(57)【要約】  本発明は、癌の治療のための、ＩＬ−３１またはＩＬ−３１とキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の両方を発現するように遺伝子改変されたマクロファージを提供する。本発明は、遺伝子改変されていないマクロファージまたはＣＡＲを発現するように遺伝子改変されたマクロファージとともにＩＬ−３１を投与することを含む癌の治療のための方法をさらに提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチド、または（ｉｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１、もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質を発現するように遺伝子改変されたマクロファージであって、前記融合タンパク質において、前記ヒトＩＬ−３１またはペプチドはＩｇＧを含む免疫グロブリンアミノ酸配列に結合している、マクロファージ。
【請求項２】
ヒトＩＬ−３１を発現するように遺伝子改変されている、請求項１に記載のマクロファージ。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子改変マクロファージを調製する方法であって、ヒトＩＬ−３１、配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチド、または前記融合タンパク質であって、前記ＩＬ−３１もしくは前記ペプチドがＩｇＧを含む免疫グロブリンアミノ酸配列に結合している、前記融合タンパク質をコードする核酸配列を、単球、ナイーブマクロファージまたは抗腫瘍マクロファージから選択される細胞の集団へ形質導入法によって導入することを含む、方法。
【請求項４】
ヒトＩＬ−３１をコードする前記核酸配列がレンチウイルス形質導入によって前記細胞に導入される、ヒトＩＬ−３１を発現するように遺伝子改変された前記マクロファージを調製する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の遺伝子改変マクロファージ、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項６】
前記マクロファージが、ヒトＩＬ−３１を発現するように遺伝子改変されている、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
癌の治療に使用するための、請求項５または６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
癌を治療するための方法であって、治療有効量の請求項１または２に記載の遺伝子改変マクロファージ、または請求項５〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物を、必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項９】
癌を治療するための方法であって、（ｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１、または配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチド、（ｉｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１、または配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質において、前記ヒトＩＬ−３１またはペプチドがＩｇＧを含む免疫グロブリンアミノ酸配列に結合している、融合タンパク質、あるいは（ｉｉｉ）ヒトＩＬ−３１、または配列番号１に記載の配列のＩＬ−３１もしくは配列番号１に記載のヒトＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ジビニルエーテル、アルブミン、無水マレイン酸コポリマー（ＤＩＶＥＭＡ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリ（スチレンコマレイン酸無水物）（ＳＭＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アルギン酸（ＡＡ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（Ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ）、グライムまたはポリイソプロピルアクリルアミドから選択される非タンパク質性またはタンパク質性部分と、を含む複合体の注入とともに、治療有効量の遺伝子改変されていないマクロファージを、必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項１０】
免疫エフェクタ細胞で発現するように設計されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されたマクロファージであって、前記ＣＡＲを発現する前記マクロファージが、食作用、標的化細胞傷害性、抗原提示、およびサイトカイン分泌を含む標的化エフェクタ活性を有する、マクロファージ。
【請求項１１】
前記ＣＡＲが、前記標的化エフェクタ活性が向けられる標的細胞上の抗原に結合する細胞外抗原結合ドメイン、前記抗原結合ドメインを細胞内ドメインに接続する膜貫通ドメイン、および前記ＣＡＲの細胞質部分を表す前記細胞内ドメインを含み、ならびに前記ＣＡＲが発現される前記マクロファージの活性化に関与する、請求項１０に記載のＣＡＲマクロファージ。
【請求項１２】
前記ＣＡＲの前記細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２２、またはＨＥＲ２を含む抗原に対する抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり、前記ＣＡＲの前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８、ＣＤ２８、またはＣＤ３ζの前記膜貫通ドメインを含み、および前記ＣＡＲの前記細胞内ドメインが、表面受容体の前記細胞質部分、刺激性もしくは共刺激性分子、またはＭｅｇｆ１０、ＦｃＲγ、ＣＤ３ζもしくはデクチン−１の前記細胞内ドメインを含む分子といった前記マクロファージにおけるシグナル伝達を開始する分子であり得る、請求項１１に記載のＣＡＲマクロファージ。
【請求項１３】
癌を治療するための方法であって、（ｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１、または配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチド、（ｉｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１または配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質において、前記ヒトＩＬ−３１またはペプチドがＩｇＧを含む免疫グロブリンアミノ酸配列に結合している、融合タンパク質、あるいは（ｉｉｉ）ヒトＩＬ−３１、または配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質と、非タンパク質性もしくはタンパク質性部分と、を含む複合体の注入とともに、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の治療有効量のＣＡＲマクロファージを、必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
マクロファージであって、（ｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチド、または配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質において、前記ヒトＩＬ−３１もしくはペプチドはＩｇＧを含む免疫グロブリンアミノ酸配列に結合している、融合タンパク質と、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する前記マクロファージが標的化エフェクタ活性を有するように免疫エフェクタ細胞で発現するように設計され、前記ＣＡＲが細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む、ＣＡＲと、の両方を発現するように遺伝子改変された、マクロファージ。
【請求項１５】
請求項１４に記載のマクロファージおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
癌の治療のための、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
癌を治療するための方法であって、請求項１４に記載の治療有効量の遺伝子改変マクロファージ、または請求項１５もしくは１６に記載の治療有効量の医薬組成物を、必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項１８】
前記癌が、膀胱、脳、乳房、頸部、結腸、結腸直腸、神経膠芽腫、頭頸部、腎臓、肝臓、肺、黒色腫、卵巣、膵臓、下垂体、前立腺、直腸、肉腫腫瘍、皮膚、胃、精巣、甲状腺および子宮の癌を含む原発性または転移性固形腫瘍である、請求項５〜７および１５〜１６に記載の医薬組成物、ならびに請求項８、９、１３または１７に記載の方法。
【請求項１９】
治療有効量の遺伝子改変されていないマクロファージまたは請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＣＡＲマクロファージとともに、治療有効量を注入によって投与されることを含む、癌の治療に使用するための、配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１、または配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチド、（ｉｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１または配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質において、前記ヒトＩＬ−３１またはペプチドはＩｇＧを含む免疫グロブリンアミノ酸配列に結合している、融合タンパク質、あるいは（ｉｉｉ）ヒトＩＬ−３１、または配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質と、非タンパク質性またはタンパク質性部分と、を含む、複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、癌治療の分野、特に養子細胞移植（ＡＣＴ）免疫療法による癌の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌免疫療法は、癌を治療するための免疫系の構成要素の使用を伴い、例えば免疫系の人工的な刺激によって癌と戦う免疫系の自然な能力を改善する。
【０００３】
養子細胞移植療法（ＡＣＴ）は、腫瘍細胞を根絶する免疫系の固有の能力を活用する有望なタイプの癌免疫療法を表している。ＡＣＴでは、免疫細胞が患者の腫瘍サンプルまたは末梢血から抽出され、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖された、そして患者に再注入される。これらの免疫細胞は、腫瘍細胞を自然に根絶することができるか、または遺伝子組み換えもしくは特定のサイトカインによる処置によってそのように再プログラムされているかのいずれかである。
【０００４】
Ｔリンパ球は、免疫監視および腫瘍細胞の根絶に重要な役割を果たす。それらは、腫瘍関連抗原を認識する受容体を発現し、一度活性化されると、悪性細胞に対して直接的な細胞毒性効果を発揮する。診療所では、腫瘍浸潤性Ｔリンパ球（ＴＩＬ）の存在は、様々な腫瘍タイプの患者の良好な予後と関連している（Ｆｒｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０００５】
ＴＩＬ療法は、開発された最初のタイプのＡＣＴ療法を表し、そして切除された腫瘍から単離された自然発生のリンパ球の抽出、選択、およびｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖を伴う。次に、腫瘍抗原に対して高い親和性を備えるＴ細胞受容体を発現する増殖したＴＩＬは、体内に注入して戻される。ＴＩＬ療法では、患者は典型的に、Ｔ制御性細胞および骨髄由来サプレッサー細胞などのサプレッサー細胞を排除するためにリンパ球を枯渇させられる。患者はまた、移植されたＴＩＬのｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を促進するＴ細胞成長因子であるＩＬ−２を高用量で投与を受ける（Ｈｏｕｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＴＩＬ療法は、進行した転移性黒色腫で成功することが証明されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。しかしながら、いくつかの制限があり、例えば、腫瘍の外科的切除が必要である。加えて、免疫浸潤が欠損している腫瘍または抗原のプロセシングおよび提示がダウンレギュレートされている腫瘍には好適ではない。
【０００６】
新規の２つのアプローチであって、どちらも末梢Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子工学に基づいているアプローチが、このような障害を克服するために開発された。第１のアプローチでは、末梢Ｔ細胞は、腫瘍抗原に対して特異性を持つＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作されている。このようなＴ細胞は、ＭＨＣとの関連で発現されるプロセシングされたペプチド抗原を認識する。
【０００７】
これまでで最も顕著なタイプのＡＣＴには、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現を介して腫瘍細胞を標的とするように再プログラムされた自己Ｔ細胞を伴う。ＣＡＲ−Ｔ療法は、多くの臨床試験、特に血液悪性腫瘍で劇的な成功を実証しており、そして特定のタイプの癌についてＦＤＡによって承認されている（Ｈａｒｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１８；  Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。この第２のアプローチでは、Ｔ細胞は、細胞外一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されている。ＣＡＲの細胞外部分は特定の腫瘍抗原の認識を可能にし、および細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞の活性化を刺激する。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＭＨＣに制限されない方法で細胞表面抗原を認識するため、抗原のプロセシングおよび提示に依存しない。第１世代のＣＡＲにはＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインが含まれるが、第２世代および第３世代のＣＡＲには、注入されたＴ細胞の持続性および増殖を改善するために、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢなどの１つまたは複数の共刺激分子の細胞内ドメインも含む（Ｈｏｕｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＣＤ１９に対して向けられたＣＡＲ−Ｔ療法は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の劇的な成功を実証しており、患者の９０％で完全寛解が達成された（Ｍａｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ただし、血液悪性腫瘍で実証された有望な応答にもかかわらず、固形腫瘍におけるＣＡＲ−Ｔ療法の有効性は限定されている。これについて考えられる説明は、敵対的な腫瘍微小環境における免疫抑制、およびＣＡＲ−Ｔ細胞の不十分な帰巣ならびに浸潤能力が含まれる（Ｂｅａｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。おそらく、免疫調節性サイトカインが使用されて、そのような障害を克服し得、それによってＣＡＲ−Ｔ療法の抗腫瘍効果を高めることができる。実際に、いくつかの前臨床研究は、ＣＡＲ−Ｔ細胞をさらに修飾することは、抑制性腫瘍微小環境からの保護を提供し、および抗腫瘍効果を改善することを実証した。加えて、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１５などのサイトカインの全身の共投与は、様々な前臨床および臨床研究におけるＣＡＲ−Ｔ療法の有効性を改善する可能性を実証している（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。
【０００８】
マクロファージは、腫瘍微小環境で最も豊富な免疫細胞タイプの１つである。内因性腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、その活性化状態に応じて、腫瘍の進行を促進または抑制のいずれかを行うことができる。初期の腫瘍では、「古典的に活性化された」マクロファージは炎症性殺腫瘍性の表現型を有している。このようなマクロファージは、抗腫瘍マクロファージまたはＭ１様マクロファージとしても知られている。しかしながら、確立された腫瘍では、マクロファージは、血管新生、抗炎症、および免疫抑制の特性を備えた「代替的に活性化された」表現型に向かって分極する。これらのマクロファージは、腫瘍促進性またはＭ２様マクロファージとしても知られている（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ  ａｎｄ  Ｌｏｃａｔｉ，２０１３）。したがって、抗腫瘍マクロファージの養子移植は、癌の治療戦略として探求されてきた。前臨床試験は、活性化マクロファージの投与は、様々なマウス腫瘍モデルにおいて腫瘍の成長および転移を大幅に減少させることを示してきた（Ｆｉｄｌｅｒ，１９７４、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）。しかしながら、今日まで、臨床試験は治療目標の達成に成功していない（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。マクロファージベースのＡＣＴの主な障害の１つは、マクロファージが腫瘍微小環境内で生成された信号に遭遇すると、ｅｘ  ｖｉｖｏで誘導された抗腫瘍表現型が失われることである。したがって、当該技術分野では、養子移植されたマクロファージを所望の機能状態に維持するためのより効果的な組成物および方法が必要とされている。
【０００９】
ＩＬ−３１は、ＩＬ−６サイトカインファミリーに属する免疫調節性サイトカインである。それは主に、Ｔｈ２表現型の活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞だけでなく、マスト細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞によって発現される（Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｎｉｙｏｎｓａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２９１０）。ＩＬ−３１は、遍在的に発現されているオンコスタチンＭ受容体β（ＯＳＭＲβ）およびより制限された発現パターンを有するＩＬ−３１受容体α（ＩＬ−３１ＲＡ）からなるヘテロ二量体複合体を介してシグナルを伝達する（Ｈｅｒｍａｎｎｓ，２０１５）。初期の研究は、ＩＬ−３１を過剰発現するトランスジェニックマウスまたはＩＬ−３１を投与した野生型マウスが、皮膚におけるＴ細胞を介した炎症誘発性の役割と一致するアトピー性皮膚炎のような症状を発症することを実証した（Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ヒトでは、高レベルのＩＬ−３１は、アトピー性皮膚炎（Ｎｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、炎症性腸疾患（Ｄａｍｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、喘息（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）などのアレルギー状態と強く関連している。
【００１０】
癌におけるＩＬ−３１の役割は十分に特徴付けられていない。腫瘍形成促進効果または抗腫瘍形成効果のいずれかを示唆する公表された研究はわずかしかない。例えば、臨床研究は、ＩＬ−３１を皮膚Ｔ細胞リンパ腫および濾胞性Ｂ細胞リンパ腫などの血液悪性腫瘍に関連付けている（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｏｈｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。加えて、ＩＬ−３１およびＩＬ−３３レベルの上昇は、子宮内膜癌患者の予後不良と相関している（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。最近では、ＩＬ−３１は、癌を含む血管新生関連障害を治療し、および転移を軽減または予防することが示された（ＷＯ  ２０１５／１７３８１２号、Ｄａｖｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。
【発明の概要】
【００１１】
腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に存在するマクロファージは、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）として知られている。それらは、様々な機能状態を採用する能力を備えた高い可塑性の細胞である。抗腫瘍マクロファージ（一般に古典的に活性化されたマクロファージまたはＭ１様マクロファージとして知られている）は、適応免疫応答を調整するための、食作用、細胞傷害性、および抗原提示などの抗腫瘍機能の能力がある。腫瘍促進性マクロファージ（一般に、代替的に活性化されたマクロファージまたはＭ２様マクロファージとして知られている）は、血管新生および免疫抑制などの腫瘍を支持するプロセスにおいて強力なプレーヤーである。固形腫瘍微小環境からの信号は、一般に、腫瘍促進表現型へのマクロファージ分極化をもたらすことが知られている。したがって、マクロファージの抗腫瘍表現型を維持するための方法、または腫瘍促進表現型へのそれらの再プログラミングを防ぐための方法は、癌治療の分野における進歩を表す。
【００１２】
本発明によれば、サイトカインであるインターロイキン−３１（ＩＬ−３１）は、養子移植されたマクロファージが癌組織に入り、および腫瘍微小環境内で生成された信号に遭遇したとき、マクロファージのｅｘ−ｖｉｖｏ−誘導性抗腫瘍表現型を維持することができ、それによってそれらの抗腫瘍表現型および治療可能性を維持することができることが、現在、見出された。したがって、Ｉｌ−３１は、癌の治療のためのマクロファージベースの養子細胞療法に有益である。
【００１３】
本発明の一態様では、マクロファージは、ヒトＩＬ−３１またはＩＬ−３１とキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の両方を発現するように遺伝子操作される。
【００１４】
本発明の別の態様において、遺伝子改変されていないマクロファージまたはＣＡＲを発現するように遺伝子改変されたマクロファージは、ＩＬ−３１の注入とともに癌患者に投与され得る。
【００１５】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の発明を実施するための形態のセクションにおいてより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】対照およびＩＬ−３１発現Ｊ７７４細胞におけるアルギナーゼ１（ＡＲＧ１）および誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の相対的な発現レベルを示している。単球−マクロファージ細胞株、Ｊ７７４は、レンチウイルス形質導入システムを使用して、ＩＬ−３１を構成的に過剰発現するように遺伝子改変された。空のベクターで形質導入された対照細胞は、Ｊ７７４−ＮＳＰＩと呼ばれる。ＩＬ−３１をコードするベクターで形質導入された細胞は、Ｊ７７４−ＮＳＰＩ−ＩＬ−３１と呼ばれる。トータルＲＮＡはＪ７７４−ＮＳＰＩおよびＪ７７４−ＮＳＰＩ−ＩＬ−３１細胞から抽出された。リアルタイムＰＣＲが実施され、酵素、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）、および誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の相対的な発現レベルを評価した。発現レベルはＨｓｐ９０に正規化された。
【図２】原発性乳房腫瘍モデルにおいて、ＩＬ−３１を発現する養子移植された単球−マクロファージの治療効果を示している。マウス４Ｔ１乳癌細胞がＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪パッドに同所移植された。腫瘍が平均サイズ７５ｍｍ３に達したとき、マウスは未治療のまま（対照）か、または対照の単球−マクロファージ（Ｊ７７４−ＮＳＰＩ）もしくはＩＬ−３１を発現する単球−マクロファージ（Ｊ７７４−ＮＳＰＩ−ＩＬ−３１）の単回静脈内注射を受けた。１９日目に、顎下静脈から血液サンプルが採取され、血漿が調製された。血漿中のＩＬ−３１のレベルはＥＬＩＳＡによって決定された（図２Ａ）。腫瘍体積は、実験を通して定期的に測定された。図２Ｂは、ＩＬ−３１を発現するＪ７７４単球−マクロファージ（Ｊ７７４−ＮＳＰＩ−ＩＬ−３１）を注射したマウスでは、両方の対照群（対照およびＪ７７４−ＮＳＰＩ）と比較して腫瘍の成長速度が有意により低いことを示している。示されているのは、平均値±ＳＤ（治療群あたりｎ＝６マウス）、＊ｐ＜０．０５である。
【図３】原発性乳房腫瘍モデルにおいて、養子移植されたＩＬ−３１で教育されたマクロファージの治療効果を示している。ＥＭＴ６乳癌細胞（５ｘ１０５細胞）がＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（８週齢）の乳腺脂肪パッドに同所移植された。移植７日後、ＩＬ−３１で教育された腹膜マクロファージが後眼窩洞に注射された。その後、マウスは、１回目、２回目、３回目および４回目の注射において、それぞれ５×１０５、３×１０５、５×１０５および１．５×１０６細胞の用量で、マクロファージ注射（矢印によって示される）の毎週の追加を受けた。対照マウスはマクロファージを注射されなかった。図３Ａ：腫瘍体積が経時的に観察された。データは平均±Ｓ．Ｄ、群あたりｎ＝６匹のマウスとして提示される。＊ｐ＜０．００１。図３Ｂ：カプランマイヤー生存分析。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の生成物および方法を説明する前に、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論およびプロトコルに限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的としており、他に定義されない場合、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されたい。
【００１８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により明らかに別の意味が指示されない限り、複数の参照を含むことにも留意されなければならない。
【００１９】
本発明をよりよく理解するために、本出願で使用されるいくつかの用語が本明細書で定義される。
【００２０】
本明細書で「癌」とも呼ばれる「腫瘍」という用語は、組織の異常な成長を指す。本発明は、固形の原発性または転移性の悪性腫瘍の治療に関する。本明細書で使用される「抗腫瘍効果」という用語は、腫瘍の形成または成長を予防、阻害、または停止することを指す。
【００２１】
「単球」という用語は、血流中に見られる白血球のタイプを指し、組織に入ると、マクロファージまたは樹状細胞に分化する。単球は白血球の最大のタイプであり、適応免疫プロセスにおいて重要な役割を果たす。
【００２２】
単球は典型的に、組織に移動する前に１〜３日間血液中を循環し、そこでマクロファージまたは樹状細胞になる。
【００２３】
「マクロファージ」という用語は、私たちの免疫系の重要な部分である大型の白血球を指す。それは、環境または外部信号に応答して、様々な機能状態を採用する能力を備えた、組織に存在する専門の食細胞および抗原提示細胞である。マクロファージは、血流から体内の任意の組織に移動した循環単球に由来し、食作用を助けて、異物、細胞の破片、および癌細胞などの有害物質を排除する。マクロファージはまた、胎児の発育中に単球とは独立して確立され得る。
【００２４】
マクロファージは、創傷の成熟において果たす役割によって決定される様々な表現型で存在する。本明細書で使用される「ナイーブマクロファージ」という用語は、環境または外部信号によって刺激されていないマクロファージを指す。一般にＭ０マクロファージとして知られているナイーブマクロファージは、中立の（または分極化されていない）表現型を有する。
【００２５】
本明細書で使用される「抗腫瘍マクロファージ」という用語は、食作用、細胞傷害性、抗原提示、およびサイトカイン分泌などの抗腫瘍活性が可能な活性化マクロファージを指す。抗腫瘍マクロファージは、一連の活性化状態で存在する。その一連の極限には、「古典的に活性化されたマクロファージ」またはＭ１マクロファージとして一般に知られているマクロファージがある。抗腫瘍マクロファージは、これらに限定されないが、ＣＤ４０、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ１Ｒ、ＳＯＣＳ３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＰＤＬ１から選択される少なくとも１つの表面マーカのアップレギュレーション、ならびに、これらに限定されないが、ＣＤ２０６およびＣＤ１６３から選択される少なくとも１つの表面マーカのダウンレギュレーションによって特徴付けられる。
【００２６】
本明細書で使用される「腫瘍促進マクロファージ」という用語は、血管新生および免疫抑制などの腫瘍支持活性が可能な活性化マクロファージを指す。腫瘍促進マクロファージは、一連の活性化状態で存在する。その一連の極限には、「代替的に活性化されたマクロファージ」またはＭ２マクロファージとして一般に知られているマクロファージがある。腫瘍促進マクロファージは、これらに限定されないが、ＣＤ２０６およびＣＤ１６３から選択される少なくとも１つの表面マーカのアップレギュレーション、ならびに、これらに限定されないが、ＣＤ４０、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ１Ｒ、ＳＯＣＳ３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＰＤＬ１から選択される少なくとも１つの表面マーカのダウンレギュレーションによって特徴付けられる。
【００２７】
本明細書で使用される「マクロファージベースの養子細胞療法」という用語は、自家または同種異系マクロファージが治療目的で対象に投与されるタイプの養子細胞療法を指す。「自家」とは、後で再導入される同一個体に由来するあらゆる材料を指す。「同種異系」とは、同じ種の異なる個体に由来するあらゆる材料を指す。
【００２８】
本発明によれば、サイトカインＩＬ−３１は、マクロファージベースの養子細胞療法と組み合わせて使用され、ＩＬ−３１の存在は、投与された細胞の抗腫瘍効果を維持および／または増強する働きをする。
【００２９】
第１の態様において、本発明は、（ｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチド、または（ｉｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１、もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質であって、融合タンパク質において、ヒトＩＬ−３１またはペプチドはＩｇＧを含む免疫グロブリンアミノ酸配列に結合している、融合タンパク質を発現するように遺伝子改変されたマクロファージに関する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、ヒトＩＬ−３１が言及されるときはいつでも、参照は、配列番号１に記載される配列を有するタンパク質への参照である。
【００３１】
好ましい一実施形態において、本発明のマクロファージは、ヒトＩＬ−３１を発現するように遺伝子改変されている。
【００３２】
いくつかの実施形態において、マクロファージは、配列番号１に記載されるＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを発現するように遺伝子改変されている。いくつかの他の実施形態において、マクロファージは、ＩＬ−３１またはペプチドはＩｇＧを含む免疫グロブリンアミノ酸配列に結合している融合タンパク質を発現するように遺伝子改変されている。
【００３３】
遺伝子改変マクロファージの調製のために、遺伝子改変はウイルス形質導入法によって細胞の集団（単球、ナイーブマクロファージ、または抗腫瘍マクロファージ）に核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を導入することによって、好ましくは達成される。これを行うために、目的のポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の分子クローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２に記載）によって最初にウイルス発現プラスミドに挿入され、ウイルス発現プラスミドは、ウイルスのゲノムに基づいてウイルスゲノムまたはその一部をコードする。レンチウイルスプラスミドは、分裂および非分裂標的細胞のゲノムへ目的のポリヌクレオチドの安定した組み込みを可能にするので好ましい。レンチウイルス発現プラスミドは、典型的に、レンチウイルスパッケージングおよびエンベローププラスミドと組み合わせて使用され、感染性ウイルス粒子（ビリオン）を生成する。次に、ビリオンが使用されて、レンチウイルス形質導入として知られるプロセスで標的細胞へ形質導入され、それにより、目的のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが標的細胞の集団に導入される。
【００３４】
本発明の一実施形態では、配列番号１（ＷＯ２０１５／１７３８１２に示される）に記載のアミノ酸配列のヒトＩＬ−３１を発現するように遺伝子改変されたマクロファージの調製のために、ヒトＩＬ−３１をコードする配列番号２（ＷＯ２０１５／１７３８１２に示される）に記載された核酸配列は、レンチウイルス形質導入法によって、単球、ナイーブマクロファージ、または抗腫瘍マクロファージから選択される細胞の集団に導入される。
【００３５】
遺伝子改変のために使用される単球またはマクロファージは、対象、好ましくはヒトドナーから得られる。ドナーは、遺伝子改変されたマクロファージが後で再導入されるのと同じ対象（すなわち、自家細胞のドナー）またはＨＬＡ適合ドナー（すなわち、同種異系細胞のドナー）であり得る。細胞は、末梢血、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、臍帯、腹水、および腫瘍を含む多くの供給源から単離され得る。好ましくは、末梢血は、ヒト対象から採取される。末梢血サンプルから単球を単離するための好ましい方法は、白血球アフェレーシスに続く水簸などの当該技術分野で知られている技術を含む。単離された単球は、当業者に周知の方法を使用して培養で増殖され得る。単球のマクロファージへの分化を刺激するＧＭ−ＣＳＦなどの成長因子の存在下で単球を４〜８日間培養することにより、単球はナイーブマクロファージに分化され得る（Ａｎｄｒｅｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ナイーブマクロファージは、当該技術分野で知られている「マクロファージ活性化キラー」または「ＭＡＫ」プロトコルに従って抗腫瘍マクロファージに活性化され得、マクロファージは、これらに限定されないが、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、ムラミルトリペプチドホスファチジルエタノールアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、ミファムルチドおよびリポ多糖（ＬＰＳ）から選択される活性化剤で刺激される（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。この刺激は、対象に抗腫瘍マクロファージを投与する前に１８時間実施される。ＭＡＫプロトコルは、典型的に、週単位で対象あたり最大１０９個の抗腫瘍マクロファージを産生する。
【００３６】
本発明はさらに、（ｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチド、または（ｉｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１、もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質であって、融合タンパク質において、ヒトＩＬ−３１もしくはペプチドはＩｇＧを含む免疫グロブリンアミノ酸配列に結合している、融合タンパク質を発現するように遺伝子改変されたマクロファージおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ヒトＩＬ−３１を発現するように遺伝子改変されたマクロファージを含む。
【００３７】
上記の医薬組成物は、癌の治療に使用することを意図されている。
【００３８】
この態様において、本発明はさらに、（ｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチド、または（ｉｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１、もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質であって、融合タンパク質において、ヒトＩＬ−３１もしくはペプチドはＩｇＧを含む免疫グロブリンアミノ酸配列に結合している、融合タンパク質を発現するように遺伝子改変された治療有効量のマクロファージを、必要とする患者に投与することを含む、癌を治療するための方法に関する。
【００３９】
第２の態様において、本発明は、（ｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチド、（ｉｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１、もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質であって、融合タンパク質において、ヒトＩＬ−３１もしくはペプチドはＩｇＧを含む免疫グロブリンアミノ酸配列に結合している、融合タンパク質、または（ｉｉｉ）ヒトＩＬ−３１、もしくは配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１、もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）ジビニルエーテル、アルブミン、無水マレイン酸コポリマー（ＤＩＶＥＭＡ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリ（スチレンコマレイン酸無水物）（ＳＭＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アルギン酸（ＡＡ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（Ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ）、グライムもしくはポリイソプロピルアクリルアミドから選択される非タンパク質性またはタンパク質性部分と、を含む複合体の注入とともに治療有効量の遺伝子改変されていないマクロファージを、必要とする患者に投与することを含む、癌を治療するための方法に関する。
【００４０】
上記の配列番号１のヒトＩＬ−３１、ペプチド、融合タンパク質、および複合体は、本明細書に完全に開示されるものとして、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／１７３８１２に記載されている。
【００４１】
いくつかの実施形態において、血漿中のＩＬ−３１の半減期を延長する、ＩＬ−３１を安定化する、または血流中または組織においてそれを保護する上記の１つ以上の分子と共にＩＬ−３１を含む融合タンパク質が使用される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、免疫グロブリンアミノ酸配列を含み得る異種アミノ酸配列に結合したＩＬ−３１を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＩＬ−３１および任意のクラスのＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３を含む。いくつかの実施形態では、２つのタンパク質部分は、酵素の切断部位を形成する、例えば、４〜１２アミノ酸のリンカーによって分離されている。
【００４２】
いくつかの実施形態において、ヒトＩＬ−３１、または配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質と、上記で特定されている非タンパク質性またはタンパク質性部分と、を含む複合体が使用される。複合体は、リポソームまたはミセルの形態であり得る。
【００４３】
第３の態様では、本発明は、免疫エフェクタ細胞で発現されるように設計されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（ここではＣＡＲマクロファージ）を発現するように遺伝子改変されたマクロファージに関し、そのＣＡＲを発現するマクロファージは食作用、標的化細胞傷害性、抗原提示、およびサイトカイン分泌を含む標的化エフェクタ活性を有する。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、標的化エフェクタ活性が向けられる標的細胞上の抗原に結合する細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。
【００４５】
抗原結合ドメインは標的細胞上の抗原に結合し、それによって特定の抗原を発現する細胞に対して標的化エフェクタ活性を誘導する。例えば、抗原は、目的の腫瘍または癌に特異的な腫瘍抗原である。抗原結合ドメインは、抗原に結合する任意のドメインを含むことができ、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、およびそれらの任意の断片を含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２２、またはＨＥＲ２を含む抗原に対する抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
【００４６】
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、抗原結合ドメインを細胞内ドメインに接続する。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質の膜貫通領域などの天然の供給源、または合成供給源のいずれかに由来し得、その場合、それは主に疎水性残基を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８、ＣＤ２８またはＣＤ３ζの膜貫通ドメインを含む。
【００４７】
ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＡＲの細胞質部分を表し、ＣＡＲが発現するマクロファージの活性化を担っている。ＣＡＲの細胞内ドメインは、表面受容体の細胞質部分、刺激性もしくは共刺激性分子、またはＭｅｇｆ１０（複数上皮成長因子様ドメインタンパク質１０）、ＦｃＲγ（Ｆｃ受容体の共通サブユニット）、ＣＤ３ζ、もしくはデクチン−１の細胞内ドメインを含む分子などのマクロファージ内でシグナル伝達を開始する分子であり得る。
【００４８】
ＣＡＲを発現する遺伝子改変マクロファージを生成するために、組換え受容体をコードする核酸配列が、上記のレンチウイルス形質導入によって細胞の集団に導入され、組換え受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。
【００４９】
この態様によれば、（ｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチド、（ｉｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１、もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質であって、融合タンパク質において、ヒトＩＬ−３１もしくはペプチドはＩｇＧを含む免疫グロブリンアミノ酸配列に結合している、融合タンパク質、または（ｉｉｉ）ヒトＩＬ−３１、もしくは配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１、もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ジビニルエーテル、アルブミン、無水マレイン酸コポリマー（ＤＩＶＥＭＡ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリ（スチレンコマレイン酸無水物）（ＳＭＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アルギン酸（ＡＡ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（Ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ）、グライムもしくはポリイソプロピルアクリルアミドから選択される非タンパク質性もしくはタンパク質性部分と、を含む複合体の注入とともに、上記で定義される治療有効量のＣＡＲマクロファージを、必要とする患者に投与することを含む、癌を治療するための方法が提供される。
【００５０】
第４の態様では、本発明は、（ｉ）配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１、または配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチド、または配列番号１に記載の配列のヒトＩＬ−３１もしくは配列番号１に記載のＩＬ−３１配列と少なくとも約７０％相同であるペプチドを含む融合タンパク質であって、融合タンパク質において、ヒトＩＬ−３１またはペプチドがＩｇＧを含む免疫グロブリンアミノ酸配列に結合している、融合タンパク質と、（ｉｉ）免疫エフェクタ細胞で発現するように設計されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、ＣＡＲを発現するマクロファージが標的化エフェクタ活性を有し、ＣＡＲが前述のとおりの細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む、キメラ抗原受容体と、の両方を発現するように遺伝子改変されたマクロファージに関する。
【００５１】
上記の段落で定義されたＣＡＲとＩＬ−３１との両方を発現する遺伝子改変マクロファージの調製は、（ｉ）で定義されたＩＬ−３１タンパク質、ペプチド、または融合タンパク質をコードする核酸配列と、ＣＡＲ（ｉｉ）をコードする核酸配列との両方を、当該技術分野で周知の分子クローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載）によってレンチウイルスベクタープラスミドに挿入し、および細胞集団（単球、ナイーブマクロファージ、または抗腫瘍マクロファージ）へ当該技術分野で知られているレンチウイルス形質導入法によって形質導入することによって達成される、２つのポリヌクレオチドの発現は、２つの独立したプロモータによって駆動され得る。代替的に、目的の２つのポリヌクレオチドは、ＣＡＲの細胞内ドメインをコードする配列の後に２Ａ自己切断ペプチドをコードする配列が続き、その後にＩＬ−３１タンパク質またはペプチドをコードする配列が続くように、インフレームで融合され得る。別の代替案では、細胞の集団に２つのレンチウイルス形質導入ベクターを形質導入することができ、一方のベクターは（ｉ）をコードする核酸配列を含み、他方のベクターはＣＡＲポリペプチド（ｉｉ）をコードする。
【００５２】
この態様によれば、本発明は、（ｉ）上記のヒトＩＬ−３１、ペプチド、または融合タンパク質、および（ｉｉ）上記のＣＡＲポリペプチドの両方を発現するように遺伝子改変されたマクロファージ、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は、癌の治療に使用するためのものである。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、細胞−未改変マクロファージもしくは遺伝子改変マクロファージ、またはヒトＩＬ−３１タンパク質、配列番号１に少なくとも７０％相同なペプチドもしくはＩＬ−３１融合タンパク質と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と、を含む。それらは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎに記載されているような、当該技術分野で周知の方法によって製造することができ、それは参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
含む医薬組成物は、静脈内、腹腔内、および腫瘍内などの様々な好適な経路によって患者に投与され得る。好ましい実施形態では、組成物は静脈内投与される。投与の量と頻度は、患者の治療を担当する医師によって決定され、患者の病気のタイプおよび重症度ならびに患者の年齢および状態によって決まる。細胞の治療用量の例は、最大８週間までの期間、投与当たり１０７〜１０９細胞（マクロファージ）の毎週の投与を含む。ＩＬ−３１が遺伝子改変されていないマクロファージまたはＣＡＲ−マクロファージとともに投与される場合、マクロファージは１回または２〜３週間ごとに投与され、ＩＬ−３１は継続的に（毎日）投与される。
【００５５】
本発明に従って治療される癌は、膀胱、脳、乳房、頸部、結腸、結腸直腸、神経膠芽腫、頭頸部、腎臓、肝臓、肺、黒色腫、卵巣、膵臓、下垂体、前立腺、直腸、肉腫腫瘍、皮膚、胃、精巣、甲状腺、および子宮の癌を含む原発性または転移性固形腫瘍であり得る。
【００５６】
次に、本発明を以下の非限定的な実施例によって説明する。
【実施例】
【００５７】
材料および方法
ｉ）細胞培養
マウス単球−マクロファージＪ７７４、マウス４Ｔ１乳癌、マウスＥＭＴ６乳癌、およびヒト２９３Ｔ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，  ＵＳＡ）から購入された。細胞は、信頼のおけるストックから解凍された後、４ヶ月以内で継代培養された。すべての細胞はマイコプラズマについて試験され、陰性であった。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（すべてＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓから購入）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、３７℃で、５％ＣＯ２下で培養された。
【００５８】
ｉｉ）レンチウイルスの生成
マウスＩＬ−３１をコードするＰＣＲ増幅断片が、ＮＳＰＩ−ＣＭＶ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓレンチウイルスベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）のマルチクローニングサイト内のＢａｍＨＩサイトとＸｈｏＩサイトの間にクローニングされ、ＮＳＰＩ−ＣＭＶ−ＩＬ−３１−Ｍｙｃ−Ｈｉｓコンストラクトが生成された。レンチウイルスは、以下、１５μｇのレンチウイルスベクター（すなわち、ＮＳＰＩ−ＣＭＶ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ空の対照ベクター、またはＮＳＰＩ−ＣＭＶ−ＩＬ−３１−Ｍｙｃ−Ｈｉｓのいずれか）、１０μｇのパッケージングプラスミドδＮＲＦ、５μｇのエンベローププラスミドＶＳＶ−Ｇの３つのプラスミドの組合せでの２９３Ｔ細胞（１０ｃｍ培養皿に播種された１．２×１０６細胞）へのリン酸カルシウム一過性トランスフェクションによって生成された。パッケージングおよびエンベローププラスミドはＡｂｍから購入された。トランスフェクションの９６時間後に培地は回収され、ろ過され、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ、最終濃度）が補充された。「レンチウイルス形質導入」のセクションで説明されるとおり、生きたウイルスを含有する培地を直ちにＪ７７４細胞の感染に使用した。
【００５９】
ｉｉｉ）レンチウイルス形質導入
Ｊ７７４細胞は６×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェル培養プレートに播種された。翌日、培地をウイルス含有培地に交換することにより、細胞は感染させられた。プレートは１１００ｇで１．５時間、３２℃で遠心分離された。翌日、新鮮なレンチウイルス生成物で感染手順は繰り返された。４μｇ／ｍｌピューロマイシンを補充した培地中で培養することにより、１０日間にわたって形質導入された細胞が選択された。空のベクターで形質導入された対照細胞は、Ｊ７７４−ＮＳＰＩと呼ばれる。ＩＬ−３１をコードするベクターで形質導入された細胞は、Ｊ７７４−ＮＳＰＩ−ＩＬ−３１と呼ばれる。
【００６０】
ｉｖ）リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して、Ｊ７７４−ＮＳＰＩおよびＪ７７４−ＮＳＰＩ−ＩＬ−３１細胞からトータルＲＮＡが抽出された。ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＲＮＡはｃＤＮＡに逆転写された。リアルタイムＰＣＲが実施され、酵素、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）および誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の相対的な発現レベルを評価した。発現レベルはＨｓｐ９０に正規化された。ＡＲＧ１について、プライマーはＣＴＣＣＡＡＧＣＣＡＡＡＧＴＣＣＴＴＡＧＡＧ（配列番号３）およびＡＧＧＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＡＧＧＧＡＣＡＴＣ（配列番号４）であった。ｉＮＯＳについて、プライマーはＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣＣＡＡＣＡＡＴＡＣＡＡＧＡ（配列番号５）およびＧＴＧＧＡＣＧＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＡＣ（配列番号６）であった。Ｈｓｐ９０について、プライマーはＴＣＧＴＣＡＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＴ（配列番号７）およびＧＣＧＴＴＴＡＡＣＣＣＡＴＣＣＡＡＣＴＧＡＡＴ（配列番号８）であった。すべてのサンプルは３回アッセイされ、そしてΔΔＣＴ法を使用して分析して、ＡＲＧ１およびｉＮＯＳの発現レベルの相対的な倍率変化を評価した。
【００６１】
ｖ）腹膜マクロファージの単離
８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）は、３ｍｌの４％チオグリコレート（生理食塩水中の重量／体積、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内注射され、腹腔内に多数のマクロファージを誘発した。４８時間後、マウスは６０Ｇｙで予め放射線照射された２×１０６個のＥＭＴ６乳癌細胞が腹腔内に注射された。このステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏでマクロファージを腫瘍抗原に曝露させる働きをする。２４時間後にマウスは屠殺され、腹膜マクロファージが以下のように回収された。氷冷ＰＢＳ（５ｍｌ）が腹腔内に注射された。その液体が抜き取られ、３５０ｇで５分間、４℃で遠心分離して細胞を沈殿させた。赤血球を溶解するために、細胞ペレットは１０ｍｌのＲＢＣ溶解バッファ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁され、室温で１０分間インキュベートされた。細胞溶液は３５０ｇ、４℃で５分間再遠心分離され、細胞ペレットは無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁された。腹膜滲出細胞は１０ｃｍ培養皿に播種され、３７℃で約２時間インキュベートされ、細胞を接着させた。非接着細胞は、ＰＢＳで徹底的に洗浄することにより除去された。残りの付着性腹膜細胞（マクロファージを表す）は、分極処置（「ｅｘ  ｖｉｖｏでのマクロファージ分極」のセクションで説明される）の前に、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で一晩培養された。
【００６２】
ｖｉ）ｅｘ  ｖｉｖｏでのマクロファージ分極
培養腹膜マクロファージは、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４および１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３１マウス組換えタンパク質（両方ともＰｅｐｒｏｔｅｃｈ製）で４８時間処置された。ＩＬ−４処置は、マクロファージを腫瘍促進Ｍ２様表現型に向けて分極化する働きをする（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ  ａｎｄ  Ｌｏｃａｔｉ，２０１３）。ＩＬ−３１との同時処置は、マクロファージを腫瘍促進から抗腫瘍表現型に分極化するＩＬ−３１の能力を試験するために実施される。このプロトコルに従って処置されたマクロファージ（すなわち、ＩＬ−４およびＩＬ−３１で同時処置されたマクロファージ）は、以後、ＩＬ−３１で教育されたマクロファージと呼ばれる。ＩＬ−３１で教育されたマクロファージは、アキュターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）での消化によって分離され、ＰＢＳで洗浄され、無血清ＲＰＭＩ培地に再懸濁され、血球計算盤でカウントされた。典型的には、マウス当たり約１×１０７個の腹膜滲出細胞から、約５×１０５個のＩＬ−３１で教育されたマクロファージが得られた。
【００６３】
ｖｉｉ）腫瘍モデルおよび治療プロトコル
単球−マクロファージ細胞株Ｊ７７４を使用した養子移植モデル：マウス４Ｔ１乳癌細胞（５×１０５）が、８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）の乳腺脂肪パッドに同所移植された。腫瘍サイズは、幅２×長さ×０．５の式を使用してベルニエノギスを用いて定期的に評価された。腫瘍が平均サイズの７５ｍｍ３に達したとき、マウスはランダムに３つの治療グループに割り当てられた：ｉ）マウスは未治療のまま、ｉｉ）マウスは２ｘ１０６個の対照Ｊ７７４−ＮＳＰＩ細胞の（尾静脈を介して）単回静脈内注射を受けた、ｉｉｉ）マウスは２ｘ１０６個のＪ７７４−ＮＳＰＩ−ＩＬ−３１細胞の（尾静脈を介して）単回静脈内注射を受けた。グループあたりｎ＝６匹のマウス。腫瘍の成長は定期的に評価された。腫瘍のサイズが約１０００ｍｍ３に達したとき、マウスは屠殺された。
【００６４】
ＩＬ−３１で教育されたマクロファージを使用した養子移植モデル：マウスＥＭＴ６乳癌細胞（５ｘ１０５個の細胞）が、８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）の乳腺脂肪パッドに同所移植された。移植７日後、腫瘍が平均１００ｍｍ３のサイズに達したとき、ＩＬ−３１で教育されたマクロファージが後眼窩洞に注射された（用量あたり１５０μｌのＲＰＭＩの容量中５ｘ１０５個の細胞）。その後、マウスは、マクロファージの注射（用量あたり１５０μｌのＲＰＭＩの体積中に０．３〜１．５ｘ１０６個の細胞）の毎週の追加を受けた。対照マウスはマクロファージを注射されなかった。グループあたりｎ＝６匹のマウス。腫瘍体積は、幅２×長さ×０．５の式に従ってノギス測定によって観察された。エンドポイント（腫瘍が１５００ｍｍ３のサイズに達したとき）でマウスは屠殺された。
【００６５】
ｖｉｉｉ）ＥＬＩＳＡ
４Ｔ１腫瘍細胞移植後１９日目にマウスから血液が採取された。簡単に説明すると、顎下静脈に針が刺され、１００〜１５０μｌの血液がＥＤＴＡを含有するチューブに採取された。血液サンプルは２０００ｇで１５分間遠心分離され、上清（血漿）が回収された。血漿中のＩＬ−３１のレベルは、ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−３１  ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して決定された。
【００６６】
ｉｘ）統計分析
データは、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表現される。差異の統計的有意性は、複数ｔ検定によって評価された。差異は、０．０５未満のｐ値で有意であると見なされた。
【００６７】
実施例１．ＩＬ−３１を発現する遺伝子改変単球−マクロファージ細胞株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性
マウス単球−マクロファージ細胞株、Ｊ７７４は、レンチウイルス形質導入システムを使用して、ＩＬ−３１を構成的に過剰発現するように遺伝子変された。ＩＬ−３１の発現がマクロファージの分極化に影響を与えるかどうかを判断するために、リアルタイムＰＣＲを使用した対照およびＩＬ−３１発現Ｊ７７４細胞におけるアルギニン代謝酵素であるｉＮＯＳ（Ｍ１様マクロファージによって発現される）とＡＲＧ１（Ｍ２様マクロファージによって発現される）との発現レベルを評価した。図１は、ＩＬ−３１発現細胞におけるｉＮＯＳの発現レベルは対照と比較して５倍増加しているのに対し、ＩＬ−３１発現細胞におけるＡＲＧ１の発現レベルは対照と比較して２倍しか増加していないことを示している。これは、ＩＬ−３１が大部分はＭ１様表現型に向かってマクロファージを分極化することを示唆している。
【００６８】
実施例２．ＩＬ−３１を発現する単球−マクロファージ細胞の養子移植は、マウス乳癌モデルにおける腫瘍の成長を阻害する
マウス４Ｔ１原発性乳癌モデルが用いられ、ＩＬ−３１を発現する養子移植された単球−マクロファージ細胞の治療可能性を判断した。簡単に説明すると、マウス４Ｔ１乳癌細胞がＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪パッドに同所移植された。腫瘍が平均サイズの７５ｍｍ３に達したとき、マウスは、未治療のままにされるか、または対照もしくはＩＬ−３１を発現するＪ７７４単球−マクロファージの単回静脈内注射されるかのいずれかである。図２Ａは、ＩＬ−３１を発現するＪ７７４単球−マクロファージを注射されたマウスが、ＩＬ−３１の高い血漿レベル（２．４ｎｇ／ｍｌ）を呈することを実証している。対照の未処置マウスおよび対照のＪ７７４単球−マクロファージを注射されたマウスにおけるＩＬ−３１の血漿レベルは、検出閾値を下回っていた。加えて、予想通り、ＩＬ−３１を発現するＪ７７４単球−マクロファージを注射されたマウスは、脱毛および引っ掻き行動などの皮膚炎の兆候を呈した。実験を通して腫瘍の成長は観察され、成長率がグループ間で比較された。図２Ｂは、ＩＬ−３１を発現するＪ７７４単球−マクロファージを注射されたマウスでは、両方の対照群（すなわち、未処置マウスおよび対照Ｊ７７４単球−マクロファージを注射されたマウス）と比較して、腫瘍の成長速度が有意により低いことを示している。データは、ＩＬ−３１を発現する養子移植された単球−マクロファージの原発性腫瘍の成長に対する阻害効果を実証している。
【００６９】
実施例３．ＩＬ−３１で教育されたマクロファージの養子移植は、マウス乳癌モデルにおける腫瘍の成長を阻害する
これは、ＩＬ−３１が、腫瘍で教育されたマクロファージ、つまり腫瘍抗原に対して向けられたマクロファージの抗腫瘍効果を高めることを示す概念実証例である。
【００７０】
腫瘍抗原に対して向けられたマクロファージの例は、致死的に放射線照射された腫瘍細胞に曝露されたマクロファージ、腫瘍抗原についての受容体を発現する遺伝子改変マクロファージ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変マクロファージ、および患者由来の抗原提示細胞（樹状細胞）と共培養されるマクロファージが含まれる。
【００７１】
本実施例では、この意見を支持する実現可能性の証拠がある。この実験において、マクロファージは、致死的に放射線照射された腫瘍細胞にインビボで曝露され、単離され、かつＩＬ−４で処置される。ＩＬ−４処置は、通常マクロファージを腫瘍促進マクロファージ（腫瘍関連マクロファージ）に変える腫瘍からの信号を模倣する働きをする。ＩＬ−３１でのマクロファージの処置の後、腫瘍抗原およびＩＬ−３１について教育を受けたマクロファージが抗腫瘍活性を実証することが見出された。これは、腫瘍抗原へのマクロファージの教育（例では致死的に放射線照射された細胞であるが、ＣＡＲなどのそのような教育を確実にする他の方法であり得る）がＩＬ３１とともに抗腫瘍反応を増加させることを強調している。
【００７２】
マクロファージを腫瘍促進から抗腫瘍表現型に分極化するＩＬ−３１の能力を試験するために、以下の実験が実施された。マクロファージは、チオグリコレート刺激ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔から採取された。次に、マクロファージはｅｘ  ｖｉｖｏでＩＬ−４およびＩＬ−３１の組み合わせで処置された。ＩＬ−４処置は、マクロファージを腫瘍促進Ｍ２表現型に向けて分極化する働きをする（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ  ａｎｄ  Ｌｏｃａｔｉ，２０１３）。ＩＬ−３１との同時処置は、マクロファージを腫瘍促進から抗腫瘍表現型に分極化するＩＬ−３１の能力を試験する。このプロトコルに従って処置されたマクロファージ（すなわち、ＩＬ−４およびＩＬ−３１で同時処置されたマクロファージ）は、以後、ＩＬ−３１で教育されたマクロファージと呼ばれる。続いて、ＩＬ−３１で教育されたマクロファージがＥＭＴ６乳癌腫瘍を有するマウスへ注射され、腫瘍の成長は経時的に観察された。図３Ａは、マクロファージを注射されなかった対照マウスと比較して、ＩＬ−３１で教育されたマクロファージを投与されたマウスにおいて腫瘍の成長速度が有意に低下したことを実証している。２６日目に、マクロファージで処置したマウスの腫瘍は、未処置のマウスの腫瘍よりも約３倍小さかった。加えて、ＩＬ−３１で教育されたマクロファージを受けたマウスは、未処置のマウスと比較して１４日間の生存利益を有していた。（図３Ｂ）。データは、養子移植された、ＩＬ−３１で教育されたマクロファージの治療効果を実証している。
【００７３】
参考文献
Ａｎｄｒｅｅｓｅｎ  Ｒ，Ｓｃｈｅｉｂｅｎｂｏｇｅｎ  Ｃ，Ｂｒｕｇｇｅｒ  Ｗ，Ｋｒａｕｓｅ  Ｓ，Ｍｅｅｒｐｏｈｌ  ＨＧ，Ｌｅｓｅｒ  ＨＧ，Ｅｎｇｌｅｒ  Ｈ，Ｌｏｈｒ  ＧＷ：Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｒｏｍ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９０，５０（２３）：７４５０−７４５６．
Ｂｅａｔｔｙ  ＧＬ，Ｏ’Ｈａｒａ  Ｍ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ：Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｘｔ  ｓｔｅｐｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１６，１６６：３０−３９．
Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ  Ｃ，Ｂｒａｎｓ  Ｒ，Ｃｚａｊａ  Ｋ，Ｓｋａｚｉｋ  Ｃ，Ｍａｒｑｕａｒｄｔ  Ｙ，Ｚｗａｄｌｏ−Ｋｌａｒｗａｓｓｅｒ  Ｇ，Ｋｉｍ  Ａ，Ｂｉｃｋｅｒｓ  ＤＲ，Ｌｕｓｃｈｅｒ−Ｆｉｒｚｌａｆｆ  Ｊ，Ｌｕｓｃｈｅｒ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ：Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｂ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２０１１，１６５（５）：９６６−９７５．
Ｄａｍｂａｃｈｅｒ，Ｊ．，Ｂｅｉｇｅｌ，Ｆ．，Ｓｅｉｄｅｒｅｒ，Ｊ．，Ｈａｌｌｅｒ，Ｄ．，Ｇｏｋｅ，Ｂ．，Ａｕｅｒｎｈａｍｍｅｒ，Ｃ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｂｒａｎｄ，Ｓ．（２００７）．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ３１  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ＳＴＡＴ１／３  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇｕｔ  ５６，１２５７−１２６５．
Ｄａｖｉｄｉ，Ｓ．，Ｆｒｅｍｄｅｒ，Ｅ．，Ｋａｎ，Ｔ．，Ｒａｖｉｖ，Ｚ．，Ｔｉｍａｎｅｒ，Ｍ．，Ｋａｒｉｎ，Ｎ．，Ｈｅｒｓｈｋｏｖｉｔｚ，Ｄ．，Ａｒｏｈｎｅｉｍ，Ａ．，ａｎｄ  Ｓｈａｋｅｄ，Ｙ．（２０１７）．Ｔｈｅ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３１．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ８，１６４３０−１６４４４．
Ｄｉｌｌｏｎ，Ｓ．Ｒ．，Ｓｐｒｅｃｈｅｒ，Ｃ．，Ｈａｍｍｏｎｄ，Ａ．，Ｂｉｌｓｂｏｒｏｕｇｈ，Ｊ．，Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ−Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｍ．，Ｐｒｅｓｎｅｌｌ，Ｓ．Ｒ．，Ｈａｕｇｅｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｍａｕｒｅｒ，Ｍ．，Ｈａｒｄｅｒ，Ｂ．，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ３１，ａ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５，７５２−７６０．
Ｆｅｒｒｅｔｔｉ，Ｅ．，Ｔｒｉｐｏｄｏ，Ｃ．，Ｐａｇｎａｎ，Ｇ．，Ｇｕａｒｎｏｔｔａ，Ｃ．，Ｍａｒｉｍｐｉｅｔｒｉ，Ｄ．，Ｃｏｒｒｉａｓ，Ｍ．Ｖ．，Ｒｉｂａｔｔｉ，Ｄ．，Ｚｕｐｏ，Ｓ．，Ｆｒａｔｅｒｎａｌｉ−Ｏｒｃｉｏｎｉ，Ｇ．，Ｒａｖｅｔｔｉ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−３１／ＩＬ−３１Ｒ  ａｘｉｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２９，９５８−９６７．
Ｆｉｄｌｅｒ，Ｉ．Ｊ．（１９７４）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４，１０７４−１０７８．
Ｆｒｉｄｍａｎ  ＷＨ，Ｐａｇｅｓ  Ｆ，Ｓａｕｔｅｓ−Ｆｒｉｄｍａｎ  Ｃ，Ｇａｌｏｎ  Ｊ：Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｎｔｅｘｔｕｒｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒｓ：ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２，１２（４）：２９８−３０６．
Ｈａｒｒｅｒ，Ｄ．Ｃ．，Ｄｏｒｒｉｅ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｃｈａｆｔ，Ｎ．（２０１８）．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｙｐｅｓ：Ｎｅｗ  Ｖｅｈｉｃｌｅｓ  Ｊｏｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｃｅ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２９，５４７−５５８．
Ｈｅｒｍａｎｎｓ，Ｈ．Ｍ．（２０１５）．Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３１：Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  ２６，５４５−５５８．
Ｈｏｕｏｔ  Ｒ，Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＬＭ，Ｍａｒａｂｅｌｌｅ  Ａ，Ｋｏｈｒｔ  Ｈ：Ｔ−ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ２０１５，３（１０）：１１１５−１１２２．
Ｈｕａｎｇ  Ｙ，Ｌｉ  Ｄ，Ｑｉｎ  ＤＹ，Ｇｏｕ  ＨＦ，Ｗｅｉ  Ｗ，Ｗａｎｇ  ＹＳ，Ｗｅｉ  ＹＱ，Ｗａｎｇ  Ｗ：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−ａｒｍｅｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０１７．
Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｈ．Ｊ．，Ｒａｆｉｑ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｒ．Ｊ．（２０１６）．Ｄｒｉｖｉｎｇ  ＣＡＲ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒｗａｒｄ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １３，３７０−３８３．
Ｌｅｅ，Ｓ．，Ｋｉｖｉｍａｅ，Ｓ．，Ｄｏｌｏｒ，Ａ．，ａｎｄ  Ｓｚｏｋａ，Ｆ．Ｃ．（２０１６）．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：Ｔｈｅ  ｌｏｎｇ  ａｎｄ  ｗｉｎｄｉｎｇ  ｒｏａｄ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２４０，５２７−５４０．
Ｌｅｉ，Ｚ．，Ｌｉｕ，Ｇ．，Ｈｕａｎｇ，Ｑ．，Ｌｖ，Ｍ．，Ｚｕ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｇ．Ｍ．，Ｆｅｎｇ，Ｚ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｂ．（２００８）．ＳＣＦ  ａｎｄ  ＩＬ−３１  ｒａｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ＩＬ−１７  ａｎｄ  ＢＡＦＦ  ａｒｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ａｓｔｈｍａ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ６３，３２７−３３２．
Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｌｏｃａｔｉ，Ｍ．（２０１３）．Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｓ  ａ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ，  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，  ａｎｄ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：  ｌｅｓｓｏｎｓ  ａｎｄ  ｏｐｅｎ  ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ３３，１４７８−１４８３．
Ｍａｕｄｅ  ＳＬ，Ｆｒｅｙ  Ｎ，Ｓｈａｗ  ＰＡ，Ａｐｌｅｎｃ  Ｒ，Ｂａｒｒｅｔｔ  ＤＭ，Ｂｕｎｉｎ  ＮＪ，Ｃｈｅｗ  Ａ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ＶＥ，Ｚｈｅｎｇ  Ｚ，Ｌａｃｅｙ  ＳＦ  ｅｔ  ａｌ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１４，３７１（１６）：１５０７−１５１７．
Ｎｅｉｓ，Ｍ．Ｍ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｂ．，Ｄｒｅｕｗ，Ａ．，Ｗｅｎｚｅｌ，Ｊ．，Ｂｉｅｂｅｒ，Ｔ．，Ｍａｕｃｈ，Ｃ．，Ｋｒｉｅｇ，Ｔ．，Ｓｔａｎｚｅｌ，Ｓ．，Ｈｅｉｎｒｉｃｈ，Ｐ．Ｃ．，Ｍｅｒｋ，Ｈ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＩＬ−３１  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ＩＬ−４  ａｎｄ  ＩＬ−１３  ｉｎ  ａｔｏｐｉｃ  ａｎｄ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１８，９３０−９３７．
Ｎｉｙｏｎｓａｂａ  Ｆ，Ｕｓｈｉｏ  Ｈ，Ｈａｒａ  Ｍ，Ｙｏｋｏｉ  Ｈ，Ｔｏｍｉｎａｇａ  Ｍ，Ｔａｋａｍｏｒｉ  Ｋ，Ｋａｊｉｗａｒａ  Ｎ，Ｓａｉｔｏ  Ｈ，Ｎａｇａｏｋａ  Ｉ，Ｏｇａｗａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ａｎｄ  ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ  ＬＬ−３７  ｉｎｄｕｃｅ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｕｒｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＩＬ−３１  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０，１８４（７）：３５２６−３５３４．
Ｏｈｍａｔｓｕ，Ｈ．，Ｓｕｇａｙａ，Ｍ．，Ｓｕｇａ，Ｈ．，Ｍｏｒｉｍｕｒａ，Ｓ．，Ｍｉｙａｇａｋｉ，Ｔ．，Ｋａｉ，Ｈ．，Ｋａｇａｍｉ，Ｓ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｈ．，Ａｓａｎｏ，Ｙ．，Ｔａｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｓｅｒｕｍ  ＩＬ−３１  ｌｅｖｅｌｓ  ａｒｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ  ９２，２８２−２８３．
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ，Ｙａｎｇ  ＪＣ，Ｓｈｅｒｒｙ  ＲＭ，Ｋａｍｍｕｌａ  ＵＳ，Ｈｕｇｈｅｓ  ＭＳ，Ｐｈａｎ  ＧＱ，Ｃｉｔｒｉｎ  ＤＥ，Ｒｅｓｔｉｆｏ  ＮＰ，Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＰＦ，Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ：Ｄｕｒａｂｌｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｖｉｌｙ  ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１１，１７（１３）：４５５０−４５５７．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．
Ｗａｎｇ，Ｂ．Ｓ．，Ｌｕｍａｎｇｌａｓ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｄｕｒｒ，Ｆ．Ｅ．（１９８６）．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｂｙ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４６，５０３−５０６．
Ｚｅｎｇ，Ｘ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｇａｏ，Ｑ．Ｑ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｙ．，Ｙｕ，Ｘ．Ｚ．，Ｚｈｏｕ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｘｉ，Ｍ．Ｒ．（２０１６）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３１  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３３  Ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  Ｃａｎｃｅｒ：Ａ  Ｃａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｔｕｄｙ．Ｄｉｓ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ２０１６，９２６２９１９．
【図１】
2021529552.tif 000002
【図２Ａ】
2021529552.tif 000003
【図２Ｂ】
2021529552.tif 000004
【図３Ａ】
2021529552.tif 000005
【図３Ｂ】
2021529552.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月23日(2021.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021529552000001.app
【国際調査報告】
2021529552.tif 000007
2021529552.tif 000008
2021529552.tif 000009
2021529552.tif 000010