメインおよびラムダ軽鎖定常ドメインを含む第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分であって、カッパ軽鎖可変ドメインおよびカッパ軽鎖定常ドメインを含む第２の結合部分とを含むことを特徴とする、実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２７１】
１５．共通重鎖を含むことを特徴とする、実施形態１３または１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２７２】
１６．ａ）前記第１の結合部分が、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１３のヒトラムダタイプの軽鎖定常ドメインとを含み、前記第２の結合部分が、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号７のＣＤＲＬ１、配列番号８に含まれるＡｌａ  Ａｌａ  ＳｅｒのＣＤＲＬ２および配列番号９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、または
ｂ）前記第１の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１３のヒトラムダタイプの軽鎖定常ドメインとを含み、前記第２の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲとして配列番号２８のＣＤＲＬ１、配列番号２９のＣＤＲＬ２および配列番号３０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする、実施形態１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２７３】
１７．ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含むことを特徴とし、
ａ）前記第１の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号３１、３２および３３；配列番号３４、３５および３６、配列番号３７、３８および３９、配列番号４０、４１および４２、配列番号４３、４４および４５、配列番号４６、４７および４８、配列番号４９、５０および５１、配列番号５２、５３および５４、配列番号５５、５６および５７、配列番号５８、５９および６０、配列番号６１、６２および６３、ならびに配列番号１１２、１１３および１１４からなる群より選択されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の組み合わせを含む軽鎖可変領域とを含み、ならびに
ｂ）前記第２の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲとして配列番号７のＣＤＲＬ１、配列番号８に含まれるＡｌａ  Ａｌａ  ＳｅｒのＣＤＲＬ２および配列番号９のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、または
前記第２の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲとして配列番号２８のＣＤＲＬ１、配列番号２９のＣＤＲＬ２および配列番号３０のＣＤＲＬ３ならびに必要に応じて配列番号１３のヒトラムダタイプの軽鎖定常ドメインを含む軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする、実施形態１〜１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２７４】
１８．ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含むことを特徴とし、
ａ）前記第１の結合部分が、配列番号４の重鎖可変領域と、
配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４および配列番号１１５からなるＶＬＣＬ領域に含まれるＶＬの群より選択される軽鎖可変領域とを含み、ならびに
ｂ）前記第１の結合部分が、配列番号４の重鎖可変領域と、配列番号１０の軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする、実施形態１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２７５】
１９．ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含むことを特徴とし、
ａ）前記第１の結合部分が、配列番号５の重鎖と、
配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４および配列番号１１５からなる群より選択される軽鎖とを含み、ならびに
ｂ）前記第２の結合部分が、配列番号５の重鎖可変領域と、配列番号１１の軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする、実施形態１〜１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２７６】
２０．ヒトＩｇＧ１タイプの全長二重特異性抗体であり、前記第１の結合部分について一価であり、前記第２の結合部分について一価であり、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分であって、カッパ軽鎖可変ドメインおよびラムダ軽鎖定常ドメインを含む第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分であって、カッパ軽鎖可変ドメインおよびカッパ軽鎖定常ドメインを含む第２の結合部分とを含むか、またはヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分であって、ラムダ軽鎖可変ドメインおよびラムダ軽鎖定常ドメインを含む第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分であって、カッパ軽鎖可変ドメインおよびカッパ軽鎖定常ドメインを含む第２の結合部分とを含むことを特徴とする、実施形態１〜１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２７７】
２１．１００ｎＭ〜６００ｎＭ、好ましくは１００〜５００ｎＭの結合親和性でヒトＣＤ４７に結合することを特徴とする、実施形態１〜２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２７８】
２２．１〜２００ｎＭのＥＣ５０値でＭＫＮ−４５細胞に結合することを特徴とする、実施形態１〜２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２７９】
２３．１００ｎＭ〜５００ｎＭの結合親和性でヒトＣＤ４７に結合し、１〜２００ｎＭのＥＣ５０値でＭＫＮ−４５細胞に結合することを特徴とする、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２８０】
２４．ａ）前記二重特異性抗体による、ヒトマクロファージの存在下におけるＭＫＮ−４５細胞の食作用指数曲線のＥＣ５０が、２００ｎｇ／ｍｌ可溶性ＣＥＡの存在下では、可溶性ＣＥＡなしで測定されたＥＣ５０と比較して高い濃度の方向に４倍超シフトせず、および／もしくは前記食作用指数曲線の最大が、２００ｎｇ／ｍＬ可溶性ＣＥＡの追加により１０％もしくはそれを超えて、１５％もしくはそれを超えてもしくは２０％もしくはそれを超えて減少せず、ならびに／または
ｂ）ＭＫＮ−４５細胞への前記二重特異性抗体の結合曲線のＥＣ５０が、２００ｎｇ／ｍｌ可溶性ＣＥＡの存在下では、可溶性ＣＥＡなしで測定されたＥＣ５０と比較して高い濃度の方向に２倍超シフトしないことを特徴とする、実施形態１〜２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２８１】
２５．ヒト組換えＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６に結合し、組換えＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＥＡＣＡＭ６への結合のＥＣ５０値が３倍未満異なることを特徴とする、実施形態１〜２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２８２】
２６．ａ）前記第１の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲとして配列番号１１２のＣＤＲＬ１、配列番号１１３のＣＤＲＬ２および配列番号１１４のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含み、
ｂ）前記第２の結合部分が、ＣＤＲとして配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２および配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲとして配列番号２８のＣＤＲＬ１、配列番号２９のＣＤＲＬ２および配列番号３０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする、実施形態２５に記載の二重特異性抗体。
【０２８３】
２７．ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３εに特異的に結合する二重特異性抗体であって、重鎖として配列番号９７および９８の重鎖と、軽鎖として配列番号９６および９９の軽鎖とを含む３００ｎＭの濃度の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の前記結合曲線の前記ＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせないことを特徴とする、実施形態１〜２６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２８４】
２８．ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３εに特異的に結合する二重特異性抗体（さらにＣＥＡ−ＴＣＢ１とも称される）であって、重鎖および軽鎖として配列番号９２〜９５のアミノ酸配列の鎖を含む３０ｎＭの濃度の二重特異性抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への本発明の二重特異性抗体の前記結合曲線の前記ＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせないことを特徴とする、実施形態１〜２７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２８５】
２９．前記Ｆｃ領域が、各親二重特異性抗体と比較して減少した数のフコース残基を有するように糖操作されていることを特徴とする、実施形態１〜２８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２８６】
３０．前記Ｆｃ領域中のＮ結合型オリゴ糖の５０％〜１００％が非フコシル型であることを特徴とする、実施形態２９に記載の二重特異性抗体。
【０２８７】
３１．前記Ｆｃ領域中のＮ結合型オリゴ糖の５０％〜１００％が二分岐型であることを特徴とする、実施形態２９または３０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２８８】
３２．前記Ｆｃ領域中のＮ結合型オリゴ糖の８０％〜１００％が二分岐型および非フコシル化型であることを特徴とする、実施形態２９から３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２８９】
３３．前記抗体により誘導されたＡＤＣＣのＥＣ５０値および／もしくはＡＤＣＣ最大が１．２〜２．０倍もしくは少なくとも２．０倍増加しており、ならびに／または前記食作用指数曲線のＥＣ５０値が、前記各親二重特異性抗体により誘導されたＡＤＣＣの最大および／もしくはＥＣ５０値と比較して少なくとも１．２〜２．０倍もしくは少なくとも２．０倍減少していることを特徴とする、実施形態２９〜３２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２９０】
３４．前記抗体により誘導されてイメージングにより決定された食作用指数の最大が少なくとも３倍増加しており、ならびに／または前記食作用指数曲線のＥＣ５０値が、前記各親二重特異性抗体により誘導された前記食作用指数の最大またはＥＣ５０値と比較して少なくとも３倍または少なくとも５倍減少していることを特徴とする、実施形態２９〜３３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０２９１】
３５．実施形態２９〜３４および３０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の生産のための方法であって、
ａ）前記二重特異性抗体の生産を可能にする条件であって、前記二重特異性抗体の前記Ｆｃ領域上に存在するオリゴ糖の糖操作改変を可能にする条件下で、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を培養すること；および
ｂ）ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ４７に特異的に結合することができる前記糖操作された二重特異性抗体を単離すること
を含むことを特徴とする、方法。
【０２９２】
３６．実施形態２９〜３０および３３〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の生産のための方法であって、
ａ）前記本発明の糖操作された二重特異性抗体の生産を可能にする条件であって、前記二重特異性抗体の前記Ｆｃ領域上に存在するオリゴ糖の糖操作改変を可能にする条件下で、ＦＵＴ８遺伝子の標的破壊により糖操作された宿主細胞を培養すること、および
ｂ）ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ４７に特異的に結合することができる前記糖操作された二重特異性抗体を単離すること
を含むことを特徴とする、方法。
【０２９３】
３７．実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
【０２９４】
３８．実施形態３７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【０２９５】
３９．実施形態３８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【０２９６】
４０．実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と、薬学的に許容され得る担体とを含む、組成物。
【０２９７】
４１．腫瘍細胞の細胞溶解を誘導する方法であって、前記腫瘍細胞を、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と接触させることを含む、方法。
【０２９８】
４２．前記腫瘍細胞が、結腸直腸癌細胞、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）細胞、胃癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、またはヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現する別の腫瘍細胞であることを特徴とする、実施形態４１に記載の方法。
【０２９９】
４３．ＣＥＡを発現する癌を有する被験体を処置する方法であって、前記被験体に治療有効量の実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を投与することを含む、方法。
【０３００】
４４．ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の生存期間を増加させる方法であって、前記被験体に治療有効量の実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を投与することを含む、方法。
【０３０１】
４５．前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌または乳癌であることを特徴とする、実施形態４３または４４に記載の方法。
【０３０２】
４６．化学療法または放射線療法と組み合わせて、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をヒト被験体に投与することを特徴とする、実施形態４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【０３０３】
４７．ＣＥＡを発現する癌を有する被験体を処置するための医薬の製造において使用するための、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０３０４】
４８．前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌および乳癌からなる群より選択されることを特徴とする、実施形態４７に記載の使用のための二重特異性抗体。
【０３０５】
４９．ＣＥＡを発現する癌を有する被験体を処置する方法において使用するための、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、前記方法が、前記被験体に治療有効量の前記二重特異性抗体を投与することを含み、前記二重特異性抗体の食作用のＥＣ５０値が、同じ実験条件下ならびに１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの存在下および／または１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧなしの場合における、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含む参照抗体Ｋ２ＡＣ２２であって、前記第１の結合部分が、配列番号５の重鎖および配列番号６５の軽鎖を含み、前記第２の結合部分が、配列番号５の重鎖および配列番号１１の軽鎖を含む参照抗体Ｋ２ＡＣ２２のＥ５０値の０．１〜１０倍の範囲内であることを特徴とする、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０３０６】
５０．ＣＥＡを発現する癌を有するヒト被験体の処置において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分と、ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第４の結合部分とを含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、第１の二重特異性抗体。
【０３０７】
５１．前記第２の二重特異性抗体の前記第４の結合部分が、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３εのエピトープに結合することを特徴とする、実施形態５０に記載の使用のための第１の二重特異性抗体。
【０３０８】
５２．前記第２の抗体が、重鎖および軽鎖として配列番号９６〜９９の鎖を含むか、または重鎖および軽鎖として配列番号９２〜９５のアミノ酸配列の鎖を含み、３００ｎＭまたは３０ｎＭの濃度の前記第２の抗体が、ＭＫＮ−４５細胞への前記第１の二重特異性抗体の前記結合曲線の前記ＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせないことを特徴とする、実施形態５０または５１に記載の使用のための第１の二重特異性抗体。
【０３０９】
５３．ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の処置において、重鎖および軽鎖として配列番号９６〜９９の鎖を含むか、または重鎖および軽鎖として配列番号９２〜９５のアミノ酸配列の鎖を含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０３１０】
５４．重鎖および軽鎖として配列番号９６〜９９の鎖を含むか、または重鎖および軽鎖として配列番号９２〜９５のアミノ酸配列の鎖を含む第２の二重特異性抗体と競合しないことを特徴とし、ヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において、前記第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、実施形態１〜３４および５０〜５３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０３１１】
５５．ヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において、ａ）ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３εのエピトープに特異的に結合する第４の結合部分とを含むか、またはｂ）それぞれ重鎖および軽鎖として配列番号９６〜９９の鎖もしくは重鎖および軽鎖として配列番号９２〜９５のアミノ酸配列の鎖を含む第２の二重特異性抗体と、ヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、実施形態１〜３４および５０〜５３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、３００ｎＭ（配列番号９６〜９９）または３０ｎＭ（配列番号９２〜９５）の濃度の前記第２の二重特異性抗体が、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体のＭＫＮ−４５細胞の前記食作用指数曲線の前記ＥＣ５０をより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない、実施形態１〜３４および５０〜５３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０３１２】
５６．前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌および乳癌であることを特徴とする、実施形態５０〜５５のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体。
【０３１３】
５７．実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体および前記第２の二重特異性抗体が、６〜１５日間隔で前記被験体に交互にまたは同時に投与されることを特徴とする、実施形態５０〜５６のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体。
【０３１４】
５８．ヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において使用するための、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む組成物であって、ａ）ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３εのエピトープに特異的に結合する第４の結合部分とを含むか、またはｂ）重鎖および軽鎖として配列番号９６〜９９の鎖もしくは重鎖および軽鎖として配列番号９２〜９５のアミノ酸配列の鎖を含む第２の二重特異性抗体と交差反応しないことを特徴とする、組成物。
【０３１５】
５９．ヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌を有する被験体の処置において、ａ）ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分であって、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２１の軽鎖可変領域を含む第３の結合部分と、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３εのエピトープに特異的に結合する第４の結合部分とを含むか、またはｂ）重鎖および軽鎖として配列番号９６〜９９の鎖もしくは重鎖および軽鎖として配列番号９２〜９５のアミノ酸配列の鎖を含む第２の二重特異性抗体と同時に、別個にまたは逐次に組み合わせて使用するための、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む組成物であって、３００ｎＭまたは３０ｎＭ（配列番号９２〜９５）の濃度の前記第２の二重特異性抗体が、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体のＭＫＮ−４５細胞の前記食作用指数曲線の前記ＥＣ５０を一実施形態ではより高い濃度の方向に３倍超シフトさせない、組成物。
【０３１６】
６０．前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌および乳癌であることを特徴とする、実施形態５８または５９に記載の組成物。
【０３１７】
６１．ＣＥＡを発現する癌を有する被験体を処置する方法において使用するための、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、前記方法が、前記被験体に治療有効量の前記二重特異性抗体を投与することを含む、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０３１８】
６２．ＣＥＡを発現する癌を有する被験体の生存期間を増加させる方法において使用するための、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、前記方法が、前記被験体に治療有効量の前記二重特異性抗体を投与することを含む、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０３１９】
６３．前記二重特異性抗体が、化学療法または放射線療法と組み合わせてヒト被験体に投与されることを特徴とする、実施形態６１または６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【０３２０】
６４．前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌または乳癌であることを特徴とする、実施形態６０または６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【表１−１】
2021525544.tif 000003
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
2021525544.tif 000006
配列番号９２〜９５はＣＥＡ−ＴＣＢ１を指し、配列番号９６〜９９はＣＥＡ−ＴＣＢを指す。
Ａｌａ：アラニン；Ｓｅｒ：セリン
【実施例】
【０３２１】
実施例１  ヒトＣＤ４７のクローニング、発現および精製
クローニング
特定のオリゴヌクレオチドを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ヒトＣＤ４７（ｈＣＤ４７）の細胞外ドメインに対応する配列をヒトｃＤＮＡから増幅する。増幅産物をゲル精製し、ｐＥＡＫ８哺乳動物発現ベクター（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）にクローニングする。Ｃ末端にＡｖｉｔａｇ（商標）（Ａｖｉｄｉｔｙ，Ｄｅｎｖｅｒ  Ｃｏｌｏ．）およびヘキサヒスチジンタグを導入するようにベクターをさらに改変して、それぞれタンパク質の単一部位ビオチン化およびＩＭＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）による精製を可能にする。ＤＮＡシークエンシングにより、構築物を検証する。
【０３２２】
発現
次いで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などのリポソームベースのトランスフェクション試薬を使用して、プラスミドを哺乳動物細胞にトランスフェクトする。トランスフェクション工程は、ごく少量のＤＮＡおよび細胞、典型的には１ウェル当たり２×１０５個の細胞および２μｇのプラスミドＤＮＡを必要とし、トランスフェクションを６ウェルプレートで行う。異なる哺乳動物細胞株を使用し得るが、以下に示されている例では、形質転換ヒト胚腎臓単層上皮細胞（ＰＥＡＫ細胞）をトランスフェクトする。これらの細胞は、エピソーム複製プロセスをさらに支援するＥＢＮＡ−１遺伝子を安定発現し、半接着性であり、標準的な細胞培養条件（５％ＣＯ２；１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地中、３７℃）下で成長させ得る。２４時間後、０．５〜２μｇ／ｍＬピューロマイシンを含有する培地を追加することにより、細胞を選択的条件下に置く；エピソームベクターを有する細胞は、この抗生物質に対して耐性である。
【０３２３】
トランスフェクションの２〜３週間後、増幅および選択した細胞を生産工程用の使い捨てＣＥＬＬｉｎｅ（商標）バイオリアクターに注入した。ＣＥＬＬｉｎｅ（商標）は、標準的な細胞培養インキュベーターで使用され得る２コンパートメントバイオリアクターである。より小さな区画（１５ｍｌ）は細胞を含有し、１０ｋＤａのカットオフサイズを有する半透膜により、より大きな（１リットル）培地含有区画から分離される（Ｂｒｕｃｅら、２００２，ＭｃＤｏｎａｌｄら、２００５）。このシステムは、細胞および分泌タンパク質をより小さな区画に保持しながら、栄養素、ゲイズおよび代謝老廃物の拡散を可能にする。上清の回収前に、培養物を７〜１０日間維持する。培地は血清を含有するので、細胞は良好な生存率を維持し、同じ細胞および容器を使用して複数回の生産ランを行い得る。
【０３２４】
精製
回収後、遠心分離により、細胞培養上清を清澄化する。次いで、１００ｍＭイミダゾールを上清に補充し、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）にロードする。比較的高濃度のイミダゾールは、樹脂への汚染物質の結合を最小化する。カラムの洗浄後、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅクロマトグラフィーシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により３０ｍＬイミダゾール勾配（２０〜４００ｍＭイミダゾール）を使用して、２ｍＬ／分の流速でタンパク質を溶出させる。溶出勾配は組換えタンパク質の純度をさらに改善するが、クロマトグラフィーシステムが利用可能ではない場合には、段階的溶出アプローチにより置き換え得る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＥＬＩＳＡにより溶出画分を分析して、それらの組換えタンパク質含有量を決定し得る。目的の画分をプールし、リン酸緩衝生理食塩水または別の適切なバッファーで平衡化したＡｍｉｃｏｎ  １０ＫＤカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により脱塩する。次いで、様々な技術を使用して、脱塩したタンパク質を定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりそれらの純度を分析し得る。製造業者の指示にしたがってビオチンリガーゼ（Ａｖｉｄｉｔｙ，Ｄｅｎｖｅｒ  Ｃｏｌｏ．）を使用して、組換えＣＤ４７をインビトロでビオチン化する。脱塩後、ストレプトアビジン磁気ビーズを使用したプルダウンアッセイおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ビオチン化レベルを評価する。
【０３２５】
実施例２  ヒトＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーのクローニング、発現および精製
クローニング
ＣＥＡＣＡＭ５の完全細胞外ドメイン（ＥＣＤ）およびＡ３−Ｂ３ドメインに対応する配列は、ＥｕｒｏｆｉｎｓおよびＴｗｉｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより合成された。これらの合成遺伝子をｐＥＡＫ８哺乳動物発現ベクター（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）にサブクローニングした。Ｃ末端にＡｖｉｔａｇ（商標）（Ａｖｉｄｉｔｙ，Ｄｅｎｖｅｒ  Ｃｏｌｏ．）およびヘキサヒスチジンタグ、ヒトＦＣ領域またはマウスＦＣ領域のいずれかを導入するようにベクターを改変した。ＤＮＡシークエンシングにより、構築物を検証した。ＩＭＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）、ＦｃＸＬまたはＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＧ−Ｆｃ（ｍｓ）アフィニティーマトリックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、組換え可溶性タンパク質の精製を行った。
【０３２６】
ＰＥＡＫおよび／またはＣＨＯ細胞の細胞表面における発現のために、ヒトＣＥＡＣＡＭ  １、３、４、５、６、７、８、１８、１９、２０、２１およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５の全長バージョンをコードするベクターも生成した。同様に、可溶性全長ヒトＣＥＡＣＡＭ１６もクローニングした。
【０３２７】
発現および精製
実施例１に詳述されているように、上記組換えタンパク質の発現、精製およびビオチン化を行った。
【０３２８】
実施例３  固定可変重ドメインを含有するヒトｓｃＦｖライブラリーを使用したＣＥＡＣＡＭ５  Ｆｖのファージディスプレイ選択
Ｍ１３バクテリオファージ上にディスプレイされるヒトｓｃＦｖライブラリーの構築および取り扱いに関する一般的な手順は、Ｖａｕｇｈａｎら、（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９６，１４：３０９−３１４）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。選択およびスクリーニングのためのライブラリーは、すべてが同じＶＨドメインを共有するｓｃＦｖであって、ＶＬドメインのみが多様化されたｓｃＦｖをコードする。固定ＶＨライブラリーの生成のための方法、ならびに二重特異性抗体の同定およびアセンブリのためのそれらの使用は、米国特許出願公開第２０１２／０１８４７１６号および国際公開第２０１２／０２３０５３号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ヒトＣＥＣＡＭ５に結合するｓｃＦｖを同定する手順を以下に記載する。
【０３２９】
タンパク質選択
ロータリーミキサー上で、ｓｃＦｖファージライブラリーのアリコート（１０１２Ｐｆｕ）を、３％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含有するＰＢＳで室温で１時間ブロッキングする。ロータリーミキサー上で、ブロッキングしたファージを、ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ−２８０）で室温で１時間選択除外する。ロータリーミキサー上で、選択除外したファージを、ストレプトアビジン磁性ビーズに捕捉された１００ｎＭのビオチン化ヒトＣＥＡＣＡＭ５またはＡ３−Ｂ３ドメインのいずれかと共に室温で２時間インキュベートする。磁気スタンドを使用してビーズを捕捉し、続いて、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で５回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄する。ロータリーミキサー上で、ファージを、１００ｎＭ  ＴＥＡで室温で３０分間溶出させる。溶出させたファージおよびビーズをＴｒｉｓ−ＨＣｌ  １Ｍ  ｐＨ７．４で中和し、１０ｍｌの対数増殖期ＴＧ１細胞に直接追加し、ゆっくりと振盪しながら（９０ｒｐｍ）３７℃で１時間インキュベートする。感染ＴＧ１のアリコートを系列希釈して、選択アウトプットを力価測定する。残りの感染ＴＧ１を３８００ｒｐｍで１０分間スピンし、２ｍｌの２ｘＴＹに再懸濁し、２ｘＴＹＡＧ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含有する２ｘＴＹ培地）寒天バイオアッセイプレートに塗る。３０℃における一晩のインキュベーション後、１０ｍｌの２ｘＴＹをプレートに追加し、細胞を表面から擦り取り、５０ｍｌポリプロピレンチューブに移す。５０％グリセロール溶液を細胞懸濁液に追加して、１７％グリセロールの最終濃度を得る。選択ラウンドのアリコートを−８０℃に保持する。
【０３３０】
ファージレスキュー
先の選択ラウンドから得られた５０μｌの細胞懸濁液を５０ｍｌの２ｘＴＹＡＧに追加し、０．３〜０．５のＯＤ６００に達するまで、撹拌（２４０ｒｐｍ）しながら３７℃で成長させる。次いで、１．２×１０１１個のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを培養物に超感染させ、３７℃（９０ｒｐｍ）で１時間インキュベートする。細胞を３８００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、培地を除去し、ペレットを５０ｍｌの２ｘＴＹＡＫ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２ｘＴＹ培地；５０μｇ／ｍｌカナマイシン）に再懸濁することにより、培地を交換する。次いで、培養物を３０℃（２４０ｒｐｍ）で一晩成長させる。翌日、ファージ含有上清を次の選択ラウンドに使用する。
【０３３１】
細胞表面選択
ロータリーミキサー上で、ファージ含有上清を、３％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含有するＰＢＳで室温で１時間ブロッキングする。次いで、ヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現しないＭＫＮ４５  ＣＥＡＣＡＭ５ＫＯで、ブロッキングしたファージを１時間選択除外する。選択除外したファージを、（ＰＢＳ３％ＢＳＡ０．１％ＮａＮ３でブロッキングした）ＣＥＡＣＡＭ５を発現する２×１０７個のＭＫＮ４５細胞と共に穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュベートする。細胞をペレット化し、ＰＢＳで６回洗浄する。結合したファージを７６ｍＭクエン酸で溶出させ、１０分間振盪する。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １Ｍ  ｐＨ８による中和後、細胞を１０ｍｌの対数増殖期ＴＧ１に直接追加し、ゆっくりと振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。感染ＴＧ１のアリコートを系列希釈して、選択アウトプットを力価測定する。感染ＴＧ１を３８００ｒｐｍで１０分間スピンし、２ｍｌの２ｘＴＹ培地に再懸濁し、２ｘＴＹＡＧ寒天バイオアッセイプレートに塗る。３０℃における一晩のインキュベーション後、１０ｍｌの２ｘＴＹをプレートに追加し、細胞を表面から擦り取り、５０ｍｌポリプロピレンチューブに移す。５０％グリセロール溶液を細胞懸濁液に追加して、１７％グリセロールの最終濃度を得る。選択ラウンドのアリコートを−８０℃に保持する。
【０３３２】
実施例４  可溶性ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６およびＣＥＡＣＡＭ１へのｓｃＦｖ結合／非結合のスクリーニング
結合および機能試験のためのｓｃＦｖペリプラズム調製
個々のクローンを、０．９ｍｌ／ウェルの２ｘＴＹＡＧ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１％グルコースを含有する２ｘＴＹ培地）を含有するディープウェルマイクロタイタープレートに接種し、３７℃で５〜６時間成長させる（２４０ｒｐｍ）。次いで、１００μｌ／ウェルの２ｘＴＹ培地中０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを追加して、０．０２ｍＭ  ＩＰＴＧの最終濃度を得る。プレートを２４０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩インキュベートする。ディープウェルプレートを３２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を慎重に除去する。ペレットを１５０μｌのＴＥＳバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、２０％スクロース、完全プロテアーゼ阻害剤，Ｒｏｃｈｅで補完）に再懸濁する。１５０μｌの希釈ＴＥＳバッファー（１：５のＴＥＳ：水希釈）を追加し、氷上で３０分間インキュベートすることにより、低張ショックを生じさせる。プレートを４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、細胞および残屑をペレット化する。上清を別のマイクロタイタープレートに慎重に移し、機能アッセイまたは結合アッセイで直ぐに試験するために氷上に保持する。
【０３３３】
結合
ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）技術を使用して均一アッセイで、ＣＥＡＣＡＭ５への結合に関するｓｃＦｖのスクリーニングを試験する。３８４クリアボトムウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェル中で、以下の試薬を混合する：対照タンパク質については、ビオチン化ＣＥＡＣＡＭ５、ビオチン化ドメインＡ３−Ｂ３またはビオチン化ＮｕｓＡのいずれかでコーティングした３０μｌのストレプトアビジンポリスチレンビーズ懸濁液（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ；ビーズ３０００個／ウェル）；６０μｌのブロッキングしたｓｃＦｖペリプラズム調製物；１０μｌの検出バッファー（５μｇ／ｍｌのマウス抗ｃ−ｍｙｃ抗体；１：２００希釈した抗マウスＦｃ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７を含有するＰＢＳ）。６００ｒｐｍで５分間混合した後、３８４ウェルプレートを室温でインキュベートし、２時間後、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）ＣＸ５ハイコンテントスクリーニングプラットフォーム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により読み取る。さらなる分析またはシークエンシングのために、ＮｕｓＡではなくＣＥＡＣＡＭ５の特異的シグナルを与えるｓｃＦｖを発現するクローンを選択する。
【０３３４】
ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６および他のＣＥＡＣＡＭへの結合を同じ方法で測定し得る。
【０３３５】
ファージクローンシークエンシング
単一クローンを、１ｍｌ／ウェルのＬＢＡＧ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含むＬＢ培地）を含有する９６ディープウェルマイクロタイタープレートに接種し、２４０ｒｐｍ、３７℃で一晩成長させる。Ｚｙｐｐｙ−９６  Ｐｌａｍｉｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＤＮＡを抽出し、シークエンシングする。
【０３３６】
実施例５  ＩｇＧへの固定ＶＨ候補の再フォーマットおよび哺乳動物細胞における一過性発現
スクリーニングおよびシークエンシングの後、所望の結合特性を有するｓｃＦｖ候補をＩｇＧに再フォーマットし、ＰＥＡＫ細胞への一過性トランスフェクションにより発現させる。選択したｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ配列を特定のオリゴヌクレオチドで増幅し、重鎖および軽鎖定常領域を含有する発現ベクターにクローニングし、シークエンシングにより構造物を検証する。製造業者の指示にしたがってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、発現ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトする。簡潔に言えば、Ｔ７５フラスコ中で、３．５×１０６個のＰＥＡＫ細胞を、ウシ胎仔血清を含有する２５ｍｌの培養培地中で培養する。トランスフェクト細胞を３７℃で５〜６日間培養し、ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６機器によりＩｇＧ産生を定量する。製造業者の指示にしたがってＦｃＸＬアフィニティー樹脂（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、ＩｇＧ精製のために上清を回収する。簡潔に言えば、トランスフェクト細胞由来の上清を適切な量のＦｃＸＬ樹脂と共に４℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳによる樹脂洗浄の後、サンプルをＡｍｉｃｏｎ  Ｐｒｏカラムにロードし、続いて、ＩｇＧを５０ｍＭグリシンｐＨ３．５で溶出させる。次いで、ヒスチジンＮａＣｌ  ｐＨ６．０バッファーに対してＡｍｉｃｏｎ  ５０ｋＤａにより、溶出ＩｇＧ画分を透析し、２８０ｎｍの吸収によりＩｇＧ含有量を定量する。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ製造業者（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）が純度およびＩｇＧ完全性を検証する。
【０３３７】
実施例６  ＣＥＡＣＡＭ５抗体の特性評価
ａ）ＣＥＡＣＡＭファミリーの異なるメンバーでトランスフェクトした細胞へのＣＥＡＣＡＭ５抗体の結合
本発明者らの知識によれば、ＣＥＡＣＡＭファミリーの異なるメンバーでトランスフェクトしたＰＥＡＫおよび／またはＣＨＯ細胞を使用してフローサイトメトリーにより、ＣＥＡＣＡＭ５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性を示し得る。ヒトＣＥＡＣＡＭ１、３、４、５、６、７、８、１８、１９、２０および２１および２０の全長バージョンをコードするベクターを使用して、実施例２に記載されているように、ＰＥＡＫおよび／またはＣＨＯ細胞の表面においてこれらのタンパク質を発現させる。非トランスフェクトＰＥＡＫおよび／またはＣＨＯ細胞を陰性対照として使用する。細胞を回収し、カウントし、生存率についてチェックし、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ２％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）に細胞３×１０６個／ｍｌで再懸濁する。１００μｌの細胞懸濁液をＶ底９６ウェルプレートに分配する（細胞３×１０５個／ウェル）。１３００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離することにより上清を除去し、細胞を、漸増濃度の本発明の抗体と共に４℃で１５分間インキュベートする。抗体をＦＡＣＳバッファーで希釈し、濃度範囲は３０ｐＭ〜５００ｎＭである。細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＥ（Ｒ−フィコエリトリン）コンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ二次抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、ＦＡＣＳバッファーで１：１００プレ希釈）と共に４℃でさらに１５分間再インキュベートする。細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１：１５００希釈ＴＯＰＲＯ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む３００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁する。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、蛍光を測定する。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアを使用して、用量反応結合曲線をフィッティングする。同じ方法で、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６および他のＣＥＡＣＡＭを特性評価し得る。簡潔に言えば、精製Ｍａｂを、１０μｇ／ｍｌの最終濃度でＣＥＡＣＡＭファミリータンパク質の１つを発現する細胞と共に３０分間インキュベートする。２回の洗浄後、Ｃｙ−５コンジュゲート抗ヒトＦｃ二次抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、結合抗体を検出する。
【０３３８】
ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ二次抗体により結合抗体が検出されない場合、本発明の抗体は、前記ＣＥＡＣＡＭに結合しないことが分かる。
【０３３９】
ｂ）カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５とのＣＥＡＣＡＭ５抗体の交差反応性
本発明者らの知識によれば、全長カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５を発現するベクターでトランスフェクトしたＰＥＡＫ  ＣＨＯ細胞を使用してフローサイトメトリーにより、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５と交差反応する本発明のＣＥＡＣＡＭ５モノクローナル抗体の能力を試験し得る。フローサイトメトリーは、前記抗体がｃｙｎｏＣＥＡＣＡＭ５を発現するＰＥＡＫ  ＣＨＯ細胞に結合するか、または前記抗体がＰＥＡＫ  ＣＨＯ細胞に結合せず前記ＣＥＡＣＡＭにも結合しないかを検出することを可能にする。
【０３４０】
実施例７  ラムダおよびカッパ軽鎖を保有する二重特異性抗体の発現および精製
同じ細胞内における１つの重鎖および２つの軽鎖の同時発現は、３つの異なる抗体のアセンブリにつながり得る。共発現させるべき鎖の１つを発現する複数のベクターのトランスフェクション、または複数の遺伝子発現を駆動するベクターの使用などの異なる方法で、同時発現を達成し得る。異なる抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体をコードするベクターを、同じ共通重鎖を担持する抗ＣＤ４７抗体である抗ＣＤ４７抗体Ｋａ３（これは、米国特許出願公開第２０１４／０３０３３５４号に記載されている）の重鎖および軽鎖（配列番号５および１１）を発現する別のベクターと共にコトランスフェクトする。あるいは、２つの軽鎖を、米国特許出願公開第２０１２／０１８４７１６号および国際公開第２０１２／０２３０５３号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように１つの重鎖、１つのカッパ軽鎖および１つのラムダ軽鎖の共発現を可能にするように以前に生成されたベクターｐＮｏｖｉ  κＨλにクローニングする。ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｈＣＭＶ）により３つの遺伝子の発現を駆動し、ベクターはまた、安定細胞株の選択および樹立を可能にするグルタミンシンテターゼ遺伝子（ＧＳ）を含有する。哺乳動物細胞における一過性発現のために、抗ＣＥＡＣＡＭ５  ＩｇＧおよび抗ＣＤ４７  ＩｇＧの共通ＶＨおよびＶＬ遺伝子をベクターｐＮｏｖｉ  κＨλにクローニングする。適切な細胞数および（ウシ胎仔血清を含有する）培養培地量を含む適切なフラスコ中で、Ｐｅａｋ細胞を培養する。製造業者の指示にしたがってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００）を使用して、プラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクトする。産生中に、ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６を使用して、トランスフェクト細胞の上清中の抗体濃度を測定する。抗体濃度に応じて、トランスフェクションの５〜７日後に上清を回収し、１３００ｇで１０分間遠心分離することにより清澄化する。精製プロセスは、３つのアフィニティー工程から構成される。最初に、ＦｃＸＬアフィニティーマトリックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳで洗浄し、次いで、清澄化上清に追加する。＋４℃における一晩のインキュベーション後、上清を２０００ｇで１０分間遠心分離し、フロースルーを保存し、樹脂をＰＢＳで２回洗浄する。次いで、樹脂をＡｍｉｃｏｎ  Ｐｒｏカラムに移し、ｐＨ３．０の５０ｍＭグリシンを含有する溶液を溶出に使用する。いくつかの溶出画分を生成し、プールし、５０ｋＤａ  Ａｍｉｃｏｎ（商標）超遠心フィルタユニット（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＰＢＳに対して脱塩する。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．）を使用して、上清由来の全ヒトＩｇＧを含有する溶出産物を定量し、適切な量のカッパセレクトアフィニティーマトリックス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に室温および２０ｒｐｍで１５分間インキュベートする。インキュベーション、樹脂回収、溶出および脱塩工程を前記のように実施する。２回の先の精製と同じプロセスを適用してラムダＦａｂセレクトアフィニティーマトリックス（ＧＥ  ���ｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、最後のアフィニティー精製工程を実施する。Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して、最終産物を定量する。変性および還元条件で電気泳動により、精製二重特異性抗体を分析する。製造業者（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）により記載されているように、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ８０キットと共にＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用する。４μＬの精製サンプルを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を補充したサンプルバッファーと混合する。サンプルを９５℃で５分間加熱し、次いで、チップにロードする。Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ試験（ＬＡＬ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）を使用して、エンドトキシン汚染について、すべてのサンプルを試験する。
【０３４１】
実施例８：一価および二重特異性抗体の特性評価
ａ）二重ターゲティング二重特異性抗体は、同じ細胞の表面上の２つの異なる抗原に結合する。
本発明者らの知識によれば、細胞表面上の２つの抗原への２つの抗体アームの同時結合（共係合と称される）は、アビディティ機構による親和性の相加的または相乗的な増加をもたらし得る。その結果として、共係合は、１つの単一抗原のみを発現する細胞と比較して、両抗原を発現する細胞に対する高い選択性を付与する。加えて、それらの各標的への二重特異性抗体の２つのアームの親和性を、標的細胞への結合が抗体アームの１つにより主に駆動される方法で設定し得る。例えば、高い親和性でＣＥＡＣＡＭ５にまたはＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６に結合する第１のアームと、低い（しかし、ＣＤ４７とのＣＥＡＣＡＭ５またはＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６共係合によりＣＤ４７／ＳＩＲＰαを阻害するために十分な）親和性でＣＤ４７に結合する第２のアームとから構成される二重ターゲティングκλ抗体は、正常細胞と対比して癌細胞におけるＣＤ４７の優先的阻害を可能にするはずである。
【０３４２】
ｂ）ヒトＣＤ４７への親和性測定
本発明者らの知識によれば、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器を使用して表面プラズモン共鳴技術により、ヒトＣＤ４７への本発明の抗体の結合親和性を評価し得る。ビオチン化ヒトＣＤ４７可溶性組換えタンパク質を、ストレプトアビジンコーティングセンサーチップ（Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＳＡ）上に捕捉させ得る。次いで、一連の濃度の試験抗体を表面に注入し、各注入の間に表面の再生を行い得る。
【０３４３】
ＣＤ１９ｘＣＤ４７κλ二重特異性抗体を用いて、このような測定を実施した。反復決定で測定した結合親和性は４００〜５００ｎＭであった。この抗体のＣＤ４７結合アームは、本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体のＣＤ４７結合アームと同じものである。本発明者らの知識によれば、本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体を用いて実施した同じ実験は、このような実験の標準偏差内で同様の結果を提供する。
【０３４４】
ｃ）標的腫瘍細胞の表面上のＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ４７の共係合を示す一価および二重特異性抗体のＳＩＲＰα遮断活性
本発明者らの知識によれば、標的細胞の表面上の（ＣＥＡＣＡＭ５のような）ＴＡＡおよびＣＤ４７の共係合の証拠を提供し得る別の一連の実験を実施し得、これは、ＣＤ４７ｘＣＥＡＣＡＭ５κλ抗体によるＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用の中和がＣＥＡＣＡＭ５依存性であることを示す実験である。このような実験では、ＣＤ４７−ＳＩＲＰα阻害アッセイにおいて、ＣＤ４７ｘＣＥＡＣＡＭ５κλボディおよび対応する一価抗体の活性を試験し得る。図６は、対応する一価の抗ＣＤ４７抗体と比較した、本発明の二重特異性抗体と同じＣＤ４７結合アームを含有するＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体（ＴＡＡはＣＥＡではない）を用いた結果を示す。
【０３４５】
ｄ）ＣＤ４７抗体のＳＩＲＰα遮断活性
本発明の二重特異性抗体について示されているＳＩＲＰα阻害効力データの測定のための実験設定（結果については、表２を参照のこと）。
【０３４６】
可溶性ＳＩＲＰαと、ＭＫＮ４５の表面において発現されるヒトＣＤ４７との相互作用をモニタリングする結合ＳＩＲＰα細胞ベースのアッセイの検出を遮断活性の検出に使用する。本発明の二重特異性抗体を用いた用量反応実験は、ＩＣ５０値の決定を可能にする。
【０３４７】
ＣＤ４７およびＣＥＡＣＡＭ５の両方を発現するＭＫＮ４５癌細胞をＣＦＳＥバイオレットで染色して、イメージングシステム（ＣＸ５）による細胞の検出を可能にする。簡潔に言えば、１ウェル当たり３’０００個の染色ＭＫＮ４５細胞を３８４オプティカルウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種し、漸増濃度の本発明の二重特異性抗体（１．９ｐＭ〜３３３ｎＭ、４回反復）と共に５０分間インキュベートする。次いで、抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ  ＡＦ６４７結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  １：２０００希釈）と予混合した一定濃度のＳＩＲＰα−マウスＦｃを最終５０ｎｇ／ｍＬで追加する。３Ｈ３０のインキュベーション後、イメージングシステム（ＣＸ５，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いてプレートを取得し、検出された結合ＳＩＲＰαにより放出された蛍光シグナルを、前記イメージングシステム専用のソフトウェアにより記録する。試験した用量範囲にしたがって蛍光シグナルをプロットし、ソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ，Ｇｒａｐｈｐａｄ）によりＩＣ５０を計算する。
【０３４８】
表２は、０．２２ｎＭ〜７ｎＭの範囲のＩＣ５０を示す、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合の阻害におけるいくつかのＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体の効力を示す。
【０３４９】
ｅ）参照抗体との競合によるＣＥＡＣＡＭ５抗体のエピトープビニング
エピトープビニングは、本発明の抗体の結合、例えば第１の結合部分の関連抗ＣＥＡ（標的タンパク質）抗体の結合を特性評価するために使用される競合イムノアッセイである。標的タンパク質に結合する抗体の競合遮断プロファイルを、この標的タンパク質にも結合する抗体であって、結合エピトープが既に確立／公開されている抗体に対して作成する。これらの参照抗体の１つとの競合は、抗体が同じまたは近い位置のエピトープを有し、それらが一緒に「ビニング」されることを示す。ＣＥＡＣＡＭ５参照抗体と競合するＣＥＡＣＡＭ５  ｍＡｂ（これは、本発明の二重特異性抗体の一部である）の能力を、マウスＦｃ領域を保有する以下の参照抗体を用いて組換えヒトＣＥＡＣＡＭ５に対するＥＬＩＳＡにより試験する：ＳＭ３Ｅ（米国特許出願公開第２００５０１４７６１４号に記載されているＳＭ３Ｅ由来のｍＡｂの配列、標準的な方法を使用して生産されたｍＡｂ）；ＭＥＤＩ（国際公開第２０１６０３６６７８号に記載されているＭＥＤＩ−５６５由来のｍＡｂ）；ＳＡＲ（欧州特許出願公開第３１９９５５２号に記載されているＭａｂ２＿ＶＬｇ５ＶＨｇ２由来のｍＡｂ）；ＣＨ１Ａ１Ａ（米国特許出願公開第２０１２０２５１５２９号およびＫｌｅｉｎら、ｉｎ  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１７  Ｊａｎ  １１；６（３）に記載されているＣＨ１Ａ１Ａ−２Ｆ１由来のｍＡｂ）；ヒト化Ｔ８４．６６（国際公開第２０１７０５５３８９号に記載されている変異体１由来のｍＡｂ）；ＬＡＢ（米国特許出願公開第２００２／０１６５３６０号に記載されているｈＭＮ１４由来のｍＡｂ）。ＳＭ３Ｅは、例えば、ＣＥＡのＮ末端細胞膜遠位部分により結合し、ＭＥＤＩは中央部分に結合し、ＣＨ１Ａ１Ａは膜の近くに結合する。
【０３５０】
ビオチン化ヒトＣＥＡＣＡＭ５をストレプトアビジンコーティング９６ウェルプレートに０．５μｇ／ｍｌでコーティングし、１０μｇ／ｍｌの参照ｍＡｂまたはマウスＦｃ領域を保有する無関係なｍＡｂと共に１時間インキュベートする。（各ＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体としてではなく二価モノクローナル抗ＣＥＡ抗体として）ＣＥＡＣＡＭ５  ｍＡｂを０．２μｇ／ｍｌで室温で１時間追加する。プレートを洗浄し、結合したＣＥＡＣＡＭ５  ｍＡｂを抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出する。洗浄後、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬を用いて、プレートを明らかにする。Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）により、蛍光シグナルを測定する。
【０３５１】
結果は表２に示されている。ビン１は、ＣＥＡＣＡＭ５への結合について、各抗体がＳＭ３Ｅと競合することを意味する。ビン２は、各抗体が上記ツール抗体のいずれとも競合しないことを意味する。表２に掲載されているすべてのＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体について、各抗ＣＥＡ二価モノクローナル抗体を用いて、競合実験を実施した。ＣＥＡＣＡＭ５へのこのようなモノクローナル抗体の結合が、各ツール抗体により８０％またはそれを超えて減少された場合、ＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体は、ツール抗体と競合的に結合すると分類されると結論付けた。ツール抗体の追加ありおよびなしの結果を比較した場合に、ＣＥＡＣＡＭ５への各抗ＣＥＡ二価ｍＡｂの結合が２０％またはそれ未満減少した場合、ＣＥＡｘＣＤ４７抗体は、ツール抗体と非競合的であると同定される。
【０３５２】
ビン１：Ｋ２ＡＣ１３、Ｋ２ＡＣ１８、Ｋ２ＡＣ２３、Ｋ２ＡＣ２７、Ｋ２ＡＣ２９
ビン２：Ｋ２ＡＣ１０、Ｋ２ＡＣ２５、Ｋ２ＡＣ２８  Ｋ２ＡＣ２６
本発明の二重特異性抗体に関するビン特性評価、ＣＥＡへの結合のＥＣ５０値、ＳＩＲＰα阻害効力およびＥＣ５０ならびに最大食作用指数の結果は表２、３および４に示されている。
【表２】
2021525544.tif 000007
【表３】
2021525544.tif 000008
【表４】
2021525544.tif 000009
【表５】
2021525544.tif 000010
【０３５３】
ｆ）ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＥＡＣＡＭ６への抗ＣＥＡ抗体の結合
ビオチン化組換えヒトＣＥＡＣＡＭ５またはＣＥＡＣＡＭ６タンパク質を、ストレプトアビジンコーティング９６ウェルマイクロプレートに０．５μｇ／ｍＬで捕捉させる。プレートを洗浄し、本発明のモノクローナル抗ＣＥＡ二価抗体を広い濃度範囲（例えば、５×１０−４〜１μｇ／ｍＬ）として追加し、１時間インキュベートする。プレートを洗浄し、結合した抗体を抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出する。洗浄後、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、プレートを明らかにする。Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）により、蛍光シグナルを測定する。
【０３５４】
モノクローナル抗体ＡＣ３９について得られた結果は表５に含まれている；この抗体は、平衡するＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６への結合を示すが、これは、ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６への結合のＥＣ５０が同様である（平衡する、抗体のＣＥＡＣＡＭ６結合に対するＣＥＡＣＡＭ５結合のＥＣ５０の比の範囲が０．３３〜３である）ことを意味する。この範囲外の比を有する抗体は、平衡していないと考えられる。
【０３５５】
実施例９：二重特異性抗体により媒介されるＡＤＣＣおよびＡＤＣＰ
ａ）ＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体により媒介されるＡＤＣＰおよびＡＤＣＣはＴＡＡ依存性である
ＣＤ４７およびＴＡＡに共係合する二重ターゲティングＴＡＡｘＣＤ４７κλ抗体の能力は、ＴＡＡ陰性細胞と比較してＴＡＡ陽性細胞への結合の親和性の有意な増加およびＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用のＴＡＡ依存的中和をもたらす。そして、これは、ＣＥＡｘＣＤ４７κλ抗体により媒介される効率的および選択的な癌細胞殺傷につながり得る。
【０３５６】
図３Ａに示されているＡＤＣＰ実験（フローサイトメトリーベースのアッセイ）から実証された結果は、二重特異性ＴＡＡｘＣＤ４７抗体のＡＤＣＰが、対応する一価ＴＡＡおよび一価ＣＤ４７抗体と比較して高いことを実証している。図４は、４つの二重特異性ＴＡＡｘＣＤ４７抗体（ＴＡＡはメソセリンＭＳＬＮである）のＡＤＣＣ（Ｃｒ５１ベースのアッセイ）が、高親和性抗ＴＡＡモノクローナル抗体アマツキシマブ（ＴＡＡはＭＳＬＮである）と比較して高いことを示している（ＭＳＬＮを保有する肺癌ＮＣＩ−Ｈ２２６腫瘍細胞を使用する。
【０３５７】
ｂ）ＴＡＡｘＣＤ４７抗体を用いて測定したＣｒ５１＋放出アッセイ
１０ｎｇ／ｍＬの組換えｈＩＬ−２を補充したＲＰＭＩ／１０％熱不活化ＦＣＳを用いて、健常ＰＢＭＣを  ３７℃で一晩活性化した。翌日、標的細胞（すなわち、ＴＡＡを発現する癌細胞）を１００μＣｉのＣｒ５１（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、３７℃、１時間）と共にインキュベートした。洗浄後、細胞を試験抗体でオプソニン化した（３０分間、３７℃）。次いで、Ｃｒ５１ロード癌細胞をＰＢＭＣ細胞と混合して、エフェクター（ＰＢＭＣ）および標的細胞（ＴＡＡ発現細胞）間で８０：１または５０：１の最終比を得た。細胞混合物を３７℃で４時間インキュベートしてから、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を（シンチラントでコーティングした）ＬｕｍａＰｌａｔｅに移し、γカウンターでカウントした。陰性対照（自然Ｃｒ５１放出）は、エフェクター細胞の非存在下で培地と共にインキュベートしたＣｒ５１ロード標的細胞から構成されていた。総溶解対照は、５μＬの細胞溶解溶液（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）と共にインキュベートしたＣｒ５１ロード標的細胞から構成されていた。非特異的溶解対照（ベースライン）は、Ａｂなしでエフェクター細胞と共にインキュベートしたＣｒ５１ロード標的細胞から構成されていた。以下の式：％特異的ＡＤＣＣ＝（（１分当たりのサンプル数（ｃｐｍ）−非特異的溶解対照ｃｐｍ）／（総溶解対照ｃｐｍ−陰性対照ｃｐｍ））×１００％を使用して、ＡＤＣＣパーセンテージを計算した。
【０３５８】
図５は、ｗｔ  ＩｇＧ１  Ｆｃバージョンと、本発明のＣＥＡｘＣＤ４７抗体と同じＣＤ４７アームを保有するＣＤ４７ｘＴＡＡ二重特異性抗体（ＣＥＡではなくＴＡＡ）のさらなるＤＥＡ突然変異Ｆｃバージョンとの間の比較実験のＡＤＣＣ（Ｃｒ５１ベースのアッセイ）の結果を示す。高親和性抗ＴＡＡ二価ｍＡｂの結果も示されている。最も高いＡＤＣＣは、ＤＥＡ突然変異を有するＩｇＧ１  Ｆｃを保有するＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体であり、続いて、ＩｇＧ１  Ｆｃを有するＣＥＡｘＣＤ４７  ｂｉＡｂ、およびｗｔ  ＩｇＧ１  Ｆｃを有する二価ｍＡｂである。
【０３５９】
ｃ）ＬＤＨ放出アッセイにより測定したＡＤＣＣ
以下のアッセイにおいて、ＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体のＡＤＣＣを試験した。
【０３６０】
１０ｎｇ／ｍＬの組換えｈＩＬ−２を補充したＲＰＭＩ／１０％熱不活化ＦＣＳを用いて、健常ＰＢＭＣを３７℃で一晩活性化した。翌日、標的細胞（例えば、ＭＫＮ４５癌細胞）を異なる濃度の試験抗体でオプソニン化する。細胞培養インキュベーターにおいて、丸底プレート中で、ＰＢＭＣおよびオプソニン化標的細胞を５０／１のエフェクター／標的比で３７℃で６時間コインキュベートする。このインキュベーション後、上清をオプティカル平底プレートに移し、Ｒｏｃｈｅの市販キットを用いてマイクロプレートリーダーでＯＤを測定することにより、ＬＤＨ放出を定量する。以下の式：
【数１】
2021525544.tif 000011
を用いて、特異的溶解の％を計算する。
【０３６１】
図１３は、本発明の二重特異性抗体とそれらの糖操作形態および抗体５Ｆ９との間の比較実験の結果を示す。図１４は、１ｍｇ／ｍｌヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）の存在下における、本発明の二重特異性抗体とそれらの糖操作形態および抗体５Ｆ９との間の比較実験の結果を示す。
【０３６２】
ｄ）ＡＤＣＰアッセイ
２つの方法を使用する。ＦＡＣＳベースの方法では、（少なくとも１つの腫瘍細胞を貪食したマクロファージのパーセンテージを表す）食作用のパーセンテージを決定する。図３Ａは、ＣＥＡｘＣＤ４７抗体でも使用したＣＤ４７結合アームを保有するＴＡＡｘＣＤ４７抗体について、このＦＡＣＳベースのアッセイを用いて得られた結果を示す。ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ  ＣＸ５ハイコンテントスクリーニングプラットフォームを使用したイメージングベースの方法では、１００個のマクロファージにより貪食された標的細胞の平均数として定義される食作用指数を決定する。図３Ｂは、ＣＥＡｘＣＤ４７抗体のＣＤ４７結合アームを保有するＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体（ＣＥＡではなくＴＡＡ）を用いて得られた結果を示す。図１２、１５、１６、１７、１８、２０Ｂおよび２１Ｂは、本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体を用いて得られた結果を示す。図１５は、本発明の二重特異性抗体とそれらの糖操作形態および抗ＣＤ４７抗体５Ｆ９との間の比較実験の結果を示す。図１６は、患者に通常存在する１ｍｇ／ｍｌヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）の存在下における、本発明の二重特異性抗体とそれらの糖操作形態および抗体５Ｆ９との間の比較実験の結果を示す。図１７は、１ｍｇ／ｍｌヒト免疫グロブリン（１ｍｇ／ｍＬまたはそれよりもさらに高いｈｕＩｇＧが患者に存在する）の存在下または非存在下における本発明の二重特異性抗体の間の比較実験の結果を示す。図１８は、３０ｎＭのＣＥＡ−ＴＣＢ１または３００ｎＭのＣＥＡ−ＴＣＢの存在下または非存在下におけるＫ２ＡＣ２２の濃度／食作用指数曲線を示す。
【０３６３】
ｅ）食作用アッセイ：１．ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ  ＣＸ５ハイコンテントスクリーニングプラットフォームをベースとするイメージングアッセイおよび２．フローサイトメトリーベースのアッセイ
マクロファージの調製：フィコール勾配により、バフィーコートからヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離する。２０ｎｇ／ｍＬのヒトマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）の存在下、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％熱不活化胎児子牛血清［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー、２５ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン（すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）および５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でＰＢＭＣを７日間培養することにより、マクロファージを生成する。続いて、細胞培養培地を交換することにより分化段階（＋１日目）で非接着細胞を排除し、細胞解離バッファー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、マクロファージに相当する接着細胞を分離し、サイトメトリーベースのＡＤＣＰ実験の場合には、使用日（８日目または９日目）に完全培地で洗浄する。細胞イメージングベースのＡＤＣＰの場合には、６日目に、細胞解離バッファーを使用してマクロファージを分離し、９６オプティカルプレート（ｃｏｓｔａｒ）に３０’０００個／ウェルで播種する。
【０３６４】
１．ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）ベースのアッセイ
マイクロプレートウェルに付着した（カルセインレッドオレンジで染色した）マクロファージを、異なる濃度の試験抗体の存在下で、カルセインＡＭ標識標的腫瘍細胞と共に１：３のエフェクター：標的細胞比で３７℃で２．５時間コインキュベートする。インキュベーション期間の終了時に、上清を完全培養培地に交換し、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）ＣＸ５ハイコンテントスクリーニングプラットフォームを用いてマイクロプレートをイメージングする。１ウェル当たり１５００個のマクロファージを取得および分析する。食作用は、二重陽性事象（マクロファージ＋標的腫瘍細胞）として証明され、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）製造業者のソフトウェアにより食作用指数を計算する。
【０３６５】
図１２、１５、１６、１７、１８、２０Ｂおよび２１Ｂのすべての結果ならびに表３および４に示されているＥＣ５０および最大食作用指数値は、ＣＥＡを発現するＭＫＮ−４５細胞と、１：３のエフェクター細胞対標的／腫瘍細胞比とを用いて得られたものである。図３Ｂにおけるデータは、ＴＡＡ（これはＣＥＡではない）を保有するＮＣＩ−Ｎ８７細胞と、１：１のエフェクター対標的／腫瘍細胞比とを用いて得られたものである。マクロファージ当たりの提供される腫瘍細胞が多いほど、予想される食作用指数が高いが、これがおそらく、ＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体（ＣＥＡではなくＴＡＡ）について図３Ｂに示されている食作用指数およびさらにはバックグラウンドシグナルが、本発明の二重特異性抗体の結果を実証する他の図と比較して全体的に低い主な理由である。
【０３６６】
本発明におけるすべてのＡＤＣＰ（食作用）値、範囲などは、特に明示的な記述がない場合には、イメージングベースのアッセイに基づくものである（図３Ａにおけるデータは、フローベースのアッセイを用いて得られたものである）。
【０３６７】
２．フローサイトメトリーベースのＡＤＣＰアッセイ
本発明者らの知識によれば、以下に記載されている方法によっても、ＡＤＣＰを測定し得る：マクロファージを、異なる濃度の試験抗体の存在下で、ＣＳＦＥ標識標的腫瘍細胞（例えば、ＭＫＮ−４５、ＬＳ１７４ＴまたはＨＰＡＣ腫瘍細胞）と共に例えば３：１のエフェクター：標的細胞比で３７℃で２．５時間コインキュベートする。インキュベーション期間の終了時に、ビオチン化抗ヒトＣＤ１４抗体およびＳｔｒｅｐ−Ｃｙ５を追加して、マクロファージを標識する。次いで、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析に供する。食作用は、二重陽性事象ＣＤ１４＋およびＣＦＳＥ＋により証明される。ＣＤ１４＋／ＣＳＦＥ＋二重陽性事象と総標的細胞との間の比に１００を乗じたものとして、食作用のパーセンテージを表す。図３Ａにおけるデータは、ＴＡＡ（これはＣＥＡではない）を保有するＨＰＡＣ細胞と、１：１のエフェクター対標的／腫瘍細胞比とを用いて得られたものである。フローサイトメトリーベースのアッセイを使用した。図３Ｂにおけるデータは、ＴＡＡ（これはＣＥＡではない）を保有するＮＣＩ−Ｎ８７細胞と、１：１のエフェクター対標的／腫瘍細胞比とを用いて得られたものである。イメージングベースのアッセイを使用した。
【０３６８】
実施例１０：ＭＮＫ−４５細胞へのＣＥＡｘＣＤ４７およびＣＥＡｘＣＤ３の結合；ＣＥＡｘＣＤ３との結合の競合
ａ）例えば、ＣＥＡ発現ヒト胃腺癌細胞（ＭＫＮ−４５、ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ４０９）でＣＤ４７ｘＣＥＡＣＡＭ５二重特異性抗体の結合を試験する。
細胞を回収し、カウントし、生存率についてチェックし、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ２％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）に細胞３×１０６個／ｍｌで再懸濁する。１００μｌの細胞懸濁液をＶ底９６ウェルプレートに分配する（細胞３×１０５個／ウェル）。１３００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離することにより、上清を除去する。次いで、漸増濃度の本発明の抗体をウェルに追加し、４℃で１５分間インキュベートする。細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＥ（Ｒ−フィコエリトリン）コンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ二次抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、ＦＡＣＳバッファーで１：１００プレ希釈）と共に４℃でさらに１５分間再インキュベートする。細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１：１５０００希釈ＳｙｔｏｘＢｌｕｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む３００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁する。Ｃｙｔｏｆｌｅｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、蛍光を測定する。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアを使用して、結合曲線およびＥＣ５０値を取得および計算する。同じ方法で、ＭＫＮ−４５細胞へのＭＡＢ  ＣＥＡまたはＭＡＢ  ＣＥＡ１の結合を試験し得る。図１１は、ＭＫＮ−４５細胞へのいくつかのＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体の結合曲線を示す。
【０３６９】
ｂ）ＣＥＡｘＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体の追加による、ＣＥＡ陽性腫瘍細胞株（ＭＫＮ−４５）へのＣＥＡｘＣＤ４７抗体の結合曲線のシフト。
本発明のＣＤ４７ｘＣＥＡＣＡＭ５二重特異性抗体と、ＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１のようなＣＥＡｘＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体との競合実験に関する本発明者らの知識によれば、ＭＫＮ−４５細胞へのＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７の結合を、ＣＥＡｘＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体の追加の有無以外は上記のように決定して、本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体の組み合わせパートナーとしてのＣＥＡｘＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体が、ＣＥＡへの結合について競合的であるか否かを研究し得る。
【０３７０】
実施例１１：フコシル化およびアフコシル化Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２二重特異性抗体の生産および精製
フコシル化およびアフコシル化Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２二重特異性抗体の生産。
【０３７１】
ＣＨＯプール（１つはＫ２ＡＣ５のためのものであり、１つはＫ２ＡＣ２２のためのものである）を、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｒｌｅｎデバイスに細胞０．３×１０６個／ｍＬの生細胞濃度で接種し、それぞれフコシル化およびアフコシル化抗体の生産について作業容量は７００ｍＬまたは１００ｍＬである。ＣＤＡＣＦ培地ＣＤＣＨＯおよび適合供給レジームを使用して、１５日間フェドバッチモードですべてのプールを操作する。アフコシル化抗体の生産については、Ｒｉｌｌａｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２  Ｊｕｌ；８（７）：６６１−８により記載されているアフコシル化戦略に基づいて、および欧州特許出願公開第２２８２７７３号に基づいて、０、５、８および１１日目にフェドバッチプロセス中に、２００μＭフコース阻害剤（１，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース）のボーラスを追加する。１５日間のフェドバッチ培養後に、フコシル化またはアフコシル化抗体を含有するＫ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２プール上清の回収を実施する。Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ（登録商標）Ｌａｂ  Ｖ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＣＨＯプール上清の回収物を清澄化する（供給業者の指示を参照のこと）。
【０３７２】
フコシル化およびアフコシル化Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２二重特異性抗体の精製
フコシル化およびアフコシル化Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２二重特異性抗体の精製は、３段階アフィニティー精製プロセスである。適切な容量のアフィニティーマトリックスを有するカラムを使用するために、精製の開始前に、ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６を使用して、Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２プールの上清中の抗体濃度を測定する。フコシル化またはアフコシル化二重特異性抗体を含有する各清澄化ＣＨＯプール上清を、事前調整なしでＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＭＳＳ）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードして、細胞培養汚染物質の大部分を除去する。次いで、低ｐＨホールドによりＭＳＳ溶出液を処理してウイルスを不活化し、Ｔｒｉｓ  １Ｍ  ｐＨ９を用いてｐＨ６で中和する。次いで、ＭＳＳ溶出液をＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（ＬＦＳ）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードして、単一特異性κ（モノκ）を除去する。次いで、ＬＦＳ溶出液をｐＨ６でｐＨ調整する。ＬＦＳをＣａｐｔｏ  Ｌ（ＣＬ）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードして、単一特異性λ（モノλ）を除去する。保存前に、ＣＬ溶出液をｐＨ調整する。次いで、最終材料を濃縮し、最終製剤バッファーにダイアフィルトレーションし、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用してその濃度を調整する。フコシル化およびアフコシル化Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２二重特異性抗体を等分し、送達まで−８０℃で保存する。製造業者（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）により記載されているようにＰｒｏｔｅｉｎ  ８０キットを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて変性および還元条件における電気泳動により、大きさについて精製二重特異性抗体を分析する。ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＵＰＬＣ）により、凝集レベルを評価する。Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ電気泳動システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して等電点電気泳動技術（ＩＥＦ）により、精製二重特異性抗体の電荷変異体分析を実行する。ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ  Ｔｏｕｃｈ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によりスループットマイクロチップ−ＣＥ法を使用して、フコシル化およびアフコシル化Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２抗体のＮ結合複合体二分岐糖型の相対分布を決定する。Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ試験（ＬＡＬ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ）を使用して、エンドトキシン汚染についてすべての抗体を試験する。糖操作Ｋ２ＡＣ５は７９．６８％のアフコシル化を示し、糖操作Ｋ２ＡＣ２２は８９．１３％のアフコシル化を示す。
【０３７３】
これらのアフコシル化ＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体を使用して、図１３、１４、１５および１６に示されている結果を得た。
【０３７４】
実施例１２：ＦＵＴ８（−）細胞株における発現および精製
あるいは、本発明者らの知識によれば、以下の方法にしたがっても、本発明のアフコシル化二重特異性抗体を生産し得る。
【０３７５】
材料および方法は、Ｎａｏｋｏ  Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．；８７（２００４）６１４−６２２にしたがう。
【０３７６】
チャイニーズハムスターＦＵＴ８  ｃＤＮＡの単離
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＣＨＯ／ＤＧ４４細胞から全ＲＮＡを単離し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してオリゴｄＴで逆転写する。マウスＦＵＴ８  ｃＤＮＡ（Ｈａｙａｓｈｉ，２０００；ＤＮＡ  Ｓｅｑ  １１：９１−９６）から設計されたプライマー
【化１】
2021525544.tif 000012
を使用してＰＣＲにより、一本鎖ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞ｃＤＮＡからチャイニーズハムスターＦＵＴ８  ｃＤＮＡを増幅する。
【０３７７】
ＦＵＴ８遺伝子座のターゲティング構築物
２つの置換ベクターｐＫＯＦＵＴ８ＮｅｏおよびｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを使用して、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的破壊を行う。ターゲティング構築物を確立するために、プローブとしてチャイニーズハムスターＦＵＴ８  ｃＤＮＡを用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞Ｅゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）をスクリーニングすることにより、第１のコードエクソンを含むＦＵＴ８遺伝子の９．０ｋｂ断片を単離する。翻訳開始部位を含有する２３４ｂｐのセグメントを、ｌｏｘＰ部位に隣接するそれぞれプラスミド  ｐＫＯＳｅｌｅｃｔＮｅｏまたはｐＫＯＳｅｌｅｃｔＰｕｒｏ（Ｌｅｘｉｃｏｎ，ＴＸ）由来のネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ）カセットまたはピューロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏｒ）カセットで置換する。プラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＤＴ（Ｌｅｘｉｃｏｎ）のジフテリア毒素遺伝子（ＤＴ）カセットを５Ｖ相同領域に挿入する。得られたターゲティング構築物ｐＫＯＦＵＴ８ＮｅｏおよびｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏは、１．５ｋｂの５Ｖ相同配列および５．３ｋｂの３Ｖ相同配列を含んでいた。トランスフェクション前に、ユニークなＳａｌＩ部位でターゲティング構築物を線状化する。
【０３７８】
相同組換え体のトランスフェクションおよびスクリーニング
Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（登録商標）ＩＩを使用して、３５０Ｖおよび２５０ＡＦで４Ａｇの線状化ｐＫＯＦＵＴ８ＮｅｏをサブコンフルエントＣＨＯ／ＤＧ４４細胞（１．６  １０６）にエレクトロポレーションする。エレクトロポレーション後、６００Ａｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、トランスフェクタントを選択する。以下のプライマー：
【化２】
2021525544.tif 000013
を使用して、以前に報告されている改変マイクロ抽出法（Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉｓら、１９９２；Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０１：３３１−３３５．）により、９６ウェルプレートでゲノムＰＣＲを実施する。
【０３７９】
ゲノムＰＣＲを使用して得られた１．７ｋｂ断片により相同組換え体を同定し、以下のプライマー：
【化３】
2021525544.tif 000014
を用いて増幅した２２１ｂｐ断片を使用してサザンブロット分析により確認する。
【０３８０】
ヘミ接合性クローンを、前記のように、線状化ｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを使用した第２ラウンドの相同組換えと、１５Ａｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）による薬物選択とに供する。Ｃｒｅ−リコンビナーゼ発現ベクターｐＢＳ１８５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、同定したホモ接合性破壊体にエレクトロポレーションして、両ＦＵＴ８対立遺伝子由来の薬物耐性遺伝子カセットを除去する。
【０３８１】
ＦＵＴ８（−）細胞によるモノクローナル抗体の産生
本発明の二重特異性抗体をコードする発現ベクターをＦＵＴ８（−）細胞株にエレクトロポレーションし、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠く培地で選択する。Ｅｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）３０１培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）中で、コンフルエントなトランスフェクタントを１週間培養する。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、培養上清から抗体を精製する。さらなる精製工程は、陰イオン／陽イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および特に上記カッパまたはラムダ選択樹脂を使用した精製であり得る。
【０３８２】
実施例１３：二重特異性抗体のインビボ抗腫瘍活性
本発明者らの知識によれば、異種移植モデルにおいて、例えば以下のモデルにより、本発明の二重特異性抗体の抗腫瘍活性を評価し得る：１または２×１０６個のＣＥＡ陽性腫瘍細胞、例えばＭＫＮ−４５またはＬＳ１７４Ｔ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下移植する。腫瘍体積を週３回測定する。腫瘍移植片が約０．１ｃｍ３に達した後、マウスをグループ（例えば、マウス４〜６匹／群）にランダムに分け、抗体処置を開始する。この実験は、例えば、本発明の二重特異性抗体および陽性対照Ｍａｂの効果を比較し得、例えば、．実験の終了（ｄ２５）までＣＤ４７  Ｍａｂ  Ｂ６Ｈ１２．２抗体を例えば毎週静脈内注射する。例えば、５０〜１２００μｇ／マウス／注射で抗体を投与する。
【０３８３】
適切なモデルにおいて、本発明の二重特異性抗体とＣＥＡｘＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせを試験し得る。本発明の抗体とＭＡＢ  ＣＥＡ、ＭＡＢ  ＣＥＡ１またはＣＥＡ−ＴＣＢ  ＣＥＡ−ＴＣＢ１との組み合わせを試験し得るモデルは、例えば、Ｂａｃａｃら、（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２２（１３）；３２８６−９７；２０１６）に記載されており、特に、ＣＥＡＣＡＭ５ｘＣＤ４７とＣＥＡ−ＴＣＢまたはＣＥＡ−ＴＣＢ１との組み合わせ研究にも使用される。
【０３８４】
実施例１４：健常ヒトドナーヒト血液由来の全血およびＰＢＭＣで試験したサイトカイン放出
本発明者らの知識によれば、水中提示で試験抗体（９５％ｖ／ｖ血液）による最小希釈で全血（ＷＢ  ＣＲＡ）を使用して、インビトロサイトカイン放出アッセイを実施し得る。このアッセイフォーマットは、サイトカイン放出の機構に影響を与え得る生理学的濃度の因子を含有するインビボ環境をより厳密に模倣すると考えられる。しかしながら、このフォーマットは、Ｔ細胞媒介性サイトカイン放出（例えば、抗ＣＤ２８）を予測するのに不十分であると考えられる。
【０３８５】
また、Ｔ細胞媒介性サイトカイン放出（ＰＢＭＣ  ＳＰ  ＣＲＡ）を評価するために固定化ｍＡｂ（固相、ＳＰ）提示を用いて、健常ヒトドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して、アッセイを実施し得る。このアッセイフォーマットは、インビボで起こり得るｍＡｂの架橋および高密度提示をシミュレートする（例えば、抗体のＦｃ部分と他の免疫細胞上のＦｃγ受容体との相互作用を介した標的のクラスタ化または抗薬物抗体によるｍＡｂの架橋）。このフォーマットは、Ｔ細胞媒介性サイトカイン放出を予測する。
【０３８６】
ＣＤ４７ｘＣＥＡ二重特異性抗体のようなＴＡＡｘＣＤ４７抗体と並行して、各アッセイフォーマットの陰性対照および特定の陽性対照を試験し得る。図７ＡおよびＢを参照のこと。
【０３８７】
実施例１５：赤血球への抗体結合、赤血球の食作用、ならびに血小板活性化および凝集
全血結合
本発明者らの知識によれば、健常ドナーから収集したヒト全血サンプルを含むクエン酸塩を、３μｇ／ｍＬの本発明のＡＦ４８８結合ＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体、Ｂ６Ｈ１２．２またはアイソタイプ対照および表面染色抗体（ＰＥ−Ｃｙ７抗ｈＣＤ４５およびＰＥ抗ｈＣＤ４１ａ、血小板のみ）と４℃で３０分間混合し得る。インキュベーション後、全血を２つのサンプルに分ける：赤血球分析の場合には、５μＬを希釈し、ＰＢＳで洗浄し、血小板分析の場合には、１５０μＬを赤血球溶解液と共にインキュベートし、洗浄する。ＣｙｔｏＦＬＥＸ機器によりサンプルを取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析して、ＭＦＩ値を決定する。
【０３８８】
赤血球貪食
本発明者らの知識によれば、３００×ｇで遠心分離することにより、ヒト全血からヒト赤血球（ＲＢＣ）を単離し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＣＦＳＥ−（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）で標識し、マクロファージの追加前に試験抗体と共に３７℃で１時間プレインキュベートし得る。標識ＲＢＣを、本発明の抗体または対照（非結合ＩｇＧ１抗体）の存在下で、ヒトマクロファージと共に２００：１の標的対エフェクター比で１時間培養し得る。培養後、細胞を抗ＣＤ１４−ＡＰＣで染色し、フローサイトメトリーにより分析する。ＣＤ１４＋事象（マクロファージ）（これはＣＦＳＥ＋でもあるので、少なくとも１つのＲＢＣを貪食している）のパーセントとして食作用を定量した（シングレットで事象をゲーティング）。マクロファージ染色の後、ＦＡＣＳ溶解液を用いて赤血球を溶解させたことを除いて、実施例９に記載されているように食作用およびＦＡＣＳ分析を行う。
【０３８９】
図８は、ＩｇＧ１抗ＣＤ４７モノクローナル抗体Ｂ６Ｈ１２．２のＲＢＣ食作用が、本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体のＣＤ４７結合アームを含有するＩｇＧ１  ＴＡＡｘＣＤ４７（ＣＥＡｘＣＤ４７ではない）κλ二重特異性抗体よりもはるかに強力であることを示す。野生型Ｆｃを有するＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体は、試験濃度範囲で食作用を示さなかった。Ｆｃがａａ突然変異ＤＥＡ（Ｓ３２９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＧ２３６Ａ）を保有する場合、食作用は検出されるが、Ｂ６Ｈ１２．２抗体のようにより高濃度である。
【０３９０】
インビトロ血小板活性化および凝集
標準的なフローサイトメトリー実験において、７人のヒト健常ドナーの全血中でヒト血小板活性化を誘導するＴＡＡｘＣＤ４７およびＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体の能力を、表面マーカーＣＤ６２Ｐのアップレギュレーションにより測定した。簡潔に言えば、５μＬの全血を１０μＬの（２×で調製した）各サンプルと共に室温で１５分間インキュベートする。各試験抗体を異なる濃度（０、０．０２、０．２、２、２０および２００μｇ／ｍＬ）で追加する。血小板活性化を誘導することが公知の陽性対照試薬として含まれるアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）および抗ＣＤ９（ＡＬＢ６）を、それぞれ１０μＭおよび１０μｇ／ｍＬの濃度で追加する。次いで、１０μＬの抗ＣＤ４１ａ−ＰＥおよび１０μＬの抗ＣＤ６２Ｐ−ＡＰＣを追加し、暗所、室温で１５分間インキュベートした。最後に、５００μＬのＣｅｌｌＦｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、水で１／１０希釈）を追加し、２００μＬの各サンプルをＣｙｔｏＦＬＥＸの取得に適切なＵ底９６ウェルプレートに移す。ＣＤ４１ａ−ＰＥ陽性染色により、血小板を同定する。ＣＤ６２Ｐマーカーの発現により、血小板活性化を評価する。
【０３９１】
図１０は、７人のボランティアドナー由来の血液で得られた結果を示す。抗ＴＡＡモノクローナル抗体もＴＡＡｘＣＤ４７二重特異性抗体も、関連血小板活性化を誘導しないことが見出された（両方ともｗｔ  ＩｇＧ１  Ｆｃを有する）。対照的に、ｗｔ  ＩｇＧ１  Ｆｃを有する抗ＣＤ４７抗体Ｂ６Ｈ１２．２は血小板活性化を誘導し、ＤＥＡ突然変異を保有するＦｃを有するＴＡＡｘＣＤ４７  ｂｉＡｂも血小板活性化を示した。
【０３９２】
また、全血中の血小板活性化について、図１０に示されている濃度範囲で、（アフコシル化を有するおよび有しない）ＣＥＡｘＣＤ４７抗体Ｋ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２を研究した。ＴＡＡｘＣＤ４７について図１０に示されているように、７人のドナーのうちの６人の血液では、有意な血小板活性化は見られなかった。１人のドナーは、陽性対照剤ではまれな血小板活性化を既に示し、次いで、Ｋ２ＡＣ５および２２ではいくらかの血小板活性化も示した。まれな血小板活性化により、この１人のドナーの結果を無視した。
【０３９３】
本発明者らの知識によれば、多血小板血漿（ＰＲＰ）上で、ＣＤ４７／ＣＥＡ二重特異性抗体の存在下における凝集の可能性を評価し得る。１０μＭおよび５μＭのＡＤＰで、または２００、１００、２０、２５および１２．５μｇ／ｍＬの試験品で、ならびに生理食塩水またはアイソタイプ対照でＰＲＰをチャレンジする。常に撹拌しながら血栓凝集計ＴＡ４Ｖを用いて、血小板刺激（すなわち、１０分間）にわたって血小板凝集を評価し得る。Ｔｈｒｏｍｂｏｓｏｆｔ１．６ソフトウェア（ＳＤ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，Ｆｒｏｕａｒｄ，Ｆｒａｎｃｅ）をデータの分析に使用し得る。
【０３９４】
実施例１６：カニクイザル例における血液学的評価
本発明者らの知識によれば、カニクイザルにおいて、（ＲＢＣおよび血小板を含む）血液学的パラメータに対する任意の効果について、カニクイザル交差反応性抗体をインビボで試験し得る。本発明の抗体を、例えば、静脈内経路によりカニクイザルに最大１００ｍｇ／ｋｇの用量で毎週与える。赤血球数および血小板数を含む血液学的パラメータを経時的にモニタリングし、サルにおける対照値（投与前の値）と比較する。ルーチンな方法により、血液学的パラメータを決定する。
【０３９５】
図９における結果は、本発明のＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体のＣＤ４７結合アームを含有するＩｇＧ１  ＴＡＡｘＣＤ４７（ＣＥＡｘＣＤ４７ではない）κλ二重特異性抗体を用いて得られたものである。高用量による反復投与にもかかわらず、ＲＢＣ数および血小板数に関して、対照動物と処置動物との間に有意差はない。これは、ＩｇＧ４抗ＣＤ４７抗体ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４（Ｊｉｅ  Ｌｉｕら、（Ｏｐｅｎ  ａｃｃｅｓｓ  ａｒｔｉｃｌｅ，ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  １０（９）Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１５））を用いた公開されている結果とは対照的であり、これは、ヘモグロビンの用量依存的な減少が、約１ｍｇ／ｋｇの単回投与で既に始まっていることを示している。ＩｇＧ４フォーマットを使用して、ＩｇＧ１フォーマットと比較して赤血球および血小板に対する効果を最小化した。この測定は、１ｍｇ／ｋｇおよびそれ未満の既にかなり低い用量によるものであるにもかかわらず、カニクイザルでは、例えばヘモグロビンの用量依存的な減少が観察される。
【０３９６】
実施例１７：カニクイザルにおける薬物動態特性の決定
本発明者らの知識によれば、単回投与薬物動態研究において、動物を、（雄および雌を含む）ｎ＝サル２〜４匹／群の２〜５つの処置群にランダムに分け得る。単回静脈内用量の本発明の二重特異性抗体を動物に投与する（１５〜３０分間にわたる注入）。処置群における用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与量は最大５ｍＬ／ｋｇである。実験プロトコールにしたがって、複数の時点、例えば二重特異性抗体の静脈内投与の０．２５、１、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、２４０、３３６、５０４（２２日目）、６７２（２９日目）、８４０（３６日目）、１００８（４３日目）、１１７６（５０日目）および１３４４時間（５７日目）後に、採血を予定する。動物１匹および１時点当たり約２ｍＬの血液サンプルを収集する。血清中または血漿中のいずれかで抗体の濃度を測定した。濃度を測定するためにＥＬＩＳＡ試験を開発および検証する。各サンプルを２回反復で測定する。
【０３９７】
濃度時間曲線から、業界標準のソフトウェア（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ；非コンパートメント分析）を使用することにより、Ｃｍａｘ、クリアランス、消失半減期、曲線下面積などのようなＰＫパラメータを決定し得る。
【０３９８】
ＣＥＡｘＣＤ４７カッパ−ラムダ二重特異性抗体の消失半減期は３〜１４日間の範囲内であると予想され、患者への１週間に１回（ｑ１ｗ）または２週間に１回（ｑ２ｗ）または３週間に１回（ｑ３ｗ）または４週間に１回（ｑ４ｗ）の投与を提案する。
【０３９９】
実施例１８：脱落ＣＥＡの存在下で二重特異性抗体により媒介されるＡＤＣＰ
標的細胞として使用するＭＫＮ４５細胞をカルセインＡＭで染色する。並行して、複数の濃度の試験抗体を、一定用量（２００ｎｇ／ｍＬ）の市販の脱落ＣＥＡ（ＢｉｏＲａｄ）と共にまたはそれなしでインキュベートする。このインキュベーション後、染色ＭＫＮ−４５を、脱落ＣＥＡと予混合した抗体を用いて室温で２０分間オプソニン化する。次いで、マイクロプレートウェルに付着した（カルセインレッドオレンジで染色した）マクロファージを、オプソニン化標識標的腫瘍細胞と共に１：３のエフェクター：標的細胞比で３７℃で２．５時間コインキュベートする。１ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧの存在下で、ＡＤＣＰを実施する。インキュベーション期間の終了時に、上清を完全培養培地に交換し、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）ＣＸ５ハイコンテントスクリーニングプラットフォームを用いてマイクロプレートをイメージングする。１ウェル当たり１５００個のマクロファージを取得および分析する。食作用は、二重陽性事象（マクロファージ＋貪食された標的腫瘍細胞）として証明され、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）製造業者のソフトウェアにより食作用指数を計算する。結果は図２０Ｂに示されている。
【０４００】
実施例１９：ＣＥＡ−ＴＣＢおよびＣＥＡ−ＴＣＢ１の存在下で二重特異性抗体により媒介されるＡＤＣＰ
標的細胞として使用するカルセインＡＭ標識ＭＫＮ４５細胞を、一定用量のＣＥＡ−ＴＣＢ（３００ｎＭ）またはＣＥＡ−ＴＣＢ１（３０ｎＭ）と共にまたはそれらなしで室温で２０分間プレインキュベートする。このインキュベーション後、異なる濃度の試験抗体を適切なウェルに２０分間追加する。次いで、マイクロプレートウェルに付着した（カルセインレッドオレンジで染色した）マクロファージを、オプソニン化標識標的腫瘍細胞と共に１：３のエフェクター：標的細胞比で３７℃で２．５時間コインキュベートする。１ｍｇ／ｍＬのヒトｈＩｇＧの存在下で、ＡＤＣＰを実施する。インキュベーション期間の終了時に、上清を完全培養培地に交換し、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）ＣＸ５ハイコンテントスクリーニングプラットフォームを用いてマイクロプレートをイメージングする。１ウェル当たり１５００個のマクロファージを取得および分析する。食作用は、二重陽性事象（マクロファージ＋貪食された標的腫瘍細胞）として証明され、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）製造業者のソフトウェアにより食作用指数を計算する。
【０４０１】
図１８は、追加したＣＥＡ−ＴＣＢもＣＥＡ−ＴＣＢ１も、Ｋ２ＡＣ２２により誘導される食作用を減少させないことを示す。驚くべきことに、Ｋ２ＡＣ２２の食作用は、３０ｎＭ  ＣＥＡ−ＴＣＢ１の追加によりわずかに増加した。
【０４０２】
実施例２０：ＣＤ４７ｘＣＥＡとＣＥＡｘＣＤ３との組み合わせによる殺傷アッセイ
バフィーコートからヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。これらのＰＢＭＣの一部を、（Ｔ細胞の供給源として使用するために）凍結培地（９０％ＦＣＳ１０％ＤＭＳＯ）で凍結し、一部を使用して（食作用のセクションで説明されているように）マクロファージを調製した。６日間のマクロファージ分化後、細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、３７℃でインキュベートした。アッセイの日（マクロファージをプレーティングした２日後）に、対応するマクロファージドナー由来の凍結ＰＢＭＣを解凍し、マクロファージプレートに追加した。抗体の組み合わせを用いて、すなわち特定の濃度のａＣＥＡｘＣＤ４７二重特異性抗体と一緒に特定の濃度のＣＥＡｘＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体を用いて、標的細胞（ルシフェラーゼを発現するように操作したＭＫＮ４５）をオプソニン化した。オプソニン化標的を、マクロファージおよび自己ＰＢＭＣを含有するプレートに追加し；プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、ウェル培地の半分を除去し、２×ルシフェリン溶液をプレートに追加して、１５０μｇ／ｍＬの最終濃度を得た。室温における５分間のインキュベーション後、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＮＥＯを使用してプレートを読み取った。（バックグラウンドを差し引いた）発光値を、標的細胞のみを含有する対照で割って１００を乗じて、生存率のパーセンテージを計算した。次いで、１００から生存率のパーセンテージに差し引くことにより、殺傷のパーセンテージを推定した。
【０４０３】
図１９ＡおよびＢは、様々な濃度のＣＥＡ−ＴＣＢおよびＫ２ＡＣ５およびＫ２ＡＣ２２の組み合わせて得られた結果を示す。
【０４０４】
本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイトおよびアクセッション番号／データベース配列（ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の両方を含む）は、個々の各刊行物、特許、特許出願、インターネットサイトまたはアクセッション番号／データベース配列が参照によりそのように組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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