(57)【要約】本開示は、免疫応答をモジュレートするための方法及び組成物、自己免疫性及び炎症性障害並びにがん等の疾患を処置又は予防する方法と共に、抗原に対する免疫応答を増強する方法及び感染性疾患の処置のための方法に関する。特に、本方法及び組成物は、ナチュラルキラー細胞顆粒タンパク質７（ＮＫＧ７）活性をモジュレートする化合物を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における免疫応答をモジュレートする方法であって、前記対象に、ＮＫＧ７活性をモジュレートする化合物を投与するステップを含む方法。
【請求項２】
前記化合物が、ＮＫＧ７活性を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、ＮＫＧ７に結合してＮＫＧ７活性を阻害する抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、ＮＫＧ７活性を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、ＮＫＧ７に結合してＮＫＧ７活性を増加させる抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、ＮＫＧ７の細胞外ループ１又は細胞外ループ２に結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
対象における自己免疫性疾患又は炎症性状態を処置又は予防する方法であって、前記対象に、ＮＫＧ７活性を阻害する化合物を投与するステップを含む方法。
【請求項８】
前記自己免疫性疾患又は炎症性状態が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ループス、神経炎症、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病及び全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
同種異系間移植片を受ける移植片レシピエントにおける移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクを低下させる方法であって、ＮＫＧ７活性を阻害する化合物を前記移植片レシピエントに投与するステップを含む方法。
【請求項１０】
ＮＫＧ７活性を阻害する前記化合物が、前記同種異系間移植片を受ける前に、前記移植片レシピエントに投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＮＫＧ７活性を阻害する前記化合物が、前記同種異系間移植片を受けるときに又は受けた後に、前記移植片レシピエントに投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が、ＮＫＧ７に結合してＮＫＧ７活性を阻害する抗体である、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
対象におけるがんを処置する方法であって、前記対象に、前記対象におけるＮＫＧ７活性を増加させる化合物を投与するステップを含む方法。
【請求項１４】
前記化合物が、ＮＫＧ７に結合してＮＫＧ７活性を増加させる抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が、がん免疫療法で処置される、請求項１３又は請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記がん免疫療法が、免疫チェックポイント阻害剤療法及び抗体療法から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象におけるワクチン抗原に対する免疫応答を増強する方法であって、前記対象に、
ｉ）ＮＫＧ７活性を増加させる化合物と、
ｉｉ）ワクチン抗原と
を投与するステップを含む方法。
【請求項１８】
ＮＫＧ７が、配列番号１、３、５、７又は９のうちのいずれか１つに対し少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＮＫＧ７活性を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＮＫＧ７が、配列番号２、４、６、８又は１０のうちのいずれかから選択される配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＮＫＧ７が、配列番号１、３、５、７又は９のうちのいずれかからなり、１個又は数個のアミノ酸の置換又は欠失又は付加を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
自己免疫性疾患又は炎症性状態を処置又は予防するための医薬組成物であって、ＮＫＧ７活性を阻害する化合物と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項２２】
がんを処置するための医薬組成物であって、ＮＫＧ７活性を増加させる化合物と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項２３】
自己免疫性疾患又は炎症性状態の処置のための医薬の製造におけるＮＫＧ７の活性を阻害する化合物の使用。
【請求項２４】
がんの処置のための医薬の製造におけるＮＫＧ７の活性を増加させる化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、免疫応答をモジュレートするための方法及び組成物、自己免疫性及び炎症性障害並びにがん等の疾患を処置又は予防する方法と共に、抗原に対する免疫応答を増強する方法及び感染性疾患の処置のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、病原体、損傷した細胞又は刺激物等の有害な刺激に対する血管性組織の複雑な生物学的応答の一部である。炎症は、生物による、傷害性刺激を除去し、治癒過程を惹起するための保護的な試みである。炎症なしに、創傷及び感染が治癒することはないであろう。同様に、進行性の組織破壊は、生物の生存を危うくするであろう。しかし、慢性炎症は、関節リウマチ、粥状動脈硬化、さらにはがん等、多数の疾患をもたらす場合もある。
【０００３】
自己免疫性障害は、免疫系が、健康な体組織を誤って攻撃し、それを破壊する場合に発生する状態である。８０種を超える異なる種類の自己免疫性障害が存在する。自己免疫性障害患者において、系は、正常であれば無視する筈の正常体組織に対して反応する。
【０００４】
がん免疫療法は、腫瘍特異的モノクローナル抗体及び他の免疫系成分の受動的投与、腫瘍細胞に対する特異的Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘発又は増大するための能動的免疫化、ｅｘ  ｖｉｖｏ改変されたＴ細胞の養子移入、並びに免疫モジュレート剤による免疫応答性の非特異的増強を含む、多様な種類の処置アプローチを包含する。免疫療法は、広範囲のがんの管理に大きな影響を既に有していたが、がん免疫療法の分野は、複雑であり、急速に発展している。免疫療法は、従来の化学療法とは、その作用機序や生じる応答の種類が異なり、多くの能動的免疫療法が、複数の成分（例えば、抗原、アジュバント及び送達媒体）を取り込む。
【０００５】
頑強な治療活性は、免疫化が、全般的な免疫応答性の増強及び免疫抑制的機序（これにより腫瘍は免疫寛容原性環境を促進する）の克服に向けられた他の免疫調節性戦略と組み合わされることを要求することがますます認識されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
よって、依然として、自己免疫性及び炎症性疾患並びにがんの処置において、並びに免疫化の際に患者の免疫応答をモジュレートする方法の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、免疫細胞におけるナチュラルキラー細胞顆粒タンパク質７（ＮＫＧ７）の発現を調査し、ＮＫＧ７発現の損失が、炎症促進性サイトカインの血中濃度低下及び抗炎症性サイトカインの増加をもたらすことを決定した。
【０００８】
したがって、一態様では、本開示は、対象における免疫応答をモジュレートする方法であって、対象に、ＮＫＧ７活性をモジュレートする化合物を投与するステップを含む方法を提供する。
【０００９】
一部の実施形態では、化合物は、ＮＫＧ７の活性を阻害する。
【００１０】
一実施形態では、化合物は、ＮＫＧ７に結合してＮＫＧ７活性を阻害する抗体である。
【００１１】
一部の実施形態では、化合物は、ＮＫＧ７活性を増加させる。
【００１２】
一実施形態では、化合物は、ＮＫＧ７に結合してＮＫＧ７活性を増加させる抗体である。
【００１３】
一部の実施形態では、化合物は、ＮＫＧ７ポリペプチド又はその断片である。
【００１４】
一部の実施形態では、ＮＫＧ７活性をモジュレートする抗体は、ＮＫＧ７の細胞外ループ１又は細胞外ループ２に結合する。特定の一実施形態では、抗体は、配列番号１１、１２、１３又は１４における１つ又は複数のアミノ酸を含むエピトープに結合する。
【００１５】
別の態様では、本開示は、対象細胞におけるＮＫＧ７の発現をモジュレートすることにより、対象における免疫応答をモジュレートする方法、及び／又は自己免疫性疾患若しくは炎症性状態を処置若しくは予防する方法であって、ＮＫＧ７遺伝子、又はＮＫＧ７遺伝子のＮＫＧ７調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列を編集し、対象細胞におけるＮＫＧ７遺伝子の発現又は機能のモジュレーションをもたらすステップを含む方法を提供する。
【００１６】
一実施形態では、方法は、対象から得られた細胞においてｅｘ−ｖｉｖｏで実行され、編集ステップは、１つ又は複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを細胞に導入して、ＮＫＧ７遺伝子若しくはＮＫＧ７遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の内に若しくはその付近に１つ若しくは複数の変異若しくはエクソンの発現又は機能の永続的な欠失、挿入、補正又はモジュレーションをもたらす、又はＮＫＧ７遺伝子若しくはＮＫＧ７遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の発現若しくは機能に影響を与える、１つ又は複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）又は二本鎖切断（ＤＳＢ）をＮＫＧ７遺伝子又はＮＫＧ７遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の内に又はその付近に引き起こすステップを含み、方法は、細胞を対象に戻すステップを含む。
【００１７】
別の実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで実行され、編集ステップは、対象に遺伝子編集系をｉｎ  ｖｉｖｏで送達することにより実行される。
【００１８】
一部の実施形態では、遺伝子編集系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集系である。
【００１９】
別の態様では、本開示は、対象における自己免疫性疾患又は炎症性状態を処置又は予防する方法であって、対象にＮＫＧ７活性を阻害する化合物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００２０】
一部の実施形態では、自己免疫性疾患又は炎症性状態は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ループス、神経炎症、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病及び全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）から選択される。
【００２１】
一実施形態では、自己免疫性疾患又は炎症性状態は、関節リウマチである。
【００２２】
別の実施形態では、自己免疫性疾患又は炎症性状態は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。
【００２３】
一実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病である。
【００２４】
別の実施形態では、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎である。
【００２５】
別の態様では、本開示は、同種異系間移植片を受ける移植片レシピエントにおける移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクを低下させる方法であって、ＮＫＧ７活性を阻害する化合物を、移植片レシピエントに投与するステップを含む方法を提供する。
【００２６】
一部の実施形態では、ＮＫＧ７活性を阻害する化合物は、同種異系間移植片を受ける前に、移植片レシピエントに投与される。
【００２７】
一部の実施形態では、ＮＫＧ７活性を阻害する化合物は、同種異系間移植片を受けるときに又は受けた後に、移植片レシピエントに投与される。
【００２８】
一実施形態では、化合物は、ＮＫＧ７に結合してＮＫＧ７活性を阻害する抗体である。
【００２９】
別の態様では、本開示は、対象におけるがんを処置する方法であって、対象に、対象におけるＮＫＧ７活性を増加させる化合物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００３０】
一部の実施形態では、化合物は、ＮＫＧ７に結合してＮＫＧ７活性を増加させる抗体である。
【００３１】
一部の実施形態では、対象は、がん免疫療法で処置される。
【００３２】
一部の実施形態では、がん免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤療法及び抗体療法から選択される。
【００３３】
一態様では、本開示は、対象におけるワクチン抗原に対する免疫応答を増強する方法であって、対象に、
ｉ）ＮＫＧ７活性を増加させる化合物と、
ｉｉ）ワクチン抗原と
を投与するステップを含む方法を提供する。
【００３４】
一部の実施形態では、ＮＫＧ７は、配列番号１、３、５、７又は９のうちのいずれか１つに対し少なくとも９０％同一であり、ＮＫＧ７活性を有する、アミノ酸配列を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、ＮＫＧ７は、配列番号２、４、６、８又は１０のうちのいずれか１つから選択される配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる。
【００３６】
一部の実施形態では、ＮＫＧ７は、配列番号１、３、５、７又は９のうちのいずれか１つから選択され、１個又は数個のアミノ酸の置換又は欠失又は付加を有する、配列からなる。
【００３７】
一態様では、本開示は、自己免疫性疾患又は炎症性状態を処置又は予防するための医薬組成物であって、ＮＫＧ７活性を阻害する化合物と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００３８】
別の態様では、本開示は、がんを処置するための医薬組成物であって、ＮＫＧ７活性を増加させる化合物と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００３９】
別の態様では、本開示は、自己免疫性疾患又は炎症性状態の処置のための医薬の製造におけるＮＫＧ７の活性を阻害する化合物の使用を提供する。
【００４０】
別の態様では、本開示は、がんの処置のための医薬の製造におけるＮＫＧ７の活性を増加させる化合物の使用を提供する。
【００４１】
別の態様では、本開示は、ＮＫＧ７活性を増加させる化合物を含む免疫原性組成物を提供する。
【００４２】
本明細書を通して、単語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変化形は、記述されているエレメント、整数若しくはステップ、又はエレメント、整数若しくはステップの群の包含を暗示すると理解されるであろうが、他のいかなるエレメント、整数若しくはステップ、又はエレメント、整数若しくはステップの群の除外を暗示するとは理解されないであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ナイーブ及びドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）感染Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓（急性、消散感染の部位）及び脾臓（慢性感染の部位）由来の、並びに感染中及び処置後の内臓リーシュマニア症（ＶＬ）患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の、ＣＤ４＋Ｔ細胞。マウス細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって単離し、患者細胞は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって単離した（Ａ〜Ｃ）。感染したマウス及びヒトのデータセットと、対応するナイーブ細胞集団（マウス）又は薬物処置３０日後の対応する細胞集団（患者）のいずれかとの比較は、それぞれ脾臓、肝臓及びＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞における１８１６種、２７４８種及び５７８４種の差次的に発現された遺伝子を同定した（Ｄ及びＥ）。
【図２Ａ】ウォーターフォール（ｗａｔｅｒｆａｌｌ）プロットは、慢性シグネチャーにおける上方調節された遺伝子（マウス脾臓及びヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞の間で共通の差次的に発現された遺伝子）を示す（Ａ）。
【図２Ｂ−２Ｃ】ＮＫＧ７は、マウス脾臓から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞において最も上方調節された遺伝子であった。細胞マップは、遺伝子オントロジーに基づく細胞局在化情報：細胞区画情報を呈する（Ｂ）。ＮＫＧ７は、膜タンパク質をコードすることが知られている。ＮＫＧ７発現の増加は、内臓リーシュマニア症患者（ＶＬ）及び固有（ｅｎｄｅｍｉｃ）対照（ＥＣ）のＰＢＭＣから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞、並びにドノバンリーシュマニア（Ｌ．  ｄｏｎｏｖａｎｉ）感染マウスの脾臓及び肝臓由来のＦｏｘｐ３−ＣＤ４＋従来Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）及びＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）における、リアルタイムｑＰＣＲによって検証された（Ｃ）。
【図３Ａ−３Ｂ】がんゲノムアトラス（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）（ＴＣＧＡ）由来のデータは、様々ながん、最も著しくは、腎臓の腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）及び神経膠芽腫（ＧＢＭ）由来の腫瘍内のＮＫＧ７の差次的発現を示す（Ａ；ｈｔｔｐ：／／ｆｉｒｅｂｒｏｗｓｅ．ｏｒｇ／から適応）。発現データは、腫瘍生検から得られるが、がんリスクを付与するＮＫＧ７における変異部位の証拠は殆どない（Ｂ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／  ｏｕｔｐｕｔから適応）。
【図３Ｃ】皮膚の皮膚性黒色腫コホート（ＴＧＣＡ：ＳＫＣＭ）由来の患者の、高ＮＫＧ７発現者（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）（最高四分位）及び低ＮＫＧ７発現者（最低四分位）への層別化は、高ＮＫＧ７発現を有する群における生存確率の有意な増加を明らかにする（Ｃ；網掛け区域は、信頼区間を示す）。
【図４】マウスモデルＢ６．Ｎｋｇ７−ｃｒｅを作製し（Ａ）、Ｂ６．膜ｔｄＴｏｍａｔｏ／膜ＧＦＰ（ｍＴ／ｍＧ）と交雑して、レポーターマウスＮｋｇ７−ｃｒｅ×ｍＴ／ｍＧを産生した（Ｂ）。代用マーカーＧＦＰによって決定された、Ｃｒｅ発現（＋）マウスにおけるＮｋｇ７の発現は、ナイーブ状態のナチュラルキラー細胞において示される。
【図５】Ｂ６Ｎ．Ｎｋｇ７−ＫＯマウスに、ドノバンリーシュマニアを感染させた。感染後（ｐ．ｉ．）１４日目に、Ｎｋｇ７欠乏の効果を定量化した。Ｎｋｇ７が欠乏したマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（野生型）マウスと比較して、より低い脾臓及び肝臓重量を示した（Ａ）。Ｎｋｇ７欠乏マウスにおける寄生生物負荷は、野生型マウスと比較して顕著に上昇した（Ｂ）。炎症促進型サイトカインのインターフェロン（ＩＦＮ）γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びＩＬ−６のレベルもまた、野生型マウスと比較して、Ｎｋｇ７欠乏マウスの血清において、より低いことが見出された（Ｃ）。
【図６Ａ−６Ｂ】ＮＫＧ７は、ヒト（Ａ）及びマウス（Ｂ）タンパク質に関して、膜貫通予測プログラムＴＭｐｒｅｄ（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｍｂｎｅｔ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）によって確認される、４個の膜貫通領域を含有することが報告された。
【図６Ｃ】ＮＫＧ７タンパク質の予測されるモデルは、ヒト及びマウスＮＫＧ７の両方に存在する、矢印によって同定される２個の細胞外ループを明らかにする（Ｃ）。
【図７】Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（Ｂ６Ｎ；野生型）及びＢ６Ｎ．Ｎｋｇ７−／−マウス由来の脾臓単核細胞を、精製されたモノクローナル抗マウス（α）−ＣＤ３＋α−ＣＤ２８＋組換え（ｒ）ＩＬ−２（Ｔｈ０条件）、リポ多糖（ＬＰＳ）又はＯＤＮ  １８２６（ＣｐＧ）のいずれかで２４時間刺激した。より高いレベルの抗炎症性サイトカイン、インターロイキン（ＩＬ）−１０が、ＬＰＳ及びＣｐＧウェルから収集された上清において、サイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）によって検出された。ｎ＝３（３回複製）。統計的有意性は、シダックの多重比較検定による二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して決定した。＊＊及び＊＊＊は、それぞれ＜０．０１及び０．００１のｐ値を示す。
【図８】折れ線グラフは、ドノバンリーシュマニア感染中の示されている時点における、各細胞サブセット内のＧＦＰ発現細胞の割合の変化を示す。統計的有意性は、ダン（Ｄｕｎｎ）の多重比較検定によるクラスカル・ワリス検定を使用して決定した。＊は、ｐ値を示し、エラーバーは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図９】野生型（ＷＴ；Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）及びＮｋｇ７欠乏（Ｂ６Ｎ．Ｎｋｇ７−／−）マウスに、ドノバンリーシュマニアを感染させた。Ｎｋｇ７欠乏は、脾臓及び肝臓における有意に増加した寄生生物負荷をもたらした（リーシュマン・ドノバン単位（Ｌｅｉｓｈｍａｎ−Ｄｏｎｏｖａｎ  Ｕｎｉｔ）（ＬＤＵ）として表現）（Ａ）。Ｎｋｇ７欠乏マウスは、ｐ．ｉ．１４日目に有意に少ない炎症促進性サイトカインを産生した（Ｂ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＷＴ又はＮｋｇ７欠乏マウスのいずれかから磁気活性化細胞選別によって精製し、Ｒａｇ１−／−マウスに移入した。レシピエントマウスにその後、ドノバンリーシュマニアを感染させた。ｐ．ｉ．１４日目の肝臓における寄生生物負荷の評価は、ＷＴ  ＣＤ４＋Ｔ細胞を受けたＲａｇ１−／−マウスと比較して、Ｎｋｇ７欠乏ＣＤ４＋Ｔ細胞を受けたＲａｇ１−／−マウスの肝臓において増加した寄生生物負荷を示した。この結果は、Ｎｋｇ７欠乏マウスにおいて観察された表現型が、少なくとも一部には、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介されることを示す（Ｃ）。統計的有意性は、多重比較による二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（Ａ及びＢ）又はマン・ホイットニー検定（Ｃ）を使用して決定した。次の場合にｐ値が示されている；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。エラーバーは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。データは１回の実験の代表であり、この場合、系統当たり時点当たりｎ＝３又は４回の生物学的複製である。
【図１０】野生型（ＷＴ；Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）又はＮｋｇ７欠乏（Ｂ６Ｎ．Ｎｋｇ７−／−）マウスは、Ｂ１６Ｆ１０又はＬＷＴ１細胞のいずれかを受け、肺を１４日後に採集して、肺転移の数を決定した。どちらの場合も、Ｎｋｇ７欠乏マウスは、増加した肺転移を示した（Ａ）。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を、ＷＴ又はＮｋｇ７欠乏マウスのいずれかから選別し、Ｒａｇ２γｃ−／−マウスに移入した。次に、レシピエントマウスに、１×１０４個又は１×１０５個のＢ１６Ｆ１０細胞のいずれかを注射した。Ｎｋｇ７欠乏ＮＫ細胞を受けたＲａｇ２γｃ−／−マウスは、ＷＴ  ＮＫ細胞を受けたマウスと比較して、増加した肺転移を示し、全身性Ｎｋｇ７欠乏マウスで為された観察と一貫した。この結果は、Ｂ１６Ｆ１０細胞を注射した全身性Ｎｋｇ７欠乏マウスにおける肺転移の増加が、ＮＫ細胞によって媒介されることを示す（Ｂ）。統計検定は、独立ｔ検定を使用して実行した。次の場合にｐ値が示されている；＊ｐ＜０．０５及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１１】野生型（ＷＴ；Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）又はＮｋｇ７欠乏（Ｂ６Ｎ．Ｎｋｇ７−／−）マウスに、デキストラン硫酸ナトリウム（ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）（ＤＳＳ）を含有する飲料水を６日間与えた。Ｎｋｇ７欠乏マウスは、ＷＴマウスと比較して、重症度の低い疾患を示す、より低い疾患活動性指標（ＤＡＩ）を有することが見出された。少ない程度の体重減少（出発体重の％として表現）も、ＷＴマウスと比べて、Ｎｋｇ７欠乏マウスにおいて観察された（Ａ）。Ｎｋｇ７欠乏マウスは、ＤＳＳの初期投与７日後に測定した場合、ＷＴマウスと比較して、増加した結腸の長さを有した。結腸短縮は、炎症増加に関連する（Ｂ）。結腸切片のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、ＤＳＳの初期投与後７日目に、ＷＴマウスにおける陰窩（ｃｒｙｐｔ）の完全損失を示す（Ｃ）。結腸切片の組織学的スコアリングは、Ｎｋｇ７欠乏マウスが、結腸の中央部及び遠位切片の両方で、ＷＴマウスよりも少ない炎症を有したことを示す（Ｄ）。統計的有意性は、シダックの多重比較検定による二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（Ａ及びＤ）又は独立ｔ検定（Ｂ）を使用して決定した。次の場合にｐ値が示されている；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。エラーバーは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。データは、２回の実験の代表であり、この場合、群当たりｎ＝８〜１０回の生物学的複製である。
【図１２】野生型（ＷＴ；Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）又はＮｋｇ７欠乏（Ｂ６Ｎ．Ｎｋｇ７−／−）マウスに、ルシフェラーゼ発現プラスモディウム・ベルゲイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ）ＡＮＫＡ（ＰｂＡ）を感染させた。Ｎｋｇ７欠乏マウスは、ＷＴマウスと比較して、増加したレベルの寄生された赤血球細胞（ｐＲＢＣ）を示した（Ａ）。Ｎｋｇ７欠乏マウスは、ＷＴマウスよりも低い実験的脳性マラリア（ＥＣＭ）スコアを記録した（Ｂ）。ＷＴマウスは、ｐ．ｉ．７〜８日目の間に感染に屈した一方、Ｎｋｇ７欠乏マウスは、最大ｐ．ｉ．１４日目まで生存した（Ｃ）。バイオルミネセンスイメージングは、Ｎｋｇ７欠乏マウスと比較して、ＷＴマウスの全身（Ｄ）及び脳（Ｅ）における増加したバイオルミネセンス、したがって、寄生生物負荷を示す。統計検定は、シダックの多重比較検定による二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（Ａ）、ログランク（マンテル・コックス（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ））検定（Ｃ）又はマン・ホイットニー検定（Ｄ及びＥ）を使用して実行した。次の場合にｐ値が示されている；＊ｐ＜０．０５及び＊＊＊ｐ＜０．００１。エラーバーは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。群当たりｎ＝５匹のマウス。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
一般技法及び定義
他に特に定義されていなければ、本明細書で使用されている技術及び科学用語は、当業者（例えば、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、細胞生物学、生化学及び化学分野の）によって一般的に理解されるものと同じ意義を有すると解釈されるものとする。
【００４５】
他に断りがなければ、本開示で利用されている組換えタンパク質、細胞培養及び免疫学的技法は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４年）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１年）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編集者）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、１及び２巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ及びＢ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編集者）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、１〜４巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５年及び１９９６年）、並びにＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編集者）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（現在までの最新版を含む１９８８年）、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編集者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８年）、並びにＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら（編集者）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（現在までの最新版を含む）に記載されているもの等、当業者に知られている標準手順である。
【００４６】
用語「及び／又は」、例えば、「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ若しくはＹ」のいずれかを意味すると理解されるものとし、両方の意義又はいずれか一方の意義に対し明示的な支持を提供すると解釈されるものとする。
【００４７】
本明細書において、用語「疾患」又は「状態」は、正常機能の破壊又は正常機能に対する干渉を指し、いかなる特異的な状態、疾患又は障害にも限定されない。
【００４８】
本明細書において、用語「処置すること」、「処置する」又は「処置」は、本明細書に記載されている化合物又は分子を投与して、疾患又は状態の少なくとも１つの症状を低下、予防又は排除することを含む。
【００４９】
本明細書において、用語「予防すること」、「予防する」又は「予防」は、疾患又は状態の少なくとも１つの症状の発症の停止又は妨害に十分な、治療有効量の化合物又は分子を投与することを含む。
【００５０】
本明細書において、用語「対象」は、ヒト、例えば、哺乳動物を含むいずれかの動物を意味すると解釈されるものとする。例示的な対象は、ヒト、マウス及びラットを含むがこれらに限定されない。一例では、対象は、ヒトである。別の例では、対象は、マウスである。
【００５１】
「投与すること」は、本明細書において、広く解釈されるべきであり、本明細書に記載されている化合物又は分子を対象に投与することと共に、本明細書に記載されている化合物又は分子を細胞に与えることを含む。
【００５２】
ＮＫＧ７
活性化されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＴ細胞は、多くの細胞溶解性成分及び表面抗原を共有する。差次的及びサブトラクティブハイブリダイゼーション戦略の組合せにより、Ｔｕｒｍａｎら（１９９３年）は、ＮＫＧ７をコードするｃＤＮＡ（ＯＭＩＭエントリー６０６００８）を単離した。推論される１４８アミノ酸Ｉ型複合的膜貫通タンパク質は、シグナル配列と、複数のＴ細胞エピトープを有するがＮ−グリコシル化部位又はシステイン残基がない３８残基外部ドメインと、数個のリン酸化部位を有する６４アミノ酸細胞質ドメインとを有する。
【００５３】
現在まで、タンパク質レベルでのＮＫＧ７の発現については十分に記載されていない。それは主に、モノクローナル抗体を含む試薬及びマウスモデルの不足による。よって、ＮＫＧ７の機能、その機能の根底にある分子機序、及びそれが物理的に相互作用する他の分子の理解には乖離が存在する。そこで、本開示において、ＮＫＧ７が、炎症促進性及び抗炎症性サイトカインのモジュレーターであることが実証された。したがって、ＮＫＧ７活性のモジュレーションは、免疫応答を増加させることが望ましい治療適用において、例えば、がん免疫療法において使用し、免疫原に対する免疫応答を誘導することができると共に、自己免疫性疾患、炎症性状態及び移植片対宿主病の処置及び予防における等の抗炎症療法において使用することができる。
【００５４】
ヒトＮＫＧ７アミノ酸配列の例は、配列番号１、３及び５に提示されており、それらの核酸コード配列は、配列番号２、４及び６に提示されている。マウスのアミノ酸及び核酸ＮＫＧ７配列の例は、配列番号７、８、９及び１０に提示されている。
【００５５】
一部の実施形態では、ＮＫＧ７は、配列番号１、３、５、７又は９のうちのいずれか１つに対し少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。一部の実施形態では、ＮＫＧ７は、配列番号１、３、５、７又は９のいずれかに対し少なくとも８５％又は少なくとも８６％、８７％、８８％若しくは８９％、又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。
【００５６】
一部の実施形態では、ＮＫＧ７は、配列番号２、４、６、８又は１０のうちのいずれか１つを含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされ得る。
【００５７】
一部の実施形態では、ＮＫＧ７は、配列番号１、３、５、７及び９のうちのいずれか１つから選択され、１個又は数個のアミノ酸の置換又は欠失又は付加を有する、配列からなる。
【００５８】
「ＮＫＧ７活性」は、本明細書において、炎症促進性及び／又は抗炎症性サイトカインの産生を調節するＮＫＧ７の能力を指す。特に、ＮＫＧ７活性は、対象におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）及びＩＬ−６等の炎症促進性サイトカインの発現を誘導若しくは上方調節するＮＫＧ７の能力、及び／又は抗炎症性サイトカインの発現を阻害若しくは低下させるＮＫＧ７の能力を指す。
【００５９】
したがって、用語「ＮＫＧ７活性をモジュレートすること」は、所望の治療成果に応じて、炎症促進性サイトカイン発現を誘導する及び／又は抗炎症性サイトカイン発現を調節するＮＫＧ７の能力を増加させること又はこれを阻害することのいずれかを指す。一部の実施形態では、ＮＫＧ７活性をモジュレートすることは、例えば、ＮＫＧ７に結合してＮＫＧ７活性をモジュレートする抗体等、ＮＫＧ７に直接的に結合する化合物により達成することができる。一部の実施形態では、ＮＫＧ７活性をモジュレートすることは、例えば、ＮＫＧ７発現をモジュレートした結果として、ＮＫＧ７活性もモジュレートするｓｉＲＮＡ分子（例えば、一部の実施形態では、低下したＮＫＧ７発現は、対象における低下したＮＫＧ７活性をもたらす）等、ＮＫＧ７の発現をモジュレートする化合物を使用することにより達成される。
【００６０】
ＮＫＧ７発現及び／又は活性のレベルは、当技術分野で知られているいずれか適した手段を使用して決定することができる。例えば、ＮＫＧ７の発現及び／又は活性のレベルは、ＮＫＧ７に結合する抗体を使用したイムノアッセイによって決定することができる。その代わりに又はそれに加えて、ＮＫＧ７の発現及び／又は活性のレベルは、当技術分野で知られている核酸検出方法によって決定することができる。一部の実施形態では、ＮＫＧ７活性は、例えば、対象由来の血液試料における等、対象由来の試料における炎症促進性サイトカイン及び／又は抗炎症性サイトカインのレベルを測定することにより決定される。例えば、ＮＫＧ７活性は、ＩＬ−６、ＩＮＦ−γ及びＴＮＦα等の炎症促進性サイトカインのレベルを測定することにより、及び／又はＩＬ−１０、ＩＬ−４若しくはＩＬ−１３等の抗炎症性サイトカインのレベルを測定することにより、決定することができる。
【００６１】
用語「ＮＫＧ７活性を増加させること」は、本明細書において、ＮＫＧ７発現又は活性を上方調節し、よって、炎症促進性サイトカインの増加及び／又は抗炎症性サイトカインの減少をもたらすことができる化合物の使用を指す。例えば、一部の実施形態では、ＮＫＧ７活性を増加させる化合物は、ＮＫＧ７に結合する、小分子、ＮＫＧ７リガンド又はアゴニスト抗体となることができる。一部の実施形態では、ＮＫＧ７活性を増加させる化合物は、ＮＫＧ７活性を有する、ＮＫＧ７ポリペプチド又はその断片となることができる。
【００６２】
よって、用語「ＮＫＧ７活性を阻害すること」は、本明細書において、ＮＫＧ７発現又は活性を減少又は下方調節し、よって、炎症促進性サイトカインの減少及び／又は抗炎症性サイトカインの増加をもたらすことができる化合物の使用を指す。例えば、一部の実施形態では、ＮＫＧ７活性を阻害する化合物は、ＮＫＧ７に結合する、小分子、ＮＫＧ７リガンド又は抗体となることができる。一部の実施形態では、ＮＫＧ７活性を阻害することができる化合物は、ＮＫＧ７の発現を阻害又は下方調節する核酸分子となることができる。例えば、核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、アンチセンス核酸又はｍｉＲＮＡとなることができる。
【００６３】
化合物
本開示によって企図される「化合物」は、天然化合物、化学的小分子化合物又は生物学的化合物又は巨大分子を含む種々の形態のいずれかを取ることができる。例示的な化合物は、抗体又は抗体の抗原結合断片、核酸、ポリペプチド、ペプチド及び小分子を含む。
【００６４】
用語「タンパク質」は、単一のポリペプチド鎖、即ち、ペプチド結合によって連結された一連の近接アミノ酸、又は互いに共有結合若しくは非共有結合により連結された一連のポリペプチド鎖（即ち、ポリペプチド複合体）を含むと解釈されるものとする。例えば、一連のポリペプチド鎖は、適した化学結合又はジスルフィド結合を使用して共有結合により連結することができる。非共有結合による結合の例は、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力及び疎水性相互作用を含む。
【００６５】
用語「ポリペプチド」又は「ポリペプチド鎖」は、前述の段落から、ペプチド結合によって連結された一連の近接アミノ酸を意味すると理解されるであろう。
【００６６】
当業者であれば、「抗体」が一般に、複数のポリペプチド鎖で構成された可変領域、例えば、ＶＬを含むポリペプチド及びＶＨを含むポリペプチドを含むタンパク質であると考慮されることに気づくであろう。抗体はまた、一般に、定常ドメインを含み、定常ドメインの一部は、重鎖の場合、定常断片又は結晶化可能断片（Ｆｃ）を含む定常領域へと配置することができる。ＶＨ及びＶＬは相互作用して、１個又は少数の密接に関係する抗原に特異的に結合することができる抗原結合領域を含むＦｖを形成する。一般に、哺乳動物由来の軽鎖は、κ軽鎖又はλ軽鎖のいずれかであり、哺乳動物由来の重鎖は、α、δ、ε、γ又はμである。抗体は、いずれの型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものとなることもできる。用語「抗体」は、ヒト化抗体、霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体、ヒト抗体及びキメラ抗体も包含する。
【００６７】
本明細書において、用語「Ｆｖ」は、複数のポリペプチドで構成されるか単一のポリペプチドで構成されるかにかかわらず、ＶＬ及びＶＨが会合し、抗原結合部位を有する、即ち、抗原に特異的に結合することができる複合体を形成した、いずれかのタンパク質を意味すると解釈されるものとする。抗原結合部位を形成するＶＨ及びＶＬは、単一のポリペプチド鎖又は異なるポリペプチド鎖に存在することができる。さらに、本開示のＦｖ（と共に本開示のいずれかのタンパク質）は、同じ抗原に結合する場合も結合しない場合もある、複数の抗原結合部位を有することができる。この用語は、抗体に直接的に由来する断片と共に、組換え手段を使用して産生された斯かる断片に対応するタンパク質を包含すると理解されるものとする。一部の例では、ＶＨは、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）１に連結されない、及び／又はＶＬは、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に連結されない。例示的なＦｖ含有ポリペプチド又はタンパク質は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）若しくはより高次の複合体、又はその定常領域若しくはドメイン、例えば、ＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインに連結された前述のうちのいずれか、例えば、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）を含む。「Ｆａｂ断片」は、免疫グロブリンの一価抗原結合断片からなり、酵素パパインにより完全抗体を消化してインタクトな軽鎖及び重鎖部分からなる断片を生じることによって産生することができる、又は組換え手段を使用して産生することができる。抗体の「Ｆａｂ’断片」は、ペプシンで完全抗体を処理し、続いて還元して、インタクトな軽鎖並びにＶＨ及び単一の定常ドメインを含む重鎖部分からなる分子を生じることにより得ることができる。この様式で処理した抗体１個当たり２個のＦａｂ’断片が得られる。Ｆａｂ’断片は、組換え手段によって産生することもできる。抗体の「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２個のジスルフィド結合によって一体に保持された２個のＦａｂ’断片の二量体からなり、酵素ペプシンで完全抗体分子を処理することにより、その後の還元なしで得られる。「Ｆａｂ２」断片は、例えば、ロイシンジッパー又はＣＨ３ドメインを使用して連結された２個のＦａｂ断片を含む組換え断片である。「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域が、適した可動性ポリペプチドリンカーによって共有結合により連結された、抗体の可変領域断片（Ｆｖ）を含有する組換え分子である。
【００６８】
本明細書において、化合物又はその抗原結合部位と抗原との相互作用を参照した用語「結合する」は、相互作用が、抗原における特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する。
【００６９】
本明細書において、用語「特異的に結合する」又は「特異的に、結合する」は、本開示の化合物が、代替抗原又は細胞との反応又は会合よりも高頻度で、それよりも急速に、それよりも多い持続時間で、及び／又はそれよりも多い親和性で、特定の抗原又は特定の抗原を発現する細胞と反応又は会合することを意味すると解釈されるものとする。例えば、化合物は、多重反応性（ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｅ）天然抗体によって（即ち、ヒトにおいて天然で見出される種々の抗原に結合することが知られている天然起源の抗体によって）一般的に認識される他のサイトカイン受容体又は抗原への結合よりも実質的に多い親和性で（例えば、２０倍又は４０倍又は６０倍又は８０倍〜１００倍又は１５０倍又は２００倍）、ＮＫＧ７に結合する。
【００７０】
一部の実施形態では、ＮＫＧ７に結合する抗体は、例えば、二特異性抗体が２種類の抗原に結合するように、２種の異なる抗体の２個の異なる断片で構成された二特異性抗体等の多特異性抗体となることができる。例えば、二特異性抗体は、ＮＫＧ７に結合する断片と、第２の抗原に結合する第２の断片とを含むことができる。第２の抗原は、例えば、ＮＫ細胞におけるＣＤ５６、又はＣＤ４＋Ｔ細胞若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的なマーカー等、例えば免疫細胞のマーカーとなることができる。二特異性抗体の調製のための技法は、当技術分野でよく知られている。
【００７１】
ＮＫＧ７に結合する抗体は、市販されている。例えば、ポリクローナル抗ＮＫＧ７抗体が利用でき（ＨＰＡ０７１４５４；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＮＫＧ７に結合するモノクローナル抗体も市販されている（抗ＴＩＡ−１（抗ＮＫＧ−７）；ＩＭ２５５０；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
【００７２】
指定の抗原に結合する抗体を作製及び単離するための方法は、当技術分野でよく知られている。
【００７３】
用語「単離されたタンパク質」又は「単離されたポリペプチド」は、その派生起源又は供給源のため、そのネイティブ状態では自身に付随する天然で会合している成分と会合していない、タンパク質又はポリペプチドであり；同じ供給源由来の他のタンパク質を実質的に含まない。タンパク質は、天然で会合している成分を実質的に含まない状態にすることができる、又は当技術分野で知られているタンパク質精製技法を使用した単離によって実質的に精製することができる。「実質的に精製された」とは、タンパク質が、混入物を実質的に含まない、例えば、混入物を少なくとも約７０％又は７５％又は８０％又は８５％又は９０％又は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は９９％含まないことを意味する。
【００７４】
用語「組換え」は、人工の遺伝的組換えの産物を意味すると理解されるものとする。したがって、抗体抗原結合ドメインを含む組換えタンパク質の文脈において、この用語は、Ｂ細胞成熟中に発生する天然の組換えの産物である、対象の身体内の天然起源の抗体を包含しない。しかし、斯かる抗体は、単離される場合、抗体抗原結合ドメインを含む単離されたタンパク質と考慮されるべきである。同様に、タンパク質をコードする核酸が単離され、組換え手段を使用して発現される場合、その結果得られるタンパク質は、抗体抗原結合ドメインを含む組換えタンパク質である。組換えタンパク質は、例えば、それが発現される細胞、組織又は対象内に存在する場合、人工組換え手段によって発現されたタンパク質も包含する。
【００７５】
本明細書において、用語「抗原結合部位」は、抗原に結合又は特異的に結合することができるタンパク質によって形成された構造を意味すると解釈されるものとする。抗原結合部位は、一連の近接アミノ酸である必要も、単一のポリペプチド鎖におけるアミノ酸である必要さえもない。例えば、２本の異なるポリペプチド鎖から産生されたＦｖにおいて、抗原結合部位は、抗原と相互作用し、一般に、各可変領域におけるＣＤＲのうちの１つ又は複数に存在するが必ずしもそうであるとは限らない、ＶＬ及びＶＨの一連のアミノ酸で構成される。一部の例では、抗原結合部位は、ＶＨ又はＶＬ又はＦｖである。
【００７６】
本明細書において、用語「エピトープ」（同義語、「抗原決定基」）は、抗体の抗原結合部位を含むタンパク質が結合するＮＫＧ７の領域を意味すると理解されるものとする。この用語は、タンパク質が接触する特異的な残基又は構造に必ずしも限定されない。例えば、この用語は、タンパク質によって接触されるアミノ酸にまたがる領域、及び／又はこの領域の５〜１０若しくは２〜５若しくは１〜３アミノ酸外側を含む。一部の例では、エピトープは、ＮＫＧ７がフォールドしたときに互いに近くに位置する一連の不連続アミノ酸、即ち、「立体構造エピトープ」を含む。当業者であれば、用語「エピトープ」が、ペプチド又はポリペプチドに限定されないことにも気づくであろう。例えば、用語「エピトープ」は、糖側鎖、ホスホリル側鎖又はスルホニル側鎖等、分子の化学的に活性な表面グルーピングを含み、ある特定の例では、特異的な三次元構造特徴及び／又は特異的な電荷特徴を有することができる。
【００７７】
本開示の一部の実施形態では、本明細書に記載されている治療及び／又は予防方法は、ＮＫＧ７の発現を低下させるステップが関与する。例えば、斯かる方法は、ＮＫＧ７をコードする核酸の転写及び／又は翻訳を低下させる化合物を投与するステップが関与することができる。一例では、ＮＫＧ７活性を阻害する化合物は、核酸、例えば、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＰＮＡ、干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はマイクロＲＮＡである。
【００７８】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特定のタンパク質の産生を特異的に阻害するために有用である。理論に限定されるものではないが、この技術は、目的の遺伝子又は目的の遺伝子の一部のｍＲＮＡ、この場合は、ＮＫＧ７をコードするｍＲＮＡと本質的に同一である配列を含有するｄｓＲＮＡ分子の存在に頼る。簡便には、ｄｓＲＮＡは、組換えベクター宿主細胞において単一のプロモーターから産生することができ、この際、センス及びアンチセンス配列は、センス及びアンチセンス配列がハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ分子を形成することを可能にする無関係配列によってフランキングされ、無関係配列は、ループ構造を形成する、例えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）となる。本開示に適したｄｓＲＮＡ分子の設計及び産生は、十分に当業者の技能範囲内にあり、国際公開第９９／３２６１９号、国際公開第９９／５３０５０号、国際公開第９９／４９０２９号及び国際公開第０１／３４８１５号を特に考慮する。ＲＮＡｉのための斯かるｄｓＲＮＡ分子は、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及び二機能性ｓｈＲＮＡを含むがこれらに限定されない。
【００７９】
例示的な低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）分子は、標的ｍＲＮＡの約１９〜２１個の近接ヌクレオチドと同一であるヌクレオチド配列を含む。例えば、ｓｉＲＮＡ配列は、ジヌクレオチドＡＡで開始し、約３０〜７０％（例えば、３０〜６０％、例えば、４０〜６０％、例えば約４５％〜５５％）のＧＣ含量を含み、例えば、標準ＢＬＡＳＴ検索によって決定される通り、ｓｉＲＮＡ配列が導入されるべき哺乳動物のゲノムにおける標的以外のいずれかのヌクレオチド配列に対し高いパーセンテージ同一性を持たない。
【００８０】
用語「アンチセンス核酸」は、本開示のいずれかの例における本明細書に記載されているポリペプチドをコードする特異的ｍＲＮＡ分子の少なくとも部分と相補的であり、ｍＲＮＡ翻訳等の転写後事象に干渉することができる、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はそれらの誘導体（例えば、ＬＮＡ又はＰＮＡ）、又はそれらの組合せを意味すると解釈されるものとする。アンチセンス方法の使用は、当技術分野で知られている（例えば、Ｈａｒｔｍａｎｎ及びＥｎｄｒｅｓ（編集者）、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、Ｋｌｕｗｅｒ（１９９９年）を参照）。
【００８１】
本開示のアンチセンス核酸は、生理的条件下で標的核酸にハイブリダイズするであろう。アンチセンス核酸は、構造遺伝子若しくはコード領域に、又は遺伝子発現若しくはスプライシングに及ぶ制御をもたらす配列に対応する配列を含む。例えば、アンチセンス核酸は、ＮＫＧ７をコードする核酸の標的化コード領域、若しくは５’非翻訳領域（ＵＴＲ）若しくは３’ＵＴＲ、又はこれらの組合せに対応することができる。アンチセンス核酸は、一部には、転写中又は転写後にスプライシング除去され得るイントロン配列に対し、例えば、標的遺伝子のエクソン配列のみに対し相補的となることができる。アンチセンス配列の長さは、ＮＫＧ７をコードする核酸の少なくとも１９個の近接ヌクレオチド、例えば、少なくとも５０ヌクレオチド、例えば、少なくとも１００、２００、５００又は１０００ヌクレオチドとなるべきである。遺伝子転写物全体に対し相補的な全長配列を使用することができる。標的化される転写物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも９０％、例えば、９５〜１００％となるべきである。
【００８２】
別の例では、化合物は、核酸アプタマー（適応可能なオリゴマー）となることができる。アプタマーは、タンパク質又は小分子、例えば、ＮＫＧ７等の特定の標的分子に結合する能力をもたらす二次及び／又は三次構造を形成することができる、一本鎖オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログである。よって、アプタマーは、抗体と類似したオリゴヌクレオチドと考慮される。一般に、アプタマーは、約１５〜約１００ヌクレオチド、例えば、約１５〜約４０ヌクレオチド、例えば約２０〜約４０ヌクレオチドを含むが、その理由として、これらの範囲内に収まる長さのオリゴヌクレオチドは、従来の技法によって調製することができることが挙げられる。
【００８３】
アプタマーは、アプタマーのライブラリーから単離又は同定することができる。アプタマーライブラリーは、例えば、ランダムオリゴヌクレオチドをベクター（又はＲＮＡアプタマーの場合は発現ベクター）にクローニングすることにより産生され、この場合、ランダム配列は、ＰＣＲプライマーの結合部位をもたらす公知配列によってフランキングされる。所望の生物学的活性をもたらす（例えば、ＮＫＧ７に特異的に結合する）アプタマーが選択される。例えば、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法（Ｓｙｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））を使用して、活性が増加したアプタマーが選択される。アプタマーライブラリーの産生及び／又はスクリーニングに適した方法は、例えば、Ｅｌｌｏｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８〜２２、１９９０年；米国特許第５２７０１６３号；及び／又は米国特許第５４７５０９６号に記載されている。
【００８４】
遺伝子編集によるＮＫＧ７活性のモジュレーション
一部の実施形態では、遺伝子編集系を使用して、ＮＫＧ７の活性をモジュレートすることができる。一例では、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連９（Ｃａｓ９）酵素は、ＣＲＩＰＲ／Ｃａｓ９として知られている技術に使用して、個々の細胞及び生物全体の内の遺伝子を編集することができる（Ｚｈａｎｇら、２０１４年）。この技術を使用して、ヒト又は動物の生殖系列ＤＮＡからＮＫＧ７を欠失させることができる（Ｈｕｌｔｑｕｉｓｔら、２０１６年）。その代わりに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて、遺伝子転写及びしたがってタンパク質発現の増強又は限定のいずれかを行うように、ＮＫＧ７遺伝子又は関連する調節性ＤＮＡ領域を改変することができる（Ｌｅｄｆｏｒｄ、２０１５年）。同様に、Ｃａｓ９の不活性バージョンをＣＲＩＳＰＲと共に使用して、ＤＮＡのカットを回避するが、その代わりに、遺伝子又はＲＮＡ標的に結合させて、遺伝子をサイレンシングすることができる（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、２０１６年）。当業者であれば、当技術分野で知られている他の遺伝子系又は技術を用いて、ＮＫＧ７の活性を改変することもできる。斯かる系及び技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びメガヌクレアーゼを含むヌクレアーゼに基づくプラットフォームを含む。
【００８５】
一部の実施形態では、ＮＫＧ７の活性又は発現は、遺伝子編集系を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞においてモジュレートすることができる。
【００８６】
他の実施形態では、対象から得られた細胞におけるＮＫＧ７活性又は発現をモジュレートするｅｘ  ｖｉｖｏ方法を実行することが望ましくなり得る。次に、このような改変された細胞を、対象におけるＮＫＧ７の活性又は発現をモジュレートすることによる治療活性のために患者に戻すことができる。
【００８７】
別の実施形態では、当業者であれば、対象に投与される遺伝子編集系を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで対象におけるＮＫＧ７の活性又は発現を改変することができる。遺伝子編集系の送達のための当技術分野で知られている技法は、ウイルスパッケージング、ｍＲＮＡ、プラスミド及びタンパク質に基づくアプローチ等のパッキングフォーマットを含む。
【００８８】
スクリーニングアッセイ
本開示を踏まえると、当業者であれば、本明細書の実施例セクションに記載されているアッセイを含む、スクリーニングアッセイを実行して、ＮＫＧ７に結合する及び／又はＮＫＧ７の活性をモジュレートする抗体及び分子を同定することができるであろう。例えば、当業者であれば、実施例１に記載されている方法に従って、被験化合物の存在下でＴ細胞活性化アッセイを実行することができる。よって、アッセイは、ＣＰＧ又はＬＰＳ等の刺激による、マウス若しくはヒトＴ細胞、マウス脾細胞又はヒトＰＢＭＣの精製された集団の活性化、及びサイトカイン産生の増加又は阻害の検出が関与することができる。当技術分野で理解される通り、Ｔ細胞活性化アッセイは、限界希釈培養、ＥＬＩＳＰＯＴ、サイトカイン捕捉及びバイオセンサーアッセイ並びに市販のＴ細胞活性化アッセイ等の技法を利用することができる。他のアッセイは、Ｔ細胞に抗原を提示するＡＰＣの変更された能力、又はサイトカインを産生する及び／又はＢ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞若しくは抗原提示細胞等の他の免疫細胞の活性をモジュレートするヘルパーＴ細胞の能力の検出に基づくことができる。
【００８９】
自己免疫性疾患及び炎症性状態の処置及び予防
自己免疫、炎症、アレルギー性障害、敗血症、ＧＶＨＤにおける又は他の疾患状態の炎症性副作用の軽減における等、炎症促進性サイトカインの発現の阻害若しくは低下、及び／又は抗炎症性サイトカインの増加が治療上有益となる治療方法が、本明細書に開示されている。よって、一部の実施形態では、ＮＫＧ７活性を阻害する化合物は、自己免疫性疾患及び／又は炎症性状態の処置又は予防のために対象に投与することができる。
【００９０】
「自己免疫」又は「自己免疫性疾患又は状態」は、本明細書において、個体自身の組織から生じ、個体自身の組織を指向する疾患若しくは障害、又はそれらの同時分離（ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔｅ）若しくは顕在化、又はその結果生じる状態を広く指し、これらを含む。本明細書における自己免疫性状態は、炎症性又はアレルギー性状態、例えば、関節リウマチ等、組織破壊を伴う可能性がある、自己抗原に対する宿主免疫反応によって特徴付けられる慢性疾患を含む。
【００９１】
一部の実施形態では、自己免疫性疾患は、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、橋本（Ｈａｓｈｉｎｏｔｏ）甲状腺炎、全身性エリテマトーデス（ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｍａｔｏｓｕｓ）、胃炎、自己免疫性肝炎、溶血性貧血、自己免疫性血友病、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性網膜ぶどう膜炎、糸球体腎炎、ギラン・バレー症候群、乾癬、脱毛症及び重症筋無力症から選択される。
【００９２】
本明細書で互換的に使用される「炎症性障害」、「炎症性状態」及び／又は「炎症」は、慢性又は急性炎症性疾患を広く指し、炎症性自己免疫性疾患及び炎症性アレルギー性状態を明確に含む。これらの状態は、例として、病原体、損傷した細胞又は刺激物等の有害な刺激に対する免疫応答調節不全によって特徴付けられる炎症性異常を含む。炎症性障害は、莫大な種類のヒト疾患の根底にある。炎症性過程に病原学的起源を持つ疾患は、がん、粥状動脈硬化、神経炎症及び虚血性心疾患を含む。炎症に関連する障害の例は、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、骨盤炎症性疾患、再灌流傷害、サルコイドーシス、血管炎、間質性膀胱炎、正補体血症性（ｎｏｒｍｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｍｉｃ）蕁麻疹様血管炎、心膜炎、筋炎、抗シンテターゼ症候群、強膜炎、マクロファージ活性化症候群、ベーチェット症候群、ＰＡＰＡ症候群、ブラウ症候群、痛風、成人及び若年性スチル病、クリオピリン症（ｃｒｙｒｏｐｙｒｉｎｏｐａｔｈｙ）、マックル・ウェルズ（Ｍｕｃｋｌｅ−Ｗｅｌｌｓ）症候群、家族性寒冷誘導性自己炎症性症候群、新生児期発症多臓器性炎症性疾患、家族性地中海熱、慢性乳児性神経性、皮膚性及び関節症候群、全身性若年性特発性関節炎、高ＩｇＤ症候群、シュニッツラー症候群、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳＰ）、歯肉炎、歯周炎、肝炎、硬変、膵炎、心筋炎、血管炎、胃炎、痛風、痛風性関節炎、並びに乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹、酒さ、蕁麻疹及びざ瘡からなる群から選択される炎症性皮膚障害；並びに全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、アルツハイマー病及びパーキンソン病を含む他の状態を含む。
【００９３】
一部の実施形態では、自己免疫性及び／又は炎症性状態は、炎症性腸障害である。本明細書において、用語「炎症性腸障害」は、次の判断基準のうちの少なくとも１つによって診断される障害を含む；１）結腸の壁における炎症、及び／又は２）少なくとも１つの症状を訴える患者と組み合わせた、炎症の炎症性マーカーに関する検査結果が陽性の糞便試料。症状は、排便によって緩和される下腹部疼痛、便秘／下痢交代症、小口径の糞便の排泄、筋痙攣、下痢、便秘、切迫、鼓腸、疼痛を伴う若しくは伴わない水様下痢、膨満、悪心及び／又は失禁を含むがこれらに限定されない。炎症性腸障害は、炎症性過敏性腸症候群、クローン病、過敏性腸症候群−下痢、過敏性腸症候群−便秘、過敏性腸症候群−混合型、過敏性腸症候群−交代型、ディスペプシア、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性大腸炎、コラーゲン性大腸炎、不確定大腸炎、セリアック病及びそれらの組合せを含む。
【００９４】
一部の実施形態では、炎症性腸障害は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。炎症性腸疾患は、クローン病及び潰瘍性大腸炎の両方を含む。クローン病は、口から肛門に及ぶ胃腸管のいずれか一部が罹患し得る炎症性腸疾患である。クローン病は、腹部疼痛、重症下痢、疲労、体重減少及び栄養不良をもたらし得る、胃腸管の裏層の炎症を引き起こす。クローン病によって引き起こされた炎症は、異なる患者において胃腸管の異なる区域が関与し得る。クローン病に伴う炎症は、多くの場合、罹患した腸組織の層へと深く拡散する。クローン病は、有痛性及び衰弱性の両方となることができ、時に、生命にかかわる合併症をもたらし得る。合併症は、腸管閉塞、腸管における潰瘍、及び十分な栄養素を得る上での問題を含む。他の合併症は、胃腸管の外側で発生し、貧血、皮疹、関節炎、眼の炎症、及び疲労を含む。従来の処置は、症状の制御に役立つ場合があり、薬、栄養補助食品及び／又は外科手術を含む。一部の患者は、症状がない長い寛解期間を有し得るが、現在、クローン病の治癒法は存在しない。したがって、依然として、クローン病の管理及び処置のための方法の必要がある。
【００９５】
潰瘍性大腸炎は、結腸としても知られている大腸の慢性疾患であり、それによると、結腸の裏層が炎症するようになり、膿汁及び粘液を産生する小さい開放創又は潰瘍を発生する。炎症及び潰瘍形成の組合せは、腹部不快感及び高頻度の結腸内容物排出を引き起こし得る。潰瘍性大腸炎のための現存する処置は、有意な副作用を伴う、高強度且つ長期にわたる併用薬物療法が関与する、又はさらには、結腸の一部を除去するための外科手術を要求する。よって、投与がより容易であり、この衰弱性状態を治癒することができる、潰瘍性大腸炎のためのより有効な処置の必要がある。
【００９６】
一部の実施形態では、本開示は、移植片、特に、同種異系間移植片のレシピエントにおける移植片対宿主病を処置又は予防する方法を提供する。ＧＶＨＤは、同種異系間組織移植後に一般的な合併症である。ＧＶＨＤは一般的に、幹細胞又は骨髄移植に伴うが、この用語は、他の形態の組織グラフトにも適用される。組織（グラフト）における免疫細胞（白血球細胞）は、レシピエント（宿主）を「異物」として認識する。一実施形態では、ＧＶＨＤは、急性ＧＶＨＤである。急性又は劇症形態のこの疾患（ａＧＶＨＤ）は通常、移植後の最初の１００日以内に観察され、関連する罹病率及び死亡率のため、移植に対する大きな課題である。急性移植片対宿主病は、肝臓、皮膚（発疹）、粘膜及び胃腸管への選択的損傷によって特徴付けることができる。最新の研究は、他の移植片対宿主病標的臓器が、免疫系（造血系、例えば、骨髄及び胸腺）それ自体、及び特発性肺臓炎の形態で肺を含むことを示す。急性ＧＶＨＤは、臓器関与の数及び程度によってステージ分類及びグレード分類（０〜ＩＶ）される。グレードＩＶ  ＧＶＨＤを有する患者は通常、予後不良を有する。ＧＶＨＤが重症であり、制御下に置くために、ステロイド及び追加的な薬剤が関与する高強度免疫抑制を要求する場合、患者は、免疫抑制の結果として重症感染を発症する場合があり、感染が原因で死亡する場合がある。
【００９７】
がん免疫療法
本開示は、ＮＫＧ７の活性をモジュレートすることにより、がん細胞に対する対象の免疫応答をモジュレートすることにより、対象におけるがんを処置する方法を提供する。よって、一部の実施形態では、ＮＫＧ７のモジュレーターにより患者を処置することは、がん免疫療法の形態として使用することができる。当技術分野で知られている通り、がん免疫療法は、免疫系の成分が関与する又はこれを使用する、患者の処置に使用される治療法である。よって、一部の実施形態では、患者におけるＮＫＧ７活性を増加させるための化合物の投与は、患者におけるがん細胞に対する免疫応答の増加に使用することができる。
【００９８】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている処置方法は、他のがん免疫療法及び免疫療法剤と組み合わせて又は併せて使用することができる。
【００９９】
免疫療法は、能動的、受動的又はハイブリッド（能動的且つ受動的）としてカテゴリー化することができる。これらのアプローチは、がん細胞が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）として知られている、免疫系によって検出され得る分子をその表面に有することが多いという事実を活用する；ＴＡＡは、タンパク質又は他の巨大分子（例えば、炭水化物）であることが多い。能動的免疫療法は、ＴＡＡを標的化することにより、腫瘍細胞を攻撃するように免疫系を方向付ける。受動的免疫療法は、現存する抗腫瘍応答を増強し、モノクローナル抗体、リンパ球及びサイトカインの使用を含む。
【０１００】
これらのうち、複数の抗体療法が、広範囲のがんを処置するために、様々な法域で承認されている。細胞表面受容体は、抗体療法のための共通標的であり、ＣＤ２０、ＣＤ２７４及びＣＤ２７９を含む。がん抗原に結合されると、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を誘導する、補体系を活性化する、又は受容体がそのリガンドと相互作用するのを防止することができ、これらは全て、細胞死をもたらすことができる。承認された抗体は、アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ及びリツキシマブを含む。
【０１０１】
能動的細胞療法は通常、血液又は腫瘍からの免疫細胞の除去が関与する。腫瘍に特異的な免疫細胞は、培養され、患者に戻され、そこで腫瘍を攻撃する；その代わりに、免疫細胞は、腫瘍特異的受容体を発現するように遺伝子操作し、培養し、患者に戻すことができる。この方法において使用することができる細胞型は、ナチュラルキラー細胞、リンホカイン活性化キラー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞及び樹状細胞である。特異的な一種類の細胞療法は、ＣＡＲ−Ｔ療法である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ、これはキメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体又は人工Ｔ細胞受容体としても知られている）は、免疫エフェクター細胞に任意の特異性をグラフトする操作された受容体である。典型的には、このような受容体は、Ｔ細胞表面へのモノクローナル抗体の特異性のグラフトに使用され、受容体のコード配列の移入は、レトロウイルスベクターによって容易になる。この受容体は、異なる供給源由来のパーツで構成されるため、キメラと呼ばれる。ＣＡＲ  Ｔ細胞設計の基本原理は、抗原結合機能及びＴ細胞活性化機能を組み合わせる組換え受容体が関与する。ＣＡＲ  Ｔ細胞の一般前提は、特異的腫瘍細胞に標的化されたＴ細胞を迅速に作製することである。科学者は、患者からＴ細胞を除去し、Ｔ細胞を遺伝子操作し、次いで患者に戻して、がん細胞を標的化することができる。
【０１０２】
一部の実施形態では、がん免疫療法剤は、免疫チェックポイントモジュレート剤、がんワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、サイトカイン及び細胞に基づく免疫療法のうちの１つ又は複数から選択することができる。
【０１０３】
一部の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死１（ＰＤ−１）、プログラム死−リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞活性化のＶ−ドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、ＣＤ１６０、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ）、並びにＩｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）のうちの１つ又は複数から選択される。
【０１０４】
一部の実施形態では、本開示は、がんを有する個体における免疫応答又は機能を増加、増強又は刺激する方法であって、ＮＫＧ７活性を増加させる化合物及び抗がん剤又は抗がん療法の有効量を個体に投与するステップを含む方法を提供する。他の態様では、本開示は、がんを有する個体における免疫応答又は機能を増加、増強又は刺激するための医薬の製造における、ＮＫＧ７活性を増加させる薬剤の有効量の使用であって、ＮＫＧ７活性を増加させる薬剤が、抗がん剤又は抗がん療法と組み合わせて使用される、使用を提供する。他の態様では、本開示は、がんを有する個体における免疫応答又は機能を増加、増強又は刺激するための医薬の製造における抗がん剤の有効量の使用であって、抗がん剤が、ＮＫＧ７活性を増加させる化合物と組み合わせて使用される、使用を提供する。他の態様では、本開示は、抗がん剤又は抗がん療法と組み合わせた、免疫応答又は機能の増加、増強又は刺激における使用のためのＮＫＧ７活性を増加させる薬剤を含む医薬組成物を提供する。他の態様では、本開示は、ＮＫＧ７活性を増加させる薬剤と組み合わせた、免疫応答又は機能の増加、増強又は刺激における使用のための抗がん剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１０５】
一部の実施形態では、ＮＫＧ７を増加させる化合物は、腫瘍関連抗原を含むがんワクチンと組み合わせて又は併せて使用することができる。一部の実施形態では、がんワクチンは、オンコファージ（Ｏｎｃｏｐｈａｇｅ）、ヒトパピローマウイルスＨＰＶワクチン、任意選択で、ガーダシル（Ｇａｒｄａｓｉｌ）若しくはサーバリックス（Ｃｅｒｖａｒｉｘ）、Ｂ型肝炎ワクチン、任意選択で、エンゲリクス（Ｅｎｇｅｒｉｘ）−Ｂ、レコンビバクス（Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ）ＨＢ若しくはツインリクス（Ｔｗｉｎｒｉｘ）、及びシプロイセル−Ｔ（プロベンジ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ））のうちの１つ若しくは複数から選択される、又はヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ１／ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＭＡＧＥ−３、Ｃ２４２抗原、５Ｔ４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、血管内皮成長因子ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、ＮＰＣ−１Ｃ、テネイシン、ビメンチン、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、アルファ−フェトプロテイン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、グアニリルシクラーゼＣ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３、サバイビン、インテグリン．アルファ．ｖ．ベータ．３、インテグリン．アルファ．５．ベータ．１、葉酸受容体１、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、糖タンパク質７５、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６（又はＣＡ−１２５）、ホスファチジルセリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＮＲ−ＬＵ−１３抗原、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ＥＧＰ４０汎癌腫（ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血小板由来成長因子受容体、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（１７−１Ａ）、プログラム死−１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、再生肝臓のホスファターゼ３（ＰＲＬ−３）、前立腺酸性ホスファターゼ、ルイス−Ｙ抗原、ＧＤ２（神経外胚葉起源の腫瘍表面に発現されるジシアロガングリオシド（ｄｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ））、グリピカン−３（ＧＰＣ３）及びメソテリンのうちの１つ若しくは複数から選択されるがん抗原を含む。
【０１０６】
一部の実施形態では、ＮＫＧ７の活性を増加させる化合物とがん免疫療法剤は、対象に別々に投与される。一部の実施形態では、ＮＫＧ７の活性を増加させる化合物とがん免疫療法剤は、同じ組成物の一部として一緒に投与される。
【０１０７】
ＮＫＧ７の活性を増加させる化合物の使用が関与するがん免疫療法の方法は、単独で又は他の知られているがん療法レジメン（ｒｅｇｉｍｅ）の補助として実行することができることが認められるであろう。例えば、処置は、化学療法、放射線療法、幹細胞移植及び／又は免疫療法、例えば、モノクローナル抗体療法等の処置と併せて又はその後に実行することができる。脳腫瘍の処置において使用される化学療法剤の例は、テモゾロミド、ＢＣＮＵ（カルムスチン）、ＰＣＶ（プロカルバジン、ＣＣＮＶ（ロムスチン）及びビンクリスチンの組合せ）、カルボプラチン、エトポシド、イリノテカン、シス−レチノイン酸（Ｒｅｔｏｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、サリドマイド、タモキシフェン及びＣＯＸ−２阻害剤を含む。他の知られている化学療法剤は、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、メトトレキセート、フルダラビン、シタラビン、エトポシド、トポテカン、プレドニゾン、デキサメタゾン、ビンクリスチン及びビンブラスチンを含む。
【０１０８】
感染性疾患及びワクチン接種
一部の実施形態では、本開示は、感染性疾患の処置若しくは予防における免疫応答を増加若しくは増強する方法、及び／又は感染病原体由来のワクチン抗原に対する免疫応答を増強する方法を提供する。
【０１０９】
本明細書において、「ワクチン」は、その後の曝露又は病原体感染又は腫瘍に対してよりよく応答することができるような様式で免疫系を刺激する、免疫原性決定基（即ち、抗原）を含有するいずれかの組成物を指す。ワクチンが通常、免疫原性決定基及び任意選択でアジュバントを含有し、アジュバントが、免疫原性決定基に対する免疫応答を非特異的に増強するように機能することが認められるであろう。
【０１１０】
よって、一部の実施形態では、本開示は、ＮＫＧ７活性を増加させる組成物を対象に投与することにより、対象におけるワクチン抗原に対する免疫応答を増強する方法を提供する。例えば、ＮＫＧ７活性を増加させることにより、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α等の炎症促進性サイトカインの増加のため、抗原に対する免疫応答増強を達成することができる。よって、一部の実施形態では、ＮＫＧ７活性を増加させる化合物は、ワクチン又はワクチン抗原と組み合わせて及び／又は併せて投与された場合に、アジュバント効果を有する。
【０１１１】
一部の実施形態では、ＮＫＧ７活性を増加させる化合物を使用して、細菌、ウイルス及び／又は寄生生物病原体由来のワクチン抗原に対する免疫応答を増強することができる。
【０１１２】
一部の実施形態では、本開示は、感染病原体によって引き起こされる炎症性免疫応答を低下させる方法を提供する。例えば、全身性炎症性免疫応答を患う対象における炎症性免疫応答を低下させることが望ましくなり得る、及び／又は敗血症を有する患者における炎症性免疫応答を低下させることが望ましくなり得る。炎症性免疫応答は、ＮＫＧ７発現又は活性を阻害する化合物を対象に投与することにより低下させることができる。
【０１１３】
組成物
ＮＫＧ７活性をモジュレートする化合物を、許容できる担体又は希釈剤と共に含む組成物は、本明細書に開示されている方法において有用である。治療組成物は、適切な程度の純度を有する所望の化合物を、任意選択の薬学的に許容できる担体、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０年））と混合することにより、凍結乾燥製剤、水性溶液又は水性懸濁液の形態で調製することができる。許容できる担体、賦形剤又は安定剤は、好ましくは、用いられる投薬量及び濃度において、レシピエントにとって無毒性であり、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウム塩化物；ベンザルコニウム塩化物、ベンゼトニウム塩化物；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖、二糖及び他の炭水化物；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はツイーン（ＴＷＥＥＮ）（商標）、プルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性物質を含む。
【０１１４】
斯かる担体の追加的な例は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、グリシン等の緩衝物質、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又はプロタミン硫酸塩等の電解質、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、塩化ナトリウム、コロイド性シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、及びセルロースに基づく物質を含む。
【０１１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用されるべき治療組成物は、滅菌されるべきである。滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。組成物は、全身性投与される場合、凍結乾燥形態で又は溶液中で貯蔵することができる。凍結乾燥形態の場合、組成物は典型的に、使用時における適切な希釈剤による再構成のための他の成分と組み合わせて製剤化される。液体製剤の例は、皮下注射のための単一用量バイアルに充填された、滅菌された清澄で無色の非保存（ｕｎｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）溶液である。
【０１１６】
組成物の単一又は複数の投与は、患者に要求され且つ患者が耐容性を示す、投薬量及び頻度に応じて投与される。投薬量及び頻度は典型的に、投与される特異的な治療剤又は予防剤、疾患又は状態の重症度及び種類、投与経路、並びに患者の年齢、体重、応答及び過去の病歴に応じて、各患者に特異的な因子に従って変動するであろう。適したレジメンは、当業者が斯かる因子を考慮することにより、また、例えば、文献に報告され、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（第５６版、２００２年）で推奨される投薬量に従うことにより、選択することができる。一般に、用量は、患者にとって許容できない毒性を生じることなく、疾患の症状又は徴候の処置又は寛解に十分である。
【０１１７】
いずれかの処置レジメンにおいて、治療組成物は、単独で、又は免疫抑制剤、寛容誘導剤、増強剤及び副作用緩和剤を含むがこれらに限定されない、他の治療剤、組成物若しくはその他を含有する組合せにおいて、患者に投与することができる。免疫抑制剤の例は、プレドニゾン、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｉｎ）、プレドニゾロン、デカドロン（ＤＥＣＡＤＲＯＮ）（Ｍｅｒｃｋ、Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ、Ｗｅｓｔ  Ｐｏｉｎｔ、Ｐａ．）、シクロホスファミド、シクロスポリン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、アザチオプリン及びｉ．ｖ．ガンマグロブリン、又はそれらの組合せを含む。好まれる増強剤は、モネンシン、塩化アンモニウム、ペルヘキシリン、ベラパミル、アマンタジン及びクロロキンを含む。これらの薬剤は全て、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第４１版、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｒ．Ｂａｒｎｈａｒｔ、Ｎ．Ｊ．（１９８７年）に開示されている用量範囲等、一般に認容される効果的な用量範囲内で投与される。
【実施例】
【０１１８】
実施例１．方法及び材料
マウス
８〜１２週齢の雌マウスを使用した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（野生型；ＷＴ）マウスは、ウォルター・イライザホール研究所（Ｗａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｅｌｉｚａ  Ｈａｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＷＥＨＩ；Ｋｅｗ、ＶＩＣ、豪州）から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ及びＢ６Ｎ．Ｎｋｇ７−ＫＯマウスは、インハウスで繁殖させた。全マウスは、ＱＩＭＲ  Ｂｅｒｇｈｏｆｅｒ医学研究所動物施設（Ｈｅｒｓｔｏｎ、ＱＬＤ、豪州）において病原体がない条件下で収容した。実験使用は、「科学目的の動物管理及び使用のための豪州実施規範（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ）」（豪州国立保健医療研究評議会（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ））に従い、ＱＩＭＲ  Ｂｅｒｇｈｏｆｅｒ医学研究所動物倫理委員会（Ｈｅｒｓｔｏｎ、ＱＬＤ、豪州；承認番号：Ａ０２−６３３Ｍ、Ａ０２−６３４Ｍ又はＡ１７０７６１５Ｍ）によって承認された。
【０１１９】
Ｎｋｇ７−ｃｒｅ×Ｂ６．ｍＴ／ｍＧマウスの作製
Ｎｋｇ７プロモーターの制御下でｃｒｅリコンビナーゼを発現するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｂ６Ｊ．Ｎｋｇ７−ｃｒｅ）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集を使用して、ウォルター・イライザホール研究所（ＷＥＨＩ）におけるメルボルン先進ゲノム編集センター（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｅ）（ＭＡＧＥＣ）によって作製された。簡潔に説明すると、以前に記載された方法に基づき、シングルガイド（ｓｇ）ＲＮＡ（配列：ＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＣＣＧＧＴＣＣＣ）を使用して、Ｎｋｇ７遺伝子座に二本鎖切断を誘導して、相同組換えを刺激し、ほぼ２ｋｂ相同性アームを含有する標的化ベクターを使用して、ｃｒｅリコンビナーゼコード配列を導入した。
【０１２０】
ｃｒｅリコンビナーゼ配列を検出するためのフォワード（ＡＣＧＡＣＣＡＡＧＴＧＡＣＡＧＣＡＡＴＧ）及びリバース（ＧＣＴＡＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣ）プライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、標的化ベクターの組込みに関して生存可能な子供（ｐｕｐ）をスクリーニングした。ｃｒｅリコンビナーゼ配列が存在する３０１ｂｐアンプリコンを検出した。ｃｒｅ配列を発現するＦ０マウスを、戻し交雑のために選択し、これにより、ヘテロ接合型Ｆ１マウスを得た。上述のＰＣＲを使用して、ｃｒｅ配列に関してＦ１マウスをスクリーニングした。ロングレンジ（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ）ＰＣＲによるさらなる検証を実行して、標的化ベクターの正確な位置的組込みを検証した。
【０１２１】
Ｂ６Ｊ．Ｎｋｇ７−ｃｒｅマウスを、ｍＴ／ｍＧ（Ｂ６．１２９（Ｃｇ）−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ４（ＡＣＴＢ−ｔｄＴｏｍａｔｏ，−ＥＧＦＰ）Ｌｕｏ／Ｊ）マウスと１回交雑させて、Ｎｋｇ７レポーター系統（Ｎｋｇ７−ｃｒｅ．ｍＴ／ｍＧ）を作製した。Ｂ６Ｎ．Ｎｋｇ７−／−（Ｎｋｇ７ｔｍ１．１（ＫＯＭＰ）Ｖｌｃｇ）マウスは、トランス−ＮＩＨノックアウトマウスプロジェクト（ｔｒａｎｓ−ＮＩＨ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）（ＫＯＭＰ）の一部として、カリフォルニア大学デービス校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｄａｖｉｓ）（ＵＣ  Ｄａｖｉｓ、Ｄａｖｉｓ  ＣＡ、米国）によって作製され、ＫＯＭＰリポジトリ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｏｍｐ．ｏｒｇ／）から得られた。
【０１２２】
マウスにおけるリーシュマニア感染
ドノバンリーシュマニア寄生生物（エチオピア系統、Ｌｖ９、ＭＨＯＭ／ＥＴ／６７／ＨＵ３）を、Ｒａｇ１−／−マウスにおける継代によって維持した。継代マウスを安楽死させ、脾臓を切除して、５ｍｌの滅菌ロズウェルパーク記念研究所培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＲＰＭＩ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、米国）＋１００μｇ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシン（ＰＳ；Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＲＰＭＩ／ＰＳ）培地に入れた。切除した脾臓を、ガラス組織グラインダーを使用してホモジナイズし、細胞懸濁液を、ブレーキをオフにして１１５×ｇで５分間室温にて遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄した。上清を１９６０×ｇで１５分間室温にて遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを１ｍｌの赤血球細胞溶解バッファーのハイブリ・マックス（Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ）（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ、米国）において５分間インキュベートし、その後に、滅菌ＲＰＭＩ／ＰＳを添加し、寄生生物を１９６０×ｇで１５分間室温にて遠心分離した。上清を廃棄した後に、ペレットに滅菌ＲＰＭＩ／ＰＳを添加し、１９６０×ｇで１５分間室温にて遠心分離ステップを反復した。上清を廃棄した後に、寄生生物ペレットを滅菌ＲＰＭＩ／ＰＳに再懸濁した。寄生生物懸濁液を、１ｍｌシリンジ（Ｔｅｒｕｍｏ（登録商標）、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ  ＮＪ、米国）に取り付けた２６Ｇ×１．５インチ（１  １／２”）針を通して吸い上げ、均質な懸濁液が達成されるまで反復して分注した。２μｌの寄生生物懸濁液をトーマ（Ｔｈｏｍａ）細胞計数チャンバー（Ｗｅｂｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、英国）にロードし、４×４グリッドにおいて寄生生物を３回複製して計数した。平均計数を使用して、次の方程式を使用して寄生生物／ｍｌの数を決定した：
【数１】
2021523164.tif 000002
【０１２３】
脾臓単一細胞懸濁液の調製
ＣＯ２窒息によりマウスを屠殺した。矢状中央部（ｍｉｄ−ｓａｇｉｔｔａｌ）切開を腹腔に入れた。脾臓を切除し、秤量し、ＲＰＭＩ／ＰＳ培地中に収集した。脾臓は、５ｃｃ／ｍＬシリンジプランジャー（Ｔｅｒｕｍｏ（登録商標）Ｍｅｄｉｃａｌ）の背部を使用して、イージーストレイナー（ＥＡＳＹｓｔｒａｉｎｅｒ）（商標）１００μｍ滅菌フィルター（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ、オーストリア）に機械的に通過させた。細胞をＲＰＭＩ／ＰＳに再懸濁し、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機５８１０  Ｒ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において３５０×ｇで遠心分離し、赤血球細胞溶解バッファーのハイブリ・マックス（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））において７分間室温にてインキュベートすることにより溶解させた。細胞をＤＰＢＳ（１×）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））及びトリパンブルー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））に希釈し、製造業者のプロトコールの通りにカウンテス（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ）ＩＩ  ＦＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を使用して計数した。
【０１２４】
肝臓単一細胞懸濁液の調製
ＣＯ２窒息によりマウスを屠殺した。矢状中央部切開を腹腔に入れた。肝臓を１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で灌流した。切除した肝臓を秤量し、ＰＢＳにおける１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ中に収集し、イージーストレイナー（商標）１００μｍ滅菌フィルター（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）に機械的に通過させた。ホモジナイズした肝臓を、エッペンドルフ遠心機５８１０  Ｒ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において３９０ｇで遠心分離することにより、１×ＰＢＳにおいて２回洗浄した。３３％（ｖ／ｖ）パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）（商標）密度勾配培地（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）及びブレーキをオフにした５７５ｇで１５分間室温の遠心分離を使用して、肝細胞をリンパ球から分離して除去した。赤血球細胞溶解バッファーのハイブリ・マックス（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を各ペレットに添加し、７分間室温にてインキュベートした。この操作に続いて、上述の通りに１×ＰＢＳにおいて単一回の洗浄を行った。細胞を、ＤＰＢＳ（１×）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））及びトリパンブルー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））に希釈し、製造業者のプロトコールの通りにカウンテスＩＩ  ＦＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を使用して計数した。
【０１２５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞移入
製造業者の説明書に従ってＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット、マウス及びＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用した磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって、ドナーマウスからＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。５×１０６個の細胞／ｍｌとなるように、単離された細胞を希釈した。２００μｌの細胞懸濁液を各レシピエントＲａｇ１−ＫＯマウスにｉ．ｖ．注射した（マウス当たり１×１０６個の細胞）。
【０１２６】
ＲＴ−ｑＰＣＲによるマウスの脾臓又は肝臓組織における寄生生物負荷の決定
皮膚掻爬ブレードを使用して、死後に各マウスの肝臓及び脾臓からおよそ１０〜２０ｍｇの組織片を採取した。組織を収集して、１５０μｌのクイックエクストラクト（ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ）（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、米国）に入れ、６５℃で３０分間インキュベートし、ボルテックスにかけ、９８℃で１６分間インキュベートして、ＤＮＡを抽出した。製造業者の説明書の通りにキュービット（登録商標）２．０蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））においてキュービット（Ｑｕｂｉｔ）（登録商標）ｄｓＤＮＡ高感度（ＨＳ）アッセイキットを使用して、各試料におけるＤＮＡの量を定量化した。２０ｎｇ／μｌ（脾臓）又は７．５ｎｇ／μｌ（肝臓）となるように、ウルトラピュア（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ）（商標）ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））に試料を希釈した。Ｋｈａｒｅら（２０１６年）によって以前に記載された、ドノバンリーシュマニアＧＰ６３特異的プライマー及びタックマン（ＴａｑＭａｎ）ＭＧＢプローブ、５’−ＦＡＭ標識レポーター色素、非蛍光クエンチャーを含有する反応マスターミックス、並びにマウスＧａｐｄｈタックマンプローブを含有する別の反応マスターミックスを、製造業者の説明書に従ってゴータック（ＧｏＴａｑ）（登録商標）プローブｑＰＣＲマスターミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、米国）を使用して調製した。クワントスタジオ（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ）５リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ、米国）におけるゴータック（登録商標）プローブｑＰＣＲマスターミックスのための製造業者の推奨プログラム設定を使用して、６μｌの反応マスターミックス及び４μｌの鋳型ＤＮＡを含有する１０μｌの総反応容量のランを行った。マウスＧａｐｄｈに対するドノバンリーシュマニアＧＰ６３のＣｔ値の倍数変化として寄生生物負荷を決定し、２−ΔＣＴ（Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎら、２００８年）として表現した。
【０１２７】
フローサイトメトリー
全フローサイトメトリー染色は、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）（登録商標）９６ウェル透明丸底組織培養（ＴＣ）処理細胞培養マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＮＹ、米国）内で実行した。単一細胞懸濁液を、５０μｌのトルステイン（ＴｒｕＳｔａｉｎ）ｆｃＸ（商標）（抗マウスＣＤ１６／３２；クローン：９３）及びゾンビ・アクア（Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ）（商標）固定可能生存率色素カクテル（両者共にＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ、米国）と共に１５分間室温にてインキュベートした。５７５ｇ、１分間、４℃でのエッペンドルフ遠心機５８１０  Ｒ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において遠心分離することにより、細胞を染色バッファー（１×ＰＢＳ、０．０２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．０１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）で１回洗浄した。次に、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）−シアニン（Ｃｙ）５．５コンジュゲート抗マウスＣＤ１１ｂ（クローン：Ｍ１−７０）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート抗マウスＴＣＲγδ（ＧＬ３）、アレクサフルオロ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）（登録商標）７００コンジュゲート抗マウスＣＤ８ａ（５３−６．７）、ＡＰＣ−Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＮＫ１．１（ＰＫ１３６）、パシフィックブルー（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）コンジュゲート抗マウスＩ−Ａ／Ｉ−Ｅ（Ｍ５．１１４−１５．３）、ブリリアントバイオレット（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ）（商標）６０５コンジュゲート抗マウスＬｙ６Ｃ（ＨＫ１．４）、ブリリアントバイオレット（商標）６５０コンジュゲート抗マウス／ヒトＢ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、ブリリアントバイオレット（商標）７８５コンジュゲート抗マウスＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）及びフィコエリトリン（ＰＥ）−Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＦ４／８０（ＢＭ８）（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ、米国）並びにブリリアントウルトラバイオレット（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ）（商標）３９５コンジュゲート抗マウスＣＤ４（ＧＫ１．５）及びブリリアントウルトラバイオレット（商標）７３７コンジュゲート抗マウスＴＣＲβ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ、米国）を含有する蛍光コンジュゲート抗体のカクテル５０μｌと共に、試料を３０分間インキュベートした。上述の染色バッファーによる２回の洗浄後に、２０分間にわたるＢＤサイトフィックス（Ｃｙｔｏｆｉｘ）（商標）固定バッファーセット（サイトカインに対する抗体でその後に染色する細胞のため）又は３０分間にわたるＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）転写因子バッファーセット（転写因子に対する抗体でその後に染色する細胞のため）（両者共にＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）のいずれかの１００μｌの固定バッファーと共に、試料をインキュベートした。次に、５７５ｇで１分間４℃にて遠心分離することにより、それぞれのキットのパーム／ウォッシュ（Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ）（商標）バッファーで細胞を２回洗浄し、その後に、細胞内分子に対する蛍光コンジュゲ��ト抗体を含有するカクテル５０μｌと共に細胞を３５分間インキュベートした。全染色は、室温にて暗所で実行した。試料を染色後に１％（ｗ／ｖ）ＰＦＡに再懸濁し、４℃で貯蔵し、その後、ＢＤ  ＦＡＣＳディーバ（ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ）（商標）Ｖ８．０によるＢＤ  ＬＳＲフォーテッサ（ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ）（商標）（特注研究製品；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において画像取得し、フロージョー（ＦｌｏｗＪｏ）ｖ１０  ＯＳＸ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ  ＯＲ、米国）において解析した。グラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ、米国）においてグラフ作成及び統計解析を実行した。ｐ値≦０．０５を統計的に有意であると考慮した。
【０１２８】
ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）
Ａｓｈｕｒｓｔによって書かれたプロトコール及びＲスクリプトに概要を述べる通りにｔＳＮＥを実行した。簡潔に説明すると、フロージョーｖ１０  ＯＳＸ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を使用して、試料は、最後の共通集団においてゲーティングした。次に、双指数関数（Ｂｉｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）スケールを目的の全フルオロフォアに対して適用した。幅基底を増加させることにより、スケールを調整して、ネガティブデータの拡散を低下させた。試料毎のゲーティングされた集団は、試料番号を割り当て、フロージョーｖ１０  ＯＳＸ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）において５０，０００事象にダウンサンプリングした。次に、全試料由来のダウンサンプリングされた集団は、単一のファイルへと連結させた。目的のマーカーをｔＳＮＥパラメーターとして選択し、次の設定を適用した：
反復：１０００
困惑（Ｐｅｒｐｌｅｘｉｔｙ）：３０
エータ（Ｅｔａ）（学習率）２００
シータ（Ｔｈｅｔａ）：０．５
【０１２９】
連結されたファイル内の各試料は、以前に割り当てた試料番号及び各試料に観察されるｔＳＮＥパラメーターに基づいて区別した。Ａｓｈｕｒｓｔ（２０１７）によって書かれたスクリプトへの入力としてエクスポートされたチャネル値を使用して、Ｒにおいてカラー化ｔＳＮＥプロットを作製した。
【０１３０】
サイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）
製造業者の説明書の通りにＢＤサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）マウス炎症キット又はマウスＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、サイトカインレベルを評価した。マウス血液由来の血清又は血漿試料は、そのままで（ｎｅａｔ）使用した一方、上清は、大部分のサイトカインの検出のため、１×ＰＢＳに１：５希釈した。上清は、ＩＦＮγの検出のため、１×ＰＢＳに１：５０希釈した。ＢＤ（商標）ＣＢＡ  ＦＣＡＰアレイソフトウェアｖ３．０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＣＢＡデータを解析した。
【０１３１】
マイクロアレイ
バッファーＲＬＴに貯蔵された、ＦＡＣＳ（商標）選別されたマウス脾臓及び肝臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＱＩＡシュレッダー（ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ）カラムにおいてホモジナイズし、その後、製造業者の説明書に従ってＲＮイージーミニ（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ）キット（全てＱＩＡＧＥＮ（登録商標）製、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使用してＲＮＡ抽出を行った。マウス全ゲノム（ＷＧ）−６  ｖ２．０発現ビーズチップ（ＢｅａｄＣｈｉｐ）キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ、米国）を使用して、試料のランを行った。ルミ（Ｌｕｍｉ）パッケージ（Ｄｕら、２００８年）を使用して、品質管理を評価し、Ｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）においてランした。リマ（Ｌｉｍｍａ）（Ｒｉｔｃｈｉｅら、２０１５年）を使用して、差次的遺伝子発現を解析した。
【０１３２】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＣＤ４＋Ｔ細胞の単離
カラアザール医学研究センター（Ｋａｌａ−ａｚａｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）（Ｍｕｚａｆｆａｐｕｒ、Ｂｉｈａｒ、インド）においてＶＬと診断された症候性患者から血液を得た。患者は、顕微鏡による脾臓吸引液スメアにおけるアマスティゴートの検出、又はｒｋ３９尿試験紙検査の使用のいずれかにより診断された。入院日（０日目）及びＡｍＢｉｓｏｍｅ（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ、米国）による処置３０日後に（３０日目）、ＢＤバキュテナー（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）（登録商標）リチウムヘパリンＮ（ＬＨ）１７０  Ｉ．Ｕ．プラス血液収集チューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、患者当たりおよそ５ｍｌの血液を収集した。フィコール・パクー（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）（商標）プラス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の上に血液を重層して、ＰＢＭＣを単離した。血球計数器を使用して、ＰＢＭＣを計数した。製造業者の説明書に従ってＣＤ４マイクロビーズ（ＭｉｃｒｏＢｅａｄ）、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｋ、ドイツ）を使用した磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって、ＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮した。
【０１３３】
ＲＮＡ配列決定
ＱＩＡシュレッダーカラムにおいて細胞をホモジナイズし、その後、製造業者の説明書に従ってＲＮイージーミニキット（両者共にＱＩＡＧＥＮ（登録商標）製）を使用してＲＮＡ抽出を行った。ＮＥＢネクスト（ＮＥＢＮｅｘｔ）（登録商標）ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気単離モジュール（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ、米国）を使用して、ｍＲＮＡを単離した。イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）（登録商標）のためのＮＥＢネクスト（登録商標）ウルトラ（Ｕｌｔｒａ）（商標）ＲＮＡライブラリープレップキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ、米国）を使用して、ライブラリーを調製した。ＫＡＰＡライブラリー定量化キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ  ＣＡ、米国）を使用してライブラリーを定量化し、ＲＮＡ  ６０００ピコ（Ｐｉｃｏ）キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ、米国）を使用してＲＮＡ統合性数（ＲＩＮ）を得た。イルミナＨｉＳｅｑプラットフォームにおける５０ｂｐシングルエンドｍＲＮＡ配列決定によって、発現プロファイリングを実行した（豪州ゲノム研究施設（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（ＡＧＲＦ）、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ  ＶＩＣ、豪州により実行）。
【０１３４】
バイオインフォマティクス解析
Ｇａｌａｘｙプラットフォーム（ｈｔｔｐｓ：／／ｇａｌａｘｙ−ｑｌｄ．ｇｅｎｏｍｅ．ｅｄｕ．ａｕ／ｇａｌａｘｙ／）［７］においてＲＮＡ−ｓｅｑデータを処理した。ＦａｓｔＱＣ（Ａｎｄｒｅｗｓ、２０１４年）を使用して品質管理を実行した。参照（ＳＴＡＲ）（Ｄｏｂｉｎら、２０１３年）に対し整列されたスプライシングされた転写物を使用して、読み取りデータをマッピングし、転写物アセンブリー及び百万種のマッピングされた読み取りデータ当たりの転写物１キロベース当たりの読み取りデータ（ＲＰＫＭ）の推定のために、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（Ｔｒａｐｎｅｌｌら、２０１０年）を使用した。適用可能であれば、Ｃｕｆｆｍｅｒｇｅを使用して、複数の転写物アセンブリーを統合した（Ｔｒａｐｎｅｌｌら、２０１２年）。ＨＴｓｅｑを使用して、マッピングされた読み取りデータを計数データに転換し、これを下流解析の入力として使用した（Ａｎｄｅｒｓら、２０１５年）。Ｒ（Ｒ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ、２０１７年、Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｖｉｅｎｎａ、オーストリア）においてランしたＥｄｇｅＲ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、２０１０年）を使用して、ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットから差次的に発現された遺伝子のリストを作製した。インジェヌイティー・パスウェイ・アナリシス（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＩＰＡ；ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を使用して、目的の遺伝子の上流調節因子を同定した。ＩＰＡにおいて予測された薬物に加えて、目的の遺伝子を薬物−遺伝子相互作用データベース（ＤＧＩｄｂ）（Ｗａｇｎｅｒら、２０１６年）に提出して、現在利用できる薬物を同定した。各標的遺伝子に利用できるトランスジェニック又はノックアウトマウス系統の検索において、国際マウス系統資源（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）（ＩＭＳＲ）を使用した。アノテーション、可視化及び統合された発見のためのデータベース（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，  Ｖｉｓｕａｌｉｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）（ＤＡＶＩＤ；ｖ６．８ベータ、国立アレルギー感染病研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）（ＮＩＡＩＤ）、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）を使用して、遺伝子オントロジー：細胞成分のデータに基づく機能アノテーションにより、標的遺伝子の局在化を決定した。タンパク質三次構造が分かっていない遺伝子のため、ｎｅＸｔＰｒｏｔ（ベータ）［２０］からヒトアミノ酸配列及びトポロジーを得た。次に、ヒトアミノ酸配列を国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）保存ドメイン検索に提出して、保存ドメイン及びそのタンパク質スーパーファミリーを同定した。遺伝子名をＳＴＲＩＮＧ  ｖ１０．０（Ｓｚｋｌａｒｃｚｙｋら、２０１５年）に入力して、遺伝子近隣、遺伝子融合、遺伝子出���、遺伝子同時発現、実験（ｅｘｐｅｒｉｅｍｅｎｔ）及びアノテートされた経路に基づきタンパク質−タンパク質相互作用を同定し、組み合わせたスコアを得た。このスコアは、Ｃｉｒｃｏｓ  Ｔａｂｌｅ  Ｖｉｅｗｅｒ  ｖ０．６３−９（Ｋｒｚｙｗｉｎｓｋｉら、２００９年）への入力として機能した。プリズム７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、グラフをプロットした。
【０１３５】
がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）データセットの生存及び相関解析
ＴＣＧＡ研究ネットワーク（ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって以前に発表されたＲＮＡ−ｓｅｑデータをダウンロードし、ＲにおいてＴＣＧＡｂｉｏｌｉｎｋｓパッケージ（Ｃｏｌａｐｒｉｃｏら、２０１６年）を使用して処理した。簡潔に説明すると、転写物計数を遺伝子の長さによって正規化し、全試料にわたる発現平均の下四分位（＜２５％）における遺伝子をフィルタリング除去した。目的の遺伝子の発現値に従って試料をランク付けし、２群へと層別化し、それによると、最高四分位（＞７５％）は高発現者と命名し、最低四分位（＜２５％）は低発現者と命名した。これらの群の間の全生存を解析し、カプラン・マイヤー曲線としてプロットし、ログランク検定を使用してｐ値を決定した。次に、２種の目的の遺伝子の間で相関解析を実行し、関係性をｒとして表現した。
【０１３６】
統計解析
プリズム７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して統計解析を実行した。ｐ値を決定し、それぞれｐ＜０．０５、０．０１、０．００１及び０．０００１を表す＊、＊＊、＊＊＊及び＊＊＊＊として示した。
【０１３７】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ（商標））
ＦＡＣＳによって、雌Ｆｏｘｐ３−ＲＦＰ＋／＋マウスの脾臓及び肝臓から従来（Ｔｃｏｎｖ）及び調節性（Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞を選別した。製造業者の説明書に従ってＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット、マウス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用したＭＡＣＳによって、ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含有するフロースルーを、モノクローナル抗マウスフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートＴＣＲβ（Ｈ５７−５９７）及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートＣＤ４（ＧＫ１．５）（両者共にＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製）で染色した。Ｔｃｏｎｖ細胞は、ＴＣＲβ＋ＣＤ４＋ＲＦＰ−として同定した一方、Ｔｒｅｇ細胞は、ＴＣＲβ＋ＣＤ４＋ＲＦＰ＋として同定した。選別後に、バッファーＲＬＴ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））において細胞を−８０℃で貯蔵した。
【０１３８】
リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）
ナイーブ又は感染Ｆｏｘｐ３−ＲＦＰ＋／＋マウスから選別されたＦｏｘｐ３＋及びＦｏｘｐ３−細胞を、バッファーＲＬＴにおいて貯蔵し、ＱＩＡシュレッダーカラム（両者共にＱＩＡＧＥＮ（登録商標）製）においてホモジナイズした。製造業者の説明書に従ってＲＮイージーミニキット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を使用して、ＲＮＡを抽出した。ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）２０００  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＲＮＡの濃度（ｎｇ／μｌ）及び試料純度（２６０／２８０比）を測定した。製造業者の説明書の通りに大容量（Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ）ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を使用して、抽出されたＲＮＡを逆転写して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）にした。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔプライマーアッセイ（マウス（Ｍ．  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｂ２ｍ、Ｈｐｒｔ、Ｎｋｇ７及びＭａｐ３ｋ８に特異的；ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））又はＲＴ２  ｑＰＣＲプライマーアッセイ（マウスＣｄｋｎ１ａに特異的；ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を、ゴータックｑＰＣＲマスターミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と共に、１μｌの鋳型ｃＤＮＡを含有する１０μｌの最終反応容量において使用した。クワントスタジオ５リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、マイクロシール（Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ）（登録商標）「Ｂ」ＰＣＲプレート封着フィルム、接着性、オプティカル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で封着したハードシェル（Ｈａｒｄ−Ｓｈｅｌｌ）（登録商標）３８４ウェルプレート、薄壁、スカーテッド（ｓｋｉｒｔｅｄ）、クリア／クリア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ、米国）において、ＲＴ−ｑＰＣＲを実行した。２種の内部対照遺伝子：Ｂ２ｍ及びＨｐｒｔの平均と比べた比較ＣＴ方法を使用して、相対的定量化を実行した。
【０１３９】
ヒト試料のため、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、製造業者の説明書に従ってＣＤ４マイクロビーズ、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用したＭＡＣＳによって濃縮した。次に、ＲＮＡを抽出し、逆転写してｃＤＮＡにした。１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）と比べた比較ＣＴ方法を使用して、相対的定量化を実行した。
【０１４０】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫刺激アッセイ
セクション：「脾臓単一細胞懸濁液の調製」に記載されている通り、マウスから脾臓単核細胞を単離した。４μｇ／ｍｌ精製抗マウス（α）−ＣＤ３（ウェルに２時間３７℃で予めコーティング）＋２μｇ／ｍｌ  α−ＣＤ２８＋２０ｎｇ／ｍｌ組換えマウス（ｒ）ＩＬ−２（全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製）、１μｇ／ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）０１１１：Ｂ４由来のリポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、又は１５μｇ／ｍｌ  ＯＤＮ  １８２６（ＣｐＧ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のいずれかの存在下で、９６ウェルＵ字底プレートの各ウェルにおいて４×１０５個の細胞を２４時間３７℃にて５％ＣＯ２により培養した。全刺激物質は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；４．５ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、Ｌ−グルタミン、１１０ｍｇ／Ｌ（１ｍＭ）ピルビン酸ナトリウム；Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）、０．０５ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ；Ｇｉｂｃｏ）並びに１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）で構成されたＴ細胞培地において調製した。Ｔ細胞培地は、対照条件として使用した。培養２４時間目に、各ウェルから５０μｌの上清を収集し、さらなる使用まで−２０℃で貯蔵した。マウス炎症ＢＤ（商標）サイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）キット（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、サイトカインレベルを測定した。
【０１４１】
転移モデル
マウスに、１×１０５個のＢ１６Ｆ１０細胞又は５×１０５個のＬＷＴ１細胞のいずれかを静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。Ｂ１６Ｆ１０細胞を注射したマウスから注射後１４日目に肺を採集した。ＬＷＴ１細胞を注射したマウスから注射後１４日目に肺を採集し、墨汁で灌流した。光学顕微鏡下で肺表面におけるコロニーを計数することにより、両方のモデルにおける転移性負荷を定量化した。
【０１４２】
ＮＫ細胞移入
Ｒａｇ２γｃ−ＫＯマウスの群に、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって単離された２×１０５個のＣ５７ＢＬ／６Ｎ（Ｂ６Ｎ；野生型）又はＢ６Ｎ．Ｎｋｇ７−ＫＯ  ＮＫ細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。６日後、ナイーブ又は養子性移入したＲａｇ２γｃ−ＫＯマウスは、１×１０５個又は１×１０４個のＢ１６Ｆ１０細胞のいずれかを受けた。Ｂ１６Ｆ１０細胞を注射したマウスから注射後１４日目に肺を採集した。光学顕微鏡下で肺表面におけるコロニーを計数することにより、転移性負荷を定量化した。
【０１４３】
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導性大腸炎
２．５％ＤＳＳ塩（ＭＷ約４０，０００；Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、ＭＡ、米国）を含有する飲料水の投与前に、マウスの出発体重を記録した。毎日大腸炎の症状に関してマウスをスコアリングし、ほぼ同時に体重を記録した。％体重減少が１０％を超えた場合、毎日２回マウスをスコアリング及び秤量した。６日目にＤＳＳを含有する飲料水を除去し、マウスに新鮮な飲料水を与えた。ＤＳＳの投与後７日目に全マウスを屠殺し、その際に、結腸を測定し、組織学切片のためホルマリンに保存した。次に、結腸を７０％エタノールに移し、パラフィンに包埋し、その後、切片を作製した。ヘマトキシリン（Ｈａｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ）及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した切片を、陰窩アーキテクチャ、陰窩膿瘍、組織損傷、炎症性細胞浸潤、及び粘膜固有層（ｌａｍｉｎａｒ  ｐｒｏｐｒｉａ）好中球の量を含むパラメーターに関してスコアリングした。
【０１４４】
プラスモディウム・ベルゲイＡＮＫＡ感染及びバイオルミネセンスイメージング
ルシフェラーゼを発現するプラスモディウム・ベルゲイ（Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ）ＡＮＫＡ寄生生物を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（野生型）継代マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ｐ．ｉ．４日後、寄生生物血症が１〜３％の間になったときに、継代マウスを安楽死させ、心臓穿刺により血液を収集して、５ｍｌ  ＲＰＭＩ／ＰＳ＋５Ｕ／ｍｌヘパリンに入れた。５ｍｌのＲＰＭＩ／ＰＳを添加し、３３８ｇで７分間室温にて遠心分離することにより、寄生生物接種材料を調製した。上清を廃棄し、計数のため１ｍｌのＲＰＭＩ／ＰＳに赤血球細胞（ＲＢＣ）ペレットを再懸濁した。計数のため０．１％トリパンブルー溶液（０．４％から１×ＰＢＳに希釈；ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ、Ｓｅｖｅｎ  Ｈｉｌｌｓ  ＮＳＷ、豪州）においてＲＢＣを調製した。５×１０５個のｐＲＢＣ／ｍｌを含有する寄生生物接種材料を調製し、マウスに、２００μｌ（マウス当たり１×１０５個の寄生生物）をｉ．ｖ．注射した。ヘキスト３３３４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びシト（Ｓｙｔｏ）（登録商標）８４オレンジ蛍光核酸染色を使用したフローサイトメトリーにより、寄生生物血症をモニターした。毛皮のラフリング、背中を丸める、覚束ない足取りの存在、四肢麻痺及び痙攣を含む実験的脳性マラリア（ＥＣＭ）の症状に関して、マウスを毎日スコアリングした。神経学的症状の発病において、イソテシア（ＩｓｏＴｈｅｓｉａ）（登録商標）ＮＸＴ（Ｈｅｎｒｙ  Ｓｃｈｅｉｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ  ＮＹ、米国）及び１００μｇのＤ−ルシフェリン（Ｃａｌｉｐｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ、米国）ｉ．ｐ．を使用してマウスを麻酔し、バイオルミネセンスイメージングにおいてＸｅｎｏｇｅｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ（登録商標）；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ、米国）セットを使用して１分間の持続時間にわたり撮像した。心臓を通して１×ＰＢＳでマウスを灌流し、バイオルミネセンスイメージングのため脳を採集した。リビングイメージ（Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ）４ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、イメージング解析を実行した。
【０１４５】
実施例２．結果
感染におけるＮＫＧ７の差次的発現
ナイーブ及びドノバンリーシュマニア感染Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓及び脾臓から選別されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって単離した（図１Ａ及び図１Ｂ）。肝臓は、急性消散感染の部位である（免疫が発生し、この臓器は再感染から保護される）一方、脾臓は、慢性感染、過剰（ｈｙｐｅｒ）炎症及び感染後５６日目までにＣ５７ＢＬ／６マウスにおける機能不全ＣＤ４＋Ｔ細胞の部位である。全ゲノムマイクロアレイにより、これらの組織特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞による遺伝子発現を決定した。同時的に、クリニックへの提示の際にドノバンリーシュマニアに感染した及び薬物処置３０日後の内臓リーシュマニア症（ＶＬ）患者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、ＲＮＡｓｅｑを使用してヒトＶＬに関連する差次的に発現された遺伝子（ＤＥＧ）の同定に使用した。次に、感染マウス及びヒトデータセットと、対応するナイーブ細胞集団（マウス）又は薬物処置３０日後の対応する細胞集団（患者）のいずれかとの比較を行ったところ、脾臓、肝臓及びＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞における１８１６種、２７４８種及び５７８４種のＤＥＧを見出した（図１Ｄ及び図１Ｅ）。
【０１４６】
各供給源由来のＤＥＧを比較して、３種の供給源の間及び２種の哺乳動物宿主種にわたって共通であった、ＶＬにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞のためのコア遺伝子シグネチャーを決定した。この遺伝子シグネチャーは、１５０種の遺伝子からなった。感染に対する組織特異的応答に基づき、ＣＤ４＋Ｔ細胞の慢性シグネチャーを、脾臓及びヒトＰＢＭＣにおいて同様に上方調節又は下方調節された遺伝子として同定した（図１、丸で囲む）一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞の消散シグネチャーは、肝臓及びヒトＰＢＭＣにおける重複遺伝子として同定した。図１Ｅにおけるベン図から分かる通り、１５３種及び２５８種の差次的に発現された遺伝子は、それぞれドノバンリーシュマニア感染におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の慢性及び消散シグネチャーを表した。ＮＫＧ７は、慢性シグネチャー由来の上位ランクの上方調節された遺伝子として同定された。
【０１４７】
慢性シグネチャーは、４９種の上方調節された遺伝子を含み（図２Ａ）、ＮＫＧ７は、マウス脾臓から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞における最も上方調節された遺伝子であり（丸で囲む）、この組織における炎症に強く関連した。遺伝子オントロジー（ＧＯ）：細胞区画（ＣＣ）項から情報を抽出することにより、これらの分子の細胞局在化を決定した（図２Ｂ）。ＮＫＧ７は、ＧＯ：ＣＣ項「原形質膜の複合的成分」に基づき、膜タンパク質をコードすることが知られている。その上、ＧＯ項「タンパク質結合」は、ＮＫＧ７に関連した。ＮＫＧ７発現の増加は、リアルタイムｑＰＣＲによって、内臓リーシュマニア症患者（ＶＬ）及び固有対照（ＥＣ）のＰＢＭＣから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞、並びにドノバンリーシュマニア感染マウスの脾臓由来のＦｏｘｐ３−ＣＤ４＋従来Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）及びＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）において検証された（図２Ｃ）。差次的遺伝子発現解析データと一致して、ＮＫＧ７は、ＥＣ試料と比較して、ＶＬ試料において有意に上方調節された（ｐ＝．００８７）。その上、Ｎｋｇ７は、感染中に脾臓及び肝臓におけるＴｃｏｎｖ及びＴｒｅｇ細胞において有意に上方調節された。しかし、肝臓由来のナイーブＴｃｏｎｖ細胞におけるＮｋｇ７の転写物発現は、ナイーブ脾臓Ｔｃｏｎｖ細胞よりも高かった。
【０１４８】
がんにおけるＮＫＧ７発現
がんにおけるＮＫＧ７の潜在的な役割を調査するために、がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）の一部である３７種のがんデータセット由来のＮＫＧ７遺伝子発現レベルを得た。腫瘍内のＮＫＧ７の差次的発現は、腎臓の腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）及び神経膠芽腫（ＧＢＭ）において最も著しく見出された（図３Ａ；ｈｔｔｐ：／／ｆｉｒｅｂｒｏｗｓｅ．ｏｒｇ／から適応）。発現データは、腫瘍生検から得られたが、がんリスクを付与するＮＫＧ７における変異部位の証拠は殆どなかった（図３Ｂ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／ｏｕｔｐｕｔから適応）。さらに、遺伝子発現データは、現在まで、ＮＫＧ７発現が、他の組織と比較して、骨髄及び免疫系において群を抜いて最高であったことを示唆する（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ＥＮＳＧ０００００１０５３７４−ＮＫＧ７／ｔｉｓｓｕｅ）。
【０１４９】
ＮＫＧ７発現の差が有益であるか有害であるか決定するために、そのＮＫＧ７発現に基づき、皮膚の皮膚性黒色腫コホート（ＴＧＣＡ：ＳＫＣＭ）由来の４７０種の患者試料を順序付けた。高ＮＫＧ７発現（上位四分位「高ＮＫＧ７」）及び低ＮＫＧ７発現（最低四分位「低ＮＫＧ７」）への患者の層別化は、高ＮＫＧ７発現を有する群における生存確率の有意な増加を明らかにした（図３Ｃ（左）；ｐ＜０．０００１、網掛け区域は信頼区間を示す）。この結果は、ＮＫＧ７標的化のより幅広い臨床的関連を示す。次に、ＳＫＣＭデータセットにおけるＮＫＧ７発現及びＣＤ４、ＣＤ８又はＮＣＡＭ発現の間の相関解析を実行して、ＮＫＧ７が、ＣＤ４発現、ＣＤ８発現又はＮＣＡＭ発現に関連するか決定した。これらの結果は、ＮＫＧ７発現が、ＣＤ４発現及びＣＤ８発現に高度に相関したが、ＮＣＡＭ発現には相関しなかったことを示した。
【０１５０】
Ｂ６．Ｎｋｇ７−ｃｒｅマウスにおけるＮＫＧ７発現
Ｂ６．Ｎｋｇ７−ｃｒｅマウスを作製して、様々な文脈におけるＮｋｇ７の発現又は損失を特徴付けた（図４Ａ）。Ｎｋｇ７の発現を決定するために、Ｂ６．Ｎｋｇ７−ｃｒｅマウスを、Ｂ６．膜ｔｄＴｏｍａｔｏ／膜緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（ｍＴ／ｍＧ）マウスと交雑して、Ｎｋｇ７レポーターマウスＮｋｇ７−ｃｒｅ×ｍＴ／ｍＧを産生した（図４Ｂ）。代用マーカーＧＦＰにより、Ｃｒｅ発現（＋）マウスにおけるＮｋｇ７の発現を決定し、ナイーブ状態のナチュラルキラー細胞において検証された。ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ−ＳＮＥ）を実行して、ナイーブ状態における重要免疫サブセットによるＮｋｇ７の発現を評価した。ｔ−ＳＮＥプロットは、ナイーブ状態におけるＧＦＰの発現が、ＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋ＴＣＲβ−）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（ＮＫ１．１−ＴＣＲβ＋ＣＤ４−ＣＤ８＋）に限定されることを実証した（データ図示せず）。
【０１５１】
Ｎｋｇ７−ｃｒｅ×ｍＴ／ｍＧマウスに、ドノバンリーシュマニアを感染させ、感染後（ｐ．ｉ．）１３、２８及び５８日目に、各免疫細胞サブセット内のＧＦＰ発現の変化を追跡した。ＮＫ細胞集団内のＧＦＰ発現は、感染の経過において減少した一方、ＧＦＰ＋ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は増加した（図８）。これらの観察は、脾臓及び肝臓の両方において一貫した。ダンの多重比較検定によるクラスカル・ワリス検定を使用して、統計的有意性を決定した。＊は、ｐ値を示し、エラーバーは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【０１５２】
Ｂ６．Ｎｋｇ７−ｋｏマウスのドノバンリーシュマニア感染
Ｂ６Ｎ．Ｎｋｇ７−ＫＯマウスに、ドノバンリーシュマニアを感染させ、内臓リーシュマニア症における宿主保護及び病理におけるＮｋｇ７欠乏の効果を測定した。感染後（ｐ．ｉ．）１４日目におけるＮｋｇ７欠乏の効果を定量化し、Ｎｋｇ７が欠乏したマウスが、対照（野生型）マウスと比較して、より低い脾臓及び肝臓重量を示すことが見出された（図５Ａ）。これは、少ない組織損傷をもたらすより低い炎症レベルを示す。Ｎｋｇ７欠乏マウスにおける寄生生物負荷は、野生型マウスと比較して、顕著に上昇し（図５Ｂ）、Ｎｋｇ７欠乏が、弱められた炎症性応答、よって、寄生生物を排除する宿主免疫応答の損なわれた能力をもたらしたことを示唆する。これらの観察に合致して、炎症促進性サイトカイン、インターフェロン（ＩＦＮ）γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びＩＬ−６のレベルは、対照マウスと比較して、Ｎｋｇ７欠乏マウスの血清においてより低いことが見出された（図５Ｃ）。
【０１５３】
ｐ．ｉ．１４、２８及び５８日目に、脾臓及び肝臓における寄生生物負荷を測定し（リーシュマン・ドノバン単位（ＬＤＵ）として表現された寄生生物負荷）、ｐ．ｉ．１４日目に加えて、ｐ．ｉ．２８及び５８日目における増加した肝臓寄生生物負荷（図９Ａ）が見出された。しかし、以前に観察された通り、炎症促進性サイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦ及びＭＣＰ−１の増加は、ｐ．ｉ．１４日目に制限された（図９Ｂ）。次に、本発明者らは、観察された表現型に寄与した免疫細胞集団を同定しようと努力した。ドノバンリーシュマニア感染における宿主免疫応答におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の主要な役割を考慮して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ対照又はＢ６Ｎ．Ｎｋｇ７−ＫＯドナーのいずれかから、Ｒａｇ１−ＫＯマウスへと、ＣＤ４＋Ｔ細胞を移入した。Ｎｋｇ７欠乏がＣＤ４＋Ｔ細胞に制限された場合であっても、ｐ．ｉ．１４日目の肝臓における増加した寄生生物負荷が観察され、Ｎｋｇ７の非存在下での、寄生生物負荷の増悪へのその寄与を示唆する（図９Ｃ）。
【０１５４】
ＮＫＧ７の膜貫通予測
ＮＫＧ７は、膜貫通予測プログラムＴＭｐｒｅｄを使用して、膜貫通タンパク質であると確認された。ヒト（図６Ａ）及びマウス（図６Ｂ）タンパク質のためのＴＭｐｒｅｄからの予測は、細胞外側で発現される可能性がある、４つの膜貫通ヘリックス及び２つの細胞外ループの存在を示した。ＮＫＧ７タンパク質の予測されたモデルは、ＴＭｐｒｅｄによる予測と一貫し、ヒト及びマウスＮＫＧ７の両方で保存された２つの細胞外ループ（矢印で示される）を示した（図６Ｃ）。ヒトＮＫＧ７細胞外ループのアミノ酸配列は、配列番号１１及び１２に提示し、マウスＮＫＧ７細胞外ループのアミノ酸配列は、配列番号１３及び１４に提示する。
【０１５５】
Ｎｋｇ７欠乏は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗炎症性サイトカインインターロイキン（ＩＬ）−１０の上昇したレベルをもたらす
免疫刺激物質の文脈におけるＮｋｇ７欠乏の効果を決定するために、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（Ｂ６Ｎ；野生型）及びＢ６Ｎ．Ｎｋｇ７−／−−ＫＯマウスから脾臓単核細胞を単離し、精製モノクローナル抗マウス（α）−ＣＤ３＋α−ＣＤ２８＋組換え（ｒ）ＩＬ−２（Ｔｈ０条件）、リポ多糖（ＬＰＳ）又はＯＤＮ  １８２６（ＣｐＧ）のいずれかによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を２４時間実行した。微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）：ＬＰＳ及びＣｐＧによる刺激は、Ｂ６Ｎウェルと比較して、Ｂ６Ｎ．Ｎｋｇ７−／−ウェルから収集した上清における上昇したＩＬ−１０レベルをもたらした（図７）。
【０１５６】
Ｎｋｇ７欠乏は、転移増加を促進する
がんの文脈におけるＮｋｇ７の役割を調査するため、Ｂ１６Ｆ１０又はＬＷＴ１細胞のいずれかを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（Ｂ６Ｎ；野生型）及びＢ６Ｎ．Ｎｋｇ７−ＫＯマウスに移入した。Ｎｋｇ７欠乏は、両方のモデルにおける肺転移増加をもたらした（図１０Ａ）。これらのモデル内の転移の制御におけるＮＫ細胞の重要性を考慮し、Ｂ６Ｎ対照マウス又はＢ６Ｎ．Ｎｋｇ７−ＫＯマウスからＮＫ細胞を単離し、Ｒａｇ２γｃ−ＫＯマウスに移入した。Ｎｋｇ７欠乏がＮＫ細胞に制限された場合であっても、同じ表現型（ｐｈｅｎｏｐｔｙｐｅ）が観察され、Ｎｋｇ７の非存在での、転移増加におけるその役割を示唆する（図１０Ｂ）。Ｎｋｇ７欠乏は、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導性大腸炎における炎症を低下させる。
【０１５７】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（Ｂ６Ｎ；野生型）及びＢ６Ｎ．Ｎｋｇ７−ＫＯマウスに、ＤＳＳを含有する飲料水を６日間与えて、大腸炎を誘導した。症状の重症度（疾患活動性指標（ＤＡＩ）として報告）及び体重変化を毎日測定した。Ｂ６Ｎ．Ｎｋｇ７−ＫＯマウスは、野生型マウスと比較して、重症度の低い疾患及び減少した程度の体重減少を示した（図１１Ａ）。結腸の短縮は、炎症を示し、ＤＳＳの投与後７日目における結腸の長さの測定は、野生型マウスと比べて、Ｂ６Ｎ．Ｎｋｇ７−ＫＯマウスにおける少ない炎症を示した（図１１Ｂ）。結腸切片の組織学的解析も、Ｂ６Ｎ．Ｎｋｇ７−ＫＯマウスにおける少ない炎症を示し、腸管陰窩は、大部分はインタクトであることが観察され（図１１Ｃ）、切片は、より低い組織学的スコアを記録した（図１１Ｄ）。
【０１５８】
Ｂ６．Ｎｋｇ７−ｋｏマウスのプラスモディウム・ベルゲイＡＮＫＡ感染
炎症によって媒介される実験的脳性マラリア（ＥＣＭ）の発症により、プラスモディウム・ベルゲイＡＮＫＡ感染は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（Ｂ６Ｎ；野生型）マウスにおいて致死的である。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（Ｂ６Ｎ；野生型）及びＢ６Ｎ．Ｎｋｇ７−ＫＯマウスに、プラスモディウム・ベルゲイＡＮＫＡを感染させて、Ｎｋｇ７欠乏が、ＥＣＭに効果を有するか決定した。Ｂ６Ｎ．Ｎｋｇ７−ＫＯマウスは、増加した循環寄生赤血球細胞（ｐＲＢＣ）を有することが見出されたが（図１２Ａ）、このようなマウスは、野生型マウスと比較して、重症度の低いＥＣＭ症状を示した（ＥＣＭスコアとして報告；図１２Ｂ）。Ｂ６Ｎ．Ｎｋｇ７−ＫＯマウスはまた、最大でｐ．ｉ．１４日目まで生存したが、そのときに、貧血の症状を患っていたが、ＥＣＭではなかった（図１２Ｃ）。逆に、野生型マウスは、ｐ．ｉ．７〜８日目の間にＥＣＭに屈した。ルシフェラーゼ発現プラスモディウム・ベルゲイＡＮＫＡ寄生生物の使用は、バイオルミネセンスイメージングを使用した、全身及び脳の寄生生物負荷の測定を可能にした。Ｂ６Ｎ．Ｎｋｇ７−ＫＯマウスは、野生型マウスと比べて、減少した全身（図１２Ｄ）及び脳（図１２Ｅ）の寄生生物負荷を示した。
【０１５９】
要約
ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットは、ドノバンリーシュマニア感染におけるヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びマウス脾臓から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞における最も差次的に発現された遺伝子のうちの１つであるとＮＫＧ７を同定した。本開示は、Ｎｋｇ７プロモーターの下でＣＲＥを発現するマウスを含む、免疫標的としてのＮＫＧ７をさらに特徴付けるために必要とされるツールの作製について記載する。膜レポーターと交雑された、このＢ６．Ｎｋｇ７−ｃｒｅマウスは、定常状態において、また、ドノバンリーシュマニア感染及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の文脈において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方でＮｋｇ７を発現する免疫細胞の同定を可能にした。
【０１６０】
さらに、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＮＫＧ７発現のインデューサー及びサプレッサーが同定された。ＫＯＭＰリポジトリから得られたＮｋｇ７−ＫＯマウスを使用して、Ｎｋｇ７の損失が、ドノバンリーシュマニア感染において血液における有意に低下した濃度の炎症促進性サイトカインをもたらすことが実証された。
【０１６１】
当業者であれば、本開示の幅広い一般範囲から逸脱することなく、上述の実施形態に対して多数の変動及び／又は改変を為すことができることが認められるであろう。したがって、本実施形態は、あらゆる点で、制限的ではなく説明的として考慮されるべきである。
【０１６２】
本明細書に記述及び／又は参照されているあらゆる刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６３】
本願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＡＵ  ２０１８９０１６７７に対する優先権を主張する。
【０１６４】
本明細書に含まれた文書、行為（ａｃｔ）、材料、装置、物品その他に関するいかなる記述も、単に、本発明の文脈の提供を目的とする。これは、本願の各請求項の優先日の前に存在したため、これらの事項のいずれか又は全てが、先行技術の基礎の一部を形成する、又は本発明に関連する分野における共通一般知識であったことの承認として解釈されるべきではない。
【０１６５】
参考文献
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Krzywinski et al. (2009) Genome Res,19(9):1639-45
Ledford (2015) Nature, 522 (7554): 20-4
Ritchie et al. (2013) Nucleic AcidsResearch, 43(7):e47-e47
Robinson et al. (2010) Bioinformatics,26(1):139-140
Schmittgen et al. (2008) Nat Protoc,3(6):1101-1108
Szklarczyk et al. (2015) Nucleic Acids Res,43:447-452
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Zhang et al. (2014) Human MolecularGenetics, (R1): R40-6
【０１６６】
配列表の要点
配列番号１  −  ＮＫＧ７ポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号２  −  ＮＫＧ７核酸コード配列
配列番号３  −  ＮＫＧ７ポリペプチドアイソフォーム１のアミノ酸配列
配列番号４  −  ＮＫＧ７アイソフォーム１の核酸コード配列
配列番号５  −  ＮＫＧ７ポリペプチドバリアントのアミノ酸配列
配列番号６  −  ＮＫＧ７ポリペプチドバリアントの核酸コード配列
配列番号７  −  マウスのＮＫＧ７ポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号８  −  マウスのＮＫＧ７ポリペプチドの核酸コード配列
配列番号９  −  マウスのＮＫＧ７ポリペプチドバリアントのアミノ酸配列
配列番号１０  −  マウスのＮＫＧ７ポリペプチドバリアントの核酸コード配列
配列番号１１  −  細胞外ループ１の予測されるアミノ酸配列
配列番号１２  −  細胞外ループ２の予測されるアミノ酸配列
配列番号１３  −  マウスの細胞外ループ１の予測されるアミノ酸配列
配列番号１４  −  マウスの細胞外ループ２の予測されるアミノ酸配列
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−２Ｃ】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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