(57)【要約】【課題】ＣＤ１３７アゴニスト分子の臨床開発は、治療が用量制限高度肝炎（ウレルマブ）又は低い臨床的有効性（ウトミルマブ）のいずれかを伴うため、遅れている。【解決手段】本出願は、ＣＤ１３７に結合する抗体分子に関する。この抗体分子は、癌及び感染症などの疾患及び障害の治療及び診断に利用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１３７に結合する抗体分子であって、前記抗体分子の抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号３０、３２、３８、１７、１９及び２２のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−１６；
（ｉｉ）配列番号３０、３２、３４、１７、１９及び２２のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−３；
（ｉｉｉ）配列番号３０、３２、３６、１７、１９及び２２のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−１２；
（ｉｖ）配列番号６２、６４、６６、１７、１９及び２３のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−３５−１４；又は
（ｖ）配列番号７、９、１１、１７、１９及び２１のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−５−３７
の相補性決定領域（ＣＤＲ）１から６を含み；
前記ＣＤＲ配列が、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従って定義される、抗体分子。
【請求項２】
前記抗体分子が、
（ｉ）配列番号５４及び４８のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−１６；
（ｉｉ）配列番号２８及び４８のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−３；
（ｉｉｉ）配列番号４４及び４８のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−１２；
（ｉｖ）配列番号６０及び７０のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−３５−１４；又は
（ｖ）配列番号５及び１５のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−５−３７
の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項３】
前記抗体分子の前記抗原結合部位が、配列番号３０、３２、３８、１７、１９及び２２のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−１６のＣＤＲ１〜６を含む、請求項１又は２に記載の抗体分子。
【請求項４】
前記抗体分子が、配列番号５４及び４８のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−１６のＶＨ及びＶＬドメインを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項５】
前記抗体分子が、多重特異的抗体分子である、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項６】
前記抗体分子が、前記抗体分子の定常ドメイン中に位置する第２の抗原に結合する第２の抗原結合部位を含む、請求項５に記載の抗体分子。
【請求項７】
前記定常ドメインが、ＣＨ３ドメインである、請求項６に記載の抗体分子。
【請求項８】
前記第２の抗原が、免疫細胞抗原、腫瘍抗原、又は病原性抗原である、請求項６又は７に記載の抗体分子。
【請求項９】
前記第２の抗原結合部位が、第１の配列、第２の配列、及び／又は第３の配列を含み、前記第１の配列、第２の配列及び第３の配列がそれぞれ、前記定常ドメインのＡＢ、ＣＤ、及びＥＦ構造ループ中に位置する、請求項６から８のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項１０】
前記抗体分子が、前記第２の抗原の存在下で、免疫細胞上のＣＤ１３７を活性化することが可能である、請求項６から９のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項１１】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項１０に記載の抗体分子。
【請求項１２】
前記抗体分子が、１つ以上のＦｃγ受容体への前記抗体分子のＣＨ２ドメインの結合を低減又は抑制するように修飾されている、請求項１から１１のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項１３】
前記抗体分子が、１つ以上のＦｃγ受容体に結合しない、請求項１から１２のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の抗体分子及び生物活性分子を含むコンジュゲート。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の抗体分子をコードする１つ又は複数の核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を含むベクター又は一連のベクター。
【請求項１７】
請求項１５に記載の核酸分子、又は請求項１６に記載のベクターを含む組み換え宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の抗体分子を産生する方法であって、前記抗体分子の産生のための条件下で、請求項１７に記載の組み換え宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項１９】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の抗体分子又はコンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項２０】
治療法によるヒト身体の治療のための方法に使用するための、請求項１から１４のいずれか１項に記載の抗体分子又はコンジュゲート。
【請求項２１】
個体における癌又は感染症を治療する方法に使用するための、請求項１から１４のいずれか１項に記載の抗体分子又はコンジュゲート。
【請求項２２】
試料におけるＣＤ１３７の存在を検出するための、請求項１から１３のいずれか１項に記載の抗体分子の使用。
【請求項２３】
個体における癌を検出又は診断するインビトロ方法であって、請求項１から１３のいずれか１項に記載の抗体を用いて、前記個体から得られた腫瘍試料における細胞表面にＣＤ１３７を含む細胞を検出することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＣＤ１３７に結合する抗体分子に関する。この抗体分子は、癌及び感染症などの疾患及び障害の治療及び診断に利用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞シグナル伝達は、全ての生物の生命に不可欠な部分であり、通常、可溶性リガンド又は表面で発現されるリガンドと相互作用する細胞表面受容体を必要とする。この相互作用は、受容体、リガンド又はその両方に変化をもたらす。例えば、リガンド結合は、受容体を一緒にクラスター化させて二量体又はオリゴマーにする、受容体の構造変化を誘発し得る。次に、このクラスター化効果が、細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらす。ＣＤ１３７などの、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーを含む、このように活性化される多くの受容体がある。
【０００３】
ＣＤ１３７（４−１ＢＢ；ＴＮＦＲＳＦ９）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）の共刺激分子である。ＣＤ１３７は、活性化の後、ＣＤ８＋  Ｔ細胞において上方制御されることが広く知られており、また、活性化ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞及び樹状細胞（ＤＣ）において発現され得る（Bartkowiak & Curran,2015）。Ｔ細胞細胞毒性の促進におけるＣＤ１３７の主な機能的役割が、１９９７年に初めて説明され（Shuford et al.,1997）、その後すぐに、抗ＣＤ１３７  ｍＡｂが、抗癌治療薬として提案された。
【０００４】
ＣＤ１３７は、ＣＲＤ１−４と呼ばれる４つの細胞外システインリッチドメイン、及びＣＤ１３７シグナル伝達に関与する細胞質領域を有する膜貫通タンパク質である。ＣＤ１３７のためのリガンドはＣＤ１３７Ｌである。ＣＤ１３７が、ＣＤ１３７Ｌとともに三量体／三量体複合体を形成することが予測されており（Won et al.,2010）、ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ複合体のＸ線結晶構造の決定により、３つのモノマーＣＤ１３７受容体が、ＣＤ１３７Ｌ三量体に結合することが確認された（Li et al.,2018）。ＣＤ１３７Ｌのエンゲージメントは、受容体三量体の形成及びその後の複数の受容体三量体のクラスター化をもたらし、ＣＤ１３７シグナル伝達カスケードの活性化につながる。このシグナル伝達カスケードは、活性化誘導細胞死に対してＴ細胞に生存シグナルを与え（Hurtado et al.,1997）、それによって、有効なＴ細胞免疫応答を維持し、免疫記憶を生成するのに重要な役割を果たす（Bartkowiak & Curran,2015）。
【０００５】
白血球生物学におけるＣＤ１３７の役割が、腫瘍免疫学におけるその役割の陰で、明らかな生物学的合理性を有して一般に十分に理解されている。ＣＤ１３７は、活性化Ｔ細胞によって発現され、抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞を同定するマーカーとして使用されている。典型的に、ＣＤ１３７の発現は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞よりＣＤ８＋  Ｔ細胞においてより高い（Wen et al.,2002）。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の場合、インターフェロンγ及びインターロイキン２の産生を介した増殖、生存及び細胞傷害性エフェクター機能が、ＣＤ１３７のクラスター化に起因するとされてきた。ＣＤ１３７のクラスター化はまた、メモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞の分化及び維持に寄与する。ＣＤ４＋  Ｔ細胞のいくつかのサブセットにおいて、ＣＤ１３７のクラスター化は、同様に、増殖及び活性化につながり、インターロイキン２などのサイトカインの放出をもたらす（Makkouk et al.,2016）。
【０００６】
腫瘍標的化ｍＡｂを介したナチュラルキラー（ＮＫ）媒介性抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）は、インビトロ及びインビボのアゴニスト抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体を介したＣＤ１３７刺激の結果として増強されることが実証されている（Bartkowiak & Curran,2015）。ＮＫ細胞は、抗体アイソタイプに応じて、それらのＦｃ受容体を介して抗体に結合し、これは、ＮＫ細胞活性化につながり得、細胞傷害性顆粒放出及び標的細胞の溶解を引き起こす（Kohrt et al.,2012）。Kohrtらは、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体が、併用して投与される場合にＡＤＣＣを増強することによって、治療用抗体リツキシマブ、トラスツズマブ、及びセツキシマブの抗腫瘍活性を増強したことを実証した（Kohrt et al.,2014；Kohrt et al.,2011）。さらに、ヒトＮＫ細胞は、それらのＦｃγＲを介して細胞結合抗体に遭遇した後、ＣＤ１３７の発現を上方制御する。抗ＣＤ１３７抗体によるこれらのＮＫ細胞のその後の刺激は、腫瘍細胞に対してそれらのＡＤＣＣを増強することが示されている（Chester et al.,2015；Chester et al.,2016）。
【０００７】
Ｂリンパ球も、活性化時にＣＤ１３７を発現する。ＣＤ１３７リガンドの、ＣＤ１３７への結合は、Ｂ細胞増殖、生存及びサイトカイン産生を促進する。ＣＤ１３７発現はまた、ＣＤ４０の、そのリガンドＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド）への結合の後、正常及び悪性ヒトＢ細胞において誘導されて、ＣＤ１３７が後に活性化される場合、Ｂ細胞生存の促進をもたらす（Vinay and Kwon,2011）。
【０００８】
ＣＤ１３７はまた、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の腫瘍反応性サブセットにおいて発現されることが実証されている。ＣＤ１３７単独療法は、ＭＣ３８、ＣＴ２６及びＢ細胞リンパ腫などのいくつかの前臨床免疫原性腫瘍モデルにおいて有効であることが示されている。化学療法、サイトカイン及び他のチェックポイント調節因子などの他の抗癌剤とのＣＤ１３７のエンゲージメントの組合せが、定着腫瘍の成長の低下を促進することが実証されている。具体的には、抗ＣＤ１３７抗体と、抗ＣＤ２０、抗ＥＧＦＲ、及び抗ＨＥＲ−２抗体の組合せが、様々な前臨床異種移植片モデルにおいて腫瘍成長の低下に対する相乗効果をもたらすことが示されている（Kohrt et al.,2014；Kohrt et al.,2012；Kohrt et al.,2011）。
【０００９】
腫瘍標的化モノクローナル抗体療法を、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体による治療と組み合わせることは、リンパ腫（Kohrt et al.,2011）、頭頸部癌、結腸直腸癌（Kohrt et al.,2014）及び乳癌（Kohrt et al.,2012）の前臨床モデルにおいて有望な結果を示した。抗ＣＤ２０  ｍＡｂリツキシマブ（ＮＣＴ０１３０７２６７、ＮＣＴ０２９５１１５６）、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂセツキシマブ（ＮＣＴ０２１１００８２）及び抗ＣＳ１  ｍＡｂエロツズマブ（ＮＣＴ０２２５２２６３）を含む、いくつかの腫瘍標的化モノクローナル抗体がまた、臨床においてＣＤ１３７アゴニスト抗体と組み合わせて試験されてきた。しかしながら、ＣＤ１３７アゴニスト抗体治療に関連する用量制限高度肝炎のため、臨床開発が遅れている。ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）、非リガンドブロッキングヒトＩｇＧ４アイソタイプ抗体（Chester et al,2018）が、臨床試験に入った最初の抗ＣＤ１３７抗体であったが、これらは、顕著なオンターゲット用量依存性肝毒性が観察された後、停止された（Chester et al.,2018）。より最近では、ウレルマブ治療を、放射線療法（ＮＣＴ０３４３１９４８）又は他の治療用抗体、例えば、リツキシマブ（ＮＣＴ０１７７５６３１）、セツキシマブ（ＮＣＴ０２１１００８２）、抗ＰＤ−１抗体ニボルマブ（ＮＣＴ０２２５３９９２、ＮＣＴ０２５３４５０６、ＮＣＴ０２８４５３２３）、及びニボルマブと抗ＬＡＧ−３抗体ＢＭＳ９８６０１６との組合せ（ＮＣＴ０２６５８９８１）と組み合わせた、固形癌の治療におけるウレルマブの臨床試験が再開された。しかしながら、ウレルマブ治療に関連する肝毒性を低減するために、これらの試験におけるウレルマブの投与は制限される必要があり、有効性の結果は残念なものであった（Chester et al.,2018）。
【００１０】
進行癌の第Ｉ相臨床試験において、０．０３ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇまでの用量範囲のPfizerの抗ＣＤ１３７抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）、ヒトＩｇＧ２アイソタイプ抗体では、用量制限毒性が観察されなかった（Chester et al.2016；Segal et al.,2018）。しかしながら、この抗体による全客観的奏効率は、固形腫瘍を有する患者の３．８％に過ぎず、これは、ウトミルマブが、より有利な安全性プロフィールを有しつつも、ウレルマブより弱い効力及び臨床的有効性を有する可能性があることを示している（Chester et al.,2018；Segal et al.,2018）。ウトミルマブは、様々な治療の組合せの安全性、忍容性、用量制限毒性（ＤＬＴ）、最大耐量（ＭＴＤ）及び有効性を評価するために、放射線療法（ＮＣＴ０３２１７７４７）若しくは化学療法と組み合わせて、並びに他の抗体療法（抗ＰＤ−Ｌ１抗体アベルマブ（ＮＣＴ０２５５４８１２）、及び抗ＰＤ−１抗体ペンブロリズマブ（ＮＣＴ０２１７９９１８）を含む）と組み合わせて試験されてきた。これらの試験は、現在進行中であり、初期結果は、ウトミルマブ及びペンブロリズマブの組合せについて、５ｍｇ／ｋｇまでの用量についてＤＬＴがないこと及び２６％の患者の奏効率を示している。ウトミルマブと、アベルマブ及び他の癌免疫療法との３剤併用も試験されている（ＮＣＴ０２５５４８１２、ＮＣＴ０３２１７７４７）。
【００１１】
ＣＤ１３７を標的とするいくつかの二重特異的分子も、開発の初期段階にあり、その多くが、非抗体ベースの足場タンパク質又は融合タンパク質技術に基づいている。ＤＡＲＰｉｎ足場タンパク質ベースの技術を用いたＣＤ１３７及びＦＡＰαを標的とする二重特異的分子の開発が報告されている（Link et al.,2018；Reichen et al.,2018）。ＨＥＲ２標的化及びＥｐｈＡ２標的化ＤＡＲＴ分子を用いたＣＤ１３７アゴニズムの腫瘍標的化によるＴ細胞活性化も示されている（Liu et al.,2017）。固形腫瘍及びリンパ腫中のＦＡＰα又はＣＤ１９を介して腫瘍を標的とするＣＤ１３７Ｌ融合タンパク質も開発されている。最も臨床的に進歩したＣＤ１３７二重特異的分子（且つ完全長抗体を含有する唯一のもの）は、ＰＲＳ−３４３、ＣＤ１３７／ＨＥＲ２二重特異的分子である。この分子において、ＣＤ１３７は、ＩｇＧ４フォーマットにおけるＨＥＲ２標的化抗体トラスツズマブのＦｃ部分に結合された人工結合タンパク質（アンチカリン）を介して結合される。ＰＲＳ−３４３は、ＨＥＲ２がヒト化マウスモデルにおいて過剰発現される部位におけるリンパ球上のＣＤ１３７の腫瘍標的依存性活性化を提供することが報告されているが、トラスツズマブ治療単独を超える腫瘍成長阻害の改善は観察されなかった（Hinner et al.,2016及び国際公開第２０１６／１７７８０２  Ａ１号）。ＰＲＳ−３４３は、最近、その安全性、忍容性及び有効性を評価するために、様々な固形腫瘍の治療のための第Ｉ相臨床試験に入った（ＮＣＴ０３３３０５６１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
発明の記述
上記の背景技術の項において説明されるように、ＣＤ１３７アゴニスト分子の臨床開発は、治療が用量制限高度肝炎（ウレルマブ）又は低い臨床的有効性（ウトミルマブ）のいずれかを伴うため、遅れている。
【００１３】
本発明者らは、向上した臨床的有効性を示すが、用量制限肝炎に関連しないＣＤ１３７アゴニスト分子が当該技術分野において必要とされていることを認識していた。このような分子は、分子の効力、及びひいては有効性を最適化する用量で個体に投与され得、免疫療法剤として癌の治療に、例えば、又は感染症の治療に用いられ得る。
【００１４】
理論に制約されるのを望むものではないが、肝臓中に存在するＴ細胞は、抗ＣＤ１３７アゴニスト分子によって活性化されて、肝炎を引き起こす可能性を有し得ると考えられる。ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、敗血症／ウイルス感染の後、肝炎及びアポトーシスを促進することが示されている（Wesche-Soldato et al.,2007）。マウスにおける抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体療法は、肝臓中へのＣＤ１３７依存性Ｔ細胞浸潤をもたらすことが示されている（Dubrot J et al.,2010）。これらの試験からの結果は、総合すると、ウレルマブなどの、高い活性を有する抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体が、肝臓中への活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞の浸潤を引き起こし、それによって、肝炎を引き起こし得ることを示す。ウトミルマブの活性は、この影響が観察されるには低過ぎていた可能性がある。或いは、ウレルマブ治療で観察される用量制限肝毒性は、この抗体によって結合された特定のエピトープに起因し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、高い親和性で二量体ヒトＣＤ１３７に結合する抗体分子を単離するために、幅広い選択プログラムを行った。使用される選択プロトコルを考慮して、抗体分子は、二量体ＣＤ１３７について観察される親和性より低い親和性でモノマーＣＤ１３７に結合すると予想され、すなわち、高い結合力でＣＤ１３７に結合すると予想される。
【００１６】
本明細書において言及される「親和性」は、ＫＤによって測定される抗体分子とその同種抗原との間の結合相互作用の強さを指し得る。当業者に容易に明らかになるであろうように、抗体分子が、抗原と複数の結合相互作用を形成することが可能である場合（例えば、抗体分子が、抗原に２価的に結合することが可能である、任意に、抗原が二量体である場合）、ＫＤによって測定される親和性はまた、結合力によって影響され得、それによって、結合力は、抗体−抗原複合体の全体的な強さを指す。
【００１７】
免疫細胞、たとえばＴ細胞によるＣＤ１３７の発現は、活性化の際に上方制御される。理論に制約されるのを望むものではないが、活性化免疫細胞におけるＣＤ１３７の高い発現のため、ＣＤ１３７は、このような細胞の表面上で二量体、三量体及びより高次の多量体の形態になるものと考えられる。対照的に、ナイーブなＴ細胞などのナイーブな免疫細胞は、それらの細胞表面において低い又はごくわずかなレベルのＣＤ１３７を発現するため、存在するＣＤ１３７は、モノマー形態である可能性が高い。したがって、高い結合力でＣＤ１３７に結合する抗体分子が、ナイーブな免疫細胞とは対照的に、活性化Ｔ細胞などの活性化免疫細胞に優先的に結合することが予想される。
【００１８】
上記の背景技術の項において説明されるように、ＣＤ１３７リガンドの、その受容体、ＣＤ１３７への最初のライゲーションは、ＣＤ１３７の三量体化、続いて、受容体のクラスター化、ＮＦｋＢ細胞内シグナル伝達経路の活性化及びその後の免疫細胞活性化をもたらす一連の事象を開始させる。ＣＤ１３７を効率的に活性化する治療剤のために、いくつかのＣＤ１３７モノマーは、三量体リガンドを模倣する方法で一緒に架橋される必要がある。
【００１９】
ウトミルマブは、ＩｇＧ２分子であり、そのアゴニスト活性のためにＦｃγ受容体による架橋に依存している。ウレルマブは、構成的活性を有するＩｇＧ４分子であるため、活性のためにＦｃγ受容体による架橋を必要としないが、そのアゴニスト活性は、いくつかのＦｃγ受容体によって架橋すると促進される。Ｆｃγ受容体は、ヒトの全身にわたって見られる。したがって、ウトミルマブ及びウレルマブの免疫細胞活性化活性は、身体の特定の部位に限定されないため、肝臓中又は身体の他の箇所で発生し得る。
【００２０】
本発明者らは、本発明の抗体分子が、ＣＤ１３７をクラスター化し、それを活性化するために、架橋を必要とすることを示した。上述されるように、Ｆｃγ受容体媒介性架橋は、Ｆｃγ受容体が、ヒトの全身にわたって見られるため、ＣＤ１３７の活性化が、特定の部位に限定されないという欠点を有する。したがって、本発明者らは、突然変異を、抗体分子のＣＨ２ドメインに導入して、Ｆｃγ受容体結合を低減又は抑制した。したがって、Ｆｃγ受容体以外の薬剤による架橋の非存在下で、本発明の抗体分子は、ＣＤ１３７アゴニスト活性を示さないため、肝炎を誘発すると予想されない。
【００２１】
本発明の抗体分子は、二量体カニクイザルＣＤ１３７に高い親和性で結合することが可能であることがさらに示された。ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７の両方に対するこの交差反応性は、抗体分子の投与及び安全性試験が、前臨床開発中にカニクイザルにおいて実施されるのを可能にするため、有利である。このような分子は、臨床において肝毒性に関連していることが示されているため、これは、ＣＤ１３７に結合する抗体分子に関して特に有利である。
【００２２】
本発明の抗体分子はまた、リガンド結合に関する様々な活性を有することが示されており、ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合をブロックする、ブロックしない、又は部分的にブロックする抗体分子を含む。抗ＣＤ１３７抗体ウトミルマブ及びウレルマブはそれぞれ、ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合をブロックすること及びブロックしないことが報告されている（米国特許出願公開第２０１２／０２３７４９８号及び米国特許第７２８８６３８号）。ウトミルマブについて、この機能はまた、本発明者らによって確認されているが、以前の報告に反して、ウレルマブは、リガンド結合もブロックすることが分かった。理論に制約されるのを望むものではないが、ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合をブロックしない、又は部分的にのみブロックする抗体分子は、ＣＤ１３７Ｌへの結合を介したＣＤ１３７発現免疫細胞の天然の活性化経路が、抗体分子の存在下で阻害されないか、又は部分的に阻害されるに過ぎないため、有利であり得ると考えられる。したがって、これは、抗体分子によって引き起こされるＣＤ１３７のクラスター化及び活性化による免疫細胞活性化に加えて、ＣＤ１３７を発現する免疫細胞の天然の活性化を可能にし得る。
【００２３】
ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合をブロックし、二量体カニクイザルＣＤ１３７に結合する本発明の抗体分子の能力を考慮して、これらの抗体分子は、ウトミルマブ及びウレルマブよりＣＤ１３７上の異なるエピトープに結合すると予想される。上述されるように、ウレルマブ治療によって引き起こされる高度肝炎が、この抗体によって結合された特定のエピトープの結果であることが可能である。これは、抗体分子が異なる効力を有するようであることを考慮して、ウトミルマブが、ウレルマブよりＣＤ１３７上の異なるエピトープに結合すると考えられること、及びウトミルマブによる治療が、用量制限毒性に関連していなかったことによって裏付けられる。
【００２４】
本発明者らは、本発明の抗ＣＤ１３７抗体が、ＣＤ１３７に加えて、腫瘍抗原などの第２の抗原に結合する多重特異的、例えば二重特異的分子を調製するのに使用され得ることを認識した。好ましくは、多重特異的分子は、第２の抗原に２価的に結合するが、第２の抗原が細胞結合腫瘍抗原である場合、抗原の１価結合が、抗体分子を架橋し、ＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を誘発するのに十分であることが予想される。具体的には、本発明者らは、抗体分子のＣＨ３ドメインのそれぞれにさらなる抗原結合部位を含み、したがって第２の抗原に２価的に結合することが可能である抗体分子を調製した。このような二重特異的抗体分子は、従来の抗体分子によって必要とされる例えばＦｃγ受容体媒介性架橋を必要とせずに、前記第２の抗原の存在下で、コンディショナルでＣＤ１３７を活性化することが可能であると予想される。第２の抗原への抗体分子の結合が、前記抗原の部位における抗体分子の架橋を引き起こし、これがひいては免疫細胞表面におけるＣＤ１３７のクラスター化及び活性化をもたらすと考えられる。したがって、抗体分子のアゴニスト活性は、存在している第２の抗原及びＣＤ１３７の両方に依存していると予想される。言い換えると、アゴニスト活性は、コンディショナルであると予想される。さらに、第２の抗原の存在下における抗体の架橋は、抗体分子の定常ドメイン抗原結合部位を介して結合されるＣＤ１３７のクラスター化を助けると考えられる。したがって、第２の抗原が、腫瘍抗原などの疾患抗原である場合、抗体分子は、例えば腫瘍微小環境中で、疾患に依存して免疫細胞を活性化することが可能であると予想される。免疫細胞のこの標的化活性化は、例えばウレルマブ治療で見られる肝炎を回避するのに有益であると予想される。
【００２５】
本発明の抗ＣＤ１３７  Ｆａｂ及び第２の抗原に特異的なＣＨ３ドメイン結合部位を含む抗体分子は、好ましくは、ＣＤ１３７及び第２の抗原の両方に２価的に結合する。これは、両方の標的の２価結合が、ＣＤ１３７を発現する免疫細胞と第２の抗原との間の架橋をより安定させ、それによって、免疫細胞が、腫瘍微小環境などの特定の部位に限局され、疾患、例えば腫瘍に作用し得る時間を延長することが予想されるため、有利である。これは、ヘテロ二量体であり、１つのＦａｂアームを介して１価的に各標的抗原に結合する従来の二重特異的抗体フォーマットの大部分と異なる。このような１価相互作用は、より不安定であるだけでなく、多くの場合、第一にＣＤ１３７などのＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスター化を誘発するのに不十分であることが予想される。
【００２６】
第２の抗原に特異的なＣＨ３ドメイン結合部位を含む本発明の抗体分子のさらなる特徴は、ＣＤ１３７及び第２の抗原のための２つの抗原結合部位が両方とも、抗体構造自体の中に含まれることである。特に、抗体分子は、その標的の両方に２価的に結合する分子をもたらすために、他のタンパク質がリンカー又は他の手段を介して抗体分子に融合される必要がない。これは、多くの利点を有する。具体的には、抗体分子は、さらなる融合された部分を含まないため、標準的な抗体の産生に用いられるものと類似の方法を用いて産生され得る。リンカーが、時間とともに分解して、抗体分子の不均一な集団をもたらし得るため、この構造はまた、改善した抗体安定性をもたらすことが予測される。１つのみのタンパク質が融合された集団中のそれらの抗体は、２つのタンパク質が融合された抗体と同じくらい効率的に、ＣＤ１３７などのＴＮＦＲＳＦ受容体のコンディショナルなアゴニズムを誘発することができないこともある。リンカーの切断又は分解は、患者への治療薬の投与前又は投与後に（例えば酵素的切断又は患者のインビボｐＨによって）起こり、それによって、患者の循環中でその有効性の低下をもたらし得る。本発明の抗体分子中にリンカーがない際、抗体分子は、投与前及び投与後の両方で同じ数の結合部位を保持することが予想される。さらに、融合されたタンパク質若しくはリンカー又はその両方の導入が、抗体分子が患者に投与されるときに免疫原性を誘発し、治療薬の有効性の低下をもたらし得るため、本発明の抗体分子の構造は、分子の免疫原性の観点からも好ましい。
【００２７】
したがって、本発明は、以下を提供する：
【００２８】
［１］  ＣＤ１３７に結合する抗体分子であって、抗体分子の抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号３０、３２、３８、１７、１９及び２２のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−１６；（ｉｉ）配列番号３０、３２、３４、１７、１９及び２２のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−３；
（ｉｉｉ）配列番号３０、３２、３６、１７、１９及び２２のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−１２；
（ｉｖ）配列番号６２、６４、６６、１７、１９及び２３のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−３５−１４；又は
（ｖ）配列番号７、９、１１、１７、１９及び２１のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−５−３７
の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜６を含み；
ここで、ＣＤＲ配列が、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従って定義される、抗体分子。
【００２９】
［２］  ＣＤ１３７に結合する抗体分子であって、抗体分子の抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号３１、３３、３９、１８、２０及び２２のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−１６；
（ｉｉ）配列番号３１、３３、３５、１８、２０及び２２のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−３；
（ｉｉｉ）配列番号３１、３３、３７、１８、２０及び２２のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−１２；
（ｉｖ）配列番号６３、６５、６７、１８、２０及び２３のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−３５−１４；又は
（ｖ）配列番号８、１０、１２、１８、２０及び２１のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−５−３７
のＣＤＲ１〜６を含み；
ここで、ＣＤＲ配列が、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って定義される、抗体分子。
【００３０】
［３］  抗体分子が、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び／又は軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、［１］又は［２］に記載の抗体分子。
【００３１】
［４］  抗体分子が、免疫グロブリン重鎖及び／又は免疫グロブリン軽鎖を含む、［１］から［３］のいずれかに記載の抗体分子。
【００３２】
［５］  抗体分子が、
（ｉ）配列番号５４及び４８のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−１６；
（ｉｉ）配列番号２８及び４８のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−３；
（ｉｉｉ）配列番号４４及び４８のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−１２；
（ｉｖ）配列番号６０及び７０のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−３５−１４；又は
（ｖ）配列番号５及び１５のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−５−３７
のＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを含む、［３］から［４］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００３３】
［６］  抗体分子が、
（ｉ）配列番号５２若しくは５０に記載される抗体ＦＳ３０−１０−１６の重鎖、及び／又は配列番号４６に記載される抗体ＦＳ３０−１０−１６の軽鎖；
（ｉｉ）配列番号２６若しくは２４に記載される抗体ＦＳ３０−１０−３の重鎖、及び／又は配列番号４６に記載される抗体ＦＳ３０−１０−３の軽鎖；
（ｉｉｉ）配列番号４２若しくは４０に記載される抗体ＦＳ３０−１０−１２の重鎖、及び／又は配列番号４６に記載される抗体ＦＳ３０−１０−１２の軽鎖；
（ｉｖ）配列番号５８若しくは５６に記載される抗体ＦＳ３０−３５−１４の重鎖、及び／又は配列番号６８に記載される抗体ＦＳ３０−３５−１４の軽鎖；又は
（ｖ）配列番号３若しくは１に記載される抗体ＦＳ３０−５−３７の重鎖、及び／又は配列番号１３に記載される抗体ＦＳ３０−５−３７の軽鎖
を含む、［１］から［５］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００３４】
［７］  抗体分子が、
（ｉ）配列番号５２及び４６のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−１６；
（ｉｉ）配列番号２６及び４６のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−３；
（ｉｉｉ）配列番号４２及び４６のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−１０−１２；
（ｉｖ）配列番号５８及び６８のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−３５−１４；又は
（ｖ）配列番号３及び１３のそれぞれに記載される抗体ＦＳ３０−５−３７
の重鎖及び軽鎖を含む、［１］から［６］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００３５】
［８］  抗体分子が、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、又はＦＳ３０−３５−１４のＣＤＲ１〜６、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖を含む、［１］から［７］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００３６】
［９］  抗体分子が、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、又はＦＳ３０−１０−１２のＣＤＲ１〜６、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖を含む、［１］から［８］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００３７】
［１０］  抗体分子が、抗体ＦＳ３０−１０−１６のＣＤＲ１〜６、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖を含む、［１］から［９］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００３８】
［１１］  抗体が、ＣＤ１３７へのＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ）の結合をブロックしないか又は部分的にブロックする、［８］から［１０］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００３９】
［１２］  抗体が、ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合を部分的にブロックする、［９］から［１１］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００４０】
［１３］  抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性が、配列番号９９及び１０１のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１の重鎖配列及び軽鎖配列を含むか又はそれからなる抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性より低い、［１１］又は［１２］に記載の抗体分子。
【００４１】
［１４］  抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性が、配列番号９９及び１０１のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１の重鎖配列及び軽鎖配列を含むか又はそれからなる抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性の８０％以下、７０％以下、又は６０％以下である、［１１］から［１３］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００４２】
［１５］  抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性が、配列番号９９及び１０１のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１の重鎖配列及び軽鎖配列を含むか又はそれからなる抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性の少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％である、［１１］から［１４］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００４３】
［１６］  抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性が、配列番号９９及び１０１のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１の重鎖配列及び軽鎖配列を含むか又はそれからなる抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性の２０％から８０％、３０％から７０％、又は４０％から６０％である、［１１］から［１５］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００４４】
［１７］  抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性が、配列番号１０４及び１０６のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／２０Ｈ４．９の重鎖配列及び軽鎖配列を含むか又はそれからなる抗体分子のＣＤ１３７Ｌのブロッキング活性より低い、［１１］から［１６］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００４５】
［１８］  抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性が、配列番号１０４及び１０６のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／２０Ｈ４．９の重鎖配列及び軽鎖配列を含むか又はそれからなる抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性の８０％以下、７０％以下、又は６０％以下である、［１１］から［１７］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００４６】
［１９］  抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性が、配列番号１０４及び１０６のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／２０Ｈ４．９の重鎖配列及び軽鎖配列を含むか又はそれからなる抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性の少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％である、［１１］から［１８］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００４７】
［２０］  抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性が、配列番号１０４及び１０６のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／２０Ｈ４．９の重鎖配列及び軽鎖配列を含むか又はそれからなる抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性の２０％から８０％、３０％から７０％、又は４０％から６０％である、［１１］から［１９］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００４８】
［２１］  抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性が、配列番号７９及び４６のそれぞれに記載される抗体ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６の重鎖配列及び軽鎖配列を含むか又はそれからなる抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性の７０％から１３０％、８０％から１２０％、又は９０％から１１０％である、［１０］に記載の抗体分子。
【００４９】
［２２］  抗体分子が、抗体ＦＳ３０−５−３７のＣＤＲ１〜６、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖を含む、［１］から［７］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００５０】
［２３］  抗体が、ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合をブロックする、［２２］に記載の抗体分子。
【００５１】
［２４］  抗体分子のリガンドブロッキング活性が、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定可能である、［１１］から［２３］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００５２】
［２５］  ＣＤ１３７が、ヒトＣＤ１３７である、［１］から［２４］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００５３】
［２６］  ＣＤ１３７が、ヒトＣＤ１３７の細胞外ドメインである、［２５］に記載の抗体分子。
【００５４】
［２７］  ＣＤ１３７が、配列番号１１２に記載される配列からなるか又はそれを含む、［２６］に記載の抗体分子。
【００５５】
［２８］  ＣＤ１３７が、カニクイザルＣＤ１３７である、［１］から［２４］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００５６】
［２９］  ＣＤ１３７が、カニクイザルＣＤ１３７の細胞外ドメインである、［２８］に記載の抗体分子。
【００５７】
［３０］  ＣＤ１３７が、配列番号１１３に記載される配列からなるか又はそれを含む、［２９］に記載の抗体分子。
【００５８】
［３１］  ＣＤ１３７Ｌが、ヒトＣＤ１３７Ｌである、［１１］から［２７］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００５９】
［３２］  ＣＤ１３７Ｌが、ヒトＣＤ１３７Ｌである、［１１］から［２７］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００６０】
［３３］  抗体分子が、多重特異的抗体分子である、［１］から［３２］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００６１】
［３４］  抗体分子が、二重特異的、三重特異的、又は四重特異的抗体分子である、［３３］に記載の抗体分子。
【００６２】
［３５］  抗体分子が、二重特異的分子である、［３４］に記載の抗体分子。
【００６３】
［３６］  抗体分子が、抗体分子の定常ドメイン中に位置する第２の抗原結合部位を含む、［３３］から［３５］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００６４】
［３７］  第２の抗原結合部位が、免疫細胞抗原、腫瘍抗原、又は感染症抗原に結合する、［３６］に記載の抗体分子。
【００６５】
［３８］  免疫細胞抗原が、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーである、［３７］に記載の抗体分子。
【００６６】
［３９］  ＴＮＦＲＳＦのメンバーがＯＸ４０である、［３８］に記載の抗体分子。
【００６７】
［４０］  腫瘍抗原が、腫瘍関連抗原である、［３７］に記載の抗体分子。
【００６８】
［４１］  感染症抗原が、細菌又はウイルス抗原である、［３７］に記載の抗体分子。
【００６９】
［４２］  第２の抗原結合部位が、第１の配列、第２の配列、及び／又は第３の配列を含み、ここで、第１の配列、第２の配列及び第３の配列がそれぞれ、定常ドメインのＡＢ構造ループ、ＣＤ構造ループ及びＥＦ構造ループ中に位置する、［３６］から［４１］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００７０】
［４３］  定常ドメインが、ＣＨ３ドメインである、［３６］から［４２］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００７１】
［４４］  抗体分子が、第２の抗原の存在下で、免疫細胞上のＣＤ１３７を活性化することが可能である、［３６］から［４３］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００７２】
［４５］  ＣＤ１３７及び第２の抗原への抗体分子の結合が、免疫細胞上のＣＤ１３７のクラスター化を引き起こす、［３６］から［４４］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００７３】
［４６］  免疫細胞が、Ｔ細胞である、［４４］又は［４５］に記載の抗体分子。
【００７４】
［４７］  抗体分子が、Ｆｃγ受容体に結合しない、［１］から［４６］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００７５】
［４８］  抗体分子が、１つ以上のＦｃγ受容体への抗体分子のＣＨ２ドメイン又は抗体分子の結合を低減又は抑制するように修飾されている、［１］から［４７］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００７６】
［４９］  Ｆｃγ受容体が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩからなる群から選択される、［４７］から［４８］に記載の抗体分子。
【００７７】
［５０］  ［１］から［４９］のいずれか１つに記載の抗体分子及び生物活性分子を含むコンジュゲート。
【００７８】
［５１］  ［１］から［４９］のいずれか１つに記載の抗体分子及び検出可能な標識を含むコンジュゲート。
【００７９】
［５２］  ［１］から［４９］のいずれか１つに記載の抗体分子をコードする１つ又は複数の核酸分子。
【００８０】
［５３］  核酸分子が、
（ｉ）配列番号５５に記載される抗体ＦＳ３０−１０−１６のＶＨドメインｃＤＮＡ配列又は、及び／又は配列番号４９に記載される抗体ＦＳ３０−１０−１６のＶＬドメインｃＤＮＡ配列；又は
（ｉｉ）配列番号２９に記載される抗体ＦＳ３０−１０−３のＶＨドメインｃＤＮＡ配列、及び／又は配列番号４９に記載される抗体ＦＳ３０−１０−３のＶＬドメインｃＤＮＡ配列；
（ｉｉｉ）配列番号４５に記載される抗体ＦＳ３０−１０−１２のＶＨドメインｃＤＮＡ配列、及び／又は配列番号４９に記載される抗体ＦＳ３０−１０−１２のＶＬドメインｃＤＮＡ配列；
（ｉｖ）配列番号６１に記載される抗体ＦＳ３０−３５−１４のＶＨドメインｃＤＮＡ配列、及び／又は配列番号６９に記載される抗体ＦＳ３０−３５−１４のＶＬドメインｃＤＮＡ配列；又は
（ｖ）配列番号６に記載される抗体ＦＳ３０−５−３７のＶＨドメインｃＤＮＡ配列、及び／又は配列番号１４に記載される抗体ＦＳ３０−５−３７のＶＬドメインｃＤＮＡ配列
を含む、［５２］に記載の核酸分子。
【００８１】
［５４］  核酸分子が、
（ｉ）配列番号５３若しくは５１に記載される抗体ＦＳ３０−１０−１６の重鎖ｃＤＮＡ配列、及び／又は配列番号４７に記載される抗体ＦＳ３０−１０−１６の軽鎖ｃＤＮＡ配列；
（ｉｉ）配列番号２７若しくは２５に記載される抗体ＦＳ３０−１０−３の重鎖ｃＤＮＡ配列、及び／又は配列番号４７に記載される抗体ＦＳ３０−１０−３の軽鎖ｃＤＮＡ配列；
（ｉｉｉ）配列番号４３若しくは４１に記載される抗体ＦＳ３０−１０−１２の重鎖ｃＤＮＡ配列、及び／又は配列番号４７に記載される抗体ＦＳ３０−１０−１２の軽鎖ｃＤＮＡ配列；
（ｉｖ）配列番号５９若しくは５７に記載される抗体ＦＳ３０−３５−１４の重鎖ｃＤＮＡ配列、及び／又は配列番号６９に記載される抗体ＦＳ３０−３５−１４の軽鎖ｃＤＮＡ配列；又は
（ｖ）配列番号４若しくは２に記載される抗体ＦＳ３０−５−３７の重鎖ｃＤＮＡ配列、及び／又は配列番号１４に記載される抗体ＦＳ３０−５−３７の軽鎖ｃＤＮＡ配列
を含む、［５２］又は［５３］に記載の核酸分子。
【００８２】
［５５］  ［５２］から［５４］のいずれか１つに記載の１つ又は複数の核酸分子を含む１つ又は複数のベクター。
【００８３】
［５６］  ［５２］から［５４］のいずれか１つに記載の核酸分子、又は［５５］に記載のベクターを含む組み換え宿主細胞。
【００８４】
［５７］  ［１］から［４９］のいずれか１つに記載の抗体分子を産生する方法であって、抗体分子の産生のための条件下で、［５６］に記載の組み換え宿主細胞を培養することを含む、方法。
【００８５】
［５８］  抗体分子を単離及び／又は精製することをさらに含む、［５７］に記載の方法。
【００８６】
［５９］  ［１］から［５１］のいずれか１つに記載の抗体分子又はコンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【００８７】
［６０］  治療法によるヒト身体の治療のための方法に使用するための、［１］から［５１］のいずれか１つに記載の抗体分子又はコンジュゲート。
【００８８】
［６１］  個体における癌又は感染症を治療する方法に使用するための、［１］から［５１］のいずれか１つに記載の抗体分子又はコンジュゲート。
【００８９】
［６２］  個体における疾患を治療する方法であって、治療有効量の、［１］から［５１］のいずれか１つに記載の抗体分子又はコンジュゲートを個体に投与することを含む、方法。
【００９０】
［６３］  疾患が、癌又は感染症である、［６２］に記載の方法。
【００９１】
［６４］  薬剤の調製における、［１］から［５１］のいずれか１つに記載の抗体分子又はコンジュゲートの使用。
【００９２】
［６５］  薬剤が、癌又は感染症の治療のためのものである、［６４］に記載の使用。
【００９３】
［６６］  治療のための方法が、抗体分子又はコンジュゲートを、第２の治療薬と組み合わせて個体に投与することを含む、［６０］又は［６１］に記載の使用のための抗体分子又はコンジュゲート。
【００９４】
［６７］  治療有効量の第２の治療薬を個体に投与することをさらに含む、［６２］又は［６３］に記載の方法。
【００９５】
［６８］  ヒト又は動物身体において実施される診断方法に使用するための、［１］から［４９］又は［５１］のいずれか１つに記載の抗体分子又はコンジュゲート。
【００９６】
［６９］  個体における疾患を検出する方法であって、［１］から［４９］又は［５１］のいずれか１つに記載の抗体分子又はコンジュゲートの使用を含む、方法。
【００９７】
［７０］  診断薬の製造における、［１］から［４９］又は［５１］のいずれか１つに記載の抗体分子又はコンジュゲートの使用。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
図面の簡単な説明
【図１】増加する濃度の抗ヒトＣＤ１３７  ＦＳ３０  ｍＡｂの存在下での初代Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＩＬ−２放出を示す。ＦＳ３０  ｍＡｂを、ＬＡＬＡ突然変異を含むＩｇＧ１フォーマット（Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−５、Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−６、Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−１０、Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−１５及びＧ１ＡＡ／ＦＳ３０−１６）において試験した。それぞれＩｇＧ１フォーマットであり、且つＬＡＬＡ突然変異を有する、抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ、ＭＯＲ７４８０．１及び２０Ｈ４．９が、陽性対照（Ｇ１ＡＡ／ＭＯＲ７４８０．１及びＧ１ＡＡ／２０Ｈ４．９）として含まれていた一方、ＩｇＧ１  ＬＡＬＡフォーマットにおける抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体が、陰性対照（Ｇ１ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３）として含まれていた。架橋される場合にのみ試験されたＧ１ＡＡ／ＭＯＲ７４８０．１及びＧ１ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３を除いて、全てのｍＡｂを、架橋剤の非存在下及び存在下で試験した。
【図１Ａ】架橋された陽性対照ｍＡｂ（Ｇ１ＡＡ／ＭＯＲ７４８０．１及びＧ１ＡＡ／２０Ｈ４．９）及び抗ＣＤ１３７  ＦＳ３０  ｍＡｂ（Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−５、Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−６、Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−１０、Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−１５及びＧ１ＡＡ／ＦＳ３０−１６）の存在下で、ＩＬ−２放出の増加によって証明されるように、Ｔ細胞の活性化の濃度依存性の増加があるが、陰性対照ｍＡｂ（Ｇ１ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３）の存在下ではないことを示す。Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−５、Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−１０、Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−１５及びＧ１ＡＡ／ＦＳ３０−１６のＴ細胞活性化活性は、Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−６のものより高かった。
【図１Ｂ】架橋の非存在下で、ＦＳ３０  ｍＡｂ（Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−５、Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−６、Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−１０、Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−１５及びＧ１ＡＡ／ＦＳ３０−１６）が、測定された低い基礎レベルのＩＬ−２によって証明されるように、Ｔ細胞活性化を示さなかったことを示す。対照的に、陽性対照ｍＡｂ（Ｇ１ＡＡ／２０Ｈ４．９）は、ＩＬ−２放出の増加によって証明されるように、架橋の非存在下で強力なＴ細胞活性化を示した。ＩＬ−２放出に対する抗ヒトＣＤ１３７  ｍＡｂ及び対照抗体の効果を、２つの濃度（２５ｎＭ及び１００ｎＭ）で試験した。
【図２】ＣＤ１３７結合及びリガンドブロッキング活性についての陽性対照としての抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ（図２ＡにおいてＧ１／ＭＯＲ７４８０．１及びＧ１／２０Ｈ４．９並びに図２ＢにおいてＧ１／ＭＯＲ７４８０．１のみ）、ＯＸ４０結合についての陰性対照ｍＡｂ２としてのｍＡｂ２  ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０、及びアイソタイプ／陰性対照としての抗ＯＸ４０  ｍＡｂ  Ｇ１／１１Ｄ４と比較した、抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂを含むｍＡｂ２フォーマットにおける抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ（ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５−３７、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６及び、図２Ａのみにおいて、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５−１４）の存在下でのヒトＣＤ１３７受容体へのヒトＣＤ１３７Ｌ結合の代表的なプロットを示す。ｍＡｂ及びｍＡｂ２を、１つの濃度（図２Ａおいて１００ｎＭ及び図２Ｂにおいて２００ｎＭ）で試験した。正規化された値が示される。これらの結果は、抗ＣＤ１３７対照抗体及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５−３７  ｍＡｂ２が両方とも、ヒトＣＤ１３７ＬとヒトＣＤ１３７受容体との間の相互作用を完全にブロックしたことを示す。ＦＳ３０−１０系統に由来する抗ＣＤ１３７  Ｆａｂを含むｍＡｂ２、すなわち、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６は、ヒトＣＤ１３７ＬとヒトＣＤ１３７受容体との間の相互作用を部分的にブロックした一方、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５−１４  ｍＡｂ２（図２Ａのみ）及びＧ１／１１Ｄ４  ｍＡｂ及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０  ｍＡｂ２対照は、受容体−リガンド相互作用を実質的に阻害する能力を欠いていたため、リガンドブロッキング活性を示さないと考えられた。
【図３】抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂを含むｍＡｂ２フォーマットにおける増加する濃度の抗ヒトＣＤ１３７  ＦＳ３０  ｍＡｂ（ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５−３７、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５−１４）の存在下でのＤＯ１１．１０−ｈＣＤ１３７  Ｔ細胞活性化アッセイにおけるマウスＩＬ−２放出の代表的なグラフを示す。抗ＣＤ１３７抗体Ｇ２／ＭＯＲ７４８０．１を、陽性対照として使用し；抗ＯＸ４０  ｍＡｂ  Ｇ１／１１Ｄ４及びｍＡｂ２クローンＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０を、陰性対照として使用し；抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ  Ｇ１／４４２０を、アイソタイプ陰性対照として使用した。全てのｍＡｂ及びｍＡｂ２を、架橋剤の非存在下及び存在下で試験した。
【図３Ａ】架橋された陽性対照ｍＡｂ（Ｇ２／ＭＯＲ７４８０．１）並びに抗ＣＤ１３７  ＦＳ３０  ｍＡｂ２（ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５−３７、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５−１４）の存在下で、マウスＩＬ−２放出の増加によって証明されるように、ＤＯ１１．１０−ｈＣＤ１３７細胞の活性化の濃度依存性の増加があったが、陰性対照ｍＡｂ及びｍＡｂ２（Ｇ１／４４２０、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０及びＧ１／１１Ｄ４）の存在下ではなかったことを示す。
【図３Ｂ】架橋の非存在下で、陽性対照Ｇ２／ＭＯＲ７４８０．１、ｍＡｂ２  ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５−３７、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５−１４、並びに陰性対照Ｇ１／４４２０、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０及びＧ１／１１Ｄ４が、測定された低い基礎レベルのＩＬ−２によって証明されるように、Ｔ細胞活性化を示さないないしは弱いＴ細胞活性化を示したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００９９】
詳細な説明
本発明は、ＣＤ１３７に結合する抗体分子に関する。ＣＤ１３７は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）又は４−１ＢＢとしても知られている。抗体分子は、好ましくは、ヒトＣＤ１３７、より好ましくは、ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７、さらにより好ましくは、二量体ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７に結合する。抗体分子によって結合されるＣＤ１３７の部分は、好ましくは、ＣＤ１３７細胞外ドメインである。ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７の細胞外ドメインは、配列番号１１２及び１１３のそれぞれに記載される配列を含むか又はそれからなり得る。本発明の抗体分子は、好ましくは、細胞の表面において発現されるＣＤ１３７に結合することが可能である。細胞は、好ましくは、免疫細胞、例えば、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋  Ｔ細胞又は制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、好ましくは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、又はＢ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。
【０１００】
抗体分子は、好ましくは、ＣＤ１３７に特異的に結合する。「特異的」という用語は、抗体分子が、その特異的結合パートナー（ここではＣＤ１３７）以外の分子への顕著な結合を示さない状況を指し得る。「特異的」という用語はまた、抗体分子が、いくつかの抗原によって保有される、ＣＤ１３７上のエピトープなどの特定のエピトープに対して特異的である場合に該当し、その場合、抗体分子は、エピトープを保有する様々な抗原に結合することが可能であろう。抗体分子は、好ましくは、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＧＩＴＲ、ＮＧＦＲ、ＣＤ４０及び／又はＤＲ６に結合しないか、又はそれらへの顕著な結合を示さない。
【０１０１】
上記の背景技術の項において説明されるように、抗ＣＤ１３７抗体ウレルマブによる患者の治療は、用量制限高度肝炎を伴っていた。理論に制約されるのを望むものではないが、ウレルマブ治療で見られる肝炎は、肝臓中に存在するＴ細胞の活性化、又は患者の肝臓中の活性化Ｔ細胞の浸潤及び蓄積に起因していた可能性があると考えられる。軽減された肝炎を伴うか又は肝炎を伴わない分子を選択するために、本発明者らは、ＣＤ１３７に対する高い結合力を有すると予想される抗体分子を選択した。具体的には、本発明者らは、高い親和性で二量体ＣＤ１３７に結合した抗体分子を選択した。Ｔ細胞によるＣＤ１３７の発現は、プライミング及び活性化の際に上方制御される。活性化Ｔ細胞におけるＣＤ１３７のより高い発現のため、ＣＤ１３７は、このような細胞の表面において二量体、三量体及びより高次の多量体の形態になるものと考えられる。対照的に、不活性Ｔ細胞によるＣＤ１３７発現は、低く発現し、或いは検出不可能である。したがって、ＣＤ１３７は、これがこのようなＴ細胞の表面において発現される限り、モノマー形態である可能性が高いものと考えられる。したがって、高い結合力でＣＤ１３７に結合する抗体分子は、肝臓中に存在する不活性Ｔ細胞などの不活性Ｔ細胞と対照的に、活性化Ｔ細胞に優先的に結合し、したがって、軽減された肝炎を示すか又は肝炎を示さないものと考えられる。
【０１０２】
抗体分子は、好ましくは、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、若しくは０．２ｎＭの親和性（ＫＤ）又はより高い親和性で二量体ヒトＣＤ１３７に結合する。抗体分子は、モノマーＣＤ１３７よりより高い親和性で二量体ＣＤ１３７に結合し得る。
【０１０３】
本発明の抗体分子はまた、二量体カニクイザルＣＤ１３７に結合することが示された。カニクイザルＣＤ１３７並びにヒトＣＤ１３７への結合は、カニクイザルにおける抗体分子の有効性及び毒性試験を行うのに有益であると考えられ、これは、ヒトにおける抗体分子の有効性及び毒性の予測であり得る。
【０１０４】
好ましい実施形態において、抗体分子は、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、若しくは０．２ｎＭの親和性（ＫＤ）又はより高い親和性で二量体カニクイザルＣＤ１３７に結合し得る。
【０１０５】
抗体分子は、同様の親和性で二量体ヒトＣＤ１３７及び二量体カニクイザルＣＤ１３７に結合し得る。これは、カニクイザルにおける抗体分子を用いて行われる有効性及び毒性試験が、ヒトにおける抗体分子の有効性及び毒性の予測であることを確実にするのに有益であると考えられる。
【０１０６】
したがって、好ましい実施形態において、抗体分子は、抗体分子が二量体ヒトＣＤ１３７に結合する親和性より１０倍以下、好ましくは、５倍以下、より好ましくは、２倍以下低いか又は高い親和性で二量体カニクイザルＣＤ１３７に結合する。
【０１０７】
ヒト又はカニクイザルＣＤ１３７などの同種抗原に対する抗体分子の結合親和性は、例えばBiacoreなどの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定され得る。
【０１０８】
抗体分子は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体分子であり得る。好ましくは、抗体分子は、ヒト抗体分子である。
【０１０９】
抗体分子は、好ましくは、モノクローナルである。
【０１１０】
抗体分子は、他のポリペプチド及び／又は血清成分に結合することが可能な抗体などの、汚染物質を含まないという意味で単離され得る。
【０１１１】
抗体分子は、天然であるか又は部分的に若しくは完全に合成的に産生され得る。例えば、抗体分子は、組み換え抗体分子であり得る。
【０１１２】
抗体分子は、ＣＤ１３７のための１つ以上のＣＤＲベースの抗原結合部位を含む。
【０１１３】
抗体分子は、免疫グロブリン又はその抗原結合断片であり得る。例えば、抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ分子、好ましくは、ＩｇＧ分子、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４分子、より好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２分子、最も好ましくは、ＩｇＧ１分子、又はその断片であり得る。好ましい実施形態において、抗体分子は、完全免疫グロブリン分子である。
【０１１４】
他の実施形態において、抗体分子は、ＣＤ１３７のためのＣＤＲベースの抗原結合部位を含む抗原結合断片であり得る。本発明の抗体分子に適用可能なＣＤＲベースの抗原結合断片は、当業者に公知であろう。例示的なＣＤＲベースの抗原結合断片は、例えば、Brinkmann and Kontermann,2017及びPowers et al.,2012に記載されている。例えば、抗原結合断片は、ＩｇＧΔＣＨ２、断片抗原結合（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、ジスルフィド安定化可変断片（ｄｓＦｖ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−ＣＨ３（ミニボディ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ジッパー、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、又は単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、例えばＶＨＨドメイン又はナノボディであり得る。好ましい抗原結合断片は、ＣＤ１３７のための２つ以上のＣＤＲベースの抗原結合部位を含み、すなわち、それらは多価であり得る。したがって、抗原結合断片は、好ましくは、ＩｇＧΔＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディであり得る。＊
【０１１５】
抗体並びにそれらの構築及び使用のための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Holliger and Hudson,2005に記載されている。モノクローナル及び他の抗体を取り、元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を産生するために組み換えＤＮＡ技術の技術を使用することが可能である。このような技術は、１つの抗体分子のＣＤＲ又は可変領域を、異なる抗体分子中に導入することを含み得る（欧州特許出願公開第Ａ−１８４１８７号、英国特許第２１８８６３８Ａ号及び欧州特許出願公開第Ａ−２３９４００号）。
【０１１６】
ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体可変領域における抗原結合部位である。ＣＤＲベースの抗原結合部位は、３つのＣＤＲ、例えば３つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ又は３つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲによって形成され得る。好ましくは、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、６つのＣＤＲ、３つのＶＬ  ＣＤＲ及び３つのＶＨ  ＣＤＲによって形成される。抗原の結合への異なるＣＤＲの寄与は、異なる抗原結合部位において異なり得る。
【０１１７】
抗原結合部位の３つのＶＨドメインＣＤＲは、免疫グロブリンＶＨドメイン内に位置してもよく、３つのＶＬドメインＣＤＲは、免疫グロブリンＶＬドメイン内に位置し得る。例えば、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体可変領域中に位置し得る。
【０１１８】
抗体分子は、１つ又は好ましくは２つ以上、例えば２つの、ＣＤ１３７のためのＣＤＲベースの抗原結合部位を有する。したがって、抗体分子は、１つのＶＨ及び１つのＶＬドメインを含み得るが、好ましくは、例えば天然のＩｇＧ分子の場合のように、２つのＶＨ及び２つのＶＬドメイン、すなわち２つのＶＨ／ＶＬドメイン対を含む。
【０１１９】
ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、又はＦＳ３０−３５−１４、又はＦＳ３０−５−３７、好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、又はＦＳ３０−３５−１４、より好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、又はＦＳ３０−１０−１２、最も好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６の３つのＶＨ  ＣＤＲ又は３つのＶＬ  ＣＤＲ、好ましくは、３つのＶＨ  ＣＤＲ及び３つのＶＬ  ＣＤＲを含み得る。
【０１２０】
ＣＤＲの配列は、日常的な技術を用いて、抗体分子のＶＨ及びＶＬドメイン配列から容易に決定され得る。抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、又はＦＳ３０−３５−１４、又はＦＳ３０−５−３７のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、本明細書に記載され、したがって、前記抗体の３つのＶＨ及び３つのＶＬドメインＣＤＲは、前記配列から決定され得る。ＣＤＲ配列は、例えば、Kabat et al.,1991又は国際免疫遺伝学情報システム（international ImMunoGeneTics information system）（ＩＭＧＴ）（Lefranc et al.,2015）に従って決定され得る。
【０１２１】
ＩＭＧＴ番号付けに従う抗体分子のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列はそれぞれ、抗体分子のＶＨドメインの２７〜３８、５６〜６５、及び１０５〜１１７位に位置する配列であり得る。
【０１２２】
Ｋａｂａｔ番号付けに従う抗体分子のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列はそれぞれ、ＶＨドメインの３１〜３５、５０〜６５、及び９５〜１０２位に位置する配列であり得る。
【０１２３】
ＩＭＧＴ番号付けに従う抗体分子のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列はそれぞれ、ＶＬドメインの２７〜３８、５６〜６５、及び１０５〜１１７位に位置する配列であり得る。
【０１２４】
Ｋａｂａｔ番号付けに従う抗体分子のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列はそれぞれ、ＶＬドメインの２４〜３４、５０〜５６、及び８９〜９７位に位置する配列であり得る。
【０１２５】
例えば、
（ｉ）抗体ＦＳ３０−１０−１６のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号３０、３２、及び３８のそれぞれに記載されるとおりであり得；
（ｉｉ）抗体ＦＳ３０−１０−３のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号３０、３２、及び３４のそれぞれに記載されるとおりであり得；
（ｉｉｉ）抗体ＦＳ３０−１０−１２のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号３０、３２、及び３６のそれぞれに記載されるとおりであり得；
（ｉｖ）抗体ＦＳ３０−３５−１４のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号６２、６４、及び６６のそれぞれに記載されるとおりであり得；又は
（ｖ）抗体ＦＳ３０−５−３７のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号７、９、及び１１のそれぞれに記載されるとおりであり得；
ここで、ＣＤＲ配列が、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従って定義される。
【０１２６】
（ｉ）抗体ＦＳ３０−１０−１６のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１７、１９、及び２２のそれぞれに記載されるとおりであり得；
（ｉｉ）抗体ＦＳ３０−１０−３のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１７、１９、及び２２のそれぞれに記載されるとおりであり得；
（ｉｉｉ）抗体ＦＳ３０−１０−１２のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１７、１９、及び２２のそれぞれに記載されるとおりであり得；
（ｉｖ）抗体ＦＳ３０−３５−１４のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１７、１９、及び２３のそれぞれに記載されるとおりであり得；又は
（ｖ）抗体ＦＳ３０−５−３７のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１７、１９、及び２１のそれぞれに記載されるとおりであり得；
ここで、ＣＤＲ配列が、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って定義される。
【０１２７】
（ｉ）抗体ＦＳ３０−１０−１６のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号３１、３３、及び３９のそれぞれに記載されるとおりであり得；
（ｉｉ）抗体ＦＳ３０−１０−３のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号３１、３３、及び３４のそれぞれに記載されるとおりであり得；
（ｉｉｉ）抗体ＦＳ３０−１０−１２のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号３１、３３、及び３７のそれぞれに記載されるとおりであり得；
（ｉｖ）抗体ＦＳ３０−３５−１４のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号６３、６５、及び６７のそれぞれに記載されるとおりであり得；又は
（ｖ）抗体ＦＳ３０−５−３７のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号８、１０、及び１２のそれぞれに記載されるとおりであり得；
ここで、ＣＤＲ配列が、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って定義される。
【０１２８】
（ｉ）抗体ＦＳ３０−１０−１６のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１８、２０、及び２２のそれぞれに記載されるとおりであり得；
（ｉｉ）抗体ＦＳ３０−１０−３のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１８、２０、及び２２のそれぞれに記載されるとおりであり得；
（ｉｉｉ）抗体ＦＳ３０−１０−１２のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１８、２０、及び２２のそれぞれに記載されるとおりであり得；
（ｉｖ）抗体ＦＳ３０−３５−１４のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１８、２０、及び２３のそれぞれに記載されるとおりであり得；又は
（ｖ）抗体ＦＳ３０−５−３７のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１８、２０、及び２１のそれぞれに記載されるとおりであり得；
ここで、ＣＤＲ配列が、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って定義される。
【０１２９】
抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、及びＦＳ３０−１０−１２の重鎖及び軽鎖配列は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従ってＶＨドメインの１０９位における残基（Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従ってＶＨドメインの残基９７）を除いて同一である。このアミノ酸変化は、ＶＨドメインＣＤＲ３内にある。したがって、抗体分子は、抗体ＦＳ３０−１０−１６のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列及び／又はＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ＶＨドメイン配列及び／又はＶＬドメイン配列、重鎖配列及び／又は軽鎖配列を含んでいてもよく、ここで、抗体分子は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従ってＶＨドメインの１０９位（Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従ってＶＨドメインの残基９７）に、アスパラギン（Ｎ）、及びトレオニン（Ｔ）からなる群から選択されるアミノ酸置換を任意に含む。
【０１３０】
ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ３０−３５−１４、又はＦＳ３０−５−３７、好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、又はＦＳ３０−３５−１４、より好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、又はＦＳ３０−１０−１２、最も好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６のＶＨ又はＶＬドメイン、好ましくは、ＶＨ及びＶＬドメインを含み得る。
【０１３１】
抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ３０−３５−１４、又はＦＳ３０−５−３７のＶＨドメインは、配列番号５４、２８、４４、６０、又は５のそれぞれに記載される配列を有し得る。抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ３０−３５−１４、又はＦＳ３０−５−３７のＶＬドメインは、配列番号４６、４６、４６、６８、又は１３のそれぞれに記載される配列を有し得る。
【０１３２】
抗体分子は、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ３０−３５−１４、又はＦＳ３０−５−３７、好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、又はＦＳ３０−３５−１４、より好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、又はＦＳ３０−１０−１２、最も好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６の重鎖又は軽鎖、好ましくは、重鎖及び軽鎖を含み得る。
【０１３３】
［ＬＡＬＡを有する配列］抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ３０−３５−１４、及びＦＳ３０−５−３７の重鎖は、配列番号５２、２６、４２、５８、及び３のそれぞれに記載される配列を有し得る。
【０１３４】
抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ３０−３５−１４、及びＦＳ３０−５−３７の軽鎖は、配列番号４６、４６、４６、６８、及び１３のそれぞれに記載される配列を有し得る。
【０１３５】
抗体分子は、本明細書に開示されるＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、重鎖又は軽鎖配列の変異体も含み得る。好適な変異体は、配列変異、又は突然変異、及びスクリーニングの方法によって得ることができる。好ましい実施形態において、１つ以上のこのような変異体配列を含む抗体分子は、ＣＤ１３７、好ましくは、ヒト及び／又はカニクイザルＣＤ１３７に対する結合特異性及び／又は結合親和性などの、親抗体分子の機能特性の１つ以上を保持する。例えば、１つ以上の変異体配列を含む抗体分子は、好ましくは、（親）抗体分子と同じ親和性、又は（親）抗体分子より高い親和性でＣＤ１３７に結合する。親抗体分子は、変異体抗体分子に組み込まれたアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を含まない抗体分子である。
【０１３６】
抗体分子は、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ３０−３５−１４、又はＦＳ３０−５−３７、好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、又はＦＳ３０−３５−１４、より好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、又はＦＳ３０−１０−１２、最も好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６のＶＨドメイン、ＶＬドメイン、重鎖、又は軽鎖に対する、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＶＨドメイン、ＶＬドメイン、重鎖、又は軽鎖を含み得る。
【０１３７】
配列同一性は、アルゴリズムＧＡＰ（Wisconsin GCG package,Accelerys Inc,San Diego USA）に関連して一般的に定義される。ＧＡＰは、Needleman and Wunschアルゴリズムを使用して、一致の数を最大にし、且つギャップの数を最小にする、２つの完全な配列をアラインする。一般に、１２に等しいギャップ作成ペナルティ（gap creation penalty）及び４に等しいギャップ伸長ペナルティ（gap extension）を伴うデフォルトパラメータが使用される。ＧＡＰの使用が、好ましいことがあるが、他のアルゴリズム、例えば、一般にデフォルトパラメータを用いる、ＢＬＡＳＴ（Altschul et al.,1990の方法を使用する、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman,1988の方法を使用する）、又はSmith-Watermanアルゴリズム（Smith and Waterman,1981）、又は上記のAltschul et al.,1990のＴＢＬＡＳＴＮプログラムが使用され得る。特に、ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔアルゴリズム（Altschul et al.,1997）が使用され得る。
【０１３８】
抗体分子は、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ３０−３５−１４、又はＦＳ３０−５−３７、好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、又はＦＳ３０−３５−１４、より好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、又はＦＳ３０−１０−１２、最も好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６のＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及び／又はＶＬ  ＣＤＲ３と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変異（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、３つ以下の変異、２つ以下の変異、又は１つの変異を有するＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及び／又はＶＬ  ＣＤＲ３を含み得る。
【０１３９】
抗体分子は、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ３０−３５−１４、又はＦＳ３０−５−３７、好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、又はＦＳ３０−３５−１４、より好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、又はＦＳ３０−１０−１２、最も好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６のＶＨドメイン、ＶＬドメイン、重鎖、又は軽鎖と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変異（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０以下の変異、１５以下の変異、１０以下の変異、５つ以下の変異、４つ以下の変異、３つ以下の変異、２つ以下の変異、又は１つの変異を有するＶＨドメイン、ＶＬドメイン、重鎖、又は軽鎖を含み得る。特に、アミノ酸配列変異は、抗体分子の１つ以上のフレームワーク領域、例えば、抗体分子の重鎖及び／又は軽鎖の１つ以上のフレームワーク領域中に位置し得る。
【０１４０】
抗体分子の重鎖は、重鎖ＣＨ３ドメイン配列の直近のＣ末端にさらなるリジン残基（Ｋ）を任意に含み得る。
【０１４１】
１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸で置換される好ましい実施形態において、置換は、例えば以下の表で表される保存的置換であり得る。ある実施形態において、真ん中の列における同じカテゴリーのアミノ酸が、互いに置換され、すなわち、非極性アミノ酸が、例えば別の非極性アミノ酸で置換される。ある実施形態において、最も右側の列における同じ行のアミノ酸が、互いに置換される。
【０１４２】
【表１】
2021525546.tif 000002
【０１４３】
ある実施形態において、置換は、機能的に保存的であり得る。すなわち、ある実施形態において、置換は、同等の非置換の抗体分子と比較して、置換を含む抗体分子の１つ以上の機能特性（例えば結合親和性）に影響を与えることはない（又は実質的に影響を与えることはない）。
【０１４４】
抗体分子のＣＨ２ドメインは、ＣＨ２ドメインの、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩなどの１つ以上のＦｃγ受容体、及び／又は補体への結合を低減又は抑制する１つ以上の突然変異を含み得る。本発明者らは、Ｆｃγ受容体への結合を低減又は抑制することが、抗体分子によって媒介されるＡＤＣＣを低減するか又はなくすと仮定している。同様に、補体への結合を低減又は抑制することが、抗体分子によって媒介されるＣＤＣを低減するか又はなくすと予想される。ＣＨ２ドメインの、１つ以上のＦｃγ受容体及び／又は補体への結合を低減又は抑制する突然変異は、当該技術分野において公知である（Wang et al.,2018）。これらの突然変異は、Bruhns et al.,2009及びHezareh et al.,2001に記載される「ＬＡＬＡ突然変異」を含み、これは、アラニン（Ｌ１．３Ａ及びＬ１．２Ａ）によるＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ位置１．３及び１．２におけるロイシン残基の置換を含む。或いは、ＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ位置８４．４におけるアスパラギン（Ｎ）を、アラニン、グリシン又はグルタミン（Ｎ８４．４Ａ、Ｎ８４．４Ｇ又はＮ８４．４Ｑ）に突然変異させることによる、保存されたＮ−結合型グリコシル化部位の突然変異を介したａ−グリコシル抗体の産生は、ＩｇＧ１エフェクター機能を低下させることも知られている（Wang et al.,2018）。さらなる代替例として、補体活性化（Ｃ１ｑ結合）及びＡＤＣＣは、ＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ位置１１４におけるプロリンの、アラニン又はグリシン（Ｐ１１４Ａ又はＰ１１４Ｇ）への突然変異によって低下されることが知られている（Idusogie et al.,2000；Klein et al.,2016）。これらの突然変異はまた、さらなる低下されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ活性を有するか又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ活性を有さない抗体分子を産生するために組み合わされてもよい。
【０１４５】
したがって、抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含んでいてもよく、ここで、ＣＨ２ドメインは、好ましくは、
（ｉ）１．３及び１．２位におけるアラニン残基；及び／又は
（ｉｉ）１１４位におけるアラニン若しくはグリシン；及び／又は
（ｉｉｉ）８４．４位におけるアラニン、グルタミン若しくはグリシン
を含み；
ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１４６】
好ましい実施形態において、抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、好ましくは、
（ｉ）１．３及び１．２位におけるアラニン残基；及び／又は
（ｉｉ）１１４位におけるアラニン若しくはグリシン
を含み；
ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１４７】
好ましい実施形態において、抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位におけるアラニン残基；及び
（ｉｉ）１．２位におけるアラニン残基
を含み；
ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１４８】
例えば、ＣＨ２ドメインは、配列番号１０７に記載される配列を有し得る。
【０１４９】
別の好ましい実施形態において、抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位におけるアラニン残基；
（ｉｉ）１．２位におけるアラニン残基；及び
（ｉｉｉ）１１４位におけるアラニン
を含み；
ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１５０】
例えば、ＣＨ２ドメインは、配列番号１０８に記載される配列を有し得る。
【０１５１】
ＣＤ１３７のためのＣＤＲベースの抗原結合部位を含み、且つ本明細書に記載される抗体分子と競合するか、又はＣＤ１３７における、本明細書に記載される抗体分子と同じエピトープに結合する抗体分子も考えられる。２つの抗体による抗原を巡る競合を決定するための方法は、当該技術分野において公知である。例えば、２つの抗体による抗原への結合の競合は、例えばBiacore機器を用いて、表面プラズモン共鳴によって決定され得る。抗体によって結合されたエピトープをマッピングするための方法が、同様に公知である。
【０１５２】
抗体分子は、リガンド結合するとある範囲の活性を有することが示された。例えば、抗体分子は、ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合をブロックすることが可能であり得るか、ブロックすることが可能であることはないか、又は部分的にブロックすることが可能であり得る。
【０１５３】
好ましくは、抗体分子は、ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合をブロックすることが可能であり得るか、ブロックすることが可能であることはないか、又は部分的にブロックすることが可能であり得る。より好ましくは、抗体分子は、ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合を部分的にブロックすることが可能である。
【０１５４】
ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合をブロックする抗体分子の能力は、配列番号９９及び１０１のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１の重鎖及び軽鎖を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号１０４及び１０６のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／２０Ｈ４．９の重鎖及び軽鎖を含むか若しくはそれからなる抗体分子を参照することによって決定され得る。
【０１５５】
或いは、本明細書においてＣＤ１３７Ｌブロッキング活性とも呼ばれる、ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合をブロックする抗体分子の能力は、配列番号７９及び４６のそれぞれに記載される抗体ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６の重鎖及び軽鎖を含むか又はそれからなる抗体分子を参照することによって決定され得る。
【０１５６】
例えば、抗体分子は、配列番号９９及び１０１のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１の重鎖及び軽鎖、又は配列番号１０４及び１０６のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／２０Ｈ４．９の重鎖及び軽鎖を含むか又はそれからなる抗体分子より低いレベルのＣＤ１３７Ｌブロッキング活性を有し得る。
【０１５７】
例えば、抗体分子は、配列番号９９及び１０１のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１の重鎖及び軽鎖配列、又は配列番号１０４及び１０６のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／２０Ｈ４．９の重鎖及び軽鎖を含むか又はそれからなる抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性の８０％以下、７０％以下、又は６０％以下であるＣＤ１３７Ｌブロッキング活性を有し得る。
【０１５８】
抗体分子は、配列番号９９及び１０１のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１の重鎖及び軽鎖配列、又は配列番号１０４及び１０６のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／２０Ｈ４．９の重鎖及び軽鎖を含むか又はそれからなる抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性の少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％であるＣＤ１３７Ｌブロッキング活性を有し得る。
【０１５９】
抗体分子は、配列番号９９及び１０１のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１の重鎖及び軽鎖配列、又は配列番号１０４及び１０６のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／２０Ｈ４．９の重鎖及び軽鎖を含むか又はそれからなる抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性の２０％から８０％、３０％から７０％、又は４０％から６０％であるＣＤ１３７Ｌブロッキング活性を有し得る。
【０１６０】
抗体分子は、配列番号７９及び４６のそれぞれに記載される抗体ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６の重鎖配列及び軽鎖配列を含むか又はそれからなる抗体分子のＣＤ１３７Ｌブロッキング活性の７０％から１３０％、８０％から１２０％、又は９０％から１１０％であるＣＤ１３７Ｌブロッキング活性を有し得る。
【０１６１】
一態様において、本発明は、上述される部分的なＣＤ１３７Ｌブロッキング活性を有し、且つヒト及びカニクイザルＣＤ１３７の両方に結合する抗体分子に関する。
【０１６２】
ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合をブロックする抗体分子の能力を決定するのに好適な方法は、当該技術分野において公知であり、ＥＬＩＳＡ及び細胞ベースのアッセイ、例えば標識された、例えばビオチン化ＣＤ１３７Ｌ又はＣＤ１３７のそれぞれの結合の試験のために、ＣＤ１３７又はＣＤ１３７リガンドを過剰発現する細胞を使用するアッセイを含む。
【０１６３】
例えば、ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合をブロックする抗体分子の能力を決定するための方法は、
（ａ）
（ｉ）ＣＤ１３７を固体担体上に固定すること；
（ｉｉ）前記固体担体を抗体分子とともにインキュベートすること；
（ｉｉｉ）工程（ａ）（ｉｉ）において調製された固体担体を、ＣＤ１３７Ｌとともにインキュベートすること；及び
（ｉｖ）ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合を測定して、測定値を得ること；並びに
（ｂ）
（ｉ）ＣＤ１３７を固体担体上に固定すること；
（ｉｉ）前記固体担体を対照抗体分子とともにインキュベートすること；
（ｉｉｉ）工程（ｂ）（ｉｉ）において調製された前記固体担体を、ＣＤ１３７Ｌとともにインキュベートすること；及び
（ｉｖ）ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合を測定して、測定値を得ること；及び（ａ）において得られた測定値を、（ｂ）において得られた測定値と比較すること
を含み得る。
【０１６４】
別の例として、ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合をブロックする抗体分子の能力を決定するための方法は、
（ａ）
（ｉ）ＣＤ１３７Ｌを固体担体上に固定すること；
（ｉｉ）ＣＤ１３７を抗体分子とともにインキュベートすること；
（ｉｉｉ）工程（ａ）（ｉ）において調製された固体担体を、工程ａ（ｉｉ）において調製されたＣＤ１３７と抗体分子との混合物とともにインキュベートすること；及び
（ｉｖ）ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合を測定して、測定値を得ること；並びに
（ｂ）
（ｉ）ＣＤ１３７Ｌを固体担体上に固定すること；
（ｉｉ）ＣＤ１３７を対照抗体分子とともにインキュベートすること；
（ｉｉｉ）工程（ｂ）（ｉ）において調製された固体担体を、工程ｂ（ｉｉ）において調製されたＣＤ１３７と対照抗体分子との混合物とともにインキュベートすること；及び
（ｉｖ）ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合を測定して、測定値を得ること；及び（ａ）において得られた測定値を、（ｂ）において得られた測定値と比較すること
を含み得る。
【０１６５】
さらなる例として、ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合をブロックする抗体分子の能力を決定するための方法は、
（ａ）
（ｉ）ＣＤ１３７を抗体分子とともにインキュベートすること；
（ｉｉ）抗体分子とＣＤ１３７との混合物を、ＣＤ１３７Ｌを発現する細胞とともにインキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合を測定して、測定値を得ること；並びに
（ｂ）
（ｉ）ＣＤ１３７を対照抗体分子とともにインキュベートすること；
（ｉｉ）対照抗体分子とＣＤ１３７との混合物を、ＣＤ１３７Ｌを発現する細胞とともにインキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合を測定して、測定値を得ること；及び（ａ）において得られた測定値を、（ｂ）において得られた測定値と比較すること
を含み得る。
【０１６６】
さらに他の例として、ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合をブロックする抗体分子の能力を決定するための方法は、
（ａ）
（ｉ）抗体分子を、ＣＤ１３７を発現する細胞とともにインキュベートすること；
（ｉｉ）抗体分子とＣＤ１３７発現細胞との混合物を、ＣＤ１３７Ｌとともにインキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合を測定して、測定値を得ること；並びに
（ｂ）
（ｉ）対照抗体分子を、ＣＤ１３７を発現する細胞とともにインキュベートすること；
（ｉｉ）対照抗体分子とＣＤ１３７発現細胞との混合物を、ＣＤ１３７Ｌとともにインキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合を測定して、測定値を得ること；及び（ａ）において得られた測定値を、（ｂ）において得られた測定値と比較すること
を含み得る。
【０１６７】
対照抗体は、好ましくは、ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合をブロックする。例えば、対照抗体は、配列番号９９及び１０１のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１の重鎖及び軽鎖、配列番号１０４及び１０６のそれぞれに記載される抗体Ｇ１／２０Ｈ４．９の重鎖及び軽鎖、又は配列番号７９及び４６のそれぞれに記載される抗体ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６の重鎖配列及び軽鎖配列を含むか又はそれからなり得る。したがって、工程（ａ）において決定される際の測定値が工程（ｂ）において決定される際の対照抗体の測定と同じか又はそれより高い抗体分子は、対照抗体と同じ程度又は対照抗体より大きい程度に、ＣＤ１３７へのＣＤ１３７Ｌの結合をブロックする。
【０１６８】
好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、ＣＤ１３７のためのＣＤＲベースの抗原結合部位に加えて、１つ以上のさらなる抗原に結合する１つ以上のさらなる抗原結合部位を含み得る。１つ以上のさらなる抗原結合部位は、好ましくは、それらの同種抗原に特異的に結合する。
【０１６９】
１つ以上のさらなる抗原結合部位は、好ましくは、ＣＤ１３７に結合しない。したがって、抗体分子は、多重特異的、例えば二重特異的、三重特異的、又は四重特異的分子、好ましくは、二重特異的分子であり得る。好ましい実施形態において、抗体分子は、ＣＤ１３７及び１つ以上のさらなる抗原に同時に結合することが可能である。
【０１７０】
抗体分子は、多重特異的、例えば二重特異的、三重特異的、又は四重特異的抗体フォーマットを形成するために複数の異なる方法で組み合わされ得る個別のドメインを含むモジュール構造を有する。例示的な多重特異的抗体フォーマットは、例えば、Spiess et al.(2015)and Kontermann(2012)に記載されている。本発明の抗体分子は、このような多重特異的フォーマットで用いられ得る。
【０１７１】
例えば、本発明の抗体分子は、ヘテロ二量体抗体分子、例えば、ヘテロ二量体完全免疫グロブリン分子、又はその断片であり得る。この場合、抗体分子の一部は、本明細書に記載される１つ又は複数の配列を有するであろう。例えば、本発明の抗体分子が、二重特異的ヘテロ二量体抗体分子である場合、抗体分子は、ＭＳＬＮ以外の抗原に結合する、ＶＨドメイン及びＶＬドメインをそれぞれ含む重鎖及び軽鎖と対合される本明細書に記載される重鎖及び軽鎖を含み得る。ヘテロ二量体抗体を調製するための技術は、当該技術分野において公知であり、ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）技術を含み、これは、鎖のヘテロ二量体化を促進するために「ノブ」又は「ホール」のいずれかを形成するように抗体分子のＣＨ３ドメインを操作することを含む。或いは、ヘテロ二量体抗体は、静電反発力によってＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避し、静電引力によってヘテロ二量体化を指向するための、抗体分子中への電荷対の導入によって調製され得る。ヘテロ二量体抗体フォーマットの例としては、CrossMab、ｍＡｂ−Ｆｖ、ＳＥＥＤ−ボディ、及びｋｉｈ  ＩｇＧが挙げられる。
【０１７２】
或いは、多重特異的抗体分子は、完全免疫グロブリン分子又はその断片及び１つ若しくは複数のさらなる抗原結合部分を含み得る。抗原結合部分は、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体であってもよく、完全免疫グロブリン分子又はその断片に融合され得る。完全免疫グロブリン分子に融合されたさらなる抗原結合部分を含む多重特異的抗体分子の例としては、ＤＶＤ−ＩｇＧ、ＤＶＩ−ＩｇＧ、ｓｃＦｖ４−ＩｇＧ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ、及びｓｃＦｖ−ＩｇＧ分子が挙げられる（Spiess et al.,2015；図１）。免疫グロブリン断片に融合されたさらなる抗原結合部分を含む多重特異的抗体分子の例としては、例えば、ＢｉＴＥ分子、二重特異性抗体及びＤＡＲＴ分子が挙げられる（Spiess et al.,2015；図１）。
【０１７３】
他の好適なフォーマットは、当業者に容易に明らかになるであろう。
【０１７４】
好ましい実施形態において、抗体分子は、第２の抗原に結合する第２の抗原結合部位を含み、第２の抗原結合部位は、好ましくは、抗体分子の定常ドメイン中に位置する。例えば、抗体分子は、ｍＡｂ２（ＴＭ）二重特異的抗体であり得る。本明細書において言及されるｍＡｂ２二重特異的抗体は、その可変領域のそれぞれにおけるＣＤＲベースの抗原結合部位及び抗体分子の定常ドメイン中の少なくとも１つの抗原結合部位を含むＩｇＧ免疫グロブリンである。
【０１７５】
好ましい実施形態において、抗体は、ＣＤ１３７及び第２の抗原に結合する抗体分子であり、抗体分子は、
（ｉ）免疫グロブリンＶＨドメイン及び免疫グロブリンＶＬドメインによってそれぞれ形成される、ＣＤ１３７のための２つのＣＤＲベースの抗原結合部位；及び
（ｉｉ）抗体分子の２つのＣＨ３ドメイン中に位置する第２の抗原に結合する２つの抗原結合部位
を含む。
【０１７６】
より好ましい実施形態において、抗体は、完全免疫グロブリン分子、例えば、ＣＤ１３７及び第２の抗原に結合する完全ＩｇＧ１分子であり、抗体分子は、
（ｉ）免疫グロブリンＶＨドメイン及び免疫グロブリンＶＬドメインによってそれぞれ形成される、ＣＤ１３７のための２つのＣＤＲベースの抗原結合部位；及び
（ｉｉ）抗体分子の２つのＣＨ３ドメイン中に位置する第２の抗原に結合する２つの抗原結合部位
を含み；
ここで、免疫グロブリン分子は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＬドメインをさらに含む。
【０１７７】
第２の抗原のための抗原結合部位は、抗体分子の任意の定常ドメイン中に位置し得る。例えば、第２の抗原のための抗原結合部位は、ＣＨ４、ＣＨ３、ＣＨ２、ＣＨ１又はＣＬドメインの１つ以上、好ましくは、ＣＨ３又はＣＨ２ドメイン、最も好ましくは、ＣＨ３ドメインに位置し得る。
【０１７８】
抗原結合部位は、１つ以上、例えば１つ、２つ、３つ又はそれ以上の、抗体分子の定常ドメインの構造ループから構成され得る。
【０１７９】
抗体定常ドメインの構造ループは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、及びＦＧ構造ループを含む。抗原結合部位は、定常ドメインのＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、及びＦＧ構造ループの２つ以上、好ましくは、ＡＢ及びＥＦ構造ループ、又はＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループを含み得る。
【０１８０】
抗体定常ドメインにおける構造ループの位置は、当該技術分野において周知である。例えば、ＣＨ３ドメインの構造ループは、ＣＨ３ドメインの１０及び１９位の間（ＡＢループ）、２８及び３９位の間（ＢＣループ）、４２及び７９位の間（ＣＤループ）、８２及び８５位の間（ＤＥループ）、９１及び１０２位の間（ＥＦループ）並びに１０６及び１１７位の間（ＦＧループ）に位置し、ここで、残基は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って番号付けされる。他の定常ドメインにおける構造ループ位置の場所は、容易に決定され得る。
【０１８１】
定常ドメインの構造ループは、第２の抗原のための抗原結合部位を形成するために、１つ以上のアミノ酸修飾を含み得る。１つ以上のアミノ酸修飾は、アミノ酸置換、付加、又は欠失を含み得る。標的抗原のための抗原結合部位を形成するための抗体定常ドメインの構造ループ領域中へのアミノ酸修飾の導入は、当該技術分野において周知であり、例えば、Wozniak-Knopp G et al.,2010、並びに特許公開番号国際公開第２００６／０７２６２０号及び国際公開第２００９／１３２８７６号に記載されている。定常ドメイン結合部位の例が、以下に示される。
【０１８２】
好ましい実施形態において、抗体分子は、ＡＢ、ＣＤ及び／又はＥＦ構造ループ、好ましくは、ＡＢ及びＥＦ構造ループ又はＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ中の１つ以上のアミノ酸修飾（置換、付加、及び／又は欠失）を含む。例えば、抗体分子は、本明細書に記載される第２の抗原のための抗原結合部位を提供するために、ＣＨ３ドメインの１０及び１９位の間、４２及び７９位の間、及び／又は９１及び１０２位の間、好ましくは、ＣＨ３ドメインの１０及び１９位の間、並びに９１及び１０２位の間、又は１０及び１９位の間、４２及び７９位の間、並びに９１及び１０２位の間に１つ以上のアミノ酸修飾（置換、付加、及び／又は欠失）を含み得る。より好ましくは、抗体分子は、本明細書に記載される第２の抗原のための抗原結合部位を提供するために、ＣＨ３ドメインの１１及び１９位の間、４５及び７８位の間、９１及び９５位の間、及び／又は９６及び１０２位の間、より好ましくは、ＣＨ３ドメインの１１及び１９位の間、９１及び９５位の間、並びに９６及び１０２位の間、又は１１及び１９位の間、４５及び７８位の間、９１及び９５位の間、並びに９６及び１０２位の間に１つ以上のアミノ酸修飾（置換、付加、及び／又は欠失）を含む。非修飾ＣＨ３ドメインは、好ましくは、配列番号１０９に記載される配列を含むか又はそれからなる。残基番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１８３】
ＣＤ１３７の活性化は、免疫細胞表面、例えばＴ細胞表面におけるＣＤ１３７のクラスター化を必要とし、これは、次に、細胞内シグナル伝達経路及び免疫細胞活性化を刺激する。抗体分子の架橋の非存在下での免疫細胞表面におけるＣＤ１３７への抗体分子の結合は、ＣＤ１３７にクラスターを形成させることはなく、その結果、免疫細胞活性化をもたらすことはない。
【０１８４】
本発明者らは、本発明の抗体分子が、抗体分子の架橋の非存在下でＴ細胞活性化を行わないことを示した（実施例７を参照）。
【０１８５】
上記に説明されるように、Ｆｃγ受容体への結合による抗体分子の架橋は、非効率的であり、且つＦｃγ受容体発現細胞がヒト身体全体に存在する際、特定の位置、例えば、疾患の部位に標的化することができない。したがって、第２の抗原結合部位によって結合された第２の抗原は、好ましくは、Ｆｃγ受容体でない。
【０１８６】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、第２の抗原に結合する第２の抗原結合部位を含み、ここで、第２の抗原は、複数の抗体分子に結合し、それを架橋することが可能である。
【０１８７】
例えば、本発明者らは、ＣＤ１３７及び第２の抗原の両方のための結合部位を含む他の二重特異的分子、特に、ＣＤ１３７のための２つの定常ドメイン結合部位及び第２の抗原のための２つのＣＤＲベースの抗原結合部位を含むｍＡｂ２分子（ＣＤ１３７／第２の抗原ｍＡｂ２）を用いて、第２の抗原が多量体分子である場合、第２の抗原への抗体分子の結合が、Ｔ細胞活性化をもたらすか、又はＴ細胞活性化を促進することを示した。したがって、第２の抗原は、好ましくは、多量体抗原、例えば二量体、三量体又はより高次の多量体であり、したがっていくつかの抗体分子に架橋することが可能である。
【０１８８】
本発明者らは、ＣＤ１３７／第２の抗原ｍＡｂ２分子を用いて、第２の抗原が、モノマー又は多量体であり得、且つ表面、例えば細胞表面に高濃度で存在するか及び／又はクラスター化された細胞表面抗原などの表面抗原である場合、抗体分子の、第２の抗原への結合は、Ｔ細胞活性化をもたらすか、又はＴ細胞活性化を促進することも示した。理論に制約されるのを望むものではないが、抗体分子の、豊富な細胞表面抗原への結合が、例えば、抗体分子が、ＣＤ１３７のクラスター化及び免疫細胞活性化を引き起こすことが可能なほど十分に近接して配置された、細胞表面に結合された高濃度の抗体分子をもたらすと考えられる。したがって、好ましい実施形態において、第２の抗原は、表面、例えば細胞表面において高濃度で発現される表面抗原である。
【０１８９】
本明細書に記載される第２の抗原に結合し、且つ第２の抗原への結合の際にのみＴ細胞などの免疫細胞を活性化するか、又はその免疫細胞活性化活性が第２の抗原への結合の際に促進される第２の抗原結合部位を含む抗体分子は、コンディショナルなアゴニストとも呼ばれる。第２の抗原への結合の際のこの免疫細胞活性化活性は、抗体分子の、Ｆｃγ受容体及び／又は外部の架橋剤、例えばプロテインＡ又はＧ又は二次抗体への結合とは無関係であり、したがって、抗体分子のコンディショナルなアゴニスト活性が、第２の抗原が存在する部位に標的化されるのを可能にする。例えば、第２の抗原が疾患抗原である場合、抗体分子は、個体における疾患の部位で選択的に免疫細胞の活性化を促進し得、他の箇所では免疫細胞の活性化を促進しない。
【０１９０】
さらに、第２の抗原への結合の際にのみＴ細胞などの免疫細胞を活性化する抗体分子は、外部の架橋剤などの他の機構による架橋、又はＦｃγ受容体相互作用による架橋に依存する抗体分子と比較して増加した免疫細胞活性化活性を有し得る。ＣＤ１３７の活性化がより効率的であるため、免疫細胞活性化は、他の抗体分子と比べてより低い濃度の本明細書に記載される抗体分子で達成され得る。
【０１９１】
したがって、本発明の抗体分子は、好ましくは、抗体分子が架橋されていない場合より、抗体分子が、例えば第２の抗原への結合によって架橋される場合、増加したＴ細胞などの免疫細胞の活性化を誘発する。
【０１９２】
Ｔ細胞を活性化する抗体分子の能力は、Ｔ細胞活性化アッセイを用いて測定され得る。Ｔ細胞は、活性化の際にＩＬ−２を放出する。したがって、Ｔ細胞活性化アッセイは、抗体分子によって誘発されるＴ細胞活性化のレベルを決定するためにＩＬ−２放出を測定し得る。
【０１９３】
例えば、Ｔ細胞を活性化する抗体分子の能力は、抗体分子が架橋される場合、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によるＩＬ−２の最大半量（half-maximal）放出を達成するのに必要な抗体分子の濃度を測定することによって決定され得る。これは、以下の抗体分子のＥＣ５０と呼ばれる。より低いＥＣ５０は、より低い濃度の抗体分子が、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によるＩＬ−２の最大半量放出を達成するのに必要とされること、及びひいては抗体分子が、より高いＴ細胞活性化活性を有することを示す。抗体分子は、例えば、抗ＣＨ２抗体を用いて架橋され得る。
【０１９４】
好ましい実施形態において、抗体分子は、同じアッセイにおいてＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６（ＬＡＬＡ突然変異を含む）のＥＣ５０の５０倍、４０倍、３０倍、２０倍、１０倍、５倍、４倍、３倍、又は２倍以内である、Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＥＣ５０を有し、ここで、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６（ＬＡＬＡ）は、配列番号７９に記載される重鎖及び配列番号４６に記載される軽鎖からなるか又はそれを含む。
【０１９５】
例えば、抗体分子は、２０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．５ｎＭ以下の、Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＥＣ５０を有し得る。
【０１９６】
それに加えて、又はその代わりに、Ｔ細胞を活性化する抗体分子の能力は、抗体分子の存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によって放出されるＩＬ−２の最高濃度を測定することによって決定され得、ここで、抗体分子は、架橋されている。
【０１９７】
好ましい実施形態において、架橋の存在下で、抗体分子の存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によって放出されるＩＬ−２の最高濃度は、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６（ＬＡＬＡ突然変異を含む）の存在下でＴ細胞によって放出されるＩＬ−２の最高濃度の１０倍、５倍、４倍、３倍、２倍、又は１．５倍以内である。架橋の存在下で、抗体分子の存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によって放出されるＩＬ−２の最高濃度は、好ましくは、同じアッセイにおいて架橋されたＧ１／ＭＯＲ７４８０．１の存在下で、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によって放出されるＩＬ−２の最高濃度より、例えば少なくとも１．１倍又は少なくとも１．２倍高い。
【０１９８】
Ｔ細胞活性化アッセイは、本発明の実施例に記載されるように、ＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイなどの、本明細書に記載されるＴ細胞アッセイであり得る、実施例２を参照のこと。
【０１９９】
例えば、Ｔ細胞活性化アッセイは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＣＤ８＋  Ｔ細胞に基づくＩＬ−２放出アッセイであり得る。例えば、Ｔ細胞活性化アッセイは、白血球除去錐体細胞（cone）からヒトＰＢＭＣを単離することを含み得る。ＰＢＭＣを単離するための方法は、当該技術分野において公知であり、本発明の実施例に記載されている。次に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから単離され得る。ＰＢＭＣからＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離するための方法は、当該技術分野において公知であり、本発明の実施例に記載されている。
【０２００】
次に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、抗ヒトＣＤ３抗体で被覆された多層プレートに加えられ得る。各試験抗体分子の好適な希釈物が、調製され、ウェルに加えられ得る。次に、Ｔ細胞は、試験抗体とともに２４時間にわたって、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートされ得る。上清が、収集され、上清中のＩＬ−２の濃度を決定するためにアッセイされ得る。溶液中のＩＬ−２の濃度を決定するための方法は、当該技術分野において公知であり、本発明の実施例に記載されている。ヒトＩＬ−２の濃度は、抗体分子のｌｏｇ濃度に対してプロットされ得る。得られた曲線は、ｌｏｇ（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングされ得る。
【０２０１】
抗体分子の第２の抗原結合部位によって結合される第２の抗原は、免疫細胞抗原、又は疾患抗原であり得る。疾患抗原としては、病原性抗原及び腫瘍抗原が挙げられる。
【０２０２】
抗体分子によって結合される免疫細胞抗原は、ＣＤ１３７と同じ免疫細胞又は異なる免疫細胞上に存在し得る。
【０２０３】
免疫細胞抗原は、ＣＤ１３７以外の、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり得る。ＴＮＦＲＳＦ受容体は、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）の１つ以上のリガンドに結合する細胞外システインリッチドメインを含む膜結合サイトカイン受容体である。
【０２０４】
ＴＮＦＲＳＦ受容体は、免疫細胞の表面上に位置し得る。ＴＮＦＲＳＦリガンドの結合の際、ＴＮＦＲＳＦ受容体は、免疫細胞を活性化する免疫細胞表面上にクラスターを形成する。例えば、リガンド結合ＴＮＦＲＳＦ受容体は、三量体などの多量体、又は多量体のクラスターを形成し得る。リガンド−結合ＮＦＲＳＦ受容体のクラスターの存在は、免疫細胞を活性化する細胞内シグナル伝達経路を刺激する。
【０２０５】
理論に制約されるのを望むものではないが、免疫細胞表面上でＣＤ１３７及び第２のＴＮＦＲＳＦ受容体を嵌合することによって、抗体分子は、ＣＤ１３７及び第２のＴＮＦＲＳＦ受容体の両方をクラスター化させ、免疫細胞を活性化させると考えられる。言い換えると、抗体分子は、両方の標的が結合されるとき、ＴＮＦＲＳＦ受容体アゴニストとして働く。
【０２０６】
ＴＮＦＲＳＦ受容体としては、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＥＤＡ２Ｒ、ＥＤＡＲ、ＦＡＳ、ＬＴＢＲ、ＲＥＬＴ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ−１０Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ２１及びＴＮＦＲＳＦ２５が挙げられる。
【０２０７】
好ましい実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ受容体は、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）である。
【０２０８】
ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７：遺伝子ＩＤ  ９３９）は、ＮＰ＿００１２３３．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２４２．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５：遺伝子ＩＤ  ９５８）は、ＮＰ＿００１２４１．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２５０．５の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥＤＡ２Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ２７：遺伝子ＩＤ  ６０４０１）は、ＮＰ＿００１１８６６１６．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１１９９６８７．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥＤＡＲ（遺伝子ＩＤ  １０９１３）は、ＮＰ＿０７１７３１．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０２２３３６、３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＦＡＳ（ＴＮＦＲＳＦ６：遺伝子ＩＤ  ３５５）は、ＮＰ＿００００３４．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００００４３．５の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＬＴＢＲ（ＴＮＦＲＳＦ３：遺伝子ＩＤ  ４０５５）は、ＮＰ＿００１２５７９１６．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２７０９８７．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＲＥＬＴ（ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ：遺伝子ＩＤ  ８４９５７）は、ＮＰ＿１１６２６０．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０３２８７１．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（遺伝子ＩＤ  ７１３２）は、ＮＰ＿００１０５６．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０６５．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（遺伝子ＩＤ  ７１３３）は、ＮＰ＿００１０５７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０６６．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０２０９】
ＴＮＦＲＳＦ４（遺伝子ＩＤ  ７２９３）は、ＮＰ＿００３３１８の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３３２７の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。）ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（遺伝子ＩＤ  ８７７１）は、ＮＰ＿００３８１４．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８２３．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ８（遺伝子ＩＤ  ９４３）は、ＮＰ＿００１２３４．３の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２４３．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（遺伝子ＩＤ  ８７９７）は、ＮＰ＿００３８３５．３の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４４．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（遺伝子ＩＤ  ８７９５）は、ＮＰ＿００３８３３．４の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４２．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（遺伝子ＩＤ  ８７９４）は、ＮＰ＿００３８３２．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４１．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（遺伝子ＩＤ  ８７９３）は、ＮＰ＿００３８３１．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４０．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（遺伝子ＩＤ  ８７９２）は、ＸＰ＿０１１５２４５４７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＸＭ＿１１５２６２４５．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（遺伝子ＩＤ  ４９８２）は、ＮＰ＿００２５３７．３の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００２５４６．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（遺伝子ＩＤ  ５１３３０）は、ＮＰ＿０５７７２３．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０１６６３９．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（遺伝子ＩＤ  ２３４９５）は、ＮＰ＿００３６５８４．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０１２４５２．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（遺伝子ＩＤ  １１５６５０）は、ＮＰ＿４４３１７７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０５２９４５．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１４（遺伝子ＩＤ  ８７６４）は、ＮＰ＿００１２８４５３４．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２９７６０５．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１７（遺伝子ＩＤ  ６０８）は、ＮＰ＿００１１８３．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１１９２．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１８（遺伝子ＩＤ  ８７８４）は、ＮＰ＿００４１９５．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００４１８６．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１９（遺伝子ＩＤ  ５５５０４）は、ＮＰ＿００１１９１３８７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２０４４５８．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＮＦＲＳＦ２１（遺伝子ＩＤ  ２７２４２）は、ＮＰ＿０５５２６７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０１４４５２．４の基準ヌクレオチ��配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３：遺伝子ＩＤ  ８７１８）は、リガンドＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ）に結合し、ＮＰ＿００１０３４７５３．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０３９６６４．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０２１０】
或いは、第２の抗原結合部位によって結合される免疫細胞抗原は、ＴＮＦＲＳＦ分子、例えば、免疫共刺激分子又は阻害性チェックポイント分子以外の免疫系を調節する分子であり得る。このような他の免疫調節分子の例としては、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＡＧ３、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、Ｔ細胞免疫グロブリン、及びムチンドメイン含有−３（ＴＩＭ−３）、ＣＤ４７、ＣＤ７３、Ａ２ａＲ、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、及びコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）、ＶＩＳＴＡ  ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＬＬＴ１、ガレクチン−９、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、及びＫＩＲが挙げられる。
【０２１１】
免疫細胞抗原が存在する免疫細胞は、任意の免疫細胞サブセットに属してもよく、Ｔ細胞、腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）、骨髄系統細胞、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、ＮＫ細胞及び／又はＢ細胞であり得る。免疫細胞抗原がＴＮＦＲＳＦ受容体である場合、ＴＮＦＲＳＦ受容体が存在する免疫細胞は、好ましくは、Ｔ細胞である。
【０２１２】
或いは、第２の抗原結合部位は、上述される疾患抗原に結合し得る。理論に制約されるのを望むものではないが、抗体分子の、ＣＤ１３７及び疾患抗原への結合が、疾患の近くでＴ細胞の活性化をもたらすと考えられる。次に、次に活性化Ｔ細胞は、免疫応答、例えば、病原体又は癌細胞に対する免疫応答を開始させ、促進し、又はそれに関与し得る。癌細胞を認識及び除去する際に免疫系が果たす役割の概説が、Chen and Mellman (2013)によって提供される。
【０２１３】
好ましい実施形態において、疾患抗原は、腫瘍抗原に結合し得る。腫瘍抗原は、腫瘍の環境中に主に存在し、個体における他の箇所に遍在的に存在していない抗原である。例えば、腫瘍抗原は、腫瘍細胞の表面に存在し得、又は腫瘍微小環境の他の間質細胞若しくは腫瘍の近くの体液中に存在し得る。したがって、腫瘍抗原は、個体における腫瘍細胞の位置のマーカーである。
【０２１４】
ある実施形態において、腫瘍抗原は、癌細胞の表面に位置する抗原であり得る。好ましくは、腫瘍抗原は、腫瘍細胞において上方制御又は過剰発現される一方、それは、腫瘍の非存在下における同じ組織から対応する正常な体細胞によって多く発現されることはない。
【０２１５】
ある実施形態において、腫瘍抗原は、腫瘍の非存在下における対応する正常な組織の間質細胞と比較して、腫瘍微小環境の間質細胞において上方制御又は過剰発現される。
【０２１６】
好ましい腫瘍抗原は、細胞表面に存在し、急速に内在化されることはない。
【０２１７】
抗体分子によって標的化するのに好適な腫瘍抗原は、当該技術分野において公知の方法を用いて同定され得る。例えば、ＣＤ１３７受容体及び腫瘍抗原を標的とする抗体分子は、ＣＤ１３７発現細胞が腫瘍抗原発現細胞とともに共培養されるアッセイにおいて使用され得、ＣＤ１３７発現細胞の活性化が、例えば、Ｔ細胞活性化アッセイ、増殖アッセイ又は細胞毒性アッセイによって測定される。
【０２１８】
細胞表面腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）であり得る。
【０２１９】
癌細胞によって発現される腫瘍抗原としては、例えば、癌生殖細胞系遺伝子、例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＧＡＧＥ−Ｉ、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＢＡＧＥ−Ｉ、ＲＡＧＥ−１、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１／ＣＴ７、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ、ＬＡＧＥ−Ｉ、ＳＳＸ−Ｉ、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−Ｉ及びＸＡＧＥによってコードされる癌精巣（ＣＴ）抗原並びに免疫原性断片又はその変異体が挙げられ得る（Simpson et al.,2005；Gure et al.,2005；Velazquez et al.,2007；Andrade et al.,2008；Tinguely et al.,2008；Napoletano et al.,2008）。
【０２２０】
他の細胞表面腫瘍抗原としては、例えば、ＡＦＰ、αｖβ３（ビトロネクチン受容体）、αｖβ６、Ｂ細胞成熟剤（ＢＣＭＡ）、ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６）、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ８０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ３ガングリオシド、ＨＥＲ２、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、抗イディオタイプ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、例えば癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＴＡＧ−７２、葉酸結合タンパク質、Ａ３３、Ｇ２５０、フェリチン、糖脂質、例えば、ガングリオシド、糖質、例えば、ＣＡ−１２５、ＩＬ−２受容体、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２００、ＥｐｈＡ２、及びメソテリン又はその変異体が挙げられる。これらの及び他の細胞表面腫瘍抗原は、Carter et al.,2004；Scott and Renner,2001；及びCheever et al.,2009；Tai and Anderson,2015；及びPodojil and Miller,2017に記載されている。
【０２２１】
他の腫瘍抗原としては、「ストレスを受けた」癌細胞によって用いられる非ＡＵＧ翻訳開始機構によって生成されるアウトオブフレームペプチド−ＭＨＣ複合体が挙げられる（Malarkannan et al.,1999）。
【０２２２】
他の腫瘍抗原としては、腫瘍細胞の表面又は腫瘍微小環境の細胞の表面におけるペプチド−ＭＨＣ複合体が挙げられ、ここで、ペプチド−ＭＨＣ複合は、突然変異した細胞内腫瘍抗原の腫瘍特異的ネオアンチゲンペプチド断片を含み、ペプチドネオアンチゲンは、１つ以上の腫瘍特異的突然変異を有する（Gubin et al.,2015）。他の腫瘍抗原が、当該技術分野において周知である（例えば国際公開第００／２０５８１号；Cancer Vaccines and Immunotherapy(2000)Eds Stern,Beverley and Carroll,Cambridge University Press,Cambridgeを参照）。これらの腫瘍抗原の配列は、公開データベースから容易に入手可能であるが、国際公開第１９９２／０２０３５６  Ａ１号、国際公開第１９９４／００５３０４  Ａ１号、国際公開第１９９４／０２３０３１  Ａ１号、国際公開第１９９５／０２０９７４  Ａ１号、国際公開第１９９５／０２３８７４  Ａ１号及び国際公開第１９９６／０２６２１４  Ａ１号にも見出される。
【０２２３】
好ましい腫瘍抗原としては、ＨＥＲ２、ＦＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ２０、ＣＤ７３、ＰＳＭＡ、メソテリン、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ２００、αｖβ６、ＢＣＭＡ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４及びＥＧＦＲが挙げられる。
【０２２４】
ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２；遺伝子ＩＤ  ２０６４）は、ＮＰ＿００１００５８６２．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１００５８６２．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＦＡＰ（遺伝子ＩＤ  ２１９１）は、ＮＰ＿００１２７８７３６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２９１８０７．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥｐＣＡＭ（遺伝子ＩＤ  ４０７２）は、ＮＰ＿００２３４５．２の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００２３５４．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＥＡＣＡＭ５（遺伝子ＩＤ  １０４８）は、ＮＰ＿００１２７８４１３．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２９１４８４．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１；遺伝子ＩＤ  ９３１）は、ＮＰ＿０６８７６９．２の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿０２１９５０．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ；遺伝子ＩＤ  ４９０７）は、ＮＰ＿００１１９１７４２．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２０４８１３．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１；遺伝子ＩＤ  ２３４６）は、ＮＰ＿００１０１４９８６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１０１４９８６．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。メソテリン（ＭＳＬＮ；遺伝子ＩＤ  １０２３２）は、ＮＰ＿００１１７０８２６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１７７３５５．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥｐｈＡ２（遺伝子ＩＤ  １９６９）は、ＮＰ＿００１３１６０１９．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１３２９０９０．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＩＧＦ１Ｒ（遺伝子ＩＤ  ３４８０）は、ＮＰ＿０００８６６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿０００８７５．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＤ２００（遺伝子ＩＤ  ４３４５）は、ＮＰ＿００１００４１９６．２の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１００４１９６．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。αｖβ６は、インテグリンサブユニットαＶ及びインテグリンサブユニットβ６から構成されるヘテロ二量体である。インテグリンサブユニットαＶ（ＩＴＧＡＶ；遺伝子ＩＤ  ３６８５）は、ＮＰ＿００１１３８４７１．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１４４９９９．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。インテグリンサブユニットβ６（ＩＴＧＢ６；遺伝子ＩＤ  ３６９４）は、ＮＰ＿０００８７９．２の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿０００８８８．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７；遺伝子ＩＤ  ６０８）は、ＮＰ＿００１１８３．２の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１９２．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４；遺伝子ＩＤ  ２９１２６）は、ＮＰ＿００１２５４６３５．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２６７７０６．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６；遺伝子ＩＤ  ８０３８���）は、ＮＰ＿００１０１９９０７．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１０２４７３６．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。Ｂ７Ｈ４（ＶＴＣＮ１；遺伝子ＩＤ  ７９６７９）は、ＮＰ＿００１２４０７７８．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２５３８４９．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥＧＦＲ（遺伝子ＩＤ  １９５６）は、ＮＰ＿００１３３３８２６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１３４６８９７．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０２２５】
他の実施形態において、腫瘍抗原は、可溶性腫瘍抗原、例えば、癌細胞によって、又は癌細胞に応答して産生される成長因子であり得る。可溶性因子は、腫瘍の近くの体液中で上方制御又は過剰発現され得る。可溶性腫瘍抗原は、多量体、例えば二量体又は三量体であり得る。可溶性腫瘍抗原は、個体の身体の他の箇所より、腫瘍部位又は腫瘍微小環境中により高い濃度で存在し得る。腫瘍微小環境及び関連する可溶性腫瘍抗原は、Bhome et al.(2015)により詳細に記載されている。
【０２２６】
好適な可溶性腫瘍抗原としては、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＳＤＦ１及びＴＧＦ−β、例えばＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β−２、ＴＧＦ−β−３及びＴＧＦ−β−４が挙げられる。
【０２２７】
ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦＡ；遺伝子ＩＤ  ７４２２）は、ＮＰ＿００１０２０５３７．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０２５３６６．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＨＧＦ（遺伝子ＩＤ  ３０８２）は、ＮＰ＿０００５９２．３の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０００６０１．５の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＳＤＦ１（ＣＸＣＬ１２；遺伝子ＩＤ  ６３８７）は、ＮＰ＿０００６００．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０００６０９．６の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＧＦ−β−１（ＴＧＦＢ１；遺伝子ＩＤ  ７０４０）は、ＮＰ＿０００６５１．３の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿０００６６０．６の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＧＦ−β−２（ＴＧＦＢ２；遺伝子ＩＤ  ７０４２）は、ＮＰ＿００１１２９０７１．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１３５５９９．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＧＦ−β−３（ＴＧＦＢ３；遺伝子ＩＤ  ７０４３）は、ＮＰ＿００１３１６８６７．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１３２９９３８．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＧＦ−β−４（ＬＥＦＴＹ２；遺伝子ＩＤ  ７０４４）は、ＮＰ＿００１１６５８９６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１７２４２５．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０２２８】
別の好ましい実施形態において、疾患抗原は、病原性抗原である。
【０２２９】
感染症の部位の近くでの抗体分子によるＴ細胞などの免疫細胞及び／又はマクロファージの活性化は、感染症の治療に有用であることが予想される。感染症は、急性又は持続性感染症であり得るが、好ましくは、持続性感染症である。
【０２３０】
病原性抗原は、好ましくは、ヒト病原体によって発現される抗原、例えば、ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫抗原（例えば原虫抗原）、好ましくは、ウイルス又は細菌抗原である。病原性抗原は、病原体、又は感染症の部位の近くに主に存在し、個体における他の箇所に遍在的に存在していない抗原である。
【０２３１】
例えば、病原性抗原は、ウイルス、細菌、真菌若しくは寄生生物の表面に存在する抗原、又はウイルス、細菌、真菌若しくは寄生生物によって発現される可溶性抗原であり得る。ウイルス、細菌、真菌、又は寄生生物は、本明細書の他の箇所で言及されるウイルス、細菌、真菌、又は寄生生物であり得る。
【０２３２】
病原性抗原が可溶性抗原である場合、抗原は、感染症の部位の近くの体液中で上方制御又は過剰発現され得る。例えば、可溶性病原性抗原は、個体の身体の他の箇所より、感染症の部位、又は感染症の部位の近くにより高い濃度で存在し得る。可溶性病原性抗原は、多量体、例えば二量体又は三量体であり得る。
【０２３３】
抗体分子によって標的化するのに好適な病原性抗原は、当該技術分野において公知の方法を用いて同定され得る。例えば、ＣＤ１３７及び病原性抗原を標的とする抗体分子が、ＣＤ１３７発現細胞が病原体又は病原性抗原とともに共培養されるアッセイにおいて使用され得、ＣＤ１３７発現細胞の活性化が、例えば、Ｔ細胞活性化アッセイ、増殖アッセイ又は細胞毒性アッセイによって測定される。
【０２３４】
抗体分子によって標的化するのに好適な多くの病原性抗原が、当該技術分野においてさらによく知られており、治療される感染症に応じて当業者によって選択され得る。ウイルス抗原の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって発現されるタンパク質ｐ２４、ｇｐ１２０、及びｇｐ４１、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって発現されるＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、並びにインフルエンザウイルスによって発現されるヘマグルチニン及びノイラミニダーゼが挙げられる。細菌抗原の例としては、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）によって発現されるＲｖ１７３３、Ｒｖ２３８９及びＲｖ２４３５ｎが挙げられる。
【０２３５】
ある実施形態において、抗体分子は、抗体分子の定常ドメイン、例えばＣＨ３ドメイン中に抗原結合部位を含むことはない。例えば、抗体分子は、抗体分子の定常ドメイン中にＯＸ４０に結合する抗原結合部位を含むことはない。特に、抗体分子は、抗体分子の定常ドメイン、例えばＣＨ３ドメイン中に抗原結合部位を含むことはなく、ここで、抗原結合部位は、定常ドメインの１つ以上の構造ループ中の修飾、例えば、定常ドメインのＡＢ、ＣＤ及び／又はＥＦ構造ループ中の１つ以上の修飾を含む。
【０２３６】
１つの例において、抗体分子は、ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループのそれぞれに位置する第１の配列、第２の配列、及び第３の配列を含むＯＸ４０抗原結合部位を含むことはなく、ここで、第１、第２、及び第３の配列は、以下に記載されるＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４９の第１、第２及び第３の配列である。
【０２３７】
それに加えて、又はその代わりに、抗体分子は、以下に記載されるＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４９のＣＨ３ドメインを含むことはない。
【０２３８】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４９  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列
ＦＳ２０−２２−４９  第１の配列−ＹＷＤＱＥ
ＦＳ２０−２２−４９  第２の配列−ＤＥＱＦＡ
ＦＳ２０−２２−４９  第３の配列−ＱＹＲＷＮＰＡＤＹ
【０２３９】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４９  ＣＨ３ドメイン配列
【化１】
2021525546.tif 000003
【０２４０】
抗体分子は、生物活性分子又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。この場合、抗体分子は、コンジュゲートと呼ばれ得る。このようなコンジュゲートは、本明細書に記載される疾患の治療及び／又は診断に利用される。
【０２４１】
例えば、生物活性分子は、サイトカイン、好ましくは、ヒトサイトカインなどの免疫系調節剤であり得る。例えば、サイトカインは、Ｔ細胞活性化及び／又は増殖を刺激するサイトカインであり得る。抗体分子へのコンジュゲーションのためのサイトカインの例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γが挙げられる。
【０２４２】
或いは、生物活性分子は、サイトカインのリガンドトラップ、例えばＴＧＦ−β又はＩＬ−６のリガンドトラップなどのリガンドトラップであり得る。
【０２４３】
抗体分子にコンジュゲートされ得る好適な検出可能な標識は、当該技術分野において公知であり、放射性同位体、例えば、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、インジウム−１１１及びテクネチウム−９９；蛍光色素、例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、Texas Red及びシアニン色素誘導体、例えば、Cy7及びAlexa750；発色性色素、例えば、ジアミノベンジジン；ラテックスビーズ；酵素標識、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ；スペクトル的に分離された吸収若しくは発光特性を有する蛍光又はレーザー色素；及び特定の同種検出可能部分、例えば標識されたアビジンへの結合を介して検出され得る、ビオチンなどの化学部分が挙げられる。
【０２４４】
抗体分子は、任意の好適な共有結合又は非共有結合、例えば、ジスルフィド又はペプチド結合によって、生物活性分子又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。生物活性分子がサイトカインである場合、サイトカインは、ペプチドリンカーによって抗体分子に結合され得る。好適なペプチドリンカーは、当該技術分野において公知であり、５から２５、５から２０、５から１５、１０から２５、１０から２０、又は１０から１５アミノ酸長であり得る。
【０２４５】
ある実施形態において、生物活性分子は、切断可能なリンカーによって抗体分子にコンジュゲートされ得る。リンカーは、治療の部位における抗体分子からの生物活性分子の放出を可能にし得る。リンカーは、アミド結合（例えばペプチドリンカー）、ジスルフィド結合又はヒドラゾンを含み得る。ペプチドリンカーは、例えば部位特異的プロテアーゼによって切断され得、ジスルフィド結合は、サイトゾルの還元環境によって切断され得、ヒドラゾンは、酸媒介性加水分解によって切断され得る。
【０２４６】
コンジュゲートは、抗体分子及び生物活性分子を含む融合タンパク質であり得る。この場合、生物活性分子は、ペプチドリンカー又はペプチド結合によって抗体分子にコンジュゲートされ得る。抗体分子が多連鎖分子である場合、例えば、抗体分子がＦｃａｂであるか若しくはそれを含むか又はｍＡｂ２である場合、生物活性分子は、抗体分子の１つ以上の鎖にコンジュゲートされ得る。例えば、生物活性分子は、ｍＡｂ２分子の重鎖の一方又は両方にコンジュゲートされ得る。融合タンパク質は、産生及び精製するのが容易であるという利点を有し、臨床グレードの材料の製造を容易にする。
【０２４７】
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードする１つ又は複数の単離された核酸分子を提供する。当業者には、当該技術分野において周知の方法を用いて、このような核酸分子を調製するのに何の困難もない。
【０２４８】
１つ又は複数の核酸分子は、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ３０−３５−１４、又はＦＳ３０−５−３７、好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、又はＦＳ３０−３５−１４、より好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、又はＦＳ３０−１０−１２、最も好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６のＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、好ましくは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードし得る。これらの抗体のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、本明細書に記載される。
【０２４９】
例えば、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ３０−３５−１４、又はＦＳ３０−５−３７のＶＨドメインをコードする核酸分子は、配列番号５３、２７、４３、５９及び４のそれぞれに記載される。
【０２５０】
抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ３０−３５−１４、又はＦＳ３０−５−３７のＶＬドメインをコードする核酸分子は、配列番号４９、４９、４９、７０及び１３のそれぞれに記載される。
【０２５１】
好ましい実施形態において、核酸分子は、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ３０−３５−１４、又はＦＳ３０−５−３７、好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、又はＦＳ３０−３５−１４、より好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、又はＦＳ３０−１０−１２、最も好ましくは、抗体ＦＳ３０−１０−１６の重鎖及び／又は軽鎖、好ましくは、重鎖及び軽鎖をコードする。これらの抗体の重鎖及び軽鎖配列は、本明細書に記載される。
【０２５２】
例えば、抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ３０−３５−１４、又はＦＳ３０−５−３７の重鎖をコードする核酸分子は、配列番号５３、２７、４３、５９及び４のそれぞれに記載される。
【０２５３】
抗体ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ３０−３５−１４、又はＦＳ３０−５−３７の軽鎖をコードする核酸分子は、配列番号４９、４９、４９、７１及び１６のそれぞれに記載される。
【０２５４】
核酸が、本発明の抗体分子のＶＨ及びＶＬドメイン、又は重鎖及び軽鎖をコードする場合、２つのドメイン又は鎖は、２つの別個の核酸分子上でコードされ得る。
【０２５５】
単離された核酸分子が、本発明の抗体分子を発現させるのに使用され得る。核酸は、一般に、発現のために組み換えベクターの形態で提供される。したがって、本発明の別の態様は、上述される核酸を含むベクターを提供する。必要に応じて、プロモータ配列、ターミネータ断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列を含む適切な制御配列を含有する好適なベクターが、選択又は構築され得る。好ましくは、ベクターは、宿主細胞内の核酸の発現を引き起こすために適切な制御配列を含有する。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、又はファージミドであり得る。
【０２５６】
本明細書に記載される核酸分子又はベクターは、宿主細胞中に導入され得る。宿主細胞中への核酸又はベクターの導入のための技術は、当該技術分野において十分に確立されており、任意の好適な技術が用いられ得る。組み換え抗体分子の産生に好適な様々な宿主細胞が、当該技術分野において公知であり、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物宿主細胞を含む。好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳ０、又はＨＥＫ細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞である。
【０２５７】
本発明の別の態様は、本発明の抗体分子を産生する方法であって、宿主細胞内で抗体分子をコードする核酸を発現させること、及び任意に、このように産生された抗体分子を単離及び／又は精製することを含む、方法を提供する。宿主細胞を培養するための方法は、当該技術分野において周知である。本方法は、抗体分子を単離及び／又は精製することをさらに含み得る。組み換え抗体分子の精製のための技術は、当該技術分野において周知であり、例えばプロテインＡ又はプロテインＬを用いた、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ又はアフィニティークロマトグラフィーを含む。ある実施形態において、精製は、抗体分子上でアフィニティータグを用いて行われ得る。本方法は、任意に、薬学的に許容される賦形剤又は後述される他の物質を用いて、抗体分子を医薬組成物へと製剤化することも含み得る。
【０２５８】
上記に説明されるように、ＣＤ１３７は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、免疫系の細胞において発現される。特に、ＣＤ１３７の活性化は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖、生存及び細胞傷害性エフェクター機能、並びにＣＤ８＋  Ｔ細胞の分化及びメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞の維持を促進するのに役割を果たすことが示された。ＣＤ１３７は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞よりＣＤ４＋  Ｔ細胞において低いレベルで発現されるが、ＣＤ４＋  Ｔ細胞のいくつかのサブセットの増殖及び活性化を誘発するのに関与していることも示されている。ＣＤ１３７の活性化はまた、ＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣ、並びにＢ細胞増殖、生存及びサイトカイン産生を促進することも実証されている。
【０２５９】
ＣＤ１３７の活性を促進する免疫応答を考慮して、ＣＤ１３７アゴニスト分子は、癌治療、並びに慢性感染症の治療に関して調査されている。
【０２６０】
したがって、本明細書に記載される抗体分子は、治療用途、特に、癌の治療に有用であり得る。さらに、抗体分子は、持続性感染症などの感染症の治療に有用であると予想される。
【０２６１】
本明細書に記載される抗体分子は、ヒト又は動物身体の治療の方法に使用され得る。本発明の関連する態様は、以下を提供する；
（ｉ）薬剤として使用するための本明細書に記載される抗体分子、
（ｉｉ）疾患又は障害の治療の方法に使用するための本明細書に記載される抗体分子、
（ｉｉｉ）疾患又は障害の治療に使用するための薬剤の製造における、本明細書に記載される抗体分子の使用；及び
（ｉｖ）個体における疾患又は障害を治療する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載される抗体分子を個体に投与することを含む、方法。
【０２６２】
個体は、患者、好ましくは、ヒト患者であり得る。
【０２６３】
治療は、ある所望の治療効果が達成される任意の治療又は治療法、例えば、病態の進行の阻害又は遅延であり得、進行速度の低下、進行速度の停止、病態の改善、病態の治癒若しくは緩和（部分的か若しくは全体的かにかかわらず）、病態の１つ以上の症状及び／又は兆候を予防、改善、遅延、低減若しくは停止するか、又は個体若しくは患者の生存期間を、治療しない場合に予想される生存期間を超えて延長することを含む。
【０２６４】
予防的措置（すなわち予防）としての治療も含まれる。例えば、癌などの疾患の発症又は再発を起こしやすい又はそのリスクがある個体が、本明細書に記載されるように治療され得る。このような治療は、個体における疾患の発症又は再発を予防するか又は遅延させ得る。
【０２６５】
本明細書に記載される治療の方法は、抗体分子に加えて、少なくとも１つのさらなる治療を個体に投与することを含み得る。したがって、本明細書に記載される抗体分子は、単独で又は１つ以上の他の治療と組み合わせて、個体に投与され得る。抗体分子が、別の治療と組み合わせて個体に投与される場合、さらなる治療は、抗体分子の投与と同時に、投与と連続して、又は投与と別々に、個体に投与され得る。さらなる治療が、抗体分子と同時に投与される場合、抗体分子及びさらなる治療は、複合製剤として個体に投与され得る。例えば、さらなる治療法は、治療される疾患のための公知の治療法又は治療剤であり得る。
【０２６６】
抗体分子は、単独で投与され得るが、抗体分子は、通常、抗体分子に加えて少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与されるであろう。したがって、本発明の別の態様は、本明細書に記載される抗体分子を含む医薬組成物を提供する。抗体分子を医薬組成物へと製剤化することを含む方法も提供される。
【０２６７】
医薬組成物は、抗体分子に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤又は当業者に周知の他の材料を含み得る。本明細書において使用される際の「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わずに、妥当なリスク・ベネフィット比に見合う、対象（例えば、ヒト）の組織と接触して使用するのに好適な化合物、材料、組成物、及び／又は剤形に関する。各担体、賦形剤などはまた、製剤の他の成分と適合するという意味で「許容され」なければならない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し、投与経路は、後述されるように、注入、注射又は任意の他の好適な経路によるものであり得る。
【０２６８】
例えば注射による、非経口、例えば皮下又は静脈内投与のため、抗体分子を含む医薬組成物は、パイロジェンフリーであり、且つ好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口で許容される水溶液の形態であり得る。当業者は、例えば、等張ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、ラクトリンゲル注射液を用いて好適な溶液を調製することが十分にできる。緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸及び他の有機酸；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸及びメチオニン；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル若しくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン；単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む他の糖質；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN（商標）、PLURONICS（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、保存剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤及び／又は他の添加剤が、必要に応じて用いられ得る。
【０２６９】
ある実施形態において、抗体分子は、投与前に再構成のために凍結乾燥形態で提供され得る。例えば、凍結乾燥された抗体分子は、滅菌水で再構成され、個体への投与前に生理食塩水と混合され得る。
【０２７０】
投与は、「治療有効量」であり得、これは、個体への利益を示すのに十分なものである。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間的経過は、治療されるものの性質及び重症度、治療される特定の個体、個体の臨床症状、障害の原因、組成物の送達の部位、抗体分子のタイプ、投与の方法、投与のスケジューリング及び医師に公知の他の要因に依存する。治療の処方、例えば、投与量に関する決定などは、一般医師及び他の医師の責任に含まれ、症状の重症度及び／又は治療される疾患の進行に依存し得る。抗体分子の適切な用量は、当該技術分野において周知である（Ledermann et al.,1991;Bagshawe et al.,1991）。本明細書に、又は投与される抗体分子について適切な場合the Physician’s Desk Reference(2003)に示される特定の投与量が使用され得る。抗体分子の治療有効量又は好適な用量は、動物モデルにおけるインビトロ活性及びインビボ活性を比較することによって決定され得る。マウス及び他の試験動物における有効な投与量をヒトに当てはめるための方法は公知である。正確な用量は、治療される部位のサイズ及び位置がどうであるか、並びに抗体分子の正確な性質を含むいくつかの要因に依存する。
【０２７１】
典型的な抗体用量は、全身適用では１００μｇから１ｇの範囲であり、局所適用では１μｇから１ｍｇの範囲である。初期のより多い負荷用量、その後、１回以上のより少ない用量が投与され得る。これは、成人個体の単回の治療のための用量であり、これは、小児及び幼児のために比例的に調整され得、また、分子量に比例して他の抗体フォーマットのために調整され得る。
【０２７２】
治療は、医師の判断で、毎日、週に２回、１週間又は１か月間隔で繰り返され得る。個体のための治療スケジュールは、抗体組成物の薬物動態及び薬力学的特性、投与経路及び治療される病態の性質に依存し得る。
【０２７３】
治療は、定期的であってもよく、投与間の期間は、約２週間以上、例えば約３週間以上、約４週間以上、１か月以上で約１回、約５週間以上、又は約６週間以上であり得る。例えば、治療は、２から４週間毎又は４から８週間毎であり得る。好適な製剤及び投与の経路は、上述されている。
【０２７４】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される抗体分子は、癌を治療する方法に使用するためのものであり得る。
【０２７５】
癌は、悪性癌細胞の異常増殖によって特徴付けられ得る。乳癌などの特定のタイプの癌が言及される場合、これは、乳房組織などの関連する組織の悪性細胞の異常増殖を指す。乳房に位置するが、卵巣組織などの別の組織の悪性細胞の異常増殖の結果である二次癌は、本明細書において言及される際、乳癌ではなく、卵巣癌である。
【０２７６】
癌は、原発性癌又は二次癌であり得る。したがって、本明細書に記載される抗体分子は、個体における癌を治療する方法に使用するためのものであり得、ここで、癌は、原発性腫瘍及び／又は腫瘍転移である。
【０２７７】
本明細書に記載される抗体分子を用いて治療される癌の腫瘍は、例えばそれらの細胞表面において、ＣＤ１３７を発現するＴＩＬを含み得る。一実施形態において、腫瘍は、ＣＤ１３７を発現するＴＩＬを含むことが決定されている場合がある。細胞表面における抗原の発現を決定するための方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、フローサイトメトリーを含む。
【０２７８】
例えば、本明細書に記載される抗体分子を用いて治療される癌は、白血病、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び多発性骨髄腫；並びに固形癌、例えば、肉腫（例えば軟組織肉腫）、皮膚癌（例えばメルケル細胞癌）、黒色腫、膀胱癌（例えば尿路上皮癌）、脳腫瘍（例えば多形性膠芽腫）、乳癌、子宮／子宮内膜癌、卵巣癌（例えば卵巣漿液性嚢胞腺腫）、前立腺癌、肺癌（例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、結腸直腸癌（例えば結腸直腸腺癌）、子宮頸癌（例えば子宮頸部扁平上皮細胞癌及び子宮頚部腺癌）、肝臓癌（例えば肝細胞癌）、頭頸部癌（例えば頭頸部扁平上皮癌）、食道癌、膵臓癌、腎臓癌（例えば腎細胞癌）、副腎癌、胃癌（例えば、胃腺癌）、精巣癌、胆嚢及び胆道の癌（例えば胆管癌）、甲状腺癌、胸腺癌、骨肉腫、及び脳腫瘍からなる群から選択され得る。
【０２７９】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される抗体分子を用いて治療される癌は、固形癌である。より好ましくは、本明細書に記載される抗体分子を用いて治療される癌は、肉腫、黒色腫、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、卵巣癌、子宮癌／子宮内膜癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎臓癌及び胃癌からなる群から選択され得る固形癌である。
【０２８０】
癌に関して、治療は、完全な癌の寛解を含む、癌成長を阻害すること、及び／又は癌転移を阻害すること、並びに癌の再発を阻害することを含み得る。癌成長は、一般に、より発達した形態への癌内の変化を示すいくつかの指標のいずれか１つを指す。したがって、癌成長の阻害を測定するための指標としては、癌細胞生存の減少、腫瘍体積若しくは形態の減少（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、若しくは他のイメージング方法を用いて決定される際）、遅延した腫瘍成長、腫瘍血管系の破壊、遅延型過敏症皮膚試験の改善した成績、抗癌免疫細胞若しくは他の抗癌免疫応答の活性の増加、及び腫瘍特異的抗原のレベルの低下が挙げられる。個体における癌性腫瘍に対する免疫応答を活性化又は促進することは、癌成長、特に、対象中に既に存在する癌の成長に抵抗し、及び／又は個体における癌成長の傾向を低下させる個体の能力を向上させ得る。
【０２８１】
癌治療に関して、本明細書に記載される抗体分子は、当該癌の治療のために、好適であることが示されているか、又は好適であると予想される抗癌治療法又は治療剤などの別の抗癌治療法又は治療剤と組み合わせて、個体に投与され得る。例えば、抗体分子は、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法（養子ＮＫ細胞療法など又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、若しくはγ／δ  Ｔ細胞を用いた治療法、又はホルモン療法のための薬剤と組み合わせて、個体に投与され得る。
【０２８２】
理論に制約されるのを望むものではないが、本明細書に記載される抗体分子は、抗癌治療法において補助剤として働き得ると考えられる。具体的には、化学療法及び／又は放射線療法と組み合わせた、又は抗腫瘍ワクチンと組み合わせた、個体への抗体分子の投与は、例えば、化学療法及び／又は放射線療法で、又は抗腫瘍ワクチン単独で達成されるより大きな、癌に対する免疫応答を引き起こすと考えられる。
【０２８３】
本明細書に記載される抗体分子と組み合わせた投与のための１つ以上の化学療法剤は、タキサン、細胞傷害性抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、アルキル化剤、白金類似体、ヌクレオシド類似体、抗葉酸剤、サリドマイド誘導体、抗腫瘍性化学療法剤及びその他からなる群から選択され得る。タキサンとしては、ドセタキセル、パクリタキセル及びｎａｂ−パクリタキセルが挙げられ；細胞傷害性抗生物質としては、アクチノマイシン、ブレオマイシン、及びアントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、ミトキサントロン及びバルルビシンが挙げられ；チロシンキナーゼ阻害剤としては、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、ＰＬＸ３３９７、イマチニブ、コビメチニブ（cobemitinib）及びトラメチニブが挙げられ；ＰＡＲＰ阻害剤としては、ニラパリブ（piraparib）が挙げられ；Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤としては、ベムラフェニブ及びダブラフェニブが挙げられ；アルキル化剤としては、ダカルバジン、シクロホスファミド及びテモゾロミドが挙げられ；白金類似体としては、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンが挙げられ；ヌクレオシド類似体としては、アザシチジン、カペシタビン、フルダラビン、フルオロウラシル及びゲムシタビンが挙げられ；抗葉酸剤としては、メトトレキサート及びペメトレキセドが挙げられる。本発明において使用するのに好適な他の化学療法剤としては、デファクチニブ、エンチノスタット、エリブリン、イリノテカン及びビンブラスチンが挙げられる。
【０２８４】
本明細書に記載される抗体分子とともに投与するための好ましい治療剤は、ドキソルビシン、ミトキサントロン、シクロホスファミド、シスプラチン、及びオキサリプラチンである。
【０２８５】
本明細書に記載される抗体分子と組み合わせた投与のための放射線療法は、外照射放射線療法又は近接照射療法であり得る。
【０２８６】
本明細書に記載される抗体分子と組み合わせた投与のための免疫療法剤は、治療用抗体分子、核酸サイトカイン、又はサイトカインベースの治療法であり得る。例えば、治療用抗体分子は、免疫調節分子、例えば阻害性チェックポイント分子若しくは免疫共刺激分子、自然免疫系の受容体又は腫瘍抗原、例えば細胞表面腫瘍抗原若しくは可溶性腫瘍抗原に結合し得る。治療用抗体分子が結合し得る免疫調節分子の例としては、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＲ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、ＩＬ−１０及びＣＳＦ−１が挙げられる。治療用抗体分子が結合し得る自然免疫系の受容体の例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（例えばＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ−５）、及びＳＴＩＮＧが挙げられる。治療用抗体分子が結合し得る腫瘍抗原の例としては、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０及びＴＧＦ−βが挙げられる。
【０２８７】
本明細書に記載される抗体分子と組み合わせた投与のための核酸は、ｓｉＲＮＡであり得る。
【０２８８】
サイトカイン又はサイトカインベースの治療法は、ＩＬ−２、コンジュゲートされたＩＬ−２のプロドラッグ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、及びＩ型インターフェロンからなる群から選択され得る。
【０２８９】
癌の治療のための抗腫瘍ワクチンは、臨床において実現されており、且つ科学文献（Rosenberg, 2000など）中で詳細に説明されている。これは、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とともに又はそれを伴わずに、ワクチン接種法として自己又は同種異系癌細胞を使用することによって、それらの細胞によって発現される様々な細胞マーカーに応答するように免疫系を促す手法を主に必要とする。ＧＭ−ＣＳＦは、前記手法により用いられるとき、抗原提示において強い応答を引き起こし、特によく機能する。
【０２９０】
化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法のための薬剤は、好ましくは、当該癌のための、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法のための薬剤、すなわち、当該癌の治療に有効であることが示されている、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法のための薬剤である。当該癌に有効であることが示されている、好適な化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法のための薬剤の選択は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２９１】
ＣＤ１３７の活性を促進する免疫応答を考慮して、ＣＤ１３７アゴニスト分子は、感染症の治療に利用されると予想される。したがって、別の好ましい実施形態において、本明細書に記載される抗体分子は、急性又は持続性感染症などの感染症を治療する方法に使用するためのものであり得る。
【０２９２】
理論に制約されるのを望むものではないが、ＣＤ１３７アゴニスト分子は、好中球及び単球などの自然免疫細胞の急速浸透及び活性化を誘発し、それによって、急性感染症の原因となる病原体の除去を促進することによって、病原体によって引き起こされる急性感染症に対する免疫応答を促進し得ると考えられる。したがって、さらなる実施形態において、本明細書に記載される抗体分子は、急性細菌性疾患などの急性感染症を治療する方法において使用するためのものであり得る。好ましい実施形態において、急性感染症は、リステリア属（Listeria）の細菌、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、又は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）などのグラム陽性菌による感染によって引き起こされる急性細菌性疾患である。
【０２９３】
感染症は、通常、免疫系によって除去されるが、一部の感染症は、数か月又は数年などの長期間にわたって持続し、免疫系によって効果的に食い止められない。このような感染症は、持続性又は慢性感染症とも呼ばれる。
【０２９４】
好ましくは、本明細書に記載される抗体分子は、持続性感染症、例えば、持続性ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫感染、好ましくは、持続性ウイルス又は細菌感染を治療するのに使用される。
【０２９５】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される抗体分子を用いて治療される持続性ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、又は水痘帯状疱疹ウイルスの持続性感染症である。
【０２９６】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される抗体分子を用いて治療される持続性細菌感染は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、インフルエンザ菌（Hemophilus influenza）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、らい菌（Mycobacterium leprae）、チフス菌（Salmonella typhi）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、エンテロコッカスフェカーリス(Enterococcus faecalis)、又は肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）の持続性感染症である。
【０２９７】
ＣＤ１３７アゴニズムは、グラム陽性菌による感染症の治療に関して有益であることが記載されている。したがって、好ましい実施形態において、本明細書に記載される抗体分子を用いて治療される持続性細菌感染は、グラム陽性菌による持続性感染症である。より好ましい実施形態において、持続性細菌感染は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、らい菌（Mycobacterium leprae）、エンテロコッカスフェカーリス(Enterococcus faecalis)、及び肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）からなる群から選択されるグラム陽性菌による持続性感染症である。
【０２９８】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される抗体分子を用いて治療される持続性真菌感染は、カンジダ属（Candida）（例えばカンジダ・アルビカンス（Candida albicans））、クリプトコッカス属（Cryptococcus）（例えばクリプトコッカス・ガッティ（Cryptococcus gattii）若しくはクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans））、タラロマイセス属（Talaromyces）（ペニシリウム属（Penicillium））（例えばタラロマイセス・マルネッフェイ（Talaromyces marneffe））、ミクロスポルム属（Microsporum）（例えばミクロスポルム・オーズアニー（Microsporum audouinii））、又はトリコフィトン・トンズランス（Trichophyton tonsurans）の持続性感染症である。
【０２９９】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される抗体分子を用いて治療される持続性寄生虫感染は、プラスモジウム属（Plasmodium）、例えば、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）、又はリーシュマニア属（Leishmania）、例えば、ドノバン・リーシュマニア（Leishmania donovani）の持続性感染症である。
【０３００】
持続性感染症の治療に関して、抗体分子は、当該病原体の治療のために、好適であることが示されているか、又は好適であると予想される第２の治療法又は治療剤と組み合わせて、個体に投与され得る。例えば、抗体分子は、免疫療法剤と組み合わせて個体に投与され得る。本明細書に記載される抗体分子と組み合わせた投与のための免疫療法剤は、治療用抗体分子であり得る。例えば、治療用抗体分子は、自然免疫系の受容体に結合し得る。治療用抗体分子が結合し得る自然免疫系の受容体の例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（例えばＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ−５）、及びＳＴＩＮＧが挙げられる。
【０３０１】
抗体分子が、感染症を予防するのに使用される場合、抗体分子は、当該病原体に対するワクチンと組み合わせて投与され得る。理論に制約されるのを望むものではないが、本明細書に記載される抗体分子が、ワクチン接種において補助剤として働き得ると考えられる。具体的には、ワクチンと組み合わせた、個体への抗体分子の投与は、ワクチン単独で達成されるより大きな、病原体に対する免疫応答を引き起こすと考えられる。
【０３０２】
持続性感染症の治療に関して、治療は、感染症を取り除くこと、個体の病原性負荷を低減すること、感染症の再発を防止することを含み得る。例えば、治療は、持続性感染症の１つ以上の症状及び／又は兆候を予防、改善、遅延、抑制又は停止することを含み得る。或いは、治療は、感染症を予防することを含み得る。
【０３０３】
本発明の抗体分子は、ＣＤ１３７の検出、特に、細胞表面にＣＤ１３７を含む細胞、すなわち、細胞表面に結合されたＣＤ１３７を発現する細胞の検出に有用であり得る。細胞は、免疫細胞、例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、又はＴＩＬであり得るが、好ましくは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞又はＴＩＬである。
【０３０４】
したがって、本発明は、試料におけるＣＤ１３７の存在、好ましくは、細胞表面にＣＤ１３７を含む細胞の存在を検出するための、抗体分子の使用に関する。抗体分子は、本明細書の他の箇所に記載される検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。
【０３０５】
ＣＤ１３７を検出するインビトロ方法も提供され、この方法は、抗体分子を、対象とする試料とともにインキュベートすること、及び試料への抗体分子の結合を検出することを含み、ここで、試料への抗体の結合は、ＣＤ１３７の存在を示す。試料への抗体分子の結合は、例えばＥＬＩＳＡを用いて検出され得る。
【０３０６】
好ましい実施形態において、本発明は、細胞表面にＣＤ１３７を含む細胞を検出するインビトロ方法に関し、この方法は、抗体分子を、対象とする細胞試料とともにインキュベートすること、及び試料中に存在する細胞への抗体分子の結合を決定することを含み、ここで、試料中に存在する細胞への抗体の結合は、細胞表面にＣＤ１３７を含む細胞の存在を示す。細胞への抗体分子の結合を検出するための方法は、当該技術分野において公知であり、ＥＬＩＳＡ、及びフローサイトメトリーを含む。
【０３０７】
対象とする細胞試料は、例えば、個体から得られた腫瘍試料であり得る。腫瘍試料における細胞表面にＣＤ１３７を含む、ＴＩＬなどの細胞の検出は、腫瘍が、活性化されたＴＩＬを含むことを示し得る。
【０３０８】
したがって、本発明の抗体分子は、疾患又は障害の検出又は診断、特に、癌の検出又は診断に有用であり得る。癌は、本明細書に記載される本発明の抗体分子で治療され得る癌であり得る。
【０３０９】
したがって、本発明の関連する態様は、
（ｉ）診断薬として使用するための本明細書に記載される抗体分子、
（ｉｉ）癌などの疾患又は障害を検出又は診断する方法に使用するための本明細書に記載される抗体分子、
（ｉｉｉ）疾患又は障害の検出又は診断に使用するための診断薬の製造における、本明細書に記載される抗体分子の使用；
（ｉｖ）個体における疾患又は障害を検出又は診断する方法；及び
（ｖ）個体における疾患又は障害を検出又は診断する方法に使用するためのキットであって、本明細書に記載される抗体分子を含む、キット
を提供する。
【０３１０】
本開示が以下の実験の例示を含むことを考えると、本発明のさらなる態様及び実施形態が、当業者に明らかであろう。
【０３１１】
本明細書において言及される全ての文献は、全体が参照により本明細書に援用される。
【０３１２】
本明細書において使用される際の「及び／又は」は、他のものを伴うか又は伴わない、２つの規定の特徴又は成分のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、それぞれが本明細書に個々に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。
【０３１３】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、上記に記載される特徴の説明及び定義は、本発明のいずれかの特定の態様又は実施形態に限定されず、記載される全ての態様及び実施形態に等しく適用される。
【０３１４】
本発明の他の態様及び実施形態は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「からなる」又は「から本質的になる」という用語によって置き換えられる「を含む」という用語を用いて上述される態様及び実施形態を提供する。
【０３１５】
本発明の特定の態様及び実施形態は、例として及び上述される図を参照して例示される。
【実施例】
【０３１６】
実施例
実施例１−ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７抗原の産生、特徴付け及び選択
活性化Ｔ細胞は、それらの細胞表面においてＣＤ１３７受容体を発現する。ＣＤ１３７受容体のクラスター化は、受容体シグナル伝達及びさらなるＴ細胞活性化を誘発するのに不可欠であることが知られている（Chester et al.,2018）。架橋時に、ＣＤ１３７受容体クラスター化及びその後のＴ細胞活性化を誘発する一方、架橋の非存在下でＴ細胞活性化を示さないか又は弱いＴ細胞活性化を示すモノクローナル抗体を単離することが望ましいであろう。この目的を達成するために、本発明者らは、抗ＣＤ１３７ｍＡｂは、細胞表面において発現される際、モノマーＣＤ１３７に結合するはずであるが、二量体ＣＤ１３７抗原及びＣＤ１３７を過剰発現する細胞によって模倣される、高レベルのＣＤ１３７への優先的な結合を必要とする可能性があると仮説を立てた。したがって、組み換えモノマー及び二量体ＣＤ１３７、並びに細胞表面で発現されるＣＤ１３７を、選択に使用するために産生した。
【０３１７】
１．１  組み換え抗原
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーは、それらの同種リガンドに結合される場合に一緒にクラスター化する多量体を形成する傾向が知られている（Croft,2003）。それらの機能性のために集合するこの傾向により、ファージディスプレイなどのインビトロ選択に使用するため、並びに選択されたタンパク質の特徴付けのために溶液中に集合しない可溶性組み換えタンパク質を産生することが困難になる。
【０３１８】
いくつかの市販の組み換え抗原は、存在する凝集体のレベルのため、選択に使用するのに適していないと見なされたため、以下の組み換えモノマー及び二量体ＣＤ１３７抗原（表１を参照）を、抗ＣＤ１３７  ｍＡｂの選択、スクリーニング及びさらなる特徴付けに使用するために社内で産生した。
【０３１９】
【表２】
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【０３２０】
ヒトＣＤ１３７の細胞外ドメインをコードするＤＮＡを、Ａｖｉ配列及び６つのＣ末端ヒスチジン残基とともに、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ及びＢａｍＨＩ−ＨＦ制限酵素を用いて、修飾されたｐＦＵＳＥベクター（Invivogen、カタログ番号ｐｆｕｓｅ−ｍｇ２ａｆｃ２）へとクローニングすることによって、ヒトＣＤ１３７（配列番号１１２）の細胞外ドメインを含むモノマーヒトＣＤ１３７抗原を産生した。ベクターを、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（National Research Council of Canada）へとトランスフェクトし、発現されたＣＤ１３７を、HisTrap（商標）エクセルニッケルカラム（GE Healthcare、２９０４８５８６）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて精製して、抗原が単一の種であり、且つ集合体を含まないことを確実にした。
【０３２１】
二量体抗原を産生するために、Ａｖｉ配列とともにｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃドメインと融合されたヒトＣＤ１３７（配列番号１１２）、カニクイザル（cyno）ＣＤ１３７（配列番号１１３）又はマウスＣＤ１３７（配列番号１１４）の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ構築物を、修飾されたｐＦＵＳＥベクターへとクローニングし、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞へとトランスフェクトした。組み換えＣＤ１３７を、MabSelect SuRe（商標）プロテインＡカラム（GE Healthcare、１１００３４９４）及びＳＥＣを用いて精製して、抗原が単一の種であり、且つ集合体を含まないことを確実にした。
【０３２２】
二量体及びモノマー抗原のそれぞれのビオチン化形態を、BirAビオチン−ビオチンタンパク質リガーゼ反応キット（Avidity LLC、BirA500）を用いて調製して、単一のビオチン分子で標識されたモノマーＣＤ１３７抗原、及び２つのモノマーのそれぞれに１つずつ、２つのビオチン分子で標識された二量体ＣＤ１３７抗原を産生した。３ｍｇの抗原を、１：５０の酵素対基質のモル比になるまで、７．８μｌのBirA酵素ミックスと混合した。次に、添加剤を、製造業者の推奨（１４２μｌのBiomix A、１４２μｌのBiomix B、１４２μｌのビオチン）に従って加え、反応ミックスを室温で２時間インキュベートした。ビオチン化タンパク質の完全性を維持するために、反応ミックスを、直ぐに、Amicon  ３０μｍフィルタ（Merck Millipore、ＵＦＣ５０３０９６）を用いてＤＰＢＳ（Life Technologies、１４１９０−１６９）に緩衝液交換した。
【０３２３】
タンパク質を、ＳＥＣによってさらに精製して、ＢｉｒＡ酵素の除去、及び高分子量の集合体を含まない最終的な高品質単分散タンパク質製剤の産生を確実にした。さらに詳細に、同じ生産ロットからの材料を、一緒に混合し、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、及びサイズ排除クロマトグラフィー／多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）によって、安定性及び純度について分析した。タンパク質の完全なビオチン化を、ストレプトアビジンシフトＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて確認した。組み換えヒト及びマウス抗原は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって抗ＣＤ１３７陽性対照抗体（それぞれ、２０Ｈ４．９（米国特許第７２８８６３８号）及びＬｏｂ１２．３（University of Southampton））にインビトロで結合すること、並びにフローサイトメトリーによって、ヒト又はマウスＣＤ１３７リガンドを発現するＤＯ１１．１０細胞に結合することが確認された。細胞を、１時間にわたってＣＤ１３７抗原とともにインキュベートし、次に、蛍光標識された抗マウスＦｃ断片抗体を用いて、細胞結合を検出した。組み換えカニクイザルＣＤ１３７抗原は、上述されるようにフローサイトメトリーによって、カニクイザルＣＤ１３７リガンドを発現するＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）に結合することが確認された。選択プロトコルに使用される材料についてできる限り高い純度を確実にするために、抗原の徹底的なタンパク質特徴付けを行って、タンパク質凝集体のパーセンテージが確実に２％を超えないようにした。
【０３２４】
１．２  細胞表面で発現される抗原
完全長ヒトＣＤ１３７（配列番号１１９）又はカニクイザルＣＤ１３７（配列番号１２０）を発現するＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）（それぞれ、「ＤＯ１１．１０−ｈＣＤ１３７」及び「ＤＯ１１．１０−ｃＣＤ１３７」と示される）（表２を参照）を、選択された抗ＣＤ１３７  ｍＡｂの選択及びさらなる特徴付けのために、その天然形態に最も類似した膜結合構造で抗原を表すために産生した。
【０３２５】
Lenti-X HTX Packaging System（Clontech、６３１２４９）を用いてヒト又はカニクイザルＣＤ１３７受容体を過剰発現するＤＯ１１．１０細胞を生成するのに、レンチウイルス形質導入を使用した。完全長ヒトＣＤ１３７又はカニクイザルＣＤ１３７をコードするＤＮＡを含有するLenti-X発現ベクター（pLVX）（Clontech、６３１２５３）を、Lenti-X HTX Packaging Mixとともに、Lenti-X 293Ｔ細胞株（Clontech、６３２１８０）へと共トランスフェクトして、ウイルスを生成した。次に、ＤＯ１１．１０細胞株に、これらのレンチウイルスベクターを形質導入した。
【０３２６】
これらの細胞におけるヒトＣＤ１３７又はカニクイザルＣＤ１３７の発現を、フローサイトメトリーを用いて、細胞への、２０Ｈ４．９及びＭＯＲ７４８０．１（米国特許出願公開第２０１２／０２３７４９８号）陽性対照抗体のそれぞれの結合によって確認した。細胞を、１時間にわたってヒト又はカニクイザル陽性対照抗体とともにインキュベートし、次に、蛍光標識された抗ヒトＦｃ検出抗体（Stratech Scientific Ltd、１０９−５４６−０９８−ＪＩＲ）を用いて、細胞結合を検出した。
【０３２７】
【表３】
2021525546.tif 000005
【０３２８】
実施例２−抗ＣＤ１３７抗体を同定するためのファージミドライブラリーの選択及びスクリーニング
２．１  抗ＣＤ１３７クローンの選択、スクリーニング及び発現
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３におけるランダム化を伴うヒト生殖細胞系列のＦａｂドメインを示す合成ナイーブファージミドライブラリー（MSM Technologies）を、実施例１に記載される組み換えＣＤ１３７抗原及び細胞表面で発現されるＣＤ１３７抗原を用いた選択に使用した。
【０３２９】
Ｆａｂライブラリーを、ストレプトアビジンDynabeads（Thermo Fisher Scientific、１１２０５Ｄ）及びDynabeadsに結合されたニュートラアビジン結合タンパク質（Thermo Fisher Scientific、３１０００）を用いて３回選択して、ビオチン化ヒトＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ又はヒトＣＤ１３７−Ｈｉｓ−Ａｖｉに結合されたファージを単離した。並列選択法において、細胞表面で発現されるＣＤ１３７へのＦａｂ結合を確実にするために、組み換えＣＤ１３７抗原を用いた選択からの１回目の出力を、ＤＯ１１．１０−ｈＣＤ１３７細胞を用いたさらに２回の選択及びＤＯ１１．１０−ｃＣＤ１３７細胞を用いた４回目の選択に供した。
【０３３０】
簡潔に述べると、１×１０７個のＤＯ１１．１０対照細胞又は５×１０６個のＤＯ１１．１０−ＣＤ１３７細胞を、１×ＰＢＳ＋２０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で２回洗浄し、続いて、４℃で１時間にわたって４ｍｌの１×ＰＭＦ（１×ＰＢＳ、４％のMarvel粉乳、２０％のＦＢＳ）でブロックした。１回目の出力からのファージを、４℃で１時間にわたってブロッキング溶液（２ｍｌの１×ＰＭＦ）中でブロックした。非関連細胞表面タンパク質に対する結合剤を回避するために、ＤＯ１１．１０細胞のブロッキング溶液を除去し、４℃で１時間にわたって、ブロックされたファージを加えることによって、除外を行った。遠心分離の後、ファージを、ＤＯ１１．１０除外細胞から除去し、４℃で１時間にわたって、ブロックされたＤＯ１１．１０−ＣＤ１３７選択細胞に加えた。次に、細胞をペレット化し、第１の洗浄の間にチューブを交換しながら、１％のＢＳＡを含有する５ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。ファージを、室温で１５分間にわたって３００μｌの１ｍｇ／ｍｌのトリプシンとともにインキュベートすることによって、細胞から溶離した。
【０３３１】
３及び４回目の出力からの約２２００個のクローンを、ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉへの結合についてファージＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ビオチン化ｍＦｃが、陰性対照として含まれていた。陽性クローン（ｍＦｃへの結合シグナルより少なくとも４倍高いＣＤ１３７結合シグナルを有するクローン）の可変領域をシーケンシングして、それにより、３６個の固有のＶＨ／ＶＬ配列の組合せが同定された。同定された配列は、両方の選択手法から、すなわち、全ての回の選択において組み換えＣＤ１３７抗原を用いて、又は１回目に組み換えＣＤ１３７抗原、続いてその後の回に細胞表面で発現されるＣＤ１３７抗原を用いて得られ、いくつかのクローンが、両方の選択手法を介して単離された。ファージＥＬＩＳＡに基づいて、３６個のうち２２個のクローンがカニクイザル（cyno）交差反応性であったが、ファージＥＬＩＳＡの感受性が、弱いカニクイザル交差反応性結合剤を検出するのに十分でなかった可能性があるため、３６個全てのクローンを、ＩｇＧ１分子へ再フォーマットするために進めた。各クローンについて、ＶＨ及びＶＬドメインを、ＣＨ１、ＣＨ２（ＣＨ２ドメイン中にＬＡＬＡ突然変異を有する（Bruhns et al.,2009;Hezareh et al.,2001）及びＣＨ３ドメイン、又はＣＬドメインのいずれかをそれぞれ含有するｐＴＴ５発現ベクター（National Research Council of Canada）へと個別にクローニングした。ＬＡＬＡ突然変異（ＡＡ）を有する得られたｐＴＴ５−ＦＳ３０  ＶＨ及びｐＴＴ５−ＦＳ３０  ＶＬベクターを、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞へと一過性に共トランスフェクトした。２８個のクローンが、可溶性ＩｇＧ１分子として発現された。これらを、MabSelect SuReプロテインＡカラム（GE Healthcare）によって精製し、後述されるようにさらなる試験に供した。
【０３３２】
２．２  ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７へのｍＡｂの結合
抗ＣＤ１３７  ｍＡｂの結合を、ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉを用いて、ＥＬＩＳＡにおいて分析した。
【０３３３】
簡潔に述べると、ストレプトアビジン（Thermo Scientific、１５５００）プレートを、１０ｎＭの組み換えビオチン化ｈＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ、ｃＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ又はヒトＯＸ４０−ｍＦｃ（社内で産生され、ヒトＯＸ４０の細胞外ドメインを含み、そのアミノ酸配列が、配列番号１１６に記載される）、ｍＦｃ−Ａｖｉ（社内で産生された；配列番号１１５）又は陰性対照としての１×ＰＢＳで、４℃で一晩被覆した。翌日、プレートを、ＰＢＳ中で３回洗浄し、続いて、室温で２時間にわたって、２％のTweenを含有する３００μｌのＰＢＳでブロックした。ブロッキング溶液を廃棄し、抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ濃度の希釈系列（０．１から３００ｎＭ、３倍希釈物）を加え、４５０ｒｐｍで振とうしながら室温で１時間インキュベートした。プレートを、３００μｌのＰＢＳ／Tween０．０５％で３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（Sigma、Ａ０１７０）にコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ断片）抗体を、ＰＢＳ中で１：１００００に希釈し、９０μｌをウェルに加えた。４５０ｒｐｍで振とうしながらの４℃で１時間にわたるインキュベーションの後、プレートを、３００μｌのＰＢＳ／Tween０．０５％で３回洗浄した。１００μｌのＴＭＢ基質（eBioscience、００−４２０１−５６）を各ウェルに加えた。反応を、５０μｌの１Ｍの硫酸溶液の添加によって、ＴＭＢの添加の２〜１０分後に停止させた。光学密度（ＯＤ）を、硫酸添加の３０分以内に９６ウェルプレートリーダーにおいて４５０〜６３０ｎｍで読み取り、GraphPad Prismソフトウェア（GraphPad Software,Inc.）を用いて分析した。
【０３３４】
試験される２８個のクローンのうち、１０個が、ヒトＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉへの用量依存性結合を示し、ヒトＯＸ４０−ｍＦｃ−Ａｖｉ、ｍＦｃ又はストレプトアビジンへの結合を示さなかった。この群の中で、４つのクローン、ＦＳ３０−５、ＦＳ３０−１０、ＦＳ３０−１５及びＦＳ３０−１６が、カニクイザルＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉに対して交差反応性であった。カニクイザル交差反応性は、抗体の前臨床開発中のカニクイザルにおける投与及び安全性試験を可能にするために必要とされる。得られたカニクイザル交差反応性クローンの数が少ないため、さらなるクローンをスクリーニングし、実施例２．１に記載されるように発現させた。これにより、１つのさらなるヒト／カニクイザル交差反応性結合剤ＦＳ３０−３５が単離された。ＦＳ３０−５、ＦＳ３０−１０、ＦＳ３０−１５及びＦＳ３０−１６を、まず、ｍＡｂフォーマットにおいて特徴付けしたが（実施例２．３から２．４を参照）、ＦＳ３０−３５を、ｍＡｂ２フォーマットのみにおいて特徴付けした（実施例３以降を参照）。
【０３３５】
２．３  細胞結合
抗ヒトＣＤ１３７  ｍＡｂ  ＦＳ３０−５、ＦＳ３０−１０、ＦＳ３０−１５及びＦＳ３０−１６を、フローサイトメトリーを用いて、ヒト又はカニクイザルＣＤ１３７（ＤＯ１１．１０−ｈＣＤ１３７又はＤＯ１１．１０−ｃＣＤ１３７）を発現する細胞への結合について試験した。非特異的結合も、ＣＤ１３７発現を欠くＤＯ１１．１０細胞及びＨＥＫ２９３細胞への結合を試験することによって評価した。結合親和性を、２つの陽性対照抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ、ＭＯＲ７４８０．１（実施例１．２を参照及び２０Ｈ４．９（米国特許第７２８８６３８号）の結合親和性と比較し、その可変ドメインをクローニングし、ＣＨ２ドメイン中にＬＡＬＡ突然変異を含むヒトＩｇＧ１フォーマット（Ｇ１ＡＡフォーマット）において発現させて、抗体Ｇ１ＡＡ／ＭＯＲ７４８０．１及びＧ１ＡＡ／２０Ｈ４．９を得た。
【０３３６】
簡潔に述べると、ＤＯ１１．１０、ＨＥＫ２９３、ＤＯ１１．１０−ｈＣＤ１３７又はＤＯ１１．１０−ｃＣＤ１３７懸濁液を、２％のＢＳＡ（Sigma、Ａ７９０６）を含有するＰＢＳ中で調製し、Ｖ底９６ウェルプレート（Costar、３８９７）において５０μｌ／ウェルで、４×１０６個の細胞／ｍｌで播種した。ｍＡｂ希釈物（１．１０−６〜１００ｎＭ、１０倍希釈物）を、１×ＤＰＢＳ（Gibco、１４１９０−０９４）において３連で、２×最終濃度で調製した。５０μｌのＦＳ３０−５、ＦＳ３０−１０、ＦＳ３０−１５又はＦＳ３０−１６  ｍＡｂ又は対照ｍＡｂ（Ｇ１ＡＡ／ＭＯＲ７４８０．１又はＧ１ＡＡ／２０Ｈ４．９）を、別個の細胞（最終体積１００μｌ）に加え、１時間にわたって４℃でインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中で１回洗浄し、次に、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中で１：１０００に希釈された１００μｌ／ウェルの二次抗体（抗ヒトＦｃ−４８８抗体、Jackson Immunoresearch、１０９−５４６−０９８）を加え、暗所で、４℃で３０分間にわたってインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中で１回洗浄し、１μｇ／ｍｌでＤＡＰＩ（Biotium、４００４３）を含有する１００μｌのＰＢＳ中で再懸濁させた。細胞を、Canto IIフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて分析した。死細胞を取り除き、ＦＩＴＣチャネルにおける蛍光（４８８ｎｍ／５３０／３０）を測定した。幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）値を、抗体のｌｏｇ濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいてｌｏｇ（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングした。
【０３３７】
ＦＳ３０−５、ＦＳ３０−１０、ＦＳ３０−１５及びＦＳ３０−１６クローンは、陽性対照ｍＡｂと同等の、０．１５〜０．５７ｎＭの範囲のＥＣ５０値で、細胞表面で発現されるヒト及びカニクイザルＣＤ１３７受容体に結合することが分かった（表３を参照）。親ＤＯ１１．１０又はＨＥＫ２９３細胞への結合は観察されず、したがって、結合の特異性を示す。カニクイザルＣＤ１３７への２０Ｈ４．９陽性対照抗ＣＤ１３７抗体の結合は、これらの細胞において観察されなかった。公開されたデータ（米国特許第７２８８６３８号）は、ＩｇＧ１フォーマットにおける２０Ｈ４．９抗体が、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）誘導性カニクイザルＰＭＢＣにおいてカニクイザルＣＤ１３７に結合することを示す。本発明者らの手で、Ｇ１ＡＡフォーマットにおける２０Ｈ４．９抗体は、組み換えカニクイザルＣＤ１３７に結合したが、親和性は、ヒトＣＤ１３７（データは示されていない）に対するよりはるかに低く、これは、ＤＯ１１．１０−ｃＣＤ１３７細胞への、この抗体で観察される結合の欠如を説明し得る。
【０３３８】
【表４】
2021525546.tif 000006
【０３３９】
２．３  ＦＳ３０  ｍＡｂの生物物理学的特性
選択されたｍＡｂの生物物理学的特性の評価は、薬剤開発だけでなく、結合及び機能データの解釈のためにも重要である。具体的には、アゴニストＴ細胞活性化を分析する場合、集合体の存在が、抗体のクラスター化を模倣し、Ｔ細胞活性化を誘発し得る。したがって、ＦＳ３０  ｍＡｂのモノマー割合のパーセンテージを、ＳＥＣによって決定した。
【０３４０】
簡潔に述べると、ＦＳ３０  ｍＡｂを、TSKgel SuperSW3000カラム（Tosoh Bioscience、１８６７５）を用いてＨＰＬＣ機械（Agilent 1100 series）において注入した。これらの実験のための流量は、０．３５ｍｇ／ｍｌであり、移動相は、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．８であった。試料濃度は、１×ＰＢＳ緩衝液中０．５〜１ｍｇ／ｍｌであった。
【０３４１】
４つ全てのＦＳ３０  ｍＡｂは、単一ピークプロフィールを示し、９７％超のモノマーであった（表４）。この高いレベルのモノマータンパク質のため、機能活性試験が続行された。
【０３４２】
【表５】
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【０３４３】
２．４  Ｔ細胞活性化アッセイ
次に、抗ＣＤ１３７  ｍＡｂの機能活性を、初代Ｔ細胞活性化アッセイにおいて分析した。インビボで、抗ＣＤ１３７  ｍＡｂは、Ｆｃｙ受容体の動員によってアゴニズムを誘発し、それによって、ｍＡｂの架橋及びその後のＣＤ１３７受容体のクラスター化を引き起こす。表面ＣＤ１３７受容体分子をクラスター化するｍＡｂの最大能力を模倣するために、ＦＳ３０  ｍＡｂを、アッセイの前に、抗ヒトＣＨ２抗体（クローンＭＫ１Ａ６［Jefferis et al.,1985；Jefferis et al.,1992］、社内で産生される）を用いて架橋させた。Ｔ細胞活性化を、非架橋のｍＡｂと比較した。ＦＳ３０−５、ＦＳ３０−１０、ＦＳ３０−１５及びＦＳ３０−１６を、ＦＳ３０−６（結合ＥＬＩＳＡ（実施例２．２）においてカニクイザルＣＤ１３７に対して交差反応性でないことが分かり、したがって異なるエピトープに結合する可能性が高いヒトＣＤ１３７結合剤である）、並びに陽性対照抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ  Ｇ１ＡＡ／ＭＯＲ７４８０．１及びＧ１ＡＡ／２０Ｈ４．９とともに試験した。ＬＡＬＡ突然変異を有するヒトＩｇＧ１骨格中の抗ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）抗体Ｄ１．３（Braden et al.,1996）（Ｇ１ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３と示される）を陰性対照として使用した。
【０３４４】
２．４．１  初代ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞の単離及び活性化
ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離するために、最初に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、血小板成分献血の副産物である白血球除去錐体細胞から単離した。簡潔に述べると、白血球錐体細胞の内容物をＰＢＳでフラッシュし、Ficoll（Sigma-Aldrich、１４４０−０２）勾配上に重ね合わせた。ＰＢＭＣを遠心分離によって単離し、Ficoll勾配を通過しなかった細胞を回収した。ＰＢＭＣをＰＢＳでさらに洗浄し、残っている赤血球を、製造業者の説明書に従って、１０ｍｌの１×赤血球溶解緩衝液（eBioscience、００−４３００−５４）の添加によって溶解させた。ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、製造業者の説明書に従って、ＣＤ８＋  Ｔ細胞単離キット（ヒト）（Miltenyi Biotec、１３０−０９６−４９５）を用いて、溶離液中に存在するＰＢＭＣから単離した。
【０３４５】
９６ウェル平底組織培養プレートを、４℃で一晩、ＰＢＳ中の８μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（Clone UCHT1、R&D Systems、ＭＡＢ１００−ＳＰ）で被覆した。次に、プレートを、２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。１０％のＦＢＳ（Life Technologies）、１×ペニシリンストレプトマイシン（Life Technologies、１５１４０１２２）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Gibco、１１３６０−０７０）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Sigma-Aldrich、Ｈ０８８７）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Sigma-Aldrich、Ｇ７５１３）及び５０μＭの２−メルカプトエタノール（Gibco、Ｍ６２５０）を含むＴ細胞培地（ＲＰＭＩ培地（Life Technologies、６１８７０−０４４）中で、５．０×１０５個の細胞／ｍｌの濃度での必要量のＴ細胞を、１００μｌの培養培地中に５．０×１０４個の細胞／ウェルがあるように平板培養した。
【０３４６】
２．４．２  Ｔ細胞活性化アッセイプロトコル
ＦＳ３０抗体を、２００ｎＭから開始して２×最終濃度で、Ｔ細胞培地中で希釈し、架橋剤（抗ヒトＣＨ２抗体ＭＫ１Ａ６）を抗体試料に加えて、１：１のモル比で架橋させてから、１：３の滴定を行った。非架橋の抗体試料を、１００ｎＭ及び２５ｎＭのみで試験した。１００μｌの希釈された抗体又は抗体／架橋剤混合物を、合計で２００μｌのアッセイ体積及び１倍濃度の抗体のために、プレートにおいてＴ細胞に加えた。アッセイを、７２時間にわたって、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。上清を収集し、製造業者の説明書に従って、ヒトＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ  Ready-SET-Go!キット（eBioscience、８８−７０２５−８８）を用いてアッセイした。プレートを、Gen5 Software、BioTekを用いて、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。６３０ｎｍの吸光度値を、４５０ｎｍの吸光度値から減算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータロジスティック曲線フィット（Gen5 Software、BioTek）に基づいていた。ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）の濃度を、抗体のｌｏｇ濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいてｌｏｇ（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングした。アッセイの結果は、表５及び図１に示される。
【０３４７】
架橋される場合、ＦＳ３０−５、ＦＳ３０−１０、ＦＳ３０−１５及びＦＳ３０−１６  ｍＡｂは、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて強力な活性を示し、１０ｎＭ未満のＥＣ５０値及び陽性対照抗ＣＤ１３７  ｍＡｂと同様の最大レベルのＩＬ−２（Ｅｍａｘ）を有していた（表５、図１Ａ）。ＦＳ３０−６  ｍＡｂのＥｍａｘは、陽性対照及び他のＦＳ３０  ｍＡｂのＥｍａｘより有意に低く、これは、より低い全体的レベルのＴ細胞活性化を示している。架橋の非存在下で活性を示した（３１７４ｐｇ／ｍｌのｈＩＬ−２産生）陽性対照Ｇ１ＡＡ／２０Ｈ４．９  ｍＡｂと異なり、ＦＳ３０  ｍＡｂは、測定されたＩＬ−２のバックグラウンド応答レベルによって示されるように、架橋されていない場合、活性を示さなかった（表５及び代表的な図１Ｂ）。
【０３４８】
【表６】
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【０３４９】
２．５  ナイーブな選択手順の概要
ナイーブファージライブラリーの最初のスクリーンによって同定された３６のｍＡｂから、５つの抗ヒトＣＤ１３７  ｍＡｂクローン（ＦＳ３０−５、ＦＳ３０−１０、ＦＳ３０−１５、ＦＳ３０−１６及びＦＳ３０−３５）が、組み換えヒト及びカニクイザルＣＤ１３７の両方に結合することが分かった。ＦＳ３０−５、ＦＳ３０−１０、ＦＳ３０−１５及びＦＳ３０−１６  ｍＡｂクローンは、細胞表面ＣＤ１３７受容体に結合して、架橋時にＴ細胞活性化を誘発することが示された。これらのクローンは、ＦＳ３０−３５  ｍＡｂクローンと一緒に、実施例３に記載されるように、ｍＡｂ２フォーマットにおける発現及び配列最適化のために選択された。
【０３５０】
実施例３−ｍＡｂ２フォーマットにおけるｍＡｂの発現及び特徴付け
ｍＡｂのＣＤＲベースの抗原結合部位は、Ｆｃ抗原結合又は「Ｆｃａｂ」ドメインとして知られている、定常ドメイン中で生成されるさらなる結合部位と組み合わされて、ｍＡｂ２と呼ばれる二重特異的抗体が得られる。ｍＡｂ２フォーマットにおける抗ＣＤ１３７結合部分の特徴付けを可能にするために、ＦＳ３０−５、ＦＳ３０−１０、ＦＳ３０−１５、ＦＳ３０−１６又はＦＳ３０−３５クローンのいずれかのＣＤＲを含み、且つＣＨ２ドメイン中にＬＡＬＡ突然変異、及びＣＨ３ドメイン中にヒトＯＸ４０受容体結合部位を含むＩｇＧ１分子からなるｍＡｂ２分子を調製した。ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３と示される抗ヒトＯＸ４０／抗ＨＥＬ  ｍＡｂ２のＶＨドメインを、ＦＳ３０クローンの対応するＶＨドメインで置換し、生成されたＶＨを、ＦＳ３０  ｍＡｂの対応する軽鎖と共トランスフェクトすることによって、これらのｍＡｂ２分子を生成した。ＩｇＧ１分子のＣＨ２ドメイン中のＬＡＬＡ突然変異は、得られたｍＡｂ２分子中に保持されていた。得られたｍＡｂ２分子の重鎖及び軽鎖配列は、配列番号８３及び１３、１０３及び４６、８９及び８８、９２及び９１、９３及び６８に示される。これらのｍＡｂ２分子は、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１５、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１６及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５と示された。ｍＡｂ２を、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞中で一過性発現によって産生し、MabSelect SuReプロテインＡカラム（GE Healthcare）を用いて精製した。
【０３５１】
３．１  抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ２の結合特異性
ＣＤ１３７は、サイトカイン受容体の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）に属する（Moran et al.,2013）。５つのｍＡｂ２分子の抗ＣＤ１３７  Ｆａｂ結合部位の特異性を分析するために、ヒトＣＤ１３７及び５つの密接に関連するヒトＴＮＦＲＳＦメンバー（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＧＩＴＲ、ＮＧＦＲ及びＣＤ４０）へのｍＡｂ２の結合を、ＳＰＲを用いて試験した。目的は、１μＭの濃度で密接に関連する抗原へのｍＡｂ２の結合を示さないが、１ｎＭの濃度でＣＤ１３７受容体への結合を示すことによって、１０００倍の特異性を実証することであった。
【０３５２】
ＣＭ５チップにおけるフローセルを、約１０００ＲＵの、ｈＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ（表１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ−Ｆｃ（R&D Systems、３７２−ＲＩ−０５０／ＣＦ）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ−Ｆｃ（R&D Systems、７２６−Ｒ２−０５０）、ＧＩＴＲ−ｈＦｃ−Ａｖｉ（社内で産生され、配列番号１１７に記載されるヒトＧＩＴＲの細胞外ドメインを含む）、ＮＧＦＲ−Ｆｃ（R&D Systems、３６７−ＮＲ−０５０／ＣＦ）又はＣＤ４０−ｍＦｃ（社内で産生され、配列番号１１８に記載されるヒトＣＤ４０の細胞外ドメインを含む）のいずれかで固定した。フローセル１を、ブランク固定化として実行した。５つのＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０  ｍＡｂ２を、１×ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（GE Healthcare、製品コードＢＲ１００１８８）中で１μＭ及び１ｎＭになるまで希釈し、３分間にわたってチップ上に流し、次に、４分間にわたって解離させた。１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５の３０秒間の注入を、再生のために使用した。陽性対照ｍＡｂを、５０〜１００ｎＭで注入して、各抗原のコーティングを確認した。結合レベルを、会合段階の最後に決定し、比較した。
【０３５３】
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１６及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５  ｍＡｂ２が、高いレベルの特異性（ほぼ１０００倍）を示した一方、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１５  ｍＡｂ２は、試験される５つ全ての密接に関連するＴＮＦＲＳＦメンバーへの非特異的結合を示した。このクローンによって示された非特異的結合は、同じ濃度でＣＤ１３７受容体への結合より平均して約５〜１０倍低く、ｍＡｂ２分子のＦａｂ結合部位に起因すると結論付けられたが、これは、ＦＳ３０−１５  ｍＡｂが、ＣＤ１３７に密接に関連する同じ５つのＴＮＦＲＳＦメンバーへの結合について試験される際に同じ結合プロフィールを示したためである。このデータに基づいて、ＦＳ３０−１５クローンは、さらなる選択作業から除外された。
【０３５４】
実施例４−配列最適化
ＦＳ３０−５、ＦＳ３０−１０、ＦＳ３０−１６及びＦＳ３０−３５抗ＣＤ１３７  ｍＡｂが、ＣＤ１３７に対する高い親和性及び特異性、並びにＴ細胞活性化アッセイにおける活性を示した一方、それらは、ＣＤＲループ内に１つ以上の潜在的な翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位を含有していた。結合及び活性を保持又は改善しながらこれらの部位において置換され得るアミノ酸残基を同定するために、これらのクローンをさらに操作することが決定された。同定された潜在的なＰＴＭ部位は、ＶＨ  ＣＤＲ３中のメチオニン残基（ＦＳ３０−５中のＫａｂａｔ位置Ｍ１００Ｄ及びＭ１００Ｈ、ＦＳ３０−１０中のＭ９７、ＦＳ３０−１６中のＭ１００Ａ、及びＦＳ３０−３５中のＭ１００Ｆ）、ＶＨ  ＣＤＲ２中の潜在的なアスパラギン酸塩異性化モチーフ（ＦＳ３０−１６中のＫａｂａｔ位置Ｄ５４Ｇ５５）及びＶＬ  ＣＤＲ３中の潜在的な脱アミド化部位（ＦＳ３０−１６中のＫａｂａｔ位置Ｑ９０Ｇ９１）を含んでいた。
【０３５５】
部位特異的突然変異誘発を、テンプレートとしての５つのＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０  ｍＡｂ２クローン、及び全ての可能なアミノ酸置換を可能にするためにメチオニン、アスパラギン酸塩又はグリシン残基をコードする部位に縮重コドンＮＮＫを含むプライマーを用いて行った。新規な潜在的なＰＴＭモチーフを生成することが可能なシステイン残基及びアミノ酸は除外された。クローンを発現させ、ＤＯ１１．１０−ｈＣＤ１３７細胞への結合についてスクリーニングした。親ｍＡｂ２クローンと比較して、１０ｎＭで同様（２倍以内）又は改善した結合を有するクローンを、３０〜５０ｍｌ規模での発現のために選択し、プロテインＡカラムにおいて精製し、ＤＯ１１．１０−ｈＣＤ１３７細胞及び架橋剤としての抗ヒトＣＨ２抗体ＭＫ１Ａ６を用いて、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてスクリーニングした。
【０３５６】
ＤＯ１１．１０−ｈＣＤ１３７細胞を、ＰＢＳ中で１回洗浄し、１．０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度で、１０％のＦＢＳ（Life Technologies）及び５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Life Technologies、Ａ１１１１３８０３））を含むＤＯ１１．１０細胞培地（ＲＰＭＩ培地（Life Technologies）中で再懸濁させた。９６ウェル平底プレートを、３７℃、５％のＣＯ２で２時間にわたってＰＢＳ中で希釈された０．１μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３抗体とのインキュベーションによって抗マウスＣＤ３抗体（Thermo Fisher Scientific、クローン１７Ａ２）で被覆し、次に、ＰＢＳで２回洗浄した。ＤＯ１１．１０−ｈＣＤ１３７細胞を、１×１０５個の細胞／ウェルでプレートに加えた。各試験抗体の２μＭの希釈物を、ＤＰＢＳ（Gibco）中で調製し、ＤＯ１１．１０細胞培地（３０μｌ＋２７０μｌ）中で１：１０にさらに希釈して、２００ｎＭの希釈物を得た。ＭＫ１Ａ６架橋剤を、架橋される試験抗体試料とともに１：１のモル比でウェルに加えた。９６ウェルプレートにおいて、各抗体又は抗体／架橋剤混合物の連続希釈物を調製した。１００μｌの希釈された抗体又は抗体／架橋剤混合物を、プレートにおいてＤＯ１１．１０−ｈＣＤ１３７細胞に加えた。細胞を、７２時間にわたって３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。上清を収集し、製造業者の説明書に従って、マウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience又はR&D Systems）を用いてアッセイした。プレートを、Gen5 Software、BioTekを用いて、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。６３０ｎｍの吸光度値を、４５０ｎｍの吸光度値から減算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータロジスティック曲線フィット（Gen5 Software、BioTek）に基づいていた。マウスＩＬ−２（ｍＩＬ−２）の濃度を、抗体のｌｏｇ濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいてｌｏｇ（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングした。
【０３５７】
クローンのそれぞれについて、細胞表面ＣＤ１３７への結合を保持又は改善した限られた数のアミノ酸を、重鎖ＣＤＲ３中のメチオニン残基の置換のために同定した（表６を参照）。ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１６  ｍＡｂ２クローンは、３つの潜在的なＰＴＭ部位を含んでおり、それらのそれぞれの突然変異が、結合親和性のわずかな減少をもたらした。これらの突然変異を、１つの分子中で組み合わせた場合、結合の減少が相加的であったため（データは示されていない）、このクローンは、さらに進めなかった。関連する親クローンと比較して、ＣＤ１３７への結合及び機能活性を改善した少しの突然変異が見られた。全てＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０  ｍＡｂ２クローンに由来する３つの突然変異体ｍＡｂ２クローンは、改善した結合親和性及び機能活性を有することが分かった。これらのｍＡｂ２は、親ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０  ｍＡｂ２における９７位にメチオニン残基の代わりにアスパラギン、トレオニン又はロイシン残基のいずれかを含んでおり、それぞれＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６と示された。ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５親ｍＡｂ２クローンに由来する突然変異体クローンについてのＥＣ５０値は、親クローンと比較して機能活性の改善を示さなかったが、親クローンにおける１００Ｆ位にメチオニン残基の代わりにアラニン残基を含む、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５−１４と示される１つの突然変異体クローンは、改善した結合を示した。ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５親ｍＡｂ２クローンの場合、１００Ｄ位におけるメチオニン残基及び１００Ｈ位におけるメチオニン残基の両方が、それぞれ、同じ分子中でイソロイシン残基及びロイシン残基に変化されて、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５−３７と示される突然変異体ｍＡｂ２クローンをもたらした。ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５−１４及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５−３７クローンを、さらなる特徴付けのために選択した。
【０３５８】
【表７】
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【０３５９】
実施例５−抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ２の結合親和性及び特異性
５．１  組み換えＣＤ１３７への選択されたｍＡｂ２クローンの結合
組み換えヒト、カニクイザル及びマウスＣＤ１３７−ｍＦＣ−Ａｖｉ抗原（表１を参照）及びラットＣＤ１３７−ｍＦｃ抗原（R&D Systems、７９６８−４Ｂ−０５０）への、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５−３７、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５−１４  ｍＡｂ２クローンの結合を、Biacore 3000機器（GE Healthcare）を用いて、ＳＰＲによって測定した。ＩｇＧ１フォーマット（Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１；配列番号９９及び１０１）における抗ＣＤ１３７  ＭＯＲ７４８０．１  ｍＡｂ及びＧ１ＡＡ／２０Ｈ４．９を、陽性対照として使用した。
【０３６０】
簡潔に述べると、２５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（GE Healthcare、Human Antibody Capture Kit、ＢＲ１００８３９）を、５μｌ／分で３分間にわたってBiacore sensor chip CM5（GE Healthcare、ＢＲ１０００１２）のフローセル１、２、３及び４上に被覆し、約４３００ＲＵの最終的な応答を達成した。０．５μｇ／ｍｌで、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（GE Healthcare、ＢＲ１００１８８）中で希釈されたｍＡｂ２クローンを、３０μｌ／分でフローセル２、３及び４において個別に注入して、約８０ＲＵの応答を達成した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で希釈された組み換えヒト、カニクイザル、マウス及びラットＣＤ１３７−ｍＦｃ抗原を、７０μｌ／分で２分間にわたって、３倍希釈物で必要に応じて２２ｎＭから０．０１ｎＭの範囲の濃度でフローセル１、２、３又は４上に注入し、次に、８分間にわたって緩衝液中で解離させた。３０μｌ／分の速度で３０秒間にわたって３Ｍの塩化マグネシウム（GE Healthcare、Human Antibody Capture Kit、ＢＲ１００８３９）を注入することによって、再生を行った。高レベルのｍＡｂを捕捉し（２７０ＲＵ）、３０μｌ／分の流量を使用したことを除いて同様の条件で、Ｇ１ＡＡ／２０Ｈ４．９対照を試験した。これらのあまり厳しくない条件を用いて、この分子がカニクイザルＣＤ１３７−ｍＦｃに結合することができたかどうかを評価した。減算されたデータ（フローセル２−フローセル１、フローセル３−フローセル１、又はフローセル４−フローセル１）を、BIAevaluation 3.2 Software（GE Healthcare）を用いて分析して、屈折率（ＲＩ）定数０で、質量移動を用いたモデル１：１結合を用いて結合を同定した。
【０３６１】
結合データは、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５−３７、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５−１４クローンが、低いナノモル親和性でヒトＣＤ１３７−ｍＦｃに結合し、完全にカニクイザル交差反応性であったことを実証した（表７）。組み換えマウス又はラットＣＤ１３７−ｍＦｃ抗原への結合は観察されなかった。陽性対照Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１  ｍＡｂと比較して、ヒトＣＤ１３７に対するＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６  ｍＡｂ２の結合親和性は、約３倍高かった。Ｇ１ＡＡ／２０Ｈ４．９対照と同様に、ヒトＣＤ１３７−ｍＦｃへのｍＡｂ２クローンの高い親和性の結合が観察された。しかしながら、カニクイザルＣＤ１３７−ｍＦｃへのこの対照ｍＡｂの結合は、ｍＡｂ２クローンと比較して弱く、検出される最大結合レベル（Ｒｍａｘ）の１０％未満であった。これは、Ｇ１ＡＡ／２０Ｈ４．９対照ｍＡｂが、このアッセイにおいて試験される他のｍＡｂ／ｍＡｂ２より、二量体ＣＤ１３７における異なる結合領域に結合する可能性があることを示す。
【０３６２】
【表８】
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【０３６３】
５．２  抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ２の結合特異性
実施例４に記載される突然変異誘発作業において導入されたアミノ酸突然変異が結合特異性に影響を与えたかどうかを試験するために、選択されたｍＡｂ２クローンを、ＣＤ１３７受容体に密接に関連する他のＴＮＦＲＳＦメンバーへの結合について試験した。
【０３６４】
特異性を、ＣＤ１３７に密接に関連する同じ５つのヒトＴＮＦＲＳＦメンバー（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＧＩＴＲ、ＮＧＦＲ及びＣＤ４０）並びにさらなる密接に関連するＴＮＦＲＳＦメンバー、ヒトＤＲ６（ＤＲ６−Ｆｃ；R&D Systems、１４４−ＤＲ−１００）に対して、実施例３．１に記載されるＳＰＲを用いて試験した。抗ＣＤ１３７  Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１  ｍＡｂを、陽性対照として使用した。陽性対照ｍＡｂと同様に、選択されたｍＡｂ２の全ては、６つの密接に関連するＴＮＦＲＳＦメンバーへの結合を示さず、したがってヒトＣＤ１３７に対する高いレベルの特異性を示し、これは、実施例４に記載される突然変異誘発作業によって導入されたアミノ酸置換が、得られるｍＡｂ２の結合特異性を変化させなかったことを示している。
【０３６５】
実施例６−ヒトＣＤ１３７リガンドブロッキングアッセイ
ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ相互作用は、ＣＤ１３７受容体の活性化のために必要とされる。アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体は、リガンド相互作用を模倣することによってＣＤ１３７の活性化を引き起こし得、それによって潜在的にリガンド結合をブロックし、又はリガンド結合を妨げずに受容体のクラスター化及び活性化を引き起こす。抗体がＣＤ１３７Ｌを潜在的に模倣する場合、それは、受容体及びリガンドの相互作用をブロックし得る。ＭＯＲ７４８０．１が、リガンド／受容体相互作用をブロックすることは、当該技術分野において公知であるが（米国特許出願公開第２０１２／０２３７４９８号）、２０Ｈ４．９抗体は、ＣＤ１３７とそのリガンドとの相互作用をブロックしないことが以前に報告されている（米国特許第７２８８６３８号）。
【０３６６】
６．１  ＥＬＩＳＡベースのヒトＣＤ１３７リガンドブロッキングアッセイ
ｍＡｂ２フォーマットにおける抗ヒトＣＤ１３７  ｍＡｂクローンＦＳ３０−５−３７、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ３０−１０−１６及びＦＳ３０−３５−１４を（抗ＯＸ４０  ＦｃａｂクローンＦＳ２０−２２−４９ＡＡとともに）、ＥＬＩＳＡベースの方法を用いて、ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ相互作用をブロックするそれらの能力について試験した。ＩｇＧ１フォーマット（Ｇ１／１１Ｄ４；配列番号１１０及び１１１）における抗ＯＸ４０  ｍＡｂ  １１Ｄ４（欧州特許第２２４２７７１号）を、アイソタイプ／陰性対照として使用し；抗ＯＸ４０  ＦｃａｂクローンＦＳ２０−２２−４９ＡＡ及び抗ＦＩＴＣ抗体４４２０のＦａｂ領域（Bedzyk et al.,1989；Bedzyk et al.,1990）を含むｍＡｂ２  ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０（配列番号９８及び９７）を、ＯＸ４０結合のための陰性対照ｍＡｂ２として使用し；抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ  Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１（配列番号９９及び１０１）並びにＧ１／２０Ｈ４．９（配列番号１０４及び１０６）を、ＣＤ１３７結合及びリガンドブロッキング活性のための陽性対照として使用した。
【０３６７】
具体的には、組み換えヒトＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ抗原を、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度で、Maxisorp 96ウェルプレートにおいて４℃で一晩被覆した。翌日、プレートを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のTween20（商標））で洗浄し、撹拌しながら室温で１時間にわたってＰＢＳ＋１％のＢＳＡ（Sigma、Ａ３０５９−５００Ｇ）でブロックした。ブロックした後、プレートを、ＰＢＳＴで再度洗浄した。各試験抗体の１００ｎＭの希釈物を、ＰＢＳ＋１％のＢＳＡ中で調製し、ＣＤ１３７被覆プレートに加え、撹拌しながら室温で１時間にわたってインキュベートした。このインキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、次に、撹拌しながら室温で１時間にわたって、ＰＢＳ中の２０ｎｇ／ｍｌのＣＤ１３７Ｌ−Ｈｉｓ（R&D Systems、２２９５−４Ｌ−０２５／ＣＦ）とともにインキュベートした。次に、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、次に、撹拌しながら室温で１時間にわたって、ＰＢＳ中１対１０００の希釈で抗ｈｉｓ二次抗体（R&D Systems、ＭＡＢ０５０Ｈ）とともにインキュベートした。次に、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、陽性対照ウェルが青色に変化するまでＴＭＢ検出試薬（Thermo Fisher Scientific、００２０２３）とともにインキュベートし、次に、２ＮのＨ２ＳＯ４の添加により、反応を停止させた。プレートを、Gen5 Software、BioTekを用いて、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。６３０ｎｍの吸光度値を、４５０ｎｍの吸光度値から減算した（補正）。減算された吸光度値を、抗体のｌｏｇ濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいてｌｏｇ（阻害剤）対応答の式を用いてフィッティングした。Ｇ１／１１Ｄ４及びＧ１／ＭＯＲ７４８０．１対照ｍＡｂをそれぞれ０及び１００％のブロッキング値として設定することによって、値を正規化した。データを、GraphPad Prismを用いて、一元ＡＮＯＶＡ検定及びHolm-Sidakの多重比較検定を用いて分析した。
【０３６８】
試験される分子のリガンドブロッキング活性（ｎ＝２の平均）が、Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１陽性対照のリガンドブロッキング活性におけるパーセンテージとして図２Ａ及び表８に示される。両方の陽性対照ｍＡｂ、Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１及びＧ１／２０Ｈ４．９は、ＣＤ１３７とそのリガンドとの間の相互作用を完全にブロックした。ＭＯＲ７４８０．１対照についてのこの観察は、以前の報告と一致している。しかしながら、２０Ｈ４．９抗体が、このアッセイにおいてリガンド結合をブロックしたことは意外であり、それは、２０Ｈ４．９抗体が、異なるアッセイにおいてＣＤ１３７とそのリガンドとの間の相互作用をブロックしないことが以前に報告されていたためである（米国特許第７２８８６３８号）。
【０３６９】
ある範囲のブロッキング活性が、試験された５つの抗ヒトＣＤ１３７  ｍＡｂ２クローンについて観察された（図２Ａ及び表８）。ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５−３７は、陽性対照抗体と同様に、受容体−リガンド相互作用の完全な阻害を示した。ＦＳ３０−１０系統の抗ＣＤ１３７  ｍＡｂのＦａｂ領域を含有する全てのｍＡｂ２クローン（すなわち、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６）は、ＣＤ１３７とＣＤ１３７Ｌとの間の相互作用を４８から５４％阻害し、したがって部分的なブロッカーと見なされた。ＣＤ１３７とＣＤ１３７Ｌとの間の相互作用を部分的にのみブロックすることによって、これらの抗体の１つが結合される場合でも、いくらかのＣＤ１３７シグナル伝達がこの機構によってまだ起こり得るように、これらのｍＡｂが、ＣＤ１３７Ｌとその受容体との天然の相互作用を完全に阻害することはないようにすることが可能である。ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５−１４クローンは、陰性対照ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０  ｍＡｂ２分子と同様に、受容体−リガンド相互作用を実質的に阻害する能力を欠いており、したがって非ブロッカーであると見なされた。
【０３７０】
要約すると、このアッセイの結果は、試験された一連の抗ＣＤ１３７  ｍＡｂが、完全なブロッキング活性、部分的なブロッキング活性及びブロッキング活性なしを含む、様々なリガンドブロッキング能力を示したことを示した。クローンＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５−１４はそれぞれ、陽性対照抗ＣＤ１３７  ｍＡｂのものと異なるブロッキング活性を示した。ある範囲のリガンドブロッキング活性が同定されたため、抗体のそれぞれの機能活性を試験した（実施例７を参照）。
【０３７１】
【表９】
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【０３７２】
６．２  細胞ベースのヒトＣＤ１３７リガンドブロッキングアッセイ
ｍＡｂ２フォーマットにおける抗ヒトＣＤ１３７  ｍＡｂクローンＦＳ３０−５−３７、ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ３０−１０−１２及びＦＳ３０−１０−１６を（抗ＯＸ４０  ＦｃａｂクローンＦＳ２０−２２−４９ＡＡとともに）、細胞ベースの方法を用いて、ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ相互作用をブロックするそれらの能力について試験した。ＩｇＧ１フォーマット（Ｇ１／１１Ｄ４；配列番号１１０及び１１１）における抗ＯＸ４０  ｍＡｂ  １１Ｄ４（欧州特許第２２４２７７１号）を、アイソタイプ／陰性対照として使用し；抗ＯＸ４０  ＦｃａｂクローンＦＳ２０−２２−４９ＡＡ及び抗ＦＩＴＣ抗体４４２０のＦａｂ領域（Bedzyk et al.,1989；Bedzyk et al.,1990）を含むｍＡｂ２  ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０（配列番号９８及び９７）を、ＯＸ４０結合のための陰性対照ｍＡｂ２として使用し；抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ  Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１（配列番号９９及び１０１）を、ＣＤ１３７結合及びリガンドブロッキング活性のための陽性対照として使用した。
【０３７３】
具体的には、１００ｎＭの組み換えヒトＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉタンパク質を、ＰＢＳ中で調製された各試験抗体の２００ｎＭの希釈物とともに、３７℃で３０分間にわたってインキュベートした。インキュベーションの後、抗体及び抗原混合物を、ヒトＣＤ１３７Ｌを発現する１０５個のＤＯ１１．１０細胞に加え、３７℃で３０分間にわたってインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中で１回洗浄し、次に、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中で１：１０００に希釈された１００μｌ／ウェルの二次抗体（抗マウスＦｃ−４８８抗体、Jackson Immunoresearch、１１５−５４６−００８）を加え、暗所で、４℃で３０分間にわたってインキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１μｇ／ｍｌでＤＡＰＩ（Biotium、４００４３）を含有する１００μｌのＰＢＳ中で再懸濁させた。細胞を、Canto IIフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて分析した。死細胞を取り除き、ＦＩＴＣチャネルにおける蛍光（４８８ｎｍ／５３０／３０）を測定した。Ｇ１／１１Ｄ４及びＧ１／ＭＯＲ７４８０．１対照ｍＡｂをそれぞれ０及び１００％のブロッキング値として設定することによって、幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）値を正規化した。データを、GraphPad Prismを用いて、一元ＡＮＯＶＡ検定及びテューキーの多重比較検定を用いて分析した。
【０３７４】
試験される分子のリガンドブロッキング活性（ｎ＝２の平均）が、ＣＤ１３７とそのリガンドとの間の相互作用を完全にブロックした、Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１陽性対照抗体のリガンドブロッキング活性におけるパーセンテージとして図２Ｂ及び表９に示される。Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１対照についてのこの観察は、以前の報告と一致している。
【０３７５】
ある範囲のブロッキング活性が、試験された４つの抗ヒトＣＤ１３７  ｍＡｂ２クローンについて観察された。ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５−３７は、陽性対照抗体と同様に、受容体−リガンド相互作用の完全な阻害を示した。ＦＳ３０−１０系統の抗ＣＤ１３７  ｍＡｂのＦａｂ領域を含有する全てのｍＡｂ２クローン（すなわち、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６）は、ＣＤ１３７とＣＤ１３７Ｌとの間の相互作用を４６〜７６％阻害し、したがって部分的なブロッカーと見なされた。
【０３７６】
要約すると、このアッセイの結果は、ＥＬＩＳＡベースのブロッキングアッセイのものと同様であり、試験された一連の抗ＣＤ１３７  ｍＡｂが、完全なブロッキング活性から部分的なブロッキング活性までのある範囲のリガンドブロッキング能力を示したことを示した。クローンＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６はそれぞれ、陽性対照抗ＣＤ１３７  ｍＡｂのものと異なるブロッキング活性を示した。
【０３７７】
【表１０】
2021525546.tif 000012
【０３７８】
実施例７−ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７  Ｔ細胞活性化アッセイにおける抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ２クローンの機能活性
選択されたＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５−３７、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５−１４  ｍＡｂ２クローンの機能活性を、実施例４に記載されるように、ＤＯ１１．１０−ｈＣＤ１３７細胞を用いて、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて試験した。ＩｇＧ１フォーマット（Ｇ１／４４２０；配列番号９６及び９７）における抗ＦＩＴＣ抗体４４２０を、アイソタイプ陰性対照として使用し；抗ＯＸ４０  ｍＡｂ  Ｇ１／１１Ｄ４（配列番号１１０及び１１１）及びｍＡｂ２クローンＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０（配列番号９８及び９７）を、陰性対照として使用し；ＩｇＧ１（Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１；配列番号９９及び１０１）及びＩｇＧ２（Ｇ２／ＭＯＲ７４８０．１；配列番号１０２及び１０１）フォーマットの両方における抗ＣＤ１３７抗体ＭＯＲ７４８０．１（ＩｇＧ２フォーマットは、抗体が臨床試験において試験されているフォーマットである（Gopal et al.,2017；Tolcher et al.,2016））を、陽性対照として使用した。アッセイの前に、ｍＡｂ及びｍＡｂ２分子を、抗ヒトＣＨ２抗体、ＭＫ１Ａ６（実施例２．４を参照）と架橋させ、１つの実験において、非架橋のｍＡｂ及びｍＡｂ２分子の活性を調べた。マウスＩＬ−２産生を、Ｔ細胞活性化の尺度として使用した。
【０３７９】
架橋される場合、５つ全ての選択されたｍＡｂ２クローンは、１５ｎＭ未満の平均ＥＣ５０値及び約１６０００〜２００００ｐｇ／ｍｌの範囲のＩＬ−２の平均Ｅｍａｘ値で、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて強力な活性を示した（表１０及び図３Ａ中の代表的なグラフ）。試験されたｍＡｂ２クローンの活性は、架橋の非存在下で観察されなかった（図３Ｂ中の代表的なグラフ）。ＭＯＲ７４８０．１陽性対照抗体は、架橋される場合にのみ活性であることが観察された（Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１について３．３ｎＭのＥＣ５０及び１２５７５ｐｇ／ｍｌのＥｍａｘ、並びにＧ２／ＭＯＲ７４８０．１について２．４ｎＭのＥＣ５０及び８５４７ｐｇ／ｍｌのＥｍａｘ）。架橋された抗ＯＸ４０  ｍＡｂ（１１Ｄ４）の活性の欠如及び非架橋の抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂ含有ｍＡｂ２分子について観察される低いバックグラウンドシグナルの組合せは、このアッセイの結果が、ＣＤ１３７活性のみから読み取られたものであることを示し、これは、ＤＯ１１．１０細胞による高レベルのＣＤ１３７受容体発現及び検出不可能なレベルのＯＸ４０受容体発現（データは示されていない）に起因する可能性が高い。
【０３８０】
【表１１】
2021525546.tif 000013
【０３８１】
実施例５．１に記載される結合実験において観察されるカニクイザル交差反応性が、機能活性に置き換えられ得るかどうかを決定するために、ｍＡｂ２はまた、カニクイザルＣＤ１３７（ＤＯ１１．１０−ｃＣＤ１３７）を発現するＤＯ１１．１０細胞を用いた以外はヒトＣＤ１３７  Ｔ細胞活性化アッセイと本質的に同じプロトコルにおいてカニクイザルＣＤ１３７を活性化するそれらの能力について分析された。アッセイの前に、ｍＡｂ及びｍＡｂ２分子を、抗ヒトＣＨ２抗体、ＭＫ１Ａ６と架橋させた。マウスＩＬ−２産生を、Ｔ細胞活性化の尺度として使用した。
【０３８２】
バックグラウンド及びＥｍａｘ活性化値は、ヒトＣＤ１３７  ＤＯ１１．１０活性化アッセイよりこのアッセイにおいてより高く、これは、ＤＯ１１．１０細胞において発現されるより高いレベルのカニクイザルＣＤ１３７受容体に起因する可能性が高い。ＭＯＲ７４８０．１陽性対照抗体と同様に、５つ全ての選択された抗ヒトＣＤ１３７  ｍＡｂ２クローンは、７．５ｎＭ以下の平均ＥＣ５０値及び約４５０００〜７００００ｐｇ／ｍｌの範囲のＩＬ−２の平均Ｅｍａｘ値で、カニクイザルＴ細胞活性化アッセイにおいて強力な活性を示した（表１１）。
【０３８３】
【表１２】
2021525546.tif 000014
【０３８４】
ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７  ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞アッセイ（ｎ＝２、表１０及び１１）の両方において最も高い平均アゴニスト活性を示したｍＡｂ２クローンは、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６及びＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５−１４であった。これらは全て、ヒトＣＤ１３７  Ｔ細胞活性化アッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ５０値及び１６０００ｐｇ／ｍｌを超えるＩＬ−２のＥｍａｘ値、並びにカニクイザルＣＤ１３７  Ｔ細胞活性化アッセイにおいて７ｎＭ未満のＥＣ５０及び４６０００ｐｇ／ｍｌを超えるＩＬ−２のＥｍａｘ値を有していた。これらのクローンは、ＣＤ１３７リガンドブロッキングアッセイにおいて同定された部分的にブロックする又はブロックしないクローンであった（実施例６）。
【０３８５】
配列表
完全な重鎖のアミノ酸配列において、可変ドメインが斜体で示され、ＩＭＧＴスキームに従うＣＤＲが太字斜体で示され、Ｋａｂａｔスキームに従うＣＤＲが斜体及び下線で示され（したがって、重複するＩＭＧＴ及びＫａｂａｔ  ＣＤＲ配列が、太字、斜体及び下線で示される）、該当する場合、ＬＡＬＡ突然変異の位置が太字及び下線で示される。
【０３８６】
完全な軽鎖のアミノ酸配列において、可変ドメインが斜体で示され、ＩＭＧＴスキームに従うＣＤＲが太字斜体で示され、Ｋａｂａｔスキームに従うＣＤＲが斜体及び下線で示される（したがって、重複するＩＭＧＴ及びＫａｂａｔ  ＣＤＲ配列が、太字、斜体及び下線で示される）。
【０３８７】
可変ドメインのアミノ酸配列において、ＩＭＧＴスキームに従うＣＤＲが太字斜体で示され、Ｋａｂａｔスキームに従うＣＤＲが斜体及び下線で示される（したがって、重複するＩＭＧＴ及びＫａｂａｔ  ＣＤＲ配列が、太字、斜体及び下線で示される）。
【０３８８】
ＦＳ３０−５−３７  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号１  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２】
2021525546.tif 000015
配列番号２  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化３】
2021525546.tif 000016
配列番号３  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化４】
2021525546.tif 000017
配列番号４  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化５】
2021525546.tif 000018
配列番号５  可変ドメインＡＡ
【化６】
2021525546.tif 000019
配列番号６  可変ドメインＤＮＡ
【化７】
2021525546.tif 000020
【化８】
2021525546.tif 000021
ＦＳ３０−５−３７  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号１３  軽鎖ＡＡ
【化９】
2021525546.tif 000022
配列番号１４  軽鎖ＤＮＡ
【化１０】
2021525546.tif 000023
配列番号１５  可変ドメインＡＡ
【化１１】
2021525546.tif 000024
配列番号１６  可変ドメインＤＮＡ
【化１２】
2021525546.tif 000025
【化１３】
2021525546.tif 000026
ＦＳ３０−１０−３  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号２４  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１４】
2021525546.tif 000027
配列番号２５  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１５】
2021525546.tif 000028
配列番号２６  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１６】
2021525546.tif 000029
配列番号２７  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１７】
2021525546.tif 000030
配列番号２８  可変ドメインＡＡ
【化１８】
2021525546.tif 000031
配列番号２９  可変ドメインＤＮＡ
【化１９】
2021525546.tif 000032
【化２０】
2021525546.tif 000033
ＦＳ３０−１０−３  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号４６  軽鎖ＡＡ
【化２１】
2021525546.tif 000034
配列番号４７  軽鎖ＤＮＡ
【化２２】
2021525546.tif 000035
配列番号４８  可変ドメインＡＡ
【化２３】
2021525546.tif 000036
配列番号４９  可変ドメインＤＮＡ
【化２４】
2021525546.tif 000037
【化２５】
2021525546.tif 000038
ＦＳ３０−１０−１２  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列（プロジェクトファイル）
配列番号４０  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２６】
2021525546.tif 000039
配列番号４１  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２７】
2021525546.tif 000040
配列番号４２  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２８】
2021525546.tif 000041
配列番号４３  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２９】
2021525546.tif 000042
配列番号４４  可変ドメインＡＡ
【化３０】
2021525546.tif 000043
配列番号４５  可変ドメインＤＮＡ
【化３１】
2021525546.tif 000044
【化３２】
2021525546.tif 000045
ＦＳ３０−１０−１２  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号４６  軽鎖ＡＡ
【化３３】
2021525546.tif 000046
配列番号４７  軽鎖ＤＮＡ
【化３４】
2021525546.tif 000047
配列番号４８  可変ドメインＡＡ
【化３５】
2021525546.tif 000048
配列番号４９  可変ドメインＤＮＡ
【化３６】
2021525546.tif 000049
【化３７】
2021525546.tif 000050
ＦＳ３０−１０−１６  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号５０  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化３８】
2021525546.tif 000051
配列番号５１  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化３９】
2021525546.tif 000052
配列番号５２  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化４０】
2021525546.tif 000053
配列番号５３  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化４１】
2021525546.tif 000054
配列番号５４  可変ドメインＡＡ
【化４２】
2021525546.tif 000055
配列番号５５  可変ドメインＤＮＡ
【化４３】
2021525546.tif 000056
【化４４】
2021525546.tif 000057
ＦＳ３０−１０−１６  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号４６  軽鎖ＡＡ
【化４５】
2021525546.tif 000058
配列番号４７  軽鎖ＤＮＡ
【化４６】
2021525546.tif 000059
配列番号４８  可変ドメインＡＡ
【化４７】
2021525546.tif 000060
配列番号４９  可変ドメインＤＮＡ
【化４８】
2021525546.tif 000061
【化４９】
2021525546.tif 000062
ＦＳ３０−３５−１４  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号５６  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化５０】
2021525546.tif 000063
配列番号５７  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化５１】
2021525546.tif 000064
配列番号５８  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化５２】
2021525546.tif 000065
配列番号５９  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化５３】
2021525546.tif 000066
配列番号６０  可変ドメインＡＡ
【化５４】
2021525546.tif 000067
配列番号６１  可変ドメインＤＮＡ
【化５５】
2021525546.tif 000068
配列番号６２  ＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）  ＧＦＴＦＳＡＹＮ
配列番号６３  ＣＤＲ１（ＡＡ）（Ｋａｂａｔ）  ＡＹＮＩＨ
配列番号６４  ＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）  ＩＳＰＹＧＧＡＴ
配列番号６５  ＣＤＲ２（ＡＡ）Ｋａｂａｔ）  ＤＩＳＰＹＧＧＡＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号６６  ＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）  ＡＲＮＬＹＥＬＳＡＹＳＹＧＡＤＹ
配列番号６７  ＣＤＲ３（ＡＡ）（Ｋａｂａｔ）  ＮＬＹＥＬＳＡＹＳＹＧＡＤＹ
ＦＳ３０−３５−１４  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号６８  軽鎖ＡＡ
【化５６】
2021525546.tif 000069
配列番号６９  軽鎖ＤＮＡ
【化５７】
2021525546.tif 000070
配列番号７０  可変ドメインＡＡ
【化５８】
2021525546.tif 000071
配列番号７１  可変ドメインＤＮＡ
【化５９】
2021525546.tif 000072
【化６０】
2021525546.tif 000073
【０３８９】
以下の配列において、重鎖配列可変ドメインが斜体で示され、該当する場合、ＬＡＬＡ突然変異の位置が、太字及び下線で示される。
【０３９０】
軽鎖配列において、可変ドメインが斜体で示される。
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５−３７  ｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列
配列番号７２  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化６１】
2021525546.tif 000074
配列番号７３  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化６２】
2021525546.tif 000075
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５−３７  ｍＡｂ２の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１３  軽鎖ＡＡ
【化６３】
2021525546.tif 000076
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３  ｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列
配列番号７４  重鎖（ＬＡＬＡを有さない）
【化６４】
2021525546.tif 000077
配列番号７５  重鎖（ＬＡＬＡを有する）
【化６５】
2021525546.tif 000078
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−３  ｍＡｂ２の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号４６  軽鎖
【化６６】
2021525546.tif 000079
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２  ｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列
配列番号７６  重鎖（ＬＡＬＡを有さない）
【化６７】
2021525546.tif 000080
配列番号７７  重鎖（ＬＡＬＡを有する）
【化６８】
2021525546.tif 000081
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１２  ｍＡｂ２の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号４６  軽鎖
【化６９】
2021525546.tif 000082
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６  ｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列
配列番号７８  重鎖（ＬＡＬＡを有さない）
【化７０】
2021525546.tif 000083
配列番号７９  重鎖（ＬＡＬＡを有する）
【化７１】
2021525546.tif 000084
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６  ｍＡｂ２の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号４６  軽鎖
【化７２】
2021525546.tif 000085
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５−１４  ｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列
配列番号８０  重鎖（ＬＡＬＡを有さない）
【化７３】
2021525546.tif 000086
配列番号８１  重鎖（ＬＡＬＡを有する）
【化７４】
2021525546.tif 000087
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５−１４  ｍＡｂ２の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号６８  軽鎖
【化７５】
2021525546.tif 000088
Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−５  ｍＡｂの重鎖のアミノ酸配列
配列番号８２  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化７６】
2021525546.tif 000089
Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−５  ｍＡｂの軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１３  軽鎖ＡＡ
【化７７】
2021525546.tif 000090
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５  ｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列
配列番号８３  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化７８】
2021525546.tif 000091
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−５  ｍＡｂ２）の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１３  軽鎖ＡＡ
【化７９】
2021525546.tif 000092
Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−６  ｍＡｂの重鎖のアミノ酸配列
配列番号８４  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化８０】
2021525546.tif 000093
Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−６  ｍＡｂの軽鎖のアミノ酸配列
配列番号８５  軽鎖ＡＡ
【化８１】
2021525546.tif 000094
Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−１０  ｍＡｂの重鎖のアミノ酸配列
配列番号８６  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化８２】
2021525546.tif 000095
Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−１０  ｍＡｂの軽鎖のアミノ酸配列
配列番号４６  軽鎖ＡＡ
【化８３】
2021525546.tif 000096
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０  ｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列
配列番号１０３  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化８４】
2021525546.tif 000097
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１０  ｍＡｂ２の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号４６  軽鎖ＡＡ
【化８５】
2021525546.tif 000098
Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−１５  ｍＡｂの重鎖のアミノ酸配列
配列番号８７  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化８６】
2021525546.tif 000099
Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−１５  ｍＡｂの軽鎖のアミノ酸配列
配列番号８８  軽鎖ＡＡ
【化８７】
2021525546.tif 000100
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１５  ｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列
配列番号８９  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化８８】
2021525546.tif 000101
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１５  ｍＡｂ２の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号８８  軽鎖ＡＡ
【化８９】
2021525546.tif 000102
Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−１６  ｍＡｂの重鎖のアミノ酸配列
配列番号９０  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化９０】
2021525546.tif 000103
Ｇ１ＡＡ／ＦＳ３０−１６  ｍＡｂの軽鎖のアミノ酸配列
配列番号９１  軽鎖ＡＡ
【化９１】
2021525546.tif 000104
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１６  ｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列
配列番号９２  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化９２】
2021525546.tif 000105
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−１６  ｍＡｂ２の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号９１  軽鎖ＡＡ
【化９３】
2021525546.tif 000106
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５  ｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列
配列番号９３  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化９４】
2021525546.tif 000107
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＦＳ３０−３５  ｍＡｂ２の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号６８  軽鎖ＡＡ
【化９５】
2021525546.tif 000108
Ｇ１ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３  ｍＡｂの重鎖のアミノ酸配列
配列番号９４  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化９６】
2021525546.tif 000109
Ｇ１ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３  ｍＡｂの軽鎖のアミノ酸配列
配列番号９５  軽鎖ＡＡ
【化９７】
2021525546.tif 000110
Ｇ１／４４２０  ｍＡｂの重鎖のアミノ酸配列
配列番号９６  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化９８】
2021525546.tif 000111
Ｇ１／４４２０  ｍＡｂの軽鎖のアミノ酸配列
配列番号９７  軽鎖ＡＡ
【化９９】
2021525546.tif 000112
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０  ｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列
配列番号９８  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１００】
2021525546.tif 000113
ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０  ｍＡｂ２の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号９７  軽鎖ＡＡ
【化１０１】
2021525546.tif 000114
Ｇ１／ＭＯＲ７４８０．１及びＧ１ＡＡ／ＭＯＲ７４８０．１  ｍＡｂ
配列番号９９  重鎖（ＬＡＬＡを有さない）
【化１０２】
2021525546.tif 000115
配列番号１００  重鎖（ＬＡＬＡを有する）
【化１０３】
2021525546.tif 000116
配列番号１０１  軽鎖
【化１０４】
2021525546.tif 000117
Ｇ２／ＭＯＲ７４８０．１  ｍＡｂ
配列番号１０２  重鎖
【化１０５】
2021525546.tif 000118
配列番号１０１  軽鎖
【化１０６】
2021525546.tif 000119
Ｇ１／２０Ｈ４．９及びＧ１ＡＡ／２０Ｈ４．９  ｍＡｂ
配列番号１０４  重鎖（ＬＡＬＡを有さない）
【化１０７】
2021525546.tif 000120
配列番号１０５  重鎖（ＬＡＬＡを有する）
【化１０８】
2021525546.tif 000121
配列番号１０６  軽鎖
【化１０９】
2021525546.tif 000122
ＣＨ２ドメイン
配列番号１０７  ＬＡＬＡを有する
【化１１０】
2021525546.tif 000123
配列番号１０８  ＬＡＬＡ  ＰＡを有する
【化１１１】
2021525546.tif 000124
ＣＨ３ドメイン
配列番号１０９
【化１１２】
2021525546.tif 000125
Ｇ１／１１Ｄ４  ｍＡｂ
配列番号１１０  重鎖（ＬＡＬＡを有さない）
【化１１３】
2021525546.tif 000126
配列番号１１１  軽鎖
【化１１４】
2021525546.tif 000127
ＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ及びＣＤ１３７−Ａｖｉ−Ｈｉｓ
配列番号１１２  ヒト
【化１１５】
2021525546.tif 000128
配列番号１１３  カニクイザル
【化１１６】
2021525546.tif 000129
配列番号１１４  マウス
【化１１７】
2021525546.tif 000130
ｍＦｃ−Ａｖｉ
配列番号１１５
マウスＦｃドメイン（斜体）
Ａｖｉタグ（太字）
【化１１８】
2021525546.tif 000131
ＯＸ４０−ｍＦｃ
配列番号１１６
【化１１９】
2021525546.tif 000132
ＧＩＴＲ−ｈＦｃ−Ａｖｉ
配列番号１１７
【化１２０】
2021525546.tif 000133
ＣＤ４０−ｍＦｃ
配列番号１１８
【化１２１】
2021525546.tif 000134
ＣＤ１３７細胞で発現される抗原
細胞外ドメイン（斜体）
膜貫通及び細胞内ドメイン（太字）
配列番号１１９  ヒト
【化１２２】
2021525546.tif 000135
配列番号１２０  カニクイザル
【化１２３】
2021525546.tif 000136
【０３９１】
参照文献
本明細書において言及される全ての文献は、全体が参照により本明細書に援用される。
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【図１】
2021525546.tif 000137
【図２−１】
2021525546.tif 000138
【図２−２】
2021525546.tif 000139
【図３】
2021525546.tif 000140
【配列表】
2021525546000001.app
【国際調査報告】
2021525546.tif 000141
2021525546.tif 000142
2021525546.tif 000143