(57)【要約】本発明は、増強されたプロセシングのためにアレルゲンを免疫細胞に送達するために、ＬＡＭＰ内腔ドメインの特定の断片を含む改善されたＬＡＭＰ構築物を提供する。これらのＬＡＭＰ構築物は、疾患、特にアレルギー反応および／またはアレルギーの処置に使用され得る。改善されたＬＡＭＰ構築物は、被験体に投与されると、免疫反応の産生のために適切に構成された三次元エピトープの提示を可能にする。改善されたＬＡＭＰ構築物は多価分子であり得、および／または２つもしくはそれを超えるＬＡＭＰ構築物を含む多価ワクチンの一部として提供され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
改善されたＬＡＭＰ構築物であって、
ａ．ＬＡＭＰタンパク質のシステイン保存断片；および
ｂ．表１／図１４に記載されている少なくとも１つのアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）
を含む、改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項２】
ａ．アレルゲンＸ（配列番号Ｙ）が、前記システイン保存断片のＮ末端に配置されているか；
ｂ．アレルゲンＸ（配列番号Ｙ）が、単一のシステイン保存断片のＣ末端に配置されているか；または
ｃ．アレルゲンＸ（配列番号Ｙ）が、２つのシステイン保存断片の間に配置されている、請求項１に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項３】
表１／図１４のアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）の少なくとも１つを含み、好ましくは、ＩＬＣ−１、ＩＬＣ−２、ＩＬＣ−３、ＩＬＣ−４、ＩＬＣ−５またはＩＬＣ−６に示されているように構築されている、請求項１または請求項２のいずれかに記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項４】
各アレルゲンＸ（配列番号Ｙ）がリンカーにより分離されている、請求項３に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項５】
前記リンカーがアミノ酸配列ＧＰＧＰＧまたはＰＭＧＬＰから選択される、請求項４に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項６】
１つを超えるシステイン保存断片を含む、前述の請求項のいずれかに記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項７】
前記システイン保存断片がＬＡＭＰタンパク質の相同ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項８】
ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項９】
シグナル配列をさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項１０】
前記シグナル配列がＬＡＭＰタンパク質に由来する、請求項９に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項１１】
前記ＬＡＭＰタンパク質が、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ−３、ＬＩＭＰ２、Ｍａｃｒｏｓａｉｌｉｎ、Ｅｎｄｏｌｙｎ、ＬＡＭＰ５またはＬＩＭＢＩＣから選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項１２】
前記ＬＡＭＰタンパク質が配列番号１〜２５０のいずれか１つから選択され、および／または前記アレルゲンＸが配列番号Ｙのいずれか１つから選択される、請求項１１に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項１３】
前記ＬＡＭＰタンパク質が、配列番号１〜１１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり、および／または前記アレルゲンＸが、配列番号Ｙと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である、請求項１２に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物、請求項１４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１５に記載の宿主細胞を含む、組成物。
【請求項１７】
アレルギー反応の処置を必要とする被験体におけるアレルギー反応を処置する方法であって、被験体に、前記疾患または障害を軽減または処置するために十分な量で請求項１〜１３のいずれか一項に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物、請求項１４に記載のポリヌクレオチド、請求項１５に記載の宿主細胞または請求項１６に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
プライミング工程および少なくとも１回のブースティング工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物、請求項１４に記載のポリヌクレオチド、請求項１５に記載の宿主細胞または請求項１６に記載の組成物を前記プライミング工程で使用する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ブースティング工程が、アレルゲンＸ、改善されたＬＡＭＰ構築物、改善されたＬＡＭＰ構築物によりコードされるポリペプチド、または改善されたＬＡＭＰ構築物を含む細胞の投与を含む、請求項１８または１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
プライミングするために使用されるアレルゲンＸが、ブースティングするために使用されるのと同じものである、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
プライミングするために使用されるアレルゲンＸが、ブースティングするために使用される第２のアレルゲンＸと同じタンパク質に由来する、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
１つを超えるアレルゲンＸを使用してプライミングおよび／またはブースティングする、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アレルゲンを含む改善されたＬＡＭＰ構築物、ならびにアレルギー反応および／またはアレルギーを患っている被験体の処置におけるそれらの使用に関する。より具体的には、本発明は、ＤＮＡワクチンとして使用するための核酸、およびそれらを使用してアレルギー反応を患っているかまたはそれに対して感受性の被験体を処置する方法に関する。本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を利用するプライムブーストプロトコールも記載される。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の論議
以下の説明では、特定の物品および方法が背景および導入目的で記載される。ここに含まれるものは、先行技術の「承認」と解釈されるべきではない。本出願人は、適切な場合には、ここで参照されている物品および方法が、適用可能な法定条項下で先行技術を構成しないことを実証する権利を明示的に留保する。
【０００３】
アレルギー反応は、免疫系がアレルゲンと称される外来物資と反応してそれを無害にする際に起こる。例えば、食物アレルギーは、死に至る可能性のある全身性ショックであるアナフィラキシーの高いリスクにより、重要な公衆衛生課題である（Ｓａｍｐｓｏｎら、（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：３８０−３８４；Ｂｏｃｋら、（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：１９１−１９３）。幼児は、一般公衆よりも食物アレルギーを発症するリスクが高い（Ｌａｃｋら、（２００３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３４８：９７７−９８５；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、（１９８９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８３：７６４−７７０；Ｇｒｅｅｎら、（２００７）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １２０：１３０４−１３１０）。生後３年間に、子供の６〜８％が、食物により引き起こされるアレルギー反応を経験する（Ｂｏｃｋ（１９８７）Ａｌｌｅｒｇｙ  ４５：５８７−５９６；Ｂｕｒｋｓ  ａｎｄ  Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂ．Ｐｅｄｉａｔｒ．２３：２３０−２５２；Ｊａｎｓｅｎら、（１９９４）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３；２：４４６−４５６；Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３；５：７１７−７２８）。ナッツアレルギー、例えばピーナツおよびナッツアレルギーは人口の最大１〜２％に影響を及ぼし、食物アレルギーのこの発生率は一般集団で増加しており、アジア系民族のものに偏って影響を及ぼしていると考えられる。
【０００４】
アレルゲン、例えばナッツまたはピーナツへの曝露により引き起こされるアナフィラキシーは、ヒスタミンの過剰生成を特徴とする深刻な免疫反応をもたらし、米国における年間のアナフィラキシー救急外来受診の半数を占める。例えば、ナッツに対する極端な反応は、米国において毎年３０，０００件を超えるアナフィラキシーの発生および１００〜２００件の死亡をもたらす。微量のナッツは、ラベルが付されていない個別ブランドの数千の包装食料品において一般に見られる。１５０万人を超える米国人がナッツアレルギーの症候を患っており、多くの場合、症候は一生続く。多くは、微量の曝露で有害反応を経験する。
【０００５】
ナッツアレルギー症候を軽減するための処置はない。過去１０年間で、ナッツアレルギーの有病率は２倍になって、成人米国人の２％に影響を及ぼしている（Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３；５：７１７−７２８；Ｓｉｃｈｅｒｅｒら、（２００３）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１２：１２０３−１２０７）。花粉症およびブタクサ花粉のような多くの他のアレルギーの症候は致命的ではないが、ナッツアレルギー個体については、ナッツの１０００分の１ほどの少量の摂取が、アナフィラキシーショックおよび死亡を誘導し得る（Ｔａｙｌｏｒら、（２００２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９（１）：２４−３０；Ｗｅｎｓｉｎｇら、（２００２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１０（６）：９１５−９２０）。偶発的な摂取がアナフィラキシーをトリガーする事象では、エピネフリンの注射を使用して気道を広げる（Ｓｔａｒｋ  ａｎｄ  Ｓｕｌｌｉｖａｎ（１９８６）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７８：７６−８３；Ｓａｍｐｓｏｎ（２００３）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １１１（６）：１６０１−１６０８）。
【０００６】
個体が経口免疫寛容の獲得に失敗し、代わりに、その後のアレルゲン曝露に対して感作されると、食物アレルギーが起こる（Ｔｉｌｌら、（２００４）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３（６）：１０２５−１０３４）。アレルギー患者では、アレルゲンは、ほとんどのアレルギー症候の基礎となる炎症の組織化を助けるアレルギー促進性サイトカインインターロイキンＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を産生する２型ヘルパーＣＤ４＋Ｔリンパ球（Ｔｈ２）を優先的に活性化する（Ｗｏｏｄｆｏｌｋ（２００７）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１８（２）：２６０−２９４）。ＩＬ−４は、アレルゲン特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｅを分泌するように抗体産生Ｂ細胞に指令する（Ｄｅｌ  Ｐｒｅｔｅら、（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：４１９３−４１９８；Ｓｗａｉｎら、（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３７９６−３８０６）。中和ＩｇＧとは異なり、ＩｇＥは、マスト細胞および好酸球により発現されるその高親和性受容体Ｆｃ−εＲ１に結合し（Ｂｌａｎｋら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：１８７−１９０；Ｂｅｎｈａｍｏｕら、（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３０７１−３０７７）、これらの細胞を感作する。その後の曝露により、ＩｇＥは問題のアレルゲンに結合し、架橋し、シグナルを伝達して、脱顆粒してアレルギー反応をトリガーする揮発性化学物質を放出するようにマスト細胞に指令する。
【０００７】
食物アレルギーの他に、他の環境作用物資もまた、個体において上記アレルギー反応を生成し得る。このような環境作用物資の例としては、限定されないが、花粉、イヌのふけ、ネコの唾液またはイエダニが挙げられる。
【０００８】
寛容をもたらすための漸増用量のアレルゲンの投与である免疫療法は、アレルギー疾患の標準的な処置であるが、頻繁なアナフィラキシー反応により、ナッツアレルギーの処置について承認されていない（Ｎｅｌｓｏｎら、（１９９７）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９９；６：７４４−７５１；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒら、（１９９２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９０：２５６−２６２）。加えて、免疫療法の有用性は、最大３６カ月間の毎週または隔週注射を必要とする処置の長さにより制限され、様々な程度の成功およびコンプライアンスをもたらす（Ｂｏｕｓｑｕｅｔら、（１９９８）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０２：５５８−５６２；Ｒａｎｋ  ａｎｄ  Ｌｉ（２００７）Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．８２（９）：１１１９−１１２３；Ｃｉｐｒａｎｄｉら、（２００７）Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｐｒｏｃ．２８：４０−４３）。
【０００９】
ＤＮＡワクチンは、アレルギー疾患の処置として提案されている（Ｒａｚら、１９９６；Ｈａｒｔｌら、２００４；Ｈｓｕら、１９９６；Ｃｒａｍｅｒｉ  ２００７；Ｗｅｉｓｓら、２００６）。基礎となる理論的根拠は、ＤＮＡワクチンによりコードされるアレルゲンタンパク質が、特徴的なＴｈ２型応答、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の分泌ならびにＢリンパ球によるＩｇＥの形成ならびに後期反応における好酸球の成熟および動員ではなく、ＡＰＣ、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびＴ細胞によるインターフェロン産生を伴うアレルゲン特異的Ｔｈ１細胞応答を優先的に活性化するというものである。しかしながら、Ｔｈ１およびＴｈ２  Ｔ細胞表現型のディファレンシャルな誘導の基礎となる機構は、数多くの要因、例えばワクチン調製物の細菌ＤＮＡのユニークな特性、例えば非メチル化およびＣｐＧ  ＤＮＡ残基、自然免疫により誘発されるサイトカイン環境およびアレルゲンの細胞輸送特性が関与すると思われる（Ｃｈｅｎら、２００１；Ｋａｅｃｈら、２００２）。
【００１０】
ＤＮＡワクチンは、予防的および治療的ワクチンの両方の開発のための新たな有望な候補である。それらは安全であることが証明されており、臨床的利益を達成するためをワクチン接種の反復サイクルが必要である場合、ベクター骨格に対する免疫反応の欠如が決定的な利点であり得る。しかしながら、従来のＤＮＡワクチンの１つの認められる欠点は、ヒトにおけるそれらの低い免疫原性である。エピトープベースのＤＮＡワクチンの免疫原性における重要な制限工程は、Ｔ細胞へのＭＨＣ  ＩＩ提示経路に対するエピトープのアクセスであり得、これは、ターゲティング技術を用いないワクチンの場合には確率的プロセスである可能性が高い。
【００１１】
米国特許第５，６３３，２３４号には、改変インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）の抗原性ドメインと、抗原をその区画に有効にターゲティングする細胞質エンドソーム／リソソームターゲティングシグナルとを含むキメラタンパク質が記載されている。抗原性ドメインがプロセシングされ、それ由来のペプチドが、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に関連して細胞表面に提示された。ＬＡＭＰ−１の細胞質尾部を使用して、キメラタンパク質のエンドソーム／リソソームターゲティングドメインが形成された。
【００１２】
米国特許第８，３１８，１７３号は、これらの最初の観察結果を拡大して、ＬＡＭＰ−１の全内腔ドメインと膜貫通ドメインとの間に挿入されたＨＩＶ−１  Ｇａｇタンパク質を含むキメラタンパク質（およびこれらのタンパク質をコードする対応するＤＮＡ）が記載されている。この構築物は樹状細胞に導入され、次いで、ＭＨＣ  ＩＩ経路をターゲティングすることが報告されている。
【００１３】
このアプローチは、いくつかのウイルス抗原、ヒトパピローマウイルスＥ７、デングウイルス膜タンパク質、ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０膜タンパク質、ＨＩＶ−１  ｐ５５  Ｇａｇ、西ナイル膜タンパク質、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質およびサイトメガロウイルスｐｐ６５に対する細胞性および体液性応答の増加に有用であることが証明されている（例えば、Ｂｏｎｉｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５２５０−５２５７，２００１を参照のこと）。増強された免疫反応は、ＬＡＭＰおよびＭＨＣ  ＩＩの共局在化、ならびに抗原ペプチドのより効率的なプロセシングおよび送達に起因し得る。加えて、ＬＡＭＰターゲティングは、増加した数の免疫原性エピトープの提示をもたらして、非標的抗原と比較して定性的に幅広い免疫反応を誘導することが報告されている。例えばＦｅｒｎａｎｄｅｓら、２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０（８）：２３３３−４３では、ワクシニアベクターにコードされるＬＡＭＰ輸送ＯＶＡ抗原の提示ペプチドの数の増加が実証された。外因供給ＯＶＡから生成された１２個のペプチドのうち、９個がＯＶＡ／ＬＡＭＰキメラにより提示されたが、それと比較して、ＬＡＭＰを含まない構築物では２個のみであった。
【００１４】
ＬＡＭＰの細胞質ドメインが（シグナル配列および膜貫通ドメインと共に）必要であることが決定されているが、すべての抗原のエンドソーム／リソソーム輸送に対して常に十分ではない。代わりに、ＬＡＭＰの全内腔ドメインもまた、リソソーム小胞経路へのタンパク質の輸送に必要であることが示されている。
【００１５】
しかしながら、ＬＡＭＰの完全内腔ドメインおよび完全膜貫通／細胞質尾部（「完全ＬＡＭＰ構築物」）が存在する場合であっても、特定の抗原が免疫反応を生じさせる効果は、これらの構造物で使用される特定の配列に高度に依存することがますます見出されている。実際、同じタンパク質の異なる抗原断片は、完全ＬＡＭＰ構築物に挿入された場合、同じ免疫反応を誘発しないこと見出されている。時々、抗原断片は免疫反応を生成するが、他の場合にはそれは生じさせない。これらの観察結果は、完全ＬＡＭＰ構築物で、目的のタンパク質由来のどの特定の抗原配列が免疫反応を生じさせるかを事前に予測する能力を困難にする。
【００１６】
また、完全ＬＡＭＰ構築物の生成では、全内腔ドメインは、抗原を適切に発現およびプロセシングするために必要であることが繰り返し観察されている。例えば、Ｇｏｄｉｎｈｏら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（６）：９（６）：ｅ９９８８７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９９８８７では、著者らは、完全およびインタクトな内腔ドメインが、抗原をリソソームにターゲティングするために必要な最小領域であり、内腔ドメインの断片は機能しなかったことを報告した。同６ページを参照のこと。
【００１７】
具体的には、Ｇｏｄｉｎｈｏらは、第１の内腔ドメインおよびいくつかの第２の内腔ドメインを完全に除去することにより（すなわち、Ｔ１−Ｌｕｍ／ｇａｇ構築物）、タンパク質発現および抗体反応の両方が減少することを示した。同様に、第１の内腔ドメインの２５％を除去するが第２の内腔ドメインをインタクトとすることにより（すなわち、Ｔ２−ｌｕｍ／ｇａｇ）、タンパク質発現および抗体反応の両方が比較的増加したが、依然として、完全ＬＡＭＰ構築物で得られた結果未満であった。
また、著者らは、免疫反応を生じさせる能力が、特定の抗原と、これらの完全ＬＡＭＰ構築物で使用されるエピトープとに依存することを確認した。例えば、９ページの２列目では、著者らは、「したがって、以前の研究では、ＶＬＰとしてまたは可溶性形態で分泌されるＧａｇを生成するＤＮＡワクチンが、異なるレベルのＴおよびＢ細胞活性化を誘導することが実証され、これは細胞質Ｇａｇにより誘導される反応とは異なる」と述べている。また、文献に記載されているようにＬＡＭＰの全内腔ドメインとＬＡＭＰの全膜貫通／細胞質ドメインとの間への抗原性配列の挿入は、過大なコストにより商業レベルで生産することができないか、または科学的な観点から非現実的になり得る大きなポリヌクレオチド配列をもたらし得る
したがって、例えば、アレルギー反応および／またはアレルギーを有効に処置するためのワクチンとして使用され得る新たな改善されたＬＡＭＰ構築物を設計する必要がある。また、改善されたら、これらの新たなＬＡＭＰ構築物は、本明細書に記載されるアレルゲンに対する抗体を生成するために使用され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第５，６３３，２３４号明細書
【特許文献２】米国特許第８，３１８，１７３号明細書
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｓａｍｐｓｏｎら、（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：３８０−３８４
【非特許文献２】Ｂｏｃｋら、（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：１９１−１９３
【非特許文献３】Ｌａｃｋら、（２００３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３４８：９７７−９８５
【非特許文献４】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、（１９８９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８３：７６４−７７０
【非特許文献５】Ｇｒｅｅｎら、（２００７）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １２０：１３０４−１３１０
【非特許文献６】Ｂｏｃｋ（１９８７）Ａｌｌｅｒｇｙ  ４５：５８７−５９６
【非特許文献７】Ｂｕｒｋｓ  ａｎｄ  Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂ．Ｐｅｄｉａｔｒ．２３：２３０−２５２
【非特許文献８】Ｊａｎｓｅｎら、（１９９４）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３；２：４４６−４５６
【非特許文献９】Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３；５：７１７−７２８
【非特許文献１０】Ｓｉｃｈｅｒｅｒら、（２００３）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１２：１２０３−１２０７
【非特許文献１１】Ｔａｙｌｏｒら、（２００２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９（１）：２４−３０
【非特許文献１２】Ｗｅｎｓｉｎｇら、（２００２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１０（６）：９１５−９２０
【非特許文献１３】Ｓｔａｒｋ  ａｎｄ  Ｓｕｌｌｉｖａｎ（１９８６）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７８：７６−８３
【非特許文献１４】Ｓａｍｐｓｏｎ（２００３）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １１１（６）：１６０１−１６０８
【非特許文献１５】Ｔｉｌｌら、（２００４）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３（６）：１０２５−１０３４
【非特許文献１６】Ｗｏｏｄｆｏｌｋ（２００７）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１８（２）：２６０−２９４
【非特許文献１７】Ｄｅｌ  Ｐｒｅｔｅら、（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：４１９３−４１９８
【非特許文献１８】Ｓｗａｉｎら、（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３７９６−３８０６
【非特許文献１９】Ｂｌａｎｋら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：１８７−１９０
【非特許文献２０】Ｂｅｎｈａｍｏｕら、（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３０７１−３０７７
【非特許文献２１】Ｎｅｌｓｏｎら、（１９９７）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９９；６：７４４−７５１
【非特許文献２２】Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒら、（１９９２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９０：２５６−２６２
【非特許文献２３】Ｂｏｕｓｑｕｅｔら、（１９９８）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０２：５５８−５６２
【非特許文献２４】Ｒａｎｋ  ａｎｄ  Ｌｉ（２００７）Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．８２（９）：１１１９−１１２３
【非特許文献２５】Ｃｉｐｒａｎｄｉら、（２００７）Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｐｒｏｃ．２８：４０−４３
【非特許文献２６】Ｂｏｎｉｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５２５０−５２５７，２００１
【非特許文献２７】Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０（８）：２３３３−４３
【非特許文献２８】Ｇｏｄｉｎｈｏら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（６）：９（６）：ｅ９９８８７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９９８８７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
発明の概要
この概要は、詳細な説明で以下にさらに記載される簡易形態の選択された概念を紹介するために提供されている。この概要は、特許請求される主題の重要なまたは本質的な特徴を特定することを意図しておらず、特許請求される主題の範囲を制限するために使用されることも意図していない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、有用性および利点は添付の図面に例示され、添付の特許請求の範囲で定義される態様を含む以下に記載の詳細な説明から明らかになる。
【００２１】
本発明の目的は、本明細書で詳述されるアレルゲンを免疫系に有効に提示して、増強された免疫反応を生成するＬＡＭＰドメインの特定の断片および／または変異体を含む新規構築物（「改善されたＬＡＭＰ構築物」）を提供することである。ヘルパーＴ細胞が優先的に刺激され、および／または抗体が生成されるように、これらの改善されたＬＡＭＰ構築物は、アレルゲンを、それらがプロセシングされて主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に提示されるリソソーム／エンドソーム区画に有効に指向させる。
【００２２】
本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物および方法は、被験体において免疫反応を誘発し得る。免疫反応は、改善されたＬＡＭＰ構築物（例えば、ワクチン）中のアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）のエピトープに対する免疫反応であり得る。免疫系が、被験体におけるワクチンのアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）を含むものを検出および破壊し得るように、ワクチンは被験体の免疫系を作動可能にする。本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物および方法は、被験体においてＴｈ１免疫反応を誘発し得る。Ｔｈ１免疫反応は、免疫細胞のサブセット（例えば、アレルゲン特異的Ｔ細胞）による炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）の分泌を含み得る。
【００２３】
いくつかの場合では、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物および方法で使用されるアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）は、被験体の免疫系により認識されてＴｈ１免疫反応を誘発し、タイプＩサイトカインを放出し得る。Ｔｈ１応答は、エピトープとＴ細胞、より具体的にはＴ細胞により発現される主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）との間の相互作用により開始され得る。例えば、エピトープのＭＨＣ受容体への高親和性結合は、Ｔｈ１応答を刺激し得る。ＭＨＣ受容体は、複数のタイプのＭＨＣ受容体のうちの少なくとも１つであり得る。Ｔ細胞が係合するＭＨＣ受容体は、集団における個体で変動し得る。
【００２４】
いくつかの場合では、免疫反応はタイプ１免疫反応である。いくつかの場合では、免疫反応は、タイプＩサイトカイン産生とタイプＩＩサイトカイン産生との比が１を超えることを特徴とする。いくつかの場合では、免疫反応は、タイプＩサイトカイン産生とタイプＩＩサイトカイン産生との比が１未満であることを特徴とする。いくつかの場合では、免疫反応は、ＩＦＮγ産生とＩＬ−１０産生との比が１を超えることを特徴とする。いくつかの場合では、免疫反応は、ＩＦＮγ産生とＩＬ−１０産生との比が１未満であることを特徴とする。
【００２５】
プライムブーストプロトコールも企図される。例えば、本発明はさらに、被験体においてアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）に対する免疫反応を生成するための方法であって、本明細書に記載されるアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）を含む改善されたＬＡＭＰ構築物で前記被験体をプライミングし、続いて、前記アレルゲンまたは関連アレルゲン（例えば、同じまたは非常に類似のタンパク質配列に由来する第２のアレルゲン）で前記被験体を少なくとも１回ブースティングすることを含む方法を提供する。アレルゲンの混合物は、プライミングおよびブースティング工程のいずれかまたは両方で使用され得る。プライム工程およびそれに続くアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）ブースト工程のための改善されたＬＡＭＰ構築物の使用は、より高い力価を有意にもたらすことが示されているが、これは、抗体反応の増強におけるＬＡＭＰの力を示している。
【００２６】
本発明はさらに、本明細書に記載されるアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）を含む改善されたＬＡＭＰ構築物のいずれかをコードする核酸分子を提供する。改善されたＬＡＭＰ構築物は、核酸分子が発現制御配列に作動可能に連結された核酸を含み得る。好ましい一態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、患者をワクチン接種するために適切なワクチンベクターである。別の態様では、本発明は、アレルゲンをコードする核酸分子を細胞に導入を容易にするための改善されたＬＡＭＰ構築物を含む送達ビヒクルを提供する。送達ビヒクルは、脂質ベース（例えば、リポソーム製剤）、ウイルスベース（例えば、核酸分子をカプセル化するウイルスタンパク質を含む）または細胞ベースであり得る。
【００２７】
好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物においてアレルゲンに対する免疫反応（例えば、抗体の生成）を誘発するための注射用組成物であって、目的のアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）を含む改善されたＬＡＭＰ構築物を含む注射用組成物を提供する。好ましい実施形態では、このワクチンは、Ｔｈ２応答に対して優先的なＴｈ１応答を生成する。改善されたＬＡＭＰ構築物は、本明細書に記載されるアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）の少なくとも１つのエピトープを含む。
【００２８】
本発明はまた、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物のいずれかを含む細胞を提供する。一態様では、細胞は抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞など）または操作された抗原提示細胞（例えば、抗原提示に必要な分子、例えばＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するように操作された非プロフェッショナル抗原提示細胞）であり得る。抗原提示に必要な分子は、他の細胞、例えば、天然に存在する細胞に由来し得るか、またはそれ自体が操作されたもの（例えば、所望の特性、例えばアレルゲン性エピトープに対すより高いまたはより低いる親和性を発現するように突然変異または改変されたもの）であり得る。一態様では、抗原提示細胞は、いかなる共刺激シグナルも発現しない。
【００２９】
本発明はさらに、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物のいずれかを含む複数の細胞を含むキットを提供する。細胞の少なくとも２つは、異なるＭＨＣクラスＩＩ分子を発現し、各細胞は同じＬＡＭＰ構築物を含む。一態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物と、ベクターを受容するための細胞とを含むキットが提供される。
【００３０】
本発明はまた、本明細書に記載される細胞の少なくとも１つおよび／または改善されたＬＡＭＰ構築物の少なくとも１つを含むトランスジェニック動物を提供する。本発明はまた、本明細書に記載される細胞の少なくとも１つを含むトランスジェニック動物を提供する。
【００３１】
本発明はさらに、動物（例えば、ヒトまたは非ヒト脊椎動物）においてアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）に対する免疫反応を生成するための方法であって、前記動物に上記細胞を投与することを含み、前記細胞が、前記動物において、前記改善されたＬＡＭＰ構築物を発現するかまたは発現するように誘導され得る方法を提供する。一態様では、動物が、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対する免疫反応を生成しないように、細胞は、動物のＭＨＣタンパク質と適合するＭＨＣクラスＩＩ分子を含む。好ましい一態様では、動物はヒトである。
【００３２】
さらなる一態様では、本発明は、アレルゲンＸ（配列番号Ｙ）に対する免疫反応を誘発するための方法であって、ヒトまたは非ヒト脊椎動物などの動物に、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物のいずれかを投与することを含む方法を提供する。好ましくは、改善されたＬＡＭＰ構築物は、動物の細胞に対して感染性である。例えば、改善されたＬＡＭＰ構築物は、ワクシニア改善型ＬＡＭＰ構築物などのウイルスベクターであり得る。
【００３３】
例えば、本発明はさらに、動物においてアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）に対する免疫反応を生成するための方法であって、本明細書に記載されるアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）を含む改善されたＬＡＭＰ構築物で前記動物をプライミングし、続いて、前記動物を少なくとも１回ブースティングすることを含む方法を提供する。プライム工程およびそれに続くアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）のブースト工程のための改善されたＬＡＭＰ構築物の使用は、より高い力価を有意にもたらすことが示されているが、これは、抗体反応の増強におけるＬＡＭＰの力を示している。
【００３４】
さらなる態様では、細胞は患者から得られ、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物が細胞に導入され、細胞または細胞の子孫が患者内に再導入される。一態様では、細胞は、抗原提示細胞に分化し得る幹細胞である。ヒト患者の処置および獣医学的使用が特に企図される。
【００３５】
具体的には、目的のアレルゲンの提示をＬＡＭＰと組み合わせることにより、次いで、アレルゲンは、アレルゲンがプロセシングされ得、それ由来のペプチドが、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に関連して細胞表面に提示される細胞質エンドソーム／リソソーム区画に効率的に輸送される。
【００３６】
これらのおよび他の態様、目的および特徴は、以下により詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
本発明の目的および特徴は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照してよりよく理解され得る。
【００３８】
【図１】図１は、本明細書に記載されるように使用され得る異なるタイプの改善されたＬＡＭＰ構築物（ＩＬＣ−１、ＩＬＣ−２、ＩＬＣ−３、ＩＬＣ−４、ＩＬＣ−５およびＩＬＣ−６として識別される）の一般図を示す。
【００３９】
【図２Ａ−１】図２Ｂは、本明細書で定義されるＬＡＭＰタンパク質のドメインを示し、図２Ａは、ヒトＬＡＭＰ−１（配列番号１）、ヒトＬＡＭＰ−２（配列番号２）、ヒトＬＡＭＰ−３（配列番号３）、ヒトＬＩＭＰ−２（配列番号４）、ヒトＥｎｄｏｌｙｎ（配列番号５）、ヒトＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎ（配列番号８０）、ヒトＬＡＭＰ−５（配列番号９３）およびヒトＬＩＭＢＩＣ（配列番号６７）のこれらのドメインの特定のアミノ酸境界を規定する図である。本明細書に記載されるように、ＬＡＭＰ内腔ドメイン、相同ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質尾部およびシグナル配列を使用して、改善されたＬＡＭＰ構築物ＩＬＣ−１、ＩＬＣ−２、ＩＬＣ−３、ＩＬＣ−４、ＩＬＣ−５およびＩＬＣ−６を生成し得る。
【図２Ａ−２】図２Ｂは、本明細書で定義されるＬＡＭＰタンパク質のドメインを示し、図２Ａは、ヒトＬＡＭＰ−１（配列番号１）、ヒトＬＡＭＰ−２（配列番号２）、ヒトＬＡＭＰ−３（配列番号３）、ヒトＬＩＭＰ−２（配列番号４）、ヒトＥｎｄｏｌｙｎ（配列番号５）、ヒトＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎ（配列番号８０）、ヒトＬＡＭＰ−５（配列番号９３）およびヒトＬＩＭＢＩＣ（配列番号６７）のこれらのドメインの特定のアミノ酸境界を規定する図である。本明細書に記載されるように、ＬＡＭＰ内腔ドメイン、相同ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質尾部およびシグナル配列を使用して、改善されたＬＡＭＰ構築物ＩＬＣ−１、ＩＬＣ−２、ＩＬＣ−３、ＩＬＣ−４、ＩＬＣ−５およびＩＬＣ−６を生成し得る。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本明細書で定義されるＬＡＭＰタンパク質のドメインを示し、図２Ａは、ヒトＬＡＭＰ−１（配列番号１）、ヒトＬＡＭＰ−２（配列番号２）、ヒトＬＡＭＰ−３（配列番号３）、ヒトＬＩＭＰ−２（配列番号４）、ヒトＥｎｄｏｌｙｎ（配列番号５）、ヒトＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎ（配列番号８０）、ヒトＬＡＭＰ−５（配列番号９３）およびヒトＬＩＭＢＩＣ（配列番号６７）のこれらのドメインの特定のアミノ酸境界を規定する図である。本明細書に記載されるように、ＬＡＭＰ内腔ドメイン、相同ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質尾部およびシグナル配列を使用して、改善されたＬＡＭＰ構築物ＩＬＣ−１、ＩＬＣ−２、ＩＬＣ−３、ＩＬＣ−４、ＩＬＣ−５およびＩＬＣ−６を生成し得る。
【００４０】
【図３−１】図３は、ヒトＬＡＭＰ−１（配列番号１）と比較した、他の種に見られるＬＡＭＰ−１タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図３でヒトＬＡＭＰ−１について識別されているドメインを、図３に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図３−２】図３は、ヒトＬＡＭＰ−１（配列番号１）と比較した、他の種に見られるＬＡＭＰ−１タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図３でヒトＬＡＭＰ−１について識別されているドメインを、図３に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図３−３】図３は、ヒトＬＡＭＰ−１（配列番号１）と比較した、他の種に見られるＬＡＭＰ−１タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図３でヒトＬＡＭＰ−１について識別されているドメインを、図３に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図３−４】図３は、ヒトＬＡＭＰ−１（配列番号１）と比較した、他の種に見られるＬＡＭＰ−１タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図３でヒトＬＡＭＰ−１について識別されているドメインを、図３に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図３−５】図３は、ヒトＬＡＭＰ−１（配列番号１）と比較した、他の種に見られるＬＡＭＰ−１タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図３でヒトＬＡＭＰ−１について識別されているドメインを、図３に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【００４１】
【図４−１】図４は、ヒトＬＡＭＰ−２（配列番号２）と比較した、他の種に見られるＬＡＭＰ−２タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図４でヒトＬＡＭＰ−２について識別されているドメインを、図４に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図４−２】図４は、ヒトＬＡＭＰ−２（配列番号２）と比較した、他の種に見られるＬＡＭＰ−２タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図４でヒトＬＡＭＰ−２について識別されているドメインを、図４に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図４−３】図４は、ヒトＬＡＭＰ−２（配列番号２）と比較した、他の種に見られるＬＡＭＰ−２タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図４でヒトＬＡＭＰ−２について識別されているドメインを、図４に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図４−４】図４は、ヒトＬＡＭＰ−２（配列番号２）と比較した、他の種に見られるＬＡＭＰ−２タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図４でヒトＬＡＭＰ−２について識別されているドメインを、図４に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図４−５】図４は、ヒトＬＡＭＰ−２（配列番号２）と比較した、他の種に見られるＬＡＭＰ−２タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図４でヒトＬＡＭＰ−２について識別されているドメインを、図４に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図４−６】図４は、ヒトＬＡＭＰ−２（配列番号２）と比較した、他の種に見られるＬＡＭＰ−２タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図４でヒトＬＡＭＰ−２について識別されているドメインを、図４に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【００４２】
【図５−１】図５は、ヒトＬＡＭＰ−３（配列番号３）と比較した、他の種に見られるＬＡＭＰ−３タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図５でヒトＬＡＭＰ−３について識別されているドメインを、図５に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図５−２】図５は、ヒトＬＡＭＰ−３（配列番号３）と比較した、他の種に見られるＬＡＭＰ−３タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図５でヒトＬＡＭＰ−３について識別されているドメインを、図５に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図５−３】図５は、ヒトＬＡＭＰ−３（配列番号３）と比較した、他の種に見られるＬＡＭＰ−３タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図５でヒトＬＡＭＰ−３について識別されているドメインを、図５に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【００４３】
【図６−１】図６は、ヒトＬＩＭＰ−２（配列番号４）と比較した、他の種に見られるＬＩＭＰ−２タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図６でヒトＬＩＭＰ−２について識別されているドメインを、図６に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図６−２】図６は、ヒトＬＩＭＰ−２（配列番号４）と比較した、他の種に見られるＬＩＭＰ−２タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図６でヒトＬＩＭＰ−２について識別されているドメインを、図６に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図６−３】図６は、ヒトＬＩＭＰ−２（配列番号４）と比較した、他の種に見られるＬＩＭＰ−２タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図６でヒトＬＩＭＰ−２について識別されているドメインを、図６に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図６−４】図６は、ヒトＬＩＭＰ−２（配列番号４）と比較した、他の種に見られるＬＩＭＰ−２タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図６でヒトＬＩＭＰ−２について識別されているドメインを、図６に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【００４４】
【図７−１】図７は、ヒトＬＩＭＢＩＣ（配列番号６７）と比較した、他の種に見られるＬＩＭＢＩＣタンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図７でヒトＬＩＭＢＩＣについて識別されているドメインを、図７に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図７−２】図７は、ヒトＬＩＭＢＩＣ（配列番号６７）と比較した、他の種に見られるＬＩＭＢＩＣタンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図７でヒトＬＩＭＢＩＣについて識別されているドメインを、図７に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図７−３】図７は、ヒトＬＩＭＢＩＣ（配列番号６７）と比較した、他の種に見られるＬＩＭＢＩＣタンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図７でヒトＬＩＭＢＩＣについて識別されているドメインを、図７に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図７−４】図７は、ヒトＬＩＭＢＩＣ（配列番号６７）と比較した、他の種に見られるＬＩＭＢＩＣタンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図７でヒトＬＩＭＢＩＣについて識別されているドメインを、図７に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【００４５】
【図８−１】図８は、ヒトＥｎｄｏｌｙｎ（配列番号５）と比較した、他の種に見られるＥｎｄｏｌｙｎタンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図８でヒトＥｎｄｏｌｙｎについて識別されているドメインを、図８に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図８−２】図８は、ヒトＥｎｄｏｌｙｎ（配列番号５）と比較した、他の種に見られるＥｎｄｏｌｙｎタンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図８でヒトＥｎｄｏｌｙｎについて識別されているドメインを、図８に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【００４６】
【図９−１】図９は、ヒトＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎ（配列番号８０）と比較した、他の種に見られるＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎタンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図９でヒトＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎについて識別されているドメインを、図９に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図９−２】図９は、ヒトＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎ（配列番号８０）と比較した、他の種に見られるＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎタンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図９でヒトＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎについて識別されているドメインを、図９に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図９−３】図９は、ヒトＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎ（配列番号８０）と比較した、他の種に見られるＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎタンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図９でヒトＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎについて識別されているドメインを、図９に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【００４７】
【図１０−１】図１０は、ヒトＬＡＭＰ−５（配列番号９３）と比較した、他の種に見られるＬＡＭＰ−５タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図１０でヒトＬＡＭＰ−５について識別されているドメインを、図１０に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【図１０−２】図１０は、ヒトＬＡＭＰ−５（配列番号９３）と比較した、他の種に見られるＬＡＭＰ−５タンパク質のアラインメントを提供する。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用され得、図２および図１０でヒトＬＡＭＰ−５について識別されているドメインを、図１０に示されているアラインメントと比較することにより容易に識別可能である。
【００４８】
【図１１】図１１は、０、７および１４日目に、ＨＶＥＭ−ＬＡＭＰ、ＨＶＥＭまたはＬＡＭＰでマウスを免疫化した場合に得られた結果を示す。２８日目に、マウスを採血し、血清サンプルを単離した。ＥＬＩＳＡにより、ＨＶＥＭ特異的ＩｇＧを調べた。データは、抗体力価の幾何平均±幾何ＳＤを表す、ｎ＝６、＊＊ｐ値＜０．０１。
【００４９】
【図１２】図１２は、０、７および１４日目に、ＨＶＥＭ−ＬＡＭＰ、ＨＶＥＭまたはＬＡＭＰでマウスを免疫化した場合に得られた結果を示す。３５日目に、ミョウバンアジュバントの存在下、５μｇのＨＶＥＭタンパク質でマウスをブーストした。４９日目に、マウスを採血し、血清サンプルを単離した。ＥＬＩＳＡにより、ＨＶＥＭ特異的ＩｇＧを調べた。データは、抗体力価の幾何平均±幾何ＳＤを表す、ｎ＝６、＊＊＊ｐ値＜０．００１、＊＊＊＊ｐ値＜０．０００１。
【００５０】
【図１３−１】図１３は、ＬＡＭＰが、ＨＶＥＭのＣＲＤ３／４におけるエピトープの結合親和性を変化させることを示す。
【図１３−２】図１３は、ＬＡＭＰが、ＨＶＥＭのＣＲＤ３／４におけるエピトープの結合親和性を変化させることを示す。
【００５１】
【図１４−１】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【図１４−２】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【図１４−３】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【図１４−４】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【図１４−５】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【図１４−６】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【図１４−７】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【図１４−８】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【図１４−９】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【図１４−１０】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【図１４−１１】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【図１４−１２】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【図１４−１３】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【図１４−１４】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【図１４−１５】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【図１４−１６】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【図１４−１７】図１４は、表１／図１４として提供されるように、本明細書に記載される様々な構築物の概略図である。
【００５２】
【図１５Ａ】図１５Ａおよび図１５Ｂは、異なるＬＡＭＰ構築物から発現されたアレルゲンＡｍｂ  ａ  １、Ｂｅｔ  ｖ  １、Ｆｅｌ  ｄ  ４のウエスタンブロットであり、図１５Ｃは、アレルゲンＣｒｙ  Ｊ  １／Ｃｒｙ  Ｊ  ２のウエスタンブロットである。抗ＬＡＭＰ抗体を用いて、各アレルゲンのタンパク質発現を実証した（図１５Ａおよび図１５Ｃ）。ＧＡＰＤＨ検出を使用して、レーン間の等しいローディングを実証した（図１５Ｂ）。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび図１５Ｂは、異なるＬＡＭＰ構築物から発現されたアレルゲンＡｍｂ  ａ  １、Ｂｅｔ  ｖ  １、Ｆｅｌ  ｄ  ４のウエスタンブロットであり、図１５Ｃは、アレルゲンＣｒｙ  Ｊ  １／Ｃｒｙ  Ｊ  ２のウエスタンブロットである。抗ＬＡＭＰ抗体を用いて、各アレルゲンのタンパク質発現を実証した（図１５Ａおよび図１５Ｃ）。ＧＡＰＤＨ検出を使用して、レーン間の等しいローディングを実証した（図１５Ｂ）。
【図１５Ｃ】図１５Ａおよび図１５Ｂは、異なるＬＡＭＰ構築物から発現されたアレルゲンＡｍｂ  ａ  １、Ｂｅｔ  ｖ  １、Ｆｅｌ  ｄ  ４のウエスタンブロットであり、図１５Ｃは、アレルゲンＣｒｙ  Ｊ  １／Ｃｒｙ  Ｊ  ２のウエスタンブロットである。抗ＬＡＭＰ抗体を用いて、各アレルゲンのタンパク質発現を実証した（図１５Ａおよび図１５Ｃ）。ＧＡＰＤＨ検出を使用して、レーン間の等しいローディングを実証した（図１５Ｂ）。
【００５３】
【図１６】図１６は、Ａｍｂ  ａ  １特異的ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【００５４】
【図１７】図１７は、Ｂｅｔ  ｖ  １特異的ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【００５５】
【図１８】図１８は、Ｆｅｌ  ｄ  ４特異的ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【００５６】
【図１９】図１９は、Ｃｒｙ  Ｊ  １特異的ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
詳細な説明
本発明は、ワクチンを生成するために使用され得る改善されたＬＡＭＰ構築物を提供する。改善されたＬＡＭＰ構築物は、免疫反応をモジュレートまたは増強するために使用され得る。好ましい一態様では、本発明は、本明細書に記載されるアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）の１つまたはそれよりも多くを含む改善されたＬＡＭＰ構築物を提供することにより、アレルギーおよび／またはアレルギー反応を有する患者を処置するための方法を提供する。
【００５８】
定義
以下の定義は、以下の説明で使用される特定の用語について提供される。
【００５９】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」いう単数形は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数の言及を含む。例えば、「細胞」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。「核酸分子」という用語は、複数の核酸分子を含む。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、改善されたＬＡＭＰ構築物および方法が、記載されているエレメントを含むが、他のエレメントを除外しないことを意味することを意図する。「から本質的になる」は、改善されたＬＡＭＰ構築物および方法を規定するために使用される場合、組み合わせにとって任意の本質的重要性の他のエレメントを除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義されるエレメントから本質的になる改善されたＬＡＭＰ構築物は、単離および精製方法からの微量混入物質、ならびに薬学的に許容され得る担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、保存剤などを除外しない。「からなる」は、微量を超える他の成分と、本発明の改善されたＬＡＭＰ構築物を投与するための実質的な方法工程とを除外することを意味するものとする。これらの各移行用語により定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００６１】
「約」または「およそ」という用語は、当業者により決定された場合に特定の値の許容可能な範囲内であることを意味し、これは、値の測定または決定方法、例えば測定系の限界に部分的に依存するであろう。例えば、「約」は、所定の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、さらにより好ましくは最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的系またはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特に記述がない限り、「約」という用語は、特定の値の許容可能な誤差範囲内、例えば±１〜２０％、好ましくは±１〜１０％、より好ましくは±１〜５％を意味する。
【００６２】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各中間値と、その記述されている範囲内の任意の他の記述値または中間値が本発明に含まれることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は独立して、より小さな範囲内に含まれ得、また、記述されている範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として本発明内に包含される。記述されている範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる両方の限界のいずれかを除外した範囲も本発明に含まれる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「リソソーム／エンドソーム区画」は、膜にＬＡＭＰ分子を含む膜結合酸性液胞、抗原プロセシングで機能する加水分解酵素、ならびに抗原認識および提示のためのＭＨＣクラスＩＩ分子を指す。この区画は、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシスおよびピノサイトーシスを含む様々な機構のいずれかにより細胞表面から内在化された異物、ならびに特殊な自己分解現象によりこの区画に送達される細胞内物質の分解部位として機能する（ｄｅ  Ｄｕｖｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７：３９１，１９８３）。本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「エンドソーム」という用語は、リソソームを包含する。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「リソソーム関連オルガネラ」は、リソソームを含む任意のオルガネラを指し、限定されないが、ＭＩＩＣ、ＣＩＩＶ、メラノソーム、分泌顆粒、溶解顆粒、血小板高密度顆粒、好塩基球顆粒、ビルベック顆粒、ファゴリソソーム、分泌リソソームなどを含む。好ましくは、このようなオルガネラは、マンノース６−リン酸受容体を欠き、ＬＡＭＰを含むが、ＭＨＣクラスＩＩ分子を含んでもよいしまたは含まなくてもよい。総説については、例えば、Ｂｌｏｔｔ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００２；Ｄｅｌｌ’Ａｎｇｅｌｉｃａら、Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４：１２６５−１２７８，２０００を参照のこと。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそれらの類似体を含み得る。ヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、公知または未知の任意の機能を果たし得る。「ポリヌクレオチド」という用語は、例えば、一本鎖、二本鎖および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス分子、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、アプタマー、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーを含む。核酸分子はまた、改変核酸分子（例えば、改変塩基、糖および／またはヌクレオチド間リンカーを含む）を含み得る。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、２つまたはそれを超えるサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド模倣物の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合または他の結合（例えば、エステル、エーテルなど）により連結され得る。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸を指す。３つまたはそれを超えるアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短い場合、一般にオリゴペプチドと称される。ペプチド鎖が長い場合（例えば、約１０個を超えるアミノ酸）、ペプチドは、一般にポリペプチドまたはタンパク質と称される。「タンパク質」という用語は「ポリペプチド」という用語を包含するが、「ポリペプチド」は全長未満のタンパク質であり得る。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「ＬＡＭＰポリペプチド」は、本明細書に記載される哺乳動物のリソソーム関連膜タンパク質ヒトＬＡＭＰ−１、ヒトＬＡＭＰ−２、ヒトＬＡＭＰ−３、ヒトＬＩＭＰ−２、ヒトＥｎｄｏｌｙｎ、ヒトＬＩＭＢＩＣ、ヒトＬＡＭＰ−５またはヒトＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎ、ならびにオルソログ（例えば、図３〜１０に示されているＬＡＭＰタンパク質など）および対立遺伝子変異体を指す。本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、および／またはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、ゲノムＤＮＡから転写されるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「転写制御下」または「作動可能に連結された」は、発現制御エレメントおよびコード配列の適切な並置により制御されるポリヌクレオチド配列の発現（例えば、転写または翻訳）を指す。一態様では、発現制御配列がそのＤＮＡ配列の転写を制御および調節する場合、ＤＮＡ配列は発現制御配列に「作動可能に連結されている」。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、適切な発現制御配列の制御下に配置された場合に転写されてポリペプチドに翻訳される配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、限定されないが、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列およびさらには合成ＤＮＡ配列を含み得る。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の３’に位置する。
【００７１】
本明細書で使用される場合、２つのコード配列は、配列またはそれらの相補配列が同じアミノ酸配列をコードする場合に互いに「対応する」。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「シグナル配列」は、小胞体転座配列を示す。この配列は、細胞と連絡して、（例えば、化学結合を介して）小胞体小胞区画に連結されたポリペプチドがエキソサイトーシス／エンドサイトーシスオルガネラに入り、細胞小胞区画、細胞表面に送達されるか、またはポリペプチドを分泌するように指令するシグナルペプチドをコードする。このシグナル配列は、タンパク質の成熟で細胞により切り取られることがある。シグナル配列は、原核生物および真核生物にネイティブの様々なタンパク質に関連して見られ得る。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「輸送」は、改善されたＬＡＭＰ構築物によりコードされるポリペプチドが、粗面小胞体から、抗原プロセシングおよびＭＨＣ  ＩＩへの結合が起こるエンドソーム／リソソーム区画または関連オルガネラへの経路において細胞オルガネラまたは区画を通して移動または進行することを意味する。
【００７４】
本明細書に記載されるベクターのいずれかへのクローニングを容易にするために、アミノ酸をコードするポリヌクレオチドの短いストレッチは、アレルゲンＸをコードするポリヌクレオチドの末端に含められ得る。例えば、配列番号Ｙのアミノ酸配列に隣接するクローニング配列、例えば「Ｌｅｕ−Ｇｌｕ」および「Ｇｌｕ−Ｐｈｅ」をコードするポリヌクレオチド（例えば、「ＣＴＣＧＡＧ」および「ＧＡＡＴＴＣ」）などの使用が構築物設計に含められ得る。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「改善されたＬＡＭＰ構築物」および「アレルゲンＸ（配列番号Ｙ）を含む改善されたＬＡＭＰ構築物」および「目的のアレルゲンを含む改善されたＬＡＭＰ構築物」は互換的に使用される。改善されたＬＡＭＰ構築物の異なる配置は、ＩＬＣ１〜ＩＬＣ６として図１に示されている。また、「改善されたＬＡＭＰ構築物」の使用は、（アレルゲンＸ（配列番号Ｙ）をコードするポリヌクレオチドを含む）改善されたＬＡＭＰ構築物のポリヌクレオチド配列、および改善されたＬＡＭＰ構築物のポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の両方を包含する。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「改善されたＬＡＭＰ構築物送達ビヒクル」は、改善されたＬＡＭＰ構築物を宿主細胞（例えば、遺伝子または遺伝子断片、アンチセンス分子、リボザイム、アプタマーなど）に運搬し得、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物に関連して生じる任意の分子または分子群または高分子として定義される。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「改善されたＬＡＭＰ構築物送達」または「改善されたＬＡＭＰ構築物移入」は、導入に使用される方法にかかわらず、改善されたＬＡＭＰ構築物を宿主細胞に導入することを指す。導入された改善されたＬＡＭＰ構築物は、宿主細胞で安定的または一時的に維持され得る。典型的には、安定維持は、導入された改善されたＬＡＭＰ構築物が、宿主細胞と適合する複製起点を含むか、または宿主細胞のレプリコン、例えば染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）もしくは核もしくはミトコンドリア染色体に組み込まれることを必要とする。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「改善されたウイルスＬＡＭＰ構築物」は、インビボ、エクスビボまたはインビトロのいずれかで宿主細胞に送達される改善されたＬＡＭＰ構築物を含むウイルスまたはウイルス粒子を指す。改善されたウイルスＬＡＭＰ構築物の例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。アデノウイルスベクターにより遺伝子移入が媒介される態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、アデノウイルスゲノムまたはその一部、およびアデノウイルスカプシドタンパク質に関連する選択された非アデノウイルス遺伝子を含む。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「アデノウイルス媒介遺伝子移入」または「アデノウイルス形質導入」は、アデノウイルスが細胞に入ることにより、改善されたＬＡＭＰ構築物が宿主細胞に移入されるプロセスを指す。好ましくは、改善されたＬＡＭＰ構築物は、細胞内で複製しおよび／または組み込まれることができ、転写されることができる。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「アデノウイルス粒子」は、外部カプシドおよび改善されたＬＡＭＰ構築物から構成される個々のアデノウイルスビリオンであり、カプシドは、アデノウイルスエンベロープタンパク質からさらに構成される。アデノウイルスエンベロープタンパク質は、例えば、アデノウイルス粒子を特定の細胞および／または組織タイプにターゲティングするために、ウイルスタンパク質に共有結合的に付着したポリペプチドリガンドを含む融合ポリペプチドを含むように改変され得る。
【００８１】
本明細書で使用される場合、改善されたＬＡＭＰ構築物の「投与」または「免疫化」または「注射」という用語は、改善されたＬＡＭＰ構築物を細胞に形質導入、トランスフェクト、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたは発射することを指す。いくつかの態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、標的細胞を送達細胞と接触させることにより（例えば、細胞融合により、または送達細胞が標的細胞に近接する場合には送達細胞を溶解することにより）標的細胞に導入される。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「プライムブースト」という語句は、アレルゲンＸ（配列番号Ｙ）を含む本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を使用してＴ細胞応答をプライミングし、続いて、アレルゲンＸ（配列番号Ｙ）、アレルゲンＸ（配列番号Ｙ）を含むＤＮＡワクチンまたは組換えアレルゲンを含む第２の改善されたＬＡＭＰ構築物を使用して応答をブーストすること（逆もまた同様）を表す。これらの非相同プライムブースト免疫化は、同じベクターでプライミングおよびブースティングすることにより達成され得るよりも高度かつ幅広い免疫反応を誘発する。アレルゲンＸ（配列番号Ｙ）を含む改善されたＬＡＭＰ構築物によるプライミングは記憶細胞を起動させ、ブースト工程は記憶応答を拡大する。好ましくは、互いに対する応答を生じさせず、したがって互いの活性に干渉しない２つの異なる薬剤が使用される。アレルゲンの混合物は、プライムおよび／またはブースト工程で特に企図される。ブースティングは１回または複数回行われ得る。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」は、１つまたはそれを超えるポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン−クリック型塩基対、フーグスティーン結合または任意の他の配列特異的方法により起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３つもしくはそれを超える鎖、単一の自己ハイブリッド形成鎖またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範なプロセスの工程、例えばＰＣＲ反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断を構成し得る。
【００８４】
本明細書で使用される場合、別の配列と特定の割合（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、当技術分野でルーチンなソフトウェアプログラムを使用して最大限にアライメントした場合に、２つの配列の比較において塩基（またはアミノ酸）の割合が同じであることを意味する。
【００８５】
ヌクレオチドの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％が、ＤＮＡ配列の規定の長さにわたって一致する場合、２つの配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。同様に、ポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６６％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％が、ポリペプチド配列の規定の長さにわたって一致する場合、２つのポリペプチド配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで利用可能な標準ソフトウェアを使用して配列を比較することにより識別され得る。実質的に相同な核酸配列もまた、例えば、その特定の系について定義されるストリンジェントな条件下におけるサザンハイブリダイゼーション実験で識別され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当技術分野の範囲内である。例えば、ストリンジェントな条件は、４２℃で５×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミドにおけるハイブリダイゼーションならびに６０℃で０．１×ＳＳＣおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウムにおける洗浄であり得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例としては、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度、約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファー濃度、約０％〜約２５％のホルムアミド濃度および約６×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。中ハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度、約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣのバッファー濃度、約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度および約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度、約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣのバッファー濃度、約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水の洗浄溶液が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、１回、２回またはそれを超える洗浄工程では５分間〜２４時間であり、洗浄インキュベーション時間は約１、２または１５分間である。ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌと１５ｍＭクエン酸バッファーである。他のバッファー系を使用するＳＳＣの同等物が使用され得ることが理解される。類似性はシークエンシングにより検証され得るが、好ましくはさらにまたはあるいは、問題の特定のドメインに適切なアッセイを使用して、機能（例えば、エンドソーム区画への輸送能力など）により検証される。
【００８６】
「配列類似性パーセント（％）」、「配列同一性パーセント（％）」などの用語は、一般に、共通の進化起源を共有してもよいしまたは共有しなくてもよい核酸分子の異なるヌクレオチド配列またはポリペプチドのアミノ酸配列間の同一性または一致の程度を指す（Ｒｅｅｃｋら、前掲を参照のこと）。配列の同一性は、公開されている多くの配列比較アルゴリズムのいずれか、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）などを使用して決定され得る。
【００８７】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸分子間の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較目的でアライメントされる。２つの配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性パーセント＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複位置）×１００）。一実施形態では、２つの配列は同じまたはほぼ同じ長さのものである。ギャップの許容にかかわらず、２つの配列間の同一性パーセントは、以下に記載されるものと同様の技術を使用して決定され得る。配列同一性パーセントの計算では、典型的には、完全一致がカウントされる。
【００８８】
２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９０，８７：２２６４、改定版Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９３，９０：５８７３−５８７７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０；２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２でＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施して、本発明の配列に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３でＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施して、本発明のタンパク質配列に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップアラインメントを取得するために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５：３３８９に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが利用され得る。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施し得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、前掲を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトのパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）が使用され得る。ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照のこと。
【００８９】
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ  １９８８；４：１  １−１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、ギャップ長さペナルティ１２およびギャップペナルティ４が使用され得る。
【００９０】
好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さウェイト１、２、３、４、５または６のいずれかを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ、ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂのａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０，４８：４４４−４５３）のアルゴリズムを使用して決定される。さらに別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ギャップウェイト４０、５０、６０、７０または８０、長さウェイト１、２、３、４、５または６を使用するＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定される。特に好ましいパラメータのセット（および分子が本発明の配列同一性または相同性制限であるかを決定するためにどのパラメータを適用すべきかについて実施者が確信がない場合に使用され得るもの）は、ギャップオープンペナルティ１２、ギャップ拡張ペナルティ４、フレームシフトギャップペナルティ５でＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスを使用することである。
【００９１】
同一性パーセントが決定され得る方法の別の非限定的な例は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ  ７．７．１に記載されているソフトウェアプログラムを使用することである。好ましくは、デフォルトのパラメータがアラインメントに使用される。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予想＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０配列；並べ替え＝ハイスコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴで見られ得る。
【００９２】
本明細書に記載される特性の統計分析は、標準的な試験、例えばｔ検定、ＡＮＯＶＡまたはカイ二乗検定により実施され得る。典型的には、統計的有意性は、ｐ＝０．０５（５％）、より好ましくはｐ＝０．０１、ｐ＝０．００１、ｐ＝０．０００１、ｐ＝０．０００００１のレベルまで測定される。
【００９３】
ドメイン配列の「保存的に改変された変異体」も提供され得る。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体は、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を指す。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたはそれを超える選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら、１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。
【００９４】
野生型タンパク質の「生物学的に活性な断片」、「生物学的に活性な形態」、「生物学的に活性な同等物」および「機能的誘導体」という用語は、活性の検出に適切なアッセイを使用して測定した場合に、野生型タンパク質の生物活性に少なくとも実質的に等しい（例えば、それと有意差がない）生物学的活性を有する。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「インビボ」核酸送達、核酸移入、核酸療法」などは、改善されたＬＡＭＰ構築物を生物、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物の体に直接導入することを指し、それにより、改善されたＬＡＭＰ構築物は、このような生物の細胞にインビボで導入される。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「インサイチュー」という用語は、改善されたＬＡＭＰ構築物を標的細胞に近接させるタイプのインビボ核酸送達を指す（例えば、核酸は全身投与されない）。例えば、インサイチュー送達方法は、限定されないが、改善されたＬＡＭＰ構築物を部位（例えば、腫瘍または心筋などの組織）に直接注射するか、開いた手術野を通して改善されたＬＡＭＰ構築物を細胞または組織と接触させるか、またはカテーテルなどの医療用アクセスデバイスを使用して改善されたＬＡＭＰ構築物を部位に送達することを含む。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「単離された」または「精製された」という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片が、天然で通常付随する細胞および他の構成物から分離されている（またはそれを実質的に含まない）ことを意味する。例えば、改善されたＬＡＭＰ構築物に関して、単離されたポリヌクレオチドは、それが染色体で通常付随する５’および３’配列から分離されたものである。当業者には明らかなように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片は、その天然に存在するカウンターパートと区別するために「単離」を必要としない。実質的に含まないまたは実質的に精製されたは、集団の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％が、それらが天然で付随する構成要素を含まないことを意味する。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「標的細胞」または「レシピエント細胞」は、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物のレシピエントであることが望まれるかまたはレシピエントであった個々の細胞または細胞を指す。この用語はまた、単一細胞の子孫を含むことを意図し、子孫は、天然、偶発的または意図的突然変異により、（形態またはゲノムまたは全ＤＮＡ相補体の点で）元の親細胞と必ずしも完全に同一ではなくてもよい。標的細胞は、他の細胞と接触し得るか（例えば、組織内のように）、または生物の体内で循環して見られ得る。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「被験体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物としては、限定されないが、ネズミ、類人猿、ヒト、家畜、スポーツ動物、ペットが挙げられる。他の好ましい実施形態では、「被験体」は齧歯類（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ラマ、ラクダ、ウシ、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウマ、非ヒト霊長類、類人猿（例えば、サルまたはエイプ）、サル（例えば、マーモセット、ヒヒ、アカゲザル）またはエイプ（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）である。他の実施形態では、非ヒト哺乳動物、特にヒトにおける治療有効性を実証するためのモデルとして従来使用されている哺乳動物（例えば、ネズミ科動物、霊長類、ブタ、イヌ科動物またはウサギ動物）が用いられ得る。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」という用語は、標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、水およびエマルジョン、例えば油／水または水／油エマルジョン、ならびに様々なタイプの湿潤剤のいずれかを包含する。改善されたＬＡＭＰ構築物を含む組成物はまた、安定剤および保存剤を含み得る。担体、安定剤およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１５ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））を参照のこと。
【０１０１】
このような核酸が細胞内に導入された場合、細胞は、改善されたＬＡＭＰ構築物により「形質転換」、「形質導入」または「トランスフェクト」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれ（共有結合的に連結され）てもよいしまたはされなくてもよい。例えば、原核生物、酵母および哺乳動物細胞では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、プラスミドなどのエピソームエレメント上で維持され得る。真核細胞では、安定形質転換細胞は、改善されたＬＡＭＰ構築物が、染色体複製を通じて娘細胞により継承されるように染色体に組み込まれているものである。この安定性は、改善されたＬＡＭＰ構築物を含む娘細胞の集団から構成される細胞株またはクローンを樹立する真核細胞の能力により実証される。「クローン」は、単一の細胞または有糸分裂による共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」は、多くの世代（例えば、少なくとも約１０）にわたってインビトロで安定成長することができる初代細胞のクローンである。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「有効量」は、有益なまたは所望の結果に影響を与えるために十分な量、例えば、改善されたＬＡＭＰ構築物の移入および／または発現および／または所望の治療エンドポイントの達成の有効量などである。有効量は、１回またはそれを超える投与、適用または投与量で投与され得る。一態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物の有効量は、少なくとも２つの細胞を含む細胞の集団における少なくとも１つの細胞を形質転換／形質導入／トランスフェクトするために十分な量である。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、異常な生理学的反応を予防、修正および／または正常化するために十分な量を意味するために本明細書で使用される。一態様では、「治療有効量」は、病状の臨床的に重要な特徴、例えば腫瘍塊のサイズ、抗体産生、サイトカイン産生、発熱または白血球数などを少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％減少させるのに十分な量である。
【０１０４】
「抗体」は、特定の抗原に結合する抗体およびその断片を含む任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびキメラ抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含する。「抗体結合部位」は、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖可変および超可変領域から構成される抗体分子の構造部分である。例示的な抗体分子は、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、ならびにパラトープを含む免疫グロブリン分子の部分（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）部分を含む）であり、これらの部分は、本明細書に記載される治療方法における使用に好ましい。したがって、抗体という用語は、抗体分子全体だけではなく、抗体断片ならびに抗体および抗体断片の変異体（融合タンパク質などの誘導体を含む）も包含する。本出願で「抗体」という用語により説明される分子の例としては、限定されないが、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＦｖおよびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むかあるいはそれからなる断片が挙げられる。本明細書で使用される場合、「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という用語は、抗体のＶＨドメインに連結された抗体のＶＬドメインを含むポリペプチドを指す。Ｃａｒｔｅｒ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２４３を参照のこと。
【０１０５】
加えて、本発明の抗体は、限定されないが、モノクローナル、多重特異性、二重特異性、ヒト、ヒト化、マウスまたはキメラ抗体、単鎖抗体、ラクダ科抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、ドメイン抗体および上記のいずれかのエピトープ結合断片を含む。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。
【０１０６】
最も好ましくは、抗体はヒト抗体である。本明細書で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリー、およびヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたゼノマウスまたは他の生物から単離された抗体を含む。本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物は、例示的なプロトコールに記載されているようにヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するための公知の技術と組み合わせて使用され得る。例えば、国際公開第９８／２４８９３号；国際公開第９２／０１０４７号；国際公開第９６／３４０９６号；国際公開第９６／３３７３５号；欧州特許第０５９８８７７号；米国特許第５，４１３，９２３号；米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６６１，０１６号；米国特許第５，５４５，８０６号；米国特許第５，８１４，３１８号；米国特許第５，８８５，７９３号；米国特許第５，９１６，７７１号；および米国特許第５，９３９，５９８号；ならびにＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。
【０１０７】
ヒト抗体または「ヒト化」キメラモノクローナル抗体は、本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の技術と組み合わせて、改善されたＬＡＭＰ構築物を使用して生産され得る。例えば、キメラ抗体を生産するための標準的な方法は当技術分野で公知である。総説については、以下の参考文献Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、欧州特許第１７１４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許第１７３４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、国際公開第８６０１５３３号；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際公開第８７０２６７１号；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと。
【０１０８】
本発明の抗体は、一価、二価、三価または多価であり得る。例えば、一価ｓｃＦｖは、化学的に、または別のタンパク質もしくは物質との会合により多量体化され得る。ヘキサヒスチジンタグまたはＦｌａｇタグに融合されたｓｃＦｖは、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）または抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）を使用して多量体化され得る。加えて、改善されたＬＡＭＰ構築物は、改善されたＬＡＭＰ構築物に含まれるコード化アレルゲンに対して単一特異性、二重特異性、三重特異性またはより大きな多重特異性を生成するために使用され得る。例えば、国際公開第９３／１７７１５号；国際公開第９２／０８８０２号；国際公開第９１／００３６０号；国際公開第９２／０５７９３号；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；米国特許第４，７１４，６８１号；米国特許第４，９２５，６４８号；米国特許第５，５７３，９２０号；米国特許第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０１０９】
「エピトープ」は、通常、免疫系の構成要素により特異的に認識または特異的に結合される短いペプチド配列またはオリゴ糖から構成される構造である。Ｔ細胞エピトープは、一般に線状オリゴペプチドであることが示されている。同じ抗体により特異的に結合され得る場合、２つのエピトープは互いに対応する。両方が、同じＢ細胞受容体または同じＴ細胞受容体に結合することができる場合、２つのエピトープは互いに対応し、そのエピトープへの一方の抗体の結合は、他方のエピトープによる結合を実質的に妨げる（例えば、他方のエピトープの約３０％未満、好ましくは約２０％未満、より好ましくは約１０％、５％、１％または約０．１％未満が結合する）。本発明では、複数のエピトープがアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）を構成し得る。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「アレルゲン」または「目的のアレルゲン」という用語は、表１／図１４に示されているように自然免疫反応または適応免疫反応を誘発するために使用される改善されたＬＡＭＰ構築物にクローニングされたポリヌクレオチド配列によりコードされる任意のポリペプチド配列をカバーする。「アレルゲン」は、改善されたＬＡＭＰ構築物にクローニングされた単一のアレルゲンおよび（同じまたは異なるタンパク質に由来する）複数のアレルゲン配列の両方を包含する。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「抗原提示細胞」という用語は、主要組織適合遺伝子複合体分子またはその一部あるいは１つまたはそれを超える非古典的ＭＨＣ分子またはその一部に関連するアレルゲンをその表面に提示する任意の細胞を含む。適切なＡＰＣの例は以下で詳細に記載され、限定されないが、全細胞、例えばマクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、ハイブリッドＡＰＣおよびフォスター抗原提示細胞が挙げられる。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「操作された抗原提示細胞」は、その表面に非天然分子部分を有する抗原提示細胞を指す。例えば、このような細胞は、その表面に共刺激物質を天然に有しなくてもよいし、またはその表面に天然共刺激物質に加えてさらなる人工共刺激物質を有してもよいし、またはその表面に非天然クラスＩＩ分子を発現してもよい。好ましい実施形態では、操作された抗原提示細胞は、その表面に、改善されたＬＡＭＰ構築物から発現されたアレルゲンを有する。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「免疫エフェクター細胞」は、アレルゲンに結合することができる細胞であって、免疫反応を媒介する細胞を指す。これらの細胞としては、限定されないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、例えばＣＴＬ株、ＣＴＬクローンおよび腫瘍、炎症性または他の浸潤からのＣＴＬが挙げられる。
【０１１４】
「ベクター」は、プラスミドおよびウイルス、ならびに自己複製するかにかかわらず、細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用され得る任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む。
【０１１５】
細胞の「単離された」または「精製された」集団は、それが天然で付随する細胞および材料を実質的に含まない。実質的に含まないまたは実質的に精製されたＡＰＣは、集団の少なくとも５０％がＡＰＣであり、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％が、それらが天然で付随する非ＡＰＣ細胞を含まないことを意味する。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」は、細胞の通常ヌクレオチドへの任意の付加、欠失または破壊を指す。ＡＰＣの遺伝的改変が達成し得る任意の方法は、本発明の精神および範囲内である。当技術分野で認められている方法としては、ウイルス媒介遺伝子移入、リポソーム媒介移入、形質転換、トランスフェクションおよび形質導入、例えばウイルス媒介遺伝子移入、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスなどのＤＮＡウイルスをベースとする改善されたＬＡＭＰ構築物、ならびにレトロウイルスベースのベクターの使用が挙げられる。
【０１１７】
特に指示がない限り、本発明の実施は、当技術分野の範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を用いる。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｉ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
【０１１８】
特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、本明細書に記載される本発明に関連して使用され得るデバイス、製剤および方法論を説明および開示する目的で参照により組み込まれる。
【０１１９】
ＬＡＭＰ構築物
ＬＡＭＰ−１は、ｃＤＮＡクローンから推論されるように（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：８７５４，１９８８）、大きな（３４６残基）内腔アミノ末端ドメイン、続いて２４残基の疎水性膜貫通領域および短い（１２残基）カルボキシル末端細胞質尾部を有する約３８２個のアミノ酸のポリペプチドコアからなる。図２Ａおよび２Ｂを参照のこと。内腔ドメインは高度にグリコシル化され、約２０個のアスパラギン連結複合型オリゴ糖で置換されており、プロリン／セリンリッチなヒンジ領域により分離された２つの約１６０残基の「相同ドメイン」からなる。これらの「相同ドメイン」はそれぞれ、４つの均一間隔システイン残基を含み、ジスルフィド結合して、内腔ドメインの２等分内に対称的に配置された４つの３６〜３８残基のループを形成する（Ａｒｔｅｒｂｕｒｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：７４１９，１９９０；Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５：２６３（１８）：８７５４−８，１９８８）も参照のこと）。図２Ａは、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３、Ｅｎｄｏｌｙｎ、ＬＩＭＢＩＣ、ＬＡＭＰ５またはＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎ間の保存されたドメインを模式的に示す。
【０１２０】
以前に報告されているＬＡＭＰ構築物は、この特定の配置で以下のエレメントを含む：（ａ）ＬＡＭＰ−１タンパク質の全内腔ドメイン、抗原、次いでＬＡＭＰ−１タンパク質の全膜貫通／細胞質尾部または（ｂ）抗原およびＬＡＭＰ−１タンパク質の全膜貫通／細胞質尾部。例（ａ）では、抗原配列は、ＬＡＭＰ−１タンパク質の全内腔ドメインとＬＡＭＰ−１全膜貫通ドメイン／細胞質尾部との間に挿入される。両構築物は、抗原配列をリソソーム／エンドソームに成功裏にターゲティングすることが示されており、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物ＩＬＣ１〜ＩＬＣ６と比較して、図１に示されているように「完全ＬＡＭＰ構築物」と称される。本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物は、先行技術に記載されている完全ＬＡＭＰ構築物を含まない。
【０１２１】
文献では、ＬＡＭＰ−１の全内腔ドメインよりも小さい断片は、ロバストな免疫反応の生成において有効ではないことが広く報告されている（例えば、Ｇｏｄｉｎｈｏらを参照のこと）。対照的に、本発明者らは、予想外のことに、特定の断片が、特定の配置において、アレルゲンを免疫系に実際に有効に提示して、多くの場合において、抗体の異なるレパートリーの生成を含むよりロバストな免疫反応を生成したことを発見した。例えば、本発明者らは、ロバストな免疫反応を生成するために有効な最小ＬＡＭＰ内腔ドメイン断片が、（文献で広く報告されている）全内腔ドメインではなく、むしろＬＡＭＰタンパク質の内腔ドメインの単一の相同ドメインであることを特定した。
【０１２２】
例えば、構築物は、全内腔ドメインではなく、ＬＡＭＰタンパク質の内腔ドメインの単一の相同ドメインを含み得る。本明細書で使用される場合、「相同ドメイン」は、図３〜１０に示されている少なくとも４つの均一間隔システイン残基を含む。これらのシステインの存在は、図３〜１０に示されているように、各相同ドメインで１、２、３および４と表示されており（ＬＩＭＰ−２およびＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎでは５つのシステインが識別され、ＬＩＭＢＩＣでは６つのシステインが識別され、Ｅｎｄｏｌｙｎでは８つのシステインが識別されている）、本明細書では「システイン保存断片」と定義される。さらなるアミノ酸をシステイン保存断片のＮ末端および／またはＣ末端のいずれかに含めて、ＬＡＭＰタンパク質の全相同ドメインまでを生成し得る。これらのさらなる追加アミノ酸は、システイン保存断片が由来する相同ドメインまたは他のＬＡＭＰタンパク質相同ドメインに由来し得る。したがって、本明細書で使用される場合、ＬＡＭＰ相同ドメインは、１つのシステイン保存断片を含み、および／またはそれからなる。少なくとも２つのＬＡＭＰ相同ドメインは、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３またはＥｎｄｏｌｙｎの内腔ドメインを構成する。
【０１２３】
具体的には、好ましい一実施形態では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、表１／図１４に記載されている少なくとも１つのアレルゲンならびに／または段落［０１３６〜０１３７］および表２に記載されている組み合わせがＬＡＭＰタンパク質の内腔ドメイン、ＬＡＭＰタンパク質の少なくとも１つの相同ドメインまたはＬＡＭＰタンパク質の少なくとも１つのシステイン保存断片のＮ末端に融合されたものを含む。例えば、図１のＩＬＣ−２およびＩＬＣ−６を参照のこと。好ましい実施形態では、これらの構築物はまた、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインおよび／またはＬＡＭＰタンパク質の細胞質尾部を含む。他の好ましい実施形態では、アレルゲンＸ（配列番号Ｙ）が膜貫通ドメインを含む場合、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインおよび／またはＬＡＭＰタンパク質の細胞質尾部は不要である。好ましい実施形態では、２つの相同ドメインが、改善されたＬＡＭＰ構築物に含まれる（例えば、図１のＩＬＣ−１）。さらに好ましい実施形態では、２つの相同ドメインは、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３またはＥｎｄｏｌｙｎタンパク質に由来する。あるいは、２つの相同ドメインは、異なるＬＡＭＰタンパク質に由来する。２つの相同ドメインを含むこれらの構築物では、ＬＡＭＰヒンジドメインも含まれ得る。抗原は、全ＬＡＭＰ−１内腔ドメインと全ＬＡＭＰ−１膜貫通／細胞質尾部との間に常に配置されており、内腔ドメインの断片は、ロバストな免疫反応の生成において有効ではないと報告されているので、この段落に記載されている改善されたＬＡＭＰ構築物は、先行技術の観点から予想外である。
【０１２４】
別の好ましい実施形態では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、表１／図１４に記載されている少なくとも１つのアレルゲンならびに／または段落［０１３６〜０１３７］および表２に記載されている組み合わせがＬＡＭＰタンパク質の単一の相同ドメインまたはＬＡＭＰタンパク質の単一のシステイン保存断片のＣ末端に融合されたものを含む（例えば、図１のＩＬＣ−５）。好ましい実施形態では、これらの構築物はまた、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインおよび／またはＬＡＭＰタンパク質の細胞質尾部を含む（例えば、図１のＩＬＣ−３）。他の好ましい実施形態では、アレルゲンＸ（配列番号：Ｙ）が膜貫通ドメインを含む場合、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインおよび／またはＬＡＭＰタンパク質の細胞質尾部は不要である。あるいは、２つの異なるＬＡＭＰタンパク質由来の２つの相同ドメインが使用され得る。アレルゲンは、全内腔ＬＡＭＰ−１ドメインと全ＬＡＭＰ−１膜貫通／細胞質尾部との間に常に配置されており、内腔ドメインの断片は、ロバストな免疫反応の生成において有効であると報告されていないので、この段落に記載されている改善されたＬＡＭＰ構築物は、先行技術の観点から予想外である。
【０１２５】
したがって、改善されたＬＡＭＰ構築物は、表１／図１４に記載されている少なくとも１つのアレルゲンならびに／または段落［０１３６〜０１３７］および表２に記載されている組み合わせがＬＡＭＰタンパク質の単一の相同ドメインまたはＬＡＭＰタンパク質の単一のシステイン保存断片のＣ末端に融合されたものを含む。例えば、図１のＩＬＣ−３およびＩＬＣ−５を参照のこと。好ましい実施形態では、これらの構築物はまた、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインおよび／またはＬＡＭＰタンパク質の細胞質尾部を含む。他の好ましい実施形態では、アレルゲンＸ（配列番号Ｙ）が膜貫通ドメインを含む場合、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインおよび／またはＬＡＭＰタンパク質の細胞質尾部は不要である。この段落に記載されている改善されたＬＡＭＰ構築物は、上記のように先行技術の観点から予想外である。
【０１２６】
別の好ましい実施形態では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、少なくとも１つの目的のアレルゲンがＬＡＭＰタンパク質の第１の相同ドメインとＬＡＭＰタンパク質の第２の相同ドメインとの間（または少なくとも２つのシステイン保存断片の間）に融合されたものを含む。例えば、図１のＩＬＣ−４を参照のこと。好ましい実施形態では、２つの相同ドメインは、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３またはＥｎｄｏｌｙｎタンパク質に由来する。これらの構築物では、アレルゲンは、ＬＡＭＰヒンジ領域に配置され得る。あるいは、２つの異なるＬＡＭＰタンパク質由来の２つの相同ドメインが使用され得る。表１／図１４に記載されている少なくとも１つのアレルゲンならびに／または段落［０１３６〜０１３７］および表２に記載されている組み合わせが２つのＬＡＭＰ相同ドメイン（システイン保存断片を含む）間に融合されたこの構成は、上記のように先行技術の観点からは予想外である。
【０１２７】
上記で定義される改善されたＬＡＭＰ構築物はそれぞれ、図で定義されるドメインを使用して生成され得る。例えば、図１に示されている改善されたＬＡＭＰ構築物に含まれるドメインは、例えば、オーソログ配列由来の配列に由来し得ることが特に企図される。例えば、図３〜１０を参照のこと。図２Ａおよび２Ｂで定義される同等のドメインを使用して、オーソログ配列について図１に示されている改善されたＬＡＭＰ構築物を生成することが明確に企図される。また、図３〜１０に示されているオーソログ配列は、ドメインを生成するために使用され得る配列の代表的ものである。他のオーソログ配列および／またはアイソタイプを識別し、それらを図３〜１０に示されているアラインメントと比較することは、十分に当技術分野の技術の範囲内である。したがって、図３〜１０に示されているアラインメントを有するヒトＬＡＭＰタンパク質について、図２Ａおよび２Ｂで定義される同等の境界を識別することにより、図１に示されている改善されたＬＡＭＰ構築物を生成し得る。
【０１２８】
当業者により十分に理解されるように、各ドメインの境界は概算であり、クローニングの検討事項および制限酵素の配置に基づいて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸調整され得る。したがって、特定のドメイン（例えば、ＬＡＭＰ相同ドメイン）が改善されたＬＡＭＰ構築物に含まれる場合、ドメインの開始および終了のアミノ酸は、図２Ａで定義される境界のように少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個アミノ酸調整され得る。
【０１２９】
上記改善されたＬＡＭＰ構築物はそれぞれ、当技術分野で周知のように、クローニング目的で各ドメイン間にシグナル配列および／またはさらなるアミノ酸をさらに含み得る。加えて、ＬＡＭＰ相同ドメイン、ＬＡＭＰ内腔ドメイン、ＬＡＭＰ膜貫通ドメインおよび／またはＬＡＭＰ細胞質尾部ドメインは、同じＬＡＭＰタンパク質（例えば、ヒトＬＡＭＰ−１）または異なるＬＡＭＰタンパク質（例えば、ヒトＬＡＭＰ−１由来の内腔ドメインおよびヒトＬＡＭＰ−２由来の膜貫通ドメインならびに／または同じ遺伝子ファミリー（例えば、ＬＡＭＰ−１）もしくは異なる遺伝子ファミリー（ＬＡＭＰ−１およびＬＡＭＰ−２）のオーソログドメインの混合に由来し得る。
【０１３０】
記載されるＬＡＭＰ構築物のポリペプチド変異体が企図される。例えば、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物のいずれかと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のポリペプチドおよびこれらの変異体をコードするポリヌクレオチドが企図される。改善されたＬＡＭＰ構築物の変異体は、アレルゲン性配列をリソソームにターゲティングすることにより機能する能力を保持する。例えば、改変内腔配列は、元のドメイン配列と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％の有効性、すなわち、免疫反応を開始するためのキメラ配列を含む細胞による十分な抗原提示をもたらす有効性で、膜および非膜抗原性材料の両方をエンドソーム区画に輸送する能力を保持しなければならない。一態様では、適切な輸送シグナルを含む配列は、オボアルブミンの十分に特徴付けられた抗原性ドメインと、膜貫通ドメインと、推定リソソーム／エンドソームターゲティングシグナルを含むタンパク質の細胞質ドメインとを含む改善されたＬＡＭＰ構築物を構築することにより識別され得る。ターゲティングの効率は、改善されたＬＡＭＰ構築物を発現する抗原提示細胞がＨＡエピトープ特異的ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞を刺激する能力を決定することにより測定され得る（例えば、米国特許第５，６３３，２３４号の実施例５を参照のこと）。
【０１３１】
記載される改善されたＬＡＭＰ構築物のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物ポリヌクレオチドのいずれかと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のポリヌクレオチドと共に、本発明の好ましい実施形態である。改善されたＬＡＭＰ構築物の変異体は、アレルゲン性配列をリソソームにターゲティングすることにより機能する能力を保持する。例えば、改変内腔配列は、元のドメイン配列と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％の有効性、すなわち、免疫反応を開始するためのキメラ配列を含む細胞による十分な抗原提示をもたらす有効性で、膜および非膜抗原性材料の両方をエンドソーム区画に輸送する能力を保持しなければならない。一態様では、適切な輸送シグナルを含む配列は、オボアルブミンの十分に特徴付けられた抗原性ドメインと、膜貫通ドメインと、推定リソソーム／エンドソームターゲティングシグナルを含むタンパク質の細胞質ドメインとを含む改善されたＬＡＭＰ構築物を構築することにより識別され得る。ターゲティングの効率は、改善されたＬＡＭＰ構築物を発現する抗原提示細胞がＨＡエピトープ特異的ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞を刺激する能力を決定することにより測定され得る（例えば、米国特許第５，６３３，２３４号の実施例５を参照のこと）。
【０１３２】
アレルゲン
表１／図１４に示されている以下のアレルゲン（例えば、アレルゲンＸ）は、当業者に周知の技術を使用して、本明細書に記載される各ＬＡＭＰ構築物にクローニングされ得る。また、表１／図１４に列挙されているアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）のいずれか１つを、表１／図１４に列挙されている任意の他の抗原と組み合わせ、本明細書に記載される、具体的には表２に開示されている改善されたＬＡＭＰ構築物に挿入し得ることが特に企図される。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「アレルゲンＸ」という用語は、以下の表１／図１４に列挙されている特定の遺伝子／タンパク質、シグナル配列が除去された（例えば、表１の列３に記載されている）その断片（例えば、配列番号Ｙの断片（例えば、表１の列４に記載されている））、または個体への反復曝露によりアレルギー、すなわちＩｇＥ媒介反応を誘導することが公知の列挙されているタンパク質の混合物を指す。一般に、アレルゲンは、アレルギー反応を惹起することができる任意の化合物、物質または材料である。アレルゲンは、通常、免疫反応を惹起することができる化合物、物質または材料である抗原のサブカテゴリとして理解される。本発明を実行するために、アレルゲンＸは、とりわけ、天然またはネイティブアレルゲン、改変天然アレルゲン、合成アレルゲン、組換えアレルゲン、アレルゴイドおよびそれらの混合物または組み合わせから選択され得る。特に興味深いものは、ＩｇＥ媒介即時型過敏症を引き起こすことができるアレルゲンＸである。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、アレルゲンＸのアミノ酸配列は、（シグナル配列の有無にかかわらず）配列番号Ｙのいずれか１つを含む。アレルゲンＸ（配列番号Ｙ）をコードし得るポリヌクレオチドの代表的な例は、表１／図１４に配列番号Ｚとして示されているか、または表１の列２に記載されているアレルゲンＸもしくは列４に記載されている断片をコードする任意のポリヌクレオチド（例えば、コドン最適化配列）として示されている。これらのポリヌクレオチドは、（配列番号Ｙのシグナル配列の有無にかかわらず）図１に示されているように構築物ＩＬＣ１〜６のいずれか１つに挿入される。挿入は、配列番号Ｙのアミノ酸配列に隣接するクローニング配列、例えば「Ｌｅｕ−Ｇｌｕ」および「Ｇｌｕ−Ｐｈｅ」をコードするポリヌクレオチド（例えば、「ＣＴＣＧＡＧ」および「ＧＡＡＴＴＣ」」などの使用により促進され得る。本明細書で使用される場合、「アレルゲンＸ」はまた、アレルゲンＸの変異体（断片を含む）を包含する。例えば、好ましい実施形態は、（表１の列２または列４に記載されているように）配列番号Ｙと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアレルゲンＸポリペプチド変異体を含む。これらの変異体は、（ａ）それが由来するアレルゲンＸと交差反応する抗体を生じさせる能力および／または（ｂ）アレルゲンＸ生物学的活性のいずれかを保持する。これらの変異体アレルゲンＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが特に企図される。
【０１３５】
本発明はさらに、表１／図１４のアレルゲンＸのいずれかをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、例えば、アレルゲンＸ（配列番号Ｙ）、例えば配列番号Ｚなどをコードする核酸または表１の列２に記載されているアレルゲンＸもしくは列４に記載されている断片をコードする任意のポリヌクレオチド（例えば、コドン最適化配列）を含むベクターであって、前記核酸分子が、ＩＬＣ１〜６のいずれか１つにおける発現制御配列に作動可能に連結されているベクターを提供する。好ましい一態様では、ベクターは、アレルゲンＸに対して患者をワクチン接種するために適切なワクチンベクターである。別の態様では、本発明は、細胞への核酸分子の導入を容易にするための核酸分子を含む送達ビヒクルを提供する。送達ビヒクルは、脂質ベース（例えば、リポソーム製剤）、ウイルスベース（例えば、核酸分子をカプセル化するウイルスタンパク質を含む）または細胞ベースのものであり得る。好ましい一態様では、ベクターはワクチンベクターである。当業者により十分に理解されるように、表１の列１および４は、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物にクローニングすべき好ましいアミノ酸を規定する。しかしながら、表１の列１および４に記載されている断片のＮ末端およびＣ末端境界は両方とも概算であり、クローニングの検討事項および制限酵素の配置に基づいて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸調整され得る。したがって、改善されたＬＡＭＰ構築物にアレルゲンＸが含まれる場合、アレルゲンＸの開始および終了のアミノ酸は、表１の列１および４で定義されるように少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸調整され得る。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【０１３６】
加えて、１つを超えるアレルゲンＸを（任意の順序で）組み合わせて、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物のいずれか１つのようにワクチンとして投与し得る。アレルゲンＸの組み合わせは、単一の改善されたＬＡＭＰ構築物内にクローニングされ得るか、またはアレルゲンＸの複数の改善されたＬＡＭＰ構築物を含む組成物で送達され得ることが特に想定される。具体的には、表１／図１４に記載されているアレルゲンＸは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物に個々に、または表２に記載されている１つの別のアレルゲンＸと組み合わせてクローニングされ得る。このリストは、改善されたＬＡＭＰ構築物が含むものを記載し、特定の構築物内のアレルゲンＸの配置を必ずしも記載する必要はないので、特定の改善されたＬＡＭＰ構築物について表２に記載されているアレルゲンＸの組み合わせの順序は変動し得る。
【０１３７】
好ましい実施形態では、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物は、（ａ）表１／図１４に示されている配列番号Ｚのポリヌクレオチドのいずれか１つ；（ｂ）表１／図１４に示されている配列番号Ｚのポリヌクレオチドのいずれか１つによりコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｃ）表１／図１４に示されている配列番号Ｙの列２もしくは列４のいずれかに記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｇ）（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドのいずれか１つと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、さらなる好ましい実施形態である。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【０１３８】
改善されたＬＡＭＰ構築物をコードする配列のアセンブリ
目的のアレルゲンを含む改善されたＬＡＭＰ構築物を構築する手順は、当技術分野で周知である（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１１：９５５，１９９０を参照のこと）。目的のセグメントをコードするＤＮＡ配列は、容易に入手可能な組換えＤＮＡ材料、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．２０８５２，Ｕ．Ｓ．Ａ．からまたは所望のＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから入手可能なものから得られ得る。
【０１３９】
例えば、所望のドメイン配列に対応するＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡ方法論のルーチンな手順を使用して、適切な制御およびシグナル配列と共にアセンブリされ得る。例えば、米国特許第４，５９３，００２号およびＬａｎｇｆｏｒｄら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：３１９１，１９８６における記載を参照のこと。
【０１４０】
タンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は化学的に合成され得るか、またはいくつかのアプローチの１つにより単離され得る。合成されるＤＮＡ配列は、所望のアミノ酸配列に適切なコドンを使用して設計され得る。一般に、配列が発現に使用される宿主のための好ましいコドンを選択する。完全配列は、標準的な方法で調製された重複オリゴヌクレオチドからアセンブリされ得、完全コード配列にアセンブリされ得る。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６，１９８１；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９，１９８４；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１，１９８４を参照のこと。
【０１４１】
一態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物のドメイン配列をコードする１つまたはそれを超える核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して個々に単離される（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら、Ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０）。ドメインは、好ましくは、それらを含むことが公知の公的に入手可能なクローンから単離されるが、それらはまた、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーから単離され得る。好ましくは、単離された断片は、アレルゲン配列をコードする改善されたＬＡＭＰ構築物の構築を可能にする適合制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接する。この技術は当業者に周知である。ドメイン配列は、互いに直接融合され得るか（例えば、介在配列なしで）、または互いに挿入され得るか（例えば、ドメイン配列が不連続である場合）、または介在配列により分離され得る（例えば、リンカー配列など）。
【０１４２】
オリゴヌクレオチドプライマー、プローブおよびＤＮＡライブラリーを調製するための基本戦略、ならびに核酸ハイブリダイゼーションによるそれらのスクリーニングは当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前掲；Ｐｅｒｂａｌ，１９８４、前掲を参照のこと。適切なゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーの構築は、当技術分野の範囲内である。例えば、Ｐｅｒｂａｌ，１９８４、前掲を参照のこと。あるいは、適切なＤＮＡライブラリーまたは公的に入手可能なクローンは、生物学的研究材料の供給業者、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＳｔｒａｔａｇｅｎｅから、ならびに公的な寄託機関、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。
【０１４３】
選択は、ＤＮＡの発現ライブラリーから配列を発現させ、発現ペプチドを免疫学的に検出することにより達成され得る。ＭＨＣ  ＩＩ分子および所望の抗体／Ｔ細胞受容体に結合するペプチドを発現するクローンが選択される。これらの選択手順は当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前掲を参照のこと）。
【０１４４】
所望のポリペプチド配列のコード配列を含むクローンが調製または単離されたら、配列は、好ましくは宿主細胞で配列を維持するための複製起点を含む任意の適切なベクターにクローニングされ得る。
【０１４５】
核酸送達ビヒクル
一態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物を含むワクチン組成物は、細胞に導入される。細胞は、核酸を複製するための、または改善されたＬＡＭＰ構築物を発現させるための宿主細胞であり得る。好ましくは、改善されたＬＡＭＰ構築物を発現させるための宿主細胞は、抗原提示細胞である（以下にさらに記載される）。
【０１４６】
好ましい実施形態では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、標的細胞への挿入のためのポリヌクレオチド配列と、細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現（例えば、転写および／または翻訳）を制御するためにそれに作動可能に連結された発現制御配列とをさらに含む。例としては、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、動原体、ならびにインビトロでまたは宿主細胞（例えば、細菌、酵母、昆虫細胞など）および／もしくは標的細胞（例えば、哺乳動物細胞、好ましくは抗原提示細胞など）で複製することができるかまたは複製されることができ、および／または改善されたＬＡＭＰ構築物をコードする配列を標的細胞内の所望の位置に運搬することができる他の配列が挙げられる。
【０１４７】
組換え発現ベクターは、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ラマ、キリン、イヌ、ネコまたはニワトリを含む動物に容易に感染する微生物に由来し得る。好ましいベクターとしては、生ワクチンとして既に使用されているもの、例えばワクシニアが挙げられる。これらの組換え体は宿主に直接接種され得、微生物ベクターだけではなく外来アレルゲンを発現する免疫も付与する。生組換えワクチンとして本明細書で企図される好ましいベクターとしては、例えば、Ｆｌｅｘｎｅｒ，Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２１：５１，１９９０に教示されているように、ＲＮＡウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアおよび他のポックスウイルスが挙げられる。
【０１４８】
発現制御配列としては、限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列、それぞれ転写アクチベーターおよびリプレッサーに結合するエンハンサー配列または負の調節エレメントならびに／またはリボソーム結合のための翻訳開始配列が挙げられる。例えば、細菌発現ベクターは、ｌａｃプロモーターなどのプロモーター、ならびに転写開始についてはシャイン−ダルガーノ配列および開始コドンＡＵＧを含み得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前掲）。同様に、真核生物発現ベクターは、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための非相同、相同またはキメラプロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧおよびリボソームの分離のための終止コドンを含む。
【０１４９】
発現制御配列は、天然に存在する遺伝子から取得され得るか、または設計され得る。設計された発現制御配列としては、限定されないが、突然変異および／またはキメラ発現制御配列、または合成もしくはクローニングされたコンセンサス配列が挙げられる。プロモーターと、ポリヌクレオチドが作動可能に連結され得るクローニング部位との両方を含むベクターは、当技術分野で周知である。このようなベクターは、インビトロまたはインビボでＲＮＡを転写することができ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）およびＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などの供給業者から市販されている。
【０１５０】
発現および／または転写を最適化するために、ベクターの５’および／または３’非翻訳部分を除去し、追加しまたは変化させて、転写または翻訳のいずれかのレベルで発現に干渉するかまたはそれを減少させ得る追加的または代替的な翻訳開始コドンまたは他の配列を排除することが必要であり得る。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンの５’に直接挿入して、発現を増強し得る。多種多様な発現制御配列（それに作動可能に連結されたＤＮＡ配列の発現を制御する配列）をこれらのベクターで使用して、本発明のＤＮＡ配列を発現させ得る。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマ、アデノウイルス、ヘルペスウイルスの初期または後期プロモーターおよび哺乳動物細胞の遺伝子の発現を制御することが公知の他の配列ならびにそれらの様々な組み合わせが挙げられる。
【０１５１】
一態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、ベクターを複製するための複製起点を含む。好ましくは、起点は、標的細胞への送達に使用するために十分な数の配列のコピーを生成するために使用され得る少なくとも１つタイプの宿主細胞で機能する。したがって、適切な起点としては、限定されないが、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属など）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ属またはＰｉｃｈｉａ属など）、昆虫細胞および哺乳動物細胞で機能するものが挙げられる。好ましい一態様では、核酸送達ビヒクルが導入される標的細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞）で機能する複製起点が提供される。別の態様では、少なくとも２つの複製起点が提供され、１つは宿主細胞で機能し、１つは標的細胞で機能する。
【０１５２】
あるいはまたは加えて、改善されたＬＡＭＰ構築物は、標的細胞染色体への核酸送達ベクターの少なくとも一部の組み込みを容易にする配列を含み得る。例えば、改善されたＬＡＭＰ構築物は、標的細胞染色体ＤＮＡと相同の領域を含み得る。一態様では、送達ベクターは、改善されたＬＡＭＰ構築物をコードする核酸配列に隣接する２つまたはそれを超える組換え部位を含む。
【０１５３】
ベクターが標的細胞に成功裏に導入され、および／または標的細胞により発現され得ることを確認するために、ベクターは、検出可能および／または選択可能なマーカーをさらに含み得る。これらのマーカーは、活性、例えば限定されないが、ＲＮＡ、ペプチドもしくはタンパク質の産生をコードし得るか、またはＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機および有機化合物もしくは組成物などのための結合部位を提供し得る。
【０１５４】
検出可能／選択可能なマーカー遺伝子の例としては、限定されないが、毒性化合物に対する耐性を提供する生成物（例えば、抗生物質）をコードするＤＮＡセグメント；レシピエント細胞に存在しない生成物（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）をコードするＤＮＡセグメント；遺伝子産物の活性を抑制する生成物をコードするＤＮＡセグメント；容易に識別可能である生成物（例えば、β−ガラクトシダーゼなどの表現型マーカー、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＧ、ＢＦＰ、ＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＢＦＰ、ｄｓＲｅｄ、それらの突然変異型、改変型または増強型など）および細胞表面タンパク質）をコードするＤＮＡセグメント；細胞の生存および／もしくは機能に有害な生成物を結合するＤＮＡセグメント；他の核酸セグメントの活性を阻害するＤＮＡセグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；基質を改変する生成物（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）を結合するＤＮＡセグメント；所望の分子を単離もしくは識別するために使用され得るＤＮＡセグメント（例えば、特定のタンパク質結合部位をコードするセグメント）；プライマー配列；存在しない場合、特定の化合物に対する抵抗性もしくは感受性を直接的もしくは間接的に付与するＤＮＡセグメント；ならびに／またはレシピエント細胞で毒性の生成物をコードするＤＮＡセグメントが挙げられる。
【０１５５】
マーカー遺伝子は、成功した遺伝子移入の立体構造のマーカーとして、および／または移入された遺伝子を発現する細胞を単離するために、および／または移入された遺伝子を細胞から回収するために使用され得る。例えば、一態様では、マーカー遺伝子は、改善されたＬＡＭＰ構築物を発現する抗原提示細胞を単離および精製するために使用される。
【０１５６】
実質的に類似の遺伝子、例えば、公知の遺伝子と約５０％超、約７０％超、８０％超、約９０％超、好ましくは約９５％超の同一性を有する遺伝子が提供され得る。実質的に類似のドメイン配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で目的のドメイン配列に特異的にハイブリダイズする配列を選択することにより最初に識別され得る。相同、変異または改変ドメイン配列の適合性を決定するためのアッセイの実施は、適切な活性を発現する配列のスクリーニングの問題にすぎない。このようなスクリーニングは、当技術分野ではルーチンである。
【０１５７】
改善されたＬＡＭＰ構築物は、ネイキッド核酸として、または細胞への核酸の進入を促進するための１つもしくはそれを超える分子に関連する送達ビヒクルで提供され得る。適切な送達ビヒクルとしては、限定されないが、リポソーム製剤、ポリペプチド、多糖、リポ多糖、ウイルス製剤（例えば、ウイルス、ウイルス粒子、人工ウイルスエンベロープなどを含む）、細胞送達ビヒクルなどが挙げられる。
【０１５８】
脂質ベースの製剤
改善されたＬＡＭＰ構築物の細胞内送達を容易にするように設計された送達ビヒクルは、（例えば、原形質膜、組織液、細胞内の区画などにおける）非極性および極性環境の両方と相互作用しなければならない。したがって、好ましくは、送達ビヒクルは、極性および非極性ドメインの両方、または改善されたＬＡＭＰ構築物を細胞に移行させるための移行配列を含むように設計される。
【０１５９】
極性ドメインおよび非極性ドメインを有する化合物は、両親媒性物質と称される。カチオン性両親媒性物質は、ＤＮＡなどの負荷電ポリヌクレオチドと相互作用するために、生理学的ｐＨまたはその付近で正に帯電されることができる極性基を有する。
【０１６０】
本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物は、細胞膜を横断するベクターの移動を容易にするために脂質単層または二重層を含む製剤で提供され得る。リポソームまたは任意の形態の脂質膜、例えば平面脂質膜またはインタクトな細胞、例えば赤血球の細胞膜が使用され得る。リポソーム製剤は、静脈内または経口投与を含む任意の手段により投与され得る。
【０１６１】
リポソームおよびリポソーム製剤は、標準的な方法にしたがって調製され得、当技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ；Ａｋｉｍａｒｕ，１９９５，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：１９７−２１０；Ａｌｖｉｎｇ，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４５：５−３１；Ｓｚｏｋａ，１９８０，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；および米国特許第４，８３７，０２８号を参照のこと。一態様では、リポソームは、リポソーム、すなわち改善されたＬＡＭＰ構築物複合体を特定の細胞タイプにターゲティングするためのターゲティング分子を含む。特に好ましい態様では、ターゲティング分子は、血管または標的組織に見られる細胞の表面上の生体分子（例えば、受容体またはリガンド）に対する結合パートナー（例えば、リガンドまたは受容体）を含む。
【０１６２】
リポソームの電荷は、血液からのリポソームのクリアランスにおける重要な決定因子であり、負荷電リポソームは、細網内皮系によってより迅速に取り込まれるので（Ｊｕｌｉａｎｏ，１９７５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６３：６５１）、より短い血流中半減期を有する。ホスファチジルエタノールアミン誘導体の組み込みは、リポソームの凝集を防止することにより、循環時間を増強する。例えば、Ｌ−α−ジステアロイルホスファチジルコリンの大きな単ラメラ小胞へのＮ−（ω−カルボキシ）アシルアミドホスファチジルエタノールアミンの組み込みは、インビボリポソーム循環寿命を劇的に増加させる（例えば、Ａｈｌ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３２９：３７０−３８２を参照のこと）。長期の循環半減期を有するリポソームは、典型的には、治療および診断用途に望ましい。薬物動態の一般的な議論については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ３７−３９，Ｌｅｅら、Ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ  １９９６）を参照のこと。
【０１６３】
典型的には、リポソームは、約５〜１５モル％の負荷電リン脂質、例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールで調製される。追加された負荷電リン脂質、例えばホスファチジルグリセロールはまた、自発的なリポソーム凝集を防止するように機能するので、小型のリポソーム凝集体形成のリスクを最小化する。膜硬化剤、例えば、少なくとも約５０モル％の濃度のスフィンゴミエリンまたは飽和中性リン脂質、および５〜１５モル％のモノシアリルガングリオシドもまた、剛性などの望ましいリポソーム特性を付与し得る（例えば、米国特許第４，８３７，０２８号を参照のこと）。
【０１６４】
加えて、リポソーム懸濁液は、保存のフリーラジカルおよび脂質過酸化損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含み得る。親油性フリーラジカルクエンチャー、例えばα−トコフェロールおよび水溶性鉄特異的キレート剤、例えばフェリオキシアニンが好ましい。
【０１６５】
本発明の改善されたＬＡＭＰ構築物は、不均一なサイズの多重ラメラ小胞を含み得る。例えば、小胞形成脂質を適切な有機溶媒または溶媒系に溶解し、真空または不活性ガス下で乾燥させて、薄い脂質膜を形成し得る。所望により、膜を第３級ブタノールなどの適切な溶媒に再溶解し、次いで、凍結乾燥して、より容易に水和される粉末形態のより均一な脂質混合物を形成し得る。この膜を、ペプチドまたはポリペプチド複合体の水溶液でカバーし、典型的には撹拌しながら１５〜６０分間水和させる。得られる多重ラメラ小胞のサイズ分布は、より激しい撹拌条件下で脂質を水和させることにより、またはデオキシコール酸などの可溶化界面活性剤を追加することにより、より小さなサイズにシフトさせ得る。水和媒体は、好ましくは、最終リポソーム懸濁液中のリポソームの内部容積で望ましい濃度の核酸を含む。
【０１６６】
リポソーム調製後、リポソームは、所望のサイズ範囲およびリポソームサイズの比較的狭い分布を達成するようにサイズ調整され得る。１つの好ましいサイズ範囲は約０．２〜０．４ミクロンであり、これは、従来のフィルタ、典型的には０．２２ミクロンフィルタを介した濾過によるリポソーム懸濁液の滅菌を可能にする。リポソームが約０．２〜０．４ミクロンにサイズダウンされた場合、濾過滅菌はハイスループットで実施され得る。いくつかの技術は、リポソームを所望のサイズにサイジングするために利用可能である（例えば、米国特許第４，７３７，３２３号を参照のこと）。
【０１６７】
適切な脂質としては、限定されないが、ＤＯＴＭＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７）、ＤＯＧＳまたはＴｒａｎｓｆｅｃｔａｉｎ（商標）（Ｂｅｈｒら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６９８２−６９８６）、ＤＮＥＲＩＥまたはＤＯＲＩＥ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５：６７−７５）、ＤＣ−ＣＨＯＬ（Ｇａｏ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，１９９１，ＢＢＲＣ  １７９：２８０−２８５）、ＤＯＴＡＰ（商標）（ＭｃＬａｃｈｌａｎら、１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：６７４−６２２）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）およびグリセロ脂質化合物（例えば、欧州特許第９０１４６３号および国際公開第９８／３７９１６号を参照のこと）が挙げられる。
【０１６８】
改善されたＬＡＭＰ構築物との複合体形成に適切な他の分子としては、カチオン分子、例えば、ポリアミドアミン（Ｈａｅｎｓｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｚｏｋａ，１９９３，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．４：３７２−３７９）、樹枝状ポリシン（国際公開第９５／２４２２１号）、ポリエチレンイリニンまたはポリプロピレンｈ−ナイン（国際公開第９６／０２６５５号）、ポリリジン（米国特許第５，５９５，８９７号；仏国特許第２７１９３１６号）、キトサン（米国特許第５，７４４，１６６号）、ＤＮＡ−ゼラチンコアセルベート（例えば、米国特許第６，２０７，１９５号；米国特許第６，０２５，３３７号；米国特許第５，９７２，７０７号を参照のこと）またはＤＥＡＥデキストラン（Ｌｏｐａｔａら、１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：５７０７−５７１７）が挙げられる。
【０１６９】
ウイルスベースの遺伝子送達ビヒクル
一態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物送達ビヒクルは、ウイルスまたはウイルス粒子を含む。この態様では、好ましくは、改善されたＬＡＭＰ構築物はウイルスベクターを含む。レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなどのウイルスベクターは、多くの場合、２つの構成要素、すなわち改変ウイルスゲノムおよびそれを囲むコート構造から構成されるが（例えば、Ｓｍｉｔｈら、１９９５，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７−８３８を参照のこと）、ウイルスベクターはネイキッド形態で導入されるか、またはウイルスタンパク質以外のタンパク質でコーティングされることがある。現在のほとんどのベクターは、野生型ウイルスに似たコート構造を有する。この構造は、ウイルス核酸をパッケージングおよび保護し、標的細胞に結合してそれに侵入する手段を提供する。
【０１７０】
好ましくは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を含むウイルスベクターは、感染性粒子を調製するために使用される宿主細胞（例えば、パッケージング細胞またはヘルパー細胞など）におけるウイルスの成長を可能にしながら、標的細胞におけるウイルスの成長を無効化するように野生型ウイルスゲノムから改変される。ベクター核酸は、一般に、ヘルパー株における複製およびパッケージングのためのシス作用性ウイルス配列、ならびに標的細胞に送達されるポリヌクレオチドの発現を調節するための発現制御配列に必須である。他のウイルス機能は、当技術分野で公知のように、特定のパッケージングまたはヘルパー細胞株でトランスで発現される。
【０１７１】
好ましい改善されたＬＡＭＰ構築物は、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、泡沫状ウイルス、レンチウイルス、セムリキフォレストウイルス、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ポックスウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来するウイルスベクターである。このようなウイルスベクターは当技術分野で周知である。
【０１７２】
好ましい一態様では、使用されるウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスゲノムは、ウイルス複製サイクルを完了するために必要な約３０個を超える遺伝子を有する約３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡ分子からなる。初期遺伝子は、抗ウイルス宿主免疫反応をモジュレートすると考えられるＥ３領域を除いて、ウイルス複製に必須の４つの領域（Ｅ１〜Ｅ４）に分けられる。Ｅ１領域（ＥＩＡおよびＥＩＢ）は、ウイルスゲノムの転写調節に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域遺伝子（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルス複製に必要なポリペプチドの合成をもたらす。Ｅ３領域によりコードされるタンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を防止する（Ｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄｉｎｇ，１９９１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８４：１−８）。Ｅ４領域によりコードされるタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、スプライシングおよび宿主細胞の遮断に関与する（Ｈａｌｂｅｒｔら、１９８５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：２５０−２５７）。後期遺伝子は、一般に、ウイルスカプシドに寄与する構造タンパク質をコードする。加えて、アデノウイルスゲノムは、シス作用性５’および３’ＩＴＲ（逆方向末端反復）ならびにＤＮＡ複製に必須のパッケージング配列を有する。ＩＴＲはＤＮＡ複製起点を有するが、感染性粒子へのアデノウイルスＤＮＡのパッケージングのために、カプシド形成領域が必要である。
【０１７３】
Ｈｅｉｓｅ  ａｎｄ  Ｋｉｍ（２０００，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：８４７−８５１）に記載されているように、特定の細胞（例えば、増殖細胞など）で選択的に複製するために、アデノウイルスベクターは、条件付き複製性であるように操作され得る（ＣＲＡｄベクター）。別の態様では、アデノウイルスベクターは、（例えば、Ｅ１の全体的または部分的な欠失または突然変異誘発により）Ｅ１機能について複製欠損である。ベクターのアデノウイルス骨格は、さらなる改変（１つまたはそれを超えるウイルス遺伝子の欠失、挿入または突然変異）を含み得る。Ｅ２改変の例は、ＤＢＰ（ＤＮＡ結合タンパク質）コード遺伝子に局在する温度感受性突然変異により例示される（Ｅｎｓｉｎｇｅｒら、１９７２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１０：３２８−３３９）。アデノウイルス配列はまた、Ｅ４領域の全部または一部を欠失され得る（例えば、欧州特許第９７４  ６６８号；Ｃｈｒｉｓｔら、２０００，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：４１５−４２７；Ｌｕｓｋｙら、１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８３０８−８３１９を参照のこと）。非必須Ｅ３領域内のさらなる欠失は、送達されるポリヌクレオチドのサイズの増加を可能にし得る（Ｙｅｈら、１９９７，ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１：６１５  ６２３）。しかしながら、ウイルスが免疫系（Ｇｏｏｄｉｎｇら、１９９０，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０：５３−７１）または炎症反応（欧州特許出願公開第００４４０２６７．３号）から逃れることを可能にするポリペプチド（例えば、ｇｐ１９ｋなど）をコードするＥ３配列の全部または一部を保持することが有利であり得る。
【０１７４】
ＩＴＲおよびパッケージング配列を保持し、ウイルス抗原の残存合成を無効化する実質的な遺伝子改変を含む第２世代のベクターもまた、形質導入細胞における発現遺伝子の長期発現を改善するために使用され得る（例えば、国際公開第９４／２８１５２号；Ｌｕｓｋｙら、１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７２：２０２２−２０３２を参照のこと）。
【０１７５】
細胞に導入される改善されたＬＡＭＰ構築物は、シス作用性配列を除いて、ウイルスゲノムの任意の場所に挿入され得る。好ましくは、それは、欠失領域（Ｅ１、Ｅ３および／またはＥ４）の置換、好ましくは欠失Ｅ１領域内に挿入される。
【０１７６】
アデノウイルスは、任意のヒトまたは動物源、特にイヌ科動物（例えば、ＣＡＶ−１またはＣＡＶ−２、それぞれＧｅｎｂａｎｋ  ｒｅｆ．ＣＡＶＩＧＥＮＯＭおよびＣＡＶ７７０８２）、鳥類（Ｇｅｎｂａｎｋ  ｒｅｆ．ＡＡＶＥＤＳＤＮＡ）、ウシ科動物（例えば、ＢＡＶ３；Ｒｅｄｄｙら、１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１３９４  １４０２）、ネズミ科動物（Ｇｅｎｂａｎｋ  ｒｅｆ．ＡＤＲＭＵＳＭＡＶＩ）、ヒツジ、ネコ科動物、ブタまたは類人猿供給業者に由来し得るか、あるいはハイブリッドウイルスであり得る。任意の血清型が用いられ得る。しかしながら、Ｃサブグループのヒトアデノウイルス、特にアデノウイルス２（Ａｄ２）および５（Ａｄ５）が好ましい。このようなウイルスは、例えばＡＴＣＣから入手可能である。
【０１７７】
アデノウイルス粒子または空のアデノウイルスカプシドもまた、米国特許第５，９２８，９４４号に記載されているように、ウイルス媒介共内在化プロセスにより、改善されたＬＡＭＰ構築物を移入するために使用され得る。このプロセスは、カチオン剤、例えば１つまたはそれを超える脂質層を含むポリカルベンまたは脂質小胞の存在下で達成され得る。
【０１７８】
アデノウイルス粒子は、ウイルス複製に必要な欠損ウイルス遺伝子をトランスで供給する相補細胞株またはヘルパーウイルスを使用して、当技術分野の任意の従来技術（例えば、国際公開第９６／１７０７０号）にしたがって調製および増殖され得る。細胞株２９３（Ｇｒａｈａｍら、１９７７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２）およびＰＥＲＣ６（Ｆａｌｌａｕｘら、１９９８，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：１９０９−１９１７）は、Ｅ１欠失を相補するために一般に使用されている。他の細胞株は、欠陥ベクターを相補するように操作されている（Ｙｅｈら、１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５５９−５６５；Ｋｒｏｕｇｈａｋ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ，１９９５，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１５７５−１５８６；Ｗａｎｇら、１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：７７５−７８３；Ｌｕｓｋｙら、１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２０２２−２０３；欧州特許第９１９６２７号および国際公開第９７／０４１１９号）。アデノウイルス粒子は、培養上清からだけではなく溶解後の細胞からも回収され得、必要に応じて標準的な技術（例えば、国際公開第９６／２７６７７号、国際公開第９８／００５２４号、国際公開第９８／２６０４８号および国際公開第００／５０５７３号に記載されているクロマトグラフィー、超遠心分離）にしたがってさらに精製され得る。
【０１７９】
細胞タイプ特異的ターゲティングは、ウイルス表面タンパク質の改変により、広範な宿主範囲を有するアデノウイルスに由来するベクターで達成され得る。例えば、アデノウイルスの感染の特異性は、許容細胞の表面に存在する細胞受容体への付着により決定される。これに関して、アデノウイルスカプシドの表面に存在する繊維およびペントンは、細胞付着において重要な役割を果たす（Ｄｅｆｅｒら、１９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３６６１−３６７３）。したがって、繊維および／またはペントンをコードするウイルス遺伝子の遺伝的改変により、アデノウイルスの細胞ターゲティングを行って、ユニークな細胞表面受容体との特異的相互作用が可能な改変繊維および／またはペントンを生成し得る。このような改変の例は、Ｗｉｃｋａｒｎら、１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８２２１−８２２９；Ａｒｒｉｂｅｒｇら、１９９７，Ｖｉｒｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６８：６８６６−６８６９；Ｒｏｕｘら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９０７９−９０８３；Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｖｉｌｅ，１９９５，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１９０−１９９；国際公開第９３／０９２２１号および国際公開第９５／２８４９４号に記載されている。
【０１８０】
特に好ましい態様では、アデノ随伴ウイルス配列がベクターとして使用される。ヒトパルボウイルスＡＡＶ−２（アデノ随伴ウイルス２型）に由来するベクターは、現在開発されている最も有望な遺伝子送達ビヒクルの１つである。一本鎖ＤＮＡをパッケージングするためのこの系のいくつかの特徴は、送達のためのネイキッドＤＮＡの可能な代替物としてそれを示唆する。主な魅力的な特徴は、ワクシニアまたはアデノウイルスなどの他のウイルスベクターとは対照的に、ＡＡＶベクターは、いかなるウイルス遺伝子も発現しないことである。ワクチン構築物に含まれる唯一のウイルスＤＮＡ配列は、１４５  ｂｐ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）である。したがって、ネイキッドＤＮＡによる免疫化の場合と同様に、発現される遺伝子は、アレルゲンまたはアレルゲンキメラの遺伝子のみである。加えて、ＡＡＶベクターは、ヒト末梢血単球由来樹状細胞などの分裂および非分裂細胞の両方を形質導入し、導入遺伝子発現は持続的であることが公知であり、粘膜免疫の生成のための経口および鼻腔内送達の可能性がある。また、必要なＤＮＡの量は、数桁よりもかなり少ないようであり、５０ｕｇまたは約１０１５コピーのネイキッドＤＮＡ用量とは対照的に、１０１０〜１０１１個の粒子またはコピーのＤＮＡ用量で最大応答である。
【０１８１】
一態様では、ＡＡＶベクターは、構築物をコードするＡＡＶ  ＩＴＲキメラタンパク質に含まれるＤＮＡと、ＩＴＲを有しないＡＡＶコード領域（ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を含むＡＡＶヘルパープラスミドＡＣＧ２とを適切な細胞株（例えば、ヒト２９３細胞）にコトランスフェクトすることによりパッケージングされる。続いて、細胞をアデノウイルスＡｄ５に感染させる。ベクターは、当技術分野で公知の方法（例えば、塩化セシウム密度勾配超遠心分離など）を使用して細胞ライセートから精製され、それらが検出可能な複製可能ＡＡＶまたはアデノウイルスを確実に含まないことを検証され得る（例えば、細胞変性効果バイオアッセイによる）。ＡＡＶ力価は、プロテイナーゼＫによる消化後に調製されたウイルスＤＮＡサンプルを用いた定量的ＰＣＲにより決定され得る。好ましくは、このような方法により生成されるベクター力価は、１ｍｌ当たり約５×１０１２〜１×１０１３個のＤＮａｓｅ耐性粒子である。
【０１８２】
他の態様では、レトロウイルスベクターが使用される。レトロウイルスは統合型ウイルスのクラスであり、ウイルスにコードされる逆転写酵素を使用して複製し、ウイルスＲＮＡゲノムを、感染細胞（例えば、標的細胞）の染色体ＤＮＡに組み込まれる二本鎖ＤＮＡに複製する。このようなベクターとしては、マウス白血病ウイルス、特にモロニー（Ｇｉｌｂｏａら、１９８８，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２４１：２９）またはフレンドのＦＢ２９株（国際公開第９５／０１４４７号）に由来するものが挙げられる。一般に、レトロウイルスベクターは、ウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの全部または一部が欠失されており、５’および３’ＬＴＲならびにカプシド形成配列を保持する。これらのエレメントは、レトロウイルスベクターの発現レベルまたは安定性を増加させるように改変され得る。このような改変としては、ＶＬ３０などのレトロトランスポゾンの１つによるレトロウイルスカプシド形成配列の置換が挙げられる（例えば、米国特許第５，７４７，３２３号を参照のこと）。好ましくは、改善されたＬＡＭＰ構築物は、カプシド形成配列の下流に、好ましくはレトロウイルスゲノムに対して反対方向で挿入される。細胞特異的ターゲティングは、当技術分野で公知のように、レトロウイルスエンベロープタンパク質への抗体または抗体断片のコンジュゲーションにより達成され得る。
【０１８３】
レトロウイルス粒子は、ヘルパーウイルスの存在下で、またはレトロウイルスベクターが欠損するレトロウイルス遺伝子（例えば、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ）をそのゲノムに含み組み込んだ適切な相補（パッケージング）細胞株で調製される。このような細胞株は、先行技術に記載されている（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｍａｎ，１９８９，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０；Ｄａｎｏｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８，Ｖｉｒｏｌ．１６７：４００）。ｅｎｖ遺伝子の産物は、標的細胞の表面に存在するウイルス受容体へのウイルス粒子の結合に関与するので、レトロウイルス粒子の宿主範囲を決定する。本発明の文脈では、両指向性エンベロープタンパク質を含むＰＡ３１７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ９０７８）または２９３ＥＩ６（国際公開第９７／３５９９６号）などのパッケージング細胞株を使用して、ヒトおよび他の種の標的細胞の感染を可能にすることが有利である。レトロウイルス粒子は、好ましくは、培養上清から回収され、必要に応じて、標準的な技術（例えば、クロマトグラフィー、超遠心分離）にしたがってさらに精製され得る。
【０１８４】
他の適切なウイルスとしては、ポックスウイルスが挙げられる。ポックスウイルス科のいくつかのメンバーのゲノムがマッピングされ、シークエンシングされている。ポックスウイルスベクターは、ポックスウイルス科の任意のメンバー、特にカナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルスおよびワクシニアウイルスから得られ得る。適切なワクシニアウイルスとしては、限定されないが、コペンハーゲン株（Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０，Ｖｉｒｏｌ．１７９：２４７−２６６；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９３，Ｖｉｒｏｌ．１９６：３８１−４０１）、ワイエス株および改変アンカラ（ＭＶＡ）株（Ａｎｔｏｉｎｅら、１９９８，Ｖｉｒｏｌ．２４４：３６５−３９６）が挙げられる。ワクシニアウイルスベクターを構築するための一般的な条件は、当技術分野で公知である（例えば、欧州特許第８３  ２８６号および欧州特許第２０６  ９２０号；Ｍａｙｒら、１９７５，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３：６−１４；Ｓｕｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８４７−１０８５１を参照のこと）。好ましくは、目的のポリヌクレオチドは、非必須遺伝子座、例えば非コード遺伝子間領域、または不活化もしくは欠失がウイルス成長および複製を有意に損なわない任意の遺伝子内に挿入される。
【０１８５】
ポックスウイルス粒子は、当技術分野で記載されているように調製される（Ｐｉｃｃｉｎｉら、１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５４５−５６３；米国特許第４，７６９，３３０号；米国特許第４，７７２，８４８号；米国特許第４，６０３，１１２号；米国特許第５，１００，５８７号および米国特許第５，１７９，９９３号）。一般に、ドナープラスミドを構築し、大腸菌における成長により増幅させ、従来の手順により単離する。次いで、それをポックスウイルスゲノムと共に適切な細胞培養物（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞）に導入して、相同組換えによりポックスウイルス粒子を生産する。溶解工程（例えば、化学的溶解、凍結／解凍、浸透圧ショック、超音波処理など）の後、これらを培養上清または培養細胞から回収し得る。連続ラウンドのプラーク精製を使用して、混入野生型ウイルスを除去し得る。次いで、当技術分野で公知の技術（例えば、クロマトグラフィー法または塩化セシウムまたはスクロース勾配における超遠心分離）を使用して、ウイルス粒子を精製し得る。
【０１８６】
天然痘を根絶するための世界的なキャンペーンにおける生ウイルスワクチンとしてのワクシニアの使用は、ワクシニアを、生組換えワクチンベクターとしての明白な開発選択肢にした。１００個近くの異なる外来タンパク質を発現する生組換えワクシニアウイルスが報告されており、これらの多くは有効な実験用ワクチンである（Ｍｏｓｓ  ａｎｄ  Ｆｌｅｘｎｅｒ，１９８７による総説）。ワクシニアは、その大きなゲノムサイズ、少なくとも２５，０００塩基対の外来ＤＮＡを受け入れる能力、および昆虫細胞を含むほとんどの真核細胞タイプに感染する能力（同上）により、発現ベクターとして特に多用途である。他のＤＮＡウイルスとは異なり、ポックスウイルスは、感染細胞の細胞質でのみ複製し、組換えウイルスＤＮＡと宿主染色体との遺伝的交換の可能性を減少させる。組換えワクシニアベクターは、ヒト、他の哺乳動物、寄生虫、ＲＮＡおよびＤＮＡウイルス、バクテリアおよびバクテリオファージを含む様々な供給業者由来のタンパク質を適切にプロセシングおよび発現することが示されている。
【０１８７】
外来タンパク質をコードするＤＮＡの発現は、上流プロモーター配列、および必要な場合にはＲＮＡプロセシングシグナルを含む宿主ウイルス調節エレメントにより制御される。ワクシニアウイルスゲノムの非必須領域への外来ＤＮＡの挿入は、相同組換えにより行われている（Ｐａｎｉｃａｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，７９：４９２７，１９８２；Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：７４１５，１９８２）。
【０１８８】
挿入部位もしくはその近くの転写調節エレメントにより、またはより正確な遺伝子操作により、改善されたＬＡＭＰ構築物によるアレルゲンの発現が起こり得る。外来遺伝子の挿入および発現を大幅に容易にするプラスミドベクターが構築されている（Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，４９：８５７，１９８２）。これらのベクターは、ワクシニア転写プロモーターと、ワクシニアゲノムの非必須領域由来のＤＮＡが隣接する外来コード配列の挿入のための１つまたはそれを超えるユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位とから構成される発現部位を含む。プロモーターの選択は、発現の時期（例えば、初期または後期）および発現のレベルの両方を決定するのに対して、隣接ＤＮＡ配列は相同組換えの部位を決定する。
【０１８９】
この手順で生産された約１０００個のウイルス粒子のうちの１個のみが組換え体である。組換えウイルスプラークは、ＤＮＡハイブリダイゼーションにより識別され得るが、効率的な選択手順が開発されている。隣接配列として非必須ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のセグメントを使用することにより、外来遺伝子はＴＫ遺伝子座に組換えられ、挿入によりＴＫ遺伝子を不活性化する。ＴＫウイルスの選択は、５−ブロモデオキシウリジンの存在下でＴＫ細胞でウイルスプラークアッセイを行うことにより達成される。ヌクレオシド類似体のリン酸化およびその結果として起こるウイルスＤＮＡへの致死的取り込みは、ＴＫ＋親ウイルスが感染した細胞でのみ起こる。トランスフェクションおよび組換えの効率に応じて、最大８０個のプラークが所望の組換え体であり、残りは自然発生ＴＫ突然変異体である。
【０１９０】
大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子と、第２の遺伝子のための発現部位とを含むプラスミドベクターは、親ウイルスと組換え体とを区別する別の方法を可能にする（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３４０３，１９８５）。このような組換え体により形成されるプラークは、適切な指標の追加により形成される青色により明確に識別され得る。ＴＫ選択およびβ−ガラクトシダーゼ発現の両方を組み合わせることにより、組換えウイルスを容易および迅速に単離する。次いで、適切な細胞株における増殖により組換え体を増幅させ、適切な酵素学的、免疫学的または物理的手順により挿入遺伝子の発現をチェックする。
【０１９１】
ワクシニアウイルスゲノムに追加され得る遺伝情報の量の上限はまだ不明である。しかしながら、ほぼ２５，０００塩基対の外来ＤＮＡの追加は、ウイルス収量に対する明らかな悪影響がなかった（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ，２５：２１，１９８３）。必要な場合には、ワクシニアウイルスゲノムの大きなセグメントを欠失させて、さらなる容量を提供し得る（Ｍｏｓｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４０：３８７，１９８１）。
【０１９２】
ウイルスカプシド分子は、細胞へのターゲティングおよび／または進入を容易にするターゲティング部分を含み得る。適切なターゲティング分子としては、限定されないが、化学的コンジュゲート、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリリジン、ＰＥＩなど）、ペプチド、ポリペプチド（例えば、国際公開第９４／４０９５８号を参照のこと）、ビタミン、抗原、レクチン、抗体およびその断片が挙げられる。好ましくは、このようなターゲティング分子は、細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原性エピトープまたは腫瘍関連マーカーを認識してそれに結合する。
【０１９３】
ウイルス粒子をベースとする改善されたＬＡＭＰ構築物を含む組成物は、１０〜１０１４ｉ．ｕ（感染単位）、好ましくは１０〜１０１１ｉ．ｕの用量の形態で製剤化され得る。力価は、従来の技術により決定され得る。ＬＡＭＰ構築物の用量は、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、より具体的には０．１〜２ｍｇ／ｋｇを占める。
【０１９４】
自己複製ＲＮＡ
自己複製ＲＮＡウイルスベクターもまた、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を使用して構築され得る。例えば、アルファウイルス、フラビウイルス、麻疹ウイルスおよびラブドウイルスは、自己複製ＲＮＡウイルスワクチンを生成するために使用され得る。自己複製ＲＮＡウイルスの好ましい株としては、限定されないが、狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）および／またはベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥ）が挙げられる。
【０１９５】
自己複製ＲＮＡウイルスは、組織への送達によりネイティブ抗原を発現するので、病原性への復帰のリスクを有しない生弱毒化ワクチンを模倣する。それらはまた、自然免疫系を刺激するので、反応を増強する。例えば、Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇ，Ｋ．“Ｓｅｌｆ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２）：１７７−９４（２０１５）；Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．，“Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”，Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ５：９（２０１７）；Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．“Ｒｅｐｌｉｃｏｎ  ＲＮＡ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，”Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ４：３９（２０１６）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を含む自己複製ワクチンの使用はまた、プライムブーストプロトコールで使用され得る。
【０１９６】
また、自己複製ＲＮＡウイルスはまた、送達およびターゲティングを改善するために、本明細書に記載されるようにリポソームよりカプセル化され得る。本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を含む自己複製ＲＮＡウイルスによる免疫化は、より高い一過性発現レベルのアレルゲンを提供し、中和抗体反応の生成および安全条件下における致死的チャレンジに対する保護をもたらし得る。
【０１９７】
細胞ベースの送達ビヒクル
本発明の改善されたＬＡＭＰ構築物は、構築物を含む他の細胞（「送達細胞」）により標的細胞に送達され得る。構築物を細胞に導入するための方法は当技術分野で公知であり、細胞の核へのＤＮＡのマイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｈｉら、１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−４８８）；ＣａＰ０４のトランスフェクション（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：２７４５  ２７５２）、エレクトロポレーション（Ｃｈｕら、１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：１３１１−１３２６）；リポフェクション／リポソーム融合（Ｆｅｉｇｎｅｒら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７）および粒子衝撃（Ｙａｎｇら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５６８−９５７２）が挙げられる。適切な細胞としては、自己および非自己細胞が挙げられ、異種細胞が挙げられ得る。送達細胞は、それらの死を誘導することにより（例えば、誘導性自殺遺伝子を細胞に提供することにより）、それらの内容物を標的細胞に送達するように誘導され得る。
【０１９８】
アクセサリー分子
本発明の改善されたＬＡＭＰ構築物を含む組成物は、細胞への改善されたＬＡＭＰ構築物の導入を容易にするための、ならびに／または特定の治療効果を増強し、および／もしくは抗体産生を増強するための１つまたはそれを超えるアクセサリー分子を含み得る。
【０１９９】
加えて、本発明の改善されたＬＡＭＰ構築物を含む組成物は、動物／ヒト体内における分解を阻害するために、および／または標的細胞へのベクターのトランスフェクション／感染を改善するために、１つまたはそれを超える安定化物質、例えば脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ヒドロゲル、ヒアルロニダーゼ（国際公開第９８／５３８５３号）、コラゲナーゼ、ポリマー、キレート剤（欧州特許第８９０３６２号）を含み得る。このような物質は単独で、または組み合わせて使用され得る（例えば、カチオン性および中性脂質）。
【０２００】
また、アデノウイルスタンパク質は、エンドソームを不安定化し、細胞へのＤＮＡの取り込みを増強することができることが示されている。脂質複合ＤＮＡベクターを含む溶液へのアデノウイルスの混合、またはタンパク質架橋剤を使用したアデノウイルスに共有結合的に付着されたポリリジンへのＤＮＡの結合は、改善されたＬＡＭＰ構築物の取り込みおよび発現を大幅に改善し得る（例えば、Ｃｕｒｉｅｌら、１９９２，Ａｍ．Ｉ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４７−２５２を参照のこと）。
【０２０１】
宿主細胞
本発明の改善されたＬＡＭＰ構築物は、限定されないが、原核細胞（例えば、大腸菌、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）；酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）；昆虫細胞；線虫細胞；植物細胞；両生類細胞（例えば、アフリカツメガエル）；鳥類細胞および哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、マウス細胞、哺乳動物細胞株、初代培養哺乳動物細胞、例えば解剖組織由来のもの）を含む様々な宿主細胞で発現され得る。
【０２０２】
分子は、生物から単離された宿主細胞、生物の一部である宿主細胞、または生物に導入される宿主細胞で発現され得る。一態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、インビトロで、例えば培養中の宿主細胞で発現される。別の態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、改善されたＬＡＭＰ構築物をコードする核酸を含む体細胞および／または生殖系列細胞を含むトランスジェニック生物（例えば、トランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ブタ、霊長類など）で発現される。トランスジェニック動物を構築するための方法は当技術分野で周知であり、ルーチンである。
【０２０３】
改善されたＬＡＭＰ構築物はまた、インビトロで細胞に導入され得、細胞（例えば、幹細胞、造血細胞、リンパ球など）を宿主生物に導入し得る。細胞は、宿主生物に関して非相同または自己であり得る。例えば、細胞を宿主生物から得て、改善されたＬＡＭＰ構築物をインビトロで細胞に導入し、次いで、宿主生物に再導入する。
【０２０４】
抗原提示細胞
本発明の好ましい態様では、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物は、天然または操作された抗原提示細胞に導入される。
【０２０５】
本明細書で使用される場合、「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）という用語は、主要組織適合遺伝子複合体分子、好ましくはクラスＩＩ分子またはその一部に関連してその表面に抗原（例えば、アレルゲン）を提示する任意の細胞を意図する。適切なＡＰＣの例は以下で詳細に記載され、限定されないが、全細胞、例えばマクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、ハイブリッドＡＰＣおよびフォスター抗原提示細胞が挙げられる。ハイブリッドＡＰＣを作製するための方法は記載されており、当技術分野で公知である。
【０２０６】
樹状細胞（ＤＣ）は、強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、Ｔ細胞活性化および増殖に必要なすべてのシグナルを提供することが示されている。これらのシグナルは、２つのタイプに分類され得る。免疫反応に特異性を与える第１のタイプは、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３（「ＴＣＲ／ＣＤ３」）複合体と、ＡＰＣ表面の主要組織適合遺伝子複合体（上記で定義される「ＭＨＣ」）クラスＩまたはＩＩタンパク質により提示されるアレルゲン性ペプチドとの相互作用により媒介される。この相互作用は、Ｔ細胞活性化の発生に必要であるが、十分ではない。実際、第２のタイプのシグナルがなければ、第１のタイプのシグナルは、Ｔ細胞アネルギーをもたらし得る。共刺激シグナルと称される第２のタイプのシグナルは、抗原特異的でもＭＨＣ拘束性でもなく、第１のタイプのシグナルの存在下でＴ細胞の全増殖反応およびＴ細胞エフェクター機能の誘導をもたらし得る。
【０２０７】
いくつかの分子は、共刺激活性を増強することが示されている。これらとしては、限定されないが、熱安定抗原（ＨＳＡ）、コンドロイチン硫酸改変ＭＨＣ不変鎖（Ｉｉ−ＣＳ）、細胞内接着分子Ｉ（ＩＣＡＭ−１）およびＡＰＣ表面のＢ７共刺激分子ならびにＴ細胞上のそのカウンター受容体ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４が挙げられる。
【０２０８】
他の重要な共刺激分子は、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６である。本明細書で使用される場合、「共刺激分子」という用語は、Ｔ細胞の表面上のＴＣＲにより結合されるペプチド／ＭＨＣ複合体と一緒に作用すると、ペプチドに結合するＴ細胞の活性化を達成する共刺激効果を提供する任意の単一分子または分子の組み合わせを包含する。したがって、この用語は、ペプチド／ＭＨＣ複合体と一緒に同族リガンドに結合し、Ｔ細胞表面のＴＣＲがペプチドに特異的に結合するとＴ細胞の活性化をもたらす（単独の、別の分子と複合体形成した、または融合タンパク質の一部としての）Ｂ７またはＡＰＣ上の他の共刺激分子、その断片を包含する。共刺激分子は、例えばＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒを含む様々な供給業者から市販されている。
【０２０９】
本発明の一態様では、Ｒｏｍａｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６：１３５−１５１，１９９６およびＢｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６：１２１−１３５，１９９６に記載されている方法は、哺乳動物、例えばネズミ科動物、類人猿またはヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から未成熟および成熟樹状細胞を生成するために使用される。簡潔に言えば、単離されたＰＢＭＣを前処理して、免疫磁気技術によりＴ細胞およびＢ細胞を枯渇させる。次いで、ヒト血漿（好ましくは自己血漿）およびＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４を補充したＲＰＭＩ培地９中でリンパ球枯渇ＰＢＭＣを例えば約７日間培養して、樹状細胞を生成する。樹状細胞は、単球前駆細胞と比較して非接着性である。したがって、およそ７日目に、さらなるプロセシングのために、非接着細胞を回収する。
【０２１０】
ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下におけるＰＢＭＣ由来樹状細胞は、サイトカイン刺激が培養物から除去されると、それらが非接着特性を喪失し、マクロファージ細胞運命に戻り得るという点で未成熟である。未成熟状態の樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性経路のネイティブタンパク質抗原のプロセシングに非常に有効である（Ｒｏｍａｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１１６９，１９８９）。培養樹状細胞のさらなる成熟は、必要な成熟因子を含むマクロファージ馴化培地（ＣＭ）で３日間培養することにより達成される。成熟樹状細胞は、提示のために新たなタンパク質を捕捉する能力が低いが、休止Ｔ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８の両方）を刺激して成長および分化させることにはるかに優れる。
【０２１１】
成熟樹状細胞は、それらの形態変化、例えばより運動性の細胞質プロセスの形成により；非接着性により；ＣＤ８３、ＣＤ６８、ＨＬＡ−ＤＲもしくはＣＤ８６のマーカーの少なくとも１つの存在により；またはＣＤ  １１５などのＦｃ受容体の喪失により識別され得る（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１，１９９１における総説）。成熟樹状細胞は、典型的な細胞蛍光検査法および細胞選別技術およびデバイス、例えばＦＡＣＳｃａｎおよびＦＡＣＳｔａｒを使用して収集および分析され得る。フローサイトメトリーに使用される一次抗体は、成熟樹状細胞の細胞表面抗原に特異的なものであり、市販されている。二次抗体は、ビオチン化Ｉｇ、続いてＦＩＴＣまたはＰＥ結合ストレプトアビジンであり得る。
【０２１２】
あるいは、他の者は、樹状細胞をアップレギュレート（活性化）し、単球を活性化樹状細胞表現型に変換するための方法を報告している。この方法は、カルシウムイオノフォアを培養培地に追加して、単球を活性化樹状細胞に変換することを伴う。例えば、２４〜４８時間の培養期間の開始時におけるカルシウム２１イオノフォアＡ２３１８７の追加は、プールされた「単球＋ＤＣ」画分の均一な活性化および樹状細胞表現型変換をもたらし、特徴的なことに、活性化集団は均一にＣＤ  １４（Ｌｅｕ  Ｍ３）陰性になり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＩＣＡＭ−１、１３７．１および１３７．２をアップレギュレートする。さらに、この活性化バルク集団は、さらに精製されると少数で機能する。サイトカインの特定の組み合わせは、カルシウムイオノフォアで達成される活性化／変換を増幅（または部分的に置換）するために成功裏に使用されている；これらのサイトカインとしては、限定されないが、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−４が挙げられる。各サイトカインは、単独で与えられると、最適なアップレギュレートに不十分である。
【０２１３】
ＡＰＣを単離するための第２のアプローチは、血液中に既に循環する比較的多数のプレコミットＡＰＣを収集することである。コミットＡＰＣをヒト末梢血から単離するための以前の技術は、物理的手順の組み合わせ、例えばメトリザミド勾配および付着／非付着工程（Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌら、ＰＮＡＳ  ８７：７６９８−７７０２，１９９０）；パーコール勾配分離（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：９９６−１００３，１９９４）；ならびに蛍光活性化細胞選別技術（Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：６８４０−５２，１９９３）を伴っていた。
【０２１４】
プロフェッショナル抗原提示細胞（またはその前駆体）を単離するための当技術分野でルーチンな多くの他の方法があり、このような方法および開発され得る他の方法は限定されず、本発明の範囲内に包含される。
【０２１５】
一実施形態では、ＡＰＣおよびしたがって１つまたはそれを超える本明細書に記載されるアレルゲンを提示する細胞は自己のものである。別の実施形態では、本明細書に記載されるアレルゲンを提示するＡＰＣは、同種のもの、すなわち異なる被験体に由来する。
【０２１６】
本明細書で議論されるように、改善されたＬＡＭＰ構築物は、限定されないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、融合、マイクロインジェクション、ウイルスベースの送達または細胞ベースの送達を含む上記方法または当技術分野で公知の他の方法を使用してＡＰＣに導入され得る。Ａｒｔｈｕｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４（ｌ）：１７−２５，１９９７には、ヒト樹状細胞における遺伝子導入法の比較が報告されている。
【０２１７】
公知の、部分的なおよび推定のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、ヒトＭＨＣの遺伝子表記、コンセンサス配列を含アミノ酸およびヌクレオチド配列は公開されており（例えば、Ｚｅｍｍｏｕｒ  ａｎｄ  Ｐａｒｈａｍ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３３：３１０−３２０，１９９１を参照のこと）、ＨＬＡ変異体を発現する細胞株は公知であり、一般に入手可能であり、多くはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）から入手可能である。したがって、ＰＣＲを使用して、ＭＨＣクラスＩＩをコードするヌクレオチド配列を本発明の発現ベクターに容易に作動可能に連結し、次いで、これを使用して、発現のために適切な細胞を形質転換する。
【０２１８】
マクロファージ、Ｂ細胞、単球、樹状細胞およびランゲルハンス細胞などのプロフェッショナルＡＰＣが使用され得る。これらは、標準的な手順（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ３  ａｎｄ  １４，１９９４）を使用して、１）自己ドナー、２）処置すべき宿主とは異なるＨＬＡ特異性を有する非相同ドナーまたは３）異なる種の異種ドナーの血液または組織から収集される。細胞は、正常宿主、または感染症、癌、自己免疫疾患もしくはアレルギーを有する患者から単離され得る。
【０２１９】
プロフェッショナルＡＰＣは、白血球除去および「ＦＩＣＯＬＬ／ＨＹＰＡＱＵＥ」密度勾配遠心分離（フィコールおよび不連続パーコール密度勾配による段階的遠心分離）を使用して、末梢血から得られ得る。ＡＰＣにより内在化され得るアレルゲンへのＡＰＣの曝露を回避する手順を利用して、目的のアレルゲンＸ（配列番号Ｙ）に特異的ではないＴ細胞の活性化をもたらす。
【０２２０】
元々抗原提示ではない細胞は、適切な分子をコードする配列を導入することにより、抗原提示になるように操作され得る。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子、アクセサリー分子、共刺激分子および抗原プロセシング補助分子をコードする核酸配列は、このような遺伝子を含む細胞由来のＤＮＡの直接合成、クローニング、精製などの後に導入され得る。本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物および方法で使用される分子をコードする遺伝子を得るための１つの適切な手段は、選択されたオリゴヌクレオチドプライマー対を有する選択された核酸テンプレートのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅による。例えば、上皮細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、線維芽細胞、活性化Ｔ細胞、好酸球、ケラチノサイト、アストロサイト、ミクログリア細胞、胸腺皮質上皮細胞、シュワン細胞、網膜色素上皮細胞、筋芽細胞、血管平滑筋細胞、軟骨細胞、腸細胞、甲状腺細胞および腎尿細管細胞が使用され得る。これらは、宿主から最近外植された初代細胞であって、樹立細胞株、または多世代にわたってもしくは無限に増殖することができる比較的均一な樹立細胞株を形成するために細胞培養で大規模に継代されていない初代細胞であり得る。
【０２２１】
プロフェッショナルＡＰＣではない細胞は、様々な公知の分離方法を使用して、それらが常在する自己ドナー、非相同ドナーまたは異種ドナーの任意の組織から単離される（Ｄａｒｌｉｎｇ，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉａ．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）。公知のヒトＨＬＡ特異性に一致するＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子を発現するように、非自己細胞、例えば非相同または異種細胞をエクスビボで操作し得る。次いで、これらの細胞を、操作された細胞のＨＬＡ特異性に一致するヒト被験体に導入し得る。１つまたはそれを超える本発明のＬＡＭＰ構築物を発現するように、細胞をエクスビボでさらに操作する。
【０２２２】
操作された細胞は、標準的な細胞培養方法により細胞培養液中で維持される（Ｄａｒｌｉｎｇ，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉａ”．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ”．Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）。本発明で使用するための細胞株は、様々な供給業者から得られるか（例えば、ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ＆Ｈｙｂｉｄｏｍａｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）、または標準的な方法を使用して生産される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）。非形質転換細胞株は、ヒト被験体における使用に好ましい。
【０２２３】
一態様では、ＧＭ−ＣＳＦの影響下で樹状細胞に分化するＣＤ３４＋前駆体は、被験体の体から得られ、本発明のＬＡＭＰ構築物をコードする核酸が細胞に導入され、次いで、これが被験体に注射される。本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物の利用は、特定の抗原に由来するペプチドと、形質導入抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子との会合を増強して、より強力な全身性Ｔ細胞依存性免疫反応および／または抗体産生を有意にもたらす。この戦略でトランスフェクトされる抗原提示細胞は好ましくは自己細胞であるが、宿主で抗原を有効に提示する任意のＭＨＣクラスＩＩ細胞が上記のように使用され得る。
【０２２４】
ペプチドワクチン
改善されたＬＡＭＰ構築物によりコードされるペプチドワクチンも本発明の範囲内である。好ましくは、アレルゲンは、区画／オルガネラ（またはそれが送達されるその後の区画／オルガネラ）内でプロセシングされ、免疫反応をモジュレートすることができるＭＨＣクラスＩＩ分子に結合したエピトープを生成する。
【０２２５】
改善されたＬＡＭＰ構築物によりコードされるペプチドワクチンはまた、膜構造に結合されて、生物の体への投与を容易にし得る。例えば、改善されたＬＡＭＰ構築物によりコードされるペプチドワクチンは、米国特許第４，４４８，７６５号に記載されているように、リポソームに組み込まれ得る。
【０２２６】
タンパク質またはポリペプチドを免疫原として使用すべき場合、それは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物のいずれか１つもしくはそれよりも多くを組換え細胞で発現させることにより生産され得るか、またはそれは、化学合成により調製され得る。例えば、メリフィールド技術（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，ｖｏｌ．８５，ｐｐ．２１４９−２１５４，１９６８）が使用され得る。
【０２２７】
アレルギーの処置
本発明は、アレルゲンＸと相関する花粉症の処置に有用な製剤を提供する。アレルゲンのタンパク質コード配列をコードするＤＮＡプラスミドを動物に送達することは、ＩＦＮ−γ産生を増加させ得、ＩＬ−４産生を低下させ得ることが以前に決定されており、これは、特定のアレルゲンに対してアレルギーの動物の処置において有用である。本発明は、アレルゲンＸと相関するアレルギーを有する患者を処置するための改善されたＬＡＭＰ構築物を提供する。改善されたＬＡＭＰ構築物は、ＭＨＣクラスＩＩ小胞と交差する特定の細胞内輸送パターンを有し、免疫系に対するアレルゲンＸの増強された提示をもたらし、具体的には、抗体反応の増強をもたらす。本発明により提供される核酸および組成物は、アレルギー免疫療法を行うために有用である。
【０２２８】
本発明は、細胞に投与された場合に、増加した特異的抗体反応をもたらす製剤を提供する。アレルゲンＸに対する増加した抗体反応は、ＩｇＥ媒介アレルギー疾患を処置するために有用である。ＩｇＥは、その細胞拘束および同族アレルゲンへの結合により得られる細胞内シグナル伝達に関する特定の特性を有する。Ｂ細胞が、Ｔｈ２細胞により分泌されるＩＬ−４を受容すると、アレルゲンに対してＩｇＥが生成される。これは、ＩｇＥクラス抗体を産生するようにＢ細胞を指示するのに役立つ。Ｂ細胞による分泌により、ＩｇＥは、マスト細胞および好酸球により発現されるその高親和性受容体Ｆｃ−εＲＩに結合し、その結果、これらの細胞および動物は、その後のアレルゲン曝露に対して感作される。その結果として、アレルギーの症候は、アレルゲンの摂取、吸入または経粘膜接触によりトリガーされ得る。抗体の結合特性により、アレルギー症候を軽減する１つの方法は、他の抗体クラスとの競合を介して、ＩｇＥによる結合に利用可能な遊離アレルゲンをキレート化することであると提案されている。特に、ＩｇＧを増加させるアレルギー製剤は、アレルギー疾患を軽減するための経路であると提案されている。本明細書に記載される本発明は、増強されたＩｇＧ産生を誘導するので、臨床的に重要な方法でＩｇＥとＩｇＧとの比の減少を引き起こす。
【０２２９】
特に好ましい実施形態では、本発明は、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を使用することにより、アレルゲンＸに対するアレルギーを処置または予防する方法を提供する。１つの好ましい方法では、本明細書に記載されるアレルゲンＸをコードするポリヌクレオチドを含む改善されたＬＡＭＰ構築物は、アレルゲンＸアレルゲンをエンドソーム／リソソーム区画またはリソソーム関連オルガネラに、前記区画／オルガネラ内における、または抗原が送達される別の区画／オルガネラ内におけるＭＨＣクラスＩＩ分子との会合のためにターゲティングする。このようなキメラＤＮＡ分子は、上記さらなるドメイン配列をコードし得る（例えば、膜貫通ドメイン、シグナル配列、エンドソーム／リソソーム区画またはリソソーム関連オルガネラをターゲティングするための細胞質ドメイン、ジロイシンドメイン、Ｔｙｒモチーフドメイン、プロリンリッチドメイン、Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌドメインなどをコードする配列）。
【０２３０】
宿主細胞
細菌系では、多くの発現ベクターが、意図する用途に応じて有利に選択され得る。例えば、（例えば、改善されたＬＡＭＰ構築物のコードポリペプチドを発現させるために）大量のタンパク質を生産すべき場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指令するベクターが望ましい場合がある。このようなベクターとしては、限定されないが、融合タンパク質が産生されるようにコード配列がベクターのｌａｃ  Ｚコード領域とインフレームで個々にライゲーションされ得る大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  １．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））などが挙げられる。ｐＧＥＸベクターはまた、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、続いて、遊離グルタチオンの存在下における溶出により、溶解細胞から容易に精製され得る。クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るように、ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０２３１】
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを発現させるためにベクターとして使用され得る。ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞で成長する。コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０２３２】
哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系が、改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを発現させるために使用され得る。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、目的のコード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三分割リーダー配列にライゲーションし得る。次いで、インビトロまたはインビボ組換えにより、このキメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムに挿入し得る。
【０２３３】
ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、感染宿主で改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを発現することができる生存可能な組換えウイルスをもたらすであろう（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８  １：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。
【０２３４】
特定の開始シグナルもまた、挿入されたコード配列の効率的な翻訳に必要とされ得る。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームとインフェーズでなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の様々な起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることにより増強され得る（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０２３５】
加えて、挿入された配列の発現をモジュレートするか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を改変およびプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のこのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変のための特徴的および特異的な機構を有する。発現された外来タンパク質の正しい改変およびプロセシングを確実にするために、適切な細胞株または宿主系が選択され得、この目的で、一次転写産物の適切なプロセシング、グリコシル化および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３およびＷ１３８が挙げられる。
【０２３６】
組換えタンパク質の長期高収量産生のために、安定発現が好ましい。例えば、改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを安定発現する細胞株が操作され得る。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるポリヌクレオチドおよび選択可能なマーカーで形質転換され得る。外来ポリヌクレオチドの導入の後、操作された細胞を濃縮培地中で１〜２日間成長させ得、次いで、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドそれらのを染色体に安定的に組み込み、成長して病巣を形成することを可能にし、そして、これがクローニングされて細胞株に拡大され得る。この方法は、有利には、改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを発現する細胞株を操作するために使用され得る。
【０２３７】
限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８  １７（１９８０））遺伝子を含む多くの選択系が使用され得、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞で用いられ得る。また、代謝拮抗薬耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として使用され得る：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２  １５（Ｍａｙ；１９９３））；およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術の分野で一般に公知の方法は、所望の組換えクローンを選択するためにルーチンに適用され得、このような方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら、（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；およびＣｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら、（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されている。
【０２３８】
改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドの発現レベルは、ベクター増幅により増加され得る（総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  Ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照のこと）。改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞培養物に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させるであろう。増幅領域はコード配列に関連するので、改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドの産生も増加するであろう（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０２３９】
ベクター配列に含められ得る他のエレメントとしては、非相同シグナルペプチド（分泌シグナル）、膜固定配列、イントロン、代替スプライス部位、翻訳開始および停止シグナル、インテイン、ビオチン化部位および翻訳後修飾を促進する他の部位、精製タグ、他のタンパク質またはペプチドへの融合をコードする配列、内部リボソーム再入部位により分離された別個のコード領域、例えば選択性（例えば、抗生物質耐性）または選別性（例えば、蛍光）、改変ヌクレオチドを付与する「マーカー」タンパク質をコードする配列、ならびに他の公知のポリヌクレオチドシス作用性フィーチャーが挙げられるが、これらの例に限定されない。
【０２４０】
改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドが組換え発現により生産されたら、それは、タンパク質の精製のための当技術分野で公知の任意の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性（特にプロテインＡの親和性と特定のアレルゲンに対する免疫親和性による）およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の違い、またはタンパク質精製のための他の標準技術により精製され得る。さらに、改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドは、精製を容易にするために、本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の非相同ポリペプチド配列に融合され得る。
【０２４１】
投与
本発明のワクチン材料は、本明細書に記載される免疫刺激性が改善されたＬＡＭＰ構築物を含み得るか、または組換え微生物、もしくは免疫刺激性が改善されたＬＡＭＰ構築物を発現する抗原提示細胞であり得る。本発明のワクチン材料を含む改善されたＬＡＭＰ構築物の調製および個体の免疫化のためのこのような改善されたＬＡＭＰ構築物の投与は、当業者に周知の免疫化原理にしたがって達成される。
【０２４２】
大量のこれらの材料は、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物を発現するレプリコンを含む組換えまたは形質転換細胞を培養することにより得られ得る。培養方法は当業者に周知であり、上記で引用されている文書の１つまたはそれよりも多くに教示されている。改善されたＬＡＭＰ構築物ワクチンは、一般に、組換えまたは形質転換細胞の培養により産生され、薬理学的に許容され得る溶液もしくは懸濁液（通常、これは生理学的に適合性の水溶液である）、または当技術分野、例えば、米国特許第４，４４６，１２８号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているコーティング錠、錠剤、カプセル、坐剤もしくはアンプルで製剤化される。投与は、経口、直腸、鼻腔内または注射による任意の適切な経路であり得、注射は、例えば経皮、皮下、筋肉内または静脈内であり得る。
【０２４３】
改善されたＬＡＭＰ構築物は、哺乳動物において免疫反応を誘導するために十分な量で哺乳動物に投与される。好ましい最小投与量は、投与前に存在したものの少なくとも４倍の濃度まで抗体形成を誘発するために必要な量である。投与のための典型的な初期用量は、静脈内、筋肉内もしくは皮下投与される場合には１０〜５０００マイクログラムまたは組換えベクターの１０５〜１０１１のプラーク形成単位であるが、この量は、ワクチンおよび免疫反応を誘導する他の薬剤の投与で一般に行われるように、投与を行う臨床医により調整され得る。通常、単回投与は、免疫を誘導するために十分であり得るが、複数回投与を行って、反応を確実にしまたはブースティングし得る。
【０２４４】
改善されたＬＡＭＰ構築物ワクチンは、最初に、非ヒト哺乳動物（例えば、マウスまたは霊長類）で試験され得る。例えば、接種マウスの免疫反応のアッセイは、野生型アレルゲンに対するよりも、改善されたＬＡＭＰ構築物に対する強い抗体、Ｔ細胞増殖および細胞傷害性Ｔ細胞応答を実証するために使用され得る。マウスで非常に有効なワクチン製剤が適切なサル免疫反応も誘発するかを決定するために、改善されたＬＡＭＰ構築物はアカゲザルで評価され得る。一態様では、各サルは、免疫化１回当たり合計５ｍｇのＤＮＡを筋肉内送達で投与され、２つの施設に分けられ、０日目ならびに４、８および２０週目に免疫化され、必要に応じたさらなる投与が行われる。抗体反応、ＡＤＣＣ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞抗原特異的サイトカイン染色は、ワクチンに対する免疫反応をモニタリングするために測定され得る。
【０２４５】
本発明の製剤化および投与の適切な方法のさらなる説明は、米国特許第４，４５４，１１６号（構築物）、米国特許第４，６８１，７６２号（組換え細菌）ならびに米国特許第４，５９２，００２号および米国特許第４，９２０，２０９号（組換えウイルス）に見られ得る。
【０２４６】
キット
本発明はさらに、本明細書に記載される方法の実施を容易にするキットを含む。一態様では、キットは、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物と、改善されたＬＡＭＰ構築物を受容するための細胞とを含む。キットは、細胞をプロフェッショナルＡＰＣに操作するための１つまたはそれを超える核酸をさらに含み得る。しかしながら、一態様では、細胞はプロフェッショナルＡＰＣである。細胞は、共刺激分子を発現してもよいしまたは発現しなくてもよい。好ましい態様では、細胞が共刺激分子を発現しない場合、改善されたＬＡＭＰ構築物によりコードされるアレルゲンは自己抗原である。別の態様では、（例えば、ヒトで発現されることが公知の）異なるＭＨＣ分子を発現する細胞のパネルが提供される。さらなる態様では、キットは、細胞（例えば、脂質ベースの製剤、ウイルスパッケージング材料、細胞など）への改善されたＬＡＭＰ構築物の進入を容易にする試薬を含む。なおさらなる態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物が免疫反応を誘発、モジュレートまたは増強する能力を検証するために、改善されたＬＡＭＰ構築物によりコードされるアレルゲンに特異的な１つまたはそれを超えるＴ細胞株が提供される。
【実施例】
【０２４７】
本発明は、以下の実施例を参照してさらに説明される。以下のものは単なる例にすぎず、本発明の範囲内である限り、詳細の改変が行われ得ると認識されよう。
【０２４８】
実施例１−ＬＡＭＰ構築物の構築
当業者に周知の標準的な分子生物学技術を使用して、図１に示されている改善されたＬＡＭＰ構築物を構築し得る。例えば、ポリヌクレオチドを含むプラスミドを、図１に示されている異なる構造ＩＬＣ−１〜ＩＬＣ−６を生成するように設計し得る。図１に示されているＬＡＭＰドメインは、図３〜１０に示されているアミノ酸配列に由来し得る。好ましくは、ＬＡＭＰドメインは、図３〜１０に示されているヒトＬＡＭＰタンパク質に由来する。各ドメインの境界は、図２Ａおよび２Ｂに由来し得る。また、ヒト配列と比較した場合に同等のドメインを識別することにより、オーソログ配列から、対応するドメインをクローニングし得ることが想定される。表１／図１４に記載されているように、アレルゲンＸ（配列番号Ｙ）を個々にまたは組み合わせて、記載されているＬＡＭＰ構築物にクローニングし得る。
【０２４９】
実施例２−ＬＡＭＰ構築物に対するマウスの免疫反応評価
免疫反応をモジュレートする能力について、実施例１に記載されている改善されたＬＡＭＰ構築物の能力を試験し得る。例えば、０、７および１４日目に、ナノパスを使用して、１００ｕｌのＰＢＳ中の５０ｕｇの改善されたＬＡＭＰ構築物で雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを皮内免疫化し得る。次いで、最終投与の２週間後に実験を終了する。
【０２５０】
脾細胞（３×１０５／ウェル）をＴ細胞培地（１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１Ｘ２−ＭＥを含むＲＰＭＩ）中アレルゲン性タンパク質（１０ｕｇ／ｍｌ）で刺激し、４８時間後に上清を収集する。上清を希釈し（４００ｕｌの上清＋２００ｕｌのＴ細胞培地）、ＥＬＩＳＡによりサイトカインを評価する。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、ＩＬ−１０またはＩＬ−４産生を測定し得る。
【０２５１】
あるいは、血清サンプルをＰＢＳ中１％ＢＳＡで１：１００（２１日目）、１：２０００（３５日目）または１：５０００（５６日目）倍希釈し得る。５６日目のサンプルを７．１：３連続希釈でさらに希釈して、エンドポイント抗体力価を測定する。ＩｇＥを検出するために、血清をアガロース−プロテインＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で５０分間処理し、次いで、１：２０希釈サンプルをＥＬＩＳＡプレートにロードする。サンプルをヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰ、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌ）またはラット抗マウス−ＩｇＥ−ビオチン（Ｒ３５−１１８，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、続いてＰｉｅｒｃｅストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で検出する。反応をＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ基質で現像し、ＴＭＢ停止溶液で停止させる。Ｅｐｏｃｈ  ＥＬＩＳＡリーダー（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用することにより、プレートを読み取る（ＯＤ４５０）。バックグラウンド平均（ＰＢＳ）読み取り値の２倍超を差し引くことにより、エンドポイント力価を決定する。Ｅｘｃｅｌ統計関数を使用することにより、群ごとのエンドポイント力価またはＯＤ４５０値の平均および標準誤差を分析する。スチューデントＴ検定を使用することにより、ＩｇＥデータを分析する。試験は両側であり、０．０５以下のｐ値を有意であるとみなした。ワクチン接種の３回投与後、レシピエントマウスでは、抗原特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体が観察されると予想される。免疫反応のＴｈ２からＴｈ１へのスキューが予測されるので、ＩｇＧ２ａレベルは、予想よりもかなり高いと考えられる。
【０２５２】
実施例３−プライム／ブーストプロトコール
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）またはＣＤ２７０としても公知のヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのヒト細胞表面受容体である。近年、ＨＶＥＭは、造血細胞および様々な実質細胞、例えば乳房、黒色腫、結腸直腸および卵巣癌細胞ならびに腸上皮で高度に発現されることが見出されている。ＨＶＥＭは、ＢＴＬＡまたはＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）への結合を介して、Ｔ細胞を阻害または刺激する双方向タンパク質である。
【０２５３】
本発明者らは、ＨＶＥＭ−ＬＡＭＰをコードするＤＮＡワクチンを生成して、腫瘍治療用途でＨＶＥＭの阻害機能を遮断し得る抗体を生成した。本発明者らは、ＬＡＭＰが、ＨＶＥＭ特異的抗体の親和性を増強し、および／またはＨＶＥＭタンパク質のＢ細胞エピトープのレパートリーを拡大することにより、抗体反応を促進すると仮説した。この研究では、本発明者らは、ＬＡＭＰを有するおよび有しないＨＶＥＭコードプラスミド（配列番号１５８および配列番号１５９）の免疫原性を比較した。ＨＶＥＭ−ＬＡＭＰおよびＨＶＥＭおよび組換えＨＶＥＭタンパク質をコードするプラスミドを、本明細書に記載されているように設計した。
【０２５４】
ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から購入した。ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質およびＴＭＢ停止溶液は、ＫＰＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入した。ＥＬＩＳＰＯＴプレートは、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＩＰＳ４５１０）から注文した。ＥＬＩＳＰＯＴで使用したＩＦＮ−γ抗体ペアはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入し、クローンＡＮ１８およびＲ４６Ａ２をそれぞれコーティングおよび検出に使用した。ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＡＥＣ基質は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から購入した。
【０２５５】
６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスはＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＡ）から購入し、Ｉｍｍｕｎｏｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＡ）の動物施設で飼育した。０、７および１４日目に、エレクトロポレーション筋肉内送達により、１０μｇ／用量のＨＶＥＭ−ＬＡＭＰ、ＨＶＥＭまたはＬＡＭＰベクター対照でマウス（ｎ＝６）を処置した。３５日目に、ミョウバンの存在下で腹腔内注射により５μｇのＨＶＥＭタンパク質でマウスをブーストした。２８日目および４９日目に、マウスから採血し、抗体検出のために血清を単離した。５６日目に、マウスを屠殺し、ＥＬＩＳＰＯＴによりＩＦＮ−γ産生について脾細胞を試験した。
【０２５６】
ＥＬＩＳＡ手順は、Ｓｕら、Ｊ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ；（１０）：１−１５（２０１６）に従った。プレートを５μｇ／ｍｌ  ＨＶＥＭタンパク質でコーティングした。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＰｒｉｓｍ  ６ソフトウェアを使用して、データを分析した。
【０２５７】
この研究の主な目的は、ＨＶＥＭ−ＬＡＭＰとＨＶＥＭとの間の抗体プロファイルを比較することであった。２８日目に、ＨＶＥＭ−ＬＡＭＰワクチン接種マウスは、ＨＶＥＭ群のものよりも有意に高いレベルのＨＶＥＭ特異的ＩｇＧ抗体を産生した（図１１）。タンパク質ブースト後、ＨＶＥＭ免疫マウスでは、ＨＶＥＭ特異的抗体が約１０００倍増加し、平均力価は１００から１０８０００に変化した。この結果は、ＨＶＥＭ  ＤＮＡプラスミドにより免疫記憶が誘導されたことを示している。ＨＶＥＭ  ＤＮＡ単独は最小抗体反応を誘導したにすぎないが、タンパク質ブーストは免疫記憶を迅速に呼び戻した。他方、ＨＶＥＭ−ＬＡＭＰ群は、ＨＶＥＭおよびＬＡＭＰ群よりも有意に高い力価を再び示し、平均力価はＨＶＥＭ群の５倍であるが、これは、抗体反応の増強におけるＬＡＭＰの力を示している（図１２）。
【０２５８】
加えて、ＨＶＥＭ＋ＬＡＭＰまたはＨＶＥＭ単独免疫化／ＨＶＥＭタンパク質ブーストマウス由来の血清サンプル（４９日目）をプールし、ペプチドマッピングについて試験した。１２個のペプチドは、プールした血清に結合したことが見出され（マウスＩｇＧ反応）、１２個のペプチドのうちの７個は、強い結合親和性を示した。図１３に示されているように、ＨＶＥＭ＋ＬＡＭＰは、ＨＶＥＭ単独と比較して、ペプチド１７、２４、２５および２８の結合親和性を変化させる。これらの変化は、腫瘍成長の保護において生理学的効果を有し得る。
【０２５９】
この実施例は、記載されているアレルゲンと一緒に、本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物によるプライムブーストプロトコールを使用する能力を示す。
【０２６０】
実施例４−Ａｍｂ  ａ  １−ｈＬＡＭＰの試験
主なアレルギーリスク因子であるブタクサは、北米およびヨーロッパの一部で最も重要な花粉アレルゲンの１つである。疫学研究は、米国人口の２３％〜３２．８％がブタクサに感作されるのに対して、ヨーロッパ諸国における感作の有病率は３．５％（例えば、イタリア）〜５４％（例えば、ハンガリー）で変動することを示した。ブタクサ花粉の最も豊富なアレルゲンであるＡｍｂ  ａ  １は、６３％〜８７％の範囲のアミノ酸配列同一性を有する５つのアイソフォームの混合物から構成される。Ａｍｂ  ａ  １の臨床的関連性は多数の刊行物に記載されている。ＤＮＡワクチン接種は、ブタクサ花粉アレルギーの有効な予防および治療解決策として大きな可能性を有する。本発明者らは、以前、ＤＮＡワクチン技術の利点をＬＡＭＰ−１のＭＨＣ  ＩＩ経路ターゲティング特性と統合し、ブタクサアレルギーに対する新規ＤＮＡワクチンを設計した。
【０２６１】
ここでは、本発明者らは、ＬＡＭＰのヒンジ領域を置き換えることにより、本発明者らのＬＡＭＰプラットフォームを最適化した（ＩＬＣ−４）。この研究は、アレルゲンとして配列番号１３７の配列を使用して、異なるバージョンのＡｍｂ  ａ  １−ＬＡＭＰワクチンのインビボ免疫原性を比較することを目的とする。対照ベクター、Ａｍｂ  ａ  １−ｈＬＡＭＰ（完全ＬＡＭＰ）、Ａｍｂ  ａ  １−ｈＬＡＭＰ前内腔（ＩＬＣ−１）、Ａｍｂ  ａ  １−ｈＬＡＭＰヒンジ（ＩＬＣ−４）およびＡｍｂ  ａ  １タンパク質は、ＮＴＣ（Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）により作製された。ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ−ＨＲＰおよびヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から購入した。ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質およびＴＭＢ停止溶液は、ＫＰＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入した。マウスモノクローナル抗ｈＬＡＭＰは、Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。ウサギモノクローナル抗ＧＡＰＤＨ抗体は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から購入した。ヤギ抗マウスおよびヤギ抗ウサギ二次抗体は、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｗａｙｎｅ，ＰＡ）から入手した。
【０２６２】
ワクチン、アジュバントおよび免疫化。４０μｇの対照ベクター、完全ＬＡＭＰ、ＩＬＣ−１およびＩＬＣ−４を、皮内／エレクトロポレーション注射のために２０μｌ／マウス／用量の総容量で使用した。０、７および１４日目に、皮内送達により、マウスをワクチンで免疫化した。血清収集のために２８日目および４０日目に、マウスを採血した。血清を収集し、−３０℃で保存した。
【０２６３】
ウエスタンブロット。リポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、プラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞をＰＢＳで洗浄し、停止プロテイナーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含む２００μｌのＲＩＰＡ溶解バッファーに懸濁した。ライセートを遠心分離し（７００ｇ、４℃で１５分間）、続いて、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、清澄化上清中のタンパク質濃度を測定した。５μｇのタンパク質をプレキャスト（４〜２０％）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で電気泳動させ、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）に転写した。膜をＤｅｔｅｃｔｉｏｎ（商標）ブロックバッファー（ＫＰＬ）でブロッキングし、抗ヒトＬＡＭＰ（図１５Ａ）または抗ＧＡＰＤＨおよびヤギ抗マウスＨＲＰまたはヤギ抗ウサギ抗体（図１５Ｂ）でプローブし、続いて、ＴＭＢ（ＫＰＬ）で現像した。
【０２６４】
ＥＬＩＳＡによる血清Ａｍｂ  ａ  １特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの測定。図１６に示されているように、間接ＥＬＩＳＡにより、Ａｍｂ  ａ  １に対するマウス抗体反応を評価した。ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ）をＰＢＳバッファー中５μｇ／ｍｌ  Ａｍｂ  ａ  １で一晩コーティングし、次いで、ＰＢＳ中２％ＢＳＡでブロッキングした。血漿サンプルをブロッキングバッファーで１：３００または１：１０００希釈した。サンプルをヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰまたはＩｇＧ２ａ−ＨＲＰで検出した。反応をＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ基質で現像し、ＫＰＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のＴＭＢ停止溶液で停止させた。Ｅｐｏｃｈ  ＥＬＩＳＡリーダー（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用することにより、プレートを読み取った（ＯＤ４５０）。
【０２６５】
統計。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェアを使用して二元配置ＡＮＯＶＡ検定を実施して、統計的有意性を評価した。データは、抗体力価の平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝９）。二元配置ＡＮＯＶＡを統計分析に使用した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【０２６６】
結果。この研究では、本発明者らは、Ａｍｂ  ａ  １−ＬＡＭＰワクチンの異なる構築物を試験した。ＤＮＡワクチンの３回投与後（１週間間隔）、本発明者らは、ＩＬＣ−１およびＩＬＣ−４が、４０日目に完全ＬＡＭＰ  Ａｍｂ  ａ  １ワクチンよりも予想外に高いＡｍｂ  ａ  １特異的ＩｇＧ２ａ応答を誘導したことを見出した。
【０２６７】
実施例５−Ｂｅｔ  ｖ  １−ｈＬＡＭＰの試験
主なカバノキ花粉アレルゲンであるＢｅｔ  ｖ  １は、呼吸器アレルギーを引き起こすＰＲ−１０タンパク質ファミリーのプロトタイプと考えられる。カバノキアレルギー患者の大多数（＞９０％）はＢｅｔ  ｖ  １に反応し、その結果として、カバノキ花粉アレルギーのマーカーとして使用される。ＤＮＡワクチン接種は、早春におけるカバノキ花粉アレルギーの有効な予防および治療解決策として大きな可能性を有する。
【０２６８】
ここでは、本発明者らは、実施例４に記載されているように、対照ベクターＢｅｔ  ｖ  １−ｈＬＡＭＰ（完全ＬＡＭＰ）、Ｂｅｔ  ｖ  １−ｈＬＡＭＰ前内腔（ＩＬＣ−１）、Ｂｅｔ  ｖ  １−ｈＬＡＭＰヒンジ（ＩＬＣ−４）およびＢｅｔ  ｖ  １タンパク質から発現されたタンパク質を試験した。この実施例では、配列番号１４１の配列がアレルゲンである。図１５Ａおよび図１５Ｂは、発現を実証する。図１７に示されているように、ＤＮＡワクチンの３回投与後（１週間間隔）、本発明者らは、ＩＬＣ−４が、２８日目および４１日目に完全ＬＡＭＰ  Ｂｅｔ  ｖ  １およびＩＬＣ−１ワクチンよりも予想外に有意に強いＢｅｔ  ｖ  １特異的ＩｇＧ２ａ応答を誘導したことを見出したが、これは、この新たなバージョンのＢｅｔ  ｖ  １−ＬＡＭＰ構築物が非常に免疫原性であることを示唆している。
【０２６９】
実施例６−Ｆｅｌ  ｄ  ４−ｈＬＡＭＰの試験
ネコは人気の家庭用ペットであり、一般にアレルギーを引き起こす。ネコアレルギーは、主なアレルゲンＦｅｌ  ｄ  １がリポカリンではなくウテログロビン様タンパク質であるという点で、哺乳動物に対するアレルギーの中でもユニークである。しかしながら、ネコ感受性個体では、ネコにより産生されるリポカリンアレルゲンとして識別されているＦｅｌ  ｄ  ４が比較的高い頻度でＩｇＥに結合する。したがって、ネコアレルゲンの生化学的スペクトルは、特に、ネコリポカリンタンパク質がアレルギー個体のネコに対する感作において果たし得る役割に関して不確実である。最近、ペットアレルギーを有する患者において、Ｆｅｌ  ｄ  １およびＦｅｌ  ｄ  ４特異的ＩｇＥが評価された。ネコアレルギーを有する者のうち、９４％が増加したＦｅｌ  ｄ  １レベルを有しており（＞０．３５ｋＵ／Ｌ）、４９％が増加したＦｅｌ  ｄ  ４レベルを有していた。
【０２７０】
ここでは、本発明者らは、実施例４に記載されているように、対照ベクターＦｅｌ  ｄ  ４−ｈＬＡＭＰ（完全ＬＡＭＰ）、Ｆｅｌ  ｄ  ４−ｈＬＡＭＰ前内腔（ＩＬＣ−１）、Ｆｅｌ  ｄ  ４−ｈＬＡＭＰヒンジ（ＩＬＣ−４）およびＦｅｌ  ｄ  ４タンパク質から発現されたタンパク質を試験した。図１５Ａおよび図１５Ｂは、発現を実証する。この実施例では、配列番号１８２の配列がアレルゲンである。図１８に示されているように、ＤＮＡワクチンの３回投与後（１週間間隔）、本発明者らは、ＩＬＣ−１が、２８日目および４１日目に他の群よりもわずかに高いＦｅｌ  ｄ  ４特異的ＩｇＧ２ａ応答を誘導したことを見出した。しかしながら、ＩＬＣ−１とＩＬＣ−４との間に統計的差異はない。
【０２７１】
実施例７−Ｃｒｙ  Ｊ  １の試験
日本アカスギの木は、日本における文化的シンボルであるが、その花粉は国民的災難である。日本の人口の推定２５％である２５００万人超の者が、日本アカスギ花粉に対してアレルギーがある。
【０２７２】
本発明者らは、ＥＬＩＳＡにより、Ｃｒｙ  Ｊ  １およびＣｒｙ  Ｊ  ２特異的抗体反応を試験した。図１５Ｃ。この実施例では、配列番号２２４の配列がアレルゲンである。０、７および１４日目に、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、耳を介して２０ｕｌのＰＢＳ中４０ｕｇの対照ベクター、ＣｒｙＪ１＋ＣｒｙＪ２＋完全ＬＡＭＰまたはＣｒｙ  Ｊ１＋Ｊ２＋ＩＬＣ−４  ＤＮＡで皮内免疫化した。最終投与の２６日後に、研究を終了した。２８日目および４０日目に、血清サンプルを収集した。間接ＥＬＩＳＡにより、Ｃｒｙ  Ｊ  １とＣｒｙ  Ｊ  ２特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを測定した。データは、抗体力価の平均±ＳＥＭを表す。Ｎ＝６／群。二元配置ＡＮＯＶＡを統計分析に使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【０２７３】
完全およびＩＬＣ−４単一Ｃｒｙ  Ｊ  １＋Ｊ２＋ＬＡＭＰ構築物を比較した。Ｃｒｙ  Ｊ  １およびＣｒｙ  Ｊ  ２特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答は図１９に要約されている。Ｃｒｙ  Ｊ  １では、ＩＬＣ−４構築物はより高い力価の傾向を示したが、これらは統計的に有意ではなかった。しかしながら、Ｃｒｙ  Ｊ  ２特異的応答では、力価は、完全ＬＡＭＰ構築物よりも統計的に（ｓｔａｔｉｃａｌｌｙ）高かった。
【０２７４】
結論として、この研究からのデータは、２つの構築物がインビボで発現され、ＬＡＭＰが体液性免疫反応を有意に改善したことを示唆している。
【０２７５】
本明細書に記載されるものの変形、改変および他の実施は、本発明および特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱せずに、当業者に想到するであろう。特定されているすべての特許、特許出願、国際出願および参考文献は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【図１４−８】
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【図１４−９】
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【図１４−１０】
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【図１４−１１】
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【図１４−１２】
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【図１４−１３】
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【図１４−１４】
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【図１４−１５】
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【図１４−１６】
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【図１４−１７】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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