(57)【要約】ある実施形態では、本開示はＮ−１大規模バイオリアクター細胞培養物の生細胞密度を増加させる新規な方法を提供し、該方法は目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞を非灌流ベースの培養系で培養することを含み、ここで生細胞密度は少なくとも５×１０６細胞／ｍＬまで増加する。ある実施形態では、本開示は目的の組換えポリペプチドの大規模産生のための新規な方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：（１）目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞を非灌流ベースの培養系においてＮ−１段階で培養する、ここで生細胞密度は少なくとも５×１０６細胞／ｍＬまで増加する；および（２）Ｎフェドバッチ産生細胞を少なくとも１．５×１０６細胞／ｍＬの高播種密度を有する濃縮培地中で培養する、ここでＮフェドバッチ産生細胞は非灌流ベースの培養系においてＮ−１段階から接種される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−１大規模バイオリアクター細胞培養物の生細胞密度を増加させる方法であって、目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞を非灌流ベースの培養系で培養することを含み、生細胞密度が少なくとも５×１０６細胞／ｍＬまで増加する、方法。
【請求項２】
非灌流ベースの培養系がバッチまたはフェドバッチバイオリアクターである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｎ−１段階の生細胞密度が、少なくとも５×１０６、少なくとも１０×１０６、少なくとも１５×１０６、少なくとも２０×１０６、少なくとも２５×１０６、または少なくとも３０×１０６生細胞／ｍＬである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細胞生存率が、Ｎ−１段階の最終日において少なくとも８０％、Ｎ−１段階の最終日において少なくとも８５％、またはＮ−１段階の最終日において少なくとも９０％である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞がＮ−１バッチ培養のために濃縮培地中で培養される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞がＮ−１フェドバッチ培養のためにフィード培地を添加した播種培地中で培養される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
培地がフィード培地によって非濃縮培地に対して少なくとも５％、非濃縮培地に対して少なくとも１０％、非濃縮培地に対して少なくとも１５％、または非濃縮培地に対して少なくとも２０％濃縮されている、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
濃縮培地またはフィード培地が増加した量の炭素源を含む、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
炭素源がグルコースである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
濃縮培地またはフィード培地が増加した量の栄養素を含む、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
栄養素が、アミノ酸、脂質、ビタミン、ミネラルおよびポリアミンから選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
濃縮培地が増加した量の炭素源および栄養素を含む、請求項５〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
炭素源がグルコースであり、栄養素がアミノ酸、脂質、ビタミン、ミネラルおよびポリアミンから選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
哺乳類細胞が、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫおよびハイブリドーマ細胞からなる群から選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
目的のポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
目的のポリペプチドが抗体または抗原結合フラグメントである、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
抗体または抗原結合フラグメントが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＣＸＣＲ４、ＣＤ７３ ＨＥＲ２、ＶＥＧＦ、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＤ１１ａ、組織因子（ＴＦ）、ＰＳＣＡ、ＩＬ−８、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からなる群から選択される抗原に結合する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
バイオリアクターが少なくとも５０Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１，０００Ｌ、少なくとも５，０００Ｌ、または少なくとも１０，０００Ｌである、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
目的の組換えポリペプチドを産生させるためにＮ産生段階の接種に使用される濃縮されたバッチ培養またはフェドバッチ培養において、Ｎ−１段階に少なくとも５×１０６生細胞／ｍＬを培養することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
目的のポリペプチドを産生培養系から単離する工程をさらに含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
以下を含む、目的の組換えポリペプチドの大規模産生のための方法：（１）目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞をＮ−１段階において非灌流ベースの培養系で培養する、ここで生細胞密度は少なくとも５×１０６細胞／ｍＬまで増加する；および（２）Ｎフェドバッチ産生細胞を少なくとも１．５×１０６細胞／ｍＬの高播種密度で基本培地または濃縮基本培地中において培養する、ここでＮフェドバッチ産生細胞はＮ−１段階から非灌流ベースの培養系において接種される。
【請求項２４】
Ｎ産生培養系がフェドバッチバイオリアクターである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
濃縮基本培地がフィード培地によって非濃縮培地に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％濃縮されている、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
濃縮培地が増加した量の炭素源を含む、請求項２３〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
炭素源がグルコースである、請求項２７記載の方法。
【請求項２８】
濃縮培地が増加した量の栄養素を含む、請求項２３〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
栄養素が、アミノ酸、脂質、ビタミン、ミネラルおよびポリアミンから選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３０】
濃縮培地が増加した量の炭素源および栄養素を含む、請求項２３〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
炭素源がグルコースであり、栄養素がアミノ酸、脂質、ビタミン、ミネラルおよびポリアミンから選択される、請求項３１記載の方法。
【請求項３２】
バイオリアクターが少なくとも５０Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１，０００Ｌ、少なくとも５，０００Ｌ、少なくとも１０，０００Ｌ、少なくとも１５，０００Ｌ、または少なくとも２０，０００Ｌである、請求項２３記載の方法。
【請求項３３】
宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項２３記載の方法。
【請求項３４】
宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３４記載の方法。
【請求項３５】
目的のポリペプチドの力価が少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも３ｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｇ／Ｌである、請求項２３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
宿主細胞がＮフェドバッチ産生バイオリアクターのための基本培地または濃縮基本培地中で培養され、少なくとも１．５×１０６、少なくとも５×１０６、または少なくとも１０×１０６生細胞／ｍＬの生細胞密度が得られる、請求項２３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
目的のポリペプチドを単離する工程をさらに含む、請求項２３記載の方法。
【請求項３８】
目的のポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項２３〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
目的のポリペプチドが抗体または抗原結合フラグメントである、請求項２３〜３８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、細胞培養物製造のための高播種密度でのＮ産生バイオリアクターの接種のために非灌流戦略を用いてＮ−１培養段階において生細胞密度を増加させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質およびポリペプチドは治療物質としてますます重要になってきている。ほとんどの場合、治療用タンパク質およびポリペプチドは、目的のポリペプチドを異常に高いレベルで産生するように設計および／または選択された細胞から細胞培養において産生される。細胞培養条件の制御および最適化は、タンパク質およびポリペプチドの商業的生産を成功させるために極めて重要である。
【０００３】
細胞培養において産生される多くのタンパク質またはポリペプチドは、細胞を一定期間培養した後、培養を終了し、産生されたタンパク質またはポリペプチドを単離するフェドバッチ法で製造される。産生されるタンパク質またはポリペプチドの最終的な量および質は、Ｎ−１播種培養およびＮ産生時の播種密度によって大きく影響され得る。フェドバッチ培養法におけるタンパク質またはポリペプチドの産生を改善するための努力がなされてきたが、さらなる改善の必要性がある。
【０００４】
灌流細胞培養は、従来のフェドバッチ細胞培養系よりもはるかに高い生細胞密度を達成できる。灌流細胞培養は老廃物を除去しながら培養系に新鮮な培地の継続的な供給を提供し、これは細胞が増殖するための豊かな環境を提供する。従来の低播種密度のフェドバッチ産生培養と比較して、Ｎ−１灌流播種を接種した高播種密度のフェドバッチ産生培養は短時間でより高い最終的な力価を達成できる。しかし、灌流細胞培養は、大規模な培養系（例えば２００Ｌを超えるバイオリアクター）で使用する場合には、大量の細胞培地を消費するため高価となる。また、灌流細胞培養は、特に大規模な製造において細胞が細胞培養系から除去されるのを防ぐ細胞保持システムが複雑になり得る。
【０００５】
非灌流系を用いた高播種細胞密度での大規模細胞培養によってタンパク質およびポリペプチドを産生するための改良された系の開発が特に必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、Ｎ−１大規模バイオリアクター細胞培養物の生細胞密度を増加させる方法に関し、該方法は目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞を非灌流ベースの培養系で培養することを含み、ここで生細胞密度は少なくとも５×１０６細胞／ｍＬまで増加する。いくつかの実施形態では、非灌流ベースの培養系はバッチまたはフェドバッチバイオリアクターである。いくつかの実施形態では、Ｎ−１段階の生細胞密度は少なくとも５×１０６、少なくとも１０×１０６、少なくとも１５×１０６、少なくとも２０×１０６、少なくとも２５×１０６、または少なくとも３０×１０６生細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、細胞生存率は、Ｎ−１段階の最終日において少なくとも８０％、Ｎ−１段階の最終日において少なくとも８５％、またはＮ−１段階の最終日において少なくとも９０％である。
【０００７】
本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞はＮ−１バッチ培養のために濃縮培地中で培養される。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＮ−１フェドバッチ培養のためにフィード培地を添加した播種培地中で培養される。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態では、培地はフィード培地によって非濃縮培地に対して少なくとも５％、非濃縮培地に対して少なくとも１０％、非濃縮培地に対して少なくとも１５％、または非濃縮培地に対して少なくとも２０％濃縮されている。いくつかの実施形態では、濃縮培地またはフィード培地は増加した量の炭素源を含む。いくつかの実施形態では、炭素源はグルコースである。いくつかの実施形態では、濃縮培地またはフィード培地は増加した量の栄養素を含む。いくつかの実施形態では、栄養素は、アミノ酸、脂質、ビタミン、ミネラルおよびポリアミンから選択される。いくつかの実施形態では、濃縮培地は増加した量の炭素源および栄養素を含む。いくつかの実施形態では、炭素源はグルコースであり、栄養素はアミノ酸、脂質、ビタミン、ミネラルおよびポリアミンから選択される。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫおよびハイブリドーマ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態では、目的のポリペプチドは治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドは抗体または抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＣＸＣＲ４、ＣＤ７３ ＨＥＲ２、ＶＥＧＦ、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＤ１１ａ、組織因子（ＴＦ）、ＰＳＣＡ、ＩＬ−８、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からなる群から選択される抗原に結合する。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態では、バイオリアクターは少なくとも５０Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１，０００Ｌ、少なくとも５，０００Ｌ、または少なくとも１０，０００Ｌである。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、目的の組換えポリペプチドを産生させるためにＮ産生段階の接種に使用される濃縮されたバッチ培養またはフェドバッチ培養において、Ｎ−１段階に少なくとも５×１０６生細胞／ｍＬを培養することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、目的のポリペプチドを産生培養系から単離する工程をさらに含む。
【００１３】
本開示はまた、以下を含む、目的の組換えポリペプチドの大規模産生のための方法に関する：（１）目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞をＮ−１段階において非灌流ベースの培養系で培養する、ここで生細胞密度は少なくとも５×１０６細胞／ｍＬまで増加する；および（２）Ｎフェドバッチ産生細胞を少なくとも１．５×１０６細胞／ｍＬの高播種密度で基本培地または濃縮基本培地中において培養する、ここでＮフェドバッチ産生細胞はＮ−１段階から非灌流ベースの培養系において接種される。いくつかの実施形態では、Ｎ産生培養系はフェドバッチバイオリアクターである。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態では、濃縮基本培地はフィード培地によって非濃縮培地に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％濃縮されている。いくつかの実施形態では、濃縮培地は増加した量の炭素源を含む。いくつかの実施形態では、炭素源はグルコースである。いくつかの実施形態では、濃縮培地は増加した量の栄養素を含む。いくつかの実施形態では、栄養素は、アミノ酸、脂質、ビタミン、ミネラルおよびポリアミンから選択される。いくつかの実施形態では、濃縮培地は増加した量の炭素源および栄養素を含む。いくつかの実施形態では、炭素源はグルコースであり、栄養素はアミノ酸、脂質、ビタミン、ミネラルおよびポリアミンから選択される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態では、バイオリアクターは少なくとも５０Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１，０００Ｌ、少なくとも５，０００Ｌ、少なくとも１０，０００Ｌ、少なくとも１５，０００Ｌ、または少なくとも２０，０００Ｌである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態では、目的のポリペプチドの力価は少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも３ｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｇ／Ｌである。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞はＮフェドバッチ産生バイオリアクターのための基本培地または濃縮基本培地中で培養され、少なくとも１．５×１０６、少なくとも５×１０６、または少なくとも１０×１０６生細胞／ｍＬの生細胞密度が得られる。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、目的のポリペプチドを単離する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドは治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドは抗体または抗原結合フラグメントである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａは、ＣＨＯ細胞株Ａについて以下の細胞培養系で増殖させたＮ−１細胞培養物の生存細胞密度（「ＶＣＤ」）を示す：灌流、フェドバッチ、バッチ、濃縮されたグルコースを伴うバッチ、ならびに濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチの細胞培養系。図１Ｂは、細胞株Ａについて以下の細胞培養系で増殖させたＮ−１細胞培養物の細胞生存率（％）を示す：灌流、フェドバッチ、バッチ、濃縮されたグルコースを伴うバッチ、ならびに濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【００２１】
【図２Ａ】図２Ａは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いた細胞株Ａによるポリペプチド−１のためのＮ産生培養の生存細胞密度を示す：灌流、フェドバッチ、濃縮されたグルコースを伴うバッチ、ならびに濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【図２Ｂ】図２Ｂは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いた産生培養において増殖させた目的のポリペプチドの力価を示す：灌流、フェドバッチ、濃縮されたグルコースを伴うバッチ、ならびに濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【図２Ｃ】図２Ｃは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ａによるポリペプチド−１の産生培養において増殖させた目的のポリペプチドの画像化キャピラリー等電点電気泳動（「ｉＣＩＥＦ」）、サイズ排除クロマトグラフィー（「ＳＥＣ」）、およびＮ−グリカン分析を示す：灌流、フェドバッチ、濃縮されたグルコースを伴うバッチ、ならびに濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【００２２】
【図３】図３Ａは、ＣＨＯ細胞株Ｂについて以下の細胞培養系で増殖させたＮ−１細胞培養物のＶＣＤを示す：灌流、フェドバッチ、バッチ、濃縮されたグルコースを伴うバッチ、ならびに濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチの細胞培養系。図３Ｂは、ＣＨＯ細胞株Ｂについて以下の細胞培養系で増殖させたＮ−１細胞培養物の細胞生存率（％）を示す：灌流、フェドバッチ、バッチ、濃縮されたグルコースを伴うバッチ、ならびに濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【００２３】
【図４Ａ】図４Ａは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ｂによるポリペプチド−２のためのＮ産生培養の生存細胞密度を示す：灌流、フェドバッチ、濃縮されたグルコースを伴うバッチ、ならびに濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【図４Ｂ】図４Ｂは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ｂによるポリペプチド−２のためのＮ産生培養において増殖させた目的のポリペプチドの力価を示す：灌流、フェドバッチ、濃縮されたグルコースを伴うバッチ、ならびに濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【図４Ｃ】図４Ｃは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ｂによるポリペプチド−２のＮ産生培養において増殖させた目的のポリペプチドのｉＣＩＥＦ、ＳＥＣおよびＮ−グリカン分析を示す：灌流、フェドバッチ、濃縮されたグルコースを伴うバッチ、ならびに濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【００２４】
【図５】図５Ａは、ＣＨＯ細胞株Ｃについて以下の細胞培養系で増殖させたＮ−１細胞培養物のＶＣＤを示す：灌流、フェドバッチ、バッチ、濃縮されたグルコースを伴うバッチ、ならびに濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチの細胞培養系。図５Ｂは、以下の細胞培養系で増殖させたＮ−１細胞培養物の細胞生存率（％）を示す：灌流、フェドバッチ、バッチ、濃縮されたグルコースを伴うバッチ、ならびに濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【００２５】
【図６Ａ】図６Ａは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ｃによるポリペプチド−３のためのＮ産生培養物の生細胞密度を示す：フェドバッチ、ならびに濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【図６Ｂ】図６Ｂは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ｃによるポリペプチド−３のための産生培養において増殖させた目的のポリペプチドの力価を示す：フェドバッチ、ならびに濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【図６Ｃ】図６Ｃは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ｃによるポリペプチド−３のＮ産生培養において増殖させた目的のポリペプチドのｉＣＩＥＦ、ＳＥＣおよびＮ−グリカン分析を示す：フェドバッチ、ならびに濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【００２６】
【図７Ａ】図７Ａは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ｃによるポリペプチド−３のためのＮ産生培養物の生細胞密度を示す：灌流およびフェドバッチ。
【図７Ｂ】図７Ｂは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ｃによるポリペプチド−３のための産生培養において増殖させた目的のポリペプチドの力価を示す：灌流およびフェドバッチ。
【図７Ｃ】図７Ｃは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ｃによるポリペプチド−３のＮ産生培養において増殖させた目的のポリペプチドのｉＣＩＥＦ、ＳＥＣおよびＮ−グリカン分析を示す：灌流およびフェドバッチ。
【００２７】
【図８Ａ】図８Ａは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ａによるポリペプチド−１のための１０００Ｌスケール（ｎ＝３）および５Ｌサテライト（ｎ＝２）でのＮ産生培養物の生細胞密度を示す：濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【図８Ｂ】図８Ｂは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ａによるポリペプチド−１のための１０００Ｌスケール（ｎ＝３）および５Ｌサテライト（ｎ＝２）での産生培養において増殖させた目的のポリペプチドの力価を示す：濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【図８Ｃ】図８Ｃは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ａによるポリペプチド−１のための１０００Ｌスケール（ｎ＝３）および５Ｌサテライト（ｎ＝２）でのＮ産生培養において増殖させた目的のポリペプチドのｉＣＩＥＦ、ＳＥＣおよびＮ−グリカン分析を示す：濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【００２８】
【図９Ａ】図９Ａは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ｂによるポリペプチド−２のための５００Ｌスケール（ｎ＝１）および５Ｌサテライト（ｎ＝２）でのＮ産生培養物の生細胞密度を示す：濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【図９Ｂ】図９Ｂは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ｂによるポリペプチド−２のための５００Ｌスケール（ｎ＝１）および５Ｌサテライト（ｎ＝２）での産生培養において増殖させた目的のポリペプチドの力価を示す：濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【図９Ｃ】図９Ｃは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ｂによるポリペプチド−２のための５００Ｌスケール（ｎ＝１）および５Ｌサテライト（ｎ＝２）でのＮ産生培養において増殖させた目的のポリペプチドのｉＣＩＥＦ、ＳＥＣおよびＮ−グリカン分析を示す：濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ。
【００２９】
【図１０Ａ】図１０Ａは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ｃによるポリペプチド−３のための５００Ｌスケール（ｎ＝１）および５Ｌサテライト（ｎ＝２）でのＮ産生培養物の生細胞密度を示す：フェドバッチ。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ｃによるポリペプチド−３のための５００Ｌスケール（ｎ＝１）および５Ｌサテライト（ｎ＝２）での産生培養において増殖させた目的のポリペプチドの力価を示す：フェドバッチ。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、以下のＮ−１細胞培養系からの播種培養物を用いたＣＨＯ細胞株Ｃによるポリペプチド−３のための５００Ｌスケール（ｎ＝１）および５Ｌサテライト（ｎ＝２）でのＮ産生培養において増殖させた目的のポリペプチドのｉＣＩＥＦ、ＳＥＣおよびＮ−グリカン分析を示す：フェドバッチ。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
ある実施形態では、本開示はＮ−１大規模バイオリアクター細胞培養物の生細胞密度を増加させる新規な方法を提供し、該方法は目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞を非灌流ベースの培養系で培養することを含み、ここで生細胞密度は少なくとも５×１０６細胞／ｍＬまで増加する。ある実施形態では、本開示は目的の組換えポリペプチドの大規模産生のための新規な方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：（１）目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞を非灌流ベースの培養系においてＮ−１段階で培養する、ここで生細胞密度は少なくとも５×１０６細胞／ｍＬまで増加する；および（２）Ｎ−１細胞培養物から非灌流ベースの培養系において接種された細胞をＮ産生段階において少なくとも１．５×１０６細胞／ｍＬまでの高播種密度で濃縮培地中で培養する。
【００３１】
定義
不定冠詞「a」または「an」は、記載または列挙された任意の成分の「１つ以上」を指すと理解されるべきである。
【００３２】
本明細書における用語「約」は当業者によって決定される特定の値または組成の許容誤差範囲内にある値または組成を指し、これは値または組成がどのように測定または決定されるか（すなわち測定系の限界）に部分的に依存する。例えば「約」は、当分野の慣例により１標準偏差の範囲内または１を超える標準偏差の範囲内を意味し得る。あるいは、「約」は最大で２０％の範囲を意味し得る。さらに、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、本用語は最大で一桁分または最大で５倍の値を意味し得る。特定の値または組成が本願および特許請求の範囲において提供される場合、別段の記載がない限り、「約」の意味はその特定の値または組成の許容誤差範囲内であると想定されるべきである。
【００３３】
本明細書における用語「および／または」は、２つの特定された特徴または成分のそれぞれの他方を伴うか、または伴わない具体的な開示として解釈されるべきである。したがって、本明細書における「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句において使用される用語「および／または」は、以下の各態様を包含することが意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；および、Ｃ（単独）。代替物（例えば「または」）の使用は、代替物のいずれか一方、両方、またはそれらの任意の組合せを意味することが理解されるべきである。
【００３４】
本明細書における用語「アミノ酸」は、その最も広い意味において、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は一般構造Ｈ２Ｎ−−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−−ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸である；いくつかの実施形態では、アミノ酸はＤ−アミノ酸である；いくつかの実施形態では、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。アミノ酸（ペプチド中のカルボキシ末端および／またはアミノ末端のアミノ酸を含む）は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、および／またはペプチドの活性に不利な影響を与えることなくペプチドの循環半減期を変化させ得る他の化学基による置換によって修飾されてい得る。アミノ酸はジスルフィド結合に関与してい得る。アミノ酸は、１以上の翻訳後修飾（１以上の化学物質（例えば、メチル基、アセテート基、アセチル基、リン酸基、ホルミル成分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール成分、脂質成分、糖鎖、ビオチン成分など）との結合など）を含んでい得る。いくつかの実施形態では、本発明のアミノ酸は細胞培養用の培地中に提供され得、または該培地中に添加するために使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞培養培地中に提供されるか、または該培地に添加するために使用されるアミノ酸は、塩または水和物の形態で提供され得る。
【００３５】
本明細書における用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して標的（タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはそれらの組合せなど）を認識して特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。本明細書において、本用語は、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントなど）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体、多特異性抗体（少なくとも２つの無傷な抗体から作製された二重特異性抗体など）、単一特異性抗体、一価抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、および抗体が所望の生物学的活性を示す限り抗原認識部位を含む他のあらゆる修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、それぞれ以下の５つの主要な免疫グロブリンのクラスのいずれかであり得る：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）。異なるクラスの免疫グロブリンは異なる周知のサブユニット構造および三次元構成を有する。抗体はネイキッド抗体であり得、または他の分子（限定されないが、毒素および放射性同位体を含む）と結合してい得る。
【００３６】
本明細書において、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合フラグメント」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は完全長抗体のフラグメントによって果たされ得ることが示されている。
用語「抗原結合フラグメント」に包含される結合フラグメントの例としては、例えば（ｉ）Ｆａｂフラグメント（パパイン切断からのフラグメント）またはＶＬ、ＶＨ、ＬＣおよびＣＨ１ドメインからなる類似の一価のフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ペプシン切断からのフラグメント）またはヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂフラグメントを含む類似の二価のフラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；および（ｖｉｉ）合成リンカーによって任意に結合されてい得る２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せが挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、これらはこれらをＶＬおよびＶＨ領域が対となって一価の分子を形成している単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）とすることができる合成リンカーによって組換え法を用いて連結され得る。このような単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の従来の技術を用いて取得され、フラグメントは無傷の抗体と同様の方法で有用性のためにスクリーニングされる。抗原結合部分は組換えＤＮＡ技術によって、または無傷の免疫グロブリンの酵素的切断もしくは化学的切断によって作製され得る。
【００３７】
本明細書における用語「バッチ培養」は、細胞を培養するのに最終的に使用されるすべての成分（培地（下記の「培地」の定義を参照）および細胞自体を含む）が培養プロセスの最初に提供されている細胞の培養方法を指す。バッチ培養は典型的にはある時点で停止され、培地中の細胞および／または成分は回収され、任意で精製される。用語「フェドバッチ培養」は、細胞培養物から第１の液体培地を実質的または大幅に除去することなく、第２の液体培地を最初の細胞培養物に漸増的または連続的に添加することを意味する。いくつかの例では、第２の液体培地は第１の液体培地と同じである。他の例では、第２の液体培地は第１の液体培地の濃縮された形態であり、かつ／または乾燥粉末として添加される。
【００３８】
本明細書における用語「バイオリアクター」は、哺乳類細胞培養物の増殖に使用される任意の容器を指す。バイオリアクターは哺乳類細胞の培養に有用である限り任意のサイズであり得る。典型的には、バイオリアクターは少なくとも１リットルであり、１０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００リットルもしくはそれ以上、またはそれらの間の任意の容積であり得る。バイオリアクターの内部条件（限定されないが、ｐＨおよび温度を含む）は典型的には培養期間中に制御される。バイオリアクターは、本発明の培養条件下で培地中に懸濁させた哺乳類細胞培養物を保持するのに適した任意の材料（ガラス、プラスチックまたは金属を含む）で構成され得る。本明細書における用語「産生バイオリアクター」は、目的のポリペプチドまたはタンパク質の産生に使用される最終的なバイオリアクターを指す。大規模な細胞培養産生バイオリアクターの容積は、典型的には少なくとも５００リットルであり、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００リットルもしくはそれ以上、またはそれらの間の任意の容積であり得る。当業者は本発明の実施において使用するのに適したバイオリアクターを認識し、選択できる。
【００３９】
本明細書における用語「生細胞密度」は、所定の体積の培地中に存在する生細胞（生きている細胞）の数を指す。用語「標的細胞密度」は、培養中に組換えタンパク質を産生するための培地の体積当たりの細胞の具体的な濃度を意味する。標的細胞密度は、培養される具体的な哺乳類細胞に応じて様々であり得る。
【００４０】
本明細書における用語「細胞生存率」は、培養中の細胞が所定の培養条件または実験的変動の状況の下で生存する能力を指す。本明細書で使用される本用語はまた、特定の時点での培養物における生細胞および死細胞の総数に関して、その時点で生きている細胞の割合を指す。
【００４１】
本明細書における用語「培養物」、「細胞培養物」および「哺乳類細胞培養物」は、細胞集団の生存および／または増殖に適した条件下で培地中に懸濁された哺乳類細胞集団を指す。当業者には明らかであるように、本明細書におけるこれらの用語は、哺乳類細胞集団およびその集団が懸濁されている培地を含む組合せを指し得る。
【００４２】
用語「培養する」または「細胞培養する」は、一連の制御された物理的条件下での液体培地中における哺乳類細胞の維持または増殖を意味する。
【００４３】
本明細書における用語「培地」、「細胞培養培地」、「培養培地」は、増殖する哺乳類細胞に栄養を与える栄養素を含む溶液を指す。典型的には、これらの溶液は、最小限の増殖および／または生存のために細胞が必要とする必須および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質ならびに微量元素を提供する。溶液はまた、最小限の割合を上回るように増殖および／または生存を増強する成分（ホルモンおよび増殖因子を含む）を含み得る。溶液は、好ましくは細胞の生存および増殖に最適なｐＨおよび塩濃度に処方される。培地はまた、「合成培地」、すなわち未知の組成のタンパク質、加水分解物または成分を含まない無血清培地であり得る。限定培地は動物由来の成分を含まず、すべての成分は既知の化学構造を有する。用語「濃縮培地」または「濃縮された合成培地」は、標準培養培地と比較して追加または増加した量の炭素源および／または栄養素を含む培養培地である。
【００４４】
本明細書における用語「Ｎ−１段階」は、産生接種の直前の最後の播種増殖段階を指す。Ｎ−１段階は、ポリペプチド産生のための産生バイオリアクターを播種する前の最後の細胞増殖段階である。本明細書における用語「Ｎ−２段階」および「Ｎ−３段階」は（典型的にはＮ産生段階の接種前の）細胞増殖期間を指す。Ｎ−３段階は、Ｎ−２段階において使用するために生細胞密度を増加させるために使用される細胞増殖段階である。Ｎ−２段階は、Ｎ−１段階において使用するために生細胞密度を増加させるために使用される細胞増殖段階である。
【００４５】
本明細書における用語「灌流」または「灌流プロセス」は、細胞をリアクター内に保持しながら等量の培地（栄養補助物質を含む）をバイオリアクターに同時に添加および除去する細胞培養方法を指す。補助培地に対応する量の細胞および培地は、典型的には連続的または半連続的に除去され、任意で精製される。典型的には、灌流プロセスを含む細胞培養プロセスは「灌流培養」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、新鮮な培地は、細胞培養プロセスにおいて使用される基本培地と同一または類似してい得る。いくつかの実施形態では、新鮮な培地は基本培地とは異なり、所望の栄養補助物質を含み得る。いくつかの実施形態では、新鮮な培地は合成培地である。
【００４６】
本明細書における用語「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は単数の核酸および複数の核酸を包含することが意図され、単離された核酸分子またはコンストラクト（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ））を指す。ある態様において、ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または従来の結合ではない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などにおいて見出されるアミド結合）を含む。
【００４７】
本明細書における用語「ポリペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結されたモノマー（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は２以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。本明細書における用語「タンパク質」は、（いくつかの例においてアミド結合以外の結合によって結合され得る）１以上のポリペプチドで構成される分子を包含することが意図される。他方、タンパク質は単一のポリペプチド鎖であり得る。後者の例では、単一のポリペプチド鎖は、いくつかの例においてタンパク質を形成するために融合された２以上のポリペプチドサブユニットを含み得る。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」はまた、発現後修飾（限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含む）の産物を指す。ポリペプチドまたはタンパク質は天然の生物学的起源に由来し得、または組換え技術によって生成され得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されない。ポリペプチドまたはタンパク質は、化学合成を含む任意の方法で生成され得る。
【００４８】
本明細書における用語「目的のポリペプチド」は、精製が望まれる混合物中に存在する任意のタンパク質（天然または組換えのいずれか）を含むように最も広い意味で使用される。そのような目的のポリペプチドには、限定されないが、酵素、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、免疫グロブリン（例えば抗体）および／または任意の融合タンパク質が含まれる。
【００４９】
細胞培養の「産生段階」という用語は、細胞培養の最終段階を指す。産生段階では、細胞が最初に増殖し、次いでポリペプチドが産生される。産生段階は、一般的に「Ｎ」または細胞培養製造の最終段階と呼ばれる。
【００５０】
本明細書において互換的に使用される用語「精製する」、「分離する」、「単離する」または「回収する」は、細胞培地中に存在する１以上の他の成分（例えば、哺乳類細胞または培養培地タンパク質）、または哺乳類細胞溶解液中に存在する１以上の他の成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他のタンパク質）から組換えタンパク質を少なくとも部分的に精製または単離（例えば、少なくともまたは約５％、例えば、少なくとももしくは約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとももしくは約９５％の重量による純度）することを指す。通常、目的のタンパク質の純度の程度は、組成物から少なくとも１つの不純物を（完全または部分的に）除去することによって増加する。
【００５１】
本明細書における用語「組換え発現されたポリペプチド」および「組換えポリペプチド」は、そのポリペプチドを発現するように遺伝子操作された哺乳類宿主細胞から発現されたポリペプチドを指す。組換え発現されたポリペプチドは、哺乳類宿主細胞において通常発現されるポリペプチドと同一または類似であり得る。組換え発現されたポリペプチドはまた、宿主細胞に対して外来性（すなわち、哺乳類宿主細胞において通常発現されるペプチドに対して異種性）であり得る。あるいは、組換え発現されたポリペプチドは、ポリペプチドの一部が哺乳類宿主細胞において通常発現されるポリペプチドと同一または類似のアミノ酸配列を含み、他の部分が宿主細胞に対して外来性であるという点でキメラであり得る。
【００５２】
本明細書における用語「播種する」は、細胞培養物をバイオリアクターまたは別の容器に提供するプロセスを指す。細胞は別のバイオリアクターまたは容器において以前に増殖されていてもよい。あるいは、細胞は、凍結およびバイオリアクターまたは容器に提供される直前に解凍され得る。本用語は、単一の細胞を含む任意の数の細胞を指す。
【００５３】
用語「振盪フラスコ」は、少なくとも１つのガス透過性表面を有する液体培養培地の体積を保持できる容器（例えば、無菌容器）を意味する。例えば、振盪フラスコは、Ｔ−フラスコ、三角フラスコまたは当分野で承認されているそれらの任意の改良版などの細胞培養フラスコであり得る。
【００５４】
本明細書における用語「力価」は、哺乳類細胞培養物によって産生された組換え発現ポリペプチドまたはタンパク質の総量を所定量の培地体積で割ったものを指す。力価は通常、培地１ミリリットル当たりのポリペプチドまたはタンパク質のミリグラムの単位で表現される。
【００５５】
本開示の様々な態様が、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に説明される。
【００５６】
本発明の方法
ある実施形態では、本開示は、Ｎ−１大規模バイオリアクター細胞培養物の生細胞密度を増加させる新規の方法であって、目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞を非灌流ベースの培養系で培養することを含み、生細胞密度が少なくとも５×１０６細胞／ｍＬまで増加する、方法を提供する。
【００５７】
ある実施形態では、本開示は、以下を含む、目的の組換えポリペプチドの大規模産生のための新規の方法を提供する：（１）目的の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞をＮ−１段階において非灌流ベースの培養系で培養する、ここで生細胞密度は少なくとも５×１０６細胞／ｍＬまで増加する；および（２）Ｎ−１細胞培養物から非灌流ベースの培養系において接種された細胞をＮ産生段階において少なくとも１．５×１０６細胞／ｍＬまでの高播種密度で濃縮培地中で培養する。
【００５８】
宿主細胞
細胞培養およびポリペプチドの発現に感受性のある任意の哺乳類細胞または細胞型が、本発明に従って利用され得る。本発明に従って使用され得る哺乳類細胞の限定されない例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／１、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ、Leiden、The Netherlands））；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓株（浮遊培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞±ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１ ５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；ｂｕｆｆａｌｏラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５ １）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ Ｇ２）が含まれる。ある実施形態では、本発明はＣＨＯ細胞株の培養およびＣＨＯ細胞株からのポリペプチドおよびタンパク質の発現に使用される。
【００５９】
さらに、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する任意の数の市販および非市販のハイブリドーマ細胞株が本発明に従って利用され得る。当業者は、ハイブリドーマ細胞株が異なる栄養要求を有し得、かつ／または最適な増殖およびポリペプチドまたはタンパク質の発現のために異なる培養条件を必要とし得ることを理解しており、必要に応じて条件を改変できる。
【００６０】
上述したように、多くの例では、細胞は高レベルのタンパク質またはポリペプチドを産生するように選択または操作される。多くの場合、細胞は（例えば、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子の導入によって、かつ／または目的のポリペプチドをコードする（内因性か、または導入された）遺伝子の発現を調節する調節エレメントの導入によって）高レベルのタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
【００６１】
特定のポリペプチドは、細胞増殖、細胞生存率、または目的のポリペプチドまたはタンパク質の産生を何らかの方法で最終的に制限する細胞の他の特徴に有害な影響を有し得る。特定のポリペプチドを発現するように操作されたある特定の種類の細胞集団の間でさえ、特定の個々の細胞がより増殖し、かつ／またはより多くの目的のポリペプチドを産生するような細胞集団内の変動性が存在する。本発明のある実施形態では、細胞株は、細胞を培養するために選択された特定の条件下での頑強な増殖のために実践者によって経験的に選択される。他の実施形態では、特定のポリペプチドを発現するように操作された個々の細胞が、細胞増殖、最終的な細胞密度、％細胞生存率、発現されたポリペプチドの力価、もしくはこれらの任意の組合せ、または実践者によって重要であるとみなされた任意の他の条件に基づいて大規模産生のために選択される。
【００６２】
フェドバッチ細胞培養産生
目的のポリペプチドを産生するための典型的な手法は、播種増殖のためのバッチ培養およびフェドバッチ培養産生段階を含む。バッチ播種培養プロセスは伝統的に、大規模産生培養物に特定の細胞密度の播種培養物を接種し、細胞を細胞増殖および生存率を助ける条件下で増殖させ、かつ細胞が特定の細胞密度に達したときに播種培養物を次の段階に移行させることを含む。フェドバッチ培養手法は、バッチ培養物に細胞増殖中に消費される栄養素および他の成分を補充するさらなる工程を含む。当業者は、本発明が細胞を培養する任意のシステム（限定されないが、バッチ、フェドバッチおよび灌流システムを含む）に利用され得ることを認識する。本発明の特定の好ましい実施形態では、細胞はバッチまたはフェドバッチシステムにおいて増殖される。
【００６３】
濃縮培地
本発明は、本明細書に記載の他の培養工程に従って使用した場合に、Ｎ−１培養において宿主細胞の生細胞密度を増加させ、かつ／または非濃縮培地で培養された宿主細胞と比較して高播種密度での産生培養においてより多くの栄養素を提供する濃縮された合成培地処方物を提供する。細胞増殖または目的のポリペプチドの産生に有益な効果を有することが示されている本発明の濃縮培地処方物は、ｉ）増加した量の炭素源、および／またはｉｉ）標準培養培地と比較して増加した栄養素を含む。さらに、炭素源は以下であり得る：カゼイン、乳酸塩、ブドウ糖、フルクトース、フルクタン、グルコース、ショ糖、乳糖、マルトース、酢酸塩、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、サッカロース、キシロース、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、アラビノース、大豆タンパク質、可溶性タンパク質、ラフィノース、アミロース、デンプン、トリプトン、酵母エキス、およびそれらの組合せ。栄養素はアミノ酸であり得る。濃縮培地は、非濃縮培地と比較して炭素源および／または栄養素とともにフィード培地により５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％または少なくとも２０％濃縮されている。当業者は、本発明の培地処方物が限定培地および非限定培地の両方を包含することを理解する。
【００６４】
実施例１〜３に示される濃縮培地を用いた予期しない結果は、Ｎ−１培養段階において濃縮培地を用いたバッチ法で培養した宿主細胞が、非濃縮培地を用いたバッチ法で培養した宿主細胞と比較して増加した生細胞密度を示したことである。また、濃縮培地を用いたバッチ法で培養した宿主細胞は、濃縮培地を用いないフェドバッチ法で培養した宿主細胞に類似した生細胞密度および／または細胞生存率を示した。したがって、濃縮培地を用いたバッチ法で培養した宿主細胞は、非濃縮培地を用いた灌流システムまたはフェドバッチシステムで培養した宿主細胞に類似した結果を達成し得る。
【００６５】
実施例１〜３に示される濃縮培地を用いた別の予期しない結果は、濃縮培地を用いたバッチ培養で増殖させた細胞から播種された産生培養物が、濃縮培地を用いない灌流法またはフェドバッチ法からの細胞を播種した産生培養物と類似した目的のポリペプチドについての力価を有していたことである。上記の条件は単独で使用してもよく、互いに様々な組合せで使用してもよい。
【００６６】
本発明で開示されるこれらの任意の培地処方物は、必要に応じてホルモンおよび／または他の増殖因子、特定のイオン（ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸など）、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（非常に低い終濃度で通常存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、タンパク質加水分解物、もしくはグルコース、または他のエネルギー源を任意に補充され得る。本発明のある実施形態では、培地に化学誘導物質(chemical inductant)（ヘキサメチレンビス（アセトアミド）（「ＨＭＢＡ」）および酪酸ナトリウム（「ＮａＢ」）など）を補充することが有益であり得る。これらの任意のサプリメントは培養の開始時に添加され得、または枯渇した栄養素を補充するために、もしくは別の理由で後の時点で添加され得る。当業者は、開示された培地処方物に含まれ得る任意の望ましいまたは必要なサプリメントを認識する。
【００６７】
哺乳類細胞培養物の提供
目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞が同定されると、細胞は当業者に周知の様々な方法のいずれかによって培養物中で増殖される。目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞は通常、細胞の生存、増殖および生存率を助ける温度および培地中で増殖させることによって増殖する。最初の培養量は任意のサイズであり得るが、目的のポリペプチドまたはタンパク質の最終的な産生に使用される産生バイオリアクターの培養量よりも小さいことが多く、細胞は産生バイオリアクターに播種する前に体積を増加させたバイオリアクター内で数回継代されることが多い。細胞が特定の生細胞密度に達すると、細胞は生細胞の数をさらに増加させるためにバイオリアクター内で増殖される。これらのバイオリアクターは、Ｎ−１、Ｎ−２およびＮ−３などと呼ばれる。「Ｎ」は主要な産生培養のバイオリアクターを指し、「Ｎ−１」は主要な産生培養の前のバイオリアクターなどを意味する。
【００６８】
細胞培養物は、培地の酸素供給および細胞への栄養素の分散を増加させるために撹拌または振盪され得る。代替的または追加的に、当分野で周知の特別な散布装置が培養物の酸素供給を増加および制御するために使用され得る。本発明に従って、当業者はバイオリアクターの特定の内部条件（限定されないが、ｐＨ、温度および酸素供給などを含む）を制御または調節することが有益であり得ることを理解する。
【００６９】
Ｎ−３バイオリアクターにおける開始細胞密度は当業者によって選択され得る。本発明に従って、産生バイオリアクターにおける開始細胞密度は、２×１０４生細胞／ｍＬのように低くてもよい。本発明のある実施形態では、Ｎ−３バイオリアクターにおける開始細胞密度は、２ｘ１０４、２ｘ１０５、２ｘ１０６、５ｘ１０６、１０ｘ１０６生細胞／ｍＬおよびそれ以上の範囲であり得る。Ｎ−３宿主細胞の濃縮培地を用いた培養は、少なくとも５ｘ１０６生細胞／ｍＬから５ｘ１０６、１０ｘ１０６、１５ｘ１０６、２０ｘ１０６、２５ｘ１０６または３０ｘ１０６生細胞／ｍＬまでの生細胞密度およびそれ以上をもたらし得る。
【００７０】
Ｎ−２バイオリアクターにおける開始細胞密度は当業者によって選択され得る。本発明に従って、産生バイオリアクターにおける開始細胞密度は、２×１０４生細胞／ｍＬのように低くてもよい。本発明のある実施形態では、Ｎ−２バイオリアクターにおける開始細胞密度は、約２ｘ１０４生細胞／ｍＬから約２ｘ１０５、２ｘ１０６、５ｘ１０６、１０ｘ１０６生細胞／ｍＬおよびそれ以上の範囲であり得る。Ｎ−２宿主細胞の濃縮培地を用いた培養は、少なくとも５ｘ１０６生細胞／ｍＬから１０ｘ１０６、１５ｘ１０６、２０ｘ１０６、２５ｘ１０６または３０ｘ１０６生細胞／ｍＬまでの生細胞密度およびそれ以上をもたらし得る。
【００７１】
Ｎ−１バイオリアクターにおける開始細胞密度は当業者によって選択され得る。本発明に従って、産生バイオリアクターにおける開始細胞密度は、培養量当たりの単一の細胞のように低くてもよい。本発明のある実施形態では、産生バイオリアクターにおける開始細胞密度は、約２ｘ１０４生細胞／ｍＬから約２ｘ１０５、２ｘ１０６、５ｘ１０６、１０ｘ１０６生細胞／ｍＬおよびそれ以上の範囲であり得る。Ｎ−１宿主細胞の濃縮培地を用いた培養は、少なくとも５ｘ１０６生細胞／ｍＬから約５ｘ１０６、１０ｘ１０６、１５ｘ１０６、２０ｘ１０６、２５ｘ１０６または３０ｘ１０６生細胞／ｍＬまでの生細胞密度およびそれ以上をもたらし得る。
【００７２】
Ｎ産生バイオリアクターにおける開始細胞密度は当業者によって選択され得る。本発明に従って、Ｎ産生バイオリアクターにおける開始細胞密度は、１×１０６生細胞／ｍＬのように低くてもよい。本発明のある実施形態では、産生バイオリアクターにおける開始細胞密度は、約１ｘ１０６生細胞／ｍＬから約２ｘ１０６、５ｘ１０６、１０ｘ１０６生細胞／ｍＬおよびそれ以上の範囲であり得る。宿主細胞の濃縮培地を用いた培養は、少なくとも１ｘ１０６生細胞／ｍＬから約２ｘ１０６、５ｘ１０６、１０ｘ１０６、１５ｘ１０６、２０ｘ１０６、２５ｘ１０６または３０ｘ１０６生細胞／ｍＬまでの生細胞密度およびそれ以上をもたらし得る。
【００７３】
一般に、Ｎ−１の細胞培養物は、次の産生バイオリアクターに播種する前に所望の密度まで増殖され得る。全生存または全生存に近い生存率は必要とされないが、大部分の細胞が播種前に生存したままであることが好ましい。本発明のある実施形態では、細胞は（例えば低速遠心分離によって）上清から取り出され得る。また、任意の不要な代謝廃棄物または培地成分を除去するために、取り出された細胞を次のバイオリアクターに播種する前に培地で洗浄することが望ましい場合がある。培地は細胞を以前に増殖させた培地であり得、または本発明の実践者によって選択された異なる培地もしくは洗浄液であり得る。
【００７４】
次に、Ｎ−１の細胞は、産生バイオリアクターに播種するために適切な密度に希釈され得る。本発明のある実施形態では、細胞は、産生バイオリアクターで使用される培地と同じ培地で希釈される。あるいは、細胞は、本発明の実践者の必要性および要求に応じて、または細胞自体の特定の要件に適応させるために（例えば細胞を産生バイオリアクターに播種する前に短期間保存すべき場合に）、別の培地または溶液で希釈され得る。
【００７５】
本発明に従って、産生バイオリアクターは、ポリペプチドまたはタンパク質の大規模産生に適した任意の体積であり得る。ある実施形態では、産生バイオリアクターの体積は少なくとも５００リットルである。他の実施形態では、産生バイオリアクターの体積は、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００リットルもしくはそれ以上、またはそれらの間の任意の体積である。当業者は、本発明の実施における使用に適したバイオリアクターを認識し、選択できる。産生バイオリアクターは、産生されたポリペプチドまたはタンパク質の発現または安定性を阻害せず、細胞の増殖および生存率を助ける任意の物質で構成され得る。
【００７６】
本発明のある実施形態では、産生段階は、非濃縮培地と比較して濃縮された培地を含む。例えば、培地は、フィード培地によって非濃縮培地と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％濃縮されている。ある実施形態では、濃縮培地は増加した量の炭素源（例えばグルコース）を含む。ある実施形態では、濃縮培地は増加した量の栄養素（例えばアミノ酸）を含む。ある実施形態では、濃縮培地は増加した量の炭素源および栄養素を含む。
【００７７】
Ｎ−１段階または産生段階における細胞培養の温度は、細胞培養物が生存可能なままである温度範囲に主に基づいて選択される。一般に、ほとんどの哺乳類細胞は約２５℃〜４２℃の範囲内で良好に増殖する。好ましくは、哺乳類細胞は約３５℃〜４０℃の範囲内で良好に増殖する。当業者は、細胞の必要性および実践者の産生要件に応じて細胞を増殖させる適切な温度を選択できる。任意で、温度は単一の一定温度に維持される。任意で、温度はある温度範囲内に維持される。例えば、温度は定常的に上昇または低下し得る。あるいは、温度は様々な時間において離散的な量で上昇または低下し得る。当業者は、単一の温度を使用すべきか、または複数の温度を使用すべきか、および温度を定常的に調整すべきか、または離散的な量で調整すべきかを決定できる。
【００７８】
Ｎ−１段階または産生段階の細胞は、実践者の必要性および細胞自体の要件に応じてより多くの時間またはより少ない時間、増殖され得る。ある実施形態では、細胞は、細胞が乱されずに増殖できる場合に最終的に達する最大の生細胞密度の所定の割合である生細胞密度を達成するのに十分な期間、増殖される。細胞は規定された期間、増殖させることができる。例えば、細胞培養の開始濃度、細胞を増殖させる温度、および細胞の本質的な増殖速度に応じて、細胞は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日またはそれ以上増殖され得る。本発明の実践者は、ポリペプチド産生要件および細胞自体の必要性に応じて増殖期間を選択できる。
【００７９】
培養条件のモニタリング
本発明のある実施形態では、増殖している細胞培養物の特定の条件がモニタリングされる。細胞培養条件のモニタリングは、細胞培養物が組換えポリペプチドまたはタンパク質を準最適レベルで産生しているか否か、または培養物が準最適な産生段階に入ろうとしているか否かを決定することを可能にする。
【００８０】
非限定的な例として、温度、ｐＨ、細胞密度、細胞生存率、統合された生細胞密度、乳酸レベル、アンモニウムレベル、オスモル濃度、または発現ポリペプチドもしくはタンパク質の力価をモニタリングすることは有益または必要であり得る。当業者がこれらの条件を測定するのを可能にする多数の技術が当分野で周知である。例えば、細胞密度は、血球計、コールターカウンター（Ｖｉ−Ｃｅｌｌ）または細胞密度検査（ＣＥＤＥＸ）を用いて測定され得る。生細胞密度は、培養試料をトリパンブルーで染色することによって決定され得る。トリパンブルーを取り込むのは死細胞のみであるため、生細胞密度は細胞の総数を計数し、色素を取り込む細胞の数を細胞の総数で割り、その逆数を取ることによって決定され得る。ＨＰＬＣが、乳酸塩、アンモニウムまたは発現ポリペプチドもしくはタンパク質のレベルを決定するために使用され得る。あるいは、発現ポリペプチドまたはタンパク質のレベルは標準的な分子生物学的技術（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色、ウエスタンブロッティング、ブラッドフォードアッセイ、ローリーアッセイ、ビウレットアッセイ、およびＵＶ吸光度など）によって決定され得る。また、発現ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾（リン酸化およびグリコシル化を含む）をモニタリングすることが有益または必要であり得る。
【００８１】
発現ポリペプチドの単離
一般に、本発明に従って発現されたタンパク質またはポリペプチドを単離および／または精製することが典型的には望ましい。ある実施形態では、発現ポリペプチドまたはタンパク質は培地中に分泌され、したがって（例えば精製プロセスの最初の工程として）細胞および他の固形物が遠心分離または濾過などによって除去され得る。本明細書に記載された方法および組成物は細胞生存率の増加をもたらすため、本実施態様は本発明に従って使用される場合に特に有用である。結果として、培養プロセス中に死ぬ細胞は少なくなり、発現ポリペプチドまたはタンパク質の収量を潜在的に減少させ得るタンパク質分解酵素がより少ない量で培地中に放出される。
【００８２】
組換えポリペプチド
本発明の方法は、目的の任意の組換えポリペプチド（治療用抗体を含む）の大規模産生に使用され得る。本明細書において提供される方法によって産生され得る組換えポリペプチドの限定されない例としては、抗体（無傷の免疫グロブリンまたは抗体フラグメントを含む）、酵素（例えばガラクトシダーゼ）、タンパク質（例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）またはインターフェロンアルファもしくはベータ）、細胞受容体（例えばＥＧＦＲ）、または免疫原性もしくは抗原性タンパク質もしくはタンパク質フラグメント（例えば、ワクチンにおける使用のためのタンパク質）が挙げられる。本発明の範囲内の抗体には以下が含まれるが、これらに限定されない：トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））を含む抗ＨＥＲ２抗体（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992)；抗ＨＥＲ３抗体；抗ＨＥＲ４抗体；米国特許第5,725,856号)；米国特許第5,736,137号（RITUXAN（登録商標））に記載されているような抗ＣＤ２０抗体（キメラ抗ＣＤ２０「Ｃ２Ｂ８」など）、米国特許第5,721,108B1号に記載されているような２Ｈ７抗体のキメラまたはヒト化バリアント、またはTositumomab（BEXXAR（登録商標））；抗ＩＬ−８（St John et al., Chest, 103:932 (1993)、および国際公開第WO 95/23865号）；ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）などのヒト化および／または親和性成熟抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体（Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992)、国際公開第WO 96/30046号、および１９９８年１０月１５日に公開された第WO 98/45331号)；抗ＰＳＣＡ抗体（WO01/40309）；Ｓ２Ｃ６およびそのヒト化バリアントを含む抗ＣＤ４０抗体（WO00/75348）；抗ＣＤ１１ａ（米国特許第5,622,700号、WO 98/23761、Steppe et al.,  Transplant Intl.  4:3-7 (1991)、およびHourmant et al.,  Transplantation  58:377-380 (1994)）；抗ＩｇＥ（Presta et al.,  J. Immunol.  151:2623-2632 (1993)、国際公開第WO 95/19181号）；抗ＣＤ１８（１９９７年４月２２日に発行された米国特許第5,622,700号、または１９９７年７月３１日に公開されたWO 97/26912のとおり）；抗ＩｇＥ（Ｅ２５、Ｅ２６およびＥ２７を含む；１９９８年２月３日に発行された米国特許第5,714,338号、または１９９２年２月２５日に発行された米国特許第5,091,313号、１９９３年３月４日に公開されたWO 93/04173、または１９９８年６月３０日に出願された国際出願第PCT/US98/13410号、米国特許第5,714,338号）；抗Ａｐｏ−２受容体抗体（１９９８年１１月１９日に公開されたWO 98/51793）；ｃＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、ＣＤＰ５７１およびＭＡＫ−１９５を含む抗ＴＮＦ−α抗体（１９９７年９月３０日に発行された米国特許第5,672,347号、Lorenz et al.,  J. Immunol.  156(4):1646-1653 (1996)、およびDhainaut et al.,  Crit. Care Med.  23(9):1461-1469 (1995)参照）；抗組織因子（ＴＦ）（１９９４年１１月９日に付与された欧州特許第0 420 937 B1号）；抗ヒトα４β７インテグリン（１９９８年２月１９日に公開されたWO 98/06248）；抗ＥＧＦＲ（１９９６年１２月１９日に公開されたWO 96/40210に記載されているようなキメラ化またはヒト化２２５抗体）；ＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体（１９８５年５月７日に発行された米国特許第4,515,893号）；ＣＨＩ−６２１（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））および（ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標））などの抗ＣＤ２５抗体または抗ｔａｃ抗体（１９９７年１２月２日に発行された米国特許第5,693,762号参照）；ｃＭ−７４１２抗体などの抗ＣＤ４抗体（Choy et al.,  Arthritis Rheum  39(1):52-56 (1996)）；ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈなどの抗ＣＤ５２抗体（Riechmann et al.,  Nature  332:323-337 (1988)）；Graziano et al.,  J. Immunol.  155(10):4996-5002 (1995)に記載されているようなＦｃγＲＩに対するＭ２２抗体などの抗Ｆｃ受容体抗体；ｈＭＮ−１４などの抗がん胎児抗原（ＣＥＡ）抗体（Sharkey et al.,  Cancer Res.  55(23 Suppl): 5935s-5945s (1995)；ｈｕＢｒＥ−３、ｈｕ−Ｍｃ３およびＣＨＬ６を含む乳房上皮細胞に対する抗体（Ceriani et al.,  Cancer Res.  55(23): 5852s-5856s (1995)；およびRichman et al.,  Cancer Res.  55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)）；Ｃ２４２などの結腸がん細胞に結合する抗体（Litton et al.,  Eur J. Immunol.  26(1):1-9 (1996)）；抗ＣＤ３８抗体、例えばＡＴ１３／５（Ellis et al.,  J. Immunol.  155(2):925-937 (1995)）；Ｈｕ Ｍ１９５（Jurcic et al.,  Cancer Res  55(23 Suppl): 5908s-5910s (1995)）およびＣＭＡ−６７６またはＣＤＰ７７１などの抗ＣＤ３３抗体；ＬＬ２またはＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅなどの抗ＣＤ２２抗体（Juweid et al.,  Cancer Res  55(23 Suppl): 5899s-5907s (1995)）；１７−１Ａ（ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））などの抗ＥｐＣＡＭ抗体；アブシキシマブまたはｃ７Ｅ３ Ｆａｂ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））などの抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体；ＭＥＤＩ−４９３（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））などの抗ＲＳＶ抗体；ＰＲＯＴＯＶＩＲ（登録商標）などの抗ＣＭＶ抗体；ＰＲＯ５４２などの抗ＨＩＶ抗体；抗Ｈｅｐ Ｂ抗体ＯＳＴＡＶＩＲ（登録商標）などの抗肝炎抗体；抗ＣＡ１２５抗体ＯｖａＲｅｘ；抗イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；抗αｖβ３抗体ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）；ｃｈ−Ｇ２５０などの抗ヒト腎細胞がん抗体；ＩＮＧ−１；抗ヒト１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；抗ヒト大腸腫瘍抗体（Ａ３３）；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒト黒色腫抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮がん（ＳＦ−２５）；Ｓｍａｒｔ ＩＤ１０などの抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体；抗ＰＤ−１抗体；抗ＰＤ−Ｌ１抗体；抗ＬＡＧ−３抗体；抗ＧＩＴＲ抗体；抗ＴＩＧＩＴ抗体；抗ＣＸＣＲ４抗体；抗ＣＤ７３抗体；および抗ＨＬＡ ＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１）。
【００８３】
上述の説明は代表的なものとしてのみ理解されるべきであり、限定的であることを意図していない。本発明を実施するための代替的な方法および物質ならびに追加的な適用は当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【実施例】
【００８４】
細胞株および培地
３つの異なるモノクローナル抗体またはポリペプチドを産生する３つの異なるＣＨＯ細胞株を、これらの実験で使用した。使用した播種培地、基本培地およびフィード培地は既知組成であった。
【００８５】
Ｎ−１播種培養
バッチおよびフェドバッチＮ−１培養のために、細胞を初期体積８０〜１００ｍｌを含む２５０ｍｌ振盪フラスコまたは初期容量１０００ｍｌを含む２Ｌ振盪フラスコのいずれかにおいて増殖させた。投入距離２５ｍｍのオービタルシェーカーにおいて１５０ｒｐｍの振盪速度を用いた。インキュベーターの設定は３６．５℃の一定温度であり、ＣＯ２は５％に調節された。バッチＮ−１培養のために、播種培地は濃縮されていないか、またはグルコース濃縮されているか、またはグルコース濃縮および栄養素濃縮されているかのいずれかであった。バッチＮ−１培養物にはフィードを添加しなかった。フェドバッチＮ−１培養のために、播種培地を３日目から毎日与えた。
【００８６】
灌流Ｎ−１培養は、初期体積５Ｌを含む１０Ｌの細胞バッグにおいて細胞を増殖させることを含んでいた。揺動速度を２８ｒｐｍに調節し、揺動角度を７°に設定した。ＣＯ２を０〜１日目において４％に調節し、その後オフにした。補助的なＡＴＦ−２（Repligen）を細胞バッグに接続し、培養物を灌流させた。新鮮な培養培地（１×濃縮）を連続的に添加しながら、古い培養培地をスケジュールに従って同じ速度で連続的に除去する：０．５ ＶＶＤ Ｄ２−４、１．０ ＶＶＤ Ｄ４−５への増加、および２．０ ＶＶＤ Ｄ５−６への最終的な増加。
【００８７】
産生培養
フェドバッチ産生バイオリアクターを、初期作業体積３．３Ｌを含む５Ｌ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓバイオリアクターにおいて実施した。
【００８８】
分析
生細胞密度（ＶＣＤ）および細胞生存率を、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ自動セルカウンター（Beckman Coulter）を用いてオフラインで測定した。また、グルコース、グルタミン、グルタミン酸、乳酸、およびアンモニウムをモニタリングするために、培養試料をＣｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴ（Roche）を用いてオフラインで分析した。バイオリアクター培養物のために、ｐＨ、ｐＣＯ２、ｐＯ２をＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ｐＨＯＸ（Nova Biomedical）を用いてオフラインで測定した。プロテインＡ ＵＰＬＣ法を用いてタンパク質力価を測定し、正規化した値として報告した。
【００８９】
高分子量（ＨＭＷ）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、温度制御されたオートサンプラーおよびＷａｔｅｒｓ ２９９６ ＰＤＡ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣシステム（Milford, MA）上で２８０ｎｍにおいてモニタリングされる均一濃度勾配を伴うＴｏｓｏｈ ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム、７．８ｘ３０ｃｍ、５ｕｍを用いて行った。
【００９０】
チャージバリアントを画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）によってアッセイし、これはＡｌｃｏｔｔ ７２０ＮＶオートサンプラー（San Jose, CA）を有するＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ ｉＣＥ３装置上で実施された。試料を適切なｐＩマーカー、両性電解質および尿素と混合し、フルオロカーボンでコーティングされたキャピラリーカートリッジに注入した。高電圧を適用し、チャージバリアントはそれぞれのｐＩに移動した。ＵＶカメラは２８０ｎＭで画像を撮影した。主要なピークを同定し、酸性領域および塩基性領域に移動したピークを合計および定量化し、相対的なパーセント面積として報告した。
【００９１】
Ｎ−グリカンの分析を、Prozymeから市販されているキットであるＧｌｙｋｏＰｒｅｐ（登録商標）Ｒａｐｉｄ Ｎ−Ｇｌｙｃａｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ２−ＡＢ（Hayward, CA）を用いて行った。遊離オリゴ糖を、温度制御オートサンプラーおよび蛍光検出器を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ−Ｃｌａｓｓシステム（Milford, MA）上でＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｇｌｙｃａｎ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｘ１０ｍｍカラム（Milford, MA）を用いてプロファイリングした。
【００９２】
実施例１
細胞株Ａ：Ｎ−１播種培養
細胞株Ａのために、Ｎ−１培養物を、バッチ、グルコース濃縮を伴うバッチ、グルコース濃縮および栄養素濃縮を伴うバッチ、フェドバッチまたは灌流の様式で増殖させた。バッチＮ−１培養はわずか１５×１０６細胞／ｍＬのピークＶＣＤに達し、培養期間の終了近くにおいて高い細胞生存率を維持できなかった（図１Ａ）。対照的に、グルコース濃縮を伴うバッチＮ−１培養は、１７×１０６細胞／ｍＬのＶＣＤに達し、＞９９％の細胞生存率を維持した（図１Ａ）。同様に、フェドバッチＮ−１ならびにグルコース濃縮および栄養素濃縮を伴うバッチＮ−１はともに、６日目において＞２０×１０６細胞／ｍＬまで増殖し、生存率は＞９９％で維持された（図１Ａおよび１Ｂ）。灌流Ｎ−１培養における細胞は、６日目において４４×１０６細胞／ｍＬまで増殖し、生存率は＞９９％であった（図１Ａおよび１Ｂ）。
【００９３】
ポリペプチド−１の産生のための細胞株Ａ：高密度フェドバッチ産生培養
細胞株Ａのために、濃縮されたグルコースを伴うバッチ、濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ、フェドバッチまたは灌流培養において増殖させたシーズを用いて高密度フェドバッチ産生培養を開始した。
【００９４】
Ｎ産生培養物を５×１０６細胞／ｍＬの高播種密度で１４日間接種した。毎日のフィードを培養体積の３．５％のフィード体積で２日目から開始した。溶存酸素（ＤＯ）を４０％に維持し、ｐＨを６．８〜７．６に調節した。温度を最初に３６．５℃に維持し、４日目に３４℃に移行させた。
【００９５】
図２Ａは、すべての産生培養物が全培養期間にわたって＞９０％の細胞生存率を維持したことを示している。フェドバッチ播種培養ならびに濃縮されたグルコースまたは濃縮されたグルコースおよび栄養素のいずれかを伴うバッチ播種培養の１７×１０６細胞／ｍＬと比較して、灌流播種培養は２２×１０６細胞／ｍＬの最大生細胞密度を有していた（図２Ａ）。灌流播種培養からのポリペプチド−１の力価は約９．３ｇ／Ｌであったが、フェドバッチ播種培養は約９ｇ／Ｌの力価であった（図２Ｂ）。グルコースまたはグルコースおよび栄養素のいずれかが濃縮されたバッチ播種からの目的のポリペプチドの力価は、それぞれ約８．５ｇ／Ｌおよび約９ｇ／Ｌであった。図２Ｃは、品質特性（ｉＣＩＥＦ、ＳＥＣおよびＮ−グリカンなど）が種々のＮ−１播種にかかわらずすべてのＮ産生条件において類似していたことを示す。
【００９６】
実施例２
細胞株Ｂ：Ｎ−１播種培養
細胞株Ｂのために、Ｎ−１培養物を、バッチ、グルコース濃縮を伴うバッチ、グルコース濃縮および栄養素濃縮を伴うバッチ、フェドバッチまたは灌流の様式で増殖させた。バッチＮ−１培養はわずか２４．５×１０６細胞／ｍＬのピークＶＣＤに達し、高い生存率を維持できなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。対照的に、グルコースのみが濃縮されたバッチＮ−１培養またはグルコースおよび栄養素がともに濃縮されたバッチＮ−１培養は、≧２５．５×１０６生細胞／ｍＬに達し、≧９９％の細胞生存率を維持した（図３Ａおよび３Ｂ）。同様に、フェドバッチＮ−１培養は５日目において≧３０×１０６生細胞／ｍＬまで増殖し、生存率は＞９９％で維持された（図３Ａおよび３Ｂ）。灌流Ｎ−１培養における細胞は、５日目において４１×１０６細胞／ｍＬまで増殖し、生存率は≧９９％であった（図３Ａおよび３Ｂ）。
【００９７】
ポリペプチド−２の産生のための細胞株Ｂ：高密度フェドバッチ産生培養
細胞株Ｂのために、バッチ、濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴うバッチ、フェドバッチまたは灌流培養において増殖させたシーズを用いて高密度フェドバッチ産生培養を開始した。
【００９８】
産生培養物を３×１０６細胞／ｍＬの高播種密度で１４日間接種した。毎日のフィードを培養体積の３．１％のフィード体積で２日目から開始した。溶存酸素（ＤＯ）を４０％に維持し、ｐＨを６．７〜７．６に調節した。温度を３６．５℃に維持した。
【００９９】
図４Ａは、すべての産生培養物が全培養期間にわたって＞９０％の細胞生存率を維持したことを示している。フェドバッチ播種培養ならびに濃縮されたグルコースまたは濃縮されたグルコースおよび栄養素のいずれかを伴うバッチ播種培養のわずか約２４×１０６細胞／ｍＬと比較して、灌流播種培養は約２６×１０６細胞／ｍＬの最大生細胞密度を有していた（図４Ａ）。灌流および（濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴う）バッチ播種培養からの目的のポリペプチドの力価は約３．２ｇ／Ｌであったが、バッチおよびフェドバッチ播種培養は約３ｇ／Ｌの力価であった（図４Ｂ）。図４Ｃは、品質特性（ｉＣＩＥＦ、ＳＥＣおよびＮ−グリカンなど）が種々のＮ−１播種にかかわらずすべてのＮ産生条件において類似していたことを示す。
【０１００】
実施例３
細胞株Ｃ：Ｎ−１播種培養
細胞株Ｃのために、Ｎ−１培養物を、バッチ、グルコース濃縮を伴うバッチ、グルコース濃縮および栄養素濃縮を伴うバッチ、フェドバッチまたは灌流の様式で増殖させた。バッチＮ−１培養はわずか２６×１０６細胞／ｍＬのピークＶＣＤに達し、高い生存率を維持できなかった（図５Ａおよび５Ｂ）。対照的に、グルコースのみが濃縮されたバッチＮ−１培養またはグルコースおよび栄養素がともに濃縮されたバッチＮ−１培養は、≧３０×１０６生細胞／ｍＬに達し、≧９９％の細胞生存率を維持した（図５Ａおよび５Ｂ）。同様に、フェドバッチＮ−１培養は５日目において≧３３×１０６生細胞／ｍＬまで増殖し、生存率は≧９９％で維持された（図５Ａおよび５Ｂ）。灌流Ｎ−１培養における細胞は、５日目において６２×１０６細胞／ｍＬまで増殖し、生存率は≧９９％であった（図５Ａおよび５Ｂ）。
【０１０１】
ポリペプチド−３の産生のための細胞株Ｃ（実験１）：フェドバッチまたは濃縮されたグルコースおよび栄養素シーズを伴うバッチを用いた高密度フェドバッチ産生培養
細胞株Ｃのために、フェドバッチまたは濃縮されたグルコースおよび栄養素培養物を伴うバッチにおいて増殖させたシーズを用いて高密度フェドバッチ産生培養を開始した。
【０１０２】
産生培養を６×１０６細胞／ｍＬの高播種密度で１４日間開始した。毎日のフィードを培養体積Ｄ２−１０の５％およびその後の開始培養体積Ｄ１１−１３の３．３％のフィード体積で２日目から開始した。フィードを指定量の半分の量で１日に２回行った。溶存酸素（ＤＯ）を４０％に維持し、ｐＨを６．８〜７．３に調節した。温度を最初に３６．５℃に維持し、６日目に３３℃に移行させた。
【０１０３】
図６Ａは、すべての産生培養物が全培養期間にわたって＞８０％の細胞生存率を維持したことを示している。フェドバッチ播種培養および（濃縮されたグルコースおよび栄養素伴う）バッチ播種培養は約２７×１０６細胞／ｍＬの最大生細胞密度を有していた（図６Ａ）。フェドバッチおよび（濃縮されたグルコースおよび栄養素を伴う）バッチ播種培養からの目的のポリペプチドの力価は約４．３ｇ／Ｌであった（図６Ｂ）。図６Ｃは、品質特性（ｉＣＩＥＦ、ＳＥＣおよびＮ−グリカンなど）が種々のＮ−１播種にかかわらずすべてのＮ産生条件において類似していたことを示す。
【０１０４】
ポリペプチド−３の産生のための細胞株Ｃ（実験２）：フェドバッチまたは灌流播種を用いた高密度フェドバッチ産生培養
細胞株Ｃのために、フェドバッチまたは灌流培養において増殖させたシーズを用いて高密度フェドバッチ産生培養を開始した。
【０１０５】
産生培養を６×１０６細胞／ｍＬの高播種密度で１４日間開始した。毎日のフィードを培養体積の３．７％のフィード体積で１日目から開始した。溶存酸素（ＤＯ）を４０％に維持し、ｐＨを６．８〜７．３に調節した。温度を最初に３６．５℃に維持し、６日目に３３℃に移行させた。
【０１０６】
図７Ａは、すべての産生培養物が全培養期間にわたって＞８０％の細胞生存率を維持したことを示している。灌流播種培養は約３３×１０６細胞／ｍＬの最大生細胞密度を有しており、フェドバッチ播種培養は約３０×１０６細胞／ｍＬの最大生細胞密度を有していた（図７Ａ）。灌流およびフェドバッチ播種培養からの目的のポリペプチドの力価は約７ｇ／Ｌであった（図７Ｂ）。図７Ｃは、品質特性（ｉＣＩＥＦ、ＳＥＣおよびＮ−グリカンなど）が種々のＮ−１播種にかかわらずすべてのＮ産生条件において類似していたことを示す。
【０１０７】
実施例４
３つの分子のための大規模製造プロセスを、１０００Ｌスケール（細胞株Ａの場合）のBristol-Myers SquibbのＧＭＰ施設または５００Ｌスケール（細胞株ＢおよびＣの場合）のスケールアップ施設のいずれかで行った。細胞株ＡおよびＢのためのＮ−１播種培養はグルコースおよび栄養分を濃縮したバッチ培養を利用し、細胞株ＣのためのＮ−１播種はフェドバッチの様式で培養された。３つのプロセスはすべて頑強であり、１０００Ｌまたは５００Ｌまで拡張可能であることが示された。細胞密度、力価および産物の品質プロファイルは、実験室規模のバイオリアクターにおけるサテライト培養のものと一致している（図８〜１０）。細胞株Ａについて、下流の精製能力を超える例外的に高い力価のために、産生培養物を１０日目に回収した。細胞株Ａの培養期間の短縮は、（２つの産生容器を用いて）新たな産生培養物を毎週接種することを可能とし、産生量を著しく増加させた。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【国際調査報告】
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