(57)【要約】  本発明は、ポロシティが２０ｎｍよりも大きな中空糸、特にポリエーテルスルホン製中空糸の使用であって、血液および血液誘導体での血液由来の細胞外小胞、特にエクソソームおよびエキソマーを困窮化させる使用、ならびにそのような困窮化されたサンプルを得るための方法および分析するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液サンプルまたは血液由来の液体サンプルを重力濾過に付すことにより細胞外小胞を困窮化させるための、ポロシティが２０ｎｍよりも大きな中空糸のインビトロでの使用であって、かかる細胞外小胞が、中空糸のポロシティよりも下位の大きさを有し、赤血球、白血球、血小板およびその組み合わせからなる群より選択される血液成分を起源とする、中空糸のインビトロにおける使用。
【請求項２】
中空糸がポリエーテルスルホン製中空糸を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
中空糸がポリエーテルスルホン製中空糸から構成される、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
細胞外小胞が、微小小胞、エクソソーム、エキソマー、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜３に記載の使用。
【請求項５】
中空糸が約２００ｎｍのポロシティを有する、請求項１〜４に記載の使用。
【請求項６】
中空糸が約１５０〜約５００ｎｍのポロシティを含む、請求項１〜４に記載の使用。
【請求項７】
血液由来の液体サンプルが血漿サンプルである、請求項１〜６に記載の使用。
【請求項８】
赤血球、白血球、血小板、およびそのいずれかの組み合わせからなる群より選択される血液成分を起源とする、細胞外小胞を実質的に困窮化させる血液または血液誘導体を得るためのインビトロでの方法であって、血液サンプルまたは血液由来の液体サンプルをポロシティが２０ｎｍよりも大きな中空糸を含むフィルターを介して重力濾過に付す工程、それにより細胞外小胞を実質的に困窮化させた血液または血液誘導体を得る工程を含め、かかる細胞外小胞が該中空糸のポロシティよりも下位にある大きさを有する、インビトロでの方法。
【請求項９】
血液サンプルまたは血液由来の液体サンプルの細胞外小胞の含量をインビトロにて分析する方法であって、
ａ）血液サンプルまたは血液由来の液体サンプルを、ポロシティが２０ｎｍよりも大きな中空糸フィルターを介する重力濾過に付し、それにより濾液を得、
ｂ）工程ａ）において得られた濾液中の細胞外小胞の含量を分析する
ことを含む、方法。
【請求項１０】
中空糸がポリエーテルスルホン製中空糸を含む、請求項８〜９に記載の方法。
【請求項１１】
中空糸がポリエーテルスルホン製中空糸から構成される、請求項８〜９に記載の使用。
【請求項１２】
細胞外小胞が、微小小胞、エクソソーム、エキソマー、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項８〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
中空糸が約２００ｎｍのポロシティを有する、請求項８〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
中空糸が約１５０〜約５００ｎｍのポロシティを含む、請求項８〜１２に記載の方法。
【請求項１５】
血液由来の液体サンプルが血漿サンプルである、請求項８〜１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポロシティ（porosity）が２０ｎｍより上の中空糸、特にポリエーテルスルホン製中空糸を用い、血液および血液誘導体にて、血液由来の細胞外小胞、特に微小小胞、エクソソームおよびエキソマーを困窮化させること、ならびにかかる困窮化させたサンプルを得る方法および分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
細胞外小胞は細胞起源の３０ｎｍ〜２μｍの膜実在物である。これらは、アポトーシス小体（１μｍより上）、オンコソーム（１μｍより上）、微小小胞（２００ｎｍ〜１μｍ）、エキソソーム（３０〜１２０ｎｍ）およびエキソマー（約３５ｎｍ）で構成される（Van Der Polら、Zhangら)。
【０００３】
中空糸（ＨＦ）は、特に透析の分野において使用される、一連の半透性障壁である（Ishiharaら）。その主な特徴は、そのポロシティ、すなわちその平均的な細孔径および細孔分布である。医学の分野において、それらは、典型的には、血液透析、血液濾過および血漿交換のためのフィルターとして使用される。
【０００４】
中空糸は、セルロース、セルロースエステル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリアミド、含窒素ポリマー、ガラス、シリカ、酢酸セルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＥＥ）、ポリエステル、セラミック、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリエチレンイミン機能性ポリアミドイミド（Torlon（登録商標））、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）を含め、種々の材料を用いて製造される（Seo-Hyun Pakら；Xing Yangaら；Hailin Zhuら；Amir Dashtiら；Ze-Lin Qiuら；Li FSら；Labreche Yら；Zhang Yら；Higa Mら, Mock 2007）。
【０００５】
血液および血液誘導体を分析のためにどのように製造し得るかの例が文献にて記載されている。
血液誘導体の製造では、典型的には、血小板および白血球の活性化および溶血が問題となる。例えば、血小板は、血液サンプルの入った試験管を振盪するだけでその活性化が達成されてしまう（Blackら）。また、造血起源の細胞外小胞の存在は、実質由来および間質由来の細胞外小胞を単離し、分子分析するための既知の交絡因子であり、分析の信号対雑音の割合および結果の再現性に影響を与える。
【０００６】
（従来技術）
中空糸は、そのポロシティが小胞を通過させない（ＷＯ２００７１２７８４８、ＷＯ２００１０８２９５８）、または中空糸が小胞と結合するように化学的に修飾されている（ＷＯ２０１５１３０９５６）かのいずれかを理由として、中空糸の有する小胞の保持能と関連して記載されている。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】遠心分離に付すか、２００ｎｍのポロシティのＨＦ装置を通して濾過するか、あるいは２０ｎｍのポロシティのＨＦ装置を通して濾過することで得られる血漿のナノ粒子の総数を示す。
【図２】２００ｎｍのＨＦ装置を通して濾過することで得られる血漿サンプル中で測定される血液由来のエクソソームの量、あるいは３人の転移性黒色腫患者の遠心分離によって得られる血漿中の対立遺伝子頻度による、ＢＲＡＦ遺伝子のコピー（コピー数／ｍＬ）を示す。
【図３】２００ｎｍのポロシティの非ＨＦセルロースフィルターを介する濾過により得られる血漿サンプル中にて測定される血液由来のエキソソームの量を示す。
【図４】２００ｎｍのＨＦ装置を介する濾過、または遠心分離によって得られる血漿サンプル中に存在する微小小胞の低分子ＲＮＡ電気泳動図を示す。
【図５】遠心分離に付すか、または２００ｎｍのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を介して濾過した後に測定した、健康なドナーの血液にスパイクされた腫瘍エキソソーム中の、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異のレベル（Ａ）、またはＢＲＡＦＶ６００ＥｖｓＢＲＡＦＷＴの割合（Ｂ）を示す。
【図６】２００ｎｍのＨＦ装置を通して濾過することで、または遠心分離に付すことで得られる血漿サンプルにて測定されるＣＤ９−およびＴＭ９ＳＦ４−陽性エクソソームの量を示す。
【図７】遠心分離に付すか、または２００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を通して濾過した後の健康なドナーの血漿サンプルの脂質異常指数を示す。
【図８】遠心分離に付すか、または２００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を通して濾過することで得られる健康なドナーの血漿にスパイクされた腫瘍エキソソーム中のＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異のコピーのレベル（コピー数／ｍＬ）を示す。
【図９】遠心分離に付すか、または２００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を通して濾過する前後の脂質異常性血漿サンプルの脂質異常指数を示す。
【図１０】遠心分離機、あるいは２００ｎｍのポロシティ、または５００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦフィルターのいずれかを用いて全血より得られる血漿のナノ粒子の総数を示す。
【図１１】遠心分離に付すか、または５００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を通して濾過するかのいずれかで得られる血漿サンプル中で測定されるＣＤ９−、ＣＤ４５−、ＣＤ６１−およびＣＤ２３５陽性エキソソームの量を示す。
【図１２】遠心分離に付すか、または２００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を通して濾過することで得られる、転移性黒色腫患者の血漿中の野生型ＢＲＡＦ遺伝子のコピーのレベル（コピー数／ｍＬ）を示す。
【図１３】遠心分離に付すか、または２００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を通して濾過することで得られる、転移性黒色腫患者の血漿中のＢＲＡＦ遺伝子のコピーの対立遺伝子頻度（コピー数／ｍＬ）を示す。
【図１４】腫瘍エキソソームをスパイクした血漿サンプル中で測定され、２００ｎｍのＨＦ装置を通して濾過するか、または遠心分離により得られる、ＴＭ９ＳＦ４−陽性エクソソームの量を示す。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、意外にも、ポロシティが２０ｎｍよりも大きな中空糸フィルターを重力濾過で使用することで、特定の血液成分を起源とし、大きさが該中空糸のポロシティよりも下位にある、細胞外小胞を困窮化させることを、見出した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の第１の態様において、血液サンプルまたは血液由来の液体サンプルを重力濾過に付すことにより細胞外小胞を困窮化させるための、ポロシティが２０ｎｍよりも大きな中空糸のインビトロでの使用であって、かかる細胞外小胞が、中空糸のポロシティよりも下位の大きさを有し、赤血球、白血球、血小板およびその組み合わせからなる群より選択される血液成分を起源とする、中空糸のインビトロにおける使用が提供される。
【００１０】
本発明の第２の態様において、赤血球、白血球、血小板、およびそのいずれかの組み合わせからなる群より選択される血液成分を起源とする、細胞外小胞を実質的に困窮化させる血液または血液誘導体を得るためのインビトロでの方法であって、血液サンプルまたは血液由来の液体サンプルをポロシティが２０ｎｍよりも大きな中空糸を含むフィルターを介して重力濾過に付す工程、それにより細胞外小胞（かかる細胞外小胞が該中空糸のポロシティよりも下位にある大きさを有する）を実質的に困窮化させた血液または血液誘導体を得る工程を含む、インビトロでの方法が提供される。
【００１１】
本発明の第３の態様において、血液サンプルまたは血液由来の液体サンプルの細胞外小胞の含量をインビトロにて分析する方法であって、
ａ）血液サンプルまたは血液由来の液体サンプルを、ポロシティが２０ｎｍよりも大きな中空糸フィルターを介する重力濾過に付し、それにより濾液を得、
ｂ）工程ａ）において得られた濾液中の細胞外小胞の含量を分析する
ことを含む、方法が提供される。
【００１２】
当業者は、環境に応じ、自身の経験および当該分野において利用可能な文献に基づき、どの分析が実施され、それをどのように行うかが分かるであろう。かかる分析は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いて、特定のタンパク質をその表面に有する細胞外小胞の量を測定することに向けられてもよい。他の分析は、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）を介してサンプル中にあるナノ粒子の総数を計数すること、または定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）または次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により遺伝子発現を測定することに向けられてもよい。
【００１３】
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、中空糸はポリエーテルスルホン製中空糸を含む。
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、中空糸はポリエーテルスルホン製中空糸からなる。
【００１４】
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、中空糸は、セルロース、セルロースエステル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリアミド、含窒素ポリマー、ガラス、シリカ、セルロースアセテート、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエステル、セラミック、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリエチレンイミン機能性ポリアミドイミド（トーロン（Torlon）（登録商標））およびポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）の群より選択される、材料を含む。
【００１５】
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、中空糸は、セルロース、セルロースエステル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリアミド、含窒素ポリマー、ガラス、シリカ、セルロースアセテート、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエステル、セラミック、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリエチレンイミン機能性ポリアミドイミド（トーロン（Torlon）（登録商標））およびポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）の群より選択される、材料からなる。
【００１６】
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、ポロシティは、２０ｎｍより上、２５ｎｍより上、３０ｎｍより上、３５ｎｍより上、４０ｎｍより上、４５ｎｍより上、５０ｎｍより上、５５ｎｍより上、６０ｎｍより上、６５ｎｍより上、７０ｎｍより上、７５ｎｍより上、８０ｎｍより上、８５ｎｍより上、９０ｎｍより上、９５ｎｍより上、１００ｎｍより上、１０５ｎｍより上、１１０ｎｍより上、１１５ｎｍより上、１２０ｎｍより上、１２５ｎｍより上、１３０ｎｍより上、１３５ｎｍより上、１４０ｎｍより上、１４５ｎｍより上、１５０ｎｍより上、１５５ｎｍより上、１６０ｎｍより上、１６５ｎｍより上、１７０ｎｍより上、１７５ｎｍより上、１８０ｎｍより上、１８５ｎｍより上、１９０ｎｍより上、１９５ｎｍより上、および２００ｎｍより上の群より選択される。
【００１７】
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、ポロシティは５００ｎｍ未満である。
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、ポロシティは、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、およびこれらの数値を含むいずれのインターバルの群からも選択される。
【００１８】
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、ポロシティは、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、およびこれらの数値を含むいずれのインターバルの群からも選択される。
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、中空糸は、約１５０〜約２５０ｎｍ、約１５０〜約３００ｎｍ、約１５０〜約３５０ｎｍ、約１５０〜約４００ｎｍ、約１５０〜約４５０ｎｍ、約１５０〜約５００ｎｍ、約２００〜約２５０ｎｍ、約２００〜約３００ｎｍ、約２００〜約３５０ｎｍ、約２００〜約４００ｎｍ、約２００〜約４５０ｎｍ、および約２００〜約５００ｎｍからなる一群の範囲から選択されるポロシティを有する。
【００１９】
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、中空糸は、１５０〜２５０ｎｍ、１５０〜３００ｎｍ、１５０〜３５０ｎｍ、１５０〜４００ｎｍ、１５０〜４５０ｎｍ、１５０〜５００ｎｍ、２００〜２５０ｎｍ、２００〜３００ｎｍ、２００〜３５０ｎｍ、２００〜４００ｎｍ、２００〜４５０ｎｍ、および２００〜５００ｎｍからなる一群の範囲から選択されるポロシティを有する。
【００２０】
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、中空糸は約２００ｎｍのポロシティを有する。
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、中空糸は２００ｎｍに等しいポロシティを有する。
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、血液由来の液体サンプルは血漿サンプルである。
【００２１】
本発明のいずれかの態様の下にある実施態様において、細胞外小胞は、微小小胞、エクソソーム、エキソマー、およびその組み合わせからなる群より選択される。
すべての実施態様は組み合わされて、本発明の上記した態様の下にある、新たな実施態様を形成してもよい。
【実施例】
【００２２】
発明を、この度、非限定例として記載する。
材料および方法
【００２３】
Ａ）血液採取
すべての患者は、午前中に採血を行うまで、夜中から空腹状態であった。血液は、ＣＰＤ含有の血液バッグ（CompoFlow；Fresenius Kabi）に収集されるか、血漿用のＫ２−ＥＤＴＡ管（バクタイナー（VACUTAINER）（登録商標）、ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）、パープルキャップ、ＲＥＦ３６７８６４、６.０ｍｌ）に収集されるかのいずれかであった。Ｋ２−ＥＤＴＡ管を、その後で５または６回、上下回転させ、垂直位置を維持し、さらなる処理に付すまで、室温（２０〜２５℃）で貯蔵した。
【００２４】
Ｂ）遠心分離による血漿の製造
遠心分離による血漿の製造は、全血を１５００ｇで２０〜２５℃にて１０分間遠心分離に付すことで、採血から１時間以内に行われた。使い捨てパスツール（Pasteur）ピペット（Steroglass、ＲＥＦ：ＬＰＭＷ０３２６５３；５ｍｌ）を用いて血漿を集め、バッフィーコートの３〜４ｍｍ上で止めておくことでそれが再び懸濁するのを回避した。サンプルを脂質、胆汁（Itterum）または溶血の痕跡について目視でチェックした。血漿を１５ｍＬのファルコン（Falcon）管に集め、緩やかに反転させ、標識を付したクライオ管（カタログ番号：ＢＳＭ５３５，Biosigma）にてアリコートに供し、−２０℃で貯蔵した。
【００２５】
Ｃ）２００ｎｍのポロシティの非ＨＦのセルロース製フィルターの濾過を介して得られる血漿
血漿を上記されるように遠心分離に付して製造し、２００ｎｍのポロシティの非ＨＦのセルロース製フィルター（カタログ番号：１９０−９９２０；Nalgene）を介して濾過した。濾過した血漿を１５ｍＬのファルコン管に集め、２ｍＬのマイクロ遠心管にてアリコートに供し、さらに使用するまで−２０℃で貯蔵した。
【００２６】
Ｄ）２０／２００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製中空糸装置の濾過を介して得られる血漿
血漿は、一般に血液透析に使用される、２０ｎｍまたは２００ｎｍのポロシティの市販されているポリエーテルスルホン製中空糸装置（Plasmart 50；Medica Srl、Italy）の修飾バージョンを用いて得られた。該装置は、その長さを１５０ｍｍから６０ｍｍに短くすることで修飾され、そうしてプライミングに必要とされる血液の容量を減らした。簡単に言えば、２つの側面の出口の１つを全血袋またはＫ２−ＥＤＴＡ管に接続する一方で、その装置の反対側の出口を空の袋に接続した。第３の側方出口を濾過された血漿を集めるための空の袋に接続した。血液袋を室温で少なくとも３０分間放置し、使用前にゆっくりと混合した。
【００２７】
４０ｍＬの全血を重力濾過により該装置を通して濾過し、１５ｍＬ（３０％）の血漿を側面袋にて集め、５０ｍＬのファルコン管に移し、２ｍＬの微小遠心管へのアリコートに供し、−２０℃で貯蔵した。全血およびその細胞成分を保持液にて濃縮し、サイドバッグに集めて廃棄した。
【００２８】
Ｅ）ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）
分析する前に、血漿サンプルを１３０００ｇで遠心分離に付し、分析に影響を及ぼす可能性のある大きな小胞を除去し、ＰＢＳでさらに１：１００００に希釈した。ＮＴＡは、ＬＭ１０ナノサイト（Nanosight）機器（Malvern, UK）を用い、カメラレベルを１６に、スライダーシャッターを１３０００に設定して行われた。粒子濃度は、３回の独立した測定の平均として、計算された。
【００２９】
Ｆ）エライザによるエクソソームの数量化
血漿サンプルを室温で解凍し、１μＬのプロテアーゼ阻害剤のカクテル（１０００Ｘ；シグマ（Sigma）カタログ番号：Ｐ−８３４）を各サンプルに加え、タンパク質バイオマーカーを保存した。血漿サンプルを室温（ＲＴ）で２０分間にわたって１２００ｇで遠心分離に付し、残りの赤血球と細胞破片を除去した。得られた上清を集め、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）と１：１の容量割合に希釈した。
【００３０】
簡単に言えば、１００μｌの希釈した血漿を、０.１μｇ／ウェルの抗−ＣＤ９抗体（カタログ番号：ＨＢＭ−ＣＤ９−１００、HansaBioMed Life Sciences Ltd）、抗−ＣＤ４５抗体（カタログ番号：６１０２６５、ＢＤ）、抗−ＣＤ６１抗体（カタログ番号：５５５７５２、ＢＤ）；および抗−ＣＤ２３５抗体（カタログ番号：５５５５６９、ＢＤ）と、ならびに抗−ＴＭ９ＳＦ４抗体（２μｇ／ｍｌ）と一緒に、プレコートした９６ウェルのプレートにて４℃で一夜インキュベートした。洗浄緩衝液（ＰＢＳ−ツィーン（Tween）  ０.０５％）で３回洗浄した後、プレートをビオチン化抗−ＣＤ９抗体（カタログ番号：５５８７４９、BD Pharmigen）と一緒にインキュベートし、４℃で２時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回洗浄し、適合したポリ−ＨＲＰ−ストレプトアビジン二次抗体（カタログ番号：２１１４０、Pierce）と一緒に４℃で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μｌの基質溶液（ＴＭＢｌｕｅ  ＰＯＤ；１：１  溶液ＡおよびＢ、Pierce）を各ウェルに添加することで比色反応を起こさせ、暗所にて室温で１０分間インキュベートし、１００μｌの停止溶液（１Ｎ硫酸）を添加して反応を停止させた。Ｏ／Ｄ吸光度をＭ１０００Ｔｅｃａｎを用いて４５０ｎｍで読み取り、結果をシグナル対バックグラウンド（Signal to Background；ＳｔＢ）比として表した。
【００３１】
Ｇ）微小小胞ペレットの製造
遠心分離機を用いて得られた血漿および中空糸の濾過で得られた血漿を、さらに１００００ｇにて室温で３０分間遠心分離に付して微小小胞（ＭＶ）ペレットを得た。ＭＶペレットを１００μＬのＰＢＳに再び懸濁させてさらなる処理に付した。
【００３２】
Ｈ）低分子ＲＮＡのＭＶペレットからの抽出および電気泳動図の分析
Overall Exosome Immunocapture and RNA extraction kit from human biofluids and cell media（カタログ番号：ＨＢＭ−ＲＮＡ−ＢＯＦ−２０；HansaBioMed Life Sciences Ldt, Estonia）を用い、製造業者の指示に従って、ＭＶペレットからＲＮＡを抽出し、１５ｍＬの溶出緩衝液にて溶出した。５マイクロリットルの抽出したＲＮＡをＲＮＡ６０００  Ｐｉｃｏ  Ｋｉｔ（カタログ番号：５０６７−１５１３；Agilent Technologies）にロードし、バイオアナライザー（Bioanalyzer）機器を操作し、ＲＮＡの電気泳動図を得た。
【００３３】
Ｉ）ＢＲＡＦＶ６００Ｅ−陽性腫瘍エクソソームを用いた血液サンプルのスパイク、およびエクソソーム関連のＤＮＡの単離
健康なドナー患者からの全血（１０ｍＬ）に、商業供給者より購入した８０μｌのＢＲＡＦＶ６００Ｅ−陽性腫瘍エクソソーム（５.５μｌ／μｌ、ＣＯＬＯ１細胞株、HansaBioMed Life Sciences Ldt）をスパイクした。
【００３４】
スパイクされた腫瘍エクソソームからのエクソソーム関連のＤＮＡ（Ｅｘｏ−ＤＮＡ）を、循環ＤＮＡを抽出するための市販のキット（ｓｅｌｅＣＴＥＶ（登録商標）ｌｏｗ  ｉｎｐｕｔ  ＤＮＡ；Exosomics Siena Spa, Italy）を用いて抽出して精製した。簡単に言えば、独自仕様のペプチドを用い、血漿からエクソソームを捕捉し、２時間インキュベーションした後にペレット状にした。エクソソームペレットを独自仕様の溶解緩衝液で溶解させ、プロテイナーゼＫで消化してＤＮＡをタンパク質の複合体から放出させた。次に、サンプルにエタノールを補充し、シリカ膜スピンカラムにロードし、１００００ｇで１分間にわたって遠心分離に付した。遠心分離に付した後、フロースローを廃棄した。製造業者の指示に従って２回の洗浄工程を行い、溶出する前に汚染溶媒および血漿由来の阻害剤を取り除いた。Ｅｘｏ−ＤＮＡを５０μｌの溶出緩衝液で溶出し、使用まで−２０℃で貯蔵した。
【００３５】
ｑＰＣＲによるＢＲＡＦＶ６００ＥおよびＢＲＡＦＷＴ遺伝子の増幅
各ｑＰＣＲ反応は、１０μｌの精製Ｅｘｏ−ＤＮＡ、１ｘのＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Biorad；US）、０.６２５μｌのプライマー（１０μＭ）および０.３１２５μｌの蛍光プローブ（１０μＭ）を２５μｌの総容量で含んだ。次のプライマーおよびプローブを用いた：
ａ）ＢＲＡＦＷＴ  ＦＷ：ＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧ＋Ｔ；
ｂ）ＢＲＡＦＷＴ  ＲＷ：ＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＧＣＣＴＣＡ；
ｃ）ＢＲＡＦＶ６００Ｅ  ＦＷ：ＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧ＋Ａ；
ｄ）ＢＲＡＦＶ６００Ｅ  ＲＷ：ＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＧＣＣＴＣＡ
ｅ）プローブ：５’−ＦＡＭ  ＣＣＧＡＡＧＧＧＧＡＴＣ＋ＣＡＧＡＣＡＡ＋ＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧ−３ＢＨＱ１−３
【００３６】
注意して混合した後、各反応を９６ウェルのＰＣＲプレートに三重重複にてロードし、次のｑＰＣＲプログラム：９５℃で３分間（’）、９５℃で５秒間（”）および６０℃で３０秒間を４０サイクル、つづいて４℃での最終保持工程を開始した。ＢＲＡＦＶ６００Ｅの回収％を計算するのに、次式：［２^(Ctinput -Ctisolation)］％
を用いた。
【００３７】
Ｌ）液滴デジタルＰＣＲ（digital droplet PCR）によるＢＲＡＦＶ６００Ｅ遺伝子コピーの検出
各液滴デジタルＰＣＲ反応は、１０μｌの精製Ｅｘｏ−ＤＮＡ、２ｘのプローブ用のｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（カタログ番号：１８６３０１；Biorad)、２０ｘのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ用のＭｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（アッセイＩＤ：ｄＨｓａＭＤＶ２０１００２７；Biorad）および５μｌのＤＮａｓｅ不含水を含んだ。各反応を製造業者の指示に従ってロードし、次のｄｄＰＣＲプログラム：９５℃で１０分間、９５℃で３０秒間および５６℃で１分間を４０サイクル、つづいて４℃での最終保持工程を開始した。ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ遺伝子コピーおよび対立遺伝子頻度をＱｕａｎｔａＳｏｆｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Biorad）を用いて計算した。
【００３８】
Ｍ）血漿サンプルの脂質異常性指数の数量化
脂質異常性指数は、製造業者の指示に従って、Ｃｏｂａｓ機器でＳｅｒｕｍ  Ｉｎｄｅｘ  Ｇｅｎ.２キット（カタログ番号：０５１７２１７９１９０；Roche）を用い、５００μｌの血漿より測定された。
【００３９】
実施例１：２００ｎｍの細孔を備えた中空糸（ＨＦ）装置がナノ粒子に富む血漿を血液から効果的に分離する
図１は、遠心分離機、遠心分離機＋２００ｎｍの非ＨＦのセルロース製フィルター、２００ｎｍのポロシティまたは２０ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製中空糸フィルターのいずれかを用い、全血より得られる血漿のナノ追跡分析（ＮＴＡ）によるナノ粒子の総数を示す。
かくして、本発明の方法は、遠心分離機＋非ＨＦセルロース製フィルターと同様の総数のナノ粒子を得ることができる旨を示している。
【００４０】
実施例２：全血を２００ｎｍのＨＦ濾過に付して得られる血漿は、赤血球および白血球由来の細胞外小胞が、遠心分離機で得られる血漿よりも少ない
図２は、遠心分離によるか、あるいは抗ＣＤ９抗体（一般的なＥＶマーカー）、抗ＣＤ４５抗体（一般的な白血球マーカー）、抗ＣＤ６１抗体（一般的な血小板マーカー）、または抗ＣＤ２３５抗体（一般的な赤血球マーカー）を用いる、２００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を介する濾過によるかのいずれかによって得られる、健康なドナーの血漿より捕捉される細胞外小胞の量を示す。
かくして、２００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置の使用が、サンプルにて、白血球、赤血球および血小板のいずれかより由来の細胞外小胞を困窮化させることが示される。
【００４１】
実施例３：２００ｎｍの非ＨＦのセルロース製カットフィルターは細胞外小胞の部分母集団を選択しない
図３は、遠心分離によるか、あるいは抗ＣＤ９抗体（一般的なＥＶマーカー）、抗ＣＤ４５抗体（一般的な白血球マーカー）、抗ＣＤ６１抗体（一般的な血小板マーカー）、または抗ＣＤ２３５抗体（一般的な赤血球マーカー）を用いる、２００ｎｍの非ＨＦのセルロース製フィルターを介する濾過によるかのいずれかによって得られる、血漿より捕捉される細胞外小胞の量を示す。
かくして、かかるフィルターは、サンプルにて、白血球、赤血球および血小板のいずれかより由来の細胞外小胞を困窮化させないことが示される。
【００４２】
実施例４：２００ｎｍのＨＦ装置はこの大きさより下位にある粒子を真に選択する
図４は、（Ａ）全血を遠心分離に付すことにより得られる血漿サンプル、および（Ｂ）全血を２００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を介して濾過することにより得られる血漿サンプル、において得られる微小小胞の低分子ＲＮＡ電気泳動図を示す。
これらのデータは、ＨＦ装置を介する濾過により得られる血漿には、遠心分離によって得られる血漿中に存在する特定の微小小胞が枯渇していることを示す。これらの微小小胞は文献から２００ｎｍより大きいことが知られており（Van der Polら）、かくして２００ｎｍのポロシティはこの大きさより下位にある粒子を真に選択する。
【００４３】
実施例５：ＢＲＡＦＶ６００Ｅ陽性腫瘍のエクソソームは、２００ｎｍのＨＦ装置で濾過した後の全血より得られる血漿中にて効率よく回収される
図５は、材料および方法において上記されるように、腫瘍エクソソームでスパイクされる、全血サンプルを遠心分離に付すか、または２００ｎｍのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を通して濾過するかのいずれかに付した後に測定される、かかる腫瘍エキソソーム中の、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異のレベル（Ａ）、またはＢＲＡＦＶ６００ＥとＢＲＡＦＷＴの割合（Ｂ）を示す。
【００４４】
そこでは、本発明の方法は、古典的な遠心分離方法と比べ、血漿サンプル中に認められる腫瘍エクソソームのレベルを有意に変化させないことが示される。
その上で、図５Ｂにおける違いは、ＢＲＡＦＷＴを有する細胞外小胞における困窮化の結果として、本発明の方法がＢＲＡＦＷＴのレベルをどのように下げるかを強調する。
【００４５】
実施例６：２００ｎｍのポロシティを用いるＨＦ濾過は、代謝マーカーＴＭ９ＳＦ４の偽陽性シグナルを除去する
図６は、遠心分離によるか、あるいは抗ＣＤ９抗体（一般的なＥＶマーカー）、または抗ＴＭ９ＳＦ４抗体（糖分解スイッチを受けている腫瘍実質細胞と間質細胞の両方に由来するが（Lozuponeら、2009；Lozuponeら、2015）、活性化された造血細胞にも由来する（Paolilloら）エクソソーム上で発現する代謝マーカー）を用いる、２００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を介する濾過によるかのいずれかによって得られる、健康なドナーの血漿より捕捉されるエクソソームの量を示す。
【００４６】
本発明の方法で得られる、健康なドナーの血漿からのＴＭ９ＳＦ４陽性エクソソームのレベルは、陽性検出のために設定された診断閾値（点線）の下方にあることが図示される。反対に、遠心分離に付すことで得られる健康なドナーの血漿からのＴＭ９ＳＦ４陽性エクソソームのレベルは、かかる診断閾値よりも上方にあり、偽陽性検出をもたらす。該結果は、ＨＦ濾過が血球の活性化による交絡効果を大幅に減少させ、実質細胞および間質細胞からのエクソソームでのバイオマーカーの検出を容易にすることを示唆する。
【００４７】
実施例７：血液のＨＦ濾過は血漿の脂質異常性指数を減少させる
図７は、遠心分離に付すか、２００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を通して濾過した後の健康なドナーの血液より得られる３つの血漿サンプルの脂質異常性指数を示す。結果は、ＨＦ濾過が、遠心分離操作と比べて、３つの血漿サンプルの全てで脂質異常性指数を減らすことを示す。この結果は、少なくとも一部では、トリグリセリドに富むカイロミクロン、すなわち直径が７０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲にある小胞の減少によって説明され得る（De Haeneら）。
【００４８】
実施例８：ＨＦ濾過による脂質異常性指数の減少は変異回復を改善する
図８は、遠心分離に付すか、２００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を通して濾過することで得られる健康なドナーの血漿にてスパイクされる腫瘍エクソソーム中のＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異コピーのレベル（コピー数／ｍＬ）を示す。結果は、より多くの変異コピーが遠心分離に付した血漿よりもＨＦ濾過に付した血漿から回収されることを示す。この変異回収の改善は、同じ血漿サンプルのセットで観察される脂質異常性指数の減少が観察されることと相関する。
【００４９】
実施例９：脂質異常性血漿サンプルのＨＦ濾過はその脂質異常性指数を減少させる
図９は、遠心分離に付すか、２００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を通して濾過する前後の、３つの脂質異常性血漿サンプルの脂質異常性指数を示す。結果は、ＨＦ濾過が、遠心分離と比べて、３つすべての脂質異常性血漿サンプルの脂質異常性指数を低下させ、該装置のトリグリセリドに富むカイロミクロンのレベルを低下させる能力と一致することを示す。
【００５０】
実施例１０：５００ｎｍの細孔を備えた中空糸（ＨＦ）装置はナノ粒子に富む血漿を血液から効果的に分離する
図１０は、遠心分離機、２００ｎｍのポロシティまたは５００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製フィルターのいずれかを用いて、全血から得られた血漿をナノ追跡分析（ＮＴＡ）に供したナノ粒子の総数を示す。
かくして、５００ｎｍのポロシティを有するＨＦフィルターは、遠心分離機および２００ｎｍのポロシティを有するＨＦフィルターと比べて、同様のナノ粒子の総数を得ることができることが示される。予想通り、ナノ粒子の平均の大きさは、遠心分離機および２００ｎｍのポロシティを有するＨＦフィルターと比べて、５００ｎｍのＨＦフィルターでわずかに増加した。
【００５１】
実施例１１：全血の５００ｎｍＨＦ濾過で得られる血漿は遠心分離で得られる血漿よりも赤血球および白血球由来の細胞外小胞が少ない
図１１は、遠心分離によるか、あるいは抗ＣＤ９抗体（遺伝的ＥＶマーカー）、抗ＣＤ４５抗体（遺伝的白血球マーカー）、抗ＣＤ６１抗体（遺伝的血小板マーカー）、または抗ＣＤ２３５抗体（遺伝的赤血球マーカー）を用いる５００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を介する濾過によるか、のいずれかによって得られる健康なドナーの血漿より捕捉される細胞外小胞の量を示す。
このように、５００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置の使用は、サンプルにて、白血球および赤血球のいずれかより由来の細胞外小胞を困窮化させるが、血小板由来の細胞外小胞については有意な効果のなかったことが分かる。
【００５２】
実施例１２：ＨＦ濾過により、転移性黒色腫患者の血漿中の野生型ＢＲＡＦ遺伝子のレベルが減少する
図１２は、遠心分離によるか、または２００ｎｍのポロシティのＨＦ装置を通して濾過することによって得られる、５人の転移性黒色腫患者の血漿中の野生型ＢＲＡＦ遺伝子コピーのレベル（コピー数／ｍＬ）を示す。結果は、ＨＦ装置を用いて得られた５人の血漿サンプルの中の４つが、遠心分離によって得られるものよりもＢＲＡＦ遺伝子コピー数が有意に少なかったことを示す。この結果はＨＦ濾過ががん患者の血漿中の野生型ＤＮＡのレベルを減少させることを示す。
【００５３】
実施例１３：ＨＦ濾過は転移性黒色腫患者の血漿中のＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異の対立遺伝子頻度を改善する
図１３は、遠心分離によるか、または２００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を通して濾過することによって得られる、３人の転移性黒色腫患者の血漿中のＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異の対立遺伝子頻度を示す。結果は血漿のＨＦ濾過が各サンプルにおいてＢＲＡＦＶ６００Ｅの対立遺伝子頻度を改善することを示す。この結果はこれらのサンプルにおいて観察される野生型ＢＲＡＦ遺伝子コピーのレベルの減少と一致する。
【００５４】
実施例１４：２００ｎｍのポロシティを用いるＨＦ濾過は腫瘍エキソソームの血漿からの検出を容易にする
図１４は、遠心分離によるか、あるいは抗ＴＭ９ＳＦ４抗体（糖分解スイッチを受けている腫瘍実質細胞と間質細胞の両方に由来するエキソソーム上で発現する代謝マーカー）を用いる２００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を通して濾過するかのいずれかによって、腫瘍エキソソームをスパイクした血液より得られる血漿より捕捉される腫瘍エクソソームの量を示す。
【００５５】
ＴＭ９ＳＦ４陽性腫瘍エキソソームのレベルが、２００ｎｍのポロシティのポリエーテルスルホン製ＨＦ装置を通して濾過した、腫瘍エキソソームをスパイクした血液より得られる血漿中にて増大することが分かる。反対に、遠心分離によって血液より得られる血漿中では、血液由来の小胞によって作り出される高バックグラウンドのノイズに起因して、ＴＭ９ＳＦ４陽性腫瘍エキソソームのレベルに変化は観察されない。結果は、ＨＦ濾過が血球の活性化による交絡効果を大幅に減少させ、腫瘍エクソソームでのバイオマーカーの検出を容易にすることを示唆する。
【００５６】
参考文献一覧
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【図１】
2021519421.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2021519421.tif 000011
【図１１】
2021519421.tif 000012
【図１２】
2021519421.tif 000013
【図１３】
2021519421.tif 000014
【図１４】
2021519421.tif 000015
【配列表】
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【国際調査報告】
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