(57)【要約】  本開示は、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株、非ヒト細胞適応化ジカウイルスなど）に由来する１つ以上の抗原を有するジカウイルスワクチン及び免疫原性組成物、ならびにその治療方法及び使用方法に関する。
2021505549.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法であって、前記ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、前記ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与またはプライム投与として投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与は、前記単回投与またはプライム投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象の集団及び／または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、１０超、または５０超、または１００超、または２００超、または２５０超の幾何平均中和抗体価を誘導する、前記方法。
【請求項２】
ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法であって、前記ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、前記ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与またはプライム投与として投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与は、前記単回投与またはプライム投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、または少なくとも９０％の抗体陽転率を誘導する、前記方法。
【請求項３】
ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法であって、前記ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、前記ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与またはプライム投与として投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与は、前記単回投与またはプライム投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団または少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、または少なくとも９０％の血清反応陽性率を誘導する、前記方法。
【請求項４】
ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法であって、前記ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、前記ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与の投与として、または少なくとも１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与を含む複数回投与の投与として投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与は、前記投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象のヒト対象集団または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団のうち、５０％未満に全身性副作用を誘発する、前記方法。
【請求項５】
ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法であって、前記ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルス調製物を不活化する方法によって得ることができるジカウイルスに由来する抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、前記ジカウイルス調製物を不活化する方法は、
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された１つ以上の細胞から前記ジカウイルス調製物を分離することであって、前記細胞は、前記ジカウイルス調製物を生産するために使用され、前記ジカウイルス調製物を分離することは、（ｉ）深層濾過、（ｉｉ）緩衝液交換及び／または希釈、（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィーから選択される１つ以上の工程を含む、前記分離することと、
（ｂ）前記ジカウイルス調製物をホルムアルデヒドで、任意選択によりホルムアルデヒドで、処理することであって、％（ｗ／ｖ）で測定したときのホルムアルデヒド濃度と、日単位で測定したときのホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０２５〜０．５である、前記処理することと、を含む、前記方法。
【請求項６】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与として、約１〜約１６週間の間隔を置いて投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象の集団及び／または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、３００超、または５００超、または１０００超、または１５００超、または２０００超、または３０００超の幾何平均中和抗体価を誘導する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与として、約１〜約１６週間の間隔を置いて投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与から１４日後及び／または２８日後に、
少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の抗体陽転率を誘導し、
及び／または
少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団もしくは少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の血清反応陽性率を誘導する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２９％未満に頭痛症状を誘発する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％以下に発熱、及び／または３３％以下に疲労、及び／または１０％以下に関節痛、及び／または１７％以下に筋肉痛、及び／または１５％以下に倦怠感を誘発する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４０％未満に全身性副作用を誘発する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与から７日後に、前記プライム投与から７日後と比較して、
−少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも４５％少ない疲労、及び／または
−発熱なし、及び／または
−筋肉痛なし、もしくは少なくとも１０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも２５％少ない筋肉痛、及び／または
−倦怠感なし、もしくは少なくとも１０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない倦怠感を、
少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団において、誘発する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満、または０％に発熱を誘発する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１９％未満に疲労を誘発する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１２％未満または８％未満に筋肉痛を誘発する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１３％未満または１０％以下に倦怠感を誘発する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％以下に頭痛症状、及び８％以下に関節痛、及び４％未満に発熱、及び１９％未満に疲労、及び１２％未満に筋肉痛、及び１３％未満に倦怠感を誘発する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、１μｇ〜４０μｇの用量の前記抗原を含み、前記抗原が、不活化全粒子ウイルスである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ジカウイルスが、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗原が精製され、サイズ排除クロマトグラフィーで精製された前記抗原のメインピークが、前記サイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下総面積の８５％超である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、ジカ流行地域のヒト対象、任意選択により、アウトブレイク下にあるジカ流行地域のヒト対象に投与される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、ジカ流行地域に旅行する非流行地域のヒト対象に投与される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、１８歳〜２９歳のヒト対象、特に、妊娠可能な女性に投与される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、３０歳〜４９歳のヒト対象、特に、妊娠可能な女性に投与される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、単回投与の投与として、または少なくとも１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与を含む複数回投与の投与として投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、約５μｇの用量の精製された不活化全粒子ウイルスを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、５０％未満、もしくは４５％未満、もしくは４０％未満に全身性副作用を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４０％未満、もしくは３５％未満、もしくは３０％未満、もしくは２５％未満、もしくは２０％未満、もしくは１５％未満に全身性副作用を誘発する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、３％未満、もしくは０％に発熱を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満、もしくは３％未満、もしくは０％に発熱を誘発する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２９％未満に頭痛を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％未満、もしくは１５％未満、もしくは１０％未満、もしくは５％未満に頭痛を誘発する、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、３０％未満、もしくは２５％未満、もしくは２０％未満に疲労を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％未満、もしくは１５％未満、もしくは１０％未満に疲労を誘発する、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満に関節痛を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、５％未満、もしくは２％未満、もしくは０％に関節痛を誘発する、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１７％以下に筋肉痛を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１２％未満、もしくは１０％未満、もしくは５％未満に筋肉痛を誘発する、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１０％未満に倦怠感を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１４％未満、もしくは１０％未満、もしくは５％未満、もしくは０％に倦怠感を誘発する、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与から７日後に、前記プライム投与から７日後と比較して、
−少なくとも７０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも５０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも３５％少ない、もしくは少なくとも３０％少ない全身性副作用、及び／または
−発熱の増加なし、及び／または
−少なくとも８０％少ない、もしくは少なくとも７０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも５０％少ない、もしくは少なくとも４５％少ない頭痛、及び／または
−少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも５５％少ない、もしくは少なくとも５０％少ない、もしくは少なくとも４５％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない疲労、及び／または
−関節痛の増加なし、もしくは少なくとも８０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない関節痛、及び／または
−筋肉痛の増加なし、もしくは少なくとも７０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない筋肉痛、及び／または
−倦怠感の増加なし、もしくは少なくとも８０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない倦怠感を、
少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団において、誘発する、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、単回投与の投与として、または少なくとも１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与を含む複数回投与の投与として投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、約１０μｇの用量の精製された不活化全粒子ウイルスを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、５０％未満に全身性副作用を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４０％未満、もしくは３５％未満、もしくは３０％未満に全身性副作用を誘発する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満に発熱を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満、もしくは３％未満、もしくは０％に発熱を誘発する、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２９％未満、もしくは２５％未満、もしくは２０％未満、もしくは１５％未満に頭痛を誘発し、及び／または前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％以下に頭痛を誘発する、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、３３％以下に疲労を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％未満に疲労を誘発する、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１０％以下に関節痛を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、５％未満に関節痛を誘発する、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１７％以下に筋肉痛を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１２％未満、または１０％未満に筋肉痛を誘発する、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１５％以下に倦怠感を誘発し、及び／または前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１３％未満、もしくは１０％以下に倦怠感を誘発する、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与から７日後に、前記プライム投与から７日後と比較して、
−少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも３５％少ない、もしくは少なくとも３０％少ない、もしくは少なくとも２５％少ない全身性副作用、及び／または
−発熱の増加なし、もしくは少なくとも８０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない発熱、及び／または
−少なくとも４５％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない疲労、及び／または
−関節痛の増加なし、もしくは少なくとも６５％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない関節痛、及び／または
−筋肉痛の増加なし、もしくは少なくとも４５％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない筋肉痛、及び／または
−倦怠感なし、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない倦怠感を、
少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団において、誘発する、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、単回投与の投与として、または少なくとも１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与を含む複数回投与の投与として投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、約２μｇの用量の精製された不活化全粒子ウイルスを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、５０％未満、もしくは４５％未満、もしくは４０％未満、もしくは３５％未満に全身性副作用を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４０％未満、もしくは３５％未満に全身性副作用を誘発する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、３％未満、もしくは０％に発熱を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満、もしくは３％未満、もしくは０％に発熱を誘発する、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２９％未満、もしくは２５％未満、もしくは２０％未満に頭痛を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％未満、もしくは１５％未満に頭痛を誘発する、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、３０％未満、もしくは２５％未満に疲労を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％未満、もしくは１５％未満に疲労を誘発する、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満に関節痛を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、８％未満に関節痛を誘発する、請求項４２〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１７％以下に筋肉痛を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１２％未満、または１０％未満に筋肉痛を誘発する、請求項４２〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１０％未満に倦怠感を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１３％未満、もしくは１０％未満、もしくは５％未満、もしくは０％に倦怠感を誘発する、請求項４２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与から７日後に、前記プライム投与から７日後と比較して、
−発熱の増加なし、及び／または
−少なくとも５０％少ない、もしくは少なくとも４５％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない疲労、及び／または
−筋肉痛なし、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない筋肉痛、及び／または
−倦怠感の増加なし、もしくは少なくとも８０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない倦怠感を、
少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団において、誘発する、請求項４２〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞が、非ヒト細胞である、請求項５〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞が、Ｖｅｒｏ細胞である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ジカウイルス調製物が、０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度のホルムアルデヒドで処理される、請求項５〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ジカウイルス調製物が、８〜１２日間処理される、請求項５〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ジカウイルス調製物が、１０日間処理される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ジカウイルス調製物が、１５℃〜３０℃の温度で処理される、請求項５〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ジカウイルス調製物が、２２℃の温度で処理される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
不活化の完全性を決定する工程（ｃ）を更に含む、請求項５〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
工程（ｃ）が、
（ｉ）工程（ｂ）に従って処理したジカウイルス調製物を、培養した昆虫細胞に接種し、前記昆虫細胞を第１の期間インキュベートし、それにより、昆虫細胞上清を生産することと、
（ｉｉ）（ｉ）で生産された前記昆虫細胞上清を、培養した哺乳動物細胞に接種し、前記哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすることと、
（ｉｉｉ）前記ジカウイルス調製物が前記哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残存複製ウイルスを含有するかどうかを決定することと、を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記昆虫細胞が、ＣＣＬ−１２５細胞、Ａａｇ−２細胞、ＲＭＬ−１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７−１０細胞、ＡＰ−６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−３細胞、ＵＭ−ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ−３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ−ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ−ＣＴＲ細胞及びＴＲＡ−１７１細胞、例えば、Ｃ６／３６細胞から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１の期間が、３〜７日である、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記哺乳動物細胞が、ＶＥＲＯ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載の受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、例えば、ＶＥＲＯ細胞から選択される、請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記第２の期間が、３〜１４日である、請求項５９〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ホルムアルデヒド処理されたジカウイルス調製物をメタ重亜硫酸ナトリウムで中和する工程（ｄ）を更に含む、請求項５〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ホルムアルデヒド処理されたジカウイルス調製物が、ホルムアルデヒド処理後、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも９日、少なくとも１１日、または少なくとも１４日中和される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、５０μｇ／ｍｌ未満の残留ホルムアルデヒド含量を有する、請求項１〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
請求項１〜６６のいずれか１項に記載の方法において使用するためのワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項６８】
請求項１〜６７のいずれか１項に記載の方法のための薬剤の製造における、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府支援研究に関する声明
本発明は、アメリカ合衆国保健福祉省事前準備対応担当次官補局生物医学先端研究開発局（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｓｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｅｃｒｅｔａｒｙ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）との契約第ＨＨＳＯ１００２０１６０００１５Ｃ号に基づき、政府支援によりなされたものである。本発明は、アメリカ合衆国保健福祉省疾病予防管理センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ａｇｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）との共同研究開発協定（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）の実施の中で創出された。アメリカ合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
技術分野
本開示は、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株、非ヒト細胞適応化ジカウイルスなど）に由来する１つ以上の抗原を有するジカウイルスワクチン及び免疫原性組成物、ならびにその治療方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ジカウイルスは、他の蚊媒介性ウイルス（例えば、黄熱ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、及び日本脳炎ウイルス）とともにフラビウイルス科内のフラビウイルス属に分類され、２０１３年にブラジルにウイルスが持ち込まれて以来、地球半球全体に急速に蔓延している。ウイルスは、アメリカ合衆国の領土を含む中央アメリカ及び北アメリカに達し、結果として、現在、アメリカ大陸を脅かしている。実際、ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９は、２０１５年にプエルトリコを旅行した人の血清から分離された。この株のゲノム配列は、少なくとも３回決定されている（Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０１６  Ｍａｙ；２２（５）：９３３−５及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＵ５０１２１５．１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＸ０８７１０１．３；ならびにＹｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｕｎｃ．２０１６  Ａｕｇ  １８；４（４）及びＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＮＫ５７８９７．１参照）。
【０００４】
ジカウイルスは、１９４７年にウガンダで最初に分離され、１９５２年にヒト疾患にはじめて関連付けられ、アフリカ及び東南アジアで軽度の自己限定性熱性疾患の原因として散発的に認められてきた（Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．１３０：６９−８０；Ｆａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５２（６２８３）：３４５−３４９）。しかしながら、２００７年に、北太平洋のヤップ島でアウトブレイクが発生し、太平洋の島から島へと伝播した。これが、２０１３〜２０１４年のフランス領ポリネシアでの広範な流行につながり、その後、ニューカレドニア、クック諸島、そして最終的にはイースター島へと広がった。その後、アジア系統ウイルスが西半球に移動したが、経路は未だ判明していない（Ｆａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５２（６２８３）：３４５−３４９）。ウイルスは、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（ネッタイシマ蚊）、Ａ．ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（ヒトスジシマ蚊）によって、また、おそらくはＡ．ｈｅｎｓｉｌｌｉ及びＡ．ｐｏｌｙｎｉｅｓｅｉｎｓｉｓによって、人畜共通感染する可能性がある（Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．１３０：６９−８０）。更に、ウイルスを運ぶ他の媒介動物が存在する可能性があり、輸血、経胎盤、及び／または性的感染によりウイルスが伝染し得ると考えられている。
【０００５】
２０１５年後半には、ジカウイルス感染症が広まった地域で胎児異常（例えば、小頭症）及びギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）が大幅に増加したことから、ジカウイルスが当初考えていたよりもはるかに悪性であり得るという警告が発せられ、世界保健機関（ＷＨＯ）が「国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態（ＰＨＥＩＣ）」を宣言するに至った（Ｈｅｙｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｌａｎｃｅｔ  ３８７（１００２０）：７１９−２１）。その後、ＷＨＯは、ＰＨＥＩＣの解除を宣言したが、ジカは、特に妊婦及びその胎児にとって、未だ重大な脅威である。
【０００６】
ジカウイルスは、公衆衛生上の大きな脅威であるが、ＦＤＡに承認されたワクチンまたは治療は、現在のところ存在せず、蚊集団を管理することでジカウイルスを制御する予防的措置があるのみである。
【０００７】
ワクチン候補の開発のための組み換えジカウイルスを特徴付ける最近の取り組みでは、位置３３０のウイルスエンベロープタンパク質に変異を有する非ヒト細胞適応化ジカウイルスが特定された（Ｗｅｇｅｒ−Ｌｕｃａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９１（１）：１−１０）。この研究の著者らは、ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９の全長感染性ｃＤＮＡクローンが、クローニングにおける増幅時に遺伝的に不安定であることを認め、この観察された不安定性に対処するためにウイルスゲノムを分割することを選択し、２つのプラスミド系を開発して適用した。しかしながら、ジカワクチンの開発に２つのプラスミド系はあまり望ましくない。
【０００８】
発明の概要
このように、ジカウイルスを治療及び／または予防するためのワクチン及び免疫原性組成物を開発する必要がある。したがって、本開示の特定の態様は、ジカウイルスに由来する（１つの）抗原を１μｇ〜４０μｇの用量で含むワクチンまたは免疫原性組成物に関し、抗原は、不活化全粒子ウイルスである。
【０００９】
したがって、本開示の特定の態様は、ジカウイルスに由来する（１つの）抗原を１μｇ〜４０μｇの用量で含むワクチンまたは免疫原性組成物に関し、ジカウイルスは、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含む。
【００１０】
したがって、本開示の特定の態様は、ジカウイルスに由来する（１つの）抗原を１μｇ〜４０μｇの用量で含むワクチンまたは免疫原性組成物に関し、ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を有する。
【００１１】
上記及び他の要望を満たすために、本開示は、少なくとも部分的に、非構造タンパク質１に適応を有する（野生型エンベロープタンパク質を含む）遺伝的に安定な非ヒト細胞適応化ジカウイルスに関し、これにより、ワクチン生産に単一ウイルス／ウイルス性ゲノム系の使用が可能になる。本開示はまた、少なくとも部分的に、遺伝的に相同であり、及び／または１つ以上の外来性感染性因子から精製されたジカウイルスクローン分離株に関する。したがって、本開示は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異（例えば、ジカウイルス非構造タンパク質１の変異）を有するジカウイルス及び／またはジカウイルスクローン分離株に由来する１つ以上のジカウイルス抗原（例えば、全粒子不活化ジカウイルスに由来する１つ以上の抗原）を含む、ジカウイルス感染症（ヒトにおけるもの）の治療及び／または予防に有用なワクチン及び免疫原性組成物を提供する。
【００１２】
本開示は、少なくとも部分的に、別々に得られた非ヒト細胞適応化ジカウイルスのクローンウイルス集団に由来する１つ以上の抗原を含むワクチンが、高用量及び低用量のいずれにおいても、強固な免疫応答を誘導し、ジカウイルス感染症からの有意な防御を提供することが可能であるという驚くべき発見に基づく（以下の実施例２及び実施例６参照）。ジカウイルス株のクローン分離は、１）汚染物質（例えば、親株と共精製される可能性のある外来性感染性因子）からウイルスを首尾良く精製すること、及び２）遺伝的に均一であるウイルス集団を生産することを可能にする。更に、本開示は、少なくとも部分的に、タンパク質ＮＳ１に適応変異を有するクローン分離ジカウイルスが、Ｖｅｒｏ細胞で十分かつ予想通りに高力価まで成長し、また、驚くべきことに、ウイルスエンベロープタンパク質に検出可能ないかなる変異もなく、遺伝的に安定／遺伝的に均一であるという発見に基づく（以下の実施例１及び２参照）。ジカウイルス非構造タンパク質１における同様の変異は、ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９について公開された３つの配列のうちの１つのゲノムシーケンス解析時に観察されていた可能性があるが（Ｙｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｕｎｃ．２０１６  Ａｕｇ  １８；４（４））、この参考文献は、ＮＳ１における変異がウイルスの安定性を改善し得ることを教示も示唆もしておらず、変異を有するウイルスがジカウイルスに対する有効なワクチンの開発に使用され得ることを教示も示唆もしておらず、また、そのようなワクチンが低用量及び高用量の両方で使用したときに強固な免疫応答を誘導し、ジカウイルス感染症からの有意な防御をもたらすのに効果的であり得ることを教示も示唆もしていない。したがって、理論に束縛されることを望むものではないが、本開示の発明者らは、タンパク質ＮＳ１における適応変異がジカウイルス内での遺伝的安定性を増大し、それにより複製効率が増加／増大するようであると判断した。更に、タンパク質ＮＳ１に適応変異を有するジカ株は、更なる変異を起こすことなく複数回継代することが可能であった。そのような安定なジカウイルス株は、マスターウイルスシード（ＭＶＳ）が、望ましくない変異を起こすリスクが低くなるので、ワクチンの生産及び製造のためのマスターウイルスシード、またはＭＶＳから得られる後続のシードとして有利である。更に、理論に束縛されることを望むものではないが、本開示のジカ株のタンパク質ＮＳ１における適応変異は、ジカウイルス株のエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）内の変異などの望ましくない変異の発生を減少または阻害し得る。
【００１３】
したがって、本開示の特定の態様は、ジカウイルスに由来する１つ以上の抗原を含有するワクチンまたは免疫原性組成物に関し、ジカウイルスは、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異は、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの適応変異は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの適応変異は、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異である。
【００１４】
したがって、本開示の特定の態様は、ジカウイルスに由来する（１つの）抗原を１μｇ〜４０μｇの用量で含むワクチンまたは免疫原性組成物に関し、ジカウイルスは、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含む。
【００１５】
したがって、本開示の特定の態様は、ジカウイルスに由来する（１つの）抗原を１μｇ〜４０μｇの用量で含むワクチンまたは免疫原性組成物に関し、ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を有する。
【００１６】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、少なくとも１つの適応変異は、少なくとも１つの適応変異を欠くジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を増大させる。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、少なくとも１つの適応変異は、少なくとも１つの適応変異を欠くジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増大させる。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ジカウイルスは、エンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）に変異を含まない。
【００１７】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、非ヒト細胞は、哺乳動物細胞である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、非ヒト細胞は、サル細胞である。いくつかの実施形態では、サル細胞は、Ｖｅｒｏ細胞株由来である。いくつかの実施形態では、Ｖｅｒｏ細胞株は、ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７細胞株である。
【００１８】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ジカウイルスは、アフリカ系統ウイルスまたはアジア系統ウイルスである。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、アジア系統ウイルスである。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株由来である。
【００１９】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、精製された抗原ワクチンもしくは免疫原性組成物、サブユニットワクチンもしくは免疫原性組成物、不活化全粒子ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物、または弱毒化ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、不活化全粒子ウイルスワクチンまたは免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、精製された不活化全粒子ジカウイルスを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を含む、精製された不活化全粒子ジカウイルスを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製された不活化全粒子ジカウイルスを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製された不活化全粒子ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製された不活化全粒子ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、配列番号２に従うゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異がある点でＰＲＶＡＢＣ５９株とは異なる、精製された不活化全粒子ジカを含む。
【００２０】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ウイルスは、化学的に不活化された。いくつかの実施形態では、ウイルスは、界面活性剤、ホルマリン、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、及びソラレンのうちの１つ以上で化学的に不活化された。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ホルマリンで化学的に不活化された。
【００２１】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、アジュバントを更に含有する。いくつかの実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、合成リピドＡ、リピドＡミメティックもしくはアナログ、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤、ビロソーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び／または不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）から選択される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ  ８５からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％がアジュバントに吸着される。
【００２２】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、低用量または中用量のワクチンまたは免疫原性組成物（例えば、約１μｇ〜約５μｇの抗原または２μｇの抗原もしくは５μｇの抗原を含有する）。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、高用量のワクチンまたは免疫原性組成物である（例えば、１０μｇの抗原を含有する）。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、約１μｇ〜約２５μｇの１つ以上の抗原、特に２μｇ、５μｇもしくは１０μｇ、または特に１０μｇの１つ以上の抗原を含有する。特定のそのような実施形態では、抗原は、本明細書に記載される配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの精製された不活化全粒子ウイルスである。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製された不活化全粒子ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製された不活化全粒子ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、配列番号２に従うゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、約０．１μｇ〜約１００μｇのジカウイルス抗原またはＥｎｖを含有する。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、アジュバント化されていない。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ジカウイルスは、クローン分離株である。いくつかの実施形態では、クローン分離株は、１つ以上の外来性感染性因子を実質的に含まない（例えば、親株と共精製される可能性のある１つ以上の外来性感染性因子を含まない）。
【００２３】
本開示の他の態様は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を有するジカウイルスを含む、ワクチンに関する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製された不活化全粒子ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製された不活化全粒子ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、配列番号２に従うゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株である。
【００２４】
本開示の他の態様は、ａ）アルミニウム塩アジュバントと、ｂ）精製された不活化全粒子ジカウイルスと、を含有するワクチンまたは免疫原性組成物に関し、ジカウイルスは、非ヒト細胞適応変異を含有し、非ヒト細胞適応変異は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置のＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異である。
【００２５】
本開示の他の態様は、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、当該ヒト対象に、本明細書に記載されるワクチンまたは免疫原性組成物のいずれかの治療上有効な量を投与することを含む、方法に関する。
【００２６】
本開示の他の態様は、免疫応答を誘導することを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、当該ヒト対象に、本明細書に記載されるワクチンまたは免疫原性組成物のいずれかの免疫原性量を投与することを含む、方法に関する。
【００２７】
一態様において、本開示は、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、当該ヒト対象に、ワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００２８】
一態様において、本開示は、ジカウイルス抗原に対する免疫応答を誘導することを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、当該ヒト対象に、ワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００２９】
一態様において、本開示は、ジカウイルス病を予防することを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、当該ヒト対象に、ワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含む、方法に関する。この場合、疾患は、軽度の発熱、斑状丘疹状皮疹、結膜炎及び関節痛に関係する。更に、ジカウイルスは、中枢神経系内の疾患及びギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）を引き起こす可能性のある神経向性フラビウイルスである。
【００３０】
一態様において本開示は、ジカウイルス病を予防することを、それを必要とする胎児または新生児において行う方法であって、妊娠したヒト対象または妊娠の意向のあるヒト対象または妊娠可能な女性に、ワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含む、方法に関する。この場合のジカ病は、胎児及び新生児への重篤な転帰に関係する。先天性ジカ症候群（ＣＺＳ）として知られるジカウイルス感染症に関連する先天性異常の範囲は、部分的な頭蓋骨の陥没を伴う重度の小頭症、皮質下の石灰化を伴う大脳皮質、斑点状瘢痕及び網膜の局所色素性斑点形成、先天性拘縮、ならびに錐体外路症状を伴う著しく早期からの緊張亢進からなる。
【００３１】
一態様において、本開示は、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象において行う方法、ジカウイルス抗原に対する免疫応答を誘導することを、それを必要とするヒト対象において行う方法、及びジカウイルス病を予防することを、それを必要とするヒト対象、胎児または新生児において行う方法で使用するためのワクチンまたは免疫原性組成物に関する。
【００３２】
一態様において、本開示は、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象において行う方法、免疫応答を誘導することを、それを必要とするヒト対象において行う方法、及びジカウイルス病を予防することを、それを必要とするヒト対象、胎児または新生児において行う方法のための薬剤の製造における、ワクチンまたは免疫原性組成物の使用に関する。
【００３３】
本開示の意味の範囲内で、治療は、単一のヒト対象の治療及びヒト対象集団の治療を含む。ヒト対象集団は、１を超える個体、例えば、２以上の個体の治療を包含するとみなされる。
【００３４】
したがって、本開示の特定の態様は、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法であって、当該ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、ワクチンまたは免疫原性組成物は、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与として、約１〜約１６週間の間隔を置いて投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象の集団及び／または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、３００超、または５００超、または１０００超、または１５００超、または２０００超、または３０００超の幾何平均中和抗体価を誘導する、方法に関する。
【００３５】
したがって、本開示の特定の態様は、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法であって、当該ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する（１つの）抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、ワクチンまたは免疫原性組成物は、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与として、約１〜約１６週間の間隔を置いて投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与から２８日後に、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象の集団及び／または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、プライム投与から２８日後に誘導される幾何平均中和抗体価よりも少なくとも１０倍、または少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも２５倍高い幾何平均中和抗体価を誘導する、方法に関する。このように、ブースト投与は、長期間にわたる防御に関与する、非常に高い幾何平均中和抗体価をもたらす。
【００３６】
したがって、本開示の特定の態様は、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法であって、当該ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する（１つの）抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与またはプライム投与として投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、単回投与またはプライム投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象の集団及び／または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、１０超、または５０超、または１００超、または２００超、または２５０超の幾何平均中和抗体価を誘導する、方法に関する。高い幾何平均中和抗体価は、早期の防御開始を示し、アウトブレイクの状況またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与から短期間内に流行地域を訪れる旅行者に有益である。
【００３７】
本開示の意味の範囲内で、ＰＲＮＴは、これまでに記載されているプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定される、ヒト対象におけるジカウイルス中和抗体価を指す（Ｓｕｎ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ａｆｔｅｒ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９３，１６５８−１６６５（２００６）Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  Ｋ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＢＤ，Ａｇａｒｗａｌ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＺＩＫＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐａｓｓｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｒＭＥｎｖ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ．ＮＰＪ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２０１６；１：１６０２１参照）。
【００３８】
本開示の意味の範囲内で、ヒト対象ＧＭＴ値は、特に、以下のように測定されるものとみなされる。ジカＰＲＮＴアッセイでは、ヒト血清を１：５から１：１０，２４０まで２倍段階希釈し、等量の希釈したジカウイルス（ＺＩＫＶ）（ＰＲＶＡＢＣ５９）と混合して、１：１０〜１：２０，４８０の最終希釈液を得た。中和を２〜８℃で２０±２時間進行させ、その後、血清／ウイルス混合物を使用してＶｅｒｏ  Ｅ６細胞に接種した。ウイルスの吸着を３７±２℃、湿度及びＣＯ２下で６０±１０分間行い、次いで、メチルセルロースを重層した。感染細胞を３７±２℃、湿度及びＣＯ２下で７２±２時間インキュベートした。クリスタルバイオレット染色を使用してプラークを可視化し、ＣＴＬ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）リーダーを使用してカウントした。５０％中和価（ＰＲＮＴ５０）の決定は、血清を含まないウイルス対照と比較した、血清の存在下でのウイルスプラーク減少率に基づき、線形回帰によって算出された。この価は、プラーク数の５０％減少をもたらす最大希釈の逆数を表す。受け入れは、臨床サンプルと並行して試験されるウイルス対照（目標約６０ｐｆｕ／ウェル）、細胞対照、陽性対照（１７３〜６５８のＰＲＮＴ５０）及び陰性対照（ＰＲＮＴ５０＜１０）を評価することによって決定される。個々のサンプル及び陽性対照の結果は、線形回帰によって生成される滴定曲線の相関係数が≧０．８５である場合、受け入れられた。更なる受け入れ基準は、クリスタルバイオレット染色及びプレートまたは実験で生成されたプラークの質に基づいた。ＰＲＮＴ５０の結果は、アッセイの開始希釈（１：１０）まで報告する。ＵＬＯＱを上回るＰＲＮＴ５０の結果は、事前希釈で繰り返し、アッセイの定量可能範囲内の結果を出す。事前希釈サンプルの結果は、希釈係数を掛けて最終結果を出す。
【００３９】
本開示の意味の範囲内で、血清反応陽性は、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定される力価が１０以上のものと定義される；ジカウイルス血清反応陰性ヒト対象は、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定される力価が１０未満の対象である；セロコンバージョンは、次のように定義される：ジカウイルス血清反応陰性ヒト対象（１０未満の力価）で、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定されるワクチン接種後の力価が１０以上であること；プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定される１０未満の結果は、５の力価を付与する；プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定される１０（検出限界）〜２６（定量下限）の間の力価は、１３の値を付与する。
【００４０】
本開示のフラビウイルスナイーブヒト対象は、反応性抗体ベースアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）によって測定したとき、フラビウイルスのパネルに対する検出可能な血清抗体を含まないヒト対象と定義される。フラビウイルススクリーニングアッセイは、同じサンプル中の複数の標的抗原を同時に検出するｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームに基づく。このビーズベースアッセイは、感度が高く、特異的で、再現性がある。本開示に関して、標的とされる抗原は、ジカ、デング、黄熱、ＪＥＶ、ＵＳＵＶ、ＳＬＥＶ及びＷＮＶである。フラビウイルス間の交差反応性により、現在の抗原セットは、以前のあらゆるフラビウイルス曝露を検出するのに役立つ。ルミネックスの概念に関する参考文献は、Ｄｉａｓ  Ｄ，Ｖａｎ  Ｄｏｒｅｎ  Ｊ，Ｓｃｈｌｏｔｔｍａｎｎ  Ｓ，Ｋｅｌｌｙ  Ｓ，Ｐｕｃｈａｌｓｋｉ  Ｄ，Ｒｕｉｚ  Ｗ，Ｂｏｅｒｃｋｅｌ  Ｐ，Ｋｅｓｓｌｅｒ  Ｊ，Ａｎｔｏｎｅｌｌｏ  ＪＭ，Ｇｒｅｅｎ  Ｔ，Ｂｒｏｗｎ  Ｍ，Ｓｍｉｔｈ  Ｊ，Ｃｈｉｒｍｕｌｅ  Ｎ，Ｂａｒｒ  Ｅ，Ｊａｎｓｅｎ  ＫＵ，Ｅｓｓｅｒ  ＭＴ．２００５．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｘ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  ｑｕａｎｔｉｆｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ６，１１，１６，ａｎｄ  １８．Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：９５９−９６９［ＰＭＣ  ｆｒｅｅ  ａｒｔｉｃｌｅ］［ＰｕｂＭｅｄ］。Ａｙｏｕｂａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓａｙ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  Ｚａｉｒｅ  Ｅｂｏｌａ  Ｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７  Ｄｅｃ  ２８；５５（１）：１６５−１７６．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＣＭ．０１９７９−１６である。
【００４１】
本開示の意味の範囲内で、流行地域は、アメリカ疾病予防管理センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）によって定義された感染のリスクのある地域として定義され、２０１８年３月時点における例としては、すなわち、アジア：バングラデシュ、ビルマ（ミャンマー）、カンボジア、インド、インドネシア、ラオス、マレーシア、モルディブ、パキスタン、フィリピン、シンガポール、タイ、東ティモール、ベトナム、太平洋諸島：フィジー、マーシャル諸島、パプアニューギニア、サモア、ソロモン諸島、トンガ、カリブ海：アングィラ島、アンティグア・バーブーダ、アルバ島、バルバドス島、ボネール島、イギリス領ヴァージン諸島、キューバ、キュラソー島、ドミニカ、ドミニカ共和国、グレナダ島、ハイチ、ジャマイカ、モントセラト島、アメリカ自治連邦区プエルトリコ、サバ島、セントクリストファー・ネイビス、セントルシア、セントマーチン、セントビンセント及びグレナディーン諸島、シント・ユースタティウス島、シント・マールテン、トリニダード・トバゴ、タークス・カイコス諸島、アメリカ領ヴァージン諸島、北アメリカ：メキシコ中央アメリカ：ベリーズ、コスタリカ、エルサルバドル、グアテマラ、ホンジュラス、ニカラグア、パナマ、南アメリカ：アルゼンチン、ボリビア、ブラジル、コロンビア、エクアドル、フランス領ギアナ、ガイアナ、パラグアイ、ペルー、スリナム、ベネズエラ、アフリカ：アンゴラ、ベナン、ブルキナファソ、ブルンジ、カメルーン、カーボベルデ、中央アフリカ共和国、チャド、コンゴ（コンゴのブラザビル）、コートジボワール、コンゴ民主共和国（コンゴのキンシャサ）、赤道ギニア、ガボン、ガンビア、ガーナ、ギニア、ギニアのビサウ、ケニア、リベリア、マリ、ニジェール、ナイジェリア、ルワンダ、セネガル、シエラレオネ、南スーダン、スーダン、タンザニア、トーゴ、ウガンダなどがある。これらの地域は変わり得る。
【００４２】
したがって、本開示の特定の態様は、免疫応答を誘導することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法であって、当該ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する（１つの）抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、ワクチンまたは免疫原性組成物は、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与として、約１〜約１６週間の間隔を置いて投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象及び／または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団において、レポーターウイルス粒子中和アッセイ（ＲＶＰ）によって決定したとき、３００超、または５００超、または１０００超、または１５００超、または２０００超、または３０００超、または５０００超、または１０，０００超の幾何平均中和抗体価を誘導する、方法に関する。
【００４３】
したがって、本開示の特定の態様は、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法であって、当該ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する（１つの）抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与またはプライム投与として投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、単回投与またはプライム投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象の集団及び／または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団において、レポーターウイルス粒子中和アッセイ（ＲＶＰ）によって決定したとき、３００超、または５００超、１０００超、または２０００超の幾何平均中和抗体価を誘導する、方法に関する。高い幾何平均中和抗体価は、早期の防御開始を示し、アウトブレイクの状況またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与から短期間内に流行地域を訪れる旅行者に有益である。
【００４４】
本開示の意味の範囲内で、レポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）中和アッセイは、９６ウェルプレートで成長させたＶｅｒｏ細胞で、一定量のジカＲＶＰを用いて血清サンプルを滴定することによって分析されるジカ中和抗体価を指す。ＲＶＰは、ジカ（ＳＰＨ２０１２株）のｐｒＭＥタンパク質及びデングベースのウミシイタケルシフェラーゼレポーターを含有した。簡潔に述べると、血清を５６℃で３０分間熱不活化し、希釈し、次いで、ＲＶＰとともに３７℃でインキュベートした。次いで、血清／ＲＶＰ混合物をＶｅｒｏ細胞と混合し、３７℃±２℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした後、ルシフェラーゼ基質で検出した。ＪＭＰ１１非線形４パラメーター解析を使用してデータを解析し、ポジティブトラッキング対照に正規化し、有効用量５０％（ＥＣ５０）を報告した。
【００４５】
したがって、本開示の特定の態様は、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法であって、当該ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する（１つの）抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、ワクチンまたは免疫原性組成物は、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与として、約１〜約１６週間の間隔を置いて投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人の血清反応陰性ヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の抗体陽転率を誘導する、方法に関する。
【００４６】
したがって、本開示の特定の態様は、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法であって、当該ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する（１つの）抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与またはプライム投与として投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、単回投与またはプライム投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、２５％、３０％、４０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の抗体陽転率を誘導する、方法に関する。単回投与またはプライム投与後の高い抗体陽転率は、早期の防御開始を示し、アウトブレイクの状況またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与から短期間内に流行地域を訪れる旅行者に有益である。
【００４７】
したがって、本開示の特定の態様は、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法であって、当該ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する（１つの）抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与またはプライム投与として投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、単回投与またはプライム投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象の集団または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、２５％、３０％、４０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の血清反応陽性率を誘導する、方法に関する。単回投与またはプライム投与後の高い抗体陽転率は、早期の防御開始を示し、アウトブレイクの状況またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与から短期間内に流行地域を訪れる旅行者に有益である。
【００４８】
本開示の特定の他の態様は、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法であって、当該ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する（１つの）抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与として、または複数回投与として、例えば、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与として投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、投与後７日までに、少なくとも２０人のヒト対象のヒト対象集団、特に少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象の集団または特に少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団のうち、５０％未満に全身性副作用を誘発する、方法に関する。上記方法は、ジカウイルス感染症の治療または予防のための薬剤の製造のための、本明細書に開示されるジカウイルスに由来する（１つの）抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物の対応する使用にも関することを理解されたい。
【００４９】
本開示の意味の範囲内で、「全身性副作用」は、特に、発熱、頭痛、疲労、関節痛、筋肉痛及び倦怠感である。
【００５０】
上記方法は、ジカウイルス感染症の治療または予防に使用するための、本明細書に開示されるジカウイルスに由来する（１つの）抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物にも関することを理解されたい。
【００５１】
いくつかの実施形態では、投与は、筋肉内または皮下投与である。いくつかの実施形態では、投与は、約１〜約１６週間の間隔を置いて投与される本明細書に記載されるワクチンまたは免疫原性組成物（例えば、１０μｇの精製された不活化全粒子ウイルス、例えば、本明細書に記載される配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルス）の２回投与の投与（１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与）を含む。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株、特に本明細書に記載されるものである。
【００５２】
本開示の上記態様は、ジカウイルス感染症を治療または予防することを、それを必要とするヒト対象において行う際の使用、免疫応答を誘導することを、それを必要とするヒト対象において行う際の使用、及びジカウイルス病を予防することを、それを必要とするヒト対象、胎児または新生児において行う際の使用のための本明細書に記載されるワクチンまたは免疫原性組成物に関する。いくつかの実施形態では、投与は、筋肉内または皮下投与である。いくつかの実施形態では、投与は、約１〜約１６週間の間隔を置いて投与される本明細書に記載されるワクチンまたは免疫原性組成物（例えば、１０μｇの精製された不活化全粒子ウイルス、例えば、本明細書に記載される配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルス）の２回投与の投与（１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与）を含む。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株、特に本明細書に記載されるものである。
【００５３】
本開示の上記態様は、ジカウイルス感染症を治療または予防することを、それを必要とするヒト対象において行うための薬剤の製造、免疫応答を誘導することを、それを必要とするヒト対象において行うための薬剤の製造、及びジカウイルス病を予防することを、それを必要とするヒト対象、胎児または新生児において行うための薬剤の製造における、本明細書に記載されるワクチンまたは免疫原性組成物の使用に関する。いくつかの実施形態では、投与は、筋肉内または皮下投与である。いくつかの実施形態では、投与は、約１〜約１６週間の間隔を置いて投与される２用量の本明細書に記載されるワクチンまたは免疫原性組成物（例えば、１０μｇの精製された不活化全粒子ウイルス、例えば、本明細書に記載される配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルス）の投与（１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与）を含む。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株、特に本明細書に記載されるものである。
【００５４】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ヒト対象は、妊娠しているか、妊娠の意向があるか、または妊娠可能な女性である。
【００５５】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ヒト対象において、防御免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態では、ヒト対象において誘導される防御免疫応答は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を欠くジカウイルスに由来する１つ以上の抗原を含有するワクチンまたは免疫原性組成物を投与した対応するヒト対象において誘導される防御免疫応答よりも大きい。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ヒト対象において、ジカウイルスに対する中和抗体の生成を誘導する。いくつかの実施形態では、ヒト対象において生成される中和抗体の濃度は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を欠くジカウイルスに由来する１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与した対応するヒト対象において生成される中和抗体の濃度よりも高い。
【００５６】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、皮下投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口的投与、鼻腔内投与、口腔粘膜投与、腹腔内投与、膣内投与、肛門投与及び／または頭蓋内投与から選択される経路によって投与される。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、１回以上投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与として投与される。いくつかの実施形態では、２回目（ブースト）の投与は、１回目（プライム）の投与から少なくとも２８日後に投与される。いくつかの実施形態では、投与は、約１〜約１６週間の間隔を置いて投与される本明細書に記載されるワクチンまたは免疫原性組成物（例えば、１０μｇの精製された不活化全粒子ウイルス、例えば、本明細書に記載される配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルス）の２回投与の投与（１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与）を含む。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株である。
【００５７】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ウイルス調製物は、アジュバントと混合される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、合成リピドＡ、リピドＡミメティックもしくはアナログ、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤、ビロソーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び／または不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）から選択される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及び／またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ  ８５から選択される。いくつかの実施形態では、ウイルス調製物中の１つ以上の抗原の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％がアジュバントに吸着される。
【００５８】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異は、ジカウイルスＮＳ１にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの適応変異は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの適応変異は、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、少なくとも１つの適応変異は、少なくとも１つの適応変異を欠くジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を増大させる。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、少なくとも１つの適応変異は、少なくとも１つの適応変異を欠くジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増大させる。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ジカウイルスは、エンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）に変異を含まない。
【００５９】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ジカウイルスの集団は、不均一である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ジカウイルスの集団は、ジカウイルス臨床分離株を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルス臨床分離株は、ＰＲＶＡＢＣ５９株由来である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ジカウイルスの集団は、細胞培養で既に１回以上継代されているジカウイルスを含む。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、接種物は、ヒト血清を含む。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、接種物は、１つ以上の外来性感染性因子を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は、１つ以上の外来性感染性因子を実質的に含まない。
【００６０】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、方法は、ジカウイルスクローン分離株の１回以上の追加のプラーク精製を更に含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は、更に２回以上プラーク精製される。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、方法は、細胞培養において、ジカウイルスクローン分離株を１回以上継代することを更に含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は、２回以上継代される。
【００６１】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、方法は、ジカウイルスクローン分離株に由来する１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を製剤化することを更に含む。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、精製された抗原ワクチンもしくは免疫原性組成物、サブユニットワクチンもしくは免疫原性組成物、不活化全粒子ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物、または弱毒化ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、精製された不活化全粒子ウイルスワクチンまたは免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は、化学的に不活化された。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は、界面活性剤、ホルマリン、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、及びソラレンのうちの１つ以上で化学的に不活化された。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は、ホルマリンで化学的に不活化された。
【００６２】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、方法は、ワクチンまたは免疫原性組成物をアジュバントと混合することを更に含む。いくつかの実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、合成リピドＡ、リピドＡミメティックもしくはアナログ、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤、ビロソーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）から選択される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ  ８５から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％がアジュバントに吸着される。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、本明細書に記載される配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの、１μｇ〜約４０μｇの精製された不活化全粒子ウイルス、または１μｇ〜約３０μｇの精製された不活化全粒子ウイルス、または１μｇ〜約２０μｇの精製された不活化全粒子ウイルス、特に２μｇ、または５μｇ、または１０μｇ、または１５μｇまたは２０μｇまたは特に１０μｇの精製された不活化全粒子ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、１μｇ〜約３０μｇの精製された不活化全粒子ウイルス、特に２μｇ、５μｇもしくは１０μｇ、または特に１０μｇの精製された不活化全粒子ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、１μｇ〜約３０μｇの精製された不活化全粒子ウイルス、特に２μｇ、５μｇもしくは１０μｇ、または特に１０μｇの精製された不活化全粒子ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、配列番号２に従うゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【００６３】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、約０．１μｇのＥｎｖ〜約１００μｇのＥｎｖを含む。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、アジュバント化されない。
【００６４】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は、均一な遺伝子集団である。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は、エンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）に変異を含有しない。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株は、少なくとも１つの変異を含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、エンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）にない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、少なくとも１つの変異を欠くジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を増大させる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、少なくとも１つの変異を欠くジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増大させる。
【００６５】
本開示の他の態様は、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株に由来する１つ以上の抗原を含有する、ワクチンまたは免疫原性組成物に関する。いくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、ジカウイルスの集団を含む接種物と接触した細胞からプラーク精製された。いくつかの実施形態では、細胞は、非ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、蚊細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、サル細胞である。いくつかの実施形態では、サル細胞は、Ｖｅｒｏ細胞株由来である。いくつかの実施形態では、Ｖｅｒｏ細胞株は、ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７細胞株である。
【００６６】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ジカウイルスの集団は、不均一であった。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ジカウイルスの集団は、ジカウイルス臨床分離株を含んだ。いくつかの実施形態では、ジカウイルス臨床分離株は、ＰＲＶＡＢＣ５９株由来である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ジカウイルスの集団は、細胞培養で既に１回以上継代されているジカウイルスを含んだ。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、接種物は、ヒト血清を含んだ。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、接種物は、１つ以上の外来性感染性因子を含んだ。いくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、１つ以上の外来性感染性因子を実質的に含まない。
【００６７】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、野生型ジカウイルスと比較して修飾されている。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、均一な遺伝子集団である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、エンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）に変異を含まない。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、ジカウイルスエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）にない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、少なくとも１つの変異を欠くジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を増大させる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、少なくとも１つの変異を欠くジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増大させる。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、アフリカ系統ウイルスまたはアジア系統ウイルスである。いくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、アジア系統ウイルスである。
【００６８】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、精製された抗原ワクチンもしくは免疫原性組成物、サブユニットワクチンもしくは免疫原性組成物、不活化全粒子ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物、または弱毒化ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、不活化全粒子ウイルスワクチンまたは免疫原性組成物である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、化学的に不活化された。いくつかの実施形態では、プラーク精製されたジカウイルスは、界面活性剤、ホルマリン、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、及びソラレンのうちの１つ以上で化学的に不活化された。いくつかの実施形態では、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株は、ホルマリンで化学的に不活化された。
【００６９】
先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、アジュバントを更に含む。いくつかの実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、合成リピドＡ、リピドＡミメティックもしくはアナログ、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤、ビロソーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）から選択される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ  ８５から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％がアジュバントに吸着される。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、本明細書に記載される配列番号１の位置９８にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの、０．１μｇ〜約２５μｇの精製された不活化全粒子ウイルス、特に２μｇ、５μｇもしくは１０μｇ、または特に１０μｇの精製された不活化全粒子ウイルス、または約０．１μｇのＥｎｖ〜約１００μｇのＥｎｖを含有する。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、アジュバント化されていない。
【００７０】
上記及び本明細書に記載される様々な実施形態の特性の１つ、複数または全てが組み合わされ、本開示の他の実施形態が形成され得ることを理解されたい。本開示のこれらの態様及び他の態様は、当業者に明らかになるであろう。本開示のこれらの実施形態及び他の実施形態は、以下の詳細な説明によって更に詳述される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】モック感染したＶｅｒｏ細胞単層（上）またはＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９株に感染したＶｅｒｏ細胞単層（下）の明視野顕微鏡画像を示す。
【図２】ＴＣＩＤ５０によって決定した、Ｖｅｒｏ細胞単層上でのＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ１の成長速度を示す。
【図３】ジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ５クローンａ〜ｆの効力アッセイ試験（ＴＣＩＤ５０）を示す。
【図４】Ｖｅｒｏ細胞単層上でのジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６クローンａ〜ｆの成長の細胞変性効果（ＣＰＥ）を表す明視野顕微鏡画像を示す。
【図５】ジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６クローンａ〜ｆの効力アッセイ試験（ＴＣＩＤ５０）を示す。
【図６】ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｅ（配列番号８）及びＰＲＶＡＢＣ５９（配列番号９）に由来する、残基３３０付近のジカウイルスのエンベロープ糖タンパク質配列をいくつかの他のフラビウイルス（ＷＮＶ（配列番号１０）；ＪＥＶ（配列番号１１）；ＳＬＥＶ（配列番号１２）；ＹＦＶ（配列番号１３）；ＤＥＮＶ  １  １６００７（配列番号１４）；ＤＥＮＶ  ２  １６６８１（配列番号１５）；ＤＥＮＶ  ３  １６５６２（配列番号１６）；及びＤＥＮＶ  ４  １０３６（配列番号１７））と比較したアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図７】ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｅ（配列番号１８）及びＰＲＶＡＢＣ５９（配列番号１９）に由来する、残基９８付近のジカウイルスのＮＳ１タンパク質配列をいくつかの他のフラビウイルス（ＷＮＶ（配列番号２０）；ＪＥＶ（配列番号２１）；ＳＬＥＶ（配列番号２２）；ＹＦＶ（配列番号２３）；ＤＥＮＶ  １  １６００７（配列番号２４）；ＤＥＮＶ  ２  １６６８１（配列番号２５）；ＤＥＮＶ  ３  １６５６２（配列番号２６）；及びＤＥＮＶ  ４  １０３６（配列番号２７））と比較したアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図８】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ１ウイルスと比較した、ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ウイルスクローンａ〜ｆのプラーク表現型を示す。
【図９】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ１ウイルスと比較した、ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ウイルスクローンの平均プラークサイズを示す。
【図１０】無血清成長条件下でのＶｅｒｏ細胞におけるＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６クローンａ〜ｆの成長速度を示す。
【図１１】免疫実験のためのＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ配合製剤を調製するために取られる工程の模式図を示す。
【図１２Ａ】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂ及びＰ６ｅクローンに由来するワクチン製剤を用いたＣＤ−１マウスの投与スケジュールを示す。ＰＢＳをプラセボとして使用した。
【図１２Ｂ】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂ及びＰ６ｅクローンに由来するワクチン製剤を使用して図１２Ａに記載されるように免疫したＣＤ−１マウスの血清中ＺＩＫＡＶ中和抗体価を示す。ＺＩＫＡＶ中和抗体価は、レポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）中和アッセイによって決定した。実線は、グループの幾何平均を表す。検出限界（１．９３  ｌｏｇ１０）を破線で表す。
【図１３Ａ】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂ及びＰ６ｅクローンに由来するワクチン製剤を用いたＡＧ１２９マウスの投与スケジュールを示す。ＰＢＳをプラセボとして使用した。
【図１３Ｂ】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂ及びＰ６ｅクローンに由来するワクチン製剤を使用して図１３Ａに記載されるように免疫したＡＧ１２９マウスの血清中ＺＩＫＡＶ中和抗体価を示す。実線は、グループの幾何平均を表す。検出限界（１．３０  ｌｏｇ１０）を破線で表す。検出可能な力価（１．３０未満）を持たない動物は、０．５の力価を付与した。
【図１４】攻撃後のＡＧ１２９試験グループの平均体重を、開始体重のパーセンテージとして表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図１５】攻撃から２日後の個々のＡＧ１２９マウスの血清中ウイルス血症を示し、ＰＦＵ／ｍＬで報告する。実線は、グループの平均を表す。検出限界（２．０  ｌｏｇ１０）を破線で表す。
【図１６】ＡＧ１２９試験グループの攻撃後の生存分析を示す。
【図１７】ワクチン接種及び攻撃を受けたＡＧ１２９マウスからプールした血清の受身伝達後の攻撃前の血清循環ＺＩＫＡＶ中和抗体（Ｎａｂ）力価を示す。
【図１８】ジカウイルスで攻撃した受身伝達マウス及び対照マウスの平均体重を示す。
【図１９】攻撃から３日後の個々のＡＧ１２９マウスの血清中ウイルス血症を示し、ＰＦＵ／ｍＬで報告する。
【図２０】ジカウイルスで攻撃した受身伝達マウス及び対照マウスの生存分析を示す。
【図２１】受身伝達マウスで観察されたＺＩＫＡＶ中和抗体価とウイルス血症との間の相関を示す。
【図２２】Ｐ６ａ及びＰ６ｅのｐｒｅＭＶＳストックで攻撃した後のＡＧ１２９マウスの生存分析をＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存曲線を使用して示す。
【図２３】Ｐ６ａ及びＰ６ｅのｐｒｅＭＶＳストックで攻撃した後の平均体重を示し、発明時の開始体重のパーセンテージで表す。破線は、参照の開始体重の１００％を表す。
【図２４】Ｐ６ａ及びＰ６ｅのｐｒｅＭＶＳストックでの攻撃から３日後の個々のＡＧ１２９マウスの血清中ウイルス血症を示し、ＰＦＵ／ｍＬで報告する。破線は、アッセイの検出限界を表す。
【図２５】編集した不活化データの動態を示す。データは、４つの毒性学ロットからのサンプルの感染力（ＴＣＩＤ５０）をＲＮＡコピー及び不活化の完全性（ＣＯＩ）と比較する。これらのデータは、ＣＯＩアッセイの感度がＴＣＩＤ５０よりも大きいことを示している。
【図２６】０．３１  ＴＣＩＤ５０の入力ウイルス力価で示した場合のアッセイにおけるＣ６／３６とＶｅｒｏの感度の比較を示す。
【図２７】０．０１  ＴＣＩＤ５０／ウェルの目標値前後に９９％信頼区間を含むＣ６／３６細胞箇所を使用したＣＰＥ対ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０の回帰分析を示す（−２  ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ウェル）；モデルは、ウェルの０．８５％が陽性になることを予測している。
【図２８】ＰＢＳ（ａ）ならびに０．０４９μｇ／ｍＬ（ｂ）、０．０９８μｇ／ｍＬ（ｃ）、０．１９６μｇ／ｍＬ（ｄ）、０．４９１μｇ／ｍＬ（ｅ）、０．９８２μｇ／ｍＬ（ｆ）、及び１．９６４μｇ／ｍＬ（ｇ）のホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ溶液のクロマトグラムを示す。
【図２９】実施例６の臨床試験デザインの要約を示す。
【図３０】実施例６におけるヒト対象のＰＲＮＴを使用して決定された幾何平均力価（ＧＭＴ）を示す。
【図３１】実施例６に記載される試験の２９日目（プライム投与後２８日）及び５７日目（ブースト投与後２８日）にＰＲＮＴを使用して決定されたセロコンバージョンに達成したヒト対象のパーセンテージを示す。
【図３２】実施例６に記載される試験の２９日目（プライム投与後２８日）に特定の幾何平均力価（ＰＲＮＴを使用して決定）に達成したヒト対象のパーセンテージのプロットを示す。
【図３３】実施例６に記載される試験の５７日目（プライム投与後５６日）に特定の幾何平均力価（ＰＲＮＴを使用して決定）に達成したヒト対象のパーセンテージのプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
一般技法
従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５）），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８），ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８３））；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８））Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），ｅｄ．，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８））；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９３−８））；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７））；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９４））；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ（１９９１））；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，（１９９７））；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８８−１９８９））；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２０００））；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９９））；及びＴｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５））に記載されている、当業者によって広く利用されている方法論などを使用する本明細書に記載または参照される技術及び手順は、一般によく理解され、広く採用されている。
【００７３】
ジカウイルス
本開示の特定の態様は、ワクチン及び／または免疫原性組成物に有用であり得る、少なくとも１つのジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株、本明細書に記載される方法によって精製されたジカウイルス、１つ以上の非ヒト細胞適応変異を含むジカウイルスなど）、例えば、限定するものではないが、精製されたウイルス、不活化ウイルス、弱毒化ウイルス、組み換えウイルス、またはサブユニットワクチンのための精製された及び／または組み換えウイルスタンパク質に関する。
【００７４】
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）は、１９４７年にウガンダのジカ森のアカゲザル歩哨動物からはじめて分離された蚊媒介性フラビウイルスである。それ以降、アフリカとアジアの両方、より最近では、アメリカ大陸で、ヒトから分離されている。ＺＩＫＶは、アフリカ系統（おそらく東アフリカ系統と西アフリカ系統とに分かれる）とアジア系統の２つ（おそらくは３つ）の系統で見つかっている。したがって、本開示の好適なジカウイルスの例は、限定するものではないが、アフリカ系統及び／またはアジア系統に由来するウイルスを含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、アフリカ系統ウイルスである。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、アジア系統ウイルスである。更に、ジカウイルスのアフリカ系統及びアジア系統内の複数の株がこれまでに特定されている。当該技術分野において知られているジカウイルスの任意の１つ以上の好適な株を本開示で使用することができ、例えば、Ｍｒ  ７６６、ＡｒＤ  ４１５１９、ＩｂＨ  ３０６５６、Ｐ６−７４０、ＥＣ  Ｙａｐ、ＦＳＳ１３０２５、ＡｒＤ  ７１１７、ＡｒＤ  ９９５７、ＡｒＤ  ３０１０１、ＡｒＤ  ３０１５６、ＡｒＤ  ３０３３２、ＨＤ  ７８７８８、ＡｒＤ  １２７７０７、ＡｒＤ  １２７７１０、ＡｒＤ  １２７９８４、ＡｒＤ  １２７９８８、ＡｒＤ  １２７９９４、ＡｒＤ  １２８０００、ＡｒＤ  １３２９１２、１３２９１５、ＡｒＤ  １４１１７０、ＡｒＤ  １４２６２３、ＡｒＤ  １４９９１７、ＡｒＤ  １４９８１０、ＡｒＤ  １４９９３８、ＡｒＤ  １５７９９５、ＡｒＤ  １５８０８４、ＡｒＤ  １６５５２２、ＡｒＤ  １６５５３１、ＡｒＡ  １４６５、ＡｒＡ  ２７１０１、ＡｒＡ  ２７２９０、ＡｒＡ  ２７１０６、ＡｒＡ  ２７０９６、ＡｒＡ  ２７４０７、ＡｒＡ  ２７４３３、ＡｒＡ  ５０６／９６、ＡｒＡ  ９７５−９９、Ａｒａ  ９８２−９９、ＡｒＡ  ９８６−９９、ＡｒＡ  ２７１８、ＡｒＢ  １３６２、Ｎｉｇｅｒｉａ６８、Ｍａｌａｙｓｉａ６６、Ｋｅｄｏｕｇｏｕ８４、Ｓｕｒｉｎａｍｅ、ＭＲ１４２９、ＰＲＶＡＢＣ５９、ＥＣＭＮ２００７、ＤａｋＡｒ４１５２４、Ｈ／ＰＦ／２０１３、Ｒ１０３４５１、１０３３４４、８３７５、ＪＭＢ−１８５、ＺＩＫＶ／Ｈ、ｓａｐｉｅｎｓ／Ｂｒａｚｉｌ／Ｎａｔａｌ／２０１５、ＳＰＨ２０１５、ＺＩＫＶ／Ｈｕ／Ｃｈｉｂａ／Ｓ３６／２０１６、及び／またはＣｕｂａ２０１７の株が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＲＶＡＢＣ５９株が本開示に使用される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスゲノム配列の例は、配列番号２として以下に記載される：
１  ｇｔｔｇｔｔｇａｔｃ  ｔｇｔｇｔｇａａｔｃ  ａｇａｃｔｇｃｇａｃ  ａｇｔｔｃｇａｇｔｔ  ｔｇａａｇｃｇａａａ  ｇｃｔａｇｃａａｃａ
６１  ｇｔａｔｃａａｃａｇ  ｇｔｔｔｔａｔｔｔｔ  ｇｇａｔｔｔｇｇａａ  ａｃｇａｇａｇｔｔｔ  ｃｔｇｇｔｃａｔｇａ  ａａａａｃｃｃａａａ
１２１  ａａａｇａａａｔｃｃ  ｇｇａｇｇａｔｔｃｃ  ｇｇａｔｔｇｔｃａａ  ｔａｔｇｃｔａａａａ  ｃｇｃｇｇａｇｔａｇ  ｃｃｃｇｔｇｔｇａｇ
１８１  ｃｃｃｃｔｔｔｇｇｇ  ｇｇｃｔｔｇａａｇａ  ｇｇｃｔｇｃｃａｇｃ  ｃｇｇａｃｔｔｃｔｇ  ｃｔｇｇｇｔｃａｔｇ  ｇｇｃｃｃａｔｃａｇ
２４１  ｇａｔｇｇｔｃｔｔｇ  ｇｃｇａｔｔｃｔａｇ  ｃｃｔｔｔｔｔｇａｇ  ａｔｔｃａｃｇｇｃａ  ａｔｃａａｇｃｃａｔ  ｃａｃｔｇｇｇｔｃｔ
３０１  ｃａｔｃａａｔａｇａ  ｔｇｇｇｇｔｔｃａｇ  ｔｇｇｇｇａａａａａ  ａｇａｇｇｃｔａｔｇ  ｇａａａｃａａｔａａ  ａｇａａｇｔｔｃａａ
３６１  ｇａａａｇａｔｃｔｇ  ｇｃｔｇｃｃａｔｇｃ  ｔｇａｇａａｔａａｔ  ｃａａｔｇｃｔａｇｇ  ａａｇｇａｇａａｇａ  ａｇａｇａｃｇａｇｇ
４２１  ｃｇｃａｇａｔａｃｔ  ａｇｔｇｔｃｇｇａａ  ｔｔｇｔｔｇｇｃｃｔ  ｃｃｔｇｃｔｇａｃｃ  ａｃａｇｃｔａｔｇｇ  ｃａｇｃｇｇａｇｇｔ
４８１  ｃａｃｔａｇａｃｇｔ  ｇｇｇａｇｔｇｃａｔ  ａｃｔａｔａｔｇｔａ  ｃｔｔｇｇａｃａｇａ  ａａｃｇａｔｇｃｔｇ  ｇｇｇａｇｇｃｃａｔ
５４１  ａｔｃｔｔｔｔｃｃａ  ａｃｃａｃａｔｔｇｇ  ｇｇａｔｇａａｔａａ  ｇｔｇｔｔａｔａｔａ  ｃａｇａｔｃａｔｇｇ  ａｔｃｔｔｇｇａｃａ
６０１  ｃａｔｇｔｇｔｇａｔ  ｇｃｃａｃｃａｔｇａ  ｇｃｔａｔｇａａｔｇ  ｃｃｃｔａｔｇｃｔｇ  ｇａｔｇａｇｇｇｇｇ  ｔｇｇａａｃｃａｇａ
６６１  ｔｇａｃｇｔｃｇａｔ  ｔｇｔｔｇｇｔｇｃａ  ａｃａｃｇａｃｇｔｃ  ａａｃｔｔｇｇｇｔｔ  ｇｔｇｔａｃｇｇａａ  ｃｃｔｇｃｃａｔｃａ
７２１  ｃａａａａａａｇｇｔ  ｇａａｇｃａｃｇｇａ  ｇａｔｃｔａｇａａｇ  ａｇｃｔｇｔｇａｃｇ  ｃｔｃｃｃｃｔｃｃｃ  ａｔｔｃｃａｃｃａｇ
７８１  ｇａａｇｃｔｇｃａａ  ａｃｇｃｇｇｔｃｇｃ  ａａａｃｃｔｇｇｔｔ  ｇｇａａｔｃａａｇａ  ｇａａｔａｃａｃａａ  ａｇｃａｃｔｔｇａｔ
８４１  ｔａｇａｇｔｃｇａａ  ａａｔｔｇｇａｔａｔ  ｔｃａｇｇａａｃｃｃ  ｔｇｇｃｔｔｃｇｃｇ  ｔｔａｇｃａｇｃａｇ  ｃｔｇｃｃａｔｃｇｃ
９０１  ｔｔｇｇｃｔｔｔｔｇ  ｇｇａａｇｃｔｃａａ  ｃｇａｇｃｃａａａａ  ａｇｔｃａｔａｔａｃ  ｔｔｇｇｔｃａｔｇａ  ｔａｃｔｇｃｔｇａｔ
９６１  ｔｇｃｃｃｃｇｇｃａ  ｔａｃａｇｃａｔｃａ  ｇｇｔｇｃａｔａｇｇ  ａｇｔｃａｇｃａａｔ  ａｇｇｇａｃｔｔｔｇ  ｔｇｇａａｇｇｔａｔ
１０２１  ｇｔｃａｇｇｔｇｇｇ  ａｃｔｔｇｇｇｔｔｇ  ａｔｇｔｔｇｔｃｔｔ  ｇｇａａｃａｔｇｇａ  ｇｇｔｔｇｔｇｔｃａ  ｃｃｇｔａａｔｇｇｃ
１０８１  ａｃａｇｇａｃａａａ  ｃｃｇａｃｔｇｔｃｇ  ａｃａｔａｇａｇｃｔ  ｇｇｔｔａｃａａｃａ  ａｃａｇｔｃａｇｃａ  ａｃａｔｇｇｃｇｇａ
１１４１  ｇｇｔａａｇａｔｃｃ  ｔａｃｔｇｃｔａｔｇ  ａｇｇｃａｔｃａａｔ  ａｔｃａｇａｃａｔｇ  ｇｃｔｔｃｔｇａｃａ  ｇｃｃｇｃｔｇｃｃｃ
１２０１  ａａｃａｃａａｇｇｔ  ｇａａｇｃｃｔａｃｃ  ｔｔｇａｃａａｇｃａ  ａｔｃａｇａｃａｃｔ  ｃａａｔａｔｇｔｃｔ  ｇｃａａａａｇａａｃ
１２６１  ｇｔｔａｇｔｇｇａｃ  ａｇａｇｇｃｔｇｇｇ  ｇａａａｔｇｇａｔｇ  ｔｇｇａｃｔｔｔｔｔ  ｇｇｃａａａｇｇｇａ  ｇｃｃｔｇｇｔｇａｃ
１３２１  ａｔｇｃｇｃｔａａｇ  ｔｔｔｇｃａｔｇｃｔ  ｃｃａａｇａａａａｔ  ｇａｃｃｇｇｇａａｇ  ａｇｃａｔｃｃａｇｃ  ｃａｇａｇａａｔｃｔ
１３８１  ｇｇａｇｔａｃｃｇｇ  ａｔａａｔｇｃｔｇｔ  ｃａｇｔｔｃａｔｇｇ  ｃｔｃｃｃａｇｃａｃ  ａｇｔｇｇｇａｔｇａ  ｔｃｇｔｔａａｔｇａ
１４４１  ｃａｃａｇｇａｃａｔ  ｇａａａｃｔｇａｔｇ  ａｇａａｔａｇａｇｃ  ｇａａａｇｔｔｇａｇ  ａｔａａｃｇｃｃｃａ  ａｔｔｃａｃｃｇａｇ
１５０１  ａｇｃｃｇａａｇｃｃ  ａｃｃｃｔｇｇｇｇｇ  ｇｔｔｔｔｇｇａａｇ  ｃｃｔａｇｇａｃｔｔ  ｇａｔｔｇｔｇａａｃ  ｃｇａｇｇａｃａｇｇ
１５６１  ｃｃｔｔｇａｃｔｔｔ  ｔｃａｇａｔｔｔｇｔ  ａｔｔａｃｔｔｇａｃ  ｔａｔｇａａｔａａｃ  ａａｇｃａｃｔｇｇｔ  ｔｇｇｔｔｃａｃａａ
１６２１  ｇｇａｇｔｇｇｔｔｃ  ｃａｃｇａｃａｔｔｃ  ｃａｔｔａｃｃｔｔｇ  ｇｃａｃｇｃｔｇｇｇ  ｇｃａｇａｃａｃｃｇ  ｇａａｃｔｃｃａｃａ
１６８１  ｃｔｇｇａａｃａａｃ  ａａａｇａａｇｃａｃ  ｔｇｇｔａｇａｇｔｔ  ｃａａｇｇａｃｇｃａ  ｃａｔｇｃｃａａａａ  ｇｇｃａａａｃｔｇｔ
１７４１  ｃｇｔｇｇｔｔｃｔａ  ｇｇｇａｇｔｃａａｇ  ａａｇｇａｇｃａｇｔ  ｔｃａｃａｃｇｇｃｃ  ｃｔｔｇｃｔｇｇａｇ  ｃｔｃｔｇｇａｇｇｃ
１８０１  ｔｇａｇａｔｇｇａｔ  ｇｇｔｇｃａａａｇｇ  ｇａａｇｇｃｔｇｔｃ  ｃｔｃｔｇｇｃｃａｃ  ｔｔｇａａａｔｇｔｃ  ｇｃｃｔｇａａａａｔ
１８６１  ｇｇａｔａａａｃｔｔ  ａｇａｔｔｇａａｇｇ  ｇｃｇｔｇｔｃａｔａ  ｃｔｃｃｔｔｇｔｇｔ  ａｃｔｇｃａｇｃｇｔ  ｔｃａｃａｔｔｃａｃ
１９２１  ｃａａｇａｔｃｃｃｇ  ｇｃｔｇａａａｃａｃ  ｔｇｃａｃｇｇｇａｃ  ａｇｔｃａｃａｇｔｇ  ｇａｇｇｔａｃａｇｔ  ａｃｇｃａｇｇｇａｃ
１９８１  ａｇａｔｇｇａｃｃｔ  ｔｇｃａａｇｇｔｔｃ  ｃａｇｃｔｃａｇａｔ  ｇｇｃｇｇｔｇｇａｃ  ａｔｇｃａａａｃｔｃ  ｔｇａｃｃｃｃａｇｔ
２０４１  ｔｇｇｇａｇｇｔｔｇ  ａｔａａｃｃｇｃｔａ  ａｃｃｃｃｇｔａａｔ  ｃａｃｔｇａａａｇｃ  ａｃｔｇａｇａａｃｔ  ｃｔａａｇａｔｇａｔ
２１０１  ｇｃｔｇｇａａｃｔｔ  ｇａｔｃｃａｃｃａｔ  ｔｔｇｇｇｇａｃｔｃ  ｔｔａｃａｔｔｇｔｃ  ａｔａｇｇａｇｔｃｇ  ｇｇｇａｇａａｇａａ
２１６１  ｇａｔｃａｃｃｃａｃ  ｃａｃｔｇｇｃａｃａ  ｇｇａｇｔｇｇｃａｇ  ｃａｃｃａｔｔｇｇａ  ａａａｇｃａｔｔｔｇ  ａａｇｃｃａｃｔｇｔ
２２２１  ｇａｇａｇｇｔｇｃｃ  ａａｇａｇａａｔｇｇ  ｃａｇｔｃｔｔｇｇｇ  ａｇａｃａｃａｇｃｃ  ｔｇｇｇａｃｔｔｔｇ  ｇａｔｃａｇｔｔｇｇ
２２８１  ａｇｇｃｇｃｔｃｔｃ  ａａｃｔｃａｔｔｇｇ  ｇｃａａｇｇｇｃａｔ  ｃｃａｔｃａａａｔｔ  ｔｔｔｇｇａｇｃａｇ  ｃｔｔｔｃａａａｔｃ
２３４１  ａｔｔｇｔｔｔｇｇａ  ｇｇａａｔｇｔｃｃｔ  ｇｇｔｔｃｔｃａｃａ  ａａｔｔｃｔｃａｔｔ  ｇｇａａｃｇｔｔｇｃ  ｔｇａｔｇｔｇｇｔｔ
２４０１  ｇｇｇｔｃｔｇａａｃ  ａｃａａａｇａａｔｇ  ｇａｔｃｔａｔｔｔｃ  ｃｃｔｔａｔｇｔｇｃ  ｔｔｇｇｃｃｔｔａｇ  ｇｇｇｇａｇｔｇｔｔ
２４６１  ｇａｔｃｔｔｃｔｔａ  ｔｃｃａｃａｇｃｃｇ  ｔｃｔｃｔｇｃｔｇａ  ｔｇｔｇｇｇｇｔｇｃ  ｔｃｇｇｔｇｇａｃｔ  ｔｃｔｃａａａｇａａ
２５２１  ｇｇａｇａｃｇａｇａ  ｔｇｃｇｇｔａｃａｇ  ｇｇｇｔｇｔｔｃｇｔ  ｃｔａｔａａｃｇａｃ  ｇｔｔｇａａｇｃｃｔ  ｇｇａｇｇｇａｃａｇ
２５８１  ｇｔａｃａａｇｔａｃ  ｃａｔｃｃｔｇａｃｔ  ｃｃｃｃｃｃｇｔａｇ  ａｔｔｇｇｃａｇｃａ  ｇｃａｇｔｃａａｇｃ  ａａｇｃｃｔｇｇｇａ
２６４１  ａｇａｔｇｇｔａｔｃ  ｔｇｃｇｇｇａｔｃｔ  ｃｃｔｃｔｇｔｔｔｃ  ａａｇａａｔｇｇａａ  ａａｃａｔｃａｔｇｔ  ｇｇａｇａｔｃａｇｔ
２７０１  ａｇａａｇｇｇｇａｇ  ｃｔｃａａｃｇｃａａ  ｔｃｃｔｇｇａａｇａ  ｇａａｔｇｇａｇｔｔ  ｃａａｃｔｇａｃｇｇ  ｔｃｇｔｔｇｔｇｇｇ
２７６１  ａｔｃｔｇｔａａａａ  ａａｃｃｃｃａｔｇｔ  ｇｇａｇａｇｇｔｃｃ  ａｃａｇａｇａｔｔｇ  ｃｃｃｇｔｇｃｃｔｇ  ｔｇａａｃｇａｇｃｔ
２８２１  ｇｃｃｃｃａｃｇｇｃ  ｔｇｇａａｇｇｃｔｔ  ｇｇｇｇｇａａａｔｃ  ｇｔａｔｔｔｃｇｔｃ  ａｇａｇｃａｇｃａａ  ａｇａｃａａａｔａａ
２８８１  ｃａｇｃｔｔｔｇｔｃ  ｇｔｇｇａｔｇｇｔｇ  ａｃａｃａｃｔｇａａ  ｇｇａａｔｇｃｃｃａ  ｃｔｃａａａｃａｔａ  ｇａｇｃａｔｇｇａａ
２９４１  ｃａｇｃｔｔｔｃｔｔ  ｇｔｇｇａｇｇａｔｃ  ａｔｇｇｇｔｔｃｇｇ  ｇｇｔａｔｔｔｃａｃ  ａｃｔａｇｔｇｔｃｔ  ｇｇｃｔｃａａｇｇｔ
３００１  ｔａｇａｇａａｇａｔ  ｔａｔｔｃａｔｔａｇ  ａｇｔｇｔｇａｔｃｃ  ａｇｃｃｇｔｔａｔｔ  ｇｇａａｃａｇｃｔｇ  ｔｔａａｇｇｇａａａ
３０６１  ｇｇａｇｇｃｔｇｔａ  ｃａｃａｇｔｇａｔｃ  ｔａｇｇｃｔａｃｔｇ  ｇａｔｔｇａｇａｇｔ  ｇａｇａａｇａａｔｇ  ａｃａｃａｔｇｇａｇ
３１２１  ｇｃｔｇａａｇａｇｇ  ｇｃｃｃａｔｃｔｇａ  ｔｃｇａｇａｔｇａａ  ａａｃａｔｇｔｇａａ  ｔｇｇｃｃａａａｇｔ  ｃｃｃａｃａｃａｔｔ
３１８１  ｇｔｇｇａｃａｇａｔ  ｇｇａａｔａｇａａｇ  ａｇａｇｔｇａｔｃｔ  ｇａｔｃａｔａｃｃｃ  ａａｇｔｃｔｔｔａｇ  ｃｔｇｇｇｃｃａｃｔ
３２４１  ｃａｇｃｃａｔｃａｃ  ａａｔａｃｃａｇａｇ  ａｇｇｇｃｔａｃａｇ  ｇａｃｃｃａａａｔｇ  ａａａｇｇｇｃｃａｔ  ｇｇｃａｃａｇｔｇａ
３３０１  ａｇａｇｃｔｔｇａａ  ａｔｔｃｇｇｔｔｔｇ  ａｇｇａａｔｇｃｃｃ  ａｇｇｃａｃｔａａｇ  ｇｔｃｃａｃｇｔｇｇ  ａｇｇａａａｃａｔｇ
３３６１  ｔｇｇａａｃａａｇａ  ｇｇａｃｃａｔｃｔｃ  ｔｇａｇａｔｃａａｃ  ｃａｃｔｇｃａａｇｃ  ｇｇａａｇｇｇｔｇａ  ｔｃｇａｇｇａａｔｇ
３４２１  ｇｔｇｃｔｇｃａｇｇ  ｇａｇｔｇｃａｃａａ  ｔｇｃｃｃｃｃａｃｔ  ｇｔｃｇｔｔｃｃｇｇ  ｇｃｔａａａｇａｔｇ  ｇｃｔｇｔｔｇｇｔａ
３４８１  ｔｇｇａａｔｇｇａｇ  ａｔａａｇｇｃｃｃａ  ｇｇａａａｇａａｃｃ  ａｇａａａｇｃａａｃ  ｔｔａｇｔａａｇｇｔ  ｃａａｔｇｇｔｇａｃ
３５４１  ｔｇｃａｇｇａｔｃａ  ａｃｔｇａｔｃａｃａ  ｔｇｇａｃｃａｃｔｔ  ｃｔｃｃｃｔｔｇｇａ  ｇｔｇｃｔｔｇｔｇａ  ｔｃｃｔｇｃｔｃａｔ
３６０１  ｇｇｔｇｃａｇｇａａ  ｇｇｇｃｔｇａａｇａ  ａｇａｇａａｔｇａｃ  ｃａｃａａａｇａｔｃ  ａｔｃａｔａａｇｃａ  ｃａｔｃａａｔｇｇｃ
３６６１  ａｇｔｇｃｔｇｇｔａ  ｇｃｔａｔｇａｔｃｃ  ｔｇｇｇａｇｇａｔｔ  ｔｔｃａａｔｇａｇｔ  ｇａｃｃｔｇｇｃｔａ  ａｇｃｔｔｇｃａａｔ
３７２１  ｔｔｔｇａｔｇｇｇｔ  ｇｃｃａｃｃｔｔｃｇ  ｃｇｇａａａｔｇａａ  ｃａｃｔｇｇａｇｇａ  ｇａｔｇｔａｇｃｔｃ  ａｔｃｔｇｇｃｇｃｔ
３７８１  ｇａｔａｇｃｇｇｃａ  ｔｔｃａａａｇｔｃａ  ｇａｃｃａｇｃｇｔｔ  ｇｃｔｇｇｔａｔｃｔ  ｔｔｃａｔｃｔｔｃａ  ｇａｇｃｔａａｔｔｇ
３８４１  ｇａｃａｃｃｃｃｇｔ  ｇａａａｇｃａｔｇｃ  ｔｇｃｔｇｇｃｃｔｔ  ｇｇｃｃｔｃｇｔｇｔ  ｃｔｔｔｔｇｃａａａ  ｃｔｇｃｇａｔｃｔｃ
３９０１  ｃｇｃｃｔｔｇｇａａ  ｇｇｃｇａｃｃｔｇａ  ｔｇｇｔｔｃｔｃａｔ  ｃａａｔｇｇｔｔｔｔ  ｇｃｔｔｔｇｇｃｃｔ  ｇｇｔｔｇｇｃａａｔ
３９６１  ａｃｇａｇｃｇａｔｇ  ｇｔｔｇｔｔｃｃａｃ  ｇｃａｃｔｇａｔａａ  ｃａｔｃａｃｃｔｔｇ  ｇｃａａｔｃｃｔｇｇ  ｃｔｇｃｔｃｔｇａｃ
４０２１  ａｃｃａｃｔｇｇｃｃ  ｃｇｇｇｇｃａｃａｃ  ｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃ  ｇｔｇｇａｇａｇｃａ  ｇｇｃｃｔｔｇｃｔａ  ｃｔｔｇｃｇｇｇｇｇ
４０８１  ｇｔｔｔａｔｇｃｔｃ  ｃｔｃｔｃｔｃｔｇａ  ａｇｇｇａａａａｇｇ  ｃａｇｔｇｔｇａａｇ  ａａｇａａｃｔｔａｃ  ｃａｔｔｔｇｔｃａｔ
４１４１  ｇｇｃｃｃｔｇｇｇａ  ｃｔａａｃｃｇｃｔｇ  ｔｇａｇｇｃｔｇｇｔ  ｃｇａｃｃｃｃａｔｃ  ａａｃｇｔｇｇｔｇｇ  ｇａｃｔｇｃｔｇｔｔ
４２０１  ｇｃｔｃａｃａａｇｇ  ａｇｔｇｇｇａａｇｃ  ｇｇａｇｃｔｇｇｃｃ  ｃｃｃｔａｇｃｇａａ  ｇｔａｃｔｃａｃａｇ  ｃｔｇｔｔｇｇｃｃｔ
４２６１  ｇａｔａｔｇｃｇｃａ  ｔｔｇｇｃｔｇｇａｇ  ｇｇｔｔｃｇｃｃａａ  ｇｇｃａｇａｔａｔａ  ｇａｇａｔｇｇｃｔｇ  ｇｇｃｃｃａｔｇｇｃ
４３２１  ｃｇｃｇｇｔｃｇｇｔ  ｃｔｇｃｔａａｔｔｇ  ｔｃａｇｔｔａｃｇｔ  ｇｇｔｃｔｃａｇｇａ  ａａｇａｇｔｇｔｇｇ  ａｃａｔｇｔａｃａｔ
４３８１  ｔｇａａａｇａｇｃａ  ｇｇｔｇａｃａｔｃａ  ｃａｔｇｇｇａａａａ  ａｇａｔｇｃｇｇａａ  ｇｔｃａｃｔｇｇａａ  ａｃａｇｔｃｃｃｃｇ
４４４１  ｇｃｔｃｇａｔｇｔｇ  ｇｃｇｃｔａｇａｔｇ  ａｇａｇｔｇｇｔｇａ  ｔｔｔｃｔｃｃｃｔｇ  ｇｔｇｇａｇｇａｔｇ  ａｃｇｇｔｃｃｃｃｃ
４５０１  ｃａｔｇａｇａｇａｇ  ａｔｃａｔａｃｔｃａ  ａｇｇｔｇｇｔｃｃｔ  ｇａｔｇａｃｃａｔｃ  ｔｇｔｇｇｃａｔｇａ  ａｃｃｃａａｔａｇｃ
４５６１  ｃａｔａｃｃｃｔｔｔ  ｇｃａｇｃｔｇｇａｇ  ｃｇｔｇｇｔａｃｇｔ  ａｔａｃｇｔｇａａｇ  ａｃｔｇｇａａａａａ  ｇｇａｇｔｇｇｔｇｃ
４６２１  ｔｃｔａｔｇｇｇａｔ  ｇｔｇｃｃｔｇｃｔｃ  ｃｃａａｇｇａａｇｔ  ａａａａａａｇｇｇｇ  ｇａｇａｃｃａｃａｇ  ａｔｇｇａｇｔｇｔａ
４６８１  ｃａｇａｇｔａａｔｇ  ａｃｔｃｇｔａｇａｃ  ｔｇｃｔａｇｇｔｔｃ  ａａｃａｃａａｇｔｔ  ｇｇａｇｔｇｇｇａｇ  ｔｔａｔｇｃａａｇａ
４７４１  ｇｇｇｇｇｔｃｔｔｔ  ｃａｃａｃｔａｔｇｔ  ｇｇｃａｃｇｔｃａｃ  ａａａａｇｇａｔｃｃ  ｇｃｇｃｔｇａｇａａ  ｇｃｇｇｔｇａａｇｇ
４８０１  ｇａｇａｃｔｔｇａｔ  ｃｃａｔａｃｔｇｇｇ  ｇａｇａｔｇｔｃａａ  ｇｃａｇｇａｔｃｔｇ  ｇｔｇｔｃａｔａｃｔ  ｇｔｇｇｔｃｃａｔｇ
４８６１  ｇａａｇｃｔａｇａｔ  ｇｃｃｇｃｃｔｇｇｇ  ａｔｇｇｇｃａｃａｇ  ｃｇａｇｇｔｇｃａｇ  ｃｔｃｔｔｇｇｃｃｇ  ｔｇｃｃｃｃｃｃｇｇ
４９２１  ａｇａｇａｇａｇｃｇ  ａｇｇａａｃａｔｃｃ  ａｇａｃｔｃｔｇｃｃ  ｃｇｇａａｔａｔｔｔ  ａａｇａｃａａａｇｇ  ａｔｇｇｇｇａｃａｔ
４９８１  ｔｇｇａｇｃｇｇｔｔ  ｇｃｇｃｔｇｇａｔｔ  ａｃｃｃａｇｃａｇｇ  ａａｃｔｔｃａｇｇａ  ｔｃｔｃｃａａｔｃｃ  ｔａｇａｃａａｇｔｇ
５０４１  ｔｇｇｇａｇａｇｔｇ  ａｔａｇｇａｃｔｔｔ  ａｔｇｇｃａａｔｇｇ  ｇｇｔｃｇｔｇａｔｃ  ａａａａａｃｇｇｇａ  ｇｔｔａｔｇｔｔａｇ
５１０１  ｔｇｃｃａｔｃａｃｃ  ｃａａｇｇｇａｇｇａ  ｇｇｇａｇｇａａｇａ  ｇａｃｔｃｃｔｇｔｔ  ｇａｇｔｇｃｔｔｃｇ  ａｇｃｃｃｔｃｇａｔ
５１６１  ｇｃｔｇａａｇａａｇ  ａａｇｃａｇｃｔａａ  ｃｔｇｔｃｔｔａｇａ  ｃｔｔｇｃａｔｃｃｔ  ｇｇａｇｃｔｇｇｇａ  ａａａｃｃａｇｇａｇ
５２２１  ａｇｔｔｃｔｔｃｃｔ  ｇａａａｔａｇｔｃｃ  ｇｔｇａａｇｃｃａｔ  ａａａａａｃａａｇａ  ｃｔｃｃｇｔａｃｔｇ  ｔｇａｔｃｔｔａｇｃ
５２８１  ｔｃｃａａｃｃａｇｇ  ｇｔｔｇｔｃｇｃｔｇ  ｃｔｇａａａｔｇｇａ  ｇｇａｇｇｃｃｃｔｔ  ａｇａｇｇｇｃｔｔｃ  ｃａｇｔｇｃｇｔｔａ
５３４１  ｔａｔｇａｃａａｃａ  ｇｃａｇｔｃａａｔｇ  ｔｃａｃｃｃａｃｔｃ  ｔｇｇａａｃａｇａａ  ａｔｃｇｔｃｇａｃｔ  ｔａａｔｇｔｇｃｃａ
５４０１  ｔｇｃｃａｃｃｔｔｃ  ａｃｔｔｃａｃｇｔｃ  ｔａｃｔａｃａｇｃｃ  ａａｔｃａｇａｇｔｃ  ｃｃｃａａｃｔａｔａ  ａｔｃｔｇｔａｔａｔ
５４６１  ｔａｔｇｇａｔｇａｇ  ｇｃｃｃａｃｔｔｃａ  ｃａｇａｔｃｃｃｔｃ  ａａｇｔａｔａｇｃａ  ｇｃａａｇａｇｇａｔ  ａｃａｔｔｔｃａａｃ
５５２１  ａａｇｇｇｔｔｇａｇ  ａｔｇｇｇｃｇａｇｇ  ｃｇｇｃｔｇｃｃａｔ  ｃｔｔｃａｔｇａｃｃ  ｇｃｃａｃｇｃｃａｃ  ｃａｇｇａａｃｃｃｇ
５５８１  ｔｇａｃｇｃａｔｔｔ  ｃｃｇｇａｃｔｃｃａ  ａｃｔｃａｃｃａａｔ  ｔａｔｇｇａｃａｃｃ  ｇａａｇｔｇｇａａｇ  ｔｃｃｃａｇａｇａｇ
５６４１  ａｇｃｃｔｇｇａｇｃ  ｔｃａｇｇｃｔｔｔｇ  ａｔｔｇｇｇｔｇａｃ  ｇｇａｔｃａｔｔｃｔ  ｇｇａａａａａｃａｇ  ｔｔｔｇｇｔｔｔｇｔ
５７０１  ｔｃｃａａｇｃｇｔｇ  ａｇｇａａｃｇｇｃａ  ａｔｇａｇａｔｃｇｃ  ａｇｃｔｔｇｔｃｔｇ  ａｃａａａｇｇｃｔｇ  ｇａａａａｃｇｇｇｔ
５７６１  ｃａｔａｃａｇｃｔｃ  ａｇｃａｇａａａｇａ  ｃｔｔｔｔｇａｇａｃ  ａｇａｇｔｔｃｃａｇ  ａａａａｃａａａａｃ  ａｔｃａａｇａｇｔｇ
５８２１  ｇｇａｃｔｔｔｇｔｃ  ｇｔｇａｃａａｃｔｇ  ａｃａｔｔｔｃａｇａ  ｇａｔｇｇｇｃｇｃｃ  ａａｃｔｔｔａａａｇ  ｃｔｇａｃｃｇｔｇｔ
５８８１  ｃａｔａｇａｔｔｃｃ  ａｇｇａｇａｔｇｃｃ  ｔａａａｇｃｃｇｇｔ  ｃａｔａｃｔｔｇａｔ  ｇｇｃｇａｇａｇａｇ  ｔｃａｔｔｃｔｇｇｃ
５９４１  ｔｇｇａｃｃｃａｔｇ  ｃｃｔｇｔｃａｃａｃ  ａｔｇｃｃａｇｃｇｃ  ｔｇｃｃｃａｇａｇｇ  ａｇｇｇｇｇｃｇｃａ  ｔａｇｇｃａｇｇａａ
６００１  ｔｃｃｃａａｃａａａ  ｃｃｔｇｇａｇａｔｇ  ａｇｔａｔｃｔｇｔａ  ｔｇｇａｇｇｔｇｇｇ  ｔｇｃｇｃａｇａｇａ  ｃｔｇａｃｇａａｇａ
６０６１  ｃｃａｔｇｃａｃａｃ  ｔｇｇｃｔｔｇａａｇ  ｃａａｇａａｔｇｃｔ  ｃｃｔｔｇａｃａａｔ  ａｔｔｔａｃｃｔｃｃ  ａａｇａｔｇｇｃｃｔ
６１２１  ｃａｔａｇｃｃｔｃｇ  ｃｔｃｔａｔｃｇａｃ  ｃｔｇａｇｇｃｃｇａ  ｃａａａｇｔａｇｃａ  ｇｃｃａｔｔｇａｇｇ  ｇａｇａｇｔｔｃａａ
６１８１  ｇｃｔｔａｇｇａｃｇ  ｇａｇｃａａａｇｇａ  ａｇａｃｃｔｔｔｇｔ  ｇｇａａｃｔｃａｔｇ  ａａａａｇａｇｇａｇ  ａｔｃｔｔｃｃｔｇｔ
６２４１  ｔｔｇｇｃｔｇｇｃｃ  ｔａｔｃａｇｇｔｔｇ  ｃａｔｃｔｇｃｃｇｇ  ａａｔａａｃｃｔａｃ  ａｃａｇａｔａｇａａ  ｇａｔｇｇｔｇｃｔｔ
６３０１  ｔｇａｔｇｇｃａｃｇ  ａｃｃａａｃａａｃａ  ｃｃａｔａａｔｇｇａ  ａｇａｃａｇｔｇｔｇ  ｃｃｇｇｃａｇａｇｇ  ｔｇｔｇｇａｃｃａｇ
６３６１  ａｃａｃｇｇａｇａｇ  ａａａａｇａｇｔｇｃ  ｔｃａａａｃｃｇａｇ  ｇｔｇｇａｔｇｇａｃ  ｇｃｃａｇａｇｔｔｔ  ｇｔｔｃａｇａｔｃａ
６４２１  ｔｇｃｇｇｃｃｃｔｇ  ａａｇｔｃａｔｔｃａ  ａｇｇａｇｔｔｔｇｃ  ｃｇｃｔｇｇｇａａａ  ａｇａｇｇａｇｃｇｇ  ｃｔｔｔｔｇｇａｇｔ
６４８１  ｇａｔｇｇａａｇｃｃ  ｃｔｇｇｇａａｃａｃ  ｔｇｃｃａｇｇａｃａ  ｃａｔｇａｃａｇａｇ  ａｇａｔｔｃｃａｇｇ  ａａｇｃｃａｔｔｇａ
６５４１  ｃａａｃｃｔｃｇｃｔ  ｇｔｇｃｔｃａｔｇｃ  ｇｇｇｃａｇａｇａｃ  ｔｇｇａａｇｃａｇｇ  ｃｃｔｔａｃａａａｇ  ｃｃｇｃｇｇｃｇｇｃ
６６０１  ｃｃａａｔｔｇｃｃｇ  ｇａｇａｃｃｃｔａｇ  ａｇａｃｃａｔａａｔ  ｇｃｔｔｔｔｇｇｇｇ  ｔｔｇｃｔｇｇｇａａ  ｃａｇｔｃｔｃｇｃｔ
６６６１  ｇｇｇａａｔｃｔｔｃ  ｔｔｃｇｔｃｔｔｇａ  ｔｇａｇｇａａｃａａ  ｇｇｇｃａｔａｇｇｇ  ａａｇａｔｇｇｇｃｔ  ｔｔｇｇａａｔｇｇｔ
６７２１  ｇａｃｔｃｔｔｇｇｇ  ｇｃｃａｇｃｇｃａｔ  ｇｇｃｔｃａｔｇｔｇ  ｇｃｔｃｔｃｇｇａａ  ａｔｔｇａｇｃｃａｇ  ｃｃａｇａａｔｔｇｃ
６７８１  ａｔｇｔｇｔｃｃｔｃ  ａｔｔｇｔｔｇｔｇｔ  ｔｃｃｔａｔｔｇｃｔ  ｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃ  ａｔａｃｃｔｇａｇｃ  ｃａｇａａａａｇｃａ
６８４１  ａａｇａｔｃｔｃｃｃ  ｃａｇｇａｃａａｃｃ  ａａａｔｇｇｃａａｔ  ｃａｔｃａｔｃａｔｇ  ｇｔａｇｃａｇｔａｇ  ｇｔｃｔｔｃｔｇｇｇ
６９０１  ｃｔｔｇａｔｔａｃｃ  ｇｃｃａａｔｇａａｃ  ｔｃｇｇａｔｇｇｔｔ  ｇｇａｇａｇａａｃａ  ａａｇａｇｔｇａｃｃ  ｔａａｇｃｃａｔｃｔ
６９６１  ａａｔｇｇｇａａｇｇ  ａｇａｇａｇｇａｇｇ  ｇｇｇｃａａｃｃａｔ  ａｇｇａｔｔｃｔｃａ  ａｔｇｇａｃａｔｔｇ  ａｃｃｔｇｃｇｇｃｃ
７０２１  ａｇｃｃｔｃａｇｃｔ  ｔｇｇｇｃｃａｔｃｔ  ａｔｇｃｔｇｃｃｔｔ  ｇａｃａａｃｔｔｔｃ  ａｔｔａｃｃｃｃａｇ  ｃｃｇｔｃｃａａｃａ
７０８１  ｔｇｃａｇｔｇａｃｃ  ａｃｃｔｃａｔａｃａ  ａｃａａｃｔａｃｔｃ  ｃｔｔａａｔｇｇｃｇ  ａｔｇｇｃｃａｃｇｃ  ａａｇｃｔｇｇａｇｔ
７１４１  ｇｔｔｇｔｔｔｇｇｃ  ａｔｇｇｇｃａａａｇ  ｇｇａｔｇｃｃａｔｔ  ｃｔａｃｇｃａｔｇｇ  ｇａｃｔｔｔｇｇａｇ  ｔｃｃｃｇｃｔｇｃｔ
７２０１  ａａｔｇａｔａｇｇｔ  ｔｇｃｔａｃｔｃａｃ  ａａｔｔａａｃａｃｃ  ｃｃｔｇａｃｃｃｔａ  ａｔａｇｔｇｇｃｃａ  ｔｃａｔｔｔｔｇｃｔ
７２６１  ｃｇｔｇｇｃｇｃａｃ  ｔａｃａｔｇｔａｃｔ  ｔｇａｔｃｃｃａｇｇ  ｇｃｔｇｃａｇｇｃａ  ｇｃａｇｃｔｇｃｇｃ  ｇｔｇｃｔｇｃｃｃａ
７３２１  ｇａａｇａｇａａｃｇ  ｇｃａｇｃｔｇｇｃａ  ｔｃａｔｇａａｇａａ  ｃｃｃｔｇｔｔｇｔｇ  ｇａｔｇｇａａｔａｇ  ｔｇｇｔｇａｃｔｇａ
７３８１  ｃａｔｔｇａｃａｃａ  ａｔｇａｃａａｔｔｇ  ａｃｃｃｃｃａａｇｔ  ｇｇａｇａａａａａｇ  ａｔｇｇｇａｃａｇｇ  ｔｇｃｔａｃｔｃａｔ
７４４１  ａｇｃａｇｔａｇｃｃ  ｇｔｃｔｃｃａｇｃｇ  ｃｃａｔａｃｔｇｔｃ  ｇｃｇｇａｃｃｇｃｃ  ｔｇｇｇｇｇｔｇｇｇ  ｇｇｇａｇｇｃｔｇｇ
７５０１  ｇｇｃｔｃｔｇａｔｃ  ａｃａｇｃｃｇｃａａ  ｃｔｔｃｃａｃｔｔｔ  ｇｔｇｇｇａａｇｇｃ  ｔｃｔｃｃｇａａｃａ  ａｇｔａｃｔｇｇａａ
７５６１  ｃｔｃｃｔｃｔａｃａ  ｇｃｃａｃｔｔｃａｃ  ｔｇｔｇｔａａｃａｔ  ｔｔｔｔａｇｇｇｇａ  ａｇｔｔａｃｔｔｇｇ  ｃｔｇｇａｇｃｔｔｃ
７６２１  ｔｃｔａａｔｃｔａｃ  ａｃａｇｔａａｃａａ  ｇａａａｃｇｃｔｇｇ  ｃｔｔｇｇｔｃａａｇ  ａｇａｃｇｔｇｇｇｇ  ｇｔｇｇａａｃａｇｇ
７６８１  ａｇａｇａｃｃｃｔｇ  ｇｇａｇａｇａａａｔ  ｇｇａａｇｇｃｃｃｇ  ｃｔｔｇａａｃｃａｇ  ａｔｇｔｃｇｇｃｃｃ  ｔｇｇａｇｔｔｃｔａ
７７４１  ｃｔｃｃｔａｃａａａ  ａａｇｔｃａｇｇｃａ  ｔｃａｃｃｇａｇｇｔ  ｇｔｇｃａｇａｇａａ  ｇａｇｇｃｃｃｇｃｃ  ｇｃｇｃｃｃｔｃａａ
７８０１  ｇｇａｃｇｇｔｇｔｇ  ｇｃａａｃｇｇｇａｇ  ｇｃｃａｔｇｃｔｇｔ  ｇｔｃｃｃｇａｇｇａ  ａｇｔｇｃａａａｇｃ  ｔｇａｇａｔｇｇｔｔ
７８６１  ｇｇｔｇｇａｇｃｇｇ  ｇｇａｔａｃｃｔｇｃ  ａｇｃｃｃｔａｔｇｇ  ａａａｇｇｔｃａｔｔ  ｇａｔｃｔｔｇｇａｔ  ｇｔｇｇｃａｇａｇｇ
７９２１  ｇｇｇｃｔｇｇａｇｔ  ｔａｃｔａｃｇｔｃｇ  ｃｃａｃｃａｔｃｃｇ  ｃａａａｇｔｔｃａａ  ｇａａｇｔｇａａａｇ  ｇａｔａｃａｃａａａ
７９８１  ａｇｇａｇｇｃｃｃｔ  ｇｇｔｃａｔｇａａｇ  ａａｃｃｃｇｔｇｔｔ  ｇｇｔｇｃａａａｇｃ  ｔａｔｇｇｇｔｇｇａ  ａｃａｔａｇｔｃｃｇ
８０４１  ｔｃｔｔａａｇａｇｔ  ｇｇｇｇｔｇｇａｃｇ  ｔｃｔｔｔｃａｔａｔ  ｇｇｃｇｇｃｔｇａｇ  ｃｃｇｔｇｔｇａｃａ  ｃｇｔｔｇｃｔｇｔｇ
８１０１  ｔｇａｃａｔａｇｇｔ  ｇａｇｔｃａｔｃａｔ  ｃｔａｇｔｃｃｔｇａ  ａｇｔｇｇａａｇａａ  ｇｃａｃｇｇａｃｇｃ  ｔｃａｇａｇｔｃｃｔ
８１６１  ｃｔｃｃａｔｇｇｔｇ  ｇｇｇｇａｔｔｇｇｃ  ｔｔｇａａａａａａｇ  ａｃｃａｇｇａｇｃｃ  ｔｔｔｔｇｔａｔａａ  ａａｇｔｇｔｔｇｔｇ
８２２１  ｃｃｃａｔａｃａｃｃ  ａｇｃａｃｔａｔｇａ  ｔｇｇａａａｃｃｃｔ  ｇｇａｇｃｇａｃｔｇ  ｃａｇｃｇｔａｇｇｔ  ａｔｇｇｇｇｇａｇｇ
８２８１  ａｃｔｇｇｔｃａｇａ  ｇｔｇｃｃａｃｔｃｔ  ｃｃｃｇｃａａｃｔｃ  ｔａｃａｃａｔｇａｇ  ａｔｇｔａｃｔｇｇｇ  ｔｃｔｃｔｇｇａｇｃ
８３４１  ｇａａａａｇｃａａｃ  ａｃｃａｔａａａａａ  ｇｔｇｔｇｔｃｃａｃ  ｃａｃｇａｇｃｃａｇ  ｃｔｃｃｔｃｔｔｇｇ  ｇｇｃｇｃａｔｇｇａ
８４０１  ｃｇｇｇｃｃｔａｇｇ  ａｇｇｃｃａｇｔｇａ  ａａｔａｔｇａｇｇａ  ｇｇａｔｇｔｇａａｔ  ｃｔｃｇｇｃｔｃｔｇ  ｇｃａｃｇｃｇｇｇｃ
８４６１  ｔｇｔｇｇｔａａｇｃ  ｔｇｃｇｃｔｇａａｇ  ｃｔｃｃｃａａｃａｔ  ｇａａｇａｔｃａｔｔ  ｇｇｔａａｃｃｇｃａ  ｔｔｇａａａｇｇａｔ
８５２１  ｃｃｇｃａｇｔｇａｇ  ｃａｃｇｃｇｇａａａ  ｃｇｔｇｇｔｔｃｔｔ  ｔｇａｃｇａｇａａｃ  ｃａｃｃｃａｔａｔａ  ｇｇａｃａｔｇｇｇｃ
８５８１  ｔｔａｃｃａｔｇｇａ  ａｇｃｔａｔｇａｇｇ  ｃｃｃｃｃａｃａｃａ  ａｇｇｇｔｃａｇｃｇ  ｔｃｃｔｃｔｃｔａａ  ｔａａａｃｇｇｇｇｔ
８６４１  ｔｇｔｃａｇｇｃｔｃ  ｃｔｇｔｃａａａａｃ  ｃｃｔｇｇｇａｔｇｔ  ｇｇｔｇａｃｔｇｇａ  ｇｔｃａｃａｇｇａａ  ｔａｇｃｃａｔｇａｃ
８７０１  ｃｇａｃａｃｃａｃａ  ｃｃｇｔａｔｇｇｔｃ  ａｇｃａａａｇａｇｔ  ｔｔｔｃａａｇｇａａ  ａａａｇｔｇｇａｃａ  ｃｔａｇｇｇｔｇｃｃ
８７６１  ａｇａｃｃｃｃｃａａ  ｇａａｇｇｃａｃｔｃ  ｇｔｃａｇｇｔｔａｔ  ｇａｇｃａｔｇｇｔｃ  ｔｃｔｔｃｃｔｇｇｔ  ｔｇｔｇｇａａａｇａ
８８２１  ｇｃｔａｇｇｃａａａ  ｃａｃａａａｃｇｇｃ  ｃａｃｇａｇｔｃｔｇ  ｃａｃｃａａａｇａａ  ｇａｇｔｔｃａｔｃａ  ａｃａａｇｇｔｔｃｇ
８８８１  ｔａｇｃａａｔｇｃａ  ｇｃａｔｔａｇｇｇｇ  ｃａａｔａｔｔｔｇａ  ａｇａｇｇａａａａａ  ｇａｇｔｇｇａａｇａ  ｃｔｇｃａｇｔｇｇａ
８９４１  ａｇｃｔｇｔｇａａｃ  ｇａｔｃｃａａｇｇｔ  ｔｃｔｇｇｇｃｔｃｔ  ａｇｔｇｇａｃａａｇ  ｇａａａｇａｇａｇｃ  ａｃｃａｃｃｔｇａｇ
９００１  ａｇｇａｇａｇｔｇｃ  ｃａｇａｇｃｔｇｔｇ  ｔｇｔａｃａａｃａｔ  ｇａｔｇｇｇａａａａ  ａｇａｇａａａａｇａ  ａａｃａａｇｇｇｇａ
９０６１  ａｔｔｔｇｇａａａｇ  ｇｃｃａａｇｇｇｃａ  ｇｃｃｇｃｇｃｃａｔ  ｃｔｇｇｔａｔａｔｇ  ｔｇｇｃｔａｇｇｇｇ  ｃｔａｇａｔｔｔｃｔ
９１２１  ａｇａｇｔｔｃｇａａ  ｇｃｃｃｔｔｇｇａｔ  ｔｃｔｔｇａａｃｇａ  ｇｇａｔｃａｃｔｇｇ  ａｔｇｇｇｇａｇａｇ  ａｇａａｃｔｃａｇｇ
９１８１  ａｇｇｔｇｇｔｇｔｔ  ｇａａｇｇｇｃｔｇｇ  ｇａｔｔａｃａａａｇ  ａｃｔｃｇｇａｔａｔ  ｇｔｃｃｔａｇａａｇ  ａｇａｔｇａｇｔｃｇ
９２４１  ｔａｔａｃｃａｇｇａ  ｇｇａａｇｇａｔｇｔ  ａｔｇｃａｇａｔｇａ  ｃａｃｔｇｃｔｇｇｃ  ｔｇｇｇａｃａｃｃｃ  ｇｃａｔｔａｇｃａｇ
９３０１  ｇｔｔｔｇａｔｃｔｇ  ｇａｇａａｔｇａａｇ  ｃｔｃｔａａｔｃａｃ  ｃａａｃｃａａａｔｇ  ｇａｇａａａｇｇｇｃ  ａｃａｇｇｇｃｃｔｔ
９３６１  ｇｇｃａｔｔｇｇｃｃ  ａｔａａｔｃａａｇｔ  ａｃａｃａｔａｃｃａ  ａａａｃａａａｇｔｇ  ｇｔａａａｇｇｔｃｃ  ｔｔａｇａｃｃａｇｃ
９４２１  ｔｇａａａａａｇｇｇ  ａａａａｃａｇｔｔａ  ｔｇｇａｃａｔｔａｔ  ｔｔｃｇａｇａｃａａ  ｇａｃｃａａａｇｇｇ  ｇｇａｇｃｇｇａｃａ
９４８１  ａｇｔｔｇｔｃａｃｔ  ｔａｃｇｃｔｃｔｔａ  ａｃａｃａｔｔｔａｃ  ｃａａｃｃｔａｇｔｇ  ｇｔｇｃａａｃｔｃａ  ｔｔｃｇｇａａｔａｔ
９５４１  ｇｇａｇｇｃｔｇａｇ  ｇａａｇｔｔｃｔａｇ  ａｇａｔｇｃａａｇａ  ｃｔｔｇｔｇｇｃｔｇ  ｃｔｇｃｇｇａｇｇｔ  ｃａｇａｇａａａｇｔ
９６０１  ｇａｃｃａａｃｔｇｇ  ｔｔｇｃａｇａｇｃａ  ａｃｇｇａｔｇｇｇａ  ｔａｇｇｃｔｃａａａ  ｃｇａａｔｇｇｃａｇ  ｔｃａｇｔｇｇａｇａ
９６６１  ｔｇａｔｔｇｃｇｔｔ  ｇｔｇａａｇｃｃａａ  ｔｔｇａｔｇａｔａｇ  ｇｔｔｔｇｃａｃａｔ  ｇｃｃｃｔｃａｇｇｔ  ｔｃｔｔｇａａｔｇａ
９７２１  ｔａｔｇｇｇａａａａ  ｇｔｔａｇｇａａｇｇ  ａｃａｃａｃａａｇａ  ｇｔｇｇａａａｃｃｃ  ｔｃａａｃｔｇｇａｔ  ｇｇｇａｃａａｃｔｇ
９７８１  ｇｇａａｇａａｇｔｔ  ｃｃｇｔｔｔｔｇｃｔ  ｃｃｃａｃｃａｃｔｔ  ｃａａｃａａｇｃｔｃ  ｃａｔｃｔｃａａｇｇ  ａｃｇｇｇａｇｇｔｃ
９８４１  ｃａｔｔｇｔｇｇｔｔ  ｃｃｃｔｇｃｃｇｃｃ  ａｃｃａａｇａｔｇａ  ａｃｔｇａｔｔｇｇｃ  ｃｇｇｇｃｃｃｇｃｇ  ｔｃｔｃｔｃｃａｇｇ
９９０１  ｇｇｃｇｇｇａｔｇｇ  ａｇｃａｔｃｃｇｇｇ  ａｇａｃｔｇｃｔｔｇ  ｃｃｔａｇｃａａａａ  ｔｃａｔａｔｇｃｇｃ  ａａａｔｇｔｇｇｃａ
９９６１  ｇｃｔｃｃｔｔｔａｔ  ｔｔｃｃａｃａｇａａ  ｇｇｇａｃｃｔｃｃｇ  ａｃｔｇａｔｇｇｃｃ  ａａｔｇｃｃａｔｔｔ  ｇｔｔｃａｔｃｔｇｔ
１００２１  ｇｃｃａｇｔｔｇａｃ  ｔｇｇｇｔｔｃｃａａ  ｃｔｇｇｇａｇａａｃ  ｔａｃｃｔｇｇｔｃａ  ａｔｃｃａｔｇｇａａ  ａｇｇｇａｇａａｔｇ
１００８１  ｇａｔｇａｃｃａｃｔ  ｇａａｇａｃａｔｇｃ  ｔｔｇｔｇｇｔｇｔｇ  ｇａａｃａｇａｇｔｇ  ｔｇｇａｔｔｇａｇｇ  ａｇａａｃｇａｃｃａ
１０１４１  ｃａｔｇｇａａｇａｃ  ａａｇａｃｃｃｃａｇ  ｔｔａｃｇａａａｔｇ  ｇａｃａｇａｃａｔｔ  ｃｃｃｔａｔｔｔｇｇ  ｇａａａａａｇｇｇａ
１０２０１  ａｇａｃｔｔｇｔｇｇ  ｔｇｔｇｇａｔｃｔｃ  ｔｃａｔａｇｇｇｃａ  ｃａｇａｃｃｇｃｇｃ  ａｃｃａｃｃｔｇｇｇ  ｃｔｇａｇａａｃａｔ
１０２６１  ｔａａａａａｃａｃａ  ｇｔｃａａｃａｔｇｇ  ｔｇｃｇｃａｇｇａｔ  ｃａｔａｇｇｔｇａｔ  ｇａａｇａａａａｇｔ  ａｃａｔｇｇａｃｔａ
１０３２１  ｃｃｔａｔｃｃａｃｃ  ｃａａｇｔｔｃｇｃｔ  ａｃｔｔｇｇｇｔｇａ  ａｇａａｇｇｇｔｃｔ  ａｃａｃｃｔｇｇａｇ  ｔｇｃｔｇｔａａｇｃ
１０３８１  ａｃｃａａｔｃｔｔａ  ａｔｇｔｔｇｔｃａｇ  ｇｃｃｔｇｃｔａｇｔ  ｃａｇｃｃａｃａｇｃ  ｔｔｇｇｇｇａａａｇ  ｃｔｇｔｇｃａｇｃｃ
１０４４１  ｔｇｔｇａｃｃｃｃｃ  ｃｃａｇｇａｇａａｇ  ｃｔｇｇｇａａａｃｃ  ａａｇｃｃｔａｔａｇ  ｔｃａｇｇｃｃｇａｇ  ａａｃｇｃｃａｔｇｇ
１０５０１  ｃａｃｇｇａａｇａａ  ｇｃｃａｔｇｃｔｇｃ  ｃｔｇｔｇａｇｃｃｃ  ｃｔｃａｇａｇｇａｃ  ａｃｔｇａｇｔｃａａ  ａａａａｃｃｃｃａｃ
１０５６１  ｇｃｇｃｔｔｇｇａｇ  ｇｃｇｃａｇｇａｔｇ  ｇｇａａａａｇａａｇ  ｇｔｇｇｃｇａｃｃｔ  ｔｃｃｃｃａｃｃｃｔ  ｔｃａａｔｃｔｇｇｇ
１０６２１  ｇｃｃｔｇａａｃｔｇ  ｇａｇａｔｃａｇｃｔ  ｇｔｇｇａｔｃｔｃｃ  ａｇａａｇａｇｇｇａ  ｃｔａｇｔｇｇｔｔａ  ｇａｇｇａ
【００７６】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＵ５０１２１５．１のゲノム配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株由来である。いくつかの実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＵ５０１２１５．１のゲノム配列は、配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号２の配列と、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％，少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％，少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％，少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するゲノム配列を含み得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号２の配列によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号２の配列によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％，少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。
【００７８】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示のジカウイルスは、本明細書で開示されるワクチン及び／または免疫原性組成物のいずれかにおいて使用され得る。例えば、本開示のジカウイルスは、ジカウイルス感染症を治療または予防することを、それを必要とするヒト対象において行うこと、及び／またはジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導することを、それを必要とするヒト対象において行うことに有用である１つ以上の抗原を提供するために使用され得る。
【００７９】
ウイルス抗原
いくつかの実施形態では、本開示は、ワクチン及び／または免疫原性組成物に有用な、本明細書に記載される任意のジカウイルス、例えば、限定するものではないが、精製されたウイルス、不活化ウイルス、弱毒化ウイルス、組み換えウイルス、またはサブユニットワクチンのための精製された及び／または組み換えウイルスタンパク質に由来する１つ以上の抗原に関する。いくつかの実施形態では、ワクチン及び／または免疫原性組成物は、不活化全粒子ウイルスを含む。
【００８０】
本開示の抗原は、免疫応答を惹起することが可能な任意の物質であり得る。好適な抗原の例としては、全粒子ウイルス、弱毒化ウイルス、不活化ウイルス、タンパク質、ポリペプチド（活性タンパク質及びタンパク質内の個々のポリペプチドエピトープを含む）、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖コンジュゲート、多糖のペプチド及び非ペプチド模倣体、ならびに他の分子、小分子、脂質、糖脂質、及び炭水化物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
本開示の抗原は、細胞培養中に１つ以上の細胞から生産される任意のジカウイルスに由来し得る（例えば、プラーク精製を介する）（例えば、ジカウイルスクローン分離株）。当該技術分野において知られている、ジカウイルスの生産に好適な任意の細胞を使用することができ、例えば、昆虫細胞（例えば、ＣＣＬ−１２５細胞、Ａａｇ−２細胞、ＲＭＬ−１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７−１０細胞、ＡＰ−６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−３細胞、ＵＭ−ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ−３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ−ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ−ＣＴＲ細胞、ＴＲＡ−１７１細胞などの蚊細胞、ならびにＡｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、Ａｅｄｅｓ  ｐｓｅｕｄｏｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｓ、Ａｅｄｅｓ  ｔｒｉｓｅｒｉａｔｕｓ、Ａｅｄｅｓ  ｖｅｘａｎｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ａｌｂｉｍｕｓ、Ｃｕｌｅｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ、Ｃｕｌｅｘ  ｔｈｅｉｌｅｒｉ、Ｃｕｌｅｘ  ｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ、Ｃｕｌｅｘ  ｂｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ、及び／またはＴｏｘｏｒｈｙｎｃｈｉｔｅｓ  ａｍｂｏｉｎｅｎｓｉｓなどの蚊種に由来する更なる細胞もしくは細胞株）、及び哺乳動物細胞（例えば、ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓由来）、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞（サル腎臓由来）、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ  （ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載の受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、非ヒト細胞から生産されるジカウイルスに由来する（例えば、プラーク精製を介する）（例えば、ジカウイルスクローン分離株）。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、昆虫細胞から生産されるジカウイルスに由来する（例えば、プラーク精製を介する）（例えば、ジカウイルスクローン分離株）。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、蚊細胞から生産されるジカウイルスに由来する（例えば、プラーク精製を介する）（例えば、ジカウイルスクローン分離株）。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、哺乳動物細胞から生産されるジカウイルスに由来する（例えば、プラーク精製を介する）（例えば、ジカウイルスクローン分離株）。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、Ｖｅｒｏ細胞から生産されるジカウイルスに由来する（例えば、プラーク精製を介する）（例えば、ジカウイルスクローン分離株）。プラーク精製を実施することによるウイルスの精製方法は、当業者に知られている（例えば、以下の実施例１参照）。
【００８２】
本開示の抗原は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含み得る。適応変異は、ウイルスを、特定の細胞株での成長に適応させることによって生成され得る。例えば、細胞は、ウイルス、ウイルス（例えば、感染性ウイルス、または感染性クローン）から転写されたＲＮＡ、及び／または全粒子ウイルスから精製されたＲＮＡをトランスフェクトまたはエレクトロポレーションして、ウイルス及び／またはウイルスＲＮＡが複製され、その核酸が変異を起こすように継代され得る。核酸変異は、点変異、挿入変異、または欠失変異であり得る。核酸変異は、ウイルスタンパク質内に、非ヒト細胞でのウイルス成長を促進するアミノ酸変化をもたらし得る。適応変異は、プラークサイズ、成長速度、温度感受性、薬剤耐性、ビルレンス、及び細胞培養におけるウイルス収量の変化を含む、ウイルスの表現型の変化を容易にし得る。これらの適応的変異は、細胞株で培養されるウイルスの速度、収量、及び一貫性を高めることから、ワクチン製造に有用であり得る。適応的変異は、免疫原性エピトープの構造を変更することによって、ウイルス抗原の免疫原性を変化させる（例えば、増大させるまたは減少させる）ことができる。加えて、適応的変異はまた、ウイルスの遺伝的安定性を増加させ得、及び／または複数回（例えば、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０回以上）の継代を介したウイルスに望ましくない変異の発生を減少もしくは阻害し得る。
【００８３】
したがって、特定の実施形態では、本開示の抗原は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含む。特定の実施形態では、適応変異は、非ヒト細胞に対するウイルス抗原の変異である。いくつかの実施形態では、非ヒト細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、当該技術分野において知られている任意の好適な細胞を使用することができ、限定するものではないが、ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓由来）、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞（サル腎臓由来）、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載の受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が含まれる。いくつかの実施形態では、非ヒト細胞は、サル細胞である。いくつかの実施形態では、サル細胞は、Ｖｅｒｏ細胞株由来である。Ｖｅｒｏ細胞株は、当該技術分野において知られている任意の好適な細胞を使用することができ、限定するものではないが、ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ  ７６（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８７）、またはＶｅｒｏ  Ｃ１００８（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８６）が含まれる。いくつかの実施形態では、Ｖｅｒｏ細胞株は、ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７である。
【００８４】
ジカウイルスは、構造ポリペプチド及び非構造ポリペプチドの両方をコードする一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを持つ。ゲノムはまた、５’末端と３’末端の両方の領域に、ウイルス複製の役割を担う非コーディング配列を含有する。これらのウイルスによってコードされる構造ポリペプチドには、限定するものではないが、カプシド（Ｃ）、前駆体膜（ｐｒＭ）、及びエンベロープ（Ｅ）が含まれる。これらのウイルスによってコードされる非構造（ＮＳ）ポリペプチドには、限定するものではないが、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５が含まれる。
【００８５】
特定の実施形態では、本開示の抗原は、限定するものではないが、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５を含む、１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０個全て）のウイルス抗原／ポリペプチド内に、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０など）の非ヒト細胞適応変異を含有し得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）に少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０など）の非ヒト細胞適応変異を含有し得る、全粒子不活化ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）に少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含有し得る、全粒子不活化ウイルスを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異は、ＮＳ１ポリペプチド内にある。例示的なジカウイルス株に由来する野生型非細胞適応化ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のように示される：
【００８７】
ＤＶＧＣＳＶＤＦＳＫＫＥＴＲＣＧＴＧＶＦＶＹＮＤＶＥＡＷＲＤＲＹＫＹＨＰＤＳＰＲＲＬＡＡＡＶＫＱＡＷＥＤＧＩＣＧＩＳＳＶＳＲＭＥＮＩＭＷＲＳＶＥＧＥＬＮＡＩＬＥＥＮＧＶＱＬＴＶＶＶＧＳＶＫＮＰＭＷＲＧＰＱＲＬＰＶＰＶＮＥＬＰＨＧＷＫＡＷＧＫＳＹＦＶＲＡＡＫＴＮＮＳＦＶＶＤＧＤＴＬＫＥＣＰＬＫＨＲＡＷＮＳＦＬＶＥＤＨＧＦＧＶＦＨＴＳＶＷＬＫＶＲＥＤＹＳＬＥＣＤＰＡＶＩＧＴＡＶＫＧＫＥＡＶＨＳＤＬＧＹＷＩＥＳＥＫＮＤＴＷＲＬＫＲＡＨＬＩＥＭＫＴＣＥＷＰＫＳＨＴＬＷＴＤＧＩＥＥＳＤＬＩＩＰＫＳＬＡＧＰＬＳＨＨＮＴＲＥＧＹＲＴＱＭＫＧＰＷＨＳＥＥＬＥＩＲＦＥＥＣＰＧＴＫＶＨＶＥＥＴＣＧＴＲＧＰＳＬＲＳＴＴＡＳＧＲＶＩＥＥＷＣＣＲＥＣＴＭＰＰＬＳＦＲＡＫＤＧＣＷＹＧＭＥＩＲＰＲＫＥＰＥＳＮＬＶＲＳＭＶＴ（配列番号１）。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１の配列と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％，少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％，少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＵ５０１２１５．１（配列番号２）の配列によってコードされるアミノ酸配列に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＵ５０１２１５．１の配列によってコードされるアミノ酸配列のアミノ酸位置７９５〜１１４５であり得る。いくつかの実施形態では、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９に由来し得る。
【００８９】
「配列同一性」、「％配列同一性」、「％同一性」、「％同一」または「配列アラインメント」は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との比較または第１の核酸配列と第２の核酸配列との比較を意味し、この比較に基づくパーセンテージとして計算される。この計算の結果は、「同一パーセント」または「ＩＤパーセント」として記載することができる。
【００９０】
一般に、２つの異なるアプローチのうちの１つによって配列同一性を計算するために、配列アラインメントを使用することができる。第１のアプローチでは、単一の位置でのミスマッチと単一の位置でのギャップの両方が、最終的な配列同一性の計算で非同一位置としてカウントされる。第２のアプローチでは、単一の位置でのミスマッチは、最終的な配列同一性の計算で非同一位置としてカウントされるが、単一の位置でのギャップは、最終的な配列同一性の計算で非同一位置としてカウントされない（無視される）。言い換えると、第２のアプローチでは、ギャップは、最終的な配列同一性の計算において無視される。これらの２つのアプローチの違い、すなわち、単一の位置でのギャップを非同一位置としてカウントするか、単一の位置でのギャップを無視するかということは、２つの配列間の配列同一性の値に変動性をもたらし得る。
【００９１】
配列同一性は、アラインメントを生成し、最終的な配列同一性の計算で単一の位置でのミスマッチと単一の位置でのギャップの両方を非同一位置としてカウントして同一性を計算するプログラムによって決定される。例えば、Ｎｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳ）は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を実装しており、最初に第１の配列と第２の配列との間のアラインメントを生成し、次いで、アラインメント長にわたって同一である位置の数をカウントし、次いで、同一残基数をアラインメント長で割り、次いで、この数に１００を掛けて％配列同一性を生成することによって、デフォルト設定に従って配列同一性を計算する［％配列同一性＝（同一残基数／アラインメント長）×１００）］。
【００９２】
配列同一性は、両方の配列を全長にわたって示し、そのため、第１の配列と第２の配列が全長で示される、ペアワイズアラインメントから計算することができる（「グローバル配列同一性」）。例えば、Ｎｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ）は、そのようなアラインメントを生成する；％配列同一性＝（同一残基数／アラインメント長）×１００）］。
【００９３】
配列同一性は、第１の配列または第２の配列のローカル領域のみを示すペアワイズアラインメントから計算することができる（「ローカル同一性」）。例えば、Ｂｌａｓｔプログラム（ＮＣＢＩ）は、そのようなアラインメントを生成する；％配列同一性＝（同一残基数／アラインメント長）×１００）］。
【００９４】
配列アラインメントは、好ましくは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７９）４８，ｐ．４４３−４５３）を使用して生成される。好ましくは、「ＮＥＥＤＬＥ」プログラム（Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＯＳＳ））をプログラムのデフォルトパラメーターで使用する（ギャップ開始＝１０．０、ギャップ伸長＝０．５及びタンパク質のマトリックス＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２及びヌクレオチドのマトリックス＝ＥＤＮＡＦＵＬＬ）。次いで、両方の配列を全長にわたって示し、そのため、第１の配列と第２の配列が全長で示される、アラインメントから配列同一性を計算することができる（「グローバル配列同一性」）。例えば、％配列同一性＝（同一残基数／アラインメント長）×１００）］。
【００９５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異は、ＮＳ１ポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸位置に生じる。いくつかの実施形態では、変異は、配列番号１の位置９８、またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１に対してアラインメントした場合、配列番号１の位置９８に対応する位置に生じる。いくつかの実施形態では、位置９８の変異は、トリプトファンからグリシンへの置換である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を含む。配列番号１の位置９８に対応する位置は、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、ＮＳ−１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に対してアラインメントすることによって、決定され得る。配列番号１の位置９８にあるトリプトファン残基に対応する、ジカウイルス以外のウイルスのアミノ酸残基を本出願の図７に示し、当該残基を四角で囲む。いくつかの実施形態では、位置９８の変異は、トリプトファンからグリシンへの置換である。いくつかの実施形態では、位置９８の変異は、配列番号１の位置９８のトリプトファンからグリシンへの置換である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、ＮＳ１タンパク質内に少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含有し、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５ウイルスタンパク質のうちの１つ以上に少なくとも１つの変異（例えば、少なくとも１つの適応変異）を含有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、ＮＳ１タンパク質内に１つ以上の非ヒト細胞適応変異を含有し、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５ウイルスタンパク質のうちの１つ以上に少なくとも１つの変異（例えば、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異）を含有しない。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、ＮＳ１タンパク質内に少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含有し、エンベロープタンパク質Ｅ内に少なくとも１つの変異（例えば、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異）を含有しない。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）に少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含有する全粒子不活化ウイルスを含み、ジカウイルスエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）に変異を含まない。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を含有し、エンベロープタンパク質Ｅ内に変異を含有しない。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を含有する全粒子不活化ウイルスを含み、ジカウイルスエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）に変異を含まない。いくつかの実施形態では、全粒子不活化ウイルスは、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）に少なくとも１つの変異を含有し、エンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２の対応する配列と同じである。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を含有し、エンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２の対応する配列と同じである。いくつかの実施形態では、全粒子不活化ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を含有し、エンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２の対応する配列と同じである。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスなどの本開示の抗原は、少なくとも１つの適応変異を欠くジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を増大させる、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含有する。いくつかの実施形態では、ジカウイルスなどの本開示の抗原は、少なくとも１つの適応変異を欠くジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増大させる、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含有する。いくつかの実施形態では、ジカウイルスなどの本開示の抗原は、ジカウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）内などの望ましくない変異の発生を減少または阻害する、少なくとも１つの非ヒト細胞適応変異を含有する。
【００９９】
本開示の上記の実施形態では、例示的なペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトのパラメーターを使用するＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムである（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用して、ギャップ開始ペナルティ＝１０．０、及びギャップ伸長ペナルティ＝０．５）。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅツールに簡便に実装される。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスに由来する本開示の抗原は、本開示のワクチン及び免疫原性組成物のいずれかに使用することができる。例えば、本開示の抗原は、ジカウイルス感染症を治療もしくは予防することを、それを必要とするヒト対象において行うこと、及び／またはジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導することを、それを必要とするヒト対象において行うことに有用であり得る。
【０１０１】
ワクチン及び免疫原性組成物の生産
本開示の他の態様は、少なくとも１つのジカウイルスに由来する１つ以上の本開示の抗原を含有する、ジカウイルスワクチン及び免疫原性組成物に関する。そのようなワクチン及び免疫原性組成物は、例えば、ジカウイルス感染症を治療もしくは予防することを、それを必要とするヒト対象において行うこと、及び／またはジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導することを、それを必要とするヒト対象において行うことに有用であり得る。本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、限定するものではないが、精製されたウイルス、不活化ウイルス、弱毒化ウイルス、組み換えウイルス、サブユニットワクチンのための精製された及び／または組み換えウイルスタンパク質を含み得る。本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、精製された抗原ワクチンもしくは免疫原性組成物、サブユニットワクチンもしくは免疫原性組成物、不活化全粒子ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物、もしくは精製された不活化全粒子ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物、または弱毒化ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物を更に含み得る。
【０１０２】
本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の生産は、ジカウイルスの成長と、成長したウイルスから抗原を調製することを含む。細胞培養での成長は、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を調製するための方法である。ウイルスを成長させるための細胞は、懸濁液中または接着条件下で培養することができる。
【０１０３】
本開示の少なくとも１つのウイルスの成長に好適な細胞株は、好ましくは、哺乳動物起源であり、また、限定するものではないが、昆虫細胞（例えば、本明細書に記載される蚊細胞、ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓由来）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）またはＷＯ９７／３７００１に記載のＭＤＣＫ  ３３０１６、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）、ネコ、及び齧歯類（例えば、ハムスター細胞、例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞））が含まれ、例えば、成体期、新生児期、胎児期、及び胚芽期を含む、多種多様な発達段階から得ることができる。特定の実施形態では、細胞は不死化される（例えば、ＷＯ０１／３８３６２及びＷＯ０２／４０６６５に記載され、ＥＣＡＣＣ受託番号９６０２２９４０として受託されているようなＰＥＲＣ．６細胞）。好ましい実施形態では、哺乳動物細胞が利用され、次の非限定的な細胞種：線維芽細胞（例えば、真皮、肺）、内皮細胞（例えば、大動脈、冠状動脈、肺、血管、皮膚微小血管、臍）、肝細胞、ケラチノサイト、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状細胞）、乳腺細胞（例えば、上皮）、平滑筋細胞（例えば、血管、大動脈、冠状動脈、動脈、子宮、気管支、頸部、網膜周皮細胞）、メラノサイト、神経系細胞（例えば、アストロサイト）、前立腺細胞（例えば、上皮、平滑筋）、腎臓細胞（例えば、上皮、メサンギウム、近位尿細管）、骨格細胞（例えば、軟骨細胞、破骨細胞、造骨細胞）、筋肉細胞（例えば、筋芽細胞、骨格、平滑、気管支）、肝臓細胞、網膜芽細胞、及び間質細胞のうちの１つ以上から選択され、及び／またはこれらに由来し得る。ＷＯ９７／３７０００及びＷＯ９７／３７００１は、懸濁液及び無血清培地で成長することが可能な動物細胞及び細胞株の生産が記載されており、ウイルスの生産及び複製に有用である。
【０１０４】
上記細胞種の培養条件は、知られており、様々な公開物に記載されている。あるいは、培地、添加物、及び条件は、例えば、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，Ｎ．Ｊ．）のカタログ及び更なる参考文献に記載されているように、商業的に購入することができる。
【０１０５】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される細胞は、無血清培地及び／またはタンパク質不含培地で培養される。本開示の文脈において、ヒトまたは動物起源の血清に由来する添加物がない培地を無血清培地と呼ぶ。タンパク質不含は、トリプシンまたはウイルス成長に必要とされ得る他のプロテアーゼなどのタンパクを任意選択により含み得るが、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物及び非血清タンパク質を含むことなく、細胞の増殖が生じる培養を意味するものと理解される。そのような培養で成長する細胞は、それ自体が天然にタンパク質を含有している。
【０１０６】
既知の無血清培地には、イスコフ培地、Ｕｌｔｒａ−ＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）またはＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が含まれる。通常の血清含有培地には、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）または最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭまたはＥＤＭ）が含まれ、通常、最大１０％のウシ胎児血清または類似の添加物が使用される。必要に応じて、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭまたはＥＤＭ）を、血清を含有するいずれの添加物も用いることなく使用してもよい。ＰＦ−ＣＨＯ（ＪＨＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）などのタンパク質不含培地、ＰｒｏＣＨＯ  ４ＣＤＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）またはＳＭＩＦ  ７（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの化学的に成分が明らかな培地、及びＰｒｉｍａｃｔｏｎｅ、ＰｅｐｔｉｃａｓｅもしくはＨｙＰｅｐ．（商標）（全てＱｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）またはラクトアルブミン加水分解物（Ｇｉｂｃｏ及び他の製造者）などのマイトジェンペプチドも従来技術において十分に知られている。植物加水分解物をベースにした培地添加物は、ウイルス、マイコプラズマまたは未知の感染因子によるコンタミネーションを排除することができるという点で特に利点がある。
【０１０７】
細胞培養条件（温度、細胞密度、ｐＨ値など）は、本開示に従って採用される細胞株の適合性によって、広範囲にわたって変化し、具体的なウイルス株の要件に適合させることができる。
【０１０８】
培養細胞においてウイルスを増殖させる方法は、一般に、培養細胞に培養する株を接種する工程と、感染細胞をウイルス培養に望ましい時間、例えば、ウイルス価または抗原発現によって決定される時間（例えば、接種後２４及び１６８時間）培養する工程と、増殖したウイルスを回収する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、プラーク精製を介して回収される。培養細胞は、１：５００〜１：１、好ましくは、１：１００〜１：５の細胞比まで、ウイルスが接種される（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０によって測定）。ウイルスは、細胞の懸濁液に加えられるか、または細胞の単層にアプライし、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、ただし、通常３００分を超えない間、２５℃〜４０℃、好ましくは、２８℃〜３８℃で、ウイルスを細胞上に吸着させる。感染した細胞培養物（例えば、単層）は、回収される培養上清のウイルス含量を高めるために、凍結融解または酵素作用のいずれかで取り出してもよい。回収した液体は、その後、不活化または凍結保存される。培養細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは、０．００２〜５、より好ましくは、０．００１〜２の多重感染度（「ＭＯＩ」）で感染させ得る。更により好ましくは、細胞は、約０．０１のＭＯＩで感染させる。感染細胞は、感染から３０〜６０時間後、または感染から３〜１０日後に回収され得る。特定の好ましい実施形態において、細胞は、感染から３〜７日後に回収される。より好ましくは、細胞は、感染から３〜５日後に回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスを放出させるために、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）が細胞培養中に添加されてもよく、プロテアーゼは、培養中の任意の好適な段階で添加され得る。あるいは、特定の実施形態では、感染細胞培養の上清が回収され得、その上清からウイルスが分離または精製されてもよい。
【０１０９】
ウイルス接種物及びウイルス培養物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、リノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、及び／またはパルボウイルス［ＷＯ２００６／０２７６９８］を含まない（すなわち、これらによるコンタミネーションについての試験が行われ、陰性結果が出ている）。
【０１１０】
ウイルスが細胞株上で増殖したら、宿主細胞ＤＮＡの腫瘍形成活性を最小限に抑えるために、最終ワクチン中に残存する細胞株ＤＮＡの量を最小限に抑えることが定石である。混入ＤＮＡは、標準的な精製手順、例えば、クロマトグラフィーなどを使用して、ワクチン調製中に取り除くことができる。残存する宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理によって、例えば、ＤＮａｓｅを使用することによって、向上させることができる。参考文献に開示されている宿主細胞ＤＮＡ汚染を減少させるための簡便な方法（Ｌｕｎｄｂｌａｄ（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１９５−１９７，Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ）Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＶＭ）Ｍａｙ  ２００１．）は、まず、ウイルス成長中に使用することができるＤＮａｓｅ（例えば、ベンゾナーゼ）を使用し、次いで、ウイルス破壊中に使用することができるカチオン系界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）を使用する、２工程の処理を含む。β−プロピオラクトン処理による除去もまた、使用することができる。一実施形態では、汚染ＤＮＡは、培養上清のベンゾナーゼ処理によって除去される。
【０１１１】
抗原の生産
限定するものではないが、精製されたウイルス、不活化ウイルス、不活化全粒子ウイルス、弱毒化ウイルス、組み換えウイルス、またはサブユニットワクチンのための精製された及び／または組み換えウイルスタンパク質を含む、ジカウイルス感染症を治療及び／または予防し、及び／またはジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導するためのワクチン及び／または免疫原性組成物に使用するための本開示の抗原は、当該技術分野において知られている任意の好適な方法によって、生産及び／または精製もしくは分離され得る。本開示の抗原は、限定するものではないが、ジカウイルスから生産、誘導、精製、及び／または分離された、全粒子ウイルス、弱毒化ウイルス、不活化ウイルス、不活化全粒子ウイルス、タンパク質、ポリペプチド（活性タンパク質及びタンパク質内の個々のポリペプチドエピトープを含む）、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖コンジュゲート、多糖のペプチド及び非ペプチド模倣体、ならびに他の分子、小分子、脂質、糖脂質、及び炭水化物を含み得る。例えば、好適な抗原は、限定するものではないが、ジカウイルスに由来する、Ｃ、ｐｒＭ、及び／またはＥなどの構造ポリペプチド、ならびにＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及び／またはＮＳ５などの非構造ポリペプチドを含み得る。
【０１１２】
一実施形態では、本開示の抗原は、精製された不活化全粒子ジカウイルスである。
【０１１３】
本開示の抗原は、化学的もしくは酵素的に合成され、組み換え的に生産され、天然源から分離され、または前述の組み合わせであってよい。特定の実施形態では、本開示の抗原は、本開示の少なくとも１つのジカウイルスから生産され、精製され、分離され、及び／または誘導される。本開示の抗原は、精製、部分的精製、または粗抽出物であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗原は、「ワクチン及び免疫原性組成物の生産」という題の上記セクションに記載されているように生産された不活化ウイルスなどのウイルスである。
【０１１４】
特定の実施形態では、１つ以上の本開示の抗原は、非ヒト細胞を培養することによって、生産され得る。本開示の１つ以上の抗原の生産に好適な細胞株は、昆虫細胞（例えば、本明細書に記載される蚊細胞のいずれか）を含み得る。本開示の１つ以上の抗原の生産に好適な細胞株はまた、哺乳動物起源の細胞であり得、また、限定するものではないが、ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓由来）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）またはＷＯ９７／３７００１に記載のＭＤＣＫ  ３３０１６、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）、ネコ、及び齧歯類（例えば、ハムスター細胞、例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞））が含まれ、例えば、成体期、新生児期、胎児期、及び胚芽期を含む、多種多様な発達段階から得ることができる。特定の実施形態では、細胞は、不死化される（例えば、ＷＯ０１／３８３６２及びＷＯ０２／４０６６５に記載され、ＥＣＡＣＣ受託番号９６０２２９４０として受託されているようなＰＥＲＣ．６細胞）。好ましい実施形態では、哺乳動物細胞が利用され、次の非限定的な細胞種：線維芽細胞（例えば、真皮、肺）、内皮細胞（例えば、大動脈、冠状動脈、肺、血管、皮膚微小血管、臍）、肝細胞、ケラチノサイト、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状細胞）、乳腺細胞（例えば、上皮）、平滑筋細胞（例えば、血管、大動脈、冠状動脈、動脈、子宮、気管支、頸部、網膜周皮細胞）、メラノサイト、神経系細胞（例えば、アストロサイト）、前立腺細胞（例えば、上皮、平滑筋）、腎臓細胞（例えば、上皮、メサンギウム、近位尿細管）、骨格細胞（例えば、軟骨細胞、破骨細胞、造骨細胞）、筋肉細胞（例えば、筋芽細胞、骨格、平滑、気管支）、肝臓細胞、網膜芽細胞、及び間質細胞のうちの１つ以上から選択され、及び／またはこれらに由来し得る。ＷＯ９７／３７０００及びＷＯ９７／３７００１は、懸濁液及び無血清培地で成長することが可能な動物細胞及び細胞株の生産が記載されており、ウイルス抗原の生産に有用である。特定の実施形態では、非ヒト細胞は、無血清培地で培養される。
【０１１５】
ポリペプチド抗原は、当該技術分野において知られている標準的なタンパク質精製方法を使用して天然源から分離され得、これらの方法には、限定するものではないが、液体クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー、高速タンパク質液体クロマトグラフィーなど）、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動（一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動を含む）、アフィニティークロマトグラフィー、または他の精製技術が含まれる。多くの実施形態では、抗原は、精製された抗原であり、例えば、約５０％〜約７５％の純度、約７５％〜約８５％の純度、約８５％〜約９０％の純度、約９０％〜約９５％の純度、約９５％〜約９８％の純度、約９８％〜約９９％の純度、または９９％を超えた純度の、精製された抗原である。精製された抗原の純度は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定することができ、％純度は、曲線下総面積に対するメインピークの％に対応する。サイズ排除クロマトグラフィーで精製された抗原のメインピークは、サイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下総面積の８５％超、またはサイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下総面積の９０％超、またはサイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下総面積の９５％超、もしくは９８％超、もしくは９９％超であり得る。そのような結果は、本発明の意味の範囲内で、「精製された」抗原とみなされる。
【０１１６】
純度に関する上記開示と一致して、「精製されたジカウイルス」という用語は、サイズ排除クロマトグラフィーで精製されたジカウイルスのメインピークが、サイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下総面積の８５％超、またはサイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下総面積の９０％超、またはサイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下総面積の９５％超、もしくは９８％超、もしくは９９％超であることを意味する。
【０１１７】
純度に関する上記開示と一致して、「精製された不活化全粒子ジカウイルス」という用語は、サイズ排除クロマトグラフィーで精製された不活化全粒子ジカウイルスのメインピークが、サイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下総面積の８５％超、またはサイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下総面積の９０％超、またはサイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下総面積の９５％超、もしくは９８％超、もしくは９９％超であることを意味する。
【０１１８】
固相ペプチド合成技術を採用することができ、そのような技術は、当業者に知られている。Ｊｏｎｅｓ，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）（１９９４）を参照されたい。一般に、そのような方法において、ペプチドは、固相結合成長ペプチド鎖に活性化モノマー単位を逐次付加していくことにより生成される。
【０１１９】
ポリペプチドの生成には、十分に確立された組み換えＤＮＡ技術を採用することができ、例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトを、適切な宿主細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養で単細胞実体として成長した真核生物宿主細胞、例えば、イースト菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞など）または原核細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養で成長したもの）に導入して、遺伝子組み換えされた宿主細胞を作製すると、適切な培養条件下で、遺伝子組み換えされた宿主細胞によって、タンパク質が生成される。
【０１２０】
不活化及び弱毒化ウイルス免疫原性組成物に加えて、サブユニット免疫原性組成物、またはジカウイルスの抗原性成分を動物に提示する他のタイプの免疫原性組成物を使用することができる。抗原性成分は、ヒトに注入した場合、ヒトの免疫応答を刺激して、ヒトがジカウイルスに対する防御免疫を起こす、タンパク質、糖タンパク質、脂質結合タンパク質もしくは糖タンパク質、修飾された脂質部分、または他のウイルス成分であり得る。サブユニット免疫原性組成物の場合、ウイルスは、上記のような哺乳動物細胞で培養され得る。細胞培養物は、ホモジナイズすることができ、免疫原性組成物は、細胞培養物のホモジネートを適切なカラムもしくは適切な孔径のフィルターに通すことにより、または細胞培養ホモジネートの遠心分離により、分離することができる。
【０１２１】
抗原性成分がタンパク質である場合、当該タンパク質をコードする核酸を単離して、当該単離された核酸を含有する免疫原性組成物を生成することができる。抗原性成分をコードする核酸は、真核生物プロモーターのシグナル配列の下流のプラスミド上に配置され得る。当該プラスミドは、１つ以上の選択マーカーを含有し得、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、または他の好適な細菌などの、弱毒化された原核生物にトランスフェクトされ得る。次いで、細菌をヒトに投与することができ、それにより、ヒトは、抗原性成分に対して防御免疫応答を起こすことができる。あるいは、抗原性成分をコードする核酸は、原核生物プロモーターの下流に配置され、１つ以上の選択マーカーを有し、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、または他の好適な細菌などの、弱毒化された原核生物にトランスフェクトされ得る。次いで、細菌は、目的抗原に対する免疫応答が望まれる、真核生物のヒト対象に投与することができる。例えば、米国特許第６，５００，４１９号を参照されたい。
【０１２２】
サブユニット免疫原性組成物の場合、ジカウイルスのタンパク質性抗原性成分をコードする核酸は、国際特許出願公開第ＷＯ００／３２０４７号（Ｇａｌｅｎ）及び国際特許出願公開第ＷＯ０２／０８３８９０号（Ｇａｌｅｎ）に記載されるように、プラスミドにクローニングされ得る。次いで、プラスミドは、細菌にトランスフェクトされ得、細菌は、所望の抗原タンパク質を生産することができる。所望の抗原タンパク質は、両特許出願に記載されている様々な方法によって、分離及び精製することができる。
【０１２３】
ウイルス不活化
本開示の特定の態様は、ジカウイルスに由来する１つ以上の抗原を含有する、ジカウイルスワクチン及び免疫原性組成物に関する。本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、精製されたウイルス、全粒子ウイルス、組み換えウイルス、弱毒化生全粒子ウイルス、あるいは、好ましくは、不活化全粒子ウイルス、または不活化ウイルスに由来するサブユニット、ポリペプチド、及び／または抗原を含み得る。したがって、本開示の特定の好ましい実施形態は、少なくとも１つの不活化ジカウイルスに由来する１つ以上の抗原を含有する、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物に関する。
哺乳動物細胞への感染能力を破壊しつつも、ウイルスの構造を破壊しないようにウイルスを不活化または殺傷する方法は、当該技術分野において知られている。そのような方法は、化学的手段と物理的手段の両方を含む。ウイルスを不活化するのに好適な手段には、限定するものではないが、界面活性剤、ホルマリン（本明細書中「ホルムアルデヒド」とも呼ばれる）、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、熱、電磁放射線照射、Ｘ線照射、ガンマ線照射、紫外線照射（ＵＶ照射），ＵＶ−Ａ照射、ＵＶ−Ｂ照射、ＵＶ−Ｃ照射、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）及びそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の有効量の剤による処理が含まれる。本明細書でホルムアルデヒドの濃度に言及する場合、それは、ホルムアルデヒドの濃度を指す（ホルマリンの濃度ではない）。したがって、「０．０１％のホルムアルデヒド濃度（ｗ／ｖ）」は、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを指し、この濃度をホルマリン原液（典型的に３７質量％のホルムアルデヒドを含有する）中のホルムアルデヒド濃度に対して更に補正する必要はない。例えば、ウイルス調製物中のそのようなホルムアルデヒド濃度は、１．８５％（ｗ／ｖ）のホルムアルデヒド含量を有する作業溶液にホルマリンを希釈し、次いで、それを、ジカウイルス調製物などのウイルス調製物と混合するときに必要な濃度に更に希釈することによって、得ることができる。
【０１２４】
本開示の特定の実施形態では、少なくとも１つのウイルスは、化学的に不活化される。化学的不活化のための剤及び化学的不活化の方法は、当該技術分野において知られており、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのウイルスは、ＢＰＬ、ホルマリン、またはＢＥＩのうちの１つ以上で化学的に不活化される。少なくとも１つのウイルスがＢＰＬで化学的に不活化される特定の実施形態では、ウイルスは、１つ以上の修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、修飾された核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾された核酸は、アルキル化核酸である。他の実施形態では、１つ以上の修飾は、修飾されたポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾されたポリペプチドは、修飾されたシステイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リシン、セリン、及びトレオニンのうちの１つ以上を含む、修飾されたアミノ酸残基を含有する。
【０１２５】
少なくとも１つのウイルスがホルマリンで化学的に不活化される特定の実施形態では、不活化ウイルスは、１つ以上の修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、修飾されたポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、架橋ポリペプチドを含み得る。少なくとも１つのウイルスがホルマリンで化学的に不活化されるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、ホルマリンを更に含む。少なくとも１つのウイルスがＢＥＩで化学的に不活化される特定の実施形態では、ウイルスは、１つ以上の修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、修飾された核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾された核酸は、アルキル化核酸である。
【０１２６】
少なくとも１つのウイルスがホルマリンで化学的に不活化されるいくつかの実施形態では、任意の未反応の残留ホルマリンをメタ重亜硫酸ナトリウムで中和し、透析し、及び／または緩衝液交換することで、未反応の残留ホルマリンを除去することができる。いくつかの実施形態では、メタ重亜硫酸ナトリウムは、過剰に添加される。いくつかの実施形態では、溶液は、インラインスタティックミキサーなどのミキサーを使用して混合され、その後、濾過または更に精製され得る（例えば、クロスフロー濾過システムの使用による）。
【０１２７】
本開示の特定の実施形態は、ジカウイルス調製物を不活化するための方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ウイルス調製物の生産に使用される１つ以上の非ヒト細胞からジカウイルス調製物を分離し、続いて精製することと、（ｂ）ウイルス調製物を有効量のホルマリンで処理することと、を含む。
【０１２８】
本開示の特定の実施形態は、ジカウイルス調製物を不活化するための方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を分離することであって、当該細胞は、ジカウイルス調製物を生産するために使用され、ジカウイルス調製物を分離することは、（ｉ）深層濾過、（ｉｉ）緩衝液交換及び／または希釈、（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィーから選択される１つ以上の工程を含む、分離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物をホルムアルデヒドで処理することであって、％（ｗ／ｖ）で測定したときのホルムアルデヒド濃度と、日単位で測定したときのホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０２５〜０．５である、処理することと、を含む。
【０１２９】
特定の実施形態では、有効量のホルマリンで処理することは、限定するものではないが、約０．００１％ｖ／ｖ〜約３．０％ｖ／ｖの範囲の量のホルマリンで処理することを含む。例えば、有効量のホルマリンで処理することは、約０．００１％〜約３．０％ｖ／ｖ、約０．００５％〜約２．０％ｖ／ｖ、もしくは約０．０１％〜約１．０％ｖ／ｖの範囲の量、または約０．００１％、約０．００２５％、約０．００５％、約０．００７５％、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．２５％、約１．５％、約１．７５％、約２．０％、約２．２５％、約２．５％、約２．７５％、もしくは約３．０％ｖ／ｖの量のホルマリンで処理することを含み得る。
【０１３０】
方法の特定の実施形態では、ジカウイルス調製物は、約２℃〜約４２℃の範囲の温度でホルマリンにより処理される。例えば、ジカウイルス調製物は、約２℃〜約４２℃、約２℃〜約８℃、約１５℃〜約３７℃、約１７℃〜約２７℃、約２０℃〜約２５℃の範囲の温度、または約２℃、約４℃、約８℃、約１０℃、約１５℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３７℃、もしくは約４２℃の温度で、ホルマリンにより処理され得る。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、室温で、ホルマリンにより処理される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約１日間、ホルマリンにより処理される。例えば、ジカウイルス調製物は、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、例えば、１５日間以下、例えば、５〜１５日間、ホルマリンにより処理され得る。例えば、ジカウイルス調製物は、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２６日間、少なくとも約２７日間、少なくとも約２８日間、少なくとも約２９日間、少なくとも約３０日間、またはそれ以上の間、ホルマリンにより処理され得る。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約９日間、ホルマリンにより処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約１１日間、ホルマリンにより処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約１４日間、ホルマリンにより処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約２０日間、ホルマリンにより処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約３０日間、ホルマリンにより処理される。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃〜３０℃の温度で、８〜１２日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃〜３０℃の温度で、９〜１１日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃〜３０℃の温度で、１０日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００８〜０．０１５％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃〜３０℃の温度で、８〜１２日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００８〜０．０１５％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃〜３０℃の温度で、９〜１１日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００８〜０．０１５％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃〜３０℃の温度で、１０日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃〜３０℃の温度で、８〜１２日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃〜３０℃の温度で、９〜１１日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃〜３０℃の温度で、１０日間処理される。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１８℃〜２５℃の温度で、８〜１２日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１８℃〜２５℃の温度で、９〜１１日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１８℃〜２５℃の温度で、１０日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００８〜０．０１５％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１８℃〜２５℃の温度で、８〜１２日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００８〜０．０１５％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１８℃〜２５℃の温度で、９〜１１日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００８〜０．０１５％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１８℃〜２５℃の温度で、１０日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１８℃〜２５℃の温度で、８〜１２日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１８℃〜２５℃の温度で、９〜１１日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１８℃〜２５℃の温度で、１０日間処理される。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、２２℃の温度で、８〜１２日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、２２℃の温度で、９〜１１日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、２２℃の温度で、１０日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００８〜０．０１５％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、２２℃の温度で、８〜１２日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００８〜０．０１５％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、２２℃の温度で、９〜１１日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００８〜０．０１５％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、２２℃の温度で、１０日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、２２℃の温度で、８〜１２日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、２２℃の温度で、９〜１１日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、２２℃の温度で、１０日間処理される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０５〜０．２５である。いくつかの実施形態では、％（ｗ／ｖ）で測定したときのホルムアルデヒド濃度と、日単位で測定したときのホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０７５〜０．１５である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．１である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度は、０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．０２％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度は、０．００７５％（ｗ／ｖ）〜０．０１５％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、％（ｗ／ｖ）で測定したときのホルムアルデヒド濃度と、日単位で測定したときのホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０２５〜０．５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．０２％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０２５〜０．５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．００７５％（ｗ／ｖ）〜０．０１５％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０２５〜０．５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、％（ｗ／ｖ）で測定したときのホルムアルデヒド濃度と、日単位で測定したときのホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０５〜０．２５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．０２％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０５〜０．２５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．００７５％（ｗ／ｖ）〜０．０１５％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０５〜０．２５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、％（ｗ／ｖ）で測定したときのホルムアルデヒド濃度と、日単位で測定したときのホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０７５〜０．１５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．０２％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０７５〜０．１５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．００７５％（ｗ／ｖ）〜０．０１５％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０７５〜０．１５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、％（ｗ／ｖ）で測定したときのホルムアルデヒド濃度と、日単位で測定したときのホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．１であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．０２％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．１であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．００７５％（ｗ／ｖ）〜０．０１５％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．１であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、％（ｗ／ｖ）で測定したときのホルムアルデヒド濃度と、日単位で測定したときのホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０２５〜０．５であり、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間は、８〜１２日である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０２５〜０．５であり、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間は、９〜１１日である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０２５〜０．５であり、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間は、１０日である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、％（ｗ／ｖ）で測定したときのホルムアルデヒド濃度と、日単位で測定したときのホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０５〜０．２５であり、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間は、８〜１２日である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０５〜０．２５であり、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間は、９〜１１日である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０５〜０．２５であり、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間は、１０日である。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、％（ｗ／ｖ）で測定したときのホルムアルデヒド濃度と、日単位で測定したときのホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０７５〜０．１５であり、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間は、８〜１２日である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０７５〜０．１５であり、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間は、９〜１１日である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０７５〜０．１５であり、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間は、１０日である。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、％（ｗ／ｖ）で測定したときのホルムアルデヒド濃度と、日単位で測定したときのホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．１であり、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間は、８〜１２日である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．１であり、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間は、９〜１１日である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度と、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．１であり、ホルムアルデヒドとのインキュベーション期間は、１０日である。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、方法は、未反応ホルマリンを有効量のメタ重亜硫酸ナトリウムで中和することを更に含む。いくつかの実施形態では、有効量のメタ重亜硫酸ナトリウムは、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲である。例えば、メタ重亜硫酸ナトリウムは、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、もしくは約１ｍＭ〜約１０ｍＭの有効濃度、または約０．０１ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２５ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．７５ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ  約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭもしくは約１００ｍＭの濃度で添加され得る。いくつかの実施形態では、ホルマリンは、約２ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウムで中和される。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ウイルス調製物の生産に使用される１つ以上の非ヒト細胞からジカウイルス調製物を分離し、続いて精製することと、（ｂ）ウイルス調製物を有効量のホルマリンで処理することと、（ｃ）ウイルス調製物を有効量のメタ重亜硫酸ナトリウムで中和することと、（ｄ）中和されたウイルス調製物を精製することと、を含む。ウイルス調製物を精製する方法は、当該技術分野において知られている任意の方法を採用することができ、限定するものではないが、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）、マルチモードクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、及び／または陰イオン交換クロマトグラフィーを使用することを含む。いくつかの実施形態では、中和されたウイルス調製物は、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）によって精製される。いくつかの実施形態では、ウイルス調製物は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上の量まで高度に精製される。
【０１４７】
したがって、本開示の特定の実施形態は、精製された不活化全粒子ジカウイルスを含有する、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物に関する。本明細書で使用される「不活化全粒子ジカウイルス」という用語は、有効量のホルマリンによる処理などの不活性化方法で処理されたジカウイルスを含むことが意図される。そのような処理は、ウイルスの構造を破壊しないものと考えられ、すなわち、ウイルスの二次、三次または四次構造及び免疫原性エピトープを破壊せず、不活化ジカウイルスは、不活化されていないジカウイルスに感染し得る宿主細胞に感染する可能性はもはやない。一実施形態では、不活化ジカウイルスは、もはやＶＥＲＯ細胞に感染することができず、ＶＥＲＯ細胞に細胞変性効果を及ぼすこともない。
【０１４８】
ジカウイルス調製物の不活化の完全性を決定するための方法は、
（ｉ）不活化工程に供したジカウイルス調製物を昆虫細胞に接種し、当該昆虫細胞を第１の期間インキュベートし、それにより、昆虫細胞上清を生産する工程と、
（ｉｉ）（ｉ）で生産された昆虫細胞上清を哺乳動物細胞に接種し、当該哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートする工程と、
（ｉｉｉ）当該ウイルス調製物が哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残存複製ウイルスを含有するかどうかを決定する工程と、を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物の不活化の完全性を決定するための方法は、次の工程：
（ｉ）不活化工程に供したジカウイルス調製物をＣ６／３６細胞に接種し、当該Ｃ６／３６細胞を第１の期間インキュベートし、それにより、Ｃ６／３６細胞上清を生産する工程と、
（ｉｉ）（ｉ）で生産されたＣ６／３６細胞上清をＶｅｒｏ細胞に接種し、当該Ｖｅｒｏ細胞を第２の期間インキュベートする工程と、
（ｉｉｉ）当該ウイルス調製物がＶｅｒｏ細胞に細胞変性効果をもたらす残存複製ウイルスを含有するかどうかを決定する工程と、を含む。
【０１５０】
第２の期間の終了時に、ウイルス調製物が哺乳動物細胞に対する細胞変性効果を有するかどうかが決定される。細胞変性効果は、ウイルスの侵入、感染、及びウイルス複製中の細胞からの出芽によって生じる細胞構造のあらゆる変化である。本開示の方法では、細胞変性効果は、細胞がフェノールレッド含有培地で培養される場合、ピンクからオレンジもしくは黄色への培地の色の変化によって、または哺乳動物細胞の顕微鏡検査によって、決定される。哺乳動物細胞の顕微鏡検査で、細胞が円形になり、組織培養容器（プレート、ウェルまたはフラスコ）からはがされ始めるか、または組織培養プレート／フラスコから離れているのが認められた場合、細胞変性効果が存在するとみなされる。細胞変性効果の他の証拠には、隣接細胞の融合による合胞体の形成、及び核封入体または細胞質封入体の出現が含まれる。
【０１５１】
上述のとおり、本明細書で開示される方法は、極めて低い検出限界を有する。この方法では、ＴＣＩＤ５０  １．０未満のウイルス含量を検出することができる。いくつかの実施形態では、ＴＣＩＤ５０  ０．８未満のウイルス含量を検出することができる。いくつかの実施形態では、ＴＣＩＤ５０  ０．５未満のウイルス含量を検出することができる。いくつかの実施形態では、ＴＣＩＤ５０  ０．２未満のウイルス含量を検出することができる。いくつかの実施形態では、ＴＣＩＤ５０  ０．１未満のウイルス含量を検出することができる。
【０１５２】
したがって、本開示では、「不活化全粒子ジカウイルス」という用語は、特に、ジカウイルスが、約０．００１％ｖ／ｖ〜約３．０％ｖ／ｖの範囲の量のホルマリンにより、約１５℃〜約３７℃の範囲の温度で５〜１５日間、特に０．０２％ｖ／ｖホルムアルデヒドにより、２２℃で１０日間、または特に０．０１％ｖ／ｖホルムアルデヒドにより、２２℃で１０日間処理される方法から得ることができるジカウイルスを指す。この定義は、ジカウイルスが、約０．００１％ｖ／ｖ〜約３．０％ｖ／ｖの範囲の量のホルマリンにより、約１５℃〜約３７℃の範囲の温度で５〜１５日間、特に０．０２％ｖ／ｖホルムアルデヒドにより、２２℃で１０日間、または特に０．０１％ｖ／ｖホルムアルデヒドにより、２２℃で１０日間処理される、方法から得ることができるジカウイルスを包含することが意図されるが、他の方法でも同じ不活化全粒子ジカウイルスが生じ得るので、これらに限定されるものと理解されるべきではない。とは言え、特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、ジカウイルスが、約０．００１％ｖ／ｖ〜約３．０％ｖ／ｖの範囲の量のホルマリンにより、約１５℃〜約３７℃の範囲の温度で５〜１５日間、特に０．０２％ｖ／ｖホルムアルデヒドにより、２２℃で１０日間、または特に０．０１％ｖ／ｖホルムアルデヒドにより、２２℃で１０日間処理される、方法から得られる。
【０１５３】
あるいは、本開示内において、「不活化全粒子ジカウイルス」は、このように、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む方法によって試験され、工程（ｉｉｉ）において、いかなるプラーク形成も示さない、ジカウイルスを指す：
（ｉ）不活化工程に供したジカウイルス調製物を昆虫細胞に接種し、当該昆虫細胞を第１の期間インキュベートし、それにより、昆虫細胞上清を生産する工程と、
（ｉｉ）（ｉ）で生産された昆虫細胞上清を哺乳動物細胞に接種し、当該哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートする工程と、
（ｉｉｉ）当該ウイルス調製物が哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残存複製ウイルスを含有するかどうかを決定する工程。
【０１５４】
したがって、「精製された不活化全粒子ジカウイルス」という用語は、ジカウイルスが、約０．００１％ｖ／ｖ〜約３．０％ｖ／ｖの範囲の量のホルマリンにより、約１５℃〜約３７℃の範囲の温度で５〜１５日間、特に０．０２％ｖ／ｖホルムアルデヒドにより、２２℃で１０日間、または特に０．０１％ｖ／ｖホルムアルデヒドにより、２２℃で１０日間処理され、あるいは、不活化の完全性を決定するための上記方法によって、また、必要に応じて、精製工程に供される、方法から得ることができるまたは得られるジカウイルスを指す。したがって、精製されたジカウイルスは、精製されていないジカウイルスよりも、Ｖｅｒｏ細胞タンパク質などの宿主細胞タンパク質及びＶｅｒｏ細胞ＤＮＡなどの宿主細胞ＤＮＡの含有量が低い。したがって、「精製された不活化全粒子ジカウイルス」という用語は、ジカウイルスが、約０．００１％ｖ／ｖ〜約３．０％ｖ／ｖの範囲の量のホルマリンにより、約１５℃〜約３７℃の範囲の温度で５〜１５日間、特に０．０２％ｖ／ｖホルムアルデヒドにより、２２℃で１０日間、または特に０．０１％ｖ／ｖホルムアルデヒドにより、２２℃で１０日間処理され、あるいは、不活化の完全性を決定するための上記方法によって、また、サイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下総面積が少なくとも８５％のメインピークをもたらす、方法から得ることができるまたは得られるジカウイルスを指す。
【０１５５】
更に、特定のそのような実施形態では、精製された不活化全粒子ジカウイルスは、プラーク精製によって得られるまたは得ることができるクローン分離株である。
【０１５６】
特定のそのような実施形態では、精製された不活化全粒子ジカウイルスは、任意選択により、更にプラーク精製によって得られるまたは得ることができるクローン分離株であり、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を含有し、エンベロープタンパク質Ｅ内にいかなる変異も含有しない。特定のそのような実施形態では、変異は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置のＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異である。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、配列番号２に従うゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０１５７】
少なくとも１つの不活化ジカウイルスに由来する１つ以上の抗原を含有する、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、ジカウイルス感染症を治療もしくは予防することを、それを必要とするヒト対象において行うこと、及び／またはジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導することを、それを必要とするヒト対象において行うことに有用であり得る。
【０１５８】
本開示の他の態様は、本明細書で開示される方法によって得ることが可能な不活化ジカウイルスを含む、ワクチンまたは免疫原性組成物に関する。これらのワクチンまたは免疫原性組成物は、残留ホルムアルデヒドの含量が特に低い。
【０１５９】
「残留ホルムアルデヒド含量」という用語は、ジカウイルスが不活化され、調製物が中和され、任意選択により、１回以上の更なる精製または濾過工程に供せられた後に、ワクチンまたは免疫原性組成物中に依然として存在するホルムアルデヒドの量を指す。米国薬局方によれば、不活化した細菌またはウイルスを含むワクチン中の残留ホルムアルデヒドの上限は、０．０２％であり、これは、１００μｇ／ｍｌのホルムアルデヒドに相当する。
【０１６０】
残留ホルムアルデヒド含量は、当業者に知られている任意の方法によって決定することができる。好適な１つの方法は、ＥＭＥＡ，ＶＩＣＨ  Ｔｏｐｉｃ  ＧＬ２５，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ：Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ，３０  Ａｐｒｉｌ  ２００２に記載されており、エチルベンゾチアゾリンヒドラゾン塩酸塩（ＭＢＴＨ）の使用を含む。他の方法には、アセチルアセトン滴定、塩化第二鉄滴定及び塩基性フクシン試験が含まれる。特に好適な方法は、本明細書に記載される。
【０１６１】
ワクチンまたは免疫原性組成物は、対象に投与することができる形態であり、典型的に、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含有する。
【０１６２】
ワクチンまたは免疫原性組成物中の残留ホルムアルデヒドの含量は、５０μｇ／ｍｌ未満である。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物中の残留ホルムアルデヒド含量は、４５μｇ／ｍｌ未満、４０μｇ／ｍｌ未満、３５μｇ／ｍｌ未満、３０μｇ／ｍｌ未満、２５μｇ／ｍｌ未満、２０μｇ／ｍｌ未満、１５μｇ／ｍｌ未満、または１０μｇ／ｍｌ未満である。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物中の残留ホルムアルデヒド含量は、９．５μｇ／ｍｌ未満、９μｇ／ｍｌ未満、８．５μｇ／ｍｌ未満、８μｇ／ｍｌ未満、７．５μｇ／ｍｌ未満、７μｇ／ｍｌ未満、６．５μｇ／ｍｌ未満、６μｇ／ｍｌ未満、５．５μｇ／ｍｌ未満、５μｇ／ｍｌ未満、４．５μｇ／ｍｌ未満、４μｇ／ｍｌ未満、３．５μｇ／ｍｌ未満、３μｇ／ｍｌ未満、２．５μｇ／ｍｌ未満、２μｇ／ｍｌ未満、１．５μｇ／ｍｌ未満、１μｇ／ｍｌ未満、または０．５μｇ／ｍｌ未満である。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物中の残留ホルムアルデヒド含量は、０．５μｇ／ｍｌ未満である。
【０１６３】
残留ホルムアルデヒド含量を決定するための方法
本開示の他の態様は、不活化ウイルスを含むワクチンまたは免疫原性組成物中の残留ホルムアルデヒド含量を決定するための方法であって、
（ａ）ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物を準備する工程と、
（ｂ）（ａ）の組成物と、リン酸及び２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）を混合して、それにより、混合物を得る工程と、
（ｃ）（ｂ）の混合物を好適な条件下でインキュベートする工程と、
（ｄ）残留ホルムアルデヒドの存在について、当該混合物を分析する工程と、を含む、方法に関する。
【０１６４】
検出試薬としてＤＮＰＨを使用することは、次の利点：（１）高感度、（２）誘導体化されたホルムアルデヒドのＵＶ検出、及び（３）加熱を伴わない１ステップサンプル調製を提供する。本発明の方法は、水酸化アルミニウムなどのアジュバントを含有するワクチン中の残留ホルムアルデヒドを検出するのに特に好適である。方法は、調和国際会議（ＩＣＨ）Ｑ２ガイドラインに従って、特異性、直線性、真度、併行精度、頑健性及び安定性の点でバリデーションが行われた。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物５０部が、１５〜２５％（ｖ／ｖ）リン酸１部及び０．９〜１．１ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨ２．５部と混合される。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物５０部が、２０％（ｖ／ｖ）リン酸１部及び１．０ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨ２．５部と混合される。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、１８℃〜３０℃の温度でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、２０℃〜２５℃の温度でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、２２℃の温度でインキュベートされる。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、１０〜３０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、１５〜２５分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、２０分間インキュベートされる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、１８℃〜３０℃の温度で、１０〜３０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、１８℃〜３０℃の温度で、１５〜２５分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、１８℃〜３０℃の温度で、２０分間インキュベートされる。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、２０℃〜２５℃の温度で、１０〜３０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、２０℃〜２５℃の温度で、１５〜２５分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、２０℃〜２５℃の温度で、２０分間インキュベートされる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、２２℃の温度で、１０〜３０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、２２℃の温度で、１５〜２５分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、２２℃の温度で、２０分間インキュベートされる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物５０部と２０％リン酸１部及び１．０ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨ２．５部との混合物は、１８℃〜３０℃の温度で、１０〜３０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物５０部と２０％リン酸１部及び１．０ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨ２．５部との混合物は、１８℃〜３０℃の温度で、１５〜２５分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物５０部と２０％リン酸１部及び１．０ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨ２．５部との混合物は、１８℃〜３０℃の温度で、２０分間インキュベートされる。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物５０部と２０％リン酸１部及び１．０ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨ２．５部との混合物は、２０℃〜２５℃の温度で、１０〜３０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物５０部と２０％リン酸１部及び１．０ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨ２．５部との混合物は、２０℃〜２５℃の温度で、１５〜２５分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物５０部と２０％リン酸１部及び１．０ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨ２．５部との混合物は、２０℃〜２５℃の温度で、２０分間インキュベートされる。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物５０部と２０％リン酸１部及び１．０ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨ２．５部との混合物は、２２℃の温度で、１０〜３０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物５０部と２０％リン酸１部及び１．０ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨ２．５部との混合物は、２２℃の温度で、１５〜２５分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物５０部と２０％リン酸１部及び１．０ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨ２．５部との混合物は、２２℃の温度で、２０分間インキュベートされる。
【０１７３】
インキュベーション後、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、任意の好適な方法によって分析され得る。一実施形態では、インキュベーション後、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、ＨＰＬＣによって分析される。一実施形態では、インキュベーション後、ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物とリン酸及びＤＮＰＨとの混合物は、逆相ＨＰＬＣによって分析される。一実施形態では、逆相ＨＰＬＣカラムのリガンドは、Ｃ１８、ｎ−ブタール、ｎ−オクチル、フェニル及びシアノプロピルから選択される。一実施形態では、逆相ＨＰＬＣカラムのリガンドは、Ｃ１８である。一実施形態では、水とアセトニトリルの混合物（１：１、ｖ／ｖ）が逆相ＨＰＬＣの移動相として使用される。一実施形態では、検出波長は、３６０ｎｍである。
【０１７４】
一実施形態では、本開示は、不活化ウイルスを含むワクチンまたは免疫原性組成物中の残留ホルムアルデヒド含量を決定するための方法であって、
（ａ）ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む組成物を準備する工程と、
（ｂ）（ａ）の組成物５０部と、２０％リン酸１部及び１ｍｇ／ｍｌの２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）２．５部を混合して、それにより、混合物を得る工程と、
（ｃ）（ｂ）の混合物を室温で２０分間インキュベートする工程と、
（ｄ）残留ホルムアルデヒドの存在について、Ｃ１８カラム及び移動相として水とアセトニトリルの混合物（１：１、ｖ／ｖ）を使用する逆相ＨＰＬＣによって、当該混合物を分析する工程と、を含む、方法を提供する。
【０１７５】
一実施形態では、本開示は、不活化ジカウイルスを含むワクチンまたは免疫原性組成物中の残留ホルムアルデヒド含量を決定するための方法であって、
（ａ）ホルムアルデヒドで処理されたジカウイルスを含む組成物を準備する工程と、
（ｂ）（ａ）の組成物５０部と、２０％リン酸１部及び１ｍｇ／ｍｌの２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）２．５部を混合して、それにより、混合物を得る工程と、
（ｃ）（ｂ）の混合物を室温で２０分間インキュベートする工程と、
（ｄ）残留ホルムアルデヒドの存在について、Ｃ１８カラム及び移動相として水とアセトニトリルの混合物（１：１、ｖ／ｖ）を使用する逆相ＨＰＬＣによって、当該混合物を分析する工程と、を含む、方法を提供する。
【０１７６】
アジュバント
本開示の他の態様は、１つ以上のアジュバントと組み合わせた、本明細書に記載される少なくとも１つのジカウイルスに由来する１つ以上の抗原を含有するジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物に関する。そのようなアジュバントされた本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、ジカウイルス感染症を治療もしくは予防することを、それを必要とするヒト対象において行うこと、及び／またはジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導することを、それを必要とするヒト対象において行うことに有用であり得る。
【０１７７】
ワクチンに対してアジュバント効果を達成するには、様々な方法が知られており、本明細書で開示されるジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物とともに使用され得る。一般的な原則及び方法は、“Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，１９９５，Ｄｕｎｃａｎ  Ｅ．Ｓ．Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ，ＩＳＢＮ  ０−４７１−９５１７０−６、及び“Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，１９９５，Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＩＳＢＮ  ０−３０６−４５２８３−９に詳細に記載されている。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスワクチンまたは免疫原性組成物は、抗原及びアジュバントを含む。抗原は、少なくとも１つのアジュバントとの混合物であり得、重量に基づく比率で、約１０：１〜約１０１０：１の抗原：アジュバント、例えば、約１０：１〜約１００：１、約１００：１〜約１０３：１、約１０３：１〜約１０４：１、約１０４：１〜約１０５：１、約１０５：１〜約１０６：１、約１０６：１〜約１０７：１、約１０７：１〜約１０８：１、約１０８：１〜約１０９：１、または約１０９：１〜約１０１０：１の抗原：アジュバントであり得る。当業者であれば、最適な比率を決定するために、アジュバントに関する情報及び通常の実験を介して、適切な比率を容易に決定することができる。
【０１７９】
例示的なアジュバントには、アルミニウム塩、リン酸カルシウム、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、ＭＬＡ誘導体、合成リピドＡ、リピドＡミメティックまたはアナログ、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤（油乳剤）、キトサン、ビタミンＤ、ステアリルまたはオクタデシルチロシン、ビロソーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩である。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ  ８５のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、本開示のアルミニウム塩アジュバントは、本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物の抗原の吸着を増大させることが見出された。したがって、いくつかの実施形態では、抗原の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％がアルミニウム塩アジュバントに吸着される。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、約１００μｇ〜約６００μｇ、約１００μｇ〜約５００μｇ、約１２５μｇ〜約５００μｇ、約１５０μｇ〜約５００μｇ、約１７５μｇ〜約５００μｇ、約１００μｇ〜約４５０μｇ、約１２５μｇ〜約４５０μｇ、約１５０μｇ〜約４５０μｇ、約１７５μｇ〜約４５０μｇ、約１００μｇ〜約４００μｇ、約１２５μｇ〜約４００μｇ、約１５０μｇ〜約４００μｇ、約１７５μｇ〜約４００μｇ、約１００μｇ〜約３５０μｇ、約１２５μｇ〜約３５０μｇ、約１５０μｇ〜約３５０μｇ、約１７５μｇ〜約３５０μｇ、約１００μｇ〜約３００μｇ、約１２５μｇ〜約３００μｇ、約１５０μｇ〜約３００μｇ、約１７５μｇ〜約３００μｇ、約１００μｇ〜約２５０μｇ、約１２５μｇ〜約２５０μｇ、約１５０μｇ〜約２５０μｇ、約１７５μｇ〜約２５０μｇ、約１００μｇ〜約２２５μｇ、約１２５μｇ〜約２２５μｇ、約１５０μｇ〜約２２５μｇ、約１７５μｇ〜約２２５μｇ、または約２００μｇのアルミニウム塩アジュバント（例えば、ミョウバン）を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、約１００μｇ〜約６００μｇ、約１００μｇ〜約３００μｇもしくは約１５０μｇ〜約２５０μｇまたは約２００μｇのアルミニウム塩アジュバント（例えば、水酸化アルミニウムなどのミョウバン）を含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、ワクチン及び／または免疫原性組成物は、本明細書に記載される配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの、１μｇ〜１５μｇ、または２μｇ、５μｇ、もしくは１０μｇの用量の精製された不活化全粒子ジカウイルスを、水酸化アルミニウムなどの１つ以上のアジュバント、例えば、１００μｇ〜約６００μｇもしくは約１５０μｇ〜約２５０μｇまたは約２００μｇのミョウバンと組み合わせて含有する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、１μｇ〜１５μｇ、または２μｇ、５μｇもしくは１０μｇの用量の精製された不活化全粒子ジカウイルスを、水酸化アルミニウムなどの１つ以上のアジュバント、例えば、１００μｇ〜約６００μｇもしくは約１５０μｇ〜約２５０μｇまたは約２００μｇのミョウバンと組み合わせて含有し、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、１μｇ〜１５μｇ、または２μｇ、５μｇもしくは１０μｇの用量の精製された不活化全粒子ジカウイルスを、水酸化アルミニウムなどの１つ以上のアジュバント、例えば、１００μｇ〜約６００μｇもしくは約１５０μｇ〜約２５０μｇまたは約２００μｇのミョウバンと組み合わせて含有し、ジカウイルスは、配列番号２に従うゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、１μｇ〜１５μｇ、または２μｇ、５μｇもしくは１０μｇの用量の精製された不活化全粒子プラーク精製ジカウイルス分離株を、水酸化アルミニウムなどの１つ以上のアジュバント、例えば、１００μｇ〜約６００μｇもしくは約１５０μｇ〜約２５０μｇまたは約２００μｇのミョウバンと組み合わせて含有し、ジカウイルスは、配列番号２に従うゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０１８６】
本開示の特定の実施形態は、アジュバント化されたジカウイルスワクチンまたは免疫原性組成物を調製する方法を含み、（ａ）ワクチンまたは免疫原性組成物をアルミニウム塩アジュバントと混合することであって、ワクチンまたは免疫原性組成物は、本明細書に記載される少なくとも１つのジカウイルスに由来する１つ以上の抗原を含む、混合することと、（ｂ）好適な条件下で、約１時間〜約２４時間（例えば、約１６時間〜約２４時間）の範囲の期間、インキュベートすることであって、抗原の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％は、アルミニウム塩アジュバントに吸着される、インキュベートすることと、を含む。方法の特定の実施形態では、少なくとも１つのジカウイルスは、非ヒト細胞適応変異（例えば、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異などのタンパク質ＮＳ１中の非ヒト細胞適応変異を含む、ジカウイルスである。
【０１８７】
方法のいくつかの実施形態では、混合物は、約２℃〜約８℃の範囲の温度でインキュベートされる。方法のいくつかの実施形態では、混合物は、当該技術分野において知られている任意の好適なミキサーを使用して、一定の混合下でインキュベートされる。方法のいくつかの実施形態では、混合物は、約６．５〜約８．５、約６．５〜約８、約６．８〜約７．８、約６．９〜約７．６、約７〜約７．５、約６．８〜約８．５、約６．９〜約８．５、または約７〜約８．５の値の範囲のｐＨでインキュベートされる。特定の好ましい実施形態では、混合物は、中性ｐＨでインキュベートされる。方法のいくつかの実施形態では、アルミニウム塩アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ  ８５から選択される。
【０１８８】
モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに由来するリピドＡの非毒性誘導体であり、ワクチンアジュバントとして開発された強力なＴＬＲ−４アゴニストである（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２（２）：２１９−２２９）。前臨床マウス研究では、鼻腔内ＭＬＡは、全身性体液性応答だけでなく分泌性応答も増強することが示されている（Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ  １８（２２）：２４１６−２４２５；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０（７）：３５５７−３５６５）。また、１２０，０００人を超える患者の臨床試験では、ワクチンアジュバントとして、安全かつ有効であることが証明されている。（Ｂａｌｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３５（３）：３９８−４１３；Ｂａｌｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４（４）：２６１−２６８）。ＭＬＡは、ＴＬＲ−４受容体を介して自然免疫の誘導を刺激することから、グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方、ウイルス、及び寄生虫を含む広範囲の感染性病原体に対する非特異的免疫応答を惹起することが可能である（Ｂａｌｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４（４）：２６１−２６８；Ｐｅｒｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０（１０  Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ３２−３７）。鼻腔内投与製剤にＭＬＡを含めると、ウイルス攻撃による非特異的免疫応答を惹起する自然応答の迅速な誘導がもたらされ、更に、ワクチンの抗原性成分によって生じる特異的応答が増強される。
【０１８９】
したがって、一実施形態では、本開示は、獲得免疫及び自然免疫の増強剤として、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ）、またはその誘導体を含む、組成物を提供する。化学的に、３Ｄ−ＭＬＡは、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡと４、５または６アシル化鎖の混合物である。３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい形態は、欧州特許第０６８９４５４Ｂ１号（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＳＡ）に開示されている。別の実施形態では、本開示は、合成リピドＡ、リピドＡミメティックもしくはアナログ、例えば、ＢｉｏＭｉｒａのＰＥＴリピドＡ、またはＴＬＲ−４アゴニストのように機能するように設計された合成誘導体を含む、組成物を提供する。
【０１９０】
更なる例示的なアジュバントには、限定するものではないが、ポリペプチドアジュバントが含まれ、これは、ポリペプチド成分と共発現させるか、またはポリペプチド成分と融合させて、キメラポリペプチドを生成することによって、本明細書に記載される抗原に容易に加えることができる。鞭毛の主要なタンパク質成分である鞭毛フラジェリンは、ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ５による自然免疫系によって認識されることから、アジュバントタンパク質として注目を高めているアジュバントである。ＴＬＲ５を介したフラジェリンシグナル伝達は、ＤＣの成熟及び遊走、ならびにマクロファージ、好中球、及び腸管上皮細胞の活性化を誘導することによって、自然免疫及び適応免疫の両機能に作用し、炎症促進性メディエーターの産生をもたらす。
【０１９１】
ＴＬＲ５は、フラジェリンタンパク質に固有であり、鞭毛機能に必要なフラジェリンモノマー内の保存的構造を認識し、免疫学的抑制に応じた変異を排除する。この受容体は、１００ｆＭの濃度まで感受性であるが、そのままのフィラメントは認識しない。結合及び刺激には、鞭毛のモノマーへの分解が必要である。
【０１９２】
アジュバントとして、フラジェリンは、非経口または鼻腔内のいずれで投与された異種抗原に対する防御応答の誘導に強力な活性を有し、ＤＮＡワクチンに対するアジュバント効果も報告されている。フラジェリンを採用すると、インフルエンザなどの呼吸器系ウイルスに適切であるＴｈ２優位が観察されたが、ＩｇＥ誘導については、マウスまたはサルにおいて、いかなる証拠も観察されていない。加えて、サルにおける鼻腔内または全身性投与後の局所性または全身性炎症反応は、いずれも報告されていない。ＴＬＲ５を介したＭｙＤ８８依存的なフラジェリンシグナル及びＴＬＲを介した他の全てのＭｙＤ８８依存的シグナルは、Ｔｈ１優位を生じることが示されているので、フラジェリン使用後に惹起される応答がＴｈ２の特徴を示すのは、いくらか意外なことである。更に重要なことには、フラジェリンに対する既存抗体は、アジュバントの有効性にさほど影響を及ぼさないことから、フラジェリンは、複数回使用のためのアジュバントとして魅力的である。
【０１９３】
近年の多くの鼻腔内ワクチン試験における共通の課題は、ワクチンの有効性を改善するアジュバント及び／または送達系の使用である。そのような研究の１つでは、遺伝子的に無毒化されたＥ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンアジュバント（ＬＴ  Ｒ１９２Ｇ）を含有するインフルエンザＨ３ワクチンにより、Ｈ５攻撃に対するヘテロサブタイプ防御が生じたが、これは、鼻腔内送達後に限られた。防御は、交差中和抗体の誘導に基づくことから、新規ワクチンの開発における鼻腔内経路の重要な示唆が示された。
【０１９４】
サイトカイン、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦなど、腫瘍壊死因子、インターロイキン−２、−７、−１２、インターフェロン及び他の同様の成長因子についても、ポリペプチド成分と混合するか、または融合させることにより、ジカウイルスワクチンまたは免疫原性組成物中に容易に含めることができることから、アジュバントとして使用することができる。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、５’−ＴＣＧ−３’配列を含む核酸ＴＬＲ９リガンド；イミダゾキノリンＴＬＲ７リガンド；置換グアニンＴＬＲ７／８リガンド；ロキソリビン、７−デアザデオキシグアノシン、７−チア−８−オキソデオキシグアノシン、イミキモド（Ｒ−８３７）、及びレシキモド（Ｒ−８４８）などの他のＴＬＲ７リガンドなどの、Ｔｏｌｌ様受容体を介して作用する他のアジュバントを含み得る。
【０１９６】
特定のアジュバントは、樹状細胞などのＡＰＣによるワクチン分子の取り込みを促進し、それらを活性化する。非限定的な例は、免疫標的アジュバント、毒素、サイトカイン、及びマイコバクテリア誘導体などの免疫調節アジュバント、油状配合物、ポリマー、ミセル形成アジュバント、サポニン、免疫刺激複合体マトリックス（ＩＳＣＯＭマトリックス）、粒子、ＤＤＡ、アルミニウムアジュバント、ＤＮＡアジュバント、ＭＬＡ、ならびに封入アジュバントからなる群から選択される。
【０１９７】
アジュバントの追加例としては、緩衝生理食塩水中０．０５〜０．１パーセント溶液として一般に使用されるアルミニウム塩、例えば、水酸化物またはリン酸塩（ミョウバン）などの剤（例えば、Ｎｉｃｋｌａｓ（１９９２）Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：４８９−４９３参照）、０．２５パーセント溶液として使用される糖の合成ポリマー（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））との混合物が挙げられ、それぞれ７０℃〜１０１℃の範囲の温度の３０秒〜２分間にわたる熱処理によるワクチン中でのタンパク質の凝集及び架橋剤による凝集も可能である。ペプシン処理した抗体（Ｆａｂフラグメント）をアルブミンに対して再活性化させることによる凝集、Ｃ．ｐａｒｖｕｍなどの細菌細胞もしくはグラム陰性菌の内毒素もしくはリポ多糖成分との混合物、モノオレイン酸マンニド（ＡｒａｃｅｌＡ）などの生理学的に許容される油性ビヒクル中のエマルジョン、またはブロック代替物として使用されるペルフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）２０パーセント溶液とのエマルジョンが使用されてもよい。スクアレン及びＩＦＡなど油との混合物が使用されてもよい。
【０１９８】
ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）は、興味深いアジュバント候補であるが、完全フロイント及び不完全フロイントアジュバントならびにＱｕｉｌＡ及びＱＳ２１などのキラヤサポニンも興味深い。更なる可能性には、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）及びトレオニルムラミルジペプチド（ｔＭＤＰ）などのリポ多糖のポリ［ジ（カルボキシレートフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰ）誘導体が含まれる。リポ多糖ベースのアジュバントはまた、主にＴｈ１型応答をもたらすのに使用され得、例えば、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡなどのモノホスホリルリピドＡとアルミニウム塩の組み合わせを含む。
【０１９９】
また、リポソーム製剤は、アジュバント効果を与えることが知られており、したがって、リポソームアジュバントは、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物とともに使用され得る。
【０２００】
免疫刺激複合体マトリックス型（ＩＳＣＯＭ（登録商標）マトリックス）アジュバントもまた、特に、この種のアジュバントが、ＡＰＣによるＭＨＣクラスＩＩ発現を上方制御することが可能であることが示されているので、ジカウイルスワクチン抗原及び免疫原性組成物とともに使用されてもよい。ＩＳＣＯＭマトリックスは、Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ由来の（任意選択的に分画された）サポニン（トリテルペノイド）、コレステロール、及びリン脂質から構成される。ジカウイルスワクチンまたは免疫原性組成物抗原などの免疫原性タンパク質と混合した場合、得られる粒子状製剤は、サポニン６０〜７０％ｗ／ｗ、コレステロール及びリン脂質１０〜１５％ｗ／ｗ、及びタンパク質１０〜１５％ｗ／ｗから構成され得るＩＳＣＯＭ粒子として知られるものである。免疫刺激複合体の組成及び使用に関する詳細は、例えば、アジュバントを取り扱う上記テキストに見出すことができるが、Ｍｏｒｅｉｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３：４６１−４７５及びＢａｒｒ  Ｉ  Ｇ  ａｎｄ  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｇ  Ｆ（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７４：８−２５にも、完全な免疫刺激複合体の調製に関する有用な説明が提供されている。
【０２０１】
本明細書で開示されるジカウイルスワクチン及び免疫原性組成物とアジュバントの組み合わせで使用され得る、サポニンは、ＩＳＣＯＭ形態であるかないかに関わらず、米国特許第５，０５７，５４０号及び“Ｓａｐｏｎｉｎｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，Ｋｅｎｓｉｌ，Ｃ．Ｒ．（１９９６）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ  １２（１−２）：１−５５；及びＥＰ０３６２２７９Ｂ１に記載されている、Ｑｕｉｌ  Ａと呼ばれるＱｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来するもの、及びその画分を含む。Ｑｕｉｌ  Ａの例示的な画分は、ＱＳ２１、ＱＳ７、及びＱＳ１７である。
【０２０２】
β−エスシンは、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物のアジュバント組成物に使用される、別の溶血性サポニンである。エスシンは、セイヨウトチノキ（ラテン名：Ａｅｓｃｕｌｕｓｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）の種子に含まれるサポニンの混合物として、Ｍｅｒｃｋインデックス（第１２版：エントリー番号３７３７）に記載されている。その単離については、クロマトグラフィー及び精製によるもの（Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈ．４，２１３（１９５３））、ならびにイオン交換樹脂によるもの（Ｅｒｂｒｉｎｇら、米国特許第３，２３８，１９０号）が記載されている。エスシンの画分は、精製され、生物学的に活性であることが示されている（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ（Ｔｏｋｙｏ）１９９６  Ａｕｇｕｓｔ；４４（８）：１４５４−１４６４））。β−エスシンは、エスシン（ａｅｓｃｉｎ）としても知られている。
【０２０３】
ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物に使用される別の溶血性サポニンは、ジギトニンである。ジギトニンは、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａの種子に由来し、Ｇｉｓｖｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９３４）Ｊ．Ａｍ．Ｐｈａｒｍ．Ａｓｓｏｃ．２３：６６４；及びＲｕｈｅｎｓｔｒｏｔｈ−Ｂａｕｅｒ（１９５５）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３０１，６２１に記載の手順に従って精製されたサポニンとして、Ｍｅｒｃｋインデックス（第１２版、エントリー番号３２０４）に記載されている。その使用については、コレステロール測定の臨床試薬であることが記載されている。
【０２０４】
アジュバント効果を達成する別の興味深い可能性は、Ｇｏｓｓｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２に記載されている技術を採用することである。簡潔に述べると、本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物の抗原などの関連抗原の提示は、当該抗原を、単球／マクロファージ上のＦＣ受容体に対する抗体（または抗原結合抗体フラグメント）にコンジュゲートすることによって増強することができる。特に、抗原と抗ＦＣＲＩの間のコンジュゲートは、ワクチン接種のための免疫原性を増強することが示されている。抗体は、作製後、または作製の一部として、ジカウイルスワクチンまたは免疫原性組成物抗原にコンジュゲートされ得、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物抗原のポリペプチド成分のうちのいずれか１つへの融合体として発現させること含む。他の可能性には、標的化物質及び免疫調節物質（例えば、サイトカイン）の使用が含まれる。加えて、ポリＩ：Ｃなどのサイトカインの合成誘導物質が使用されてもよい。
【０２０５】
好適なマイコバクテリア誘導体は、ムラミルジペプチド、完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ、（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）ならびにＴＤＭ及びＴＤＥなどのトレハロースのジエステルからなる群から選択され得る。
【０２０６】
好適な免疫標的アジュバントの例には、ＣＤ４０リガンド及びＣＤ４０抗体またはその特異的結合フラグメント（上記の考察を参照）、マンノース、Ｆａｂフラグメント、及びＣＴＬＡ−４が含まれる。
【０２０７】
好適なポリマーアジュバントの例には、デキストラン、ＰＥＧ、デンプン、マンナン、及びマンノースなどの炭水化物；プラスチックポリマー；ならびにラテックスビーズなどのラテックスが挙げられる。
【０２０８】
免疫応答を調節する更に別の興味深い方法は、「仮想リンパ節」（ＶＬＮ）（ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ，Ｉｎｃ．（３６０  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１００１７−６５０１）によって開発された特許取得済み医療デバイス）に免疫原（任意選択によりアジュバントならびに薬学的に許容される担体及びビヒクルとともに）を含めることである。ＶＬＮ（細長い管状デバイス）は、リンパ節の構造及び機能を模倣する。皮膚下にＶＬＮを挿入すると、サイトカイン及びケモカインの急増に伴う無菌的炎症部位が生じる。この危険シグナルに対し、Ｔ細胞及びＢ細胞ならびにＡＰＣが迅速に応答し、炎症部位に向かい、ＶＬＮの多孔質マトリックス内部に蓄積する。ＶＬＮを使用すると、抗原に対する免疫応答を開始するのに必要な抗原量が減少し、ＶＬＮを使用したワクチン接種によって付与される免疫防御がＲｉｂｉをアジュバントとして使用する従来の予防接種よりも上回ることが示されている。この技術は、Ｇｅｌｂｅｒ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，“Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｏｂｕｓｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｓｍａｌｌ  Ａｍｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ  ｔｈｅ  Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅ”，ｉｎ：“Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃ，Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｏｃｔ．１２−１５，１９９８，Ｓｅａｓｃａｐｅ  Ｒｅｓｏｒｔ，Ａｐｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．”に概略されている。
【０２０９】
ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物抗原とのアジュバントとしてオリゴヌクレオチドを使用してもよく、オリゴヌクレオチドは、少なくとも３つ以上または更に少なくとも６つ以上のヌクレオチドによって隔てられた２つ以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含有し得る。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）は、主にＴｈ１応答を誘導する。そのようなオリゴヌクレオチドは、よく知られており、例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号及び同第５，８５６，４６２号に記載されている。
【０２１０】
そのようなオリゴヌクレオチドアジュバントは、デオキシヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド骨格は、ホスホロジチオエート結合、またはホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステル骨格及び混合骨格結合を有するオリゴヌクレオチドを含むＰＮＡなどの他のヌクレオチド骨格が使用されてもよい。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートを作製する方法は、米国特許第５，６６６，１５３号、米国特許第５，２７８，３０２号及びＷＯ９５／２６２０４に記載されている。
【０２１１】
例示的なオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有する。配列は、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド骨格を含有し得る：
【０２１２】
（配列番号３）オリゴ１：ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴ（ＣｐＧ  １８２６）；
【０２１３】
（配列番号４）オリゴ２：ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ（ＣｐＧ  １７５８）；
【０２１４】
（配列番号  ５）オリゴ３：ＡＣＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＡＣＧ；
【０２１５】
（配列番号６）オリゴ４：ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ（ＣｐＧ  ２００６）；及び
【０２１６】
（配列番号７）オリゴ５：ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＧ  ＣＴ（ＣｐＧ  １６６８）
【０２１７】
代替のＣｐＧオリゴヌクレオチドには、上記配列であって、重要でない欠失または付加を有するものが含まれる。アジュバントとしてのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において知られている任意の方法によって合成することができる（例えば、ＥＰ４６８５２０）。例えば、そのようなオリゴヌクレオチドは、自動合成装置を利用して合成され得る。そのようなオリゴヌクレオチドアジュバントは、１０〜５０塩基長であり得る。別のアジュバント系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の混合物を含み、特に、ＷＯ００／０９１５９には、ＣｐＧとＱＳ２１の混合物が開示されている。
【０２１８】
多くの単相または多相エマルジョン系が記載されている。当業者であれば、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物抗原とともに使用されるそのようなエマルジョン系を、エマルジョンが抗原の構造を破壊しないように、容易に適合させることができる。水中油型エマルジョンアジュバントは、それ自体、アジュバント組成物として有用であることが示唆されており（ＥＰ３９９８４３Ｂ）、水中油型エマルジョンと他の活性剤との組み合わせも、ワクチン用アジュバントとして記載されている（ＷＯ９５／１７２１０；ＷＯ９８／５６４１４；ＷＯ９９／１２５６５；ＷＯ９９／１１２４１）。他のオイルエマルジョンアジュバント、例えば、油中水型エマルジョン（米国特許第５，４２２，１０９号；ＥＰ０４８０９８２Ｂ２）及び水中油中水型エマルジョン（米国特許第５，４２４，０６７号；ＥＰ０４８０９８１Ｂ）などが記載されている。
【０２１９】
本明細書に記載されるジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物とともに使用されるオイルエマルジョンアジュバントは、天然でも合成でもよく、鉱油系でも有機油系でもよい。鉱油及び有機油の例は、当業者には容易に明らかであろう。
【０２２０】
任意の水中油型組成物がヒトへの投与に好適であるためには、エマルジョン系の油相は、代謝可能な油を含み得る。代謝可能な油という用語の意味は、当該技術分野においてよく知られている。代謝可能は、「代謝によって変換可能な」と定義される（Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，２５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７４））。油は、レシピエントに対して毒性がなく、代謝によって変換可能な任意の植物油、魚油、動物油または合成油であり得、堅果（ピーナッツ油など）、種子、及び穀粒は、植物油の一般的な原料である。合成油も使用することができ、ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）などの市販の油も含み得る。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は、サメの肝油中に多量に見られ、オリーブ油、小麦粉芽油、米糠油、及び酵母菌中に少量見られる不飽和油であり、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物とともに使用され得る。スクアレンは、コレステロールの生合成における中間体であるという事実から、代謝可能な油である（Ｍｅｒｃｋインデックス、第１０版、エントリー番号８６１９）。
【０２２１】
例示的なオイルエマルジョンは、水中油型エマルジョン、特に、水中スクアレンエマルジョンである。
【０２２２】
加えて、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物とともに使用されるオイルエマルジョンアジュバントは、油α−トコフェロール（ビタミンＥ、ＥＰ０３８２２７１Ｂ１）などの抗酸化剤を含み得る。
【０２２３】
ＷＯ９５／１７２１０及びＷＯ９９／１１２４１は、任意選択により免疫促進剤ＱＳ２１及び／または３Ｄ−ＭＬＡが配合される、スクアレン、α−トコフェロール、及びＴＷＥＥＮ  ８０（ＴＭ）をベースにしたエマルジョンアジュバントを開示している。ＷＯ９９／１２５６５は、油相にステロールを添加することによる、これらのスクアレンエマルジョンの改善を開示している。更に、エマルジョンを安定化させるために、トリカプリリン（Ｃ２７Ｈ５０Ｏ６）などのトリグリセリドを油相に加えることができる（ＷＯ９８／５６４１４）。
【０２２４】
安定した水中油型エマルジョン内に見られる油滴のサイズは、光子相関分光法によって測定したとき、１マイクロメートル未満であり得、実質的に３０〜６００ｎｍの範囲内、実質的に約３０〜５００ｎｍの直径または実質的に１５０〜５００ｎｍの直径、特に約１５０ｎｍの直径であり得る。この点に関して、油滴数の８０％がこれらの範囲内であり得、油滴数の９０％超または９５％超が指定サイズ範囲内である。オイルエマルジョン中に存在する成分の量は、通常、スクアレンなどの油が２〜１０％の範囲内であり、存在する場合、αトコフェロールが２〜１０％であり、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどの界面活性剤が０．３〜３％である。油：αトコフェロールの比は、より安定したエマルジョンがもたらされるため、１以下であり得る。ＳＰＡＮ  ８５（ＴＭ）もまた、約１％のレベルで存在し得る。ある場合には、本明細書で開示されるジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物が安定剤を更に含有することは、有利であり得る。
【０２２５】
水中油型エマルジョンを作製する方法は、当業者によく知られている。一般に、方法は、ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）溶液などの界面活性剤と油相を混合した後、ホモジナイザーを使用してホモジナイゼーションを行う工程を含み、混合物をシリンジ針に２回通すことを含む方法が、少量の液体をホモジナイズするのに好適であることは、当業者には明らかであろう。同様に、当業者であれば、マイクロフルイダイザーでの乳化プロセス（Ｍ１１０Ｓマイクロ流体機器、最大５０回、２分間、最大入力圧力６バール（出力圧力約８５０バール））を、少量または多量のエマルジョンを生成するように適合させることができる。この適合は、所望の直径の油滴を有する調製物が達成されるまで、得られたエマルジョンの測定を含む通常の実験によって達成することができる。
【０２２６】
あるいは、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、キトサン（上記など）または他のポリカチオン性ポリマー、ポリラクチド粒子及びポリラクチド−コグリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリックス、多糖または化学修飾された多糖からなる粒子、リポソーム及び脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルからなる粒子などからなるワクチンビヒクルと組み合わせることができる。サポニンはまた、コレステロールの存在下で配合すると、リポソームまたはＩＳＣＯＭなどの粒子状構造を形成し得る。更に、サポニンは、ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルとともに、非粒子溶液もしくは懸濁液のいずれかで、または小ラメラリポソームもしくはＩＳＣＯＭなどの粒子状構造で、配合され得る。
【０２２７】
本明細書に記載されるジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物に使用される、更なる例示的なアジュバントには、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｃａｌｉｆ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ、例えば、Ｇｒａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６５（５）：１７１０−１７１５参照）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えば、ＳＢ−ＡＳ２（ＭＬＡ及びＱＳ２１を含有する水中油型エマルジョン）；ＳＢＡＳ−４（ミョウバン及びＭＬＡを含有するアジュバント系）、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＲＣ−５１２、ＲＣ−５２２、ＲＣ−５２７、ＲＣ−５２９、ＲＣ−５４４、及びＲＣ−５６０（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）ならびに他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）、例えば、米国特許出願第０８／８５３，８２６号及び同第０９／０７４，７２０号に記載されるものが含まれる。
【０２２８】
アジュバントの他の例には、ＨｕｎｔｅｒのＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）アジュバント（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，Ｇａ．）；Ｇｅｒｂｕアジュバント（Ｇｅｒｂｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ，Ｇａｉｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；ニトロセルロース（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓｓｏｎ（１９９２）Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：５５３−５５７）；鉱油、非鉱油、油中水型または水中油型エマルジョンを含む、ミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）エマルジョンベースの製剤、例えば、Ｓｅｐｐｉｃ  ＩＳＡシリーズのＭｏｎｔａｍｉｄｅアジュバント（例えば、ＩＳＡ−５１、ＩＳＡ−５７、ＩＳＡ−７２０、ＩＳＡ−１５１など；Ｓｅｐｐｉｃ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）；及びＰＲＯＶＡＸ（登録商標）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＯＭ−１７４（リピドＡに関するグルコサミン二糖）；Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ伸長因子；ＣＲＬ１００５などのミセルを形成する非イオン性ブロックコポリマー；及びＳｙｎｔｅｘアジュバント製剤が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｏ’Ｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．１８（３）：６９−８５；及び“Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”  Ｄ．Ｏ’Ｈａｇａｎ，ｅｄ．（２０００）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【０２２９】
他の例示的なアジュバントには、一般式：ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ（Ｉ）（式中、ｎは、１〜５０であり、Ａは、結合または−−Ｃ（Ｏ）−−であり、Ｒは、Ｃ１〜５０アルキルまたはフェニルＣ１〜５０アルキルである）のアジュバント分子が含まれる。
【０２３０】
一実施形態は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテル（式中、ｎは、１〜５０、４〜２４、または９であり、Ｒ成分は、Ｃ１〜５０、Ｃ４〜Ｃ２０アルキル、またはＣ１２アルキルであり、Ａは、結合である）を含む、ワクチン製剤からなる。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％の範囲、０．１〜１０％、または０．１〜１％の範囲であるものとする。例示的なポリオキシエチレンエーテルは、次の群：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、及びポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルから選択される。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋインデックス（第１２版：エントリー番号７７１７）に記載されている。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載されている。
【０２３１】
上記の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルは、所望により、別のアジュバントと組み合わせてもよい。例えば、アジュバントの組み合わせは、上記のようなＣｐＧを含み得る。
本明細書で開示されるジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物との使用に好適な薬学的に許容される賦形剤の更なる例は、水、リン酸緩衝生理食塩水、等張性緩衝液が挙げられる。
【０２３２】
ウイルス精製
本開示の更なる態様は、ジカウイルスを精製する方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、ジカウイルスの集団を含有する接種物を複数の細胞に接種することと、接種された細胞のうちの１つ以上からプラーク精製によってジカウイルスクローン分離株を得ることと、を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、非ヒト細胞（例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞など）である。いくつかの実施形態では、細胞は、昆虫細胞（本明細書に記載される蚊細胞／細胞株のいずれかなど）である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞（本明細書に記載される哺乳動物細胞／細胞株のいずれかなど）である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、サル細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、Ｖｅｒｏ細胞である。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスの集団は、不均一である（例えば、２つ以上遺伝子型を含む）。２つ以上の遺伝子型は、少なくとも１つのヌクレオチドが互いに異なる。いくつかの実施形態では、ジカウイルスの集団は、ジカウイルス臨床分離株（例えば、ＰＲＶＡＢＣ５９株由来）及び／または細胞培養で既に継代されている１つ以上のジカウイルスを含む。ジカウイルスの臨床分離株は、ジカウイルスに感染した患者のサンプルから得られる。いくつかの実施形態では、プラーク精製（例えば、本明細書に記載されるもの）により、不均一なウイルス集団から、（遺伝的に均一な）クローン分離株を実質的及び／または完全に分離することが可能となる。いくつかの実施形態では、サル細胞はＶＥＲＯ細胞株（例えば、ＶＥＲＯ  １０−８７細胞）由来である。いくつかの実施形態では、接種物は、ヒト血清を含む。いくつかの実施形態では、接種物は、１つ以上の外来性感染性因子（例えば、１つ以上の汚染ウイルス）を含む。いくつかの実施形態では、プラーク精製（例えば、本明細書に記載されるもの）により、１つ以上の外来性感染性因子から、（遺伝的に均一な）クローン分離株を実質的及び／または完全に精製することが可能となる。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローンを分離及び／または精製するために記載される方法は、ジカウイルスクローン分離株の１回以上（例えば、１回以上、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上など）の追加のプラーク精製を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン分離株を分離及び／または精製するために記載される方法は、細胞培養（例えば、蚊細胞株などの昆虫細胞及び／またはＶＥＲＯ細胞株などの哺乳動物細胞）でジカウイルスクローン分離株を１回以上（例えば、１回以上、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上など）継代することを含む。
【０２３５】
本開示の更なる態様は、ワクチンまたは免疫原性組成物の調製のためにジカウイルスを精製する方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、次のうちの１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ）の工程を（以下の順序を含む、任意の順で）含む：ジカウイルスを含有するサンプルもしくは調製物の深層濾過を実施する工程；ジカウイルスを含有するサンプルを緩衝液交換及び／または希釈して保持液を生成する工程（例えば、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）により）；ジカウイルスを含むサンプルをイオン交換膜（例えば、陰イオン交換膜、陽イオン交換膜）に結合させて結合分画を生成し、結合分画をイオン交換膜から溶出する工程（ここで、結合分画はジカウイルスを含む）；ジカウイルスを含有するサンプルを本明細書に記載されるいずれかの有効量の化学的不活性化剤で処理する工程；化学的に不活化されたジカウイルスを含有するサンプルをメタ重亜硫酸ナトリウムで中和する工程；及び／または化学的に不活化されたジカウイルスを含む中和されたサンプルを精製する工程（例えば、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）により）。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ジカウイルスを含有するサンプルを第１のデプスフィルターに通過させて第１の溶出液を生成する工程（ここで、第１の溶出液は、ジカウイルスを含有する）；（ｂ）第１の溶出液をクロスフロー濾過（ＣＦＦ）によって緩衝液交換及び／または希釈して第１の保持液を生成する工程（ここで、第１の保持液は、ジカウイルスを含有する）；（ｃ）第１の保持液をイオン交換膜に結合させて第１の結合分画を生成し（ここで、第１の結合分画は、ジカウイルスを含有する）、第１の結合分画をイオン交換膜から溶出して第２の溶出液を生成する工程（ここで、第２の溶出液は、ジカウイルスを含有する）；（ｄ）第２の溶出液を第２のデプスフィルターに通過させて第２の保持液を生成する工程（ここで、第２の保持液は、ジカウイルスを含有する）；（ｅ）第２の保持液を有効量の化学的不活性化剤で処理する工程；（ｆ）処理された第２の保持液をメタ重亜硫酸ナトリウムで中和する工程；ならびに（ｇ）中和された第２の保持液をクロスフロー濾過（ＣＦＦ）によって精製する工程を含む。
【０２３６】
デプスフィルターは、カートリッジまたはカプセル、例えば、Ｂｉｏ  ２０  ＳＥＩＴＺ（登録商標）デプスフィルターシートを使用したＳＵＰＲＡＣＡＰ（商標）シリーズのデプスフィルターカプセル（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などの形式で適用され得る。他の好適な深層濾過技術及び装置は、当該技術分野において知られており、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＰ３フィルターを含む。いくつかの実施形態では、デプスフィルターは、約０．２μｍ〜約３μｍの孔径を有する。いくつかの実施形態では、デプスフィルターの孔径は、次の孔径（μｍ）のいずれかよりも小さい：約３、２．８、２．６、２．４、２．２、２．０、１．８、１．６、１．４、１．２、１．０、０．８、０．６、及び０．４。いくつかの実施形態では、デプスフィルターの孔径は、次の孔径（μｍ）のいずれかよりも大きい：約０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、または２．８。すなわち、デプスフィルターの孔径は、３、２．８、２．６、２．４、２．２、２．０、１．８、１．６、１．４、１．２、１．０、０．８、０．６、及び０．４の上限ならびに独立して選択される０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、または２．８の下限を有する孔径（μｍ）の範囲のいずれかであり得、ここで、下限は、上限よりも小さい。
【０２３７】
本明細書に記載されるように、陽イオン交換及び陰イオン交換クロマトグラフィーを本開示の方法に使用して、本開示の細胞から回収されたジカウイルスを精製することができる。例えば、清澄化されたウイルス回収物は、塩基性化され、陰イオン交換膜にロードされ、塩またはｐＨによって溶出され、濾過され、不活化され得る。これは、単なる例示的なスキームであり、当業者であれば、置換、削除、挿入、または順序変更した工程を有するこれらの変形形態を容易に企図することができる。
【０２３８】
陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィーはいずれも、移動相中の目的の荷電性巨大分子（例えば、ウイルス）が反対の電荷を持つ基質に引きつけられることによる。陽イオン交換クロマトグラフィーでは、負電荷を帯びた基質または膜が正電荷を帯びた巨大分子を引きつける。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、正電荷を帯びた基質または膜が負電荷を帯びた巨大分子を引きつける。巨大分子が基質上に結合またはロードされたら、それを、その特徴に応じた様式で基質から直線的または段階的に溶出することができ、それにより、電荷の異なる分子の分離が行われる。この原理を使用して、他の巨大分子からウイルスを精製することができる。溶出は、移動相緩衝液のｐＨまたは塩濃度を変えることによって達成することができる。溶出は、グラジエントまたは段階的であり得る。本明細書に記載されるように、溶出は、移動相のｐＨの変化を使用して、または移動相のイオン強度の変化（例えば、塩の添加によって）を使用して、達成することができる。溶出には様々な塩が使用され、限定するものではないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウムが含まれる。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。様々な好適な緩衝液が当該技術分野において知られており、本明細書に記載される。イオン交換クロマトグラフィーを使用したウイルス精製方法もまた一般に知られており、例えば、オンラインで入手可能なインフルエンザウイルス精製（ｗｗｗ．ｐａｌｌ．ｃｏｍ／ｐｄｆｓ／Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＭｕｓｔａｎｇＱＸＴ＿ＡｃｒｏＰｒｅｐ＿ＵＳＤ２９１６．ｐｄｆ）を参照されたい。
【０２３９】
陽イオン交換クロマトグラフィー（濾過を任意選択により含む）には、孔径０．６５μｍの陽イオン交換膜を使用するＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓシステム（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などの当該技術分野において知られている様々な装置が好適である。陽イオン交換膜には様々な官能基が使用され、限定するものではないが、架橋ポリマーコーティングのペンダントスルホン官能基が含まれる。本開示のジカウイルスを含有する溶出液を陽イオン交換膜に結合させるには、様々な緩衝液を使用することができる。例示的な緩衝液には、限定するものではないが、クエン酸緩衝液及びリン酸緩衝液が含まれる（更なる緩衝液は以下に記載される）。いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーに使用される緩衝液（例えば、ローディング及び／または溶出）は、ポリソルベート（例えば、０．０５％、０．１％、０．２５％、または０．５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０）を含有する。
【０２４０】
陰イオン交換クロマトグラフィー（濾過を任意選択により含む）には、孔径０．８μｍの陰イオン交換膜を使用するＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑシステム（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などの当該技術分野において知られている様々な装置が好適である。別の好適な陰イオン交換膜は、ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ  ＩＥＸＮａｎｏである。陰イオン交換膜には様々な官能基が使用され、限定するものではないが、架橋ポリマーコーティングのペンダント四級アミン官能基が含まれる。本開示のジカウイルスを含有する溶出液を陰イオン交換膜に結合させるには、様々な緩衝液を使用することができる。例示的な緩衝液には、限定するものではないが、リン酸緩衝液が含まれる（更なる緩衝液は以下に記載される）。いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィーに使用される緩衝液（例えば、ローディング及び／または溶出）は、ポリソルベート（例えば、０．０５％、０．１％、０．２５％、または０．５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０）を含有する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、例えば、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び７５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用する、段階溶出によって溶出される。
【０２４１】
ワクチン及び／または免疫原性組成物の製剤及び用量
本開示の更なる態様は、本明細書に記載されるジカウイルスに由来する１つ以上の抗原を含有する、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の製剤に関する。
【０２４２】
本明細書に記載されるジカウイルスに由来する１つ以上の抗原を含有する、本開示のそのようなワクチン及び／または免疫原性組成物は、ジカウイルス感染症を治療もしくは予防することを、それを必要とするヒト対象において行うこと、及び／またはジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導することを、それを必要とするヒト対象において行うことに有用であり得る。
【０２４３】
典型的に、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、溶液または懸濁液のいずれかの注射剤として調製され、また、注射前に液体中に溶解または懸濁するのに好適な固体形態が調製されてもよい。そのような調製物はまた、乳化されてもよいし、乾燥粉末として作製されてもよい。免疫原性活性成分は、多くの場合、薬学的に許容され、活性成分と適合性のある賦形剤と混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、スクロース、グリセロール、エタノールまたは同等物、及びこれらの組み合わせである。加えて、所望により、ワクチンまたは免疫原性組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはワクチンもしくは免疫原性組成物の効果を増強させるアジュバントなどの補助的物質を含有してもよい。
【０２４４】
ワクチンまたは免疫原性組成物は、従来通り、非経口的に、例えば、皮下、経皮、皮内、真皮下または筋肉内のいずれかの注射により、投与され得る。特定の実施形態では、組成物は、筋肉内または皮下投与される。他の投与様式に好適な更なる製剤には、坐剤が含まれ、ある場合には、経口、経口的、鼻腔内、口腔粘膜、舌下、腹腔内、膣内、肛門及び頭蓋内の製剤が含まれる。坐剤の場合、従来の結合剤及び担体には、例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドが含まれ得、そのような坐剤は、活性成分を０．５％〜１０％、または更には１〜２％の範囲で含有する混合物から形成され得る。特定の実施形態では、脂肪酸グリセリドまたはカカオ脂の混合物などの低融点ワックスを最初に溶かし、本明細書に記載されるジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物を、例えば、攪拌によって、均一に分散させる。次いで、溶融した均一な混合物を、簡便な大きさの型に注入し、冷却して固化させる。
【０２４５】
鼻腔内送達に好適な製剤には、液体（例えば、エアロゾルまたは点鼻剤として投与される水溶液）及び乾燥粉末（例えば、鼻腔内に迅速に沈着させるため）が含まれる。製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、キシリトール、及びキトサンなどの通常用いられる賦形剤を含む。キトサンなどの粘膜付着剤は、鼻腔内投与製剤の粘液線毛クリアランスを遅らせるために、液体または粉末のいずれかの形態で使用され得る。マンニトール、ソルビトール、トレハロース、及び／またはスクロースなどの糖は、液体製剤では安定剤として、また乾燥粉末製剤では安定剤、増量剤、または粉末流動剤及びサイズ剤として使用され得る。加えて、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）もしくはその誘導体、またはＣｐＧオリゴヌクレオチドなどのアジュバントは、液体製剤及び乾燥粉末製剤の両方において、免疫活性化アジュバントとして使用され得る。
【０２４６】
経口送達に好適な製剤には、液剤、固形剤、半固形剤、ゲル剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤などが含まれる。経口送達に好適な製剤には、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、ゲル剤、液剤、食品、飲料、栄養補助食品などが含まれる。製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ソルビトール、トレハロース、ポリオール、例えば、糖、例えば、スクロース、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常用いられる賦形剤を含む。他のジカウイルスワクチン及び免疫原性組成物は、溶液剤、懸濁剤、丸剤、徐放性製剤または散剤の形態を取り得、１０〜９５％、または２５〜７０％の活性成分を含有し得る。経口製剤の場合、コレラ毒素は、興味深い製剤パートナー（また可能なコンジュゲーションパートナー）である。
【０２４７】
ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、膣投与用に製剤化される場合、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、フォーム剤またはスプレー剤の形態であり得る。上記製剤はいずれも、ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物に加えて、当該技術分野において適切であることが知られている担体などの剤を含有し得る。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、全身送達または局所送達用に製剤化され得る。そのような製剤は、当該技術分野においてよく知られている。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖加リンゲル液、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養補助物質、電解質補助物質（例えば、ブドウ糖加リンゲル液をベースにしたもの）などが含まれる。全身及び局所の投与経路には、例えば、皮内、局所適用、静脈内、筋肉内などが含まれる。
【０２４９】
本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、剤形に適合した様式で、また治療上有効で免疫原性のある量で投与され得る。抗原の投与量は、特に、約１μｇ〜約１００μｇ、約１μｇ〜約４０μｇ、約１μｇ〜約３０μｇ、約１μｇ〜約２０μｇ、約１μｇ〜約１５μｇ、または約２μｇ〜約１５μｇ、または約５μｇ〜約１５μｇ、または約１０μｇ〜約１５μｇの範囲であり得る。投与量は、特に、約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇまたは約２０μｇ、特に約１０μｇであり得る。抗原、すなわち、精製された不活化ジカウイルスの量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄｅｔａｌ．（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）によって、指定量の組み換えジカエンベロープタンパク質を使用し、標準曲線を確立することによって決定することができる。したがって、抗原の投与量は、マイクログラム（μｇ）のジカエンベロープタンパク質Ｅ（μｇ  Ｅｎｖ）とも呼ばれ得る。そのため、μｇ抗原及びμｇ  Ｅｎｖは、本開示の意味の範囲内で同じ意味である。いくつかの実施形態では、ワクチン及び／または免疫原性組成物は、本明細書に記載される配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの１μｇ〜１５μｇ、または２μｇ、５μｇもしくは１０μｇの用量の抗原を、精製された不活化全粒子ジカウイルスの形態で含有する。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製された不活化全粒子ジカウイルスの形態で、１μｇ〜１５μｇ、または２μｇ、５μｇもしくは１０μｇの用量の抗原を含有し、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製された不活化全粒子ジカウイルスの形態で、１μｇ〜１５μｇ、または２μｇ、５μｇもしくは１０μｇの用量の抗原を含有し、ジカウイルスは、配列番号２に従うゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製された不活化全粒子プラーク精製ジカウイルス分離株の形態で、１μｇ〜１５μｇ、または２μｇ、５μｇもしくは１０μｇの用量の抗原を含有し、ジカウイルスは、配列番号２に従うゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０２５３】
特定のそのような実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、
約１０μｇの用量の精製された不活化全粒子ウイルス、
約２００μｇの水酸化アルミニウム、
緩衝液、及び任意選択により
スクロースなどの糖を含む。
【０２５４】
初回投与及びブースト注射の好適なレジメンも変わり得るが、初回投与にその後の接種または他の投与が続くのが典型的である。
【０２５５】
適用様式は、大きく異なり得る。従来のワクチンまたは免疫原性組成物投与方法のいずれも適用可能である。これらには、生理学的に許容される固形基剤による経口適用、または注射、例えば、筋肉内もしくは皮下投与用注射などによる生理学的に許容される分散液の非経口的適用が含まれる。ワクチンまたは免疫原性組成物の投与量は、投与経路に依存し、ワクチン接種を行う人の年齢及び抗原製剤に応じて変化し得る。ワクチンまたは免疫原性組成物は、本明細書に記載されるように、０．５ｍＬ超、０．５ｍＬまたは０．５ｍＬ未満の単位投与量を有し得る。例えば、０．２５ｍＬの量で投与され得る。０．５ｍＬの量が筋肉内または皮下投与に好適である。
【０２５６】
粘膜付着を改善する送達剤を使用して、特に、鼻腔内、経口または肺による送達製剤の送達及び免疫原性を改善することができる。そのような化合物の１つである、キチンのＮ脱アセチル化形態であるキトサンは、多くの医薬製剤に使用されている。キトサンは、粘液線毛クリアランスを遅延させ、粘膜による抗原取り込みとプロセシングの時間を長くする能力があることから、鼻腔内ワクチン送達の魅力的な粘膜付着剤である。加えて、タイトジャンクションを一時的に開くことができ、これにより、抗原のＮＡＬＴへの経上皮輸送が増強し得る近年のヒト臨床試験では、三価不活化インフルエンザワクチンを、キトサンを含むが、いかなる追加のアジュバントも含めずに鼻腔内投与すると、抗体陽転及びＨＩ価は、筋肉内接種後に得られる抗体陽転及びＨＩ価よりもごくわずかに下回るだけであった。
【０２５７】
キトサンはまた、遺伝子的に無毒化されたＥ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシン変異体ＬＴＫ６３などの、鼻腔内で良好に機能するアジュバントとともに製剤化され得る。これにより、キトサンによって付与される送達及び付着の利益の上に免疫活性化効果が加わり、粘膜応答と全身性応答が増強される。
【０２５８】
最後に、キトサン製剤は、乾燥粉末形態に調製することもでき、乾燥粉末形態は、ワクチンの安定性を改善し、液体製剤よりも粘液線毛クリアランスを更に遅延させることが示されていることに留意されたい。このことは、キトサンとともに製剤化された鼻腔内乾燥粉末ジフテリアトキソイドワクチンに関する近年のヒト臨床試験で確認されており、鼻腔内経路は、従来の筋肉内経路と同等の効果があり、分泌型ＩｇＡ応答という追加の利点もあった。ワクチンはまた、忍容性が極めて良好であった。キトサン及びＭＬＡまたはその誘導体を含有する炭疽用鼻腔内乾燥粉末ワクチンは、ウサギにおいて、筋肉内接種よりも強い応答を誘導し、エアロゾル芽胞攻撃に対しても防御的である。
【０２５９】
鼻腔内ワクチンは、下気道への作用が優れる非経口投与ワクチンとは対照的に、上気道と下気道に作用することができる例示的な製剤である。これは、アレルゲンベースのワクチンには耐性を誘導し、病原体ベースのワクチンには免疫性を誘導する点で有益であり得る。
【０２６０】
上気道と下気道の両方で防御を提供することに加えて、鼻腔内ワクチンは、針接種による合併症を回避し、粒子状及び／または可溶性抗原と鼻咽頭関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）の相互作用を介して、粘膜及び全身における体液性応答と細胞性応答の両方を誘導する手段を提供する。
【０２６１】
本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、薬学的に許容される。抗原及びアジュバント以外の構成成分を含んでもよく、例えば、典型的に、１つ以上の薬学的担体（複数可）及び／または賦形剤（複数可）を含む。そのような構成成分の綿密は考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２から入手可能である。
【０２６２】
張性を制御するために、ナトリウム塩などの生理学的塩を含めることが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在し得る。存在し得る他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。
【０２６３】
本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、１つ以上の緩衝液を含み得る。典型的な緩衝液には、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウムアジュバントを含むもの）、またはクエン酸緩衝液が含まれる。緩衝液は、典型的に、５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【０２６４】
ワクチンまたは免疫原性組成物のｐＨは、一般に、５．０〜８．５または５．０〜８．１、より典型的には、６．０〜８．５、例えば、６．０〜８．０、６．５〜８．０、６．５〜７．５、７．０〜８．５、７．０〜８．０、または７．０〜７．８である。したがって、本開示の製造プロセスは、包装の前に、バルクワクチンのｐＨを調整する工程を含み得る。
【０２６５】
ワクチンまたは免疫原性組成物は、好ましくは、無菌である。好ましくは、非発熱性であり、例えば、１投与量当たり１ＥＵ未満（エンドトキシン単位、標準的測定）、好ましくは、１投与量当たり０．１ＥＵ未満の含有である。好ましくは、グルテンを含まない。
【０２６６】
特定の実施形態では、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、界面活性剤を有効濃度で含み得る。いくつかの実施形態では、有効量の界面活性剤は、限定するものではないが、約０．００００５％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖまたは約０．０００１％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖを含み得る。特定の実施形態では、有効量の界面活性剤は、約０．００１％ｖ／ｖ、約０．００２％ｖ／ｖ、約０．００３％ｖ／ｖ、約０．００４％ｖ／ｖ、約０．００５％ｖ／ｖ、約０．００６％ｖ／ｖ、約０．００７％ｖ／ｖ、約０．００８％ｖ／ｖ、約０．００９％ｖ／ｖ、または約０．０１％ｖ／ｖである。理論に束縛されることを望むものではないが、界面活性剤は、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を溶解状態に維持するのを助け、ワクチン及び／または免疫原性組成物の凝集防止に役立つ。
【０２６７】
好適な界面活性剤には、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎｓ」としても知られる）、オクトキシノール（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、及びデオキシコール酸ナトリウム（特に、スプリットまたは表面抗原ワクチンの場合）が含まれる。界面活性剤は、微量でのみ存在し得る。他の残りの微量成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベートを含有する。いくつかの実施形態では、界面活性剤の有効濃度は、約０．００００５％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖの範囲を含む。
【０２６８】
ワクチン及び／または免疫原性組成物は、好ましくは、２℃〜８℃で保存される。理想的には、直射日光を避けるものとする。抗原及びエマルジョンは、典型的に混合状態であるが、はじめは、即時調合される別個の成分のキットの形態で提示されてもよい。ワクチン及び／または免疫原性組成物は、一般に、ヒト対象に投与されるとき、水性形態である。
【０２６９】
本開示の方法
本発明は、特に、ジカウイルス感染症を治療もしくは予防すること、特に予防すること、及び／またはジカウイルス病を予防することを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、本明細書に記載されるワクチンまたは免疫原性組成物の治療上有効な量をヒト対象またはヒト対象集団に投与することを含む、方法にも関する。
【０２７０】
この疾患は、一般的に軽度で、持続期間は短い。いくつかの臨床症状には、軽度の発熱、斑状丘疹状皮疹、結膜炎及び関節痛が含まれるが、これらに限定されない。妊娠中の女性の臨床症状は軽度にもかかわらず、妊娠中のジカウイルス感染は、胎児及び新生児への重篤な転帰に関連付けられている。疾患の重症度は、妊娠中にジカウイルスに感染した女性からの胎児及び新生児への影響に関係する。先天性ジカ症候群（ＣＺＳ）として知られるジカウイルス感染症に関連する先天性異常の範囲は、部分的な頭蓋骨の陥没を伴う重度の小頭症、皮質下の石灰化を伴う大脳皮質、斑点状瘢痕及び網膜の局所色素性斑点形成、先天性拘縮、ならびに錐体外路症状を伴う著しく早期からの緊張亢進からなる。更に、ジカウイルスは、中枢神経系内の疾患を引き起こす可能性のある神経向性フラビウイルスである。加えて、ジカウイルスがギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）を引き起こすという世界的懸念がある。
【０２７１】
そのため、ジカウイルス病の予防は、治療されるヒト対象にとって重要であるだけでなく、治療されるヒト対象が妊娠している場合または妊娠予定である場合、胎児及び新生児にも及ぶものである。したがって、本発明による方法は、ワクチンまたは免疫原性組成物をヒト対象に投与することによって、ヒト対象を治療すること、及び妊娠したヒト対象または妊娠の意向があるヒト対象または妊娠可能な女性に、ワクチンまたは免疫原性組成物を投与することによって、胎児及び新生児を治療することを含む。
【０２７２】
本開示の更なる態様は、ジカウイルスを治療もしくは予防することを、それを必要とするヒト対象に行うために、及び／またはジカウイルスに対する免疫応答を誘導することを、それを必要とするヒト対象に行うために、少なくとも１つのジカウイルス（例えば、クローンジカウイルス分離株、タンパク質ＮＳ１の非ヒト細胞適応変異などの非ヒト細胞適応変異を含むジカウイルス）に由来する１つ以上の抗原を含有する、本明細書に記載されるワクチン及び／または免疫原性組成物を使用する方法に関する。
【０２７３】
特定のそのような方法では、ワクチン及び／または免疫原性組成物は、本明細書に記載される配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの、１μｇ〜１５μｇ、または２μｇ、もしくは５μｇ、もしくは１０μｇの用量の精製された不活化全粒子ジカウイルスを、任意選択により、水酸化アルミニウムなどの１つ以上のアジュバント、例えば、１００μｇ〜約３００μｇもしくは約１５０μｇ〜約２５０μｇまたは約２００μｇのミョウバンと組み合わせて含有する。
【０２７４】
特定のそのような方法では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、１μｇ〜１５μｇ、または２μｇ、５μｇもしくは１０μｇの用量の精製された不活化全粒子ジカウイルスを、任意選択により、水酸化アルミニウムなどの１つ以上のアジュバント、例えば、１００μｇ〜約６００μｇもしくは約１５０μｇ〜約２５０μｇまたは約２００μｇのミョウバンと組み合わせて含有し、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０２７５】
特定のそのような方法では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、１μｇ〜１５μｇ、または２μｇ、５μｇもしくは１０μｇの用量の精製された不活化全粒子ジカウイルスを、任意選択により、水酸化アルミニウムなどの１つ以上のアジュバント、例えば、１００μｇ〜約６００μｇもしくは約１５０μｇ〜約２５０μｇまたは約２００μｇのミョウバンと組み合わせて含有し、ジカウイルスは、配列番号２に従うゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０２７６】
特定のそのような方法では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、１μｇ〜１５μｇ、または２μｇ、５μｇもしくは１０μｇの用量の精製された不活化全粒子プラーク精製ジカウイルス分離株を、任意選択により、水酸化アルミニウムなどの１つ以上のアジュバント、例えば、１００μｇ〜約６００μｇもしくは約１５０μｇ〜約２５０μｇまたは約２００μｇのミョウバンと組み合わせて含有し、ジカウイルスは、配列番号２に従うゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つのジカウイルス（例えば、クローンジカウイルス分離株、タンパク質ＮＳ１に非ヒト細胞適応変異などの非ヒト細胞適応変異を含むジカウイルス）に由来する１つ以上の抗原を含有する本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の治療上有効な量をヒト対象に投与することによって、ジカウイルス感染症を治療または予防することを、それを必要とするヒト対象において行う方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つのジカウイルス（例えば、クローンジカウイルス分離株、タンパク質ＮＳ１に非ヒト細胞適応変異などの非ヒト細胞適応変異を含むジカウイルス）に由来する１つ以上の抗原を含有する本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の治療上有効な量をヒト対象に投与することによって、ジカウイルスに対する免疫応答を誘導することを、それを必要とするヒト対象において行う方法に関する。いくつかの実施形態では、投与工程は、ヒト対象において、ジカウイルスに対する防御免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、妊娠しているか、妊娠の意向があるか、または妊娠可能な女性である。
【０２７８】
本明細書で開示されるジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、鼻腔内、経口的、経口、口腔粘膜、舌下、筋肉内、腹腔内、皮内、経皮、皮下、膣内、肛門、頭蓋内、静脈内、経皮、または皮下投与、特に筋肉内投与によってワクチンを投与する手段によって、ウイルス感染症に罹患しやすいまたはウイルス感染症に罹患しているヒト対象を保護または治療するために使用され得る。本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の全身性投与の方法は、従来のシリンジと針、または固体ワクチンを銃式送達するために設計された装置（ＷＯ９９／２７９６１）、または無針圧力液体噴射装置（米国特許第４，５９６，５５６号；米国特許第５，９９３，４１２号）、または経皮パッチ（ＷＯ９７／４８４４０；ＷＯ９８／２８０３７）を含み得る。本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物はまた、皮膚に適用され得る（経皮または経皮的送達ＷＯ９８／２０７３４；ＷＯ９８／２８０３７）。したがって、本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、ジカウイルスワクチンまたは免疫原性組成物が予め充填された全身性投与のための送達装置を含み得る。したがって、ヒト対象において、ジカウイルス感染症を治療もしくは予防する方法及び／または免疫応答を誘導する方法であって、ヒト対象に、アジュバント及び／または担体を任意選択により含む、本開示のワクチンまたは免疫原性組成物を投与する工程を含み、ワクチンまたは免疫原性組成物は、非経口または全身性経路を介して投与される、方法が提供される。
【０２７９】
本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、経口／消化管または鼻経路などの粘膜経路を介してワクチンまたは免疫原性組成物を投与する手段によって、ウイルス感染症に罹患しやすいまたはウイルス感染症に罹患しているヒト対象を保護または治療するために使用され得る。代替の粘膜経路は、膣内及び直腸内経路である。粘膜投与経路は、鼻腔内ワクチン接種と称される鼻経路を介するものであり得る。鼻腔内ワクチン接種の方法は、当該技術分野においてよく知られており、免疫する個人の鼻咽腔に、液滴、スプレー、または乾燥粉末形態のワクチンを投与することを含む。噴霧化またはエアロゾル化ワクチン製剤は、本明細書で開示されるジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物の形態候補である。胃耐性カプセル剤などの腸溶性製剤、及び経口投与用顆粒剤、直腸または膣投与用坐剤もまた、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の製剤である。
【０２８０】
本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物はまた、経口経路を介して投与され得る。そのような場合、薬学的に許容される賦形剤はまた、アルカリ性緩衝液、または腸溶性カプセル剤または微粒剤を含み得る。本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物はまた、膣経路によって投与され得る。そのような場合、薬学的に許容される賦形剤はまた、乳化剤、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）などのポリマー、ならびに膣クリーム及び坐剤の他の既知の安定剤を含み得る。ジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物はまた、直腸経路によって投与され得る。そのような場合、賦形剤はまた、当該技術分野において知られている、肛門坐剤を作るためのワックス及びポリマーを含み得る。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、投与工程は、１つ以上の投与を含む。投与は、単回投与スケジュールまたは複数回投与（プライム−ブースト）スケジュールによるものであり得る。複数回投与スケジュールでは、様々な投与は、同じまたは異なる経路、例えば、非経口プライムと粘膜ブースト、粘膜プライムと非経口ブーストなどによって投与され得、典型的には、筋肉内投与または皮下投与などの同じ経路によって投与される。複数回投与は、典型的に、少なくとも１週間の間隔（例えば、１〜１６週間の間隔、例えば、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１６週間などの間隔）を置いて投与される。２５〜３０日の間隔（例えば、２８日、４週間）を置いて２回投与することが特に有用である。特定のそのような実施形態では、投与の方法は、筋肉内投与または皮下投与である。
【０２８２】
本開示の方法は、本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物の治療上有効な量または免疫原性量の投与を含む。治療上有効な量または免疫原性量は、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物が投与される、非感染、感染、または非曝露のヒト対象において防御免疫応答を誘導する、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の量であり得る。そのような応答は、一般に、ヒト対象における、ワクチンに対する分泌性、細胞性及び／または抗体媒介性の免疫応答の発生による。通常、そのような応答には、限定するものではないが、以下の作用のうちの１つ以上が含まれる：免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭなどの免疫学的クラスのいずれかに由来する抗体の産生；Ｂ及びＴリンパ球の増殖；免疫細胞に対する活性化、成長及び分化シグナルの提供；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、及び／または細胞傷害性Ｔ細胞の拡大。
【０２８３】
特定のそのような方法では、ワクチン及び／または免疫原性組成物は、本明細書に記載される配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの、１μｇ〜１５μｇ、または２μｇ、５μｇ、もしくは１０μｇの用量の精製された不活化全粒子ジカウイルスを、任意選択により、水酸化アルミニウムなどの１つ以上のアジュバント、例えば、１００μｇ〜約６００μｇもしくは約１５０μｇ〜約２５０μｇまたは約２００μｇのミョウバンと組み合わせて含有する。
【０２８４】
特定のそのような方法では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、１μｇ〜１５μｇ、または２μｇ、５μｇもしくは１０μｇの用量の精製された不活化全粒子ジカウイルスを、任意選択により、水酸化アルミニウムなどの１つ以上のアジュバント、例えば、１００μｇ〜約６００μｇもしくは約１５０μｇ〜約２５０μｇまたは約２００μｇのミョウバンと組み合わせて含有し、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０２８５】
特定のそのような方法では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、１μｇ〜１５μｇ、または２μｇ、５μｇもしくは１０μｇの用量の精製された不活化全粒子ジカウイルスを、任意選択により、水酸化アルミニウムなどの１つ以上のアジュバント、例えば、１００μｇ〜約６００μｇもしくは約１５０μｇ〜約２５０μｇまたは約２００μｇのミョウバンと組み合わせて含有し、ジカウイルスは、配列番号２に従うゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０２８６】
特定のそのような方法では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、１μｇ〜１５μｇ、または２μｇ、または５μｇもしくは１０μｇの用量の精製された不活化全粒子プラーク精製ジカウイルス分離株を、任意選択により、水酸化アルミニウムなどの１つ以上のアジュバント、例えば、１００μｇ〜約６００μｇもしくは約１５０μｇ〜約２５０μｇまたは約２００μｇのミョウバンと組み合わせて含有し、ジカウイルスは、配列番号２に従うゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０２８７】
特定のそのような方法では、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ヒト対象において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、１０超、または５０超、または１００超、または２００超または１０００超、または１５００超、または２０００超、または２０００超、または３０００超のジカウイルスに対する中和抗体価の生成を誘導する。
【０２８８】
特定のそのような方法では、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ヒト対象において、レポーターウイルス粒子中和アッセイ（ＲＶＰ）によって決定したとき、３００超または５００超、または１０００超、または１５００超、または２０００超、または２０００超、または３０００超、または５０００超、または１０，０００超のジカウイルスに対する中和抗体価の生成を誘導する。
【０２８９】
特定のそのような方法では、上記中和抗体価は、投与から１４日後及び／または２８日後に達成される。
【０２９０】
特定のそのような方法では、ヒト対象におけるジカウイルスに対する中和抗体価の生成は、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与から１４日後及び／または２８日後、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、２５０超である。
【０２９１】
特定のそのような方法では、ヒト対象におけるジカウイルスに対する中和抗体価の生成は、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与から１４日後及び／または２８日後、レポーターウイルス粒子中和アッセイ（ＲＶＰ）によって決定したとき、１０００超である。
【０２９２】
特定のそのような方法では、そのような抗体価は、投与から１４日後及び／または２８日後に達成される。中和抗体のそのような生成は、少なくとも２０人のヒト対象のジカウイルス血清反応陰性集団において、高い抗体陽転率をもたらす。特定のそのような実施形態では、抗体陽転率は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％である。
【０２９３】
特定のそのような方法では、そのような抗体価は、投与から１４日後及び／または２８日後に達成される。中和抗体のそのような生成は、少なくとも２０人のヒト対象の集団、特にジカウイルス血清反応陰性集団において、高い血清反応陽性率をもたらす。特定のそのような実施形態では、血清反応陽性率は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である。
【０２９４】
本発明の方法によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与として、または複数回投与として、例えば、１〜１６週間の間隔を置いて投与される、例えば、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与として投与される。特定のそのような方法では、２回目（ブースト）の投与は、１回目（プライム）の投与から少なくとも２８日後に投与される。
【０２９５】
特定のそのような方法では、高い抗体陽転率は、単回投与または複数回投与の投与、例えば、１回目（プライム）及びその後の２回目（ブースト）の投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のヒト対象のジカウイルス血清反応陰性集団において達成される。特定のそのような実施形態では、抗体陽転率は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である。
【０２９６】
１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与としての投与を含む、特定のそのような方法では、高い抗体陽転率は、２回目（ブースト）の投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のヒト対象のジカウイルス血清反応陰性集団において達成される。特定のそのような実施形態では、抗体陽転率は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である。
【０２９７】
特定のそのような方法では、高い抗体陽転率は、単回投与としての投与から、または１回目（プライム）の投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のヒト対象のジカウイルス血清反応陰性集団において達成される。特定のそのような実施形態では、抗体陽転率は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％，少なくとも６０％、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。
【０２９８】
特定のそのような方法では、高い血清反応陽性率は、単回投与または複数回投与の投与、例えば、１回目（プライム）及びその後の２回目（ブースト）の投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のヒト対象の集団、特にジカウイルス血清反応陰性集団またはフラビウイルスナイーブ集団において達成される。特定のそのような実施形態では、血清反応陽性率は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である。
【０２９９】
１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与としての投与を含む、特定のそのような方法では、高い血清反応陽性率は、２回目（ブースト）の投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のヒト対象の集団、特にジカウイルス血清反応陰性集団において達成される。特定のそのような実施形態では、血清反応陽性率は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である。
【０３００】
特定のそのような方法では、高い血清反応陽性率は、単回投与としての投与から、または１回目（プライム）の投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のヒト対象の集団、特にジカウイルス血清反応陰性集団またはフラビウイルスナイーブ集団において達成される。特定のそのような実施形態では、血清反応陽性率は、２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％，少なくとも６０％、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。
【０３０１】
特定のそのような方法では、ヒト対象、特にフラビウイルスナイーブヒト対象または特にジカウイルス血清反応陰性ヒト対象におけるジカウイルスに対する中和抗体価は、ワクチンまたは免疫原性組成物の単回投与またはプライム投与から１４日後及び／または２８日後、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、２００超である。
【０３０２】
特定のそのような方法では、少なくとも２０人のヒト対象の、特にフラビウイルスナイーブ集団または特にジカウイルス血清反応陰性集団におけるジカウイルスに対する幾何平均中和抗体価は、ワクチンまたは免疫原性組成物の単回投与またはプライム投与から１４日後及び／または２８日後、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、２００超である。
【０３０３】
特定のそのような方法では、ヒト対象、特にフラビウイルスナイーブヒト対象、または特にジカウイルス血清反応陰性ヒト対象におけるジカウイルスに対する中和抗体価は、ワクチンまたは免疫原性組成物の単回投与またはプライム投与から１４日後及び／または２８日後、レポーターウイルス粒子中和アッセイ（ＲＶＰ）によって決定したとき、１０００超である。
【０３０４】
特定のそのような方法では、少なくとも２０人のヒト対象の、特にフラビウイルスナイーブ集団または特にジカウイルス血清反応陰性集団におけるジカウイルスに対する幾何平均中和抗体価は、ワクチンまたは免疫原性組成物の単回投与またはプライム投与から１４日後及び／または２８日後、レポーターウイルス粒子中和アッセイ（ＲＶＰ）によって決定したとき、１０００超である。
【０３０５】
中和抗体のそのような生成は、少なくとも２０人のヒト対象のフラビウイルスナイーブ集団または特にジカウイルス血清反応陰性集団において、単回投与またはプライム投与後、高い抗体陽転率をもたらす。特定のそのような実施形態では、抗体陽転率は、２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である。
【０３０６】
中和抗体のそのような生成は、少なくとも２０人のヒト対象の集団、特にフラビウイルスナイーブ集団または特にジカウイルス血清反応陰性集団において、単回投与またはプライム投与後、高い血清反応陽性率をもたらす。特定のそのような実施形態では、血清反応陽性率は、２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である。
【０３０７】
特定の方法では、投与は、プライム及びブースト投与を含み、プライム及びブースト投与は、約１〜約１６週間の間隔を置いて行われる。特定のそのような方法では、２回目（ブースト）の投与は、１回目（プライム）の投与から少なくとも２８日後に投与される。
【０３０８】
特定のそのような方法では、ヒト対象、特にフラビウイルスナイーブヒト対象または特にジカウイルス血清反応陰性ヒト対象におけるジカウイルスに対する中和抗体価は、ワクチンまたは免疫原性組成物のブースト投与から１４日後及び／または２８日後、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、１０００超、または１５００超、または３０００超である。
【０３０９】
特定のそのような方法では、少なくとも２０人のヒト対象の、特にフラビウイルスナイーブ集団または特にジカウイルス血清反応陰性集団におけるジカウイルスに対する幾何平均中和抗体価は、ワクチンまたは免疫原性組成物のブースト投与から１４日後及び／または２８日後、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、１０００超、または１５００超、または３０００超である。
【０３１０】
特定のそのような方法では、ヒト対象、特にフラビウイルスナイーブヒト対象または特にジカウイルス血清反応陰性ヒト対象におけるジカウイルスに対する中和抗体価は、ワクチンまたは免疫原性組成物のブースト投与から１４日後及び／または２８日後、レポーターウイルス粒子中和アッセイ（ＲＶＰ）によって決定したとき、３０００超、または５０００超、または１００００超である。
【０３１１】
特定のそのような方法では、少なくとも２０人のヒト対象の、特にフラビウイルスナイーブ集団または特にジカウイルス血清反応陰性集団におけるジカウイルスに対する幾何平均中和抗体価は、ワクチンまたは免疫原性組成物のブースト投与から１４日後及び／または２８日後、レポーターウイルス粒子中和アッセイ（ＲＶＰ）によって決定したとき、３０００超、または５０００超、または１００００超である。
【０３１２】
中和抗体のそのような生成は、少なくとも２０人のヒト対象のフラビウイルスナイーブ集団または特にジカウイルス血清反応陰性集団において、ブースト投与後、高い抗体陽転率をもたらす。特定のそのような実施形態では、抗体陽転率は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である。
【０３１３】
中和抗体のそのような生成は、少なくとも２０人のヒト対象の集団、特にフラビウイルスナイーブ集団において、ブースト投与後、高い血清反応陽性率をもたらす。特定のそのような実施形態では、血清反応陽性率は、２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である。
【０３１４】
中和抗体のそのような生成は、少なくとも２０人のヒト対象のフラビウイルスナイーブ集団または特にジカウイルス血清反応陰性集団において、単回投与またはプライム投与後、高い抗体陽転率をもたらす。特定のそのような実施形態では、抗体陽転率は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である。
【０３１５】
中和抗体のそのような生成は、少なくとも２０人のヒト対象のフラビウイルスナイーブ集団または特にジカウイルス血清反応陰性集団において、単回投与またはプライム投与後、高い抗体陽転率をもたらす。特定のそのような実施形態では、血清反応陽性率は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である。
【０３１６】
更に、本開示の特定の態様は、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法であって、当該ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与として、または複数回投与として、例えば、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与として投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、投与後７日までに、少なくとも２０人のヒト対象のヒト対象集団、特に少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象の集団または特に少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団のうち、５０％未満に全身性副作用を誘発する、方法に関する。
【０３１７】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２９％未満に頭痛症状を誘発する。
【０３１８】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％以下に発熱、及び／または３３％以下に疲労、及び／または１０％以下に関節痛、及び／または１７％以下に筋肉痛、及び／または１５％以下に倦怠感を誘発する。
【０３１９】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物は、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４０％未満に全身性副作用を誘発する。
【０３２０】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物は、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、プライム投与から７日後と比較して、
−少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも４５％少ない疲労、及び／または
−発熱なし、及び／または
−筋肉痛なし、もしくは少なくとも１０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも２５％少ない筋肉痛、及び／または
−倦怠感なし、もしくは少なくとも１０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない倦怠感を、
少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団において、誘発する。
【０３２１】
「プライム投与後と比較したブースト投与後の有害事象（ＡＥ）の減少率（％）」は、以下の等式によって定義される：
【数１】
2021505549.tif 000003
【０３２２】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物は、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満または０％に発熱を誘発する。
【０３２３】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物は、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１９％未満に疲労を誘発する。
【０３２４】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物は、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１２％未満または８％未満に筋肉痛を誘発する。
【０３２５】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物は、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１３％未満または１０％以下に倦怠感を誘発する。
【０３２６】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物は、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％以下に頭痛症状、及び８％以下に関節痛、及び４％未満に発熱、及び１９％未満に疲労、及び１２％未満に筋肉痛、及び１３％未満に倦怠感を誘発する。
【０３２７】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物は、１μｇ〜４０μｇの用量の（１つの）抗原を含み、抗原は、不活化全粒子ウイルスである。
【０３２８】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与の投与として、または少なくとも１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与を含む複数回投与の投与として投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物は、約５μｇの用量の精製された不活化全粒子ウイルスを含む。
【０３２９】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、５０％未満、もしくは４５％未満、もしくは４０％未満に全身性副作用を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４０％未満、もしくは３５％未満、もしくは３０％未満、もしくは２５％未満、もしくは２０％未満、もしくは１５％未満に全身性副作用を誘発する。
【０３３０】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、３％未満、もしくは０％に発熱を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満、もしくは３％未満、もしくは０％に発熱を誘発する。
【０３３１】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２９％未満に頭痛を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％未満、もしくは１５％未満、もしくは１０％未満、もしくは５％未満に頭痛を誘発する。
【０３３２】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、３０％未満、もしくは２５％未満、もしくは２０％未満に疲労を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％未満、もしくは１５％未満、もしくは１０％未満に疲労を誘発する。
【０３３３】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満に関節痛を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、５％未満、もしくは２％未満、もしくは０％に関節痛を誘発する。
【０３３４】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１７％以下に筋肉痛を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１２％未満、もしくは１０％未満、もしくは５％未満に筋肉痛を誘発する。
【０３３５】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１０％未満に倦怠感を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１４％未満、もしくは１０％未満、もしくは５％未満、もしくは０％に倦怠感を誘発する。
【０３３６】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物は、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、プライム投与から７日後と比較して、
−少なくとも７０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも５０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも３５％少ない、もしくは少なくとも３０％少ない全身性副作用、及び／または
−発熱の増加なし、及び／または
−少なくとも８０％少ない、もしくは少なくとも７０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも５０％少ない、もしくは少なくとも４５％少ない頭痛、及び／または
−少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも５５％少ない、もしくは少なくとも５０％少ない、もしくは少なくとも４５％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない疲労、及び／または
−関節痛の増加なし、もしくは少なくとも８０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない関節痛、及び／または
−筋肉痛の増加なし、もしくは少なくとも７０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない筋肉痛、及び／または
−倦怠感の増加なし、もしくは少なくとも８０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない倦怠感を、
少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団において、誘発する。
【０３３７】
本開示の特定の態様によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与の投与として、または少なくとも１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与を含む複数回投与の投与として投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物は、約１０μｇの用量の精製された不活化全粒子ウイルスを含む。
【０３３８】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、５０％未満に全身性副作用を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４０％未満、もしくは３５％未満、もしくは３０％未満に全身性副作用を誘発する。
【０３３９】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満に発熱を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満、もしくは３％未満、もしくは０％に発熱を誘発する。
【０３４０】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２９％未満、もしくは２５％未満、もしくは２０％未満、もしくは１５％未満に頭痛を誘発し、及び／またはワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％以下に頭痛を誘発する。
【０３４１】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、３３％以下に疲労を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％未満に疲労を誘発する。
【０３４２】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１０％以下に関節痛を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、５％未満に関節痛を誘発する。
【０３４３】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１７％以下に筋肉痛を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１２％未満、または１０％未満に筋肉痛を誘発する。
【０３４４】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１５％以下に倦怠感を誘発し、及び／またはワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１３％未満、もしくは１０％以下に倦怠感を誘発する。
【０３４５】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物は、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、プライム投与から７日後と比較して、
−少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも３５％少ない、もしくは少なくとも３０％少ない、もしくは少なくとも２５％少ない全身性副作用、及び／または
−発熱の増加なし、もしくは少なくとも８０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない発熱、及び／または
−少なくとも４５％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない疲労、及び／または
−関節痛の増加なし、もしくは少なくとも６５％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない関節痛、及び／または
−筋肉痛の増加なし、もしくは少なくとも４５％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない筋肉痛、及び／または
−倦怠感なし、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない倦怠感を、
少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団において、誘発する。
【０３４６】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与の投与として、または少なくとも１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与を含む複数回投与の投与として投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物は、約２μｇの用量の精製された不活化全粒子ウイルスを含む。
【０３４７】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、５０％未満、もしくは４５％未満、もしくは４０％未満、もしくは３５％未満に全身性副作用を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４０％未満、もしくは３５％未満に全身性副作用を誘発する。
【０３４８】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、３％未満、もしくは０％に発熱を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満、もしくは３％未満、もしくは０％に発熱を誘発する。
【０３４９】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２９％未満、もしくは２５％未満、もしくは２０％未満に頭痛を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％未満、もしくは１５％未満に頭痛を誘発する。
【０３５０】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、３０％未満、もしくは２５％未満に疲労を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％未満、もしくは１５％未満に疲労を誘発する。
【０３５１】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満に関節痛を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、８％未満に関節痛を誘発する。
【０３５２】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１７％以下に筋肉痛を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１２％未満、または１０％未満に筋肉痛を誘発する。
【０３５３】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１０％未満に倦怠感を誘発し、及び／またはワクチンもしくは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１３％未満、もしくは１０％未満、もしくは５％未満、もしくは０％に倦怠感を誘発する。
【０３５４】
本開示の特定のそのような態様によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物は、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、ブースト投与後７日までに、プライム投与から７日後と比較して、
−発熱の増加なし、及び／または
−少なくとも５０％少ない、もしくは少なくとも４５％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない疲労、及び／または
−筋肉痛なし、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない筋肉痛、及び／または
−倦怠感の増加なし、もしくは少なくとも８０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない倦怠感を、
少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団において、誘発する。
【０３５５】
特定の方法によれば、ヒト対象またはヒト対象集団は、ジカ流行地域のヒト対象またはヒト対象集団である。特定のそのような方法によれば、ヒト対象またはヒト対象集団は、アウトブレイク下にあるジカ流行地域のヒト対象またはヒト対象集団である。特定のそのような方法によれば、ヒト対象またはヒト対象集団は、フラビウイルスナイーブである。
【０３５６】
特定の方法によれば、ヒト対象またはヒト対象集団は、ジカ非流行地域のヒト対象またはヒト対象集団である。特定のそのような方法によれば、ヒト対象またはヒト対象集団は、ジカ流行地域に旅行する非流行地域のヒト対象またはヒト対象集団である。特定のそのような方法によれば、ヒト対象またはヒト対象集団は、フラビウイルスナイーブである。
【０３５７】
特定の方法によれば、ヒト対象またはヒト対象集団は、ヒスパニック系、ラテン系、アメリカインディアン、アラスカ先住民、アジア系、黒人またはアフリカ系アメリカ人、ハワイ先住民、もしくは白人またはそれらの混血である。
【０３５８】
特定の方法によれば、ヒト対象またはヒト対象集団は、１８〜２９歳である。
【０３５９】
特定の方法によれば、ヒト対象またはヒト対象集団は、３０〜４９歳である。
【０３６０】
本明細書で開示されるワクチンまたは免疫原性組成物は、本明細書で開示される方法における使用についても開示する。
【０３６１】
本明細書で開示される方法のための薬剤の製造における、本明細書で開示されるワクチンまたは免疫原性組成物の使用もまた本明細書で開示される。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト細胞適応化ジカウイルスを含有するワクチン及び／または免疫原性組成物の投与後にヒト対象において誘導される防御免疫応答は、非ヒト細胞成長に適応させていない及び／または異なる非ヒト細胞適応変異を含むジカウイルスを含有するワクチン及び／または免疫原性組成物を投与した対応するヒト対象において誘導される免疫応答よりも大きい。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト細胞適応化ジカウイルスを含有するワクチン及び／または免疫原性組成物の投与後にヒト対象において誘導される防御免疫応答は、非ヒト細胞成長に適応させていない及び／または異なる非ヒト細胞適応変異を含むジカウイルスを含有するワクチン及び／または免疫原性組成物を投与した対応するヒト対象において誘導される免疫応答よりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％，少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％大きい。防御免疫応答を測定する方法は、一般に、当業者に知られている。
【０３６３】
いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト細胞適応化ジカウイルスを含有するワクチン及び／または免疫原性組成物の投与は、ヒト対象において、ジカウイルスに対する中和抗体の生成を誘導する。いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト細胞適応化ジカウイルスを含有するワクチン及び／または免疫原性組成物の投与は、ヒト対象において、ジカウイルスに対する中和抗体の生成を、非ヒト細胞成長に適応させていない及び／または異なる非ヒト細胞適応変異を含むジカウイルスを含有するワクチン及び／または免疫原性組成物を投与した対応するヒト対象において誘導される中和抗体の量よりも多い量で誘導する。いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト細胞適応化ジカウイルスを含有するワクチン及び／または免疫原性組成物の投与は、ヒト対象において、ジカウイルスに対する中和抗体の生成を、非ヒト細胞成長に適応させていない及び／または異なる非ヒト細胞適応変異を含むジカウイルスを含有するワクチン及び／または免疫原性組成物を投与した対応するヒト対象において誘導される中和抗体の量よりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％，少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％多い量で誘導する。いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト細胞適応化ジカウイルスを含有するワクチン及び／または免疫原性組成物の投与は、ヒト対象において、ジカウイルスに対する中和抗体の生成を、非ヒト細胞成長に適応させていない及び／または異なる非ヒト細胞適応変異を含むジカウイルスを含有するワクチン及び／または免疫原性組成物を投与した対応するヒト対象において誘導される中和抗体の量よりも少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、または少なくとも約１０００倍多い量で誘導する。ヒト対象において中和抗体を測定する方法は、一般に、当業者に知られている。
【０３６４】
好ましくは、治療上有効な量または免疫原性量は、疾患の症状の治療または予防をもたらすのに十分である。好適な投与量は、約２μｇ、約５μｇまたは約１０μｇ、特に約１０μｇである。
【０３６５】
本開示は、以下の実施例を参照することによって、より十分に理解される。しかしながら、これらの実施例は、本開示のあらゆる態様または範囲を限定するものとして何ら解釈されるべきではない。
【実施例】
【０３６６】
実施例１：クローンジカウイルス株の生成
この実施例は、既知の研究歴のある、ジカウイルス（ＺＩＫＡＶ）株の生産を記載する。
【０３６７】
材料及び方法
Ｖｅｒｏ細胞の維持
１バイアルのＷＨＯ  Ｖｅｒｏ１０−８７細胞を水浴中で迅速に融解し、Ｔ−７５ｃｍ２フラスコで、ペニシリン−ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン４０ｍＭ、及び１０％ＦＢＳを含有する、予め温めておいた１９ｍＬのＤＭＥＭ（ダルベッコ改変最小必須培地）中に３６℃＋／２℃、５％ＣＯ２で直接接種した。細胞をコンフルエントになるまで成長させ、ＴｒｙｐｌＥを使用して継代培養した。このフラスコを２つのＴ−１８５ｃｍ２フラスコに拡張し、コンフルエントになるまで成長させ、３１×Ｔ−１８５ｃｍ２フラスコまで継代培養し、細胞が１００％コンフルエントになるまで成長させた。トリプシン処理によって細胞を回収し、８００×ｇで１０分間遠心分離にかけ、１０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ中に、１．９×１０７細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。上記のように、１バイアルのＶｅｒｏ細胞を迅速に解凍し、Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ内で蘇生させた。これらを２回継代培養して、１３×Ｔ−１８５ｃｍ２フラスコの細胞バンクを作製した。トリプシン処理後、細胞を８００×ｇで遠心分離にかけ、凍結培地（１０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ）中に、４．６８×１０５細胞／ｍＬの濃度で、再懸濁した。この細胞バンクをクライオバイアルに等分した。
【０３６８】
Ｖｅｒｏ細胞を、ペニシリン−ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン及び１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（ｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳ）中で成長させ、維持した。ＴｒｙｐｌＥｘｐｒｅｓｓを使用して、細胞を維持し、トリプシン処理した。ウイルス吸着の２日前に、６ウェルプレートで３ｍＬのｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳ中に４〜５×１０５細胞／ウェル、またはＴ−２５ｃｍ２フラスコで５ｍＬのｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳ中に７×１０５細胞、または９６ウェルプレートで０．１ｍＬのｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳ中に１×１０４細胞／ウェルを播種した。インキュベータを毎日モニタリングして、指定温度を維持した。Ｖｅｒｏ細胞株は、液体窒素中に保存した。
【０３６９】
プラークアッセイ
６ウェルプレートで成長させたＶｅｒｏ細胞の新鮮なコンフルエント単層のウイルス力価をプラーク滴定により決定した。凍結アリコートを解凍し、９６ウェルプレートでアリコートの１０倍希釈系列をｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳで作製した。希釈したウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞単層の接種前まで、氷上に維持した。アッセイ時に、６ウェルプレートから成長培地を吸引し、各ウイルス希釈液１００μＬをウェルに加えた。細胞シートの乾燥を防ぐために、プレートを頻繁に（１０分ごとに）揺らしながら、ウイルスを３６℃±２℃、５％ＣＯ２で６０分間吸着させた。ウイルス吸着後、４０〜４１℃に維持した第１のアガロースオーバーレイ（１Ｘ  ｃＤＭＥＭ−２％−ＦＢＳ＋０．８％アガロース）４ｍＬを各ウェルに加えた。アガロースを室温で３０分間固化させ、次いで、プレートを上下逆さまにして３６℃＋／２℃、５％ＣＯ２で、４〜６日間インキュベートした。１６０μｇ／ｍＬのニュートラルレッド生体染色色素を含有する第２のアガロースオーバーレイ２ｍＬを４日目に加えた。プラークを５日目及び６日目に可視化した。
【０３７０】
ＴＣＩＤ５０アッセイによるウイルスの定量
９６ウェルプレートで成長させたＶｅｒｏ細胞の新鮮なコンフルエント単層でのウイルス力価も滴定により決定した。凍結アリコートを解凍し、９６ウェルプレートでアリコートの１０倍希釈系列をｃＤＭＥＭ−２％−ＦＢＳ希釈液で作製した。希釈したウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞単層の接種前まで、氷上に維持した。アッセイ時に、９６ウェルプレートから成長培地を吸引し、各ウイルス希釈液１００μＬをウェルに加えた。プレートを３６℃＋／２℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。５０％組織培養物感染量（ＴＣＩＤ５０）の力価をＲｅｅｄ／Ｍｕｅｎｃｈ計算表の使用により算出した。
【０３７１】
試験物
ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９（ドライアイス上の０．５ｍＬバイアル１本）を疾病予防管理センター（ＣＤＣ）から受領し、ジカウイルスの同定をＲＴ−ＰＣＲによって確認した。この株を試験すると、ＰＣＲによるＡｌｐｈａｖｉｒｕｓ及びマイコプラズマ汚染は陰性であった。この情報を表１にまとめる。
【表１】
2021505549.tif 000004
【０３７２】
シークエンシング
ＱＩＡａｍｐＶｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎキットを製造元のプロトコルに従って使用して、各分離株の安定化されたウイルス回収物からＲＮＡを抽出した。各分離株から抽出したＲＮＡを使用して、全ジカウイルスゲノムを包含する６つのｃＤＮＡフラグメントを作製し、増幅した。増幅したｃＤＮＡフラグメントのサイズ及び純度を１％アガロース／ＴＢＥゲルで分析し、その後、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してゲル精製した。ＡＢＩ  ３１３０ＸＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサーを使用して自動シークエンシング反応を行った。Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ＳｅｑＭａｎソフトウェアを使用してシークエンシングデータを解析した。
【０３７３】
結果
アメリカにおける現在のＺＩＫＡＶアウトブレイクに関連し、既知の研究歴のあるＺＩＫＡＶ株が必要とされた。このため、ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９株が選択された。Ｖｅｒｏ細胞での成長に適合した十分に特徴付けされたウイルスを生成するために、ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９を最初にＶｅｒｏ細胞で増幅させた（Ｐ１）。
【０３７４】
フラスコ（Ｔ−１７５ｃｍ２）の１００％コンフルエントのＶｅｒｏ細胞を、４ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳ中、０．０１のＭＯＩで感染させた。ウイルスを単層に３６℃±２℃、５％ＣＯ２で６０分間吸着させ、次いで、２０ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳをアプライし、３６℃±２℃、５％ＣＯ２でウイルス増幅した。接種後の細胞変性効果（ＣＰＥ）について、細胞層を毎日モニタリングした（図１）。９６時間後、培地を収集することによって、上清を回収し、遠心分離（６００×ｇ、４℃、１０分）によって清澄化した。トレハロースを１８％ｗ／ｖの最終濃度まで加えることによって、回収物を安定化した。バルクを０．５ｍＬクライオバイアルに等分し、−８０℃で保存した。
【０３７５】
ＴＣＩＤ５０アッセイにより、Ｖｅｒｏ細胞単層上の感染性ウイルスの存在について、安定化したＰ１回収物を分析した。０時間から毎日アリコートを採取することによって、成長速度をモニタリングした。７２時間までにピーク力価に到達した（図２）。
【０３７６】
Ｐ１材料は、Ｖｅｒｏ細胞の６ウェル単層で３日目の回収物を滴定することによって、プラーク精製した。６日目のプラークを可視化し、プラスチック製プレートの底部に、独立した別個のプラークの周りに円を描くことによって、分離する１０個のプラークを特定した。滅菌ワイドボアピペットを使用して、ウェルの底部を掻き取りながら、アガロースプラグを抽出し、ｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳですすぐことによって、プラークを採取した。アガロースプラグを０．５ｍＬのｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳに加え、ボルテックス処理し、ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ２ａ−ｊのラベルを付け、インキュベータ内に３６℃±２℃、５％ＣＯ２で一晩置いた。
【０３７７】
３つのプラーク（ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ２ａ〜ｃ）を追加の精製に進めた。各分離株を、新鮮な６ウェルＶｅｒｏ細胞単層上にデュプリケートでそのまま播種した。このＰ２／Ｐ３移行物をプラーク精製し、ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ３ａ〜ｊのラベルを付けた。
【０３７８】
６つのプラーク（ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ３ａ〜ｆ）を最終精製ラウンドに進めた。各分離株を、新鮮な６ウェルＶｅｒｏ細胞単層上にデュプリケートでそのまま播種した。このＰ３／Ｐ４移行物をプラーク精製し、ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ４ａ〜ｊのラベルを付けた。
【０３７９】
Ｐ４プラーク精製からの６つのプラーク（ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ４ａ〜ｆ）を、Ｔ−２５ｃｍ２フラスコで、Ｖｅｒｏ細胞の単層上でブラインド継代した。各プラーク採取物を２ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳ中に希釈し、１ｍＬを３６℃±２℃、５％ＣＯ２で１時間吸着させ、もう１つの１ｍＬをトレハロース（最終１８％ｖ／ｖ）で安定化し、−６０℃未満で保存した。ウイルス吸着後、各フラスコにｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳを加え、３６℃±２℃、５％ＣＯ２で４日間成長させた。ウイルス上清を回収し、遠心分離（６００×ｇ、４Ｃ、１０分）によって清澄化し、１８％トレハロースで安定化し、等分して、−６０℃未満で保存した。このＰ５シードのジカウイルス効力について、ＴＣＩＤ５０によって試験した（図３）。
【０３８０】
Ｔ−１７５ｃｍ２フラスコのＶｅｒｏ細胞のコンフルエント単層に、ＰＲＶＡＢＣ５９のｐ６つのクローン（Ｐ５ａ〜ｆ）のそれぞれを、４ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳ中、０．０１のＭＯＩで感染させた。ウイルスを３６℃＋／２℃、５％ＣＯ２で６０分間吸着させ、その後、各フラスコに２０ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳを加え、３６℃＋／２℃、５％ＣＯ２で成長させた。Ｖｅｒｏ細胞単層の健全さ及びＣＰＥを毎日モニタリングした。ウイルスを指示されているように３日目及び５日目に回収した（図４）。３日目及び５日目のＰ６株の回収物をプールし、１８％トレハロースで安定化し、等分し、−６０℃未満で保存した。
【０３８１】
ＰＲＶＡＢＣ５９の６つのクローン（Ｐ６ａ〜ｆ）のそれぞれのジカウイルスｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力について試験した（図５）。効力は、２つの異なる方法、ＴＣＩＤ５０及びプラーク滴定によって決定した。ＴＣＩＤ５０は、ＣＰＥの目視検査（顕微鏡）と、ＣＰＥ（黄色）を示すウェルと赤（ＣＰＥなし）とを比較した吸光度の差（Ａ５６０−Ａ４２０）を測定することによって、算出した。プレートをプレートリーダーで読み取り、顕微鏡で読み取ったプレートと同じ計算表を適用した（吸光度）。２つの評価技術間のＴＣＩＤ５０の値は、極めて似ているが、プラーク滴定によって得た値のほうが低かった。
【０３８２】
Ｐ６ウイルス生産及び特性評価の概要を以下の表２に示す。
【表２】
2021505549.tif 000005
【０３８３】
フラビウイルスのエンベロープタンパク質がウイルスの主な免疫原性部分であるので、元の分離株のエンベロープ糖タンパク質配列によく似た分離ジカウイルスクローンを探した。ＰＲＶＡＢＣ５９クローンＰ６ａ、Ｐ６ｃ、Ｐ６ｄ及びＰ６ｆは、エンベロープ領域（Ｇ９９０Ｔ）のヌクレオチド９９０にＧ→Ｔ変異を含有し、エンベロープ残基３３０にＶａｌ→Ｌｅｕのアミノ酸変異をもたらしたが、ＰＲＶＡＢＣ５９クローンＰ６ｂ及びＰ６ｅのエンベロープ遺伝子は、参照株（ＧｅｎＢａｎｋ  ｒｅｆ  ＫＵ５０１２１５．１）に対して同一であった（表３及び図６）。
【表３】
2021505549.tif 000006
【０３８４】
次いで、エンベロープ配列に変異を持たない２つのクローンを全ゲノムシークエンシングにかけた。シークエンシング結果を上の表３にまとめる。配列解析により、両クローンのＮＳ１領域のヌクレオチド２９２におけるＴ→Ｇ置換が明らかになり、ＮＳ１残基９８にＴｒｐ→Ｇｌｙ変異が生じた。この変異は、その後のディープシークエンシングによっても確認された。ＮＳ１  Ｗ９８Ｇ変異は、膜会合、エンベロープタンパク質との相互作用、及び潜在的な六量体ＮＳ１形成に関与している、ＺＩＫＡＶ  ＮＳ１のウイングドメインの絡み合ったループに位置する。他のトリプトファン残基（Ｗ１１５、Ｗ１１８）は、フラビウイルスで高度に保存されているが、Ｗ９８はそうではない（図７）。しかしながら、興味深いことに、Ｗ９８残基の１００％の保存が、アフリカ系統及びアジア系統に由来する株を含む、１１の異なるＺＩＫＡＶ株で観察されている。各株で特定された変異を表４にまとめる。
【表４】
2021505549.tif 000007
【０３８５】
ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ストックの表現型解析を実施して、ＺＩＫＡＶクローンの特性評価を行った。図８に示し、図９に定量するように、各クローン分離株は、大きなプラークと小さなプラークの混合集団を有するＰ１ウイルスと比較すると、比較的均一な大型プラークの集団からなる。これらのデータは、単一ＺＩＫＡＶクローンの分離が成功したことを示唆している。
【０３８６】
次に、ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６クローンのＶｅｒｏ細胞における成長速度解析を行った。Ｖｅｒｏ細胞に、無血清成長培地中、０．０１ＴＣＩＤ５０／細胞の各ＺＩＫＡＶ  Ｐ６クローンを感染させた。ウイルス上清サンプルを毎日採取し、ＴＣＩＤ５０アッセイによって感染力価を同時にアッセイした。Ｐ６クローンの全てで、３日目〜４日目の間にピーク力価が生じた（約９．０  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）。様々なＰ６クローンの成長速度に有意差はなかった（図１０）。
【０３８７】
まとめると、これらの結果は、ジカウイルスシードの作製が成功したことを示している。このシード選択には、ウイルスの成長履歴、速度、収量、遺伝子型、及び表現型の理解を要した。重要なことに、ジカウイルス株のクローン分離により、汚染物質（例えば、親ヒト分離株中に存在し得る外来性感染性因子）からウイルスを首尾良く精製することができた。興味深いことに、連続３回のプラーク精製により、Ｖｅｒｏ細胞適応化ウイルス（Ｐ６ａ〜ｆ株）を素早く選択することに成功した。これらの株は、無血清Ｖｅｒｏ細胞培養で良好に複製することができ、Ｐ６ａ、ｃ、ｄ、及びｆ株は、ウイルスエンベロープタンパク質に変異を有するのに対し、ｐ６ｂ及びｐ６ｅ株は、ウイルスＮＳ１タンパク質に変異を得た（ウイルスエンベロープに改変なし）。更に、Ｖｅｒｏ適応化株は、これらの株から増殖した後続のウイルス継代の効率的かつ再現可能な成長及び製造が可能であった。理論に束縛されることを望むものではないが、Ｐ６ａ、ｃ、ｄ、及びｆ株に観察されたＥｎｖ−Ｖ３３０Ｌ変異は、Ｖｅｒｏ細胞の継代時にもＥｎｖ  ３３０の変異が観察されたことから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ適応の結果である可能性があり得る（Ｗｅｇｅｒ−Ｌｕｃａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１７．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）。エンベロープタンパク質がジカウイルスの主な免疫原性エピトープであるので、ＥｎｖにＶｅｒｏ適応変異を含有する株は、ワクチン免疫原性に悪影響を及ぼし得る。理論に束縛されることを望むものではないが、タンパク質ＮＳ１の適応変異は、ウイルス複製を増大させるだけでなく、ジカウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）などにおける望ましくない変異の発生を減少または阻害し得ると思われる。加えて、ＮＳ１は、ウイルスの生活環中にエンベロープタンパク質に結合することが知られ得る。この変異（ＮＳ１  Ｗ９８Ｇ）は、下流プロセシング中に、ＮＳ１がウイルスと会合し、場合により共精製する能力の変化と関係し得る。ＮＳ１はまた、免疫原性であることが知られており、ワクチンに対する免疫応答に関係し得る。
【０３８８】
実施例２：Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ株に由来する精製された不活化ジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）の前臨床免疫原性及び有効性
以下の実施例は、Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ株に由来する不活化ジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）の、ＣＤ１及びＡＧ１２９マウスにおける前臨床免疫原性及び有効性について記載する。実施例１に記載されるように、疫学的に関連するＰＲＶＡＢＣ５９株から６つのクローンを作製し、更なる前臨床免疫原性及び有効性試験のために２つ（Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ）を選択した。
【０３８９】
材料及び方法
ジカウイルスワクチンの精製、不活化及び製剤化
前臨床免疫原性及び有効性試験における使用に好適な不活化ＺＩＫＡＶワクチンを多数作製し、特性評価を行った。フラスコのコンフルエントＶｅｒｏ細胞を０．０１のＭＯＩで感染させることによって、Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ株からウイルスを増幅した。ウイルスを３６℃±２℃／５％ＣＯ２で１時間吸着させた。ウイルス吸着後、各フラスコに２０ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳを加え、３６℃±２℃／５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。感染後３日目及び５日目に細胞上清を回収し、細胞デブリを遠心分離によって清澄化した。
【０３９０】
各分離株について、清澄化した上清をプールし、１８％トレハロースを含有するＤＭＥＭで安定化し、−６０℃未満で保存した。プールした清澄化ウイルス上清を３７℃の水浴中で解凍し、４℃で一晩ベンゾナーゼで処理した。ベンゾナーゼ処理後、各サンプルをＳａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＰ３デプスフィルターに適用した。深層濾過後、各サンプルをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）装置に適用した。保持液を緩衝液交換し、希釈し、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ  ＩＥＸＮａｎｏに適用した。各サンプルを２回目のＳａｒｔｏｒｉｕｓ  ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ  ＩＥＸＮａｎｏに適用し、３ステップ溶出プロセスを使用して２５０ｍＭ、５００ｍＭ、及び７５０ｍＭ  ＮａＣｌにより溶出した。ＭｏｎｏＱクロマトグラフィー及び希釈後、各２５０ｍＭ溶出液を緩衝液交換のためにＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０クロスフロー濾過（ＣＦＦ）装置に適用し、ＰＢＳで３５ｍＬに希釈し、２〜８℃で保存した。
【０３９１】
ホルマリンによる不活化のために、新たに調製した１％ホルムアルデヒドを穏やかに攪拌しながら各精製サンプルに滴加して、０．０２％の最終ホルムアルデヒド濃度を得た。サンプルを毎日上下反転させながら室温で（約２２℃）１４日間インキュベートした。ホルムアルデヒドをメタ重亜硫酸ナトリウムにより室温で１５分間中和した後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）装置に適用した。５０ｍＬのＤｒｕｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６％スクロース、ｐＨ７．４）の添加による緩衝液交換を４回実施した。次いで、各サンプルをＤｒｕｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｂｕｆｆｅｒで１５ｍＬに希釈し、０．２ｍシリンジフィルターを使用して滅菌し、滅菌ストッパー付きガラスバイアル（０．５ｍＬ／バイアル）に等分し、−６０℃未満で凍結した。
【０３９２】
ウイルス不活化をＴＣＩＤ５０アッセイ及び二重感染力アッセイによって確認した。簡潔に述べると、原薬サンプルをＣ６／３６細胞にアプライし、６日間増幅させた。Ｃ６／３６細胞の上清をＶｅｒｏ細胞にアプライし、ＣＰＥを８日間モニタリングした。医薬品の製剤化について、ＰＩＺＶ原薬のウイルスを解凍し、サンプルの種類に応じてプールし、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ；最終０．５ｍｇ／ｍＬ、０．０５０ｍｇ／用量）ありまたはなしのＰＢＳで１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬまで希釈し、穏やかに攪拌しながら２〜８℃で一晩インキュベートした。次いで、得られた医薬品ロットを滅菌ストッパー付きガラスバイアルに等分し、使用まで２〜８℃で保存した。図１１は、医薬品を調製するのに使用した工程の要約を提供する。
【０３９３】
マウス接種及び攻撃
免疫原性試験のために、６週齢のオス及びメスのＳｗｉｓｓ−ＩＣＲ（ＣＤ−１）マウスを６つのグループに分けた（ｎ＝１０／グループ）。０日目に、グループ１〜５のマウスに０．１ｍＬのワクチンを筋肉内（ｉ．ｍ．）経路によって接種した（２×０．０５ｍＬの注射）。グループ６のマウスには、プラセボ対照であるＰＢＳを接種した。２８日目及び５６日目に、０日目と同じ投与量及び同じワクチンタイプを使用してマウスにブースト投与し、血液サンプルを−１日目（免疫前）、２７日目（プライム）、４２日目（ブースト１）及び７０日目（ブースト２）に採取した。
【０３９４】
免疫原性及び有効性試験のために、４週齢のオス及びメスのＡＧ１２９マウスを７つのグループに分けた（ｎ＝５／グループ）。０日目に、グループ１〜６のマウスに０．１ｍＬのワクチンを筋肉内（ｉ．ｍ．）経路によって接種した（２×０．０５ｍＬの注射）。グループ７のマウスには、プラセボ対照であるＰＢＳを接種した。２８日目に、０日目と同じ投与量及び同じワクチンタイプを使用してマウスにブースト投与した。尾静脈から血液サンプルを−１日目（免疫前）、２７日目（プライム）及び５５日目（ブースト）に採取した。安楽死の時点で、イソフルランによる深麻酔下で心臓穿刺を介してマウスから採血した（最終）。５６日目に、マウスに１０４プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９を腹腔内刺激した。
【０３９５】
血清移入
ＰＩＺＶをワクチン接種及び攻撃したＡＧ１２９マウスから血清を採取し、プール後に凍結した（表６のグループ１、２、４、及び５）。血清プールを解凍し、血清プールをＰＢＳで３倍希釈することによって試験物質を作製した。ＡＧ１２９正常マウス血清のＰＢＳ３倍希釈を使用して、プラセボを作製した。
【０３９６】
試験物質をＡＧ１２９マウスに０．１ｍＬの腹腔内注射として投与した（等量のプラセボ物品を対照マウスに投与した）。次いで、動物への腹腔内攻撃を、１０４プラーク形成単位のジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９を１００μＬで用いて行った。
【０３９７】
−１１日目（免疫化前）に、重量による許容血液量を１０匹のマウスから尾採血によって全血として採取した。１日目（一次循環中和抗体）及び４日目（ウイルス血症）に、各マウスから尾採血によって全血を採取した。致死的攻撃後の最終採血を多量に深麻酔下で心臓穿刺によって実施した後、頸椎脱臼により安楽死させた。マイクロティナＳＳＴ血清分離剤ゲル入り採血管に血液サンプルを採取し、少なくとも３０分間凝固させた後、遠心分離（１０，０００×ｇ、２分間）により血清を分離し、−８０℃で凍結した。
【０３９８】
プラーク減少中和試験
中和抗体価を、以前に記載されているとおりに、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定した（例えば、Ｏｓｏｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２０１４  Ｓｅｐ；１４（９）：８３０−８参照）。
【０３９９】
レポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）中和アッセイ
９６ウェルプレートで成長させたＶｅｒｏ細胞における中和抗体価を、一定量のジカＲＶＰを用いて血清サンプルを滴定することによって分析した。ＲＶＰは、ジカ（ＳＰＨ２０１２株）のｐｒＭＥタンパク質及びデングベースのウミシイタケルシフェラーゼレポーターを含有した。簡潔に述べると、血清を５６℃で３０分間熱不活化し、希釈し、次いで、ＲＶＰとともに３７℃でインキュベートした。次いで、血清／ＲＶＰ混合物をＶｅｒｏ細胞とともに混合し、３７℃±２℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした後、ルシフェラーゼ基質で検出した。ＪＭＰ１１非線形４パラメーター解析を使用してデータを解析し、ポジティブトラッキング対照に正規化し、有効用量５０％（ＥＣ５０）を報告した。
【０４００】
別途反する指示がない限り、全ての追加の実験方法は、上の実施例１に記載するとおりに実施した。
【０４０１】
結果
６週齢のオス及びメスのＣＤ−１マウスにおけるＰＩＺＶ候補の免疫原性を評価するために、ＣＤ−１マウスの各グループ（Ｎ＝１０／グループ）を、ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ６９  Ｐ６ｂまたはＰ６ｅのいずれかのウイルス株に由来する、０．１μｇ（＋ミョウバン）、１．０μｇ（＋ミョウバン）のいずれかの用量のワクチンで、ｉ．ｍ．経路により免疫した。アジュバントの必要性を評価するために、動物の１グループに、ミョウバンアジュバントを含まないＰ６ｅに由来するワクチン０．１μｇを接種した。ワクチン接種を０日目、２８日目、及び５６日目に行い、グループ６は、プラセボ対照のＰＢＳを投与した（図１２Ａ及び表５）。
【表５】
2021505549.tif 000008
【０４０２】
ワクチン接種後、１回目（２７日目）、２回目（４０日目）及び３回目（７０日目）の免疫後に採取した血清サンプルを、ＲＶＰ中和アッセイにより、ＺＩＫＡＶ特異的中和抗体について試験した（図１２Ｂ）。初回投与を受けてから２７日後、ＰＢＳプラセボ対照群と比較して、ミョウバンを含有するいずれかのクローンに由来するＰＩＺＶをワクチン接種したマウスにおいて、わずかな中和抗体応答が観察された。重要なことに、この応答は、２回目の免疫（４０日目）の際に有意に増加したが、３回目の投与（７０日目）による免疫の際には更に増強されなかった。アジュバント化していないワクチンを接種したマウスでは、中和抗体応答は観察されなかった（図１２Ｂ）。
【０４０３】
ＰＩＺＶ候補の免疫原性及び防御効果を評価するために、１日目及び２８日目に、４週齢のＡＧ１２９マウスグループ（ｎ＝５／グループ）を、ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂまたはＰ６ｅストックのいずれかに由来する、用量０．１μｇ（＋ミョウバン）、用量１．０μｇ（＋ミョウバン）または用量０．１μｇ（−ミョウバン）のいずれかのワクチンで、ｉ．ｍ．経路により免疫した（図１３Ａ及び表６）。
【表６】
2021505549.tif 000009
【０４０４】
ワクチン接種後、５６日目に、ワクチン接種をした対照マウスへの腹腔内攻撃を、１０４ＰＦＵのＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９（低継代）により行った。１回目（Ｄ２７）及び２回目（Ｄ５５）の免疫後に採取した血清サンプルを、ＺＩＫＡＶ特異的中和抗体応答について試験した（図１３Ｂ及び表７）。高用量のミョウバンアジュバント化ワクチンを投与したグループ（グループ２及び５）でのみ、単回免疫後に中和抗体応答が惹起され、これはブースト投与後に劇的に増加した。対照的に、低用量または高用量のいずれかのミョウバンアジュバント化ワクチンを投与したグループでは、２回目の投与後に高い中和抗体応答が生じた。ワクチンを２回投与した場合、Ｐ６クローンの投与量または由来に関係なく、ミョウバンアジュバント化ワクチンを投与したマウスのグループ間に統計的な差はなかった。
【表７】
2021505549.tif 000010
【０４０５】
攻撃後２１日間、全てのグループの死亡率、罹患率及び体重減少についてもモニタリングした。攻撃後のウイルス血症を検出し、プラーク滴定によって定量した。ミョウバンを配合した低用量または高用量のＰＩＺＶ候補をワクチン接種したマウス（グループ１、２、４及び５）は、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）アッセイ及び比較可能な二次中和アッセイによって評価したとき、致死的ＺＩＫＡＶ攻撃から完全に保護された（表８）。ワクチン接種をしたマウスでは、体重減少または疾病の臨床徴候は観察されず、攻撃から３日後、検出可能な感染性ウイルス血症はなく、低用量または高用量のいずれかの抗原＋ミョウバンアジュバントでワクチン接種した全てのマウスが攻撃後２１日まで生存した（図１４〜１６）。対照的に、全てのナイーブマウスの攻撃では、攻撃後２日目に、ウイルス血症が高くなり、攻撃後１０日目と１８日目の間に罹患／死亡が生じた（生存中央値＝Ｄ１３）。更に、Ｐ６ｂ株に由来するミョウバンアジュバント化していない低用量ワクチンをワクチン接種したマウスの攻撃では、攻撃後２日目にウイルス血症が高くなり、プラセボ対照群と同様の生存期間中央値を有したが、クローンｅに由来するミョウバンアジュバント化していない低用量をワクチン接種したマウスは、部分的に保護され、１９日の生存中央値を有した。これらの結果は、ミョウバンを加えると免疫がより効果的になり、二次免疫が必要であり得、また、低用量が高用量と同じように効果的であったことを示している。
【表８】
2021505549.tif 000011
【０４０６】
更に、全粒子不活化Ｐ７ｂ及びＰ７ｅウイルス（それぞれＰ６ｂ及びＰ６ｅ株から１回追加継代）から生産したワクチン原薬（ＤＳ）におけるＮＳ１の存在を試験した。アジア系統とアフリカ系統の両方のジカウイルスＮＳ１に対して反応するが、デングＮＳ１に対しては交差反応しないモノクローナル抗体をプレコーティングしたプレートを使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。２、４、８、１６、及び３２倍希釈のＤＳをデュプリケートで調製し、組み換え精製されたＮＳ１を０〜８ｎｇ／ｍＬの濃度でデュプリケートで使用した標準曲線と比較した。陰性対照として、ＤＳ緩衝液のみの希釈液をデュプリケートで調製した。結合したＮＳ１を抗ＮＳ１  ＨＲＰコンジュゲートにより検出し、ＤＳ緩衝液のみのウェルの吸光度（Ａ４５０−Ａ６３０）を、対応するＤＳサンプルを含有するウェルで測定された吸光度から差し引いた。サンドイッチＥＬＩＳＡの結果を以下の表９に示す。興味深いことに、ＮＳ１は、ワクチン原薬調製物と共精製されることが観察され、これは、ウイルスＮＳ１が全粒子不活化ウイルスワクチンの免疫原性成分である可能性を示唆している。
【表９】
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【０４０７】
抗体の受身伝達後に野生型ジカウイルス攻撃からの防御を与えるのに必要な中和抗体（Ｎａｂ）の閾値を次に試験した。（表１０Ａ及びＢ）。
【表１０】
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【０４０８】
ワクチン接種及び攻撃を受けたＡＧ１２９マウスからプールした血清をＰＢＳで３倍段階希釈し、５〜６週齢のＡＧ１２９マウスの７つのグループ（Ｎ＝５／グループ）に腹腔内注射した。免疫前ＡＧ１２９マウス血清をプラセボ対照として使用した（グループ８）。受身伝達後（約１６〜１９時間後）、全血を採取し、各マウスからの血清を遠心分離によって分離した後、ウイルス攻撃を行って循環中和抗体価を決定した（図１７）。ウイルス攻撃の直前に、マウスの各グループ（グループ１、２、３、４、５、６、７、８と指定）は、それぞれ２．６９、２．２６、１．７２、１．３０、＜１．３０、＜１．３０、＜１．３０、＜１．３０の平均ｌｏｇ１０中和抗体価を有した。
【０４０９】
ＺＩＫＶ  ｎＡｂの受身伝達から２４時間後、マウスへの腹腔内攻撃を１０４ｐｆｕのＺＩＫＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９により行った。攻撃後、動物の体重を毎日測定し、疾病の徴候を１日１〜３回２８日間、モニタリングした。症状に基づいて各動物に臨床スコアを付けた（表１１）。瀕死状態及び／または明らかな神経学的徴候（臨床スコア２以上）を示した動物は、人道的に安楽死させ、非生存動物としてカウントした。
【表１１】
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【０４１０】
疾患の徴候は、攻撃の９日後に対照群（グループ８）及びグループ５〜７で現れ始め、それに対応して体重が減少した（図１８）。攻撃から３日後に、全血を採取し、各動物からの血清を遠心分離によって分離した。血清サンプルを、プラーク滴定アッセイを使用して感染性ＺＩＫＶの存在について分析した（図１９）。グループ１〜８のマウスの平均感染力価（ｌｏｇ１０  ｐｆｕ／ｍＬ）は、それぞれ１．６６、２．７４、４．７０、４．９２、７．２４、７．５４、７．５４及び７．４６であった。重要なことに、検出可能なレベルのＺＩＫＶ中和抗体（≧１．３０  ｌｏｇ１０）を有するグループ１〜４のマウスは、ウイルス血症（ｐ＝０．０００１、０．０００３、０．０００７及び０．０３７４）が対照マウスよりも統計的に有意に低いレベル（１０２．５倍〜１０６．０倍低い力価）であった。これらの結果は、検出可能なレベルのＺＩＫＶ中和抗体（≧１．３０  ｌｏｇ１０）が用量依存的にウイルス血症を減少させることを示唆した。
【０４１１】
グループ１〜８のマウスの生存期間中央値は、それぞれ決定なし、１７日、１７日、１３日、１１日、１１日、１１日、及び１０日であった（図２０）。重要なことに、検出可能なＺＩＫＶ中和抗体価（グループ１〜４）を有するマウスのグループの生存曲線は、対照群（グループ８）と比較して統計的に異なった（各ｐ＝０．００１９、０．００１９、０．００１９、０．０１５３）。これらの結果は、検出可能なレベル（≧１．３０  ｌｏｇ１０）のＺＩＫＶ中和抗体が用量依存的に疾患の発症を遅らせることを示唆した。
【０４１２】
最後に、各動物のＺＩＫＶ中和抗体価を、対応するウイルス血症力価に対してグラフ化し、線形回帰分析を実施した。攻撃後３日目のＺＩＫＶ中和抗体価レベルとウイルス血症レベルとの間には、大きな逆相関関係が観察された（図２１）。受身伝達試験の結果の概要を以下の表１２に示す。
【表１２】
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【０４１３】
本実験では、ＺＩＫＡＶ中和抗体を投与したマウスのグループで致死的ＺＩＫＡＶ攻撃から完全に保護されたグループはなかったが、検出可能なレベルの循環ＺＩＫＡＶ中和抗体価を有するマウスのグループ間では、用量依存的なウイルス血症レベルの減少及び疾患の発症遅延が示された。
【０４１４】
まとめると、ＣＤ−１とＡＧ１２９マウスの両試験からの前臨床データは、十分に特徴付けられた別個のウイルスクローンに由来するＰＩＺＶが免疫原性であり、野生型ＺＩＫＡＶによる攻撃に対する防御をもたらすことができることを示している。重要なことに、低用量及び高用量のワクチンは、２回の投与後、同様の中和抗体応答を惹起し、致死的ＺＩＫＡＶ攻撃に対して同様のレベルの防御をもたらした。興味深いことに、アジュバント化していないＰＩＺＶ候補をワクチン接種したマウスもＺＩＫＡＶ攻撃からの部分的防御を示した。ワクチン抗血清は、受動免疫されたＡＧ１２９マウスのウイルス血症を有意に減少させ、致死的ＺＩＫＡＶ攻撃に対する生存を延長させた。これらの結果はまた、十分に特徴付けられたＰＩＺＶ候補が、ＺＩＫＡＶ高感受性ＡＧ１２９マウスモデルのＺＩＫＡＶ感染に対して極めて効果的であったことを示している。
【０４１５】
更に、継代７のＰＲＶＡＢＣ５９（ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｅ由来）の配列が継代６の配列と遺伝的に同一であることがわかった。これは、フラビウイルスが遺伝的に不安定であると考えられていることから、驚くべきことであった。ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｅを、１つには７継代にわたるその遺伝的安定性により、マスターウイルスシードとして選択した。理論に束縛されることを望むものではないが、ＮＳ１のウイングドメインの単一アミノ酸置換（Ｗ９８Ｇ）がＶｅｒｏ細胞適応化ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ゲノムに観察される唯一の変異であるので、この増大された遺伝的安定性は、当該変異による可能性があると考えられる。更に、遺伝的安定性及び均一性は、ワクチン製剤に使用され得る後続の株の変動性を減少させ、再現可能な生産を増加させるという点で有利である。
【０４１６】
実施例３：Ｐ６ａ株及びＰ６ｅ株の表現型の前臨床評価
材料及び方法
ＡＧ１２９マウス（インターフェロンα／β及びγ受容体を欠く）は、ＺＩＫＶ感染症及び脳の重篤な病態を含む疾患に感受性である。１４週齢のＡＧ１２９マウスに１０４及び１０３ｐｆｕのＺＩＫＶ継代６クローンａ（Ｐ６ａ）及びｅ（Ｐ６ｅ）を腹腔内感染させた。
【０４１７】
マウスの体重測定及び疾病の臨床徴候（体重減少、立毛、丸まった姿勢、嗜眠、四肢の衰弱、部分的／完全な麻痺）を毎日（最大２８日）モニタリングした。更に、ウイルス血症の分析を、実施例１に記載されるように、攻撃から３日後に採取した血清サンプルのプラーク滴定によって実施した。
【０４１８】
結果
Ｐ６ｅによる感染症は１００％の死亡率（生存期間の中央値＝１２．５日）をもたらしたが、Ｐ６ａによる感染症はわずか３３％の死亡率（生存期間の中央値＝決定なし）をもたらした（図２２）。これと一致して、ｐｒｅＭＶＳ  Ｐ６ｅ感染マウスは、ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ａ感染マウスと比較して大きな体重減少を示した（３）。ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ａまたはＰ６ｅを感染させたマウスのグループ間で、ウイルス血症レベルのグループ平均に統計的な差は見られなかった（図２４）。これらのデータは、成長速度のみが主要な決定因子ではない可能性があり（両株がｉｎ  ｖｉｔｒｏで同様のウイルス血症、及び同様のピーク力価をもたらしたため）、また、エンベロープタンパク質の特徴がビルレンス（野生型株）及び免疫原性（不活化候補）にとって重要であり得ることを示唆している。
【０４１９】
実施例４：不活化の有効性を決定するための不活化アッセイの完全性
不活化（ＣＯＩ）アッセイの完全性とも呼ばれる二重感染力アッセイを開発して、ホルマリン不活化（０．０１％ホルムアルデヒド）の有効性と、精製された不活化ジカウイルス（ＰＩＺＶ）バルク原薬（ＢＤＳ）の潜在的な残留感染性ウイルス活性を決定した。
【０４２０】
サンプル調製：上記のクローンｅの精製された不活化ジカワクチン（ＰＩＺＶ）ロットを、Ｖｅｒｏ細胞における成長により、４つ製造した（Ｔｏｘロット１〜４）。毎日の４回の採取物（合計約４０００ｍＬ）から上清をクロマトグラフィーによって精製し、続いて、最終濃度０．０１％ｗ／ｖまでホルムアルデヒドを加えた。不活化を２２℃で１０日間進行させた。不活化中に、特性評価及び解析のために、工程内管理（ＩＰＣ）サンプルをバルク原薬（ＢＤＳ）から毎日取り出した。日々のＩＰＣサンプルをメタ重亜硫酸ナトリウムで中和し、ＤＭＥＭ（ウイルス成長培地）に透析した。サンプルは、精製された不活化ジカウイルスを含有する。不活化の最終日に、残量のＢＤＳサンプルは、中和せずに、ＴＦＦで処理してホルムアルデヒドを除去し、ＰＢＳに緩衝液交換した。
【０４２１】
不活化アッセイ（ＣＯＩ）の完全性：日々のＩＰＣサンプルにおける不活化の有効性を分析して、不活化の動態、及び最終ＢＤＳを理解するために、ＣＯＩアッセイを使用した。最大の感度を得るために、このアッセイでは、２つの細胞株Ｖｅｒｏ及びＣ６／３６をまず利用して、ＩＰＣ及びＤＳサンプル中で生きている可能性のあるウイルスを検出した。フェノールレッドを含有する成長培地の存在下でジカウイルスをＶｅｒｏ細胞に感染させると、死細胞の副産物によってｐＨが低下する。その結果として、培地の色が赤／ピンクから黄色に変化し、これは、培地のｐＨが酸性にシフトしたことを示す。この現象は、アポトーシス及び細胞変性効果（ＣＰＥ）によって生じ、ＣＰＥは、ウイルスの侵入、感染、及びウイルス複製中の細胞からの出芽によって生じる宿主細胞の細胞構造に変化が観察されたことを示す。最終的には、Ｃ６／３６蚊細胞及びＶｅｒｏ細胞の両方は、感染に対して許容細胞株であるが、ジカウイルス感染は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＶｅｒｏ細胞のみを殺傷する。したがって、Ｖｅｒｏ細胞をアッセイの指標細胞株として使用した。対照的に、ジカウイルスの天然宿主ベクターに由来するＣ６／３６細胞は、ジカ感染時にＣＰＥを示さず、溶解しない。培地の色は変化せず、Ｃ６／３６細胞の生存率は変化しない。
【０４２２】
そのため、アッセイは２部に分かれる。アッセイの第１部では、２つの感受性細胞株の９６ウェルプレートで、生きている可能性のあるウイルス粒子を並行して６日間増幅させる。アッセイの第２の工程は、９６ウェルプレートの上清（場合により増幅した粒子を含む）をＶｅｒｏ細胞の単層を含有する６ウェルプレートに移し、更に８日間インキュベーションして、ウイルス感染させ、Ｖｅｒｏ細胞に細胞変性効果を発現させることを含む。観察されたＣＰＥは全て光学顕微鏡を使用して確認した。
【０４２３】
アッセイの第１部、すなわち、Ｃ６／３６細胞の培養での９６ウェルプレートの使用、及びアッセイの第２部、すなわち、細胞変性効果を観察するためのＶｅｒｏ細胞の培養での６ウェルプレートの使用に関して詳述したが、アッセイは、以下の表に従って、容易にスケールアップすることができる。
【表１３】
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スケールアップ中、容器１ｃｍ２当たりのサンプル量は、第１部で一定に維持され、第２部では同じウイルス感染条件が維持されることは明らかである。
【０４２４】
ＣＯＩアッセイコントロール：このアッセイの力価及び逆滴定コントロールは、Ｖｅｒｏ指標細胞を使用して実施し、ＴＣＩＤ５０  ９６ウェルフォーマットで評価した。ウェルは、細胞死の代替、またはＣＰＥの存在である、ピンクから黄色への培地の色の変化に基づき、陽性と評価した。
【０４２５】
ウイルス力価コントロール試験：既知の力価を有する対照ウイルス（ＰＲＶＡＢＣ５９）の２つの独立したレプリケートを２％ＦＢＳ含有培地で１０倍希釈系列にし、１００μＬの各希釈液をＶｅｒｏ細胞を含有する９６ウェルプレートの４ウェルに加えた。プレートを５日間インキュベートし、次いで、ＣＰＥ含有ウェルを記録し、Ｒｅｅｄ−Ｍｅｕｎｃｈ計算表を使用して、ウイルス力価を算出した。
【０４２６】
ウイルス逆滴定コントロール試験：既知の力価を有する対照ウイルスを２００  ＴＣＩＤ５０に段階希釈した。２００  ＴＣＩＤ５０対照ウイルスの２つの独立したレプリケートを２％ＦＢＳ含有培地で２倍希釈系列にし、１００μＬの各希釈液をＶｅｒｏ細胞を含有する９６ウェルプレートの４ウェルに加えた。細胞を５日間インキュベートし、次いで、ＣＰＥ含有ウェルを記録し、Ｒｅｅｄ−Ｍｅｕｎｃｈ計算表を使用して、ウイルス力価を算出した。
ＣＯＩプロトコルの詳細：
１．アッセイの第１部：サンプル添加の２日前に、Ｖｅｒｏ（１．４Ｅ＋０５細胞／ｍＬ）細胞及びＡｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉＣ６／３６（４Ｅ＋０５細胞／ｍＬ）細胞を９６ウェルプレートに播種した。Ｖｅｒｏ細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％最終ＦＢＳ＋２％Ｌ−グルタミン＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中、３７℃で培養した。Ｃ６／３６細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２％Ｌ−グルタミン＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン＋１％非必須アミノ酸中、２８℃で培養した。
２．２００  ＴＣＩＤ５０対照ウイルス（ウイルス逆滴定コントロール試験で調製）またはＤＳサンプルの３つの独立したレプリケートを２％ＦＢＳ含有培地に希釈した（５倍及び１０倍希釈）。
３．９６ウェルプレート中の細胞にサンプルを接種した。サンプルは、９６ウェルプレートの細胞単層への感染前に、ボルテックス処理をし、存在し得るあらゆる凝集を解いた。１００μＬの各希釈液をそれぞれＶｅｒｏ及びＣ６／３６細胞を含有する２つの別個の９６ウェルプレートの５つのウェルのそれぞれにアプライした。
４．各細胞種の別のウェルには、陰性ＣＰＥ対照として、培地のみを含めた。
５．プレートを細胞株に適した温度で６日間インキュベートした。
６．アッセイの第２部：許容細胞株において、生きているウイルスを更に増幅し、ＣＰＥによって可視化するために、Ｖｅｒｏ及びＣ６／３６細胞の両方から、各９６ウェル上清の全量をＶｅｒｏ細胞の６ウェルプレートの個々のウェルに移した。１５分間隔で揺らしながら、接種を９０分間進行させた。
７．２％ＦＢＳ含有培地をウェルに加え、プレートを更に８日間インキュベートし、その後、ＣＰＥに関して増幅サンプルの検出を行った。不活化は、ＤＳのレプリケートのいずれかが８日目の終わりにＣＰＥを示した場合、不完全であるとみなした。
７．生きている／複製するビリオンの存在を、６ウェルプレートに移し、８日間インキュベーションして、ウイルスを複製させた後の感受性細胞単層上のプラークまたはＣＰＥの形成によって可視化した。アッセイ終了時の６ウェルプレートの％ＣＰＥ評価は、次のように算出した：
−Ｖｅｒｏ細胞の各６ウェルプレートを比色変化の可視化によってＣＰＥについて試験し、続いて、倒立光学顕微鏡での検査によってＣＰＥを確認した。
−各６ウェルプレートは、上記の５倍及び１０倍希釈で調製されたＤＳ希釈液のレプリケートの１つであった（５つのウェル＋培地のみを含有するウェル１つ）。
したがって、各レプリケートの％ＣＰＥは、１サンプル当たり合計５ウェルのうち、ＣＰＥを有するウェルの数を反映するものであった（アッセイごとに合計１２０個のウェルを使用）。平均％ＣＰＥ及び標準偏差は、各希釈液の３つのレプリケートに基づいて算出した。
【０４２７】
結果：以下の表に示すようにＴｏｘロット＃１〜４のそれぞれで日々のサンプルを分析した。
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
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【０４２８】
編集した不活化の動態データ：４つの毒性学ロットからのサンプルのＣＯＩデータを、上記のように決定された感染力（ＴＣＩＤ５０）及びＲＮＡコピーと比較した。ＲＮＡコピーは、サンプルから核酸を精製し、ＲＴ−ＰＣＲキットを使用して血清型特異的プライマーによりジカＲＮＡを増幅させることによって、決定した。図２５に示す結果は、ＣＯＩアッセイの感度がＴＣＩＤ５０の感度よりも大幅に高いことを示す。
【０４２９】
ＣＯＩアッセイの分析能パラメーター−真度：標的希釈（ＴＣＩＤ５０／ウェル）及びＣＰＥのそれぞれの比率を使用して、相対真度を決定した。Ｖｅｒｏ細胞の場合、陽性ＣＰＥについて観察された割合と予想された割合の間には、統計的に有意な線形関係があった。観察結果と予想結果を関連付ける線の傾きは、０．９２であり、１と重なると１００％真度を示す９５％信頼区間（ＣＩ）は、０．８３〜１．０１である。Ｃ６／３６細胞の場合、陽性ＣＰＥについて観察された割合と予想された割合の間には、統計的に有意な線形関係がある。観察結果と予想結果を関連付ける線の傾きは、０．８８であり、９５％信頼区間（ＣＩ）は、０．８０〜０．９５である。これは、この細胞株では、わずかな偏り（５〜２０％）が見られたことを示している。細胞株はいずれも満足のいく真度（相対）を示している。
【０４３０】
ＣＯＩアッセイの分析能パラメーター−検出限界（ＬｏＤ）：アッセイの感度は、Ｃ６／３６からＶｅｒｏへのプレートとＶｅｒｏからＶｅｒｏへのプレートの両方で評価した。上記のように、データのフィッティングは、１０．００  ＴＣＩＤ５０／ウェルから０．０８  ＴＣＩＤ５０の低い力価まで播種した力価の希釈で播種した全てのウェルで観察されたＣＰＥ陽性の割合の最小２乗回帰を使用して行った。更に、プレートの各希釈について、陰性対照（０．００  ＴＣＩＤ５０／ウェル）を含めた。ＣＰＥの評価は、Ｃ６／３６からＶｅｒｏへのプレート及びＶｅｒｏからＶｅｒｏへのプレートの両方で、各希釈ごとに実施した。ＣＰＥとｌｏｇ入力ウイルス力価との間に明らかな関係が認められた。これは、ＴＣＩＤ５０／ウェルのｌｏｇ１０濃度に対するＣＰＥ陽性ウェルの割合のロジスティック（シグモイド）関係を示し、９９％信頼限界の下限値及び上限値を有する。−２  ｌｏｇ１０濃度（＝０．０１  ＴＣＩＤ５０／ウェル）では、適格性評価データの全ての固定及びランダム変動源に基づいた、またこれらを考慮したモデルによると、０．８５％、または０．０１  ＴＣＩＤ５０／ウェルに切り上げた場合、０．０１が予測され、下限の９９％信頼限界は０．４２％である。９９％信頼限界の下限値はゼロを含まないので、０  ＴＣＩＤ５０／ウェルから０．８５％ＣＰＥウェルが生じ得る可能性を定量化できる（＜１％）見込みは極めて小さい（すなわち、ノイズに起因する）。これにより、少なくとも０．０１  ＴＣＩＤ５０／ウェルがアッセイの検出限界であることが確立される（すなわち、検出することができるサンプル中で生きているジカ粒子の最低量）。すなわち、６０ウェル中の１つがＣＰＥ陽性または所与のこれらのパラメーターであるとき、端数を切り上げると、６０ウェルで検出することができるＣＰＥ陽性の最低理論割合は、１．６７％、または０．０１６７である。
【０４３１】
細胞の種類（Ｃ３６３及びＶｅｒｏ）を相対感度について比較した。図２６に示されるように、Ｃ６／３６は、Ｖｅｒｏ細胞と比較して、より低い希釈のウイルス力価を検出することができることを示しており、同じウイルス入力レベル（０．３１  ＴＣＩＤ５０）では、ＣＰＥ陽性ウェルの割合は、Ｖｅｒｏ細胞に比べてＣ６／３６でより高い。
【０４３２】
このアッセイの適格性評価中に使用された最低ウイルス入力値は、０．０２  ＴＣＩＤ５０（−１．６１  ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０）であった。Ｃ６／３６細胞の近似曲線を使用すると、ＣＰＥ陽性と評価されるウェルは０．０３５または３．５％（２８ウェル中１つ）となる。曲線を０．１６７または１．６％の最低実用レベルに外挿すると、０．０１５  ＴＣＩＤ５０（−１．８２  ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０）のウイルス入力レベルに相当する。しかしながら、ＣＰＥ陽性結果に反映される検出することができる感染性ウイルスの最低レベルを決定する場合、伝達されるアッセイ変動の影響を考慮する必要がある。このノイズは、入力ウイルスの作業ストックの作製から発生する。目標ＴＣＩＤ５０と逆滴定の計算を比較すると、作業ストックウイルスのＴＣＩＤ５０は、８５  ＴＣＩＤ５０／ｍＬの標準偏差（ＳＤ）を示し、これは、２００のストックのＴＣＩＤ５０／ｍＬ濃度を目標にしたとき、２１３の平均から得られた。％ＣＶを計算すると、約４０％であり、偏りは約＋７％である。このノイズをロジスティック回帰モデルに組み込み、ウイルス希釈の目標値の前後に信頼区間を生成した。０．０１  ＴＣＩＤ５０／ウェルの目標値では、２箇所にわたる適格性評価データの全ての固定及びランダム変動源に基づいた、またこれらを考慮したモデルによると、ウェルの０．８６％がＣＰＥ陽性になることが予想される（６０ウェル中１つ）。９９％信頼限界の下限値はゼロを含まないので、０  ＴＣＩＤ５０／ウェルから０．８５％ＣＰＥ陽性ウェルがノイズに起因して生じ得る可能性を定量化できる（＜１％）見込みは極めて小さい（図２７）。これにより、アッセイの検出限界が確立される：０．０１  ＴＣＩＤ５０／ウェルが、検出することができるサンプル中で生きているジカ粒子の最低量である。
【０４３３】
ＣＯＩアッセイの分析能パラメーター−範囲：アッセイの範囲は、０．０１  ＴＣＩＤ５０／ウェル〜４．５  ＴＣＩＤ５０／ウェルであり、０％を超えるが１００％未満であるＣＰＥ陽性割合の評価をもたらす入力ウイルスの範囲と定義される。
【０４３４】
結果：４つのＴｏｘの分析により、０．０１％ホルムアルデヒド中、室温で１０日間インキュベーションした後に、不活化が完全であったことが明らかになった。ＣＯＩアッセイによって測定すると、不活化は、生産した全てのロットで、３〜４日までに達成された。ＣＯＩアッセイは、ＴＣＩＤ５０効力またはＲＮＡ測定よりも感度が高く、この感度の向上は、ＬｏＤによっても観察されている。
【０４３５】
実施例５：医薬組成物中の残留ホルマリン含量の決定
材料及び方法
材料
ホルムアルデヒド標準溶液（メタノール中）（９８２μｇ／ｍＬ）、ＤＮＰＨ、ＨＰＬＣグレードアセトニトリル、及びリン酸をＷａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。リン酸の希釈に使用される蒸留水は、Ｏｔｓｕｋａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ，Ｊａｐａｎ）から入手した。水酸化アルミニウムゲルとして使用したＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）２％（１０ｍｇ／ｍＬアルミニウムに相当）は、Ｂｒｅｎｎｔａｇ（Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手した。ＰＢＳは、社内で調製し、水酸化アルミニウムゲルを含有するジカワクチン製剤を以下のように製造した。ジカウイルスは、回収後、様々な技術で精製した。ホルムアルデヒドで不活化した後、ウイルスを濃縮し、緩衝液を濾過によりＰＢＳに交換した。バルク原薬をＰＢＳで希釈し、水酸化アルミニウムゲル（０．４ｍｇ／ｍＬアルミニウム）とともに製剤化して最終医薬品を作製した。
【０４３６】
ＨＰＬＣ条件
ＵＶ検出器（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＵＳＡ）及び逆相カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ（Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ））を備えるＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣアライアンスシステムを使用した。水とアセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ）の混合物を移動相として使用し、検出波長は３６０ｎｍに設定し、流量は１．０ｍＬ／分とした。カラム温度及び注入量は、それぞれ２５℃及び５０μＬであった。
【０４３７】
サンプル調製
ワクチン製剤（１．２ｍＬ）を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、上清（１ｍＬ）をＷａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＵＳＡ）から購入した２ｍＬ  ＨＰＬＣガラスバイアルに移した。次に、２０μＬの２０％（ｖ／ｖ）リン酸及び５０μＬの１．０ｍｇ／ｍＬ  ＤＮＰＨのアセトニトリル溶液を加え、混合物を攪拌し、室温で２０分間静置した後、注入した。
【０４３８】
方法のバリデーション
ＩＣＨ  Ｑ２ガイドラインに従って、サンプルの特異性、直線性、真度、併行精度、室内再現精度、頑健性、及び安定性の点で、方法のバリデーションを行った。真度試験では、ジカワクチン製剤及び水酸化アルミニウムゲル溶液に特定量のホルムアルデヒドを加え、ボルテックスによりサンプルを十分混合してから、セクション２．３に記載の手順に従った。
【０４３９】
結果及び考察
直線性及び特異性
６つのホルムアルデヒド標準溶液（０．０４９、０．０９８、０．１９６、０．４９１、０．９８２、及び１．９６４μｇ／ｍＬ）をＰＢＳでの希釈によって調製した。次に、２０％（ｖ／ｖ）リン酸及び１ｍｇ／ｍＬ  ＤＮＰＨのアセトニトリル溶液を各溶液に加えた。対応するクロマトグラムを図２８に示す。明らかに、１０．４分のピーク面積は、回帰方程式で直線性を示した：ｙ＝１０７５７３０ｘ＋１１７３１（式中、ｙは、１０．４分のピーク面積であり、ｘは、ホルムアルデヒドの濃度（μｇ／ｍＬ）である）（相関係数：０．９９９８）。これは、ＨＣＨＯ−ＤＮＰＨ（すなわち、ＤＮＰＨで誘導体化されたホルムアルデヒド）に起因するものであることを示している。更に、５．８分でのピークは、ＤＮＰＨを加えた全てのサンプルで検出されていることから、ＤＮＰＨに帰属した。したがって、ＨＣＨＯ−ＤＮＰＨピーク面積を、ＰＢＳのバックグラウンドピーク面積を差し引いてから直線性及び特異性の評価に使用した。
【０４４０】
真度及び精度（併行精度）
水酸化アルミニウムアジュバントの効果を回収試験によって評価した。この試験は、ワクチン原薬の不在下で、ＰＢＳ中の水酸化アルミニウムの３つのサンプル（０．１、０．４、及び１．０ｍｇ／ｍＬのアルミニウム）に０．０５μｇ／ｍＬのホルムアルデヒドを加えることによって実施した。平均回収率はそれぞれ１０２％（ｎ＝３）、１００％（ｎ＝３）、及び１００％（ｎ＝３）であり、相対標準偏差（ＲＳＤ）の値は低かった（表１３）。併行精度を評価するために、真度データのＲＳＤを算出すると、１．０％であることがわかった。これは、１．０ｍｇ／ｍＬまでのアルミニウム量が、ホルムアルデヒドの回収に干渉しなかったことを示す。
【表１５】
2021505549.tif 000021
【０４４１】
方法の真度を回収試験によって評価した。この試験は、水酸化アルミニウムアジュバント含有ジカワクチン製剤に３つの濃度のホルムアルデヒド（０．０５、０．１０、及び１．００μｇ／ｍＬ）を加えることによって実施した。平均回収結果を表１４に示す。併行精度を評価するために、真度データのＲＳＤを算出すると、３．７％であることがわかった。これは、水酸化アルミニウムとともに製剤化されたジカワクチン製剤が、０．０５〜１．００μｇ／ｍＬのホルムアルデヒドの回収に干渉しないことを示す。
【表１６】
2021505549.tif 000022
【０４４２】
頑健性
サンプル調製中の実験パラメーターの変動によって、サンプル中のホルムアルデヒドの濃度がどのような影響を受けるかを決定するために、方法の頑健性を評価した。誘導体化の有効性に対する影響を考慮して、ＤＮＰＨ及びリン酸の濃度を、本試験でモニタリングするパラメーターに選択した。ＤＮＰＨ及びリン酸の濃度をそれぞれ±０．１ｍｇ／ｍＬ及び±５％まで変化させることによって、その影響を調べた。ホルムアルデヒドは、各条件下で、２つ開発製剤ロットで測定された。結果を表１５に示す。これは、ＤＮＰＨ及びリン酸の濃度変動がホルムアルデヒドの測定に大きな影響を与えなかったことを示唆している。
【表１７】
2021505549.tif 000023
【０４４３】
実施例６：Ｐ６ｅ株に由来する精製された不活化ジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）の臨床免疫原性及び有効性
サンプル調製：
精製された不活化ジカワクチン（ＰＩＺＶ）ロットを、上記のＶｅｒｏ細胞における成長により、４つ製造した（Ｔｏｘロット１〜４）。毎日の４回の採取物（毎日１日１回１０００ｍＬの採取、合計約４０００ｍＬ）から上清を濾過及びクロマトグラフィーによって精製し、濃縮し、最終濃度０．０１％までホルムアルデヒドを加えることによって、不活化した。不活化を２２℃で１０日間進行させた後、サンプルをＤｒｕｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６％スクロース、ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。
【０４４４】
不活化したジカウイルス活性剤は、不活化されていないジカウイルスに感染し得る宿主細胞に感染する可能性はもはやない。不活化を以下の試験プロトコルによって決定した。不活化は、プラークが検出されない場合に認められる。
【０４４５】
ＣＯＩ（不活化の完全性）プロトコルの詳細：
１．アッセイの第１部：サンプル添加の２日前に、Ｖｅｒｏ（１．４Ｅ＋０５細胞／ｍＬ）細胞及びＡｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉＣ６／３６（４Ｅ＋０５細胞／ｍＬ）細胞を９６ウェルプレートに播種した。Ｖｅｒｏ細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％最終ＦＢＳ＋２％Ｌ−グルタミン＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中、３７℃で培養した。Ｃ６３６細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２％Ｌ−グルタミン＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン＋１％非必須アミノ酸中、２８℃で培養した。
２．２００  ＴＣＩＤ５０対照ウイルス（ウイルス逆滴定コントロール試験で調製）またはＤＳサンプルの３つの独立したレプリケートを２％ＦＢＳ含有培地に希釈した（５倍及び１０倍希釈）。
３．９６ウェルプレート中の細胞にサンプルを接種した。サンプルは、９６ウェルプレートの細胞単層への感染前に、ボルテックス処理をし、存在し得るあらゆる凝集を解いた。１００μＬの各希釈液をそれぞれＶｅｒｏ及びＣ６３６細胞を含有する２つの別個の９６ウェルプレートの５つのウェルのそれぞれにアプライした。
４．各細胞種の別のウェルには、陰性ＣＰＥ対照として、培地のみを含めた。
５．プレートを細胞株に適した温度で６日間インキュベートした。
６．アッセイの第２部：許容細胞株において、生きているウイルスを更に増幅し、ＣＰＥによって可視化するために、Ｖｅｒｏ及びＣ６３６細胞の両方から、各９６ウェル上清の全量をＶｅｒｏ細胞の６ウェルプレートの個々のウェルに移した。１５分間隔で揺らしながら、接種を９０分間進行させた。
７．２％ＦＢＳ含有培地をウェルに加え、プレートを更に８日間インキュベートし、その後、ＣＰＥに関して増幅サンプルの検出を行った。不活化は、ＤＳのレプリケートのいずれかが８日目の終わりにＣＰＥを示した場合、不完全であるとみなした。
７．生きている／複製するビリオンの存在を、６ウェルプレートに移し、８日間インキュベーションして、ウイルスを複製させた後の感受性細胞単層上のプラークまたはＣＰＥの形成によって可視化した。アッセイ終了時の６ウェルプレートの％ＣＰＥ評価は、次のように算出した：
−Ｖｅｒｏ細胞の各６ウェルプレートを比色変化の可視化によってＣＰＥについて試験し、続いて、倒立光学顕微鏡での検査によってＣＰＥを確認した。
−各６ウェルプレートは、上記の５倍及び１０倍希釈で調製されたＤＳ希釈液のレプリケートの１つであった（５つのウェル＋培地のみを含有するウェル１つ）。
したがって、各レプリケートの％ＣＰＥは、１サンプル当たり合計５ウェルのうち、ＣＰＥを有するウェルの数を反映するものであった（アッセイごとに合計１２０個のウェルを使用）。平均％ＣＰＥ及び標準偏差は、各希釈液の３つのレプリケートに基づいて算出した。
【０４４６】
精製された不活化ジカウイルスの量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）によって、指定量の組み換えジカエンベロープタンパク質を使用し、標準曲線を確立することによって決定することができる。
【０４４７】
精製されたジカウイルスの純度は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定することができる。この実施例では、サイズ排除クロマトグラフィーで精製されたジカウイルスのメインピークは、サイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下総面積の８５％超であった。
【０４４８】
治験ワクチン（ＰＩＺＶ）は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、アジュバントである２００μｇの水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３とともに製剤化したジカ精製ホルマリン不活化ウイルスを指す。最終的な液体製剤は、単回使用バイアルに充填され、不正開封防止シールで密閉される。治験ワクチンは、１用量当たり２、５、または１０μｇの抗原での０．５ｍＬの２回投与レジメンで２８日の間隔を置いてＩＭ（筋肉内）投与される。
【０４４９】
注射用塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）０．９％溶液がプラセボとして使用され、単回使用バイアルで提供される。これは、非経口用途向けの保存剤を含まない、無菌で無色透明な塩化ナトリウム液体溶液である。プラセボは、１用量当たり０．５ｍＬの２回投与レジメンで２８日の間隔を置いてＩＭ投与される。
【０４５０】
試験方法
ＰＲＮＴアッセイ：中和抗体価は、これまでに記載されているプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定した（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ａｆｔｅｒ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９３、１６５８−１６６５（２００６）Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  Ｋ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＢＤ，Ａｇａｒｗａｌ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＺＩＫＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐａｓｓｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｒＭＥｎｖ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ．ＮＰＪ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２０１６；１：１６０２１参照）。簡潔に述べると、以下に記載するＱ２  Ｌａｂ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓによって開発されたプロトコルに従って、ジカＰＲＮＴアッセイを実施した。
【０４５１】
ジカＰＲＮＴアッセイでは、ヒト血清を１：５から１：１０，２４０まで２倍段階希釈し、等量の希釈したジカウイルス（ＺＩＫＶ）（ＰＲＶＡＢＣ５９）と混合して、１：１０〜１：２０，４８０の最終希釈液を得た。中和を２〜８℃で２０±２時間進行させ、その後、血清／ウイルス混合物を使用してＶｅｒｏ  Ｅ６細胞に接種した。ウイルスの吸着を３７±２℃、湿度及びＣＯ２下で６０±１０分間行い、次いで、メチルセルロースを重層した。感染細胞を３７±２℃、湿度及びＣＯ２下で７２±２時間インキュベートした。クリスタルバイオレット染色を使用してプラークを可視化し、ＣＴＬ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）リーダーを使用してカウントした。５０％中和価（ＰＲＮＴ５０）の決定は、血清を含まないウイルス対照と比較した、血清の存在下でのウイルスプラーク減少率に基づき、線形回帰によって算出された。この価は、プラーク数の５０％減少をもたらす最大希釈の逆数を表す。受け入れは、臨床サンプルと並行して試験されるウイルス対照（目標約６０ｐｆｕ／ウェル）、細胞対照、陽性対照（１７３〜６５８のＰＲＮＴ５０）及び陰性対照（ＰＲＮＴ５０＜１０）を評価することによって決定される。個々のサンプル及び陽性対照の結果は、線形回帰によって生成される滴定曲線の相関係数が≧０．８５である場合、受け入れられた。更なる受け入れ基準は、クリスタルバイオレット染色及びプレートまたは実験で生成されたプラークの質に基づいた。ＰＲＮＴ５０の結果は、アッセイの開始希釈（１：１０）まで報告する。ＵＬＯＱを上回るＰＲＮＴ５０の結果は、事前希釈で繰り返し、アッセイの定量可能範囲内の結果を出す。事前希釈サンプルの結果は、希釈係数を掛けて最終結果を出す。
【０４５２】
ＰＲＮＴアッセイ開発に使用したジカ株は、ＰＲＶＡＢＣ５９であった。
【０４５３】
免疫評価項目：
定義：
血清反応陽性（ＰＲＮＴ）：ＬＯＤ（検出限界）以上の力価
【０４５４】
血清反応陰性（ＰＲＮＴ）：ＬＯＤ（検出限界）を下回る力価
【０４５５】
セロコンバージョン（ＰＲＮＴ）：最初は血清反応陰性であったヒト対象におけるＬＯＤ以上のワクチン接種後の力価
【０４５６】
ＬＯＤ（ＰＲＮＴ）＝１０
【０４５７】
ＬＯＤ未満に付与される値＝５
【０４５８】
ＬＬｏＱ（定量下限、ＰＲＮＴ）＝２６
【０４５９】
ＬＬｏＱ（定量下限）未満に付与される値＝１３
【０４６０】
定量上限（ＵＬＯＱ）を上回る力価を持つヒト対象は、アッセイで認められた定量限界内の力価が得られるまで、更に希釈した後、再度試験を行った。
【０４６１】
レポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）中和アッセイ：９６ウェルプレートで成長させたＶｅｒｏ細胞における中和抗体価を、一定量のジカＲＶＰを用いて血清サンプルを滴定することによって分析した。ＲＶＰは、ジカ（ＳＰＨ２０１２株）のｐｒＭＥタンパク質及びデングベースのウミシイタケルシフェラーゼレポーターを含有した。簡潔に述べると、血清を５６℃で３０分間熱不活化し、希釈し、次いで、ＲＶＰとともに３７℃でインキュベートした。次いで、血清／ＲＶＰ混合物をＶｅｒｏ細胞とともに混合し、３７℃±２℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした後、ルシフェラーゼ基質で検出した。ＪＭＰ１１非線形４パラメーター解析を使用してデータを解析し、ポジティブトラッキング対照に正規化し、有効用量５０％（ＥＣ５０）を報告した。
【０４６２】
試験の説明
フラビウイルスナイーブ及びプライム投与を受けた１８〜４９歳の健康成人における、精製された不活化ジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）の第１相無作為化オブザーバーブラインドプラセボ対照安全性・免疫原性・用量範囲試験
【０４６３】
試験設計を図２９に示す。この試験は、フラビウイルスナイーブ及びフラビウイルスプライム投与を受けた１８〜４９歳の間の健康成人を順次登録するように設計した。２つの順次コホートは、それぞれ１２０人のヒト対象（計画）から構成され、それを３０人のヒト対象からなる４グループの１つにランダムに割り当て、３つの投与量のいずれか１つのＰＩＺＶワクチンまたは生理食塩水プラセボを投与する。ワクチン接種レジメンは、２８日の間隔を置いて投与される２回投与からなる。この実施例のデータは、フラビウイルスナイーブヒト対象（ｎ＝１２４）にのみ関連し、フラビウイルスプライム投与ヒト対象の更なるデータが期待される。この実施例は、「フラビウイルスナイーブコホート」の５７日目（２回目の投与から２８日後）の最初の中間解析のデータを提供する。フラビウイルスプライム投与コホートのデータは、最初の中間解析の時点では、この群の募集がまだ継続中であったため、この中間解析の一部に入らない。
【０４６４】
要約すると、ヒト対象を４つの試験群にランダムに割り付け、プラセボ（生理食塩水）または２μｇ、５μｇ及び１０μｇの濃度の精製された不活化ジカワクチン（ＰＩＺＶ）のいずれかの投与を２回受けた。試験は、１日目及び２９日目のワクチン（またはプラセボ）の筋肉内注射と、試験の−１５、１、８、２９、３６、５７、２１１、３９３、７６７日目に採取される血液サンプルを含んだ。フラビウイルスセロステータススクリーニング及び適格性スクリーニングを決定するために、−１５日目の血液サンプルを使用した。免疫原性評価には、１日目、２９日目、５７日目のサンプルを使用した。安全性臨床検査試験を８日目及び３６日目に実施した。免疫の持続性を２１１日目、３９３日目及び７６７日目に評価する。
【０４６５】
２回目の投与から２８日後のデータに基づくと、精製された不活化ジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）は、１８〜４９歳のフラビウイルスナイーブ成人において、安全かつ免疫原性であった。
【０４６６】
主要目的
試験の主要目的は、２８日の間隔を置いて投与されるＰＩＺＶの２回投与の安全性を記述し、後続の臨床試験にて使用される用量レベルを３つの異なる抗原濃度（２、５または１０μｇ）から選択することであった。主要エンドポイントは、各用量のＰＩＺＶまたはプラセボの投与後７日間に非自発的な局所及び全身性有害事象（ＡＥ）を経験したヒト対象のパーセンテージ、及びワクチン接種後２８日間に深刻でない自発的なＡＥ及び重篤な有害事象（ＳＡＥ）を経験したヒト対象のパーセンテージであった。
【０４６７】
副次的目的
副次的目的は、フラビウイルスナイーブ成人における、１回目の投与から２８日後及び２回目の投与から２８日後の精製された不活化ジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）に対する免疫応答を記述することであった。これらの目的に関連する副次的エンドポイントは、検討された時点における、中和抗ＺＩＫＶ抗体の幾何平均力価（ＧＭＴ）、血清反応陽性率（ＳＰＲ）及び抗体陽転率（ＳＣＲ）である。
【０４６８】
データの解析は、個々の治療割り当てにアクセスできる、盲検化されていない統計家とプログラマーの別のチームによって実施された。試験の実施に関与した全担当者は、個々のヒト対象の治療割り当てに対して盲検化された。試験チームは、群レベルの非盲検化結果にのみアクセスできた。
【０４６９】
試験集団：
合計１２４人のヒト対象をフラビウイルスナイーブコホートに登録し、安全性解析対象集団（ＳＳ）に含めた。ＳＳは、少なくとも１回のＰＩＺＶまたはプラセボ投与を受けた全てのランダム化ヒト対象から構成された。このうち、１１８人（ＳＳの９５．２％）が、最大解析対象集団（ＦＡＳ）に含まれた。ＦＡＳは、少なくとも１回の治験ワクチン（ＰＩＺＶ）／プラセボ投与を受け、ベースライン時及びワクチン接種後に少なくとも１回、有効な血清反応の結果があったランダム化ヒト対象である。ＦＡＳのヒト対象のうち、免疫原性解析に関連する主要なプロトコル違反がなかった１１３人のヒト対象（ＳＳの９１．１％）がプロトコル適合解析対象集団（ＰＰＳ）に含まれた。解析対象集団を表１６に示す。
【表１８】
2021505549.tif 000024
安全性解析対象集団＝少なくとも一回（１）のＰＩＺＶまたはプラセボ投与を受けた全てのランダム化ヒト対象
最大解析対象集団＝少なくとも１回のＰＩＺＶ／プラセボ投与を受け、ベースライン及びワクチン接種後の少なくとも１回の血清反応結果が有効あった全てのランダム化ヒト対象。
プロトコル適合解析対象集団＝主要なプロトコル違反がなかったＦＡＳの全てのヒト対象。
【０４７０】
ＳＳのヒト対象は、３５．３±８．９１歳（平均±標準偏差）であり、１８〜２９歳の年齢範囲で２８．２％、３０〜４９歳の年齢範囲で７１．８％の分布であった。女性は、コホートの５４．８％を占めた。試験参加者は、人種及び民族に関して、白人（８１．５％）、黒人（１４．５％）、及び「非ヒスパニック系」（９３．５％）であった。ＳＳの平均ＢＭＩは、２７．５±４．０５（平均±標準偏差）であった。人口統計学的特徴（年齢、性別、身長、体重、ＢＭＩ及び民族）は、４つの試験群にわたって全体的に同じであった。女性は、性別分布のバランスがより取れている他の群よりも、プラセボ群でより多く、試験参加者の６６％を構成した。人口統計及びベースラインの特徴を表１７に示す。
【０４７１】
組み入れ基準の一部として、試験登録時に安全性検査所見パラメーター及びバイタルサインを調べた。これは、具体的に言うと、バイタルサインが正常範囲内でなければならないこと（すなわち、ＦＤＡ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｃａｌｅで示されるグレード１未満）、及び安全性臨床検査試験が正常範囲内であるか、またはＦＤＡ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｃａｌｅで定義されるグレード１を超えてはならないことであった。
【表１９】
2021505549.tif 000025
ＢＭＩ＝体重（ｋｇ）／身長２（ｍ２）
注１：年齢は、同意書の日付を使用して算出した。
注２：ヒト対象は、複数の人種分類が選択された場合にのみ、多民族カテゴリーに含めた。
【０４７２】
安全性／反応原性
報告された非自発的な局所有害事象（ＡＥ）の全体的な発生率は、プラセボ群よりもワクチン（ＰＩＺＶ）が投与された群で高かった。注射部位の疼痛が非自発的なＡＥで最も頻繁に報告された。１回目の投与後、プラセボ群の１３．８％と比較して、ＰＩＺＶ群では３０．０％〜３８．７％のヒト対象が疼痛を経験した。２回目の投与後の疼痛の発生率は、１回目の投与後の発生率と同様であった：ＰＩＺＶ群で２９．６％〜４０％、及びプラセボ群で１４．３％。疼痛の強度は、１回目の投与後で軽度、２回目の投与後で軽度から中等度と報告され、５μｇ  ＰＩＺＶ群の２人のヒト対象（６．７％）及び１０μｇ  ＰＩＺＶ群の１人のヒト対象（３．３％）が中等度の疼痛を報告した。他の非自発的な局所ＡＥ（発赤、腫脹及び硬結）は、９．７％以下のヒト対象で報告された。
【０４７３】
疼痛の開始は、９０％のヒト対象で１日目または２日目（３人のヒト対象）で生じた。疼痛は、５日目以降には、プラセボまたはＰＩＺＶ群のいずれのヒト対象からも報告されなかった。
【０４７４】
１回目の投与後、何らかの性質の非自発的な全身性ＡＥがＰＩＺＶ群で３０％〜４８．４％のヒト対象、及びプラセボ群で４１．４％報告された。２回目の投与後、発生率は、ＰＩＺＶ群で１０％〜３３．３％、及びプラセボ群で２７．６％であった。全体で８１．３％（１回目の投与）及び７５％（２回目の投与）の非自発的な全身性ＡＥは、試験ワクチン接種に関係するものと判断した。２回の投与後、最も報告された全身性事象は、頭痛、疲労及び筋肉痛であった。
【０４７５】
ほとんどの全身性ＡＥは、軽度であり、すなわち、日常的活動に影響しなかった。いくつかの発生は、中等度の強度であった：
【０４７６】
１回目の投与後では、ＰＩＺＶ群で６．７〜１２．９％のヒト対象、及び１７．２％のプラセボレシピエント；
【０４７７】
２回目の投与後では、ＰＩＺＶ群で０〜３．３％のヒト対象、及びプラセボ群で１０．３％。
【０４７８】
重度のＡＥが１件報告された：プラセボ群のヒト対象１人が発熱を経験した。この試験参加者は、２回目の試験ワクチン接種を受けた４日後に口腔測定で３９．４℃の熱があった。この発熱は、試験責任医師により、試験に関係しないものと判断された。
【０４７９】
非自発的な全身性ＡＥは、４つの群で７日間にわたって様々に報告された。発熱、疲労、関節痛及び筋肉痛の事象開始は、主に、ワクチン接種後２日の間であり、頭痛及び倦怠感は様々であった。発熱は、４日目に重度の発熱を報告したプラセボ群のヒト対象を除き、ワクチン接種後２日の間に報告された。
【０４８０】
ワクチン接種から７日後の非自発的な局所及び全身性有害事象の発生率を表１８に示す。
【表２０】
2021505549.tif 000026
Ｎ＝利用可能な情報を有するヒト対象の数；ｎ（％）＝特定のＡＥを報告したヒト対象の数（パーセンテージ）
【０４８１】
ヒト対象のうち合計３０．６％がいずれかの投与後２８日の間に自発的なＡＥ（長期的な非自発的なＡＥを含まない）を報告した：ＰＩＺＶ群で２１．９〜３８．７％及びプラセボ群で３６．７％。これらのＡＥは、主に、感染症、寄生虫症（１３．７％）及び神経系疾患（３．２％：頭痛、片頭痛、眩暈）であった。全て、軽度から中等度の強度であった。
【０４８２】
自発的なＡＥは、３人のヒト対象（２．４％）において、試験ワクチン接種に関係するものとみなされた。報告された事象は、
【０４８３】
１回目の投与後では、５μｇ  ＰＩＺＶ群の１人のヒト対象で眩暈、及び２μｇ  ＰＩＺＶ群の１人のヒト対象で潮紅；
【０４８４】
２回目の投与後では、１０μｇ  ＰＩＺＶ群の１人のヒト対象で目のかゆみ及び流涙の増加であった。
【０４８５】
これらは、軽度から中等度の強度であり、ワクチン接種後１日目または２日目に始まり、１〜３日間継続し、全て回復した。
【０４８６】
１人のヒト対象が１回目の投与後の頭痛により試験ワクチン接種を中止した。このヒト対象は、ＰＩＺＶの投与を受け、ワクチン接種の１日後に頭痛を経験した。頭痛は、その発生から３６日後に解消した。１回目の投与から２回目の投与後２８日までの期間中、重篤な有害事象（ＳＡＥ）は報告されなかった。
【０４８７】
ワクチン接種後７日間の血液安全性臨床検査パラメーターでは、ベースラインからのいくつかの変化が観察された。例えば、正常から軽度または軽度から中等度のＡＥが４つの群にわたるヒト対象の同等パーセンテージで生じた。尿検査パラメーターは、全ての時点で正常であるか、またはグレード分類が群及び訪問にわたって同様であった。
【０４８８】
免疫原性
表１９は、各ワクチン投与後のＰＲＮＴによって測定したジカウイルス中和抗体（ＥＣ５０）の幾何抗体価ならびに血清反応陽性率及び抗体陽転率を表す。
【０４８９】
ＰＩＺＶワクチンは、フラビウイルスナイーブ成人において免疫原性であった。全てのヒト対象がベースライン時に血清反応陰性であった。ジカウイルスに対する抗体について、最初は血清反応陰性であったヒト対象にワクチン接種を行うと、いずれかの用量のＰＩＺＶワクチンの２回投与後、全てのヒト対象で血清反応陽性が惹起された。抗体陽転率は、１回目の投与後で６９．２３％〜９６．４３％の範囲であり、２回目の投与後は１００％であった。プラセボ群の全てのヒト対象は、検討期間を通じて血清反応陰性のままであった。
【０４９０】
用量設定効果が１回目の投与後の血清反応陽性率及び各投与後のＧＭＴで観察された。最初の投与後、１０μｇ  ＰＩＺＶ投与を受けたほぼ全てのヒト対象（９６．４％）がジカウイルスに対する中和抗体を得た。２回目の投与により、１回目の投与後のＧＭＴが３つのＰＩＺＶ群で１０倍を超えて増加した。
【表２１】
2021505549.tif 000027
Ｎ＝利用可能なＰＲＮＴデータを有するＰＰＳのヒト対象の数；
血清反応陽性は、１０以上の力価と定義する；セロコンバージョンは、次のように定義される：ベースライン時に血清反応陰性（１０未満の力価）であるヒト対象がワクチン接種後１０以上の力価を有すること；１０未満の結果は、５の力価を付与する；１０以上（検出限界）及び２６未満（定量下限）の力価には１３の値を付与する。
【０４９１】
ＰＲＮＴを使用して決定された表１９による幾何平均力価を図３０にグラフとして示す。ＰＲＮＴを使用して決定された表１９によるセロコンバージョンを達成したヒト対象のパーセンテージを図３１にグラフとして示す。
【０４９２】
１回目の投与後及び２回目の投与後の中和力価の分布を、それぞれ図３２及び図３３に逆累積分布曲線で示す。
【０４９３】
免疫応答をＰＲＮＴアッセイで測定することに加えて、ＲＶＰ中和アッセイでもサンプルを試験した。表２０は、ＲＶＰアッセイによって測定されたジカウイルス中和抗体（ＥＣ５０）の幾何抗体価を表す。ＲＶＰアッセイの結果は、ＰＲＮＴデータと同様の用量設定効果を示しており、ＰＩＺＶ用量の増加に伴ってＧＭＴが段階的に高くなった。
【表２２】
2021505549.tif 000028
Ｎ＝利用可能なＲＶＰデータを有するＰＰＳのヒト対象の数。
【０４９４】
結論
ＰＩＺＶワクチンは、フラビウイルスナイーブコホートで評価した全ての抗原用量で、忍容性が良好であり、安全であった。非自発的な全身性ＡＥが全ての群で報告されたが、用量強度の増加に伴う明らかな増加はなく、強度は軽度から中等度であった。非自発的な局所ＡＥも報告されたが、群全体で軽度から中等度の強度であった。４つの試験群で類似の頻度で自発的な症状が報告された。全体として、ワクチンは、フラビウイルスナイーブヒト対象において免疫原性であり、正の用量設定反応が観察された。
本発明の更なる項目：
１．ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法における使用のためのワクチンまたは免疫原性組成物であって、前記ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する抗原を含む前記ワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、前記ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与またはプライム投与として投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与は、前記単回投与またはプライム投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象の集団及び／または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、１０超、または５０超、または１００超、または２００超、または２５０超の幾何平均中和抗体価を誘導する、前記ワクチンまたは免疫原性組成物。
２．ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法における使用のためのワクチンまたは免疫原性組成物であって、前記ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する抗原を含む前記ワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、前記ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与またはプライム投与として投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与は、前記単回投与またはプライム投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、または少なくとも９０％の抗体陽転率を誘導する、前記ワクチンまたは免疫原性組成物。
３．ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法における使用のためのワクチンまたは免疫原性組成物であって、前記ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する抗原を含む前記ワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、前記ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与またはプライム投与として投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与は、前記単回投与またはプライム投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団または少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、または少なくとも９０％の血清反応陽性率を誘導する、前記ワクチンまたは免疫原性組成物。
４．ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法における使用のためのワクチンまたは免疫原性組成物であって、前記ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルスに由来する抗原を含む前記ワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、前記ワクチンまたは免疫原性組成物は、単回投与の投与として、または少なくとも１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与を含む複数回投与の投与として投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与は、前記投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象のヒト対象集団または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団のうち、５０％未満に全身性副作用を誘発する、前記ワクチンまたは免疫原性組成物。
５．ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法における使用のためのワクチンまたは免疫原性組成物であって、前記ヒト対象集団の個々のヒト対象に、ジカウイルス調製物を不活化する方法によって得ることができるジカウイルスに由来する抗原を含む前記ワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含み、前記ジカウイルス調製物を不活化する方法は、
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された１つ以上の細胞から前記ジカウイルス調製物を分離することであって、前記細胞は、前記ジカウイルス調製物を生産するために使用され、前記ジカウイルス調製物を分離することは、（ｉ）深層濾過、（ｉｉ）緩衝液交換及び／または希釈、（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィーから選択される１つ以上の工程を含む、前記分離することと、
（ｂ）前記ジカウイルス調製物をホルムアルデヒドで、任意選択によりホルムアルデヒドで、処理することであって、％（ｗ／ｖ）で測定したときのホルムアルデヒド濃度と、日単位で測定したときのホルムアルデヒドとのインキュベーション期間を乗算した数値結果は、０．０２５〜０．５である、前記処理することと、を含む、前記ワクチンまたは免疫原性組成物。
６．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与として、約１〜約１６週間の間隔を置いて投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与から１４日後及び／または２８日後に、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象の集団及び／または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、３００超、または５００超、または１０００超、または１５００超、または２０００超、または３０００超の幾何平均中和抗体価を誘導する、項目１〜５のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
７．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与として、約１〜約１６週間の間隔を置いて投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与から１４日後及び／または２８日後に、
少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の抗体陽転率を誘導し、
及び／または
少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象の集団もしくは少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象の集団において、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定したとき、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の血清反応陽性率を誘導する、項目１〜６のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
８．前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２９％未満に頭痛症状を誘発する、項目１〜７のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
９．前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％以下に発熱、及び／または３３％以下に疲労、及び／または１０％以下に関節痛、及び／または１７％以下に筋肉痛、及び／または１５％以下に倦怠感を誘発する、項目１〜８のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
１０．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４０％未満に全身性副作用を誘発する、項目１〜９のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
１１．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与から７日後に、前記プライム投与から７日後と比較して、
−少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも４５％少ない疲労、及び／または
−発熱なし、及び／または
−筋肉痛なし、もしくは少なくとも１０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも２５％少ない筋肉痛、及び／または
−倦怠感なし、もしくは少なくとも１０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない倦怠感を、
少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団において、誘発する、項目１〜１０のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
１２．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満、または０％に発熱を誘発する、項目１〜１１のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
１３．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１９％未満に疲労を誘発する、項目１〜１２のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
１４．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１２％未満または８％未満に筋肉痛を誘発する、項目１〜１３のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
１５．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１３％未満または１０％以下に倦怠感を誘発する、項目１〜１４のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
１６．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％以下に頭痛症状、及び８％以下に関節痛、及び４％未満に発熱、及び１９％未満に疲労、及び１２％未満に筋肉痛、及び１３％未満に倦怠感を誘発する、項目１〜１５のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
１７．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、１μｇ〜４０μｇの用量の前記抗原を含み、前記抗原が、不活化全粒子ウイルスである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
１８．前記ジカウイルスが、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を有する、請求項１７に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
１９．前記抗原が精製され、サイズ排除クロマトグラフィーで精製された前記抗原のメインピークが、前記サイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下総面積の８５％超である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
２０．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、ジカ流行地域のヒト対象、任意選択により、アウトブレイク下にあるジカ流行地域のヒト対象に投与される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
２１．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、ジカ流行地域に旅行する非流行地域のヒト対象に投与される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
２２．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、１８歳〜２９歳のヒト対象、特に、妊娠可能な女性に投与される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
２３．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、３０歳〜４９歳のヒト対象、特に、妊娠可能な女性に投与される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
２４．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、単回投与の投与として、または少なくとも１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与を含む複数回投与の投与として投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、約５μｇの用量の精製された不活化全粒子ウイルスを含む、項目１〜２３のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
２５．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、５０％未満、もしくは４５％未満、もしくは４０％未満に全身性副作用を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４０％未満、もしくは３５％未満、もしくは３０％未満、もしくは２５％未満、もしくは２０％未満、もしくは１５％未満に全身性副作用を誘発する、請求項２４に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
２６．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、３％未満、もしくは０％に発熱を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満、もしくは３％未満、もしくは０％に発熱を誘発する、請求項２４または２５に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
２７．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２９％未満に頭痛を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％未満、もしくは１５％未満、もしくは１０％未満、もしくは５％未満に頭痛を誘発する、項目２４〜２６のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
２８．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、３０％未満、もしくは２５％未満、もしくは２０％未満に疲労を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％未満、もしくは１５％未満、もしくは１０％未満に疲労を誘発する、項目２４〜２７のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
２９．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満に関節痛を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、５％未満、もしくは２％未満、もしくは０％に関節痛を誘発する、項目２４〜２８のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
３０．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１７％以下に筋肉痛を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１２％未満、もしくは１０％未満、もしくは５％未満に筋肉痛を誘発する、項目２４〜２９のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
３１．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１０％未満に倦怠感を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１４％未満、もしくは１０％未満、もしくは５％未満、もしくは０％に倦怠感を誘発する、項目２４〜３０のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
３２．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与から７日後に、前記プライム投与から７日後と比較して、
−少なくとも７０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも５０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも３５％少ない、もしくは少なくとも３０％少ない全身性副作用、及び／または
−発熱の増加なし、及び／または
−少なくとも８０％少ない、もしくは少なくとも７０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも５０％少ない、もしくは少なくとも４５％少ない頭痛、及び／または
−少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも５５％少ない、もしくは少なくとも５０％少ない、もしくは少なくとも４５％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない疲労、及び／または
−関節痛の増加なし、もしくは少なくとも８０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない関節痛、及び／または
−筋肉痛の増加なし、もしくは少なくとも７０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない筋肉痛、及び／または
−倦怠感の増加なし、もしくは少なくとも８０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない倦怠感を、
少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団において、誘発する、項目２４〜３１のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
３３．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、単回投与の投与として、または少なくとも１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与を含む複数回投与の投与として投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、約１０μｇの用量の精製された不活化全粒子ウイルスを含む、項目１〜２３のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
３４．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、５０％未満に全身性副作用を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４０％未満、もしくは３５％未満、もしくは３０％未満に全身性副作用を誘発する、請求項３３に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
３５．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満に発熱を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満、もしくは３％未満、もしくは０％に発熱を誘発する、請求項３３または３４に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
３６．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２９％未満、もしくは２５％未満、もしくは２０％未満、もしくは１５％未満に頭痛を誘発し、及び／または前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％以下に頭痛を誘発する、項目３３〜３５のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
３７．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、３３％以下に疲労を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％未満に疲労を誘発する、項目３３〜３６のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
３８．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１０％以下に関節痛を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、５％未満に関節痛を誘発する、項目３３〜３７のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
３９．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１７％以下に筋肉痛を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１２％未満、または１０％未満に筋肉痛を誘発する、項目３３〜３８のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
４０．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１５％以下に倦怠感を誘発し、及び／または前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１３％未満、もしくは１０％以下に倦怠感を誘発する、項目３３〜３９のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
４１．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与から７日後に、前記プライム投与から７日後と比較して、
−少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも３５％少ない、もしくは少なくとも３０％少ない、もしくは少なくとも２５％少ない全身性副作用、及び／または
−発熱の増加なし、もしくは少なくとも８０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない発熱、及び／または
−少なくとも４５％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない疲労、及び／または
−関節痛の増加なし、もしくは少なくとも６５％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない関節痛、及び／または
−筋肉痛の増加なし、もしくは少なくとも４５％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない筋肉痛、及び／または
−倦怠感なし、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない倦怠感を、
少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団において、誘発する、項目３３〜４０のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
４２．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、単回投与の投与として、または少なくとも１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与を含む複数回投与の投与として投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、約２μｇの用量の精製された不活化全粒子ウイルスを含む、項目１〜２３のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
４３．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、５０％未満、もしくは４５％未満、もしくは４０％未満、もしくは３５％未満に全身性副作用を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４０％未満、もしくは３５％未満に全身性副作用を誘発する、請求項４２に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
４４．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、３％未満、もしくは０％に発熱を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満、もしくは３％未満、もしくは０％に発熱を誘発する、請求項４２または４３に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
４５．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２９％未満、もしくは２５％未満、もしくは２０％未満に頭痛を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％未満、もしくは１５％未満に頭痛を誘発する、項目４２〜４４のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
４６．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、３０％未満、もしくは２５％未満に疲労を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、２０％未満、もしくは１５％未満に疲労を誘発する、項目４２〜４５のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
４７．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、４％未満に関節痛を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、８％未満に関節痛を誘発する、項目４２〜４６のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
４８．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１７％以下に筋肉痛を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１２％未満、または１０％未満に筋肉痛を誘発する、項目４２〜４７のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
４９．前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記単回投与もしくはプライム投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１０％未満に倦怠感を誘発し、及び／または前記ワクチンもしくは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与後７日までに、少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象もしくは少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団のうち、１３％未満、もしくは１０％未満、もしくは５％未満、もしくは０％に倦怠感を誘発する、項目４２〜４８のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
５０．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、複数回投与として、１回目（プライム）及び２回目（ブースト）の投与で投与され、前記ワクチンまたは免疫原性組成物の前記投与が、前記ブースト投与から７日後に、前記プライム投与から７日後と比較して、
−発熱の増加なし、及び／または
−少なくとも５０％少ない、もしくは少なくとも４５％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない疲労、及び／または
−筋肉痛なし、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない筋肉痛、及び／または
−倦怠感の増加なし、もしくは少なくとも８０％少ない、もしくは少なくとも６０％少ない、もしくは少なくとも４０％少ない、もしくは少なくとも２０％少ない、もしくは少なくとも１０％少ない倦怠感を、
少なくとも２０人のフラビウイルスナイーブヒト対象または少なくとも２０人のジカウイルス血清反応陰性ヒト対象のヒト対象集団において、誘発する、項目４２〜４９のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
５１．前記細胞が、非ヒト細胞である、項目５〜５０のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
５２．前記細胞が、Ｖｅｒｏ細胞である、請求項５１に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
５３．前記ジカウイルス調製物が、０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度のホルムアルデヒドで処理される、項目５〜５２のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
５４．前記ジカウイルス調製物が、８〜１２日間処理される、項目５〜５３のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
５５．前記ジカウイルス調製物が、１０日間処理される、請求項５４に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
５６．前記ジカウイルス調製物が、１５℃〜３０℃の温度で処理される、項目５〜５５のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
５７．前記ジカウイルス調製物が、２２℃の温度で処理される、請求項５６に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
５８．不活化の完全性を決定する工程（ｃ）を更に含む、項目５〜５７のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
５９．工程（ｃ）が、
（ｉ）工程（ｂ）に従って処理したジカウイルス調製物を、培養した昆虫細胞に接種し、前記昆虫細胞を第１の期間インキュベートし、それにより、昆虫細胞上清を生産することと、
（ｉｉ）（ｉ）で生産された前記昆虫細胞上清を、培養した哺乳動物細胞に接種し、前記哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすることと、
（ｉｉｉ）前記ジカウイルス調製物が前記哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残存複製ウイルスを含有するかどうかを決定することと、を含む、請求項５８に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
６０．前記昆虫細胞が、ＣＣＬ−１２５細胞、Ａａｇ−２細胞、ＲＭＬ−１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７−１０細胞、ＡＰ−６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−３細胞、ＵＭ−ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ−３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ−ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ−ＣＴＲ細胞及びＴＲＡ−１７１細胞、例えば、Ｃ６／３６細胞から選択される、請求項５９に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
６１．前記第１の期間が、３〜７日である、請求項５９または６０に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
６２．前記哺乳動物細胞が、ＶＥＲＯ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載の受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、例えば、ＶＥＲＯ細胞から選択される、項目５９〜６１のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
６３．前記第２の期間が、３〜１４日である、項目５９〜６２のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
６４．前記ホルムアルデヒド処理されたジカウイルス調製物をメタ重亜硫酸ナトリウムで中和する工程（ｄ）を更に含む、項目５〜６３のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
６５．前記ホルムアルデヒド処理されたジカウイルス調製物が、ホルムアルデヒド処理後、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも９日、少なくとも１１日、または少なくとも１４日中和される、請求項６４に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
６６．前記ワクチンまたは免疫原性組成物が、５０μｇ／ｍｌ未満の残留ホルムアルデヒド含量を有する、項目１〜６５のいずれか１項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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