(57)【要約】本発明において、クエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子の製造プロセスは、１）クエン酸イオン対カルシウムイオンのモル比が１〜２の範囲であるカルシウムの塩およびクエン酸塩の第一の溶液を提供し、こうして、透明な第一の溶液を得るステップと、２）リン酸アニオンおよび炭酸塩を与えることができる塩の第二の溶液の提供するステップと、３）第一の溶液と第二の溶液とをｐＨ８〜１１の範囲で一緒に混合するステップと、４）ナノ粒子を沈殿させるステップと、５）ステップ４）から得られたナノ粒子を乾燥させるステップと、を含む。好ましくは、本発明は、フッ素ドープクエン酸塩被覆リン酸カルシウムのナノ粒子またはナノ粒子凝集体を得るためのステップ２）で、フッ素化合物の添加を提供する。本発明のナノ粒子／ナノ粒子凝集体は、それを歯科用途のための生体材料として使用することを可能にする特有の表面積および直径を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クエン酸塩で被覆された非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子の調製プロセスであって、
１）クエン酸イオン対カルシウムイオンのモル比が１〜２の範囲であるカルシウムの塩およびクエン酸塩の第一の溶液を提供し、こうして、透明な第一の溶液を得るステップと、
２）リン酸アニオンおよび炭酸塩を与えることができる塩の第二の溶液の提供するステップと、
３）透明な前記第一の溶液と前記第二の溶液とをｐＨ８〜１１の範囲で一緒に混合するステップと、
４）ナノ粒子を沈殿させるステップと、
５）ステップ４）から得られた前記ナノ粒子を乾燥させるステップと、を含む、調製プロセス。
【請求項２】
前記カルシウムの塩が、塩化物、硝酸塩、水酸化物、酢酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩からなる群から選択されるアニオンからなり、好ましくは前記アニオンが塩化物である、請求項１に記載の調製プロセス。
【請求項３】
前記クエン酸塩が、ナトリウムおよびカリウムからなる群から選択されるカチオンからなり、好ましくは前記カチオンがナトリウムである、請求項１または２に記載の調製プロセス。
【請求項４】
前記クエン酸イオン対カルシウムイオンのモル比が約２である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の調製プロセス。
【請求項５】
ステップ１）の前記第一の溶液が、ストロンチウム塩およびマグネシウム塩の群から選択される少なくとも１つのさらなる塩を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の調製プロセス。
【請求項６】
リン酸アニオンを与えることができる前記塩は、リン酸、リン酸水素またはリン酸水素の塩であり、好ましくは、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウムからなる群から選択されるカチオンからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製プロセス。
【請求項７】
ステップ３）の前記ｐＨが８．５〜１０．７の範囲である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の調製プロセス。
【請求項８】
前記混合させるステップ３）において、前記第二の溶液を透明な前記第一の溶液に添加する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の調製プロセス。
【請求項９】
ステップ４）において、上澄みを遠心分離除去し、沈殿物を回収し、洗浄することによる沈降サイクルを提供することにより、前記沈殿が実行される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の調製プロセス。
【請求項１０】
前記乾燥させるステップ５）が、凍結乾燥、噴霧乾燥、および換気オーブン乾燥から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の調製プロセス。
【請求項１１】
ステップ１）において、フッ素化合物が添加される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の調製プロセス。
【請求項１２】
前記フッ素化合物が、ナトリウムおよびカリウムからなる群から選択されるカチオンのフッ化物である、請求項１１に記載の調製プロセス。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の調製プロセスで得られるクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子であって、前記乾燥させるステップ５）が凍結乾燥させるステップであり、前記ナノ粒子は、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定した表面積が２５０ｍ２ｇ−１〜３６０ｍ２ｇ−１であり、円形形態を有し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像で測定した直径が３０〜８０ｎｍの範囲を有することを特徴とする、クエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の調製プロセスによって得ることができるクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子凝集体であって、
前記乾燥させるステップ５）は、凍結乾燥させるステップであり、前記ナノ粒子凝集体は、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定した表面積が２ｍ２ｇ−１〜１０ｍ２ｇ−１であり、円形形態を有し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で測定した直径が２〜２５μｍの範囲を有することを特徴とする、クエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子凝集体。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の調製プロセスによって得られるフッ素ドープクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子であって、前記乾燥させるステップ５）が凍結乾燥させるステップであり、前記ナノ粒子が、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定した表面積が２５０ｍ２ｇ−１〜３７０ｍ２ｇ−１であり、円形形態を有し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像で測定した直径が３０〜８０ｎｍの範囲を有することを特徴とする、フッ素ドープクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の調製プロセスによって得られるフッ素ドープクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子凝集体であって、前記乾燥させるステップ５）は、噴霧乾燥させるステップであり、前記ナノ粒子凝集体は、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定した表面積が３ｍ２ｇ−１〜１０ｍ２ｇ−１であり、円形形態を有し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で測定した直径が２〜２５μｍの範囲を有することを特徴とする、クエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子凝集体。
【請求項１７】
歯科用途に使用するための生体材料としての、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のナノ粒子またはナノ粒子凝集体。
【請求項１８】
前記生体材料が再石灰化剤または象牙質知覚過敏抑制剤として使用される、請求項１７に記載の使用のための生体材料としてのナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、好ましくは歯科に使用される生体材料に関する。特に、本発明は、好ましくはフッ化物イオンでドープされたクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムの粒子およびその製造プロセスに関する。本発明はまた、医薬において、好ましくは歯科において、歯の再石灰化および象牙質知覚過敏抑制剤のための生体材料としての、生体材料としての本発明の粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）は、生体鉱物化科学においても生物医学材料分野においても最も重要なリン酸カルシウム（ＣａＰ）相の１つである。ＡＣＰは、多くの生物系、とりわけ、原始生物において、主にＣａ２＋とＰＯ４３−イオンの貯蔵庫として発生する。ＡＣＰは、水酸アパタイト（ＨＡ）とリン酸八カルシウム（ＯＣＰ）よりも表面エネルギが低いため、Ｃａ２＋とＰＯ４３−イオンを含む過飽和水溶液から沈殿する最初の相である。ＡＣＰは、結晶性の長距離秩序ではなく、短距離秩序を有する鉱物相である。ＢｅｔｔｓとＰｏｓｎｅｒにより提案されたＡＣＰの基本構造単位は、化学組成Ｃａ９（ＰＯ４）６と一致する平均直径９．５ｎｍの略球状イオンクラスターである。
【０００３】
ＡＣＰは不安定な物質であり、溶液中でも乾燥状態でも、より熱力学的に安定なＣａＰ相（すなわち、ＨＡおよびＯＣＰ）に変化し、大気中の水と反応して、最終的な生体材料として使用される場合、ＡＣＰの安定性という問題を明らかに悪化させることが知られている。
【０００４】
ＡＣＰは、その優れた生物活性、高い細胞接着性、調整可能な生分解性、および良好な骨伝導性のために、いくつかの生体材料を製造するために、現在、研究されている。例えば、金属補綴物の被覆にも、自己硬化性の注射用セメントにも、ポリマーとのハイブリッド複合体にも、調整で使用されている。
【０００５】
ＡＣＰは、他の結晶性ＣａＰ相と比較して、かなりの量のＣａ２＋イオンおよびＰＯ４３−イオンを放出する能力があるので、エナメル再石灰化剤として歯科で、特に魅力的な材料である。これらの薬剤は、修復材料に添加することも、あるいはエナメル質表面下病変に浸透するように歯の表面に直接塗布することもできる。ＡＣＰは、石灰化組織の形成中の必須の前駆体相であることが提案されている。したがって、ＡＣＰを使用はすることで、新しい鉱物相を形成する生体鉱物化処理を模倣することによって、生体模倣再石灰化戦略を提供することができる。
【０００６】
歯の硬組織（エナメル質および象牙質）の脱灰は、虫歯および象牙質知覚過敏症の主な原因である。これはｐＨが低い環境によって引き起こされる。ｐＨが低くなるのは、酸性の飲食物の摂取、胃食道逆流症の存在、または病原性の口腔バイオフィルムの酸生成活性という３つの主な原因によるものである。唾液のｐＨ値が５．５未満に低下すると、エナメル質および象牙質でそれぞれ９５重量％および７５重量％を占める歯の組織の主要な無機成分であるヒドロキシアパタイト（ＨＡ）が溶解し始める。
【０００７】
損傷した組織が再石灰化に有利な口腔環境に晒される場合、脱灰は、可逆的なプロセスである。例えば、脱灰プロセスによって引き起こされたエナメル質の空洞は、核形成部位として機能する残留結晶のエピタキシャル成長によって自然に再石灰化され、唾液はＨＡに対して過飽和なＣａ２＋およびＰＯ４３−イオン環境を提供する。しかしながら、唾液によるエナメル質の再石灰化が完全に達成されることは、めったにない。特に、脱灰／再石灰化段階の期間と程度に不均衡がある場合は、めったに達成されない。脱灰を効率的に逆転させ、再石灰化を促進するには、おそらく結晶病変およびボイドにＣａ２＋イオンとＰＯ４３−イオンを供給する外部ソースを使用して、ＨＡの過飽和を増加させ、正味のミネラルゲインを生成することが役立つ。したがって、異なる形態のＣａＰ（すなわち、ＨＡ、フルオロヒドロキシアパタイト（ＦＨＡ）、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）、β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、ＡＣＰなど）を含有するいくつかの製剤が、エナメル質脱灰の治癒剤として報告されている。しかしながら、再石灰化を促進するために口腔内に結晶性ＣａＰ相を塗布することに伴う主な課題は、特にフッ化物イオンの存在下での溶解度が低いことであり、その結果、Ｃａ２＋イオンおよびＰＯ４３−イオンが利用できないことである。
【０００８】
最近、クエン酸塩がＨＡ結晶化において重要な二重の役割、すなわち、非晶質前駆体を介して成長経路を駆動する役割と、非古典的な配向凝集結晶成長メカニズムによってナノ粒子のサイズを制御する役割を果たすことが報告された。
【０００９】
さらに、フッ化物は、エナメル質脱灰を減少および予防するために最も広く使用されている予防剤であり、虫歯予防のための最も有効な薬剤として残っている。フッ化物は、以下の２つの異なるメカニズムによって機能すると考えられている。ｉ）新しく形成されたＨＡのヒドロキシル基の置換により、フッ素アパタイト［ＦＨＡ、Ｃａ５（ＰＯ４）３Ｆ］が生成される。これは、ＨＡよりも溶解性が低く、したがって酸の攻撃に対してより耐性がある。ｉｉ）歯の組織を脱灰するために有機酸を生成する齲蝕原性バイオフィルム中の微生物の代謝的および生理学的経路を阻害する。
【００１０】
したがって、本発明の第一の目的は、エナメル質病変におけるＣａ２＋、ＰＯ４３−およびＦ−の送達であり、再石灰化効果を改善し、同時に象牙質細管の咬合（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）をもたらす。
【００１１】
特許文献１には、フッ化物でドープされたクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子を得るプロセスが記載されている。これは、エナメル質と象牙質の再石灰化剤として、医学やうがい薬、練り歯磨き、チューインガムなどの歯科用製品に適用できる。
【００１２】
具体的には、同文献に記載されているプロセスは、以下のステップ、すなわち、
・濃度が０．０８Ｍ〜０．１２ＭであるＣａＣｌ２溶液、および濃度が０．３５Ｍ〜０．５０Ｍであるクエン酸ナトリウムを、調製するステップと、
・濃度が０．１０Ｍ〜０．１５ＭであるＮａ２ＨＰＯ４と、０．２ＭのＮａ２ＣＯ３およびフッ素化合物とによって形成されている、第二の溶液を調製するステップと、
・先行する段階において調製した２種類の溶液を、１：１（ｖ／ｖ）の比率、８．３〜８．７のｐＨ（例えば、ＨＣｌによって調整されている）、室温にて、２分間未満の期間、攪拌しながら混合するステップと、
・遠心分離、上澄みの除去、および超純水を用いた沈殿物の洗浄による沈殿サイクルを３回連続して行うステップと、
・湿った沈殿物を凍結乾燥させるステップと、を含む。
【００１３】
このプロセスにより、骨芽細胞で生物学的応答をもたらすナノ粒子を得ることができる。具体的には、骨芽細胞と接触して完全に生体適合性を保ちながら、様々なナノ粒子濃度で細胞増殖が観察された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０１２４５２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
特許文献１のナノ粒子が、エナメル質の再石灰化に適合した良好な生体材料であったとしても、依然として、効果的で短期間で再石灰化剤として作用することのできる生体材料が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、クエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子の製造プロセスを見出した。このプロセスは、以下のステップ、すなわち、
１）クエン酸イオン対カルシウムイオンのモル比が１〜２の範囲であるカルシウムの塩およびクエン酸塩の第一の溶液を提供し、こうして、透明な第一の溶液を得るステップと、
２）リン酸アニオンおよび炭酸塩を与えることができる塩の第二の溶液の提供するステップと、
３）透明な第一の溶液と第二の溶液とをｐＨ８〜１１の範囲で一緒に混合するステップと、
４）ナノ粒子を沈殿させるステップと、
５）ステップ４）から得られたナノ粒子を乾燥させるステップと、を含む。
【００１７】
本発明のプロセスでは、混合するステップを実施する前に、第一の溶液は透明である。「透明な第一の溶液」という表現は、第一の溶液が、いかなる種類の粒子も実質的に含まないことを意味する。
【００１８】
有利なことに、ステップ５）は、凍結乾燥させるステップである。
【００１９】
別の態様では、本発明は、本発明によるプロセスによって得ることができるクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子に関し、乾燥させるステップ５）は、凍結乾燥させるステップであり、前記ナノ粒子は、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定した表面積が２５０ｍ２ｇ−１〜３６０ｍ２ｇ−１であり、円形形態を有し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像で測定した直径が３０〜８０ｎｍの範囲を有することを特徴とする。
【００２０】
したがって、第一の実施形態では、ナノ粒子の表面積は、粉末サンプルおよびＳｏｒｐｔｙ１７５０（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ、イタリア国ミラノ）を使用することによるブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定して、２５０ｍ２ｇ−１〜３６０ｍ２ｇ−１の範囲にあり、前記ナノ粒子は、好ましくは、円形形態を有し、直径が３０〜８０ｎｍの範囲を有する。直径を決定するために使用されるすべての器具は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を有することができる器具である。
【００２１】
有利なことに、ステップ５）は、噴霧乾燥させるステップである。
【００２２】
別の態様では、本発明は、本発明によるプロセスによって得ることができるクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子凝集体に関し、乾燥させるステップ５）は、噴霧乾燥させるステップであり、前記ナノ粒子凝集体は、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定した表面積が３ｍ２ｇ−１〜１０ｍ２ｇ−１であり、球形を有し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で測定した直径が２〜２５μｍの範囲を有することを特徴とする。
【００２３】
ステップ５）が噴霧乾燥させるステップからなる場合、以下の実験の部によっても明らかであるように、最終生成物は、２〜２５μｍの範囲の直径を有する微粒子に対応するナノ粒子の凝集体である。
【００２４】
したがって、第二の実施形態では、ナノ粒子凝集体の表面積は、粉末サンプルおよびＳｏｒｐｔｙ１７５０（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ、イタリア国ミラノ）を使用することによるブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定して、３ｍ２ｇ−１〜１０ｍ２ｇ−１の範囲にあり、前記ナノ粒子凝集体は、好ましくは、球形であって、直径が２〜２５μｍの範囲を有する。直径を決定するために使用される器具は、すべて走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）用の器具である。
【００２５】
本発明のさらなる好ましい態様では、ステップ２）の第二の溶液にフッ素化合物を添加することによって、フッ素ドープクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子を得ることができる。
【００２６】
したがって、別の好ましい態様では、本発明は、本発明によるプロセスによって得られるフッ素ドープクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子に関し、ステップ２）でフッ素化合物を添加することを含み、乾燥させるステップ５）は、凍結乾燥させるステップであり、前記ナノ粒子は、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定した表面積が２５０ｍ２ｇ−１〜３６０ｍ２ｇ−１であり、円形形態を有し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像で測定した直径が３０〜８０ｎｍの範囲を有することを特徴とする。
【００２７】
したがって、第一の実施形態では、フッ素ドープクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子の表面積は、粉末サンプルおよびＳｏｒｐｔｙ１７５０（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ、イタリア国ミラノ）を使用することによるブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定して、２５０ｍ２ｇ−１〜３７０ｍ２ｇ−１の範囲にあり、前記ナノ粒子は、好ましくは、球形であって、直径が３０〜８０μｍの範囲を有する。直径を決定するために使用されるすべての器具は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を有することができる器具である。
【００２８】
別の好ましい態様では、本発明は、本発明によるプロセスによって得ることができるフッ素ドープクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子凝集体に関し、ステップ２）でフッ素化合物を添加することを含み、乾燥させるステップ５）は、噴霧乾燥させるステップであり、前記ナノ粒子凝集体は、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定した表面積が３ｍ２ｇ−１〜１０ｍ２ｇ−１であり、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で測定した直径が２〜２５μｍの範囲を有することを特徴とする。
【００２９】
表面積は、粉末サンプルおよびＳｏｒｐｔｙ１７５０（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ、イタリア国ミラノ）を用いて、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定する。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、一般に歯科における口腔の処置で、生体材料としての本発明のナノ粒子またはナノ粒子凝集体の使用に関する。好ましくは、生体材料は、再石灰化剤として、好ましくは歯の硬組織の再石灰化のために、または象牙質知覚過敏抑制剤として使用され、後者の場合、その作用は、好ましくは象牙質細管を充填し、閉塞することである。
【００３１】
具体的には、生体材料は、再石灰化剤であり、好ましくは、アブフラクション、酸蝕症、歯腔、摩耗症、白斑、および低石灰化の場合である。
【００３２】
さらに別の態様では、本発明は、整形外科用途における生体材料としての本発明の粒子の利用に関する。
【発明の効果】
【００３３】
驚くべきことに、本発明のクエン酸塩安定化ナノ粒子およびフッ素ドープクエン酸塩安定化ナノ粒子は、大きな表面積を有し、その結果、Ｃａ２＋およびＦ１−イオンを非常に速く送達できるようになった。これは、特許文献１に記載されているような従来技術のナノ粒子よりも確かに高速である。
【００３４】
いかなる特定の理論にも束縛されることなく、実験の部でより詳細に説明されるように、本発明者らは、Ｃａ２＋イオンおよびＦ１−イオンを非常に速い方法で送達する驚くべき特性は、このプロセス、すなわち、クエン酸イオン対カルシウムイオンのモル比が１〜２であることに起因すると考える。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】実施例１で調製したＡＣＰ４のＴＥＭ顕微鏡写真を示す。（挿入図：対応するＳＡＥＤパターン）。
【図１Ｂ】実施例１で調製したＡＣＰ４のＸＲＤパターンを示す。
【図１Ｃ】実施例１で調製したＡＣＰ４のＦＴ−ＩＲスペクトルを示している。
【図２Ａ】実施例１で調製したＦ−ＡＣＰ４のＴＥＭ顕微鏡写真を示す。（挿入図：対応するＳＡＥＤパターン）。
【図２Ｂ】実施例１で調製したＦ−ＡＣＰ４のＸＲＤパターンを示す。
【図２Ｃ】実施例１で調製したＦ−ＡＣＰ４のＦＴ−ＩＲスペクトルを示している。
【図３Ａ】実施例２で調製したＡＣＰ１のＴＥＭ顕微鏡写真を示す。（挿入図：対応するＳＡＥＤパターン）。
【図３Ｂ】実施例２で調製したＡＣＰ２、ＡＣＰ１、Ｆ−ＡＣＰ１、Ｆ−ＡＣＰ２のＸＲＤパターンを示す。
【図３Ｃ】実施例２で調製したＡＣＰ２、ＡＣＰ１、Ｆ−ＡＣＰ１、Ｆ−ＡＣＰ２のＦＴ−ＩＲスペクトルを示す。
【図４Ａ】実施例１および実施例２で調製したＡＣＰサンプルからの累積Ｃａ２＋放出を報告する。データは、平均±標準偏差（ｎ＝５）として表される。
【図４Ｂ】実施例１および実施例２で調製したＦ−ＡＣＰサンプルからの累積Ｃａ２＋放出を報告する。データは、平均±標準偏差（ｎ＝５）として表される。
【図４Ｃ】実施例１および実施例２で調製したＦ−ＡＣＰサンプルからの累積Ｆ−を報告する。データは平均±標準偏差（ｎ＝５）として表される。
【図５】実施例８の噴霧乾燥したＦ−ＡＣＰ１のＸＲＤパターンを示す。
【図６】実施例８の噴霧乾燥したＦ−ＡＣＰ１の異なる倍率でのＳＥＭ顕微鏡写真を示す。
【図７】実施例２で調製し、合成後１年間、実施例９の室温で保存したＡＣＰ２、ＡＣＰ１、Ｆ−ＡＣＰ２、Ｆ−ＡＣＰ１のＸＲＤパターンを示す。
【図８】実施例２の２で調製したＳｒＦ−ＡＣＰ２、ＭｇＦ−ＡＣＰ２、ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ２、ＳｒＦ−ＡＣＰ１、ＭｇＦ−ＡＣＰ１、ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ１のＸＲＤパターンを示す。
【図９】実施例２の２で調製したＳｒＦ−ＡＣＰ２，ＭｇＦ−ＡＣＰ２，ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ２，ＳｒＦ−ＡＣＰ１，ＭｇＦ−ＡＣＰ１，ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ１のＦＴ−ＩＲスペクトルを示す。
【図１０Ａ】実施例２の２で調製したＳｒＦ−ＡＣＰ２、ＭｇＦ−ＡＣＰ２、ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ２、ＳｒＦ−ＡＣＰ１、ＭｇＦ−ＡＣＰ１、ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ１サンプルからの累積Ｃａ２＋放出を報告する。データは平均±標準偏差（ｎ＝５）で表される。
【図１０Ｂ】実施例２の２で調製したＳｒＦ−ＡＣＰ２、ＭｇＦ−ＡＣＰ２、ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ２、ＳｒＦ−ＡＣＰ１、ＭｇＦ−ＡＣＰ１、ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ１からの累積Ｆ−放出を報告する。データは平均±標準偏差（ｎ＝５）で表される。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
したがって、本発明は、クエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子の製造プロセスに関し、このプロセスは、以下のステップ、すなわち、
１）クエン酸イオン対カルシウムイオンのモル比が１〜２の範囲であるカルシウムの塩およびクエン酸塩の第一の溶液を提供し、こうして、透明な第一の溶液を得るステップと、
２）リン酸アニオンおよび炭酸塩を与えることができる塩の第二の溶液の提供するステップと、
３）透明な第一の溶液と第二の溶液とをｐＨ８〜１１の範囲で一緒に混合するステップと、
４）ナノ粒子を沈殿させるステップと、
５）ステップ４）から得られたナノ粒子を乾燥させるステップと、を含む。
【００３７】
このプロセスのステップ１）は、カルシウムの塩およびクエン酸塩からなる第一の溶液を提供することからなり、ここで、クエン酸イオン対カルシウムイオンのモル比は、１〜２の範囲である。こうして得られた第一の溶液は、透明である。
【００３８】
カルシウムの塩は、好ましくは、塩化物、硝酸塩、水酸化物、酢酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩からなる群から選択されるアニオンからなり、より好ましくは、アニオンは塩化物である。
【００３９】
クエン酸塩は、好ましくは、ナトリウムおよびカリウムからなる群から選択されるカチオンからなり、より好ましくは、カチオンはナトリウムである。
【００４０】
より好ましくは、クエン酸イオン対カルシウムイオンのモル比は、約１である。
【００４１】
さらにより好ましくは、クエン酸イオン対カルシウムイオンのモル比は、約２であり、好ましい実施形態において、本発明によるプロセスのステップ１）の第一の溶液は、ストロンチウム塩およびマグネシウム塩の群から選択される少なくとも１つのさらなる塩を含む。
【００４２】
ストロンチウム塩は、好ましくは、塩化物、硝酸塩、水酸化物、酢酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩からなる群から選択されるアニオンからなり、より好ましくは、アニオンは塩化物である。
【００４３】
マグネシウム塩は、好ましくは、塩化物、硝酸塩、水酸化物、酢酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩からなる群から選択されるアニオンからなり、より好ましくは、アニオンは塩化物である。
【００４４】
ステップ２）は、リン酸アニオンおよび炭酸塩を与えることができる塩の第二の溶液を提供することからなる。
【００４５】
好ましくは、炭酸アニオンとリン酸塩との比は、１〜１．６６の範囲である。
【００４６】
好ましくは、リン酸アニオンを与えることができる塩は、リン酸、リン酸水素、またはリン酸水素の塩である。リン酸アニオンを与えることができる塩は、好ましくは、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウムからなる群から選択されるカチオンからなり、より好ましくは、カチオンはナトリウムである。
【００４７】
ステップ３）は、第一の溶液と第二の溶液とを、ｐＨ８〜１１の範囲で、好ましくは８．５〜１０．７の範囲で、一緒に混合することからなる。
【００４８】
有利な態様では、第一の溶液と第二の溶液との比は、１：１〜１：１．５の範囲である。
【００４９】
本発明によれば、混合するステップ３）は、第一の溶液が透明になった後に実施される。好ましくは、第二の溶液は、混合するステップのために、透明な第一の溶液に添加される。
【００５０】
ステップ４）は、ナノ粒子を沈殿させることからなる。
【００５１】
沈殿させるステップは、有利なことに、遠心分離による沈降サイクルを提供することによって実施することができ、その後、周知の方法に従って、上澄みの除去を実施することができる。沈殿物を収集すると、すぐに、好ましくは、超純水で洗浄することができる。次いで、湿った沈殿物を、当技術分野で公知の乾燥方法に従って乾燥させる。
【００５２】
ステップ５）は、本発明の沈殿したナノ粒子を乾燥させることからなる。
【００５３】
乾燥させるステップは、当技術分野で公知の任意の適切な手段を用いて実施することができる。好ましくは、乾燥させるステップは、凍結乾燥、噴霧乾燥、および換気オーブン乾燥から選択することができる。この換気オーブン乾燥は、好ましくは、エタノールで洗浄した後、約４０℃の温度で行う。
【００５４】
好ましい態様では、乾燥させるステップ５）は、凍結乾燥させるステップである。
【００５５】
別の態様では、本発明は、本発明によるプロセスによって得ることができるクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子に関し、乾燥させるステップ５）は、凍結乾燥させるステップであり、前記ナノ粒子は、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定して、２５０ｍ２ｇ−１〜３６０ｍ２ｇ−１であり、好ましくは、２７０ｍ２ｇ−１〜３６０ｍ２ｇ−１であり、円形形態を有し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像で測定した直径が３０〜８０ｎｍの範囲を有する。
【００５６】
したがって、第一の実施形態では、ナノ粒子の表面積は、粉末サンプルおよびＳｏｒｐｔｙ１７５０（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ、イタリア国ミラノ）を使用することによるブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定して、２５０ｍ２ｇ−１〜３６０ｍ２ｇ−１の範囲にあり、好ましくは、２７０ｍ２ｇ−１〜３６０ｍ２ｇ−１の範囲にあり、前記ナノ粒子は、好ましくは、球形を有し、直径が３０〜８０ｎｍの範囲を有する。直径を決定するために使用されるすべての器具は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を有することができる器具である。
【００５７】
さらなる有利な態様では、乾燥させるステップ５）は、噴霧乾燥させるステップである。
【００５８】
別の態様では、本発明は、本発明によるプロセスによって得ることができるクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子凝集体に関する。乾燥させるステップ５）は、噴霧乾燥させるステップであり、前記ナノ粒子凝集体は、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定した表面積が３ｍ２ｇ−１〜１０ｍ２ｇ−１であり、円形形態を有し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で測定した直径が２〜２５μｍの範囲を有することを特徴とする。
【００５９】
したがって、第一の実施形態では、ナノ粒子凝集体の表面積は、粉末サンプルおよびＳｏｒｐｔｙ１７５０（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ、イタリア国ミラノ）を使用することによるブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定して、３ｍ２ｇ−１〜１０ｍ２ｇ−１の範囲にあり、前記ナノ粒子凝集体は、好ましくは、球形であって、直径が２〜２５μｍの範囲を有する。直径を決定するために使用される器具は、すべて走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）用の器具である。
【００６０】
本発明のさらなる好ましい態様では、ステップ２）の第二の溶液中にフッ素化合物を添加することによって、フッ素ドープクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子を得ることができる。
【００６１】
好ましくは、フッ素化合物は、ナトリウムおよびカリウムからなる群から選択されるカチオンのフッ化物である。
【００６２】
したがって、別の好ましい態様では、本発明によるプロセスによって得ることができるフッ素ドープクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子に関し、ステップ２）においてフッ素化合物を添加することを含み、乾燥させるステップ５）は、凍結乾燥させるステップであり、前記ナノ粒子は、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定した表面積が２５０ｍ２ｇ−１〜３７０ｍ２ｇ−１であり、好ましくは、２７０ｍ２ｇ−１〜３７０ｍ２ｇ−１であり、円形形態を有し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像で測定した直径が３０〜８０ｎｍの範囲を有することを特徴とする。
【００６３】
したがって、第一の実施形態では、フッ素ドープクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子の表面積は、粉末サンプルおよびＳｏｒｐｔｙ１７５０（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ、イタリア国ミラノ）を使用することによるブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定して、２５０ｍ２ｇ−１〜３７０ｍ２ｇ−１の範囲にあり、好ましくは、２７０ｍ２ｇ−１〜３７０ｍ２ｇ−１の範囲にあり、前記ナノ粒子は、好ましくは、球形を有し、直径が３０〜８０ｎｍの範囲を有する。直径を決定するために使用されるすべての器具は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を有することができる器具である。
【００６４】
別の好ましい態様では、本発明は、本発明によるプロセスによって得ることができ、ステップ２）においてフッ素化合物を添加することを含み、フッ素ドープクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子凝集体に関し、乾燥させるステップ５）は、噴霧乾燥させるステップであり、前記ナノ粒子凝集体は、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定した表面積が３ｍ２ｇ−１〜１０ｍ２ｇ−１であり、円形形状を有し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で測定した直径が２〜２５μｍの範囲を有することを特徴とする。
【００６５】
表面積は、粉末サンプルおよびＳｏｒｐｔｙ１７５０（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ、イタリア国ミラノ）を用いて、ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定する。
【００６６】
さらなる態様では、本発明は、歯科用途で使用するための生体材料としての本発明の粒子の使用に関する。好ましくは、生体材料は、歯の硬組織の再石灰化のために、または象牙質知覚過敏抑制剤として使用され、この後者の場合、その作用は、好ましくは象牙質細管を充填し、閉塞することである。
【００６７】
さらに別の態様では、本発明は、整形外科用途における生体材料としての本発明の粒子の利用に関する。
【００６８】
（実験の部）
（材料）
塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、純度９９．０％以上）、クエン酸三ナトリウム二水和物（Ｎａ３（Ｃ６Ｈ５Ｏ７）・２Ｈ２Ｏ、純度９９．０％以上）、リン酸ナトリウム二塩基性二水和物（以下、Ｎａ３（Ｃｉｔ）と称する）、リン酸ナトリウム二水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、純度９９．０％以上）、塩化ストロンチウム六水和物（ＳｒＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、純度９９．０％以上）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、純度９９．０％以上）、炭酸ナトリウム一水和物（Ｎａ２ＣＯ３・２Ｈ２Ｏ、純度９９．０％以上）、フッ化ナトリウム（ＮａＦ、純度９９．０％以上）、塩化カリウム（ＫＣｌ、純度９９．０％以上）、チオシアン酸カリウム（ＫＳＣＮ、純度９８．０％以上）、炭酸ナトリウム一塩基性（ＮａＨＣＯ３、純度９９．７％以上）および乳酸（Ｃ３Ｈ６Ｏ３、純度９０．０％以上）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。全ての溶液を超純水（０．２２μＳ、２５℃、ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で調製した。
【００６９】
（評価の手段および方法）
表１に報告したサンプルのＸ線回折（ＸＲＤ）パターンを、４０ｋＶおよび４０ｍＡで生成したＣｕ  Ｋα放射線（λ＝１．５４１７８Å）を用いたＬｙｎｘ−ｅｙｅ位置有感検出器を備えたＤ８  Ａｄｖａｎｃｅ回折計（Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツ国カールスルーヘ）に記録した。スペクトルは、１０〜６０°の２θ範囲にて、０．０２１のステップサイズ（２θ）および０．５秒の計数時間で記録した。
【００７０】
フーリエ変換赤外（ＦＴ−ＩＲ）分光分析は、ＫＢｒペレット法を用いて、２ｃｍ−１の分解能を有するＮｉｃｏｌｅｔ５７００分光計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で４０００〜４００ｃｍ−１の範囲をカバーする６４回のスキャンの蓄積により行った。
【００７１】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）および選択視野電子回折（ＳＡＥＤ）による評価は、１２０  ｋＶで動作するＴｅｃｎａｉ  Ｆ２０顕微鏡（Ｆｅｉ  Ｃｏｒｐ．、米国オレゴン州ヒルズボロ）で行った。粉末サンプルを超純水中に超音波で分散させ、次いで、スラリーの数滴を、薄い非晶質炭素フィルムで覆われた２００メッシュの銅ＴＥＭグリッド上に堆積させ、数分間インキュベートした。
【００７２】
ＣａおよびＰ、ＭｇおよびＳｒの定量は、誘導結合プラズマ原子発光（ＩＣＰ−ＯＥＳ）分光計（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ５１００  ＩＣＰ−ＯＥＳ、米国カリフォルニア州サンタクララ）で行い、Ｆは、フッ化物イオン電極（Ｉｎｔｅｌｌｉｃａｌ（商標）ＩＳＥＦ１２１、Ｈａｃｈ  Ｌａｎｇｅ、米国コロラド州ラブランド）によって定量した。サンプルは、粉末のアリコートを１重量％ＨＮＯ３溶液に溶解して調製した。
【００７３】
熱重量分析（ＴＧＡ）は、ＳＴＡ  ４４９  Ｊｕｐｉｔｅｒ（Ｎｅｔｚｓｃｈ  ＧｍｂＨ、ドイツ国ゼルプ）装置を用いて行った。約１０ｍｇのサンプルを白金るつぼ中で秤量し、１０℃／分の加熱速度で、空気流下で室温から１２００℃まで加熱した。
【００７４】
ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で、Ｓｏｒｐｔｙ１７５０（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ、イタリア国ミラノ）を用いて、粉末サンプルの比表面積（ＳＳＡ）を測定した。
【００７５】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）評価は、Ｓｉｇｍａ  ＮＴＳ  Ｇｍｂｈ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ドイツ国オーバーコッヘン）を用いて行った。粉末サンプルを、カーボンテープを用いてアルミニウムスタブ上にマウントし、分析前に、スパッタリング電流３０ｍＡ、１０−３ｍｂａｒのアルゴン下で４分間にわたって、Ｓｐｕｔｔｅｒ  Ｃｏａｔｅｒ  Ｅ５１００（Ｐｏｌａｒｏｎ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、英国ハートフォードシャー州ワトフォード）中で、金でスパッタ被覆した。
【００７６】
（実施例１）従来技術（特許文献１）のナノ粒子の調製
乾燥粉末ＡＣＰ（非晶質リン酸カルシウム）は、（ｉ）１００ｍＭ  ＣａＣｌ２＋４００ｍＭ  Ｎａ３（Ｃｉｔ）および（ｉｉ）１２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４＋２００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３の２つの溶液（１：１（ｖ／ｖ）、総量２００ｍＬ）を室温で混合することによって合成した。ＨＣｌ溶液でｐＨを８．５に調整した。混合物が乳状になったとき、粒子を、４℃でサーモスタットをかけて、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによって超純水で３回洗浄し、次いで、３ｍｂａｒの真空下で、−５０℃で一晩凍結乾燥した。
【００７７】
Ｆ−ＡＣＰサンプルをＡＣＰと同様に調製したが、その一方で、５０ｍＭ  ＮａＦ２を溶液（ｉｉ）に添加した。
【００７８】
（実施例２）本発明のナノ粒子の調製
実施例１と同じ調製に続いて、初期Ｃｉｔ／Ｃａモル比を２および１に減少させて、ＡＣＰおよびＦ−ＡＣＰ（５０ｍＭ  ＮａＦ２を用いてドープした）のサンプルも調製した（以下、それぞれＡＣＰ２、Ｆ−ＡＣＰ２およびＡＣＰ１、Ｆ−ＡＣＰ１とコード化）。
【００７９】
（実施例２の２）ＭｇおよびＳｒを用いた本発明のナノ粒子の調製
実施例２の調製に続いて、ＳｒＦ−ＡＣＰ、ＭｇＦ−ＡＣＰおよびＳｒＭｇＦ−ＡＣＰのサンプルもＦ−ＡＣＰと同様に調製し、その一方で、５ｍＭ  ＳｒＣｌ２もしくは４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２またはその両方を溶液（ｉ）に添加した。初期モルＣｉｔ／Ｃａ比２および１（以下、それぞれＳｒＦ−ＡＣＰ２、ＭｇＦ−ＡＣＰ２、ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ２およびＳｒＦ−ＡＣＰ１、ＭｇＦ−ＡＣＰ１、ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ１とコード化）を使用した。
【００８０】
実施例１および実施例２の調製に使用したサンプルのコードおよび化学反応物の濃度を以下の表１に報告する。
【表１】
2021529719.tif 000002
【００８１】
従来技術のサンプルは、クエン酸塩とカルシウムとのモル比が４であるのに対し、本発明のサンプルは、モル比が１〜２の範囲で調製された。
【００８２】
（実施例３：実施例１で調製したＡＣＰ４粒子の物理的特性および組成の評価）
実施例１で調製した乾燥粉末ＡＣＰ４を、上記に報告した装置を用いて物性について評価した。
【００８３】
図１Ａでは、ＡＣＰ４のＴＥＭ顕微鏡写真が報告されており、結晶性ＣａＰに典型的なファセットの角張った形状ではなく、２０〜５０ｎｍの範囲のサイズを有する丸い形状のナノ粒子が明確になっている。そのようなナノ粒子について収集されたＳＡＥＤパターン（図１Ａの右上の挿入図）は、スポットではなく拡散翼が存在することから、非晶質性を示す。
【００８４】
ＡＣＰ４のＸＲＤパターン（図１Ｂ）は、長距離周期性のない相に典型的な約３０°（２θ）の広いバンドを示し、ＡＣＰ４の非結晶組織を確認し、ＨＡおよび他のＣａＰ結晶相の存在を排除している。ＦＴ−ＩＲスペクトル（図１Ｃ）は、非晶質構造を有するＣａＰに特徴的な広い未分解のバンドを示す。特に、約５６０ｃｍ−１および約１０５０ｃｍ−１の吸着バンドは、それぞれ、リン酸基の曲げおよび伸張モードに関連しており、約８７０ｃｍ−１および約１４００〜１５００ｃｍ−１のバンドは、炭酸イオンに起因するのに対し、約１６０５ｃｍ−１のバンドは、吸着水およびクエン酸塩ＣＯＯ−の伸縮に割り当てられた。
【００８５】
したがって、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃは、非晶質リン酸カルシウムからなるナノ粒子が球形であることを確認した。
【００８６】
（実施例４：実施例１で調製したＦ−ＡＣＰ粒子の物理的特性および組成の評価）
実施例１を参考に、第一のステップは、ＡＣＰ４の調製に用いられるプロトコルに関して、試薬濃度とＣｉｔ／Ｃａ比を一定に保ち、一方、ドープＡＣＰ４（以下、Ｆ−ＡＣＰ４と呼ぶ）にＮａＦを添加した。
【００８７】
Ｆ−ＡＣＰ４（図２Ａ）のＴＥＭ画像は、ＡＣＰ４と同様のサイズと形態を有する丸い形状の粒子を示す。そのようなナノ粒子について収集されたＳＡＥＤパターン（図２Ａの右上の挿入図）は、スポットではなく拡散翼が存在することから、非晶質性を示す。Ｆ−ＡＣＰ４のＸＲＤパターン（図２Ｂ）は、ＡＣＰ４で記録されたのと同じ約３０°（２β）で広範な回折ピークを示し、これは、Ｆ−イオンの存在が、フッ化物塩または他の結晶性ＣａＰ相の沈殿を引き起こさなかったことを示している。Ｆ−ＡＣＰ４のＦＴ−ＩＲスペクトルも、ＡＣＰ４のＦＴ−ＩＲスペクトルで報告されているものと同様の広い未分解のバンドを示している（図２Ｃ）。
【００８８】
（実施例５：実施例２で調製したＡＣＰおよびＦ−ＡＣＰの粒子の物理的特性および組成の評価）
上記のように、先行技術によれば４に設定されていた本発明による試薬の公称Ｃｉｔ／Ｃａ比を、本発明に従って２または１（以下、それぞれＡＣＰ２およびＡＣＰ１と呼ぶ）に変更して、２つのＡＣＰサンプルを調製した。その理由は、これらの非晶質材料の化学的物理的特徴に対するモル比Ｃｉｔ／Ｃａの影響を評価するためである。さらに、Ｆ−ＡＣＰ４の合成に使用したのと同じ量のＮａＦを使用して、ＡＣＰ２とＡＣＰ１をドープし、これらのサンプルをそれぞれＦ−ＡＣＰ２とＦ−ＡＣＰ１と呼んだ。
【００８９】
ＡＣＰ２（図示せず）およびＡＣＰ１（図３Ａ）のＴＥＭ画像は、ＡＣＰ４と同程度のサイズおよび形状を有する丸い形状の粒子を示す。ＡＣＰ１（図３Ａの右上の挿入図）について収集されたＳＡＥＤパターンは、スポットではなく拡散翼の存在によるそれらの非晶質性を示す。また、この場合、Ｆ−の添加は、ドープされていない対応物と比較して、サイズと形態の変化を引き起こさなかった。ＡＣＰ２、ＡＣＰ１、Ｆ−ＡＣＰ２、Ｆ−ＡＣＰ１（図３Ｂ）のＸＲＤパターンは、純粋な非晶質相と同じ広い回折バンド特性を示した。ＡＣＰ２、ＡＣＰ１、Ｆ−ＡＣＰ２およびＦ−ＡＣＰ１のＦＴ−ＩＲスペクトル（図３Ｃ）も、他のＦＴ−ＩＲスペクトルで報告されているものと同様の広い未分解のバンドを示している。
【００９０】
したがって、本発明によるＡＣＰまたはＦ−ＡＣＰの粒子は、円形であり、従来技術のものと同様の寸法を有していた。
【００９１】
（実施例５の２）
ＳｒＦ−ＡＣＰ２，ＭｇＦ−ＡＣＰ２，ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ２，ＳｒＦ−ＡＣＰ１，ＭｇＦ−ＡＣＰ１，ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ１（図８）のＸＲＤパターンは、純粋な非晶質相と同じ広い回折バンド特性を示した。ＳｒＦ−ＡＣＰ２、ＭｇＦ−ＡＣＰ２、ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ２、ＳｒＦ−ＡＣＰ１、ＭｇＦ−ＡＣＰ１、ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ１（図９）のＦＴ−ＩＲスペクトルも、他のＦＴ−ＩＲスペクトルで報告されているものと同じ広い未分解のバンド特性を示した。
【００９２】
（実施例６：実施例１および実施例２ならびに実施例２の２で調製したサンプルの化学組成）
実施例２で調製したサンプルの化学組成を表２にまとめる。
【表２】
2021529719.tif 000003
【００９３】
実施例１で調製した従来技術のサンプルについてもＳＳＡＢＥＴを測定した。
【００９４】
以下の値が得られた：
ＡＣＰ４            ２００±２０ｍ２ｇ−１
Ｆ−ＡＣＰ４        ２１３±２１ｍ２ｇ−１
【００９５】
ＳＳＡＢＥＴの値は、従来技術のステップと本発明のステップで得られたＡＣＰとＦ−ＡＣＰを区別する特徴となった。
【００９６】
本発明によるサンプルのＴＧＡ曲線は、主に、吸着水（室温〜１５０℃）、構造水（１５０〜３５０℃）、クエン酸塩（３５０〜７００℃）および炭酸塩（７００〜１０００℃）に起因し得る４つの重量損失を示す。これらの損失に従って、クエン酸塩および炭酸塩の含有率を推定し、表２に報告した。
【００９７】
ＡＣＰ２のカルシウム／リン酸塩比は、ＡＣＰ１と同様であったが、Ｆ−ＡＣＰ２，Ｆ−ＡＣＰ１は、ドープされていない対応物よりもカルシウム含有量が高く、Ｃａ／Ｐ比が高い。Ｆ−ＡＣＰ２のＣａ／リン酸塩の比は、Ｆ−ＡＣＰ１と同様であった。
【００９８】
ＳｒＦ−ＡＣＰ２、ＭｇＦ−ＡＣＰ２、ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ２、ＳｒＦ−ＡＣＰ１、ＭｇＦ−ＡＣＰ１、ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ１のカルシウム＋マグネシウム／リン酸塩の比は、サンプルＦ−ＡＣＰ２、Ｆ−ＡＣＰ１に対して計算した値と同様であった。クエン酸塩および炭酸塩の含有量は、ＳｒおよびＭｇをドープしたサンプル間で変化せず、サンプルＦ−ＡＣＰ２およびＦ−ＡＣＰ１について計算した値と同様であった。興味深いことに、Ｍｇを単独で、またはＳｒと組み合わせて調製すると、フッ化物の量が増加することが分かった。
【００９９】
いかなる理論にも束縛されるものではないが、本発明者らは、より高い表面積は、クエン酸イオン対カルシウムイオンのモル比が１〜２の範囲である本発明のプロセスによるものであると考えている。
【０１００】
上記のデータは、本発明の処理によって得られたクエン酸塩被覆粒子およびフッ素ドープクエン酸塩被覆粒子が、特許文献１のフッ素ドープクエン酸塩被覆粒子とは異なり、したがって新規であることを実証する。
【０１０１】
（実施例７：実施例１および実施例２で調製したサンプルの人工唾液中のイオン放出）
歯の治療製品におけるＡＣＰの適用は、エナメル質の再石灰化を引き起こすための局所過飽和を生じさせるために、カルシウムイオンおよびリン酸イオンを放出するという原理に基づいている。したがって、この効果は、インビトロで試験されている。酸性人工唾液（高分子成分を含まない、食後のヒトの唾液を模倣する溶液）中で、インビトロでイオン放出を試験した。
【０１０２】
実施例１および実施例２で調製したＡＣＰまたはＦ−ＡＣＰ粉末２００ｍｇを、ＫＣｌ  ２０ｍＭ、ＫＳＣＮ  ５．３ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４  １．４ｍＭ、ＮａＨＣＯ３  １５ｍＭ、および乳酸１０ｍＭを含む改変Ｔａｎｉ−Ｚｕｃｃｈｉ溶液として調製した人工唾液１０ｍＬの中に分散させた。懸濁液を振盪しながら、３７℃に維持した。予定された時間に、８ｍＬの上澄み（５０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって固相から十分に分離された）を、それぞれＩＣＰ−ＯＥＳおよびフッ化物イオン電極によるＣａ２＋およびＦ−定量のために除去した。その後、サンプルを８ｍＬの新鮮な人工唾液ですすぎ、懸濁液を振盪下３７℃に維持し、次の時点で前述のように処理した。
【０１０３】
実施例１と実施例２のすべてのサンプルは、最初の２時間でＣａ２＋イオンとＦ−イオンが持続的に放出されていることを示す（図４）。本発明によるＣｉｔ／Ｃａ比を有するサンプルは、驚くほど高いイオン放出速度を示し、したがって、従来技術に対して改善された有利な生成物であることが明らかになった。
【０１０４】
いかなる理論にも束縛されることなく、本発明者らは、この驚くべき効果は、おそらく、ナノ粒子を製造するためのプロセスにおいて使用される特定のモル比のために、より高い表面積を有する本発明の粒子の特有の特徴によるものであると考える。
【０１０５】
（実施例７の２）
実施例２の２に従って調製したＳｒＦ−ＡＣＰ２、ＭｇＦ−ＡＣＰ２、ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ２、ＳｒＦ−ＡＣＰ１、ＭｇＦ−ＡＣＰ１、ＳｒＭｇＦ−ＡＣＰ１の酸性人工唾液中でのインビトロでイオン放出を、実施例７と同じ条件で試験した。
【０１０６】
実施例２の２のサンプルは、実施例１よび実施例２のサンプルと同様に、最初の２時間でＣａ２＋イオンとＦ−イオンが持続的に放出されていることを示す（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。本発明による実施例２の２のサンプルは、実施例２のサンプルに匹敵するイオン放出速度を示し、したがって、それ自体が従来技術に関して改善された有利な生成物であることが明らかになった。
【０１０７】
（実施例８：微粒子に凝集した本発明のナノ粒子の調製（本発明のナノ粒子凝集体））
実施例２のサンプルを、その非晶質の特徴に影響を及ぼすことなく、噴霧乾燥機によって乾燥させる可能性を評価するために、洗浄後、実施例２で得られたＡＣＰ２、ＡＣＰ１、Ｆ−ＡＣＰ２およびＦ−ＡＣＰ１を、３．５％ｗ／ｖで水の中で再懸濁し、噴霧乾燥（Ｍｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｅｒ  Ｂ−２９０，Ｂｕｃｈｉ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ  ＡＧ、スイス）により、ノズル直径０．７ｍｍ、供給速度３ｍＬ／ｍｉｎ、アルゴン流量４５０Ｌｈ−１、入口温度１２０°Ｃ、吸引器速度７０％という条件下で、乾燥した。噴霧乾燥したＦ−ＡＣＰ１粉末のＸＲＤパターン（図５）は、約３０°（２θ）で広いバンドのみを示し、非晶質相が保存されていることを裏付ける。噴霧乾燥したＦ−ＡＣＰ１粉末のＳＥＭ顕微鏡写真（図６）は、サンプルが、Ｃｉｔ／Ｃａ比とも、フッ化物の存在とも関係なしに、凝集したナノ粒子から構成される直径約２〜２５μｍの球状粒子からなることを明らかにした。乾燥粉末のＳＳＡＢＥＴは、Ｃｉｔ／Ｃａ比とも、フッ化物の存在とも関係なしに、３〜１０ｍ２ｇ−１の範囲であった。
【０１０８】
（実施例９：実施例２で調製したサンプルの乾燥粉末の安定性）
ＡＣＰはＣａＰの結晶多形よりも不安定であるため、大気中の水と反応する乾燥状態であっても結晶相に転化する。したがって、安定な材料が開発されない限り、その使用および取り扱いは困難である。室温で保存されたＡＣＰ２、ＡＣＰ１、Ｆ−ＡＣＰ２、Ｆ−ＡＣＰ１粉末の安定性を、最大１年間のＸＲＤを収集して解析した（図７）。興味深いことに、ＸＲＤパターンは変化しないで留まり、全てのサンプルの非晶質性がこの期間中保存されることが確立された。
【図１Ａ】
2021529719.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年2月17日(2021.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クエン酸塩で被覆された非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子の調製プロセスであって、
１）クエン酸イオン対カルシウムイオンのモル比が１〜２の範囲であるカルシウムの塩およびクエン酸塩の第一の溶液を提供し、こうして、透明な第一の溶液を得るステップと、
２）リン酸アニオンおよび炭酸塩を与えることができる塩の第二の溶液の提供するステップと、
３）透明な前記第一の溶液と前記第二の溶液とをｐＨ８〜１１の範囲で一緒に混合するステップと、
４）ナノ粒子を沈殿させるステップと、
５）ステップ４）から得られた前記ナノ粒子を乾燥させるステップと、を含む、調製プロセス。
【請求項２】
前記カルシウムの塩が、塩化物、硝酸塩、水酸化物、酢酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩からなる群から選択されるアニオンからなり、好ましくは前記アニオンが塩化物である、請求項１に記載の調製プロセス。
【請求項３】
前記クエン酸塩が、ナトリウムおよびカリウムからなる群から選択されるカチオンからなり、好ましくは前記カチオンがナトリウムである、請求項１または２に記載の調製プロセス。
【請求項４】
前記クエン酸イオン対カルシウムイオンのモル比が約２である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の調製プロセス。
【請求項５】
ステップ１）の前記第一の溶液が、ストロンチウム塩およびマグネシウム塩の群から選択される少なくとも１つのさらなる塩を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の調製プロセス。
【請求項６】
リン酸アニオンを与えることができる前記塩は、リン酸、リン酸水素またはリン酸水素の塩であり、好ましくは、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウムからなる群から選択されるカチオンからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製プロセス。
【請求項７】
ステップ３）の前記ｐＨが８．５〜１０．７の範囲である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の調製プロセス。
【請求項８】
前記混合させるステップ３）において、前記第二の溶液を透明な前記第一の溶液に添加する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の調製プロセス。
【請求項９】
ステップ４）において、上澄みを遠心分離除去し、沈殿物を回収し、洗浄することによる沈降サイクルを提供することにより、前記沈殿が実行される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の調製プロセス。
【請求項１０】
前記乾燥させるステップ５）が、凍結乾燥、噴霧乾燥、および換気オーブン乾燥から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の調製プロセス。
【請求項１１】
ステップ１）において、フッ素化合物が添加される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の調製プロセス。
【請求項１２】
前記フッ素化合物が、ナトリウムおよびカリウムからなる群から選択されるカチオンのフッ化物である、請求項１１に記載の調製プロセス。
【請求項１３】
ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定した表面積が２５０ｍ２ｇ−１〜３６０ｍ２ｇ−１であり、円形形態を有し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像で測定した直径が３０〜８０ｎｍの範囲を有することを特徴とする、クエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子。
【請求項１４】
ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定した表面積が２ｍ２ｇ−１〜１０ｍ２ｇ−１であり、円形形態を有し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で測定した直径が２〜２５μｍの範囲を有することを特徴とする、クエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子凝集体。
【請求項１５】
ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定した表面積が２５０ｍ２ｇ−１〜３７０ｍ２ｇ−１であり、円形形態を有し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像で測定した直径が３０〜８０ｎｍの範囲を有することを特徴とする、フッ素ドープクエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子。
【請求項１６】
ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）気体吸着法で測定した表面積が３ｍ２ｇ−１〜１０ｍ２ｇ−１であり、円形形態を有し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で測定した直径が２〜２５μｍの範囲を有することを特徴とする、クエン酸塩被覆非晶質リン酸カルシウムのナノ粒子凝集体。
【請求項１７】
歯科用途に使用するための生体材料としての、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のナノ粒子またはナノ粒子凝集体。
【請求項１８】
前記生体材料が再石灰化剤または象牙質知覚過敏抑制剤として使用される、請求項１７に記載の使用のための生体材料としてのナノ粒子。
【国際調査報告】
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