(57)【要約】  本開示は、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを発酵生産するための微生物細胞の設計を記載し、新規な設計された微生物細胞及び培養物、並びに関連する(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産方法を提供する。
2021505154.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)ネイティブでないゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ)、及び
(b)ネイティブでないゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼ
を発現し、
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産する、設計された微生物細胞。
【請求項２】
設計された微生物細胞が、1つ若しくは複数の上流(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路酵素の増大した活性、又は上流経路活性の調節因子の増大した活性を含み、前記増大した活性が、コントロール細胞と比較して増大している、請求項1に記載の設計された微生物細胞。
【請求項３】
1つ又は複数の上流(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路酵素が、ATP-クエン酸シンターゼ、アセチル-CoAシンターゼ、チオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aシンターゼ(HMG-CoAシンターゼ)、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aレダクターゼ(HMG-CoAレダクターゼ)、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ、及びゲラニル二リン酸シンターゼからなる群から選択される、請求項2に記載の設計された微生物細胞。
【請求項４】
1つ又は複数の上流(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路酵素が、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼを含む、請求項3に記載の設計された微生物細胞。
【請求項５】
設計された微生物細胞が、1つ又は複数の(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路前駆体を消費する1つ又は複数の酵素の低減した活性を含み、前記低減した活性が、コントロール細胞と比較して低減している、請求項1から4のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞。
【請求項６】
1つ又は複数の(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路前駆体を消費する1つ又は複数の酵素が、二機能性の(2E,6E)-ファルネシル二リン酸シンターゼ/ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ及び/又はゲラニルピロリン酸シンターゼを含む、請求項5に記載の設計された微生物細胞。
【請求項７】
フィードバック脱調節されたHMG-CoAレダクターゼを更に発現する、請求項1から6のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞。
【請求項８】
より高速のアセチル-CoA合成及び/又はより低速のアセチル-CoA分解に起因する、コントロール細胞と比較してのアセチル-CoAの増大した利用可能性を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞。
【請求項９】
(a)ネイティブでないネイティブゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ)を発現させるための手段、及び
(b)ネイティブでないゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼを発現させるための手段
を含み、
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産する、
設計された微生物細胞。
【請求項１０】
1つ又は複数の上流(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路酵素の活性を増大させるため又は上流経路活性の調節因子の活性を増大させるための手段を含む、請求項9に記載の設計された微生物細胞。
【請求項１１】
1つ又は複数の上流(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路酵素が、ATP-クエン酸シンターゼ、アセチル-CoAシンターゼ、チオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aシンターゼ(HMG-CoAシンターゼ)、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aレダクターゼ(HMG-CoAレダクターゼ)、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ、及びゲラニル二リン酸シンターゼからなる群から選択される、請求項10に記載の設計された微生物細胞。
【請求項１２】
1つ又は複数の上流(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路酵素が、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼを含む、請求項11に記載の設計された微生物細胞。
【請求項１３】
設計された微生物細胞が、1つ又は複数の(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路前駆体を消費する1つ又は複数の酵素の活性を低減させるための手段を含み、前記低減した活性が、コントロール細胞と比較して低減している、請求項9から12のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞。
【請求項１４】
1つ又は複数の(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路前駆体を消費する1つ又は複数の酵素が、二機能性の(2E,6E)-ファルネシル二リン酸シンターゼ/ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ及び/又はゲラニルピロリン酸シンターゼを含む、請求項13に記載の設計された微生物細胞。
【請求項１５】
フィードバック脱調節されたHMG-CoAレダクターゼを発現させるための手段を更に含む、請求項9から14のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞。
【請求項１６】
より高速のアセチル-CoA合成及び/又はより低速のアセチル-CoA分解に起因して、コントロール細胞と比較してアセチル-CoAの利用可能性を増大させるための手段を含む、請求項9から15のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞。
【請求項１７】
真菌細胞を含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞。
【請求項１８】
酵母細胞を含む、請求項17に記載の設計された微生物細胞。
【請求項１９】
酵母細胞がサッカロミケス属の細胞である、請求項18に記載の設計された微生物細胞。
【請求項２０】
酵母細胞がセレビシエ種の細胞である、請求項19に記載の設計された微生物細胞。
【請求項２１】
酵母細胞がヤロウイア属の細胞である、請求項18に記載の設計された微生物細胞。
【請求項２２】
酵母細胞がリポリティカ種の細胞である、請求項21に記載の設計された微生物細胞。
【請求項２３】
ネイティブでないゲラニオールシンターゼが、ペリラ・セトエンシスのゲラニオールシンターゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するゲラニオールシンターゼを含む、請求項1から22のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞。
【請求項２４】
ネイティブでないゲラニオールシンターゼが、ヴィティス・ヴィニフェラのゲラニオールシンターゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するゲラニオールシンターゼを含む、請求項1から22のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞。
【請求項２５】
ネイティブでないゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼが、ファセオルス・アンギュラリスのゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼを含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞。
【請求項２６】
イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼの増大した活性が、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼの異種発現によって達成される、請求項4及び12から25のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞。
【請求項２７】
異種のイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼが、サッカロミセス・セレビシエのイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼを含む、請求項26に記載の設計された微生物細胞。
【請求項２８】
1つ又は複数の(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路前駆体を消費する1つ又は複数の酵素が、二機能性の(2E,6E)-ファルネシル二リン酸シンターゼ/ジメチルアリルトランストランスフェラーゼを含む、請求項6及び14から27のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞。
【請求項２９】
二機能性の(2E,6E)-ファルネシル二リン酸シンターゼ/ジメチルアリルトランストランスフェラーゼが、大腸菌の二機能性の(2E,6E)-ファルネシル二リン酸シンターゼ/ジメチルアリルトランストランスフェラーゼと少なくとも70%のアミノ酸同一性を有し、アミノ酸置換S80Fを含む、請求項28に記載の設計された微生物細胞。
【請求項３０】
HMG-CoAレダクターゼが、サッカロミセス・セレビシエのHMG-CoAレダクターゼのバリアントである、請求項7及び15から27のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞。
【請求項３１】
培養されると、培養培地1L当たり100μgよりも高いレベルで(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産する、請求項1から30のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞。
【請求項３２】
請求項1から31のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞の培養物。
【請求項３３】
基質が、炭素源、並びに、尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される窒素源を含む、請求項32に記載の培養物。
【請求項３４】
設計された微生物細胞が、培養物が600nmで10〜500の光学密度を有するような濃度で存在する、請求項32又は33に記載の培養物。
【請求項３５】
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを含む、請求項32から34のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項３６】
培養培地1L当たり100μgよりも高いレベルで(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを含む、請求項32から35のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項３７】
請求項1から31のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞を培養する方法であって、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産するために適した条件下で細胞を培養する工程を含む、方法。
【請求項３８】
最初のグルコースレベルが1〜100g/Lの範囲であり、その後に制御された糖添加が行われる、フェドバッチ培養を含む、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
発酵基質が、グルコース、並びに、尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される窒素源を含む、請求項37又は38に記載の方法。
【請求項４０】
培養物が培養の間にpH制御されている、請求項37から39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
培養物が培養の間に通気されている、請求項37から40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
設計された微生物細胞が、培養培地1L当たり100μgよりも高いレベルで(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産する、請求項37から41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを培養物から回収する工程を更に含む、請求項37から42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産するように設計された微生物細胞を使用して(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを調製するための方法であって、
(a)ネイティブでないゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ)を微生物細胞において発現させる工程、
(b)ネイティブでないゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼを微生物細胞において発現させる工程、
(c)微生物細胞を、適切な培養培地において、微生物細胞による(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産を可能にする条件下で培養する工程であって、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールが培養培地に放出される工程、及び
(d)(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを培養培地から単離する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、2017年12月7日に出願された米国特許仮出願第62/596,013号の利益を主張するものである。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の下でなされた発明に対する権利に関する記載
本発明は、DARPAによって付与された契約番号第HR0011-15-9-0014号の下で、政府支援を伴ってなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
【０００３】
参照による配列表の組み込み
本出願は配列表を含み、この配列表は、ASCIIフォーマットで電子的に提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。2018年12月5日に作成されたこのASCIIコピーは、2018-12-05_ZMGNP007WO_SeqList_ST25.txtという名称であり、327,680バイトのサイズである。
【０００４】
本開示の分野
本開示は全体として、発酵によって(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産するために微生物を設計する分野に関する。
【背景技術】
【０００５】
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール(8-ヒドロキシゲラニオール)は、天然に存在することが知られている非環式のモノテルペンである。化学合成によってテルペンアルコールを生産するための方法は、既知である(米国特許第4,107,219号)。(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールは、核となる代謝産物前駆体であるアセチル-CoAに基づいて、メバロン酸生合成経路から派生する(図1)。メバロン酸生合成経路におけるHMG-CoAレダクターゼは、フィードバック阻害を受ける[1、2]。8-ヒドロキシゲラニオールは、モノテルペンインドールアルカロイド[3]及びモノテルペングリコシド(JP2013158298A[4]、米国特許第9,518,282号)の前駆体である。テルペンは、新規なポリエステル材料を調製するために使用されている[5]。ヒートシール性のテルペンポリマーフィルムが調製されている(米国特許第3,278,646号)。水素化テルペンは、ポリマーブレンドにおいて使用されている(米国特許第3,361,849号)。テルペン樹脂及びテルペン-フェノール樹脂が調製されており、自動車産業のためのコーティング保護フィルムとして使用されている(米国特許第5,643,676号)。テルペンは、包装フィルム材料として使用するために高い防湿特性を有する配向ポリプロピレンフィルムに組み込まれている(米国特許第5,500,282号)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第4,107,219号
【特許文献２】JP2013158298A
【特許文献３】米国特許第9,518,282号
【特許文献４】米国特許第3,278,646号
【特許文献５】米国特許第3,361,849号
【特許文献６】米国特許第5,643,676号
【特許文献７】米国特許第5,500,282号
【特許文献８】米国特許出願公開第20170159045号
【特許文献９】米国特許出願第62/455,428号
【特許文献１０】WO2001031027A1
【特許文献１１】米国特許第8,715,962号
【特許文献１２】米国特許出願公開第2011/0045563号
【特許文献１３】米国特許第7,659,097号
【特許文献１４】米国特許出願公開第2010/0297749号
【特許文献１５】国際公開第WO2011/034863号
【特許文献１６】米国特許出願公開第2009/0282545号
【特許文献１７】米国特許出願公開第2014/0068797号
【特許文献１８】米国特許出願公開第2014-0315985号
【特許文献１９】米国特許出願公開第2009/0203102号
【特許文献２０】米国特許出願公開第2010/0003716号
【特許文献２１】米国特許出願公開第2010/0048964号
【特許文献２２】国際公開第WO 2004/033646号
【特許文献２３】国際公開第WO 2009/076676号
【特許文献２４】国際公開第WO 2009/132220号
【特許文献２５】国際公開第WO 2010/003007号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Berka & Barnett、Biotechnology Advances、(1989)、7(2):127〜154
【非特許文献２】Romanosら、Yeast、(1992)8(6):423〜488
【非特許文献３】Saunders & Warmbrodt、「Gene Expression in Algae and Fungi, Including Yeast」(1993)、National Agricultural Library、Beltsville、Md.
【非特許文献４】Lindbergら、MetaB. Eng.、(2010)12(1):70〜79
【非特許文献５】「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第4版(Sambrookら、2012)
【非特許文献６】「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait編、1984)
【非特許文献７】「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications」(R. I. Freshney編、第6版、2010)
【非特許文献８】「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.)
【非特許文献９】「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubelら編、1987及び定期更新)
【非特許文献１０】「PCR: The Polymerase Chain Reaction」(Mullisら編、1994)
【非特許文献１１】Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology、第2版、J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)
【非特許文献１２】Goeddel、Gene Expression Technology: Methods In Enzymology 185、Academic Press、San Diego、Calif. (1990)
【非特許文献１３】Jinek Mら、「A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity」、Science 337:816〜21、2012
【非特許文献１４】「In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9」、Nature 520(7546):186〜91、2015年4月9日
【非特許文献１５】Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardtら編、American Society for Microbiology、Washington、D.C. (1994)
【非特許文献１６】Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology、第2版(1989) Sinauer Associates, Inc.、Sunderland、Mass
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、以下を含む、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産するための、設計された微生物細胞、当該微生物細胞の培養物、及び方法を含む。
【０００９】
実施形態1:(a)ネイティブでないゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ)、及び(b)ネイティブでないゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼを発現し、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産する、設計された微生物細胞。
【００１０】
実施形態2:1つ若しくは複数の上流(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路酵素の増大した活性、又は上流経路活性の調節因子の増大した活性を含み、前記増大した活性が、コントロール細胞と比較して増大している、実施形態1に記載の設計された微生物細胞。
【００１１】
実施形態3:1つ又は複数の上流(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路酵素が、ATP-クエン酸シンターゼ、アセチル-CoAシンターゼ、チオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aシンターゼ(HMG-CoAシンターゼ)、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aレダクターゼ(HMG-CoAレダクターゼ)、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ、及びゲラニル二リン酸シンターゼからなる群から選択される、実施形態2に記載の設計された微生物細胞。
【００１２】
実施形態4:1つ又は複数の上流(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路酵素が、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼを含む、実施形態3に記載の設計された微生物細胞。
【００１３】
実施形態5:1つ又は複数の(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路前駆体を消費する1つ又は複数の酵素の低減した活性を含み、前記低減した活性が、コントロール細胞と比較して低減している、実施形態1から4のいずれか一つに記載の設計された微生物細胞。
【００１４】
実施形態6:1つ又は複数の(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路前駆体を消費する1つ又は複数の酵素が、二機能性の(2E,6E)-ファルネシル二リン酸シンターゼ/ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ及び/又はゲラニルピロリン酸シンターゼを含む、実施形態5に記載の設計された微生物細胞。
【００１５】
実施形態7:フィードバック脱調節されたHMG-CoAレダクターゼを更に発現する、実施形態1から6のいずれか一つに記載の設計された微生物細胞。
【００１６】
実施形態8:より高速のアセチル-CoA合成及び/又はより低速のアセチル-CoA分解に起因する、コントロール細胞と比較してのアセチル-CoAの増大した利用可能性を含む、実施形態1から7のいずれか一つに記載の設計された微生物細胞。
【００１７】
実施形態9:(a)ネイティブでないネイティブゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ)を発現させるための手段、及び(b)ネイティブでないゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼを発現させるための手段を含み、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産する、設計された微生物細胞。
【００１８】
実施形態10:1つ又は複数の上流(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路酵素の活性を増大させるため又は上流経路活性の調節因子の活性を増大させるための手段を含む、実施形態9に記載の設計された微生物細胞。
【００１９】
実施形態11:1つ又は複数の上流(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路酵素が、ATP-クエン酸シンターゼ、アセチル-CoAシンターゼ、チオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aシンターゼ(HMG-CoAシンターゼ)、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aレダクターゼ(HMG-CoAレダクターゼ)、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ、及びゲラニル二リン酸シンターゼからなる群から選択される、実施形態10に記載の設計された微生物細胞。
【００２０】
実施形態12:1つ又は複数の上流(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路酵素が、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼを含む、実施形態11に記載の設計された微生物細胞。
【００２１】
実施形態13:設計された微生物細胞が、1つ又は複数の(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路前駆体を消費する1つ又は複数の酵素の活性を低減させるための手段を含み、前記低減した活性が、コントロール細胞と比較して低減している、実施形態9から12のいずれか一つに記載の設計された微生物細胞。
【００２２】
実施形態14:1つ又は複数の(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路前駆体を消費する1つ又は複数の酵素が、二機能性の(2E,6E)-ファルネシル二リン酸シンターゼ/ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ及び/又はゲラニルピロリン酸シンターゼを含む、実施形態13に記載の設計された微生物細胞。
【００２３】
実施形態15:フィードバック脱調節されたHMG-CoAレダクターゼを発現させるための手段を更に含む、実施形態9から14のいずれか一つに記載の設計された微生物細胞。
【００２４】
実施形態16:より高速のアセチル-CoA合成及び/又はより低速のアセチル-CoA分解に起因して、コントロール細胞と比較してアセチル-CoAの利用可能性を増大させるための手段を含む、実施形態9から15のいずれか一つに記載の設計された微生物細胞。
【００２５】
実施形態17:真菌細胞を含む、実施形態1から16のいずれか一つに記載の設計された微生物細胞。
【００２６】
実施形態18:酵母細胞を含む、実施形態17に記載の設計された微生物細胞。
【００２７】
実施形態19:酵母細胞がサッカロミケス属(Saccharomyces)の細胞である、実施形態18に記載の設計された微生物細胞。
【００２８】
実施形態20:酵母細胞がセレビシエ(cerevisiae)種の細胞である、実施形態19に記載の設計された微生物細胞。
【００２９】
実施形態21:酵母細胞がヤロウイア属(Yarrowia)の細胞である、実施形態18に記載の設計された微生物細胞。
【００３０】
実施形態22:酵母細胞がリポリティカ(lipolytica)種の細胞である、実施形態21に記載の設計された微生物細胞。
【００３１】
実施形態23:ネイティブでないゲラニオールシンターゼが、ペリラ・セトエンシス(Perilla setoyensis)のゲラニオールシンターゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するゲラニオールシンターゼを含む、実施形態1から22のいずれか一つに記載の設計された微生物細胞。
【００３２】
実施形態24:ネイティブでないゲラニオールシンターゼが、ヴィティス・ヴィニフェラ(Vitis vinifera)のゲラニオールシンターゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するゲラニオールシンターゼを含む、実施形態1から22のいずれか一つに記載の設計された微生物細胞。
【００３３】
実施形態25:ネイティブでないゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼが、ファセオルス・アンギュラリス(Phaseolus angularis)のゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼを含む、実施形態1から23のいずれか一つに記載の設計された微生物細胞。
【００３４】
実施形態26:イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼの増大した活性が、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼの異種発現によって達成される、実施形態4及び12から25のいずれか一つに記載の設計された微生物細胞。
【００３５】
実施形態27:異種イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼが、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼを含む、実施形態26に記載の設計された微生物細胞。
【００３６】
実施形態28:1つ又は複数の(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路前駆体を消費する1つ又は複数の酵素が、二機能性の(2E,6E)-ファルネシル二リン酸シンターゼ/ジメチルアリルトランストランスフェラーゼを含む、実施形態6及び14から27のいずれか一つに記載の設計された微生物細胞。
【００３７】
実施形態29:二機能性の(2E,6E)-ファルネシル二リン酸シンターゼ/ジメチルアリルトランストランスフェラーゼが、大腸菌(Escherichia coli)の二機能性の(2E,6E)-ファルネシル二リン酸シンターゼ/ジメチルアリルトランストランスフェラーゼと少なくとも70%のアミノ酸同一性を有し、アミノ酸置換S80Fを含む、実施形態28に記載の設計された微生物細胞。
【００３８】
実施形態30:HMG-CoAレダクターゼが、サッカロミセス・セレビシエ(S. cerevisiae)のHMG-CoAレダクターゼのバリアントである、実施形態7及び15から27のいずれか一つに記載の設計された微生物細胞。
【００３９】
実施形態31:培養されると、培養培地1L当たり100μgよりも高いレベルで(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産する、実施形態1から30のいずれか一つに記載の設計された微生物細胞。
【００４０】
実施形態32:実施形態1から31のいずれか一つに記載の設計された微生物細胞の培養物。
【００４１】
実施形態33:基質が、炭素源、並びに、尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される窒素源を含む、実施形態32に記載の培養物。
【００４２】
実施形態34:設計された微生物細胞が、培養物が600nmで10〜500の光学密度を有するような濃度で存在する、実施形態32又は33に記載の培養物。
【００４３】
実施形態35:(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを含む、実施形態32から34のいずれか一つに記載の培養物。
【００４４】
実施形態36:培養培地1L当たり100μgよりも高いレベルで(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを含む、実施形態32から35のいずれか一つに記載の培養物。
【００４５】
実施形態37:(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産するために適した条件下で細胞を培養する工程を含む、実施形態1から31のいずれか一項に記載の設計された微生物細胞を培養する方法。
【００４６】
実施形態38:最初のグルコースレベルが1〜100g/Lの範囲であり、その後に制御された糖添加が行われる、フェドバッチ培養を含む、実施形態37に記載の方法。
【００４７】
実施形態39:発酵基質が、グルコース、並びに、尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される窒素源を含む、実施形態37又は実施形態38に記載の方法。
【００４８】
実施形態40:培養物が培養の間にpH制御されている、実施形態37から39のいずれか一つに記載の方法。
【００４９】
実施形態41:培養物が培養の間に通気されている、実施形態37から40のいずれか一つに記載の方法。
【００５０】
実施形態42:設計された微生物細胞が、培養培地1L当たり100μgよりも高いレベルで(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産する、実施形態37から41のいずれか一つに記載の方法。
【００５１】
実施形態43:(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを培養物から回収する工程を更に含む、実施形態37から42のいずれか一つに記載の方法。
【００５２】
実施形態44:(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産するように設計された微生物細胞を使用して(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを調製するための方法であって、(a)ネイティブでないゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ)を微生物細胞において発現させる工程、(b)ネイティブでないゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼを微生物細胞において発現させる工程、(c)微生物細胞を、適切な培養培地において、微生物細胞による(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産を可能にする条件下で培養する工程であって、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールが培養培地に放出される工程、及び(d)(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを培養培地から単離する工程を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】発酵によって(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産するための経路を示す図である。
【図２】1ラウンド目の設計をされた宿主であるサッカロミセス・セレビシエによる発酵の後の、細胞外培養液において測定された(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価を示す図である。(実施例1、Table 1(表1)も参照されたい。)
【図３】2ラウンド目の設計をされた宿主であるサッカロミセス・セレビシエによる発酵の後の、細胞外培養液において測定された(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価を示す図である。(実施例1、Table 2(表2)も参照されたい。)
【図４】1ラウンド目の設計された宿主であるヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)による発酵の後の、細胞外培養液において測定された(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価を示す図である。(実施例2、Table 4(表4)も参照されたい。)
【図５】宿主の評価のための、サッカロミセス・セレビシエにおける発酵の後の、細胞外培養液において測定された(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価を示す図である。(実施例3、Table 5(表5)も参照されたい。)
【図６】4(改良)ラウンドの株のための、サッカロミセス・セレビシエにおける発酵の後の、細胞外培養液において測定された(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価を示す図である。(実施例1、Table 3(表3)も参照されたい。)
【図７】サッカロミセス・セレビシエ及びヤロウィア・リポリティカへのプロモーター-遺伝子-ターミネーターの組み込みを示す図である。
【図８】サッカロミセス・セレビシエ及びヤロウィア・リポリティカにおけるプロモーターの置き換えを示す図である。
【図９】サッカロミセス・セレビシエ及びヤロウィア・リポリティカにおける標的遺伝子の欠失を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
生物発酵による(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール等のジアルコールの生産によって、古来の材料適用及び新たに同定された材料適用のための、経済的に入手しやすいモノマーを作ることができる。ジアルコールを含有するポリマーは、新規な材料適用にとって魅力的な特性を有する。
【００５５】
本発明者らは、代謝を調べて[1]、産業用宿主生物において代謝経路による(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産を可能にする酵素を同定した(Table 1(表1)を参照されたい)。(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産を設計するために、産業用微生物には、遺伝子設計ツール及びDNA配列を操作するための方法が必要であった(図7〜図9を参照されたい)。次いで、微生物の代謝を、全ての生化学的反応又は代謝調節の態様が単一遺伝子及び複数遺伝子の修飾を使用する反復ハイスループット(HTP)株設計によって特徴付けされているわけではない産業用宿主を含む宿主において、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産するように体系的に再設計した(例えば、HTP株の設計の方法については、共有の且つ同時係属中の米国特許出願公開第20170159045号を参照されたく、また、チラミンを生産するための微生物の設計について説明している、共有の且つ同時係属中の米国特許出願第62/455,428号も参照されたい)。
【００５６】
上記のように、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールは、テルペノイド経路から代謝により生産されるモノテルペンである。微生物には、メバロネート経路及び非メバロネート経路の2つのテルペノイド生合成経路がある。サッカロミセス・セレビシエ及びヤロウィア・リポリティカの両方が、テルペンの生産にメバロネート経路を使用する[2]。
【００５７】
本開示は、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを発酵生産するための微生物細胞の設計を記載し、新規な設計された微生物細胞及び培養物、並びに関連する(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産方法を提供する。
【００５８】
定義
特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、別段の特定がない限り、以下で示す通りに定義される。
【００５９】
用語「発酵」は、微生物細胞が何らかの化学変換工程を必要とすることなく1つ又は複数の生物学的変換工程によって1つ又は複数の基質を所望の生成物((6E)-8-ヒドロキシゲラニオール等)に変換するプロセスを指すために、本明細書において使用される。
【００６０】
用語「設計された」は、細胞に関して、細胞が、設計された細胞を天然の細胞から区別する、人によって導入された少なくとも1つの標的化された遺伝子改変を含むことを示すために、本明細書において使用される。
【００６１】
用語「ネイティブな」は、特定の細胞内に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチド等の細胞成分を指すために、本明細書において使用される。ネイティブなポリヌクレオチド又はポリペプチドは、細胞に対して内因性である。
【００６２】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関して使用する場合、用語「ネイティブでない」は、特定の細胞内に天然に存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。
【００６３】
遺伝子が発現する環境に関して使用される場合、用語「ネイティブでない」は、遺伝子環境及び細胞環境以外の、遺伝子が天然に発現する任意の環境において発現する遺伝子を指す。ネイティブでない様式で発現した遺伝子は、宿主細胞における対応する遺伝子と同一のヌクレオチド配列を有し得るが、ベクターから、又はネイティブな遺伝子の遺伝子座と異なるゲノム内の組み込み点から発現し得る。
【００６４】
用語「異種の」は、宿主細胞に導入されるポリヌクレオチド又はポリペプチドを記載するために、本明細書において使用される。この用語は、宿主細胞のものとは異なる生物、種、又は株にそれぞれ由来するポリヌクレオチド又はポリペプチドを包含する。このケースにおいて、異種ポリヌクレオチド又は異種ポリペプチドは、同一の宿主細胞で見られる任意の配列と異なる配列を有する。しかし、この用語はまた、宿主細胞で見られる配列と同一の配列を有するポリヌクレオチド又はポリペプチドであって、ネイティブな配列と異なる環境で存在する(例えば、異種ポリヌクレオチドは、異なるプロモーターに連結していてよく、また、ネイティブな配列のものとは異なるゲノム位置に挿入されてよい)ポリヌクレオチド又はポリペプチドも包含する。「異種発現」は、したがって、宿主細胞にとってネイティブでない配列の発現、及び、ネイティブでない環境における、宿主細胞にとってネイティブな配列の発現を包含する。
【００６５】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関して使用される場合、用語「野生型」は、分子の由来源に関わらず、天然の生物に由来するポリヌクレオチド又はポリペプチド内に存在する、ヌクレオチド配列を有する任意のポリヌクレオチド又はアミノ酸配列を有する任意のポリペプチドを指す。すなわち、用語「野生型」は、分子が天然の由来源から精製されているか、組換えによって発現し、その後精製されているか、又は合成されているかに関わらず、配列の特徴を指す。用語「野生型」は、天然の細胞を指すためにも使用される。
【００６６】
「コントロール細胞」は、試験対象の設計された細胞に別のところでは同一であるが、例えば、設計された細胞と同一の属及び種に属するが、設計された細胞において試験される特定の遺伝子修飾を欠いている、細胞である。
【００６７】
酵素は、本明細書において、それらが触媒する反応によって同定され、そして、別段の指示がない限り、同定される反応を触媒し得る任意のポリペプチドを指す。別段の指示がない限り、酵素は、任意の生物に由来し得、ネイティブな又は突然変異したアミノ酸配列を有し得る。周知のように、酵素は、それが由来する元である由来源生物に時として応じて、複数の機能及び/又は複数の名称を有し得る。本明細書において使用される酵素名は、1つ又は複数の更なる機能又は異なる名称を有し得る酵素を含むオルソログを包含する。
【００６８】
用語「フィードバック脱調節される」は、特定の細胞における酵素経路の下流の生成物によって通常は負の調節をされる(すなわち、フィードバック阻害)酵素に関して、本明細書において使用される。この文脈において、「フィードバック脱調節される」酵素は、細胞に対してネイティブなネイティブ酵素よりもフィードバック阻害に対して感受性が低い酵素の形態である。フィードバック脱調節される酵素は、1つ又は複数の突然変異をネイティブな酵素に導入することによって生産することができる。或いは、フィードバック脱調節される酵素は、単純に、特定の微生物細胞に導入されるとネイティブなネイティブ酵素ほどにはフィードバック阻害に対して感受性ではない、異種のネイティブ酵素であり得る。一部の実施形態において、フィードバック脱調節される酵素は、微生物細胞においてフィードバック阻害を示さない。
【００６９】
用語「(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール」は、(2E,6E)-2,6-ジメチル-2,6-オクタジエン-1,8-ジオール(CAS#26488-97-1)を指す。
【００７０】
2つ以上のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の文脈における用語「配列同一性」は、配列比較アルゴリズムを使用して又は目視検査によって測定した場合に、同一であるか、又は、最大の対応となるように比較及びアラインされた場合に特定のパーセンテージの同一のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する、2つ以上の配列を指す。
【００７１】
ヌクレオチド又はアミノ酸配列の同一性のパーセントを判定するための配列の比較では、典型的には、一方の配列は「参照配列」として機能し、それに対して「試験」配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピューターにインプットし、部分配列座標を必要に応じて指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。配列比較アルゴリズムは次いで、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列の配列同一性パーセントを計算する。比較のための配列のアラインメントは、デフォルトパラメーターに設定されたBLASTを使用して行うことができる。
【００７２】
用語「力価」は、本明細書において使用される場合、微生物細胞の培養物によって生産された生成物(例えば、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール)の質量を培養物の容積で割ったものを指す。
【００７３】
細胞培養物からの(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの回収に関して本明細書において使用される場合、「回収すること」は、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを細胞培養培地の少なくとも1つの他の成分から分離することを指す。
【００７４】
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産するための微生物の設計
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生合成経路
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールは、核となる代謝産物前駆体であるアセチル-CoAに基づいて、メバロン酸生合成経路から派生する。この経路は、図1で説明されている。メバロン酸生合成経路におけるHMG-CoAレダクターゼは、フィードバック阻害を受ける。サッカロミセス・セレビシエ等の多くの微生物は、この経路における最後の2つの工程を触媒する酵素、すなわち、ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ)及びゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼを欠いている。このような微生物宿主における(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産は、少なくとも1つの異種ゲラニオールシンターゼ酵素及び少なくとも1つの異種ゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼの添加を要する。
【００７５】
微生物による(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産のための設計
設計されている微生物細胞において活性な任意のゲラニオールシンターゼ及びゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼを、典型的には、標準的な遺伝子設計技術を使用してこれらの酵素をコードする遺伝子を導入すること及び発現させることによって、細胞に導入することができる。適切なゲラニオールシンターゼ及びゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼは、植物由来源、古細菌由来源、真菌由来源、グラム陽性細菌由来源、及びグラム陰性細菌由来源を含む、任意の由来源に由来し得る。典型的な由来源としては、限定はしないが、ペリラ・セトエンシス、ファセオルス・アンギュラリス、ヴィティス・ヴィニフェラ(ブドウ)、スウェルティア・ムソティ(Swertia mussotii)(リンドウ(Felwort))、ポプルス・トリコカルパ(Populus trichocarpa)(ウェスタンバルサムポプラ)(ポプルス・バルサミフェラ亜種トリコカルパ(Populus balsamifera subsp. Trichocarpa))、パパベル・ソムニフェルム(Papaver somniferum)、ペトロセリヌム・クリスプム(Petroselinum crispum)、オリザ・サティバ(Oryza sativa)、メタノスフェルラ・パルストリス(Methanosphaerula palustris)、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ(Methanocaldococcus jannaschii)、チゴサッカロミセス・バイリイ(Zygosaccharomyces bailii)、ペニシリウム・マルネッフェイ(Penicillium marneffei)、タラロミセス・スティピタトゥス(Talaromyces stipitatus)、トリコフィトン・エクイヌム(Trichophyton equinum)、プロピオニバクテリウム菌種オーラル(Propionibacterium sp. oral)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス(Streptomyces hygroscopicus)、ストレプトマイセス・スビセウス(Streptomyces sviceus)、モデストバクター・マリヌス(Modestobacter marinus)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シノリゾビウム・フレディ(Sinorhizobium fredii)、Cathatanthus roseaus、ゼア・メイズ(Zea mays)、カサランサス・ロセウス(Catharanthus roseus)(ニチニチソウ)(ビンカ・ロセア(Vinca rosea))、ペリラ・フルテスケンス変種クリスパ(Perilla frutescens var. crispa)、ペリラ・フルテスケンス変種ヒルテラ(Perilla frutescens var. hirtella)、シナモマム・テヌイピル(Cinnamomum tenuipile)(アルセオダフネ・モリス(Alseodaphne mollis))、オシマム・バシリクム(Ocimum basilicum)(スイートバジル)、ペリラ・シトリオドラ(Perilla citriodora)、オレア・ユーロピア(Olea europaea)(オリーブ)、フィラ・デュルキス(Phyla dulcis)(スイートハーブ・メキシカン)(リッピア・デュルキス(Lippia dulcis))、ロサ・ルゴサ(Rosa rugosa)(ハマナス)、カンプトテカ・アクミナタ(Camptotheca acuminata)(カンレンボク)、シトラス・ヤムヒリ(Citrus jambhiri)ラフレモン)、ピクロリザ・クルロオア(Picrorhiza kurrooa)、アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)(シロイヌナズナ)、グリシン・マックス(Glycine max)(ダイズ)(グリシン・ヒスピダ(Glycine hispida))、ベータ・ブルガリス(Beta vulgaris)(サトウダイコン)、モルゴ・ベルチシラタ(Mollugo verticillata)(クルマバザクロソウ)、アムボレラ・トリコポダ(Amborella trichopoda)、ソラヌム・ツベロスム(Solanum tuberosum)(ジャガイモ)、グリシン・ソーヤ(Glycine Soja)(ツルマメ)、バンダ・セルレア(Vanda coerulea)、オリザ・バーシー(Oryza barthii)、ヒペリカム・アンドロサエマム(Hypericum androsaemum)(コボウズオトギリ)、ソラヌム・リコペルシクム(Solanum lycopersicum)(トマト)(リコペルシコン・エスクレンタム(Lycopersicon esculentum))、及びコフィア・カネフ���ラ(Coffea canephora)(ロブスタコーヒーノキ)が含まれる。
【００７６】
ゲラニオールシンターゼ遺伝子及びゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼ遺伝子の各々の1つ又は複数のコピーを、選択された微生物宿主細胞に導入することができる。遺伝子の2つ以上のコピーが導入される場合、これらのコピーは、同一の又は異なるヌクレオチド配列を有し得るコピーであり得る。一部の実施形態において、異種遺伝子の一方又は両方が、強力な構成的プロモーターから発現される。一部の実施形態において、異種ゲラニオールシンターゼ遺伝子及び/又は異種ゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼ遺伝子が、誘導性プロモーターから発現される。異種遺伝子は、場合によって、選択された微生物宿主細胞における発現を増強させるためにコドン最適化されてよい。
【００７７】
実施例1において、サッカロミセス・セレビシエを、ペリラ・セトエンシス由来のゲラニオールシンターゼ(UniProt ID C0KWV4)(配列番号5)及びファセオルス・アンギュラリス由来のゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼ(UniProt ID C6J436)(配列番号11)を発現するように設計し、それによって、1ラウンド目の遺伝子設計において37.5μg/Lの(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール力価を得た(以下のTable(表1))。この力価は、イソペンテニル二リン酸デルタ3-デルタ2-イソメラーゼ(UniProt ID P15496)(配列番号25)の3つのコピーを更に発現した株において、2ラウンド目で122.9μg/Lまで増大した。
【００７８】
実施例2において、ヤロウィア・リポリティカを、ペリラ・セトエンシス由来のゲラニオールシンターゼ(UniProt ID C0KWV4)(配列番号99)、ファセオルス・アンギュラリス由来のゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(UniProt ID A0A0L9UT99)(配列番号115)、及びサッカロミセス・セレビシエ由来のイソペンテニル二リン酸デルタ3-デルタ2-イソメラーゼ(UniProt ID P15496)(配列番号126)を発現するように設計し、それによって、310マイクログラム/Lの(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール力価を得た。
【００７９】
実施例3において、サッカロミセス・セレビシエを、ペリラ・セトエンシス由来のゲラニオールシンターゼ(UniProt ID C0KWV4)(配列番号99)、ファセオルス・アンギュラリス由来のゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼ(UniProt ID C6J436)、及びサッカロミセス・セレビシエ由来のイソペンテニル二リン酸デルタ3-デルタ2-イソメラーゼ(UniProt ID P15496)(配列番号126)を発現するように設計し、それによって、217マイクログラム/Lの(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール力価を得た。
【００８０】
上流酵素活性の増大
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産が可能な微生物細胞におけるこのような生産を増大させるための1つのアプローチは、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生合成経路における1つ又は複数の上流酵素活性を増大させることである。上流経路酵素は、原料から遥かネイティブな最終代謝産物(すなわち、サッカロミセス・セレビシエにおけるゲラニル二リン酸)までの変換に関与する全ての酵素を含む。ある特定の実施形態において、上流経路酵素は、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールをもたらす経路における鍵となる前駆体からゲラニル二リン酸への変換に関与する酵素を具体的に指す。このような遺伝子としては、ATP-クエン酸シンターゼ、アセチル-CoAシンターゼ、チオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aシンターゼ(HMG-CoAシンターゼ)、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aレダクターゼ(HMG-CoAレダクターゼ)、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ(系統名:イソペンテニル二リン酸デルタ2-デルタ3-イソメラーゼ)、及びゲラニル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子が含まれる。適切な上流経路遺伝子は、例えば、異種ゲラニオールシンターゼ遺伝子又は異種ゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼ遺伝子の由来源として上記で論じられたものを含む、任意の由来源に由来し得る。
【００８１】
一部の実施形態において、1つ又は複数の上流経路酵素の活性は、ネイティブな酵素の発現又は活性を調節することによって増大する。このアプローチの例としては、(1)(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路の前駆体であるゲラニル二リン酸のレベルを増大させるための、HMG-CoAレダクターゼの過剰発現及び/若しくはゲラニル二リン酸シンターゼの構成的過剰発現、並びに/又は、(2)アセチル-CoAの利用可能性を向上させるための、ATP-クエン酸シンターゼ(P53396)及び/若しくはアセチル-CoAシンターゼ(ACS、Q8ZKF6)の過剰発現が含まれる。
【００８２】
ネイティブな上流経路酵素の発現は、上流経路活性の1つ又は複数の天然の調節因子によって増大させることができる。例えば、イソプレノイド経路酵素の発現を向上させるために、ステロール取り込み制御タンパク質のバリアントであるUPC2(UniProt ID Q12151;G888D又はG888R[これらの指定は、アミノ酸の標準的な1文字コードを使用したアミノ酸置換を示し、最初の文字が野生型残基を指し、最後の文字が置き換え残基を指し、数字が翻訳されたタンパク質におけるアミノ酸置換の位置を示す]のいずれかを含有する、サッカロミセス・セレビシエS288c由来のもの)を導入し、場合によって過剰発現させることができる[6、7]。ステロール取り込み制御タンパク質UPC2はステロール合成を調節し、C末端のアミノ酸置換はこの転写因子の活性を増大させる。例えば、ERG8の上流のUPC2結合エレメントは、他のステロール生合成経路遺伝子に加えて、ERG8のUPC2転写活性化を可能にする[7]。
【００８３】
或いは、又は更に、1つ又は複数のプロモーターを、例えば図5で示すもののような技術を使用して、ネイティブなプロモーターについて置換することができる。ある特定の実施形態において、置き換えプロモーターは、ネイティブなプロモーターよりも強力であり、及び/又は構成的プロモーターである。
【００８４】
一部の実施形態において、1つ又は複数の上流経路酵素の活性は、対応する遺伝子の1つ又は複数を、ゲラニオールシンターゼを発現する微生物宿主細胞及びゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼを発現する微生物宿主細胞に導入することによって、補われる。実施例1は、異種ゲラニオールシンターゼ及び異種ゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼを、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼをコードする導入遺伝子と共に発現させるための、微生物宿主細胞の成功裏の設計を記載する。
【００８５】
導入された上流経路遺伝子は、宿主細胞の生物以外の生物に由来し得るか、又は単にネイティブな遺伝子の更なるコピーであり得る。一部の実施形態において、1つ又は複数のこのような遺伝子は、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産が可能な微生物宿主細胞に導入されており、強力な構成的プロモーターから発現され、及び/又は、場合によって、選択された微生物宿主細胞における発現を増強させるためにコドン最適化され得る。
【００８６】
様々な実施形態において、1つ又は複数の上流経路酵素の活性を増大させるための、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産する微生物細胞の設計は、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価を、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、若しくは90パーセント、又は少なくとも2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、若しくは100倍増大させる。様々な実施形態において、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価の増大は、10パーセントから100倍、2倍から50倍、5倍から40倍、10倍から30倍の範囲、又は上記に列挙した値のいずれかを限界とする任意の範囲内にある(本明細書における範囲は、そのエンドポイントを含む)。これらの増大は、上流経路酵素の活性が全く増大していない(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール生産微生物細胞において見られる(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価と比較して決定される。この参照細胞は、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産の増大を目的とした1つ又は複数の他の遺伝子改変を有し得、例えば、参照細胞は、フィードバック脱調節される酵素を発現し得る。
【００８７】
様々な実施形態において、1つ又は複数の上流経路遺伝子の活性の増大によって達成される(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価は、少なくとも100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900μg/L、又は少なくとも1、10、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900mg/L、又は少なくとも1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、若しくは10グラム/Lである。様々な実施形態において、力価は、100μg/Lから10グラム/L、200μg/Lから5グラム/L、500μg/Lから4グラム/L、1mg/Lから3グラム/L、500mg/Lから2グラム/Lの範囲、又は上記に列挙した値のいずれかを限界とする任意の範囲内にある。
【００８８】
フィードバック脱調節される酵素の導入
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生合成はフィードバック阻害を受けるため、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産するように設計された微生物細胞における(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産を増大させるための別のアプローチは、フィードバック調節を通常は受ける1つ又は複数の酵素のフィードバック脱調節された形態を導入することである。HMG-CoAレダクターゼは、1つのこのような酵素である。フィードバック脱調節された形態は、特定の微生物宿主細胞におけるネイティブな酵素ほどにはフィードバック阻害に対して感受性ではない、異種のネイティブな酵素であり得る。或いは、フィードバック脱調節された形態は、その酵素を対応するネイティブな酵素ほどにはフィードバック阻害に対して感受性ではなくする1つ又は複数の突然変異又はトランケーションを有する、ネイティブな酵素又は異種酵素のバリアントであり得る。このようなバリアントの例としては、N末端トランケーションを有するバリアントHMG-CoAレダクターゼ(サッカロミセス・セレビシエに由来する)(配列番号27)が含まれる。宿主細胞におけるこのフィードバック脱調節されたHMG-CoAレダクターゼの発現は、サッカロミセス・セレビシエ[3]及び他の生物におけるメバロネート経路フラックスを改善することが示されている(例えば、植物の遺伝子設計について記載しているPCT公開第WO2001031027A1を参照されたい)。
【００８９】
様々な実施形態において、フィードバック脱調節される酵素を発現させるための、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産する微生物細胞の設計は、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価を、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、若しくは90パーセント、又は少なくとも2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、若しくは100倍増大させる。様々な実施形態において、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価の増大は、10パーセントから100倍、2倍から50倍、5倍から40倍、10倍から30倍の範囲、又は上記に列挙した値のいずれかを限界とする任意の範囲内にある。これらの増大は、フィードバック脱調節される酵素を発現しない(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール生産微生物細胞において見られる(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価と比較して決定される。この参照細胞は、(必ずしも必要ではないが)(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産を増大させることを目的とした他の遺伝子改変を有し得、すなわち、細胞は、フィードバック非感受性以外の一部の手段から生じる上流経路酵素の増大した活性を有し得る。
【００９０】
様々な実施形態において、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール生合成経路を経るフラックスを増大させるための、フィードバック脱調節される酵素を使用することによって達成される(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価は、少なくとも100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900μg/L、又は少なくとも1、10、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900mg/L、又は少なくとも1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、若しくは10g/Lである。様々な実施形態において、力価は、100μg/Lから10g/L、200μg/Lから5g/L、500μg/Lから4g/L、1mg/Lから3g/L、500mg/Lから2g/Lの範囲、又は上記に列挙した値のいずれかを限界とする任意の範囲内にある。
【００９１】
1つ若しくは複数のネイティブな酵素の活性を補う及び/又は1つ若しくは複数のフィードバック脱調節される酵素を導入するアプローチを、ゲラニオールシンターゼを発現する微生物細胞内で組み合わせて、更に高い(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産レベルを達成することができる。
【００９２】
前駆体の消費の低減
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産が可能な微生物細胞におけるこのような生産を増大させるための別のアプローチは、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール生合成の1つ又は複数の前駆体を1つ又は複数の副経路(すなわち、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール以外の生成物を生じさせる経路)にそらす1つ又は複数の酵素の活性を低下させることである。一部の実施形態において、1つ又は複数の副経路酵素の活性は、ネイティブな酵素の発現又は活性を調節することによって低減する。例示的な副経路酵素としては、二機能性の(2E,6E)-ファルネシル二リン酸シンターゼ/ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、及びアセチルCo-Aを消費するあらゆる副経路酵素が含まれる。このような酵素の活性は、例えば、対応する遺伝子のネイティブなプロモーターをあまり活性でない若しくは不活性なプロモーターで置換することによって、又は対応する遺伝子を欠失させることによって、低下させることができる。サッカロミセス・セレビシエにおける、それぞれプロモーターの置き換え及び標的遺伝子の欠失についてのスキームの例としては、図5及び図6を参照されたい。
【００９３】
ネイティブな二機能性の(2E,6E)-ファルネシル二リン酸シンターゼ/ジメチルアリルトランストランスフェラーゼは、二機能性であり、ゲラニル二リン酸を形成し得、その後、第2の反応が、ゲラニル二リン酸を(2E,6E)-ファルネシル二リン酸に変換し得る。ネイティブな酵素はこれら2つの活性を有し、中間体は(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路の代謝産物であるため、ネイティブな二機能性の(2E,6E)-ファルネシル二リン酸シンターゼ/ジメチルアリルトランストランスフェラーゼの発現を低下させることが有利である。しかし、S80Fアミノ酸置換を有する酵素の発現は、測定可能な量のモノテルペノイドを生産する[4](米国特許第8,715,962号も参照されたい)。例えば、ステロールへの更なるフラックスを防ぐために、サッカロミセス・セレビシエにおいてERG9によってコードされる二機能性のファルネシル二リン酸ファルネシルトランスフェラーゼ(EC 2.5.1.21)、及び/又は、サッカロミセス・セレビシエにおいてERG20によってコードされる(2E,6E)-ファルネシル二リン酸シンターゼ(EC 2.5.1.10)の発現又は活性が下げられて、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール生合成のためのゲラニル二リン酸のプールが最大化される。
【００９４】
サッカロミセス・セレビシエにおける例示的な実施形態において、(1)二機能性の(2E,6E)-ファルネシル二リン酸シンターゼ/ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ(ERG20、YJL167W)のプロモーターを、サッカロミセス・セレビシエのpRnr1プロモーターで置き換えて、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール経路の代謝産物であるゲラニル二リン酸を消費するこのネイティブな酵素の発現を低下させることができる、(2)ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ(Bts1、YPL069C)のプロモーターを、サッカロミセス・セレビシエのpPsp2で置き換えて、ゲラニル二リン酸も消費するこのネイティブな酵素の発現を低下させることができる、並びに/又は、遺伝子Pdc5(YLR134W)、Pdc6(YGR087C)、及びPdc1(YLR044C)の1つ若しくは複数を欠失させて、アセチル-CoAの消費を低減させることができる。
【００９５】
様々な実施形態において、1つ又は複数の副経路による前駆体の消費を低減させるための(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産する微生物細胞の設計は、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価を、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、若しくは90パーセント、又は少なくとも2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、若しくは100倍増大させる。様々な実施形態において、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価の増大は、10パーセントから100倍、2倍から50倍、5倍から40倍、10倍から30倍の範囲、又は上記に列挙した値のいずれかを限界とする任意の範囲内にある。これらの増大は、前駆体の消費を低減させるための遺伝子改変を含まない(6E)-8-ヒドロキシゲラニオール生産微生物細胞において見られる(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価と比較して決定される。この参照細胞は、(必ずしも必要ではないが)(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産を増大させることを目的とした他の遺伝子改変を有し、すなわち、細胞は、上流経路酵素の増大した活性を有し得る。
【００９６】
様々な実施形態において、1つ又は複数の副経路による前駆体の消費を低減させることによって達成される(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価は、少なくとも100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900μg/L、又は少なくとも1、10、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900mg/L、又は少なくとも1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、若しくは10g/Lである。様々な実施形態において、力価は、100μg/Lから10g/L、200μg/Lから5グラム/L、500μg/Lから4g/L、1mg/Lから3g/L、500mg/Lから2g/Lの範囲、又は上記に列挙した値のいずれかを限界とする任意の範囲内にある。
【００９７】
1つ若しくは複数のネイティブな酵素の活性を増大させるアプローチ、及び/又は1つ若しくは複数のフィードバック脱調節される酵素を導入するアプローチ、及び/又は1つ若しくは複数の副経路による前駆体の消費を低減させるアプローチを組み合わせて、更に高い(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産レベルを達成することができる。
【００９８】
微生物宿主細胞
導入された遺伝子を発現させるために使用され得る任意の微生物を、上記のような(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの発酵生産のために設計することができる。ある特定の実施形態において、微生物は、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの発酵生産が天然では不可能である微生物である。一部の実施形態において、微生物は、例えば、目的の化合物の発酵生産において宿主細胞として有用であることが知られている微生物等の、容易に培養される微生物である。グラム陽性細菌又はグラム陰性細菌を含む細菌細胞を、上記のように設計することができる。例としては、コリネバクテリウム・グルタミクム(C. glutamicum)の細胞に加えて、バチルス・サブティリス(Bacillus subtilus)、バチルス・リケニフォルミス(B. licheniformis)、バチルス・レンタス(B. lentus)、バチルス・ブレビス(B. brevis)、バチルス・ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)、バチルス・アルカロフィルス(B. alkalophilus)、バチルス・アミロリクエファシエンス(B. amyloliquefaciens)、バチルス・クラウジ(B. clausii)、バチルス・ハロデュランス(B. halodurans)、バチルス・メガテリウム(B. megaterium)、バチルス・コアギュランス(B. coagulans)、バチルス・サーキュランス(B. circulans)、バチルス・ロータス(B. lautus)、バチルス・チューリンギエンシス(B. thuringiensis)、ストレプトマイセス・アルブス(S. albus)、ストレプトマイセス・リビダンス(S. lividans)、ストレプトマイセス・セリカラー(S. coelicolor)、ストレプトマイセス・グリセウス(S. griseus)、シュードモナス属菌種(Pseudomonas sp.)、シュードモナス・アルカリゲネス(P. alcaligenes)、P.シトレア(P. citrea)、ラクトバチルス菌種(Lactobacilis spp.)(ラクトバチルス・ラクティス(L. lactis)、ラクトバチルス・プランタルム(L. plantarum)等)、L.グレイ(L. grayi)、大腸菌(E. coli)、エンテロコッカス・フェシウム(E. faecium)、エンテロコッカス・ガリナルム(E. gallinarum)、エンテロコッカス・カセリフラバス(E. casseliflavus)、及び/又はエンテロコッカス・フェカリス(E. faecalis)の細胞が含まれる。
【００９９】
本明細書において記載される方法において微生物宿主細胞として使用することができる多くのタイプの嫌気性細胞が存在する。一部の実施形態において、微生物細胞は、偏性嫌気性細胞である。偏性嫌気性細菌は、酸素が存在する条件下では、典型的にはあまり良く成長しない。少量の酸素が存在し得ること、すなわち、偏性嫌気性細菌が低レベルの酸素に対してある程度のレベルの耐性レベルを有することが理解される。上記のように設計された偏性嫌気性細菌は、存在する酸素の量が嫌気性細菌の成長、維持、及び/又は発酵に対して無害であるほぼ無酸素の条件下で成長することができる。
【０１００】
或いは、本明細書において記載される方法において使用される微生物宿主細胞は、通性嫌気性細胞であり得る。通性嫌気性細菌は、酸素が存在すれば、好気性の呼吸(例えば、TCAサイクルの利用)によって細胞ATPを生成し得る。しかし、通性嫌気性細菌はまた、酸素の不存在下でも成長することができる。上記のように設計された通性嫌気性細菌は、存在する酸素の量が嫌気性細菌の成長、維持、及び/若しくは発酵に対して無害であるほぼ無酸素の条件下で成長することができ、又は、より多くの量の酸素の存在下で或いは成長することができる。
【０１０１】
一部の実施形態において、本明細書において記載される方法において使用される微生物宿主細胞は、糸状真菌細胞である(例えば、Berka & Barnett、Biotechnology Advances、(1989)、7(2):127〜154を参照されたい)。例としては、トリコデルマ・ロンギブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・ビリデ(T. viride)、トリコデルマ・コニンギ(T. koningii)、トリコデルマ・ハルジアナム(T. harzianum)、ペニシリウム属菌種(Penicillium sp.)、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、フミコラ・ラヌギノセ(H. lanuginose)、フミコラ・グリセア(H. grisea)、クリソスポリウム属菌種(Chrysosporium sp.)、クリソスポリウム・ルクノウエンス(C. lucknowense)、グリオクラジウム属菌種(Gliocladium sp.)、アスペルギルス属菌種(Aspergillus sp.)(アスペルギルス・オリゼー(A. Oryzae)、アスペルギルス・ニガー(A. niger)、アスペルギルス・ソーエ(A. Sojae)、アスペルギルス・ジャポニクス(A. japonicus)、アスペルギルス・ニデュランス(A. nidulans)、又はアスペルギルス・アワモリ(A. awamori)等)、フザリウム属菌種(Fusarium sp.)(フザリウム・ロゼウム(F. roseum)、フザリウム・グラミヌム(F. graminum)、フザリウム・セラリス(F. cerealis)、フザリウム・オキシスポルム(F. oxysporuim)、又はフザリウム・ベネナツム(F. venenatum)等)、ニューロスポラ属菌種(Neurospora sp.)(ニューロスポラ・クラッサ(N. crassa)又はヒポクレア菌種(Hypocrea sp.)等)、ケカビ属菌種(Mucor sp.)(ムコール・ミーハイ(M. miehei)等)、クモノスカビ属菌種(Rhizopus sp.)、及びエメリセラ属菌種(Emericella sp.)の細胞が含まれる。特定の実施形態において、上記のように設計された真菌細胞は、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・アクレトゥス(A. aculeatus)、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ジャポニクス、トリコデルマ・リーセイ(T. reesei)、トリコデルマ・ビリデ、フザリウム・オキシスポラム(F. oxysporum)、又はフザリウム・ソラニ(F. solani)である。このような宿主と共に使用するための例示的なプラスミド又はプラスミド成分としては、米国特許出願公開第2011/0045563号において記載されているものが含まれる。
【０１０２】
酵母もまた、本明細書において記載される方法において微生物宿主細胞として使用することができる。例としては、サッカロミケス属菌種(Saccharomyces sp.)、シゾサッカロミセス属菌種(Schizosaccharomyces sp.)、ピキア属菌種(Pichia sp.)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピキア・スティピティス(Pichia stipites)、クルイベロミセス・マーキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、クルイベロミセス属菌種(Kluyveromyces sp.)、ヤロウィア・リポリティカ、及びカンジダ属菌種(Candida sp.)が含まれる。一部の実施形態において、サッカロミケス属菌種は、サッカロミセス・セレビシエである(例えば、Romanosら、Yeast、(1992)8(6):423〜488を参照されたい)。このような宿主と共に使用するための例示的なプラスミド又はプラスミド成分としては、米国特許第7,659,097号及び米国特許出願公開第2011/0045563号において記載されているものが含まれる。
【０１０３】
一部の実施形態において、宿主細胞は、藻類細胞に由来するもの、例えば、緑藻類、紅藻類、灰色藻、クロララクニオン藻、ユーグレナ藻、クロミスタ、又は渦鞭毛藻に由来するものであり得る。(例えば、Saunders & Warmbrodt、「Gene Expression in Algae and Fungi, Including Yeast」(1993)、National Agricultural Library、Beltsville、Md.を参照されたい)。藻類細胞において使用するための例示的なプラスミド又はプラスミド成分としては、米国特許出願公開第2011/0045563号において記載されているものが含まれる.
【０１０４】
他の実施形態において、宿主細胞は、シアノバクテリウム、例えば、形態学に基づいて以下の群のいずれかに分類されるシアノバクテリウムである:クロロコックム目(Chlorococcales)、プレウロカプサ目(Pleurocapsales)、ユレモ目(Oscillatoriales)、ネンジュモ目(Nostocales)、シネコシスティス(Synechosystic)、又はスチゴネマ目(Stigonematales)(例えば、Lindbergら、MetaB. Eng.、(2010)12(1):70〜79を参照されたい)。シアノバクテリア細胞において使用するための例示的なプラスミド又はプラスミド成分としては、米国特許出願公開第2010/0297749号及び米国特許出願公開第2009/0282545号、並びに国際公開第WO2011/034863号において記載されているものが含まれる。
【０１０５】
遺伝子設計の方法
微生物細胞は、当技術分野の技術の範囲内である、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、及び生化学の従来の技術を使用して、発酵による(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産のために設計することができる。このような技術は文献において十分に説明されており、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第4版(Sambrookら、2012);「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait編、1984);「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications」(R. I. Freshney編、第6版、2010);「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.);「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubelら編、1987及び定期更新);「PCR: The Polymerase Chain Reaction」(Mullisら編、1994);Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology、第2版、J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)を参照されたい。
【０１０６】
ベクターは、遺伝物質を細胞に導入するために使用されるポリヌクレオチド媒体である。本明細書において記載される方法において有用なベクターは、線状であっても環状であってもよい。ベクターは、宿主細胞の標的ゲノム内に組み込まれ得るか、又は宿主細胞内で独立して複製し得る。多くの適用で、安定な形質転換体を生産したベクターを組み込むことが好ましい。ベクターは、例えば、複製起点、マルチクローニングサイト(MCS)、及び/又は選択マーカーを含み得る。発現ベクターは、典型的には、特定の宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列(多くはコード配列)の発現を容易にする調節エレメントを含有する発現カセットを含む。ベクターとしては、限定はしないが、組み込みベクター、原核生物プラスミド、エピソーム、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体が含まれる。
【０１０７】
発現カセットにおいて使用され得る例示的な調節エレメントとしては、プロモーター、エンハンサー、配列内リポソーム侵入部位(IRES)、及び他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリU配列等の転写終結シグナル)が含まれる。このような調節エレメントは、例えば、Goeddel、Gene Expression Technology: Methods In Enzymology 185、Academic Press、San Diego、Calif. (1990)において記載されている。
【０１０８】
一部の実施形態において、ベクターは、CRISPR系等のゲノム編集を行い得る系を導入するために使用することができる。2014年3月6日に公開された米国特許出願公開第2014/0068797号を参照されたい。また、Jinek Mら、「A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity」、Science 337:816〜21、2012も参照されたい。II型のCRISPR-Cas9系において、Cas9は、部位特異的なエンドヌクレアーゼ、すなわち、2つの異なるエンドヌクレアーゼドメイン(HNHドメイン及びRuvC/RNase H様ドメイン)を使用して特定の標的配列のところでポリヌクレオチドを切断することを目的としているか又は切断することができる酵素である。Cas9はRNAによってその切断部位に向けられるため、Cas9は、任意の所望の部位でDNAを切断するように設計することができる。Cas9は、したがって、「RNA誘導型ヌクレアーゼ」とも記載される。更に具体的には、Cas9は、標的ポリヌクレオチド内の特異的配列へのRNA分子の少なくとも一部分のハイブリダイゼーションに基づいてCas9を特異的ポリヌクレオチド標的に誘導する1つ又は複数のRNA分子と結び付く。Ran, F. A.ら、(全ての追加されたデータを含む、「In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9」、Nature 520(7546):186〜91、2015年4月9日)は、8つのII型CRISPR-Cas9システムのcrRNA/tracrRNAの配列及び二次構造を提示している。Cas9様合成タンパク質もまた、当技術分野において知られている(2014年10月23日に公開された米国特許出願公開第2014-0315985号を参照されたい)。
【０１０９】
実施例1は、ポリヌクレオチド及び他の遺伝子改変をサッカロミセス・セレビシエ細胞のゲノムに導入するための例示的な組み込みアプローチを記載する。
【０１１０】
ベクター又は他のポリヌクレオチドは、様々な標準的な方法、例えば、形質転換、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、トランスダクション、トランスフェクション(例えば、リポフェクションを介する若しくはDEAE-デキストリンを介するトランスフェクション、又は組換えファージウイルスを使用するトランスフェクション)、リン酸カルシウムDNA沈殿を伴うインキュベーション、DNAで被覆した微粒子銃での高速衝撃、及びプロトプラスト融合のいずれかによって、微生物細胞に導入することができる。形質転換体は、当技術分野において知られているあらゆる方法によって選択することができる。形質転換体を選択するための適切な方法は、米国特許出願公開第2009/0203102号、米国特許出願公開第2010/0048964号、及び米国特許出願公開第2010/0003716号、並びに国際公開第WO 2009/076676号、国際公開第WO 2010/003007号、及び国際公開第WO 2009/132220号において記載されている。
【０１１１】
設計された微生物細胞
上記の方法を使用して、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産し、またある特定の実施形態においては過剰生産する、設計された微生物細胞を生産することができる。設計された微生物細胞は、ネイティブな微生物細胞、例えば本明細書において記載される微生物宿主細胞のいずれかと比較して、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10個、又はそれを超える遺伝子改変、例えば30〜40個の改変を有し得る。以下の実施例において記載されている設計された微生物細胞は、1つ、2つ、又は3つの遺伝子改変を有するが、当業者は、本明細書において示されるガイダンスに従って、更なる改変を有する微生物細胞を設計することができる。一部の実施形態において、設計された微生物細胞は、ネイティブな微生物細胞と比較して、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9つ、8つ、7つ、6つ、5つ、又は4つより多くの遺伝子改変は有さない。様々な実施形態において、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産するように設計された微生物細胞は、以下の例示的な範囲:1〜10、1〜9、1〜8、2〜7、2〜6、2〜5、2〜4、2〜3、3〜7、3〜6、3〜5、3〜4等のいずれかの範囲内の、いくつかの遺伝子改変を有し得る。
【０１１２】
一部の実施形態において、設計された微生物細胞は、例えば、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを天然に生産しない微生物宿主細胞のケースにおいて、少なくとも1つの異種ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ)を発現する。様々な実施形態において、微生物細胞は、例えば、(1)単一の異種ゲラニオールシンターゼ遺伝子、(2)同一であっても異なっていてもよい2つ以上の異種ゲラニオールシンターゼ遺伝子(言い換えると、同一の異種ゲラニオールシンターゼ遺伝子の複数のコピーを導入することができるか、若しくは複数の異なる異種ゲラニオールシンターゼ遺伝子を導入することができる)、(3)細胞に対してネイティブではない単一の異種ゲラニオールシンターゼ遺伝子、及びネイティブなゲラニオールシンターゼ遺伝子の1つ若しくは複数の更なるコピー、又は(4)同一であっても異なっていてもよい2つ以上のネイティブでないゲラニオールシンターゼ遺伝子、及びネイティブなゲラニオールシンターゼ遺伝子の1つ若しくは複数の更なるコピーを含み得、発現し得る。
【０１１３】
一部の実施形態において、設計された微生物細胞は、例えば、ゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼ酵素を有さない微生物宿主細胞のケースにおいて、少なくとも1つの異種ゲラニオールシンターゼに加えて、少なくとも1つの異種ゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼを発現する。様々な実施形態において、微生物細胞は、例えば、(1)単一の異種ゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼ遺伝子、(2)同一であっても異なっていてもよい2つ以上の異種ゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼ遺伝子(言い換えると、同一の異種ゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼ遺伝子の複数のコピーを導入することができるか、若しくは複数の異なる異種ゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼ遺伝子を導入することができる)、(3)細胞に対してネイティブではない単一の異種ゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼ、及びネイティブなゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼ遺伝子の1つ若しくは複数の更なるコピー、又は(4)同一であっても異なっていてもよい2つ以上のネイティブでないゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼ遺伝子、及びネイティブなゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼの1つ又は複数の更なるコピーを含み得、発現し得る。
【０１１４】
この設計された宿主細胞は、ゲラニル-PP((6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの直接前駆体)の生産をもたらす経路を経るフラックスを増大させる少なくとも1つの更なる遺伝子改変を含み得る。この経路におけるこれらの「上流」酵素としては、ATP-クエン酸シンターゼ、アセチル-CoAシンターゼ、チオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aシンターゼ(HMG-CoAシンターゼ)、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aレダクターゼ(HMG-CoAレダクターゼ)、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ、及びゲラニル二リン酸シンターゼが含まれ、これらの酵素活性を有する任意のアイソフォーム、パラログ、又はオルソログも含まれる(当業者には容易に理解されるであろうが、これらは異なる名称で知られている場合もある)。少なくとも1つの更なる改変が、任意の利用可能な手段によって、例えば、(1)ネイティブな酵素の発現若しくは活性の調節、(2)ネイティブな酵素の遺伝子の1つ若しくは複数の更なるコピーの発現、又は(3)1つ若しくは複数のネイティブでない酵素の遺伝子の1つ若しくは複数のコピーの発現によって、上流経路酵素の活性を増大させ得る。
【０１１５】
一部の実施形態において、経路を経る増大したフラックスは、上述したように、フィードバック脱調節される酵素をコードする1つ又は複数の遺伝子を発現させることによって達成され得る。例えば、設計された宿主細胞は、1つ又は複数のフィードバック脱調節されるHMG-CoAレダクターゼ遺伝子を含み得、発現し得る。
【０１１６】
設計された微生物細胞は、ネイティブなヌクレオチド配列を有する導入遺伝子又はネイティブなものとは異なる導入遺伝子を含有し得る。例えば、ネイティブなヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得る。これらの導入された遺伝子のいずれかによってコードされるアミノ酸配列は、ネイティブであっても、ネイティブのものと異なっていてもよい。様々な実施形態において、アミノ酸配列は、ネイティブなアミノ酸配列と少なくとも0パーセント、70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント、又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する。
【０１１７】
一部の実施形態において、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールへの前駆体の増大した利用可能性は、二機能性の(2E,6E)-ファルネシル二リン酸シンターゼ/ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、及びアセチルCo-Aを消費するあらゆる副経路酵素等の1つ又は複数の副経路酵素の発現又は活性を低減させることによって、達成され得る。例えば、設計された宿主細胞は、これらの酵素のうちのいずれかの発現を下方調節する1つ若しくは複数のプロモータースワップを含み得るか、及び/又は、これらの酵素の遺伝子が欠失しておりその発現が完全になくなっていてよい。
【０１１８】
本明細書において記載されるアプローチは、真菌細胞、すなわち、酵母サッカロミセス・セレビシエ(真核生物)において、及び細菌細胞、すなわち、コリネバクテリウム・グルタミクム(原核生物)において行われている(実施例1を参照されたい)。
【０１１９】
例示的な設計された真菌細胞
ある特定の実施形態において、設計された酵母(例えば、サッカロミセス・セレビシエ)細胞は、ペリラ・セトエンシス由来のゲラニオールシンターゼ(例えば、配列番号5)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント、又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する異種ゲラニオールシンターゼを発現する。特定の実施形態において、ペリラ・セトエンシスのゲラニオールシンターゼは、配列番号5を含み得る。
【０１２０】
設計された酵母(例えば、サッカロミセス・セレビシエ)細胞はまた、ある特定の実施形態においてファセオルス・アンギュラリス由来のゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼ(例えば、配列番号11)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント、又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する、異種ゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼを発現する。特定の実施形態において、ファセオルス・アンギュラリスのゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼは、配列番号11を含み得る。
【０１２１】
これらは設計された酵母細胞の唯一の遺伝子改変であり得るか、又は酵母細胞は、上記でより一般的に論じたように、1つ又は複数の更なる遺伝子改変を含み得る。
【０１２２】
1つ又は複数の更なる遺伝子改変を有する例示的な酵母(例えば、サッカロミセス・セレビシエ)細胞は、コントロール細胞と比較して、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ等の上流経路酵素の活性が増大していてよく、これは例えば、ネイティブなサッカロミセス・セレビシエのイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ(配列番号25)遺伝子の更なるコピーを細胞に導入することによって、又はネイティブなサッカロミセス・セレビシエのイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼと少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、若しくは95パーセントのアミノ酸配列同一性を有するイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼコード遺伝子を細胞に導入することによって生じる。
【０１２３】
特定の実施形態において、設計された酵母(例えば、サッカロミセス・セレビシエ)細胞は、更に、ネイティブなサッカロミセス・セレビシエのHMG-CoAレダクターゼと少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、若しくは95パーセントのアミノ酸配列同一性を典型的に有する、サッカロミセス・セレビシエのHMG-CoAレダクターゼのバリアント、又は、アミノ酸残基1〜529が欠失している、サッカロミセス・セレビシエのHMG-CoAレダクターゼのトランケートバリアントを発現する。特定の実施形態において、サッカロミセス・セレビシエのHMG-CoAレダクターゼのバリアントは、配列番号27を含み得る。
【０１２４】
設計された微生物細胞の培養
本明細書において記載される微生物細胞のいずれかを、例えば、維持、成長、及び/又は(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産のために培養することができる。
【０１２５】
一部の実施形態において、培養物は、600nmで10〜500の光学密度、例えば50〜150の光学密度まで成長させられる。
【０１２６】
様々な実施形態において、培養物は、少なくとも10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900μg/L、又は少なくとも1、10、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900mg/L、又は少なくとも1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、若しくは10グラム/Lの力価の、生産された(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを含む。様々な実施形態において、力価は、10μg/Lから10グラム/L、25μg/Lから10グラム/L、100μg/Lから10グラム/L、200μg/Lから5グラム/L、500μg/Lから4グラム/L、1mg/Lから3グラム/L、500mg/Lから2グラム/Lの範囲、又は上記に列挙した値のいずれかを限界とする任意の範囲内にある。
【０１２７】
培養培地
微生物細胞は、限定はしないが、最少培地、すなわち、細胞の成長にとって可能な最少の栄養を含有する培地を含む、任意の適切な培地において培養することができる。最少培地は、典型的には、(1)微生物の成長のための炭素源、(2)特定の微生物細胞及び成長条件に応じ得る塩、並びに(3)水を含有する。適切な培地はまた、成長及び生成物の形成のための窒素源、成長のための硫黄源、成長のためのリン酸源、成長のための金属塩、成長のためのビタミン、並びに成長のための他の補因子の、任意の組み合わせも含み得る。
【０１２８】
任意の適切な炭素源を、宿主細胞の培養に使用することができる。用語「炭素源」は、微生物細胞によって代謝され得る1つ又は複数の炭素含有化合物を指す。様々な実施形態において、炭素源は、糖質(単糖、二糖、オリゴ糖、若しくは多糖等)、又は転化糖(例えば、酵素処理されたショ糖シロップ)である。例示的な単糖としては、グルコース(デキストロース)、フルクトース(レブロース)、及びガラクトースが含まれる。例示的なオリゴ糖としてはデキストラン又はグルカンが含まれ、例示的な多糖としてはデンプン及びセルロースが含まれる。適切な糖としては、C6糖(例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、又はグルコース)及びC5糖(例えば、キシロース又はアラビノース)が含まれる。他の、あまり高価ではない炭素源としては、サトウキビ液、ビート液、モロコシ液、及びそれに類するものが含まれ、これらのいずれも、必ずしも必要ではないが、完全に又は部分的に脱イオン化されていてよい。
【０１２９】
培養培地中の塩は一般に、細胞によるタンパク質及び核酸の合成を可能にするマグネシウム、窒素、リン、及び硫黄等の必須エレメントを提供する。
【０１３０】
最少培地には、抗生物質等の1つ又は複数の選択剤を補充することができる。
【０１３１】
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産するために、培養培地は、グルコース、及び/又は尿素、アンモニウム塩、アンモニア、若しくはこれらの任意の組み合わせ等の窒素源を含み得、及び/又は、培養の間に補充され得る。
【０１３２】
培養条件
微生物細胞の維持及び成長に適した材料及び方法は、当技術分野において周知である。例えば、米国特許出願公開第2009/0203102号、米国特許出願公開第2010/0003716号、及び米国特許出願公開第2010/0048964号、並びに国際公開第WO 2004/033646号、国際公開第WO 2009/076676号、国際公開第WO 2009/132220号、及び国際公開第WO 2010/003007号、Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardtら編、American Society for Microbiology、Washington、D.C. (1994)、又はBrock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology、第2版(1989) Sinauer Associates, Inc.、Sunderland、Massを参照されたい。
【０１３３】
通常、細胞は、適切な温度、気体混合物、及びpH(例えば、約20℃から約37℃、約6%から約84%CO2、及び約5から約9の間のpH)で成長させられ、維持される。一部の態様では、細胞は35℃で成長させられる。例えば好熱細菌を宿主細胞として使用する、ある特定の実施形態において、より高い温度(例えば、50℃〜75℃)を使用することができる。一部の態様において、発酵のためのpH範囲は、約pH5.0から約pH9.0(例えば、約pH6.0から約pH8.0、又は約6.5から約7.0)の間である。細胞は、特定の細胞の要求に応じて、好気性条件下で、無酸素条件下で、又は嫌気性条件下で成長させることができる。
【０１３４】
使用され得る標準的な培養条件及び発酵の態様、例えば、バッチ発酵、フェドバッチ発酵、又は連続発酵は、米国特許出願公開第2009/0203102号、米国特許出願公開第2010/0003716号、及び米国特許出願公開第2010/0048964号、並びに国際公開第WO 2009/076676号、国際公開第WO 2009/132220号、及び国際公開第WO 2010/003007号において記載されている。バッチ発酵及びフェドバッチ発酵は一般的であり、当技術分野において周知であり、例は、Brock、Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology、第2版(1989) Sinauer Associates, Inc.において見ることができる。
【０１３５】
一部の実施形態において、細胞は、限られた糖(例えば、グルコース)条件下で培養される。様々な実施形態において、添加される糖の量は、細胞によって消費され得る糖の量の約105%又はそれ未満(例えば、約100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、又は10%)である。特定の実施形態において、培養培地に添加される糖の量は、特定の時間の間に細胞によって消費される糖の量とほぼ同一である。一部の実施形態において、細胞の成長の速度は、添加する糖の量を制限して、細胞培地中の糖の量によってサポートされ得る速度で細胞が成長するようにすることによって、制御される。一部の実施形態において、糖は、細胞を培養する時間では溜まらない。様々な実施形態において、細胞は、限られた糖条件下で、約1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、若しくは70時間又はそれを超える時間、又は更には最大約5〜10日間にわたって培養される。様々な実施形態において、細胞は、制限された糖条件下で、細胞を培養する総時間の約5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、95、又は100%又はそれ超にわたり培養される。何らかの特定の理論に拘束されることは意図しないが、制限された糖条件によって、細胞のより好ましい調節が可能になり得ると考えられる。
【０１３６】
一部の態様において、細胞は、バッチ培養で成長させられる。細胞はまた、フェドバッチ培養又は連続培養でも成長させることができる。更に、細胞は、限定はしないが上記の最少培地のいずれかを含む最少培地で培養することができる。最少培地には、1.0%(w/v)以下のグルコース(又は6つの炭素からなるあらゆる他の糖)を更に補充することができる。具体的には、最少培地には、1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)、又は0.1%(w/v)のグルコースを補充することができる。一部の培養において、非常に高いレベルの、例えば、少なくとも10%(w/v)、20%(w/v)、30%(w/v)、40%(w/v)、50%(w/v)、60%(w/v)、70%(w/v)の、又は培地中での糖の溶解限界までの糖(例えば、グルコース)が使用される。一部の実施形態において、糖レベルは、上記の値の任意の2つからなる範囲内、例えば、0.1〜10%(w/v)、10〜20%(w/v)、10〜70%(w/v)、20-60%(w/v)、又は30-50%(w/v)の間にある。更に、異なる糖レベルを異なる培養相に使用することができる。フェドバッチ培養(例えば、サッカロミセス・セレビシエ又はコリネバクテリウム・グルタミクムの)では、糖レベルは、バッチ相では約100〜200g/L(10〜20%(w/v))であり、次いで約500〜700g/L(フィードの50〜70%)まで上げることができる。
【０１３７】
更に、最少培地には、0.1%(w/v)以下の酵母抽出物を補充することができる。具体的には、最少培地には、0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)、又は0.01%(w/v)の酵母抽出物を補充することができる。或いは、最少培地には、1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)、又は0.1%(w/v)のグルコース、及び0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、又は0.02%(w/v)の酵母抽出物を補充することができる。一部の培養において、非常に高いレベルの、例えば、少なくとも1.5%(w/v)、2.0%(w/v)、2.5%(w/v)、又は3%(w/v)の酵母抽出物を使用することができる。一部の培養において(例えば、サッカロミセス・セレビシエ又はコリネバクテリウム・グルタミクムの)、酵母抽出物レベルは、上記の値の任意の2つからなる範囲内、例えば、0.5〜3.0%(w/v)、10〜2.5%(w/v)、又は1.5〜2.0%(w/v)の間にある。
【０１３８】
本明細書において記載される設計された微生物細胞の維持及び成長に適した例示的な材料及び方法は、以下の実施例1において見ることができる。
【０１３９】
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産及び回収
本明細書において記載される方法のいずれかは、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを回収する工程を更に含み得る。一部の実施形態において、いわゆる採取物流に含有される生産された(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールは、生産管から回収/採取される。採取物流は、例えば、生産管内の休止細胞による生産基質の変換の結果生じる(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを含有する、生産管から来る無細胞の又は細胞を含有する水溶液を含み得る。採取物流中に依然として存在する細胞は、当技術分野において知られている任意の操作、例えば、濾過、遠心分離、デカンテーション、膜クロスフロー限外濾過若しくは膜クロスフロー精密濾過、タンジェンシャルフロー限外濾過若しくはタンジェンシャルフロー精密濾過、又はデッドエンド濾過によって、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールから分離することができる。この細胞分離操作の後、採取物流は基本的に細胞を有さない。
【０１４０】
生産された(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを採取物流に含有される他の成分から分離及び/又は精製する更なる工程、すなわち、いわゆる、下流のプロセシング工程を、場合によって行うことができる。これらの工程は、当業者に知られている任意の手段、例えば、濃縮、抽出、結晶化、沈殿、吸着、イオン交換、及び/又はクロマトグラフィーを含み得る。これらの手順のいずれかを単独で又は組み合わせて使用して、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを精製することができる。更なる精製工程は、例えば、濃縮、結晶化、沈殿、洗浄、及び乾燥、活性炭での処理、イオン交換、ナノ濾過、並びに/又は再結晶化の1つ又は複数を含み得る。適切な精製プロトコルの設計は、細胞、培養培地、培養物のサイズ、生産管等に依存し得、当技術分野における技術のレベルの範囲内である。
【０１４１】
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を説明する目的で記載されており、本開示をいかなる形でも限定するものではない。特許請求の範囲によって規定される、本開示の趣旨に包含される、実施例における変更及び他の使用は、当業者に識別可能である。
【実施例１】
【０１４２】
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産するように設計されたサッカロミセス・セレビシエの株の構築及び選択
プラスミド/DNAの設計
この作業で試験される全ての株を、専売のソフトウェアを使用して設計されたプラスミドDNAで形質転換した。プラスミドの設計は、この作業において設計された2つの宿主生物の一方に対して特異的であった。プラスミドDNAを、標準的なDNAアセンブリ方法によって物理的に構築した。このプラスミドDNAを次いで、それぞれ以下に記載される2つの宿主特異的な方法の一方によって代謝経路インサートを組み込むために使用した。
【０１４３】
サッカロミセス・セレビシエ経路の組み込み
「スプリットマーカー、ダブルクロスオーバー」ゲノム組み込み戦略が、サッカロミセス・セレビシエ株を設計するために開発されている。図2は、サッカロミセス・セレビシエにおける、相補的なスプリットマーカープラスミドのゲノム組み込み、及びコロニーPCRを介する正確なゲノム組み込みの検証を説明している。相補的な5'及び3'のホモロジーアーム並びにURA3選択マーカーのオーバーラップしている半分(斜線の入ったバーによって示される定方向反復)を有する2つのプラスミドを、メガヌクレアーゼで消化し、線状断片として形質転換した。トリプルクロスオーバー事象によって、所望の異種遺伝子を標的遺伝子座に組み込み、完全なURA3遺伝子を再構築した。この組み込み事象から派生するコロニーを、2つの3プライマー反応を使用してアッセイして、5'での結合及び3'での結合の両方について確認した(UF/IF/wt-R及びDR/IF/wt-F)。更なる設計が望ましい株では、株を5-FOAプレート上に播種して、元の定方向反復の小さな単一のコピーを残してURA3を除去することを選択することができる。このゲノム組み込み戦略は、同一のワークフローにおける遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、及びプロモータータイトレーションに使用することができる。
【０１４４】
細胞培養
サッカロミセス・セレビシエのために確立されたワークフローは、株をプレート全体にランダム化する自動ワークフローを使用して、成功裏に構築された株を定着させる、ヒットピッキング工程を伴うものであった。成功裏に構築された各株で、異なるコロニーからの最大4つの複製物を試験して、コロニー間の変動、及び他のプロセス間の変動を試験した。得られたコロニーが4つに満たない場合には、それぞれの所望の遺伝子型から少なくとも4つのウェルが試験されるように、既存のコロニーを複製した。
【０１４５】
コロニーを、選択培地(サッカロミセス・セレビシエのためのSD-ura)を有する96ウェルプレートに定着させ、飽和するまで2日間培養し、次いで、16.6%グリセロールと共に-80℃で保存のために凍結した。凍結されたグリセロールストックを次いで使用して、成長及び凍結からの回復を助けるために、最少培地中の播種ステージに低レベルのアミノ酸を接種した。播種プレートを30℃で1〜2日間成長させた。播種プレートを次いで使用して、メインの培養プレートに最少培地を接種し、48〜88時間成長させた。プレートを所望の時点で取り出し、細胞密度(OD600)、生存能力、及びグルコースについて試験し、上清サンプルを、目的の生成物のLC-MS分析のために保存した。
【０１４６】
細胞密度
各ウェルの600nmでの吸光度を検出する分光光度アッセイを使用して、細胞密度を測定した。ロボット工学を使用して、一定量の培養物を各培養プレートからアッセイプレートに移し、その後、175mMのリン酸ナトリウム(pH7.0)と混合して、10倍希釈物を得た。Tecan M1000分光光度計を使用してアッセイプレートを測定し、アッセイデータをLIMSデータベースにアップロードした。接種なしのコントロールを使用して、バックグラウンド吸光度を差し引いた。各ステージで複数のプレートに接種することによって細胞の成長をモニタリングし、次いで、各時点でプレート全体を処分した。
【０１４７】
数多くのプレートを扱いながらも(これは、測定の間に典型的ではないサンプルを生じさせ得る)細胞の沈降を最小にするために、各プレートを読み取る前に、それぞれを10〜15秒間振盪した。プレート内の細胞密度が幅広いバリエーションであることで、検出の線形範囲から外れた吸光度測定値が得られ、その結果、ODが高めの培養物が過小評価される。通常、試験対象の株は、これまでのところ、このことが懸案事項になるほどまでには著しく多様ではない。
【０１４８】
液体-固体の分離
LC-MSによる分析のために細胞外サンプルを採取するために、液相及び固相を、遠心分離を介して分離した。培養プレートを2000rpmで4分間遠心分離し、上清を、ロボット工学を使用して、デスティネーションプレートに移した。75μLの上清を各プレートに移し、1つは4℃で保存し、2つ目は長期保存のために80℃で保存した。
【０１４９】
1ラウンド目の遺伝子設計の結果
1ラウンド目の遺伝子設計及びスクリーニングは、サッカロミセス・セレビシエを宿主細胞として使用して行った。ライブラリーアプローチを行って、宿主生物における機能的酵素を同定した。ゲラニオールシンターゼ配列の広範なサーチによって、全部で13のオルソログ配列が同定された。異種ゲラニオールシンターゼは、一部のケースにおいて、異種ゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼを伴って、宿主細胞において発現した。一部のケースにおいて、ゲラニオールシンターゼ及び/又はゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼのヌクレオチド配列を、サッカロミセス・セレビシエに対してコドン最適化した。株を生産し、上記のように培養し、そして培養培地における(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価をLC-MSによって測定した。株及び結果をTable 1(表1)及び図2に示す。最良の働きをした1ラウンド目の株は、ペリラ・セトエンシスのゲラニオールシンターゼとファセオルス・アンギュラリスのゲラニオール-8-ヒドロキシラーゼとを発現するサッカロミセス・セレビシエ株であり、これは、培養培地1L当たり37.5μgの(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価を示した。この株を、2ラウンド目の遺伝子設計及びスクリーニングのために選択した。
【０１５０】
【表１Ａ】
2021505154.tif 000003
【０１５１】
【表１Ｂ】
2021505154.tif 000004
【０１５２】
2ラウンド目の遺伝子設計の結果
最良の働きをした1ラウンド目の株を、コンビナトリアルライブラリーアプローチを使用する2ラウンド目の遺伝子設計のための開始宿主で使用した。このラウンドにおいて、1〜3個の上流経路遺伝子の更なるコピーを、強力な構成的プロモーターの制御下で、別個の「娘」株に導入した(Table 2(表2))。上流経路遺伝子は、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールをもたらす経路における、鍵となる前駆体(例えば、アセチル-CoA)からネイティブな最終代謝産物への変換に関与する全ての遺伝子に相当する。コンビナトリアルライブラリーアプローチにおいて株で試験するために選択した酵素を、メバロネート経路の図において示す(図1)。このラウンドの最良の働きをした株は、サッカロミセス・セレビシエのイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼを過剰発現し、培養培地1L当たり123μgの(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価を示した。
【０１５３】
【表２Ａ】
2021505154.tif 000005
【０１５４】
【表２Ｂ】
2021505154.tif 000006
【０１５５】
【表２Ｃ】
2021505154.tif 000007
【０１５６】
【表２Ｄ】
2021505154.tif 000008
【０１５７】
【表２Ｅ】
2021505154.tif 000009
【０１５８】
3ラウンド目及び4ラウンド目の遺伝子設計の結果
3ラウンド目の遺伝子設計は改良株を生産せず、これは、株の構築におけるエラーに起因する可能性が最も高い。4ラウンド目(改良ラウンド)の株の設計及び結果をTable 3(表3)に示す。
【０１５９】
【表３Ａ】
2021505154.tif 000010
【０１６０】
【表３Ｂ】
2021505154.tif 000011
【０１６１】
【表３Ｃ】
2021505154.tif 000012
【０１６２】
【表３Ｄ】
2021505154.tif 000013
【０１６３】
【表３Ｅ】
2021505154.tif 000014
【０１６４】
【表３Ｆ】
2021505154.tif 000015
【０１６５】
【表３Ｇ】
2021505154.tif 000016
【０１６６】
【表３Ｈ】
2021505154.tif 000017
【０１６７】
【表３Ｉ】
2021505154.tif 000018
【０１６８】
【表３Ｊ】
2021505154.tif 000019
【０１６９】
【表３Ｋ】
2021505154.tif 000020
【０１７０】
【表３Ｌ】
2021505154.tif 000021
【０１７１】
【表３Ｍ】
2021505154.tif 000022
【０１７２】
【表３Ｎ】
2021505154.tif 000023
【０１７３】
【表３Ｏ】
2021505154.tif 000024
【０１７４】
【表３Ｐ】
2021505154.tif 000025
【０１７５】
【表３Ｑ】
2021505154.tif 000026
【０１７６】
【表３Ｒ】
2021505154.tif 000027
【０１７７】
【表３Ｓ】
2021505154.tif 000028
【０１７８】
【表３Ｔ】
2021505154.tif 000029
【０１７９】
【表３Ｕ】
2021505154.tif 000030
【０１８０】
【表３Ｖ】
2021505154.tif 000031
【０１８１】
【表３Ｗ】
2021505154.tif 000032
【０１８２】
【表３Ｘ】
2021505154.tif 000033
【実施例２】
【０１８３】
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを生産するように設計されたヤロウィア・リポリティカの株の構築及び選択
ヤロウィア・リポリティカを、サッカロミセス・セレビシエについて上記で記載したアプローチを使用して設計した。1ラウンド目の遺伝子設計で構築された株及びこれらの(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの力価をTable 4(表4)に示す。
【０１８４】
【表４Ａ】
2021505154.tif 000034
【０１８５】
【表４Ｂ】
2021505154.tif 000035
【０１８６】
【表４Ｃ】
2021505154.tif 000036
【０１８７】
【表４Ｄ】
2021505154.tif 000037
【０１８８】
【表４Ｅ】
2021505154.tif 000038
【０１８９】
【表４Ｆ】
2021505154.tif 000039
【０１９０】
【表４Ｇ】
2021505154.tif 000040
【０１９１】
【表４Ｈ】
2021505154.tif 000041
【０１９２】
【表４Ｉ】
2021505154.tif 000042
【０１９３】
【表４Ｊ】
2021505154.tif 000043
【０１９４】
【表４Ｋ】
2021505154.tif 000044
【０１９５】
【表４Ｌ】
2021505154.tif 000045
【実施例３】
【０１９６】
(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産についての宿主の評価
最良の働きをした酵素を、4つの宿主:ヤロウィア・リポリティカ、バチルス・サブティリス、コリネバクテリア・グルタミクム、サッカロミセス・セレビシエにおいて試験した。サッカロミセス・セレビシエでの結果を以下のTable 5(表5)に示す。
【０１９７】
ヤロウィア・リポリティカにおいて最良の働きをした株は、310マイクログラム/Lの力価を示した。このヤロウィア・リポリティカ株は、ペリラ・セトエンシスのゲラニオールシンターゼ(UniProt ID C0KWV4)、ファセオルス・アンギュラリスのゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(UniProt ID A0A0L9UT99)、及びサッカロミセス・セレビシエのイソペンテニル二リン酸デルタ3-デルタ2-イソメラーゼ(UniProt ID P15496)を発現した。2番目の働きをしたヤロウィア・リポリティカ株は、200マイクログラム/Lを生産し、この株は、アミノ酸置換S80Fを有する大腸菌K12のファルネシル二リン酸シンターゼ(UniProt ID P22939)[4]、ヴィティス・ヴィニフェラのゲラニオールシンターゼ(UniProt ID E5GAH8)、及びファセオルス・アンギュラリスのゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(UniProt ID A0A0L9UT99)を発現した。
【０１９８】
サッカロミセス・セレビシエにおける最良の働きをした株は、217マイクログラム/Lの力価を示した。このサッカロミセス・セレビシエ株は、ペリラ・セトエンシスのゲラニオールシンターゼ(UniProt ID C0KWV4)、ファセオルス・アンギュラリスのゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(UniProt ID A0A0L9UT99)、及びサッカロミセス・セレビシエのイソペンテニル二リン酸デルタ3-デルタ2-イソメラーゼ(UniProt ID P15496)を発現した。
【０１９９】
バチルス・サブティリス株又はコリネバクテリウム・グルタミクム株のいずれによっても力価は示されなかった。
【０２００】
【表５Ａ】
2021505154.tif 000046
【０２０１】
【表５Ｂ】
2021505154.tif 000047
【０２０２】
【表５Ｃ】
2021505154.tif 000048
【０２０３】
【表５Ｄ】
2021505154.tif 000049
【０２０４】
【表５Ｅ】
2021505154.tif 000050
【０２０５】
【表５Ｆ】
2021505154.tif 000051
【０２０６】
【表５Ｇ】
2021505154.tif 000052
【０２０７】
【表５Ｈ】
2021505154.tif 000053
【０２０８】
【表５Ｉ】
2021505154.tif 000054
【０２０９】
【表５Ｊ】
2021505154.tif 000055
【０２１０】
(参考文献)
2021505154.tif 000056
【図１】
2021505154.tif 000057
【図２】
2021505154.tif 000058
【図３】
2021505154.tif 000059
【図４】
2021505154.tif 000060
【図５】
2021505154.tif 000061
【図６】
2021505154.tif 000062
【図７】
2021505154.tif 000063
【図８】
2021505154.tif 000064
【図９】
2021505154.tif 000065
【配列表】
2021505154000001.app
【国際調査報告】
2021505154.tif 000066
2021505154.tif 000067