(57)【要約】本開示は、カテコラミン誘発多形性心室頻拍（ＣＰＶＴ）、特に常染色体優性様式で遺伝する疾患の形態を、カルセクエストリン２（ＣＡＳＱ２）遺伝子治療によって治療するための組成物および方法を特徴とする。本明細書に記載の組成物および方法は、例えば、リアノジン受容体２およびカルモジュリン１（ＣＡＬＭ１）やＣＡＬＭ３などのカルモジュリンの突然変異によって引き起こされるＣＰＶＴを治療するために使用することができる。本開示は、とりわけ、アデノ随伴ウイルスベクターを含む、常染色体優性ＣＰＶＴに罹患しているヒト患者などの患者へのＣＡＳＱ２導入遺伝子の送達に利用可能な様々なベクターを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とするヒト患者における優性カテコラミン誘発多形性心室頻拍（ＣＰＶＴ）を治療する方法であって、
カルセクエストリン２（ＣＡＳＱ２）をコードする導入遺伝子を含む組成物の治療上有効量を前記患者に投与するステップを含む方法。
【請求項２】
優性ＣＰＶＴを有すると診断されたヒト患者における不整脈を低減する方法であって、
ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子を含む組成物の治療上有効量を前記患者に投与するステップを含む方法。
【請求項３】
優性ＣＰＶＴを有すると診断されたヒト患者におけるカルシウム恒常性を回復する方法であって、
ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子を含む組成物の治療上有効量を前記患者に投与するステップを含む方法。
【請求項４】
優性ＣＰＶＴを有すると診断されたヒト患者における遅延後脱分極事象を低減する方法であって、
ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子を含む組成物の治療上有効量を前記患者に投与するステップを含む方法。
【請求項５】
必要とするヒト患者における優性カテコラミン誘発多形性心室頻拍（ＣＰＶＴ）の治療処置に用いられる、カルセクエストリン２（ＣＡＳＱ２）をコードする導入遺伝子を含む組成物。
【請求項６】
優性ＣＰＶＴを有すると診断されたヒト患者における不整脈の低減に用いられる、カルセクエストリン２（ＣＡＳＱ２）をコードする導入遺伝子を含む組成物。
【請求項７】
優性ＣＰＶＴを有すると診断されたヒト患者におけるカルシウム恒常性の回復に用いられる、カルセクエストリン２（ＣＡＳＱ２）をコードする導入遺伝子を含む組成物。
【請求項８】
優性ＣＰＶＴを有すると診断されたヒト患者における遅延後脱分極事象の低減に用いられる、カルセクエストリン２（ＣＡＳＱ２）をコードする導入遺伝子を含む組成物。
【請求項９】
前記患者は、リアノジン受容体２（ＲＹＲ２）をコードする内因性遺伝子において機能獲得型突然変異を示す、請求項１〜８のいずれかに記載の方法または用いられる組成物。
【請求項１０】
前記ＲＹＲ２の突然変異は、ＲＹＲ２アゴニストと接触していない心筋細胞と比較して、前記ＲＹＲ２アゴニストと接触している心筋細胞における細胞質カルシウム放出の増加をもたらす、請求項９に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項１１】
前記ＲＹＲ２の突然変異は、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｇ１７８Ａ、Ｒ４２０Ｗ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、および／またはＲ４９５９Ｑである、請求項９または１０に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項１２】
前記患者は、カルモジュリンをコードする内因性遺伝子において突然変異を示す、請求項１〜８のいずれかに記載の方法または用いられる組成物。
【請求項１３】
前記カルモジュリンは、ＣＡＬＭ１である、請求項１２に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項１４】
前記突然変異は、心筋細胞の筋小胞体からのカルシウム放出のＣＡＬＭ１阻害を低減する、請求項１３に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項１５】
前記突然変異を宿すＣＡＬＭ１は、心筋細胞の筋小胞体からのカルシウム放出を直接活性化する、請求項１３に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項１６】
前記突然変異は、約５０ｎＭから約５μＭのＣａ２＋濃度を有する水溶液中に存在するＣＡＬＭ１−ＲＹＲ２複合体におけるＲＹＲ２のオープン構造の安定性を高める、請求項１３に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項１７】
前記ＣＡＬＭ１の突然変異は、Ｎ９７ＳまたはＮ５３Ｉである、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法または用いられる組成物。
【請求項１８】
前記カルモジュリンは、ＣＡＬＭ３である、請求項１２に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項１９】
前記突然変異を宿すＣＡＬＭ３は、心筋細胞の筋小胞体からのカルシウム放出を直接活性化する、請求項１８に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項２０】
前記ＣＡＬＭ３突然変異は、Ａ１０３Ｖである、請求項１８または１９に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項２１】
前記突然変異は、ヘテロ接合性である、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法または用いられる組成物。
【請求項２２】
前記ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法または用いられる組成物。
【請求項２３】
前記ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項２２に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項２４】
前記ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項２３に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項２５】
前記ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項２４に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項２６】
前記ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号２の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法または用いられる組成物。
【請求項２７】
前記ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項２６に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項２８】
前記ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号２の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項２７に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項２９】
前記ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号２の核酸配列を有する、請求項２８に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項３０】
前記組成物は、ベクターである、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法または用いられる組成物。
【請求項３１】
前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項３０に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項３２】
前記ウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、および合成ウイルスから成る群から選択される、請求項３１に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項３３】
前記合成ウイルスは、キメラウイルス、モザイクウイルス、または偽型化ウイルスである、および／または、外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、または小分子を含む、請求項３２に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項３４】
前記ウイルスベクターは、ＡＡＶである、請求項３２に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項３５】
前記ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ７４血清型である、請求項３４に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項３６】
前記ウイルスベクターは、偽型化ＡＡＶである、請求項３１に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項３７】
前記偽型化ＡＡＶは、ＡＡＶ２／８である、請求項３６に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項３８】
前記偽型化ＡＡＶは、ＡＡＶ２／９である、請求項３６に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項３９】
前記ＡＡＶは、組み換えキャプシドタンパク質を含む、請求項３４に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項４０】
前記組成物は、リポソーム、小胞、合成小胞、エキソソーム、合成エキソソーム、デンドリマー、またはナノ粒子である、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法または用いられる組成物。
【請求項４１】
前記導入遺伝子は、心筋細胞において前記ＣＡＳＱ２の発現を誘導するプロモーターに作動可能に連結される、請求項１〜４０のいずれかに記載の方法または用いられる組成物。
【請求項４２】
前記プロモーターは、デスミンプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ミオシン軽鎖２プロモーター、アルファアクチンプロモーター、トロポニン１プロモーター、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体プロモーター、ジストロフィンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、アルファ７インテグリンプロモーター、脳性ナトリウム利尿ペプチドプロモーター、アルファＢクリスタリン／小熱ショックタンパク質プロモーター、アルファミオシン重鎖プロモーター、または心房性ナトリウム利尿因子プロモーターである、請求項４１に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項４３】
前記プロモーターは、デスミンプロモーターである、請求項４２に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項４４】
前記組成物を前記患者に投与すると、前記患者の心臓細胞においてＣＡＳＱ２の発現が増加する、請求項１〜４３のいずれかに記載の方法または用いられる組成物。
【請求項４５】
前記心臓細胞は、心筋細胞である、請求項４４に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項４６】
前記ＣＡＳＱ２の発現は、前記細胞におけるＣＡＳＱ２タンパク質を測定することによって評価される、請求項４４または４５に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項４７】
前記ＣＡＳＱ２の発現は、前記細胞におけるＣＡＳＱ２ｍＲＮＡを測定することによって評価される、請求項４４または４５に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項４８】
前記ＣＡＳＱ２ｍＲＮＡの発現は、前記細胞において約１．５倍〜約３．５倍増加する、請求項４７に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項４９】
前記ＣＡＳＱ２ｍＲＮＡの発現は、前記細胞において約２倍〜約３倍増加する、請求項４８に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項５０】
前記ＣＡＳＱ２ｍＲＮＡの発現は、前記細胞において約２．５倍〜約３倍増加する、請求項４９に記載の方法または用いられる組成物。
【請求項５１】
前記組成物を前記患者に投与すると、ＲＹＲ２、トリアジン、および／またはジャンクチンの発現は、前記患者の心臓細胞において実質的に変化しない、請求項１〜５０のいずれかに記載の方法または用いられる組成物。
【請求項５２】
前記組成物は、静脈内、髄腔内、皮内、経皮、非経口、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮的、気管内、腹腔内、動脈内、血管内、吸入、灌流、洗浄、および／または経口投与によって前記患者に投与される、請求項１〜５１のいずれかに記載の方法または用いられる組成物。
【請求項５３】
キットであって、
ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子を含む組成物と、
添付文書と、
を含み、
前記添付文書は、請求項１〜５２のいずれかに記載の方法に従って、優性ＣＰＶＴを患っている患者に前記組成物を投与するようにキットのユーザーに指示する、キット。
【請求項５４】
前記組成物は、ベクターである、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびワクシニアウイルスから成る群から選択される、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
前記ウイルスベクターは、ＡＡＶである、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ７４血清型である、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記ウイルスベクターは、偽型化ＡＡＶである、請求項５５に記載のキット。
【請求項６０】
前記偽型化ＡＡＶは、ＡＡＶ２／８である、請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
前記偽型化ＡＡＶは、ＡＡＶ２／９である、請求項５９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸バイオテクノロジーの分野に関し、遺伝的な遺伝性障害を治療するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
カテコラミン誘発多形性心室頻拍（Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ：ＣＰＶＴ）は、心臓細胞におけるカルシウムシグナリングの調節不全を特徴とする。優性ＣＰＶＴの患者は、特に心臓拡張期において、心筋細胞の筋小胞体からのカルシウムの過剰または調節不全の放出を示すことが多い。このカルシウムの放出は、期外収縮性心拍を生じさせ得る活動電位で終了する一連のシグナリング事象を引き起こす。これは、不整脈につながる可能性がある。不整脈は、治療せずに放置すると、致命的になり得る。ＣＰＶＴの症状をうまく改善するために利用可能な戦略は不足しており、この疾患を治癒する治療法が必要である。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書に記載されるのは、ヒト患者などの患者における優性遺伝性カテコラミン誘発多形性心室頻拍（ＣＰＶＴ）の治療のための組成物および方法である。本開示の組成物および方法は、優性ＣＰＶＴを患っている患者への機能的カルセクエストリン２（ＣＡＳＱ２）タンパク質をコードする遺伝子の送達に関する。例えば、本明細書に記載の組成物および方法を用いて、機能的ＣＡＳＱ２タンパク質をコードする導入遺伝子を、ウイルス遺伝子治療によって患者に送達してもよい。導入遺伝子は、心臓細胞（例えば、心筋細胞）などの患者の細胞におけるＣＡＳＱ２の発現を促進するようなやり方で送達されてもよい。本開示は、ＣＡＳＱ２をコードする遺伝子の送達によって、機能的ＣＡＳＱ２タンパク質を既に発現しておりむしろ別のカルシウム調節タンパク質における１つ以上の有害な突然変異に苦しんでいる患者のＣＰＶＴを改善できるという発見に部分的に基づく。例えば、患者は、リアノジン受容体２（ＲＹＲ２）をコードする遺伝子の機能獲得型突然変異および／またはカルモジュリン１（ＣＡＬＭ１）やカルモジュリン３（ＣＡＬＭ３）などのカルモジュリンをコードする遺伝子の突然変異など、優性ＣＰＶＴを引き起こす様々な突然変異のうちの１つ以上を示し得る。本明細書に記載の組成物および方法を用いて、種々のカルシウム調節タンパク質に突然変異が存在するにもかかわらず、変異内因性遺伝子の機能的バージョンを提供する必要なしに、優性ＣＰＶＴを有する患者において心臓カルシウム調節を回復し得る。
【０００４】
第１の態様において、本発明は、ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子を含む組成物の治療上有効量を患者（例えば、それを必要とするヒト患者などの哺乳動物）に投与することによって、患者における優性ＣＰＶＴを治療または予防する方法を特徴とする。
【０００５】
別の態様において、本開示は、ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子を含む組成物の治療上有効量を優性ＣＰＶＴを有すると診断された患者（例えば、ヒト患者などの哺乳動物）に投与することによって、患者における不整脈を低減する方法を特徴とする。例えば、本開示は、ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子を含む組成物の治療上有効量を優性ＣＰＶＴを有すると診断された患者（例えば、ヒト患者などの哺乳動物）に投与することによって、患者における不整脈事象の量を低減する方法を特徴とする。本開示はさらに、ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子を含む組成物の治療上有効量を優性ＣＰＶＴを有すると診断された患者（例えば、ヒト患者などの哺乳動物）に投与することによって、患者における不整脈事象の頻度を低減する方法を特徴とする。
【０００６】
別の態様において、本開示は、ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子を含む組成物の治療上有効量を優性ＣＰＶＴを有すると診断された患者（例えば、ヒト患者などの哺乳動物）に投与することによって、患者の心臓におけるカルシウム恒常性を回復する方法を特徴とする。
【０００７】
さらなる態様において、本開示は、ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子を含む組成物の治療上有効量を優性ＣＰＶＴを有すると診断された患者（例えば、ヒト患者などの哺乳動物）に投与することによって、患者の心筋細胞などにおける自発的なカルシウム放出を低減する方法を特徴とする。
【０００８】
さらなる態様において、本開示は、ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子を含む組成物の治療上有効量を優性ＣＰＶＴを有すると診断された患者（例えば、ヒト患者などの哺乳動物）に投与することによって、患者における遅延後脱分極を低減する方法を特徴とする。
【０００９】
本開示の上記の態様のいずれかに係るいくつかの実施形態において、患者は、ＲＹＲ２をコードする内因性遺伝子において機能獲得型突然変異を示す。例えば、ＲＹＲ２の突然変異は、ＲＹＲ２アゴニストと接触していない心筋細胞と比較して、ＲＹＲ２アゴニストと接触している心筋細胞における細胞質カルシウム放出の増加をもたらし得る。特に、ＲＹＲ２の突然変異は、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｇ１７８Ａ、Ｒ４２０Ｗ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、および／またはＲ４９５９Ｑであってもよい。
【００１０】
例えば、患者は、上記のＲＹＲ２の突然変異のうちの２つ以上の組み合わせを有し得る。いくつかの実施形態において、患者は、Ｒ４４９７Ｃ突然変異と、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｇ１７８Ａ、Ｒ４２０Ｗ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、またはＲ４９５９Ｑ突然変異とを有する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｎ４１０４Ｋ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｇ１７８Ａ、Ｒ４２０Ｗ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｎ４８９５Ｄ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｒ１７６Ｑ、Ｇ１７８Ａ、Ｒ４２０Ｗ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｒ１７６Ｑ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｇ１７８Ａ、Ｒ４２０Ｗ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｇ１７８Ａ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｒ４２０Ｗ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｇ１７８Ａ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｌ４３３Ｐ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｐ１０６７Ｓ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｓ２２４６Ｌ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｇ２２７３Ｒ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｆ２３０７Ｌ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｅ２３１１Ｄ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｌ２３４４Ｐ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｒ２４７４Ｓ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｔ２５０４Ｍ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｋ３７１７Ｒ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｌ３７７８Ｆ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｇ３９２６Ｄ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｇ３９４６Ｓ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｑ４１５９Ｐ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｒ４６５１Ｉ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｖ４７７１Ｉ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｆ４８５１Ｌ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００３５】
いくつかの実施形態において、患者は、Ａ４８６０Ｇ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００３６】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｉ４８６７Ｍ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００３７】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｐ４９０２Ｓ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、およびＲ４９５９Ｑ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００３８】
いくつかの実施形態において、患者は、Ｒ４９５９Ｑ突然変異と、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｇ１７８Ａ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、およびＰ４９０２Ｓ突然変異のうちの１つ以上とを有する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、患者は、カルモジュリンをコードする内因性遺伝子において突然変異を示す。例えば、患者は、心筋細胞の筋小胞体からのカルシウム放出のＣＡＬＭ１阻害を低減する突然変異などのＣＡＬＭ１の突然変異を示し得る。いくつかの実施形態において、突然変異を宿すＣＡＬＭ１は、心筋細胞の筋小胞体からのカルシウム放出を直接活性化する。例えば、突然変異は、約５０ｎＭから約５μＭのＣａ２＋濃度（例えば、約５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、９５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、または５μＭのＣａ２＋濃度）を有する水溶液中に存在するＣＡＬＭ１−ＲＹＲ２複合体におけるＲＹＲ２のオープン構造の安定性を高め得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＬＭ１の突然変異は、Ｎ９７ＳまたはＮ５３Ｉである。
【００４０】
いくつかの実施形態において、患者は、心筋細胞の筋小胞体からのカルシウム放出の直接活性化をもたらす突然変異などのＣＡＬＭ３の突然変異を示す。いくつかの実施形態において、ＣＡＬＭ３の突然変異はＡ１０３Ｖである。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ＲＹＲ２またはカルモジュリン（例えば、ＣＡＬＭ１および／またはＣＡＬＭ３）の突然変異は、ヘテロ接合性である。
【００４２】
いくつかの実施形態（例えば、ヒト患者を治療する実施形態）において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、配列番号１のアミノ酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列に対して１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するタンパク質をコードし得る。例えば、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列に対して最大５０個の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の保存的アミノ酸置換）を有するタンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列に対して最大２５個の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の保存的アミノ酸置換）を有するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列に対して最大１０個の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の保存的アミノ酸置換）を有するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、保存的アミノ酸置換によってのみ配列番号１のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するものをコードする。
【００４３】
いくつかの実施形態（例えば、ヒト患者を治療する実施形態）において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列に対して１つ以上の非保存的アミノ酸置換を有するタンパク質をコードする。例えば、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列に対して最大５０個の非保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の非保存的アミノ酸置換）を有するタンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列に対して最大２５個の非保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の保存的アミノ酸置換）を有するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列に対して最大１０個の非保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の保存的アミノ酸置換）を有するタンパク質をコードする。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、配列番号３のアミノ酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列に対して１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するタンパク質をコードし得る。例えば、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列に対して最大５０個の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の保存的アミノ酸置換）を有するタンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列に対して最大２５個の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の保存的アミノ酸置換）を有するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列に対して最大１０個の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の保存的アミノ酸置換）を有するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、保存的アミノ酸置換によってのみ配列番号３のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するものをコードする。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列に対して１つ以上の非保存的アミノ酸置換を有するタンパク質をコードする。例えば、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列に対して最大５０個の非保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の非保存的アミノ酸置換）を有するタンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列に対して最大２５個の非保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の保存的アミノ酸置換）を有するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列に対して最大１０個の非保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の保存的アミノ酸置換）を有するタンパク質をコードする。
【００４６】
いくつかの実施形態（例えば、ヒト患者を治療する実施形態）において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号２の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、配列番号２の核酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号４の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、配列番号４の核酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子を含む組成物は、ウイルスベクターなどのベクターである。ウイルスベクターは、例えば、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または合成ウイルス（例えば、キメラウイルス、モザイクウイルス、または偽型化ウイルス、および／または、外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、および／または小分子を含むウイルス）であってもよい。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ７４血清型ベクターなどのＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは偽型化されてもよい。いくつかの実施形態において、偽型化ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／８またはＡＶ２／９である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、組成物は、ベクター（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ２／８、またはＡＶ２／９ベクターに例示される上記のＡＡＶベクターなどのウイルスベクター）であり、ベクターは、約１ｘ１０６ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ〜約１ｘ１０１８ＧＣ／ｋｇの用量（例えば、約１ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、または１ｘ１０１８ＧＣ／ｋｇの用量）で患者に投与される。いくつかの実施形態において、ベクターは、約１ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ〜約１ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇの用量（例えば、約１ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、または１ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇの用量）で患者に投与される。いくつかの実施形態において、ベクターは、約１ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ〜約１ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇの用量（例えば、約１ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、または１ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇの用量）で患者に投与される。
【００５０】
いくつかの実施形態において、組成物は、リポソーム、小胞、合成小胞、エキソソーム、合成エキソソーム、デンドリマー、またはナノ粒子である。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子は、心筋細胞においてＣＡＳＱ２の発現を誘導するプロモーターに作動可能に連結される。例えば、プロモーターは、デスミンプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ミオシン軽鎖２プロモーター、アルファアクチンプロモーター、トロポニン１プロモーター、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体プロモーター、ジストロフィンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、アルファ７インテグリンプロモーター、脳性ナトリウム利尿ペプチドプロモーター、アルファＢクリスタリン／小熱ショックタンパク質プロモーター、アルファミオシン重鎖プロモーター、または心房性ナトリウム利尿因子プロモーターであってもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターは、デスミンプロモーターである。
【００５２】
いくつかの実施形態において、デスミンプロモーターは、内因性ヒトデスミン転写開始部位に関してヌクレオチド−９８４から＋７６の核酸配列を有する領域、または、この核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６  ％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である）領域を含む。いくつかの実施形態において、デスミンプロモーターは、内因性ヒトデスミン転写開始部位に関してヌクレオチド−９７３から−６９３の核酸配列を有する領域、または、この核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である）領域を含む。いくつかの実施形態において、デスミンプロモーターは、内因性ヒトデスミン転写開始部位に関してヌクレオチド−９８４から−６４４の核酸配列を有する領域、または、この核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である）領域を含む。いくつかの実施形態において、デスミンプロモーターは、内因性ヒトデスミン転写開始部位に関してヌクレオチド−２６９から＋７６の核酸配列を有する領域、または、この核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である）領域を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態において、デスミンプロモーターは、（ｉ）内因性ヒトデスミン転写開始部位に関してヌクレオチド−９７３から−６９３の核酸配列、または、（ｉｉ）内因性ヒトデスミン転写開始部位に関してヌクレオチド−９７３から−６９３の核酸配列に少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）、を有する第１の領域を含む。デスミンプロモーターはさらに、（ｉ）内因性ヒトデスミン転写開始部位に関してヌクレオチド−２６９から＋７６の核酸配列、または、（ｉｉ）内因性ヒトデスミン転写開始部位に関するヌクレオチド−２６９から＋７６の核酸配列に少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）、を有する第２の領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、第１の領域は、第２の領域に作動可能に連結される。例えば、第１の領域は、介在するヌクレオチドの有無にかかわらず、第２の領域に直接連結されてもよい。いくつかの実施形態において、第１の領域は、第２の領域の５’に位置する（すなわち、第１の領域の３’末端が第２の領域の５’末端に連結される）。いくつかの実施形態において、第１の領域は、第２の領域の３’に位置する（すなわち、第１の領域の５’末端が第２の領域の３’末端に連結される）。
【００５４】
いくつかの実施形態において、デスミンプロモーターは、（ｉ）内因性ヒトデスミン転写開始部位に関してヌクレオチド−９８４から−６４４の核酸配列、または、（ｉｉ）内因性ヒトデスミン転写開始部位に関してヌクレオチド−９８４から−６４４の核酸配列に少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）、を有する第１の領域を含む。デスミンプロモーターはさらに、（ｉ）内因性ヒトデスミン転写開始部位に関してヌクレオチド−２６９から＋７６の核酸配列、または、（ｉｉ）内因性ヒトデスミン転写開始部位に関してヌクレオチド−２６９から＋７６の核酸配列に少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）、を有する第２の領域を含んでもよい。いくつかの実施形態において、第１の領域は、第２の領域に作動可能に連結される。例えば、第１の領域は、介在するヌクレオチドの有無にかかわらず、第２の領域に直接連結されてもよい。いくつかの実施形態において、第１の領域は、第２の領域の５’に位置する（すなわち、第１の領域の３’末端が第２の領域の５’末端に連結される）。いくつかの実施形態において、第１の領域は、第２の領域の３’に位置する（すなわち、第１の領域の５’末端が第２の領域の３’末端に連結される）。
【００５５】
本開示の組成物および方法と併せて使用され得る例示的なデスミンプロモーターは、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３：６４０２−６４０９（１９９８）に記載されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、組成物を患者に投与すると、患者の心臓細胞（例えば、心筋細胞）においてＣＡＳＱ２の発現が増加する。例えば、ＣＡＳＱ２の発現は、当該技術分野において既知であり本明細書に記載される遺伝子発現アッセイを使用してＣＡＳＱ２タンパク質またはＣＡＳＱ２ｍＲＮＡを測定することによって評価することができる。組成物を患者に投与すると、心臓細胞におけるＣＡＳＱ２発現は、例えば、約１．１倍〜約１０倍、またはそれ以上（例えば、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６倍、６．１倍、６．２倍、６．３倍、６．４倍、６．５倍、６．６倍、６．７倍、６．８倍、６．９倍、７倍、７．１倍、７．２倍、７．３倍、７．４倍、７．５倍、７．６倍、７．７倍、７．８倍、７．９倍、８倍、８．１倍、８．２倍、８．３倍、８．４倍、８．５倍、８．６倍、８．７倍、８．８倍、８．９倍、９倍、９．１倍、９．２倍、９．３倍、９．４倍、９．５倍、９．６倍、９．７倍、９．８倍、９．８倍、１０倍、またはそれ以上）増加し得る。例えば、ＣＡＳＱ２発現は、心臓細胞において約１．５倍〜約３．５倍（例えば、約．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、または３．５倍）増加し得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２発現は、細胞において約２倍〜約３倍（例えば、約２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、または３倍）増加する。いくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２発現は、細胞において約２．５倍〜約３倍（例えば、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、または３倍）増加する。
【００５７】
いくつかの実施形態において、組成物を患者に投与すると、ＲＹＲ２、トリアジン、および／またはジャンクチンの発現は、例えばタンパク質および／またはｍＲＮＡ発現を評価することによって判断されるように、患者の心臓細胞（例えば、心筋細胞）において実質的に変化しない。例えば、組成物を患者に投与すると、ＲＹＲ２、トリアジン、および／またはジャンクチンの発現は、１０％未満（例えば、９．９％、９．８％、９．７％、９．６％、９．５％、９．４％、９．３％、９．２％、９．１％、９％、８．９％、８．８％、８．７％、８．６％、８．５％、８．４％、８．３％、８．２％、８．１％、８％、７．９％、７．８％、７．７％、７．６％、７．５％、７．４％、７．３％、７．２％、７．１％、７％、６．９％、６．８％、６．７％、６．６％、６．５％、６．４％、６．３％、６．２％、６．１％、６％、５．９％、５．８％、５．７％、５．６％、５．５％、５．４％、５．３％、５．２％、５．１％、５％、４．９％、４．８％、４．７％、４．６％、４．５％、４．４％、４．３％、４．２％、４．１％、４％、３．９％、３．８％、３．７％、３．６％、３．５％、３．４％、３．３％、３．２％、３．１％、３％、２．９％、２．８％、２．７％、２．６％、２．５％、２．４％、２．３％、２．２％、２．１％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０１％、０．００１％、またはそれ以下）増加および／または減少する。
【００５８】
いくつかの実施形態において、組成物は、静脈内、髄腔内、筋肉内、皮内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、非経口、鼻腔内、皮下、経皮的（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、気管内、腹腔内、動脈内、血管内、吸入、灌流、洗浄、および／または経口投与によって患者に投与される。
【００５９】
別の態様において、本発明は、ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子を含む組成物を含むキットを特徴とする。キットはさらに、本発明の上記態様のうちのいずれかおよび／または上記実施形態のうちのいずれかの方法に従って、患者（例えば、ヒト患者）の優性ＣＰＶＴまたはその症状を治療するために患者に組成物を投与するようにキットのユーザーに指示する添付文書を含んでもよい。
【００６０】
前述の態様のいくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、配列番号１のアミノ酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【００６１】
前述の態様のいくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号２の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、配列番号２の核酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有するものをコードする。
【００６２】
前述の態様のいくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子を含む組成物は、ウイルスベクターなどのベクターである。ウイルスベクターは、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはワクシニアウイルスであってもよい。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ７４血清型ベクターなどのＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは偽型化されてもよい。いくつかの実施形態において、偽型化ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／８またはＡＶ２／９である。
【００６３】
前述の態様のいくつかの実施形態において、組成物は、リポソーム、小胞、合成小胞、エキソソーム、合成エキソソーム、デンドリマー、またはナノ粒子である。
【００６４】
前述の態様のいくつかの実施形態において、ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子は、心筋細胞においてＣＡＳＱ２の発現を誘導するプロモーターに作動可能に連結される。例えば、プロモーターは、デスミンプロモーター、ミオシン軽鎖２プロモーター、アルファアクチンプロモーター、トロポニン１プロモーター、、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体プロモーター、ジストロフィンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、アルファ７インテグリンプロモーター、脳性ナトリウム利尿ペプチドプロモーター、アルファＢ−クリスタリン／小熱ショックタンパク質プロモーター、アルファミオシン重鎖プロモーター、または心房性ナトリウム利尿因子プロモーターであってもよい。
【定義】
【００６５】
本明細書において、用語「約」は、記載される値のプラスマイナス１０％以内の値を指す。
【００６６】
本明細書において、用語「カルモジュリン１」（「ＣＡＬＭ１」）および「カルモジュリン３」（「ＣＡＬＭ３」）は、例えば筋肉細胞（例えば、心筋細胞）において二次メッセンジャーとして発現されるカルモジュリンカルシウム結合タンパク質を指す。ＣＡＬＭ１およびＣＡＬＭ３は、二価カルシウムイオンの細胞質濃度の調節を支援する。野生型ＣＡＬＭ１の例示的なアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００８８１９．１に見られる。同様に、野生型ＣＡＬＭ３の例示的なアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１３１６８５１．１に見られる。
【００６７】
本明細書において、用語「カルセクエストリン２」および「ＣＡＳＱ２」は、例えば、心筋細胞などの筋肉組織における二価カルシウムの細胞質濃度の調節に関与するカルシウム結合タンパク質を指す。ヒトでは、ＣＡＳＱ２をコードする自然発生遺伝子は、１番染色体上に位置し、「ＰＤＩＢ２」としても知られる。用語「カルセクエストリン２」、「ＣＡＳＱ２」、および「ＰＤＩＢ２」は、本明細書において互換的に使用され、野生型のＣＡＳＱ２だけでなく、野生型ＣＡＳＱ２タンパク質の変種およびそれをコードする核酸も指す。野生型ヒトＣＡＳＱ２のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号１として提供され、当該技術分野においてＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１２２３．２として特徴付けられる。さらに、野生型ヒトＣＡＳＱ２の核酸配列は、本明細書では配列番号２として提供され、当該技術分野においてＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１２３２．３として特徴付けられる。本明細書に記載の組成物および方法と併せて使用され得るＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、配列番号１のアミノ酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする導入遺伝子、および、配列番号１のアミノ酸配列に対して１つ以上の保存的アミノ酸置換（例えば、最大５、最大１０、最大１５、最大２０、最大２５、最大３０、最大３５、最大４０、最大４５、または最大５０個の保存的アミノ酸置換）および／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換（例えば、最大５、最大１０、最大１５、最大２０、最大２５、最大３０、最大３５、最大４０、最大４５、または最大５０個の非保存的アミノ酸置換）を有するタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。本明細書に記載の組成物および方法と併せて使用され得る例示的なＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、配列番号２のアミノ酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有するものを含む。本明細書におけるＣＡＳＱ２導入遺伝子はさらに、例えば、野生型ＣＡＳＱ２の親和性の最大２５％以内の親和性（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、または２５％以内の親和性）および／または野生型ＣＡＳＱ２の化学量論から２５％以下の範囲内（例えば、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の範囲内）で逸脱する化学量論で、二価カルシウムを重合および結合する能力を保持する前述のタンパク質のフラグメントをコードするものを含む。カルシウム結合親和性および化学量論を評価するために使用することができるアッセイの例は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １７３：８９−１０２（２００２）に記載されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６８】
本明細書において、用語「カテコラミン誘発多形性心室頻拍」および「ＣＰＶＴ」は、致命的な不整脈に対する患者の高い感受性を特徴とする遺伝性チャネル病を指す。常染色体優性および常染色体劣性変種というこの疾患の２つの形態が記載されている。この疾患の常染色体優性型は、心臓リアノジン受容体２型（ＲＹＲ２）遺伝子の突然変異に関連付けられ、常染色体劣性変種は、ＣＡＳＱ２遺伝子の突然変異に関連付けられる（例えば、Ｐｒｉｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ＩＩ）：３３５（２００１）、および、Ｌａｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ６９：１３７８−１３８４（２００１）を参照。それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書において区別なく「優性ＣＰＶＴ」および「常染色体優性ＣＰＶＴ」と呼ばれる優性遺伝性の疾患を有する患者は、典型的に、交感神経活性化に応答して双方向性および多形性心室頻拍を呈する。優性ＣＰＶＴを有する患者の安静時心電図プロファイルは目立たず、心臓構造が保たれている。ＣＰＶＴの不整脈は、本明細書において「自発的カルシウム放出」または「ＳＣＲ」と呼ばれる、活動電位によって引き起こされないカルシウム放出事象によって誘発される。ＳＣＲは、単一のカルシウム放出ユニット（ＣＲＵ）を伴う局所的事象として始まるが、隣接するＣＲＵに拡散することもあり、その結果、より多くのカルシウム放出が引き起こされ、細胞全体のカルシウム波が発生する。筋小胞体からの異常なカルシウム放出が発生すると、その後に続く活動電位が心臓全体に伝播し、期外収縮性心拍を引き起こす可能性がある。この一連の事象が繰り返されると、撃発不整脈活動が誘発される。優性ＣＰＶＴは、βアドレナリン作動性刺激中にＳＣＲの発生を促進することが示されているリアノジン受容体２（ＲＹＲ２）の突然変異によって引き起こされることが多い。このカルシウム活性の調節不全の結果として生じる不整脈は、致命的な不整脈につながる可能性がある（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９９：２９２−２９８（２００６）を参照。その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。優性ＣＰＶＴに関連付けられるＲＹＲ２の突然変異には、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｇ１７８Ａ、Ｒ４２０Ｗ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑが含まれる。
【００６９】
本明細書において、タンパク質の突然変異は、「ＡＡ１−Ｎ−ＡＡ２」の形態を使用して表され、ＡＡ１は、目的のタンパク質の野生型形態のＮ位に生じるアミノ酸を表し、ＡＡ２は、タンパク質の変異形態のＮ位に生じるアミノ酸を表す。例えば、ＲＹＲ２突然変異体「Ｒ４４９７Ｃ」は、野生型ＲＹＲ２タンパク質の４４９７位のアルギニン残基がシステイン残基で置き換えられているＲＹＲ２の変異形を指す。ＲＹＲ２突然変異体「Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ」は、野生型ＲＹＲ２のアミノ酸残基Ｖ４３１９からＫ４３２４をコードするヌクレオチドが複製され、これらアミノ酸をコードする１８ヌクレオチドの追加のインスタンスの挿入（例えば、野生型ＲＹＲ２遺伝子のヌクレオチド１２９５５および１２９５６の間の残基ＧＴＣＧＡＡＧＧＴＧＣＴＡＡＡＡＡＧ（配列番号７）の挿入）をもたらす、ＲＹＲ２遺伝子の変異形を指す。
【００７０】
本明細書において、用語「保存的突然変異」、「保存的置換」、または「保存的アミノ酸置換」は、極性、静電荷、および立体体積などの同様の物理化学的特性を示す１つ以上の異なるアミノ酸に対する１つ以上のアミノ酸の置換を指す。これらの特性は、以下の表１に、２０個の自然発生アミノ酸のそれぞれについて要約される。
【００７１】
【表１】
2021523093.tif 000002
【００７２】
この表から、保存的アミノ酸ファミリーには、例えば、（ｉ）Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、およびＭ、（ｉｉ）ＤおよびＥ、（ｉｉｉ）Ｃ、Ｓ、およびＴ、（ｉｖ）Ｈ、Ｋ、およびＲ、（ｖ）ＮおよびＱ、および（ｖｉ）Ｆ、Ｙ、およびＷが含まれることが分かる。したがって、保存的突然変異または置換は、同じアミノ酸ファミリーのメンバーを１つのアミノ酸で置換するものである（例えば、ＴｈｒをＳｅｒで置換する、または、ＡｒｇをＬｙｓで置換する）。
【００７３】
本明細書において、用語「デスミンプロモーター」は、（ｉ）ヒトデスミン転写開始部位に関してヌクレオチド−９８４から＋７６までで定義される内因性ヒトデスミンプロモーターの核酸配列を有するポリヌクレオチド、および、（ｉｉ）その変種および機能的部分を指す。例えば、本開示の組成物および方法と併せて使用され得るデスミンプロモーターには、ヒトデスミン転写開始部位に関してヌクレオチド−９８４から＋７６までの核酸配列と少なくとも８５％同一（例えば、８５％、８６％、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％、またはそれ以上同一）であり、導入遺伝子がプロモーターに作動可能に連結される際に細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞、またはヒト心筋細胞などの真核細胞）におけるＣＡＳＱ２導入遺伝子の発現を促進するものが含まれる。本明細書に記載の組成物および方法と併せて使用され得るデスミンプロモーターのさらなる例は、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３：６４０２−６４０９（１９９８）に記載されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書においてプロモーターなどの転写調節エレメントとの関連で使用される場合、用語「機能的部分」は、標的細胞において目的の遺伝子の転写を刺激する能力を保持するより大きな核酸の部分を指す。例えば、内因性ヒトデスミンプロモーターは、デスミン転写開始部位に関して、ヌクレオチド−９８４から＋７６を含む。より大きな核酸の転写活性化特性を保持することができるこの遺伝子座の機能的部分の例は、デスミン転写開始部位に関して、ヌクレオチド−９７３から−６９３を含む領域である。他の例は、デスミン転写開始部位に関して、ヌクレオチド−２６９から＋７６を含む領域である。
【００７４】
同様に、本明細書において、用語「サイトメガロウイルスプロモーター」、「ミオシン軽鎖２プロモーター」、「アルファアクチンプロモーター」、「トロポニン１プロモーター」、「Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体プロモーター」、「ジストロフィンプロモーター」、「クレアチンキナーゼプロモーター」、「アルファ７インテグリンプロモーター」、「脳性ナトリウム利尿ペプチドプロモーター」、「アルファＢクリスタリン／小熱ショックタンパク質プロモーター」、「アルファミオシン重鎖プロモーター」、および「心房性ナトリウム利尿因子プロモーター」はそれぞれ、野生型内因性ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、ミオシン軽鎖２プロモーター、アルファアクチンプロモーター、トロポニン１プロモーター、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体プロモーター、ジストロフィンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、アルファ７インテグリンプロモーター、脳性ナトリウム利尿ペプチドプロモーター、アルファＢクリスタリン／小熱ショックタンパク質プロモーター、アルファミオシン重鎖プロモーター、および心房性ナトリウム利尿因子プロモーター、ならびにその変種および機能的部分を指す。
【００７５】
本明細書において突然変異との関連で使用される場合、用語「ヘテロ接合性」は、患者が特定の遺伝子の１つの突然変異アレル、すなわち突然変異母方アレルまたは突然変異父方アレルのいずれかを有する場合を指す。
【００７６】
本明細書において突然変異との関連で使用される場合、用語「ホモ接合性」は、患者が特定の遺伝子の２つの突然変異アレル、すなわち突然変異母方アレルおよび突然変異父方アレルを有する場合を指す。
【００７７】
本明細書において、用語「機能獲得型突然変異」は、タンパク質内の１つ以上のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失によってタンパク質の機能が増強される突然変異を指す。例えば、リアノジン受容体２（ＲＹＲ２）タンパク質は、心筋細胞の筋小胞体から細胞質ゾルへの二価カルシウムイオンの放出を仲介するチャネルタンパク質である。ＲＹＲ２の場合における例示的な機能獲得型突然変異は、筋小胞体からのＲＹＲ２媒介性カルシウム輸出の上昇をもたらすものである。ＲＹＲ２の機能獲得型突然変異には、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｇ１７８Ａ、Ｒ４２０Ｗ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、および／またはＲ４９５９Ｑなどが含まれる。
【００７８】
本明細書において、用語「作動可能に連結された」は、第２の分子（例えば、第２の核酸）に第１の分子（例えば、第１の核酸）が結合することを指し、これら分子は、第１の分子が第２の分子の機能に影響を与えるように配置される。２つの分子は、単一の隣接する分子の一部であってもなくてもよく、互いに隣接していてもしていなくてもよい。例えば、プロモーターが細胞内の目的の転写可能なポリヌクレオチド分子の転写を調節する場合、プロモーターは転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結される。さらに、転写調節エレメントの２つの部分は、一方の部分の転写活性化機能が他方の部分の存在によって悪影響を受けないようにそれらが結合されている場合、互いに作動可能に連結される。２つの転写調節エレメントは、リンカー核酸（例えば、介在する非コード核酸）を介して互いに作動可能に連結され得るか、または介在するヌクレオチドなしに互いに作動可能に連結され得る。
【００７９】
参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関する「パーセント（％）配列同一性」は、配列を整列（アライメント）し必要に応じてギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後の、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における核酸またはアミノ酸と同一である候補配列における核酸またはアミノ酸のパーセンテージとして定義される。パーセント核酸またはアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、またはＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを利用して、当業者の能力の範囲内で種々の方法で行うことができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列アラインメントのための適切なパラメーターを決定することができる。例えば、パーセント配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを用いて生成してもよい。実例として、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｂに対する所与の核酸またはアミノ酸配列Ａのパーセント配列同一性（言い換えると、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｂに対して特定のパーセント配列同一性を有する所与の核酸またはアミノ酸配列Ａ）は、以下のように計算される：
１００×（分数Ｘ／Ｙ）
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラム（ＢＬＡＳＴなど）によってそのプログラムのＡとＢとのアラインメントで完全な一致としてスコア付けされたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｙは、Ｂにおける核酸の総数である。核酸またはアミノ酸配列Ａの長さが核酸またはアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのパーセント配列同一性は、Ａに対するＢのパーセント配列同一性と等しくない。
【００８０】
本明細書において、用語「医薬組成物」は、ヒトに例示される哺乳動物などの対象に影響を与えているまたは影響を与える可能性のある特定の疾患や状態を予防、治療、または制御するために対象に投与される治療薬を、任意に１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤、および／または担体と組み合わせて含む混合物を指す。
【００８１】
本明細書において、用語「薬学的に受容可能」は、合理的なベネフィット‐リスク比に見合った過度の毒性、刺激、アレルギー反応、およびその他の問題なしに、哺乳動物（例えば、ヒト）などの対象の組織との接触に適した化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
【００８２】
本明細書において、用語「リアノジン受容体２」および「ＲＹＲ２」は、例えば心筋細胞において筋小胞体の外側に位置するカルシウムチャネルタンパク質を指す。ＲＹＲ２は、筋小胞体からの二価カルシウムの放出を仲介し、これにより、心臓の収縮につながる活動電位を刺激する。野生型ヒトＲＹＲ２の例示的なアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１０２６．２に見られる。
【００８３】
本明細書において、用語「リアノジン受容体２アゴニスト」および「ＲＹＲ２アゴニスト」は、ＲＹＲ２チャネルタンパク質のカルシウム放出特性を刺激する薬剤を指す。例示的なＲＹＲ２アゴニストには、カフェイン、エピネフリン、トリフルオロペラジン、およびマウロカルシンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
本明細書において、用語「サンプル」は、対象から分離された標本（例えば、血液、血液成分（例えば、血清または血漿）、尿、唾液、羊水、脳脊髄液、組織（例えば、胎盤または皮膚）、膵臓液、絨毛膜絨毛サンプル、または細胞）を指す。対象は、例えば、遺伝性心臓障害（例えば、優性カテコラミン誘発多形性心室頻拍などの頻脈）などの、本明細書に記載の疾患に罹患している患者であってもよい。
【００８５】
本明細書において、表現「特異的に結合する」および「結合する」は、特異的に、カルシウム結合タンパク質などの、リガンドまたは受容体などによって認識されるイオン、塩、小分子、および／またはタンパク質の異種集団における、二価カルシウムイオンなどの特定の分子またはイオンの存在を決定する結合反応を指す。種（例えば、二価イオン）に特異的に結合するリガンド（例えば、カルシウム結合タンパク質）は、例えば、１ｍＭ未満のＫＤで種に結合し得る。例えば、種に特異的に結合するリガンドは、最大１００μＭ（例えば、１ｐＭから１００μＭの間）のＫＤで種に結合し得る。別の分子またはイオンへの特異的結合を示さないリガンドは、その特定の分子またはイオンに１ｍＭ（例えば、１μＭ、１００μＭ、５００μＭ、１ｍＭ、またはそれ以上）を超えるＫＤを示し得る。特定のタンパク質に対するリガンドの親和性を決定するために、様々なアッセイフォーマットを用いてもよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡアッセイは、標的タンパク質に特異的に結合するリガンドを同定するために日常的に使用されている。特定のタンパク質結合を決定するために利用可能なアッセイフォーマットと条件の説明については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、および、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照されたい。標的イオン（例えば、二価カルシウムイオン）に対するリガンドの親和性を決定するために利用可能な例示的なアッセイは、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １７３：８９−１０２（２００２）に記載されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８６】
本明細書において、用語「対象」および「患者」は、本明細書に記載の特定の疾患や状態（例えば、常染色体優性カテコラミン誘発多形性心室頻拍などの遺伝性心臓障害）の治療を受ける生物を指す。対象および患者の例には、本明細書に記載の疾患や状態の治療を受けているヒトなどの哺乳動物が含まれる。
【００８７】
本明細書において、用語「頻脈」は、所与の種の通常の安静時心拍数を超える、患者（例えば、優性ＣＰＶＴを有するヒト患者）によって示される心拍数を指す。ヒト患者の治療の場合、頻脈には、患者の心拍数が１分あたり１００拍を超える場合が含まれる。頻脈を監視するための方法は当該技術分野で既知であり、例えば、後述の実施例１に記載される。
【００８８】
本明細書において、用語「転写調節エレメント」は、目的の遺伝子の転写を少なくとも部分的に制御する核酸を指す。転写調節エレメントは、遺伝子転写を制御するか、または制御するのを助けるプロモーター、エンハンサー、および他の核酸（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含み得る。転写調節エレメントの例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  １９９０）に記載されている。
【００８９】
本明細書において、用語「治療する」または「治療」は、治療処置を指し、その目的は、ＣＰＶＴ、特に優性なＣＰＶＴなどの遺伝性心臓障害の進行などの望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速（軽減）することである。ＣＰＶＴ治療の場合、有益または望ましい臨床結果には、検出可能か検出不可能かにかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、および寛解（部分的または全体的）が含まれるが、これらに限定されない。ＣＰＶＴ（例えば、優性ＣＰＶＴ）を有する患者の治療は、本明細書に記載の治療薬の投与後の特定期間に患者によって示される不整脈事象（例えば、頻脈事象）の量または頻度の減少（例えば、本明細書に記載のＣＡＳＱ２導入遺伝子をコードするウイルスベクターなどのベクターの投与後に患者によって示される不整脈事象（例えば、頻脈事象）の量または頻度の減少）などの１つ以上の検出可能な変化に現れ得る。例えば、本明細書に記載の組成物および方法を使用する優性ＣＰＶＴ患者の治療の成功の兆候は、治療薬の投与前の期間（例えば、同じ長さの期間）に患者によって示される不整脈事象（例えば、頻脈事象）の量および／または頻度に対して、治療薬の投与後の特定期間に患者によって示される不整脈事象（例えば、頻脈事象）の量または頻度が、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少したという知見を含む。ＣＰＶＴ患者の治療の成功の別の臨床的兆候には、患者への治療薬の投与後、患者の心筋細胞（例えば、心筋細胞）における細胞質カルシウム（［Ｃａ２＋］）の平均拡張期濃度が、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、またはそれ以上減少したという知見を含む。治療の成功のさらに別の兆候は、患者（例えば、患者の心筋細胞などの心臓細胞）におけるＣＡＳＱ２の発現が治療薬の投与後に増加したという知見である。ＣＡＳＱ２の発現は、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはそれ以上増加し得る。ＣＡＳＱ２タンパク質の濃度は、例えば、本明細書に記載のＥＬＩＳＡアッセイを含む、当該技術分野で既知のタンパク質検出アッセイを用いて、ｅｘ  ｖｉｖｏで決定されてもよい。ＣＡＳＱ２をコードする核酸の濃度は、例えば、本明細書に記載の核酸検出アッセイ（例えば、ＲＮＡＳｅｑアッセイ）を用いて、ｅｘ  ｖｉｖｏで決定されてもよい。
【００９０】
本明細書において、用語「ベクター」は、複製および／または発現などの目的で、目的の遺伝子を細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞）に送達するためのビヒクルとして機能し得るＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸を指す。本明細書に記載の組成物および方法と併せて有用な例示的なベクターは、プラスミド、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、ビリオン、または他の適切なレプリコン（例えば、ウイルスベクター）である。外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを原核生物または真核生物の細胞に送達するために、様々なベクターが開発されている。このような発現ベクターの例は、例えば、ＷＯ１９９４／１１０２６に開示されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列、ならびに、例えば、タンパク質の発現および／またはこれらのポリヌクレオチド配列の哺乳動物細胞のゲノムへの組み込みに使用される追加の配列エレメントを含む。本明細書に記載の導入遺伝子の発現に利用可能な特定のベクターには、遺伝子転写を誘導するプロモーターおよびエンハンサー領域などの調節配列を含むプラスミドが含まれる。導入遺伝子の発現のための他の有用なベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を高めるか、または遺伝子転写から生じるｍＲＮＡの安定性または核輸出を改善するポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列エレメントには、例えば、５’および３’非翻訳領域、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、および発現ベクターで運ばれる遺伝子の効率的な転写を指示するためのポリアデニル化シグナル部位が含まれる。本明細書に記載の発現ベクターはまた、そのようなベクターを含む細胞の選択のためのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含み得る。適切なマーカーの例には、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、またはヌールセオスリシンなどの抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】後述の実施例１に記載のマウスＣＡＳＱ２遺伝子治療実験で使用されるｐＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−ＣＡＳＱ２−ＩＲＥＳ−ｅＧＰ構成物の図である。ベクターは、５’から３’の方向に、５’ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）、野生型マウスカルセクエストリン２（ＣＡＳＱ２）導入遺伝子、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）導入遺伝子、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列、および３’ＡＡＶ２ＩＴＲを含む。後述の実施例１で使用されるｐＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−ＣＡＳＱ２−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ構成物は、ＡＡＶ９キャプシドにパッケージされ、こうして組み換えＡＡＶ２／９ベクターを生成した。
【図２】エピネフリン（２ｍｇ／ｋｇ）とカフェイン（１２０ｍｇ／ｋｇ）への曝露時の、常染色体優性ＣＰＶＴのモデルであるＲ４４９６Ｃ／＋ヘテロ接合性ノックインマウス（Ｒｙｒ２−Ｈｅｔ）における不整脈事象のパーセンテージ（比率）に対するｐＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−ＣＡＳＱ２−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰベクターの効果を示すグラフである。黒いバー（左）は、未治療の全てのＲｙＲ２−Ｈｅｔマウス（ｎ＝５）がエピネフリンとカフェインの投与後に不整脈を示したことを示す。グラフの右側の結果は、ｐＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−ＣＡＳＱ２−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰベクター（ｎ＝４）に感染したＲｙＲ２−Ｈｅｔマウスのいずれも不整脈を発症しなかったことを示す。
【図３】野生型マウスおよび未治療またはｐＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−ＣＡＳＱ２−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰベクターで治療したＲＹＲ２Ｒ４４９６Ｃ／＋マウスの心筋組織におけるＣＡＳＱ２、心臓ＲＹＲ２、トリアジン、およびジャンクチンのｍＲＮＡ発現を示すグラフである。結果は、野生型マウス（ＷＴ、白いバー）におけるｍＲＮＡ発現に対して正規化されたｍＲＮＡの発現倍率（発現量）として報告される。黒いバーは、野生型（ＷＴ）に対する、未治療のＲＹＲ２Ｒ４４９６Ｃ／＋ヘテロ接合性ノックインマウス（Ｒｙｒ２−Ｈｅｔ）のｍＲＮＡ転写物の発現倍率（発現量）を示す。灰色のバーは、野生型（ＷＴ）に対する、ｐＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−ＣＡＳＱ２−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰベクター（Ｒｙｒ２−Ｈｅｔ  ＡＡＶ９−ＣＡＳＱ２）で治療したＲＹＲ２Ｒ４４９６Ｃ／＋ヘテロ接合性ノックインマウスにおけるｍＲＮＡ転写物の発現倍率（発現量）を示す。
【図４】Ｒ４４９６Ｃ／＋ヘテロ接合性ノックインマウスにおいて抗不整脈効果を示すことが見出された別のＡＡＶベクターの種々の成分を示す図である。ベクターは、５’および３’ＡＡＶ２ＩＴＲが隣接するＣＡＳＱ２発現カセットを含む。発現カセットは、デスミンプロモーターに作動可能に連結された野生型ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子を含む。
【図５】４エピネフリン（２ｍｇ／ｋｇ）およびカフェイン（１２０ｍｇ／ｋｇ）への曝露時の、Ｒ４４９６Ｃ／＋ヘテロ接合性ノックインマウス（Ｒｙｒ２−Ｈｅｔ）における不整脈事象のパーセンテージ（比率）に対する、図４に示されるベクターを含む組み換え偽型化ＡＡＶ２／８の効果を示すグラフである。黒いバー（左）は、未治療のＲｙＲ２−Ｈｅｔマウス（ｎ＝９）の約４４％（９体中４体）がエピネフリンとカフェインの投与後に不整脈を示したことを示しす。グラフの右側の結果は、ＣＡＳＱ２をコードするｒＡＡＶ２／８ベクターに感染したＲｙＲ２−Ｈｅｔマウス（ｎ＝９）のいずれも不整脈を発症しなかったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
本明細書では、ヒト患者などの患者においてカテコラミン誘発多形性心室頻拍（ＣＰＶＴ）、特に常染色体優性ＣＰＶＴを治療する組成物および方法を記載する。優性ＣＰＶＴは、心筋細胞の２価カルシウムイオンの濃度を調節する１つ以上のタンパク質の突然変異によって引き起こされる。例えば、優性ＣＰＶＴは、リアノジン受容体２（ＲＹＲ２）タンパク質の様々な突然変異、特に筋小胞体からのＲＹＲ２を介した二価カルシウムイオンの放出を上方制御する機能獲得型突然変異に関連付けられる。以下に説明するように、これは、心拍で終了するシグナリング事象と筋収縮事象との連鎖につながる。優性ＣＰＶＴはまた、カルモジュリン１（ＣＡＬＭ１）やＣＡＬＭ３などのカルモジュリンタンパク質の機能喪失型突然変異にも関連付けられる。これらのタンパク質は、二価のカルシウムイオンを結合および隔離することによって細胞質カルシウムの調節を助け、それによって活動電位の伝播を防ぐ。拡張期、すなわち心臓の弛緩の期間、の筋小胞体からの過剰なカルシウム放出は、不整脈を引き起こす可能性のある期外収縮性心拍を生じさせる。
【００９３】
本開示は、優性ＣＰＶＴが、機能的ＲＹＲ２、ＣＡＬＭ１、またはＣＡＬＭ３タンパク質またはそれらをコードする導入遺伝子を患者に提供する必要なしに治療され得るという発見に部分的に基づく。本明細書に記載の組成物および方法を用いて、優性ＣＰＶＴを有するヒト患者などの患者は、機能的カルセクエストリン２（ＣＡＳＱ２）タンパク質をコードする導入遺伝子の投与によって治療され得る。ＣＡＳＱ２を投与すると、心臓のカルシウム恒常性が回復し、不整脈事象が減少し、正常な心拍が戻る。
【００９４】
本明細書に記載の組成物および方法を用いて、機能的ＣＡＳＱ２タンパク質をコードする導入遺伝子を、リポソーム、小胞、エクソソーム、デンドリマー、またはナノ粒子の使用など、以下に記載する他のアプローチの中でも、ウイルス遺伝子治療によって患者に送達することができる。以下の節では、優性ＣＰＶＴの基となる病態生理学の概要、および、患者に機能的ＣＡＳＱ２導入遺伝子を提供するために利用可能な例示的なベクターおよびその他の遺伝子送達ビヒクルについて説明する。
【００９５】
優性ＣＰＶＴ
ＣＰＶＴは、致命的な不整脈に対する高い感受性を特徴とする遺伝性チャネル病である。常染色体優性および常染色体劣性変種という、この疾患の２つの形態が報告されている。常染色体優性は心臓のＲＹＲ２遺伝子の突然変異に関連付けられ、常染色体劣性変種は心臓のＣＡＳＱ２遺伝子の突然変異に関連付けられる（Ｐｒｉｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ＩＩ）：３３５（２００１）、および、Ｌａｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ６９：１３７８−１３８４（２００１））。臨床観察では、ＣＰＶＴの優性な形態を有する患者は、交感神経の活性化に応答して双方向性および多形性心室頻拍を発症するが、安静時の心電図プロファイルは目立たず、心臓構造が保たれることが示されている。
【００９６】
優性ＣＰＶＴの基となる病理は、心臓の興奮収縮連関を維持するための基本であるカルシウム誘発性カルシウム放出（ＣＩＣＲ）と呼ばれる生理学的メカニズムの異常な機能に関連している。心筋細胞の膜にある電位依存性イオンチャネルの高度に調整された開閉によって、心臓の活動電位が生じる。活動電位のプラトー期に、電位依存性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルが開くことで、原形質膜におけるＣａ２＋の流入が可能になる。このプロセスは、カルシウムトランジェントを引き起こし、筋小胞体Ｃａ２＋放出チャネル：ＲＹＲ２の開口を誘発する（Ｂｅｒｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：１９８−２０５（２００２））。これらの局所放出は、カルシウム放出ユニット（ＣＲＵ）と呼ばれる特殊な構造で起こる。ＣＲＵは、筋小胞体の膜が細胞膜に並置されている横行小管（Ｔ管）のレベルに優先的に局在する。１つのＣＲＵは、細胞膜上のＬ型Ｃａ２＋チャネルに近接する、筋小胞体膜にまたがるＲＹＲ２のクラスターによって形成される（Ｆｒａｎｚｉｎｉ−Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，  ｅｔ  ｌ．，  Ａｎｎ．  ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０４７：７６-８５（２００５））。筋小胞体から放出されたＣａ２＋は、トロポニンＣに結合し、ミオシンフィラメントに一連のアロステリック変化を誘発して筋線維の収縮を引き起こす。その後のＣａ２＋の除去は、ＲＹＲ２の同時閉鎖と、Ｃａ２＋を筋小胞体ストア内へと送り返す筋小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼの作用とによって媒介される。
【００９７】
Ｃａ２＋トランジェント終了の別の成分は、Ｎａ＋−Ｃａ２＋交換体（ＮＣＸ）である。ＮＣＸは、細胞に取り込まれた３つのＮａ＋イオン（３つの正電荷）毎に、１つのＣａ２＋イオン（２つの正電荷）を押し出す。こうして、ＮＣＸは、正味の内向き脱分極電流、すなわち、一過性内向き電流（Ｉｔｉ）を生成することによって、Ｃａ２＋を除去する（Ｐｉｅｓｋｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ８５：３８-４６（１９９９））。ＮＣＸは、例えばＲＹＲ２遺伝性突然変異の場合などカルシウム過負荷を特徴とする条件下で、Ｃａ２＋の除去にとって非常に重要となる。
【００９８】
ＣＰＶＴの不整脈は、活動電位によって引き起こされないＣａ２＋放出事象（自発的カルシウム放出（ＳＣＲ）と呼ばれる）によって誘発される。ＳＣＲは、単一のＣＲＵが関与する局所的事象として始まるが、隣接するＣＲＵに拡散することもあり、その結果、より多くのＣａ２＋放出が引き起こされ、細胞全体のカルシウム波が発生する。ＳＣＲがカルシウム波を引き起こす確率は、筋小胞体Ｃａ２＋含有量と、筋小胞体カルシウム閾値と呼ばれるＣａ２＋放出を誘発するＣａ２＋濃度との間のバランスに影響される。ＲＹＲ２機能は、この閾値を制御する上で重要な役割を果たす。ＣＰＶＴに関連するいくつかのＲＹＲ２突然変異は、ＳＣＲが容易に誘導されるように筋小胞体カルシウム閾値を低下させることによって作用することが示唆されている（Ｖｅｎｅｔｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ９：５６１−７５（２０１２））。
【００９９】
異常なＣａ２＋漏出が発生すると、細胞質Ｃａ２＋濃度が上昇し、細胞は、Ｃａ２＋恒常性の崩壊を防ぎＣａ２＋の生理学的拡張期レベルを再確立するメカニズムを活性化する必要がある。Ｉｔｉ電流は、活動電位の完了後に一過性膜脱分極を生じ、これは、遅延後脱分極（ＤＡＤ）として知られている。ＤＡＤの振幅がＮａ＋チャネル活性化の電圧閾値に達すると、撃発活動電位が生成される。活動電位が心臓全体に伝播すると、期外収縮性心拍が起こる。この一連の事象が繰り返され、いくつかのＤＡＤが伝播活動電位の生成閾値に達すると、撃発不整脈活動が誘発される。いくつかの研究では、ＲＹＲ２の突然変異は、β-アドレナリン作動性刺激中にＳＣＲの発生を促進し、次にＤＡＤを誘発し、致命的な不整脈につながる活動を誘発することが示されている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９９：２９２−２９８（２００６））。
【０１００】
常染色体優性ＣＰＶＴのためのＲＹＲ２Ｒ４４９６Ｃ／＋ノックインマウスモデルの生成および特徴付け（例えば、Ｃｅｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９６：ｅ７７−ｅ８２（２００５）、および、ＵＳ７，７４１，５２９を参照）は、この疾患の病態メカニズムに対する優れた洞察を提供する。ＲＹＲ２Ｒ４４９６Ｃ／＋ヘテロ接合性マウスは、ヒトＣＰＶＴを再現し、アドレナリン作動性に誘発された双方向性および多型性心室性不整脈を発症する。ヒトのＲ４４９７Ｃ突然変異に対応するマウスのＲ４４９６Ｃ突然変異は、内腔カルシウムに対するＲＹＲ２チャネルの感受性を高め、筋小胞体からのカルシウムの自発的放出を促進する。
【０１０１】
優性ＣＰＶＴを引き起こす可能性のある突然変異の例は、Ｒ４４９７Ｃ、Ｎ４１０４Ｋ、Ｎ４８９５Ｄ、Ｒ１７６Ｑ、Ｇ１７８Ａ、Ｒ４２０Ｗ、Ｌ４３３Ｐ、Ｐ１０６７Ｓ、Ｓ２２４６Ｌ、Ｇ２２７３Ｒ、Ｆ２３０７Ｌ、Ｅ２３１１Ｄ、Ｌ２３４４Ｐ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｔ２５０４Ｍ、Ｋ３７１７Ｒ、Ｌ３７７８Ｆ、Ｇ３９２６Ｄ、Ｇ３９４６Ｓ、Ｑ４１５９Ｐ、Ｖ４３１９−Ｋ４３２４ｄｕｐ、Ｒ４６５１Ｉ、Ｖ４７７１Ｉ、Ｆ４８５１Ｌ、Ａ４８６０Ｇ、Ｉ４８６７Ｍ、Ｐ４９０２Ｓ、およびＲ４９５９Ｑである。優性ＣＰＶＴにつながる可能性のあるＣＡＬＭ１の突然変異には、Ｎ９７ＳおよびＮ５３Ｉが含まれ、優性ＣＰＶＴにつながる可能性のあるＣＡＬＭ３の突然変異の例はＡ１０３Ｖである。
【０１０２】
ヒトのＲ４９９７Ｃなどの不整脈を引き起こすＲＹＲ２、ＣＡＬＭ１、および／またはＣＡＬＭ３突然変異によって起こるＣＰＶＴは、これらのタンパク質をコードする機能的導入遺伝子を患者に提供する必要なしに治療できることが発見されている。本明細書に記載の組成物および方法を用いて、優性ＣＰＶＴを有する患者は、ＣＡＳＱ２導入遺伝子を含む送達ビヒクルの投与によって治療することができる。本明細書に記載の組成物および方法と併せて有用なＣＡＳＱ２の送達のための例示的なビヒクルを以下に詳細に記載する。
【０１０３】
ＣＡＳＱ２遺伝子治療によるＣＰＶＴ治療
ＣＡＳＱ２導入遺伝子
本明細書に記載の組成物および方法を用いて、ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子を、病理を治療するために、優性ＣＰＶＴを有するヒト患者などの患者に提供することができる。ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、本明細書に記載の遺伝子治療のための他の組成物の中でも、様々なベクター（例えば、ウイルスベクター）を介して患者に送達され得る。いくつかの実施形態（例えば、ヒト患者を治療する実施形態）において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、以下に示す配列番号１に提示される野生型ヒトＣＡＳＱ２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。本明細書に記載の組成物および方法と併せて使用するためのＣＡＳＱ２導入遺伝子には、配列番号１のアミノ酸配列に対して１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するタンパク質をコードするものが含まれる。例えば、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列に対して最大５０個の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の保存的アミノ酸置換）を有するタンパク質をコードし得る。ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、付加的または代替的に、配列番号１のアミノ酸配列に対して１つ以上の非保存的アミノ酸置換を有し得る。例えば、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列に対して最大５０個の非保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の非保存的アミノ酸置換）を有するタンパク質をコードし得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態（例えば、ヒト患者を治療する実施形態）において、ＣＡＳＱ２導入遺伝子は、以下に示す配列番号２に提示される野生型ヒトＣＡＳＱ２の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する。
本明細書に記載の組成物および方法と併せて有用な例示的な野生型ＣＡＳＱ２アミノ酸および核酸配列を、以下の表２に記載する。
【０１０５】
【表２−１】
2021523093.tif 000003
【表２−２】
2021523093.tif 000004
【表２−３】
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【表２−４】
2021523093.tif 000006
【０１０６】
本明細書におけるＣＡＳＱ２導入遺伝子はさらに、例えば、野生型ＣＡＳＱ２の親和性の最大２５％以内の親和性（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、または２５％以内の親和性）および／または野生型ＣＡＳＱ２の化学量論から２５％以下の範囲内（例えば、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の範囲内）で逸脱する化学量論で、二価カルシウムを重合および結合する能力を保持する前述のタンパク質のフラグメントをコードするものを含む。カルシウム結合親和性および化学量論を評価するために使用することができるアッセイの例は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １７３：８９−１０２（２００２）に記載されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０７】
転写調節エレメント
本明細書に記載のＣＡＳＱ２導入遺伝子は、導入遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されるように、ベクター、プラスミド、または本明細書に記載の他の核酸送達ビヒクルなどの送達ビヒクルに組み込まれてもよい。本明細書に記載の組成物および方法と併せて有用な例示的なプロモーターは、患者（例えば、ヒト患者）の心筋細胞などの心臓細胞において導入遺伝子の発現を誘導するものである。例えば、本明細書に記載の遺伝子送達ビヒクルにおいてＣＡＳＱ２の発現を誘導するために用いられ得るプロモーターには、デスミンプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ミオシン軽鎖２プロモーター、アルファアクチンプロモーター、トロポニン１プロモーター、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体プロモーター、ジストロフィンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、アルファ７インテグリンプロモーター、脳性ナトリウム利尿ペプチドプロモーター、アルファＢ−クリスタリン／小熱ショックタンパク質プロモーター、アルファミオシン重鎖プロモーター、または心房性ナトリウム利尿因子プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
外因性核酸を標的細胞に送達するためのベクター
核酸送達用のウイルスベクター
ウイルスゲノムは、患者の標的細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞）のゲノムへの目的の遺伝子の効率的な送達に利用可能な豊富なベクター供給源を提供する。ウイルスゲノムは、このようなゲノム内に含まれるポリヌクレオチドが通常、一般化または特殊化された形質導入によって標的細胞のゲノムに組み込まれるため、遺伝子送達のための特に有用なベクターである。これらのプロセスは、自然のウイルス複製サイクルの一部として発生し、遺伝子の統合を誘導するためにタンパク質や試薬を追加する必要はない。本明細書に記載の組成物および方法と併せて使用され得るウイルスベクターの例には、ＡＡＶ、レトロウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、およびＡｄ４８）、パルボウイルス（例えば、アデノ関連ウイルス）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（例、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例、狂犬病および小胞性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例、はしかおよびセンダイ）などの負鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスなどの正鎖ＲＮＡウイルス、およびアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例、ヘルペスシンプレックスウイルス１型および２型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例、ワクシニア、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、鶏痘およびカナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスがある。本明細書に記載の組成物および方法と併せて使用され得る他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫、哺乳類のＣ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶグループ、レンチウイルス、スプマウイルスが含まれる（Ｃｏｆｆｉｎ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：  Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｂ．  Ｎ．  Ｆｉｅｌｄｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  １９９６）。他の例としては、ネズミ白血病ウイルス、ネズミ肉腫ウイルス、マウス乳房腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒツジ内因性ウイルス、ギボンエイプ白血病ウイルス、メイソンファイザーサルウイルス、シミアン免疫不全ウイルス、シミアン肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、およびレンチウイルスがある。ベクターの他の例は、例えば、ＵＳ５，８０１，０３０に記載されており、その開示は、遺伝子治療で使用するウイルスベクターに関するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
核酸送達用のＡＡＶベクター
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物および方法の核酸は、患者の標的心臓細胞（例えば、心筋細胞）などの細胞へのｒＡＡＶベクターおよび／またはビリオンの導入を容易にするために、ｒＡＡＶベクターおよび／またはビリオンに組み込まれる。本明細書に記載の組成物および方法と併せて有用なｒＡＡＶベクターには、（１）ＣＡＳＱ２導入遺伝子、および（２）異種遺伝子の組み込みおよび発現を促進するウイルス核酸を含む組み換え核酸構成物が含まれる。ウイルス核酸は、ＤＮＡのビリオン内への複製およびパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）のためにシスで必要とされるＡＡＶのそれらの配列を含み得る。このようなｒＡＡＶベクターは、マーカーまたはレポーター遺伝子も含んでもよい。有用なｒＡＡＶベクターには、１つ以上の自然発生ＡＡＶ遺伝子の全体または一部が削除されているが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持しているものが含まれる。ＡＡＶＩＴＲは、特定の用途に適した任意の血清型（例えば、血清型２に由来する）であり得る。ｒＡＡＶベクターを使用する方法は、例えば、Ｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  ７：２７９−２９１（２０００）、および、Ｍｏｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ７：２４−３０（２０００）に記載されており、それらの開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
本明細書に記載の核酸およびベクターは、細胞内への核酸またはベクターの導入を容易にするために、ｒＡＡＶビリオンに組み込むことができる。ＡＡＶのキャプシドタンパク質は、ビリオンの外部の非核酸部分を構成し、ＡＡＶキャップ遺伝子によってコードされる。キャップ遺伝子は、ビリオンの組み立てに必要な３つのウイルスコートタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。ｒＡＡＶビリオンの構成は、例えば、ＵＳ５，１７３，４１４、第５，１３９，９４１、第５，８６３，５４１、第  ５，８６９，３０５、第６，０５７，１５２、および第６，３７６，２３７、ならびに、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：７９１−８０１（２００２）およびＢｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：４２３−４３２（２００３）に記載されており、それらの開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１１】
本明細書に記載の組成物および方法と併せて有用なｒＡＡＶビリオンには、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８および９を含む様々なＡＡＶ血清型に由来するものが含まれる。異なる血清型のＡＡＶベクターおよびＡＡＶタンパク質の構成および使用は、例えば、Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２：６１９−６２３（２０００）、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：３４２８−３４３２（２０００）、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：２２２４−２２３２（１９９８）、Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：１５２４−１５３２（２０００）、Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：６６１５−６６２４（２００１）、およびＡｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｇｅｎｅｔ．  １０：３０７５−３０８１（２００１）に記載されており、それらの開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
本明細書に記載の組成物および方法と併せて有用なものには、偽型化ｒＡＡＶベクターもある。偽型化ベクターには、所与の血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９）以外の血清型に由来するキャプシド遺伝子で偽型化された所与の血清型（例えば、ＡＡＶ２）のＡＡＶベクターが含まれる。例えば、代表的な偽型化ベクターは、ＡＡＶ血清型８またはＡＡＶ血清型９に由来するキャプシド遺伝子で偽型化された治療タンパク質をコードするＡＡＶ２ベクターである。偽型化ｒＡＡＶビリオンのｒＡＡＶビリオンおよび使用を含む技術は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：７６６２−７６７１（２００１）、Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：１５２４−１５３２（２０００）、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２８：１５８−１６７（２００２）、およびＡｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １０：３０７５−３０８１（２００１）に記載されている。
【０１１３】
ビリオンキャプシド内に突然変異があるＡＡＶビリオンは、変異していないキャプシドビリオンよりも効果的に特定の細胞型を感染させるために用いられ得る。例えば、適切なＡＡＶ突然変異体は、ＡＡＶを特定の細胞型に標的化することを容易にするためのリガンド挿入突然変異体を有し得る。挿入突然変異体、アラニンスクリーニング突然変異体、およびエピトープタグ突然変異体を含むＡＡＶキャプシド突然変異体の構成および特徴付けは、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：８６３５−４５（２０００）に記載されている。本発明の方法で使用することができる他のｒＡＡＶビリオンには、ウイルスの分子育種およびエキソンシャッフリングによって生成されるキャプシドハイブリッドが含まれる。例えば、Ｓｏｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２５：４３６−４３９（２０００）、およびＫｏｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：４２３−４２８（２００１）を参照のこと。
【０１１４】
標的細胞への導入遺伝子の送達のための付加的方法
トランスフェクション技術
本明細書に記載の転写調節エレメントに作動可能に連結されたＣＡＳＱ２導入遺伝子などのＣＡＳＱ２導入遺伝子を標的細胞に導入するために利用可能な技術は、当該技術分野で既知である。例えば、エレクトロポレーションは、対象の細胞に静電ポテンシャルを印加することによって哺乳動物細胞（例えば、ヒト標的細胞）を透過性にするために使用することができる。このようにして外部電界にさらされたヒト細胞などの哺乳動物細胞は、その後、外因性核酸の取り込みを受けやすくなる。哺乳動物細胞のエレクトロポレーションは、例えば、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：１３１１（１９８７）に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。類似の技術であるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎTM（核酸を遺伝子注入する技術）は、真核細胞の核への外因性ポリヌクレオチドの取り込みを刺激するために、印加電界を利用する。ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎTMおよびこの技術を実行するために有用なプロトコルは、例えば、Ｄｉｓｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １４：３１５（２００５）、およびＵＳ２０１０／０３１７１１４に詳細に記載されており、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
標的細胞のトランスフェクションに有用なさらなる技術には、スクイーズポレーション法が含まれる。この技術は、印加応力に応答して形成される膜状の細孔を介した外因性ＤＮＡの取り込みを刺激するために、細胞の急速な機械的変形を誘発する。この技術は、ヒト標的細胞などの細胞内への核酸の送達にベクターを要しないという点で有利である。スクイーズポレーションは、例えば、Ｓｈａｒｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ８１：ｅ５０９８０（２０１３）に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
リポフェクションは、標的細胞のトランスフェクションに有用な別の技術である。この方法は、リポソームへの核酸のロードを含み、これは、リポソームの外部に向かって、四次またはプロトン化アミンなどのカチオン性官能基を呈示することが多い。これによって、細胞膜の陰イオン性によりリポソームと細胞との間の静電相互作用を促進し、最終的に、例えばリポソームと細胞膜との直接融合または複合体のエンドサイトーシスによって、外因性核酸の取り込みをもたらす。リポフェクションは、例えば、ＵＳ７，４４２，３８６に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。細胞膜とのイオン相互作用を利用して外来核酸の取り込みを誘発する類似の技術には、細胞をカチオン性ポリマー−核酸複合体と接触させることが含まれる。細胞膜との相互作用に有利な正電荷を与えるようにポリヌクレオチドと結合する例示的なカチオン性分子は、活性化デンドリマー（例えば、Ｄｅｎｎｉｇ，  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２８：２２７（２００３）に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。）、および、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランであり、これらのトランスフェクション剤としての使用は、例えば、Ｇｕｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０：Ｉ：９．２：９．２．１（１９９７）に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。磁気ビーズは、緩やかで効率的な方法で標的細胞をトランスフェクトするために使用できる別のツールである。この方法は、核酸の取り込みを指示するために印加された磁場を利用するからである。この技術は、例えば、ＵＳ２０１０／０２２７４０６に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
標的細胞による外因性核酸の取り込みを誘導するための別の有用なツールは、レーザーフェクションであり、これは、細胞を穏やかに透過性にし、ポリヌクレオチドが細胞膜に浸透できるようにするために、細胞を特定の波長の電磁放射に曝露することを含む技術である。この技術は、例えば、Ｒｈｏｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８２：３０９（２００７）に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
微小胞は、本明細書に記載の方法に従って標的細胞のゲノムを改変するために利用可能な別の潜在的なビヒクルを表す。例えば、糖タンパク質ＶＳＶ−Ｇと、ヌクレアーゼなどのゲノム修飾タンパク質との共過剰発現によって誘導された微小小胞を使用して、タンパク質を細胞内に効率的に送達し、その後、遺伝子または調節配列などの目的のポリヌクレオチドの共有結合取り込みのために細胞のゲノムを調製するように内因性ポリヌクレオチド配列の部位特異的開裂を触媒する。真核細胞の遺伝子改変のための、ゲシクルとも呼ばれるこのような小胞の使用は、例えば、Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ［ａｂｓｔｒａｃｔ］．  Ｉｎ：  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ［ａｂｓｔｒａｃｔ］，  ｉｎ：  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １８ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ；  ２０１５  Ｍａｙ  １３，  Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．１２２に詳細に記載されている。
【０１１９】
遺伝子編集技術による標的遺伝子の組み込み
上記に加えて、目的の遺伝子をヒト細胞などの標的細胞に組み込むために利用可能な様々なツールが開発されている。標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを標的細胞に組み込むために利用可能な方法の１つは、トランスポゾンの使用を伴う。トランスポゾンは、トランスポザーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドであり、５’および３’切除部位に隣接する目的のポリヌクレオチド配列または遺伝子を含む。トランスポゾンが細胞に送達されると、トランスポザーゼ遺伝子の発現が始まり、結果的に、目的の遺伝子をトランスポゾンから開裂する活性酵素が生じる。この活動は、トランスポザーゼによるトランスポゾン切除部位の部位特異的認識によって媒介される。場合によっては、これらの切除部位は、末端反復または逆方向末端反復であり得る。トランスポゾンから切除されると、目的の遺伝子は、細胞の核ゲノム内に存在する同様の切除部位のトランスポザーゼ触媒開裂によって、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ得る。これにより、目的の遺伝子を、相補的な切除部位において開裂核ＤＮＡに挿入することができ、その後の哺乳類細胞ゲノムのＤＮＡに目的の遺伝子を結合するホスホジエステル結合の共有核酸連結により、組み込みプロセスが完了する。場合によっては、トランスポゾンは、標的遺伝子をコードする遺伝子が最初にＲＮＡ産物に転写され、その後、哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれる前にＤＮＡに逆転写されるようなレトロトランスポゾンであり得る。例示的なトランスポゾンシステムは、ピギーバックトランスポゾン（例えば、ＷＯ２０１０／０８５６９９に詳細に記載されている）およびＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン（例えば、ＵＳ２００５／０１１２７６４に詳細に記載されている）であり、それらの開示は、目的の細胞への遺伝子送達に使用するトランスポゾンに関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
標的遺伝子を標的細胞のゲノムに統合するための別のツールは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ））／  Ｃａｓシステムである。これは、もともとウイルス感染に対する細菌や古細菌の適応防御メカニズムとして進化したシステムである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには、プラスミドＤＮＡ内のパリンドローム反復配列と、関連するＣａｓ９ヌクレアーゼとが含まれる。このＤＮＡとタンパク質のアンサンブルは、最初に外来ＤＮＡをＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込むことにより、標的配列の部位特異的ＤＮＡ開裂を指示する。これらの外来配列とＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のリピートスペーサーエレメントを含むポリヌクレオチドは、次に宿主細胞で転写されてガイドＲＮＡを作成し、その後、標的配列にアニーリングして、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをこの部位に局在化させることができる。このように、ｃａｓ９を標的ＤＮＡ分子のすぐ近くにもたらす相互作用はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションによって支配されるため、非常に部位特異的なｃａｓ９を介したＤＮＡ開裂を外来ポリヌクレオチドで引き起こすことができる。よって、目的の任意の標的ＤＮＡ分子を開裂するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを設計できる。この技術は、真核生物のゲノムを編集するために利用されており（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：２２７（２０１３））、標的遺伝子をコードする遺伝子の組み込み前にＤＮＡを開裂するために標的細胞ゲノムを部位特異的に編集する効率的な手段として利用可能である。遺伝子発現を調節するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの使用は、例えば、ＵＳ８，６９７，３５９に記載されており、その開示は、ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用に関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。目的の遺伝子を標的細胞に組み込む前にゲノムＤＮＡを部位特異的に開裂するための代替方法には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとは異なり、これらの酵素には、特定の標的配列に局在するためのガイドポリヌクレオチドが含まれない。代わりに、標的特異性は、これらの酵素内のＤＮＡ結合ドメインによって制御される。ゲノム編集用途でのＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの使用は、例えば、Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１：６３６（２０１０）およびＪｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４：４９（２０１３）に記載されており、それらの開示は、ゲノム編集のための組成物および方法に関するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを標的細胞のゲノムに組み込むために利用可能な別のゲノム編集技術には、ゲノムＤＮＡを部位特異的に開裂するように合理的に設計できるＡＲＣＵＳTMメガヌクレアーゼの使用が含まれる。標的遺伝子をコードする遺伝子を哺乳動物細胞のゲノムに組み込むためのこれらの酵素の使用は、そのような酵素について確立された定義された構造活性相関の観点から有利である。一本鎖メガヌクレアーゼは、特定のアミノ酸位置で修飾して、所望の位置でＤＮＡを選択的に開裂するヌクレアーゼを生成し、標的細胞の核ＤＮＡへの標的遺伝子の部位特異的組み込みを可能にする。これらの一本鎖ヌクレアーゼは、例えば、ＵＳ８，０２１，８６７およびＵＳ８，４４５，２５１に詳しく記載されており、それらの開示は、ゲノム編集のための組成物および方法に関するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
導入遺伝子発現を測定する方法
患者の標的細胞（例えば、心筋細胞）によって発現されるＣＡＳＱ２導入遺伝子の発現レベルは、例えば、ＣＡＳＱ２導入遺伝子の転写に由来するｍＲＮＡ転写物の濃度または相対的存在量を評価することによって確認することができる。付加的または代替的に、遺伝子発現は、ＣＡＳＱ２導入遺伝子の転写および翻訳によって生成されるＣＡＳＱ２タンパク質の濃度または相対的存在量を評価することによって決定することができる。タンパク質濃度は、カルシウム存在量アッセイなどの機能アッセイを使用して評価することもできる。以下の節では、本明細書に記載の優性ＣＰＶＴを有する患者などの患者への送達時にＣＡＳＱ２導入遺伝子の発現レベルを測定するために利用可能な例示的な技術について説明する。導入遺伝子発現は、核酸配列決定、マイクロアレイ分析、プロテオミクス、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））、増幅ベースのアッセイ、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、ノーザン分析、および／またはｍＲＮＡのＰＣＲ分析を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の多くの方法によって評価可能である。
【０１２３】
核酸検出
本明細書に記載の組成物および方法と併せて分析に適した導入遺伝子発現検出方法データセットを決定するための核酸ベースの方法には、イメージングベースの技術（例えば、ノーザンブロッティングまたはサザンブロッティング）が含まれ、これは、導入遺伝子の投与後の患者から得られる細胞と共に用いられ得る。ノーザンブロット分析は、当該技術分野で周知の従来技術であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８９，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｃｈ，  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  １０  Ｓｋｙｌｉｎｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  ＮＹ  １１８０３−２５００に記載されている。遺伝子および遺伝子産物の状態を評価するための典型的なプロトコルは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９５，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｕｎｉｔｓ  ２（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ），  ４（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ），  １５（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）  ａｎｄ  １８（ＰＣＲ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）に見られる。
【０１２４】
ＣＡＳＱ２発現を評価するために本明細書に記載の組成物および方法と併せて利用可能な導入遺伝子検出技術にはさらに、マイクロアレイ配列決定実験（例えば、ハイスループット配列決定またはディープ配列決定としても知られるサンガー配列決定および次世代配列決定法）が含まれる。例示的な次世代配列決定技術には、イルミナ配列決定、イオントレント配列決定、４５４配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、およびナノポア配列決定プラットフォームが含まれるが、これらに限定されない。当技術分野で既知である他の配列決定の方法も利用可能である。例えば、ｍＲＮＡレベルでの導入遺伝子発現は、ＲＮＡ−Ｓｅｑを使用して決定され得る（例えば、Ｍｏｒｔａｚａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５：６２１−６２８（２００８）に記載され、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＲＮＡ−Ｓｅｑは、サンプル中のＲＮＡ分子を直接配列決定することで発現をモニタリングするための堅牢な技術である。簡単に言えば、この方法は、ＲＮＡの平均長２００ヌクレオチドへの断片化、ランダムプライミングによるｃＤＮＡへの変換、および二本鎖ｃＤＮＡの合成を伴い得る（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＪｕｓｔ  ｃＤＮＡ  ＤｏｕｂｌｅＳｔｒａｎｄｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用する）。そして、ｃＤＮＡは、各ライブラリーの配列アダプター（例えば、ｌｌｌｕｍｉｎａ(R)／  Ｓｏｌｅｘａ）を追加することによって、配列決定用の分子ライブラリーに変換され、結果として得られる５０〜１００ヌクレオチドの読取りがゲノムにマッピングされる。
【０１２５】
マイクロアレイ技術は高解像度を提供するため、導入遺伝子の発現レベルは、マイクロアレイベースのプラットフォーム（一塩基多型アレイなど）を用いて決定されてもよい。種々のマイクロアレイ法の詳細は、文献に記載されている。例えば、ＵＳ６，２３２，０６８およびＰｏｌｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２３：４１−４６（１９９９）を参照のこと。それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。核酸マイクロアレイを使用して、ｍＲＮＡサンプルを逆転写および標識してｃＤＮＡを生成する。その後、プローブを、固体支持体上に配列され固定化された１つ以上の相補的核酸にハイブリダイズすることができる。アレイは、例えば、アレイの各メンバーの配列および位置が既知であるように構成することができる。標識されたプローブと特定のアレイメンバーとのハイブリダイゼーションは、プローブが由来するサンプルがその遺伝子を発現していることを示す。発現レベルは、ハイブリダイズしたプローブ−サンプル複合体から検出されたシグナルの量に従って定量化されてもよい。典型的なマイクロアレイ実験は、次のステップを含む：１）サンプルから単離されたＲＮＡからの蛍光標識された標的の調製、２）マイクロアレイへの標識標的のハイブリダイゼーション、３）アレイの洗浄、染色、およびスキャン、４）スキャン画像の分析、および５）遺伝子発現プロファイルの生成。マイクロアレイプロセッサの一例は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧＥＮＥＣＨＩＰ(R)システムであり、これは市販されており、ガラス表面上でオリゴヌクレオチドを直接合成することによって製造されたアレイを含む。当業者に既知の他のシステムを用いてもよい。
【０１２６】
増幅ベースのアッセイは、患者への送達後の標的細胞における導入遺伝子の発現レベルを測定するためにも使用できる。このようなアッセイでは、遺伝子の核酸配列は、増幅反応（例えば、ｑＰＣＲなどのＰＣＲ）のテンプレートとして機能する。定量的増幅では、増幅産物の量は元のサンプルのテンプレートの量に比例する。適切な対照との比較によって、本明細書に記載の原理に従って、使用される特定のプローブに対応する遺伝子の発現レベルの尺度が提供される。ＴａｑＭａｎプローブを使用するリアルタイムｑＰＣＲの方法は当該技術分野で周知である。リアルタイムｑＰＣＲの詳細なプロトコルは、例えば、Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ６：９９５−１００１（１９９６）およびＨｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ６：９８６−９９４（１９９６）に記載されており、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される遺伝子発現のレベルは、ＲＴ−ＰＣＲ技術によって決定することができる。ＰＣＲに使用されるプローブは、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーター、または酵素などの検出可能なマーカーで標識され得る。
【０１２７】
タンパク質検出
導入遺伝子の発現はさらに、目的の遺伝子によってコードされる対応するタンパク質産物（例えば、ＣＡＳＱ２）の濃度または相対的存在量を測定することによって決定することができる。タンパク質レベルは、当該技術分野で既知の標準的な検出技術を用いて評価することができる。本明細書に記載の組成物および方法での使用に適したタンパク質発現アッセイには、プロテオミクス法、免疫組織化学的および／またはウエスタンブロット分析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫濾過アッセイ（ＥＬＩＦＡ）、質量分析、質量分析免疫アッセイ、および生化学的酵素活性アッセイが含まれる。特に、プロテオミクス法を使用して、マルチプレックスで大規模なタンパク質発現データセットを生成することができる。プロテオミクス法は、質量分析を利用して、ポリペプチド（例えば、タンパク質）および／または標的タンパク質のパネルに特異的な捕捉試薬（例えば、抗体）を利用するペプチドマイクロアレイを検出および定量化して、サンプル（例えば、単一細胞サンプルまたは複数細胞集団）で発現されるタンパク質の発現レベルを同定および測定し得る。
【０１２８】
例示的なペプチドマイクロアレイは、基質に結合した複数のポリペプチドを有し、オリゴヌクレオチド、ペプチド、またはタンパク質の、複数の結合したポリペプチドのそれぞれへの結合は、個別に検出可能である。あるいは、ペプチドマイクロアレイは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ファージディスプレイバインダー、酵母ツーハイブリッドバインダー、アプタマーを含むがこれらに限定されない複数のバインダーを含み得り、これらは、特異的オリゴヌクレオチド、ペプチド、またはタンパク質結合を特異的に検出することができる。ペプチドアレイの例は、ＵＳ６，２６８，２１０、５，７６６，９６０、および５，１４３，８５４に見出すことができ、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
質量分析（ＭＳ）は、導入遺伝子の送達後の患者（例えば、ヒト患者）からの細胞における導入遺伝子発現を同定および特徴付けるために、本明細書に記載の方法と組み合わせて使用され得る。当該技術分野で既知の任意のＭＳの方法を用いて、目的のタンパク質またはペプチドフラグメントを決定、検出、および／または測定することができる、例えば、ＬＣ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳ、タンデムＭＳなどを用いることができる。質量分析計は通常、イオン源と光学系、質量分析計、およびデータ処理電子機器を備える。質量分析計には、飛行時間（ＴＯＦ）や４倍（Ｑ）などの走査型およびイオンビーム質量分析計が含まれ、イオントラップ（ＩＴ）、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）などのトラッピング質量分析計を本明細書に記載の方法で用いてもよい。種々のＭＳ方法の詳細は、文献に記載されている。例えば、Ｙａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １１：４９−７９，  ２００９を参照のこと。その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３０】
ＭＳ分析の前に、患者から得られたサンプル中のタンパク質は、まず、化学的（例えば、臭化シアン開裂を介して）または酵素的（例えば、トリプシン）消化によって、より小さなペプチドに消化され得る。複雑なペプチドサンプルには、２Ｄ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＲＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィーなどのフロントエンド分離技術の使用も有効である。次に、分解され任意に分離されたサンプルは、イオン源を用いてイオン化され、さらなる分析のための荷電分子が生成される。サンプルのイオン化は、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、電子イオン化、高速原子衝撃（ＦＡＢ）／液体二次イオン化（ＬＳＩＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、フィールドイオン化、フィールド脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、および粒子ビームイオン化によって行われてもよい。イオン化方法の選択に関する付加的な情報は、当業者に既知である。
【０１３１】
イオン化後、消化ペプチドをフラグメント化することにより、シグネチャーＭＳ／ＭＳスペクトルを生成し得る。タンデムＭＳは、ＭＳ／ＭＳとしても知られており、複雑な混合物の分析に特に有用であり得る。タンデムＭＳは、ＭＳ選択の複数のステップを含み、ステージ間で何らかの形のイオンフラグメンテーションが発生する。これは、空間で分離された個々の質量分析計要素、または、ＭＳステップを時間で分離した単一の質量分析計を使用して、達成することができる。空間的に分離されたタンデムＭＳでは、要素は物理的に分離されて別個であり、要素間の物理的な接続によって高真空が維持される。時間的に分離されたタンデムＭＳでは、分離は、同じ場所にトラップされたイオンで達成され、経時的に複数の分離ステップが行われる。その後、シグネチャーＭＳ／ＭＳスペクトルをペプチド配列データベース（ＳＥＱＵＥＳＴなど）と比較してもよい。ペプチドへの翻訳後修飾はまた、例えば、特定のペプチド修飾を可能にしながらデータベースに対してスペクトルを検索することによって決定され得る。
【０１３２】
医薬組成物
本明細書に記載のＣＡＳＱ２導入遺伝子は、本明細書に記載されるように、優性ＣＰＶＴを患っているヒト患者などの患者への投与のためのビヒクルに組み込まれてもよい。ＣＡＳＱ２導入遺伝子を含む、ウイルスベクターなどのベクターを含む医薬組成物は、当該技術分野で既知の方法を用いて調製することができる。例えば、該組成物は、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．（１９８０）、参照により本明細書に組み込まれる）を使用して、凍結乾燥製剤または水溶液などの所望の形態で調製することができる。
【０１３３】
本明細書に記載の核酸およびウイルスベクターの混合物は、１つ以上の賦形剤、担体、または希釈剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、ならびに油中で調製してもよい。通常の保管および使用条件下では、これらの製剤は、微生物の成長を防ぐための防腐剤を含んでもよい。注射可能用途に適した剤形には、無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌の水溶液または分散液および無菌の粉末が含まれる（ＵＳ５，４６６，４６８に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。いずれにせよ、製剤は無菌であり得、注射が容易な程度まで流動性であり得る。製剤は、製造および保管の条件下で安定であり得、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／または植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合に必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌剤および抗真菌剤によって可能である。多くの場合、糖または塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅らせる薬剤の組成物での使用によって可能である。
【０１３４】
例えば、本明細書に記載の医薬組成物を含む溶液は、必要に応じて適切に緩衝され得、液体希釈剤は、最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張になる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用可能な無菌の水性媒体は、本開示に照らして当業者には既知であろう。例えば、１回分の投薬量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解され、１０００ｍｌの皮下溶解液に添加されるか、または提案された注入部位に注射され得る。治療される対象の状態に応じて、投薬量は必然的にいくらか変動する。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の対象に適切な用量を決定する。また、ヒトへの投与のために、調製物は、アメリカ食品医薬局生物製剤部（ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の基準によって要求される無菌性、発熱原性、ならびに一般的な安全性および純度の基準を満たし得る。
【０１３５】
投与経路と投薬
導入遺伝子を含む、本明細書に記載のＡＡＶベクターおよび他のベクターなどのウイルスベクターは、様々な投与経路によって患者（例えば、ヒト患者）に投与され得る。投与経路は、例えば、疾患の発症および重症度によって異なり、例えば、静脈内、髄腔内、皮内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、非経口、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮的（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、気管内、腹腔内、動脈内、血管内、吸入、灌流、洗浄、および経口投与を含む。血管内投与には、患者の血管系への送達が含まれる。いくつかの実施形態において、投与は、静脈（静脈内）であると考えられる血管への投与であり、いくつかの投与において、投与は、動脈（動脈内）であると考えられる血管への投与である。静脈には、内頸静脈、末梢静脈、冠状静脈、肝静脈、門脈、大伏在静脈、肺静脈、上大静脈、下大静脈、胃静脈、脾静脈、下腸間膜静脈、上腸間膜静脈、頭静脈、および／または大腿静脈が含まれるが、これらに限定されない。動脈には、冠状動脈、肺動脈、上腕動脈、内頸動脈、大動脈弓、大腿動脈、末梢動脈、および／または繊毛動脈が含まれるが、これらに限定されない。送達は、細動脈または毛細血管を介して、または細動脈または毛細血管へと行われ得ると考えられる。
【０１３６】
治療計画にはいろいろあり、多くの場合、疾患の重症度と患者の年齢、体重、および性別によって決まる。治療は、様々な単位用量での標的細胞への導入遺伝子の導入に有用であるとして本明細書に記載されるベクター（例えば、ウイルスベクター）または他の薬剤の投与を含み得る。各単位用量は、通常、所定量の治療用組成物を含む。
【０１３７】
導入遺伝子がウイルス遺伝子治療によって（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ２／８、またはＡＡＶ２／９ベクターなどの本明細書に記載のＡＡＶベクターの投与によって）患者に送達される場合、ウイルスベクターは、例えば、約１ｘ１０６ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ〜約１ｘ１０１８ＧＣ／ｋｇの用量で（例えば、約１ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０６ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０７ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１７ＧＣ／ｋｇ、または１ｘ１０１８ＧＣ／ｋｇの用量で）患者に投与され得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、約１ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ〜約１ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇの用量で（例えば、約１ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１５ＧＣ／ｋｇ、または１ｘ１０１６ＧＣ／ｋｇの用量で）患者に投与される。いくつかの実施形態において、ベクターは、約１ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ〜約１ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で（例えば、約１ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、１ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、２ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、３ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、４ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、５ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、６ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、７ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、８ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、９ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、または１ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇの用量で）患者に投与される。
【実施例】
【０１３８】
本明細書に記載の組成物および方法がどのように使用、製造、及び評価され得るかについての説明を当業者に提供するために、後述の実施例が挙げられる。後述の実施例は、本発明の単なる例示であることを意図し、本発明者らが本発明であると考える範囲を限定することを意図するものではない。
【０１３９】
実施例１：ヘテロ接合性ＲＹＲ４４９６Ｃ／＋マウスへのＣＡＳＱ２の送達は、ＲＹＲ２、トリアジン、およびジャンクチンの発現とは独立した方法で不整脈を排除する。
材料および方法
動物の使用
動物を、イタリアのカルコにあるＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで維持および飼育し、表現型の特徴付けのためにＩＣＳ  ＭａｕｇｅｒｉＳｐａ−ＳＢに移送した。動物を、パヴィア大学によって動物福祉のための委員会で承認されたプロトコルに従って維持および研究した。
【０１４０】
ノックインＲ４４９６ＣＲＹＲ２マウスモデルの生成
本実施例に記載する実験では、ヒトＲＹＲ２Ｒ４９９７Ｃ突然変異の表現型を再現する優性ＣＰＶＴのヘテロ接合性ＲＹＲ２Ｒ４４９６Ｃ／＋ノックインマウスモデルを使用した。このマウスモデルの製造に関する詳細は、ＵＳ７，７４１，５２９に記載されており、その開示は、ＲＹＲ２Ｒ４４９６Ｃ／＋ノックインモデルの生成に関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４１】
ベクターの設計および製造
これらの実験で使用したベクターのうちの１つの設計の詳細な説明は、ＵＳ８，８５９，５１７に提供されている。簡単に説明すると、ＵＴＲ配列なしの、野生型マウスＣＡＳＱ２（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００９８１４．２）のコード配列を含む、偽型化アデノ随伴血清型９ベクター（ＡＡＶ２／９）を生成した。野生型マウスＣＡＳＱ２をｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。ＥｃｏＲＩを使用した酵素消化により、ＣＡＳＱ２導入遺伝子に対応するインサートをｐＧＥＭベクターから切り出し、ビスシストロン性ｐＩＲＥＳベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ．  Ｎｏ：６３１６０５，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア州、米国）においてサブクローニングした。その後、ＣＡＳＱ２導入遺伝子に対応するフラグメントとそれに続くＩＲＥＳ配列を、特定のプライマーを使用したＰＣＲ増幅によってサブクローニングした（Ｎｏｔ１酵素部位を含むフォワード５’ＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＴＡＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＧ−３’（配列番号５）およびリバース５’−ＣＧＡＡＧＣＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３’（配列番号６））。アンプリコンを、ＮｏｔＩによる酵素消化によって、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターコアファシリティ（ティゲム、ナポリ、イタリア）によって提供されたアデノウイルスバックボーンベクターｐＡＡＶ−２．１−ｅＧＦＰ、血清型９（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ｐｏｌｙＡ配列およびＣＭＶプロモーターを含む）に挿入した。全てのプラスミドの配列を決定した。
【０１４２】
ＡＡＶの製造は、ティゲムＡＡＶベクターコアファシリティと協力して行った。ＡＡＶベクターを、ＨＥＫ２９３細胞における次の３つのプラスミドの一過性トランスフェクションを用いて製造した：ｐＡｄ  ｈｅｌｐｅｒ、ｐＡＡＶ  ｒｅｐ−ｃａｐ（パッケージング）、およびｐＡＡＶＣｉｓ（ＣＡＳＱ２インサートを含み、ｐＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−ｅＧＦＰプラスミドＭＣＳにクローニング化される）。ウイルス力価を評価するためにリアルタイムＰＣＲとドットブロット分析を行い、キャプシドタンパク質の存在と純度を評価するためにＳＤＳＰＡＧＥとそれに続くクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色を行った。感染性と無菌性も評価した。サービスは、１ｘ１０１２ゲノムコピーを超える総収量でＰＢＳ中のウイルス調製物とともに戻った。全てのＡＡＶ２／９−ＷＴ−ｍＣＡＳＱ２−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰストックを−８０°Ｃで単一アリコートずつ凍結し、外科手術中に解凍した。
【０１４３】
同様の組み換えＡＡＶ製造方法を使用して、これらの実験で調査した第２のベクターを提供した。第２のベクターは、デスミンプロモーターに作動可能に連結された野生型ＣＡＳＱ２をコードする導入遺伝子を含む偽型化ＡＡＶ２／８ベクターであった。この第２のベクターの様々な成分を図４に示す。
【０１４４】
定量的リアルタイムＰＣＲ
ＲＹＲ２Ｒ４４９６Ｃ／＋マウスの心臓組織からおよびＡＡＶ９−ＷＴ−ｍＣＡＳＱ２ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰウイルスベクターに感染したＲＹＲ２Ｒ４４９６Ｃ／＋ヘテロ接合性ノックインマウスからの総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。反応あたり１μｇのテンプレートＲＮＡの総量を、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、米国）を用いて行ったＲＴ−ＰＣＲアッセイに使用した。種々の目的の遺伝子（ＲＹＲ２ＣＡＳＱ２、トリアジン、ジャンクチン）および参照遺伝子（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡのリアルタイム定量化を、ＣＦＸ９６検出モジュール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して光学９６ウェルプレートで実施した。全サンプルを、特定のプライマーミックスと既に報告されたプライマー（Ｄｅｎｅｇｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２９：２６７３８１（２０１４））を含む２０ｎｇのｃＤＮＡテンプレートを使用して、ＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘで３回分析した。リアルタイムＰＣＲを、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システムを用いて行い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ９６  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア（バージョン１．５）を用いて分析した。
【０１４５】
生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）実験
図１に示す構成物を含むＡＡＶベクターを、生後８日目（Ｐ８）に２５ゲージの注射器でｎ＝４の新生児マウスに６．４ｘ１０１１ゲノムコピーの用量で１００μｌの精製ウイルスの腹腔内注射により送達した。合計ｎ＝５の同腹仔は治療されなかった。
【０１４６】
７週齢で、心電図検査（ＥＣＧ）とラジオテレメトリーモニター（Ｄａｔａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、全てのマウスに全身麻酔（イソフルラン１．５〜３％）下で皮下移植した。手術から７２時間回復した後、表現型の特徴付けを行った。自発性不整脈の存在を評価するために、基礎心電図を記録した。直後に、アドレナリン作動性誘発性不整脈に対するマウスの感受性を、腹腔内注射によってエピネフリン（２ｍｇ／ｋｇ）およびカフェイン（１２０ｍｇ／ｋｇ）を投与することによってテストした（Ｃｅｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９６：ｅ７７−ｅ８２（２００５）、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９９：２９２−２９８（２００６））。ＥＣＧ記録が行われている間、全ての動物は自由に動いていた。
【０１４７】
その後、優性遺伝性ＣＰＶＴに対するモデル生物における該構成物の抗不整脈効果を調査するために、この実験を、図４に示すＡＡＶ２／８ベクターを使用して繰り返した。ＲＹＲ２Ｒ４４９６Ｃ／＋ヘテロ接合性マウス（ｎ＝９）に、ＡＡＶ２／８ベクターをｋｇあたり６ｘ１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）の用量で投与した。未治療のＲＹＲ２Ｒ４４９６Ｃ／＋ヘテロ接合性マウス（ｎ＝９）をコントロールとして使用した。投与後２ヶ月で、マウスを、エピネフリンおよびカフェイン刺激下でｉｎ  ｖｉｖｏでの電気生理学的分析（ＥＣＧ）によって評価した。
【０１４８】
結果
図２に示すように。ＣＡＳＱ２導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターのＲＹＲ２Ｒ４９９６Ｃ／＋マウスへの投与の結果、カフェインおよびエピネフリン誘発性不整脈が完全に抑制された。β−アドレナリン作動性刺激後、ｎ＝４のＡＡＶＣＡＳＱ２治療マウスはいずれも不整脈活動を示さなかったが、ｎ＝５の未治療マウスは全て不整脈を示した。また、ＲＹＲ２Ｒ４９９６Ｃ／＋マウスにおけるＣＡＳＱ２送達の治療効果は、ＲＹＲ２または膜関連タンパク質であるトリアジンおよびジャンクチンの活性に依存しなかった。図３に示すように、ＡＡＶＣＡＳＱ２ベクターの投与の結果、心筋細胞におけるＣＡＳＱ２発現が上昇したが、該細胞におけるＲＹＲ２、トリアジン、またはジャンクチンの発現は実質的に変化しなかった。
【０１４９】
図５に示すように、ＡＡＶ２／８構成物を使用して同様の結果が得られた。特に、ＡＡＶ２／８−デスミン−ＣＡＳＱ２ベクターの投与の結果、ＲＹＲ２Ｒ４９９６Ｃ／＋マウスにおけるカフェインおよびエピネフリン誘発性不整脈が完全に抑制された一方、未治療のマウスの４４％が不整脈を示した。
【０１５０】
まとめると、これらの結果は、優性ＣＰＶＴのマウスモデルにおけるＣＡＳＱ２導入遺伝子送達が、双方向性および多型性不整脈の矯正を促進することを実証している。驚くべきことに、ＲＹＲ２送達を必要とせずに、ＣＡＳＱ２遺伝子導入のみで、アドレナリン作動性活性化により不整脈を引き起こす生理学的洞調律を予防することが分かった。マウス優性ＣＰＶＴモデルでのＣＡＳＱ２遺伝子治療の結果、心筋細胞でのＣＡＳＱ２発現が増加し、抗不整脈性心臓収縮機能が回復した。
【０１５１】
これらの結果および本明細書で提示される説明を鑑みて、ＣＡＳＱ２遺伝子治療は、後述の実施例２に示されるように、優性ＣＰＶＴの治療のためのパラダイムとして使用することができる。
【０１５２】
実施例２：ＣＡＳＱ２導入遺伝子を含むウイルスベクターの投与によるヒト患者の優性ＣＰＶＴの治療
当該技術分野で既知である従来の分子生物学技術を使用して、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ヒトＣＡＳＱ２タンパク質（または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するその変種）などのＣＡＳＱ２タンパク質をコードする遺伝子を、ウイルスベクターに組み込みヒト患者への投与のために配合することができる。例えば、優性ＣＰＶＴを患っている患者に、心筋細胞におけるＣＡＳＱ２発現を促進する転写調節エレメントの制御下でＣＡＳＱ２導入遺伝子を含むＡＡＶベクターを投与することができる。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２の５’および３’逆方向末端反復の間にＣＡＳＱ２導入遺伝子を組み込み、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９キャプシドタンパク質（ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９ベクターなど）によってキャプシド形成される偽型化ベクターであってもよい。ＡＡＶベクターは、特に、静脈内、筋肉内、または皮下などの様々な投与経路によって対象に投与することができる。
【０１５３】
ベクターを患者に投与した後、当該技術分野の専門家は、様々な方法によって、ＣＡＳＱ２遺伝子の発現、および治療に応答した患者の改善をモニターすることができる。例えば、医師は、導入遺伝子の投与後に患者が示す不整脈事象の量または頻度を分析することによって、患者の心機能をモニターすることができる。導入遺伝子の投与前に評価された同等の期間と比較して、ＣＡＳＱ２導入遺伝子の投与後の特定期間に患者が不整脈活動をほとんどまたはまったく示さないという所見は、患者が治療に好意的に反応していることを示唆し得る。その後の投与量は、必要に応じて決定して投与することができる。
【０１５４】
他の実施形態
本明細書で述べられている全ての出版物、特許、及び特許出願は、あたかも、それぞれ独立した出版物又は特許出願が具体的且つ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
本発明はその具体的な実施形態と関係して記載されてきたものの、更なる変更が可能であり、また、本出願は、一般に本発明の原理に従って、且つ、本発明が関連する技術分野において既知のまたは慣行されている範囲内にあり、前述の本質的な特徴に適用することができ、そして特許請求の範囲に従った本発明からのこのような展開も含めて、本発明のあらゆる変形、使用、又は適応を網羅する意図であると理解されるであろう。
【０１５６】
他の実施形態は、特許請求の範囲内にある。
【図１】
2021523093.tif 000007
【図２】
2021523093.tif 000008
【図３】
2021523093.tif 000009
【図４】
2021523093.tif 000010
【図５】
2021523093.tif 000011
【配列表】
2021523093000001.app
【国際調査報告】
2021523093.tif 000012
2021523093.tif 000013
2021523093.tif 000014
2021523093.tif 000015