(57)【要約】  本発明は、抗ＣＤ２７抗体、その抗原結合フラグメント、及びその医学的使用を提供する。特に、本発明は、抗ＣＤ２７抗体のＣＤＲ領域を含むヒト抗体、ヒト抗ＣＤ２７抗体とその抗原結合フラグメントとを含む医薬組成物、及び抗がん剤としてのその使用を提供する。特に、本発明は、ヒト抗ＣＤ２７抗体及びＣＤ２７介在性疾患又は障害の治療のための薬物の調製におけるその使用を提供する【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体の前記軽鎖可変領域が、それぞれ、配列番号６、配列番号７及び配列番号８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、及び／又は、
前記抗体の前記重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号３、配列番号４及び配列番号５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗ＣＤ２７抗体又は前記抗原結合フラグメントがヒト生殖系列軽鎖可変領域のＶκ１配列のフレームワーク領域又はその誘導配列をさらに含み、好ましくは、前記軽鎖可変領域の前記フレームワーク領域がＶκ１−１２配列から誘導される、及び／又は、
前記抗ＣＤ２７抗体又は前記その抗原結合フラグメントが、ヒト生殖系列重鎖可変領域のＶＨ３配列のフレームワーク領域又はその誘導配列をさらに含み、好ましくは、前記重鎖可変領域配列の前記フレームワーク領域がＶＨ３−７４配列から誘導される、請求項１に記載の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体の前記重鎖可変領域のＶＨ３配列のフレームワーク領域配列におけるＫａｂａｔ位置７３でのアスパラギンがトレオニンで置換されている、請求項１又は２に記載の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号２で示されるか、又は、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する、及び／又は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号１若しくは配列番号１１で示されるか、又は、配列番号１若しくは配列番号１１と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
ヒト抗体又はそのフラグメントである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
ヒト抗体の重鎖が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４又はその変異体の重鎖定常領域を含み、前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は（Ｆａｂ’）２フラグメントであり、好ましくは、前記ヒト抗体の前記重鎖が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４の重鎖定常領域を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号９で示されるか、若しくは、配列番号９と少なくとも９０％の同一性を有する、及び／又は、
前記抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖のアミノ酸配列が、配列番号１０又は配列番号１２で示されるか、若しくは、配列番号１０又は配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、真核発現ベクター、原核発現ベクター又はウイルスベクターである、ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを用いた形質転換によって得られる宿主細胞であって、
好ましくは、細菌、酵母又は哺乳動物細胞であり、
さらに好ましくは、大腸菌、ピキア・パストリス、チャイニーズハムスター卵巣細胞又はヒト胎児腎２９３細胞である、宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２７抗体及びその抗原結合フラグメントを調製する方法であって、前記抗体又は前記その抗原結合フラグメントを請求項１０に記載の宿主細胞において発現させ、前記抗体及び前記その抗原結合フラグメントを単離することを含む、方法。
【請求項１２】
前記抗体が、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントと、薬剤的に許容される賦形剤、希釈又は担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメント、若しくは、請求項１２に記載の抗体−薬物コンジュゲート、若しくは、請求項１３に記載の医薬組成物の、ＣＤ２７介在性疾患若しくは障害の治療及び／又は予防用薬剤の調製における使用であって、
好ましくは、前記疾患又は障害が、がん又は自己免疫疾患であり、
さらに好ましくは、前記疾患又は障害が、ＣＤ２７発現を伴うがん又は自己免疫疾患であり、
さらに好ましくは、前記がんが、直腸がん、脳腫瘍、腎臓がん、肺がん、肝臓がん、多発性骨髄腫及び黒色腫であり、自己免疫疾患が、前記自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症及び関節リウマチである、使用。
【請求項１５】
ＣＤ２７介在性疾患又は障害の治療及び／又は予防の方法であって、治療上有効な量の請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメント、若しくは、請求項１２に記載の抗体−薬物コンジュゲート、若しくは、請求項１３に記載の医薬組成物を必要とする患者に投与することを含み、
好ましくは、前記疾患又は障害が、がん又は自己免疫疾患であり、
さらに好ましくは、前記疾患又は障害が、ＣＤ２７を発現するがん又は自己免疫疾患であり、
さらに好ましくは、前記がんが、直腸がん、脳腫瘍、腎臓がん、肺がん、肝臓がん、多発性骨髄腫及び黒色腫であり、前記自己免疫疾患が、自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症及び関節リウマチである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、参照によりその内容が全体として本明細書中で援用される、２０１８年３月２８日に提出された、中国特許出願第ＣＮ２０１８１０２６７０５０．４号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、抗ＣＤ２７抗体、ＣＤ２７の抗原結合フラグメント、抗体のＣＤＲ領域を含むキメラ抗体及びヒト化抗体、並びにヒト抗ＣＤ２７抗体とその抗原結合フラグメントとを含む医薬組成物、並びに抗がん薬としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍免疫療法は抗がん薬の分野において長期にわたるホットスポットである。腫瘍免疫療法は、腫瘍患者において、キラーＴ細胞を充分に活用し、動機づけて、腫瘍を殺滅し破壊する。腫瘍免疫療法は、最も有効かつ最も安全な腫瘍治療法の一つであり得る。ヒト体内でのＴ細胞の活性化は、二つのシグナル経路を有するシステムである。Ｔ細胞に提供される第一シグナルとして、抗原提示細胞によって提示されるＭＨＣ抗原ペプチドに加えて、第二シグナルを提供するために一連の同時刺激分子も必要である。両経路により、Ｔ細胞が正常な免疫応答を引き起こすことが可能になる。
【０００４】
Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の相互作用は、免疫応答の誘導をもたらす様々なヘルパー分子から構成され、ＣＤ２７はこれらの分子のうちの一つである。ＣＤ２７は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）スーパーファミリーに属し、Ｔ細胞の表面上のＣＤ７０に結合する。ＣＤ２７は、グリコシル化されたＩ型膜貫通タンパク質であり、これは、通常、ジスルフィド架橋によって結合されたホモダイマーである。ジスルフィド架橋は、細胞外ドメインにおける細胞膜付近の領域に位置する（Ｃａｍｅｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：  ３１６５−６９，  １９９１（非特許文献１））。Ｔ細胞上で、架橋ＣＤ２７抗原は相乗的刺激シグナルを提供することができ、Ｔ細胞受容体と架橋すると、Ｔ細胞増殖及び細胞性免疫活性化を誘導することができる。
【０００５】
ＣＤ２７は、成熟胸腺細胞、ほとんどのＣＤ４＋及びＣＤ８＋外部血液Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞並びにＢ細胞において発現され、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫及びＢ細胞慢性リンパ球性白血病、寄生生物及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などの感染症、多発性硬化症、サルコイドーシス、及びＢ細胞慢性リンパ球性白血病においても高度に発現され、改善されたレベルの可溶性ＣＤ２７タンパク質はまた、疾患の血清又は活性部分でも観察されている（Ｋｏｂａｔａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  １９９５  （２４）  １１２４９−５３（非特許文献２）、Ｒａｎｈｅｉｍ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ．  １９９５  ８５  （１２）  ３５５６−６５（非特許文献３）、Ｌｏｅｎｅｎ  ＷＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９２  ２２：  ４４７（非特許文献４））。
【０００６】
最近の研究では、抗ＣＤ２７モノクローナル抗体アゴニストがＴ細胞応答を促進することができ、可能性のある抗がん治療薬として使用することができることが示されている（特許、国際公開第２００８０５１４２４号（特許文献１）、国際公開第２０１１１３０４３４号（特許文献２）、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／１０３８４２（特許文献３）を参照）。これまでに得られた研究結果により、ＣＤ２７は免疫療法の有用な標的であることが確認されているが、治療に特に有益である抗ＣＤ２７モノクローナル抗体の特異的性質はいまだ解明されていない。抗ＣＤ２７モノクローナル抗体のどの特異的な機能特性が当該技術分野で有効であり、したがって、疾患の予防及び治療にさらに有効である、潜在的に改善された抗ＣＤ２７抗体をさらに得ることをさらに理解することが依然として必要である。
【０００７】
今まで、多くの国際企業がＣＤ２７標的に対する腫瘍抗体薬物を開発してきた。ＵＳ  Ｃｅｌｌｄｅｘからの抗ＣＤ２７抗体は、すでに第二相臨床試験にあり、その一方で、Ｍｅｒｃｋ、Ａｄｕｒｏ及びＡｐｏｇｅｎｉｘなどの企業からの関連製品は依然として前臨床開発段階である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００８０５１４２４号
【特許文献２】国際公開第２０１１１３０４３４号
【特許文献３】ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／１０３８４２
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃａｍｅｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：  ３１６５−６９，  １９９１
【非特許文献２】Ｋｏｂａｔａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  １９９５  （２４）  １１２４９−５３
【非特許文献３】Ｒａｎｈｅｉｍ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ．  １９９５  ８５  （１２）  ３５５６−６５
【非特許文献４】Ｌｏｅｎｅｎ  ＷＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９２  ２２：  ４４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、当該技術分野では、高親和性、高選択性、高生物活性及び高安定性を有する抗ＣＤ２７抗体、並びに所望の有益な治療効果と関連づけることができる特異的機能特性を有する抗体を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の内容
本発明のいくつかの実施形態は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体の前記軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号６で示されるＬＣＤＲ１、配列番号７で示されるＬＣＤＲ２及び／又は配列番号８で示されるＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、及び／又は、前記抗体の前記重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号３で示されるＨＣＤＲ１、配列番号４で示されるＨＣＤＲ２、及び／又は配列番号５で示されるＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体の前記軽鎖可変領域が、それぞれ、配列番号６、配列番号７及び配列番号８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、及び／又は、前記抗体の前記重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号３、配列番号４及び配列番号５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、前記軽鎖可変領域と前記重鎖可変領域とを含む抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、定義の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントは、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はそのフラグメントである。
【００１４】
いくつかの実施形態において、定義の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト生殖系列軽鎖可変領域のＶκ１配列フレームワーク領域又はその誘導配列をさらに含み、少なくとも一つの実施形態において、軽鎖可変領域のフレームワーク領域は、Ｖκ１−１２の配列に由来する、及び／又は、抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト生殖系列重鎖可変領域のＶＨ３配列フレームワーク領域又はその誘導配列をさらに含み、少なくとも一つの実施形態において、重鎖可変領域配列のフレームワーク領域はＶＨ３−７４配列に由来する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、定義の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントの前記重鎖可変領域の前記ＶＨ３配列のフレームワーク領域においてＫａｂａｔ位置７３でのアスパラギンは、トレオニンで置換されている。
【００１６】
いくつかの実施形態において、定義のヒト化抗体の重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４又はその変異体の重鎖定常領域を含み、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及び／又は（Ｆａｂ’）２フラグメントである。少なくとも一つの実施形態において、前記ヒト化抗体の重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４の重鎖定常領域を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、前記抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントの前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２で示されるか、又は、配列番号２と少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する、及び／又は、前記重鎖可変領域配列のアミノ酸配列は、配列番号１若しくは配列番号１１で示されるか、又は配列番号１若しくは配列番号１１と少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する。少なくとも一つの実施形態において、定義の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号９で示されるか、若しくは配列番号９と少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する、及び／又は定義の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖のアミノ酸配列は配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるか、又は配列番号１０若しくは配列番号１２と少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する。
【００１８】
いくつかの実施形態は、抗ＣＤ２７抗体若しくはその抗原結合フラグメントであって、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む抗ＣＤ２７抗体若しくはその抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体の前記軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号６、配列番号７及び配列番号８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト生殖系列軽鎖可変領域のＶκ１配列のフレームワーク領域を含む、前記抗体の前記重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号３、配列番号４及び配列番号５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と、ヒト生殖系列重鎖可変領域のＶＨ３配列のフレームワーク領域とを含む。
【００１９】
少なくとも一つの実施形態において、前記抗ＣＤ２７抗体の前記軽鎖可変領域の前記フレームワーク領域は、Ｖκ１−１２配列由来のフレームワーク領域から選択される、重鎖可変領域のフレームワーク領域は、ＶＨ３−７４配列由来のフレームワーク領域から選択される。
【００２０】
ヒト生殖系列ＶＨ３−７４の配列（ＩＭＧＴアクセッション番号ＩＧＨＶ３−７４＊０１）は以下のように提示される。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLVWVSRINSDGSSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
配列番号１３
【００２１】
ヒト生殖系列Ｖκ１−１２の配列（ＩＭＧＴアクセッション番号ＩＧＫＶ１−１２＊０１）は以下のように提示される。
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFP
配列番号１４
【００２２】
少なくとも一つの実施形態において、前記抗体の前記重鎖可変領域の前記ＶＨ３配列のフレームワーク領域配列においてＫａｂａｔ位置７３でのアスパラギン（Ａｓｎ）はトレオニン（Ｔｈｒ）で置換されている。
【００２３】
少なくとも一つの実施形態において、前記抗ＣＤ２７抗体の前記軽鎖可変領域の配列は配列番号１であり、前記重鎖可変領域の配列は配列番号１１である。
【００２４】
少なくとも一つの実施形態において、前記抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体又はそのフラグメントである。
【００２５】
少なくとも一つの実施形態において、前記抗ＣＤ２７抗体の前記軽鎖配列は配列番号９であり、前記抗体の前記重鎖配列は配列番号１２である。
【００２６】
いくつかの実施形態は、抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントであって、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体の前記軽鎖可変領域の配列は配列番号１であり、前記抗体の前記重鎖可変領域の配列は配列番号１１である。
【００２７】
少なくとも一つの実施形態において、前記抗ＣＤ２７抗体の軽鎖配列は配列番号９であり、前記抗体の重鎖配列は配列番号１１である。
【００２８】
いくつかの実施形態は、ＣＤ２７に対する結合に関して、定義のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントと競合し得る単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。
【００２９】
いくつかの実施形態は、多特異的抗体であって、定義の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む、多特異的抗体を提供する。
【００３０】
いくつかの実施形態は、単鎖抗体であって、定義のように軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む、単鎖抗体を提供する。
【００３１】
いくつかの実施形態は、抗体−薬物コンジュゲートであって、定義のような軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む、抗体−薬物コンジュゲートを提供する。前記抗体−薬物コンジュゲートは、当該技術分野で周知であり、抗体−リンカー−薬物（毒素）の相互接続によって形成される。公知リンカーは、切断リンカーと非切断リンカーとを含む。例えば、リンカーは、限定されるものではないが、ＳＭＣＣ、ＳＰＤＰなどを含む、例えば、ＤＭ１、ＤＭ４、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦなどの毒素もまた、当該技術分野で周知である。
【００３２】
いくつかの実施形態は、定義のような抗ＣＤ２７抗体又は抗原結合フラグメントをコードする核酸を提供する。
【００３３】
いくつかの実施形態は、定義のような核酸を含む発現ベクターを提供する。
【００３４】
いくつかの実施形態は、定義のような発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００３５】
少なくとも一つの実施形態において、細菌、好ましくは大腸菌である、定義の宿主細胞である。
【００３６】
少なくとも一つの実施形態において、酵母、好ましくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、定義の宿主細胞である。
【００３７】
少なくとも一つの実施形態において、哺乳動物細胞、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞である、定義の宿主細胞である。
【００３８】
いくつかの実施形態は、抗ＣＤ２７抗体及びその抗原結合フラグメントを調製する方法であって、定義のような宿主細胞において抗体又はその抗原結合フラグメントを発現し、前記抗体又は抗原結合フラグメントを前記宿主細胞から単離することを含む、方法を提供する。
【００３９】
いくつかの実施形態は、医薬組成物であって、定義の抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合フラグメントと、薬剤的に許容される賦形剤、希釈又は担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【００４０】
いくつかの実施形態は、定義のような、抗ＣＤ２７抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又はそれを含む医薬組成物の、ＣＤ２７介在性疾患若しくは障害の治療及び／又は予防用薬剤の調製における使用を提供し、ここで定義される疾患は、好ましくは、がん及び自己免疫疾患であり、さらに好ましくはＣＤ２７発現を伴うがん又は自己免疫疾患であり、前記がんは、最も好ましくは、直腸がん、脳腫瘍、腎臓がん、肺がん、肝臓がん、多発性骨髄腫及び黒色腫であり、自己免疫疾患は、最も好ましくは、前記自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症及び関節リウマチである。
【００４１】
いくつかの実施形態は、ＣＤ２７介在性疾患又は障害の治療及び／又は予防のための方法を提供し、方法は、治療上有効な量の、定義のような抗ＣＤ２７抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は定義のような抗ＣＤ２７抗体若しくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を必要とする患者に投与することを含み、前記疾患は、好ましくは、がん又は自己免疫疾患であり、さらに好ましくは、ＣＤ２７発現を伴うがん又は自己免疫疾患であり、前記がんは、最も好ましくは、直腸がん、脳腫瘍、腎臓がん、肺がん、肝臓がん、多発性骨髄腫及び黒色腫であり、前記自己免疫疾患は、最も好ましくは、自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症及び関節リウマチである。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ｍＡｂ０７７の酸性成分及び主ピーク成分の脱アミド化状態を、クロマトグラフィ−質量分析によって特定した。結果から、酸性成分が主に脱アミド化された７４番目のアミノ酸アスパラギン（Ａｓｎ）であり、反応率が５９．６％に達することがわかった。
【図２】変異前のｍＡｂ０７７及び変異後の０７７Ｎ７４Ｔの酸−塩基ピーク分布状態をＳＥＣ−ＨＰＬＣ法によって特定した。酸性ピークはｍＡｂ０７７において２９分で主ピークの前に溶出された。
【図３】４０℃で1か月の熱処理後、０７７Ｎ７４Ｔ酸−塩基等電点成分の分布と、その初期状態に対する変化とを、ＩＣＥを使用して測定した。
【図４】異なる濃度の抗ＣＤ２７抗体（変異前／変異後分子）又はハーセプチン（参照として使用）を使用して、ヒト血液ＰＢＭＣ増殖の機能的強度を刺激した。
【図５】腫瘍接種後の日数に対する、対照ヒトＩｇＧ１抗体又は様々な抗ＣＤ２７抗体で処置したマウスにおけるヒトＲａｊｉ移植リンパ腫の腫瘍サイズ（ｍｍ３として表示）である。誤差は標準誤差を示す。
【図６】対照ヒトＩｇＧ１抗体又は様々な抗ＣＤ２７抗体で処置したマウスの体重における変化（ｇとして表示）である。誤差は標準誤差を示す。
【００４３】
〔発明の詳細な説明〕
１．定義
いくつかの科学技術用語を以下で具体的に定義する。本明細書において明確に別段の定めがない限り、本明細書中で使用するすべての他の科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味を有する。
【００４４】
本明細書中で使用するアミノ酸三文字コード及び一文字コードは、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ，  ２４３，  ｐ３５５８  （１９６８）に記載されている。
【００４５】
用語「抗体」は、本明細書中で使用する場合、鎖間ジスルフィド結合によって二本の同じ重鎖と二本の同じ軽鎖を連結することによって形成されるテトラペプチド鎖構造であるイムノグロブリンを指す。前記イムノグロブリンの重鎖定常領域はアミノ酸の異なる組成及び順序を有するので、イムノグロブリンの抗原性は異なる。したがって、イムノグロブリンは五つのクラス、すなわち、イムノグロブリンのアイソタイプ、つまり、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥに分類することができ、その対応する重鎖は、それぞれ、μ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖と称される。同じタイプのＩｇは、ヒンジ領域のアミノ酸組成における相違並びに重鎖ジスルフィド結合の数及び位置に従って異なるサブクラスに分けることができる。例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に分類することができる。軽鎖は、それらの定常領域における相違にしたがってκ鎖又はλ鎖として分類することができる。Ｉｇの五つのクラスの各々は、κ鎖又はλ鎖を有し得る。
【００４６】
抗体軽鎖は軽鎖定常領域をさらに含み得、これは、ヒト若しくはマウスκ、λ鎖又はその変異体を含む。
【００４７】
抗体重鎖は重鎖定常領域をさらに含み得、これは、ヒト若しくはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はその変異体を含む。
【００４８】
抗体重鎖及び軽鎖のＮ末端に近いアミノ酸から構成される可変領域（Ｖ領域）は、そのアミノ酸配列がかなり異なる。抗体のＣ末端に近い残りのアミノ酸配列から構成される定常領域（Ｃ領域）は、比較的安定である。軽鎖及び重鎖の可変領域は、約１１０のアミノ酸から構成され、軽鎖における位置２４〜３４、５０〜５６、８９〜９７及び重鎖における位置３１〜３５、５０〜６５、９５〜１０２などのいくつかの領域におけるアミノ酸残基の変化は、可変領域の他の部分よりも頻度が高い。これらの領域は、超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる。超可変領域は、抗体及びエピトープが直接接触する部分であるので、相補性領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる。可変領域における非超可変領域は、アミノ酸組成及び配列における変化が比較的少なく、これらのアミノ酸残基は、可変領域の安定な三次元構造、つまり、フレームワーク構造又はフレームワーク領域（ＦＲ）を構成する。可変領域は、三つの超可変領域（ＨＶＲ）と比較的保存的配列を有する四つのフレームワーク領域（ＦＲ）とを含む。各軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）は、三つのＣＤＲ領域及び四つのＦＲ領域から構成される。アミノ末端からカルボキシ末端へのこれらの領域の順序は：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４である。軽鎖の三つのＣＤＲ領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を指し、重鎖の三つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を指す。Ｋａｂａｔデータベースの情報によると、抗体分子の各領域のアミノ酸番号は以下の通りである。
【００４９】
2021519088.tif 000002
【００５０】
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントのＶＬ及びＶＨ領域のＣＤＲアミノ酸残基の数及び位置は、公知のＫａｂａｔナンバリング基準に従う。
【００５１】
本開示では、ヒトＣＤ２７抗原を標的とするヒト抗体フラグメントのスクリーニングのためにインビトロファージミドディスプレイシステムを使用し、一連の抗ＣＤ２７抗体をスクリーニングによって同定し、ここで、配列番号１の重鎖可変領域及び配列番号２の軽鎖可変領域をさらなる研究のために選択した。これらのうち、配列番号１の配列はＶＨ３ファミリー由来であり、これは、ＶＨ３−７４生殖系列配列と最も類似している。配列番号２の配列は、Ｖκ１ファミリー由来であり、これは、Ｖκ１−１２生殖系列配列と最も類似している。
【００５２】
ＶＨ３ファミリーは、ヒトＶＨ生殖系列の成分の一部である。ＶＨ生殖系列の成分は、ヌクレオチド配列、つまり、ＶＨ１−ＶＨ７の相同性に基づいて七つのファミリーに分けることができる（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２７，  ７７６−７９８及びＣｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，  １６，  ２３７−２４２）。任意の所与のヒトＶＨ３生殖系列抗体配列について、アミノ酸配列同一性は全ＶＨ３ファミリー全体の中で最も高い（例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２７，  ７７６−７９８及びＣｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，  １６，  ２３７−２４２を参照のこと）。任意の二つのＶＨ３ファミリー生殖系列ＶＨ配列間のアミノ酸配列同一性は、１００ＶＨ残基のうち６９〜９８残基で変動する（すなわち、任意の二つの生殖系列ＶＨ配列間のアミノ酸配列相同性は６９〜９８％である）。ほとんどの生殖系列配列対について、１００のアミノ酸残基中に少なくとも８０以上の同じアミノ酸残基がある（すなわち、少なくとも８０％アミノ酸配列相同性）。
【００５３】
Ｖκ１ファミリーはヒトＶκ生殖系列の全成分の一部である。Ｖκ生殖系列の全成分は、ヌクレオチド配列の相同性に基づいて七つのファミリー、つまり、Ｖκ１〜Ｖκ７に分けることができる（Ｅｎｒｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｄｅｃ；９  （１２）：１８０１−１５．）。ほとんどの生殖系列配列対について、Ｖκ１ファミリー生殖系列のＶκ配列間で少なくとも８０％のアミノ酸配列相同性がある。
【００５４】
ＶＨ３ファミリー配列間の高いアミノ酸配列類似性及び構造類似性を考慮して、当業者は、Ｃｈａｉｎシャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）技術（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．  ｌｍｍｕｎｏｌ．，  １２，  ４３３−５５）を使用することができるか、又はげっ歯類抗体若しくは他のヒト抗体のＣＤＲ（本発明の抗体のＣＤＲを含む）をＶＨ３ファミリーのフレームワーク領域上にグラフトし、それに対合する好適なＶＬを選択することができる。同様に、Ｖκ１ファミリー配列はまた、高いアミノ酸配列類似性及び構造類似性を共有し、当業者は、Ｃｈａｉｎシャフリング技術（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．  ｌｍｍｕｎｏｌ．，  １２，  ４３３−５５）を使用することができるか、又はげっ歯類抗体若しくは他のヒト抗体のＣＤＲ（本発明の抗体のＣＤＲを含む）をＶκ１ファミリーのフレームワーク領域上にグラフトし、それに対合する好適なＶＨを選択することができる。
【００５５】
用語「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」とは、その表面上にＭＨＣと複合体形成した外来抗原を提示する細胞である。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介してこの複合体を認識する。ＡＰＣの例としては、限定されるものではないが、樹状細胞（ＤＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、単球、Ｂリンパ芽球、及び単球由来樹状細胞（ＤＣ）が挙げられる。用語「抗原提示」とは、ＡＰＣが抗原を捕捉し、それらがＴ細胞によって、例えば、ＭＨＣ−Ｉ／ＭＨＣ−ＩＩコンジュゲートの成分として認識されることを可能にするプロセスを指す。
【００５６】
用語「ＣＤ２７」は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの構成要素である細胞表面受容体を指す。ＣＤ２７は、Ｔ細胞免疫の産生及び長期維持に必要な分子であり、Ｂ細胞の活性化及びイムノグロブリン合成の調節において重要な役割を果たす。用語「ＣＤ２７」は、細胞によって天然で発現されるＣＤ２７のあらゆる変異体又はアイソフォーム（例えば、ＡＡＨ１２１６０．１のアクセッション番号でＧＥＮＢＡＮＫに登録されているヒトＣＤ２７）を包含する。発明の抗体は、非ヒト種からのＣＤ２７と交差反応性であり得る。あるいは、抗体は、ヒトＣＤ２７特異性であり得、他の種と交差反応性を示さない可能性がある。ＣＤ２７、又はその任意の変異体若しくはアイソフォームは、それらが天然に発現される細胞若しくは組織から単離することができるか、又は当該技術分野で一般的であり、また本明細書中で記載する技術を使用して組換え技術によって産生される。好ましくは、抗ＣＤ２７抗体は、正常なグリコシル化パターンを有するヒトＣＤ２７を標的とする。
【００５７】
用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列の可変領域及び定常領域を有する抗体を包含する。発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列によってコードされなかったアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでランダム若しくは部位特異的変異によって、又はインビボで体細胞変異によって導入された変異）。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされた抗体（すなわち、「ヒト化抗体」）を包含しない。
【００５８】
用語「ヒト化抗体」は、ＣＤＲグラフト化抗体としても知られ、マウスのＣＤＲ配列をヒト抗体可変領域のフレームワーク中にグラフトすることによって産生される抗体を指す。これは、大量のマウスタンパク質成分を有するキメラ抗体によって誘導される強力な免疫応答を克服することができる。免疫原性を低下させることによって引き起こされる活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域を最小復帰変異させて活性を維持することができる。
【００５９】
用語「キメラ抗体」は、マウス抗体によって誘導される免疫応答を軽減することができる、ヒト抗体の定常領域と、マウス抗体の可変領域とを融合させることによって形成される抗体である。キメラ抗体を構築するために、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをまず構築し、選択し、次いで可変領域遺伝子をマウスハイブリドーマ細胞からクローニングする。続いて、ヒト抗体の定常領域遺伝子を必要に応じてクローニングする。マウス可変領域遺伝子及びヒト定常領域遺伝子をライゲートしてキメラ遺伝子とし、次いでヒトベクターに挿入し、最後にキメラ抗体分子を真核又は原核工業システムで発現させる。ヒト抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４又はその変異体の重鎖定常領域、好ましくはヒトＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４の重鎖定常領域を含むものから選択してもよいし、あるいはアミノ酸変異後のＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用）毒性のないＩｇＧ１から選択してもよい。
【００６０】
「抗原結合フラグメント」は、抗原結合活性を有する、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント及びヒトＣＤ２７に結合するＦｖフラグメントのｓＦＶフラグメントであって、配列番号３〜配列番号８から選択される本発明の抗体の一つ以上のＣＤＲを含むものを指す。Ｆｖフラグメントは、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含むが、定常領域を有さず、全ての抗原結合部位を有する、最小の抗体フラグメントである。一般に、Ｆｖ抗体はまた、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含み、抗原結合に必要とされる構造を形成し得る。異なるリンカーを使用して、二つの抗体可変領域を接続して、単鎖抗体又は単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）と呼ばれるポリペプチド鎖とすることもできる。本発明において、用語「ＣＤ２７に対する結合」は、ヒトＣＤ２７と相互作用する能力を指す。本発明の用語「抗原結合部位」は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントによって認識される抗原上の独立した三次元部位を指す。
【００６１】
用語「多特異的抗体」は、多エピトープ特異性を有する抗体を包含する、その最も広い意味で使用される。これらの多特異的抗体には、限定されるものではないが、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む抗体であってＶＨ−ＶＬ単位が多エピトープ特異性を有する抗体、二つ以上のＶＬ及びＶＨ領域を有する抗体であって各ＶＨ−ＶＬ単位が、異なる標的又は同じ標的の異なるエピトープと結合する抗体、二つ以上の単一可変領域を有する抗体であって各単一可変領域が異なる標的又は同じ標的の異なるエピトープと結合する抗体、完全長抗体、抗体フラグメント、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ及びトライアボディ、共有的若しくは非共有的に連結する抗体フラグメントなどが含まれる。
【００６２】
用語「抗体−薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）は、限定されるものではないが、細胞毒性薬剤とコンジュゲートした抗体又は抗体フラグメントを含む、一つ以上の異種性の化学的に合成された分子と結合させた抗体又は抗体フラグメントを指す。
【００６３】
用語「単鎖抗体」は、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を、リンカーペプチドを介して結合させることによって形成される単鎖組換えタンパク質であり、完全抗原結合部位を有する最小の抗体フラグメントである。
【００６４】
用語「エピトープ」は、イムノグロブリン又は抗体と特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、隣接アミノ酸、タンパク質の三次元フォールディングによって並置された非隣接アミノ酸によって形成することができる。隣接アミノ酸によって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露後も維持されるが、三次元フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒での処理後に失われる。エピトープは、典型的には、独特の空間配置で少なくとも３〜１５のアミノ酸を含む。どのエピトープが所与の抗体によって結合されるかを判定する方法は当該技術分野で周知であり、例えば、免疫ブロッティング及び免疫沈降アッセイ等である。エピトープの空間配置を決定する方法には、当該技術分野の方法及び本明細書中で記載する技術、例えば、Ｘ線結晶学及び二次元核磁気共鳴が含まれる。
【００６５】
用語「特異的に結合する」又は「選択的に結合する」とは、抗体の、所定の抗原上のエピトープに対する結合を指す。典型的には、組換えヒトＣＤ２７を分析物として使用し、抗体をリガンドとして使用する場合、抗体は、装置において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって測定すると、約１０−７Ｍ未満又はさらに小さな平衡解離定数（ＫＤ）で所定の抗原と結合し、所定の抗原に対する結合に対するその親和性は、所定の抗原もしくは密接に関連した抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡなど）に対するその親和性の少なくとも二倍である。用語「抗原を認識する抗体」は、本明細書中では、用語「特異的に結合する抗体」と交換可能に使用できる。
【００６６】
用語「競合的結合」は、本発明のモノクローナル抗体でヒトＣＤ２７の細胞外領域上の同じエピトープ（抗原決定基とも呼ばれる）又は、同じエピトープの一部を認識し、抗原と結合する抗体を指す。本発明のモノクローナル抗体と同じエピトープと結合する抗体とは、本発明のモノクローナル抗体によって認識されるヒトＣＤ２７のアミノ酸配列を認識し結合する抗体を指す。
【００６７】
用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を指す。核酸分子は一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、核酸が別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「機能的に連結され」ている。例えば、プロモータ又はエンハンサがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモータ又はエンハンサはコード配列に機能的に連結される。
【００６８】
用語「交差反応」は、本発明の抗体が異なる種由来のＣＤ２７と結合する能力を指す。例えば、ヒトＣＤ２７と結合する本発明の抗体は、別の種のＣＤ２７とも結合することができる。交差反応性は、結合アッセイ（例えば、ＳＰＲ及びＥＬＩＳＡ）において精製された抗原と抗体の比反応性、又はＣＤ２７生理学的を発現する細胞と抗体との結合若しくは機能的相互作用を検出することによって測定される。交差反応性を決定するための方法としては、本明細書中で記載するような標準的結合アッセイ、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ若しくはフローサイトメトリーが挙げられる。
【００６９】
用語「阻害」又は「遮断」は、交換可能に使用され、部分的及び完全阻害／遮断の両方を包含する。ＣＤ７０の阻害／遮断は、好ましくは、阻害若しくは遮断されないＣＤ７０結合の活性の正常レベル又はタイプを好ましくは低減若しくは変更する。阻害及び遮断はまた、抗ＣＤ２７抗体と接触しないＣＤ７０と比較して、抗ＣＤ２７抗体と接触した場合、ＣＤ７０結合親和性において測定可能な低減を含むことが意図される。
【００７０】
用語「成長の阻害」（例えば、細胞を含む）は、細胞成長における任意の測定可能な低減を含むことが意図される。
【００７１】
用語「免疫応答を誘発する」及び「免疫応答を増強する」は、交換可能に用いることができ、特定の抗原に対する免疫応答の刺激（すなわち、受動又は適応）を指す。ＣＤＣ又はＡＤＣＣの誘導について特異的な「誘導する」との用語は、特異的な直接細胞殺滅メカニズムを刺激することを指す。
【００７２】
「ＡＤＣＣ」、すなわち、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用とは、Ｆｃ受容体を発現する細胞が、抗体のＦｃセグメントを認識することによって、抗体で被覆された標的細胞を直接殺滅することを意味する。抗体のＡＤＣＣエフェクタ機能は、ＩｇＧのＦｃフラグメントの改変によって低減若しくは排除することができる。改変とは、抗体の重鎖定常領域における変異、例えば、ＩｇＧ１のＮ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；ＩｇＧ２／４キメラ、ＩｇＧ４のＦ２３５Ｅ、及びＬ２３４Ａ／Ｅ２３５Ａ変異からなる群から選択される変異を指す。
【００７３】
抗体及び抗原結合フラグメントを産生し精製する方法は周知であり、先行技術、例えば、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ５−８  ａｎｄ  １５，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒで見出すことができる。例えば、マウスをヒトＣＤ４０又はそのフラグメントで免疫化することができ、結果として得られる抗体を、通常の方法により、復元し、精製し、そしてアミノ酸配列決定に供することができる。抗原結合フラグメントはまた、通常の方法によって調製することもできる。本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを遺伝子的に操作して、一つ以上のヒトＦＲ領域を非ヒトＣＤＲ領域に導入する。ヒト生殖系列ＦＲ配列はＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ  ｏｒ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ，  ２００１  ＩＳＢＮ  ０１４４４１３５１で入手可能である。
【００７４】
操作された抗体又は抗原結合フラグメントは、通常の方法によって調製し精製することができる。対応する抗体のｃＤＮＡ配列をＧＳ発現ベクターにクローニングし組換えることができる。ＣＨＯ細胞を組換えイムノグロブリン発現ベクターによって安定的にトランスフェクトすることができる。当該技術分野で周知のより推奨される方法として、哺乳動物発現系は、抗体の、特にＦＣ領域の高度に保存されたＮ末端でのグリコシル化をもたらす。好適なクローンは、ヒト抗原と特異的に結合する抗体を発現させることによって得られる。陽性クローンをバイオリアクターにおいて無血清培地中で増殖させて、抗体を産生する。抗体が分泌される培養培地を通常の技術によって精製し収集することができる。抗体を通常の方法でろ過によって濃縮することができる。可溶性混合物及び多量体を、通常の方法、例えば、モレキュラシーブ、イオン交換によって除去することもできる。結果として得られる生成物は、例えば−７０℃で急速凍結、又は凍結乾燥する必要がある。
【００７５】
抗体とは、モノクローナル抗体を指す。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、単一クローン性細胞ラインから得られる抗体を指し、細胞ラインは真核性、原核性、又は、ファージクローン性細胞ラインに限定されない。モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、ハイブリドーマテクノロジー、組換え技術、ファージディスプレイテクノロジー、合成技術（例えば、ＣＤＲグラフティング）、又は他の先行技術を使用して組換え的に得ることができる。
【００７６】
動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官又は生体液に適用する場合、「投与」及び「治療」は、外因性薬物、治療薬剤、診断薬剤又は組成物を、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官若しくは生体液と接触させることを指す。「投与」及び「治療」とは、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、及び実験方法を指す可能性がある。細胞の処置は、試薬を細胞と接触させること、並びに試薬を流体と接触させることを含み、流体を細胞と接触させる。「投与」及び「処置」は、また、例えば、試薬、診断薬剤、結合組成物によって、又は別の細胞によって、インビトロ及びエクスビボで細胞を処理することも意味する。「処置」は、ヒト、獣医学的又は研究対象に適用される場合、治療的処置、防護的又は予防的手段、研究及び診断用途を指す。
【００７７】
「療法」とは、内用又は外用治療薬剤、例えば、本発明の結合化合物のいずれかを含む組成物の、治療薬が治療効果を有することが知られている疾患の一つ以上の症状を有する患者への投与を意味する。一般的に、治療薬剤を、かかる症状の縮退を誘導することによるか、又はかかる症状の進行を任意の臨床的に測定可能な程度まで阻害することによるか、のいずれかで、治療される対象又は集団における一つ以上の疾患の症状を効果的に軽減する量で投与する。任意の特定の疾患の症状の軽減に有効な治療薬剤量（「治療上有効な量」とも称する）は、様々な因子、例えば、患者の疾患状態、年齢及び体重、並びに薬物が患者において所望の効果を誘発する能力に応じて変化し得る。疾患の症状が軽減されたか否かは、状態の重篤度又は進行を評価するために医師又は他の医療従事者によって通常使用される任意の臨床試験方法によって評価することができる。発明の実施形態（例えば、治療方法又は製剤）は各患者に共通の標的疾患の症状を改善するのに有効でない場合もあるが、標的疾患の症状が、当該技術分野で公知の任意の統計的試験方法、例えば、スチューデントｔ検定、カイ二乗検定、マン・ホイットニーに基づくＵ検定、クラスカル・ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール・タプストラ検定、及びウィルコクソン検定にしたがって、統計的に有意な数の患者において軽減されたことが確認されている。
【００７８】
用語「〜から本質的になる」又はその変形は、全てのかかる要素又は要素の群を含み、任意選択的に、要素と性質が類似又は異なる他の要素を含んでもよく、他の要素は、所与の投薬計画、方法又は組成物の本質的又は新規特性を大きく変更しない。非限定例として、記載するアミノ酸配列から本質的になる結合化合物はまた、結合化合物の特性に大きく影響を及ぼさない一つ以上のアミノ酸も含み得る。
【００７９】
用語「天然に存在する」とは、物体を天然で見出すことができるという事実を指す。例えば、天然源から単離することができ、実験室で意図的に人工的に改変されていない、生物体（ウイルスを含む）において存在するポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００８０】
「有効量」は、病状の症状又は兆候を改善又は予防するために充分な量を含む。有効量はまた、診断を可能又は促進するために充分な量を意味する。特定の患者又は獣医学的対象にとっての有効量は、治療する状態、患者の健康全般、並びに投与方法の経路及び投与量、並びに副作用の重篤度などの因子に依存して変化し得る。有効量は、重大な副作用又は毒性効果を回避する最大用量又は投薬計画であり得る。
【００８１】
「外因性」とは、バックグラウンドにしたがって、生きている生物体、細胞、又はヒト身体の外部で産生される物質を指す。「内因性」とは、バックグラウンドにしたがって、細胞、生物体又はヒト身体において産生される物質を指す。
【００８２】
表現「細胞」、「細胞ライン」及び「細胞培養物」は、本明細書中で使用する場合、交換可能に使用することができ、そのような名称はすべてそれらの子孫を含む。したがって、語「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、トランスファーの回数に関係なく、一次試験細胞及びそれに由来する培養物を含む。全ての子孫は、意図的又は意図的でない変異に起因するＤＮＡ量に関して正確に同じでない可能性があることも理解すべきである。本来の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫も含まれる。異なる名称が意図される場合、それらは、文脈から明らかに区別可能である。
【００８３】
「任意選択的な」又は「任意選択的に」とは、続いて記載される事象又は環境が起こり得るが、必ずしも起こる必要はなく、事象又は環境が起こる場合又は起こらない場合を含むことを意味する。例えば、「任意選択的に１〜３の抗体重鎖可変領域を含んでもよい」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在し得るが、存在する必要はないことを意味する。
【００８４】
「医薬組成物」とは、本明細書中で記載される一つ以上の化合物、又はその生理学的／薬剤的に許容される塩若しくはプロドラッグ、及び他の化学成分、並びに生理学的／薬剤的に許容される担体及び賦形剤などの他の成分の混合物を意味する。医薬組成物の目的は、生命体の投与を促進することであり、これにより活性成分の吸収を促進し、それによって生物活性を発揮する。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
好ましい実施形態の詳細な説明
以下の実施例は本発明をさらに説明し、本発明を限定するものと理解されるべきではない。発明の実施形態において特定の条件を示していない実験方法は、通常、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌｏｆ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙなどの従来の条件に従って、又は、原料若しくは商品の製造業者によって推奨される条件に従って実施される。供給源が指定されていない試薬は、市場から購入した所定の試薬である。
【実施例】
【００８６】
実施例１  ヒトＣＤ２７抗原結合抗体フラグメント（Ｆａｂ）のスクリーニング及び発見
インビトロファージミドディスプレイシステムを、ＣＤ２７−ＨｉｓＦｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＃１００３９−Ｈ０３Ｈ）、ＣＤ２７−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＃１００３９−Ｈ３１Ｈ）及びＣＤ２７−Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＃１００３９−Ｈ０８Ｂ１）を含むヒトＣＤ２７抗原に対するヒト化抗体フラグメントのスクリーニングのために使用した。抗原は、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルスクリーニングプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ４４６４６９）上に直接吸着固定化するか、又はビオチン化してダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）微粒子（Ｍ２８０、ストレプトアビジン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃６０２１０）上に吸着させ、そしてＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）自動スクリーニングワークステーションを標準的ファージディスプレイスクリーニング手順によるスクリーニングのために使用した。各抗原について３〜４ラウンドを越えるスクリーニングを実施し、ヒト抗体Ｆｃフラグメントを各ラウンドで使用して、バックグラウンドを排除した。スクリーニングの最終ラウンドの後、単一のコロニーをクローニング、インキュベートのために採取し、上清を採取し、ヒトＣＤ２７と結合する抗体フラグメントをＥＬＩＳＡ法によって事前に特定した。一次選択の基準は、ＥＬＩＳＡ読取値がバックグラウンドシグナルの少なくとも二倍であることであった。
【００８７】
実施例２  抗体フラグメントのヒトＣＤ２７に対する親和性のバイオフィルム層干渉（ＢＬＩ）測定
そのＣ末端でヒスチジンタグを付加した各固有配列の抗体Ｆａｂフラグメントを、大腸菌発現系を用いて過剰発現させ、次いでＮｉ−ＮＴＡ親和性樹脂によって精製した。ＦａｂのヒトＣＤ２７に対する親和性を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６システムを使用し、以下の方法によって決定した：まず、ＢＬＩシステムのＡＨＣ（ヒトＩｇＧ抗体Ｆｃフラグメントについて特異的）センサを使用して、ヒトＣＤ２７−ＨｉｓＦｃ融合タンパク質を捕捉し、次いで５〜１０μｇ／ｍｌの各精製Ｆａｂタンパク質の濃度を有する測定緩衝液中に浸漬した。収集したデータを、Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ７．１ソフトウェアによって処理し、１：１  ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）モデル曲線に適合させた。さらなる分析及び発展実験のためにスクリーニングによって最高の結合能力を有する抗体ｍＡｂ０７７を得た。抗体のＣＤ２７に対する結合定数及び速度定数を表１に示す。
【００８８】
【表１】
2021519088.tif 000003
【００８９】
１Ｆ５−ＩｇＧは抗体バルリルマブ（Ｖａｒｌｉｌｕｍａｂ）である。
【００９０】
ヒトモノクローナル抗体ｍＡｂ０７７の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列は以下のとおりである。
【００９１】
ｍＡｂ０７７  ＶＨ
2021519088.tif 000004
配列番号１
【００９２】
ｍＡｂ０７７ ＶＬ
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSDLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRDAWPPTFGQGTKVEIK
配列番号２
【００９３】
これは以下のＣＤＲ配列を含む。
【００９４】
2021519088.tif 000005
【００９５】
選択された抗体軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列をデータベースに対してアラインメントさせた。配列番号１の配列を、データベースにおける重鎖生殖系列配列に対してアラインメントさせ、これは、生殖系列配列のＶＨ３ファミリーに属する、ＶＨ３−７４生殖系列配列に対して類似性を示す。配列番号２の配列を、データベースにおける軽鎖生殖系列配列に対してアラインメントさせ、これは、生殖系列配列のＶκ１ファミリーに属する、Ｖκ１−１２生殖系列配列に対して類似性を示す。
【００９６】
ＶＨ３−７４生殖系列配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLVWVSRINSDGSSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
配列番号１３
【００９７】
Ｖκ１−１２生殖系列配列
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFP
配列番号１４
【００９８】
実施例３  抗体ＦａｂフラグメントのＩｇＧへの変換、並びに、ＩｇＧの発現及び精製
各抗体フラグメントを哺乳動物細胞の発現ベクターにクローニングして、軽鎖及び重鎖ＩｇＧ１サブタイプ抗体を発現させた。ＨＥＫ２９３細胞を、標準手順にしたがって、適合したベクターで一過的にトランスフェクトした。発現後、上清を遠心ろ過によって集め、次いでＩｇＧをプロテインＡ親和性クロマトグラフィによって精製した。溶出したタンパク質を中和し、イオン交換によってＰＢ緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に移した。タンパク質濃度を紫外分光光度計により測定し、その純度及び特性を、変性、還元又は非還元条件下で測定した。
【００９９】
軽鎖の完全長配列
ｍＡｂ０７７ ＬＣ
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSDLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRDAWPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号９
【０１００】
重鎖の完全長配列
ｍＡｂ０７７  ＨＣ
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGIHWVRQAPGKGLEWIGWINPNRGSTKYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARDPGYTWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号１０
【０１０１】
実施例４  質量スペクトルを使用したｍＡｂ０７７分子のペプチドマップ分析
分取スケールＩＥＣを使用して、その後の試験のためにｍＡｂ０７７の酸ピーク及び主ピークの成分を分離した。５００μｇの各抗体サンプルを、６Ｍ塩酸グアニジンを含む４００μＬの０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に添加し、よく混合し、１Ｍ  ＤＴＴをサンプルに２０ｍＭの最終濃度まで添加し、よく混合し、水浴中、３７℃で１時間インキュベートした。サンプルを室温に平衡化し、ＩＡＭを５０ｍＭの最終濃度まで添加し、サンプルを３０分間暗所にてインキュベートし、次いで１０ｋＤａ限外ろ過チューブに移し、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、サンプルを、２Ｍ尿素を含有する４００μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液に限外ろ過のために添加して、もとの緩衝液と置換し、緩衝液の置換をもう一度繰り返した。限外ろ過サンプルをタンパク質濃度について試験し、サンプルの濃度を、２Ｍ尿素を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液で０．５ｍｇ／ｍｌに調整した。４μＬのトリプシン酵素を、２５：１のサンプル対酵素比で添加し、混合物を水浴中で３７℃にて４時間インキュベートした。調製したサンプルを、ＬＣ−ＭＳデータ収集のためにＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラムを用いるＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ＿Ｑ−ＴＯＦカラー−質量分析計を用いて実施した。クロマトグラフ移動相Ａ：０．１％ギ酸水、移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル。Ｗａｔｅｒｓ  ＵＮＩＦＩを使用して、各ペプチドの質量スペクトル情報を抽出し、配列比較を実施して、抗体のペプチドカバレッジを決定した。改変設定は以下の通りであった。Ｇ０Ｆ（＋１４４４．５３３８７）及び他のグリコシル化設定を動的改変に設定した。カルバミドメチルＣ（＋５７．０２１４６）を固定改変に設定した。酸化Ｍ及び脱アミド化Ｎは動的改変であった、標的適合許容範囲を２０ｐｐｍに設定した。フラグメント適合許容範囲を５０ｐｐｍに設定した。
【０１０２】
【数１】
2021519088.tif 000006
【０１０３】
分析結果を図１に示す。ｍＡｂ０７７の分離後の重鎖の７４番目のアミノ酸アスパラギン（Ｋａｂａｔ位置番号は７３である）の酸ピークの成分の脱アミド化率は５９．６％であり、一方、主ピークの成分の脱アミド化率はわずか１２．２％であり、これにより、ｍＡｂ０７７サンプルの重鎖可変領域における７４番目のアミノ酸アスパラギン（Ｋａｂａｔ位置番号は７３である）が著しく脱アミノ化され、この部位での脱アミド化の結果、ＩＥＣ上の酸ピークの遊離成分が得られたことが確認された。したがって、我々は、重鎖可変領域の７４番目のアミノ酸アスパラギン（Ａｓｎ）（Ｋａｂａｔ位置番号は７３である）をトレオニン（Ｔｈｒ）で置換した。変異後の分子０７７Ｎ７４Ｔの重鎖可変領域の配列は以下のとおりである（軽鎖はもとのｍＡｂ０７７と同じである）。
【０１０４】
０７７Ｎ７４Ｔ ＶＨ
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGIHWVRQAPGKGLEWIGWINPNRGSTKYAQKFQGRVTISRDTSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARDPGYTWYFDVWGQGTLVTVSS
配列番号１１
【０１０５】
変異後の０７７Ｎ７４Ｔ抗体の重鎖の完全長配列
０７７Ｎ７４Ｔ ＨＣ
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGIHWVRQAPGKGLEWIGWINPNRGSTKYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARDPGYTWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号１２
【０１０６】
実施例５  抗ＣＤ２７抗体及びその変異分子のヒトＣＤ２７抗原との親和性のＢｉａｃｏｒｅ比較
プロテインＡバイオセンサチップを使用して、試験する抗体分子を親和性捕捉し、次いで、様々な勾配濃度のヒトＣＤ２７−ｈｉｓ抗原（Ｙｉｑｉａｏ  Ｓｈｅｎｚｈｏｕ＃１００３９−Ｈ０８Ｈ）をチップの表面上に流し、反応シグナルを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置を用いてリアルタイムで検出して、会合及び解離曲線を得た。各実験サイクルの解離が完了した後、バイオセンサチップを洗浄し、グリシン−塩酸再生溶液（ｐＨ１．５）で再生させた。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン４．１及びＧＥソフトウェアを使用して、データを（１：１）ラングミュアモデルと適合させ、以下の表に示すような親和性値を得た。変異分子０７７Ｎ７４Ｔの親和性は元のｍＡｂ０７７分子よりも若干高いが、有意差はない。
【０１０７】
【表２】
2021519088.tif 000007
【０１０８】
実施例６  抗ＣＤ２７抗体及びその変異分子のイオン交換酸−塩基ピークの分析
Ａｇｉｌｅｎｔ−１２６０高性能液体クロマトグラフを使用し、移動相Ａ：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５０）、及び移動相Ｂ：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５０）であった。試験する抗体タンパク質サンプルを脱塩した後、移動相Ａを使用して、試験生成物を約５．０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈し、注入容積は０．８ｍＬ／分の流量で５０μｇであった。ブランク緩衝液及び試験生成物をそれぞれサンプルボトル又はライナー付チューブに入れ、システムを、９６．０％移動相Ａ＋４．０％移動相Ｂで、０．８ｍＬ／分の流量にて、ベースラインが安定になるまで平衡化させた。次いで、サンプルを注入し、クロマトグラムを記録した。サンプル検出が終了した後、１Ｍ  ＮａＣｌを使用して、カラムを０．２〜０．５ｍＬ／分の流量で洗浄した。分析結果を図２に示す。抗ＣＤ２７抗体ｍＡｂ０７７は、ＩＥＣ液相ダイアグラムにおいて約２９分でかなりの酸ピーク成分を生じる一方で、変異体０７７Ｎ７４Ｔ分子のかかる酸ピークの成分は、分子が脱アミド化しないために消失した。
【０１０９】
実施例７  抗ＣＤ２７抗体０７７Ｎ７４Ｔ加速熱安定性試験
０７７Ｎ７４Ｔ抗体溶液を加速熱安定性試験のために４０℃のインキュベータ中に入れた。サンプルを第１５日及び第３０日の時点で採取し、ｉＣＩＥＦ−フル−カラムイメージングキャピラリ焦点電気泳動（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ  Ｅ５０６３４フル−カラムイメージングキャピラリ等電点アナライザー、焦点時間１：１５００Ｖで１分、焦点時間２：３０００Ｖで８分）を使用して、試験する抗体タンパク質の等電点（ｐＩ）不均一性及び加熱前後の異なる時点でのそれらの酸−塩基成分の変化の傾向を分析した。結果を図３及び表３に示す。０７７Ｎ７４Ｔを４０℃で１５日間置いた後、成分の割合に有意な変化はなかった、タンパク質を一カ月置いた後、ｐＩ９．０の酸性成分は１０．４％増加し、ｐＩ９．１の中性基のパーセンテージは１２．３％減少した。全体として、変異抗体はまた良好な熱安定性を有し、脱アミド化のために鋭い酸ピークをさらに増加しないことが分かる。
【０１１０】
【表３】
2021519088.tif 000008
【０１１１】
実施例８  抗ＣＤ２７抗体及びその変異分子のインビトロＰＢＭＣ活性化機能
ヒト血液ＰＢＭＣをフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）密度勾配遠心分離法によって新鮮なヘパリン抗凝固処理血液から分離した。３μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体及び試験される異なる濃度の各抗体薬（ＩｇＧ１サブタイプ対照としてのハーセプチン）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃にて一晩インキュベートした。翌日プレートを洗浄した後、２×１０５／ウェルの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を添加し、プレートをインキュベータ中で７日間、３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベート後、ＣＣＫ−８キットを使用して、ＰＢＭＣの増殖を検出し、ＥＣ５０をＯＤ４５０値に基づいて算出した。結果を図４に示し、ＰＢＭＣ増殖活性についての変異分子０７７Ｎ７４Ｔの刺激は、本来のｍＡｂ０７７分子のものよりも若干強い。
【０１１２】
実施例９  抗ＣＤ２７抗体及びその変異分子のインビボ有効性の比較
５４匹のＣＢ１７−ＳＣＩＤマウス、メス、５〜６週令、１８〜２０ｇ、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｗｅｉｔｏｎｇｌｉｈｕａから購入したものを、各群９匹のマウスを含む６群に分割した。Ｒａｊｉ細胞をインビトロで、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。指数増殖期のＲａｊｉ細胞を集め、ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスに無菌条件下で皮下移植し、各マウスに２×１０６細胞を接種した。参照抗体バルリルマブはＣｅｌｌｄｅｘによって開発された抗ＣＤ２７抗体である（詳細についてはＣＮ１０３１５４０３４Ｂを参照のこと）。腫瘍接種当日を第０日とした。初回投与をワクチン接種の第３日に実施し、次いで以下のように進めた：
【０１１３】
グループ１：ＩｇＧ１  ３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、Ｎ＝９、Ｑ２Ｄ、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７日、
グループ２：００７７Ｎ７４Ｔ  ３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、Ｎ＝９、Ｑ２Ｄ、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７日、
グループ３：００７７Ｎ７４Ｔ  １０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、Ｎ＝９、Ｑ２Ｄ、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７日、
グループ４：００７７Ｎ７４Ｔ  ３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、Ｎ＝９、Ｑ２Ｄ、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７日、
グループ５：ｍＡｂ０７７  ３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、Ｎ＝９、Ｑ２Ｄ、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７日、
グループ６：バルリルマブ３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、Ｎ＝９、Ｑ２Ｄ、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７日、
【０１１４】
動物の日周行動を投与後毎日１８日間モニタリングした。ノギスを用いて腫瘍の長径及び短径を測定した後、腫瘍体積を長さ×幅２／２で算出した。腫瘍成長阻害値は式ＴＧＩ％＝（１−Ｔ／Ｃ）×１００％を採用した。Ｔ及びＣは、それぞれ特定時点での治療群及び対照群の腫瘍体積（ＴＶ）である。重量変化は、式ＲＣＢＷ％＝（ＢＷｉ−ＢＷ０）／ＢＷ０×１００％を採用し、ＢＷｉはマウスの現在の重量であり、ＢＷ０は、グループ分け当日のマウスの重量である。すべての実験結果は、平均腫瘍体積±標準誤差（ＳＥＭ）として表示した。Ｔ−検定法を使用して、治療群と対照群との間で腫瘍体積及び腫瘍重量を比較して、有意差があるかどうかを調べた。すべてのデータをＧｒａｐｈｐａｄによって分析し、ｐ＜０．０５は有意差を示した。
【０１１５】
図５及び図６に示すように、Ｒａｊｉ移植腫瘍モデルにおいて、０７７Ｎ７４Ｔは用量依存的な抗腫瘍効果を示した。低、中、及び高用量群の腫瘍成長阻害値（ＴＧＩ）は、それぞれ、６２％、６７％及び７３％であった。そして、最高用量群（３０ｍｇ／ｋｇ）における０７７Ｎ７４Ｔの抗腫瘍効果は、変異前のｍＡｂ０７７（５９％）又は同じ用量での参照抗体バルリルマブ（６１％）よりも若干強かった。各投与群でマウスの有意な減量はなく、マウスが異なる用量での各抗体に対して十分に耐性があったことを示す。
【０１１６】
本発明の具体的な実施形態を記載してきたが、これらが単に例示的であって、本発明の原理及び主旨から逸脱することなく、様々な変更又は改変できることを当業者は理解するはずであり、これらの均等な形態はまた、本願の添付の請求の範囲によって規定される範囲内に含まれる。
【図１】
2021519088.tif 000009
【図２】
2021519088.tif 000010
【図３】
2021519088.tif 000011
【図４】
2021519088.tif 000012
【図５】
2021519088.tif 000013
【図６】
2021519088.tif 000014
【配列表】
2021519088000001.app
【国際調査報告】
2021519088.tif 000015
2021519088.tif 000016
2021519088.tif 000017
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