(57)【要約】本開示はとりわけ、光硬化性バイオマトリックスゲル中の試料から単一の細胞／粒子を選択かつ単離するための方法およびデバイスを提供する。個別の細胞または粒子は顕微鏡によって観察され、試料の詳細な画像を提供するために試料の下に配向された液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）からの光の伝達を正確に制御することによって操作され、かつ単離される。一部の実施形態では、選択された細胞または粒子は次に、ＬＥＤピクセルアレイから伝達される青色／紫色の光でバイオマトリックスゲルを硬化させることによって固定化される。他の実施形態では、選択された目的の細胞または粒子は、可動性のままであることができる。いずれの実施形態でも、目的の個別の細胞または粒子は、試料の残りの部分から分離かつ単離される。
2021533830.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光硬化性ポリマー性媒体中で調製された試料から粒子を分離するためのシステムであって、
（ａ）前記試料を含むための１つまたは複数の受容器を有する光透過性試料プレート、
（ｂ）前記試料を照射および／または硬化するための１つまたは複数の光源、
（ｃ）前記試料への光の伝達を選択的に制御するための液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、
（ｄ）前記試料プレートと前記ＬＣＤとを互いに整列させるための手段、
（ｅ）顕微鏡によって前記試料を観察するための手段、
（ｆ）前記（ｅ）の顕微鏡手段から得られた画像を捕捉するための手段、および
（ｇ）前記システムを制御するためのマイクロプロセッサーおよびソフトウェア
を含むシステム。
【請求項２】
前記光透過性試料プレート（ａ）が、９６ウェルプレートである、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記ＬＣＤが、ピクセルの長方形のアレイを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記ＬＣＤアレイのそれぞれのピクセルが、２つまたはそれより多いサブピクセルを含む、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記ＬＣＤアレイのそれぞれのピクセルが、緑色発光サブピクセル、赤色発光サブピクセル、および青色発光サブピクセルを含む、請求項３に記載のシステム。
【請求項６】
それぞれのピクセルが、約６０μｍ×約６０μｍの寸法を有し、それぞれのサブピクセルが、約２０μｍ×約６０μｍの寸法を有する、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記ピクセルの長方形のアレイが、約５００〜約１０，０００×約５００〜約１０，０００の長方形のアレイを含む、請求項３に記載のシステム。
【請求項８】
前記ピクセルの長方形のアレイが、約１５００×約２４００の長方形のアレイを含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記１つまたは複数の光源が、発光ダイオード（ＬＥＤ）光源、レーザー、白熱灯、蛍光灯、紫外光、ハロゲン光、およびキセノン光から選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記ＬＥＤ光源が、白色光を発する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記ＬＥＤ光源が、約３９０ｎｍ〜約７００ｎｍの波長を有する白色光を発する、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記ＬＥＤ光源が、約３９０ｎｍ〜約４９０ｎｍの波長を有する青色／紫色の光を発する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１３】
前記ＬＥＤ光源が、約５２０ｎｍ〜約５６０ｎｍの波長を有する緑色の光を発する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１４】
前記ＬＥＤ光源が、約６３５ｎｍ〜約７００ｎｍの波長を有する赤色の光を発する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１５】
前記ＬＥＤ光源が、約２９０ｎｍ〜約３９０ｎｍの波長を有する紫外光を発する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１６】
前記ＬＣＤが、前記試料プレートと前記試料を照射および／または硬化するための前記１つまたは複数の光源との間に配向されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記ＬＣＤが。前記試料プレートの下に位置し、前記試料を照射および／または硬化するための前記１つまたは複数の光源が、前記ＬＣＤの下に位置している、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
顕微鏡によって前記試料を観察するための前記手段が、前記試料プレートの上に位置している、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
（ｈ）分離した粒子を前記試料から取り出すための手段をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２０】
分離した粒子を前記試料から取り出すための前記手段（ｈ）が、ピペッティング、洗浄、すすぎ、吸引から選択される、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記試料が、生体試料である、請求項１に記載のシステム。
【請求項２２】
前記粒子が、細胞、生体粒子、ビーズ、細胞外材料、および液滴から選択される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記細胞が、循環する腫瘍細胞（ＣＴＣ）、血液細胞、細菌、初代細胞、トランスフォームされた細胞、病原性細胞、および希少な免疫細胞から選択される、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記光硬化性ポリマー性媒体が、約２９０〜約４００ｎｍの波長を有する光源に曝露された際に粘度の増加を示す光反応性ポリマーから選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２５】
前記光硬化性ポリマー性媒体が、ゼラチン誘導体、ポリエチレングリコール誘導体、アルギネートおよびその誘導体、コラーゲンおよびその誘導体、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）およびその誘導体、ならびにそれらの混合物等の光開始剤からなる群から選択される材料から選択される、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
光硬化性ポリマー性媒体中で調製された試料から粒子を分離するためのシステムであって、
（ａ）前記試料を含むための１つまたは複数の受容器を有する光透過性試料プレート、
（ｂ）光学アレイパターンを生成するための光源の組合せ、
（ｃ）前記試料プレートと前記ＬＣＤとを相互に整列させるための手段、
（ｄ）顕微鏡によって前記試料を観察するための手段、
（ｅ）前記（ｄ）の顕微鏡手段から得られた画像を捕捉するための手段、および
（ｆ）前記システムを制御するためのマイクロプロセッサーおよびソフトウェア
を含むシステム。
【請求項２７】
前記光学アレイパターンを生成するための光源の組合せが、光投射器または有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）から選択される、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
光硬化性ポリマー性ビヒクル中で調製された試料から粒子を分離するための方法であって、請求項１または１９に記載のシステムを利用して分離をもたらすステップを含む方法。
【請求項２９】
光硬化性ポリマー性媒体中で調製された試料から請求項１のシステムを利用して粒子を分離するための方法であって、
（ａ）前記調製された試料を前記光透過性試料プレートの受容器の中に分注するステップ、
（ｂ）前記試料と前記光源との間にＬＣＤなしで前記試料の顕微鏡画像を得るステップ、
（ｃ）前記試料と前記光源との間にＬＣＤを配向して前記試料の顕微鏡画像を得るステップ、
（ｄ）前記マイクロプロセッサーおよびソフトウェアを使用して（ｂ）および（ｃ）から得られた画像を解析および整列して複合画像を取得し、前記試料中の粒子の位置付け、かつ識別するステップ、ならびに
（ｅ）（ｄ）の結果を使用して、所望の位置において硬化性ポリマー性媒体にポリマーを硬化させる波長の光を選択的に伝達するか、または伝達しないように前記マイクロプロセッサーおよびソフトウェアに指示し、ポリマー性媒体の硬化領域および非硬化領域のアレイを提供して目的の粒子を選択的に固定化するか、または固定化しないステップ
を含む方法。
【請求項３０】
光硬化性ポリマー性媒体中で調製された試料から請求項１９のシステムを利用して粒子を分離するための方法であって、
（ａ）前記調製された試料を前記光透過性試料プレートの受容器の中に分注するステップ、
（ｂ）前記試料と前記光源との間にＬＣＤなしで前記試料の顕微鏡画像を得るステップ、
（ｃ）前記試料と前記光源との間にＬＣＤを配向して前記試料の顕微鏡画像を得るステップ、
（ｄ）前記マイクロプロセッサーおよびソフトウェアを使用して（ｂ）および（ｃ）から得られた画像を解析および整列して複合画像を取得し、前記試料中の粒子の位置付け、かつ識別するステップ、
（ｅ）（ｄ）の結果を使用して、所望の位置において硬化性ポリマー性媒体にポリマーを硬化させる波長の光を選択的に伝達するか、または伝達しないように前記マイクロプロセッサーおよびソフトウェアに指示し、ポリマー性媒体の硬化領域および非硬化領域のアレイを提供して目的の粒子を選択的に固定化するか、または固定化しないステップ、ならびに
（ｆ）前記分離した粒子を取り出すための前記手段を使用して前記粒子を収集するステップ
を含む方法。
【請求項３１】
調製された試料から粒子を分離するための方法であって、
（ａ）感光性媒体中に試料をローディングするステップ、
（ｂ）１つまたは複数の非ゲル化光を使用して１つまたは複数の画像を取得するステップ、
（ｃ）前記試料と前記１つまたは複数の非ゲル化光との間に表示手段を位置決めするステップ、
（ｄ）前記表示手段の上にパターンを表示するステップ、
（ｅ）前記１つまたは複数の非ゲル化光を使用して複合画像を取得するステップ、
（ｆ）前記試料中の１つまたは複数の粒子の位置を計算するステップ、
（ｇ）前記表示手段の上にゲル化パターンを表示するステップ、
（ｈ）ゲル化光を使用して少なくとも１つのミクロヒドロゲルを形成させるステップ、および
（ｉ）洗浄または溶出によって前記試料を処理するステップ
を含む方法。
【請求項３２】
前記表示手段がＬＣＤである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
調製された試料から粒子を分離するための方法であって、
（ａ）感光性媒体中に試料をローディングするステップ、
（ｂ）前記試料と１つまたは複数の非ゲル化光との間に表示手段を位置決めするステップ、
（ｃ）前記表示手段の上にパターンを表示するステップ、
（ｄ）前記１つまたは複数の非ゲル化光を使用して複合画像を取得するステップ、
（ｅ）前記試料中の１つまたは複数の粒子の位置を計算するステップ、
（ｆ）前記表示手段の上にゲル化パターンを表示するステップ、
（ｇ）ゲル化光を使用して少なくとも１つのミクロヒドロゲルを形成させるステップ、および
（ｈ）洗浄または溶出によって前記試料を処理するステップ
を含む方法。
【請求項３４】
前記表示手段がＬＣＤである、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府によって助成された研究または開発に関する声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金Ｒ４３ＡＩ１４７７３４−０１による政府助成によってなされたものである。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本開示はとりわけ、光硬化性バイオマトリックスゲル中の試料から単一の細胞／粒子を選択かつ単離するための方法およびデバイスを提供する。個別の細胞または粒子は顕微鏡によって観察され、試料の詳細な画像を提供するために試料の下に配向された液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）からの光の伝達を正確に制御することによって操作され、単離される。一部の実施形態では、選択された細胞または粒子は次に、ＬＥＤピクセルアレイから伝達される青色／紫色の光でバイオマトリックスゲルを硬化させることによって固定化される。他の実施形態では、選択された目的の細胞または粒子は、可動性のままであることができる。いずれの実施形態でも、目的の個別の細胞または粒子は、試料の残りの部分から分離かつ単離される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
粒子および細胞を顕微鏡下で直接単離することは、生医学分野ではいまだに課題である。顕微鏡を使用すれば、特定の形態学的表現型を有する細胞または他の細胞型と相互作用する細胞を識別することは比較的容易である。しかし、ミクロン以下の精度を有する機械的装置および方法（たとえばマイクロピペッティング、光学ピンセット、またはレーザー顕微解剖）を採用せずに試料から目的の細胞または粒子を選択することはもっと困難である。画像に基づいて試料から単一の細胞および粒子を単離することを容易にするため、本発明者らはＬＣＤピクセルアレイおよび顕微鏡を使用するシステムおよび方法を開発した。それにより、高価なもしくは嵩張る装置または面倒な単一分子取り扱いスキルが必要でなくなる。また、捕捉プロセスが１回の単一な全体の曝露ステップによって行われるので、単一細胞操作技術と比較してスループットが大幅に向上する。
【０００４】
生存単一細胞の単離技術は、生命科学研究の多数の前線、たとえば抗体の開発、初代細胞の分離、細胞系の構築、免疫細胞療法、および循環する腫瘍細胞（ＣＴＣ）の分離において潜在的価値を有している。粒子または細胞を単離するために使用される競争力のある現在の主要な技術には、フローサイトメトリー、ミクロ流体デバイス、ミクロピペット、および光学ピンセットがある。本発明の利点は、限定された試料サイズ、塊状の試料、および付着性の細胞等の困難な状況における生存細胞の単離を可能にする安価で堅固な選択機構を提供することである。たとえば、フローサイトメトリーの設備は高価で実験室の大きなスペースを必要とすることがあり、単一細胞を単離する目的では、それほど扱いやすくない。さらに、本発明は標識のための特定の細胞マーカーも、細胞−細胞の分離も必要としない。本明細書で明白になるように、本発明は、生体試料等の試料から粒子または細胞を単離するための現在の技術の欠点の多くに対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
顕微鏡およびＬＣＤの技術を使用して粒子または細胞を追跡し、選択かつ単離する方法が本明細書で提供される。
【０００６】
本開示はとりわけ、試料から単一の細胞または粒子を選択かつ単離するための顕微鏡によって導かれる方法およびデバイスを提供する。一部の実施形態では、試料の下に位置するＬＣＤピクセルからの光の伝達を正確に制御することによって、個別の細胞または粒子が操作される。一部の実施形態では、選択されなかった細胞は、光硬化性バイオマトリックスゲルの中で、細胞／粒子の下にあるＬＣＤピクセルから伝達される青色／紫色の光によって固定化される。一部の実施形態では、選択された細胞は、光硬化性バイオマトリックスゲルの中で、細胞／粒子の下にあるＬＣＤピクセルから伝達される青色／紫色の光によって固定化される。
【０００７】
実質的には、単離を実施するために本発明の主要な２つの実施形態が意図される。一実施形態では、目的の粒子または細胞は可動性のままとされる一方、選択されなかった粒子または細胞はバイオマトリックスの中にトラップされもしくは固定化され、それにより目的の粒子または細胞は次に、固定化された粒子または細胞から分離される。別の実施形態では逆の手順が実施され、それにより目的の粒子または細胞はバイオマトリックス中にトラップされもしくは固定化され、それにより選択されなかった粒子または細胞は可動性のままとされ、それにより可動性の粒子または細胞はトラップされた粒子または細胞から除去され、これらは次に収集される。
【０００８】
目的の粒子または細胞が可動性のままにされている実施形態には、以下のステップが含まれる。（ａ）粒子／細胞の画像を手動で採取し、パターンを抽出する。（ｂ）整列させ、連結させた隣接する領域の画像を連続的に取得することによって、合成された画像を得る。（ｃ）選択した細胞の座標を、画像の整列を介して直下のＬＣＤピクセルにマッピングする。（ｄ）目的の細胞の下のＬＣＤピクセルを暗くして、光が試料を通過しないようにし、外部ＬＥＤ光源から放射される青色／紫色の光によるバイオインクの硬化によって、選択されなかった細胞をトラップする。ＬＣＤは内部光源を有しておらず、本発明においては２つの外部光源、即ちイメージングのための白色光ＬＥＤ、およびミクロゲル化のためのＵＶ／紫色ＬＥＤまたはレーザーを使用する。選択された細胞は可動性のままであり、下流における利用のための溶出を容易にする。目的でない粒子または細胞が可動性のままとされる他の実施形態では、逆の選択戦略が採用され、それにより選択された細胞のみが照射されてマトリックス中にトラップされる。
【０００９】
一部の実施形態では、本発明は、光硬化性ポリマー性媒体中で調製された試料から目的の粒子等の粒子を分離するためのシステムであって、
（ａ）試料を含むための１つまたは複数の受容器を有する光透過性試料プレート、
（ｂ）試料を照射および／または硬化するための１つまたは複数の光源、
（ｃ）試料への光の伝達を選択的に制御するための取り外し可能な液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）等のＬＣＤ、
（ｄ）試料プレートとＬＣＤとを互いに整列させるための手段、
（ｅ）顕微鏡によって試料を観察するための手段、
（ｆ）（ｅ）の顕微鏡手段から得られた画像を捕捉するための手段、および
（ｇ）システムを制御するためのマイクロプロセッサーおよびソフトウェア
を含むシステムに関する。
【００１０】
一部の実施形態では、本発明は前記光透過性試料プレート（ａ）が、９６ウェルプレートであるシステムに関する。
【００１１】
一部の実施形態では、本発明は前記ＬＣＤが、ピクセルの長方形のアレイを含むシステムに関する。
【００１２】
一部の実施形態では、本発明は前記ＬＣＤアレイのそれぞれのピクセルが、２つまたはそれより多いサブピクセルを含むシステムに関する。
【００１３】
一部の実施形態では、本発明は前記ＬＣＤアレイのそれぞれのピクセルが、緑色発光サブピクセル、赤色発光サブピクセル、および青色発光サブピクセルを含むシステムに関する。
【００１４】
一部の実施形態では、本発明はそれぞれのピクセルが、約６０μｍ×約６０μｍの寸法を有し、それぞれのサブピクセルが、約２０μｍ×約６０μｍの寸法を有するシステムに関する。
【００１５】
一部の実施形態では、本発明は前記ピクセルの長方形のアレイが、約５００〜約１０，０００×約５００〜約１０，０００の長方形のアレイを含むシステムに関する。
【００１６】
一部の実施形態では、本発明は前記ピクセルの長方形のアレイが、約１５００×約２４００の長方形のアレイを含むシステムに関する。
【００１７】
一部の実施形態では、本発明は前記１つまたは複数の光源が、発光ダイオード（ＬＥＤ）光源、レーザー、白熱灯、蛍光灯、紫外光、ハロゲン光、およびキセノン光から選択されるシステムに関する。
【００１８】
一部の実施形態では、本発明は前記ＬＥＤ光源が、白色光を発するシステムに関する。
【００１９】
一部の実施形態では、本発明は前記ＬＥＤ光源が、約３９０ｎｍ〜約７００ｎｍの波長を有する白色光を発するシステムに関する。
【００２０】
一部の実施形態では、本発明は前記ＬＥＤ光源が、約３９０ｎｍ〜約４９０ｎｍの波長を有する青色／紫色の光を発するシステムに関する。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明は前記ＬＥＤ光源が、約５２０ｎｍ〜約５６０ｎｍの波長を有する緑色の光を発するシステムに関する。
【００２２】
一部の実施形態では、本発明は前記ＬＥＤ光源が、約６３５ｎｍ〜約７００ｎｍの波長を有する赤色の光を発するシステムに関する。
【００２３】
一部の実施形態では、本発明は前記ＬＥＤ光源が、約２９０ｎｍ〜約３９０ｎｍの波長を有する紫外光を発するシステムに関する。
【００２４】
一部の実施形態では、本発明は前記ＬＣＤが、前記試料プレートと試料を照射および／または硬化するための前記１つまたは複数の光源との間に配向されているシステムに関する。
【００２５】
一部の実施形態では、本発明は前記ＬＣＤが、前記試料プレートの下に位置し、試料を照射および／または硬化するための前記１つまたは複数の光源がＬＣＤの下に位置しているシステムに関する。
【００２６】
一部の実施形態では、本発明は顕微鏡によって試料を観察するための前記手段が、前記試料プレートの上に位置しているシステムに関する。
【００２７】
一部の実施形態では、本発明は（ｈ）分離した粒子を試料から取り出すための手段をさらに含むシステムに関する。
【００２８】
一部の実施形態では、本発明は分離した粒子を試料から取り出すための前記手段（ｈ）が、ピペッティング、洗浄、すすぎ、吸引から選択されるシステムに関する。
【００２９】
一部の実施形態では、本発明は試料が、生体試料であるシステムに関する。
【００３０】
一部の実施形態では、本発明は粒子が、細胞、生体粒子、ビーズ、細胞外材料、および液滴から選択されるシステムに関する。
【００３１】
一部の実施形態では、本発明は前記細胞が、循環する腫瘍細胞（ＣＴＣ）、血液細胞、細菌、初代細胞、トランスフォームされた細胞、病原性細胞、および希少な免疫細胞から選択されるシステムに関する。
【００３２】
一部の実施形態では、本発明は前記光硬化性ポリマー性媒体が、約２９０〜約４００ｎｍの波長を有する光源に曝露された際に粘度の増加を示す光反応性ポリマーから選択されるシステムに関する。
【００３３】
一部の実施形態では、本発明は前記光硬化性ポリマー性媒体が、ゼラチン誘導体、ポリエチレングリコール誘導体、アルギネートおよびその誘導体、コラーゲンおよびその誘導体、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）およびその誘導体、ならびにそれらの混合物等の光開始剤からなる群から選択される材料から選択されるシステムに関する。
【００３４】
一部の実施形態では、本発明は、光硬化性ポリマー性媒体中で調製された試料から目的の粒子等の粒子を分離するためのシステムであって、
（ａ）試料を含むための１つまたは複数の受容器を有する光透過性試料プレート、
（ｂ）光学アレイパターンを生成するための光源の組合せ、
（ｃ）試料プレートとＬＣＤとを相互に整列させるための手段、
（ｄ）顕微鏡によって試料を観察するための手段、
（ｅ）（ｄ）の顕微鏡手段から得られた画像を捕捉するための手段、および
（ｆ）システムを制御するためのマイクロプロセッサーおよびソフトウェア
を含むシステムに関する。
【００３５】
一部の実施形態では、本発明は光学アレイパターンを生成するための光源の前記組合せが、光投射器または有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）から選択されるシステムに関する。
【００３６】
一部の実施形態では、本発明は、光硬化性ポリマー性ビヒクル中で調製された試料から目的の粒子等の粒子を分離するための方法であって、分離をもたらす本発明のシステムを利用するステップを含む方法に関する。
【００３７】
一部の実施形態では、本発明は光硬化性ポリマー性媒体中で調製された試料から本発明のシステムを利用して目的の粒子等の粒子を分離するための方法であって、
（ａ）調製された試料を光透過性試料プレートの受容器の中に分注するステップ、
（ｂ）試料と光源との間にＬＣＤなしで試料の顕微鏡画像を得るステップ、
（ｃ）試料と光源との間にＬＣＤを配向して試料の顕微鏡画像を得るステップ、
（ｄ）マイクロプロセッサーおよびソフトウェアを使用して（ｂ）および（ｃ）から得られた画像を解析および整列して複合画像を取得し、試料中の粒子の位置を決定して粒子を識別するステップ、ならびに
（ｅ）（ｄ）の結果を使用して、所望の位置において硬化性ポリマー性媒体にポリマーを硬化させる波長の光を選択的に伝達するか、または伝達しないようにマイクロプロセッサーおよびソフトウェアに指示し、ポリマー性媒体の硬化領域および非硬化領域のアレイを提供して目的の粒子を選択的に固定化するか、または固定化しないステップ
を含む方法に関する。
【００３８】
一部の実施形態では、本発明は光硬化性ポリマー性媒体中で調製された試料から本発明のシステムを利用して目的の粒子等の粒子を分離するための方法であって、
（ａ）調製された試料を光透過性試料プレートの受容器の中に分注するステップ、
（ｂ）試料と光源との間にＬＣＤなしで試料の顕微鏡画像を得るステップ、
（ｃ）試料と光源との間にＬＣＤを配向して試料の顕微鏡画像を得るステップ、
（ｄ）マイクロプロセッサーおよびソフトウェアを使用して（ｂ）および（ｃ）から得られた画像を解析および整列して複合画像を取得し、試料中の粒子の位置を決定して粒子を識別するステップ、
（ｅ）（ｄ）の結果を使用して、所望の位置において硬化性ポリマー性媒体にポリマーを硬化させる波長の光を選択的に伝達するか、または伝達しないようにマイクロプロセッサーおよびソフトウェアに指示し、ポリマー性媒体の硬化領域および非硬化領域のアレイを提供して目的の粒子を選択的に固定化するか、または固定化しないステップ、ならびに
（ｆ）分離した粒子を取り出すための手段を使用して粒子を収集するステップ
を含む方法に関する。
【００３９】
一部の実施形態では、本発明は調製された試料から目的の粒子等の粒子を分離するための方法であって、
（ａ）感光性媒体中に試料をローディングするステップ、
（ｂ）１つまたは複数の非ゲル化光を使用して１つまたは複数の画像を取得するステップ、
（ｃ）試料と１つまたは複数の非ゲル化光との間に表示手段の位置を決定するステップ、
（ｄ）表示手段の上にパターンを表示するステップ、
（ｅ）１つまたは複数の非ゲル化光を使用して複合画像を取得するステップ、
（ｆ）試料中の１つまたは複数の粒子の位置を計算するステップ、
（ｇ）表示手段の上にゲル化パターンを表示するステップ、
（ｈ）ゲル化光を使用して少なくとも１つのミクロヒドロゲルを形成させるステップ、および
（ｉ）洗浄または溶出によって試料を処理するステップ
を含む方法に関する。
【００４０】
一部の実施形態では、本発明は表示手段が、ＬＣＤである方法に関する。
【００４１】
一部の実施形態では、本発明は調製された試料から目的の粒子等の粒子を分離するための方法であって、
（ａ）感光性媒体中に試料をローディングするステップ、
（ｂ）試料と１つまたは複数の非ゲル化光との間に表示手段を位置決めするステップ、
（ｃ）表示手段の上にパターンを表示するステップ、
（ｄ）１つまたは複数の非ゲル化光を使用して複合画像を取得するステップ、
（ｅ）試料中の１つまたは複数の粒子の位置を計算するステップ、
（ｆ）表示手段の上にゲル化パターンを表示するステップ、
（ｇ）ゲル化光を使用して少なくとも１つのミクロヒドロゲルを形成させるステップ、および
（ｈ）洗浄または溶出によって試料を処理するステップ
を含む方法に関する。
【００４２】
一部の実施形態では、本発明は表示手段がＬＣＤである方法に関する。
【００４３】
一部の実施形態では、デジタルマイクロミラーデバイスによって生成される光パターンをＬＣＤの代わりに使用することができる。
【００４４】
一部の実施形態では、レーザー等の他の光源をＬＥＤの代わりに使用することができる。
【００４５】
一部の実施形態では、他の波長の光を青色／紫色の光の代わりに使用することができる。
【００４６】
一部の実施形態では、画像整列ステップを省略することができる。
【００４７】
一部の実施形態では、選択した粒子または細胞が感光性である場合には、バイオマトリックスの固化ステップの使用を省略することができる。
【００４８】
一部の実施形態では、任意の光子応答性ヒドロゲルを青色光硬化性バイオインクの代わりに使用することができる。
【００４９】
本発明のこれらのおよびその他の態様は本明細書の開示から明らかになる。
【００５０】
上記の一般的記述および以下の詳細な説明は例示的であり説明のためのみであって、特許を請求する開示を制限するものではないことが理解されよう。
【００５１】
本明細書に組み込まれ、かつその一部を構成する添付した図面は本開示の例示的な態様を図示し、記述とともに本開示の原理の説明に役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、本発明の概略的ワークフローの例である。（Ａ）操作および装置のパイプライン。（Ｂ）試料のみの顕微鏡画像の取得。（Ｃ）試料およびＬＣＤの顕微鏡画像の取得。（Ｄ）選択した標的を選択的に減光しまたは照射する。（Ｅ）光誘起ミクロゲル生成。および（Ｆ）標的の洗浄または溶出。ステップはコンピュータースクリプトによって実施される。特に（Ｂ）細胞のプールは青色光硬化性バイオインク（ゼラチン−ＭＡまたはｐｅｇ−ＭＡと生体親和性光開始剤ＬＡＰ、またはその他の感光性薬剤−光の組合せ）と混合され、白色光ＬＥＤで照射されたＬＣＤ上にローディングされる。目的の細胞は手で、または機械学習プログラム（黒色矢印で示す）で採取され、顕微鏡画像は中間ステップ（赤色ＬＣＤアレイ照射）を介してＬＣＤピクセルと整列され、選択した細胞の下にあるピクセルが黒色と設定される（Ｃ）。青色光源および青色ピクセルマスクをオンにすることにより、ウェル全体の青色への短時間の曝露が実施される（Ｄ）。負の選択の場合（Ｄ、Ｅ、Ｆの上のパネル）には、選択されなかった細胞または領域が固化し（暗色の領域Ｃ）、移動相の標的細胞が溶出する。大きさの参照として人髪のストランド（幅１００ミクロン）を示す。正の選択の場合（Ｄ、Ｅ、Ｆの下のパネル）には、目的の細胞が照明され、生体親和性バイオインクでトラップされる。望まない細胞は洗浄除去され、選択された細胞が残っておそらくｉｎ  ｓｉｔｕで培養される。
【００５３】
【図２】図２Ａ−１〜図２Ａ−４は、例示的な試料ステージの斜視図である。  図２Ａ−１は試料ステージの側面図である。  図２Ａ−２は試料ステージの前面図である。  図２Ａ−３は試料ステージの上面図である。  図２Ａ−４は試料ステージの斜視図である。
【００５４】
図２Ｂは、ＬＣＤ、試料ステージ、９６ウェル光学底マイクロタイタープレート、およびベンチ直立顕微鏡を含む本開示の実施形態による例示的な装置の例である。
【００５５】
【図３Ａ】図３は、整列のための画像取得ステップの例である。
【図３Ｂ】図３は、整列のための画像取得ステップの例である。
【図３Ｃ】図３は、整列のための画像取得ステップの例である。
【００５６】
図３Ａ〜図３Ｃは、試料のみの図を取得して目的の細胞を選択し、ＬＣＤがまだ挿入されていない画像を示す。図３Ｂ。図３Ｂに示すように、ＬＣＤを挿入して全パターンを表示する。図３Ｃに示すように、ＬＣＤおよび試料の図を捕捉する。
【００５７】
図３Ｃは、画像インデキシングの準備ができた例示的なＬＣＤおよびＬＣＤパターンの捕捉を示す。
【００５８】
【図４】図４Ａ〜図４Ｆはインデキシングピクセルの例である。そのような例ではパターンは６×６であり、全てのボーダーピクセルは０に設定している。中央の４×４のピクセルは行および列を識別するために使用する。隣接するパターンは１ピクセル分の分離を有している。それを行う場合、内側の１パターンを検索するために８×８のパターンを使用する。赤いチャネルは行を、青いチャネルは列を表わすために使用する。
【００５９】
図４Ａは全てのチャネルを含むＬＣＤパターン画像を示す。
【００６０】
図４Ｂは、緑色のチャネルのみを使用する図４Ａの１つのパターンを検索するための境界の８×８パターンを示す。
【００６１】
図４Ｃは、交差相関マップを使用する図４Ｂの、また図４Ａにおける境界パターンの検索結果を示す。
【００６２】
図４Ｄは、赤色チャネルから切り取った１つのパターンを示す。二進法表示は００００  ００００  １００１  ００１１であり、これは１４７である。
【００６３】
図４Ｅは青色チャネルを示す。二進法表示は００００  ００００  １０００  ０１１１であり、これは１３５で、このパターンブロックがＬＣＤ全体の行１４７、列１３５に位置していることを示している。
【００６４】
図４Ｆは陰性対照としての緑色チャネルを示し、ここではシグナルがないはずである。
【００６５】
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｂは正確なＬＣＤピクセル制御を示す。顕微鏡画像（左のパネル）上で目的の粒子を直接選択した後、ライブ画像は単一ビーズの下のＬＣＤピクセル（赤色矢印で標識）がオン／オフされていることを示した。
【図５Ｂ】図５Ａ〜図５Ｂは正確なＬＣＤピクセル制御を示す。顕微鏡画像（左のパネル）上で目的の粒子を直接選択した後、ライブ画像は単一ビーズの下のＬＣＤピクセル（赤色矢印で標識）がオン／オフされていることを示した。
【００６６】
図５Ａは、ピクセルがオンになっている陽性対照を示す。
【００６７】
図５Ｂは、ピクセルがオフになっている陰性対照を示す。
【００６８】
【図６Ａ】図６Ａは、ファージを産生するために使用でき、本発明の抗体選択用途に使用できるファージディスプレイベクターの例を示す。
【００６９】
【図６Ｂ】図６Ｂは、典型的なＫｕｎｋｅｌ変異誘発ライブラリー生成プロセスとしての本発明の抗体選択用途におけるファージライブラリーの設計および構築ならびにライブラリーの使用の分子生物学プロセスの例を示す。
【００７０】
【図６Ｃ】図６Ｃは、単一ビーズ／細胞系ファージディスプレイパイプラインにおいて本発明を使用する例を示す。
【００７１】
【図７】図７Ａ〜図７Ｂは、細胞相互作用表現型による腫瘍殺滅クローンの選択を示す。
【００７２】
図７Ａは、細胞療法の研究における公開された免疫細胞−腫瘍細胞の相互作用を示す。
【００７３】
図７Ｂは、顕微鏡法下での選択による概念的な腫瘍相互作用クローン富化プロセスを示す。厚い縁がついた実体としての腫瘍細胞、白色の無関係なＴ細胞、および灰色の腫瘍結合性Ｔ細胞。
【００７４】
【図８】図８は、本開示の態様によるＬＣＤを含まない試料の画像から出発する例示的な方法のフローチャートを示す。
【００７５】
【図９】図９は、本開示の態様によるＬＣＤ−試料の複合画像のみを使用する例示的な方法のフローチャートを示す。
【００７６】
【図１０】図１０は、粒子捕捉結果の例示的な画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
発明の詳細な説明
定義
本発明をより容易に理解するため、ある種の用語を以下に定義する。以下の用語およびその他の用語についてのさらなる定義を、明細書全体にわたって説明する。
【００７８】
親和性試薬：本明細書で使用される場合、用語「親和性試薬」は、標的分子に特異的に結合して、標的分子の活性をたとえば識別し、追跡し、捕捉し、またはそれに影響する任意の分子である。本明細書に記載した方法によって識別されまたは回収される親和性試薬は、「遺伝子的にコードされた」たとえば抗体、ペプチド、または核酸であり、したがってシーケンシングすることができる。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は本明細書で相互交換可能に使用され、ともに連結された２つまたはそれより多いアミノ酸を意味する。
【００７９】
バイオインクは、細胞外基質環境を模倣し、生細胞の付着、増殖、および分化を支持するバイオインク材料を意味する。これらは通常、ゼラチン、アルギネート、フィブリン、キトサン、ＰＥＧ、およびヒアルロン酸等の生体親和性ポリマーから誘導される。
【００８０】
バイオマトリックス：バイオインクの架橋したまたは固化した形態。
【００８１】
ヒドロゲルは、架橋したポリマー鎖のネットワークから構築された高分子ポリマーゲルを意味する。ヒドロゲルは逐次重合または連鎖重合によって、ネットワークの形成を促進する機能性架橋剤とともに親水性モノマーから合成される。
システムおよび方法
【００８２】
本発明の種々の態様を以下の節で詳細に記述する。節の使用は本発明を限定することを意味しない。それぞれの節は本発明のいずれの態様にも適用することができる。本出願において「または」の使用は、他に述べない限り、「および／または」を意味する。
【００８３】
本開示はとりわけ、標的タンパク質の機能性エピトープに対する抗体を生成させるための方法および組成物を提供する。標的タンパク質の機能性エピトープを標的とする抗体の生成により、抗体が標的タンパク質の機能をモジュレートすることが可能になる。たとえば、機能性エピトープを標的とする能力により、抗体が標的タンパク質の機能をアゴナイズしまたはアンタゴナイズすることが可能になる。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法では、標的タンパク質の機能をモジュレートすることができる抗体の開発のためのリガンドコンジュゲート抗体ライブラリーが使用される。
【００８４】
既に利用可能な蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または微小流体チップに基づく細胞単離ツール（１、２）では、薄い流体のストリームが生成され、単一細胞が検査され、またある種の数値的特徴に基づいて細胞のサブ集団が単離される。しかし、細胞の表現型および細胞間相互作用に関する情報は失われる。その他の画像系単一細胞採取手法、たとえばマイクロピペッティング（３）、光学ピンセット（４）、またはレーザー捕捉顕微解剖（５、６）は、高精度の機械装置およびそれぞれの細胞の個別の捕捉動作が必要であり、それによりスループットが低下し、市販化が妨げられる。急速に成長する消費者向け電子産業によって液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）は単一細胞の分解能のオーダーにまで達し、即ち２Ｋの５．５インチのディスプレイの単一カラーピクセルの直径はほぼ３０〜５０μｍ、即ちおよそ哺乳動物細胞の横断幅である。ＬＣＤ上の波長選択的ピクセルアレイをプログラムして、一時的な空間パターンを形成させることができる。さらに、機械学習手法の進歩により、画像に基づく粒子認識および分割アリゴリズム（７）が適用されてきた。
【００８５】
細胞外基質環境を模倣し、生細胞の付着、増殖、および分化を支持する材料である生体親和性三次元（３Ｄ）印刷インクは通常、可視光によって硬化しまたは固化することができるゼラチン、アルギネート、フィブリン、キトサン、ＰＥＧ、およびヒアルロン酸等の生体親和性ポリマーから誘導され（８）、これらもまた利用可能である。これらの材料により、市販のセルソーター、即ちＦＡＣＳおよび微小流体系ソーターに匹敵する９０％を超える細胞生存率が得られる。捕捉プロセスは単一の全曝露ステップによって実施することができるので、この技術のスループットは大幅に増大する。
【００８６】
リンパ球、神経細胞、筋肉細胞、幹細胞等の初代細胞の単離（９）は、研究、診断、および治療の用途に重要である。現在のワークフローには組織の消化、デブリの除去、およびフローサイトメトリーが含まれる。デブリ除去のステップは生細胞の主要な損失（たとえば約７０％〜９０％）を惹起し得るが、塞栓のリスクがあるので流体系システムには必要である。本発明の技術は流体系ではないので、組織デブリおよび塊状の細胞の存在を忍容することができる。本発明のシステムおよび方法は消化した試料および単一の生細胞を生成させる試料に直接適用することができるので、必要な試料の量は本発明によって大幅に低減される。
【００８７】
本発明では、細胞工学のために特定の遺伝子または制御ＤＮＡエレメントが細胞ゲノムに挿入される。この挿入は細胞表現型の変化、即ちレポーター遺伝子の発現および表面タンパク質の呈示を誘起し得る。対照的に、ゲノム操作等の現在の工学技術は大部分ランダムまたはあまり制御されておらず、不均一な細胞のプールが生じる。したがって、最適化された表現型の読み出しを有する単一の生細胞を単離することは、全体の工学プロセスの重要なステップである。現在の方法では、単離プロセスは大部分、フローサイトメトリーを使用して実施されている。しかし、これらの従来法は、比較的大量（数十万個の細胞）の出発材料ならびに連続希釈、培養、および実施するのに数か月を要することもあるバリデーション等の面倒な下流の操作を必要とする。対照的に本発明では、僅か数百〜数千個の細胞のように限定された出発試料から僅か数時間程度の短い時間で、望まれる的確なクローンを顕微鏡の直下で単離することが実現可能で費用効率が高い。
【００８８】
ハイブリドーマの選択のため、異なる抗体を呈示する細胞クローンの混合物が通常、単一クローンの単離のための出発材料として役立つ。従来の細胞工学であるフローサイトメトリーまたは微小流体デバイスが、最も強い抗原親和性を有するクローンを選択するために使用されてきた。この現在の慣行は、比較的大量（数十万個の細胞）の出発材料ならびに連続希釈、培養、および実施するのに数か月を要することもあるバリデーション等の面倒な下流の操作を必要とする。対照的に本発明では、僅か数百〜数千個の細胞のように限定された出発試料から僅か数時間程度の短い時間で、望まれる的確なクローンを顕微鏡の直下で単離することが実現可能で費用効率が高い。
【００８９】
基材、即ちプレート、ビーズにコートされた、または細胞上に発現された抗原を標的として特異的に結合するバインダーを単離するために、ファージディスプレイのプロセス（１０、１１）が使用されている。それにも関わらず、これらの現在の方法は通常、プレートをコートするために数ｍｇの精製されたタンパク質（これは高価で入手が面倒である）またはＦＡＣＳのプロセスを実施するために数千万個の細胞を必要とする。研究者らは長年、抗原の量に制限されない理想的なプラットフォームを探索してきた。本発明は、抗体の発見および診断における試料の富化等の目的のための、種々の生体分子とコンジュゲートしたビーズの選択を可能にするものである。
【００９０】
がん患者の細胞療法処置において、腫瘍殺滅クローン（１２）を最初に患者の腫瘍試料から分離しなければならない。このプロセスには粗い選別および高スループットの単一細胞培養が含まれる。次に腫瘍細胞とＴ細胞の共培養において腫瘍細胞の殺滅を顕微鏡観察することによって、機能性クローンの有効性が識別される。本発明において、腫瘍細胞に結合し、元のプールから直ちに形態学的変化を誘起するＴ細胞クローンを直接識別し選択する能力を有することにより、プロセスは大幅に促進される。
【００９１】
循環する腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分離するため、表面マーカーまたは細胞の大きさ等の様々なパラメーターを使用することができる（１３）。以前の技術では腫瘍細胞を腫瘍特異的表面マーカーで染色して、細胞混合物を流体系のストリームに添加することによって、循環する腫瘍細胞を単離し、そこでそれぞれの細胞を検査している。次いで特定の蛍光マーカーを有する細胞が単離されプールされる。この方法は大きさに基づいている。全血または前処理された血液試料が液体の単一ビームに添加され、そこでそれぞれの細胞の大きさが検出され、ＣＴＣの大きさの細胞が収集される。ちょうど１ｍｌの血液は数個のＣＴＣと比較して１０９個を超える赤血球を含んでいるので、干渉する血液細胞がデバイスの塞栓の課題を引き起こし、試料の前処理が必要になる。本発明は迅速な画像取得および流体を含まない捕捉機構を使用しており、標準化されたＣＴＣの検出、単離、および特徴解析のために理想的である。
【００９２】
図８は本開示の態様によるＬＣＤを含まない試料の画像から出発する例示的な方法８００のフローチャートを示す。例示的な方法は初期ステップ８０２で開始する。ステップ８０２で、試料は本明細書で教示するように感光性媒体中にローディングしてよい。次のステップ８０４で、１つまたは複数の非ゲル化光を使用して１つまたは複数の画像を取得してよい。次のステップ８０６で示すように、試料と１つまたは複数の非ゲル化光との間にＬＣＤを配置してよい。ＬＣＤは試料の下または上に直接配置しなくてもよく、試料から距離を置いてもよいことが認識される。一部の実施形態では、ＬＣＤおよび／または光源の組合せは、光学アレイパターンを生成させることができる任意のデバイス、たとえば光投射器、ＯＬＥＤ等で置き換えてもよい。
【００９３】
次のステップ８０８で、本明細書で教示するように、ＬＣＤまたは本明細書で教示する他の任意の好適なデバイスの上にパターンを表示してよい。パターンが表示されれば、次のステップ８１０で、１つまたは複数の非ゲル化光を使用して複合画像を取得してよい。ステップ８１２で、本明細書で教示するように１つまたは複数の粒子の位置を計算してよい。次のステップ８１４で、ＬＣＤまたは本明細書で教示する他の任意の好適なデバイスの上にゲル化パターンを表示しまたは投射してよい。ゲル化パターンが表示されれば、ステップ８１６で、ゲル化光を使用してミクロヒドロゲルを形成してよい。これらのミクロヒドロゲルが形成されれば、後処理ステップ８１８で全体の試料を洗浄しまたは溶出してよい。例示的な実施形態では、洗浄は試料を処理して固定化ミクロゲルの中に標的とさせるために使用してよい。固定化とは、移動しない相を意味する。別の例示的な実施形態では、移動相の中に標的とさせるために、溶出を用いてもよい。
【００９４】
図９は本開示の態様による例示的な方法９００のフローチャートを示す。方法９００はＬＣＤ−試料複合画像のみを使用する。方法９００は、１つまたは複数の非ゲル化光を使用して１つまたは複数の画像を取得するステップを必要としない。方法９００は既に述べた方法８００の他のステップに関して同様であり、簡略化の目的のため繰り返さない。
【００９５】
図１０は本開示の態様による粒子捕捉結果の例示的な画像を示す。示すように、本明細書で教示する例示的なプロセスにより、６つの異なる反復、即ち１００１、１００２、１００３、１００４、１００５、および１００６に関する捕捉前、捕捉後、および洗浄後の画像を図示する。
【００９６】
特定の応用のための説明的な実施形態に関して本開示の原理を本明細書に記載したが、本開示はそれに限定されないことを理解されたい。当技術における通常のスキルおよび本明細書で提供した教示への接近手段を有する者であれば、さらなる改変、応用、実施形態、および等価の置換が全て本明細書に記載した実施形態の範囲に含まれることを認識することになる。したがって、本明細書に記載した発明は上の記載によって限定されると考えるべきではない。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例は、本発明の範囲内の実施形態をさらに説明し実証する。実施例は説明のためにのみ与えられ、本発明の限定であると考えるべきではない。それは、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの変形が可能であるからである。
（実施例１）
ビーズの下のＬＣＤピクセルの選択的暗色化
【００９８】
ハードウェアの設定：顕微鏡、図２Ａ−１〜図２Ａ−４に示すＬＣＤ−試料ステージ、コンピューター。システムの光学系は直立顕微鏡からなる。画像の要求ならびにマスキングは５．５インチのＴＦＴ  ＬＣＤ（２５６０×１４４０分解能）によって達成する。プロトタイプのため、図２Ｂに示すように、ＬＣＤの挿入および取り出しを可能にする機械的設定を、ＡＢＳ印刷試料ステージによって実施する。画像処理ならびにＬＣＤおよびＬＥＤの制御は、パーソナルラップトップで実施する。９６ウェルのマイクロタイタープレートを利用することにより、高スループット応用のために電動化されるべきポテンシャルが可能になる。
【００９９】
ソフトウェアの設定：画像捕捉、試料−ＬＣＤの整列、パターン認識、粒子の採取。画像取得、処理および粒子操作の制御ソフトウェアは、パイソンプログラミング言語によってプロトタイプ化する。主要な課題は、それぞれの目的の粒子の下にあるＬＣＤタイルに正確にアドレス指定することである。これを達成するため、それぞれの目的の区域についていくつかの画像を得る。図３Ａに示すようにＬＣＤを取り付けていない画像を従来の顕微鏡画像として、また図３Ｂに示すようにＬＣＤを取り付けた画像を取る。パターンをＬＣＤ上に（下で論じるように）表示し、図３Ｂに示すようにＬＣＤパターンを有する試料を取得する。最後に顕微鏡の焦点をＬＣＤに合わせ、図３Ｃに示すようにＬＣＤのパターンを画像化する。画像取得の設定のため、ＬＣＤパネルの設置および焦点ぼけの変化によって、画像にずれが生じることがある。
【０１００】
細胞の所望のピクセルをオンまたはオフにするために使用されるＬＣＤパネル上の細胞の位置を把握するために、ＬＣＤ画像上のそれぞれの点の指標を計算する必要がある。パターンを使用してＬＣＤパネルに対応するＬＣＤの画像位置を識別する。これについては以下の文脈で述べる。それぞれのピクセルの位置はデカルト系上の点として記述される。座標系の原点および単位ベクトルは逆格子空間内のピークを見出すことによって計算する。それぞれのピクセルの位置を計算する。ＬＣＤ上の曝露の区域の位置をパターンによって識別する。曝露区域はＬＣＤパネルと比較して極めて小さいので、位置を識別するために１つのパターンを使用することは自明ではない。この制限を克服するため、ＬＣＤ上のそれぞれの８×８のピクセル２について６×６のパターンを生成させる。ＬＣＤパネルの背景は所望の色に設定する。それぞれのパターンについて、正方形の周辺をオフにし、４×４ピクセルの中央部を使用してＬＣＤ上のこのパターンの行と列を識別する。現在の設定において、ＬＣＤは２５６０×１４４０ピクセルを有している。３６６×２０６のパターンが存在し、これらは１７ピクセルで指標化することができる。図３Ｃに示すように、周辺における白色ピクセルを有するパターン枠を、図４Ａに示すように元の画像からパターンを見出すための鋳型として使用する。パターン枠とＬＣＤパターン画像との間で相互相関マップを計算する。最良の整列を使用して、図４Ｂに示すように、元のＬＣＤパターンからパターンを切り取り、図４Ｄ、図４Ｅ、および図４Ｆに示すように、中央部の４×４ピクセルを２進数としてマッピングすることによって、パターンの行および列の指標を識別する。
【０１０１】
ＬＣＤ上に表示されるパターンによって、ＬＣＤタイルの絶対アドレスを指標化した。これは元の明視野画像において採取する任意の粒子を計算するための参照として役立つことになる。細胞選別のための動的マスクを生成させるため、図５Ｂに示すように負のトラッピングのために下にあるＬＣＤタイルを減光するか、または図５Ａに示すように正のトラッピングのためにＬＣＤタイルを選択的に明るくすることによって、目的の粒子を選択する。画像の整列およびピクセルのトラッピングを試験するため、直径３０〜２００ミクロンの市販のビーズを使用し、本発明者らのプロトタイプシステムによって過誤なしに画像を整列させ、粒子を検出し、下にあるＬＣＤタイルの伝達を制御できることを実証した。
（実施例２）
赤血球の除去
【０１０２】
フローサイトメトリーまたは微小流体分離法の特別の型である蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）とは対照的に、本発明の技術は細胞の選択および分離のプロセスを気密のマイクロタイターウェルの内部に物理的に閉じ込めるものである。生体有害物質への曝露が限定されているので、顕微鏡下の選択は液体生検のための理想的なプロセスになる。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の解析は、がんを診断して表現型に分類し、処置を予知するための液体生検の強力なツールである。ＣＴＣの量は比較的少ないので、周囲の赤血球（ＲＢＣ）からＣＴＣを分離することは困難である。フィコール、細胞溶解等のバルク富化ステップの後でも、顕著な数の赤血球が残存して、単一細胞のローディング効率が低い、希少な細胞の増殖が物理的にブロックされる等、下流での効果的なＣＴＣの解析を妨害することが多い。
【０１０３】
ＲＢＣは明視野顕微鏡画像において区別できる色および形態を呈示し、これはパターン認識アルゴリズムによって容易に採取できる。本システムの個別のステップ、即ち自動細胞採取、全ウェルパノラマ合成、および光子重合を最適化するための概念実証実験としてこの応用を使用する。
【０１０４】
実験デザインおよび結果。（Ａ）試料の調製および画像の取得。ＣＴＣを模倣するため、ＲＢＣ夾雑レベルを変化させた試料。培養したＨｅｌａ細胞（Ｈｅｌａ  ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２（商標））に１：０、１：１０、１：１００、および１：１０００のレベルでＲＢＣ細胞（マウス赤血球、ＨｅＬａ  ＡＴＣＣ（登録商標）ｔｉｂ−１１２（商標））を添加する。光学底マイクロタイタープレートの単一のウェルに３０００個の細胞をローディングする。それぞれのウェルについて部分的に重複する１０個の明視野顕微鏡画像を収集し、最後の画像を整列に使用する。最後の画像のそれぞれの画像ピクセルをＬＣＤの絶対座標に整列させ、これをＬＣＤのピクセルマッピングに使用する。（Ｂ）全ウェル画像合成および自動的細胞採取。全ウェルを包含する複合画像を合成し、全ウェルパノラマの上の画像ピクセルの位置を計算して、最後の画像を参照として使用してＬＣＤ座標にマッピングする。機械学習アルゴリズム（パイソンサイイメージモジュール）のための訓練用データセットとして、１００個の８０×８０の単一細胞画像の正方形をＲＢＣのみの画像から採取する。パノラマ上の全ての粒子を採取してＲＢＣまたは「非ＲＢＣ」に分類する。ＲＢＣの質量中心の座標を記録し、その下にある最近接したＬＣＤピクセルを選択的な照明または暗色化のために計算する。試料とＬＣＤとの整列の正確度を検証するため、ＲＢＣのみが照明されるバリデート用ＬＣＤ対照画像を生成させる。（Ｃ）露光時間の最適化およびバイオインクの選択。硬化半径および硬化深さは、ＵＶの線量および光子開始剤の濃度の関数である。異なるバイオインク組成はまた、溶解性および粘度等の異なる物性を有する。ＬＣＤについては、異なる光子エネルギー（波長）も光重合の速度に影響する。５種類の１０Ｗ  ＵＶ  ＬＥＤ（波長それぞれ３６５ｎｍ、３９０ｎｍ、３９５ｎｍ、４００ｎｍ、および４１０ｎｍにおける光子強度ピーク、５°、０．１ｃｍ２フラックスビーム）照射下に、ゼラチン−ＭＡ系（ＩｇｃｕｒｅおよびＩＡＰ）ならびにＰＥＧ−ＭＡ（ＩｇｃｕｒｅおよびＩＡＰ）の市販のバイオインク組成物を試験した。ゲル化の最適条件は、半径２０〜３０ミクロンの非拡散硬化ディスクが得られる条件である。（Ｄ）細胞の回収およびＨｅＬａ細胞の生存率。ＲＢＣを除去した後、粘着性の縁を有するマイクロタイタープレートを試料プレートに取り付け、移動相に保持された細胞を低速遠心分離（３００ｒｐｍ）によって収集プレートに収集する。収集した細胞を再懸濁し、細胞の生存率をトリパンブルー染色で検証して、選別ステップを省略した対照細胞と比較する。
（実施例３）
単一細胞／ビーズ上のファージディスプレイ
【０１０５】
ファージディスプレイは親和性薬剤の開発のための強力な方法である。他のｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ法（リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ）と比較して、ファージディスプレイは種々のフォーマット、即ちビーズ、プレート、または全細胞においても、抗原に対して強固である。それにも関わらず、バルクパニング法は大量の抗原（数ｍｇのタンパク質または数百万個の細胞）を必要とし、これはその費用を顕著に増大させる。本発明者らの選択技術は数個のビーズまたは細胞を必要とするのみである。したがって、必要な抗原は小規模のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳キットまたは哺乳動物細胞系の一時的発現を用いて自製することができる。本提案の開始に先立って、本発明者らはナイーブなラクダ重鎖ライブラリーを構築し、本発明者らの顕微鏡下選択パイプラインを使用して、腫瘍免疫療法に関与するいくつかの標的（ＥＧＦＲ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ１、およびＢＣＭＡ）についてこれをスクリーニングする。膜貫通ドメインを含む４つの遺伝子を一時的発現ベクターｐＴＴ５にクローニングして、ＨＥＫ２９３ＦＳ細胞に形質導入する。細胞のプールを液体窒素下の保存のために分注する。
【０１０６】
実験の設計および予想される結果。（Ａ）ライブラリーの設計。ラクダ生殖細胞系列のＶＨ配列を利用可能なナノボディ配列に整列させ、図６Ａに示すようにナノボディライブラリーのフレームワークとしてクローニングする。利用可能なラクダ免疫レパートリー配列のＮＧＳ解析に基づいて、部位特異的なアミノ酸の多様性を計算する。ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２における１３個の位置（Ｈ２７、Ｈ２９、Ｈ３１Ａ、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３１Ｃ、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５２Ｂ、Ｈ５３、Ｈ５４、およびＨ５６）、ＣＤＲＨ３における８個の位置（Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ９９、Ｈ１００、Ｈ１００Ａ、およびＨ１００Ｂ）を可能なランダム化部位として選択する。（Ｂ）ライブラリーの構築。ライブラリーを構築するため、図６Ｂに示すように、変異誘発の標的である相補性決定領域（ＣＤＲ）にフレームシフトを組み込み、図６Ｂに示すように、Ｋｕｎｋｅｌ系部位特異的変異誘発を採用して、これらのフレームシフト部位を、Ｋａｂａｔデータベースにおける選択したＣＤＲ位置での天然に分布する残基の組をコードするトリ−オリゴヌクレオチドで置き換える。ナノボディのライブラリーをｇｐＩＩＩコートタンパク質への遺伝子融合としてバクテリオファージＭ１３の表面上に呈示し（１）、１０１０までの多様性を有するナイーブなライブラリーを構築する。（Ｃ）図６Ｃに示すビーズ上のファージディスプレイスクリーン。単一粒子パニングスクリーニングの標的として４つのがん免疫標的（ＥＧＦＲ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ１、およびＢＣＭＡ）を使用する。１０μｇの精製されたＣ末端ビオチン化タンパク質を販売業者から購入し、ストレプトアビジンビーズ（５０ミクロンのＣｒｅａｔｉｖｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログＮｏ．ＷＨＭ−Ｓ１７９および１０ミクロンのＷＨＭ−Ｓ１１０）にコートする。
【０１０７】
それぞれの選択のため、５０ミクロンのビーズ上の標的タンパク質を、他の３種のタンパク質でコートした１００倍超の１０ミクロンのビーズに添加する。２０００個のビーズのプールをナイーブなファージライブラリーとインキュベートし、洗浄後に本発明の選別用顕微鏡にローディングする。１０個の大きな粒子を採取し、トリプシン溶出によってファージを回収する。全体で３回の選択を実施する。（Ｄ）細胞上のファージディスプレイスクリーン。ビーズパニングと並行して、標的タンパク質を一時的に発現する単一細胞を使用して本発明の選択システムを評価する。標的細胞を１００倍のＨｅｌａ細胞に添加し、２００個の細胞のプールをファージライブラリーとともにインキュベートし、選別のためにローディングする。ＨＥＫ２９３細胞はＨｅｌａ細胞より小さいので、顕微鏡下に同定された１０個の小さな細胞を選択し、ファージ溶出のためにそれらを選別する。（Ｅ）抗体の特徴解析。スクリーンから単離された４４０個またはそれより多い個別のクローンをファージＥＬＩＳＡによって解析する。バックグラウンドの２倍を超えるＥＬＩＳＡシグナルを有するクローンをＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、金属親和性クロマトグラフィーで精製する。（Ｆ）抗体のバリデーション。可溶性ナノボディを、一時的に発現した細胞および親のＨＥＫ２９３ＦＳ細胞の細胞上の全細胞ＥＬＩＳＡによってさらにバリデートする。
（実施例４）
腫瘍殺滅性リンパ球の選択
【０１０８】
図７Ａに示すように、細胞間相互作用は細胞系腫瘍殺滅の第１のステップである。しかし、一般的な慣行は非免疫細胞の大部分の除去から開始されるので、細胞間相互作用の情報は現行のプロセスでは利用されていない。概念実証として、図７Ｂに示すように、本発明者らの細胞選択法を市販のＣＡＲＴアッセイ制御に適用し、次いで適合したプロセスを利用してがんマーカーバインダーから腫瘍殺滅クローンを得る。
【０１０９】
標的の選択。市販のＣＡＲＴ−腫瘍細胞システム（ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＰｒｏＭａｂ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＭ−ＣＡＲ１０２１−１０Ｍ）、およびＥＧＦＲ腫瘍系（ＡＴＣＣ（登録商標）ＥＧＦＲ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐａｎｅｌ（ＴＣＰ−１０２７（商標）））を選択し、スライド上での選択によって富化のレベルを評価する。
【０１１０】
実験のデザインおよび結果。（Ａ）市販のＣＡＲＴシステムを使用するＣＡＲ−Ｔ細胞富化。異なるＥＧＦＲ発現状態の２つの腫瘍細胞系を標的細胞として使用する。１）高いＥＧＦＲコピー数の増幅を含むＨＣＣ８２７細胞、および２）ＥＧＦＲコピー数ゼロの増幅を含むＮＣＩ−Ｈ４６０細胞。ＨＣＣ８２７およびＮＣＩ−Ｈ４６０細胞系を、推奨されたプロトコールに従って培養する。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２５−０５８−ＣＩ）を使用して全ての細胞を収集する。ＫＩＬＲ  Ｒｅｔｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ａｄｈｅｒｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ、Ｃａｔ．Ｎｏ．９７−００３）を使用して細胞を形質導入する。ＣＡＲ−Ｔ細胞はＰｒｏＭａｂ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入する。本研究では、ＥＧＦＲを標的とするように一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）で操作され、ＣＤ３ζ抗原認識ドメインおよびＣＤ２８共刺激ドメインを含むＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を利用した。模擬ＳｃＦｖ対照ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＰｒｏＭａｂ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＭ−ＣＡＲ１０００−１Ｍ）を空のベクターで形質導入する。両方のＳｃＦｖ  ＣＡＲＴ細胞を模擬ＳｃＦｖ  ＣＡＲＴ細胞と１：１０の比で混合する。Ｔ細胞の混合物を腫瘍細胞と１：１の比でさらに混合する。３０００個の細胞を９６ウェルプレート中で４日間培養し、腫瘍細胞に付着した１０個、２０個、４０個、５０個のＴ細胞を選択して、多数のウェルから溶出させる。細胞ＲＮＡを抽出して逆翻訳し、ｓｃＦｃ領域を標的とするプライマーを使用するＮＧＳシーケンシングに供する。類似したＳｃＦｖの前および後のｍＲＮＡの比を模擬ＳｃＦｖベクターと比較することによって、標的ｓｃＦｖ−ＣＡＲＴの富化を定量する。（Ｂ）ＣＡＲ−Ｔクローンの発見スクリーニング。ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ法からの外部的に富化したＥＧＦＲ  ｓｃＦｖコレクションをクローニングによってＣＡＲ−ＴレンチウイルスベクターにリフォーマットしてＣＡＲＴ細胞のプールを生成し、ＨＣＣ８２７およびＮＣＩ−Ｈ４６０細胞系と共培養して、本発明者らの顕微鏡下選択パイプラインを使用して選別する。１００個の生きたＣＡＲＴクローンを増殖させ、腫瘍細胞の細胞毒性についてバリデートする。
（実施例５）
細胞活性による特異的形態を有する細胞の選択
【０１１１】
異なる機能活性または発生活性について形態学的変化がある細胞を、本発明を使用して解析し、分離することができる。本方法を使用し、オルガネラの転位、クロマチンの形態、ファゴサイトーシス、シナプスの形成、およびタンパク質の共局在化に基づいて、細胞を選択かつ単離することができる。
（実施例６）
ＤＮＡでコートされたビーズの選択
【０１１２】
ＤＮＡでコートされたビーズはハイブリダイゼーションの実験で広く使用されてきた。本方法を使用して特定のＤＮＡ配列を有する実体を単離することができる。
（実施例７）
ハイブリドーマクローンの選択
【０１１３】
色素にコンジュゲートした標的抗原でコートされれば、特定のハイブリドーマクローンの選択に本方法を使用することができる。
（実施例８）
微小液滴の選択
【０１１４】
油中水エマルジョン等の微小液滴は、高スループットの多重解析におけるカプセル化細胞およびその他の材料のための広く用いられる微小環境である。液滴が液体であっても、ヒドロゲルのシェルを形成させて液滴全体を捕捉させることができる。したがって、本方法はエマルジョン環境中の目的の液滴を選択するために使用することができ、細胞、ビーズ、およびタンパク質を顕微鏡的液滴の中にトラップし、次いで本発明のシステムおよび方法を使用して産生された硬化ヒドロゲルのシェルによって液滴を捕捉することができる。
参考文献
【化１】
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【化２】
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参照による組み込み
【０１１５】
補正証明書、特許出願書類、科学論文、政府の報告、ウェブサイト、およびその他の本明細書で引用した参考文献を含む特許書類のそれぞれにおける全ての開示は、あらゆる目的のため全体が参照により本明細書に組み込まれる。用語に齟齬が生じた場合には、本明細書が優先する。
均等物および範囲
【０１１６】
当業者であれば、日常の実験を超えずに、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または解明することができる。本発明の範囲は上の記載に限定されることを意図していない。
【０１１７】
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で実現することができる。上記の実施形態は全ての点において本明細書に記載した発明について限定的であるより説明的であると考えるべきである。含まれる用語が引用した方法のステップまたは組成物の成分に関して使用される本発明の方法およびシステムの種々の実施形態において、方法および組成物は引用したステップまたは成分から本質的になるか、またはこれらからなることも意図されている。さらに、ステップの順序またはある動作を実施する順序は、本発明が操作可能である限り、重要でないことを理解されたい。さらに、２つまたはそれより多いステップまたは動作は、同時に行うことができる。
【０１１８】
本明細書において、文脈によって他が明らかに指示されない限り、単数形は複数形をも含む。他に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通に理解される同じ意味を有する。齟齬が生じた場合には、本明細書が優先する。
【０１１９】
さらに、ある場合には、組成物は混合前の成分からなっていると記述できることを認識されたい。それは、混合によってある種の成分がさらに反応し、またはさらなる物質に変換されることがあるからである。
【０１２０】
本明細書で使用する全てのパーセンテージおよび比は、他に指示されない限り、重量による。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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