(57)【要約】  抗FXIa抗体を含む凍結乾燥ペレットを生成する方法は、  a）抗FXIa抗体を含む溶液の液滴を凍結させて、ペレットを形成するステップ、  b）ペレットを凍結乾燥させるステップを含み、  ステップa）では、液滴は、温度制御可能な内壁面と溶液の凍結温度よりも低い内部温度とを有する冷却塔内に向かう、抗FXIa抗体を含む溶液の液滴形成によって形成され、ステップb）では、ペレットは、真空チャンバ内に収容される回転受容器内で凍結乾燥される。
2021529801.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）抗FXIa抗体を含む溶液の液滴を凍結させて、ペレットを形成するステップ、
b）前記ペレットを凍結乾燥させるステップ、
を含む、抗凝固因子XIa（FXIa）抗体を含む凍結乾燥ペレットを生成する方法であって、
ステップa）では、前記液滴が、温度制御可能な内壁面（110）と前記溶液の凍結温度よりも低い内部温度とを有する冷却塔（100）内に向かう、抗FXIa抗体を含む前記溶液の液滴形成によって形成され、
さらに、
ステップb）では、前記ペレットが、真空チャンバ（200）内に収容される回転受容器（210）内で凍結乾燥される
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
a）抗FXIa抗体を含む溶液の液滴を凍結させて、ペレットを形成するステップ、
b）前記ペレットを凍結乾燥させるステップ、
を含む、従来の凍結乾燥によって得られた凍結乾燥物を含む抗FXIa抗体と比較して、抗FXIa抗体を含む凍結乾燥ペレットの再構成時間を短縮する方法であって、
ステップa）では、前記液滴が、温度制御可能な内壁面（110）と前記溶液の凍結温度よりも低い内部温度とを有する冷却塔（100）内に向かう、抗FXIa抗体を含む前記溶液の液滴形成によって形成され、
さらに、
ステップb）では、前記ペレットが、真空チャンバ（200）内に収容される回転受容器（210）内で凍結乾燥される
ことを特徴とする方法。
【請求項３】
ステップb）の後にステップc）およびd）をさらに含む、請求項1または2に記載の方法：
c）前記凍結乾燥ペレットを保管および均質化するステップ
d）前記凍結乾燥ペレットを容器に投入するステップ。
【請求項４】
ステップa）では、前記液滴が、周波数支援ノズルに前記溶液を通すことによる液滴形成によって作製される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
発振周波数が、≧200Hz〜≦5000Hz、具体的には≧400Hz〜≦4000Hzであるか、≧100Hz〜≦2000Hzである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
ステップa）では、前記冷却塔（100）の前記内面（110）が、≦−120°Cの温度を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記冷却塔（100）の前記内面（110）が、前記内面（110）と熱的に接触している1つ以上のパイプ（140）に冷却剤を通すことによって冷却される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップa）で得られた前記ペレットのペレット寸法中央値が、約≧200μm〜≦1500μm、具体的には約≧500μm〜≦900μmである、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップa）では、抗FXIa抗体を含む前記溶液が、≧5重量％〜≦30重量％、具体的には≧10重量％〜≦20重量％の溶解固形物含有量を有する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップa）では、抗FXIa抗体を含む前記溶液が、≧5mg／ml〜≦300mg／ml、具体的には≧50mg／ml〜≦250mg／ml、さらに具体的には≧100mg／ml〜≦200mg／mlの抗体濃度を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップa）では、抗FXIa抗体を含む前記溶液が、100mlの前記溶液に関して以下の組成を有し、残部が注射用水である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法：
抗FXIa抗体        ≧0．5g〜≦30g
トレハロース        ≧1g〜≦25g
ヒスチジン          ≧50mg〜≦1．5g
グリシン            ≧50mg〜≦1．5g
アルギニン          ≧50mg〜≦5g
ポリソルベート80    ≧5mg〜≦0．5g
【請求項１２】
請求項1および3から11のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、抗FXIa抗体を含む凍結乾燥ペレット。
【請求項１３】
抗FXIa抗体を含む前記凍結乾燥ペレットが、従来の凍結乾燥によって得られた凍結乾燥物を含む抗FXIa抗体と比較して、短縮された再構成時間を示す、請求項12に記載の抗FXIa抗体を含む凍結乾燥ペレット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗凝固因子XIa（FXIa）抗体を含む凍結乾燥ペレットを生成する方法に関し、該方法は、a）抗FXIa抗体を含む溶液の液滴を凍結させてペレットを形成するステップと、b）ペレットを凍結乾燥させるステップとを含む。本発明はさらに、抗FXIa抗体を含む凍結乾燥ペレットの再構成時間を短縮する方法と、本発明による方法によって得ることができる、抗FXIa抗体を含む凍結乾燥ペレットとに関する。
【背景技術】
【０００２】
1964年に、Macfarlane、ならびにDavieおよびRatnoff［Macfarlane RG．An enzyme cascade in the blood clotting mechanism，and its function as a biochemical amplifier．Nature 1964；202：498−9．；Davie EW，Ratnoff OD．Waterfall sequence for intrinsic blood clotting．Science 1964；145：1310−2．］は、血液凝固過程に関するカスケード仮説を発表した。それ以来、インビボでの凝固機能に関する我々の知見は深まっている。ここ数年、凝固を開始し、共通の経路に収束し、最終的にトロンビン生成およびフィブリン沈着をもたらす、いわゆる外因性経路および内因性経路の2つの異なる経路の学説が見直されている。現在のモデルでは、凝固の開始は、血漿プロテアーゼ活性化因子VIIが組織因子（TF）と接触し、これによって組織因子（TF）と複合体を形成する際に生じる。この組織因子−FVIIa複合体は、チモーゲンFXをその活性形態FXaに活性化することができ、FXaは、プロトロンビン（凝固因子I）をトロンビン（I la）に変換することができる。凝固の主要な作用因子であるトロンビンは、次いで、フィブリノーゲンがフィブリンに変換するのを触媒することができる。さらに、トロンビンは血小板によって発現される特定の受容体を活性化し、これにより、血小板の活性化を引き起こす。活性化された血小板は、フィブリンとともに血餅形成に不可欠であるため、正常な止血の基本的な作用因子である。
【０００３】
第2の増幅経路は、凝固因子XI（FXI）によって形成される。FXIは、凝固カスケードの他のメンバーと同様に、インビボでの血液凝固の開始段階と増幅段階との橋渡しに重要な役割を果たす血漿セリンプロテアーゼチモーゲンであることが十分に確認されている［Davie EW，Fujikawa K，Kisiel W．The coagulation cascade：initiation，maintenance，and regulation．Biochemistry 1991；30：10363−70；Gailani D，Broze Jr GJ．Factor XI activation in a revised model of blood coagulation．Science 1991；253：909−12；Kravtsov DV，Matafonov A，Tucker El，Sun MF，Walsh PN，Gruber Aら、Factor XI contributes to thrombin generation in the absence of factor XI I．Blood 2009；1 14：452−8．3−5］。凝固因子XI（FXI）は肝臓内で合成され、高分子量キニノーゲン（HMWK）と複合体形成したジスルフィド結合二量体として血漿中に循環する。この二量体の各ポリペプチド鎖は約80kDである。チモーゲン因子XIは、血液凝固の接触段階を介して、または血小板表面でのトロンビン媒介活性化を介して、その活性形態である凝固因子Xla（FXIa）に変換される。因子XIのこの活性化中に、内部ペプチド結合が2つの鎖のそれぞれで切断され、ジスルフィド結合によって結合された2つの重鎖および2つの軽鎖から構成されるセリンプロテアーゼである活性化因子Xla因子が生じる。このセリンプロテアーゼFXIaは、凝固因子IXをIXaに変換し、IXaはその後、凝固因子X（Xa）を活性化する。次いで、Xaは凝固因子II／トロンビンの活性化を媒介し得る。
【０００４】
FXI欠乏は通常、自発性の出血を引き起こさないが、止血の課題を伴う出血リスクの増加と関連するのに対して、出血の重症度は、FXIの血漿レベルとあまり相関しない。ヒトでは、重度のFXI欠乏は、血栓性疾患からの特定の保護効果を有する。ただし、高レベルのFXIは、血栓性事象に関連付けられている。したがって、FXIの阻害は、便益とリスクとの比率の改善を達成するための新たな抗血栓薬の開発に対する新規のアプローチとして提案されている。
【０００５】
国際公開第2013／167669号パンフレットは、活性化形態の血漿因子XI、FXIaに選択的に結合し、それによって血小板凝集および関連する血栓症を阻害することができる抗体を開示している。これらの抗体は止血を損なわないことが発見された。
【０００６】
他の多くのバイオ医薬品と同様に、免疫グロブリンは長期間にわたって溶液中で安定ではない。凍結乾燥（lyophilization）としても知られる凍結乾燥（Freeze−drying）は、氷晶を水蒸気に昇華させることによって、すなわち、水が固相から気相に直接転移することによって、熱および／または加水分解感受性材料を乾燥させるプロセスである。
【０００７】
従来のプロセスでは、凍結乾燥は通常、（真空）乾燥チャンバ内に1つ以上のトレイまたは棚を備える標準的な凍結乾燥チャンバ内で行われる。バイアルに生成物を充填して凍結乾燥させ、これらのトレイ上に配置することができる。これらの乾燥機は、典型的には、温度制御された壁を有さず、乾燥機チャンバに配置されたバイアルに不均質な熱伝達を提供する。特に、縁部に配置されたバイアルは、チャンバの壁とプレート／棚のスタックとの間の間隙内の放射熱伝達およびガス伝導により、プレートの中心に配置されたバイアルよりも集中的にエネルギーを交換する。このエネルギー分布の不均一性は、端部のバイアルと中心のバイアルとの間の凍結速度および乾燥速度の変動につながり、それぞれのバイアルの活性内容物の活性の変動と、生成物の収量損失とをもたらす可能性がある。最終生成物の均一性を確保するために、実験室規模および生産規模の両方で広範囲な開発および検証作業を行う必要がある。
【０００８】
国際公開第2006／008006 A1号パンフレットは、バイアルなどの最終容器内のペレット化されたバイオ医薬品の凍結乾燥、保管、アッセイおよび充填を含む無菌製造のプロセスに関する。記載されたプロセスは、噴霧凍結と凍結乾燥とを組み合わせ、a）生成物の液滴を凍結させてペレットを形成し、それにより、液滴が、周波数支援ノズルに生成物の溶液を通すことによって形成され、ペレットが、極低温ガスの向流に液滴を通すことによって上記液滴から形成されるステップと、b）ペレットを凍結乾燥させるステップと、c）凍結乾燥ペレットを保管および均質化するステップと、d）凍結乾燥ペレットを保管および均質化しながらアッセイするステップと、e）凍結乾燥ペレットを上記容器に投入するステップとを含む。
【０００９】
国際公開第2013／050156 A1号パンフレットは、液滴生成のため、および液滴を凍結凝固して粒子を形成するための噴霧チャンバと、粒子を凍結乾燥させるためのバルク凍結乾燥機とを少なくとも備える、閉鎖条件下で凍結乾燥粒子を製造するためのプロセスラインであって、凍結乾燥機が、粒子を受け入れるための回転ドラムを備えるプロセスラインを記載している。さらに、噴霧チャンバから凍結乾燥機への生成物移送のための移送セクションが提供されている。エンドツーエンドの閉鎖条件下で粒子を製造するために、装置および移送セクションの各々は、凍結乾燥および／または格納される生成物の無菌性を維持する操作に別個に適合されている。
【００１０】
国際公開第2013／050161 A1号パンフレットは、閉鎖条件下で凍結乾燥粒子を製造するためのプロセスラインを開示しており、プロセスラインは、閉鎖条件下で凍結乾燥粒子をバルクウェア製造するための凍結乾燥機を備え、凍結乾燥機は、凍結された粒子を受け入れるための回転ドラムと、回転ドラムを収容する静止した真空チャンバとを備え、真空チャンバは、閉鎖条件下で粒子を製造するために、粒子の処理中の閉鎖操作に適合されている。ドラムは真空チャンバと開放された連絡状態にあり、プロセスラインの別個の装置と凍結乾燥機との間の生成物移送のために少なくとも1つの移送セクションが設けられ、凍結乾燥機および移送セクションは、閉鎖操作に別個に適合されており、移送セクションは、温度制御可能な内壁面を備える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第2013／167669号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2006／008006 A1号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2013／050156 A1号パンフレット
【特許文献４】国際公開第2013／050161 A1号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Macfarlane RG．An enzyme cascade in the blood clotting mechanism， and its function as a biochemical amplifier．Nature 1964； 202：498−9．
【非特許文献２】Davie EW， Ratnoff OD．Waterfall sequence for intrinsic blood clotting．Science 1964； 145：1310−2．
【非特許文献３】Davie EW， Fujikawa K， Kisiel W．The coagulation cascade：initiation， maintenance， and regulation． Biochemistry 1991 ；30：10363−70
【非特許文献４】Gailani D， Broze Jr GJ ．Factor XI activation in a revised model of blood coagulation．Science 1991 ；253：909−12
【非特許文献５】Kravtsov DV， Matafonov A， Tucker El， Sun MF， Walsh PN， Gruber Aら、Factor XI contributes to thrombin generation in the absence of factor XI I ．Blood 2009；1 14：452−8．3−5
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
治療用抗体は、限られた容量で高用量の投与を必要とし、したがって、投与される最終溶液中の高濃度の抗体を必要とする場合があり、その結果、従来の凍結乾燥生成物では最大数時間という非実用的に長い再構成時間がもたらされ、そのような状況下での凍結乾燥の適用性が制限される。再構成時間が短縮された凍結乾燥ペレットを含む抗FXIa抗体を生成する方法が好ましい。さらに、処理中の抗FXIa抗体に対する損傷を回避し、したがって結合親和性の損失を回避する、凍結乾燥ペレットを含む抗FXIa抗体を生成するための凍結乾燥法が望ましい。特に、個々のペレット間の活性（例えば、結合親和性）の変動は回避すべきである。好ましくは、無菌性を確保するために外部から厳密に分離するという条件下で、ペレットを含む抗FXIa抗体を生成するためのそのような凍結乾燥法を行うことが可能であるべきである。これは、液体窒素などの極低温ガスの冷却向流または冷却並流による冷却を回避する必要があることを意味する。最後に、狭い寸法および重量分布の均質な凍結乾燥ペレットを生成する再現可能なプロセスは、その後の取扱いに大きな利点を提供する。本発明は、そのような方法を提供するという目的を有する。参照された先行技術の参考文献のいずれも、そのような方法を開示していない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記の目的は、本発明によれば、抗FXIa抗体を含む凍結乾燥ペレットを生成する方法によって達成され、該方法は、
a）抗FXIa抗体を含む溶液の液滴を凍結させて、ペレットを形成するステップ、
b）ペレットを凍結乾燥させるステップを含み、
ステップa）では、液滴は、温度制御可能な内壁面と溶液の凍結温度よりも低い内部温度とを有する冷却塔内に向かう、抗FXIa抗体を含む溶液の液滴形成によって形成され、ステップb）では、ペレットは、真空チャンバ内に収容される回転受容器内で凍結乾燥される。
【００１５】
本発明による方法の操作原理は、いくつかの明確な利点を有する。第一に、本発明による方法では、溶液を含む、抗FXIa抗体の噴霧された液滴は、国際公開第2006／008006 A1号パンフレットに記載されるような向流様式で極低温ガスに接触しないことに留意されたい。冷却塔の内部空間に極低温ガスを導入する必要がないため、極低温ガスの取扱いおよび滅菌ステップはいずれも省略することができる。本発明による方法のステップはいずれも、無菌条件下で、個々のステップ間の無菌性を損なうことなく行うことができる。
【００１６】
第二に、本発明による方法は、抗FXIa抗体に重大な損傷をもたらさず、したがって、最終生成物における結合親和性の損失を回避することが実験的に見出された。実際に、本発明による方法によって得られた凍結乾燥ペレットを含む抗FXIa抗体は、従来の凍結乾燥、または国際公開第2006／008006号パンフレットによる凍結乾燥プロセスによって得られた凍結乾燥物を含む抗FXIa抗体と比較して、間接ELISAによって評価されたように、FXIa抗原に対する増大した結合親和性を示した。抗FXIa抗体に対する損傷を回避することにより、狭い指定された範囲内で所望の量の活性な抗FXIa抗体を正確に充填することが可能になる。さらに、本発明による方法は、標準的な凍結乾燥と比較して、多様な容量および適用システムで凍結乾燥ペレットを充填する点でさらに柔軟性を可能にする。
【００１７】
第三に、真空チャンバ内の回転受容器内で凍結乾燥ステップを行うことにより、各個々のペレットの空間位置が経時的に均等に分布される。これにより、均一な乾燥条件が確保されるため、ラック上の凍結乾燥バイアルの場合のような、抗体活性、例えば結合親和性の空間的変動が排除される。
【００１８】
最後に、驚くべきことに、本発明に従って生成されたペレットを含む抗FXIa抗体は、従来の凍結乾燥によって得られた凍結乾燥物を含む抗FXIa抗体だけでなく、国際公開第2006／008006 A1号パンフレットに開示されたプロセスによって得られたペレットと比較して、大幅に短縮された再構成時間を示すことが見出された。
【００１９】
凍結ペレットの作成は、任意の公知の技術に従って行うことができる。ただし、重要なことに、液滴を含む抗体を液体窒素に滴下してペレットを形成することは避けるべきである。
【００２０】
その後の凍結乾燥ステップを考慮すると、凍結ペレットは、狭い粒径分布を有することが好ましい。その後、凍結ペレットは、無菌および低温条件下で凍結乾燥機に輸送することができる。次いで、ペレットは、受容器の回転によって、乾燥チャンバ内の運搬面全体に分配される。原則として、ペレットに適したあらゆる種類の凍結乾燥機では昇華乾燥が可能である。昇華蒸気流のための空間、制御された壁温度、および乾燥チャンバと凝縮器との間の好適な断面積を提供する凍結乾燥機が好ましい。
【００２１】
本発明による方法で使用することができる抗FXIa抗体変異体の詳細を以下に記載する。
【００２２】
本発明に従って使用される抗FXIa抗体は、活性化形態の血漿因子XI、FXIaに結合することができる。好ましくは、抗FXIa抗体はFXIaに特異的に結合する。好ましくは、抗FXIa抗体は、血小板凝集および関連する血栓症を阻害することができる。好ましくは、血小板凝集の抗体媒介阻害は、血小板依存性一次止血を損なわない。本発明の文脈では、用語「止血を損なうことなく」は、凝固因子XIaの阻害が、望ましくない測定可能な出血事象を引き起こさないことを意味する。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「凝固因子XIa」、「因子XIa」または「FXIa」は、チモーゲン因子XIを発現する任意の哺乳動物種由来の任意のFXIaを指す。例えば、FXIaは、ヒト、ヒト以外の霊長類（ヒヒなど）、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ウサギ、および血流、凝固および／または血栓症の調節に関与する凝固因子XIを発現する任意の他の種であり得る。
【００２４】
本明細書で使用される場合、結合特異性は絶対的ではなく、相対的な特性であるため、抗体が「特異的に結合する」とは、そのような抗体がそのような抗原と1つ以上の1個または複数の参照抗原とを区別することができる場合、抗原（本明細書ではFXIa）「に特異的な」または抗原（本明細書ではFXIa）「を特異的に認識する」である。その最も一般的な形態では（かつ定義された参照が言及されていない場合）、「特異的結合」は、例えば、以下の方法のいずれかに従って決定されるように、目的の抗原と無関係の抗原とを区別する抗体の能力を指している。そのような方法には、限定するものではないが、ウエスタンブロット、ELISA試験、RIA試験、ECL試験、IRMA試験およびペプチドスキャンが含まれる。例えば、標準的なELISAアッセイを行うことができる。スコア化は、標準的な発色（例えば、西洋ワサビ過酸化物を用いた二次抗体、および過酸化水素を用いたテトラメチルベンジジン）によって行われ得る。ある種のウェルでの反応は、例えば450ranでの光学密度によってスコア化される。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は0．1ODであり得、典型的な陽性反応は1ODであり得る。これは、陽性／陰性の差が10倍を超え得ることを意味する。典型的には、結合特異性の決定は、単一の参照抗原ではなく、粉乳、BSA、トランスフェリンなどのような約3つから5つの一連の無関係な抗原を使用することによって行われる。
【００２５】
ただし、「特異的結合」はまた、標的抗原と、参照点として使用される1つ以上の密接に関連する1個または複数の抗原、例えば、相同体とを区別する抗体の能力を指し得る。例えば、抗体は、参照抗原と比較して、標的抗原に対して、少なくとも1．5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍またはそれ以上の相対的親和性を有し得る。さらに、「特異的結合」は、その標的抗原の異なる部分、例えば、FXIaの異なるドメインまたは領域を区別する抗体の能力に関し得る。
【００２６】
「親和性」または「結合親和性」KDは、多くの場合、平衡会合定数（ka）および平衡解離定数（kd）を測定し、kdとkaとの比を計算する（KD＝kd／ka）ことによって決定される。用語「免疫特異的」または「特異的結合」は、好ましくは、抗体が、106M（一価親和性）以下の親和性KDで凝固因子XIaに結合することを意味する。用語「高親和性」は、抗体が、107M（一価親和性）以下の親和性KDで凝固因子XIaに結合することを意味する。このような親和性は、従来の技術を使用して、例えば、平衡透析によって、製造業者が概説した一般的な手順を使用するBIAcore 2000機器を使用することによって、放射性標識された標的抗原を使用するラジオイムノアッセイによって、または当業者に公知の別の方法によって、容易に決定され得る。親和性データは、例えば、［Kaufman RJ，Sharp PA．（1982）Amplification and expression of sequences cotransfected with a  modular dihydrofolate reductase complementary dna gene．J Mol Biol．159：601−621］に記載されている方法によって分析され得る。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、天然から単離された、または組換え手段によって調製された免疫グロブリン分子（例えば、IgG、IgE1、IgM、IgD、IgAおよびIgYを含む任意のタイプ、および／またはIgGI、lgG2、lgG3、lgG4、IgAIおよびIgA2を含む任意のクラス）を含み、あらゆる従来公知の抗体およびその機能的断片を含む。用語「抗体」はまた、天然抗体に見出されるのと同じ活性結合立体配座に抗体CDR挿入物を配向させることができ、その結果、これらのキメラタンパク質に観察される標的抗原の結合が、CDRが由来する天然抗体の結合活性と比較して維持される他のタンパク質足場にも及ぶ。
【００２８】
本明細書では、抗体／免疫グロブリンの「機能的断片」または「抗原結合抗体断片」は、抗原結合領域を保持する抗体／免疫グロブリンの断片（例えば、IgGの可変領域）として定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には、抗体の1つ以上の1個または複数の超可変領域、すなわち、CDR−1、CDR−2および／またはCDR−3領域に見出される。ただし、可変「フレームワーク」領域は、例えば、CDRの足場を提供することにより、抗原結合に重要な役割を果たし得る。好ましくは、「抗原結合領域」は、可変軽（VL）鎖の少なくともアミノ酸残基4から103および可変重（VH）鎖の5から109、さらに好ましくはVLのアミノ酸残基3から107およびVHの4から111を含み、完全なVL鎖およびVH鎖であることが特に好ましい（VLのアミノ酸位置1から109およびVHの1から113；国際公開第97／08320号パンフレットによる番号付け）。本発明で使用するための好ましいクラスの免疫グロブリンはIgGである。
【００２９】
本発明の「機能的断片」には、Fab、Fab1、F（ab’）2およびFv断片；二重特異性抗体；線状抗体（linear antibody）；一本鎖抗体分子（scFv）；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、およびVLまたはVHドメインを含む断片が含まれ、これらは、インタクトな免疫グロブリンから調製されるか、組換え手段によって調製される。
【００３０】
抗原結合抗体断片は、1個もしくは複数の可変領域を単独で、またはヒンジ領域、CHI、CH2、CH3およびCLドメインの全体もしくは一部と組み合わせて含み得る。1個または複数の可変領域とヒンジ領域、CHI、CH2、CH3およびCLドメインとの任意の組合せを含む抗原結合抗体断片も本発明に含まれる。
【００３１】
抗体および／または抗原結合抗体断片は、単一特異性（例えば、モノクローナル）、二重特異性、三重特異性、またはさらに高い多重特異性であり得る。好ましくは、モノクローナル抗体が使用される。本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対する。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する。モノクローナル抗体は、それらの特異性に加えて、それらが均質な培養によって合成され、異なる特異性および特徴を有する他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点で有利である。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。
【００３２】
抗体または抗原結合抗体断片は、例えば、ヒト、ヒト化、齧歯類（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリであり得る。好ましくは、ヒトまたはヒト化抗FXIa抗体が使用される。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、ヒトB細胞から、または1つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな動物から単離された抗体、ならびに合成ヒト抗体が含まれる。
【００３４】
「ヒト化抗体」または機能的ヒト化抗体断片は、本明細書では、（i）非ヒト供給源（例えば、異種免疫系を有するトランスジェニックマウス）に由来するものであって、この抗体が、ヒト生殖系列配列に基づくもの、または（ii）可変ドメインが非ヒト起源に由来し、定常ドメインがヒト起源に由来するキメラであるもの、または（iii）可変ドメインのCDRが非ヒト起源に由来し、可変ドメインの1つ以上のフレームワークがヒト起源であり、定常ドメイン（存在する場合）がヒト起源であるCDR移植片であるものとして定義される。
【００３５】
本発明による方法に適した抗体は、例えば、国際公開第2013／167669号パンフレットに開示されている。特定の実施形態では、抗FXIa抗体は、国際公開第2013／167669号パンフレットの表9に示されるように、少なくとも1つのCDRアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗FXIa抗体は、国際公開第2013／167669号パンフレットの表9に示されるように、可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列のうちの少なくとも1つと、可変重鎖ドメインのアミノ酸配列のうちの少なくとも1つとを含む。特定のそのような実施形態では、抗FXIa抗体は、i）可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列については配列番号19、および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列については配列番号20、またはii）可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列については配列番号29、および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列については配列番号30、またはiii）可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列については配列番号27、および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列については配列番号20を含む。特定の実施形態では、抗FXIa抗体は、国際公開第2013／167669号パンフレットに開示されている抗体076D−M007−H04、076D−M007−H04−CDRL3−N110Dおよび076D−M028−H17から選択される。特に好ましい実施形態では、抗FXIa抗体は、本明細書では可変重鎖ドメインのアミノ酸配列については配列番号1により、可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列については配列番号2により表される076D−M007−H04−CDRL3−N110Dである。
【００３６】
特定の実施形態では、抗FXIa抗体は、追加の部分、特に薬物にコンジュゲートされる。
【００３７】
本発明の実施形態および追加の態様を以下に説明する。文脈で明確に指示されない限り、これらを自由に組み合わせることができる。
【００３８】
本発明の場合、任意の抗FXIa抗体またはその機能的断片もしくは変異体は、プロセス自体をさらに変更する必要なく処理され得る。ただし、再構成に必要な期間の有利な短縮を実現するために、抗FXIa抗体が本発明による方法で処理されることが適切である。
【００３９】
このプロセスは、好ましくは、抗FXIa抗体ポリペプチドに対する潜在的な損傷、ひいては、最終生成物の活性／親和性の損失を回避する。
【００４０】
第2の態様では、本発明は、従来の凍結乾燥によって得られた凍結乾燥物を含む抗FXIa抗体と比較して、抗FXIa抗体を含む凍結乾燥ペレットの再構成時間を短縮する方法に関し、該方法は、
a）抗FXIa抗体を含む溶液の液滴を凍結させて、ペレットを形成するステップ、
b）ペレットを凍結乾燥させるステップを含み、
ステップa）では、液滴は、温度制御可能な内壁面（110）と溶液の凍結温度よりも低い内部温度とを有する冷却塔（100）内に向かう、抗FXIa抗体を含む溶液の液滴形成によって形成され、ステップb）では、ペレットは、真空チャンバ（200）内に収容される回転受容器（210）内で凍結乾燥される。
【００４１】
本発明の文脈では、用語「従来の凍結乾燥」および「従来通りに凍結乾燥された」は、（真空）乾燥チャンバ内に1つ以上のトレイまたは棚を備える標準的な凍結乾燥チャンバ内で行われる、バイアル内の標準的な凍結乾燥プロセスを指し、噴霧凍結のプロセスステップは含まない。典型的には、凍結乾燥される生成物はバイアルに充填され、次いでバイアルは（真空）乾燥チャンバに入れられる。
【００４２】
本発明の文脈では、用語「従来の凍結乾燥によって得られる凍結乾燥物と比較して凍結乾燥ペレットの再構成時間を短縮する」は、従来の凍結乾燥によって得られる凍結乾燥物と比較して、滅菌水などの再構成培地を加えた際に、本発明による方法によって得られる凍結乾燥ペレットを完全またはほぼ完全に溶解するのに必要な期間の短縮として理解されるべきである。再構成時間は、特に、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも95％短縮される。本発明の文脈では、用語「凍結乾燥ペレットの完全またはほぼ完全な再構成／溶解」は、再構成培地中の凍結乾燥ペレットの固形分含有量の少なくとも98％の溶解、さらに具体的には、凍結乾燥ペレットの固形分含有量の少なくとも98．5％の溶解、最も具体的には、凍結乾燥ペレットの固形分含有量の少なくとも99％、少なくとも99．5％、少なくとも99．75％または少なくとも99．9％の溶解を指す。
【００４３】
本発明による方法の一実施形態では、該方法は、ステップb）の後にステップc）およびd）をさらに含む：
c）凍結乾燥ペレットを保管および均質化するステップ
d）凍結乾燥ペレットを容器に投入するステップ。
【００４４】
保管および均質化ステップc）はまた、凍結乾燥に使用される真空チャンバ内の回転受容器内で行うことができる。ステップd）では、ユーザが定義した量の凍結乾燥ペレットが最終容器に充填される。保管容器は隔離された充填ラインに移送され、無菌ドッキングステーションにドッキングされる。容器の内容物は、隔離装置内で充填機の保管場所に移送される。処理された抗FXIa抗体に対する損傷を完全にまたは最小限に抑える本発明による方法は、狭い指定された範囲内で所望の抗体量の正確な充填を可能にする。本発明による方法は、最終使用のための容器に柔軟かつ個別に充填することを可能にする。
【００４５】
本発明による方法の別の実施形態では、ステップa）で、周波数支援ノズルに通すことによる溶液の液滴形成によって、液滴が形成される。好ましくは、発振周波数は、≧200Hz〜≦5000Hz、さらに具体的には、≧400Hz〜≦4000Hzまたは≧1000Hz〜≦2000Hzである。
【００４６】
周波数支援されるノズルとは関係なく、ノズル開口部の直径は、100μm〜500μmの範囲、好ましくは200μm〜400μmの範囲、非常に好ましくは300μm〜400μmの範囲であり得る。上記ノズル直径は、約200μm〜約1000μmの範囲、好ましくは約400μm〜約900μmの範囲、非常に好ましくは約600μm〜800μmの範囲の液滴寸法をもたらす。
【００４７】
この文脈では、「約」所与の値の寸法、例えば、所与の寸法範囲の上限または下限は、この所与の値から最大±30％逸脱するあらゆる液滴寸法を包含すると理解されるべきである。例えば、結果として得られる約400μmの液滴寸法には、280μm〜520μm変化する液滴寸法が包含される。同様に、約100μm〜約500μmの寸法範囲は、70mm〜650μmの液滴寸法を包含すると理解されるべきである。
【００４８】
形成された液滴は、中央値の周りに特定の液滴寸法分布を示し、これは、上記で参照されたものとほぼ同じであるはずである。
【００４９】
ノズルが周波数支援される本発明の実施形態では、中央値の周りの変動は比較的小さい可能性がある。したがって、以下に説明する効果を考慮すると、周波数支援ノズルに液滴を通すことは、最終的な凍結乾燥ペレットに対する潜在的な負の影響をさらに減少させるためにさらに有利である。また、この文脈では、「約」所与の値という用語は、この所与の値から最大±30％逸脱するあらゆる値を包含すると理解されるべきである。
【００５０】
後続のステップb）からd）は、抗FXIa抗体の親和性を良好に維持しながら行うことができることが見出されたため、一般に、上記の寸法の液滴が有利である。
【００５１】
それに拘束されることなく、凍結ステップa）では、液滴が小さくなれば、はるかに大きい表面対体積比のために過度に急速に凍結し、それによって、脆弱な抗FXIa抗体が部分的に破壊されると仮定される。さらに、液滴が小さくなるとペレットが小さくなり、これにより、帯電する傾向が高まり、後者はそのようなペレットのその後の取扱いを損なう。例えば、比較的小さな帯電した凍結ペレットが冷却塔を通って落下すると、方向性が低くなる傾向があり、その結果、ペレットが塔内に残り、それによって生成物の収量が低下する。液滴が大きくなると均質に凍結しない。液滴の内部コア区画が不完全に凍結すると、凍結ペレットが塔の底に凝集し、均質なペレットバルクの形成が妨げられ、ひいては、その後の処理が妨げられる。不均質な凍結はさらに、保管中に、凍結ペレットの外殻での抗FXIa抗体の部分的破壊、および内部の不完全に凍結されたコアでの抗FXIa抗体の部分的破壊をもたらす可能性がある。
【００５２】
本発明による方法の別の実施形態では、ステップa）で、冷却塔の内面は、−120°C以下、好ましくは、≧−180°C〜≦−120°Cの温度を有する。好ましくは、温度は≧−160°C〜≦−140°Cである。
【００５３】
上記の≧−160°C〜≦−140°Cの温度は、2m〜4m、特に約3mの距離を落下しながら凍結する、約≧600μm〜約≦800μmの範囲の液滴寸法に最適化されている。
【００５４】
原則として、落下距離に関して上限はない。冷却塔内の内面温度と落下距離とは、所定の寸法の液滴が選択された落下距離にわたって完全に凍結するように好適に選択される。冷却塔内の−120°Cよりも低い内面温度により、実行可能な落下距離にわたって完全な液滴凍結が可能になる。
【００５５】
本発明による方法の別の実施形態では、冷却塔の内面は、内面と熱的に接触している1つ以上のパイプに冷却剤を通すことによって冷却される。冷却剤は、液体窒素、または所望の温度の窒素蒸気であり得る。
【００５６】
本発明による方法の別の実施形態では、ステップa）で得られたペレットのペレット寸法中央値は、約≧200μm〜約≦1500μmである。約≧500μm〜約≦900μmのペレット寸法中央値が好ましい。
【００５７】
200μmよりも小さい寸法のペレットは、ペレットの凍結が速くなり、凍結乾燥抗FXIa抗体が損傷し、結合親和性が損失するため、さらに高い標的投与量が必要になる可能性があるように、あまり好ましくない。さらに、得られた粉末の静電的影響は200μm未満の寸法で劇的に増加し、本プロセスの生成物の取扱い特性が低下し、水蒸気中のペレットの捕捉による収量損失が予測され得る。
【００５８】
ペレット寸法を1500μmよりも大きくすると、記載された設定ではペレットの完全な凍結を危うくし、したがって、後の生成物の全体的な品質を損なう可能性がある。
【００５９】
本発明による方法の別の実施形態では、抗FXIa抗体を含む溶液は、ステップa）で、≧5重量％〜≦30重量％の溶解固形物含有量を有する。≧10重量％〜≦20重量％の溶解固形物含有量が好ましい。
【００６０】
本発明による方法の別の実施形態では、抗FXIa抗体を含む溶液は、ステップa）で、≧5mg／ml〜≦300mg／ml、具体的には≧50mg／ml〜≦250mg／ml、さらに具体的には≧100mg／ml〜≦200mg／mlの抗体濃度を有する。
【００６１】
投与に必要な抗FXIa抗体濃度は比較的高い場合があり、これは一般に、凍結乾燥物を含む従来通りに得られた抗FXIa抗体の非実用的に長い再構成時間という問題を引き起こす。本発明による方法は、再構成培地に著しく速く溶解するペレットを含む凍結乾燥抗FXIa抗体を生じることが実験的に見出された。この発見はまったく予想外であった。
【００６２】
本発明による方法の別の実施形態では、抗FXIa抗体を含む溶液は、ステップa）で、100mlの溶液に関して以下の組成を有し、残部は注射用水である。
【００６３】
抗FXIa抗体        ≧0．5g〜≦30g
トレハロース        ≧1g〜≦25g
ヒスチジン          ≧50mg〜≦1．5g
グリシン            ≧50mg〜≦1．5g
アルギニン          ≧50mg〜≦5g
ポリソルベート80    ≧5mg〜≦0．5g
【００６４】
別の態様では、本発明は、本発明による方法によって得ることができる、抗FXIa抗体を含む凍結乾燥ペレットに関する。上記のように、本発明による方法によって得られたペレットを含む凍結乾燥抗FXIa抗体は、従来の凍結乾燥によって得られた凍結乾燥物、または国際公開第2006／008006号パンフレットに開示される同様の噴霧凍結ベースの方法によって得られた凍結乾燥ペレットと比較して、明らかに異なる特性を示す。特に、本発明による方法によって得られた凍結乾燥ペレットを含む抗FXIa抗体は、出発溶液（プロセスステップa）の抗FXIa抗体を含む溶液）を含む同一の抗FXIa抗体を従来の凍結乾燥、または国際公開第2006／008006号パンフレットに開示されている凍結乾燥法に供することによって生成された凍結乾燥物を含む同等の抗FXIa抗体と比較して、顕著に短い再構成時間を示す。走査型電子顕微鏡（SEM）ではさらに、3つの異なる凍結乾燥法によって得られた凍結乾燥物間の形態学的な差が明らかにされた。本発明による方法によって得られたペレットは、特に均質な表面、および微小崩壊の発生が少ないことを特徴とする。
【００６５】
本発明による凍結乾燥ペレットの一実施形態では、抗FXIa抗体を含む凍結乾燥ペレットは、従来の凍結乾燥によって得られた凍結乾燥物を含む抗FXIa抗体と比較して、短縮された再構成時間を示す。
【００６６】
本発明は、以下の図および実施例を参照してさらに説明されるが、それらによって限定されることを望まない。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明による方法のための装置を概略的に示す。
【図２】抗体溶液の従来の凍結乾燥（方法1）中に経時的に測定された温度および圧力プロファイルをグラフで示している。
【図３】国際公開第2006／008006号パンフレットに記載の方法（方法2）に従った、抗体溶液の凍結および乾燥中に経時的に測定された温度および圧力プロファイルをグラフで示している。
【図４】本発明（方法3）による抗体溶液の処理中に経時的に測定された冷却塔内の温度プロファイルをグラフで示している。
【図５】本発明（方法3）による抗体溶液の凍結および乾燥中に経時的に測定された温度および圧力プロファイルをグラフで示している。
【図６】本発明（方法3）に従って生成されたペレットの走査型電子顕微鏡（SEM）写真を示す。
【図７】従来の凍結乾燥（方法1）に従って生成された凍結乾燥物の走査型電子顕微鏡（SEM）写真を示す。
【図８】国際公開第2006／008006号パンフレットに開示された凍結乾燥プロセス（方法2）に従って生成された凍結乾燥物の走査型電子顕微鏡（SEM）写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
図1は、本発明による方法を実施するための装置を概略的に示している。装置は、主要な構成要素として、冷却塔100および真空乾燥チャンバ200を備える。冷却塔は、内壁110と外壁120とを備え、それにより、内壁110と外壁120との間に空間130を画定する。
【００６９】
この空間130は、配管の形態で冷却手段140を収容する。冷却剤は、図の矢印によって示されるように、冷却手段140に出入りすることができる。
【００７０】
冷却手段140を通って流れる冷却剤は、内壁110を冷却し、したがって、冷却塔100の内部を冷却する。凍結ペレット（クライオペレット（cryopellet））の生成では、液体がノズル150を介して冷却塔に噴霧される。液滴は、符号160に従って表されている。
【００７１】
液滴は、それらの下向きの経路上で最終的に固化（凍結）し、これは、符号170に従って表されている。凍結ペレット170はシュート180を下って移動し、そこで弁190が真空乾燥チャンバ200への進入を可能にする。
【００７２】
ここには図示されていないが、シュート180が、閉じた弁190の前でそれらが収集している間、ペレット170を凍結状態に保つように温度制御されることも言うまでもなく可能であり、さらには好ましい。
【００７３】
真空乾燥チャンバ200の内部には、乾燥される凍結ペレットを収容するために回転可能なドラム210が配置されている。ペレットへの効率的なエネルギー伝達を実現するために、水平軸を中心に回転が発生する。ドラムを通して、またはカプセル化された赤外線ヒータを介して、熱を導入することができる。その結果、符号220によって表される凍結乾燥ペレットが得られる。
【００７４】
実施例
実施例1：従来の凍結乾燥による凍結乾燥
この実施例は、076D−M007−H04−CDRL3−N110Dを含む液体高濃度組成物の従来の凍結乾燥（方法1）を説明する。組成物には、ヒスチジン−グリシン−アルギニン緩衝系を含めた。安定剤としてトレハロースを加えた。076D−M007−H04−CDRL3−N110Dを、
20mM L−ヒスチジン、50mM L−アルギニン塩酸塩、50mMグリシン、5％トレハロース二水和物、0．10％ポリソルベート80、pH5．0中に、約150mg／mlで配合した（組成物32）。
【００７５】
好適な凍結乾燥プロセスを開発するためには、一次乾燥を行うことができる温度を決定する崩壊温度を決定することが不可欠であった。組成物を−50°Cまで凍結させてから真空（0．1mbar）にし、試料を1°C／分の勾配で20．0°Cまで加熱することにより、lyo−顕微鏡（lyo−microscope）（Lyostat 2、Biopharma）を使用して、崩壊温度を測定した。組成物を加熱しながら、試験した系の崩壊を観察することができるまで写真を撮影し、分析した。
【００７６】
076D−M007−H04−CDRL3−N110Dの崩壊温度は−14．3°Cであることが分かり、これは、以下の凍結乾燥サイクルを選択するための重要なパラメータである。
【００７７】
従来の凍結乾燥法（方法1）に従って、抗FXIa抗体076D−M007−H04−CDRL3−N110Dを含む液体組成物32を処理した。10RタイプIガラスバイアルに、150mg／mlの抗FXIa抗体を含有する溶液を充填し、従来のバイアル凍結乾燥機内で凍結乾燥させた。合計20本のバイアルに1バイアル当たり2．25mlの溶液を充填し、半分栓をし、Virtis Genesis凍結乾燥機に投入した。溶液を−45°Cまで凍結させ、＋10°Cで一次乾燥を行い、続いて40°Cで二次乾燥ステップを行った。完全凍結乾燥プロセスには約38時間を要した。凍結乾燥機内でバイアルに栓をし、凍結乾燥機から出した直後に密封した。
【００７８】
組成物32に関する従来の凍結乾燥法（方法1）による凍結乾燥サイクルの詳細を表1に要約する。
【００７９】
【表１】
2021529801.tif 000003
【００８０】
このように実施された従来の凍結乾燥プロセス中に経時的に測定された圧力および温度プロファイルは、図2にグラフで示されている。
【００８１】
上記の従来の凍結乾燥法は、その後再構成することができる黄色がかったケーキまたは粉末を生じた。
【００８２】
凍結乾燥物の再構成のために、再構成培地としての2mlの注射用滅菌水を各バイアルに注入した。次いで、バイアルを約10〜20秒間穏やかに撹拌した。従来の凍結乾燥によって得られたこの凍結乾燥物の再構成は、137分の再構成時間をもたらした。
【００８３】
再構成後、目に見える粒子のない透明な黄色がかった溶液が観察された。凝集、または凝集の兆候は検出されなかった。
【００８４】
実施例2：2つの異なる噴霧凍結乾燥法による凍結乾燥
実施例1（方法1）に記載の従来の凍結乾燥法によって得られた凍結乾燥物の再構成時間は、2時間を超え、許容できないほど長いため、2つの異なる他の凍結乾燥法を適用し、上記の従来の凍結乾燥と比較した。
【００８５】
第一に、国際公開第2006／008006号パンフレットに記載された方法（方法2）に従って、抗FXIa抗体076D−M007−H04−CDRL3−N110Dを含む液体組成物32を処理した。150mg／mlの抗FXIa抗体を含有する138mlの溶液を400μmのノズルを通して噴霧し、470Hzの周波数で、約19．5g／分の速度および220mbarの圧力オーバーレイで噴霧した。ノズルの約25cm下に配置した、液体窒素を充填した隔離された容器内で液滴を凍結させ、プロセス全体を通して撹拌した。噴霧の完了後、凍結ペレットを、予冷したふるいを通して液体窒素を注ぐことによって除去し、プラスチックホイルにより裏打ちされたスチールラックに入れて、Virtis Advantage Pro凍結乾燥機の予冷した棚に置き、凍結乾燥させた。0°Cの棚温度で33時間にわたって一次乾燥を行い、続いて、30°Cで5時間にわたって二次乾燥を行った。乾燥の完了後、乾燥したペレットを即座にガラス瓶に移し、これをしっかりと閉じた。続いて、乾燥窒素雰囲気下で520mgのペレットを秤量して10RタイプIガラスバイアルに入れた。国際公開第2006／008006号パンフレットに記載の方法に従った、抗体溶液の凍結および乾燥中に経時的に測定された圧力および温度プロファイルは、図3にグラフで示されている。
【００８６】
第二に、本発明による凍結乾燥ペレットの再構成時間を短縮するための噴霧凍結乾燥ベースの方法（方法3）に従って、抗FXIa抗体076D−M007−H04−CDRL3−N110Dを含む液体組成物32を処理し、該方法は、
a）抗FXIa抗体を含む溶液の液滴を凍結させて、ペレットを形成するステップ、
b）ペレットを凍結乾燥させるステップを含み、
ステップa）では、液滴は、温度制御可能な内壁面と溶液の凍結温度よりも低い内部温度とを有する冷却塔内に向かう、抗FXIa抗体を含む溶液の液滴形成によって形成され、ステップb）では、ペレットは、真空チャンバ内に収容される回転受容器内で凍結乾燥される。
【００８７】
この目的のために、壁によって冷却された冷却塔に溶液を噴霧することによって、150mg／mlの抗FXIa抗体を含有する250mlの溶液を凍結乾燥させた。噴霧ノズルは直径400μmの開口部を1つ有した。これは約800μmの液滴寸法に対応する。発振周波数は1445Hz、偏向圧力は0．4barであり、ポンプは14rpmで作動させた。乾燥の完了後、乾燥したペレットを即座にガラス瓶に移し、これをしっかりと閉じた。続いて、乾燥窒素雰囲気下で520mgのペレットを秤量して10RタイプIガラスバイアルに入れた。経時的に測定された、冷却塔の温度プロファイルを図4にグラフで示す。抗体溶液の凍結および乾燥中に経時的に測定された温度および圧力プロファイルを図5にグラフで示す。
【００８８】
本発明による凍結乾燥法（方法3）は、狭い寸法および重量分布と、高い表面積とを示す均一なペレットを生じた。この方法によって得られたペレットの残留湿度は0．268％であった。従来の凍結乾燥（方法1）によって得られた凍結乾燥物は、0．15％の残留水分を含んでいた。
【００８９】
3つの異なる凍結乾燥プロセスによって得られたペレットのサイズ排除クロマトグラフィー分析を表2に示す。
【００９０】
【表２】
2021529801.tif 000004
【００９１】
全体として、3つの凍結乾燥法のサイズ排除クロマトグラフィーによって、同等の分析データが得られた。
【００９２】
試料中に存在するタンパク質性成分全体に対するインタクトな抗体の量を決定するために、キャピラリーSDS−ゲル電気泳動（CGE）によりIgGの純度を分析した。ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の存在下で裸のフューズドシリカキャピラリーを使用して、CGEによって試験試料および参照試料を分離した。試験は非還元条件下で行った。220nmの吸光度により、分離した試料をモニタリングした。アッセイの目的は、メインピークのピーク面積を統合し、還元後の副産物を分析することであった。
【００９３】
キャピラリーゲル電気泳動（CGE）およびELISA分析の結果を表3に示す。
【００９４】
【表３】
2021529801.tif 000005
【００９５】
3つの異なる凍結乾燥法によって得られたペレットの再構成時間を以下のように比較した。再構成培地として2mlの注射用滅菌水を各バイアルに注入した。写真を撮った後、バイアルを約10〜20秒間穏やかに撹拌した。ペレットの経時的な再構成を視覚的に観察し、写真で記録した。
【００９６】
3つの異なる凍結乾燥法によって得られたペレットの再構成時間を以下に示す。
【００９７】
凍結乾燥法    再構成時間    抗体濃度
方法1        137分        150mg／mL
方法2        16分          150mg／mL
方法3        11分          150mg／mL
【００９８】
本発明による方法（方法3）により得られたペレットを含む凍結乾燥抗FXIa抗体の再構成は、従来の凍結乾燥（方法1）によって得られた凍結乾燥物を含む同等の抗FXIa抗体の再構成よりも顕著に速いだけでなく、国際公開第2006／008006号パンフレット（方法2）に従って得られた凍結乾燥ペレットよりも速かった。
【００９９】
その後、3つの異なる凍結乾燥法によって得られたペレットを走査型電子顕微鏡（SEM）測定に供した。したがって、窒素雰囲気下でグローブバッグ内で試料の調製を行い、各試料を個別に調製した。試料をホルダ上に置き、金をスパッタリングした。続いて、走査型電子顕微鏡測定を行った。SEM写真を図6から図8に示す。
【０１００】
本発明による方法に従って生成されたペレットは、特に均質な形態を示し、これは、後のプロセスステップにおける取扱い特性を改善し得ることが分かる。
【符号の説明】
【０１０１】
100  冷却塔
110  温度制御可能な内壁面、内面、内壁
120  外壁
130  空間
140  冷却手段
150  ノズル
160  液滴
170  凍結ペレット
180  シュート
190  弁
200  真空チャンバ、真空乾燥チャンバ
210  回転受容器、回転可能なドラム
220  凍結乾燥ペレット
【図１】
2021529801.tif 000006
【図２】
2021529801.tif 000007
【図３】
2021529801.tif 000008
【図４】
2021529801.tif 000009
【図５】
2021529801.tif 000010
【図６】
2021529801.tif 000011
【図７】
2021529801.tif 000012
【図８】
2021529801.tif 000013
【配列表】
2021529801000001.app
【国際調査報告】
2021529801.tif 000014
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