(57)【要約】  本発明は、皮膚に対する空気汚染の影響の処置に使用するための、または空気汚染の影響に関連する皮膚の早期老化の処置に使用するための組成物に関する。前記組成物は、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチンおよびヒドロキシチロソールを含む。好ましい実施形態では、前記組成物は、１５ｗｔ％の最小ジテルペン含有量を有する約３２ｗｔ％のローズマリー抽出物、１６ｗｔ％の最小オレウロペイン含有量および５ｗｔ％の最小ヒドロキシチロソール含有量を有する約３０ｗｔ％のオリーブの果実または葉の抽出物、２５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量を有する約２８ｗｔ％のリッピア・シトリオドラ抽出物ならびに４０ｗｔ％の最小ケルセチンの含有量を有する約１０ｗｔ％のソフォラ・ジャポニカ抽出物を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚に対する空気汚染の影響を処置するための組成物であって、前記組成物は、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチンおよびヒドロキシチロソールを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記組成物は、最終処方物の４．５ｗｔ％の最小ジテルペン含有量を提供する２５ｗｔ％〜４０ｗｔ％のローズマリー抽出物、最終処方物の４．５ｗｔ％の最小オレウロペイン含有量および１．５ｗｔ％の最小ヒドロキシチロソール含有量を提供する２０ｗｔ％〜４０ｗｔ％のオリーブの葉または果実の抽出物、最終処方物の６．５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量を提供する２０ｗｔ％〜３５ｗｔ％のリッピア・シトリオドラ抽出物ならびに最終処方物の３．５ｗｔ％の最小ケルセチン含有量を提供する５ｗｔ％〜２５ｗｔ％のソフォラ・ジャポニカ抽出物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ジテルペン、前記オレウロペイン、前記ベルバスコシドおよび前記ケルセチンの前記ヒドロキシチロソールに対する個々の重量比は、それぞれ約２．５〜５である、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ジテルペンの前記ヒドロキシチロソールに対する重量比は約３であり、前記オレウロペインの前記ヒドロキシチロソールに対する重量比は約３であり、前記ベルバスコシドの前記ヒドロキシチロソールに対する重量比は約４．５であり、前記ケルセチンの前記ヒドロキシチロソールに対する重量比は約２．５である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、４０ｗｔ％の最小ケルセチン含有量を有するソフォラ・ジャポニカ抽出物を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、カルノシン酸を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、１５ｗｔ％の最小ジテルペン含有量を有するローズマリー抽出物を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、１６ｗｔ％の最小オレウロペイン含有量を有するオリーブ抽出物を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、５ｗｔ％の最小ヒドロキシチロソール含有量を有するオリーブ抽出物を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、２５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量を有するリッピア・シトリオドラ抽出物を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、空気汚染の影響に関連する早期の皮膚老化の予防に使用される、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の組成物の０．１〜１０００ｍｇの間の用量。
【請求項１３】
請求項１０に記載の組成物の２５０ｍｇの用量。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物を含む、非経口的、経皮的、経口的または局所的に投与される、製剤。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物を含む栄養補助食品。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物を含むニュートリコスメティクス製品。
【請求項１７】
前記組成物は、薬剤として使用される、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患の予防および／または治療に使用される、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
前記環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患は、炎症、座瘡、慢性皮膚炎および乾癬から選択され、請求項１８の記載に従って、使用される組成物。
【請求項２０】
前記組成物は、１日当たり０．１〜１０００ｍｇの間の用量で経口投与され、請求項１７〜１８のいずれかの記載に従って、使用される組成物。
【請求項２１】
美容製品としての請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項２２】
皮膚に対する環境汚染の美観に関する影響を美容的に軽減するための、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
抗酸化作用、抗炎症作用を有する美容製品としての、この作用は治療的処置としてではなく、単に美観的な、皮膚に対する老化防止および美白としてとらえられる、請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記組成物は、１日当たり０．１〜１０００ｍｇの間の用量で経口投与される、請求項２１〜２３のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの皮膚疾患を処置するための、特に、皮膚に対する複数の都市の空気汚染の影響を軽減するための製品の技術分野に属する。しかし、本組成物は、複数の都市環境汚染の影響を軽減するために特別に処方されているが、商品化して、例えば、細胞の老化による皮膚劣化遅延製品として、顕著な軽減効果を伴う異なる適応症で使用することもできる。
【背景技術】
【０００２】
都市の空気汚染への慢性的な曝露は、ヒトの皮膚に同時に複数の有害な影響を引き起こす。これらの有害な影響の中には、早期の皮膚老化、アトピー性皮膚の出現、皮膚炎、湿疹、乾癬または座瘡などのアレルギーまたは炎症の状態があり、とりわけ、汚染が引き起こす可能性のあるより深刻な疾患の中では、皮膚癌を引き起こすものさえある（１）。
【０００３】
環境汚染と皮膚に生じる有害な影響との関係は、近年の多くの科学的研究で証明されている。
例えば、タバコの煙、揮発性有機化合物（ＶＯＣ）、ホルムアルデヒド、トルエン、二酸化窒素、粒子状物質などのいくつかの空気汚染物質が、皮膚の炎症過程であるアトピー性皮膚炎の発症または悪化の危険因子として作用することは、科学的に実証されている（２、３、４）。理由としては、これらの空気汚染物質が皮膚において酸化ストレスを誘発し、それが保護バリアの機能不全または免疫の脱制御につながるということが考えられる。さらに、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の活性化もどのように関与しているように見えるかが示されている（５、６、７）。
【０００４】
空気汚染は、座瘡を含むいくつかの皮膚の炎症性病変における悪化要因である。その結果、非常に高い空気汚染レベルの間に、正常の皮膚に濃いしみ（ｄａｒｋ  ｓｐｏｔｓ）が現れ、脂肪の多い皮膚に座瘡が現れることが頻繁にある。空気の環境汚染と座瘡の発生および増悪との間には、正の相関関係が存在する。これは、研究により、特定の大気汚染物質の濃度が高いほど、尋常性座瘡患者の診察の回数が多くなり、特定の大気汚染物質の濃度が高くなると、皮脂分泌および座瘡の皮膚病変も増加することが確立されているためである（８、９）。
【０００５】
さらに、環境空気汚染は、皮膚の皮脂酸化を引き起こし、座瘡の兆候を増大させる。さらに、大気汚染は、環境ダストおよび太陽放射に起因する紫外線（ＵＶ）放射と組み合わさって、皮脂の主成分であるスクアレンの酸化を引き起こす。
早期の皮膚老化と空気環境汚染曝露との関係は、白人の高齢女性を対象に実施された疫学研究ＳＡＩＬＡで最初に観察され、道路交通に由来する粒子状物質へのより多くの曝露とより高度な皮膚老化との相関が見出された。特に、その曝露は頬や額のしみの数の増加に加えて、より大量でより深いしわ（鼻唇溝）の出現と相関していた。実際、混雑した交通道路までの距離が１００ｍ以下であることと、額のしみが３５％多く、頬のしみが１５％多いこととの間で関連性が見出された（１０）。
【０００６】
しかし、粒子状物質への曝露だけが皮膚の老化の加速に関連しているわけではない。ＮＯ２と白人の女性のしみの形成との間にも強い相関関係が見出された（ｎ＝８０６；ＳＡＩＬＡ）。これらの結果は、中国人女性でも確認された（ｎ＋１，０７２；台州市縦断研究コホート）。１０μｇ／ｍ３のＮＯ２の増加は、ドイツ人女性のしみが２５％増加し（ｐ＝０．００３）、５０歳以上の中国人女性のしみが２４％増加した（１１）。追加データとして、多くの英国の都市は、法定限度を超えるようなＮＯ２レベルを示しており、ロンドンは２０１６年の第１週に年間閾値を超え、ＮＯ２濃度は２００μｇ／ｍ３ＮＯ２を超えていた。
【０００７】
環境空気汚染は、皮膚に短期的な影響、例えば、乾燥の増加、赤みや刺激を引き起こし、しみや深いしわの出現に加えて、早期老化、コラーゲンの分解などの他の長期的な影響を引き起こす。
現在の皮膚治療製品およびスキンケア製品は、環境空気汚染による幅広い影響をカバーするために開発されているため、しわ防止製品があり、座瘡防止製品があり、保湿製品などがある。皮膚への環境空気汚染の影響を軽減するためにこれら全ての製品を使用することは、かなりの支出となり、皮膚にいくつかの製剤を並行してまたは同時に使用することを意味し、前述の製品の組み合わせが以前に試験されていないことを考えると、望ましくない影響を生じるリスクが伴う。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の第１の態様は、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチン、およびヒドロキシチロソールを含む、皮膚に対する空気汚染の影響を処置するための組成物に関する。
本発明はまた、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチンおよびヒドロキシチロソールを含む組成物の０．１〜１０００ｍｇの間の用量に関する。
さらに、本発明は、非経口、経皮、経口または局所投与用の製剤に関し、前記製剤は、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチンおよびヒドロキシチロソールを含む組成物を含む。
【０００９】
本発明の別の態様は、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチンおよびヒドロキシチロソールを含む前記組成物の美容的使用に関し、皮膚に対する審美的環境汚染の影響を美容的に軽減し、皮膚に対する前記空気汚染の影響に関連する早期の皮膚老化を防止する。
別の追加の態様は、薬剤として使用するための、特に、環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患の治療または予防に使用するための、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチン、およびヒドロキシチロソールを含む組成物に関する。
最後に、本発明は、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチン、およびヒドロキシチロソールを含む前記組成物を含む栄養補助食品またはニュートリコスメティクス製品に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、未処理の細胞と比較した２つの異なる濃度の本発明の組成物１Ｂ、２Ｂおよび３Ｂで処理されたヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の酸化のパーセンテージを示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、未処理で非照射の試料と比較した、表１の製剤（本発明の１Ｂ）と共にインビトロでインキュベートされ、８００および１２００Ｊ／ｍ２の強度で、タイプＢ紫外線（ＵＶＢ）に曝露されたヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の酸化のパーセンテージを示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、未処理で非照射の試料と比較した、表１の製剤（本発明の２Ｂ）と共にインビトロでインキュベートされ、８００および１２００Ｊ／ｍ２の強度で、タイプＢ紫外線（ＵＶＢ）に曝露されたヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の酸化のパーセンテージを示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、未処理で非照射の試料と比較した、表１の製剤（本発明の３Ｂ）と共にインビトロでインキュベートされ、８００および１２００Ｊ／ｍ２の強度で、タイプＢ紫外線（ＵＶＢ）に曝露されたヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の酸化のパーセンテージを示す図である。
【図３】図３は、未処理で照射した細胞と比較したインビトロでの相対的なヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）のＩＬ−８レベルを示す図である。ケラチノサイトを１０μｇ／ｍｌの異なる製剤で処理し、ＵＶＢ放射（３００Ｊ／ｍ２）に曝露した。データは平均±ＳＤとして表す。異なる製剤の使用は、照射中および照射後、また照射後にのみ実施された。
【図４Ａ】図４Ａは、未処理のメラノサイトと比較した表１の製剤（本発明の１Ｂ）で処理されたヒトメラノサイトによって生成されたメラニンのパーセンテージを示すグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、未処理のメラノサイトと比較した表１の製剤（本発明の２Ｂ）で処理されたヒトメラノサイトによって生成されたメラニンのパーセンテージを示すグラフである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、未処理のメラノサイトと比較した表１の製剤（本発明の３Ｂ）で処理されたヒトメラノサイトによって生成されたメラニンのパーセンテージを示すグラフである。
【図５】図５は、０．００１ｗｔ％および０．００５ｗｔ％の濃度で本発明の１Ｂ組成物（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）で処理され、４００μｇ／ｍｌ濃度で都市の粉塵（ＵＤ）に２４時間暴露され、続いて２５分間ＵＶＡを照射されたヒトケラチノサイト試料（ＨａＣａＴ）におけるＲＯＳの蓄積を表す棒グラフである。データは、同じＵＤ量とＵＶＡ放射線に暴露された対照に関して正規化されている。
【図６】図６は、汚染物質混合物に曝露され、未処理（対照バー）および１Ｂ製剤で処理された（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎバー）後のエクスビボでの皮膚外植片におけるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）濃度の増加を示す図である。
【図７】図７は、エクスビボでの皮膚外植片におけるＩＬ１−アルファ濃度を示す図である。第１のカラム：汚染物質の混合物に暴露されることなくかつ処理なし、第２のカラム：汚染物質の混合物に暴露された後に処理なし、および第３のカラム：汚染物質の混合物に曝露された後に本発明の１Ｂ組成物（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）での処理。
【図８】図８は、エクスビボでの皮膚外植片のＡｈＲ発現を示す図である。第１のカラム：汚染物質の混合物に暴露されることなくかつ処理なし、第２のカラム：汚染物質の混合物に暴露された後に処理なし、および第３のカラム：汚染物質の混合物に曝露された後に本発明の１Ｂ組成物（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）での処理。
【図９】図９は、エクスビボでの皮膚外植片におけるメタロチオネインＭＴ−Ｈ１タンパク質発現を示す図である。第１のカラム：汚染物質の混合物に暴露されず、第２のカラム：汚染物質の混合物に暴露後、および第３のカラム：汚染物質の混合物に曝露された後に本発明の１Ｂ組成物（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）での処理。
【図１０】図１０は、本発明の組成物（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ、黒塗りバー）の使用のまたはプラセボ（水平線バー）を用いる１４、２８、５６および８４日目での研究の開始Ｔ０からの水分補給変化の％として測定された皮膚の水分補給を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明の組成物（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ、黒塗りバー）の使用のまたはプラセボ（水平線バー）を用いる１４、２８、５６および８４日目での研究の開始Ｔ０からの％水分補給変化として測定された経表皮の水分損失を示す図である。
【図１２】図１２は、本発明の組成物の使用の１４、２８、５６および８４日目で汚染物と接触して生成された皮脂分泌における変化を示す図である（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎは黒塗りバーおよびプラセボは水平線バー）。
【図１３】図１３は、プラセボ使用（水平線バー）と比較した、本発明の組成物の使用（黒塗りバー）の１４、２８、５６および８４日目での皮膚の弾性の変化を示す図である。
【図１４】図１４は、プラセボ使用（水平線バー）と比較した、本発明の組成物の使用（黒塗りバー）の１４、２８、５６および８４日目での皮膚の堅さの変化（Ｒ０絶対値が減少するにつれて測定され、皮膚の堅さの増加を表す）。
【図１５】図１５は、プラセボ使用（水平線バー）と比較した、本発明の組成物の使用（黒塗りバー）の１４、２８、５６および８４日目での皮膚の明るさ（頬の明るさの値として測定）の変化を（％で）示す。
【図１６】図１６は、プラセボ使用（水平線バー）と比較した、本発明の組成物の使用（黒塗りバー）の１４、２８、５６および８４日目の色素沈着中で測定されたＩＴＡ値の変化を（％で）示す。
【図１７】図１７は、プラセボ使用（水平線バー）と比較した、本発明の組成物の使用（黒塗りバー）の１４、２８、５６および８４日目でのしわの深さの変化を（％で）示す。
【図１８】図１８は、プラセボ使用（水平線バー）と比較した、本発明の組成物の使用（黒塗りバー）の１４、２８、５６および８４日目での皮膚の均一性の変化を（％で）示す。
【図１９】図１９は、プラセボ使用（水平線バー）と比較した、本発明の組成物の使用の２８、５６および８４日目でのＭＤＡ産生の変化を（％で）示す。
【図２０】図２０は、プラセボ使用（水平線バー）と比較した、本発明の組成物１Ｂの使用（黒塗りバー）の２８日目および８４日目でのＦＲＡＳ（唾液還元第二鉄抗酸化剤）の変化を（％で）示す。
【００１１】
本発明の第１の態様は、皮膚に対する空気汚染の影響を処置するための組成物を提供し、前記組成物は、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチン、およびヒドロキシチロソールを含む。好ましい実施形態では、本発明の組成物はカルノシン酸を含む。好ましくは、前記組成物は、主要なジテルペンとしてカルノシン酸を含む。
一実施形態では、前記組成物は、カルノシン酸、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチンおよびヒドロキシチロソールを含む。
【００１２】
前述の組成物は、全ての有害な空気汚染の影響を軽減または打ち消すために必要な作用の組み合わせをもたらすため、皮膚への空気汚染の影響の処置に適している。これは、前述の組成物が、ヒトの皮膚に対して重要かつ顕著な抗酸化、抗炎症、抗老化および美白効果を与える、すなわち、前記組成物が、美容効果（老化防止）ならびに医薬効果（抗炎症）を提供することである。このようにして、炎症、座瘡の増加、慢性皮膚炎、乾癬などの空気汚染に関連する全ての疾患を防ぐために、いくつかのスキンケア製品を同時に使用することを回避できる。前述のような組成物の使用は、予防的であるか、または既存の皮膚状態を治療するためであってもよい。
したがって、一実施形態は、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチンおよびヒドロキシチロソールを含む組成物に言及する。
【００１３】
一実施形態では、前記組成物は、ヒドロキシチロソールに対してジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシドおよびケルセチンのそれぞれをおよそ、重量で２．５〜５倍の個々の割り当て量で含む。よって、一実施形態では、本発明の組成物は、２．５〜５のヒドロキシチロソールに対するジテルペン比率、２．５〜５のヒドロキシチロソールに対するオレウロペイン比率、２．５〜５のヒドロキシチロソールに対するベルバスコシド比率、および２．５〜５のヒドロキシチロソールに対するケルセチン比率を含む。
好ましくは、ヒドロキシチロソールに対するジテルペン重量比は約３であり、ヒドロキシチロソールに対するオレウロペインの重量比は約３であり、ヒドロキシチロソールに対するベルバスコシドの重量比は約４．５であり、ヒドロキシチロソールに対するケルセチンの重量比は約２．５である。
【００１４】
本発明の効果について、数値、比率またはパーセンテージを指す「およそ」および「約」という用語は、前記数値、比率またはパーセンテージがその値の±１０％変動し得ることを示す。したがって、約２．５は、２．２５〜２．７５の間に含まれる全ての値、すなわち、例えば、２，２５を含むだけでなく、２．２５７、２．３１、２．５４、２．５、２．６２、２．６３、２．７、２．７５などとその中の全ての値を含む。
これらの重量比は、抗酸化、抗炎症、老化防止、美白（または過度の色素沈着防止）作用の間の適切なバランスを組成物に与えるため、さまざまな環境空気汚染の影響の予防および／または治療が効果的で単一の製品で実現可能である。
【００１５】
前述の特徴を備えた組成物は、異なる植物の抽出物の組み合わせによってのみ達成可能である。各抽出物は、有効成分の１つまたは複数、または各有効成分の総含有量の一部を提供し得る。
一実施形態では、ケルセチン源として、例えば、タマネギ、フェンネル、ディル、クランベリーまたは菊抽出物などのいくつかの抽出物を使用することができるが、好ましいケルセチン源は、最小ケルセチン含有量が４０ｗｔ％のソフォラ・ジャポニカ（エンジュ）抽出物である。好ましい実施形態では、前記組成物は、４０ｗｔ％の最小ケルセチン含有量を有するソフォラ・ジャポニカ抽出物を含む。好ましくは、前記ソフォラ・ジャポニカ抽出物は、総組成物重量の３．５％の最小ケルセチン含有量を提供する。
【００１６】
ケルセチンの最小含有量が４０ｗｔ％のソフォラ・ジャポニカ抽出物は、その製造コストと重量に比べてケルセチン濃度が高く、残りの有効成分を十分な濃度で得ることができるため、この組成物にとって有益な成分である。
ケルセチンはフラボノールファミリーに属するフラボノイドである。主にタマネギ、ブドウ、ベリー、チェリー、ブロッコリーおよび柑橘系の果物に見られ得る。ケルセチンは、優れた抗炎症活性に加えて、高いフリーラジカル捕捉活性を持つ強力な抗酸化剤である。ケルセチンのもう１つの興味深い特性は、ヒスタミン放出能力を低下させることが示されている研究が存在することである（１２）。いくつかの研究は、ディーゼル微粒子のような特定の汚染物質がヒスタミンレベルを上昇させるため、高度に汚染された地域に住む人々においてアレルギー反応を増加させることを証明している。
【００１７】
一実施形態では、ジテルペン源は、植物抽出物の１つまたは組み合わせであり得る。ジテルペンには顕著な抗炎症作用があり、これは皮膚への環境空気汚染の影響を軽減するための組成物にとって非常に有益である。
カルノシン酸は、多くの容易に入手できる植物に見られるジテルペンであるため、その適切なコストおよび豊富さのゆえに、この組成物に使用するのに適したジテルペンである。一実施形態では、カルノシン酸源は、例えば、ローズマリー、セージ、オレガノ、メリッサまたはタイムの抽出物またはそれらの抽出物の組み合わせである。
【００１８】
好ましくは、前記組成物は、１５ｗｔ％の最小ジテルペン含有量を有するローズマリー抽出物を含む。前記抽出物は、その製造コストおよび重量に関して高いジテルペン濃度を提供し、残りの有効成分の十分な濃度を得ることができる。好ましくは、前記ローズマリー抽出物は、本発明の総組成物重量の４．５ｗｔ％の最小ジテルペン含有量を提供する。
カルノシン酸はまた、インターロイキンを排除し、亜酸化窒素の放出とチロシンキナーゼ経路を遮断または阻害するその能力ゆえに、強力な抗酸化活性、重要な抗炎症活性を有している。カルノシン酸はまた、抗脂肪生成特性を有し、皮膚の脂質酸化の阻害によりまたは生物物理学的メカニズムにより早期の皮膚老化を予防する。
【００１９】
一実施形態では、オレウロペイン源は、植物抽出物、例えば、オリーブの葉または果実の抽出物またはアルガン抽出物またはトネリコ抽出物の抽出物またはそれらの組み合わせである。好ましくは、前記組成物は、オレウロペインにおける最小含有量が１６ｗｔ％のオリーブ（葉または果実）抽出物を含む。好ましくは、前記オリーブ抽出物は、本発明の組成物の全重量の４．５ｗｔ％の最小オレウロペイン含有量を提供する。
オレウロペインの最小含有量が１６ｗｔ％のオリーブ抽出物は、適切なコストで製造が容易であり、地中海沿岸に非常に豊富な樹木であるため、非常に適切なオレウロペイン源である。さらに、少なくとも１６ｗｔ％のオレウロペイン含有量は、他の抽出物と組み合わせたときに適切な生物活性を保証するのに十分である。
【００２０】
オレウロペインは、いくつかのメカニズムを通じて実行される重要な抗酸化活性を示す。主に、オレウロペインは、ヒドロキシル基の遊離酸素とそのフェノキシルラジカルとの間の水素結合形成によってフリーラジカルの安定性を高める。
同様に、オレウロペインは、リポキシゲナーゼ活性、ロイコトリエンＢ４産生、炎症誘発性サイトカイン生合成阻害、または炎症パラメーターの調節を通じて抗炎症作用を示す。
【００２１】
一実施形態では、ヒドロキシチロソール源は、植物抽出物、例えば、オリーブの葉または果実の抽出物またはアルガン抽出物またはトネリコ抽出物の抽出物またはそれらの組み合わせである。好ましくは、前記組成物は、５ｗｔ％のヒドロキシチロソールの最小含有量を有するオリーブ（葉または果実）抽出物を含む。好ましくは、前記オリーブ抽出物は、本発明の組成物の全重量の１．５ｗｔ％の最小ヒドロキシチロソール含有量を提供する。
最小ヒドロキシチロソール含有量が５ｗｔ％のオリーブ抽出物は、適切なコストで製造が容易であり、地中海沿岸に非常に豊富な樹木であるため、非常に適切なヒドロキシチロソール源である。さらに、他の抽出物と組み合わせた場合に適切な生物活性を保証するには、少なくとも５ｗｔ％のヒドロキシチロソール含有量で十分である。
【００２２】
ヒドロキシチロソールの優れた抗酸化活性は、フリーラジカル効果を阻害するその能力とそのＦｅ＋３イオン還元力よりｏ−ジヒドロキシフェニル分子断片に起因する。ｏ−ジフェノールの抗酸化特性は、ヒドロキシル基とフェノキシルラジカルの間に分子内水素ブリッジを形成するそれらの能力に関連しているため、カテコール基は、脂質酸化の初期段階で形成された過酸化アルキルラジカルに水素ラジカルを供与することにより、鎖の伝播を防ぐ。
炎症とその結果は、皮膚疾患に重要な役割を果たす。ヒドロキシチロソールは、炎症誘発性ロイコトリエン分子の産生とアラキドン酸リポキシゲナーゼ活性の両方を阻害することが証明されている。最近、２０ｗｔ％のヒドロキシチロソールを含む抽出物が炎症性腫脹および痛覚過敏を抑制し、炎症ラットモデルにおいて炎症誘発性サイトカインを抑制することが発表された。
【００２３】
一実施形態では、ベルバスコシド源は、植物抽出物、例えば、オリーブの葉または果実の抽出物、ブッドレア・グロボーサ（タマフジウツグミ）、リッピア・シトリオドラ（レモンバーベナ）、プランタゴ・ランセオラタ（ヘラオオバコ）、シスタンチェ・タブロザ（カンカニクジュヨウ）、レーマンニア・グルチノーサ（アカヤジオウ）などの抽出物またはそれらの組み合わせである。好ましくは、前記組成物は、２５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量を有するリッピア・シトリオドラ抽出物を含む。好ましくは、前記オリーブ抽出物は、本発明の組成物の総重量の６．５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量を提供する。
ベルバスコシドの最小含有量が２５ｗｔ％のリッピア・シトリオドラ抽出物は、この植物からの抽出物が地中海沿岸に豊富にあるため、適切なコストで簡単に製造できるので、非常に適したベルバスコシド源である。さらに、この抽出物を他の抽出物と組み合わせた場合、２５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量で十分な生物活性を保証できる。
アセトキシドとしても知られるベルバスコシドは、抗酸化活性、抗炎症活性、美白活性、光防護活性、キレート活性を示す。前記抗酸化活性は多くの研究で証明されている。前記抗炎症活性は、ヒトケラチノサイト培養物に関するインビトロ研究で証明されており、その培養物中で、ベルバスコシドは用量依存反応で炎症誘発性ケモカインの放出を減らすことができた（１３）。Ｙｏｕｎｇらの研究によると、ベルバスコシドは、メラノーマＢ１６細胞のチロシナーゼ活性とメラニン生成を阻害する（１３、１４）。
【００２４】
一実施形態では、前記組成物は、組成物総重量の４．５ｗｔ％の最小ジテルペン含有量を提供する２５ｗｔ％〜４０ｗｔ％の間のローズマリー抽出物、組成物総重量の４．５ｗｔ％の最小オレウロペイン含有量および組成物総重量の１．５ｗｔ％の最小ヒドロキシチロソール含有量を提供する２０ｗｔ％〜４０ｗｔ％の間のオリーブの葉または果実の抽出物、組成物総重量の６．５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量を提供する２０ｗｔ％〜３５ｗｔ％の間のリッピア・シトリオドラ抽出物、および組成物総重量の３．５ｗｔ％の最小ケルセチン含有量を提供する５ｗｔ％〜から２５ｗｔ％の間のソフォラ・ジャポニカ抽出物を含む。
好ましくは、前記組成物は、組成物総重量の４．５ｗｔ％の最小ジテルペン含有量を提供する約３２ｗｔ％のローズマリー抽出物、組成物総重量の４．５ｗｔ％の最小オレウロペイン含有量および組成物総重量の１．５ｗｔ％の最小ヒドロキシチロソール含有量を提供する約３０ｗｔ％のオリーブの葉または果実の抽出物、組成物総重量の６．５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量を提供する約２８ｗｔ％のリッピア・シトリオドラ抽出物ならびに組成物総重量の３．５ｗｔ％の最小ケルセチン含有量を提供する約１０ｗｔ％のソフォラ・ジャポニカ抽出物を含む。
【００２５】
一実施形態では、前記組成物は、組成物総重量において、４．５％（ｗｔ／ｗｔ）の最小ジテルペン含有量、４．５％（ｗｔ／ｗｔ）の最小オレウロペイン含有量、１．５％（ｗｔ／ｗｔ）の最小ヒドロキシチロソール含有量、６．５％（ｗｔ／ｗｔ）の最小ベルバスコシド含有量および３．５％（ｗｔ／ｗｔ）の最小ケルセチン含有量を含む。
より好ましくは、前記組成物は、１５ｗｔ％の最小ジテルペン含有量を有する約３２ｗｔ％のローズマリー抽出物、１６ｗｔ％の最小オレウロペイン含有量および５ｗｔ％の最小ヒドロキシチロソール含有量を有する約３０ｗｔ％のオリーブの葉または果実の抽出物、２５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量を有するリッピア・シトリオドラ抽出物ならびに４０ｗｔ％の最小ケルセチン含有量を有する約１０ｗｔ％のソフォラ・ジャポニカ抽出物を含む。
【００２６】
本文書に記載されている組成物は、皮膚に対する抗酸化作用、抗炎症作用、および美白作用の間の適切なバランスを示し、これは、ＵＶ照射の暴露下およびＵＶ照射なしでのケラチノサイトにおける抗酸化活性に関する、ＵＶ照射暴露下のケラチノサイトにおける抗炎症活性とメラノサイトにおける美白活性に関する本発明者らの研究によって実証されている。単一の組成物中にバランスのとれた抗酸化機能、抗炎症機能、および美白機能を有することは非常に便利であるため、適切に試験されている単一の製品を適用することによって、皮膚に対する複数の環境空気汚染の影響を軽減することが実現可能となる。対照的に、皮膚への複数の環境空気汚染の影響をそれぞれの作用に関して多様な製品を適用することによって処置しようとすると、それらの併用が前もって試験されていないため、互換性のない製品を使用するリスクが高まり、使用される治療が、最初の問題よりも悪い影響を引き起こす可能性がある。さらに、単一の製品を使用するという事実は、毎日のスキンケアのコストが下がることを意味する。
【００２７】
本発明の組成物は、非経口的、経皮的、経口的または局所的に投与され得る。
一実施形態は、本発明の組成物の美容的な使用に言及する。
したがって、一実施形態は、皮膚に対する美観的な環境汚染の影響を美容的に軽減するための本発明の組成物の美容的な使用に言及する。
【００２８】
別の実施形態は、抗酸化、抗炎症の美観的作用を有する美容製品（ｃｏｓｍｅｔｉｃ）として使用するための本発明の組成物に言及するが、この作用は治療的処置としてではなく、単に皮膚に対する美観的な、老化防止および美白処置としてとらえられる。
好ましくは、前記使用は、本文書に記載されている本発明の組成物の０．１ｇから１ｇ（１０００ｍｇ）の間の経口用量を毎日投与するステップを含む。より好ましくは、経口用量は１日２５０ｍｇである。
したがって、一実施形態は、美容製品の抗酸化剤、抗炎症製品の製造のための、本文書に記載の本発明の組成物の使用に言及し、これの作用は治療的処置としてではなく、単に美観的な、皮膚に対する老化防止および美白としてとらえられる。
【００２９】
一実施形態は、薬剤としての使用のための、本文書に記載される本発明の組成物に言及する。
特に、一実施形態は、環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患の治療または予防におけるその使用のための、本文書に記載される本発明の組成物に言及する。好ましくは、前記使用は、本文書に記載される本発明の組成物の０．１ｇ〜１ｇ（１０００ｍｇ）の間の経口１日量を投与するステップを含む。より好ましくは、経口用量は１日２５０ｍｇである。
好ましくは、前記疾患は、炎症、座瘡、慢性皮膚炎および乾癬からなる群から選択される。
【００３０】
別の実施形態は、環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患の治療または予防に使用するための薬剤を製造するための、本文書に記載の本発明の組成物の使用に言及する。
別の実施形態は、本文書に記載される本発明の組成物の有効量を個体に投与するステップを含む、環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患の治療または予防の方法に言及する。
【００３１】
本発明の作用に対する「有効量」は、患者に許容できない毒性効果を引き起こすことなく治療効果を提供するものであると理解される。前記組成物の有効量または用量は、例えば、治療される疾患、治療される患者の年齢、体重および臨床状態、投与形態、患者の病歴、治療される疾患の重症度および投与される組成物の効力に依存する。好ましくは、前記有効量または用量は、本文書に記載される本発明の組成物の０．１ｇ〜１ｇ（１０００ｍｇ）の間の経口１日用量である。
前述の組成物は、１日０．１ｇ〜１ｇの間の用量で投与され得る。実施され、実施例４に示された毒性試験によれば、この用量は安全であると考えられる。
好ましくは、１日用量は２５０ｍｇである。この用量は、薬学的または美容的に未処理のモデルまたは人々と比較して、皮膚に対する環境空気汚染の影響の軽減において有意かつ顕著な効果を生じる。
【００３２】
本発明の別の第２の態様は、皮膚に対する環境空気汚染の影響に関連する早期の皮膚老化の予防に使用するための組成物を提供し、前記組成物は、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチンおよびヒドロキシチロソールを含む。前記美容的使用は、汚染の影響の低減をもたらすため、早期の皮膚老化を予防する。
本発明の第１の態様の組成物の特徴は、概して、特にそれがその組成、成分比およびその供給源を指すものにおいて、本発明の第２の態様の組成物に等しく適用可能である。
より特定の実施形態では、本発明の組成物の投与は、経口、局所、経皮または非経口投与を目的としたそれを含む製剤の中から選択される。
好ましくは、本発明の組成物は、１つまたは複数の生理学的に適合性のある媒体または賦形剤を、固体または液体の形態で含有して経口投与することができる。したがって、本発明の別の態様は、本文書に記載される本発明の組成物、および１つまたは複数の生理学的に適合性のある媒体または賦形剤を含む製剤に言及する。
【００３３】
一実施形態は、本文書に記載されるような本発明の組成物、および１つまたは複数の薬学的に許容され得る媒体または賦形剤を含む医薬製剤に言及する。
【００３４】
別の実施形態は、本文書に記載されているような本発明の組成物、および１つまたは複数の薬学的に許容され得る媒体または賦形剤を含む美容的な製剤に言及する。
特定の実施形態では、前記美容的な製剤は栄養補助食品である。したがって、本発明の一実施形態は、本文書に記載されているような本発明の組成物を含む栄養補助食品に言及する。別の実施形態は、皮膚に対する環境汚染の美観的影響を美容的に軽減するための前記栄養補助食品の使用に言及する。
【００３５】
別の特定の実施形態では、前記美容的な製剤はニュートリコスメティクス製品である。したがって、本発明の一実施形態は、本文書に記載されているような本発明の組成物を含むニュートリコスメティクス製品に言及する。別の実施形態は、皮膚に対する環境汚染の美観的影響を美容的に軽減するための前記ニュートリコスメティクス製品の使用に言及する。
ニュートリコスメティクス製品という用語は、本発明の作用を指し、摂取されたときに美容上の利益を提供する、食品または食品の一部を指す。
したがって、一実施形態は、美容的な抗酸化製品、抗炎症製品、老化防止製品、および美白製品の製造のための、本文書に記載されている美容的な製剤の使用に言及する。
【００３６】
別の実施形態は、環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患を治療または予防するための薬剤を製造するための、本文書に記載されている医薬製剤の使用に言及する。
特に、一実施形態は、環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患の治療または予防に使用するための、本文書に記載される医薬製剤の使用に言及する。
別の実施形態は、本文書に記載される本発明の美容製剤または医薬製剤を個体に投与するステップを含む、環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患の治療または予防の方法に言及する。
【００３７】
前記製剤は、生理学的に許容され得る賦形剤、媒体、結合剤、充填剤、潤滑剤および保湿剤などの従来の成分を含み得る。前記製剤は、任意の適切な形態をとることができ、クリーム、バルム、気化器、丸薬、糖衣錠、カプセル、トローチ剤、油性溶液または水溶液、懸濁液、乳濁液、または、即時または制御放出のための、水または他の液体溶剤中での使用前の再構成に適した乾燥粉末形態などで、経口、経鼻、局所または非経口的に投与することができる。
前記製剤を製造するために、医薬製剤または美容的な製剤を製造するための従来の技術を使用することができる。前記媒体が溶媒として機能する場合、それは固体、半固体または液体であってもよく、そして前記活性化合物のための賦形剤または溶剤として作用し得る。目的の組成物は、粒状の固体溶剤に吸収することができる。適切な媒体のいくつかの例は、水、食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエトキシル化ヒマシ油、ピーナッツ油、オリーブ油、ラクトース、テラアルバ、サッカロース、シクロデキストリン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルカム、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸である。酸、アルキルセルロースエーテル、シリコン酸、脂肪酸、脂肪酸アミン、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリトロール脂肪エステル、ポリエチレン、ヒドロキシメチルセルロース、微結晶性セルロースおよびポリビニルピロリドンである。
【００３８】
ピルなどの固体製剤を調製するために、目的の化合物を、タルカム、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、ケイ酸アルミニウムおよびマグネシウム、デンプン、ラクトース、アカシア、メチルセルロース、微結晶性セルロースなどの他の従来の成分および医薬品媒体および希釈剤などの機能的に同様の材料と製剤中で混合する。
液体経口形態はまた、甘味料、香料、防腐剤および乳化剤などの特定の添加物を含み得る。経口投与用の非水性液体組成物はまた、例えば、食用油を含んで処方され得る。そのような液体組成物は、適切な方法で、例えば、単回用量のゼラチンカプセルにカプセル化することができる。
【００３９】
カプセルは、目的の化合物を薬学的に不活性な溶媒と混合し、得られた混合物を適切なサイズの硬ゼラチンに充填して調製することができる。ソフトカプセルは、植物油、軽質パラフィン、または許容し得る不活性油中に目的の化合物を懸濁させてカプセル化機を用いて調製される。シロップ、エリキシル剤、懸濁液などの液体剤形も調製できる。水溶性形態は、砂糖、香味料芳香剤および防腐剤と共に水性媒体に溶解して、シロップを形成し得る。エリキシル剤は、香料芳香剤と共に砂糖やサッカリンなどの適切な甘味料を含む水性アルコール媒体（エタノールなど）を使用して調製される。懸濁液は、水性媒体と、アカシア、トラガカント、メチルセルロースなどの懸濁剤の補助により調製することができる。
【００４０】
一実施形態では、本発明による美容的な使用のための前記組成物は、１日０．１ｇ〜１０００ｍｇの間の用量で経口投与される。好ましくは、前記用量は１日２５０ｍｇである。特に、本発明による美容的な使用のための前記組成物は、栄養補助食品において、または経口投与される０．１〜１０００ｍｇの間の用量を含むニュートリコスメティクス製品として投与される。
一実施形態では、前記栄養補助食品は、追加の賦形剤、好ましくは水、食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエトキシル化ヒマシ油、ピーナッツ油、オリーブ油、ラクトース、テラアルバ、サッカロース、シクロデキストリン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルカム、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸、アルキルセルロースエーテル、シリコン酸、脂肪酸、脂肪酸アミン、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリトロール脂肪エステル、ポリエチレン、ヒドロキシメチルセルロース、微結晶セルロースおよびポリビニルピロリドンを含む。
【００４１】
別の追加の実施形態では、前記栄養補助食品はカプセルである。好ましくは、硬ゼラチンカプセルである。
本発明の組成物は、水および適切なアルコールなどの注射可能な液体媒体と組み合わせて非経口的に投与することができる。安定剤、可溶化剤および緩衝液などの注射に対する通常の医薬補助剤もまた、そのような注射可能な製剤に含まれ得る。本発明の組成物は、筋肉内、腹腔内、または静脈内に投与することができる。
【００４２】
同様に、本発明の組成物は局所投与され得る。局所投与製剤は、液体、エアロゾル、クリームの形態などで、皮膚と生理学的に適合性のある１つまたは複数の媒体または賦形剤を含み得る。
局所適用の製剤を調製するために、本発明の組成物は、皮膚科学的に受け入れられた媒体に含まれる。投与される組成物の量および局所使用の製剤中の組成物量は、媒体に依存し、それが投与される個体、所望の効果および製剤の安定性に依存する。したがって、当業者は、適切な組成物量を含む適切な調製物の使用方法を理解し、前述の条件に応じて、投与する製剤量を選択する。
好ましくは、本発明による美容的な使用のための前記組成物は、０．０５ｗｔ％から２ｗｔ％の本発明の組成物を含む化粧品で局所投与される。好ましくは、０．１ｗｔ％〜１ｗｔ％の前記化粧品は、０．１ｗｔ％〜１ｗｔ％の本発明の組成物を含み、局所投与される。
【００４３】
皮膚に対する空気汚染の影響の分子メカニズム
大気汚染は、オゾンとＵＶ放射と組み合わされて、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成と除去の間の既存のバランスを変化させる。この変化は炎症反応の誘発を意味する。大気汚染が誘導する慢性的なストレスは、皮膚のバリアの完全性に影響を与えかつその完全性を、特定の病状（敏感性（ｓｅｎｓｉｂｉｌｉｔｙ）、過敏性、脱水症、色素沈着の変化、皮膚炎、座瘡など）を発生または悪化させる程度まで変化させる可能性がある（１５）。
オゾンは主に角質層に作用するが、対照的に、粒子状物質（ＰＭ）は、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）などの一連の有毒分子を含み、皮膚と接触するとそれに浸透し、より深いレベルで害を及ぼす可能性があり、例えば、ＡｈＲ（アリール炭化水素受容体）と結合することにより、ケラチノサイトおよびメラノサイトに直接作用し、それらの活性化は、皮膚の老化、色素沈着、および皮膚の炎症を引き起こす酸化ストレスに関与する遺伝子の発現を刺激する（１５）。
【００４４】
このように、皮膚の炎症（掻痒感覚過敏）やしみの出現、既存の状態の悪化に関連するＡｈＲ過剰活性化を阻害できる化合物は、汚染防止組成物を得るための優れた戦略である。
この意味で、前記製剤の目的の１つは、空気汚染の結果としてのＡｈＲの活性化を抑制できるようにすることである。
【００４５】
既に述べたように、環境空気汚染が皮膚に損傷を与え得るメカニズムの１つには、ＡｈＲの活性化が含まれる。環境空気汚染はフリーラジカルを生成し、皮膚の免疫炎症反応はＡｈＲの活性化に依存するメカニズムの活性化を引き起こし、皮膚のミクロフローラを変化させる。
いくつかの科学的研究は、いくつかの皮膚疾患におけるＡｈＲ活性化の関与を示している。トランスジェニックマウスにおけるＡｈＲ活性化の関与に関する研究は、ＡｈＲ転写活性化がアトピー性皮膚炎と同様の炎症性皮膚病変を引き起こすことを証明した。マウス皮膚のマイクロアレイ遺伝子分析は、炎症関連遺伝子の過剰発現を示した。この研究の結果は、ＡｈＲの活性化が皮膚の炎症性疾患の発症に関与している可能性があることを証明している。
【００４６】
ＡｈＲは、ケラチノサイト、線維芽細胞およびメラノサイトを含む、増殖性細胞の炎症とメラニン形成を調節するさまざまな皮膚細胞タイプに存在するリガンド活性化サイトゾル転写因子である（１６、１７）。非活性化ＡｈＲは、サイトゾルタンパク質複合体に見られ、リガンドと結合すると複合体が解離するため、核へのＡｈＲ移行が引き起こされ、そのＡｈＲが生体異物応答要素（ＸＲＥ）を含む遺伝子の発現を刺激する。生体異物応答要素（ＸＲＥ）を含む遺伝子には、シトクロム解毒酵素Ｐ４５０（ＣＹＰ）が含まれる（１３）。ＡｈＲの活性化は、ダイオキシン、オゾン、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）などのリガンドとして作用する環境空気汚染物質の生化学的効果と毒性効果の間の仲介役を果たすため、成長および分化などの細胞の生物学的プロセスに影響を与えることになる。最近、メラノサイトの増殖を誘発するため、マウスの皮膚を黒化し得ることが証明された（１８）。
【００４７】
多環芳香族炭化水素２，３，７，８−テトラクロロジベンゼン−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）は、ＡｈＲの活性化を通じてヒトにいくつかの病理学的影響を及ぼす。ＴＣＤＤによって誘発される遺伝子発現の変化に従属する主要なメカニズムは、ＡｈＲおよびＡｈＲトランスロケーター（Ａｒｎｔ）が関与する転写サイクルの活性化である。ＡｈＲとＡｒｎｔは、発生調節、低酸素シグナル伝達および概日リズムに関与する転写因子であり、補助タンパク質との不活性な複合体内の細胞質内に見られるタンパク質ファミリーに属している。
ＴＣＤＤに結合すると、ＡｈＲはいくつかの不活性な複合体タンパク質から解離し、核に移行してＡｒｎｔと二量体化する。ヘテロダイマーＡｈＲ／Ａｒｎｔは、生体異物代謝遺伝子の転写を活性化し、その一部は、成長制御、サイトカイン、核転写、および細胞外マトリックスタンパク質分解調節因子に関与するタンパク質をコード化する（１９）。
ＡｈＲサイクルは、ＴＣＤＤによっておよびトランスレチノイン酸（オールトランスレチノイン酸）によって活性化され、ヒトの正常なケラチノサイトにおけるＭＭＰ−１の発現を増加させる。これは、ＭＭＰの誘導がＴＣＤＤによって誘導される病状に従属する共通のメカニズムであることを示唆している（２０）。
【００４８】
ＡｈＲはメラニン形成調節因子であることが証明されている。いくつかの研究でＡｈＲの役割が調べられ、その一例は、ヒトドナーのメラノサイトをＴＣＤＤに曝露させ、続いてチロシナーゼ活性とメラニン含有量をインビトロで測定した研究である。ＴＣＤＤへの５日間の曝露後、メラノサイトはチロシナーゼ活性レベルの増加と細胞内メラニンの３倍の増加を示した。ＦＭ５５ヒトメラノーマ細胞で実施された同様の実験は、ＴＣＤＤがメラニン含有量を有意に増加させることを証明したため、メラニン形成サイクルがＡｈＲ活性化によって過剰調節されたことが確認された（２１）。
ＡｈＲはオゾンセンサーとしても識別されている。オゾンはＡｈＲ核転座を誘発し、ｍＲＮＡによるＡｈＲ発現を増加させる。さらに、オゾンはタンパク質発現とＣＹＰ１アイソフォームｍＲＮＡを有意に増加させる。ＣＹＰ１酵素は、元のそれぞれの化合物よりも毒性の高い化合物を代謝し、多くの生体異物の発癌性化合物を活性化する（２２）。
【００４９】
タバコの煙（汚染物質とも考えられる）によって誘発される皮膚の老化へのＡｈＲの関与を分析する目的で、ヒト初代線維芽細胞をヘキサン可溶性タバコ煙抽出物に曝露した。この抽出物は、Ｐ１Ｂ１シトクロムの過剰発現と並行して、ヒト線維芽細胞培養におけるＭＭＰ−１誘導を有意に増加させた。ＡｈＲ量の減少は、前記抽出物によって誘発されるＡｈｒ依存性遺伝子転写の上昇ＣＹＰ１Ａ１／ＣＹＰ１Ｂ１を抑制した。ＭＭＰ−１およびＣＹＰ１Ｂ１の誘導は、ＡｈＲ３−メトキシ−４−ニトロフラボンおよびα−ナフトフラボンサイクル阻害剤によって抑制された。これらの研究は、ヘキサン可溶性タバコ煙抽出物が、ＡｈＲサイクルの活性化を通じてヒト皮膚線維芽細胞でＭＭＰ−１の過剰発現を誘発することを示唆している。したがって、ＡｈＲサイクルは、外的要因による皮膚の老化に病原として関与している可能性がある（２３）。
【００５０】
空気汚染とアトピー性皮膚炎の優勢および重症度との相関関係はよく知られているが、その従属するメカニズムはそれほどよくは知られていない。現在、アトピー性皮膚炎の症状はステロイド化合物で治療されている。しかし、多くの場合、掻痒は持続する。その理由の１つは、交通由来の粒子状物質などの空気汚染物質に応じたＡｈＲの活性化である。活性化されたＡｈＲは、ケラチノサイトでアルテミン神経栄養因子の発現を誘導する。これには、表皮の過敏症が含まれるため、掻痒の感覚過敏を引き起こす。その後の掻き傷は、皮膚バリアの変化と抗原浸透の増加を意味し、これは感作を意味し、他のアレルギー性疾患の素因に有利に働く（２４）。
【実施例】
【００５１】
以下に説明する実施例は、例示的な特徴を有し、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００５２】
実施例１．  高フラボノイド含有量の抽出物組成物の抗酸化、抗炎症および美白作用の研究
【表１】
2021530433.tif 000002
【００５３】
汚染が皮膚に引き起こす損傷の発生において、酸化および炎症過程が非常に重要であることを念頭に置いて、皮膚に対する空気汚染の影響に対する異なる組成の緩和活性を決定するための予備アッセイを実施した。
さらに、空気汚染が皮膚の色素沈着としみの出現を増加させることを考慮して、メラニン生成を阻害するいくつかの製剤の能力に関する研究を行った。
【００５４】
表１は、予備調査で調べた各組成物の成分とそれらの濃度を示す。表１は、３種類の試験製剤の組成を要約したものであり、製品１００ｍｇ当たりのフラボノイドのｍｇまたは各抽出物が製剤に提供する最終組成を示す。
各製剤の総フラボノイド寄与は同じであり、１００ｍｇの組成物または最終生成物当たり約３１ｍｇである。全ての製剤には、同量のソフォラ・ジャポニカ抽出物およびローズマリー抽出物が含まれている（常に同じフラボノイド含有量を提供する）。
【００５５】
この研究では、インビトロでのヒトケラチノサイト培養物を、それぞれ２種類の異なる濃度を使用して、前記３種類の製剤のそれぞれに曝露し、基礎酸化を測定した。データは、算術平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。統計的有意水準は、任意の組成物で処理されていない対照培養物と比較して＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（ｐ＜０．０００１）である。
図１に見られるように、処方物１Ｂならびに処方物２Ｂは、未処理の細胞（黒いバー）と比較して、ケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の酸化の割合を有意に減少させた。反対に、処方物３Ｂは、２つの研究された濃度のいずれにおいても細胞の基礎酸化を減少させることができなかった。
それらの間で製剤を比較すると、処方物１Ｂおよび２Ｂの抗酸化作用に有意差はないが、処方物３Ｂに関しては、両方の濃度で有意差がある。
【００５６】
結果を図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに示す別の試験では、表１の３種類の製剤の抗酸化作用を、インビトロで培養したヒトケラチノサイトで測定し、Ｂ型紫外線（ＵＶＢ）に８００および１２００Ｊ／ｍ２に暴露させた。
データは、算術平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。統計的有意水準は、同じ放射線強度を受けたがいずれの組成物でも処理されていない対照培養物と比較して、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（ｐ＜０．０００１）である。表２は、それぞれの対照と比較した酸化抑制率を示す。
【００５７】
試験された全ての製剤は、ＵＶＢ放射線によって引き起こされる酸化を有意に抑制した。しかし、２００μｇ／ｍＬの濃度の製剤１Ｂは、ＵＶＢによって誘発される酸化をほぼ完全に阻害したものであり、製剤２Ｂおよび３Ｂよりも有意に高いパーセンテージであった。
【表２】
2021530433.tif 000003
【００５８】
図３に、表１の３種類の製剤の抗炎症活性の研究結果を示す。この試験では、３００Ｊ／ｍ２の強度のＵＶＢ放射線に曝露され、１０μｇ／ｍＬの濃度で表１の製剤で処理されたヒトケラチノサイトによって産生されたＩＬ−８（インターロイキン８）の量を測定した。
データは、算術平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。統計的有意水準は、同じ放射線強度を受けたがいずれの組成物でも処理されていない対照培養物と比較して、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（ｐ＜０．０００１）である。
【００５９】
インターロイキン８は、ケラチノサイトや他の細胞によって産生されるサイトカインであり、炎症過程に関連している。
図３では、処方物１Ｂならびに処方物２Ｂが、未処理の細胞（黒いバー）と比較して、ケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の炎症率（ＩＬ−８アルファ発現）を照射中および照射後にインキュベートした場合に加えて、これらが放射線照射後にのみインキュベートされた場合も有意に低下させたことが理解できる。
【００６０】
反対に、製剤３Ｂは、ケラチノサイトが照射後に前記製剤とインキュベートされた場合にのみ、サイトカインＩＬ−８アルファ産生を有意に阻害することができた。
【００６１】
図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、表１の製剤の美白活性研究の結果を示す。グラフは、同じ培養条件で、未処理のメラノサイトと比較して、表１の製剤で処理されたメラノサイトによって生成されたメラニンのパーセンテージを表す。
データは、算術平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。統計的有意水準は、いずれの組成物でも処理されなかったメラノサイト対照培養物と比較して、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（ｐ＜０．０００１）である。
試験濃度での製剤２Ｂならびに製剤３Ｂは、統計的に有意な量でメラニン生成を阻害することができなかった。製剤１Ｂのみがそのような能力を示したため、記載された影響の１つが慢性空気汚染に暴露された人々の色素沈着の増加であることを考えると、皮膚への前記空気汚染影響の治療に使用するための組成物を得るための重要な要件を満たす。
【００６２】
前記抽出物のフラボノイド含有量の決定
リッピア・シトリオドラ抽出物およびオリーブ抽出物のフェノール化合物のＨＰＬＣ分析
−標準検量線の準備
前記検量線を、オレウロペイン、ヒドロキシチロソール、およびベルバスコシド標準のさまざまな濃度で作成する。各標準に割り当てられた純度は、標準の分析証明書に記載されているものである。
−乾燥試料の準備
試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して５ｍｇ／ｍｌの濃度にする。得られた溶液を０．４５μｍナイロンメンブレンでろ過する。
−ＨＰＬＣ法
カラム：ＬｉＣｒｏｓｐｈｅｒ  １００−Ｃ１８（２５０ｘ４．０ｍｍ  内径）、平均粒子サイズ５μｍ。移動相の流れ：１ｍｌ／分。温度：３０℃。注入量：２０μｌ。
−移動相：溶媒Ａ：２．５ｗｔ％の酢酸。
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：
【表３】
2021530433.tif 000004
吸光度の変化を２８０および３３０ｎｍで監視する。
オレウロペイン、ヒドロキシチロソール、およびベルバスコシドを、対応する標準との保持時間の比較によって同定する。濃度を検量線の補間によって計算する。
【００６３】
ローズマリー抽出物のフェノール化合物、ジテルペンのＨＰＬＣ分析
−カルノシン酸（ＣＡ）標準液の準備
標準液をＤＭＳＯ中に０．２ｍｇ／ｍｌ溶解する。得られた溶液を０．４５μｍナイロンメンブレンでろ過する。
−乾燥試料の準備
試料を１ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯ中に溶解する。得られた溶液を０．４５μｍナイロンメンブレンでろ過する。
−ＨＰＬＣ法
カラム：ＬｉＣｒｏｓｐｈｅｒ  １００−Ｃ１８（２５０ｘ４．０ｍｍ  内径）、平均粒子サイズ５μｍ。移動相の流れ：１ｍｌ／分。温度：３０℃。注入量：２０μｌ。
−移動相。  ５００ｍｌの水、９３５ｍｌのアセトニトリル、２．５ｍｌのリン酸、０．１６ｇの二水分補給物ＥＤＴＡ二ナトリウム塩。
吸光度の変化を、ＵＶ−ＶｉｓＤＡＤ検出器を使用して２３０で監視する。
−計算。カルノシン酸（ＣＡ）とカルノソール（ＣＯＬ）を、対応する標準との保持時間の比較によって同定した。
％カルノシン酸：（ＡｒｅａＣＡｓａｍｐｌｅ／ＡｒｅａＣＡＳｔｄ  ｘ（Ｗｔ  Ｓｔｄ／Ｗｔ  ｓａｍｐｌｅ）ｘＣＡ標準純度
ここで：
ＡｒｅａＣＡｓａｍｐｌｅ：試料ＣＡピーク面積
ＡｒｅａＣＡＳｔｄ：標準のＣＡピーク面積
Ｗｔ  ｓａｍｐｌｅ：試料重量（ｍｇ）
Ｗｔ  Ｓｔｄ：ＣＡ標準重量（ｍｇ）
％カルノソール：（ＡｒｅａＣＯＬｓａｍｐｌｅ／ＡｒｅａＣＯＬＳｔｄ  ｘ（Ｗｔ  Ｓｔｄ／Ｗｔ  ｓａｍｐｌｅ）ｘＣＯＬ標準純度ｘ０．９
ここで：
ＡｒｅａＣＯＬｓａｍｐｌｅ：試料ＣＯＬピーク面積
ＡｒｅａＣＯＬＳｔｄ：標準のＣＯＬピーク面積
Ｗｔ  ｓａｍｐｌｅ：試料重量（ｍｇ）
Ｗｔ  Ｓｔｄ：ＣＯＬ標準重量（ｍｇ）
【００６４】
ソフォラ・ジャポニカ抽出物のフェノール化合物、ケルセチンのＨＰＬＣ分析
−ケルセチン標準液の準備
標準液をＤＭＳＯ中に０．２ｍｇ／ｍｌ溶解する。得られた溶液を０．４５μｍナイロンメンブレンでろ過する。
−乾燥試料準備
試料を１ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯ中に溶解する。得られた溶液を０．４５μｍナイロンメンブレンでろ過する。
−ＨＰＬＣ法
カラム：ＬｉＣｒｏｓｐｈｅｒ  １００−ＲＰ１８（２５０ｘ４．０ｍｍ  内径）、平均粒子サイズ５μｍ。移動相の流れ：１．３ｍｌ／分。温度：５０℃。注入量：２０μｌ。
−移動相：メタノール：アセトニトリル：酢酸：水、１０：１０：５：７５の比率。アイソクラティックメソッド。
吸光度の変化をＵＶ−ＶｉｓＤＡＤ検出器を使用して２５９で監視する。
ケルセチンを対応する標準との保持時間の比較によって同定した。その濃度を検量線の補間によって計算する。
【００６５】
実施例２．  ヒトケラチノサイトに対するＵＶ放射および都市粒子状物質の影響に対する製剤１Ｂの抗酸化および細胞保護活性のインビトロ研究
生きた有機体を空気汚染物質に暴露し、これらはヒトの皮膚に重要な影響を及ぼす。空気汚染物質は、固体、液体、気体、粒子状物質（ＰＭ）である。これらは、皮下組織に到達するまで、または毛包や汗／皮脂細胞を介して皮膚に直接吸収される。急速な都市化と世界中での巨大なエネルギー消費の増加は、人々をますます多くの環境空気汚染にさらしている。体の最大かつ最も外部の器官を構成する皮膚は、これらの環境要因に対する物理的、化学的および免疫学的障壁として機能する。
【００６６】
空気汚染物質は、皮膚の抗酸化防御に対して作用する酸化ストレスの増加を通じて皮膚に有害な影響を及ぼす。フリーラジカルが生成され、酸素化された活性種が脂質に富む原形質膜と相互作用して、脂質過酸化反応カスケードを開始する。前記酸素化された活性種はまた、炎症誘発性メディエーターの放出を引き起こし、その結果、好中球分子が蓄積し、次に他の食細胞がさらにフリーラジカルを生成し、それが悪循環を引き起こす。さらに、空気汚染物質は、酸化的損傷によって正常な脂質機能、ＡＲＮ、および／またはヒトの皮膚タンパク質に深刻な変化を引き起こし、外因性の皮膚老化、皮膚アレルギーまたは接触皮膚炎、乾癬、座瘡、皮膚癌などの炎症状態を引き起こす。同様に、ヒトの皮膚は、多くの細胞タイプの機能と生存に影響を及ぼし、皮膚の老化を引き起こす主な要因と考えられている紫外線に繰り返しさらされている。ヒトの皮膚の急性紫外線曝露は、日焼け、色素沈着の変化、炎症、免疫抑制、皮膚結合組織の損傷を引き起こす。
【００６７】
最近の研究では、日光と空気汚染が相乗的に皮膚ストレスを引き起こし、酸化ストレスを加速し（活性酸素種の生成、過酸化、スクアレン過酸化の増加）、皮膚層角質からのビタミンＥの枯渇を増加させ、炎症反応を増加させ、皮膚癌のリスクさえ高める。最近の研究では、他の空気汚染物質（タバコの煙を含む）と組み合わされたＡタイプのＵＶ放射線（ＵＶＡ）が皮膚癌のリスクを大幅に高めることが示されている。
また、空気汚染物質は、光による損傷を悪化させること、および環境空気汚染の多い地域では特定のスキンケア戦略が必要であることも強調されている。
この実施例では、誘発された酸化ストレスに対する細胞応答を調査し、誘発された損傷を打ち消す製剤１Ｂの可能性を検証するために、ヒトケラチノサイト培養物を都市の粉塵物質およびＵＶＡ放射線に曝露した。
生細胞を顕微鏡下ビュルカーチャンバー内でカウントした。ＨａＣａＴ細胞を培地を含む９６ウェルプレートで一晩培養した。２４時間後、前記培地を抜き取り、４００μｇ／ｍｌの都市粉塵物質（ＵＤ）および０．００５ｗｔ％および０．００１ｗｔ％の量の製剤１Ｂを補充した新しい培地と交換した。
【００６８】
活性酸素種の蓄積（％ＲＯＳ）を、都市粉塵物質に暴露した後、生物学的レプリカで評価し、８つの実験的レプリカ（本発明の組成物および対照）を使用した。２４時間のインキュベーション後、全てのウェルの培地をＰＢＳ混合物とＲＯＳ検出マスターに交換した。続いて、試料に６．９Ｊ／ｃｍ２の強度で２５分間ＵＶＡを照射した。照射していない対照は、この間ずっと暗所で保たれた。ＲＯＳ検出混合物の添加の２時間後、試料のＲＯＳ濃度を、細胞のない２つの対照ウェルを含む分光分析によって測定して、ブランク対照を得た。蓄積された細胞内ＲＯＳは、細胞質にある蛍光センサーと反応し、存在するＲＯＳ量に比例した量の蛍光生成物を生成する。蛍光定量化は、４９０ｎｍの波長励起と５２５ｎｍの波長発光で測定した。
並行して、都市粉塵物質およびＵＶＡ照射によって誘発された細胞死亡率を評価するために、ＲＯＳで測定したレベルを全ての特定の条件で生細胞量に正規化するために、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾールブロミド（ＭＴＴ）の代謝還元によって細胞生存率分析を実施した。ＭＴＴアッセイでは、代替方法検証のためのヨーロッパセンター（ＥＣＶＡＭ）のプロトコルＮｏ．１７に従った。
【００６９】
細胞生存率アッセイにおいて、結果は、対照試料と比較して、２４時間の製剤１Ｂ使用が、０．０１ｗｔ％以上の濃度でＨａＣａＴ細胞に有意な細胞毒性を示すのに対し、０．００２５ｗｔ％以下の濃度では有意な効果は観察されなかったことを示す。結果に従って、０．００１ｗｔ％および０．００５ｗｔ％の濃度をさらなる研究のために選択した。
この研究の結果は、都市粉塵物質をＵＶＡ放射線と共に用いると、未処理の対照試料と比較して、酸化ストレスを１３．２±０．８倍増加させたことを示している。０．００１ｗｔ％および０．００５ｗｔ％の濃度の製剤１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）で処理された試料は、ＲＯＳレベルをそれぞれ２５．４±７．２％および２９．３±６．２％有意に減少させた。全ての試料の基礎酸化ストレスレベルを除去すると、結果は、上記の環境要因にさらされた対照試料と比較して、それぞれ０．００１ｗｔ％および０．００５ｗｔ％の濃度での製剤１Ｂ使用が、都市粉塵物質およびＵＶＡ放射線酸化の影響から培養細胞を保護し、酸化ストレスをそれぞれ２７．３±７．８％および３１．５±６．７％低減させることを示している。この事実は図５に反映されている。
【００７０】
図５の棒グラフは、０．００１ｗｔ％および０．００５ｗｔ％の濃度の製剤１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）で処理され、４００μｇ／ｍｌ濃度で都市粉塵（ＵＤ）に２４時間暴露され、続いて２５分間ＵＶＡを照射したヒトケラチノサイト試料（ＨａＣａＴ）に蓄積されたＲＯＳを表す。データは、同じＵＤ量とＵＶＡ放射線に暴露された対照に関して正規化されている。＊はｐ値＜０．０５の統計的有意性を表す。
＊＊はｐ値＜０．０１の統計的有意性を表す。＊＊＊はｐ値＜０．００１の統計的有意性を表す。＊＊＊＊はｐ値＜０．０００１の統計的有意性を表す。
【００７１】
実施例３．  生きているヒトの皮膚外植片における製剤１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）の抗空気汚染影響活性のエクスビボ評価
この研究の目的は、汚染物質混合物で処理された後の生きているヒトの皮膚外植片に対する表１の製剤１Ｂの抗空気汚染活性の評価である。外植片への製剤１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）と重金属、炭化水素、ディーゼル粒子溶液のエクスビボ後、マロンアルデヒド生化学的アッセイ、アリール炭化水素（ＡｈＲ）受容体免疫染色、メタロチオネインＭＴ−１Ｈ免疫染色、インターロイキン−１−アルファ（ＩＬ−１α）生化学的定量アッセイによって抗空気汚染活性を評価した。
１９の平均直径１２ｍｍのヒトの皮膚外植片は、白人の５６歳の女性の腹壁形成術によって得られた。前記外植片は、適切な雰囲気、温度、湿度条件の培地（ＢＩＯ−ＥＣ外植片培地）で生きたまま保たれた。
【００７２】
０日目に、２００μｇ／ｍＬの濃度の製品（製剤１Ｂ）を含むまたは含まない２ｍｌの培地中に前記外植片を配置した。対照試料はいずれの処理も受けなかった。前記培地を（試験する製品の有無にかかわらず）、汚染物質曝露後、１日目はウェル当たり１ｍｌ、２日目はウェル当たり２ｍｌの新鮮な培地で新しくした。
２日目に、前記外植片を皮膚外植片用の特別な培養プレートに配置し、ＰｏｌｌｕＢｏｘ（登録商標）システム内に配置した。３ｍｌの汚染物質溶液（重金属、炭化水素、ディーゼル粒子の混合物）を１時間半の間気化させた。ＰｏｌｌｕＢｏｘ（登録商標）を使用すると、雲の形で汚染物質を気化させて皮膚表面のみに接触させることができるため、生理学的状態を可能な限り再現することができる。
【００７３】
前記曝露中、対照試料（汚染物に曝露されない）を、ウェル当たり９００μｌのＨＢＢＳ溶液を含む１２ウェルの培養プレートに配置した。前記曝露後、全ての外植片を、標準条件でインキュベーター内に、ウェル当たり２ｍｌの新鮮なＢＥＭで新たに配置した。
０日目（Ｄ０）に、バッチＴ０からの３つの外植片を収集し、２つの部分に切断した。１つの部分は緩衝ホルマリンに入れ、他の部分は−８０℃で凍結した。
３日目に、各バッチの３つの外植片を収集し、０日目の外植片と同じ方法で処理し、各バッチの２ｍｌの培地を収集して、ＭＤＡおよびＩＬ１αアッセイのために−８０℃で保存した。
【００７４】
組織学的処理：２４時間の緩衝ホルマリン固定後、試料を脱水し、組織処理装置Ｌｅｉｃａ  ＴＰ１０２０でパラフィンを含浸させた。試料は、パラフィン包接ステーションＬｅｉｃａ  ＥＧ１１６０で固定した。Ｍｉｎｏｔ  Ｌｅｉｃａ  ＲＭ  ２１２５ミクロトームを使用して厚さ５μｍの切開を行い、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）ガラス組織プレートに切開片を取り付けた。
顕微鏡観察は、ライカＤＭＬＢまたはオリンパスＢＸ４３顕微鏡を使用して実施した。ＣｅｌｌＤ保存ソフトウェアを備えたオリンパスＤＰ７２数値カメラを使用して画像をデジタル化し、９〜１２枚の画像をバッチで分析した。
【００７５】
ＭＤＡ生化学的アッセイ
３日目に、前記培地中のＭＤＡ含有量を測定した。バッチごとに４つの外植片を分析した。
ＭＤＡアッセイは、改良されたＴＢＡＲＳアッセイ法を使用して実施した。ＴＢＡＲＳ溶液（チオバルビツール酸、塩酸、およびトリクロロ酢酸）を添加し、８０℃の水浴中で１５分間インキュベートすることにより、ＨＢＳＳ培地（ハンクス食塩水）中でＭＤＡを検出した。ＭＤＡを液体／液体ブタノール抽出によって抽出した。ブタノール中のＭＤＡを、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  Ｐｒｏマイクロプレートリーダーを使用して、５１５ｎｍの励起波長と５５０ｎｍの発光波長で分光蛍光光度法によって測定した。ＭＤＡ濃度をＭＤＡナノモル／ｍｌ培地で表す。
【００７６】
ＡｈＲ免疫染色
ＡｈＲ免疫染色は、ＰＢＳ−ＢＳＡ  ０．３％−Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０５％で１：５０に希釈した抗ＡｈＲモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｒｅｆ．ＭＡ１−５１４、ｃｌｏｎ  ＲＰＴ１）を使用してパラフィン切開で１時間、周囲温度で、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）  ＲＴＵ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＶＥＣＴＯＲストレプトアビジン／ビオチンシステムを使用して行い、バイオレットペルオキシダーゼ基質であるＶＩＰ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｒｅｆ．ＳＫ４６００）を使用して明らかにした。
【００７７】
ＭＴ−１Ｈ免疫染色
ＭＴ−１Ｈ免疫染色は、抗ＭＴ−１Ｈモノクローナル抗体（Ｄａｋｉ、ｒｅｆ．Ｍ０６３９、ｃｌｏｎ  Ｅ９）を使用して、ＰＢＳ−ＢＳＡ  ０．３％−Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０５％で１：２００に希釈したパラフィン切開で１時間、周囲温度でＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）ＲＴＵ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＶＥＣＴＯＲストレプトアビジン／ビオチンシステムを使用して行い、紫色のペルオキシダーゼ基質であるＶＩＰ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｒｅｆ．ＳＫ４６００）を使用して明らかにした。
【００７８】
ＩＬ１−α生化学的アッセイ
ＩＬ１−α生化学的アッセイは、ヒトＩＬ１−αＥＬＩＳＡキット（Ｃａｙｍａｎ）を使用して実施した。キットサプライヤーの指示に従って、培地とＩＬ１−α標準を、固定化されたＩＬ１−α抗体を含むウェル中のＩＬ１−αに選択的に結合するアセチルコリンエステラーゼ：Ｆａｂ’（ＡＣｈＥ／Ｆａｂ’）結合抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。前記ウェルを洗浄した後、４０分間ＡＣｈＥ基質を含む溶液で反応を明らかにした。Ｔｅｃａｎ  Ｍ２００ＰｒｏマイクロプレートリーダーとＭａｇｅｌｌａｎ  ７ソフトウェアを使用して、４１２ｎｍで吸光度を測定した。
【００７９】
結果
ＭＤＡ
マロンアルデヒド（ＭＤＡ）は、細胞膜の脂質過酸化反応で生成される生成物である。酸化ストレス（ＵＶＡ、汚染物質、重金属、農薬など）によって誘発されるフリーラジカルは、多価不飽和脂質を分解し、ヒドロペルオキシドを生成する。その結果、フリーラジカル中間体とアルデヒド、特にＭＤＡが形成される。
ＭＤＡは、脂質過酸化による特定の一次および二次生成物の分解によって形成されるさまざまな低分子量の最終生成物の１つである（２５）。
図６に見ることができるように、３日目に、製剤１Ｂは汚染物質混合物によって生成されるＭＤＡの増加を１０３％＊（ｐ＜０．０５）有意に減少させる。これは、製剤１Ｂが汚染物質によって生成される酸化ストレスを完全に抑制することを意味する。
【００８０】
ＩＬ１−α
ＩＬ１−αは免疫反応と炎症反応に関与している。培地中に放出されたインターロイキンの濃度は、製剤１Ｂの保護活性を評価するために、汚染物質への曝露によって誘発された炎症反応を測定するために使用される。
図７に見られ得るように、製剤１Ｂは、汚染物質混合物への曝露後に放出されるＩＬ１−α量を８２％＊（ｐ＜０．０５）有意に減少させる。
【００８１】
ＡｈＲ発現
アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）は、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）、オゾン、植物ポリフェノールを含む、いくつかの化合物への曝露後の分子応答に関与する転写因子である（２６、２２）。通常の状況では、ＡｈＲは、ＨＳＰ９０、ｃ−ｓｃｒ、およびその他の付随するタンパク質からなるタンパク質複合体に結合した細胞質中にある。前述の汚染物質の存在下で、ＡｈＲは前記タンパク質複合体から解離し、核に移行し、そこで、生体異物に応答して特異的に活性化される促進配列を介してＡＲＮＴと二量体化する。ＡｈＲの標的遺伝子は、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）１ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、およびＣＹＰ１Ｂ１である。並行して、多環芳香族炭化水素を含む空気汚染物質は、ＮＦ−ｋＢ  ＤＮＡに対するリガンド活性の増加を刺激することができ、次にそれがＡｈＲをコード化する遺伝子を刺激することが可能となる（２７、２８）。
【００８２】
ＡｈＲは、ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲハンス細胞、およびＴ細胞を含む、いくつかの細胞タイプによって発現される（２９）。
前記空気汚染が皮膚の損傷を引き起こすメカニズムの１つは、前述のようにＡｈＲの活性化によるものである。
図８に見られ得るように、汚染物質曝露の３日目は、ＡｈＲ発現の６０％＊＊（ｐ＜０．０１）の有意な増加を誘発する。製剤１Ｂの適用は、汚染物質のみに曝露された外植片と比較して、ＡｈＲ発現の８７％＊＊（ｐ＜０．０１）の有意な減少を引き起こす。
【００８３】
ＭＴ−１Ｈ発現
メタロチオネインタンパク質（ＭＴ−１Ｈ）は、重金属曝露と酸化ストレスのマーカーとして使用される。
メタロチオネイン（ＭＴ）は、組織に広く分布しているタンパク質のグループであり、金属代謝、フリーラジカル捕捉を調節し、免疫反応にも関与する。メタロチオネイン１（ＭＴ−Ｈ１）は、低分子量（６ｋＤａ）で芳香族アミノ酸を含まない、熱の下で安定なユニークなタンパク質である。金属結合との親和性が高く、亜鉛や銅などの必須金属やカドミウムや水銀などの他の有害金属によって誘発されるため、必須金属の恒常性や重金属の無害化に重要な役割を果たしていると考えられている。
【００８４】
図９に見られ得るように、ＭＴ−Ｈ１マーカーは汚染物質の存在にもかかわらず増加しなかった。これは、製剤１Ｂが皮膚に対して保護効果を示すことを示唆している。
曝露３日目に、汚染物質はＭＴ−Ｈ１発現の６３％＊＊（ｐ＜０．０１）の増加を引き起こした。製剤１Ｂの適用は、汚染物質のみに曝露された外植片と比較して、ＭＴ−Ｈ１発現の４０％＊＊（ｐ＜０．０１）の有意な減少を引き起こした。
【００８５】
実施例４．  製剤１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）の経口急性毒性測定
この研究の目的は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙタイプの雌性ラットに適用された「急性毒性クラス法」（限界試験、ＯＥＣＤガイドラインｎｏ．４２３）によって製剤１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）の経口急性毒性を評価することである。死亡を引き起こさないと考えられたため、初期用量レベルは２０００ｍｇ／ｋｇ体重であった。この方法により、化学製品の毒性を決定するために、世界調和システム（ＧＨＳ）に従って製剤１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）を分類することが可能になる。
【００８６】
研究の要約。前記「限界試験」は、２０００ｍｇ／ｋｇ体重の初期用量で段階的に実施される手順に基づいており、６匹の動物において２段階（１段階当たり３匹）で実施される。次の用量は３００、５０、および５ｍｇ／ｋｇ体重となる。１４日間の観察期間の後、最初の段階で投与された製剤１Ｂによる死亡率を使用して、その方法を次の用量で継続するか否かを決定し、国際分類に従って物質を分類する。次の用量は、前の用量で投与された動物の生存率が決定されるまで投与されない。
観察期間中に死亡した動物はいないため、製剤１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）は、物質および混合物の世界調和分類システムのカテゴリー５または「非分類」に分類できると結論付けることができる。
【００８７】
実施例５．  皮膚に対する空気汚染の影響の予防および／または治療に使用するための、本発明の組成物１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）を含む栄養補助食品の有効性の機器による臨床評価
本発明の組成物の効果を、１００人の女性で１２週間使用した後、環境汚染物質からの保護剤として、単施設、ランダム、二重盲検、プラセボ対照アッセイで研究した。
参加者全員に毎日使用するクリームを提供した。前記クリーム（プラセボおよび本発明の組成物１Ｂ）は、匿名の包装で供給された。データは、アッセイの２、４、８、および１２週目に集めた。ａ）唾液中の総抗酸化能およびｂ）酸化的皮膚損傷について研究した。
【００８８】
さらに、皮膚の老化に関連するいくつかのパラメーターについて研究した：ａ）皮膚の水分補給、ｂ）皮膚の明るさ、ｃ）皮膚の弾力性、ｄ）経表皮の水分喪失、ｆ）皮膚の色素沈着、ｇ）皮膚の血清含有量、およびｈ）皮膚のプロフィロメトリー（しわ）。
参加者には、以下の要件を尊重するように求めた。
−研究開始前の少なくとも２日間は化粧品を使用しないこと。
−全ての研究期間中、（自然にまたはＵＶ人工光源を使用して）日光浴をしないこと。
−供給された製品のみを使用し、他の化粧品は使用しないこと。
研究から離脱する条件は、個人の高い割合での副作用または不耐性反応の存在であった。可能な離脱の交代はなかった。
【００８９】
選択基準は、３５〜６５歳の健康な女性、５０％がアジア人、５０％が白人、５０％が敏感肌でかつ１日２時間以上屋外で仕事をしており、適切な方法で同様の研究に参加していない女性であった。彼女らは、研究中の製品に干渉する可能性のある製品を使用しないことを受け入れ、適切に保護されていない限り、研究中に日光浴をしない（またはソーラーキャビンを使用しない）ことを受け入れ、研究中に避妊方法を変更せず、研究規則を順守する準備ができており、供給された製品と中性石鹸を使用する準備ができていた。
選択基準を満たさなかった全ての個人を除外し、またはアトピー性または過敏性の皮膚、化粧品アレルギー、石鹸または皮膚保護薬もしくは日焼け止め薬に対するアレルギーを持っていた人、ならびに研究の前の２年間にレーザーまたは化学剥離治療を受けた人を除外し、研究開始日に顔に化粧品または医薬品を使用した個人、栄養障害、食物アレルギーまたは不耐性のある個人、ＡＩＤＳ、ＨＩＶなどの免疫抑制疾患のために免疫システムが変化した個人または免疫抑制薬を使用したもの、前記製品に干渉することが知られている薬理学的治療を受けていたものまたは代謝に影響を与えるもの、同時にさまざまな重篤な疾患に罹っているもの、薬物中毒、アルコール依存症、妊娠中または授乳中の女性、法律により（管理下、公的または私的機関に入院中、調査研究に対する別の理由で、または投獄された）個人、言語の問題、知的発達、または脳機能障害のために研究者とコミュニケーションまたは協力することができなかったもの、研究者が特定したその他の理由によるものを除外した。
【００９０】
前記製品の使用に一時的に関連する好ましくない症状または疾患を伴うそのような医学的出来事を、それが前記製品の使用によって引き起こされたか否にかかわらず、有害事象として定義した。前記有害事象は、それらが解決するまで監視された。全ての研究の間、同じ皮膚科研究者が各個人に割り当てられた。製品の耐性と、それぞれの不快感が、詳細な方法で研究され、全ての可能な不耐性反応と、予期しない影響が通知された。副次的効果が重度に分類された場合、個別の除外が行われ、その副次的効果はその解決まで監視された。
各研究個人は、研究中に他の個人と関連付けることができない個人コードで識別された。
【００９１】
ヘルシンキ宣言（１９６４）によると、個人はいつでも理由を問わず研究から離脱する権利があり、それについて評価と分類がなされることになる。また、研究者は、正当な理由でいつでも個人を除外することができる。ただし、離脱数が多い場合の結果解釈の問題を回避するために、離脱は可能な限り回避される。前記研究中に交代した個人はいなかった。
有害事象のある全ての個人は、研究に関連しているか否かにかかわらず、観察期間がすでに終了している場合でも、事象が安定または解決するまで、進展を判定するために監視された。
前記製品は、朝食の３０分前に１日１回、ハードゼラチンカプセルの形（青Ｎ°０）で供給された。
【００９２】
開始時との比較を含め、データ分布に基づく適切な統計モデルが使用された。ｐ＜０．０５の値は、統計的に有意であるとみなした。個人は、研究の４週目と１２週目に質問票に回答し、日報（０日目から２７日目）に回答する。
活性生成物を含むカプセルは、２５０ｍｇの本発明の組成物（実施例１の１Ｂ）と１２０ｍｇの微結晶性セルロースで構成されていた。
プラセボカプセルは、２５０ｍｇのマルトデキストリンと１２０ｍｇの微結晶性セルロースで構成されていた。
前記製品は周囲温度（３０℃未満）で保存され、直射日光、熱および水から保護された。
【００９３】
医療統計学者は、Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｓｅｒｖｅｒ  ２００８  Ｒ２  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＰ１  ６４ｂｉｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、米国）のＰＡＳＳ  ２００８ソフトウェア（ＰＡＳＳ，  ＬＬＣ．ケイズビル、ユタ州、米国）を使用して、限定されたランダム化リストを生成し、安全な場所に保管した。ランダム化された製品（またはプラセボ）シーケンスは、１：２の分布比を使用して１０％の最大偏差を使用して層化された。分布は不透明で閉じた封筒に隠されており、研究の開始時に各個人に割り当てられた番号に基づいて治療分布を示す。独立した技術者が、各個人に割り当てられた番号に従ってアクティブまたはプラセボを供給した。
製品の有効性を評価するために、研究の開始から４週目と１２週目に各ユーザーに主観的な評価アンケートを提供し、以下の測定も実行した。
【００９４】
皮膚の水分補給：
汚染はバリアとしての皮膚の機能を変化させ、皮膚が乾燥して敏感になる原因となる。したがって、研究中の経表皮の水分損失として、皮膚の水分補給を評価した。
皮膚の水分補給評価は、右頬の５点で測定され、水の誘電率に基づいて、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（登録商標）  ＣＭ  ８２５法が使用された（Ｃｏｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ，  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＧｍｂＨ）。それは皮膚の水分量の関数として静電容量の変化を測定するプローブを使用する。電界が最も外側の皮膚層に浸透し、誘電性が決定される。
図１０は、本発明の組成物１Ｂが、研究の開始から皮膚の水分補給の有意な増加をもたらしたことを示している（研究の開始、Ｔ０に対する水分補給の変化％として測定される）。
さらに、図１１は、本発明の組成物１Ｂが表皮バリアを強化し、表皮を通過する水分損失を有意に減少させたことを示している（研究の開始、Ｔ０に対する水分補給の変化％として測定される）。研究の最後に、本発明の組成物１Ｂで処置された患者の８２％は、皮膚感覚の改善を認識し、彼女らの８４％は、皮膚が保護されている感覚を得た。さらに、本発明の組成物１Ｂで処置された患者の８６％は、彼女らの皮膚がより水分補給されていると感じた。
【００９５】
皮脂の評価：
汚染に暴露された皮膚は、より多くの皮脂量を分泌し、炎症の増加と共に、より多くの座瘡の発生を生じる。
Ｓｅｂｕｍｅｔｅｒ（登録商標）装置（Ｓｅｂｕｍｅｔｅｒ  ８１５，  Ｃｏｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ  ＧｍｂＨ）を使用した。この方法は、原則として測光を使用する。皮脂がカセットに入った６４ｍｍ２の合成テープ中に集められ、その後、カセット測定ヘッドが前記装置の開口部に挿入され、そこで太陽電池が透明度を測定した。光透過率は、測定された表面積の皮脂含有量を表す。マイクロプロセッサが結果を計算し、μｇ皮脂／ｃｍ２として示した。
図１２は、本発明の組成物１Ｂが、汚染物曝露下で生成された皮脂分泌をいかに減少させたかを示している。さらに、処置を受けた個人の８２％が、毛穴の拡張や黒ずみの減少などの皮膚の欠陥の改善を認識した。
【００９６】
皮膚の堅さと弾力性：
皮膚の堅さと弾力性の測定は、皮膚を機械的に変形させる負圧を生成する吸引法（Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）法）を使用して頬の皮膚で実施された。４５０ｍｂａｒの負圧が発生し、２秒間プローブ開口部上に皮膚を引き付け、２秒後に再び解放した。前記プローブの侵入深さは、光学的検出システム（非接触）によって決定された。光学システムは、光源と光受容体、および送信機から受容体に光を投射する２つの対向するプリズムで構成されている。光の強さは、皮膚の侵入深さによって変化する。負圧に対する皮膚の抵抗とその初期位置に戻る能力は、評価中にリアルタイムで曲線（侵入深さ（ｍｍ／時間単位））で表される。使用した装置は、ＭＰＡ  ５８０  Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）（Ｃｏｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ，  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＧｍｂＨ）である。選択された生体力学的指標は以下のとおりであった。
【００９７】
Ｒ２：皮膚全体の弾力性。最大振幅と再変形する皮膚能力の間の部分（ブリュット弾性）
Ｒ０：最大の皮膚の伸展性（色調／堅さ）パラメーターが低いほど、変形に対する皮膚の抵抗が高くなる。
パラメーターＲ０が低いほど、変形に対する皮膚の抵抗が高くなる。このように、Ｒ０値の減少は、絶対値では、皮膚の堅さの増加を意味する。
図１３は、本発明の組成物１Ｂが、プラセボ使用と比較して、総皮膚弾性の有意な増加をいかにもたらすかを示している（使用の１４、２８、５６および８４日目で得られたデータ）。
本発明の組成物１Ｂはまた、使用の１４、２８、５６および８４日目で得られたデータにおいて、図１４で理解できるように、皮膚の堅さの有意な増加をもたらした（皮膚の堅さの増加を表すとして、Ｒ０絶対値の減少として測定される）。
さらに、研究の最後の主観的評価質問票において、本発明の組成物１Ｂを服用した個人の８２％が、皮膚の堅さの増加およびより健康な顔色を認識したことが観察された。
【００９８】
皮膚の色と明度：
汚染はまた、色素沈着障害の増加の原因である。実際、交通に由来する汚染、または煤は、皮膚のしみを最大２０％増加させる可能性がある。
皮膚の明度と皮膚の色は、ＣＭ  ７００Ｄ分光光度計／比色計（コニカミノルタ）を使用して測定した。ＩＴＡ値（その英語Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｔｏｐｏｌｏｇｙ  Ａｎｇｌｅの頭字語から）は、皮膚の色素沈着度を定義し、分光光度計で得られたＬ値とｂ値（Ｌ、ａ、ｂ色空間を形成）を使用して、式ＩＴＡ＝［ＡｒｃＴａｎ（Ｌ−５０）／ｂ］１８０／πを用いて計算した。
皮膚の明度は、分散光に対する反射光の比率として定義された輝度値を使用して定義した（反射光が大きいほど輝度が高くなり、しわのある表面が多いほど分散する光が多くなり、輝度値が小さくなる）。
前記ＩＴＡ値は色素過剰領域で測定したが、明度は頬で測定した。
【００９９】
皮膚の色素沈着含有量は、ＭＸ１８  Ｍｅｘａｍｅｔｅｒ（Ｃｏｕｒａｇ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ）を用いて測定した。Ｍｅｘａｍｅｔｅｒ（登録商標）  ＭＸ  １８プローブは、３つの特定の波長で発光する。受光器は、皮膚によって反射された光を測定する。放出される光の量が既知であるとすると、皮膚に吸収される光を計算することができる。メラニンは特定の波長で測定される。
図１５は、プラセボ処置に対する本発明の組成物１Ｂでの処置の１４日後および１８日後の皮膚の明度（頬の輝度値として測定される）の研究の開始に関する増加（％）を反映している。
図１６は、プラセボ使用と比較した、本発明の組成物１Ｂの使用の１４、２８、５６および８４日後の色素沈着過剰領域で測定されたＩＴＡ値の増加（％）を表す。
図１５および１６において理解できるように、本発明の組成物１Ｂの使用により、より明るい皮膚が生成され、しみの着色も有意に薄くなった。
【０１００】
皮膚パーフィロメトリー（粗さ）：
疫学研究は、環境汚染への曝露がより大きなしわの発現度と関連していることを証明している。
マイクロトポグラフィック３Ｄイメージングシステム（Ｐｒｉｍｏｓｌｉｔｅ  ＧＦＭｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ，  ＧｍｂＨ）を使用して、目尻のしわ領域の滑らかさ（ｒａパラメーター）としわの深さを測定した。皮膚表面は、３Ｄ画像を生成するアルゴリズムを使用して再構築された。個人の再配置は、再配置装置（Ｃａｎｆｉｅｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して確実に行われた。一方、画像結合の前後は、画像分析ソフトウェアの重複する特性によって保証された。図１７および１８において理解されるように、本発明の組成物１Ｂの使用は、より柔らかく、より均一な皮膚を生成したが、しわおよび線の深さは著しく減少した。
【０１０１】
生化学的分析
以下の特性は、標準的な生化学的方法を使用して測定された。
ＦＲＡＰ（その英語Ｆｅｒｒｉｃ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｐｏｗｅｒの頭字語から）およびＭＤＡアッセイ（皮膚の角質除去）による総抗酸化能力
【０１０２】
皮膚の角質除去
Ｃｏｒｎｅｏｆｉｘ（登録商標）シート（Ｃａｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＧｍｂＨ）を使用して皮膚層を採取した。この技術は、角質層のいくつかの層を集めることを可能にする。層２と３を収集し、次のＦＲＡＰ分析のために−８０℃で保存した。マロンアルデヒド（ＭＤＡ）と４−ヒドロキシノネナールは、脂質過酸化の２つの主要な生成物であるため、生体系でのそれらの濃度をリポ過酸化物損傷指数として使用できる。リポ過酸化物レベルを決定するために、Ｎ−メチル−２−フェニルインドール発色団のＭＤＡとの４５℃および酸性ｐＨでの反応能力に基づいて５８６ｎｍに吸収ピークを持つ発色団を生成するＥｒｄｅｌｍｅｉｅｒら（１９９８）の方法：
【化１】
2021530433.tif 000005
リポ過酸化レベルは、酸化促進剤（ＣｕＳＯ４  ５００μＭ）を使用した酸化プロセスによって生成された不安定なヒドロペルオキシド分解誘導後に測定された。
本発明の組成物１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）は、図１９に示すように、２８、５６および８４日目の皮膚過酸化の測定値のように、ＭＤＡ生成を減少させた。
【０１０３】
ＦＲＡＳ（唾液第二鉄抗酸化還元剤）：
前記ＦＲＡＳのアッセイは、システムの還元力の直接的な尺度であり、酸化的損傷に抵抗する有機体の能力の間接的な値である。ＴＰＴＺ−Ｆｅ（ＩＩ）錯体の酸性ｐＨでのＦｅ（ＩＩＩ）錯体への還元は、濃い青色を特徴とする。５９５ｎｍでの溶液の吸光度を測定することで、反応を監視する。収集された吸光度は、既知のＦｅ（ＩＩ）の検量線の吸光度と比較される。結果は、混合酸化防止剤の総還元能力に正比例する。
図２０は、本発明の組成物１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）がいかにＦＲＡＳ増加をもたらしたかを示すため、その使用の２８日目で抗酸化能を示し、８４日目でさらに大きな抗酸化能を示す。
以下に、これらの測定結果を表４に要約する。
【表４】
2021530433.tif 000006
【０１０４】
参考文献
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（４）Ｋｉｍ，  Ｊ．ら  Ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｏｆ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ａｒｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  ｂｙ  ｏｕｔｄｏｏｒ  ａｉｒ  ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ．（アトピー性皮膚炎の症状は、屋外の空気汚染の影響を受ける。）  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３２，  ４９５‐４９９  （２０１３）．
（５）Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｏｇａａｒｄ，  Ｅ．Ｈ．ら  Ｃｏａｌ  ｔａｒ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＡＨＲ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｋｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．（コールタールは、アトピー性皮膚炎においてＡＨＲ依存性の皮膚バリア修復を誘発する。）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２３，  ９１７‐９２７  （２０１３）．
（６）Ｋｉｍ，  Ｈ．Ｏ．，  Ｋｉｍ，  Ｊ．Ｈ．，  Ｃｈｕｎｇ，  Ｂ．Ｙ．，  Ｃｈｏｉ，  Ｍ．Ｇ．  ；  Ｐａｒｋ，  Ｃ．Ｗ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｋｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．（慢性炎症性皮膚疾患の患者におけるアリール炭化水素受容体の発現の増加）  Ｅｘｐ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２３，  ２７８‐２８１  （２０１４）．
（７）ＤｉＭｅｇｌｉｏ，  Ｐ．ら  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄａｍｐｅｎｓ  ｔｈｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．（アリール炭化水素受容体の活性化は、炎症性皮膚状態の重症度を弱める。）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４０，  ９８９‐１００１  （２０１４）．
（８）Ｊｅａｎ  Ｋｒｕｔｍａｎｎ，  Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ  Ｍｏｙａｌ，  Ｗｅｉ  Ｌｉｕ，  Ｓａｎｊｉｖ  Ｋａｎｄａｈａｒｉ，  Ｇｅｕｎ−Ｓｏｏ  Ｌｅｅ，  Ｎｏｐｐａｋｕｎ  Ｎｏｐａｄｏｎ，  Ｌｅｉｈｏｎｇ  Ｆｌｏｒａ  Ｘｉａｎｇ  ｙ  Ｓｏｐｈｉｅ  Ｓｅｉｔe．  “Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｎｅ：  ｉｓ  ｔｈｅｒｅ  ａ  ｌｉｎｋ？”（「汚染と座瘡：関連性はあるか？」）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ，  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．  Ｍａｙ  ２０１７
（９）Ｊｕ  Ｑ，  Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓ  ＣＣ，  Ｘｉａ  Ｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｎｅ：  Ｃｈｌｏｒａｃｎｅ．（環境汚染と座瘡：クロロアクネ）  Ｄｅｒｍａｔｏ−ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．  ２００９；１（３）：１２５−１２８
（１０）Ｖｉｅｒｋｏｌｅｒ  Ａら  Ａｉｒｂｏｒｎｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ  ｓｋｉｎ  ａｇｉｎｇ，（空中浮遊粒子曝露と外因性皮膚老化、）  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．      Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １３０  （１２）  （２０１０）  ２７１９‐２７２６．
（１１）Ｈｕｌｓ  Ａら  Ｔｒａｆｆｉｃ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｉｒ  Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆａｃｉａｌ  Ｌｅｎｔｉｇｉｎｅｓ：  Ｆｕｒｔｈｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  Ｃａｕｃａｓｉａｎｓ  ａｎｄ  Ａｓｉａｎｓ．（交通関連の空気汚染は顔面レンチギンの発達に寄与する：白人とアジア人からのさらなる疫学的証拠）  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２０１６  Ｍａｙ；  １３６（５）：１０５３−６．
（１２）Ｗｅｎｇ，  Ｚｕｙｉら  Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  Ｉｓ  Ｍｏｒｅ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｈａｎ  Ｃｒｏｍｏｌｙｎ  ｉｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ．（ケルセチンは、ヒト肥満細胞のサイトカイン放出の遮断においてクロモリンよりも効果的であり、ヒトの接触性皮膚炎および光線過敏症を抑制する。）  Ｅｄ．  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｔａｕｂｅ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７．３  （２０１２）：  ｅ３３８０５．  ＰＭＣ．  Ｗｅｂ．  １５  Ｓｅｐｔ．  ２０１７．
（１３）Ｓｉｍ，  Ｈ．Ｓ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｓ．Ｓ．，  Ａｃｅｔｏｓｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａ−ＭＳＨ−  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｌａｎｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ．（アセトシドは、アデニルシクラーゼの不活性化により、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるα−ＭＳＨ誘発メラニン産生を阻害する。）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００９．  ６１：  ｐ．  １３４７−１３５１．
（１４）Ｙｏｕｎｇ−Ｏｋ  Ｓｏｎａ，  Ｓ．−Ａ．Ｌ．ｅ．ａ．，  Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｂ１６Ｆ１０  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＥＲＫ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．（アセトシドは、ＥＲＫの活性化とチロシナーゼのダウンレギュレーションを通じてＢ１６Ｆ１０細胞におけるメラニン形成を阻害する。）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２０１１．  ６３：  ｐ．  １３０９−１３１９．
（１５）Ｍａｎｃｅｂｏ  ＳＥ，  Ｗａｎｇ  ＳＱ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ａｍｂｉｅｎｔ  ａｉｒ  ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓｋｉｎ  ｈｅａｌｔｈ．（皮膚の健康に対する周囲の空気汚染の影響を認識する。）  Ｊ  Ｅｕｒ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．  ２０１５  Ｄｅｃ；２９（１２）：２３２６−３２．
（１６）Ｍｕｌｅｒｏ−Ｎａｖａｒｒｏ  Ｓ，  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌｇｕｅｒｏ  ＰＭ．  Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ａｒｙｌ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．（アリール炭化水素受容体または生物学の新しいトレンド）  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．
（１７）Ａｂｅｌ  Ｊ，  Ｈａａｒｍａｎｎ−Ｓｔｅｍｍａｎｎ  Ｔ．  Ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｃｓ  ｏｆ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．（アリール炭化水素受容体生物学の分子基礎の紹介）  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２０１０  Ｎｏｖ；３９１（１１）：１２３５−４８．
（１８）Ｋｒｕｔｍａｎｎ  Ｊ，  Ｊｕｘ  Ｂ，  Ｌｕｅｃｋｅ  Ｓ，  Ｆｒｉｔｓｃｈｅ  Ｅ，  Ａｂｅｌ  Ｊ，  Ｅｓｓｅｌ  Ｃ，  Ｒａｎｎｕｇ  Ａ．  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｒｙｌｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＡｈＲ−）  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｓｋｉｎ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．（皮膚のメラニン形成におけるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ−）シグナル伝達の関与）  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００８；１２８：Ｓ２２
（１９）Ｍｏｒｉｔａ  Ａ，  Ｔｏｒｉｉ  Ｋ，  Ｍａｅｄａ  Ａ，  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｙ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｓｍｏｋｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｓｋｉｎ  ａｇｉｎｇ．（タバコの煙が誘発する皮膚の早期老化の分子基礎）  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｙｍｐ  Ｐｒｏｃ．  ２００９  Ａｕｇ；１４（１）：５３−５．
（２０）Ｍｕｒｐｈｙ  ＫＡ，  Ｖｉｌｌａｎｏ  ＣＭ，  Ｄｏｒｎ  Ｒ，  Ｗｈｉｔｅ  ＬＡ．  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．（アリール炭化水素受容体とレチノイン酸経路の間の相互作用は、ケラチノサイトにおけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−１の発現を増加させる。）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００４  Ｊｕｎ  １１；２７９（２４）：２５２８４−９３．
（２１）Ｌｕｅｃｋｅ  Ｓ，  Ｂａｃｋｌｕｎｄ  Ｍ，  Ｊｕｘ  Ｂ，  Ｅｓｓｅｒ  Ｃ，  Ｋｒｕｔｍａｎｎ  Ｊ，  Ｒａｎｎｕｇ  Ａ．  Ｔｈｅ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＡＨＲ），  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．（ヒトメラニン形成の新規調節因子であるアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ））  Ｐｉｇｍｅｎｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．  ２０１０  Ｄｅｃ；２３（６）：８２８−３３．
（２２）Ａｆａｑ  Ｆ，  Ｚａｉｄ  ＭＡ，  Ｐｅｌｌｅ  Ｅ，  Ｋｈａｎ  Ｎ，  Ｓｙｅｄ  ＤＮ，  Ｍａｔｓｕｉ  ＭＳ，  Ｍａｅｓ  Ｄ，  Ｍｕｋｈｔａｒ  Ｈ．  Ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ａｎ  ｏｚｏｎｅ  ｓｅｎｓｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ．（アリール炭化水素受容体は、ヒトの皮膚のオゾンセンサーである。）  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２００９  Ｏｃｔ；１２９（１０）：２３９６−４０３．
（２３）Ｏｎｏ  Ｙ，  Ｔｏｒｉｉ  Ｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈｅ  Ｅ，  Ｓｈｉｎｔａｎｉ  Ｙ，  Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｅ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｍ，  Ｓｈｉｒａｋａｔａ  Ｙ，  Ｈａａｒｍａｎｎ−Ｓｔｅｍｍａｎｎ  Ｔ，  Ａｂｅｌ  Ｊ，  Ｋｒｕｔｍａｎｎ  Ｊ，  Ｍｏｒｉｔａ  Ａ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｓｍｏｋｅ  ｅｘｔｒａｃｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．（タバコ煙抽出物誘発マトリックスメタロプロテイナーゼ−１の発現におけるアリール炭化水素受容体の役割）  Ｅｘｐ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２０１３  Ｍａｙ  ２２（５）：３４９−５３．
（２４）Ｈｉｄａｋａ  Ｔ，  Ｏｇａｗａ  Ｅ，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ＥＨ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ，  Ｆｕｎａｙａｍａ  Ｒ，  Ｎａｇａｓｈｉｍａ  Ｔ，  Ｆｕｊｉｍｕｒａ，  Ｔ，  Ａｉｂａ  Ｓ，  Ｎａｋａｙａｍａ  Ｋ，  Ｏｋｕｙａｍａ  Ｒ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｍ．  Ｔｈｅ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＡｈＲ  ｌｉｎｋｓ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ａｉｒ  ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ａｒｔｅｍｉｎ．（アリール炭化水素受容体ＡｈＲは、神経栄養因子アルテミンの誘導を介してアトピー性皮膚炎と空気汚染を関連付ける。）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１７  Ｊａｎ；１８（１）：６４−７３
（２５）Ｊａｎｅｒｏ  Ｄ．Ｒ．  Ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ａｎｄ  ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ  ａｃｉｄ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｎｄｉｃｅｓ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｊｕｒｙ．（脂質過酸化および過酸化組織損傷の診断指標としてのマロンジアルデヒドおよびチオバルビツール酸反応性）  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．  １９９０；  ９（６）：５１５−４０．
（２６）Ｈａａｒｍａｎｎ−Ｓｔｅｍｍａｎｎ  Ｔ，  Ａｂｅｌ  Ｊ，  Ｆｒｉｔｓｃｈｅ  Ｅ，  Ｋｒｕｔｍａｎｎ  Ｊ．  Ｔｈｅ  ＡｈＲ−Ｎｒｆ２  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ：  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｏａｄ  ｔｏ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．（ケラチノサイトのＡｈＲ−Ｎｒｆ２経路：化学的予防への道）  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２０１２  Ｊａｎ；１３２（１）：７−９．  
（２７）Ｃｈａｍｐｉｏｎ  Ｓ．ら，  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＦκＢ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＡｈＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｃａｃｏ−２  Ｃｅｌｌｓ，（ＮＦκＢ経路の活性化は、腸のＣａｃｏ−２細胞におけるＡｈＲ発現を増強する、）  ＩＳＲＮ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１３  （２０１３）．
（２８）Ｔａｕｃｈｉら，  ２００５．  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒｙｌ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  Ｃａｕｓｅｓ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｓｋｉｎ  Ｌｅｓｉｏｎｓ，（ケラチノサイトにおけるアリール炭化水素受容体の構成的発現は、炎症性皮膚病変を引き起こす、）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｎｏｖ．  ２００５，  ｐ．  ９３６０‐９３６８．
（２９）Ｆｕｒｕｅら，  ２０１４．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＡｈＲ／ＡＲＮＴ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｓｋｉｎ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ（皮膚の恒常性におけるＡｈＲ／ＡＲＮＴシステムの役割）  Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｒｅｓ．  ３０６：７６９‐７７９
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月26日(2019.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの皮膚疾患を処置するための、特に、皮膚に対する複数の都市の空気汚染の影響を軽減するための製品の技術分野に属する。しかし、本組成物は、複数の都市環境汚染の影響を軽減するために特別に処方されているが、商品化して、例えば、細胞の老化による皮膚劣化遅延製品として、顕著な軽減効果を伴う異なる適応症で使用することもできる。
【背景技術】
【０００２】
都市の空気汚染への慢性的な曝露は、ヒトの皮膚に同時に複数の有害な影響を引き起こす。これらの有害な影響の中には、早期の皮膚老化、アトピー性皮膚の出現、皮膚炎、湿疹、乾癬または座瘡などのアレルギーまたは炎症の状態があり、とりわけ、汚染が引き起こす可能性のあるより深刻な疾患の中では、皮膚癌を引き起こすものさえある（１）。
【０００３】
環境汚染と皮膚に生じる有害な影響との関係は、近年の多くの科学的研究で証明されている。
例えば、タバコの煙、揮発性有機化合物（ＶＯＣ）、ホルムアルデヒド、トルエン、二酸化窒素、粒子状物質などのいくつかの空気汚染物質が、皮膚の炎症過程であるアトピー性皮膚炎の発症または悪化の危険因子として作用することは、科学的に実証されている（２、３、４）。理由としては、これらの空気汚染物質が皮膚において酸化ストレスを誘発し、それが保護バリアの機能不全または免疫の脱制御につながるということが考えられる。さらに、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の活性化もどのように関与しているように見えるかが示されている（５、６、７）。
【０００４】
空気汚染は、座瘡を含むいくつかの皮膚の炎症性病変における悪化要因である。その結果、非常に高い空気汚染レベルの間に、正常の皮膚に濃いしみ（ｄａｒｋ  ｓｐｏｔｓ）が現れ、脂肪の多い皮膚に座瘡が現れることが頻繁にある。空気の環境汚染と座瘡の発生および増悪との間には、正の相関関係が存在する。これは、研究により、特定の大気汚染物質の濃度が高いほど、尋常性座瘡患者の診察の回数が多くなり、特定の大気汚染物質の濃度が高くなると、皮脂分泌および座瘡の皮膚病変も増加することが確立されているためである（８、９）。
【０００５】
さらに、環境空気汚染は、皮膚の皮脂酸化を引き起こし、座瘡の兆候を増大させる。さらに、大気汚染は、環境ダストおよび太陽放射に起因する紫外線（ＵＶ）放射と組み合わさって、皮脂の主成分であるスクアレンの酸化を引き起こす。
早期の皮膚老化と空気環境汚染曝露との関係は、白人の高齢女性を対象に実施された疫学研究ＳＡＩＬＡで最初に観察され、道路交通に由来する粒子状物質へのより多くの曝露とより高度な皮膚老化との相関が見出された。特に、その曝露は頬や額のしみの数の増加に加えて、より大量でより深いしわ（鼻唇溝）の出現と相関していた。実際、混雑した交通道路までの距離が１００ｍ以下であることと、額のしみが３５％多く、頬のしみが１５％多いこととの間で関連性が見出された（１０）。
【０００６】
しかし、粒子状物質への曝露だけが皮膚の老化の加速に関連しているわけではない。ＮＯ２と白人の女性のしみの形成との間にも強い相関関係が見出された（ｎ＝８０６；ＳＡＩＬＡ）。これらの結果は、中国人女性でも確認された（ｎ＋１，０７２；台州市縦断研究コホート）。１０μｇ／ｍ３のＮＯ２の増加は、ドイツ人女性のしみが２５％増加し（ｐ＝０．００３）、５０歳以上の中国人女性のしみが２４％増加した（１１）。追加データとして、多くの英国の都市は、法定限度を超えるようなＮＯ２レベルを示しており、ロンドンは２０１６年の第１週に年間閾値を超え、ＮＯ２濃度は２００μｇ／ｍ３ＮＯ２を超えていた。
【０００７】
環境空気汚染は、皮膚に短期的な影響、例えば、乾燥の増加、赤みや刺激を引き起こし、しみや深いしわの出現に加えて、早期老化、コラーゲンの分解などの他の長期的な影響を引き起こす。
現在の皮膚治療製品およびスキンケア製品は、環境空気汚染による幅広い影響をカバーするために開発されているため、しわ防止製品があり、座瘡防止製品があり、保湿製品などがある。皮膚への環境空気汚染の影響を軽減するためにこれら全ての製品を使用することは、かなりの支出となり、皮膚にいくつかの製剤を並行してまたは同時に使用することを意味し、前述の製品の組み合わせが以前に試験されていないことを考えると、望ましくない影響を生じるリスクが伴う。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の第１の態様は、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチン、およびヒドロキシチロソールを含む、皮膚に対する空気汚染の影響を処置するための組成物に関する。
本発明はまた、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチンおよびヒドロキシチロソールを含む組成物の０．１〜１０００ｍｇの間の用量に関する。
さらに、本発明は、非経口、経皮、経口または局所投与用の製剤に関し、前記製剤は、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチンおよびヒドロキシチロソールを含む組成物を含む。
【０００９】
本発明の別の態様は、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチンおよびヒドロキシチロソールを含む前記組成物の美容的使用に関し、皮膚に対する審美的環境汚染の影響を美容的に軽減し、皮膚に対する前記空気汚染の影響に関連する早期の皮膚老化を防止する。
別の追加の態様は、薬剤として使用するための、特に、環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患の治療または予防に使用するための、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチン、およびヒドロキシチロソールを含む組成物に関する。
最後に、本発明は、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチン、およびヒドロキシチロソールを含む前記組成物を含む栄養補助食品またはニュートリコスメティクス製品に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、未処理の細胞と比較した２つの異なる濃度の本発明の組成物１Ｂ、２Ｂおよび３Ｂで処理されたヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の酸化のパーセンテージを示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、未処理で非照射の試料と比較した、表１の製剤（本発明の１Ｂ）と共にインビトロでインキュベートされ、８００および１２００Ｊ／ｍ２の強度で、タイプＢ紫外線（ＵＶＢ）に曝露されたヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の酸化のパーセンテージを示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、未処理で非照射の試料と比較した、表１の製剤（本発明の２Ｂ）と共にインビトロでインキュベートされ、８００および１２００Ｊ／ｍ２の強度で、タイプＢ紫外線（ＵＶＢ）に曝露されたヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の酸化のパーセンテージを示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、未処理で非照射の試料と比較した、表１の製剤（本発明の３Ｂ）と共にインビトロでインキュベートされ、８００および１２００Ｊ／ｍ２の強度で、タイプＢ紫外線（ＵＶＢ）に曝露されたヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の酸化のパーセンテージを示す図である。
【図３】図３は、未処理で照射した細胞と比較したインビトロでの相対的なヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）のＩＬ−８レベルを示す図である。ケラチノサイトを１０μｇ／ｍｌの異なる製剤で処理し、ＵＶＢ放射（３００Ｊ／ｍ２）に曝露した。データは平均±ＳＤとして表す。異なる製剤による処理は、照射中および照射後、また照射後にのみ実施された。
【図４Ａ】図４Ａは、未処理のメラノサイトと比較した表１の製剤（本発明の１Ｂ）で処理されたヒトメラノサイトによって生成されたメラニンのパーセンテージを示すグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、未処理のメラノサイトと比較した表１の製剤（本発明の２Ｂ）で処理されたヒトメラノサイトによって生成されたメラニンのパーセンテージを示すグラフである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、未処理のメラノサイトと比較した表１の製剤（本発明の３Ｂ）で処理されたヒトメラノサイトによって生成されたメラニンのパーセンテージを示すグラフである。
【図５】図５は、０．００１ｗｔ％および０．００５ｗｔ％の濃度で本発明の１Ｂ組成物（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）で処理され、４００μｇ／ｍｌ濃度で都市の粉塵（ＵＤ）に２４時間暴露され、続いて２５分間ＵＶＡを照射されたヒトケラチノサイト試料（ＨａＣａＴ）におけるＲＯＳの蓄積を表す棒グラフである。データは、同じＵＤ量とＵＶＡ放射線に暴露された対照に関して正規化されている。
【図６】図６は、汚染物質混合物に曝露され、未処理（対照バー）および１Ｂ製剤で処理された（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎバー）後のエクスビボでの皮膚外植片におけるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）濃度の増加を示す図である。
【図７】図７は、エクスビボでの皮膚外植片におけるＩＬ１−アルファ濃度を示す図である。第１のカラム：汚染物質の混合物に暴露されることなくかつ処理なし、第２のカラム：汚染物質の混合物に暴露された後に処理なし、および第３のカラム：汚染物質の混合物に曝露された後に本発明の１Ｂ組成物（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）での処理。
【図８】図８は、エクスビボでの皮膚外植片のＡｈＲ濃度を示す図である。第１のカラム：汚染物質の混合物に暴露されることなくかつ処理なし、第２のカラム：汚染物質の混合物に暴露された後に処理なし、および第３のカラム：汚染物質の混合物に曝露された後に本発明の１Ｂ組成物（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）での処理。
【図９】図９は、エクスビボでの皮膚外植片におけるメタロチオネインＭＴ−Ｈ１タンパク質発現を示す図である。第１のカラム：汚染物質の混合物に暴露されず、第２のカラム：汚染物質の混合物に暴露後、および第３のカラム：汚染物質の混合物に曝露された後に本発明の１Ｂ組成物（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）での処理。
【図１０】図１０は、本発明の組成物（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ、黒塗りバー）での処理後またはプラセボ（水平線バー）を用いる１４日目および２８日目での研究の開始Ｔ０からの水分補給変化の％として測定された皮膚の水分補給を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明の組成物（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ、黒塗りバー）での処置後またはプラセボ（水平線バー）を用いる１４日目および２８日目での研究の開始Ｔ０からの％水分補給変化として測定された経表皮の水分損失を示す図である。
【図１２】図１２は、本発明の組成物での処理の１４日目および２８日目で汚染物と接触して生成された皮脂分泌における変化を示す図である（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎは黒塗りバーおよびプラセボは水平線バー）。
【図１３】図１３は、プラセボ処置（水平線バー）と比較した、本発明の組成物での処置（黒塗りバー）の１４日目および２８日目での皮膚の弾性の変化を示す図である。
【図１４】図１４は、プラセボ（水平線バー）と比較した、本発明の組成物による処置（黒塗りバー）の１４日目および２８日目での皮膚の堅さの変化（Ｒ０絶対値が減少するにつれて測定され、皮膚の堅さの増加を表す）。
【図１５】図１５は、プラセボ（水平線バー）と比較した、本発明の組成物での処置（黒塗りバー）の１４日目および２８日目での皮膚の明るさ（頬の明るさの値として測定）の変化を（％で）示す。
【図１６】図１６は、プラセボ（水平線バー）と比較した、本発明の組成物での処置（黒塗りバー）の１４日目および２８日目の色素沈着中で測定されたＩＴＡ値の変化を（％で）示す。
【図１７】図１７は、プラセボ（水平線バー）と比較した、本発明の組成物での処置（黒塗りバー）の１４日目および２８日目でのしわの深さの変化を（％で）示す。
【図１８】図１８は、プラセボ（水平線バー）と比較した、本発明の組成物での処置（黒塗りバー）の１４日目および２８日目での皮膚の均一性の変化を（％で）示す。
【図１９】図１９は、プラセボの使用（水平線バー）と比較した、本発明の組成物の使用の１４、５６および８４日目でのＭＤＡ産生の変化を（％で）示す。
【図２０】図２０は、プラセボ使用（水平線バー）と比較した、本発明の組成物１Ｂの使用（黒塗りバー）の１４日目および５６日目でのＦＲＡＳ（唾液還元第二鉄抗酸化剤）の変化を（％で）示す。
【００１１】
本発明の第１の態様は、皮膚に対する空気汚染の影響を処置するための組成物を提供し、前記組成物は、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチン、およびヒドロキシチロソールを含む。好ましい実施形態では、本発明の組成物はカルノシン酸を含む。好ましくは、前記組成物は、主要なジテルペンとしてカルノシン酸を含む。
一実施形態では、前記組成物は、カルノシン酸、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチンおよびヒドロキシチロソールを含む。
【００１２】
前述の組成物は、全ての有害な空気汚染の影響を軽減または打ち消すために必要な作用の組み合わせをもたらすため、皮膚への空気汚染の影響の処置に適している。これは、前述の組成物が、ヒトの皮膚に対して重要かつ顕著な抗酸化、抗炎症、抗老化および美白効果を与える、すなわち、前記組成物が、美容効果（老化防止）ならびに医薬効果（抗炎症）を提供することである。このようにして、炎症、座瘡の増加、慢性皮膚炎、乾癬などの空気汚染に関連する全ての疾患を防ぐために、いくつかのスキンケア製品を同時に使用することを回避できる。前述のような組成物の使用は、予防的であるか、または既存の皮膚状態を治療するためであってもよい。
したがって、一実施形態は、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチンおよびヒドロキシチロソールを含む組成物に言及する。
【００１３】
一実施形態では、前記組成物は、ヒドロキシチロソールに対してジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシドおよびケルセチンのそれぞれをおよそ、重量で２．５〜５倍の個々の割り当て量で含む。よって、一実施形態では、本発明の組成物は、２．５〜５のヒドロキシチロソールに対するジテルペン比率、２．５〜５のヒドロキシチロソールに対するオレウロペイン比率、２．５〜５のヒドロキシチロソールに対するベルバスコシド比率、および２．５〜５のヒドロキシチロソールに対するケルセチン比率を含む。
好ましくは、ヒドロキシチロソールに対するジテルペン重量比は約３であり、ヒドロキシチロソールに対するオレウロペインの重量比は約３であり、ヒドロキシチロソールに対するベルバスコシドの重量比は約４．５であり、ヒドロキシチロソールに対するケルセチンの重量比は約２．５である。
【００１４】
本発明の効果について、数値、比率またはパーセンテージを指す「およそ」および「約」という用語は、前記数値、比率またはパーセンテージがその値の±１０％変動し得ることを示す。したがって、約２．５は、２．２５〜２．７５の間に含まれる全ての値、すなわち、例えば、２，２５を含むだけでなく、２．２５７、２．３１、２．５４、２．５、２．６２、２．６３、２．７、２．７５などとその中の全ての値を含む。
これらの重量比は、抗酸化、抗炎症、老化防止、美白（または過度の色素沈着防止）作用の間の適切なバランスを組成物に与えるため、さまざまな環境空気汚染の影響の予防および／または治療が効果的で単一の製品で実現可能である。
【００１５】
前述の特徴を備えた組成物は、異なる植物の抽出物の組み合わせによってのみ達成可能である。各抽出物は、有効成分の１つまたは複数、または各有効成分の総含有量の一部を提供し得る。
一実施形態では、ケルセチン源として、例えば、タマネギ、フェンネル、ディル、クランベリーまたは菊抽出物などのいくつかの抽出物を使用することができるが、好ましいケルセチン源は、最小ケルセチン含有量が４０ｗｔ％のソフォラ・ジャポニカ（エンジュ）抽出物である。好ましい実施形態では、前記組成物は、４０ｗｔ％の最小ケルセチン含有量を有するソフォラ・ジャポニカ抽出物を含む。好ましくは、前記ソフォラ・ジャポニカ抽出物は、総組成物重量の３．５％の最小ケルセチン含有量を提供する。
【００１６】
ケルセチンの最小含有量が４０ｗｔ％のソフォラ・ジャポニカ抽出物は、その製造コストと重量に比べてケルセチン濃度が高く、残りの有効成分を十分な濃度で得ることができるため、この組成物にとって有益な成分である。
ケルセチンはフラボノールファミリーに属するフラボノイドである。主にタマネギ、ブドウ、ベリー、チェリー、ブロッコリーおよび柑橘系の果物に見られ得る。ケルセチンは、優れた抗炎症活性に加えて、高いフリーラジカル捕捉活性を持つ強力な抗酸化剤である。ケルセチンのもう１つの興味深い特性は、ヒスタミン放出能力を低下させることが示されている研究が存在することである（１２）。いくつかの研究は、ディーゼル微粒子のような特定の汚染物質がヒスタミンレベルを上昇させるため、高度に汚染された地域に住む人々においてアレルギー反応を増加させることを証明している。
【００１７】
一実施形態では、ジテルペン源は、植物抽出物の１つまたは組み合わせであり得る。ジテルペンには顕著な抗炎症作用があり、これは皮膚への環境空気汚染の影響を軽減するための組成物にとって非常に有益である。
カルノシン酸は、多くの容易に入手できる植物に見られるジテルペンであるため、その適切なコストおよび豊富さのゆえに、この組成物に使用するのに適したジテルペンである。一実施形態では、カルノシン酸源は、例えば、ローズマリー、セージ、オレガノ、メリッサまたはタイムの抽出物またはそれらの抽出物の組み合わせである。
【００１８】
好ましくは、前記組成物は、１５ｗｔ％の最小ジテルペン含有量を有するローズマリー抽出物を含む。前記抽出物は、その製造コストおよび重量に関して高いジテルペン濃度を提供し、残りの有効成分の十分な濃度を得ることができる。好ましくは、前記ローズマリー抽出物は、本発明の総組成物重量の４．５ｗｔ％の最小ジテルペン含有量を提供する。
カルノシン酸はまた、インターロイキンを排除し、亜酸化窒素の放出とチロシンキナーゼ経路を遮断または阻害するその能力ゆえに、強力な抗酸化活性、重要な抗炎症活性を有している。カルノシン酸はまた、抗脂肪生成特性を有し、皮膚の脂質酸化の阻害によりまたは生物物理学的メカニズムにより早期の皮膚老化を予防する。
【００１９】
一実施形態では、オレウロペイン源は、植物抽出物、例えば、オリーブの葉または果実の抽出物またはアルガン抽出物またはトネリコ抽出物の抽出物またはそれらの組み合わせである。好ましくは、前記組成物は、オレウロペインにおける最小含有量が１６ｗｔ％のオリーブ（葉または果実）抽出物を含む。好ましくは、前記オリーブ抽出物は、本発明の組成物の全重量の４．５ｗｔ％の最小オレウロペイン含有量を提供する。
オレウロペインの最小含有量が１６ｗｔ％のオリーブ抽出物は、適切なコストで製造が容易であり、地中海沿岸に非常に豊富な樹木であるため、非常に適切なオレウロペイン源である。さらに、少なくとも１６ｗｔ％のオレウロペイン含有量は、他の抽出物と組み合わせたときに適切な生物活性を保証するのに十分である。
【００２０】
オレウロペインは、いくつかのメカニズムを通じて実行される重要な抗酸化活性を示す。主に、オレウロペインは、ヒドロキシル基の遊離酸素とそのフェノキシルラジカルとの間の水素結合形成によってフリーラジカルの安定性を高める。
同様に、オレウロペインは、リポキシゲナーゼ活性、ロイコトリエンＢ４産生、炎症誘発性サイトカイン生合成阻害、または炎症パラメーターの調節を通じて抗炎症作用を示す。
【００２１】
一実施形態では、ヒドロキシチロソール源は、植物抽出物、例えば、オリーブの葉または果実の抽出物またはアルガン抽出物またはトネリコ抽出物の抽出物またはそれらの組み合わせである。好ましくは、前記組成物は、５ｗｔ％のヒドロキシチロソールの最小含有量を有するオリーブ（葉または果実）抽出物を含む。好ましくは、前記オリーブ抽出物は、本発明の組成物の全重量の１．５ｗｔ％の最小ヒドロキシチロソール含有量を提供する。
最小ヒドロキシチロソール含有量が５ｗｔ％のオリーブ抽出物は、適切なコストで製造が容易であり、地中海沿岸に非常に豊富な樹木であるため、非常に適切なヒドロキシチロソール源である。さらに、他の抽出物と組み合わせた場合に適切な生物活性を保証するには、少なくとも５ｗｔ％のヒドロキシチロソール含有量で十分である。
【００２２】
ヒドロキシチロソールの優れた抗酸化活性は、フリーラジカル効果を阻害するその能力とそのＦｅ＋３イオン還元力よりｏ−ジヒドロキシフェニル分子断片に起因する。ｏ−ジフェノールの抗酸化特性は、ヒドロキシル基とフェノキシルラジカルの間に分子内水素ブリッジを形成するそれらの能力に関連しているため、カテコール基は、脂質酸化の初期段階で形成された過酸化アルキルラジカルに水素ラジカルを供与することにより、鎖の伝播を防ぐ。
炎症とその結果は、皮膚疾患に重要な役割を果たす。ヒドロキシチロソールは、炎症誘発性ロイコトリエン分子の産生とアラキドン酸リポキシゲナーゼ活性の両方を阻害することが証明されている。最近、２０ｗｔ％のヒドロキシチロソールを含む抽出物が炎症性腫脹および痛覚過敏を抑制し、炎症ラットモデルにおいて炎症誘発性サイトカインを抑制することが発表された。
【００２３】
一実施形態では、ベルバスコシド源は、植物抽出物、例えば、オリーブの葉または果実の抽出物、ブッドレア・グロボーサ（タマフジウツグミ）、リッピア・シトリオドラ（レモンバーベナ）、プランタゴ・ランセオラタ（ヘラオオバコ）、シスタンチェ・タブロザ（カンカニクジュヨウ）、レーマンニア・グルチノーサ（アカヤジオウ）などの抽出物またはそれらの組み合わせである。好ましくは、前記組成物は、２５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量を有するリッピア・シトリオドラ抽出物を含む。好ましくは、前記オリーブ抽出物は、本発明の組成物の総重量の６．５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量を提供する。
ベルバスコシドの最小含有量が２５ｗｔ％のリッピア・シトリオドラ抽出物は、この植物からの抽出物が地中海沿岸に豊富にあるため、適切なコストで簡単に製造できるので、非常に適したベルバスコシド源である。さらに、この抽出物を他の抽出物と組み合わせた場合、２５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量で十分な生物活性を保証できる。
アセトキシドとしても知られるベルバスコシドは、抗酸化活性、抗炎症活性、美白活性、光防護活性、キレート活性を示す。前記抗酸化活性は多くの研究で証明されている。前記抗炎症活性は、ヒトケラチノサイト培養物に関するインビトロ研究で証明されており、その培養物中で、ベルバスコシドは用量依存反応で炎症誘発性ケモカインの放出を減らすことができた（１３）。Ｙｏｕｎｇらの研究によると、ベルバスコシドは、メラノーマＢ１６細胞のチロシナーゼ活性とメラニン生成を阻害する（１３、１４）。
【００２４】
一実施形態では、前記組成物は、組成物総重量の４．５ｗｔ％の最小ジテルペン含有量を提供する２５ｗｔ％〜４０ｗｔ％の間のローズマリー抽出物、組成物総重量の４．５ｗｔ％の最小オレウロペイン含有量および組成物総重量の１．５ｗｔ％の最小ヒドロキシチロソール含有量を提供する２０ｗｔ％〜４０ｗｔ％の間のオリーブの葉または果実の抽出物、組成物総重量の６．５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量を提供する２０ｗｔ％〜３５ｗｔ％の間のリッピア・シトリオドラ抽出物、および組成物総重量の３．５ｗｔ％の最小ケルセチン含有量を提供する５ｗｔ％〜から２５ｗｔ％の間のソフォラ・ジャポニカ抽出物を含む。
好ましくは、前記組成物は、組成物総重量の４．５ｗｔ％の最小ジテルペン含有量を提供する約３２ｗｔ％のローズマリー抽出物、組成物総重量の４．５ｗｔ％の最小オレウロペイン含有量および組成物総重量の１．５ｗｔ％の最小ヒドロキシチロソール含有量を提供する約３０ｗｔ％のオリーブの葉または果実の抽出物、組成物総重量の６．５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量を提供する約２８ｗｔ％のリッピア・シトリオドラ抽出物ならびに組成物総重量の３．５ｗｔ％の最小ケルセチン含有量を提供する約１０ｗｔ％のソフォラ・ジャポニカ抽出物を含む。
【００２５】
一実施形態では、前記組成物は、組成物総重量において、４．５％（ｗｔ／ｗｔ）の最小ジテルペン含有量、４．５％（ｗｔ／ｗｔ）の最小オレウロペイン含有量、１．５％（ｗｔ／ｗｔ）の最小ヒドロキシチロソール含有量、６．５％（ｗｔ／ｗｔ）の最小ベルバスコシド含有量および３．５％（ｗｔ／ｗｔ）の最小ケルセチン含有量を含む。
より好ましくは、前記組成物は、１５ｗｔ％の最小ジテルペン含有量を有する約３２ｗｔ％のローズマリー抽出物、１６ｗｔ％の最小オレウロペイン含有量および５ｗｔ％の最小ヒドロキシチロソール含有量を有する約３０ｗｔ％のオリーブの葉または果実の抽出物、２５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量を有するリッピア・シトリオドラ抽出物ならびに４０ｗｔ％の最小ケルセチン含有量を有する約１０ｗｔ％のソフォラ・ジャポニカ抽出物を含む。
【００２６】
本文書に記載されている組成物は、皮膚に対する抗酸化作用、抗炎症作用、および美白作用の間の適切なバランスを示し、これは、ＵＶ照射の暴露下およびＵＶ照射なしでのケラチノサイトにおける抗酸化活性に関する、ＵＶ照射暴露下のケラチノサイトにおける抗炎症活性とメラノサイトにおける美白活性に関する本発明者らの研究によって実証されている。単一の組成物中にバランスのとれた抗酸化機能、抗炎症機能、および美白機能を有することは非常に便利であるため、適切に試験されている単一の製品を適用することによって、皮膚に対する複数の環境空気汚染の影響を軽減することが実現可能となる。対照的に、皮膚への複数の環境空気汚染の影響をそれぞれの作用に関して多様な製品を適用することによって処置しようとすると、それらの併用が前もって試験されていないため、互換性のない製品を使用するリスクが高まり、使用される治療が、最初の問題よりも悪い影響を引き起こす可能性がある。さらに、単一の製品を使用するという事実は、毎日のスキンケアのコストが下がることを意味する。
【００２７】
本発明の組成物は、非経口的、経皮的、経口的または局所的に投与され得る。
一実施形態は、本発明の組成物の美容的な使用に言及する。
したがって、一実施形態は、皮膚に対する美観的な環境汚染の影響を美容的に軽減するための本発明の組成物の美容的な使用に言及する。
【００２８】
別の実施形態は、抗酸化、抗炎症の美観的作用を有する美容製品（ｃｏｓｍｅｔｉｃ）として使用するための本発明の組成物に言及するが、この作用は治療的処置としてではなく、単に皮膚に対する美観的な、老化防止および美白処置としてとらえられる。
好ましくは、前記使用は、本文書に記載されている本発明の組成物の０．１ｇから１ｇ（１０００ｍｇ）の間の経口用量を毎日投与するステップを含む。より好ましくは、経口用量は１日２５０ｍｇである。
したがって、一実施形態は、美容製品の抗酸化剤、抗炎症製品の製造のための、本文書に記載の本発明の組成物の使用に言及し、これの作用は治療的処置としてではなく、単に美観的な、皮膚に対する老化防止および美白としてとらえられる。
【００２９】
一実施形態は、薬剤としての使用のための、本文書に記載される本発明の組成物に言及する。
特に、一実施形態は、環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患の治療または予防におけるその使用のための、本文書に記載される本発明の組成物に言及する。好ましくは、前記使用は、本文書に記載される本発明の組成物の０．１ｇ〜１ｇ（１０００ｍｇ）の間の経口１日量を投与するステップを含む。より好ましくは、経口用量は１日２５０ｍｇである。
好ましくは、前記疾患は、炎症、座瘡、慢性皮膚炎および乾癬からなる群から選択される。
【００３０】
別の実施形態は、環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患の治療または予防に使用するための薬剤を製造するための、本文書に記載の本発明の組成物の使用に言及する。
別の実施形態は、本文書に記載される本発明の組成物の有効量を個体に投与するステップを含む、環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患の治療または予防の方法に言及する。
【００３１】
本発明の作用に対する「有効量」は、患者に許容できない毒性効果を引き起こすことなく治療効果を提供するものであると理解される。前記組成物の有効量または用量は、例えば、治療される疾患、治療される患者の年齢、体重および臨床状態、投与形態、患者の病歴、治療される疾患の重症度および投与される組成物の効力に依存する。好ましくは、前記有効量または用量は、本文書に記載される本発明の組成物の０．１ｇ〜１ｇ（１０００ｍｇ）の間の経口１日用量である。
前述の組成物は、１日０．１ｇ〜１ｇの間の用量で投与され得る。実施され、図４に示された毒性試験によれば、この用量は安全であると考えられる。
好ましくは、１日用量は２５０ｍｇである。この用量は、薬学的または美容的に未処理のモデルまたは人々と比較して、皮膚に対する環境空気汚染の影響の軽減において有意かつ顕著な効果を生じる。
【００３２】
本発明の別の第２の態様は、皮膚に対する環境空気汚染の影響に関連する早期の皮膚老化の予防に使用するための組成物を提供し、前記組成物は、ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチンおよびヒドロキシチロソールを含む。前記美容的使用は、汚染の影響の低減をもたらすため、早期の皮膚老化を予防する。
本発明の第１の態様の組成物の特徴は、概して、特にそれがその組成、成分比およびその供給源を指すものにおいて、本発明の第２の態様の組成物に等しく適用可能である。
より特定の実施形態では、本発明の組成物の投与は、経口、局所、経皮または非経口投与を目的としたそれを含む製剤の中から選択される。
好ましくは、本発明の組成物は、１つまたは複数の生理学的に適合性のある媒体または賦形剤を、経口または液体の形態で含有して経口投与することができる。したがって、本発明の別の態様は、本文書に記載される本発明の組成物、および１つまたは複数の生理学的に適合性のある媒体または賦形剤を含む製剤に言及する。
【００３３】
一実施形態は、本文書に記載されるような本発明の組成物、および１つまたは複数の生理学的に適合性のある媒体または賦形剤を含む医薬製剤に言及する。
【００３４】
別の実施形態は、本文書に記載されているような本発明の組成物、および１つまたは複数の生理学的に適合性のある媒体または賦形剤を含む美容的な製剤に言及する。
特定の実施形態では、前記美容的な製剤は栄養補助食品である。したがって、本発明の一実施形態は、本文書に記載されているような本発明の組成物を含む栄養補助食品に言及する。別の実施形態は、皮膚に対する環境汚染の美観的影響を美容的に軽減するための前記栄養補助食品の使用に言及する。
【００３５】
別の特定の実施形態では、前記美容的な製剤はニュートリコスメティクス製品である。したがって、本発明の一実施形態は、本文書に記載されているような本発明の組成物を含むニュートリコスメティクス製品に言及する。別の実施形態は、皮膚に対する環境汚染の美観的影響を美容的に軽減するための前記ニュートリコスメティクス製品の使用に言及する。
ニュートリコスメティクス製品という用語は、本発明の作用を指し、摂取されたときに美容上の利益を提供する、食品または食品の一部を指す。
したがって、一実施形態は、美容的な抗酸化製品、抗炎症製品、老化防止製品、および美白製品の製造のための、本文書に記載されている美容的な製剤の使用に言及する。
【００３６】
別の実施形態は、環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患を治療または予防するための薬剤を製造するための、本文書に記載されている医薬製剤の使用に言及する。
特に、一実施形態は、環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患の治療または予防に使用するための、本文書に記載される医薬製剤の使用に言及する。
別の実施形態は、本文書に記載される本発明の美容製剤または医薬製剤を個体に投与するステップを含む、環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患の治療または予防の方法に言及する。
【００３７】
前記製剤は、生理学的に許容され得る結合剤、充填剤、潤滑剤および保湿剤などの従来の成分を含み得る。前記製剤は、任意の適切な形態をとることができ、クリーム、バルム、気化器、丸薬、糖衣錠、カプセル、トローチ剤、油性溶液または水溶液、懸濁液、乳濁液、または、即時または制御放出のための、液体溶剤中での使用前の再構成に適した乾燥粉末形態などで、経口、経鼻、局所または非経口的に投与することができる。
前記製剤を製造するために、医薬製剤または美容的な製剤を製造するための従来の技術を使用することができる。前記媒体が溶媒として機能する場合、それは固体、半固体または液体であってもよく、そして前記活性化合物のための賦形剤または溶剤として作用し得る。目的の組成物は、粒状の固体溶剤に吸収することができる。適切な媒体のいくつかの例は、水、食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエトキシル化ヒマシ油、ピーナッツ油、オリーブ油、ラクトース、テラアルバ、サッカロース、シクロデキストリン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルカム、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸である。酸、アルキルセルロースエーテル、シリコン酸、脂肪酸、脂肪酸アミン、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリトロール脂肪エステル、ポリエチレン、ヒドロキシメチルセルロース、微結晶性セルロースおよびポリビニルピロリドンである。
【００３８】
ピルなどの固体製剤を調製するために、目的の化合物を、タルカム、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、ケイ酸アルミニウムおよびマグネシウム、デンプン、ラクトース、アカシア、メチルセルロース、微結晶性セルロースなどの他の従来の成分および医薬品媒体および希釈剤などの機能的に同様の材料と製剤中で混合する。
液体経口形態はまた、甘味料、香料、防腐剤および乳化剤などの特定の添加物を含み得る。経口投与用の非水性液体組成物はまた、例えば、食用油を含んで処方され得る。そのような液体組成物は、適切な方法で、例えば、単回用量のゼラチンカプセルにカプセル化することができる。
【００３９】
カプセルは、目的の化合物を薬学的に不活性な溶媒と混合し、得られた混合物を適切なサイズの硬ゼラチンに充填して調製することができる。ソフトカプセルは、植物油、軽質パラフィン、または許容し得る不活性油中に目的の化合物を懸濁させてカプセル化機を用いて調製される。シロップ、エリキシル剤、懸濁液などの液体剤形も調製できる。水溶性形態は、砂糖、香味料芳香剤および防腐剤と共に水性媒体に溶解して、シロップを形成し得る。エリキシル剤は、香料芳香剤と共に砂糖やサッカリンなどの適切な甘味料を含む水性アルコール媒体（エタノールなど）を使用して調製される。懸濁液は、水性媒体と、アカシア、トラガカント、メチルセルロースなどの懸濁剤の補助により調製することができる。
【００４０】
一実施形態では、本発明による美容的な使用のための前記組成物は、１日０．１ｇ〜１０００ｍｇの間の用量で経口投与される。好ましくは、前記用量は１日２５０ｍｇである。特に、本発明による美容的な使用のための前記組成物は、栄養補助食品において、または経口投与される０．１〜１０００ｍｇの間の用量を含むニュートリコスメティクス製品として投与される。
一実施形態では、前記栄養補助食品は、追加の賦形剤、好ましくは水、食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエトキシル化ヒマシ油、ピーナッツ油、オリーブ油、ラクトース、テラアルバ、サッカロース、シクロデキストリン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルカム、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸、アルキルセルロースエーテル、シリコン酸、脂肪酸、脂肪酸アミン、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリトロール脂肪エステル、ポリエチレン、ヒドロキシメチルセルロース、微結晶セルロースおよびポリビニルピロリドンを含む。
【００４１】
別の追加の実施形態では、前記栄養補助食品はカプセルである。好ましくは、硬ゼラチンカプセルである。
本発明の組成物は、水および適切なアルコールなどの注射可能な液体媒体と組み合わせて非経口的に投与することができる。安定剤、可溶化剤および緩衝液などの注射に対する通常の医薬補助剤もまた、そのような注射可能な製剤に含まれ得る。本発明の組成物は、筋肉内、腹腔内、または静脈内に投与することができる。
【００４２】
同様に、本発明の組成物は局所投与され得る。局所投与製剤は、液体、エアロゾル、クリームの形態などで、皮膚と生理学的に適合性のある１つまたは複数の媒体または賦形剤を含み得る。
局所適用の製剤を調製するために、本発明の組成物は、皮膚科学的に受け入れられた媒体に含まれる。投与される組成物の量および局所使用の製剤中の組成物量は、媒体に依存し、それが投与される個体、所望の効果および製剤の安定性に依存する。したがって、当業者は、適切な組成物量を含む適切な調製物の使用方法を理解し、前述の条件に応じて、投与する製剤量を選択する。
好ましくは、本発明による美容的な使用のための前記組成物は、０．０５ｗｔ％から２ｗｔ％の本発明の組成物を含む化粧品で局所投与される。好ましくは、０．１ｗｔ％〜１ｗｔ％の前記化粧品は、０．１ｗｔ％〜１ｗｔ％の本発明の組成物を含み、局所投与される。
【００４３】
皮膚に対する空気汚染の影響の分子メカニズム
大気汚染は、オゾンとＵＶ放射と組み合わされて、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成と除去の間の既存のバランスを変化させる。この変化は炎症反応の誘発を意味する。大気汚染が誘導する慢性的なストレスは、皮膚のバリアの完全性に影響を与えかつその完全性を、特定の病状（敏感性（ｓｅｎｓｉｂｉｌｉｔｙ）、過敏性、脱水症、色素沈着の変化、皮膚炎、座瘡など）を発生または悪化させる程度まで変化させる可能性がある（１５）。
オゾンは主に角質層に作用するが、対照的に、粒子状物質（ＰＭ）は、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）などの一連の有毒分子を含み、皮膚と接触するとそれに浸透し、より深いレベルで害を及ぼす可能性があり、例えば、ＡｈＲ（アリール炭化水素受容体）と結合することにより、ケラチノサイトおよびメラノサイトに直接作用し、それらの活性化は、皮膚の老化、色素沈着、および皮膚の炎症を引き起こす酸化ストレスに関与する遺伝子の発現を刺激する（１５）。
【００４４】
このように、皮膚の炎症（掻痒感覚過敏）やしみの出現、既存の状態の悪化に関連するＡｈＲ活性化を阻害できる化合物は、汚染防止組成物を得るための優れた戦略である。
この意味で、前記製剤の目的の１つは、空気汚染の結果としてのＡｈＲの活性化を抑制できるようにすることである。
【００４５】
既に述べたように、環境空気汚染が皮膚に損傷を与え得るメカニズムの１つには、ＡｈＲの活性化が含まれる。環境空気汚染はフリーラジカルを生成し、皮膚の免疫炎症反応はＡｈＲの活性化に依存するメカニズムの活性化を引き起こし、皮膚のミクロフローラを変化させる。
いくつかの科学的研究は、いくつかの皮膚疾患におけるＡｈＲ活性化の関与を示している。トランスジェニックマウスにおけるＡｈＲ活性化の関与に関する研究は、ＡｈＲ転写活性化がアトピー性皮膚炎と同様の炎症性皮膚病変を引き起こすことを証明した。マウス皮膚のマイクロアレイ遺伝子分析は、炎症関連遺伝子の過剰発現を示した。この研究の結果は、ＡｈＲの活性化が皮膚の炎症性疾患の発症に関与している可能性があることを証明している。
【００４６】
ＡｈＲは、ケラチノサイト、線維芽細胞およびメラノサイトを含む、増殖性細胞の炎症とメラニン形成を調節するさまざまな皮膚細胞タイプに存在するリガンド活性化サイトゾル転写因子である（１６、１７）。非活性化ＡｈＲは、サイトゾルタンパク質複合体に見られ、リガンドと結合すると複合体が解離するため、核へのＡｈＲ移行が引き起こされ、そのＡｈＲが生体異物応答要素（ＸＲＥ）を含む遺伝子の発現を刺激する。生体異物応答要素（ＸＲＥ）を含む遺伝子には、シトクロム解毒酵素Ｐ４５０（ＣＹＰ）が含まれる（１３）。ＡｈＲの活性化は、ダイオキシン、オゾン、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）などのリガンドとして作用する環境空気汚染物質の生化学的効果と毒性効果の間の仲介役を果たすため、成長および分化などの細胞の生物学的プロセスに影響を与えることになる。最近、メラノサイトの増殖を誘発するため、マウスの皮膚を黒化し得ることが証明された（１８）。
【００４７】
多環芳香族炭化水素２，３，７，８−テトラクロロジベンゼン−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）は、ＡｈＲの活性化を通じてヒトにいくつかの病理学的影響を及ぼす。ＴＣＤＤによって誘発される遺伝子発現の変化に従属する主要なメカニズムは、ＡｈＲおよびＡｈＲトランスロケーター（Ａｒｎｔ）が関与する転写サイクルの活性化である。ＡｈＲとＡｒｎｔは、発生調節、低酸素シグナル伝達および概日リズムに関与する転写因子であり、補助タンパク質との不活性な複合体内の細胞質内に見られるタンパク質ファミリーに属している。
ＴＣＤＤに結合すると、ＡｈＲはいくつかの不活性な複合体タンパク質から解離し、核に移行してＡｒｎｔと二量体化する。ヘテロダイマーＡｈＲ／Ａｒｎｔは、生体異物代謝遺伝子の転写を活性化し、その一部は、成長制御、サイトカイン、核転写、および細胞外マトリックスタンパク質分解調節因子に関与するタンパク質をコード化する（１９）。
ＡｈＲサイクルは、ＴＣＤＤによっておよびトランスレチノイン酸（オールトランスレチノイン酸）によって活性化され、ヒトの正常なケラチノサイトにおけるＭＭＰ−１の発現を増加させる。これは、ＭＭＰの誘導がＴＣＤＤによって誘導される病状に従属する共通のメカニズムであることを示唆している（２０）。
【００４８】
ＡｈＲはメラニン形成調節因子であることが証明されている。いくつかの研究でＡｈＲの役割が調べられ、その一例は、ヒトドナーのメラノサイトをＴＣＤＤに曝露させ、続いてチロシナーゼ活性とメラニン含有量をインビトロで測定した研究である。ＴＣＤＤへの５日間の曝露後、メラノサイトはチロシナーゼ活性レベルの増加と細胞内メラニンの３倍の増加を示した。ＦＭ５５ヒトメラノーマ細胞で実施された同様の実験は、ＴＣＤＤがメラニン含有量を有意に増加させることを証明したため、メラニン形成サイクルがＡｈＲ活性化によって過剰調節されたことが確認された（２１）。
ＡｈＲはオゾンセンサーとしても識別されている。オゾンはＡｈＲ核転座を誘発し、ｍＲＮＡによるＡｈＲ発現を増加させる。さらに、オゾンはタンパク質発現とＣＹＰ１アイソフォームｍＲＮＡを有意に増加させる。ＣＹＰ１酵素は、元のそれぞれの化合物よりも毒性の高い化合物を代謝し、多くの生体異物の発癌性化合物を活性化する（２２）。
【００４９】
タバコの煙（汚染物質とも考えられる）によって誘発される皮膚の老化へのＡｈＲの関与を分析する目的で、ヒト初代線維芽細胞をヘキサン可溶性タバコ煙抽出物に曝露した。この抽出物は、Ｐ１Ｂ１シトクロムの過剰発現と並行して、ヒト線維芽細胞培養におけるＭＭＰ−１誘導を有意に増加させた。ＡｈＲ量の減少は、前記抽出物によって誘発されるＡｈｒ依存性遺伝子転写の上昇ＣＹＰ１Ａ１／ＣＹＰ１Ｂ１を抑制した。ＭＭＰ−１およびＣＹＰ１Ｂ１の誘導は、ＡｈＲ３−メトキシ−４−ニトロフラボンおよびα−ナフトフラボンサイクル阻害剤によって抑制された。これらの研究は、ヘキサン可溶性タバコ煙抽出物が、ＡｈＲサイクルの活性化を通じてヒト皮膚線維芽細胞でＭＭＰ−１の過剰発現を誘発することを示唆している。したがって、ＡｈＲサイクルは、外的要因による皮膚の老化に病原として関与している可能性がある（２３）。
【００５０】
空気汚染とアトピー性皮膚炎の優勢および重症度との相関関係はよく知られているが、その従属するメカニズムはそれほどよくは知られていない。現在、アトピー性皮膚炎の症状はステロイド化合物で治療されている。しかし、多くの場合、掻痒は持続する。その理由の１つは、交通由来の粒子状物質などの空気汚染物質に応じたＡｈＲの活性化である。活性化されたＡｈＲは、ケラチノサイトでアルテミン神経栄養因子の発現を誘導する。これには、表皮の過敏症が含まれるため、掻痒の感覚過敏を引き起こす。その後の掻き傷は、皮膚バリアの変化と抗原浸透の増加を意味し、これは感作を意味し、他のアレルギー性疾患の素因に有利に働く（２４）。
【実施例】
【００５１】
以下に説明する実施例は、例示的な特徴を有し、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００５２】
実施例１．  高フラボノイド含有量の抽出物組成物の抗酸化、抗炎症および美白作用の研究
【表１】
2021530433.tif 000031
【００５３】
汚染が皮膚に引き起こす損傷の発生において、酸化および炎症過程が非常に重要であることを念頭に置いて、皮膚に対する空気汚染の影響に対する異なる組成の緩和活性を決定するための予備アッセイを実施した。
さらに、空気汚染が皮膚の色素沈着としみの出現を増加させることを考慮して、メラニン生成を阻害するいくつかの製剤の能力に関する研究を行った。
【００５４】
表１は、予備調査で調べた各組成物の成分とそれらの濃度を示す。表１は、３種類の試験製剤の組成を要約したものであり、製品１００ｍｇ当たりのフラボノイドのｍｇまたは各抽出物が製剤に提供する最終組成を示す。
各製剤の総フラボノイド寄与は同じであり、１００ｍｇの組成物または最終生成物当たり約３１ｍｇである。全ての製剤には、同量のソフォラ・ジャポニカ抽出物およびローズマリー抽出物が含まれている（常に同じフラボノイド含有量を提供する）。
【００５５】
この研究では、インビトロでのヒトケラチノサイト培養物を、それぞれ２種類の異なる濃度を使用して、前記３種類の製剤のそれぞれに曝露し、基礎酸化を測定した。データは、算術平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。統計的有意水準は、任意の組成物で処理されていない対照培養物と比較して＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（ｐ＜０．０００１）である。
図１に見られるように、処方物１Ｂならびに処方物２Ｂは、未処理の細胞（黒いバー）と比較して、ケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の酸化の割合を有意に減少させた。反対に、処方物３Ｂは、２つの研究された濃度のいずれにおいても細胞の基礎酸化を減少させることができなかった。
それらの間で製剤を比較すると、処方物１Ｂおよび２Ｂの抗酸化作用に有意差はないが、処方物３Ｂに関しては、両方の濃度で有意差がある。
【００５６】
結果を図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに示す別の試験では、表１の３種類の製剤の抗酸化作用を、インビトロで培養したヒトケラチノサイトで測定し、Ｂ型紫外線（ＵＶＢ）に８００および１２００Ｊ／ｍ２に暴露させた。
データは、算術平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。統計的有意水準は、同じ放射線強度を受けたがいずれの組成物でも処理されていない対照培養物と比較して、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（ｐ＜０．０００１）である。表２は、それぞれの対照と比較した酸化抑制率を示す。
【００５７】
試験された全ての製剤は、ＵＶＢ放射線によって引き起こされる酸化を有意に抑制した。しかし、２００μｇ／ｍＬの濃度の製剤１Ｂは、ＵＶＢによって誘発される酸化をほぼ完全に阻害したものであり、製剤２Ｂおよび３Ｂよりも有意に高いパーセンテージであった。
【表２】
2021530433.tif 000032
【００５８】
図３に、表１の３種類の製剤の抗炎症活性の研究結果を示す。この試験では、３００Ｊ／ｍ２の強度のＵＶＢ放射線に曝露され、１０μｇ／ｍＬの濃度で表１の製剤で処理されたヒトケラチノサイトによって産生されたＩＬ−８（インターロイキン８）の量を測定した。
データは、算術平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。統計的有意水準は、同じ放射線強度を受けたがいずれの組成物でも処理されていない対照培養物と比較して、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（ｐ＜０．０００１）である。
【００５９】
インターロイキン８は、ケラチノサイトや他の細胞によって産生されるサイトカインであり、炎症過程に関連している。
図３では、処方物１Ｂならびに処方物２Ｂが、未処理の細胞（黒いバー）と比較して、ケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の炎症率（ＩＬ−８アルファ発現）を照射中および照射後にインキュベートした場合に加えて、これらが放射線照射後にのみインキュベートされた場合も有意に低下させたことが理解できる。
【００６０】
反対に、製剤３Ｂは、ケラチノサイトが照射後に前記製剤とインキュベートされた場合にのみ、サイトカインＩＬ−８アルファ産生を有意に阻害することができた。
それらの間での前記製剤の比較は、製剤１Ａと１Ｂの間に有意差を示さない。
【００６１】
図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、表１の製剤の美白活性研究の結果を示す。グラフは、同じ培養条件で、未処理のメラノサイトと比較して、表１の製剤で処理されたメラノサイトによって生成されたメラニンのパーセンテージを表す。
データは、算術平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。統計的有意水準は、いずれの組成物でも処理されなかったメラノサイト対照培養物と比較して、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（ｐ＜０．０００１）である。
試験濃度での製剤２Ｂならびに製剤３Ｂは、統計的に有意な量でメラニン生成を阻害することができなかった。製剤１Ｂのみがそのような能力を示したため、記載された影響の１つが慢性空気汚染に暴露された人々の色素沈着の増加であることを考えると、皮膚への前記空気汚染影響の治療に使用するための組成物を得るための重要な要件を満たす。
【００６２】
前記抽出物のフラボノイド含有量の決定
リッピア・シトリオドラ抽出物およびオリーブ抽出物のフェノール化合物のＨＰＬＣ分析
−標準検量線の準備
前記検量線を、オレウロペイン、ヒドロキシチロソール、およびベルバスコシド標準のさまざまな濃度で作成する。各標準に割り当てられた純度は、標準の分析証明書に記載されているものである。
−乾燥試料の準備
試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して５ｍｇ／ｍｌの濃度にする。得られた溶液を０．４５μｍナイロンメンブレンでろ過する。
−ＨＰＬＣ法
カラム：ＬｉＣｒｏｓｐｈｅｒ  １００−Ｃ１８（２５０ｘ４．０ｍｍ  内径）、平均粒子サイズ５μｍ。移動相の流れ：１ｍｌ／分。温度：３０℃。注入量：２０μｌ。
−移動相：溶媒Ａ：２．５ｗｔ％の酢酸。
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：
【表３】
2021530433.tif 000033
吸光度の変化を２８０および３３０ｎｍで監視する。
オレウロペイン、ヒドロキシチロソール、およびベルバスコシドを、対応する標準との保持時間の比較によって同定する。濃度を検量線の補間によって計算する。
【００６３】
ローズマリー抽出物のフェノール化合物、ジテルペンのＨＰＬＣ分析
−カルノシン酸（ＣＡ）標準液の準備
標準液をＤＭＳＯ中に０．２ｍｇ／ｍｌ溶解する。得られた溶液を０．４５μｍナイロンメンブレンでろ過する。
−乾燥試料の準備
試料を１ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯ中に溶解する。得られた溶液を０．４５μｍナイロンメンブレンでろ過する。
−ＨＰＬＣ法
カラム：ＬｉＣｒｏｓｐｈｅｒ  １００−Ｃ１８（２５０ｘ４．０ｍｍ  内径）、平均粒子サイズ５μｍ。移動相の流れ：１ｍｌ／分。温度：３０℃。注入量：２０μｌ。
−移動相。  ５００ｍｌの水、９３５ｍｌのアセトニトリル、２．５ｍｌのリン酸、０．１６ｇの二水分補給物ＥＤＴＡ二ナトリウム塩。
吸光度の変化を、ＵＶ−ＶｉｓＤＡＤ検出器を使用して２３０で監視する。
−計算。カルノシン酸（ＣＡ）とカルノソール（ＣＯＬ）を、対応する標準との保持時間の比較によって同定した。
％カルノシン酸：（ＡｒｅａＣＡｓａｍｐｌｅ／ＡｒｅａＣＡＳｔｄ  ｘ（Ｗｔ  Ｓｔｄ／Ｗｔ  ｓａｍｐｌｅ）ｘＣＡ標準純度
ここで：
ＡｒｅａＣＡｓａｍｐｌｅ：試料ＣＡピーク面積
ＡｒｅａＣＡＳｔｄ：標準のＣＡピーク面積
Ｗｔ  ｓａｍｐｌｅ：試料重量（ｍｇ）
Ｗｔ  Ｓｔｄ：ＣＡ標準重量（ｍｇ）
％カルノソール：（ＡｒｅａＣＯＬｓａｍｐｌｅ／ＡｒｅａＣＯＬＳｔｄ  ｘ（Ｗｔ  Ｓｔｄ／Ｗｔ  ｓａｍｐｌｅ）ｘＣＯＬ標準純度ｘ０．９
ここで：
ＡｒｅａＣＯＬｓａｍｐｌｅ：試料ＣＯＬピーク面積
ＡｒｅａＣＯＬＳｔｄ：標準のＣＯＬピーク面積
Ｗｔ  ｓａｍｐｌｅ：試料重量（ｍｇ）
Ｗｔ  Ｓｔｄ：ＣＯＬ標準重量（ｍｇ）
【００６４】
ソフォラ・ジャポニカ抽出物のフェノール化合物、ケルセチンのＨＰＬＣ分析
−ケルセチン標準液の準備
標準液をＤＭＳＯ中に０．２ｍｇ／ｍｌ溶解する。得られた溶液を０．４５μｍナイロンメンブレンでろ過する。
−乾燥試料準備
試料を１ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯ中に溶解する。得られた溶液を０．４５μｍナイロンメンブレンでろ過する。
−ＨＰＬＣ法
カラム：ＬｉＣｒｏｓｐｈｅｒ  １００−ＲＰ１８（２５０ｘ４．０ｍｍ  内径）、平均粒子サイズ５μｍ。移動相の流れ：１．３ｍｌ／分。温度：５０℃。注入量：２０μｌ。
−移動相：メタノール：アセトニトリル：酢酸：水、１０：１０：５：７５の比率。アイソクラティックメソッド。
吸光度の変化をＵＶ−ＶｉｓＤＡＤ検出器を使用して２５９で監視する。
ケルセチンを対応する標準との保持時間の比較によって同定した。その濃度を検量線の補間によって計算する。
【００６５】
実施例２．  ヒトケラチノサイトに対するＵＶ放射および都市粒子状物質の影響に対する製剤１Ｂの抗酸化および細胞保護活性のインビトロ研究
生きた有機体を空気汚染物質に暴露し、これらはヒトの皮膚に重要な影響を及ぼす。空気汚染物質は、固体、液体、気体、粒子状物質（ＰＭ）である。これらは、皮下組織に到達するまで、または毛包や汗／皮脂細胞を介して皮膚に直接吸収される。急速な都市化と世界中での巨大なエネルギー消費の増加は、人々をますます多くの環境空気汚染にさらしている。体の最大かつ最も外部の器官を構成する皮膚は、これらの環境要因に対する物理的、化学的および免疫学的障壁として機能する。
【００６６】
空気汚染物質は、皮膚の抗酸化防御に対して作用する酸化ストレスの増加を通じて皮膚に有害な影響を及ぼす。フリーラジカルが生成され、酸素化された活性種が脂質に富む原形質膜と相互作用して、脂質過酸化反応カスケードを開始する。前記酸素化された活性種はまた、炎症誘発性メディエーターの放出を引き起こし、その結果、好中球分子が蓄積し、次に他の食細胞がさらにフリーラジカルを生成し、それが悪循環を引き起こす。さらに、空気汚染物質は、酸化的損傷によって正常な脂質機能、ＡＲＮ、および／またはヒトの皮膚タンパク質に深刻な変化を引き起こし、外因性の皮膚老化、皮膚アレルギーまたは接触皮膚炎、乾癬、座瘡、皮膚癌などの炎症状態を引き起こす。同様に、ヒトの皮膚は、多くの細胞タイプの機能と生存に影響を及ぼし、皮膚の老化を引き起こす主な要因と考えられている紫外線に繰り返しさらされている。ヒトの皮膚の急性紫外線曝露は、日焼け、色素沈着の変化、炎症、免疫抑制、皮膚結合組織の損傷を引き起こす。
【００６７】
最近の研究では、日光と空気汚染が相乗的に皮膚ストレスを引き起こし、酸化ストレスを加速し（活性酸素種の生成、過酸化、スクアレン過酸化の増加）、皮膚層角質からのビタミンＥの枯渇を増加させ、炎症反応を増加させ、皮膚癌のリスクさえ高める。最近の研究では、他の空気汚染物質（タバコの煙を含む）と組み合わされたＡタイプのＵＶ放射線（ＵＶＡ）が皮膚癌のリスクを大幅に高めることが示されている。
また、空気汚染物質は、光による損傷を悪化させること、および環境空気汚染の多い地域では特定のスキンケア戦略が必要であることも強調されている。
この実施例では、誘発された酸化ストレスに対する細胞応答を調査し、誘発された損傷を打ち消す製剤１Ｂの可能性を検証するために、ヒトケラチノサイト培養物を都市の粉塵物質およびＵＶＡ放射線に曝露した。
生細胞を顕微鏡下ビュルカーチャンバー内でカウントした。ＨａＣａＴ細胞を培地を含む９６ウェルプレートで一晩培養した。２４時間後、前記培地を抜き取り、４００μｇ／ｍｌの都市粉塵物質（ＵＤ）および０．００５ｗｔ％および０．００１ｗｔ％の量の製剤１Ｂを補充した新しい培地と交換した。
【００６８】
活性酸素種の蓄積（％ＲＯＳ）を、都市粉塵物質に暴露した後、生物学的レプリカで評価し、８つの実験的レプリカ（処理および対照）を使用した。２４時間のインキュベーション後、全てのウェルの培地をＰＢＳ混合物とＲＯＳ検出マスターに交換した。続いて、試料に６．９Ｊ／ｃｍ２の強度で２５分間ＵＶＡを照射した。照射していない対照は、この間ずっと暗所で保たれた。ＲＯＳ検出混合物の添加の２時間後、試料のＲＯＳ濃度を、細胞のない２つの対照ウェルを含む分光分析によって測定して、ブランク対照を得た。蓄積された細胞内ＲＯＳは、細胞質にある蛍光センサーと反応し、存在するＲＯＳ量に比例した量の蛍光生成物を生成する。蛍光定量化は、４９０ｎｍの波長励起と５２５ｎｍの波長発光で測定した。
並行して、都市粉塵物質およびＵＶＡ照射によって誘発された細胞死亡率を評価するために、ＲＯＳで測定したレベルを全ての特定の条件で生細胞量に正規化するために、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾールブロミド（ＭＴＴ）の代謝還元によって細胞生存率分析を実施した。ＭＴＴアッセイでは、代替方法検証のためのヨーロッパセンター（ＥＣＶＡＭ）のプロトコルＮｏ．１７に従った。
【００６９】
細胞生存率アッセイにおいて、結果は、対照試料と比較して、２４時間の製剤１Ｂ処理が、０．０１ｗｔ％以上の濃度でＨａＣａＴ細胞に有意な細胞毒性を示すのに対し、０．００２５ｗｔ％以下の濃度では有意な効果は観察されなかったことを示す。結果に従って、０．００１ｗｔ％および０．００５ｗｔ％の濃度をさらなる研究のために選択した。
この研究の結果は、都市粉塵物質をＵＶＡ放射線と共に用いると、未処理の対照試料と比較して、酸化ストレスを１３．２±０．８倍増加させたことを示している。０．００１ｗｔ％および０．００５ｗｔ％の濃度の製剤１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）で処理された試料は、ＲＯＳレベルをそれぞれ２５．４±７．２％および２９．３±６．２％有意に減少させた。全ての試料の基礎酸化ストレスレベルを除去すると、結果は、上記の環境要因にさらされた対照試料と比較して、それぞれ０．００１ｗｔ％および０．００５ｗｔ％の濃度での製剤１Ｂ処理が、都市粉塵物質およびＵＶＡ放射線酸化の影響から培養細胞を保護し、酸化ストレスをそれぞれ２７．３±７．８％および３１．５±６．７％低減させることを示している。この事実は図５に反映されている。
【００７０】
図５の棒グラフは、０．００１ｗｔ％および０．００５ｗｔ％の濃度の製剤１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）で処理され、４００μｇ／ｍｌ濃度で都市粉塵（ＵＤ）に２４時間暴露され、続いて２５分間ＵＶＡを照射したヒトケラチノサイト試料（ＨａＣａＴ）に蓄積されたＲＯＳを表す。データは、同じＵＤ量とＵＶＡ放射線に暴露された対照に関して正規化されている。＊はｐ値＜０．０５の統計的有意性を表す。
＊＊はｐ値＜０．０１の統計的有意性を表す。＊＊＊はｐ値＜０．００１の統計的有意性を表す。＊＊＊＊はｐ値＜０．０００１の統計的有意性を表す。
【００７１】
実施例３．  生きているヒトの皮膚外植片における製剤１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）の抗空気汚染影響活性のエクスビボ評価
この研究の目的は、汚染物質混合物で処理された後の生きているヒトの皮膚外植片に対する表１の製剤１Ｂの抗空気汚染活性の評価である。前記外植片を製剤１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）と重金属、炭化水素、ディーゼル粒子溶液でエクスビボ処理した後、マロンアルデヒド生化学的アッセイ、アリール炭化水素（ＡｈＲ）受容体免疫染色、メタロチオネインＭＴ−１Ｈ免疫染色、インターロイキン−１−アルファ（ＩＬ−１α）生化学的定量アッセイによって抗空気汚染活性を評価した。
１９の平均直径１２ｍｍのヒトの皮膚外植片は、白人の５６歳の女性の腹壁形成術によって得られた。前記外植片は、適切な雰囲気、温度、湿度条件の培地（ＢＩＯ−ＥＣ外植片培地）で生きたまま保たれた。
【００７２】
０日目に、２００μｇ／ｍＬの濃度の製品（製剤１Ｂ）を含むまたは含まない２ｍｌの培地中に前記外植片を配置した。対照試料はいずれの処理も受けなかった。前記培地を（試験する製品の有無にかかわらず）、汚染物質曝露後、１日目はウェル当たり１ｍｌ、２日目はウェル当たり２ｍｌの新鮮な培地で新しくした。
２日目に、前記外植片を皮膚外植片用の特別な培養プレートに配置し、ＰｏｌｌｕＢｏｘ（登録商標）システム内に配置した。３ｍｌの汚染物質溶液（重金属、炭化水素、ディーゼル粒子の混合物）を１時間半の間気化させた。ＰｏｌｌｕＢｏｘ（登録商標）を使用すると、雲の形で汚染物質を気化させて皮膚表面のみに接触させることができるため、生理学的状態を可能な限り再現することができる。
【００７３】
前記曝露中、対照試料（汚染物に曝露されない）を、ウェル当たり９００μｌのＨＢＢＳ溶液を含む１２ウェルの培養プレートに配置した。前記曝露後、全ての外植片を、標準条件でインキュベーター内に、ウェル当たり２ｍｌの新鮮なＢＥＭで新たに配置した。
０日目（Ｄ０）に、バッチＴ０からの３つの外植片を収集し、２つの部分に切断した。１つの部分は緩衝ホルマリンに入れ、他の部分は−８０℃で凍結した。
３日目に、各バッチの３つの外植片を収集し、０日目の外植片と同じ方法で処理し、各バッチの２ｍｌの培地を収集して、ＭＤＡおよびＩＬ１αアッセイのために−８０℃で保存した。
【００７４】
組織学的処理：２４時間の緩衝ホルマリン固定後、試料を脱水し、組織処理装置Ｌｅｉｃａ  ＴＰ１０２０でパラフィンを含浸させた。試料は、パラフィン包接ステーションＬｅｉｃａ  ＥＧ１１６０で固定した。Ｍｉｎｏｔ  Ｌｅｉｃａ  ＲＭ  ２１２５ミクロトームを使用して厚さ５μｍの切開を行い、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）ガラス組織プレートに切開片を取り付けた。
顕微鏡観察は、ライカＤＭＬＢまたはオリンパスＢＸ４３顕微鏡を使用して実施した。ＣｅｌｌＤ保存ソフトウェアを備えたオリンパスＤＰ７２数値カメラを使用して画像をデジタル化し、９〜１２枚の画像をバッチで分析した。
【００７５】
ＭＤＡ生化学的アッセイ
３日目に、前記培地中のＭＤＡ含有量を測定した。バッチごとに４つの外植片を分析した。
ＭＤＡアッセイは、改良されたＴＢＡＲＳアッセイ法を使用して実施した。ＴＢＡＲＳ溶液（チオバルビツール酸、塩酸、およびトリクロロ酢酸）を添加し、８０℃の水浴中で１５分間インキュベートすることにより、ＨＢＳＳ培地（ハンクス食塩水）中でＭＤＡを検出した。ＭＤＡを液体／液体ブタノール抽出によって抽出した。ブタノール中のＭＤＡを、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  Ｐｒｏマイクロプレートリーダーを使用して、５１５ｎｍの励起波長と５５０ｎｍの発光波長で分光蛍光光度法によって測定した。ＭＤＡ濃度をＭＤＡナノモル／ｍｌ培地で表す。
【００７６】
ＡｈＲ免疫染色
ＡｈＲ免疫染色は、ＰＢＳ−ＢＳＡ  ０．３％−Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０５％で１：５０に希釈した抗ＡｈＲモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｒｅｆ．ＭＡ１−５１４、ｃｌｏｎ  ＲＰＴ１）を使用してパラフィン切開で１時間、周囲温度で、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）  ＲＴＵ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＶＥＣＴＯＲストレプトアビジン／ビオチンシステムを使用して行い、バイオレットペルオキシダーゼ基質であるＶＩＰ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｒｅｆ．ＳＫ４６００）を使用して明らかにした。
【００７７】
ＭＴ−１Ｈ免疫染色
ＭＴ−１Ｈ免疫染色は、抗ＭＴ−１Ｈモノクローナル抗体（Ｄａｋｉ、ｒｅｆ．Ｍ０６３９、ｃｌｏｎ  Ｅ９）を使用して、ＰＢＳ−ＢＳＡ  ０．３％−Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０５％で１：２００に希釈したパラフィン切開で１時間、周囲温度でＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）ＲＴＵ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＶＥＣＴＯＲストレプトアビジン／ビオチンシステムを使用して行い、紫色のペルオキシダーゼ基質であるＶＩＰ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｒｅｆ．ＳＫ４６００）を使用して明らかにした。
【００７８】
ＩＬ１−α生化学的アッセイ
ＩＬ１−α生化学的アッセイは、ヒトＩＬ１−αＥＬＩＳＡキット（Ｃａｙｍａｎ）を使用して実施した。キットサプライヤーの指示に従って、培地とＩＬ１−α標準を、固定化されたＩＬ１−α抗体を含むウェル中のＩＬ１−αに選択的に結合するアセチルコリンエステラーゼ：Ｆａｂ’（ＡＣｈＥ／Ｆａｂ’）結合抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。前記ウェルを洗浄した後、４０分間ＡＣｈＥ基質を含む溶液で反応を明らかにした。Ｔｅｃａｎ  Ｍ２００ＰｒｏマイクロプレートリーダーとＭａｇｅｌｌａｎ  ７ソフトウェアを使用して、４１２ｎｍで吸光度を測定した。
【００７９】
結果
ＭＤＡ
マロンアルデヒド（ＭＤＡ）は、細胞膜の脂質過酸化反応で生成される生成物である。酸化ストレス（ＵＶＡ、汚染物質、重金属、農薬など）によって誘発されるフリーラジカルは、多価不飽和脂質を分解し、ヒドロペルオキシドを生成する。その結果、フリーラジカル中間体とアルデヒド、特にＭＤＡが形成される。
ＭＤＡは、脂質過酸化による特定の一次および二次生成物の分解によって形成されるさまざまな低分子量の最終生成物の１つである（２５）。
図６に見ることができるように、３日目に、製剤１Ｂは汚染物質混合物によって生成されるＭＤＡの増加を１０３％＊（ｐ＜０．０５）有意に減少させる。これは、製剤１Ｂが汚染物質によって生成される酸化ストレスを完全に抑制することを意味する。
【００８０】
ＩＬ１−α
ＩＬ１−αは免疫反応と炎症反応に関与している。培地中に放出されたインターロイキンの濃度は、製剤１Ｂの保護活性を評価するために、汚染物質への曝露によって誘発された炎症反応を測定するために使用される。
図７に見られ得るように、製剤１Ｂは、汚染物質混合物への曝露後に放出されるＩＬ１−α量を８２％＊（ｐ＜０．０５）有意に減少させる。
【００８１】
ＡｈＲ発現
アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）は、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）、オゾン、植物ポリフェノールを含む、いくつかの化合物への曝露後の分子応答に関与する転写因子である（２６、２２）。通常の状況では、ＡｈＲは、ＨＳＰ９０、ｃ−ｓｃｒ、およびその他の付随するタンパク質からなるタンパク質複合体に結合した細胞質中にある。前述の汚染物質の存在下で、ＡｈＲは前記タンパク質複合体から解離し、核に移行し、そこで、生体異物に応答して特異的に活性化される促進配列を介してＡＲＮＴと二量体化する。ＡｈＲの標的遺伝子は、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）１ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、およびＣＹＰ１Ｂ１である。並行して、多環芳香族炭化水素を含む空気汚染物質は、ＮＦ−ｋＢ  ＤＮＡに対するリガンド活性の増加を刺激することができ、次にそれがＡｈＲをコード化する遺伝子を刺激することが可能となる（２７、２８）。
【００８２】
ＡｈＲは、ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲハンス細胞、およびＴ細胞を含む、いくつかの細胞タイプによって発現される（２９）。
前記空気汚染が皮膚の損傷を引き起こすメカニズムの１つは、前述のようにＡｈＲの活性化によるものである。
図８に見られ得るように、汚染物質曝露の３日目は、ＡｈＲ発現の６０％＊＊（ｐ＜０．０１）の有意な増加を誘発する。製剤１Ｂの適用は、汚染物質のみに曝露された外植片と比較して、ＡｈＲ発現の８７％＊＊（ｐ＜０．０１）の有意な減少を引き起こす。
【００８３】
ＭＴ−１Ｈ発現
メタロチオネインタンパク質（ＭＴ−１Ｈ）は、重金属曝露と酸化ストレスのマーカーとして使用される。
メタロチオネイン（ＭＴ）は、組織に広く分布しているタンパク質のグループであり、金属代謝、フリーラジカル捕捉を調節し、免疫反応にも関与する。メタロチオネイン１（ＭＴ−Ｈ１）は、低分子量（６ｋＤａ）で芳香族アミノ酸を含まない、熱の下で安定なユニークなタンパク質である。金属結合との親和性が高く、亜鉛や銅などの必須金属やカドミウムや水銀などの他の有害金属によって誘発されるため、必須金属の恒常性や重金属の無害化に重要な役割を果たしていると考えられている。
【００８４】
図９に見られ得るように、ＭＴ−Ｈ１マーカーは汚染物質の存在にもかかわらず増加しなかった。これは、製剤１Ｂが皮膚に対して保護効果を示すことを示唆している。
曝露３日目に、汚染物質はＭＴ−Ｈ１発現の６３％＊＊（ｐ＜０．０１）の増加を引き起こした。製剤１Ｂの適用は、汚染物質のみに曝露された外植片と比較して、ＭＴ−Ｈ１発現の４０％＊＊（ｐ＜０．０１）の有意な減少を引き起こした。
【００８５】
実施例４．  製剤１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）の経口急性毒性測定
この研究の目的は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙタイプの雌性ラットに適用された「急性毒性クラス法」（限界試験、ＯＥＣＤガイドラインｎｏ．４２３）によって製剤１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）の経口急性毒性を評価することである。死亡を引き起こさないと考えられたため、初期用量レベルは２０００ｍｇ／ｋｇ体重であった。この方法により、化学製品の毒性を決定するために、世界調和システム（ＧＨＳ）に従って製剤１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）を分類することが可能になる。
【００８６】
研究の要約。前記「限界試験」は、２０００ｍｇ／ｋｇ体重の初期用量で段階的に実施される手順に基づいており、６匹の動物において２段階（１段階当たり３匹）で実施される。次の用量は３００、５０、および５ｍｇ／ｋｇ体重となる。１４日間の観察期間の後、最初の段階で投与された製剤１Ｂによる死亡率を使用して、その方法を次の用量で継続するか否かを決定し、国際分類に従って物質を分類する。次の用量は、前の用量で投与された動物の生存率が決定されるまで投与されない。
観察期間中に死亡した動物はいないため、製剤１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）は、物質および混合物の世界調和分類システムのカテゴリー５または「非分類」に分類できると結論付けることができる。
【００８７】
実施例５．  皮膚に対する空気汚染の影響の予防および／または治療に使用するための、本発明の組成物１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）を含む栄養補助食品の有効性の機器による臨床評価
本発明の組成物の効果を、１００人の女性で１２週間使用した後、環境汚染物質からの保護剤として、単施設、ランダム、二重盲検、プラセボ対照アッセイで研究した。
参加者全員に毎日使用するクリームを提供した。前記クリーム（プラセボおよび本発明の組成物１Ｂ）は、匿名の包装で供給された。データは、アッセイの２、４、８、および１２週目に集めた。ａ）唾液中の総抗酸化能およびｂ）酸化的皮膚損傷について研究した。
【００８８】
さらに、皮膚の老化に関連するいくつかのパラメーターについて研究した：ａ）皮膚の水分補給、ｂ）皮膚の明るさ、ｃ）皮膚の弾力性、ｄ）経表皮の水分喪失、ｆ）皮膚の色素沈着、ｇ）皮膚の血清含有量、およびｈ）皮膚のプロフィロメトリー（しわ）。
参加者には、以下の要件を尊重するように求めた。
−研究開始前の少なくとも２日間は化粧品を使用しないこと。
−全ての研究期間中、（自然にまたはＵＶ人工光源を使用して）日光浴をしないこと。
−供給された製品のみを使用し、他の化粧品は使用しないこと。
研究から離脱する条件は、個人の高い割合での副作用または不耐性反応の存在であった。可能な離脱の交代はなかった。
【００８９】
選択基準は、３５〜６５歳の健康な女性、５０％がアジア人、５０％が白人、５０％が敏感肌でかつ１日２時間以上屋外で仕事をしており、適切な方法で同様の研究に参加していない女性であった。彼女らは、研究中の製品に干渉する可能性のある製品を使用しないことを受け入れ、適切に保護されていない限り、研究中に日光浴をしない（またはソーラーキャビンを使用しない）ことを受け入れ、研究中に避妊方法を変更せず、研究規則を順守する準備ができており、供給された製品と中性石鹸を使用する準備ができていた。
選択基準を満たさなかった全ての個人を除外し、またはアトピー性または過敏性の皮膚、化粧品アレルギー、石鹸または皮膚保護薬もしくは日焼け止め薬に対するアレルギーを持っていた人、ならびに研究の前の２年間にレーザーまたは化学剥離治療を受けた人を除外し、研究開始日に顔に化粧品または医薬品を使用した個人、栄養障害、食物アレルギーまたは不耐性のある個人、ＡＩＤＳ、ＨＩＶなどの免疫抑制疾患のために免疫システムが変化した個人または免疫抑制薬を使用したもの、前記製品に干渉することが知られている薬理学的治療を受けていたものまたは代謝に影響を与えるもの、同時にさまざまな重篤な疾患に罹っているもの、薬物中毒、アルコール依存症、妊娠中または授乳中の女性、法律により（管理下、公的または私的機関に入院中、調査研究に対する別の理由で、または投獄された）個人、言語の問題、知的発達、または脳機能障害のために研究者とコミュニケーションまたは協力することができなかったもの、研究者が特定したその他の理由によるものを除外した。
【００９０】
前記製品の使用に一時的に関連する好ましくない症状または疾患を伴うそのような医学的出来事を、それが前記製品の使用によって引き起こされたか否にかかわらず、有害事象として定義した。前記有害事象は、それらが解決するまで監視された。全ての研究の間、同じ皮膚科研究者が各個人に割り当てられた。製品の耐性と、それぞれの不快感が、詳細な方法で研究され、全ての可能な不耐性反応と、予期しない影響が通知された。副次的効果が重度に分類された場合、個別の除外が行われ、その副次的効果はその解決まで監視された。
各研究個人は、研究中に他の個人と関連付けることができない個人コードで識別された。
【００９１】
ヘルシンキ宣言（１９６４）によると、個人はいつでも理由を問わず研究から離脱する権利があり、それについて評価と分類がなされることになる。また、研究者は、正当な理由でいつでも個人を除外することができる。ただし、離脱数が多い場合の結果解釈の問題を回避するために、離脱は可能な限り回避される。前記研究中に交代した個人はいなかった。
有害事象のある全ての個人は、研究に関連しているか否かにかかわらず、観察期間がすでに終了している場合でも、事象が安定または解決するまで、進展を判定するために監視された。
前記製品は、朝食の３０分前に１日１回、ハードゼラチンカプセルの形（青Ｎ°０）で供給された。
【００９２】
開始時との比較を含め、データ分布に基づく適切な統計モデルが使用された。ｐ＜０．０５の値は、統計的に有意であるとみなした。個人は、研究の４週目と１２週目に質問票に回答し、日報（０日目から２７日目）に回答する。
活性生成物を含むカプセルは、２５０ｍｇの本発明の組成物（実施例１の１Ｂ）と１２０ｍｇの微結晶性セルロースで構成されていた。
プラセボカプセルは、２５０ｍｇのマルトデキストリンと１２０ｍｇの微結晶性セルロースで構成されていた。
前記製品は周囲温度（３０℃未満）で保存され、直射日光、熱および水から保護された。
【００９３】
医療統計学者は、Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｓｅｒｖｅｒ  ２００８  Ｒ２  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＰ１  ６４ｂｉｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、米国）のＰＡＳＳ  ２００８ソフトウェア（ＰＡＳＳ，  ＬＬＣ．ケイズビル、ユタ州、米国）を使用して、限定されたランダム化リストを生成し、安全な場所に保管した。ランダム化された製品（またはプラセボ）シーケンスは、１：２の分布比を使用して１０％の最大偏差を使用して層化された。分布は不透明で閉じた封筒に隠されており、研究の開始時に各個人に割り当てられた番号に基づいて治療分布を示す。独立した技術者が、各個人に割り当てられた番号に従ってアクティブまたはプラセボを供給した。
製品の有効性を評価するために、研究の開始から４週目と１２週目に各ユーザーに主観的な評価アンケートを提供し、以下の測定も実行した。
【００９４】
皮膚の水分補給：
汚染はバリアとしての皮膚の機能を変化させ、皮膚が乾燥して敏感になる原因となる。したがって、研究中の経表皮の水分損失として、皮膚の水分補給を評価した。
皮膚の水分補給評価は、右頬の５点で測定され、水の誘電率に基づいて、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（登録商標）  ＣＭ  ８２５法が使用された（Ｃｏｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ，  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＧｍｂＨ）。それは皮膚の水分量の関数として静電容量の変化を測定するプローブを使用する。電界が最も外側の皮膚層に浸透し、誘電性が決定される。
図１０は、本発明の組成物１Ｂが、研究の開始から皮膚の水分補給の有意な増加をもたらしたことを示している（研究の開始、Ｔ０に対する水分補給の変化％として測定される）。
さらに、図１１は、本発明の組成物１Ｂが表皮バリアを強化し、表皮を通過する水分損失を有意に減少させたことを示している（研究の開始、Ｔ０に対する水分補給の変化％として測定される）。本発明の組成物１Ｂで処置された患者の７０％は、皮膚感覚の改善を認識し、彼女らの７４％は、皮膚が保護されている感覚を得た。さらに、本発明の組成物１Ｂで処置された患者の７６％は、彼女らの皮膚がより水分補給されていると感じた。
【００９５】
皮脂の評価：
汚染に暴露された皮膚は、より多くの皮脂量を分泌し、炎症の増加と共に、より多くの座瘡の発生を生じる。
Ｓｅｂｕｍｅｔｅｒ（登録商標）装置（Ｓｅｂｕｍｅｔｅｒ  ８１５，  Ｃｏｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ  ＧｍｂＨ）を使用した。この方法は、原則として測光を使用する。皮脂がカセットに入った６４ｍｍ２の合成テープ中に集められ、その後、カセット測定ヘッドが前記装置の開口部に挿入され、そこで太陽電池が透明度を測定した。光透過率は、測定された表面積の皮脂含有量を表す。マイクロプロセッサが結果を計算し、μｇ皮脂／ｃｍ２として示した。
図１２は、本発明の組成物１Ｂが、汚染物曝露下で生成された皮脂分泌をいかに減少させたかを示している。さらに、処置を受けた個人の６８％が、毛穴の拡張や黒ずみの減少などの皮膚の欠陥の改善を認識した。
【００９６】
皮膚の堅さと弾力性：
皮膚の堅さと弾力性の測定は、皮膚を機械的に変形させる負圧を生成する吸引法（Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）法）を使用して頬の皮膚で実施された。４５０ｍｂａｒの負圧が発生し、２秒間プローブ開口部上に皮膚を引き付け、２秒後に再び解放した。前記プローブの侵入深さは、光学的検出システム（非接触）によって決定された。光学システムは、光源と光受容体、および送信機から受容体に光を投射する２つの対向するプリズムで構成されている。光の強さは、皮膚の侵入深さによって変化する。負圧に対する皮膚の抵抗とその初期位置に戻る能力は、評価中にリアルタイムで曲線（侵入深さ（ｍｍ／時間単位））で表される。使用した装置は、ＭＰＡ  ５８０  Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）（Ｃｏｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ，  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＧｍｂＨ）である。選択された生体力学的指標は以下のとおりであった。
【００９７】
Ｒ２：皮膚全体の弾力性。最大振幅と再変形する皮膚能力の間の部分（ブリュット弾性）
Ｒ０：最大の皮膚の伸展性（色調／堅さ）パラメーターが低いほど、変形に対する皮膚の抵抗が高くなる。
パラメーターＲ０が低いほど、変形に対する皮膚の抵抗が高くなる。このように、Ｒ０値の減少は、絶対値では、皮膚の堅さの増加を意味する。
図１３は、本発明の組成物１Ｂが、プラセボ処置と比較して、総皮膚弾性の有意な増加をいかにもたらすかを示している（処置の１４日目および２８日目で得られたデータ）。
本発明の組成物１Ｂはまた、処置の１４日目および２８日目で得られたデータにおいて、図１４で理解できるように、皮膚の堅さの有意な増加をもたらした（皮膚の堅さの増加を表すとして、Ｒ０絶対値の減少として測定される）。
さらに、処置の月の主観的評価質問票において、本発明の組成物１Ｂを服用した個人の７０％が、皮膚の堅さの増加およびより健康な顔色を認識したことが観察された。
【００９８】
皮膚の色と明度：
汚染はまた、色素沈着障害の増加の原因である。実際、交通に由来する汚染、または煤は、皮膚のしみを最大２０％増加させる可能性がある。
皮膚の明度と皮膚の色は、ＣＭ  ７００Ｄ分光光度計／比色計（コニカミノルタ）を使用して測定した。ＩＴＡ値（その英語Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｔｏｐｏｌｏｇｙ  Ａｎｇｌｅの頭字語から）は、皮膚の色素沈着度を定義し、分光光度計で得られたＬ値とｂ値（Ｌ、ａ、ｂ色空間を形成）を使用して、式ＩＴＡ＝［ＡｒｃＴａｎ（Ｌ−５０）／ｂ］１８０／πを用いて計算した。
皮膚の明度は、分散光に対する反射光の比率として定義された輝度値を使用して定義した（反射光が大きいほど輝度が高くなり、しわのある表面が多いほど分散する光が多くなり、輝度値が小さくなる）。
前記ＩＴＡ値は色素過剰領域で測定したが、明度は頬で測定した。
【００９９】
皮膚の色素沈着含有量は、ＭＸ１８  Ｍｅｘａｍｅｔｅｒ（Ｃｏｕｒａｇ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ）を用いて測定した。Ｍｅｘａｍｅｔｅｒ（登録商標）  ＭＸ  １８プローブは、３つの特定の波長で発光する。受光器は、皮膚によって反射された光を測定する。放出される光の量が既知であるとすると、皮膚に吸収される光を計算することができる。メラニンは特定の波長で測定される。
図１５は、プラセボ処置に対する本発明の組成物１Ｂでの処置の１４日後および１８日後の皮膚の明度（頬の輝度値として測定される）の研究の開始に関する増加（％）を反映している。
図１６は、プラセボ処置と比較した、本発明の組成物１Ｂでの処置の１４日後および２８日後の色素沈着過剰領域で測定されたＩＴＡ値の増加（％）を表す。
【０１００】
皮膚パーフィロメトリー（粗さ）：
疫学研究は、環境汚染への曝露がより大きなしわの発現度と関連していることを証明している。
マイクロトポグラフィック３Ｄイメージングシステム（Ｐｒｉｍｏｓｌｉｔｅ  ＧＦＭｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ，  ＧｍｂＨ）を使用して、目尻のしわ領域の柔軟性（ｒａパラメーター）としわの深さを測定した。皮膚表面は、３Ｄ画像を生成するアルゴリズムを使用して再構築された。個人の再配置は、再配置装置（Ｃａｎｆｉｅｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して確実に行われた。一方、画像結合の前後は、画像分析ソフトウェアの重複する特性によって保証された。図１７および１８において理解されるように、本発明の組成物１Ｂの使用は、より柔らかく、より均一な皮膚を生成したが、しわおよび線の深さは著しく減少した。
【０１０１】
生化学的分析
以下の特性は、標準的な生化学的方法を使用して測定された。
ＦＲＡＰ（その英語Ｆｅｒｒｉｃ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｐｏｗｅｒの頭字語から）およびＭＤＡアッセイ（皮膚の角質除去）による総抗酸化能力
【０１０２】
皮膚の角質除去
Ｃｏｒｎｅｏｆｉｘ（登録商標）シート（Ｃａｕｒａｇｅ  ＋  Ｋｈａｚａｋａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＧｍｂＨ）を使用して皮膚層を採取した。この技術は、角質層のいくつかの層を集めることを可能にする。層２と３を収集し、次のＦＲＡＰ分析のために−８０℃で保存した。マロンアルデヒド（ＭＤＡ）と４−ヒドロキシノネナールは、脂質過酸化の２つの主要な生成物であるため、生体系でのそれらの濃度をリポ過酸化物損傷指数として使用できる。リポ過酸化物レベルを決定するために、Ｎ−メチル−２−フェニルインドール発色団のＭＤＡとの４５℃および酸性ｐＨでの反応能力に基づいて５８６ｎｍに吸収ピークを持つ発色団を生成するＥｒｄｅｌｍｅｉｅｒら（１９９８）の方法：
【化１】
2021530433.tif 000034
リポ過酸化レベルは、酸化促進剤（ＣｕＳＯ４  ５００μＭ）を使用した酸化プロセスによって生成された不安定なヒドロペルオキシド分解誘導後に測定された。
【０１０３】
ＦＲＡＳ（唾液第二鉄抗酸化還元剤）：
前記ＦＲＡＳのアッセイは、システムの還元力の直接的な尺度であり、酸化的損傷に抵抗する有機体の能力の間接的な値である。ＴＰＴＺ−Ｆｅ（ＩＩ）錯体の酸性ｐＨでのＦｅ（ＩＩＩ）錯体への還元は、濃い青色を特徴とする。５９５ｎｍでの溶液の吸光度を測定することで、反応を監視する。収集された吸光度は、既知のＦｅ（ＩＩ）の検量線の吸光度と比較される。結果は、混合酸化防止剤の総還元能力に正比例する。
図２０は、本発明の組成物１Ｂ（ＺｅｒｏＰｏｌｌｕｔｉｏｎ）がいかにＦＲＡＳ増加をもたらしたかを示すため、その使用の２８日目で抗酸化能を示し、８４日目でさらに大きな抗酸化能を示す。
以下に、これらの測定結果を表４に要約する。
【表４】
2021530433.tif 000035
【０１０４】
参考文献
（１）Ｋｒｕｔｍａｎｎ  Ｊ．ら  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  （ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ）  ｓｋｉｎ  ａｇｉｎｇ．（環境によって誘発される（外因性の）皮膚の老化）  Ｈａｕｔａｒｚｔ．２０１６  Ｆｅｂ；  ６７（２）：９９−１０２．
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（４）Ｋｉｍ，  Ｊ．ら  Ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｏｆ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ａｒｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  ｂｙ  ｏｕｔｄｏｏｒ  ａｉｒ  ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ．（アトピー性皮膚炎の症状は、屋外の空気汚染の影響を受ける。）  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３２，  ４９５-４９９  （２０１３）．
（５）Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｏｇａａｒｄ，  Ｅ．Ｈ．ら  Ｃｏａｌ  ｔａｒ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＡＨＲ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｋｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．（コールタールは、アトピー性皮膚炎においてＡＨＲ依存性の皮膚バリア修復を誘発する。）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２３，  ９１７-９２７  （２０１３）．
（６）Ｋｉｍ，  Ｈ．Ｏ．，  Ｋｉｍ，  Ｊ．Ｈ．，  Ｃｈｕｎｇ，  Ｂ．Ｙ．，  Ｃｈｏｉ，  Ｍ．Ｇ．  ；  Ｐａｒｋ，  Ｃ．Ｗ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｋｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．（慢性炎症性皮膚疾患の患者におけるアリール炭化水素受容体の発現の増加）  Ｅｘｐ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２３，  ２７８-２８１  （２０１４）．
（７）ＤｉＭｅｇｌｉｏ，  Ｐ．ら  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄａｍｐｅｎｓ  ｔｈｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．（アリール炭化水素受容体の活性化は、炎症性皮膚状態の重症度を弱める。）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４０，  ９８９-１００１  （２０１４）．
（８）Ｊｅａｎ  Ｋｒｕｔｍａｎｎ，  Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ  Ｍｏｙａｌ，  Ｗｅｉ  Ｌｉｕ，  Ｓａｎｊｉｖ  Ｋａｎｄａｈａｒｉ，  Ｇｅｕｎ−Ｓｏｏ  Ｌｅｅ，  Ｎｏｐｐａｋｕｎ  Ｎｏｐａｄｏｎ，  Ｌｅｉｈｏｎｇ  Ｆｌｏｒａ  Ｘｉａｎｇ  ｙ  Ｓｏｐｈｉｅ  Ｓｅｉｔe．  “Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｎｅ：  ｉｓ  ｔｈｅｒｅ  ａ  ｌｉｎｋ？”（「汚染と座瘡：関連性はあるか？」）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ，  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．  Ｍａｙ  ２０１７
（９）Ｊｕ  Ｑ，  Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓ  ＣＣ，  Ｘｉａ  Ｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｎｅ：  Ｃｈｌｏｒａｃｎｅ．（環境汚染と座瘡：クロロアクネ）  Ｄｅｒｍａｔｏ−ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．  ２００９；１（３）：１２５−１２８
（１０）Ｖｉｅｒｋｏｌｅｒ  Ａら  Ａｉｒｂｏｒｎｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ  ｓｋｉｎ  ａｇｉｎｇ，（空中浮遊粒子曝露と外因性皮膚老化、）  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．      Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １３０  （１２）  （２０１０）  ２７１９-２７２６．
（１１）Ｈｕｌｓ  Ａら  Ｔｒａｆｆｉｃ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｉｒ  Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆａｃｉａｌ  Ｌｅｎｔｉｇｉｎｅｓ：  Ｆｕｒｔｈｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  Ｃａｕｃａｓｉａｎｓ  ａｎｄ  Ａｓｉａｎｓ．（交通関連の空気汚染は顔面レンチギンの発達に寄与する：白人とアジア人からのさらなる疫学的証拠）  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２０１６  Ｍａｙ；  １３６（５）：１０５３−６．
（１２）Ｗｅｎｇ，  Ｚｕｙｉら  Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  Ｉｓ  Ｍｏｒｅ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｈａｎ  Ｃｒｏｍｏｌｙｎ  ｉｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ．（ケルセチンは、ヒト肥満細胞のサイトカイン放出の遮断においてクロモリンよりも効果的であり、ヒトの接触性皮膚炎および光線過敏症を抑制する。）  Ｅｄ．  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｔａｕｂｅ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７．３  （２０１２）：  ｅ３３８０５．  ＰＭＣ．  Ｗｅｂ．  １５  Ｓｅｐｔ．  ２０１７．
（１３）Ｓｉｍ，  Ｈ．Ｓ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｓ．Ｓ．，  Ａｃｅｔｏｓｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａ−ＭＳＨ−  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｌａｎｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ．（アセトシドは、アデニルシクラーゼの不活性化により、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるα−ＭＳＨ誘発メラニン産生を阻害する。）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００９．  ６１：  ｐ．  １３４７−１３５１．
（１４）Ｙｏｕｎｇ−Ｏｋ  Ｓｏｎａ，  Ｓ．−Ａ．Ｌ．ｅ．ａ．，  Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｂ１６Ｆ１０  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＥＲＫ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．（アセトシドは、ＥＲＫの活性化とチロシナーゼのダウンレギュレーションを通じてＢ１６Ｆ１０細胞におけるメラニン形成を阻害する。）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２０１１．  ６３：  ｐ．  １３０９−１３１９．
（１５）Ｍａｎｃｅｂｏ  ＳＥ，  Ｗａｎｇ  ＳＱ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ａｍｂｉｅｎｔ  ａｉｒ  ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓｋｉｎ  ｈｅａｌｔｈ．（皮膚の健康に対する周囲の空気汚染の影響を認識する。）  Ｊ  Ｅｕｒ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．  ２０１５  Ｄｅｃ；２９（１２）：２３２６−３２．
（１６）Ｍｕｌｅｒｏ−Ｎａｖａｒｒｏ  Ｓ，  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌｇｕｅｒｏ  ＰＭ．  Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ａｒｙｌ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．（アリール炭化水素受容体または生物学の新しいトレンド）  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．
（１７）Ａｂｅｌ  Ｊ，  Ｈａａｒｍａｎｎ−Ｓｔｅｍｍａｎｎ  Ｔ．  Ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｃｓ  ｏｆ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．（アリール炭化水素受容体生物学の分子基礎の紹介）  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２０１０  Ｎｏｖ；３９１（１１）：１２３５−４８．
（１８）Ｋｒｕｔｍａｎｎ  Ｊ，  Ｊｕｘ  Ｂ，  Ｌｕｅｃｋｅ  Ｓ，  Ｆｒｉｔｓｃｈｅ  Ｅ，  Ａｂｅｌ  Ｊ，  Ｅｓｓｅｌ  Ｃ，  Ｒａｎｎｕｇ  Ａ．  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｒｙｌｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＡｈＲ−）  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｓｋｉｎ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．（皮膚のメラニン形成におけるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ−）シグナル伝達の関与）  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００８；１２８：Ｓ２２
（１９）Ｍｏｒｉｔａ  Ａ，  Ｔｏｒｉｉ  Ｋ，  Ｍａｅｄａ  Ａ，  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｙ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｓｍｏｋｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｓｋｉｎ  ａｇｉｎｇ．（タバコの煙が誘発する皮膚の早期老化の分子基礎）  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｙｍｐ  Ｐｒｏｃ．  ２００９  Ａｕｇ；１４（１）：５３−５．
（２０）Ｍｕｒｐｈｙ  ＫＡ，  Ｖｉｌｌａｎｏ  ＣＭ，  Ｄｏｒｎ  Ｒ，  Ｗｈｉｔｅ  ＬＡ．  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．（アリール炭化水素受容体とレチノイン酸経路の間の相互作用は、ケラチノサイトにおけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−１の発現を増加させる。）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００４  Ｊｕｎ  １１；２７９（２４）：２５２８４−９３．
（２１）Ｌｕｅｃｋｅ  Ｓ，  Ｂａｃｋｌｕｎｄ  Ｍ，  Ｊｕｘ  Ｂ，  Ｅｓｓｅｒ  Ｃ，  Ｋｒｕｔｍａｎｎ  Ｊ，  Ｒａｎｎｕｇ  Ａ．  Ｔｈｅ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＡＨＲ），  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．（ヒトメラニン形成の新規調節因子であるアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ））  Ｐｉｇｍｅｎｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．  ２０１０  Ｄｅｃ；２３（６）：８２８−３３．
（２２）Ａｆａｑ  Ｆ，  Ｚａｉｄ  ＭＡ，  Ｐｅｌｌｅ  Ｅ，  Ｋｈａｎ  Ｎ，  Ｓｙｅｄ  ＤＮ，  Ｍａｔｓｕｉ  ＭＳ，  Ｍａｅｓ  Ｄ，  Ｍｕｋｈｔａｒ  Ｈ．  Ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ａｎ  ｏｚｏｎｅ  ｓｅｎｓｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ．（アリール炭化水素受容体は、ヒトの皮膚のオゾンセンサーである。）  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２００９  Ｏｃｔ；１２９（１０）：２３９６−４０３．
（２３）Ｏｎｏ  Ｙ，  Ｔｏｒｉｉ  Ｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈｅ  Ｅ，  Ｓｈｉｎｔａｎｉ  Ｙ，  Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｅ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｍ，  Ｓｈｉｒａｋａｔａ  Ｙ，  Ｈａａｒｍａｎｎ−Ｓｔｅｍｍａｎｎ  Ｔ，  Ａｂｅｌ  Ｊ，  Ｋｒｕｔｍａｎｎ  Ｊ，  Ｍｏｒｉｔａ  Ａ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｓｍｏｋｅ  ｅｘｔｒａｃｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．（タバコ煙抽出物誘発マトリックスメタロプロテイナーゼ−１の発現におけるアリール炭化水素受容体の役割）  Ｅｘｐ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２０１３  Ｍａｙ  ２２（５）：３４９−５３．
（２４）Ｈｉｄａｋａ  Ｔ，  Ｏｇａｗａ  Ｅ，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ＥＨ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ，  Ｆｕｎａｙａｍａ  Ｒ，  Ｎａｇａｓｈｉｍａ  Ｔ，  Ｆｕｊｉｍｕｒａ，  Ｔ，  Ａｉｂａ  Ｓ，  Ｎａｋａｙａｍａ  Ｋ，  Ｏｋｕｙａｍａ  Ｒ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｍ．  Ｔｈｅ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＡｈＲ  ｌｉｎｋｓ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ａｉｒ  ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ａｒｔｅｍｉｎ．（アリール炭化水素受容体ＡｈＲは、神経栄養因子アルテミンの誘導を介してアトピー性皮膚炎と空気汚染を関連付ける。）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１７  Ｊａｎ；１８（１）：６４−７３
（２５）Ｊａｎｅｒｏ  Ｄ．Ｒ．  Ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ａｎｄ  ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ  ａｃｉｄ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｎｄｉｃｅｓ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｊｕｒｙ．（脂質過酸化および過酸化組織損傷の診断指標としてのマロンジアルデヒドおよびチオバルビツール酸反応性）  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．  １９９０；  ９（６）：５１５−４０．
（２６）Ｈａａｒｍａｎｎ−Ｓｔｅｍｍａｎｎ  Ｔ，  Ａｂｅｌ  Ｊ，  Ｆｒｉｔｓｃｈｅ  Ｅ，  Ｋｒｕｔｍａｎｎ  Ｊ．  Ｔｈｅ  ＡｈＲ−Ｎｒｆ２  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ：  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｏａｄ  ｔｏ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．（ケラチノサイトのＡｈＲ−Ｎｒｆ２経路：化学的予防への道）  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２０１２  Ｊａｎ；１３２（１）：７−９．  
（２７）Ｃｈａｍｐｉｏｎ  Ｓ．ら，  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＦκＢ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＡｈＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｃａｃｏ−２  Ｃｅｌｌｓ，（ＮＦκＢ経路の活性化は、腸のＣａｃｏ−２細胞におけるＡｈＲ発現を増強する、）  ＩＳＲＮ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１３  （２０１３）．
（２８）Ｔａｕｃｈｉら，  ２００５．  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒｙｌ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  Ｃａｕｓｅｓ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｓｋｉｎ  Ｌｅｓｉｏｎｓ，（ケラチノサイトにおけるアリール炭化水素受容体の構成的発現は、炎症性皮膚病変を引き起こす、）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｎｏｖ．  ２００５，  ｐ．  ９３６０-９３６８．
（２９）Ｆｕｒｕｅら，  ２０１４．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＡｈＲ／ＡＲＮＴ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｓｋｉｎ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ（皮膚の恒常性におけるＡｈＲ／ＡＲＮＴシステムの役割）  Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｒｅｓ．  ３０６：７６９-７７９
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジテルペン、オレウロペイン、ベルバスコシド、ケルセチンおよびヒドロキシチロソールを含む組成物。
【請求項２】
前記組成物は、最終処方物の４．５ｗｔ％の最小ジテルペン含有量を提供する２５ｗｔ％〜４０ｗｔ％のローズマリー抽出物、最終処方物の４．５ｗｔ％の最小オレウロペイン含有量および１．５ｗｔ％の最小ヒドロキシチロソール含有量を提供する２０ｗｔ％〜４０ｗｔ％のオリーブの葉または果実の抽出物、最終処方物の６．５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量を提供する２０ｗｔ％〜３５ｗｔ％のリッピア・シトリオドラ抽出物ならびに最終処方物の３．５ｗｔ％の最小ケルセチン含有量を提供する５ｗｔ％〜２５ｗｔ％のソフォラ・ジャポニカ抽出物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ジテルペン、前記オレウロペイン、前記ベルバスコシドおよび前記ケルセチンの前記ヒドロキシチロソールに対する個々の重量比は、それぞれ約２．５〜５である、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ジテルペンの前記ヒドロキシチロソールに対する重量比は約３であり、前記オレウロペインの前記ヒドロキシチロソールに対する重量比は約３であり、前記ベルバスコシドの前記ヒドロキシチロソールに対する重量比は約４．５であり、前記ケルセチンの前記ヒドロキシチロソールに対する重量比は約２．５である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、４０ｗｔ％の最小ケルセチン含有量を有するソフォラ・ジャポニカ抽出物を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、カルノシン酸を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、１５ｗｔ％の最小ジテルペン含有量を有するローズマリー抽出物を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、１６ｗｔ％の最小オレウロペイン含有量を有するオリーブ抽出物を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、５ｗｔ％の最小ヒドロキシチロソール含有量を有するオリーブ抽出物を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、２５ｗｔ％の最小ベルバスコシド含有量を有するリッピア・シトリオドラ抽出物を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、空気汚染の影響に関連する早期の皮膚老化の予防に使用される、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の組成物の０．１〜１０００ｍｇの間の用量。
【請求項１３】
請求項１０に記載の組成物の２５０ｍｇの用量。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物を含む栄養補助食品。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物を含むニュートリコスメティクス製品。
【請求項１６】
前記組成物は、薬剤として使用される、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患の予防および／または治療に使用される、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記環境汚染によって引き起こされる皮膚疾患は、炎症、座瘡、慢性皮膚炎および乾癬から選択され、請求項１７の記載に従って、使用される組成物。
【請求項１９】
前記組成物は、非経口的、経皮的、経口的または局所的に投与され、請求項１６〜１８のいずれかの記載に従って、使用される組成物。
【請求項２０】
前記組成物は、１日当たり０．１〜１０００ｍｇの間の用量で経口投与され、請求項１６〜１８のいずれかの記載に従って、使用される組成物。
【請求項２１】
美容化粧品としての請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項２２】
皮膚に対する環境汚染の美観に関する影響を美容的に軽減するための、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
抗酸化作用、抗炎症作用を有する化粧品としての、この作用は治療的処置としてではなく、単に美観的な、皮膚に対する老化防止および美白としてとらえられる、請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記組成物は、非経口的、経皮的、経口的、または局所的に投与される、請求項２１〜２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
前記組成物は、１日当たり０．１〜１０００ｍｇの間の用量で経口投与される、請求項２１〜２３のいずれかに記載の使用。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2021530433.tif 000036
【図２Ａ】
2021530433.tif 000037
【図２Ｂ】
2021530433.tif 000038
【図２Ｃ】
2021530433.tif 000039
【図３】
2021530433.tif 000040
【図４Ａ】
2021530433.tif 000041
【図４Ｂ】
2021530433.tif 000042
【図４Ｃ】
2021530433.tif 000043
【図５】
2021530433.tif 000044
【図６】
2021530433.tif 000045
【図７】
2021530433.tif 000046
【図８】
2021530433.tif 000047
【図９】
2021530433.tif 000048
【図１０】
2021530433.tif 000049
【図１１】
2021530433.tif 000050
【図１２】
2021530433.tif 000051
【図１３】
2021530433.tif 000052
【図１４】
2021530433.tif 000053
【図１５】
2021530433.tif 000054
【図１６】
2021530433.tif 000055
【図１７】
2021530433.tif 000056
【図１８】
2021530433.tif 000057
【図１９】
2021530433.tif 000058
【図２０】
2021530433.tif 000059
【国際調査報告】
2021530433.tif 000060
2021530433.tif 000061
2021530433.tif 000062
2021530433.tif 000063
2021530433.tif 000064
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2021530433.tif 000066
2021530433.tif 000067