(57)【要約】  本開示は、最適化されたがんワクチン、ならびに当該ワクチンを作製する方法、当該ワクチンを使用する方法、及び当該ワクチンを含む組成物に関する。がんワクチンは、個別化がん抗原またはがんホットスポット抗原の部分を含む。さらに、本開示は、最適化されたがんワクチンに含める核酸を選択するためのコンピュータ化システムに関する。
2021529750.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸がんワクチンであって、
各々が３〜１３０個のペプチドエピトープをコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを有する１つ以上の核酸を含み、
前記ペプチドエピトープの各々が、個別化されたがん抗原の部分またはがんホットスポット抗原の部分であり、
前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも２個が、異なる長さを有する、前記核酸がんワクチン。
【請求項２】
前記ペプチドエピトープのうちの１〜３４個が、がんホットスポット抗原の部分である、請求項１に記載の核酸がんワクチン。
【請求項３】
前記ペプチドエピトープのうちの５〜３４個が、がんホットスポット抗原の部分である、請求項１に記載の核酸がんワクチン。
【請求項４】
前記がんホットスポット抗原が、ＫＲＡＳ  Ｇ１２変異もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１３変異、または両方の変異を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項５】
前記がんホットスポットネオ抗原の前記部分が、以下の変異：ＫＲＡＳ  Ｇ１２変異、ＫＲＡＳ  Ｇ１３変異、ＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＢＲＡＦ  Ｖ６００変異、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｒ８８変異、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５変異、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７変異、ＴＰ５３  Ｒ１７５変異、ＴＰ５３  Ｒ２８２変異、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８変異、ＦＧＦＲ３  Ｓ２４９変異、ＥＲＢＢ２  Ｓ３１０変異、ＰＴＥＮ  Ｒ１３０変異、及びＢＣＯＲ  Ｎ１４５９変異のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項６】
各ペプチドエピトープの長さが、前記核酸がんワクチンの抗がん有効性が、前記１つ以上の核酸の長さに基づいて最大Ｔ細胞活性化値を有するように決定される、請求項１に記載の核酸がんワクチン。
【請求項７】
各ペプチドエピトープの長さが、前記核酸がんワクチンの抗がん有効性が、前記１つ以上の核酸の長さに基づいて最大生存値を有するように決定される、請求項１に記載の核酸がんワクチン。
【請求項８】
任意のペプチドエピトープの最小長が、８〜１３アミノ酸である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項９】
任意のペプチドエピトープの最大長が、３１〜３５アミノ酸である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項１０】
前記がんワクチンが、ＤＮＡがんワクチンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項１１】
前記がんワクチンが、ＲＮＡがんワクチンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項１２】
前記がんワクチンが、ｍＲＮＡがんワクチンであり、前記１つ以上の核酸が、ｍＲＮＡである、請求項１１に記載の核酸がんワクチン。
【請求項１３】
前記１つ以上のｍＲＮＡが、各々５′ＵＴＲ及び／または３′ＵＴＲを含む、請求項１２に記載の核酸がんワクチン。
【請求項１４】
前記１つ以上のｍＲＮＡが、各々ポリＡ尾部を含む、請求項１２または請求項１３に記載の核酸がんワクチン。
【請求項１５】
前記ポリＡ尾部が、約１００ヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の核酸がんワクチン。
【請求項１６】
前記１つ以上のｍＲＮＡが、各々キャップ構造または修飾キャップ構造を含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項１７】
前記キャップ構造または前記修飾キャップ構造が、５′キャップ構造、５′キャップ−０構造、５′キャップ−１構造、または５′キャップ−２構造である、請求項１６に記載の核酸がんワクチン。
【請求項１８】
前記１つ以上のｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項１９】
前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、Ｎ１−エチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４´−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メチルシュードウリジン、５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン、及び２´−０−メチルウリジンからなる群から選択される、請求項１８に記載の核酸がんワクチン。
【請求項２０】
前記１つ以上のｍＲＮＡが、完全に修飾される、請求項１８または請求項１９に記載の核酸がんワクチン。
【請求項２１】
前記１つ以上の核酸が、３４個のペプチドエピトープ、５〜１０個のペプチドエピトープ、１０〜２０個のペプチドエピトープ、２０〜３０個のペプチドエピトープ、３０〜４０個のペプチドエピトープ、４０〜５０個のペプチドエピトープ、５０〜６０個のペプチドエピトープ、６０〜７０個のペプチドエピトープ、７０〜８０個のペプチドエピトープ、８０〜９０個のペプチドエピトープ、９０〜１００個のペプチドエピトープ、１００〜１１０個のペプチドエピトープ、１１０〜１２０個のペプチドエピトープ、または１２０〜１３０個のペプチドエピトープをコードする、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項２２】
前記ペプチドエピトープの各々が、別個のオープンリーディングフレームによってコードされる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項２３】
前記ペプチドエピトープが、５〜１３０個のペプチドエピトープからなる鎖状体状がん抗原の形態である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項２４】
以下の条件、
ａ）５〜１３０個のペプチドエピトープが、切断感受性部位によって散在する、及び／または
ｂ）各ペプチドエピトープが、リンカーなしで互いに直接連結される、及び／または
ｃ）各ペプチドエピトープが、単一のアミノ酸リンカーで互いに連結される、及び／または
ｄ）各ペプチドエピトープが、短いペプチドリンカーで互いに連結される、及び／または
ｅ）各ペプチドエピトープが、８〜３５アミノ酸を含み、１つ以上のＳＮＰ変異を含む、及び／または
ｆ）各ペプチドエピトープが、８〜３５アミノ酸を含み、固有の発現ペプチド配列を引き起こす変異を含む、及び／または
ｇ）ペプチドエピトープのいずれも、対象由来のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有しない、及び／または
ｈ）前記ペプチドエピトープをコードする前記核酸が、前記ペプチドエピトープが擬似エピトープを最小限に抑えるように並べられる、及び／または
ｉ）クラスＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープ対クラスＩＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープの比が、少なくとも１：１、２：１、３：１、４：１、もしくは５：１である、及び／または
ｊ）クラスＩＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープが存在しない、及び／または
ｋ）前記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象由来のクラスＩ  ＭＨＣ分子及び／またはクラスＩＩ  ＭＨＣクラス分子に対して最も高い親和性を有する、及び／または
ｌ）前記ペプチドエピトープの少なくとも５０％が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／またはＤＲＢ１について０．５％を超える確率パーセントランクを有する、及び／または
ｍ）前記オープンリーディングフレームが、３４個のペプチドエピトープをコードし、２９個のエピトープが、ＭＨＣクラスＩエピトープであり、５個のエピトープが、ＭＨＣクラスＩＩまたはＭＨＣクラスＩ及びＩＩエピトープである、のうちの１つ以上が満たされる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項２５】
前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つが、予測されるＴ細胞反応性エピトープである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項２６】
前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つが、予測されるＢ細胞反応性エピトープである、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項２７】
前記ペプチドエピトープが、予測されるＴ細胞反応性エピトープ及び予測されるＢ細胞反応性エピトープの組み合わせを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項２８】
前記ペプチドエピトープが、予測されるＴ細胞反応性エピトープ及び／または予測されるＢ細胞反応性エピトープである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項２９】
前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つが、予測されるネオエピトープである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項３０】
少なくとも１つの核酸が、１つ以上の従来のがん抗原または１つ以上のがん／精巣抗原の少なくとも断片をコードするオープンリーディングフレームを有する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項３１】
各核酸が、脂質ナノ粒子中に製剤化される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項３２】
各核酸が、異なる脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項３１に記載の核酸がんワクチン。
【請求項３３】
各核酸が、同じ脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項３１に記載の核酸がんワクチン。
【請求項３４】
前記１つ以上の核酸の全長が、５０〜１００アミノ酸、１００〜２００アミノ酸、２００〜３００アミノ酸、３００〜４００アミノ酸、４００〜５００アミノ酸、５００〜６００アミノ酸、６００〜７００アミノ酸、７００〜８００アミノ酸、８００〜９００アミノ酸、９００〜１０００アミノ酸、１０００〜１１００アミノ酸、または１１００〜１２００アミノ酸の総タンパク質長をコードする、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項３５】
前記抗がん有効性が、遺伝子発現、ＲＮＡ配列、転写物存在量、ＤＮＡアレル頻度、アミノ酸保存、生理化学的類似性、がん遺伝子、特異的ＨＬＡアレルに対する予測される結合親和性、クローン性、結合効率、及びインデル中の存在からなる群から選択される１つ以上の因子に少なくとも部分的に基づいて計算される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の核酸がんワクチン。
【請求項３６】
前記１つ以上の因子が、統計モデルに入力される、請求項３５に記載の核酸がんワクチン。
【請求項３７】
核酸がんワクチンであって、
各々が５〜１３０個のペプチドエピトープをコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを有する１つ以上の核酸を含み、
前記ペプチドエピトープの各々が、個別化されたがん抗原の部分またはがんホットスポット抗原の部分であり、
各ペプチドエピトープが、等しい長さを有する、前記核酸がんワクチン。
【請求項３８】
がんワクチンを作製する方法であって、
ａ）１〜３４個のがんホットスポットを同定することと、
ｂ）患者のための５〜１３０個の個別化がん抗原を同定することと、
ｃ）前記５〜１３０個の個別化がん抗原の各々に対する少なくとも２つのペプチドエピトープの抗腫瘍有効性を決定することと、
ｄ）前記がんワクチンの全抗がん有効性が、所与の全長の前記がんワクチンに対して最大化され、前記ワクチンが、１〜３４個のがんホットスポットネオ抗原の部分を含む、がんワクチンを調製することと、を含む、前記方法。
【請求項３９】
がんを有する患者を治療するための方法であって、
ａ）１つ以上の個別化がん抗原を同定するために、患者に由来する試料を分析することと、
ｂ）前記同定された個別化がん抗原の各々に対する少なくとも２つのペプチドエピトープの前記抗腫瘍有効性を決定することと、
ｃ）前記がんワクチンの前記総抗がん有効性が、所与の全長の前記がんワクチンに対して最大化されるがんワクチンを調製することであって、前記がんワクチンが、１〜３４個のがんホットスポット抗原の部分をさらに含む、前記調製することと、
ｄ）前記がんワクチンを前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
【請求項４０】
１〜３４個のがんホットスポットネオ抗原の前記部分が、以下の変異：ＫＲＡＳ  Ｇ１２変異、ＫＲＡＳ  Ｇ１３変異、ＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＢＲＡＦ  Ｖ６００変異、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｒ８８変異、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５変異、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７変異、ＴＰ５３  Ｒ１７５変異、ＴＰ５３  Ｒ２８２変異、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８変異、ＦＧＦＲ３  Ｓ２４９変異、ＥＲＢＢ２  Ｓ３１０変異、ＰＴＥＮ  Ｒ１３０変異、及びＢＣＯＲ  Ｎ１４５９変異のうちの少なくとも１つを含む、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
１〜３４個のがんホットスポットネオ抗原の前記部分が、ＫＲＡＳ  Ｇ１２変異もしくはＫＲＡＳ  Ｇ１３変異、または両方の変異を含む、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記がんワクチンが、各々が１つ以上のオープンリーディングフレームを有する１つ以上の核酸を含む核酸がんワクチンである、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記がんワクチンが、ＤＮＡがんワクチンである、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記がんワクチンが、ＲＮＡがんワクチンである、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記がんワクチンが、ｍＲＮＡがんワクチンである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記がんワクチンが、ペプチドがんワクチンである、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記がんワクチンが、０．０２〜１．０ｍｇの前記がんワクチンを前記対象に送達するのに十分な投薬量レベルで投与される、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記がんワクチンが、前記対象に、２回、３回、４回、またはそれ以上投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記がんワクチンが、皮内、筋肉内、血管内、腫瘍内、及び／または皮下投与によって投与される、請求項３９〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記がんワクチンが、筋肉内投与によって投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記がんが、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、黒色腫、膀胱尿路上皮癌、ＨＰＶ陰性頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、マイクロサテライト高（ＭＳＩ  Ｈ）／ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損である固形悪性腫瘍、腎癌、胃癌、及び腫瘍変異負荷の高い腫瘍からなる群から選択される、請求項３９〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＮＳＣＬＣが、ＥＧＦＲ感受性変異及び／またはＡＬＫ転座を欠く、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
マイクロサテライト高（ＭＳＩ  Ｈ）／ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損である前記固形悪性腫瘍が、結腸直腸癌、胃腺癌、食道腺癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記１つ以上のｍＲＮＡが、各々５′ＵＴＲ及び／または３′ＵＴＲを含む、請求項４５〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記１つ以上のｍＲＮＡが、各々ポリＡ尾部を含む、請求項４５〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ポリＡ尾部が、約１００ヌクレオチドを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記１つ以上のｍＲＮＡが、各々キャップ構造または修飾キャップ構造を含む、請求項４５〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記キャップ構造または前記修飾キャップ構造が、５′キャップ構造、５′キャップ−０構造、５′キャップ−１構造、または５′キャップ−２構造である、請求項５７に記載の核酸がんワクチン。
【請求項５９】
前記１つ以上のｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項４５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、Ｎ１−エチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４´−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メチルシュードウリジン、５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン、及び２´−０−メチルウリジンからなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記１つ以上のｍＲＮＡが、完全修飾される、請求項５９または請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記１つ以上の核酸が、５〜１０個のペプチドエピトープ、１０〜２０個のペプチドエピトープ、２０〜３０個のペプチドエピトープ、３０〜４０個のペプチドエピトープ、４０〜５０個のペプチドエピトープ、５０〜６０個のペプチドエピトープ、６０〜７０個のペプチドエピトープ、７０〜８０個のペプチドエピトープ、８０〜９０個のペプチドエピトープ、９０〜１００個のペプチドエピトープ、１００〜１１０個のペプチドエピトープ、１１０〜１２０個のペプチドエピトープ、または１２０〜１３０個のペプチドエピトープをコードする、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ペプチドエピトープの各々が、別個のオープンリーディングフレームによってコードされる、請求項３８〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ペプチドエピトープが、５〜１３０個のペプチドエピトープからなる鎖状体状がん抗原の形態である、請求項３８〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
以下の条件、
ａ）前記５〜１３０個のペプチドエピトープが、切断感受性部位によって散在する、及び／または
ｂ）各ペプチドエピトープが、リンカーなしで互いに直接連結される、及び／または
ｃ）各ペプチドエピトープが、単一のアミノ酸リンカーで互いに連結される、及び／または
ｄ）各ペプチドエピトープが、短いリンカーで互いに連結される、及び／または
ｅ）各ペプチドエピトープが、８〜３５アミノ酸を含み、１つ以上のＳＮＰ変異を含む、及び／または
ｆ）各ペプチドエピトープが、８〜３５アミノ酸を含み、固有の発現ペプチド配列を引き起こす変異を含む、及び／または
ｇ）ペプチドエピトープのいずれも、対象由来のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有しない、及び／または
ｈ）前記ペプチドエピトープをコードする前記核酸が、前記ペプチドエピトープが擬似エピトープを最小限に抑えるように並べられる、及び／または
ｉ）クラスＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープ対クラスＩＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープの比が、少なくとも１：１、２：１、３：１、４：１、もしくは５：１である、及び／または
ｊ）クラスＩＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープが存在しない、及び／または
ｋ）前記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象由来のクラスＩ  ＭＨＣ分子及び／またはクラスＩＩ  ＭＨＣクラス分子に対して最も高い親和性を有する、及び／または
ｌ）前記ペプチドエピトープの少なくとも５０％が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／またはＤＲＢ１について０．５％を超える確率パーセントランクを有する、及び／または
ｍ）前記オープンリーディングフレームが、３４個のペプチドエピトープをコードし、２９個のエピトープが、ＭＨＣクラスＩエピトープであり、５個のエピトープが、ＭＨＣクラスＩＩまたはＭＨＣクラスＩ及びＩＩエピトープである、のうちの１つ以上が満たされる、請求項３８〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つが、予測されるＴ細胞反応性エピトープである、請求項３８〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つが、予測Ｂ細胞反応性エピトープである、請求項３８〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ペプチドエピトープが、予測されるＴ細胞反応性エピトープ及び予測されるＢ細胞反応性エピトープの組み合わせを含む、請求項３８〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ペプチドエピトープが、予測されるＴ細胞反応性エピトープ及び／または予測されるＢ細胞反応性エピトープである、請求項３８〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つが、予測されるネオエピトープである、請求項３８〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも１つの核酸が、１つ以上の従来のがん抗原または１つ以上のがん／精巣抗原の少なくとも断片をコードするオープンリーディングフレームを有する、請求項４２〜４５または６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
各核酸が、脂質ナノ粒子中に製剤化される、請求項４２〜４５または６２〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
各核酸が、異なる脂質ナノ粒子中で製剤化される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
各核酸が、同じ脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記１つ以上の核酸の全長が、５０〜１００アミノ酸、１００〜２００アミノ酸、２００〜３００アミノ酸、３００〜４００アミノ酸、４００〜５００アミノ酸、５００〜６００アミノ酸、６００〜７００アミノ酸、７００〜８００アミノ酸、８００〜９００アミノ酸、９００〜１０００アミノ酸、１０００〜１１００アミノ酸、または１１００〜１２００アミノ酸の総タンパク質長をコードする、請求項４２〜４５または６２〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗がん有効性が、遺伝子発現、ＲＮＡ配列、転写物存在量、ＤＮＡアレル頻度、アミノ酸保存、生理化学的類似性、がん遺伝子、特異的ＨＬＡアレルに対する予測される結合親和性、クローン性、結合効率、及びインデル中の存在からなる群から選択される１つ以上の因子に少なくとも部分的に基づいて計算される、請求項３８〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記１つ以上の因子が、統計モデルに入力される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
最大長を有する核酸がんワクチンに含まれる核酸を選択するためのコンピュータ化システムであって、
複数のペプチドエピトープをコードする核酸の複数の配列を受信するように構成された通信インターフェースであって、前記ペプチドエピトープの各々が、個別化がん抗原の部分である、前記通信インターフェースと、
少なくとも１つのコンピュータプロセッサであって、
前記複数のペプチドエピトープの各々について、前記ペプチド内の複数の核酸の各々についてスコアを計算するようにプログラムされ、その各々が、前記１つ以上のペプチドエピトープのうちの少なくとも１つを含み、前記核酸配列のうちの少なくとも２つが、異なる長さを有し、
前記計算されたスコアに基づいて、前記複数のペプチド内の前記複数の核酸配列をランク付けするようにプログラムされ、及び
前記ワクチンの前記ランク付け及び前記最大長に基づいて、前記ワクチンに含めるための核酸配列を選択するようにプログラムされた、前記コンピュータプロセッサと、を含む、前記コンピュータ化システム。
【請求項７９】
任意のペプチドエピトープの最小長が、８アミノ酸である、請求項７８に記載のコンピュータ化システム。
【請求項８０】
任意のペプチドエピトープの最大長が、３１アミノ酸である、請求項７８または請求項７９に記載のコンピュータ化システム。
【請求項８１】
前記複数の核酸が、５〜１０個のペプチドエピトープ、１０〜２０個のペプチドエピトープ、２０〜３０個のペプチドエピトープ、３０〜４０個のペプチドエピトープ、３４個のエピトープ、４０〜５０個のペプチドエピトープ、５０〜６０個のペプチドエピトープ、６０〜７０個のペプチドエピトープ、７０〜８０個のペプチドエピトープ、８０〜９０個のペプチドエピトープ、９０〜１００個のペプチドエピトープ、１００〜１１０個のペプチドエピトープ、１１０〜１２０個のペプチドエピトープ、または１２０〜１３０個のペプチドエピトープをコードする、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のコンピュータ化システム。
【請求項８２】
以下の条件、
ａ）各ペプチドエピトープが、８〜３１アミノ酸を含み、１つ以上のＳＮＰ変異を含む、及び／または
ｂ）各ペプチドエピトープが、８〜３１個のアミノ酸を含み、固有の発現ペプチド配列を引き起こす変異を含む、及び／または
ｃ）前記ペプチドエピトープのいずれも、対象由来のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有しない、及び／または
ｄ）クラスＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープ対クラスＩＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープの比が、少なくとも１：１、２：１、３：１、４：１、もしくは５：１である、及び／または
ｅ）クラスＩＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープが存在しない、
ｆ）前記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象由来のクラスＩ  ＭＨＣ分子及び／またはクラスＩＩ  ＭＨＣクラス分子に対して最も高い親和性を有する、及び／または
ｇ）前記ペプチドエピトープの少なくとも５０％が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／またはＤＲＢ１について０．５％を超える確率パーセントランクを有する、のうちの１つ以上が満たされる、請求項７８〜８１のいずれか１項に記載のコンピュータ化システム。
【請求項８３】
前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つが、予測されるＴ細胞反応性エピトープである、請求項７８〜８２のいずれか１項に記載のコンピュータ化システム。
【請求項８４】
前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つが、予測されるＢ細胞反応性エピトープである、請求項７８〜８３のいずれか１項に記載のコンピュータ化システム。
【請求項８５】
前記ペプチドエピトープが、予測されるＴ細胞反応性エピトープ及び予測されるＢ細胞反応性エピトープの組み合わせを含む、請求項７８〜８４のいずれか１項に記載のコンピュータ化システム。
【請求項８６】
前記ペプチドエピトープが、予測されるＴ細胞反応性エピトープ及び／または予測されるＢ細胞反応性エピトープである、請求項７８〜８５のいずれか１項に記載のコンピュータ化システム。
【請求項８７】
前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つが、予測されるネオエピトープである、請求項７８〜８６のいずれか１項に記載のコンピュータ化システム。
【請求項８８】
少なくとも１つの核酸が、１つ以上の従来のがん抗原または１つ以上のがん／精巣抗原の少なくとも断片をコードするオープンリーディングフレームを有する、請求項７８〜８７のいずれか１項に記載のコンピュータ化システム。
【請求項８９】
前記ワクチンの全長が、５０〜１００アミノ酸、１００〜２００アミノ酸、２００〜３００アミノ酸、３００〜４００アミノ酸、４００〜５００アミノ酸、５００〜６００アミノ酸、６００〜７００アミノ酸、７００〜８００アミノ酸、８００〜９００アミノ酸、９００〜１０００アミノ酸、１０００〜１１００アミノ酸、または１１００〜１２００アミノ酸の総タンパク質長をコードする、請求項７８〜８８のいずれか１項に記載のコンピュータ化システム。
【請求項９０】
前記スコアが、遺伝子発現、ＲＮＡ配列、転写物存在量、ＤＮＡアレル頻度、アミノ酸保存、生理化学的類似性、がん遺伝子、特異的ＨＬＡアレルに対する予測される結合親和性、クローン性、結合効率、及びインデル中の存在からなる群から選択される１つ以上の因子に少なくとも部分的に基づいて計算される、請求項７８〜８９のいずれか１項に記載のコンピュータ化システム。
【請求項９１】
前記１つ以上の因子が、統計モデルに入力される、請求項９０に記載のコンピュータ化システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１８年６月２７日に出願された米国仮出願第６２／６９０，４４１号、２０１８年１１月７日に出願された米国仮出願第６２／７５７，０４５号、２０１９年３月５日に出願された米国仮出願第６２／８１４，２００号、及び２０１９年５月３１日に出願された米国仮出願第６２／８５５，３１１号の優先権の利益を主張し、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
がんの進化における最近の理論は、ストレス誘発性ゲノム不安定性、集団の多様性または異種性、及びゲノム媒介性マクロ進化を含む３つのステップに焦点を当てている。この理論は、既知の分子機序のほとんどががんに寄与できるのに、ほとんどの臨床症例に単一の支配的機序がない理由を説明する。しかしながら、一般的な機序は、がんワクチンががんの治療において普遍的な解決策を提供し得ることを示唆している。
【０００３】
がんワクチンには、健康な人々におけるがんの発症を防止することを意図した防止的または予防的ワクチンと、がんに対する身体の自然な防御を強化することによって既存のがんを治療することを意図した治療的ワクチンが含まれる。がん予防ワクチンは、例えば、感染症ががんを引き起こすことを防止するために、がんを引き起こすか、またはがんの発症に寄与する感染因子を標的とし得る。Ｇａｒｄａｓｉｌ（登録商標）及びＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）は、ＨＰＶ感染及び結果として生じるがんから保護する市販の予防ワクチンの２つの例である。他の予防がんワクチンは、個体が将来がんを発症する可能性を増加させると予測される宿主タンパク質または断片を標的とし得る。
【０００４】
多くの市販または開発中のワクチンは、全微生物、タンパク質抗原、ペプチド、または多糖、及びそれらの組み合わせに基づく。ある特定の開発中のワクチンは、核酸ワクチン（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ワクチンまたはリボ核酸（ＲＮＡ）ワクチン）にも基づく。そのような核酸ワクチンは、一般に、それらのサイズまたは長さに対して最大の有効性を有するように最適化されない。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書では、所与の長さにわたって抗がん有効性が最大化され、身体の細胞機構を誘導して、大概の目的のがんタンパク質またはその断片を産生することができる１つ以上の核酸を含む核酸（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ））がんワクチンが提供される。いくつかの実施形態では、本開示は、所与の長さの最大化抗がん有効性を有する核酸がんワクチンを作製する方法も提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、所与の長さの最大化された抗がん有効性を有するがんワクチンでがんを有する患者を治療する方法も提供する。加えて、ある特定の実施形態では、本開示は、所与の長さの最大化されたがん有効性を有する核酸がんワクチンを作成するためのコンピュータ化システムを提供する。
【０００６】
一態様では、本開示は、各々が５〜１３０個のペプチドエピトープをコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを有する１つ以上の核酸を含み、ペプチドエピトープの各々は、個別化がん抗原の部分であり、少なくとも２つのペプチドエピトープは、異なる長さを有する、核酸がんワクチンを提供する。別の態様では、本開示は、各々が、５〜１３０、２０〜４０、３０〜３５、または３４ペプチドエピトープをコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを有する１つ以上の核酸を含み、ペプチドエピトープの各々が、個別化がん抗原の部分であり、ペプチドエピトープの各々が、異なる長さを有する、核酸がんワクチンを提供する。別の態様では、本開示は、各々が、５〜１３０、２０〜４０、３０〜３５、または３４ペプチドエピトープをコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを有する１つ以上の核酸を含み、ペプチドエピトープの各々が、個別化がん抗原の部分であり、ペプチドエピトープの各々が、等しい長さを有する、核酸がんワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、がんワクチン組成物は、各々が３４ペプチドエピトープをコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを有する１つ以上のｍＲＮＡを含み、２９個のエピトープが、ＭＨＣクラスＩエピトープであり、５個のエピトープが、ＭＨＣクラスＩＩまたはＭＨＣクラスＩ及びＩＩエピトープである。
【０００７】
いくつかの実施形態では、各ペプチドエピトープの長さは、核酸がんワクチンの抗がん有効性が、所与の全長の１つ以上の核酸に対して最大化されるように決定される。いくつかの実施形態では、任意のペプチドエピトープの最小長は、８アミノ酸である。いくつかの実施形態では、任意のペプチドエピトープの最大長は、３１アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちのいずれかまたは全ての最小長は、１３アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちのいずれかまたは全ての最大長は、３５アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちのいずれかまたは全ての長さは、２５アミノ酸である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ＤＮＡがんワクチンである。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ＲＮＡがんワクチンである。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ｍＲＮＡがんワクチンであり、１つ以上の核酸は、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡは各々、５′ＵＴＲ及び／または３′ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡは各々、ポリＡ尾部を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、約１００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡは各々、キャップ構造または修飾キャップ構造を含む。いくつかの実施形態では、キャップ構造または修飾キャップ構造は、５′キャップ構造、５′キャップ−０構造、５′キャップ−１構造、または５′キャップ−２構造である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾を含む。ある特定の実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、Ｎ１−エチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４´−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メチルシュードウリジン、５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン、及び２´−０−メチルウリジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡは、完全修飾される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸は、３〜１０個のペプチドエピトープ、５〜１０個のペプチドエピトープ、１０〜２０個のペプチドエピトープ、２０〜３０個のペプチドエピトープ、３０〜４０個のペプチドエピトープ、４０〜５０個のペプチドエピトープ、５０〜６０個のペプチドエピトープ、６０〜７０個のペプチドエピトープ、７０〜８０個のペプチドエピトープ、８０〜９０個のペプチドエピトープ、９０〜１００個のペプチドエピトープ、１００〜１１０個のペプチドエピトープ、１１０〜１２０個のペプチドエピトープ、または１２０〜１３０個のペプチドエピトープをコードする。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープの各々は、別個のオープンリーディングフレームによってコードされる。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、３〜１３０個のペプチドエピトープからなる鎖状体状がん抗原の形態である。いくつかの実施形態では、がんワクチン組成物は、１５個のペプチドエピトープをコードする１つのオープンリーディングフレームを有する１つのｍＲＮＡを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、以下の条件のうちの１つ以上が満たされる：ａ）３〜１３０個のペプチドエピトープは、切断感受性部位（例えば、切断感受性部位もしくは隣接するエピトープの一部としての切断感受性部位を含むペプチドリンカーなどのリンカー）によって散在される、及び／またはｂ）各ペプチドエピトープは、リンカーなしで互いに直接連結される、及び／またはｃ）各ペプチドエピトープは、単一のアミノ酸リンカーで互いに連結される、及び／またはｄ）各ペプチドエピトープは、短いリンカーで互いに連結される、及び／またはｅ）各ペプチドエピトープは、８〜３１アミノ酸を含み、１つ以上のＳＮＰ変異を含む、及び／またはｆ）各ペプチドエピトープは、８〜３１アミノ酸を含み、固有の発現ペプチド配列を引き起こす変異を含む、及び／またはｇ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％は、対象由来のクラスＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する、及び／またはｈ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％は、対象由来のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する、及び／またはｉ）ペプチドエピトープのうちのいずれも、対象由来のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有しない、及び／またはｊ）ペプチドエピトープの少なくとも５０％は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／またはＤＲＢ１についてＩＣ５０＜５００ｎＭの予測結合親和性を有する、及び／またはｋ）ペプチドエピトープをコードする核酸は、ペプチドエピトープが擬似エピトープを最小化するように命令されるように配置される、及び／またはｌ）クラスＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープ対クラスＩＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープの比は、少なくとも１：１、２：１、３：１、４：１、もしくは５：１である、及び／またはｍ）クラスＩＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープは存在しない。他の実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象由来のクラスＩ  ＭＨＣ分子及び／またはクラスＩＩ  ＭＨＣクラス分子に対して最も高い親和性を有する。他の実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも５０％が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／またはＤＲＢ１について０．５％を超える確率パーセントランクを有する。確率パーセンタイルランクは、強いバインダーを決定するための閾値を提供し、それと等しいまたはそれよりも低い頻度分布におけるスコアのパーセンテージの計算である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、予測されるＴ細胞反応性エピトープである。ある特定の実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、予測されるＢ細胞反応性エピトープである。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、予測されるＴ細胞反応性エピトープと予測されるＢ細胞反応性エピトープとの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、予測されるＴ細胞反応性エピトープ及び／または予測されるＢ細胞反応性エピトープである。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、予測されるネオエピトープである。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの核酸は、１つ以上の従来のがん抗原または１つ以上のがん／精巣抗原の少なくとも断片をコードするオープンリーディングフレームを有する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、各核酸は、脂質ナノ粒子中で製剤化される。いくつかの実施形態では、各核酸は、異なる脂質ナノ粒子中で製剤化される。いくつかの実施形態では、各核酸は、同じ脂質ナノ粒子中で製剤化される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸の全長は、５０〜１００アミノ酸、１００〜２００アミノ酸、２００〜３００アミノ酸、３００〜４００アミノ酸、４００〜５００アミノ酸、５００〜６００アミノ酸、６００〜７００アミノ酸、７００〜８００アミノ酸、８００〜９００アミノ酸、９００〜１０００アミノ酸、１０００〜１１００アミノ酸、または１１００〜１２００アミノ酸の総タンパク質長をコードする。
【００１５】
いくつかの実施形態では、抗がん有効性は、少なくとも部分的に、遺伝子発現、ＲＮＡ配列、転写物存在量、ＤＮＡアレル頻度、アミノ酸保存、生理化学的類似性、がん遺伝子、特定のＨＬＡアレルへの予測される結合親和性、クローン性、結合効率、及びインデル中の存在からなる群から選択される１つ以上の因子に基づいて計算される。いくつかの実施形態では、１つ以上の因子は、統計モデル（例えば、回帰モデル（線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、一般線形モデル等）、一般線形モデル（ロジスティック回帰モデル、プロビット回帰モデル等）、ランダムフォレスト回帰モデル、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、ガウス混合モデル、階層ベイズモデル、及び／または任意の他の好適な統計モデル）に入力される。
【００１６】
別の態様では、本開示は、がんワクチンの作製方法を提供し、ａ）患者のための３〜１３０個の個別化がん抗原を同定することと、ｂ）３〜１３０個の個別化がん抗原の各々について少なくとも２つのペプチドエピトープの抗腫瘍有効性を決定することと、ｃ）がんワクチンの全抗がん有効性が所与の全長のがんワクチンに対して最大化されるがんワクチンを調製することと、を含む。
【００１７】
別の態様では、本開示は、がんを有する患者を治療するための方法を提供し、ａ）１つ以上の個別化されたがん抗原を同定するために、患者に由来する試料を分析することと、ｂ）同定された個別化がん抗原の各々について少なくとも２つのペプチドエピトープの抗腫瘍有効性を決定することと、ｃ）がんワクチンの全抗がん有効性が所与の全長のがんワクチンに対して最大化されるがんワクチンを調製することと、ｄ）がんワクチンを患者に投与することと、を含む。任意選択で、本明細書に記載される方法のうちのいずれかは、がんワクチンの製造を含み得る。
【００１８】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、各々が１つ以上のオープンリーディングフレームを有する１つ以上の核酸を含む核酸がんワクチンである。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ＤＮＡがんワクチンである。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ＲＮＡがんワクチンである。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ｍＲＮＡがんワクチンである。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ペプチドがんワクチンである。
【００１９】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、０．０２〜１．０ｍｇのがんワクチンを対象に送達するのに十分な投薬量レベルで投与される。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、対象に２回、３回、４回、またはそれ以上投与される。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、皮膚内、筋肉内、血管内、腫瘍内、及び／または皮下投与によって投与される。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、筋肉内投与によって投与される。
【００２０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物は、任意のタイプのがんと共に、またはそのために使用され得る。いくつかの実施形態では、がんは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、黒色腫、膀胱尿路上皮癌、ＨＰＶ陰性頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、マイクロサテライト高（ＭＳＩ  Ｈ）／ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損である固形悪性腫瘍、腎癌、胃癌、及び腫瘍変異負荷の高い腫瘍からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、ＥＧＦＲ感作変異及び／またはＡＬＫ転座を欠く。いくつかの実施形態では、マイクロサテライト高（ＭＳＩ  Ｈ）／ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損である固形悪性腫瘍は、結腸直腸癌、胃腺癌、食道腺癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、膀胱癌、ＨＰＶ陰性ＨＮＳＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、ＭＳＩ−高腫瘍、またはＴＭＢ（腫瘍変異負荷）の高いがんのうちのいずれか１つである。
【００２１】
ある特定の実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡは各々、５′ＵＴＲ及び／または３′ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡは各々、ポリＡ尾部を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、約１００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡは各々、キャップ構造または修飾キャップ構造を含む。いくつかの実施形態では、キャップ構造または修飾キャップ構造は、５′キャップ構造、５′キャップ−０構造、５′キャップ−１構造、または５′キャップ−２構造である。ある特定の実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、Ｎ１−エチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４´−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メチルシュードウリジン、５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン、及び２´−０−メチルウリジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡは、完全修飾される。
【００２２】
ある特定の実施形態では、１つ以上の核酸は、３〜１０個のペプチドエピトープ、５〜１０個のペプチドエピトープ、１０〜２０個のペプチドエピトープ、２０〜３０個のペプチドエピトープ、３０〜４０個のペプチドエピトープ、４０〜５０個のペプチドエピトープ、５０〜６０個のペプチドエピトープ、６０〜７０個のペプチドエピトープ、７０〜８０個のペプチドエピトープ、８０〜９０個のペプチドエピトープ、９０〜１００個のペプチドエピトープ、１００〜１１０個のペプチドエピトープ、１１０〜１２０個のペプチドエピトープ、または１２０〜１３０個のペプチドエピトープをコードする。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープの各々は、別個のオープンリーディングフレームによってコードされる。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、５〜１３０個のペプチドエピトープからなる鎖状体状がん抗原の形態である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、以下の条件のうちの１つ以上が満たされる：ａ）３〜１３０個のペプチドエピトープは、切断感受性部位によって散在される、及び／またはｂ）各ペプチドエピトープは、リンカーなしで互いに直接連結される、及び／またはｃ）各ペプチドエピトープは、単一のアミノ酸リンカーで互いに連結される、及び／またはｄ）各ペプチドエピトープは、短いリンカーで互いに連結される、及び／またはｅ）各ペプチドエピトープは、８〜３１アミノ酸を含み、１つ以上のＳＮＰ変異を含む、及び／またはｆ）各ペプチドエピトープは、８〜３１アミノ酸を含み、固有の発現ペプチド配列を引き起こす変異を含む、及び／またはｇ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％は、対象由来のクラスＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する、及び／またはｈ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％は、対象由来のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する、及び／またはｉ）ペプチドエピトープのうちのいずれも、対象由来のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有しない、及び／またはｊ）ペプチドエピトープの少なくとも５０％は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／またはＤＲＢ１についてＩＣ５０＜５００ｎＭの予測結合親和性を有する、及び／またはｋ）ペプチドエピトープをコードする核酸は、ペプチドエピトープが擬似エピトープを最小化するように命令されるように配置される、及び／またはｌ）クラスＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープ対クラスＩＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープの比は、少なくとも１：１、２：１、３：１、４：１、もしくは５：１である、及び／またはｍ）クラスＩＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープは存在しない。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、予測されるＴ細胞反応性エピトープである。ある特定の実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、予測されるＢ細胞反応性エピトープである。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、予測されるＴ細胞反応性エピトープと予測されるＢ細胞反応性エピトープとの組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、ペプチドエピトープは、予測されるＴ細胞反応性エピトープ及び／または予測されるＢ細胞反応性エピトープである。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、予測されるネオエピトープである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸は、１つ以上の従来のがん抗原または１つ以上のがん／精巣抗原の少なくとも断片をコードするオープンリーディングフレームを有する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、各核酸は、脂質ナノ粒子中で製剤化される。いくつかの実施形態では、各核酸は、異なる脂質ナノ粒子中で製剤化される。ある特定の実施形態では、各核酸は、同じ脂質ナノ粒子中で製剤化される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸の全長は、５０〜１００アミノ酸、１００〜２００アミノ酸、２００〜３００アミノ酸、３００〜４００アミノ酸、４００〜５００アミノ酸、５００〜６００アミノ酸、６００〜７００アミノ酸、７００〜８００アミノ酸、８００〜９００アミノ酸、９００〜１０００アミノ酸、１０００〜１１００アミノ酸、または１１００〜１２００アミノ酸の総タンパク質長をコードする。いくつかの実施形態では、抗がん有効性は、少なくとも部分的に、遺伝子発現、ＲＮＡ配列、転写物存在量、ＤＮＡアレル頻度、アミノ酸保存、生理化学的類似性、癌遺伝子、特定のＨＬＡアレルへの予測される結合親和性、クローン性、結合効率、及びインデル中の存在からなる群から選択される１つ以上の因子に基づいて計算される。ある特定の実施形態では、１つ以上の因子は、統計モデル（例えば、回帰モデル（線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、一般線形モデル等）、一般線形モデル（ロジスティック回帰モデル、プロビット回帰モデル等）、ランダムフォレスト回帰モデル、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、ガウス混合モデル、階層ベイズモデル、及び／または任意の他の好適な統計モデル）に入力される。
【００２７】
別の態様では、本開示は、最大長を有する核酸がんワクチンに含める核酸を選択するためのコンピュータ化システムを提供し、このシステムは、複数のペプチドエピトープをコードする核酸の複数の配列を受信するように構成された通信インターフェースであって、ペプチドエピトープの各々が個別化がん抗原の部分である、通信インターフェースと、複数のペプチドエピトープの各々について、ペプチド内の複数の核酸の各々についてスコアを計算するようにプログラムされた少なくとも１つのコンピュータプロセッサであって、その各々が、１つ以上のペプチドエピトープのうちの少なくとも１つを含み、核酸配列の少なくとも２つが異なる長さを有する、コンピュータプロセッサと、計算されたスコアに基づいて、複数のペプチド内の複数の核酸配列をランク付けすることと、ランキング及び最大長のワクチンに基づいて、ワクチンに含めるための核酸配列を選択することと、を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、任意のペプチドエピトープの最小長は、８アミノ酸である。いくつかの実施形態では、任意のペプチドエピトープの最大長は、３１アミノ酸である。ある特定の実施形態では、複数の核酸は、３〜１０個のペプチドエピトープ、５〜１０個のペプチドエピトープ、１０〜２０個のペプチドエピトープ、２０〜３０個のペプチドエピトープ、３０〜４０個のペプチドエピトープ、４０〜５０個のペプチドエピトープ、５０〜６０個のペプチドエピトープ、６０〜７０個のペプチドエピトープ、７０〜８０個のペプチドエピトープ、８０〜９０個のペプチドエピトープ、９０〜１００個のペプチドエピトープ、１００〜１１０個のペプチドエピトープ、１１０〜１２０個のペプチドエピトープ、または１２０〜１３０個のペプチドエピトープをコードする。
【００２９】
いくつかの実施形態では、以下の条件のうちの１つ以上が満たされる：ａ）各ペプチドエピトープは、８〜３１アミノ酸を含み、１つ以上のＳＮＰ変異を含む、及び／またはｂ）各ペプチドエピトープは、８〜３１アミノ酸を含み、固有の発現されたペプチド配列を引き起こす変異を含む、及び／またはｃ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％は、対象に由来するクラスＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和せを有する、及び／またはｄ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％は、対象に由来するクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和せを有する、及び／またはｅ）ペプチドエピトープのいずれも、対象に由来するクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する、及び／またはｆ）ペプチドエピトープの少なくとも５０％は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／またはＤＲＢ１についてＩＣ５０＜５００ｎＭの予測結合親和性を有する、及び／またはｇ）クラスＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープ対クラスＩＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープの比は、少なくとも１：１、２：１、３：１、４：１、もしくは５：１である、及び／またはｈ）クラスＩＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープは存在しない。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、予測されるＴ細胞反応性エピトープである。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、予測されるＢ細胞反応性エピトープである。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、予測されるＴ細胞反応性エピトープと予測されるＢ細胞反応性エピトープとの組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、ペプチドエピトープは、予測されるＴ細胞反応性エピトープ及び／または予測されるＢ細胞反応性エピトープである。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、予測されるネオエピトープである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸は、１つ以上の従来のがん抗原または１つ以上のがん／精巣抗原の少なくとも断片をコードするオープンリーディングフレームを有する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ワクチンの全長は、５０〜１００アミノ酸、１００〜２００アミノ酸、２００〜３００アミノ酸、３００〜４００アミノ酸、４００〜５００アミノ酸、５００〜６００アミノ酸、６００〜７００アミノ酸、７００〜８００アミノ酸、８００〜９００アミノ酸、９００〜１０００アミノ酸、１０００〜１１００アミノ酸、または１１００〜１２００アミノ酸の総タンパク質長をコードする。いくつかの実施形態では、スコアは、少なくとも部分的に、遺伝子発現、ＲＮＡ配列、転写物存在量、ＤＮＡアレル頻度、アミノ酸保存、生理化学的類似性、癌遺伝子、特定のＨＬＡアレルへの予測される結合親和性、クローン性、結合効率、及びインデル中の存在からなる群から選択される１つ以上の因子に基づいて計算される。ある特定の実施形態では、１つ以上の因子は、統計モデル（例えば、回帰モデル（線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、一般線形モデル等）、一般線形モデル（ロジスティック回帰モデル、プロビット回帰モデル等）、ランダムフォレスト回帰モデル、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、ガウス混合モデル、階層ベイズモデル、及び／または任意の他の好適な統計モデル）に入力される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、抗腫瘍Ｔ細胞応答は、各ネオ抗原について評価される。いくつかの実施形態では、評価は、ＷＥＳ及びＲＮＡ−Ｓｅｑデータからのバリアントコールの信頼性、ＲＮＡ−ＳｅｑデータからのｍＲＮＡ転写産物存在量、ＷＥＳ及びＲＮＡ−Ｓｅｑデータからの変異アレル頻度、ならびにＮｅｔＭＨＣｐａｎ及びＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎからの予測されるＨＬＡ結合親和性に基づく。
【００３３】
いくつかの実施形態では、患者のＨＬＡアロタイプが同定され、患者のＨＬＡに結合すると予測される抗原が組み込まれる。いくつかの実施形態では、より多くの重量が、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、及びＤＲ（コア標的）の予測バインダーに割り当てられてもよく、（ゼロではないが）より低い重量が、患者の他のＨＬＡアロタイプ（補足標的）に割り当てられてもよい。ほぼ全ての個体は、少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、及びＤＲ機能性アロタイプ（すなわち、コアＭＨＣアレル）を有し、これらは、全ての既知のヒトエピトープの約９０％の制限要素である（図５）。ＨＬＡ−Ｃ制限または同種反応性Ｔ細胞はほとんど観察されず、ＨＬＡ−Ｃの細胞表面発現は、ＨＬＡ−Ａ及びＢについて見られるものの１０％である。残りの補足標的は、クラスＩＩ分子をコードし、個体は、それらをコードする遺伝子についてヌルであり得る。さらに、これらの補足クラスＩＩ標的の４桁の精密タイピングは、最先端のＮＧＳ及び他の配列に基づくタイピング方法を使用しても、しばしば曖昧である。いくつかの実施形態では、コアまたは補足ＨＬＡ標的のいずれかのためのＮＧＳに基づくアレルタイピングが曖昧である場合、アレル（複数可）は、ネオ抗原をランク付けするときに考慮されない場合がある。
【００３４】
いくつかの実施形態では、各ネオ抗原の自己性チェックを実施してもよい。いくつかの実施形態では、患者特異的な転写産物のセットは、配列を患者自身の生殖細胞系タンパク質コーディングバリアントのセットに調整することによって、参照ヒトゲノム注釈からのタンパク質コーディング転写産物アミノ酸配列を使用して作成される。いくつかの実施形態では、この患者特異的エクソーム（ネオ抗原を含有する遺伝子を除く）を使用して、各ＨＬＡクラスＩ結合ネオ抗原エピトープ（８〜１１−ｍｅｒ）を１００％正確な自己一致についてチェックしてもよい。いくつかの実施形態では、このツールを使用して、ゲノム及び／またはトランスクリプトームの他の場所で１００％自己一致として同定された任意のネオ抗原は、ｍＲＮＡ構築物から除外され得る。
【００３５】
自己性チェックによって除外されない全てのバリアントは、患者特異的ｍＲＮＡ構築物の設計に含めるために評価され得る。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ結合予測が不完全であり、ＲＮＡ−Ｓｅｑ感受性が生検の腫瘍含量及び配列決定の深度によって制限され得るという知識に基づいて、ハードフィルターではなく、所定の重みを使用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】適応症によるホットスポット変異を示す表である。
【図２】ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１について、ｎｅｔＭＨＣｐａｎ  ｖ３．０対ｎｅｔＭＨＣｐａｎ  ４．０ＥＬの予測％ランクの比較を示す。多くのペプチドは、一般に「強いバインダー」のカットオフであると考えられる０．５％ランクを出たり入ったりする。
【図３】結合予測の異なる方法を示す。Ａは、主要なＨＬＡアレルへの予測バインダーの均一性を示すグラフである。パーセントランク（％ランク）に切り替えることは、異なるＨＬＡアレル間の予測バインダーのよりバランスの取れた分布につながる。Ｂは、同様に、ＭＨＣ結合を予測するための異なる方法を使用した異なる試料の曲線下面積（ＡＵＣ）を示すグラフである。パーセントランク法は、他の代替案（例えば、ＩＣ５０）よりも予測性能を向上させることが示された。
【図４Ａ】インビボ免疫原性研究の結果を示す。クラスＩエピトープに対する同等の免疫応答は、２０ｍｅｒ／３１フランク（ｆｌａｎｋ）及び３４ｍｅｒ／２５フランクワクチンによって検出されたが、４０ｍｅｒ／２１フランクは、３μｇ及び１０μｇ用量の両方では検出されなかった。いくつかの再刺激について、３４ｍｅｒ構築物のみが、試験条件下で検出可能な応答を示した。
【図４Ｂ】インビボ免疫原性研究の結果を示す。クラスＩエピトープに対する同等の免疫応答は、２０ｍｅｒ／３１フランク（ｆｌａｎｋ）及び３４ｍｅｒ／２５フランクワクチンによって検出されたが、４０ｍｅｒ／２１フランクは、３μｇ及び１０μｇ用量の両方では検出されなかった。いくつかの再刺激について、３４ｍｅｒ構築物のみが、試験条件下で検出可能な応答を示した。
【図４Ｃ】インビボ免疫原性研究の結果を示す。クラスＩエピトープに対する同等の免疫応答は、２０ｍｅｒ／３１フランク（ｆｌａｎｋ）及び３４ｍｅｒ／２５フランクワクチンによって検出されたが、４０ｍｅｒ／２１フランクは、３μｇ及び１０μｇ用量の両方では検出されなかった。いくつかの再刺激について、３４ｍｅｒ構築物のみが、試験条件下で検出可能な応答を示した。
【図５】ネオ抗原のコア標的及び補足ＨＬＡ標的を示す。Ａは、免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ、ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／）を使用した全ての既知のヒトＴ細胞エピトープ（ヒトＴ細胞刺激アッセイにおいて陽性）の分析により、データベース内の全ての記載されたヒトエピトープの約９０％を占めるＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、及びＤＲを有するＨＬＡ制限要素の明確な階層が明らかになった（ｎ＝８１０１）。Ｂは、ＩＥＤＢ検索ツールをウイルスエピトープのみに限定することにより（ｎ＝４４７２）、これらのコアクラスＩ及びクラスＩＩ遺伝子座に対するＴ細胞の明らかな選好を強化した。この分析は、患者のＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、及び−ＤＲＢ１アロタイプに結合すると予測される変異に対して、ネオ抗原選択を優先させることができることを示唆する。
【図６】体細胞変異負荷の集団分析を示す。ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌからのがん組織学コホートにおける非同義変異の分布。赤、青、及び緑の線は、それぞれ２０、３４、及び１００変異を表す。
【図７Ａ】次世代配列決定（ＮＧＳ）及びバイオインフォマティクスシステム出力の再現性を示す。単一の患者からの４つの関連腫瘍試料の独立した処理を使用する。原発性腫瘍試料及びそれに由来する３つの腫瘍細胞株を、ＮＧＳ、バリアントコール、及びバイオインフォマティクスシステムを通して実行した。
【図７Ｂ】次世代配列決定（ＮＧＳ）及びバイオインフォマティクスシステム出力の再現性を示す。単一の患者からの４つの関連腫瘍試料の独立した処理を使用する。４つの試料間でコールされるバリアントにおける最小の差異が観察された。
【図７Ｃ】次世代配列決定（ＮＧＳ）及びバイオインフォマティクスシステム出力の再現性を示す。単一の患者からの４つの関連腫瘍試料の独立した処理を使用する。同定された３６９変異の生のネオ抗原スコア間の相関（スピアマンの順位相関係数：腫瘍対株１：ρ＝０．８６、ｐ＝１．９２Ｅ−１０１、腫瘍対株２：ρ＝０．８４、ｐ＝３．０１Ｅ−８９、及び腫瘍対株３：ρ＝０．８４、ｐ＝５．７７Ｅ−９１）。
【図７Ｄ】次世代配列決定（ＮＧＳ）及びバイオインフォマティクスシステム出力の再現性を示す。単一の患者からの４つの関連腫瘍試料の独立した処理を使用する。代表的なｍＲＮＡ配列に含めるために選択された共通及び固有のネオ抗原のＶｅｎｎ図。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本開示の実施形態は、ペプチドエピトープをコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを有する１つ以上の核酸を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのＲＮＡ）ワクチンを提供する。本明細書に提供されるように、不均一な長さのペプチドエピトープをコードする核酸がんワクチンを使用して、細胞及び／または体液性免疫を含むバランスの取れた免疫応答を誘導してもよい。所与の長さの最大化された抗がん有効性を有する核酸がんワクチンを作製する方法もまた、所与の長さの最大化された抗がん有効性を有するがんワクチンでがんを有する患者を治療する方法と同様に、本明細書に提供される。加えて、本明細書では、所与の長さの最大化されたがん有効性を有する核酸がんワクチンを作成するためのコンピュータ化システムが提供される。最大化された抗がん有効性は、エピトープまたはエピトープをコードする核酸の長さに基づいて、最大Ｔ細胞活性化値または生存値などのＴ細胞活性化値または生存値を同定することによって決定され得る。Ｔ細胞活性化値または生存値は、当該技術分野において知られている任意の方法を使用して、例えば、市販のアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ等）を使用して決定することができる。典型的には、Ｔ細胞活性化値は、サイトカインの発現レベルの変化、例えば、Ｔ細胞活性化または４１ＢＢ及び／またはＯＸ４０などの細胞表面活性化マーカーの上方調節に関連するインターフェロンγに基づいて決定される。生存値は、対照における生存率、または生存率に関する集団に基づくデータと比較して評価することができる。
【００３８】
ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）がんワクチンなどの核酸がんワクチンを産生する試みがなされているが、そのようなワクチンの有効性は依然として変動する。非常に驚くべきことに、本発明者らは、そのようながんワクチンに対する免疫応答が、がんワクチンに含めるための様々なサイズのペプチドエピトープの評価及び選択を通じて（均一な長さ／サイズのペプチドエピトープの選択とは対照的に）最適化され得ることを発見した。
【００３９】
ワクチン開発における標的ポリペプチド配列に対する所望の免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答）を誘発するがん抗原の生成は、依然として困難な課題である。本発明は、ワクチン開発に関連するハードルを克服する技術を伴う。いくつかの実施形態では、本発明の核酸ワクチンは、少なくとも１０倍、２０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１，０００倍の倍率で、従来のワクチン（例えば、均一な長さのペプチドエピトープをコードするもの）よりも優れている。
【００４０】
非限定的な例として、本明細書に記載されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）核酸がんワクチンが細胞に送達されるとき、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、細胞内機構によってポリペプチドに処理され、次いで、ポリペプチドを、腫瘍またはがん細胞集団に対する免疫応答を刺激することができる免疫感受性断片に処理することができる。
【００４１】
ペプチドエピトープ
本開示の核酸がんワクチンは、１つ以上のペプチドエピトープ（個別化がん抗原の部分である）をコードし得る。個別化がん抗原の部分は、完全長の個別化がん抗原未満の個別化がん抗原のセグメントである。個別化がん抗原は、腫瘍特異的抗原であり、個体の正常な非がん性組織において発現されないか、または低レベルで発現される個体の腫瘍中に存在するネオ抗原とも称される。抗原は、他の個体の腫瘍中に存在してもしなくてもよい。
【００４２】
一実施形態では、核酸がんワクチンは、任意の数のペプチドエピトープを含有し得るオープンリーディングフレームから構成される。いくつかの実施形態では、核酸がんワクチンは、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、２４個以上、２５個以上、２６個以上、２７個以上、２８個以上、２９個以上、３０個以上、３１個以上、３２個以上、３３個以上、３４個以上、３５個以上、３６個以上、３７個以上、３８個以上、３９個以上、４０個以上、４５個以上、５０個以上、５５個以上、６０個以上、６５個以上、７０個以上、７５個以上、８０個以上、８５個以上、９０個以上、９５個以上、１００個以上、１０５個以上、１１０個以上、１１５個以上、１２０個以上、１２５個以上、１３０個以上、１３５個以上、１４０個以上、１４５個以上、１５０個以上、１５５個以上、１６０個以上、１６５個以上、１７０個以上、１７５個以上、１８０個以上、１８５個以上、１９０個以上、１９５個以上、または２００個以上のペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームから構成される。他の実施形態では、核酸がんワクチンは、２００個以下、１９５個以下、１９０個以下、１８５個以下、１８０個以下、１７５個以下、１７０個以下、１６５個以下、１６０個以下、１５５個以下、１５０個以下、１４５個以下、１４０個以下、１３５個以下、１３０個以下、１２５個以下、１２０個以下、１１５個以下、１１０個以下、１００個以下、９５個以下、９０個以下、８５個以下、８０個以下、７５個以下、７０個以下、６５個以下、６０個以下、５５個以下、５０個以下、４５個以下、４０個以下、３５個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、または５個以下のペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームから構成される。他の実施形態では、核酸がんワクチンは、最大２００個、最大１９５個、最大１９０個、最大１８５個、最大１８０個、最大１７５個、最大１７０個、最大１６５個、最大１６０個、最大１５５個、最大１５０個、最大１４５個、最大１４０個、最大１３５個、最大１３０個、最大１２５個、最大１２０個、最大１１５個、最大１１０個、最大１００個、最大９５個、最大９０個、最大８５個、最大８０個、最大７５個、最大７０個、最大６５個、最大６０個、最大５５個、最大５０個、最大４５個、最大４０個、最大３５個、最大３０個、最大２５個、最大２０個、最大１５個、最大１０個のペプチドエピトープ、最大５個のペプチドエピトープ、または最大３個のペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームから構成される。
【００４３】
ある特定の実施形態では、核酸がんワクチンは、３〜１０個のペプチドエピトープ、５〜１０個のペプチドエピトープ、１０〜２０個のペプチドエピトープ、２０〜３０個のペプチドエピトープ、３０〜４０個のペプチドエピトープ、４０〜５０個のペプチドエピトープ、５０〜６０個のペプチドエピトープ、６０〜７０個のペプチドエピトープ、７０〜８０個のペプチドエピトープ、８０〜９０個のペプチドエピトープ、９０〜１００個のペプチドエピトープ、１００〜１１０個のペプチドエピトープ、１１０〜１２０個のペプチドエピトープ、１２０〜１３０個のペプチドエピトープ、１３０〜１４０個のペプチドエピトープ、１４０〜１５０個のペプチドエピトープ、１５０〜１６０個のペプチドエピトープ、１６０〜１７０個のペプチドエピトープ、１７０〜１８０個のペプチドエピトープ、１８０〜１９０個のペプチドエピトープ、または１９０〜２００個のペプチドエピトープをコードする。
【００４４】
ある特定の実施形態では、核酸がんワクチンは、２〜２００、５〜２００、８〜２００、１０〜２００、２〜１９０、５〜１９０、８〜１９０、１０〜１９０、２〜１８０、５〜１８０、８〜１８０、１０〜１８０、２〜１７０、５〜１７０、８〜１７０、１０〜１７０、２〜１６０、５〜１６０、８〜１６０、１０〜１６０、２〜１５０、５〜１５０、８〜１５０、１０〜１５０、２〜１４５、５〜１４５、８〜１４５、１０〜１４５、２〜１４０、５〜１４０、８〜１４０、１０〜１４０、２〜１３９、５〜１３９、８〜１３９、１０〜１３９、２〜１３８、５〜１３８、８〜１３８、１０〜１３８、２〜１３７、５〜１３７、８〜１３７、１０〜１３７、２〜１３６、５〜１３６、８〜１３６、１０〜１３６、２〜１３５、５〜１３５、８〜１３５、１０〜１３５、２〜１３４、５〜１３４、８〜１３４、１０〜１３４、２〜１３３、５〜１３３、８〜１３３、１０〜１３３、２〜１３２、５〜１３２、８〜１３２、１０〜１３２、２〜１３１、５〜１３１、８〜１３１、１０〜１３１、２〜１３０、５〜１３０、８〜１３０、１０〜１３０、２〜１２９、５〜１２９、８〜１２９、１０〜１２９、２〜１２８、５〜１２８、８〜１２８、１０〜１２８、２〜１２７、５〜１２７、８〜１２７、１０〜１２７、２〜１２６、５〜１２６、８〜１２６、１０〜１２６、２〜１２５、５〜１２５、８〜１２５、１０〜１２５、２〜１２４、５〜１２４、８〜１２４、１０〜１２４、２〜１２３、５〜１２３、８〜１２３、１０〜１２３、２〜１２２、５〜１２２、８〜１２２、１０〜１２２、２〜１２１、５〜１２１、８〜１２１、１０〜１２１、２〜１２０、５〜１２０、８〜１２０、１０〜１２０、２〜１１９、５〜１１９、８〜１１９、１０〜１１９、２〜１１８、５〜１１８、８〜１１８、１０〜１１８、２〜１１７、５〜１１７、８〜１１７、１０〜１１７、２〜１１６、５〜１１６、８〜１１６、１０〜１１６、２〜１１５、５〜１１５、８〜１１５、１０〜１１５、２〜１１４、５〜１１４、８〜１１４、１０〜１１４、２〜１１３、５〜１１３、８〜１１３、１０〜１１３、２〜１１２、５〜１１２、８〜１１２、１０〜１１２、２〜１１１、５〜１１１、８〜１１１、１０〜１１１、２〜１１０、５〜１１０、８〜１１０、１０〜１１０、２〜１００、５〜１００、８〜１００、または１０〜１００個のペプチドエピトープをコードする。
【００４５】
他の実施形態では、核酸がんワクチンは、２〜９５、５〜９５、８〜９５、１０〜９５、２〜９０、５〜９０、８〜９０、１０〜８５、２〜８５、５〜８５、８〜８５、１０〜８５、２〜８０、５〜８０、８〜８０、１０〜８０、２〜８５、５〜８５、８〜８５、１０〜８５、２〜８０、５〜８０、８〜８０、１０〜８０、２〜７５、５〜７５、８〜７５、１０〜７５、２〜７０、５〜７０、８〜７０、１０〜７０、２〜６５、５〜６５、８〜６５、１０〜６５、２〜６０、５〜６０、８〜６０、１０〜６０、２〜５５、５〜５５、８〜５５、１０〜５５、２〜５０、５〜５０、８〜５０、１０〜５０、２〜４５、５〜４５、８〜４５、１０〜４５、２〜４０、５〜４０、８〜４０、１０〜４０、２〜３９、５〜３９、８〜３９、１０〜３９、２〜３８、５〜３８、８〜３８、１０〜３８、２〜３７、５〜３７、８〜３７、１０〜３７、２〜３６、５〜３６、８〜３６、１０〜３６、２〜３５、５〜３５、８〜３５、１０〜３５、２〜３４、５〜３４、８〜３４、１０〜３４、２〜３３、５〜３３、８〜３３、１０〜３３、２〜３２、５〜３２、８〜３２、１０〜３２、２〜３１、５〜３１、８〜３１、１０〜３１、２〜３０、５〜３０、８〜３０、１０〜３０、２〜２９、５〜２９、８〜２９、１０〜２９、２〜２８、５〜２８、８〜２８、１０〜２８、２〜２７、５〜２７、８〜２７、１０〜２７、２〜２６、５〜２６、８〜２６、１０〜２６、２〜２５、５〜２５、８〜２５、１０〜２５、２〜２４、５〜２４、８〜２４、１０〜２４、２〜２３、５〜２３、８〜２３、１０〜２３、２〜２２、５〜２２、８〜２２、１０〜２２、２〜２１、５〜２１、８〜２１、１０〜２１、２〜２０、５〜２０、８〜２０、１０〜２０、２〜１９、５〜１９、８〜１９、１０〜１９、２〜１８、５〜１８、８〜１８、１０〜１８、２〜１７、５〜１７、８〜１７、１０〜１７、２〜１６、５〜１６、８〜１６、１０〜１６、２〜１５、５〜１５、８〜１５、１０〜１５、２〜１４、５〜１４、８〜１４、１０〜１４、２〜１３、５〜１３、８〜１３、１０〜１３、２〜１２、５〜１２、８〜１２、１０〜１２、２〜１１、５〜１１、８〜１１、１０〜１１、２〜１０、５〜１０、または８〜１０個のペプチドエピトープをコードする。
【００４６】
さらに他の実施形態では、核酸がんワクチンは、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、２０〜１８０、３０〜１８０、４０〜１８０、５０〜１８０、２０〜１７０、３０〜１７０、４０〜１７０、５０〜１７０、２０〜１６０、３０〜１６０、４０〜１６０、２０〜１５０、３０〜１５０、４０〜１５０、５０〜１５０、２０〜１４０、３０〜１４０、４０〜１４０、５０〜１４０、２０〜１３０、２０〜１３０、４０〜１３０、５０〜１３０、２０〜１２０、３０〜１２０、４０〜１２０、５０〜１２０、２０〜１１０、３０〜１１０、４０〜１１０、５０〜１１０、２０〜１００、３０〜１００、４０〜１００、または５０〜１００個のペプチドエピトープをコードする。一実施形態では、核酸ワクチンは、３４個のペプチドエピトープをコードする。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸がんワクチン及びワクチン接種方法は、特定の変異（ネオエピトープ）及び／またはがん生殖細胞系遺伝子（複数の患者に見られる腫瘍に共通の抗原）によって発現される変異に基づくエピトープまたは抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む。
【００４８】
本明細書で使用される、抗原決定基としても知られるエピトープは、適切な文脈では免疫系によって、具体的には抗体、Ｂ細胞、またはＴ細胞によって認識される抗原の部分である。エピトープとしては、Ｂ細胞エピトープ（例えば、予測されるＢ細胞反応性エピトープ）及びＴ細胞エピトープ（例えば、予測されるＴ細胞反応性エピトープ）を挙げることができる。Ｂ細胞エピトープ（例えば、予測されるＢ細胞反応性エピトープ）は、特異的抗体産生Ｂ細胞による認識に必要なペプチド配列である。Ｂ細胞エピトープ（例えば、予測されるＢ細胞反応性エピトープ）は、抗体によって認識される抗原の特異的領域を指す。Ｔ細胞エピトープ（例えば、予測されるＴ細胞反応性エピトープ）は、ＡＰＣ上のタンパク質と関連して、特異的Ｔ細胞による認識に必要とされるペプチド配列である。Ｔ細胞エピトープ（例えば、予測されるＴ細胞反応性エピトープ）を細胞内で処理し、ＡＰＣの表面上に提示し、そこでそれらは、ＭＨＣクラスＩＩ及びＭＨＣクラスＩ分子を含むＭＨＣ分子に結合する。エピトープに結合する抗体の部分をパラトープと呼ぶ。エピトープは、構造及びパラトープとの相互作用に基づいて、立体構造エピトープまたは線形エピトープであり得る。線形または連続性エピトープは、タンパク質の特定の領域の一次アミノ酸配列によって定義される。抗体と相互作用する配列は、タンパク質上で互いに隣接して順次位置付けられ、エピトープは通常、単一のペプチドによって模倣され得る。立体構造エピトープは、天然タンパク質の立体構造によって定義されるエピトープである。これらのエピトープは、連続的であっても不連続であってもよい（すなわち、おそらく、エピトープの成分は、折り畳まれた天然タンパク質構造において互いに近接してもたらされるタンパク質の異なる部分に位置し得る）。
【００４９】
各ペプチドエピトープは、エピトープにとって合理的な任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、各ペプチドエピトープの長さは、必ずしも等しくはない。いくつかの実施形態では、核酸がんワクチンにおける各ペプチドエピトープは、異なる長さである。ある特定の実施形態では、核酸がんワクチン中のペプチドエピトープのうちの少なくとも２つ（例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、及び最大及び全てを含む）は、異なる長さである。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つの長さは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００アミノ酸である。他の実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つの長さは、１００以下、９５以下、９０以下、８５以下、８０以下、７５以下、７０以下、６５以下、６０以下、５５以下、５０以下、４５以下、４０以下、３５以下、３０以下、２５以下、２０以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下のアミノ酸である。他の実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つの長さは、最大１００、最大９５、最大９０、最大８５、最大８０、最大７５、最大７０、最大６５、最大６０、最大５５、最大５０、最大４５、最大４０、最大３５、最大３０、最大２５、最大２０、最大１５、または最大１０アミノ酸である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、各ペプチドエピトープは、５〜１００アミノ酸長（包含的）であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つの長さは、５〜１００、５〜９５、５〜９０、５〜８５、５〜８０、５〜７５、５〜７０、５〜６５、５〜６０、５〜５５、５〜５０、５〜４５、５〜４０、５〜３９、５〜３８、５〜３７、５〜３６、５〜３５、５〜３４、５〜３３、５〜３２、５〜３１、５〜３０、５〜２９、５〜２８、５〜２７、５〜２６、５〜２５、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、５〜２０、８〜１００、８〜９５、８〜９０、８〜８５、８〜８０、８〜７５、８〜７０、８〜６５、８〜６０、８〜５５、８〜５０、８〜４５、８〜４０、８〜３９、８〜３８、８〜３７、８〜３６、８〜３５、８〜３４、８〜３３、８〜３２、８〜３１、８〜３０、８〜２９、８〜２８、８〜２７、８〜２６、８〜２５、８〜２４、８〜２３、８〜２２、８〜２１、８〜２０、１０〜１００、１０〜９５、１０〜９０、１０〜８５、１０〜８０、１０〜７５、１０〜７０、１０〜６５、１０〜６０、１０〜５５、１０〜５０、１０〜４５、１０〜４０、１０〜３９、１０〜３８、１０〜３７、１０〜３６、１０〜３５、１０〜３４、１０〜３３、１０〜３２、１０〜３１、１０〜３０、１０〜２９、１０〜２８、１０〜２７、１０〜２６、１０〜２５、１０〜２４、１０〜２３、１０〜２２、１０〜２１、または１０〜２０アミノ酸である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、核酸がんワクチンによってコードされるペプチドエピトープの各々は、異なる長さを有し得る。ある特定の実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、核酸がんワクチンによってコードされる別のペプチドエピトープとは異なる長さを有する。各ペプチドエピトープは、エピトープにとって合理的な任意の長さであり得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープ長の異なるパーセンテージが、核酸によってコードされる。以下の一覧に記載されている全てのパーセンテージは、およそ（すなわち、記載された量の５％以内）であり得る。「およそ」及び「約」という用語の使用は同等である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、核酸によってコードされるペプチドエピトープ長のパーセンテージは、以下のとおりであり得る：約１００％＜１５アミノ酸、約０％≧１５アミノ酸、約９５％＜１５アミノ酸、約５％≧１５アミノ酸、約９０％＜１５アミノ酸、約１０％≧１５アミノ酸、約８５％＜１５アミノ酸、約１５％≧１５アミノ酸、約８０％＜１５アミノ酸、約２０％≧１５アミノ酸、約７５％＜１５アミノ酸、約２５％≧１５アミノ酸、約７０％＜１５アミノ酸、約３０％≧１５アミノ酸、約６５％＜１５アミノ酸、約３５％≧１５アミノ酸、約６０％＜１５アミノ酸、約４０％≧１５アミノ酸、約５５％＜１５アミノ酸、約４５％≧１５アミノ酸、約５０％＜１５アミノ酸、約５０％≧１５アミノ酸、約４５％＜１５アミノ酸、約５５％≧１５アミノ酸、約４０％＜１５アミノ酸、約６０％≧１５アミノ酸、約３５％＜１５アミノ酸、約６５％≧１５アミノ酸、約３０％＜１５アミノ酸、約７０％≧１５アミノ酸、約２５％＜１５アミノ酸、約７５％≧１５アミノ酸、約２０％＜１５アミノ酸、約８０％≧１５アミノ酸、約１５％＜１５アミノ酸、約８５％≧１５アミノ酸、約１０％＜１５アミノ酸、約９０％≧１５アミノ酸、約５％＜１５アミノ酸、約９５％≧１５アミノ酸、または約０％＜１５アミノ酸、約１００％≧１５アミノ酸。
【００５５】
いくつかの実施形態では、核酸によってコードされるペプチドエピトープ長のパーセンテージは、以下のとおりであり得る：約１００％＜１７アミノ酸、約０％≧１７アミノ酸、約９５％＜１７アミノ酸、約５％≧１７アミノ酸、約９０％＜１７アミノ酸、約１０％≧１７アミノ酸、約８５％＜１７アミノ酸、約１７％≧１７アミノ酸、約８０％＜１７アミノ酸、約２０％≧１７アミノ酸、約７５％＜１７アミノ酸、約２５％≧１７アミノ酸、約７０％＜１７アミノ酸、約３０％≧１７アミノ酸、約６５％＜１７アミノ酸、約３５％≧１７アミノ酸、約６０％＜１７アミノ酸、約４０％≧１７アミノ酸、約５５％＜１７アミノ酸、約４５％≧１７アミノ酸、約５０％＜１７アミノ酸、約５０％≧１７アミノ酸、約４５％＜１７アミノ酸、約５５％≧１７アミノ酸、約４０％＜１７アミノ酸、約６０％≧１７アミノ酸、約３５％＜１７アミノ酸、約６５％≧１７アミノ酸、約３０％＜１７アミノ酸、約７０％≧１７アミノ酸、約２５％＜１７アミノ酸、約７５％≧１７アミノ酸、約２０％＜１７アミノ酸、約８０％≧１７アミノ酸、約１７％＜１７アミノ酸、約８５％≧１７アミノ酸、約１０％＜１７アミノ酸、約９０％≧１７アミノ酸、約５％＜１７アミノ酸、約９５％≧１７アミノ酸、または約０％＜１７アミノ酸、約１００％≧１７アミノ酸。
【００５６】
いくつかの実施形態では、核酸によってコードされるペプチドエピトープ長のパーセンテージは、以下のとおりであり得る：約１００％＜１９アミノ酸、約０％≧１９アミノ酸、約９５％＜１９アミノ酸、約５％≧１９アミノ酸、約９０％＜１９アミノ酸、約１０％≧１９アミノ酸、約８５％＜１９アミノ酸、約１９％≧１９アミノ酸、約８０％＜１９アミノ酸、約２０％≧１９アミノ酸、約７５％＜１９アミノ酸、約２５％≧１９アミノ酸、約７０％＜１９アミノ酸、約３０％≧１９アミノ酸、約６５％＜１９アミノ酸、約３５％≧１９アミノ酸、約６０％＜１９アミノ酸、約４０％≧１９アミノ酸、約５５％＜１９アミノ酸、約４５％≧１９アミノ酸、約５０％＜１９アミノ酸、約５０％≧１９アミノ酸、約４５％＜１９アミノ酸、約５５％≧１９アミノ酸、約４０％＜１９アミノ酸、約６０％≧１９アミノ酸、約３５％＜１９アミノ酸、約６５％≧１９アミノ酸、約３０％＜１９アミノ酸、約７０％≧１９アミノ酸、約２５％＜１９アミノ酸、約７５％≧１９アミノ酸、約２０％＜１９アミノ酸、約８０％≧１９アミノ酸、約１９％＜１９アミノ酸、約８５％≧１９アミノ酸、約１０％＜１９アミノ酸、約９０％≧１９アミノ酸、約５％＜１９アミノ酸、約９５％≧１９アミノ酸、または約０％＜１９アミノ酸、約１００％≧１９アミノ酸。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープ長は、以下の群のうちの１つに分類され得る（合計１００％）：８〜１２アミノ酸、１３〜１７アミノ酸、１８〜２１アミノ酸、２２〜２６アミノ酸、または２７〜３１アミノ酸。核酸のオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドエピトープの約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％は、８〜１２アミノ酸長であり得る。核酸のオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドエピトープの約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％は、１３〜１７アミノ酸長であり得る。核酸のオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドエピトープの約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％は、１８〜２１アミノ酸長であり得る。核酸のオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドエピトープの約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％は、２２〜２６アミノ酸長であり得る。核酸のオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドエピトープの約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％は、２７〜３１アミノ酸長であり得る。核酸のオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドエピトープ長のパーセンテージのいくつかの非限定的な例が続く。
【００５８】
いくつかの実施形態では、核酸によってコードされるペプチドエピトープ長のパーセンテージは、以下のとおりであり得る：５０％  ８〜１２アミノ酸、５０％  １３〜１７アミノ酸、０％  １８〜２１アミノ酸、０％  ２２〜２６アミノ酸、及び０％  ２７〜３１アミノ酸；０％  ８〜１２アミノ酸、５０％  １３〜１７アミノ酸、５０％  １８〜２１アミノ酸、０％  ２２〜２６アミノ酸、及び０％  ２７〜３１アミノ酸；０％  ８〜１２アミノ酸、０％  １３〜１７アミノ酸、５０％  １８〜２１アミノ酸、５０％  ２２〜２６アミノ酸、及び０％  ２７〜３１アミノ酸；０％  ８〜１２アミノ酸、０％  １３〜１７アミノ酸、０％  １８〜２１アミノ酸、５０％  ２２〜２６アミノ酸、及び５０％  ２７〜３１アミノ酸；５０％  ８〜１２アミノ酸、０％  １３〜１７アミノ酸、５０％  １８〜２１アミノ酸、０％  ２２〜２６アミノ酸、及び０％  ２７〜３１アミノ酸；５０％  ８〜１２アミノ酸、０％  １３〜１７アミノ酸、０％  １８〜２１アミノ酸、５０％  ２２〜２６アミノ酸、及び０％  ２７〜３１アミノ酸；５０％  ８〜１２アミノ酸、０％  １３〜１７アミノ酸、０％  １８〜２１アミノ酸、０％  ２２〜２６アミノ酸、及び５０％  ２７〜３１アミノ酸；０％  ８〜１２アミノ酸、５０％  １３〜１７アミノ酸、５０％  １８〜２１アミノ酸、０％  ２２〜２６アミノ酸、及び０％  ２７〜３１アミノ酸；０％  ８〜１２アミノ酸、５０％  １３〜１７アミノ酸、０％  １８〜２１アミノ酸、５０％  ２２〜２６アミノ酸、及び０％  ２７〜３１アミノ酸；０％  ８〜１２アミノ酸、５０％  １３〜１７アミノ酸、０％  １８〜２１アミノ酸、０％  ２２〜２６アミノ酸、及び５０％  ２７〜３１アミノ酸；または０％  ８〜１２アミノ酸、０％  １３〜１７アミノ酸、５０％  １８〜２１アミノ酸、０％  ２２〜２６アミノ酸、及び５０％  ２７〜３１アミノ酸。
【００５９】
いくつかの実施形態では、核酸によってコードされるペプチドエピトープ長のパーセンテージは、以下のとおりであり得る：１０％  ８〜１２アミノ酸、４０％  １３〜１７アミノ酸、４０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び０％  ２７〜３１アミノ酸；１０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、４０％  １８〜２１アミノ酸、４０％  ２２〜２６アミノ酸、及び０％  ２７〜３１アミノ酸；４０％  ８〜１２アミノ酸、４０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び０％  ２７〜３１アミノ酸；１０％  ８〜１２アミノ酸、４０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、４０％  ２２〜２６アミノ酸、及び０％  ２７〜３１アミノ酸；４０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、４０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び０％  ２７〜３１アミノ酸；０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、４０％  １８〜２１アミノ酸、４０％  ２２〜２６アミノ酸、及び１０％  ２７〜３１アミノ酸；０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、４０％  ２２〜２６アミノ酸、及び４０％  ２７〜３１アミノ酸；０％  ８〜１２アミノ酸、４０％  １３〜１７アミノ酸、４０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び１０％  ２７〜３１アミノ酸；０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、４０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び４０％  ２７〜３１アミノ酸；０％  ８〜１２アミノ酸、４０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、４０％  ２２〜２６アミノ酸、及び１０％  ２７〜３１アミノ酸。
【００６０】
いくつかの実施形態では、核酸によってコードされるペプチドエピトープ長のパーセンテージは、以下のとおりであり得る：２５％  ８〜１２アミノ酸、２５％  １３〜１７アミノ酸、２５％  １８〜２１アミノ酸、２５％  ２２〜２６アミノ酸、及び０％  ２７〜３１アミノ酸；２５％  ８〜１２アミノ酸、２５％  １３〜１７アミノ酸、２５％  １８〜２１アミノ酸、０％  ２２〜２６アミノ酸、及び２５％  ２７〜３１アミノ酸；２５％  ８〜１２アミノ酸、２５％  １３〜１７アミノ酸、０％  １８〜２１アミノ酸、２５％  ２２〜２６アミノ酸、及び２５％  ２７〜３１アミノ酸；２５％  ８〜１２アミノ酸、０％  １３〜１７アミノ酸、２５％  １８〜２１アミノ酸、２５％  ２２〜２６アミノ酸、及び２５％  ２７〜３１アミノ酸；０％  ８〜１２アミノ酸、２５％  １３〜１７アミノ酸、２５％  １８〜２１アミノ酸、２５％  ２２〜２６アミノ酸、及び２５％  ２７〜３１アミノ酸。
【００６１】
いくつかの実施形態では、核酸によってコードされるペプチドエピトープ長のパーセンテージは、以下のとおりであり得る：１５％  ８〜１２アミノ酸、１５％  １３〜１７アミノ酸、１５％  １８〜２１アミノ酸、１５％  ２２〜２６アミノ酸、及び４０％  ２７〜３１アミノ酸；１５％  ８〜１２アミノ酸、１５％  １３〜１７アミノ酸、１５％  １８〜２１アミノ酸、１５％  ２２〜２６アミノ酸、及び４０％  ２７〜３１アミノ酸；１５％  ８〜１２アミノ酸、１５％  １３〜１７アミノ酸、１５％  １８〜２１アミノ酸、１５％  ２２〜２６アミノ酸、及び４０％  ２７〜３１アミノ酸；１５％  ８〜１２アミノ酸、１５％  １３〜１７アミノ酸、１５％  １８〜２１アミノ酸、１５％  ２２〜２６アミノ酸、及び４０％  ２７〜３１アミノ酸；１５％  ８〜１２アミノ酸、１５％  １３〜１７アミノ酸、１５％  １８〜２１アミノ酸、１５％  ２２〜２６アミノ酸、及び４０％  ２７〜３１アミノ酸；４０％  ８〜１２アミノ酸、１５％  １３〜１７アミノ酸、１５％  １８〜２１アミノ酸、１５％  ２２〜２６アミノ酸、及び１５％  ２７〜３１アミノ酸；４０％  ８〜１２アミノ酸、１５％  １３〜１７アミノ酸、１５％  １８〜２１アミノ酸、１５％  ２２〜２６アミノ酸、及び１５％  ２７〜３１アミノ酸；４０％  ８〜１２アミノ酸、１５％  １３〜１７アミノ酸、１５％  １８〜２１アミノ酸、１５％  ２２〜２６アミノ酸、及び１５％  ２７〜３１アミノ酸；４０％  ８〜１２アミノ酸、１５％  １３〜１７アミノ酸、１５％  １８〜２１アミノ酸、１５％  ２２〜２６アミノ酸、及び１５％  ２７〜３１アミノ酸；４０％  ８〜１２アミノ酸、１５％  １３〜１７アミノ酸、１５％  １８〜２１アミノ酸、１５％  ２２〜２６アミノ酸、及び１５％  ２７〜３１アミノ酸。
【００６２】
いくつかの実施形態では、核酸によってコードされるペプチドエピトープ長のパーセンテージは、以下のとおりであり得る：１０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び６０％  ２７〜３１アミノ酸；１０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び６０％  ２７〜３１アミノ酸；１０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び６０％  ２７〜３１アミノ酸；１０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び６０％  ２７〜３１アミノ酸；１０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び６０％  ２７〜３１アミノ酸；６０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び１０％  ２７〜３１アミノ酸；６０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び１０％  ２７〜３１アミノ酸；６０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び１０％  ２７〜３１アミノ酸；６０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び１０％  ２７〜３１アミノ酸；６０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び１０％  ２７〜３１アミノ酸。
【００６３】
いくつかの実施形態では、核酸によってコードされるペプチドエピトープ長のパーセンテージは、以下のとおりであり得る：１５％  ８〜１２アミノ酸、２０％  １３〜１７アミノ酸、２０％  １８〜２１アミノ酸、１５％  ２２〜２６アミノ酸、及び３０％  ２７〜３１アミノ酸；１５％  ８〜１２アミノ酸、１５％  １３〜１７アミノ酸、２０％  １８〜２１アミノ酸、２０％  ２２〜２６アミノ酸、及び３０％  ２７〜３１アミノ酸；２０％  ８〜１２アミノ酸、２０％  １３〜１７アミノ酸、１５％  １８〜２１アミノ酸、１５％  ２２〜２６アミノ酸、及び３０％  ２７〜３１アミノ酸；１５％  ８〜１２アミノ酸、２０％  １３〜１７アミノ酸、１５％  １８〜２１アミノ酸、２０％  ２２〜２６アミノ酸、及び３０％  ２７〜３１アミノ酸；２０％  ８〜１２アミノ酸、１５％  １３〜１７アミノ酸、２０％  １８〜２１アミノ酸、１５％  ２２〜２６アミノ酸、及び３０％  ２７〜３１アミノ酸；３０％  ８〜１２アミノ酸、１５％  １３〜１７アミノ酸、２０％  １８〜２１アミノ酸、２０％  ２２〜２６アミノ酸、及び１５％  ２７〜３１アミノ酸；３０％  ８〜１２アミノ酸、１５％  １３〜１７アミノ酸、１５％  １８〜２１アミノ酸、２０％  ２２〜２６アミノ酸、及び２０％  ２７〜３１アミノ酸；３０％  ８〜１２アミノ酸、２０％  １３〜１７アミノ酸、２０％  １８〜２１アミノ酸、１５％  ２２〜２６アミノ酸、及び１５％  ２７〜３１アミノ酸；３０％  ８〜１２アミノ酸、１５％  １３〜１７アミノ酸、２０％  １８〜２１アミノ酸、１５％  ２２〜２６アミノ酸、及び２０％  ２７〜３１アミノ酸；３０％  ８〜１２アミノ酸、２０％  １３〜１７アミノ酸、１５％  １８〜２１アミノ酸、２０％  ２２〜２６アミノ酸、及び１５％  ２７〜３１アミノ酸。
【００６４】
いくつかの実施形態では、核酸によってコードされるペプチドエピトープ長のパーセンテージは、以下のとおりであり得る：３５％  ８〜１２アミノ酸、３５％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び１０％  ２７〜３１アミノ酸；１０％  ８〜１２アミノ酸、３５％  １３〜１７アミノ酸、３５％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び１０％  ２７〜３１アミノ酸；１０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、３５％  １８〜２１アミノ酸、３５％  ２２〜２６アミノ酸、及び１０％  ２７〜３１アミノ酸；１０％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、３５％  ２２〜２６アミノ酸、及び３５％  ２７〜３１アミノ酸；３５％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、３５％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び１０％  ２７〜３１アミノ酸；３５％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、３５％  ２２〜２６アミノ酸、及び１０％  ２７〜３１アミノ酸；３５％  ８〜１２アミノ酸、１０％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び３５％  ２７〜３１アミノ酸；１０％  ８〜１２アミノ酸、３５％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、３５％  ２２〜２６アミノ酸、及び１０％  ２７〜３１アミノ酸；１０％  ８〜１２アミノ酸、３５％  １３〜１７アミノ酸、１０％  １８〜２１アミノ酸、１０％  ２２〜２６アミノ酸、及び３５％  ２７〜３１アミノ酸。
【００６５】
いくつかの実施形態では、核酸によってコードされるペプチドエピトープ長のパーセンテージは、以下のとおりであり得る：３０％  ８〜１２アミノ酸、３０％  １３〜１７アミノ酸、３０％  １８〜２１アミノ酸、５％  ２２〜２６アミノ酸、及び５％  ２７〜３１アミノ酸；５％  ８〜１２アミノ酸、３０％  １３〜１７アミノ酸、３０％  １８〜２１アミノ酸、３０％  ２２〜２６アミノ酸、及び５％  ２７〜３１アミノ酸；５％  ８〜１２アミノ酸、５％  １３〜１７アミノ酸、３０％  １８〜２１アミノ酸、３０％  ２２〜２６アミノ酸、及び３０％  ２７〜３１アミノ酸；３０％  ８〜１２アミノ酸、５％  １３〜１７アミノ酸、５％  １８〜２１アミノ酸、３０％  ２２〜２６アミノ酸、及び３０％  ２７〜３１アミノ酸；３０％  ８〜１２アミノ酸、３０％  １３〜１７アミノ酸、５％  １８〜２１アミノ酸、５％  ２２〜２６アミノ酸、及び３０％  ２７〜３１アミノ酸；５％  ８〜１２アミノ酸、３０％  １３〜１７アミノ酸、５％  １８〜２１アミノ酸、３０％  ２２〜２６アミノ酸、及び３０％  ２７〜３１アミノ酸；５％  ８〜１２アミノ酸、３０％  １３〜１７アミノ酸、３０％  １８〜２１アミノ酸、５％  ２２〜２６アミノ酸、及び３０％  ２７〜３１アミノ酸；３０％  ８〜１２アミノ酸、３０％  １３〜１７アミノ酸、５％  １８〜２１アミノ酸、３０％  ２２〜２６アミノ酸、及び５％  ２７〜３１アミノ酸；３０％  ８〜１２アミノ酸、５％  １３〜１７アミノ酸、３０％  １８〜２１アミノ酸、５％  ２２〜２６アミノ酸、及び３０％  ２７〜３１アミノ酸。
【００６６】
いくつかの実施形態では、核酸によってコードされるペプチドエピトープ長のパーセンテージは、以下のとおりであり得る：２０％  ８〜１２アミノ酸、２０％  １３〜１７アミノ酸、２０％  １８〜２１アミノ酸、２０％  ２２〜２６アミノ酸、及び２０％  ２７〜３１アミノ酸。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープの最適な長さは、以下の手順を介して得ることができる：Ｖ５タグ鎖状体テストプロテアーゼ部位を合成し、それをＤＣ細胞に導入し（例えば、ＲＮＡ  Ｓｑｕｅｅｚｅ手順を使用して）、細胞を溶解し、次いで抗Ｖ５ウェスタンブロットを実行して、プロテアーゼ部位での切断を評価する。
【００６８】
ＲＮＡ  Ｓｑｕｅｅｚｅ技法は、様々な材料を広範囲の生細胞に送達することができる細胞内送達方法である。細胞は、急速な機械的変形を引き起こすマイクロ流体構造に供される。変形は、一時的な膜破壊及び新たに形成された一過性細孔をもたらす。次いで、材料は、一過性細孔を介して細胞サイトゾル中に受動的に拡散される。この技法は、初代線維芽細胞、胚幹細胞、及び免疫細胞の宿主を含む様々な細胞型で使用することができ、ほとんどの用途において比較的高い生存率を有し、その作用を通じて量子ドットまたはタンパク質などの感受性材料を損傷しないことが示されている。Ｓｈａｒｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０１３）；１１０（６）：２０８２−７。
【００６９】
本明細書に記載されるペプチドエピトープは、核酸において任意の順序でコードされ得る。例えば、ペプチドエピトープの各々は、以下の群のうちの１つに分類され得る長さを有し得る（合計１００％）：８〜１２アミノ酸（「Ａ」で表される）、１３〜１７アミノ酸（「Ｂ」で表される）、１８〜２１アミノ酸（「Ｃ」で表される）、２２〜２６アミノ酸（「Ｄ」で表される）、または２７〜３１アミノ酸（「Ｅ」で表される）。任意の基の１つ以上のペプチドエピトープ（例えば、８〜１２ａａ）は、核酸によって連続してコードされてもよい（例えば、核酸は、長さ「Ａ」の２つ以上のペプチドエピトープを連続してコードしてもよく、これらのエピトープは、本明細書の他の箇所に記載されるように、直接的に連結し得るか、または間接的に連結し得る）。加えて、異なる基のペプチドエピトープが散在し得、核酸は、連続して異なる基のエピトープをコードし得る（例えば、核酸は、長さＢ、Ｃ、Ｄ、またはＥのペプチドエピトープの隣にある長さＡのペプチドエピトープをコードし得、これらのエピトープは、本明細書の他の箇所に記載されるように、直接的に連結し得るか、または間接的に連結し得る）。
【００７０】
非限定的な例として、ペプチドエピトープは、核酸中で以下のようにコードされ得るか、または核酸は、ペプチドエピトープの以下の組み合わせのうちの１つを（少なくとも部分的に）コードすることができ、
（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ
）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｅ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｄ）１〜５０（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ａ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｄ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｂ）１〜５０（Ｃ）１〜５０、または（Ｅ）１〜５０（Ａ）１〜５０（Ｄ）１〜５０（Ｃ）１〜５０（Ｂ）１〜５０、
ここで、８〜１２アミノ酸のペプチドエピトープは「Ａ」で表され、１３〜１７アミノ酸のペプチドエピトープは「Ｂ」で表され、１８〜２１アミノ酸のペプチドエピトープは「Ｃ」で表され、２２〜２６アミノ酸のペプチドエピトープは「Ｄ」で表され、２７〜３１アミノ酸のペプチドエピトープは「Ｅ」で表される。
【００７１】
ペプチドエピトープの前述の組み合わせのうちのいずれかを組み合わせてもよい。例えば、本明細書に記載される核酸がんワクチンのうちのいずれかは、列挙されたペプチドエピトープ群のうちの２つ以上をコードし得る。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープと、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープとを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも１０％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも２０％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも３０％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも４０％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのいずれも（０％）、ＭＨＣクラスＩＩエピトープではない。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも１０％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも２０％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも３０％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも４０％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩエピトープ対ＭＨＣクラスＩＩエピトープの比は、約１０％：約９０％、約２０％：約８０％、約３０％：約７０％、約４０％：約６０％、約５０％：約５０％、約６０％：約４０％、約７０％：約３０％、約８０％：約２０％、約９０％：約１０％のＭＨＣクラス１：ＭＨＣクラスＩＩエピトープから選択される比である。一実施形態では、ＭＨＣクラスＩ：ＭＨＣクラスＩＩエピトープの比は、１：１である。一実施形態では、ＭＨＣクラスＩ：ＭＨＣクラスＩＩエピトープの比は、２：１である。一実施形態では、ＭＨＣクラスＩ：ＭＨＣクラスＩＩエピトープの比は、３：１である。一実施形態では、ＭＨＣクラスＩ：ＭＨＣクラスＩＩエピトープの比は、４：１である。一実施形態では、ＭＨＣクラスＩ：ＭＨＣクラスＩＩエピトープの比は、５：１である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ対ＭＨＣクラスＩエピトープの比は、約１０％：約９０％、約２０％：約８０％、約３０％：約７０％、約４０％：約６０％、約５０％：約５０％、約６０％：約４０％、約７０％：約３０％、約８０％：約２０％、約９０％：約１０％のＭＨＣクラスＩＩ：ＭＨＣクラスＩエピトープから選択される比である。一実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ：ＭＨＣクラスＩエピトープの比は、１：１である。一実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ：ＭＨＣクラスＩエピトープの比は、１：２である。一実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ：ＭＨＣクラスＩエピトープの比は、１：３である。一実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ：ＭＨＣクラスＩエピトープの比は、１：４である。一実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ：ＭＨＣクラスＩエピトープの比は、１：５である。いくつかの実施形態では、がんワクチンのペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、Ｂ細胞エピトープである。いくつかの実施形態では、がんワクチンの１つ以上の予測されるＴ細胞反応性エピトープは、８〜１１アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、がんワクチンの１つ以上の予測されるＢ細胞反応性エピトープは、１３〜１７アミノ酸を含む。
【００７３】
本開示のがんワクチンは、いくつかの態様では、ペプチドエピトープ間の単一のアミノ酸スペーサー、ペプチドエピトープ間の短いリンカー、またはペプチドエピトープ間のスペーサーなしで互いに直接配置された複数のペプチドエピトープ抗原をコードするｍＲＮＡワクチンを含む。複数のエピトープ抗原は、ＭＨＣクラスＩエピトープ及びＭＨＣクラスＩＩエピトープの混合物を含み得る。非限定的な例として、複数のペプチドエピトープ抗原は、以下の構造を有するポリペプチドであり得、
（Ｘ−Ｇ−Ｘ）１〜１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）１〜１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）０〜１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）０〜１０、（Ｘ−Ｇ）１〜１０（Ｇ−Ｙ）１〜１０（Ｇ−Ｘ）０〜１０（Ｇ−Ｙ）０〜１０、（Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）１〜１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）１〜１０（Ｘ−Ｇ−Ｘ）０〜１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）０〜１０、（Ｘ−Ｇ−Ｘ）１〜１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）１〜１０（Ｘ−Ｇ−Ｘ）０〜１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）０〜１０、（Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）１〜１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）１〜１０（Ｘ−Ｇ−Ｘ）０〜１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）０〜１０、（Ｘ−Ｇ−Ｘ）１〜１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）１〜１０（Ｘ−Ｇ−Ｘ）０〜１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）０〜１０、（Ｘ）１〜１０（Ｙ）１〜１０（Ｘ）０〜１０（Ｙ）０〜１０、（Ｙ）１〜１０（Ｘ）１〜１０（Ｙ）０〜１０（Ｘ）０〜１０、（ＸＸ）１〜１０（Ｙ）１〜１０（Ｘ）０〜１０（Ｙ）０〜１０、（ＹＹ）１〜１０（ＸＸ）１〜１０（Ｙ）０〜１０（Ｘ）０〜１０、（Ｘ）１〜１０（ＹＹ）１〜１０（Ｘ）０〜１０（Ｙ）０〜１０、（ＸＸＸ）１〜１０（ＹＹＹ）１〜１０（ＸＸ）０〜１０（ＹＹ）０〜１０、（ＹＹＹ）１〜１０（ＸＸＸ）１〜１０（ＹＹ）０〜１０（ＸＸ）０〜１０、（ＸＹ）１〜１０（Ｙ）１〜１０（Ｘ）１〜１０（Ｙ）１〜１０、（ＹＸ）１〜１０（Ｙ）１〜１０（Ｘ）１〜１０（Ｙ）１〜１０、（ＹＸ）１〜１０（Ｘ）１〜１０（Ｙ）１〜１０（Ｙ）１〜１０、（Ｙ−Ｇ−Ｙ）１〜１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）１〜１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）０〜１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）０〜１０、（Ｙ−Ｇ）１〜１０（Ｇ−Ｘ）１〜１０（Ｇ−Ｙ）０〜１０（Ｇ−Ｘ）０〜１０、（Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）１〜１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）１〜１０（Ｙ−Ｇ−Ｙ）０〜１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）０〜１０、（Ｙ−Ｇ−Ｙ）１〜１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）１〜１０（Ｙ−Ｇ−Ｙ）０〜１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）０〜１０、（Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）１〜１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）１〜１０（Ｙ−Ｇ−Ｙ）０〜１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）０〜１０、（Ｙ−Ｇ−Ｙ）１〜１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）１〜１０（Ｙ−Ｇ−Ｙ）０〜１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）０〜１０、（ＸＹ）１〜１０（ＹＸ）１〜１０（ＸＹ）０〜１０（ＹＸ）０〜１０、（ＹＸ）１〜１０（ＸＹ）１〜１０（Ｙ）０〜１０（Ｘ）０〜１０、（ＹＹ）１〜１０（Ｘ）１〜１０（Ｙ）０〜１０（Ｘ）０〜１０、（ＸＹ）１〜１０（ＸＹ）１〜１０（Ｘ）０〜１０（Ｘ）０〜１０、（Ｙ）１〜１０（ＹＸ）１〜１０（Ｘ）０〜１０（Ｙ）０〜１０、（ＸＹＸ）１〜１０（ＹＸＸ）１〜１０（ＹＸ）０〜１０（ＹＹ）０〜１０、または（ＹＹＸ）１〜１０（ＸＸＹ）１〜１０（ＹＸ）０〜１０（ＸＹ）０〜１０、
式中、Ｘは、長さが５〜１００アミノ酸（例えば、８〜３１アミノ酸を含む本明細書に記載される長さのうちのいずれか）のＭＨＣクラスＩエピトープであり、Ｙは、長さが５〜１００アミノ酸（例えば、８〜３１アミノ酸を含む本明細書に記載される長さのうちのいずれか）のＭＨＣクラスＩＩエピトープであり、Ｇは、グリシンである。
【００７４】
本開示の核酸がんワクチンは、いくつかの態様では、固有の発現ペプチド配列を引き起こす変異を含む１つ以上のペプチドエピトープをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、固有の発現ペプチド配列を引き起こす変異は、挿入、欠失、フレームシフト変異、及び／またはスプライシングバリアントであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、核酸がんワクチンは、一塩基多型（ＳＮＰ）変異の各側に隣接アミノ酸を有する１つ以上のＳＮＰ変異を含む複数のペプチドエピトープ抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ＳＮＰ変異の各側の隣接アミノ酸の数は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、または３０であり得る。いくつかの実施形態では、ＳＮＰ変異は、中央に位置し、ＳＮＰ変異の各側の隣接アミノ酸の数は、ほぼ同じである。他の実施形態では、ＳＮＰ変異は、各側に等数の隣接アミノ酸を有しない。実施形態では、がんワクチンのエピトープは、２つのクラスＩ配列に隣接するＳＮＰを含み、各配列は、７アミノ酸を含む。別の実施形態では、がんワクチンのエピトープは、２つのクラスＩＩ配列に隣接するＳＮＰを含み、各配列は、１０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、エピトープは、中央に位置するＳＮＰと、両方がクラスＩ配列、両方がクラスＩＩ配列、または１つがクラスＩ及び１つがクラスＩＩ配列であるフランクとを含み得る。
【００７５】
別の実施形態では、ペプチドエピトープは、ペプチドエピトープからなる鎖状体状がん抗原の形態である。任意の数のペプチドエピトープが使用され得る。ある特定の実施形態では、ペプチドエピトープは、５〜２００個のペプチドエピトープからなる鎖状体状がん抗原の形態である。ある特定の実施形態では、ペプチドエピトープは、３〜１３０個のペプチドエピトープからなる鎖状体状がん抗原の形態である。いくつかの実施形態では、鎖状体状がん抗原は、以下のうちの１つ以上を含む：ａ）ペプチドエピトープ（例えば、３〜２００もしくは３〜１３０個のペプチドエピトープ）は、切断感受性部位によって散在される、及び／またはｂ）各ペプチドエピトープは、リンカーなしで互いに直接連結される、及び／またはｃ）各ペプチドエピトープは、単一のアミノ酸リンカーで互いに連結される、及び／またはｄ）各ペプチドエピトープは、短いリンカーで互いに連結される、及び／またはｅ）各ペプチドエピトープは、８〜３１アミノ酸を含み、１つ以上のＳＮＰ変異（例えば、中央に位置するＳＮＰ変異）を含む、及び／またはｆ）各ペプチドエピトープは、８〜３１アミノ酸を含み、固有の発現ペプチド配列を引き起こす変異を含む、及び／またはｇ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％は、対象由来のクラスＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する、及び／またはｈ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％は、対象由来のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する、及び／またはｉ）ペプチドエピトープのうちのいずれも、対象由来のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有しない、及び／またはｊ）ペプチドエピトープの少なくとも５０％は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／またはＤＲＢ１についてＩＣ５０＜５００ｎＭの予測結合親和性を有する、及び／またはｋ）ペプチドエピトープをコードする核酸は、ペプチドエピトープが擬似エピトープを最小化するように命令されるように配置される、及び／またはｌ）クラスＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープ対クラスＩＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープの比は、少なくとも１：１、２：１、３：１、４：１、もしくは５：１である、及び／またはｍ）クラスＩＩ  ＭＨＣ分子ペプチドエピトープは存在しない。いくつかの実施形態では、クラスＩ  ＭＨＣ分子に対して「最も高い親和性」を有するペプチドエピトープは、そのクラスＩ  ＭＨＣ分子に特異的に結合する（すなわち、最も高い親和性で結合する）。いくつかの実施形態では、クラスＩ  ＭＨＣ分子に対して「最も高い親和性」を有するペプチドエピトープは、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子よりもそのクラスＩ  ＭＨＣ分子に対してより高い結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対して「最も高い親和性」を有するペプチドエピトープは、そのクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に特異的に結合する（すなわち、最も高い親和性で結合する）。いくつかの実施形態では、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対して「最も高い親和性」を有するペプチドエピトープは、クラスＩ  ＭＨＣ分子よりもそのクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対してより高い結合親和性を有する。
【００７６】
２つ以上のペプチド、例えば、２つ以上のネオ抗原の鎖状体は、ペプチド境界で意図されない新しいエピトープ（疑似エピトープ）を作成し得ることが理解されるであろう。そのような擬似エピトープを予防または排除するために、クラスＩアレルは、鎖状体中のペプチド境界を横断するヒットについて走査され得る。いくつかの実施形態では、鎖状体内のペプチド順序は、擬似エピトープ形成を低減または排除するためにシャッフルされる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチド、例えば、グリシンなどの単一アミノ酸リンカーの間で使用され、擬似エピトープ形成を低減または排除する。いくつかの実施形態では、アンカーアミノ酸は、擬似エピトープ形成を低減または排除する他のアミノ酸で置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、鎖状体内のペプチド境界でトリミングされ、擬似エピトープ形成を低減または排除する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、複数のペプチドエピトープ抗原は、擬似エピトープを最小限に抑えるように配置及び順序付けされる。他の実施形態では、複数のペプチドエピトープ抗原は、擬似エピトープを含まないポリペプチドである。がん抗原エピトープが頭部から尾部形成における鎖状体構造に配置されるとき、各がん抗原エピトープ間に接合部が形成される。これには、ペプチドのＮ末端上のエピトープ由来のいくつか、すなわち、１〜１０アミノ酸、及び隣接する直接連結エピトープのＣ末端上のいくつか、すなわち、１〜１０アミノ酸が含まれる。接合部が免疫応答を生じ得る免疫原性ペプチドでないことが重要である。いくつかの実施形態では、接合部は、個別化がんワクチンが約５０ｎＭを超えるＩＣ５０で設計される、対象のＨＬＡタンパク質に結合するペプチド配列を形成する。他の実施形態では、接合部ペプチド配列は、対象のＨＬＡタンパク質に、約１０ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎｍ、または５００ｎＭを超えるＩＣ５０で結合する。
【００７８】
個別化がんワクチン
いくつかの態様では、本開示は、１つ以上の核酸を含む核酸がんワクチンを提供し、核酸の各々は、がん対象に特異的な個別化抗原などの少なくとも１つの好適ながん抗原をコードする。
【００７９】
例えば、核酸がんワクチンは、ネオエピトープと称される、各対象に特異的な１つ以上のがん抗原をコードする核酸を含み得る。腫瘍細胞内でまたは腫瘍細胞によって発現される抗原は、「腫瘍関連抗原」と称される。特定の腫瘍関連抗原は、非がん性細胞において発現されても、発現されなくてもよい。多くの腫瘍変異は、当該技術分野において周知である。非がん性細胞において発現されない、もしくは滅多に発現されない腫瘍関連抗原、または非がん性細胞における発現が、がん性細胞における発現と比較して十分に低減し、ワクチン接種時に誘導される免疫応答を誘導する腫瘍関連抗原は、ネオエピトープと称される。ネオエピトープは、身体にとって完全に異物であり、故に、健康な組織に対する免疫応答を生じない、または免疫系の保護成分によってマスキングされない。いくつかの実施形態では、ネオエピトープに基づく個別化ワクチンは、そのようなワクチン製剤が、患者の特異的腫瘍に対する特異性を最大化するため望ましい。変異由来のネオエピトープは、点変異、タンパク質中の異なるアミノ酸につながる非同義変異、停止コドンが修飾または欠失され、Ｃ末端に新規の腫瘍特異的配列を有するより長いタンパク質の翻訳につながるリードスルー変異、成熟ｍＲＮＡ及びしたがって固有の腫瘍特異的タンパク質配列にイントロンを含めることにつながるスプライス部位変異、２つのタンパク質の接合部に腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質をもたらす染色体再配列（すなわち、遺伝子融合）、新規の腫瘍特異的タンパク質配列を有する新しいオープンリーディングフレームをもたらすフレームシフト変異もしくは欠失、及び／または転座から生じ得る。
【００８０】
個別化がんワクチンを生成するための方法は、一般に、例えば、深い核酸またはタンパク質配列決定技法を使用した変異の同定、例えば、検証されたペプチド−ＭＨＣ結合予測アルゴリズムまたは他の分析技法の適用を使用して、患者のＨＬＡアレルに結合し得、腫瘍中に存在する変異に基づく候補Ｔ細胞エピトープのセットを生成すること、選択されたネオエピトープに対する抗原特異的Ｔ細胞の任意の実証、または候補のネオピエトープが腫瘍表面上のＨＬＡタンパク質に結合していることの実証、及びワクチンの開発を含む。変異を同定するための技法の例としては、動的アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイ対角ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシーケンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎ系、ならびに種々のＤＮＡ「チップ」技術（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰチップ）、及び浸潤的切断による小シグナル分子の生成、続いて質量分析または固定化錠型プローブ及びローリングサークル増幅に基づく方法を含む。
【００８１】
いくつかの深い核酸及びタンパク質配列決定技法が、当該技術分野において知られている。任意の種類の配列分析方法を使用することができる。例えば、核酸配列決定は、全腫瘍ゲノム、腫瘍エクソーム（タンパク質コーディングＤＮＡ）、及び／または腫瘍トランスクリプトーム上で行われ得る。合成技術によるリアルタイムの単一分子配列決定は、それらが配列決定されるテンプレートに相補的なＤＮＡの新生鎖に組み込まれるとき、蛍光ヌクレオチドの検出に依存する。他の迅速な高スループット配列決定方法も存在する。タンパク質配列決定は、腫瘍プロテオーム上で行われ得る。加えて、タンパク質質量分析を使用して、腫瘍細胞上のＭＨＣタンパク質に結合した変異ペプチドの存在を同定または検証することができる。ペプチドは、腫瘍細胞または腫瘍から免疫沈降されたＨＬＡ分子から酸溶出され、次いで質量分析を使用して同定され得る。配列決定の結果は、既知の対照セットと比較され得るか、または患者の正常組織に対して行われる配列決定分析と比較され得る。いくつかの実施形態では、これらのネオエピトープは、野生型ペプチドよりも高い親和性でクラスＩ  ＨＬＡタンパク質に結合する、及び／または抗腫瘍ＣＤ８  Ｔ細胞を活性化することができる。任意の特定の遺伝子における同一の変異は、腫瘍にわたってまれに見出される。
【００８２】
ＭＨＣクラスＩのタンパク質は、ほとんどの腫瘍細胞を含む、身体のほぼ全ての細胞の表面に存在する。ＭＨＣクラスＩのタンパク質には、通常、内因性タンパク質または細胞内に存在する病原体に由来する抗原が負荷され、次いで細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に提示される。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣクラスＩの分子と複合体化されたペプチドを認識し、結合することができる。各細胞傷害性Ｔリンパ球は、特異的ＭＨＣ／ペプチド複合体に結合することができる固有のＴ細胞受容体を発現する。
【００８３】
コンピュータアルゴリズムを使用して、ペプチド提示複合体の形態でクラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子によって結合され、次いで、この形態では、Ｔリンパ球のＴ細胞受容体によって認識される、推定Ｔ細胞反応性エピトープ、すなわち、ペプチド配列などの潜在的なネオエピトープを予測することが可能である。ＭＨＣに結合するペプチドを同定するのに有用なプログラムの例としては、例えば、Ｌｏｎｚａ  Ｅｐｉｂａｓｅ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，５０（１９９９），２１３−２１９）、及びＨＬＡ＿ＢＩＮＤ（Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２（１９９４），１６３−１７５）が挙げられる。
【００８４】
推定ネオエピトープが選択されると、それらは、インビトロ及び／またはインビボアッセイを使用してさらに試験され得る。Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイなどの従来のインビトロラボアッセイを、各患者からの分離株と共に使用して、アルゴリズムの予測に基づいて選択されたネオエピトープのリストを精製してもよい。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸がんワクチン及びワクチン接種方法は、特定の変異（ネオエピトープ）に基づくペプチドエピトープまたは抗原、及びがん生殖細胞株遺伝子（本明細書で「従来のがん抗原」または「共有がん抗原」と称される、複数の患者で見出される腫瘍に共通の抗原）によって発現されるものを含み得る。いくつかの実施形態では、従来の抗原は、一般に、がんもしくは腫瘍、または特定のタイプのがんもしくは腫瘍に見出されることが知られているものである。いくつかの実施形態では、従来のがん抗原は、非変異腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、従来のがん抗原は、変異腫瘍抗原である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸がんワクチン及び方法は、がん／精巣（ＣＴ）抗原に基づくペプチドエピトープを含み得る。がん／精巣抗原発現は、健康な成体における雄生殖細胞に限定されるが、複数のタイプのヒトがんの腫瘍細胞において異所性発現が観察されている。雄生殖細胞は、ＨＬＡクラスＩ分子を欠き、Ｔ細胞に抗原を提示することができないため、がん／精巣抗原は、がん細胞内で発現される場合、一般にネオ抗原とみなされ、厳密にはがん特異的である免疫応答を誘発する能力を有する。本明細書に記載される組成物及び方法と共に使用するためのがん／精巣抗原は、限定されないが、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥＡ９、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＡ１１、ＭＡＧＥＡ１２、ＢＡＧＥ、ＢＡＧＥ２、ＢＡＧＥ３、ＢＡＧＥ４、ＢＡＧＥ５、ＭＡＧＥＢ１、ＭＡＧＥＢ２、ＭＡＧＥＢ５、ＭＡＧＥＢ６、ＭＡＧＥＢ３、ＭＡＧＥＢ４、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２Ａ、ＧＡＧＥ３、ＧＡＧＥ４、ＧＡＧＥ５、ＧＡＧＥ６、ＧＡＧＥ７、ＧＡＧＥ８、ＳＳＸ１、ＳＳＸ２、ＳＳＸ２ｂ、ＳＳＸ３、ＳＳＸ４、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＬＡＧＥ−１ｂ、ＣＴＡＧ２、ＭＡＧＥＣ１、ＭＡＧＥＣ３、ＳＹＣＰ１、ＢＲＤＴ、ＭＡＧＥＣ２、ＳＰＡＮＸＡ１、ＳＰＡＮＸＢ１、ＳＰＡＮＸＣ、ＳＰＡＮＸＤ、ＳＰＡＮＸＮ１、ＳＰＡＮＸＮ２、ＳＰＡＮＸＮ３、ＳＰＡＮＸＮ４、ＳＰＡＮＸＮ５、ＸＡＧＥ１Ｄ、ＸＡＧＥ１Ｃ、ＸＡＧＥ１Ｂ、ＸＡＧＥ１、ＸＡＧＥ２、ＸＡＧＥ３、ＸＡＧＥ−３ｂ、ＸＡＧＥ−４／ＲＰ１１−１６７Ｐ２３．２、ＸＡＧＥ５、ＤＤＸ４３、ＳＡＧＥ１、ＡＤＡＭ２、ＰＡＧＥ５、ＣＴ１６．２、ＰＡＧＥ１、ＰＡＧＥ２、ＰＡＧＥ２Ｂ、ＰＡＧＥ３、ＰＡＧＥ４、ＬＩＰＩ、ＶＥＮＴＸＰ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＴＳＰ５０、ＣＴＡＧＥ１、ＣＴＡＧＥ−２、ＣＴＡＧＥ５、ＳＰＡ１７、ＡＣＲＢＰ、ＣＳＡＧ１、ＣＳＡＧ２、ＤＳＣＲ８、ＭＭＡ１ｂ、ＤＤＸ５３、ＣＴＣＦＬ、ＬＵＺＰ４、ＣＡＳＣ５、ＴＦＤＰ３、ＪＡＲＩＤ１Ｂ、ＬＤＨＣ、ＭＯＲＣ１、ＤＫＫＬ１、ＳＰＯ１１、ＣＲＩＳＰ２、ＦＭＲ１ＮＢ、ＦＴＨＬ１７、ＮＸＦ２、ＴＡＦ７Ｌ、ＴＤＲＤ１、ＴＤＲＤ６、ＴＤＲＤ４、ＴＥＸ１５、ＦＡＴＥ１、ＴＰＴＥ、ＣＴ４５Ａ１、ＣＴ４５Ａ２、ＣＴ４５Ａ３、ＣＴ４５Ａ４、ＣＴ４５Ａ５、ＣＴ４５Ａ６、ＨＯＲＭＡＤ１、ＨＯＲＭＡＤ２、ＣＴ４７Ａ１、ＣＴ４７Ａ２、ＣＴ４７Ａ３、ＣＴ４７Ａ４、ＣＴ４７Ａ５、ＣＴ４７Ａ６、ＣＴ４７Ａ７、ＣＴ４７Ａ８、ＣＴ４７Ａ９、ＣＴ４７Ａ１０、ＣＴ４７Ａ１１、ＣＴ４７Ｂ１、ＳＬＣＯ６Ａ１、ＴＡＧ、ＬＥＭＤ１、ＨＳＰＢ９、ＣＣＤＣ１１０、ＺＮＦ１６５、ＳＰＡＣＡ３、ＣＸｏｒｆ４８、ＴＨＥＧ、ＡＣＴＬ８、ＮＬＲＰ４、ＣＯＸ６Ｂ２、ＬＯＣ３４８１２０、ＣＣＤＣ３３、ＬＯＣ１９６９９３、ＰＡＳＤ１、ＬＯＣ６４７１０７、ＴＵＬＰ２、ＣＴ６６／ＡＡ８８４５９５、ＰＲＳＳ５４、ＲＢＭ４６、ＣＴ６９／ＢＣ０４０３０８、ＣＴ７０／ＢＩ８１８０９７、ＳＰＩＮＬＷ１、ＴＳＳＫ６、ＡＤＡＭ２９、ＣＣＤＣ３６、ＬＯＣ４４０９３４、ＳＹＣＥ１、ＣＰＸＣＲ１、ＴＳＰＹ３、ＴＳＧＡ１０、ＨＩＷＩ、ＭＩＷＩ、ＰＩＷＩ、ＰＩＷＩＬ２、ＡＲＭＣ３、ＡＫＡＰ３、Ｃｘｏｒｆ６１、ＰＢＫ、Ｃ２１ｏｒｆ９９、ＯＩＰ５、ＣＥＰ２９０、ＣＡＢＹＲ、ＳＰＡＧ９、ＭＰＨＯＳＰＨ１、ＲＯＰＮ１、ＰＬＡＣ１、ＣＡＬＲ３、ＰＲＭ１、ＰＲＭ２、ＣＡＧＥ１、ＴＴＫ、ＬＹ６Ｋ、ＩＭＰ−３、ＡＫＡＰ４、ＤＰＰＡ２、ＫＩＡＡ０１００、ＤＣＡＦ１２、ＳＥＭＧ１、ＰＯＴＥＤ、ＰＯＴＥＥ、ＰＯＴＥＡ、ＰＯＴＥＧ、ＰＯＴＥＢ、ＰＯＴＥＣ、ＰＯＴＥＨ、ＧＯＬＧＡＧＬ２  ＦＡ、ＣＤＣＡ１、ＰＥＰＰ２、ＯＴＯＡ、ＣＣＤＣ６２、ＧＰＡＴＣＨ２、ＣＥＰ５５、ＦＡＭ４６Ｄ、ＴＥＸ１４、ＣＴＮＮＡ２、ＦＡＭ１３３Ａ、ＬＯＣ１３０５７６、ＡＮＫＲＤ４５、ＥＬＯＶＬ４、ＩＧＳＦ１１、ＴＭＥＦＦ１、ＴＭＥＦＦ２、ＡＲＸ、ＳＰＥＦ２、ＧＰＡＴ２、ＴＭＥＭ１０８、ＮＯＬ４、ＰＴＰＮ２０Ａ、ＳＰＡＧ４、ＭＡＥＬ、ＲＱＣＤ１、ＰＲＡＭＥ、ＴＥＸ１０１、ＳＰＡＴＡ１９、ＯＤＦ１、ＯＤＦ２、ＯＤＦ３、ＯＤＦ４、ＡＴＡＤ２、ＺＮＦ６４５、ＭＣＡＫ、ＳＰＡＧ１、ＳＰＡＧ６、ＳＰＡＧ８、ＳＰＡＧ１７、ＦＢＸＯ３９、ＲＧＳ２２、サイクリンＡ１、Ｃ１５ｏｒｆ６０、ＣＣＤＣ８３、ＴＥＫＴ５、ＮＲ６Ａ１、ＴＭＰＲＳＳ１２、ＴＰＰＰ２、ＰＲＳＳ５５、ＤＭＲＴ１、ＥＤＡＧ、ＮＤＲ、ＤＮＡＪＢ８、ＣＳＡＧ３Ｂ、ＣＴＡＧ１Ａ、ＧＡＧＥ１２Ｂ、ＧＡＧＥ１２Ｃ、ＧＡＧＥ１２Ｄ、ＧＡＧＥ１２Ｅ、ＧＡＧＥ１２Ｆ、ＧＡＧＥ１２Ｇ、ＧＡＧＥ１２Ｈ、ＧＡＧＥ１２Ｉ、ＧＡＧＥ１２Ｊ、ＧＡＧＥ１３、ＬＯＣ７２８１３７、ＭＡＧＥＡ２Ｂ、ＭＡＧＥＡ９Ｂ／ＬＯＣ７２８２６９、ＮＸＦ２Ｂ、ＳＰＡＮＸＡ２、ＳＰＡＮＸＢ２、ＳＰＡＮＸＥ、ＳＳＸ４Ｂ、ＳＳＸ５、ＳＳＸ６、ＳＳＸ７、ＳＳＸ９、ＴＳＰＹ１Ｄ、ＴＳＰＹ１Ｅ、ＴＳＰＹ１Ｆ、ＴＳＰＹ１Ｇ、ＴＳＰＹ１Ｈ、ＴＳＰＹ１Ｉ、ＴＳＰＹ２、ＸＡＧＥ１Ｅ、ＸＡＧＥ２Ｂ／ＣＴＤ−２２６７Ｇ１７．３、及び／またはそれらのバリアントを含む、当該分野において知られている任意のそのようながん／精巣抗原であり得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、核酸がんワクチンは、１つ以上の非変異腫瘍抗原をコードする１つ以上の核酸をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、核酸がんワクチンは、１つ以上の変異腫瘍抗原をコードする１つ以上の核酸をさらに含み得る。
【００８８】
多くの腫瘍抗原が、当該技術分野において知られている。本明細書に記載される組成物及び方法と共に使用するためのがんまたは腫瘍抗原（例えば、従来のがん抗原）は、当該分野において知られている任意のそのようながんまたは腫瘍抗原であり得る。いくつかの実施形態では、がんまたは腫瘍抗原（例えば、従来のがん抗原）は、以下の抗原のうちの１つである：ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ１３７、４−ＩＢＢ、５Ｔ４、ＡＧＳ−５、ＡＧＳ−１６、アンジオポエチン２、Ｂ２Ｍ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、ＢＴ−０６２、ＢＴＬＡ、ＣＡＩＸ、がん胎児抗原、ＣＴＬＡ４、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ−Ｂ、ＥｒｂＢｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＬ７、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＢ２、ＦＡＰ、フィブロネクチン、葉酸受容体、ガングリオシドＧＭ３、ＧＤ２、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、ｇｐｌ００、ｇｐＡ３３、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＯＳ、ＩＧＦ１Ｒ、インテグリンａｖ、インテグリンανβ、ＬＡＧ−３、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、メソテリン、ｃ−ＭＥＴ、ＭＮ炭酸脱水酵素ＩＸ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｎｅｃｔｉｎ−４、ＮＫＧＤ２、ＮＯＴＣＨ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＳＬＣ４４Ａ４、Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２、Ｔｅｎａｓｃｉｎ、ＴＩＭ３、ＴＲＡＩＬＲｌ、ＴＲＡＩＬＲ２，ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、及び／またはそれらのバリアント。
【００８９】
エピトープは、無料または商用データベース（例えば、Ｌｏｎｚａ  Ｅｐｉｂａｓｅ、アンチトープ）を使用して同定することができる。そのようなツールは、標的抗原タンパク質内の最も免疫原性の高いエピトープを予測するのに有用である。次いで、選択されたペプチドを合成し、ヒトＨＬＡパネルでスクリーニングしてもよく、最も免疫原性の高い配列を使用して、ペプチドエピトープ（複数可）をコードする核酸を構築する。タンパク質にわたる各公称１１−ｍｅｒについて４つのＣ末端ペプチドの等モル混合物を生成することに基づいて、細胞傷害性Ｔ細胞のエピトープをマッピングするための１つの戦略。この戦略は、考えられる全ての活性ＣＴＬエピトープを含有するライブラリー抗原を産生するであろう。
【００９０】
ネオエピトープは、強固な免疫応答を促進するためにＭＨＣに最適に結合するように設計され得る。いくつかの実施形態では、各ペプチドエピトープは、抗原領域及びＭＨＣ安定化領域を含む。ＭＨＣ安定化領域は、ＭＨＣ中のペプチドを安定化する配列である。
【００９１】
エピトープ内の全てのＭＨＣ安定化領域は、同じであり得るか、またはそれらは異なり得る。ＭＨＣ安定化領域は、ペプチドのＮ末端部分またはペプチドのＣ末端部分にあり得る。あるいは、ＭＨＣ安定化領域は、ペプチドの中央領域にあり得る。
【００９２】
ＭＨＣ安定化領域は、５〜１０、５〜１５、８〜１０、１〜５、３〜７、または３〜８アミノ酸長であり得る。さらに他の実施形態では、抗原領域は、５〜１００アミノ酸長である。ペプチドは、それらが細胞表面上に提示される前に、小胞体内での競合親和性結合によって、ＭＨＣクラスＩの分子と相互作用する。個々のペプチドの親和性は、そのアミノ酸配列及びアミノ酸配列内の定義された位置における特異的結合モチーフの存在に直接連結される。ＭＨＣに提示されるペプチドは、α１／α２ヘテロ二量体（２つの非同一のサブユニットからなる分子）の中央領域のペプチド結合溝の床によって保持される。ペプチド結合溝の床の残基の配列は、それが結合する特定のペプチド残基を決定する。
【００９３】
最適な結合領域を、標的エピトープの各々に対する結合部位内の各アミノ酸における特定のアミノ酸に対する結合部位（ＭＨＣポケット）の親和性のコンピュータ支援の比較によって同定して、全ての検査された抗原に対する理想的なバインダーを同定することができる。エピトープのＭＨＣ安定化領域は、結合部位のデータ点のアミノ酸予測マトリックスを使用して同定され得る。アミノ酸予測マトリックスは、データ点を定義する第１及び第２の軸を有するテーブルである。予測マトリックスは、Ｓｉｎｇｈ，Ｈ．ａｎｄ  Ｒａｇｈａｖａ，Ｇ．Ｐ．Ｓ．（２００１），″ＰｒｏＰｒｅｄ：ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−ＤＲ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ．″Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１７（１２），１２３６−３７）に示されるように生成され得る。いくつかの実施形態では、予測マトリックスは、進化保存に基づいており、別の実施形態では、予測マトリックスは、体細胞アミノ酸が生殖細胞系アミノ酸とどの程度類似しているかを調べるために生化学的類似性を使用する（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７：３３６０−３３６８）。体細胞アミノ酸と生殖細胞系アミノ酸との類似性は、変異が結合にどのように影響するか（例えば、Ｔ細胞受容体認識）に近似する。いくつかの実施形態では、より少ない類似性は、改善された結合（例えば、Ｔ細胞受容体認識）を示す。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣ安定化領域は、対象の特定のＭＨＣに基づいて設計される。このようにして、ＭＨＣ安定化領域は、各患者に対して最適化され得る。
【００９５】
がんワクチン（例えば、核酸がんワクチン）に含めるために選択されるネオエピトープは、典型的には、高親和性結合ペプチドである。いくつかの態様では、ネオエピトープは、野生型ペプチドよりも優れた親和性でＨＬＡタンパク質に結合する。ネオエピトープは、いくつかの実施形態では、少なくとも５０００ｎＭ未満、少なくとも５００ｎＭ未満、少なくとも２５０ｎＭ未満、少なくとも２００ｎＭ未満、少なくとも１５０ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ未満、またはそれ以下のＩＣ５０を有する。典型的には、予測ＩＣ５０＜５０ｎＭのペプチドは、一般に、中〜高親和性結合ペプチドと見なされ、ＨＬＡ結合の生化学アッセイを使用して、それらの親和性を実験的に試験するために選択される。最後に、ヒト免疫系が、これらの変異腫瘍抗原に対する有効な免疫応答を引き起こし、したがって正常細胞ではなく腫瘍を効果的に死滅させることができるかどうかが決定される。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ネオエピトープは、長さが１３残基以下であり、約８〜約１１残基、特に９または１０残基からなり得る。他の実施形態では、ネオエピトープは、より長くなるように設計され得る。例えば、ネオエピトープは、各対応する遺伝子産物のＮ末端及びＣ末端に向かって２〜５アミノ酸の伸長を有し得る。より長いペプチドの使用は、患者細胞による内因性処理を可能にし得、より効果的な抗原提示及びＴ細胞応答の誘導につながり得る。
【００９７】
所望の活性を有するネオエピトープは、所望のＭＨＣ分子に結合し、適切なＴ細胞またはＢ細胞を活性化するために、非修飾ペプチドの生物学的活性を増加させるか、または少なくとも実質的にその全て保持しながら、必要に応じて修飾されて、ある特定の所望の属性、例えば、改善された薬理学的特性を提供し得る。例えば、ネオエピトープは、保存的または非保存的のいずれかの置換などの様々な変化を受けることができ、そのような変化は、それらの使用におけるある特定の利点、例えば、改善されたＭＨＣ結合を提供し得る。保存的置換とは、アミノ酸残基を、生物学的及び／または化学的に類似する別の残基、例えば、別の疎水性残基、または別の極性残基で置き換えることを意味する。置換としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせが挙げられる。単一アミノ酸置換の効果は、Ｄ−アミノ酸を使用して探索することもできる。そのような修飾は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−３４７（１９８６），Ｂａｒａｎｙ＆Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ＆Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．（Ｎ．Ｙ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．１−２８４（１９７９）、及びＳｔｅｗａｒｔ＆Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｐｉｅｒｃｅ），２ｄ  Ｅｄ．（１９８４）に記載されるように、周知のペプチド合成手順を使用して作製され得る。
【００９８】
ネオエピトープは、化合物のアミノ酸配列を伸長または減少させることによって、例えば、アミノ酸の付加または欠失によって修飾することもできる。ペプチド、ポリペプチド、または類似体は、ある特定の残基の順序または組成を変更することによって修飾することもでき、生物学的活性に不可欠なある特定のアミノ酸残基、例えば、重要な接触部位または保存された残基でのアミノ酸残基は、生物学的活性に悪影響なしに一般に変更されないことが容易に理解される。
【００９９】
典型的には、単一のアミノ酸置換を有する一連のペプチドを用いて、静電気電荷、疎水性等が結合に及ぼす影響を決定する。例えば、一連の正電荷（例えば、ＬｙｓもしくはＡｒｇ）または負電荷（例えば、Ｇｌｕ）アミノ酸置換は、ペプチドの長さに沿って行われ、様々なＭＨＣ分子及びＴ細胞またはＢ細胞受容体に対する感受性の異なるパターンを明らかにする。加えて、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、または同様の残基などの小さな比較的中立な部分を使用する複数の置換が用いられ得る。置換は、ホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーであり得る。置換または付加される残基の数及び種類は、必須接点と求められるある特定の機能属性との間に必要な間隔（例えば、疎水性対親水性）に依存する。ＭＨＣ分子またはＴ細胞受容体に対する結合親和性の増加は、親ペプチドの親和性と比較して、そのような置換によっても達成され得る。いずれにしても、そのような置換は、アミノ酸残基または、例えば、結合を破壊し得る立体干渉及び電荷干渉を回避するために選択される他の分子断片を用いるべきである。
【０１００】
ネオエピトープはまた、ネオエピトープ内の２つ以上の残基のアイソスターを含んでもよい。本明細書で定義されるアイソスターは、第１の配列の立体構造が第２の配列に特異的な結合部位に適合するため、第２の配列に置換され得る２つ以上の残基の配列である。この用語は、具体的には、当業者に周知のペプチド骨格修飾を含む。そのような修飾としては、アミド窒素、α−炭素、アミドカルボニル、アミド結合の完全置換、伸長、欠失、または骨格架橋の修飾が挙げられる。概して、Ｓｐａｔｏｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．ＶＩＩ（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｄ．，１９８３）を参照されたい。
【０１０１】
免疫原性の検討は、ワクチンに含めるための最適なネオエピトープの選択における重要な構成要素である。一連の非限定的な例として、免疫原性は、ネオエピトープのＭＨＣ結合能力、ＨＬＡ非特異性、変異位置、予測されるＴ細胞反応性、実際のＴ細胞反応性、特定の立体構造及び結果として生じる溶媒曝露、ならびに特定のアミノ酸の表現を分析することによって評価され得る。ＮｅｔＭＨＣ予測アルゴリズムなどの既知のアルゴリズムを使用して、共通のＨＬＡ−Ａ及び−Ｂアレルに結合するペプチドの能力を予測することができる。いくつかの実施形態では、ＮｅｔＭＨＣ予測アルゴリズムは、ＩＣ５０を使用して結合能力を決定する。他の実施形態では、ＮｅｔＭＨＣ予測アルゴリズムは、パーセントランク及び溶出リガンドデータを使用して、結合能力を決定する（Ｊｕｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７  Ｎｏｖ  １；１９９（９）：３３６０−３３６８）。図２〜３Ｂに示されるように、パーセントランク法は、異なるＨＬＡアレル間の予測バインダーのよりバランスの取れた分布をもたらす。ＭＨＣ結合ペプチドの構造評価はまた、コンピュータによる３次元分析及び／またはタンパク質ドッキングプログラムにおいて行うこともできる。ロゼッタアルゴリズムから取得されるなど、ＭＨＣ分子に結合したときの予測エピトープ構造の使用は、エピトープがＭＨＣ分子に結合したときのエピトープのアミノ酸残基の溶媒曝露の程度を評価するために使用され得る。Ｔ細胞反応性は、インビトロでエピトープ及びＴ細胞で実験的に評価され得る。あるいは、Ｔ細胞反応性は、Ｔ細胞応答／配列データセットを使用して評価され得る。
【０１０２】
ワクチンに含まれるネオエピトープの重要な一態様は、自己反応性の欠如である。推定上のネオエピトープをスクリーニングして、エピトープが、例えば、悪性細胞内の遺伝子変化の結果として生じる腫瘍組織に限定されることを確認してもよい。理想的には、エピトープは、患者の正常な組織内に存在してはならず、故に、自己類似のエピトープは、データセットから除外される。個別化コーディングゲノムは、自己反応性の欠如を決定するために、ネオ抗原候補の比較のための参照として使用され得る。いくつかの実施形態では、個別化コーディングゲノムは、個別化トランスクリプトーム及び／またはエクソームから生成される。
【０１０３】
ペプチド組成物の性質は、エピトープ設計においても考慮され得る。例えば、各推定エピトープについて、エピトープに見られる保存アミノ酸対非保存アミノ酸の値に関するスコアを提供することができる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるツールによって行われる分析は、患者から異なる時点で、すなわち、治療介入の前及び後、異なる組織試料から、類似の腫瘍を有する異なる患者等から取得された異なる特性のセットを比較することを含み得る。いくつかの実施形態では、１つの特性のセットからのピーク値の平均は、別の特性のセットからのピーク値の平均と比較され得る。例えば、ＨＬＡ結合の平均値は、２つの異なる分布セット間で比較され得る。２つの分布セットは、例えば、日数、月数、または年数で区切られた時間持続期間について決定され得る。
【０１０５】
本明細書に記載される技法によるネオエピトープ特性評価システムは、実施形態がこの点に限定されないため、任意の好適な形態をとってもよい。１つ以上のコンピュータシステムを使用して、上述の機能のうちのいずれかを実装することができる。コンピュータシステムは、任意の好適なデータ記憶媒体から形成され得る、１つ以上のプロセッサ及び１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体（すなわち、有形の、非一時的なコンピュータ可読媒体）、例えば、揮発性記憶媒体及び１つ以上の不揮発性記憶媒体を含み得る。実施形態がこの点に限定されないため、プロセッサは、任意の好適な様式で揮発性記憶装置及び不揮発性記憶装置への書き込みデータ及びそれらからの読み取りデータを制御し得る。本明細書に記載される機能のうちのいずれかを行うために、プロセッサは、１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体（例えば、揮発性記憶媒体及び／または不揮発性記憶媒体）に記憶された１つ以上の命令を実行することができ、これは、プロセッサによる実行のための命令を記憶する有形の、非一時的なコンピュータ可読媒体として機能し得る。
【０１０６】
調製方法
他の態様では、本開示は、がんワクチンを調製するための方法であって、ａ）患者のための個別化がん抗原間で同定することと、ｂ）３〜１３０個の個別化がん抗原の各々について少なくとも２つのペプチドエピトープの抗腫瘍有効性を決定することと、ｃ）がんワクチンの全抗がん有効性が、がんワクチンの所与の全長にわたって最大化される（例えば、がんワクチンの予測される全抗がん有効性が最大化される）がんワクチンを調製することと、を含む、方法を提供する。
【０１０７】
本開示によるがんワクチンを生成するための方法は、組織試料の本明細書に記載されるような深い核酸またはタンパク質配列決定方法などの技法を使用した変異の同定を含み得る。いくつかの実施形態では、対象の（例えば、患者の）トランスクリプトームにおける変異の初期同定を行う。発現される患者特異的変異及び腫瘍特異的変異を同定するために、対象の（例えば、患者の）トランスクリプトームからのデータを、対象の（例えば、患者の）エクソームからの配列情報と比較する。比較は、ミュータノーム（ｍｕｔａｎｏｍｅ）と称される推定ネオエピトープのデータセットを生成する。ミュータノームは、患者あたりおよそ１００〜１０，０００個の候補変異を含んでもよい。ミュータノームは、ネオ抗原ワクチンの生成のための最適な変異セットを同定するために、一連の照会またはアルゴリズムを使用したデータプロービング分析の対象となる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡネオ抗原ワクチンが設計され、製造される。次いで、患者はワクチンで治療される。ある特定の実施形態では、そのようなネオ抗原含有ワクチンは、複数のネオエピトープまたは１つ以上の単一ＲＮＡワクチンまたはそれらの組み合わせを含む、ポリシストロンワクチンであり得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、変異同定プロセスの開始から患者治療の開始までの全方法は、２ヶ月未満で達成される。他の実施形態では、プロセス全体は、７週間以下、６週間以下、５週間以下、４週間以下、３週間以下、２週間以下、または１週間未満で達成される。いくつかの実施形態では、方法全体は、３０日未満で行われる。
【０１０９】
個別化がんワクチンでは、対象特異的がん抗原は、患者の試料中で同定され得る。「生体試料」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質などの生体材料を含有する試料を指す。いくつかの実施形態では、生体試料は、対象由来の体液を好適に含み得る。体液は、対象の体内の任意の場所、好ましくは末梢位置から単離された流体であり得、例えば、血液、血漿、血清、尿、痰、脊髄液、脳脊髄液、胸水、乳頭吸引液、リンパ液、呼吸器、腸、及び生殖泌尿器管の流体、涙液、唾液、母乳、リンパ系からの流体、精液、脳脊髄液、臓器内システム流体、腹水、腫瘍嚢胞液、羊水、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、試料は、組織試料または腫瘍試料であり得る。例えば、１つ以上の腫瘍細胞の試料を、対象特異的がん抗原の存在について検査してもよい。
【０１１０】
特異的がん抗原の同定プロセスは、トランスクリプトーム及びエクソーム分析の両方、またはトランスクリプトームもしくはエクソーム分析のみを伴い得る。いくつかの実施形態では、トランスクリプトーム分析を最初に行い、エクソーム分析を次に行う。分析は、生物学的または組織試料上で行う。いくつかの実施形態では、生物学的または組織試料は、血液または血清試料である。他の実施形態では、試料は、組織バンク試料またはＢ細胞のＥＢＶ形質転換である。
【０１１１】
あるいは、対象特異的がん抗原は、対象のエクソソームにおいて同定され得る。ワクチンの抗原が対象のエクソソーム中で同定される場合、そのような抗原は、対象のエクソソーム抗原を表すと言われる。
【０１１２】
エクソソームは、細胞によって流れ落ちる小さな微小胞であり、典型的には、およそ３０〜１００ｎｍの直径を有する。エクソソームは、内側に侵入し、後期エンドソーム膜を挟み込むことから古典的に形成され、小さな脂質二層小胞を充填した多胞体（ＭＶＢ）の形成をもたらし、各々が親細胞の細胞質の試料を含有する。ＭＶＢと細胞膜との融合により、これらのエクソソームが細胞から放出され、それらが血液、尿、脳脊髄液、または他の体液中に送達される。エクソソームは、さらなる分析のために、これらの生物学的流体のうちのいずれかから回収することができる。
【０１１３】
エクソソーム内の核酸は、腫瘍抗原のバイオマーカーとしての役割を有する。対象特異的がん抗原を同定するためにエクソソームを分析する利点は、方法が生検の必要性を回避することである。これは、患者が、がん抗原の同定、及びワクチン接種を含むいくつかのラウンドの療法を有する必要がある場合に特に有利であり得る。
【０１１４】
生体試料からエクソソームを単離するいくつかの方法が、当該技術分野で記載されている。例えば、以下の方法を使用することができる：差動遠心分離、低速遠心分離、陰イオン交換、及び／またはゲル透過クロマトグラフィー、スクロース密度勾配もしくは有機電気泳動、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、ナノ膜限外濾過濃度、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配単離、及びマイクロ流体デバイスを使用する。例示的な方法は、例えば、米国特許公開第２０１４／０２１２８７１号に記載されている。
【０１１５】
ｍＲＮＡワクチンが合成されると、患者に投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、最大２ヶ月、最大３ヶ月、最大４ヶ月、最大５ヶ月、最大６ヶ月、最大７ヶ月、最大８ヶ月、最大９ヶ月、最大１０ヶ月、最大１１ヶ月、最大１年、最大１年半、最大２年、最大３年、または最大４年間のスケジュールで投与される。スケジュールは同じであっても、様々であってもよい。いくつかの実施形態では、スケジュールは、最初の３週間は週１回であり、その後は月１回である。
【０１１６】
治療の任意の時点で、患者は、ワクチンにおける変異が依然として適切であるかどうかを決定するために検査され得る。その分析に基づいて、ワクチンは、１つ以上の異なる変異を含むか、または１つ以上の変異を除去するように調整または再構成され得る。
【０１１７】
がん関連変異のある特定の特性を分析することによって、最適なネオエピトープが、がんワクチンに含めるために評価及び／または選択され得ることが認識及び理解されている。ネオエピトープまたはネオエピトープのセットの特性としては、例えば、患者ＲＮＡ−ｓｅｑまたは他の核酸分析における遺伝子または転写レベル発現の評価、利用可能なデータベースにおける組織特異的発現、既知のがん遺伝子／腫瘍抑制因子、バリアントコールの信頼性スコア、ＲＮＡ−ｓｅｑアレル特異的発現、保存的対非保存的ＡＡ置換、点変異の位置（ＴＣＲ結合の増加のためのセンタリングスコア）、点変異の位置（差動ＨＬＡ結合のためのアンカーリングスコア）、自己性：患者ＷＥＳデータとの１００％未満のコアエピトープ相同性、８ｍｅｒ〜１１ｍｅｒのＨＬＡ−Ａ及び−Ｂ  ＩＣ５０、１５ｍｅｒ〜２０ｍｅｒのＨＬＡ−ＤＲＢ１  ＩＣ５０、非特異性スコア（すなわち、結合すると予測される患者ＨＬＡの数）、８ｍｅｒ〜１１ｍｅｒのＨＬＡ−Ｃ  ＩＣ５０、１５ｍｅｒ〜２０ｍｅｒのＨＬＡ−ＤＲＢ３−５  ＩＣ５０、１５ｍｅｒ〜２０ｍｅｒのＨＬＡ−ＤＱＢ１／Ａ１  ＩＣ５０、１５ｍｅｒ〜２０ｍｅｒのＨＬＡ−ＤＰＢ１／Ａ１  ＩＣ５０、クラスＩ対クラスＩＩの割合、網羅される患者ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、及びＤＲＢ１アロタイプの多様性、点変異対複雑なエピトープ（例えば、フレームシフト）の割合、及び／または擬似エピトープＨＬＡ結合スコアを挙げることができる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、最適なネオエピトープを同定するために使用されるがん関連変異の特性は、変異の種類、患者試料中の変異の存在量、免疫原性、自己反応性の欠如、及びペプチド組成物の性質に関連する特性である。変異の種類は、推定エピトープがワクチンに含まれるべきかどうかを決定する際の要因として決定され、考慮されるべきである。変異の種類は様々であり得る。いくつかの事例では、単一のワクチンに複数の異なる種類の変異を含むことが望ましい場合がある。他の事例では、単一種類の変異が、より望ましい場合がある。各特定の変異の値は、重み付けされ、計算され得る。いくつかの実施形態では、特定の変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。いくつかの実施形態では、特定の変異は、複雑なバリアント、例えば、イントロン保持、複雑なスプライシング事象、または配列の読み取りフレームを変化させる挿入／欠失変異から生じるペプチド配列である。
【０１１９】
患者試料中の変異の存在量はまた、スコア化され、推定エピトープがワクチンに含まれるべきかどうかの決定に因子分解され得る。高度に豊富な変異は、より堅牢な免疫応答を促進し得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される個別化ｍＲＮＡがんワクチンは、がんの治療に使用され得る。１つの非限定的な例として、本開示は、がんを有する患者を治療するための方法を提供し、ａ）１つ以上の個別化がん抗原を同定するために、患者に由来する試料を分析することと、ｂ）同定された個別化がん抗原の各々について少なくとも２つのペプチドエピトープの抗腫瘍有効性を決定することと、ｃ）がんワクチンの全抗がん有効性が所与の全長のがんワクチンに対して最大化される（例えば、がんワクチンの予測される全抗がん有効性が最大化される）がんワクチンを調製することと、ｄ）がんワクチンを患者に投与することと、を含む。
【０１２１】
がんワクチン（例えば、核酸がんワクチン）は、健康な個体に、あるいはがんまたは後期及び／または転移性がんの早期に、活性免疫スキームの一部として予防的または治療的に投与され得る。一実施形態では、細胞、組織、または対象に提供されるがんワクチン（例えば、核酸がんワクチン）の有効量は、免疫活性化、特に抗原特異的免疫活性化のために十分であり得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、がんワクチン（例えば、核酸がんワクチン）は、抗がん治療剤と共に投与されてもよい。がんワクチン（例えば、核酸がんワクチン）及び抗がん治療薬を組み合わせて、免疫治療応答をさらに増強することができる。がんワクチン（例えば、核酸がんワクチン）及び他の治療剤は、同時にまたは順次投与されてもよい。他の治療剤が同時に投与される場合、それらは、同じまたは別個の製剤で投与することができるが、同時に投与される。他の治療剤は、他の治療剤及びがんワクチン（例えば、核酸がんワクチン）の投与が一時的に分離されるときに、互いに及びがんワクチン（例えば、核酸がんワクチン）と共に順次投与される。これらの化合物の投与間の時間の分離は、数分間であってもよく、またはそれは、より長く、例えば、数時間、数日間、数週間、数ヶ月間であってもよい。他の治療剤には、抗がん治療薬、アジュバント、サイトカイン、抗体、抗原等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、がんの進行を監視して、発現抗原の変化を同定することができる。故に、いくつかの実施形態では、この方法はまた、がんｍＲＮＡワクチンの投与から少なくとも１ヶ月後、対象の試料から少なくとも２つのがん抗原を同定して、がん抗原の第２のセットを産生し、対象に対してがん抗原の第２のセットをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンを対象に投与することも含む。いくつかの実施形態では、抗原の第２のセットをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンは、がん抗原の第１のセットをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの２ヶ月後、３ヶ月後、４ヶ月後、５ヶ月後、６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後、または１年後に対象に投与される。他の実施形態では、抗原の第２のセットをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンは、がん抗原の第１のセットをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの１年半、２年、２年半、３年、３年半、４年、４年半、または５年後に対象に投与される。
【０１２４】
ネオ抗原としてのホットスポット変異
がんの集団分析では、ある特定の変異は、偶然に予測されるよりも高いパーセンテージの患者に生じる。これらの「再発性」または「ホットスポット」変異は、しばしば腫瘍において「ドライバー」の役割を有することが示されており、腫瘍の開始、維持、または転移にとって重要であるがん細胞機能のいくつかの変化をもたらし、したがって、腫瘍の進化において選択される。腫瘍生物学及び療法におけるそれらの重要性に加えて、精密医学の機会を提供し、ここで再発性変異は、患者集団が、変異タンパク質自体を標的とすることを含むが、これに限定されない特定の療法に応答する可能性の高い群に階層化される。
【０１２５】
したがって、いくつかの実施形態では、がんワクチンは、個別化がんエピトープに加えて、１つ以上のがんホットスポットネオエピトープをさらに含む。いくつかの実施形態では、目的の適応症における閾値有病率を超えて生じるがんホットスポット変異が、ワクチンに含まれる。閾値有病率は、いくつかの実施形態では、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％を超える。目的の適応症としては、膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）、結腸腺癌（ＣＯＡＤ）、食道癌（ＥＳＣＡ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、膵臓腺癌（ＰＡＡＤ）、前立腺癌（ＰＲＡＤ）、直腸腺癌（ＲＥＡＤ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）、血清卵巣癌（ＳＯＣ）、胃腺癌（ＳＴＡＤ）、及び子宮内膜癌（ＵＥＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な変異を以下の表に提供し、適応症別のホットスポット変異の例示的なグラフを図１として提供する。
【表１】
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【０１２６】
再発変異に関する多くの努力及び研究は、非同義（または「ミスセンス」）一塩基バリアント（ＳＮＶ）に焦点を当ててきたが、集団分析は、同義（または「サイレント」）、スプライス部位、多塩基バリアント、挿入、及び欠失などの様々なより複雑な（非ＳＮＶ）バリアント分類もまた、高頻度で生じ得ることを明らかにした。
【０１２７】
ｐ５３遺伝子（公式記号ＴＰ５３）は、ヒトがんにおける任意の他の遺伝子よりも頻繁に変異される。大規模なコホート研究は、ほとんどのｐ５３変異について、ゲノム位置は、１人またはわずかな患者に固有であり、変異は、特定の患者集団のために設計された治療ワクチンの再発性ネオ抗原として使用することができないことを示している。しかしながら、驚くべきことに、ｐ５３遺伝子座の小さなサブセットは、遺伝子内のいくつかの位置が比較的高い頻度で変異する「ホットスポット」パターンを呈する。驚くべきことに、これらの繰り返し変異した領域の大部分は、エクソン−イントロン境界付近で生じ、ｍＲＮＡスプライシング機構によって認識される正準ヌクレオチド配列モチーフを破壊する。スプライシングモチーフの変異は、局所アミノ酸配列への変化が予測されなくても（すなわち、同義変異またはイントロン変異について）最終ｍＲＮＡ配列を変化させることができる。したがって、これらの変異は、予測不可能な方法でｍＲＮＡスプライシングを変更し、翻訳されたタンパク質に深刻な機能的影響を及ぼし得るにもかかわらず、一般的な注釈ツールによって「非コード化」として注釈付けられ、さらなる分析のために無視されることが多い。代替的にスプライシングされたアイソフォームがフレーム内配列変化を産生する場合（すなわち、ＰＴＣは産生されない）、ＮＭＤによる枯渇を回避し、ＨＬＡ系によって細胞表面上で容易に発現、処理、及び提示され得る。さらに、変異由来の代替スプライシングは、通常、「クリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）」であり、すなわち、正常な組織では発現せず、したがって、Ｔ細胞によって非自己ネオ抗原として認識され得る。
【０１２８】
変異は、典型的には、患者のＤＮＡ配列決定データから得られ、従来技術のペプチドワクチンのネオエピトープを導出する。しかしながら、ｍＲＮＡ発現は、考えられるネオエピトープのグローバル空間のより直接的な測定である。例えば、いくつかの腫瘍特異的ネオエピトープは、エクソーム配列決定データのみを使用して容易に同定されないフレームシフト、代替プロモーター、またはエピジェネティック修飾をもたらすスプライシング変化、挿入／欠失（ＩｎＤｅｌ）から生じ得る。いくつかの態様では、ＩｎＤｅｌからのネオ抗原は、ｎｓＳＮＶに対して予測される高親和性バインダーについて濃縮される。そのようなネオ抗原は、免疫原性であり得る。例えば、フレームシフトＩｎＤｅｌは、３つの黒色腫コホートにわたるチェックポイント阻害剤応答と有意に関連することが見出されている。全てのネオエピトープは、ＩｎＤｅｌに対するバイアスを回避するために、最大でも、ＩｎＤｅｌあたり１つのネオ抗原候補が含まれるが、ＳＮＶから生じるそれらのネオエピトープと同じ方法でスコア化されてもよい。ネオ抗原ワクチンのこれらのタイプの複雑な変異を同定することには未開発の価値がある。なぜなら、それらは、患者の固有のＨＬＡアロタイプに結合することができるエピトープの数を増加させるからである。さらに、複雑なバリアントは、単一のアミノ酸変化から生じるバリアントと比較して、自己タンパク質とのそれらの差に起因して、より免疫原性であり、腫瘍に対するより効果的な免疫応答につながる可能性が高い。
【０１２９】
いくつかの態様では、本発明は、患者特異的な複雑な変異を同定し、これらの変異を効果的な個別化がんワクチン（例えば、核酸がんワクチン）に製剤化するための方法を伴う。この方法は、短いリードＲＮＡ−Ｓｅｑの使用を伴う。ＲＮＡ−ｓｅｑに短いリードを使用することに固有の大きな課題は、代替スプライシング及び他の機構のために、複数のｍＲＮＡ転写アイソフォームが同じゲノム遺伝子座から得ることができるという事実である。配列決定リードが完全長ｍＲＮＡ転写産物よりもはるかに短いため、既知の遺伝子注釈モデル内の正しい対応するアイソフォームにリードのセットをマッピングすることが困難になる。結果として、既知の遺伝子注釈から逸脱する複雑なバリアント（癌において一般的である）は、標準的なアプローチによって発見することが困難であり得る。しかしながら、完全長転写産物の正確なエクソン組成物ではなく、短いペプチドが同定され得る。これらの複雑な変異を表すであろう短いペプチドを同定するための方法は、複雑なバリアントのネオエピトープ予測に対する短いｋ−ｍｅｒ計数アプローチを伴う。
【０１３０】
核酸／ポリヌクレオチド
がんワクチン（例えば、核酸がんワクチン）は、本明細書で提供されるように、少なくとも１つのペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの（１つ以上の）核酸を含む。「核酸」という用語は、その最も広い意味において、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／または物質を含む。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドとも称される。
【０１３１】
核酸は、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ、β−Ｄ−リボ構成を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ構成を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２′−アミノ機能化を有する２´−アミノ−ＬＮＡ、及び２′−アミノ機能化を有する２´−アミノ−α−ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）もしくはキメラ、またはそれらの組み合わせであり得るか、または含み得る。
【０１３２】
非限定的な例として、本明細書に記載されるＤＮＡ核酸がんワクチンが細胞に送達されるとき、ＤＮＡは、ＲＮＡに転写され、ＲＮＡは、細胞内機構によってポリペプチドに処理され、次いで、ポリペプチドを、腫瘍またはがん細胞集団に対する免疫応答を刺激することができる免疫感受性断片に処理することができる。非限定的な例として、本明細書に記載されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）核酸がんワクチンが細胞に送達されるとき、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、細胞内機構によってポリペプチドに処理され、次いで、ポリペプチドを、腫瘍またはがん細胞集団に対する免疫応答を刺激することができる免疫感受性断片に処理することができる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として機能する。「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、（少なくとも１つの）ポリペプチド（アミノ酸の天然に存在する、非天然に存在する、または修飾ポリマー）をコードし、インビトロ、インビボ、原位置、またはエクスビボで翻訳されて、コードされたポリペプチドをもたらすことができる任意の核酸を指す。
【０１３４】
ｍＲＮＡ分子の塩基性成分は、典型的には、少なくとも１つのコード領域、５′非翻訳領域（ＵＴＲ）、３′ＵＴＲ、５′キャップ、及びポリＡ尾部を含む。本開示の核酸は、ｍＲＮＡとして機能し得るが、核酸ベースの治療薬を使用して有効なポリペプチド発現の既存の問題を克服する役割を果たすそれらの機能的及び／または構造的設計特徴において、野生型ｍＲＮＡと区別することができる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、コドン最適化される。コドン最適化方法は、当該技術分野で知られており、本明細書に提供されるように使用され得る。いくつかの実施形態では、コドン最適化を使用して、適切な折り畳みが確実となるように、標的及び宿主生物におけるコドン頻度を一致させる；ｍＲＮＡ安定性を増加させるもしくは二次構造を低減するようにＧ／Ｃ含量を偏向させる；遺伝子構築もしくは発現を損ない得る縦列型反復コドンもしくは塩基の連なりを最小化する；転写及び翻訳制御領域をカスタマイズする；タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去する；コードされたタンパク質における翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加する；タンパク質ドメインを除去もしくはシャッフルする；制限部位を挿入もしくは欠失する；リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾する；タンパク質の種々のドメインが適切に折り畳まれるようにする翻訳率を調整する；またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造を低減もしくは排除することができる。コドン最適化ツール、アルゴリズム、及びサービスは、当該技術分野で知られており、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）からのサービス及び／または専有の方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するまたは野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然に存在するまたは野生型ｍＲＮＡ配列）と９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するまたは野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然に存在するまたは野生型ｍＲＮＡ配列）と９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するまたは野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然に存在するまたは野生型ｍＲＮＡ配列）と８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するまたは野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然に存在するまたは野生型ｍＲＮＡ配列）と８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するまたは野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然に存在するまたは野生型ｍＲＮＡ配列）と７５％未満の配列同一性を共有する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するまたは野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然に存在するまたは野生型ｍＲＮＡ配列）と６５％〜８５％（例えば、約６７％〜約８５％、または約６７％〜約８０％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するまたは野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然に存在するまたは野生型ｍＲＮＡ配列）と６５％〜７５％、または約８０％の配列同一性を共有する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、コドン最適化ＲＮＡは、例えば、Ｇ／Ｃのレベルが増強されたＲＮＡであり得る。核酸分子のＧ／Ｃ含有量は、ＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。増加した量のグアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）残基を有するＲＮＡは、大量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含有する核酸よりも機能的に安定であり得る。ＷＯ０２／０９８４４３は、翻訳領域内の配列修飾によって安定化されたｍＲＮＡを含有する薬学的組成物を開示している。遺伝子コードの退縮により、修飾は、結果として生じるアミノ酸を変更することなく、より大きなＲＮＡ安定性を促進するものに既存のコドンを置き換えることによって機能する。アプローチは、ＲＮＡのコード領域に限定される。
【０１３９】
抗原／抗原ポリペプチド
いくつかの実施形態では、各ペプチドエピトープは、５〜１００アミノ酸長（包含的）であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つの長さは、５〜１００、５〜９５、５〜９０、５〜８５、５〜８０、５〜７５、５〜７０、５〜６５、５〜６０、５〜５５、５〜５０、５〜４５、５〜４０、５〜３９、５〜３８、５〜３７、５〜３６、５〜３５、５〜３４、５〜３３、５〜３２、５〜３１、５〜３０、５〜２９、５〜２８、５〜２７、５〜２６、５〜２５、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、５〜２０、８〜１００、８〜９５、８〜９０、８〜８５、８〜８０、８〜７５、８〜７０、８〜６５、８〜６０、８〜５５、８〜５０、８〜４５、８〜４０、８〜３９、８〜３８、８〜３７、８〜３６、８〜３５、８〜３４、８〜３３、８〜３２、８〜３１、８〜３０、８〜２９、８〜２８、８〜２７、８〜２６、８〜２５、８〜２４、８〜２３、８〜２２、８〜２１、８〜２０、１０〜１００、１０〜９５、１０〜９０、１０〜８５、１０〜８０、１０〜７５、１０〜７０、１０〜６５、１０〜６０、１０〜５５、１０〜５０、１０〜４５、１０〜４０、１０〜３９、１０〜３８、１０〜３７、１０〜３６、１０〜３５、１０〜３４、１０〜３３、１０〜３２、１０〜３１、１０〜３０、１０〜２９、１０〜２８、１０〜２７、１０〜２６、１０〜２５、１０〜２４、１０〜２３、１０〜２２、１０〜２１、または１０〜２０アミノ酸である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、核酸がんワクチンによってコードされるペプチドエピトープの各々は、異なる長さを有し得る。ある特定の実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、核酸がんワクチンによってコードされる別のペプチドエピトープとは異なる長さを有する。各ペプチドエピトープは、エピトープにとって合理的な任意の長さであり得る。
【０１４１】
本開示と共に使用するためのポリペプチドとしては、前述の遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、及び他の同等物、バリアント、及び類似体が挙げられる。ポリペプチドは、単一分子であり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体などの多分子複合体であり得る。ポリペプチドはまた、抗体またはインスリンなどの一本鎖または多鎖ポリペプチドを含んでもよく、会合または連結されてもよい。最も一般的に、ジスルフィド結合は、多鎖ポリペプチドにおいて見られる。ポリペプチドという用語は、アミノ酸ポリマーに適用することもでき、少なくとも１つのアミノ酸残基は、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体である。
【０１４２】
「ポリペプチドバリアント」という用語は、アミノ酸配列が天然または参照配列とは異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、及び／または挿入を有し得る。通常、バリアントは、天然または参照配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントは、天然または参照配列と少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を共有する。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、「バリアント模倣物」が提供される。本明細書で使用されるとき、「バリアント模倣物」という用語は、活性化配列を模倣する少なくとも１つのアミノ酸を含有するものである。例えば、グルタミン酸塩は、ホスホロ−スレオニン及び／またはホスホロ−セリンの模倣物として機能し得る。あるいは、バリアント模倣物は、非活性化をもたらし得るか、または模倣物を含有する不活性化生成物をもたらし得、例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活性化置換として機能し得るか、またはアラニンは、セリンの不活性化置換として機能し得る。
【０１４４】
「オルソログ」は、種分化により共通の先祖遺伝子から進化した異なる種の遺伝子を指す。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持する。オルソログの同定は、新たに配列決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼性の予測に重要である。
【０１４５】
「類似体」は、例えば、親または出発ポリペプチドの特性のうちの１つ以上を依然として維持するアミノ酸残基の置換、付加、または欠失を含む、１つ以上のアミノ酸変更だけ異なるポリペプチドバリアントを含むことを意味する。
【０１４６】
本開示は、バリアント及び誘導体を含む、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドベースのいくつかの種類の組成物を提供する。これらには、例えば、置換、挿入、欠失、及び共有結合バリアント及び誘導体が含まれる。「誘導体」という用語は、「バリアント」という用語と同義に使用されるが、一般に、参照分子または出発分子に対して任意の方法で修飾及び／または変更された分子を指す。
【０１４７】
したがって、参照配列、特に本明細書に開示されるポリペプチド配列に関して置換、挿入及び／または付加、欠失、ならびに共有結合修飾を含有するペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば、１つ以上のリジンが、ペプチド配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端で）付加され得る。配列タグは、ペプチド検出、精製、または局在化のために使用され得る。リジンを使用して、ペプチド溶解度を増加させるか、またはビオチン化を可能にすることができる。あるいは、任意選択で、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端領域及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基が欠失されて、切断配列をもたらし得る。ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端もしくはＮ末端残基）は、あるいは、配列の使用に応じて、例えば、可溶性であるか、または固体支持体に連結されたより大きな配列の一部としての配列の発現に応じて欠失され得る。
【０１４８】
「置換バリアント」とは、ポリペプチドについて言及するとき、天然または出発配列において少なくとも１つのアミノ酸残基を有し、異なるアミノ酸が同じ位置に挿入されるバリアントである。置換は、単一であり得る（分子中１つのアミノ酸のみが置換されている）、または複数であり得る（２つ以上のアミノ酸が同じ分子中で置換されている）。
【０１４９】
本明細書で使用されるとき、「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、または極性を有する異なるアミノ酸での置換を指す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、及びロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基への置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、及びグリシンとセリンとの間など、１つの極性（疎水性）残基の、別の極性残基への置換が挙げられる。加えて、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基の、別の塩基性残基への置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基の、別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリジンなどの極性（親水性）残基の置換、及び／または極性残基の非極性残基への置換が挙げられる。
【０１５０】
「特徴」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドについて言及するとき、それぞれ分子の別個のアミノ酸配列ベースまたはヌクレオチドベースの構成成分として定義される。ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴は、表面発現、局所立体配座形状、折り畳み、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１５１】
ポリペプチドについて言及するときに本明細書で使用されるとき、「ドメイン」という用語は、１つ以上の同定可能な構造的または機能的特徴または特性（例えば、結合能力、タンパク質−タンパク質相互作用のための部位として機能する）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
【０１５２】
ポリペプチドについて言及するときに本明細書で使用されるとき、それがアミノ酸に基づく実施形態に関連する「部位」という用語は、「アミノ酸残基」及び「アミノ酸側鎖」と同義に使用される。ポリヌクレオチドについて言及するときに本明細書で使用されるとき、それがヌクレオチドに基づく実施形態に関連する「部位」という用語は、「ヌクレオチド」と同義に使用される。部位は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに基づく分子内で修飾、操作、変更、誘導体化、または変化し得るペプチドまたはポリペプチドまたはポリヌクレオチド内の位置を表す。
【０１５３】
本明細書で使用されるとき、「末端（ｔｅｒｍｉｎｉ）」または「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」という用語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指すとき、それぞれポリペプチドまたはポリヌクレオチドの端部を指す。そのような端部は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの最初または最後の部位のみに限定されないが、末端領域内の追加のアミノ酸またはヌクレオチドを含み得る。ポリペプチドベースの分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸によって終端する）及びＣ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸によって終端する）の両方を有するものとして特徴付けることができる。タンパク質は、場合によっては、ジスルフィド結合によってまたは非共有結合力（多量体、オリゴマー）によって一緒にされた複数のポリペプチド鎖で形成される。これらのタンパク質は、複数のＮ末端及びＣ末端を有する。代替的に、ポリペプチドの末端は、場合によって有機コンジュゲートなどの非ポリペプチドベースの部分で始まるまたは終わるように修飾され得る。
【０１５４】
当業者に認識されるように、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、及び同種タンパク質もまた、目的のポリペプチドの範囲内にあると見なされる。例えば、本明細書に提供されるのは、参照タンパク質５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００超のアミノ酸長の任意のタンパク質断片である（参照ポリペプチド配列よりも短いが別様に同一の少なくとも１つのアミノ酸残基のポリペプチド配列を意味する）。別の実施例では、本明細書に記載される配列のうちのいずれかと４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一である１０、２０、３０、４０、５０、または１００アミノ酸の伸長を含む任意のタンパク質を、本開示に従って利用することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で提供または参照される配列のうちのいずれかに示されるように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の変異を含む。別の実施例では、本明細書に記載される配列のうちのいずれかと８０％、９０％、９５％、または１００％超同一である２０、３０、４０、５０、または１００アミノ酸の伸長を含む任意のタンパク質であって、このタンパク質は、本明細書に記載される配列のうちのいずれかと８０％、７５％、７０％、６５％、または６０％未満同一である５、１０、１５、２０、２５、または３０アミノ酸の伸長を有する。
【０１５５】
本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子は、参照分子（例えば、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチド）と、例えば、当該技術分野に記載される分子（例えば、操作または設計された分子または野生型分子）と、ある程度の配列類似性または「同一性」を共有し得る。当該技術分野において知られている「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）の配列間の関係を指す。当該技術分野において、同一性はまた、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基の文字列間の一致の数によって決定される、それらの間の配列相関性の程度を意味する。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（例えば、「アルゴリズム」）によってアドレス指定されたギャップアラインメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のうちの小さい方の間の同一の一致のパーセントを測定する。関連ペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント」または「同一性％」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大同一性パーセントを達成した後に、第２の配列のアミノ酸配列または核酸配列中の残基と同一である、候補アミノ酸または核酸配列中の残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージとして定義される。整列のための方法及びコンピュータプログラムは、当該技術分野において周知である。同一性は、同一性パーセントの計算に依存するが、計算に導入されたギャップ及びペナルティにより価値が異なる場合があることが理解される。２つのポリ核酸配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって行うことができる（例えば、ギャップは、最適な整列のために第１及び第２の核酸配列の一方または両方に導入され得、非同一の配列は、比較目的のために無視され得る）。ある特定の実施形態では、比較目的のために整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置におけるヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置は、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められるとき、分子は、その位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、これを２つの配列の最適な整列のために導入される必要がある。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを使用して達成され得る。
【０１５６】
一般に、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、本明細書に記載され、当業者に知られている配列アラインメントプログラム及びパラメータによって決定される、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％未満の配列同一性を有する。例えば、２つの核酸配列間の同一性パーセントは、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１（各々が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどの方法を使用して決定され得る。例えば、２つの核酸配列間の同一性パーセントは、Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１−１７）のアルゴリズムを使用して決定することができ、このアルゴリズムは、ＰＡＭ１２０重量残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用してＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。２つの核酸配列間の同一性パーセントは、代替として、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般に用いられる方法としては、参照により本明細書に組み込まれるＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。同一性を決定するための技法は、公開されているコンピュータプログラムに編纂されている。２つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピュータソフトウェアとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１），３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ（１９９７），″Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ″，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）が挙げられるが、これらに限定されない。別の普及しているローカルアラインメント技法は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）″Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．″Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）に基づいている。動的プログラミングに基づく一般的なグローバルアラインメント技法は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）″Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．″Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）である。より最近では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む他の最適なグローバルアラインメント方法よりも速くヌクレオチド及びタンパク質配列のグローバルアラインメントを生成すると言われる高速最適グローバルシーケンスアラインメントアルゴリズム（ＦＯＧＳＡＡ）が開発されている。
【０１５７】
本明細書で使用されるとき、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子間（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）及び／またはポリペプチド分子間の全体的な相関性を指す。一致する残基のアラインメントによって決定される類似性または同一性の閾値レベルを共有するポリマー分子（例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）及び／またはポリペプチド分子）は、相同であると称される。相同性は、分子間の関係を説明する定性的用語であり、定量的類似性または同一性に基づき得る。類似性または同一性は、２つの比較された配列間の配列一致の程度を定義する定量的用語である。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一または類似である場合、互いに「相同」であると見なされる。「相同」という用語は必ず、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも２０アミノ酸の少なくとも１つの伸長に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらには９９％である場合、相同であると見なされる。いくつかの実施形態では、相同ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５個の一意に指定されたアミノ酸の伸長をコードする能力を特徴とする。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列について、相同性は、少なくとも４〜５個の一意に指定されたアミノ酸の伸長をコードする能力によって決定される。２つのタンパク質配列は、タンパク質が、少なくとも２０アミノ酸の少なくとも１つの伸長に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である場合、相同であると見なされる。
【０１５８】
相同性は、比較された配列が共通の起源からの進化で分岐したことを意味する。「相同体」という用語は、共通の先祖配列からの降順で第２のアミノ酸配列または核酸配列に関連する、第１のアミノ酸配列または核酸配列（例えば、遺伝子（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）またはタンパク質配列）を指す。「相同体」という用語は、種分化の事象によって分離された遺伝子及び／またはタンパク質の関係、または遺伝子重複の事象によって分離された遺伝子及び／またはタンパク質の関係に適用され得る。「オルソログ」は、種分化によって共通の先祖遺伝子（またはタンパク質）から進化した異なる種における遺伝子（またはタンパク質）である。典型的には、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持する。「パラログ」は、ゲノム内での重複によって関連する遺伝子（またはタンパク質）である。オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持するが、パラログは、元の機能に関連していても、新しい機能を進化させる。
【０１５９】
化学修飾
修飾ヌクレオチド配列はエピトープ抗原ポリペプチドをコードする
いくつかの実施形態では、本発明の核酸がんワクチンは、１つ以上の化学修飾された核酸塩基を含む。本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む修飾ポリヌクレオチド（例えば、１つ以上のがんペプチドエピトープをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）を含む。修飾核酸は、化学的に修飾及び／または構造的に修飾され得る。本発明の核酸が、化学的に及び／または構造的に修飾されるとき、ポリヌクレオチドは、「修飾核酸」と称され得る。
【０１６０】
本開示は、１つ以上のがんペプチドエピトープをコードする核酸の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）を提供する。「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも称される）と組み合わせた、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）を含有する化合物またはその誘導体を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含むように、任意の有用な方法によって、例えば、化学的に、酵素的に、または組み換え的に合成され得る。核酸は、連結されたヌクレオシドの領域（複数可）を含み得る。そのような領域は、可変骨格結合を有し得る。これらの結合は、標準ホスホジエステル結合であり得、この場合、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの領域を含む。
【０１６１】
本明細書に開示される修飾核酸は、様々な別個の修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドは、１つ、２つ、またはそれ以上の（任意選択で異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞に導入された修飾ポリヌクレオチドは、非修飾ポリヌクレオチドと比較して、例えば、細胞中のタンパク質発現の改善、免疫原性の低減、または分解の低減などの１つ以上の望ましい特性を呈し得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸（例えば、１つ以上のペプチドエピトープをコードする核酸）は、構造的に修飾される。本明細書で使用されるとき、「構造的」修飾は、２つ以上の連結されたヌクレオシドが、ヌクレオチド自体への重要な化学修飾なしに、ポリヌクレオチドにおいて挿入、欠失、重複、反転、またはランダム化される。化学結合は、必ず破壊され、再形成されて構造的修飾を引き起こすため、構造的修飾は、化学的性質のものであり、したがって化学修飾である。しかしながら、構造的修飾は、ヌクレオチドの異なる配列をもたらすであろう。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、「ＡＴ−５ｍｅＣ−Ｇ」に化学的に修飾され得る。同じポリヌクレオチドは、「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」に構造的に修飾され得る。ここで、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されており、核酸への構造的修飾をもたらす。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、化学的に修飾される。核酸に関して本明細書で使用されるとき、「化学修飾」または必要に応じて「化学的に修飾される」という用語は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、またはシチジン（Ｃ）リボもしくはデオキシリボヌクレオシドに関して、それらの位置、パターン、パーセンテージ、または集団のうちの１つ以上における修飾を指す。一般に、本明細書では、これらの用語は、天然に存在する５´末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すことを意図しない。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、同じヌクレオシド型の全てもしくはいずれかの均一な化学修飾、または同じヌクレオシド型の全てもしくはいずれかにおける同じ出発修飾の単なる下方滴定によってもたらされる修飾の集団、あるいは測定したパーセントの、同じヌクレオシド型であるが、ランダムな組み込みを有する全ていずれかの化学修飾を有し得、例えば、全てのウリジンが、ウリジン類似体、例えばシュードウリジンまたは５−メトキシウリジンによって置き換えられる。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド全体を通して同じヌクレオシド型のうちの２つ、３つ、または４つの均一な化学修飾を有し得る（例えば、全てのウリジン及び全てのシトシン等は、同じ方法で修飾される）。
【０１６５】
修飾ヌクレオチド塩基対合は、標準アデノシン−チミン、アデノシン−ウラシル、またはグアノシン−シトシン塩基対だけでなく、ヌクレオチド及び／または非標準もしくは修飾塩基を含む修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、水素結合ドナー及び水素結合アクセプターの配置は、非標準塩基と標準塩基との間または２つの相補的非標準塩基構造の間の水素結合を許容する。そのような非標準塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせは、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。
【０１６６】
熟練者であれば、別途示される場合を除いて、本出願に記載される核酸配列が、代表的なＤＮＡ配列において「Ｔ」を列挙するが、配列がＲＮＡを表す場合、「Ｔ」が「Ｕ」に置換されることを理解するであろう。
【０１６７】
本開示のがんワクチンは、いくつかの実施形態では、少なくとも１つ（例えば、３〜２００または３〜１３０）のペプチドエピトープ（複数可）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの核酸（例えば、ＲＮＡ）を含み、ここで核酸は、当該技術分野において知られているように、標準（非修飾）であり得るか、あるいは修飾され得るヌクレオチド及び／またはヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。そのような修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドは、天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオシド、または非天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドであり得る。そのような修飾は、当該技術分野で認識されるように、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシドの糖、骨格、または核酸塩基部分での修飾を含むことができる。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、本開示の天然に存在する修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドは、一般に知られているか、または当該技術分野において認識されているものである。そのような天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドの非限定的な例は、特に、広く認識されているＭＯＤＯＭＩＣＳデータベースに見出すことができる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本開示の非天然に存在する修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、一般に知られているか、または当該技術分野において認識されているものである。そのような非天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドの非限定的な例は、特に、公開されている米国出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７５１７７号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９７号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９１号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０４１３号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７３号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７５９号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７１号、またはＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５１３６７に見出すことができ、これらの全ては、この目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７０】
したがって、本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、標準ヌクレオチド及びヌクレオシド、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシド、非天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシド、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０１７１】
本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、いくつかの実施形態では、様々な（１つより多くの）異なる種類の標準及び／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、核酸の特定の領域は、１つ、２つ、またはそれ以上の（任意選択で異なる）種類の標準及び／または修飾ヌクレオチドならびにヌクレオシドを含有する。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入される修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ細胞または生物における低減された分解を呈する。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入される修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ細胞または生物における低減された免疫原性（例えば、低減された生得的応答）を呈し得る。
【０１７４】
核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、いくつかの実施形態では、核酸の合成または合成後に導入されて、所望の機能または特性を達成する非天然修飾ヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖上に存在し得る。修飾は、化学合成と共に、または鎖の末端もしくは鎖内の任意の場所にポリメラーゼ酵素と共に導入され得る。核酸の領域のうちのいずれかは、化学修飾されてもよい。
【０１７５】
本開示は、核酸の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ核酸またはｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）を提供する。「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも称される）と組み合わせた、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）を含有する化合物またはその誘導体を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含むように、任意の有用な方法によって、例えば、化学的に、酵素的に、または組み換え的に合成され得る。核酸は、連結されたヌクレオシドの領域（複数可）を含み得る。そのような領域は、可変骨格結合を有し得る。これらの結合は、標準ホスホジエステル結合であり得、この場合、核酸は、ヌクレオチドの領域を含む。
【０１７６】
修飾ヌクレオチド塩基対合は、標準アデノシン−チミン、アデノシン−ウラシル、またはグアノシン−シトシン塩基対だけでなく、ヌクレオチド及び／または非標準もしくは修飾塩基を含む修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、水素結合ドナー及び水素結合アクセプターの配置は、例えば、少なくとも１つの化学修飾を有するそれらの核酸において、非標準塩基と標準塩基との間または２つの相補的非標準塩基構造の間の水素結合を許容する。そのような非標準塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせは、本開示の核酸に組み込まれ得る。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、核酸中の修飾核酸塩基（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、１−エチル−シュードウリジン（ｅ１ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはシュードウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸中の修飾核酸塩基（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、５−メトキシメチルウリジン、５−メチルチオウリジン、１−メトキシメチルシュードウリジン、５−メチルシチジン、及び／または５−メトキシシチジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、限定されないが、化学修飾を含む前述の修飾核酸塩基のうちのいずれかのうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の組み合わせを含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置での１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）置換を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置での１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置での５−メチルシチジン置換を含む。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置でのシュードウリジン（ψ）置換を含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置でのシュードウリジン（ψ）置換及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置での５−メチルシチジン置換を含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にウリジンを含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、特定の修飾について均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体にわたって修飾される）。例えば、核酸は、１−メチル−シュードウリジンで均一に修飾され得、ｍＲＮＡ配列における全てのウリジン残基が、１−メチル−シュードウリジンで置き換えられることを意味する。同様に、核酸は、上記のものなどの修飾残基での置換によって、配列に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について均一に修飾され得る。
【０１８４】
本開示の核酸は、分子の全長に沿って部分的または完全に修飾され得る。例えば、１つ以上または全てまたは所与の種類のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上もしくは全て）は、本開示の核酸、またはその所定の配列領域（例えば、ポリＡ尾部を含むか、または除外するｍＲＮＡ）において均一に修飾され得る。いくつかの実施形態では、本開示の核酸（またはその配列領域）中の全てのヌクレオチドＸは、修飾ヌクレオチドであり、式中、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか１つ、または組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのうちのいずれか１つであり得る。
【０１８５】
核酸は、約１％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（全体のヌクレオチド含有量に関して、または１つ以上の種類のヌクレオチド、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのうちのいずれか１つ以上に関して）あるいは任意の介在するパーセンテージ（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、及び９５％〜１００％）を含み得る。任意の残りのパーセンテージが、非修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在によって説明されることが理解されるであろう。
【０１８６】
核酸は、最少１％及び最大１００％の修飾ヌクレオチド、または任意の介在パーセンテージ、例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、または少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドを含有し得る。例えば、核酸は、修飾ウラシルまたはシトシンなどの修飾ピリミジンを含有し得る。いくつかの実施形態では、核酸中のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾ウラシル（例えば、５置換ウラシル）で置き換えられる。修飾ウラシルは、単一の固有の構造を有する化合物によって置き換えられ得るか、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物によって置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、核酸中のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾シトシン（例えば、５置換シトシン）で置き換えられる。修飾シトシンは、単一の固有の構造を有する化合物によって置き換えられ得るか、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物によって置き換えられ得る。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、核酸は、ヌクレオシド間の任意の有用なリンカーを含み得る。本開示の組成物中で有用なそのようなリンカー（骨格修飾を含む）には、以下が含まれるが、これらに限定されない：３´−アルキレンホスホネート、３´−アミノホスホロアミデート、アルケン含有骨格、アミノアルキルホスホロアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル、ボラノホスフェート、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、キラルホスホネート、キラルホスホロチオエート、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレン（メチルイミノ）、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、モルホリノ結合、−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−、ヘテロ原子ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオシド、ホスフィナート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ＰＮＡ、シロキサン骨格、スルファメート骨格、スルフィドスルホキシド及びスルホン骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及びチオノホスホルアミデート。
【０１８８】
核酸（例えば、本明細書に記載されるＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に組み込まれ得る修飾ヌクレオシド及びヌクレオチド（例えば、構築ブロック分子）は、リボ核酸の糖上で修飾され得る。例えば、２′ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる置換基で修飾され得るか、または置き換えられ得る。２′位置における例示的な置換としては、Ｈ、ハロ、任意に置換されたＣ１〜６アルキル；任意に置換されたＣ１〜６アルコキシ；任意に置換されたＣ６〜１０アリールオキシ；任意に置換されたＣ３〜８シクロアルキル；任意に置換されたＣ３〜８シクロアルコキシ；任意に置換されたＣ６〜１０アリールオキシ；任意に置換されたＣ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ；任意に置換されたＣ１〜１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載のいずれか）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（ここでＲは、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり、ｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、及び４〜２０）の整数である）；２´−ヒドロキシルが、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって同じリボース糖の４´−炭素に接続されている「ロック」核酸（ＬＮＡ）（ここで、例示的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋が挙げられる）；アミノアルキル；アミノアルコキシ；アミノ；及びアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である、糖基リボースを含む。例示的な非限定的修飾ヌクレオチドは、リボース中の酸素の置換（例えば、Ｓ、Ｓｅ、またはメチレンもしくはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置き換える）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボースの環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びホスホロアミデート骨格も有するモルホリノなどについて、追加の炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）；多環式形態（例えば、トリシクロ、及びグリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロック」形態（例えば、リボースがホスホジエステル結合に付着したグリコール単位によって置き換えられる、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ）、トレオース核酸（リボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３´→２´）で置き換えられる、ＴＮＡ）、ならびにペプチド核酸（２−アミノ−エチル−グリシン結合がリボース及びホスホジエステル骨格を置き換える、ＰＮＡ）を含む。糖基はまた、リボース中の対応する炭素のものとは反対の立体化学構成を有する１つ以上の炭素を含有し得る。故に、ポリヌクレオチド分子は、例えば、アラビノースを糖として含有するヌクレオチドを含み得る。そのような糖修飾は、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１３０５２５２３号及び同第ＷＯ２０１４０９３９２４号に記載され、各々の内容は、この目的のためにそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９０】
本開示の核酸（例えば、１つ以上のペプチドエピトープをコードする核酸、またはその機能的断片もしくはバリアント）は、糖、核酸塩基、及び／またはヌクレオシド間結合に対する修飾の組み合わせを含み得る。これらの組み合わせは、本明細書に記載される任意の１つ以上の修飾を含み得る。
【０１９１】
本明細書に開示される核酸がんワクチンは、薬学的組成物を含む組成物である。本開示はまた、本明細書に提供される核酸がんワクチンの選択、設計、調製、製造、製剤、及び／または使用のための方法も包含する。本明細書に記載される核酸がんワクチンの選択、設計、及び／または利用のためのシステム（例えば、コンピュータ化システム）、プロセス、デバイス、及びキットもまた提供される。
【０１９２】
ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のインビトロ転写
本開示のがんワクチンは、少なくとも１つの核酸（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ（メッセージＲＮＡ）またはｍｍＲＮＡ（修飾ｍＲＮＡ））を含み得る。ｍＲＮＡは、例えば、「インビトロ転写テンプレート」と称されるテンプレートＤＮＡからインビトロで転写される。いくつかの実施形態では、インビトロ転写テンプレートは、５′非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含有し、３′ＵＴＲ及びポリＡ尾部をコードする。特定の核酸配列組成物及びインビトロ転写テンプレートの長さは、テンプレートによってコードされるｍＲＮＡに依存する。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、核酸は、１５〜３，０００ヌクレオチドを含む。例えば、ポリヌクレオチドは、１５〜５０、１５〜１００、１５〜２００、１５〜３００、１５〜４００、１５〜５００、１５〜６００、１５〜７００、１５〜８００、１５〜９００、１５〜１０００、１５〜１２００、１５〜１４００、１５〜１５００、１５〜１８００、１５〜２０００、１５〜２５００、１５〜３０００、５０〜１００、５０〜２００、５０〜３００、５０〜４００、５０〜５００、５０〜６００、５０〜７００、５０〜８００、５０〜９００、５０〜１０００、５０〜１２００、５０〜１４００、５０〜１５００、５０〜１８００、５０〜２０００、５０〜２５００、５０〜３０００、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、１００〜６００、１００〜７００、１００〜８００、１００〜９００、１００〜１０００、１００〜１２００、１００〜１４００、１００〜１５００、１００〜１８００、１００〜２０００、１００〜２５００、１００〜３０００、２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００、２００〜６００、２００〜７００、２００，〜８００、２００〜９００、２００〜１０００、２００〜１５００、２００〜３０００、５００〜１０００、５００〜１５００、５００〜２０００、５００〜２５００、５００〜３０００、１０００〜１５００、１０００〜２０００、１０００〜２５００、１０００〜３０００、１５００〜３０００、２５００〜３０００、または２０００〜３０００ヌクレオチド）を含み得る。
【０１９４】
他の態様では、本開示は、ＩＶＴ方法による、核酸がんワクチン（例えば、ｍＲＮＡがんワクチン）を調製するための方法に関する。インビトロ転写（ＩＶＴ）法は、ほぼ任意の配列のＲＮＡ分子のテンプレート指向性合成を可能にする。ＩＶＴ方法を使用して合成することができるＲＮＡ分子のサイズは、短いオリゴヌクレオチドから数千塩基の長い核酸ポリマーまでの範囲である。ＩＶＴ方法は、大量のＲＮＡ転写産物（例えば、マイクログラム〜ミリグラム量）の合成を可能にする。Ｂｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．７０３：２９−４１（２０１１）、Ｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１１，２０５−２２０．、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｇｅｏｆｆｅｒｙ  Ｍ．Ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．４ｔｈ  ｅｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．：ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，２００７．２６２−２９９（各々は、この目的のために参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。一般に、ＩＶＴは、目的の配列の上流のプロモーター配列を特徴とするＤＮＡテンプレートを利用する。プロモーター配列は、最も一般的には、バクテリオファージ起源（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列）であるが、デノボで設計されたものを含む多くの他のプロモーター配列が許容され得る。ＤＮＡテンプレートの転写は、典型的には、特異的バクテリオファージプロモーター配列に対応するＲＮＡポリメラーゼを使用することによって最適に達成される。例示的なＲＮＡポリメラーゼには、とりわけ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。ＩＶＴは、一般にｄｓＤＮＡで開始されるが、一本鎖上で進行することができる。
【０１９５】
本開示の核酸がんワクチン（例えば、ｍＲＮＡがんワクチン）、例えば、がん抗原をコードするｍＲＮＡは、任意の適切な合成方法を使用して作製され得ることが理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡワクチンは、テンプレート及びプロモーターとして機能する相補性オリゴヌクレオチドとして、一本底鎖ＤＮＡ由来のＩＶＴを使用して作製される。一本底鎖ＤＮＡは、ＲＮＡのインビトロ転写のためのＤＮＡテンプレートとして機能し得、例えば、プラスミド、ＰＣＲ生成物、または化学合成から得られ得る。いくつかの実施形態では、一本底鎖ＤＮＡは、環状テンプレートから線形化される。一本底鎖ＤＮＡテンプレートは、一般に、ＩＶＴを促進するためのプロモーター配列、例えば、バクテリオファージプロモーター配列を含む。一本底鎖ＤＮＡ及び上鎖プロモーター相補性オリゴヌクレオチドを使用してＲＮＡを作製する方法は、当該技術分野において知られている。例示的な方法には、ＤＮＡ底鎖テンプレートを上部鎖プロモーター相補性オリゴヌクレオチド（例えば、Ｔ７プロモーター相補性オリゴヌクレオチド、Ｔ３プロモーター相補性オリゴヌクレオチド、またはＳＰ６プロモーター相補性オリゴヌクレオチド）でアニーリングすること、続いて、プロモーター配列に対応するＲＮＡポリメラーゼ、例えば、ａＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを使用するＩＶＴが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９６】
ＩＶＴ方法は、二本鎖ＤＮＡテンプレートを使用して行うこともできる。例えば、いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡテンプレートは、相補性オリゴヌクレオチドを伸長して、当該技術分野において利用可能な鎖伸長技法を使用して相補性ＤＮＡ鎖を生成することによって作製される。いくつかの実施形態では、プロモーター配列及び１つ以上の目的のペプチドエピトープをコードする配列を含有する一本底鎖ＤＮＡテンプレートは、上部鎖プロモーター相補性オリゴヌクレオチドにアニールされ、ＰＣＲ様プロセスに供されて、上部鎖を伸長して二本鎖ＤＮＡテンプレートを生成する。代替的にまたは付加的に、底鎖プロモーター配列に相補的であり、目的の１つ以上のペプチドエピトープをコードする配列に相補的な配列を含有する上部鎖ＤＮＡを、底鎖プロモーターオリゴヌクレオチドにアニールし、ＰＣＲ様プロセスに供して底鎖を伸長させて二本鎖ＤＮＡテンプレートを生成する。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ様サイクルの数は、１〜２０サイクル、例えば、３〜１０サイクルの範囲である。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡテンプレートは、化学合成方法によって全体的または部分的に合成される。二本鎖ＤＮＡテンプレートは、本明細書に記載されるインビトロ転写に供され得る。
【０１９７】
別の態様では、例えば、ペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡを含む本開示の核酸がんワクチンは、それらの配列の重複部分にわたって相補的な２つのＤＮＡ鎖を使用して作製され得、相補的部分がアニールされると、一本鎖オーバーハング（すなわち、粘着末端）を残す。これらの一本鎖オーバーハングは、他の鎖をテンプレートとして使用して伸長することによって二本鎖にすることができ、それによって二本鎖ＤＮＡを生成する。場合によっては、このプライマー伸長方法は、例えば、上部鎖ＤＮＡ合成方法によって得られるテンプレートＤＮＡ配列に組み込まれるサイズと比較して、より大きなＯＲＦをテンプレートＤＮＡ配列に組み込むことを可能にすることができる。プライマー伸長方法では、第１の鎖の３′末端の部分（５′−３′方向）は、第２の鎖の部分３′末端（３′−５′方向）に相補的である。いくつかのそのような実施形態では、第１の一本鎖ＤＮＡは、プロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）の配列、任意選択で５´−ＵＴＲ、及びＯＲＦの一部または全て（例えば、ＯＲＦの５´末端の部分）を含み得る。いくつかの実施形態では、第２の一本鎖ＤＮＡは、ＯＲＦ（例えば、ＯＲＦの３′末端に相補的な部分）の一部または全ての相補配列、ならびに任意選択で３′−ＵＴＲ、停止配列、及び／またはポリＡ尾部を含み得る。２つの合成ＤＮＡ鎖を使用してＲＮＡを作製する方法は、２つの鎖を重複した相補部分でアニーリングし、続いて、１つ以上のＰＣＲ様サイクルを使用したプライマー伸長により鎖を伸長して、二本鎖ＤＮＡテンプレートを生成することを含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ様サイクルの数は、１〜２０サイクル、例えば、３〜１０サイクルの範囲である。そのような二本鎖ＤＮＡは、本明細書に記載されるインビトロ転写に供され得る。
【０１９８】
別の態様では、例えば、ペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡを含む本開示の核酸ワクチンは、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）などの合成二本鎖線状ＤＮＡ分子を、二本鎖ＤＮＡテンプレートとして使用して作製され得る。そのような合成二本鎖線状ＤＮＡ分子の利点は、それらがｍＲＮＡを生成するためのより長いテンプレートを提供することである。例えば、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）のサイズは、４５〜１０００（例えば、１２５〜７５０ヌクレオチド）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、合成二本鎖線状ＤＮＡテンプレートは、完全長５′−ＵＴＲ、完全長３′−ＵＴＲ、またはその両方を含む。完全長５´−ＵＴＲは、最大１００ヌクレオチド長、例えば、約４０〜６０ヌクレオチドであり得る。完全長３´−ＵＴＲは、最大３００ヌクレオチド長、例えば、約１００〜１５０ヌクレオチドであり得る。
【０１９９】
より長い構築物の生成を容易にするために、３´鎖上の重複配列で設計された２つ以上の二本鎖線状ＤＮＡ分子及び／または遺伝子断片を、当該技術分野において知られている方法を使用して一緒に組み立ててもよい。例えば、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（商標）方法（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）は、二本鎖ＤＮＡ断片の５′末端から塩基を切断する好中球性エキソヌクレアーゼの使用、続いて、新たに形成された相補的な一本鎖３′末端のアニール、任意の一本鎖ギャップを埋めるためのポリメラーゼ依存性伸長、及び最後にＤＮＡリガーゼによるＤＮＡセグメントの共有結合を用いて行われ得る。
【０２００】
別の態様では、例えば、ペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡを含む本開示の核酸がんワクチンは、ＲＮＡの化学合成を使用して作製され得る。方法は、例えば、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む第１のポリヌクレオチドと、５´−ＵＴＲを含む第２のポリヌクレオチドとを固体支持体にコンジュゲートされた相補性ポリヌクレオチドにアニーリングすることを含む。次いで、第２のポリヌクレオチドの３′末端を、好適な条件下で第１のポリヌクレオチドの５′末端にライゲーションする。好適な条件としては、ＤＮＡリガーゼの使用が挙げられる。ライゲーション反応は、第１のライゲーション生成物を産生する。次いで、３´−ＵＴＲを含む第３のポリヌクレオチドの５′末端を、好適な条件下で第１のライゲーション生成物の３′末端にライゲーションする。第２のライゲーション反応に好適な条件としては、ＲＮＡリガーゼが挙げられる。第２のライゲーション生成物は、第２のライゲーション反応において産生される。第２のライゲーション生成物を固体支持体から放出して、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを産生する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３０〜１０００ヌクレオチドである。
【０２０１】
１つ以上のペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡは、核酸をコードするオープンリーディングフレームを含む第１の核酸を、固体支持体にコンジュゲートされた相補性核酸に対する３´−ＵＴＲを含む第２の核酸に結合することによって調製することもできる。第２の核酸の５′末端は、好適な条件下で（例えば、ＤＮＡリガーゼを含む）第１の核酸の３′末端にライゲーションされる。方法は、第１のライゲーション生成物を産生する。５´−ＵＴＲを含む第３の核酸を、好適な条件下（例えば、ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４  ＲＮＡを含む）で第１のライゲーション生成物にライゲーションして、第２のライゲーション生成物を産生する。第２のライゲーション生成物は、固体支持体から放出され、１つ以上のペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡを産生する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、第１の核酸は、５´−三リン酸及び３´−ＯＨを特徴とする。他の実施形態では、第２の核酸は、３´−ＯＨを含む。さらに他の実施形態では、第３の核酸は、５´−三リン酸及び３´−ＯＨを含む。第２の核酸はまた、５´−キャップ構造を含んでもよい。この方法はまた、第３の核酸の３′末端にポリＡ領域を含む第４の核酸をライゲーションするさらなるステップも含み得る。第４の核酸は、５´−三リン酸を含んでもよい。
【０２０３】
この方法は、逆相精製を含んでも、含んでいなくてもよい。この方法はまた、固体支持体を洗浄して未反応の核酸を除去する洗浄ステップを含み得る。固体支持体は、例えば、捕捉樹脂であり得る。いくつかの実施形態では、本方法は、ｄＴ精製を含む。
【０２０４】
本開示によれば、本開示の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）がんワクチンをコードするテンプレートＤＮＡは、１つ以上のペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。いくつかの実施形態では、テンプレートＤＮＡは、最大１０００ヌクレオチド、例えば、約１０〜３５０、３０〜３００ヌクレオチドまたは約５０〜２５０ヌクレオチドのＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、テンプレートＤＮＡは、約１５０ヌクレオチドのＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、テンプレートＤＮＡは、約２００ヌクレオチドのＯＲＦを含む。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ転写産物は、反応が生じた後にＩＶＴ反応混合物の成分から精製される。例えば、粗ＩＶＴ混合物を、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅで処理して元のテンプレートを消化することができる。核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、当該技術分野において知られている方法を使用して精製することができ、これには、限定されないが、有機溶媒またはカラムベースの精製方法を使用した沈殿が含まれる。ＲＮＡ、例えば、ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を精製するために、市販のキットが利用可能である。核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、当該技術分野において知られている方法を使用して定量化することができ、これには、限定されないが、市販の器具、例えば、ＮａｎｏＤｒｏｐが含まれる。精製核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、アガロースゲル電気泳動によって分析して、核酸が適切なサイズであることを確認する、及び／または核酸の分解が発生していないことを確認することができる。
【０２０６】
未翻訳領域（ＵＴＲ）
未翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳されていない開始コドン（５´ＵＴＲ）前及び停止コドン（３´ＵＴＲ）後の核酸の切片である。いくつかの実施形態では、１つ以上のペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む本開示の核酸（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、１つ以上のＵＴＲ（例えば、５´ＵＴＲもしくはその機能的断片、３´ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの組み合わせ）をさらに含む。
【０２０７】
ＵＴＲは、核酸中のコード領域に対して相同または異種であり得る。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、１つ以上のペプチドエピトープをコードするＯＲＦに対して相同である。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、１つ以上のペプチドエピトープをコードするＯＲＦに対して異種である。いくつかの実施形態では、核酸は、２つ以上の５´ＵＴＲまたはその機能的断片を含み、各々が同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、２つ以上の３´ＵＴＲまたはその機能的断片を含み、各々が同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、５′ＵＴＲもしくはその機能的断片、３´ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせは、配列最適化される。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、５′ＵＴＲもしくはその機能的断片、３´ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも１つの化学修飾された核酸塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含む。
【０２１０】
ＵＴＲは、調節的役割、例えば、増加もしくは減少した安定性、局在化、及び／または翻訳効率を提供する特徴を有し得る。ＵＴＲを含む核酸は、細胞、組織、または生物に投与することができ、１つ以上の調節的特徴は、ルーチン方法を使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、５´ＵＴＲまたは３´ＵＴＲの機能的断片は、それぞれ完全長５´または３´ＵＴＲの１つ以上の調節的特徴を含む。
【０２１１】
天然の５′ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす機能を持つ。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般的に知られている、コザック配列のようなシグネチャーを内包する。５′ＵＴＲはまた、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することが知られている。
【０２１２】
特異的標的臓器の豊富に発現された遺伝子において典型的に見られる特徴を操作することによって、核酸の安定性及びタンパク質産生を増強することができる。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、αフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子などの肝臓発現ｍＲＮＡの５´ＵＴＲの導入は、肝細胞株または肝臓における核酸の発現を増強することができる。同様に、その組織における発現を改善するための他の組織特異的ｍＲＮＡからの５´ＵＴＲの使用は、筋肉（例えば、ＭｙｏＤ、Ｍｙｏｓｉｎ、Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、Ｈｅｒｃｕｌｉｎ）、内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ−１、ＣＤ３６）、骨髄細胞（例えば、Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ−１、ｉ−ＮＯＳ）、白血球（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（例えば、ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）、及び肺上皮細胞（例えば、ＳＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）に対して可能である。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、タンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する、転写産物のファミリーから選択される。例えば、コードされるポリペプチドは、特定の細胞、組織中で、または発達中のある時点で発現されるタンパク質のファミリー（すなわち、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する）に属し得る。遺伝子またはｍＲＮＡのうちのいずれかからのＵＴＲを、同じまたは異なるタンパク質のファミリーの任意の他のＵＴＲと交換して、新たな核酸を作成する。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、５´ＵＴＲ及び３´ＵＴＲは異種であり得る。いくつかの実施形態では、５´ＵＴＲは、３´ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。いくつかの実施形態では、３´ＵＴＲは、５´ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。
【０２１５】
国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１５２２号（公開第ＷＯ／２０１４／１６４２５３号）は、本開示の核酸においてＯＲＦに隣接する領域として利用することができる例示的なＵＴＲの一覧を提供する。本公開は、この目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１６】
本開示の核酸において利用され得る追加の例示的なＵＴＲとしては、α−またはβ−グロビンなどのグロビン（例えば、アフリカツメガエル、マウス、ウサギ、もしくはヒトグロビン）；強力なコザック翻訳開始シグナル；ＣＹＢＡ（例えば、ヒトチトクロムｂ−２４５αポリペプチド）；アルブミン（例えば、ヒトアルブミン７）；ＨＳＤ１７Ｂ４（ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ）；ウイルス（例えば、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デング熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ、例えば、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１））、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルス、またはＰＡＶオオムギ黄化萎縮ウイルス）；熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０）；翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４Ｇ）；グルコース輸送体（例えば、ｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコース輸送体１））；アクチン（例えば、ヒトαまたはβアクチン）；ＧＡＰＤＨ；チューブリン；ヒストン；クエン酸サイクル酵素；トポイソメラーゼ（例えば、５´ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）を欠くＴＯＰ遺伝子の５´ＵＴＲ）；リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）；リボソームタンパク質（例えば、ヒトまたはマウスリボソームタンパク質、例えば、ｒｐｓ９など）；ＡＴＰシンターゼ（例えば、ＡＴＰ５Ａ１またはミトコンドリアＨ＋−ＡＴＰシンターゼのβサブユニット）；成長ホルモン（例えば、ウシ（ｂＧＨ）またはヒト（ｈＧＨ））；伸長因子（例えば、伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１））；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）；筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）；β−Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；コラーゲン（例えば、コラーゲンＩ型α２（Ｃｏｌ１Ａ２）、コラーゲンＩ型α１（Ｃｏｌ１Ａ１）、コラーゲンＶＩ型α２（Ｃｏｌ６Ａ２）、コラーゲンＶＩ型α１（Ｃｏｌ６Ａ１））；リボフォリン（例えば、リボフォリンＩ（ＲＰＮＩ））；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（例えば、ＬＲＰ１）；カルジオトロフィン様サイトカイン因子（例えば、Ｎｎｔ１）；カルレティキュリン（Ｃａｌｒ）；プロコラーゲン−リジン、２−オキソグルタレート５−ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）；及びヌクレオビンジン（例えば、Ｎｕｃｂ１）の核酸配列に由来する１つ以上の５´ＵＴＲ及び／または３´ＵＴＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、５′ＵＴＲは、β−グロビン５′ＵＴＲ；強力なコザック翻訳開始シグナルを含有する５′ＵＴＲ；チトクロムｂ−２４５αポリペプチド（ＣＹＢＡ）５′ＵＴＲ；ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ１７Ｂ４）５′ＵＴＲ；タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）５′ＵＴＲ；ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＴＥＥＶ）５′ＵＴＲ；非構造的タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５′近位オープンリーディングフレーム；デング熱ウイルス（ＤＥＮ）５′ＵＴＲ；熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）５′ＵＴＲ；ｅＩＦ４Ｇ  ５′ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１  ５′ＵＴＲ；その機能的断片及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、３′ＵＴＲは、β−グロビン３′ＵＴＲ；ＣＹＢＡ  ３′ＵＴＲ；アルブミン３′ＵＴＲ；成長ホルモン（ＧＨ）３′ＵＴＲ；ＶＥＥＶ  ３′ＵＴＲ；肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）３′ＵＴＲ；α−グロビン３′ＵＴＲ；ＤＥＮ  ３′ＵＴＲ；ＰＡＶオオムギ黄化萎縮ウイルス（ＢＹＤＶ−ＰＡＶ）３′ＵＴＲ；伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１）３′ＵＴＲ；マンガンスーパーオキシドジムスターゼ（ＭｎＳＯＤ）３′ＵＴＲ；ミトコンドリアＨ（＋）−ＡＴＰシンターゼのβサブユニット（β−ｍＲＮＡ）３′ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１  ３′ＵＴＲ；ＭＥＦ２Ａ  ３′ＵＴＲ；β−Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ  ３′ＵＴＲ；その機能的断片及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０２１９】
任意の遺伝子またはｍＲＮＡに由来する野生型ＵＴＲは、本開示の核酸に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、例えば、ＯＲＦに対してＵＴＲの配向もしくは位置を変えることによって、または追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転位によって、野生型または天然のＵＴＲに対して変更されて、バリアントＵＴＲを産生することができる。いくつかの実施形態では、５′または３′ＵＴＲのバリアント、例えば、野生型ＵＴＲの変異体またはバリアントを利用することができ、１つ以上のヌクレオチドがＵＴＲの末端に付加されるか、またはそこから除去される。
【０２２０】
付加的に、１つ以上の合成ＵＴＲは、１つ以上の非合成ＵＴＲと組み合わせて使用され得る。例えば、Ｍａｎｄａｌ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，  Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  ８（３）：５６８−８２、及びｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／Ｄｅｒｒｉｃｋ＿Ｒｏｓｓｉ／において入手可能な配列を参照されたい。各々の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＵＴＲまたはそれらの部分は、それらが選択された転写産物と同じ配向で置かれ得るか、または配向もしくは位置が変更され得る。したがって、５′及び／または３′ＵＴＲは、反転、短縮、延長され得るか、または１つ以上の他の５´ＵＴＲもしくは３´ＵＴＲと組み合わされる。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、核酸は、複数のＵＴＲ、例えば、二重、三重、または四重５´ＵＴＲまたは３´ＵＴＲを含み得る。例えば、二重ＵＴＲは、同じＵＴＲの２つのコピーを連続して、または実質的に連続して含む。例えば、二重β−グロビン３′ＵＴＲが使用され得る（例えば、ＵＳ２０１０／０１２９８７７を参照されたい。この内容は、この目的のために参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２２２】
本開示の核酸は、特徴の組み合わせを含み得る。例えば、ＯＲＦは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５´ＵＴＲ及び／またはポリＡ尾部のテンプレート化付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含む３´ＵＴＲによって隣接され得る。５′ＵＴＲは、第１の核酸断片及び同じ及び／または異なるＵＴＲからの第２の核酸断片を含み得る（例えば、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０２９３６２５を参照されたい）。
【０２２３】
他の非ＵＴＲ配列は、本開示の核酸内の領域または小領域として使用され得る。例えば、イントロンまたはイントロン配列の部分は、本開示の核酸に組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生ならびに核酸の発現レベルを増加させることができる。いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、ＵＴＲの代わりにまたはＵＴＲに加えて、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を含む（例えば、Ｙａｋｕｂｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０  ３９４（１）：１８９−１９３を参照されたい。この内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、核酸は、５´ＵＴＲ配列の代わりにＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＯＲＦ及びウイルスカプシド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、非合成３´ＵＴＲと組み合わせて合成５´ＵＴＲを含む。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、ＵＴＲはまた、少なくとも１つの翻訳エンハンサー核酸、翻訳エンハンサーエレメント、または翻訳エンハンサーエレメント（複数）を含む（集合的に「ＴＥＥ」、これはポリヌクレオチドから産生されたポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる核酸配列を指す。非限定的な例として、ＴＥＥは、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００９／０２２６４７０に記載されるもの、及び当該技術分野において知られている他のものを含み得る。非限定的な例として、ＴＥＥは、転写プロモーターと開始コドンとの間に位置し得る。いくつかの実施形態では、５´ＵＴＲは、ＴＥＥを含む。一態様では、ＴＥＥは、限定されないが、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳などの核酸の翻訳活性を促進し得る、ＵＴＲにおける保存エレメントである。１つの非限定的な例では、ＴＥＥは、Ｇｔｘホメオドメインタンパク質の５´リーダーにおけるＴＥＥ配列を含む。この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００４  １０１：９５９０−９５９４を参照されたい。
【０２２５】
「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド」または「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列」という用語は、本明細書に提供される、及び／または当該技術分野において知られているＴＥＥのうちの１つ以上を含む核酸（例えば、ＵＳ６３１０１９７、ＵＳ６８４９４０５、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００９／０２２６４７０、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＵＳ２００９／００９３０４９、ＵＳ２０１３／０１７７５８１、ＷＯ２００９／０７５８８６、ＷＯ２００７／０２５００８、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００１／０５５３７１、ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＥＰ２６１０３４１Ａ１、及びＥＰ２６１０３４０Ａ１を参照されたい。これらの各々の内容は、この目的のためにそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる）、またはそれらのバリアント、相同体、もしくは機能的誘導体を指す。いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、ＴＥＥの１つまたは複数のコピーを含む。翻訳エンハンサー核酸中のＴＥＥは、１つ以上の配列セグメントにおいて組織化され得る。配列セグメントは、本明細書に提供されるＴＥＥのうちの１つ以上を内包することができ、各ＴＥＥは、１つ以上のコピーに存在している。複数の配列セグメントが翻訳エンハンサー核酸中に存在するとき、それらは相同または異種であり得る。故に、翻訳エンハンサー核酸中の複数の配列セグメントは、同一種類もしくは異なる種類の本明細書に提供されるＴＥＥ、ＴＥＥの各々の同一数もしくは異なる数のコピー、及び／または各配列セグメント内のＴＥＥの同一もしくは異なる組織を内包し得る。一実施形態では、本開示の核酸は、翻訳エンハンサー核酸配列を含む。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される少なくとも１つのＴＥＥを含む５′ＵＴＲ及び／または３′ＵＴＲは、限定されないが、ベクター系または核酸ベクターなどの単シストロン性配列に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５′ＵＴＲ及び／または３′ＵＴＲは、本明細書に記載されるＴＥＥまたはその部分を含む。いくつかの実施形態では、３′ＵＴＲにおけるＴＥＥは、５′ＵＴＲに位置するＴＥＥと同じ及び／または異なり得る。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸の５′ＵＴＲ及び／または３′ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、または６０超のＴＥＥ配列を含み得る。一実施形態では、本開示の核酸の５´ＵＴＲは、１〜６０、１〜５５、１〜５０、１〜４５、１〜４０、１〜３５、１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のＴＥＥ配列を含み得る。本開示の核酸の５′ＵＴＲにおけるＴＥＥ配列は、同じまたは異なるＴＥＥ配列であり得る。本開示の核酸の５′ＵＴＲにおける異なるＴＥＥ配列の組み合わせは、異なるＴＥＥ配列のうちのいずれかの２つ以上のコピーが組み込まれる組み合わせを含み得る。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、５′ＵＴＲ及び／または３′ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーを含む。非限定的な例として、スペーサーは、１５ヌクレオチドスペーサー及び／または当該技術分野において知られている他のスペーサー（例えば、３ヌクレオチドの倍数で）であり得る。別の非限定的な例として、５′ＵＴＲ及び／または３′ＵＴＲは、それぞれ５′ＵＴＲ及び／または３′ＵＴＲにおいて、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、または１０回を超えて繰り返されるＴＥＥ配列スペーサーモジュールを含む。いくつかの実施形態では、５′ＵＴＲ及び／または３′ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回繰り返されるＴＥＥ配列スペーサーモジュールを含む。
【０２２９】
３′ＵＴＲ及びＡＵリッチエレメント
ある特定の実施形態では、本開示の核酸（例えば、本開示のペプチドエピトープをコードする核酸）は、３´ＵＴＲをさらに含む。
【０２３０】
３´−ＵＴＲは、翻訳終止コドンのすぐ後に続き、多くの場合、転写後に遺伝子発現に影響を及ぼす調節領域を含有するｍＲＮＡの切片である。３´−ＵＴＲ内の調節領域は、ｍＲＮＡのポリアデニル化、翻訳効率、局在化、及び安定性に影響を及ぼし得る。一実施形態では、本開示に有用な３´−ＵＴＲは、調節タンパク質またはマイクロＲＮＡの結合部位を含む。いくつかの実施形態では、３′−ＵＴＲは、抑制タンパク質に結合し、ｍＲＮＡの発現を阻害するサイレンサー領域を有する。他の実施形態では、３´−ＵＴＲは、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）を含む。タンパク質は、ＡＲＥに結合して、局在化された様式で転写産物の安定性または減衰速度に影響を及ぼすか、または翻訳開始に影響を及ぼす。他の実施形態では、３´−ＵＴＲは、ポリＡ尾部と呼ばれる数百個のアデニン残基のｍＲＮＡ転写産物の末端への付加を指示する配列ＡＡＵＡＡＡを含む。
【０２３１】
天然または野生型３′ＵＴＲは、それらにアデノシン及びウリジンの伸長が埋め込まれていることが知られている。これらのＡＵリッチシグネチャーは、ターンオーバー率が高い遺伝子において特に一般的である。それらの配列特徴及び機能特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）を３つのクラスに分離することができる（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）：クラスＩ  ＡＲＥは、Ｕリッチ地域内のＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散コピーを含む。Ｃ−Ｍｙｃ及びＭｙｏＤは、クラスＩ  ＡＲＥを含む。クラスＩＩ  ＡＲＥは、２つ以上の重複ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を有する。この種類のＡＲＥを含有する分子としては、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−ａが挙げられる。クラスＩＩＩ  ＡＲＥＳは、ＡＵＵＵＡモチーフを含まない。ｃ−Ｊｕｎ及びＭｙｏｇｅｎｉｎは、このクラスのよく研究された２つの例である。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質は、メッセンジャーを不安定にすることが知られている一方で、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、最も顕著なＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増加させることが記録されている。ＨｕＲは、３つのクラスの全てのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３′ＵＴＲに操作することは、ＨｕＲ結合をもたらし、故に、インビボでのメッセージの安定化をもたらす。
【０２３２】
３′ＵＴＲ  ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、または修飾を使用して、本開示の核酸の安定性を調節することができる。特異的核酸を操作するとき、ＡＲＥの１つ以上のコピーを導入して、本開示の核酸の安定性を低下させ、それによって翻訳を抑制し、結果として生じるタンパク質の産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥを同定し、除去または変異させて、細胞内安定性を増加させ、故に、結果として生じるタンパク質の翻訳及び産生を増加させることができる。トランスフェクション実験は、本開示の核酸を使用して、関連細胞株において実施することができ、タンパク質産生は、トランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、細胞は、異なるＡＲＥ操作分子を用いて、及びＥＬＩＳＡキットを関連タンパク質に使用し、トランスフェクション後６時間、１２時間、２４時間、４８時間、及び７日で産生されるタンパク質をアッセイすることによってトランスフェクトされ得る。
【０２３３】
５´キャップを有する領域
本明細書に記載される核酸がんワクチンは、ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡがんワクチンであり得る。これらのｍＲＮＡの各々は、５′キャップを有し得る。
【０２３４】
天然ｍＲＮＡの５′キャップ構造は、核外移行に関与し、ｍＲＮＡ安定性を増加させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、これは成熟環状ｍＲＮＡ種を形成するためにポリＡ結合タンパク質とのＣＢＰの会合を通して細胞中のｍＲＮＡ安定性及び翻訳能力に関与する。キャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシング中の５´近位イントロンの除去を支援する。
【０２３５】
内因性ｍＲＮＡ分子は、末端グアノシンキャップ残基と、ｍＲＮＡ分子の５´末端転写センスヌクレオチド（キャップ）との間に５´−ｐｐｐ−５´−三リン酸結合を生成する、キャップされた５´末端であり得る。次いで、この５′−グアニレートキャップをメチル化して、Ｎ７−メチル−グアニレート残基（キャップ−０）を生成することができる。ｍＲＮＡの５´末端の末端及び／または末端前転写ヌクレオチドのリボース糖はまた、任意選択で（例えば、第１のリボース糖上の２´−ヒドロキシ基（キャップ−１）で、または第１の２つのリボース糖上の２´−ヒドロキシ基（キャップ−２）で）２´−Ｏ−メチル化され得る。加水分解による５′デキャッピング及びグアニレートキャップ構造の切断は、分解のためにｍＲＮＡ分子などの核酸分子を標的とし得る。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸（例えば、ペプチドエピトープをコードする核酸）は、キャップ部分を組み込む。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸（例えば、ペプチドエピトープをコードする核酸）は、デキャッピングを防止し、したがってｍＲＮＡ半減期を増加させる、非加水分解可能なキャップ構造を含む。キャップ構造の加水分解は、５´−ｐｐｐ−５´ホスホロジエステル結合の切断を必要とするため、修飾ヌクレオチドは、キャッピング反応中に使用され得る。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）からのワクシニアキャッピング酵素を、α−チオ−グアノシンヌクレオチドと共に製造元の指示に従って使用して、５´−ｐｐｐ−５´キャップにおけるホスホロチオエート結合を作成することができる。α−メチル−ホスホネート及びセレノ−ホスフェートヌクレオチドなどの追加の修飾グアノシンヌクレオチドが使用され得る。
【０２３８】
追加の修飾には、糖環の２´−ヒドロキシル基上の（上述のような）ポリヌクレオチドの５´末端及び／または５´−末端前ヌクレオチドのリボース糖の２´−Ｏ−メチル化が含まれるが、これに限定されない。複数の別個の５´−キャップ構造を使用して、ｍＲＮＡ分子として機能するポリヌクレオチドなどの核酸分子の５´−キャップを生成し得る。本明細書では合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構造的もしくは機能的キャップ類似体とも称されるキャップ類似体は、キャップ機能を保持しながら、それらの化学構造において天然の（すなわち、内因性、野生型、または物理的）５´−キャップとは異なる。キャップ類似体は、化学的に（すなわち、非酵素的に）または酵素的に合成され得る、及び／または本開示のポリヌクレオチドに連結され得る。
【０２３９】
例えば、抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップは、５´−５´−三リン酸基によって連結された２つのグアニンを含有し、１つのグアニンは、Ｎ７メチル基ならびに３´−Ｏ−メチル基を含有する（すなわち、Ｎ７，３´−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５´−三リン酸−５´−グアノシン（ｍ７Ｇ−３´ｍｐｐｐ−Ｇ）、これは同等に、指定された３´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇであり得る）。他の未修飾のグアニンの３′−Ｏ原子は、キャップされたポリヌクレオチドの５´末端ヌクレオチドに連結される。Ｎ７−及び３´−Ｏ−メチル化グアニンは、キャップされたポリヌクレオチドの末端部分を提供する。
【０２４０】
別の例示的なキャップは、ｍＣＡＰであり、これはＡＲＣＡに類似しているが、グアノシン上の２´−Ｏ−メチル基（すなわち、Ｎ７，２´−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５´−三リン酸−５´−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）を有する。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体である。非限定的な例として、ジヌクレオチドキャップ類似体は、異なるリン酸位置で、米国特許第ＵＳ８，５１９，１１０号（この内容は、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるジヌクレオチドキャップ類似体などのボラノリン酸基またはホスホロセレノエート基により修飾され得る。
【０２４２】
別の実施形態では、キャップは、キャップ類似体であり、当該技術分野において知られている及び／または本明細書に記載されるキャップ類似体のＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態である。キャップ類似体のＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態の非限定的な例としては、Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）−Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ及びＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）−ｍ３´−ＯＧ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇキャップ類似体が挙げられる（例えば、Ｋｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１３  ２１：４５７０−４５７４に記載される様々なキャップ類似体及びキャップ類似体を合成する方法を参照されたい。この内容は、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、本開示のキャップ類似体は、４−クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体である。
【０２４３】
キャップ類似体は、インビトロ転写反応におけるポリヌクレオチドまたはその領域の付随キャッピングを可能にするが、転写産物の最大２０％はキャップされないままであり得る。これは、内在性の細胞転写機構によって産生される核酸の内在性５´−キャップ構造からのキャップ類似体の構造的差異と同様に、低減した翻訳能力及び低減した細胞安定性につながり得る。
【０２４４】
本開示の核酸（例えば、ペプチド抗原をコードする核酸）はまた、より真正な５´−キャップ構造を生成するために、酵素を使用して、（ＩＶＴまたは化学合成によって）製造後にキャップされ得る。本明細書で使用されるとき、「より真正な」という語句は、内在性または野生型特徴を、構造的にまたは機能的にしっかりと繁栄または模倣する特徴を指す。すなわち、「より真正な」特徴は、合成特徴もしくは類似体等と比較して、内在性の野生型、天然、もしくは生理学的細胞機能及び／または構造をより良く表すか、あるいは１つ以上の点において対応する内在性の野生型、天然、または生理学的特徴よりも優れている。より真正な５´キャップ構造の非限定的な例は、中でも、当該技術分野において知られている合成５´キャップ構造（または野生型、天然、もしくは生理学的５´キャップ構造）と比較して、増強されたキャップ結合タンパク質の結合、増加した半減期、５´エンドヌクレアーゼに対する低減した感受性及び／または低減した５´デキャッピングを有するものである。例えば、組み換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組み換え２′−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチド及びグアニンキャップヌクレオチドの５´末端ヌクレオチド間の正準５´−５´−三リン酸結合を作成することができ、ここで、キャップグアニンは、Ｎ７メチル化を含み、ｍＲＮＡの５´末端ヌクレオチドは、２´−Ｏ−メチルを含む。そのような構造は、キャップ−１構造と呼ばれる。このキャップは、例えば、当該技術分野において知られている他の５´キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳能力及び細胞安定性、ならびに低減した細胞炎症促進性サイトカインの活性化をもたらす。キャップ構造としては、７ｍＧ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｎ、ｐＮ２ｐ（キャップ−０）、７ｍＧ（５´）ｐｐｐ（５´）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ−１）、及び７ｍＧ（５´）−ｐｐｐ（５´）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ−２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４５】
非限定的な例として、製造後にキメラ核酸をキャッピングすることは、キメラ核酸のほぼ１００％がキャップされ得るため、より効率的であり得る。これは、インビトロ転写反応の過程でキャップ類似体がキメラ核酸に連結される場合の約８０％とは対照的である。
【０２４６】
本開示に従い、５′末端キャップは、内在性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本発明に従い、５′末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体としては、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２′フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、及び２−アジド−グアノシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４７】
ポリＡ尾部
いくつかの実施形態では、本開示の核酸（例えば、ペプチドエピトープをコードする核酸）は、ポリＡ尾部をさらに含む。さらなる実施形態では、ポリＡ尾部上の末端基は、安定化のために組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリＡ尾部は、ｄｅｓ−３´ヒドロキシル尾部を含む。
【０２４８】
ＲＮＡ処理中、アデニンヌクレオチド（ポリＡ尾部）の長鎖は、安定性を増加させるためにｍＲＮＡ分子などの核酸に付加され得る。転写の直後に、転写産物の３´端を切断して３´ヒドロキシルを遊離することができる。次いで、ポリＡポリメラーゼは、アデニンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、例えば、およそ８０〜およそ２５０残基長の間（およそ８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０残基長を含む）であり得るポリＡ尾部を付加する。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、約１００ヌクレオチドを含む。
【０２４９】
ポリＡ尾部はまた、構築物が核外から移行された後に付加され得る。
【０２５０】
本開示に従い、ポリＡ尾部上の末端基は、安定化のために組み込まれ得る。本開示のポリヌクレオチドは、ｄｅｓ−３´ヒドロキシル尾部を含み得る。それらはまた、Ｊｕｎｊｉｅ  Ｌｉら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，１５０１−１５０７，Ａｕｇｕｓｔ  ２３，２００５、この内容はこの目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって教示される構造部分または２´−Ｏメチル修飾を含み得る。
【０２５１】
本開示の核酸は、ヒストンｍＲＮＡを含む代替ポリＡ尾部構造を有する転写産物をコードするように設計され得る。Ｎｏｒｂｕｒｙによれば、「末端ウリジン化もまた、ヒト複製依存的ヒストンｍＲＮＡ上で検出された。これらのｍＲＮＡのターンオーバーは、染色体ＤＮＡ複製の完了または阻害に続いて毒性ヒストン蓄積を潜在的に防止するために重要であると考えられる。これらのｍＲＮＡは、それらの３´ポリＡ尾部の欠失によって区別され、この機能は代わりに、安定なステムループ構造及びその同種のステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）によって想定され、後者はポリアデニル化ｍＲＮＡに対するＰＡＢＰの機能と同じ機能を実行する」（Ｎｏｒｂｕｒｙ，″Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＲＮＡ：ａ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｉｌ  ｗａｇｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｇ，″Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；ＡＯＰ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２９  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１３；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５、この内容は、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２５２】
固有のポリＡ尾部の長さは、本開示の核酸にある特定の利点を提供する。一般に、ポリＡ尾部の長さは、存在する場合、３０ヌクレオチド長を超える。別の実施形態では、ポリＡ尾部は、３５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、または３，０００ヌクレオチドまたはそれを超える）。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、核酸またはその領域は、約１５〜約３，０００ヌクレオチドを含む（例えば、１５〜５０、１５〜１００、１５〜２００、１５〜３００、１５〜４００、１５〜５００、１５〜６００、１５〜７００、１５〜８００、１５〜９００、１５〜１０００、１５〜１２００、１５〜１４００、１５〜１５００、１５〜１８００、１５〜２０００、１５〜２５００、１５〜３０００、５０〜１００、５０〜２００、５０〜３００、５０〜４００、５０〜５００、５０〜６００、５０〜７００、５０〜８００、５０〜９００、５０〜１０００、５０〜１２００、５０〜１４００、５０〜１５００、５０〜１８００、５０〜２０００、５０〜２５００、５０〜３０００、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、１００〜６００、１００〜７００、１００〜８００、１００〜９００、１００〜１０００、１００〜１２００、１００〜１４００、１００〜１５００、１００〜１８００、１００〜２０００、１００〜２５００、１００〜３０００、２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００、２００〜６００、２００〜７００、２００、８００、２００〜９００、２００〜１０００、２００〜１５００、２００〜３０００、５００〜１０００、５００〜１５００、５００〜２０００、５００〜２５００、５００〜３０００、１０００〜１５００、１０００〜２０００、１０００〜２５００、１０００〜３０００、１５００〜３０００、２５００〜３０００、または２０００〜３０００ヌクレオチド）。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、核酸全体の長さまたは核酸の特定の領域の長さに対して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さに基づき得るか、または核酸から発現された最終生成物の長さに基づき得る。
【０２５５】
この文脈において、ポリＡ尾部は、核酸またはその特徴よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％超の長さであり得る。ポリＡ尾部はまた、それが属する核酸の画分として設計され得る。この文脈において、ポリＡ尾部は、構築物の全長の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０％、またはそれ以上、構築物領域または構築物の全長からポリＡ尾部を差し引いたものであり得る。さらに、ポリＡ結合タンパク質の操作された結合部位及び核酸部位のコンジュゲーションは、発現を増強し得る。
【０２５６】
追加として、複数の別個の核酸は、ポリＡ尾部の３´末端における修飾ヌクレオチドを使用して、３´端を通るＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）を介して一緒に連結され得る。トランスフェクション実験は、関連細胞株において実行することができ、タンパク質産生は、トランスフェクション後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、及び／または７日でＥＬＩＳＡによってアッセイされ得る。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、ポリＡ−Ｇカルテット領域を含むように設計される。Ｇ−カルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方においてＧリッチ配列によって形成され得る４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この実施形態では、Ｇカルテットは、ポリＡ尾部の端部に組み込まれる。結果として得られる核酸は、安定性、タンパク質産生、及び半減期を含む他のパラメータについて様々な時点でアッセイされる。ポリＡ−Ｇカルテットが、１２０ヌクレオチドのポリＡ尾部を単独で使用して見られる少なくとも７５％に等しいｍＲＮＡからのタンパク質産生をもたらすことが発見された。
【０２５８】
開始コドン領域
本発明はまた、開始コドン領域及び本明細書に記載される核酸の両方を含む核酸（例えば、ペプチドエピトープをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、開始コドン領域に類似するか、または同様に機能する領域を有し得る。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、核酸の翻訳は、開始コドンＡＵＧではないコドン上で開始し得る。核酸の翻訳は、限定されないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧなどの代替開始コドン上で開始し得る（Ｔｏｕｒｉｏｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ９５（２００３）１６９−１７８及びＭａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１を参照されたい。これらの各々の内容は、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２６０】
非限定的な例として、核酸の翻訳は、代替開始コドンＡＣＧ上で始まる。別の非限定的な例として、核酸翻訳は、代替開始コドンＣＴＧまたはＣＵＧ上で始まる。別の非限定的な例として、核酸の翻訳は、代替開始コドンＧＴＧまたはＧＵＧ上で始まる。
【０２６１】
限定されないが、開始コドンまたは代替開始コドンなどの翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドは、核酸の翻訳効率、長さ、及び／または構造に影響を及ぼすことが知られている。（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１を参照されたい。この内容は、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのうちのいずれかをマスキングすることを使用して、ポリヌクレオチドの翻訳開始の位置、翻訳効率、長さ、及び／または構造を変更することができる。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、コドンをマスクするかまたは隠して、マスクされた開始コドンまたは代替開始コドンにおける翻訳開始の可能性を低減するために、開始コドンまたは代替開始コドンの近くでマスキング剤を使用することができる。マスキング剤の非限定的な例としては、アンチセンスロック核酸（ＬＮＡ）核酸及びエクソン接合部複合体（ＥＪＣ）が挙げられる（例えば、マスキング剤ＬＮＡポリヌクレオチド及びＥＪＣについて記載しているＭａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏ（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１）を参照されたい。この内容は、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２６３】
別の実施形態では、マスキング剤を使用して、翻訳が代替開始コドン上で開始する可能性を高めるために、核酸の開始コドンをマスクすることができる。いくつかの実施形態では、マスキング剤を使用して、マスクされた開始コドンまたは代替開始コドンの下流にある開始コドンまたは代替開始コドン上で開始する可能性を高めるために、第１の開始コドンまたは代替開始コドンをマスクすることができる。
【０２６４】
別の実施形態では、核酸の翻訳を開始コドンではないコドン上で始めさせるために、核酸の開始コドンを核酸配列から除去することができる。核酸の翻訳は、除去した開始コドンに続くコドン上、または下流開始コドンもしくは代替開始コドン上で始まり得る。非限定的な例では、開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧは、翻訳を下流開始コドンまたは代替開始コドン上で開始させるために、核酸配列の最初の３ヌクレオチドとして除去される。開始コドンが除去された核酸配列は、翻訳の開始、核酸の長さ、及び／または核酸の構造を制御するか、または制御を試みるために、下流開始コドン及び／または代替開始コドンに対して少なくとも１つのマスキング剤をさらに含み得る。
【０２６５】
停止コドン領域
本開示はまた、停止コドン領域及び本明細書に記載される核酸（例えば、ペプチドエピトープをコードする核酸）の両方を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、３´非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの停止コドンを含み得る。停止コドンは、ＤＮＡの場合はＴＧＡ、ＴＡＡ、及びＴＡＧから、またはＲＮＡの場合はＵＧＡ、ＵＡＡ、及びＵＡＧから選択され得る。いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、ＤＮＡの場合は停止コドンＴＧＡ、またはＲＮＡの場合は停止コドンＵＧＡ、及び１つの追加の停止コドンを含む。さらなる実施形態では、追加の停止コドンは、ＴＡＡまたはＵＡＡであり得る。別の実施形態では、本開示の核酸は、３つの連続する停止コドン、４つの停止コドン、またはそれ以上を含む。
【０２６６】
挿入及び置換
本開示はまた、挿入及び／または置換をさらに含む本開示の核酸を含む。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、核酸の５´ＵＴＲは、同じ塩基のヌクレオシドの少なくとも１つの領域及び／またはストリングの挿入によって置き換えられ得る。ヌクレオチドの領域及び／またはストリングは、限定されないが、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８ヌクレオチドを含み得、ヌクレオチドは、天然及び／または非天然であり得る。非限定的な例として、ヌクレオチドの基は、５〜８アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示される他のヌクレオチドのうちのいずれかのストリング、及び／またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、核酸の５´ＵＴＲは、限定されないが、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示される他のヌクレオチドのうちのいずれか、及び／またはそれらの組み合わせなどの２つの異なる塩基のヌクレオチドの少なくとも２つの領域及び／またはストリングの挿入によって置換され得る。例えば、５´ＵＴＲは、５〜８アデニン塩基の挿入に続いて、５〜８シトシン塩基の挿入によって置き換えられ得る。別の実施例では、５´ＵＴＲは、５〜８シトシン塩基の挿入に続いて、５〜８アデニン塩基の挿入によって置き換えられ得る。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得る転写開始部位の下流に少なくとも１つの置換及び／または挿入を含み得る。非限定的な例として、少なくとも１つの置換及び／または挿入は、転写開始部位のすぐ下流の領域における少なくとも１つの核酸を置換することによって（限定されないが、＋１〜＋６など）、転写開始部位の下流で起こり得る。転写開始部位のすぐ下流のヌクレオチドの領域への変更は、開始速度に影響を及ぼし、見かけのヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）反応一定値を増加させ、初期転写を直す転写複合体からの短い転写産物の解離を増加させることができる（Ｂｒｉｅｂａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：５１４４−５１４９、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。少なくとも１つのヌクレオシドの修飾、置換、及び／または挿入は、配列のサイレント変異を引き起こし得るか、またはアミノ酸配列における変異を引き起こし得る。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、核酸は、転写開始部位の下流に少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３グアニン塩基の置換を含み得る。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、核酸は、転写開始部位のすぐ下流の領域に少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６グアニン塩基の置換を含み得る。非限定的な例として、領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４アデニンヌクレオチドによって置換され得る。別の非限定的な例では、領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４シトシン塩基によって置換され得る。別の非限定的な例では、領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、もしくは少なくとも４チミン、及び／または本明細書に記載されるヌクレオチドのうちのいずれかによって置換され得る。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、核酸は、開始コドンの上流に少なくとも１つの置換及び／または挿入を含み得る。明確にするために、当業者は、開始コドンが、タンパク質コード領域の第１のコドンであるのに対し、転写開始部位が、転写が始まる部位であることを理解するであろう。核酸には、限定されないが、ヌクレオチド塩基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つの置換及び／または挿入を含み得る。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの位置において挿入または置換され得る。挿入及び／または置換されたヌクレオチドは、同じ塩基（例えば、全てＡ、もしくは全てＣ、もしくは全てＴ、もしくは全てＧ）、２つの異なる塩基（例えば、Ａ及びＣ、Ａ及びＴ、もしくはＣ及びＴ）、３つの異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ及びＴ，もしくはＡ、Ｃ及びＴ）、または少なくとも４つの異なる塩基であり得る。
【０２７３】
非限定的な例として、核酸内のコード領域の上流のグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載されるヌクレオチドのうちのいずれかで置換され得る。別の非限定的な例では、核酸内のグアニン塩基の置換は、転写開始部位の下流及び開始コドン前の１つのグアニン塩基を残すように設計され得る（Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７２（７３４４）：４９９−５０３を参照されたい。この内容は、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。非限定的な例として、少なくとも５つのヌクレオチドが、転写開始部位の下流であるが、開始コドンの上流の１つの位置に挿入され得、少なくとも５つのヌクレオチドは、同じ塩基型であり得る。
【０２７４】
本開示によれば、キメラ核酸の２つの領域または部分は、例えば、三リン酸化学を使用して、接合またはライゲーションされ得る。いくつかの実施形態では、１００ヌクレオチド以下の第１の領域または部分は、５´一リン酸及び末端３´ｄｅｓＯＨまたは遮断ＯＨと化学的に合成される。領域が８０ヌクレオチドよりも長い場合、それは、その後、ライゲーションによって化学的に連結される２つ以上の鎖として合成され得る。第１の領域または部分が、ＩＶＴを使用して非位置的に修飾された領域または部分として合成される場合、３´末端の後次キャッピングを伴う５´一リン酸への変換が続き得る。一リン酸保護基は、当該技術分野において知られているもののうちのいずれかから選択され得る。キメラ核酸の第２の領域または部分は、例えば、本明細書に記載される化学合成またはＩＶＴ方法のいずれかを使用して合成され得る。ＩＶＴ方法は、修飾されたキャップを有するプライマーを利用することができるＲＮＡポリメラーゼの使用を含み得る。代替的に、キャップは、化学的に合成され、ＩＶＴ領域または部分に結合されてもよい。
【０２７５】
ライゲーション方法については、ＤＮＡ  Ｔ４リガーゼとのライゲーション、続いてＤＮＡｓｅ処理（ＤＮＡ  Ｔ４リガーゼ活性に必要なＤＮＡスプリントを排除するため）は、連結生成物の望ましくない形成を容易に防止するはずであることに留意されたい。
【０２７６】
キメラポリヌクレオチド全体が、リン酸−糖骨格で製造される必要はない。領域または部分のうちの１つがポリペプチドをコードする場合、そのような領域または部分が、リン酸−糖骨格を含むことが好ましい。
【０２７７】
ライゲーションは、酵素ライゲーション、クリックケミストリー、Ｏｒｔｈｏｃｌｉｃｋケミストリー、ＳｏｌｕＬＩＮＫ、または当業者に知られている他のバイオコンジュゲートケミストリーなどの任意の適切な技法を使用して行われ得る。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、相補的オリゴヌクレオチドスプリントによって指向される。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、相補的オリゴヌクレオチドスプリントなしで行われる。
【０２７８】
コンピュータ化システム
上述の実施形態は、多数の方法のうちのいずれかで実装され得る。例えば、実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせを使用して実装され得る。ソフトウェアで実装される場合、ソフトウェアコードは、単一のコンピュータで提供されるか、または複数のコンピュータ間で分散されるかにかかわらず、任意の適切なプロセッサまたはプロセッサの集合上で実行され得る。上述の機能を実行する任意の構成要素または構成要素の集合が、上述の機能を制御する１つ以上のコントローラとして一般に考慮され得ることを理解されたい。１つ以上のコントローラは、専用ハードウェア、または上述の機能を実行するためにマイクロコードもしくはソフトウェアを使用してプログラムされる汎用ハードウェア（例えば、１つ以上のプロセッサ）など、多数の方法で実装され得る。
【０２７９】
この点で、１つの実装態様は、コンピュータプログラム（すなわち、複数の命令）でコードされ、１つ以上のプロセッサ上で実行されると、上述の機能を実行する、コンピュータメモリ（例えば、ハードドライブ、フラッシュメモリ、プロセッサワーキングメモリ等）、フロッピーディスク、光ディスク、磁気テープ、または他の有形の非一時的なコンピュータ可読媒体などの、少なくとも１つのコンピュータ可読記憶媒体（すなわち、少なくとも１つの有形の非一時的なコンピュータ可読媒体）を含むことを理解されたい。コンピュータ可読記憶媒体は、その上に記憶されたプログラムが本明細書で考察される技法を実装するために任意のコンピュータリソース上にロードされ得るように、搬送可能であり得る。加えて、実行されると、上述の機能を実行するコンピュータプログラムへの参照は、ホストコンピュータ上で実行されるアプリケーションプログラムに限定されないことを理解されたい。むしろ、「コンピュータプログラム」という用語は、本明細書で一般的な意味で使用され、上記の技法を実装するために１つ以上のプロセッサをプログラムするために使用され得る任意のタイプのコンピュータコード（例えば、ソフトウェアまたはマイクロコード）を参照する。
【０２８０】
非限定的な例として、一態様では、本開示は、最大長を有する核酸がんワクチンに含める核酸を選択するためのコンピュータ化システムを提供し、このシステムは、複数のペプチドエピトープをコードする核酸の複数の配列を受信するように構成された通信インターフェースであって、ペプチドエピトープの各々が個別化がん抗原の部分である、通信インターフェースと、複数のペプチドエピトープの各々について、ペプチド内の複数の核酸の各々についてスコアを計算し（各々が１つ以上のペプチドエピトープのうちの少なくとも１つを含み、核酸配列の少なくとも２つが異なる長さを有する）、計算されたスコアに基づいて、複数のペプチド内の複数の核酸配列をランク付けし、そのランキング及びワクチンの最大長に基づいて、ワクチンに含めるための核酸配列を選択するようにプログラムされた少なくとも１つのコンピュータプロセッサと、を含む。スコアは、当該技術分野において知られている任意の手段によって計算され得る。一連の非限定的な例として、スコアは、少なくとも部分的に、遺伝子発現、ＲＮＡ配列、転写物存在量、ＤＮＡアレル頻度、アミノ酸保存、生理化学的類似性、癌遺伝子、特異的ＨＬＡアレルへの予測される結合親和性、クローン性、結合効率、及びインデル中の存在からなる群から選択される１つ以上の因子に基づいて計算され得る。いくつかの実施形態では、変異アレル頻度（ＶＡＦ）が使用され得る。一実施形態では、ＶＡＦカットオフは、腫瘍試料を隣接する正常組織で汚染すると、両方とも腫瘍純度が低下し、低下した（見かけの）ＶＡＦをもたらすため、付加サブクローナル変異が回避されるレベルになるように選択される。したがって、腫瘍純度が低い事例では（例えば、平均ＶＡＦが２０％未満の場合）、ＶＡＦカットオフが低下する（例えば、１０％〜５％）。いくつかの実施形態では、ＶＡＦカットオフは、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％未満、またはそれ以下である。ある特定の実施形態では、１つ以上の因子は、統計モデルに入力される。いくつかの実施形態では、統計モデルは、回帰モデル（例えば、線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、一般化線形モデル等）であってもよい。いくつかの実施形態では、統計モデルは、一般化線形モデル（例えば、ロジスティック回帰モデル、プロビット回帰モデル等）であり得る。いくつかの実施形態では、統計モデルは、例えば、ランダムフォレスト回帰モデル、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、ガウス混合モデル、階層ベイズモデル、及び／または任意の他の公的な統計モデルであってもよい。
【０２８１】
治療方法
本明細書では、ヒト（例えば、対象または患者）及び他の哺乳動物におけるがんの予防及び／または治療のための組成物（例えば、薬学的組成物）、方法、キット、及び試薬が提供される。核酸がんワクチンは、がんを予防及び／または治療するために、医学における治療剤または予防剤として使用され得る。例示的な態様では、本開示のがんワクチンは、がんからの予防的保護を提供するために使用される。がんからの予防的保護は、本開示のがんワクチンの投与後に達成され得る。ワクチンは、１回、２回、３回、４回、またはそれ以上投与することができるが、ワクチンを１回投与するだけで十分であり得る（任意選択で、単一のブースターが続く）。また、がんを有する個体にワクチンを投与して治療応答を達成することが望ましい場合もある。投与量は、それに応じて調整する必要があり得る。
【０２８２】
がんワクチン（例えば、核酸がんワクチン）が合成されると、それが患者に投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、最大２ヶ月、最大３ヶ月、最大４ヶ月、最大５ヶ月、最大６ヶ月、最大７ヶ月、最大８ヶ月、最大９ヶ月、最大１０ヶ月、最大１１ヶ月、最大１年、最大１年半、最大２年、最大３年、または最大４年間スケジュールで投与される。スケジュールは同じであっても、様々であってもよい。いくつかの実施形態では、スケジュールは、最初の３週間は週１回であり、その後は月１回である。スケジュールは、個々の患者または対象の基準（例えば、体重、年齢、がんの種類等）に応じて、当業者（例えば、医師）によって決定または変化され得る。
【０２８３】
ワクチンは、任意の経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、ワクチンは、皮内、筋肉内、血管内、腫瘍内、及び／または皮下経路によって投与される。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、核酸がんワクチンはまた、抗がん治療剤と共に投与され得る。核酸がんワクチン及び他の治療剤は、同時にまたは連続して投与され得る。他の治療剤が同時に投与される場合、それらは、同じまたは別個の製剤で投与することができるが、同時に投与される。他の治療剤は、他の治療剤及び核酸がんワクチンの投与が一時的に分離されるときに、互いに及び核酸がんワクチンと共に順次投与される。これらの化合物の投与間の時間の分離は、数分間であってもよく、またはそれは、より長く、例えば、数時間、数日間、数週間、数ヶ月間であってもよい。他の治療剤には、抗がん治療薬、アジュバント、サイトカイン、抗体、抗原等が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８５】
治療の任意の時点で、患者は、ワクチンにおける変異が依然として適切であるかどうかを決定するために検査され得る。その分析に基づいて、ワクチンは、１つ以上の異なる変異を含むか、または１つ以上の変異を除去するように調整または再構成され得る。
【０２８６】
例示的な実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡポリヌクレオチドを含有するがんワクチンは、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与され得、ＲＮＡポリヌクレオチドは、インビボで翻訳されて、抗原ポリペプチドを産生する。
【０２８７】
がんワクチンは、細胞、組織、または生物におけるポリペプチド（例えば、抗原または免疫原）の翻訳のために誘導され得る。例示的な実施形態では、そのような翻訳はインビボで生じるが、そのような翻訳がエクスビボ、培養物中、またはインビトロで生じる実施形態が想定され得る。例示的な実施形態では、細胞、組織、または生物は、抗原ポリペプチドをコードする翻訳可能領域を少なくとも１つ有するポリヌクレオチドを含有するがんワクチンを含有する、有効量の組成物と接触する。
【０２８８】
「有効量」のがんＲＮＡワクチンは、標的組織、標的細胞型、投与手段、ポリヌクレオチドの物理的特徴（例えば、サイズ、及び修飾ヌクレオシドの程度）ならびにがんワクチンの他の成分、ならびに他の決定基に少なくとも部分的に基づいて提供され得る。一般に、有効量のがんワクチン組成物は、細胞内の抗原産生の関数として誘導または増強された免疫応答を提供し、好ましくは、同じ抗原またはペプチド抗原をコードする対応する未修飾ポリヌクレオチドを含有する組成物よりも効率的である。抗原産生の増加は、細胞トランスフェクションの増加（がんワクチンでトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ）、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の増加、核酸分解の減少（例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の持続時間の増加によって実証されるように）、または宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化によって実証され得る。
【０２８９】
がんワクチンは、健康な個体に能動的免疫スキームの一部として予防的または治療的に投与されてもよく、がんの早期または症状の発症後の進行がんの間に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞、組織、または対象に提供される本開示のＲＮＡワクチンの量は、免疫予防に有効な量であり得る。
【０２９０】
がんワクチンは、他の予防的または治療的化合物と共に投与され得る。非限定的な例として、予防的または治療的化合物は、免疫増強剤またはブースターであり得る。本明細書で使用されるとき、ワクチンなどの組成物を指す場合、「ブースター」という用語は、予防的（ワクチン）組成物の追加投与を指す。ブースター（またはブースターワクチン）は、予防的組成物の早期投与後に与えられ得る。予防的組成物の初回投与とブースターとの間の投与時間は、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、１８ヶ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５０年、５５年、６０年、６５年、７０年、７５年、８０年、８５年、９０年、９５年、または９９年以上であり得るが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、予防的組成物の初回投与とブースターとの間の投与時間は、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、または１年であり得るが、これらに限定されない。
【０２９１】
がんワクチンは、がんの重症度または満たされていない医療ニーズの程度もしくはレベルに応じて、様々な設定で利用され得る。非限定的な例として、がんワクチンは、がんの任意の段階を治療するために利用され得る。
【０２９２】
がんワクチンが治療し得るがんの非限定的なリストを以下に提示する。ペプチドエピトープまたは抗原は、これらのがんまたは腫瘍の任意の抗原に由来し得る。そのようなエピトープは、がんまたは腫瘍抗原と称され得る。がん細胞は、腫瘍進行の異なる段階で細胞表面分子を差次的に発現し得る。例えば、癌細胞は、良性状態で細胞表面抗原を発現し得るが、転移時にその特定の細胞表面抗原を下方調節し得る。したがって、腫瘍またはがん抗原は、がん進行の任意の段階で産生される抗原を包含し得ることが想定される。本開示の方法は、これらの変更に対応するように調整され得る。例えば、いくつかの異なるがんワクチンが、特定の患者に対して生成され得る。例えば、第１のワクチンは、治療の開始時に使用され得る。後の時点で、発現される異なる抗原を説明するために、新しいがんワクチンが生成され、患者に投与され得る。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、以下の抗原のうちの１つである：ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ１３７、４−ＩＢＢ、５Ｔ４、ＡＧＳ−５、ＡＧＳ−１６、アンジオポエチン２、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、ＢＴ−０６２、ＢＴＬＡ、ＣＡＩＸ、がん胎児抗原、ＣＴＬＡ４、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ−Ｂ、ＥｒｂＢｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＬ７、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＢ２、ＦＡＰ、フィブロネクチン、葉酸受容体、ガングリオシドＧＭ３、ＧＤ２、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、ｇｐｌ００、ｇｐＡ３３、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＯＳ、ＩＧＦ１Ｒ、インテグリンａｖ、インテグリンανβ、ＬＡＧ−３、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、メソテリン、ｃ−ＭＥＴ、ＭＮ炭酸脱水酵素ＩＸ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｎｅｃｔｉｎ−４、ＮＫＧＤ２、ＮＯＴＣＨ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＳＬＣ４４Ａ４、Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２、Ｔｅｎａｓｃｉｎ、ＴＩＭ３、ＴＲＡＩＬＲｌ、ＴＲＡＩＬＲ２，ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、及びそれらのバリアント。
【０２９４】
がんまたは腫瘍には、がん性と見なされるように、制御されていない細胞成長を特徴とする新生物、悪性腫瘍、転移、または任意の疾患もしくは障害が含まれるが、これらに限定されない。がんは、原発性または転移性のがんであり得る。本開示に従って治療され得る特定のがんには、以下に列挙されるものが含まれるが、これらに限定されない（そのような障害の概説については、Ｆｉｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照されたい）。本明細書に記載される方法及び組成物と共に使用するためのがんとしては、胆道癌；膀胱癌；膠芽腫及び髄芽腫を含む脳癌；乳癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；急性リンパ球性及び骨髄性白血病を含む血液腫瘍；多発性骨髄腫；ＡＩＤＳ関連白血病及び成人Ｔ細胞白血病リンパ腫；ボーエン病及びページェット病を含む上皮内腫瘍；肝臓癌；肺癌；ホジキン病及びリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽腫；扁平上皮細胞癌を含む口腔癌；上皮細胞、間質細胞、生殖細胞、及び間葉細胞に由来するものを含む卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、及び骨肉腫を含む肉腫；黒色腫、カポジ肉腫、基底細胞癌、及び扁平上皮細胞癌を含む皮膚癌；生殖腫瘍、例えばセミノーマ、非セミノーマ、奇形腫瘍を含む睾丸癌；腫瘍変異高負荷腫瘍；絨毛腫；間質腫瘍及び生殖細胞腫瘍；甲状腺癌及び髄質癌を含む甲状腺癌；ならびに腺癌及びウィルムス腫瘍を含む腎癌が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、膀胱癌、ＨＰＶ陰性ＨＮＳＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、ＭＳＩ−高腫瘍、またはＴＭＢ（腫瘍変異負荷）の高いがんのうちのいずれか１つである。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、がんは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、黒色腫、膀胱尿路上皮癌、ＨＰＶ陰性頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及びマイクロサテライト高（ＭＳＩ  Ｈ）／ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損である固形悪性腫瘍からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、ＥＧＦＲ感作変異及び／またはＡＬＫ転座を欠く。いくつかの実施形態では、マイクロサテライト高（ＭＳＩ  Ｈ）／ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損である固形悪性腫瘍は、結腸直腸癌、胃腺癌、食道腺癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される。
【０２９６】
本明細書では、がんワクチン、ならびにＲＮＡワクチン組成物、及び／または任意選択で１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた複合体を含む薬学的組成物が提供される。がんワクチンは、単独で、または本明細書に記載される１つ以上の他の成分と併せて製剤化または投与され得る。
【０２９７】
他の実施形態では、本明細書に記載されるがんワクチンは、患者の治療に有用な任意の他の療法と組み合わせてもよい。例えば、患者は、がんワクチン及び抗がん剤で治療され得る。故に、一実施形態では、本開示の方法は、１つ以上のがん治療薬と併せて、例えば、抗がん剤、従来のがんワクチン、化学療法、放射線療法等と併せて（例えば、同時に、または全体的な治療手順の一部として）使用され得る。変化し得るがん治療のパラメータには、限定されないが、投薬量、投与のタイミングまたは持続時間または療法が含まれ、がん治療は、投薬量、タイミング、または持続時間において変化し得る。がんの別の治療は、単独で、または以前の治療方法のうちのいずれかと組み合わせて利用することができる、手術である。有用であることが知られている、またはがんの予防もしくは治療のために使用された、または現在使用されている任意の薬剤または療法（例えば、従来のがんワクチン、化学療法、放射線療法、手術、ホルモン療法、及び／または生物学的療法／免疫療法）は、本明細書に記載される開示に従って本開示の組成物と組み合わせて使用することができる。当業者であれば、対象に対する適切な治療を決定することができる。
【０２９８】
そのような薬剤（すなわち、抗がん剤）の例としては、限定されないが、アルキル化剤（例えば、窒素マスタード、例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド、イソファミド、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタード；チオテパなどのアジリジン；ブスルファンなどのメタンスルホン酸エステル；カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシンなどのニトロソ尿素；シスプラチン、カルボプラチンなどの白金錯体；ミトマイシン、及びプロカルバジン、ダカルバジン、及びアルトレタミンなどの生物還元性アルキル化剤）；ＤＮＡ鎖切断剤、例えば、ブレオマイシン；インターカレートトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、インターカレーター、例えば、アムサクリン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、及び非インターカレーター、例えば、エトポシド及びテニポシド；非インターカレートトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、エトポシド及びテニポシド；ならびにＤＮＡ小溝バインダー、例えば、プリカマイジンを含む、ＤＮＡ相互作用剤；限定されないが、メトトレキサート及びトリメトレキセートなどの葉酸アンタゴニスト；フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ＣＢ３７１７、アザシチジン、及びフロキシウリジンなどのピリミジンアンタゴニスト；メルカプトプリン、６−チオグアニン、ペントスタチンなどのプリンアンタゴニスト；シタラビン及びフルダラビンなどの糖修飾類似体；ならびにヒドロキシ尿素などのリボヌクレオチド還元酵素阻害剤を含む抗代謝物；限定されないが、コルヒチン、ビンクリスチン及びビンブラスチン、アルカロイドならびにパクリタキセル及びシトキサンの両方を含むチューブリン相互作用剤；限定されないが、エストロゲン、共役エストロゲン、ならびにエチニルエストラジオール及びジエチルスチルベステロール、クロルトリアニセン及びイデネンストロール；ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、メドロキシプロゲステロン、及びメゲストロールなどのプロゲスチン；ならびにテストステロン、テストステロンプロピオネートなどのアンドロゲン；フルオキシメステロン、メチルテストステロン；副腎コルチコステロイド、例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、及びプレドニゾロン；白血球放出ホルモン剤またはゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニスト、例えば、酢酸ロイプロリド及び酢酸ゴセレリンを含むホルモン剤；限定されないが、タモキシフェンなどの抗エストロゲン剤、フルタミドなどの抗アンドロゲン、ならびにミトタン及びアミノグルテチミドなどの抗副腎剤を含む抗ホルモン抗原；限定されないが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、及びウテログロビン（米国特許第５，６９６，０９２号）を含むサイトカイン；限定されないが、ＶＥＧＦ（例えば、他の中和抗体）��阻害する薬剤、可溶性受容体構築物、チロシンキナーゼ阻害剤、アンチセンス戦略、ＲＮＡアプタマー及びＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対するリボザイム、免疫毒素及び凝固体、腫瘍ワクチン、ならびに抗体を含む血管新生抑制剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９９】
本開示の方法に従って使用することができる抗がん剤の具体例としては、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテイミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ジメシル酸ビスナフィド、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カリステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴル、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキサート、塩酸エフロミチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロミジン、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブゾール、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エタニゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロキシニド、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、フォスキドン、ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、塩酸イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン、インターロイキンＩＩ（組み換えインターロイキンＩＩ、またはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−ｎ１、インターフェロンα−ｎ３、インターフェロンβ−Ｉａ、インターフェロンγ−Ｉｂ、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リオロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、マイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドマイド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、ミトマイシン、ミトスパー、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガファー、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、ティラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキセート、グルクロン酸トリメトレキセート、トリプトレリン、塩酸チューブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、ビンクリスチン硫酸塩、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシナート、硫酸ビンレウロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、及び塩酸ゾルビシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３００】
本組成物及び方法と共に使用され得る他の抗がん薬としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３、５−エチニルウラシル、血管新生阻害剤、抗背方化形態形成タンパク質−１、ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ、ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３、ＣＡＲＮ  ７００、カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯ）、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、クラムベシジン８１６、クリプトフィシン８、キュラシンＡ、デヒドロジデムニンＢ、ジデムニンＢ、ジヒドロ−５−アザシチジン、ジヒドロタキソール、デュオカルマイシンＳＡ、カハラリドＦ、ラメラリン−Ｎ−トリアセテート、ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン、リソクリナミド７、モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ、Ｎ−アセチルジナジン、Ｎ−置換ベンズアミド、Ｏ６−ベンジルグアニン、プラセチンＡ、プラセチンＢ、白金複合体、白金化合物、白金−トリアミン複合体、レニウムＲｅ１８６エチドロン酸塩、ＲＩＩレチナミド、ルビギノンＢ１、ＳａｒＣＮＵ、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、セネセンス由来阻害剤１、スピカマイシンＤ、タリムスチン、５−フルオロウラシル、トロンボポエチン、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、バリオリンＢ、サチドマイド、ベラレゾール、ベラミン、ベルジン、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、ビタキシン、ザノテロン、ゼニプラチン、及びジラスコルブ。
【０３０１】
本開示はまた、がんワクチンを含む組成物を、Ｘ線、γ線、及び他の放射線源を使用してがん細胞を破壊することを含む放射線療法と組み合わせて投与することを包含する。ある特定の実施形態では、放射線治療は、外部ビーム放射線または遠隔療法として投与され、ここで放射線は、遠隔線源から指向される。他の実施形態では、放射線治療は、内部療法または近接照射療法として投与され、放射線源は、がん細胞または腫瘍塊に近い体内に置かれる。
【０３０２】
具体的な実施形態では、適切な抗がんレジメンは、がんの種類に応じて（例えば、医師によって）選択される。例えば、卵巣癌を有する患者は、予防的または治療的に有効な量の、がんワクチンを含む組成物を、予防的または治療的に有効な量の、卵巣癌療法に有用な１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与することができ、これには腹腔内放射線療法、例えばＰ３２療法、全腹部及び骨盤放射線療法、シスプラチン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）またはドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）とシスプラチンまたはカルボプラチンの組み合わせ、シクロホスファミドとシスプラチンの組み合わせ、シクロホスファミドとカルボプラチンの組み合わせ、５−ＦＵとロイコボリンの組み合わせ、エトポシド、リポソームドキソルビシン、ゲムシタビンまたはトポテカンが含まれるが、これらに限定されない。がん療法及びそれらの投薬量、投与経路、及び推奨される使用法は、当該技術分野において知られており、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ´ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（５６ｔｈ  ｅｄ．，２００２）などの文献に記載されている。
【０３０３】
本開示のいくつかの実施形態では、がんワクチンは、免疫チェックポイント調節物質などのＴ細胞活性化物質と共に投与される。免疫チェックポイント調節物質としては、刺激チェックポイント分子及び阻害チェックポイント分子（例えば、抗ＣＴＬＡ４及び／または抗ＰＤ１抗体）の両方が挙げられる。
【０３０４】
刺激的チェックポイント阻害剤は、チェックポイントプロセスを促進することによって機能する。いくつかの刺激チェックポイント分子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリー（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、またはＣＤ１３７）のメンバーであり、他の分子は、Ｂ７−ＣＤ２８スーパーファミリー（例えば、ＣＤ２８またはＩＣＯＳ０に属する。ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、エフェクター及びメモリＴ細胞の拡張に関与する。抗ＯＸ４０モノクローナル抗体は、進行癌の治療に有効であることが示されている。ＭＥＤＩ０５６２は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストである。ＧＩＴＲ、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子は、Ｔ細胞増殖に関与する。ＧＩＴＲに対するいくつかの抗体は、抗腫瘍応答を促進することが示されている。ＩＣＯＳ、誘導性Ｔ細胞共刺激物質は、Ｔ細胞エフェクター機能において重要である。ＣＤ２７は、ナイーブＴ細胞の抗原特異的増殖を支持し、Ｔ細胞及びＢ細胞メモリの生成に関与する。いくつかのアゴニスト抗ＣＤ２７抗体が開発中である。ＣＤ１２２は、インターロイキン−２受容体βサブユニットである。ＮＫＴＲ−２１４は、ＣＤ１２２偏向免疫刺激サイトカインである。
【０３０５】
阻害チェックポイント分子には、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、及びＬＡＧ３が含まれるが、これらに限定されない。ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、及びそのリガンドは、Ｔ細胞機能及び他の細胞機能の全ての段階にわたって重要な役割を果たす共シグナル伝達分子のＣＤ２８−Ｂ７ファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ−４、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＤ１５２）は、Ｔ細胞増殖の制御に関与する。
【０３０６】
ＰＤ−１受容体は、活性化Ｔ細胞（及びＢ細胞）の表面上で発現され、通常の状況下では、樹状細胞またはマクロファージなどの抗原提示細胞の表面上で発現されるそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２）に結合する。この相互作用は、シグナルをＴ細胞に送信し、それを阻害する。がん細胞は、表面上の高レベルのＰＤ−Ｌ１発現を駆動することによって、このシステムを利用する。これにより、ＰＤ−１経路の制御を得て、腫瘍微小環境に入り得るＰＤ−１を発現するＴ細胞をオフにすることができ、故に、抗がん免疫応答を抑制する。ペムブロリズマブ（旧ＭＫ−３４７５及びラムブロリズマブ、商品名Ｋｅｙｔｒｕｄａ）は、がん免疫療法で使用されるヒト抗体であり、ＰＤ−１受容体を標的とする。
【０３０７】
チェックポイント阻害剤は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、融合タンパク質、もしくはそれらの組み合わせなどの分子、または小分子である。例えば、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、Ｂ−７ファミリーリガンド、またはそれらの組み合わせであり得るチェックポイントタンパク質を阻害する。チェックポイントタンパク質のリガンドとしては、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、及びＢ−７ファミリーリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＢＭＳ−９３６５５８（ニボルマブ）である。他の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ（商品名Ｙｅｒｖｏｙ、以前はＭＤＸ−０１０及びＭＤＸ−１０１として知られていた）である。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、チェックポイント調節物質を含むがん治療剤は、がん治療剤をコードするｍＲＮＡの形態で送達される。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、がん治療剤は、標的療法である。標的療法は、ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２）またはダブラフェニブなどのＢＲＡＦ阻害剤であり得る。ＢＲＡＦ阻害剤は、ＰＬＸ  ４０３２、ＰＬＸ  ４７２０、ＰＬＸ  ４７３４、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ  ４０３２、ＰＬＸ−４７２０、ＰＬＸ  ４７３４、及びソラフェニブトシル酸塩であり得る。ＢＲＡＦは、Ｂ−Ｒａｆと呼ばれるタンパク質を作製するヒト遺伝子であり、がん原遺伝子Ｂ−Ｒａｆ及びｖ−Ｒａｆマウス肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログＢ１とも称される。Ｂ−Ｒａｆタンパク質は、細胞の成長を誘導することに関与する、細胞内のシグナルの送信に関与する。ＢＲＡＦ阻害剤であるベムラフェニブは、後期黒色腫の治療のためにＦＤＡによって承認された。
【０３１０】
他の実施形態では、がん治療剤は、サイトカインである。さらに他の実施形態では、がん治療剤は、集団ベースの腫瘍特異的抗原を含むワクチンである。さらに他の実施形態では、がん治療剤は、がん生殖細胞系遺伝子によって発現される１つ以上の従来の抗原（複数の患者で見出される腫瘍に共通の抗原、「共有がん抗原」とも称される）を含有するワクチンである。いくつかの実施形態では、従来の抗原は、一般に、がんもしくは腫瘍、または特定のタイプのがんもしくは腫瘍に見出されることが知られているものである。いくつかの実施形態では、従来のがん抗原は、非変異腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、従来のがん抗原は、変異腫瘍抗原である。
【０３１１】
ｐ５３遺伝子（公式記号ＴＰ５３）は、ヒトがんにおける任意の他の遺伝子よりも頻繁に変異される。大規模なコホート研究は、ほとんどのｐ５３変異について、ゲノム位置は、１人またはわずかな患者に固有であり、変異は、特定の患者集団のために設計された治療ワクチンの再発性ネオ抗原として使用することができないことを示している。しかしながら、ｐ５３遺伝子座の小さなサブセットは、遺伝子内のいくつかの位置が比較的高い頻度で変異する「ホットスポット」パターン（本明細書の他の箇所に記載）を示す。驚くべきことに、これらの繰り返し変異した領域の大部分は、エクソン−イントロン境界付近で生じ、ｍＲＮＡスプライシング機構によって認識される正準ヌクレオチド配列モチーフを破壊する。
【０３１２】
スプライシングモチーフの変異は、局所アミノ酸配列への変化が予測されなくても（すなわち、同義変異またはイントロン変異について）最終的なｍＲＮＡ配列を変更することができる。したがって、これらの変異は、予測不可能な方法でｍＲＮＡスプライシングを変更し、翻訳されたタンパク質に深刻な機能的影響を及ぼし得るにもかかわらず、一般的な注釈ツールによって「非コード化」として注釈付けられ、さらなる分析のために無視されることが多い。代替的にスプライシングされたアイソフォームがフレーム内配列変化をもたらす場合（すなわち、プレターミネーションコドン（ＰＴＣ）は産生されない）、それは、ナンセンス媒介性ｍＲＮＡ減衰（ＮＭＤ）によって枯渇を逃れることができ、ＨＬＡ系によって細胞表面上で容易に発現、処理、及び提示され得る。さらに、変異由来の代替スプライシングは、通常、「クリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）」であり、すなわち、正常な組織では発現せず、したがって、Ｔ細胞によって非自己ネオ抗原として認識され得る。
【０３１３】
いくつかの事例では、がん治療剤は、再発性多型（「ホットスポット変異」）である１つ以上のネオ抗原を含むワクチンである。例えば、とりわけ、本開示は、ｐ５３におけるある特定の再発性体細胞癌変異から生じるネオ抗原ペプチド配列を提供する。
【０３１４】
製剤
がんワクチン（例えば、ｍＲＮＡがんワクチンなどの核酸がんワクチン）は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて製剤化または投与され得る。非限定的な実施例のセットとして、がんワクチンは、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化され、（１）安定性を増加する、（２）細胞トランスフェクションを増加する、（３）持続放出もしくは遅延放出（例えば、デポー製剤から）を可能にする、（４）生体内分布を変更する（例えば、特定の組織または細胞型を標的とする）、（５）コードされたタンパク質の翻訳をインビボで増加する、及び／または（６）コードされたタンパク質（抗原）の放出プロファイルをインビボで変更することができる。任意及び全ての溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクルなどの従来の賦形剤に加えて、分散または懸濁液補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、賦形剤は、限定されないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、がんワクチンでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植のため）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、及びそれらの組み合わせを含み得る。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、少なくとも１つの追加の活性物質、例えば、治療活性物質、予防活性物質、または両方の組み合わせを含む。ワクチン組成物は、滅菌、パイロジェンフリー、または滅菌及びパイロジェンフリーの両方であり得る。ワクチン組成物などの医薬品の製剤化及び／または製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ヒト、ヒト患者、または対象に投与される。本開示の目的のために、「活性成分」という語句は、一般に、がんワクチンまたはその中に含まれる核酸、例えば、抗原ポリペプチドをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を指す。
【０３１７】
本明細書に記載されるワクチン組成物の製剤は、既知の任意の方法によって調製され得るか、または薬理学の分野において今後開発され得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分（例えば、ｍＲＮＡなどの核酸）を賦形剤及び／または１つ以上の他の副成分と会合させるステップと、次いで必要に応じて及び／または望ましい場合、生成物を所望の単一または複数用量単位に分割、成形、及び／または包装するステップと、を含む。
【０３１８】
本明細書に開示される組成物のうちのいずれかの製剤は、上述されるものに加えて１つ以上の構成成分を含み得る。例えば、脂質組成物は、１つ以上の透過促進分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤（例えば、界面活性剤）、または他の構成成分を含み得る。例えば、透過促進分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載される分子であり得る。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）及び多糖類（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及び類似体）を含み得る。
【０３１９】
本明細書に開示される薬学的組成物（例えば、脂質ナノ粒子形態の薬学的組成物）をカプセル封入または部分的にカプセル封入するために、ポリマーを含める及び／または使用することができる。ポリマーは、生分解性及び／または生体適合性であり得る。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリエタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートから選択され得るが、これらに限定されない。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化され得る。したがって、本開示はまた、（ｉ）送達剤を含む脂質組成物、及び（ｉｉ）１つ以上のペプチドエピトープをコードする核酸を含むナノ粒子組成物を提供する。そのようなナノ粒子組成物において、本明細書に開示される脂質組成物は、１つ以上のペプチドエピトープをコードする核酸をカプセル封入することができる。
【０３２１】
ナノ粒子組成物は、典型的に、およそ数マイクロメートル以下のサイズにされ、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）、及びリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、直径５００ｎｍ以下の脂質二重層を有するリポソームであり得る。
【０３２２】
ナノ粒子組成物は、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム、及びリポプレックスを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、１つ以上の脂質二重層を含む小胞である。ある特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、水性区画によって分離された２つ以上の同心二重層を含む。脂質二重層は、官能化及び／または互いに架橋結合され得る。脂質二重層は、１つ以上のリガンド、タンパク質、またはチャネルを含み得る。
【０３２３】
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン性脂質、構造脂質、リン脂質、及びｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、リン脂質、及び構造脂質を含む。
【０３２４】
脂質組成物とがんワクチンとの間の比は、約１０：１〜約６０：１（重量／重量）であり得る。いくつかの実施形態では、脂質組成物と核酸との間の比は、約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、または６０：１（重量／重量）であり得る。いくつかの実施形態では、脂質組成物対がんワクチンの重量／重量比は、約２０：１または約１５：１である。
【０３２５】
一実施形態では、がんワクチン（例えば、核酸がんワクチン）は、脂質：ポリヌクレオチド重量比が、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、もしくは７０：１、またはこれらの比の範囲もしくはそのいずれか、例えば、限定されないが、５：１〜約１０：１、約５：１〜約１５：１、約５：１〜約２０：１、約５：１〜約２５：１、約５：１〜約３０：１、約５：１〜約３５：１、約５：１〜約４０：１、約５：１〜約４５：１、約５：１〜約５０：１、約５：１〜約５５：１、約５：１〜約６０：１、約５：１〜約７０：１、約１０：１〜約１５：１、約１０：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１、約１０：１〜約３０：１、約１０：１〜約３５：１、約１０：１〜約４０：１、約１０：１〜約４５：１、約１０：１〜約５０：１、約１０：１〜約５５：１、約１０：１〜約６０：１、約１０：１〜約７０：１、約１５：１〜約２０：１、約１５：１〜約２５：１，約１５：１〜約３０：１、約１５：１〜約３５：１、約１５：１〜約４０：１、約１５：１〜約４５：１、約１５：１〜約５０：１、約１５：１〜約５５：１、約１５：１〜約６０：１もしくは約１５：１〜約７０：１であるように、脂質ナノ粒子に含まれ得る。
【０３２６】
一実施形態では、がんワクチン（例えば、核酸がんワクチン）は、およそ０．１ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬ、例えば、限定されないが、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．１ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬ、１．３ｍｇ／ｍＬ、１．４ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍｇ／ｍＬ、１．７ｍｇ／ｍＬ、１．８ｍｇ／ｍＬ、１．９ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ）、または２．０ｍｇ／ｍＬ超の濃度で脂質ナノ粒子中に含まれ得る。
【０３２７】
本明細書で一般に定義されるとき、「脂質」という用語は、疎水性または両親媒性特性を有する小分子を指す。脂質は、天然型でも合成であってもよい。脂質の分類の例としては、脂肪、ろう、ステロール含有代謝産物、ビタミン、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄ）、及びポリケチド、及びプレノール脂質が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの事例では、一部の脂質の両親媒性特性により、それらは水性溶媒中でリポソーム、小胞、または膜を形成する。
【０３２８】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、イオン性脂質を含んでもよい。本明細書で使用されるとき、「イオン性脂質」という用語は、当該技術分野におけるその通例の意味を有し、１つ以上の荷電部分を含む脂質を指し得る。いくつかの実施形態では、イオン性脂質は、正荷電性または負荷電性であり得る。イオン性脂質は、正荷電性であり得、その場合、それは「カチオン性脂質」と称され得る。ある特定の実施形態では、イオン性脂質分子は、アミン基を含んでもよく、イオン性アミノ脂質と称され得る。本明細書で使用されるとき、「荷電部分」は、形式荷電、例えば、一価（＋１または−１）、二価（＋２または−２）、三価（＋３または−３）等を持つ化学部分である。荷電部分は、アニオン性（すなわち、負荷電性）またはカチオン性（すなわち、正荷電性）であり得る。正荷電部分の例としては、アミン基（例えば、第１級、第２級、及び／または第３級アミン）、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基、及びイミジゾリウム基が挙げられる。特定の実施形態では、荷電部分は、アミン基を含む。負荷電基またはその前駆体の例としては、カルボキシレート基、スルホネート基、スルフェート基、ホスホネート基、ホスフェート基、ヒドロキシル基等が挙げられる。荷電部分の電荷は、場合によっては、環境条件によって異なり得、例えば、ｐＨの変化が、その部分の電荷を変化させ、及び／またはその部分を荷電させ得るかもしくは非荷電にさせ得る。一般に、分子の電荷密度は、所望に応じて選択され得る。イオン性脂質はまた、国際公開第ＷＯ２０１７０７５５３１号、同第ＷＯ２０１５１９９９５２号、同第ＷＯ２０１３０８６３５４号、もしくは同第ＷＯ２０１３１１６１２６号に開示されるか、または米国特許第７，４０４，９６９号の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＸＸＩＩから選択される化合物であり得、同文献の各々は、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３２９】
「荷電」または「荷電部分」という用語は、分子上の「部分負電荷」または「部分正電荷」を指すわけではないことを理解されたい。「部分負電荷」及び「部分正電荷」という用語は、当該技術分野におけるその通例の意味を与えられる。「部分負電荷」は、電子密度が結合の１個の原子の方へ引き寄せられて、その原子上で部分負電荷を作り出すといったように、官能基が極性を持つようになる結合を含むときにもたらされ得る。当業者であれば、一般に、このようにして極性を持つようになり得る結合を認識するであろう。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、イオン性脂質は、イオン性アミノ脂質であり、これは当該技術分野で「イオン性カチオン性脂質」と称されることもある。一実施形態では、イオン性アミノ脂質は、リンカー構造を介して接続された正荷電性親水性の頭部及び疎水性の尾部を有し得る。これらに加えて、イオン性脂質はまた、環状アミン基を含む脂質でもあり得る。
【０３３１】
本開示のワクチンは、典型的には、脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのイオン性アミノ脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、及び／または少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾された脂質を含む。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０〜６０％のイオン性アミノ脂質のモル比を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２０〜５０％、２０〜４０％、２０〜３０％、３０〜６０％、３０〜５０％、３０〜４０％、４０〜６０％、４０〜５０％、または５０〜６０％のイオン性アミノ脂質のモル比を含んでよい。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０％、３０％、４０％、５０、または６０％のイオン性アミノ脂質のモル比を含む。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５〜２５％の非カチオン性脂質のモル比を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５〜２０％、５〜１５％、５〜１０％、１０〜２５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１５〜２５％、１５〜２０％、または２０〜２５％の非カチオン性脂質のモル比を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％の非カチオン性脂質のモル比を含む。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２５〜５５％のステロールのモル比を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２５〜５０％、２５〜４５％、２５〜４０％、２５〜３５％、２５〜３０％、３０〜５５％、３０〜５０％、３０〜４５％、３０〜４０％、３０〜３５％、３５〜５５％、３５〜５０％、３５〜４５％、３５〜４０％、４０〜５５％、４０〜５０％、４０〜４５％、４５〜５５％、４５〜５０％、または５０〜５５％のステロールのモル比を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または５５％ステロールのモル比を含む。
【０３３５】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、０．５〜１０％、０．５〜５％、１〜１５％、１〜１０％、１〜５％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％、５〜１５％、５〜１０％、または１０〜１５％のモル比を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％  ＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。
【０３３６】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０〜６０％のイオン性脂質、５〜２５％の非カチオン性脂質、２５〜５５％のステロール、及び０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、本開示のイオン性アミノ脂質は、式（Ｉ）の化合物、
【化１】
2021529750.tif 000004
またはその塩もしくは異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜３０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及び−Ｒ″Ｍ´Ｒ´からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及び−Ｒ＊ＯＲ″からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３は、それらが結合される原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここでＱは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ´は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）−、−Ｎ（Ｒ´）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３〜６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ３〜６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ´は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ″は、独立して、Ｃ３〜１４アルキル及びＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキル及びＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４、もしくは５である場合に−Ｎ（Ｒ）２ではないか、あるいは（ｉｉ）Ｑは、ｎが１または２である場合に５、６、または７員のヘテロシクロアルキルではない化合物が含まれる。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５〜３０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及び−Ｒ″Ｍ´Ｒ´からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及び−Ｒ＊ＯＲ″からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３が、それらが結合される原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここでＱは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳ、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員ヘテロアリール、ならびにオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、モノまたはジアルキルアミノ、及びＣ１〜３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換されるＮ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員ヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎが、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ´が、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）−、−Ｎ（Ｒ´）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３〜６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ３〜６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ´が、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ″が、独立して、Ｃ３〜１４アルキル及びＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊が、独立して、Ｃ１〜１２アルキル及びＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘが、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは異性体が含まれる。
【０３４０】
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５〜３０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及び−Ｒ″Ｍ´Ｒ´からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及び−Ｒ＊ＯＲ″からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３が、それらが結合される原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員の複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｑが５〜１４員の複素環である場合、ならびに（ｉ）Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱである（ここでｎは、１もしくは２である）、または（ｉｉ）Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲである（ここでｎは、１である）、または（ｉｉｉ）Ｒ４が、−ＣＨＱＲ及び−ＣＱ（Ｒ）２である場合、Ｑは、５〜１４員のヘテロアリールまたは８〜１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各Ｒ５が、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ´が、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）−、−Ｎ（Ｒ´）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３〜６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ３〜６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ´が、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ″が、独立して、Ｃ３〜１４アルキル及びＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊が、独立して、Ｃ１〜１２アルキル及びＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘが、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは異性体が含まれる。
【０３４１】
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５〜３０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及び−Ｒ″Ｍ´Ｒ´からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及び−Ｒ＊ＯＲ″からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３が、それらが結合される原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここでＱは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ´が、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）−、−Ｎ（Ｒ´）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３〜６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ３〜６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ´が、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ″が、独立して、Ｃ３〜１４アルキル及びＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊が、独立して、Ｃ１〜１２アルキル及びＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘが、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは異性体が含まれる。
【０３４２】
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５〜３０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及び−Ｒ″Ｍ´Ｒ´からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ２〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及び−Ｒ＊ＯＲ″からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３が、それらが結合される原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここでＱは、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ´が、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）−、−Ｎ（Ｒ´）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ´が、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ″が、独立して、Ｃ３〜１４アルキル及びＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊が、独立して、Ｃ１〜１２アルキル及びＣ１〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘが、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは異性体が含まれる。
【０３４３】
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５〜３０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及び−Ｒ″Ｍ´Ｒ´からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及び−Ｒ＊ＯＲ″からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３が、それらが結合される原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここでＱは、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ´が、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）−、−Ｎ（Ｒ´）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ´が、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ″、−ＹＲ″、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ″が、独立して、Ｃ３〜１４アルキル及びＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊が、独立して、Ｃ１〜１２アルキル及びＣ１〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘが、独立して、Ｆ，Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは異性体が含まれる。
【０３４４】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）の化合物、
【化２】
2021529750.tif 000005
またはその塩もしくは異性体を含み、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ´であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１〜３アルキルまたは−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここでＱは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ´は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、及びＣ２〜１４アルケニルからなる群から選択される。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）の化合物、
【化３】
2021529750.tif 000006
たはその塩もしくは異性体を含み、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ´であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１〜３アルキルまたは−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここでｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ´は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ´）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル及びＣ２〜１４アルケニルから選択される。
【０３４６】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、もしくは（ＩＩｅ）、
【化４】
2021529750.tif 000007
またはその塩もしくは異性体を含み、式中、Ｒ４は、本明細書に記載されるとおりである。
【０３４７】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩｄ）の化合物、
【化５】
2021529750.tif 000008
またはその塩もしくは異性体を含み、式中、ｎは、２、３、または４であり、ｍ、Ｒ´、Ｒ″、及びＲ２〜Ｒ６は、本明細書に記載されるとおりである。例えば、Ｒ２及びＲ３の各々は、独立して、Ｃ５〜１４アルキル及びＣ５〜１４アルケニルからなる群から選択され得る。
【０３４８】
いくつかの実施形態では、本開示のイオン性カチオン性脂質は、以下の構造を有する化合物を含む。
【化６】
2021529750.tif 000009
【０３４９】
いくつかの実施形態では、本開示の非カチオン性脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１−オレオイル−２コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６．０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物を含む。
【０３５０】
いくつかの実施形態では、本開示のＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（ＰＥＧ−ＤＯＭＧとも称される）、ＰＥＧ−ＤＳＧ、及び／またはＰＥＧ−ＤＰＧである。
【０３５１】
いくつかの実施形態では、本開示のステロールは、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、α−トコフェロール、及びそれらの混合物を含む。
【０３５２】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、化合物１のイオン性アミノ脂質を含み、非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣであり、構造脂質は、コレステロールであり、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧである。
【０３５３】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約２：１〜約３０：１のＮ：Ｐ比を含む。
【０３５４】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約６：１のＮ：Ｐ比を含む。
【０３５５】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約３：１のＮ：Ｐ比を含む。
【０３５６】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約１０：１〜約１００：１のイオン性カチオン性脂質成分対ＲＮＡの重量／重量比を含む。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約２０：１のイオン性カチオン性脂質成分対ＲＮＡの重量／重量比を含む。
【０３５８】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約１０：１のイオン性カチオン性脂質成分対ＲＮＡの重量／重量比を含む。
【０３５９】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍの平均直径を有する。
【０３６０】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約７０ｎｍ〜約１２０ｎｍの平均直径を有する。
【０３６１】
一実施形態では、脂質は、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２１７０８８９号に記載されるものなどの、切断可能な脂質であり得る。一実施形態では、脂質は、当該技術分野において知られている、及び／または国際公開第ＷＯ２０１３０８６３５４号に記載される方法によって合成され得、同文献の内容は、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３６２】
ナノ粒子組成物は、多様な方法によって特徴付けることができる。例えば、顕微鏡法（例えば、透過型電子顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法）を用いて、ナノ粒子組成物の形態及びサイズ分布を検査することができる。動的光散乱法または電位差測定法（例えば、電位差滴定）を用いて、ゼータ電位を測定することができる。動的光散乱法をまた利用して、粒子サイズを決定することもできる。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）などの機器をまた使用して、粒子サイズ、多分散インデックス、及びゼータ電位などの、ナノ粒子組成物の複数の特性を測定することもできる。
【０３６３】
ナノ粒子組成物は、多様な方法によって特徴付けることができる。例えば、顕微鏡法（例えば、透過型電子顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法）を用いて、ナノ粒子組成物の形態及びサイズ分布を検査することができる。動的光散乱法または電位差測定法（例えば、電位差滴定）を用いて、ゼータ電位を測定することができる。動的光散乱法をまた利用して、粒子サイズを決定することもできる。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）などの機器をまた使用して、粒子サイズ、多分散インデックス、及びゼータ電位などの、ナノ粒子組成物の複数の特性を測定することもできる。
【０３６４】
ナノ粒子のサイズはまた、生物学的反応、例えば、限定されないが、炎症に対抗する一助となり得るか、またはポリヌクレオチドの生物学的効果を増加させることができる。本明細書で使用されるとき、ナノ粒子組成物の関連における「サイズ」または「平均サイズ」は、ナノ粒子組成物の平均直径を指す。
【０３６５】
キット
これらの方法を達成するためのキットは、本開示の他の態様でも提供される。キットは、製剤を収容する容器、ワクチン製剤を収容する容器、及びがんワクチン製剤をワクチン製剤に添加してがんワクチン製剤を生成し、対象への投与から２４時間以内にがんワクチン製剤を混合するための説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、３〜２００（例えば、３〜１３０）がん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む。
【０３６６】
物品は、１つ以上の容器中の本開示の医薬または診断グレードの化合物を含む。物品は、本開示の化合物の使用を促進するまたは説明する指示またはラベルを含み得る。
【０３６７】
本明細書で使用されるとき、「促進された」は、教育的、病院、及び他の臨床的指導の方法、医薬品販売を含む医薬品業界活動、ならびにがんの治療に関連する本開示の組成物に関連する、任意の形態の書面、口頭、及び電子通信を含む任意の広告または他の販促活動を含む、ビジネスを行う全ての方法を含む。
【０３６８】
「説明書」は、販促の構成要素を定義することができ、典型的には、本開示の組成物のパッケージに関するまたはそれに関連する書面による説明書を含む。説明書はまた、任意の方法で提供される任意の口頭または電子説明書を含み得る。
【０３６９】
故に、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬剤は、治療、診断、または研究用途でのそれらの使用を容易にするために、薬学的または診断または研究キットに組み立てられ得る。キットは、本開示の構成要素及び使用説明書を収容する１つ以上の容器を含んでもよい。具体的には、そのようなキットは、意図される治療用途及びこれらの薬剤の適切な投与を説明する説明書と共に、本明細書に記載される１つ以上の薬剤を含んでもよい。ある特定の実施形態では、キット中の薬剤は、特定の用途及び薬剤の投与方法に好適な医薬製剤及び投薬量であってもよい。
【０３７０】
キットは、医師による本明細書に記載される方法の使用を容易にするように設計され得、多くの形態をとることができる。該当する場合、キットの組成物の各々は、液体形態（例えば、溶液中）、または固体形態（例えば、乾燥粉末）で提供され得る。ある特定の場合において、組成物のいくつかは、例えば、キットと共に提供されても提供されなくてもよい、好適な溶媒または他の種（例えば、水または細胞培養培地）の添加によって、構成可能であっても、そうでなければ（例えば、活性形態に）加工可能であってもよい。本明細書で使用されるとき、「説明書」は、説明書及び／または販促の構成要素を定義することができ、典型的には、本開示のパッケージに関するまたはそれに関連する書面による説明書を含む。説明書はまた、ユーザが、説明書がキットと関連付けられることを明確に認識するように、任意の方法で提供される任意の口頭または電子説明書、例えば、視聴覚（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤ等）、インターネット、及び／またはウェブベースの通信等を含み得る。この書面による説明書は、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式であってもよく、これらの説明書はまた、ヒト投与のための製造、使用、または販売の機関の承認を反映することができる。
【０３７１】
ある特定の態様では、本開示は、ＩＶＴ方法による核酸がんワクチン（例えば、ＲＮＡがんワクチン）の調製のためのキットに関する。個別化されたがんワクチンでは、患者特異的変異を同定し、患者に１つ以上のネオエピトープをワクチン接種することが重要である。そのようなワクチンにおいて、そのような核酸のＯＲＦによってコードされる抗原（複数可）は、患者に特異的である。抗原（複数可）をコードする核酸（例えば、ＲＮＡ）の５′及び３′末端は、多くの核酸（例えば、ＲＮＡ）に共通の非翻訳領域及び安定化領域を含むため、より広範に適用可能であり得る。とりわけ、本開示は、患者特異的エピトープをコードするＯＲＦと組み合わせることができる、ＲＮＡの１つ以上の５′及び／または３′領域などのキメラ核酸の１つまたは一部を含むキットを提供する。例えば、キットは、５´−ＯＲＦ、３´−ＯＲＦ、及びポリＡ尾部のうちの１つ以上を含有する核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、各核酸成分は、個々の容器にある。他の実施形態では、２つ以上の核酸成分は、単一の容器に一緒に存在する。いくつかの実施形態では、キットは、リガーゼ酵素を含む。いくつかの実施形態では、提供されるキットは、使用説明書を含む。いくつかの実施形態では、説明書は、ＯＲＦをコードするペプチドエピトープを、キットからの１つ以上の他の成分、例えば、５´−ＯＲＦ、３´−ＯＲＦ、及び／またはポリＡ尾部にライゲーションするための説明書を含む。
【０３７２】
キットは、１つ以上の容器に、本明細書に記載される構成要素のうちのいずれか１つ以上を含有し得る。例として、一実施形態では、キットは、キットの１つ以上の構成成分を混合する、及び／または試料を単離及び混合し、対象に適用するための説明書を含み得る。キットは、本明細書に記載される容器収容剤を含み得る。薬剤は、滅菌して調製され、シリンジに包装され、冷蔵で出荷され得る。あるいは、それは、貯蔵のためにバイアルまたは他の容器に収容され得る。第２の容器は、他の薬剤を無菌で調製してもよい。あるいは、キットは、シリンジ、バイアル、チューブ、または他の容器に予め混合され、出荷される活性剤を含み得る。
【０３７３】
キットは、ブリスターパウチ、収縮包装パウチ、真空密封可能なパウチ、密封可能な熱成形トレイ、または同様のポーチもしくはトレイ形態などの様々な形態を有し得、付属品は、パウチ、１つ以上のチューブ、容器、箱、またはバッグ内に緩やかに梱包される。キットは、付属品が追加された後に滅菌されてもよく、それによって容器内の個々の付属品が別の方法でラッピングされないようにする。キットは、任意の適切な滅菌技法、例えば、放射線滅菌、熱滅菌、または当該技術分野で知られている他の滅菌方法を使用して滅菌することができる。キットはまた、特定の用途に応じて、他の構成要素、例えば、容器、細胞培地、塩、緩衝液、試薬、シリンジ、針、消毒剤を塗布または除去するためのガーゼなどの布地、使い捨て手袋、投与前の薬剤の支持体等も含み得る。
【０３７４】
キットの組成物は、任意の好適な形態、例えば、液体溶液または乾燥粉末として提供され得る。提供される組成物が乾燥粉末である場合、粉末は、好適な溶媒の添加によって再構成され得、これもまた提供され得る。組成物の液体形態が求められる実施形態では、液体形態は、濃縮されてもよく、または使用する準備ができていてもよい。溶媒は、化合物、及び使用または投与の様式に依存するであろう。薬物組成物に好適な溶媒は周知であり、文献で入手可能である。溶媒は、化合物、及び使用または投与の様式に依存するであろう。
【０３７５】
キットは、一組の実施形態では、バイアル、チューブなどの１つ以上の容器手段を密閉で受容するように区画化された担体手段を含んでよく、容器手段の各々は、方法で使用される別個の要素のうちの１つを含む。例えば、容器のうちの１つは、アッセイの陽性対照を含み得る。加えて、キットは、他の構成要素、例えば、アッセイに有用な緩衝液のための容器を含み得る。
【０３７６】
本開示はまた、完成したパッケージ化及びラベル付けされた医薬製品も包含する。この製品は、ガラスバイアルまたは気密密封されている他の容器などの適切な器または容器に適切な単位剤形を含む。非経口投与に好適な剤形の場合、活性成分は無菌であり、無粒子溶液としての投与に好適である。言い換えれば、本開示は、非経口溶液及び凍結乾燥粉末の両方を包含し、各々が滅菌され、後者は、注射前の再構成に好適である。あるいは、単位剤形は、経口、経皮、局所、または粘膜送達に好適な固体であり得る。
【０３７７】
好ましい実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、または皮下送達に好適である。故に、本開示は、各送達経路に好適な溶液、好ましくは滅菌溶液を包含する。
【０３７８】
別の好ましい実施形態では、本開示の組成物は、生体適合性洗剤（レシチン、タウロコリン酸、及びコレステロールを含むが、これらに限定されない）、または他のタンパク質（γグロブリン及び血清アルブミンを含むが、これらに限定されない）と共に容器に保管される。より好ましくは、本開示の組成物は、ヒト使用のためにヒト血清アルブミンと共に保管され、獣医使用のためにウシ血清アルブミンと共に保管される。
【０３７９】
任意の医薬品と同様に、包装材料及び容器は、保管及び出荷中に製品の安定性を保護するように設計されている。さらに、本開示の製品は、目的の疾患または障害を適切に予防または治療する方法について医師、技術者、または患者に助言する使用説明書または他の情報材料を含む。言い換えれば、製品は、実際の用量、モニタリング手順（例えば、平均絶対リンパ球数、腫瘍細胞数、及び腫瘍サイズをモニタリングするための方法）、ならびに他のモニタリング情報を含むが、これらに限定されない、投薬レジメンを指示または示唆する命令手段を含む。
【０３８０】
より具体的には、本開示は、包装材料、例えば、箱、ボトル、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、注入器、静脈内（ｉ．ｖ．）バッグ、封筒等と、当該包装材料内に含まれる薬剤の少なくとも１つの単位剤形とを含む、製品を提供する。本開示はまた、包装材料、例えば、箱、ボトル、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、注入器、静脈内（ｉ．ｖ．）バッグ、封筒等と、当該包装材料内に含まれる各薬剤の少なくとも１つの単位剤形とを含む、製品を提供する。本開示は、包装材料、例えば、箱、ボトル、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、注入器、静脈内（ｉ．ｖ．）バッグ、封筒等と、当該包装材料内に含まれる各薬剤の少なくとも１つの単位剤形とを含む、製品をさらに提供する。本開示は、好ましくは滅菌形態で梱包された、製剤の注射用の針もしくはシリンジ、及び／または梱包されたアルコールパッドを含む製品をさらに提供する。
【０３８１】
ワクチン組成物中の活性成分（例えば、核酸がんワクチン）、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の識別、サイズ、及び／または状態に応じて、さらに組成物が投与される経路に応じて変化し得る。例えば、組成物は、活性成分の０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）を含んでよい。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば、０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでよい。
【０３８２】
いくつかの実施形態では、医薬製品を含有するパッケージは、０．１ｍｇ〜１ｍｇの核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含有する。いくつかの実施形態では、医薬製品を含有するパッケージは、０．３５ｍｇの核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含有する。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の濃度は、１ｍｇ／ｍＬである。
【０３８３】
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、対象の体重の０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇを、１日、１日１回以上、１週間、１ヶ月等で送達するのに十分な投薬量レベルで投与されて、所望の治療、診断、予防、またはイメージング効果を得ることができる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３０７８１９９号に記載される単位用量の範囲を参照されたい）。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、０．０１００ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．０７５ｍｇ、０．１００ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．１５０ｍｇ、０．１７５ｍｇ、０．２００ｍｇ、０．２２５ｍｇ、０．２５０ｍｇ、０．２７５ｍｇ、０．３００ｍｇ、０．３２５ｍｇ、０．３５０ｍｇ、０．３７５ｍｇ、０．４００ｍｇ、０．４２５ｍｇ、０．４５０ｍｇ、０．４７５ｍｇ、０．５００ｍｇ、０．５２５ｍｇ、０．５５０ｍｇ、０．５７５ｍｇ、０．６００ｍｇ、０．６２５ｍｇ、０．６５０ｍｇ、０．６７５ｍｇ、０．７００ｍｇ、０．７２５ｍｇ、０．７５０ｍｇ、０．７７５ｍｇ、０．８００ｍｇ、０．８２５ｍｇ、０．８５０ｍｇ、０．８７５ｍｇ、０．９００ｍｇ、０．９２５ｍｇ、０．９５０ｍｇ、０．９７５ｍｇ、または１．０ｍｇを送達するのに十分な投薬量レベルで投与される。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、１０μｇ〜４００μｇのｍＲＮＡワクチンを対象に送達するのに十分な投薬量レベルで投与される。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、０．０３３ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、または０．４ｍｇを対象に送達するのに十分な投薬量レベルで投与される。
【０３８４】
所望の投薬量は、１日３回、１日２回、１日１回、隔日、３日毎、毎週、２週間毎、３週間毎、４週間毎、２ヶ月毎、３ヶ月毎、６ヶ月毎等に送達され得る。ある特定の実施形態では、所望の投薬量は、複数の投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回、またはそれよりも多くの投与）を使用して送達され得る。複数の投与が用いられる場合、本明細書に記載のものなどの分割投与レジメンが使用され得る。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜０．０１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜約０．００７５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００３ｍｇ／ｋｇ、約０．００４ｍｇ／ｋｇ、または約０．００５ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投薬量レベルで投与され得る。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜０．２５０ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜０．５００ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜０．７５０ｍｇ／ｋｇ、または０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投薬量レベルで１回または２回（またはそれ以上）投与され得る。
【０３８５】
いくつかの実施形態では、核酸（例えばｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、０．０１００ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．０７５ｍｇ、０．１００ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．１５０ｍｇ、０．１７５ｍｇ、０．２００ｍｇ、０．２２５ｍｇ、０．２５０ｍｇ、０．２７５ｍｇ、０．３００ｍｇ、０．３２５ｍｇ、０．３５０ｍｇ、０．３７５ｍｇ、０．４００ｍｇ、０．４２５ｍｇ、０．４５０ｍｇ、０．４７５ｍｇ、０．５００ｍｇ、０．５２５ｍｇ、０．５５０ｍｇ、０．５７５ｍｇ、０．６００ｍｇ、０．６２５ｍｇ、０．６５０ｍｇ、０．６７５ｍｇ、０．７００ｍｇ、０．７２５ｍｇ、０．７５０ｍｇ、０．７７５ｍｇ、０．８００ｍｇ、０．８２５ｍｇ、０．８５０ｍｇ、０．８７５ｍｇ、０．９００ｍｇ、０．９２５ｍｇ、０．９５０ｍｇ、０．９７５ｍｇ、または１．０ｍｇの総用量を送達するのに十分な総用量または投薬量レベルで、２回投与されてもよい（例えば、０日目及び７日目、０日目及び１４日目、０日目及び２１日目、０日目及び２８日目、０日目及び６０日目、０日目及び９０日目、０日目及び１２０日目、０日目及び１５０日目、０日目及び１８０日目、０日目及び３ヶ月後、０日目及び６ヶ月後、０日目及び９ヶ月後、０日目及び１２ヶ月後、０日目及び１８ヶ月後、０日目及び２年後、０日目及び５年後、または０日目及び１０年後）。より高い及びより低い投薬量及び投与頻度は、本開示に包含される。例えば、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、３回もしくは４回、またはそれ以上投与され得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチン組成物は、３週間毎に１日１回投与される。
【０３８６】
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、０．０１０ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．１００ｍｇ、または０．４００ｍｇの総用量を送達するのに十分な総用量または投薬量レベルで、２回（例えば、０日目及び７日目、０日目及び１４日目、０日目及び２１日目、０日目及び２８日目、０日目及び６０日目、０日目及び９０日目、０日目及び１２０日目、０日目及び１５０日目、０日目及び１８０日目、０日目及び３ヶ月後、０日目及び６ヶ月後、０日目及び９ヶ月後、０日目及び１２ヶ月後、０日目及び１８ヶ月後、０日目及び２年後、０日目及び５年後、または０日目及び１０年後）投与され得る。
【０３８７】
いくつかの実施形態では、対象にワクチン接種する方法で使用するための核酸（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、対象に、有効量の１０μｇ／ｋｇ〜４００μｇ／ｋｇの核酸ワクチンを投与して、対象にワクチン接種する。いくつかの実施形態では、対象にワクチン接種する方法で使用するためのＲＮＡワクチンは、対象に、有効量の１０μｇ〜４００μｇの核酸ワクチンの単一投薬量を投与して、対象にワクチン接種する。
【０３８８】
本明細書に記載される方法及び組成物は、その用途において、以下の説明に記載される構成の詳細及び構成要素の配置に限定されるものではない。本明細書に記載される方法及び組成物は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施されるか、または実行されることができる。また、本明細書で使用される語句及び用語は、説明の目的のためであり、限定的とみなされるべきではない。本明細書における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、及びそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目及びそれらの等価物、ならびに追加の項目を包含することを意味する。
【実施例】
【０３８９】
実施例１．ポリヌクレオチドの製造
本開示によれば、核酸及び／またはその部分もしくは領域の製造は、国際出願第ＷＯ２０１４／１５２０２７号「Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ」に詳述される方法を含む、当該技術分野で教示される方法を利用して達成され得、同文献の内容は、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３９０】
精製方法としては、国際出願第ＷＯ２０１４／１５２０３０号及び同第ＷＯ２０１４／１５２０３１号に教示されるものを含み得、同文献の各々は、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３９１】
核酸と共に使用するための検出及び特徴付け方法は、ＷＯ２０１４／１４４０３９に教示されるものを含む当該技術分野で既知の任意の方法を使用して実施され得、同文献は、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３９２】
本開示のポリヌクレオチドの特徴付けは、例えば、ポリヌクレオチドマッピング、逆転写酵素配列決定、電荷分布分析、及びＲＮＡ不純物の検出からなる群から選択される手順を使用して達成され得、特徴付けは、ＲＮＡ転写配列を決定すること、ＲＮＡ転写産物の純度を決定すること、またはＲＮＡ転写産物の電荷不均一性を決定することを含む。そのような方法は、例えば、ＷＯ２０１４／１４４７１１及びＷＯ２０１４／１４４７６７に教示され、同文献の各々の内容は、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３９３】
実施例２  キメラポリヌクレオチド合成
導入
本開示によれば、キメラ核酸の２つの領域または部分は、三リン酸ケミストリーを使用して接合またはライゲーションされ得る。
【０３９４】
この方法によれば、１００ヌクレオチド以下の第１の領域または部分は、５´一リン酸及び末端３´ｄｅｓＯＨまたは遮断ＯＨと化学的に合成される。この領域が８０ヌクレオチドより長い場合、ライゲーションのための２つの鎖として合成され得る。
【０３９５】
第１の領域または部分が、インビトロ転写（ＩＶＴ）を使用して非位置的に修飾された領域または部分として合成される場合、３´末端の後次キャッピングを伴う５´一リン酸への変換が続き得る。
【０３９６】
一リン酸保護基は、当該技術分野において知られているもののうちのいずれかから選択され得る。
【０３９７】
キメラポリヌクレオチドの第２の領域または部分は、化学合成またはＩＶＴ方法のいずれかを使用して合成され得る。ＩＶＴ方法は、修飾されたキャップを有するプライマーを利用することができるＲＮＡポリメラーゼの使用を含み得る。代替的に、最大１３０ヌクレオチドのキャップは、化学的に合成され、ＩＶＴ領域または部分に結合されてもよい。
【０３９８】
キメラポリヌクレオチド全体が、リン酸−糖骨格で製造される必要はない。領域または部分のうちの１つがポリペプチドをコードする場合、そのような領域または部分が、リン酸−糖骨格を含むことが好ましい。
【０３９９】
次いで、ライゲーションは、任意の既知のクリックケミストリー、Ｏｒｔｈｏｃｌｉｃｋケミストリー、ＳｏｌｕＬＩＮＫ、または当業者に知られている他のバイオコンジュゲートケミストリーを使用して行われる。
【０４００】
合成経路
キメラ核酸は、一連の開始セグメントを使用して作製される。そのようなセグメントは、以下を含む。
（ａ）通常の３´ＯＨを含むキャップ及び保護された５´セグメント（ＳＥＧ．１）
（ｂ）ポリペプチドのコード領域を含み、通常の３´ＯＨを含み得る５´三リン酸セグメント（ＳＥＧ．２）
（ｃ）コルジセピンを含むか、または３´ＯＨを含まないキメラポリヌクレオチドの３´末端の５´一リン酸セグメント（ＳＥＧ．３）
【０４０１】
合成後（化学的またはＩＶＴ）、セグメント３（ＳＥＧ．３）をコルジセピンで処理し、次いでピロホスファターゼで処理して、５´一リン酸を生成する。
【０４０２】
次いで、セグメント２（ＳＥＧ．２）を、ＲＮＡリガーゼを使用してＳＥＧ．３にライゲーションする。次いで、ライゲーションされたポリヌクレオチドを精製し、ピロホスファターゼで処理してジホスファターゼを切断する。次いで、処理されたＳＥＧ．２−ＳＥＧ．３構築物を生成し、ＳＥＧ．１を５´末端にライゲーションする。キメラポリヌクレオチドのさらなる精製ステップを実施することができる。
【０４０３】
各ステップの収率は、９０〜９５％であり得る。
【０４０４】
実施例３：ｃＤＮＡ産生のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡの調製のためのＰＣＲ手順は、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）による２ｘ  ＫＡＰＡ  ＨＩＦＩ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘを使用して実施される。このシステムは、２ｘ  ＫＡＰＡ  ＲｅａｄｙＭｉｘ１２．５μＬ、順方向プライマー（１０μＭ）０．７５μＬ、逆方向プライマー（１０μＭ）０．７５μＬ、テンプレートｃＤＮＡ−１００ｎｇ、及び２５．０μＬに希釈されたｄＨ２Ｏを含む。反応条件は、９５℃で５分間、及び２５サイクルの９８℃で２０秒間、次いで５８℃で１５秒間、次いで７２℃で４５秒間、次いで７２℃で５分間、次いで４℃で終了までである。
【０４０５】
反応は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲマイクロキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用し、製造元の指示に従ってクリーンアップする（最大５μｇ）。より大きな反応は、より大きな容量を持つ製品を使用してクリーンアップする必要がある。クリーンアップに続いて、ｃＤＮＡを、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を使用して定量化し、アガロースゲル電気泳動によって分析して、ｃＤＮＡが予想されるサイズであることを確認する。次いで、インビトロ転写反応に進む前に、配列決定分析のためにｃＤＮＡを提出する。
【０４０６】
実施例４．インビトロ転写（ＩＶＴ）
インビトロ転写反応は、均一に修飾された核酸を含有する核酸を生成する。そのような均一に修飾された核酸は、本開示の核酸の領域または一部を含み得る。インプットヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスは、天然及び非天然ＮＴＰを使用して社内で作製される。
【０４０７】
典型的なインビトロ転写反応は、以下を含む。
１   テンプレートｃＤＮＡ                          １．０μｇ
２   １０ｘ転写緩衝液（４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．   ２．０μＬ
０、１９０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭスペ
ルミジン）
３   カスタムＮＴＰ（各２５ｍＭ）                  ７．２μＬ
４   ＲＮａｓｅ阻害剤                              ２０Ｕ
５   Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ                      ３０００Ｕ
６   ｄＨ２Ｏ                                       最大２０．０μＬ、及び
７   ３７℃で３〜５時間のインキュベーション。
【０４０８】
粗ＩＶＴミックスは、翌日のクリーンアップのために４℃で一晩保管され得る。次いで、１ＵのＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅを使用して、オリジナルテンプレートを消化する。３７℃で１５分のインキュベーション後、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用し、製造元の指示に従ってｍＲＮＡを精製する。このキットは、最大５００μｇのＲＮＡを精製することができる。クリーンアップに続いて、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用してＲＮＡを定量化し、アガロースゲル電気泳動によって分析して、ＲＮＡが適正サイズであり、ＲＮＡの分解が起こらなかったことを確認する。
【０４０９】
実施例５：構築物及びフランク長さのインビボ研究
インビボ免疫原性研究を実施して、異なるエピトープ数及びフランク長さを有するワクチンの効果を調べた。以下の表に示されるように、３つの構築物を使用して試験を実施した。マウスワクチンは、バイオインフォマティクスアルゴリズムによって決定されるように、マウス結腸（ＭＣ３８）腫瘍株に存在する予測ネオエピトープ（一塩基バリアント）をコードする。ＭＣ３８Ｓ−１ａは、１５個のクラスＩ及び５個のクラスＩＩエピトープを含み、ＭＣ３８Ｓ−２ｂは、２６個のクラスＩ及び８個のクラスＩＩエピトープを含み、ＭＣ３８Ｓ−３ｂは３０個のクラスＩ及び１０個のクラスＩＩエピトープを含む。以下の表では、３つの異なるワクチンを作製し、１ａでは、３１アミノ酸の全長について、全てのエピトープが隣接するアミノ酸によって囲まれ、２ｂでは、エピトープ＋フランクの全２５アミノ酸に対してエピトープがアミノ酸によって囲まれ、次いで３ｂでは、２１ａａに等しい各エピトープ＋フランクの全長について、エピトープがアミノ酸によって囲まれる。エピトープは、それが結合すると予測されるＭＨＣ分子に応じてわずかに長さが変化し得るが、この実施例では、全長を３１、２５、または２１に維持するために、このわずかな変化を考慮して全長を調整した。
【表２】
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【０４１０】
マウスに、１日目（ｄ１、プライム）及び８日目（ｄ８、ブースト）に、３μｇまたは１０μｇの試験ｍＲＮＡワクチンを投与した。脾細胞を、ＥＬＩｓｐｏｔ分析のために１５日目に採取した。簡潔に述べると、１ウェル当たり４０万個の細胞を１μｇ／ｍＬのペプチドで１６〜１８時間インキュベートし、その後、ＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）をカウントした。３つ全てのワクチンに含まれるエピトープに対応する最小ペプチドを、再刺激に使用した。異なる群の統計的比較を以下の表に示す。
【表３】
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【０４１１】
図４Ａ〜４Ｃに示されるように、クラスＩエピトープに対する同等の免疫応答が、２０ｍｅｒ／３１フランクと３４ｍｅｒ／２５フランクワクチンとの間で検出されたが、３０ｍｅｒ／２１フランクは、３μｇ及び１０μｇ用量の両方では検出されなかった。３４ｍｅｒ構築物は、いくつかの再刺激についてのみ検出された応答を実証した。
【０４１２】
実施例６：エピトープの選択
ｍＲＮＡエピトープ選択プロセスは、以下を含み得る：
１）ネオ抗原予測ステップは、正常組織ではなく腫瘍において特異的に発現される変異由来ペプチドの一覧を生成し、患者のＨＬＡ分子によって提示される予測能力、ならびに腫瘍トランスクリプトームにおけるそれらの存在量及び頻度に基づいて、頑丈な腫瘍特異的Ｔ細胞応答を生成する可能性が最も高いネオ抗原のサブセットを選択する。
２）自己性分析を使用して、患者の正常組織内で潜在的に発現する他のものと一致するペプチドを除外することによって、患者のゲノム内のネオ抗原と他の配列との間の分子模倣のリスクを最小限に抑えることができる。ネオ抗原は、ネオ抗原接合部での擬似エピトープの生成を最小限に抑えるために、鎖状体内に配置される。
３）ワクチン設計は、選択されたネオ抗原を、合成の容易さのために最適化された核酸配列を生成する鎖状体構築物に設計することを伴う。
【０４１３】
ネオ抗原予測
ネオ抗原予測及び選択のためのコアアルゴリズムは、バリアントのｍＲＮＡ存在量及び頻度、ならびに患者のＨＬＡ標的へのその予測結合を決定する。ペプチドは、体細胞ＤＮＡバリアントの位置を、信頼性の高いヒトゲノム注釈、ＧＥＮＣＯＤＥからのアミノ酸（ＡＡ）配列にマッピングすることによって生成される。ＲＮＡ−Ｓｅｑデータを使用して、一塩基バリアントのレベルでのバリアントコールをサポートし、ゲノム及びトランスクリプトームにおけるバリアント頻度を決定する。
【０４１４】
ｍＲＮＡにおけるネオ抗原の大部分は、中心に単一の変異ＡＡを有するペプチドからなり得、Ｃ末端及びＮ末端に１２個の隣接するＡＡ´を有し、ネオ抗原当たり２５アミノ酸の長さをもたらす（ｍＲＮＡ配列中の７５ヌクレオチド）。複数の変異ＡＡを有するインデルは、少なくとも１つ以上の変異体ＡＡを含有する２５ＡＡ長のＡＡ配列からなり、最大２５ｍｅｒ全体が変異体ＡＡである。変異がタンパク質末端から１２ＡＡ未満離れて生じる場合、ペプチド及び対応するヌクレオチド長はより短くてもよい。いくつかの実施形態では、好ましいペプチド長は、１３ＡＡであり、これは、全ての腫瘍型にわたるミュータノームの広範な分析に基づいて稀である。
【０４１５】
抗腫瘍Ｔ細胞応答に関連するいくつかの特徴は、各ネオ抗原について評価され、以下を含む。１）ＷＥＳ及びＲＮＡ−Ｓｅｑデータからのバリアントコールの信頼性、２）ＲＮＡ−ＳｅｑデータからのｍＲＮＡ転写産物存在量、３）ＷＥＳ及びＲＮＡ−Ｓｅｑデータからの変異アレル頻度、４）ＮｅｔＭＨＣｐａｎ及びＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ由来の予測されるＨＬＡ結合親和性。
【０４１６】
患者のＨＬＡアロタイプは、それらが患者のＴ細胞にネオ抗原を提示するため、標的化され得る。ＨＬＡ遺伝子は、ヒトゲノムにおいて最も多型であり、コドミナント発現により、ほとんどの個体が、いくつかの遺伝子座でヘテロ接合性になる。ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、及び−Ｃ遺伝子座は、クラスＩアロタイプをコードし、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、及びＤＱは、クラスＩＩアロタイプをコードする。いくつかの実施形態では、より多くの重量が、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、及びＤＲ（コア標的）の予測バインダーに割り当てられてもよく、より低い（ゼロではないが）重量が、患者の他のＨＬＡアロタイプ（補足標的）に割り当てられてもよい。ほぼ全ての個体は、少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、及びＤＲ機能性アロタイプ（すなわち、コアＭＨＣアレル）を有し、これらは、全ての既知のヒトエピトープの約９０％の制限要素である（図５）。ＨＬＡ−Ｃ制限または同種反応性Ｔ細胞はほとんど観察されず、ＨＬＡ−Ｃの細胞表面発現は、ＨＬＡ−Ａ及びＢについて見られるものの１０％である。残りの補足標的は、クラスＩＩ分子をコードし、個体は、それらをコードする遺伝子についてヌルであり得る。さらに、これらの補足的なクラスＩＩ標的の４桁の精密タイピングは、最先端のＮＧＳ及び他の配列ベースのタイピング方法を使用しても、しばしば曖昧である。コアまたは補足ＨＬＡ標的のいずれかのためのＮＧＳに基づくアレル型が曖昧である場合、アレル（複数可）は、ネオ抗原をランク付けするときに考慮されない場合がある。
【０４１７】
自己性チェック
各ネオ抗原の自己性チェックを実施してもよい。患者特異的な転写産物のセットは、配列を患者自身の生殖細胞系タンパク質コーディングバリアントのセットに調整することによって、参照ヒトゲノム注釈からのタンパク質コード転写産物アミノ酸配列を使用して生成される。この患者特異的エクソーム（ネオ抗原を含有する遺伝子を除く）を使用して、各ＨＬＡクラスＩ結合ネオ抗原エピトープ（８〜１１−ｍｅｒ）を１００％正確な自己一致についてチェックしてもよい。このツールを使用して、ゲノム及び／またはトランスクリプトームの他の場所で１００％自己一致として同定された任意のネオ抗原は、ｍＲＮＡ構築物から除外され得る。
【０４１８】
ネオ抗原選択
自己性チェックによって除外されない全てのバリアントは、患者特異的ｍＲＮＡ構築物設計に含めるために評価され得る。ＭＨＣ結合予測が不完全であり、ＲＮＡ−Ｓｅｑ感受性が生検の腫瘍含量及び配列決定の深度によって制限され得るという知識に基づいて、ハードフィルターではなく、所定の重みを使用してもよい。
【０４１９】
いくつかの実施形態では、各ｍＲＮＡ構築物は、最大３４個のネオ抗原（最大２５アミノ酸／７５ヌクレオチド長のペプチドを有する）または１３〜３４個のネオ抗原の任意の範囲を有するように設計され得る。この範囲は、ｍＲＮＡ配列長について１，２３５〜２，９２４ヌクレオチドに対応する。３４個のネオ抗原を含む構築物の例示的な実施形態では、組成物は、最初に上位２９個のＨＬＡクラスＩネオ抗原を選択し、次いで上位５個のＨＬＡクラスＩＩネオ抗原を選択することによって決定され得る。特定のネオ抗原がクラスＩ及びＩＩネオ抗原の両方として選択される場合、それは、５つのクラスＩＩネオ抗原のうちの１つとしてカウントされ得る。これらの二重クラスＩ及びＩＩ予測バインダーによってもたらされた結果として生じるネオ抗原スロットは、自動的に次の最高スコアのクラスＩネオ抗原で満たされる。
【０４２０】
低変異負荷腫瘍
腫瘍ミュータノームの固有の変動性を考慮すると、低変異負荷を有する腫瘍の稀な症例は、本明細書に記載されるがんワクチンで治療され得る。これらの実施形態では、３４個未満のネオ抗原を使用して個々のｍＲＮＡ構築物を生成することが望ましい場合がある。例えば、わずか７個の腫瘍ネオ抗原が使用され得る。最適な３４抗原未満であるが１３個以上のネオ抗原が同定される場合には、各ネオ抗原がｍＲＮＡ構築物に１回含まれる構築物を生成することができる。腫瘍ミュータノーム中に１３個未満のネオ抗原が見出される実施形態では、ネオ抗原は、所望の１３個のネオ抗原スロットを満たすように複製され得る。
【０４２１】
擬似エピトープ
ネオ抗原は、それらの接合部での擬似エピトープの生成を最小限に抑えるために、鎖状体内で順序付けされ得る。あるいは、単一のアミノ酸スペーサーなどのスペーサーを使用して、エピトープを破壊し、予測されるＨＬＡ結合親和性を低減し得る。
【０４２２】
母集団及びエンド・ツー・エンド試験
ＮＧＳは、いくつかのバイオバンキングレポジトリから得られた１５個の腫瘍及び血液試料に対して実施した。試料は、異なる形式の様々な腫瘍型（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋［ＦＦＰＥ］及び新鮮な凍結）から得た。本明細書に記載される方法を、完全な適格性評価プロトコルの一部として、これらの代表的な試料の各々についてＮＧＳデータ上で実行した。加えて、４つの関連腫瘍試料を使用して試験を行った。単一の患者に由来する３つの腫瘍株及び原発性腫瘍試料を、ＷＥＳ及びＲＮＡ−Ｓｅｑに供し、結果を分析した。
【０４２３】
４つの独立した出力を比較すると、コールされるバリアント、ネオ抗原ランク付け、及びワクチンに含めるために選択されたバリアントの間で強い一致が観察された（図７Ａ〜７Ｄ）。差は認められたが、原発腫瘍と互いにインビトロで増殖した株の分岐によって説明された。４つの試料にわたって同定された３６９個のバリアントのうち、９０．５％は全ての試料に共通であった。生のネオ抗原スコアを使用して、腫瘍と比較して全ての株間に強い相関があり、スコアが実質的に乖離したとき、それは株または腫瘍におけるＲＮＡ−Ｓｅｑデータの欠如に起因した。本明細書に記載される分析方法によって各腫瘍試料から独立してネオ抗原を選択した場合、３４個が４つのワクチン設計の全てにおいて共通であり、さらに５個が３つのワクチン設計において共通であった。全体的に、分析は、ＮＧＳプロセス、バリアントコール、及びｍＲＮＡ分析システムが、堅牢で再現可能であり、合理的な出力を生成することを示す。
【０４２４】
等価物
当業者であれば、ほんの日常的な実験を用いて、本明細書に記載される本開示の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、またはそれを確認することができよう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【０４２５】
本明細書に開示される特許文献を含む全ての参照文献は、それら全体が参照により組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【国際調査報告】
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