(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラフラビウイルスを含むデングウイルスワクチンと、緩衝液と、糖と、セルロース誘導体と、グリコールまたは糖アルコールと、場合によりアルカリまたはアルカリ塩と、アミノ酸との製剤；および、少なくとも１つの弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラフラビウイルスを含むデングウイルスワクチンと、緩衝液と、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの糖と、担体と、場合によりアルカリまたはアルカリ塩と、アミノ酸との製剤に関する。【選択図】図１
2021505588.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンと、
ｐＨ約６．５〜８．５の緩衝液と、
糖、グリコールまたは糖アルコールと、
カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、クロスカルメロースおよびメチルセルロース、またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択されるセルロース誘導体と、
場合によりアルカリまたはアルカリ塩と、
場合によりＡｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸と
を含む製剤。
【請求項２】
前記緩衝液が、コハク酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、ＴＲＩＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩およびクエン酸塩、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記アルカリまたはアルカリ塩が、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはこれらの組み合わせである、請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
前記糖が、トレハロースまたはスクロースである、請求項１から３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５】
前記セルロース誘導体が、カルボキシメチルセルロースの薬学的に許容される塩である、請求項１から４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
前記グリコールが、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールモノメチルエーテルからなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７】
前記グリコールまたは糖アルコールが、プロピレングリコールまたはグリセロールである、請求項１から５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８】
約１００〜１０００００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンと、
ｐＨ約６．５〜８．５の緩衝液と、
約５０〜３００ｍｇ／ｍｌの糖と、
約２．５〜１０．０ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコール（ＰＧ）またはグリセロールと、
約０．３〜１０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣナトリウム）と、
場合により約１０〜１５０ｍＭのＮａＣｌと、
場合により約１０〜１００ｍＭのＡｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸と
を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
約１００〜１０００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンと、
ｐＨ約７．０〜８．０の約５〜３００ｍＭのヒスチジン、ＴＲＩＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓまたはリン酸塩緩衝液、またはこれらの組み合わせと、
約５０〜３００ｍｇ／ｍｌの糖と、
約３〜１０ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコールまたはグリセロールと、
約３〜１０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウムと、
場合により約１５〜７５ｍＭのＮａＣｌと、
場合により約１０〜７５ｍＭのＡｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸と
を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１０】
約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンと、
ｐＨ約７．０〜８．０の約５〜３００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液と、
約６０〜１２０ｍｇ／ｍｌのスクロースと、
約３〜７ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコールまたはグリセロールと、
約３〜７ｍｇ／ｍｌの平均分子量約９００００のカルボキシメチルセルロースナトリウムと、
約３０〜９０ｍＭのＮａＣｌと、
場合により約１０〜７５ｍＭのアミノ酸Ｌｅｕ、ＬｙｓまたはＧｌｕ、またはこれらの組み合わせと
を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１１】
約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンと、
ｐＨ約７．０〜８．０の約１１ｍＭのリン酸カリウム緩衝液と、
約９０ｍｇ／ｍｌのスクロースと、
約５ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコールまたはグリセロールと、
約５ｍｇ／ｍｌの平均分子量約９００００のカルボキシメチルセルロースナトリウムと、
約７５ｍＭのＮａＣｌと
を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１２】
約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンと、
ｐＨ約７．０〜８．０の約１１ｍＭのリン酸カリウム緩衝液と、
約９０ｍｇ／ｍｌのスクロースと、
約５ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコールと、
約５ｍｇ／ｍｌの平均分子量約９００００のカルボキシメチルセルロースナトリウムと、
約５０ｍＭのＮａＣｌと、
約２５ｍＭのＬｅｕと
を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１３】
約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンと、
ｐＨ約７．５の約１１ｍＭのリン酸カリウム緩衝液と、
約９０ｍｇ／ｍｌのスクロースと、
約５ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコールと、
約５ｍｇ／ｍｌの平均分子量約９００００のカルボキシメチルセルロースナトリウムと、
約３０ｍＭのＮａＣｌと
を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１４】
約９０〜２００ｍｇ／ｍｌのトレハロースをさらに含む、請求項９から１３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５】
約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンと、
ｐＨ約７．５〜８の約１１ｍＭのリン酸カリウム緩衝液と、
約９０ｍｇ／ｍｌのスクロースと、
約１１０ｍｇ／ｍｌのトレハロースと、
約５ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコールと、
約５ｍｇ／ｍｌの平均分子量約９００００のカルボキシメチルセルロースナトリウムと、
約５０ｍＭのＮａＣｌと、
約２５ｍＭのＬｅｕと
を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１６】
約０．０００１〜５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８およびポロキサマー４０７から選択される界面活性剤をさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１７】
約２０〜２０００００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルスを含む弱毒化生デングワクチンと、
ｐＨ約６．５〜８．５の緩衝液と、
約１５０〜３００ｍｇ／ｍｌの糖と、
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、クロスカルメロース、メチルセルロースまたはその薬学的に許容される塩、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびゼラチンからなる群から選択される担体と；
場合により約５〜１００ｍＭのアルカリ塩またはアルカリ塩と；
場合によりアミノ酸Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ、またはこれらの組み合わせと
を含む製剤。
【請求項１８】
前記緩衝液が、コハク酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、ＴＲＩＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩およびクエン酸塩、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の製剤。
【請求項１９】
前記アルカリまたはアルカリ塩が、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはこれらの組み合わせである、請求項１７に記載の製剤。
【請求項２０】
前記糖が、トレハロースもしくはスクロース、またはこれらの組み合わせである、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２１】
前記スクロースとトレハロースの比が、１：１〜１：４の間である、請求項２０に記載の製剤。
【請求項２２】
前記担体が、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ＨＰＭＣ、ＨＳＡまたはゼラチンである、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２３】
約１００〜１０００００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンと、
ｐＨ約６．５〜８．０の緩衝液と、
約１５０〜３００ｍｇ／ｍｌのスクロースとトレハロースの組み合わせとしての糖と、
約０．３〜４０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウム、ＨＳＡ、ＨＰＭＣまたはゼラチンと、
場合により約１０〜１００ｍＭのアルカリまたはアルカリ塩と、
場合により約５〜２５ｍＭのＧｌｕと
を含む、請求項１７に記載の製剤。
【請求項２４】
約１００〜１０００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンと、
ｐＨ約７．０〜８．０の約５〜３００ｍＭのヒスチジン、ＴＲＩＳもしくはリン酸緩衝液、またはこれらの組み合わせと、
約５０〜１００ｍｇ／ｍｌのスクロースと、
約９０〜２００ｍｇ／ｍｌのトレハロースと、
約０．３〜１０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウムまたは約１０〜４０ｍｇ／ｍｌのゼラチンと、
約３０〜９０ｍＭのアルカリまたはアルカリ塩と
を含む、請求項１７に記載の製剤。
【請求項２５】
約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンと、
ｐＨ約７．０〜８．０の約５〜２０ｍＭのリン酸カリウムと、
約７５ｍｇ／ｍｌのスクロースと、
約１７５ｍｇ／ｍｌのトレハロースと、
約５ｍｇ／ｍｌの平均分子量約９００００のカルボキシメチルセルロースナトリウムと、
約３０ｍＭのＮａＣｌ
とを含む、請求項１７に記載の製剤。
【請求項２６】
約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンと、
ｐＨ約７．０〜８．０の約５〜２０ｍＭのリン酸カリウムと、
約７５ｍｇ／ｍｌのスクロースと、
約１７５ｍｇ／ｍｌのトレハロースと、
約２５ｍｇ／ｍｌのゼラチンと、
約３０ｍＭのＮａＣｌと
を含む、請求項１７に記載の製剤。
【請求項２７】
約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンと、
ｐＨ約７〜８の約５〜２０ｍＭのリン酸カリウムと、
約２５０ｍｇ／ｍｌのスクロースと、
約５０ｍｇ／ｍｌのＰＶＰ  Ｋ１２と
を含む、請求項１７に記載の製剤。
【請求項２８】
約０．０００１〜５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８およびポロキサマー４０７から選択される界面活性剤をさらに含む、請求項１７から２７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２９】
アルミニウムアジュバントをさらに含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３０】
凍結または凍結乾燥されている、請求項１から７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３１】
溶液中で再構成される、請求項８から２９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３２】
凍結乾燥またはマイクロ波真空乾燥前に水溶液である、請求項８から２９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３３】
前記再構成が、約０．５〜１．０ｍｌの生理食塩水、水または注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、および場合によりアルミニウムアジュバントを含む希釈剤で実施される、請求項３１に記載の製剤。
【請求項３４】
前記弱毒化生デングワクチンが四価である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３５】
前記ＬＡＶまたは前記ＬＡＣＶが、３’非翻訳（ＵＴＲ）領域のＴＬ−２ステムループ構造に相当する約３０ヌクレオチドの欠失を含むウイルスゲノムを含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３６】
前記弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）が、３’非翻訳（ＵＴＲ）領域のＴＬ−２ステムループ構造に相当する約３０ヌクレオチドの欠失を含むウイルスゲノムを含み、デング血清型３に対して免疫原性であり、
前記ＬＡＶのウイルスゲノムが、前記３’ＵＴＲのＴＬ−３構造に相当するΔ３０欠失から上流にヌクレオチドの欠失をさらに含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３７】
前記ワクチンが弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）を少なくとも４つ含み、
当該弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）が、ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１およびｒＤＥＮ４Δ３０である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３８】
前記ワクチンが弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）を少なくとも４つ含み、
当該弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）が、ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５、ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４およびｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラフラビウイルスを含むデングウイルスワクチンと、緩衝液と、糖と、セルロース誘導体と、糖アルコールまたはグリコールと、場合によりアミノ酸と、アルカリまたはアルカリ塩との製剤；および少なくとも１つの弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラフラビウイルスを含むデングウイルスワクチンと、緩衝液と、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの糖と、担体と、場合によりアルカリまたはアルカリ塩、または、アルカリまたはアルカリ塩と、アミノ酸との製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）には、プロトタイプの黄熱病ウイルス（ＹＦ）、デングウイルスの４つの血清型（ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４）、日本脳炎ウイルス（ＪＥ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥ）、ウエストナイルウイルス（ＷＮ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥ）、および約７０種の他の疾患の原因となるウイルスが含まれる。フラビウイルスは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを含む小さなエンベロープウイルスである。１０個の遺伝子産物が単一のオープンリーディングフレームによってコードされ、カプシド（Ｃ）、「プレメンブレン（ｐｒｅＭｅｍｂｒａｎｅ）」（ｐｒＭ、これは細胞からのビリオン放出直前に「膜」（Ｍ）にプロセシングされる）、「エンベロープ」（Ｅ）、引き続いて非構造（ＮＳ）タンパク質ＮＳ１、ＮＳ２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂおよびＮＳ５の順で組織化されたポリタンパク質として翻訳される（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９０）４４：６４９−６８８；Ｈｅｎｃｈａｌ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ  Ｐｕｔｎａｋ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．（１９９０）３：３７６−３９６に概説されている）。次いで、個々のフラビウイルスタンパク質が、宿主ならびにウイルスがコードするプロテアーゼによって媒介される正確なプロセシングイベントを通して産生される。
【０００３】
フラビウイルスのエンベロープは宿主細胞膜に由来し、ウイルスがコードする膜を固定する膜（Ｍ）およびエンベロープ（Ｅ）糖タンパク質を含有する。Ｅ糖タンパク質は、最大のウイルス構造タンパク質であり、細胞表面付着およびエンドソーム内融合活性を担う機能的ドメインを含む。これはまた、防御免疫に関連する、ウイルス中和抗体の産生を誘導する宿主免疫系の主要な標的でもある。
【０００４】
デングウイルスは、ヤブカ属（Ａｅｄｅｓ）の蚊、主にネッタイシマカ（Ａ．ａｅｇｙｐｔｉ）およびヒトスジシマカ（Ａ．ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）によってヒトに伝染する。デングウイルスによる感染は、不顕性または軽度の熱病から古典的なデング熱（ＤＦ）を経てデング出血熱／デングショック症候群（ＤＨＦ／ＤＳＳ）まで及ぶ多様な臨床像をもたらす。デング熱は、高熱、頭痛、関節および筋肉の痛み、発疹、リンパ節腫脹および白血球減少を特徴とする（Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｒ．Ｖ．ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｖａｕｇｈｎ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００２）３２４：１５６３−１５６６）。ＤＨＦ／ＤＳＳは、小児においてより一般的な、より重篤な感染症形態であって、点状出血および斑状出血の存在から特発性の重篤な出血および重度のショックまで及ぶ血管透過および／または重篤な出血性徴候により特徴付けられる。診断および迅速な医学的介入がなければ、ＤＨＦ／ＤＳＳの突然の発症および急速な進行は処置されないと致命的となり得る。
【０００５】
デングウイルスは、世界的な罹患率および死亡率の点で最も重要な節足動物伝染性ウイルスのグループであり、少なくとも３６００万のデング熱症例および２５００００〜５０００００のＤＨＦ／ＤＳＳ症例を含む推測１億のデング感染症が毎年発生している（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９８）１１：４８０−４９６；Ｇｉｂｂｏｎｓ、上記）。人口の世界的な増加、特に熱帯全体にわたる人口の都会化、および持続的な蚊防除手段の欠如によって、デングの蚊ベクターはその分布を熱帯、亜熱帯およびいくつかの温帯地域にわたって拡大しており、世界人口の半分超にデング感染のリスクをもたらしている。現代のジェット機旅行およびヒトの移動がデング血清型の世界的分布を容易にし、結果として今や多くの地域で複数のデング血清型が地域流行している。ここ２０年以上で、デング流行の頻度およびＤＨＦ／ＤＳＳの発生率は増加している。例えば、東南アジアでは、ＤＨＦ／ＤＳＳは小児の間で入院および死亡の主要な原因である（Ｇｕｂｌｅｒ、上記；Ｇｉｂｂｏｎｓ  ａｎｄ  Ｖａｕｇｈｎ、上記）。
【０００６】
これまでに、フラビウイルスワクチンの開発は、様々な成功を収めてきた。フラビウイルスによって引き起こされる疾患から保護するためのワクチン候補を製造する試みにおいて、４つの基本的なアプローチ：弱毒化生ワクチン、不活化全粒子ワクチン、組換えサブユニットタンパク質ワクチン、およびＤＮＡベースのワクチンが実行されている。黄熱病ウイルスに対する弱毒化生ワクチンは数十年にわたって利用可能であり、より近年は日本脳炎に対する弱毒化生ワクチンが世界中の様々な国で登録されている。不活化全粒子ワクチンの使用は、いくつかの利用可能な登録製品でＴＢＥウイルスおよびＪＥウイルスについて実証されている。Ｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：４３０１−０６（２０１２）。
【０００７】
上で強調したＹＦワクチン、ＪＥワクチンおよびＴＢＥワクチンの成功にもかかわらず、デングウイルスに対するワクチンを開発するための弱毒化生ウイルスおよび不活化ウイルスの方法の使用は、重要な課題に直面している。デングウイルスには４つの血清型（ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４）があり、各血清型の株は世界のデング流行地域全体にわたって巡回していることが分かっている。自然感染は感染した血清型への長期持続性の免疫を付与するが、他のデング血清型への免疫は付与しない。疾患のより重篤な形態（ＤＨＦ／ＤＳＳ）は、ほとんどの場合は、１つの血清型のデングウイルスの感染に別の血清型の第２の感染が続いた場合に、第２のデング感染の後に生じる。ＤＨＦおよびＤＳＳと第２のデング感染のより高頻度の関連性は、第２のデングウイルス型の感染力を増強する、１つのウイルス型の感染によって誘導される非中和抗体によると仮定されている（抗体依存性増強−ＡＤＥ）。
【０００８】
これまでに、臨床で試験されたワクチンの大部分は弱毒化生ワクチンである。非複製ワクチン候補の使用もまた探求されている。例えば、Ｉｖｙら（米国特許第６４３２４１１号明細書）は、ＤＥＮ１〜４  ８０％  Ｅ（ＤＥＮＶ−２エンベロープポリペプチドのアミノ酸１〜３９５に相当するＤＥＮ１〜４のペプチド領域）タンパク質を含む四価のサブユニットワクチンを開示している。Ｉｖｙら、上記はまた、ＤＥＮＶ１〜４  ８０％  ＥおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントを含む組成物も報告している。Ｃｏｌｌｅｒら（国際公開第２０１２／１５４２０２号）は、ＤＥＮ１〜４のＤＥＮ１〜４  ８０％  Ｅを含む四価の製剤を開示している。不活化ウイルスも潜在的なワクチン候補として、または有効なワクチンの成分として使用され得る（Ｐｕｔｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：４４４２−４４５２（２００５）、米国特許第６１９０８５９号明細書、米国特許第６２５４８７３号明細書およびＳｔｅｒｎｅｒらの国際公開第２００７／００２４７０号）。弱毒化生デングウイルスワクチンおよび非複製デングワクチンを含む組成物は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１４／０４２６２５（国際公開第２０１４／２０４８９２号）に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６４３２４１１号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１２／１５４２０２号
【特許文献３】米国特許第６１９０８５９号明細書
【特許文献４】米国特許第６２５４８７３号明細書
【特許文献５】国際公開第２００７／００２４７０号
【特許文献６】国際公開第２０１４／２０４８９２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９０）４４：６４９−６８８
【非特許文献２】Ｈｅｎｃｈａｌ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ  Ｐｕｔｎａｋ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．（１９９０）３：３７６−３９６
【非特許文献３】Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｒ．Ｖ．  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｖａｕｇｈｎ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００２）３２４：１５６３−１５６６
【非特許文献４】Ｇｕｂｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９８）１１：４８０−４９６
【非特許文献５】Ｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：４３０１−０６（２０１２）
【非特許文献６】Ｐｕｔｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：４４４２−４４５２（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ウイルスの全体は、液性免疫応答および細胞免疫応答を生成する能力のために、いくつかのワクチン製品で一般的に使用される抗原の１つである。ウイルス全体を含有するワクチン製品は、熱、凍結／解凍および他の処理ストレスに敏感で、著しい効力損失につながるので、安定性を維持するのが困難である。これらの製品は、典型的には、凍結して（−２０℃未満）または乾燥粉末として保存される。凍結された製品は、効力損失を防ぐために厳しいコールドチェーン要件を必要とするため、保存および流通が容易ではない。ウイルス全体、特にエンベロープウイルスを乾燥させると、乾燥プロセス中に発生する凍結および乾燥ストレスのために、効力が大幅に失われることがよくある。したがって、デングウイルスの安定な製剤を製造することが当技術分野で必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、弱毒化生デングワクチンの安定な製剤を提供する。セルロース誘導体および糖アルコールまたはグリコールの添加によって、乾燥後の安定性および／または収率が改善された。あるいは、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの糖を添加すると、マイクロ波乾燥後の安定性および／または収率が改善された。
【００１３】
一態様では、本発明は、少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンと、ｐＨ約６．５〜８．５の緩衝液と、糖、グリコールまたは糖アルコールと、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、クロスカルメロースおよびメチルセルロース、またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択されるセルロース誘導体と；場合によりアルカリまたはアルカリ塩と、場合によりＡｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸とを含む製剤を提供する。
【００１４】
一実施形態では、緩衝液が、コハク酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、ＴＲＩＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩およびクエン酸塩、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、アルカリまたはアルカリ塩が、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはこれらの組み合わせである。さらなる実施形態では、糖がトレハロースまたはスクロースである。一実施形態では、セルロース誘導体がカルボキシメチルセルロースの薬学的に許容される塩である。別の実施形態では、グリコールが、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールモノメチルエーテルからなる群から選択される。さらなる実施形態では、糖アルコールがグリセロールである。
【００１５】
別の態様では、製剤が、約１００〜１０００００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルスを含む弱毒化生デングワクチンと、ｐＨ約６．５〜８．５の緩衝液と、約５０〜３００ｍｇ／ｍｌの糖と、約２．５〜１０．０ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコール（ＰＧ）またはグリセロールと、約０．３〜１０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣナトリウム）と、場合により約１０〜１５０ｍＭのＮａＣｌと、場合により約１０〜１００ｍＭのＡｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸と；約１００〜１０００００ｐｆｕ／ｍｌの弱毒化生デングワクチンと、ｐＨ約７．０〜８．０の約５〜３００ｍＭのヒスチジン、ＴＲＩＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓまたはリン酸塩緩衝液、またはこれらの組み合わせと、約５０〜３００ｍｇ／ｍｌの糖と、約３〜１０ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコールまたはグリセロールと、約３〜１０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウムと、場合により約１５〜７５ｍＭのＮａＣｌと、場合により約１０〜７５ｍＭのＡｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸と；約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの弱毒化生デングワクチンと、ｐＨ約７．０〜８．０の約５〜３００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液と、約６０〜１２０ｍｇ／ｍｌのスクロースまたはトレハロースまたはこれらの組み合わせと、約３〜７ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコールまたはグリセロールと、約３〜７ｍｇ／ｍｌの平均分子量約９００００のカルボキシメチルセルロースナトリウムと、および約３０〜９０ｍＭのＮａＣｌと、場合により約１０〜７５ｍＭのアミノ酸Ｌｅｕ、ＬｙｓまたはＧｌｕ、またはこれらの組み合わせと；約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの弱毒化生デングワクチンと、ｐＨ約７．０〜８．０の約１１ｍＭのリン酸カリウム緩衝液と、約９０ｍｇ／ｍｌのスクロースと、約５ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコールまたはグリセロールと、約５ｍｇ／ｍｌの平均分子量約９００００のカルボキシメチルセルロースナトリウムと、約７５ｍＭのＮａＣｌと；約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの弱毒化生デングワクチンと、ｐＨ約７．０〜８．０の約１１ｍＭのリン酸カリウム緩衝液と、約９０ｍｇ／ｍｌのスクロースと、約５ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコールと、約５ｍｇ／ｍｌの平均分子量約９００００のカルボキシメチルセルロースナトリウムと、約５０ｍＭのＮａＣｌと、約２５ｍＭのＬｅｕと；約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの弱毒化生デングワクチンと、ｐＨ約７．５の約１１ｍＭのリン酸カリウム緩衝液と、約９０ｍｇ／ｍｌのスクロースと、約５ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコールと、約５ｍｇ／ｍｌの平均分子量約９００００のカルボキシメチルセルロースナトリウムと、約３０ｍＭのＮａＣｌとを含む。前記実施形態の一態様では、製剤が、約９０〜２００ｍｇ／ｍｌのトレハロースをさらに含む。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態では、製剤が、約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルスを含む弱毒化生デングワクチンと、ｐＨ約７．５〜８の約１１ｍＭのリン酸カリウム緩衝液と、約９０ｍｇ／ｍｌのスクロースと、約１１０ｍｇ／ｍｌのトレハロースと、約５ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコールと、約５ｍｇ／ｍｌの平均分子量約９００００のカルボキシメチルセルロースナトリウムと、約５０ｍＭのＮａＣｌと、約２５ｍＭのＬｅｕとを含む。前記実施形態の一態様では、製剤が、約０．０００１〜５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８およびポロキサマー４０７から選択される界面活性剤をさらに含む。
【００１７】
本発明はまた、約１００〜１０００００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルスを含む弱毒化生デングワクチンと、ｐＨ約６．５〜８．５の緩衝液と、約１５０〜３００ｍｇ／ｍｌの糖と、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、クロスカルメロース、メチルセルロースまたはその薬学的に許容される塩、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびゼラチンからなる群から選択される担体と；場合により約５〜１００ｍＭのアルカリ塩またはアルカリ塩と；場合によりアミノ酸Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ、またはこれらの組み合わせとを含む製剤を提供する。
【００１８】
一実施形態では、緩衝液が、コハク酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、ＴＲＩＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩およびクエン酸塩、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、アルカリまたはアルカリ塩が、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはこれらの組み合わせである。さらなる実施形態では、糖がトレハロースまたはスクロース、またはこれらの組み合わせである。一実施形態では、スクロースとトレハロースの比が、１：１〜１：４の間である。別の実施形態では、担体が、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ＨＰＭＣ、ＨＳＡまたはゼラチンである。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、約２００〜１０００００ｐｆｕ／ｍｌ少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルスを含む弱毒化生デングワクチンと、ｐＨ約６．５〜８．０の緩衝液と、約１５０〜３００ｍｇ／ｍｌのスクロースとトレハロースの組み合わせとしての糖と、約０．３〜４０ｍｇ／ｍｌのＣＭＣナトリウム、ＨＳＡ、ＨＰＭＣまたはゼラチンと、場合により約１０〜１００ｍＭのアルカリまたはアルカリ塩と、場合により約５〜２５ｍＭグルタミン酸との製剤；約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの弱毒化生デングワクチンと、ｐＨ約７．０〜８．０の約５〜３００ｍＭのヒスチジン、ＴＲＩＳまたはリン酸塩緩衝液、またはこれらの組み合わせと、約５０〜１００ｍｇ／ｍｌのスクロースと、約９０〜２００ｍｇ／ｍｌのトレハロースと、約０．３〜１０ｍｇ／ｍｌのＣＭＣナトリウムまたは約１０〜４０ｍｇ／ｍｌゼラチンと、約３０〜９０ｍＭのアルカリまたはアルカリ塩との製剤；約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの弱毒化生デングワクチンと、ｐＨ約７〜８の約５〜２０ｍＭのリン酸カリウムと、約７５ｍｇ／ｍｌのスクロースと、約１７５ｍｇ／ｍｌのトレハロースと、約５ｍｇ／ｍｌの平均分子量約９００００のＣＭＣナトリウムと、約３０ｍＭのＮａＣｌとの製剤；約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの弱毒化生デングワクチンと、ｐＨ約７．０〜８．０の約５〜２０ｍＭのリン酸カリウムと、約７５ｍｇ／ｍｌのスクロースと、約１７５ｍｇ／ｍｌのトレハロースと、約２５ｍｇ／ｍｌのゼラチンと、約３０ｍＭのＮａＣｌとの製剤；約６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの弱毒化生デングワクチンと、ｐＨ約７．０〜８．０の約５〜２０ｍＭのリン酸カリウムと、約２５０ｍｇ／ｍｌのスクロースと、約５０ｍｇ／ｍｌのＰＶＰ  Ｋ１２との製剤を提供する。前記実施形態の一態様では、製剤が、約０．０００１〜５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８およびポロキサマー４０７から選択される界面活性剤をさらに含む。
【００２０】
前記実施形態の一定の態様では、製剤が、アルミニウムアジュバントをさらに含む。上記製剤は、凍結もしくは凍結乾燥することができる、または溶液中で再構成することができる。一実施形態では、再構成が、約０．５〜１．０ｍｌの生理食塩水、水または注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、および場合によりアルミニウムアジュバントを含む希釈剤で実施される。別の実施形態では、製剤が、凍結乾燥またはマイクロ波真空乾燥前に水溶液である。
【００２１】
一実施形態では、弱毒化生デングワクチンが、四価の弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラフラビウイルスを含む。別の実施形態では、ＬＡＶまたはＬＡＣＶが、ウイルスの複製能を低下させる、３’非翻訳（ＵＴＲ）領域のＴＬ−２ステムループ構造に相当する約３０ヌクレオチドの欠失を含むウイルスゲノムを含む。さらなる実施形態では、弱毒化生デングウイルスが、３’非翻訳（ＵＴＲ）領域のＴＬ−２ステムループ構造に相当する約３０ヌクレオチドの欠失を含むウイルスゲノムを含み、デング血清型３に対して免疫原性であり、ＬＡＶのウイルスゲノムが、３’ＵＴＲのＴＬ−３構造に相当するΔ３０欠失から上流にヌクレオチドの欠失をさらに含むＬＡＶである。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態では、弱毒化生デングワクチンが、ＤＥＮ１Δ３０ウイルス、ＤＥＮ２／４Δ３０ウイルス（ＤＥＮ４骨格上のＤＥＮ２Δ３０ＬＡＣＶ）、ＤＥＮ３Δ３０ウイルスおよびＤＥＮ４Δ３０ウイルスを含む四価の弱毒化生ワクチンである。別の好ましい実施形態では、弱毒化生デングウイルスが、ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５、ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４およびｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８を含むＬＡＶである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＤＥＮ４製剤についてのＤＥＮＶ４凍結乾燥収率に対するＣＭＣナトリウム、ＰＧ、アミノ酸の効果を示す図である。
【図２】ＤＥＮ４製剤についてのＤＥＮＶ４安定性に対するＣＭＣナトリウム、ＰＧ、アミノ酸の効果を示す図である。製剤２６（＊）は、２５℃での保存後にケークが崩壊したため、試験しなかった。
【図３】ＤＥＮ４製剤についてのＤＥＮＶ４凍結乾燥収率に対する糖アルコールの効果を示す図である。
【図４】ＤＥＮ４製剤についてのＤＥＮＶ４安定性に対する糖アルコールの効果を示す図である。
【図５】ＤＥＮ４製剤についてのＤＥＮＶ４凍結乾燥収率に対するｐＨの効果を示す図である。
【図６】ＤＥＮ４製剤についてのＤＥＮＶ４安定性に対するｐＨの効果を示す図である。
【図７】ＤＥＮ４製剤についてのＤＥＮＶ４凍結乾燥収率に対する緩衝液の効果を示す図である。
【図８】ＤＥＮ４製剤についてのＤＥＮＶ４安定性に対する緩衝液の効果を示す図である。
【図９】ＤＥＮ４製剤についてのＤＥＮＶ４凍結乾燥収率に対するＮａＣｌ濃度の効果を示す図である。
【図１０】ＤＥＮ４製剤についてのＤＥＮＶ４安定性に対するＮａＣｌ濃度の効果を示す図である。
【図１１】デング血清型の凍結乾燥収率に対するプロピレングリコールおよびグリセロールの効果を示す図である。
【図１２】デング血清型の安定性に対するプロピレングリコールおよびグリセロールの効果を示す図である。
【図１３】凍結、マイクロ波乾燥（ＭＶＤ）および凍結乾燥（ｌｙｏ）ＤＥＮ１製剤についての相対効力に対するＬ−１５濃度の効果を示す図である。
【図１４】凍結、マイクロ波乾燥（ＭＶＤ）および凍結乾燥（ｌｙｏ）ＤＥＮ２製剤についての相対効力に対するＬ−１５濃度の効果を示す図である。
【図１５】凍結、マイクロ波乾燥（ＭＶＤ）および凍結乾燥（ｌｙｏ）ＤＥＮ３製剤についての相対効力に対するＬ−１５濃度の効果を示す図である。
【図１６】凍結、マイクロ波乾燥（ＭＶＤ）および凍結乾燥（ｌｙｏ）ＤＥＮ４製剤についての相対効力に対するＬ−１５濃度の効果を示す図である。
【図１７】凍結、マイクロ波乾燥（ＭＶＤ）および凍結乾燥（ｌｙｏ）ＤＥＮ１製剤についての相対効力を示す図である。
【図１８Ａ】３７℃で１週間後の四価の製剤の安定性を示す図である。
【図１８Ｂ】２５℃で１ヶ月後の四価の製剤の安定性を示す図である。
【図１９Ａ】２〜８℃で３ヶ月毎に最大１８ヶ月まで試験した四価の製剤（ＤＥＮ１）の安定性を示す図である。
【図１９Ｂ】２〜８℃で３ヶ月毎に最大１８ヶ月まで試験した四価の製剤（ＤＥＮ２）の安定性を示す図である。
【図１９Ｃ】２〜８℃で３ヶ月毎に最大１８ヶ月まで試験した四価の製剤（ＤＥＮ３）の安定性を示す図である。
【図１９Ｄ】２〜８℃で３ヶ月毎に最大１８ヶ月まで試験した四価の製剤（ＤＥＮ４）の安定性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書を通しておよび添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の意味を有することが明らかな場合を除き、複数指示対象を含む。
【００２５】
「または」への言及は、文脈が示される可能性の１つを明確に指示しない限り、いずれかまたは両方の可能性を示す。場合によっては、いずれかまたは両方の可能性を強調するために「および／または」を使用した。
【００２６】
「約」という用語は、物質または組成物の量（例えば、ｍＭまたはＭ）、製剤成分の割合（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）、溶液／製剤のｐＨ、または方法のステップを特徴付けるパラメータの値などを修飾する場合、例えば、これらの手順の器差を通した；組成物の製造もしくは使用、または手順の実施に使用される成分の製造、供給源もしくは純度の違いなどを通した、物質または組成物の調製、特性評価、および／または使用に関与する典型的な測定、取り扱い、およびサンプリング手順を通して生じ得る数量の変動を指す。一定の実施形態では、「約」が、±０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％または１０％の変動を意味し得る。
【００２７】
「増量剤」という用語は、凍結乾燥製品の構造を提供する薬剤を含む。増量剤に使用される一般的な例としては、マンニトール、グリシンおよびラクトースが挙げられる。薬学的にエレガントなケークを提供することに加えて、増量剤は、崩壊温度の修正、凍結−融解保護の提供、および長期保存にわたるタンパク質安定性の増強に関して有用な品質を付与することもできる。これらの薬剤はまた、張度調整剤としても役立ち得る。
【００２８】
「デングウイルス参照試料」は、デングウイルス製剤試験試料と同じデングウイルス製剤成分および比を有し、デングウイルス製剤試験試料と同じ条件（すなわち、凍結乾燥、マイクロ波乾燥、リオスフェア（ｌｙｏｓｐｈｅｒｅ）乾燥）下でデングウイルス製剤を乾燥させた直後の固体組成物、またはデングウイルスの感染力損失がないもしくは最小限である条件下で保存された前記乾燥固体組成物（すなわち、−７０℃以下で保存）；または−７０℃で凍結した固体デングウイルス製剤を指す。
【００２９】
「グリコール」は、２つのヒドロキシル基を有する化合物を指す。
【００３０】
「感染力損失」は、当技術分野で知られている方法を使用して、デングウイルス試験試料のウイルス複製の損失をデングウイルス参照試料と比較することを指す。一実施形態では、感染力損失が、デング相対感染力アッセイを使用して測定される。別の実施形態では、感染力損失が、プラークアッセイを使用して測定される。
【００３１】
「凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」、「凍結乾燥した（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）」、および「凍結乾燥した（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）」という用語は、乾燥される材料が最初に凍結され、次いで、氷または凍結溶媒が真空環境での昇華によって除去されるプロセスを指す。保存時の凍結乾燥製品の安定性を高めるために、賦形剤を凍結乾燥前製剤に含めることができる。
【００３２】
本明細書で使用される「リオスフェア」は、実質的に球形または卵形の治療活性剤を含む乾燥した凍結単一体を指す。いくつかの実施形態では、リオスフェアの直径が、約２〜約１２ｍｍ、好ましくは２〜８ｍｍ、例えば２．５〜６ｍｍまたは２．５〜５ｍｍである。いくつかの実施形態では、リオスフェアの体積が、約２０〜５５０μＬ、好ましくは２０〜１００μＬ、例えば２０〜５０μＬである。リオスフェアが実質的に球形ではない実施形態では、リオスフェアのサイズが、より長い寸法とより短い寸法の比であるそのアスペクト比に関して記載され得る。リオスフェアのアスペクト比は、０．５〜２．５、好ましくは０．７５〜２、例えば１〜１．５であり得る。
【００３３】
本明細書で使用される「マイクロ波真空乾燥」は、昇華を通してワクチン製剤の乾燥ワクチン製品（好ましくは水分６％未満）を形成するためにマイクロ波放射（放射エネルギーまたは非電離放射としても知られる）を利用する乾燥方法を指す。一定の実施形態では、マイクロ波乾燥が、米国特許出願公開第２０１６／０２２８５３２号明細書に記載されるように実施される。一実施形態では、マイクロ波放射が進行波形式である。
【００３４】
「再構成された溶液」は、ウイルスが、再構成された溶液中に分散されるように、固体形態（凍結乾燥ケークなど）の乾燥したウイルスを希釈剤に溶解することによって調製されたものである。再構成された溶液は、投与（例えば、筋肉内投与）に適しており、皮下投与に適していてもよい。
【００３５】
本明細書で使用される「（１又は複数の）塩」は、無機および／または有機酸によって形成される酸性塩、ならびに無機および／または有機塩基によって形成される塩基性塩を表す。他の塩も有用であるが、薬学的に許容される（すなわち、非毒性で生理学的に許容される）塩が好ましい。代表的な塩基性塩には、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（ナトリウム、リチウムおよびカリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウムおよびマグネシウム塩、亜鉛塩など）、有機塩基（例えば、有機アミン）による塩（Ｎ−Ｍｅ−Ｄ−グルカミン、コリン、トロメタミン、ジシクロヘキシルアミン、ｔ−ブチルアミンなど）、およびアミノ酸（アルギニン、リジンなど）による塩などが含まれる。
【００３６】
「糖アルコール」は、糖に由来するポリオールを指し、一般式ＨＯＣＨ２（ＣＨＯＨ）ｎＣＨ２ＯＨ、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０を有する。例としては、それだけに限らないが、マンニトール、ソルビトール、エリスリトール、キシリトールおよびグリセロールが挙げられる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「ｘ％（ｗ／ｖ）」は、ｘｇ／１００ｍｌと同等である（例えば、５％ｗ／ｖは、５０ｍｇ／ｍｌに等しい）。
【００３８】
「弱毒化生デングウイルス」という用語は、本明細書中で「ＬＡＶ」とも呼ばれ、デングウイルスが疾患を引き起こす能力が、野生型デングウイルスと比較して低下していることを意味する。当業者であれば、ウイルスが培養、継代または伝播されると突然変異を受け得ることを理解するだろう。ＬＡＶは、クローニングの目的で導入された突然変異に加えて、これらの自然発生の突然変異を含み得る。ＬＡＶは、これらの突然変異がまったくない、または１つもしくは複数ある、同種または異種集団であり得る。
【００３９】
「弱毒化生キメラウイルス」（あるいは「弱毒化生キメラフラビウイルス」）または「ＬＡＣＶ」という用語は、ウイルスゲノムが第１のフラビウイルスの骨格（Ｃ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５遺伝子を含む）ならびに第２のフラビウイルスのプレメンブレン（ｐｒＭ）およびエンベロープ（Ｅ）遺伝子を含み、第２のフラビウイルスがＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３またはＤＥＮＶ４から選択される、弱毒化生キメラウイルスを指す。第１のフラビウイルスは、異なるデング血清型であることができる、または別のフラビウイルス、例えば黄熱病ウイルスであることもできる。
【００４０】
「Δ３０  ＬＡＶ」という用語は、ウイルスの複製能力を低下させるヌクレオチド（ｎｔ）１４３付近〜ｎｔ１７２付近の３’非翻訳（ＵＴＲ）領域のＴＬ２ステムループ構造に相当する約３０ｎｔの欠失を含むウイルスゲノムを含む、弱毒化生ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４ウイルスを指す（国際公開第０３／０９２５９２号およびＷｈｉｔｅｈｅａｄらの米国特許第８３３７８６０号明細書参照）。
【００４１】
「Δ３０  ＬＡＣＶ」という用語は、ウイルスの複製能力を低下させるｎｔ１４３付近〜ｎｔ１７２付近の３’ＵＴＲ領域のＴＬ２ステムループ構造に相当する約３０ｎｔの欠失を含むウイルスゲノムを含む、ＤＥＮＶ１〜４の弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を指す（国際公開第０３／０９２５９２号およびＷｈｉｔｅｈｅａｄらの米国特許第８３３７８６０号明細書参照）。
【００４２】
「Δ３０／Δ３１  ＬＡＶ」という用語は、ウイルスゲノムが３’ＵＴＲのＴＬ２ステムループ構造の約３０ｎｔの欠失を含み、欠失がデング３’ＵＴＲのＴＬ−３相同構造の５’境界まで広がるようにＴＬ−３相同構造までのおよびこれを含む配列を除去する３’ＵＴＲのｎｔ２５８〜２２８の約３１ｎｔの別の非隣接上流欠失をさらに含む、弱毒化生ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４を指す。Ｗｈｉｔｅｈｅａｄらの米国特許第８３３７８６０号明細書を参照されたい。本発明の好ましい実施形態では、ＤＥＮ３  ＬＡＶがΔ３０／Δ３１突然変異を含む。
【００４３】
「Δ３０／Δ３１  ＬＡＣＶ」という用語は、キメラウイルスのウイルスゲノムが３’ＵＴＲのＴＬ２ステムループ構造の３０ｎｔの欠失を含み、上記のＴＬ−３構造を欠失させる３’ＵＴＲの別の非隣接上流３１ｎｔ欠失をさらに含む、上記の弱毒化生キメラＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４を指す。
【００４４】
「ＬＡＴＶ」または「四価の弱毒化生デングワクチン」または「ＬＡＴＶワクチン」という用語は、有効量のＤＥＮ１  ＬＡＶまたはＬＡＣＶ、ＤＥＮ２  ＬＡＶまたはＬＡＣＶ、ＤＥＮ３  ＬＡＶまたはＬＡＣＶおよびＤＥＮ４  ＬＡＶまたはＬＡＣＶを含むワクチンを指す。一実施形態では、デングＬＡＶまたはＬＡＣＶのうちの少なくとも１つが、上および国際公開第０３／０９２５９２号に記載されるように、３’ＵＴＲ中のＴＬ−２構造のΔ３０突然変異を含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＬＡＴＶが次の特徴を含む：（１）ＤＥＮＶ１ウイルスゲノムが３’ＵＴＲ中のＴＬ２ステムループ構造に相当する３０ｎｔ欠失を含むＤＥＮＶ１  ＬＡＶである、ｒＤＥＮ１Δ３０；（２）ＤＥＮＶ４骨格上にＤＥＮＶ２  ｐｒＭおよびＥ遺伝子を含むＤＥＮＶ２  ＬＡＣＶであって、ＤＥＮ４骨格が３’ＵＴＲ中のＴＬ２ステムループ構造に相当する３０ｎｔ欠失を含む、ｒＤＥＮ２／４Δ３０；（３）ＤＥＮＶ３ウイルスゲノムが３’ＵＴＲ中のＴＬ２ステムループ構造に相当する３０ｎｔ欠失および３’ＵＴＲのＴＬ−３構造に相当する別の非隣接上流３１ｎｔ欠失を含むＤＥＮＶ３  ＬＡＶである、ｒＤＥＮ３Δ３０／Δ３１；ならびに（４）ＤＥＮＶ４ウイルスゲノムが３’ＵＴＲ中のＴＬ２ステムループ構造に相当する３０ｎｔ欠失を含むＤＥＮＶ４  ＬＡＶである、ｒＤＥＮ４Δ３０（国際公開第２０１６１０６１０７号の図１参照）。
【００４５】
「非複製ワクチン」は、組換えサブユニットワクチン、不活化ワクチン、コンジュゲートワクチンまたはＤＮＡワクチンから選択される、デングウイルス感染またはその臨床症状を予防または処置するためのデングウイルスワクチンを指す。
【００４６】
「不活化ワクチン」は、有効量の死滅したまたは不活性な全粒子デングウイルスと、薬学的に許容される担体とを含むワクチンであって、ウイルスが化学物質、熱または放射線を含む任意の手段によって不活化されているワクチンを指す。不活化ワクチンの不活化の後の残存感染力は低く、例えば不活化後は５プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬ未満である。好ましい実施形態では、不活化の後の残存感染力が非常に低く、例えば４ＰＦＵ／ｍＬ以下、３ＰＦＵ／ｍＬ以下または２ＰＦＵ／ｍＬ以下、１ＰＦＵ／ｍＬ未満、０．５ＰＦＵ／ｍＬ以下または０．１ＰＦＵ／ｍＬ以下である。特定のワクチンのＰＦＵは、例えば、プラークアッセイ、免疫染色アッセイまたはウイルス感染力を検出することが当技術分野で知られている他の方法を使用することによって決定され得る。
【００４７】
「コンジュゲートワクチン」は、担体タンパク質に共有結合したデング抗原を含むワクチンを指す。
【００４８】
「ＤＮＡワクチン」は、デングタンパク質、デングタンパク質断片およびデング融合タンパク質、ならびにこれらの変異体を含むデングタンパク質抗原をコードするヌクレオチドの配列を含むワクチンである。ＤＮＡワクチンは、プロモーターと作動可能に連結された目的の抗原をコードするヌクレオチドの配列を含むプラスミド（例えば、ＤＮＡまたはウイルスプラスミド）を含む。
【００４９】
「サブユニットワクチン」は、完全なデングウイルスではないが１つまたは複数のデング抗原成分、例えばデング免疫原性エピトープ、デングタンパク質、異なるデング血清型抗原の融合体を含むデング抗原融合タンパク質またはデングタンパク質断片を含むワクチンを指す。本明細書で使用されるサブユニットワクチンは、一価（単一のデング抗原を含む）であることができる、または多価（２つ以上の抗原成分を含む）であることができる。好ましい実施形態では、サブユニットワクチンが四価である。
【００５０】
「プライム−ブースト」という用語は、（１）（ａ）少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む第１のデングウイルスワクチン組成物を、それを必要とする患者に投与することと；（２）所定の時間が経過するのを待つことと；（３）第２のデングウイルスワクチン組成物または非複製デングワクチンを患者に投与することとを含む治療レジメンを指す。第２のデングウイルスワクチン組成物は、第１のデングウイルスワクチン組成物と同じであっても異なっていてもよい。一実施形態では、第２のデングウイルスワクチンが、弱毒化生デングワクチンまたは組換えデングサブユニットワクチンである。本発明の組成物に使用されるデングウイルスワクチンは、ヒト患者において相同デングウイルスに対するウイルス中和抗体応答を誘導するのに有用である。
【００５１】
「処置」という用語は、治療的処置と予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指す。処置「を必要とする」個体または患者は、いずれかの臨床症状が顕在化しているかどうかかにかかわらず既にデング感染しているもの、ならびにデングに感染するリスクがあるものを含む。本発明のデングワクチン組成物による患者の処置は、以下のうちの１つまたは複数を含む：患者のデングに対する免疫応答を誘導する／増加させること、１つまたは複数のデングウイルスに対するウイルス中和抗体応答を誘導すること、デングに感染している患者のデングの臨床症状の可能性を予防する、改善する、抑止するまたは減少させること、デング熱、ＤＨＦもしくはＤＳＳおよび／またはデング感染に関連する他の疾患もしくは合併症を発症する可能性を予防するまたは減少させること、デング感染および／またはデングに関連する他の疾患もしくは合併症の臨床症状の重症度または持続期間を減少させること、ならびにデング感染の可能性を予防するまたは減少させること。
【００５２】
「薬学的有効量」または「有効量」という用語は、それだけに限らないが、患者のデングに対する免疫応答を誘導する／増加させること、患者のデングに対するウイルス中和抗体応答を誘導する／増加させること、デング感染の可能性を予防するもしくは減少させること、デング再発性感染の可能性を予防するもしくは減少させること、デングに感染している患者のデング感染の臨床症状を予防する、改善するもしくは抑止すること、デング熱、ＤＨＦおよび／もしくはＤＳＳを予防すること、またはデングに関連する疾患の重症度もしくは持続期間を減少させることを含む、所望の効果をもたらすために十分なワクチン組成物が患者に導入されることを意味する。当業者は、このレベルが変化し得ることを認識する。
【００５３】
「免疫応答」という用語は、細胞媒介（Ｔ細胞）免疫応答および／または抗体（Ｂ細胞）応答を指す。
【００５４】
「患者」という用語は、免疫適格性個体と免疫不全個体の両方の個体を含む、本明細書に記載されるデングワクチン組成物を受けることになる、デングウイルス、例えばＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４に感染することが可能な哺乳動物を指す。好ましい実施形態では、患者がヒトである。本明細書で定義される場合、「患者」は、自然感染もしくはワクチン接種を通して既にデングに感染しているもの、またはその後に曝露され得るものを含む。
【００５５】
「ＩＳＣＯＭ様アジュバント」は、その機能に寄与する独特な球状のケージ様構造を有する、特徴的なケージ様粒子を共に形成するサポニン、コレステロールおよびリン脂質から構成される免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）を含むアジュバントである（概説については、Ｂａｒｒ  ａｎｄ  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７４：８−２５（１９９６）参照）。この用語は、抗原を使用して製造され、ＩＳＣＯＭ（商標）粒子内に抗原を含むＩＳＣＯＭ（商標）アジュバントと抗原を使用しないで製造される中空のＩＳＣＯＭ型アジュバントであるＩＳＣＯＭ（商標）マトリックスアジュバントの両方を含む。本明細書で提供される組成物および方法の好ましい実施形態では、ＩＳＣＯＭ型アジュバントが、ＩＳＣＯＭ（商標）マトリックス粒子アジュバント、例えば抗原を使用しないで製造されるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）である（ＩＳＣＯＭ（商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）はＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、オーストラリアの登録商標である）。
【００５６】
「ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５」という名称は、ウイルスゲノムが（１）３’ＵＴＲのＴＬ２ステムループ構造の３０ｎｔ欠失および（２）Ｖｅｒｏ細胞における増殖にウイルスが適応した後に生じた１５４５位ヌクレオチドにおけるＧへの置換を含む、組換えデング１ウイルスを指す。
【００５７】
「ｒＤＥＮ２／４  Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３」という名称は、ウイルスゲノムが：（１）（ｉ）３’ＵＴＲのＴＬ２ステムループ構造の３０ｎｔ欠失ならびに（ｉｉ）Ｖｅｒｏ細胞における増殖にウイルスが適応した後に生じた１４９５位ヌクレオチドにおけるＵへの置換および７１６３位ヌクレオチドにおけるＣへの置換を含むデング４の骨格（Ｃ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５遺伝子）ならびに（２）デング２のｐｒＭおよびＥ遺伝子を含む、組換えキメラデング２／４ウイルスを指す。
【００５８】
「ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４」という名称は、ウイルスゲノムが：（１）３’ＵＴＲのＴＬ２ステムループ構造の３０ｎｔ欠失、（２）ＴＬ−３構造を欠失させる、Δ３０突然変異の上流の３’ＵＴＲ中の別の３１ｎｔ欠失、および（３）Ｖｅｒｏ細胞における増殖にウイルスが適応した後に生じた７１６４位ヌクレオチドにおけるＣへの置換を含む、組換えデング３ウイルスを指す。
【００５９】
「ｒＤＥＮ４Δ  ３０−７１３２，７１６３，８３０８」という名称は、ウイルスゲノムが：（１）３’ＵＴＲのＴＬ２ステムループ構造の３０ｎｔ欠失ならびに（２）Ｖｅｒｏ細胞における増殖にウイルスが適応した後に生じた７１３２位ヌクレオチドにおけるＵへの置換、７１６３位ヌクレオチドにおけるＣへの置換および８３０８位ヌクレオチドにおけるＧへの置換を含む、組換えデング４ウイルスを指す。
【００６０】
「Ｖ１８０」は、４つのデングウイルス血清型（ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４）の各々由来の切断型エンベロープ糖タンパク質（ＤＥＮ−８０Ｅ）から構成される四価のサブユニットワクチンを指し、Ｅタンパク質が、宿主細胞内で組換え発現したときに前記Ｅタンパク質が増殖培地中に分泌可能であるように、各々がそのＮ末端のアミノ酸残基１から始まる野生型Ｅの長さのおよそ８０％を構成する。Ｃｏｌｌｅｒらの国際公開第２０１２／１５４２０２号を参照されたい。
【００６１】
以下の略語が本明細書で使用され、以下の意味を有する：Ｃはデングカプシド遺伝子であり、ＤＥＮ（あるいはＤＥＮＶ）はデングウイルスであり、ＤＦはデング熱であり、ＤＨＦはデング出血熱であり、ＤＳＳはデングショック症候群であり、ｈは時間であり、ＧＭＴは幾何平均力価であり、ＩＭは筋肉内であり、ＩＭＸはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（商標）であり、ＪＥは日本脳炎であり、ＬＡＶは弱毒化生ウイルスであり、ＮＳ（ＮＳ１〜ＮＳ５に使用される）は非構造であり、ｎｔはヌクレオチドであり、ＰＦＵはプラーク形成単位であり、ｐｒＭはデングプレメンブレン遺伝子であり、ＳＣは皮下であり、ＴＢＥはダニ媒介性脳炎であり、ＵＴＲは非翻訳領域であり、ＷＮ（あるいはＷＮＶ）はウエストナイルウイルスであり、ＹＦ（あるいはＹＦＶ）は黄熱病ウイルスであり、ｗｔは野生型である。
【００６２】
弱毒化生デングウイルスワクチン
上記のように、本発明のデングウイルスワクチン組成物は、少なくとも１つのデングウイルス１型（ＤＥＮ１）、デングウイルス２型（ＤＥＮ２）、デングウイルス３型（ＤＥＮ３）およびデングウイルス４型（ＤＥＮ４）からなる群から選択されるＬＡＶ、またはＬＡＣＶを含む弱毒化生デングワクチンを含む。一実施形態では、ＬＡＶまたはＬＡＣＶが、３’ＵＴＲ中のＴＬ−２  Δ３０改変を含むウイルスゲノムを含み、ＬＡＶまたはＬＡＣＶが、デングに対する免疫応答を誘導する、デングに対するウイルス中和抗体応答を誘導する、感染の可能性から保護するもしくはこれを減少させる、またはその臨床症状の重症度もしくは持続期間を減少させる。本発明の実施形態では、弱毒化生デングワクチンが、一価、二価、三価または四価である、すなわち、ＤＥＮ血清型１〜４ののうちそれぞれ１つ、２つ、３つまたは４つに対する免疫応答を誘導するまたはこれらから保護する。本発明の好ましい実施形態では、弱毒化生デングワクチンが四価である、すなわち、ＤＥＮ血清型１〜４に対する免疫応答を誘導するまたはこれらから保護し、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４成分を含み、各成分がＬＡＶまたはＬＡＣＶのいずれかである。
【００６３】
本発明の追加の実施形態では、弱毒化生デングワクチンが、四価のＬＡＶまたは「ＬＡＴＶ」である（すなわち、本明細書で定義される、ＤＥＮＶ１〜４由来の弱毒化生デングウイルス、またはＤＥＮＶ１〜４由来の弱毒化生キメラフラビウイルス、またはこれらの組み合わせを含み、ＬＡＶまたはＬＡＣＶの少なくとも１つがΔ３０ＬＡＶまたはΔ３０ＬＡＣＶである）。本発明の追加の実施形態では、弱毒化生デングワクチンが四価であり、少なくとも１つのキメラフラビウイルスを含み；キメラフラビウイルスが、単一デングウイルス血清型のｐｒＭおよびＥタンパク質をコードするヌクレオチド配列ならびに異なるフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムを含み、キメラフラビウイルスが弱毒化されている。本発明のいくつかの実施形態では、キメラフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質が、ｐｒＭおよびＥタンパク質とは異なるデング血清型に由来する。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＬＡＴＶの各ＬＡＶまたはＬＡＣＶ成分が、独立にウイルスゲノムの３’ＵＴＲ中のＴＬ−２  Δ３０改変を含む弱毒化キメラフラビウイルスまたは弱毒化デングウイルスのいずれかである、弱毒化生ウイルスを含む。デングウイルスの弱毒化は、ＴＬ−２  Δ３０改変を通して達成される。しかしながら、それだけに限らないが、１４９５位、１５４５位、７１３２位、７１６３位、７１６４位および８３０８位の突然変異を含む、付加的な弱毒化突然変異がワクチンの１つまたは複数の成分に含まれてもよい。弱毒化変異は、当技術分野で公知の方法を含む様々な技術によって、例えば組織培養の連続継代を通して、またはより定義されている遺伝子操作を通して、達成することができる。デングウイルスおよびキメラデングウイルスを弱毒化するのに有用な突然変異は、当技術分野で公知である。例えば、国際公開第０２／０９５０７５号、国際公開第２００６／４４８５７号、米国特許第７１８９４０３号明細書、米国特許第８３３７８６０号明細書、国際公開第２００３／１０３５７１号、国際公開第２０００／０１４２４５号および国際公開第２００８／０２２１９６号を参照されたい。国際公開第０６／１３４４３３号、国際公開第２００６／１３４４４３号、国際公開第２００７／１４１２５９号、国際公開第９６／４０９３３号、国際公開第２０００／０５７９０７号、国際公開第２０００／０５７９０８号、国際公開第２０００／０５７９０９号、国際公開第２０００／０５７９１０号および国際公開第２００７／０１５７８３号に記載されている株などの、公知の弱毒化デング株も本明細書の組成物に使用することができる。
【００６５】
本発明の組成物の好ましい実施形態は、四価の弱毒化生デングワクチン（ＬＡＴＶ）を含む。このような四価の弱毒化生ワクチンは、４つの弱毒化デングウイルス（ＬＡＶ）、３つのＬＡＶと１つの弱毒化キメラフラビウイルス株（ＬＡＣＶ）、２つのデングＬＡＶと２つのＬＡＣＶ、１つのデングＬＡＶと３つのＬＡＣＶ、または４つのＬＡＣＶを含むことができる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ＬＡＴＶが次の特徴を含む：（１）ＤＥＮＶ１ウイルスゲノムが３’ＵＴＲ中のＴＬ２ステムループ構造に相当する３０ｎｔ欠失を含むＤＥＮＶ１  ＬＡＶである、ｒＤＥＮ１Δ３０；（２）ＤＥＮＶ４骨格上にＤＥＮＶ２  ｐｒＭおよびＥ遺伝子を含むＤＥＮＶ２  ＬＡＣＶであって、ＤＥＮ４骨格が３’ＵＴＲ中のＴＬ２ステムループ構造に相当する３０ｎｔ欠失を含む、ｒＤＥＮ２／４Δ３０；（３）ＤＥＮＶ３ウイルスゲノムが３’ＵＴＲ中のＴＬ２ステムループ構造に相当する３０ｎｔ欠失および３’ＵＴＲのＴＬ−３構造に相当する別の非隣接上流３１ｎｔ欠失を含むＤＥＮＶ３  ＬＡＶである、ｒＤＥＮ３Δ３０／Δ３１；ならびに（４）ＤＥＮＶ４ウイルスゲノムが３’ＵＴＲ中のＴＬ２ステムループ構造に相当する３０ｎｔ欠失を含むＤＥＮＶ４  ＬＡＶである、ｒＤＥＮ４Δ３０。
【００６７】
キメラフラビウイルスを含む本発明の実施形態では、各キメラフラビウイルスが、単一デングウイルス血清型のｐｒＭおよびＥタンパク質をコードするヌクレオチド配列ならびに異なるフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質（すなわち、「骨格」）をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムを含み、キメラフラビウイルスの各々が弱毒化されている。組換え弱毒化生フラビウイルス株を構築する方法は、ベースとしての公知の弱毒化株の使用を含んでよく、この方法は、目的の関連ウイルスからの適切な遺伝子（ｐｒＭおよびＥ）でベースウイルスの等価の遺伝子を置換することを含む。例えば、このアプローチは、キメラウイルスがＷＮＶのｐｒＭおよびＥ遺伝子を含む弱毒化ＤＥＮ−４株をベースとした内部型キメラであるＷＮＶのために使用されている（Ｂｒａｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：４１６２−４１６６；Ｃｈｅｎ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：５１８６−５１９０；Ｂｒａｙ，Ｍ．ａｎｄ  Ｌａｉ，Ｃ．−Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：１０３４２−１０３４６；Ｌａｉ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）１０：１７３−１７９）。
【００６８】
別のアプローチは、組換えキメラワクチンを開発するためのベースとしてのＹＦ  １７Ｄ弱毒化黄熱病株の使用であり、これは以前にＪＥウイルス、ＤＥＮウイルスおよびＷＮウイルスのために使用された。キメラ黄熱病ワクチンは、任意の黄熱病株、例えばＹＦＶ  １７Ｄ由来のｐｒＭおよびＥタンパク質をコードする遺伝子を、デング血清型のもので置き換えることによって黄熱病骨格を含んで構築することができる。ＤＮＡクローニング後、ＲＮＡを転写し、Ｖｅｒｏ細胞にトランスフェクトして、ＹＦＶ  １７Ｄ複製機構および関連デングウイルスの外被を有するキメラウイルスが得られる。Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７４（１２）：５４７７−５４８５（２０００）；Ｇｕｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：６３２−６４９（２０１０）；Ｍｏｎａｔｈ  Ｔ．Ｐ．Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ（２００３）６１：４６９−５０９；Ｍｏｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００６）１０３：６６９４；および国際公開第９８／３７９１１号を参照されたい。よって、本発明のいくつかの実施形態では、弱毒化生デングワクチンが、（１）単一デング血清型のｐｒＭおよびＥタンパク質ならびに黄熱病骨格を含む少なくとも１のキメラフラビウイルス、ならびに（２）３’ＵＴＲのＴＬ−２ステムループ構造の３０ヌクレオチド欠失を含むウイルスゲノムを含む少なくとも１のＬＡＶまたはＬＡＣＶを含む。
【００６９】
本発明の組成物で有用なキメラ弱毒化生フラビウイルスはまた、ウイルスゲノムが単一デングウイルス血清型のｐｒＭおよびＥ遺伝子ならびに異なるデングウイルス血清型のカプシドおよび非構造遺伝子を含むデングキメラウイルスを含み得る。キメラウイルスが第２のデング血清型由来の骨格を含む実施形態では、デング骨格が、ＴＬ−２ステムループ構造に相当する３’ＵＴＲの約３０ヌクレオチドの欠失を含み、付加的な弱毒化突然変異を含んでもよい。任意の弱毒化デングウイルスまたは野生型デングウイルスを、弱毒化デング骨格または野生型デングウイルス骨格へのＴＬ−２ステムループ構造の３０ヌクレオチド欠失の導入によって、キメラウイルスの骨格として使用することができる。デングウイルス骨格の弱毒化は、連続継代を通して、定義されている遺伝子突然変異の導入を通して、または公知の弱毒化デング株の使用を通して達成することができる。デングキメラワクチンは、例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄらの国際公開第０３／０９２５９２号に記載されている。本発明のいくつかの実施形態では、弱毒化生ワクチンが、カプシドおよび非構造タンパク質がｐｒＭおよびＥタンパク質とは異なるデング血清型に由来する、キメラフラビウイルスを含む。
【００７０】
本発明のデングウイルスワクチン組成物は、有効量の弱毒化生ウイルスワクチンを含む。本発明のいくつかの実施形態では、弱毒化生デングワクチンの効力が、１０〜約１×１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）である。代替実施形態では、弱毒化生デングワクチンの効力が、約１×１０２〜約１×１０６ＰＦＵである。他の実施形態では、弱毒化生デングワクチンの効力が、約１×１０３〜約１×１０５ＰＦＵである。
【００７１】
ウイルスプラークアッセイは、ウイルス試料中のプラーク形成単位（ｐｆｕ）の数を決定する。手短に言えば、デング免疫プラークアッセイでは、宿主細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞）のコンフルエントな単層を様々な希釈度のデングウイルスに感染させ、メチルセルロースを含有する半固体オーバーレイ培地で覆って、ウイルス感染が無差別に広がるのを防ぐ。（１又は複数の）ウイルス感染細胞は溶解し、隣接細胞に感染を広げ、感染から溶解のサイクルが繰り返される。感染細胞はプラーク（非感染細胞に囲まれた感染Ｖｅｒｏ細胞の群）を形成し、これは固定および抗デング血清型特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用した免疫染色後、視覚的に見ることができる。プラークをカウントし、希釈係数と組み合わせた結果を使用して、試料中の１ｍＬ当たりのプラーク形成単位数（ｐｆｕ／ｍＬ）を計算する。デング効力の結果（ｐｆｕ／ｍＬ）は、試料内の感染性粒子の数を表し、形成された各プラークが１つの感染性ウイルス粒子を表すという仮定に基づく。
【００７２】
デングサブユニットワクチン
本発明のいくつかの実施形態では、製剤が、１つまたは複数のデング抗原タンパク質を含む組換えデングサブユニットワクチンを含む。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、組換えデングサブユニットワクチンが、１つまたは複数のデングタンパク質、融合タンパク質、またはその１つもしくは複数の断片を含む。さらに好ましい実施形態では、組換えデングサブユニットワクチンが、デングエンベロープまたはＥタンパク質、またはこれらの断片を含む。
【００７３】
さらに好ましい実施形態では、組換えデングサブユニットワクチンが四価である、すなわち、４つ全てのデング血清型に対する免疫応答を標的とする。組換えデングサブユニットワクチンは、４つの組換えデングタンパク質または４つ未満、例えば組換えＤＥＮ１タンパク質、組換えＤＥＮ２タンパク質および組換えＤＥＮ３／４融合タンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、組換えデングサブユニットワクチンが、組換え発現系を使用して産生および分泌されるＤＥＮ１〜４のデングウイルスエンベロープ糖タンパク質またはその断片（例えば、ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０Ｅ、ＤＥＮ４−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ）を含む。前記サブユニットワクチンは、以下により完全に記載されるように、アジュバントを含んでもよい。
【００７４】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、組換えデングサブユニットワクチンが、１つまたは複数の精製されたデングウイルスエンベロープ（「Ｅ」）タンパク質、薬学的に許容される賦形剤を含み、Ｅタンパク質が、宿主細胞内で組換え発現したときに前記Ｅタンパク質が増殖培地中に分泌可能であるように、各々がそのＮ末端のアミノ酸残基１から始まる野生型Ｅの長さのおよそ８０％を構成し、組成物がヒト対象で中和抗体の産生を誘導する。本発明のいくつかの実施形態では、組換えデングサブユニットワクチンが、有効量のアジュバントをさらに含む。本発明のいくつかの実施形態では、ＤＥＮ−４  Ｅタンパク質が、米国特許第６７４９８５７号明細書および国際公開第２０１２／１５４２０２号に記載されるように、二量体（「ＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ」）である。
【００７５】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、上記組成物中のＥタンパク質が、昆虫宿主細胞内で組換え産生および発現される。さらに好ましい実施形態では、Ｅタンパク質が、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＳｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２（Ｓ２）宿主細胞内で組換え産生および発現される。
【００７６】
組換えデングウイルスＥタンパク質は、ショウジョウバエのＳｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２（Ｓ２）細胞を使用する細胞培養発現系によって産生することができる。この系は、天然様構造を維持した組換えデングエンベロープタンパク質を産生することが実証されている（Ｃｕｚｚｕｂｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）８：１１５０−５５；Ｍｏｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００３）１００：６９８６−９１；Ｍｏｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００４）４２７：３１３−９；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２００４）１２（９）：１６０７−１８）。この発現系はまた、ウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびダニ媒介性脳炎ウイルスなどの他のフラビウイルス由来の他の組換えエンベロープタンパク質を発現することも示されている。組換えデングエンベロープタンパク質は、天然エンベロープタンパク質の８０％を残して、Ｃ末端で切断され得る（「８０Ｅ」）。よって、８０Ｅは、そのＮ末端のアミノ酸１で始まるＥタンパク質の連続アミノ酸のおよそ最初の８０％として定義される。
【００７７】
上記のように、本発明のこの態様のいくつかの実施形態は、そのＮ末端のアミノ酸残基１から始まる野生型Ｅの長さのおよそ８０％からなる切断型８０Ｅタンパク質を含む。本発明のいくつかの実施形態に使用されるＥタンパク質は、そのタンパク質の膜アンカー部分（カルボキシ末端のＥのおよそ最後の１０％）を欠失している。換言すれば、本発明の具体的な実施形態に使用される切断型８０Ｅタンパク質は、そのＮ末端のアミノ酸１で始まるＥの連続アミノ酸の最大で最初の９０％からなり、よって細胞外培地中に分泌されることが可能になり、回収が容易になる。切断は、８０Ｅ部分を膜アンカー部分と連結するＥタンパク質の「ステム」部分をさらに欠失させ得る；ステム部分は注目すべき抗原性エピトープを含まないので、好ましい抗原であるＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０Ｅ、ＤＥＮ４−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐに含まれない。Ｅタンパク質の９０％超であるが１００％未満をクローニングし、分泌することができる、すなわちこのタンパク質は９０％＋の長さのカルボキシ切断型であることができ、切断型Ｅタンパク質が分泌可能である限り、膜貫通ドメインの一部を含むことができる。「分泌可能」は、発現系中の形質転換細胞から分泌されることが可能であり、典型的には分泌されることを意味する。よって、当業者であれば、本発明の組成物および方法に有用なデングＥタンパク質が、このタンパク質が分泌可能である限り、本明細書に例示される８０％から変動し得ることを認識するだろう。本発明の各態様の好ましい実施形態では、ＤＥＮ  Ｅタンパク質が、エンベロープタンパク質のＮ末端アミノ酸から始まって３９３番目から４０１番目のアミノ酸の範囲内のアミノ酸で終わる約８０％の長さであり、例えばデングウイルス２型のアミノ酸１〜アミノ酸３９５である。本発明の各態様の代替実施形態では、デングＥタンパク質が、そのＮ末端のアミノ酸１で始まるＥの連続アミノ酸の約７５％、約８５％、約９０％、約９５％または約９８％であり得る。本明細書中の発明の態様の例示的な実施形態では、ＤＥＮ  Ｅタンパク質が、そのＮ末端のアミノ酸１で始まるＥタンパク質の連続アミノ酸のおよそ８０％であり；例えば、配列番号１に示されるＤＥＮ１−８０Ｅ、配列番号２に示されるＤＥＮ２−８０Ｅ、配列番号３に示されるＤＥＮ３−８０Ｅおよび配列番号４に示されるＤＥＮ４−８０Ｅである。
【００７８】
分泌されるＥタンパク質は、組換えタンパク質の免疫原性がさらに増強されるように、ＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐタンパク質などの中の二量体化を促進するドメインをさらに含み得る。例示的なＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐタンパク質は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、組成物に含まれるＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３の８０Ｅ抗原が単量体であり、ＤＥＮ４  ８０Ｅ抗原が二量体である。
【００７９】
本発明のこの態様の代替実施形態では、組成物中のＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０ＥおよびＤＥＮ４−８０Ｅタンパク質が、単量体である。このような実施形態では、ＤＥＮ４成分が、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３タンパク質の個々の量の約１．５倍〜約３倍、好ましくはＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３成分（タンパク質）の量の約２倍の量で存在する。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、組成物中のＤＥＮ１：ＤＥＮ２：ＤＥＮ３：ＤＥＮ４抗原の比が、およそ１：１：１：２である。
【００８０】
デングＥタンパク質を含む本発明の実施形態では、組成物中の各Ｅタンパク質の量が、約０．５μｇ〜約５００μｇである。代替実施形態では、各Ｅタンパク質の量が、約０．５μｇ〜約４５０μｇ、０．５μｇ〜約４００μｇ、０．５μｇ〜約３５０μｇ、０．５μｇ〜約３００μｇ、０．５μｇ〜約２５０μｇ、０．５μｇ〜約２００μｇ、０．５μｇ〜約１５０μｇ、０．５μｇ〜約１００μｇ、０．５μｇ〜約５０μｇ、５．０μｇ〜約５００μｇ、５．０μｇ〜約４５０μｇ、５．０μｇ〜約４００μｇ、５．０μｇ〜約３５０μｇ、５．０μｇ〜約３００μｇ、５．０μｇ〜約２５０μｇ、５．０μｇ〜約２００μｇ、５．０μｇ〜約１５０μｇ、５．０μｇ〜約１００μｇ、５．０μｇ〜約５０μｇ、１０μｇ〜約５００μｇ、１０μｇ〜約４５０μｇ、１０μｇ〜約４００μｇ、１０μｇ〜約３５０μｇ、１０μｇ〜約３００μｇ、１０μｇ〜約２５０μｇ、１０μｇ〜約２００μｇ、１０μｇ〜約１５０μｇ、１０μｇ〜約１００μｇ、１０μｇ〜約５０μｇ、２５μｇ〜約５００μｇ、２５μｇ〜約４５０μｇ、２５μｇ〜約４００μｇ、２５μｇ〜約３５０μｇ、２５μｇ〜約３００μｇ、２５μｇ〜約２５０μｇ、２５μｇ〜約２００μｇ、２５μｇ〜約１５０μｇ、２５μｇ〜約１００μｇまたは２５μｇ〜約５０μｇである。さらに好ましい実施形態では、組成物中の各Ｅタンパク質の量が、約１．０μｇ〜約１００μｇである。なおさらなる実施形態では、組成物中の各Ｅタンパク質の量が、およそ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００μｇから選択される。
【００８１】
不活化デングワクチン
本明細書における不活化デングワクチンは、１つもしくは複数の全粒子不活化デングウイルスおよび／または１つもしくは複数の不活化デングキメラウイルスを含む。本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、不活化デングワクチンが四価であり、全粒子不活化ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４を含む。別の実施形態では、不活化ワクチンが４つの不活化キメラデングウイルスを含む。さらに他の実施形態では、不活化ワクチンが四価であり、１つまたは複数の全粒子不活化デングウイルスおよび１つまたは複数の不活化デングキメラウイルス、例えば不活化全粒子ＤＥＮ１ウイルス、不活化全粒子ＤＥＮ２ウイルス、不活化ＤＥＮ３キメラウイルスおよび不活化ＤＥＮ４キメラウイルスを含む。当業者であれば、ワクチン組成物が４つ全てのデング血清型を標的とする限り、不活化全粒子またはキメラＤＥＮウイルスの任意の組み合わせが本発明の四価の組成物および方法に使用され得ることを理解する。
【００８２】
本発明の組成物および方法に有用な不活化デングワクチンは、Ｐｕｔｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：４４４２−４４５２（２００５）、米国特許第６１９０８５９号明細書、米国特許第６２５４８７３号明細書およびＳｔｅｒｎｅｒらの国際公開第２００７／００２４７０号に記載されている。あるいは、デングウイルス株およびキメラデング株／キメラフラビウイルス株は、当技術分野で公知の方法、例えば化学物質、熱または放射線を通して、組成物に使用するために不活化することができる。
【００８３】
したがって、本発明はまた、有効量の弱毒化生デングワクチンおよび非複製デングワクチンを含む上記製剤であって、弱毒化生デングワクチンは、少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含み、ＬＡＶまたはＬＡＣＶは、３’ＵＴＲのＴＬ−２ステムループ構造の３０ヌクレオチドの欠失を含むウイルスゲノムを含む、製剤に関する。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のデングウイルスワクチン組成物の非複製デングワクチンが、組換えデングサブユニットワクチンまたは不活化デングワクチンから選択される。一実施形態では、製剤が、凍結乾燥、凍結、マイクロ波乾燥される、または有効量の弱毒化生デングワクチンおよび非複製デングワクチンを含むリオスフェアを有する。別の実施形態では、弱毒化生デングワクチンの製剤が、非複製デングワクチン、例えばＶ１８０を含む液体溶液で再構成される。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態では、弱毒化生ワクチンおよび非複製デングワクチンが四価である（すなわち、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４成分を含む、またはＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４に対する免疫応答を誘導する）。
【００８５】
アジュバント
ワクチンと、アジュバントとして知られる、目的の抗原に対する免疫応答を増強することができる化合物の共投与は、広範に研究されている。目的の抗原に対する免疫応答を増加させることに加えて、いくつかのアジュバントは、所望の免疫応答を誘発するために必要とされる抗原の量を減少させるために、または持続的免疫応答を誘導して疾患からの保護を提供するための臨床レジメンにおいて必要な注射の回数を減少させるために使用され得る。
【００８６】
そのために、本発明のデングウイルスワクチン製剤は、アジュバントを使用し得る。本明細書に記載される製剤のアジュバントは、上記の所望の機能を果たし、組成物のＬＡＶまたはＬＡＣＶを不活化せず、またその力価に有意に影響を及ぼさない任意のアジュバントであることができる。
【００８７】
アルミニウム系化合物は、６０年以上前にアジュバント活性を有することが決定された（概説については、Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｅ．Ｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８２：４９７−５０５（２００４）；Ｂａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：Ｓ１８−Ｓ２３（２００２）参照）。アルミニウムアジュバントは、適切な投与量で使用された場合、安全であると一般に考えられている。多くのものが、世界中の規制当局によってヒトへの投与について承認されている。
【００８８】
したがって、アルミニウム系化合物、例えば水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）、アルミニウムヒドロキシホスフェート（ＡｌＰＯ４）、非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェート硫酸塩（ＡＡＨＳ）またはいわゆる「アルム（ａｌｕｍ）」（ＫＡｌ（ＳＯ４）・１２Ｈ２Ｏ）（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｂｙ  Ａｌ  ＭＡＳ  ＮＭＲ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８９（３）：３１１−２１（２０００）参照）が、本明細書で提供される組成物と組み合わされ得る。本明細書で提供される本発明の例示的な実施形態では、アルミニウムアジュバントが、アルミニウムヒドロキシホスフェートまたはＡＡＨＳである。代替実施形態では、アルミニウムアジュバントが、本明細書で「ＡＰＡ」と呼ばれるリン酸アルミニウムアジュバントである。他の実施形態では、アジュバントが水酸化アルミニウムである。
【００８９】
当業者であれば、安全であると同時に標的デングウイルスへの免疫応答を増加させることに有効であるアルミニウムアジュバントの最適投与量を決定することができるだろう。アルミニウムの安全性プロファイル、ならびにＦＤＡ認可ワクチンに含まれるアルミニウムの量の議論については、Ｂａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：Ｓ１８−Ｓ２３（２００２）を参照されたい。一般に、アルミニウムアジュバントの有効かつ安全な用量は、１用量当たり５０μｇ〜１．２５ｍｇのアルミニウム元素（１００μｇ／ｍＬ〜２．５ｍｇ／ｍＬの濃度）で変動する。
【００９０】
したがって、本発明の具体的な実施形態は、弱毒化生デングウイルスワクチンを含み、アルミニウムアジュバントをさらに含む組成物を含む。本発明の実施形態では、デング組成物が、ワクチンの１用量当たり約５０μｇ〜約１．２５ｍｇのアルミニウム元素を含むアジュバントを含む。他の実施形態では、ワクチン組成物の１用量当たりのアルミニウムアジュバントが、約１００μｇ〜約１．０ｍｇ、約１００μｇ〜約９００μｇ、約１００μｇ〜約８５０μｇ、約１００μｇ〜約８００μｇ、約１００μｇ〜約７００μｇ、約１００μｇ〜約６００μｇ、約１００μｇ〜約５００μｇ、約１００μｇ〜約４００μｇ、約１００μｇ〜約３００μｇ、約１００〜約２５０μｇ、約２００μｇ〜約１．２５ｍｇ、約２００μｇ〜約１．０ｍｇ、約２００μｇ〜約９００μｇ、約２００μｇ〜約８５０μｇ、約２００μｇ〜約８００μｇ、約２００μｇ〜約７００μｇ、約２００μｇ〜約６００μｇ、約２００μｇ〜約５００μｇ、約２００μｇ〜約４００μｇ、約２００μｇ〜約３００μｇ、約３００μｇ〜約１．２５ｍｇ、約３００μｇ〜約１．０ｍｇ、約３００μｇ〜約９００μｇ、約３００μｇ〜約８５０μｇ、約３００μｇ〜約８００μｇ、約３００μｇ〜約７００μｇ、約３００μｇ〜約６００μｇ、約３００μｇ〜約５００μｇ、約３００μｇ〜約４００μｇ、約４００μｇ〜約１．２５ｍｇ、約４００μｇ〜約１．０ｍｇ、約４００μｇ〜約９００μｇ、約４００μｇ〜約８５０μｇ、約４００μｇ〜約８００μｇ、約４００μｇ〜約７００μｇ、約４００μｇ〜約６００μｇ、約４００μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約１．２５ｍｇ、約５００μｇ〜約１．０ｍｇ、約５００μｇ〜約９００μｇ、約５００μｇ〜約８５０μｇ、約５００μｇ〜約８００μｇ、約５００μｇ〜約７００μｇ、約５００μｇ〜約６００μｇ、約６００μｇ〜約１．２５ｍｇ、約６００μｇ〜約１．０ｍｇ、約６００μｇ〜約９００μｇ、約６００μｇ〜約８５０μｇ、約６００μｇ〜約８００μｇまたは約６００μｇ〜約７００μｇに及ぶ量のアルミニウム元素を含む。
【００９１】
本発明のデングウイルスワクチン組成物と一緒に使用され得る他のアジュバントとしては、それだけに限らないが、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、またはリポ多糖、モノホスホリルリピドＡおよびアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸を含む、ＴＬＲ４およびＴＬＲ９などのｔｏｌｌ様受容体に対して作用する他の分子を含有するアジュバントが挙げられる（概説については、Ｄａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９（１）：４５−５２（２００７）；Ｄｕｔｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２３９（１）：１７８−１９６（２０１１）；Ｈｅｄａｙａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３２（２）：２９４−３２５（２０１２）参照）。本発明の組成物中に有用な付加的なアジュバントとしては、免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ；例えば、米国特許第７７１３５３５号明細書および米国特許第７４７０６７４号明細書参照）；Ｔヘルパーエピトープ、リピドＡおよびその誘導体または変異体、リポソーム、リン酸カルシウム、サイトカイン（例えば、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、Ｆｌｔ−３Ｌ）、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＣＤ７０、ＩＬ−１２、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）９０、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７、ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴ、非イオン性ブロックコポリマー、不完全フロイントアジュバント、ケモカイン、コレラ毒素；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシン；百日咳毒素；ムラミルジペプチド、ムラミルペプチド類似体、ＭＦ５９、ＳＡＦ、免疫賦活複合体、生分解性マイクロスフェア、ポリホスファゼン；合成ポリヌクレオチドが挙げられる。
【００９２】
本明細書に記載される組成物と使用するための付加的なアジュバントは、サポニン（例えば、ＱＳ２１）を単独で、またはＩＳＣＯＭ（「免疫刺激複合体」、概説については、Ｂａｒｒ  ａｎｄ  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７４：８−２５（１９９６）；およびＳｋｅｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｔｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４０：５３−５９（２００６）参照）の特徴的形態でコレステロールおよびリン脂質と組み合わせて含有するアジュバントである。このようなアジュバントは、本明細書で「サポニン系アジュバント」と呼ばれる。本明細書中の組成物の具体的な実施形態では、突然変異体毒素および／または毒素タンパク質が、ＩＳＣＯＭマトリックス粒子アジュバントであるＩＳＣＯＭ型アジュバントまたは「ＩＳＣＯＭ」、例えば抗原を使用しないで製造されるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）と組み合わされる（ＩＳＣＯＭ（商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）はＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、オーストラリアの登録商標である）。
【００９３】
製剤
本発明の製剤または組成物は、少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンと、ｐＨ約６．５〜８．５の緩衝液と、糖、グリコールまたは糖アルコールと、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、クロスカルメロースおよびメチルセルロース、またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択されるセルロース誘導体と；場合によりアルカリまたはアルカリ塩と、場合によりＡｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸とを含む。
【００９４】
本発明の別の態様では、製剤が、約２０〜２０００００００ｐｆｕ／ｍｌの少なくとも１つの弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１つの弱毒化生キメラフラビウイルスを含む弱毒化生デングワクチンと、ｐＨ約６．５〜８．５の緩衝液と、約１５０〜３００ｍｇ／ｍｌの糖と、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、クロスカルメロース、メチルセルロースまたはその薬学的に許容される塩、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびゼラチンからなる群から選択される担体と；場合により約５〜１００ｍＭのアルカリ塩またはアルカリ塩と；場合によりアミノ酸Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ、またはこれらの組み合わせとを含む。
【００９５】
一実施形態では、弱毒化生デングワクチンが、製剤中１００〜１０００００００ｐｆｕ／ｍｌ、１００〜１０００００ｐｆｕ／ｍｌまたは６００〜２００００ｐｆｕ／ｍｌの濃度である。別の実施形態では、弱毒化生デングワクチンが、製剤中２００〜２０００００ｐｆｕ／ｍｌ、６００〜２０００００ｐｆｕ／ｍｌまたは６００〜１０００００ｐｆｕ／ｍｌの濃度である。
【００９６】
好ましい実施形態では、セルロース誘導体がアニオン性であり、弱毒化生デングワクチン製剤中約０．３〜１０ｍｇ／ｍｌ、１〜１０ｍｇ／ｍｌ、３〜７ｍｇ／ｍｌまたは５ｍｇ／ｍｌの塩、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウムまたはカリウムを形成する。カルボキシメチルセルロース塩は、平均分子量約７０００００の高粘度型；平均分子量約２５００００の中粘度型；および平均分子量約９００００の低粘度型で利用可能である。一実施形態では、セルロース誘導体が、弱毒化生デングワクチン製剤中約０．３〜１．５ｍｇ／ｍｌの平均分子量約７０００００のカルボキシメチルセルロース塩である。別の実施形態では、セルロース誘導体が、約１〜４ｍｇ／ｍｌの平均分子量約２５００００のカルボキシメチルセルロース塩である。さらなる実施形態では、セルロース誘導体が、約３〜７または３〜１０ｍｇ／ｍｌの平均分子量約９００００のカルボキシメチルセルロース塩である。なおさらなる実施形態では、セルロース誘導体が、約０．３〜１０ｍｇ／ｍｌの平均分子量約５００００〜１００００００のカルボキシメチルセルロース塩である。
【００９７】
一実施形態では、緩衝液が、約５〜３００ｍＭ、５〜２０ｍＭ、１０〜１２ｍＭまたは１１ｍＭのリン酸塩、
コハク酸塩、ヒスチジン、ＴＲＩＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩およびクエン酸塩からなる群から選択される。
【００９８】
アルカリまたはアルカリ塩は、安定化効果を提供することができ、約１０〜１５０ｍＭ、１０〜１００ｍＭ、１５〜７５ｍＭ、３０〜９０ｍＭ、７５ｍＭ、５０ｍＭまたは３０ｍＭの塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【００９９】
アミノ酸は、１０〜１００、１０〜７５、１０〜５０、２０〜３０または２５ｍＭのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。別の実施形態では、アミノ酸が、アミノ酸は、１０〜１００、１０〜７５、１０〜５０、２０〜３０または２５ｍＭのＡｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。一実施形態では、アミノ酸がＬｙｓ、ＬｅｕまたはＧｌｕである。別の実施形態では、アミノ酸がＬｅｕおよびＧｌｕである。別の実施形態では、アミノ酸がＬｅｕ、Ｌｙｓ、ＧｌｕまたはＡｌａである。別の実施形態では、アミノ酸がＬｅｕである。
【０１００】
糖およびグリコールまたは糖アルコールは、抗凍結剤または安定化賦形剤として作用することができる。一実施形態では、糖が５０〜３００ｍｇ／ｍｌの濃度である。別の実施形態では、糖が、約６０〜１２０ｍｇ／ｍｌ、９０〜１１０ｍｇ／ｍｌまたは８０〜１００ｍｇ／ｍｌのトレハロースまたはスクロースまたはこれらの組み合わせである。一実施形態では、スクロースとトレハロースの比が、１：１〜１：４の間である。別の実施形態では、スクロースが９０ｍｇ／ｍｌであり、トレハロースが９０〜２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１１０ｍｇ／ｍｌである。別の実施形態では、グリコールがプロピレングリコールであり、糖アルコールが約２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌ、３〜７ｍｇ／ｍｌまたは５ｍｇ／ｍｌのグリセロールまたはソルビトールである。
【０１０１】
本発明の組成物は、非経口、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、鼻腔内、皮下、腹腔内などの当業者に知られている１つまたは複数の方法によって対象に投与することができ、それに応じて製剤化することができる。
【０１０２】
一実施形態では、本発明の組成物が、液体調製物の表皮注射、筋肉内注射、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射または呼吸器内粘膜注射を介して投与される。注射用の液体製剤には、溶液などが含まれる。本発明の組成物は、単回用量バイアル、複数回用量バイアルまたはプレフィルドシリンジとして製剤化され得る。
【０１０３】
別の実施形態では、本発明の組成物が経口投与され、したがって、経口投与に適した形態に、すなわち、固体または液体調製物として製剤化される。固体経口製剤には、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆剤、ペレットなどが含まれる。液体経口製剤には、液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、油などが含まれる。
【０１０４】
本発明の一態様では、製剤が、凍結乾燥、凍結、マイクロ波乾燥から、またはリオスフェアの生成を通して調製された固体乾燥製剤である。一実施形態では、固体乾燥製剤が、実施例７に記載されるマイクロ波乾燥法によって得ることができる、または製造される。製剤は、−７０℃、−２０℃、２〜８℃または室温（２５もしくは３７℃）で保存することができる。乾燥製剤は、単位用量バイアルの成分の重量に関して表すことができるが、これは、用量やバイアルサイズによって異なる。あるいは、本発明の乾燥製剤は、同じ試料（例えば、バイアル）中の原体（ＤＳ）の重量と比較した成分の重量の比としての成分の量で表すことができる。この比は百分率として表すことができる。このような比は、バイアルサイズ、投与および再構成プロトコルにかかわらず、本発明の乾燥製剤の固有の特性を反映している。他の実施形態では、製剤がリオスフェアにある。
【０１０５】
本発明の別の態様では、製剤が再構成された溶液である。乾燥固形製剤は、投与または投薬経路などの臨床因子に応じて、様々な濃度で再構成することができる。例えば、乾燥製剤は、皮下投与に必要な場合、高濃度で（すなわち、少量で）再構成することができる。特定の対象に高用量が必要な場合、特に注射量を最小限にしなければならない場合に皮下投与する場合、高濃度が必要になる場合もある。その後の水または等張緩衝液による希釈を、製剤をより低濃度に希釈するために容易に使用することができる。より低い製剤濃度で等張性が望まれる場合、乾燥粉末を標準的な少量の水で再構成し、次いで、０．９％塩化ナトリウムなどの等張希釈剤でさらに希釈することができる。
【０１０６】
完全な水和を確実にするために、一般的に再構成は約２５℃の温度で行われるが、所望であれば他の温度を使用することもできる。再構成に必要な時間は、例えば、希釈剤の種類、（１又は複数の）賦形剤の量およびウイルスまたはタンパク質に依存する。例示的な希釈剤には、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液が含まれる。再構成体積は、約０．５〜１．０ｍｌ、好ましくは０．５ｍｌまたは０．７ｍｌであり得る。一実施形態では、単回用量が、０．５ｍｌの体積を有する。別の態様では、本発明は、液体製剤を調製する方法であって、本発明の製剤を上記の希釈剤で再構成するステップを含む方法を提供する。
【０１０７】
本発明の別の実施形態では、製剤が、凍結乾燥、凍結、マイクロ波乾燥またはリオスフェアの生成の前に調製される水溶液である。
【０１０８】
リオスフェアを調製する方法
リオスフェアを調製する方法は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１４０２９４８７２号明細書に開示されている。この方法は、実質的に球形状を有する少なくとも１つの液滴を固体および平坦な表面（すなわち、いずれの試料ウェルもキャビティもない）上に分配し、液滴を低温物質と接触させずに表面上の液滴を凍結し、凍結した液滴を凍結乾燥して、形状が実質的に球形の乾燥ペレットを製造することを含む。その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９１１９７９４号明細書も、リオスフェアを形成する方法を開示している。水性媒体混合物を含有する単一体積を、キャビティを含有する固体要素上に形成する。固体要素を、混合物の凍結温度未満に冷却し、キャビティを混合物で充填し、混合物を、キャビティ内に存在する間に固化して、単一形態を形成する。単一形態を真空中で乾燥させて、リオスフェアを得る。
【０１０９】
他の実施形態では、リオスフェアが、実質的に球形態で形成され、平坦な固体表面、特に、キャビティを有さない表面上で、所望の生物学的材料の液体組成物の液滴を凍結し、引き続いて単一形態を凍結乾燥することによって調製される。その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２９４８７２号明細書は、リオスフェアを形成する同様の方法を開示している。
【０１１０】
手短に言えば、いくつかの実施形態では、方法が、実質的に球形状を有する少なくとも１つの液滴を固体および平坦な表面（すなわち、いずれの試料ウェルもキャビティもない）上に分配し、液滴を低温物質と接触させずに表面上の液滴を凍結し、凍結した液滴を凍結乾燥して、形状が実質的に球形の乾燥ペレットを製造することを含む。この方法をハイスループットモードで使用して、固体の平坦な表面上に所望の数の液滴を同時に分配し、液滴を凍結し、凍結した液滴を凍結乾燥することによって、複数の乾燥ペレットを調製することができる。この方法によって液体製剤から調製されたペレットは、高濃度の生物学的物質（タンパク質治療薬など）を有することができ、乾燥ペレットのセットに組み合わせることができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、固体の平坦な表面が、金属板の上面を−９０℃以下の温度に維持するように適合されたヒートシンクと物理的に接触する底面を備える金属板の上面である。金属板の上面は液体製剤の凝固点よりかなり下にあるので、液滴は本質的に瞬時に凍結し、液滴の底面は金属板の上面に接触する。
【０１１２】
他の実施形態では、固体の平坦な表面が疎水性であり、分配ステップ中に０℃より上に維持される薄膜の上面を含む。薄膜を製剤の凍結温度未満の温度に冷却することによって、分配された液滴を凍結する。
【０１１３】
凍結乾燥方法
本発明の凍結乾燥製剤は、凍結乾燥前溶液の凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ））によって形成される。凍結乾燥は、製剤を凍結し、その後、一次乾燥に適した温度で水を昇華させることによって達成される。この条件下では、製品温度が共晶点または製剤の崩壊温度未満である。典型的には、一次乾燥の棚温度が、典型的には約３０〜２５０ミリトルに及ぶ適切な圧力で、約−５０〜２５℃に及ぶ（製品が一次乾燥中に凍結したままである限り）。製剤、試料を保持する容器（例えば、ガラスバイアル）のサイズおよび種類ならびに液体の体積によって、乾燥に必要な時間が決まり、これは数時間〜数日（例えば、４０〜６０時間）に及び得る。二次乾燥段階は、主に容器の種類およびサイズ、ならびに使用するタンパク質の種類に応じて、約０〜４０℃で行うことができる。二次乾燥時間は、製品中の所望の残留水分レベルによって決まり、典型的には少なくとも約５時間かかる。典型的には、凍結乾燥製剤の含水量は、約５％未満、好ましくは約３％未満である。圧力は、一次乾燥ステップ中に使用される圧力と同じであってもよい。凍結乾燥条件は、製剤、バイアルサイズおよび凍結乾燥トレイに応じて変化し得る。
【０１１４】
場合によっては、移動ステップを回避するために、再構成が行われる容器中の製剤を凍結乾燥またはマイクロ波乾燥することが望ましい場合がある。この場合の容器は、例えば、２、３、５、１０または２０ｍｌのバイアルであり得る。
【０１１５】
使用方法
本発明の実施形態はまた、（ａ）治療（例えば、ヒトの体の）；（ｂ）医薬品；（ｃ）ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３および／またはＤＥＮ４を含むデングウイルス複製の阻害；（ｄ）ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３および／またはＤＥＮ４のうちの１つまたは複数に対する免疫応答または防御免疫応答の誘導；（ｅ）デングの１つまたは複数の型に対するウイルス中和抗体応答の誘導；（ｆ）デングウイルスによる感染の処置または予防；（ｇ）デングウイルス感染の再発の予防；（ｈ）デングウイルス感染に関連する病理症状の進行、発症または重症度の減少ならびに／あるいはデングウイルス感染の可能性の減少、あるいは（ｉ）それだけに限らないが、デング熱、デング出血熱およびデングショック症候群を含む、（１又は複数の）デング関連疾患の発症、重症度または進行の処置、予防または遅延（ｉ）に使用するため、（ｉｉ）のための医薬品または組成物として使用するため、または（ｉｉｉ）のための医薬品の調製に使用するための本明細書に記載されるデングワクチン組成物または製剤の１つまたは複数も含む。これらの使用では、デングワクチン組成物を、１つまたは複数のアジュバント（例えば、本明細書に記載される、ＡＡＨＳ、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、例えばＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、または他のアルミニウム塩アジュバント、サポニン系アジュバント、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（ＣＳＬ，Ｌｔｄ．）、ＴＬＲアゴニストまたは脂質ナノ粒子）と組み合わせて使用してもよい。
【０１１６】
予防的処置は、本明細書に記載される本発明のデングウイルスワクチン組成物を使用して実施することができる。本発明の組成物は、一般集団に、またはデング感染のリスクが増加している人、例えばヤブカ属（Ａｅｄｅｓ）の蚊が蔓延している世界の地域に住んでいるまたは旅行する予定がある人に投与することができる。
【０１１７】
「処置を必要とする」ものには、既にデング感染を有するもの（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４のうちの１つまたは複数に感染したもの）、ならびに感染しやすいもの、または感染の可能性の減少が望まれるあらゆる人が含まれる。
【０１１８】
本発明のデングウイルスワクチン組成物は、当技術分野で周知の技術を使用して、製剤化し、患者に投与することができる。一般的な医薬投与のためのガイドラインは、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｅｄｓ．Ｐｌｏｔｋｉｎ  ａｎｄ  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９９；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；およびＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｓ．Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に提供されている。
【０１１９】
したがって、本発明は、デング感染に対する患者の防御免疫応答を誘導する方法であって、免疫学的有効量の本明細書に記載されるデングウイルスワクチン組成物のうちのいずれかを患者に投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、デングウイルスワクチン組成物が、ジカ、麻疹、流行性耳下腺炎および風疹、または水痘等の疾患を処置または予防するための他のワクチンと組み合わせて共投与される。
【０１２０】
また、本発明によって提供されるのは、デング感染を処置するまたはデング感染に関連する任意の病態を処置する方法であり、このような処置は、感染の予防および臨床症状の重症度の減少、疾患の進行の遅延もしくは予防および／または感染もしくはその臨床症状の可能性の減少を含み；この方法は、免疫学的有効量の本明細書に記載されるワクチン組成物のうちのいずれかを患者に投与するステップを含む。
【０１２１】
本発明の付加的な実施形態は、プライム／ブースト体制における、本発明の２つ以上の組成物の患者への投与を含む。したがって、本発明は、それを必要とする患者のデング感染を予防するまたはデング感染の可能性を減少させる方法であって、
（ａ）本発明の第１のデングウイルスワクチン組成物を患者に投与するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の後に所定の時間が経過するのを待つステップと；
（ｃ）本発明の第２のデングウイルスワクチン組成物を患者に投与するステップと；
（ｄ）場合により、ステップ（ｂ）および（ｃ）を繰り返すステップと
を含み、
それによって、患者においてデング感染が予防されるまたはデングに感染する可能性が低下する、方法に関する。
【０１２２】
上記方法の実施形態では、本発明のデングウイルスワクチン組成物が、凍結液体の形態である。別の実施形態では、デングウイルスワクチン組成物が、凍結乾燥される、またはマイクロ波乾燥され、患者への投与の前に滅菌希釈剤で再構成される。
【０１２３】
本発明のデングウイルスワクチン組成物の第１の用量および本発明のデングウイルスワクチン組成物の第２の用量、またはその後の任意の用量の間の時間は、約２週間〜約２年間である。本発明の好ましい実施形態では、複数の投与の間で２ヶ月〜１２ヶ月の時間を経過させることが可能である。本発明のこの態様の代替実施形態では、ワクチン組成物の各用量の各投与の間の時間が、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月および２４ヶ月よりなる群から独立に選択される。
【０１２４】
本発明のいくつかの実施形態では、第１および第２のデングウイルスワクチン組成物が同じである。代替実施形態では、第１および第２のデングウイルスワクチン組成物が同じでない。
【０１２５】
本発明のデングウイルスワクチン組成物は、異なる経路によって投与することができる。本発明の好ましい実施形態では、本発明の組成物が、非経口的に、すなわち皮内、皮下または筋肉内注射によって投与される。皮下および筋肉内投与は、例えば針またはジェット式注射器を使用して実施することができる。
【０１２６】
本明細書に記載される組成物は、投与製剤に適合した様式で、デング感染を処置するおよび／またはデング感染の可能性を減少させるために免疫学的に有効であるような量で投与され得る。本発明の文脈において、患者に投与される用量は、時間と共に患者において有益な応答、例えばデングウイルスのレベルの低下に影響を及ぼすために、またはデングによる感染の可能性を減少させるために十分であるべきである。投与されるデングウイルスワクチンの量は、その年齢、性別、体重および全身健康状態を含めて、処置される対象に依存し得る。これに関して、投与されることが必要となるワクチンの正確な量は、専門家の判断に依存するだろう。デング感染に対する処置または予防で投与されるワクチンの有効量を決定する際、医師は、循環血漿レベル、疾患の進行および抗デング抗体の産生を評価し得る。いずれにしても、本発明の免疫原性組成物の適切な投与量は、当業者によって容易に決定され得る。
【０１２７】
適切な投与レジメンは、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および医学的状態；投与経路；所望の効果；ならびに使用される具体的な組成物を含む当技術分野で周知の因子を考慮に入れて決定される。投与のタイミングは当技術分野で周知の因子に応じ、２週間〜２４ヶ月に及ぶことができる。最初の投与の後、抗体価を維持および／またはブーストするため、１回または複数回の追加の用量が投与され得る。
【０１２８】
本発明はまた、デング感染を予防する、またはその症状を予防もしくは改善する方法であって、デングウイルスワクチンの組成物を、デング感染またはその症状が予防または改善されるべき患者に投与するステップを含む方法に関する。本発明のこの態様のさらなる実施形態は、デングウイルスワクチン組成物の投与後に所定の時間を経過させるステップと、デングウイルスワクチン組成物の第２の用量を投与するステップとを含む。
【０１２９】
上記方法では、第１のデングワクチンが好ましくは四価であり、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４成分を含み、各成分が、本明細書に記載される弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラフラビウイルスのいずれかを含む。例示的な実施形態では、弱毒化生デングワクチンが４つのキメラフラビウイルスを含み；キメラフラビウイルスの各々が単一デングウイルス血清型のｐｒＭおよびＥタンパク質ならびに異なるフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質を含み、キメラフラビウイルスの各々が弱毒化されている。一定の実施形態では、４つのキメラフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質が、黄熱病ウイルスに由来する。代替実施形態では、４つのキメラフラビウイルスの各々のカプシドおよび非構造タンパク質が、ｐｒＭおよびＥタンパク質とは異なるデング血清型に由来する。
【０１３０】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、第２のデングワクチンが、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４由来のデングＥタンパク質またはその断片を含む四価の組換えデングサブユニットワクチンである。本発明のこの方法に有用なサブユニットワクチンは、本明細書に記載されている。好ましい実施形態では、Ｅタンパク質の各々がそのＮ末端のアミノ酸残基１から始まるＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４の野生型Ｅの長さの約８０％を構成する。
【０１３１】
［実施例］
これらの試験で使用される弱毒化生デングウイルス配列の例は、ｒＤＥＮ１−ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５  ＰＭＶＳ（配列番号６）；ｒＤＥＮ２−ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３  ＰＭＶＳ（配列番号７）；ｒＤＥＮ３−ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４  ＰＭＶＳ（配列番号８）；およびｒＤＥＮ４−ｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８  ＰＭＶＳ（配列番号９）である。
【表１】
2021505588.tif 000003
【表２】
2021505588.tif 000004
【表３】
2021505588.tif 000005
【表４】
2021505588.tif 000006
【０１３２】
上記の表のＤＥＮＶ１、２、３および４の野生型および元のｃＤＮＡクローンは、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：１６５３−１６５７（２００３）；Ｂｌａｎｅｙ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｒｏｐｉｃａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｙｇｉｅｎｅ  ７１：８１１−８２１（２００４）；Ｂｌａｎｅｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ４：３９（２００４）；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｒｏｐｉｃａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｙｇｉｅｎｅ  ６５：４０５−４１３（２００１）に記載されるデングウイルス血清型に相当する。
【０１３３】
弱毒化生デングウイルスの上記バージョンを、以下の実施例では、ＤＥＮＶ１またはＤＥＮ１、ＤＥＮＶ２またはＤＥＮ２、ＤＥＮＶ３またはＤＥＮ３およびＤＥＮＶ４またはＤＥＮ４と呼ぶ。実施例１〜６では、製剤が、２×１０５ｐｆｕ／ｍｌのＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３またはＤＥＮＶ４のそれぞれの効力を有した。実施例７〜１０では、製剤が、１．５×１０５ｐｆｕ／ｍｌのＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４のそれぞれの効力を有した。
【０１３４】
［実施例１］
ＤＥＮＶ４に対するＣＭＣ、ＰＧおよびアミノ酸の効果（Ｄｅｎｇｖａｘｉａ（登録商標）製剤と比較）
ＤＥＮＶ４の凍結乾燥収率および安定性に対する種々の賦形剤の効果を調査するために、３つの別個の試験を実施した。製剤を表５に列挙する。
【表５】
2021505588.tif 000007
2021505588.tif 000008
【０１３５】
試験１：ＤＥＮＶ４を、１１ｍＭリン酸カリウム、９０ｍｇ／ｍＬスクロースおよび７５ｍＭ  ＮａＣｌ（製剤３）で製剤化し、５ｍｇ／ｍＬカルボキシメチルセルロースナトリウム（ナトリウムＣＭＣ）（製剤４）または５ｍｇ／ｍＬ  ＣＭＣナトリウムと５ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール（製剤５）を添加した。
【０１３６】
試験２：製剤５を、２５ｍＭロイシン（製剤２０）または２５ｍＭプロリン（製剤２１）、ならびに１１ｍＭリン酸カリウム、９０ｍｇ／ｍＬスクロース、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍＬ  ＣＭＣナトリウムおよび５ｍｇ／ｍＬプロピレングリコールを含有する同等の製剤に対して試験した。
【０１３７】
試験３：製剤２０を、１１ｍＭリン酸カリウム、９０ｍｇ／ｍＬスクロース、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍＬ  ＣＭＣナトリウムおよび５ｍｇ／ｍＬプロピレングリコールならびに２５ｍＭグルタミン酸（製剤１９）およびＤｅｎｇｖａｘｉａ（登録商標）製剤（製剤２６）（３７．５ｍｇ／ｍＬソルビトール、７５ｍｇ／ｍＬスクロース、５５ｍｇ／ｍＬトレハロース、２５ｍｇ／ｍＬ尿素、６ｍＭ  ＴＲＩＳ、１５ｍｇ／ｍＬのアミノ酸混合物からなる）を含有する同等の製剤に対して試験した。
【０１３８】
全ての試験で、試料を凍結し、一部を凍結液体対照として−７０℃で保存し、一部を凍結乾燥した。凍結乾燥後、いくつかの試料を対照として−７０℃で保存し、残りを２５℃で１週間置いた。インキュベーション後、２５℃の試料を凍結し、凍結液体対照および凍結凍結乾燥対照と共にデング相対感染力アッセイ（ＤＲＩＡ）で試験した。各試料の２つの個別のバイアルを試験した。
【０１３９】
ＤＲＩＡは、エンベロープタンパク質の発現に基づいてデングウイルス製剤試料の感染力を測定するために使用される、細胞ベースの相対感染力アッセイである。Ｖｅｒｏ細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに蒔き、２４時間インキュベートし、次いで、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３および／またはＤＥＮ４参照標準の段階希釈液ならびに試験物に加えて試験する血清型に特異的な陽性対照に感染させた。感染細胞を４８時間インキュベートし、引き続いて希釈ホルムアルデヒド溶液で細胞を固定した。次いで、固定した細胞を透過処理した後、一次抗体（ウサギ抗ＤＥＮ血清型特異的ＭＡｂ）をプレートに添加し、一晩インキュベートした。プレートを洗浄した後、二次抗体（Ｄｏｎｋｅｙ  ＮＬ６３７コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をウェルに添加し、室温で２時間超インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＭｉｎｉＭａｘイメージングリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した画像分析の準備で、ＰＢＳをウェルに添加した。減少した４パラメータロジスティック曲線フィットを使用して、ＳｏｆｔＭＡＸ  Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、試料の相対効力（％ＲＰ）（参照標準に対する）を計算した。
【０１４０】
凍結乾燥した感染力の結果を凍結液体対照の感染力の結果で割ることによって凍結乾燥収率を計算した。２５℃で１週間保存した後の対数損失を計算するために、感染力値を対数スケールに変換し、各製剤についての−７０℃凍結乾燥対照結果から１週間２５℃対数結果を差し引いた。
【０１４１】
ＣＭＣナトリウムとプロピレングリコールの組み合わせで相乗効果が観察され、凍結乾燥収率および安定性が改善した。ロイシンの添加により、収率および安定性がさらに改善された。ＣＭＣナトリウム、プロピレングリコールおよびロイシンまたはグルタミン酸を含有する製剤は、Ｄｅｎｇｖａｘｉａ製剤よりも改善された凍結乾燥収率を提供した。図１〜図２を参照されたい。製剤２６についての１週間２５℃安定性時点は、２５℃での保存後にケークが崩壊したため、試験しなかった。
【０１４２】
［実施例２］
ＤＥＮＶ４に対する糖アルコールの効果：
ＤＥＮＶ４を、１１ｍＭリン酸カリウム、９０ｍｇ／ｍＬスクロース、７５ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍｇ／ｍＬ  ＣＭＣナトリウム  ｐＨ７．５のベース製剤と糖アルコールとしての５ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール（製剤５）、５ｍｇ／ｍＬグリセロール（製剤２２）または２５ｍｇ／ｍＬソルビトール（製剤１３）で製剤化した。
【０１４３】
試料を凍結し、一部を凍結液体対照として−７０℃で保存し、一部を凍結乾燥した。凍結乾燥後、いくつかの試料を−７０℃で保存し、残りを２５℃で１週間置いた。インキュベーション後、２５℃の試料を凍結し、凍結液体対照および凍結凍結乾燥対照と共にデング相対感染力アッセイで試験した。各試料の２つの個別のバイアルを試験した。
【０１４４】
凍結乾燥した感染力の結果を凍結液体対照の感染力の結果で割ることによって凍結乾燥収率を計算した。２５℃で１週間保存した後の対数損失を計算するために、感染力値を対数スケールに変換し、各製剤についての−７０℃凍結乾燥対照結果から１週間２５℃対数結果を差し引いた。
【０１４５】
この実施例は、プロピレングリコールとグリセロールの両方が、ソルビトールと比較してＤＥＮＶ４の凍結乾燥収率および安定性を改善したことを実証している（図３および図４参照）。
【０１４６】
［実施例３］
ＤＥＮＶ４に対するｐＨの効果：
ＤＥＮＶ４を、製剤２２（１１ｍＭリン酸カリウム、９０ｍｇ／ｍＬスクロース、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍＬ  ＣＭＣナトリウム、５ｍｇ／ｍＬグリセロール、ｐＨ７．０、７．５または８．０）で製剤化した。
【０１４７】
試料を凍結し、一部を凍結液体対照として−７０℃で保存し、一部を凍結乾燥した。凍結乾燥後、いくつかの試料を−７０℃で保存し、残りを２５℃で１週間置いた。インキュベーション後、２５℃の試料を凍結し、凍結液体対照および凍結凍結乾燥対照と共にデング相対感染力アッセイで試験した。各試料の２つの個別のバイアルを試験した。
【０１４８】
凍結乾燥した感染力の結果を凍結液体対照の感染力の結果で割ることによって凍結乾燥収率を計算した。２５℃で１週間保存した後の対数損失を計算するために、感染力値を対数スケールに変換し、各製剤についての−７０℃凍結乾燥対照結果から１週間２５℃対数結果を差し引いた。
【０１４９】
図５および図６は、ＤＥＮＶ４をｐＨ７．０〜ｐＨ８．０で製剤２２で製剤化することができることを実証している。
【０１５０】
［実施例４］
ＤＥＮＶ４に対する緩衝液の効果：
試験１では、ＤＥＮＶ４を、９０ｍｇ／ｍＬスクロース、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍＬ  ＣＭＣナトリウムおよび５ｍｇ／ｍＬグリセロールのベース製剤とｐＨ７．５に調整された代替緩衝系で製剤化した。製剤２２は、ベース製剤に加えて１１ｍＭリン酸カリウムを含有し、製剤２５は、ベース製剤に加えて１１ｍＭ  ＴＲＩＳを含有していた。
【０１５１】
試験２では、ＤＥＮＶ４を、９０ｍｇ／ｍＬスクロース、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍＬ  ＣＭＣナトリウムおよび５ｍｇ／ｍＬプロピレングリコールのベース製剤とｐＨ７．５に調整された代替緩衝系で製剤化した。製剤５は、ベース製剤に加えて１１ｍＭリン酸カリウムを含有し、製剤５７はベース製剤に加えて、５．５ｍＭヒスチジンと５．５ｍＭ  ＴＲＩＳの組み合わせを含有していた。
【０１５２】
試料を凍結し、一部を凍結液体対照として−７０℃で保存し、一部を凍結乾燥した。凍結乾燥後、いくつかの試料を−７０℃で保存し、残りを２５℃で１週間置いた。インキュベーション後、２５℃の試料を凍結し、凍結液体対照および凍結凍結乾燥対照と共にデング相対感染力アッセイで試験した。各試料の２つの個別のバイアルを試験した。
【０１５３】
凍結乾燥した感染力の結果を凍結液体対照の感染力の結果で割ることによって凍結乾燥収率を計算した。２５℃で１週間保存した後の対数損失を計算するために、感染力値を対数スケールに変換し、各製剤についての−７０℃凍結乾燥対照結果から１週間２５℃対数結果を差し引いた。
【０１５４】
図７および図８は、ＤＥＮＶ４をリン酸カリウム、ＴＲＩＳまたはヒスチジンとＴＲＩＳの組み合わせを含む、ｐＨ７．５の種々の緩衝系で製剤化することができることを実証している。
【０１５５】
［実施例５］
ＤＥＮＶ４に対するＮａＣｌの効果：
ＤＥＮＶ４を、１１ｍＭリン酸カリウム、９０ｍｇ／ｍＬスクロース、５ｍｇ／ｍＬ  ＣＭＣナトリウムおよび５ｍｇ／ｍＬプロピレングリコールのベース製剤と１５〜７５ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌで製剤化した。
【０１５６】
試料を凍結し、一部を凍結液体対照として−７０℃で保存し、一部を凍結乾燥した。凍結乾燥後、いくつかの試料を−７０℃で保存し、残りを２５℃で１週間置いた。インキュベーション後、２５℃の試料を凍結し、凍結液体対照および凍結凍結乾燥対照と共にデング相対感染力アッセイで試験した。各試料の２つの個別のバイアルを試験した。
【０１５７】
凍結乾燥した感染力の結果を凍結液体対照の感染力の結果で割ることによって凍結乾燥収率を計算した。２５℃で１週間保存した後の対数損失を計算するために、感染力値を対数スケールに変換し、各製剤についての−７０℃凍結乾燥対照結果から１週間２５℃対数結果を差し引いた。
【０１５８】
図９および図１０は、ＮａＣｌ濃度が１５〜７５ｍＭに及ぶ場合に、ＤＥＮＶ４の凍結乾燥収率および２５℃での１週間の安定性が類似であったことを示している。
【０１５９】
［実施例６］
全てのデング血清型に対するプロピレングリコールおよびグリセロールの効果：
ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４を、ｐＨ７．５で、製剤５（１１ｍＭリン酸カリウム、９０ｍｇ／ｍＬスクロース、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍＬ  ＣＭＣ、５ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール）、製剤２０（１１ｍＭリン酸カリウム、９０ｍｇ／ｍＬスクロース、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍＬ  ＣＭＣ、５ｍｇ／ｍＬプロピレングリコールおよび２５ｍＭロイシン）および製剤２２（１１ｍＭリン酸カリウム、９０ｍｇ／ｍＬスクロース、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍＬ  ＣＭＣ、５ｍｇ／ｍＬグリセロール）で一価製剤として調製した。
【０１６０】
試料を凍結し、一部を凍結液体対照として−７０℃で保存し、一部を凍結乾燥した。凍結乾燥後、いくつかの試料を−７０℃で保存し、残りを２５℃で１週間置いた。インキュベーション後、２５℃の試料を凍結し、凍結液体対照および凍結凍結乾燥対照と共にデング相対感染力アッセイで試験した。各試料の２つの個別のバイアルを試験した。
【０１６１】
凍結乾燥した感染力の結果を凍結液体対照の感染力の結果で割ることによって凍結乾燥収率を計算した。２５℃で１週間保存した後の対数損失を計算するために、感染力値を対数スケールに変換し、各製剤についての−７０℃凍結乾燥対照結果から１週間２５℃対数結果を差し引いた。
【０１６２】
図１１および図１２は、プロピレングリコールおよびグリセロールが、スクロース、ＮａＣｌおよびＣＭＣナトリウムと組み合わせて４つの血清型全てを安定化することを示している。
【０１６３】
［実施例７］
ＳＰＧ（スクロース、リン酸カリウム、グルタミン酸）を、表６に示される以下の濃度の１０Ｘ溶液として作製した。
【表６】
2021505588.tif 000009
【０１６４】
以下の他の溶液も作製した：６５０ｍｇ／ｍＬスクロース、６５０ｍｇ／ｍＬトレハロース、二水和物、２００ｍｇ／ｍＬゼラチン、１５０ｍｇ／ｍＬアルギニンおよび２０ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）。
【０１６５】
ＳＰＧ、スクロース、トレハロース、ゼラチン、アルギニンおよびＨＳＡを、ＰＥＳ  ０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルタで濾過した。溶液であるＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５とＤＥＮ１を合わせて、以下に示される最終的な製剤を得た：
【表７】
2021505588.tif 000010
【０１６６】
製剤を０．５ｍＬの充填量で２Ｒガラスバイアルに充填し、−１１５℃で１５分間凍結した。いったん凍結したら、バイアルをマイクロ波真空乾燥機（ＭＶＤ）で乾燥させた。いったん乾燥したら、いくつかのバイアルを２５℃で１週間安定させた。次いで、バイアルを、デング相対感染力アッセイ（ＤＲＩＡ）を使用した効力試験に供した。
【０１６７】
マイクロ波乾燥法
マイクロ波真空乾燥機（ＭＶＤ）で乾燥する材料を、急速冷凍し、直ちに乾燥室に入れた。室内の真空を急速に１００ミリトル未満に引き下げた。いったん真空設定値に達したら、マグネトロン（つまり、マグネトロンの数および出力）を選択して、材料の乾燥を開始した。マイクロ波（放射を進行波形式で適用）を、均一な出力分布のために、選択されたマグネトロン（例えば、４つの合計マグネトロンのうち２つのマグネトロンなど）を３０秒毎にオン／オフでサイクルするアルゴリズムで走査モードで操作した。さらに、ユニットの上部の水負荷により、試料にマイクロ波を１回通過させることができ、反射したマイクロ波による干渉を最小限に抑え、昇華を制御できる。乾燥サイクル全体で出力を上げて、最終的な平衡温度３０〜４５℃を達成した。いったん乾燥したら、質内の真空を解除し、材料を密封した。
【表８】
2021505588.tif 000011
【０１６８】
全ての製剤について、凍結／解凍（Ｆ／Ｔ）収率、乾燥収率および２５℃で１週間の対数損失を決定した。報告された相対効力を−７０℃での凍結対照の予想相対効力で割ることによって、凍結／解凍（Ｆ／Ｔ）収率を計算した。乾燥材料の相対効力を凍結対照の相対効力で割ることによって、乾燥収率を計算した。乾燥材料のＴ０時点と１週間２５℃安定性材料の相対効力をＬｏｇ１０計算によって対数に変換することによって、対数損失を計算した。いったん数値を対数に変換したら、Ｔ０時点から安定性時点を差し引いて、２５℃で１週間の対数損失を決定した。
【０１６９】
製剤２、４、５および１２が、Ｆ／Ｔ収率、乾燥収率および２５℃で１週間の対数損失の最良の組み合わせを示した。これらの４つの製剤は全て、２５％以上の二糖（スクロースおよび／またはトレハロース）を含有していた。
【表９】
2021505588.tif 000012
【０１７０】
［実施例８］
ＳＰＧ（スクロース、リン酸カリウム、グルタミン酸）を、実施例７に従って作製した。
【０１７１】
以下の他の溶液も作製した：６５０ｍｇ／ｍＬスクロース、６５０ｍｇ／ｍＬトレハロース、５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）および１０ｍｇ／ｍＬカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣナトリウム）。
【０１７２】
全ての溶液をＰＥＳ  ０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルタで濾過した。溶液とデングウイルスＤＥＮ１またはＤＥＮ４を合わせて、結果の表に示される最終的な製剤を得た。
【０１７３】
製剤を０．５ｍＬの充填量で２Ｒガラスバイアルに充填し、−１１５℃で１５分間凍結した。いったん凍結したら、バイアルをマイクロ波真空乾燥機（ＭＶＤ）で乾燥させた。いったん乾燥したら、いくつかのバイアルを２５℃で１週間安定させた。次いで、バイアルを、デング相対感染力アッセイ（ＤＲＩＡ）を使用した効力試験に供した。
【表１０】
2021505588.tif 000013
【０１７４】
乾燥材料のＴ０時点と１週間２５℃安定性材料の相対効力をＬｏｇ１０計算によって対数に変換することによって、対数損失を計算した。いったん数値を対数に変換したら、Ｔ０時点から安定性時点を差し引いて、２５℃で１週間の対数損失を決定した。
【０１７５】
結果は、２５％以上の二糖を含有するＤＥＮ１製剤について、最も低い２５℃で１週間の対数損失が観察されることを示した。１５％以上の二糖および３０ｍＭの塩を含むＤＥＮ４製剤が、最も低い２５℃で１週間の対数損失を有した。１５％以上の二糖および塩を含む製剤については、ＣＭＣナトリウムの添加が残留水分の減少に役立った。
【表１１】
2021505588.tif 000014
【０１７６】
［実施例９］
製剤は、１ｘＳＰＧ（１１ｍＭリン酸カリウム、６ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、０．２２Ｍスクロース）と様々な量のＬ−１５（９０％、４５％および２５％）およびＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４とした。ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５の主成分はＮａＣｌ（１３７．３９ｍＭ）である。したがって、９０％Ｌ−１５は１２３．６５ｍＭ  ＮａＣｌに相当し、４５％Ｌ−１５は６１．８３ｍＭ  ＮａＣｌに相当し、２５％Ｌ−１５は３４．３５ｍＭ  ＮａＣｌに相当する。
【０１７７】
製剤を０．５ｍＬの充填量で２Ｒガラスバイアルに充填し、−１１５℃で１５分間凍結した。いったん凍結したら、バイアルをマイクロ波真空乾燥機（ＭＶＤ）で乾燥させた。次いで、バイアルを、デング相対感染力アッセイ（ＤＲＩＡ）を使用した効力試験に供した。
【０１７８】
ＭＶＤで速く乾燥した製剤は、凍結乾燥でゆっくり乾燥した製剤よりも安定であった（図１３〜図１６参照）。上記製剤では、塩濃度が６１．８３ｍＭ以上のＮａＣｌであると、他の３つの型（ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、およびＤＥＮ３）では観察されない、乾燥中のＤＥＮ４の安定性が改善するようである。
【０１７９】
［実施例１０］
以下の溶液も作製した：５００ｍｇ／ｍＬスクロース、２５０ｍｇ／ｍＬトレハロース、１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）および１０ｍｇ／ｍＬナトリウムカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣナトリウム）、１００ｍｇ／ｍＬポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、１００ｍＭリン酸カリウム、５００ｍｇ／ｍＬプロピレングリコールおよび滅菌水。
【０１８０】
全ての溶液をＰＥＳ  ０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルタで濾過した。溶液とデングウイルス（ＤＥＮ１）を合わせて、以下の製剤を得た：１１ｍＭリン酸カリウム、９０ｍｇ／ｍＬスクロース、５ｍｇ／ｍＬ  ＣＭＣナトリウム、５ｍｇ／ｍｌ  ＰＧ；１１ｍＭリン酸カリウム、２００ｍｇ／ｍＬスクロース、５０ｍｇ／ｍｌ  ＰＶＰ  Ｋ１２；１１ｍＭリン酸カリウム、７５ｍｇ／ｍＬスクロース、１７５ｍｇ／ｍｌトレハロース、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＣ。
【０１８１】
製剤を０．５ｍＬの充填量で２Ｒガラスバイアルに充填し、−１１５℃で１５分間凍結した。いったん凍結したら、バイアルをマイクロ波真空乾燥機（ＭＶＤ）または凍結乾燥器（Ｌｙｏ）のいずれかで乾燥させた。次いで、バイアルを、デング相対感染力アッセイ（ＤＲＩＡ）を使用した効力試験に供した。
【０１８２】
図１７は、マイクロ波真空乾燥機で乾燥した製剤のバイアルの相対効力が、凍結乾燥機で乾燥したもの以上であることを示している。
【表１２】
2021505588.tif 000015
【０１８３】
［実施例１１］
ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４の四価の製剤（製剤２０）を凍結乾燥し、３７℃で１週間（図１８Ａ）、２５℃で１ヶ月（図１８Ｂ）、および２〜８℃で１８ヶ月保存した（図１９Ａ〜図１９Ｄ）。各時点でプラークアッセイ（本文で前に記載される）によって効力を分析した。−７０℃で保存した対照試料を、各安定性時点と同じアッセイ実行でプラークアッセイによって試験した。−７０℃対照試料から安定性試料の対数結果を差し引くことによって、各時点の対数損失を計算した。図１８Ａ〜図１８Ｂおよび図１９Ａ〜図１９Ｄは、四価の製剤２０における各血清型の経時的な対数損失を示している。エラーバーは、各時点で計算された対数損失の平均の２つの標準誤差を示す。製剤２０は、１週間、１ヶ月および１８ヶ月でそれぞれ観察された最小の効力損失によって証明されるように、３７℃、２５℃および２〜８℃で、四価のワクチンの４つ全てのデング血清型に熱安定性を提供する。
【０１８４】
［実施例１２］
ハイスループットプラークアッセイ
ハイスループットプラークアッセイ「マイクロプラーク（ｕＰ）」アッセイは、９６ウェルマイクロプレートで実行される自動化されたミニチュア化デングプラークアッセイである。手短に言えば、Ｖｅｒｏ細胞を、１ウェル当たり４００００個細胞で、２％Ｌ−グルタミンを含むＯｐｔｉＰｒｏ  ＳＦＭの黒色壁の透明底組織培養プレートに播種する。細胞を３７℃、５％ｐＣＯ２、９０％超ｒＨで一晩付着させる。ウイルスをＯｐｔｉＭＥＭ還元血清培地で事前希釈し、超低付着プレートの培地でさらに１：２に段階希釈する。穏やかな吸引を使用して植物培地を細胞プレートから除去し、２５μＬ／ウェルの接種材料を段階希釈プレートから細胞プレートに移す。ウイルス吸着は、３７℃、５％ｐＣＯ２、９０％超ｒＨで４時間進行する。吸着インキュベーション後、１７５μＬ／ウェルのオーバーレイ培地を全てのウェルに添加して、ウイルスの分泌および拡散を阻害する。血清型に応じて、感染は前記インキュベーション条件で２または３日間進行する。
【０１８５】
感染インキュベーション後、オーバーレイ培地を除去し、細胞をＰＢＳ中３．７％ホルムアルデヒドで固定する。プレートをＰＢＳ中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、次いで、ＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロッキングする。型特異的ウサギモノクローナル抗体、引き続いて抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を使用して、ウイルスプラークを蛍光染色する。プレートを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎＳｉｇｈｔを使用して画像化し、蛍光プラークを自動カウントアルゴリズムによってカウントする。以下の式を使用して、カウント基準（型に依存）内にある有効なオブジェクト数を含有するウェルから力価を決定する。
【数１】
2021505588.tif 000016
【０１８６】
ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４の四価の製剤を表１３に詳述される製剤で凍結乾燥し、２５℃で１週間保存した２つの試験を実行した。各製剤は、９％スクロース、１１ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｌｅｕ（ｐＨ７．５）および様々な量のＣＭＣまたはＰＧを含有している。各時点で上記のハイスループットプラークアッセイによって、効力を分析した。−７０℃で保存した対照試料もアッセイで試験した。−７０℃対照試料から安定性試料の対数結果を差し引くことによって、各時点の対数損失を計算した。表１４ａおよび表１４ｂは、様々な四価の製剤における各血清型の経時的な対数損失を示している。種々の組み合わせの０．２％〜１％濃度のＣＭＣまたはＰＧは、互いに同様の安定性および組み合わせのない製剤よりも増加した安定性を示す。
【表１３】
2021505588.tif 000017
【表１４】
2021505588.tif 000018
【表１５】
2021505588.tif 000019
【０１８７】
本明細書で言及される全ての刊行物は、本発明に関連して使用され得る方法論および材料を説明および開示する目的で参照により組み込まれる。
【０１８８】
添付の図面を参照して本明細書で本発明の様々な実施形態を説明してきたが、本発明はこれらの正確な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲または精神から逸脱することなく、種々の変更および修正が当業者によってそこで行われ得ることを理解されたい。
【図１】
2021505588.tif 000020
【図２】
2021505588.tif 000021
【図３】
2021505588.tif 000022
【図４】
2021505588.tif 000023
【図５】
2021505588.tif 000024
【図６】
2021505588.tif 000025
【図７】
2021505588.tif 000026
【図８】
2021505588.tif 000027
【図９】
2021505588.tif 000028
【図１０】
2021505588.tif 000029
【図１１】
2021505588.tif 000030
【図１２】
2021505588.tif 000031
【図１３】
2021505588.tif 000032
【図１４】
2021505588.tif 000033
【図１５】
2021505588.tif 000034
【図１６】
2021505588.tif 000035
【図１７】
2021505588.tif 000036
【図１８Ａ】
2021505588.tif 000037
【図１８Ｂ】
2021505588.tif 000038
【図１９Ａ】
2021505588.tif 000039
【図１９Ｂ】
2021505588.tif 000040
【図１９Ｃ】
2021505588.tif 000041
【図１９Ｄ】
2021505588.tif 000042
【国際調査報告】
2021505588.tif 000043
2021505588.tif 000044
2021505588.tif 000045
2021505588.tif 000046