(57)【要約】  鎌状赤血球性潰瘍の処置の為の経皮パッチが提供される。パッチはＤＦＯ等の鉄キレート剤の送達を促し得る。真皮内への透過及び真皮に依る吸収を向上させる為に、ＤＦＯは逆ミセル中に封入され得る。パッチは治癒を加速させる為に及び鎌状赤血球性潰瘍に関連する疼痛を縮減する為に用いられ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法が：
潰瘍及び周囲の皮膚を、マトリックス中の非イオン性界面活性剤に依る逆ミセル中に封入されたデフェロキサミン（ＤＦＯ）を含むフィルムを含む皮内パッチと接触させる事と；
封入されたＤＦＯを処置期間に渡ってマトリックスから放出する事と；
ＤＦＯを潰瘍及び周囲の皮膚内に透過させる事と、
を含む、
鉄毒性及びフリーラジカルダメージに依って引き起こされる皮膚潰瘍を処置する為の方法。
【請求項２】
皮膚潰瘍が鎌状赤血球性潰瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
皮膚潰瘍が静脈性下腿潰瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
患者が其れ等を潰瘍形成について易発性にする血液異常又は疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
マトリックスがポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）及びエチルセルロースを含む、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
フィルムがＤＦＯをフィルムの重量／重量パーセントとして少なくとも約１％から且つ約２０％以下の濃度で含む、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
フィルムがＤＦＯを約１〜２ｍｇ／ｃｍ２の濃度で含む、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
パッチが約６０〜１７５ｍｍの長さを含む、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
パッチが約７５〜４００ｍｍの幅を含む、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
方法が：
潰瘍及び周囲の皮膚を鉄キレート剤を含む経皮パッチと接触させる事と；
鉄キレート剤の一部ずつを処置期間に渡って経皮パッチから放出する事と；
鉄キレート剤を潰瘍及び周囲の皮膚内に透過させる事と、
を含む、
鉄毒性及びフリーラジカルダメージに依って引き起こされる皮膚潰瘍を処置する為の方法。
【請求項１１】
鉄キレート剤がＤＦＯを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
鉄キレート剤が皮膚の角質層の層の透過を向上させる様に適合される、請求項１０又は１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
鉄キレート剤が持続的な様式で真皮内に放出される様に適合される、請求項１０〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
鉄キレート剤が逆ミセル中に封入される、請求項１０〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
皮膚潰瘍が鎌状赤血球性潰瘍である、請求項１０〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
皮膚潰瘍が静脈性下腿潰瘍である、請求項１０〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
皮膚潰瘍が、其れ等を皮膚潰瘍について易発性にする血液異常又は希少疾患を有する患者に在る、請求項１０〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
鎌状赤血球性潰瘍の局所的処置への使用の為に調製されるデフェロキサミン（ＤＦＯ）。
【請求項１９】
ＤＦＯが逆ミセル中に封入される、請求項１８に記載の調製。
【請求項２０】
ＤＦＯが経皮パッチ内に含有される、請求項１８又は１９の何れか１項に記載の調製。
【請求項２１】
ＤＦＯが皮膚潰瘍及び周囲の皮膚への放出及び透過の為に調製される、鉄毒性及びフリーラジカルダメージに依って引き起こされる皮膚潰瘍の処置への使用の為のデフェロキサミン（ＤＦＯ）。
【請求項２２】
ＤＦＯが逆ミセル中に封入される、請求項２１に記載の調製。
【請求項２３】
ＤＦＯが経皮パッチ内に含有される、請求項２１又は２２の何れか１項に記載の調製。
【請求項２４】
パッチが、マトリックス中の非イオン性界面活性剤に依る逆ミセル中に封入されたデフェロキサミン（ＤＦＯ）を含むフィルムを含む、請求項２１〜２３の何れか１項に記載の調製。
【請求項２５】
ＤＦＯの濃度が約１〜２ｍｇ／ｃｍ２である、請求項２１〜２４の何れか１項に記載の調製。
【請求項２６】
ＤＦＯの濃度がフィルムの重量／重量パーセントとして少なくとも約１％から且つ約２０％以下である、請求項２１〜２５の何れか１項に記載の調製。
【請求項２７】
パッチの長さが約６０〜１７５ｍｍである、請求項２１〜２６の何れか１項に記載の調製。
【請求項２８】
パッチの幅が約７５〜４００ｍｍである、請求項２１〜２７の何れか１項に記載の調製。
【請求項２９】
方法が：
潰瘍及び周囲の皮膚を、マトリックス中の非イオン性界面活性剤に依る逆ミセル中に封入されたデフェロキサミン（ＤＦＯ）を含むフィルムを含む皮内パッチと接触させる事と；
封入されたＤＦＯを処置期間に渡ってマトリックスから放出する事と；
ＤＦＯを潰瘍及び周囲の皮膚内に透過させる事と、
を含む、
鉄毒性及びフリーラジカルダメージに依って引き起こされる皮膚潰瘍に関連する（associate）疼痛を縮減する為の方法。
【請求項３０】
皮膚潰瘍が鎌状赤血球性潰瘍である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
皮膚潰瘍が静脈性下腿潰瘍である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
皮膚潰瘍が、其れ等を皮膚潰瘍について易発性にする血液異常又は希少疾患を有する患者に在る、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
マトリックスがポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）及びエチルセルロースを含む、請求項２９〜３２の何れか１項に記載の方法。
【請求項３４】
フィルムがＤＦＯをフィルムの重量／重量パーセントとして少なくとも約１％から且つ約２０％以下の濃度で含む、請求項２９〜３３の何れか１項に記載の方法。
【請求項３５】
フィルムがＤＦＯを約１〜２ｍｇ／ｃｍ２の濃度で含む、請求項２９〜３４の何れか１項に記載の方法。
【請求項３６】
パッチが約６０〜１７５ｍｍの長さを含む、請求項２９〜３５の何れか１項に記載の方法。
【請求項３７】
パッチが約７５〜４００ｍｍの幅を含む、請求項２９〜３６の何れか１項に記載の方法。
【請求項３８】
方法が：
潰瘍及び周囲の皮膚を鉄キレート剤を含む経皮パッチと接触させる事と；
鉄キレート剤の一部ずつを処置期間に渡って経皮パッチから放出する事と；
鉄キレート剤を潰瘍及び周囲の皮膚内に透過させる事と、
を含む、
鉄毒性及びフリーラジカルダメージに依って引き起こされる皮膚潰瘍に関連する疼痛を縮減する為の方法。
【請求項３９】
鉄キレート剤がＤＦＯを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
鉄キレート剤が皮膚の角質層の層の透過を向上させる様に適合される、請求項３８又は３９の何れか１項に記載の方法。
【請求項４１】
鉄キレート剤が持続的な様式で真皮内に放出される様に適合される、請求項３８〜４０の何れか１項に記載の方法。
【請求項４２】
鉄キレート剤が逆ミセル中に封入される、請求項３８〜４１の何れか１項に記載の方法。
【請求項４３】
皮膚潰瘍が鎌状赤血球性潰瘍である、請求項３８〜４２の何れか１項に記載の方法。
【請求項４４】
皮膚潰瘍が静脈性下腿潰瘍である、請求項３８〜４２の何れか１項に記載の方法。
【請求項４５】
皮膚潰瘍が、其れ等を皮膚潰瘍について易発性にする血液異常又は希少疾患を有する患者に在る、請求項３９〜４２の何れか１項に記載の方法。
【請求項４６】
局所投与に依る鎌状赤血球性潰瘍に関連する疼痛の縮減への使用の為に調製されるデフェロキサミン（ＤＦＯ）。
【請求項４７】
ＤＦＯが逆ミセル中に封入される、請求項４６に記載の調製。
【請求項４８】
ＤＦＯが経皮パッチ内に含有される、請求項４６又は４７の何れか１項に記載の調製。
【請求項４９】
ＤＦＯが皮膚潰瘍及び周囲の皮膚への放出及び透過の為に調製される、鉄毒性及びフリーラジカルダメージに依って引き起こされる皮膚潰瘍に関連する疼痛の縮減への使用の為のデフェロキサミン（ＤＦＯ）。
【請求項５０】
ＤＦＯが逆ミセル中に封入される、請求項４９に記載の調製。
【請求項５１】
ＤＦＯが経皮パッチ内に含有される、請求項４９又は５０の何れか１項に記載の調製。
【請求項５２】
パッチが、マトリックス中の非イオン性界面活性剤に依る逆ミセル中に封入されたデフェロキサミン（ＤＦＯ）を含むフィルムを含む、請求項４９〜５１の何れか１項に記載の調製。
【請求項５３】
ＤＦＯの濃度が約１〜２ｍｇ／ｃｍ２である、請求項４９〜５２の何れか１項に記載の調製。
【請求項５４】
ＤＦＯの濃度がフィルムの重量／重量パーセントとして少なくとも約１％から且つ約２０％以下である、請求項４９〜５２の何れか１項に記載の調製。
【請求項５５】
パッチの長さが約６０〜１７５ｍｍである、請求項４９〜５４の何れか１項に記載の調製。
【請求項５６】
パッチの幅が約７５〜４００ｍｍである、請求項４９〜５５の何れか１項に記載の調製。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
此の発明は、慢性創傷を予防及び処置する為の鉄キレート剤の外用及び経皮送達に関する。
【０００２】
参照に依る組み込み
本明細書に於いて挙げられる全ての公開及び特許出願は、各個々の公開又は特許出願が参照に因って組み込まれる事を具体的に且つ個々に指示される場合と同じ程度に其れ等の全体が参照に依って本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
難治性の慢性創傷は患者、ヘルスケア従事者、及びヘルスケアシステムに取って課題である。其れ等は何百万人ものクオリティ・オブ・ライフを有意に障害し、失われる生産性及びヘルスケア費用の観点から社会に重荷を課す。
【０００４】
創傷治癒は最適に組織インテグリティ及び機能の回復に至るダイナミックな経路である。慢性創傷は正常な修復プロセスが中断される時に齎される。創傷治癒の生物学を理解する事に依って、医師は創傷が存在する組織環境を最適化し得る。創傷治癒は、凝固、炎症、礎質及びマトリックス合成、血管新生、線維増殖、上皮化、創傷収縮、並びにリモデリングを包含するプロセスの蓄積の結果である。
【０００５】
慢性創傷では、プロセスは遮断され、其れ故に治癒は遷延し且つ不完全である。何らかの因子が正常なコントロールされた炎症期又は細胞増殖期の遮断を引き起こす時には、慢性創傷が起こる。其れ故に、如何なる因子が存在しているか及び如何にして問題を直すかを決定する為に、各創傷は評価されるべきである。
【０００６】
創傷を有する患者に於ける基礎全身疾患は、創傷が慢性に成るであろう確率を増大させ得る。糖尿病は１つの例である。多くの場合に、創傷治癒は炎症及び増殖期の中断故に遅延する。好中球及びマクロファージは充分には創傷の細菌負荷をコントロール下に保ち得ず、感染が炎症期を遷延させる。エリスロサイトはグリコシル化に依って影響され得、微小血管スラッジング及び虚血に至る。低い組織酸素分圧は細胞増殖及びコラーゲン合成を障害する。
【０００７】
普通の慢性の皮膚及び軟部組織の創傷は糖尿病性足潰瘍、圧迫性潰瘍、静脈性下腿潰瘍、及び鎌状赤血球性潰瘍を包含する。此れ等の慢性創傷の夫々は共通の症状（例えば、真皮及び表皮の開放創）を有するが、夫々は異なる病因学を有し、人は、１つの型の慢性皮膚潰瘍を処置する為に有効な治療が他の型を処置する為に有効であろうとは必ずしも予期しないであろう。
【０００８】
糖尿病性潰瘍は足及び脚切断の普通の原因である。Ｉ型及びＩＩ型糖尿病を有する患者では、足潰瘍を発生する罹患率は年当たり凡そ２％である。糖尿病性足潰瘍の発病機序は特有であり、皮膚中に増加する高レベルの血糖に依って開始され、糖尿病が進行すると末梢ニューロパチーの発症に至る。高レベルの血糖は、繰り返しの圧迫傷害を有する領域（通常は、足の裏の様な体重を支える表面）に於ける低酸素状態に対する正常な血管新生応答（低酸素誘導因子アルファＨＩＦ−１α）に干渉し、此れ等の領域を遷延した虚血状態からの崩壊について易発性にする。ニューロパチーが進行すると、此れ等の虚血領域（単数又は複数）に関連する痛覚は失われ、潰瘍が気付かれずに且つ野放しに形成する事を許す。炎症及び上昇したレベルの活性酸素種（ＲＯＳ）が潰瘍形成に付随し、鈍った白血球応答が感染の蓋然性を増大させる。
【０００９】
不良な低酸素応答（ＨＩＦ１−α）を原因として、高血糖は糖尿病患者を潰瘍について易発性にするが、老齢の組織に於けるＨＩＦ１−αの自然減少、及び低酸素応答の効率の減少は、高齢者を圧迫性潰瘍について自然により易発性にする。圧迫性潰瘍は、虚血に至る骨突出に対する遷延した緩和されない圧迫の結果である。体重を逃す為に体位変換する事が出来ない患者、例えば麻痺した、意識不明の、又は非常に衰弱した者では、プロリルヒドロキシラーゼドメイン（ＰＨＤ）及び低酸素誘導因子阻害因子（ＦＩＨ）酵素の上方制御故に、創傷はＨＩＦ−１アルファレベルが低い年配の患者に於いて起こりがちである。
【００１０】
鎌状赤血球性潰瘍（ＳＣＵ）は鎌状赤血球症（ＳＣＤ）を有する患者を冒す激甚な併存症である。ＳＣＤは異常なヘモグロビン及び鎌状形状のエリスロサイトを作り出すヘモグロビン遺伝子の変異から齎される。其れ等の形状とフレキシビリティの欠如とは鎌状エリスロサイトを正常な血流に取ってより不都合にし、破裂、小血管の機械的閉塞、反復的な局所的虚血事象、及びＳＣＵの形成を齎す。鎌状赤血球エリスロサイトは異常なレベルの膜結合鉄及び過度のスーパーオキシド産生をもまた呈示する。更に其の上、慢性溶血は血漿中及び組織中のヘムの蓄積に至り、フェントン反応並びに好中球及び単球由来の酸化バースト両方からの増大した活性酸素種（ＲＯＳ）を齎す。増大したＲＯＳは組織フリーラジカル防御メカニズムに至り、ＤＮＡダメージ、過度の炎症、及び慢性の潰瘍化を生む。此れ等の患者に於いては、過度の疼痛を齎す微小血管閉塞もまた有る。
【００１１】
疾患を有する患者は１０歳よりも後にＳＣＵを現し始める。ＳＣＵの病理生物学は多因子的であり、血管症及び慢性炎症等の局所的及び全身的機能障害両方が関わり、其れは他の慢性皮膚潰瘍の病理生物学とは異なる。図１のＳＣＵ形成フローチャートに記載されている通り、鎌状赤血球（ｓＲＢＣ）は正常な赤血球（ＲＢＣ）よりも脆く、破裂をし易く、血行中へのヘモグロビンの遊離した放出を引き起こす。遊離ヘモグロビンは沈殿し、其れが血管拡張因子一酸化窒素（ＮＯ）に結合する事を引き起こす。主要な血管拡張因子の損失はｓＲＢＣの更なる隔離を促し、微小血管閉塞及び激しい痛みに至る。破裂するｓＲＢＣは炎症、増大した活性酸素種（ＲＯＳ）、及び局所的虚血をもまた引き起こし、潰瘍化への進行を有する。ＳＣＵは下肢の内又は外果上に形成し、感染及び常習性の傾向が有る。幾つかのＳＣＵは何時迄も治癒し得ず、疼痛、変形、及び切断に至る。
【００１２】
ＳＣＵを処置する為の如何なる標準化されたプロトコールも無い。現行では、ＳＣＵは他の慢性創傷の様に処置される。肉芽形成が起こる事を許す為の作業では、死んだ及び感染した組織を除去する為に、外科的デブリードマンが行われる。湿った創傷表面を維持し乍ら過剰な滲出液を吸収する為に働くドレッシングが適用される。然し乍ら、創傷ケアはかなり労働集約的であり、毎週の基準で多数の繰り返しの通院を要求する。此れ等の作業にも関わらず、ＳＣＵは治癒する事が遅く、仮に其れ等が治癒する場合でも、其れ等は再発の傾向が有る。上に記載されている全身的及び局所的機能障害を原因として、創傷部位に於いては肉芽形成が阻害され、治癒は遅延する。明白な化膿、蜂巣炎、又は骨髄炎を有する創傷については抗生物質もまた考えられ得るが、ＳＣＵの為の全身的又は局所的抗生物質治療の何方かを支持するデータは少ししか無い。
【００１３】
鉄過多はＳＣＤ患者に於いては普通に発生する。患者は鎌状エリスロサイトを交換する為の繰り返しの輸血を受け、此れは最も重篤には心臓及び肝臓に於いて遊離鉄蓄積及び臓器損傷に至る。ｓＲＢＣの破壊及び繰り返しの輸血は、血中の過度の量の遊離鉄に至り得る。全身送達されるデフェロキサミン（ＤＦＯ）は米国に於いては１９６８年からＳＣＤ患者の鉄過多を処置する為に認可されている。其れ等の血液から過度の鉄をキレートする為に、ＳＣＤ患者はＤＦＯを投与され、携帯型輸液ポンプの使用に依って８〜２４時間に渡って皮下的に（２０〜４０ｍｇ／ｋｇ／日を超過するべきではない）、８〜１２時間に渡って静脈内に（児童では２０〜４０ｍｇ／ｋｇ／日、成人では４０〜５０ｍｇ／ｋｇ／日）、又は１０００ｍｇの毎日のドーズを超過せずに筋肉内に、何方かで送達される。ＤＦＯは第二鉄に対する最大の親和性を維持し、キレート後に、例外的に安定な六座配位子のフェリオキサミンを形成する。然し乍ら、ＤＦＯの非経口投与はＳＣＵの発生率、重症度、又は持続性を逓減させる事を助けていない。
【００１４】
ＤＦＯはＳＣＵ以外の状態を処置する為にもまた経皮的に適用されている。例えば、特許文献１は関節炎を処置する為のＤＦＯの経皮適用を記載しているが、其れは何れかの経皮送達デバイス又は何れかの特定の経皮送達方法の使用を記載していない。
【００１５】
特許文献２は過剰な鉄を創傷の細胞外液から外へとトラップする事に依って創傷治癒を促進する為の創傷被覆材へのＤＦＯの使用を記載している。然し乍ら、ＤＦＯは創傷被覆材料に共有結合され、創傷中の又は創傷の周りの組織内には送達されない。其の結果、創傷被覆材が除去される時には、何れかのトラップされた鉄が創傷から除去され得る。特許文献２は、ＤＦＯが組織内に及び組織中を透過し其れに依って其れを創傷からの鉄の除去に取って理想的な「トラッパー分子」にする事が、如何に困難かをもまた指摘している。此れ等の方法では、鉄は創傷の滲出液又は表面からのみキレートされる。ＤＦＯは皮膚よりも下には透過しない。
【００１６】
特許文献３及び特許文献４は、糖尿病性足潰瘍等の糖尿病性潰瘍を処置する為に、種々の形態の活性酸素種阻害剤（例えばＤＦＯ）の投与（例えば、経口的に、非経口的に、経皮的に、皮下的に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、膀胱内（intraversal）注入に依って、眼内に（intracularly）、鼻腔内に、動脈内に、及び病巣内に）を記載している。然し乍ら、此れ等の特許は何れかの経皮送達デバイス又は経皮送達方法を記載せず、其れ等はＳＣＵの処置にも対処していない。
【００１７】
特許文献５は、ＤＦＯ等の低酸素誘導因子ＨＩＦ−１α増強薬剤の活性を増大させる薬剤の経皮送達に依る慢性創傷（圧迫性潰瘍及び糖尿病性潰瘍を包含するが、ＳＣＵは包含しない）の処置の為の組成物及び方法を記載しており、ハイドロゲル又は生分解性ポリマー中にＤＦＯを有する経皮パッチを用いている。特許文献６は、皮膚内への送達を向上させる為に、放出制御ポリマーマトリックス（例えばエチルセルロース）中に分散されたＤＦＯを非イオン性界面活性剤及びポリマー中に封入する事に依るＤＦＯの経皮送達を記載している（逆ミセル封入）。此れ等の公開は創傷のＨＩＦ−１α活性を増大させる為のＤＦＯ及び他のＨＩＦ−１α調節剤の使用を記載している。此れ等の公開は糖尿病マウスの皮膚の圧迫性潰瘍を処置する為のＤＦＯの使用を記載しているが、其れ等は、ＳＣＵを処置する為に皮膚表面に適用された送達デバイスから真皮内に送達されるＤＦＯの使用には対処していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第４，３９７，８６７号
【特許文献２】米国特許第６，１５６，３３４号
【特許文献３】米国特許第８，８２９，０５１号
【特許文献４】米国特許第９，７３７，５１１号
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１０／００９２５４６号
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１４／０３７００７８号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
第１の態様では、鉄毒性及びフリーラジカルダメージに依って引き起こされる皮膚潰瘍を処置する為の方法が提供される。方法は、潰瘍及び周囲の皮膚を、マトリックス中の非イオン性界面活性剤に依る逆ミセル中に封入されたデフェロキサミン（ＤＦＯ）を含むフィルムを含む皮内パッチと接触させる事と；封入されたＤＦＯを処置期間に渡ってマトリックスから放出する事と；ＤＦＯを潰瘍及び周囲の皮膚内に透過させる事とを含む。
【００２０】
幾つかの実施形態では、皮膚潰瘍は鎌状赤血球性潰瘍である。皮膚潰瘍は静脈性下腿潰瘍であり得る。幾つかの実施形態では、患者は其れ等を潰瘍形成について易発性にする血液異常又は疾患を有する。マトリックスはポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）及びエチルセルロースを含み得る。幾つかの実施形態では、フィルムはＤＦＯをフィルムの重量／重量パーセントとして少なくとも約１％から且つ約２０％以下の濃度で含む。フィルムはＤＦＯを約１〜２ｍｇ／ｃｍ２の濃度で含み得る。幾つかの実施形態では、パッチは約６０〜１７５ｍｍの長さを含む。パッチは約７５〜４００ｍｍの幅を含み得る。
【００２１】
別の態様では、鉄毒性及びフリーラジカルダメージに依って引き起こされる皮膚潰瘍を処置する為の方法が提供される。方法は、潰瘍及び周囲の皮膚を鉄キレート剤を含む経皮パッチと接触させる事と；鉄キレート剤の一部ずつを処置期間に渡って経皮パッチから放出する事と；鉄キレート剤を潰瘍及び周囲の皮膚内に透過させる事とを含む。
【００２２】
幾つかの実施形態では、鉄キレート剤はＤＦＯを含む。鉄キレート剤は、皮膚の角質層の層の透過を向上させるか及び／又は持続的な様式で真皮内に放出される様に適合され得る。幾つかの実施形態では、鉄キレート剤は逆ミセル中に封入される。皮膚潰瘍は鎌状赤血球性潰瘍であり得る。幾つかの実施形態では、皮膚潰瘍は静脈性下腿潰瘍である。皮膚潰瘍は、其れ等を皮膚潰瘍について易発性にする血液異常又は希少疾患を有する患者に在り得る。
【００２３】
別の態様では、鎌状赤血球性潰瘍の局所的処置への使用の為のデフェロキサミン（ＤＦＯ）が提供される。
【００２４】
ＤＦＯは逆ミセル中に封入され得る。幾つかの実施形態では、ＤＦＯは経皮パッチ内に含有される。
【００２５】
尚別の態様では、鉄毒性及びフリーラジカルダメージに依って引き起こされる皮膚潰瘍の処置への使用の為のデフェロキサミン（ＤＦＯ）が提供される。ＤＦＯは皮膚潰瘍及び周囲の皮膚への放出及び透過の為に調製される。
【００２６】
幾つかの実施形態では、ＤＦＯは逆ミセル中に封入される。ＤＦＯは経皮パッチ内に含有され得る。幾つかの実施形態では、パッチは、マトリックス中の非イオン性界面活性剤に依る逆ミセル中に封入されたデフェロキサミン（ＤＦＯ）を含むフィルムを含む。ＤＦＯの濃度は約１〜２ｍｇ／ｃｍ２である。幾つかの実施形態では、ＤＦＯの濃度はフィルムの重量／重量パーセントとして少なくとも約１％から且つ約２０％以下である。パッチの長さは約６０〜１７５ｍｍであり得る。パッチの幅は約７５〜４００ｍｍであり得る。
【００２７】
別の態様では、鉄毒性及びフリーラジカルダメージに依って引き起こされる皮膚潰瘍に関連する（associate）疼痛を縮減する為の方法が提供される。方法は、潰瘍及び周囲の皮膚を、マトリックス中の非イオン性界面活性剤に依る逆ミセル中に封入されたデフェロキサミン（ＤＦＯ）を含むフィルムを含む皮内パッチと接触させる事と；封入されたＤＦＯを処置期間に渡ってマトリックスから放出する事と；ＤＦＯを潰瘍及び周囲の皮膚内に透過させる事とを含む。
【００２８】
皮膚潰瘍は鎌状赤血球性潰瘍であり得る。幾つかの実施形態では、皮膚潰瘍は静脈性下腿潰瘍である。幾つかの実施形態では、皮膚潰瘍は、其れ等を皮膚潰瘍について易発性にする血液異常又は希少疾患を有する患者に在る。マトリックスはポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）及びエチルセルロースを含み得る。幾つかの実施形態では、フィルムはＤＦＯをフィルムの重量／重量パーセントとして少なくとも約１％から且つ約２０％以下の濃度で含む。フィルムはＤＦＯを約１〜２ｍｇ／ｃｍ２の濃度で含み得る。幾つかの実施形態では、パッチは約６０〜１７５ｍｍの長さを含み得る。パッチは約７５〜４００ｍｍの幅を含み得る。
【００２９】
別の態様では、鉄毒性及びフリーラジカルダメージに依って引き起こされる皮膚潰瘍に関連する疼痛を縮減する為の方法が提供される。方法は、潰瘍及び周囲の皮膚を鉄キレート剤を含む経皮パッチと接触させる事と；鉄キレート剤の一部ずつを処置期間に渡って経皮パッチから放出する事と；鉄キレート剤を潰瘍及び周囲の皮膚内に透過させる事とを含む。
【００３０】
鉄キレート剤はＤＦＯを含み得る。幾つかの実施形態では、鉄キレート剤は皮膚の角質層の層の透過を向上させる様に適合される。鉄キレート剤は持続的な様式で真皮内に放出される様に適合され得る。幾つかの実施形態では、鉄キレート剤は逆ミセル中に封入される。皮膚潰瘍は鎌状赤血球性潰瘍であり得る。皮膚潰瘍は静脈性下腿潰瘍であり得る。幾つかの実施形態では、皮膚潰瘍は、其れ等を皮膚潰瘍について易発性にする血液異常又は希少疾患を有する患者に在る。
【００３１】
別の態様では、局所投与に依る鎌状赤血球性潰瘍に関連する疼痛の縮減への使用の為に調製されたデフェロキサミン（ＤＦＯ）が提供される。
【００３２】
ＤＦＯは逆ミセル中に封入され得る。幾つかの実施形態では、ＤＦＯは経皮パッチ内に含有される。
【００３３】
別の態様では、鉄毒性及びフリーラジカルダメージに依って引き起こされる皮膚潰瘍に関連する疼痛の縮減への使用の為のデフェロキサミン（ＤＦＯ）が提供される。ＤＦＯは皮膚潰瘍及び周囲の皮膚への放出及び透過の為に調製される。
【００３４】
幾つかの実施形態では、ＤＦＯは逆ミセル中に封入される。ＤＦＯは経皮パッチ内に含有され得る。幾つかの実施形態では、パッチは、マトリックス中の非イオン性界面活性剤に依る逆ミセル中に封入されたデフェロキサミン（ＤＦＯ）を含むフィルムを含む。ＤＦＯの濃度は約１〜２ｍｇ／ｃｍ２であり得る。幾つかの実施形態では、ＤＦＯの濃度はフィルムの重量／重量パーセントとして少なくとも約１％から且つ約２０％以下である。パッチの長さは約６０〜１７５ｍｍであり得る。パッチの幅は約７５〜４００ｍｍであり得る。
【００３５】
本発明の新規の特徴は次の請求項に於いて特定して提出される。本発明の特徴及び利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を提出する次の詳細な記載、及び付随する図面の参照に依って得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１はＳＣＵ形成を概観するフローチャートである。
【図２】図２は、本明細書に記載される通り、ＳＣＵ形成に対するＤＦＯの皮内送達の効果を実証するフローチャートである。
【図３Ａ】乃至
【図３Ｄ】図３ＡはＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウスの作出の図を示している。図３Ｂ〜３ＤはＤＩＤＰに依って処置されたマウス及び無処置のマウスの創傷治癒を実証している。
【図４Ａ】乃至
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、ＤＩＤＰに依って処置されたマウス及びＤＦＯ溶液が其れ等の創傷に毎日注射されたマウスの創傷治癒を実証している。
【図５Ａ】乃至
【図５Ｂ】図５ＡはＤＩＤＰ処置されたマウス、無処置のマウス、及びＤＦＯ注射処置されたマウスに於けるコラーゲン堆積を示している。図５ＢはＤＩＤＰ処置されたマウス、無処置のマウス、及びＤＦＯ注射処置されたマウスに於ける真皮厚さを示している。
【図６Ａ】乃至
【図６Ｄ】図６Ａ及び６ＢはＤＩＤＰ処置されたマウス、無処置のマウス、及びＤＦＯ注射処置されたマウスに於ける鉄の存在を示している。図６Ｃ及び６Ｄはデフェロキサミン及びフェリオキサミン（ferroxamine）の分子組成を示している。
【図７Ａ】乃至
【図７Ｆ】図７Ａ〜７ＦはＳＣＵに対する皮内鉄キレート剤の適用の模式図を示している。
【図８】図８は垂直フランツ拡散セルを図示している。
【図９Ａ】乃至
【図９Ｄ】図９Ａは皮内送達デバイスの実施形態からのＤＦＯの放出を示している。図９Ｂは、皮内送達デバイスの実施形態を用いる、及びＤＦＯを包含する水溶液を滴下する事に依る相対的なＤＦＯ濃度を図示している。図９Ｃは真皮の細胞内鉄凝集塊を示している。図９Ｄは皮内送達デバイスの実施形態に依って送達されたＤＦＯの真皮透過を図示している。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明の１つの態様は、ＤＦＯ等の鉄キレート剤を遅い且つ持続的な速度で局所的に創傷に送達する事に依ってＳＣＵを処置する方法を提供する。下に記載されている通り、本発明を実施する為の１つのやり方は、外用パッチ（例えば、デフェロキサミン皮内送達パッチ又はＤＩＤＰ）から鉄キレート剤を送達する事であり、此れは、キレート剤が組織を透過する事を可能にする様式で、且つ長い時間期間に渡ってキレート剤を提供する。此の局所送達は創傷の周りの鉄をキレートし、鉄に依って生ずるフリーラジカルと其れ等の関連する酸化ストレスとを縮減し、炎症を縮減し、血流を縮減する血管攣縮メカニズムを安定化する。ＤＦＯ等の鉄キレート剤は、血管新生に必要な転写因子の分解を触媒するヒドロキシラーゼを阻害する事に依って、酸素依存的経路が機能する事を許す。図２のフローチャートに示されている通り、一旦酸素依存的経路が回復すると、創傷への新生血管性の灌流が確立され得る。
【００３８】
本発明の別の態様は、鉄毒性及び結果的なフリーラジカルダメージに依って引き起こされる潰瘍、例えば鎌状赤血球性潰瘍及び静脈性下腿潰瘍を処置する方法を提供する。此の方法に従うと、鉄キレート剤（例えばＤＦＯだが、此れに限定されない）が潰瘍及び周囲の皮膚に外用的に適用される。ＤＦＯ又は他の鉄キレート剤は、潰瘍及び周囲の健康な組織内に且つ皮膚の角質層から真皮内に透過する其の能力を向上させる様式で調製され得る。ＤＦＯ又は他の鉄キレート剤は経皮又は皮内パッチから適用され得る。ＤＦＯ又は他の鉄キレート剤は処置期間に渡って潰瘍及び周囲の皮膚に適用され得る。上に記載されている通り、全身送達されるＤＦＯは鎌状赤血球患者の鉄過多を処置する為にＦＤＡ認可されている。典型的には、薬物は、携帯型輸液ポンプの使用に依って８〜２４時間に渡って皮下的に（２０〜４０ｍｇ／ｋｇ／日を超過するべきではない）、８〜１２時間に渡って静脈内に（児童では２０〜４０ｍｇ／ｋｇ／日、成人では４０〜５０ｍｇ／ｋｇ／日）、又は１０００ｍｇの毎日のドーズを超過せずに筋肉内に、何方かで送達される（ヴィシンスキー（Vichinsky）等著，２００６年）。此れ等のドーズ限度内に於いて処置される時の成人又は小児患者に於いて、毒性の如何なる証拠も無い。
【００３９】
ＤＦＯ等の鉄キレート剤の全身投与は鎌状赤血球患者の鉄過多を処置する為に用いられるが、ＳＣＵ等のＳＣＤに関連する特有の付随的な治癒課題に対処する為には用いられない。ＤＦＯ等の鉄キレート剤の非経口投与もまた、ＳＣＵ等のＳＣＤに関連する特有の付随的な治癒課題に対処する事を助ける事は示されていない。
【００４０】
其れにも関わらず、ＳＣＵの標的化した鉄キレートは治癒を改善するであろうと言う仮説が立てられた。ＤＦＯ等の鉄キレート剤のより創傷を標的化した適用は、此れ等の治癒課題に対処し得る事が見出された。ＤＦＯの親水性特性は疎水性組織への直接的適用を非蓋然的な解決法にする。此の課題に対処する為に、角質層を透過し、治癒する真皮内に持続的な様式で真皮下に鉄キレート剤を放出する為のＤＦＯ等の鉄キレート剤を含有する疎水性逆ミセルを用いる新規のパッチ（ＤＩＤＰ）が用いられる。其れは了解されるであろう。
【００４１】
鉄キレート剤は非イオン性界面活性剤に依る逆ミセル中に封入され得、此の逆ミセルはエチルセルロースマトリックス中のＰＶＰに依って安定化される。興味深い界面活性剤は、限定無しに、ツイーン（TWEEN）８５（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）トリオレイン酸ソルビタン）；リン脂質、例えばプルロール・オレク（Plurol Oleique）（登録商標）；トリトンＸ−１００（登録商標）（オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物）；ＡＯＴ（ジオクチルスルホコハク酸）−ツイーン（TWEEN）８０（登録商標）（ポリソルベート８０）；ＡＯＴ−ＤＯＬＰＡ（ジオレイルリン酸）；ＡＯＴ−ＯＰＥ４（ｐ，ｔ−オクチルフェノキシエトキシエタノール）；ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）−ＴＲＰＯ（混合トリアルキルホスフィンオキシド）；レシチン；及びＣＴＡＢを包含する。便利には、逆ミセル構造はフィルムコンポーネント、例えば親水性薬剤、ＰＶＰ、エチルセルロース、及び界面活性剤を低級アルコール、例えばエタノール中に溶解する事に依って作り出され得、其れから疎水性表面上で乾かしてフィルムを形成する。此れはラップに依って正しい位置に保持され得るか、又は本発明の方法への使用に取って好適なバッキング材に接着され得る。
【００４２】
幾つかの実施形態では、パッチの鉄キレート剤（例えばＤＦＯ）濃度は約１ｍｇ／ｃｍ２である。例えば、約６０ｍｍ×７５ｍｍのサイズを有するパッチがパッチ当たり約４５ｍｇのＤＦＯを送達する様に構成され得る。他の濃度もまた可能である（例えば、約０．５ｍｇ／ｃｍ２、約０．５〜１ｍｇ／ｃｍ２、約０．５〜１．５ｍｇ／ｃｍ２、約１〜２ｍｇ／ｃｍ２、約２ｍｇ／ｃｍ２、約２ｍｇ／ｃｍ２よりも多大等）。他のパッチサイズもまた可能である（例えば、約１〜２０００ｍｍ２、約２０００〜４０００ｍｍ２、約３０００〜４０００ｍｍ２、約２５００〜６５００ｍｍ２、約４０００〜６０００ｍｍ２、約４５００〜６０００ｍｍ２、約５０００〜６０００ｍｍ２、６０００〜１００００ｍｍ２、１０，０００〜３０，０００ｍｍ２、３０，０００〜６０，０００ｍｍ２、４０，０００〜６０，０００ｍｍ２、５０，０００〜６０，０００ｍｍ２等）。ＳＣＵは足首の周りに完全に延在し得るので、幾つかの実施形態では、パッチは患者の足首を周回する様に構成され得る。例えば、パッチは約１３０〜１７０ｍｍ×３３０〜３７０ｍｍの寸法を含み得る。他の寸法もまた可能である。
【００４３】
幾つかの実施形態では、パッチは、ＤＦＯ等の鉄キレート剤をエチルセルロース又はエチルセルロース及びポリビニルピロリドンの生分解性ポリマー中に含むマトリックスを含む。
【００４４】
上で指摘されている通り、米国公開第２０１４／０３７００７８号（「‘０７８出願」）は、ＨＩＦ−１αに依って制御される新生血管形成カスケードを標的化して圧迫性及び糖尿病性潰瘍等の慢性創傷の治癒を改善する為の適用について、ＤＦＯを非イオン性界面活性剤及びポリマー中に封入する事に依るＤＦＯの経皮送達を記載している。然し乍ら、ＨＩＦ−１αに依って制御される新生血管形成カスケードはＳＣＵでは問題ではないので、‘０７８出願に記載されている送達デバイスは、ＳＣＵを処置する時に有用であるとは必ずしも思料されないであろう。然し乍ら、本願の発明者は、ＤＦＯの創傷標的化した適用は実際にＳＣＵの治癒を増大させる事を見出した。
【００４５】
加えて、幾つかの実施形態では、本願に記載されるＤＦＯ等の鉄キレート剤の皮内投与はＳＣＵに関連する疼痛を処置する為に用いられ得る。理論に依って拘束される事を意図する事無しに、創傷の鉄キレート及び創傷の爾後の鉄縮減は、創傷に関連する疼痛の縮減を引き起こす事が思料される。血管直径が自然に又は血管攣縮故により小さく成ると、鎌状赤血球の鎌状形状は血流を機械的インターロッキングについて易発性にする。血流の遷延した欠如は領域から酸素を枯渇させ（低酸素状態）、此れは疼痛発作を齎す。鉄キレート剤の経皮適用は血管攣縮を緩和し及び血流を回復させる事を助け、疼痛を縮減及び／又は排除するであろう。疼痛の縮減は、創傷の何れかの知覚可能な治癒有り又は無しに起こり得る。ＳＣＵに関連する疼痛は激しく、抑鬱、労働の損失、及び多くのケースではオピオイド嗜癖に至り得るので、疼痛を縮減する能力は有意な結果である。
【００４６】
幾つかの実施形態では、疼痛発作縮減は皮内パッチの適用の数時間以内に起こり始める。他の有効時間もまた可能である（例えば、１〜６時間、６〜１２時間、１日、１〜２日、２日、１〜３日、１〜５日、３〜５日等）。
【００４７】
下で更に詳細に説明される通り、毎日の創傷へのＤＦＯのシングルボーラス注射と比較して、終日のＤＦＯの持続的放出は遊離鉄の増大した（increase）キレートを提供する事もまた見出された。幾つかの実施形態では、本明細書に於いて開示されるパッチは最高で３６時間に渡ってＤＦＯ等の鉄キレート剤の持続的放出を提供し得る。研究は、幾つかの実施形態では、ＤＦＯの濃度が６時間で頂点に達し、２０時間迄維持されたと言う事を示した。３６時間前後迄、ＤＦＯは真皮内に存在した儘であり得る。
【００４８】
本明細書に於いて開示されるパッチがＳＣＵ及び静脈性下腿潰瘍以外の潰瘍に用いられ得ると言う事は了解されるであろう。例えば、其れ等を皮膚潰瘍について易発性にする血液異常又は希少疾患を有する患者もまた、本明細書に於いて開示されるパッチに依って利され得る。斯かる異常又は疾患は、動脈性皮膚潰瘍、神経障害性皮膚潰瘍、悪性潰瘍、壊疽性膿皮症、コレステロール塞栓症、カルシフィラキシスに依って引き起こされる潰瘍、ベーチェット病、関節リウマチ関係（血管炎）、レイノー現象、レイノー症候群、レイノー病、全身性硬化症、強皮症、ハンセン病、放射線皮膚ダメージ（放射線治療前／後）、限局性筋肉痛、うっ滞性皮膚炎、バザン病、マルトレル潰瘍、凍傷、栄養性、静脈瘤性潰瘍、皮膚血管炎、白血球破砕性血管炎、クリオフィブリノーゲン血症及びクリオグロブリン血症、糖尿病性リポイド類壊死、ワルファリン誘発性皮膚壊死、非糖尿病性足潰瘍、フェルティ症候群から齎される潰瘍、貧血、クーリー貧血、血小板血症、溶血性貧血、並びに多血症を包含し得る。
【実施例】
【００４９】
例１
鎌状赤血球マウス研究を用いて、治癒の提唱されているメカニズムを調べた（ロドリゲス（Rodrigues）等著，公開未定）。此の研究では、トランスジェニック鎌状赤血球マウスモデルＨｂＳＳ−ＢＥＲＫを用いてＤＩＤＰの有効性を決定した。此れ等のマウスはマウスヘモグロビンを発現せず、混合された遺伝背景上にヒトα１、γ、δ、及びβ鎌状遺伝子を含有するトランスジーンのコピーを保有する。其れ等は、溶血、網状赤血球増加、貧血、広範な臓器ダメージ、縮められた寿命、及び疼痛を包含するヒトの鎌状赤血球症を概括する。
【００５０】
下でより詳細に記載される通り、ＳＣＤマウスの創傷は野生型マウスよりも有意に遅く治癒した（＊＊＊ｐ＜０．００１）。無処置の創傷（＊＊＊ｐ＜０．００１）及びＤＦＯ注射処置（＊ｐ＜０．０５）と比較して、ＤＦＯ−ＴＤＤＳ（ＴＤＤＳはＤＩＤＰと同義である）処置された創傷は、有意に加速した閉鎖時間、縮減されたサイズ、及び改善された創傷リモデリングを実証した。ＴＤＤＳから創傷内に放出されたＤＦＯは真皮の過度の遊離鉄のキレートを齎した。
【００５１】
マウス．ＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウスはマウスヘモグロビンを発現せず、混合された遺伝背景上にヒトα１、γ、δ、及びβ鎌状遺伝子を含有するトランスジーンのコピーを保有する。此れ等のマウスは、溶血、網状赤血球増加、貧血、広範な臓器ダメージ、縮められた寿命、及び疼痛を包含するヒト鎌状赤血球症を模擬する２６〜２８。ＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウスを繁殖させ、ヒト鎌状ヘモグロビンについて表現型解析した。ノックアウト及びヘモグロビントランスジーンについて遺伝子型決定を行った。Ｃ５７／Ｂｌ６背景のコントロールマウス（野生型）［＃０００６６４］もまた得た。
【００５２】
ＤＦＯ送達デバイス．経皮送達システムを用いてＤＦＯをマウスの真皮組織内に送達した。送達システムは、エチルセルロースマトリックス中のポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）に依って安定化された非イオン性界面活性剤に依る逆ミセル中に封入された１３．４％のフィルムの重量／重量％の濃度のＤＦＯを含む乾いたフィルムを含み、５／８インチの円形に切られ、同じサイズのシリコーン（silicon）シートに依って被覆された。
【００５３】
切除創治癒．５ヶ月齢の雄のＨｂＳＳ−ＢＥＲＫ及び野生型マウスを切除創形成の定量的且つ再現性のモデルに付した。ガリアーノ（Galioano）等著，ウンドリペア・アンド・リジェネレーション（Wound Repair and Regeneration）第１２巻，ｐ．４８５−４９２，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１０６７−１９２７．２００４．１２４０４．ｘ（２００４年）に記載されている確立されたプロトコールを用いた。簡潔には、麻酔の誘導並びにシェーバー及び除毛クリームを用いる体毛の除去後に、生検パンチを用いてネズミ背中の正中線の両側に２つの６ｍｍの完全厚さの皮膚創傷を切除した。各創傷を１６ｍｍ及び１０ｍｍの外側及び内側直径を有するシリコーンリングに依ってステントし、正しい位置に縫合して、創傷収縮を予防した。
【００５４】
創傷処置．ＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウスを３つの処置群へとランダム化した：ＤＦＯ皮内パッチＤＩＤＰ（若しくはＤＦＯ−ＤＩＤＰ（上に記載されている経皮送達システムから送達されるＤＦＯ））、ＤＦＯ注射、又は無処置。創傷形成後に、ＤＩＤＰの６ｍｍパンチを毎日創傷上に置くか、又は２０μｌの１００ｍＭのＤＦＯ溶液を毎日創傷に皮下的に注射した。無処置群は如何なる注射又はパッチも受けなかった。全ての創傷は閉塞ドレッシング（テガダーム，３Ｍ，セントポール，ＭＮ）に依って被覆された。デジタル写真を一日置きに撮った。イメージ（Image）Ｊソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて創傷領域を測定した。
【００５５】
組織学．閉鎖後に、創傷を収集し、４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、パラフィンに包埋した。真皮厚さの分析の為には、パラフィン切片をトリクローム（シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich））に依って染色し、平均厚さを創傷当たりの強拡大視野当たり３つの測定から算出した。
【００５６】
パールズ（Perl's）プルシアンブルー染色．組織切片中に存在する鉄を呈示する為には、アブカム（Abcam）鉄染色キット（ａｂ１５０６７４，ケンブリッジ，ＵＫ）を用いた。組織学用切片を脱パラフィン及び再水和した。等体積のフェロシアン化カリウム及び塩酸溶液（２％）を組み合わせて鉄染色溶液を作った。スライドを溶液中で３分に渡ってインキュベーションし、其れから蒸留水に依ってリンスした。其れから、スライドをアブカム・ニュークリアファーストレッド（abcam nuclear fast red）溶液に依って５分に渡って染色し、其れから蒸留水に依って別々の４回洗浄した。其れから、スライドを９５％エタノール、次に無水エタノール中で脱水した。青色の染色は皮膚のキレートされていない鉄と直接的に相関する。ＤＦＯは鉄をキレートし、フェリオキサミンを形成し、此れはパールズ（Perl's）プルシアンブルー反応に於いて反応しない。
【００５７】
統計分析．結果は平均±ｓ．ｅ．ｍとして提示されている。標準的なデータ分析はスチューデントのｔ検定を用いて行った。結果は＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１について有意と考えた。
【００５８】
結果
ＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウスは野生型マウスと比較して創傷治癒の障害を被る．
ＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウスの作出は以前に記載されている。簡潔には、ヒトα、βＳ、及びγグロビンを含有するヒトＤＮＡの断片をマウス受精卵にコインジェクションして、ヒトα１、γ、δ、及びβ鎌状遺伝子を含有するトランスジェニックファウンダーＴｇ（Ｈｕ−ｍｉｎｉＬＣＲα１ＧγＡγδβＳ）を作り出した。此のマウスをネズミα及びβグロビン遺伝子の欠失についてヘテロ接合のノックアウトマウス（Ｈｂａａ０／／＋Ｈｂｂｂ０／／＋）と交配して、ネズミα及びβグロビン遺伝子の欠失についてホモ接合であり且つヒト鎌状トランスジーンを含有するＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウスを作り出した。ＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウスはＴｇ（Ｈｕ−ｍｉｎｉＬＣＲα１ＧγＡγδβＳ）Ｈｂａ０／／Ｈｂａ０ネズミＨｂｂ０／／Ｈｂｂ０である（図３Ａ）。
【００５９】
拘縮を最小化する為及びヒト様の創傷治癒速度論を再現する為に、創傷形成後には、ＨｂＳＳ−ＢＥＲＫ及び野生型マウスに副木した。切除創の画像を一日置きに撮り、創傷治癒アウトカムを判定した（図３Ｂ）。野生型コントロールマウス（図３Ｃの下の線）と比較して、ＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウス（図３Ｃの上の線）は顕著に遅延した創傷治癒を実証した。創傷領域の差異は第６日以降から閉鎖迄の全ての時点に於いて統計的に有意であった（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）（図３Ｃ）。ＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウス及び野生型マウスの創傷閉鎖を完了する時間は夫々１７．１４２９＋０．４０４１及び１３．４＋０．３０５５であった（図３Ｄ）。此れ等の結果はＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウスが遅延した創傷治癒を見せると言う事を指示している。
【００６０】
ＤＩＤＰに依って処置されたＨｂＳＳ−ＢＥＲＫ創傷は加速した創傷治癒を実証する．
一旦、我々はＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウスが障害された創傷治癒を有する事を確立したので、我々は、此れ等のマウスをＤＩＤＰに依って処置するか、又は創傷に皮下的にＤＦＯ溶液を毎日注射した。処置されたマウスの創傷治癒を、無処置で放置されたＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウスの創傷と比較した。ＤＩＤＰ処置されたマウスはＤＦＯ注射（＊ｐ＜０．０５）及び無処置群（＊＊＊ｐ＜０．００１）両方と比較して有意に加速した創傷閉鎖を呈示した（図４Ａ〜Ｂ）。図４Ｂでは、一番上の線は無処置のマウスのデータを示し、真中の線はＤＦＯ注射されたマウスのデータを示し、一番下の線はＤＩＤＰ処置されたマウスのデータを示している。ＤＦＯ溶液に依る注射は無処置のコントロールと比較して創傷領域を有意に縮減したが（＊＊ｐ＜０．０１）、ＤＩＤＰ群と同じくらい有効には縮減しなかった。ＤＩＤＰ群、ＤＦＯ注射群、及び無処置群に於ける創傷閉鎖を完了する時間は夫々１３＋０．３６６０、１４．５＋０．６２６８、及び１７．１４２９＋０．４０４１であった（図４Ｃ）。此れ等の結果は、ＤＩＤＰが創傷治癒を有意に加速させ、鎌状赤血球性潰瘍化のネズミモデルの創傷を処置する際にＤＦＯ注射よりも有効である事を実証している。
【００６１】
ＤＩＤＰに依って処置されたＨｂＳＳ−ＢＥＲＫ創傷はより厚い真皮を実証する．
治癒した創傷の組織学用切片をトリクローム分析に付して、真皮のコラーゲン堆積を決定した。図５Ａに示されている通り、無処置群及びＤＦＯ注射処置されたマウスと比較して、ＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウスに於けるＤＩＤＰ処置された創傷は、秩序立った束としての顕著により多大なコラーゲン堆積を呈示した。スライド上のコラーゲンの幅を測定して真皮の厚さを決定した。ＤＩＤＰに依って処置された創傷は有意により高い真皮厚さを実証した（＊ｐ＜０．００１）（図５Ｂ）。鎌状赤血球患者の治癒した皮膚に於いては、同じ部位に於ける創傷再発を予防する為に、より多大なコラーゲン堆積及びより高い真皮厚さが望ましい。
【００６２】
ＤＩＤＰは遊離鉄のキレートに依ってＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウスの創傷治癒を加速させる．
鎌状赤血球症は組織機能障害に至る過度の遊離鉄を特徴とするので、治癒した創傷の組織学用切片をパールズ（Perl's）プルシアンブルー染色に付して、無処置の創傷及びＤＦＯに依って処置された創傷に於ける鉄の存在を決定した。無処置群では、鉄の過度の堆積が観察され、此れ等の創傷箇所はより少ない真皮厚さ及び縮減された真皮インテグリティと高度に相関した（図６Ａ〜Ｂ）。図６Ａに示されている通り、ＤＩＤＰ及びＤＦＯ注射は両方とも、僅かなレベルでしかないパールズ（Perl's）プルシアンブルー染色に依って証される通り皮膚の鉄を減少させた（図６Ｂ）。然し乍ら、ＤＩＤＰ処置群は、過度の細胞増殖無しの良好にリモデリングされた創傷、均等に束化した細胞外マトリックス、及び皮膚付属器の復活を実証した。ＤＩＤＰ処置された創傷は厚い真皮をもまた呈示し（５００μｍ厚超）、此れは無処置のマウスでは観察されなかった。興味深い事に、ＤＦＯ注射群は活発な細胞増殖の箇所及び乱れた細胞外マトリックスの存在を示し、此の処置群では創傷は、解消していない治癒を有すると言う事を指示した。其れ故に、ＴＤＤＳからのＤＦＯの持続的放出は鎌状赤血球マウスの創傷を治癒させる際により有効である。
【００６３】
次に、何故ＤＦＯ処置及びＤＦＯ注射群では縮減されたプルシアンブルー染色があったのかを理解する為に、我々はＤＦＯが鉄に結合する化学反応を理解する事を目指した。鉄は６つの酸素原子に結合している時には安定である。色々なキレート剤が此れ等の酸素原子を提供し得るが、ＤＦＯ（図６Ｃ）は鉄と最も強い結合を形成する事が公知である。何故なら、其れは六座配位子であり、６つの酸素原子をＦｅ３＋と共有してフェリオキサミンを形成するからである（図６Ｄ）。フェリオキサミンは解離する事が希釈溶液（１０−５Ｍ）中でさえも困難であり、其れ故に、第二鉄がパールズ（Perl's）反応に取って利用可能である事を妨げる。其れ故に、我々の結果は、ＤＩＤＰの存在下に於いては、鎌状赤血球性創傷の遊離鉄がキレートされ、ＲＯＳ及び細胞ダメージを作り出す為には最早利用可能ではない事を指示している。
【００６４】
考察
ヘモグロビンＳはヘモグロビンＡのβ−グロビン鎖上の位置６に於けるグルタミン（glumatic）酸からバリンへの置換（ＧＡＧ→ＧＴＧ）に依って形成される。各親から１つの２コピーの此の変異（ＨｂＳＳ）の遺伝はＳＣＤに至る。ＨｂＳＳは脱酸素化に依って重合し、硬直した鎌状形状のエリスロサイトを形成する。此れ等のエリスロサイトは血流を障害し、直ぐに溶血し、血漿中及び組織中の過度の遊離鉄の蓄積に至る。ＳＣＤの合併症は無数であるが、児童期に於ける最も普通の急性事象は血管症、血管痛、及び急性胸部症候群である。患者が成人期に進むと、ヘモクロマトーシスは慢性腎不全、卒中、無血管性骨壊死、及び肺高血圧を包含する末端臓器ダメージに至る。ＳＣＤを有する患者は皮膚の鉄の増加を原因としてＳＣＵをもまた通例経験し、此れは身体機能及び患者のクオリティ・オブ・ライフに影響する。
【００６５】
ＤＦＯは高度に有効な且つ非毒性の鉄キレート剤であり、此れはヘモクロマトーシスを有する患者から過度の鉄を除去する為に通例用いられている。其の短い半減期を原因として、其れは皮下又は静脈内輸液に依って通常は５〜７日／週で８〜１２ｈに渡って投与されている。此処で、創傷部位へのＤＦＯの局所送達は、創傷の過度の遊離鉄をキレートする事に依って、鎌状赤血球症を有するマウスの創傷治癒を改善するであろうと言う仮説が立てられた。然し乍ら、ＤＦＯ分子は親水性であり且つ比較的大きく、細胞拡散を困難にする。
【００６６】
局所送達を可能にする為に、本発明者は逆ミセル中に封入されたＤＦＯを含有するＤＦＯ等の鉄キレート剤の為の新規の経皮送達システムを開発した（ＤＦＯ−ＤＩＤＰ）。外用的に適用される時には、其れはＤＦＯが不浸透性の角質層及び疎水性膜を通って容易に拡散する事を許し、真皮内への標的化した送達を有する。ＤＩＤＰは新たな血管形成を向上させる事及び活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を縮減する事に依ってマウスの創傷治癒を改善すると言う事が以前に実証されている。
【００６７】
此処で、焦点は、ＤＩＤＰが鎌状赤血球マウスの皮膚の鉄をキレートし創傷治癒を向上させ得るかどうかを決定する事であった。ＨｂＳＳ−ＢＥＲＫ鎌状赤血球マウスを実験に用いた。此れ等のマウスは＞９９％ヒト鎌状ヘモグロビンを含有し、ヘム誘発性の血管閉塞、減少した真皮厚さ、痛覚過敏、及び機械的アロディニアを包含する鎌状赤血球症を有する患者に於いて証される物に類似の組織障害を呈示する。実験では、ＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウスは野生型マウスと比較してより遅い創傷治癒を実証した。無処置のＨｂＳＳ−ＢＥＲＫマウスの治癒した創傷はパールズ（Perl's）プルシアンブルー染色に依って真皮中の鉄を呈示した。高い鉄蓄積の箇所は縮減された真皮厚さと直接的に相関した（図７）。
【００６８】
無処置の創傷及びＤＦＯ溶液を毎日注射された創傷両方と比較して、創傷へのＤＩＤＰの毎日の適用は有意に創傷閉鎖を加速させ、真皮厚さを増大させ、秩序立ったコラーゲン束の堆積を齎した。重要な事に、ＤＩＤＰ処置された創傷は真皮中に僅かな鉄しか呈示せず（図７）、フェリオキサミンの形成に依る鉄キレートを指示した。ＤＦＯ注射処置された創傷もまた真皮中に僅かな鉄しか呈示しなかったが、此の処置群の創傷は未だ乱れた細胞外マトリックスを有する増殖状況であり、１日１回与えられるＤＦＯのシングルドーズは創傷治癒プロセスに渡るＤＦＯの持続的放出と同じくらい有効ではない事を指示した。
【００６９】
第一鉄（Ｆｅ２＋）と比べると、第二鉄（Ｆｅ３＋）は有酸素条件下に於いて大分より安定であり、異なるキレート剤の価値を判定する時にはより多大に有意である。第二鉄の正電荷は原子内に特に高い電荷密度を生じ、其れに依って、其れを高い電荷密度を持つ他の原子との結合を形成する性向にする。ＤＦＯ等のキレート剤は分極の箇所を有し、此れ等は高度に荷電した第二鉄カチオンに対する強い結合点として働く。ＤＦＯは第二鉄との６つの結合部位を有するので、其れは六座配位子と呼ばれる。六座配位子は、二座配位子等の他の物よりも低い濃度に於いて多大な結合強さを見せ、其れ故に、解離しヒドロキシルラジカルを形成する事はより蓋然的でない。此れ等の化学的特性は、ＤＦＯを皮膚の過度の第二鉄をキレートする為の高度に効率的な薬物にしている。一旦キレートされると、フェリオキサミンは最も蓋然的には表皮細胞の脱離に依って、汗に依って排出されるか、又は血行中に入り得、腎臓から排出される。
【００７０】
結果は、ＨｂＳＳ鎌状赤血球マウスの皮膚の鉄の過度の増加が創傷治癒の障害と直接的に相関すると言う事を初めて指示している。ＦＤＡ認可されたキレート剤ＤＦＯを用いて皮膚の鉄を局所的に縮減する事は、創傷閉鎖時間、真皮厚さ、及び創傷リモデリングを有意に向上させる。ＤＩＤＰシステムに依るＤＦＯの持続的送達は、局所注射されるＤＦＯのシングルボーラスと比較して創傷を閉鎖する際により有効である。
【００７１】
ＤＩＤＰシステムは有傷の及び無傷の角質層両方を通してＤＦＯを送達する能力を実証しているので、依って、ＤＩＤＰシステムは、発生しようとする創傷（創傷周辺（per-wound））に予防的に適用されて更なる創傷発生を予防し得る。鉄毒性の創傷（例えば、ＳＣＵ、静脈性下腿潰瘍）を発生する事について易発性の患者では、内足首等の決まった場所に於ける発赤及び血鉄症の発生が皮膚崩壊及び創傷形成の発生に先立つ。
【００７２】
例２
ＤＦＯ等の鉄キレート剤を含む皮内パッチがＤＦＯをヒト真皮内に送達するキャパシティを研究する為に、垂直フランツ拡散セル（図８）を用いてＤＩＤＰを評価した。スタンフォード大学ＩＲＢ認可下で得られた完全厚さのヒト皮膚サンプルを拡散セルの２つのコンパートメント間にマウントし、角質層はドナーコンパートメントに面した。ＤＩＤＰを適用し、等張リン酸緩衝溶液をマグネチックスターラーに依って撹拌し、循環ウォータージャケットに依って３７℃に維持した。１５時間の過程に渡って毎時間に、皮膚サンプルを取り出し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に依って洗浄し、吸水タオルに依って乾かした。皮膚サンプルは−２０℃で凍結し、ミクロトームに依って２０μｍ切片に切った。サンプルを薬物含量について５６０ｎｍで分光測色分析し（島津製作所，日本）、相対的なＤＦＯ濃度を決定した。
【００７３】
ＤＩＤＰ適用後のフランツセル実験に用いた新鮮な完全厚さの皮膚サンプルの皮膚生検を組織学用に処理した。以前に記載されている通り改変プルシアンブルー反応に依るフェロシアニド染色を用いて、細胞内ＤＦＯ−鉄凝集塊を可視化した。３％塩酸中に溶解した７％フェロシアン化カリウム中で、皮膚サンプルを一晩インキュベーションした。インキュベーション後に、サンプルを蒸留水中で夫々５ｍｉｎに渡って２回洗浄し、其れから、茶〜青色が発生する迄、安定なＤＡＢ含有３％Ｈ２Ｏ２と室温でインキュベーションした。
【００７４】
同時に、最高で１５時間のＤＩＤＰ適用に依るフランツセル実験に用いた皮膚サンプルの皮膚生検を質量分析用に処理した。ヒト組織切片中のＤＦＯ分子の同定の為の質量分析を以前に記載されている通り行った。２００Ｈｚで作動する固体スマートビームレーザーを装備したウルトラフレックスワン（Ultraflex I）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（ブルカー・ダルトニクス（Bruker Daltonics），ＭＡ）を用いた。
【００７５】
ＤＩＤＰからのＤＦＯの放出をインビトロで評価し（図９Ａ）、外用パッチに依って放出される薬物の累積量が、混合された零次／一次速度論に従って直線的な様式で徐々に増大した事を実証した。ＤＩＤＰが持続的なＤＦＯ送達を提供する能力を確立したので、ヒト皮膚浸透についての其のキャパシティを評価した。水溶液を用いて滴下されたＤＦＯに依って完全厚さのヒト死体皮膚に対して実行されたフランツ拡散セル実験は角質層の如何なる浸透も齎さなかったが、ＤＩＤＰに依って溶出されたＤＦＯは有意な真皮蓄積を齎した（図９Ｂ）。此れはフランツセルサンプルからの組織切片のフェロシアン化カリウム組織化学染色に依って裏付けられた。細胞内鉄凝集塊が真皮中に同定され、ＤＦＯの存在を示唆した（図９Ｃ）。此れ等の知見の特異性を確かめる為に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析を執り行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は６５６ｎｍに於けるＤＦＯ／鉄錯体の存在を立証する事が出来、ＤＩＤＰに依って送達されたＤＦＯの首尾良い真皮透過を指示した（図９Ｄ）。総合すると、此れ等のデータは、ＤＩＤＰ技術を用いて、許容される安全性プロファイルで以て、ＤＦＯが効率的に封入され、ヒト皮膚の角質層を越えて送達されたと言う事を実証している。
【００７６】
其れ等は当然の事乍ら変わり得るので、本発明が、記載されている特定の方法論、プロトコール、細胞株、動物種又は属、コンストラクト、及び試薬に限定されないと言う事は理解されるべきである。本明細書に於いて用いられる術語は特定の実施形態のみを記載する目的であり、添付の請求項に依ってのみ限定される本発明の範囲を限定する事は意図されないと言う事もまた理解されるべきである。
【００７７】
別様に定義されない限り、本明細書に於いて用いられる全ての技術及び科学用語は本発明が属する分野の業者に普通に理解される物と同じ意味を有する。本明細書に記載される物に類似又は同等の何れかの方法、デバイス、及び材料は本発明の実施又は試験に用いられ得るが、今は好ましい方法、デバイス、及び材料が記載されている。
【００７８】
本明細書に於いて挙げられる全ての公開は、例えば、記載されている本発明との繋がりで用いられ得る公開に記載されている細胞株、コンストラクト、及び方法論を記載及び開示する目的で、参照に依って本明細書に組み込まれる。上及び本文中で論じられている公開は専ら本願の出願日に先行する其れ等の開示について提供される。本明細書の如何なる事も、本発明者が先行発明の理由に依って斯かる開示に先行する権利を付与されていないと言う承認として解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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