(57)【要約】  本開示は、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類の生成方法を提示している。この方法には、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を産出するための、(i)少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした雌の魚、甲殻類、または軟体類と(ii) 少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした雄の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖が含まれる。最初の変異は、性分化を決定する1つ以上の遺伝子を阻害、2つ目の変異は、  配偶子機能を決定する1つ以上の遺伝子を阻害し、この繁殖能力のあるホモ接合型雌の魚、甲殻類、または軟体類および繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした雄の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力は回復した。また本開示は、種親そのものだけでなく、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類の産出における、種親の生成方法も提示している。
2021533754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のステップを含む、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類の生成方法:
(i)少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるヘミ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類と(ii) 少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類を繁殖する；および
遺伝子型選択によるホモ接合型の原始、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類であるホモ接合変異をした原始の選択、
最初の変異が、性分化を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する、および
2つ目の変異が、配偶子機能を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する。
【請求項２】
次のステップを含む、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類の生成方法:
不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を産出するため、(i)少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるホモ接合変異した雌の魚、甲殻類、または軟体類と(ii) 少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるホモ接合変異した雄の魚、甲殻類、または軟体類を繁殖する、
最初の変異が、性分化を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する、
2つ目の変異が、配偶子機能を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する、および
繁殖能力のあるホモ接合体雌の魚、甲殻類、または軟体類および繁殖能力のあるホモ接合変異した雄の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力が回復した。
【請求項３】
この繁殖能力の回復が、生殖系幹細胞移植を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
この繁殖能力の回復が、さらに性ステロイド変化を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
性ステロイドの変化がエストロゲンの変化、またはアロマターゼ阻害剤の変化である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
生殖系幹細胞移植が次のステップを含む、請求項3〜5のいずれか記載の方法:  
少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ不妊のホモ接合体雄の魚、甲殻類、または軟体類から生殖系幹細胞を、または少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ不妊のホモ接合体雌の魚、甲殻類、または軟体類から生殖系幹細胞を得る；および
この生殖系幹細胞を、生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類、または生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類へ移植する。
【請求項７】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、dnd、Elavl2、vasa、nanos3またはpiwi様遺伝子のヌル変異に対しホモ接合体である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、倍数性操作により作成された、請求項6記載の方法。
【請求項９】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、交雑により作成された、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、高レベルの性ホルモンに暴露し作成された、請求項6記載の方法。
【請求項１１】
この生殖系幹細胞移植が次のステップを含む、請求項3〜5のいずれか記載の方法:
少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ不妊のホモ接合体雄の魚、甲殻類、または軟体類から精原幹細胞を、または少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ不妊のホモ接合体雌の魚、甲殻類、または軟体類から卵原幹細胞を得る；および
この精原幹細胞を、生殖細胞のない繁殖能力のある雄の魚、甲殻類、または軟体類の精巣へ、またはこの卵原幹細胞を、生殖細胞のない繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類の卵巣へ移植する。
【請求項１２】
この生殖細胞のない繁殖能力のある雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類が、dnd、Elavl2、vasa、nanos3またはpiwi様遺伝子の変異に対しホモ接合体である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、倍数性操作により作成された、請求項11記載の方法
【請求項１４】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、交雑により作成された、請求項11記載の方法
【請求項１５】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、高レベルの性ホルモンに暴露し作成された、請求項11記載の方法
【請求項１６】
この不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類が、不妊雄の魚、甲殻類、または軟体類である、請求項1〜15のいずれか記載の方法。
【請求項１７】
最初の変異が、アンドロゲンおよび／またはエストロゲンの合成を調整する1つ以上の遺伝子における変異を含む、請求項1〜16のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
最初の変異が、アロマターゼCyp19a1a、Cyp17またはその組み合わせの発現を調整する1つ以上の遺伝子における変異を含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
アロマターゼCyp19a1aの発現を調整する1つ以上の遺伝子が、cyp19a1a、FoxL2、およびそのオルソログから成るグループから選択した1つ以上の遺伝子である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
Cyp17の発現を調整する1つ異常音遺伝子が、cyp17Iまたはそのオルソログである、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
2つ目の変異が、精子形成を調整する1つ以上の遺伝子における変異を含む、請求項1〜20のいずれか記載の方法。
【請求項２２】
2つ目の変異が、巨大頭部精子症の原因となる1つ以上の遺伝子における変異を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
巨大頭部精子症の原因となる1つ以上の遺伝子における 2つ目の変異が、円形の頭部、円形の核、離断した中間部、部分的にコイル状の尾部、またはその組み合わせを引き起こす、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
2つ目の変異が、 Gopc、Hiat1、Tjp1a、Smap2、Csnk2a2、およびそのオルソログから成るグループから選択した1つ以上の遺伝子における変異を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
この不妊の性決定した不妊の魚、甲殻類、または軟体類が、不妊の雌の魚、甲殻類、または軟体類である、請求項1〜15のいずれか記載の方法。
【請求項２６】
最初の変異が、アロマターゼCyp19a1a阻害剤の発現を調整する1つ以上の遺伝子における変異を含む、請求項1〜15および25のいずれか記載の方法。
【請求項２７】
アロマターゼCyp19a1a阻害剤の発現を調製する1つ以上の遺伝子が、Gsdf、dmrt1、Amh、Amhr、およびそのオルソログから成るグループから選択した1つ以上の遺伝子である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
2つ目の変異が、卵子形成、卵胞形成、または組み合わせを調整する1つ以上の遺伝子を含む、請求項1〜15および25〜27のいずれか記載の方法。
【請求項２９】
卵子形成を調整する1つ以上の遺伝子がエストロゲンの合成を調整する、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
エストロゲンの合成を調整する1つ以上の遺伝子がFSHRまたはそのオルソログである、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
卵胞形成を調整する1つ以上の遺伝子がビテロゲニンの発現を調整する、請求項28記載の方法。
【請求項３２】
ビテロゲニンの発現を調整する1つ以上の遺伝子がvtgsまたはそのオルソログである、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
ビテロゲニンの発現を調整する1つ以上の遺伝子が、ビテロゲニン；エストロゲン受容体1；Cytochrome p450、ファミリー1、サブファミリーa；透明帯糖タンパク質；Choriogenin H；ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体；ステロイド産生急性調節タンパク質、またはそのオルソログをコード化または制御する遺伝子における変異である、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
次のステップを含む、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を生成する方法:
不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を産出するため、(i)ホモ接合型の変異を持つ繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類を(ii)ホモ接合変異を持つ魚、甲殻類、または軟体類と繁殖する、
この変異が、精子形成を直接的または間接的に阻害、および／または卵黄形成を直接的に阻害する、および
この繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類および繁殖能力のある雄の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力が回復した。
【請求項３５】
精子形成を直接的または間接的に阻害するこの変異が、Gopc、Hiat1、Tjp1a、Smap2、Csnk2a2、またはそのオルソログにおける変異である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
卵黄形成を直接的に阻害するこの変異が、ビテロゲニン；エストロゲン受容体1；Cytochrome p450、ファミリー1、サブファミリーa；透明帯糖タンパク質；Choriogenin H；ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体；ステロイド産生急性調節タンパク質、またはそのオルソログをコード化または制御する遺伝子における変異である、請求項34または35記載の方法。
【請求項３７】
繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類および繁殖能力のある雄の魚、甲殻類、または軟体類が、精子形成を直接的または間接的に阻害する；卵黄形成を直接的に阻害する；または両方の組み合わせである、複数のホモ接合型変異を持つ、請求項34、35または36記載の方法。
【請求項３８】
この繁殖能力の回復が生殖系幹細胞移植を含む、請求項34〜37のいずれか記載の方法。
【請求項３９】
この繁殖能力の回復がさらに、性ステロイド変化を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
この性ステロイドの変化が、エストロゲンの変化、またはアロマターゼ阻害剤の変化である、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
この生殖系幹細胞移植が次のステップを含む、請求項38〜40記載の方法:
少なくともホモ接合型変異を持つ不妊のホモ接合型雄の魚、甲殻類、または軟体類から生殖系幹細胞を、少なくともホモ接合型変異を持つ不妊のホモ接合型雌の魚、甲殻類、または軟体類から生殖系幹細胞を得る；および
この生殖系幹細胞を、生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類へ、または生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類へ移植する。
【請求項４２】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、dnd、Elavl2、vasa、nanos3、またはpiwi様遺伝子のヌル変異に対しホモ接合型である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、倍数性操作により作成された、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、交雑により作成された、請求項41記載の方法。
【請求項４５】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、高レベルの性ホルモンに暴露し作成された、請求項41記載の方法。
【請求項４６】
この繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類および繁殖能力のある雄の魚、甲殻類、または軟体類が、性分化を決定する付加的なホモ接合型変異を持つ、請求項34〜45のいずれか記載の方法。
【請求項４７】
性分化を決定するこの変異が、アロマターゼCyp19a1a、Cyp17、アロマターゼCyp19a1aに対する阻害剤、またはその組み合わせの発現を調整する、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
Cyp17の発現を調整するこの変異が、cyp17Iまたはそのオルソログにおける変異である、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
アロマターゼCyp19a1a阻害剤を調整するこの変異が、Gsdf、dmrt1、Amh、Amhr、またはそのオルソログにおける変異である、請求項47または48記載の方法。
【請求項５０】
この繁殖ステップが、性分化を決定するため、交雑またはホルモン操作および繁殖方法を含む、請求項34〜45記載の方法。
【請求項５１】
この魚、甲殻類、または軟体類が魚である、請求項1〜50のいずれか記載の方法。
【請求項５２】
最初の変異が性分化を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する、2つ目の変異が配偶子機能を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する、およびこの繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力が回復した、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類、少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類を産出するための、繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項５３】
この繁殖能力の回復が、生殖系幹細胞移植を含む、請求項52記載のこの繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項５４】
この繁殖能力の回復がさらに、性ステロイド変化を含む、請求項53記載のこの繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項５５】
この性ステロイドの変化がエストロゲンの変化、またはアロマターゼ阻害剤の変化である、請求項54記載のこの繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項５６】
この生殖系幹細胞移植が次のステップを含む、この繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類:
少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ不妊のホモ接合型雄の魚、甲殻類、または軟体類から生殖系幹細胞を、または少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ不妊のホモ接合型雌の魚、甲殻類、または軟体類から生殖系幹細胞を得る；および
生殖系幹細胞を、生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類へ、または生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類へ移植する。
【請求項５７】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、dnd、Elavl2、vasa、nanos3、またはpiwi様遺伝子のヌル変異に対しホモ接合型である、請求項56記載のこの繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項５８】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、倍数性操作により作成された、請求項56記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項５９】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、交雑により作成された、請求項56記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項６０】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、高レベルの性ホルモンに暴露し作成された、請求項56記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項６１】
この生殖系幹細胞移植が次のステップを含む、請求項53〜55のいずれか記載の、この繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類:
少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ不妊のホモ接合型雄の魚、甲殻類、または軟体類から精原幹細胞を、少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ不妊のホモ接合型雌の魚、甲殻類、または軟体類から卵原幹細胞を得る；および
この精原幹細胞を、生殖細胞のない繁殖能力のある雄の魚、甲殻類、または軟体類の精巣へ、またはこの卵原幹細胞を、生殖細胞のない繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類の卵巣へ移植する。
【請求項６２】
この生殖細胞のない繁殖能力のある雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類が、dnd、Elavl2、vasa、nanos3、またはpiwi様遺伝子の変異に対しホモ接合型である、請求項61記載のこの繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項６３】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、倍数性操作により作成された、請求項61記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項６４】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、交雑により作成された、請求項56記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項６５】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、高レベルの性ホルモンに暴露し作成された、請求項61記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項６６】
この不妊の性決定した不妊の魚、甲殻類、または軟体類が、不妊雄の魚、甲殻類、または軟体類である、請求項52〜65のいずれか記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項６７】
最初の変異がアンドロゲンおよび／またはエストロゲンの合成を調整する1つ以上の遺伝子における変異を含む、請求項52〜66のいずれか記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項６８】
最初の変異が、アロマターゼCyp19a1a 、Cyp17、またはその組み合わせの発現を調整する1つ以上の遺伝子における変異を含む、請求項67記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項６９】
アロマターゼCyp19a1aの発現を調整する1つ以上の遺伝子が、cyp19a1a、FoxL2、およびそのオルソログから成るグループから選択した1つ以上の遺伝子である、請求項68記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項７０】
Cyp17の発現を調整する1つ以上の遺伝子が、cyp17Iまたはそのオルソログである、請求項68記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項７１】
2つ目の変異が、精子形成を調整する1つ以上の遺伝子における変異を含む、請求項52〜70のいずれか記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項７２】
2つ目の変異が、巨大頭部精子症の原因となる1つ以上の遺伝子における変異を含む、請求項71記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項７３】
巨大頭部精子症の原因となる1つ以上の遺伝子における 2つ目の変異が、円形の頭部、円形の核、離断した中間部、部分的にコイル状の尾部、またはその組み合わせを持つ精子の原因となる、請求項72の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項７４】
2つ目の変異が、Gopc、Hiat1、Tjp1a、Smap2、Csnk2a2、およびそのオルソログから成るグループから選択した1つ以上の遺伝子における変異を含む、請求項73記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項７５】
この不妊の性決定した不妊の魚、甲殻類、または軟体類が、不妊雌の魚、甲殻類、または軟体類である、請求項52〜65のいずれか記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項７６】
最初の変異が、アロマターゼCyp19a1a阻害剤の発現を調整する1つ以上の遺伝子における変異を含む、請求項52〜65および75のいずれか記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項７７】
アロマターゼCyp19a1a阻害剤の発現を調整する1つ以上の遺伝子が、Gsdf、dmrt1、Amh、Amhr、およびそのオルソログから成るグループから選択した1つ以上の遺伝子である、請求項76記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項７８】
2つ目の変異が、卵子形成、卵胞形成、または組み合わせを調整する1つ以上の遺伝子における変異を含む、請求項52〜65および75〜77のいずれか記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項７９】
卵子形成を調整する1つ以上の遺伝子がエストロゲンの合成を調整する、請求項78記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項８０】
エストロゲンの合成を調整する1つ以上の遺伝子がFSHRまたはそのオルソログである、請求項79記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項８１】
卵胞形成を調整する1つ以上の遺伝子がビテロゲニンの発現を調整する、請求項80記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項８２】
ビテロゲニンの発現を調整する1つ以上の遺伝子がvtgsまたはそのオルソログである、請求項80記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項８３】
ビテロゲニンの発現を調整する1つ以上の遺伝子が、ビテロゲニン；エストロゲン受容体1；Cytochrome p450、ファミリー1、サブファミリーa；透明帯糖タンパク質；Choriogenin H；ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体；ステロイド産生急性調節タンパク質、またはそのオルソログをコード化または制御する遺伝子における変異である、請求項82記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項８４】
精子形成を直接的または間接的に阻害、および／または卵胞形成を直接的に阻害する変異、およびこの繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力が回復した、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を産出するための、ホモ接合型の変異を持つ繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項８５】
精子形成を直接的または間接的に阻害するこの変異が、Gopc、Hiat1、Tjp1a、Smap2、Csnk2a2、またはそのオルソログにおける変異である、請求項84記載の繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項８６】
卵黄形成を直接的に阻害するこの変異が、ビテロゲニン；エストロゲン受容体1；Cytochrome p450、ファミリー1、サブファミリーa；透明帯糖タンパク質；Choriogenin H；ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体；ステロイド産生急性調節タンパク質、またはそのオルソログをコード化または制御する遺伝子における変異である、請求項84またあ85記載の繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項８７】
この繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類が、精子形成を直接的または間接的に阻害する；卵黄形成を直接的に阻害する；または両方の組み合わせである、複数のホモ接合型変異を持つ、請求項84、85または86記載の繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項８８】
この繁殖能力の回復が生殖系幹細胞移植を含む、請求項84〜87のいずれか記載の繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項８９】
この繁殖能力の回復がさらに、性ステロイド変化を含む、請求項88記載の繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項９０】
この性ステロイドの変化が、エストロゲンの変化、またはアロマターゼ阻害剤の変化である、請求項89記載の繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項９１】
この生殖系幹細胞移植が次のステップを含む、請求項88〜90のいずれか記載の繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類:
少なくともホモ接合型の変異を持つ不妊のホモ接合型雄の魚、甲殻類、または軟体類から生殖系幹細胞を、または少なくともホモ接合型の変異を持つ不妊のホモ接合型雌の魚、甲殻類、または軟体類から生殖系幹細胞を得る；および
この生殖系幹細胞を、生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類、または生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類へ移植する。
【請求項９２】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、dnd、Elavl2、vasa、nanos3、またはpiwi様遺伝子のヌル変異に対しホモ接合型である、請求項91記載のこの繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項９３】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、倍数性操作により作成された、請求項91記載の繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項９４】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、交雑により作成された、請求項91記載の繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項９５】
この生殖細胞のない被移植体雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない被移植体雌の魚、甲殻類、または軟体類が、高レベルの性ホルモンに暴露し作成された、請求項91記載の繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項９６】
この繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類が、性分化を決定する付加的なホモ接合型変異を持つ、請求項84〜95のいずれか記載の繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項９７】
性分化を決定するこの変異が、アロマターゼCyp19a1a、Cyp17、アロマターゼCyp19a1aに対する阻害剤、またはその組み合わせの発現を調整する、請求項96記載の繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項９８】
アロマターゼCyp19a1aの発現を調整する1つ以上の遺伝子が、cyp19a1a、FoxL2、およびそのオルソログから成るグループから選択した1つ以上の遺伝子である、請求項97記載の繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項９９】
アロマターゼCyp19a1a阻害剤の発現を調整する1つ以上の遺伝子が、Gsdf、dmrt1、Amh、Amhr、およびそのオルソログから成るグループから選択した1つ以上の遺伝子である、請求項97記載の繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項１００】
不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類の産出が、性分化を決定するため、交雑またはホルモン操作および繁殖方法を含む繁殖ステップを含む、請求項84〜95記載の繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項１０１】
この繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類が、請求項52〜100のいずれか記載の繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項１０２】
次のステップを含む、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を生成する、繁殖能力のあるホモ接合型の変異をした魚、甲殻類、または軟体類:
(i)少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるヘミ接合型の変異をした雌の魚、甲殻類、または軟体類を(ii) 少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるヘミ接合型の変異をした雄の魚、甲殻類、または軟体類を繁殖する; 
遺伝子型選択によりホモ接合型である原子を選択する; および
このホモ接合型原始の繁殖能力を回復する、
最初の変異が、性分化を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する、および
2つ目の変異が、配偶子機能を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利に関する声明
ここに記述された作業の態様は、アメリカ合衆国農務省および国立食糧・農業研究所からの補助金# 2018-33522-28745支援によるものである。米国政府は、これらの発明に関し特定の権利を有する。
【０００２】
分野
本開示は概ね、真水および海水生物の不妊化および性決定方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
次項は、これらにおいて議論された内容は、先行技術または当業者の知識の一部であるということを認めているものではない。
【０００４】
魚の種は、貴重な医療用タンパク質を生産するため、または養殖へ有利な形質を取り入れるため、遺伝子的に操作されてきた(GE)。海産食品に対する将来的な需要および養殖産業におけるサステナビリティ改善に対するニーズに対応するため、様々な魚における成長率、飼料要求率、耐病性および栄養面におけるメリットは向上した。しかし、こういったGEの魚を世界的に採用することは、これらが自然生態系へ偶発的に放出することへの懸念により妨げられている。養殖魚は、自然環境で繁殖および生存することが証明されている。同様に、GEの魚には、天然の近縁がいるかもしれず、遺伝子的な改良は、自然集団全体へ広がり、天然の遺伝子プールが変化する可能性を高めている。このため、商用のGEの魚は、環境にとって潜在的な脅威となり、政策立案者および規制機関にとって、リスク・ベネフィット評価を行う課題となる。
【０００５】
前述の1つ以上の問題に対処する方法の1つに、魚の不妊化がある。三倍体の誘発は、不妊の魚を産出する方法としては最もよく使われ、またよく研究されている方法である。三倍体魚は通常、温度または圧力による衝撃を受精卵へ与え、強制的に第二極体を組み込み、3対の染色体組(3N)を持つ細胞を産出し生成される。三倍体魚は、染色体が1組多いため減数分裂が阻害され、生殖腺が正常に発達しない。産業規模では、卵塊へ確実に、圧力または温度による衝撃を与えることは複雑であり、多大な費用がかかる。物理的処理により誘発した三倍体の他に、遺伝学により誘発した三倍体があり、これは四倍体を二倍体魚と交配したことによるものである。しかし四倍体魚は、胚の生存率が低く、成長も遅いため、生成することが困難である。三倍体の雄は正常な単相の精子細胞を産出するため、雄が卵子を受精させることが可能となるが、効率性は低下するという例がいくつかある。さらにある種では、成長の遅滞や病気になりやすいなど、三倍体の表現型に関連し、性能が低いといった特徴を持ったものもあった。
【０００６】
数週間に及ぶホルモン処理により魚を不妊化するという方法もある。しかし長期間集中的に刺激を与えるなど、多くの場合、このようなプロセスは不妊化において望ましい有効性はなく、さらに／または魚の成長機能の低下に関連している。その上、合成ステロイドを使用した処理では、より高い死亡率に繋がることがある。
【０００７】
トランスジェニックをベーとしたテクノロジーにより、魚を不妊化する方法もあり、これには、生殖細胞致死を誘発、または移動パターンを阻害することで、発生過程にある胚を除去する導入遺伝子を挿入する手順が含まれる。しかし、導入遺伝子は、サイレンシングおよび位置効果に依存する。従って、このような方法が、商業用途として許容されるためには、広範囲におよぶ規制レビュープロセスの対象となる。
【０００８】
始原生殖細胞(PGC)発生を支配する遺伝子のノックダウンまたはノックアウトにより、魚を不妊化する方法もある。このような方法は、PGCの欠失および不妊を引き起こすと報告されている。しかし、これらの魚における不妊形質は、遺伝性ではない。従って、PGC発生を支配する遺伝子のノックダウンまたはノックアウト方法を利用することは、ロジスティックおよびコストの面における課題となり得るため、商業規模で不妊の魚を効率的に量産することは、実現困難である。
【０００９】
硬骨魚における性分化または生殖腺分化を支配するメカニズムは、内部(遺伝子的および内分泌因子)および相互作用および環境条件(水温、pHおよび酸素)などの外部因子に影響を受ける複雑なプロセスであり、この相対寄与は、種により大きく変化する。
【００１０】
不妊、性決定した魚、甲殻類、または軟体類の生成における改良が望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
導入
この導入の目的は、読者へ対し本明細書を示すことであり、いかなる発明をも定義することではない。以下または本文書の他の部分で記述されている、器具等または方法過程の組み合わせまたは部分的組み合わせにおいて、1つ以上の発明について記載されていることがある。本発明者は、他のいかなる発明者または本明細書において公開されたいかなる発明へ対しても、そのような発明または発明者について、本特許請求内に記述しないことにより、その権利を放棄または拒否しない。
【００１２】
真水および海水生物の不妊化に用いられる前述の方法の1つ以上は、次のような結果となることがある：(1)不十分な有効性；(2) 例えば、不妊の個体の部分母集団を同定するための遺伝子選択の実施、および／またはそれぞれのジェネレーションにおいて処理を繰り返すことにより、不妊形質を伝播することが困難となって行く；(3)例えば、畜産における慣行の大幅な変更、複数の種において転送が不可能、生産時間の増加、成長率の低い不妊の生物の割合の増加および病気にかかりやすい、不妊の生物の死亡率の上昇、またはその組み合わせにより生じる運営コストの増加；(4) 野生の個体群への遺伝子流入および養殖、外来種による新しい生息場所でのコロニー形成；または (5)その組み合わせ。
【００１３】
本開示は、性分化および配偶子形成パスウェイを阻害することで、性決定した不妊の真水および海水生物を生成する方法を提示している。本開示の1つ以上の例は、真水および海水生物の不妊化に用いられる前述の1つ以上の方法と比較し、：(1)例えば、不妊の個体の量産を可能とし、全ての個体が完全に不妊であることを保証することで、不妊化の効果を高めることがある；(2)例えば、コストのかかる処理機材の量を減らす、大規模に実現可能とする、複数の種において転送可能とする、飼料を減らす、生産時間を短縮する、性的に成熟する生物の割合を減らす、性的に成熟した生物の物理的なサイズを大きくする、またはこれらの組み合わせにより運営コストを削減することがある；(3) 野生の個体群への遺伝子流入および養殖、外来種による新しい生息場所でのコロニー形成を減らすことがある；(4)生殖腺発育へ対するエネルギーの損失を減らすことにより、養殖パフォーマンスを向上することがある；または(5)これらの組み合わせ。
【００１４】
本開示の1つ以上の例は、生産システムにおいて現在用いられている他の方法(メチルテストステロン処理)と比較し、飼料要求率(FCR＝与えられた飼料の分量あたり増加した体重)を、少なくとも10%改善し、成長速度が20%加速することがある。これらは、飼料費(飼料費の直接的な削減)および労働力(養殖時間の短縮による労働力の削減)のみに影響を与え得るというメリットがある。1000ポンドを生産している、アメリカ国内ティラピア養殖業の平均項目別コストに基づき、全て雄の不妊ティラピアを使用した市販サイズの魚(1.5ポンド)ごとに、$0.23の節約が実現するかもしれず、これは、生産コストの節約を維持する運営は、約130%の利益率増加へ繋がる可能性があることを示唆している。
【００１５】
また本開示では、種親そのものだけでなく、性決定した不妊の真水および海水生物の生成に用いる、真水および海水生物の種親の生成方法についても議論している。
【００１６】
本開示は、次のステップを含む、不妊の性決定した魚、甲殻類、また軟体類を生成する方法を提示している：(i)少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるヘミ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を (ii) 少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類と繁殖させる；および遺伝子型選択によりホモ接合体の原始、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類であるホモ接合変異体原始を選択する、最初の変異が性分化を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する、および2つ目の変異が配偶子機能を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する。
【００１７】
また本開示は、次のステップを含む、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を生成する方法も提示している：不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を産出するため、(i)少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を(ii) 少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類を繁殖させる；最初の変異が性分化を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する、2つ目の変異が配偶子機能を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する、および繁殖能力のあるホモ接合体雌の魚、甲殻類、または軟体類および繁殖能力のあるホモ接合変異型雄の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力が回復した。
【００１８】
この繁殖能力の回復には、生殖系幹細胞移植が含まれることがある。この繁殖能力の回復にはさらに、性ストロイド変化が含まれることがある。この性ステロイドの変化は、エストロゲンの変化、またはアロマターゼ阻害剤の変化であることがある。
【００１９】
この生殖系幹細胞移植は、次のステップを含むことがある：少なくとも最初の変異および2番目の変異を持つ不妊ホモ接合体雄の魚、甲殻類、または軟体類の生殖系幹細胞、または不妊ホモ接合体雌の魚、甲殻類、または軟体類から生殖系幹細胞を得る；および生殖系幹細胞を生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体へ移植する。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、dnd、Elavl2、vasa、nanos3、またはpiwi様遺伝子のヌル変異に対し、ホモ接合型であり得る。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、倍数性操作を用い、作成することが可能な場合がある。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、交雑により作成することが可能な場合がある。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、高レベルの性ホルモンに暴露することで作成することが可能な場合がある。
【００２０】
この生殖系幹細胞移植は、次のステップを含むことがある：少なくとも最初の変異および2番目の変異を持つ不妊ホモ接合体雄の魚、甲殻類、または軟体類から精原幹細胞を、または少なくとも最初の変異および2番目の変異を持つ不妊ホモ接合体雌の魚、甲殻類、または軟体類から卵原幹細胞を得る；および精原幹細胞を生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の精巣へ、または卵原幹細胞を生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の卵巣へ移植する。この生殖細胞のない繁殖能力のあるの雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない繁殖能力のあるの雌の魚、甲殻類、または軟体類は、dnd、Elavl2、vasa、nanos3、またはpiwi様遺伝子の変異に対し、ホモ接合型であり得る。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、倍数性操作を用い、作成することが可能な場合がある。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、交雑により作成することが可能な場合がある。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、高レベルの性ホルモンに暴露することで作成することが可能な場合がある。
【００２１】
この不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類は、不妊の雄の魚、甲殻類、または軟体類であることがある。最初の変異は、アンドロゲンおよび／またはエストロゲンの合成を調整する、1つ以上の遺伝子における変異を含むことがある。最初の変異は、アロマターゼCyp19a1a、Cyp17、またはその組み合わせの発現を調整する、1つ以上の遺伝子における変異を含むことがある。アロマターゼCyp19a1a の発現を調整する1つ以上の遺伝子は、cyp19a1a、FoxL2、オルソログから成るグループから選択した、1つ以上の遺伝子であることがある。2つ目の変異は、精子形成を調整する、1つ以上の遺伝子における変異を含むことがあり、2つ目の変異は、巨大頭部精子症を発症する、1つ以上の遺伝子における変異を含むことがある。巨大頭部精子症を発症する、1つ以上の遺伝子における2つ目の変異は、円形の頭部、円形の核、離断した中間部、部分的にコイル状の尾部、またはその組み合わせを持つ精子の原因となることがある。この2つ目の変異は、Gopc、Hiat1、Tjp1a、Smap2、Csnk2a2、およびそのオルソログから成るグループから選択した、1つ以上の遺伝子における変異を含むことがある。
【００２２】
この不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類は、不妊の雌の魚、甲殻類、または軟体類であることがある。最初の変異は、アロマターゼCyp19a1a阻害剤の発現を調整する、1つ以上の遺伝子における変異を含むことがある。アロマターゼCyp19a1a阻害剤の発現を調整する、1つ以上の遺伝子は、Gsdf、dmrt1、Amh、Amhr、およびそのオルソログから成るグループから選択した、1つ以上の遺伝子における変異を含むことがある。2つ目の変異は、卵形成、卵胞形成、または組み合わせを調整する、1つ以上の遺伝子における変異を含むことがある。卵形成を調整する、1つ以上の遺伝子は、エストロゲンの合成を調整することがある。エストロゲンの合成を調整する、1つ以上の遺伝子は、FSHRまたはそのオルソログであることがある。卵胞形成を調整する、1つ以上の遺伝子は、ビテロゲニンの発現を調整することがある。ビテロゲニンの発現を調整する、1つ以上の遺伝子は、vtgsまたはそのオルソログであることがある。ビテロゲニンの発現を調整する、1つ以上の遺伝子は、ビテロゲニン；エストロゲン受容体1；Cytochrome p450、ファミリー1、サブファミリーa；透明帯糖タンパク質；Choriogenin H；ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体；ステロイド産生急性調節タンパク質、またはそのオルソログをコード化または制御する遺伝子における変異であることがある。
【００２３】
また本開示は、次のステップを含む、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を生成する方法も提示している：不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を産出するため、(i)ホモ接合変異を持つ繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類を(ii) ホモ接合変異を持つ繁殖能力のある雄の魚、甲殻類、または軟体類と繁殖させる、変異が、精子形成を直接的または間接的に阻害する、および／または卵黄形成を直接的に阻害する、および繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類および繁殖能力のある雄の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力が回復した。
【００２４】
精子形成を直接的または間接的に阻害するこの変異は、Gopc、Hiat1、Tjp1a、Smap2、Csnk2a2、またはそのオルソログにおける変異であることがある。卵黄形成を直接的に阻害する変異は、ビテロゲニン；エストロゲン受容体1；Cytochrome p450、ファミリー1、サブファミリーa；透明帯糖タンパク質；Choriogenin H；ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体；ステロイド産生急性調節タンパク質、またはそのオルソログをコード化または制御する遺伝子における変異であることがある。この繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類および繁殖能力のある雄の魚、甲殻類、または軟体類は、精子形成を直接的または間接的に阻害する；卵黄形成を直接的に阻害する；または両方を組み合わせた、複数のホモ接合変異体を持つことがある。
【００２５】
この繁殖能力の回復は、生殖系幹細胞移植を含むことがある。この繁殖能力の回復にはさらに、性ストロイド変化が含まれることがある。この性ステロイドの変化は、エストロゲンの変化、またはアロマターゼ阻害剤の変化であることがある。
【００２６】
この生殖系幹細胞移植は、次のステップを含むことがある：少なくともホモ接合型の変異を持つ不妊のホモ接合体雄の魚、甲殻類、または軟体類からの生殖系幹細胞または少なくともホモ接合型の変異を持つ不妊のホモ接合体雌からの生殖系幹細胞を得る；および生殖系幹細胞を、生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体へ、または生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体へ移植する。生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、dnd、Elavl2、vasa、nanos3、またはpiwi様遺伝子のヌル変異へ対し、ホモ接合型であることがある。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、倍数性操作を用い、作成することが可能な場合がある。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、交雑により作成することが可能な場合がある。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、高レベルの性ホルモンに暴露することで作成することが可能な場合がある。
【００２７】
この繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類および繁殖能力のある雄の魚、甲殻類、または軟体類は、性分化を決定する付加的なホモ接合型の変異を持つことがある。性分化を決定するこの変異は、アロマターゼCyp19a1a 、Cyp17、アロマターゼCyp19a1aへの阻害剤、またはその組み合わせの発現を調整することがある。Cyp17の発現を調整するこの変異は、cyp17Iまたはそのオルソログにおける変異であることがある。アロマターゼCyp19a1a阻害剤を調整するこの変異は、Gsdf、dmrt1、Amh、Amhr、またはそのオルソログにおける変異であることがある。
【００２８】
ここに開示されている方法の繁殖ステップは、性分化を決定するための、交雑またはホルモン処置および繁殖方法を含むことがある。
【００２９】
ここに開示されている方法の魚、甲殻類、または軟体類は、魚であることがある。
【００３０】
また本開示は、最初の変異が、性分化を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する、2つ目の変異が、配偶子機能を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する、および繁殖能力のあるホモ接合変異型の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力が回復した、少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類、繁殖能力のあるホモ接合変異型の魚、甲殻類、または軟体類を産出するための、繁殖能力のあるホモ接合変異型の魚、甲殻類、または軟体類についても提示している。この繁殖能力の回復は、生殖系幹細胞を含むことがある。この繁殖能力の回復はさらに、性ストロイド変化を含むことがある。この性ステロイドの変化は、エストロゲンの変化、またはアロマターゼ阻害剤の変化であることがある。
【００３１】
この生殖系幹細胞移植は、次のステップを含むことがある：少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ不妊のホモ接合体雄の魚、甲殻類、または軟体類からの生殖系幹細胞、または少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ不妊のホモ接合体雄の魚、甲殻類、または軟体類からの生殖系幹細胞を得る；および生殖系幹細胞を、生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体へ、または生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体へ移植する。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、dnd、Elavl2、vasa、nanos3、またはpiwi様遺伝子のヌル変異へ対し、ホモ接合型であることがある。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、倍数性操作を用い、作成することが可能な場合がある。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、交雑により作成することが可能な場合がある。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、高レベルの性ホルモンに暴露することで作成することが可能な場合がある。
【００３２】
この生殖系幹細胞移植は、次のステップを含むことがある：少なくとも最初の変異および2番目の変異を持つ不妊ホモ接合体雄の魚、甲殻類、または軟体類から精原幹細胞を、または少なくとも最初の変異および2番目の変異を持つ不妊ホモ接合体雌の魚、甲殻類、または軟体類から卵原幹細胞を得る；および精原幹細胞を、生殖細胞のない繁殖能力のある雄の魚、甲殻類、または軟体類の精巣へ、または卵原幹細胞を、生殖細胞のない繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類の卵巣へ移植する。この生殖細胞のない繁殖能力のある雄の魚、甲殻類、または軟体類および生殖細胞のない繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類は、dnd、Elavl2、vasa、nanos3、またはpiwi様遺伝子の変異に対し、ホモ接合型であり得る。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、倍数性操作を用い、作成することが可能な場合がある。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、交雑により作成することが可能な場合がある。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、高レベルの性ホルモンに暴露することで作成することが可能な場合がある。
【００３３】
この不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類は、不妊の雄の魚、甲殻類、または軟体類であることがある。最初の変異は、アンドロゲンおよび／またはエストロゲンの合成を調整する、1つ以上の遺伝子における変異を含むことがある。最初の変異は、アロマターゼCyp19a1a、Cyp17、またはその組み合わせの発現を調整する、1つ以上の遺伝子における変異を含むことがある。アロマターゼCyp19a1a の発現を調整する1つ以上の遺伝子は、cyp19a1a、FoxL2、およびそのオルソログから成るグループから選択した、1つ以上の遺伝子であることがある。Cyp17の発現を調整する1つ以上の遺伝子は、cyp17Iまたはそのオルソログであることがある。この2つ目の変異は、精子形成を調整する、1つ以上の遺伝子における変異を含むことがある。この2つ目の変異は、巨大頭部精子症を発症する、1つ以上の遺伝子における変異を含むことがある。巨大頭部精子症を発症する、1つ以上の遺伝子における2つ目の変異は、円形の頭部、円形の核、離断した中間部、部分的にコイル状の尾部、またはその組み合わせを持つ精子の原因となることがある。この2つ目の変異は、Gopc、Hiat1、Tjp1a、Smap2、Csnk2a2、およびそのオルソログから成るグループから選択した、1つ以上の遺伝子における変異を含むことがある。
【００３４】
この不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類は、不妊の雌の魚、甲殻類、または軟体類であることがある。最初の変異は、アロマターゼCyp19a1a阻害剤の発現を調整する、1つ以上の遺伝子における変異を含むことがある。アロマターゼCyp19a1a阻害剤の発現を調整する、1つ以上の遺伝子は、Gsdf、dmrt1、Amh、Amhr、およびそのオルソログから成るグループから選択した、1つ以上の遺伝子における変異を含むことがある。2つ目の変異は、卵形成、卵胞形成、または組み合わせを調整する、1つ以上の遺伝子における変異を含むことがある。卵形成を調整する、1つ以上の遺伝子は、エストロゲンの合成を調整することがある。エストロゲンの合成を調整する、1つ以上の遺伝子は、FSHRまたはそのオルソログであることがある。卵胞形成を調整する、1つ以上の遺伝子は、ビテロゲニンの発現を調整することがある。ビテロゲニンの発現を調整する、1つ以上の遺伝子は、vtgsまたはそのオルソログであることがある。ビテロゲニンの発現を調整する、1つ以上の遺伝子は、ビテロゲニン；エストロゲン受容体1；Cytochrome p450、ファミリー1、サブファミリーa；透明帯糖タンパク質；Choriogenin H；ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体；ステロイド産生急性調節タンパク質、またはそのオルソログをコード化または制御する遺伝子における変異であることがある。
【００３５】
また本開示は、精子形成を直接的または間接的に阻害する、および／または卵黄形成を直接的に阻害する、および繁殖能力のある雄の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力が回復した、ホモ接合型の変異を持つ繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類についても提示している。
【００３６】
T精子形成を直接的または間接的に阻害するこの変異は、Gopc、Hiat1、Tjp1a、Smap2、Csnk2a2、またはそのオルソログにおける変異であることがある。卵黄形成を直接的に阻害する変異は、ビテロゲニン；エストロゲン受容体1；Cytochrome p450、ファミリー1、サブファミリーa；透明帯糖タンパク質；Choriogenin H；ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体；ステロイド産生急性調節タンパク質、またはそのオルソログをコード化または制御する遺伝子における変異であることがある。この繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類は、精子形成を直接的または間接的に阻害する；卵黄形成を直接的に阻害する；または両方を組み合わせた、複数のホモ接合変異体を持つことがある。この繁殖能力の回復は、生殖系幹細胞を含むことがある。この繁殖能力の回復はさらに、性ストロイド変化を含むことがある。この性ステロイドの変化は、エストロゲンの変化、またはアロマターゼ阻害剤の変化であることがある。
【００３７】
この生殖系幹細胞移植は、次のステップを含むことがある：少なくともホモ接合型の変異を持つ不妊ホモ接合体雄の魚、甲殻類、または軟体類の生殖系幹細胞、または少なくともホモ接合型の変異を持つ不妊ホモ接合体雌の魚、甲殻類、または軟体類から生殖系幹細胞を得る；および生殖系幹細胞を生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体へ、または生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体へ移植する。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、dnd、Elavl2、vasa、nanos3、またはpiwi様遺伝子のヌル変異に対し、ホモ接合型であり得る。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、倍数性操作を用い、作成することが可能な場合がある。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、交雑により作成することが可能な場合がある。この生殖細胞のない雄の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体および生殖細胞のない雌の魚、甲殻類、または軟体類の被移植体は、高レベルの性ホルモンに暴露することで作成することが可能な場合がある。
【００３８】
この繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類は、性分化を決定する付加的なホモ接合型の変異を持つことがある。性分化を決定するこの変異は、アロマターゼCyp19a1a 、Cyp17、アロマターゼCyp19a1aへの阻害剤、またはその組み合わせの発現を調整することがある。アロマターゼCyp19a1aの発現を調整するこの変異は、cyp19a1a、FoxL2、およびそのオルソログから成るグループから選択した1つ以上の遺伝子であることがある。アロマターゼCyp19a1a阻害剤の発現を調整する1つ以上の遺伝子は、Gsdf、dmrt1、Amh、Amhr、およびそのオルソログから成るグループから選択した1つ以上の遺伝子であることがある。
【００３９】
不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類の産出は、性分化を決定するための、交雑またはホルモン処置および繁殖方法を含む、繁殖ステップを含むことがある。
【００４０】
ここに開示されている繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類は、魚であることがある。
【００４１】
また本開示は、次のステップを含む、不妊の性決定した魚、甲殻類、また軟体類を生成する、繁殖能力のあるホモ接合変異体の魚、甲殻類、また軟体類を生成する方法も提示している：(i)少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるヘミ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を (ii) 少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類と繁殖させる；遺伝子型選択によりホモ接合体の原始を選択する；およびホモ接合体の原始の繁殖能力を回復する、最初の変異が性分化を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する、および2つ目の変異が配偶子機能を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する。
【００４２】
本開示におけるその他の実施例および機能は、添付図と併せ、具体例に関する以下の記述をレビューすることで、当業者へ対し明らかになる。
現在開示されている方法および生物は、添付図を参照とし、例を通してのみ記述される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図1は、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類の生成および変異系を伝播する方法の例を示したフローチャートである。
【図２】図2は、F0モザイクファウンダー変異体の同定および選択方法を示した例およびグラフである。変異アレルは、ターゲットとなる遺伝子座の周辺領域を増幅させるため設計された、遺伝子特異的プライマーを用いた蛍光PCRにより同定された(120-300 bp)。蛍光PCRについては、遺伝子特異的プライマーおよび蛍光色素6-FAMまたはNED が取り付けられた2つのフォワードオリゴ両方の組み合わせが、反応に追加された。野生型DNAを用いた制御反応は、個々の遺伝子座において、単一ピークの増幅の存在を確認するために使用される。結果として生じるアンプリコンは、塩基対の解像度に的確なアンプリコンのサイズを決定するためのLIZ標識サイズ基準を追加したキャピラリー電気泳動(CE)により分解された(Retrogen)。Rawトレースファイルは、Peak Scanner ソフトウェアで分析された(サーモフィッシャー)。野生型のピーク対照と比較したピークのサイズにより、変異の本質(挿入または欠失)および長さを決定する。ピークの回数は、モザイクのレベルを示している。本発明者らは、最少の変異アレルを持つF0モザイクファウンダーを選択した(選択的に2〜4ピーク)。
【図３】図3は、融解曲線プロットにより、ヘテロ接合の遺伝子型、ホモ接合変異体および野生型サンプルを可視化したグラフである。温度(-dF/dT)に対し、蛍光性がマイナスに変化していることがわかる。それぞれのトレースは、サンプルを表している。この例の野生型アレルの融解温度は、〜81℃(野生型ピーク)であり、ホモ接合変異体産物(ホモ接合欠失ピーク)の融解温度は、〜79℃である。それ以外のトレースは、ヘテロ接合型を表している。
【図４】図4パネルAからDは、色素形成遺伝子の両アレルノックアウトと比較した、ティラピアF0ジェネレーションの成長過程の写真である。
【図５】図5パネルAからBは、dead end1 (dnd)およびtyrosinase (Tyr)を含む、マルチ遺伝子ターゲッティング後のティラピアの写真である。図5パネルAは、F0 Tyrが不足したアルビノである。図5パネルBは、対照(WT)および不妊(F0 dnd KO)ティラピアの解剖した精巣である。
【図６】図6パネルAからBは、Elavl2-ノックアウトティラピア(Elavl2△8/△8)の生殖細胞が欠失した精巣および卵巣の写真である(矢印は生殖腺を指している)。小さな写真は、泌尿生殖突起である。Elavl2変異体は、細胞卵割期前に、Elavl2コード配列をターゲットとした人工ヌクレアーゼを、1細胞期のティラピアの胚へ顕微注入し生成された。結果として生じたファウンダーの雄の1匹が、野生型雌と交配し、F1ジェネレーションでヘテロ接合変異体を産出した。F1変異体Elavl2△8/+と交配することで、卵の約25％が両性の不妊ホモ接合変異体のF2ジェネレーションを産出した。
【図７】図7パネルAからCは、ティラピアcyp17遺伝子座で選択した変異アレルを示している。図7パネルAは、cyp17遺伝子の図式である。エクソン(E1-8)は、影付きボックスで示されている；翻訳開始部位および停止部位はそれぞれ、ATGおよびTAAである。矢印は、最初のエクソンにおけるターゲット位置を指している。図7パネルBは、Cyp17 F0変異ティラピアの子の生殖系変異アレル(SEQ ID NO: 61)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 60)である。この11nt+5 nt欠失は、位置521ではなく、アミノ酸44で切断する短縮型タンパク質を生成すると予想される。図7パネルCは、予想されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 62)および最初の16のアミノ酸が、野生型Cyp17タンパク質のそれと一致し、44のアミノ酸が誤ってコード化されている、変異cyp17アレル(SEQ ID NO: 63)である。
【図８】図8パネルAからCは、cyp17機能欠損は、二次性徴のない雄の子のみを産出するということを示しているグラフおよび写真である。図8パネルAは、完全に雄に偏っているCyp17変異体の魚を示しているグラフである。cyp17遺伝子座で生殖細胞系変異を持つファウンダー雄を、野生型雌と繁殖し、ヌルΔ16-cyp17アレルを持つ、この雄および雌F1子孫を選択し、野生型(WT)ホモ接合(-/-)およびヘミ接合変異体(+/-)のF2ジェネレーションを産出するため交配した。グラフは、これらの遺伝子型の雄および雌の数を示している。図8パネルBは、cyp17機能欠損変異体におけるテストステロンの検出不能なレベルを表している。尾静脈から血液を採取し、3000 rpmで10分間遠心分離した。血漿を分離し、-80° Cで凍結し、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA) (Cayman Chemical, Michigan, USA)により、血漿遊離テストステロンレベルを測定した。血漿サンプルは、3度分析された。図8パネルCは、年齢をマッチングした未処理の雄(右)と比較し、未発達のUGP を持つcyp17 F0 KO (-/-)雄の写真である。
【図９】図9パネルAからEは、Cyp17機能欠損変異体は、小さな精巣および乏精子症を持つ性的に遅延しているということを示している。ヘミ接合cyp17変異体のF2子孫を、5月齢まで育て、重量を測り(図9パネルC)、遺伝子型を決定した。図9パネルAは、安楽死した雄の露出した精巣(図9パネルA)および解剖した精巣(図パネルB)であり、性的に遅延していると思われる、最も成熟した生殖腺を持ち、ホモ接合体であるWT精巣の色およびサイズ勾配を示している。図9パネルEは、ホモ接合体およびWT雄8匹の剥離性魚精の大きさを示し、図9パネルFは、精子濃度の分光光度分析による比較を示している(600nm吸光度)。
【図１０】図10パネルAからCは、ティラピアタイトジャンクション構成タンパク質1(Tjp1a)遺伝子座で選択した、変異アレルを表している。図10パネルAは、Tjp1a遺伝子の図式である。エクソン(E1-32)は、影付きボックスで示されている；翻訳開始部位および停止部位はそれぞれ、ATGおよびTAAである。矢印は、ターゲットエクソン15および17を指している。図10パネルBは、Tjp1a F0変異ティラピアの子の選択した生殖系変異アレル(SEQ ID NO: 72)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 71)である。この7 nt欠失は、位置1652ではなく、アミノ酸439で切断する短縮型タンパク質を生成すると予想される。図10パネルCは、予想されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 73)および最初の439のアミノ酸が、野生型Tjp1aタンパク質のそれと一致しする変異Tjp1aアレル(SEQ ID NO: 74)である。
【図１１】図11パネルAからCは、ティラピアHippocampus abundant transcript 1a (Hiat1)遺伝子座で選択した変異を示している。図11パネルAは、ティラピアHiat1遺伝子の図式である。エクソン(E1-12)は、影付きボックスで示されている；5’ および3’非翻訳領域は、オープンボックスで示されている。矢印は、ターゲットエクソン4および6を指している。図11パネルBは、Hiat1 F0変異ティラピアの子の選択した生殖系変異アレル(SEQ ID NO: 76)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 75)である。17ヌクレオチド欠失の位置は、ダッシュで示されている。このフレームシフト変異は、位置491ではなく、アミノ酸234で切断する短縮型タンパク質を生成すると予想される。図11パネルCは、予想されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 77)および最初の218のアミノ酸が、野生型のそれと一致し、これに続く16のアミノ酸が誤ってコード化されている、欠失変異体Hiat1 タンパク質(SEQ ID NO: 78)である。
【図１２】図12パネルAからCは、ティラピアSmall ArfGAP2 (Smap2)遺伝子座で選択した変異を示している。図12パネルAは、ティラピアSmap2遺伝子の図式である。エクソン(E1-12)は、影付きボックスで示され、3’非翻訳領域は、オープンボックスで示されている。矢印は、ターゲットエクソン2および9を指している。図12パネルBは、Smap2 F0変異ティラピアの子の選択した生殖系変異アレル(SEQ ID NO: 80)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 79)である。17ヌクレオチド欠失の位置は、ダッシュで示されている。このフレームシフト変異は、位置429ではなく、アミノ酸118で切断する短縮型タンパク質を生成すると予想される。図12パネルCは、予想されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 81)および最初の53のアミノ酸が、野生型のそれと一致し、これに続く63のアミノ酸が誤ってコード化されている、欠失変異体Smap2 タンパク質(SEQ ID NO: 82)である。
【図１３】図13パネルAからCは、ティラピアカゼインキナーゼ2、アルファプライムポリペプチド(Csnk2a2)遺伝子座で選択した変異アレルを示している。図13パネルAは、Csnk2a2遺伝子の図式である。エクソン(E1-11)は、影付きボックスで示されている；翻訳開始部位および停止部位はそれぞれ、ATGおよびTGAである。矢印は、ターゲットエクソン1および2を指している。図13パネルBは、Csnk2a2 F0変異ティラピアの子の選択した生殖系変異アレル(SEQ ID NO: 84)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 83)である。この22 nt欠失は、位置350ではなく、アミノ酸31で切断する短縮型タンパク質を生成すると予想される。図13パネルCは、予想されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 85)および最初の31のアミノ酸が誤ってコード化されている、変異Csnk2a2 アレル(SEQ ID NO: 86)である。
【図１４】図14パネルAからCは、ティラピアGolgi-associated PDZ およびコイルドコイルモチーフ(Gopc)遺伝子座で選択した変異アレルを示している。図14パネルAは、Gopc遺伝子の図式である。エクソン(E1-9)は、影付きボックスで示されている；翻訳開始部位および停止部位はそれぞれ、ATGおよびTAAである。矢印は、ターゲットエクソン1および2を指している。図14パネルBは、Gopc F0変異ティラピアの子の選択した生殖系変異アレル(SEQ ID NO: 88)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 87)である。この8 nt欠失は、位置444ではなく、アミノ酸30で切断する短縮型タンパク質を生成すると予想される。図14パネルCは、予想されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 89)および最初の9のアミノ酸が、野生型Gopcタンパク質のそれと一致し、これに続く21のアミノ酸が誤ってコード化されている、変異Gopc アレル(SEQ ID NO: 90)である。
【図１５】図15パネルAおよびBは、人間およびネズミ欠失のノックアウト表現型を模写した、ティラピアの精巣形成特異的遺伝子の写真およびグラフである。図15パネルAは、5つの候補遺伝子に対するF0欠失ティラピアにおける精子の奇形を表している。精子の顕微画像はそれぞれ、野生型(WT)およびTjp1a、Gopc、Smap2、Hiat1およびCsnk2a2 F0変異体の魚からそれぞれ採取した。黒い矢印は、WT精子頭部のサイズを指し、黄色の矢印は、円形の大きな精子頭部を指している。スケールバーは100μmである。図15パネルBは、乾燥した配偶子(卵子200個および剥離した魚精)を混ぜ、直ちに孵化水2mLで活性化し体外受精を行った、手で剥がした配偶子の受精成功率を示している。データは、平均値+/- SD、n=3 replicatesである。
【図１６】図16パネルAからCは、繁殖能力があり、生殖細胞のない精巣におけるSMS遺伝子の発現レベルを示した画像およびグラフである。図16パネルAは、4月齢dnd1ノックアウトおよび年齢をマッチングした野生型対照の精巣を解剖したものである。図16パネルBは、vasaの相対的な発現レベルを示し、野生型および不妊のティラピアの精巣内において、同レベルでセルトリ特異的遺伝子Dmrt1が発現している一方で、生殖細胞特異的遺伝子は、dnd1 KOの魚の精巣内で、検出不能なレベルまで減少している。VasaおよびDmrt1の発現レベルを正常化するため、参照遺伝子としてβアクチンを使用した。図16パネルCは、野生型および不妊のティラピアの精巣内における、SMS遺伝子Tjp1a、Hiat1、GopcおよびCsnk2a2の相対的な発現レベルを示している。SMS遺伝子の発現レベルを正常化するため、参照遺伝子としてDmrt1を使用した。全てのケースにおいて、値は平均3 biological replicates、 +/- SDを示している。
【図１７】図17パネルAからCは、Cyp9a1a遺伝子座で選択した変異を示している。図17パネルAは、Cyp9a1a遺伝子の図式である。エクソン(E1-9)は、影付きボックスで示されている。矢印は、ターゲットエクソン1および9を指している。図17パネルBは、Cyp19a1a F0変異ティラピアの子の選択した生殖系変異アレル(SEQ ID NOs: 66および67)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 65)である。この7 nt(欠失8および挿入1)および10 nt欠失は、ダッシュで示されている。これらのフレームシフトは、位置511ではなく、アミノ酸12 および11で切断する短縮型タンパク質を生成すると予想される。図17パネルCは、予想されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 68)および最初の7および5のアミノ酸が、野生型Cyp19a1aタンパク質のそれと一致し、これに続く5 および6のアミノ酸が誤ってコード化されている、欠失変異体タンパク質(SEQ ID NO: 69および70)である。変化したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図１８】図18は、二重ヘテロ接合体の親の繁殖図式および変異体子孫の予想される遺伝子型の説明および表である。m1, 2, 3は、F0モザイク雌における、Tjp1a遺伝子座での異なる変異を示している。表中の列は、予想される性比および繁殖能力の状態と、cyp17およびTjp1aアレルそれぞれの組み合わせに対し、予想されるF2子孫の頻度を示している。全て雄および不妊であると予想される子孫は、枠で囲まれている。
【図１９】図19パネルAからCは、Dmrt1遺伝子座で選択した変異を示している。図19パネルAは、Dmrt1遺伝子の図式である。エクソン(E1-9)は、影付きボックスで示されている。矢印は、ターゲットエクソン1および3を指している。図19パネルBは、Dmrt1 F0変異ティラピアの選択した生殖系変異アレル(SEQ ID NOs: 92および93)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 91)である。この7 ntおよび13 nt欠失は、ダッシュで示されている。これらのフレームシフト変異は、位置293ではなく、アミノ酸40 および38で切断する短縮型タンパク質を生成すると予想される。図19パネルCは、予想されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 94)および最初の16のアミノ酸が、野生型Dmrt1タンパク質のそれと一致し、これに続く24 および22のアミノ酸が誤ってコード化されている、欠失変異体タンパク質(SEQ ID NO: 95および96)である。変化したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図２０】図20パネルAからCは、増殖／分化因子6-B-様遺伝子座(Gsdf)で選択した変異を示している。図20パネルAは、ティラピアGsdf遺伝子の図式である。エクソン(E1-5)は、影付きボックスで示されている。矢印は、ターゲットエクソン2および4を指している。図20パネルBは、Gsdf F0変異ティラピアの選択した生殖系変異アレルの配列(SEQ ID NOs: 98および99)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 97)である。この5 ntおよび22 nt欠失は、ダッシュで示されている。これらのフレームシフト変異は、位置213ではなく、アミノ酸56および46で切断する短縮型タンパク質を生成すると予想される。図20パネルCは、予想されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 100)および最初の52 および46のアミノ酸が、野生型Gsdfタンパク質のそれと一致し、これに続く4 および0のアミノ酸が誤ってコード化されている、欠失変異体タンパク質(SEQ ID NO: 101および102)である。変化したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図２１】図21パネルAからCは、ティラピア卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)遺伝子座で選択した変異を示している。図21パネルAは、ティラピアFSHR遺伝子の図式である。エクソン(E1-15)は、影付きボックスで示されている；5’ and 3’非翻訳領域は、オープンボックスで示されている。矢印は、ターゲットエクソン11および15を指している。図21パネルBは、FSHR F0変異ティラピアの子の選択した生殖系変異アレルの配列(SEQ ID NO: 104)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 103)である。5ヌクレオチドの位置は、ダッシュで示されている。このフレームシフト変異は、位置689ではなく、アミノ酸264で切断する短縮型タンパク質を生成すると予想される。図21パネルCは、予想されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 105)および最初の258のアミノ酸が、野生型のそれと一致し、これに続く6のアミノ酸が誤ってコード化されている、欠失変異体FSHR タンパク質(SEQ ID NO: 106)である。
【図２２】図22パネルAからCは、ビテロゲニンAa (VtgAa)遺伝子座で選択した変異を示している。図22パネルAは、ティラピアVtgAa遺伝子の図式である。エクソン(E1-35)は、影付きボックスで示されている。矢印は、ターゲットエクソン7および22を指している。図22パネルBは、VtgAa F0変異ティラピアの選択した生殖系変異アレルの配列(SEQ ID NOs: 108および109)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 107)である。この5 ntおよび25 nt欠失は、ダッシュで示されている。これらのフレームシフト変異は、位置1657ではなく、アミノ酸279および301で切断する短縮型タンパク質を生成すると予想される。図22パネルCは、予想されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 110)および最初の278および269のアミノ酸が、野生型VtgAaタンパク質のそれと一致し、これに続く1 および32のアミノ酸が誤ってコード化されている、欠失変異体タンパク質(SEQ ID NO: 111および112)である。変化したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図２３】図23パネルAからCは、ビテロゲニンAb (VtgAb)遺伝子座で選択した変異を示している。図23パネルAは、ティラピアVtgAb遺伝子の図式である。エクソン(E1-35)は、影付きボックスで示されている；5’非翻訳領域は、オープンボックスで示されている。矢印は、ターゲットエクソン5および22を指している。図23パネルBは、VtgAb F0変異ティラピアの子の選択した生殖系変異アレルの配列(SEQ ID NOs: 114)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 113)である。8ヌクレオチド欠失の位置は、ダッシュで示されている。このフレームシフト変異は、位置1747ではなく、アミノ酸202で切断する短縮型タンパク質を生成すると予想される。図23パネルCは、予想されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 115)および最初の270のアミノ酸が、野生型VtgAbタンパク質のそれと一致し、これに続く32のアミノ酸が誤ってコード化されている、欠失変異体VtgAbタンパク質(SEQ ID NO: 116)である。変化したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図２４】図24パネルAおよびBは、生存能力のある子孫を産出するための、VtgAa が不足している雌の尾を示している写真およびグラフである。図24パネルAは、受精から8時間後のメチレンブルーを含有した(Roth、孵化水内保存溶液の0.01%)孵化水内の胚の写真である。青の染色は、未受精卵および死んだ胚を示している。光を当てた実体顕微鏡で、胚を毎日検証し、死んだ胚の数を数え、取り除いた。図24パネルBは、野生型の魚と異系交配したF0 VtgAa雄および雌の子孫における生存率を示している。データは、平均値+/- SD、n=2x3 replicatesである。
【図２５】図25は、繁殖方法および二重ヘミ接合変異体親の変異体子孫の遺伝子型を示している。m1-nおよびm1は、F0におけるモザイク変異およびそれぞれのターゲットとなる遺伝子座に対し選択した、特異的変異を示している。示されているF1遺伝子型は、本発明者らが確立しようとしている、4つのアレルのうちの1つに対応している。表中の列は、予測される性比および繁殖能力の状態と、アレルそれぞれの組み合わせに対し、予想されるF2子孫の相対頻度を示している。全て雌および不妊であると予想される子孫は、赤い枠で囲まれている。
【図２６】図26は、卵巣発達に関するFSHR不足の影響を示している写真である。体のサイズが似ている12月齢雌の対照(WT体色−下のパネル)およびアルビノF0 FSHR変異体雌(FSHR -/-, tyr-/-; 上のパネル)のシブリングの生殖腺を、形態素解析のため解剖した。左は、対照および変異体雌の解剖した腹腔内の卵巣の画像である。白い矢印は生殖腺を指し、黒い矢印は泌尿生殖突起を指している。FSHRの変異により、卵胞形成が完全に停止し、萎縮性の紐のような生殖腺となった。野生型雌は、大きく突き出した泌尿生殖突起であるのに対し、アルビノF0 FSHR -/-雌は、はるかに小さな突起であった。
【図２７】図27は、FEM (cyp17、Cyp19a1a)、SMS (Tjp1a、Csnk2a2、Gopc、Smap2、Hiat1)、MA (Dmrt1、Gsdf)およびFLS 遺伝子(Vtgs、FSHR)を持つ配偶子に由来するドナーの量産を可能とする生殖細胞移植方法を示している。変異体ドナーにおいて、この欠陥遺伝子は、単性雄(FEM遺伝子)または雌(MA遺伝子)個体数が増加する、または機能しない精子(SMS遺伝子)または卵母細胞(FLS遺伝子)を有する結果となる。このため、これらのホモ接合変異体の量産は、不可能である。この制限を回避するため、本発明者らは、変異体表現型が、生殖細胞ではなく、体細胞の機能低下により生じる遺伝子のみをターゲットとし、「生殖細胞移植」テクニックにより、キメラ胚を産出した。キメラを産出するため、ホモ接合変異体の稚魚の卵巣または精巣細胞浮遊を、ターゲット遺伝子へ対し野生型である、生殖細胞のない被移植体の腹腔へ移植した。この方法により、野生型ホストのキメラ胚は、正常な体細胞であるが、変異体生殖系を持つ。これらのキメラ被移植体は、機能的な体細胞を持つことで、正常な性比および／または不妊状態を回復させる。これらの被移植体の魚は、単性および／または不妊の魚を量産するため、商用の種親として使用することが可能である。
【図２８】図28は、精子形成欠陥遺伝子(SMS (-))を持つ機能的な精子を量産するための、生殖細胞移植の方法を示している。ヘテロ接合SMS変異体の親から得た、SMSヌルの魚原始における始原生殖細胞(PGC)および精原細胞生成中に、欠陥は見られない。しかし成熟期では、SMS変異体雄は、円形の頭部を持つ、繁殖能力のない不動精子のみを産出する。雌のSMS変異体は、繁殖能力がある。このSMS遺伝子が、活動性を発揮する生殖細胞(セルトリ細胞およびライディッヒ細胞)を取り囲む体細胞内に発現される。SMSタンパク質の不足は、精子の成熟が損なわれる欠陥のある微小環境の原因となる。精子形成を回復するため、生殖系幹細胞をSMS変異体稚魚から分離し、それ自体のPGCが激減しているが、機能的なSMS遺伝子を持つ被移植体の胚へ移植することが可能である。移植したSMS -/-精原幹細胞は、被移植体の生殖腺を形成し、SMSは、これらの継続的な発生に欠かすことができないため、被移植体の体細胞は、移植した生殖細胞を育み、精子形成を回復し、機能的な精子の産出を可能とする。これらの全ては、変異体SMS遺伝子を持つ。
【図２９】図29は、ビテロゲニン欠損遺伝子(Vtg (-))を持つ機能的な卵子を産出するための、生殖細胞移植の方法を示している。ヘテロ接合Vtg変異体の親から得た、Vtg-ヌルの魚原始における始原生殖細胞(PGC)および卵原細胞生成中に、欠陥は見られない。しかし成熟期では、Vtg変異体雌は、雌の不妊に繋がる、Vtgタンパク質が欠失している卵母細胞のみを産出する。Vtgが不足している雄は、正常に発達し、繁殖能力がある。このVtg遺伝子は通常、肝細胞および血流を介し、卵母細胞へ輸送されるVtgタンパク質内に発現する。Vtgタンパク質の不足は、初期胚または幼生の発達に必要な重要な栄養素を卵子が欠く原因となり、発達が停止することに繋がる。このため、Vtg -/-雌は、子なしである。卵黄形成を回復するため、生殖系幹細胞をVtgヌル変異体稚魚から分離し、それ自体のPGCが激減しているが、機能的なVtg遺伝子を持つ被移植体の胚へ移植することが可能である。移植したVtg -/-生殖系幹細胞は、被移植体の生殖腺を形成し、代理母の肝細胞は必ず、初期発生をサポートする栄養素が、適切に卵子へ送り込まれるにする。Vtg -/-雄と交配した被移植体の雌は、生存能力のあるVtg -/-子孫を産出する。
【図３０】図30は、生存能力のあるFSHR-変異体卵子(FSHR (-))を産出するための、生殖細胞移植の方法を示している。ヘテロ接合FSHR変異体の親から得た、FSHR-ヌルの魚原始における始原生殖細胞(PGC)および卵原細胞生成中に、欠陥は見られない。しかし成熟期では、FSHR変異体雌は、FSHRが仲介するシグナルへ反応せず、卵胞形成の停止に繋がり、雌となる。FSHRノックアウト雄は、正常に発達し、繁殖能力がある。FSHRは、体の濾胞細胞内に単独で発現するため、FSHRヌル変異体稚魚から、それ自体のPGCが激減しているが、機能的なFSHR遺伝子を持つ被移植体の胚へ、生殖系幹細胞を移植ことで、正常な卵母細胞の発生を回復し、生存能力のある卵子の産出が可能となる。FSHR (-/-)雄と交配した被移植体の雌は、FSHR (-/-)子孫のみを産出する。
【図３１】図31は、機能的なFEM-変異体卵子(FEM: Cyp19a1a、およびcyp17)を産出するための、生殖細胞移植の方法を示している。本発明者らは、ヘテロ接合FEM変異体の親から得た、FEM -ヌルの魚原始における始原生殖細胞(PGC)および卵原細胞生成中に、欠陥を見い出さなかった。しかし成熟期では、FEM変異体雌は、アンドロゲンをエストロゲンへ変換せず、これにより、卵巣体細胞指示細胞(卵胞膜細胞および果粒膜細胞)を、精巣体細胞指示細胞(ライディッヒ細胞およびセルトリ細胞)を再プログラミングし、遺伝的な雌を、表現型の雄へ復帰させることになる。FSHRが仲介するシグナルへ反応せず、卵胞形成の停止に繋がり、雌となる。FSHRノックアウト雄は、正常に発達し、繁殖能力がある。FEMが不足した雄は、正常に発達し、繁殖能力がある。このFEM遺伝子は、卵巣体細胞内に正常に発現する。FEMが不足した遺伝子を持つ卵母細胞の量産を可能とするため、生殖系幹細胞を、FEMヌル変異体稚魚から分離し、それ自体のPGCが激減しているが、機能的なFEM遺伝子を持つ被移植体の胚へ移植することが可能である。移植したFEM -/-生殖系細胞は、被移植体の生殖腺を形成する。ドナー卵母細胞を取り囲むこの体細胞は、正常な量のエストロゲンを産出し、卵胞形成の進行および雌の運命維持を可能とする。FEM (-/-)雄と交配したこれらの被移植体雌は、FEM -/-子孫のみを産出する。
【図３２】図32は、全て雄で不妊の魚を量産する方法を示した図式である。ダブルKOの親(例、SMSおよびcyp17)は、図27〜32で示した生殖細胞移植技術を使い、伝播することが可能である。これらの種親は、変異遺伝子を持つ配偶子に由来するドナーのみを産出する。この種親の自然および人工交配は、全て雄の不妊の個体群のみを産出する。
【図３３】図33パネルAおよびBは、ティラピア配偶子に由来するドナーの形成および産出に成功した、生殖細胞移植実験を表している。図33パネルAは、孵化したばかりの生殖細胞のないティラピアの幼生への生殖細胞移植を示した図である。変異を持つドナー精原幹細胞(SSC)を、内因性生殖細胞が激減した幼生の腹腔へ移植した。参照遺伝子内にin frame △3nt 欠失および色素遺伝子(tyri6/i6)内に6 nt挿入を持つグループ、および参照遺伝子内にout of frame 4 nt欠失および色素遺伝子(tyr△22/△22)内に22欠失を持つフループの、SSCの2つのグループを同時に移植した。この3 nt欠失は、遺伝子機能を変化するとは予想されず、このため正の対照として機能する。この移植した細胞は移動し、被移植体の生殖隆起 を形成する。性成熟達成後、この被移植体の魚の配偶子を採取し、配偶子に由来するドナーの変異領域に隣接するPCRプライマーを使用したPCR断片サイズアッセイにより、これらのDNAを分析した。この増幅産物を分類し、キャピラリー電気泳動により検知した。精原幹細胞の移植後、ドナー細胞に由来する機能的な卵子および精子を産出する雌および雄の被移植体の割合を出した。図33パネルBは、野生型対照および移植した繁殖能力のあるティラピアから採取した、精子DNAの毛細血管の断片の長さを分析したものである。下のトレースは、色素遺伝子内の6nt挿入および△22nt欠失フラグメントと併せ、参照遺伝子の△3ntおよび△4nt欠失フラグメントに由来するドナーのみを示している。野生型サイズのテスト遺伝子に対し遺伝子特異的フラグメント(268bp)およびtyr遺伝子に対し467ntを持つ陰性対照を、参照として示している。
【図３４】図34パネルAからDは、単性の不妊の個体数を繁殖させる、異なる方法を示している。FEM-/- およびMA-/-は、雌性および雄性ヌル遺伝子を表す。SMS-/-およびFLS-/-は、精子形成および卵胞形成ヌル遺伝子を表す。雄および雌の種親は、ステロイドホルモン操作および生殖細胞移植による生殖細胞移植(図34パネルAおよびB)によりのみ産出した(図34パネルCおよびD)。養殖システムで使用する数百万という全て雄の不妊の胚(図34パネルAおよびC)または全て雌の不妊の胚(図34パネルBおよびD)を量産するために、限られた数の種親を交配することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
全体として本開示は、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類の生成方法を示している。この方法には、次が含まれる：(i)少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるヘミ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を (ii) 少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類と繁殖させる；および遺伝子型選択により、ホモ接合体の原始、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類であるホモ接合変異体原始を選択する。最初の変異は、性分化を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する。2つ目の変異は、配偶子の機能を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する。
【００４５】
本開示では、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を生成する方法についても示している。この方法には、次のステップが含まれる：不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を生成するため、(i) 少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を(ii) 少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類と繁殖させる。最初の変異は、性分化を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する。2つ目の変異は、配偶子の機能を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する。この繁殖能力のあるホモ接合体雌の魚、甲殻類、または軟体類および繁殖能力のあるホモ接合変異型雄の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力は回復した。
【００４６】
本開示では、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を生成する方法についても示している。この方法には、次のステップが含まれる：不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を生成するため、(i) ホモ接合変異を持つ繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を(ii) ホモ接合変異を持つ繁殖能力のあるホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類と繁殖させる。この変異は、精子形成を直接的または間接的に阻害し、および／または卵黄形成を直接的に阻害する。この繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類および繁殖能力のある雄の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力は回復した。
【００４７】
本開示では、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を生成する、繁殖能力のあるホモ接合変異体の魚、甲殻類、または軟体類を生成する方法についても示している。この方法には、次のステップが含まれる：不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を生成するため、(i) 少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ繁殖能力のあるヘミ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を(ii) 少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類と繁殖させる；遺伝子型選択により、ホモ接合体の原始を選択する；およびこのホモ接合体の原始の繁殖能力を回復する。最初の変異は、性分化を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する。2つ目の変異は、配偶子の機能を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する。
【００４８】
本開示では、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を産出するための、繁殖能力のあるホモ接合変異体の魚、甲殻類、または軟体類についてもさらに提示している。少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つこの繁殖能力のあるホモ接合変異体の魚、甲殻類、または軟体類において、最初の変異は、性分化を決定する1つ以上の遺伝子を阻害し、2つ目の変異は、配偶子の機能を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する。この繁殖能力のあるホモ接合変異体の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力は回復した。
【００４９】
本開示では、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を産出するための、繁殖能力のあるホモ接合変異体の魚、甲殻類、または軟体類についてもさらに提示している。この変異は、精子形成を直接的または間接的に阻害、および／または卵黄形成を直接的に阻害し、この繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力が回復した。
【００５０】
本開示の文脈において、魚とは、指のある手足のない、鰓を持つあらゆる有頭動物のことである。魚の例としては、コイ、ティラピア、サケ、マスおよびナマズが挙げられる。本開示の文脈において、甲殻類とは、あらゆる節足動物分類群のことである。甲殻類の例としては、カニ、ロブスター、ザリガニおよびエビが挙げられる。本開示の文脈において、軟体類とは、柔らかく未分節の体を持ち、通常、石灰質の殻に覆われているあらゆる無脊椎動物のことである。軟体類の例としては、二枚貝、ホタテガイ、カキ、タコ、イカおよび ヒザラガイが挙げられる。
【００５１】
不妊の魚、甲殻類、または軟体類とは、野生型の対照と比較し、繁殖または交配により子孫を生む能力が低下しているあらゆる魚、甲殻類、または軟体類のことである；例えば、不妊の魚、甲殻類、または軟体類は、生存能力のある子孫を産出する可能性が約50%、約75%、約90%、約95%、または100%低下している。これに対し、繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類とは、繁殖または交配により子孫を産出する能力を有するあらゆる魚、甲殻類、または軟体類のことである。繁殖および交配とは、子孫または子を生み出すための雄の種および雌の種の交尾における、あらゆるプロセスのことである。
【００５２】
性決定した魚、甲殻類、または軟体類とは、あらゆる魚、甲殻類、または軟体類の原始のことであり、この原始の性別は、原始の性分化パスウェイを阻害することで、あらかじめ決定されている。同じジェネレーションの性決定した原始は単性であるという例もいくつかある。
【００５３】
配偶子の機能とは、受精中、配偶子が他の配偶子と結合するプロセスのことである。
【００５４】
性分化を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する変異とは、生殖腺機能を直接的または間接的に調整する、あらゆる遺伝子変異のことである。生殖腺機能に直接的または間接的に作用するとは、生殖腺機能を調整するため、(1)1つ以上の生殖腺細胞遺伝子のコード配列を変異させる；(2)1つ以上の生殖腺細胞の転写を多少制御する非コード配列を変異させる；(3)1つ以上の生殖腺細胞の翻訳後調節に関与する、他の遺伝子のコード配列を変異させる；または(4)その組み合わせのことである。生殖腺機能の調整とは、生殖腺が雌の配偶子を産出するまたは雄の配偶子を産出することを決定することである。雄性化が優先されるときの例には、例えば、アロマターゼCyp19a1a、Cyp17またはその組み合わせの発現の調整など、アンドロゲンおよび／またはエストロゲンの合成を調整する、1つ以上の遺伝子の調整が含まれる。アロマターゼCyp19a1aｎ発現の調整に関与する遺伝子は、cyp19a1a、FoxL2、sf1 (ステロイド産生因子1)、およびそのオルソログを含む。Cyp17の発現の調整に関与する遺伝子は、cyp17Iまたはそのオルソログを含む。雌性化が優先されるときの例には、アロマターゼCyp19a1a 阻害剤の発現を調整する1つ以上の遺伝子の調整が含まれる。アロマターゼCyp19a1a 阻害剤の発現を調整する遺伝子には、Gsdf、dmrt1、Amh、Amhr、およびそのオルソログが含まれる。
【００５５】
あるいは、性分化は、1つ以上の遺伝子変異なしに決定されることがある。性分化を決定する非遺伝的な変異の方法の例として、性転換(ホルモン操作)および繁殖、後代検定、雄性発生、および雌性発生を活用する方法があり、これはホモ接合性XX、YYまたはZZである、単性の雄または雌の個体群を産出することが可能である(例[21]参照；Dunham 2004、参照により含まれるものとする)。本開示によるいくつかの例では、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類を産出するため、(i)ホモ接合変異体の繁殖能力のある雌の魚、甲殻類、または軟体類を(ii)ホモ接合変異体の繁殖能力のある雄の魚、甲殻類、または軟体類と繁殖させることは、性分化決定の非遺伝子的な変異の方法を含む。セイヨウサケを使用した本開示によるいくつかの例では、性転換した雄(XX)の作成および雌との繁殖は、単性雌の原始を産出する。本開示による他の例では、性分化の決定は、種間交雑により達成可能である(Pruginin、Rothbard et al. 1975、Wolters and DeMay 1996参照、参照により含まれるものとする)。
【００５６】
配偶子機能を決定する1つ以上の遺伝子を阻害する変異とは、不妊の魚、甲殻類、または軟体類を産出するため、精子形成、卵子形成および／または卵胞形成を直接的または間接的に調整する、あらゆる遺伝子変異のことである。精子形成、卵子形成および／または卵胞形成を直接的または間接的に調節するとは、不妊の魚、甲殻類、または軟体類を産出するため、(1)1つ以上の配偶子遺伝子のコード配列を変異させる；(2)1つ以上の配偶子遺伝子の転写を多少制御する非コード配列を変異させる；(3)1つ以上の配偶子遺伝子の翻訳後調節に関与する、他の遺伝子のコード配列を変異させる；または(4)その組み合わせのことである。
【００５７】
精子形成を直接的または間接的に阻害する、および／または卵黄形成を直接的に阻害する変異とは、不妊の魚、甲殻類、または軟体類を産出するため、精子形成を直接的または間接的に調整する、および／または卵黄形成を直接的に阻害する、あらゆる遺伝子変異のことである。精子形成を直接的または間接的に調整するとは、不妊の魚、甲殻類、または軟体類を産出するため、(1)精子形成に関与する1つ以上の配偶子遺伝子のコード配列を変異させる；(2)精子形成に関与する1つ以上の配偶子遺伝子の転写を多少制御する非コード配列を変異させる；(3)精子形成に関与する1つ以上の配偶子遺伝子の翻訳後調節に関与する、他の遺伝子のコード配列を変異させる；または(4)その組み合わせのことである。卵黄形成を直接調節するとは、不妊の魚、甲殻類、または軟体類を産出するため、(1) 卵黄形成に関与する1つ以上の配偶子遺伝子のコード配列を変異させる；(2)卵黄形成に関与する1つ以上の配偶子遺伝子の転写を多少制御する非コード配列を変異させる；または(3)その組み合わせのことである。
【００５８】
不妊の雄の魚、甲殻類、または軟体類の産出が優先されるときの例は、精子形成を調整する1つ以上の遺伝子の調整を含む。精子形成を調整する1つ以上の遺伝子の例は、巨大頭部精子症、円形の頭部、円形の核、離断した中間部、部分的にコイル状の尾部、またはその組み合わせを持つ精子の原因となることがある。巨大頭部精子症を引き起こす遺伝子の例は、Gopc、Hiat1、Tjp1a、Smap2、Csnk2a2、およびそのオルソログを含む。不妊の雌の魚、甲殻類、または軟体類の産出が優先されるときの例は、卵子形成、卵胞形成、または組み合わせを調整する1つ以上の遺伝子の調整を含む。卵子形成を調整する1つ以上の遺伝子の例は、エストロゲンの合成を調整する1つ以上の遺伝子を含む。エストロゲンの合成を調整する1つ以上の遺伝子の例は、FSHRまたはそのオルソログを含む。卵胞形成を調整する1つ以上の遺伝子の例は、卵黄形成の発現を調整する1つ以上の遺伝子を含む。卵黄形成の発現を調整する1つ以上の遺伝子の例は、vtgsまたはそのオルソログを含む。精子形成を直接的または間接的に阻害する変異の例は、Gopc、Hiat1、Tjp1a、Smap2、Csnk2a2、またはそのオルソログである。卵黄形成を直接的に阻害する変異の例は、ビテロゲニン；エストロゲン受容体1；Cytochrome p450、ファミリー1、サブファミリーa；透明帯糖タンパク質；Choriogenin H；ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体；ステロイド産生急性調節タンパク質、またはそのオルソログをコード化または制御する遺伝子における変異である。
【００５９】
変異は、例えば、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、およびヌクレオチド置換など、対象となるヌクレオチド配列のあらゆるタイプの変化であることがある。
【００６０】
不妊または繁殖能力の回復とは、不妊の魚、甲殻類、または軟体類が、繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類へ変換されるあらゆるプロセスのことである。繁殖能力を回復させるため、アロマターゼ阻害剤を、不妊の魚、甲殻類、または軟体類へ与えるという例もいくつかある。その他の例では、不妊の魚、甲殻類、または軟体類の生殖系幹細胞移植により、繁殖能力が回復する。生殖系幹細胞移植とは、不妊の魚、甲殻類、または軟体類の生殖幹細胞を、繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類へ移植し、繁殖能力を回復するあらゆるプロセスのことである。本開示によるいくつかの例では、生殖系幹細胞移植は、次を含むプロセスである：少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ不妊のホモ接合体雄の魚、甲殻類、または軟体類の生殖系幹細胞、または少なくとも最初の変異および2つ目の変異を持つ不妊のホモ接合体雌の魚、甲殻類、または軟体類の生殖系幹細胞を得る；およびこの生殖系幹細胞を生殖細胞のない被移植体の雄の魚、甲殻類、または軟体類へ、または生殖細胞のない被移植体の雌の魚、甲殻類、または軟体類へ移植する。被移植体の雄または雌の魚、甲殻類、または軟体類は、それ自体の生殖細胞が激減しているが、性分化および配偶子機能を決定する、ターゲット遺伝子の機能的なコピーを持つ、あらゆる胚である。あるいは、生殖細胞の激減した被移植体は、ターゲット遺伝子の機能的なコピーを持つ稚魚または成魚である得る。むしろ、この被医者体の種は、ドナーである種(同種異系の被移植体)と同じであるが、その他の種を用いることも可能である(異種被移植体)。移植後の被移植体は、正常な体細胞を持つが、変異体生殖系であるキメラの魚、甲殻類、または軟体類である。生殖細胞のない被移植体は、倍数性操作、交雑方法、または高レベルの性ホルモンに暴露することで、作成することが可能な場合がある。水生種の稚魚を高レベルの性ホルモンに暴露することで、暴露した動物の不妊化に繋がることがある。この方法は、すでに証明されているが(Hunter et al, 1982; Solar et al, 1984; Piferrer et al, 1994)、商業規模では使われていない。この方法は、不妊の魚を作成することにおいて効果的である場合があるが、100％処理した魚において、不妊の誘発に効果的であることは証明されていない。処理された魚は、研究、または生殖細胞移植の被移植体として最適である場合があるが、この方法は、商業養殖用として不妊の魚を作成するには十分ではない(Hunter, G.A., E.M. Donaldson, F.W. Goetz, and P.R. Edgell. 1982. 全雌および不妊のギンザケの産出、および雄性異型配偶子性の実験的証明、米国水産学会の取扱 111: 367-372; Piferrer, F, M Carillo, S. Zanuy, I.I. Solar, and E.M. Donaldson. 1994.  初めての給餌前のアンドロゲン浸漬によるギンザケ(Oncorhynchus kisutch)における不妊化の誘発、水産養殖 119: 409-423; and Solar, I., E.M. Donaldson, and G.A. Hunter. 1984.   17α-メチルテストステロンの経口投与による制御された性分化へ対する処理法の最適化および野生ニジマス(Salmo gairdeneri Richardson)における不妊化、水産養殖42: 129-139参照)。
【００６１】
いくつかの例においては、この生殖系幹細胞移植は、次を含むプロセスである：不妊のホモ接合体雄の魚、甲殻類、または軟体類の精原幹細胞または不妊のホモ接合体雌の魚、甲殻類、または軟体類の卵原幹細胞を得る、および精原幹細胞を生殖細胞のない胚の腹腔、または魚、甲殻類、または軟体類の生殖細胞のない分化した精巣または卵巣へ移植する。必要に応じ、繁殖能力を回復するため、生殖系幹細胞移植に加え、外因性ステロイド、例えば、エストロゲンを不妊の魚、甲殻類、または軟体類へ提供する。他の例では、繁殖能力を回復するため、アロマターゼ阻害剤を、不妊の魚、甲殻類、または軟体類へ提供する。
【００６２】
図1は、例えば、不妊の性決定した魚、甲殻類、または軟体類の産出に用いる、繁殖能力のあるホモ接合変異体雄および雌の魚、甲殻類、または軟体類など、雄および雌の種親の作成方法を示した本開示によるフローチャートである。
【００６３】
図1は、性分化および配偶性形成を支配する遺伝子的パスウェイ、および単性の不妊の個体群を産出するためのKO方法を示している。
【００６４】
遺伝子cyp19a1a、FoxI2、またはその組み合わせにおける1つ以上の変異は、精巣形成および雄の魚、甲殻類、または軟体類の産出の要因となる、エストロゲンの発現が低下または減少することとなる。同様に、遺伝子cyp17における1つ以上の変異は、雄の魚、甲殻類、または軟体類の産出の要因となる、エストロゲンおよびアンドロゲンが低下または減少することとなる。精子形成(SMS)を阻害する遺伝子における1つ以上の付加的な変異は、雄の魚、甲殻類、または軟体類となる。従って、不妊のホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類が産出される。
【００６５】
この系統を繁殖するために用いる付加的なステップにおいて、この不妊のホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力は、エストロゲン処理をすることで回復することがある。次の処理により、繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を産出する。この性転換プロセスにおいて、この表現型雌は、精子形成を阻害する1つ以上の変異を持ち、繁殖能力はある、さらに精子形成を阻害する1つ以上の変異を持つ卵母細胞が産出され、この系統の繁殖を可能とする。あるいは、実施例10に記述している通り、繁殖能力のあるホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類を産出するため、不妊のホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力は、不妊のホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類の生殖細胞を、繁殖能力のある野生型雄の精巣細胞へ組み込むことで回復することがあり、これによりこの系統の繁殖が可能となる。
【００６６】
図1とは対照的に、遺伝子Gsdf、Dmrt1、またはその組み合わせにおける1つ以上の変異は、Cyp19a1a阻害剤の不活性化に繋がり、卵巣形成および雌の魚、甲殻類、または軟体類の産出の要因となるエストロゲンの発現が高いまたは増加することとなる。卵子形成、卵胞形成(FLS)、またその組み合わせを調整する遺伝子における1つ以上の付加的な変異は、不妊の雌の魚、甲殻類、または軟体類となる。従って、不妊のホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類が産出される。
【００６７】
この系統を繁殖するために用いる付加的なステップにおいて、この不妊のホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力は、アロマターゼ阻害剤の処理により回復することがある。次の処理により、繁殖能力のあるホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類を産出する。この性転換プロセスにおいて、この表現型雄は、卵子形成、卵胞形成、またその組み合わせを阻害する1つ以上の変異を持ち、繁殖能力はある、さらに卵子形成、卵胞形成、またはその組み合わせを阻害する1つ以上の変異を持つ精子が産出され、この系統の繁殖を可能とする。あるいは、実施例10に記述している通り、繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を産出するため、不妊のホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖能力は、不妊のホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類の生殖細胞を、繁殖能力のある野生型雌の卵巣細胞へ組み込むことで、回復することがあり、これによりこの系統の繁殖が可能となる。
【実施例】
【００６８】
実施例1 - 材料および方法
使用する動物および倫理に関する声明:  動物福祉および畜産の手順を保証する、米国の規制に準拠した全ての実験は、IACUC認可の動物に関するプロトコルであるCAT-004に基づき実施された。本研究において使用したティラピア(Oreochromis niloticus)系は、米国の商業生産者から得たブラジル系統に由来している。
【００６９】
ヌクレアーゼの生成および方法: F0変異体の生成: cyp17、Cyp19a1a、Tjp1a、Csnk2a2、Hiat1、Smap2、Gopc、Gsdf、Dmrt1、FSHRおよびビテロゲニン遺伝子(VtgAaおよびVtgAb)のティラピアオーソログは、ゲノムデータベースから、イン・シリコで同定された。
【００７０】
特定の遺伝子位置において、DNA二重鎖切断(DSB)を作成するため、本発明者らは、人工ヌクレアーゼを使用した。ほとんどのアプリケーションにおいて、修復遺伝子がない場合に単一DSBが産出され、非相同的な不活性化へと繋がり、修復パスウェイと結合(NHEJ)した。このNHEJは、不完全な修復パスウェイとなり得、ターゲット位置において、挿入または欠失(インデル)を生成する。インデルの導入は、遺伝子のコード領域内にフレームシフトを作成することができ、不正確なアミノ酸配列を持つ、異常タンパク質産物をもたらす。対象となる遺伝子において、ヌル変異の生成頻度を高めるため、本発明者らは、ターゲットであるこれらのcyp17の他に、2つの異なるエクソンを同時にターゲットとした。この対象となる遺伝子と並行して、本発明者らは、突然変異誘発色選択マーカーとして機能する、素形成遺伝子を共同ターゲットとした。通常、素形成遺伝子と対象となる遺伝子間の突然変異頻度には、相関性がある。このため、モザイク色素性表現型(部分的な遺伝子不活性)と比較し、完全に色素が欠如している胚(アルビノ表現型)を優先的に選択した。新設計のヌクレアーゼの機能を確認するため、処理したそれぞれのグループからアルビノ胚5つを選択し、遺伝子座での遺伝子修飾を、PCRフラグメント分析により定量的に分析した。検証した5つの全ての胚が、ターゲットとした遺伝子座において、インデルを示さなかった場合、処理された同じgループの胚を取り除いた。さらに、本発明者らは、1または2細胞期で変異が起こった胚グループ(例、フラグメント分析により、ターゲットとなる遺伝子座につき、2または4つの変異アレルを検知)を優先的に育てた。
【００７１】
人工ヌクレアーゼをコード化する、このテンプレートDNAを直線化し、DNA Clean & concentrator-5 column (Zymo Resarch)により精製した。mMESSAGE mMACHINE T3 kit (Invitrogen)を用い、キャップRNAを合成するため、直線化したテンプレート1ミクログラムを使用し、Qiaquick (Qiagen)により精製、終濃度800 ng/μl のRNaseフリー水内、-80℃で保存した。
【００７２】
胚への注入:体外受精により、胚を産出した。人工ヌクレアーゼを含有した全容積約10 nLの溶液を、1細胞期の胚の細胞質へ同時注入した。通常、200個の胚への注入で、色素を完全に欠損した胚(アルビノ表現型)が10〜60個産出される。注入後の胚／幼生の生存能力を、10〜12日間監視した。
【００７３】
ファウンダーの選択:アルビノの胚を最低10個、3月齢まで育て、蛍光PCRフラグメント分析により、遺伝子修飾を定量的に分析した(遺伝子特異的表現型決定プライマーについては、表1列8および11を参照)。本発明者らは、1または2細胞期で変異が起こったファウンダー (例、フラグメント分析により、ターゲットとなる遺伝子座につき、2または4つの変異アレルを検知(図2))を優先的に選択した。
【００７４】
F1遺伝子型決定:この選択したファウンダーを、野生型系と異系交配した。これらのF1子孫を2月齢まで育て、MS-222 (トリカイン) 200mg/Lに浸し麻酔をかけ、プラスチックスプーンを使い、清潔な表面へ移した。これらのヒレをかみそりの刃で切り取り、ウェル(キャップ付き96ウェルプレート)の上へ設置した。その後、蛍光PCRでヒレのDNAを分析し、ヒレを切り取った魚は、個別に容器へ入れた。簡単に説明すると、一晩組織を消化し、gDNAを抽出するため、キレックス9.4％およびプロテイナーゼKを0.625mg/ml含有した薬液60μlを、55℃のインキュベーター内のそれぞれのウェルへ追加した。その後、このプレートを撹拌し、遠心分離した。それから、混合液内のPCR阻害物質を全て除去するため、gDNAの抽出液を、超清浄水により10倍に希釈した。本発明者らは、同一サイズの変異体を持つ稚魚約20匹を選択し、育てるため、主に稚魚／ファウンダー80匹を分析した。
【００７５】
蛍光PCR (図2参照): PCR反応には、水3.8 μL、フィンDNA0.2 μLおよび蛍光タグで標識したテイルドプライマー(6-FAM、NED)、フォワードテイルによるアンプリコン特異的フォワードプライマー(SEQ ID NO: 117: 5′ -TGTAAAACGACGGCCAGT-3′およびSEQ ID NO: 118: 5′ -TAGGAGTGCAGCAAGCAT-3′)、アンプリコン特異的リバースプライマー(蛍光PCR遺伝子特異的プライマーは表1に記載)の3つのプライマーを含有するプライマーミックス1 ul のPCRのマスターミックス(Quiagen Multiplex PCR) 5 μLを用いた。PCR条件は次の通りである：95°Cで15分変性ののち、増幅30サイクル(94°Cで30秒、57°Cで45秒、および72°Cで45秒) 、その後増幅8サイクル(94°Cで30秒、53°Cで45秒、および72°Cで45秒)および最後の伸長反応72°Cで10分、および4°Cで無期限に保持。
結果として生じるアンプリコンの1:10希釈液1〜2マイクロミリリットルは、塩基対の解像度に的確なアンプリコンのサイズを決定するためのLIZ標識サイズ基準を追加したキャピラリー電気泳動(CE)により分解された(Retrogen Inc.、サンディエゴ)。Rawトレースファイルは、Peak Scanner ソフトウェア(サーモフィッシャー)により分析された。野生型のピーク対照と比較したピークのサイズにより、変異の本質(挿入または欠失)および長さを決定する。ピークの回数は、モザイクのレベルを示している。本発明者らは、最少の変異アレルを持つF0モザイクファウンダーを選択した(選択的に2〜4ピーク)。
【００７６】
このアレルのサイズを、観察中のインデル変異を研鑽するために使用した。配列決定によりさらに確認するため、3 bpの倍数ではなく、フレームシフト変異となると予想される変異体を選択した。次世代のためのQPCR融解分析による遺伝子型決定を容易にするため、8bpよりも大きいが、30bpよりもサイズの小さい変異を優先的に選択した。配列確認に関し、この選択したインデルのPCR産物はさらに、遺伝子配列へ送信された。同時に2つのリードが存在するPCRの配列決定クロマトグラフィーは、インデルの存在を示している。欠失または挿入の開始は通常、配列リードが分岐したときに始まる。この二重配列はその後、一意のヌクレオチドリードを検知するため、慎重に分析される。その後、野生型配列そのものを徐々にシフトすることにより生成された一連の人工的な単一のリードパターンに対し、一意のヌクレオチドリードのパターンを分析する。
【００７７】
F1およびF2ジェネレーションのQPCR遺伝子型決定: リアルタイムqPCRを、ROTOR-GENE RG-3000リアルタイムPCRシステム(Corbett Research)により実施した。フォワードおよびリバースプライマーそれぞれの濃縮液0.15 μMおよびQPCR 2x Master Mix (Apex Bio社製品) 5 μLを含有する、1-μL遺伝子DNA(gDNA)テンプレート(5-20ng/μlで希釈)を合計10μL使用した。使用したqPCRプライマーは、表2に記載されている(遺伝子型決定RT-PCRプライマーは列11〜14)。このqPCRは、95°Cで15秒、60°Cで60秒の40サイクルの後、アッセイの特異性を確認するため、融解曲線分析により実施された(67°Cから97°C)。この方法において、対象となる領域を含む、短いPCRアンプリコン(約120〜200 bp)がgDNAサンプルから生成され、これは温度依存性解離(融解曲線)に依存する。ヘミ接合型gDNA内でインデルの誘発が起こると、ヘテロ二本鎖分子および異なるホモ二本鎖分子が形成される。二本鎖分子の複数形成は、融解プロファイルにより検知され、二重溶解が、単一種として機能しているのか、または1つ以上の種として機能しているのかを表す。概して、融解曲線および融解温度の対称性は、dsDNA配列およびその長さの均一性を暗示している。従って、ホモ接合型および野生型(WT)は、異なる融解温度により区別可能な対称的な融解曲線を表す。この融解分析は、同じマスターミクス反応と同時に増幅した(対照野生型DNAからの)参照DNAサンプルと比較し、実施された。要するに、融解プロファイルにおける変化は  ホモ接合型、ヘミ接合型およびWT gDNAから生成したアンプリコンにより異なる(図3参照)。
【００７８】
雄における不妊化の評価: それぞれの遺伝子型に対し、雄5匹(5月齢)から採取した剥離可能な精子の量および精子濃度を測定した。段階希釈したサンプルの分光測光(光学濃度(OD値)600 nm)およびノイバウエル血球計数板を使用し、精子を数えた。視野内の精子生存率の観点から、精子運動性を測定した[4]。ニグロシン・エオシンで染色した精子細胞の形態を、光学顕微鏡を使用し、400倍で分析した。異なる3匹の雌から採取した、野生型卵子を体外受精し、最適な精子と卵子の比率(精子5.106に対し、卵子100個)における精子の受精能力を分析した。野生型雄から採取した精子を使用し、野生型卵子の質も同時に調査した。受精率は、受精から24時間後に収集した、卵子合計数に対し、残存している胚の割合として示した。これらの調査から得た平均値を、独立t検定により、変異体遺伝子型全体で比較した。
【００７９】
雌における不妊化の評価:本発明者らは、サンプリングした全ての魚の重量を記録した。それぞれの遺伝子型に対し、4および6月齢の雌を最低6匹解剖し、生殖腺を解剖する前に、in situで撮影した。生殖腺重量指数合計の平均値を、全ての遺伝子型全体で統計的に比較した(独立t検定)。野生型雄と異系交雑した、最低6匹の卵子、胚および幼生の生存率を、統計的に分析し、対照(変異体雄と交配した野生型雌)と比較した。
【００８０】
ドナー細胞の分離および生殖腺細胞の移植: Lacerdaによる記述通り、酵素消化により、3〜4月齢の魚(〜50−70g)の生殖腺から、生殖幹細胞を採取した[5]。簡潔に言うと、新鮮分離した生殖腺を細かく刻み、ウシ胎児血清(Gibco Invitrogen Co., ニューヨーク州グランドアイランド)5％およびDNase I (Roche Diagnostics、ドイツ、マンハイム)0.05％を含有する0.5％トリプシン1 ml(Worthington Biochemical Corp., ニュージャージ州レイクウッド)を溶解したPBS(pH 8.2)内、25℃で3〜4時間培養した。培養中、生殖腺のあらゆる無傷で残っている部分を物理的に阻害するため、優しくピペッティングを行った。移植するまでの氷上での保管に先立ち、分離されていないあらゆる細胞集塊を除去するため、結果として生じた細胞浮遊を、細孔径42 μmナイロンスクリーン(N-No.330T; 東京スクリーン株式会社、日本、東京都)でろ過し、その後L-15培地(Gibco Invitrogen Co.)で再懸濁した。
【００８１】
生殖細胞のない被移植体の幼生(5〜7dpf)に、0.0075%の3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩(Sigma-Aldrich Inc.)で麻酔をかけ、2%の寒天培地で覆ったペトリ皿へ移動した。約15,000個の精巣細胞を、Elavl2ヘミ接合変異体親の幼生子孫、約80匹の腹腔へ注入し、細胞移植を実施した。あるいは、MSCホモ接合体雌および野生型雄を交配し、PGCのない胚を採取した[6]。移植後、被移植体の幼生を、曝気した胚培養液へ戻し、成体まで育てた。
【００８２】
【表１】
2021533754.tif 000003
【００８３】
【表２】
2021533754.tif 000004
【００８４】
実施例2 - ティラピアF0ジェネレーションにおける両アレルノックアウト誘発のための遺伝子編集ツールの利用
本発明者らは、色素形成に関与する2つの遺伝子、すなわち、チロシナーゼ(tyr) [2]およびミトコンドリア内膜タンパク質MpV17 (mpv17) (Krauss, Astrinides et al. 2013) [8]をコード化する遺伝子を別々にターゲットとした。本発明者らは、Tyrおよびmpv17それぞれの遺伝子座において注入された胚全体の50%および46%が、高変異性を示したということを見い出した(図4)。機能欠損アレルは、胚体(図4パネルB)および網膜色素上皮(図4パネルC)において、細胞自律的に無色素の黒色素胞となり、野生型表現型と比較し同定が容易な、メラニンおよび虹色素胞色素の完全欠損から部分欠損におよぶ胚の表現型を産出した(図4パネルAおよびC)。色素の完全欠損を示している胚(処理した魚のうち10〜30%)を、3月齢まで育てたが、全てにおいて野生型tyrおよびmpv17配列が欠損していた。これらの魚は、半透明およびアルビノ表現型を表し(図4パネルD)、F0ティラピアにおいて、機能的研究の実施が可能であることを示唆している。
【００８５】
実施例3 - ティラピアにおける多重遺伝子ターゲッティング
本発明者らは、多重ゲノムの遺伝子座は、同時にターゲットとすることができるのか、およびティラピアのゲノムにおいて、1つの遺伝子座で測定した変異原性効率は、もう1つの遺伝子座での変異を予想することが可能であるのかを検証した。本発明の仮説を検証するため、本発明者らは、tyrおよびDead-end1 (dnd)を共同ターゲットとした。Dndは、生殖細胞運命および移動能力を維持する、PGC特異的RNA結合タンパク質(RBP)である[3]。プログラムしたヌクレアーゼの注入後、本発明者らは、tyrおよびdnd両方の遺伝子ターゲットにおける変異は、相関性が高いということを見い出した。約95%のアルビノ(tyr)変異体も、dnd遺伝子座における変異を持ち、選択マーカーとして、色素欠乏の適合性を証明していた(図5パネルA)。アルビノの魚10匹の生殖腺をさらに分析したところ、6匹の精巣が、生殖細胞のない半透明のものであった(図5パネルB)。野生型の精巣に強く発現している生殖細胞特異的マーカー、vasaの発現は、dnd変異体の精巣では全く検知されなかった。この結果は、接合性のdndの発現は、生殖細胞の維持に必要であり、その上、母から寄与されたdnd mRNAおよび／またはタンパク質は、この遺伝子の接合性の消失を回復することはできないということを示唆している。
【００８６】
実施例4 - 生殖細胞のない生殖腺の産出
本発明者らは、アンチセンス修飾オリゴヌクレオチド(dnd-モルホリノおよびdnd- AUMオリゴ)を注入し、胚内のdnd遺伝子の一時的なサイレンシングにより、不妊のティラピア産出した。本発明者らは、ゼブラフィッシュのPGCを除去するため、スクリーンで最初に発見された小分子に暴露した胚を薬浴した後、不妊のティラピアを産出した[10]。本発明者らはさらに、前項においてdndについて記述している通り、遺伝子ノックアウト方法を用い、不妊のティラピアを生成した(実施例3)。また本発明者らは、Elavl2ヘテロ接合変異体系および選択したホモ接合変異体子孫を交配することで、生殖細胞のない両性の成体を産出することが可能であるということを見い出した(図6)。これらの遺伝子KO方法は、前述したその他の方法と併せ、生殖能力のないティラピアを産出し、これは、雌の泌尿生殖突起(UGP)および紐のような生殖腺または雄のUGPおよび半透明の管のような生殖腺のいずれかを示している(図6)。しかしこれらの方法は、ヘテロ接合変異体の親の子孫のわずか25%のみが不妊であり、その他のノックダウン方法は、それぞれのバッチ処理の全ての魚の不妊化を確実に完了させるには、安定性や信頼性が不十分であるため、不妊の魚を商用として生産することにおいては、実行可能なソリューションではない。本発明において、不妊の魚の量産は、生殖細胞のない魚として生まれ、そして生殖系幹細胞移植を受け、最終的に精子または卵子に由来するドナーを産出する種親代理親に依存する。本発明の方法における、これらの被移植体種親の不妊化では、優先的にノックアウト方法を使用する(例、ヘテロ接合親のelavl2-ヌル子孫；実施例11参照)。Elavl2以外のノックアウト方法は、dead-end1、vasa、nanos3またはpiwi様遺伝子へ対するヌル変異体など、不妊の被移植体を産出するために使用されることがある。このようなノックアウト被移植体は、移植後、配偶子に由来するドナーのみが確実に産出されるようにする。魚、甲殻類、または軟体類の種により、交雑および三倍体化など、不妊の被移植体を産出するための代替方法を使用することが可能である(Benfey et al.,1984; Felip et al., 2001)。
【００８７】
実施例5 - Cyp17Iは、ナイルティラピアの雌の発達に必要である 
エストロゲンは、雌の分化に対し重要な役割を担うため、ステロイド産生ホルモンのバランスは、硬骨魚類における性分化および生殖腺の変異を支配することがある。しかし、アンドロゲンおよびエストロゲンが両方ない状態での生殖腺の分化および配偶子形成については、未調査である。この目標を達成するため、本発明者らは、cyp17I遺伝子が不足している、体外受精のティラピアモデルを産出した。
【００８８】
ナイルティラピアにおいて、この酵素は、莢膜細胞内のみに発現し、黄体形成ホルモンに反応し、アンドロゲンを産出する(LH) [13]。アンドロゲンはその後、隣接する発達中の卵胞の顆粒膜細胞内の卵胞刺激ホルモン(FSH)を誘発したアロマターゼ(cyp19a1a)により、エストロゲンへ変換される。従って、 (遺伝子編集ノックアウトによる) 機能の cyp17欠失は、アンドロゲンおよびエストロゲンの合成を同時にブロックするはずである。このモデルと一貫して、本発明者らは、選択した22匹中20匹の選択したF0アルビノ/cyp17変異体は、表現型雄として発達し、全てにおいて、極めて小さなUGPであるということを見い出した(図8パネルC)。アンドロゲンおよび泌尿生殖突起の関係性を考慮すると、この生殖器の萎縮は予想外ではない[14]。これらのF0雄の繁殖能力はそのままであったが、これは、モザイクF0コンテキストにおける、部分的な機能欠損表現型のためである可能性がある。完全な表現型分析に関し、本発明者らは、F1子孫の選抜育種による、個体の全ての細胞内に同じヌルΔ16-cyp17変異を持つ個体を生成した(図7)。F1ヘテロ接合体(cyp17+/-)間の交雑は、〜360匹のF2子孫、通常の野生型(n = 110; cyp17+/+ )のメンデル型分離、ヘミ接合体(n = 159; cyp17+/-)およびホモ接合体動物(n = 91; cyp17-/-)を産出した。合計155匹のF2子孫を6月齢で、泌尿生殖突起(UGP)の形態的特徴により性別判定をした。本発明者らは、33匹全てのホモ接合体魚は、萎縮したUGPを持つ表現型雄として発達したことを見い出した(図8パネルA)。本発明の結果は、雌の発達にとって、Cyp17は必須であるということを示唆している。
【００８９】
その後、本発明者らは、ELISAにより、野生型およびcyp17変異体ティラピアにおける血漿遊離テストステロンの量を測定した。野生型(cyp17+/+)およびヘテロ接合変異体ティラピア(cyp17 +/-)における、テストステロン86pg/mLの平均を測定したが、ホモ接合変異体(cyp17 -/-)において、検出可能なレベルのテストステロンは発見されなかった(図8パネルB)。これは、この酵素がアンドロゲン産出に必須であることを裏付けている。
【００９０】
本発明者らは、Cyp17が不足している魚における生殖腺の形態および機能をさらに検証した。同時サイズの5月齢雄シブリングcyp17+/+ 、cyp17+/- およびcyp17-/-を解剖し、生殖腺以外の全ての器官を体腔から取り除いた(図9パネルA)。WTおよびヘミ接合変異体は、通常、性的に成熟した雄に見られる通り、ピンク色の精巣であったが、ホモ接合変異体は、半透明の精巣であった(図9パネルAおよびB)。さらに、変異体の精巣は、対照よりも50％小さく(図9パネルD)、剥離可能な魚精の量は、WTのものよりも20％少なかった(図9パネルE)。その上、ホモ接合cyp17変異体の精子濃度は、5および6月齢においてそれぞれ、20倍および6倍減少した(図9パネルF)。本発明者らは、10匹のヌル変異体から採取した魚精とWT卵子の受精に成功したことからも明らかなように、精子の形態、運動性または機能に欠陥は見つからなかった。
【００９１】
cyp17ヌル変異体は、精子形成を経ることが可能であるという事実は、ナイルティラピアにおいて、アンドロゲンはこのプロセスに対し、不可欠ではないということを示唆している。このため、この遺伝子における機能を欠損した変異体は、全て不妊の雄の個体群を産出するには十分ではないことがある。機能的な精子の形成を担う制御メカニズムを同定するため、本発明者らは、哺乳類の繁殖能力のない雄に関連する遺伝子についても、さらに調査を行った。
【００９２】
実施例6 - 精子形成をターゲットとした遺伝子候補
哺乳類および魚の精子の形態および機能には、著しい違いがある。特に、哺乳類の精子は、アクロソーム(卵子の絨毛膜に浸透するために必要な重要な細胞小器官)を持ち、精液内では可動であるのに対し、魚の精子は、アクロソームに欠け、精液内では不動である。巨大頭部精子症は稀であり、形態および機能の両方における精子の欠陥を特徴とする、人間の不妊の重症型である。しかし、この病気の魚モデルは恐らく、魚の精子がアクロソームを欠いているために発育しなかった。ゲノムデータベースを用い、本発明者らは、次の哺乳類の遺伝子のティラピアオルソログを、イン・シリコで同定した：Csnk2a2 [15] Gopc [16, 17]、Hiat1 [18]、Tjp1a、Smap2 [21]。ティラピアにおけるこれらの機能を探るため、本発明者らは、それぞれの遺伝子に対し、2つの異なるエクソンをターゲットとした(図10〜14参照)。色素形成遺伝子(チロシナーゼ)を共同ターゲットとし、突然変異誘発色選択マーカーとして使用した。
【００９３】
非処理の対照と併せ、色素形成異常を示している候補遺伝子につき約20個の胚を、成体まで育てた。5月齢で、F0雄およびWT対照の魚精を剥ぎ取り、精子濃度、運動性および形態を分析した。対照と比較し、全てのF0変異体雄は、薄い精子を産出した。顕微鏡検査の結果、変異体精子の大部分は、震えた動きのみをし、本発明者らは、広範囲にわたり(25%〜95%)、異常な形の精子頭部、人間およびネズミの巨大頭部精子症において見られる欠陥の特徴があることを見い出した(図15パネルA)。これらの変異は、受精率の大幅な低下を引き起こした(図15パネルB)。さらに、本発明者らは、不妊表現型の重症型および、精子の95%が変形しているTjp1a変異体で見られる最低受精率を持つ、この観測された精子の変形頻度には正の相関があるということを見い出した(図15パネルAおよびB)。本発明者らは、これらF0変異体系の雌は全て、繁殖能力があるということを見い出した。
【００９４】
本発明の結果は、魚および哺乳類において、精子形成を制御している進化的に保存されたパスウェイの存在を示している。これらの結果は、対応するこれらの遺伝子のターゲットとなる阻害は、その他多くの硬骨魚類、あるいは他のより広範囲の分類群においても同様に、不妊表現型を引き起こすであろうという概念を支持している。
【００９５】
実施例7 - cyp17 KO背景における全て不妊雄の魚
雄の不妊化を操作するため、本発明者らはまず、ステロイドホルモン合成における重要な分岐点を制御し、アンドロゲンおよびエストロゲン両方の産出を調節している。cyp17遺伝子におけるヌル変異の効果を評価した。本発明者らは、全てのcyp17-/-魚は、雄として発達するということを見い出した。驚くことに、cyp17-/-により産出された魚精は、体外受精により、卵母細胞を受精することが可能な成熟した精子を少数含んでいた。その後本発明者らは、精子形成をブロックしている可能性について調査した。本発明の予備的なスクリーンでは、変異が、F0変異体雌は完全に生殖能力がある一方で、重度のオリゴアステノ奇形精子症を持つF0雄における低受胎の原因となる、巨大頭部精子症に関連している5つの遺伝子(まとめて精子形成特異的遺伝子またはSMS遺伝子: Smap2、Cnsk2a2、Gopc、Hiat1およびTjp1aとする)に重点を置いた。F0 KO魚の以前の遺伝子的特徴は、通常これらが対応するターゲット遺伝子座においてモザイク変異を持つこと、しばしば表現型の部分的な回復に繋がるインフレームであることを示している。このため、完全な機能損失表現型を測定するため、本発明者らは、ホモ接合SMSヌル変異体についても、追加で表現型特性評価を行った。さらに本発明者らは、精子形成およびステロイドホルモン合成を同時に損なう効果を探るため、二重ホモ接合変異体を持つティラピア系を確立した。
【００９６】
実験: cyp17およびこの5つのSMS遺伝子の1つにおける二重遺伝子ノックアウトの生体内機能を分析するため、本発明者らは、F0 SMS変異体雌と、cyp17Δ16/+雄を異系交配した。PCRフラグメント分析により、子孫(120〜180匹)をそれぞれのターゲット遺伝子において、遺伝子型決定した(図2で記述) [22]。本発明者らは、選択したSMS遺伝子座において(通常F1子孫個体群の12〜50％が同じ遺伝子型を共有する)、以下m1とする、同じ変異アレルを持つ個体のみを育てた(図18)。二重ヘテロ接合体(例、cyp17Δ16/+; SMSm1/+)最低10匹を成体まで育てた。これらの二重ヘテロ接合体を相互交配し、1月齢におけるこの子孫の遺伝子型を、QPCR融解分析した。F2遺伝型の可能性を確保する9匹(図9参照)それぞれに関し、最低30匹の魚を現在成体まで育てている途中であり、繁殖能力を分析予定である。cyp17+/+; SMS+/m1 (例、cyp17+/+; Tjp1a+/m1)雌は、以下の2項で記述している研究のために確保した。図9は、Tjp1aをSMS遺伝子ターゲットの例として使用した、この実験スキームを要約したものである。
【００９７】
理論に拘束されることなく、本発明者らは、鰭のある魚において、哺乳類に見られるように、保存された精子形成特異的遺伝子5つ全てにおけるヌル変異体は、オリゴアステノ奇形精子症となり、不妊の原因となると考える。本発明者らは、全ての二重ホモ接合変異体(cyp17-/-; SMS-/-)は、精子形成に欠陥のあるあらゆる単一KO雄(SMS-/-)よりも、さらに少ない数の精子を持つ不妊の雄として発達すると予想する。実際、cyp17-/-魚は、精子形成の正の調整因子である11-ケトテストステロンが不足するはずである。アンドロゲンは、精子形成において精巣内傍分泌の役割を果たしているという概念と一致し、cyp17-/-ティラピアの精子の数は少ないということが以前示された。図9は、予想される割合：1)繁殖能力のある両性〜56％、2)繁殖能力のある雌および不妊の雄〜19％、3)全て不妊の雌〜19％；および4)全て不妊の雄〜6％である、異なる4つの対応する表現型と併せ、9つの遺伝子型を示している。それぞれの形質を個別に見ることで、本発明者らは、子孫個体群の62％が雄であり、これらの雄の25％が不妊であると予想する。
【００９８】
実施例8 - cyp19a1a KO背景における全て不妊雄の魚
全て雄の個体群を生成する代替方法は、Cyp19a1aアロマターゼ(以下Cyp19とする)の不活性化である。本発明者らは、ティラピアcyp19遺伝子のコード配列におけるフレーム外変異を作成した(図17)。この酵素は、生殖腺体細胞により産出され、テストステロンをエストロゲンへ変換する。このモデルと一致し、本発明者らは、選択したF0 Cyp19変異体25匹の間で、20匹の変異体が表現型雄として発達し、雄への偏りが強いことを見い出した(表3)。とりわけ、これらの変異体雄は、正常と思われる雄の泌尿生殖突起を持ち、アンドロゲン産出は損なわれず、第二次性徴は正常に発達していることを示している。これはcyp17 KO雄とは対照的であり、アンドロゲンが不足し、従って萎縮した泌尿生殖突起が発達する。 (それぞれcyp19 KOおよびcyp17 KO背景で見られるように) アンドロゲンを発現する、または発現しないのどちらかである、全て雄の不妊のティラピア個体群を生成することにより、本発明者らは、ティラピアの成長能力における、雄性ステロイドホルモンの効果を探ることが可能となる。哺乳類におけるGH分泌のテストステロンの促進作用および反応性は、十分に立証されている。完全な表現型分析に関し、本発明者らは、個体の全ての細胞内に同じヌル変異体を持つ個体群を生成した。F2ジェネレーションを繁殖するため、最初のエクソンにおいて、Δ10-cyp19欠失を持つヘテロ接合cyp19 F1子孫を選択した。このフレームシフト変異は、野生型アミノ酸配列の>98%が不足している短縮タンパク質を作成すると予想される(図17)。このF2ジェネレーションを、遺伝子型決定および性決定した。予想した通り、本発明者らは、ヘミ接合体(n=97)および野生型(n=40)は、正常な性比であったが、ホモ接合体Δ10-cyp19ティラピアは、全て雄(n=38)として発達したことを見い出した。さらに本発明者らは、精子形成およびステロイドホルモン合成を同時に損なう効果を探るため、二重ホモ接合変異を持つティラピア系を確立した。
【００９９】
実験: 本発明者らは、ヘテロ接合体F1雄△10-cyp19a1aを、実施例7のヘテロ接合変異体雌(Gopc△8/+; Smap2△17/+; Tjp1a△7/+; Csnk2a2△22/+; Hiat1△17/+)を異系交配した。Cyp17ヌル背景において阻害されたとき(実施例7の結果)、雄の不妊を引き起こすSMS遺伝子のみ選択した。この子孫は遺伝子型決定し、ヘテロ接合体最低10匹を成体まで育て、性決定し、相互交配する。実施例7で記述している通り、結果として生じる子孫の繁殖能力を分析する。異なる二重KO雄を最低5匹生成する。理論に拘束されることなく、本発明者らは、二重KO cyp19-/-; SMS-/-の魚は、不妊の雄として発達し、子孫個体群の62％が雄、その25％が不妊となると予想する。
【表３】
2021533754.tif 000005
【０１００】
実施例9 - 不妊の全て雄の個体群を生成するための、雄の分化をターゲットとした2つの遺伝子および卵子形成を制御するその他2つの遺伝子の評価
転写阻害剤生殖腺体細胞由来因子(Gsdf)は、魚の生殖腺、主にセルトリ細胞においてのみ発現するTGF-bスーパーファミリーメンバーである。同様に、この転写因子Dmrt1は、精巣の上皮細胞および前セルトリおよびセルトリ細胞内で優先的に発現する。どちらの遺伝子も、正常な精巣の発達に必要である([23, 24])。
【０１０１】
全て雌のティラピア個体群を産出するため、本発明者らは、Dmrt1またはGsdf遺伝子(雄性遺伝子またはMA)のどちらかにおけるヌル変異を生成した(図19および図20)。本発明者らは、Gsdf変異アルビノティラピア20匹のうち19匹が、雌として発達したことを見い出した(表3)。対照的に、モザイク色素欠損を示すF0変異体は、正常な性比となった。共同ターゲットとしたチロシナーゼおよびGsdf遺伝子間の変異原性頻度における正の相関を前提とし、本発明の結果は、Gsdfにおける高変異率は、XY雄が雌へ性転換する原因となることを示唆している。驚くことに本発明者らは、選択したF0 Dmrt1変異体において、雌性の偏りを観測しなかった(表3)。
【０１０２】
雌の不妊化を操作するため、本発明者らは、卵胞の成熟に関与する遺伝子をターゲットとした。本発明者らは、卵胞形成を制御する分子パスウェイ内の2つの遺伝子：1)卵巣の エストロゲン合成の上流で機能するFSHRおよび2) 卵巣の エストロゲン合成の下流で機能するビテロゲニン(Vtgs)を同定した。ビテロゲニンは、肝臓により優先的に産出され、卵胞刺激ホルモン(FSH)受容体FSHRは、発生中の卵母細胞周囲の莢膜細胞内で発現する。正常な卵巣の発達(卵胞形成特異的遺伝子またはFLS)におけるFSHR およびVtgsの必要性を検証するため、本発明者らは、F0系それぞれにおけるこれらの遺伝子内で、機能を欠損した変異を産出した(図22〜24)。
【０１０３】
本発明者らは、FSHRは、卵胞形成にとって必須であり、このFSHR遺伝子を阻害することで、卵胞の活性化および雌の不妊化が完全な失敗するということを見い出した(図26および表3)。以前ゼブラフィッシュに関し記述した通り[29]、ティラピアにおいては、FSHR変異の後、遺伝子的な雌から雄への雄性化は起こらなかった。しかし、本発明者らは、F0 FSHR変異体雌は、対照雌と比較し、著しく小さな泌尿生殖突起を持っていたことを見い出した。この観測は、FSHR変異体において、エストロゲンレベルが低下していることを反映していると思われ、これは、局部的にアロマターゼの発現およびエストロゲン産出を増加させるというFSHRの役割と一致している。本発明者らは、F0 FSHR変異体雄における重要な生殖表現型を発見しなかった。
【０１０４】
ナイルティラピアは、Vtg遺伝子を3つ[25]、完全なVtgs型(VtgAaおよびVtgAb)を2つおよび不完全なC型硬骨魚類ビテロゲニン型を1つのみ有し、3つのタンパク質ドメイン(VtgC)が不足している。VtgAaおよびVtgAbは、VtgCよりも高いレベルで発現し、初期胚の発生にとって重要であると推定されるため、本発明者らは、これら2つの遺伝子を両方および別々にターゲットとした(図22、23および表3)。卵母細胞変異における機能および胚形成に対する栄養維持と一貫し、本発明者らは、検証した4匹中、VtgAa において変異したF0雌3匹は、生存能力のある子孫の産出に何度も失敗したということを見い出した(図24)。また本発明者らは、5匹中VtgAb において変異を持つF0雌1匹は、孵化前に死亡する胚子孫を産出したということも見い出した(データの表示なし)。
【０１０５】
完全な表現型の特性評価に関し、動物のあらゆる細胞において、同じ変異を生成することが重要である。このため、本発明者らは、雄性化および卵黄形成が不十分な4つのティラピア系統を確立し、特性評価する。
【０１０６】
6月齢において、それぞれの遺伝子座において、同じ遺伝子特異的インデル(表3)を持つ二重ヘテロ接合変異体(例、Dmrt1△7/+- FSHR△5/+  )を同定するため、モザイクF0 XX MA m1-n雌(例、Dmrt1 m1-n またはGsdf m1-n)を、モザイクF0 FLS m1-n雄および遺伝子型決定したそのF1子孫と異系交配した。
【０１０７】
実験: (4つの遺伝子の組み合わせそれぞれに対し) 二重ヘテロ接合最低10匹を現在、成体まで育てている途中である。このWTアレルは、これらのF1魚が、雄および雌の両方として発達することを保証するはずである。これらの二重ヘテロ接合変異体をその後、インクロスし、その子孫を1月齢においてQPCR融解分析により遺伝子決定する。遺伝型の可能性を確保する9匹(図25参照)それぞれに関し、最低30匹の魚を現在、成体まで育てている途中であり、繁殖能力を分析予定である。
図25は、本発明者らは：1)〜56％が繁殖能力のある両性、2)〜19％が繁殖能力のある雌およ
【０１０８】
び不妊、3)〜19％が全て繁殖能力のある雄；および4)〜6％が全て不妊の雌であると予想する、9つの遺伝子型および対応する4つの異なる表現型を示している。それぞれの形質を個別に見ることで、本発明者らは、子孫の個体数の62％が雌であり、この25％が不妊であると予想する。
【０１０９】
F0変異体系における本発明の表現型調査(表3)は、本発明の初期仮説とほぼ一致し、本発明者らは、次のジェネレーションにおける遺伝子型−表現型の関係性の裏付けを十分に予想する。本発明者らは、FSHR およびVtgsの不活性化は、雌の不妊化の原因となるが、 Gsdfの不足は、雌性化の原因となるということを見い出した。この結果は、二重FSHR-Gsdf KOは、前卵黄形成期卵で停止した卵胞を持つ、萎縮した卵巣という特徴のある単性不妊の雌の個体群へと発達するということを、強く示唆している。F0 Dmrt1変異体における性分化表現型の欠如は、不完全な編集、局所的なモザイク状態および非変異遺伝子による補正を反映していると思われる。しかし理論に拘束されることなく、本発明者らは、生殖系から変異が受け継がれている二重FSHR-Dmrt1 KOは、全て雌不妊の個体群となると考える。本発明のF0突然変異誘発スクリーンにおいて、本発明者らは、(Vtg KOに見られるような)需要な卵黄タンパク質の前駆体遮断は、卵子の質を損ない、胚の発生および生存能力を損なうことをを観測した。そのため、本発明者らは、二重KO Gsdf-VtgsおよびDmrt1-Vtgsは、単性不妊の雌の個体群となると予想した。
【０１１０】
実施例10 - 不妊代理成体への生殖系移植による全て雄および全て雌の不妊系の繁殖
前述の実施例8および9は、二重ヘミ接合変異体の繁殖、および二重KO子孫の亜集団を個別に選択することにより、単性不妊の魚を生成する方法を示している。しかしこの方法は、十分に効率的ではないことがあり、産業環境で使用するには高価すぎることがある。生殖補助における細胞質内精子注入は、精子形成に欠陥のある雄の種親を繁殖するためのソリューションとなる。しかし、この方法もまた、(一度に1匹ずつという方法を取る必要があるため)商用の種親の量産に対し、スケーラブルではない。大規模生産の鍵は、二重KO子孫を同定するために選択する必要がないため、変異体配偶子のみを産出する雄および雌の種親を生成することである。重要なことは、これらの変異体配偶子は、これらの種親の自然交配を、単性不妊子孫の生存能力のある個体を産出するために使用することが可能なため、機能的でなくてはならない。これは、性比および配偶子の機能が、種親において回復された場合にのみ可能である。本発明者らは、二重KO変異体魚から、同じ遺伝子に対する変異ではない、生殖細胞のない被移植体へ生殖系幹細胞移植することで可能であると推測した。このような移植した種親は、正常な体細胞を持つが、変異体生殖系である(図27〜32参照)。これらのキメラ性被移植体は、精子形成(図28)または卵子形成(図29および30)を回復するため、正常な性比を保証する機能的なMAまたはFEM体細胞 (図34パネルCおよびD)、または機能的なSMSまたはFLS体細胞を持ち、変異した遺伝子は、生殖細胞において機能しないと想定する。
【０１１１】
精子形成不全は、生殖細胞または体細胞環境における欠陥から生じるため、本発明者らは、生殖細胞内に発現しないものを優先的に同定するため、SMS遺伝子発現を分析した(図16)。不妊検査における、本発明のSMS遺伝子発現検査は、生殖細胞発達のサポートにおける、生殖腺体細胞の役割を指している。例えば、本発明者らは、Hiat1 およびGopc の発現レベルは、繁殖能力のある精巣と比較し、わずかに低下しているだけであるが、Tjp1aは、野生型の精巣よりも高いレベルにおいて、不妊の精巣内に強く発現することを見い出した(図16)。
【０１１２】
この結果は、これらの遺伝子の変異体は、精巣の微小環境を構築し、セルトリおよび／またはライディッヒ特異的欠陥のため、ここで精子形成が損なわれることを示している(図28)。従って、本発明者らは、雄ノックアウト不妊ドナーから、許容状態の野生型精巣環境への精原幹細胞の移植は、精子の機能および繁殖能力を回復すると予想する(図28)。
【０１１３】
同様に、FSHR およびVtgsは、体細胞内のみに発現する(それぞれ莢膜細胞および肝細胞)。このように、これらの遺伝子のヌルアレルを持つ卵母細胞は、急増および分化のための固有容量を保持するはずであり、WT／許容状態の被移植体への移植により、不妊雌の変異体ドナーの卵原幹細胞は、卵巣を再配置し、機能的な卵子へ分化することが可能であることを保証している(図29および30)。このため、本発明者らは、被移植体雄または雌は、ドナー遺伝子型を持つ配偶子を産出することが可能であると考える。
【０１１４】
実施例11 - Elavl2 KO被移植体は機能的な配偶子を産出することが可能 
不妊のElavl2 KO被移植体が、ドナーに由来した生殖細胞から機能的な配偶子を産出することができるということを確認するため、本発明者らは、 参照遺伝子において変異(フレーム内およびフレーム外)を持つアルビノ(tyr-/-)雄ティラピアから、精原幹細胞を採取した(図33パネルA)。本発明者らは、両方の変異体系からの精巣細胞浮遊を、Elavl2 -/+、tyr+/+親の生殖細胞が激減した被移植体胚子孫へ移植した。本発明者らは、ホモ接合Elavl2-/-変異体を選択するため、移植した魚を遺伝子型決定し、成体まで育てた。5月齢において、アルビノ雄および雌と異系交配した際、移植したElavl2-/-雄の31〜50％および6月齢の移植したElavl2-/-雌の40％が、アルビノ子孫のみを産出した。移植していないElavl2-/- 対照は、不妊であった。このため、Elavl2 -/-被移植体は、生殖系幹細胞移植後に、ドナーに由来した配偶子を産出することが可能であり、ドナーに由来した配偶子のみを産出したティラピアを作成する実現可能性を示している。Tyrアレルを持つ配偶子を分析するため、アルビニズムを用い、変異体アレルの生殖系移植の有効性に対し、簡単に定量化が可能なハイスループットアッセイを実施したが、これらの実験は、ヌル変異の繁殖に成功したということを示しているものではない。この目標を達成するため、本発明者らは、PCRフラグメントサイジング分析により、不妊の被移植体1匹から精子DNAを抽出し分析した。キャピラリー電気泳動を用い、この増幅産物を分類した(図33パネルB)。結果は、被移植体の魚は、ドナーに由来したフレーム内およびフレーム外(3 ntおよび4 nt)欠失フラグメントを持つ精子のみを産出するということを明らかにし、このヌルアレル(4 nt欠失)は、生殖腺を形成し、陽性対照変異と同じくらい効率的に増殖することができるということを示唆している(図33パネルB)。
【０１１５】
実験: 精原幹細胞および卵原幹細胞(SSC、OSC)を、稚魚が全て雄および全て雌のティラピア系から分離する(実施例7、8および9に従い発育)。採取後、前述した通り、これらの生殖系幹細胞を、Elavl2 KO被移植体稚魚へ移植する。理論に拘束されることなく、本発明者らは、このドナー遺伝子型を持つ機能的な精子および卵母細胞の産出を予想する。移植後に産出されたドナーに由来する配偶子の機能を評価するため、体外受精アッセイを実施する。さらに、本発明者らは、アルビノ子孫は、アルビノドナー配偶子を持つ自然に色素が欠乏した被移植体およびアルビノ系の交配に起因すると予想する。本発明者らは、ドナーに由来する精子形成および卵黄形成特異的遺伝子における変異に対し、子孫10匹の遺伝子型を決定する。
【０１１６】
図34パネルBが示す通り、代理母を、アロマターゼ阻害剤を使った処理により性転換した二重KOの雄と交配し、全て雌の不妊の子孫を産出する。あるいは、代理父を、エストロゲン処理後に回復し性転換した二重KOの雌変異体と交配し、全て雄の不妊個体群を産出する(図34パネルA)。エストロゲン(図34パネルAの通り)またはアンドロゲン阻害剤(図34パネルBの通り)による二重KOの性転換は、雌の種親(図34パネルC)または雄の種親(図34パネルD)を産出するため、生殖系移植方法により代替可能である。
【０１１７】
実施例12 - 水槽成長検査
生殖腺に向けられたエネルギーは、体成長を損なうため、成長および繁殖には直接的なトレードオフがある。短期間で卵黄形成し[26]、高い代謝率を必要とする生理的プロセスにより、ナイルティラピアは早期に成熟し、1年を通し繁殖可能である。さらに、ティラピア種は、生殖能力を維持するため、成長を抑制することができ[27]、他の魚の種において、春機発動は、食欲、成長率、飼料転換効率、肉質形質、見た目、健康、福祉および生存率など、養殖業における重要な生産パラメータに大きな影響を与え得る。従って、性成熟の遅延または遮断は、商用養殖産業へ大きな利益を与える可能性がある。不妊の単性個体群を増やすための努力の一環として、本発明者らは、変異が春機発動を遮断または遅延する遺伝子をターゲットとした。しかし、これらの効果に対し、ターゲットとした遺伝子は、未知のホルモン、生理的なまたは行動に関係する変化を通し作用する、系統にとって有害となる多面的効果を持つことがある。
【０１１８】
実験: 成長能力検査に使用するグループを生成するため、対象となるそれぞれの系統に対し、単一ペア(少なくとも別々に3回交雑)の胚を産出する。処理胚および対照胚を、決められた孵化手順に従い、別々に飼育する。給餌段階において、適切な外因性ホルモンプロトコルを用い、対照動物の半分を性転換する(例、メチルテストステロンまたはDESを与える)。(処理および対照) グループ内の魚の重量が平均60gに到達したとき、PITタグを付け、1000Lの水槽6槽に分ける(対照用3槽および処理用3槽、50匹／1槽)。全ての魚へ1日3回、餌を飽食量与える。
【０１１９】
それぞれの魚は、市販可能なサイズ(680g Sdv:77g、8月齢)になるまで4週間ごとに、個別に重量および体長を測定する。これらの魚は実験の終わりに、殺処分され、泌尿生殖口の構造により性別判定を行う。本発明者らは、生殖腺重量指数(GSI)および死骸指数(グループにつきn=60)を算出するため、解剖した生殖腺および死骸の重量を個別に記録する。HoudeおよびScheckterの公式[28]に従い、比増殖速度(G)を計算する。
【０１２０】
理論に拘束されることなく、本発明者らは、実施例7、8および9で産出されたほぼ全ての二重KOの魚は、単性として発達し、他の生物学的プロセスが損なわれていない不妊となると考える。このため、選択した変異は、全体的な魚の能力に悪影響を与えないはずである。対照的に、本発明者らは、生殖腺の重量に関連する成長率および飼料要求率は増加すると予想する。変異体系は、性的に遅延(雄不妊)または未熟(前卵黄形成期卵で停止した雌)となるはずである。万一、本発明者らが、単性個体群の一部のみを不妊化した場合、本発明者らは、エネルギーの消費が低下した結果として、ティラピアにおける生産性の向上は、個体群の不妊の魚の割合と比例すると予想する。全ての場合において、本発明者らは、不妊の魚および萎縮した生殖腺を持つ魚は、成長特性という点で、完全に繁殖能力のある相手(例、外因性ホルモン処理に由来する単性個体群)をしのぐと予想する。
【０１２１】
参照
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【０１２２】
配列一覧
【０１２３】
SEQ ID NO 1
長さ: 38
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (FAM)
配列: 1 
TGTAAAACGACGGCCAGTttgaagttgctacataaaag
【０１２４】
SEQ ID NO 2
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 2 
TGGTTGATGACAATCACACTGT
【０１２５】
SEQ ID NO 3
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (NED)
配列: 3 
TAGGAGTGCAGCAAGCATtgttctacatcatcacccttctc
【０１２６】
SEQ ID NO 4
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 4
AGCAGACAGACGAGCAGTATCAG
【０１２７】
SEQ ID NO 5
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (FAM)
配列: 5 
TGTAAAACGACGGCCAGTTGATGGAGAGCTTCATCTACGAA
【０１２８】
SEQ ID NO 6
長さ: 20
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 6
GTTCCAGGTTAAATTGATTG
【０１２９】
SEQ ID NO 7
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (NED)
配列: 7
TAGGAGTGCAGCAAGCATgcgtgatttgctgacctttttac
【０１３０】
SEQ ID NO 8
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 8 
acacttacCCTGAGAATCTGG
【０１３１】
SEQ ID NO 9
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (FAM)
配列: 9 
TGTAAAACGACGGCCAGTGAAAAAGGATGgtgagggatgac
【０１３２】
SEQ ID NO 10
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 10
GAGTGTGTCTACCACACGGAAAA
【０１３３】
SEQ ID NO 11
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (FAM)
配列: 11 
TGTAAAACGACGGCCAGTgtatttagaaggcggtgaaggtc
【０１３４】
SEQ ID NO 12
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 12
CAGTTTGGCACATGAGCATCGTA
【０１３５】
SEQ ID NO 13
長さ: 37
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (NED)
配列: 13
TAGGAGTGCAGCAAGCATATGCTCATGTGCCAAACTG
【０１３６】
SEQ ID NO 14
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 14
cCTTCAGGATTTTCACCACCACT
【０１３７】
SEQ ID NO 15
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (FAM)
配列: 15
TGTAAAACGACGGCCAGTtactgacacatccagcagcgtct
【０１３８】
SEQ ID NO 16
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 16
cagcactgagccgtcagtattct
【０１３９】
SEQ ID NO 17
長さ: 37
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (NED)
配列: 17
TAGGAGTGCAGCAAGCATTGGAGCCTACCTGTCTGAG
【０１４０】
SEQ ID NO 18
長さ: 20
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 18
tactcacAGCGAAGGGGTCT
【０１４１】
SEQ ID NO 19
長さ: 38
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (NED)
配列: 19
TAGGAGTGCAGCAAGCATgctcctctgcgaagactctc
【０１４２】
SEQ ID NO 20
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 20
aagacctccgacCTGGACTTGCT
【０１４３】
SEQ ID NO 21
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (FAM)
配列: 21
TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGAGGGCACAGTCAAGAAAC
【０１４４】
SEQ ID NO 22
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 22
TTGGATATCCCATTTGGTTCAT
【０１４５】
SEQ ID NO 23
長さ: 40
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (NED)
配列: 23
TAGGAGTGCAGCAAGCATtttaacggtgttggcagagatt
【０１４６】
SEQ ID NO 24
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 24
AGATCCACATCCACGAAAGCCT
【０１４７】
SEQ ID NO 25
長さ: 37
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (FAM)
配列: 25
TGTAAAACGACGGCCAGTtgcccctttaaaccaccta
【０１４８】
SEQ ID NO 26
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 26
CTCAGCTTGGCCTTGCTTGACAT
【０１４９】
SEQ ID NO 27
長さ: 39
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (NED)
配列: 27
TAGGAGTGCAGCAAGCATttgccaggacccATGAGCCAG
【０１５０】
SEQ ID NO 28
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 28
AGACACGTATCCGTGATTTCTAC
【０１５１】
SEQ ID NO 29
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (FAM)
配列: 29
TGTAAAACGACGGCCAGTctcttcatcctctgtgtctcatc
【０１５２】
SEQ ID NO 30
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 30
GGGTTTCCAGCAGGAGGTCAGA
【０１５３】
SEQ ID NO 31
長さ: 39
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (NED)
配列: 31
TAGGAGTGCAGCAAGCATttatgttcagGTGCCAAGGTG
【０１５４】
SEQ ID NO 32
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 32
TGGCTGTGTGAGAAACGATGCTG
【０１５５】
SEQ ID NO 33
長さ: 35
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (FAM)
配列: 33
TGTAAAACGACGGCCAGTagATCTGGGCTGGGACA
【０１５６】
SEQ ID NO 34
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 34
tgttaactatacCTGTGTGTTGG
【０１５７】
SEQ ID NO 35
長さ: 38
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (NED)
配列: 35
TAGGAGTGCAGCAAGCATttttctccgcttgcttctgc
【０１５８】
SEQ ID NO 36
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 36
AAAGAGCTGAATAGGAGGAAGTT
【０１５９】
SEQ ID NO 37
長さ: 39
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (FAM)
配列: 37
TGTAAAACGACGGCCAGTCATCTTGGCGTTCTTCTGTGT
【０１６０】
SEQ ID NO 38
長さ: 21
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 38
CTTGAGGGCAGCTGAGATGGC
【０１６１】
SEQ ID NO 39
長さ: 40
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (NED)
配列: 39
TAGGAGTGCAGCAAGCATGCAATCCTTGATGCTCCTTGAC
【０１６２】
SEQ ID NO 40
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 40
CTGAGACTCTATGTCGTTGATA
【０１６３】
SEQ ID NO 41
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (FAM)
配列: 41
TGTAAAACGACGGCCAGTAGAAGATCATCAAACACATCACG
【０１６４】
SEQ ID NO 42
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 42
GACTTGTTGAGCAGTTGCATCAA
【０１６５】
SEQ ID NO 43
長さ: 38
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (NED)
配列: 43
TAGGAGTGCAGCAAGCATttttgtgatctagTCTGGAG
【０１６６】
SEQ ID NO 44
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 44
gctcttacAGCTTCACAATCAT
【０１６７】
SEQ ID NO 45
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (FAM)
配列: 45
TGTAAAACGACGGCCAGTAGAAGATCATCAAACACATCACG
【０１６８】
SEQ ID NO 46
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 46
GACTTGTTGAGCAGTTGCATCAA
【０１６９】
SEQ ID NO 47
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 47
GAACCAAACCCCTCTGTCACTG
【０１７０】
SEQ ID NO 48
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 48
GTAATTCACTCCGCAGGCTCAG
【０１７１】
SEQ ID NO 49
長さ: 17
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 49
ggcgATGAATCCTGTAG
【０１７２】
SEQ ID NO 50
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 50
ATGGCATTTGAGGTCACAGAGA
【０１７３】
SEQ ID NO 51
長さ: 19
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 51
GTTCAAGAAGGGAGAGAGT
【０１７４】
SEQ ID NO 52
長さ: 18
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 52
AAAAATTCCCACATCGTT
【０１７５】
SEQ ID NO 53
長さ: 20
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 53
tgctttggcttcagTGTATC
【０１７６】
SEQ ID NO 54
長さ: 19
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 54
AATGCGTTCGAATGTAGAA
【０１７７】
SEQ ID NO 55
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 55
CATCTGCTTCATCCTGGTGGCTG
【０１７８】
SEQ ID NO 56
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 56
AATTTGGGCATCTTCATCTGTAT
【０１７９】
SEQ ID NO 57
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 57
GACAGACTTGACCTTGGAGATG
【０１８０】
SEQ ID NO 58
長さ: 21
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 58
ATGTCTGCTTCGACTGGATGC
【０１８１】
SEQ ID NO 59
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 59
GCCATCGAAACATGGACATACTG
【０１８２】
SEQ ID NOs 60および62 (野生型 Cyp17a1)
長さ: 1563bpおよび521aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 60)およびタンパク質(SEQ ID NO: 62)
生物: ナイルティラピア
【化１−１】
2021533754.tif 000006
【化１−２】
2021533754.tif 000007
【０１８３】
SEQ ID NOs 61および63 (Cyp17a1変異アレル- 16nt欠失)
長さ: 1563bpおよび44aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 61)およびタンパク質(SEQ ID NO: 63)
生物: ナイルティラピア
【化２】
2021533754.tif 000008
【０１８４】
SEQ ID NOs 65および68 (野生型 Cyp19a1a)
長さ: 1707bpおよび511aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 65)およびタンパク質(SEQ ID NO: 68)
生物: ナイルティラピア
【化３−１】
2021533754.tif 000009
【化３−２】
2021533754.tif 000010
【０１８５】
SEQ ID NOs 66および 69 (Cyp19a1a変異アレル- 7nt欠失)
長さ: 1707bpおよび 12aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 66)およびタンパク質 (SEQ ID NO: 69)
生物: ナイルティラピア
【化４】
2021533754.tif 000011
【０１８６】
SEQ ID NOs 67および70 (Cyp19a1a変異アレル- 10nt欠失)
長さ: 1707bpおよび11aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 67)およびタンパク質(SEQ ID NO: 70)
生物: ナイルティラピア
【化５】
2021533754.tif 000012
【０１８７】
SEQ ID NOs 71および73 (野生型 Tjp1a)
長さ: 6674bpおよび 1652aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 71)およびタンパク質(SEQ ID NO: 73)
生物: ナイルティラピア
【化６−１】
2021533754.tif 000013
【化６−２】
2021533754.tif 000014
【化６−３】
2021533754.tif 000015
【化６−４】
2021533754.tif 000016
【化６−５】
2021533754.tif 000017
【化６−６】
2021533754.tif 000018
【０１８８】
SEQ ID NOs 72 and 74 (Tjp1a 変異アレル- 7nt 欠失)
長さ: 6674bp and 439aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 72)およびタンパク質(SEQ ID NO: 74)
生物: ナイルティラピア
【化７−１】
2021533754.tif 000019
【化７−２】
2021533754.tif 000020
【０１８９】
SEQ ID NOs 75 および 77 (野生型 Hiat1a)
長さ: 5281bp および 491aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 75)およびタンパク質(SEQ ID NO: 77)
生物: ナイルティラピア
【化８−１】
2021533754.tif 000021
【化８−２】
2021533754.tif 000022
【化８−３】
2021533754.tif 000023
【化８−４】
2021533754.tif 000024
【０１９０】
SEQ ID NOs 76 および 78 (Hiat1a 変異アレル- 17nt 欠失)
長さ: 5281bp および 234aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 76)およびタンパク質(SEQ ID NO: 78)
生物: ナイルティラピア
【化９】
2021533754.tif 000025
【０１９１】
SEQ ID NOs 79 および 81 (野生型 Smap2)
長さ: 4207bp および 429aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 79)およびタンパク質(SEQ ID NO: 81)
生物: ナイルティラピア
【化１０−１】
2021533754.tif 000026
【化１０−２】
2021533754.tif 000027
【化１０−３】
2021533754.tif 000028
【０１９２】
SEQ ID NOs 80 および 82 (Smap2 変異アレル- 17nt 欠失)
長さ: 4207bp および 118aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 80)およびタンパク質(SEQ ID NO: 82)
生物: ナイルティラピア
【化１１】
2021533754.tif 000029
【０１９３】
SEQ ID NOs 83 および 85 (野生型 Csnk2a2)
長さ: 1053bp および 350aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 83)およびタンパク質(SEQ ID NO: 85)
生物: ナイルティラピア
【化１２】
2021533754.tif 000030
【０１９４】
SEQ ID NOs 84 および 86 (Csnk2a2 変異アレル- 22nt 欠失)
長さ: 1053bp および 31aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 84)およびタンパク質(SEQ ID NO: 86)
生物: ナイルティラピア
【化１３】
2021533754.tif 000031
【０１９５】
SEQ ID NOs  87および 89 (野生型 Gope)
長さ: 1335bp および 444aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 87)およびタンパク質(SEQ ID NO: 89)
生物: ナイルティラピア
【化１４−１】
2021533754.tif 000032
【化１４−２】
2021533754.tif 000033
【０１９６】
SEQ ID NOs  88および 90 (Gope 変異アレル- 8nt 欠失)
長さ: 1335bp および 30aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 88)およびタンパク質(SEQ ID NO: 90)
生物: ナイルティラピア
【化１５】
2021533754.tif 000034
【０１９７】
SEQ ID NOs 91 および 94 (野生型 DMRT-1)
長さ: 882bp および 293aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 91)およびタンパク質(SEQ ID NO: 94)
生物: ナイルティラピア
【化１６】
2021533754.tif 000035
【０１９８】
SEQ ID NOs 92 および 95 (DMRT-1 変異アレル- 7nt 欠失)
長さ: 882bp および 40aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 92)およびタンパク質(SEQ ID NO: 95)
生物: ナイルティラピア
【化１７】
2021533754.tif 000036
【０１９９】
SEQ ID NOs 93 および 96 (DMRT-1 変異アレル- 13nt 欠失)
長さ: 882bp および 38aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 93)およびタンパク質(SEQ ID NO: 96)
生物: ナイルティラピア
【化１８】
2021533754.tif 000037
【０２００】
SEQ ID NOs 97 および 100 (野生型 GSDF)
長さ: 840bp および 213aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 97)およびタンパク質(SEQ ID NO: 100)
生物: ナイルティラピア
【化１９】
2021533754.tif 000038
【０２０１】
SEQ ID NOs 98 および 101 (GSDF 変異アレル- 5nt 欠失)
長さ: 840bp および 56aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 98)およびタンパク質(SEQ ID NO: 101)
生物: ナイルティラピア
【化２０】
2021533754.tif 000039
【０２０２】
SEQ ID NOs 99 および 102 (GSDF 変異アレル- 22nt 欠失)
長さ: 840bp および 46aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 99)およびタンパク質(SEQ ID NO: 102)
生物: ナイルティラピア
【化２１】
2021533754.tif 000040
【０２０３】
SEQ ID NOs 103 および 105 (野生型 FSHR)
長さ: 5853bp および 689aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 103)およびタンパク質(SEQ ID NO: 105)
生物: ナイルティラピア
【化２２−１】
2021533754.tif 000041
【化２２−２】
2021533754.tif 000042
【化２２−３】
2021533754.tif 000043
【化２２−４】
2021533754.tif 000044
【化２２−５】
2021533754.tif 000045
【０２０４】
SEQ ID NOs 104 および 106 (FSHR 変異アレル- 5nt 欠失)
長さ: 5853bp および 264aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 104)およびタンパク質(SEQ ID NO: 106)
生物: ナイルティラピア
【化２３】
2021533754.tif 000046
【０２０５】
SEQ ID NOs 107 および 110 (野生型 VtgAa)
長さ: 4974bp および 1657aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 107)およびタンパク質(SEQ ID NO: 110)
生物: ナイルティラピア
【化２４−１】
2021533754.tif 000047
【化２４−２】
2021533754.tif 000048
【化２４−３】
2021533754.tif 000049
【化２４−４】
2021533754.tif 000050
【化２４−５】
2021533754.tif 000051
【０２０６】
SEQ ID NOs 108 および 111 (VtgAa 変異アレル- 5nt 欠失)
長さ: 4974bp および 279aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 108)およびタンパク質(SEQ ID NO: 111)
生物: ナイルティラピア
【化２５】
2021533754.tif 000052
【０２０７】
SEQ ID NOs 109 および 112 (VtgAa 変異アレル- 25nt 欠失)
長さ: 4974bp および 301aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 109)およびタンパク質(SEQ ID NO: 112)
生物: ナイルティラピア
【化２６】
2021533754.tif 000053
【０２０８】
SEQ ID NOs 113 および 115 (野生型 VtgAb)
長さ: 5339bp および 1747aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 113)およびタンパク質(SEQ ID NO: 115)
生物: ナイルティラピア
【化２７−１】
2021533754.tif 000054
【化２７−２】
2021533754.tif 000055
【化２７−３】
2021533754.tif 000056
【化２７−４】
2021533754.tif 000057
【化２７−５】
2021533754.tif 000058
【０２０９】
SEQ ID NOs 114 および 116 (VtgAb 変異アレル- 8nt 欠失)
長さ: 5339bp および 202aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 114)およびタンパク質(SEQ ID NO: 116)
生物: ナイルティラピア
【化２８】
2021533754.tif 000059
【０２１０】
SEQ ID NO 117
長さ: 18
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: 5’ テイルドプライマー拡張配列(FAM)
配列: 1  
TGTAAAACGACGGCCAGT
【０２１１】
SEQ ID NO 118
長さ: 18
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: 5’ テイルドプライマー拡張配列(NED)
配列: 3 
TAGGAGTGCAGCAAGCAT
【０２１２】
前述の説明において、説明の目的で、実施例の徹底的な理解を提供するため、多数の詳細事項が提示されている。しかし、これらの具体的な詳細事項は義務ではないということは当業者において明らかである。
【０２１３】
上記の実施例は、例を示すことが目的である。特定の実施例に対する変更、修正および変形は、当業者により可能である。特許請求の範囲は、ここに示した特定の実施例に制限されるべきではないが、明細書全体に合致する方法で解釈されなければならない。
【図１】
2021533754.tif 000060
【図２】
2021533754.tif 000061
【図３】
2021533754.tif 000062
【図４】
2021533754.tif 000063
【図５】
2021533754.tif 000064
【図６】
2021533754.tif 000065
【図７】
2021533754.tif 000066
【図８】
2021533754.tif 000067
【図９】
2021533754.tif 000068
【図１０】
2021533754.tif 000069
【図１１】
2021533754.tif 000070
【図１２】
2021533754.tif 000071
【図１３】
2021533754.tif 000072
【図１４】
2021533754.tif 000073
【図１５】
2021533754.tif 000074
【図１６】
2021533754.tif 000075
【図１７】
2021533754.tif 000076
【図１８】
2021533754.tif 000077
【図１９】
2021533754.tif 000078
【図２０】
2021533754.tif 000079
【図２１】
2021533754.tif 000080
【図２２】
2021533754.tif 000081
【図２３】
2021533754.tif 000082
【図２４】
2021533754.tif 000083
【図２５】
2021533754.tif 000084
【図２６】
2021533754.tif 000085
【図２７】
2021533754.tif 000086
【図２８】
2021533754.tif 000087
【図２９】
2021533754.tif 000088
【図３０】
2021533754.tif 000089
【図３１】
2021533754.tif 000090
【図３２】
2021533754.tif 000091
【図３３】
2021533754.tif 000092
【図３４】
2021533754.tif 000093
【配列表】
2021533754000001.app
【国際調査報告】
2021533754.tif 000094
2021533754.tif 000095