(57)【要約】  本明細書に記載されているものは、導入遺伝子の肝臓特異的発現のために使用される構築物である。
2021533098.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質をコードするアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの５×１０１２から５×１０１３ｖｇ／ｋｇの１つ以上の用量をヒト対象に投与することを含む、ヒト対象において第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を増加させる方法であって、ＡＡＶベクターの投与は、循環ＦＶＩＩＩ活性のレベルにおける臨床的に関連する増加をもたらす、方法。
【請求項２】
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質をコードするアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの５×１０１２から５×１０１３ｖｇ／ｋｇの１つ以上の用量をヒト対象に投与することを含む、ヒト対象において第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を増加させる方法であって、ＡＡＶベクターの投与は、ヒト対象が受けるＦＶＩＩＩ処置の数の減少をもたらす、方法。
【請求項３】
投与が、投与後３−１２月の間にヒト対象において自然出血エピソードの１つまたはゼロの発生をもたらす、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
１ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇから３ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇの１つ以上の用量を投与することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
２ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇから４ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇの１つ以上の用量を投与することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
３ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇの１つ以上の用量を投与することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
ＦＶＩＩＩが配列番号：１のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
ＡＡＶベクターがＡＡＶ６血清型を有する、請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＡＡＶベクターが、肝臓特異的エンハンサーおよびプロモーターに作動可能に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
肝臓特異的エンハンサーが配列番号：２のヌクレオチド配列を含み、および／またはプロモーターが配列番号：３のヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＡＡＶベクターが、発現カセットに隣接するＡＡＶ２  ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列およびＡＡＶ２  ３’ＩＴＲ配列を含む、請求項８から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲが配列番号：１２のヌクレオチド配列を含み、および／またはＡＡＶ２  ３’ＩＴＲが配列番号：１３のヌクレオチド配列を含む、請求項８から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
発現カセットの配列が、配列番号：５のヌクレオチド配列を含む、請求項８から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ヒト対象が血友病を有する、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ヒト対象が、投与の３−１２月後にＦＶＩＩＩ処置を受けない、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月３日出願の米国仮特許出願第６２／７１４，５５３号、２０１９年３月２９日出願の米国仮特許出願第６２／８２６，８８７号および２０１９年７月１日出願の米国仮特許出願第６２／８６９，４４５号のそれぞれに対する優先権の利益を主張し、これらはそれぞれ、それら全体において出典明示により包含させる。
【０００２】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体において出典明示により包含させる配列表を含む。２０１９年８月１日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、１１４７４６５  ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは２８，２０７バイトである。
【背景技術】
【０００３】
背景
遺伝子治療は、１つ以上の不活性化遺伝子を有し、および／またはその細胞において以前に生産されない産物を発現させるようにその細胞を引き起こすように、細胞を遺伝子的に操作するために（例えば、導入遺伝子の挿入および／または内因性配列の修正を介して）使用することができる。導入遺伝子の挿入の使用例は、１つ以上の新規治療タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の挿入、細胞または個体に欠けているタンパク質をコードするコード配列の挿入、変異した遺伝子配列を含む細胞における野生型遺伝子の挿入、および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなどの構造的核酸をコードする配列の挿入を含む。内因性遺伝子配列の「修正」の有用な用途の例は、疾患関連遺伝子変異の変化、スプライス部位をコードする配列の変化、調節配列の変化、および／またはタンパク質の構造的特性をコードする配列の標的変化を含む。
【０００４】
肝臓遺伝子導入は、血友病およびリソソーム蓄積障害を含む様々な障害の処置および／または予防のために、導入遺伝子を対象に送達する効果的な手段を提供する。例えば、米国特許第９，１５０，８４７号および米国公開番号２０１３０１７７９８３および２０１４００１７２１２を参照のこと。肝臓に向けられた遺伝子治療に特異的なベクターも記載されている。例えば、ＷＯ  ２０１４０６４２７７；ＷＯ  ２００９１３０２０８；  ＥＰ  ２４５１４７４Ｂ１、Chuah et al., (2014) Molecular Therapy, 22, 1605-1613;およびNair et al. (2014) Blood 123:3195-3199を参照のこと。これらのベクターは、野生型マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン配列を含むことができる。例えば、Haut and Pintel (1998) J. Virol. 72: 1834-1843; Haut and Pintel (1998) Virol. 258:84-94を参照のこと。
【０００５】
血友病Ａおよび血友病Ｂなどの血友病は、血液凝固系の遺伝性障害であり、関節および軟組織への出血、および外傷を経験しているまたは手術を受けている部位への過度の出血により特徴付けられる。血友病Ａは血友病Ｂと臨床的に区別することができないが、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩまたはＦ８）が血友病Ａにおいて不足しているかまたは存在しないが、第ＩＸ因子（ＦＩＸまたはＦ．ＩＸ）が血友病Ｂを有する患者において不足しているかまたは存在しない。Ｆ８遺伝子は、不活性型のフォンワイルブランド(von Wilebrand)因子と一緒に循環する血漿糖タンパク質をコードする。表面が損傷すると、内因性の凝固カスケードが始まり、ＦＶＩＩＩが複合体から放出されて活性化される。活性化形態は、第ＩＸ因子と作用して第Ｘ因子を活性化し、活性化されたＸａになり、最終的にフィブリノーゲンからフィブリンへの変化および血餅の誘導をもたらす。Levinson et al. (1990) Genomics 7(1): 1-11を参照のこと。血友病Ａ患者の４０−５０％は、Ｆ８イントロン２２（ＩＶＳ２２としても知られている）が関与する染色体逆位を有する。逆位は、Ｆ８遺伝子のイントロン２２内の９．６ｋｂ配列と、Ｆ８遺伝子の約３００ｋｂ遠位に位置する２つの密接に関連した逆配向配列の１つとの間の染色体内組換え事象によって引き起こされ、エキソン２３から２６に対してエキソン１から２２の逆位をもたらす。血友病のテキストを参照のこと。Lee et al. (eds) 2005, Blackwell Publishing。他の血友病Ａ患者は、活性部位の突然変異、ナンセンスおよびミスセンス突然変異を含むＦ８の欠陥を有する。
【０００６】
臨床的に、血友病Ａ患者は、患者が出血エピソードを起こす頻度およびそれらのエピソードが続く期間に依存して評価および層別化される。これらの特性は両方とも、患者の血液中のＦＶＩＩＩタンパク質の量に直接的に依存する。重度の血友病を有する患者は、典型的に、ＦＶＩＩＩの正常な血中レベルの１％未満を有し、損傷後の出血、しばしば関節への自然出血を経験する。中度の患者は正常なＦＶＩＩＩレベルの１〜５％を有するが、軽度の患者は正常なＦＶＩＩＩの６％以上を有し、重傷、外傷、または手術後にのみ出血エピソードを有する（Kulkami et al. (2009) Haemophilia 15 : 1281 -90）。血友病Ａを有する患者は、ヒト血漿に由来するか、または処置の頻度が血友病の出血パターンおよび重症度に基づくところに組換え的に生産される置換ＦＶＩＩＩタンパク質（しばしば「因子」と呼ばれる）で処置される。重度の血友病Ａを有する患者は、出血の発生を防ぐために定期的に予防的処置を受けるが、比較的軽度の患者は、損傷後に必要な場合にのみ処置を受けることができる。
【０００７】
機能的なＦＶＩＩＩまたはＦ．ＩＸタンパク質をコードするプラスミドおよび他のベクター（例えば、ＡＡＶ）の導入を含む、血友病ＡまたはＢを有する患者のための遺伝子治療が記載されている。（例えば、米国特許第６，９３６，２４３号；第７，２３８，３４６号および第６，２００，５６０号； Shi et al. (2007) J Thromb Haemost. (2): 352-61; Lee et al. (2004) Pharm. Res. 7: 1229-1232; Graham et al. (2008) Genet Vaccines Ther. 3:6-9; Manno et al. (2003) Blood 101(8): 2963-72; Manno et al. (2006) Nature Medicine 12(3): 342-7; Nathwani et al. (2011) Mol Ther 19(5): 876-85; Nathwani et al. (201 1); N Engl J Med. 365(25): 2357-65およびMcintosh et al. (2013) Blood 121 (17): 3335-44を参照のこと）。
【発明の概要】
【０００８】
第ＶＩＩＩ因子を発現するＡＡＶベクターおよび血友病の処置方法ならびに他の局面が記載される。いくつかの態様において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質をヒトに提供する方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、本明細書に記載されているアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの６ｘ１０１１から１ｘ１０１３または３ｘ１０１３、１ｘ１０１３から１ｘ１０１４、または１ｘ１０１３から５ｘ１０１３、または２ｘ１０１３から４ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇの１つ以上の用量をヒトに投与することを含み、ＡＡＶベクターの投与は、ヒトにおいて第ＶＩＩＩ因子タンパク質の生産をもたらす。いくつかの態様において、用量は、９ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ、２ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ、１ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、２ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、３ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇまたは４ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、肝臓特異的エンハンサーおよび配列番号：１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットに隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復配列を含むヌクレオチド配列を含むＡＡＶ６血清型を有する。
【０００９】
いくつかの態様において、方法は、投与の前および後にヒトの血液中のＦＶＩＩＩタンパク質を測定することをさらに含む。
【００１０】
いくつかの態様において、例えば１ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇから３ｘ１０１３または１ｘ１０１３から１ｘ１０１４、または１ｘ１０１３から５ｘ１０１３、または２ｘ１０１３から４ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇの範囲の用量での、ＡＡＶベクターの投与は、投与前に患者において評価される患者の循環ＦＶＩＩＩ活性と比較して、５％から１５０％またはそれ以上の範囲で、ＦＶＩＩＩ活性における臨床的に関連する増加をもたらす。いくつかの態様において、例えば３×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量での、ＡＡＶベクターの投与は、２０％から１５０％またはそれ以上の範囲でＦＶＩＩＩ活性における臨床的に関連する増加をもたらす。いくつかの態様において、投与は、投与後３−１２月の間（または、例えば、３−６月、３月−１、２、５または１０年、またはそれ以上）にヒト対象における自然出血エピソードの１つまたはゼロの発生をもたらす。
【００１１】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるものは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質（所望により配列番号：１のアミノ酸配列を含む）をコードするアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの２ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇから３ｘ１０１３または１ｘ１０１３から１ｘ１０１４、または１ｘ１０１３から５ｘ１０１３、または２ｘ１０１３から４ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇの１つ以上の用量をヒト対象に投与することを含む、ヒト対象において第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を増加させる方法であって、ＡＡＶベクターの投与は、循環ＦＶＩＩＩ活性のレベルの臨床的に関連する増加、例えば５％から１５０％；または５０％から１５０％をもたらす、方法である。いくつかの態様において、患者に投与されるＦＶＩＩＩの１つ以上の用量は１ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇから３ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ６血清型を有する。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、肝臓特異的エンハンサーおよびプロモーターに作動可能に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。いくつかの態様において、肝臓特異的エンハンサーはＳｅｒｐｉｎ  １エンハンサーであり、および／またはプロモーターはトランスサイレチンミニマルプロモーターである。いくつかの態様において、肝臓特異的エンハンサーは配列番号：２のヌクレオチド配列を含み、および／またはプロモーターは配列番号：３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、発現カセットに隣接するＡＡＶ２  ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列およびＡＡＶ２  ３’ＩＴＲ配列を含む。いくつかの態様において、ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲは配列番号：１２のヌクレオチド配列を含み、および／またはＡＡＶ２  ３’ＩＴＲは配列番号：１３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、発現カセットの配列は、配列番号：５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ヒト対象は血友病を有する。
【００１２】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるものは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質（所望により配列番号：１のアミノ酸配列を含む）をコードするアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの２ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇから３ｘ１０１３または１ｘ１０１３から１ｘ１０１４、または１ｘ１０１３から５ｘ１０１３、または２ｘ１０１３から４ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇの１つ以上の用量をヒト対象に投与することを含む、ヒト対象において第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を増加させる方法であって、ＡＡＶベクターの投与は、ヒト対象が受けるＦＶＩＩＩ処置の数の減少をもたらす、方法である。いくつかの態様において、ヒト対象は、投与後３−１２月の間（または、例えば、３−６月、３月−１、２、５または１０年、またはそれ以上）にＦＶＩＩＩ処置を受けない。いくつかの態様において、患者に投与される第ＶＩＩＩ因子の１つ以上の用量は、１ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇから３ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ６血清型を有する。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、肝臓特異的エンハンサーおよびプロモーターに作動可能に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。いくつかの態様において、肝臓特異的エンハンサーはＳｅｒｐｉｎ  １エンハンサーであり、および／またはプロモーターはトランスサイレチンミニマルプロモーターである。いくつかの態様において、肝臓特異的エンハンサーは配列番号：２のヌクレオチド配列を含み、および／またはプロモーターは配列番号：３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、発現カセットに隣接するＡＡＶ２  ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列およびＡＡＶ２  ３’ＩＴＲ配列を含む。いくつかの態様において、ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲは配列番号：１２のヌクレオチド配列を含み、および／またはＡＡＶ２  ３’ＩＴＲは配列番号：１３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、発現カセットの配列は、配列番号：５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ヒト対象は血友病を有する。
【００１３】
いくつかの態様において、例えば２ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇから３ｘ１０１３または１ｘ１０１３から１ｘ１０１４、または１ｘ１０１３から５ｘ１０１３、または２ｘ１０１３から４ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇの範囲の用量での、ＡＡＶベクターの投与は、ＦＶＩＩＩ処置の使用における減少、例えば患者が週あたりまたは月あたりに受けるＦＶＩＩＩ注射の数の減少をもたらす。いくつかの態様において、ＦＶＩＩＩの使用は少なくとも２０％減少させる。さらなる態様において、ＦＶＩＩＩの使用は少なくとも５０％減少させる。いくつかの態様において、ＦＶＩＩＩの使用は９０％またはそれ以上減少させる。
【００１４】
いくつかの態様において、投与前に、ヒトは、正常なヒト循環ＦＶＩＩＩ活性の１％未満を有し、投与後２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、または５２週以内に、ヒトは、正常なヒト循環ＦＶＩＩＩ活性の少なくとも１％を有する。
【００１５】
いくつかの態様において、投与前に、ヒトは、正常なヒト循環ＦＶＩＩＩ活性の５％未満を有し、投与後２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、または５２週以内に、ヒトは、正常なヒト循環ＦＶＩＩＩ活性の少なくとも５％を有する。
【００１６】
いくつかの態様において、ヒトは、投与の２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、または５２週以内に、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ビリルビン、アルカリホスファターゼ、またはアルブミンの少なくとも１つの正常な上限（ＵＬＮ）の１．５倍以下を示す。
【００１７】
いくつかの態様において、ヒトは、投与の４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、または５２週後に検出可能なレベルのＦＶＩＩＩインヒビターを有さない。
【００１８】
いくつかの態様において、ＡＡＶベクターを投与される対象は、予防的ステロイド処置を受ける。
【００１９】
いくつかの態様において、方法は、投与前に、および投与後２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、または５２週以内に、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、可溶性上皮細胞増殖因子受容体（ｓＥＧＦＲ）、ガレクチン−３−結合タンパク質（ＧＡＬ３ＢＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ＩＬ−６、循環アルファフェトプロテインの少なくとも１つレベルを測定することをさらに含む。
【００２０】
いくつかの態様において、投与後２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、または５２週以内のフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、可溶性上皮細胞増殖因子受容体（ｓＥＧＦＲ）、ガレクチン−３−結合タンパク質（ＧＡＬ３ＢＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ＩＬ−６、循環アルファフェトプロテインのレベルは、投与前２週間以内のレベルの１．５倍以下である。
【００２１】
いくつかの態様において、ヒトは、投与後、より少ない出血エピソードを示す。いくつかの態様において、ヒトは、投与後、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のより少ない出血エピソードを有する。
【００２２】
いくつかの態様において、ヒトは、補充第ＶＩＩＩ因子タンパク質での処置の必要性の減少を示す。いくつかの態様において、ヒトは、投与後、補充第ＶＩＩＩ因子タンパク質での１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のより少ない処置を必要とする。
【００２３】
いくつかの態様において、ヒトは血友病を有する。
【００２４】
いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は配列番号：５を含む。いくつかの態様において、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列は配列番号：１２および配列番号：１３である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、実施例１に記載されるような発色アッセイを使用する実施例６からのＦＶＩＩＩ活性データを示す。
【００２６】
【図２】図２は、実施例１に記載されるような発色アッセイを使用する実施例６からのＦＶＩＩＩ活性データを示す。
【００２７】
【図３】図３は、実施例１に記載されるような一段階凝固アッセイを使用する実施例６からのＦＶＩＩＩ活性データを示す。
【００２８】
【図４】図４は、ベクターでの処置後に時間とともに１０人の患者において、実施例１に記載されるような一段階凝固アッセイに基づくＦＶＩＩＩ活性を示す。
【００２９】
【図５】図５は、ベクターでの処置後に時間とともに１０人の患者において、実施例１に記載されるような発色アッセイに基づくＦＶＩＩＩ活性を示す。
【００３０】
【図６】図６は、指示された用量でのベクター投与の少なくとも３週間後での患者の自然出血エピソードについてのデータを示す。
【００３１】
【図７】図７は、ベクター注射の３週またはそれ以上後の患者のＦＶＩＩＩ使用量を示す。
【００３２】
【図８】図８は、重篤な有害事象（ＳＡＥ）概要を提供する。
【００３３】
【図９】図９は、処置関連有害事象（ＡＥ）概要を提供する。
【００３４】
【図１０】図１０は、結果の概要を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
イントロダクション
本発明者らは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を発現するＡＡＶベクターが、血友病を有するヒトを含むヒトにおいて増加したＦＶＩＩＩ活性を産生することにおいて有効であることを見いだした。例えば、いくつかの態様において本明細書に記載されるようなＡＡＶベクターの投与が、１％未満の正常なＦＶＩＩＩ活性から少なくとも１％およびいくつかの態様において少なくとも２、３、４、または５％の正常なＦＶＩＩＩ活性に上昇された循環ＦＶＩＩＩ活性をもたらすことが見いだされた。さらに、いくつかの態様において、循環ＦＶＩＩＩ活性は、本明細書に記載されるように肝臓機能または他のバイオマーカーにほとんどあるいは全く副作用を有することなくヒトにおいて増加される。１ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇでまたはそれ以上でのベクターの投与される濃度で、投与の３週（または３週以上）後での出血エピソードの割合は、ほとんどの患者についてゼロに低下し、１ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇでまたはそれ以上での濃度（例えば、１ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇから１ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、例えば２−４ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ）が、非常に効果的な処置をもたらしたことを示す。したがって、いくつかの態様において、これらの濃度でベクターを受ける患者は、さらなるＦＶＩＩＩ注入を必要とせず、または少なくともベクター投与後３、６、９、または１２月以内にそれらを必要としない。
【００３６】
ＦＶＩＩＩをコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが提供される。例示的なＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６血清型のものであり、イントロンおよびＦＶＩＩＩをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された肝臓特異的エンハンサーおよびプロモーターを含む発現カセットに隣接する逆方向反復（ＩＴＲ）配列を含む。例示的なＦＶＩＩＩは、配列番号：１である。いくつかの態様において、ＩＴＲ配列はＡＡＶ２  ＩＴＲであり、したがって、ベクターは「ＡＡＶ２／６」ベクターと呼ぶことができる。ＡＡＶ血清型のゲノム配列およびゲノム類似性の議論については、例えば、GenBank 受入番号AF028704.1; GenBank受入番号J01901.1; Chiorini et al., J. Vir. 71: 6823-33(1997); Srivastava et al., J. Vir. 45:555-64 (1983); Chiorini et al., J. Vir. 73: 1309-1319 (1999); Rutledge et al., J. Vir. 72:309-319 (1998);およびWu et al., J. Vir. 74: 8635-47 (2000)を参照のこと。例示的なＡＡＶ２  ＩＴＲ配列は、以下の通りである。
ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲ
【化１】
2021533098.tif 000003
（配列番号：１２）。
ＡＡＶ２  ３’ＩＴＲ
【化２】
2021533098.tif 000004
（配列番号：１３）。
【００３７】
例示的な肝臓特異的エンハンサーは、例えば、野生型または変異型Ｓｅｒｐｉｎ１エンハンサーを含み、例示的なプロモーターは、トランスサイレチンミニマル（ＴＴＲｍ）プロモーターである。したがって、いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、ＦＶＩＩＩ（例えば、配列番号：１）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＴＴＲｍプロモーターに連結された野生型または変異型Ｓｅｒｐｉｎ１エンハンサーに隣接するＡＡＶ２  ＩＴＲ配列を含むＡＡＶ２／６ベクターである。例示的なベクター配列は、例えば、ＷＯ２０１７／０７４５２６に記載されている。
【００３８】
配列番号１は、シグナルペプチドを有するヒトＦＶＩＩＩアミノ酸配列を示す：
【化３】
2021533098.tif 000005
【００３９】
配列番号：１のシグナルペプチド部分は、
【化４】
2021533098.tif 000006
（配列番号１４）であり、これはタンパク質が分泌されるときに切断される。
【００４０】
例えば、例示的なＳＥＲＰＩＮ１エンハンサーは、
【化５】
2021533098.tif 000007
（配列番号：２）である。
【００４１】
例示的なＴＴＲｍプロモーターは、
【化６】
2021533098.tif 000008
（配列番号：３）である。
【００４２】
ＦＶＩＩＩについての例示的なコード配列は、
【化７】
2021533098.tif 000009
【化８】
2021533098.tif 000010
（配列番号：４）である。
【００４３】
逆方向末端反復配列に隣接する発現カセットについての例示的な配列は、
【化９】
2021533098.tif 000011
【化１０】
2021533098.tif 000012
【化１１】
2021533098.tif 000013
（配列番号：５）である。配列番号：５は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／０７４５２６に記載されているように、（５’から３’に）インシュレーター（スペーサー）配列Ｉｎｓ１（配列番号：５のｎｔ１４−３２）、Ｓｅｒｐｉｎ１エンハンサーＣＲＭＳＢＳ２（配列番号：５のｎｔ３３−１０４）、トランスサイレチンミニマルプロモーターＴＴＲｍ（配列番号：５のｎｔ１１７−３３９）、ＳＢＲ  Ｉｎｔｒｏｎ３（配列番号：５のｎｔ３４０−４３２）、ＦＶＩＩＩコード配列ｈＦ８  ＢＤＤ（配列番号：５の４３８−４８１１）、ＳＰＡ５１合成ポリＡ配列（配列番号：５のｎｔ４８１８−４８６８）、およびインシュレーター配列Ｉｎｓ３（配列番号：５のｎｔ４８６９−４８８５）を含む。
【００４４】
組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984);およびSamulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)を含む多くの刊行物に記載されている。形質導入される細胞のゲノムへの組み込みによる効率的な遺伝子導入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の特徴である。例えば、Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)を参照のこと。
【００４５】
投与されるＡＡＶベクターの有効量は、患者ごとに異なることができる。いくつかの態様において、有効量は、組成物（ＡＡＶベクター）を投与する医師によって決定される。治療ポリペプチドの血清、血漿または他の組織レベルの分析および投与前の初期レベルとの比較は、投与される量が低すぎるか、適切な範囲内であるか、または高すぎるかを決定することができる。最初およびその後の投与のために適切なレジメンもまた可変であるが、最初の投与に代表され、所望により必要なとき後の投与が続く。後の投与は、毎日から毎年、数年ごとまでの範囲である、さまざまな間隔で投与されてよい。いくつかの態様において、送達ベクターの免疫抑制による形質導入の阻害または遮断を回避するために、適切な免疫抑制技術が推奨され得る。例えば、Vilquin et al., (1995) Human Gene Ther., 6:1391-1401を参照されたい。
【００４６】
投与は、任意の手段によるものであってよい。インビボおよびエキソビボの両方の方法が検討される。いくつかの態様において、静脈内注射（例えば、門脈を介するが、これに限定されない）は、投与の方法である。いくつかの態様において、投与は、標準の静脈内投与を介するものである。他のインビボ投与モードは、例えば、肝葉または胆管への直接的な注射、および肝動脈を介することを含む肝臓の遠位への静脈内注射、肝実質への直接的な注射、肝動脈を介する注射、および／または胆道系を介する逆行性注射を含む。エキソビボ投与モードは、切除された肝細胞または肝臓の他の細胞のインビトロでの形質導入、次に、形質導入され切除された肝細胞のヒト患者の門脈血管系、肝実質または胆道系への再注入を含む、例えば、Grossman et al., (1994) Nature Genetics, 6:335-341を参照のこと。
【００４７】
本明細書に記載されているようにＡＡＶベクターの例示的な静脈内用量は、いくつかの態様において、ヒトレシピエントの６ｘ１０１１から１ｘ１０１３または３ｘ１０１３または１ｘ１０１３から１ｘ１０１４、または１ｘ１０１３から５ｘ１０１３、または２ｘ１０１３から４ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、例えば、１ｘ１０１２または２ｘ１０１２から３ｘ１０１３、ウイルスゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）であってよい。いくつかの態様において、用量は、１ｘ１０１１から１ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様において、用量は、１ｘ１０１２から１ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇまたは３ｘ１０１３である。いくつかの態様において、用量は、２ｘ１０１２から３ｘ１０１３である。いくつかの態様において、用量は、５ｘ１０１２から５ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇである。上記のとおり、いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、単回投与としてレシピエントに提供される。いくつかの態様において、用量は、６ｘ１０１１、９ｘ１０１１、１．２ｘ１０１２、２ｘ１０１２、４ｘ１０１２、６ｘ１０１２、１ｘ１０１３、３ｘ１０１３、４ｘ１０１３または５ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様において、患者はＡＡＶベクターの単回投与を受ける。
【００４８】
薬学的に許容される担体を、投与される製剤の一部として含めることができる。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、以下に記載されるように、多種多様の利用できる医薬組成物の適切な製剤が存在する（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989を参照のこと）。
【００４９】
エキソビボおよびインビボ投与の両方のための製剤は、液体または乳化液体中の（例えば、遺伝子改変された細胞、リポソームまたはナノ粒子の）懸濁液を含むことができる。活性成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合性のある賦形剤と混合することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせを含む。加えて、組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤または医薬組成物の有効性を増強する他の試薬などの補助物質の少量を含んでよい。
【００５０】
記載されているＡＡＶベクターを受ける対象は、任意のヒトであることができる。例示的なレシピエントは、例えば血友病（例えば血友病Ａ）を有する個体を含む。いくつかの態様において、血友病Ａの処置に関して、または血友病Ａに罹患している対象における出血エピソード中の出血時間を減少させるための方法における使用のための、治療有効量は、以下の効果の１つ以上を引き起こすことができる量を指す：（１）例えば、打撲傷、関節の痛みまたは腫れ、長期の頭痛、嘔吐または疲労を含む、血友病Ａの生理学的症状の１つ以上のある程度の減少、阻害、または予防、（２）血液を凝固させる能力の改善、（３）出血エピソード中の全体的な出血時間の減少、（４）対象の血漿中の機能的ＦＶＩＩＩタンパク質の濃度または活性における測定可能な増加を引き起こす投与、および／または（５）障害と関連する１つ以上の症状のある程度の軽減。
【００５１】
いくつかの態様において、正常な個体に見られる因子濃度の１％より大きいＦＶＩＩＩ血液濃度は、本明細書に記載されているＡＡＶベクターの投与から生じ、それにより、重度の疾患表現型を中等度のものに変化させる。重度の表現型は、関節の損傷および生命に関わる出血により特徴付けられる。いくつかの態様において、本明細書に記載されるようなＡＡＶベクターの投与は、正常の少なくとも５％のＦＶＩＩＩ血液濃度をもたらす。いくつかの態様において、中等度の疾患表現型を軽度のものに変更するために、正常の５％より大きいＦＶＩＩＩ血液濃度が必要とされる。正常なヒトにおけるＦＶＩＩＩレベルは、例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）一段階凝固アッセイによって約１．１４＋−０．４８ｎＭ血漿である（例えば、Butenas, et al., Thromb Res. (2010 Aug); 126(2): 119-123を参照のこと）。したがって、治療効果は、対象／ヒトにおけるＦＶＩＩＩの総量が、正常な対象／ヒトに存在するＦＶＩＩＩの１％、例えば、１．１４＋−０．４８ｎＭの１％より大きいような、ＦＶＩＩＩの発現によってなし遂げることができる。
【００５２】
いくつかの態様において、投与前に、ヒトは、正常なヒト循環ＦＶＩＩＩ活性の１％、２％、３％、４％、または５％未満を有し、投与後２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、または５２週以内に、ヒトは、正常なヒト循環ＦＶＩＩＩ活性のそれぞれ少なくとも１％、２％、３％、４％、または５％を有する。いくつかの態様において、本明細書に記載されているＡＡＶベクターの投与は、投与前（例えば、投与前の１４日以内）に対象における血漿中に存在する機能的ＦＶＩＩＩタンパク質活性の量と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のＩＵ／ｄｌのヒトレシピエントの血漿中の機能的ＦＶＩＩＩタンパク質活性における増加をもたらす。いくつかの態様において、本明細書に記載されているＡＡＶベクターの投与は、対象の血漿における循環ＦＶＩＩＩ活性の少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のＩＵ／ｄｌの発現をもたらす。この点において、「ＩＵ」または「国際単位」なる用語は、ＦＶＩＩＩ活性に関して、一般的に理解されている用語であり、ＦＶＩＩＩ活性の１ＩＵは、１ｍｌの正常なヒト血漿中のＦＶＩＩＩの量に相当する。いくつかの態様において、正常なヒトＦＶＩＩＩ活性は、０．５００−１．５００ＩＵ／ｍｌ血漿である。世界保健機関は、血友病の重症度のレベルを以下のように説明している：
【表１】
2021533098.tif 000014
【００５３】
血漿中のＦＶＩＩＩ活性は、例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＰＴ）法を含む、多くのよく知られて受け入れられているアッセイによって定量的に決定されてよい（例えば、Miletich JP: Activated partial thromboplastin time. In Williams Hematology. Fifth edition. Edited by E Beutler, MA Lichtman, BA Coller, TJ Kipps. New York, McGraw-Hill, 1995, pp L85-86, Greaves and Preston, Approach to the bleeding patient. In Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice. Fourth edition. Edited by RW Colman, J Hirsh, VJ Marder, et al. Philadelphia, JB Lippincott Co, 2001, pp 1197-1234およびOlson et al, Arch. Pathol. Lab. Med. 122:782-798 (1998))または発色ＦＸａアッセイ(Harris et al., Thromb. Res. 128(6): 125-129 (2011)を参照のこと）。
【００５４】
他の態様において、対象における出血時間は、例えば、アイビー法（例えば、Ivy et al., Surg. Gynec. Obstet. 60:781 (1935)およびIvy et al., J. Lab. Clin. Med. 26: 1812 (1941)を参照のこと)またはデューク法(例えば、Duke et al., JAMA 55: 1185 (1910)を参照のこと)を含む、周知なおよび受け入れられている技術によって測定されてよい。対象における「出血エピソード」は、外部的にまたは内部的にのいずれかで対象に出血をもたらす損傷を指し、損傷から血餅の形成までの期間を一般的に含む。いくつかの態様において、出血エピソードの頻度は、本明細書に記載のＡＡＶベクターの投与後の対象において減少される。いくつかの態様において、出血エピソードの頻度は、投与後１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少される。
【００５５】
いくつかの態様において、ヒトの血液中のＦＶＩＩＩタンパク質の濃度は、投与の前、後、または前後に測定される。ＦＶＩＩＩ血液濃度を測定するための直接的または間接的なアッセイを使用することができる。例示的な間接的な方法は、例えば、Over, J. (1986) Scand. J. Haematol. 33 (Suool. 41), 13-24; Kemball-Cook, G., et al. (1993) Brit. J. Haematol. 84, 273-278に記載されているものを含む。直接的な検出方法は、例えば、米国特許第８７１５９５１号に記載されているものを含む。いくつかの態様において、ＦＶＩＩＩ血液濃度は、投与後の効果を最もよく決定するために、ＡＡＶベクターの最初の投与前２週間以内に決定される。
【００５６】
いくつかの態様において、本明細書に記載のＡＡＶベクターでの投与および処置は、対象による補充第ＶＩＩＩ因子タンパク質での処置の必要性の減少を引き起こす。これは、本明細書に記載のＡＡＶベクターの投与前の処置の必要性の頻度に注目し、次に投与後の処置の必要性の頻度に注目することによって測定することができる。いくつかの態様において、処置の必要性の減少は、投与後１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少である。
【００５７】
いくつかの態様において、本明細書に記載のＡＡＶベクターでの投与および処置は、肝臓にほとんどあるいは全く害を引き起こさない。肝臓の状態は、例えば、個人の血液中の１つ以上のマーカーを測定することによって測定することができる。肝臓の健康を示す例示的なマーカーは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ））ビリルビン、アルカリホスファターゼ、およびアルブミンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、ヒトは、投与の２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、または５２週以内に、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ビリルビン、アルカリホスファターゼまたはアルブミンの少なくとも１つの正常な上限（ＵＬＮ）の１．０、１．２、１．５、１．７、または２．０倍以下を示す。ＵＬＮは、一般的に、集団から決定することができる。例えば、ＡＬＴについて議論しているNeuschwander-Tetri, B., et al., Arch Intern Med. 2004 Mar 24; 168(6): 663-666参照のこと。いくつかの態様において、ＡＬＴについてのＵＬＮは４４Ｕ／Ｌである。いくつかの態様において、ＡＳＴについてのＵＬＮは３９Ｕ／Ｌである。いくつかの態様において、ビリルビンについてのＵＬＮは、総ビリルビンについて０．１−１．０ｍｇ／ｄｌ、コンジュゲートされたビリルビンについて０．２−０．７ｍｇ／ｄｌおよびコンジュゲートされていないビリルビンについて０．１−０．４ｍｇ／ｄｌである。例えば、Lisa B, VanWagner (2015). Journal of American Medical Association (JAMA) 313 (5): 516-517参照のこと。いくつかの態様において、アルカリホスファターゼについてのＵＬＮは、１２９または１３３Ｕ／Ｌである。例えば、Gowda, et al., Pan Afr Med J. (2009) 3:17参照のこと。いくつかの態様において、アルブミンについての正常な範囲は３５−５５ｇ／リットルである（Burtis and Ashwood (1999) Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd edition. Saunders Editor）。
【００５８】
いくつかの態様において、本明細書に記載のＡＡＶベクターでの投与および処置は、例えば、投与後４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、または５２週の時点の１つ以上で、ＦＶＩＩＩインヒビターの検出可能なレベルをもたらさない。ＦＶＩＩＩインヒビターは、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ−Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイによって検出される（Duncan, et al., Methods Mol Biol. 2013;992:321-33およびMiller CH, et al. Am J Hematol. 90:871-876 (2015))。このアッセイの検出限界は０．６ＢＵである。０．６ＢＵ未満の結果は、検出できないと考慮される。
【００５９】
いくつかの態様において、本明細書に記載のＡＡＶベクターでの投与および処置は、特定のバイオマーカーの発現に有意に影響を与えず、理想的には、バイオマーカーの改善された結果をもたらす。例示的なバイオマーカーは、例えば、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、可溶性上皮細胞増殖因子受容体（ｓＥＧＦＲ）、ガレクチン−３−結合タンパク質（ＧＡＬ３ＢＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ＩＬ−６、循環アルファフェトプロテインを含む。いくつかの態様において、上記に列挙されたバイオマーカーの１つ以上は、投与の前または後に、あるいはその両方で、個体の血液中で測定される。いくつかの態様において、投与後２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、または５２週以内にアッセイされたときのバイオマーカーの１つ以上の血液レベルは、投与前２週間以内のレベルの１．０、１．２、１．５、１．７、または２．０倍以下である。
【００６０】
一般
本明細書に記載されている方法の実施、ならびに組成物の製造および使用は、他に記載のない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび当分野の技術内である関連分野における従来の技術を使用する。これらの技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001;  Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates;  the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego;  Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998;  METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, “Chromatin” (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999;およびMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, “Chromatin Protocols” (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999参照のこと。
【００６１】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」なる用語は、互換的に使用され、線状または環状コンフォメーションにおいておよび一本鎖または二本鎖形態のいずれかにおいてデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されているヌクレオチドを包含することができる。一般的に、特定のヌクレオチドの類似体は同じ塩基対特異性を有している；すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対を形成する。
【００６２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」なる用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用される。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸が対応する天然アミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用する。
【００６３】
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、外因性ヌクレオチド配列（「発現構築物」または「発現カセット」または「ベクター」）は、興味ある領域のゲノム配列と相同であるが同一ではない配列を含み、それによって興味ある領域に同一でない配列を挿入するように相同組換えを刺激することができる。したがって、１つの態様において、興味ある領域内の配列に相同である発現カセット配列の部分は、置換されるゲノム配列に対して約８０から９９％（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の態様において、例えば、１００を超える連続する塩基対の発現カセットとゲノム配列との相同領域間で１ヌクレオチドのみが異なる場合、発現カセットとゲノム配列との間の相同性は９９％より高い。ある場合において、発現カセットの非相同部分は、興味ある領域に存在しない配列を含むことができ、その結果、新しい配列が興味ある領域に導入される。これらの例において、非相同配列は、一般的に、興味ある領域の配列と相同または同一である、５０−１，０００塩基対（またはそれらの間の任意の整数値）または１，０００を超える任意の数の塩基対の配列に隣接している。
【００６４】
「配列」なる用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい、線状、円状、または分岐状であってよい、および一本鎖または二本鎖のいずれかであってよい任意の長さのヌクレオチド配列を指す。「導入遺伝子」なる用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。導入遺伝子は、任意の長さ、例えば２から１００，０００，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間またはそれ以上の任意の整数）、好ましくは約１００から１００，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間の任意の値）、さらに好ましくは約２０００から２０，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間の任意の値）およびさらにより好ましくは、約５から１５ｋｂ（またはそれらの間の任意の値）であってよい。
【００６５】
「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合である核型によってしばしば特徴付けられる。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含むことができる。
【００６６】
「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例は、プラスミドおよび特定のウイルスゲノムを含む。本明細書に記載の肝臓特異的構築物は、エピソーム的に維持されてよく、あるいは、細胞に安定に組み込まれていてよい。
【００６７】
「外因性」分子は、通常は細胞内に存在しない分子であるが、遺伝的、生化学的、または他の方法の１つ以上によって細胞に導入することができる。「細胞における正常な存在」は、細胞の特定の発達段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成体の筋肉細胞に関して外因性の分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、熱ショックを受けていない細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能するバージョン、または正常に機能する内因性分子の機能不全のバージョンを含むことができる。
【００６８】
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセス(combinatorial chemistry process)によって産生されるような、小分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、それら上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子の１つ以上を含む任意の複合体などの高分子であってよい。核酸はＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であってよく、線状、分岐状、または円状であってよく、任意の長さであってよい。核酸は、二本鎖を形成することができるもの、ならびに三本鎖を形成する核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、リガーゼ、脱ユビキチン化酵素、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼを含むが、これらに限定されない。
【００６９】
外因性分子は、内因性分子と同じタイプの分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってよい。例えば、外因性核酸は、感染性ウイルスゲノム、細胞に導入されたプラスミドまたはエピソーム、または通常は細胞に存在しない染色体を含んでよい。外因性分子を細胞に導入するための方法は、当業者に知られており、脂質媒介性転移（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子衝撃(bombardment)、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性転移およびウイルスベクター媒介性転移を含むが、これらに限定されない。外因性分子はまた、内因性分子と同じタイプの分子であってよいが、細胞が由来するものとは異なる種に由来してもよい。例えば、ヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターに本来由来する細胞株に導入され得る。外因性分子を植物細胞に導入するための方法は、当業者に知られており、プロトプラスト形質転換、炭化ケイ素（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））、アグロバクテリウム媒介形質転換、脂質媒介伝達（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子衝撃（例えば、「遺伝子銃」を使用）、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性転移およびウイルスベクター媒介性転移を含むが、これらに限定されない。
【００７０】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階で特定の細胞に通常存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体または他のオルガネラのゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含むことができる。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含むことができる。
【００７１】
本明細書において使用される「外因性核酸の産物」なる用語は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド産物の両方、例えば、転写産物（ＲＮＡなどのポリヌクレオチド）および翻訳産物（ポリペプチド）を含む。
【００７２】
本開示の目的のための「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記参照）、ならびに調節配列がコードおよび／または転写配列に隣接しているか否かにかかわらず、遺伝子産物の生産を調節するすべてのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界要素、複製起点、マトリックス結合部位および遺伝子座調節領域を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報を遺伝子産物に変更することを指す。遺伝子産物は、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたはあらゆる他のタイプのＲＮＡ）の直接転写産物、またはｍＲＮＡの翻訳によって生産されるタンパク質であってよい。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡ、およびメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、グリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。
【００７４】
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性における変化を指す。発現の調節は、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含むことができるが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、開裂、変化、不活性化、ランダム突然変異）を使用して、発現を調節することができる。遺伝子の不活性化は、本明細書に記載のＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含まない細胞と比較したとき、遺伝子発現における減少を指す。したがって、遺伝子の不活性化は部分的または完全であってよい。
【００７５】
「真核」細胞は、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）、例えば幹細胞（多能性および多能）を含むが、これらに限定されない。
【００７６】
「作動可能な連結」および「作動可能に連結」（または「作動可能に連結した」）なる用語は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素の少なくとも１つが他の構成要素の少なくとも１つに発揮される機能を仲介することができる可能性を可能にするように構成要素が配置される、２つ以上の構成要素（配列要素など）の並置を基準にして互換的に使用される。実例として、転写調節配列が１つ以上の転写調節因子の存在または不存在に応答してコード配列の転写レベルを制御するとき、プロモーターなどの転写調節配列は、コード配列に作動可能に連結されている。転写調節配列は、一般的に、シスにおいてコード配列と作動可能に連結されているが、それに直接的に隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、隣接していなくても、コード配列に作動可能に連結された転写調節配列である。
【００７７】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能性フラグメント」は、配列が完全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持しているタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能性フラグメントは、対応する天然分子とより多い、より少ない、または同じ数の残基を有することができ、および／または１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含むことができる。核酸の機能（例えば、コーディング機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野で周知である。同様に、タンパク質の機能を決定する方法はよく知られている。例えば、Ｂドメインが欠失されたヒト第ＶＩＩＩ因子は、完全長の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の機能性フラグメントである。
【００７８】
ポリヌクレオチド「ベクター」または「構築物」は、遺伝子配列を標的細胞に移すことができる。典型的に、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、「発現構築物」、「発現カセット」、および「遺伝子導入ベクター」は、興味ある遺伝子の発現を指向することができ、遺伝子配列を標的細胞に移すことができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニング、発現媒体(vehicles)、および組み込みベクターを含む。
【００７９】
「対象」および「患者」なる用語は、互換的に使用され、ヒト患者および非ヒト霊長類などの哺乳動物、およびウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、および他の動物などの実験動物を指す。したがって、本明細書において使用される「対象」または「患者」なる用語は、本発明の発現カセットを投与することができる任意の哺乳動物患者または対象を意味する。本発明の対象は、障害を有するものを含む。
【００８０】
本明細書において使用される「処置する」および「処置」なる用語は、症状の重症度および／または頻度の減少、症状および／または根本的な原因の除去、症状および／またはそれらの根本的な原因の発生の防止、ならびに損傷の改善または修正を指す。癌および移植片対宿主病は、本明細書に記載の組成物および方法を使用して処置され得る状態の非限定的な例である。したがって、「処置する」および「処置」は、
（ｉ）特に、哺乳動物がその状態になりやすいが、まだそれを有すると診断されていないとき、哺乳動物において疾患または状態が発生するのを防止すること；
（ｉｉ）疾患または状態を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること；
（ｉｉｉ）疾患または状態を緩和すること、すなわち、疾患または状態の退行を引き起こすこと；および／または
（ｉｖ）疾患または状態に起因する症状を緩和または排除すること、すなわち、根底にある疾患または状態に対処するかどうかにかかわらず、痛みを緩和すること
を含む。
【００８１】
本明細書において使用される「疾患」および「状態」なる用語は、互換的に使用されてよく、または特定の疾患または状態が既知の原因物質を有さない可能性があり（したがって、病因はまだ解明されていない）、および、したがって、まだ疾患として認識されていないが、多かれ少なかれ特定の症状のセットが臨床医によって同定されている、望ましくない状態または症候群としてのみ認識されているという点で異なる可能性がある。
【００８２】
「医薬組成物」は、本発明の化合物、および生物学的に活性な化合物を哺乳動物、例えばヒトへの送達のために当技術分野で一般的に受け入れられている媒体の製剤を指す。かかる媒体は、そのためのすべての薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。
【００８３】
「有効量」または「治療有効量」は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与されたとき、哺乳動物、好ましくはヒトにおける処置を行うのに十分である本発明の化合物の量を指す。「治療有効量」を構成する本発明の組成物の量は、化合物、状態およびその重症度、投与様式、および処置される哺乳動物の年齢に依存して変化するが、当業者の知識およびこの開示を考慮した当業者によって日常的に決定することができる。
【００８４】
肝臓特異的発現構築物
対象への発現カセットの投与（例えば、肝臓送達）後の、インビボを含む、肝細胞において導入遺伝子の発現を指向することにおける使用のための発現カセット（構築物）もまた、本明細書に記載される。発現構築物は、エピソーム的に維持され、導入遺伝子の発現を染色体外で駆動してもよく、あるいは、発現構築物は、例えば、ヌクレアーゼ媒介標的化組み込みによって、肝細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
【００８５】
ポリヌクレオチド発現構築物は、エンハンサー配列、プロモーター配列、および１つ以上の導入遺伝子を含む。所望により、以下のうちの１つ以上が含まれる：イントロン配列、ポリアデニル化配列および／またはシグナルペプチド。本明細書に記載の発現構築物において、任意のエンハンサー配列が使用されてよい。１つの態様において、エンハンサーは、野生型または改変されたＳｅｒｐｉｎ１エンハンサーである（Chuah et al., (2014) Molecular Therapy, 22, 1605-1613,; Nair et al., (2014) Blood, 123, 3195-3199）。
【００８６】
明らかなように、任意の導入遺伝子を本明細書に記載の構築物において使用することができる。さらに、本明細書に記載の構築物の個々の構成要素（プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、導入遺伝子など）は、任意の組み合わせで混合および適合されてよい。
【００８７】
本明細書に記載の構築物は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクター内に含まれてよい。構築物は、エピソーム的に維持されてよく、または細胞のゲノムに組み込まれてよい（例えば、ヌクレアーゼ媒介標的化組み込みを介して）。
【００８８】
非ウイルスベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡプラスミド、ＤＮＡ  ＭＣ、裸の核酸、およびリポソーム、ナノ粒子、またはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体を形成した核酸を含む。本明細書に記載の発現カセットを運ぶために使用され得るウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアおよび単純ヘルペスウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法で可能であり、本明細書に記載されているように、ヌクレアーゼ媒介組み込みによって促進されてよい。
【００８９】
１つの態様において、構築物は、エピソーム的に維持されてよく、または肝細胞のゲノムに組み込まれてよい（例えば、ヌクレアーゼ媒介標的化組み込みを介して）アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターまたはベクター系に含まれる。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984);およびSamulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)を含む多くの刊行物にある。
【００９０】
したがって、１つの態様において、発現構築物は、ＡＡＶ構築物上に運ばれ、本明細書に記載されているように発現構築物要素（例えば、エンハンサー、プロモーター、任意のイントロン、導入遺伝子など）に隣接する５’および３’ＩＴＲをさらに含む。所望により、スペーサー分子はまた、発現構築物の構成要素の１つ以上間、例えば、５’ＩＴＲおよびエンハンサー間、および／またはポリアデニル化シグナルおよび３’ＩＴＲ間に含まれる。スペーサーは、セーフハーバー遺伝子座（例えば、アルブミン）への組換えを促進するための相同性アームとして機能してよい。
【００９１】
１つの態様において、本明細書に記載されるようなＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶから誘導することができる。１つの態様において、ＡＡＶベクターは、欠陥のある非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに由来する。すべてのこのようなベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ  １４５ｂｐ逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入される細胞のゲノムへの組み込みによる効率的な遺伝子導入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である。(Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996))。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ．１０を含む他のＡＡＶ血清型および任意の新規のＡＡＶ血清型もまた本発明に従って使用することができる。いくつかの態様において、ウイルス核酸のＬＴＲ配列のウイルス起源がキャプシド配列のウイルス起源と異種である場合、キメラＡＡＶが使用される。非限定的な例は、ＡＡＶ２に由来するＬＴＲおよびＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に由来するキャプシド（すなわち、それぞれＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／９）を有するキメラウイルスを含む。
【００９２】
パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するために使用される。このような細胞は、ＡＡＶおよびアデノウイルスをパッケージするために使用することができるＨＥＫ２９３およびＳｆ９細胞、およびレトロウイルスをパッケージするΨ２細胞またはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージする生産細胞株によって産生される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組み込み（該当する場合）のために必要な最小限のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。不足しているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組み込みのために必要であるＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠いているヘルパープラスミドを含む、細胞株にパッケージされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染される。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ＩＴＲ配列の欠失のため、ヘルパープラスミドは大量にパッケージされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって減少させることができる。いくつかの態様において、ＡＡＶは、バキュロウイルス発現系を使用して生産される。
【００９３】
多くの遺伝子治療適用において、遺伝子治療ベクターが特定の組織タイプに対して高度の特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターを、ウイルスの外表面上にウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、所定の細胞型に対して特異性を有するように修飾することができる。リガンドは、興味ある細胞型に存在することが知られている受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995)は、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスを改変してｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現させることができ、組換えウイルスがヒト上皮細胞増殖因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス−標的細胞対に拡張させることができる。例えば、繊維状ファージは、実質的に任意の選択された細胞受容体に対して特異的な結合親和性を有する抗体フラグメント（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように操作することができる。上記の説明は主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターにも適用することができる。このようなベクターは、特定の標的細胞による摂取に有利な特定の摂取配列を含むように操作することができる。
【００９４】
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、１つ以上の非天然塩基および／または骨格を含んでよい。特に、本明細書に記載されているように発現カセットは、興味ある領域において転写静止の状態をなし遂げるためにメチル化シトシンを含んでよい。
【００９５】
さらに、本明細書に記載の発現構築物はまた、さらなる転写または翻訳調節または他の配列、例えば、コザック配列、さらなるプロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム侵入部位、２Ａペプチドをコードする配列、フューリン切断部位および／またはポリアデニル化シグナルを含んでよい。さらに、興味ある遺伝子の制御要素は、レポーター遺伝子に作動可能に連結されて、キメラ遺伝子（例えば、レポーター発現カセット）を作成することができる。
【００９６】
送達
本明細書に記載の構築物は、任意の適切な手段によって、任意の細胞型、好ましくは肝臓にインビボまたはエクスビボで送達されてよい（肝臓送達）。同様に、標的化された組み込みのためにヌクレアーゼと組み合わせて使用されるとき、ヌクレアーゼは、例えば非ウイルスベクター、ウイルスベクターを使用して、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質形態において、および／または、ＲＮＡ形態において、例えばｍＲＮＡとして、送達されてよい。
【００９７】
慣用のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法を使用して、操作された遺伝子モジュレーターをコードする核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に導入することができる。このような方法はまた、そのようなリプレッサー（またはその構成要素）をコードする核酸をインビトロで細胞に投与するために使用することができる。１つの態様において、リプレッサーをコードする核酸は、インビボまたはエキソビボの遺伝子治療の使用のために投与される。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体を形成した核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子治療手順のレビューについて、Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds.) (1995);およびYu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)を参照のこと。
【００９８】
プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない、任意のベクター系を使用してよい。また、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６；６，５３４，２６１；６，６０７，８８２；６，８２４，９７８；６，９３３，１１３；６，９７９，５３９；７，０１３，２１９；および７，１６３，８２４号を参照のこと。
【００９９】
核酸の非ウイルス送達の方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、他のナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤増強摂取を含む。例えばSonitron 2000 system（Rich-Mar）を使用するソノポレーションは、核酸の送達のためにも使用することができる。さらなる例示的な核酸送達系は、AmaxaBiosystems (Cologne, Germany), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA)およびCopernicus Therapeutics Inc., (例えば、US6008336参照のこと)によって提供されるものを含む。
【０１００】
いくつかの態様において、発現構築物は、ＡＡＶベクターである。所望のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ形態において、または１つ以上のウイルスベクター（ＡＡＶ、Ａｄなど）を使用して、投与されてよい。投与は、ポリヌクレオチドが所望の標的細胞に送達される任意の手段によって行うことができる。インビボおよびエキソビボの両方の方法が予期される。門脈への静脈内注射は、投与の可能な方法である。他のインビボ投与モードは、例えば、肝葉または胆管への直接的な注射、および肝動脈を介することを含む肝臓の遠位への静脈内注射、肝実質への直接的な注射、肝動脈を介する注射、および／または胆道系を介する逆行性注射を含む。エキソビボ投与モードは、切除された肝細胞または肝臓の他の細胞のインビトロでの形質導入、次に、形質導入され切除された肝細胞のヒト患者の門脈血管系、肝実質または胆道系への再注入を含む、例えば、Grossman et al., (1994) Nature Genetics, 6:335-341を参照のこと。
【０１０１】
２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載の構築物およびポリヌクレオチド形態のヌクレアーゼ）の送達を含むシステムにおいて、２つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上の同じおよび／または異なるベクターを使用して送達される。例えば、ポリヌクレオチド形態におけるヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ形態において送達されてよく、そして本明細書に記載される肝臓特異的構築物は、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）、ミニサークルＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、線状ＤＮＡ、リポソーム、ナノ粒子などの他の様式を介して送達されてよい。
【０１０２】
さらなる例示的な核酸送達系は、Amaxa Biosystems (Cologne, Germany), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA)およびCopernicus Therapeutics Inc, (例えば、US6008336参照のこと)によって提供されるものを含む。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６；４，９４６，７８７；および４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適切なカチオン性および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ  ９１／１７４２４、ＷＯ  ９１／１６０２４のものを含む。送達は、細胞（エキソビボ投与）または標的組織（インビボ投与）に行うことができる。
【０１０３】
免疫脂質複合体などの標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992);米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号、および第４，９４６，７８７号参照のこと）。
【０１０４】
送達のさらなる方法は、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）に送達される核酸をパッケージングする使用を含む。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に特異性を有し、もう一方のアームがＥＤＶに特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体はＥＤＶを標的細胞表面に運び、次にＥＤＶはエンドサイトーシスによって細胞に運ばれる。細胞に入ると、内容物が放出される（MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643)を参照のこと）。
【０１０５】
一過性の発現が望まれる適用において、アデノウイルスベースのシステムを使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞タイプで非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターにより、高力価および高レベルの発現が得られる。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて多量に生産することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターはまた、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ生産において、ならびにインビボおよびエキソビボ遺伝子治療手順のために、標的核酸で細胞を形質導入するために使用される（例えば、West et al., Virology 160:38-47 (1987); 米国特許第４，７９７，３６８号; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)を参照のこと）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984);およびSamulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)を含む多くの文献に記載されている。
【０１０６】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠陥のある非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ  １４５ｂｐ逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入される細胞のゲノムへの組み込みによる効率的な遺伝子導入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である。(Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996))。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８ＡＡＶ  ８．２、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ  ｒｈ１０を含む他のＡＡＶ血清型およびＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６などの偽型ＡＡＶもまた、本発明にしたがって使用することができる。血液脳関門を通過することができる新規のＡＡＶ血清型もまた、本発明にしたがって使用することができる（例えば、ＵＳ２０１５００７９０３８を参照のこと）。いくつかの態様において、ＡＡＶ６が使用される。
【０１０７】
パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するために使用される。このような細胞は、アデノウイルスをパッケージする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージするΨ２細胞またはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージする生産細胞株によって産生される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組み込み（該当する場合）のために必要な最小限のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。不足しているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組み込みのために必要であるＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠いているヘルパープラスミドを含む、細胞株にパッケージされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染される。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ＩＴＲ配列の欠失のため、ヘルパープラスミドは大量にパッケージされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって減少させることができる。
【０１０８】
２９３またはバキュロウイルスシステムからのＡＡＶ粒子の精製は、典型的には、ウイルスを生産する細胞の増殖と、それに続く細胞上清からのウイルス粒子の回収、または細胞の溶解および粗溶解物からのウイルスの回収を含む。次に、ＡＡＶを、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、米国特許第７，４１９，８１７号および第６，９８９，２６４号を参照のこと）、イオン交換クロマトグラフィーおよびＣｓＣｌ密度遠心分離（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯＷＯ２０１１０９４１９８Ａ１０）、免疫アフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＷＯ２０１６１２８４０８）またはＡＶＢセファロースを使用する精製（例えば、GE Healthcare Life Sciences）を含む当技術分野で知られる方法によって精製する。
【０１０９】
多くの遺伝子治療適用において、遺伝子治療ベクターが特定の組織タイプに対して高度の特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターを、ウイルスの外表面上にウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、所定の細胞型に対して特異性を有するように修飾することができる。リガンドは、興味ある細胞型に存在することが知られている受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995)は、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスを改変してｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現させることができ、組換えウイルスがヒト上皮細胞増殖因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス−標的細胞対に拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的に任意の選択された細胞受容体に対して特異的な結合親和性を有する抗体フラグメント（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように操作することができる。上記の説明は主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターにも適用することができる。このようなベクターは、特定の標的細胞による摂取に有利な特定の摂取配列を含むように操作することができる。
【０１１０】
遺伝子治療ベクターは、以下に記載されるように、個々の患者への投与によって、典型的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入、脳への直接注射を含む）または局所適用によってインビボで送達することができる。
【０１１１】
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、以下に記載されるように、利用できる医薬組成物の多種多様な適切な製剤が存在する（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989を参照のこと）。
【０１１２】
投与される発現カセット（および所望のヌクレアーゼ、および／または修飾細胞）の有効量は、患者ごとに異なる。したがって、有効量は、組成物（例えば、細胞）を投与する医師によってよく決定され、適切な投与量は、当業者によって容易に決定することができる。治療ポリペプチドの血清、血漿または他の組織レベルの分析および投与前の初期レベルとの比較は、投与される量が低すぎるか、適切な範囲内であるか、または高すぎるかを決定することができる。最初およびその後の投与のために適切なレジメンもまた可変であるが、最初の投与に代表され、必要なとき後の投与が続く。後の投与は、毎日から毎年、数年ごとまでの範囲である、さまざまな間隔で投与されてよい。送達ベクターの免疫抑制による形質導入の阻害または遮断を回避するために、適切な免疫抑制技術が推奨され得ることを当業者は理解するだろう、例えば、Vilquin et al., (1995) Human Gene Ther., 6:1391-1401を参照されたい。
【０１１３】
エキソビボおよびインビボ投与の両方のための製剤は、液体または乳化液体中の（例えば、遺伝子改変された細胞、リポソームまたはナノ粒子の）懸濁液を含む。活性成分は、しばしば、薬学的に許容され、活性成分と適合性のある賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせを含む。加えて、組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤または医薬組成物の有効性を増強する他の試薬などの補助物質の少量を含んでよい。
【０１１４】
適用
本明細書に記載される方法および組成物は、疾患を欠くかまたは欠乏するか、さもなければ疾患を処置または予防する産物を発現する、導入遺伝子を提供することによって、任意の疾患の治療を提供するためのものである。
【実施例】
【０１１５】
実施例１：臨床的方法
定量ＰＣＲ
ｑＲＴ−ＰＣＲ（ヒト第ＶＩＩＩ因子ｍＲＮＡレベルのため）：ＲＮＡ／ＤＮＡを、ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡキットを製造業者の指示（Qiagen, Carlsbad CA）に従って使用して血漿から単離する。次に、抽出されたＲＮＡを使用して、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Qiagen, Carlsbad CA）を使用してｃＤＮＡを作成する。次に、定量ＰＣＲを、ＩＤＴ（Coralville IA）からの標識プライマー／プローブアッセイを使用するＢｉｏｒａｄ  ＣＦＸ９６でＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Biorad, Hercules CA）を使用して実行する。ヒト第ＶＩＩＩ因子ｍＲＮＡの特異的検出のために、プライマー／プローブアッセイがカスタムである；フォワードプライマー（ＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＴＴＴＧ）（配列番号：６）、プローブ（ＡＣＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣＣＡ）（配列番号：７）およびリバースプライマー（ＴＣＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＴＧＡＡＧＴＡＧ）（配列番号：８）。定量ｑＲＴ−ＰＣＲ（絶対ではない）は、それぞれのサンプルについてのＧＡＰＤＨに正規化で使用され、最終的なデータ分析は、１．０に設定される１つのサンプルを基準として報告される。鋳型なしコントロールおよび逆転写酵素なしコントロールがすべてのサンプルで実行され、検出可能なシグナルを生成しない。
【０１１６】
ｑＰＣＲ（ベクターゲノム、ＶＧ、分析のため）：ＲＮＡ／ＤＮＡを、ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡキットを製造業者の指示(Qiagen, Carlsbad CA)に従って使用して血漿から単離する。抽出されたＤＮＡを使用して、ＡＢ  ７３００  リアルタイム  ＰＣＲシステム(Applied Biosystems, Foster City, CA)でのＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ(Applied Biosystems, Foster City, CA)で定量ＰＣＲのために使用する。ヒト第ＶＩＩＩ因子の特異的検出のために、プライマー／プローブアッセイはカスタムである；フォワードプライマー（ＣＣＴＧＧＧＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴ）（配列番号：９）、プローブ（ＴＴＣＴＧＣＣＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＣＡ）（配列番号：１０）およびリバースプライマー（ＧＧＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧ）（配列番号：１１）。鋳型なしコントロールが全てのサンプルで実行され、検出可能なシグナルを生成しない。ｑＰＣＲ  ＤＮＡ標準曲線を、精製され線形化されたヒト第ＶＩＩＩ因子プラスミドの既知の量の７つの連続４倍希釈から生成する。
【０１１７】
ヒトＦＶＩＩＩ総抗原免疫測定法。クエン酸ヒト血漿中のヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失（ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ）総抗原は、Ｓａｎｇａｍｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃで開発されたｈＦＶＩＩＩＢＤＤ免疫測定法を使用して測定される。Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）（ヒト組換えＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）参照物質を較正器として使用される。Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）はまた、ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ抗原を表すためにＱＣとしても使用される。このアッセイは、両方がＦＶＩＩＩのＡ２ドメインをエピトープとして有する、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を捕捉抗体としておよびビオチン化ｍＡｂを検出抗体として使用するサンドイッチＥＬＩＳＡである。捕捉ｍＡｂ（ＧＭＡ−８０２３；  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）でコーティング、ブロッキングおよび洗浄後、５の最小必要希釈（ＭＲＤ）での血漿サンプル、較正および品質管理サンプルを、アッセイプレートにおいてインキュベートし、次に洗浄する。ストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）コンジュゲート試薬を添加する前に、ビオチン化ｍＡｂ（ＧＭＡ−８０２４；  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）をインキュベーションでプレートに適用し、次に洗浄を行う。ＳＡ−ＨＲＰインキュベーションおよび洗浄後、３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を１０分間添加した後、酸性停止溶液を添加して反応をクエンチし、４５０ｒｕｎで検出する。捕捉されたｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ抗原を、０．０２０ＩＵ／ｍＬ〜０．５００ＩＵ／ｍＬの範囲にわたって両対数線形フィットを使用して回帰される線形標準曲線に対して定量化する。較正器は、プールされる先天性ＦＶＩＩＩ欠乏血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ、または同等品）で調製される１０．０ＩＵ／ｍＬ  Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）希釈標準溶液を使用して調製される。
【０１１８】
９ポイントの較正曲線（０．０１０ＩＵ／ｍＬおよび０．０００ＩＵ／ｍＬでのアンカーポイントで０．５００ＩＵ／ｍＬから０．０２０ＩＵ／ｍＬの定量範囲）を、アッセイ希釈剤において適用できるレベルに希釈されるアッセイ較正器を使用して作成される。較正は、ｘ軸にＩＵ／ｍＬで測定される総ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ抗原含有量、ｙ軸に光学密度（ＯＤ、４５０ｎｍで測定）で両対数線形フィッティングを使用して、デュプリケートにおいて単一の曲線として実行される。最後の２つの標準レベルは、０．０１０ＩＵ／ｍＬおよび０．０００ＩＵ／ｍＬで作成されるアンカーポイントであり、許容基準は有さない。サンプルおよびＱＣをデュプリケートにおいてアッセイし、較正曲線に対して逆算して、総ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ抗原（濃度はＩＵ／ｍＬとして報告）を決定する。
【０１１９】
発色性ヒト第ＶＩＩＩ因子活性アッセイ。血漿中の分泌されるヒト第ＶＩＩＩ因子の活性を、ヒト第ＶＩＩＩ因子標準を除いて、製造業者のプロトコールに従って、Diapharma Chromogenic Coamatic Factor VIIIアッセイ（West Chester, OH）を使用して決定される。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用されるヒト第ＶＩＩＩ因子標準は、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Salem, MA）からの組換え精製ヒト第ＶＩＩＩ因子（＃Ｆ００１６−０６）である。
【０１２０】
凝固活性アッセイ  血漿中の分泌されるヒト第ＶＩＩＩ因子の活性を、ヒト第ＶＩＩＩ因子標準およびヒト第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿を除いて、製造業者のプロトコールに従ってＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ（Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＡ）による活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイを使用して決定する。ヒト第ＶＩＩＩ因子標準は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用されるものと同じである（組換え精製ヒト第ＶＩＩＩ因子、US Biologicals, Salem, MAからの#F0016-06）。凝固アッセイにおいて使用される欠乏ＦＶＩＩＩ試薬は、Haematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT)からのＦＶＩＩＩ−ＣＤ  ＜１％  ＦＶＩＩＩ活性（凍結欠乏ＦＶＩＩＩ）である。
【０１２１】
実施例２：ＳＢ−５２５の調製
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、３５ｍＭ  ＮａＣｌ（すなわち、０．９０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．４９ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１７２ｍＭ  ＮａＣｌ、８．１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で構成される最終製品製剤ベースバッファーであるＳＢＲ−００９９を、ＵＳＰグレード試薬を使用して調製した。ＳＢ−５２５  Ｂｕｌｋを、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、３５ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  スクロース、０．０５％  Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（Poloxamer）  Ｐ  １８８を含むＰＢＳで構成される最終製剤バッファーにおいて１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｍＬの標的濃度に調整した。
【０１２２】
ＳＢ−５２５ベクターは、ＡＡＶ６キャプシドを含み、ＡＡＶ２  ＩＴＲ  配列番号：１２および１３それぞれに５’および３’に隣接する配列番号５を含むＡＡＶベクターである。
【０１２３】
ＳＢ−５２５産物は、用量レベル（ｖｇ／ｋｇ）に対象の体重（ｋｇ）を掛け、次にウイルスゲノム濃度（ｖｇ／ｍＬ）で割ることにより、産物構成要素容量を計算することによって調製された。生理食塩水（ＮＳ）の容量を、ＳＢ−５２５産物の比率が１：１であるように計算した。総容量を、ＮＳの容量とＳＢ−５２５産物の容量を合計することによって計算した。対象におけるＳＢ−５２５産物についての例示的な用量を以下の表Ｉに示す：
表Ｉ：例示的なＳＢ−５２５用量
【表Ｉ】
2021533098.tif 000015
【０１２４】
実施例３：注入プロトコール
総容量は、対象の用量レベルの割り当ておよび体重に依存して、４ｍＬから２００ｍＬの間になると予想された。総容量が５０ｍＬ未満であるとき、注入産物をシリンジを介して投与し、容量が５０ｍＬより大きいとき、注入産物を注入バッグを介して投与した。両方の注入速度は、一定速度の注入ポンプを使用して１００ｍＬ／時間であった。
【０１２５】
実施例４：研究の目的および臨床エンドポイント
包含および除外基準：この研究について、包含基準は、ＦＶＩＩＩ濃縮物または寒冷沈降物に少なくとも１５０の曝露日間で処置または曝露されている、１８歳以上の男性の対象を含んだ。加えて、対象は過去１２月間に１２回以上の出血エピソードを有する必要があった。除外基準は、ＡＡＶ６キャプシドに対する中和抗体、ＦＶＩＩＩインヒビターまたはその経歴、ＦＶＩＩＩに対する過敏症、血友病Ａに加えての何らかの出血性障害の証拠、肝炎症のマーカー、および全身性（ＩＶまたは経口）免疫調節薬の使用を有する対象を含んだ。
【０１２６】
研究の目的：この研究の主な目的は、安全性を評価することであった。この主な目的は、ＳＢ−５２５の安全性および忍容性を調べ、ＳＢ−５２５投与後のＦＶＩＩＩ活性の経時的プロフィールを評価することであった。二次エンドポイントは、ＦＶＩＩＩ補充療法（「因子」）のベースライン使用の変化の観察、出血エピソードの頻度および重症度、投与後の血友病Ａに対する臨床的影響の評価、およびＦＶＩＩＩに対する免疫反応の評価とＡＡＶ２／６ベクターのベクター切断（shedding）を含んだ。探索的目的は、ＥＬＩＳＡによるＦＶＩＩＩレベルおよびＦＶＩＩＩ活性アッセイ間の一致の評価、およびＳＢ−５２５に対する免疫応答を評価することを含んだ。
【０１２７】
約２０人の対象がこの試験に登録されてよい。各用量レベルで試験される対象の用量選択および数は、安全性および以前に投与された対象で観察された累積薬力学的反応（循環ＦＶＩＩＩレベルの動態）に基づく。
【０１２８】
安全性および許容できる治療範囲を特定するために、約７つの用量レベルを試験する必要性があってよい。潜在的な用量レベルは、６ｘ１０１１、９ｘ１０１１、１．２ｘ１０１２、２ｘ１０１２、４ｘ１０１２、６ｘ１０１２および１ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇである。開始用量レベル（９ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ）は、ＮＨＰ試験における正常の１２％のＦＶＩＩＩ活性と関連している。
【０１２９】
実施例５：予備的結果
５人の患者が予備的に処置された。ＳＢ−５２５は、処置に関連する重篤な有害事象なしおよびステロイド漸減の使用なしで、一般的に忍容性が良好であることが見いだされた。第３のコホート（用量レベル３）で処置された１人の患者は、自発的出血の有意な減少または排除を予測する可能性のある治療的に適切なレベルで第ＶＩＩＩ因子の発現および因子使用を達成した。第２のコホート（用量レベル２）において、因子使用の減少が処置後に観察された。
【０１３０】
実施例６：・ＳＢ−５２５遺伝子治療で処置された８人の患者はＦＶＩＩＩ活性の用量依存的な増加を示し、３ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ用量で処置された２人の患者は正常ＦＶＩＩＩレベルに達した
第１／２相Ａｌｔａ試験は、重度の血友病Ａを有する最大２０人の成人患者におけるＳＢ−５２５の安全性および忍容性を評価するために設計された非盲検の用量設定臨床試験である。データは、ＳＢ−５２５が概ね忍容性が良好であり、４つの投与コホートにわたって第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）レベルの用量依存的な増加を実証したことを示す。
【０１３１】
ＳＢ−５２５遺伝子治療で処置される血友病Ａを有する第１の８人の患者からのデータは、各患者内および各コホート内の両方で、用量依存的な関係、持続的な因子レベルの証拠、および低い変動性を促進および証明する。
【０１３２】
第１／２相データは、４つの漸増投与コホート（９ｘ１０１１  ｖｇ／ｋｇ、２ｘ１０１２  ｖｇ／ｋｇ、１ｘ１０１３  ｖｇ／ｋｇ、および３ｘ１０１３  ｖｇ／ｋｇ、コホートごとに２人の患者）で処置される８人の患者を含む。患者は、ＦＶＩＩＩレベルの用量依存的な増加を示し、高用量コホートにおいてＦＶＩＩＩ活性の臨床的に関連する増加、および３ｘ１０１３  ｖｇ／ｋｇ投与コホートにおいて正常なＦＶＩＩＩレベル（正常範囲：５０−１５０％）を達成した。第ＶＩＩＩ因子補充療法の使用における用量依存的減少もまた観察され、高用量コホートにおいて有意な減少が観察された。ＳＢ−５２５は一般的に忍容性が良好であり、１人の患者（３ｘ１０１３  ｖｇ／ｋｇ  用量で処置）が低血圧および発熱の処置関連の重篤な有害事象を報告し、これはベクター注入後に発生し、ベクトル注入完了後２４時間以内に処置で解消した。
【０１３３】
この試験において患者は予防的ステロイドで処置されなかった。処置関連の重篤な有害事象および７日以上のコルチコステロイド処置を必要とするＡＬＴの上昇は、第１の３つのコホートにおいて観察されなかった。第４のコホートにおける１人の患者は、４週目にＡＬＴ上昇（＞  １．５ｘ  ＵＬＮ）を経験し、経口ステロイドの漸減コースを必要とした。ステロイド療法の開始後７週間で、患者は第ＶＩＩＩ因子活性の関連喪失またはＡＬＴ上昇を有さなかった。同じ患者が処置関連の注入反応を経験したが、プロトコールで指定されたタイムラインに従って翌日退院した。
【０１３４】
表ＩＩは、９  ｘ  １０１１、２  ｘ  １０１２、１  ｘ  １０１３および３  ｘ  １０１３  ｖｇ／ＫｇのＡＡＶベクターの用量の投与の結果を示すデータを提供する。図１−３は、投与後に得られたＦＶＩＩＩ活性データを提供する。
表ＩＩ．  ＡＡＶの投与量の投与の結果。「フォローアップ」とは、ＦＶＩＩＩ活性レベル（列２）およびＦＶＩＩＩ処置の頻度（列５）が測定された、投与後の期間を指す。
【表ＩＩ】
2021533098.tif 000016
【０１３５】
実施例７：・ＳＢ−５２５遺伝子治療で処置された１０人の患者はＦＶＩＩＩ活性の用量依存的増加を示し、３ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で処置された４人の患者は正常なＦＶＩＩＩレベルに達した
実施例６に記載されている８人の患者をより長い時間追跡し、さらに２人の患者（患者９および１０）を３×１０１３  ｖｇ／ｋｇの用量で試験に加えた。図４および５は、ベクターでの処置後の経時的な１０人の患者すべてにおけるＦＶＩＩＩ活性を示す。
【０１３６】
用量が増加するにつれて、自然出血エピソードは消え、高用量患者のいずれについても出血エピソードは報告されなかった。図６参照。ＦＶＩＩＩの使用は、約３週間のベクター注射適用後、コホート３（１  ｘ  １０１３  ｖｇ／ｋｇ）の１人の患者および高用量コホート（３  ｘ  １０１３  ｖｇ／ｋｇ）のすべての患者でゼロに低下した。患者９は３週間と２日で最後の注入を受けたが、それ以降は注入されていない。図７（注入が３週間以上で２日発生したことを示すアスタリスク）参照。
【０１３７】
図８−１０は、臨床試験からの有害事象の所見を要約する。
【０１３８】
本明細書に記載されているすべての特許、特許出願および文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３９】
開示は、理解の明確さの目的のために例示および例としてある程度詳細に提供されているが、開示の精神または範囲から逸脱することなく様々な変更および修飾を実施することができることは当業者に明らかであろう。したがって、前述の説明および例は、限定的なものとして解釈されるべきではない。
【図１】
2021533098.tif 000017
【図２】
2021533098.tif 000018
【図３】
2021533098.tif 000019
【図４】
2021533098.tif 000020
【図５】
2021533098.tif 000021
【図６】
2021533098.tif 000022
【図７】
2021533098.tif 000023
【図８】
2021533098.tif 000024
【図９】
2021533098.tif 000025
【図１０】
2021533098.tif 000026
【配列表】
2021533098000001.app
【国際調査報告】
2021533098.tif 000027
2021533098.tif 000028
2021533098.tif 000029