(57)【要約】  本発明は、治療有効量のスクレロスチンアンタゴニストを対象に投与するステップを含む、対象においてミオパチーを処置するための方法および組成物に関する。ミオパチーは、骨格筋の量、サイズ、力および／または機能の喪失によって特徴付けることができる。スクレロスチンアンタゴニストは、抗スクレロスチン抗体であってもよい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてミオパチーを処置する方法であって、前記対象に治療有効量のスクレロスチンアンタゴニストを対象に投与するステップを含む方法。
【請求項２】
前記ミオパチーは、骨格筋の量、サイズ、力および／または機能の喪失によって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ミオパチーは、悪液質、サルコペニア、またはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）もしくはベッカー型筋ジストロフィー（ＤＭＢ）などの筋ジストロフィー（ＭＤ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ミオパチーは、がん悪液質、がん関連筋炎（ＣＡＭ）、炎症性ミオパチーまたは骨格筋の量、サイズ、力および／または機能のステロイド誘発性の喪失などの、骨格筋の量、サイズ、力および／または機能のがん関連の喪失である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記がんは、乳がん、肺がん、前立腺がん、多発性骨髄腫、胆管癌、または肝細胞癌である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記がんは乳がんである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記スクレロスチンアンタゴニストは、抗スクレロスチン抗体、小分子化合物またはオリゴヌクレオチドである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗スクレロスチン抗体は、マウス抗体、キメラヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗スクレロスチン抗体はモノクローナル抗体である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗スクレロスチン抗体はヒト化抗体である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗スクレロスチン抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、またはジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗スクレロスチン抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプなどのＩｇＧアイソタイプのものである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗スクレロスチン抗体は、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗スクレロスチン抗体は、
ａ）配列番号８と記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセントの配列同一性を有するＶＨポリペプチド配列；および／または
ｂ）配列番号９と記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセントの配列同一性を有するＶＬポリペプチド配列
を含む、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗スクレロスチン抗体は、配列番号８と記載のアミノ酸配列を含むＶＨポリペプチド配列および配列番号９と記載のアミノ酸配列を含むＶＬポリペプチド配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗スクレロスチン抗体は、
ａ）配列番号１０と記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する完全長重鎖アミノ酸配列；および／または
ｂ）配列番号１１と記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する完全長軽鎖アミノ酸配列
を含む、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗スクレロスチン抗体は、配列番号１０と記載のアミノ酸配列を含む完全長重鎖アミノ酸配列および配列番号１１と記載のアミノ酸配列を含む完全長軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗スクレロスチン抗体は、配列番号１６および／または配列番号１７から選択される配列に結合する、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗スクレロスチン抗体は、配列番号８と記載のアミノ酸配列を有するＶＨポリペプチド配列および配列番号９と記載のアミノ酸配列を有するＶＬポリペプチド配列を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合する、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗スクレロスチン抗体は、配列番号１２と記載のアミノ酸配列を有する完全長重鎖アミノ酸配列および配列番号１３と記載のアミノ酸配列を有する完全長軽鎖アミノ酸配列を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合する、請求項７〜１２または１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗スクレロスチン抗体は、配列番号１４と記載のアミノ酸配列を有する完全長重鎖アミノ酸配列および配列番号１５と記載のアミノ酸配列を有する完全長軽鎖アミノ酸配列を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合する、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗スクレロスチン抗体はセトルスマブ、ロモソズマブ、またはブロソズマブである、請求項７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象に治療有効量のさらなる治療剤を投与するステップを含み、任意選択で、前記さらなる治療剤は抗がん薬および／またはミオパチーの処置用の薬剤である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記さらなる治療剤は、
イマチニブ、レナリドマイド、ボルテゾミブ、ロイプロレリン、アビラテロンおよびペメトレキセドなどの化学療法剤、リツキシマブ、ベバシズマブ、トラスツズマブ、およびセツキシマブなどのモノクローナル抗体、ビスホスホネート、ゾレドロン酸、デノスマブ、アレンドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、リセドロネート、テリパラチド、アバロパラチドおよびカルシトリオールなどの骨温存薬
のうちの１つまたは複数から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
対象においてミオパチーを処置するのに使用するための抗スクレロスチンアンタゴニストであって、任意選択で、前記ミオパチーは請求項２〜６のいずれか一項に記載の通りに定義され、および／または前記スクレロスチンアンタゴニストは請求項７〜２２のいずれか一項に記載の通りに定義される、抗スクレロスチンアンタゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミオパチー、特に、骨格筋の量、サイズ、力および／または機能の喪失によって特徴付けられるミオパチーの処置の分野の発明である。
【背景技術】
【０００２】
ミオパチーは、骨格筋組織または筋肉の疾患または障害である。一次症状には、筋線維の機能不全に起因する筋力低下ならびに筋萎縮が含まれる。こむら返り、筋肉痛、および労作性疲労は、一般的な他の主症状である。がん関連のミオパチーにはがん悪液質が含まれ、これは、進行性の機能障害、治療関連合併症、生活の質の悪さ、およびがん関連死亡につながる。いくつかの推計によれば、がん死のほぼ３分の１は、がん悪液質が原因とされる。ミオパチーの現在の処置法としては、薬物療法や理学療法が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ミオパチーのさらなる改善された処置法の必要性が依然としてあり、これらを提供することが本発明の一目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
処置の方法
本発明は、対象においてミオパチーを処置する方法であって、対象に治療有効量のスクレロスチンアンタゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。
【０００５】
ミオパチーは、骨格筋組織または筋肉の疾患または障害である。一次症状には、筋線維の機能不全に起因する筋力低下ならびに筋萎縮が含まれる。こむら返り、筋肉痛、および労作性疲労は、一般的な他の主症状である。ミオパチーの診断は、当業者にとっては通常のことであり、病歴ならびに椅子立ち上がりテスト、タイムアップアンドゴーテスト、タンデム立位テストおよびハンドグリップテストといった身体検査テストに基づくことができる。診断検査としては、カリウムレベルおよび種々の筋肉酵素（クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）およびピルビン酸キナーゼ（ＰＫ））および筋炎特異的自己抗体のレベルを測定する血液検査、筋肉の電気的活動を計測する筋電図（ＥＭＧ）、筋生検、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、異常筋、筋喪失および脂肪変性を特定する超音波分析または生体電気分析、ならびに遺伝子検査が挙げられる。
【０００６】
本発明の一実施形態では、ミオパチーは、骨格筋の量、サイズ、力および／または機能の喪失によって特徴付けられる。上記のように、これらのパラメーターは、当業者によって通常に決定することができる。骨格筋の量および／またはサイズの喪失は、たとえば、ＣＴ、ＭＲＩ、超音波または生検のうちの１つまたは複数によって決定することができる。骨格筋の力および／または機能の喪失は、たとえば、椅子立ち上がりテスト、タンデム立位テスト、タイムアップアンドゴーテスト、ハンドグリップテスト、ＥＭＧ、および診断血液検査のうちの１つまたは複数によって決定することができる。骨格筋の機能の喪失は、たとえば、椅子立ち上がりテスト、タンデム立位テスト、タイムアップアンドゴーテスト、ハンドグリップテスト、ＥＭＧ、および診断血液検査のうちの１つまたは複数によっても決定することができる。一実施形態では、ミオパチーは、骨格筋の量の喪失によって特徴付けられる。一実施形態では、ミオパチーは、骨格筋のサイズの喪失によって特徴付けられる。一実施形態では、ミオパチーは、骨格筋の力の喪失によって特徴付けられる。一実施形態では、ミオパチーは骨格筋の機能の喪失によって特徴付けられる。骨格筋の量、サイズ、力および／または機能の喪失によって特徴付けられるミオパチーの例としては、悪液質、サルコペニア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）またはベッカー型筋ジストロフィー（ＤＭＢ）などの筋ジストロフィー（ＭＤ）が挙げられる。したがって、一実施形態では、ミオパチーは悪液質である。一実施形態では、ミオパチーはサルコペニアである。一実施形態では、ミオパチーはＤＭＤまたはＢＭＤなどの筋ジストロフィー（ＭＤ）である。骨格筋の量、サイズ、力および／または機能は、固定化、重力喪失、または廃用により喪失する場合もある。
【０００７】
一実施形態では、ミオパチーは、骨格筋の量、サイズ、力および／または機能のがん関連の喪失である。骨格筋の量、サイズ、力および／または機能のがん関連の喪失の例としては、悪液質およびがん関連筋炎（ＣＡＭ）、炎症性ミオパチーならびに骨格筋の量、サイズ、力および／または機能のステロイド誘発性の喪失が挙げられる。骨格筋の量、サイズ、力および／または機能のがん関連の喪失は、乳がん、肺がん、前立腺がん、多発性骨髄腫、胆管癌、または肝細胞癌に起因することができる。一実施形態では、がんは乳がんである。したがって、一実施形態では、本発明は、対象において骨格筋の量、サイズ、力および／または機能の乳がん関連の喪失を処置する方法であって、対象に治療有効量のスクレロスチンアンタゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。
【０００８】
一実施形態では、ミオパチーは、スクレロスチン発現のレベルの上昇によってさらに特徴付けられる。すなわち、ミオパチーに罹患している患者は、ミオパチーに罹患していない患者に対して、スクレロスチンの発現のレベルが上昇している。生物学的試料中のスクレロスチンの発現および濃度を決定する方法は、当業者にとって通常のものである（その方法がそれを参照することにより本明細書に明確に組み込まれる、Bezooijen et al. 2004, J Exp Med Vol. 199(6):805-814およびMcNulty et al. 2011, JCEM Vol. 96(7):E1159-E1162を参照されたい）。
【０００９】
本発明者らは、本発明によるスクレロスチンアンタゴニストの使用は、ミオパチーに罹患している患者において骨格筋の量、サイズ、力および／または機能を向上させるのに、特に、悪液質などの骨格筋の量、サイズ、力および／または機能のがん関連の喪失に罹患している患者の状況において、有用であると考えている。スクレロスチンアンタゴニストによる処置は、ミオパチーに罹患している患者の生存を延長／寿命を延ばすこともできる。したがって、一実施形態では、治療有効量のスクレロスチンアンタゴニストの投与によって、骨格筋の量、サイズ、力および／または機能が向上する。一実施形態では、治療有効量のスクレロスチンアンタゴニストの投与によって、骨格筋の量が向上する。一実施形態では、治療有効量のスクレロスチンアンタゴニストの投与によって、骨格筋のサイズが向上する。一実施形態では、治療有効量のスクレロスチンアンタゴニストの投与によって、骨格筋の力が向上する。一実施形態では、治療有効量のスクレロスチンアンタゴニストの投与によって、骨格筋の機能が向上する。
【００１０】
一実施形態では、本発明の方法は、対象に、抗がん薬および／またはミオパチーの処置用の薬剤などの、治療有効量のさらなる治療剤を投与するステップを含む。抗がん薬およびミオパチーの処置用の薬剤は、当業者によく知られている。抗がん薬の非網羅的な例としては、イマチニブ、レナリドマイド、ボルテゾミブ、リュープロレリン、アビラテロンおよびペメトレキセドなどの化学療法剤、ならびにリツキシマブ、ベバシズマブ、トラスツズマブおよびセツキシマブなどのモノクローナル抗体、が挙げられる。ミオパチーの処置用の薬剤の例としては、ビスホスホネート、ゾレドロン酸、デノスマブ、アレンドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、リセドロネート、およびテリパラチド、アバロパラチドおよびカルシトリオールなどの骨温存薬、が挙げられる。本発明のスクレロスチンアンタゴニストおよびさらなる治療剤は、同時に、別々にまたは連続的に投与することができる。
【００１１】
別の態様では、本開示は、対象においてがんを処置する方法であって、対象に治療有効量のスクレロスチンアンタゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。ミオパチーの処置に関連して本明細書に記載の実施形態はいずれも、本開示のがんの態様の処置に対して等しく当てはまる。したがって、ほんの一例として、一実施形態では、がんは乳がんであり、一実施形態では、スクレロスチンアンタゴニストは、抗スクレロスチン抗体セトルスマブである。
【００１２】
がん誘発性の骨溶解性疾患は、骨溶解性破壊および骨芽細胞破壊を伴う、骨髄へのがん細胞の播種性転移として定義される。がん誘発性の骨溶解性疾患は、疼痛、脊髄圧迫や骨折のリスクの増大を引き起こす。がん誘発性の骨溶解性疾患は、乳がん、前立腺がん、肺がん、腎がん、甲状腺がん、皮膚がん、卵巣がん、ならびに多発性骨髄腫に関連している。がん誘発性の骨溶解性疾患の診断は、当業者にとって通常であり、Ｘ線撮影法、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）および１８ＦＤＧ−ＰＥＴを含めて種々の画像診断法に基づくことができる。
【００１３】
別の態様では、本開示は、対象においてがん誘発性の骨溶解性疾患を処置する方法であって、対象に治療有効量のスクレロスチンアンタゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。ミオパチーの処置に関連して本明細書に記載の実施形態はいずれも、本開示のがん誘発性の骨溶解性疾患の態様の処置に対して等しく当てはまる。したがって、ほんの一例として、一実施形態では、がんは乳がんであり、一実施形態では、スクレロスチンアンタゴニストは、抗スクレロスチン抗体セトルスマブである。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「対象」または「個体」または「患者」という用語は、治療を必要とする人を指す。本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、たとえば哺乳動物および非哺乳動物、たとえばマウス、ラット、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマおよびウシを含む。しかし、典型的には、「対象」という用語はヒトを指す。
【００１５】
「有効量」または「に有効な量」または「治療有効量」という用語は、所望の結果、特に疾患の進行の予防および／または対象が処置されている疾患に伴う症状の改善をもたらすのに十分な治療剤の投薬量への言及を含む。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「処置する」、「処置すること」または「処置」という用語は、その目的が、骨格筋の量、サイズ、力および／または機能の喪失などの望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速する（和らげる）ことである、治療手段を指す。有益または所望の臨床結果には、それらに限定されないが、症状の緩和、疾患の程度の縮小、疾患の安定化（すなわち、非増悪）状態、疾患の進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または寛解、および、緩解（部分的であれ、完全であれ）が含まれる。「処置」とはまた、処置を受けない場合の予測される生存と比較して生存の延長も意味することができる。処置を必要とする対象とは典型的には、処置が与えられる疾患、状態または障害にすでに罹患している患者を指す。
【００１７】
一態様では、本開示は、対象においてミオパチーを処置するのに使用するためのスクレロスチンアンタゴニストを提供する。ミオパチーの処置の方法に関連して本明細書に記載の実施形態／開示はいずれも、本開示のこの医学的使用の態様に対して等しく当てはまる。
【００１８】
一態様では、本開示は、ミオパチーを処置する医薬の製造におけるスクレロスチンアンタゴニストの使用を提供する。ミオパチーの処置の方法に関連して本明細書に記載の実施形態／開示はいずれも、本開示のこの使用の態様に対して等しく当てはまる。
【００１９】
一態様では、本開示は、対象においてがんを処置するのに使用するためのスクレロスチンアンタゴニストを提供する。対象におけるがんの処置の方法に関連して本明細書に記載の実施形態／開示はいずれも、本開示のこの医学的使用の態様に対して等しく当てはまる。
【００２０】
一態様では、本開示は、対象においてがん誘発性の骨溶解性疾患を処置するのに使用するためのスクレロスチンアンタゴニストを提供する。対象におけるがん誘発性の骨溶解性疾患の処置の方法に関連して本明細書に記載の実施形態／開示はいずれも、本開示のこの医学的使用の態様に対して等しく当てはまる。
【００２１】
スクレロスチンアンタゴニスト
スクレロスチンは、ヒトにおいてＳＯＳＴ遺伝子によってコードされる天然タンパク質である。スクレオスチンは、Ｃ末端システインノット様（ＣＴＣＫ）ドメインと、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）アンタゴニストのＤＡＮ（ディファレンシャルスクリーニングにより選択された神経芽細胞腫の異常遺伝子（differential screening-selected gene aberrative in neuroblastoma））ファミリーに対する配列類似性と、を有する分泌性糖タンパク質である。スクレロスチンは主に骨細胞によって産生されるが、他の組織でも発現する。ヒトスクレロスチンのアミノ酸配列を、配列番号１に提供する。
【００２２】
スクレロスチンアンタゴニストは当分野で知られており、これには抗体、小分子化合物およびオリゴヌクレオチドが含まれる。したがって、一実施形態では、スクレロスチンアンタゴニストは、抗体、小分子化合物、またはオリゴヌクレオチドである。小分子スクレロスチンアンタゴニストは、たとえば、それを参照することにより本明細書に明確に組み込まれる、国際公開第２０１４１５３２０３号パンフレットに記載されている。オリゴヌクレオチドのスクレロスチンアンタゴニストの例としては、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらなるスクレロスチンアンタゴニストを同定する方法は、たとえば、それらの方法がそれらを参照することにより本明細書に明確に組み込まれる欧州特許第２２７７５２２号および米国特許第９７９１４６２号に記載のように、当分野で知られている。
【００２３】
本発明のスクレロスチンアンタゴニストは典型的には、ヒトスクレロスチンに高い親和性で結合する。本明細書で使用する場合、「高い親和性」という用語は、ヒトスクレロスチンに、１×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下、１×１０−１１Ｍ以下または１×１０−１２Ｍ以下のＫＤで結合するスクレロスチンアンタゴニストを指す。一実施形態では、スクレロスチンアンタゴニストは、ヒトスクレロスチンに１×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する。一実施形態では、スクレロスチンアンタゴニストは、ヒトスクレロスチンに１×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する。一実施形態では、スクレロスチンアンタゴニストは、ヒトスクレロスチンに１×１０−１０Ｍ以下のＫＤで結合する。一実施形態では、スクレロスチンアンタゴニストは、ヒトスクレロスチンに１×１０−１１Ｍ以下のＫＤで結合する。一実施形態では、スクレロスチンアンタゴニストは、ヒトスクレロスチンに１×１０−１２Ｍ以下のＫＤで結合する。より高い親和性の結合が一般的に好ましい。典型的には、スクレロスチンアンタゴニストはヒトスクレロスチンに１×１０−８〜１×１０−１１ＭのＫＤで結合する。「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用する場合、解離定数を指すことを意図しており、この解離定数は、ＫｄとＫａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）で表される。ＫＤ値は、当分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための方法は、たとえば、表面プラズモン共鳴を使用することによるもの、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによるもの、である。
【００２４】
スクレロスチンアンタゴニストはまた、細胞ベースのｗｎｔシグナル伝達アッセイにおいてスクレロスチンの阻害効果をブロックすることができる。「細胞ベースのｗｎｔシグナル伝達アッセイにおいてスクレロスチンの阻害効果をブロックする」スクレロスチンアンタゴニストに関連して、一実施形態では、このことは、ＩＣ５０が１ｍＭ未満、１００ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ以下で、細胞ベースのＳｕｐｅｒ  ＴｏｐＦｌａｓｈ（ＳＴＦ）アッセイにおいてスクレロスチンの存在中でｗｎｔ誘導性のシグナル伝達を修復するスクレロスチンアンタゴニストを指すものである。その開示がそれを参照することにより明確に組み込まれる、国際公開第２００９／０４７３５６号パンフレットでは、前記ｗｎｔ  ＳＴＦアッセイがより詳細に説明されている。
【００２５】
抗スクレロスチン抗体とは、本発明の好ましいスクレロスチンアンタゴニストを表し、適切な抗スクレロスチン抗体および抗スクレロスチン抗体を作製する方法は、たとえば、国際公開第２００９０４７４５６号パンフレットに開示されているが、６ＣＤＲ、ＶＨおよびＶＬの各配列ならびにこれらの抗体の完全長の重鎖配列および軽鎖配列を明確に含めて、その方法および抗体はそれらを参照することにより本開示に明確に組み込まれる。好ましい実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、抗スクレロスチンモノクローナル抗体であるセトルスマブである。セトルスマブは、以下のＣＤＲ：配列番号２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号７の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。セトルスマブのＶＨ配列およびＶＬ配列は、配列番号８と記載のＶＨポリペプチドアミノ酸配列および配列番号９と記載のＶＬポリペプチドアミノ酸配列を含む。セトルスマブの重鎖配列および軽鎖配列は、配列番号１０と記載の重鎖ポリペプチドアミノ酸配列および配列番号１１と記載の軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列を含む。
【００２６】
したがって、一実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｆ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。一実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、少なくとも、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、前述のＣＤＲの６つすべてを含む。
【００２７】
別の実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；または（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合する抗スクレロスチン抗体を含む。関連する実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、配列番号９と記載のアミノ酸配列を有するＶＬポリペプチド配列および配列番号８と記載のアミノ酸配列を有するＶＨポリペプチド配列を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合する。別の実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、配列番号１１と記載のアミノ酸配列を有する完全長軽鎖アミノ酸配列および配列番号１０と記載のアミノ酸配列を有する完全長重鎖アミノ酸配列を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合する。一実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、配列番号１１と記載のアミノ酸配列を有する完全長軽鎖アミノ酸配列および配列番号１０と記載のアミノ酸配列を有する完全長重鎖アミノ酸配列を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合する。
【００２８】
別の実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０（少なくとも９５、９８、または９９または１００などの）パーセントの同一性（％）を有するＶＨを含む。さらに別の実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、配列番号９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０（少なくとも９５、９８、または９９または１００など）パーセントの同一性（％）を有するＶＬを含む。さらに別の実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０（少なくとも９５、９８、または９９または１００などの）パーセントの同一性（％）を有するＶＨ、および配列番号９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０（少なくとも９５、９８、または９９または１００など）パーセントの同一性（％）を有するＶＬを含む。
【００２９】
さらに別の実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。さらに別の実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０（少なくとも９５、９８、または９９または１００など）パーセントの同一性（％）を有する重鎖、および／または配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖に対して少なくとも９０（少なくとも９５、９８、または９９または１００など）パーセントの同一性（％）を含む。一実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【００３０】
その他の抗スクレロスチン抗体および抗スクレロスチン抗体を作製する方法の多数の例が、国際公開第００／３２７７３号パンフレット、国際公開第２００５／００３１５８号パンフレット、国際公開第２００５／０１４６５０号パンフレット、国際公開第２００６／１１９１０７号パンフレット、国際公開第２００６／１１９０６２号パンフレット、国際公開第２００９／０３９１７５号パンフレット、国際公開第２００８／０６１０１３号パンフレット、および国際公開第２００８／１１５７３２号パンフレットに見いだすことができる。前述のＰＣＴ公開において開示の方法および抗スクレロスチン抗体それぞれは、６つのＣＤＲ、重鎖可変配列（ＶＨ）、軽鎖可変配列（ＶＬ）、ならびにこれらの抗体の完全長の重鎖配列および軽鎖配列を明確に含めて、それらを参照することにより本開示に明確に組み込まれる。
【００３１】
一実施形態では、抗スクレロスチン抗体はロモソズマブである。ロモソズマブは、配列番号１２によって表される完全長重鎖配列、および配列番号１３によって表される完全長軽鎖配列を含む。したがって、一実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、配列番号１２と記載のアミノ酸配列を含む完全長重鎖アミノ酸配列、および配列番号１３と記載のアミノ酸配列を含む完全長軽鎖アミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、ロモソズマブと同じエピトープに結合する、すなわち、抗スクレロスチン抗体は、配列番号１２と記載のアミノ酸配列を有する完全長重鎖アミノ酸配列、および配列番号１３と記載のアミノ酸配列を有する完全長軽鎖アミノ酸配列を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合する。
【００３２】
別の実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、ブロソズマブである。ブロソズマブは、配列番号１４によって表される完全長重鎖配列、および配列番号１５によって表される完全長軽鎖配列を含む。したがって、一実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、配列番号１４と記載のアミノ酸配列を含む完全長重鎖アミノ酸配列、および配列番号１５と記載のアミノ酸配列を含む完全長軽鎖アミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、ブロソズマブと同じエピトープに結合する、すなわち、抗スクレロスチン抗体は、配列番号１４と記載のアミノ酸配列を有する完全長重鎖アミノ酸配列、および配列番号１５と記載のアミノ酸配列を有する完全長軽鎖アミノ酸配列を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合する。
【００３３】
以下のヒトスクレロスチン配列に／内に結合する抗スクレロスチン抗体が当分野で知られており：ＣＧＰＡＲＬＬＰＮＡＩＧＲＧＫＷＷＲＰＳＧＰＤＦＲＣ（「ループ２エピトープ」；配列番号１６）および／またはＤＶＳＥＹＣＲＥＬＨＦＴＲ  ＳＡＫＰＶＴＥＬＶＣＳＧＱＣＧＰＡＲ  ＷＷＲＰＳＧＰＤＦＲＣＩＰＤＲＹＲ  ＬＶＡＳＣＫＣＫＲＬＴＲ（「Ｔ２０．６エピトープ」配列番号１７）、たとえば、国際公開第００／３２７７３号パンフレット、国際公開第２００５／００３１５８号パンフレット、国際公開第２００５／０１４６５０号パンフレット、国際公開第２００６／１１９１０７号パンフレット、国際公開第２００６／１１９０６２号パンフレット、国際公開第２００９／０３９１７５号パンフレットおよび国際公開第２００８／０６１０１３号パンフレットに例示の通りであり、これらは、上記のように、これらを参照することにより本開示に明確に組み込まれる。したがって、一実施形態では、本発明の抗スクレロスチン抗体は、「ループ２エピトープ」（配列番号１６）および／または「Ｔ２０．６エピトープ」（配列番号１７）に／内に結合する。
【００３４】
抗スクレロスチン抗体
「抗体」という用語には、本明細書で言及される場合、抗体全体およびそれらの任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）またはそれらの単鎖が含まれる。天然「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存されている領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配列されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（たとえば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含めて、宿主の組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。免疫グロブリン可変ドメイン、たとえば、ＣＤＲの構造と位置は、よく知られているナンバリングスキーム、たとえば、Ｋａｂａｔのナンバリングスキーム（Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）またはＣｈｏｔｈｉａのナンバリングスキーム（Al Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio. 273:927 948）を使用して定義することができる。一実施形態では、ＣＤＲ領域はＫａｂａｔシステムを使用して定義される。別の実施形態では、ＣＤＲ領域はＣｈｏｔｈｉａシステムを使用して定義される。
【００３５】
一実施形態では、本明細書で抗体への言及は、単離した、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を包含する。抗スクレロスチン抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、またはキメラ抗体であってもよい。抗スクレロスチン抗体は、二重特異性、多重特異性、または単鎖の抗体であってもよい。一実施形態では、抗スクレロスチン抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗スクレロスチン抗体はヒト化抗体である。
【００３６】
抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗原部分」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原（たとえば、スクレロスチン）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の完全長または１つもしくは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行できることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例としては、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１の各ドメインからなる一価の断片；Ｆａｂ’断片、ＣＨ１ドメインがさらなるアミノ酸によって伸長されて、たとえばヒンジ領域またはヒンジ領域ドメインの一部を提供しているＦａｂ断片を含む、Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、組換え方法を使用して、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対となって一価の分子を形成している単一のタンパク質鎖としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって、連結することができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；たとえば、米国特許第５，８９２，０１９号を参照されたい）。このような単鎖抗体はまた、抗体という用語内に包含されることも意図されている。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来の技法を使用して得られ、断片は、インタクトな抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。本発明の抗スクレロスチン抗体の抗原結合断片、変異体または派生体には、それらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、またはジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）が含まれる。一実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、またはジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）である。
【００３７】
一実施形態では、抗スクレロスチン抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４アイソタイプなどのＩｇＧアイソタイプのものである。本明細書で使用する場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によって提供される抗体クラスを指す。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの各定常領域であってもよい。一実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ２アイソタイプおよびＩｇＧ４アイソタイプの中から選択される。
【００３８】
「単離された抗体」とは、本明細書で使用する場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（たとえば、スクレロスチンに特異的に結合する単離された抗体は、スクレロスチン以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、スクレロスチンに特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのスクレロスチン分子などの、他の抗原に交差反応性を有する場合がある。さらに、単離された抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まないものであってもよい。一実施形態では、本明細書での抗体への言及は単離された抗体を意味する。
【００３９】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書で使用する場合、単一の分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープへの単一の結合特異性および親和性を提示する。
【００４０】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図されている。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域も、かかるヒト配列に、たとえば、ヒト生殖細胞系列配列にまたはヒト生殖細胞系列配列の突然変異のバージョンに由来し、または、抗体は、Knappik, et al.（2000. J Mol Biol 296, 57-86）に記載のヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列を含有する。
【００４１】
ヒト抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基を含むことができる（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によってまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、マウスなどの、別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むことは、意図されていない。
【００４２】
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がヒト配列に由来する可変領域を有する単一の結合特異性を提示する抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、たとえばトランスジェニックマウスから得たＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【００４３】
「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されたあらゆるヒト抗体を含む。たとえば、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックもしくはトランスクロモソーマルである動物（たとえば、マウス）、またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、たとえばトランスフェクトーマから単離された抗体、組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ならびに、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列のすべてまたは部分を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む他の任意の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体、である。このような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する。しかし、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列トランスジェニック動物を使用する場合はｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）に供することが可能であり、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来しかつこれらに関連するものであるが、ヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内にｉｎ  ｖｉｖｏで天然に存在しない場合もある配列である。
【００４４】
スクレロスチンに対する抗体の結合能力を評価する標準的なアッセイは、たとえば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよびＲＩＡを含めて、当分野で知られている。適切なアッセイは、国際公開第２００９／０４７３５６号パンフレットに記載に詳細に記載されている。抗体の結合動態（たとえば、結合親和性）はまた、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によるなどの、当分野で知られている標準的なアッセイによって評価することができる。スクレロスチンの機能特性に対する抗体の効果（たとえば、受容体結合、骨溶解の防止または改善）を評価するアッセイは、国際公開第２００９／０４７３５６号パンフレットにさらに詳細に記載されている。したがって、たとえば、本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合する抗体は、標準的なスクレロスチン結合アッセイにおいて本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体と交差ブロックするまたは交差ブロックされる（たとえばその結合を競合的に阻害する）その能力によって決定することができる。本発明の抗体のヒトスクレロスチンへの結合を阻害する試験抗体の能力が実証するところは、試験抗体はヒトスクレロスチンへの結合に対して当該抗体と競合できることである；非限定的な理論によると、そのような抗体は、それが競合する抗体と同じもしくは関連する（たとえば、構造的に類似するか、もしくは空間的に近位である）、ヒトスクレロスチン上のエピトープに結合することができる。抗体または他の結合剤が、別の抗体もしくは結合分子のヒトスクレロスチンへの結合を妨害できる能力または程度は、したがって、交差ブロックするまたは交差ブロックされると言えるかどうかは、標準的な競合結合アッセイを使用して決定することができる。適切な一アッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅ技術の使用を含み、これは、表面プラズモン共鳴技術を使用して、相互作用の程度を測定することができる。交差ブロックを測定する別のアッセイでは、ＥＬＩＳＡベースのアプローチを使用する。これらの方法のさらなる詳細は、たとえば、その開示がそれを参照することにより本明細書に明確に組み込まれる、国際公開第２００９／０４７３５６号パンフレットに見いだすことができる。
【００４５】
セトルスマブなどの抗スクレロスチン抗体のさらなる特徴は、その開示、論議およびデータがそれを参照することにより本明細書に組み込まれる、国際公開第２００９／０４７３５６号パンフレットに記載されている。ほんの一例として、抗スクレロスチン抗体は、以下の機能特性のうちの少なくとも１つを提示する：当該抗体は細胞ベースの石灰化アッセイにおいてスクレロスチンの阻害効果をブロックする、当該抗体はＳｍａｄ１リン酸化アッセイにおいてスクレロスチンの阻害効果をブロックする、当該抗体はスクレロスチンのＬＲＰ−６への結合を抑制する、および当該抗体は骨形成および骨量および骨密度を増大する。上述のように、これらの特性は国際公開第２００９／０４７３５６号パンフレットに詳細に記載されている。
【００４６】
医薬組成物
本発明のスクレロスチンアンタゴニストはまた、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化される本発明のスクレロスチンアンタゴニストを含む医薬組成物の一部として製剤化することができる。かかる組成物は、本発明の（たとえば、２種以上の異なる）スクレロスチンアンタゴニストのうちの１種または組合せを含むことができる。たとえば、本発明の医薬組成物は、ヒトスクレロスチン上の異なるエピトープに結合する、または、そうでなければ相補的な活性を有する、２種以上の抗スクレロスチン抗体を含むことができる。本発明のスクレロスチンアンタゴニストと本発明のさらなる治療剤を、組合せ調製物に製剤化することもできる。
【００４７】
「薬学的に許容される担体」という用語には、生理学的に適合する、任意およびあらゆる溶剤、バッファー、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または表皮の各投与（たとえば、注射または点滴による）に適したものであることが求められる。投与の経路に依存して、スクレロスチンアンタゴニストは物質でコーティングして、酸の作用および化合物を不活性化する可能性のある他の天然条件から化合物を保護することができる。一部の実施形態では、静脈内投与用の組成物は典型的には、滅菌等張水性バッファーの溶液である。
【００４８】
一部の実施形態では、薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液または分散液および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。ある特定の実施形態では、本開示は、滅菌注射用溶液の調製用にスクレロスチンアンタゴニストの滅菌粉末を提供する。滅菌注射用溶液の調製用の滅菌粉末の場合では、調製の好ましい方法は、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）であり、これらによって、スクレロスチンアンタゴニストの粉末に加えて、その前もって滅菌ろ過した溶液からさらなる所望の任意の成分が得られる。組成物が点滴によって投与される場合、組成物は、滅菌医薬品グレードの水、生理食塩水またはデキストロース／水を含有する点滴ボトルで調合することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供してもよい。
【００４９】
投薬および投与
本発明のスクレロスチンアンタゴニストは、当分野で知られている１つまたは複数の様々な方法を使用して、１つまたは複数の投与経路によって投与することができる。当業者であれば、投与経路および／または投与様式が、問題のアンタゴニストおよび所望の結果に応じて異なることを理解するであろう。投与経路には、たとえば、注射または点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄またはその他の非経腸の投与経路、が含まれる。一実施形態では、投与は静脈内経路を介して行われる。一実施形態では、投与は、点滴によって静脈内に行われる。別の実施形態では、投与は皮下に行われる。
【００５０】
「非経口投与」という句は、本明細書で使用する場合、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、限定されないが、これには、静脈、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内注射および点滴、が含まれる。あるいは、スクレロスチンアンタゴニストは、局所、表皮もしくは粘膜投与経路などの非経口ではない経路により、たとえば、鼻腔内に、経口的に、膣に、直腸内に、舌下にもしくは局所に投与することができる。
【００５１】
投薬レジメンを調整して、所望の最適な応答（たとえば、治療応答）を提供する。たとえば、単一ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割した用量を経時的に投与してもよく、治療状況の緊急性によって必要とされる通りに用量を比例的に減少しても増加してもよい。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、単位剤形で非経口組成物を製剤化することは、とりわけ有利である。単位剤形とは、本明細書で使用する場合、処置される対象の単位投薬量として適した、物理的に個別的な単位のことを指す；各単位は、必要な医薬担体と共同して、所望の治療効果を生むように計算された、所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、スクレロスチンアンタゴニストの独自の特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに、個体における処置の感受性に関してこのような活性化合物を調合する技術に固有である制限、によって決定され、かつこれらによって直接的に左右される。
【００５２】
一例として、宿主体重の約０．０００１から２００ｍｇ／ｋｇまでの範囲の投薬量が、選択される特定のスクレロスチンアンタゴニストに応じて、適当であろう。例示的な処置レジメは、週１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、月１回、３カ月毎に１回または３〜６カ月毎に１回の投与を必要とする。
【００５３】
全般
「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」ならびに「〜なる（consisting）」を包含し、たとえば、Ｘを「含む（comprising）」組成物はＸのみからなってもよく、さらなる何か、たとえばＸ＋Ｙを含んでもよい。
【００５４】
数値ｘに対して「約」という用語は、任意選択であり、たとえば、ｘ±１０％を意味する。
【００５５】
本明細書で使用する場合、２つの配列間のパーセント同一性とは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮した、当該配列で共有される同一の位置の数の関数（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、下の非限定的な実施例に記載のように、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。
【００５６】
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers and W. Miller（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch（J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970）のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびにギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さウェイト１、２、３、４、５または６を使用して、決定することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１−１】乳がん由来のスクレロスチンが骨芽細胞の分化およびがん細胞の遊走を阻害する、図である。  Ａ）Ｓｏｓｔ  ｍＲＮＡ発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって非転移性ＭＣＦ−７および転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の乳がん細胞で決定した。Ｂ）頭蓋冠骨芽細胞は、対照培地またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞から収集したがん馴化培地（ＣＭ）の存在中で骨芽細胞に分化した。骨芽細胞の分化はアリザリンレッド染色によって決定した。Ｃ）頭蓋冠骨芽細胞を、示されている濃度のＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来のＣＭの存在中で培養した。Ｗｎｔシグナル伝達活性をＴｏｐＦｌａｓｈレポーターアッセイによって決定した。Ｄ）対照培地、陰性対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からのＣＭ（ｓｉＲＮＡ陰性ＣＭ）またはＳｏｓｔに対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からのＣＭ（ｓｉＲＮＡ  Ｓｏｓｔ  ＣＭ）、で培養した頭蓋冠骨芽細胞におけるＷｎｔシグナル伝達活性。Ｅ）陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ陰性ＣＭ）またはＳｏｓｔに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  Ｓｏｓｔ  ＣＭ）をトランスフェクトした後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞の遊走を決定するトランスウェルアッセイの定量化。Ｆ）頭蓋冠細胞は、対照培地またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１転移性乳がん細胞から収集したがん馴化培地（ＣＭ）で骨芽細胞に分化した。骨芽細胞の分化を、Ｒｕｎｘ２とオステオカルシン（Ｏｘｎ）の遺伝子発現の定量化によって決定した。データは平均±ＳＥＭで表されている。両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して２群Ａ、Ｄ）を比較し、ＡＮＯＶＡとそれに続くＴｕｋｅｙのポストホック分析を使用して３群以上、Ｃ、Ｅ、Ｆ）を比較した、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１−２】図１−１と同様である。
【図１−３】図１−１と同様である。
【図２−１】スクレロスチンの薬理学的抑制がマウスにおいて骨転移の量を低減する、図である。  ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を、８週齢の免疫不全ＳＣＩＤ雌性マウスの左心室に注射した。乳がん細胞注射の２週間後に、微小転移巣を生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって検出し、マウスを無作為化し、ビヒクルまたは抗スクレロスチン抗体（Ｓｃｌ−Ａｂ、１００ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを週に１回４週間投与した。Ａ＋Ｂ）骨内での腫瘍増殖をＡ）視覚化し、Ｂ）ＢＬＩによって定量化した。Ｃ、Ｄ）ＨＬＡタンパク質およびｍＲＮＡの発現を、免疫組織化学およびｑＲＴ−ＰＣＲによって、Ｃ）肺においておよびＤ）脳において、決定した。Ｅ、Ｆ）組織切片を使用した、ビヒクル（ｎ＝１６脛骨）またはＳｃｌ−Ａｂ（ｎ＝１６脛骨）で処置した担がんマウスの脛骨における転移面積の定量化。スケールバー：１ｍｍ。
【図２−２】図２−１と同様である。
【図２−３】図２−１と同様である。
【図３−１】スクレロスチン抗体の処置が乳がん誘発性の骨破壊から保護する、図である。  Ａ、Ｂ）ビヒクルまたは抗スクレロスチン抗体（Ｓｃｌ−Ａｂ）で処置した非担腫瘍マウスのおよび腫瘍のマウスにおけるＡ）大腿骨およびＢ）脛骨の骨量（ＢＶ／ＴＶ、骨体積／総体積）のマイクロコンピューター断層撮影法（μＣＴ）分析。Ｃ）ビヒクルまたはＳｃｌ−Ａｂで処置した担腫瘍マウスの遠位大腿骨の酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色。Ｄ）近位脛骨（健常な未処置  ｎ＝５、ビヒクル処置  ｎ＝１０、Ｓｃｌ−Ａｂ処置  ｎ＝１０；担がんビヒクル処置  ｎ＝８、担がんＳｃｌ−Ａｂ処置  ｎ＝８）の骨量（ＢＶ／ＴＶ、骨体積／総体積）の組織形態計測分析。Ｅ）近位脛骨の骨形成速度（ＢＦＲ／ＢＳ、骨形成速度／骨面）の分析。Ｆ）骨転移を有するマウスの近位脛骨のＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ／ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎ染色（左の２つのパネル）および骨−がん境界面でのカルセイン二重標識（右の２つのパネル）。スケールバーは５０μｍを示す。Ｇ）骨−がん境界面での骨面当たりの骨形成速度（ＢＦＲ／ＢＳ）の定量化（ビヒクル  ｎ＝６、Ｓｃｌ−Ａｂ  ｎ＝３）。Ｈ）ビヒクルまたはＳｃｌ−Ａｂで処置した担がんマウスの遠位大腿骨におけるＯｓｔｅｒｉｘの免疫組織化学的染色。スケールバーは５０μｍを示す。Ｉ）遠位大腿骨の組織形態計測分析（Ｎ．Ｏｂ／Ｂ．Ｐｍ、骨芽細胞の数／骨周囲長；Ｏｂ．Ｓ／ＢＳ、骨芽細胞面／骨面）（ビヒクル  ｎ＝６、Ｓｃｌ−Ａｂ  ｎ＝３）。Ｊ）ビヒクルまたはＳｃｌ−Ａｂで処置した担がんマウスの遠位大腿骨の酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色。スケールバーは５０μｍを示す。Ｋ）骨周囲長あたりの破骨細胞数（Ｎ．Ｏｃ／Ｂ．Ｐｍ）および骨面あたりの破骨細胞面（Ｏｃ．Ｓ／ＢＳ）の定量化（ビヒクルｎ  ＝８、Ｓｃｌ−Ａｂ  ｎ＝８）。データは平均±ＳＥＭで表されている。両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して２群（Ａ、Ｂ、Ｇ、Ｉ、Ｋ）を比較し、ＡＮＯＶＡとそれに続くＴｕｋｅｙのポストホック分析を使用して３群以上（Ｄ、Ｅ）を比較した、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｌ）ビヒクルまたはＳｃｌ−Ａｂで処置した健常なマウスおよび担がんマウスからの近位脛骨のＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ／ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎ染色および蛍光二重標識（挿入図）。スケールバーは１ｍｍ（黒）および５０μｍ（白）を示す。
【図３−２】図３−１と同様である。
【図３−３】図３−１と同様である。
【図３−４】図３−１と同様である。
【図４−１】スクレロスチンの抑制が、筋肉の機能の乳がん誘発性喪失を防ぎ、生存を延ばす、図である。  Ａ）ビヒクルまたは抗スクレロスチン抗体（Ｓｃｌ−Ａｂ）で処置した非担腫瘍マウスのＥＤＬ筋肉の力周波数。Ｂ）ビヒクルまたはＳｃｌ−Ａｂで処置した非担腫瘍マウスおよび担腫瘍マウスにおけるＥＤＬ筋肉重量。Ｃ）ビヒクルまたはＳｃｌ−Ａｂで処置した非担腫瘍マウスおよび担腫瘍マウスのＥＤＬ筋肉の力周波数。Ｄ）ＴＡ筋肉切片をコハク酸染色で染色し、Ｏｓｔｅｏｍｅａｓｕｒｅシステムを使用して筋線維面積を定量化した。Ｅ）ビヒクルまたはＳｃｌ−Ａｂで処置した担腫瘍マウスの生存曲線。Ｆ）処置無しの健常なマウス（ｎ＝５）、ビヒクル（ｎ＝１０）または抗スクレロスチン抗体（Ｓｃｌ−Ａｂ、ｎ＝１０）で処置した健常なマウスからの、およびビヒクル（ｎ＝８）またはＳｃｌ−Ａｂ（ｎ＝８）で処置した担がんマウスからの、長趾伸（ＥＤＬ）筋の比筋力（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒｃｅ）。Ｇ）ビヒクル（ｎ＝８）またはＳｃｌ−Ａｂ（ｎ＝８）で処置した骨転移を有するマウスのＥＤＬ筋肉の持久力。Ｈ）コハク酸デヒドロキシゲナーゼ（ＳＤＨ）で染色した、処置無し、ビヒクルまたはＳｃｌ−Ａｂ処置の健常なマウスからの、ならびにビヒクルまたはＳｃｌ−Ａｂで処置した骨転移を有するマウスからの、前脛骨筋切片。代表的な２つの筋肉／群が示されている。スケールバーは５０μｍを示す。Ｉ）処置無し（ｎ＝５）、ビヒクル処置（ｎ＝１０）またはＳｃｌ−Ａｂ処置無し（ｎ＝１０）の健常なマウスからの、およびビヒクル（ｎ＝８）またはＳｃｌ−Ａｂ（ｎ＝８）で処置した担がんマウスからの、全筋線維、酸化的線維（暗）および非酸化的（明）線維の断面積（ＣＳＡ）の、ＳＤＨ染色筋肉切片を使用した定量化。データは平均±ＳＥＭで表されている。ＡＮＯＶＡとそれに続くＴｕｋｅｙのポストホック分析を使用して３群以上を比較した、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図４−２】図４−１と同様である。
【図４−３】図４−１と同様である。
【図４−４】図４−１と同様である。
【図５】患者からの原発性乳がん組織におけるスクレロスチンの発現、の図である。  ＳＯＳＴｍＲＮＡの発現を、４８人の患者からの乳がん組織で分析した。スクレロスチン陽性の組織試料とスクレロスチン陰性の組織試料の割合を、すべての患者において、トリプルネガティブ（ＥＲ−、ＰＲ−、ＨＥＲ−）の患者においておよびホルモン受容体ネガティブ（ＥＲ−、ＰＲ−）の患者において、示す。すべての患者、ｎ＝４８；ＥＲ−、ＰＲ−、ＨＥＲ−、ｎ＝９；ＥＲ−、ＨＥＲ−、ｎ＝７。
【図６−１】担がんマウスの骨格筋に対するＳｃｌ−Ａｂの効果の基礎をなす分子メカニズム、の図である  抗スクレロスチン抗体による処置によって、ＮＦ−κＢシグナル伝達の乳がん誘発性の活性化およびＰａｘ７−陽性細胞の数の増大が修復される。Ａ）健常な非処置マウス（ｎ＝５）およびビヒクル（ｎ＝８）またはＳｃｌ−Ａｂ（ｎ＝８）で処置された担がんマウスの腓腹（ＧＡＳ）筋における、リン酸化ＩＫＫαおよびリン酸化ＩＫＫβ（ｐ−ＩＫＫαおよびｐ−ＩＫＫβ）、リン酸化ＮＦ−κＢｐ６５（ｐ−ＮＦ−κＢｐ６５）、リン酸化ｐ３８（ｐ−ｐ３８）および総ｐ３８の免疫ブロット分析。アクチンをローディング対照として使用した。代表的な試料を示す。Ｂ）ビヒクル（ｖｅｈ）またはＴＧＦ−β１で刺激したＣ２Ｃ１２筋芽細胞におけるリン酸化ＮＦ−κＢｐ６５（ｐ−ＮＦ−κＢｐ６５）、リン酸化ｐ３８（ｐ−ｐ３８）および総ｐ３８のイムノブロット分析。アクチンをローディング対照として使用した。６回の独立した実験の代表的な画像を示す。Ｃ）対照ペプチドまたはＮＦ−κＢブロッキングペプチド（ＮＰＤ）で処理し、ビヒクルまたはＴＧＦ−β１で刺激したＣ２Ｃ１２細胞におけるリン酸化ＮＦ−κＢｐ６５（ｐ−ＮＦ−κＢｐ６５）、リン酸化ｐ３８（ｐ−ｐ３８）および総ｐ３８のイムノブロット分析。アクチンをローディング対照として使用した。４回の独立した実験の代表的な画像を示す。Ｄ）ミオゲニンおよびＭｙｏＤ  ｍＲＮＡの発現を、筋分化の１０日後にＣ２Ｃ１２細胞でｑＲＴ−ＰＣＲによって定量化した（ｎ＝３）。Ｅ）Ｐａｉ１  ｍＲＮＡ発現を、健常な未処置マウス（ｎ＝５）からのおよびビヒクル（ｎ＝８）またはＳｃｌ−Ａｂ（ｎ＝８）で処置した担がんマウスからの、ＧＡＳ筋肉で定量化した。Ｆ）健常な未処置マウスからのおよびビヒクルまたはＳｃｌ−Ａｂで処置した骨転移を有するマウスからの、ＴＡ筋におけるＰａｘ７の免疫組織化学的染色。スケールバーは、上部パネルで５０μｍ、下部パネルで１００μｍを示す。Ｇ）健常な未処置マウス（ｎ＝５）からのおよびビヒクル（ｎ＝８）またはＳｃｌ−Ａｂ（ｎ＝８）で処置した骨転移を有するマウスからの、ＴＡ筋におけるＰａｘ７陽性細胞の定量化。データは平均±ＳＥＭで表されている。両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して２群Ｄ）を比較し、ＡＮＯＶＡとそれに続くＴｕｋｅｙのポストホック分析を使用して３群以上Ｅ、Ｇ）を比較した、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図６−２】図６−１と同様である。
【図７】Ｗｎｔシグナル伝達の乳がん媒介性の抑制に対して、ＬＲＰ５突然変異が付与する耐性、の図である  ＬＲＰ５突然変異Ｇ１７１Ｖ（ＬＲＰ５−Ｇ１７１Ｖ＋／Ｔ）がヘテロ接合であるマウスから、および対照培地またはがんＣＭで刺激した対照同腹仔（ＬＲＰ５−Ｇ１７１Ｖ＋／＋）から、単離された頭蓋冠骨芽細胞におけるＷｎｔシグナル伝達活性（ｎ＝４の独立した実験）。ＡＮＯＶＡとそれに続くＴｕｋｅｙのポストホック分析を使用して３群以上を比較した、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
[実施例１]
抗スクレロスチンアンタゴニストは、マウス腫瘍モデルにおいて筋肉のサイズ、量、力および機能の喪失を処置する
方法
頭蓋冠骨芽細胞培養については、頭蓋冠を１〜３日齢のマウスから切断し、０．１％コラゲナーゼと０．２％ディスパーゼを含有するα−ＭＥＭで順次消化した。細胞画分２〜４を合わせ、１０％ＦＢＳおよびＰ／Ｓを含有するα−ＭＥＭで増殖させた。Ｃ２Ｃ１２細胞はＤＳＭＺから購入し、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。細胞をＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ）１０ｎｇ／ｍｌまたは組換えスクレロスチン（Ｒ＆Ｄ）１００ｎｇ／ｍｌで刺激した。Ｃ２Ｃ１２細胞のＮＦ−ｋＢシグナル伝達を阻害するために、細胞をＮＥＭＯ結合ドメインペプチド（ＮＰＤ、Ｅｎｚｏ）またはＬ−ＴＡＴ対照ペプチド（Ｅｎｚｏ）で１時間、前処理した。筋細胞の分化を、２％ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤ−ＭＥＭを使用して誘導した。ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１の乳がん細胞はＡＴＣＣから購入した。ＭＣＦ−７細胞をＤ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をα−ＭＥＭで増殖し、両方とも１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した。すべての細胞株を、マイコプラズマ汚染について検査した。メーカーの取扱説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）を使用して、スクランブル対照ｓｉＲＮＡまたはスクレロスチンに対するｓｉＲＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）をＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にトランスフェクトした。馴化培地（ＣＭ）の収集については、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を１％ＦＢＳの存在中で２４時間培養し、ＣＭを収集し−８０℃で保存した。
【００５９】
骨芽細胞の分化を、０．２ｍＭＬ−アスコルビン酸と１０ｍＭβ−グリセロホスフェートでα−ＭＥＭを補充することによって誘導した。骨芽細胞の分化を、細胞を４％中性緩衝ホルムアルデヒド溶液に固定した後、アリザリンレッド染色によって決定した。ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１の乳がん細胞はＡＴＣＣから購入した。ＭＣＦ−７細胞をＤ−ＭＥＭで培養し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をα−ＭＥＭで培養し、両方とも１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した。ＲＮＥａｓｙキットを使用して培養細胞からＲＮＡを単離し、メーカーの取扱説明書に従ってＮＥＢ  ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキットを使用してｃＤＮＡを合成した。スクレロスチン／ｓｏｓｔ発現を、以下のプライマーを使用してｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した：Ｓｏｓｔ  Ｆｏｒｗａｒｄ：ＣＣＡ  ＣＧＧ  ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＡＧ（配列番号１８）、Ｓｏｓｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣＡＴ  ＣＧＧ  ＴＣＡ  ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＧＧＧ  ＴＧ（配列番号１９）。
【００６０】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、陰性対照ｓｉＲＮＡまたはＳｏｓｔに対するｓｉＲＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅから購入）をＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にトランスフェクトした。馴化培地（ＣＭ）の収集については、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を１％ＦＢＳの存在中で２４時間培養し、馴化培地を収集し−８０℃で保存した。細胞遊走を、トランスウェルアッセイを使用して決定した。Ｗｎｔシグナル伝達活性を決定するために、Ｎｅｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してＴｏｐＦｌａｓｈおよびＲｅｎｉｌｌａプラスミドを頭蓋冠骨芽細胞にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅキットを使用して測定した。
【００６１】
ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を、８週齢の免疫不全ＳＣＩＤ雌性マウスの左心室に注射した。微小転移巣を、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって、乳がん細胞の注射の２週間後に検出し、マウスを２つの処置群に無作為化した。静脈内（ｉ．ｖ）週１回４週間で、一方の群はビヒクル（５０μｌ／１０ｇマウス）を投与し、もう一方の群は抗スクレロスチン抗体セルトルスマブ（Ｓｃｌ−Ａｂ）（１００ｍｇ／ｋｇ）を投与した。腫瘍量をＢＬＩによって毎週測定した。最後の注射の１週間後にマウスを屠殺にした。生存研究では、マウスを毎日モニターし、２０％の体重喪失などの明確に定義された基準に達したら屠殺した。処置無し（ｎ＝１０）、ビヒクル（ｎ＝１０）またはＳｃｌ−Ａｂ（ｎ＝１０）で処置した健常なＣＢ−１７／ｌｃｒ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊマウスを対照として利用した。試験責任者については群割り当てに対して盲検化した。
【００６２】
長骨の３次元分析には、マイクロコンピューター断層撮影法（μＣＴ）を使用した。マウスの長骨を、１０μｍの固定等方性ボクセルサイズ（ＸμＡ４００ｍｓ積分時間で７０ピークｋＶ；Ｖｉｖａ８０  ｍｉｃｒｏ−ＣＴ；Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＧ）で高解像度マイクロコンピューター断層撮影法を使用して分析した。ミネラル化されていない組織を除外しながらミネラル化した組織を分離し、その形態を保持するように、１群あたり４試料からの１０個のシングル断層スライスを手動で評価することによって、このしきい値を検証した。すべての分析は、３Ｄ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＧ）を使用して、デジタル処理で抽出した骨組織に関して実行した。関心領域（ＲＯＩ）を、スライスに輪郭を描くことによって手動で画定した。がん誘発性の骨破壊および担がんマウスのインタクトの骨面の非存在に起因して、ＲＯＩは皮質骨と骨梁骨の両方を含有していた。非担がん骨では、骨梁骨のみを標準的な方法を使用して分析した（Bouxsein et al., J Bone Miner Res. 2013;28(1):2-17）。
【００６３】
長趾伸筋（ＥＤＬ）のｅｘ  ｖｉｖｏ収縮性を、１３００Ａ  Ｗｈｏｌｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分析した。この目的のために、ＥＤＬを後肢から切断し、フックを筋肉の腱に縛り付け、筋肉を力変換器の間に搭載した。筋肉を、２つの電極間の最大刺激を使用して収縮するように刺激した。疲労研究については、ＥＤＬを７０Ｈｚで５０回繰り返し刺激し、最大の強縮力を検出した。データを、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ／Ｄａｔａ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（ＤＭＣ）およびＤｙｎａｍｉｃ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＤＭＡ）プログラム（Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して収集および分析した。この目的のために、ＥＤＬを後肢から切断し、ループを筋肉の腱に縛り付け、力変換器に搭載した。筋肉を、２つの電極によって印加される最大刺激を使用して収縮するように刺激した。疲労研究については、ＥＤＬを７０Ｈｚで５０回繰り返し刺激し、最大の強縮力を検出した。データを、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ／Ｄａｔａ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（ＤＭＣ）およびＤｙｎａｍｉｃ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＤＭＡ）プログラム（Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して収集および分析した。比筋力を先に記載の通りに算出した（Bonetto et al., Bonekey Rep. 2015;4:732）。試験責任者についてはデータ分析中は盲検化した。
【００６４】
骨分析については、マウスに屠殺の７日前および２日前に、それぞれ、カルセイン（２０ｍｇ／ｋｇ）およびデメクロサイクリン（２０ｍｇ／ｋｇ；両方ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を注射した。脛骨を収集し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で４８時間固定した。組織形態計測分析については、脛骨をメタクリル酸メチルに包埋した。トルイジンブルー、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ／ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎおよび酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色を、５μｍの矢状切片を使用して実施した。定量的骨組織形態計測測定を、ＯｓｔｅｏＭｅａｓｕｒｅシステム（Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓ）を使用して標準プロトコルに従って実行した。軟組織から大腿骨を取って、４％ＰＦＡで＋４℃で２４時間固定し、４％ＥＤＴＡで４日間、２０％ＥＤＴＡで２４時間脱灰し、パラフィンに包埋した。切片をカットし、抗Ｏｓｔｅｒｉｘ抗体（ウサギポリクローナル；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を使用して免疫組織化学的染色を実施した。脳組織および肺組織を４％ＰＦＡで＋４℃で２４時間固定した。組織試料をパラフィンに包埋し、カットし、ＨＬＡクラス１  ＡＢＣ（マウスモノクローナル、Ａｂｃａｍ）に対する抗体を用いて免疫組織化学的染色を実施した。組織学的分析については、前脛骨（ＴＡ）筋を後肢から切断し、１０％トラガカントガムに包埋し、冷却した２−メチルブタンで急速凍結した。クリオトームを使用して凍結切片を実施し、切片をコハク酸塩で染色した。筋線維面積（ＭＦＡ）の定量化については、ＴＡ筋の１２μｍ厚の凍結切片をコハク酸染色し（下の試薬およびプロトコルを参照されたい）、Ｏｓｔｅｏｍｅａｓｕｒｅ（商標）システム（Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を使用して線維の面積と数を定量化した。総線維面積を線維数で割って、図４Ｂに示す平均線維面積に達した。ＭＦＡによって、筋線維萎縮の尺度、すなわち、個々の筋線維のサイズがもたらされる。試験責任者については処置に関して盲検化した。
【００６５】
コハク酸染色プロトコル
試薬：
０．２Ｍリン酸ナトリウム一塩基性→室温で保存
０．２Ｍリン酸ナトリウム二塩基性→室温で保管
０．２Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．６→＋４℃で保存
０．２Ｍリン酸ナトリウム一塩基性バッファー  １３ｍｌ
０．２Ｍリン酸ナトリウム二塩基性バッファー  ８７ｍｌ
ｐＨを確認し、ＮａＯＨまたはＨＣＬを使用して７．６に調整する
０．２Ｍコハク酸ナトリウム溶液→室温で保存
ＮＢＴ溶液→＋４℃で保管
ＮＢＴ（ニトロテトラゾリウムブルークロリド）  ０．１ｇ  Ｓｉｇｍａ＃６８７６
ｄＨ２Ｏ  ５０ｍｌ
【００６６】
インキュベーション培地→使用直前に調製。
０．２Ｍリン酸バッファー  １０ｍｌ（結晶がなくなるまで加熱プレート（５０〜７０℃）上で混合）
コハク酸ナトリウム溶液  １０ｍｌ
ＮＢＴ溶液  １０ｍｌ
ｄＨ２Ｏ  １０ｍｌ
生理食塩水→室温で保管
ホルマリン−生理食塩水  ９％〜１０％→毎回新しいものを調製
生理食塩水  ９０ｍｌ
３７％〜４０％ホルムアルデヒド  １０ｍｌ
１５％エタノール
【００６７】
プロトコル：
−  コプリンジャー中のインキュベーション培地で３７℃で３０分間、切片をインキュベートする
−  生理食塩水で切片をすすぐ
−  ホルマリン生理食塩水（コプリンジャー）で切片を３〜５分間固定する
−  コプリンジャー中の１５％エタノールで５分間すすぐ
−  水性封入剤（アクアマウント）でまたはグルセリンゼラチンでマウントし、２〜３分間放置する
−  マニキュアでカバースリップの端をシールし、乾かす
−  スライドは室温で保存できる
【００６８】
軟組織から大腿骨を取って、４％パラホルムアルデヒドで＋４℃で４８時間固定し、ＥＤＴＡで脱灰し、パラフィンに包埋した。切片をカットし、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色で染色した（Taipaleenmaki et al. Oncotarget. 2016 Nov 29;7(48):79032-79046）。
【００６９】
肺組織および脳組織をマウスから切断し、半分にカットした。半分を液体窒素で急速凍結し、Ｔｒｉｚｏｌを使用してＲＮＡを単離した。ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、培養細胞からＲＮＡを単離した。ＮＥＢ  ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキットを使用してｃＤＮＡを合成し、ヒト特異的ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子、ミオゲニン、ＭｙｏＤ、Ｐａｉ１、およびＳＯＳＴの発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡに標準化した後、各標的遺伝子の相対的発現レベルを比較ＣＴ方法を使用して算出した。
【００７０】
組織の他の半分を４％パラホルムアルデヒドで＋４℃で２４時間固定した。組織試料をパラフィンに包埋し、カットしてＨＬＡに対する抗体で染色した（Taipaleenmaki et al. Cancer Res. 2015 Apr 1;75(7):1433-44を参照されたい）。
【００７１】
２群を比較する場合、パラメトリックデータについて両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して分析した。３群以上を比較する場合は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、これに続いてＴｕｋｅｙのポストホック分析を使用して当該群を比較した。確率値は、ｐ＜０．０５で統計的に有意であるとした。実験については、技術的な繰り返しとしては最低２回とし、生物学的な繰り返しとしては少なくとも３回繰り返しで行った。すべての定量的データは平均±ＳＥＭで表されている。
【００７２】
結果
スクレロスチンの発現は、非転移性のＭＣＦ−７乳がん細胞と比較して、転移性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞で有意により高い（図１Ａ）。転移性乳がん細胞が骨芽細胞の分化を損なうという仮説に取り組むために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１転移性乳がん細胞から馴化培地を収集し、乳がん細胞によって馴化した培地の存在中または非存在中で初代カルバリア細胞を骨芽細胞に分化させた。骨芽細胞の分化および骨芽細胞におけるＷｎｔシグナル伝達の活性は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞からの馴化培地（ＣＭ）によって用量依存的に阻害された（図１Ｂ、Ｃ）。馴化培地によって、骨芽細胞の分化およびマトリックスの石灰化が阻害されたが、このことは、骨芽細胞マーカー遺伝子であるＲｕｎｘ２およびＯｃｎの発現が低減したこと、ならびにアリザリンレッド染色がより弱かったことによって実証された（図１Ｆ、Ｂ）。これらの発見によって、転移性乳がん細胞が、骨芽細胞における正統的なＷｎｔシグナル伝達を傍分泌様式で阻害する因子を分泌する可能性があること、が示されている。
【００７３】
ＣＭによるＷｎｔ活性の抑制は、ｓｉＲＮＡを使用して乳がん細胞のスクレロスチンに拮抗したところ部分的に無効となった（図１Ｄ）。乳がん細胞におけるスクレロスチン発現の低下は、がん細胞の遊走も制限した（図１Ｅ）。このことによって、乳がん細胞に由来するスクレロスチンは骨形成を損なうが転移特徴を支持すること、が実証された。
【００７４】
ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を、ＳＣＩＤ雌性マウスにおいて心臓注射によって送達し、ビヒクルまたはセルトルスマブ（Ｓｃｌ−Ａｂ、１００ｍｇ／ｋｇ）で処置する前に転移を形成させた。処置無し、ビヒクルまたはＳｃｌ−Ａｂの処置有り、非担がんマウスを、健常な対照として利用した。週毎の生物発光イメージングによって、対照と比較して、Ｓｃｌ−Ａｂ処置マウスにおける骨転移の増殖の低下が明らかとなった（図２Ａ、Ｂ）。腫瘍増殖の低下は、担がんマウスの脛骨の転移領域の組織学的分析（図２Ｅ、Ｆ）によって確認された。Ｓｃｌ−Ａｂ処置が他の部位でのがん細胞の再配置および転移形成に与える潜在的な影響を評価するために、肺、肝臓、および脳を含めていくつかの臓器を、屠殺後のｅｘ  ｖｉｖｏ生物発光によって画像化した（データ示さず）。スクレロスチンの抑制によって、骨外性部位での乳がん細胞の存在量は変化せず、このことは、乳がん細胞は他の臓器に再配置しなかったことを示している（図２Ｃ、Ｄ）。
【００７５】
Ｓｃｌ−Ａｂ処置は、ナイーブマウスの筋肉の機能に影響を与えなかったが（図４Ａ）、担がんマウスにおいて筋線維面積のがん誘発性の低減（図４Ｂ）ならびに筋肉の力および機能の喪失から保護するとともに（図４Ｃ）、これら動物の寿命を延ばした（図４Ｄ）。まとめると、データが実証するところは、スクレロスチンの薬理学的抑制は、骨転移量を低減し、がん誘発性の骨溶解性疾患、ならびに骨格筋の量、サイズ、力および機能の喪失を防止すること、である。
【００７６】
[実施例２]
スクレロスチンの発現は乳がん細胞の一般的な特徴である
乳がん細胞は、正統的なＷｎｔシグナル伝達の可溶性アンタゴニストであるＤｉｃｋｋｏｐｆ  １（Ｄｋｋ１）を発現することが示されている。しかし、がん細胞由来のＤｋｋ１に拮抗することでＷｎｔ経路の活性は完全には修復されず、このことは、さらなるメカニズムが存在する可能性があることを示唆する。実際、発現分析により、非転移性ＭＣＦ−７乳がん細胞と比較して、転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞においてＷｎｔ阻害剤スクレロスチンの発現が有意により高いことが明らかになった（図１Ａ）。スクレロスチンの発現が乳がん細胞の一般的な特徴であるかどうかを判定するために、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｔｌａｓ（Papatheodorou I et al. Nucleic Acids Rs. 2018;46(D1):D246-D251）を使用してｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析を実施した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の細胞に加えて、スクレロスチンの発現が、ＳＵＭ１５９ＰＴ、ＣＡＬ５１、ＨＣＣ  １１８７、ＨＣＣ  １１９７、ＨＣＣ  １３９５、ＨＣＣ  １８０６およびＫＰＬ−４の各乳がん細胞株の細胞でも見られた。興味深いことに、これらの細胞株のうち６株（ＳＵＭ１５９ＰＴ、ＣＡＬ５１、ＨＣＣ  １１８７、ＨＣＣ  １１９７、ＨＣＣ  １３９５、ＨＣＣ  １８０６）は、エストロゲン受容体（ＥＲ）もプロゲステロン受容体（ＰＲ）も発現せず、ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ遺伝子の増幅も有さない（トリプルネガティブ乳がん細胞と呼ばれる）。さらに、ＫＰＬ−４細胞は、ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ増幅を有するが、ＥＲまたはＰＲを発現せず、このことは、スクレロスチンの発現がホルモン受容体陰性乳がん細胞の共通の特徴であることを示唆する。
【００７７】
スクレロスチンが患者からの原発性乳がん組織で発現するか否かという問題を解決するために、本発明者らは、４８人の乳がん患者からおよび４人の健常な個体から得られた組織生検においてスクレロスチン発現を定量化した。メーカーの取扱説明書に従ってＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｒｒａｙ  ＩＩＩ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を使用して、４８のヒト乳がん組織におけるＳＯＳＴ発現を分析した。７２の腫瘍試料からの９６の試料および異なる８つの主要臓器からの２４の非悪性組織試料からなるＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖｅｙ  Ａｒｒａｙ  ９６  Ｉ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を利用して、種々の悪性組織におけるＳＯＳＴの発現パターンを分析した。ＳＯＳＴの発現をｑＲＴ−ＰＣＲを使用して定量化した。ＢＥＴＡ−ＡＣＴＩＮ（ＡＣＴＢ）を内部対照として使用した。
【００７８】
スクレロスチンの発現は健常な乳房組織では検出されなかったが、原発性乳がんのうちの２１％がスクレロスチンを発現していた（図５）。興味深いことに、トリプルネガティブ乳がん組織のうちの５６％ならびにＥＲ陰性およびＰＲ陰性乳がん組織のうちの４３％がスクレロスチンを発現していた（図５）。さらに、受容体の状態が不明である３例の転移性乳がんのうちの２例（６６％）がスクレロスチン発現に陽性であった。ＥＲもしくはＰＲのいずれか、または両方の受容体を発現する腫瘍は、スクレロスチンを発現しなかった（データ示さず）。スクレロスチン発現が乳がんの特異的な特徴であるかどうか、またはそれが他のタイプのがんによっても発現されるかどうかを判定するために、本発明者らは、ヒト結腸（ｎ＝９）、腎臓（ｎ＝９）、肝臓（ｎ＝９）、肺（ｎ＝９）、前立腺（ｎ＝９）、卵巣（ｎ＝９）および甲状腺（ｎ＝９）の各がん生検ならびにそれぞれの健常な組織におけるスクレロスチン発現を分析した。スクレロスチンの発現が、２例の結腸（２２％）、１例の卵巣（１１％）、および２例の肺（２２％）の各がん組織で検出されたが、このことは、スクレロスチンの発現は乳がんに特異的ではないことを示唆する（表１）。
【００７９】
【表１】
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【００８０】
[実施例３]
Ｗｎｔシグナル伝達の乳がん媒介性の抑制に対する、ＬＲＰ５突然変異が付与する耐性
スクレロスチンは、ＬＲＰ５受容体の細胞外領域の第１のβプロペラドメインに結合することによって、骨芽細胞において正統的なＷｎｔシグナル伝達経路の活性化を阻害する。ＬＲＰ５のこのドメイン内のヘテロ接合型ミスセンス突然変異（Ｇ１７１ＶおよびＡ２１４Ｖ）は、スクレロスチンの結合が低下していることに起因して、患者においておよびマウスにおいて高骨量の表現型を引き起こす。がん細胞誘発性のスクレロスチンがＬｒｐ５を介して骨芽細胞のＷｎｔ活性を阻害するかどうかを判定するために、本発明者らは、Ｌｒｐ５突然変異Ｇ１７１Ｖがヘテロ接合である遺伝子改変マウスから骨芽細胞を得た。本発明者らの仮説を支持して、スクレロスチン結合部位が無効である突然変異体Ｌｒｐ５を有する骨芽細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の乳がん媒介性の抑制に耐性であった（図７）。これらのデータが示唆するところは、乳がん細胞によって、少なくとも部分的に、正統的なＷｎｔシグナル伝達経路のスクレロスチン／Ｌｒｐ５−媒介性の阻害によって骨芽細胞の分化が損なわれることである。
【００８１】
[実施例４]
スクレロスチン誘発性の骨破壊およびＳｃｌ−Ａｂ処置の効果
加えて、スクレロスチンの抑制は、μＣＴおよび組織学的分析によって決定したがん誘発性の骨破壊も防止した（図３Ａ〜Ｃ）。近位脛骨の組織学的分析によって、健常なビヒクル処置対照動物と比較して、担がんビヒクル処置マウスにおいて骨形成速度および骨量が有意に低下すること、が明らかになった（図３Ｌ、Ｄ、Ｅ）。興味深いことに、骨転移を有するマウスをＳｃｌ−Ａｂ処置すると、健常なビヒクル処置対照動物の骨量に匹敵する骨量が修復されただけでなく、骨量と骨形成の両方が健常なＳｃｌ−Ａｂ処置マウスのレベルまでに向上した（図３、ＤおよびＥ）。転移近傍の骨面の詳細な組織形態計測分析によって明らかになったことは、乳がん細胞の存在がビヒクル処置マウスにおいて骨形成を鈍らせたが、これは、Ｓｃｌ−Ａｂ処置によって有意に修復されたことである（図３、ＦおよびＧ）。これらの結果が示唆するところは、Ｓｃｌ−Ａｂは、少なくとも部分的に、骨−腫瘍境界面での骨形成の乳がん誘発性の阻害を修復することによって、骨転移という状況において骨喪失を防止することである。
【００８２】
乳がんの骨転移を有するマウスにおいてＳｃｌ−Ａｂの作用様式をさらに分析するために、それぞれ、骨形成および骨吸収のバイオマーカーとして、１型コラーゲンのアミノプロペプチド（Ｐ１ＮＰ）および酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）５ｂを担がんマウスの血清で測定した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、マウス血清中のＰ１ＮＰ濃度およびＴＲＡＰ濃度を決定した。すべての手順は、メーカー（免疫診断システム）の取扱説明書に従って実行した。
【００８３】
Ｐ１ＮＰ血清濃度はＳｃｌ−Ａｂ処置マウスでより高い一方、ＴＲＡＰ５ｂの血清濃度はビヒクル処置動物と比較して減少し、このことは、Ｓｃｌ−Ａｂ処置によって骨形成が活性化し骨吸収が減少することを示唆する。こういった二重の作用様式は、閉経後骨粗鬆症の処置の状況で一貫して報告されてきた。細胞レベルでこの発見をさらに調査するために、骨芽細胞および破骨細胞のパラメーターを、担がんマウスにおいて定量化した。予想通り、骨形成骨芽細胞の数とサイズは、ビヒクルで処置した対照動物と比較して、Ｓｃｌ−Ａｂで処置した担がんマウスにおいて有意に向上した（図３Ｈ、Ｉ）。さらに、骨吸収性破骨細胞の数とサイズは、Ｓｃｌ−Ａｂ処置に応答して強く減少したが（図３Ｊ、Ｋ）、このことは、骨量の増大は、同時に骨形成が向上し骨吸収が減少したことによるものであったことを示唆する。総合すると、これらのデータが強く示すところは、Ｓｃｌ−Ａｂ処置によって、骨芽細胞機能の腫瘍誘発性の障害を修復することによってその同化作用を通して骨量が増大するだけでなく、破骨細胞活性の乳がん媒介性の上昇が減少し、それによって骨溶解性疾患が元の状態に戻ることである。
【００８４】
[実施例５]
筋肉の機能に対するＳｃｌ−Ａｂの効果
骨転移を有する患者は筋力低下に罹患している場合が多い。同様に、乳がん誘発性の転移性骨疾患のマウスは、健常な動物と比較して、ｅｘｖｉｖｏでの筋肉の収縮性が低下している（図４Ｆ）。腫瘍量および骨破壊を低減させる上で、Ｓｃｌ−Ａｂの有益な効果を考慮して、本発明者らは、スクレロスチンの抑制はまた筋肉の機能に影響を与え得ると仮定した。この仮説を試験するために、本発明者らは、健常なマウスのおよびＳｃｌ−Ａｂまたはビヒクル対照で処置した骨転移を有するマウスの、長趾伸（ＥＤＬ）筋の比筋力および持久力を分析した。Ｓｃｌ−Ａｂ処置によって健常なマウスの骨量が向上したが（図３Ｌ、Ｄ）、これらの動物では筋肉の機能は変化しなかった（図４Ｆ）。対照的に、比筋力（図４Ｆ）と持久力（図４Ｇ）の定量化によって決定して、骨転移を有するマウスをＳｃｌ−Ａｂ処置すると、がん誘発性の筋力低下から保護された。変化した筋肉の機能の疾患メカニズムをよりよく理解するために、前脛骨（ＴＡ）筋をコハク酸デヒドロゲナーゼで染色し、酸化的線維と非酸化的線維の断面積（ＣＳＡ）を定量化した。
【００８５】
未変化の筋肉の機能と一致して、健常なマウスのＳｃｌ−Ａｂ処置は、酸化的筋線維と非酸化的筋線維の両方のＣＳＡに影響を及ぼさなかった（図４Ｈ、Ｉ）。興味深いことに、骨転移はＣＳＡの有意な低減をもたらしたが、この低減は、Ｓｃｌ−Ａｂ処置によって完全に修復された（図４Ｈ、Ｉ）。担がんマウスでは酸化的筋線維が影響を受けたので（図４Ｉ）、転移性骨疾患は骨格筋において酸化ストレスと筋線維萎縮を引き起こす可能性があるように思われるが、これは、Ｓｃｌ−Ａｂによる処置によって防止される。
【００８６】
[実施例６]
担がんマウスの骨格筋に対するＳｃｌ−Ａｂの効果の基礎をなす分子メカニズム
担がんマウスの骨格筋に対するＳｃｌ−Ａｂの効果の基礎をなす分子メカニズムをさらに解明するために、本発明者らは、酸化ストレスに関与する種々のシグナル伝達経路について調査した。
【００８７】
細胞を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％Ｎｏｎｉｎｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、０．２５％デオキシコール酸ナトリウムおよびコンプリートプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有する低塩溶解バッファー（ｐＨ７．６）で溶解した。筋肉組織を、ダウンス型ホモジナイザーを使用して、溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトールならびにプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤）でホモジナイズした。溶解物を１２％ポリアクリルアミドゲルで分離し、イムノブロット分析に供した。イムノブロットを、表２に列記の一次抗体とともに４℃で終夜インキュベートした。
【００８８】
【表２】
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【００８９】
ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ二次抗体または抗マウス二次抗体（１：１００００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｗ４０１Ｂ、Ｗ４０２Ｂ）を使用して、Ｃｌａｒｉｔｙ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢｉｏＲａｄ）を使用してバンドを可視化した。イムノブロットの画像を、ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステムおよびＩｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して取得した。
【００９０】
ウエスタンブロット分析によって、健常な対照動物と比較して、担がんマウスの腓腹（ＧＡＳ）筋におけるｐ３８、ＥＲＫ１／２、およびＳＴＡＴ３のリン酸化の増大が明らかになった（図６Ａ）。興味深いことに、ｐ３８のがん誘発性のリン酸化は、Ｓｃｌ−Ａｂで処置した動物の筋肉において修復された（図６Ａ）。ＮＦ−κＢ経路の活性化は骨格筋萎縮の重要な要素であることが示されているので、本発明者らは、ＮＦ−κＢシグナル伝達が乳がん誘発性の骨転移にも関係しているかどうか調査した。定常状態下では、ＮＦ−κＢはＩκＢ（κＢの阻害剤）と称される阻害剤タンパク質のＩκＢファミリーのメンバーとの相互作用を通して細胞質に隔離されている。活性化されると、２つのＩκＢキナーゼＩＫＫαおよびＩＫＫβを含有するＩＫＫ複合体がＩκＢタンパク質をリン酸化し、それによってそれらタンパク質をユビキチン化とプロテアソーム分解に向ける。興味深いことに、ＩＫＫαおよびＩＫＫβは、健常な動物と比較して、ビヒクルで処置した担がんマウスの筋肉で強くリン酸化されていた。さらに、ＮＦ−κＢサブユニットｐ６５のリン酸化は、担がんマウスで強く増大し、このことは、ＮＦ−κＢシグナル伝達が活性化されたことを示す。ＩＫＫα、ＩＫＫβおよびｐ６５のリン酸化はＳｃｌ−Ａｂ処置によって著しく減少し（図６Ａ）、このことは、乳がんの骨転移の存在がｐ３８−ＮＦ−κＢシグナル伝達カスケードを活性化し、このカスケードは、スクレロスチンの抑制によって減弱することを示唆する。
【００９１】
スクレロスチンが筋芽細胞のｐ３８−ＮＦ−κＢシグナル伝達経路を直接活性化するかどうかを判定するために、本発明者らは、組換えスクレロスチンでＣ２Ｃ１２筋芽細胞を刺激した。スクレロスチン処理によって、ｐ３８のリン酸化またはＮＦ−κＢ経路の成分は誘導されず（データ示さず）、このことは、当該経路が転移性微小環境に存在するサイトカインによって間接的に活性化されることを示唆する。ＴＧＦ−β１は、乳がん誘発性の骨吸収の過程で骨基質から放出される豊富な増殖因子である。興味深いことに、未分化のＣ２Ｃ１２筋芽細胞をＴＧＦ−β１で刺激すると、ｐ３８−ＮＦ−κＢ経路が活性化され、その結果、担がんマウスの筋肉で観察された効果が再現した（図６Ｂ）。ＮＦ−κＢ経路を抑制すると、ｐ３８のＴＧＦ−β１誘発性のリン酸化が抑止され（図６Ｃ）、このことは、ＴＧＦ−β１の効果が少なくとも部分的にＮＦ−κＢを介して媒介されることを示唆する。一貫して、ＴＧＦ−β１刺激は、ミオゲニンおよびＭｙｏＤの発現低下によって決定されたＣ２Ｃ１２筋芽細胞の筋細胞への分化を阻害した（図６Ｄ）。これらのデータが示唆するところは、骨溶解性骨吸収の過程で骨基質から放出されたＴＧＦ−β１が筋肉の機能を低下させるが、Ｓｃｌ−Ａｂ処置がこれを防止することである。実際、ＴＧＦ−β１標的遺伝子Ｐａｉ１の発現は、健常な動物と比較して、骨転移を有するマウスの筋肉において有意に増大した（図６Ｅ）。しかし、Ｐａｉ１の発現は、Ｓｃｌ−Ａｂ処置の担がんマウスの筋肉では増大せず（図６Ｅ）、このことは、Ｓｃｌ−Ａｂ処置によってＴＧＦ−β１およびｐ３８−ＮＦ−κＢ経路の乳がん誘発性の活性化が修復されることを示す。
【００９２】
結腸がんでは、ＮＦ−κＢの蓄積がＰａｘ７の下方制御を妨げ、その結果、筋肉再生が弱められ、骨格筋の機能が損なわれることになる。このことが乳がん骨転移を有するマウスでも起こるか否かという問題を解決するために、本発明者らは、前脛骨筋におけるＰａｘ７陽性衛星細胞の数を分析した。興味深いことに、Ｐａｘ７陽性細胞の数は、健常な動物と比較して、担がんマウスで有意に増大した（図６、ＦおよびＧ）。こういったがん誘発性の増大は、Ｓｃｌ−Ａｂ処置によって部分的ではあるが有意に修復された（図６Ｇ）。総合すると、これらのデータが示唆するところは、スクレロスチンの薬理学的抑制が、ＮＦ−κＢシグナル伝達のがん媒介性活性化およびＰａｘ７陽性衛星細胞のその後の増大を防ぐことにより、筋肉の機能の乳がん誘発性の喪失から保護することである。
【００９３】
本発明をほんの一例として説明してきたが、本発明の範囲および精神の範囲内から逸脱せずに変更形態がなし得ることが理解されよう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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