(57)【要約】本開示は、対象の腫瘍によって発現される抗原に特異的な１つ以上のネオ抗原をコードする核酸分子を含む個別化されたワクチンを製造する方法に関する。核酸配列のパターンで組織化されたネオ抗原をコードするコード領域を含む組成物、ならびにそれを使用して対象を免疫する方法も開示される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉを含む核酸配列を含む核酸分子であって、
［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］、
式中、前記ＡＥＤは、発現可能な核酸配列を含む抗原発現ドメインであり、
各リンカーは、約０〜約１２５の長さの、天然または非天然の核酸から独立して選択可能であり、
抗原発現ドメイン１は、約２４〜約２５０ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、エピトープをコードし、
抗原発現ドメイン２は、約２４〜約２５０ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、エピトープをコードし、
ｎは、約１〜約５００の任意の正の整数である、核酸分子。
【請求項２】
前記抗原発現ドメイン１または前記抗原発現ドメイン２が、約２０〜約２０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記抗原発現ドメイン１または前記抗原発現ドメイン２が、約５０〜約１０，０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、
ｎが、約６〜約２６の任意の正の整数である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記抗原発現ドメイン１および／または前記抗原発現ドメイン２が、約１５〜約１５０ヌクレオチドの長さから独立して選択可能である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記抗原発現ドメイン１および／または前記抗原発現ドメイン２が、約１５〜約１００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記抗原発現ドメイン１および／または前記抗原発現ドメイン２が、約１５〜約５０ヌクレオチドの長さから独立して選択可能である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
ｎが、約５〜約３０の正の整数である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
ｎが、約２〜約１００の正の整数である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項９】
ｎが、約２〜約５８の正の整数である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１０】
ｎが、約２〜約２９の正の整数である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１１】
少なくとも１つのリンカーが、約１５〜約３００ヌクレオチドを含み、切断部位をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１２】
少なくとも１つのリンカーが、フューリンプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
少なくとも１つのリンカーが、ブタテッショウウイルス−１２Ａ（Ｐ２Ａ）切断部位を含む、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記式が少なくとも第１のリンカーおよび第２のリンカーを含み、前記第１および第２のリンカーがフューリンプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１５】
ｎが約５〜約５０の正の整数であり、各リンカーが、フューリンプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１６】
少なくとも１つの制御配列をさらに含み、式Ｉの少なくとも１つの核酸配列が、制御配列に作動可能に連結されている、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記抗原発現ドメイン１が、約１２〜約１５，０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、対象からの１つまたは複数のがん細胞由来のエピトープをコードし、
前記抗原発現ドメイン２が、約１２〜約１５，０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、前記対象からの１つまたは複数のがん細胞由来のエピトープをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記核酸分子が、１つまたは複数の抗原発現ドメインによってコードされる任意の１つまたは複数のアミノ酸配列に対してＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発するのに十分な量である、請求項１〜１７のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記核酸分子が、１つまたは複数の抗原発現ドメインによってコードされる任意の１つまたは複数のアミノ酸配列に対してＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発するのに十分な量である、請求項１〜１７のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２０】
リーダー配列をさらに含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記リーダー配列が、ＩｇＥリーダー配列である、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２２】
前記分子が、プラスミドである、請求項１〜２１のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２３】
式Ｉの前記核酸配列が、（ｉ）ＬＬＣ、ＴＣ１、ＩＤ８、ｐＧＸ４５０１、ｐＧＸ４５０３、ｐＧＸ４５０４、ｐＧＸ４５０５、およびｐＧＸ４５０６からなる群から選択されるプラスミド、または（ｉｉ）ＬＬＣ、ＴＣ１、ＩＤ８、ｐＧＸ４５０１、ｐＧＸ４５０３、ｐＧＸ４５０４、ｐＧＸ４５０５、およびｐＧＸ４５０６からなる群から選択されるプラスミドと少なくとも７０％の相同性を有するプラスミドのマルチクローニングサイトに配置される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２４】
前記プラスミドが、ｐＧＸ４５０５である、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２５】
請求項２２に記載のプラスミドで形質転換された、宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれかに記載の１つまたは複数の核酸分子を含む、組成物。
【請求項２７】
（ｉ）請求項１〜２４のいずれかに記載の１つもしくは複数の核酸分子、またはその薬学的に許容される塩と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
１つ以上の治療薬をさらに含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記追加の治療薬が、生物学的治療薬または小分子である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記治療薬のうちの１つが、（ｉ）チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメント、または（ｉｉ）チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸配列である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメントが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、およびＢ−７ファミリーリガンド、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるチェックポイントタンパク質と会合するか、またはそれを阻害する、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記チェックポイント阻害剤が、プログラム死−１（ＰＤ−１）経路の阻害剤である、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記チェックポイント阻害剤が、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）抗体である、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記治療薬が、アジュバントまたはその機能的フラグメントである、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記アジュバントまたはその機能的フラグメントが、（ｉ）ポリＩＣＬＣ、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、ＡｍｐｌｉｖａｘＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ  １ＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、一リン酸リピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ１３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡマイクロ粒子、レシキモド、Ｓ  Ｌ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルアン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、アクリルもしくはメタクリルポリマー、無水マレイン酸のコポリマーおよびＡｑｕｉｌａのＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、ならびにそれらのいずれかの機能的フラグメント、または（ｉｉ）ポリＩＣＬＣ、１０１８ＩＳＳからなる群から選択されるアジュバントをコードする核酸分子、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ  ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ  １ＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、モノホスホリフリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ１３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡ微粒子、レシキモド、Ｓ  Ｌ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルアン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、アクリルまたはメタクリルポリマー、無水マレイン酸のコポリマー、およびＡｑｕｉｌａのＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、またはそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記治療薬が、（ｉ）免疫賦活剤もしくはその機能的フラグメント、または（ｉｉ）免疫賦活剤もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸配列である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記免疫賦活剤が、インターロイキンまたはその機能的フラグメントである、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記治療薬が、（ｉ）化学療法薬もしくはその機能的フラグメント、または（ｉｉ）化学療法薬もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸配列である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
対象においてがんを治療および／または予防する方法であって、それを必要とする前記対象に、薬学的有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸分子のうちのいずれか、または請求項２７〜３８に記載の医薬組成物のうちのいずれかを投与することを含む、方法。
【請求項４０】
治療が、臨床転帰、Ｔ細胞による抗腫瘍活性の増加、増強、もしくは延長、治療前の数と比較した抗腫瘍Ｔ細胞もしくは活性化Ｔ細胞の数の増加、またはこれらの組み合わせによって決定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記臨床転帰が、腫瘍退縮、腫瘍縮小、腫瘍壊死、免疫系による抗腫瘍応答、腫瘍拡大、再発もしくは拡大、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記がんが、高い突然変異荷重を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記がんが、
非小細胞肺癌、黒色腫、卵巣癌、頸部癌、神経膠芽細胞腫、泌尿生殖器癌、婦人科癌、肺癌、胃腸癌、頭頸部癌、非転移性または転移性乳癌、悪性黒色腫、メルケル細胞癌または骨および軟組織肉腫、血液新生物、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群および急性リンパ芽球性白血病、乳癌、転移性結腸直腸癌、ホルモン感受性またはホルモン抵抗性前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、肝細胞癌、胆管細胞癌、頭頸部扁平上皮癌軟部組織肉腫、および小細胞肺がんからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
対象において複数の不均一な過剰増殖細胞に対する免疫応答を増強する方法であって、それを必要とする前記対象に、薬学的有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸分子のうちのいずれか、または請求項２７〜３８に記載の医薬組成物のうちのいずれかを投与することを含む、方法。
【請求項４５】
前記免疫応答が、腫瘍増殖を阻害もしくは遅らせ、腫瘍細胞死を誘導し、腫瘍退縮を誘導し、腫瘍再発を防止もしくは遅延させ、腫瘍増殖を防止し、腫瘍拡大を防止し、および／または腫瘍除去を誘導するのに十分な大きさまたは効力のものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
１つ以上の治療薬の投与をさらに含む、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記追加の治療薬が生物学的治療薬または小分子である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記治療薬が、（ｉ）チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメント、または（ｉｉ）チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸分子である、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、およびＢ−７ファミリーリガンド、ＩＤＯ阻害剤、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるチェックポイントタンパク質と会合するか、またはそれを阻害する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記チェックポイント阻害剤が、プログラム死−１（ＰＤ−１）経路の阻害剤である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記チェックポイント阻害剤が、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）抗体またはその機能的フラグメントである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記治療薬が、アジュバントである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記アジュバントが、（ｉ）ポリＩＣＬＣ、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ  ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ  １ＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、一リン酸リピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ１３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡマイクロ粒子、レシキモド、Ｓ  Ｌ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルアン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、アクリルもしくはメタクリルポリマー、無水マレイン酸のコポリマーおよびＡｑｕｉｌａのＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、ならびにそれらのいずれかの機能的フラグメント、または（ｉｉ）（ｉ）ポリＩＣＬＣ、１０１８ＩＳＳからなる群から選択されるアジュバントをコードする核酸分子、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ  ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ  １ＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、モノホスホリフリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ１３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡ微粒子、レシキモド、Ｓ  Ｌ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルアン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、アクリルまたはメタクリルポリマー、無水マレイン酸のコポリマーおよびＡｑｕｉｌａのＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、またはそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記治療薬が、免疫賦活剤またはその機能的フラグメントである、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項５５】
前記免疫賦活剤が、インターロイキンまたはその機能的フラグメントである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記治療薬が、化学療法剤である、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が、がんを有する、請求項４４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記対象が、チェックポイント阻害剤療法に応答しなかった、請求項４４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記核酸分子が、エレクトロポレーションによって前記対象に投与される、請求項３９〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
対象において免疫応答を誘導する方法であって、それを必要とする前記対象に、薬学的有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸分子のうちのいずれか、または請求項２７〜３８に記載の医薬組成物のうちのいずれかを投与することを含む、方法。
【請求項６１】
前記免疫応答が、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を誘導することが、０．０１％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を誘導することが、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖することを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
対象において免疫応答を増強する方法であって、それを必要とする前記対象に、薬学的有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸分子のうちのいずれか、または請求項２７〜３８に記載の医薬組成物のうちのいずれかを投与することを含む、方法。
【請求項６５】
前記免疫応答が、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することが、０．０１％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することが、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖することを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
対象において１つ以上の対象特異的ＤＮＡネオ抗原突然変異を識別する方法であって、前記対象が、複数のネオ抗原突然変異の存在または量によって特徴付けられるがんを有し、前記方法が、
前記対象の腫瘍および前記対象の非腫瘍試料からの核酸試料を配列決定することと、
前記配列を分析して、コーディング領域および非コーディング領域を決定することと、
前記非腫瘍試料に存在しない腫瘍特異的非同義または非サイレント変異を含む配列を識別することと、
単一ヌクレオチド変異、ならびに単一ヌクレオチド挿入および欠失を識別することと、
前記非腫瘍試料には存在しない前記腫瘍特異的非同義または非サイレント突然変異を含む前記配列によってコードされる対象特異的ペプチドを産生することと、
前記対象特異的ペプチドの結合特性を測定することと、を含み、
各対象特異的ペプチドは、前記非腫瘍試料には存在しない対象特異的ＤＮＡネオ抗原の発現産物であり、
それにより、対象において１つ以上の対象特異的ＤＮＡネオ抗原を識別する、方法。
【請求項６９】
前記対象特異的ペプチドの結合特性を測定することは、
前記対象特異的ペプチドのＴ細胞受容体への結合を測定すること、
前記対象のＨＬＡタンパク質への前記対象特異的ペプチドの結合を測定すること、または
抗原処理に関連するトランスポーター（ＴＡＰ）への前記対象特異的ペプチドの結合を測定すること、のうちの１つ以上によって実行される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記対象特異的ペプチドが、約５００ｎＭ未満のＩＣ５０で前記対象のＨＬＡタンパク質に結合する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記結合特性に基づいて前記対象特異的ペプチドをランク付けするステップをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記対象特異的ペプチドによって生成されるＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を測定するステップをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記対象に投与するための免疫原性組成物中に前記対象特異的ＤＮＡネオ抗原を製剤化することをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
約２００のランク付けされたネオ抗原突然変異が、前記免疫原性組成物に含まれる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
前記対象から取得された樹状細胞を含む培養物を提供することと、
前記樹状細胞を前記免疫原性組成物と接触させることと、をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７６】
前記樹状細胞を前記対象に投与することと、
前記対象からの末梢血試料からＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を取得することであって、前記ＣＤ８＋細胞が前記少なくとも１つのネオ抗原を認識する、取得することと、
前記ネオ抗原を認識する前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を増殖することと、をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖した集団を前記対象に投与することをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
がんを有すると疑われるか、またはがんと診断された対象のために個別化されたがんワクチンを作製する方法であって、
前記対象からの試料中の複数の突然変異を識別することと、
前記複数の突然変異を分析して、１つ以上のネオ抗原突然変異を識別することと、
識別されたサブセットに基づいて、個人化されたがんワクチンを産生することと、を含む、方法。
【請求項７９】
識別することが、前記がんの配列決定を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
分析することが、前記ネオ抗原突然変異に関連する１つ以上の結合特性、Ｔ細胞受容体への前記対象特異的ペプチドの結合からなる群から選択される結合特性、前記対象のＨＬＡタンパク質への前記対象特異的ペプチドの結合および抗原プロセシングに関連するトランスポーター（ＴＡＰ）への前記対象特異的ペプチドの結合を決定することと、
前記決定された特性に基づいて、前記ネオ抗原突然変異の各々をランク付けすることと、をさらに含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記１つまたは複数のネオ抗原突然変異をコードする核酸配列を核酸分子にクローニングすることをさらに含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記核酸分子が、プラスミドである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記核酸分子が、ｐＧＸ４５０１、ｐＧＸ４５０３、ｐＧＸ  ４５０４、ｐＧＸ４５０５、およびｐＧＸ４５０６からなる群から選択されるプラスミドのマルチクローニングサイト内に配置される式Ｉの核酸配列を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
ｎが、約２５〜約６０の任意の正の整数である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８５】
ｎが、約３５〜約５０の任意の正の整数である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８６】
ｎが、約４０〜約５０の任意の正の整数である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８７】
ｎが、４０、５０、または５５である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８８】
（ｉ）請求項８４に記載の核酸分子を含む第１の核酸分と、（ｉｉ）ＩＬ−１２またはその機能的フラグメントをコードするコード配列を含む第２の核酸分子と、（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項８９】
前記第１の核酸分子が、約４０〜約５０の抗原発現ドメインを含む、請求項８８に記載の医薬組成物。
【請求項９０】
各抗原発現ドメインが、少なくとも１つのフューリンリンカーによって分離されている、請求項８９に記載の医薬組成物。
【請求項９１】
前記抗原発現ドメインが、少なくとも１０個のネオ抗原と、ネオ抗原ではない少なくとも１０個の腫瘍抗原と、を含む、請求項８９に記載の医薬組成物。
【請求項９２】
前記抗原発現ドメインが、少なくとも２０個のネオ抗原と、ネオ抗原ではない少なくとも２０個の腫瘍抗原と、を含む、請求項９１に記載の医薬組成物。
【請求項９３】
ネオ抗原ではない少なくとも２０個の腫瘍抗原が、サバイビン、ＭＡＧＥＡ１０、ｇｐ１００、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、カルレティキュリン、およびＷＴ１から選択されるアミノ酸をコードする核酸配列の少なくとも１つまたはその組み合わせを含む、請求項８２に記載の医薬組成物。
【請求項９４】
前記抗原発現ドメインが、対象に由来する少なくとも２０個のネオ抗原を含む、請求項９１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ワクチン、ワクチンの構成要素である核酸配列、ならびに対象において抗原特異的免疫応答を誘導するためにそれを製造および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、自然免疫系と獲得免疫系の２つの機能サブシステムに分類できる。自然免疫システムは、感染に対する防御の第一線であり、ほとんどの潜在的な病原体は、例えば、顕著な感染を引き起こす前に、このシステムによって迅速に中和され得る。獲得免疫系は、侵入する生物の抗原と呼ばれる分子構造と反応する。獲得免疫反応には、体液性免疫反応と細胞性免疫反応の２種類がある。体液性免疫反応では、Ｂ細胞から体液に分泌される抗体が病原体由来の抗原に結合し、例えば補体を介した溶解などの様々なメカニズムで病原体の排除をもたらす。細胞性免疫反応では、他の細胞を破壊することができるＴ細胞が活性化される。例えば、疾患に関連するタンパク質が細胞内に存在する場合、それらは細胞内のペプチドにタンパク質分解的にフラグメント化される。次いで、特定の細胞タンパク質は、このように形成された抗原またはペプチドに付着し、それらを細胞の表面に輸送し、そこでそれらは生体の分子防御機構、特にＴ細胞に提示される。細胞傷害性Ｔ細胞はこれらの抗原を認識し、その抗原を持っている細胞を殺傷する。
【０００３】
ペプチドを輸送して細胞表面に提示する分子は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質と呼ばれる。ＭＨＣタンパク質は、ＭＨＣクラスＩとＭＨＣクラスＩＩの２つのタイプに分類される。２つのＭＨＣクラスのタンパク質の構造は非常に類似しているが、機能は大きく異なる。ＭＨＣクラスＩのタンパク質は、ほとんどの腫瘍細胞を含む、生体のほぼ全ての細胞の表面に存在する。ＭＨＣクラスＩタンパク質には、通常、内因性タンパク質または細胞内に存在する病原体に由来する抗原がロードされ、次いでナイーブまたは細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に提示される。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、樹状細胞、Ｂリンパ球、マクロファージ、他の抗原提示細胞に存在する。それらは主に、外部の抗原源から、すなわち細胞の外部で処理されるペプチドをＴヘルパー（Ｔｈ）細胞に提示する。ＭＨＣクラスＩタンパク質が結合するペプチドのほとんどは、生物自体の健康な宿主細胞で産生される細胞質タンパク質に由来し、通常は免疫反応を刺激しない。したがって、そのような自己ペプチドを提示するクラスＩのＭＨＣ分子を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、胸腺で削除されるか（中枢性寛容）、胸腺から放出された後、削除または不活性化、すなわち、寛容化される（末梢性寛容）。ＭＨＣ分子は、寛容化されていないＴリンパ球にペプチドを提示すると、免疫反応を刺激することができる。細胞傷害性Ｔリンパ球は、その表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と表面抗原分類（ＣＤ）分子の両方を有する。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣクラスＩの分子と複合体形成したペプチドを認識して結合することができる。各細胞傷害性Ｔリンパ球は、特異的なＭＨＣ／ペプチド複合体に結合できる固有のＴ細胞受容体を発現する。
【０００４】
ペプチド抗原は、細胞表面に提示される前に、小胞体内の競合的親和性結合によってＭＨＣクラスＩの分子に付着する。ここで、個々のペプチド抗原の親和性は、そのアミノ酸配列と、アミノ酸配列内の定義された位置にある特異的結合モチーフの存在に直接関連している。そのようなペプチドの配列が知られている場合、例えば、ペプチドワクチンを使用して、疾患を有する細胞に対する免疫系を操作することが可能である。
【０００５】
治癒的で腫瘍特異的な免疫療法を開発する上での重要な障壁の１つは、自己免疫を回避するための非常に特異的で制限された腫瘍抗原の識別と選択である。ＭＨＣに提示される腫瘍特異的な体細胞変異に由来するエピトープであるがんネオ抗原は、個人化された免疫療法の有望な標的として浮上している。これらのエピトープは、次の理由により、共有され、過剰発現された腫瘍関連自己抗原と比較して、より強力な免疫療法の標的であると考えられている：ｉ）それらがヒトのがんに高い頻度で存在すること（成人の一般的な固形腫瘍について、約３３〜１６３の発現した非同義変異の範囲（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０−）．２０１３；３３９：１５４６−５８））、ｉｉ）正常な体細胞組織での発現の欠如、ならびにｉｉｉ）中枢性および末梢性寛容の欠如により免疫原性の可能性が高い。実際、効果的な免疫チェックポイント阻害療法は、腫瘍ネオ抗原の特異的標的化と関連している（Ｇｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１４；５１５：５７７−８１；ＭｃＧｒａｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６；３５１：１４６３−９）。しかしながら、同じ免疫原性ネオ抗原が複数の患者で共有されることはめったにない（Ｒｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１８）。したがって、このタイプの治療法は高度に個人化されており、迅速で効率的かつ手頃な価格の配列決定および製造プロセスが必要である。さらに、これらの変異の大部分はパッセンジャー変異であり、悪性腫瘍のドライバーではなく、したがって、腫瘍エスケープの可能性が高い。
【０００６】
２０１７年には、推定で１，６８８，７８０件の新しいがん症例が診断され、米国では６００，９２０件のがんによる死亡があった。過去数十年にわたって、がんの検出、診断、および治療に大幅な改善が見られ、多くの種類のがんの生存率が大幅に向上した。がんによる死亡数（がんによる死亡率）は、男性と女性の年間１０万人あたり１７１．２人（２００８年から２０１２年の死亡に基づく）であり、これはがんを米国の主要な死因の１つにしている。
【０００７】
既存のがん療法には、切除技法（例えば、外科的処置、極低温／熱処理、超音波、高周波、および放射線）ならびに化学的技法（例えば、薬剤、細胞傷害／化学療法剤、モノクローナル抗体、およびそれらの様々な組み合わせ）が含まれる。残念ながら、そのような治療法はしばしば深刻なリスク、有毒な副作用、および非常に高いコスト、ならびに不確実な有効性と関連している。
【０００８】
がんワクチンは典型的に、腫瘍抗原と免疫刺激分子（例えば、サイトカインまたはＴＬＲリガンド）で構成されており、これらが連携して、腫瘍細胞を標的にして破壊する抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する。現在のがんワクチンは典型的に、多くの個人に見られる腫瘍で選択的に発現または過剰発現する天然タンパク質（すなわち、個人において全ての正常細胞のＤＮＡによってコードされるタンパク質）である共有腫瘍抗原を含んでいる。このような共有腫瘍抗原は特定のタイプの腫瘍を識別するのに有用であるが、自己寛容の免疫抑制効果を受けるため、特定の腫瘍タイプに対するＴ細胞応答を標的とする免疫原としては理想的ではない。
ポリ（Ｉ：Ｃ）とともに送達される合成の長いペプチド（１５−３０ｍｅｒ）、短いＨＬＡクラスＩ拘束ペプチドをロードした樹状細胞、または長い（２７ｍｅｒ）ネオエピトープペプチドをコードするＲＮＡワクチンを使用した初期の臨床試験では、送達された変異エピトープのかなりの部分に対する免疫応答を示した（Ｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ；２０１７；５４７：２１７−２１；Ｓａｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ；２０１７；５４７：２２２−６；Ｃａｒｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３４８：８０３−８）。ＲＮＡまたは合成の長いペプチドによって引き起こされるこれらの応答の大部分は、これらの初期の臨床研究と前臨床マウス研究の両方でＭＨＣクラスＩＩ拘束されていた（マウスで７０〜９５％、ヒトで７２．５〜７９％）（Ｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１７；Ｓａｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１７；Ｋｒｅｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ；２０１５；５２０：６９２−６；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１６；１１）。ＣＤ４＋Ｔ細胞応答のこの強力な誘導は、エピトープが高いＭＨＣＩ結合親和性についてｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで選択されたという事実にもかかわらず発生する（Ｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１７；Ｓａｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１７；Ｋｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０−）．２０１３；３３９：１５４６−５８
【非特許文献２】Ｇｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１４；５１５：５７７−８１
【非特許文献３】ＭｃＧｒａｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６；３５１：１４６３−９
【非特許文献４】Ｒｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１８
【非特許文献５】Ｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ；２０１７；５４７：２１７−２１
【非特許文献６】Ｓａｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ；２０１７；５４７：２２２−６
【非特許文献７】Ｃａｒｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３４８：８０３−８
【非特許文献８】Ｋｒｅｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ；２０１５；５２０：６９２−６
【非特許文献９】Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１６；１１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、ＲＮＡおよびペプチドワクチンプラットフォームによって生成される免疫応答よりも大きな割合で、ネオ抗原に対して強力なＭＨＣクラスＩ拘束免疫応答を生成することができるネオ抗原をコードするＤＮＡワクチンの開発を記載している。ネオ抗原を標的とした免疫療法は、患者の特定の腫瘍にマッピングされた、明確に定義された特定の腫瘍抗原の特異的な活性化に基づいている。これらは、腫瘍で発現し、その患者の免疫系に提示されることが示されている抗原であり、したがって、自然免疫の広範な活性化からの非特異的／バイスタンダー標的化のリスクなしに、患者の腫瘍を特異的に標的とする。
【００１１】
本開示に記載されているＤＮＡワクチンは、驚くべきことに、免疫原性エピトープに対してはるかに大きな割合のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成する。本開示は、免疫原性エピトープのより大きな割合のために選択され、１００％のＣＤ８＋またはＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのために選択された高親和性ＭＨＣクラスＩエピトープのみの包含を初めて記載する。さらに、本開示は、ネオ抗原をコードするＤＮＡワクチンが治療環境においてｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖を制御することができ、免疫化マウスから増殖したＴ細胞がｅｘ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞を殺傷することができることを初めて記載した。したがって、本開示に記載されているネオ抗原を標的とするＤＮＡワクチンは、他のワクチンプラットフォームの制限の多くを克服することができ、効果的な免疫療法アプローチのために他のプラットフォームと相乗的に作用することが可能であり得る。
【００１２】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、式Ｉ：［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］を含む核酸配列を含み、式中、ＡＥＤは、発現可能な核酸配列を含む抗原発現ドメインである。各リンカーは、約０〜約１２５の長さの、天然または非天然の核酸から独立して選択可能である。抗原発現ドメイン１は、約２４〜約２５０ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、エピトープをコードする。抗原発現ドメイン２は、約２４〜約２５０ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、エピトープをコードし、ｎは、約１〜約５００の任意の正の整数である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、抗原発現ドメイン１および抗原発現ドメイン２は、約２０〜約２０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、抗原発現ドメイン１または抗原発現ドメイン２は、約５０〜約１０，０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、ｎは、約６〜約２６の任意の正の整数である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、抗原発現ドメイン１および／または抗原発現ドメイン２は、約１５〜約１５０、約１５〜約１００、または約１５〜約５０ヌクレオチドの長さから独立して選択可能である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ｎは、約５〜約３０、約２〜約１００、約２〜約５８、または約２〜約２９の正の整数である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、約１５〜約３００ヌクレオチドを含み、切断部位をコードする。任意選択的に、少なくとも１つのリンカーは、フューリンプロテアーゼ切断部位またはブタテッショウウイルス−１２Ａ（Ｐ２Ａ）切断部位を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、約１５〜約３００ヌクレオチドを含み、切断部位をコードし、式Ｉは、少なくとも第１のリンカーおよび第２のリンカーを含み、第１および第２のリンカーは、フューリンプロテアーゼ切断部位を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、約１５〜約３００ヌクレオチドを含み、切断部位をコードし、ｎは、約５〜約５０の正の整数であり、各リンカーは、フューリンプロテアーゼ切断部位を含む。この実施形態の核酸分子は、少なくとも１つの制御配列をさらに含み得、ここで、式Ｉの少なくとも１つの核酸配列は、制御配列に作動可能に連結されている。
【００２０】
いくつかの実施形態では、抗原発現ドメイン１は、約１２〜約１５，０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、対象からの１つまたは複数のがん細胞由来のエピトープをコードする。抗原発現ドメイン２は、約１２〜約１５，０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、対象からの１つまたは複数のがん細胞由来のエピトープをコードする。
【００２１】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、１つまたは複数の抗原発現ドメインによってコードされる任意の１つまたは複数のアミノ酸配列に対して、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発するのに十分な量である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＩｇＥリーダー配列などのリーダー配列をさらに含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、核酸分子はプラスミドである。いくつかの実施形態では、式Ｉの核酸配列は（ｉ）ＬＬＣ、ＴＣ１、ＩＤ８、ｐＧＸ４５０１、ｐＧＸ４５０３、ｐＧＸ４５０４、ｐＧＸ４５０５、およびｐＧＸ４５０６からなる群から選択されるプラスミド、または（ｉｉ）ＬＬＣ、ＴＣ１、ＩＤ８、ｐＧＸ４５０１、ｐＧＸ４５０３、ｐＧＸ４５０４、ｐＧＸ４５０５、およびｐＧＸ４５０６からなる群から選択されるプラスミドと少なくとも７０％の相同性を有するプラスミドのマルチクローニングサイトに配置される。宿主細胞はそのようなプラスミドで形質転換できることを理解されたい。
【００２４】
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の１つまたは複数の核酸分子を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ｉ）本明細書に記載の核酸分子のいずれかのうちの１つもしくは複数、またはその薬学的に許容される塩と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、を含む。任意選択的に、医薬組成物は、生物学的治療薬または小分子などの１つ以上の治療薬をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、治療薬のうちの１つは、（ｉ）チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメント、または（ｉｉ）チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸配列である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメントは、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、およびＢ−７ファミリーリガンド、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるチェックポイントタンパク質と会合するか、またはそれを阻害する。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、プログラム死−１（ＰＤ−１）経路の阻害剤である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）抗体である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的有効量の（ｉ）本明細書に記載の核酸配列のいずれか、または本明細書に記載のいずれかの核酸分子もしくはその薬学的に許容される塩に対して、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相同である核酸配列のうちの１つまたは複数と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、治療薬は、アジュバントまたはその機能的フラグメントである。いくつかの実施形態では、アジュバントまたはその機能的フラグメントは、（ｉ）ポリＩＣＬＣ、１０１８ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ  ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ  １ＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、一リン酸リピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ１３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡマイクロ粒子、レシキモド、Ｓ  Ｌ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルアン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、アクリルもしくはメタクリルポリマー、無水マレイン酸のコポリマーおよびＡｑｕｉｌａのＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、ならびにそれらのいずれかの機能的フラグメント、または（ｉｉ）ポリＩＣＬＣ、１０１８  ＩＳＳからなる群から選択されるアジュバントをコードする核酸分子、Ａｍｐｌｉｖａｘ  ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ  １ＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、モノホスホリフリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ１３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、レシキモド、Ｓ  Ｌ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルアン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、およびＡｑｕｉｌａのＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、またはそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される。ＩＬ−１２、ＩＬ−１５（タンパク質もしくはプラスミドもしくはＮＡ）
【００２７】
いくつかの実施形態では、治療薬は、（ｉ）免疫賦活剤もしくはその機能的フラグメント、または（ｉｉ）免疫賦活剤もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸配列である。いくつかの実施形態では、免疫賦活剤は、インターロイキンまたはその機能的フラグメントである。いくつかの実施形態では、治療薬は、（ｉ）化学療法薬もしくはその機能的フラグメント、または（ｉｉ）化学療法薬もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸配列である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、対象においてがんを治療および／または予防する方法は、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、本開示に記載される、核酸分子のうちのいずれか、または医薬組成物のうちのいずれかを投与することを含む。いくつかの実施形態では、治療は、臨床転帰、Ｔ細胞による抗腫瘍活性の増加、増強、もしくは延長、治療前の数と比較した抗腫瘍Ｔ細胞もしくは活性化Ｔ細胞の数の増加、またはこれらの組み合わせによって決定される。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍退縮、腫瘍縮小、腫瘍壊死、免疫系による抗腫瘍応答、腫瘍拡大、再発もしくは拡大、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がんは高い突然変異荷重を有する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、がんは、非小細胞肺癌、黒色腫、卵巣癌、頸部癌、神経膠芽細胞腫、泌尿生殖器癌、婦人科癌、肺癌、胃腸癌、頭頸部癌、非転移性または転移性乳癌、悪性黒色腫、メルケル細胞癌または骨および軟組織肉腫、血液新生物、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群および急性リンパ芽球性白血病、乳癌、転移性結腸直腸癌、ホルモン感受性またはホルモン抵抗性前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、肝細胞癌、胆管細胞癌、頭頸部扁平上皮癌軟部組織肉腫、および小細胞肺がんからなる群から選択される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、対象において複数の不均一な過剰増殖性細胞に対する免疫応答を増強する方法は、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、本開示に記載される核酸分子のうちのいずれか、または医薬組成物のうちのいずれかを投与することを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答は、腫瘍増殖を阻害もしくは遅延らせ、腫瘍細胞死を誘導し、腫瘍退縮を誘導し、腫瘍再発を防止もしくは遅延させ、腫瘍増殖を防止し、腫瘍拡大を防止し、および／または腫瘍除去を誘導するのに十分な大きさまたは効力のものである。
【００３１】
いくつかの実施形態では、対象において複数の不均一な過剰増殖細胞に対する免疫応答を増強することは、本明細書に開示される、１つ以上の治療薬の投与をさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、生物学的治療薬または小分子である。いくつかの実施形態では、治療薬は、（ｉ）チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメント、または（ｉｉ）チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸分子である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、およびＢ−７ファミリーリガンド、ＩＤＯ阻害剤、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるチェックポイントタンパク質と結合するか、またはそれを阻害する。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、プログラム死−１（ＰＤ−１）経路の阻害剤である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）抗体またはその機能的フラグメントである。いくつかの実施形態では、治療薬は、本明細書に開示されるアジュバント、または免疫賦活剤もしくはその機能的フラグメントから選択される。いくつかの実施形態では、免疫賦活剤は、インターロイキンまたはその機能的フラグメントである。いくつかの実施形態では、治療薬は化学療法薬である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、対象はがんを有している。いくつかの実施形態では、対象は、チェックポイント阻害剤療法に応答していない。
【００３３】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、エレクトロポレーションによって対象に投与される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、対象において免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、本開示に記載の核酸分子のうちのいずれか、または医薬組成物のうちのいずれかを投与することを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を誘導することは、０．０１％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を誘導することは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖することを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、対象において免疫応答を増強する方法は、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、本明細書に開示される核酸分子のうちのいずれか、または医薬組成物のうちのいずれかを投与することを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、０．０１％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖することを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、対象において１つ以上の対象特異的ＤＮＡネオ抗原突然変異を識別する方法であって、対象が、複数のネオ抗原突然変異の存在または量によって特徴付けられるがんを有し、方法が、
対象の腫瘍および対象の非腫瘍試料からの核酸試料を配列決定することと、
配列を分析して、コーディング領域および非コーディング領域を決定することと、
非腫瘍試料に存在しない腫瘍特異的非同義または非サイレント変異を含む配列を識別すること、
単一ヌクレオチド変異、ならびに単一ヌクレオチド挿入および欠失を識別することと、
非腫瘍試料には存在しない腫瘍特異的非同義または非サイレント突然変異を含む配列によってコードされる対象特異的ペプチドを産生することと、
対象特異的ペプチドの結合特性を測定することと、を含み、
各対象特異的ペプチドは、非腫瘍試料には存在しない対象特異的ＤＮＡネオ抗原の発現産物であり、
それにより、対象において１つま以上の対象特異的ＤＮＡネオ抗原を識別する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、対象特異的ペプチドの結合特性を測定するステップは、
対象特異的ペプチドのＴ細胞受容体への結合を測定すること、
対象のＨＬＡタンパク質への対象特異的ペプチドの結合を測定すること、または
抗原処理に関連するトランスポーター（ＴＡＰ）への対象特異的ペプチドの結合を測定すること、のうちの１つ以上によって実行される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、対象特異的ペプチドは、約５００ｎＭ未満のＩＣ５０で対象のＨＬＡタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、結合特性に基づいて対象特異的ペプチドをランク付けするステップ。いくつかの実施形態では、この方法は、対象特異的ペプチドによって生成されるＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を測定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、対象に投与するための免疫原性組成物中に対象特異的ＤＮＡネオ抗原を製剤化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、約２００のランク付けされたネオ抗原突然変異が免疫原性組成物に含まれる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、この方法は、対象から得られた樹状細胞を含む培養物を提供するステップと、樹状細胞を免疫原性組成物と接触させるステップと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、樹状細胞を対象に投与するステップと、対象からの末梢血試料からＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を取得するステップであって、ＣＤ８＋細胞が少なくとも１つのネオ抗原を認識する、取得するステップと、ネオ抗原を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を増殖するステップと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖した集団を対象に投与することをさらに含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、がんを有すると疑われるか、またはがんと診断された対象のために個別化されたがんワクチンを作製する方法は、
対象からの試料中の複数の突然変異を識別することと、
複数の突然変異を分析して、１つ以上のネオ抗原突然変異を識別することと、
識別されたサブセットに基づいて、個人化されたがんワクチンを産生することと、を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、識別するステップは、がんを配列決定することを含む。いくつかの実施形態では、分析するステップは、ネオ抗原突然変異に関連する１つ以上の結合特性、Ｔ細胞受容体への対象特異的ペプチドの結合からなる群から選択される結合特性、対象のＨＬＡタンパク質への対象特異的ペプチドの結合および抗原プロセシングに関連するトランスポーター（ＴＡＰ）への対象特異的ペプチドの結合を決定することと、決定された特性に基づいて、ネオ抗原突然変異の各々をランク付けすることと、をさらに含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のネオ抗原突然変異をコードする核酸配列を、プラスミドなどの核酸分子にクローニングすることを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ｐＧＸ４５０１、ｐＧＸ４５０３、ｐＧＸ  ４５０４、ｐＧＸ４５０５、およびｐＧＸ４５０６からなる群から選択されるプラスミドのマルチクローニングサイト内に配置される式Ｉの核酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ】ＤＮＡワクチンのネオエピトープドデカマーが頻繁な免疫応答を誘導することを示す。図１Ａ．実験のセットアップ。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、ＬＬＣ、ＴＣ１、またはＩＤ８腫瘍細胞を皮下（ＬＬＣおよびＴＣ１）または腹膜（ＩＤ８）に移植した。ＲＮＡおよびＤＮＡの単離および配列決定のために、移植の３週間後に腫瘍および正常な尾組織を採取した。変異は、正常組織との比較を通じて識別された。図１Ｂ．示されたＭＨＣクラスＩ親和性（ＮｅｔＭＨＣｏｎｓ  ｖ１．１）で腫瘍タイプごとに識別された変異の数。ＲＮＡ−ｓｅｑ≧１、プロテアソーム切断スコア≧１０、およびＴＡＰプロセッシングスコア≦０．５でＡｌｔ対立遺伝子深度で発現した場合、変異が含められた。図１Ｃ．プラスミドＤＮＡの設計。予測された９ｍｅｒのエピトープは、両側に１２個のアミノ酸が隣接していた。各エピトープは、フューリン切断部位によって分離されていた。図１Ｄ．マウスを２５μｇのＤＮＡで各プラスミドで免疫し（ｎ＝５マウス／群）、続いて２週間間隔で３回エレクトロポレーション（ＥＰ）し、最終免疫の１週間後にＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔおよびフローサイトメトリー分析のために屠殺した。図１Ｅ．各腫瘍タイプに対して免疫応答（＞５０ＳＦＵ／百万脾細胞）を生成したエピトープのパーセンテージ。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図１Ｄ】同上。
【図１Ｅ】同上。
【図２Ａ】図２ＡはＬＬＣプラスミド＃１のヌクレオチド配列を示し、図２ＢはＬＬＣプラスミド＃１のアミノ酸配列を示す。図２Ｃは、ＬＬＣプラスミド＃２のヌクレオチド配列を示し、図２Ｄは、ＬＬＣプラスミド＃２のアミノ酸配列を示す。図２Ｅは、ＬＬＣプラスミド＃１のヌクレオチド配列を示し、図２Ｆは、ＬＬＣプラスミド＃３のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【図２Ｄ】同上。
【図２Ｅ】同上。
【図２Ｆ】同上。
【図３Ａ】図３ＡはＴＣ１プラスミド＃１のヌクレオチド配列を示し、図３ＢはＴＣ１プラスミド＃１のアミノ酸配列を示す。図３Ｃは、ＴＣ１プラスミド＃２のヌクレオチド配列を示し、図３Ｄは、ＴＣ１プラスミド＃２のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図３Ｄ】同上。
【図４Ａ】図４ＡはＩＤ８プラスミド＃１のヌクレオチド配列を示し、図４ＢはＩＤ８プラスミド＃１のアミノ酸配列を示す。図４Ｃは、ＩＤ８プラスミド＃２のヌクレオチド配列を示し、図４Ｄは、ＩＤ８プラスミド＃２のアミノ酸配列を示す。
【図４Ｂ】同上。
【図４Ｃ】同上。
【図４Ｄ】同上。
【図５】腫瘍細胞株におけるｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏでのネオ抗原遺伝子発現の対立遺伝子頻度を示す。ｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｃ５７Ｂｌ／６で腫瘍を形成）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（細胞培養フラスコで２Ｄで成長）で増殖するＴＣ１、ＩＤ８、およびＬＬＣ腫瘍細胞株における変異遺伝子の対立遺伝子頻度。
【図６Ａ】ネオ抗原に対するＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の応答を示す。図６Ａ〜図６Ｆは、対応するネオ抗原特異的ペプチドで５時間刺激された、対照（ｐＶａｘ）またはネオ抗原免疫化マウスから単離された脾細胞の細胞内サイトカイン染色を示す。示されているのは、ＩＦＮγ＋（図６Ａ）、ＴＮＦα＋（図６Ｂ）およびＩＬ−２＋（図６Ｃ）であるＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびにＩＦＮγ＋（図６Ｄ）、ＴＮＦα＋（図６Ｅ）、およびＩＬ−２＋（図６Ｆ）であるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージである。群あたりＮ＝５のマウス。有意性は、両側スチューデントのｔ検定を使用して計算された。エラーバーは±ＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。
【図６Ｄ】同上。
【図６Ｅ】同上。
【図６Ｆ】同上。
【図７Ａ】ＤＮＡワクチンが主にネオ抗原に対するＣＤ８Ｔ細胞応答を生成することを示す。図７Ａは、有意な免疫応答（＞５０ＳＦＵ／百万脾細胞、ｐＶａｘ免疫化マウスと比較して統計的に有意に大きい応答）を生成した各エピトープに対するＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ応答のグラフである。赤いバーはＣＤ８＋Ｔ細胞のみの応答を示し、青いバーはＣＤ４＋Ｔ細胞のみの応答を示し、紫色のバーはＣＤ８＋とＣＤ４＋Ｔ細胞の両方である応答を示す。図７Ｂおよび図７Ｃは、Ｓｇｓｍ２（図７Ｂ）またはＬｔａ４ｈ（図７Ｃ）を含むＴＣ１プラスミドで免疫化されたマウスからのフローサイトメトリーデータの例を示す。ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞に対するＩＦＮγおよびＴＮＦα応答が示される。図７Ｄは、ＭＨＣクラスＩ親和性（ＮｅｔＭＨＣＣｏｎｓ  ｖ１．１）に従って表示された（図７Ａ）からのＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ応答を示す。赤いバーは高親和性（＜５００ｎＭ）を示し、オレンジ色のバーは中程度の親和性（５００ｎＭ〜２０００ｎＭ）を示し、黄色のバーは低親和性（＞２０００ｎＭ）を示す。図７Ｅは、ＣＤ４対ＣＤ８Ｔ細胞応答を生成するエピトープのパーセンテージを、ＭＨＣクラスＩ親和性に従って組織化して示す。示されている全てのデータは±ＳＥＭである。群あたりＮ＝５のマウス。
【図７Ｂ】同上。
【図７Ｃ】同上。
【図７Ｄ】同上。
【図７Ｅ】同上。
【図８Ａ】ネオ抗原に対する多機能Ｔ細胞応答を示す。図８Ａ〜図８Ｆは、図６に示されるデータの多機能サイトカイン分析を示す。示されているのは、ＩＦＮγ、Ｔ−ｂｅｔ、およびＣＤ１０７ａを共発現するＣＤ８＋Ｔ細胞（図８Ａ）、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを共発現するＣＤ８＋Ｔ細胞（図８Ｂ）、ならびにＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ−２を共発現するＣＤ８＋Ｔ細胞（図５Ｃ）のパーセンテージである。同様に、ＩＦＮγ、Ｔ−ｂｅｔ、およびＣＤ１０７ａを共発現するＣＤ４＋Ｔ細胞（図８Ｄ）、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを共発現するＣＤ８＋Ｔ細胞（図８Ｅ）、ならびにＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ−２を共発現するＣＤ８＋Ｔ細胞（図８Ｆ）のパーセンテージも示される。群あたりＮ＝５のマウス。有意性は、両側スチューデントのｔ検定を使用して計算された。エラーバーは±ＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図８Ｂ】同上。
【図８Ｃ】同上。
【図８Ｄ】同上。
【図８Ｅ】同上。
【図８Ｆ】同上。
【図９Ａ】ネオ抗原応答のＭＨＣＩＩ予測を示す。ＳＭＭアライン法（ｎｅｔＭＨＣＩＩ−１．１、図９Ａ）またはＮＮアライン法（ｎｅｔＭＨＣＩＩ−２．２、図９Ｂ）を使用して予測された、ＭＨＣクラスＩＩ親和性に従って編成されたＣＤ４対ＣＤ８Ｔ細胞応答を生成するエピトープのパーセンテージ。
【図９Ｂ】同上。
【図１０Ａ】ほとんどのネオ抗原応答が野生型ペプチドではなく変異ペプチドに特異的であることを示す。図１０Ａは、変異したネオ抗原エピトープ（ＭＵＴ）に対するＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ応答と、対応する野生型の非変異エピトープ（ＷＴ）に対する応答との比較を示す。図１０Ｂ．ＭＵＴとＷＴエピトープ（ＭＵＴ／ＷＴ）への応答間の倍率変化の観点から表されたＡからのデータ。赤いバーは応答が２倍以上増加したエピトープを示し、オレンジ色のバーは応答が１．５倍以上増加したエピトープを示し、青いバーは応答が１．５倍以上変化したエピトープを示し、緑のバーは応答が１．５倍以上減少したエピトープを示す。群あたりＮ＝５のマウス。エラーバーは±ＳＥＭを示す。
【図１０Ｂ】同上。
【図１１Ａ】ＤＮＡワクチンでプライミングされたＴ細胞が変異細胞を選択的に殺傷することを示す。図１１Ａは、Ｈｅｒｐｕｄ２およびＬｔａ４ｈ反応性Ｔ細胞の増殖から生じた、ＩＦＮｇを発現するＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。ＴＣ１プラスミドに由来するＴ細胞の細胞傷害。図１１ＢのＳｇｍｓｍ２、図１１ＣのＨｅｒｐｕｄ２、および図１１ＣのＬｔａ４ｈは、それらの対応する重複ペプチド（５μｇ／ｍｌ）で４週間増殖し、ＴＣ１またはＩＤ８腫瘍細胞のいずれかと２４時間共培養し、２４時間の共培養後のルシフェラーゼ発現によって測定された（三重、５時間のインキュベーションで同様の結果）。図１１Ｄは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖したＴＣ１細胞と比較した、ｉｎ  ｖｉｖｏで増殖したＴＣ１腫瘍におけるＳｇｍｓｍ２、Ｈｅｒｐｕｄ２、およびＬｔａ４ｈのＲＮＡ発現レベルを示す。図１１Ｅは、正常な状態で、または５０ｎｇ／ｍｌのインターフェロンガンマに曝露された後の、Ｂ１６黒色腫、ＴＣ１、ＩＤ８およびＬＬＣ腫瘍細胞におけるＭＨＣクラスＩＩの表面発現を示すフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。図１１Ｆフローサイトメトリーによって測定されたＢ１６黒色腫、ＴＣ１、ＬＬＣおよびＩＤ８におけるＭＨＣクラスＩＩのベースおよびＩＦＮγ誘導性発現を示すヒストグラム。二元配置分散分析。エラーバーは±ＳＥＭを示す。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１１Ｂ】同上。
【図１１Ｃ】同上。
【図１１Ｄ】同上。
【図１１Ｅ】同上。
【図１１Ｆ】同上。
【図１２】腫瘍細胞におけるＭＨＣクラスＩＩの表面発現。異なる濃度のインターフェロンガンマ（平均蛍光強度として測定、三重）への曝露時のＢ１６黒色腫、ＴＣ１、ＩＤ８、およびＬＬＣ腫瘍細胞株におけるＭＨＣクラスＩＩ表面発現のフローサイトメトリーによる定量化。エラーバーは±ＳＥＭを示す。
【図１３Ａ】ＴＣ１プラスミドにおける免疫優勢エピトープの欠失が、サブ優勢エピトープの免疫原性の改善をもたらさないことを示す。Ｓｇｓｍ２およびＨｅｒｐｕｄ２免疫優勢エピトープが削除されたＴＣ１プラスミド＃１（図１３Ａ）またはＬｔａ４ｈが免疫優勢エピトープが削除されたＴＣ１プラスミド＃２（図１３Ｂ）で免疫されたマウスと比較した、対照プラスミド（ｐＶａｘ）で免疫されたマウスからのＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ応答。群あたりＮ＝５のマウス。エラーバーは±ＳＥＭを示す。
【図１３Ｂ】同上。
【図１４Ａ】ＤＮＡネオ抗原ワクチンが腫瘍の進行を遅らせることを示す。図１４Ａ  腫瘍チャレンジ実験の概略図：１００，０００個のＴＣ１腫瘍細胞を皮下に移植し、７日後にＴＣ１プラスミド１、２、両方、またはｐＶａｘ空ベクターで毎週の免疫を開始した。図１４Ｂ  ＴＣ１プラスミド１、２、両方またはｐＶａｘで処理されたＴＣ１を保有するマウスの腫瘍体積。図１４Ｃ  ＴＣ１プラスミド１、２、両方またはｐＶａｘで処理されたＴＣ１を有するマウスの生存曲線（ｎ＝１０匹のマウス／群）。ログランクと二元配置分散分析。エラーバーは±ＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１４Ｂ】同上。
【図１４Ｃ】同上。
【図１５】Ｂ１６モデルに対するポリネオエピトープＤＮＡワクチンの設計の概略図を示す。ｐＧＸ４５０１およびｐＧＸ４５０３プラスミドを使用した。Ｆは、リンカー領域によってコードされるフューリン切断部位を示す。Ｐ２Ａは、リンカーによってコードされたブタテッショウウイルス１型の切断部位を示す。
【図１６】Ｂ１６に対するＤＮＡワクチンによって誘発される免疫応答を評価するための戦略を示す。メスのＣ５７／Ｂ６マウスは、ネオ抗原コンストラクト（ｎ＝８／群）または空のベクター対照（ｎ＝４）で免疫された。免疫化は０、２、および４週目に実行された。脾臓リンパ球は、完全なネオペプチド配列のペプチド（ＭＨＣ  ＩＩ）または１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチド（ＭＨＣ  Ｉ）で１８時間刺激された。ペプチドは、切断部位を含まないように設計されている。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは５週目に実行された。
【図１７】ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示すグラフのパネルを示し、試験された全長ペプチド、プールされた１５ｍｅｒペプチド、および個々のネオエピトープについて、Ｔ細胞活性化に対応するＩＦＮγ  ＳＦＵ／１０ｅ６脾細胞の量を測定する。Ｂ１６融合ネオ抗原コンストラクト（上）とＢ１６フューリン／Ｐ２Ａネオ抗原コンストラクト（下）を試験した。
【図１８】概念実証のネオ抗原研究：Ｂ１６ネオ抗原を示す。アジュバントがない場合、ｐＧＸ４５０１はマウス、特にＣＤ８エピトープであるＭ３３領域で免疫応答を誘発できる。
【図１９】Ｂ１６モデルに対するポリネオエピトープＤＮＡワクチンの設計の概略図を示す。ｐＧＸ４５０４、ｐＧＸ５４０５、およびｐＧＸ４５０６プラスミドを使用した。Ｆは、リンカーによってコードされるフューリン切断部位を示す。Ｐ２Ａは、リンカーによってコードされたブタテッショウウイルス１型の切断部位を示す。
【図２０】Ｂ１６に対するＤＮＡワクチンによって誘発される免疫応答を評価するための戦略を示す。メスのＣ５７／Ｂ６マウスは、ネオ抗原コンストラクト（ｎ＝８／群）または空のベクター対照（ｎ＝４）で免疫された。免疫化は０、２、および４週目に実行された。脾臓リンパ球は、完全なネオペプチド配列のペプチド（ＭＨＣ  ＩＩ）または１１アミノ酸が重複する１５ｍｅｒペプチド（ＭＨＣ  Ｉ）で１８時間刺激された。ペプチドは、切断部位を含まないように設計された。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは５週目に実行された。
【図２１】ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示すパネルを示し、試験された全長ペプチド、プールされた１５ｍｅｒペプチド、および個々のネオエピトープについて、Ｔ細胞活性化に対応するＩＦＮγ  ＳＦＵ／１０ｅ６脾細胞の量を測定する。ＣＴ２６融合ネオ抗原コンストラクト（上）、ＣＴ２６フューリンネオ抗原（中央）、およびＣＴ２６フューリン／Ｐ２Ａネオ抗原コンストラクト（下）を試験した。
【図２２】概念実証のネオ抗原研究：ＣＴ２６ネオ抗原を示す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、ｐＧＸ４５０１の全長ＤＮＡ配列を示す。図２３Ｂは、ｐＧＸ４５０１プラスミドマップを示す。
【図２３Ｂ】同上。
【図２４Ａ】図２４Ａは、ｐＧＸ４５０３全長ＤＮＡ配列を示す。図２４Ｂは、ｐＧＸ４５０３プラスミドマップを示す。
【図２４Ｂ】同上。
【図２５Ａ】図２５Ａは、ｐＧＸ４５０４の全長ＤＮＡ配列を示す。図２５Ｂは、ｐＧＸ４５０４プラスミドマップを示す。
【図２５Ｂ】同上。
【図２６Ａ】図２６Ａは、ｐＧＸ４５０５全長ＤＮＡ配列を示す。図２５Ｂは、ｐＧＸ４５０５プラスミドマップを示す。
【図２６Ｂ】同上。
【図２７Ａ】図２６Ａは、ｐＧＸ４５０５の全長ＤＮＡ配列を示す。図２５Ｂは、ｐＧＸ４５０５プラスミドマップを示す。
【図２７Ｂ】同上。
【図２８】２９９９塩基対のバックボーンベクタープラスミドｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａｌｉｆ．）のマップである。ＣＭＶプロモーターは、１３７〜７２４塩基に位置している。Ｔ７プロモーター／プライミング部位は、塩基６６４〜６８３にある。マルチクローニングサイトは、塩基６９６〜８１１にある。ウシＧＨポリアデニル化シグナルは、塩基８２９〜１０５３にある。カナマイシン耐性遺伝子は、塩基１２２６〜２０２０にある。ｐＵＣの起点は、２３２０〜２９９３塩基にある。
【図２９】ＤＮＡネオ抗原ワクチンが腫瘍増殖にどのように影響するかを示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを３週間間隔で３回、約２５マイクログラムのＩＤ８プラスミド１および２またはインサートなしのｐＶＡＸで免疫し、最後の免疫化の１週間後に２×１０６のＩＤ８腫瘍細胞を腹腔内注射してチャレンジした。図２９は、ＩＤ８プラスミドカクテル（２５マイクログラムのＩＤ８プラスミド１および２５マイクログラムのｉｄ  ＩＤ８プラスミド２が一緒に製剤化された）または５０マイクロラムのｐＶａｘ対照プラスミドで処理されたＩＤ８腫瘍を保持するマウスの生存分析を示す。この実験では、腹水が発生したときにマウスを安楽死させた。全ての研究で、Ｎ＝１０マウス／群。二元配置分散分析。Ｇｅｈａｎ−Ｂｒｅｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定。＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１
【図３０】ｐＶＡＸプラスミドの制限マップである。
【図３１】プラスミドを用いて実施した実験のワクチン接種プロトコルとプラスミドの構造の両方を図で表したものである。
【図３２】図３１で識別されたプラスミドを使用した実施例１１の実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本開示は、複数の腫瘍特異的ネオ抗原を含む治療有効量の医薬組成物（例えば、癌ワクチン）を対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することによる、がんの治療のための個人化された戦略に関する。
【００４６】
定義
量、時間的持続時間などの測定可能な値を指すときに本明細書で使用される「約」という用語は、指定された値からの±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または±０．１％の変動を、開示された方法を実施するためにそのような変動が適切であるときに包含することを意味する。
【００４７】
本明細書および特許請求の範囲で本願で使用されるとき、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【００４８】
本明細書および特許請求の範囲で本願で使用されるとき、「および／または」という句は、そのように結合された要素、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」節によって具体的に識別される要素以外の他の要素は、反対に明確に示されない限り、具体的に識別される要素に関連するかどうかにかかわらず、任意選択的に存在し得る。したがって、非限定的な例として、「含む」などの制限のない言語と組み合わせて使用される場合、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、いくつかの実施形態では、ＢのないＡ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、ＡのないＢ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（任意選択的に他の要素を含む）等を指し得る。
【００４９】
本明細書および特許請求の範囲で本願で使用されるとき、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」あるいは「および／または」は包括的であると解釈されるものとする。すなわち、要素の数またはリストの少なくとも１つを含むが、１つを超えるもの、および、任意選択的に、追加のリストされていない項目を含むと解釈される。「〜の１つのみ」または「正確に１つ」などの反対に明確に示される用語のみ、または特許請求の範囲で使用される場合、「〜からなる」は、要素の数またはリストの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用されるとき、「または」という用語は、排他性、「いずれか」、「一方」、「一方のみ」の用語が先行する場合にのみ、排他的代替（すなわち、「一方または他方、しかし両方ではない」）を示すものとして解釈されるものとし、あるいは、「そのうちの正確に１つ」「本質的にからなる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するべきである。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、「活性化する」、「刺激する」、「増強する」、「増加する」および／または「誘導する」（ならびに同様の用語）という用語は、一般に、直接的または間接的に、自然、期待、もしくは平均に対する、または対照条件に対する濃度、レベル、機能、活動、または行動を改善または増加する行為を指すために互換的に使用される。「活性化する」は、細胞表面部分のライゲーションによって誘導される一次応答を指す。例えば、受容体の文脈では、そのような刺激は、受容体のライゲーションよびその後のシグナル伝達事象を伴う。さらに、刺激事象は、細胞を活性化し、分子の発現または分泌を上方制御または下方制御し得る。したがって、細胞表面部分のライゲーションは、直接的なシグナル伝達イベントがない場合でも、細胞骨格構造の再編成、または細胞表面部分の合体をもたらす可能性があり、これらのそれぞれは、その後の細胞応答の増強、修飾、または変更に有用であり得る。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、「ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化」または「ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化」という用語は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）の、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害性活性、および活性化マーカーの発現から選択される、１つ以上の細胞応答を引き起こし、またはもたらすプロセス（例えば、シグナル伝達イベント）を指す。本明細書で使用されるとき、「活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞」は、活性化シグナルを受け取ったＣＤ８＋Ｔ細胞を指し、したがって、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害性活性、および活性化マーカーの発現から選択される１つ以上の細胞応答を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を測定するための好適なアッセイは当該技術分野で知られており、本明細書に記載されている。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、「アジュバント」という用語は、ＤＮＡプラスミドによってコードされる抗原および以下に記載されるコードする核酸配列の免疫原性を増強するために本明細書に記載のＤＮＡプラスミドワクチンに添加される任意の分子を指すことを意味する。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、「抗原」は、免疫応答を誘発する任意の物質を指すことを意味する。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、「抗腫瘍応答」という用語は、抗原または抗原提示細胞を攻撃するためにＴ細胞を活性化することを含むがこれらに限定されない免疫系応答を指す。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、「がん」という用語は、不適切に高レベルの細胞分裂、不適切に低レベルのアポトーシス、またはその両方によって引き起こされる、またはその結果となる任意の疾患を指すことを意味する。がんの特定の例には、急性リンパ芽球性白血病、成人；急性リンパ芽球性白血病、小児期；急性骨髄性白血病、成人；副腎皮質癌；副腎皮質癌、小児期；エイズ関連リンパ腫；エイズ関連悪性腫瘍；肛門癌；星状細胞腫、小児期小脳；星状細胞腫、小児期大脳；胆管癌、肝外；膀胱癌；膀胱癌、小児期；骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫；脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、成人；脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、小脳星細胞腫、小児期；脳腫瘍、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、小児期；脳腫瘍、上衣腫、小児期；脳腫瘍、髄芽腫、小児期；脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍、小児期；脳腫瘍、視経路および視床下部膠腫、小児期；脳腫瘍、小児期（その他）；乳癌；乳癌および妊娠；乳がん、小児期；乳がん、男性；気管支腺腫／カルチノイド、小児期；カルチノイド腫瘍、小児期；カルチノイド腫瘍、消化器系；癌腫、副腎皮質；癌腫、島細胞；原発不明癌腫；中枢神経系リンパ腫、原発性；小脳星細胞腫、小児期；大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、小児期；子宮頸癌；小児癌；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；腱鞘の明細胞肉腫；結腸癌；結腸直腸癌、小児期；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；子宮内膜癌；上衣腫、小児期；上皮癌、卵巣；食道癌；食道癌、小児期；ユーイングファミリー腫瘍；頭蓋外胚細胞腫瘍、小児期；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；眼癌、眼内黒色腫；眼癌、網膜芽腫；胆嚢癌；胃（胃）癌；胃（胃）癌、小児期；消化管カルチノイド腫瘍；胚細胞腫瘍、性腺外、小児期；胚細胞腫瘍、性腺外；胚細胞腫瘍、卵巣；妊娠性絨毛腫瘍；神経膠腫、小児脳幹；神経膠腫、小児期視経路および視床下部；ヘアリー細胞白血病；頭頸部癌；肝細胞（肝）癌、成人（原発性）；肝細胞（肝）癌、小児期（原発性）；ホジキンリンパ腫、成人；ホジキンリンパ腫、小児期；妊娠中ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；視床下部および視経路神経膠腫、小児期；眼内黒色腫；島細胞癌腫（内分泌性膵臓）；カポジ肉腫；腎癌；喉頭癌；喉頭癌、小児期；白血病、急性リンパ性、成人；白血病、急性リンパ性、小児期；白血病、急性骨髄性、成人；白血病、急性骨髄性、小児期；白血病、慢性リンパ性；白血病、慢性骨髄性；白血病、ヘアリー細胞；口唇および口腔癌；肝癌、成人（原発性）；肝癌、小児期（原発性）；肺癌、非小細胞；肺癌、小細胞；リンパ芽球性白血病、成人急性；リンパ芽球性白血病、小児期急性；リンパ性白血病、慢性；リンパ腫、エイズ関連；リンパ腫、中枢神経系（原発性）；リンパ腫、皮膚Ｔ細胞；リンパ腫、ホジキン、成人；リンパ腫、ホジキン、小児期；リンパ腫、ホジキン、妊娠中；リンパ腫、非ホジキン、成人；リンパ腫、非ホジキン、小児期；リンパ腫、非ホジキン、妊娠中；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ヴァルデンストレーム；男性乳癌；悪性中皮腫、成人；悪性中皮腫、小児期；悪性胸腺腫；髄芽腫、小児期；黒色腫；黒色腫、眼内；メルケル細胞癌腫；中皮腫、悪性；原発不明の転移性頸部扁平上皮癌；多発性内分泌腫瘍症候群、小児期；多発性骨髄腫／形質細胞腫；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄性白血病、慢性；骨髄性白血病、小児期急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖性疾患、慢性；鼻腔および副鼻腔癌；上咽頭癌；上咽頭癌、小児期；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫、成人；非ホジキンリンパ腫、小児期；非ホジキンリンパ腫、妊娠中；非小細胞肺癌；口腔癌、小児期；口腔および口唇癌；口腔咽頭癌；骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫；卵巣癌、小児期；上皮性卵巣癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵癌；膵癌、小児期；膵癌、島細胞；副鼻腔および鼻腔癌；副甲状腺癌；陰茎癌；褐色細胞腫；松果腺およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、小児期；下垂体部腫瘍；形質細胞腫／多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；妊娠および乳癌；妊娠およびホジキンリンパ腫；妊娠および非ホジキンリンパ腫；原発性中枢神経系リンパ腫；原発性肝癌、成人；原発性肝癌、小児期；前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎）癌、腎細胞癌、小児期；腎盂および尿管、移行上皮癌；網膜芽腫；横紋筋肉腫、小児期；唾液腺癌；唾液腺癌、小児期；肉腫、ユーイングファミリー腫瘍；肉腫、カポジ；肉腫（骨肉腫）／骨の悪性線維性組織球腫；肉腫、横紋筋肉腫、小児期；肉腫、軟組織、成人；肉腫、軟組織、小児期；セザリー症候群；皮膚癌；皮膚癌、小児期；皮膚癌（黒色腫）、皮膚癌腫、メルケル細胞；小細胞肺癌；小腸癌；軟組織肉腫、成人；軟組織肉腫、小児期；原発不明の頸部扁平上皮癌、転移性；胃（胃）癌；胃（胃）癌、小児期；テント上原始神経外胚葉腫瘍、小児期；Ｔ細胞リンパ腫、皮膚；精巣癌；胸腺腫、小児期；胸腺腫、悪性；甲状腺癌；甲状腺癌、小児期；腎盂および尿管の移行上皮癌；絨毛性腫瘍、妊娠；原発不明、癌、小児期；小児期の希少癌；尿管および腎盂、移行上皮癌；尿道癌；子宮肉腫；膣癌；視経路および視床下部膠腫、小児期；外陰癌；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
特定の実施形態では、がんは、非小細胞肺癌、黒色腫、卵巣癌、頸部癌、神経膠芽細胞腫、泌尿生殖器癌、婦人科癌、肺癌、胃腸癌、頭頸部癌、非転移性または転移性乳癌、悪性黒色腫、メルケル細胞癌または骨および軟組織肉腫、血液新生物、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群および急性リンパ芽球性白血病、乳癌、転移性結腸直腸癌、ホルモン感受性またはホルモン抵抗性前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、肝細胞癌、胆管細胞癌、頭頸部扁平上皮癌軟部組織肉腫、および小細胞肺癌からなる群から選択される。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、「チェックポイント阻害剤」という用語は、阻害経路を阻害し、より広範な免疫活性を可能にする、任意の小分子化学化合物、抗体、核酸分子、またはポリペプチド、またはそれらのフラグメントを指すことを意味する。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、プログラム死−１（ＰＤ−１）経路の阻害剤、例えば、ニボイウマブなどであるがこれに限定されない抗ＰＤ１抗体である。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ−４）抗体である。さらなる追加の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、またはＴＩＭ−３などのＴＮＦスーパーファミリーのメンバーを標的とする。場合によっては、チェックポイント阻害剤を標的とすることは、阻害抗体または同様の分子で達成される。他の場合では、それは標的のアゴニストで達成される。このクラスの例には、刺激性標的ＯＸ４０およびＧＩＴＲが含まれる。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、「併用療法」という用語は、１つ以上の治療薬の連続的な投与、すなわち、各治療薬が異なる時間に投与されること、ならびにこれらの治療薬、または少なくとも２つの治療薬実質的に同時の投与を指すことを意味する。実質的に同時の投与は、例えば、各治療薬の固定比率を有する単一のカプセルを対象に投与することによって、または各治療薬についての単一のカプセルの複数で投与することによって達成することができる。例えば、本発明の１つの組み合わせは、腫瘍特異的ネオ抗原のプールされた試料と、同じまたは異なる時間に投与されるチェックポイント阻害剤とを含み得るか、または）’は、２つの化合物を含む単一の共製剤化された医薬組成物として製剤化され得る。別の例として、本発明の組み合わせ（例えば、ＤＮＡネオ抗原ワクチンおよびチェックポイント阻害剤）は、同時にまたは異なる時間に投与することができる別個の医薬組成物として製剤化することができる。本明細書で使用されるとき、「同時に」という用語は、１つ以上の薬剤の同時投与を指すことを意味する。例えば、特定の実施形態では、がんワクチンまたは免疫原性組成物およびチェックポイント阻害剤が同時に投与される）。「同時に」には、「同時期に」に、すなわち同じ期間の投与が含まれる。特定の実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、同じ時間に同時に、または同じ日に同時に投与される。各治療薬の逐次的または実質的に同時の投与は、経口経路、静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、粘膜組織（例えば、鼻、口、膣、および直腸）を介した直接吸収、および眼の経路（例えば、硝子体内、眼内など）を含むがこれらに限定されない、任意の適切な経路によって達成され得る。治療薬は、同じ経路または異なる経路で投与することができる。例えば、特定の組み合わせの一方の成分は、静脈内注射によって投与され得るが、組み合わせの他方の成分は、経口的に投与され得る。成分は、任意の治療上有効な順序で投与することができる。「組み合わせ」は、組み合わせ療法の一部として有用な化合物の群または非薬物療法を包含する。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、「エレクトロポレーション」、「電気透過化」、または「動電学的増強」（「ＥＰ」）という用語は、互換的に使用され、それらの存在がプラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、および／または水などの生体分子が細胞膜の一方の側からもう一方の側に通過することを可能にする生体膜内の微視的経路（細孔）を誘導するための膜貫通電場パルスの使用を指すことを意味する。
【００６０】
「フラグメント」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含む。フラグメントは、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子コンストラクト」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指すことを意味する。コード配列は、核酸分子が投与される個体の細胞における発現を指示することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された開始および終結シグナルを含む。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」という用語は、核酸、例えば、本開示の核酸を発現するために使用することができる細胞を指すことを意味する。真核細胞、細菌細胞、昆虫細胞、またはヒト細胞であることができるが、これらに限定されない。好適な真核細胞には、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、およびＭＤＣＫＩＩ細胞が含まれるが、これらに限定されない。好適な昆虫細胞には、Ｓｆ９細胞が含まれるが、これに限定されない。「組換え宿主細胞」という句は、発現する核酸で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を示すために使用することができる。宿主細胞はまた、核酸を含むが、それが核酸と作動可能に連結されるように制御配列が宿主細胞に導入されない限り、それを所望のレベルで発現しない細胞であり得る。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。突然変異や環境の影響などにより、特定の改変が次の世代で発生する可能性があるため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、「ハイブリダイズする」という用語は、様々なストリンジェンシーの条件下で、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）またはその一部との間に二本鎖分子を形成する対を意味する。（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、「免疫チェックポイント」という用語は、免疫反応を減速または停止し、免疫細胞の制御されていない活動による過度の組織損傷を防ぐ抑制性経路を指すことを意味する。
【００６５】
本明細書で使用される「免疫応答」という用語は、本明細書に記載のネオ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の導入に応答した、宿主の免疫系、例えば哺乳動物の免疫系の活性化を指すことを意味する。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたはそのフラグメント、バリアント、または誘導体が、それが天然に関連する他の生物学的材料から、または例えば、本発明のポリペプチドを発現するように遺伝子操作された組換え宿主細胞から、本質的に取り出されている。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、「リガンド」という用語は、受容体の構造に相補的な構造を有し、この受容体と複合体を形成することができる分子を指すことを意味する。本発明の実施形態によれば、リガンドは、特に、その好適な長さおよびアミノ酸配列における好適な結合モチーフを有し、その結果、ペプチドまたはペプチドフラグメントは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩのタンパク質と複合体を形成することができるペプチドまたはペプチドフラグメントを意味するものとして理解されるべきである。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、「ＭＨＣ分子」、「ＭＨＣタンパク質」、または「ＨＬＡタンパク質」という用語は、タンパク質抗原のタンパク質分解的切断から生じるペプチドに結合し、潜在的なＴ細胞エピトープを表し、それらを細胞表面に輸送し、それらをそこで、特定の細胞、特に細胞傷害性Ｔリンパ球またはＴヘルパー細胞に提示することにできるタンパク質を指すことを意味する。ゲノムの主要組織適合遺伝子複合体は、細胞表面に発現する遺伝子産物が内因性および／または外来抗原の結合と提示、したがって免疫学的プロセスの調節に重要である遺伝子領域を含む。主要組織適合遺伝子複合体は、異なるタンパク質をコードする２つの遺伝子群、すなわちＭＨＣクラスＩの分子とＭＨＣクラスＩＩの分子に分類される。２つのＭＨＣクラスの分子は、異なる抗原源に特化している。ＭＨＣクラスＩの分子は、内因的に合成された抗原、例えばウイルスタンパク質や腫瘍抗原を提示する。ＭＨＣクラスＩＩの分子は、外因性の供給源、例えば細菌産物に由来するタンパク質抗原を提示する。細胞生物学と２つのＭＨＣクラスの発現パターンは、これらの異なる役割に適応している。
【００６９】
クラスＩのＭＨＣ分子は、重鎖と軽鎖からなり、ペプチドに好適な結合モチーフがある場合、約８〜１１アミノ酸、通常９または１０アミノ酸のペプチドに結合し、それを胞傷害性Ｔリンパ球に提示することができる。クラスＩのＭＨＣ分子が結合するペプチドは、内因性タンパク質抗原に由来する。クラスＩのＭＨＣ分子の重鎖は、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃモノマーであり、軽鎖は、β−２−ミクログロブリンである。
【００７０】
クラスＩＩのＭＨＣ分子は、α鎖とβ鎖からなり、このペプチドが好適な結合モチーフを持っている場合、約１５〜２４アミノ酸のペプチドに結合し、それをＴヘルパー細胞に提示することができる。クラスＩＩのＭＨＣ分子が結合するペプチドは、通常、外因性タンパク質抗原の細胞外に由来する。α鎖およびβ鎖は、特にＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰモノマーである。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、「ネオ抗原」という用語は、対象の発現したタンパク質における腫瘍特異的突然変異から生じる腫瘍抗原のクラスを指すことを意味する。いくつかの実施形態では、ネオ抗原は、対象の腫瘍に直接由来する。これは、腫瘍抗原を発現するが対象に由来する腫瘍によって必ずしも発現されない細胞に対する免疫応答を誘発することが知られているコンセンサス配列である可能性がある既知の腫瘍関連抗原とは対照的である。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、「ネオ抗原突然変異」という用語は、ネオ抗原性ペプチドをコードすると予測される突然変異を指す。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される」という用語は、連邦または州政府の規制機関によって承認もしくは承認可能であるとされるか、または米国薬局方またはヒトを含む動物で使用するための他の一般に認められた薬局方に記載されていることを指す。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤」という用語は、薬剤と共に対象に投与することができ、その薬理学的活性を破壊せず、治療量の薬剤を送達するのに十分な用量で投与された場合に毒性がない賦形剤、担体または希釈剤を指すことを意味する。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、腫瘍特異的ネオ抗原の「薬学的に許容される塩」という用語は、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なしにヒトまたは動物の組織と接触して使用するのに好適であると一般に当該技術分野で考えられている酸または塩基塩であり得る。このような塩には、アミンなどの塩基性残基の無機塩および有機酸塩、ならびにカルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩が含まれる。具体的な医薬塩には、塩酸、リン、臭化水素酸、マレイン酸、グリコール酸、フマル酸、硫酸、スルファミン酸、スイファニル酸、ホルム酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエチルスルホン酸、硝酸、安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ステアリン酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、パモ酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、プロピオン酸、ヒドロキシマレイン酸、ヨウ化水素酸、フェニル酢酸、酢酸などのアルカン酸、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎは０〜４）などの酸の塩が含まれるが、これらに限定されない。同様に、薬学的に許容されるカチオンには、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム、およびアンモニウムが含まれるが、これらに限定されない。当業者は、本開示および当該技術分野における知識から、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｐ．１４１８（１９８５）に列挙されるものを含めて本明細書で提供されるプールされた腫瘍特異的ネオ抗原のためのさらなる薬学的に許容される塩を認識するであろう。一般に、薬学的に許容される酸または塩基塩は、任意の従来の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含む親化合物から合成することができる。簡潔に述べると、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、適切な溶媒中で化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができる。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、「予防する」、「予防すること」、または「予防」、「予防的処置」などの用語は、疾患または状態を発症していないが、疾患または状態を発症する危険性があるか、またはそれにかかりやすい対象において、疾患または状態を発症する可能性を減らすことを指すことを意味する。
【００７７】
本明細書で使用されるとき、「精製された」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたはそのフラグメント、バリアント、または誘導体が、それが天然に関連する他の生物学的材料由来を実質的に含まないか、または例えば、本発明のポリペプチドを発現するように遺伝子操作された組換え宿主細胞由来の他の生物学的材料由来を含まない。すなわち、例えば、本発明の精製されたポリペプチドは、少なくとも約７０〜約１００％の純度であるポリペプチドであり、すなわち、ポリペプチドは、ポリペプチドが総組成の約７０〜約１００重量％を構成する組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、本発明の精製されたポリペプチドは、約７５重量％〜約９９重量％の純度、約８０重量％〜約９９重量％の純度、約９０〜約９９重量％の純度、または約９５重量％〜約９９重量％の純度である。
【００７８】
本明細書で使用されるとき、「受容体」という用語は、生体分子またはリガンドに結合することができる分子群を指すことを意味する。受容体は、細胞、細胞形成、または生物の情報を伝達するのに役立ち得る。受容体は、少なくとも１つの受容体ユニット、好ましくは２つの受容体ユニットを含み、各受容体ユニットは、タンパク質分子、特に糖タンパク質分子からなり得る。受容体は、リガンドの構造を補完する構造を有し、結合パートナーとしてリガンドを複合化し得る。情報は、特に細胞表面でのリガンドの複合体形成に続く受容体のコンフォメーション変化によって伝達される。本発明の実施形態によれば、受容体は、特に、リガンド、特に好適な長さのペプチドまたはペプチドフラグメントと受容体／リガンド複合体を形成することができるＭＨＣクラスＩおよびＩＩのタンパク質を意味すると理解されるべきである。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、「小分子」という用語は、生物学的プロセスの調節を助けることができる、１０９ｍのオーダーのサイズの低分子量（＜９００ダルトン）有機化合物を指す。ほとんどの薬は小分子である。
【００８０】
本明細書で使用されるとき、「対象」、「個人」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、診断、治療、または治療が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書に記載の方法は、ヒト治療用途と獣医学用途の両方に適用可能である。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物であり、他の実施形態では、対象はヒトである。
【００８１】
本明細書で使用されるとき、「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」は、記載された発明によるワクチン（またはネオ抗原ＤＮＡワクチンを含む医薬組成物）の投与によって治療することができる疾患または状態に罹患または罹患しやすい生物を指す。「それを必要とする患者」または「必要とする対象」はまた、記載された本発明によるネオ抗原ＤＮＡワクチン（またはネオ抗原ＤＮＡワクチンを含む医薬組成物）を受けているか、または記載された発明によるネオ抗原ＤＮＡワクチン（またはネオ抗原ＤＮＡワクチンを含む医薬組成物）を受けたか、または腫瘍を有する生物を指し得、あるいは非限定的な例には、ヒト、他の哺乳動物、ウシ、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウシ、シカ、および他の非哺乳動物が含まれる。実施形態では、患者または対象はヒトである。
【００８２】
本明細書で使用されるとき、「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ペプチド提示ＭＨＣ分子またはＭＨＣ複合体の形態でクラスＩまたはＩＩのＭＨＣ分子によって結合され、次いで、この形態でそれぞれ、細胞傷害性Ｔリンパ球またはＴヘルパー細胞によって認識され、結合され得るペプチド配列を指すことを意味する。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、「治療効果」という用語は、障害（例えば、新生物もしくは腫瘍）またはそれに関連する病状の１つ以上の症状のある程度の軽減を指すことを意味する。本明細書で使用されるとき、「治療有効量」は、細胞または対象への単回または複数回投与時に、そのような治療がない場合に予想される以上に、そのような障害を有する患者の生存性を延長すること、傷害の１つ以上の徴候または症状を軽減すること、予防または遅延させることにおいて有効である薬剤の量を指すことを意味する。「治療有効量」は、治療効果を達成するために必要な量を識別することを目的としている。当該技術分野の通常の技術を有する医師または獣医は、必要な医薬組成物の「治療有効量」（例えば、ＥＤ５０）を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルの医薬組成物に使用される本発明の化合物の用量で開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることができる。いくつかの実施形態では、治療有効量は、固形腫瘍を、治療前のその質量または推定質量と比較して、総質量で約２％、治療前の固形腫瘍の総質量と比較して、総質量で約４％、総質量で約６％、総質量で約８％、総質量で約１０％、総質量で約１５％、総質量で約２０％、総質量で約２５％、総質量で約３０％、総質量で約３５％、総質量で約４０％、総質量で約４５％、または総質量の約５０％、縮小するのに有効な量である。
【００８４】
本明細書で使用されるとき、「治療する」、「治療される」、「治療すること」、「治療」などの用語は、障害および／またはそれに関連する症状（例えば、がんまたは腫瘍）を軽減または改善することを指すことを意味する。「治療すること」は、がんの発症後または発症が疑われる後の対象への本明細書に記載のネオ抗原ワクチンの投与を指し得る。「治療すること」は、「緩和すること」の概念を含み、これは、がんに関連する症状または他の悪影響および／またはがん治療に関連する副作用の発生または再発の頻度、または重症度を軽減することを指す。「治療すること」という用語はまた、患者の特定の疾患または障害の重症度を軽減すること、またはその再発を遅延させること、例えば、疾患に苦しんでいる患者の寛解期間を延長することを指す「管理すること」の概念を包含する。排除されないが、障害または状態を治療することは、それに関連する障害、状態、または症状が完全に排除されることを必要としないことが理解される。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、「がんを治療すること」という用語は、絶対的な用語を意味するものではない。いくつかの態様において、本発明の組成物および方法は、腫瘍のサイズまたはがん細胞の数を減少させ、がんを寛解させ、またはがん細胞のサイズまたは細胞数の増殖を防止しようとする。状況によっては、治療は予後の改善をもたらす。
【００８６】
本明細書で使用されるとき、「治療効果」という用語は、障害（例えば、新生物もしくは腫瘍）またはそれに関連する病状の１つ以上の症状のある程度の軽減を指すことを意味する。本明細書で使用されるとき、「治療有効量」は、細胞または対象への単回または複数回投与時に、そのような治療がない場合に予想される以上に、そのような障害を有する患者の生存性を延長すること、傷害の１つ以上の徴候または症状を軽減すること、予防または遅延させることにおいて有効である薬剤の量を指すことを意味する。「治療有効量」は、治療効果を達成するために必要な量を識別することを目的としている。当該技術分野の通常の技術を有する医師または獣医は、必要な医薬組成物の「治療有効量」（例えば、ＥＤ５０）を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルの医薬組成物に使用される本発明の化合物の用量で開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることができる。
【００８７】
本明細書に記載の任意の治療薬について、治療有効量は、予備的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究および／または動物モデルから最初に決定され得る。治療有効用量はまた、ヒトのデータから決定され得る。適用される用量は、投与される薬剤の相対的なバイオアベイラビリティおよび効力に基づいて調整することができる。上述の方法および他の周知の方法に基づいて最大の効力を達成するように用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（２００１）の第１章に見出され得る治療効果を決定するための一般原則を以下に要約する。
【００８８】
薬物動態学的原理は、許容できない副作用を最小限に抑えながら、望ましい程度の治療効果を得るために投与計画を変更するための基礎を提供する。薬物の血漿濃度を測定し、治療濃度域に関連付けることができる状況では、投与量の変更に関する追加のガイダンスを取得できる。
医薬品は、同じ有効成分を含み、強度または濃度、剤形、および投与経路が同一である場合、薬学的に均等であるとみなされる。２つの薬学的に均等の医薬品は、好適な試験条件下で２つの製品の有効成分のバイオアベイラビリティの速度と程度が有意に異ならない場合、生物学的に同等であるとみなされる。
【００８９】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、全体を通して互換的に使用され、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ペプチド核酸および非天然に存在するヌクレオチド類似体）、およびそれらのハイブリッドを含む。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、本明細書に記載されるように、抗体またはそのフラグメントをコードする連続的なオープンリーディングフレームを含む。本明細書で使用されるとき、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列を定義する。したがって、核酸はまた、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くのバリアントは、所与の核酸と同じ目的で使用することができる。したがって、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびその相補体を包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。したがって、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを包含する。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得るか、または二本鎖と一本鎖配列の両方の部分を含み得る。核酸は、ゲノムとｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、ここで、核酸は、デオキシリボおよびリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含み得る。核酸は、化学合成法または組換え法によって得ることができる。
核酸は一般にホスホジエステル結合を含むが、少なくとも１つの異なる結合、例えば、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはＯ−メチルホスホロアミダイト結合およびペプチド核酸骨格および連結を有し得る核酸類似体が含まれ得る。他のアナログ核酸には、正の骨格、非イオン性骨格、および非リボース骨格を含むものが含まれ、参照によりその全体が組み込まれる米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号に記載されているものが含まれる。１つ以上の天然に存在しない、または修飾されたヌクレオチドを含む核酸もまた、核酸の１つの定義に含まれる。修飾ヌクレオチド類似体は、例えば、核酸分子の５’末端および／または３’末端に位置し得る。ヌクレオチド類似体の代表的な例は、糖または骨格で修飾されたリボヌクレオチドから選択され得る。しかしながら、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち、５位で修飾されたウリジンまたはシチジンなどの天然に存在する核酸塩基の代わりに非天然に存在する核酸塩基を含むリボヌクレオチド、例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン、８位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば８−ブロモグアノシン、デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシン、Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチドにも注目すべきであり、例えばＮ６−メチルアデノシンが好適である。２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ．ｓｕｂ．２、ＮＨＲ、Ｎ．ｓｕｂ．２またはＣＮから選択される基で置き換えることができ、ここで、ＲはＣ．ｓｕｂ．１−Ｃ．ｓｕｂ．６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。修飾ヌクレオチドはまた、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫｒｕｔｚｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｏｃｔ．３０，２００５），Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−１７８（２００４）、および米国特許出願公開第２００５０１０７３２５号に記載されているように、ヒドロキシプロリン結合を介してコレステロールと共役したヌクレオチドも含まれる。修飾ヌクレオチドおよび核酸はまた、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２００２０１１５０８０号に記載されているように、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含み得る。さらなる修飾ヌクレオチドおよび核酸は、米国特許出願公開第２００５０１８２００５号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。リボース−リン酸骨格の修飾は、様々な理由で、例えば、生理学的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を増加させるため、細胞膜を横切る拡散を増強するため、またはバイオチップ上のプローブとして行うことができる。天然に存在する核酸と類似体の混合物を作製することができる。代替的に、異なる核酸類似体の混合物、および天然に存在する核酸と類似体の混合物を作製することができる。
【００９０】
本明細書で使用されるとき、「核酸分子」という用語は、１つまたは複数のタンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、核酸分子が投与される個体の細胞における発現を指示することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された開始および終結シグナルを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子はまた、１つ以上のネオ抗原をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、第１、第２、第３またはそれ以上の核酸分子を含む医薬組成物に関するものであり、そのそれぞれは、１つまたは複数のネオ抗原をコードし、各プラスミドのうちの少なくとも１つは、本明細書に開示される１つ以上の式を含む。
【００９１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状または分枝状であってよく、修飾されたアミノ酸を含み得、非天然アミノ酸またはアミノ酸ではない化学基によって中断されていてもよい。この用語は、改変されたアミノ酸ポリマーも包含し、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との共役などの任意の他の操作を包含する。本明細書で使用されるとき、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬの両方の光学異性体、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣物を含む、天然および／または非天然または合成アミノ酸を含む。
【００９２】
２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリヌクレオチド配列の「パーセント同一性」または「パーセント相同性」は、ＧＡＰコンピュータプログラム（ＧＣＧウィスコンシンパッケージ、バージョン１０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）の一部）を、そのデフォルトパラメータで使用して配列を比較することによって決定される。２つ以上の核酸またはアミノ酸配列の文脈で本明細書で使用される「同一」または「同一性」は、配列が特定の領域にわたって同じである特定のパーセンテージの残基を有することを意味し得る。パーセンテージは、２つの配列を最適に整列させ、指定された領域で２つの配列を比較し、両方の配列で同一の残基が発生する位置の数を決定して、一致する位置の数を算出し、一致する位置の数を指定された領域内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算できる。２つの配列の長さが異なる場合、またはアラインメントによって１つ以上の千鳥末端が産生され、指定された比較領域に単一の配列のみが含まれる場合、単一の配列の残基は分母に含まれるが、計算の分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同等とみなされる場合がある。同一性は、手動で実行することも、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用して実施することもできる。簡単に言えば、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌの略であるＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列の類似性を決定するのに好適である。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から公開されている。このアルゴリズムでは、最初に長さの短い単語を識別することにより、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を識別する。データベース配列内の同じ長さの単語と整列したときに、正の値の閾値スコアＴに一致するかそれを満たすクエリ配列を得る。Ｔは、近傍単語スコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の近隣単語ヒットは、それらを含むＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。単語ヒットは、累積アラインメントスコアを増やすことができる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。各方向の単語ヒットの拡張は、次の場合に停止される。１）累積アラインメントスコアがその最大達成値から数量Ｘだけ低下する。２）１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になる。または３）いずれかの配列の末端に到達した。ブラストアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度と速度を決定する。ブラストプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，１０９１５−１０９１９を参照されたい）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴ���ルゴリズム（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，５８７３−５７８７）とＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴは、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小の合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と他の核酸との比較における最小の合計確率が約１未満、約０．１未満、約０．０１未満、および約０．００１未満である場合、その核酸は別の核酸と類似しているとみなされる。２つの一本鎖ポリヌクレオチドは、それらの配列が逆平行配向で整列され得、その結果、一方のポリヌクレオチドの全てのヌクレオチドが他方のポリヌクレオチドのその相補的ヌクレオチドと反対であり、ギャップを導入することなく、またいずれかの配列の５’または３’末端にある対になっていないヌクレオチドがない場合、互いに「相補体」である。２つのポリヌクレオチドが適度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることができる場合、ポリヌクレオチドは別のポリヌクレオチドに対して「相補的」である。したがって、ポリヌクレオチドは、その相補体でなくても、別のポリヌクレオチドに相補的であり得る。
【００９３】
本明細書で使用されるとき、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」という句は、核酸分子が別の核酸分子をハイブリダイズするが、他の配列をハイブリダイズしない条件を指すことを意味する。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる条件では異なる。より長い配列は、高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度とｐＨでの特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下で）である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（または他の塩）未満であり、短いプローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に対しては、温度が少なくとも約３０℃である条件であり、より長いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドについては少なくとも約６００Ｃである。ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することで、厳しい条件を達成することもできる。
【００９４】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のうちのいずれか１つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列のうちのいずれか１つ）に対して少なくとも５０％の同一性を示す核酸分子（またはポリペプチド）を意味する。好ましくは、そのような配列は、比較に使用される配列とアミノ酸レベルまたは核酸で少なくとも６０％、より好ましくは８０％または８５％、より好ましくは９０％、９５％、または９９％までも同一である。
【００９５】
制御配列がヌクレオチド配列の発現に影響（例えば、発現のレベル、タイミング、または位置）を与える場合、ヌクレオチド配列は、制御配列に「作動可能に連結」されている。「制御配列」は、それが作動可能に連結されている核酸の発現に影響（例えば、発現のレベル、タイミング、または位置）を与える核酸である。制御配列は、例えば、調節された核酸に直接、または１つ以上の他の分子（例えば、制御配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を介してその効果を発揮することができる。制御配列の例には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。制御配列のさらなる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．、およびＢａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３６０５−０６に記載されている。
【００９６】
本明細書で使用されるとき、「試料」という用語は、一般に、その何かに類似し、より多くの量を表すことを意図した限られた量の何かを指す。本開示では、試料は、過剰増殖組織、場合によってはがん性組織または１つ以上の細胞の不在、存在、または等級付けを試験するための収集、スワブ、ブラッシング、擦過、生検、除去組織、または外科的切除である。いくつかの実施形態では、試料は、がん、過形成、前がん性を有するか、または１つ以上の腫瘍細胞を有すると考えられる患者または対象から採取される。いくつかの実施形態では、１つ以上の過剰増殖性細胞を含むと考えられる試料は、１つまたは以上の過剰増殖性細胞を含まないことが知られている「対照試料」と比較される。本開示は、本明細書に開示される任意の１つまたは複数の試料を使用して、特定の試料内の（高度または最小の免疫原性の）ネオ抗原の量を識別、検出、配列決定および／または定量化することを企図する。いくつかの実施形態では、方法は、スワブ、ブラッシング、または他の試料を、環境から、試料中の１つまたは複数の細胞のＤＮＡおよびＲＮＡを単離および／または配列決定するのに十分な試薬のセットに曝露するステップに関する。
【００９７】
「ベクター」は、それに連結された別の核酸を細胞に導入するために使用することができる核酸である。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、追加の核酸セグメントを連結することができる線状または環状の二本鎖ＤＮＡ分子を指す。別のタイプのベクターはウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）であり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに導入することができる。あるベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。「発現ベクター」は、選択されたポリヌクレオチドの発現を指示することができるタイプのベクターである。本開示は、本明細書に開示される任意の１つまたは複数のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む任意の１つまたは複数のベクターに関する。
【００９８】
本明細書で使用されるとき、「ワクチン」という用語は、疾患（例えば、がん）の予防および／または治療のための免疫を生成するための組成物を指すことを意味する。したがって、ワクチンは、抗原を含む医薬であり、ワクチン接種によって特定の防御および保護物質を生成するためにヒトまたは動物で使用されることを意図している。「ワクチン組成物」または「ネオ抗原ワクチン組成物」は、薬学的に許容される賦形剤、獲得剤、または希釈剤を含み得る。
【００９９】
組成物
本開示は、少なくとも部分的に、がん／腫瘍内の突然変異（例えば、転座、逆位、大小の欠失および挿入、ミスセンス突然変異、スプライス部位突然変異など）の全てまたは実質的に全てを識別する能力に基づく。特に、これらの突然変異は、対象のがん／腫瘍細胞のゲノムに存在するが、対象の正常組織には存在しない。本開示は、いくつかの異なるがん細胞における数千の突然変異を表す約１〜約１００の異なるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む医薬組成物を投与することが、そのような突然変異が、患者のがん／腫瘍に固有のアミノ酸配列が変更されたタンパク質（例えば、ネオ抗原）をもたらす変化をもたらす場合に特に興味深いという革新的な発見に関する。
【０１００】
一態様では、本開示は、式Ｉを含む核酸配列を含む核酸分子を特徴とする：
［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］、
式中、ＡＥＤは、発現可能な核酸配列を含む独立して選択可能な抗原発現ドメインであり、ＡＥＤｎは、抗原発現ドメインと呼ばれ、ＡＥＤｎ＋１は、抗原発現ドメイン２と呼ばれ、各リンカーは、約０〜約３００の長さの天然または非天然の核酸から独立して選択可能であり、抗原発現ドメイン１は、約１２〜約１５，０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、エピトープをコードし、抗原発現ドメイン２は、約１２〜約１５，０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、エピトープをコードし、ｎは、約１〜約５００の任意の正の整数である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、各リンカーは、約０〜約２５、約１〜約２５、約２〜約２５、約３〜約２５、約４〜約２５、約５〜約２５、約６〜約２５、約７〜約２５、約８〜約２５、約９〜約２５、約１０〜約２５、約１１〜約２５、約１２〜約２５、約１３〜約２５、約１４〜約２５、約１５〜約２５、約１６〜約２５、約１７〜約２５、約１８〜約２５、約１９〜約２５、約２０〜約２５、約２１〜約２５、約２２〜約２５、約２３〜約２５、約２４〜約２５の長さの天然または非天然の核酸から独立して選択可能である。いくつかの実施形態では、各リンカーは、約０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５の長さの天然または非天然の核酸である。いくつかの実施形態では、各リンカーは、約０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５の長さの天然または非天然の核酸であるリンカーから独立して選択可能である。いくつかの実施形態では、各リンカーは、約２１の長さの天然または非天然の核酸である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、式Ｉによる各リンカーの長さは異なる。例えば、いくつかの実施形態では、第１のリンカーの長さは、約０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５の長さの天然または非天然の核酸であり、第２のリンカーの長さは、約０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５の長さの天然または非天然の核酸であり、第１のリンカーの長さは、第２のリンカーの長さとは異なる。式Ｉが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のリンカーを含み、リンカーが類似または異なる長さである、本開示によって様々な構成を想定することができる。
【０１０３】
特定の実施形態では、融合ペプチドをコードするヌクレオチド配列において、２つのリンカーを一緒に使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、約０〜約２５の長さの天然または非天然の核酸、約０〜約２５、約１〜約２５、約２〜約２５、約３〜約２５、約４〜約２５、約５〜約２５、約６〜約２５、約７〜約２５、約８〜約２５、約９〜約２５、約１０〜約２５、約１１〜約２５、約１２〜約２５、約１３〜約２５、約１４〜約２５、約１５〜約２５、約１６〜約２５、約１７〜約２５、約１８〜約２５、約１９〜約２５、約２０〜約２５、約２１〜約２５、約２２〜約２５、約２３〜約２５、約２４〜約２５の長さの天然または非天然の核酸から独立して選択可能である。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、約０〜約２５、約１〜約２５、約２〜約２５、約３〜約２５、約４〜約２５、約５〜約２５、約６〜約２５、約７〜約２５、約８〜約２５、約９〜約２５、約１０〜約２５、約１１〜約２５、約１２〜約２５、約１３〜約２５、約１４〜約２５、約１５〜約２５、約１６〜約２５、約１７〜約２５、約１８〜約２５、約１９〜約２５、約２０〜約２５、約２１〜約２５、約２２〜約２５、約２３〜約２５、約２４〜約２５の長さの天然または非天然の核酸から独立して選択可能である。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、約０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５の長さの天然または非天然の核酸であるリンカーから独立して選択可能である。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、約０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５の長さの天然または非天然の核酸であるリンカーから独立して選択可能である。
【０１０４】
特定の実施形態では、抗原発現ドメイン１および抗原発現ドメイン２は、特定の腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原発現ドメイン１は、ＣＤ４ネオエピトープをコードする。いくつかの実施形態では、抗原発現ドメイン１は、ＣＤ８ネオエピトープをコードする。いくつかの実施形態では、抗原発現ドメイン２は、ＣＤ４ネオエピトープをコードする。いくつかの実施形態では、抗原発現ドメイン２は、ＣＤ８ネオエピトープをコードする。いくつかの実施形態では、抗原ドメイン１は、ＣＤ８ネオエピトープをコードし、抗原発現ドメイン２は、ＣＤ８ネオエピトープをコードする。ＣＤ４ネオエピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識されるエピトープである。ＣＤ８ネオエピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されるエピトープである。
【０１０５】
本開示は、１つまたは複数のリンカーによって分離された少なくとも２つのネオ抗原をコードする複数の抗原発現ドメインを含む核酸配列に関する。いくつかの実施形態では、抗原発現ドメインは、約３〜約１００アミノ酸の長さのアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、約３〜約２５アミノ酸の長さのリンカーをコードする少なくとも１つのリンカーが存在する。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、各抗原発現ドメインを分離する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれ以上のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれ以上のリンカーを含み、少なくとも１つ以上は、フューリンリンカーを含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれ以上のリンカードメインを含み、そして核酸配列は、以下を含む。
式Ｉ（ａ）：
（ＡＥＤ１）−（リンカー）−（ＡＥＤ２）−（リンカー）］ｎ
式中、各ＡＥＤは、対象からの任意の１つまたは複数の腫瘍関連抗原から独立して選択可能であり、ｎは、約１〜約５０の任意の正の整数であり、各「リンカー」は、１つまたは複数のアミノ酸切断部位をコードする核酸配列である。各リンカーは、本明細書に開示される１つまたは複数のリンカーを含むために同じまたは独立して選択可能であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、約９〜約１０５ヌクレオチドの長さのフューリン切断部位であり、アミノ酸切断部位であるアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、核酸配列は、核酸分子の構成要素である。本明細書で企図されるいくつかの組成物では、組成物は、１、２、３、４、５、またはそれ以上の核酸分子を含み、そのそれぞれが、本明細書に開示されるＡＥＤのパターンまたは式のいずれかを発現する。
【０１０６】
本開示はまた、コード領域および非コード領域を含む核酸配列に関連し、コード領域は、式Ｉ（ｂ）からなる：
［（ＡＥＤ１）−（リンカー）−（ＡＥＤ２）−（リンカー）］ｎ。−（ＡＥＤ３）］ｎ＋１、
式中、ｎは、約１〜約２０の正の整数であり、各「リンカー」は、１つまたは複数のアミノ酸切断配列をコードし、非コード領域は、１つ以上のＡＥＤに作動可能に連結された少なくとも１つの制御配列を含み、５’または３’方向で、ＡＥＤ３は、ＡＥＤの配列における端末抗原発現ドメインである。いくつかの実施形態では、調節は、図に示される制御配列のいずれか、または図に示されている制御配列に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同を含む機能的フラグメントである。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子または配列は、１つまたは複数のリンカーによって分離された少なくとも２つのネオ抗原をコードする複数の抗原発現ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原発現ドメインは、約３〜約１００アミノ酸の長さのアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、約３〜約２５アミノ酸の長さのリンカーをコードする少なくとも１つのリンカーが存在する。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、各抗原発現ドメインを分離する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれ以上のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれ以上のリンカーを含み、少なくとも１つ以上は、フューリンリンカーを含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれ以上のリンカードメインを含み、そして核酸配列は、以下を含む。
式Ｉ（ａ）：
（ＡＥＤ１）−（リンカー）−（ＡＥＤ２）−（リンカー）］ｎ
式中、各ＡＥＤは、対象からの任意の１つまたは複数の腫瘍関連抗原から独立して選択可能であり、ｎは、約１〜約５０の任意の正の整数であり、各「リンカー」は、１つまたは複数のアミノ酸切断部位をコードする核酸配列である。各リンカーは、本明細書に開示される１つまたは複数のリンカーを含むために同じまたは独立して選択可能であり得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、抗原発現ドメイン１および／または２は、約１２〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約５０〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約１００〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約５００〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約１，０００〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約５，０００〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約１０，０００〜約１５，０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能である。他の実施形態では、抗原発現ドメイン１は、約１２、約２５、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１，０００、約２，０００、約３，０００、約４，０００、約５，０００、約６，０００、約７，０００、約８，０００、約９，０００、約１０，０００、約１１，０００、約１２，０００、約１３，０００、約１４，０００、約１５，０００ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、抗原発現ドメイン２は、約１２〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約５０〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約１００〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約５００〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約１，０００〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約５，０００〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約１０，０００〜約１５，０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能である。別の実施形態では、抗原発現ドメイン２は、約１２、約２５、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１，０００、約２，０００、約３，０００、約４，０００、約５，０００、約６，０００、約７，０００、約８，０００、約９，０００、約１０，０００、約１１，０００、約１２，０００、約１３，０００、約１４，０００、約１５，０００ヌクレオチドの長さである。
【０１０９】
他の実施形態では、抗原発現ドメイン１または抗原発現ドメイン２は、約２０〜約２０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能である。いくつかの実施形態では、抗原発現ドメイン１は、約２０〜約２，０００ヌクレオチドの長さ、約５０〜約２，０００ヌクレオチドの長さ、約１００〜約２，０００ヌクレオチドの長さ、約５００〜約２，０００ヌクレオチドの長さ、約１５００〜約２，０００ヌクレオチドの長さである。他の実施形態では、抗原発現ドメイン１は、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１，１００、約１，２００、約１，３００、約１，４００、約１，５００、約１，６００、約１，７００、約１，８００、約１９００、約２０００ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、抗原発現ドメイン２は、約２０〜約２，０００ヌクレオチドの長さ、約５０〜約２，０００ヌクレオチドの長さ、約１００〜約２，０００ヌクレオチドの長さ、約５００〜約２，０００ヌクレオチドの長さ、約１５００〜約２，０００ヌクレオチドの長さである。他の実施形態では、抗原発現ドメイン２は、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１，１００、約１，２００、約１，３００、約１，４００、約１，５００、約１，６００、約１，７００、約１，８００、約１９００、約２０００ヌクレオチドの長さである。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、抗原発現ドメイン１および／または抗原発現ドメイン２は、約１５〜約１５０ヌクレオチの長さ、例えば、約１５〜約１５０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約１２５ヌクレオチドの長さ、約１５〜約１００、約１５〜約９０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約９０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約７０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約６０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約５０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約４０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約３０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約２０ヌクレオチドの長さから独立して選択可能である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、抗原発現ドメイン１および／または抗原発現ドメイン２は、約１５〜約１００ヌクレオチドの長さ、例えば、約３〜約１２０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約１００、約１５〜約９０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約９０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約７０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約６０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約５０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約４０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約３０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約２０ヌクレオチドの長さから独立して選択可能である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、抗原発現ドメイン１および／または抗原発現ドメイン２は、約１５〜約５０ヌクレオチドの長さ、例えば、約１５〜約５０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約４０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約３０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約２０ヌクレオチドの長さから独立して選択可能である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ｎは、約１〜約５００の任意の正の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、約１〜約５００、約１０〜約５００、約５０〜約５００、約１００〜約５００、約２００〜約５００、約３００〜約５００、約４００〜約５００の任意の正の整数である。他の実施形態では、ｎは、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、約１８０、約１８５、約１９０、約１９５、約２００、約２０５、約２１０、約２１５、約２２０、約２２５、約２３０、約２３５、約２４０、約２４５、約２５０、約２５５、約２６０、約２６５、約２７０、約２７５、約２８０、約２８５、約２９０、約２９５、約３００、約３０５、約３１０、約３１５、約１２０、約３２５、約３３０、約３３５、約３４０、約３４５、約３５０、約３５５、約３６０、約３６５、約３７０、約３７５、約３８０、約３８５、約３９０、約３９５、約４００、約４０５、約４１０、約４１５、約４２０、約４２５、約４３０、約４３５、約４４０、約４４５、約４５０、約４５５、約４６０、約４６５、約４７０、約４７５、約４８０、約４８５、約４９０、約４９５、約５００の任意の正の整数である。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ｎは、約５〜約３０、約５〜約２５、約５〜約２０、約５〜約１５、約５〜約１０の正の整数である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ｎは、約２〜約１００、約２〜約９０、約２〜約８０、約２〜約７０、約２〜約６０、約２〜約５０、約２〜約４０、約２〜約３０、約２〜約２０、約２〜約１０の正の整数である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ｎは、約２〜約５８、約３〜約５８、約４〜約５８、約５〜約５８、約６〜約５８、約７〜約５８、約８〜約５８、約９〜約５８、約１０〜約５８、約１１〜約５８、約１２〜約５８、約１３〜約５８、約１４〜約５８、約１５〜約５８、約１６〜約５８、約１７〜約５８、約１８〜約５８、約１９〜約５８、約２０〜約５８、約２１〜約５８、約２２〜約５８、約２３〜約５８、約２４〜約５８、約２５〜約５８、約２６〜約５８、約２７〜約５８、約２８〜約５８、約２９〜約５８、約３０〜約５８、約３１〜約５８、約３２〜約５８、約３３〜約５８、約３４〜約５８、約３５〜約５８、約３６〜約５８、約３７〜約５８、約３８〜約５８、約３９〜約５８、約４０〜約５８、約４１〜約５８、約４２〜約５８、約４３〜約５８、約４４〜約５８、約４５〜約５８、約４６〜約５８、約４７〜約５８、約４８〜約５８、約４９〜約５８、約５０〜約５８、約５１〜約５８、約５２〜約５８、約５３〜約５８、約５４〜約５８、約５５〜約５８、約５６〜約５８、約５７〜約５８の正の整数である。
【０１１７】
いくつかの実施形態中の１つでは、ｎは、約２〜約２９、約３〜約２９、約４〜約２９、約５〜約２９、約６〜約５８、約７〜約２９、約８〜約２９、約９〜約２９、約１０〜約２９、約１１〜約２９、約１２〜約２９、約１３〜約２９、約１４〜約２９、約１５〜約２９、約１６〜約２９、約１７〜約２９、約１８〜約２９、約１９〜約２９、約２０〜約２９、約２１〜約２９、約２２〜約２９、約２３〜約２９、約２４〜約２９、約２５〜約２９、約２６〜約２９、約２７〜約２９、約２８〜約２９の正の整数である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、抗原発現ドメイン１または抗原発現ドメイン２は、約５０〜約１０，０００ヌクレオチドの長さ、例えば、約５０〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約１００〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約５００〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約１，０００〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約５，０００〜約１５，０００ヌクレオチドの長さ、約１０，０００〜約１５，０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、ｎは、約６〜約２６、例えば約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、または約２６の任意の正の整数である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、式Ｉ（［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］）を含む核酸配列を含み、式中、各リンカーは、約０〜約２５までの長さの天然または非天然の核酸から独立して選択可能である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、式Ｉ（［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］）を含む核酸配列を含み、各リンカーは、約０〜約２５の長さ、約０〜約２５、約１〜約２５、約２〜約２５、約３〜約２５、約４〜約２５、約５〜約２５、約６〜約２５、約７〜約２５、約８〜約２５、約９〜約２５、約１０〜約２５、約１１〜約２５、約１２〜約２５、約１３〜約２５、約１４〜約２５、約１５〜約２５、約１６〜約２５、約１７〜約２５、約１８〜約２５、約１９〜約２５、約２０〜約２５、約２１〜約２５、約２２〜約２５、約２３〜約２５、約２４〜約２５の長さの天然または非天然の核酸から独立して選択可能である。いくつかの実施形態では、各リンカーは、約０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５の長さの天然または非天然の核酸である。いくつかの実施形態では、各リンカーは、約２１の長さの天然または非天然の核酸である。特定の実施形態では、２つのリンカーを融合して一緒に使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、約０〜約２５の長さの天然または非天然の核酸、約０〜約２５、約１〜約２５、約２〜約２５、約３〜約２５、約４〜約２５、約５〜約２５、約６〜約２５、約７〜約２５、約８〜約２５、約９〜約２５、約１０〜約２５、約１１〜約２５、約１２〜約２５、約１３〜約２５、約１４〜約２５、約１５〜約２５、約１６〜約２５、約１７〜約２５、約１８〜約２５、約１９〜約２５、約２０〜約２５、約２１〜約２５、約２２〜約２５、約２３〜約２５、約２４〜約２５の長さの天然または非天然の核酸から独立して選択可能である。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、約０〜約２５、約１〜約２５、約２〜約２５、約３〜約２５、約４〜約２５、約５〜約２５、約６〜約２５、約７〜約２５、約８〜約２５、約９〜約２５、約１０〜約２５、約１１〜約２５、約１２〜約２５、約１３〜約２５、約１４〜約２５、約１５〜約２５、約１６〜約２５、約１７〜約２５、約１８〜約２５、約１９〜約２５、約２０〜約２５、約２１〜約２５、約２２〜約２５、約２３〜約２５、約２４〜約２５の長さの天然または非天然の核酸から独立して選択可能である。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、約０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５の長さの天然または非天然の核酸であるリンカーから独立して選択可能である。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、約０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５の長さの天然または非天然の核酸であるリンカーから独立して選択可能である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、約１５〜約３００ヌクレオチドを含み、アミノ酸切断部位をコードする。いくつかの実施形態では、各ＡＥＤの間に配置された各リンカーは、約１５〜約１２０ヌクレオチドを含み、アミノ酸切断部位をコードする同じヌクレオチド配列である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、式（例えば、［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］）は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のリンカーを含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカーおよび第２のリンカーを含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、および第３のリンカーを含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカー、および第４のリンカーを含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカー、第４のリンカー、および第５のリンカーを含む。
【０１２６】
さらなる実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、フューリンプロテアーゼ切断部位を含む。
【０１２７】
フューリンは、真核細胞のトランスゴルジネットワークに存在するプロテアーゼである。その機能は、最終的な細胞の目的地に送達される直前のステップでタンパク質を切断することである。フューリンは、コンセンサスアミノ酸配列、ＲＸＲＲ、ＲＸＲＫ、またはＫＸＫＲ（Ｘは任意のアミノ酸、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭｏｅｈｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）を認識し、トランスゴルジネットワークに到達するとこれらの配列を含むタンパク質を切断する。フューリンはＣａ２＋依存性のセリンエンドプロテアーゼであり、以下の表１に示す複数の基本的なモチーフの後で、タンパク質前駆体を高い特異性で切断する。
【表１】
2021525549.tif 000003
【０１２８】
特定の実施形態では、１つまたは複数の核酸分子は、配列Ｒ−Ｘ−［Ｒ／Ｋ］−Ｒから選択されるフューリン感受性切断部位をコードし、ここで、Ｒはアルギニンを示し、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｋはリジンである。「Ｒ／Ｋ」は、このアミノ酸がアルギニンまたはリジンのいずれかであり得ることを示す。
【０１２９】
特定の実施形態では、フューリン切断部位は、抗原ドメイン１および／または抗原ドメイン２の後に導入される（例えば、［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］）。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、約１５〜約３００ヌクレオチドを含み、切断部位をコードし、少なくとも１つのリンカーは、２Ａ切断部位を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、約１５〜約３００ヌクレオチドを含み、切断部位をコードし、少なくとも１つのリンカーは、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）切断部位を含む。
【０１３１】
２Ａペプチドは、「自己切断型」の小さなペプチドである。２Ａペプチドの平均の長さは１８〜２２アミノ酸である。「２Ａ」という呼称は、ピコルナウイルスポリタンパク質の特定の領域を指す。現在までに識別された２Ａペプチドのうち、４つが研究で広く使用されている：ＦＭＤＶ２Ａ（本明細書ではＦ２Ａと略記）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）；ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）およびＴｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）。前者の３つのウイルスはピコルナウイルスに属し、後者は昆虫ウイルスである。様々な２ＡペプチドのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を以下の表２に示す。下線が付された配列は、切断効率を改善するために追加されたアミノ酸ＧＳＧをコードしている。Ｐ２Ａはブタテッショウウイルス−１  ２Ａを示し、Ｔ２ＡはＴｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス２Ａを、Ｅ２Ａはウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａを、Ｆ２ＡはＦＭＤＶ２Ａを示す。
【表２】
2021525549.tif 000004
【０１３２】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカーおよび第２のリンカーを含み、第１および第２のリンカーは、フューリンプロテアーゼ切断部位を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、および第３のリンカーを含み、第１、第２、および第３のリンカーは、フューリンプロテアーゼ切断部位を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカー、および第４のリンカーを含み、第１、第２、第３、および第４のリンカーは、フューリンプロテアーゼ切断部位を含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカー、第４のリンカー、および第５のリンカーを含み、第１、第２、第３、第４、および第５のリンカーは、フューリンプロテアーゼ切断部位を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカー、第４のリンカー、および第５のリンカーを含み、第１、第２、第３、第４、および第５のリンカーは、フューリンプロテアーゼ切断部位を含む。
【０１３７】
別の実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカーおよび第２のリンカーを含み、第１および第２のリンカーは、Ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、および第３のリンカーを含み、第１、第２、および第３のリンカーは、Ｐ２Ａ切断部位を含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカー、および第４のリンカーを含み、第１、第２、第３、および第４のリンカーは、Ｐ２Ａ切断部位を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカー、第４のリンカー、および第５のリンカーを含み、第１、第２、第３、第４、および第５のリンカーは、Ｐ２Ａ切断部位を含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカー、第４のリンカー、および第５のリンカー、またはそれ以上を含み、第１、第２、第３、第４、および第５のリンカー、またはそれ以上は、Ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位を含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカーおよび第２のリンカーを含み、第１または第２のリンカーのうちの少なくとも１つは、フューリンプロテアーゼ切断部位を含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、および第３のリンカーを含み、第１、第２、または第３のリンカーのうちの少なくとも１つは、フューリンプロテアーゼ切断部位を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカー、および第４のリンカーを含み、第１、第２、第３または第４のリンカーのうちの少なくとも１つは、フューリンプロテアーゼ切断部位を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカー、第４のリンカー、および第５のリンカーを含み、第１、第２、第３、第４、および第５のリンカーのうちの少なくとも１つは、フューリンプロテアーゼ切断部位を含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカーおよび第２のリンカーを含み、第１または第２のリンカーのうちの少なくとも１つは、Ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位を含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、および第３のリンカーを含み、第１、第２、または第３のリンカーのうちの少なくとも１つは、Ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位を含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカー、および第４のリンカーを含み、第１、第２、第３または第４のリンカーのうちの少なくとも１つは、Ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、式は、少なくとも第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカー、第４のリンカー、および第５のリンカーを含み、第１、第２、第３、第４、および第５のリンカーのうちの少なくとも１つは、Ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位を含む。
【０１５０】
本発明の方法において有用な核酸分子には、ネオ抗原またはそのフラグメントをコードする任意の核酸分子、リンカーをコードする任意の核酸、制御配列をコードする任意の核酸、リーダー配列をコードする任意の核酸が含まれる。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示すであろう。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態では、本開示の核酸配列または分子は、配列番号６８、図２Ａ、図２Ｃ、図２Ｅ、図３Ａ、図３Ｃ、図４Ａ、または図４Ｃの配列に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性の核酸配列を含む核酸配列に関する。いくつかの実施形態では、本開示の核酸配列または分子は、配列番号６８、図２Ａ、図２Ｃ、図２Ｅ、図３Ａ、図３Ｃ、図４Ａ、または図４Ｃに対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列を含み、それらのマルチクローニングサイト内に式Ｉ、Ｉ（ａ）、またはＩＩ（ａ）を含む、核酸配列に関する。いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態では、本開示の核酸配列または分子は、配列番号６８、図２Ａ、図２Ｃ、図２Ｅ、図３Ａ、図３Ｃ、図４Ａ、または図４Ｃの配列に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸配列に関する。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ｐＶａｘであるか、または配列番号６８に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸分子に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ｐＶａｘであるか、または配列番号１〜４０に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列のうちの任意の１つまたは複数を含むコード配列を含む配列番号６８に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸分子に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ｐＶａｘであるか、または配列番号１〜４０に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列のうちの任意の１つまたは複数、および任意選択的に、配列番号６１〜６６に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列のうちの１つまたは複数をコードする核酸配列のうちの１つまたは複数を含むコード配列を含む配列番号６８に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸分子に関する。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、例示的なリーダー配列は、以下の配列に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６０１７５４２７に記載されているＩｇＥリーダーアミノ酸配列である。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、核酸は、式Ｉ、式Ｉ（ａ）および／または式Ｉ（ｂ）のうちのいずれか、ならびに１つまたは複数のリーダー配列からなるコード領域を含む。いくつかの実施形態では、リーダー配列は、ＩｇＥリーダー配列：Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｖａｌ（配列番号６９）であるか、または前述の文で識別されたＩｇＥリーダー配列に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同を含むその機能的フラグメントであるリーダー配列である。いくつかの実施形態では、本開示の核酸配列または分子は、配列番号６９に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のリーダーを含む核酸配列に関する。
【０１５４】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭのＮａＣｌ未満および７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約５００ｍＭのＮａＣｌ未満および５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満、より好ましくは約２５０ｍＭのＮａＣｌ未満および２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満である。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下で得ることができ、一方、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、そして最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含むであろう。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、および担体ＤＮＡの包含または除外などの様々な追加のパラメータは、当業者に周知である。必要に応じてこれらの様々な条件を組み合わせることにより、様々なレベルのストリンジェンシーが実現される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および１％のＳＤＳ中、３０℃で起こる。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、および１００μｇ／ｍｌの変性サーモン精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中、３７℃で起こる。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、および２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中、４２℃で起こる。これらの条件の有用な変更は、当業者には容易に明らかになるであろう。
【０１５５】
ほとんどのアプリケーションでは、ハイブリダイゼーションに続く洗浄ステップもストリンジェンシーが異なる。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度と温度によって定義できる。上述のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を下げるか、温度を上げることによって高めることができる。例えば、洗浄ステップのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭのＮａＣｌ未満および３ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満であり、最も好ましくは約１５ｍＭ  ＮａＣｌ未満および１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満である。洗浄ステップのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、さらにより好ましくは少なくとも約６８℃の温度を含むであろう。好ましい実施形態では、洗浄ステップは、３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中、２５℃で起こる。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中、４２℃で起こる。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中、６８℃で起こる。これらの条件の追加の変更は、当業者には容易に明らかになるであろう。ハイブリダイゼーション技術は当業者に周知であり、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，１９７７）、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７２：３９６１，１９７５）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【０１５６】
核酸配列は、ネオ抗原配列の発現を制御する制御タンパク質をコードする他のポリヌクレオチド配列と関連して使用することができる。例えば、本発明による核酸分子は、認識、調節、リーダー、およびおよびプロモーター配列をさらに含み得る。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、少なくとも１つの制御配列をさらに含み、式Ｉの少なくとも１つの核酸配列は、制御配列に作動可能に連結されている。
【０１５８】
別の実施形態では、核酸分子は、リーダー配列をさらに含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、例示的なリーダー配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１６０１７５４２７に記載されるようなＩｇＥリーダーアミノ酸配列である。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、式Ｉ（［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］）を含む核酸配列を含み、式中、抗原発現ドメイン１は、約１２〜約１５，０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、対象からの１つまたは複数のがん細胞由来のエピトープをコードし、抗原発現ドメイン２は、約１２〜約１５，０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、対象からの１つまたは複数のがん細胞由来のエピトープをコードする。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、式Ｉ（［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］）を含む核酸配列を含む核酸分子は、細胞免疫応答を誘発するのに十分な量である。「細胞性免疫応答」は、クラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣを有する抗原の提示を特徴とする細胞に向けられた細胞応答を含むことを意味する。細胞応答は、「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして機能するＴ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関連している。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも呼ばれる）は免疫応答を調節することによって中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＣＴＬとも呼ばれる）はがん細胞などの疾患を有する細胞を殺傷し、より多くの疾患を有する細胞の産生を防ぐ。好ましい実施形態では、本発明は、１つ以上の腫瘍発現抗原を発現し、好ましくはそのような腫瘍発現抗原をクラスＩ  ＭＨＣにより提示する腫瘍細胞に対する抗腫瘍ＣＴＬ応答の刺激を含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、式Ｉ（［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］）を含む核酸配列を含む核酸分子は、１つまたは複数の抗原発現ドメインによってコードされる１つまたは複数のアミノ酸配列のいずれかに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、式Ｉ（［（ＡＥＤｎ）−［ＡＥＤｎ＋１］）を含む核酸配列を含む核酸分子は、１つまたは複数の抗原発現ドメインによってコードされる１つまたは複数のアミノ酸配列のいずれかに対するＣＤ８＋Ｔおよび／またはＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発するのに十分な量である。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、式Ｉ（［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］）を含む核酸配列を含む核酸分子は、１つまたは複数の抗原発現ドメインによってコードされる１つまたは複数のアミノ酸配列のいずれかに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、式Ｉ（［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］）を含む核酸配列を含む核酸分子は、本明細書に開示される核酸配列なしで生成された応答と比較して、１つまたは複数の抗原発現ドメインによってコードされる１つまたは複数のアミノ酸配列のいずれかに対する応答でのＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも約４０％を超えるＴ細胞の亜集団を誘発するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、式Ｉ（［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］）を含む核酸配列を含む核酸分子は、本明細書に開示される核酸配列なしで生成された応答と比較して、１つまたは複数の抗原発現ドメインによってコードされる１つまたは複数のアミノ酸配列のいずれかに対する応答でのＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも約４０％を超えるＴ細胞の亜集団を誘発するのに十ある。いくつかの実施形態では、式Ｉ（［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］）を含む核酸配列を含む核酸分子は、本明細書に開示される核酸配列なしで生成された応答と比較して、１つまたは複数の抗原発現ドメインによってコードされる１つまたは複数のアミノ酸配列のいずれかに対する応答での少なくとも約４０％を超えるＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、かつ少なくとも約４０％を超えるＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、Ｔ細胞の亜集団を誘発するのに十分な量である。
【０１６４】
さらに別の態様では、本明細書の態様および実施形態のいずれかに記載された核酸分子は、プラスミドである。特定の実施形態では、発現ベクターは、態様および実施形態のいずれかに記載された核酸分子を含む。特定の実施形態では、核酸発現ベクターは、プラスミドである。ベクターは、哺乳動物の免疫応答を誘発するのに有効な量で、哺乳動物の細胞内で１つまたは複数のコンセンサスネオ抗原配列を発現できるものであり得る。ベクターは、組換え体であり得る。ベクターは、ネオ抗原をコードする異種核酸を含むことができる。ベクターは、プラスミドであり得る。ベクターは、ネオ抗原をコードする核酸で細胞をトランスフェクトするのに有用であり得、これは、形質転換された宿主細胞が、ネオ抗原の発現が起こる条件下で培養および維持される。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物において免疫応答を誘発するのに有効な量で、哺乳動物の細胞において１つまたは複数のネオ抗原配列を発現することができる。いくつかの実施形態では、核酸分子を含む細胞は、腫瘍を約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、またはそれ以上のパーセント以上縮小する哺乳動物において免疫応答を誘発するのに有効な量で、哺乳動物の細胞において１つまたは複数のコンセンサスネオ抗原配列を発現することができる。いくつかの実施形態では、核酸分子を含む細胞は、１つまたは複数のネオ抗原に対する総Ｔ細胞刺激の約０．１〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞のクローン増殖を誘発するのに有効な量で、哺乳動物の細胞において１つまたは複数のネオ抗原アミノ酸配列を発現することができる。
【０１６５】
ベクターは、ネオ抗原をコードする異種核酸を含むことができ、ネオ抗原コード配列の上流にあり得る開始コドン、およびネオ抗原コード配列の下流にあり得る終止コドンをさらに含むことができる。開始および終止コドンは、ネオ抗原コード配列とインフレームにすることができる。ベクターはまた、ネオ抗原コード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含むことができる。ネオ抗原コード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復リピート（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ前初期プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターであり得る。プロモーターはまた、天然または合成の筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号に記載されており、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
ベクターはまた、ＨＡコード配列の下流にあり得るポリアデニル化シグナルを含み得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトベータグロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）由来のポリアデニル化シグナルであり得る。
【０１６７】
ベクターはまた、ネオ抗原コーディングの上流にエンハンサーを含むことができる。エンハンサーは、ＤＮＡ発現に必要な場合がある。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶもしくはＥＢＶ由来のものなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能増強は、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、およびＷＯ９４／０１６７３７に記載されており、それぞれの内容は、参照により完全に組み込まれる。
【０１６８】
ベクターはまた、ベクターを染色体外に維持し、細胞内でベクターの複数のコピーを産生するために、哺乳動物の複製起点を含むことができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＬＬＣ、ＴＣ１、ＩＤ８、ｐＧＸ４５０１、ｐＧＸ４５０３、ｐＧＸ４５０４、ｐＧＸ４５０５、および／またはｐＧＸ４５０６、またはＬＬＣ、ＴＣ１、ＩＤ８、ｐＧＸ４５０１、ｐＧＸ４５０３、ｐＧＸ４５０４、ｐＧＸ４５０５、および／またはｐＧＸ４５０６のうちの１つ以上のいずれかの制御配列または非コード配列であり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｐＶＡＸ１である配列を含む。ベクターのバックボーンは、ｐＡＶ０２４２であり得る。ベクターは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）ベクターであり得る。
【０１６９】
ベクターはまた、ベクターが投与される哺乳動物またはヒト細胞における遺伝子発現によく適している可能性がある制御配列を含むことができる。ネオ抗原コード配列は、宿主細胞におけるコード配列のより効率的な転写を可能にすることができるコドンを含むことができる。
【０１７０】
ベクターは、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのタンパク質生産に使用することができる。ベクターはまた、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、これは酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株でのタンパク質産生に使用することができる。ベクターはまた、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全なバキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）のものであり得、これは昆虫細胞でのタンパク質産生に使用できる。ベクターは、ｐｃＤＮＡ  ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞でのタンパク質産生に使用できる。ベクターは、日常的な技術によってタンパク質を産生するための発現ベクターまたはシステム、および参照により完全に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）を含む容易に入手可能な出発物質であり得る。
【０１７１】
異なる細胞型に対する発現ベクターは当該技術分野で周知であり、過度の実験なしに選択することができる。一般に、ＤＮＡはプラスミドなどの発現ベクターに、発現のための適切な方向および正しいリーディングフレームで挿入される。必要に応じて、ＤＮＡは、所望の宿主（例えば、細菌）によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結され得るが、そのような制御は、一般に、発現ベクターにおいて利用可能である。次いで、ベクターは、標準的な技術を使用してクローニングするために宿主細菌に導入される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、式Ｉの核酸配列は、ＬＬＣ、ＴＣ１、ＩＤ８、ｐＧＸ４５０１、ｐＧＸ４５０３、ｐＧＸ４５０４、ｐＧＸ４５０５、およびｐＧＸ４５０６からなる群から選択されるプラスミドのマルチクローニングサイトで配置される。いくつかの実施形態では、式Ｉの核酸配列は、ＬＬＣのマルチクローニングサイトに配置される。いくつかの実施形態では、式Ｉの核酸配列は、ＴＣ１のマルチクローニングサイトに配置される。いくつかの実施形態では、式Ｉの核酸配列は、ＩＤ８のマルチクローニングサイトに配置される。いくつかの実施形態では、式Ｉの核酸配列は、ｐＧＸ４５０１のマルチクローニングサイトに配置される。いくつかの実施形態では、式Ｉの核酸配列は、ｐＧＸ４５０３のマルチクローニングサイトに配置される。いくつかの実施形態では、式Ｉの核酸配列は、ｐＧＸ４５０４のマルチクローニングサイトに配置される。いくつかの実施形態では、式Ｉの核酸配列は、ｐＧＸ４５０５のマルチクローニングサイト内に配置される。いくつかの実施形態では、式Ｉの核酸配列は、ｐＧＸ４５０６のマルチクローニングサイトに配置される。好ましい実施形態では、プラスミドは、ｐＧＸ４５０５または上述で識別されたヌクレオチド配列に対して７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である配列である。
【０１７３】
別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載のプラスミドで形質転換される。
【０１７４】
本発明はまた、本発明の１つ以上のネオ抗原性ペプチドが単一の発現ベクターによってコードされ得ることを提供する。本発明はまた、本発明の１つ以上のネオ抗原ペプチドが、ウイルスベースのシステム（例えば、アデノウイルスシステム）を使用してインビボでコードおよび発現され得ることを提供する。
【０１７５】
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに追加のコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれ、二本鎖、または一本鎖がコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る場合一本鎖であり得る。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞からのポリペプチドの発現および／または分泌を助けるポリヌクレオチド（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に同じリーディングフレームで融合された腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドのコード配列を含み得る。リーダー配列を有するポリペプチドは前駆タンパク質であり、宿主細胞によって切断されてポリペプチドの成熟形態を形成するリーダー配列を有することができる。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、コードされたポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に同じリーディングフレームで融合された腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドのコード配列を含み得、これは、その後、個人化された新生物ワクチンに組み込まれ得る。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供するためにｐＱＥ−９ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグであり得るか、または哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合、マーカー配列はインフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来する血球凝集素（ＨＡ）タグであり得る。追加のタグには、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐタグ、Ｓｐｙタグ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ＧＳＴタグ、蛍光タンパク質タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質タグ）、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、チオレドキシンタグ、ＴＣタグ、Ｔｙタグなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７８】
実施形態では、ポリヌクレオチドは、同じリーディングフレームに融合されて、複数のネオ抗原ペプチドを産生することができる単一の連結されたネオ抗原ペプチドコンストラクトを作製する１つ以上の腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドのコード配列を含み得る。
【０１７９】
実施形態では、本発明は、本発明の腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一のヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を提供する。
【０１８０】
少なくとも例えば、参照ヌクレオチド配列に対して９５％「同一」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドあたり最大５つの点突然変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることが意図される。換言すると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの最大５％を削除するか、または別のヌクレオチドと置き換え、あるいは参照配列の全ヌクレオチドの最大５％のヌクレオチドの数を参照配列に挿入することができる。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列のアミノ末端またはカルボキシ末端の位置、またはそれらの末端位置の間の任意の場所で起こり得、参照配列のヌクレオチド間に個別に、または参照配列内の１つ以上の連続する群に散在する。
【０１８１】
実際問題として、特定の核酸分子が参照配列に対して少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、およびいくつかの実施形態では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）などの既知のコンピュータプログラムを使用して従来どおり決定できる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）のローカル相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間の相同性の最良のセグメントを見つける。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは他の配列アラインメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば本発明による参照配列と９５％同一であるかどうかを決定するとき、パラメータは、同一のパーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、参照配列内のヌクレオチドの総数の最大５％の相同性のギャップが許容されるように設定される。
【０１８２】
本開示はまた、本明細書に記載の１つまたは複数の核酸分子を含む組成物を含む。
【０１８３】
本開示はまた、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡワクチンの形態で、ｉｎ  ｖｉｖｏで対象にネオ抗原を送達するためのビヒクルとしての核酸分子の使用を企図する（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／１５９６４３、およびＷＯ２０１２／１５９７５４を参照されたい）。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、個人化された新生物ワクチンは、例えば、本発明に従って識別された１つ以上のネオ抗原ペプチド／ポリペプチドをコードする別個のＤＮＡプラスミドを含み得る。上で考察されるように、発現ベクターの正確な選択は、発現されるペプチド／ポリペプチドに依存し、そして当業者の技術の範囲内である。ＤＮＡコンストラクトの予想される持続性（例えば、筋肉細胞におけるエピソーム、非複製、非組み込み形態）は、保護期間の延長を提供すると予想される。いくつかの実施形態では、組成物は、第１、第２、または第３の核酸分子を含み、少なくとも第１の核酸分子は、１つ以上のネオ抗原をコードする。いくつかの実施形態では、第２の核酸分子は、１つ以上のネオ抗原を含む。いくつかの実施形態では、第２の核酸分子は１つ以上のアジュバントをコードする核酸配列を含む。他の実施形態では、個人化された新生物ワクチンは、本発明のネオ抗原ペプチド／ポリペプチドをコードする別個のＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子を含み得る。
【０１８５】
別の実施形態では、個人化された新生物ワクチンは、例えば、アデノウイルスシステムなどのヒト患者で使用するためのウイルスベースのベクターを含み得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｈｕｍａｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２６  ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｖａｃｃｉｎｅ（ＩＰＣＡＶＤ  ００１）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２０１３  Ｊａｎ．１５；２０７（２）：２４０−７を参照されたい）。
【０１８６】
ネオ抗原を識別する方法
本明細書でより詳細に記載されるように、腫瘍特異的突然変異を識別するために各患者の新生物／腫瘍および正常ＤＮＡを配列決定し、そして患者のＨＬＡアロタイプを決定することによって、新生物／腫瘍特異的ネオ抗原の集団を識別し得る。新生物／腫瘍特異的ネオ抗原およびそれらの同族の天然抗原の集団は、検証されたアルゴリズムを使用して生物情報分析の対象となり、どの腫瘍特異的変異が患者のＨＬＡアロタイプに結合できるエピトープを作成するか、特にどの腫瘍特異的変異が同族の天然抗原よりも効果的に患者のＨＬＡアロタイプに結合できるエピトープを作成するかを予測することができる。この分析に基づいて、これらの突然変異に対応する識別されたヌクレオチド配列は、各患者のために設計され得、そして対象を免疫する際のがんワクチンとして使用するために一緒に使用され得る。
【０１８７】
一態様では、本開示は、対象が１つ以上の過剰増殖性細胞（例えば腫瘍など）と診断されているか、その疑いがあるか、またはそれを含む、対象において１つ以上の対象特異的ネオ抗原突然変異を識別する方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示は、対象において１つ以上の対象特異的ネオ抗原突然変異を識別する方法であって、対象が、複数のネオ抗原突然変異の存在または量を特徴とする１つ以上の過剰増殖性細胞（例えば、腫瘍など）と診断されているか、その疑いがあるか、またはそれらを含み、対象の腫瘍および対象の非腫瘍試料からの核酸試料を配列決定することと、配列を分析して、コード領域と非コード領域を決定することと、非腫瘍試料に存在しない腫瘍特異的非同義または非サイレント変異を含む配列を識別することと、単一ヌクレオチド変異、ならびに単一ヌクレオチド挿入および欠失を識別することと、非腫瘍試料には存在しない腫瘍特異的非同義または非サイレント突然変異を含む配列によってコードされる対象特異的ペプチドを産生することと、対象特異的ペプチドの結合特性を測定することと、を含み、各対象特異的ペプチドは、非腫瘍試料には存在しない対象特異的ＤＮＡネオ抗原の発現産物であり、それにより、対象において１つ以上の対象特異的ＤＮＡネオ抗原を識別する、方法を特徴とする。
【０１８８】
対象特異的ペプチドの結合特性を測定することは、Ｔ細胞受容体への対象特異的ペプチドの結合を測定すること、対象のＨＬＡタンパク質への対象特異的ペプチドの結合を測定すること、または抗原処理（ＴＡＰ）に関連するトランスポーターへの対象特異的ペプチドの結合を測定すること、のうちの１つ以上によって実行される。
【０１８９】
免疫原として利用する特定の突然変異を効率的に選択するには、患者のＨＬＡタイプを識別し、どの変異ペプチドが患者のＨＬＡ対立遺伝子に効率的に結合するかを予測する能力が必要である。したがって、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体への対象特異的ペプチドの結合を測定することは、対象または試料のＨＬＡタンパク質への対象特異的ペプチドの結合を測定することを含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、対象特異的ペプチドは、約５５０ｎＭ未満のＩＣ５０で対象のＨＬＡタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、対象特異的ペプチドは、約５００ｎＭ未満のＩＣ５０で対象のＨＬＡタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、対象特異的ペプチドは、約４５０ｎＭ未満のＩＣ５０で対象のＨＬＡタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、対象特異的ペプチドは、約４００ｎＭ未満のＩＣ５０で対象のＨＬＡタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、対象特異的ペプチドは、約３５０ｎＭ未満のＩＣ５０で対象のＨＬＡタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、対象特異的ペプチドは、約３００ｎＭ未満のＩＣ５０で対象のＨＬＡタンパク質に結合する。
【０１９１】
別の実施形態では、対象において１つ以上の対象特異的ＤＮＡネオ抗原突然変異を識別する方法は、結合特性に基づいて対象特異的ペプチドをランク付けするステップをさらに含む。
【０１９２】
別の実施形態では、対象において１つ以上の対象特異的ＤＮＡネオ抗原突然変異を識別する方法は、対象特異的ペプチドによって生成されるＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を測定するステップをさらに含む。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を測定する方法は当該技術分野で既知であり、本明細書に記載されている。
【０１９３】
さらなる実施形態では、対象において１つ以上の対象特異的ＤＮＡネオ抗原突然変異を識別する方法は、対象への投与のために対象特異的ＤＮＡネオ抗原を免疫原性組成物へと製剤化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、上位２００位のネオ抗原突然変異は、免疫原性組成物に含まれるか、またはサブクローン化され、これは、いくつかの実施形態では、１つまたは複数のプラスミドである。別の実施形態では、上位１５０位のネオ抗原突然変異は、免疫原性組成物に含まれる。別の実施形態では、上位１００位のネオ抗原突然変異は、免疫原性組成物に含まれる。別の実施形態では、上位５０位のネオ抗原突然変異は、免疫原性組成物に含まれる。別の実施形態では、上位２５位のネオ抗原突然変異は、免疫原性組成物に含まれる。別の実施形態では、上位１０位のネオ抗原突然変異は、免疫原性組成物に含まれる。別の実施形態では、上位５位のネオ抗原突然変異は、免疫原性組成物に含まれる。別の実施形態では、上位５〜２０位のネオ抗原突然変異は、免疫原性組成物に含まれる。別の実施形態では、上位１０〜５０位のネオ抗原突然変異は、疫原性組成物に含まれる。別の実施形態では、上位２５〜１００位のネオ抗原突然変異は、免疫原性組成物に含まれる。別の実施形態では、上位５０〜１００位のネオ抗原突然変異は、免疫原性組成物に含まれる。別の実施形態では、上位１００〜２００位のネオ抗原突然変異は、免疫原性組成物に含まれる。
【０１９４】
別の実施形態では、対象において１つ以上の対象特異的ＤＮＡネオ抗原突然変異を識別する方法は、対象から得られた樹状細胞（ＤＣ）を含む培養物を提供することと、樹状細胞を免疫原性組成物と接触させることをさらに含む。ＤＣは、Ｔ細胞免疫を開始する強力な抗原提示細胞であり、目的の１つ以上のネオ抗原をロードするとがんワクチンとして使用できる。さらなる実施形態では、この方法は、樹状細胞を対象に投与することと、対象からの末梢血試料からＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を取得することであって、ＣＤ８＋細胞が少なくとも１つのネオ抗原を認識する、取得することと、ネオ抗原を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を増殖することと、をさらに含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖した集団は、対象に投与される。
【０１９６】
好ましくは、任意の好適な合成による配列決定プラットフォームを使用して、突然変異を識別することができる。Ｒｏｃｈｅ／４５４  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／ＳｏｌｅｘａのＨｉＳｅｑアナライザー、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤシステム、Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＨｅｌｉｓｃｏｐｅシステムの４つの主要な合成による配列決定プラットフォームが現在利用可能である。合成による配列決定プラットフォームは、Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＶｉｓｉＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによっても説明されている。これらのプラットフォームの各々は、本発明の方法で使用することができる。いくつかの実施形態では、配列決定されている複数の核酸分子は、支持体（例えば、固体支持体）に結合している。核酸を支持体に固定化するために、捕捉配列／ユニバーサルプライミング部位をテンプレートの３’および／または５’末端に付加することができる。支持体に共有結合している相補的配列に捕捉配列をハイブリダイズさせることにより、核酸を支持体に結合させることができる。捕捉配列（ユニバーサル捕捉配列とも呼ばれる）は、ユニバーサルプライマーとして二重に機能し得る支持体に付着した配列に相補的な核酸配列である。
【０１９７】
捕捉配列の代替として、カップリング対のメンバー（例えば、抗体／抗原、受容体／リガンド、または例えば、米国特許出願第２００６／０２５２０７７号に記載されているようなアビジン−ビオチン対）は、そのカップリング対のそれぞれの第２のメンバーでコーティングされた表面に捕捉される各フラグメントに連結できる。捕捉に続いて、配列は、例えば、例えば、実施例および米国特許第７，２８３，３３７号に記載されているように、合成によるテンプレート依存性配列決定を含む、単一分子の検出／配列決定によって分析され得る。合成による配列決定において、表面結合分子は、ポリメラーゼの存在下で複数の標識されたヌクレオチド三リン酸に曝露される。テンプレートの配列は、成長する鎖の３’末端に組み込まれた標識ヌクレオチドの順序によって決定される。これは、リアルタイムまたはステップアンドリピートモードで行うことができる。リアルタイム分析のために、各ヌクレオチドへの異なる光学的標識を組み込むことができ、組み込まれたヌクレオチドの刺激のために複数のレーザーを利用することができる。
【０１９８】
本明細書に記載の配列決定法で使用するための核酸試料を得るために、任意の細胞型または組織を利用することができる。好ましい実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料は、新生物、腫瘍、または既知の技術（例えば、静脈穿刺）または唾液によって得られた体液、例えば、血液から得られる。代替的に、核酸検査は乾燥した試料（例えば髪または皮膚）で実施することができる。
【０１９９】
個人のＤＮＡまたはＲＮＡにおける特定の突然変異または対立遺伝子の存在を検出するために、様々な方法が利用可能である。この分野の進歩により、正確、簡単、かつ安価な大規模ＳＮＰジェノタイピングが提供されている。最近では、例えば、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイダイアゴナルゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシーケンス、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム、およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰチップなどの様々なＤＮＡ「チップ」テクノロジーを含むいくつかの新しい技術が説明されている。これらの方法では、典型的にはＰＣＲによる標的遺伝子領域の増幅が必要である。侵襲的切断とそれに続く質量分析または固定化されたパドロックプローブおよびローリングサークル増幅による小シグナル分子の生成に基づくさらに他の新しく開発された方法は、最終的にはＰＣＲの必要性を排除する可能性がある。特定の一塩基多型を検出するための当該技術分野で既知のいくつかの方法を以下に要約する。本発明の方法は、利用可能な全ての方法を含むと理解される。
【０２００】
ＰＣＲベースの検出手段は、複数のマーカーの同時の多重増幅を含み得る。例えば、サイズが重複せず、同時に分析することができるＰＣＲ産物を生成するためにＰＣＲプライマーを選択することは当該技術分野で周知である。
【０２０１】
代替的に、異なって標識され、したがって各々が異なって検出され得るプライマーで異なるマーカーを増幅することが可能である。当然に、ハイブリダイゼーションベースの検出手段は、試料中の複数のＰＣＲ産物の差次的検出を可能にする。複数のマーカーの多重分析を可能にする他の技術が当該技術分野で既知である。
【０２０２】
ゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡの単一ヌクレオチド多型の分析を促進するためにいくつかの方法が開発されている。いくつかの実施形態では、単一ヌクレオチド多型は、例えば、米国特許第４，６５６，１２７号のように開示されているように、特殊なエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを使用することによって検出することができる。この方法によれば、多型部位のすぐ３’にある対立遺伝子配列に相補的なプライマーは、特定の動物またはヒトから得られた標的分子にハイブリダイズすることが可能である。標的分子の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含む場合、その誘導体は、ハイブリダイズしたプライマーの末端に組み込まれる。そのような組み込みは、プライマーをエキソヌクレアーゼに対して耐性にし、それによってその検出を可能にする。試料のエキソヌクレアーゼ耐性誘導体の同一性が知られているので、プライマーがエキソヌクレアーゼに耐性になったという発見は、標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドが反応で使用されるヌクレオチド誘導体のヌクレオチドと相補的であることを明らかにする。この方法には、大量の無関係な配列データの決定を必要としないという利点がある。
【０２０３】
本発明の別の実施形態では、溶液ベースの方法が、多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するために使用される。Ｃｏｈｅｎら（フランス特許第２，６５０，８４０号、ＰＣＴ出願番号第ＷＯ１９９１／０２０８７号）。米国特許第４，６５６，１２７号の方法のように、多型部位のすぐ３’にある対立遺伝子配列に相補的なプライマーを使用することができる。この方法は、標識されたジデオキシヌクレオチド誘導体を使用してその部位のヌクレオチドの同一性を決定し、これは、多型部位のヌクレオチドに相補的である場合、プライマーの末端に組み込まれるようになる。
【０２０４】
Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  ＡｎａｌｙｓｉｓまたはＧＢＡとして知られる代替的な方法は、ＰＣＴ出願番号第ＷＯ１９９２／１５７１２号に記載されている。ＧＢＡは、標識されたターミネーターと、多型部位の３’側の配列に相補的なプライマーの混合物を使用する。したがって、組み込まれる標識されたターミネーターは、評価される標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドによって決定され、相補的である。Ｃｏｈｅｎらの方法（フランス特許第２，６５０，８４０号、ＰＣＴ出願番号第ＷＯ１９９１／０２０８７号）とは対照的に、ＧＢＡ法は、好ましくは、プライマーまたは標的分子が固相に固定化される不均一相アッセイである。
【０２０５】
ＤＮＡの多型部位をアッセイするためのいくつかのプライマー誘導ヌクレオチド組み込み手順が記載されている（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９−７７８４（１９８９）；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３６７１（１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：６８４−６９２（１９９０）；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３−１１４７（１９９１）；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９−１６４（１９９２）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，ＧＡＴＡ  ９：１０７−１１２（１９９２）；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１−１７５（１９９３））。これらの方法は、多型部位の塩基を区別するために標識されたデオキシヌクレオチドの組み込みに全て依存しているという点でＧＢＡとは異なる。このようなフォーマットでは、シグナルは組み込まれるデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチドの実行で発生する多型は、実行の長さに比例するシグナルをもたらす可能性がある（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６−５９（１９９３））。
【０２０６】
本開示は、一般に、試料から１つまたは複数のネオ抗原を識別または選択する方法であって、（ａ）試料からのＤＮＡ／ＲＮＡを配列決定することと、（ｂ）対象または試料のＨＬＡタンパク質への対象特異的ペプチドの結合を測定することを含む対象特異的ペプチドのＴ細胞受容体への結合を測定することと、（ｃ）対象からのＨＬＡタンパク質が約５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、または１００ｎＭ未満のＩＣ５０で対象のＨＬＡタンパク質に結合する場合に試料から複数のネオ抗原を選択することと、任意選択的に、（ｄ）最低ＩＣ５０値から最高ＩＣ５０値の順にネオ抗原を順序付けることと、を含む方法に関する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、本開示は、前述のステップのうちのいずれか１つ以上を実施することを含み、１つまたは複数のネオ抗原をコードする核酸配列を１つ以上の核酸分子にサブクローニングすることをさらに含み、任意選択的に、核酸分子を１つ以上の薬学的に許容される担体に懸濁することを含む、ワクチンを生成することまたは医薬組成物を製造することに関する。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、ネオ抗原をコードする核酸配列はまた、リンカーを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、Ｐ２Ａリンカーをコードする核酸配列を含まない。いくつかの実施形態では、核酸分子は、２つの異なるリンカーをコードする核酸配列を含まない。いくつかの実施形態では、核酸分子は、リンカーをコードする核酸配列を含まず、その結果、５’から３’方向の少なくとも２つまたは複数のＡＥＤ配列は、別個のポリペプチドまたは大きな連続する融合タンパク質としてコードされる。別の実施形態では、対象において１つ以上の対象特異的ＤＮＡネオ抗原突然変異を識別する方法は、対象から得られた樹状細胞（ＤＣ）を含む培養物を提供することと、樹状細胞を免疫原性組成物と接触させることと、をさらに含む。ＤＣは、Ｔ細胞免疫を開始する強力な抗原提示細胞であり、目的の１つ以上のネオ抗原をロードするとがんワクチンとして使用できる。さらなる実施形態では、この方法は、樹状細胞を対象に投与することと、対象からの末梢血試料からＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を取得することでって、ＣＤ８＋細胞が少なくとも１つのネオ抗原を認識する、取得することと、ネオ抗原を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を増殖することと、をさらに含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖した集団は、対象に投与される。
【０２１０】
好ましくは、任意の好適な合成による配列決定プラットフォームを使用して、突然変異を識別することができる。Ｒｏｃｈｅ／４５４  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／ＳｏｌｅｘａのＨｉＳｅｑアナライザー、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤシステム、Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＨｅｌｉｓｃｏｐｅシステムの４つの主要な合成による配列決定プラットフォームが現在利用可能である。合成による配列決定プラットフォームは、Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＶｉｓｉＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによっても説明されている。これらのプラットフォームの各々は、本発明の方法で使用することができる。いくつかの実施形態では、配列決定されている複数の核酸分子は、支持体（例えば、固体支持体）に結合している。核酸を支持体に固定化するために、捕捉配列／ユニバーサルプライミング部位をテンプレートの３’および／または５’末端に付加することができる。支持体に共有結合している相補的配列に捕捉配列をハイブリダイズさせることにより、核酸を支持体に結合させることができる。捕捉配列（ユニバーサル捕捉配列とも呼ばれる）は、ユニバーサルプライマーとして二重に機能し得る支持体に付着した配列に相補的な核酸配列である。
【０２１１】
捕捉配列の代替として、カップリング対のメンバー（例えば、抗体／抗原、受容体／リガンド、または例えば、米国特許出願第２００６／０２５２０７７号に記載されているようなアビジン−ビオチン対）は、そのカップリング対のそれぞれの第２のメンバーでコーティングされた表面に捕捉される各フラグメントに連結できる。捕捉に続いて、配列は、例えば、例えば、実施例および米国特許第７，２８３，３３７号に記載されているように、合成によるテンプレート依存性配列決定を含む、単一分子の検出／配列決定によって分析され得る。合成による配列決定において、表面結合分子は、ポリメラーゼの存在下で複数の標識されたヌクレオチド三リン酸に曝露される。テンプレートの配列は、成長する鎖の３’末端に組み込まれた標識ヌクレオチドの順序によって決定される。これは、リアルタイムまたはステップアンドリピートモードで行うことができる。リアルタイム分析のために、各ヌクレオチドへの異なる光学的標識を組み込むことができ、組み込まれたヌクレオチドの刺激のために複数のレーザーを利用することができる。
【０２１２】
本明細書に記載の配列決定法で使用するための核酸試料を得るために、任意の細胞型または組織を利用することができる。好ましい実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料は、新生物／腫瘍、または既知の技術（例えば、静脈穿刺）または唾液によって得られた体液、例えば、血液から得られる。代替的に、核酸検査は乾燥した試料（例えば髪または皮膚）で実施することができる。
【０２１３】
個人のＤＮＡまたはＲＮＡにおける特定の突然変異または対立遺伝子の存在を検出するために、様々な方法が利用可能である。この分野の進歩により、正確、簡単、かつ安価な大規模ＳＮＰジェノタイピングが提供されている。最近では、例えば、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイダイアゴナルゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシーケンス、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム、およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰチップなどの様々なＤＮＡ「チップ」テクノロジーを含むいくつかの新しい技術が説明されている。これらの方法では、典型的にはＰＣＲによる標的遺伝子領域の増幅が必要である。侵襲的切断とそれに続く質量分析または固定化されたパドロックプローブおよびローリングサークル増幅による小シグナル分子の生成に基づくさらに他の新しく開発された方法は、最終的にはＰＣＲの必要性を排除する可能性がある。特定の単一ヌクレオチド多型を検出するための当該技術分野で既知のいくつかの方法を以下に要約する。本発明の方法は、利用可能な全ての方法を含むと理解される。
【０２１４】
ＰＣＲベースの検出手段は、複数のマーカーの同時の多重増幅を含み得る。例えば、サイズが重複せず、同時に分析することができるＰＣＲ産物を生成するためにＰＣＲプライマーを選択することは当該技術分野で周知である。
【０２１５】
代替的に、異なって標識され、したがってそれぞれが異なって検出され得るプライマーで異なるマーカーを増幅することが可能である。当然に、ハイブリダイゼーションベースの検出手段は、試料中の複数のＰＣＲ産物の差次的検出を可能にする。複数のマーカーの多重分析を可能にする他の技術が当該技術分野で既知である。
【０２１６】
ゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡの単一ヌクレオチド多型の分析を促進するためにいくつかの方法が開発されている。いくつかの実施形態では、単一ヌクレオチド多型は、例えば、米国特許第４，６５６，１２７号のように開示されているように、特殊なエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを使用することによって検出することができる。この方法によれば、多型部位のすぐ３’にある対立遺伝子配列に相補的なプライマーは、特定の動物またはヒトから得られた標的分子にハイブリダイズすることが可能である。標的分子の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含む場合、その誘導体は、ハイブリダイズしたプライマーの末端に組み込まれる。そのような組み込みは、プライマーをエキソヌクレアーゼに対して耐性にし、それによってその検出を可能にする。試料のエキソヌクレアーゼ耐性誘導体の同一性が知られているので、プライマーがエキソヌクレアーゼに耐性になったという発見は、標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドが反応で使用されるヌクレオチド誘導体のヌクレオチドと相補的であることを明らかにする。この方法には、大量の無関係な配列データの決定を必要としないという利点がある。
【０２１７】
本発明の別の実施形態では、溶液ベースの方法が、多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するために使用される。Ｃｏｈｅｎら（フランス特許第２，６５０，８４０号、ＰＣＴ出願番号第ＷＯ１９９１／０２０８７号）。米国特許第４，６５６，１２７号の方法のように、多型部位のすぐ３’にある対立遺伝子配列に相補的なプライマーを使用することができる。この方法は、標識されたジデオキシヌクレオチド誘導体を使用してその部位のヌクレオチドの同一性を決定し、これは、多型部位のヌクレオチドに相補的である場合、プライマーの末端に組み込まれるようになる。
【０２１８】
Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  ＡｎａｌｙｓｉｓまたはＧＢＡとして既知の代替的な方法は、ＰＣＴ出願番号第ＷＯ１９９２／１５７１２号に記載されている。ＧＢＡは、標識されたターミネーターと、多型部位の３’側の配列に相補的なプライマーの混合物を使用する。したがって、組み込まれる標識されたターミネーターは、評価される標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドによって決定され、相補的である。Ｃｏｈｅｎらの方法（フランス特許第２，６５０，８４０号、ＰＣＴ出願番号第ＷＯ１９９１／０２０８７号）とは対照的に、ＧＢＡ法は、好ましくは、プライマーまたは標的分子が固相に固定化される不均一相アッセイである。
【０２１９】
ＤＮＡの多型部位をアッセイするためのいくつかのプライマー誘導ヌクレオチド組み込み手順が記載されている（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９−７７８４（１９８９）；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３６７１（１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：６８４−６９２（１９９０）；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３−１１４７（１９９１）；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９−１６４（１９９２）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，ＧＡＴＡ  ９：１０７−１１２（１９９２）；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１−１７５（１９９３））。これらの方法は、多型部位の塩基を区別するために標識されたデオキシヌクレオチドの組み込みに全て依存しているという点でＧＢＡとは異なる。このようなフォーマットでは、シグナルは組み込まれるデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチドの実行で発生する多型は、実行の長さに比例するシグナルをもたらす可能性がある（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６−５９（１９９３））。
【０２２０】
がんを治療する方法
本開示はさらに、対象において新生物／腫瘍特異的免疫応答を誘導し、新生物／腫瘍に対してワクチン接種し、対象に本明細書に記載の核酸配列を投与することにより対象においてがんの症状を治療および／または緩和する方法を提供する。
【０２２１】
一態様では、本開示は、対象においてがんを治療および／または予防する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載のいずれかの核酸分子（例えば、式Ｉ：［［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］を含む核酸配列を含む核酸分子）または本明細書に記載の医薬組成物のいずれかを投与することを含む、方法を提供する。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、エレクトロポレーションによって対象に投与される。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、治療は、臨床転帰、Ｔ細胞による抗腫瘍活性の増加、増強もしくは延長、治療前の数と比較した抗腫瘍Ｔ細胞もしくは活性化Ｔ細胞の数の増加、またはこれらの組み合わせによって決定される。さらなる実施形態では、臨床転帰は、腫瘍退縮、腫瘍縮小、腫瘍壊死、免疫系による抗腫瘍応答、腫瘍拡大、再発もしくは拡大、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０２２４】
この文書の組み合わせ療法で治療することができるがんおよびがん状態の例には、がんを有すると診断された、またはがんを発症するリスクがある、それを必要とする患者が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、対象は以前に治療されており、チェックポイント阻害剤療法に応答していない。
【０２２６】
本明細書に記載の治療法は、対象が検出可能な新生物を有さないが、疾患再発のリスクが高い場合にも適用可能である。
【０２２７】
本開示によれば、本明細書に記載の核酸分子は、がんを有すると診断された、またはがんを発症するリスクがあると診断された患者に使用することができる。
【０２２８】
特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、がんは、高い突然変異荷重を有する。
【０２３０】
別の実施形態では、がんは、中程度の突然変異荷重を有する。
【０２３１】
他の実施形態では、がんは、チェックポイント阻害剤療法に対して不十分または低い応答を有することが示されている。
【０２３２】
特定の実施形態では、がんは、急性リンパ芽球性白血病、成人；急性リンパ芽球性白血病、小児期；急性骨髄性白血病、成人；副腎皮質癌；副腎皮質癌、小児期；エイズ関連リンパ腫；エイズ関連悪性腫瘍；肛門癌；星状細胞腫、小児期小脳；星状細胞腫、小児期大脳；胆管癌、肝外；膀胱癌；膀胱癌、小児期；骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫；脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、成人；脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、小脳星細胞腫、小児期；脳腫瘍、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、小児期；脳腫瘍、上衣腫、小児期；脳腫瘍、髄芽腫、小児期；脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍、小児期；脳腫瘍、視経路および視床下部膠腫、小児期；脳腫瘍、小児期（その他）；乳癌；乳癌および妊娠；乳がん、小児期；乳がん、男性；気管支腺腫／カルチノイド、小児期；カルチノイド腫瘍、小児期；カルチノイド腫瘍、消化器系；癌腫、副腎皮質；癌腫、島細胞；原発不明癌腫；中枢神経系リンパ腫、原発性；小脳星細胞腫、小児期；大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、小児期；子宮頸癌；小児癌；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；腱鞘の明細胞肉腫；結腸癌；結腸直腸癌、小児期；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；子宮内膜癌；上衣腫、小児期；上皮癌、卵巣；食道癌；食道癌、小児期；ユーイングファミリー腫瘍；頭蓋外胚細胞腫瘍、小児期；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；眼癌、眼内黒色腫；眼癌、網膜芽腫；胆嚢癌；胃（胃）癌；胃（胃）癌、小児期；消化管カルチノイド腫瘍；胚細胞腫瘍、性腺外、小児期；胚細胞腫瘍、性腺外；胚細胞腫瘍、卵巣；妊娠性絨毛腫瘍；神経膠腫、小児脳幹；神経膠腫、小児期視経路および視床下部；ヘアリー細胞白血病；頭頸部癌；肝細胞（肝）癌、成人（原発性）；肝細胞（肝）癌、小児期（原発性）；ホジキンリンパ腫、成人；ホジキンリンパ腫、小児期；妊娠中ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；視床下部および視経路神経膠腫、小児期；眼内黒色腫；島細胞癌腫（内分泌性膵臓）；カポジ肉腫；腎癌；喉頭癌；喉頭癌、小児期；白血病、急性リンパ性、成人；白血病、急性リンパ性、小児期；白血病、急性骨髄性、成人；白血病、急性骨髄性、小児期；白血病、慢性リンパ性；白血病、慢性骨髄性；白血病、ヘアリー細胞；口唇および口腔癌；肝癌、成人（原発性）；肝癌、小児期（原発性）；肺癌、非小細胞；肺癌、小細胞；リンパ芽球性白血病、成人急性；リンパ芽球性白血病、小児期急性；リンパ性白血病、慢性；リンパ腫、エイズ関連；リンパ腫、中枢神経系（原発性）；リンパ腫、皮膚Ｔ細胞；リンパ腫、ホジキン、成人；リンパ腫、ホジキン、小児期；リンパ腫、ホジキン、妊娠中；リンパ腫、非ホジキン、成人；リンパ腫、非ホジキン、小児期；リンパ腫、非ホジキン、妊娠中；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ヴァルデンストレーム；男性乳癌；悪性中皮腫、成人；悪性中皮腫、小児期；悪性胸腺腫；髄芽腫、小児期；黒色腫；黒色腫、眼内；メルケル細胞癌腫；中皮腫、悪性；原発不明の転移性頸部扁平上皮癌；多発性内分泌腫瘍症候群、小児期；多発性骨髄腫／形質細胞腫；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄性白血病、慢性；骨髄性白血病、小児期急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖性疾患、慢性；鼻腔および副鼻腔癌；上咽頭癌；上咽頭癌、小児期；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫、成人；非ホジキンリンパ腫、小児期；非ホジキンリンパ腫、妊娠中；非小細胞肺癌；口腔癌、小児期；口腔および口唇癌；口腔咽頭癌；骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫；卵巣癌、小児期；上皮性卵巣癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵癌；膵癌、小児期；膵癌、島細胞；副鼻腔および鼻腔癌；副甲状腺癌；陰茎癌；褐色細胞腫；松果腺およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、小児期；下垂体部腫瘍；形質細胞腫／多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；妊娠および乳癌；妊娠およびホジキンリンパ腫；妊娠および非ホジキンリンパ腫；原発性中枢神経系リンパ腫；原発性肝癌、成人；原発性肝癌、小児期；前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎）癌、腎細胞癌、小児期；腎盂および尿管、移行上皮癌；網膜芽腫；横紋筋肉腫、小児期；唾液腺癌；唾液腺癌、小児期；肉腫、ユーイングファミリー腫瘍；肉腫、カポジ；肉腫（骨肉腫）／骨の悪性線維性組織球腫；肉腫、横紋筋肉腫、小児期；肉腫、軟組織、成人；肉腫、軟組織、小児期；セザリー症候群；皮膚癌；皮膚癌、小児期；皮膚癌（黒色腫）、皮膚癌腫、メルケル細胞；小細胞肺癌；小腸癌；軟組織肉腫、成人；軟組織肉腫、小児期；原発不明の頸部扁平上皮癌、転移性；胃（胃）癌；胃（胃）癌、小児期；テント上原始神経外胚葉腫瘍、小児期；Ｔ細胞リンパ腫、皮膚；精巣癌；胸腺腫、小児期；胸腺腫、悪性；甲状腺癌；甲状腺癌、小児期；腎盂および尿管の移行上皮癌；絨毛性腫瘍、妊娠；原発不明、癌、小児期；小児期の希少癌；尿管および腎盂、移行上皮癌；尿道癌；子宮肉腫；膣癌；視経路および視床下部膠腫、小児期；外陰癌；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍から選択されるが、これらに限定されない。
【０２３３】
さらなる実施形態では、がんは、非小細胞肺癌、黒色腫、卵巣癌、頸部癌、神経膠芽細胞腫、泌尿生殖器癌、婦人科癌、肺癌、胃腸癌、頭頸部癌、非転移性または転移性乳癌、悪性黒色腫、メルケル細胞癌または骨および軟組織肉腫、血液新生物、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群および急性リンパ芽球性白血病、乳癌、転移性結腸直腸癌、ホルモン感受性またはホルモン抵抗性前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、肝細胞癌、胆管細胞癌、頭頸部扁平上皮癌軟部組織肉腫、および小細胞肺癌からなる群から選択される。
【０２３４】
特定の実施形態では、がんは非小細胞肺癌または黒色腫であり、これらは両方とも高い突然変異荷重を有することが示されている。
【０２３５】
他の実施形態では、がんは卵巣癌または多型性膠芽腫であり、これらは両方とも中程度の突然変異荷重を示し、チェックポイント阻害剤療法に対する応答が不十分または低いことが示されている。
【０２３６】
免疫応答を誘導／増強する方法
一態様では、本開示は、対象において免疫応答を誘導する方法であって、それを必要とする対象に、薬学的に有効な量の、本明細書の態様または実施形態に記載のいずれか１つの核酸分子のうちのいずれか、あるいは、本明細書の態様および実施形態に記載のいずれか１つの医薬組成物のうちのいずれか１つを投与することを含む、方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、この方法は、対象から試料を採取するステップと、試料中の過剰増殖性細胞によって発現される１つ以上のネオ抗原を識別するステップと、試料中のネオ抗原の発現に基づいて１つ以上のｃＤＮＡライブラリーを合成するステップと、１つ以上のネオ抗原のエピトープをコードする１つ以上の核酸配列を、本明細書に開示される１つ以上の成分を含む核酸分子にクローニングするステップと、核酸分子を対象に投与するステップと、を含む。
【０２３７】
一態様では、本開示は、対象においてＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を誘導する方法であって、それを必要とする対象に、薬学的に有効な量の、本明細書の態様または実施形態に記載のいずれか１つの核酸分子のうちのいずれか、あるいは、本明細書の態様および実施形態に記載のいずれか１つの医薬組成物のうちのいずれか１つを投与することを含む、方法を特徴とする。
【０２３８】
一態様では、本開示は、対象において免疫応答を増強する方法であって、それを必要とする対象に、薬学的に有効な量の、本明細書の態様または実施形態に記載のいずれか１つの核酸分子のうちのいずれか、あるいは、本明細書の態様および実施形態に記載のいずれか１つの医薬組成物のうちのいずれか１つを投与することを含む、方法を特徴とする。
【０２３９】
いくつかの態様では、本開示は、対象においてＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強する方法であって、それを必要とする対象に、薬学的に有効な量の、本明細書の態様または実施形態に記載のいずれか１つの核酸分子のうちのいずれか、あるいは、本明細書の態様および実施形態に記載のいずれか１つの医薬組成物のうちのいずれか１つを投与することを含む、方法を特徴とする。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、対象は、がんを有している。別の実施形態では、対象は以前に治療されており、チェックポイント阻害剤療法に応答していない。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、エレクトロポレーションによって対象に投与される。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約０．０１％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、ＩＦＮ−γ陽性である約０．０１％〜約５０％を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、本明細書に開示されるか、または対象において過剰増殖性細胞によって発現される核酸配列を発現する抗原提示細胞またはそれを含むプラスミドとの接触後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の時間以内に達成される。ＣＤ８＋Ｔ細胞。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約０．０５％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約０．１０％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約０．２％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約０．３％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約０．４％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約０．５％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約０．６％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約０．７％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約０．８％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約０．９％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答を増強することは、約１．００％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約２．０％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約３．０％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約５．０％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約６．０％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約７．０％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約８．０％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活���化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約９．０％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約１０％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約１５％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、約２０％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。
【０２４３】
Ｔ細胞活性化は、本明細書に記載されるような様々なアッセイによって測定することができる。例えば、測定され得るＴ細胞活性には、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞におけるシグナル伝達の誘導、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）などのＴ細胞における活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、およびＴ細胞の細胞傷害活性が含まれる。例えば、特定の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化は、増殖アッセイによって測定される。いくつかの実施形態では、活性化は、コードされた核酸配列による細胞または細胞試料の刺激後に測定され得る。
【０２４４】
サイトカイン分泌
ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン２（ＩＬ−２）などのサイトカインの分泌を決定することによって評価または測定できる。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡは、サイトカイン分泌、例えば、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、またはインターロイキン２（ＩＬ−２）の分泌を決定するために使用される。ＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合免疫スポット）技法を使用して、本明細書の態様もしくは実施形態に記載のいずれか１つの核酸分子、または本明細書の態様もしくは実施形態に記載のいずれか１つの医薬組成物のうちのいずれか１つによる刺激に応答して、所与のサイトカイン（例えば、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ））を分泌するＴ細胞を検出することができる。Ｔ細胞は、例えば、抗ＩＦＮ−γ抗体でコーティングされたウェルの本明細書の態様または実施形態に記載のいずれか１つの核酸分子のいずれかと共に培養される。分泌されたＩＦＮ−γはコーティングされた抗体によって捕捉され、発色基質に結合した二次抗体で明らかになる。したがって、局所的に分泌されるサイトカイン分子はスポットを形成し、各スポットは１つのＩＦＮ−γ分泌細胞に対応する。スポットの数により、分析された試料中のＩＦＮ−γ分泌細胞の頻度を決定することができる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、腫瘍壊死因子α、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、およびグランザイムＢ分泌リンパ球の検出についても記載されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫｌｉｎｍａｎ  Ｄ，Ｎｕｔｍａｎ  Ｔ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；１９９４．ｐｐ．６．１９．１−６．１９．８）。
【０２４５】
細胞内サイトカインのフローサイトメトリー分析は、培養上清中のサイトカイン含有量を測定するために使用できるが、実際にサイトカインを分泌するＴ細胞の数に関する情報は提供しない。Ｔ細胞がモネンシンまたはブレフェルジンＡなどの分泌阻害剤で処理される場合、それらは、活性化時にそれらの細胞質内にサイトカインを蓄積する（例えば、本発明の核酸分子と共に）。リンパ球の固定と透過処理の後、細胞内サイトカインはサイトメトリーによって定量化できる。この技法により、産生されたサイトカイン、これらのサイトカインを産生する細胞のタイプ、および細胞あたりに産生されたサイトカインの量を決定することができる。
【０２４６】
細胞傷害性
本明細書の態様または実施形態に記載のいずれか１つの核酸分子のうちのいずれか、または本明細書の態様および実施形態に記載のいずれか１つの医薬組成物のうちのいずれか１つによるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性活性をアッセイすることによって評価することができる。
【０２４７】
Ｔ細胞の細胞傷害活性は、当業者に既知の任意の好適な技術によって評価することができる。例えば、本発明による核酸分子に曝露されたＴ細胞を含む試料は、標準的な細胞傷害アッセイにおいて、適切な期間の後に細胞傷害活性についてアッセイされ得る。そのようなアッセイには、当該技術分野で既知のクロム放出ＣＴＬアッセイおよびＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（商標）蛍光アッセイが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０２４８】
増殖／増殖
本明細書の態様もしくは実施形態に記載のいずれか１つの核酸分子のうちのいずれか、または本明細書の態様および実施形態に記載のいずれか１つの医薬組成物のうちのいずれか１つのＴ細胞を増殖させる能力は、ＣＦＳＥ染色を使用することによって評価することができる。細胞増殖の初期速度を比較するために、細胞をＣＦＳＥ染色に供して、本明細書の態様もしくは実施形態に記載のいずれか１つの核酸分子のうちのいずれか、または本明細書の態様もしくは実施形態に記載のいずれか１つの医薬組成物のうちのいずれか１つは、Ｔ細胞の増殖を誘導した。ＣＦＳＥ染色は、はるかに定量的なエンドポイントを提供し、増殖した細胞の同時表現型決定を可能にする。刺激後、毎日、細胞のアリコートを各培養物から取り出し、フローサイトメトリーで分析する。ＣＦＳＥ染色は細胞を非常に蛍光性にする。細胞分裂すると、蛍光は半分になり、細胞が分裂する回数が増えると、蛍光は弱くなる。本明細書の態様もしくは実施形態に記載のいずれか１つの核酸分子のうちのいずれか、または本明細書の態様および実施形態に記載のいずれか１つの医薬組成物のうちのいずれか１つのＴ細胞増殖を誘導する能力は、１回、２回、３回など分裂した細胞の数を測定することによって定量化される。特定の時点で最大数の細胞分裂を誘導する核酸分子は、最も強力なエキスパンダーとみなされる。
【０２４９】
本明細書の態様もしくは実施形態に記載のいずれか１つの核酸分子のうちのいずれか、または本明細書の態様および実施形態に記載のいずれか１つの医薬組成物のうちのいずれか１つがＴ細胞の長期増殖をどれだけ良好に促進するかを決定するために、細胞増殖曲線を生成することができる。これらの実験は、前述のＣＦＳＥ実験として設定されているが、ＣＦＳＥは使用されない。培養の２〜３日ごとに、Ｔ細胞をそれぞれの培養物から取り出し、存在する細胞の数と細胞の平均体積を測定するコールターカウンターを使用してカウントする。平均赤血球体積は、いつ細胞を再刺激するかについての最良の予測因子である。一般に、Ｔ細胞が適切に刺激されると、細胞の体積は３倍になる。この体積が最初のブラストの約半分以上減少した場合、対数線形膨張を維持するためにＴ細胞を再刺激する必要があり得る（Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：１９３９−１９４３；Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５９２１−５９３０）。本明細書の態様もしくは実施形態に記載のいずれか１つの核酸分子、または本明細書の態様および実施形態に記載のいずれか１つの医薬組成物のうちのいずれか１つが２０回の集団倍加を誘導するのにかかる時間を計算する。このレベルのＴ細胞増殖を誘導するための各核酸分子の相対的差異は、本明細書の態様もしくは実施形態に記載のいずれか１つの核酸分子、または本明細書の態様および実施形態に記載のいずれか１つの医薬組成物のうちのいずれか１つが評価される重要な基準である。
【０２５０】
アポトーシスマーカー
本発明の特定の実施形態では、本明細書の態様もしくは実施形態に記載のいずれか１つの核酸分子、または本明細書の態様および実施形態に記載のいずれか１つの医薬組成物のうちのいずれか１つを使用するＴ細胞の刺激、活性化、および増殖が、アポトーシスを再び保護するか、そうでなければｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで生存を延長するＴ細胞の特定の重要な分子の発現を増強する。アポトーシスは通常、Ｔ細胞における特定のシグナルの誘導に起因する。したがって、本明細書の態様もしくは実施形態に記載のいずれか１つの核酸分子、または本明細書の態様および実施形態に記載のいずれか１つの医薬組成物のうちのいずれか１つは、Ｔ細胞の刺激に起因する細胞死からＴ細胞を保護することを提供し得る。したがって、本発明には、早期死からの保護、またはＴ細胞の生存に通常必要なＢｃｌ−ｘＬ、増殖因子、サイトカイン、またはリンホカインなどの認識されたＴ細胞増殖マーカーの欠如または枯渇からの保護、ならびにＦａｓまたは腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の架橋からの保護、または特定のホルモンまたはストレスへの曝露による、増強されたＴ細胞増殖も含まれる。
【０２５１】
別の態様では、本開示は、対象において複数の不均一な過剰増殖細胞に対する免疫応答を増強する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載のいずれかの核酸分子（例えば、式Ｉ：［［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］を含む核酸配列を含む核酸分子）または本明細書に記載の医薬組成物のいずれかを投与することを含む、方法を特徴とする。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、対象は、がんを有している。別の実施形態では、対象は以前に治療されており、チェックポイント阻害剤療法に応答していない。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、エレクトロポレーションによって対象に投与される。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、免疫応答は、腫瘍増殖を阻害または遅らせ、腫瘍細胞死を誘導し、腫瘍退縮を誘導し、腫瘍再発を防止もしくは遅延させ、腫瘍増殖を防止し、腫瘍拡大を防止し、および／または腫瘍除去を誘導するのに十分な大きさまたは効力のものである。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、対象において複数の不均一な過剰増殖細胞に対する免疫応答を増強する方法は、１つ以上の治療薬の投与をさらに含む。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、生物学的治療薬または小分子である。
【０２５７】
別の実施形態では、治療薬は、（ｉ）チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメント、または（ｉｉ）チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸分子である。さらなる実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、およびＢ−７ファミリーリガンド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるチェックポイントタンパク質と結合するか、またはそれらを阻害する。例示的な実施形態では、チェックポイント阻害剤は、プログラム死−１（ＰＤ−１）経路の阻害剤である。別の例示的な実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）抗体またはその機能的フラグメントである。
【０２５８】
別の実施形態では、治療薬はアジュバントである。抗原に対する免疫応答を増加させるアジュバントの能力は、典型的には、免疫介在性反応の有意な増加、または疾患症状の減少によって明らかになる。例えば、体液性免疫の増加は、典型的には、抗原に対して産生される抗体の力価の有意な増加によって明らかにされ、Ｔ細胞活性の増加は、典型的には、細胞増殖、または細胞傷害、またはサイトカイン分泌の増加として現れる。アジュバントはまた、例えば、主に体液性またはＴｈ２応答を主に細胞性またはＴｈ１応答に変化させることによって、免疫応答を変化させ得る。いくつかの実施形態では、アジュバントは、代替的なプラスミドで発現されるか、またはワクチンにおいて上記のプラスミドと組み合わせてタンパク質として送達される他の遺伝子であり得る。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、アジュバントは、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、シグナル配列が削除され、任意選択的にＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含むＣＤ８６からなる群から選択され得る。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０２６０】
有用なアジュバントとなり得る他の遺伝子には、以下をコードするものが含まれる：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、非アクティブＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能的フラグメント。
【０２６１】
ヒトＩＬ−１２アルファサブユニットは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００８７３．２、ＮＭ＿０００８８２．３に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例示的なヒトＩＬ−１２アルファサブユニットアミノ酸配列を以下に示す：
ＭＣＰＡＲＳＬＬＬＶ  ＡＴＬＶＬＬＤＨＬＳ  ＬＡＲＮＬＰＶＡＴＰ  ＤＰＧＭＦＰＣＬＨＨ  ＳＱＮＬＬＲＡＶＳＮ
ＭＬＱＫＡＲＱＴＬＥ  ＦＹＰＣＴＳＥＥＩＤ  ＨＥＤＩＴＫＤＫＴＳ  ＴＶＥＡＣＬＰＬＥＬ  ＴＫＮＥＳＣＬＮＳＲ
ＥＴＳＦＩＴＮＧＳＣ  ＬＡＳＲＫＴＳＦＭＭ  ＡＬＣＬＳＳＩＹＥＤ  ＬＫＭＹＱＶＥＦＫＴ  ＭＮＡＫＬＬＭＤＰＫ
ＲＱＩＦＬＤＱＮＭＬ  ＡＶＩＤＥＬＭＱＡＬ  ＮＦＮＳＥＴＶＰＱＫ  ＳＳＬＥＥＰＤＦＹＫ  ＴＫＩＫＬＣＩＬＬＨ
ＡＦＲＩＲＡＶＴＩＤ  ＲＶＭＳＹＬＮＡＳ（配列番号：５４）
【０２６２】
ヒトＩＬ−１２ベータサブユニットは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２１７８．２に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例示的なヒトＩＬ−１２ベータサブユニットアミノ酸配列を以下に示す：
ＭＣＨＱＱＬＶＩＳＷ  ＦＳＬＶＦＬＡＳＰＬ  ＶＡＩＷＥＬＫＫＤＶ  ＹＶＶＥＬＤＷＹＰＤ  ＡＰＧＥＭＶＶＬＴＣ
ＤＴＰＥＥＤＧＩＴＷ  ＴＬＤＱＳＳＥＶＬＧ  ＳＧＫＴＬＴＩＱＶＫ  ＥＦＧＤＡＧＱＹＴＣ  ＨＫＧＧＥＶＬＳＨＳ
ＬＬＬＬＨＫＫＥＤＧ  ＩＷＳＴＤＩＬＫＤＱ  ＫＥＰＫＮＫＴＦＬＲ  ＣＥＡＫＮＹＳＧＲＦ  ＴＣＷＷＬＴＴＩＳＴ
ＤＬＴＦＳＶＫＳＳＲ  ＧＳＳＤＰＱＧＶＴＣ  ＧＡＡＴＬＳＡＥＲＶ  ＲＧＤＮＫＥＹＥＹＳ  ＶＥＣＱＥＤＳＡＣＰ
ＡＡＥＥＳＬＰＩＥＶ  ＭＶＤＡＶＨＫＬＫＹ  ＥＮＹＴＳＳＦＦＩＲ  ＤＩＩＫＰＤＰＰＫＮ  ＬＱＬＫＰＬＫＮＳＲ
ＱＶＥＶＳＷＥＹＰＤ  ＴＷＳＴＰＨＳＹＦＳ  ＬＴＦＣＶＱＶＱＧＫ  ＳＫＲＥＫＫＤＲＶＦ  ＴＤＫＴＳＡＴＶＩＣ
ＲＫＮＡＳＩＳＶＲＡ  ＱＤＲＹＹＳＳＳＷＳ  ＥＷＡＳＶＰＣＳ（配列番号：５５）
【０２６３】
ヒトＩＬ−１５は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００５７６．１、ＮＰ＿７５１９１５．１、ＡＡＩ００９６２．１に記載されており、本明細書にその全体が参照により組み込まれる。例示的なヒトＩＬ−１５アミノ酸配列を以下に示す：
ＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳ  ＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬ  ＬＮＳＨＦＬＴＥＡＧ  ＩＨＶＦＩＬＧＣＦＳ  ＡＧＬＰＫＴＥＡＮＷ
ＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩ  ＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤ  ＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨ  ＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣ  ＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬ
ＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴ  ＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮ  ＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥ  ＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥ  ＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳ
ＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮ  ＴＳ（配列番号：５６）
【０２６４】
ヒトＩＬ−１７は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２１８１．１、ＮＭ＿００２１９０．２に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例示的なヒトＩＬ−１７アミノ酸配列を以下に示す：
ＭＴＰＧＫＴＳＬＶＳ  ＬＬＬＬＬＳＬＥＡＩ  ＶＫＡＧＩＴＩＰＲＮ  ＰＧＣＰＮＳＥＤＫＮ  ＦＰＲＴＶＭＶＮＬＮ
ＩＨＮＲＮＴＮＴＮＰ  ＫＲＳＳＤＹＹＮＲＳ  ＴＳＰＷＮＬＨＲＮＥ  ＤＰＥＲＹＰＳＶＩＷ  ＥＡＫＣＲＨＬＧＣＩ
ＮＡＤＧＮＶＤＹＨＭ  ＮＳＶＰＩＱＱＥＩＬ  ＶＬＲＲＥＰＰＨＣＰ  ＮＳＦＲＬＥＫＩＬＶ  ＳＶＧＣＴＣＶＴＰＩ
ＶＨＨＶＡ（配列番号：５７）
【０２６５】
ヒトＩＬ−８は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００５７５．１、ＮＭ＿０００５８４．３に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例示的なヒトＩＬ−８アミノ酸配列を以下に示す：
ＭＴＳＫＬＡＶＡＬＬ  ＡＡＦＬＩＳＡＡＬＣ  ＥＧＡＶＬＰＲＳＡＫ  ＥＬＲＣＱＣＩＫＴＹ  ＳＫＰＦＨＰＫＦＩＫ
ＥＬＲＶＩＥＳＧＰＨ  ＣＡＮＴＥＩＩＶＫＬ  ＳＤＧＲＥＬＣＬＤＰ  ＫＥＮＷＶＱＲＶＶＥ  ＫＦＬＫＲＡＥＮＳ（配列番号：５８）
【０２６６】
ヒトＣＣモチーフケモカイン５（ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）から処理されたもの）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２９７６．２、ＮＭ＿００２９８５．２に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例示的なヒトＣＣモチーフケモカイン５アミノ酸配列を以下に示す：
ＭＫＶＳＡＡＡＬＡＶ  ＩＬＩＡＴＡＬＣＡＰ  ＡＳＡＳＰＹＳＳＤＴ  ＴＰＣＣＦＡＹＩＡＲ  ＰＬＰＲＡＨＩＫＥＹ
ＦＹＴＳＧＫＣＳＮＰ  ＡＶＶＦＶＴＲＫＮＲ  ＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷ  ＶＲＥＹＩＮＳＬＥＭ  Ｓ（配列番号：５９）
【０２６７】
ヒトマクロファージ炎症性タンパク質１−アルファ（ＭＩＰ−１ａ）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２９７４．１、ＮＭ＿００２９８３．２に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例示的なヒトＣＣモチーフケモカイン５アミノ酸配列を以下に示す：
ＭＱＶＳＴＡＡＬＡＶ  ＬＬＣＴＭＡＬＣＮＱ  ＦＳＡＳＬＡＡＤＴＰ  ＴＡＣＣＦＳＹＴＳＲ  ＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹ
ＦＥＴＳＳＱＣＳＫＰ  ＧＶＩＦＬＴＫＲＳＲ  ＱＶＣＡＤＰＳＥＥＷ  ＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬ  ＳＡ（配列番号：６０）
【０２６８】
他の例示的なアジュバントには、ポリＩＣＬＣ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１５  Ｆｅｂ；１４６：１２０−３１を参照されたい）、１０１８  ＩＳＳ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＶａｃｃｉｎｅ．２００３  Ｊｕｎ  ２；２１（１９−２０）：２４６１−７を参照されたい）、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ  ＡＳ１５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃｏｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｊａｎ；９４（１）：６４−７２を参照されたい）、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＳ５７６６０３．１）、ＣｙａＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ６７０５３６．１）、ＧＭ−ＣＳＦ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１１２２０．１），、ＩＣ３０（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる専門家のレビューＶａｃｃｉｎｅｓ．２００７  Ｏｃｔ；６（５）：７４１−６を参照されたい）、ＩＣ３１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる専門家のレビューＶａｃｃｉｎｅｓ．２００７  Ｏｃｔ；６（５）：７４１−６を参照されたい）、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＶａｃｃｉｎｅ．２００６  Ｍａｒ  １０；２４（１１）：１９５８−６，を参照されたい）、ＩｍｕＦａｃｔ  １ＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、一リン酸リピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ  １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡマイクロ粒子、レシキモド、Ｓ  Ｌ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルアン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、アクリルもしくはメタクリルポリマー、無水マレイン酸のコポリマーおよびとＡｑｕｉｌａのＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、ならびにそれらのいずれかの機能的フラグメント、または（ｉｉ）（ｉ）ポリＩＣＬＣ、１０１８  ＩＳＳからなる群から選択されるアジュバントをコードする核酸分子、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ  ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ  １ＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、モノホスホリフリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ  １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡ微粒子、レシキモド、Ｓ  Ｌ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルアン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、アクリルまたはメタクリルポリマー、無水マレイン酸のコポリマーおよびＡｑ���ｉｌａのＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、またはそれらの機能的フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６９】
別の実施形態では、治療薬は、免疫賦活剤またはその機能的フラグメントである。例えば、いくつかの実施形態では、免疫賦活剤は、インターロイキンまたはその機能的フラグメントである。
【０２７０】
別の実施形態では、治療薬は化学療法薬である。化学療法剤の例には、アルデスロイキン、アルトレタミン、アミフォスチン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クラドリビン、シサプリド、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロナビノール、エポエチンアルファ、エトポシド、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、グラニセトロン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、インターフェロンアルファ、イリノテカン、ランソプラゾール、レバミソール、ロイコボリン、メゲストロール、メズナ、メトトレキサート、メトクロプラミド、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オメプラゾール、オンダンセトロン、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ピロカルピン、プロクロロペラジン、リツキシマブ、タモキシフェン、タキソール、塩酸トポテカン、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、および酒石酸ビノレルビンが含まれるが、これらに限定されない。前立腺癌治療の場合、抗ＣＴＬＡ−４と組み合わせることができる好ましい化学療法剤はパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））である。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、アジュバントは、任意選択的に対象に由来しない１つまたは複数の腫瘍関連抗原と共に、複数の新抗原をコードするプラスミドを含む、薬理学組成物と共に連続的に投与される任意のサイトカインまたはその機能的フラグメントをコードする核酸プラスミドを含み得る。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１２またはＩＬ−１２のサブユニットである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、配列番号５４またはその機能的フラグメントに対して、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、配列番号５５またはその機能的フラグメントに対して、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、配列番号５４に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする第１の核酸配列と、配列番号５５またはその機能的フラグメントに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む第２のアミノ酸配列とである。いくつかの実施形態では、サイトカインまたはその機能的フラグメントをコードする核酸配列が２つのサブユニットを含む場合、本開示は、第１のサブユニットをコードする第１の核酸配列と第２のサブユニットをコードする第２の核酸とを含む核酸分子に関し、第１または第２の核酸配列の各々がＣＭＶプロモーターなどの少なくとも第１のプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、サイトカインまたはその機能的フラグメントをコードする核酸配列が２つのサブユニットを含む場合、本開示は、第１のサブユニットをコードする第１の核酸配列と第２のサブユニットをコードする第２の核酸とを含む核酸分子に関し、第１の核酸配列は、少なくとも第１のプロモーターに作動可能に連結され、第２の核酸配列は、少なくとも第２のプロモーターに作動可能に連結されている。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１２配列およびそれをコードする核酸配列は、米国特許第９，９８１，０３６号および同第９，２７２，０２４号に見出すことができ、これらの各々は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０２７３】
治療組成物および投与
本開示はまた、有効量の、本発明による１つ以上の核酸分子（その薬学的に許容される塩を含む）を、任意選択的に薬学的に許容される担体、賦形剤、または添加剤と組み合わせて含む医薬組成物に関する。
【０２７４】
実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含み、これは、それ自体が組成物を受け取る対象に有害な免疫応答の産生を誘発せず、過度の毒性なしに投与され得る任意の薬剤を含む。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されること、または哺乳動物、特にヒトにおいて使用するために米国薬局方、欧州薬局方、または他の一般に認められた薬局方に記載されることを意味する。これらの組成物は、ウイルス感染および／または自己免疫疾患を治療および／または予防するのに有用であり得る。
【０２７５】
製薬上許容される担体、希釈剤、および他の賦形剤の詳細な考察は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１  ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）に記載されている。医薬組成物の製剤は、投与様式に適合しなければならない。実施形態では、医薬組成物は、ヒトへの投与に好適であり、無菌、非粒子状、および／または非発熱性であり得る。
【０２７６】
一態様では、本開示は、（ｉ）本明細書に記載の１つまたは複数の核酸分子（例えば、式Ｉ：［（［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］）を含む核酸配列を含む核酸分子）と、（ｉｉ）製薬上許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子または核酸配列は、リンカーセグメントを含まず、得られるプラスミドは、長さが約３〜約３０アミノ酸であるネオ抗原アミノ酸配列またはエピトープをコードする１つ以上の連続する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に有効な量の、（ｉ）本明細書に記載のプラスミドの任意の成分の１つまたは組み合わせを含む、本明細書に記載の核酸分子の１つまたは複数、あるいは本明細書に記載されているプラスミドの成分である任意の核酸配列に対して、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同である、任意の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ネオ抗原および１つ以上のリンカーをコードする１つ以上の核酸をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、１つ以上のＡＥＤを分離する１つまたは複数のフューリン切断配列をコードする。いくつかの実施形態では、本開示は、ｐＧＸ４５０５またはｐＧＸ４５０５の配列に対して少なくとも７０％相同である核酸配列である核酸分子を含む医薬組成物に関するものであり、そのマルチクローニングサイトは、本明細書で開示された式のいずれかによって置き換えられる。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の治療薬をさらに含む。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、生物学的治療薬または小分子である。
【０２７９】
別の実施形態では、治療薬は、（ｉ）チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメント、または（ｉｉ）チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸分子である。さらなる実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、およびＢ−７ファミリーリガンド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるチェックポイントタンパク質と結合するか、またはそれらを阻害する。例示的な実施形態では、チェックポイント阻害剤は、プログラム死−１（ＰＤ−１）経路の阻害剤である。別の例示的な実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）抗体またはその機能的フラグメントである。
【０２８０】
別の実施形態では、治療薬はアジュバントである。抗原に対する免疫応答を増加させるアジュバントの能力は、典型的には、免疫介在性反応の有意な増加、または疾患症状の減少によって明らかになる。例えば、体液性免疫の増加は、典型的には、抗原に対して産生される抗体の力価の有意な増加によって明らかにされ、Ｔ細胞活性の増加は、典型的には、細胞増殖、または細胞傷害、またはサイトカイン分泌の増加として現れる。アジュバントはまた、例えば、主に体液性またはＴｈ２応答を主に細胞性またはＴｈ１応答に変化させることによって、免疫応答を変化させ得る。例示的なアジュバントには、ポリＩＣＬＣ、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ  ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ  １ＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、一リン酸リピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ  １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡマイクロ粒子、レシキモド、Ｓ  Ｌ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルアン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、アクリルもしくはメタクリルポリマー、無水マレイン酸のコポリマーおよびとＡｑｕｉｌａのＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、ならびにそれらのいずれかの機能的フラグメント、または（ｉｉ）（ｉ）ポリＩＣＬＣ、１０１８  ＩＳＳからなる群から選択されるアジュバントをコードする核酸分子、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ  ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ  １ＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、モノホスホリフリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ  １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡ微粒子、レシキモド、Ｓ  Ｌ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルアン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、アクリルまたはメタクリルポリマー、無水マレイン酸のコポリマーおよびＡｑｕｉｌａのＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、またはそれらの機能的フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【０２８１】
別の実施形態では、治療薬は、免疫賦活剤またはその機能的フラグメントである。例えば、いくつかの実施形態では、免疫賦活剤は、インターロイキンまたはその機能的フラグメントである。
【０２８２】
別の実施形態では、治療薬は化学療法薬である。化学療法剤の例には、アルデスロイキン、アルトレタミン、アミフォスチン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クラドリビン、シサプリド、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロナビノール、エポエチンアルファ、エトポシド、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、グラニセトロン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、インターフェロンアルファ、イリノテカン、ランソプラゾール、レバミソール、ロイコボリン、メゲストロール、メズナ、メトトレキサート、メトクロプラミド、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オメプラゾール、オンダンセトロン、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ピロカルピン、プロクロロペラジン、リツキシマブ、タモキシフェン、タキソール、塩酸トポテカン、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、および酒石酸ビノレルビンが含まれるが、これらに限定されない。前立腺癌治療の場合、抗ＣＴＬＡ−４と組み合わせることができる好ましい化学療法剤はパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））である。
【０２８３】
当業者は、例えば、それらのがんおよびそれらの免疫状態（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞の活性および／または数）に応じて、対象ごとにどの治療レジメンが適切であるかを決定することができる。
【０２８４】
本開示によれば、宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（すなわち、動物内）またはｅｘ  ｖｉｖｏ（すなわち、動物の外）でトランスフェクトすることができる。核酸分子の宿主細胞へのトランスフェクションは、核酸分子を細胞に挿入することができる任意の方法によって達成することができる。トランスフェクション技法には、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、およびプロトプラスト融合が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の核酸分子を含む組成物に関し、各核酸分子は、式Ｉを含む少なくとも１つのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、および／または第３の核酸分子は、ネオ抗原である少なくとも１つのＡＥＤと、対象に由来しない腫瘍関連抗原である少なくともＡＥＤとを含む。いくつかの実施形態では、第１、第２および／または第３の核酸分子は、対象に由来する少なくとも約１０のＡＥＤを含む少なくとも１つのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２および／または第３の核酸分子は、対象に由来する少なくとも約２０のＡＥＤを含む少なくとも１つのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２および／または第３の核酸分子は、対象に由来する少なくとも約３０のＡＥＤを含む少なくとも１つのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２および／または第３の核酸分子は、対象に由来する少なくとも約４０のＡＥＤを含む少なくとも１つのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２および／または第３の核酸分子は、対象に由来する少なくとも約５０のＡＥＤを含む少なくとも１つのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２および／または第３の核酸分子は、対象に由来する少なくとも約６０のＡＥＤを含む少なくとも１つのコード配列を含む。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、第１、第２および／または第３の核酸分子は、それぞれ独立して対象に由来しない腫瘍関連抗原である、少なくとも約１０のＡＥＤを含む少なくとも１つのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２および／または第３の核酸分子は、それぞれ独立して対象に由来しない腫瘍関連抗原である、少なくとも約２０のＡＥＤを含む少なくとも１つのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２および／または第３の核酸分子は、それぞれ独立して対象に由来しない腫瘍関連抗原である、少なくとも約３０のＡＥＤを含む少なくとも１つのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２および／または第３の核酸分子は、それぞれ独立して対象に由来しない腫瘍関連抗原である、少なくとも約４０のＡＥＤを含む少なくとも１つのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２および／または第３の核酸分子は、それぞれ独立して対象に由来しない腫瘍関連抗原である、少なくとも約５０のＡＥＤを含む少なくとも１つのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２および／または第３の核酸分子は、それぞれ独立して対象に由来しない腫瘍関連抗原である、少なくとも約６０のＡＥＤを含む少なくとも１つのコード配列を含む。ネオ抗原をコードする核酸配列：対象に由来しない腫瘍関連抗原をコードする核酸配列の任意の比率、例えば、１：１、２：１：、１：２、１：４、４：１、５：１、１：５、１：３、３：１などを実施形態に含めることができる。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはそれ以上のリンカードメインを含み、そして核酸配列は、以下を含む。
式ＩＩ（ａ）：
（ＡＥＤ１）−（リンカー）−（ＡＥＤ２）−（リンカー）］ｎ
式中、各ＡＥＤは、対象からの任意の１つもしくは複数の腫瘍関連抗原もしくは対象に由来しない１つまたは複数の腫瘍抗原から独立して選択可能であり、ｎは、約１〜約１００の任意の正の整数であり、各「リンカー」は、１つまたは複数のアミノ酸切断部位をコードする核酸配列である。いくつかの実施形態では、核酸配列は、各ＡＥＤ間に少なくとも１つのリンカードメインを含み、核酸配列は、以下を含む。
式ＩＩ（ａ）：
（ＡＥＤ１）−（リンカー）−（ＡＥＤ２）−（リンカー）］ｎ
式中、各ＡＥＤは、対象からの任意の１つもしくは複数の腫瘍関連抗原もしくは対象に由来しない１つまたは複数の腫瘍抗原から独立して選択可能であり、ｎは、約２５〜約６０の任意の正の整数であり、各「リンカー」は、１つまたは複数のアミノ酸切断部位をコードする核酸配列である。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、各ＡＥＤ間に少なくとも１つのリンカードメインを含み、核酸配列は、以下を含む。
式ＩＩ（ａ）：
（ＡＥＤ１）−（リンカー）−（ＡＥＤ２）−（リンカー）］ｎ
式中、各ＡＥＤは、対象からの任意の１つもしくは複数の腫瘍関連抗原もしくは対象に由来しない１つまたは複数の腫瘍抗原から独立して選択可能であり、ｎは、約３５〜約５０の任意の正の整数であり、各「リンカー」は、１つまたは複数のアミノ酸切断部位をコードする核酸配列である。いくつかの実施形態では、核酸配列は、各ＡＥＤ間に少なくとも１つのリンカードメインを含み、核酸配列は、以下を含む。
式ＩＩ（ａ）：
（ＡＥＤ１）−（リンカー）−（ＡＥＤ２）−（リンカー）］ｎ
式中、各ＡＥＤは、対象からの任意の１つもしくは複数の腫瘍関連抗原もしくは対象に由来しない１つまたは複数の腫瘍抗原から独立して選択可能であり、ｎは、４０〜約５０の任意の正の整数であり、各「リンカー」は、１つまたは複数のアミノ酸切断部位をコードする核酸配列である。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、対象に由来しない腫瘍関連抗原は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のサバイビン、ＭＡＧＥ  Ａ１０、ｇｐ１００、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、カルレティキュリン、およびＷＴ１を含むアミノ酸のうちの１つ、またはこれらの組み合わせを含む。
サバイビン
ＭＧＡＰＴＬＰＰＡＷ  ＱＰＦＬＫＤＨＲＩＳ  ＴＦＫＮＷＰＦＬＥＧ  ＣＡＣＴＰＥＲＭＡＥ  ＡＧＦＩＨＣＰＴＥＮ  ＥＰＤＬＡＱＣＦＦＣＦＫＥＬＥＧＷＥＰＤ  ＤＤＰＩＥＥＨＫＫＨ  ＳＳＧＣＡＦＬＳＶＫ  ＫＱＦＥＥＬＴＬＧＥ  ＦＬＫＬＤＲＥＲＡＫ  ＮＫＩＡＫＥＴＮＮＫ  ＫＥＦＥＥＴＡＥＫ  ＶＲＲＡＩＥＱＬＡＡ  ＭＤ（配列番号：６１）
ＭＡＧＥ
１  ｍａｔｓｑａｄｉｅｔ  ｄｐｇｉｓｅｐｄｇａ  ｔａｑｔｓａｄｇｓｑ  ａｑｎｌｅｓｒｔｉｉ  ｒｇｋｒｔｒｋｉｎｎ  ｌｎｖｅｅｎｓｓｇｄ
６１  ｑｒｒａｐｌａａｇｔ  ｗｒｓａｐｖｐｖｔｔ  ｑｎｐｐｇａｐｐｎｖ  ｌｗｑｔｐｌａｗｑｎ  ｐｓｇｗｑｎｑｔａｒ  ｑｔｐｐａｒｑｓｐｐ
１２１  ａｒｑｔｐｐａｗｑｎ  ｐｖａｗｑｎｐｖｉｗ  ｐｎｐｖｉｗｑｎｐｖ  ｉｗｐｎｐｉｖｗｐｇ  ｐｖｖｗｐｎｐｌａｗ  ｑｎｐｐｇｗｑｔｐｐ
１８１  ｇｗｑｔｐｐｇｗｑｇ  ｐｐｄｗｑｇｐｐｄｗ  ｐｌｐｐｄｗｐｌｐｐ  ｄｗｐｌｐｔｄｗｐｌ  ｐｐｄｗｉｐａｄｗｐ  ｉｐｐｄｗｑｎｌｒｐ
２４１  ｓｐｎｌｒｐｓｐｎｓ  ｒａｓｑｎｐｇａａｑ  ｐｒｄｖａｌｌｑｅｒ  ａｎｋｌｖｋｙｌｍｌ  ｋｄｙｔｋｖｐｉｋｒ  ｓｅｍｌｒｄｉｉｒｅ
３０１  ｙｔｄｖｙｐｅｉｉｅ  ｒａｃｆｖｌｅｋｋｆ  ｇｉｑｌｋｅｉｄｋｅ  ｅｈｌｙｉｌｉｓｔｐ  ｅｓｌａｇｉｌｇｔｔ  ｋｄｔｐｋｌｇｌｌｌ
３６１  ｖｉｌｇｖｉｆｍｎｇ  ｎｒａｓｅａｖｌｗｅ  ａｌｒｋｍｇｌｒｐｇ  ｖｒｈｐｌｌｇｄｌｒ  ｋｌｌｔｙｅｆｖｋｑ  ｋｙｌｄｙｒｒｖｐｎ
４２１  ｓｎｐｐｅｙｅｆｌｗ  ｇｌｒｓｙｈｅｔｓｋ  ｍｋｖｌｒｆｉａｅｖ  ｑｋｒｄｐｒｄｗｔａ  ｑｆｍｅａａｄｅａｌ  ｄａｌｄａａａａｅａ
４８１  ｅａｒａｅａｒｔｒｍ  ｇｉｇｄｅａｖｓｇｐ  ｗｓｗｄｄｉｅｆｅｌ  ｌｔｗｄｅｅｇｄｆｇ  ｄｐｗｓｒｉｐｆｔｆ  ｗａｒｙｈｑｎａｒｓ
５４１  ｒｆｐｑｔｆａｇｐｉ  ｉｇｐｇｇｔａｓａｎ  ｆａａｎｆｇａｉｇｆ  ｆｗｖｅ（配列番号６２）
Ａ１０
１  ｍｔｄｋｔｅｋｖａｖ  ｄｐｅｔｖｆｋｒｐｒ  ｅｃｄｓｐｓｙｑｋｒ  ｑｒｍａｌｌａｒｋｑ  ｇａｇｄｓｌｉａｇｓ  ａｍｓｋｅｋｋｌｍｔ
６１  ｇｈａｉｐｐｓｑｌｄ  ｓｑｉｄｄｆｔｇｆｓ  ｋｄｇｍｍｑｋｐｇｓ  ｎａｐｖｇｇｎｖｔｓ  ｎｆｓｇｄｄｌｅｃｒ  ｇｉａｓｓｐｋｓｑｑ
１２１  ｅｉｎａｄｉｋｃｑｖ  ｖｋｅｉｒｃｌｇｒｋ  ｙｅｋｉｆｅｍｌｅｇ  ｖｑｇｐｔａｖｒｋｒ  ｆｆｅｓｉｉｋｅａａ  ｒｃｍｒｒｄｆｖｋｈ
１８１  ｌｋｋｋｌｋｒｍｉ（配列番号６３）
ｇｐ１００
１  ｍｄｌｖｌｋｒｃｌｌ  ｈｌａｖｉｇａｌｌａ  ｖｇａｔｋｖｐｒｎｑ  ｄｗｌｇｖｓｒｑｌｒ  ｔｋａｗｎｒｑｌｙｐ  ｅｗｔｅａｑｒｌｄｃ
６１  ｗｒｇｇｑｖｓｌｋｖ  ｓｎｄｇｐｔｌｉｇａ  ｎａｓｆｓｉａｌｎｆ  ｐｇｓｑｋｖｌｐｄｇ  ｑｖｉｗｖｎｎｔｉｉ  ｎｇｓｑｖｗｇｇｑｐ
１２１  ｖｙｐｑｅｔｄｄａｃ  ｉｆｐｄｇｇｐｃｐｓ  ｇｓｗｓｑｋｒｓｆｖ  ｙｖｗｋｔｗｇｑｙｗ  ｑｖｌｇｇｐｖｓｇｌ  ｓｉｇｔｇｒａｍｌｇ
１８１  ｔｈｔｍｅｖｔｖｙｈ  ｒｒｇｓｒｓｙｖｐｌ  ａｈｓｓｓａｆｔｉｔ  ｄｑｖｐｆｓｖｓｖｓ  ｑｌｒａｌｄｇｇｎｋ  ｈｆｌｒｎｑｐｌｔｆ
２４１  ａｌｑｌｈｄｐｓｇｙ  ｌａｅａｄｌｓｙｔｗ  ｄｆｇｄｓｓｇｔｌｉ  ｓｒａｌｖｖｔｈｔｙ  ｌｅｐｇｐｖｔａｑｖ  ｖｌｑａａｉｐｌｔｓ
３０１  ｃｇｓｓｐｖｐｇｔｔ  ｄｇｈｒｐｔａｅａｐ  ｎｔｔａｇｑｖｐｔｔ  ｅｖｖｇｔｔｐｇｑａ  ｐｔａｅｐｓｇｔｔｓ  ｖｑｖｐｔｔｅｖｉｓ
３６１  ｔａｐｖｑｍｐｔａｅ  ｓｔｇｍｔｐｅｋｖｐ  ｖｓｅｖｍｇｔｔｌａ  ｅｍｓｔｐｅａｔｇｍ  ｔｐａｅｖｓｉｖｖｌ  ｓｇｔｔａａｑｖｔｔ
４２１  ｔｅｗｖｅｔｔａｒｅ  ｌｐｉｐｅｐｅｇｐｄ  ａｓｓｉｍｓｔｅｓｉ  ｔｇｓｌｇｐｌｌｄｇ  ｔａｔｌｒｌｖｋｒｑ  ｖｐｌｄｃｖｌｙｒｙ
４８１  ｇｓｆｓｖｔｌｄｉｖ  ｑｇｉｅｓａｅｉｌｑ  ａｖｐｓｇｅｇｄａｆ  ｅｌｔｖｓｃｑｇｇｌ  ｐｋｅａｃｍｅｉｓｓ  ｐｇｃｑｐｐａｑｒｌ
５４１  ｃｑｐｖｌｐｓｐａｃ  ｑｌｖｌｈｑｉｌｋｇ  ｇｓｇｔｙｃｌｎｖｓ  ｌａｄｔｎｓｌａｖｖ  ｓｔｑｌｉｍｐｇｑｅ  ａｇｌｇｑｖｐｌｉｖ
６０１  ｇｉｌｌｖｌｍａｖｖ  ｌａｓｌｉｙｒｒｒｌ  ｍｋｑｄｆｓｖｐｑｌ  ｐｈｓｓｓｈｗｌｒｌ  ｐｒｉｆｃｓｃｐｉｇ  ｅｎｓｐｌｌｓｇｑｑ
６６１  ｖ（配列番号６４）
ＥＧＦＲｖＩＩＩ
１  ｍｒｐｓｇｔａｇａａ  ｌｌａｌｌａａｌｃｐ  ａｓｒａｌｅｅｋｋｇ  ｎｙｖｖｔｄｈｇｓｃ  ｖｒａｃｇａｄｓｙｅ  ｍｅｅｄｇｖｒｋｃｋ
６１  ｋｃｅｇｐｃｒｋｖｃ  ｎｇｉｇｉｇｅｆｋｄ  ｓｌｓｉｎａｔｎｉｋ  ｈｆｋｎｃｔｓｉｓｇ  ｄｌｈｉｌｐｖａｆｒ  ｇｄｓｆｔｈｔｐｐｌ
１２１  ｄｐｑｅｌｄｉｌｋｔ  ｖｋｅｉｔｇｆｌｌｉ  ｑａｗｐｅｎｒｔｄｌ  ｈａｆｅｎｌｅｉｉｒ  ｇｒｔｋｑｈｇｑｆｓ  ｌａｖｖｓｌｎｉｔｓ
１８１  ｌｇｌｒｓｌｋｅｉｓ  ｄｇｄｖｉｉｓｇｎｋ  ｎｌｃｙａｎｔｉｎｗ  ｋｋｌｆｇｔｓｇｑｋ  ｔｋｉｉｓｎｒｇｅｎ  ｓｃｋａｔｇｑｖｃｈ
２４１  ａｌｃｓｐｅｇｃｗｇ  ｐｅｐｒｄｃｖｓｃｒ  ｎｖｓｒｇｒｅｃｖｄ  ｋｃｎｌｌｅｇｅｐｒ  ｅｆｖｅｎｓｅｃｉｑ  ｃｈｐｅｃｌｐｑａｍ
３０１  ｎｉｔｃｔｇｒｇｐｄ  ｎｃｉｑｃａｈｙｉｄ  ｇｐｈｃｖｋｔｃｐａ  ｇｖｍｇｅｎｎｔｌｖ  ｗｋｙａｄａｇｈｖｃ  ｈｌｃｈｐｎｃｔｙｇ
３６１  ｃｔｇｐｇｌｅｇｃｐ  ｔｎｇｐｋｉｐｓｉａ  ｔｇｍｖｇａｌｌｌｌ  ｌｖｖａｌｇｉｇｌｆ  ｍｒｒｒｈｉｖｒｋｒ  ｔｌｒｒｌｌｑｅｒｅ
４２１  ｌｖｅｐｌｔｐｓｇｅ  ａｐｎｑａｌｌｒｉｌ  ｋｅｔｅｆｋｋｉｋｖ  ｌｇｓｇａｆｇｔｖｙ  ｋｇｌｗｉｐｅｇｅｋ  ｖｋｉｐｖａｉｋｅｌ
４８１  ｒｅａｔｓｐｋａｎｋ  ｅｉｌｄｅａｙｖｍａ  ｓｖｄｎｐｈｖｃｒｌ  ｌｇｉｃｌｔｓｔｖｑ  ｌｉｔｑｌｍｐｆｇｃ  ｌｌｄｙｖｒｅｈｋｄ
５４１  ｎｉｇｓｑｙｌｌｎｗ  ｃｖｑｉａｋｇｍｎｙ  ｌｅｄｒｒｌｖｈｒｄ  ｌａａｒｎｖｌｖｋｔ  ｐｑｈｖｋｉｔｄｆｇ  ｌａｋｌｌｇａｅｅｋ
６０１  ｅｙｈａｅｇｇｋｖｐ  ｉｋｗｍａｌｅｓｉｌ  ｈｒｉｙｔｈｑｓｄｖ  ｗｓｙｇｖｔｖｗｅｌ  ｍｔｆｇｓｋｐｙｄｇ  ｉｐａｓｅｉｓｓｉｌ
６６１  ｅｋｇｅｒｌｐｑｐｐ  ｉｃｔｉｄｖｙｍｉｍ  ｖｋｃｗｍｉｄａｄｓ  ｒｐｋｆｒｅｌｉｉｅ  ｆｓｋｍａｒｄｐｑｒ  ｙｌｖｉｑｇｄｅｒｍ
７２１  ｈｌｐｓｐｔｄｓｎｆ  ｙｒａｌｍｄｅｅｄｍ  ｄｄｖｖｄａｄｅｙｌ  ｉｐｑｑｇｆｆｓｓｐ  ｓｔｓｒｔｐｌｌｓｓ  ｌｓａｔｓｎｎｓｔｖ
７８１  ａｃｉｄｒｎｇｌｑｓ  ｃｐｉｋｅｄｓｆｌｑ  ｒｙｓｓｄｐｔｇａｌ  ｔｅｄｓｉｄｄｔｆｌ  ｐｖｐｅｙｉｎｑｓｖ  ｐｋｒｐａｇｓｖｑｎ
８４１  ｐｖｙｈｎｑｐｌｎｐ  ａｐｓｒｄｐｈｙｑｄ  ｐｈｓｔａｖｇｎｐｅ  ｙｌｎｔｖｑｐｔｃｖ  ｎｓｔｆｄｓｐａｈｗ  ａｑｋｇｓｈｑｉｓｌ
９０１  ｄｎｐｄｙｑｑｄｆｆ  ｐｋｅａｋｐｎｇｉｆ  ｋｇｓｔａｅｎａｅｙ  ｌｒｖａｐｑｓｓｅｆ  ｉｇａ（配列番号６５）
カルレティキュリン
１  ｍｌｌｓｖｐｌｌｌｇ  ｌｌｇｌａｖａｅｐａ  ｖｙｆｋｅｑｆｌｄｇ  ｄｇｗｔｓｒｗｉｅｓ  ｋｈｋｓｄｆｇｋｆｖ  ｌｓｓｇｋｆｙｇｄｅ
６１  ｅｋｄｋｇｌｑｔｓｑ  ｄａｒｆｙａｌｓａｓ  ｆｅｐｆｓｎｋｇｑｔ  ｌｖｖｑｆｔｖｋｈｅ  ｑｎｉｄｃｇｇｇｙｖ  ｋｌｆｐｎｓｌｄｑｔ
１２１  ｄｍｈｇｄｓｅｙｎｉ  ｍｆｇｐｄｉｃｇｐｇ  ｔｋｋｖｈｖｉｆｎｙ  ｋｇｋｎｖｌｉｎｋｄ  ｉｒｃｋｄｄｅｆｔｈ  ｌｙｔｌｉｖｒｐｄｎ
１８１  ｔｙｅｖｋｉｄｎｓｑ  ｖｅｓｇｓｌｅｄｄｗ  ｄｆｌｐｐｋｋｉｋｄ  ｐｄａｓｋｐｅｄｗｄ  ｅｒａｋｉｄｄｐｔｄ  ｓｋｐｅｄｗｄｋｐｅ
２４１  ｈｉｐｄｐｄａｋｋｐ  ｅｄｗｄｅｅｍｄｇｅ  ｗｅｐｐｖｉｑｎｐｅ  ｙｋｇｅｗｋｐｒｑｉ  ｄｎｐｄｙｋｇｔｗｉ  ｈｐｅｉｄｎｐｅｙｓ
３０１  ｐｄｐｓｉｙａｙｄｎ  ｆｇｖｌｇｌｄｌｗｑ  ｖｋｓｇｔｉｆｄｎｆ  ｌｉｔｎｄｅａｙａｅ  ｅｆｇｎｅｔｗｇｖｔ  ｋａａｅｋｑｍｋｄｋ
３６１  ｑｄｅｅｑｒｌｋｅｅ  ｅｅｄｋｋｒｋｅｅｅ  ｅａｅｄｋｅｄｄｅｄ  ｋｄｅｄｅｅｄｅｅｄ  ｋｅｅｄｅｅｅｄｖｐ  ｇｑａｋｄｅｌ（配列番号６６）
ＷＴ１
１  ｍｄｆｌｌｌｑｄｐａ  ｓｔｃｖｐｅｐａｓｑ  ｈｔｌｒｓｇｐｇｃｌ  ｑｑｐｅｑｑｇｖｒｄ  ｐｇｇｉｗａｋｌｇａ  ａｅａｓａｅｒｌｑｇ
６１  ｒｒｓｒｇａｓｇｓｅ  ｐｑｑｍｇｓｄｖｒｄ  ｌｎａｌｌｐａｖｐｓ  ｌｇｇｇｇｇｃａｌｐ  ｖｓｇａａｑｗａｐｖ  ｌｄｆａｐｐｇａｓａ
１２１  ｙｇｓｌｇｇｐａｐｐ  ｐａｐｐｐｐｐｐｐｐ  ｐｈｓｆｉｋｑｅｐｓ  ｗｇｇａｅｐｈｅｅｑ  ｃｌｓａｆｔｖｈｆｓ  ｇｑｆｔｇｔａｇａｃ
１８１  ｒｙｇｐｆｇｐｐｐｐ  ｓｑａｓｓｇｑａｒｍ  ｆｐｎａｐｙｌｐｓｃ  ｌｅｓｑｐａｉｒｎｑ  ｇｙｓｔｖｔｆｄｇｔ  ｐｓｙｇｈｔｐｓｈｈ
２４１  ａａｑｆｐｎｈｓｆｋ  ｈｅｄｐｍｇｑｑｇｓ  ｌｇｅｑｑｙｓｖｐｐ  ｐｖｙｇｃｈｔｐｔｄ  ｓｃｔｇｓｑａｌｌｌ  ｒｔｐｙｓｓｄｎｌｙ
３０１  ｑｍｔｓｑｌｅｃｍｔ  ｗｎｑｍｎｌｇａｔｌ  ｋｇｈｓｔｇｙｅｓｄ  ｎｈｔｔｐｉｌｃｇａ  ｑｙｒｉｈｔｈｇｖｆ  ｒｇｉｑｄｖｒｒｖｐ
３６１  ｇｖａｐｔｌｖｒｓａ  ｓｅｔｓｅｋｒｐｆｍ  ｃａｙｐｇｃｎｋｒｙ  ｆｋｌｓｈｌｑｍｈｓ  ｒｋｈｔｇｅｋｐｙｑ  ｃｄｆｋｄｃｅｒｒｆ
４２１  ｓｒｓｄｑｌｋｒｈｑ  ｒｒｈｔｇｖｋｐｆｑ  ｃｋｔｃｑｒｋｆｓｒ  ｓｄｈｌｋｔｈｔｒｔ  ｈｔｇｅｋｐｆｓｃｒ  ｗｐｓｃｑｋｋｆａｒ
４８１  ｓｄｅｌｖｒｈｈｎｍ  ｈｑｒｎｍｔｋｌｑｌ  ａｌ（配列番号６７）
【０２９０】
本開示は、１つまたは複数のネオ抗原をコードする１つまたは複数の核酸配列と、１つまたは複数の腫瘍関連抗原をコードする１つまたは複数の核酸配列と、を含む、核酸配列に関する。いくつかの実施形態では、対象に由来しない腫瘍関連抗原は、配列番号６１、６２、６３、６４、６５、６６、もしくは６７、またはそれらの機能的フラグメントに対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むアミノ酸配列のうちの１つ、またはこれらの組み合わせから選択される。
【０２９１】
本開示は、１つまたは複数のネオ抗原をコードする１つまたは複数の核酸配列と、１つまたは複数の腫瘍関連抗原をコードする１つまたは複数の核酸配列と、を含む、核酸配列に関し、１つまたは複数のネオ抗原は、配列番号１〜２０、またはその機能的フラグメントに対して、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むアミノ酸配列のうちの１つまたは複数から選択される。
【０２９２】
投与経路には、筋肉内、鼻腔内、皮内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内および経口、ならびに局所的、経皮的、吸入または坐薬、または膣、直腸、尿道、頬、および舌下組織に対する洗浄などによる粘膜組織が含まれるが、これらに限定されない。好ましい投与経路には、筋肉内、腹腔内、皮内、および皮下注射が含まれる。遺伝子コンストラクトは、従来の注射器、無針注射装置、「マイクロプロジェクタイルボンバードメントゴーンガン」、またはエレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、または超音波などの他の物理的方法を含むがこれらに限定されない手段によって投与することができる。
【０２９３】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進するために好ましいエレクトロポレーション装置およびエレクトロポレーション方法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらによって出願された米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載されているものが含まれ、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、２００７年１０月１７日に出願された共同係属中および共同所有の米国特許出願連続番号第１１／８７４０７２号で提供されるＤＮＡワクチンの送達を促進するためのエレクトロポレーション装置およびエレクトロポレーション法があり、これは、２００６年１０月１７日に出願された米国仮出願連続番号第６０／８５２，１４９号、および２００７年１０月１０日に出願された米国仮出願連続番号第６０／９７８，９８２号に対する３５  ＵＳＣ  １  １９（ｅ）に基づく権益を主張し、これらは全て本明細書に完全に組み込まれる。
【０２９４】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、モジュラー電極システムと、生体または植物の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのそれらの使用について記載している。モジュラー電極システムは、複数の針電極と、皮下注射針と、プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極への導電性リンクを提供する電気コネクタと、電源と、を含む。オペレータは、支持構造に取り付けられた複数の針電極をつかみ、それらを生体または植物の選択された組織にしっかりと挿入することができる。次いで、生体分子は皮下注射針を介して選択された組織に送達される。プログラム可能な定電流パルスコントローラが作動し、定電流電気パルスが複数の針電極に印加される。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞への生体分子の導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９５】
米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、生体または植物の選択された組織の細胞への生体分子の導入を効果的に促進するために使用できるエレクトロポレーションデバイスを記載している。エレクトロポレーションデバイスは、動作がソフトウェアまたはファームウェアによって指定される動電学的デバイス（「ＥＫＤデバイス」）を含む。ＥＫＤデバイスは、ユーザ制御とパルスパラメータの入力に基づいて、アレイ内の電極間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを産生し、電流波形データの保存と取得を可能にする。エレクトロポレーション装置はまた、針電極のアレイを有する交換可能な電極ディスク、注射針用の中央注射チャネル、および取り外し可能なガイドディスクを含む。
【０２９６】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載されている電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく、他の組織または器官への深い浸透にも適合している。電極アレイの構成により、（選択した生体分子を送達するための）注射針も完全に標的器官に挿入され、注射は、電極によって事前に描写された領域で標的組織に対して垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許出願公開第２００５／００５２６３号に記載されている電極は、長さが２０ｍｍ、ゲージが２１であることが好ましい。
【０２９７】
特定の例示的な実施形態では、エレクトロポレーション装置は、哺乳動物の所望の組織に、ユーザによって入力されたプリセット電流と同様の定電流を産生するエネルギーのパルスを送達するように構成することができる。エレクトロポレーション装置は、エレクトロポレーションコンポーネントおよび電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含む。エレクトロポレーションコンポーネントは、コントローラ、電流波形発生器、インピーダンステスター、波形ロガー、入力エレメント、ステータスレポートエレメント、通信ポート、メモリコンポーネント、電源、および電源スイッチを含む、エレクトロポレーション装置の様々なエレメントのうちの１つ以上を含み、組み込むことができる。エレクトロポレーションコンポーネントは、エレクトロポレーション装置の１つの要素として機能することができ、他の要素は、エレクトロポレーションコンポーネントと通信する別個の要素（または複数のコンポーネント）である。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションコンポーネントは、エレクトロポレーション装置の２つ以上の要素として機能することができ、これは、エレクトロポレーションコンポーネントとは別のエレクトロポレーション装置のさらに他の要素と通信することができる。本発明は、１つの電気機械的または機械的装置の一部として存在するエレクトロポレーション装置の要素によって限定されない。なぜなら、要素は、１つの装置として、または互いに通信する別個の要素として機能することができるからである。エレクトロポレーションコンポーネントは、所望の組織に定電流を産生するエネルギーのパルスを供給することができ、フィードバックメカニズムを備えている。電極アセンブリは、空間配置に複数の電極を有する電極アレイを含み、電極アセンブリは、エレクトロポレーションコンポーネントからエネルギーのパルスを受け取り、電極を介してそれを所望の組織に送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーのパルスの送達中に中性であり、所望の組織のインピーダンスを測定し、そのインピーダンスをエレクトロポレーションコンポーネントに伝達する。フィードバックメカニズムは、測定されたインピーダンスを受信し、エレクトロポレーションコンポーネントによって供給されるエネルギーのパルスを調整して、定電流を維持することができる。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、複数の電極は、分散パターンでエネルギーのパルスを送達することができる。いくつかの実施形態では、複数の電極は、プログラムされたシーケンスの下で電極の制御を介して分散パターンでエネルギーのパルスを送達することができ、プログラムされたシーケンスは、ユーザによってエレクトロポレーションコンポーネントに入力される。いくつかの実施形態では、プログラムされたシーケンスは、順番に送達される複数のパルスを含み、複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を備えた少なくとも２つのアクティブ電極によって送達され、複数のパルスの後続のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を備えた少なくとも２つのアクティブ電極の異なる１つによって供給される。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、フィードバックメカニズムは、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって実施される。好ましくは、フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって実施される。特定の実施形態では、このフィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または１μｓごとに発生するが、好ましくは、リアルタイムフィードバックまたは瞬間的（すなわち、応答時間を決定するための利用可能な技術によって決定される実質的に瞬間的）である。いくつかの実施形態では、中性電極は、所望の組織のインピーダンスを測定し、インピーダンスをフィードバック機構に伝達し、フィードバック機構は、インピーダンスに応答し、エネルギーのパルスを調整して、定電流をプリセット電流と同様の値に維持する。いくつかの実施形態では、フィードバック機構は、エネルギーのパルスの送達中に連続的かつ瞬時に定電流を維持する。
【０３００】
治療または免疫化の目的で、本発明の核酸分子を患者に投与することもできる。核酸を患者に送達するために、多くの方法が便利に使用されている。例えば、核酸は「ネイキッドＤＮＡ」として直接送達することができる。このアプローチは、例えば、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８（１９９０）ならびに米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号に記載されている。核酸はまた、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されているように、弾道送達を使用して投与することができる。ＤＮＡのみからなる粒子を投与することができる。代替的に、ＤＮＡを金粒子などの粒子に付着させることもできる。
【０３０１】
核酸はまた、カチオン性脂質などのカチオン性化合物と複合体を形成して送達することができる。脂質媒介遺伝子送達方法は、例えば、ＷＯ１９９６／１８３７２、ＷＯ１９９３／２４６４０、Ｍａｎｎｉｎｏ＆Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６（７）：６８２−６９１（１９８８）、米国特許第５，２７９，８３３号、ＷＯ１９９１／０６３０９、およびＦｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１４（１９８７）に記載されている。
【０３０２】
目的のペプチドをコードするＲＮＡも送達に使用できる（例えば、Ｋｉｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１、Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１１を参照されたい）。
【０３０３】
薬学的に許容される担体または賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの機能性分子を含むことができ、これらは既知であり、一般に容易に入手可能である。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体はアジュバントである。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤である。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、または脂質であり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸である。いくつかの実施形態では、核酸分子、またはＤＮＡプラスミドは、ポリヌクレオチド機能増強剤または遺伝子ワクチン促進剤（またはトランスフェクション促進剤）の投与と組み合わせて細胞に送達される。ポリヌクレオチド機能増強剤は、米国特許第５，５９３，９７２号、米国特許第５，９６２，４２８号、および１９９４年１月２６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号に記載されており、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。遺伝子ワクチン促進剤は、１９９４年４月１日に出願されたＵ米国特許出願連続番号第０２１，５７９号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。トランスフェクション促進剤は、核酸分子との混合物として核酸分子と組み合わせて投与するか、または核酸分子の投与の前または後に別々に同時に投与することができる。トランスフェクション促進剤の例には、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体およびスクアレンおよびスクアレンなどの小胞が含まれ、ヒアルロン酸も使用して、遺伝子コンストラクトと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンはまた、脂質などのトランスフェクション促進剤、レシチンリポソームまたは当該技術分野で既知の他のリポソームを含むリポソーム、例えばＤＮＡ−リポソーム混合物（例えば、Ｗ０９３２４６４０を参照されたい）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含み得る。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含むポリカチオン、または脂質である。
【０３０５】
いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、免疫応答をさらに増強するタンパク質の遺伝子と共に送達される。そのような遺伝子の例は、アルファインターフェロン、ガンマインターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＩＬ−１５（シグナル配列が削除され、任意選択的にＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含む、ＩＬ−１５を含む）などの他のサイトカインおよびリンホカインをコードするものである。有用となり得る他の遺伝子には、以下をコードするものが含まれる：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−ｌｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、非アクティブＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能的フラグメント。
【０３０６】
本明細書に記載の薬剤が医薬品としてヒトまたは動物に投与される場合、それらは、それ自体で、または薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と組み合わせた有効成分を含む医薬組成物として投与することができる。
【０３０７】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルおよび投与の時間経過は、患者に毒性を与えることなく、特定の患者、組成物、および投与の様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分の量を得るために変えることができる。一般に、本発明の薬剤または医薬組成物は、ウイルス感染および／または自己免疫疾患に関連する症状を軽減または排除するのに十分な量で投与される。
【０３０８】
本明細書に記載の１つまたは複数の核酸分子を含む組成物は、好ましくは、約１ナノグラム〜１０ミリグラムの、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、または好ましくは約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、またはより好ましくは、約１００マイクログラム〜約１ミリグラムのＤＮＡ量を含む。いくつかの好ましい実施形態では、本発明によるＤＮＡプラスミドワクチンは、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、約１００マイクログラム〜約１ミリグラムのＤＮＡを含む。
【０３０９】
本発明による医薬組成物は、使用される投与様式に従って製剤化される。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合、それらは無菌であり、パイロジェンフリーであり、粒子フリーである。等張製剤が好ましく使用される。一般に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水などの等張液が好ましい。安定剤には、ゼラチンとアルブミンが含まれる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤が製剤に添加される。
【０３１０】
好ましくは、本明細書に記載の筋肉または皮膚ＥＰ装置と共に使用するためのＤＮＡ製剤は、高ＤＮＡ濃度、好ましくは、皮膚への送達に最適な少量、好ましくは、少ない注入量、理想的には２５〜２００マイクロリットル（μＬ）中に、マイクログラム〜数十ミリグラム量、好ましくはミリグラム量のＤＮＡを含む濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ製剤は、１ｍｇ／ｍＬ以上（ｍｇ  ＤＮＡ／製剤の体積）などの高いＤＮＡ濃度を有する。より好ましくは、ＤＮＡ製剤は、２００μＬの製剤でグラム量のＤＮＡ、より好ましくは１００μＬの製剤でグラム量のＤＮＡを提供するＤＮＡ濃度を有する。
【０３１１】
本発明のエレクトロポレーション装置で使用するためのＤＮＡプラスミドは、既知の装置および技法の組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは、それらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９０００４７１６号に記載される最適化されたプラスミド製造技法を使用して製造される。いくつかの例では、これらの研究で使用されるＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化することができる。製造技法はまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９０００４７１６号に記載されているものおよび米国特許第７，２３８，５２２号に記載されているものに加えて、当業者に一般的に既知の様々な装置およびプロトコルを含むかまたは組み込む。本明細書に記載の皮膚エレクトロポレーション装置および送達技法で使用される高濃度のプラスミドは、適度に少量でプラスミドをＩＤ／ＳＣ空間に投与することを可能にし、発現および免疫効果の増強を助ける。
【０３１２】
好ましい単位投与製剤は、本明細書において上述されるような１日用量もしくは単位１日サブ用量、またはその適切な部分の投与される成分を含むものである。
【０３１３】
本発明の腫瘍特異的ネオ抗原性ペプチドおよび／または本発明の組成物で障害または疾患を治療するための投与計画は、患者の疾患のタイプ、年齢、体重、性別、医療状態、状態の重症度、投与経路、使用される特定の化合物を含む様々な因子に基づく。したがって、投与計画は大きく異なり得るが、標準的な方法を使用して日常的に決定され得る。
【０３１４】
対象に投与される量および投与計画は、投与方法、治療される状態の性質、治療される対象の体重、および処方する医師の判断などの多くの因子に依存するであろう。
【０３１５】
本発明による治療的に活性な製剤に含まれるＤＮＡの量は、疾患または状態を治療するのに有効な量である。有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らして、当業者の能力の範囲内である。一般に、薬剤の有効量（ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ）または有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）は、最初に低用量の薬剤を投与し、次いで、所望の効果（例えば、ウイルス感染または自己免疫疾患に関連する症状を軽減または排除する）が、毒性の副作用が最小限または許容範囲内で、治療される対象で観察されるまで、投与量を徐々に増加させることによって決定される。本発明の医薬組成物の投与のための適切な用量および投薬スケジュールを決定するための適用可能な方法は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  ２００５、ならびにＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ａｎｄ  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００３  ａｎｄ  ２００５）に記載されている。
【０３１６】
特定の実施形態では、医薬組成物は１日１回投与される。他の実施形態では、医薬組成物は１日２回投与される。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、２日ごとに１回、３日ごとに１回、４日ごとに１回、５日ごとに１回、６日ごとに１回、７日ごとに１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、２ヶ月ごとに１回、６ヶ月ごとに１回、または１年ごとに１回投与される。投与間隔は、個々の患者のニーズに応じて調整することができる。より長い投与間隔のために、徐放またはデポー製剤を使用することができる。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、いくつかの分割された投薬量、および時差投与量は、毎日または連続して投与され得るか、または用量は連続的に注入され得るか、またはボーラス注射であり得る。さらに、本開示の化合物（複数可）の投与量は、治療的または予防的状況の緊急性によって示されるように、比例して増加または減少させることができる。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、本開示はまた、プライムブーストレジメンを使用して本明細書に記載の医薬組成物を投与するための方法に関する。「プライムブースト」という用語は、少なくとも１つの共通の免疫原を有する２つの異なる免疫原性組成物または免疫学的組成物タイプの連続投与を指す。プライミング投与（プライミング）は、第１の免疫原性または免疫学的組成物タイプの投与であり、１回、２回、またはそれ以上の投与を含み得る。ブースト投与は、第２の免疫原性または免疫学的組成物タイプの投与であり、１回、２回以上の投与を含み得、例えば、毎年の投与を含み得るか、または本質的にそれからなり得る。「ブースト」は、「プライミング」後約２週間〜約３２週間、またはプライミング後約４〜約３０週間、またはプライミング後約８〜約２８週間、有利にはプライミング後約１６週間〜約２４週間後、より有利には、プライミングの約２４週間後に投与できる。
【０３１９】
本明細書に記載の医薬組成物は、急性である疾患および病状を治療するために使用することができ、慢性状態の治療にも使用することができる。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、または５年、１０年、または１５年を超える期間、または、例えば、範囲の下限が１４日〜１５年の間の任意の期間であり、範囲の上限が１５日〜２０年の間（例えば、４週間〜１５年、６ヶ月〜２０年）である日、月、または年の任意の期間範囲、投与される。場合によっては、本発明の医薬組成物が患者の残りの生涯にわたって投与されることが有利であり得る。好ましい実施形態では、患者は、疾患または障害の進行をチェックするためにモニターされ、用量はそれに応じて調整される。好ましい実施形態では、本発明による治療は、少なくとも２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、または５年、１０年、１５年、２０年、または対象の残りの生涯にわたって有効である。
【０３２０】
組み合わせ療法
本開示の実施形態によれば、本明細書に記載の医薬組成物は、１つ以上の追加の治療薬と共に投与することができる。本発明によって企図される様々な組み合わせ療法が全体を通して記載されている。
【０３２１】
特定の実施形態では、追加の治療薬のうちのいずれかは、ＤＮＡワクチンの後にまたは同時である、時系列的に投与される。特定の実施形態では、追加の治療薬は、ＤＮＡワクチンまたは免疫原性組成物が投与される前の、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、１ヶ月、またはそれらの任意の組み合わせで投与される。特定の実施形態では、追加の治療薬は、ＤＮＡワクチンまたは免疫原性組成物が投与された後の、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、１ヶ月、またはそれらの任意の組み合わせで投与される。
【０３２２】
アジュバント
さらなる実施形態では、方法は、対象にアジュバントを投与することをさらに含む。投与は、本明細書に記載のＤＮＡワクチンまたは免疫原性組成物による治療の前、同時、または後のいずれかであり得る。
【０３２３】
本明細書に記載の効果的なワクチンまたは免疫原性組成物は、免疫応答を開始するための強力なアジュバントを含み得る。
【０３２４】
特定の実施形態では、アジュバントは、ポリＩＣＬＣ、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、ＡｍｐｌｉｖａｘＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ  １ＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、一リン酸リピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ  １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡマイクロ粒子、レシキモド、Ｓ  Ｌ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルアン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、アクリルまたはメタクリルのポリマー、無水マレイン酸のコポリマー、およびＡｑｕｉｌａのＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎから選択される。
【０３２５】
本明細書に記載されるように、ＴＬＲ３のアゴニストであるポリＩＣＬＣならびにＭＤＡ５およびＲＩＧ３のＲＮＡヘリカーゼドメインは、ワクチンまたは免疫原性組成物アジュバントに対していくつかの望ましい特性を示した。これらの特性には、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫細胞の局所的および全身的活性化の誘導、刺激性ケモカインおよびサイトカインの産生、およびＤＣによる抗原提示の刺激が含まれる。さらに、ポリＩＣＬＣは、ヒトに耐久性のあるＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を誘導することができる。重要なことに、転写経路とシグナル伝達経路の上方制御に著しい類似性が見られたのは、ポリＩＣＬＣを接種した対象と、非常に効果的で複製能力のある黄熱ワクチンを接種したボランティアであった。さらに、最近の第１相試験において、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドワクチン（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅに加えて）と組み合わせてポリＩＣＬＣで免疫された９０％を超える卵巣癌患者は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導、ならびにペプチドに対する抗体反応を示した。同時に、ポリＩＣＬＣは、これまでに２５以上の臨床試験で広範囲に試験されており、比較的良性の毒性プロファイルを示している。強力で特異的な免疫原に加えて、本開示のネオ抗原ワクチンは、アジュバント（例えば、ポリＩＣＬＣ）と組み合わせることができる。理論に拘束されることなく、これらのネオ抗原は、自己免疫の可能性を低減しながら（例えば、正常な自己抗原の標的化を回避することによって）、中枢胸腺寛容をバイパスする（したがって、より強力な抗腫瘍Ｔ細胞応答を可能にする）と予想される。効果的な免疫応答には、免疫系を活性化する強力なアジュバントが有利に含まれる（Ｓｐｅｉｓｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｍｅｒｏ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２：１４４（２０１０））。例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、微生物およびウイルス性病原体の「危険信号」の強力なセンサーとして登場し、自然免疫系、さらには適応免疫系を効果的に誘導する（Ｂｈａｒｄｗａｊ  ａｎｄ  Ｇｎｊａｔｉｃ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．１６：３８２−３９１（２０１０））。ＴＬＲアゴニストの中で、ポリＩＣＬＣ（合成二本鎖ＲＮＡ模倣体）は、骨髄由来樹状細胞の最も強力な活性化因子の１つである。人間のボランティア研究では、ポリＩＣＬＣは安全であり、最も強力な弱毒生ウイルスワクチンの１つである黄熱ワクチンＹＦ−１７Ｄによって誘発されるものに匹敵する遺伝子発現プロファイルを末梢血細胞に誘導することが示されている（Ｃａｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｏｕｂｌｅ−  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ａ  ｌｉｖｅ  ｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０８：２３５７（２０１１））。他の実施形態では、本明細書に記載の他のアジュバントが想定される。例えば、水中油型、油中水型、または多相Ｗ／Ｏ／Ｗである。例えば、ＵＳ７，６０８，２７９およびＡｕｃｏｕｔｕｒ���ｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９（２００１），２６６６−２６７２、およびそこに引用されている文書を参照されたい。
【０３２６】
任意の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）のアジュバントの組み合わせを、本明細書に記載のＤＮＡワクチンまたは免疫原性組成物と組み合わせて使用することができる。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つまたは複数のネオ抗原をコードする第１のプラスミド、第２、および／または第３、および／または第４のプラスミドを含み、第２、第３、または第４のプラスミドの各々は、サイトカインまたはその機能的フラグメントをコードする核酸配列を含む。
【０３２８】
チェックポイント阻害剤
さらなる実施形態では、方法は、対象にチェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む。投与は、本明細書に記載のＤＮＡワクチンまたは免疫原性組成物による治療の前、同時、または後のいずれかであり得る。
【０３２９】
免疫チェックポイントは、免疫系のＴ細胞機能を調節する。Ｔ細胞は細胞性免疫において中心的な役割を果たす。チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞にシグナルを送り、Ｔ細胞の機能を、本質的にスイッチを切るか、阻害する特定のリガンドと相互作用する。がん細胞は、その表面でチェックポイントタンパク質の高レベルの発現を促進することによってこのシステムを利用し、腫瘍微小環境に入るＴ細胞の表面でチェックポイントタンパク質を発現するＴ細胞を制御し、抗がん免疫応答を抑制する。このように、チェックポイントタンパク質の阻害は、Ｔ細胞機能の回復とがん細胞に対する免疫応答をもたらす。
【０３３０】
チェックポイント阻害剤には、免疫系の阻害経路を遮断または阻害する任意の薬剤が含まれる。そのような阻害剤は、免疫チェックポイント受容体に結合して遮断または阻害する抗体またはその抗原結合フラグメント、または免疫チェックポイント受容体リガンドに結合して遮断または阻害する抗体を含み得る小分子阻害剤を含み得る。遮断または阻害の標的となり得る例示的なチェックポイント分子には、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４（ＣＤ２ファミリーの分子に属し、全てのＮＫ、γδ、およびメモリーＣＤ８＋（αβ）Ｔ細胞で発現する）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも呼ばれる）、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１およびＣＨＫ２キナーゼ、Ａ２ａＲおよび様々なＢ−７ファミリーリガンドが含まれるが、これらに限定されない。Ｂ７ファミリーリガンドには、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６、およびＢ７−Ｈ７が含まれるが、これらに限定されない。チェックポイント阻害剤には、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、およびＣＧＥＮ−１５０４９のうちの１つ以上に結合してその活性を遮断または阻害する抗体またはその抗原結合フラグメント、他の結合タンパク質、生物学的治療薬、または小分子が含まれる。例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ−４ブロッキング抗体）、抗ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（抗Ｂ７−Ｈ１；ＭＥＤＩ４７３６）、ＭＫ−３４７５（ＰＤ−１ブロッカー）、ニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）、ＣＴ−０１１（抗ＰＤ１抗体）、ＢＹ５５モノクローナル抗体、ＡＭＰ２２４（抗ＰＤＬ１抗体）、ＢＭＳ−９３６５５９（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＰＬＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（抗ＰＤＬ１抗体）およびヤーボイイピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤）が含まれる。チェックポイントタンパク質リガンドには、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ２８、ＣＤ８６、およびＴＩＭ−３が含まれるが、これらに限定されない。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫チェックポイント受容体プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）とそのリガンドＰＤＬ−１との間の相互作用を遮断する薬物である特定のクラスのチェックポイント阻害剤の使用を包含する。Ａ．Ｍｕｌｌａｒｄ，「Ｎｅｗ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｒｉｄｅ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｓｕｎａｍｉ」  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１３），１２：４８９−４９２を参照されたい。ＰＤ−１はＴ細胞に発現し、Ｔ細胞の活性を調節する。具体的には、ＰＤ−１がＰＤＬ−１に結合していない場合、Ｔ細胞は標的細胞と結合して殺傷することができる。しかしながら、ＰＤ−１がＰＤＬ−１に結合すると、Ｔ細胞は標的細胞との結合および殺傷を停止する。さらに、他のチェックポイントとは異なり、ＰＤ−１は、がん細胞で直接過剰発現するＰＤＬなどに近接して作用し、ＰＤ−１を発現するＴ細胞への結合を増加させる。
【０３３２】
本開示の一態様は、ＰＤ−１のアゴニストとして作用することができる抗体であり、それによってＰＤ−１によって調節される免疫応答を調節することができるチェックポイント阻害剤を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、抗原結合フラグメントであり得る。本明細書に開示される抗ＰＤ−１抗体は、ヒトＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１の活性に作動することができ、それにより、ＰＤ−１を発現する免疫細胞の機能を阻害する。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＴＬＡ−４を阻害する薬物である特定のクラスのチェックポイント阻害剤の使用を包含する。本発明の方法で使用するのに好適な抗ＣＴＬＡ４アンタゴニスト剤には、抗ＣＴＬＡ４抗体、ヒト抗ＣＴＬＡ４抗体、マウス抗ＣＴＬＡ４抗体、哺乳動物抗ＣＴＬＡ４抗体、ヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体、モノクローナル抗ＣＴＬＡ４抗体、ポリクローナル抗ＣＴＬＡ４抗体、キメラ抗ＣＴＬＡ４抗体、ＭＤＸ−０１０（イピリムマブ）、トレメリムマブ、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＴＬＡ４アドネクチン、抗ＣＴＬＡ４ドメイン抗体、一本鎖抗ＣＴＬＡ４フラグメント、重鎖抗ＣＴＬＡ４フラグメント、軽鎖抗ＣＴＬＡ４フラグメント、共刺激経路に作用するＣＴＬＡ４の阻害剤、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２００１／０１４４２４号に開示されている抗体、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２００４／０３５６０７号に開示されている抗体、米国公開第２００５／０２０１９９４号に開示されている抗体、および付与された欧州特許第ＥＰ１２１２４２２Ｂｌ号に開示されている抗体が含まれるが、これらに限定されない。追加のＣＴＬＡ−４抗体は米国特許第５，８１１，０９７号、同第５，８５５，８８７号、同第６，０５１，２２７号、および同第６，９８４，７２０号、ならびにＰＣＴ公開番号第ＷＯ０１／１４４２４号および同第ＷＯ００／３７５０４号、ならびに米国特許公開第２００２／００３９５８１号および同第２００２／０８６０１４号に記載されている。本発明の方法で使用することができる他の抗ＣＴＬＡ−４抗体には、例えば、以下に開示されるものが含まれる：ＷＯ９８／４２７５２、米国特許第６，６８２，７３６号および同第６，２０７，１５６号、Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（１７）：１００６７−１００７１（１９９８）、Ｃａｍａｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．２５０５（２００４）（抗体ＣＰ−６７５２０６）、Ｍｏｋｙｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８：５３０１−５３０４（１９９８）、および米国特許第５，９７７，３１８号、同第６，６８２，７３６号、同第７，１０９，００３号、および同第７，１３２，２８１号。
【０３３４】
追加の抗ＣＴＬＡ４アンタゴニストには、以下が含まれるが、これらに限定されない：ＣＤ２８抗原がその同族リガンドに結合する能力を破壊し、ＣＴＬＡ４がその同族リガンドに結合する能力を阻害し、阻害剤共刺激経路を介したＴ細胞応答を増強し、Ｂ７がＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４に結合する能力を破壊し、Ｂ７が共刺激経路を活性化する能力を破壊し、ＣＤ８０がＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４に結合する能力を破壊し、ＣＤ８０が共刺激経路を活性化する能力を破壊し、ＣＤ８６がＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４に結合する能力を破壊し、ＣＤ８６が共刺激経路を活性化する能力を破壊し、および破壊する一般に活性化されることからの共刺激経路を破壊することのできる任意の阻害剤。これには、他の抗ＣＴＬＡ４拮抗薬のなかでも、共刺激経路の他のメンバーの中でも、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４の小分子阻害剤、共刺激経路の他のメンバーの中でも、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４に対する抗体、共刺激経路の他のメンバーの中でも、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４に対するアンチセンス分子、共刺激経路の他のメンバーの中でも、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４に対するアドネクチン、共刺激経路の他のメンバーの中でも、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４のＲＮＡｉ阻害剤（一本鎖と二本鎖の両方）が必然的に含まれる。
【０３３５】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３を阻害する特定のクラスのチェックポイント阻害剤薬物の使用を包含する。リガンドによるΤΓΜ−３の活性化を遮断すると、Ｔｈｌ細胞の活性化が増加する。さらに、ＴＩＭ−３は、疲弊したＣＤ８＋Ｔ細胞によって発現される重要な抑制性受容体として識別されている。ＴＩＭ−３は、核酸を介した抗腫瘍免疫の重要な調節因子としても報告されている。一例では、ＴＩＭ−３は腫瘍関連樹状細胞（ＴＡＤＣ）で上方制御されることが示されている。
【０３３６】
チェックポイント阻害剤と本明細書に記載のＤＮＡワクチンまたは免疫原性組成物との組み合わせは、一部の対象においてがんの治療においてより効果的であり得、および／または免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および／または他を含む）の活性および／または数を開始、可能、増加、増強、または延長し得、あるいは腫瘍による医学的に有益な応答（退行、壊死またはそれらの排除を含む）を伝達する。
【０３３７】
任意の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）のチェックポイント阻害剤の組み合わせを、本明細書に記載のＤＮＡワクチンまたは免疫原性組成物と組み合わせて使用することができる。
【０３３８】
免疫調節薬
さらなる実施形態では、方法は、１つ以上の免疫賦活剤を対象に投与することをさらに含む。投与は、本明細書に記載のＤＮＡワクチンまたは免疫原性組成物による治療の前、同時、または後のいずれかであり得る。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞増殖因子およびインターロイキンを含む免疫賦活剤の使用に関する。免疫賦活剤は、その成分のいずれかの活性化を誘導するかまたは活性を増加させることによって免疫系を刺激する物質（薬物および栄養素）である。免疫賦活剤には、細菌ワクチン、コロニー刺激因子、インターフェロン、インターロイキン、他の免疫賦活剤、治療用ワクチン、ワクチンの組み合わせ、およびウイルスワクチンが含まれる。
【０３４０】
Ｔ細胞増殖因子はＴ細胞の増殖を刺激するタンパク質である。Ｔ細胞増殖因子の例には、１１−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１およびＩＬ−３３が含まれる。
【０３４１】
インターロイキンは、白血球で発現することが最初に発見されたサイトカインの群である。免疫系の機能は大部分がインターロイキンに依存しており、それらの多くのまれな欠陥が報告されており、全て自己免疫疾患または免疫不全を特徴としている。インターロイキンの大部分は、ヘルパーＣＤ４  Ｔリンパ球、ならびに単球、マクロファージ、および内皮細胞によって合成される。それらは、Ｔリンパ球とＢリンパ球、および造血細胞の発達と分化を促進する。インターロイキンの例には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１７が含まれる。
【０３４２】
いくつかの実施形態では、インターロイキンはＩＬ−１２である。
【０３４３】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、そのような標的タンパク質に対する免疫応答をさらに増強するタンパク質の遺伝子である免疫賦活剤と共に送達される。そのような遺伝子の例は、アルファインターフェロン、ガンマインターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＩＬ−１５（シグナル配列が削除され、任意選択的にＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含む、ＩＬ−１５を含む）などの他のサイトカインおよびリンホカインをコードするものである。有用となり得る他の遺伝子には、以下をコードするものが含まれる：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−ｌｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、非アクティブＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能的フラグメント。
【０３４４】
任意の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）の免疫賦活剤の組み合わせを、本明細書に記載のＤＮＡワクチンまたは免疫原性組成物と組み合わせて使用することができる。
【０３４５】
化学療法薬
さらなる実施形態では、この方法は、化学療法剤、標的療法、または放射線を対象に投与することをさらに含む。投与は、本明細書に記載のＤＮＡワクチンまたは免疫原性組成物による治療の前、同時、または後のいずれかであり得る。
【０３４６】
癌治療薬または化学療法薬の例には、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ）などのアルキル化剤、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホネート、ベンゾドーパ、カルボクオン、メチュレドーパ、およびウレドパなどのアジリジン、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスファオラミドおよびトリメチルオロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生剤、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体、カルステロン、プロピオン酸ドロスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎、フロリン酸などの葉酸補充剤、アセグラトン、アルドホスファミド配糖体、アミノレブリン酸、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトレキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジクオン、エルフォルミチン、酢酸エリプチニウム、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ．ＲＴＭ．、ラゾキサン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジクオン、２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＰｖＥ（商標）、Ｐｖｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）、クロランブシル、ジェムシタビン、６−チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキサート、シスプラチンおよびカルボプラチンなどのプラチナ類似体、ビンブラスチン、トラスツズマブエトポシド（ＶＰ−１６）、イフォスファミド、ミトキサントロンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ナベルビン、ノバントロン、テニポシド、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセロダ、イバンドロネート、ＣＰＴ−１１、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００、ジフルオロメチルオミチン（ＤＭＦＯ）、レチノインＴａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）、ＯＮＴＡＫＴ（商標）（デニルキンジフチトックス）などのレチノイン酸誘導体、エスペラマイシン、カペシタビン、および上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体などが含まれる。この定義には、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１  １７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（ファレストン）を含む抗エストロゲン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、ゴセレリンなどの抗アンドロゲン、および上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体などの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれる。さらなるがん治療薬には、ソラフェニブおよび他のプロテインキナーゼ阻害剤、例えばアファチニブ、アキシチニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ルキソリチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、およびスニチニブ、シロリムス（ラパマイシン）、エベロリムスおよび他のｍＴＯＲ阻害剤が含まれる。
【０３４７】
追加の化学療法剤の例には、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシンおよびそれらの類似体または代謝産物、ならびにドキソルビシン）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、ダウノルビシン）、アルキル化剤（例えば、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イフォスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、デカルバジン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、およびシクロホスファミド）、ＤＮＡインターカレーター（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン）、ＤＮＡインターカレーターおよびフリーラジカルジェネレーター、例えばブレオマイシン、ならびにヌクレオシド模倣物（例えば、５−フルオロウラシル、カペシチビン、ゲムシタビン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、およびヒドロキシ尿素）が含まれる。さらに、細胞複製を破壊する例示的な化学療法剤には、以下が含まれる：パクリタキセル、ドセタキセル、および関連する類似体、ビンクリスチン、ビンブラスチン、および関連する類似体、サリドマイド、レナリドマイド、および関連する類似体（例えば、ＣＣ−５０１３およびＣＣ−４０４７）、プロテインチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブおよびゲフィチニブ）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、ΙκΒキナーゼの阻害剤を含むＮＦ−κΒ阻害剤、がんで過剰発現したタンパク質に結合する抗体、およびがんで上方制御、過剰発現、または活性化されることが知られており、その阻害が細胞複製を下方制御するタンパク質または酵素の他の阻害剤。
【０３４８】
任意の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）の化学療法剤の組み合わせを、本明細書に記載のＤＮＡワクチンまたは免疫原性組成物と組み合わせて使用することができる。
【０３４９】
特定の実施形態では、本開示の主題の核酸分子、および核酸分子を含む組成物は、単独で使用することができる。
【０３５０】
ワクチン
例示的な実施形態では、本発明は、免疫原性組成物、例えば、免疫応答、特に特定のＴ細胞応答を生じさせることができる、本明細書に記載の核酸分子を含む組成物であるワクチンに関する。
【０３５１】
ＤＮＡワクチンは米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、同第５，６７６，５９４号、およびそこに引用されている優先出願に記載され、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。これらの出願で説明されている送達プロトコルに加えて、ＤＮＡを送達する代替的な方法が米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，０３６，００６号に記載され、両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【０３５２】
特定の実施形態では、ワクチン組成物は、本明細書に記載の方法によって識別された腫瘍特異的ネオ抗原に対応する、本明細書に記載の変異型ネオ抗原性核酸分子を含む（例えば、式：［（抗原発現ドメイン１）−（リンカー）−（抗原発現ドメイン２）−（リンカー）］ｎを含む核酸配列を含む）。好適なワクチンは、好ましくは、複数の腫瘍特異的ネオ抗原性核酸分子を含むであろう。一実施形態では、ワクチンは、約１〜約２００の核酸分子、約２〜約１００の核酸分子、約２〜約５８の核酸分子、約２〜約２９の核酸分子を含む。特定の実施形態では、ワクチンは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の核酸分子を含む。特定の実施形態では、ワクチンは、約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の核酸分子を含む。特定の実施形態では、ワクチンは、約４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０の核酸分子を含む。特定の実施形態では、ワクチンは、約６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０核酸分子を含む。特定の実施形態では、ワクチンは、約８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００の核酸分子を含む。
【０３５３】
特定の実施形態では、ワクチン組成物は、対象においてＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答を増強することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。別の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答を増強することは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖することを含む。他の実施形態では、ワクチン組成物は、特定の細胞傷害性Ｔ細胞応答および／または特定のヘルパーＴ細胞応答を上昇させることができる。
【０３５４】
ワクチン組成物は、アジュバントおよび／または担体をさらに含むことができる。
【０３５５】
アジュバントは、本明細書に記載されており、ワクチン組成物への混合物が変異型ペプチドに対する免疫応答を増加させるか、または別様に改変する任意の物質である。担体は、ネオ抗原性ペプチドが会合することができる足場構造、例えば、ポリペプチドまたは多糖である。任意選択的に、アジュバントは、本発明のペプチドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合で共役される。
【０３５６】
抗原に対する免疫応答を増加させるアジュバントの能力は、典型的には、免疫介在性反応の有意な増加、または疾患症状の減少によって明らかになる。例えば、体液性免疫の増加は、典型的には、抗原に対して産生される抗体の力価の有意な増加によって明らかにされ、Ｔ細胞活性の増加は、典型的には、細胞増殖、または細胞傷害、またはサイトカイン分泌の増加として現れる。アジュバントはまた、例えば、主に体液性またはＴｈ２応答を主に細胞性またはＴｈ１応答に変化させることによって、免疫応答を変化させ得る。好適なアジュバントは本明細書に記載されている。
【０３５７】
本発明によるワクチン組成物は、１つを超える異なるアジュバントを含み得る。さらに、本発明は、上述のいずれかまたはそれらの組み合わせを含む任意のアジュバント物質を含む治療用組成物を包含する。核酸分子およびアジュバントは、任意の適切な順序で別々に投与することができることも企図される。
【０３５８】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、無傷の外来抗原自体ではなく、ＭＨＣ分子に結合したペプチドの形で抗原を認識する。ＭＨＣ分子自体は、抗原提示細胞の細胞表面にある。したがって、ＣＴＬの活性化は、ペプチド抗原、ＭＨＣ分子、およびＡＰＣの三量体複合体が存在する場合にのみ可能である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明によるワクチン組成物は、少なくとも１つの抗原提示細胞をさらに含む。
【０３５９】
抗原提示細胞（または刺激細胞）は、典型的には、その表面にＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子を有し、いくつかの実施形態では、それ自体が、選択された抗原をＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子にロードすることが実質的に不可能である。
【０３６０】
好ましくは、抗原提示細胞は樹状細胞である。いくつかの実施形態では、樹状細胞は、対象に対して自己由来である。本発明のいくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、本発明の核酸分子を含む発現コンストラクトを含む。核酸分子は樹状細胞を形質導入することができ、したがってペプチドの提示および免疫の誘導をもたらす。
【０３６１】
一態様では、本開示は、がんを有すると疑われるかまたはがんと診断された対象のために個別化されたがんワクチンを作製する方法であって対象からの試料中の複数の突然変異を識別することと、複数の突然変異を分析して、１つ以上のネオ抗原突然変異を識別することと、識別されたサブセットに基づいて、個人化されたがんワクチンを産生することと、を含む。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、識別することは、がんを配列決定することを含む。配列決定を実行するための方法は、本明細書に記載されている。
【０３６３】
いくつかの実施形態では、識別することは、がんを配列決定することを含む。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、分析することは、ネオ抗原突然変異に関連する１つ以上の結合特性、Ｔ細胞受容体への対象特異的ペプチドの結合からなる群から選択される結合特性、対象のＨＬＡタンパク質への対象特異的ペプチドの結合および抗原プロセシングに関連するトランスポーター（ＴＡＰ）への対象特異的ペプチドの結合を決定すること、決定された特性に基づいて、ネオ抗原突然変異の各々をランク付けすることをさらに含む。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のネオ抗原突然変異をコードする核酸配列を、核酸分子にクローニングすることをさらに含む。
【０３６６】
いくつかの実施形態では、核酸分子はプラスミドである。別の実施形態では、核酸分子は、ｐＧＸ４５０１、ｐＧＸ４５０３、ｐＧＸ  ４５０４、ｐＧＸ４５０５、およびｐＧＸ４５０６からなる群から選択されるものからなる群から選択されるプラスミドのマルチクローニングサイト内に位置する式Ｉの核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、式Ｉの核酸配列は、ｐＧＸ４５０１のマルチクローニングサイトに配置される。いくつかの実施形態では、式Ｉの核酸配列は、ｐＧＸ４５０３からなる群から選択されるプラスミドのマルチクローニングサイトで配置される。いくつかの実施形態では、式Ｉの核酸配列は、ｐｐＧＸ４５０４からなる群から選択されるプラスミドのマルチクローニングサイトで配置される。いくつかの実施形態では、式Ｉの核酸配列は、ｐＧＸ４５０５からなる群から選択されるプラスミドのマルチクローニングサイトで配置される。いくつかの実施形態では、式Ｉの核酸配列は、ｐＧＸ４５０６からなる群から選択されるプラスミドのマルチクローニングサイトで配置される。いくつかの実施形態では、プラスミドは、ｐＧＸ４５０５である。いくつかの実施形態では、プラスミドは、対象からの１つ以上のネオ抗原をコードする少なくとも２つ以上のＡＥＤヌクレオチド配列を有するｐＧＸ４５０５のバックボーンおよびリンカー配列を含む。
【０３６７】
キット
本開示は、本明細書に記載の１つまたは複数の核酸分子を含む医薬組成物を含むキットを提供する。キットの構成要素は、好ましくは、薬学的に許容される担体で製剤化される。
【０３６８】
キットには、対象のがんを治療する方法、または対象のＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強する方法で使用するための使用説明書も含まれている。
【０３６９】
本発明の実施は、別途示されない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を利用するが、これらは十分に当業者の範囲内である。そのような技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇａｉｔ，１９８４）、  「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」  「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｗｅｉ，１９９６）、「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）、「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）などの文献で完全に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に適用可能であり、したがって、本発明を作成および実施する際に考慮され得る。特定の実施形態のための特に有用な技法は、以下のセクションで考察される。
【０３７０】
他の実施形態は、以下の非限定的な実施例に記載されている。
【実施例】
【０３７１】
実施例１．材料および方法
以下の実施例で実行される実験は、以下の材料および方法を使用して実施されたが、これらに限定されない。
【０３７２】
動物および細胞株
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスはＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから購入した。ＴＣ１およびＬＬＣ腫瘍は、１００，０００個の細胞を皮下注射することによって生成された。ＩＤ８腫瘍は、２００万個の細胞を腹腔内注射することによって生成された。３０μＬの水に再懸濁した２５μｇのＤＮＡを前脛骨筋に注入した後、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ−３Ｐデバイス（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）でエレクトロポレーションすることによりマウスを処理した。各免疫化について、マウスに２つの０．１アンペアの定電流方形波パルスを供給した。
【０３７３】
ＤＮＡおよびＲＮＡの配列決定
マウスエクソームとＲＮＡ配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ−２５００プラットフォームで実施された。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｌｌ  Ｅｘｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を使用した。全ての試料で１３Ｇｂを超えるデータが生成され、エクソームの９８％以上が１５０倍以上でカバーされた。全体として、リードの９９％がマウス参照ゲノムに整列された。整列されたリードの８０％のマッピング品質はＱ６０以上であった。重複％は４〜６％と低かった。体細胞バリアントの呼び出しは、Ｓｔｒｅｌｋａプログラムｖ１．０．１４を使用して実施された。識別された体細胞バリアントはさらにフィルタリングされ、合格したバリアントとオンターゲットバリアントのみがさらなる分析のために考慮された。
【０３７４】
ＲＮＡ配列決定は、ＴｒｕｅＳｅｑ  ＲＮＡライブラリー調製キットｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＵＳＡ）を使用して実施した。全ての試料で１億を超えるリードが生成された。リボソームおよびミトコンドリアゲノムへのリードマッピングは、アラインメントを実施する前に削除された。リードは、ＳＴＡＲ（２．４．１）アライナーを使用して整列された。前処理されたリード全体の９６〜９８％が、参照遺伝子モデル／ゲノムにマッピングされた。遺伝子発現は、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ  ｖ２．２．１を使用して推定された。
【０３７５】
ネオエピトープは、非同義のコーディングミスセンス突然変異およびフレームシフト突然変異から優先順位が付けられ、突然変異対立遺伝子の発現は１ＦＰＫＭを超えていた。ＭＨＣクラスＩ結合分析は、全てのコーディングミスセンスおよびフレームシフト突然変異に対して実施された。この９ｍｅｒのペプチドは、Ｃ５７Ｂｌ／６  ＭＨＣ対立遺伝子（Ｈ−２−Ｋｂ、Ｈ−２−Ｄｂ）でＮｅｔＭＨＣｏｎｓ  ｖ１．１を使用して処理された。ＮｅｔＣｈｏｐ３．１（ＩＥＤＢ）を使用したプロテアソーム処理スコアの低下に基づいて、ペプチドにさらに優先順位を付けた。スコアが０．７以上のペプチドを選択した。ペプチドはＴＡＰ結合についてスコアリングされ、結合親和性が０．５未満のペプチドに優先順位を付けた。
【０３７６】
ネオ抗原ワクチンの設計
ネオ抗原ワクチンは、ＴＣ１、ＬＬＣ、およびＩＤ８で確立された腫瘍から得られたＤＮＡおよびＲＮＡ配列決定データから予測されるネオ抗原を選択することによって設計された。Ｈ２−Ｋ（ｂ）またはＨ２−Ｄ（ｂ）に結合し、変異アミノ酸を中央位置に保ち、両側に１２の非変異アミノ酸を隣接させる予測配列として定義される、１２のエピトープが含まれていた。１２個の３３ｍｅｒをフューリン切断部位と連結し、各コンストラクトをｐＶａｘ１プラスミド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）にサブクローニングした。図２８は、２９９９塩基対のバックボーンベクタープラスミドｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａｌｉｆ．）のマップである。ＣＭＶプロモーターは、１３７〜７２４塩基に位置している。Ｔ７プロモーター／プライミング部位は、塩基６６４〜６８３にある。マルチクローニングサイトは、塩基６９６〜８１１にある。ウシＧＨポリアデニル化シグナルは、塩基８２９〜１０５３にある。カナマイシン耐性遺伝子は、塩基１２２６〜２０２０にある。ｐＵＣの起点は、２３２０〜２９９３塩基にある。
【０３７７】
フローサイトメトリー
ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。使用した抗マウス抗体は、直接蛍光色素共役された。次の抗体を使用した：ＣＤ３ｅ（１７Ａ２）、ＣＤ４（ＲＭ４−５）、ＣＤ８ｂ（ＹＴＳ１５６．７．７）、インターフェロン−γ（ＸＭＧ１．２）、ＴＮＦα（ＭＰ６−ＸＴ２２）、インターロイキン−２（ＪＥＳ６−５Ｈ４）、およびＴ−ｂｅｔ（４Ｂ１０）、全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄから。生／死の除外は、Ｖｉｏｌｅｔ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。細胞内サイトカイン産生を決定するために、対応する野生型または変異型ネオ抗原、ゴルジ停止タンパク質輸送阻害剤（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣＤ１０７ａ抗体（１Ｄ４Ｂ）に由来するペプチド（５μｇ／ｍＬ）の存在下で、表面および細胞内染色の前に４〜５時間２００万個の脾細胞を培養した。ネオ抗原ペプチドは、９個のアミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドからなった。これらのペプチドは、免疫化に使用される３３ｍｅｒ全体に及んだ。
【０３７８】
ＥＬＩＳＰＯＴ
脾細胞を採取し、９個のアミノ酸が重複する１５ｍｅｒを含む各ネオ抗原由来ペプチドプールと共培養した。２４時間のインキュベーション後、マウスインターフェロン−γ  ＥＬＩＳＰＯＴを製造者の使用説明書（Ｍａｂｔｅｃｈ）に従って実施した。スポットはＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  ＣＴＬリーダーを使用して読み取られ、スポット形成単位（ＳＦＵ）は、刺激されたウェルから培地のみのウェルを差し引くことによって計算された。コンカナバリンＡを陽性対照（図示せず）として使用して、スポットの発生を確実にした。
【０３７９】
Ｔ細胞の増殖と活性化
脾臓細胞をワクチン接種されたマウスから採取し、５ｕｇ／ｍｌのネオ抗原特異的ペプチドおよび３０ＵＩ／ｍｌのＩＬ−２でパルスした。ペプチドとＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）は、ナイーブマウスからの照射（４０００ｒａｄ）脾細胞（１：３−１０  Ｔ細胞：脾細胞比）で週に１回リフレッシュされた。Ｔ細胞増殖を開始してから４〜６週間後、脾細胞を腫瘍細胞と共培養して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性実験を実施した。
【０３８０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性
１０，０００個のルシフェラーゼを形質導入したＴＣ１またはＩＤ８細胞を、９６ウェルプレートのウェルごとに播種した。１８時間後、細胞を１０個または５０，０００個のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖したＴ細胞と２４時間共培養した。細胞傷害性は、ＣＹＴＯＴＯＸ−ＧＬＯ細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の使用説明書に従って使用して測定した。細胞傷害性は、研究ウェルを含むＴ細胞におけるルシフェラーゼ発現を、腫瘍細胞のみ（Ｔ細胞を含まない）を含むウェルにおけるルシフェラーゼ発現で割った比率として報告された。
【０３８１】
統計学的分析
実験群の平均間の差異は、両側独立スチューデントのｔ検定を使用して計算された。反復測定を使用した２つの群間の比較は、二元配置分散分析を使用して行われた。エラーバーは平均値の標準偏差を表す。マウスの生存率分析では、Ｇｅｈａｎ−Ｂｒｅｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して有意性を決定した。全ての統計分析は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ７．０を使用して行われた。ｐ＜０．０５は統計的に有意であるとみなされた。
【０３８２】
実施例２．ＤＮＡワクチンネオエピトープドデカマーはマウスに頻繁な免疫反応を誘導する。
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスには、ＬＬＣとＴＣ１、マウス肺腫瘍モデル、およびＩＤ８、マウス卵巣腫瘍モデルの３つの異なる腫瘍タイプが移植された。ＬＬＣおよびＴＣ１腫瘍細胞を皮下注射し、ＩＤ８腫瘍細胞を腹膜に注射した。３週間後、腫瘍を採取し、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、ならびにエクソームおよびＲＮＡの配列決定を実施した（図１Ａ）。マウスに移植された同じ細胞株に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された細胞株のＤＮＡおよびＲＮＡの配列決定（図５）。ＲＮＡ−ｓｅｑ≧１、プロテアソーム切断スコア≧１０、およびＴＡＰプロセッシングスコア≦０．５でＡｌｔ対立遺伝子深度で発現した（詳細は方法を参照）変異が含められた。以前に報告されたように（１３）、突然変異のかなりの割合が細胞株と比較して腫瘍で異なって発現し、三次元腫瘍微小環境との関連でこれらの遺伝子の差次的発現を示している（図５）。
【０３８３】
ＬＬＣ、ＴＣ１、およびＩＤ８腫瘍モデルでそれぞれ固有のネオエピトープを生成する合計３３４、５４、および２７の非同義の発現変異があった（図１Ｂ）。ＮｅｔＭＨＣｏｎｓ  ｖ１．１を使用して予測した、ＬＬＣ、ＴＣ１、およびＩＤ８からの１９、３、および２のエピトープのみが、Ｈ２−Ｋ（ｂ）またはＨ２−Ｄ（ｂ）に対して５００ｎＭ未満の結合親和性を示した（図１Ｂ）。ＤＮＡワクチンプラットフォームを使用して免疫原性を試験するために、ＬＬＣから３６のエピトープを選択し、ＴＣ１から２４のエピトープを選択し、ＩＤ８から２４のエピトープを選択した。ＭＨＣＩ予測プログラムの価値を評価するために、全ての最高親和性エピトープ（＜５００ｎＭ）と、いくつかの低親和性エピトープが含まれていた。７つの全ＤＮＡワクチンネオエピトープドデカマーが設計され、これは、プラスミドあたり１２の合計３３ｍｅｒエピトープを含み、フューリン切断部位と共に連結された（図１Ｃ）。３３ｍｅｒエピトープは、エピトープに潜在的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を供給するために、両側が１２アミノ酸に囲まれた予測免疫原性９ｍｅｒを含むように設計された（図１Ｃ）。
【０３８４】
７つのプラスミドは次のとおりである：
（１）ＬＬＣプラスミド＃１を図２Ａ（ヌクレオチド配列）および図２Ｂ（アミノ酸配列）に示す。
（２）ＬＬＣプラスミド＃２を図２Ｃ（ヌクレオチド配列）および図２Ｄ（アミノ酸配列）に示す。
（３）ＬＬＣプラスミド＃３を図２Ｅ（ヌクレオチド配列）および図２Ｆ（アミノ酸配列）に示す。ＬＬプラスミド＃３は、約５００ｎＭ未満のＩＣ５０でＨＬＡタンパク質に結合する。
（４）ＴＣ１プラスミド＃１を図３Ａ（ヌクレオチド配列）および図３Ｂ（アミノ酸配列）に示す。
（５）ＴＣ１プラスミド＃２を図３Ｃ（ヌクレオチド配列）および図３Ｄ（アミノ酸配列）に示す。
（６）ＩＤ８プラスミド＃１を図４Ａ（ヌクレオチド配列）および図４Ｂ（アミノ酸配列）に示す。
（７）ＩＤ８プラスミド＃２を図４Ｃ（ヌクレオチド配列）および図４Ｄ（アミノ酸配列）に示す。
合計８４のネオエピトープを含むこれらの７つのプラスミドは、２５μｇのＤＮＡでＣ５７Ｂｌ／６マウスを免疫し、続いてＣＥＬＬＥＣＴＲＡ−３Ｐデバイスで３週間間隔でエレクトロポレーションを行い、合計３回の免疫を行うことによって試験された（図１Ｄ）。最終免疫の１週間後にマウスを屠殺し、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ分析と細胞内サイトカイン染色の両方のために脾臓を採取して、ＣＤ４＋反応性エピトープとＣＤ８＋反応性エピトープを識別した（図１Ｄ）。免疫反応性の閾値は、変異ペプチドに対応するペプチドに対するＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔにより、脾細胞１００万個あたり３０スポット形成単位以上に設定された。さらに、免疫原性として分類されたエピトープは、対照ｐＶａｘプラスミドで免疫されたマウスによって誘導されたものよりも統計的に有意に高い変異ペプチドに対する応答を必要とした。これらの基準を使用して、ＤＮＡワクチンを使用して送達されたときに免疫原性であった、ＬＬＣモデルからの１２／３６エピトープが識別され、ＴＣ１腫瘍モデルからの３／２４エピトープが識別され、ＩＤ８モデルからの５／２４エピトープが識別された（図１Ｅ）。全体として、エピトープの２４％（２０／８４）が免疫応答を生成した。これは、高親和性ＭＨＣＩ結合を選択しない前臨床試験でＲＮＡおよびＳＬＰワクチンについて報告されているものと同様であった。
【０３８５】
実施例３．ＤＮＡワクチンが主にネオ抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成することを示す。
これらのエピトープのどれがＣＤ８＋Ｔ細胞応答、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、またはその両方を生成したかを決定するために、細胞内染色およびフローサイトメトリーを実施した（図６Ａ〜図６Ｆ）。驚くべきことに、生成された応答の４０％はＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介され、応答の３５％はＣＤ８＋とＣＤ４＋Ｔ細胞の両方によって媒介され、応答の２５％のみがＣＤ４＋Ｔ細胞単独で媒介された（図７Ａ、図６Ａ〜図６Ｆ）。個々のエピトープ免疫応答には、平均３６〜１２８６．５ＳＦＵの範囲の広い範囲があった（図２Ａ）。最強のＣＤ８＋（Ｓｇｓｍ２）およびＣＤ４＋（Ｌｔａ４ｈ）Ｔ細胞エピトープは、それぞれＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞でのみＩＦＮγおよびＴＮＦαサイトカイン産生を生成した（図７Ｂおよび図７Ｃ）。他の多くのエピトープも、Ｔ−ｂｅｔおよびＣＤ１０７ａの発現に加えて、複数のサイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ−２）の発現を同時に伴う多機能応答を生成し、細胞溶解の可能性を示した（図８Ａ〜Ｆ）。
【０３８６】
次に、免疫原性エピトープを予測するためのＭＨＣクラスＩ結合親和性の能力を評価した。ＮｅｔＭＨＣｃｏｎｓ  ｖ１．１はある程度の予測力を有していることがわかり、免疫原性であったエピトープが選択された（図７Ｄおよび図７Ｅ）。実際、５００ｎＭ未満の結合親和性を有するエピトープの４６％が免疫応答を生成し、これは、ＭＨＣクラスＩ親和性選択を伴わない免疫原性エピトープの２４％よりも優れている（図１Ｅ、図７Ｅ）。驚くべきことに、高親和性エピトープの１００％がＣＤ８＋またはＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞応答のいずれかを生成した（図７Ｅ）。これらのデータは、ネオ抗原によって誘発される応答のタイプが免疫化プラットフォームに依存する可能性があり、ＤＮＡワクチンは、最小限のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する他のワクチン接種モードとは対照的に、ネオ抗原に対する強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導できることを示唆している。
【０３８７】
次に、免疫原性エピトープを予測するＭＨＣクラスＩＩ結合親和性の能力を試験した（図９Ａおよび図９Ｂ）。ｎｅｔＭＨＣＩＩ−１．１（ＳＭＭアライン）とｎｅｔＭＨＣＩＩ−２．２（ＮＮアライン）の両方の予測プログラムが試験され、どちらのプログラムにもＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを特異的に予測する実証可能な力がないことが判明した。ＳＭＭアライン予測プログラムは免疫原性エピトープを予測しなかった（５００ｎＭ未満の結合親和性を持つエピトープの２８．６％が免疫応答を生成した、図９Ａ）。ＮＮアラインプログラムは免疫原性エピトープを選択したが（５００ｎＭ未満の結合親和性を有するエピトープの３７．５％が免疫応答を生成した）、このプログラムはＣＤ４＋Ｔ細胞応答を特異的に選択しなかった（図９Ｂ）。したがって、他で報告されているように（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００８；９  Ｓｕｐｐｌ  １２：Ｓ２２）、これらのＭＨＣクラスＩＩ予測プログラムは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを予測する能力が限られている。
【０３８８】
実施例４．ＤＮＡワクチンでプライミングされたＴ細胞は変異細胞を選択的に殺傷する。
対応する野生型（変異していない）ネオ抗原エピトープに対して免疫化されたマウスから生成された免疫応答を比較した。免疫応答の大部分は、野生型エピトープではなく、変異エピトープに特異的であることが見出された（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。生成された免疫応答の７５％は、野生型エピトープと比較して、変異エピトープで少なくとも１．５倍高かった。変異体と野生型のエピトープを比較した場合、免疫応答の残りの２５％は類似していた（図１０Ｂ）。これらの結果は、応答の６８．８％が変異エピトープに特異的であったネオ抗原ＳＬＰワクチンについて以前に報告されたものと類似している（Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２０１２；７２：１０８１−９１）。
【０３８９】
私たちのネオ抗原ＤＮＡワクチンによってプライミングされたＴ細胞の細胞傷害性機能と特異性を決定するために、様々なＴＣ１ネオ抗原（Ｓｇｓｍ２、Ｈｅｒｐｕｄ２、およびＬｔａ４ｈ）に最もよく反応するＴ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた。興味深いことに、ｅｘ  ｖｉｖｏ増殖後、Ｈｅｒｐｕｄ２およびＬｔａ４ｈペプチド（元々はＣＤ４＋）で増殖したＴ細胞の大部分は実際にはＣＤ８＋Ｔ細胞であり（図１１Ａ）、これらのエピトープがマウスで、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答に加えてＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成できることを示している。
【０３９０】
これらの増殖したＴ細胞は、選択した遺伝子にネオ抗原突然変異を持たないＴＣ１細胞またはＩＤ８細胞と共培養した。Ｔ細胞と腫瘍細胞との共インキュベーションは、Ｈｅｒｐｕｄ２およびＳｇｓｍ２の場合において、ＴＣ１に対するＴＣ１ネオ抗原Ｔ細胞の特異的な細胞傷害性を示した（図１１Ｂおよび図１１Ｃ）。しかしながら、ＴＣ１に対するＬｔａ４ｈ拘束Ｔ細胞の細胞傷害性活性は見られなかった（図１１Ｃ）。この結果を説明する１つの仮説は、ＴＣ１細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬｔａ４ｈを発現しない可能性があるというものである。ＴＣ１培養細胞および腫瘍から生成されたＲＮＡ配列決定データを調べたところ（図５）、Ｌｔａ４ｈは腫瘍組織においてｉｎ  ｖｉｖｏでＲＮＡレベルでのみ発現され、培養ＴＣ１細胞では発現されないことが見出された（図１１Ｄ）。
【０３９１】
ＭＨＣクラスＩＩの生理学的発現は抗原提示細胞に限定されているが、ヒトとマウスの両方の一部の腫瘍はこの提示タンパク質複合体を発現し、ＣＤ４＋の直接認識を可能にする。ＣＤ４＋Ｔ細胞による潜在的な直接認識および潜在的な細胞傷害性があったかどうかを判断するために、ＭＨＣクラスＩＩを腫瘍細胞で測定した。Ｂ１６黒色腫またはＩＤ８とは異なり、ＴＣ１およびＬＬＣ細胞は様々な用量のＩＦＮγとのインキュベーション時にＭＨＣクラスＩＩ発現を示さなかったため（図１１Ｅおよび図１２）、腫瘍の殺傷はＭＨＣクラスＩ拘束メカニズムを介して発生する必要がある。
【０３９２】
次に、ＴＣ１ネオ抗原プラスミド内のエピトープの免疫優勢の階層を調べた。Ｓｇｓｍ２、Ｈｅｒｐｕｄ２、およびＬｔａ４ｈエピトープで観察された強い応答が、各プラスミドから免疫優勢エピトープを削除することにより、同じプラスミド内の他のエピトープからの潜在的な亜優勢免疫応答をマスキングできるかどうかを試験した（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。各プラスミドについて、免疫優勢エピトープを削除しても、亜優勢エピトープからの免疫応答の生成は生じなかったことが見出された（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。
【０３９３】
実施例５．ＤＮＡネオ抗原ワクチンは腫瘍の進行を遅らせる
ＴＣ１ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を調べた。これを行うために、マウスにＴＣ１細胞株を移植し、７日後、マウスにドデカマーワクチンプラスミド１（免疫原性ネオ抗原Ｓｇｓｍ２およびＨｅｒｐｕｄ２を含む）、プラスミド２（免疫原性ネオ抗原Ｌｔａ４ｈを含む）、その両方または空のｐＶａｘベクター（図１４Ａ）を毎週ワクチン接種した。マウスをプラスミド１単独または組み合わせで処理した場合、より長い生存に関連する腫瘍進行の重大な遅延が見出された（図１４Ｂ）。プラスミド２では、それほど強くはないが、有意な腫瘍遅延が見られた（図１４Ｂ）。図１４Ｃ  ＴＣ１プラスミド１、２、両方またはｐＶａｘで処理されたＴＣ１を有するマウスの生存曲線（ｎ＝１０匹のマウス／群）。Ｌｔａ４ｈエピトープは免疫原性が高いが、主にＣＤ４＋Ｔ細胞応答を生成した（図７Ａ）。これらのネオ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＴＣ１細胞がＭＨＣクラスＩＩを発現しないため、このＴＣ１腫瘍モデルにおける腫瘍進行の遅延にそれほど効果的ではなかった可能性がある（図１１Ｅ）。さらに、Ｌｔａ４ｈネオ抗原の発現レベルは、プラスミド１に存在するネオ抗原と比較して比較的低かった（図１１Ｄ）。
【０３９４】
実施例１〜５は、ＤＮＡベースのワクチンを使用してがんネオ抗原に対して効果的な抗腫瘍免疫応答を生成する可能性を初めて説明している。ＤＮＡワクチンプラットフォームには、ワクチン製造の速度、ワクチンの安定性、製造コストなど、効果的な抗腫瘍ネオ抗原ワクチンを生成するための他のアッセイプラットフォームに比べていくつかの先験的な利点がある。時間はがん治療の重要な要素である。外科的に切除可能な腫瘍を有する患者でさえ、潜在的に免疫抑制性の微小環境を伴う微小転移巣の発症のリスクがある。したがって、個人化されたワクチンを製造することができる速度が最も重要である。ＤＮＡワクチンの製造は、複雑なペプチド合成またはＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を必要としないため、他のプラットフォームよりも迅速である。さらに、ＤＮＡは室温で安定しており、ＲＮＡおよびペプチドワクチンとは異なり、コールドチェーンを必要としない。この製造および輸送の容易性は、ＤＮＡワクチンのはるかに低いコストに寄与し、個人化された患者固有の治療用途に理想的な技術となる。
【０３９５】
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗腫瘍Ｔ細胞応答の主要なメディエーターであると考えられている。前臨床および臨床研究で以前に示したように（Ｔｒｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．２０１５；Ｄｕｐｅｒｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１７）、ＤＮＡワクチンは、強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成することができる。実施例１〜５は、予想通り、高いＭＨＣＩ結合が予測されるＤＮＡコードされたネオ抗原が、ＣＤ８＋またはＣＤ８＋／ＣＤ４＋ネオ抗原特異的免疫応答を生成したことを示している。予測されたＭＨＣＩ拘束応答に基づいて生成されたＲＮＡおよびペプチドベースのワクチンは、驚くべきことにＭＨＣＩＩ拘束応答をもたらした（Ｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１７；Ｓａｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。エピトープのＭＨＣＩ提示には、細胞内タンパク質合成とプロテアソーム分解が必要である（Ｒｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７）。合成の長いペプチドは組織に直接注入されるため、主に抗原提示細胞に飲み込まれて提示され、クラスＩＩの提示に偏る。ＲＮＡとＤＮＡの場合、ペプチド合成は細胞内で起こり、必要に応じてプロテアソームによって切断され、ＭＨＣクラスＩ経路に入ることができる。ＲＮＡワクチンによる強いＣＤ４＋バイアスは、ＲＮＡの炎症誘発性に起因する可能性がある。ＲＮＡは、ＴＬＲ３、７、８などの複数の自然免疫受容体および炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６またはＴＮＦα）産生を促進するＲＩＧ−Ｉ様受容体によって感知される（Ｐａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１８）。この炎症応答は、ＣＤ８＋の活性化とサイトカイン産生に有害である可能性があり（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５）、さらにｍＲＮＡ複製、失速翻訳を阻害し、ＲＮＡ分解を引き起こす可能性がある（Ｐａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１８；Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０１２；８６：２９００−１０）。
【０３９６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は抗腫瘍細胞傷害性を引き起こす可能性があることが示されている。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ−ペプチド複合体の認識時に、顆粒エキソサイトーシスまたはＦａｓ−Ｆａｓリガンド経路に基づいて直接的な細胞傷害を発揮することができる（Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１；１０９：９９８３−８；Ｊａｎｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１：４６０４−１２）。しかしながら、固形腫瘍がＭＨＣＩＩを発現することは一般的ではない（黒色腫で４１％、小細胞肺癌で０％）（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１７；１１２：７５−８０；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６；７：１０５８２）。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍細胞のマクロファージ殺傷を活性化することにより、ＭＨＣクラスＩＩを発現しない腫瘍細胞の殺傷を誘導することも示唆されている（Ｌａｕｒｔｉｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３；１４８：１７７−８８）。
【０３９７】
がんのネオ抗原の数は腫瘍の種類によって大きく異なるが、約３３〜１６３の発現した非同義変異であると定義されている（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ２０１３）。記載されているＤＮＡプラットフォームを使用してネオ抗原ベースのワクチンを生成すると、各プラスミドに多数のネオ抗原をコード化できる。インサートサイズ（３３ａａ）とリンカー（７ａａ）を考慮すると、５０個のネオ抗原を含むワクチンは６１５０ｂｐのインサートのみを必要とする。これにより、１つのプラスミドのみを使用して、ほとんどのがん患者で識別された全てのネオ抗原の免疫化が可能になる。突然変異荷重が非常に高い場合は、２つまたは３つのプラスミドを使用して全てのネオ抗原を含めることができる。この戦略は、広範囲の抗腫瘍Ｔ細胞応答を生成する能力を指数関数的に増加させる。ドライバー変異が免疫原性になることはめったになく、免疫原性ネオ抗原は通常パッセンジャー変異として発生するため、腫瘍あたりの多数のネオ抗原に対して免疫すると、腫瘍の免疫逃避が防止または遅延する。全ての潜在的なネオ抗原に対して免疫するこのアプローチはまた、個々のエピトープの実際の（予測されたものに対する）値を実験的に検証する必要性を排除し、ワクチンが製造されて患者に投与される前の貴重な時間を短縮する。さらに、ヒトは６つの異なるＭＨＣクラスＩ分子（近交系マウスに存在する２つの異なる分子より多い）を持っているため、より高い割合のエピトープがヒトＨＬＡに結合し、ワクチンに対する応答を生成できる可能性がある。
【０３９８】
結論として、実施例１〜５は、腫瘍ネオ抗原に対するＤＮＡワクチンが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍特異的応答を生成し、腫瘍の進行を遅らせることができることを初めて示している。この有望な技術には、製造時間の短縮、製造コストの削減、安定性の向上、各患者に存在するネオ抗原の全てではないにしてもほとんどを標的とする能力などの利点がある。
【０３９９】
実施例６．Ｂ１６モデルに対するポリネオエピトープＤＮＡワクチンの設計
ネオ抗原ワクチンの設計
以前に識別された２７ｍｅｒのＢ１６およびＣＴ２６ネオ抗原（Ｂ１６の場合はＭ２７、Ｍ３０、およびＭ３３、ＣＴ２６の場合はＭ１９、Ｍ２０、およびＭ２６）をエンコードすることにより、ｐＧＸ４５０１、ｐＧＸ４５０３、ｐＧＸ４５０４、ｐＧＸ４５０５、およびｐＧＸ４５０６ワクチンを設計した（Ｋｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。リンカーなしの各エピトープを、フューリン切断部位または２つのエピトープを分離するフューリン切断部位と２つのエピトープを分離するＰ２Ａ切断部位とで分離した。これらの配列は、ｐＶａｘ１プラスミド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）にサブクローニングされた。
【０４００】
ベクターのｖＡＥＤ部分を設計する方法は、ペプチドが（上述のように９だけ重なる１５ｍｅｒの代わりに）１１だけ重なる１５ｍｅｒであったことを除いて、上述の実施例１で実施した方法と同じであった。
【０４０１】
図１５は、Ｂ１６モデルに対するポリネオエピトープＤＮＡワクチンの設計の概略図を示す。ｐＧＸ４５０１およびｐＧＸ４５０３プラスミドを使用したＦは、フューリン切断部位またはリンカーを示す。Ｐ２Ａは、ブタテッショウウイルス１切断部位またはリンカーを示す。
【０４０２】
図１６は、Ｂ１６に対するＤＮＡワクチンによって誘発される免疫応答を評価するための戦略を示す。メスのＣ５７／Ｂ６マウスは、ネオ抗原コンストラクト（ｎ＝８／群）または空のベクター対照（ｎ＝４）で免疫された。免疫化は０、２、および４週目に実施された。脾臓リンパ球は、完全なネオペプチド配列のペプチド（ＭＨＣ  ＩＩ）または１１アミノ酸が重複する１５−ｍｅｒペプチド（ＭＨＣ  Ｉ）で１８時間刺激された。ペプチドは、切断部位を含まないように設計されている。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは５週目に実施された。
【０４０３】
図１７は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示すグラフのパネルを示し、全長ペプチド、プールされた１５ｍｅｒペプチド、および個々のネオエピトープに応答する、Ｔ細胞活性化に対応するＩＦＮγ  ＳＦＵ／１０ｅ６脾細胞の量を測定する。図１７に示すように、Ｂ１６融合ネオ抗原に提示された個々のネオエピトープは、最も強い応答を生成した。Ｂ１６融合ネオ抗原コンストラクト（上）とＢ１６フューリン／Ｐ２Ａネオ抗原コンストラクト（下）を試験した。
【０４０４】
図１８は、概念実証のネオ抗原研究：Ｂ１６ネオ抗原を示す。アジュバントがない場合、ｐＧＸ４５０１はマウス、特にＣＤ８エピトープであるＭ３３領域で免疫応答を誘発できる。
【０４０５】
実施例７．ＣＴ２６モデルに対するポリネオエピトープＤＮＡワクチンの設計
図１９は、Ｂ１６モデルに対するポリネオエピトープＤＮＡワクチンの設計の概略図を示す。ｐＧＸ４５０４、ｐＧＸ５４０５、およびｐＧＣ４５０６プラスミドを使用した。Ｆはフューリンリンカーを示す。Ｐ２Ａは、ブタテッショウウイルス１リンカーを示す。
【０４０６】
図２０は、Ｂ１６に対するＤＮＡワクチンによって誘発される免疫応答を評価するための戦略を示す。メスのＣ５７／Ｂ６マウスは、ネオ抗原コンストラクト（ｎ＝８／群）または空のベクター対照（ｎ＝４）で免疫された。免疫化は０、２、および４週目に実施された。脾臓リンパ球は、完全なネオペプチド配列のペプチド（ＭＨＣ  ＩＩ）または１１アミノ酸が重複する１５−ｍｅｒペプチド（ＭＨＣ  Ｉ）で１８時間刺激された。ペプチドは、切断部位を含まないように設計されている。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは５週目に実施された。
【０４０７】
図２１は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示すグラフのパネルを示し、試験された全長ペプチド、プールされた１５ｍｅｒペプチド、および個々のネオエピトープについて、Ｔ細胞活性化に対応するＩＦＮγ  ＳＦＵ／１０ｅ６脾細胞の量を測定する。図２１に示すように、ＣＴ２６フューリンネオ抗原に提示された個々のネオエピトープは、最も強い応答を生成した。ＣＴ２６融合ネオ抗原コンストラクト（上）、ＣＴ２６フューリンネオ抗原（中央）、およびＣＴ２６フューリン／Ｐ２Ａネオ抗原コンストラクト（下）を試験した。
【０４０８】
図２２は、概念実証のネオ抗原研究：ＣＴ２６ネオ抗原を示す。
【０４０９】
実施例８．樹状細胞を使用するｅｘ  ｖｉｖｏプライミング用のＤＮＡワクチンの発現
ネオ抗原ＤＮＡワクチンは、ｅｘ  ｖｉｖｏでネオ抗原に対してＴ細胞をプライミングするためにも使用できる。樹状細胞は宿主から分化し、ＤＮＡプラスミドでトランスフェクトされる。Ｔ細胞を培養物に添加して、ネオ抗原ＭＨＣ−ペプチド複合体を検出できるＴ細胞の選択的増殖を得る。
【０４１０】
簡潔に述べると、手順は次のとおりである：
骨髄ＢＭを解凍または分離する（メスのＢ６を１匹入手し、骨髄細胞を洗い流し、赤血球を溶解し、ウェルあたり２５０万を１０ｃｍの皿に播種し、１０ｍｌのＲＰＭＩを加え、４０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦを加える。
３日目に、１０ｍｌのＲＰＭＩと４０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦを加えることによってＧＭＣＳＦをリフレッシュする。
６日目に、１０ｍｌのＲＰＭＩをスピンダウンして、４０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦを含む１０ｍｌの新しいＲＰＭＩに再懸濁することによってＧＭＣＳＦをリフレッシュする。
【０４１１】
７日目：増殖した樹状細胞を収集し、６ウェルプレートに５０万で播種する。続いて、リポフェクタミン試薬を使用してネオ抗原ワクチンプラスミドをトランスフェクトする。
【０４１２】
８日目：Ｔ細胞を１０（Ｔ細胞）：１（ＢＭＤＣ）比（ウェルあたり５００万）で２０ＩＵのＩＬ−２／ｍｌおよび１ｎｇ／ｍｌのＩＬ７と共に播種する。
【０４１３】
トランスフェクトされた樹状細胞培養を毎週４〜６週間リフレッシュし、Ｔ細胞を目的の実験に使用する。
【０４１４】
実施例９：１つの製剤における複数のエピトープの送達および腫瘍チャレンジ有効性に対する効果
この研究の目的は、１つの製剤（５つのプラスミド）で６０のエピトープを送達する能力を実証し、より多くのエピトープの送達が腫瘍チャレンジの有効性に影響を与えないことを実証することである。
【０４１５】
この研究では、５群のマウスに腫瘍（特にＴＣ１腫瘍）を移植し、次のワクチンの組み合わせを送達する。
１．ｐＶａｘ（２５ｕｇ）
２．ＴＣ１プラスミド＃１単独（２５ｕｇ）
３．３つのＬＬＣプラスミド（プラスミドあたり２５ｕｇ）＋ｐＶａｘ（５０ｕｇ）
４．２つのＴＣ１プラスミド（プラスミドあたり２５ｕｇ）＋ｐＶａｘ（７５ｕｇ）
５．３つのＬＬＣプラスミド（プラスミドあたり２５ｕｇ）＋２つのＴＣ１プラスミド（プラスミドあたり２５ｕｇ）
【０４１６】
この研究では、群＃２、群＃４、および群＃５は同様の抗腫瘍活性を有し、群＃１および群＃３は抗腫瘍活性を有しないと予想される。
【０４１７】
この研究は、ＬＬＣ腫瘍から無関係な免疫原性エピトープを追加しても、ＴＣ１プラスミドがＴＣ１腫瘍に対する抗腫瘍免疫を生成する能力に影響を与えないことを示している。
【０４１８】
全長のｐＶＡＸシーケンスは次のとおりである：
ｇｃｔｇｃｔｔｃｇｃｇａｔｇｔａｃｇｇｇｃｃａｇａｔａｔａｃｇｃｇｔｔｇａｃａｔｔｇａｔｔａｔｔｇａｃｔａｇｔｔａｔｔａａｔａｇｔａａｔｃａａｔｔａｃｇｇｇｇｔｃａｔｔａｇｔｔｃａｔａｇｃｃｃａｔａｔａｔｇｇａｇｔｔｃｃｇｃｇｔｔａｃａｔａａｃｔｔａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｃｃａａｃｇａｃｃｃｃｃｇｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔａａｔｇａｃｇｔａｔｇｔｔｃｃｃａｔａｇｔａａｃｇｃｃａａｔａｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇｔｇｇａｇｔａｔｔｔａｃｇｇｔａａａｃｔｇｃｃｃａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｇｔｇｔａｔｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔａｃｇｃｃｃｃｃｔａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃａｔｔａｔｇｃｃｃａｇｔａｃａｔｇａｃｃｔｔａｔｇｇｇａｃｔｔｔｃｃｔａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃｔａｃｇｔａｔｔａｇｔｃａｔｃｇｃｔａｔｔａｃｃａｔｇｇｔｇａｔｇｃｇｇｔｔｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｔｇｇｇｃｇｔｇｇａｔａｇｃｇｇｔｔｔｇａｃｔｃａｃｇｇｇｇａｔｔｔｃｃａａｇｔｃｔｃｃａｃｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇａｇｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｃａｃｃａａａａｔｃａａｃｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａａａａｔｇｔｃｇｔａａｃａａｃｔｃｃｇｃｃｃｃａｔｔｇａｃｇｃａａａｔｇｇｇｃｇｇｔａｇｇｃｇｔｇｔａｃｇｇｔｇｇｇａｇｇｔｃｔａｔａｔａａｇｃａｇａｇｃｔｃｔｃｔｇｇｃｔａａｃｔａｇａｇａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｔａｃｔｇｇｃｔｔａｔｃｇａａａｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａｃｃｃａａｇｃｔｇｇｃｔａｇｃｇｔｔｔａａａｃｔｔａａｇｃｔｔｇｇｔａｃｃｇａｇｃｔｃｇｇａｔｃｃａｃｔａｇｔｃｃａｇｔｇｔｇｇｔｇｇａａｔｔｃｔｇｃａｇａｔａｔｃｃａｇｃａｃａｇｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｃｔａｇａｇｇｇｃｃｃｇｔｔｔａａａｃｃｃｇｃｔｇａｔｃａｇｃｃｔｃｇａｃｔｇｔｇｃｃｔｔｃｔａｇｔｔｇｃｃａｇｃｃａｔｃｔｇｔｔｇｔｔｔｇｃｃｃｃｔｃｃｃｃｃｇｔｇｃｃｔｔｃｃｔｔｇａｃｃｃｔｇｇａａｇｇｔｇｃｃａｃｔｃｃｃａｃｔｇｔｃｃｔｔｔｃｃｔａａｔａａａａｔｇａｇｇａａａｔｔｇｃａｔｃｇｃａｔｔｇｔｃｔｇａｇｔａｇｇｔｇｔｃａｔｔｃｔａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｇｔｇｇｇｇｔｇｇｇｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇｇｇｇａｇｇａｔｔｇｇｇａａｇａｃａａｔａｇｃａｇｇｃａｔｇｃｔｇｇｇｇａｔｇｃｇｇｔｇｇｇｃｔｃｔａｔｇｇｃｔｔｃｔａｃｔｇｇｇｃｇｇｔｔｔｔａｔｇｇａｃａｇｃａａｇｃｇａａｃｃｇｇａａｔｔｇｃｃａｇｃｔｇｇｇｇｃｇｃｃｃｔｃｔｇｇｔａａｇｇｔｔｇｇｇａａｇｃｃｃｔｇｃａａａｇｔａａａｃｔｇｇａｔｇｇｃｔｔｔｃｔｔｇｃｃｇｃｃａａｇｇａｔｃｔｇａｔｇｇｃｇｃａｇｇｇｇａｔｃａａｇｃｔｃｔｇａｔｃａａｇａｇａｃａｇｇａｔｇａｇｇａｔｃｇｔｔｔｃｇｃａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃａｔｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔｇａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａａｔｔａｔｔａａｃｇｃｔｔａｃａａｔｔｔｃｃｔｇａｔｇｃｇｇｔａｔｔｔｔｃｔｃｃｔｔａｃｇｃａｔｃｔｇｔｇｃｇｇｔａｔｔｔｃａｃａｃｃｇｃａｔｃａｇｇｔｇｇｃａｃｔｔｔｔｃｇｇｇｇａａａｔｇｔｇｃｇｃｇｇａａｃｃｃｃｔａｔｔｔｇｔｔｔａｔｔｔｔｔｃｔａａａｔａｃａｔｔｃａａａｔａｔｇｔａｔｃｃｇｃｔｃａｔｇａｇａｃａａｔａａｃｃｃｔｇａｔａａａｔｇｃｔｔｃａａｔａａｔａｇｃａｃｇｔｇｃｔａａａａｃｔｔｃａｔｔｔｔｔａａｔｔｔａａａａｇｇａｔｃｔａｇｇｔｇａａｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｇａｔａａｔｃｔｃａｔｇａｃｃａａａａｔｃｃｃｔｔａａｃｇｔｇａｇｔｔｔｔｃｇｔｔｃｃａｃｔｇａｇｃｇｔｃａｇａｃｃｃｃｇｔａｇａａａａｇａｔｃａａａｇｇａｔｃｔｔｃｔｔｇａｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｔｔｃｔｇｃｇｃｇｔａａｔｃｔｇｃｔｇｃｔｔｇｃａａａｃａａａａａａａｃｃａｃｃｇｃｔａｃｃａｇｃｇｇｔｇｇｔｔｔｇｔｔｔｇｃｃｇｇａｔｃａａｇａｇｃｔａｃｃａａｃｔｃｔｔｔｔｔｃｃｇａａｇｇｔａａｃｔｇｇｃｔｔｃａｇｃａｇａｇｃｇｃａｇａｔａｃｃａａａｔａｃｔｇｔｔｃｔｔｃｔａｇｔｇｔａｇｃｃｇｔａｇｔｔａｇｇｃｃａｃｃａｃｔｔｃａａｇａａｃｔｃｔｇｔａｇｃａｃｃｇｃｃｔａｃａｔａｃｃｔｃｇｃｔｃｔｇｃｔａａｔｃｃｔｇｔｔａｃｃａｇｔｇｇｃｔｇｃｔｇｃｃａｇｔｇｇｃｇａｔａａｇｔｃｇｔｇｔｃｔｔａｃｃｇｇｇｔｔｇｇａｃｔｃａａｇａｃｇａｔａｇｔｔａｃｃｇｇａｔａａｇｇｃｇｃａｇｃｇｇｔｃｇｇｇｃｔｇａａｃｇｇｇｇｇｇｔｔｃｇｔｇｃａｃａｃａｇｃｃｃａｇｃｔｔｇｇａｇｃｇａａｃｇａｃｃｔａｃａｃｃｇａａｃｔｇａｇａｔａｃｃｔａｃａｇｃｇｔｇａｇｃｔａｔｇａｇａａａｇｃｇｃｃａｃｇｃｔｔｃｃｃｇａａｇｇｇａｇａａａｇｇｃｇｇａｃａｇｇｔａｔｃｃｇｇｔａａｇｃｇｇｃａｇｇｇｔｃｇｇａａｃａｇｇａｇａｇｃｇｃａｃｇａｇｇｇａｇｃｔｔｃｃａｇｇｇｇｇａａａｃｇｃｃｔｇｇｔａｔｃｔｔｔａｔａｇｔｃｃｔｇｔｃｇｇｇｔｔｔｃｇｃｃａｃｃｔｃｔｇａｃｔｔｇａｇｃｇｔｃｇａｔｔｔｔｔｇｔｇａｔｇｃｔｃｇｔｃａｇｇｇｇｇｇｃｇｇａｇｃｃｔａｔｇｇａａａａａｃｇｃｃａｇｃａａｃｇｃｇｇｃｃｔｔｔｔｔａｃｇｇｔｔｃｃｔｇｇｃｃｔｔｔｔｇｃｔｇｇｃｃｔｔｔｔｇｃｔｃａｃａｔｇｔｔｃｔｔ（配列番号：６８）
プラスミドのマップを図３０に示す。
【０４１９】
実施例１０．
現在進行中の調査は次のとおりである：
１．ＩＬ−１２免疫プラスミドアジュバントがＬＬＣプラスミド＃３によって生成される免疫応答を高めることができるかどうかを試験している。
２．免疫枯渇研究を通じて、ＴＣ１プラスミド＃１ワクチンの抗腫瘍効果についてＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の相対的な寄与を試験している。
３．ＬＬＣ腫瘍モデルで３つのＬＬＣプラスミドの抗腫瘍活性を試験している。
４．ＩＤ８卵巣腫瘍モデルにおいて、２つのＩＤ８プラスミドの抗腫瘍活性を単独で、またはＣＴＬＡ４およびＰＤ１を標的とする免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて試験している。
５．ＴＣ１プラスミドと組み合わせて非ＴＣ１標的ネオエピトーププラスミド（ＬＬＣから）を送達し、ＴＣ１プラスミド＃１のみと比較することにより、ＴＣ１腫瘍モデルにおけるネオ抗原の競合を調査している。
【０４２０】
実施例１１−４０の抗原プラスミドの構築およびワクチン接種。
目的＃１：１２エピトーププラスミドと２４エピトーププラスミドと４０エピトーププラスミドの有効性を比較する。
目的＃２：各プラスミド内のＳｇｓｍ２の位置を変更して、影響があるかどうかを判断する。
以下のエピトープをコードする核酸コンストラクトを含むｐＶＡＸ１のプラスミド配列を作成した。示されているように、１０個の抗原、２０個の抗原、または４０個の抗原を有する提供されたアミノ酸配列をコードする核酸配列は、ｐＶＡＸ１ベクターマルチクローニングサイトにクローン化された。動物は、図３１に示されるプロトコルを使用してワクチン接種された。各プラスミドのラベルは、プラスミド内で抗原が提供される数と順序を示している。ワクチン接種後、上述の実施例１で識別されたプロトコルによるＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施し、ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋細胞を、実施例１の上記のフローサイトメトリープロトコルを使用して単離した。それらの特定のサブセットのＩＦＮ−γ産生細胞がどれだけ多いかが計算された結果を図３２に示す。
全ての免疫原性エピトープ：
１．Ｓｇｓｍ２  Ｖ６５６Ａ：ＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥ（配列番号１）
２．Ｈｅｒｐｕｄ２  Ｖ８５Ｌ：ＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳ（配列番号２）
３．Ｌｔａ４ｈ  Ｖ４６３Ａ：ＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶ（配列番号３）
４．Ｐｈａｃｔｒ４  Ｖ２５３Ｌ：ＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲ（配列番号４）
５．Ａｕｎｉｐ  Ｅ１６８Ｇ：ＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬ（配列番号５）
６．Ｐｉｋ３ｃａ  Ｙ１４３Ｆ：ＱＧＫＹＩＬＫＶＣＧＣＤＥＹＦＬＥＫＦＰＬＳＱＹＫＹＩＲＳＣＩＭＬ（配列番号６）
７．Ｇｐｎ２  Ｉ１５１Ｖ：ＫＦＩＳＶＬＣＴＳＬＡＴＭＬＨＶＥＬＰＨＶＮＬＬＳＫＭＤＬＩＥＨＹ（配列番号７）
８．Ｅｎｇ  Ｉ２８６Ｖ：ＬＲＰＳＴＬＳＱＥＶＹＫＴＶＳＭＲＬＮＶＶＳＰＤＬＳＧＫＧＬＶＬＰ（配列番号８）
９．Ｚｍｙｍ１  Ｐ１７２Ｓ：ＡＣＳＳＳＹＮＳＡＶＭＥＳＳＳＶＮＶＳＭＶＨＳＳＳＫＥＮＬＣＰＫＫ（配列番号９）
１０．Ｓｅｍａ６ｄ  Ｖ２５５Ｍ：ＲＥＩＡＶＥＨＮＮＬＧＫＡＶＹＳＲＭＡＲＩＣＫＮＤＭＧＧＳＱＲＶＬ（配列番号１０）
１１．Ｕｂｒ１  Ｇ１４１２Ｓ：ＰＧＬＬＳＶＤＬＦＨＶＬＶＳＡＶＬＡＦＰＳＬＹＷＤＤＴＶＤＬＱＰＳ（配列番号１１）
１２．Ｚｇｒｆ１  Ｙ１６３８Ｃ：ＬＣＬＭＧＨＫＰＶＬＬＲＴＱＣＲＣＨＰＡＩＳＡＩＡＮＤＬＦＹＥＧＳ（配列番号１２）
１３．Ｃａｓｚ１  Ｌ１０８７Ｐ：ＴＳＡＡＥＴＫＰＰＬＡＰＳＳＰＰＡＰＰＧＴＭＶＡＧＳＳＬＥＧＰＡＰ（配列番号１３）
１４．Ａｄｇｒｂ２  Ｌ５７２Ｐ：ＲＳＬＱＥＬＬＡＲＲＴＹＹＳＧＤＰＬＦＳＶＤＩＬＲＮＶＴＤＴＦＫＲ（配列番号１４）
１５．Ｏｂｓｌ１  Ｔ１７６４Ｍ：ＧＧＨＶＣＷＭＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨ（配列番号１５）
１６．Ｄｈｒｓ９  Ｌ１４６Ｐ：ＥＰＩＥＶＮＬＦＧＬＩＮＶＴＰＮＭＬＰＬＶＫＫＡＲＧＲＶＩＮＶＳＳ（配列番号１６）
１７．Ｚｍｙｍ１  Ｔ４６６Ｒ：ＶＤＦＮＫＩＣＧＱＡＹＤＳＡＴＮＦＲＶＫＬＮＥＶＶＡＥＦＫＫＥＥＰ（配列番号１７）
１８．Ｎｒｐ２  Ｗ６６４Ｌ：ＮＣＮＦＤＦＰＥＥＴＣＧＷＶＹＤＨＡＫＬＬＲＳＴＷＩＳＳＡＮＰＮＤ（配列番号１８）
１９．Ａｂｈｄ１８  Ｓ２１０Ｃ：ＩＳＭＧＧＨＭＡＳＬＡＶＣＮＷＰＫＰＭＰＬＩＰＣＬＳＷＳＴＡＳＧＶ（配列番号１９）
２０．Ｆｏｃａｄ  Ｖ１３８８Ｍ：ＧＬＳＬＮＩＫＫＹＬＬＶＳＭＰＬＷＡＫＨＭＳＤＥＱＩＱＧＦＶＥＮＬ（配列番号２０）
ＲＧＲＫＲＲＳ（配列番号４１）−フューリン切断部位
１０−エピトーププラスミド：
１．Ｓｇｓｍ２  Ｖ６５６Ａ：ＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥ
２．Ｈｅｒｐｕｄ２  Ｖ８５Ｌ：ＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳ
３．Ｌｔａ４ｈ  Ｖ４６３Ａ：ＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶ
９．Ｚｍｙｍ１  Ｐ１７２Ｓ：ＡＣＳＳＳＹＮＳＡＶＭＥＳＳＳＶＮＶＳＭＶＨＳＳＳＫＥＮＬＣＰＫＫ
１１．Ｕｂｒ１  Ｇ１４１２Ｓ：ＰＧＬＬＳＶＤＬＦＨＶＬＶＳＡＶＬＡＦＰＳＬＹＷＤＤＴＶＤＬＱＰＳ
１５．Ｏｂｓｌ１  Ｔ１７６４Ｍ：ＧＧＨＶＣＷＭＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨ
１６．Ｄｈｒｓ９  Ｌ１４６Ｐ：ＥＰＩＥＶＮＬＦＧＬＩＮＶＴＰＮＭＬＰＬＶＫＫＡＲＧＲＶＩＮＶＳＳ
１７．Ｚｍｙｍ１  Ｔ４６６Ｒ：ＶＤＦＮＫＩＣＧＱＡＹＤＳＡＴＮＦＲＶＫＬＮＥＶＶＡＥＦＫＫＥＥＰ
１８．Ｎｒｐ２  Ｗ６６４Ｌ：ＮＣＮＦＤＦＰＥＥＴＣＧＷＶＹＤＨＡＫＬＬＲＳＴＷＩＳＳＡＮＰＮＤ
１９．Ａｂｈｄ１８  Ｓ２１０Ｃ：ＩＳＭＧＧＨＭＡＳＬＡＶＣＮＷＰＫＰＭＰＬＩＰＣＬＳＷＳＴＡＳＧＶ
２０−エピトーププラスミド：
１．Ｓｇｓｍ２  Ｖ６５６Ａ：ＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥ
２．Ｈｅｒｐｕｄ２  Ｖ８５Ｌ：ＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳ
３．Ｌｔａ４ｈ  Ｖ４６３Ａ：ＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶ
４．Ｐｈａｃｔｒ４  Ｖ２５３Ｌ：ＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲ
５．Ａｕｎｉｐ  Ｅ１６８Ｇ：ＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬ
６．Ｐｉｋ３ｃａ  Ｙ１４３Ｆ：ＱＧＫＹＩＬＫＶＣＧＣＤＥＹＦＬＥＫＦＰＬＳＱＹＫＹＩＲＳＣＩＭＬ
７．Ｇｐｎ２  Ｉ１５１Ｖ：ＫＦＩＳＶＬＣＴＳＬＡＴＭＬＨＶＥＬＰＨＶＮＬＬＳＫＭＤＬＩＥＨＹ
８．Ｅｎｇ  Ｉ２８６Ｖ：ＬＲＰＳＴＬＳＱＥＶＹＫＴＶＳＭＲＬＮＶＶＳＰＤＬＳＧＫＧＬＶＬＰ
９．Ｚｍｙｍ１  Ｐ１７２Ｓ：ＡＣＳＳＳＹＮＳＡＶＭＥＳＳＳＶＮＶＳＭＶＨＳＳＳＫＥＮＬＣＰＫＫ
１０．Ｓｅｍａ６ｄ  Ｖ２５５Ｍ：ＲＥＩＡＶＥＨＮＮＬＧＫＡＶＹＳＲＭＡＲＩＣＫＮＤＭＧＧＳＱＲＶＬ
１１．Ｕｂｒ１  Ｇ１４１２Ｓ：ＰＧＬＬＳＶＤＬＦＨＶＬＶＳＡＶＬＡＦＰＳＬＹＷＤＤＴＶＤＬＱＰＳ
１２．Ｚｇｒｆ１  Ｙ１６３８Ｃ：ＬＣＬＭＧＨＫＰＶＬＬＲＴＱＣＲＣＨＰＡＩＳＡＩＡＮＤＬＦＹＥＧＳ
１３．Ｃａｓｚ１  Ｌ１０８７Ｐ：ＴＳＡＡＥＴＫＰＰＬＡＰＳＳＰＰＡＰＰＧＴＭＶＡＧＳＳＬＥＧＰＡＰ
１４．Ａｄｇｒｂ２  Ｌ５７２Ｐ：ＲＳＬＱＥＬＬＡＲＲＴＹＹＳＧＤＰＬＦＳＶＤＩＬＲＮＶＴＤＴＦＫＲ
１５．Ｏｂｓｌ１  Ｔ１７６４Ｍ：ＧＧＨＶＣＷＭＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨ
１６．Ｄｈｒｓ９  Ｌ１４６Ｐ：ＥＰＩＥＶＮＬＦＧＬＩＮＶＴＰＮＭＬＰＬＶＫＫＡＲＧＲＶＩＮＶＳＳ
１７．Ｚｍｙｍ１  Ｔ４６６Ｒ：ＶＤＦＮＫＩＣＧＱＡＹＤＳＡＴＮＦＲＶＫＬＮＥＶＶＡＥＦＫＫＥＥＰ
１８．Ｎｒｐ２  Ｗ６６４Ｌ：ＮＣＮＦＤＦＰＥＥＴＣＧＷＶＹＤＨＡＫＬＬＲＳＴＷＩＳＳＡＮＰＮＤ
１９．Ａｂｈｄ１８  Ｓ２１０Ｃ：ＩＳＭＧＧＨＭＡＳＬＡＶＣＮＷＰＫＰＭＰＬＩＰＣＬＳＷＳＴＡＳＧＶ
２０．Ｆｏｃａｄ  Ｖ１３８８Ｍ：ＧＬＳＬＮＩＫＫＹＬＬＶＳＭＰＬＷＡＫＨＭＳＤＥＱＩＱＧＦＶＥＮＬ
４０−エピトーププラスミド：
２０の免疫原性エピトープ＋２０の非免疫原性エピトープ
１．Ｓｇｓｍ２  Ｖ６５６Ａ：ＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥ
２．Ｈｅｒｐｕｄ２  Ｖ８５Ｌ：ＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳ
３．Ｌｔａ４ｈ  Ｖ４６３Ａ：ＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶ
４．Ｐｈａｃｔｒ４  Ｖ２５３Ｌ：ＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲ
５．Ａｕｎｉｐ  Ｅ１６８Ｇ：ＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬ
６．Ｐｉｋ３ｃａ  Ｙ１４３Ｆ：ＱＧＫＹＩＬＫＶＣＧＣＤＥＹＦＬＥＫＦＰＬＳＱＹＫＹＩＲＳＣＩＭＬ
７．Ｇｐｎ２  Ｉ１５１Ｖ：ＫＦＩＳＶＬＣＴＳＬＡＴＭＬＨＶＥＬＰＨＶＮＬＬＳＫＭＤＬＩＥＨＹ
８．Ｅｎｇ  Ｉ２８６Ｖ：ＬＲＰＳＴＬＳＱＥＶＹＫＴＶＳＭＲＬＮＶＶＳＰＤＬＳＧＫＧＬＶＬＰ
９．Ｚｍｙｍ１  Ｐ１７２Ｓ：ＡＣＳＳＳＹＮＳＡＶＭＥＳＳＳＶＮＶＳＭＶＨＳＳＳＫＥＮＬＣＰＫＫ
１０．Ｓｅｍａ６ｄ  Ｖ２５５Ｍ：ＲＥＩＡＶＥＨＮＮＬＧＫＡＶＹＳＲＭＡＲＩＣＫＮＤＭＧＧＳＱＲＶＬ
１１．Ｕｂｒ１  Ｇ１４１２Ｓ：ＰＧＬＬＳＶＤＬＦＨＶＬＶＳＡＶＬＡＦＰＳＬＹＷＤＤＴＶＤＬＱＰＳ
１２．Ｚｇｒｆ１  Ｙ１６３８Ｃ：ＬＣＬＭＧＨＫＰＶＬＬＲＴＱＣＲＣＨＰＡＩＳＡＩＡＮＤＬＦＹＥＧＳ
１３．Ｃａｓｚ１  Ｌ１０８７Ｐ：ＴＳＡＡＥＴＫＰＰＬＡＰＳＳＰＰＡＰＰＧＴＭＶＡＧＳＳＬＥＧＰＡＰ
１４．Ａｄｇｒｂ２  Ｌ５７２Ｐ：ＲＳＬＱＥＬＬＡＲＲＴＹＹＳＧＤＰＬＦＳＶＤＩＬＲＮＶＴＤＴＦＫＲ
１５．Ｏｂｓｌ１  Ｔ１７６４Ｍ：ＧＧＨＶＣＷＭＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨ
１６．Ｄｈｒｓ９  Ｌ１４６Ｐ：ＥＰＩＥＶＮＬＦＧＬＩＮＶＴＰＮＭＬＰＬＶＫＫＡＲＧＲＶＩＮＶＳＳ
１７．Ｚｍｙｍ１  Ｔ４６６Ｒ：ＶＤＦＮＫＩＣＧＱＡＹＤＳＡＴＮＦＲＶＫＬＮＥＶＶＡＥＦＫＫＥＥＰ
１８．Ｎｒｐ２  Ｗ６６４Ｌ：ＮＣＮＦＤＦＰＥＥＴＣＧＷＶＹＤＨＡＫＬＬＲＳＴＷＩＳＳＡＮＰＮＤ
１９．Ａｂｈｄ１８  Ｓ２１０Ｃ：ＩＳＭＧＧＨＭＡＳＬＡＶＣＮＷＰＫＰＭＰＬＩＰＣＬＳＷＳＴＡＳＧＶ
２０．Ｆｏｃａｄ  Ｖ１３８８Ｍ：ＧＬＳＬＮＩＫＫＹＬＬＶＳＭＰＬＷＡＫＨＭＳＤＥＱＩＱＧＦＶＥＮＬ
非免疫原性エピトープ：
１．Ｈｄａｃ４  Ｗ１０２０Ｃ：ＡＮＡＶＨＳＭＥＫＶＭＤＩＨＳＫＹＣＲＣＬＱＲＬＳＳＴＶＧＨＳＬＩ（配列番号２１）
２．Ｇｍｐｐａ  Ｈ２４Ｙ：ＥＶＰＫＰＬＦＰＶＡＧＶＰＭＩＱＹＨＩＥＡＣＡＱＶＰＧＭＱＥＩＬＬ（配列番号２２）
３．Ｆｒａｓ１  Ｌ３１３５Ｐ：ＳＮＥＤＲＥＷＨＥＳＦＳＬＶＬＧＰＤＤＰＶＥＡＶＬＧＤＶＴＴＡＴＶ（配列番号２３）
４．Ｐａｄｉ３  Ｌ１９３Ｐ：ＭＳＶＭＶＬＲＴＱＧＰＥＡＰＦＥＤＨＲＬＩＬＨＴＳＳＣＤＡＥＲＡＲ（配列番号２４）
５．Ｐｄｉａ３  Ｙ２６４Ｃ：ＣＰＨＭＴＥＤＮＫＤＬＩＱＧＫＤＬＬＴＡＣＹＤＶＤＹＥＫＮＡＫＧＳ（配列番号２５）
６．Ｐｎｉｓｒ  Ｒ４７６Ｇ：ＴＲＧＬＡＹＬＨＴＥＬＰＱＧＤＨＹＫＰＡＩＳＨＲＤＬＮＳＲＮＶＬＶ（配列番号２６）
７．Ｃａｐｇ  Ｆ１６７Ｌ：ＩＨＲＥＱＮＳＬＳＬＬＥＡＳＥＡＤＧＤＡＶＮＤＫＫＲＴＰＮＥＡＰＳ（配列番号２７）
８．Ｓｐｅｎ  Ｎ２０６６Ｓ：ＥＰＫＲＤＲＲＤＰＳＴＤＫＳＧＰＤＴＦＰＶＥＶＬＥＲＫＰＰＥＫＴＹ（配列番号２８）
９．Ｕｓｐ２１  Ｖ２２９Ｍ：ＳＧＨＶＧＬＲＮＬＧＮＴＬＰＱＣＦＬＮＡＭＬＱＣＬＳＳＴＲＰＬＲＤ（配列番号２９）
１０．Ｃｌｓｐｎ  Ａ１０１Ｖ：ＡＥＤＴＱＥＮＬＨＳＧＫＳＱＳＲＳＦＰＫＶＬＡＤＳＤＥＳＤＭＥＥＴ（配列番号３０）
１１．Ｎｃｋａｐ１  Ｋ３４４Ｔ：ＥＣＫＥＡＡＶＳＨＡＧＳＭＨＲＥＲＲＴＦＬＲＳＡＬＫＥＬＡＴＶＬＳ（配列番号３１）
１２．Ｍａｐ７ｄ１  Ｒ５７７Ｗ：ＲＭＲＥＥＱＬＡＲＥＡＥＡＷＡＥＲＥＡＥＡＲＲＲＥＥＱＥＡＲＥＫＡ（配列番号３２）
１３．Ｃ７７０８０  Ｓ７７０Ａ：ＬＳＱＴＰＰＰＡＰＰＰＳＡＧＳＥＰＬＡＲＬＰＱＫＤＳＶＧＫＨＳＧＡ（配列番号３３）
１４．Ｓｔａｒｄ９  Ｒ１６８６Ｍ：ＮＴＱＩＱＫＬＴＧＳＰＦＲＳＲＥＹＶＱＴＭＥＳＥＳＥＨＳＹＰＰＰＧ（配列番号３４）
１５．Ｗｄｒ３７  Ｈ１１０Ｙ：ＴＴＴＳＲＡＩＣＱＬＶＫＥＹＩＧＹＲＤＧＩＷＤＶＳＶＴＲＴＱＰＩＶ（配列番号３５）
１６．Ｆａｍ１６０ｂ２  Ｓ５７５Ｒ：ＮＧＹＤＴＹＶＨＤＡＹＧＬＦＱＥＣＲＳＲＶＡＨＷＧＷＰＬＧＰＡＰＬ（配列番号３６）
１７．Ｍｂ２１ｄ１  Ｙ３４６Ｓ：ＩＱＧＷＬＧＴＫＶＲＴＮＬＲＲＥＰＦＳＬＶＰＫＮＡＫＤＧＮＳＦＱＧ（配列番号３７）
１８．Ｐｙｒｏｘｄ２  Ｖ４８３Ｌ：ＧＧＫＶＷＮＥＱＥＫＮＴＹＡＤＫＬＦＤＣＩＥＡＹＡＰＧＦＫＲＳＶＬ（配列番号３８）
１９．Ｊｍｊｄ１ｃ  Ｌ１７１５Ｐ：ＷＭＫＣＶＫＧＱＰＨＤＨＫＨＬＭＰＴＱＩＩＰＧＳＶＬＴＤＬＬＤＡＭ（配列番号３９）
２０．Ｓｍｅｋ１  Ｅ６６５Ｋ：ＳＩＬＲＮＨＲＹＲＲＤＡＲＴＬＥＤＫＥＥＭＷＦＮＴＤＥＤＤＭＥＤＧ（配列番号４０）
プラスミドにコードされているアミノ酸配列の全長を以下に示す。
＊＊は終止コドンを示し、「＊＊」の後に配列番号が表示されている場合でも、各配列識別子に含めるべきではない。
１０−エピトープＳｇｓｍ２位置１：
ＭＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥＲＧＲＫＲＲＳＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳＲＧＲＫＲＲＳＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶＲＧＲＫＲＲＳＡＣＳＳＳＹＮＳＡＶＭＥＳＳＳＶＮＶＳＭＶＨＳＳＳＫＥＮＬＣＰＫＫＲＧＲＫＲＲＳＰＧＬＬＳＶＤＬＦＨＶＬＶＳＡＶＬＡＦＰＳＬＹＷＤＤＴＶＤＬＱＰＳＲＧＲＫＲＲＳＧＧＨＶＣＷＭＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨＲＧＲＫＲＲＳＥＰＩＥＶＮＬＦＧＬＩＮＶＴＰＮＭＬＰＬＶＫＫＡＲＧＲＶＩＮＶＳＳＲＧＲＫＲＲＳＶＤＦＮＫＩＣＧＱＡＹＤＳＡＴＮＦＲＶＫＬＮＥＶＶＡＥＦＫＫＥＥＰＲＧＲＫＲＲＳＮＣＮＦＤＦＰＥＥＴＣＧＷＶＹＤＨＡＫＬＬＲＳＴＷＩＳＳＡＮＰＮＤＲＧＲＫＲＲＳＩＳＭＧＧＨＭＡＳＬＡＶＣＮＷＰＫＰＭＰＬＩＰＣＬＳＷＳＴＡＳＧＶ＊＊（配列番号：４２）
１０−エピトープＳｇｓｍ２位置１０：
ＭＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳＲＧＲＫＲＲＳＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶＲＧＲＫＲＲＳＡＣＳＳＳＹＮＳＡＶＭＥＳＳＳＶＮＶＳＭＶＨＳＳＳＫＥＮＬＣＰＫＫＲＧＲＫＲＲＳＰＧＬＬＳＶＤＬＦＨＶＬＶＳＡＶＬＡＦＰＳＬＹＷＤＤＴＶＤＬＱＰＳＲＧＲＫＲＲＳＧＧＨＶＣＷＭＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨＲＧＲＫＲＲＳＥＰＩＥＶＮＬＦＧＬＩＮＶＴＰＮＭＬＰＬＶＫＫＡＲＧＲＶＩＮＶＳＳＲＧＲＫＲＲＳＶＤＦＮＫＩＣＧＱＡＹＤＳＡＴＮＦＲＶＫＬＮＥＶＶＡＥＦＫＫＥＥＰＲＧＲＫＲＲＳＮＣＮＦＤＦＰＥＥＴＣＧＷＶＹＤＨＡＫＬＬＲＳＴＷＩＳＳＡＮＰＮＤＲＧＲＫＲＲＳＩＳＭＧＧＨＭＡＳＬＡＶＣＮＷＰＫＰＭＰＬＩＰＣＬＳＷＳＴＡＳＧＶＲＧＲＫＲＲＳＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥ＊＊（配列番号：４３）
２０−エピトープＳｇｓｍ２位置１：
ＭＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥＲＧＲＫＲＲＳＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳＲＧＲＫＲＲＳＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶＲＧＲＫＲＲＳＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲＲＧＲＫＲＲＳＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬＲＧＲＫＲＲＳＱＧＫＹＩＬＫＶＣＧＣＤＥＹＦＬＥＫＦＰＬＳＱＹＫＹＩＲＳＣＩＭＬＲＧＲＫＲＲＳＫＦＩＳＶＬＣＴＳＬＡＴＭＬＨＶＥＬＰＨＶＮＬＬＳＫＭＤＬＩＥＨＹＲＧＲＫＲＲＳＬＲＰＳＴＬＳＱＥＶＹＫＴＶＳＭＲＬＮＶＶＳＰＤＬＳＧＫＧＬＶＬＰＲＧＲＫＲＲＳＡＣＳＳＳＹＮＳＡＶＭＥＳＳＳＶＮＶＳＭＶＨＳＳＳＫＥＮＬＣＰＫＫＲＧＲＫＲＲＳＲＥＩＡＶＥＨＮＮＬＧＫＡＶＹＳＲＭＡＲＩＣＫＮＤＭＧＧＳＱＲＶＬＲＧＲＫＲＲＳＰＧＬＬＳＶＤＬＦＨＶＬＶＳＡＶＬＡＦＰＳＬＹＷＤＤＴＶＤＬＱＰＳＲＧＲＫＲＲＳＬＣＬＭＧＨＫＰＶＬＬＲＴＱＣＲＣＨＰＡＩＳＡＩＡＮＤＬＦＹＥＧＳＲＧＲＫＲＲＳＴＳＡＡＥＴＫＰＰＬＡＰＳＳＰＰＡＰＰＧＴＭＶＡＧＳＳＬＥＧＰＡＰＲＧＲＫＲＲＳＲＳＬＱＥＬＬＡＲＲＴＹＹＳＧＤＰＬＦＳＶＤＩＬＲＮＶＴＤＴＦＫＲＲＧＲＫＲＲＳＧＧＨＶＣＷＭＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨＲＧＲＫＲＲＳＥＰＩＥＶＮＬＦＧＬＩＮＶＴＰＮＭＬＰＬＶＫＫＡＲＧＲＶＩＮＶＳＳＲＧＲＫＲＲＳＶＤＦＮＫＩＣＧＱＡＹＤＳＡＴＮＦＲＶＫＬＮＥＶＶＡＥＦＫＫＥＥＰＲＧＲＫＲＲＳＮＣＮＦＤＦＰＥＥＴＣＧＷＶＹＤＨＡＫＬＬＲＳＴＷＩＳＳＡＮＰＮＤＲＧＲＫＲＲＳＩＳＭＧＧＨＭＡＳＬＡＶＣＮＷＰＫＰＭＰＬＩＰＣＬＳＷＳＴＡＳＧＶＲＧＲＫＲＲＳＧＬＳＬＮＩＫＫＹＬＬＶＳＭＰＬＷＡＫＨＭＳＤＥＱＩＱＧＦＶＥＮＬ＊＊（配列番号：４４）
２０−エピトープＳｇｓｍ２位置１０：
ＭＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳＲＧＲＫＲＲＳＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶＲＧＲＫＲＲＳＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲＲＧＲＫＲＲＳＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬＲＧＲＫＲＲＳＱＧＫＹＩＬＫＶＣＧＣＤＥＹＦＬＥＫＦＰＬＳＱＹＫＹＩＲＳＣＩＭＬＲＧＲＫＲＲＳＫＦＩＳＶＬＣＴＳＬＡＴＭＬＨＶＥＬＰＨＶＮＬＬＳＫＭＤＬＩＥＨＹＲＧＲＫＲＲＳＬＲＰＳＴＬＳＱＥＶＹＫＴＶＳＭＲＬＮＶＶＳＰＤＬＳＧＫＧＬＶＬＰＲＧＲＫＲＲＳＡＣＳＳＳＹＮＳＡＶＭＥＳＳＳＶＮＶＳＭＶＨＳＳＳＫＥＮＬＣＰＫＫＲＧＲＫＲＲＳＲＥＩＡＶＥＨＮＮＬＧＫＡＶＹＳＲＭＡＲＩＣＫＮＤＭＧＧＳＱＲＶＬＲＧＲＫＲＲＳＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥＲＧＲＫＲＲＳＰＧＬＬＳＶＤＬＦＨＶＬＶＳＡＶＬＡＦＰＳＬＹＷＤＤＴＶＤＬＱＰＳＲＧＲＫＲＲＳＬＣＬＭＧＨＫＰＶＬＬＲＴＱＣＲＣＨＰＡＩＳＡＩＡＮＤＬＦＹＥＧＳＲＧＲＫＲＲＳＴＳＡＡＥＴＫＰＰＬＡＰＳＳＰＰＡＰＰＧＴＭＶＡＧＳＳＬＥＧＰＡＰＲＧＲＫＲＲＳＲＳＬＱＥＬＬＡＲＲＴＹＹＳＧＤＰＬＦＳＶＤＩＬＲＮＶＴＤＴＦＫＲＲＧＲＫＲＲＳＧＧＨＶＣＷＭＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨＲＧＲＫＲＲＳＥＰＩＥＶＮＬＦＧＬＩＮＶＴＰＮＭＬＰＬＶＫＫＡＲＧＲＶＩＮＶＳＳＲＧＲＫＲＲＳＶＤＦＮＫＩＣＧＱＡＹＤＳＡＴＮＦＲＶＫＬＮＥＶＶＡＥＦＫＫＥＥＰＲＧＲＫＲＲＳＮＣＮＦＤＦＰＥＥＴＣＧＷＶＹＤＨＡＫＬＬＲＳＴＷＩＳＳＡＮＰＮＤＲＧＲＫＲＲＳＩＳＭＧＧＨＭＡＳＬＡＶＣＮＷＰＫＰＭＰＬＩＰＣＬＳＷＳＴＡＳＧＶＲＧＲＫＲＲＳＧＬＳＬＮＩＫＫＹＬＬＶＳＭＰＬＷＡＫＨＭＳＤＥＱＩＱＧＦＶＥＮＬ＊＊（配列番号：４５）
２０−エピトープＳｇｓｍ２位置２０：
ＭＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳＲＧＲＫＲＲＳＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶＲＧＲＫＲＲＳＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲＲＧＲＫＲＲＳＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬＲＧＲＫＲＲＳＱＧＫＹＩＬＫＶＣＧＣＤＥＹＦＬＥＫＦＰＬＳＱＹＫＹＩＲＳＣＩＭＬＲＧＲＫＲＲＳＫＦＩＳＶＬＣＴＳＬＡＴＭＬＨＶＥＬＰＨＶＮＬＬＳＫＭＤＬＩＥＨＹＲＧＲＫＲＲＳＬＲＰＳＴＬＳＱＥＶＹＫＴＶＳＭＲＬＮＶＶＳＰＤＬＳＧＫＧＬＶＬＰＲＧＲＫＲＲＳＡＣＳＳＳＹＮＳＡＶＭＥＳＳＳＶＮＶＳＭＶＨＳＳＳＫＥＮＬＣＰＫＫＲＧＲＫＲＲＳＲＥＩＡＶＥＨＮＮＬＧＫＡＶＹＳＲＭＡＲＩＣＫＮＤＭＧＧＳＱＲＶＬＲＧＲＫＲＲＳＰＧＬＬＳＶＤＬＦＨＶＬＶＳＡＶＬＡＦＰＳＬＹＷＤＤＴＶＤＬＱＰＳＲＧＲＫＲＲＳＬＣＬＭＧＨＫＰＶＬＬＲＴＱＣＲＣＨＰＡＩＳＡＩＡＮＤＬＦＹＥＧＳＲＧＲＫＲＲＳＴＳＡＡＥＴＫＰＰＬＡＰＳＳＰＰＡＰＰＧＴＭＶＡＧＳＳＬＥＧＰＡＰＲＧＲＫＲＲＳＲＳＬＱＥＬＬＡＲＲＴＹＹＳＧＤＰＬＦＳＶＤＩＬＲＮＶＴＤＴＦＫＲＲＧＲＫＲＲＳＧＧＨＶＣＷＭＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨＲＧＲＫＲＲＳＥＰＩＥＶＮＬＦＧＬＩＮＶＴＰＮＭＬＰＬＶＫＫＡＲＧＲＶＩＮＶＳＳＲＧＲＫＲＲＳＶＤＦＮＫＩＣＧＱＡＹＤＳＡＴＮＦＲＶＫＬＮＥＶＶＡＥＦＫＫＥＥＰＲＧＲＫＲＲＳＮＣＮＦＤＦＰＥＥＴＣＧＷＶＹＤＨＡＫＬＬＲＳＴＷＩＳＳＡＮＰＮＤＲＧＲＫＲＲＳＩＳＭＧＧＨＭＡＳＬＡＶＣＮＷＰＫＰＭＰＬＩＰＣＬＳＷＳＴＡＳＧＶＲＧＲＫＲＲＳＧＬＳＬＮＩＫＫＹＬＬＶＳＭＰＬＷＡＫＨＭＳＤＥＱＩＱＧＦＶＥＮＬＲＧＲＫＲＲＳＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥ＊＊（配列番号：４６）
４０−エピトープＳｇｓｍ２位置１：
ＭＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥＲＧＲＫＲＲＳＡＮＡＶＨＳＭＥＫＶＭＤＩＨＳＫＹＣＲＣＬＱＲＬＳＳＴＶＧＨＳＬＩＲＧＲＫＲＲＳＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳＲＧＲＫＲＲＳＥＶＰＫＰＬＦＰＶＡＧＶＰＭＩＱＹＨＩＥＡＣＡＱＶＰＧＭＱＥＩＬＬＲＧＲＫＲＲＳＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶＲＧＲＫＲＲＳＳＮＥＤＲＥＷＨＥＳＦＳＬＶＬＧＰＤＤＰＶＥＡＶＬＧＤＶＴＴＡＴＶＲＧＲＫＲＲＳＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲＲＧＲＫＲＲＳＭＳＶＭＶＬＲＴＱＧＰＥＡＰＦＥＤＨＲＬＩＬＨＴＳＳＣＤＡＥＲＡＲＲＧＲＫＲＲＳＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬＲＧＲＫＲＲＳＣＰＨＭＴＥＤＮＫＤＬＩＱＧＫＤＬＬＴＡＣＹＤＶＤＹＥＫＮＡＫＧＳＲＧＲＫＲＲＳＱＧＫＹＩＬＫＶＣＧＣＤＥＹＦＬＥＫＦＰＬＳＱＹＫＹＩＲＳＣＩＭＬＲＧＲＫＲＲＳＴＲＧＬＡＹＬＨＴＥＬＰＱＧＤＨＹＫＰＡＩＳＨＲＤＬＮＳＲＮＶＬＶＲＧＲＫＲＲＳＫＦＩＳＶＬＣＴＳＬＡＴＭＬＨＶＥＬＰＨＶＮＬＬＳＫＭＤＬＩＥＨＹＲＧＲＫＲＲＳＩＨＲＥＱＮＳＬＳＬＬＥＡＳＥＡＤＧＤＡＶＮＤＫＫＲＴＰＮＥＡＰＳＲＧＲＫＲＲＳＬＲＰＳＴＬＳＱＥＶＹＫＴＶＳＭＲＬＮＶＶＳＰＤＬＳＧＫＧＬＶＬＰＲＧＲＫＲＲＳＥＰＫＲＤＲＲＤＰＳＴＤＫＳＧＰＤＴＦＰＶＥＶＬＥＲＫＰＰＥＫＴＹＲＧＲＫＲＲＳＡＣＳＳＳＹＮＳＡＶＭＥＳＳＳＶＮＶＳＭＶＨＳＳＳＫＥＮＬＣＰＫＫＲＧＲＫＲＲＳＳＧＨＶＧＬＲＮＬＧＮＴＬＰＱＣＦＬＮＡＭＬＱＣＬＳＳＴＲＰＬＲＤＲＧＲＫＲＲＳＲＥＩＡＶＥＨＮＮＬＧＫＡＶＹＳＲＭＡＲＩＣＫＮＤＭＧＧＳＱＲＶＬＲＧＲＫＲＲＳＡＥＤＴＱＥＮＬＨＳＧＫＳＱＳＲＳＦＰＫＶＬＡＤＳＤＥＳＤＭＥＥＴＲＧＲＫＲＲＳＰＧＬＬＳＶＤＬＦＨＶＬＶＳＡＶＬＡＦＰＳＬＹＷＤＤＴＶＤＬＱＰＳＲＧＲＫＲＲＳＥＣＫＥＡＡＶＳＨＡＧＳＭＨＲＥＲＲＴＦＬＲＳＡＬＫＥＬＡＴＶＬＳＲＧＲＫＲＲＳＬＣＬＭＧＨＫＰＶＬＬＲＴＱＣＲＣＨＰＡＩＳＡＩＡＮＤＬＦＹＥＧＳＲＧＲＫＲＲＳＲＭＲＥＥＱＬＡＲＥＡＥＡＷＡＥＲＥＡＥＡＲＲＲＥＥＱＥＡＲＥＫＡＲＧＲＫＲＲＳＴＳＡＡＥＴＫＰＰＬＡＰＳＳＰＰＡＰＰＧＴＭＶＡＧＳＳＬＥＧＰＡＰＲＧＲＫＲＲＳＬＳＱＴＰＰＰＡＰＰＰＳＡＧＳＥＰＬＡＲＬＰＱＫＤＳＶＧＫＨＳＧＡＲＧＲＫＲＲＳＲＳＬＱＥＬＬＡＲＲＴＹＹＳＧＤＰＬＦＳＶＤＩＬＲＮＶＴＤＴＦＫＲＲＧＲＫＲＲＳＮＴＱＩＱＫＬＴＧＳＰＦＲＳＲＥＹＶＱＴＭＥＳＥＳＥＨＳＹＰＰＰＧＲＧＲＫＲＲＳＧＧＨＶＣＷＭＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨＲＧＲＫＲＲＳＴＴＴＳＲＡＩＣＱＬＶＫＥＹＩＧＹＲＤＧＩＷＤＶＳＶＴＲＴＱＰＩＶＲＧＲＫＲＲＳＥＰＩＥＶＮＬＦＧＬＩＮＶＴＰＮＭＬＰＬＶＫＫＡＲＧＲＶＩＮＶＳＳＲＧＲＫＲＲＳＮＧＹＤＴＹＶＨＤＡＹＧＬＦＱＥＣＲＳＲＶＡＨＷＧＷＰＬＧＰＡＰＬＲＧＲＫＲＲＳＶＤＦＮＫＩＣＧＱＡＹＤＳＡＴＮＦＲＶＫＬＮＥＶＶＡＥＦＫＫＥＥＰＲＧＲＫＲＲＳＩＱＧＷＬＧＴＫＶＲＴＮＬＲＲＥＰＦＳＬＶＰＫＮＡＫＤＧＮＳＦＱＧＲＧＲＫＲＲＳＮＣＮＦＤＦＰＥＥＴＣＧＷＶＹＤＨＡＫＬＬＲＳＴＷＩＳＳＡＮＰＮＤＲＧＲＫＲＲＳＧＧＫＶＷＮＥＱＥＫＮＴＹＡＤＫＬＦＤＣＩＥＡＹＡＰＧＦＫＲＳＶＬＲＧＲＫＲＲＳＩＳＭＧＧＨＭＡＳＬＡＶＣＮＷＰＫＰＭＰＬＩＰＣＬＳＷＳＴＡＳＧＶＲＧＲＫＲＲＳＷＭＫＣＶＫＧＱＰＨＤＨＫＨＬＭＰＴＱＩＩＰＧＳＶＬＴＤＬＬＤＡＭＲＧＲＫＲＲＳＧＬＳＬＮＩＫＫＹＬＬＶＳＭＰＬＷＡＫＨＭＳＤＥＱＩＱＧＦＶＥＮＬＲＧＲＫＲＲＳＳＩＬＲＮＨＲＹＲＲＤＡＲＴＬＥＤＫＥＥＭＷＦＮＴＤＥＤＤＭＥＤＧ＊＊（配列番号：４７）
４０−エピトープＳｇｓｍ２位置１０：
ＭＡＮＡＶＨＳＭＥＫＶＭＤＩＨＳＫＹＣＲＣＬＱＲＬＳＳＴＶＧＨＳＬＩＲＧＲＫＲＲＳＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳＲＧＲＫＲＲＳＥＶＰＫＰＬＦＰＶＡＧＶＰＭＩＱＹＨＩＥＡＣＡＱＶＰＧＭＱＥＩＬＬＲＧＲＫＲＲＳＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶＲＧＲＫＲＲＳＳＮＥＤＲＥＷＨＥＳＦＳＬＶＬＧＰＤＤＰＶＥＡＶＬＧＤＶＴＴＡＴＶＲＧＲＫＲＲＳＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲＲＧＲＫＲＲＳＭＳＶＭＶＬＲＴＱＧＰＥＡＰＦＥＤＨＲＬＩＬＨＴＳＳＣＤＡＥＲＡＲＲＧＲＫＲＲＳＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬＲＧＲＫＲＲＳＣＰＨＭＴＥＤＮＫＤＬＩＱＧＫＤＬＬＴＡＣＹＤＶＤＹＥＫＮＡＫＧＳＲＧＲＫＲＲＳＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥＲＧＲＫＲＲＳＱＧＫＹＩＬＫＶＣＧＣＤＥＹＦＬＥＫＦＰＬＳＱＹＫＹＩＲＳＣＩＭＬＲＧＲＫＲＲＳＴＲＧＬＡＹＬＨＴＥＬＰＱＧＤＨＹＫＰＡＩＳＨＲＤＬＮＳＲＮＶＬＶＲＧＲＫＲＲＳＫＦＩＳＶＬＣＴＳＬＡＴＭＬＨＶＥＬＰＨＶＮＬＬＳＫＭＤＬＩＥＨＹＲＧＲＫＲＲＳＩＨＲＥＱＮＳＬＳＬＬＥＡＳＥＡＤＧＤＡＶＮＤＫＫＲＴＰＮＥＡＰＳＲＧＲＫＲＲＳＬＲＰＳＴＬＳＱＥＶＹＫＴＶＳＭＲＬＮＶＶＳＰＤＬＳＧＫＧＬＶＬＰＲＧＲＫＲＲＳＥＰＫＲＤＲＲＤＰＳＴＤＫＳＧＰＤＴＦＰＶＥＶＬＥＲＫＰＰＥＫＴＹＲＧＲＫＲＲＳＡＣＳＳＳＹＮＳＡＶＭＥＳＳＳＶＮＶＳＭＶＨＳＳＳＫＥＮＬＣＰＫＫＲＧＲＫＲＲＳＳＧＨＶＧＬＲＮＬＧＮＴＬＰＱＣＦＬＮＡＭＬＱＣＬＳＳＴＲＰＬＲＤＲＧＲＫＲＲＳＲＥＩＡＶＥＨＮＮＬＧＫＡＶＹＳＲＭＡＲＩＣＫＮＤＭＧＧＳＱＲＶＬＲＧＲＫＲＲＳＡＥＤＴＱＥＮＬＨＳＧＫＳＱＳＲＳＦＰＫＶＬＡＤＳＤＥＳＤＭＥＥＴＲＧＲＫＲＲＳＰＧＬＬＳＶＤＬＦＨＶＬＶＳＡＶＬＡＦＰＳＬＹＷＤＤＴＶＤＬＱＰＳＲＧＲＫＲＲＳＥＣＫＥＡＡＶＳＨＡＧＳＭＨＲＥＲＲＴＦＬＲＳＡＬＫＥＬＡＴＶＬＳＲＧＲＫＲＲＳＬＣＬＭＧＨＫＰＶＬＬＲＴＱＣＲＣＨＰＡＩＳＡＩＡＮＤＬＦＹＥＧＳＲＧＲＫＲＲＳＲＭＲＥＥＱＬＡＲＥＡＥＡＷＡＥＲＥＡＥＡＲＲＲＥＥＱＥＡＲＥＫＡＲＧＲＫＲＲＳＴＳＡＡＥＴＫＰＰＬＡＰＳＳＰＰＡＰＰＧＴＭＶＡＧＳＳＬＥＧＰＡＰＲＧＲＫＲＲＳＬＳＱＴＰＰＰＡＰＰＰＳＡＧＳＥＰＬＡＲＬＰＱＫＤＳＶＧＫＨＳＧＡＲＧＲＫＲＲＳＲＳＬＱＥＬＬＡＲＲＴＹＹＳＧＤＰＬＦＳＶＤＩＬＲＮＶＴＤＴＦＫＲＲＧＲＫＲＲＳＮＴＱＩＱＫＬＴＧＳＰＦＲＳＲＥＹＶＱＴＭＥＳＥＳＥＨＳＹＰＰＰＧＲＧＲＫＲＲＳＧＧＨＶＣＷＭＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨＲＧＲＫＲＲＳＴＴＴＳＲＡＩＣＱＬＶＫＥＹＩＧＹＲＤＧＩＷＤＶＳＶＴＲＴＱＰＩＶＲＧＲＫＲＲＳＥＰＩＥＶＮＬＦＧＬＩＮＶＴＰＮＭＬＰＬＶＫＫＡＲＧＲＶＩＮＶＳＳＲＧＲＫＲＲＳＮＧＹＤＴＹＶＨＤＡＹＧＬＦＱＥＣＲＳＲＶＡＨＷＧＷＰＬＧＰＡＰＬＲＧＲＫＲＲＳＶＤＦＮＫＩＣＧＱＡＹＤＳＡＴＮＦＲＶＫＬＮＥＶＶＡＥＦＫＫＥＥＰＲＧＲＫＲＲＳＩＱＧＷＬＧＴＫＶＲＴＮＬＲＲＥＰＦＳＬＶＰＫＮＡＫＤＧＮＳＦＱＧＲＧＲＫＲＲＳＮＣＮＦＤＦＰＥＥＴＣＧＷＶＹＤＨＡＫＬＬＲＳＴＷＩＳＳＡＮＰＮＤＲＧＲＫＲＲＳＧＧＫＶＷＮＥＱＥＫＮＴＹＡＤＫＬＦＤＣＩＥＡＹＡＰＧＦＫＲＳＶＬＲＧＲＫＲＲＳＩＳＭＧＧＨＭＡＳＬＡＶＣＮＷＰＫＰＭＰＬＩＰＣＬＳＷＳＴＡＳＧＶＲＧＲＫＲＲＳＷＭＫＣＶＫＧＱＰＨＤＨＫＨＬＭＰＴＱＩＩＰＧＳＶＬＴＤＬＬＤＡＭＲＧＲＫＲＲＳＧＬＳＬＮＩＫＫＹＬＬＶＳＭＰＬＷＡＫＨＭＳＤＥＱＩＱＧＦＶＥＮＬＲＧＲＫＲＲＳＳＩＬＲＮＨＲＹＲＲＤＡＲＴＬＥＤＫＥＥＭＷＦＮＴＤＥＤＤＭＥＤＧ＊＊（配列番号：４８）
４０−エピトープＳｇｓｍ２位置２０：
ＭＡＮＡＶＨＳＭＥＫＶＭＤＩＨＳＫＹＣＲＣＬＱＲＬＳＳＴＶＧＨＳＬＩＲＧＲＫＲＲＳＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳＲＧＲＫＲＲＳＥＶＰＫＰＬＦＰＶＡＧＶＰＭＩＱＹＨＩＥＡＣＡＱＶＰＧＭＱＥＩＬＬＲＧＲＫＲＲＳＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶＲＧＲＫＲＲＳＳＮＥＤＲＥＷＨＥＳＦＳＬＶＬＧＰＤＤＰＶＥＡＶＬＧＤＶＴＴＡＴＶＲＧＲＫＲＲＳＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲＲＧＲＫＲＲＳＭＳＶＭＶＬＲＴＱＧＰＥＡＰＦＥＤＨＲＬＩＬＨＴＳＳＣＤＡＥＲＡＲＲＧＲＫＲＲＳＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬＲＧＲＫＲＲＳＣＰＨＭＴＥＤＮＫＤＬＩＱＧＫＤＬＬＴＡＣＹＤＶＤＹＥＫＮＡＫＧＳＲＧＲＫＲＲＳＱＧＫＹＩＬＫＶＣＧＣＤＥＹＦＬＥＫＦＰＬＳＱＹＫＹＩＲＳＣＩＭＬＲＧＲＫＲＲＳＴＲＧＬＡＹＬＨＴＥＬＰＱＧＤＨＹＫＰＡＩＳＨＲＤＬＮＳＲＮＶＬＶＲＧＲＫＲＲＳＫＦＩＳＶＬＣＴＳＬＡＴＭＬＨＶＥＬＰＨＶＮＬＬＳＫＭＤＬＩＥＨＹＲＧＲＫＲＲＳＩＨＲＥＱＮＳＬＳＬＬＥＡＳＥＡＤＧＤＡＶＮＤＫＫＲＴＰＮＥＡＰＳＲＧＲＫＲＲＳＬＲＰＳＴＬＳＱＥＶＹＫＴＶＳＭＲＬＮＶＶＳＰＤＬＳＧＫＧＬＶＬＰＲＧＲＫＲＲＳＥＰＫＲＤＲＲＤＰＳＴＤＫＳＧＰＤＴＦＰＶＥＶＬＥＲＫＰＰＥＫＴＹＲＧＲＫＲＲＳＡＣＳＳＳＹＮＳＡＶＭＥＳＳＳＶＮＶＳＭＶＨＳＳＳＫＥＮＬＣＰＫＫＲＧＲＫＲＲＳＳＧＨＶＧＬＲＮＬＧＮＴＬＰＱＣＦＬＮＡＭＬＱＣＬＳＳＴＲＰＬＲＤＲＧＲＫＲＲＳＲＥＩＡＶＥＨＮＮＬＧＫＡＶＹＳＲＭＡＲＩＣＫＮＤＭＧＧＳＱＲＶＬＲＧＲＫＲＲＳＡＥＤＴＱＥＮＬＨＳＧＫＳＱＳＲＳＦＰＫＶＬＡＤＳＤＥＳＤＭＥＥＴＲＧＲＫＲＲＳＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥＲＧＲＫＲＲＳＰＧＬＬＳＶＤＬＦＨＶＬＶＳＡＶＬＡＦＰＳＬＹＷＤＤＴＶＤＬＱＰＳＲＧＲＫＲＲＳＥＣＫＥＡＡＶＳＨＡＧＳＭＨＲＥＲＲＴＦＬＲＳＡＬＫＥＬＡＴＶＬＳＲＧＲＫＲＲＳＬＣＬＭＧＨＫＰＶＬＬＲＴＱＣＲＣＨＰＡＩＳＡＩＡＮＤＬＦＹＥＧＳＲＧＲＫＲＲＳＲＭＲＥＥＱＬＡＲＥＡＥＡＷＡＥＲＥＡＥＡＲＲＲＥＥＱＥＡＲＥＫＡＲＧＲＫＲＲＳＴＳＡＡＥＴＫＰＰＬＡＰＳＳＰＰＡＰＰＧＴＭＶＡＧＳＳＬＥＧＰＡＰＲＧＲＫＲＲＳＬＳＱＴＰＰＰＡＰＰＰＳＡＧＳＥＰＬＡＲＬＰＱＫＤＳＶＧＫＨＳＧＡＲＧＲＫＲＲＳＲＳＬＱＥＬＬＡＲＲＴＹＹＳＧＤＰＬＦＳＶＤＩＬＲＮＶＴＤＴＦＫＲＲＧＲＫＲＲＳＮＴＱＩＱＫＬＴＧＳＰＦＲＳＲＥＹＶＱＴＭＥＳＥＳＥＨＳＹＰＰＰＧＲＧＲＫＲＲＳＧＧＨＶＣＷＭＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨＲＧＲＫＲＲＳＴＴＴＳＲＡＩＣＱＬＶＫＥＹＩＧＹＲＤＧＩＷＤＶＳＶＴＲＴＱＰＩＶＲＧＲＫＲＲＳＥＰＩＥＶＮＬＦＧＬＩＮＶＴＰＮＭＬＰＬＶＫＫＡＲＧＲＶＩＮＶＳＳＲＧＲＫＲＲＳＮＧＹＤＴＹＶＨＤＡＹＧＬＦＱＥＣＲＳＲＶＡＨＷＧＷＰＬＧＰＡＰＬＲＧＲＫＲＲＳＶＤＦＮＫＩＣＧＱＡＹＤＳＡＴＮＦＲＶＫＬＮＥＶＶＡＥＦＫＫＥＥＰＲＧＲＫＲＲＳＩＱＧＷＬＧＴＫＶＲＴＮＬＲＲＥＰＦＳＬＶＰＫＮＡＫＤＧＮＳＦＱＧＲＧＲＫＲＲＳＮＣＮＦＤＦＰＥＥＴＣＧＷＶＹＤＨＡＫＬＬＲＳＴＷＩＳＳＡＮＰＮＤＲＧＲＫＲＲＳＧＧＫＶＷＮＥＱＥＫＮＴＹＡＤＫＬＦＤＣＩＥＡＹＡＰＧＦＫＲＳＶＬＲＧＲＫＲＲＳＩＳＭＧＧＨＭＡＳＬＡＶＣＮＷＰＫＰＭＰＬＩＰＣＬＳＷＳＴＡＳＧＶＲＧＲＫＲＲＳＷＭＫＣＶＫＧＱＰＨＤＨＫＨＬＭＰＴＱＩＩＰＧＳＶＬＴＤＬＬＤＡＭＲＧＲＫＲＲＳＧＬＳＬＮＩＫＫＹＬＬＶＳＭＰＬＷＡＫＨＭＳＤＥＱＩＱＧＦＶＥＮＬＲＧＲＫＲＲＳＳＩＬＲＮＨＲＹＲＲＤＡＲＴＬＥＤＫＥＥＭＷＦＮＴＤＥＤＤＭＥＤＧ＊＊（配列番号：４９）
４０−エピトープＳｇｓｍ２位置３０：
ＭＡＮＡＶＨＳＭＥＫＶＭＤＩＨＳＫＹＣＲＣＬＱＲＬＳＳＴＶＧＨＳＬＩＲＧＲＫＲＲＳＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳＲＧＲＫＲＲＳＥＶＰＫＰＬＦＰＶＡＧＶＰＭＩＱＹＨＩＥＡＣＡＱＶＰＧＭＱＥＩＬＬＲＧＲＫＲＲＳＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶＲＧＲＫＲＲＳＳＮＥＤＲＥＷＨＥＳＦＳＬＶＬＧＰＤＤＰＶＥＡＶＬＧＤＶＴＴＡＴＶＲＧＲＫＲＲＳＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲＲＧＲＫＲＲＳＭＳＶＭＶＬＲＴＱＧＰＥＡＰＦＥＤＨＲＬＩＬＨＴＳＳＣＤＡＥＲＡＲＲＧＲＫＲＲＳＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬＲＧＲＫＲＲＳＣＰＨＭＴＥＤＮＫＤＬＩＱＧＫＤＬＬＴＡＣＹＤＶＤＹＥＫＮＡＫＧＳＲＧＲＫＲＲＳＱＧＫＹＩＬＫＶＣＧＣＤＥＹＦＬＥＫＦＰＬＳＱＹＫＹＩＲＳＣＩＭＬＲＧＲＫＲＲＳＴＲＧＬＡＹＬＨＴＥＬＰＱＧＤＨＹＫＰＡＩＳＨＲＤＬＮＳＲＮＶＬＶＲＧＲＫＲＲＳＫＦＩＳＶＬＣＴＳＬＡＴＭＬＨＶＥＬＰＨＶＮＬＬＳＫＭＤＬＩＥＨＹＲＧＲＫＲＲＳＩＨＲＥＱＮＳＬＳＬＬＥＡＳＥＡＤＧＤＡＶＮＤＫＫＲＴＰＮＥＡＰＳＲＧＲＫＲＲＳＬＲＰＳＴＬＳＱＥＶＹＫＴＶＳＭＲＬＮＶＶＳＰＤＬＳＧＫＧＬＶＬＰＲＧＲＫＲＲＳＥＰＫＲＤＲＲＤＰＳＴＤＫＳＧＰＤＴＦＰＶＥＶＬＥＲＫＰＰＥＫＴＹＲＧＲＫＲＲＳＡＣＳＳＳＹＮＳＡＶＭＥＳＳＳＶＮＶＳＭＶＨＳＳＳＫＥＮＬＣＰＫＫＲＧＲＫＲＲＳＳＧＨＶＧＬＲＮＬＧＮＴＬＰＱＣＦＬＮＡＭＬＱＣＬＳＳＴＲＰＬＲＤＲＧＲＫＲＲＳＲＥＩＡＶＥＨＮＮＬＧＫＡＶＹＳＲＭＡＲＩＣＫＮＤＭＧＧＳＱＲＶＬＲＧＲＫＲＲＳＡＥＤＴＱＥＮＬＨＳＧＫＳＱＳＲＳＦＰＫＶＬＡＤＳＤＥＳＤＭＥＥＴＲＧＲＫＲＲＳＰＧＬＬＳＶＤＬＦＨＶＬＶＳＡＶＬＡＦＰＳＬＹＷＤＤＴＶＤＬＱＰＳＲＧＲＫＲＲＳＥＣＫＥＡＡＶＳＨＡＧＳＭＨＲＥＲＲＴＦＬＲＳＡＬＫＥＬＡＴＶＬＳＲＧＲＫＲＲＳＬＣＬＭＧＨＫＰＶＬＬＲＴＱＣＲＣＨＰＡＩＳＡＩＡＮＤＬＦＹＥＧＳＲＧＲＫＲＲＳＲＭＲＥＥＱＬＡＲＥＡＥＡＷＡＥＲＥＡＥＡＲＲＲＥＥＱＥＡＲＥＫＡＲＧＲＫＲＲＳＴＳＡＡＥＴＫＰＰＬＡＰＳＳＰＰＡＰＰＧＴＭＶＡＧＳＳＬＥＧＰＡＰＲＧＲＫＲＲＳＬＳＱＴＰＰＰＡＰＰＰＳＡＧＳＥＰＬＡＲＬＰＱＫＤＳＶＧＫＨＳＧＡＲＧＲＫＲＲＳＲＳＬＱＥＬＬＡＲＲＴＹＹＳＧＤＰＬＦＳＶＤＩＬＲＮＶＴＤＴＦＫＲＲＧＲＫＲＲＳＮＴＱＩＱＫＬＴＧＳＰＦＲＳＲＥＹＶＱＴＭＥＳＥＳＥＨＳＹＰＰＰＧＲＧＲＫＲＲＳＧＧＨＶＣＷＭＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨＲＧＲＫＲＲＳＴＴＴＳＲＡＩＣＱＬＶＫＥＹＩＧＹＲＤＧＩＷＤＶＳＶＴＲＴＱＰＩＶＲＧＲＫＲＲＳＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥＲＧＲＫＲＲＳＥＰＩＥＶＮＬＦＧＬＩＮＶＴＰＮＭＬＰＬＶＫＫＡＲＧＲＶＩＮＶＳＳＲＧＲＫＲＲＳＮＧＹＤＴＹＶＨＤＡＹＧＬＦＱＥＣＲＳＲＶＡＨＷＧＷＰＬＧＰＡＰＬＲＧＲＫＲＲＳＶＤＦＮＫＩＣＧＱＡＹＤＳＡＴＮＦＲＶＫＬＮＥＶＶＡＥＦＫＫＥＥＰＲＧＲＫＲＲＳＩＱＧＷＬＧＴＫＶＲＴＮＬＲＲＥＰＦＳＬＶＰＫＮＡＫＤＧＮＳＦＱＧＲＧＲＫＲＲＳＮＣＮＦＤＦＰＥＥＴＣＧＷＶＹＤＨＡＫＬＬＲＳＴＷＩＳＳＡＮＰＮＤＲＧＲＫＲＲＳＧＧＫＶＷＮＥＱＥＫＮＴＹＡＤＫＬＦＤＣＩＥＡＹＡＰＧＦＫＲＳＶＬＲＧＲＫＲＲＳＩＳＭＧＧＨＭＡＳＬＡＶＣＮＷＰＫＰＭＰＬＩＰＣＬＳＷＳＴＡＳＧＶＲＧＲＫＲＲＳＷＭＫＣＶＫＧＱＰＨＤＨＫＨＬＭＰＴＱＩＩＰＧＳＶＬＴＤＬＬＤＡＭＲＧＲＫＲＲＳＧＬＳＬＮＩＫＫＹＬＬＶＳＭＰＬＷＡＫＨＭＳＤＥＱＩＱＧＦＶＥＮＬＲＧＲＫＲＲＳＳＩＬＲＮＨＲＹＲＲＤＡＲＴＬＥＤＫＥＥＭＷＦＮＴＤＥＤＤＭＥＤＧ＊＊（配列番号：５０）
４０−エピトープＳｇｓｍ２位置４０：
ＭＡＮＡＶＨＳＭＥＫＶＭＤＩＨＳＫＹＣＲＣＬＱＲＬＳＳＴＶＧＨＳＬＩＲＧＲＫＲＲＳＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳＲＧＲＫＲＲＳＥＶＰＫＰＬＦＰＶＡＧＶＰＭＩＱＹＨＩＥＡＣＡＱＶＰＧＭＱＥＩＬＬＲＧＲＫＲＲＳＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶＲＧＲＫＲＲＳＳＮＥＤＲＥＷＨＥＳＦＳＬＶＬＧＰＤＤＰＶＥＡＶＬＧＤＶＴＴＡＴＶＲＧＲＫＲＲＳＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲＲＧＲＫＲＲＳＭＳＶＭＶＬＲＴＱＧＰＥＡＰＦＥＤＨＲＬＩＬＨＴＳＳＣＤＡＥＲＡＲＲＧＲＫＲＲＳＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬＲＧＲＫＲＲＳＣＰＨＭＴＥＤＮＫＤＬＩＱＧＫＤＬＬＴＡＣＹＤＶＤＹＥＫＮＡＫＧＳＲＧＲＫＲＲＳＱＧＫＹＩＬＫＶＣＧＣＤＥＹＦＬＥＫＦＰＬＳＱＹＫＹＩＲＳＣＩＭＬＲＧＲＫＲＲＳＴＲＧＬＡＹＬＨＴＥＬＰＱＧＤＨＹＫＰＡＩＳＨＲＤＬＮＳＲＮＶＬＶＲＧＲＫＲＲＳＫＦＩＳＶＬＣＴＳＬＡＴＭＬＨＶＥＬＰＨＶＮＬＬＳＫＭＤＬＩＥＨＹＲＧＲＫＲＲＳＩＨＲＥＱＮＳＬＳＬＬＥＡＳＥＡＤＧＤＡＶＮＤＫＫＲＴＰＮＥＡＰＳＲＧＲＫＲＲＳＬＲＰＳＴＬＳＱＥＶＹＫＴＶＳＭＲＬＮＶＶＳＰＤＬＳＧＫＧＬＶＬＰＲＧＲＫＲＲＳＥＰＫＲＤＲＲＤＰＳＴＤＫＳＧＰＤＴＦＰＶＥＶＬＥＲＫＰＰＥＫＴＹＲＧＲＫＲＲＳＡＣＳＳＳＹＮＳＡＶＭＥＳＳＳＶＮＶＳＭＶＨＳＳＳＫＥＮＬＣＰＫＫＲＧＲＫＲＲＳＳＧＨＶＧＬＲＮＬＧＮＴＬＰＱＣＦＬＮＡＭＬＱＣＬＳＳＴＲＰＬＲＤＲＧＲＫＲＲＳＲＥＩＡＶＥＨＮＮＬＧＫＡＶＹＳＲＭＡＲＩＣＫＮＤＭＧＧＳＱＲＶＬＲＧＲＫＲＲＳＡＥＤＴＱＥＮＬＨＳＧＫＳＱＳＲＳＦＰＫＶＬＡＤＳＤＥＳＤＭＥＥＴＲＧＲＫＲＲＳＰＧＬＬＳＶＤＬＦＨＶＬＶＳＡＶＬＡＦＰＳＬＹＷＤＤＴＶＤＬＱＰＳＲＧＲＫＲＲＳＥＣＫＥＡＡＶＳＨＡＧＳＭＨＲＥＲＲＴＦＬＲＳＡＬＫＥＬＡＴＶＬＳＲＧＲＫＲＲＳＬＣＬＭＧＨＫＰＶＬＬＲＴＱＣＲＣＨＰＡＩＳＡＩＡＮＤＬＦＹＥＧＳＲＧＲＫＲＲＳＲＭＲＥＥＱＬＡＲＥＡＥＡＷＡＥＲＥＡＥＡＲＲＲＥＥＱＥＡＲＥＫＡＲＧＲＫＲＲＳＴＳＡＡＥＴＫＰＰＬＡＰＳＳＰＰＡＰＰＧＴＭＶＡＧＳＳＬＥＧＰＡＰＲＧＲＫＲＲＳＬＳＱＴＰＰＰＡＰＰＰＳＡＧＳＥＰＬＡＲＬＰＱＫＤＳＶＧＫＨＳＧＡＲＧＲＫＲＲＳＲＳＬＱＥＬＬＡＲＲＴＹＹＳＧＤＰＬＦＳＶＤＩＬＲＮＶＴＤＴＦＫＲＲＧＲＫＲＲＳＮＴＱＩＱＫＬＴＧＳＰＦＲＳＲＥＹＶＱＴＭＥＳＥＳＥＨＳＹＰＰＰＧＲＧＲＫＲＲＳＧＧＨＶＣＷＭＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨＲＧＲＫＲＲＳＴＴＴＳＲＡＩＣＱＬＶＫＥＹＩＧＹＲＤＧＩＷＤＶＳＶＴＲＴＱＰＩＶＲＧＲＫＲＲＳＥＰＩＥＶＮＬＦＧＬＩＮＶＴＰＮＭＬＰＬＶＫＫＡＲＧＲＶＩＮＶＳＳＲＧＲＫＲＲＳＮＧＹＤＴＹＶＨＤＡＹＧＬＦＱＥＣＲＳＲＶＡＨＷＧＷＰＬＧＰＡＰＬＲＧＲＫＲＲＳＶＤＦＮＫＩＣＧＱＡＹＤＳＡＴＮＦＲＶＫＬＮＥＶＶＡＥＦＫＫＥＥＰＲＧＲＫＲＲＳＩＱＧＷＬＧＴＫＶＲＴＮＬＲＲＥＰＦＳＬＶＰＫＮＡＫＤＧＮＳＦＱＧＲＧＲＫＲＲＳＮＣＮＦＤＦＰＥＥＴＣＧＷＶＹＤＨＡＫＬＬＲＳＴＷＩＳＳＡＮＰＮＤＲＧＲＫＲＲＳＧＧＫＶＷＮＥＱＥＫＮＴＹＡＤＫＬＦＤＣＩＥＡＹＡＰＧＦＫＲＳＶＬＲＧＲＫＲＲＳＩＳＭＧＧＨＭＡＳＬＡＶＣＮＷＰＫＰＭＰＬＩＰＣＬＳＷＳＴＡＳＧＶＲＧＲＫＲＲＳＷＭＫＣＶＫＧＱＰＨＤＨＫＨＬＭＰＴＱＩＩＰＧＳＶＬＴＤＬＬＤＡＭＲＧＲＫＲＲＳＧＬＳＬＮＩＫＫＹＬＬＶＳＭＰＬＷＡＫＨＭＳＤＥＱＩＱＧＦＶＥＮＬＲＧＲＫＲＲＳＳＩＬＲＮＨＲＹＲＲＤＡＲＴＬＥＤＫＥＥＭＷＦＮＴＤＥＤＤＭＥＤＧＲＧＲＫＲＲＳＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥ＊＊（配列番号：５１）
フォローアップ研究＃２：
エピトープを（クローニングの問題なしに）繰り返すことができるかどうか、そしてこれにより、エピトープが少ない患者の免疫原性を高めることができるかどうかを判断する。
＊前の研究からの第１位から５位
１．Ｓｇｓｍ２  Ｖ６５６Ａ：ＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥ
２．Ｈｅｒｐｕｄ２  Ｖ８５Ｌ：ＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳ
３．Ｌｔａ４ｈ  Ｖ４６３Ａ：ＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶ
４．Ｐｈａｃｔｒ４  Ｖ２５３Ｌ：ＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲ
５．Ａｕｎｉｐ  Ｅ１６８Ｇ：ＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬ
５−エピトープＳｇｓｍ２位置１：
ＭＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥＲＧＲＫＲＲＳＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳＲＧＲＫＲＲＳＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶＲＧＲＫＲＲＳＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲＲＧＲＫＲＲＳＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬ＊＊（配列番号５２）
４０−エピトープリピート：
ＭＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥＲＧＲＫＲＲＳＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳＲＧＲＫＲＲＳＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶＲＧＲＫＲＲＳＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲＲＧＲＫＲＲＳＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬＲＧＲＫＲＲＳＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥＲＧＲＫＲＲＳＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳＲＧＲＫＲＲＳＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶＲＧＲＫＲＲＳＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲＲＧＲＫＲＲＳＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬＲＧＲＫＲＲＳＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥＲＧＲＫＲＲＳＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳＲＧＲＫＲＲＳＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶＲＧＲＫＲＲＳＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲＲＧＲＫＲＲＳＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬＲＧＲＫＲＲＳＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥＲＧＲＫＲＲＳＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳＲＧＲＫＲＲＳＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶＲＧＲＫＲＲＳＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲＲＧＲＫＲＲＳＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬＲＧＲＫＲＲＳＳＨＶＱＲＬＶＨＲＤＳＴＩＳＮＤＡＦＩＳＶＤＤＬＥＰＳＧＰＱＤＬＥＲＧＲＫＲＲＳＤＨＬＱＬＫＤＩＬＲＫＱＤＥＹＨＭＶＨＬＬＣＡＳＲＳＰＰＳＳＰＫＳＲＧＲＫＲＲＳＷＮＴＷＬＹＡＰＧＬＰＰＶＫＰＮＹＤＡＴＬＴＮＡＣＩＡＬＳＱＲＷＶＲＧＲＫＲＲＳＡＱＲＮＳＮＰＩＩＡＥＬＳＱＡＭＮＳＧＴＬＬＳＫＰＳＰＰＬＰＰＫＲＲＧＲＫＲＲＳＧＥＳＫＧＰＬＤＳＳＦＳＱＹＬＧＲＳＣＬＬＤＱＲＥＡＫＲＫＧＥＧＬ＊＊（配列番号：５３）
【図１Ａ】
2021525549.tif 000005
【図１Ｂ】
2021525549.tif 000006
【図１Ｃ】
2021525549.tif 000007
【図１Ｄ】
2021525549.tif 000008
【図１Ｅ】
2021525549.tif 000009
【図２Ａ】
2021525549.tif 000010
【図２Ｂ】
2021525549.tif 000011
【図２Ｃ】
2021525549.tif 000012
【図２Ｄ】
2021525549.tif 000013
【図２Ｅ】
2021525549.tif 000014
【図２Ｆ】
2021525549.tif 000015
【図３Ａ】
2021525549.tif 000016
【図３Ｂ】
2021525549.tif 000017
【図３Ｃ】
2021525549.tif 000018
【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
2021525549.tif 000020
【図４Ｂ】
2021525549.tif 000021
【図４Ｃ】
2021525549.tif 000022
【図４Ｄ】
2021525549.tif 000023
【図５】
2021525549.tif 000024
【図６Ａ】
2021525549.tif 000025
【図６Ｂ】
2021525549.tif 000026
【図６Ｃ】
2021525549.tif 000027
【図６Ｄ】
2021525549.tif 000028
【図６Ｅ】
2021525549.tif 000029
【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2021525549.tif 000032
【図７Ｃ】
2021525549.tif 000033
【図７Ｄ】
2021525549.tif 000034
【図７Ｅ】
2021525549.tif 000035
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
2021525549.tif 000039
【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
2021525549.tif 000042
【図９Ｂ】
2021525549.tif 000043
【図１０Ａ】
2021525549.tif 000044
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2021525549.tif 000047
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
2021525549.tif 000050
【図１１Ｆ】
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【図１２】
2021525549.tif 000052
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2021525549.tif 000054
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
2021525549.tif 000058
【図１６】
2021525549.tif 000059
【図１７】
2021525549.tif 000060
【図１８】
2021525549.tif 000061
【図１９】
2021525549.tif 000062
【図２０】
2021525549.tif 000063
【図２１】
2021525549.tif 000064
【図２２】
2021525549.tif 000065
【図２３Ａ】
2021525549.tif 000066
【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
2021525549.tif 000073
【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
2021525549.tif 000075
【図２８】
2021525549.tif 000076
【図２９】
2021525549.tif 000077
【図３０】
2021525549.tif 000078
【図３１】
2021525549.tif 000079
【図３２】
2021525549.tif 000080
【配列表】
2021525549000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月26日(2021.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のネオ抗原突然変異をコードする核酸配列を、プラスミドなどの核酸分子にクローニングすることを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ｐＧＸ４５０１、ｐＧＸ４５０３、ｐＧＸ  ４５０４、ｐＧＸ４５０５、およびｐＧＸ４５０６からなる群から選択されるプラスミドのマルチクローニングサイト内に配置される式Ｉの核酸配列を含む。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
式Ｉを含む核酸配列を含む核酸分子であって、
［（ＡＥＤｎ）−（リンカー）］ｎ−［ＡＥＤｎ＋１］、
式中、前記ＡＥＤは、発現可能な核酸配列を含む抗原発現ドメインであり、
各リンカーは、約０〜約１２５の長さの、天然または非天然の核酸から独立して選択可能であり、
抗原発現ドメイン１は、約２４〜約２５０ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、エピトープをコードし、
抗原発現ドメイン２は、約２４〜約２５０ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、エピトープをコードし、
ｎは、約１〜約５００の任意の正の整数である、核酸分子。
（項目２）
前記抗原発現ドメイン１または前記抗原発現ドメイン２が、約２０〜約２０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能である、項目１に記載の核酸分子。
（項目３）
前記抗原発現ドメイン１または前記抗原発現ドメイン２が、約５０〜約１０，０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、
ｎが、約６〜約２６の任意の正の整数である、項目１に記載の核酸分子。
（項目４）
前記抗原発現ドメイン１および／または前記抗原発現ドメイン２が、約１５〜約１５０ヌクレオチドの長さから独立して選択可能である、項目１に記載の核酸分子。
（項目５）
前記抗原発現ドメイン１および／または前記抗原発現ドメイン２が、約１５〜約１００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能である、項目１に記載の核酸分子。
（項目６）
前記抗原発現ドメイン１および／または前記抗原発現ドメイン２が、約１５〜約５０ヌクレオチドの長さから独立して選択可能である、項目１に記載の核酸分子。
（項目７）
ｎが、約５〜約３０の正の整数である、項目１に記載の核酸分子。
（項目８）
ｎが、約２〜約１００の正の整数である、項目１に記載の核酸分子。
（項目９）
ｎが、約２〜約５８の正の整数である、項目１に記載の核酸分子。
（項目１０）
ｎが、約２〜約２９の正の整数である、項目１に記載の核酸分子。
（項目１１）
少なくとも１つのリンカーが、約１５〜約３００ヌクレオチドを含み、切断部位をコードする、項目１に記載の核酸分子。
（項目１２）
少なくとも１つのリンカーが、フューリンプロテアーゼ切断部位を含む、項目１１に記載の核酸分子。
（項目１３）
少なくとも１つのリンカーが、ブタテッショウウイルス−１２Ａ（Ｐ２Ａ）切断部位を含む、項目１１に記載の核酸分子。
（項目１４）
前記式が少なくとも第１のリンカーおよび第２のリンカーを含み、前記第１および第２のリンカーがフューリンプロテアーゼ切断部位を含む、項目１１に記載の核酸分子。
（項目１５）
ｎが約５〜約５０の正の整数であり、各リンカーが、フューリンプロテアーゼ切断部位を含む、項目１１に記載の核酸分子。
（項目１６）
少なくとも１つの制御配列をさらに含み、式Ｉの少なくとも１つの核酸配列が、制御配列に作動可能に連結されている、項目１４に記載の核酸分子。
（項目１７）
前記抗原発現ドメイン１が、約１２〜約１５，０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、対象からの１つまたは複数のがん細胞由来のエピトープをコードし、
前記抗原発現ドメイン２が、約１２〜約１５，０００ヌクレオチドの長さから独立して選択可能であり、前記対象からの１つまたは複数のがん細胞由来のエピトープをコードする、項目１に記載の核酸分子。
（項目１８）
前記核酸分子が、１つまたは複数の抗原発現ドメインによってコードされる任意の１つまたは複数のアミノ酸配列に対してＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発するのに十分な量である、項目１〜１７のいずれかに記載の核酸分子。
（項目１９）
前記核酸分子が、１つまたは複数の抗原発現ドメインによってコードされる任意の１つまたは複数のアミノ酸配列に対してＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発するのに十分な量である、項目１〜１７のいずれかに記載の核酸分子。
（項目２０）
リーダー配列をさらに含む、項目１〜１９のいずれかに記載の核酸分子。
（項目２１）
前記リーダー配列が、ＩｇＥリーダー配列である、項目２０に記載の核酸分子。
（項目２２）
前記分子が、プラスミドである、項目１〜２１のいずれかに記載の核酸分子。
（項目２３）
式Ｉの前記核酸配列が、（ｉ）ＬＬＣ、ＴＣ１、ＩＤ８、ｐＧＸ４５０１、ｐＧＸ４５０３、ｐＧＸ４５０４、ｐＧＸ４５０５、およびｐＧＸ４５０６からなる群から選択されるプラスミド、または（ｉｉ）ＬＬＣ、ＴＣ１、ＩＤ８、ｐＧＸ４５０１、ｐＧＸ４５０３、ｐＧＸ４５０４、ｐＧＸ４５０５、およびｐＧＸ４５０６からなる群から選択されるプラスミドと少なくとも７０％の相同性を有するプラスミドのマルチクローニングサイトに配置される、項目１に記載の核酸分子。
（項目２４）
前記プラスミドが、ｐＧＸ４５０５である、項目２２に記載の核酸分子。
（項目２５）
項目２２に記載のプラスミドで形質転換された、宿主細胞。
（項目２６）
項目１〜２５のいずれかに記載の１つまたは複数の核酸分子を含む、組成物。
（項目２７）
（ｉ）項目１〜２４のいずれかに記載の１つもしくは複数の核酸分子、またはその薬学的に許容される塩と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
（項目２８）
１つ以上の治療薬をさらに含む、項目２７に記載の医薬組成物。
（項目２９）
前記追加の治療薬が、生物学的治療薬または小分子である、項目２７に記載の医薬組成物。
（項目３０）
前記治療薬のうちの１つが、（ｉ）チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメント、または（ｉｉ）チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸配列である、項目２７に記載の医薬組成物。
（項目３１）
前記チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメントが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、およびＢ−７ファミリーリガンド、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるチェックポイントタンパク質と会合するか、またはそれを阻害する、項目３０に記載の医薬組成物。
（項目３２）
前記チェックポイント阻害剤が、プログラム死−１（ＰＤ−１）経路の阻害剤である、項目３０に記載の医薬組成物。
（項目３３）
前記チェックポイント阻害剤が、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）抗体である、項目３０に記載の医薬組成物。
（項目３４）
前記治療薬が、アジュバントまたはその機能的フラグメントである、項目２７に記載の医薬組成物。
（項目３５）
前記アジュバントまたはその機能的フラグメントが、（ｉ）ポリＩＣＬＣ、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、ＡｍｐｌｉｖａｘＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ  １ＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、一リン酸リピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ１３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡマイクロ粒子、レシキモド、Ｓ  Ｌ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルアン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、アクリルもしくはメタクリルポリマー、無水マレイン酸のコポリマーおよびＡｑｕｉｌａのＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、ならびにそれらのいずれかの機能的フラグメント、または（ｉｉ）ポリＩＣＬＣ、１０１８ＩＳＳからなる群から選択されるアジュバントをコードする核酸分子、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ  ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ  １ＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、モノホスホリフリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ１３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡ微粒子、レシキモド、Ｓ  Ｌ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルアン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、アクリルまたはメタクリルポリマー、無水マレイン酸のコポリマー、およびＡｑｕｉｌａのＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、またはそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される、項目３４に記載の医薬組成物。
（項目３６）
前記治療薬が、（ｉ）免疫賦活剤もしくはその機能的フラグメント、または（ｉｉ）免疫賦活剤もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸配列である、項目２７に記載の医薬組成物。
（項目３７）
前記免疫賦活剤が、インターロイキンまたはその機能的フラグメントである、項目３６に記載の医薬組成物。
（項目３８）
前記治療薬が、（ｉ）化学療法薬もしくはその機能的フラグメント、または（ｉｉ）化学療法薬もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸配列である、項目２７に記載の医薬組成物。
（項目３９）
対象においてがんを治療および／または予防する方法であって、それを必要とする前記対象に、薬学的有効量の、項目１〜２４のいずれか一項に記載の核酸分子のうちのいずれか、または項目２７〜３８に記載の医薬組成物のうちのいずれかを投与することを含む、方法。
（項目４０）
治療が、臨床転帰、Ｔ細胞による抗腫瘍活性の増加、増強、もしくは延長、治療前の数と比較した抗腫瘍Ｔ細胞もしくは活性化Ｔ細胞の数の増加、またはこれらの組み合わせによって決定される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記臨床転帰が、腫瘍退縮、腫瘍縮小、腫瘍壊死、免疫系による抗腫瘍応答、腫瘍拡大、再発もしくは拡大、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記がんが、高い突然変異荷重を有する、項目３９に記載の方法。
（項目４３）
前記がんが、
非小細胞肺癌、黒色腫、卵巣癌、頸部癌、神経膠芽細胞腫、泌尿生殖器癌、婦人科癌、肺癌、胃腸癌、頭頸部癌、非転移性または転移性乳癌、悪性黒色腫、メルケル細胞癌または骨および軟組織肉腫、血液新生物、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群および急性リンパ芽球性白血病、乳癌、転移性結腸直腸癌、ホルモン感受性またはホルモン抵抗性前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、肝細胞癌、胆管細胞癌、頭頸部扁平上皮癌軟部組織肉腫、および小細胞肺がんからなる群から選択される、項目３９に記載の方法。
（項目４４）
対象において複数の不均一な過剰増殖細胞に対する免疫応答を増強する方法であって、それを必要とする前記対象に、薬学的有効量の、項目１〜２４のいずれか一項に記載の核酸分子のうちのいずれか、または項目２７〜３８に記載の医薬組成物のうちのいずれかを投与することを含む、方法。
（項目４５）
前記免疫応答が、腫瘍増殖を阻害もしくは遅らせ、腫瘍細胞死を誘導し、腫瘍退縮を誘導し、腫瘍再発を防止もしくは遅延させ、腫瘍増殖を防止し、腫瘍拡大を防止し、および／または腫瘍除去を誘導するのに十分な大きさまたは効力のものである、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
１つ以上の治療薬の投与をさらに含む、項目４４または４５に記載の方法。
（項目４７）
前記追加の治療薬が生物学的治療薬または小分子である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記治療薬が、（ｉ）チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメント、または（ｉｉ）チェックポイント阻害剤もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸分子である、項目４６または４７に記載の方法。
（項目４９）
前記チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、およびＢ−７ファミリーリガンド、ＩＤＯ阻害剤、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるチェックポイントタンパク質と会合するか、またはそれを阻害する、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記チェックポイント阻害剤が、プログラム死−１（ＰＤ−１）経路の阻害剤である、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
前記チェックポイント阻害剤が、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）抗体またはその機能的フラグメントである、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
前記治療薬が、アジュバントである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記アジュバントが、（ｉ）ポリＩＣＬＣ、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ  ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ  １ＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、一リン酸リピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ１３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡマイクロ粒子、レシキモド、Ｓ  Ｌ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルアン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、アクリルもしくはメタクリルポリマー、無水マレイン酸のコポリマーおよびＡｑｕｉｌａのＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、ならびにそれらのいずれかの機能的フラグメント、または（ｉｉ）（ｉ）ポリＩＣＬＣ、１０１８ＩＳＳからなる群から選択されるアジュバントをコードする核酸分子、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ  ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ  １ＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、モノホスホリフリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ１３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡ微粒子、レシキモド、Ｓ  Ｌ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルアン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、アクリルまたはメタクリルポリマー、無水マレイン酸のコポリマーおよびＡｑｕｉｌａのＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、またはそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記治療薬が、免疫賦活剤またはその機能的フラグメントである、項目４６または４７に記載の方法。
（項目５５）
前記免疫賦活剤が、インターロイキンまたはその機能的フラグメントである、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記治療薬が、化学療法剤である、項目４６または４７に記載の方法。
（項目５７）
前記対象が、がんを有する、項目４４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記対象が、チェックポイント阻害剤療法に応答しなかった、項目４４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記核酸分子が、エレクトロポレーションによって前記対象に投与される、項目３９〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
対象において免疫応答を誘導する方法であって、それを必要とする前記対象に、薬学的有効量の、項目１〜２４のいずれか一項に記載の核酸分子のうちのいずれか、または項目２７〜３８に記載の医薬組成物のうちのいずれかを投与することを含む、方法。
（項目６１）
前記免疫応答が、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を誘導することが、０．０１％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を誘導することが、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖することを含む、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
対象において免疫応答を増強する方法であって、それを必要とする前記対象に、薬学的有効量の、項目１〜２４のいずれか一項に記載の核酸分子のうちのいずれか、または項目２７〜３８に記載の医薬組成物のうちのいずれかを投与することを含む、方法。
（項目６５）
前記免疫応答が、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答である、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することが、０．０１％〜約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することが、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖することを含む、項目６５に記載の方法。
（項目６８）
対象において１つ以上の対象特異的ＤＮＡネオ抗原突然変異を識別する方法であって、前記対象が、複数のネオ抗原突然変異の存在または量によって特徴付けられるがんを有し、前記方法が、
前記対象の腫瘍および前記対象の非腫瘍試料からの核酸試料を配列決定することと、
前記配列を分析して、コーディング領域および非コーディング領域を決定することと、
前記非腫瘍試料に存在しない腫瘍特異的非同義または非サイレント変異を含む配列を識別することと、
単一ヌクレオチド変異、ならびに単一ヌクレオチド挿入および欠失を識別することと、
前記非腫瘍試料には存在しない前記腫瘍特異的非同義または非サイレント突然変異を含む前記配列によってコードされる対象特異的ペプチドを産生することと、
前記対象特異的ペプチドの結合特性を測定することと、を含み、
各対象特異的ペプチドは、前記非腫瘍試料には存在しない対象特異的ＤＮＡネオ抗原の発現産物であり、
それにより、対象において１つ以上の対象特異的ＤＮＡネオ抗原を識別する、方法。
（項目６９）
前記対象特異的ペプチドの結合特性を測定することは、
前記対象特異的ペプチドのＴ細胞受容体への結合を測定すること、
前記対象のＨＬＡタンパク質への前記対象特異的ペプチドの結合を測定すること、または
抗原処理に関連するトランスポーター（ＴＡＰ）への前記対象特異的ペプチドの結合を測定すること、のうちの１つ以上によって実行される、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記対象特異的ペプチドが、約５００ｎＭ未満のＩＣ５０で前記対象のＨＬＡタンパク質に結合する、項目６８に記載の方法。
（項目７１）
前記結合特性に基づいて前記対象特異的ペプチドをランク付けするステップをさらに含む、項目６８に記載の方法。
（項目７２）
前記対象特異的ペプチドによって生成されるＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を測定するステップをさらに含む、項目６８に記載の方法。
（項目７３）
前記対象に投与するための免疫原性組成物中に前記対象特異的ＤＮＡネオ抗原を製剤化することをさらに含む、項目６８に記載の方法。
（項目７４）
約２００のランク付けされたネオ抗原突然変異が、前記免疫原性組成物に含まれる、項目６８に記載の方法。
（項目７５）
前記対象から取得された樹状細胞を含む培養物を提供することと、
前記樹状細胞を前記免疫原性組成物と接触させることと、をさらに含む、項目６８に記載の方法。
（項目７６）
前記樹状細胞を前記対象に投与することと、
前記対象からの末梢血試料からＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を取得することであって、前記ＣＤ８＋細胞が前記少なくとも１つのネオ抗原を認識する、取得することと、
前記ネオ抗原を認識する前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を増殖することと、をさらに含む、項目６８に記載の方法。
（項目７７）
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖した集団を前記対象に投与することをさらに含む、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
がんを有すると疑われるか、またはがんと診断された対象のために個別化されたがんワクチンを作製する方法であって、
前記対象からの試料中の複数の突然変異を識別することと、
前記複数の突然変異を分析して、１つ以上のネオ抗原突然変異を識別することと、
識別されたサブセットに基づいて、個人化されたがんワクチンを産生することと、を含む、方法。
（項目７９）
識別することが、前記がんの配列決定を含む、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
分析することが、前記ネオ抗原突然変異に関連する１つ以上の結合特性、Ｔ細胞受容体への前記対象特異的ペプチドの結合からなる群から選択される結合特性、前記対象のＨＬＡタンパク質への前記対象特異的ペプチドの結合および抗原プロセシングに関連するトランスポーター（ＴＡＰ）への前記対象特異的ペプチドの結合を決定することと、
前記決定された特性に基づいて、前記ネオ抗原突然変異の各々をランク付けすることと、をさらに含む、項目７８に記載の方法。
（項目８１）
前記１つまたは複数のネオ抗原突然変異をコードする核酸配列を核酸分子にクローニングすることをさらに含む、項目７８に記載の方法。
（項目８２）
前記核酸分子が、プラスミドである、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記核酸分子が、ｐＧＸ４５０１、ｐＧＸ４５０３、ｐＧＸ  ４５０４、ｐＧＸ４５０５、およびｐＧＸ４５０６からなる群から選択されるプラスミドのマルチクローニングサイト内に配置される式Ｉの核酸配列を含む、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
ｎが、約２５〜約６０の任意の正の整数である、項目１に記載の核酸分子。
（項目８５）
ｎが、約３５〜約５０の任意の正の整数である、項目１に記載の核酸分子。
（項目８６）
ｎが、約４０〜約５０の任意の正の整数である、項目１に記載の核酸分子。
（項目８７）
ｎが、４０、５０、または５５である、項目１に記載の核酸分子。
（項目８８）
（ｉ）項目８４に記載の核酸分子を含む第１の核酸分と、（ｉｉ）ＩＬ−１２またはその機能的フラグメントをコードするコード配列を含む第２の核酸分子と、（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
（項目８９）
前記第１の核酸分子が、約４０〜約５０の抗原発現ドメインを含む、項目８８に記載の医薬組成物。
（項目９０）
各抗原発現ドメインが、少なくとも１つのフューリンリンカーによって分離されている、項目８９に記載の医薬組成物。
（項目９１）
前記抗原発現ドメインが、少なくとも１０個のネオ抗原と、ネオ抗原ではない少なくとも１０個の腫瘍抗原と、を含む、項目８９に記載の医薬組成物。
（項目９２）
前記抗原発現ドメインが、少なくとも２０個のネオ抗原と、ネオ抗原ではない少なくとも２０個の腫瘍抗原と、を含む、項目９１に記載の医薬組成物。
（項目９３）
ネオ抗原ではない少なくとも２０個の腫瘍抗原が、サバイビン、ＭＡＧＥＡ１０、ｇｐ１００、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、カルレティキュリン、およびＷＴ１から選択されるアミノ酸をコードする核酸配列の少なくとも１つまたはその組み合わせを含む、項目８２に記載の医薬組成物。
（項目９４）
前記抗原発現ドメインが、対象に由来する少なくとも２０個のネオ抗原を含む、項目９１に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2021525549000001.app
【国際調査報告】
2021525549.tif 000081
2021525549.tif 000082
2021525549.tif 000083
2021525549.tif 000084