(57)【要約】本発明は、普遍的に許容可能な「容易に入手可能である」低免疫多能性（ＨＩＰ）細胞及びＨＩＰ細胞由来の低免疫キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞を提供する。本改変治療用細胞は、癌を処置するために養子細胞に基づく免疫療法として対象に投与され得る。
2021530999.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む単離低免疫原性誘導多能性幹（ＨＩＰ）細胞であって、
内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している、単離低免疫原性誘導多能性幹（ＨＩＰ）細胞。
【請求項２】
前記ＣＡＲが細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項３】
前記細胞外ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６、ＲＯＲ１及びＷＴ１からなる群から選択される抗原に結合する、請求項２に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項４】
前記細胞外ドメインが１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項２又は３に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項５】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３及びＢＴＬＡを含む、請求項２〜４の何れか１項に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項６】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３及びＢＴＬＡを含む、請求項２〜５の何れか１項に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項７】
Ｂ２Ｍ遺伝子活性及びＣＩＩＴＡ遺伝子が排除され、ＣＤ４７発現が上昇した後、前記ＣＡＲをコードする核酸がｉＰＳＣに導入される、請求項２〜６の何れか１項に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項８】
前記ＨＩＰ細胞がヒト誘導多能性幹細胞であり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモーターの制御下でヒトＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果である、請求項１〜７の何れか１項に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項９】
前記ＨＩＰ細胞がマウス誘導多能性幹細胞であり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモーターの制御下でマウスＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果である、請求項１〜７の何れか１項に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項１０】
前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項８又は９に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項１１】
Ｂ２Ｍ遺伝子活性の前記排除が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを破壊するクラスター化された規則的配置の短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項１〜１０の何れか１項に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項１２】
ＣＩＩＴＡ遺伝子活性の前記排除が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項１〜１１の何れか１項に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項１３】
前記低免疫原性多能性細胞を死に誘導するトリガー物質により活性化される自殺遺伝子をさらに含む、請求項１〜１２の何れか１項に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項１４】
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子であり、前記トリガー物質がガンシクロビルである、請求項１３に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項１５】
前記ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項１４に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項１６】
前記ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項１４に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項１７】
前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子であり、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）である、請求項１３に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項１８】
前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項１７に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項１９】
前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項１７に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項２０】
前記自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードし、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項１３に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項２１】
前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項２０に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項２２】
前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項２３】
前記ＣＩＤが化合物ＡＰ１９０３である、請求項２０〜２２の何れか１項に記載の単離ＨＩＰ細胞。
【請求項２４】
請求項１〜２３の何れか１項に記載のＨＩＰ細胞のインビトロ分化により作製される単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２５】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞が低免疫細胞傷害性ＣＡＲ−Ｔ細胞である、請求項２４に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２６】
前記インビトロ分化が、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ及びＶＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の増殖因子又はサイトカインを含む培地中で前記ＨＩＰ細胞を培養することを含む、請求項２４又は２５に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２７】
前記培地が、ＢＭＰ活性化因子、ＧＳＫ３阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤及びＮＯＴＣＨ活性化因子からなる群から選択される１つ以上をさらに含む、請求項２４〜２６の何れか１項に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２８】
前記インビトロ分化が、前記ＨＩＰ細胞をフィーダー細胞上で培養することを含む、請求項２４〜２７の何れか１項に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２９】
前記インビトロ分化が、擬似微小重力中で培養することを含む、請求項２４〜２８の何れか１項に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項３０】
擬似微小重力中での前記培養が少なくとも７２時間にわたる、請求項２９に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項３１】
癌の処置としての使用のための、請求項２４〜３０の何れか１項に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項３２】
請求項２４〜２７の何れか１項に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞の治療的有効量を含む組成物を投与することによって癌患者を処置する方法。
【請求項３３】
前記組成物が治療的に有効な担体をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記投与が、静脈内投与、皮下投与、リンパ節内投与、腫瘍内投与、くも膜下腔内投与、胸膜内投与及び腹腔内投与を含む、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記投与が、ボーラス又は連続点滴によるものをさらに含む、請求項３２〜３４の何れか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌が、白血病、リンパ腫及び骨髄腫からなる群から選択される血液癌である、請求項３２〜３５の何れか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記癌が、固形腫瘍癌又は液性腫瘍癌である、請求項３２〜３５の何れか１項に記載の方法。
【請求項３８】
インビトロ分化を含む方法による単離ＨＩＰ細胞集団由来の低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞の純粋集団であって、
前記単離ＨＩＰ細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸及び前記ＨＩＰ細胞を死に誘導し得るトリガー物質により活性化される自殺遺伝子を含み、
前記ＨＩＰ細胞において、内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している、低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞の純粋集団。
【請求項３９】
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子であり、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子であり、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか又は前記自殺遺伝子が誘導性カスパーゼ９タンパク質であり、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項３８に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞の純粋集団。
【請求項４０】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞が低免疫細胞傷害性ＣＡＲ−Ｔ細胞である、請求項３８又は３９に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞の純粋集団。
【請求項４１】
前記インビトロ分化が、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ及びＶＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の増殖因子又はサイトカインを含む培地中で前記ＨＩＰ細胞を培養することを含む、請求項３８〜４０の何れか１項に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞の純粋集団。
【請求項４２】
前記培地が、ＢＭＰ活性化因子、ＧＳＫ３阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤及びＮＯＴＣＨ活性化因子からなる群から選択される１つ以上をさらに含む、請求項３８〜４１の何れか１項に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞の純粋集団。
【請求項４３】
前記インビトロ分化が、フィーダー細胞上で前記ＨＩＰ細胞を培養することを含む、請求項３８〜４２の何れか１項に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞の純粋集団。
【請求項４４】
前記インビトロ分化が、擬似微小重力中で培養することを含む、請求項３８〜４３の何れか１項に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞の純粋集団。
【請求項４５】
擬似微小重力中での前記培養が少なくとも７２時間にわたる、請求項４４に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞の純粋集団。
【請求項４６】
前記方法が、前記ＨＩＰ細胞を死に誘導するために前記トリガー物質を含む負の選択培地中で前記低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞を培養し、それによって、実質的に低免疫原性ｉＰＳＣ不含であるか又は低免疫原性ｉＰＳＣ不含である単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞集団を作製することをさらに含む、請求項３８〜４２の何れか１項に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞の純粋集団。
【請求項４７】
請求項３８〜４６の何れか１項に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞の純粋集団の治療的有効量を含む組成物を投与することによって癌患者を処置する方法。
【請求項４８】
前記組成物が、治療的に有効な担体をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記投与が、静脈内投与、皮下投与、リンパ節内投与、腫瘍内投与、くも膜下腔内投与、胸膜内投与及び腹腔内投与を含む、請求項４７又は４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記投与がボーラス又は連続点滴によるものをさらに含む、請求項４７〜４９の何れか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記癌が、白血病、リンパ腫及び骨髄腫からなる群から選択される血液癌である、請求項４７〜５０の何れか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記癌が固形腫瘍癌又は液性腫瘍癌である、請求項４７〜５０の何れか１項に記載の方法。
【請求項５３】
請求項１〜２３の何れか１項に記載のＨＩＰ細胞の何れか１つのインビトロ分化を含む請求項２４〜２７の何れか１項に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製する方法であって、インビトロ分化が、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ及びＶＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の増殖因子又はサイトカインを含む培地中で前記ＨＩＰ細胞を培養することを含む、方法。
【請求項５４】
前記培地が、ＢＭＰ活性化因子、ＧＳＫ３阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤及びＮＯＴＣＨ活性化因子からなる群から選択される１つ以上をさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記インビトロ分化が、フィーダー細胞上で前記ＨＩＰ細胞を培養することを含む、請求項５３又は５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記インビトロ分化が、フィーダー細胞上で前記ＨＩＰ細胞を培養することを含む、請求項５３〜５５の何れか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記インビトロ分化が、擬似微小重力中で培養することを含む、請求項５３〜５６の何れか１項に記載の方法。
【請求項５８】
擬似微小重力中での前記培養が少なくとも７２時間にわたる、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる２０１８年７月１７日提出の第６２／６９８，９４１号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、養子免疫療法の技術分野に関する。本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現免疫細胞、例えばＣＡＲをコードする核酸を含む低免疫原性多能性（ＨＩＰ）幹細胞から分化させられたＴ細胞を提供する。改変ＨＩＰ細胞は、ベータ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子に対してホモ接合型ヌル、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子に対してホモ接合型ヌルになり、ＣＤ４７を過剰発現するように遺伝子修飾される。
【背景技術】
【０００３】
養子細胞免疫療法は、癌及び抗体介在性の移植片拒絶を含む疾患の多くを処置するために、抗原特異的な免疫細胞、例えばＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を利用する。残念ながら、普遍的な腫瘍特異的Ｔ細胞が存在しないことにより、現在の養子Ｔ細胞療法は限定的である。例えばＫｙｍｒｉａｈ（商標）（チサゲンレクルユーセル、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びＹｅｓｃａｒｔａ（商標）（アキシカブタゲンシロルユーセル、Ｋｉｔｅ）は、ＣＡＲ−Ｔ療法を作製するために患者自身のＴ細胞を使用する。
【０００４】
このような養子Ｔ細胞療法は自己細胞移行に基づく。Ｔリンパ球を患者から回収し、遺伝子修飾するか又はエクスビボで選択し、細胞数を増幅させるためにインビトロで培養し、最後に患者に点滴する。リンパ球点滴に加えて、Ｔ細胞の生着及び／又は治療応答を促進し、支持するために、放射線又は化学療法及びＩＬ−２などのリンパ球増殖因子の投与により、患者に対して予めコンディショニングを行い得る。
【０００５】
各患者は、患者自身のリンパ球を使用して個別に作製された処置を受ける。このような自己療法は、かなりの技術的及びロジスティックな問題に直面する。例えば、治療用細胞は、専門スタッフが配属されている、高価な専用施設で作製しなければならず、これらは、患者の診断後、短時間で作製しなければならない。一部の例では、患者の前処理ゆえに、単離リンパ球は、機能性が低く、非常に少数しか存在しない可能性があり、従って患者を処置するための治療用細胞の有効量を作製することは困難である。
【０００６】
従って、養子免疫療法での使用のための「容易に入手可能である」治療用の抗原特異的Ｔ細胞が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む、単離低免疫原性又は低免疫多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）を提供する。ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。
【０００８】
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＳ１、ＣＤ１７１、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６、ＲＯＲ１及びＷＴ１からなる群から選択される抗原に結合する。ある一定の実施形態では、細胞外ドメインは１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３及びＢＴＬＡを含む。ある一定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３及びＢＴＬＡを含む。
【０００９】
ある一定の実施形態では、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン及びＣＤ３ゼータシグナル伝達細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢシグナル伝達細胞内ドメイン及びＣＤ３ゼータシグナル伝達細胞内ドメインを含む。
【００１０】
様々な実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子活性及びＣＩＩＴＡ遺伝子を排除し、ＣＤ４７発現を上昇させた後、ＣＡＲをコードする核酸をＨＩＰ細胞に導入する。
【００１１】
特定の実施形態では、ヒトＨＩＰ細胞は、ヒト改変誘導多能性幹細胞（ヒト改変ｉＰＳＣ）であり、Ｂ２Ｍ遺伝子はヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、ＣＩＩＴＡ遺伝子はヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、ＣＤ４７発現上昇は、プロモーターの調節下でヒトＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーをヒト改変ｉＰＳＣに導入した結果である。他の実施形態では、マウスＨＩＰ細胞は、マウス改変ｉＰＳＣであり、Ｂ２Ｍ遺伝子はマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、ＣＩＩＴＡ遺伝子はマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、ＣＤ４７発現上昇は、プロモーターの調節下でマウスＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーをマウス改変ｉＰＳＣに導入した結果である。プロモーターは構成的プロモーターであり得る。
【００１２】
一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子活性の排除は、Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを破壊するクラスター化された規則的配置の短回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応の結果である。ある一定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子活性の排除は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応の結果である。
【００１３】
一部の実施形態では、自殺遺伝子は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子であり、トリガー物質はガンシクロビルである。一部の例では、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする。ある特定の例では、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子は、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。
【００１４】
特定の実施形態では、自殺遺伝子はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子であり、トリガー物質は５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）である。ＣＤ遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードし得る。一部の例では、ＣＤ遺伝子は、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。
【００１５】
様々な実施形態では、自殺遺伝子は誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードし、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。特定の例では、誘導型カスパーゼ９タンパク質は、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。他の例では、誘導型カスパーゼ９タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
本発明の別の態様では、本明細書中に記載のＨＩＰ細胞の何れか１つのインビトロ分化により作製される単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ（ＨＩ−ＣＡＲ−Ｔ）細胞が提供される。
【００１７】
一部の実施形態では、ＨＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は細胞傷害性低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞である。
【００１８】
様々な実施形態で、インビトロ分化は、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ及びＶＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の増殖因子又はサイトカインを含む培地中でＣＡＲコンストラクトを保有するＨＩＰ細胞を培養することを含む。一部の実施形態では、培地は、ＢＭＰ活性化因子、ＧＳＫ３阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤及びＮＯＴＣＨ活性化因子からなる群から選択される１つ以上をさらに含む。
【００１９】
特定の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔコンストラクトを保有するＨＩＰのうち何れか１つのインビトロ分化により作製される単離ＨＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、癌の処置剤としての使用のためである。
【００２０】
本発明の別の態様では、本明細書中に記載の単離ＨＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の何れかの治療的有効量を含む組成物を投与することによって、癌患者を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、本組成物は治療的に有効な担体をさらに含む。
【００２１】
一部の実施形態では、投与段階は、静脈内投与、皮下投与、リンパ節内投与、腫瘍内投与、くも膜下腔内投与、胸膜内投与及び腹腔内投与を含む。ある一定の例では、投与は、ボーラス又は連続点滴によるものをさらに含む。
【００２２】
一部の実施形態では、癌は、白血病、リンパ腫及び骨髄腫からなる群から選択される血液癌である。様々な実施形態で、癌は固形腫瘍癌又は液性腫瘍癌である。
【００２３】
別の態様では、本発明は、インビトロ分化を含む方法によりＣＡＲコンストラクトを保有する単離ＨＩＰ細胞集団由来のＨＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の純粋集団を提供し、この単離ＨＩＰ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸及ＨＩＰ細胞を死に誘導し得るトリガー物質により活性化される自殺遺伝子を含み、ＨＩＰ細胞において、内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している。
【００２４】
一部の実施形態では、自殺遺伝子は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子であり、トリガー物質はガンシクロビルであるか、自殺遺伝子はエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子であり、トリガー物質は５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は自殺遺伝子は誘導性カスパーゼ９タンパク質であり、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。
【００２５】
一部の実施形態では、ＨＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は細胞傷害性低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞である。
【００２６】
一部の実施形態では、インビトロ分化は、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ及びＶＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の増殖因子又はサイトカインを含む培地中でＨＩＰ細胞を培養することを含む。一部の実施形態では、培地は、ＢＭＰ活性化因子、ＧＳＫ３阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤及びＮＯＴＣＨ活性化因子からなる群から選択される１つ以上をさらに含む。一部の例では、インビトロ分化は、フィーダー細胞上でＨＩＰ細胞を培養することを含む。一部の実施形態では，フィーダー細胞は内皮細胞である。ある一定の実施形態では、フィーダー細胞は、ヒトＨＩＰ細胞などであるが限定されないＨＩＰ細胞由来の内皮細胞である。一部の実施形態では、インビトロ分化は、擬似微小重力中で培養することを含む。ある一定の実施形態では、擬似微小重力中での培養は少なくとも７２時間にわたる。様々な実施形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞を死に誘導するためのトリガー物質を含む負の選択培地中でＨＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞を培養し、それにより、実質的にＨＩＰ細胞不含であるか又はＨＩＰ細胞不含である単離ＨＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞集団を作製することをさらに含む。このような単離ＨＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は癌の処置としての使用のためのものであり得る。
【００２７】
一部の実施形態では、単離ＨＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の純粋集団の何れか１つの治療的有効量を含む組成物を投与することによって、癌患者を処置する方法が本明細書中で提供される。本組成物は治療的に有効な担体も含み得る。
【００２８】
一部の実施形態では、投与段階は、静脈内投与、皮下投与、リンパ節内投与、腫瘍内投与、くも膜下腔内投与、胸膜内投与及び腹腔内投与を含む。ある一定の例では、投与はボーラス又は連続点滴によるものをさらに含む。
【００２９】
一部の実施形態では、癌は、白血病、リンパ腫及び骨髄腫からなる群から選択される血液癌である。様々な実施形態では、癌は固形腫瘍癌又は液性腫瘍癌である。
【００３０】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載の単離低免疫ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＨＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞）の何れか１つを作製する方法を提供する。本方法は、本発明のＨＩＰ細胞の何れか１つのインビトロ分化を含み、インビトロ分化は、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ及びＶＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の増殖因子又はサイトカインを含む培地中でＨＩＰ細胞を培養することを含む。一部の実施形態では、培地は、ＢＭＰ活性化因子、ＧＳＫ３阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤及びＮＯＴＣＨ活性化因子からなる群から選択される１つ以上をさらに含む。
【００３１】
一部の実施形態では、インビトロ分化は、フィーダー細胞上でＨＩＰ細胞を培養することを含む。様々な実施形態では、インビトロ分化は、擬似微小重力中で培養することを含む。ある一定の例では、擬似微小重力中での培養は少なくとも７２時間にわたる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、マウスナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）と温置したマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す。
【図２】図２は、ヒトＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）と温置したヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す。
【図３】図３は、ヒトＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）と温置したマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す。
【図４】図４は、マウスＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）と温置したヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す。
【図５】図５は、ヒトマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。
【図６】図６は、マウスマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。
【図７】図７は、マウスマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。
【図８】図８は、ヒトマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。
【図９】図９は、Ｔ細胞への本明細書中に記載のＨＩＰ細胞の分化を示す。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞へのＨＩＰ細胞の分化を示す。図１０Ａは、ＯＰ９−ＤＬ１細胞上での分化の第２３日（Ｄ２３）の細胞を示す。図１０Ｂは、フィーダー細胞から外し、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を行った、分化第３０日（Ｄ３０）での細胞を示す。
【図１１】図１１は、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を行った、フィーダー細胞上の分化第２３日（Ｄ２３）でのＴ細胞（例えばＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞）へのＨＩＰ細胞の分化を示す。
【図１２】図１２はＨＩＰ細胞由来の内皮祖先細胞を示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１３Ａ）、ナイーブＣＤ４＋細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４＋細胞；図１３Ｂ）及びセントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋ＣＤ４＋細胞；図１３Ｃ）に分化した内皮祖先細胞（ＥＰＣ）とともに培養されたヒトＨＩＰ細胞を示す。＊＊はｐ＜０．００１を示す；独立スチューデントｔ検定。
【図１４】図１４Ａ及び１４Ｂは、擬似微小重力（ｓμｇ）を７２時間使用したヒトＨＩＰ細胞由来のヒトＴ細胞を示す。図１４Ａは、ヒトＨＩＰ細胞由来のヒトＴ細胞の形態を示す。図１４ＢはヒトＴ細胞の細胞生存能を示す。Ｐ＝ｎ．ｓ．；独立スチューデントｔ検定。
【図１５】図１５は、擬似微小重力（ｓμｇ）を７２時間使用したヒトＨＩＰ細胞由来のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。＊はｐ＜０．０５を示す；独立スチューデントｔ検定。
【図１６】図１６は、擬似微小重力（ｓμｇ）を７２時間及び１０日間使用したヒトＨＩＰ細胞由来のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。
【図１７】図１７は、擬似微小重力（ｓμｇ）を７２時間使用し、次いで１ｇで７２時間処理したヒトＨＩＰ細胞由来のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞及びヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−Ｔ細胞を示す。＊はｐ＜０．０５を示す；独立スチューデントｔ検定。
【図１８】図１８は、擬似微小重力及びサイトカイン刺激を使用したヒトＨＩＰ細胞由来のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
Ａ．導入
本発明は、本明細書中で概説するようないくつかの遺伝子操作ゆえに宿主免疫反応を回避する低免疫原性多能性（「ＨＩＰ」）細胞を提供する。本細胞は、免疫応答を惹起する主要免疫抗原を欠き、食作用を回避するように改変される。これにより、特異的な組織及び臓器を生成させるための「容易に入手可能な」細胞生成物の誘導が可能になる。ヒト患者においてヒト同種ＨＩＰ細胞派生物を使用可能であることの利点により、一般に同種移植で見られる長期の補助免疫抑制療法及び薬物使用を回避することができるようになることを含め、顕著な有益性が得られる。細胞療法は、各患者に対する個々の処置を必要とせずに使用し得るので、コストも顕著に削減される。近年、自己細胞源から作製された細胞生成物が、僅か数個又はさらには１個の抗原性突然変異で免疫拒絶に対する対象になり得ることが示された。従って、自己細胞生成物は本質的に非免疫原性ではない。また、細胞改変及び品質管理は非常に重労働でコスト集約的であり、自己細胞は急性治療の選択肢としては利用可能ではない。免疫ハードルが克服され得る場合、同種細胞生成物のみが、より大きい患者集団に対して使用可能である。ＨＩＰ細胞は、普遍的に許容可能な派生物の作製のための普遍的な細胞供給源となる。
【００３４】
本発明は、妊婦に存在する胎児母体間寛容の利用を対象とする。胎児のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の半分が父親から受け継がれ、胎児は主要ＨＬＡ不適合抗原を発現するものの、母系の免疫系は胎児を同種実体として認識せず、例えば免疫反応の「宿主対移植片」タイプで見られるような免疫応答を開始しない。胎児−母体界面において胎児母体間寛容には主に合胞体栄養細胞が介在する。合胞体栄養細胞は、主要組織適合複合体Ｉ及びＩＩ（ＭＨＣ−Ｉ及びＭＨＣ−ＩＩ）のタンパク質を僅かしか、又は全く、示さず、同時に、ＨＬＡを欠く細胞の食作用性自然免疫監視及び排除を抑制する「私を食べないで（ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ）」タンパク質として知られる、ＣＤ４７の発現上昇を示す。驚くことに、妊娠中に胎児の拒絶を防ぐ同じ免疫寛容原性機序によって、本発明のＨＩＰ細胞も拒絶から逃れ、同種移植後のこれらの細胞の長期生存及び生着を促進することも可能になる。
【００３５】
これらの結果は、さらに、３個という少ない遺伝子修飾（開始ｉＰＳＣ、例えばヒトｉＰＳＣと比較した場合）、活性の２つの低下（さらに本明細書中に記載のような「ノックアウト」）及び活性の１つの上昇（本明細書中に記載のような「ノックイン」）で、この胎児母体間寛容を導入し得る点で、驚くべきことである。一般に、当技術分野の他の熟練者がｉＰＳＣの免疫原性の抑制を試みてきたが、成功は部分的なものでしかない；Ｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １４：１２１−１３０（２０１４）及びＧｏｒｎａｌｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３８６０を参照）。
【００３６】
本願は、それらの全体において本開示が参照により本明細書中に組み込まれる２０１８年１月１４日提出の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書及び２０１７年１月１３日提出の米国仮特許出願第６２／４４５，９６９号明細書に関連し、特に実施例、図面、図面の説明及び低免疫原性多能性幹細胞を作製すること及び他の細胞タイプへこのような細胞を分化させることについての説明に関する。
【００３７】
従って、本発明は、多能性幹細胞からのＨＩＰ細胞の作製及び次にそれらの維持、分化及び最終的にはそれを必要とする患者へのそれらの派生物の移植を提供する。
【００３８】
Ｂ．定義
「多能性細胞」という用語は、未分化状態に留まりながら自己更新及び増殖し得、適正な条件下で特別な細胞タイプに分化するように誘導され得る細胞を指す。「多能性細胞」という用語は、本明細書中で使用される場合、胚性幹細胞及び、胎児、羊膜又は体細胞の幹細胞を含め、他のタイプの幹細胞を包含する。代表的なヒト幹細胞株はＨ９ヒト胚性幹細胞株を含む。さらなる代表的な幹細胞株は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＨＵＥＳ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＣｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．ｅｔ．ａｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１３．（２００４）に記載のとおり）を通じて利用可能にされるものを含む。
【００３９】
「多能性幹細胞」は、本明細書中で使用される場合、３つの胚葉：内胚葉（例えば胃関連、消化管、肺など）、中胚葉（例えば筋肉、骨、血液、泌尿生殖器組織など）又は外胚葉（例えば表皮組織及び神経系組織）の何れかに分化する能力を有する。「多能性幹細胞」という用語は、本明細書中で使用される場合、「誘導多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」、非多能性細胞由来の多能性幹細胞のタイプも包含する。親細胞の例は、様々な手段により多能性の未分化表現型を誘導するように初期化されている体細胞を含む。このような「ｉＰＳ」又は「ｉＰＳＣ」細胞は、ある特定の制御遺伝子の発現を誘導することにより、又はある特定のタンパク質の外因性適用により、作製され得る。ｉＰＳ細胞の誘導のための方法は当技術分野で公知であり、以下でさらに記載する（例えば、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７（１１）：２６６７−７４（２００９）；Ｈｕａｎｇｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（７）：７９５（２００８）；Ｗｏｌｔｊｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５８（７２３９）：７６６−７７０（２００９）；及びＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ８：３８１−３８４（２００９）；これらのそれぞれはそれらの全体において本明細書中に参照により組み込まれる）。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の作製を以下で概説する。本明細書中で使用される場合、「ｈｉＰＳＣ」は、ヒト誘導多能性幹細胞であり、「ｍｉＰＳＣ」はマウス誘導多能性幹細胞である。
【００４０】
「多能性幹細胞の特徴」は、他の細胞から多能性幹細胞を区別する細胞の特徴を指す。適切な条件下で、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）の全てからの細胞系列と関連する特徴をまとめて示す細胞タイプへの分化が起き得る子孫を生じさせる能力は、多能性幹細胞の特徴である。分子マーカーのある特定の組み合わせの発現又は非発現も多能性幹細胞の特徴である。例えば、ヒト多能性幹細胞は、少なくとも数個及び一部の実施形態では、次の非限定リスト：ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、ＡＬＰ、Ｓｏｘ２、Ｅ−カドヘリン、ＵＴＦ−１、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１及びＮａｎｏｇからのマーカーの全てを発現する。多能性幹細胞に関連する細胞形態学も多能性幹細胞の特徴である。本明細書中で記載のように、細胞は、内胚葉性の祖先細胞及び／又は肝細胞へと初期化されるという多能性を経る必要はない。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「多能性」又は「多能性細胞」は、限定数の他の特定の細胞タイプを生じさせ得る細胞タイプを指す。例えば、誘導多能性細胞は、内胚葉性細胞を形成可能である。さらに、多能性血液幹細胞は、リンパ球、単球、好中球などを含め、血液細胞のいくつかのタイプにそれ自身分化し得る。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「少能性」という用語は、成体幹細胞が数種類の異なる細胞タイプにしか分化する能力がないことを指す。例えば、リンパ系又は骨髄幹細胞は、それぞれリンパ系又は骨髄系列の何れかの細胞を形成させることが可能である。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「単能性」という用語は、１つの細胞タイプを形成する細胞の能力を意味する。例えば、精原幹細胞が形成可能であるのは精子細胞のみである。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「全能性」という用語は、細胞が生物全体を形成させる能力を意味する。例えば哺乳動物において、全能性であるのは、接合体及び第１の卵割段階の卵割球のみである。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「非多能性細胞」は、多能性細胞ではない哺乳動物細胞を指す。このような細胞の例としては、分化した細胞並びに祖先細胞が挙げられる。分化した細胞の例としては、骨髄、皮膚、骨格筋肉、脂肪組織及び末梢血液から選択される組織からの細胞が挙げられるが限定されない。代表的な細胞タイプとしては、線維芽細胞、肝細胞、筋芽細胞、ニューロン、骨芽細胞、破骨細胞及びＴ細胞が挙げられるが限定されない。誘導多能性細胞、内胚葉性祖先細胞及び肝細胞を作製するために使用される出発細胞は非多能性細胞であり得る。
【００４６】
分化した細胞としては、多能性細胞、少能性細胞、単能性細胞、祖先細胞及び最終分化した細胞が挙げられるが限定されない。特定の実施形態では、能力が低い細胞は、より強力な細胞に対して「分化している」とみなされる。
【００４７】
「体細胞」は、生物の体を形成する細胞である。体細胞は、生物において、臓器、皮膚、血液、骨及び結合組織を構成する細胞を含むが、生殖細胞は含まない。
【００４８】
細胞は、例えば、ヒト又は非ヒト哺乳動物由来であり得る。代表的な非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ及び非ヒト霊長類が挙げられるが限定されない。一部の実施形態では、細胞は、成人ヒト又は非ヒト哺乳動物由来である。一部の実施形態では、細胞は新生児ヒト、成人又は非ヒト哺乳動物由来である。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「対象」又は「患者」という用語は、何らかの動物、例えば家畜化された動物、動物園の動物又はヒトを指す。「対象」又は「患者」は、イヌ、ネコ、鳥、家畜又はヒトのような哺乳動物であり得る。「対象」及び「患者」の具体例としては、肝臓、心臓、肺、腎臓、膵臓、脳、神経組織、血液、骨、骨髄などに関連する疾患又は障害がある個体（特にヒト）が挙げられるが限定されない。
【００５０】
哺乳動物細胞は、ヒト又は非ヒト哺乳動物由来であり得る。代表的な非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ及び非ヒト霊長類（例えばチンパンジー、マカク及び類人猿）が挙げられるが限定されない。
【００５１】
「低免疫原性多能性細胞」、「低免疫多能性幹細胞」、「低免疫多能性細胞」又は「ＨＩＰ細胞」は本明細書中で、その多能性の特徴を保持し、また同種宿主に移した場合に免疫拒絶応答の低下を引き起こす多能性細胞を意味する。好ましい実施形態では、ＨＩＰ細胞は免疫応答を生じさせない。従って、「低免疫原性」又は「低免疫」は、本明細書中で概説されるように免疫改変前の親（即ち「野生型」又は「ｗｔ」）細胞の免疫応答と比較した場合、免疫応答が顕著に低下しているか又は排除されていることを指す。多くのケースで、ＨＩＰ細胞は、免疫学的にサイレントであり、また多能性の可能性を保持する。ＨＩＰの特徴に対するアッセイを以下で概説する。
【００５２】
「ＨＬＡ」又は「ヒト白血球抗原」複合体は、ヒトにおいて主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。ＨＬＡ複合体を構成するこれらの細胞表面タンパク質は、抗原に対する免疫応答の制御に関与する。ヒトにおいて、２つのＭＨＣ、クラスＩ及びクラスＩＩ、「ＨＬＡ−Ｉ」及び「ＨＬＡ−ＩＩ」がある。ＨＬＡ−Ｉは、細胞内部からペプチドを提示する３つのタンパク質、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃを含み、ＨＬＡ−Ｉ複合体により提示される抗原は、キラーＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞としても知られる）を引き付ける。ＨＬＡ−Ｉタンパク質はβ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と会合する。ＨＬＡ−ＩＩは、５つのタンパク質、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＲを含み、これらはＴリンパ球に対して細胞の外側から抗原を提示する。これはＣＤ４＋細胞（Ｔヘルパー細胞としても知られる）を刺激する。遺伝子がヒト（ＨＬＡ）由来であるか又はマウス（ＭＨＣ）由来であるかに依存するので、「ＭＨＣ」又は「ＨＬＡ」の何れかの使用は限定することを意味しないことを理解されたい。従って、これは哺乳動物細胞に関するので、これらの用語は本明細書中で交換可能に使用され得る。
【００５３】
「遺伝子ノックアウト」は、本明細書中で、それが存在する宿主細胞において特定の遺伝子を不活性にして、その結果、関心のあるタンパク質が産生されないか又は不活性形態になるかの何れかになる工程を意味する。当業者により理解されるように、及び下でさらに記載されるように、これは、遺伝子から核酸配列を除去するか又はその配列を他の配列で妨害するか、読み枠を変更するか又は核酸の制御因子を変更することを含め、多くの様々な方法により遂行され得る。例えば関心のある遺伝子のコード領域の全て又は一部を除去し得るか、又は「ナンセンス」配列で置き換え得、プロモーターなどの制御配列の全て又は一部を除去し得るか又は置き換え得、翻訳開始配列を除去し得るか又は置き換え得るなどである。
【００５４】
「遺伝子ノックイン」は、本明細書中で、宿主細胞に遺伝子機能を追加する工程を意味する。これにより、コードされるタンパク質のレベル上昇が起こる。当業者により理解されるように、これは、遺伝子の１つ以上のさらなるコピーを宿主細胞に付加するか又はタンパク質発現を向上させる内在性遺伝子の制御因子を変化させることを含め、いくつかの方法で遂行され得る。これは、プロモーターを修飾するか、異なるプロモーターを付加するか、エンハンサーを付加するか又は他の遺伝子発現配列を修飾することにより遂行され得る。
【００５５】
「β−２ミクログロブリン」又は「β２Ｍ」又は「Ｂ２Ｍ」タンパク質は、以下で示されるアミノ酸及び核酸配列を有するヒトβ２Ｍタンパク質を指し；このヒト遺伝子は受入番号ＮＣ＿００００１５．１０：４４７１１４８７−４４７１８１５９を有する。
【００５６】
「ＣＤ４７タンパク質」タンパク質は、下で示されるアミノ酸及び核酸配列を有するヒトＣＤ４７タンパク質を指し；このヒト遺伝子は受入番号ＮＣ＿０００００３．１２：１０８０４３０９４−１０８０９４２００を有する。
【００５７】
「ＣＩＩＴＡタンパク質」タンパク質は、下で示されるアミノ酸及び核酸配列を有するヒトＣＩＩＴＡタンパク質を指し；ヒト遺伝子は受入番号ＮＣ＿００００１６．１０：１０８６６２０８−１０９４１５６２を有する。
【００５８】
細胞との関連での「野生型」は、天然で見出される細胞を意味する。しかし多能性幹細胞との関連で、本明細書中で使用される場合、これは、多能性を生じさせる核酸変化を含有し得るが、低免疫原性を達成するための本発明の遺伝子編集手順を経なかったｉＰＳＣも意味する。
【００５９】
「同系」は、本明細書中で、宿主生物の遺伝学的類似性又は同一性及び免疫学的適合性がある細胞移植を指し；例えば免疫応答は生じない。
【００６０】
「同種」は、本明細書中で、免疫応答が生じる宿主生物及び細胞移植物の遺伝学的相違を指す。
【００６１】
「Ｂ２Ｍ−／−」は、本明細書中で、二倍体細胞において両染色体でＢ２Ｍ遺伝子が不活性化されていることを意味する。本明細書中で記載のように、これは様々な方法で行われ得る。
【００６２】
「ＣＩＩＴＡ−／−」は、本明細書中で、二倍体細胞において両染色体でＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化されていることを意味する。本明細書中で記載のように、これは様々な方法で行われ得る。
【００６３】
「ＣＤ４７ｔｇ」（「導入遺伝子」を表す）又は「ＣＤ４７＋」）は本明細書中で、一部の例ではＣＤ４７遺伝子の少なくとも１個のさらなるコピーを有することにより、宿主細胞がＣＤ４７を発現することを意味する。
【００６４】
「Ｏｃｔポリペプチド」は、転写因子のオクタマーファミリーの天然のメンバー又は、最も近縁な天然ファミリーメンバーと比較して類似の（少なくとも５０％、８０％又は９０％活性以内）転写因子活性を維持するそれらの変異体又は、天然のファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドの何れかを指し、転写活性化ドメインをさらに含み得る。代表的なＯｃｔポリペプチドとしては、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、Ｏｃｔ−３／４、Ｏｃｔ−６、Ｏｃｔ−７、Ｏｃｔ−８、Ｏｃｔ−９及びＯｃｔ−１１が挙げられる。Ｏｃｔ３／４（本明細書中で「Ｏｃｔ４」と呼ぶ）は、ＰＯＵドメイン、Ｐｉｔ−１、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２及びｕｒｉｃ−８６で保存される１５０アミノ酸配列、を含有する（その全体において参照により本明細書中に組み込まれる、Ｒｙａｎ，Ａ．Ｋ．＆  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．，Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．１１：１２０７−１２２５（１９９７）を参照）。一部の実施形態では、変異体は、天然のＯｃｔポリペプチドファミリーメンバーと、例えば上記で列挙されるものなど又はＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ−００２６９２．２（ヒトＯｃｔ４）又はＮＰ−０３８６６１．１（マウスＯｃｔ４）で列挙されるものなどと比較して、それらの配列全体にわたり、少なくとも８５％、９０％又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｏｃｔポリペプチド（例えばＯｃｔ３／４又はＯｃｔ４）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ又は他の動物由来であり得る。一般に、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質が使用される。Ｏｃｔポリペプチドは、非多能性細胞において多能性を誘導するのを助け得る多能性因子であり得る。
【００６５】
「Ｋｌｆポリペプチド」は、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子（Ｋｌｆ）のファミリーの天然のメンバー、ショウジョウバエ胚パターン調節因子Ｋｒｕｐｐｅｌのものと同様のアミノ酸配列を含有するジンクフィンガータンパク質又は、最も近縁な天然のファミリーメンバーと比較して類似の（少なくとも５０％、８０％又は９０％活性以内）転写因子活性を維持する天然メンバーの変異体、又は天然のファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドの何れかを指し、転写活性化ドメインをさらに含み得る。（その全体において本明細書中で参照により組み込まれる、Ｄａｎｇ，Ｄ．Ｔ．，Ｐｅｖｓｎｅｒ，Ｊ．＆Ｙａｎｇ，Ｖ．Ｗ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３２：１１０３−１１２１（２０００）を参照）。代表的なＫｌｆファミリーメンバーとしては、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ３、Ｋｌｆ−４、Ｋｌｆ５、Ｋｌｆ６、Ｋｌｆ７、Ｋｌｆ８、Ｋｌｆ９、Ｋｌｆ１０、Ｋｌｆ１１、Ｋｌｆ１２、Ｋｌｆ１３、Ｋｌｆ１４、Ｋｌｆ１５、Ｋｌｆ１６及びＫｌｆ１７が挙げられる。Ｋｌｆ２及びＫｌｆ−４は、マウスにおいてｉＰＳ細胞を作製可能な因子であることが分かり、関連する遺伝子Ｋｌｆ１及びＫｌｆ５もそうであったが、効率は低かった（その全体において本明細書中で参照により組み込まれる、Ｎａｋａｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１０１−１０６（２００７）参照）。一部の実施形態では、変異体は、天然のＫｌｆポリペプチドファミリーメンバー、例えば上で列挙されるものなど又はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＸ１６０８８（マウスＫｌｆ４）若しくはＣＡＸ１４９６２（ヒトＫｌｆ４）で列挙されるものなどと比較して、それらの全配列にわたり少なくとも８５％、９０％又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｋｌｆポリペプチド（例えばＫｌｆ１、Ｋｌｆ４及びＫｌｆ５）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ又は他の動物由来であり得る。一般に、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質が使用される。Ｋｌｆポリペプチドは、多能性因子であり得る。Ｋｌｆ４遺伝子又はポリペプチドの発現は、開始細胞又は開始細胞集団において多能性の誘導を助け得る。
【００６６】
「Ｍｙｃポリペプチド」は、Ｍｙｃファミリーの天然メンバーの何れかを指す（例えばその全体において本明細書中で参照により組み込まれるＡｄｈｉｋａｒｙ，Ｓ．＆Ｅｉｌｅｒｓ，Ｍ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：６３５−６４５（２００５）を参照）。これは、最も近縁な天然のファミリーメンバーと比較した場合に類似の（即ち少なくとも５０％、８０％又は９０％活性以内）転写因子活性を維持する変異体も含む。これは、天然のファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをさらに含み、転写活性化ドメインをさらに含み得る。代表的なＭｙｃポリペプチドは、例えばｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ及びＬ−Ｍｙｃを含む。一部の実施形態では、変異体は、天然のＭｙｃポリペプチドファミリーメンバー、例えば上で列挙されるものなど、又はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ２５０１５（ヒトＭｙｃ）で列挙されるものなど、と比較して、それらの全配列にわたり、少なくとも８５％、９０％又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｍｙｃポリペプチド（例えばｃ−Ｍｙｃ）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ又は他の動物由来であり得る。一般に、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質が使用される。Ｍｙｃポリペプチドは多能性因子であり得る。
【００６７】
「Ｓｏｘポリペプチド」は、ＳＲＹ関連ＨＭＧ−ｂｏｘ（Ｓｏｘ）転写因子の天然メンバーの何れかを指し、最も近縁な天然のファミリーメンバーと比較した場合に類似の（即ち少なくとも５０％、８０％又は９０％活性以内）転写因子活性を維持する高移動度群（ＨＭＧ）ドメイン又はそれらの変異体の存在を特徴とする。これは、天然のファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドも含み、転写活性化ドメインをさらに含み得る（例えばその全体において本明細書中で参照により組み込まれるＤａｎｇ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３２：１１０３−１１２１（２０００）を参照）。代表的なＳｏｘポリペプチドとしては、例えばＳｏｘ１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ４、Ｓｏｘ５、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ８、Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ１０、Ｓｏｘ１１、Ｓｏｘ１２、Ｓｏｘ１３、Ｓｏｘ１４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ１８、Ｓｏｘ−２１及びＳｏｘ３０が挙げられる。Ｓｏｘ１は、Ｓｏｘ２と同様の効率でｉＰＳ細胞をもたらすことが示されており、遺伝子Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５及びＳｏｘ１８もｉＰＳ細胞を産生させることが示されているが、Ｓｏｘ２よりも幾分効率が低い（その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＮａｋａｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１０１−１０６（２００７）を参照）。一部の実施形態では、変異体は、天然のＳｏｘポリペプチドファミリーメンバー、例えば上で列挙されるものなど又はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ８３４３５（ヒトＳｏｘ２）に挙げられるものなどと比較して、それらの全配列にわたり少なくとも８５％、９０％又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｓｏｘポリペプチド（例えばＳｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５又はＳｏｘ１８）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ又は他の動物由来であり得る。一般に、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質が使用される。Ｓｏｘポリペプチドは多能性因子であり得る。本明細書中で論じるように、ＳＯＸ２タンパク質はｉＰＳＣの作製において特定の用途がある。
【００６８】
「分化した低免疫原性多能性細胞」又は「分化したＨＩＰ細胞」又は「ｄＨＩＰ細胞」は、本明細書中で、低免疫原性を保持するように改変されているｉＰＳ細胞を意味し（例えばＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡのノックアウト及びＣＤ４７のノックイン）、次に対象への最終的な移植のための細胞タイプに分化させられる。従って、例えばＨＩＰ細胞は、肝細胞（「ｄＨＩＰ肝細胞」）、ベータ様膵臓細胞又は膵島オルガノイド（「ｄＨＩＰベータ細胞」）、内皮細胞（「ｄＨＩＰ内皮細胞」）などへと、分化させられ得る。
【００６９】
パーセント「同一性」という用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列という観点で、以下に記載の配列比較アルゴリズム（例えばＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ又は当業者にとって利用可能な他のアルゴリズム）の１つを使用して、又は目視検査によって測定した場合、比較し、一致が最大となるように並べたとき、同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基が指定のパーセンテージとなる２つ以上の配列又はサブ配列を指す。適用に依存して、パーセント「同一性」は、比較される配列の領域にわたり、例えば機能的ドメインにわたり存在し得るか又は、或いは、比較しようとする２つの配列の全長にわたり存在し得る。配列比較の場合、一般的には１つの配列を、試験配列が比較される参照配列とする。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次に、配列比較アルゴリズムが、指定されるプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列についてパーセント配列同一性を計算する。
【００７０】
比較のための配列の最適アライメントは、例えばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ）に対する検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータライズドインプリメンテーション（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．の、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）又は目視検査（一般にＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，以下を参照）によって、遂行され得る。
【００７１】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適切なアルゴリズムの一例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公開されている。
【００７２】
「阻害剤」、「活性化因子」及び「修飾因子」は、生物学的関連分子の機能又は発現に影響を及ぼす。「修飾因子」という用語は、阻害剤及び活性化因子の両方を含む。これらは、標的分子の発現又は活性に対するインビトロ及びインビボアッセイを用いて同定され得る。
【００７３】
「阻害剤」は、例えば発現を阻害するか又は標的分子又はタンパク質に結合する物質を指す。これらは、部分的又は全体的に刺激を遮断し得るか又はプロテアーゼ阻害剤活性を有し得る。これらは、記載される標的タンパク質の活性の不活性化、脱感作又は下方制御を含め、活性化を軽減、低下、防止又は遅延させ得る。修飾因子は、標的分子又はタンパク質のアンタゴニストであり得る。
【００７４】
「活性化因子」は、例えば標的分子又はタンパク質の機能又は発現を誘導又は活性化する物質を指す。これらは、結合して、標的分子活性を刺激し得るか、上昇させ得るか、開き得るか、活性化し得るか、又は促進し得る。活性化因子は標的分子又はタンパク質のアゴニストであり得る。
【００７５】
「相同体」は、ヌクレオチド配列、ペプチド配列、機能又は構造レベルで参照分子と同様である生理活性分子である。相同体は、参照配列とある一定のパーセント同一性を共有する配列誘導体を含み得る。従って、一実施形態では、相同又は誘導体配列は、少なくとも７０パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同又は誘導体配列は、少なくとも８０又は８５パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同又は誘導体配列は、少なくとも９０パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同又は誘導体配列は、少なくとも９５パーセントの配列同一性を共有する。より具体的な実施形態では、相同又は誘導体配列は、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの配列同一性を共有する。相同又は誘導体核酸配列はまた、高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件下で参照核酸配列に結合し続けるそれらの能力によっても定められ得る。参照分子に対して構造又は機能的類似性を有する相同体は、参照分子の化学誘導体であり得る。構造及び機能的相同体並びに誘導体について検出し、作製し、スクリーニングする方法は当技術分野で公知である。
【００７６】
「ハイブリッド形成」は一般に、相補鎖がそれらの融解温度を下回る環境で存在するときに変性ＤＮＡが再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の度合いが高いほど、使用され得る相対温度は高くなる。結果として、より高い相対温度はよりストリンジェンシーの高い反応条件を作る傾向があり、一方でより低い温度はストリンジェンシーがより低くなるということになる。ハイブリッド形成反応のストリンジェンシーのさらなる詳細及び説明については、その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）を参照。
【００７７】
ハイブリッド形成反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定可能であり、一般にプローブの長さ、洗浄温度及び塩濃度に依存する経験的計算である。一般に、正確なアニーリングのためには、プローブが長いほど高い温度が必要となり、一方でプローブが短いほど必要な温度は低くなる。
【００７８】
「ストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェンシー条件」は、本明細書中で定義される場合、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温、例えば５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用するもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミドなどの変性剤、例えば４２℃で、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５の５０Ｍｍリン酸ナトリウム緩衝液、７５０Ｍｍ  塩化ナトリウム、７５Ｍｍクエン酸ナトリウム入りの５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、を使用するもの；又は（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０Ｍｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｌ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ及び１０％硫酸デキストランを使用し、０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃で１０分間洗浄し、続いて５５℃でＥＤＴＡ含有０．１ｘＳＳＣからなる１０分間の高ストリンジェンシー洗浄を行う、溶液中での一晩のハイブリッド形成により同定され得る。
【００７９】
本願全体を通じて与えられる全ての最大の数値制限は、全てのより低い数値制限が本明細書中で明らかに書かれているかのように、全てのより低い数値制限を含むものとする。本願全体を通じて与えられる全ての最小の数値制限は、全てのより高い数値制限が本明細書中で明らかに書かれているかのように、全てのより高い数値制限を含むものとする。本願全体を通じて与えられる全ての数値範囲は、全てのより狭い数値範囲が全て本明細書中で明らかに書かれているかのように、このようなより広い数値範囲内に入る全てのより狭い数値範囲を含む。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、「修飾」という用語は、親分子から修飾された分子を物理的に区別する変化を指す。一実施形態では、本明細書中に記載の方法に従い調製されるＣＤ４７、ＨＳＶｔｋ、ＥＣ−ＣＤ又はｉＣａｓｐ９変異体ポリペプチド中のアミノ酸変化は、野生型タンパク質、天然の突然変異体タンパク質又はこのような変異体ポリペプチドの修飾を含まない別の改変タンパク質など、本明細書中に記載の方法に従い修飾されていない対応する親とそれを区別する。別の実施形態では、変異体ポリペプチドは、未修飾ポリペプチドと変異体ポリペプチドの機能を区別する１つ以上の修飾を含む。例えば、変異体ポリペプチド中のアミノ酸変化は、その受容体結合プロファイルに影響を及ぼす。他の実施形態では、変異体ポリペプチドは、置換、欠失又は挿入修飾又はそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、変異体ポリペプチドは、未修飾ポリペプチドの親和性と比較して、受容体に対してその親和性を向上させる１つ以上の修飾を含む。
【００８１】
一実施形態では、変異体ポリペプチドは、対応するネイティブ又は親配列と比較して、１つ以上の置換、挿入又は欠失を含む。ある一定の実施形態では、変異体ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１〜４０、４１〜５０又は５１個以上の修飾を含む。
【００８２】
「エピソームベクター」は、本明細書中で、細胞の細胞質に存在し得、自律的に複製し得る遺伝子ベクターを意味し；例えば、これは宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれない。多くのエピソームベクターが当技術分野で公知であり、下で記載する。
【００８３】
遺伝子との関連での「ノックアウト」は、ノックアウトを有する宿主細胞が遺伝子の機能的タンパク質産物を産生しないことを意味する。本明細書中で概説するように、ノックアウトは、様々な方法で、コード配列の全て又は一部を除去し、機能的タンパク質が産生されないように（短縮又はナンセンス配列の何れか）フレームシフト突然変異を導入し、遺伝子が転写されないように調節因子（例えばプロモーター）を除去又は改変し、ｍＲＮＡなどへの結合を通じて翻訳を妨害することによる結果であり得る。一般に、ノックアウトは、細胞の子孫も永久的にノックアウトを保有するようにゲノムＤＮＡレベルでもたらされる。
【００８４】
遺伝子の文脈において、「ノックイン」は、ノックインを有する宿主細胞が細胞において活性のあるより機能的なタンパク質を有することを意味する。本明細書中で概説するように、ノックインは、様々な方法で、通常はタンパク質をコードする導入遺伝子（ｔｇ）の少なくとも１コピーの細胞への導入により、行われ得るが、これはまた、調節コンポーネントを置き換えることによっても、例えば内在性遺伝子に構成的プロモーターを付加することによって、行われ得る。一般に、ノックイン技術の結果、宿主細胞への導入遺伝子のさらなるコピーの組み込みが起こる。
【００８５】
ＶＩＩ．低免疫原性多能性（ＨＩＰ）細胞
本発明は、ＨＩＰ細胞を作製し、野生型細胞を用いて開始し、それらを多能性にし（例えば誘導多能性幹細胞又はｉＰＳＣを作製）、次いでｉＰＳＣ集団からＨＩＰ細胞を作製するための、組成物及び方法を提供する。
【００８６】
Ａ．遺伝子変異のための方法
本発明は、多能性細胞及びＨＩＰ細胞の両方を作製するために細胞内又は無細胞条件下で核酸配列を修飾する方法を含む。代表的な技術としては、相同組み換え、ノックイン、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、メガヌクレアーゼ（例えばホーミングエンドヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的配置の短回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ））／Ｃａｓ９及び他の部位特異的なヌクレアーゼ技術が挙げられる。これらの技術により、所望の遺伝子座部位での２本鎖ＤＮＡ破壊が可能になる。これらの制御された２本鎖破壊は、特異的な遺伝子座部位で相同組み換えを促進する。この工程は、配列を認識し結合するエンドヌクレアーゼでの、染色体など、核酸分子の特異的な配列を標的とすることに焦点を当て、核酸分子での２本鎖破壊を誘導する。２本鎖破壊は、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組み換え（ＨＲ）の何れかにより修復される。
【００８７】
当業者により認められるように、本発明の多能性細胞を改変するために多くの様々な技術を使用し得、本明細書中で概説するように低免疫原性になるようにｉＰＳＣを改変する。
【００８８】
一般に、これらの技術は、個々に又は組み合わせて使用され得る。例えばＨＩＰ細胞の作製において、ＣＤ４７の機能性をノックインするためのウイルス技術（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）とともに、改変細胞での活性Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡタンパク質の発現を低下させるためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓが使用され得る。また、当業者により認められるように、一実施形態は、ＣＤ４７機能性をノックインするためのレンチウイルスの最終段階とともに、Ｂ２ＭをノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ段階、続いてＣＩＩＴＡをノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ段階を連続的に利用したが、これらの遺伝子は様々な技術を使用して様々な順序で操作され得る。
【００８９】
下でより詳細に論じるように、初期化遺伝子の一過性発現は一般に誘導多能性幹細胞を作製するために行われる。
【００９０】
ａ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術
一実施形態では、当技術分野で公知のように、クラスター化された規則的配置の短回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ（「ＣＲＩＳＰＲ」）技術を使用して、細胞を操作する。開始ｉＰＳＣを作製するため又はｉＰＳＣからＨＩＰ細胞を作製するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを使用し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づく多数の技術があり、例えば参照により本明細書によって組み込まれるＤｏｕｄｎａ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５８０９６を参照。ＣＲＩＳＰＲ技術及びキットは市販されている。
【００９１】
ｂ．ＴＡＬＥＮ技術
一部の実施形態では、本発明のＨＩＰ細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）法を使用して作製される。ＴＡＬＥＮは、実際に何らかの所望のＤＮＡ配列に結合し、切断するように改変され得るヌクレアーゼと組み合わせられた制限酵素である。ＴＡＬＥＮキットは市販されている。
【００９２】
ｃ．ジンクフィンガー技術
一実施形態では、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ技術を使用して細胞を操作する。Ｚｎフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより作製される人工的制限酵素である。ジンクフィンガードメインは特異的な所望のＤＮＡ配列を標的とするために改変され得、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内でユニークな配列を標的とすることが可能になる。内在性ＤＮＡ修復機構の長所により、ＣＲＩＳＰＲ及びＴＡＬＥＮと同様に、より高等な生物のゲノムを適正に改変するためにこれらの試薬を使用し得る。
【００９３】
ｄ．ウイルスに基づく技術
レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びセンダイウイルスベクターの使用を含むが限定されない、本発明のＨＩＰ細胞を作製するために（並びにｉＰＳＣのオリジナル作製（ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）のため）使用し得る多岐にわたるウイルス技術がある。ｉＰＳＣの作製において使用されるエピソームベクターを下で記載する。
【００９４】
ｅ．干渉ＲＮＡを使用した遺伝子の下方制御
他の実施形態では、ＨＬＡ分子で使用されるタンパク質をコードする遺伝子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術により下方制御される。ＲＮＡｉは、しばしば特異的なｍＲＮＡ分子の分解を引き起こすことにより、ＲＮＡ分子が遺伝子発現を阻害する過程を指す。２つのタイプのＲＮＡ分子−マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）−がＲＮＡ干渉のために使用され得る。これらは、標的ｍＲＮＡ分子に結合し、それらの活性を上昇又は低下させる。ＲＮＡｉは、ウイルス及びトランスポゾン由来のものなどの寄生性の核酸に対する細胞防御を助ける。ＲＮＡｉは発生にも影響を与える。
【００９５】
特定の実施形態によれば、本阻害性核酸は、標的遺伝子、例えばＢ２Ｍ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的タンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリッド形成し（例えば結合し）、それにより遺伝子の転写及び／又は翻訳を阻害する核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡの何れか）であり得る。結合は従来の塩基対相補性によるものであり得る。或いは、結合は、例えばＤＮＡ二本鎖への結合の場合、ダブルヘリックスの主溝における特異的な相互作用を通じたものであり得る。絶対的な相補性は好ましいものではあるが必要ではない。
【００９６】
従って、一実施形態によれば、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは１本鎖又は２本鎖ＤＮＡ分子、より好ましくは２本鎖ＤＮＡ分子である。別の実施形態によれば、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１本鎖又は２本鎖ＲＮＡ分子、より好ましくは１本鎖ＲＮＡ分子である。一部の例では、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、内在性ヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼに対して耐性があり、従ってインビボ及びインビトロで安定である修飾オリゴヌクレオチドである。
【００９７】
本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば分子の安定性を向上させるために、塩基部分、糖部分又はリン酸骨格で修飾され得る。本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば宿主細胞受容体を標的とするため）又は細胞膜を横断する輸送を促進する物質などの他の付加基を含み得る。本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド又は輸送剤などの別の分子に複合化され得る。一部の例では、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシトリエチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアンニノンエチルウラシル（５−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｎｎｉｎｏｎｎｅｔｈｙｌｕｒａｃｉｌ）、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−ンネチルグアニン（１−ｎｎｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ）、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−ンネチルグアニン（７−ｎｎｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ）、５−メチルアミノンエチルウラシル（５−ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｎｎｅｔｈｙｌｕｒａｃｉｌ）、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ及び２，６−ジアミノプリンを含むが限定されない群から選択される、少なくとも１つの修飾塩基部分を含む。
【００９８】
ある一定の実施形態では、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース及びヘキソースを含むが限定されない群から選択される、少なくとも１つの修飾糖部分を含む。他の実施形態では、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミダート、ホスホルジアミダート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル及びホルムアセタール又はその類似体を含むが限定されない群から選択される、少なくとも１つの修飾リン酸骨格を含む。
【００９９】
ｓｄＲＮＡ分子は、１９〜２１塩基のガイド（アンチセンス）鎖を含む非対称ｓｉＲＮＡのクラスである。これらは、５’ホスフェート、２’Ｏｍｅ又は２’Ｆ修飾ピリミジン及び６個のホスホロチオエートを３’位置に含有し得る。これらは、３’複合化ステロール部分、２個のホスホチオエートを３’位置に、及び２’Ｏｍｅ修飾ピリミジンを含有するセンス鎖を含有し得る。両鎖は、３を超えない長さの未修飾プリンの連続ストレッチとともに２’Ｏｍｅプリンを含有し得る。ｓｄＲＮＡは、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第８，７９６，４４３号明細書で開示される。
【０１００】
これらの技術の全てに対して、本明細書中で概説するように組み換え核酸を作製するために周知の組み換え技術が使用される。ある一定の実施形態では、組み換え核酸（所望のポリペプチド、例えばＣＤ４７又は破壊配列の何れかをコードする）は、発現コンストラクト中で１つ以上の制御ヌクレオチド配列に操作可能に連結され得る。制御ヌクレオチド配列は、一般に処置しようとする宿主細胞及び対象に適切である。様々な宿主細胞に対して、多くのタイプの適切な発現ベクター及び適切な調節配列が当技術分野で公知である。一般的には、１つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー又はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列及びエンハンサー又は活性化因子配列が挙げられ得るが限定されない。当技術分野で公知のような構成的又は誘導性プロモーターも企図される。プロモーターは、天然のプロモーター又は複数のプロモーターのエレメントを組み合わせるハイブリッドプロモーターの何れかであり得る。発現コンストラクトは、プラスミド又はベクターなど、エピソーム上で細胞中に存在し得るか、又は発現コンストラクトは染色体に挿入され得る。特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために選択可能マーカー遺伝子を含む。ある一定の実施形態は、少なくとも１個の調節配列に操作可能に連結される変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。本明細書中での使用のための調節配列は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメントを含む。ある一定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換しようとする宿主細胞の選択、発現させようと所望する特定の変異体ポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御するための能力又はベクターによりコードされる何らかの他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーなど、の発現のために設計される。
【０１０１】
適切なプロモーターの例としては、例えば次の遺伝子からのプロモーター：ハムスターのユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター（国際公開第９７／１５６６４号パンフレット）、サル空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の末端反復配列領域、マウス乳癌ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス末端反復配列領域及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターが挙げられる。他の異種哺乳動物プロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリン又は熱ショックプロモーターである。一部の実施形態では、伸長因子１−アルファプロモーターが使用される。
【０１０２】
さらなる実施形態では、哺乳動物宿主細胞での使用のためのプロモーターは、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（英国特許第２，２１１，５０４号明細書、１９８９年７月５日公開）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られ得る。さらなる実施形態では、異種哺乳動物プロモーターが使用される。例としては、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター及び熱ショックプロモーターが挙げられる。ＳＶ４０の初期及び後期プロモーターは、都合よく、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として得られる。Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３−１２０（１９７８）。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、都合よく、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として得られる。Ｇｒｅｅｎａｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８：３５５−３６０（１９８２）。前述の参考文献はそれらの全体において参照により組み込まれる。
【０１０３】
Ｂ．多能性細胞の作製
本発明は、多能性細胞から非免疫原性多能性細胞を作製する方法を提供する。従って、第１段階は多能性幹細胞を提供することである。
【０１０４】
マウス及びヒト多能性幹細胞（一般にｉＰＳＣと呼ばれ；マウス細胞の場合はｍｉＰＳＣ又はヒト細胞の場合はｈｉＰＳＣ）の作製は一般に当技術分野で公知である。当業者により認められるように、ｉＰＳＣの作製のために様々な異なる方法がある。４つの転写因子、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４のウイルス導入を使用して、マウス胚又は成体線維芽細胞から最初の誘導が行われた；その全体において、及び具体的には文献中で概説される技術に対して、参照により本明細書によって組み込まれるＴａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ  Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−６７６（２００６）を参照。そのときから、多くの方法が開発された；両者ともそれらの全体において、及び特にｈｉＰＳＣを作製するための方法について、参照により本発明により明確に組み込まれる、概説に対するＳｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ７（１）：１１６−１２５（２０１５）及びＬａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ  ａｎｄ  Ｖｅｒｍｕｒｉ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ２０１３を参照（例えば後者の参考文献の第３章を参照）。
【０１０５】
一般に、ｉＰＳＣは、通常はエピソームベクターを使用して導入される、宿主細胞中での１つ以上の「初期化因子」の一過性発現により作製される。これらの条件下で少量の細胞がｉＰＳＣになるように誘導される（選択マーカーが使用されないので一般にこの段階の効率は低い）。細胞が「初期化」され、多能性になると、これらはエピソームベクターを失い、内在遺伝子を使用して因子を産生する。このエピソームベクターの喪失の結果、「ゼロフットプリント（ｚｅｒｏ  ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）」細胞と呼ばれる細胞が得られる。（特に宿主細胞のゲノムにおいて）遺伝子修飾が少ないほど良いのでこれは望ましい。従って、得られるｈｉＰＳＣに永久的な遺伝子修飾がないことが好ましい。
【０１０６】
また当業者により認識されるように、使用され得るか又は使用される多くの初期化因子が変動し得る。一般に、より少ない初期化因子が使用される場合、多能性状態への細胞の形質転換の効率が低下し、「多能性」も低下し、例えばより少ない初期化因子では、十分に多能性ではないが、より少ない細胞タイプにのみ分化可能であり得る細胞が得られ得る。
【０１０７】
一部の実施形態では、１個の初期化因子、ＯＣＴ４が使用される。他の実施形態では、２つの初期化因子、ＯＣＴ４及びＫＬＦ４が使用される。他の実施形態では、３つの初期化因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４及びＳＯＸ２が使用される。他の実施形態では、４つの初期化因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ−Ｍｙｃが使用される。他の実施形態では、ＳＯＫＭＮＬＴ；ＳＯＸ２、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８及びＳＶ４０Ｌ  Ｔ抗原から選択される、５、６又は７個の初期化因子が使用され得る。
【０１０８】
一般に、当技術分野で公知のもの及び市販のものなど、エピソームベクターにおいてこれらの初期化因子遺伝子が提供される。例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎは、ｈｉＰＳＣのゼロフットプリント（ｚｅｒｏ  ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）作製のためのセンダイウイルス初期化キットを販売しており、カタログ番号Ａ３４５４６を参照。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒは、ＥＢＮＡに基づく系も販売しており、カタログ番号Ａ１４７０３を参照。
【０１０９】
さらに、利用可能な多くの市販ｈｉＰＳＣ株がある；例えばゼロフットプリント（ｚｅｒｏ  ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）、ウイルス組み込みのないヒトｉＰＳＣ細胞株であるＧｉｂｃｏ（登録商標）エピソームｈｉＰＳＣ株、Ｋ１８９４５を参照（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、上出も参照）。
【０１１０】
一般に、当技術分野で公知のように、ｉＰＳＣは、本明細書中で記載のように初期化因子を一過性に発現させることにより、ＣＤ３４＋臍帯血細胞、線維芽細胞など、非多能性細胞から作製される。
【０１１１】
例えば、成功したｉＰＳＣはまた、初期化効率が低下するものの、Ｃ−Ｍｙｃを省略してＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４のみを使用して作製された。
【０１１２】
一般に、ｉＰＳＣは、ＫＬＦ４、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＥＳＲＲＢ、ＴＢＸ３、ｃ−Ｍｙｃ及びＴＣＬ１を含むある一定の因子の発現を特徴とする。本発明の目的のためのこれらの因子の新しい発現又は発現上昇は、内在遺伝子座の誘導若しくは調整を介し得るか又は導入遺伝子からの発現からのものであり得る。
【０１１３】
例えば、マウスｉＰＳＣは、その全体において、及び具体的にはｍｉＰＳＣの作製のための方法及び試薬に対して、参照により本明細書によって組み込まれるＤｉｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５，Ｊａｎ．２８；５：８０８１（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０８０８１）の方法を使用して作製され得る。また、例えば全体において及び具体的には本明細書中で概説される方法に対して、参照により本明細書によって組み込まれるＢｕｒｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１１  ６（４）：１８２９３も参照。
【０１１４】
一部の例では、細胞の多能性は、本明細書中で概説するように、例えば一般にＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書で示されるような初期化因子についてアッセイすることにより、又はそこで、例えば実施例で概説されるような分化反応を遂行することにより、測定又は確認される。
【０１１５】
Ｃ．低免疫原性多能性（ＨＩＰ）細胞の作製
本発明は、本明細書中で定められるように、患者への低免疫原性細胞の作製、操作、増殖及び移植を対象とする。多能性細胞からのＨＩＰ細胞の作製は３個という少ない遺伝子変化により行われ、その結果、細胞活性の破壊が最小限となるが、細胞に対して免疫サイレンシングを与える。
【０１１６】
本明細書中で論じられるように、一実施形態は、ＭＨＣＩ及びＩＩ（細胞がヒトである場合はＨＬＡＩ及びＩＩ）のタンパク質活性の低下又は排除を利用する。これは、それらの構成成分をコードする遺伝子を変化させることにより行われ得る。一実施形態では、遺伝子のコード領域又は調節配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを使用して破壊される。別の実施形態では、干渉ＲＮＡ技術を使用して、遺伝子翻訳を減少させる。第３の変化は、ＣＤ４７など、マクロファージ食作用に対する感受性を調節する遺伝子における変化であり、これは一般的にウイルス技術を使用した遺伝子の「ノックイン」である。
【０１１７】
ＨＩＰ細胞のさらなる説明は、２０１８年１月１４日提出の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書及び２０１７年１月１３日提出の米国仮特許出願第６２／４４５，９６９号明細書で見出され得、その全体におけるこれらの開示は本明細書中で、参照により、特に実施例、図面、図面の説明及び低免疫原性多能性幹細胞の作製及び他の細胞タイプへのこのような細胞の分化の説明が組み込まれる。
【０１１８】
一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは遺伝子修飾のために使用されており、細胞株の高効率編集を可能にするＣａｓ９コンストラクトを含有するｈｉＰＳＣ細胞が使用され得；例えばＬｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＨｕｍａｎ  Ｅｐｉｓｏｍａｌ  Ｃａｓ９  ｉＰＳＣ細胞株、Ａ３３１２４を参照。
【０１１９】
１．ＨＬＡ−Ｉ低下
本発明のＨＩＰ細胞は、ＭＨＣＩ機能（細胞がヒト細胞由来である場合はＨＬＡ  Ｉ）の低下を含む。
【０１２０】
当業者により認められるように、機能の低下は、遺伝子から核酸配列を除去するか、配列を他の配列で妨害するか、又は核酸の調節コンポーネントを変化させることを含め、多くの方法において遂行され得る。例えば、関心のある遺伝子のコード領域の全て又は一部を除去し得るか、又は「ナンセンス」配列で置換し得、フレームシフト突然変異を作製し得、プロモーターなどの調節配列の全て又は一部を除去又は置換し得、翻訳開始配列を除去又は置換し得るなどである。
【０１２１】
当業者により認められるように、多能性細胞におけるＭＨＣＩ機能（細胞がヒト細胞である場合はＨＬＡ  Ｉ）の良好な低下は、当技術分野で公知の技術を使用して、及び下に記載のように；例えば、ＨＬＡ複合体に結合する標識される抗体を使用したＦＡＣＳ技術；例えばヒト主要組織適合ＨＬＡクラスＩ抗原のアルファ鎖に結合する市販のＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗体を使用して、測定され得る。
【０１２２】
Ｂ２Ｍ変化
一実施形態では、多能性幹細胞、本明細書中で開示されるヒト配列、におけるＨＬＡ−Ｉ活性の低下は、β−２ミクログロブリン遺伝子の発現を破壊することにより行われる。この変化は一般に本明細書中で、遺伝子「ノックアウト」と呼び、本発明のＨＩＰ細胞において、これは宿主細胞において両アレル上で行われる。一般に、両破壊を行うための技術は同じである。
【０１２３】
特に有用な実施形態は、遺伝子を破壊するためにＣＲＩＳＰＲ技術を使用する。一部の例では、遺伝子のコード領域に小さい欠失／挿入を導入するためにＣＲＩＳＰＲ技術が使用され、機能的タンパク質が産生されないようになり、しばしば、フレームシフト突然変異の結果、停止コドンが生じ、短縮された非機能的タンパク質が作製されるようになる。
【０１２４】
従って、有用な技術は、マウスでのＢ２Ｍ遺伝子又はヒトでのＢ２Ｍ遺伝子のコード配列を標的とするために設計されるＣＲＩＳＰＲ配列を使用することである。遺伝子編集後、遺伝子移入したｉＰＳＣ培養物を単一細胞に解離させる。単一細胞をフルサイズのコロニーになるように増殖させ、ＣＲＩＳＰＲ切断部位からの異常な配列の存在についてスクリーニングすることによりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集について評価する。両アレルで欠失があるクローンを拾う。このようなクローンは、ＰＣＲにより示されるようにＢ２Ｍを発現せず、ＦＡＣＳ分析により示されるようにＨＬＡ−Ｉを発現しなかった（例えばＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の実施例１及び６参照）。
【０１２５】
Ｂ２Ｍ遺伝子が不活性化されているか否かを試験するためのアッセイは公知であり、本明細書中に記載されている。一実施形態では、本アッセイは、Ｂ２Ｍタンパク質に対する抗体で探索する、細胞溶解物のウエスタンブロットである。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、不活性変化の存在を確認する。
【０１２６】
さらに、ＨＬＡ  Ｉ複合体が細胞表面上で発現されないことを確認するために細胞を評価し得る。これは、上で論じるような１つ以上のＨＬＡ細胞表面構成成分に対する抗体を使用して、ＦＡＣＳ分析によりアッセイされ得る。
【０１２７】
両アレルでＢ２Ｍ遺伝子を抑制しようとする場合、他のものでは不良な結果であったことは注目すべきことである。例えばＧｏｒｎａｌｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｂｔ．３８６０）を参照。
【０１２８】
２．ＨＬＡ−ＩＩ低下
ＨＬＡ  Ｉの低下に加えて、本発明のＨＩＰ細胞は、ＭＨＣ  ＩＩ機能（細胞がヒト由来の場合はＨＬＡ  ＩＩ）も欠く。
【０１２９】
当業者により認められるように、機能の低下は、遺伝子からの核酸配列の除去、遺伝子への核酸配列の付加、読み枠の破壊、配列を他の配列で妨害すること又は核酸の調節コンポーネントの変化を含む、多くの方法で遂行され得る。一実施形態では、関心のある遺伝子のコード領域の全て又は一部を除去し得るか又は「ナンセンス」配列で置換し得る。別の実施形態では、プロモーターなどの調節配列を除去又は置換し得、翻訳開始配列を除去又は置換し得るなどである。
【０１３０】
多能性細胞又はそれらの派生物におけるＭＨＣ  ＩＩ機能（細胞がヒト由来の場合はＨＬＡ  ＩＩ）の低下の成功は、タンパク質に対する抗体を使用してウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ技術、ＲＴ−ＰＣＲ技術などの当技術分野で公知の技術を使用して測定され得る。
【０１３１】
ＣＩＩＴＡの変化
一実施形態では、ＨＬＡ−ＩＩ活性の低下は、多能性幹細胞においてＣＩＩＴＡ遺伝子の発現を破壊することにより行われ、そのヒト配列は本明細書中で示す。この変化は一般に、本明細書中で遺伝子「ノックアウト」と呼ばれ、本発明のＨＩＰ細胞において、宿主細胞中の両アレル上で行われる。
【０１３２】
ＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化されているか否かを試験するためのアッセイは公知であり、本明細書中に記載される。一実施形態では、本アッセイは、ＣＩＩＴＡタンパク質に対する抗体で探索する細胞溶解物のウエスタンブロットである。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、不活性化する変化の存在を確認する。
【０１３３】
さらに、ＨＬＡ  ＩＩ複合体が細胞表面上で発現されないことを確認するために、本細胞を評価し得る。再び、このアッセイは当技術分野で公知のように行われ（例えばＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図２１参照）、一般に、下で概説されるようなヒトＨＬＡクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ及び殆どのＤＱ抗原に結合する市販抗体に基づいて、ウエスタンブロット又はＦＡＣＳ分析の何れかを使用して行われる。
【０１３４】
特に有用な実施形態は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊するためにＣＲＩＳＰＲ技術を使用する。全てのＭＨＣ  ＩＩ分子に対する必須の転写因子である、マウスにおけるＣＩＩＴＡ遺伝子又はヒトにおけるＣＩＩＴＡ遺伝子のコード配列を標的とするためにＣＲＩＳＰＲを設計した。遺伝子編集後、遺伝子移入したｉＰＳＣ培養物を単一細胞に解離させた。これらをフルサイズのコロニーに増殖させ、ＣＲＩＳＰＲ切断部位からの異常な配列の存在についてスクリーニングすることによりＣＲＩＳＰＲ編集の成功について評価した。欠失のあるクローンは、ＰＣＲにより判定した場合、ＣＩＩＴＡを発現せず、ＦＡＣＳ分析により判定した場合、ＭＨＣ  ＩＩ／ＨＬＡ−ＩＩを発現しなかった。
【０１３５】
３．マクロファージ食作用及び／又はＮＫ細胞殺傷の低下
ＨＬＡ  Ｉ及びＩＩ（又はＭＨＣ  Ｉ及びＩＩ）の減少に加えて、一般的にはＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡノックアウトを使用して、本発明のＨＩＰ細胞は、マクロファージ食作用及びＮＫ細胞殺傷に対する感受性が低下している。得られたＨＩＰ細胞は、１つ以上のＣＤ４７トランス遺伝子の発現により、免疫マクロファージ及び自然経路を「回避する」。
【０１３６】
ＨＩＰ細胞及びＨＩＰ細胞由来の細胞がＮＫ細胞殺傷及び／又はマクロファージ食作用を逃れるか又は回避するための能力は、ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図１４Ａ〜１４Ｃ及び３４Ａ〜３４Ｃで示され、その内容、特に図面、図面の説明及び実施例が本明細書中で参照により組み込まれる。例えば、図１４Ｂ〜１４Ｃは、マウスＨＩＰ細胞（例えばＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７トランスジェニックマウスｉＰＳＣ）がＮＫ細胞によるＣＤ１０７ａ発現の誘導ができず、従ってＮＫ細胞応答を惹起しなかったことを示す。さらに、このようなマウスＨＩＰ細胞がＮＫ細胞の活性化又はＩＦＮγの放出を誘導しなかったことが示された。ＮＫ細胞をＨＩＰ細胞由来の分化細胞（内皮細胞、平滑筋細胞及び心筋細胞など）と温置した場合、ＮＫ細胞応答は誘導されなかった（例えばＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図３４Ａ〜３４Ｃ）を参照。
【０１３７】
ＣＤ４７発現上昇
一部の実施形態では、マクロファージ食作用及びＮＫ細胞殺傷感受性の低下は、ＨＩＰ細胞表面上でのＣＤ４７上昇によるものである。これは、「ノックイン」又はトランスジェニック技術を使用して当業者により認められるように、いくつかの方法で行われる。一部の例では、ＣＤ４７発現上昇は、１つ以上のＣＤ４７導入遺伝子によるものである。
【０１３８】
従って、一部の実施形態では、ＣＤ４７遺伝子の１コピー以上をＨＩＰ細胞に誘導性又は構成的プロモーターの制御下で付加するが、後者が好ましい。一部の実施形態では、レンチウイルスコンストラクトが本明細書中で記載のように使用されるか、又は当技術分野で公知である。ＣＤ４７遺伝子は、当技術分野で公知のような適切なプロモーターの制御下で、宿主細胞のゲノムに組み込み得る。
【０１３９】
Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ｉＰＳＣからＨＩＰ細胞株を作製した。ブラストサイジンマーカーを使用して、ＣＤ４７を発現するレンチウイルスベクターを含有する細胞を選択した。ＣＤ４７遺伝子配列を合成し、ブラストサイジン耐性があるプラスミドレンチウイルスｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５にＤＮＡをクローニングした（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。
【０１４０】
一部の実施形態では、内在性ＣＤ４７遺伝子の調節配列を変化させることにより、例えば構成的プロモーターへと、又は異なる誘導性プロモーターへと、内在性プロモーターを交換することにより、ＣＤ４７遺伝子の発現を上昇させ得る。これは一般にＣＲＩＳＰＲなどの公知の技術を使用して行われ得る。
【０１４１】
変化させたら、抗ＣＤ４７抗体を使用した、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ又はＦＡＣＳアッセイなど、実施例に記載のものなどの公知の技術を使用して、十分なＣＤ４７発現の存在をアッセイし得る。一般に、「十分」は、この文脈において、ＮＫ細胞殺傷及び／又はマクロファージ食作用を抑制するＨＩＰ細胞表面上でのＣＤ４７の発現の上昇を意味する。それらのＭＨＣ  Ｉが排除されると、細胞上の天然発現レベルが低すぎてＮＫ細胞溶解からそれらを保護できない。
【０１４２】
４．自殺遺伝子
一部の実施形態では、本発明は、「自殺遺伝子」又は「自殺スイッチ」を含む低免疫原性多能性細胞を提供する。これらは、望ましくない方式で増殖し、分裂する場合に低免疫原性多能性細胞の死を引き起こし得る「安全スイッチ」として機能するように組み込まれる。「自殺遺伝子」消失アプローチは、特異的な化合物により活性化された場合のみ細胞死滅を引き起こすタンパク質をコードする遺伝子移入ベクターにおいて自殺遺伝子を含む。自殺遺伝子は、選択的に無毒性化合物を強毒性代謝産物に変換する酵素をコードし得る。この結果は、酵素を発現する細胞を特異的に除去している。一部の実施形態では、自殺遺伝子はヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子であり、トリガーはガンシクロビルである。他の実施形態では、自殺遺伝子はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＥＣ−ＣＤ）遺伝子であり、トリガーは５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）である（両者ともそれらの全体において参照により本明細書中で組み込まれる、Ｂａｒｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２０（１０）：１９３２−１９４３（２０１２），Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．８：７３−８（１９９８））。
【０１４３】
他の実施形態では、自殺遺伝子は誘導性カスパーゼタンパク質である。誘導性カスパーゼタンパク質は、アポトーシスを誘導可能なカスパーゼタンパク質の少なくとも一部を含む。一実施形態では、カスパーゼタンパク質の一部は配列番号６で例示される。好ましい実施形態では、誘導性カスパーゼタンパク質はｉＣａｓｐ９である。これは、ヒトカスパーゼ９をコードする遺伝子に一連のアミノ酸を通じて連結される、Ｆ３６Ｖ突然変異がある、ヒトＦＫ５０６−結合タンパク質、ＦＫＢＰ１２の配列を含む。ＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖは、低分子二量体化剤ＡＰ１９０３に高い親和性で結合する。従って本発明でのｉＣａｓｐ９の自殺機能は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）の投与により惹起される。一部の実施形態では、ＣＩＤは低分子薬ＡＰ１９０３である。二量体化はアポトーシスの迅速な誘導を引き起こす。（それぞれがそれらの全体において本明細書中に参照により組み込まれる、国際公開第２０１１１４６８６２号パンフレット；Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３６５；１８（２０１１）；Ｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３：９１３−９２４（２００７）参照）。
【０１４４】
５．ＨＩＰ表現型に対するアッセイ及び多能性の保持
ＨＩＰ細胞が作製されたら、一般に本明細書中に及び実施例に記載のように、これらをそれらの低免疫原性及び／又は多能性保持についてアッセイし得る。
【０１４５】
例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図１３及び図１５で例示されるような多くの技術を使用して、低免疫原性をアッセイし得る。これらの技術には、同種宿主への移植及び宿主免疫系を回避するＨＩＰ細胞増殖（例えば奇形腫）についての監視が含まれる。ルシフェラーゼを発現させるために、ＨＩＰ派生物に対して形質導入を行い、次に生体発光イメージングを使用して追跡し得る。同様に、ＨＩＰ細胞が宿主動物において免疫反応を引き起こさないことを確認するために、ＨＩＰ細胞に対する宿主動物のＴ細胞及び／又はＢ細胞応答を分析する。Ｅｌｉｓｐｏｔ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＰＣＲ又はマスサイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）によってＴ細胞機能を評価する。ＦＡＣＳ又はルミネックスを使用して、Ｂ細胞応答又は抗体応答を評価する。さらに又は或いは、一般にＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図１４Ａ〜１４Ｃで示されるように、自然免疫応答、例えばＮＫ細胞殺傷を回避するためのその能力について細胞をアッセイし得る。インビトロ又はインビボでＮＫ細胞リトリティック（ｌｙｔｏｌｙｔｉｃ）活性を評価する（ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図１５Ａ〜１５Ｂで示されるように）。
【０１４６】
同様に、多くの方法で多能性の保持が評価される。一実施形態では、一般に本明細書中に記載され、ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図２９で示されるように、ある種の多能性特異的な因子の発現によって、多能性をアッセイする。さらに又は或いは、多能性の指標としてＨＩＰ細胞を１つ以上の細胞タイプに分化させる。
【０１４７】
Ｄ．ＨＩＰ細胞の好ましい実施形態
ＨＩＰ細胞として又はＨＩＰ細胞の分化産物としての何れかでヒト患者などの同種宿主に移植された場合に多能性を示すが宿主免疫応答を生じさせない低免疫原性多能性幹細胞（「ＨＩＰ細胞」）が本明細書中で提供される。
【０１４８】
一実施形態では、ヒト誘導多能性幹細胞などのヒト多能性幹細胞は、ａ）各アレルでのＢ２Ｍ遺伝子の破壊（例えばＢ２Ｍ−／−）、ｂ）各アレルでのＣＩＩＴＡ遺伝子の破壊（例えばＣＩＩＴＡ−／−）及びｃ）ＣＤ４７遺伝子の過剰発現（ＣＤ４７＋、例えばＣＤ４７遺伝子の１つ以上のさらなるコピーを導入すること又はゲノム遺伝子を活性することを通じて）により、低免疫原性にされる。これにより、ｈｉＰＳＣ集団Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇが付与される。好ましい実施形態では、細胞は非免疫原性である。別の実施形態では、ＨＩＰ細胞に、上記のようであるが、必要なときにインビボで細胞を死滅させるために誘導される誘導性自殺遺伝子を含むことによりさらに修飾される非免疫原性Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７導入遺伝子が与えられる。
【０１４９】
Ｅ．ＨＩＰ細胞の維持
作製されたら、ｉＰＳＣの維持のために知られているようにＨＩＰ細胞を未分化状態に維持し得る。例えば分化を防ぎ、多能性を維持する培地を使用してマトリゲル上でＨＩＰ細胞を培養する。
【０１５０】
Ｆ．ＨＩＰ細胞の分化
本明細書中に記載のＨＩＰ細胞を様々な細胞タイプに分化させ得る。ＨＩＰの多能性は、細胞を内胚葉、中胚葉及び外胚葉細胞タイプに分化させることにより評価され得る。一部の例では、ＨＩＰ細胞は奇形腫形成により評価される。
【０１５１】
当業者により認められるように、分化のための方法は、公知の技術を使用して所望の細胞タイプに依存する。懸濁液中で細胞を分化させ、次に細胞生存を促進するためにマトリゲル、ゼラチン又はフィブリン／トロンビン形態などのゲルマトリクス形態に入れる。当技術分野で公知のように、例えば、一般に細胞特異的マーカーの存在を評価することによって分化をアッセイする。
【０１５２】
一部の実施形態では、肝細胞機能の喪失又は肝臓の肝硬変に対処するために、ＨＩＰ細胞を肝細胞に分化させる。ＨＩＰ細胞を肝細胞に分化させるために使用され得る多くの技術がある；例えばそれらの全体において、及び特に分化のための方法及び試薬に対して、参照により本明細書により明確に全て組み込まれる、Ｐｅｔｔｉｎａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｐｒｅ３２８８８，Ｓｎｙｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ６９８：３０５−３１４（２０１１），Ｓｉ−Ｔａｙｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５１：２９７−３０５（２０１０）及びＡｓｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ（：４９３−５０４（２０１３）を参照。一般に関連する肝細胞及び／又はアルブミン、アルファフェトプロテイン及びフィブリノーゲンを含むが限定されない特異的なマーカーの存在を評価することによって、当技術分野で公知のように分化をアッセイする。アンモニアの代謝、ＬＤＬ貯蔵及び取り込み、ＩＣＧ取り込み及び放出及びグリコーゲン貯蔵など、分化は機能面でも測定され得る。
【０１５３】
一部の実施形態では、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）に対処するための移植用にＨＩＰ細胞をベータ様細胞又は膵島オルガノイドに分化させる。細胞系はＴ１ＤＭに対処するための有望な方法であり、例えば参照により本明細書中で組み込まれるＥｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｒｇａｓｔｒｏ．２０１７．９３を参照。さらにＰａｇｌｉｕｃａ  ｅｔ  ａｌ．は、ｈｉＰＳＣからのβ細胞分化の成功について報告している（その全体において、及び特にヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模産生についてそこで概説される方法及び試薬に対して、参照により本明細書によって組み込まれるｄｏｉ／１０．１０６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０４０を参照）。さらに、Ｖｅｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．は、ヒト多能性幹細胞からのヒトβ細胞の産生と、その後の宿主による免疫拒絶を回避するための封入を示す；（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４０３０、その全体において、特にヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模産生についてそこで概説される方法及び試薬に対して、参照により本明細書によって組み込まれる）。
【０１５４】
一般に、インスリンを含むが限定されないβ細胞関連の又は特異的なマーカーの存在を評価することによって、当技術分野で公知のように分化をアッセイする。グルコース代謝の測定など、分化はまた機能面でも測定され得、一般的にはその全体において、及び具体的にはそこで概説されるバイオマーカーに対して、参照により本明細書によって組み込まれるＭｕｒａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｓ．２０１６．０９．００２を参照。
【０１５５】
ＨＩＰ細胞由来のベータ細胞を作製したら、それらを（細胞懸濁液として又は本明細書中で論じるようなゲルマトリクス内での何れか）門脈／肝臓、網、胃腸粘膜、骨髄、筋肉又は皮下嚢へと移植し得る。
【０１５６】
一部の実施形態では、視力を脅かす眼疾患に対処するために、ＨＩＰ細胞を網膜色素上皮（ＲＰＥ）に分化させる。その全体において、及び特に分化技術及び試薬についてそこで概説される方法及び試薬に対して、参照により本明細書によって組み込まれるＫａｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１４：２：２０５−１８で概説される技術を使用して、ヒト多能性幹細胞をＲＰＥ細胞に分化させた；ＲＰＥ細胞のシート作製のための技術及び患者への移植に対してその全体においてまた組み込まれるＭａｎｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１６０８３６８も参照。
【０１５７】
当技術分野で公知のように、一般的には、ＲＰＥ関連及び／又は特異的なマーカーの存在を評価することにより、又は機能性を測定することにより、分化をアッセイし得る。例えばその全体において、及び具体的には結果セクションの第１段落で概説されるマーカーに対して、参照により本明細書によってまた組み込まれるＫａｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１３．１２．００７も参照。
【０１５８】
一部の実施形態では、心血管系疾患に対処するためにＨＩＰ細胞を心筋細胞に分化させる。カーディオミオクト（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｔｅ）のｈｉＰＳＣの分化について、技術は当技術分野で公知であり、実施例で論じる。当技術分野で公知のように、一般に心筋細胞関連の又は特異的なマーカーの存在を評価することによって、又は機能面を測定することによって分化をアッセイし得る；例えばその全体において、及び具体的に心筋細胞を含む幹細胞を分化させる方法に対して、参照により本明細書によって組み込まれるＬｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．Ｃｅｌｌ．２０１６．０６．００１を参照。
【０１５９】
一部の実施形態では、新しい血管を形成させて末梢動脈性疾患に対処するために、内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）へとＨＩＰ細胞を分化させる。内皮細胞を分化させるための技術は公知である。例えば、その全体において、及び具体的にはヒト多能性幹細胞からの内皮細胞の作製のため、及びまた移植技術のための方法及び試薬に対して、参照により組み込まれるＰｒａｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０４８を参照。一般に内皮細胞関連又は特異的マーカーの存在を評価することにより、又は機能面で測定することにより、当技術分野で公知のように分化をアッセイし得る。
【０１６０】
一部の実施形態では、自己免疫甲状腺炎に対処するために、甲状腺祖先細胞及び甲状腺ホルモンを分泌し得る甲状腺濾胞オルガノイドへとＨＩＰ細胞を分化させる。甲状腺細胞を分化させるための技術は当技術分野で公知である。例えばその全体において、及び具体的にはヒト多能性幹細胞からの甲状腺細胞作製のための方法及び試薬に対して、及びまた移植技術に対して、参照により本明細書によって明確に組み込まれる、Ｋｕｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１５．０９．００４を参照。一般的に、甲状腺細胞に関連するか又は特異的なマーカーの存在を評価することにより、又は機能面で測定することにより、当技術分野で公知のように分化をアッセイし得る。
【０１６１】
ＶＩＩＩ．ＨＩＰ細胞由来の低免疫キメラ抗原受容体Ｔ細胞
本発明は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含むＨＩＰ細胞から分化させられた改変Ｔ細胞を提供する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び同時刺激ドメインの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。本発明の別の態様では、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含む低免疫原性多能性細胞が本明細書中で提供される。低免疫原性ＣＡＲ−Ｔ（ＨＩ−ＣＡＲ−Ｔ）細胞を作製するために、このような低免疫原性多能性細胞をインビトロでＴ細胞に分化させ得る。
【０１６２】
一部の実施形態では、低免疫原性ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＭＨＣ  Ｉ機能又はＨＬＡ−Ｉ機能を欠く。例えば、本低免疫原性ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａタンパク質、ＨＬＡ−Ｂタンパク質及びＨＬＡ−Ｃタンパク質の発現が低下しているか又は発現を欠く。特定の例では、低免疫原性ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａタンパク質をコードする遺伝子、ＨＬＡ−Ｂタンパク質をコードする遺伝子、ＨＬＡ−Ｃタンパク質をコードする遺伝子を不活性化するための遺伝子修飾を保持する。ある一定の例では、低免疫原性ＣＡＲ−Ｔ細胞は、β−２ミクログロブリンタンパク質の発現が低下しているか又は発現を欠く。一部の実施形態では、このような細胞は、β−２ミクログロブリンをコードする遺伝子を不活性化する遺伝子修飾を保持する。このような低免疫原性ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ｉ機能を欠く低免疫原性多能性細胞から分化させ得る。一部の実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、β−２ミクログロブリンをコードする遺伝子を不活性化する遺伝子修飾を保持する。
【０１６３】
ある一定の実施形態では、低免疫原性ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＭＨＣ  ＩＩ機能又はＨＬＡ−ＩＩ機能を欠く。一部の例では、低免疫原性ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＨＬＡ−ＤＰタンパク質、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質及びＨＬＡ−ＤＱタンパク質の発現が低下しているか又は発現を欠く。低免疫原性ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＨＬＡ−ＤＰタンパク質をコードする遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質をコードする遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱタンパク質をコードする遺伝子を不活性化するための遺伝子修飾を保持し得る。一部の実施形態では、低免疫原性ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＩＩＴＡタンパク質の発現が低下しているか又は発現を欠く。一部の実施形態では、このような細胞は、ＣＩＩＴＡをコードする遺伝子を不活性化する遺伝子修飾を保持する。このような低免疫原性ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＨＬＡ−ＩＩ機能を欠く低免疫原性多能性細胞から分化させ得る。一部の実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、ＣＩＩＴＡをコードする遺伝子を不活性化する遺伝子修飾を保持する。
【０１６４】
一部の実施形態では、低免疫原性ＣＡＲ−Ｔ細胞は、野生型又はネイティブＴ細胞と比較して、ＣＤ４７タンパク質の発現が上昇している。他の実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、野生型又はネイティブ多能性細胞と比較して、ＣＤ４７タンパク質の発現が上昇している。ＣＤ４７の発現上昇は、内在性ＣＤ４７遺伝子への遺伝子修飾の結果であり得る。他の例では、発現上昇は、外因性ＣＤ４７遺伝子、例えばＣＤ４７をコードする外因性核酸の発現の結果である。このような低免疫原性ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ４７タンパク質を過剰発現する低免疫原性多能性細胞から分化させ得る。一部の実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、ＣＤ４７タンパク質の発現が上昇している。
【０１６５】
一部の実施形態では、低免疫原性ＣＡＲ−Ｔ細胞は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子及び誘導性カスパーゼ−９タンパク質をコードする遺伝子などであるが限定されない自殺遺伝子を含む。自殺遺伝子は、その遺伝子を含む細胞を、その細胞の死を引き起こす化学物質（例えば化学的トリガー）に曝露したときに活性化され得る。ＨＳＶ−ｔｋに対する化学的トリガーは、ジデオキシヌクレオシド類似体、例えばガンシクロビルであり得る。ＥＣ−ＣＤに対する化学的トリガーは５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であり得る。カスパーゼ−９に対する化学的トリガーは、化合物ＡＰ１９０３などの二量体誘導化合物（ＣＩＤ）であり得る。従って、低免疫原性多能性細胞は、自殺遺伝子を含み、本明細書中に記載の低免疫原性ＣＡＲ−Ｔ細胞の何れか１つに分化させ得る。
【０１６６】
シトシンデアミナーゼ自殺遺伝子系に関する記載は、例えばＭｕｌｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，５４：１５０３−１５０６で見出され得る。チミジンキナーゼ自殺遺伝子系に関する詳細は、例えばＭｏｏｌｔｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８６，４６（１０）：５２７６−５２８１で見出され得る。誘導性カスパーゼ−９自殺遺伝子系の詳細な説明は、例えばＧａｒｇｅｔｔ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１４，５：２３５で見出され得る。
【０１６７】
Ａ．キメラ抗原受容体
様々な実施形態では、本抗原結合ドメインは、標的細胞、例えば癌細胞上の抗原に結合する。抗原結合ドメイン（細胞外ドメインとも呼ばれる）は、当技術分野で公知のように抗原に結合し得る。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、ナノボディ、１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖなどを含む。
【０１６８】
抗原結合ドメインはシグナルペプチドを含み得る。さらに、ＣＡＲは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサー領域を含有し得る。スペーサー領域は、抗原認識を促進するために異なる方向に抗原結合ドメインを向かわせるのに十分柔軟であるはずである。スペーサーは、ＩｇＧ１又は免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３領域及びＣＤ３の一部からのヒンジ領域であり得る。
【０１６９】
抗原結合ドメインは、ＣＡＲの膜貫通ドメインに連結され得る。一部の実施形態では、抗原結合ドメインをコードする核酸が、ＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸に操作可能に連結される。
【０１７０】
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、膜結合型又は膜貫通タンパク質由来であり得る。ある一定の実施形態では、膜貫通ドメインは、膜結合型又は膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインの野生型アミノ酸配列と比較して、１つ以上の、例えば１、２、３、４、５、６、７、８又はそれを超えるアミノ酸修飾（例えば置換、挿入及び欠失）を含む。ＣＡＲの膜貫通ドメインの非限定例は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ又はゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ξ）、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４又はエリスロポエチン受容体の少なくとも膜貫通領域を含む。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、疎水性アミノ酸残基（例えばロイシン及びバリン）を含む組み換え又は合成ドメインである。一部の例では、膜貫通ドメインは、ドメインの一方又は両方の末端にフェニルアラニン、トリプトファン及びバリンを含む。
【０１７１】
膜貫通ドメインは、抗原結合ドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインをコードする核酸が、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸に操作可能に連結される膜貫通ドメインをコードする核酸に、操作可能に連結される。
【０１７２】
一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル活性化又はシグナル伝達ドメインを含む。そうであるので、細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル、例えば活性化シグナルを伝達又は伝えるために、又は細胞内の細胞応答を媒介するために十分である、当技術分野で公知のタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの何れかの部分を含む。
【０１７３】
一部の実施形態では、本発明のＣＡＲをコードする核酸は、合成プロモーター、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターなどのプロモーターに操作可能に連結される。有用な構成的プロモーターとしては、ユビキチンＣプロモーター、伸長因子−１アルファプロモーター（ＥＦ１αプロモーター）、ＣＭＶプロモーター及び当業者にとって公知の何れかの他の構成的プロモーターが挙げられる。有用な誘導性プロモーターは、例えばＥｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ，２０１６，５（５）：３９５−４０４に記載され、細胞型特異的なプロモーター及び誘導性スイッチプロモーターを含み得る。例示的な構成的プロモーターは、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１０，５（８）：ｅ１２４１３に記載されている。一部の実施形態では、プロモーターはＥＦ１αプロモーターである。
【０１７４】
本明細書中に記載のＣＡＲは、発現ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターなどのベクターを使用してＨＩＰ細胞に導入され得る。一部の例において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ベクターである。一部の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、細胞のセーフハーバー遺伝子座などの遺伝子座に導入される。他の実施形態では、ミニサークルＤＮＡベクター、ヌードＤＮＡ（ｎｕｄｅ  ＤＮＡ）、リポソーム、重合化剤及び分子複合物を含むが限定されない非ウイルスベクターを使用して、ＣＡＲがＨＩＰ細胞に導入される。
【０１７５】
現在のところ、ベクターで遺伝子組み込みを完遂するための２つの方法、即ちウイルス系及び非ウイルス系がある。基礎研究及び臨床研究における遺伝子治療のための主要なベクターは、移入効率が高いこと、培養Ｔ細胞の臨床的必要数に到達するのに必要とされる時間が比較的短いこと及び異なる発現特徴を有する異なるウイルスの利用可能性という理由で、ウイルスである。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスが挙げられる。中でも、遺伝子送達のための最も一般的なツールは、遺伝子改変されたレトロウイルス（例えばＨｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．２０００；５２（４）：４９３−５１１）である。ＨＩＰ細胞にＣＡＲコンストラクトを導入するために、ヌードＤＮＡ、リポソーム、重合化剤及び分子複合物を含むが限定されない非ウイルスベクターが使用され得る。プラスミド細菌ＤＮＡ配列不含のミニサークルＤＮＡベクターは、親プラスミドから細菌において作製され得、インビボにて高レベルで導入遺伝子を持続的に発現し得る新規非ウイルスベクターである。臨床の状況においてミニサークルＤＮＡ系を使用し得る。ミニサークルＤＮＡベクターの詳細な説明は、例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００５；１６（１）：１２６−１３１；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０；２８（１２）：１２８７−１２８９で見出され得る。
【０１７６】
Ｂ．ＨＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞へのＨＩＰ細胞分化
当業者により認識される何れかの方法を使用して、ＣＡＲをコードする核酸を含むＨＩＰ細胞をＣＡＲ  Ｔ細胞などのＣＡＲ発現免疫細胞に分化させ得る。
【０１７７】
免疫細胞（例えば免疫幹細胞、免疫祖先細胞、免疫多能性祖先細胞、プレＴ細胞祖先細胞、プレＮＫ細胞祖先細胞、Ｔ細胞祖先細胞、ＮＫ細胞祖先細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞及びＢ細胞）へと幹細胞を分化させるための有用な方法は、例えば米国特許出願公開第２０１８／００７２９９２号明細書、同第２０１７／０２９６６４９号明細書及び同第２０１６／０００９８１３号明細書に記載されている。
【０１７８】
Ｔ細胞は、αβＴ細胞、δγＴ細胞、ヘルパー／制御Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、祖先Ｔ細胞（例えばＣＤ３４＋ＣＤ７＋ＣＤ１ａ−又はＣＤ３４＋ＣＤ７＋ＣＤ５＋ＣＤ１ａ−である祖先Ｔ細胞）、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、最終エフェクターＴ細胞、未熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞などであり得る。言い換えると、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、ナイーブセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞）及びエフェクターメモリーＲＡ  Ｔ細胞（ＴＥＭＲＡ細胞）であり得る。ナイーブＴ細胞は、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＤ４５ＲＡを発現し得る。ナイーブセントラルＴ細胞は、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＤ４５ＲＯを発現し得る。エフェクターメモリーＴ細胞は、ＰＤ１、ＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＤ４５ＲＯを発現し得る。エフェクターメモリーＲＡ  Ｔ細胞はＰＤ１、ＣＤ５７及びＣＤ４５ＲＡを発現し得る。
【０１７９】
一部の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸配列を含むＨＩＰ細胞は、ＢＭＰ経路活性化因子、ＷＮＴ経路活性化因子、ＭＥＫ阻害剤、ＮＯＴＣＨ経路阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、増殖因子、サイトカイン及び何らかのそれらの組み合わせを含む培地中で培養される。
【０１８０】
ＢＭＰ経路活性化因子としては、ＢＭＰ−２の活性化因子、ＢＭＰ−４の活性化因子、ＢＭＰ−５の活性化因子、ＢＭＰ−６の活性化因子、ＢＭＰ−７の活性化因子、ＢＭＰ−８の活性化因子、その類似体及びそれらの変異体が挙げられ得るが限定されない。
【０１８１】
ＧＳＫ３阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１、その類似体及びそれらの変異体が挙げられ得るが限定されない。ＮＯＴＣＨ経路活性化因子としては、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、ＤＬＬ−４、その類似体及びそれらの変異体が挙げられ得るが限定されない。ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ２７６３２、ファスジル、ＡＲ１２２−８６、Ｙ２７６３２  Ｈ−１１５２、Ｙ−３０１４１、Ｗｆ−５３６、ＨＡ−１０７７、ヒドロキシル−ＨＡ−１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、ＳＢ−７７２０７７−Ｂ、Ｎ−（４−ピリジル）−Ｎ’−（２，４，６−トリクロロフェニル）尿素、３−（４−ピリジル）−１Ｈ−インドール及び（Ｒ）−（＋）−トランス−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド、米国特許第８０４４２０１号明細書で開示される他のＲＯＣＫ阻害剤、その類似体及びそれらの変異体が挙げられ得るが限定されない。増殖因子としては、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＶＥＧＦ、その類似体及びそれらの変異体が挙げられ得るが限定されない。サイトカインとしてはＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ＩＬ−１５、その類似体及びそれらの変異体が挙げられ得るが限定されない。
【０１８２】
一部の実施形態では、ＣＡＲコンストラクトを保有するＨＩＰ細胞は、Ｔ細胞分化を促進するためにフィーダー細胞上で培養される。「フィーダー細胞」という用語は、異なる組織タイプ及び一般的には増殖を促進し、及び／又はそれらが同時培養される細胞の分化を制御するように作用し得る異なるゲノムの細胞を含み得る。未分化ＨＩＰ細胞は、特定の組織タイプ（例えばＴ細胞又は特定のＴ細胞サブタイプ）へと分化を向けるフィーダー細胞と同時培養され得る。一部の実施形態では、マウスＨＩＰ細胞はＯＰ９又はＯＰ９−ＤＬフィーダー細胞上で培養される。マウスＨＩＰ細胞は、約１５日以上にわたりフィーダー細胞上で培養され得る。他の実施形態では、ＨＩＰ細胞は、フィーダー細胞上で培養し、次いで特定の培養日数後にフィーダー細胞なしで培養する。ある一定の実施形態では、Ｔ細胞への分化のためにＨＩＰ細胞をフィーダー細胞上で培養しない。一部の例では、ＨＩＰ細胞は、ＣＤ３刺激及びさらにＣＤ２８刺激を促進する培地中で培養される。
【０１８３】
様々な実施形態で、ヒトＨＩＰ細胞由来の内皮祖先細胞などのフィーダー細胞上でヒトＨＩＰ細胞が培養される。一部の実施形態では、ＨＩＰ細胞由来のヒトＴ細胞が、ヒトＨＩＰ細胞由来の内皮祖先細胞（ＥＰＣ）上で培養される。細胞は、約１５日以上にわたりフィーダー細胞上で培養され得る。他の実施形態では、細胞は、フィーダー細胞上で培養され、次いで特定の日数後、フィーダー細胞なしで培養される。ある一定の実施形態では、ヒトＥＰＣは、ＨＩＰ由来Ｔ細胞の生成を促進する。様々な実施形態では、ヒトＥＰＣは、ＨＩＰ由来ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の生成を促進する。ある一定の実施形態では、ヒトＥＰＣは、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞などのＨＩＰ由来Ｔ細胞のある種のサブタイプの生成を妨害する。
【０１８４】
一部の実施形態では、ＨＩＰ由来Ｔ細胞は、擬似微小重力（ｓμｇ）中で培養される。特定の実施形態では、このようなＴ細胞はｓμｇを使用して分化ＨＩＰ細胞により作製される。ヒトＨＩＰ由来Ｔ細胞は、少なくとも７２時間ｓμｇ中で培養され得る。一部の実施形態では、ヒトＨＩＰ由来Ｔ細胞は、７２時間〜１０日以上ｓμｇ中で培養される。一部の例では、ＣＤ８＋Ｔ細胞を作製するためにｓμｇ中での細胞の培養が使用され得る。一部の実施形態では、ｓμｇは、ＴＥＭＲＡ  ＣＤ８＋Ｔ細胞の量又はパーセンテージを上昇させる。他の実施形態では、ｓμｇは、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の量又はパーセンテージを上昇させない。
【０１８５】
一部の実施形態では、ＨＩＰ由来Ｔ細胞は、擬似微小重力（ｓμｇ）中で及びＩＬ−２、ＩＬ−７又はＩＬ−２及びＩＬ−７の組み合わせを含む培地中で培養される。一部の実施形態では、ＨＩＰ由来Ｔ細胞は、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を作製するためにｓμｇ中及びＩＬ−２の存在下で培養される。他の実施形態では、ＨＩＰ由来Ｔ細胞は、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を作製するためにｓμｇ中及びＩＬ−７の存在下で培養される。また他の実施形態では、ＨＩＰ由来Ｔ細胞は、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を作製するためにｓμｇ中及びＩＬ−２及びＩＬ−７の存在下で培養される。
【０１８６】
ＨＩＰ細胞由来のＣＡＲ発現免疫細胞を評価する方法としては、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、サイトカインプロファイリング、Ｔ細胞活性化／刺激アッセイ、標的細胞の細胞傷害性アッセイ、抗原反応アッセイ及び動物モデルを使用したインビボ機能アッセイが挙げられるが限定されない。
【０１８７】
Ｃ．ＨＩ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用する方法
一部の態様では、治療的有効量のＨＩＰ細胞由来ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与することにより、患者、例えばヒト患者における癌を処置する方法が本明細書中で提供される。一部の例では、ＨＩＰ細胞由来ＣＡＲ−Ｔ細胞は、治療的に有効な担体とともに投与される。
【０１８８】
「治療的有効量」は、処置時に有益であるか又は所望の臨床の結果をもたらすのに十分である量を含む。１回以上の投与で治療的有効量が対象に投与され得る。処置の観点から、有効量は、疾患を、緩和する、寛解させる、安定化する、逆転する、又は進行を遅らせるか、又はそうでなければ疾患の病理的結果を軽減するのに十分な量である。有効量は一般に、個別的に医師により決定され、当技術分野の技術内である。有効量を達成するための適切な投与量を決定する際、一般的にはいくつかの因子を考慮に入れる。これらの因子としては、対象の年齢、性別及び体重、処置している状態、状態の重症度及び投与される抗原結合断片の形態及び有効濃度が挙げられる。
【０１８９】
静脈内投与、皮下投与、リンパ節内投与、腫瘍内投与、くも膜下腔内投与、胸膜内投与、腹腔内投与及び胸腺への直接投与を含むが限定されない、当技術分野で公知の何れかの方法によって治療用細胞処置を施し得る。治療用細胞は、ボーラスで又は連続点滴により投与され得る。
【０１９０】
癌は、血液癌、固形腫瘍癌及び液性腫瘍癌からなる群から選択され得る。一部の実施形態では、血液癌は、白血病、リンパ腫又は骨髄腫である。腫瘍癌としては、神経膠芽腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、腺癌、神経膠腫、軟組織肉腫及び様々な癌腫（小細胞肺癌を含む）が挙げられるが限定されない。適切な癌腫としては、星状細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、軟骨肉腫、骨原性肉腫、膵管腺癌、小及び大細胞肺腺癌、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、扁平上皮癌、気管支肺胞癌、上皮腺癌及びその肝臓転移、リンパ血管肉腫、リンパ管内皮肉腫、肝細胞腫、胆管細胞癌、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、横紋筋肉腫、結腸癌、基底細胞癌、汗腺癌、乳頭癌、皮脂腺癌、乳頭状腺癌、嚢胞性腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎臓細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症及び重鎖病、乳癌、例えば腺管及び小葉腺癌、子宮頸部の扁平上皮及び腺癌、子宮及び卵巣上皮癌、前立腺腺癌、膀胱の移行扁平上皮癌、Ｂ及びＴ細胞リンパ腫（結節状及びびまん性）形質細胞腫、悪性メラノーマ、軟組織肉腫及び平滑筋肉腫を含むが限定されない、腫瘍学の技術分野で公知の何れかを含み得る。
【０１９１】
ＩＸ．代表的な実施形態の詳細な説明
一部の実施形態では、本発明のマウス低免疫原性多能性幹（マウスＨＩＰ）細胞は、Ｂ２Ｍ活性を排除するゲノム修飾、ＣＩＩＴＡ活性を排除するゲノム修飾、ＣＤ４７をコードする外因性核酸配列及びＣＡＲコンストラクトをコードする外因性核酸配列を含む。他の実施形態では、マウス低免疫原性多能性幹細胞は誘導性自殺遺伝子も含む。
【０１９２】
他の実施形態では、本発明のヒト低免疫原性多能性幹（ヒトＨＩＰ）細胞は、Ｂ２Ｍ活性を排除するゲノム修飾、ＣＩＩＴＡ活性を排除するゲノム修飾、ＣＤ４７をコードする外因性核酸配列及びＣＡＲコンストラクトをコードする外因性核酸配列を含む。他の実施形態では、ヒト低免疫原性多能性幹細胞は、誘導性自殺遺伝子も含む。
【０１９３】
特定の実施形態では、本発明の低免疫原性多能性幹細胞は、Ｂ２Ｍ活性を排除するゲノム修飾、ＣＩＩＴＡ活性を排除するゲノム修飾、ＣＤ４７をコードする外因性核酸配列、ＣＡＲコンストラクトをコードする外因性核酸配列及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子を含む。一部の実施形態では、本発明の低免疫原性多能性幹細胞は、Ｂ２Ｍ活性を排除するゲノム修飾、ＣＩＩＴＡ活性を排除するゲノム修飾、ＣＤ４７をコードする外因性核酸配列、ＣＡＲコンストラクトをコードする外因性核酸配列及びエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子を含む。ある一定の実施形態では、本発明の低免疫原性多能性幹細胞は、Ｂ２Ｍ活性を排除するゲノム修飾、ＣＩＩＴＡ活性を排除するゲノム修飾、ＣＤ４７をコードする外因性核酸配列、ＣＡＲコンストラクトをコードする外因性核酸配列及び誘導性カスパーゼ９タンパク質をコードする外因性遺伝子を含む。
【０１９４】
様々な実施形態では、本発明のマウスＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｂ２Ｍ活性を排除するゲノム修飾、ＣＩＩＴＡ活性を排除するゲノム修飾、ＣＤ４７をコードする外因性核酸配列及びＣＡＲコンストラクトをコードする外因性核酸配列を含む、マウス低免疫原性多能性幹細胞から作製される。他の実施形態では、マウス低免疫原性多能性幹細胞は誘導性自殺遺伝子も含む。そうであるので、マウスＣＡＲ−Ｔ細胞は、主要組織適合抗原複合体Ｉ（ＭＨＣ  Ｉ）及び主要組織適合抗原複合体ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）機能が低下しているか又はそれが欠けており、ＣＤ４７タンパク質を過剰発現する。マウスＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＮＫ細胞による殺傷に対する感受性がより低いものであり得る。
【０１９５】
他の実施形態では、本発明のヒトＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｂ２Ｍ活性を排除するゲノム修飾、ＣＩＩＴＡ活性を排除するゲノム修飾、ヒトＣＤ４７をコードする外因性核酸配列及びＣＡＲコンストラクトをコードする外因性核酸配列を含むヒト低免疫原性多能性幹細胞から作製される。他の実施形態では、ヒト低免疫原性多能性幹細胞は誘導性自殺遺伝子も含む。従って、ヒトＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ｉ及びＨＬＡ−ＩＩ機能が低下しているか又はそれが欠けており、ＣＤ４７タンパク質を過剰発現する。一部の実施形態では、ヒトＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ又はＨＬＡ−Ｃの発現が低下しているか又はそれが欠けており、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＲ又はＨＬＡ−ＤＱタンパク質の発現が低下しているか又はそれが欠けており、ヒトＣＤ４７タンパク質を過剰発現する。ヒトＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＮＫ細胞による殺傷に対する感受性が低下し得る。
【０１９６】
一部の実施形態では、本発明のヒトＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｂ２Ｍ活性を排除するゲノム修飾、ＣＩＩＴＡ活性を排除するゲノム修飾、ヒトＣＤ４７をコードする外因性核酸配列及び抗ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトをコードする外因性核酸配列を含む、ヒト低免疫原性多能性幹細胞から作製される。
【実施例】
【０１９７】
Ｘ．実施例
実施例１：マウス誘導多能性幹細胞の作製
本明細書中に記載の方法の出典はＤｉｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ，２０１５，８０８１である。
【０１９８】
マウスのマウス尾部先端の線維芽細胞を分離し、ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）で単離し、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン、４．５ｇ／Ｌグルコース、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とともに、加湿インキュベーター中、３７℃、２０％Ｏ２及び５％ＣＯ２で維持した。
【０１９９】
次にＮｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ系を使用し、４個の初期化因子、Ｏｃｔ４、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２及びｃ−Ｍｙｃを発現する新規コドン最適化ミニイントロン（ｍｉｎｉ−ｉｎｔｒｏｎｉｃ）プラスミド（ｃｏ−ＭＩＰ）（ＤＮＡ１０〜１２μｍ）を使用して、１ｘ１０６個のマウス線維芽細胞を初期化した。遺伝子移入後、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー層上に線維芽細胞を播種し、酪酸ナトリウム（０．２ｍＭ）及び５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸の添加により線維芽細胞培地中で維持した。
【０２００】
ＥＳＣ様コロニーが出現したとき、ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、β−メルカプトエタノール及び１０ｎｇ／ｍＬ白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含有するマウスｉＰＳＣ培地に培地を変えた。２回の継代後、マウスｉＰＳＣを０．２％ゼラチンコーティングプレートに移し、さらに増殖させた。全ての継代で、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を使用して、マウス多能性マーカーＳＳＥＡ−１についてｉＰＳＣを選別した。
【０２０１】
上記方法によりマウス低免疫原性ｉＰＳＣを作製するために単離マウスｉＰＳＣを使用し得る。
【０２０２】
実施例２：ヒト誘導多能性幹細胞の作製
Ｇｉｂｃｏ（商標）ヒトエピソームｉＰＳＣ株（カタログ番号Ａ１８９４５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）は、３プラスミド、７因子（ＳＯＫＭＮＬＴ；ＳＯＸ２、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８及びＳＶ４０Ｌ  Ｔ抗原）ＥＢＮＡに基づくエピソーム系を使用して、ＣＤ３４＋臍帯血から得た。このｉＰＳＣ株は、初期化事象からのゲノムへの組み込みがなかったので、ゼロフットプリント（ｚｅｒｏ  ｆｏｏｔ−ｐｒｉｎｔ）であるとみなされる。全ての初期化遺伝子不含であることが示された。ヒトｉＰＳＣを凍結融解し、培養し、継代するためのプロトコールは製品マニュアルで提供される。
【０２０３】
インビボ奇形腫アッセイ及びインビトロ多能性遺伝子発現アッセイ（例えばＰＣＲ及びアレイ）によって又は多能性マーカーに対する蛍光染色によってヒトｉＰＳＣの多能性を判定し得る。
【０２０４】
Ｇｉｂｃｏ（商標）ヒトエピソームｉＰＳＣ株は、正常な核型及び、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧ（ＲＴ−ＰＣＲにより示されるように）及びＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１（ＩＣＣにより示されるように）のような多能性マーカーの内在性発現を有する。全ゲノム発現及びエピジェネティックプロファイリング分析から、このエピソームｈｉＰＳＣ株がヒト胚性幹細胞株とは分子的に区別できないことが示される（Ｑｕｉｎｔａｎｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ，２０１４，９（１）：ｅ８５４１９）。定方向分化及び奇形腫分析で、これらのｈｉＰＳＣは外胚葉性、内胚葉性及び中胚葉性の系列に対するそれらの分化能を保持した（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１１，６（４）：ｅ１８２９３）。さらに血管、造血系、神経及び心臓系列が安定的な効率で導かれた（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，上出）。
【０２０５】
【表１】
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【０２０６】
上記方法によりヒト低免疫原性ｉＰＳＣを作製するために単離ヒトｉＰＳＣを使用し得る。
【０２０７】
実施例３：低免疫原性多能性細胞は、ＮＫ細胞殺傷及びマクロファージ食作用に対してより感受性が低かった。
低免疫原性多能性細胞（例えばマウスｂ２ｍ−／−ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣ及びヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣ）の能力及び免疫自然応答経路を逃れるための能力を評価するために、実施例を行った。
【０２０８】
特に、酵素結合免疫スポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）アッセイを行った。マウスＨＩＰ細胞又はヒトＨＩＰ細胞（マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣ又はヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣ）とＮＫ細胞を同時培養し、ＩＦＮγ放出を測定した（例えばＥｌｉｓｐｏｔプレートリーダーを使用して自然ＩＦＮγスポット頻度を測定した）。一部の例において、抗ＣＤ４７抗体を使用することによってＣＤ４７を遮断した。
【０２０９】
およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージなどのマウスＮＫ細胞と同時培養したマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣは、ＮＫ細胞活性化を刺激できなかった（図１）。ＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおいてマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ｉＰＳＣは、ＮＫ細胞によるＩＦＮγ放出を惹起し、一方でマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣは惹起しなかった。ＣＤ４７の遮断（例えば抗ＣＤ４７抗体の使用）は、マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ｉＰＳＣにおいて効果がなかった。しかし、ＣＤ４７遮断は、Ｂ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣが有した防御を完全に消失させた。ＮＫ細胞を活性化し、従ってＩＦＮγを放出させることが知られているＹＡＣ−１細胞を対照とした。
【０２１０】
ヒトＮＫ細胞と同時培養したヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣもＮＫ細胞活性化を刺激できなかった。図２は、ＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおいてヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ｉＰＳＣがＮＫ細胞によるＩＦＮγ放出を惹起し、一方でヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣは惹起しなかったことを示す。ＣＤ４７の遮断は、ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ｉＰＳＣにおいて効果がなかったが、これはヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣが有した保護を消失させた。ＮＫ細胞を活性化し、従ってＩＦＮγを放出することが知られているＫ５６２細胞を対照とした。
【０２１１】
図３は、ヒトＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）とともに温置したマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す。マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ｉＰＳＣ及びマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣは、ヒトＮＫ細胞によるＩＦＮγ放出を惹起した。ＣＤ４７の遮断は、ＮＫ細胞応答に対して効果がなかった。ＹＡＣ−１細胞は、ヒトＮＫ細胞による強いＩＦＮγ放出を誘発し、これを対照とした。
【０２１２】
図４は、マウスＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）とともに温置したヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す。ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ｉＰＳＣ及びヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣは、マウスＮＫ細胞によるＩＦＮγ放出を惹起した。ＣＤ４７の遮断はＮＫ細胞応答に対して効果がなかった。ヒトＫ５６２細胞は、マウスＮＫ細胞による強いＩＦＮγ放出を誘導し、これを対照とした。
【０２１３】
本発明のＨＩＰ細胞がマクロファージ食作用に対して感受性であるか否かを判定するために、マクロファージ食作用アッセイも行った。簡潔に述べると、本明細書中に記載のＨＩＰ細胞を蛍ルシフェラーゼで標識し、マクロファージと同時培養した。ルシフェラーゼレポーターアッセイにより、ＨＩＰ細胞の生存能又は存在を分析した。
【０２１４】
図５は、ヒトマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼで標識されるヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。マクロファージと温置した場合、ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ｉＰＳＣの生存能シグナルは顕著に減弱した。一方で、ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの生存能シグナルはヒトマクロファージの存在下で変化しなかった。全てのＨＩＰ細胞を死滅させたＴｒｉｔｏｎＸ−１００を対照として使用した。ＣＤ４７の遮断によって、ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの防御特性が排除され、それらがマクロファージ食作用又は排除に対して感受性になった。
【０２１５】
図６は、マウスマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。
【０２１６】
マクロファージと温置した場合、マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ｉＰＳＣの生存能シグナルが顕著に低下した。一方で、マウスマクロファージの存在下でマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの生存能シグナルは変化しなかった。全てのＨＩＰ細胞を死滅させたＴｒｉｔｏｎＸ−１００を対照として使用した。ＣＤ４７の遮断によって、マウスＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの保護機能が排除され、それらがマクロファージ食作用又は排除に対して感受性になった。全てのＨＩＰ細胞を死滅させたＴｒｉｔｏｎＸ−１００を対照として使用した。
【０２１７】
図７は、マウスマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ｉＰＳＣ及びヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの両方の生存能シグナルは、マウスマクロファージと同時培養した場合、顕著に低下した。全てのＨＩＰ細胞を死滅させたＴｒｉｔｏｎＸ−１００を対照として使用した。
【０２１８】
図８は、ヒトマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。ヒトマクロファージと同時培養した場合、マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ｉＰＳＣ及びマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの両方の生存能シグナルが顕著に低下した。全てのＨＩＰ細胞を死滅させたＴｒｉｔｏｎＸ−１００を対照として使用した。
【０２１９】
本明細書中で提供される結果から、マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣ及びヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣは、ＮＫ細胞活性化及びマクロファージ食作用など、自然免疫応答を逃れることが可能であったことが示される。
【０２２０】
実施例４：ＨＩＰ細胞からのＴ細胞の作製
この実施例は、ＣＤ８＋低、ＣＤ８＋高、ＣＤ４＋、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋高及びＣＤ４＋／ＣＤ８＋低Ｔ細胞を含むＴ細胞にＨＩＰ細胞（例えばマウスＨＩＰ細胞及びヒトＨＩＰ細胞）を分化させたことを示す。この実施例はまた、分化を様々なＴ細胞サブタイプに向けるために刺激性シグナル及びサイトカインを使用したことも示す。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の数を増加させ、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の数を減少させるために、ＨＩＰ由来ＥＰＣなどの内皮祖先細胞（ＥＰＣ）を使用したことが示された。この実施例はまた、擬似微小重力（ｓμｇ）刺激のみ又はサイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−７又はＩＬ−２及びＩＬ−２の組み合わせ）との組み合わせがセントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞へのＨＩＰ由来Ｔ細胞の分化を誘導したことも示す。
【０２２１】
Ｄ０（分化開始）にＯＰ９細胞上でマウスＨＩＰ細胞を培養した。分化Ｄ１５に、ＯＰ９−ＤＬ１フィーダー細胞上で、得られた細胞はＴ細胞に類似していた（図９）。ＦＡＣＳ分析は、Ｄ２３に、ＯＰ９−ＤＬ１上で培養したマウスＨＩＰ細胞がＣＤ３＋Ｔ細胞（６９．８％）、ＣＤ８＋高Ｔ細胞（１８．５％）、ＣＤ８＋低Ｔ細胞（１２．４％）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（３．６％）、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋高Ｔ細胞（１．６％）及びＣＤ４＋／ＣＤ８＋低Ｔ細胞（０．８％）に分化したことを示す（図１０Ａ）。ＦＡＣＳ分析は、Ｄ３０に、フィード細胞から外して、ＣＤ３及びＣＤ２８刺激の存在下で培養したマウスＨＩＰ細胞がＣＤ３＋Ｔ細胞（９２．６％）、ＣＤ８＋高Ｔ細胞（８．１％）、ＣＤ８＋低Ｔ細胞（９．６％）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（７．７％）、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋高Ｔ細胞（０．７％）及びＣＤ４＋／ＣＤ８＋低Ｔ細胞（１．５％）に分化したことも示す（図１０Ｂ）。ＦＡＣＳ分析は、Ｄ２３に、フィーダー細胞（例えばＯＰ９−ＤＬ１細胞）上及びＣＤ３及びＣＤ２８刺激の存在下で培養したマウスＨＩＰ細胞が、ＣＤ３＋Ｔ細胞（８８．４％）、ＣＤ８＋高Ｔ細胞（５．５％）、ＣＤ８＋低Ｔ細胞（１７．６％）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（５．９％）、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋高Ｔ細胞（０．９％）及びＣＤ４＋／ＣＤ８＋低Ｔ細胞（１．９％）に分化したことも示す（図１１）。その結果から、マウスＨＩＰ細胞をＴ細胞に分化させたこと及び異なる刺激性シグナル及びサイトカイン、例えばＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−７など、を使用することにより特定のＴ細胞サブタイプが得られ得ることが示される。これらの条件下で、ＣＤ３＋細胞及びＣＤ８＋細胞のパーセンテージと比較して、ＨＩＰ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージは低いままであった。
【０２２２】
Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、ナイーブセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞）及びエフェクターメモリーＲＡ  Ｔ細胞（ＴＥＭＲＡ細胞）であり得る。ナイーブＴ細胞は、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＤ４５ＲＡを発現し得る。ナイーブセントラルＴ細胞は、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＤ４５ＲＯを発現し得る。エフェクターメモリーＴ細胞は、ＰＤ１、ＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＤ４５ＲＯを発現し得る。エフェクターメモリーＲＡ  Ｔ細胞は、ＰＤ１、ＣＤ５７及びＣＤ４５ＲＡを発現し得る。
【０２２３】
ヒトＨＩＰ細胞から分化したＣＤ４＋Ｔ細胞を作製するために実施例を行った。ヒトＨＩＰ細胞由来のＴ細胞をＨＩＰ細胞由来の内皮祖先細胞（ＥＰＣ）と同時培養することにより、ＨＩＰ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の数が増加し得ると仮定された。図１２は、ヒトＨＩＰ細胞由来のＥＰＣの画像を提供する。一部の実施形態では、次の因子：ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、Ｒｏｃｋ阻害剤（例えばＹ−２７６３２）、ＴＧＦβ経路阻害剤（例えばＳＢ−４３１５４２）、ＧＳＫ３阻害剤（ＣＨＩＲ−９９０２１）又は何らかのそれらの組み合わせのうち１つ以上を含む培地中でヒトＨＩＰ細胞を分化させることによってＥＰＣを作製した。ヒトＨＩＰ細胞由来のヒトＥＰＣ及びヒトＴ細胞の同時培養により、ヒトＥＰＣがない場合と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が増加した（図１３Ａ）。図１３Ｂは、ヒトＨＩＰ由来ＥＰＣとの同時培養により、ナイーブＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞への分化が誘導されたことを示す。図１３Ｃは、ヒトＨＩＰ由来ＥＰＣとの同時培養により、セントラルメモリーＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞への分化が妨げられたことを示す。この試験は、ＨＩＰ由来内皮祖先細胞と同時培養することによりＣＤ４＋Ｔ細胞分化が増加したことを示す。ＥＰＣとの同時培養により、ヒトＨＩＰ細胞由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の数が増加し、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の数が減少した。
【０２２４】
ＨＩＰ細胞のＴ細胞分化により特異的なＴ細胞サブタイプを作製するための新規方法を開発するために、さらなる実施例を行った。この実施例は、得られたＴ細胞上で擬似微小重力（ｓμｇ）を使用することの効果を評価した。Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｉｒｂｕｓ）又は回転装置ベースを用いるＳｙｎｔｈｅｃｏｎの幹細胞培養系などであるが限定されない、回転する同様の系を使用して、Ｓμｇを生成させ得る。ｓμｇ条件下でヒトＨＩＰ由来Ｔ細胞を７２時間培養した。対照として、１ｇ（標準的重力）で細胞を７２時間培養した。図１４Ａは、ｓμｇで培養したＴ細胞の形態が１ｇ（１重力）で培養したものと異なったことを示す。Ｔ細胞の生存能は、ｓμｇ条件と標準的条件との間で異ならなかった。ＣＤ８＋Ｔ細胞の分析から、擬似微小重力では、より少ないＣＤ８＋Ｔ細胞及びより少ないナイーブＣＤ８＋（ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）Ｔ細胞しか生じなかったことが示された（図１５）。擬似微小重力は、標準培養条件と比較して、ＴＥＭＲＡ  ＣＤ８＋（ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−）細胞の数も増加させた（図１５）。図１６は、ｓμｇの温置時間の延長は有益な効果をもたらさなかったことを示す。Ｓμｇは７２時間で十分であり、１０日というより長い曝露により、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の異なるサブタイプの数は顕著には増加しなかった。
【０２２５】
ＨＩＰ由来ヒトＴ細胞をｓμｇ中で７２時間培養し、次いで１ｇでさらに７２時間培養することによりＴ細胞分化に影響が及ぼされたか否かも分析した。この結果から、ｓμｇを使用したＴ細胞分化が可逆的ではなかったことが示された。ｓμｇ中及び１ｇでの処理は、ｓμｇ単独と比較して分化に対して顕著な効果がなかった（図１７）。
【０２２６】
ｓμｇ中及び１つ以上のサイトカイン存在下でＨＩＰ由来ヒトＴ細胞を分化させることにより、セントラルメモリーＣＤ８＋（ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋）Ｔ細胞の生成を誘導したことも示された。図１８は、ｓμｇ中で１０日間及びＩＬ−２、ＩＬ−７，又はＩＬ−２及びＩＬ−７の組み合わせとともに細胞を培養した場合、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞が誘導されたことを示す。
【０２２７】
この実施例は、擬似微小重力中でのＨＩＰ由来ヒトＴ細胞の７２時間にわたる培養により、産生されるナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞数が減少したことを明らかに示す。このような培養条件により、ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞数が増加した。得られたＴ細胞は、ｓμｇ中で７２時間後に生存可能であった。サイトカイン刺激と組み合わせた場合、ｓμｇ培養によりＣＤ８＋ＣＭ  Ｔ細胞数が増加した。
【０２２８】
この実施例は、マウス及びヒトＨＩＰ細胞をＴ細胞に分化させたことを示すデータを提供する。特定の培養条件を使用してある一定のＴ細胞サブタイプが誘導された。フィーダー細胞及び任意選択によりＣＤ３及びＣＤ２８刺激を使用して、ＨＩＰ細胞をＴ細胞に分化させた。ＨＩＰ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞を作製するために、ＨＩＰ由来内皮細胞とＨＩＰ由来ヒトＴ細胞を同時培養した。一部の例では、このようなＨＩＰ由来ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞であった。ＴＥＭＲＡ  ＣＤ８＋Ｔ細胞を作製するために、ｓμｇ中でＨＩＰ由来ヒトＴ細胞を少なくとも７２時間培養した。セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を作製するために、ＨＩＰ由来ヒトＴ細胞をｓμｇ中で培養し、少なくとも７２時間（例えば１０日間）サイトカインで刺激した。ＣＡＲ技術に適用可能であり得る特異的なＴ細胞集団を得るために、本明細書中に記載の方法を使用し得る。本方法は、多能性幹細胞由来Ｔ細胞分化、造血系幹細胞由来Ｔ細胞分化及び他の免疫細胞集団の分化のためにも利用され得る。
【０２２９】
本明細書中で開示又は参照する全ての刊行物及び特許文書は、それらの全体において参照により組み込まれる。前述の記載は、例示及び説明の目的のためにのみ与えられている。この記載は、開示される正確な形態に本発明を限定するものではない。
【０２３０】
本発明の範囲は、本明細書に添付される特許請求の範囲により定められるものとする。
【０２３１】
非公式配列リスト
配列番号１−ヒトβ−２−ミクログロブリンタンパク質
【化１】
2021530999.tif 000004
配列番号２−ヒトＣＩＩＴＡタンパク質、１６０アミノ酸Ｎ−末端
【化２】
2021530999.tif 000005
配列番号３−ヒトＣＤ４７タンパク質
【化３】
2021530999.tif 000006
配列番号４−単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）タンパク質
【化４】
2021530999.tif 000007
配列番号５−エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）タンパク質
【化５】
2021530999.tif 000008
配列番号６−短縮ヒトカスパーゼ９タンパク質
【化６】
2021530999.tif 000009
【図１】
2021530999.tif 000010
【図２】
2021530999.tif 000011
【図３】
2021530999.tif 000012
【図４】
2021530999.tif 000013
【図５】
2021530999.tif 000014
【図６】
2021530999.tif 000015
【図７】
2021530999.tif 000016
【図８】
2021530999.tif 000017
【図９】
2021530999.tif 000018
【図１０Ａ】
2021530999.tif 000019
【図１０Ｂ】
2021530999.tif 000020
【図１１】
2021530999.tif 000021
【図１２】
2021530999.tif 000022
【図１３】
2021530999.tif 000023
【図１４】
2021530999.tif 000024
【図１５】
2021530999.tif 000025
【図１６】
2021530999.tif 000026
【図１７】
2021530999.tif 000027
【図１８】
2021530999.tif 000028
【配列表】
2021530999000001.xml
【国際調査報告】
2021530999.tif 000035
2021530999.tif 000036