(57)【要約】【課題】  糖尿病を治療するための方法および試薬に関する。【解決手段】  糖尿病を治療またはその発症を制限するために有効な量の、Ｃａｖのβ３サブユニット（Ｃａｖβ３）の発現を減少させるように操作されたインスリン産生細胞を、糖尿病対象または糖尿病のリスクのある対象の眼に移植することによって、糖尿病を治療またはその発症を制限する方法が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病を治療またはその発症を制限するための方法であって、糖尿病を治療またはその発症を制限するために有効な量の、Ｃａｖのβ３サブユニット（Ｃａｖβ３）の発現を減少させるように操作されたインスリン産生細胞を、糖尿病対象または糖尿病のリスクのある対象の眼に移植することを含む、方法。
【請求項２】
前記インスリン産生細胞が、前記Ｃａｖβ３遺伝子の各コピーを破壊するように操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インスリン産生細胞が、ａｐｏＣＩＩＩの発現を減少させるように操作される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記インスリン産生細胞が、前記ａｐｏＣＩＩＩ遺伝子の各コピーを破壊するように操作される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記インスリン産生細胞が、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、および／もしくはＣＸＣＬ１１を含むがこれらに限定されない１つ以上のケモカイン、ならびに／またはＩＬ−６および／もしくはＩＬ−８を含むがこれらに限定されない１つ以上のサイトカインの発現を減少させるように操作される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記インスリン産生細胞が、前記１つ以上のケモカイン遺伝子および／または前記１つ以上のサイトカイン遺伝子の各コピーを破壊するように操作される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記インスリン産生細胞が、１つ以上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質の発現を減少させるように操作される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記インスリン産生細胞が、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩタンパク質の各コピーを破壊するように操作される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記インスリン産生細胞が、ＧＬＰ１受容体、インスリン受容体、および／またはサイトカインＩＬ１Ｂを含むがこれらに限定されない、インスリン産生細胞に有益な１つ以上のタンパク質の発現を増加させるように操作される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記インスリン産生細胞が、単離されたヒト膵島もしくは単離されたヒト膵臓β細胞などの単離された膵島または単離された膵臓β細胞を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
眼への前記移植が、前眼房への移植を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記前眼房への前記移植が角膜を介した注射を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト対象などの前記対象が糖尿病を有し、前記移植が、糖尿病を有する対象の眼に糖尿病を治療するために有効な量を移植することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が２型糖尿病を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が１型糖尿病を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヒト対象などの前記対象は糖尿病のリスクがあり、前記移植が、前記糖尿病のリスクのある対象の眼に糖尿病の発症を制限するために有効な量を移植することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象は２型糖尿病のリスクがある、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象は１型糖尿病のリスクがある、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ヒト対象などの前記対象が、対照と比較してＣａｖβ３を過剰発現する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｃａｖのβ３サブユニット（Ｃａｖβ３）の発現を減少させるように操作されたインスリン産生細胞を含む組換え細胞。
【請求項２１】
前記インスリン産生細胞が、前記Ｃａｖβ３遺伝子の各コピーを破壊するように操作される、請求項２０に記載の組換え細胞。
【請求項２２】
前記インスリン産生細胞が、ａｐｏＣＩＩＩの発現を減少させるように操作される、請求項２０または２１に記載の組換え細胞。
【請求項２３】
前記インスリン産生細胞が、前記ａｐｏＣＩＩＩ遺伝子の各コピーを破壊するように操作される、請求項２２に記載の組換え細胞。
【請求項２４】
前記インスリン産生細胞が、ＣＣＬ２／３／５、ＣＸＣＬ１／９／１０／１１、およびＩＬ−６／８を含むがこれらに限定されない１つ以上のケモカインの発現を減少させるように操作される、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２５】
前記インスリン産生細胞が、前記１つ以上のケモカイン遺伝子の各コピーを破壊するように操作される、請求項２４に記載の組換え細胞。
【請求項２６】
前記インスリン産生細胞が、１つ以上の主要組織適合遺伝子複合体ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を減少させるように操作される、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２７】
前記インスリン産生細胞が、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩタンパク質の各コピーを破壊するように操作される、請求項２６に記載の組換え細胞。
【請求項２８】
前記インスリン産生細胞が、ＧＬＰ１受容体、インスリン受容体、および／またはサイトカインＩＬ１Ｂを含むがこれらに限定されない、インスリン産生細胞に有益な１つ以上のタンパク質の発現を増加させるように操作される、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２９】
前記インスリン産生細胞が、単離されたヒト膵島もしくは単離されたヒト膵臓β細胞などの単離された膵島または単離された膵臓β細胞を含む、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１８年７月１９日に出願の米国特許仮出願第６２／７００５８３号および２０１８年７月１９日に出願の米国特許仮出願第６２／７００５８７号の優先権を主張し、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
国際糖尿病連合（ＩＤＦ）は、２０１１年の糖尿病患者数は３億６６００万人と推定しており、この数は２０３０年までに５億５０００万人に増加すると予測した。患者の大多数は２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）に苦しんでいる。肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病の発症には関連があるが、正確な根本的なメカニズムは未知のままであり、この重大な問題に最終的に対処できる潜在的な治療標的を特定することが最も重要になる。
【０００３】
Ｔ２ＤＭにおいてインスリン抵抗性に特有の古典的な標的組織は、筋肉、肝臓、脂肪である。これらの末梢組織は、インスリンに効果的に応答し、インスリンがその受容体を活性化できないことによってグルコース恒常性を維持し、下流のシグナル伝達カスケードにより、グルコース処置の欠損となる。さらに、インスリンは膵臓のβ細胞上のその受容体を刺激し、それによってインスリンの生合成と分泌の正のフィードバックループに直接寄与することができる。
【発明の概要】
【０００４】
一態様では、本開示は、糖尿病を治療またはその発症を制限するための方法を提供し、該方法は、糖尿病を治療またはその発症を制限するために有効な量の、Ｃａｖのβ３サブユニット（Ｃａｖβ３）の発現を減少させるように操作されたインスリン産生細胞を、糖尿病対象または糖尿病のリスクのある対象の眼に移植することを含む。一実施形態では、インスリン産生細胞は、Ｃａｖβ３遺伝子の各コピーを破壊するように操作される。別の実施形態では、インスリン産生細胞は、ａｐｏＣＩＩＩ遺伝子の各コピーを破壊することによってなど、ａｐｏＣＩＩＩの発現を減少させるように操作される。別の実施形態では、インスリン産生細胞は、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、および／もしくはＣＸＣＬ１１を含むがこれらに限定されない１つ以上のケモカイン、ならびに／またはＩＬ−６および／もしくはＩＬ−８を含むがこれらに限定されない１つ以上のサイトカインの発現を減少させるように操作される。一実施形態では、インスリン産生細胞は、ヒトＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子、および／またはＨＬＡ−Ｃ遺伝子を含むがこれらに限定されない、１つ以上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質の発現を減少させるように操作される。さらなる実施形態では、インスリン産生細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩタンパク質の各コピーを破壊するように操作される。一実施形態では、インスリン産生細胞は、ＧＬＰ１受容体、インスリン受容体、および／またはサイトカインＩＬ１Ｂを含むがこれらに限定されない、インスリン産生細胞に有益な１つ以上のタンパク質の発現を増加させるように操作される。別の実施形態では、インスリン産生細胞は、単離された膵島または単離された膵島β細胞、例えば、単離されたヒト膵島または単離されたヒト膵臓β細胞を含む。さらなる実施形態では、眼への移植は、前眼房への移植を含み、前眼房への移植は、角膜を介した注射を含むがこれに限定されない。一実施形態では、ヒト対象などの対象は、糖尿病を有し、移植は、糖尿病（１型および２型糖尿病を含むがこれらに限定されない）の対象の眼への糖尿病の治療に有効な量の移植を含む。別の実施形態では、ヒト対象などの対象は、糖尿病のリスクがあり、移植は、糖尿病のリスクがある対象（１型および２型糖尿病のリスクを含むがこれらに限定されない）の眼への糖尿病の発症を制限するために有効な量の移植を含む。さらなる実施形態では、ヒト対象などの対象は、対照と比較してＣａｖβ３を過剰発現する。
【０００５】
別の態様では、本開示は、Ｃａｖのβ３サブユニット（Ｃａｖβ３）の発現を減少させるように操作されたインスリン産生細胞を含む組換え細胞を提供する。一実施形態では、インスリン産生細胞は、Ｃａｖβ３遺伝子の各コピーを破壊するように操作される。別の実施形態では、インスリン産生細胞は、ａｐｏＣＩＩＩ遺伝子の各コピーを破壊することによってなど、ａｐｏＣＩＩＩの発現を減少させるように操作される。別の実施形態では、インスリン産生細胞は、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、および／もしくはＣＸＣＬ１１を含むがこれらに限定されない１つ以上のケモカイン、ならびに／またはＩＬ−６および／もしくはＩＬ−８を含むがこれらに限定されない１つ以上のサイトカインの発現を減少させるように操作される。一実施形態では、インスリン産生細胞は、ヒトＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子、および／またはＨＬＡ−Ｃ遺伝子を含むがこれらに限定されない、１つ以上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質の発現を減少させるように操作される。さらなる実施形態において、インスリン産生細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩタンパク質の各コピーを破壊するように操作される。一実施形態では、インスリン産生細胞は、ＧＬＰ１受容体、インスリン受容体、および／またはサイトカインＩＬ１Ｂを含むがこれらに限定されない、インスリン産生細胞に有益な１つ以上のタンパク質の発現を増加させるように操作される。別の実施形態では、インスリン産生細胞は、単離された膵島または単離された膵島β細胞、例えば、単離されたヒト膵島または単離されたヒト膵臓β細胞を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】Ｃａｖβ３発現および［Ｃａ２＋］ｉ動態をｏｂ／ｏｂマウスの膵島で変化させた。（Ａ）左のパネルは、対照痩せ型マウスおよびｏｂ／ｏｂマウスの膵島におけるＣａｖβ３のタンパク質レベルを示す。右のパネルは、左のパネルのＣａｖβ３タンパク質の発現の相対的定量化を示す（ｎ＝５、いずれの場合も４０個の膵島）。（Ｂ、Ｃ）対照マウスおよびｏｂ／ｏｂマウスの膵島における［Ｃａ２＋］ｉに対する１１ｍＭのグルコースの影響。痩せ型膵島およびｏｂ／ｏｂ膵島の３９個のうちの代表的なトレースを示す。（Ｄ）対照の痩せ型マウスおよびｏｂ／ｏｂマウスからの膵島におけるグルコース誘発性［Ｃａ２＋］ｉ変化の最初のピーク比。（Ｅ）対照の痩せ型およびｏｂ／ｏｂマウスからの膵島におけるグルコース誘発性［Ｃａ２＋］ｉ変化の振動周期。（Ｆ）対照の痩せ型マウスおよびｏｂ／ｏｂマウスからの膵島におけるグルコース誘発性［Ｃａ２＋］ｉ変化の振動振幅。（Ｇ）対照の痩せ型（黒）マウスおよびｏｂ／ｏｂ（赤）マウスから分離された膵島細胞における［Ｃａ２＋］ｉに対する２５ｍＭのＫＣｌの影響。対照の痩せ型マウスおよびｏｂ／ｏｂマウスから分離された膵島細胞の代表的なトレースを示す。（Ｈ）痩せ型（黒）マウスおよびｏｂ／ｏｂ（赤）マウスから分離された膵島細胞において２５ｍＭのＫＣｌによって誘発された［Ｃａ２＋］ｉ変化のピーク比。（ｎ＝１０、各実験には５０個の単一細胞が含まれていた）。（Ｉ）対照の痩せ型マウスおよびｏｂ／ｏｂマウスからの膵島におけるグルコース誘発性インスリン放出。膵島を３ｍＭまたは１１ｍＭのグルコースで３０分間処置した（ｎ＝５、いずれの場合も１０個の膵島）。（Ｊ）左のパネルは、対照の痩せ型マウスおよびｏｂ／ｏｂマウス（それぞれｎ＝５）における腹腔内グルコース耐性試験を示す。右のパネルは、左のパネルの曲線下の領域の比較を示す。データは、平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１として表す。
【図２】Ｃａｖβ３発現および［Ｃａ２＋］ｉ動態をＨＦＤマウスの膵島で変化させた。（Ａ）左のパネルは、ＮＣＤマウスおよびＨＦＤ  Ｂ６マウスからの膵島におけるＣａｖβ３のタンパク質レベルを示す。右のパネルは、左のパネルにおけるＣａｖβ３タンパク質発現の相対的定量化を示す（ｎ＝５、いずれの場合も４０個の膵島）。（Ｂ、Ｃ）ＮＣＤマウスおよびＨＦＤ  Ｂ６マウスからの膵島における［Ｃａ２＋］ｉに対する１１ｍＭのグルコースの影響。ＮＣＤ膵島およびＨＦＤ膵島の３０個のうちの代表的なトレースを示す。（Ｄ）ＮＣＤマウスおよびＨＦＤ  Ｂ６マウスからの膵島におけるグルコース誘発性［Ｃａ２＋］ｉ変化の最初のピーク比。（Ｅ）ＮＣＤマウスおよびＨＦＤ  Ｂ６マウスからの膵島におけるグルコース誘発性［Ｃａ２＋］ｉ変化の振動周期。（Ｆ）ＮＣＤおよびＨＦＤ  Ｂ６マウスの膵島におけるグルコース誘発性［Ｃａ２＋］ｉ変化の振動振幅。（Ｇ）ＮＣＤ（黒）マウスおよびＨＦＤ（赤）Ｂ６マウスから分離された膵島細胞における［Ｃａ２＋］ｉに対する２５ｍＭのＫＣｌの影響。ＮＣＤマウスおよびＨＦＤ  Ｂ６マウスから分離された膵島細胞の代表的なトレースを示す。（Ｈ）ＮＣＤ（黒）マウスおよびＨＦＤ（赤）Ｂ６マウスから分離された膵島細胞における２５ｍＭのＫＣｌによって誘発された［Ｃａ２＋］ｉ変化のピーク比。（ｎ＝１０、各実験には５０個の単一細胞が含まれていた）。（Ｉ）ＮＣＤマウスおよびＨＦＤ  Ｂ６マウスからの膵島におけるグルコース誘発性インスリン放出。膵島を３ｍＭまたは１１ｍＭのグルコースで３０分間処置した（ｎ＝５、いずれの場合も１０個の膵島）。（Ｊ）左のパネルは、ＮＣＤマウスおよびＨＦＤ  Ｂ６マウスの腹腔内グルコース耐性試験を示す（いずれの場合もｎ＝５）。右のパネルは、左のパネルの曲線下の領域の比較を示す。データは、平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１として表す。
【図３】Ｃａｖβ３の過剰発現は、膵島における［Ｃａ２＋］ｉ動態を変化させた。（Ａ）左パネルは、対照アデノウイルス処置膵島およびＣａｖβ３過剰発現アデノウイルス処置膵島におけるＣａｖβ３のタンパク質レベルを示す。右のパネルは、左のパネルにおけるＣａｖβ３のタンパク質レベルの相対的定量化を示す（ｎ＝５、いずれの場合も４０個の膵島）。（Ｂ、Ｃ）対照膵島およびＣａｖβ３過剰発現膵島における１１ｍＭのグルコースの［Ｃａ２＋］ｉに対する影響。対照膵島およびＣａｖβ３過剰発現膵島について３０個のうちの代表的なトレースを示す。（Ｄ）対照膵島およびＣａｖβ３過剰発現膵島におけるグルコース誘発性［Ｃａ２＋］ｉ変化の最初のピーク比。（Ｅ）対照膵島およびＣａｖβ３過剰発現膵島におけるグルコース誘発性［Ｃａ２＋］ｉ変化の振動周期。（Ｆ）対照膵島およびＣａｖβ３過剰発現膵島におけるグルコース誘発性［Ｃａ２＋］ｉ変化の振動振幅。（Ｇ）対照膵島細胞（黒）およびＣａｖβ３過剰発現膵島細胞（赤色）における［Ｃａ２＋］ｉに対する２５ｍＭのＫＣｌの影響。各群の代表的なトレースを示す。（Ｈ）対照膵島細胞（黒）およびＣａｖβ３過剰発現膵島細胞（赤色）において２５ｍＭのＫＣｌにより誘発された［Ｃａ２＋］Ｉ変化のピーク比（ｎ＝１０、各実験には５０個の単一細胞が含まれていた）。（Ｉ）対照膵島細胞およびＣａｖβ３過剰発現膵島細胞において２００ｕＭのＣｃｈにより誘発された［Ｃａ２＋］Ｉ変化のピーク比（ｎ＝５、各実験には３０個の単一細胞が含まれていた）。（Ｊ）対照膵島細胞およびＣａｖβ３過剰発現膵島細胞におけるグルコース誘発性インスリン放出。３ｍＭまたは１１ｍＭのグルコースで３０分間処置した（１１ｍＭグルコース／３ｍＭグルコース）膵島を示す（ｎ＝５、いずれの場合も１０個の膵島）。データは、平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１として表す。
【図４】ＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウスは、それほどひどくない糖尿病表現型を示す。（Ａ）ＨＦＤ給餌対照マウスおよびＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウスからの膵島におけるＣａｖβ３タンパク質レベル（ｎ＝５、いずれの場合も４０個の膵島）。（Ｂ、Ｃ）ＨＦＤ給餌対照マウスおよびＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウスからの膵島における［Ｃａ２＋］ｉに対する１１ｍＭのグルコースの影響。３０個のうちの代表的なトレースを示す。（Ｄ）対照マウスおよびＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウスからの膵島におけるグルコース誘発性［Ｃａ２＋］ｉの最初のピーク比。（Ｅ）対照マウスおよびＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウスからの膵島におけるグルコース誘発性［Ｃａ２＋］ｉの振動周期。（Ｆ）対照マウスおよびＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウスからの膵島におけるグルコース誘発性［Ｃａ２＋］ｉの振動振幅。（Ｇ）対照マウス（黒）およびＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウス（赤）から分離された膵島細胞における［Ｃａ２＋］ｉに対する２５ｍＭのＫＣｌの影響。分離された膵島細胞の代表的なトレースを示す。（Ｈ）対照マウス（黒）およびＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウス（赤）から分離された膵島細胞において２５ｍＭのＫＣｌによって誘発された［Ｃａ２＋］ｉ変化のピーク比（ｎ＝５、各実験には５０個の単一細胞が含まれていた）。（Ｉ）ＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウスおよびＨＦＤ給餌対照マウスから分離された膵島細胞において２００ｕＭのＣｃｈによって誘発された［Ｃａ２＋］ｉ変化のピーク比（ｎ＝５、各実験には３０個の単一細胞が含まれていた）。（Ｊ）対照マウスおよびＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウスの膵島からのグルコース誘発インスリン放出。膵島を３ｍＭまたは１１ｍＭのグルコースで３０分間処置した（ｎ＝３、いずれの場合も１０個の膵島）。（Ｋ）左のパネルは、対照マウスおよびＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウスの腹腔内グルコース耐性試験を示す（いずれの場合もｎ＝４）。右のパネルは、左のパネルの曲線下の領域の比較を示す。（Ｌ）絶食対照マウス（黒）ＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウス（赤）からのグルコース注射から３０分後の血漿インスリンレベル（いずれの場合もｎ＝５）。データは、平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１として表す。
【図５】Ｃａｖβ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置は、ｏｂ／ｏｂ膵島における［Ｃａ２＋］ｉ動態およびインスリン分泌を改善する。（Ａ）左のパネルは、スクランブルＡＳＯおよびＣａｖβ３ＡＳＯで処置したｏｂ／ｏｂ膵島におけるＣａｖβ３のタンパク質レベルを示す。右のパネルは、（左）のＣａｖβ３タンパク質レベルの相対的定量化を示す（ｎ＝５、いずれの場合も４０個の膵島）。（Ｂ、Ｃ）スクランブルＡＳＯおよびＣａｖβ３ＡＳＯで処置したｏｂ／ｏｂ膵島における［Ｃａ２＋］ｉに対する１１ｍＭのグルコースの影響。３０個のうちの代表的なトレースを示す。（Ｄ）スクランブルＡＳＯおよびＣａｖβ３ＡＳＯで処置したｏｂ／ｏｂ膵島におけるグルコース誘発性［Ｃａ２＋］ｉ変化の最初のピーク比。（Ｅ）スクランブルＡＳＯおよびＣａｖβ３ＡＳＯで処置したｏｂ／ｏｂ膵島におけるグルコース誘発性［Ｃａ２＋］ｉ変化の振動周期。（Ｆ）スクランブルＡＳＯおよびＣａｖβ３ＡＳＯで処置したｏｂ／ｏｂ膵島におけるグルコース誘発性［Ｃａ２＋］ｉ変化の振動振幅。（Ｇ）スクランブルＡＳＯ（黒）およびＣａｖβ３ＡＳＯで処置（赤）したｏｂ／ｏｂマウスから分離された膵島細胞における［Ｃａ２＋］ｉに対する２５ｍＭのＫＣｌの影響。分解された膵島細胞の代表的なトレースを示す。（Ｈ）スクランブルＡＳＯ（黒）およびＣａｖβ３ＡＳＯで処置（赤）したｏｂ／ｏｂマウスから分離された膵島細胞において２５ｍＭのＫＣｌによる誘発性［Ｃａ２＋］ｉ変化のピーク比（ｎ＝５、各実験には５０個の単一細胞が含まれていた）。（Ｉ）スクランブルＡＳＯおよびＣａｖβ３ＡＳＯで処置したｏｂ／ｏｂマウスの分離された膵島細胞において２００ｕＭのＣｃｈによる誘発性［Ｃａ２＋］ｉ変化のピーク比（ｎ＝５、各実験には３０個の単一細胞が含まれていた）。（Ｊ）スクランブルＡＳＯおよびＣａｖβ３ＡＳＯで処置したｏｂ／ｏｂ膵島におけるグルコース誘発性インスリン放出。膵島を３ｍＭまたは１１ｍＭのグルコースで３０分間処置した（ｎ＝５、いずれの場合も１０個の膵島）。データは平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５として表す。
【図６】Ｃａｖβ３−／−膵島の代謝性移植により、糖尿病条件下でグルコースコントロールが改善される。（Ａ）実験プロトコルの概略図。（Ｂ）虹彩に移植された膵島の代表的な写真。（Ｃ）代表的な膵島血管画像、移植後３週間の前眼房における膵島移植片の画像スタックの最大投影。膵島は緑色で、血管は赤色である（テキサスレッド染色）。スケールバー＝１００ｕｍ。（Ｄ）左のパネルは、対照マウスおよびＣａｖβ３−／−マウスからの膵島を移植したＨＦＤ給餌マウスにおける腹腔内グルコース耐性試験を示す（いずれの場合もｎ＝８）。右のパネルは、左のパネルの曲線下の領域の比較を示す。（Ｅ）対照マウスおよびＣａｖβ３−／−マウスからの膵島を移植したＨＦＤ給餌マウスにおける腹腔内インスリン耐性試験（いずれの場合もｎ＝８）。データは平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１として表す。
【図７】Ａｄ−Ｃａｖβ３を形質導入されたヒト膵島は、グルコース応答性インスリン分泌障害を呈する。（Ａ）対照膵島（左パネル）およびＣａｖβ３過剰発現ヒト膵島（右パネル）の試料の共焦点画像。（Ｂ）３ｍＭまたは１１ｍＭのグルコースと共にインキュベートした対照膵島または個々のヒトドナーのＣａｖβ３過剰発現膵島からのインスリン分泌。（Ｃ）３ｍＭまたは１１ｍＭのグルコースと共にインキュベートした対照膵島またはヒトドナーのＣａｖβ３過剰発現膵島からの平均インスリン分泌。データは平均±ＳＥＭとして表す。＃Ｐ＜０．０１対３ｍＭグルコース／Ａｄ−ＧＦＰ、および
【数１】
2021530476.tif 000002
対１１ｍＭグルコース／Ａｄ−ＧＦＰ、および＊＊Ｐ＜０．０１対１１−３ｍＭグルコース／Ａｄ−ＧＦＰ。スケールバー＝２０μｍ。Δインスリン：１１ｍＭグルコースと共にインキュベートした膵島から放出されたインスリンから、３ｍＭグルコースと共にインキュベートした膵島から放出されたインスリンを差し引いたもの。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
引用されたすべての参考文献は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。本出願では、別途記載されない限り、用いられる技術は、いくつかの周知の文献のいずれかに見いだすことができる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌによる編，１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ，ｅｄ．，（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ），Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９−１２８，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編，Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、およびＡｍｂｉｏｎ  １９９８  Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）．
【０００８】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。本明細書で使用される「および」は、特に明記しない限り、「または」と互換的に使用される。
【０００９】
本開示の任意の態様のすべての実施形態は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、組み合わせて使用することができる。
【００１０】
電位依存性Ｃａ２＋チャネル（Ｃａｖ）は、孔形成α１サブユニット、α２／δ、β、およびγサブユニットの４種のサブユニットで構成されている。βサブユニットは膜の細胞内部側に固定されており、孔形成α１サブユニットに結合することでＣａ２＋チャネル電流を変化させる。４種のβサブユニットのうち、β３サブユニット（Ｃａｖβ３）は、β２サブユニット（Ｃａｖβ２）に加えて、主に膵島で発現する。糖尿病におけるＣａｖβ３の役割は不明なままである。
【００１１】
第１の態様では、本開示は、糖尿病を治療またはその発症を制限するために有効な量の、Ｃａｖのβ３サブユニット（Ｃａｖβ３）の発現を減少させる、または排除するように操作されたインスリン産生細胞を、糖尿病対象または糖尿病のリスクのある対象の眼に移植することを含む、糖尿病を治療またはその発症を制限するための方法を提供する。実施例に開示されるように、本発明者は、本開示の方法および組換え細胞が、Ｃａｖβ３の発現を減少させるよう、または排除するように操作された移植膵島と比較して、糖尿病を治療またはその発症を制限する能力をかなり改善することを見いだした。
【００１２】
一実施形態では、ヒトインスリン産生細胞は、ヒトＣａｖβ３の発現を減少させるよう、または排除するように操作されている。当業者によって理解されるように、ヒトＣａｖβ３には複数のアイソフォームがあり、本方法を使用して、そのようなアイソフォーム、またはそのようなアイソフォームをコードする遺伝子の発現を減少させる、または排除することができる。種々の非限定的な実施形態では、ヒトＣａｖβ３は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤエントリー７８４、Ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ＥＮＳＧ０００００１６７５３５（遺伝子ＣＡＣＮＢ３）、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースアクセッションＰ５４２８４、およびＧｅｎＢａｎｋ  ｍＲＮＡ参照配列ＮＭ＿０００７２５、ＮＭ＿００１２０６９１５、ＮＭ＿００１２０６９１６、およびＮＭ＿００１２０６９１７；ＧｅｎＰｅｐｔタンパク質参照配列ＮＰ＿０００７１６、ＮＰ＿００１１９３８４４、ＮＰ＿００１１９３８４５、およびＮＰ＿００１１９３８４６に記載されるように、アミノ酸配列を含み得るか、または核酸によってコードされ得る。
【００１３】
細胞工学は、利用可能な遺伝子工学技術を使用してＣａｖβ３遺伝子発現／転写またはタンパク質翻訳を減少させるように細胞を操作することを含むがこれらに限定されない、Ｃａｖβ３の発現を減少させる任意の適切な手段を含み得る。発現の任意の適切な減少により、利点がもたらされる（すなわち、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれ以上、または発現の完全な排除）。
【００１４】
非限定的な実施形態では、方法は、本明細書に開示される方法を含むがこれに限定されない任意の適切な技術によってＣａｖβ３遺伝子の発現／転写を減少させるように細胞を操作することを含む。一実施形態では、Ｃａｖβ３遺伝子の各コピーは、遺伝子発現／転写が起こらないように破壊されるか、またはＣａｖβ３遺伝子の各コピーが排除される。
【００１５】
種々の実施形態では、細胞は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ａｐｏＣＩＩＩ）、１つ以上のケモカイン（ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、および／またはＣＸＣＬ１１を含むがこれらに限定されない）、１つ以上のサイトカイン（ＩＬ−６および／またはＩＬ−８を含むがこれらに限定されない）、ならびに／または１つ以上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質（ヒトＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子、および／またはＨＬＡ−Ｃ遺伝子を含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない他のタンパク質の発現を減少させるように操作される。細胞工学は、利用可能な遺伝子工学技術を使用して遺伝子発現／転写またはタンパク質翻訳を減少させるように細胞を操作することを含むがこれらに限定されない、これらの他のタンパク質の発現を減少させる任意の適切な手段を含み得る。発現の任意の適切な減少により、利点がもたらされる（すなわち、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれ以上、または発現の完全な排除）。
【００１６】
非限定的な実施形態では、方法は、本明細書に開示される方法を含むがこれに限定されない任意の適切な技術によって、他のタンパク質をコードする遺伝子の発現／転写を減少させるように細胞を操作することを含む。一実施形態では、タンパク質をコードする遺伝子の各コピーは、遺伝子発現／転写が起こらないように破壊されるか、またはタンパク質をコードする遺伝子の各コピーが排除される。
【００１７】
種々のさらなる実施形態では、細胞は、ＧＬＰ１受容体、インスリン受容体、およびサイトカインＩＬ１Ｂを含むがこれらに限定されない、インスリン産生細胞の生存および機能に有益な他のタンパク質の発現を増加させるように操作される。細胞工学は、利用可能な遺伝子工学技術を使用して遺伝子発現／転写またはタンパク質翻訳を増加させるように細胞を操作することを含むがこれらに限定されない、これらの他のタンパク質の発現を増加させる任意の適切な手段を含み得る。発現の任意の適切な増加により、利点がもたらされる（すなわち、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）。
【００１８】
任意の適切なインスリン産生細胞を使用することができる。一実施形態では、インスリン産生細胞は、単離された膵臓β細胞を含む。本明細書で使用される場合、「膵臓β細胞」とは、膵臓β膵島細胞を含む細胞の任意の集団である。そのような膵臓β膵島細胞集団には、膵臓細胞、ランゲルハンスの単離された膵島（「膵島」）細胞、および単離された膵臓β膵島細胞が挙げられる。当業者によって理解されるように、β細胞は、他の細胞（α細胞、δ細胞、ε細胞、および／もしくはγ細胞などの他の膵島細胞、または目的の他の細胞型を含むがこれらに限定されない）と一緒に移植され得る。そのような他の細胞が、例えば、１つ以上のケモカイン（ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、および／またはＣＸＣＬ１１を含むがこれらに限定されない）、１つ以上のサイトカイン（ＩＬ−６および／またはＩＬ−８を含むがこれらに限定されない）、ならびに／または１つ以上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質（ヒトＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子、および／またはＨＬＡ−Ｃ遺伝子を含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない他のタンパク質の発現を減少させるように操作され得る。
【００１９】
眼への移植は、前眼房への移植を含み得る。前眼房は、眼の前部を含み、硝子体液の前の構造、ならびに角膜、虹彩、毛様体、および水晶体を含む。前眼房への細胞の移植は、これらの前眼房コンパートメントのいずれか１つ以上の細胞の配置を含み得る。非限定的な一例では、細胞は角膜を介した注射によって移植され、移植された細胞の虹彩への移植を可能にし、角膜を介した観察および画像化を可能にする。
【００２０】
前眼房に移植された膵臓β細胞などのインスリン産生細胞は、虹彩に生着し、血管が新生し、神経支配され、それらの細胞組成を保持し、刺激に応答する。さらに、それらは、膵島の血管新生、神経支配、ならびにβ細胞機能およびインスリン放出のインビボイメージングを可能にする非侵襲的レーザー走査顕微鏡法（ＬＳＭ）によってモニターすることができる。これらの実施形態では、インスリン産生細胞またはその成分を蛍光標識することができ、蛍光イメージングを使用して細胞活性をモニターすることができる。
【００２１】
前眼房での蛍光イメージングは、レーザー走査顕微鏡法を含むがこれに限定されない、当業者に知られている任意の技術によって達成することができる。一実施形態では、方法は、移植された細胞内の細胞成分の蛍光画像を非侵襲的に取得するために、適切な波長でのレーザー刺激によって目的の標識細胞成分からの蛍光を刺激することを含む。
【００２２】
一実施形態では、この方法は糖尿病を治療するためのものである。この実施形態では、対象は、１型または２型糖尿病と診断されている。本明細書で使用される場合、「糖尿病」とは、膵臓によるインスリンの産生が不十分であるかまたは全くないことを特徴とし、高血糖値をもたらす。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「糖尿病の治療」とは、以下の１つ以上を達成することを意味し得る：（ａ）糖尿病または糖尿病合併症の重症度を軽減する、（ｂ）糖尿病合併症の発症を制限または予防する、（ｃ）糖尿病合併症または糖尿病に特徴的な症状の悪化を抑制する、（ｄ）糖尿病合併症または糖尿病に特徴的な症状の再発を制限または予防する、（ｅ）以前に症状があった患者における糖尿病合併症または糖尿病に特徴的な症状の再発を制限または予防する。
【００２４】
本発明の方法によって治療することができる糖尿病に特徴的な症状には、血糖値の上昇、インスリン産生の減少、インスリン抵抗性、タンパク尿、および糸球体クリアランスの障害が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法によって治療することができる糖尿病合併症には、神経の合併症（糖尿病性ニューロパチーなど）および平滑筋細胞の調節不全に関連する合併症（勃起不全、膀胱機能障害を含むがこれらに限定されない、およびアテローム動脈硬化症、脳卒中、および末梢血管疾患を含むがこれらに限定されない血管合併症）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
別の実施形態では、本方法は、糖尿病の発症を制限するためのものである。この態様では、対象は１型または２型の糖尿病のリスクがあり、利点は、糖尿病および／または糖尿病合併症の発症を制限することである。メタボリックシンドローム、糖尿病の既知の遺伝的危険因子、糖尿病の家族歴、および肥満のうちの１つ以上を有する対象を含むがこれらに限定されない、糖尿病を発症するリスクのある任意の対象を治療することができる。
【００２６】
さらなる実施形態において、糖尿病および／または糖尿病合併症を治療またはその発症を制限するための方法は、対照と比較してＣａｖβ３を過剰発現していると同定された個体を治療することを含み得る。Ｃａｖβ３発現の増加は、糖尿病合併症の発症に先行する可能性があり、したがって、この実施形態は、本発明の方法を使用する治療に適した患者の早期発見を可能にする。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「過剰発現」とは、対照を超える任意の量のＣａｖβ３発現である。糖尿病を患っていないことが知られている対象からのＣａｖβ３発現レベル、または同様の患者サンプルの集団からの以前に決定されたＣａｖβ３の標準化された発現レベルを含む、任意の適切な対照を使用することができる。任意の量の、対照と比較して増加したＣａｖβ３発現は「過剰発現」と見なされ、種々の実施形態では、過剰発現は、対照と比較して、少なくとも１０％、２０％、５０％、１００％、２００％、またはそれ以上に増加したＣａｖβ３発現を含む。Ｃａｖβ３は、任意の適切な手法を使用して識別できる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」という用語は、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、昆虫、ウマ、ニワトリなどを含む、治療が望まれる任意の対象を意味する。最も好ましくは、対象はヒトである。
【００２９】
別の態様では、本開示は、本開示の方法を実行するための操作された細胞を提供する。方法について開示される操作された細胞のすべての実施形態は、本開示の操作された細胞に適用可能である。種々の実施形態では、細胞は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ａｐｏＣＩＩＩ）、１つ以上のケモカイン（ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、および／またはＣＸＣＬ１１を含むがこれらに限定されない）、１つ以上のサイトカイン（ＩＬ−６および／またはＩＬ−８を含むがこれらに限定されない）、ならびに／または１つ以上の主要な組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質（ヒトＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子、および／またはＨＬＡ−Ｃ遺伝子を含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない他のタンパク質の発現を減少させるように操作される。種々のさらなる実施形態では、細胞は、ＧＬＰ１受容体、インスリン受容体、およびサイトカインＩＬ１Ｂを含むがこれらに限定されない、インスリン産生細胞の生存および機能に有益な他のタンパク質の発現を増加させるように操作される。任意の適切なインスリン産生細胞を使用することができる。一実施形態では、インスリン産生細胞は、ヒト膵臓β細胞などの単離された膵臓β細胞を含む。
【実施例】
【００３０】
ここでは、Ｃａｖβ３がＣａ２＋動態の変化およびそれに続く糖尿病性膵島におけるインスリン分泌に主要な役割を果たしていることを報告する。糖尿病マウスからの膵島におけるＣａｖβ３のタンパク質レベルが上昇し、高グルコース濃度に応答した［Ｃａ２＋］ｉ動態が変化したことを観察した。Ｃａｖβ３の欠損は、糖尿病の進行中のＣａ２＋シグナル伝達の変化を阻止した。糖尿病マウスからの膵島におけるＣａｖβ３の発現の減少は、対照マウスの膵島と比較して、［Ｃａ２＋］ｉ動態およびインスリン分泌の改善を示し、マウスにおけるグルコース耐性の回復をもたらした。したがって、Ｃａｖβ３を標的とすることは、Ｔ２ＤＭなどの糖尿病の治療戦略になり得る。
【００３１】
結果
結果
ｏｂ／ｏｂマウスからの膵島は、Ｃａｖβ３を過剰発現し、［Ｃａ２＋］ｉ動態およびインスリン分泌を変化させた。
糖尿病マウスモデルであるＢ６．Ｃｇ−Ｌｅｐｏｂ／Ｊ（ｏｂ／ｏｂ）マウスを使用して、糖尿病とＣａｖβ３との関係を調べた。まず、８〜１２週齢のｏｂ／ｏｂマウスからの膵島におけるＣａｖβ３のタンパク質レベルを痩せ型マウスからの膵島におけるタンパク質レベルと比較した。ｏｂ／ｏｂマウスからの膵島におけるＣａｖβ３のタンパク質レベルが対照（痩せ型）マウスからの膵島における該タンパク質レベルよりもかなり高かった（図１Ａ）。Ｃａｖβ３−／−マウスの表現型がＣａ２＋シグナル伝達において振動周期が短く、グルコース誘発性インスリン分泌（ＧＩＩＳ）が改善されたと考慮して、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて反対の変化を予測した。ｏｂ／ｏｂマウスおよび痩せ型マウスからの膵島において高グルコース（１１ｍＭ）刺激時の［Ｃａ２＋］ｉ動態を測定した。代表的なＣａ２＋トレースを図１Ｂ、Ｃに示す。グルコース誘発性Ｃａ２＋トレースの最初のピーク振幅は、痩せ型マウスからの膵島におけるよりもｏｂ／ｏｂマウスからの膵島においてよりも低かった（図１Ｄ）。振動パターンの定量分析のために、パワースペクトル密度に基づいて振動の周期および振幅を分析した。ｏｂ／ｏｂマウスからの膵島は、痩せ型マウスの膵島よりも振動周期が長く、振動振幅が小さいことを示した（図１Ｅ、Ｆ）。Ｃａ２＋増加がＣａｖに依存しているかを確認するために、分離された膵島細胞を２５ｍＭのＫＣｌで脱分極させた。ｏｂ／ｏｂマウスからの膵島細胞における［Ｃａ２＋］ｉピークは、痩せ型マウスからの膵島細胞よりも低かった（図１Ｇ、Ｈ）。ＧＩＩＳは、痩せ型マウスからの膵島よりもｏｂ／ｏｂマウスからの膵島において低かった（図１Ｉ）。これらの結果と一致して、グルコース不耐性は、対照の痩せ型マウスよりもｏｂ／ｏｂマウスにおいてかなり高かった（図１Ｊ）。したがって、ｏｂ／ｏｂマウスからの膵島において、Ｃａｖβ３の過剰発現と、例えば、グルコース誘発性Ｃａ２＋増加の最初のピークの小さい振幅、長い振動周期／小さい振動振幅などの［Ｃａ２＋］ｉ動態の変化とを観察した。これらの変化により、ＧＩＩＳが損なわれ、インビボでグルコース耐性が全体的に損なわれる。
【００３２】
ＨＦＤ給餌マウスからの膵島は、Ｃａｖβ３を過剰発現し、変化した［Ｃａ２＋］ｉ動態およびインスリン分泌を示す。
次に、Ｔ２ＤＭの別のモデルである高脂肪食（ＨＦＤ）給餌マウスを用いて、Ｃａｖβ３と糖尿病との関係を調べた。ｏｂ／ｏｂマウスと同様に、Ｃａｖβ３タンパク質レベルは、８週間ＨＦＤを給餌したマウスからの膵島では、通常の固形飼料（ＮＣＤ）給餌マウスからの膵島よりも高かった（図２Ａ）。１１ｍＭのグルコース刺激時の代表的なＣａ２＋トレースを図２Ｂ、Ｃに示す。グルコース誘発性Ｃａ２＋トレースにおける最初のピーク振幅は、ＨＦＤ給餌マウスからの膵島では、ＮＣＤ給餌マウスの膵島と比較して低かった（図２Ｄ）。パワースペクトル密度に基づいて、ＨＦＤ給餌マウスからの膵島がより長い振動周期（図２Ｅ）とより小さい振動振幅（図２Ｆ）を生成することがわかった。しかし、２５ｍＭのＫＣｌは、ＨＦＤ給餌マウスからの膵島とＮＣＤ給餌マウスからの膵島の間でＣａ２＋流入に有意差を誘発しなかった（図２Ｇ、Ｈ）。それにもかかわらず、ＧＩＩＳは、ＨＦＤ給餌マウスからの膵島では、ＮＣＤ給餌マウスからの膵島よりも低かった（図２Ｉ）。ＨＦＤ給餌マウスは、ＮＣＤ給餌マウスよりも強いグルコース不耐性を示した（図２Ｊ）。まとめると、これらの結果は、ｏｂ／ｏｂマウスにおいてなされた観察と同様に、ＨＦＤ給餌マウスからの膵島におけるＣａｖβ３過剰発現、Ｃａ２＋動態およびインスリン分泌の変化を明らかにした。Ｃａｖβ３−／−マウスで得られた結果とは反対であったこれらの知見に基づいて、Ｃａｖβ３の過剰発現は、糖尿病性膵島における変化した［Ｃａ２＋］ｉ動態およびインスリン分泌の基礎をなす原因因子であり得ると推測した。
【００３３】
膵島でのＣａｖβ３過剰発現は、［Ｃａ２＋］ｉ動態およびインスリン分泌を変化させる
糖尿病性膵島における［Ｃａ２＋］ｉ動態変化およびインスリン分泌障害がＣａｖβ３過剰発現に直接起因するかどうかを調べるために、Ｃａｖβ３を過剰発現するＣ５７ＢＬ／６マウスからの膵島においてこれらのパラメータを測定し（図３Ａ）、対照マウスからの膵島と比較した。グルコース誘発性Ｃａ２＋トレースにおける最初のピーク振幅は、Ｃａｖβ３を過剰発現する膵島では、緑色蛍光タンパク質を発現する対照島よりも低かった（図３Ｂ〜Ｄ）。対照マウスからのものと比較して、Ｃａｖβ３過剰発現マウスからの膵島において振動周期が長く、振動振幅が小さかった（図３Ｅ、Ｆ）。２５ｍＭのＫＣｌで分離された膵島細胞の脱分極時に、Ｃａｖβ３を過剰発現する膵島細胞における［Ｃａ２＋］ｉピーク振幅は、対照膵島細胞におけるピーク振幅よりも低かった（図３Ｇ、Ｈ）。本出願者の以前の研究では、ＥＲからのＩＰ３媒介Ｃａ２＋放出の増加は、Ｃａｖβ３ＫＯ膵島における［Ｃａ２＋］ｉの発振周波数およびインスリン分泌の変化に寄与し得ることを示唆した（Ｂｅｒｇｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。この機構が、Ｃａｖβ３を過剰発現する膵島に関与しているかどうかを確認するために、カルバミルコリン（Ｃｃｈ）でＣａｖβ３を過剰発現する膵島細胞と、対照膵島細胞とを刺激し、リン作動性／ＩＰ３シグナル伝達経路を誘発する。Ｃａｖβ３を過剰発現する膵島細胞の［Ｃａ２＋］ｉ増加をもたらすピークは、対照におけるピークよりも低かった（図３Ｉ）。ＧＩＩＳも、Ｃａｖβ３を過剰発現する膵島細胞において１１ｍＭのグルコースで刺激した後に低かった（図３Ｊ）。Ｃａｖβ３を過剰発現する膵島または膵島細胞で得られた結果はｏｂ／ｏｂマウスおよびＨＦＤ給餌マウスにおける知見と一致した。Ｃａｖβ３レベルが糖尿病性膵島においてどのように上昇し得るかに光を当てるために、いくつかの要因、例えば、グルコース、インスリン、糖尿病の進行と関連することが知られている炎症性サイトカインの、などいくつかの要因の潜在的影響を調べた。ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１βは、単離された膵島においてＣａｖβ３のタンパク質レベルをかなり増加させた（データ不図示）。これは、炎症誘発性サイトカインが膵島においてＣａｖβ３の過剰発現を誘発することができ、それによって膵島細胞機能障害が引き起こされることを示唆する。
【００３４】
ＨＦＤに曝露されたＣａｖβ３−／−マウスからの膵島は、［Ｃａ２＋］ｉ動態およびインスリン分泌を回復させた。
Ｃａｖβ３がＨＦＤモデルにおいて観察された膵島機能障害における直接的な役割を有するかどうかを調べた。Ｃａｖβ３−／−マウスおよびそれらの同腹仔対照に８週間ＨＦＤを給餌したが、体重変化の有意差は、２つの群の間で観察されなかった（データ不図示）。次に、対照マウスおよびＣａｖβ３−／−マウスからの膵島において［Ｃａ２＋］ｉ動態を調べた（図４Ｂ、Ｃ）。グルコース誘導性Ｃａ２＋トレースの最初のピーク振幅は、ＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウスからの膵島では、ＨＦＤ給餌対照動物からのものよりも高かった（図４Ｄ）。Ｃａｖβ３−／−膵島は、より短い振動周期およびより大きな振幅を示した（図４Ｅ、Ｆ）。２５ｍＭのＫＣｌでの刺激後、Ｃａｖβ３−／−膵島細胞および対照膵島細胞の間に［Ｃａ２＋］ｉピークに有意差はなかった（図４Ｇ、Ｈ）。これは、ＮＣＤ給餌対照マウスからの膵島およびＨＦＤ給餌対照マウスからの膵島における同様のＫＣｌ刺激応答と一致していた（図２Ｈ）。Ｃａｖβ３−／−マウスおよびそれらの同腹仔のＨＦＤ給餌対照からの膵島におけるＣｃｈの影響を比較した。対照膵島と比較すると、Ｃａｖβ３−／−膵島は、［Ｃａ２＋］ｉピークの増加を示し（図４Ｉ）、これはＣａｖβ３を過剰発現する膵島においてＣｃｈ影響と一致している（図３Ｉ）。ＨＦＤ給餌マウスからの膵島における損なわれたＧＩＩＳもＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウスからの膵島において改善された（図４Ｊ）。［Ｃａ２＋］ｉ動態およびインスリン分泌の結果と一致して、ＨＦＤでＣａｖβ３−／−マウスでのグルコース耐性は、対照マウスにおけるグルコース耐性よりも良好であった（図４Ｋ）が、一方インスリン耐性は大きく異なっていなかった（データ不図示）。グルコース注射後３０分で血漿インスリンレベルは、ＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウスにおいて高かった（図４Ｌ）。空腹時インスリンレベルは、痩せ型マウスと比較して、ＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウスにおいて大きく異なっていなかった（データ不図示）にもかかわらず、非空腹時インスリンレベルは、ＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウスにおいて高かった（データ不図示）。したがって、インビボでＧＩＩＳの増加は、おそらくＨＦＤ給餌Ｃａｖβ３−／−マウスにおける良好なグルコース耐性の説明となるであろう。これらの観察に基づいて、Ｃａｖβ３の過剰発現が糖尿病発症において膵島機能障害を引き起こす重要な要因であり、Ｃａｖβ３レベルを調節することにより、膵島機能およびグルコース恒常性の改善につながり得ることを示唆する。
【００３５】
Ｃａｖβ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置により、ｏｂ／ｏｂ膵島における［Ｃａ２＋］ｉ動態およびインスリン分泌が改善される。
次の問題は、Ｃａｖβ３の発現を減少させることにより、糖尿病の発症状態におけるＣａ２＋動態およびインスリン分泌を改善し得るかどうかであった。Ｃａｖβ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｃａｖβ３ＡＳＯ）で処置することにより、８〜１２週齢のマウスからのｏｂ／ｏｂ膵島でこの考えを検証した。Ｃａｖβ３ＡＳＯによる処置は、ｏｂ／ｏｂ膵島におけるＣａｖβ３発現を効果的に減少させた（図５Ａ）。Ｃａｖβ３ＡＳＯまたはスクランブルＡＳＯで処置したｏｂ／ｏｂ膵島におけるグルコース誘発性Ｃａ２＋動態を測定した（図５Ｂ、Ｃ）。グルコース誘導性Ｃａ２＋トレースの最初のピーク振幅は、Ｃａｖβ３ＡＳＯ処置後のｏｂ／ｏｂ膵島においてかなり高かった（図５Ｄ）。パワースペクトル分析によって示したように、Ｃａｖβ３ＡＳＯで処置した膵島は、短い振動周期（図５Ｅ）および大きな振幅（図５Ｆ）を示した。２５ｍＭのＫＣｌで刺激すると、Ｃａｖβ３ＡＳＯで処置した分離された膵島細胞は、スクランブルＡＳＯで処置した膵島細胞よりも高いＣａ２＋ピーク比を示した（図５Ｇ、Ｈ）。さらに、スクランブルＡＳＯでの処置と比較して、Ｃａｖβ３ＡＳＯでの処置は、ｏｂ／ｏｂマウスからの膵島細胞におけるＣｃｈ誘発性Ｃａ２＋放出を増加させた（図５Ｉ）。Ｃａ２＋流入結果と一致して、Ｃａｖβ３ＡＳＯで処置した膵島はＧＩＩＳの改善を示した（図５Ｊ）。
【００３６】
Ｃａｖβ３−／−膵島の移植は、ＨＦＤ給餌マウスの血糖コントロールを改善する
インビボでの糖尿病発症後、膵島においてＣａｖβ３を標的とする影響を評価するために、Ｃａｖβ３−／−マウスおよび対照同腹仔からの膵島を糖尿病マウスの前眼房内に移植した。実験の全期間中、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＨＦＤを与えた。８週間のＨＦＤ給餌後、内因性膵島の影響を避けるために、動物にストレプトゾトシンの処置を施した。その後、膵島移植を行った（図６Ａ、Ｂ）。３週間後、インビボで膵島の血管新生を画像化した（図６Ｃ）。膵島内部の血管の直径は、Ｃａｖβ３−／−膵島移植マウスおよび対照膵島移植マウスの間で大きく異なっていなかった（データ不図示）。血中グルコースレベルは、Ｃａｖβ３−／−膵島移植マウスおよび対照膵島移植マウス双方とも減少した（データ不図示）。４週間後、移植した膵島が完全に血管新生され神経支配されると、グルコース耐性試験を実施した。移植から５週間後、Ｃａｖβ３−／−膵島を移植したマウスにおけるグルコース耐性は、対照膵島を移植したマウスと比較して改善された。グルコース耐性がより大きく改善された、移植後６週間で得られた結果を示した。曲線下面積は、対照膵島を移植したマウスと比較して、Ｃａｖβ３−／−膵島を移植したマウスにおいてかなり低かった（図６Ｄ）。しかし、インスリン耐性は大きく異なってなかった（図６Ｅ）。手短に言えば、Ｃａｖβ３−／−膵島を移植したマウスにおいてグルコースクリアランスは改善したが、インスリン感受性は改善しなかった。これらの結果は、糖尿病の発症後にＣａｖβ３を抑制すると、マウスにおいて糖尿病表現型をかなり改善し得ることを示唆する。
【００３７】
Ｃａｖβ３の過剰発現は、ヒト膵島においてＧＩＩＳを破壊する
ヒト膵島においてＣａｖβ３が機能するかどうかを調べるために、アデノウイルスを使用して個々のドナーからの膵島においてＣａｖβ３を過剰発現し（図７Ａ）、ＧＩＩＳを測定した。てＣａｖβ３の過剰発現は、高濃度のグルコースの存在下で特異的にインスリン分泌を減少させたのに対して、基礎インスリン分泌には影響を及ぼさなかった（図７Ｂ、Ｃ）。これらの結果は、Ｃａｖβ３の過剰発現が、げっ歯類の膵島におけるようにヒト膵島において同様の役割を有する可能性がある、すなわちＧＩＩＳを減少させることを示唆している。
【００３８】
考察
本試験では、Ｃａｖβ３が、糖尿病マウスの膵島において過剰発現し、これはＴ２ＤＭの進行にとって重要であることを示した。ＡＳＯ処置および膵島移植で得られた結果に基づいて、Ｃａｖβ３がＴ２ＤＭの治療のための標的になり得ることを示唆する。
【００３９】
膵島におけるＣａｖβ３の過剰発現により、糖尿病の進行の間にＣａ２＋動態の変化が引き起こされた。ｏｂ／ｏｂマウスおよびＨＦＤ給餌マウスからの膵島を使用した本実験では、これらの表現型はＣａｖβ３の過剰発現と同時に起こり、Ｃａｖβ３の過剰発現自体がＣａ２＋動態で同様の変化を誘発したことが一貫して観察された。糖尿病性膵島におけるＣａｖβ３発現を減少させた一連の実験では、Ｃａ２＋動態の変化を元に戻した。まとめると、これらの結果は、Ｃａｖβ３が、糖尿病マウスの膵島におけるＣａ２＋動態の変化の原因であることを示している。
【００４０】
糖尿病治療のための潜在的な標的としてのＣａｖβ３を提案する。ｏｂ／ｏｂ膵島におけるＣａｖβ３のレベルを減少させると、それらのＧＩＩＳが回復し、ＨＦＤ誘発性糖尿病マウスへのＣａｖβ３−／−膵島の移植は、グルコース耐性を回復し得ることを示した。インスリン分泌アッセイは、Ｃａｖβ３の操作は、高いグルコース濃度でのみ分泌に影響を及ぼすことを示した（図４Ｌ）。これは、Ｃａｖβ３を標的とすることは、Ｔ２ＤＭ患者においてインスリン分泌を増大させる戦略に関連した主要な問題の１つである、低血糖症のリスクに関連していないことを意味する。Ｃａｖβ３の過剰発現がヒト膵島においてもＧＩＩＳを減少させた（図７）ことを示す我々のデータは、Ｃａｖβ３が実際に糖尿病の治療における有望な臨床目標を表し得るという考えを支持している。Ｃａｖβ３を標的とする糖尿病の治療戦略を開発するために、２つのアプローチを考えることができる。１つは、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡ治療によって膵島におけるＣａｖβ３のレベルを減少させること、あるいは、Ｃａｖβ３の内因性発現レベルが抑制されている膵島を移植することである。他のアプローチは、Ｃａｖβ３の機能をブロックすることである。
【００４１】
方法の詳細
実験動物飼育および膵島／細胞の準備
すべての実験手順は、浦項工科大学校の動物実験倫理委員会（ＰＯＳＴＥＣＨ−２０１５−００５５−Ｒ１、ＰＯＳＴＥＣＨ  ＩＡＣＵＣ、Ｋｏｒｅａ）によって承認された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｂ６．Ｃｇ−Ｌｅｐｏｂ／Ｊ雄マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）を用いた。Ｃａｖβ３−／−マウスを１８世代にわたって生成し、戻し交配した。Ｃａｖβ３ヘテロ接合体（Ｃａｖβ３＋／−）マウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊに戻し交配した。分析用に用いた野生型（Ｃａｖβ３＋／＋）マウスおよびＣａｖβ３−／−マウスは、Ｃａｖβ３＋／−マウスを交配によって得た。動物を、水を自由に摂取できる１２時間明／暗サイクルで維持した。ＣＯ２による麻酔下で、頸椎脱臼によりマウスを犠牲にした。４週齢のマウスに６０％ＨＦＤ（Ｄ１２４９２，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ）を８週間与え、体重と摂餌量をモニターした。ランゲルハンス島を、コラゲナーゼ消化（１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＰ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって単離し、その後実体顕微鏡下で精選した。実験前に、膵島を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で、３７℃で、空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で一日培養した。単一の膵島細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）によるＣａ２＋を含まない培地中で膵島を振とうすることにより得られ、ポリ−Ｌ−リジン被覆ガラス上に播種し、ＲＰＭＩ１６４０培地で一晩培養した。炎症性サイトカインによる治療のために、膵島をプールし、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で、３７℃で、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で２４時間、２０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）または２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でインキュベートした。
【００４２】
［Ｃａ２＋］ｉ測定
［Ｃａ２＋］ｉはＦｕｒａ２−ＡＭ法を用いて測定した。膵島または膵島細胞をＨＥＰＥＳ緩衝液（１２５ｍＭのＮａＣｌ、５．９ｍＭのＫＣｌ、２．５６ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、３ｍＭのグルコース、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中Ｆｕｒａ２（商標）−ＡＭ（２μｍｏｌ／Ｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と共に、５％ＣＯ２下、３７℃で３０分間インキュベートした。ロード後、膵島と細胞を含むガラスカバースリップを開放灌流チャンバーにマウントし、３７℃に維持し、［Ｃａ２＋］ｉを３４０／３８０ｎｍの蛍光比として測定した。膵島を１１ｍＭのグルコース、２５ｍＭのＫＣｌ、または２００ｕＭのＣｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した。光源には、キセノンアークランプおよび一体型シャッター（Ｌａｍｂｄａ  ＤＧ−４；Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）が装備され、液体ライトガイドを介して顕微鏡（ＩＸ ７１；Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に連結させた。冷却されたＥＭ−ＣＣＤカメラ（ＩｍａｇＥＭ（商標）Ｘ２；Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を使用して、ビニングが１×１の１６ビットグレースケール画像を毎秒（露光時間約１００ｍｓ）キャプチャした。カメラおよびシャッターをＭｅｔａＦｌｕｏｒ（商標）ソフトウェア（ＭＤＳ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって制御した。データは同じソフトウェアで分析した。明るい［Ｃａ２＋］ｉ信号を有する細胞を関心領域（ＲＯＩ）と定義した。ＲＯＩ信号は、バックグラウンドノイズ信号を差し引くことによって計算した。［Ｃａ２＋］ｉ振動は、Ｍａｔｌａｂ（商標）（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）のパワースペクトル分析を使用して、膵島の振動の分析に適合したコード（Ｕｈｌｅｎ、２００４）を変更して分析した。振動振幅値は、６〜６００秒の期間の総電力の平方根として計算した。高速フーリエ変換パワースペクトルを使用して、それぞれのパワースペクトルから優位を占める振動周期を決定した。
【００４３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット分析
膵島をＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液で溶解し、９５°Ｃで５分間加熱した。タンパク質をＳＤＳ−ｐａｇｅゲル（６〜１６％勾配）で分離し、ニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，ＵＫ）に移した。ブロットを、５％脱脂乳で３０分間ブロックし、Ｃａｖβ３抗体（１：２０００、Ｃ１９７８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＢＩＰ（１：１０００、３１７７、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ＡＴＦ−６α（１：１００、ｓｃ−１６６６５９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）またはＡＲＥ１α（１：１０００、３２９４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に４°Ｃで一晩インキュベートし、洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓアミノメタン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した。ニトロセルロース膜を二次抗体（ウサギ）と共に室温で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。免疫反応性バンドをＥＣＬ  Ｐｌｕｓイムノブロッティング検出システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で視覚化した。
【００４４】
組換えアデノウイルスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド
Ｃａｖβ３コンストラクトを過剰発現するアデノウイルスを、Ｆｌａｇ２−野生型またはＦｌａｇ２−Ｃａｖβ３のいずれかを担持する線形化ｐＡｄ−Ｔｒａｃｋ（商標）−ＣＭＶベクターと、アデノウイルス骨格ベクターｐＡｄ−Ｅａｓｙ（商標）との間の相同組換えを介して生成した。アドグリーン蛍光タンパク質をすべての実験の対照として使用した。ウイルスをＡｄｅｎｏ−Ｘ  Ｍａｘｉ精製キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で精製し、メーカーの指示に従って滴定した。マウスＣａｖβ３を標的とした、１〜５および１６〜２０位に２’−Ｏ−メトキシエチル基を含む一連のキメラ２０−ｍｅｒのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成および精製した（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）。アデノウイルスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを、培地中の膵島にそれぞれ４時間および一晩直接添加した。
【００４５】
グルコースよびインスリンの耐性試験
グルコース耐性試験では、マウスを一晩絶食させ、１ｇ／ｋｇのＤ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内注射した。インスリン耐性試験では、マウスを４時間絶食させ、０．２Ｕ／ｋｇのインスリン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）を腹腔内注射した。血液試料を注射から０、１５、３０、６０、および１２０分後に尾部出血によって採取した。血糖値は、血糖値計（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ（商標）Ａｃｔｉｖｅ，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して決定した。
【００４６】
インスリン放出
対応するマウスから単離された１０個の膵島をプールし、ＨＥＰＥＳ緩衝液中３ｍＭまたは１１ｍＭのグルコースで、３７℃で３０分間インキュベートした。調整した緩衝液を収集し、メーカーの指示に従って、ラット／マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（ＡＬＰＣＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）を使用してインスリン濃度を測定した。ＧＳＩＳデータを膵島の数によって正規化する。ヒト膵島での実験のために、Ａｄ−ＧＦＰまたはＡｄ−Ｃａｖβ３に感染した１０個のヒト膵島の群をＫｒｅｂｓ緩衝液中３ｍＭのグルコースと共に３７℃で、１時間プレインキュベートした。続いて、プレインキュベートした膵島を、Ｋｒｅｂｓ緩衝液中３ｍＭグルコース、次いで１１ｍＭグルコースと共に３７℃で１時間処置した。インスリン分泌アッセイのために試料を収集した。収集された試料中のインスリン濃度は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（商標）アッセイを用いて決定した。Ｋｒｅｂｓ緩衝液は、１１９のＮａＣｌ、２０のＨＥＰＥＳ、４．６のＫＣｌ、２のＣａＣｌ２、１のＭｇＳＯ４、０．１５のＮａ２ＨＰＯ４、０．４のＫＨ２ＰＯ４、５のＮａＨＣＯ３および０．１％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）（単位：ｍＭ）からなる。ヒト膵島は、亡くなったドナーから膵島移植のためのＮｏｒｄｉｃ  Ｎｅｔｗｏｒｋ内で入手した。本試験には、３名のドナーからの膵島が含まれている。実験は、ウプサラおよびストックホルムの地域倫理審査委員会によって承認された。
【００４７】
膵島移植
マウスを一晩絶食させた後、腹腔内注射により１５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を注射した。血糖値が＞３００ｍｇ／ｄＬであったとき、血糖を維持するために０．２Ｕ／ｋｇ／日のインスリン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．）を注射した。膵島はドナーマウスから単離し、約１００個の膵島がレシピエントマウスの前眼房に移植された（Ｓｐｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００４８】
電気生理学的記録
アデノウイルスに感染した単一膵島細胞を、ＥＰＣ−１０パッチクランプ増幅器（ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ，Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ／Ｐｆａｌｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた従来の全細胞パッチクランプ分析に供した。細胞を、外部溶液（１３８ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴＥＡＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、５．６ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、３ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４）に浸した。ホウケイ酸ガラス電極（外径１．２ｍｍ、Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｈａｍｄｅｎ，ＣＴ）を垂直ピペットプラー（ＰＣ−１０、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で引っ張り、記録ピペットをピペット溶液（１５０ｍＭのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン、２ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．２）で充填すると、記録ピペットの先端抵抗は、２〜３ＭΩの範囲であった。すべての記録は室温で行なった。全細胞のＣａ２＋電流の振幅を細胞容量に対して正規化した。データの取得および分析は、Ｐａｔｃｈｍａｓｔｅｒ（ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ）を使用して行った。
【００４９】
統計
すべての結果は、平均±ＳＥＭとして表す。ペアワイズ比較には、対応のないスチューデントのｔ検定を使用した。グルコースおよびインスリンの耐性試験の結果の統計的有意性は、二元配置反復測定分散分析と、それに続くボンフェローニの補正との多重比較によって評価した。０．０５未満のｐ値は、統計的に有意であると見なされた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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