(57)【要約】  本発明は、肝様細胞、内皮様細胞、胆管上皮様細胞、膵島様細胞への分化においてＥ−ｃａｄ−Ｆｃ、ＶＥ−ｃａｄ−ＦｃとＶＦＧＦ−Ｆｃの使用に係る。
2021519603.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の中に存在するＥＧＦＲを活性化するための、上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質の使用。
【請求項２】
幹細胞から肝様細胞、膵様細胞又は胆管上皮様細胞への分化誘導を促進するための、上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質の使用。
【請求項３】
前記上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質がＥＧＦの代わりに用いられる、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質が基材に固定される、請求項１−３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
幹細胞から内皮様細胞（好ましくは、血管内皮細胞）、肝様細胞、膵様細胞又は胆管上皮様細胞への分化誘導を促進するための、血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質の使用。
【請求項６】
前記血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質が基材に固定される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質が、ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質と組み合わせて用いられる、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質と前記ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質が基材に固定され、好ましくは、同一又は異なる基材に固定される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
細胞から内皮様細胞、肝様細胞、膵様細胞又は胆管上皮様細胞への分化誘導を促進するための、上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質と血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質の使用。
【請求項１０】
前記上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質と前記血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質との割合が、３：１〜１：３、好ましくは１：３、３：１又は１：１である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質と前記血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質が、基材に固定され、好ましくは同一又は異なる基材に固定される、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質が、ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質と組み合わせて用いられる、請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
前記血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質と前記ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質が、基材に固定され、好ましくは同一又は異なる基材に固定される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記基材が、細胞培養プレート、細胞培養ディッシュ、ハイドロゲル（好ましくは、ヒアルロン酸ハイドロゲル、好ましくは、アクリルヒドラジン化ヒアルロン酸ハイドロゲル、又はＰＡＭＡＭデンドリマー／チオール化ヒアルロン酸ハイドロゲル）、多孔質スキャホールド、フィルム（好ましくは、ナノファイバーのフィルム）、又はマイクロビーズからなる群から選ばれ、好ましくは、前記マイクロビーズの粒子径が１０−５０μｍ（好ましくは、１５−３０、１５−２０μｍ）であり、好ましくは前記マイクロビーズがＰＬＧＡマイクロビーズであり、より好ましくは粒子径が１０−５０μｍ（好ましくは、１５−３０、１５−２０μｍ）のＰＬＧＡマイクロビーズであり；又は、前記マイクロビーズはポリスチレンビーズであり、好ましくはポリスチレンビーズの粒子径が１０−５０μｍ（好ましくは、１５−３０、１５−２０μｍ）である、請求項４、６、８、１１又は１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズが、親水性又は疎水性である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズが，親水性の多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズである場合、前記上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質又は前記血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質又はＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質が、リンカー（好ましくは、Ｆｃ−結合ペプチド）を介して前記多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズに連接される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記Ｆｃ結合ペプチドが、ＣＨＷＲＧＷＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）、ＨＹＦＫＦＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）、ＨＦＲＲＨＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）、ＦＹＷＨＣＬＤＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）又はＳｐＡ（ブドウ球菌プロテインA ）からなる群から選ばれる、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
幹細胞を、上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質、及び／又は血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質の存在下で培養することを特徴とする、肝様細胞、膵様細胞又は胆管上皮様細胞を調製する方法。
【請求項１９】
幹細胞を、血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質の存在下で培養することを特徴とする、内皮様細胞を調製する方法。
【請求項２０】
幹細胞を、さらにＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質の存在下で培養する、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質と前記血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質／ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質が基材に固定され、好ましくは同一又は異なる基材に固定され、好ましくは、前記ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質と前記血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質が、同一又は異なる基材に固定される、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記基材が、細胞培養プレート、細胞培養ディッシュ、ハイドロゲル（好ましくは、ヒアルロン酸ハイドロゲル、より好ましくは、アクリルヒドラジン化ヒアルロン酸ハイドロゲル、又はＰＡＭＡＭデンドリマー／チオール化ヒアルロン酸ハイドロゲル）、多孔質スキャホールド、フィルム（好ましくは、ナノファイバーのフィルム）、又はマイクロビーズからなる群から選ばれ、好ましくは、前記マイクロビーズの粒子径が１０−５０μｍ（好ましくは、１５−３０、１５−２０μｍ）であり、好ましくは前記マイクロビーズがＰＬＧＡマイクロビーズ、より好ましくは粒子径が１０−５０μｍ（好ましくは、１５−３０、１５−２０μｍ）のＰＬＧＡマイクロビーズであり；又は、前記マイクロビーズはポリスチレンビーズであり、好ましくはポリスチレンビーズの粒子径が１０−５０μｍ（好ましくは、１５−３０、１５−２０μｍ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズが、親水性又は疎水性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズは親水性の多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズである場合、前記上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質又は前記血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質又はＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質がリンカー（好ましくは、Ｆｃ−結合ペプチド）を介して前記多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズに連接される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｆｃ結合ペプチドが、ＣＨＷＲＧＷＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）、ＨＹＦＫＦＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）、ＨＦＲＲＨＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）、ＦＹＷＨＣＬＤＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）又はＳｐＡ（ブドウ球菌プロテインA ）からなる群から選ばれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記幹細胞が、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞又は胚性幹細胞である、請求項１−１３のいずれか１項に記載の使用、又は請求項１８−２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記幹細胞が、哺乳動物由来、好ましくはヒト、ネズミ、ブタ由来である、請求項１−１３のいずれか１項に記載の使用、又は請求項１８−２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
上皮細胞カドヘリンが、ヒト上皮細胞カドヘリンであり、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示される配列である、請求項１−４、９−１１のいずれか１項に記載の使用、又は請求項１８又は２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
血管内皮細胞カドヘリンが、ヒト血管内皮細胞カドヘリンであり、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される配列である、請求項５−１３のいずれか１項に記載の使用、又は請求項１９−２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
血管内皮細胞増殖因子が、ヒトＶＥＧＦ１６５であり、好ましくはＶＥＧＦの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１である、請求項７、１２又は１３のいずれか１項に記載の使用，又は請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
Ｆｃが、ヒトＩｇＧ（好ましくは、ＩｇＧ１）のＦｃであり、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される配列である、請求項１−１３のいずれか１項に記載の使用、又は請求項１８−２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質、及び／又は血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質を含み、好ましくは、前記上皮細胞カドヘリンが、ヒト上皮細胞カドヘリンであり、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示される配列であり、前記血管内皮細胞カドヘリンはヒト血管内皮細胞カドヘリンであり、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される配列である、細胞培養のための修飾基材。
【請求項３３】
細胞から内皮様細胞、肝様細胞、膵様細胞又は胆管上皮様細胞への分化誘導を促進するための、修飾基材であり、好ましくは、前記幹細胞は間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞又は胚性幹細胞であり、より好ましくは、前記幹細胞は哺乳動物由来、好ましくはヒト、ネズミ、ブタ由来である、請求項３２に記載の修飾基材。
【請求項３４】
修飾基材が血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質を含む場合、さらにＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質を含み、好ましくは、前記ＶＥＧＦはヒトＶＥＧＦ１６５であり、より好ましくはＶＥＧＦの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１である、請求項３２又は３３に記載の修飾基材。
【請求項３５】
前記基材が、細胞培養プレート、細胞培養ディッシュ、ハイドロゲル（好ましくは、ヒアルロン酸ハイドロゲル、より好ましくはアクリルヒドラジン化ヒアルロン酸ハイドロゲル、又はＰＡＭＡＭデンドリマー／チオール化ヒアルロン酸ハイドロゲル）、多孔質スキャホールド、フィルム（好ましくは、ナノファイバーのフィルム）、又はマイクロビーズからなる群から選ばれ、好ましくは、前記マイクロビーズはＰＬＧＡマイクロビーズであり、より好ましくは粒子径が１０−５０μｍ（好ましくは、１５−３０、１５−２０μｍ）のＰＬＧＡマイクロビーズであり；又は、前記マイクロビーズはポリスチレンビーズであり、好ましくはポリスチレンビーズの粒子径が１０−５０μｍ（好ましくは、１５−３０、１５−２０μｍ）である、請求項３２又は３３に記載の修飾基材。
【請求項３６】
前記多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズは親水性又は疎水性である、請求項３５に記載の修飾基材。
【請求項３７】
前記多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズが、親水性の多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズである場合、前記上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質又は前記血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質が、リンカー（好ましくは、Ｆｃ−結合ペプチド）を介して前記多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズに連接される、請求項３６に記載の修飾基材。
【請求項３８】
前記Ｆｃ結合ペプチドが、ＣＨＷＲＧＷＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）、ＨＹＦＫＦＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）、ＨＦＲＲＨＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）、ＦＹＷＨＣＬＤＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）又はＳｐＡ（ブドウ球菌プロテインA ）からなる群から選ばれる、請求項３７に記載の修飾基材。
【請求項３９】
細胞（好ましくは、幹細胞、より好ましくは、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞又は胚性幹細胞）の分化誘導（好ましくは、幹細胞から内皮様細胞、肝様細胞、膵様細胞又は胆管上皮様細胞への分化誘導）を促進するための、請求項３２−３８のいずれか１項に記載の修飾基材の使用。
【請求項４０】
上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質及び／又は血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質を基材と混合することにより前記基材を修飾することを含む、修飾基材の調製方法。
【請求項４１】
前記基材が、細胞から内皮様細胞、肝様細胞、膵様細胞又は胆管上皮様細胞への分化誘導を促進するための基材であり、好ましくは、前記幹細胞は間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞又は胚性幹細胞であり、より好ましくは、前記幹細胞は哺乳動物由来、好ましくはヒト、ネズミ、ブタ由来である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質を用いて前記基材を修飾する場合、さらにＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質を混合して用いて、好ましくは、前記ＶＥＧＦはヒトＶＥＧＦ１６５であり、より好ましくはＶＥＧＦの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１である、請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記基材が、細胞培養プレート、細胞培養ディッシュ、ハイドロゲル（好ましくは、ヒアルロン酸ハイドロゲル、より好ましくは、アクリルヒドラジン化ヒアルロン酸ハイドロゲル、又はＰＡＭＡＭデンドリマー／チオール化ヒアルロン酸ハイドロゲル）、多孔質スキャホールド、フィルム（好ましくは、ナノファイバーのフィルム）、又はマイクロビーズからなる群から選ばれ、好ましくは、前記マイクロビーズの粒子径が１０−５０μｍ（好ましくは、１５−３０、１５−２０μｍ）であり、好ましくは前記マイクロビーズがＰＬＧＡマイクロビーズであり、より好ましくは粒子径が１０−５０μｍ（好ましくは、１５−３０、１５−２０μｍ）のＰＬＧＡマイクロビーズであり；又は、前記マイクロビーズはポリスチレンビーズであり、好ましくはポリスチレンビーズの粒子径が１０−５０μｍ（好ましくは、１５−３０、１５−２０μｍ）である、請求項４０−４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズが、親水性又は疎水性である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズが、親水性の多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズである場合、前記上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質又は前記血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質が、リンカー（好ましくは、Ｆｃ−結合ペプチド）を介して前記多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズに連接される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｆｃ結合ペプチドが、ＣＨＷＲＧＷＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）、ＨＹＦＫＦＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）、ＨＦＲＲＨＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）、ＦＹＷＨＣＬＤＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）又はＳｐＡ（ブドウ球菌プロテインA ）からなる群から選ばれる、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分化の分野に属し、特に、幹細胞から肝様細胞、内皮様細胞、膵島様細胞又は胆管上皮様細胞への分化誘導を促進する、上皮細胞カドヘリン（Ｅ−カドヘリン）−Ｆｃ融合蛋白質、及び／又は血管内皮細胞カドヘリン（ＶＥ−カドヘリン）−Ｆｃ融合蛋白質、及び／又は内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）−Ｆｃ融合蛋白質の新たな使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の器官発生は、複数のシグナル伝達分子によって構築された微小環境の影響を受け、非常にダイナミックなプロセスである。近年、３次元幹細胞培養に基づくオルガノイド（ｏｒｇａｎｏｉｄ）技術は、in vitroで器官の形成・発生の全過程をシミュレートすることが期待されており、徐々に幹細胞技術と再生医学の新しい研究ホットスポットとなっている。煩雑な立体構造と機能を持つ肝臓は、人体中の最も重要な内分泌・外分泌器官の1つであり、その体内での発生過程は、多くの因子によって共同で制御されている。肝実質細胞（肝細胞）と肝非実質細胞（例えば、胆管上皮細胞、クッパー細胞、ＮＫ細胞）は、肝組織の構造と機能を構成する基本単位であり、その中で肝細胞と胆管上皮細胞は肝臓内の主な機能を担っており、様々なサイトカインの制御下で肝芽細胞から分化している。初期肝内皮細胞とその分泌因子TGFβは、肝発生時の肝芽細胞の分化運命（肝細胞や胆管上皮細胞への分化運命）を制御するだけでなく、初期肝発生時の肝内皮細胞の横中隔間充織への移動や肝芽の形成を促進することが報告されている。 したがって、in vitroでの肝オルガノイド形成誘導の過程において、幹細胞を血管内皮細胞や肝細胞／胆管上皮細胞に分化誘導させ、一定の構造と機能を有する肝細胞凝集体を形成するための自己組織化を正確に制御することが、本技術の主な技術的ボトルネックとなっている。
【０００３】
細胞ソーティング（ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｕｔ）は肝オルガノイドの形成の第一段階であり、細胞表面の接着分子（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に関係している。カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ、本文で「Ｃａｄ」と略記）は、細胞特異的な接着因子の1つであり、同種細胞の表面に同じサブタイプのカルシウムカドヘリンが相同的に結合することで細胞間接着結合（Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を形成し、細胞の分化に影響を与える。また、カドヘリンは、胚発生における細胞認識、移動、組織分化、又は成体組織・器官の構成にも、大きな役割を果たしている。上皮細胞カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）は、哺乳動物の発生過程の中で最先に発現したカドヘリンであり、胚性幹細胞分裂球の密着結合および上皮細胞の分化に対して重要な影響を与える。なお、血管内皮細胞カドヘリン（ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）は、幹細胞／内皮前駆細胞の内皮細胞への分化及びその機能実現に重要な役割を果たしている。
【０００４】
Ｆｃセグメントに基づく複数種のカドヘリン融合蛋白質は、組織工学や再生医学の研究に応用されている。例えば、Ｅ−カドヘリン−Ｆｃ、Ｎ−カドヘリン−Ｆｃ等は、細胞外マトリクスの修飾成分の1つとして用い、細胞行為の制御への影響を研究している。内皮細胞間の接着接合の重要な構成要素である血管内皮細胞カドヘリン蛋白（ＶＥ−カドヘリン）は、新生血管化の過程で非常に重要な役割を果たしていることが研究により明らかにされている。
【０００５】
南開大学の杜鳳儀、許可博士は、ヒト内皮細胞カドヘリン蛋白の細胞外ドメインと、イムノグロブリンＩｇＧのＦｃドメインからなる融合蛋白質（ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ）を生合成し、ポリスチレン培養プレート表面への固定化と血管内皮細胞の接着・増殖・遊走・分化機能の発現調節における生物学的活性を調査・最適化した（杜鳳儀、許可、博士学位論文、２０１１、２０１６年、南開大学）。
【０００６】
しかしながら、これまでのところ、先行技術において、ヒト内皮細胞カドヘリン蛋白−Ｆｃ融合蛋白質による幹細胞の肝細胞への分化の促進についての報告はない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質（例えば、ヒト上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃと略記）、血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質（例えば、ヒト血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃと略記）と内皮細胞増殖因子融合蛋白質（例えば、ヒトＶＥＧＦ１６５−Ｆｃ融合蛋白質、ｈＶＥＧＦ−Ｆｃと略記）を基材に固定し、幹細胞を基材表面に固定した融合蛋白質上で二次元的に培養し、或いは、表面に融合蛋白質を固定された基材を３次元的に幹細胞の凝集体の内部に導入し、細胞表面のカドヘリンと基材表面の同種タイプのカドヘリン−Ｆｃとの結合によって、基材表面の幹細胞の接着、移動とソーティングを制御し、さらに、幹細胞の分泌機能を制御し、外来性の細胞分化因子との相乗効果により、生体の細胞外微小環境を生体工学的に構築し、幹細胞の分化を制御する。Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ、ＶＥ−ｃａｄ−ＦｃとＶＥＧＦ−Ｆｃを同一又は異なる基材に固定することで、幹細胞から肝様細胞、内皮様細胞、膵島様細胞、胆管上皮様細胞への分化効率を向上させる。
【０００８】
融合蛋白質は、分化誘導の全過程において、以下のような主な役割を果たしている。
１．基材材料表面に固定した異なるサブタイプのカドヘリン融合蛋白質は、幹細胞からの複数細胞の凝集体の形成を媒介し、カドヘリンサブタイプ依存性の細胞接着を可能にし、幹細胞による組織特異性の細胞外微小環境の構築を促進する。
２．また、対応する外因性サイトカインと協働して、内皮および上皮への幹細胞分化を方向的に誘導する。ＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃは、内在、外来性のＶＥＧＦと協調して、幹細胞を内皮様細胞へ迅速に分化誘導するのを促進する。同時に、それらが分泌した細胞外マトリクス、サイトカインおよび内皮ニッチの形成によって、さらにＥ−ｃａｄ−Ｆｃと協調して幹細胞を上皮様細胞へ分化誘導する。Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ、外来添加したサイトカインと内皮ニッチ及びその内在性ＴＧＦβの働きで、幹細胞の肝様細胞又は胆管上皮様細胞への分化をそれぞれ調節する。このプロセスは、主に融合タンパク質の種類と濃度の調節を介して、in vitroで肝臓の発生プロセスをよりよく生体工学的に模倣している。
３．分化過程で、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃは、幹細胞のＥＧＦ受容体のリン酸化を持続的に活性化させて、外来性のＥＧＦの使用を代替する。ＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃは、幹細胞のＶＥＧＦの発現を持続的に上向きに調節するだけではなく、幹細胞のＶＥＧＦ受容体のリン酸化も効果的に活性化でき、幹細胞の内皮細胞への定向分化において外来性のＶＥＧＦの添加に対する依存性を減少させる。
【０００９】
４．Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃは幹細胞のＨＮＦ４αの発現を上向きに調節し、幹細胞のＭＥＴ形質転換を促進し、幹細胞の肝様細胞への分化を促進する。
５．Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃは幹細胞のβ−カテニン発現を抑制するだけでなく、細胞質内での局在性を高めることで、幹細胞の肝様細胞への分化を促進する。
６．Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃは、ＹＡＰタンパク質の発現及びそれが細胞内の分布を調節することで、幹細胞の内皮および上皮への定向分化を促進する。
７．Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃは、幹細胞の凝集体構造と機能の安定性を改善させ、生体内の細胞微小環境を模倣し、幹細胞の体外定向分化を促進する。
８．Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃは、幹細胞を複数細胞の凝集体に形成させ、幹細胞の定向分化を効率よく制御でき、分化効率を上げる。肝臓、胆、膵臓のオルガノイドの構築、及びそれらの再生医学、薬品の研究開発等の分野における使用について、新たな方案と技術を提供する。
【００１０】
具体的に、本発明は、肝様細胞、内皮様細胞、胆管上皮様細胞、膵島様細胞の分化において、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ、ＶＥ−ｃａｄ−ＦｃとＶＦＧＦ−Ｆｃの使用に関する。
本発明の１つの態様は、細胞の中に存在するＥＧＦＲを活性化するための、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃの使用に係る。
本発明の１つの態様は、幹細胞から肝様細胞、膵様細胞又は胆管上皮様細胞への分化誘導を促進するための、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃの使用に係る。
本発明の１つの実施形態では、前記Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃは、ＥＧＦの代わりに用いられる。
本発明の１つの実施形態では、前記Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃは基材に固定される。
本発明の１つの態様は、幹細胞を内皮様細胞、肝様細胞、膵様細胞又は胆管上皮様細胞への分化誘導を促進するための、ＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの使用に係る。
本発明の１つの実施形態では、前記ＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃが基材に固定される。
本発明の１つの実施形態では、前記ＶＥ−ｃａｄ−ＦｃはＶＥＧＦ−Ｆｃと併用する。
本発明の１つの実施形態では、前記ＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃと前記ＶＥＧＦ−Ｆｃが基材に固定され、好ましくは、同一又は異なる基材に固定される。
【００１１】
本発明の１つの態様は、細胞を内皮様細胞、肝様細胞、膵様細胞又は胆管上皮様細胞への分化誘導を促進するための、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの使用に係る。
本発明の１つの実施形態では、前記Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃと前記ＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃとの比率が３：１〜１：３であり、好ましくは１：３、３：１又は１：１である。
本発明の１つの実施形態では、前記ＶＥ−ｃａｄ−ＦｃはＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質と併用する。
本発明の１つの実施形態では、前記ＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃと前記ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質が基材に固定され、好ましくは同一又は異なる基材に固定される。
本発明の１つの態様は、幹細胞をＥ−ｃａｄ−Ｆｃ及び／又はＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの存在下で培養することを特徴とする、肝様細胞、膵様細胞又は胆管上皮様細胞の製造方法に係る。
【００１２】
本発明の１つの態様は、幹細胞をＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの存在下で培養することを特徴とする、内皮様細胞の製造方法に係る。
本発明の１つの実施形態では、幹細胞を、ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質をさらに添加して培養する。
本発明の１つの実施形態では、前記Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃと前記ＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃが基材に固定され、好ましくは同一又は異なる基材に固定される。
本発明の１つの実施形態では、前記幹細胞は間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞又は胚性幹細胞である。
本発明の１つの実施形態では、前記幹細胞は哺乳動物由来、好ましくはヒト、ネズミ、ブタ由来である。
本発明の１つの実施形態では、前記上皮細胞カドヘリンはヒト上皮細胞カドヘリンであり、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示される配列である。
本発明の１つの実施形態では、前記血管内皮細胞カドヘリンはヒト血管内皮細胞カドヘリンであり、好ましくはその配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される配列である。
本発明の１つの実施形態では、前記ＦｃはヒトＩｇＧ（好ましくは、ＩｇＧ１）のＦｃであり、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される配列である。
本発明の１つの実施形態では、前記血管内皮細胞増殖因子はヒトＶＥＧＦ１６５であり、好ましくはＶＥＧＦの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１である。
【００１３】
本発明の１つの態様は、上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質、及び／又は血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質を含む、細胞培養のための修飾基材に係る。好ましくは、前記上皮細胞カドヘリンがヒト上皮細胞カドヘリンであり、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示される配列であり、前記血管内皮細胞カドヘリンはヒト血管内皮細胞カドヘリンであり、好ましくはその配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される配列である。
本発明の実施形態では、前記基材は、細胞から内皮様細胞、肝様細胞、膵様細胞又は胆管上皮様細胞への分化を促進するためのものである。好ましくは、前記幹細胞は間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞又は胚性幹細胞であり、より好ましくは、前記幹細胞は哺乳動物由来、好ましくはヒト、ネズミ、ブタ由来である。
本発明の実施形態では、修飾基材が血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質を含む場合、さらにＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質を含み、好ましくは、前記ＶＥＧＦはヒトＶＥＧＦ１６５であり、より好ましくは、ＶＥＧＦの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１である。
【００１４】
本発明のもう１つの態様は、細胞（好ましくは幹細胞、より好ましくは間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞又は胚性幹細胞）の分化（好ましくは、内皮様細胞、肝様細胞、膵様細胞又は胆管上皮様細胞への分化）を促進するための、前記修飾基材の使用に係る。
本発明のもう１つの態様は、上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質、及び／又は血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質を基材と混合して、前記基材を修飾することを含む、修飾基材を調製する方法に係る。
本発明の実施形態では、前記基材は細胞から内皮様細胞、肝様細胞、膵様細胞又は胆管上皮様細胞への分化を促進するための基材である。好ましくは、前記幹細胞は間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞又は胚性幹細胞であり、より好ましくは、前記幹細胞は哺乳動物由来、好ましくはヒト、ネズミ、ブタ由来である。
本発明の実施形態では、血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質を用いて基材を修飾する場合、さらにＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質を用いて前記基材を修飾する。好ましくは、前記ＶＥＧＦはヒトＶＥＧＦ１６５であり、より好ましくはＶＥＧＦの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１である。
【００１５】
本発明の上述したさまざまの実施形態では、前記基材は、細胞培養プレート、細胞培養ディッシュ、ハイドロゲル、多孔質スキャホールド（好ましくは、ＰＬＧＡスキャホ−ルード又はＰＧＬスキャホ−ルード）又はマイクロビーズからなる群から選ばれる。好ましくは、前記マイクロビーズの粒子径が１０−５０μｍ（好ましくは、１５−３０、１５−２０μｍ）であり、好ましくは疎水性マイクロビーズ又は親水性マイクロビーズであり、より好ましくは前記マイクロビーズがＰＬＧＡマイクロビーズであり、さらに好ましくは粒子径が１０−５０μｍ（好ましくは、１５−３０、１５−２０μｍ）のＰＬＧＡマイクロビーズである。あるいは、前記マイクロビーズはポリスチレンビーズであり、より好ましくは粒子径が１０−５０μｍ（好ましくは、１５−３０、１５−２０μｍ）のポリスチレンマイクロビーズである。
【００１６】
本発明の上述したさまざまの実施形態では、前記多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズは、親水性又は疎水性である。１つの実施形態では、前記多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズは親水性の多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズである場合、前記上皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質又は前記血管内皮細胞カドヘリン−Ｆｃ融合蛋白質が、リンカー（好ましくは、Ｆｃ−結合ペプチド）を介して前記多孔質スキャホールド、フィルム又はマイクロビーズに連接される。好ましくは、前記Ｆｃ結合ペプチドは、ＣＨＷＲＧＷＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）、ＨＹＦＫＦＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４、ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ  ３、４参照）、ＨＦＲＲＨＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５、ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ  ３、４参照）、ＦＹＷＨＣＬＤＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６、ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ  １、２参照）又はＳｐＡ（ブドウ球菌（staphylococcal）プロテインA 、ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ  １、２参照）からなる群から選ばれる。
【００１７】
本発明の前記したさまざまの実施形態では、好ましくは、前記ハイドロゲルが、ヒアルロン酸ハイドロゲルであり、より好ましくは、アクリルヒドラジン化ヒアルロン酸ハイドロゲル、又はＰＡＭＡＭデンドリマー／チオール化ヒアルロン酸ハイドロゲルである。
本発明の実施形態では、前記アクリルヒドラジン化ヒアルロン酸ハイドロゲルは、アジピン酸ジヒドラジドとＮ−アクリルオキシスクシンイミドで、ヒアルロン酸を修飾して調製される。
【００１８】
本発明の実施形態では、前記ＰＡＭＡＭデンドリマー／チオール化ヒアルロン酸ハイドロゲルは、ＰＡＭＡＭデンドリマーとチオール化ヒアルロン酸とのマイケル付加反応によって調製される。
【００１９】
ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ
１．Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＩｇＧ  ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ，８８（２０１４（１−１１）。
２．ＦＹＷＨＣＬＤＥ−ｂａｓｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ＩｇＧ：  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，  １３５５（２０１４）１０７−１１４。
３．Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｘａｍｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，１２１８（２０１１）１６９１−１７００。
４．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ｖｉａ  Ｆｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  １２１６（２００９）９１０−９１８。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの構成の模式図とその同定。この中で、図１Ａは、ｐｃＤＮＡ  ３．１−ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの構造を示す模式図である；図１Ｂは、精製したｈＶＥ−ｃａｄ−ＦｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥとＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔによる解析結果を示す。この中で、Ｍ：基準タンパク質；Ｐ：ヒトＩｇＧ（陽性対照、Ｓｉｇｍａカタログ番号、Ｎｏ．Ｍ１５１５４）；Ｒ：還元条件で精製したｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質；Ｎ：非還元条件で精製したｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質。
【図２】ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃの構成の模式図とその同定。この中で、図２Ａは、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターの酵素消化による同定を示す。Ｍ：基準タンパク質；１：酵素消化したｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質の遺伝子断片；２：酵素消化したｈＥ−ｃａｄの細胞外ドメインの遺伝子断片；３：酵素消化したＦｃ遺伝子断片；４：酵素消化なしのプラスミドベクター；図２ＢはｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質のウエスタンブロット同定を示す。Ｍ：ｍａｒｋｅｒ；１：還元態のヒトＥ−カドヘリン融合蛋白質；２：非還元態のヒトＥ−カドヘリン融合蛋白質。
【図３】コラーゲン溶液、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの混合溶液により基材およびＴＣＰＳ基材の表面をそれぞれ処理して、２４時間培養した細胞の関連因子の遺伝子の発現。
【図４】コラーゲン溶液、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの混合溶液により基材およびＴＣＰＳ基材の表面をそれぞれ処理して、４８時間培養した細胞の関連因子の遺伝子の発現。
【００２１】
【図５】それぞれ、コラーゲン溶液、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液およびｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液により、基材を異なる時間で処理して、細胞を培養する場合、総ＥＧＦ受容体とリン酸化ＥＧＦ受容体リン酸化タンパク質の発現。
【図６】ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液で処理した基材により、異なる濃度のＥＧＦの存在下で細胞を培養する場合、総ＥＧＦ受容体、リン酸化したＥＧＦ受容体、Ｏｃｔ４、ＣＫ１８、ＣＫ１９およびβ−アクチンの発現。
【図７】ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液と異なる濃度のｈＶＥＧＦ−Ｆｃ溶液で共処理した基材で細胞を培養する場合、総ＶＥＧＦＲ２受容体、リン酸化ＶＥＧＦＲ２受容体、Ｏｃｔ４、ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンおよびβ−アクチンの発現。
【図８】それぞれ、コラーゲン溶液、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で処理した基材表面で、定向分化誘導された細胞の形態。
【図９】それぞれ、コラーゲン溶液、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で処理した基材表面で、定向分化誘導された細胞のＯｃｔ４、ＦｏｘＡ２およびＳｏｘ１７遺伝子の発現。
【図１０】それぞれ、コラーゲン溶液、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で処理した基材表面で、定向分化誘導された細胞のＣＫ１８、ＡＦＰおよびＡＬＢ遺伝子の発現。
【００２２】
【図１１】それぞれ、コラーゲン溶液、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で処理した基材表面で、定向分化誘導された細胞のＯＡＴＰおよびＭＲＰ２遺伝子の発現。
【図１２】それぞれ、コラーゲン溶液、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で処理した基材表面で、定向分化誘導された細胞のＧ６Ｐａｓｅおよびα１−ＡＴ遺伝子の発現。
【図１３】それぞれ、コラーゲン溶液、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で処理した基材表面で、定向分化誘導された細胞のＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンおよびＶＥＧＦＲ２遺伝子の発現。
【図１４】それぞれ、コラーゲン溶液、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で処理した基材表面で、定向分化誘導された細胞のＡＬＢ分泌およびＵｒｅａ合成。
【図１５】それぞれ、コラーゲン溶液、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で処理した基材表面で、４週間定向分化誘導された細胞が発現したＡＬＢの免疫蛍光染色。
【００２３】
【図１６】それぞれ、コラーゲン溶液、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で処理した基材表面で、定向分化誘導された細胞の関連タンパク質の発現。
【図１７】それぞれ、コラーゲン溶液、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で処理した基材表面で、定向分化誘導された細胞が分泌した関連因子の遺伝子の発現。
【図１８】それぞれ、コラーゲン溶液、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの混合溶液で基材又はＴＣＰＳ基材表面を処理して、細胞を４８時間培養した時に、細胞が発現したＹＡＰタンパク質の免疫蛍光染色の結果。
【図１９】それぞれ、コラーゲン溶液、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で処理した基材表面で、定向分化誘導された細胞のＭＥＴ形質転換に関連する遺伝子の発現。
【図２０】ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液とｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液の固定量、安定性とマイクロビーズの表面での分布。
【００２４】
【図２１】細胞とマイクロビーズの異なる配合比率で調製した細胞凝集体の形態。
【図２２】細胞とマイクロビーズの異なる配合比率で調製した細胞凝集体が１週間定向分化誘導された時、関連遺伝子の発現。
【図２３】コラーゲン溶液修飾マイクロビーズ、ｈＥ−ｃａｄ−ＦｃとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの異なる配合比率で修飾マイクロビーズによって調製した細胞凝集体は、１週間分化誘導した時、関連遺伝子の発現。
【図２４】コラーゲン溶液修飾マイクロビーズ、異なる配合比率のｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ修飾マイクロビーズによって調製した幹細胞の凝集体は、１週間分化誘導した時、関連遺伝子の発現。
【図２５】マイクロビーズを含まない細胞凝集体、コラーゲン溶液修飾マイクロビーズを含む細胞凝集体、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとを含む細胞凝集体、及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で修飾されたマイクロビーズを含む幹細胞の凝集体が、４週間分化誘導された時、関連遺伝子の発現。
【００２５】
【図２６】マイクロビーズを含まない細胞凝集体、コラーゲン溶液修飾マイクロビーズを含む細胞凝集体、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとを含む細胞凝集体、及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で修飾されたマイクロビーズを含む幹細胞の凝集体が、２週間分化誘導された時、細胞のＡＬＢとＣＤ３１の免疫蛍光染色。
【図２７】ヒト臍静脈内皮細胞とｈＭＳＣとを含む細胞凝集体、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとを含む幹細胞の凝集体、及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で修飾されたマイクロビーズを含む幹細胞の凝集体が、４週間分化誘導された時、関連遺伝子の発現状況とＡＬＢの分泌。
【図２８】それぞれ、コラーゲン溶液、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で処理した基材表面で、定向分化誘導された細胞のＯｃｔ４、ＰＤＸ−１、ＩＮＳ、ＭＡＦＡ、ＣＰＡ１およびβ−アクチン遺伝子の発現。
【図２９】マイクロビーズを含まない細胞凝集体、ＰＬＧＡマイクロビーズを含む細胞凝集体、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ修飾マイクロビーズを含む細胞凝集体が、それぞれ１週間分化誘導された時、関連遺伝子と蛋白質の発現。この中で、図２９Ａは、１週間分化誘導した時、内皮細胞の関連するマーカー遺伝子と蛋白質の発現を示す。図２９Ｂは、１週間分化誘導した期間の関連因子および間質遺伝子の発現を示す。
【図３０】ＰＡＭＡＭデンドリマーを合成する経路の図と、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質によるハイドロゲルの機能化修飾。この中で、図３０Ａは、ＰＡＭＡＭデンドリマーを合成する経路の図であり、図３０Ｂは、三つの異なるＰＡＭＡＭデンドリマーの核磁気共鳴の水素スペクトルの図であり、図３０Ｃは、Ｆｃ−ｂｐ含有／非含有のハイドロゲルの中、１４日間にわたってｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質の固定量のパーセンテージであり、図３０Ｄは、異なる手段で修飾したハイドロゲルによって、ＨＵＶＥＣとｈＭＳＣの接着と増殖を示す。
【００２６】
【図３１】ハイドロゲルの物理化学的特性の特性化。この中で、図３１Ａは、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾前、後のハイドロゲルは、培地、ヒアルロニダーゼ、ｈＭＳＣ又はＨＵＶＥＣ上清において、それぞれの異なる時点の残量のパーセンテージを示す。図３１Ｂは、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾前、後のハイドロゲルの、ＰＢＳにおける膨潤性を示す。図３１Ｃは、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾前、後のハイドロゲルのレオメーター特性を示す。図３１Ｄは、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾前、後のハイドロゲルの外観特徴を示す。
【図３２】ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ機能化修飾ハイドロゲルによるＨＵＶＥＣの生存に対して影響の検討。この中で、図３２Ａは、異なる修飾ハイドロゲルでＨＵＶＥＣを３日間二次元的培養した時、光学顕微鏡にて観察した図である。図３２Ｂは、ＨＵＶＥＣが異なる修飾ハイドロゲルで３日間二次元的培養した時の生存死亡染色図である；図３２Ｃは、ＨＵＶＥＣを異なる修飾ハイドロゲルで二次元的４、２４、４８と７２時間培養した時、ＣＣＫ−８にて検出した接着、増殖を示す。図３２Ｄは、ＨＵＶＥＣが異なる修飾ハイドロゲルでの３日間二次元的培養した時の細胞の骨格染色を示す。図３２Ｅは、ＨＵＶＥＣが異なる修飾ハイドロゲルで１、３、５と７日間３次元的培養した時の接着、増殖を示す。図３２Ｆは、ＨＵＶＥＣが異なる修飾ハイドロゲルで７日間３次元的培養した時の生存死亡染色を示す。
【図３３】ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質機能化修飾ハイドロゲルによるＨＵＶＥＣの血管機能化に対する影響。この中で、図３３Ａ、Ｂは、ＨＵＶＥＣを異なる修飾ハイドロゲルでそれぞれ２４、４８、７２時間培養した後、ｖＷＦとｅＮＯＳタンパク質の発現をウェスタンブロッティングにて検出した。図３３Ｃは、ＨＵＶＥＣを異なる修飾ハイドロゲルで４、２４、４８、７２時間培養した後の一酸化窒素放出量である；図３３Ｄは、ＨＵＶＥＣを異なる修飾ハイドロゲルで７２時間培養した後、レーザー共焦点顕微鏡にて低密度リポ蛋白に対する貪食を検出した。
【図３４】クリヒドラジド化ヒアルロン酸の核磁気共鳴の水素スペクトルテストである。この中で、図３４Ａは、ＨＡの核磁気共鳴の水素スペクトルであり、図３４Ｂは、ＨＡ−ＡＤＨの核磁気共鳴の水素スペクトルであり、図３４Ｃは、ＨＡ−ＡＣの核磁気共鳴の水素スペクトルである。
【図３５】融合蛋白質ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃはハイドロゲルに固定されている１週間の、酵素結合イムノソルベントアッセイ試験を示す。
【００２７】
【図３６】ハイドロゲルのゲル化性、安定性と分解性についての、物理化学的特性の特性化。この中で、図３６Ａは、異なる架橋剤によるゲルの図である。図３６Ｂは、異なる架橋度を有するハイドロゲルが、ＰＢＳ溶液での安定性の解析、低架橋度を有するハイドロゲルについてのレオロジーの解析である。図３６Ｃは、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃによる機能的に修飾された前、後のハイドロゲル（ＤＴＴによる架橋、ＭＭＰによる架橋）の膨潤性の検討である。
【図３７】マイクロビーズを含まない細胞凝集体（ｍと記す）、コラーゲン溶液修飾マイクロビーズを含む細胞凝集体（ｍｃｐと記す）、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとを含む細胞凝集体（（ｍＥ＋ｍＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと記す）、及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で修飾されたマイクロビーズ（ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと記す）を含む幹細胞の凝集体が、２週間分化誘導された時、細胞のＣＫ１８とＣＫ１９の免疫蛍光染色。
【図３８】ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ修飾マイクロビーズを含む細胞凝集体（（ｍＥ＋ｍＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと記す）、及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で修飾されたマイクロビーズを含む複数の幹細胞の凝集体（ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと記す）が、２週間分化誘導された時、細胞のＣＫ１９の免疫蛍光染色。
【図３９】マイクロビーズを含まない細胞凝集体（ｍと記す）、コラーゲン溶液修飾マイクロビーズを含む細胞凝集体（ｍｃｐと記す）、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ修飾マイクロビーズを含む細胞凝集体（（ｍＥ＋ｍＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと記す）、及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で修飾されたマイクロビーズを含む幹細胞の凝集体（ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと記す）が、２週間分化誘導された時、細胞のアルブミンとＣＤ３１のフローサイトメトリーでの検出。
【図４０】マイクロビーズを含まない細胞凝集体（ｍと記す）、コラーゲン溶液修飾マイクロビーズを含む細胞凝集体（ｍｃｐと記す）、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ修飾マイクロビーズを含む細胞凝集体（（ｍＥ＋ｍＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと記す）、及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で修飾されたマイクロビーズを含む幹細胞の凝集体（ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと記す）が、２週間分化誘導された時、細胞のＰＡＳとインドシアニングリーン染色の図。図４０Ａは、分化誘導した後の肝オルガノイドのＰＡＳ染色の図である；図４０Ｂは、分化誘導した後の肝オルガノイドには、インドシアニングリーンの摂取と放出の図である。
【００２８】
【図４１】マイクロビーズを含まない細胞凝集体（ｍと記す）、コラーゲン溶液修飾マイクロビーズを含む細胞凝集体（ｍｃｐと記す）、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ修飾マイクロビーズを含む細胞凝集体（（ｍＥ＋ｍＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと記す）、及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で修飾されたマイクロビーズを含む幹細胞の凝集体（ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと記す）が、２週間分化誘導された時、細胞のＭＲＰ２の免疫蛍光染色図。
【図４２】マイクロビーズを含まない細胞凝集体（ｍと記す）、コラーゲン溶液修飾マイクロビーズを含む細胞凝集体（ｍｃｐと記す）、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ修飾マイクロビーズを含む細胞凝集体（（ｍＥ＋ｍＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと記す）、及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で修飾されたマイクロビーズを含む幹細胞の凝集体（ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと記す）が、２週間分化誘導された時、細胞のＣＹＰ３Ａ４の免疫蛍光染色図。
【図４３】ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で修飾されたマイクロビーズによる肝オルガノイドの、モデルドラッグによる酸化ストレス損傷の評価。図４３Ａは、肝オルガノイドをアセトアミノフェンで処理した後の、ＲＯＳとミトコンドリアの染色の図である。図４３Ｂは、肝オルガノイドをイソニコチン酸ヒドラジッドで処理した後の、ＲＯＳとミトコンドリアの染色図である。
【図４４】ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃで修飾されたマイクロビーズとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃで修飾されたマイクロビーズを含むことによる肝オルガノイドに対して、モデルドラッグによる酸化ストレス損傷の評価。図４３Ａは、アセトアミノフェンにより肝オルガノイドを処理した後の、ＲＯＳとミトコンドリアの染色の図である。図４４Ｂは、イソニコチン酸ヒドラジッドで肝オルガノイドを処理した後の、ＲＯＳとミトコンドリアの染色図である。
【図４５】マイクロビーズを含まないマウス幹細胞凝集体、コラーゲン溶液修飾マイクロビーズを含むマウス幹細胞凝集体、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとを含むマウス幹細胞凝集体、及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液で修飾されたマイクロビーズを含むマウス幹細胞凝集体が、３週間分化誘導された時、関連遺伝子の発現。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、実施例と図面を参照して本発明を詳細に説明する。一般当業者が理解できるように、以下の実施形態は例示を目的とするものであり、本発明を何らこれらに限定されるものと解釈されるべきではない。本発明の保護範囲は、後述する請求項により限定された。
【００３０】
実施例１：ヒトｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質の構築と発現
杜鳳儀、博士論文、南開大学、２０１１年１１月を参照。主な内容は以下の通りである。
【００３１】
１．１  血管内皮細胞カドヘリンの細胞外ドメイン遺伝子ＶＥ−ｃａｄのクローニングと配列分析
ＵｎｉＰｒｏｔデータベースに収載したヒトＶＥ  カドヘリンの蛋白配列と機能ドメインに基づいて、ＧｅｎＢａｎｋに収載した遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００１７９５．３）配列を参考して特異的なＰＣＲプライマーを設計し、ｈＶＥ  カドヘリン蛋白の細胞外ドメイン（ＥＣ１−ＥＣ５）を増幅した。上流プライマー（Ｐ１）：５′−ＣＣＧＧＡＴＡＴＣＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＴＣＣ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＥｃｏＲＶ酵素消化サイトを組み込まれ（下線）、下流プライマー：（Ｐ２）５′−ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＡＴＡＴＣ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＮｏｔＩ酵素消化サイトを組み込まれた（下線）。プライマーの合成およびシークエンス解析は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ．に委託して実施した。
【００３２】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ会社、米国）の総ｍＲＮＡの抽出：『分子クローニング実験ガイド』（第３版）の中の常法に従ってｍＲＮＡを抽出した。Ｏ．Ｄ値を測定して、ＲＮＡの純度と濃度を定量した。逆転写は、購入したＢＤ会社のキットのＴａｑＭａｎ＠ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓにて作業を行い、次のような逆転写系を用いた：
【００３３】
【表１】
2021519603.tif 000003
【００３４】
逆転写のプログラムは以下の通りである。
【００３５】
【表２】
2021519603.tif 000004
【００３６】
ＨＵＶＥＣ  ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡを鋳型として、ＶＥ−ｃａｄの遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ反応系は以下の通りである。
【００３７】
【表３】
2021519603.tif 000005
【００３８】
増幅の条件は：９４℃で３０ｓ変性、６０℃で３０ｓアニーリング、７２℃で３０ｓ伸長、計３５サイクル、最後７２℃で１０分間伸長した。反応液に３８０μＬ  ｄｄＨ２Ｏを加えて、同体積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出を一回行い、１／１０倍体積の３Ｍ  ＮａＡｃ（ｐＨ  ５．０）、２倍体積の無水エタノールを加えて、−２０℃で１ｈ放置した。４℃、１２０００  ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿物は７０％エタノールで洗浄を両回行い、真空乾燥した。沈殿物は適量のＴＥに溶解した。
【００３９】
１．２  ｐｃＤＮＡ  ３．１−ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ真核発現ベクターの構築
（１）ＥｃｏＲＶ、ＮｏｔＩ二重酵素消化で精製したＰＣＲ産物
酵素消化系は以下の通りである。
【００４０】
【表４】
2021519603.tif 000006
【００４１】
３７℃でオーバーナイト反応し、６５℃で１５分間に酵素を非働化し、反応液に３５０μＬ  ｄｄＨ２Ｏを加えて、さらに同体積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出を一回行い、１／１０倍体積の３Ｍ  ＮａＡｃ（ｐＨ  ５．０）、２倍体積の無水エタノールを加えて、−２０℃で１ｈ放置した。４℃、１２０００  ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿物は７０％エタノールで洗浄を両回行い、真空乾燥した。沈殿物は１０μＬ  ＴＥに溶解した。
【００４２】
（２）ｐｃＤＮＡ／３．１に対するＥｃｏＲＶとＮｏｔＩ酵素消化：
ｐｃＤＮＡ／３．１（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国、商品番号Ｖ７９０２０）の二重酵素消化系（３×５０μＬ）は以下の通りである。
【００４３】
【表５】
2021519603.tif 000007
【００４４】
３７℃でオーバーナイト反応した。酵素消化産物は、１％のアガロースゲルに電気泳動して分離した。目的断片をＵＶランプの下で切り取って、ＤＮＡアガロースゲル回収キット（ＴａＫａＲａ、日本、商品番号９７６２）を用いて回収して、回収した断片は２５μＬ  ｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【００４５】
（３）ベクターと目的断片とのライゲーション反応と形質転換反応
反応系は以下の通りである。
【００４６】
【表６】
2021519603.tif 000008
【００４７】
１６℃で１６ｈ反応した。その後、ＣａＣｌ２でコンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して、３７℃で１６〜１８ｈオーバーナイト培養した。形質転換細胞をピックアップし、プラスミドを少量抽出して検出した。
回収した目的遺伝子であるｈＶＥ−カドヘリンの細胞外ドメインと、Ｆｃ断片を持つベクターであるｐｃＤＮＡ  ３．１とを、分別、３７℃の恒温で二重酵素（ＥｃｏＲＶとＮｏｔＩ）消化した。電気泳動で回収して、回収した産物を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを触媒として１６℃でオーバーナイトライゲーションした。ライゲーション産物は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換して、アンピシリン（Ａｍｐ＋）を用いて耐性によるスクリーニングを行った。プラスミドは抽出した後、二重酵素消化で同定した。最初の同定で正しい組み換えプラスミドと認可されたものについて、ＤＮＡ配列を分析された。構築した組み換えプラスミドは、ｐｃＤＮＡ  ３．１／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃと命名した（図１Ａに示す）。シークエンス解析で配列の正確性を確認した。ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示す。なお、Ｆｃの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示し、ｈＶＥ−ｃａｄの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示す。
【００４８】
１．３  細胞のトランスフェクションとタンパク質の精製
ｐｃＤＮＡ  ３．１／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃで、２９３Ｆ細胞（中国科学院典型培養物寄託委員会細胞バンク）をトランスフェクションした。
免疫グロブリンのＦｃセグメントとｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａとの特異的な結合により、ＧＥヘルスケア会社のＨｉｔｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦカラムで、目的のタンパク質を精製した。
【００４９】
１．４  ウエスタンブロット分析
精製したｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動して、ＰＶＤＦフィルムに移行された。５％脱脂ミルクで２時間ブロックし、第一抗体であるウサギ抗ヒトＶＥ−カドヘリンの細胞外ドメインモノクローナル抗体（ＲＤ、米国、１：４００で希釈する）で、４℃で一晩インキュベートした。ＨＲＰ標識ヒツジ抗ウサギ第二抗体（Ａｂｃａｍ、米国、１：１００００で希釈する）で室温１ｈインキュベートした。フィルムをＴＢＳＴで洗浄して、ＤＡＢ試薬で露光させ、現像・定着させて分析した。Ｆｃからなる二量体の検出を行う場合、ローディングバッファーには、βメルカプトエタノールを含まない。結果は図１Ｂに示す。
図１Ｂから分かるように、非還元条件の場合、約２４０  ＫＤの位置に１つのバンドが見られ、還元条件の場合、約１２０  ＫＤの位置に１つのバンドが見られた。これらの結果より、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質は二量体として存在している示唆を与える。
【００５０】
実施例２：ヒトｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質の構築と発現
徐建斌、博士論文、南開大学、２０１３年１２月を参照した。本実施例の主な内容は以下の通りである。
【００５１】
２．１  上皮細胞カドヘリンの細胞外ドメイン遺伝子であるＥ−ｃａｄのクローニングと配列分析
ＵｎｉＰｒｏｔデータベースに収載したヒトＥ  カドヘリンの蛋白配列と機能ドメインに基づいて、ＧｅｎＢａｎｋに収載した遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ  ００４３６０．３）配列を参考して、特異的なＰＣＲ  プライマーを設計し、Ｅ  カドヘリン蛋白の細胞外ドメインを増幅した。上流プライマー（Ｐ１）：５’−ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧ−ＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６；下流プライマー：（Ｐ２）５’−ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴＴＧＣＡＡＴＣＣＴＧＣ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７。プライマーの合成およびシークエンス解析は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ．に委託して実施した。
【００５２】
Ｌ−０２（中国科学院典型的培養物寄託委員会細胞バンク）細胞の総ｍＲＮＡの抽出：分子クローニング実験ガイド》（第３版）の中の常法に従ってｍＲＮＡを抽出した。Ｏ．Ｄ値を測定して、ＲＮＡの純度と濃度の定量を行う。逆転写は、購入したＢＤ会社のキットのＴａｑＭａｎ＠ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓに従って操作を行った。逆転写系は以下の通りである。
【００５３】
【表７】
2021519603.tif 000009
【００５４】
逆転写のプログラムは以下の通りである。
【００５５】
【表８】
2021519603.tif 000010
【００５６】
Ｌ−０２  ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡを鋳型として、Ｅ−ｃａｄの遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ反応系は以下の通りである。
【００５７】
【表９】
2021519603.tif 000011
【００５８】
増幅の条件は：９４℃で３０ｓ変性して、６０℃で３０ｓアニーリングして、７２℃で３０ｓ伸長して、計３５サイクルを行って、最後、７２℃で１０分間伸長した。反応液に３８０μＬ  ｄｄＨ２Ｏを加えて、同体積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出を一回行い、１／１０倍体積の３Ｍ  ＮａＡｃ（ｐＨ  ５．０）、２倍体積の無水エタノールを加えて、−２０℃で１ｈ放置した。４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿物は７０％エタノールで洗浄を両回行い、真空乾燥した。沈殿物は適量のＴＥに溶解した。
【００５９】
２．２  ｐｃＤＮＡ  ３．１−ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ真核発現ベクターの構築
（１）Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、ＮｏｔＩ二重酵素消化で精製したＰＣＲ産物
酵素消化系は以下の通りである。
【００６０】
【表１０】
2021519603.tif 000012
【００６１】
３７℃オーバーナイト反応し、６５℃で１５分間に酵素を非働化し、反応液に３５０μＬ  ｄｄＨ２Ｏ加えて、同体積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出を一回行い、１／１０倍体積の３Ｍ  ＮａＡｃ（ｐＨ  ５．０）、２倍体積の無水エタノールを加えて、−２０℃で１ｈ放置した。４℃、１２０００  ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿物は７０％エタノールで洗浄を両回行い、真空乾燥した。沈殿物は１０μＬ  ＴＥに溶解した。
【００６２】
（２）ｐｃＤＮＡ／３．１に対するＨｉｎｄ  ＩＩＩとＮｏｔＩ酵素消化
【００６３】
【表１１】
2021519603.tif 000013
【００６４】
３７℃でオーバーナイト反応した。酵素消化産物は、１％のアガロースゲルで電気泳動して分離した。ＵＶランプの下で目的断片を切り取って、ＤＮＡアガロースゲル回収キット（ＴａＫａＲａ）を用いて回収して、回収した断片は２５μＬ  ｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【００６５】
（３）ベクターと目的断片とのライゲーション反応、形質転換反応
反応系は以下の通りである。
【００６６】
【表１２】
2021519603.tif 000014
【００６７】
１６℃反応１６ｈ。その後、ＣａＣｌ２でコンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して、３７℃で１６〜１８ｈオーバーナイト培養した。形質転換細胞をピックアップし、プラスミドを少量抽出して検出した。
回収した目的遺伝子であるＥ−カドヘリンの細胞外ドメインと、Ｆｃ断片を持つベクターｐｃＤＮＡ  ３．１とを、それぞれ、３７℃の恒温で二重酵素（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＮｏｔＩ）消化した。電気泳動で回収した後、回収した産物を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを触媒として、１６℃でオーバーナイトライゲーションした。ライゲーション産物は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換した後、アンピシリン（Ａｍｐ＋）を用いて耐性によるスクリーニングを行った。プラスミドは抽出した後、二重酵素消化で同定した。予備同定で正しいと認可された組み換えプラスミドは、ＤＮＡ配列を分析した（図２Ａに示す）。構築した組み換えプラスミドは、ｐｃＤＮＡ  ３．１／ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃと命名した。シークエンス解析で配列の正確性を確認した。ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示す。この中で、ｈＥ−ｃａｄの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示し、Ｆｃの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示す。
【００６８】
２．３  細胞トランスフェクションとタンパク質の精製
ｐｃＤＮＡ  ３．１／ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃで２９３Ｆ細胞（中国科学院典型的培養物寄託委員会細胞バンク）をトランスフェクションした。
免疫グロブリンのＦｃセグメントとｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａとの特異的な結合により、ＧＥヘルスケア会社のＨｉｔｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦカラムで、目的のタンパク質を精製した。
【００６９】
２．４  ウエスタンブロット分析
精製したｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動して、ＰＶＤＦフィルムに移行された。５％脱脂ミルクで２ｈブロックし、第一抗体であるウサギ抗ヒトＥ−カドヘリンの細胞外ドメインのモノクローナル抗体（ＲＤ、米国、１：４００で希釈する）で、４℃で一晩インキュベートした。ＨＲＰ標識ヒツジ抗ウサギ第二抗体（Ａｂｃａｍ、米国、１：１０,０００で希釈する）で室温１ｈインキュベートした。フィルムをＴＢＳＴで洗浄して、ＤＡＢ試薬で露光させ、現像・定着させて分析した。Ｆｃからなる二量体の検出を行う場合、ローディングバッファーには、βメルカプトエタノールを含まない。結果は図２Ｂに示す。
図２Ｂから分かるように、非還元条件の場合、約２４０ＫＤの位置１つのバンドが見られ、還元条件の場合、約１２０ＫＤの位置に１つのバンドが見られた。これらの結果より、ｈＥ−ｃａｄは二量体として存在している示唆を与える。
【００７０】
特記しない限り、以下の実施例に係るＰＣＲ反応は、以下の通り行う：
Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，  ＬＴＤから提供したＰＣＲキットを用いて、下表に従って、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅへフリーのＰＣＲチューブに、それぞれ下記成分を加えた：
【００７１】
【表１３】
2021519603.tif 000015
【００７２】
ＰＣＲ機の設定プログラム：９５°Ｃで５分間  １サイクル、９５℃で５分間、アニーリング温度で１分間、７２℃で４５ｓ、３５サイクルを繰り返し、７２℃１０分間  １サイクル、４℃で保温した。１％のアガロースゲルで電気泳動してＰＣＲ産物の発現状況を検出した。
【００７３】
実施例３．異なる修飾を行った基材の表面におけるは、ｈＭＳＣのサイトカインと細胞外マトリクスの分泌の検出
Ｉ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＢＤ、米国、商品番号３５４２４９）、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの混合溶液（２種の融合蛋白質の割合は、１：１）を、０．０１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）で、それぞれ終濃度が１０μｇ／ｍＬに希釈した。６ウェルの細胞培養プレートに、希釈したコラーゲン溶液とｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの混合溶液１．５  ｍＬを別々加えて、細胞インキュベーターに置き、３７℃で２ｈインキュベートした。取り出した後上清を棄て、０．０１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）で３回洗浄した。
【００７４】
その後、ｈＭＳＣ（Ｃｙａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．  中国）を細胞密度１０５細胞／ウェルで、ＴＣＰＳプレート、前記溶液でインキュベーション後の培養用プレートに接種した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＢＩ、米国）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ′ｓ  Ｆ１２  １：１（ＤＦ１２、ＢＩ、米国）培地を用いて、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に培養した。２４ｈ、４８ｈに個別に培養した後、培地を棄て、細胞を０．０１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）で３回洗浄した。ウェル毎に１ｍＬ  Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  、米国、商品番号１５５９６０２６）を加えて、製品明細書に従ってＲＮＡを抽出した。ＢｉｏｄｒｏｐでＲＮＡサンプルの濃度を測定した。２μｇ  ＲＮＡを取って、Ｒｏｃｈｅ逆転写キット（商品番号４６５５８７７００１）明細書に従って、キット添付のランダムプライマーにより逆転写して、ｃＤＮＡを得た（ＰＣＲ機の設定プログラム：５５°Ｃ  ３０分間  １サイクル、８５℃５分間  １サイクル、４℃で保温）。遺伝子の発現量は、Ｒｏｃｈｅ蛍光定量ＰＣＲキット（商品番号４９１４０５８００１）にて分析する。使用したプライマーの配列とアニーリング温度は、下記の表１（ＰＣＲ機の設定プログラム：９５℃で５分間  １サイクル、９５℃で５分間、アニーリング温度で１分間、７２℃で４５ｓ  ３５  サイクルを繰り返し、７２℃で１０分間  １サイクル、４℃に保温した）に示す。前記サンプルをよく混ぜて、蛍光定量ＰＣＲ機（Ｂｉｏｒａｄ）に置いて検出した。得られるデータは、ＴＣＰＳ群をコントロール群として、２−ΔΔＣｔ法により処理した。２４ｈ培養の検出結果は図３に示し、４８ｈ培養の検出結果は図４に示す。
【００７５】
ＰＣＲの結果から分かるように、ｈＥ−ｃａｄ−ＦｃとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの２種類の融合蛋白質の併用は、ｈＭＳの細胞外マトリクスプロテインとサイトカインの自己分泌能力を著しく向上させ、ｈＭＳＣが外来性のサイトカインの作用で定向分化誘導されることに寄与する。
【００７６】
【表１４】
2021519603.tif 000016
【００７７】
実施例４．異なる修飾を持つ基材表面においてＥＧＦ受容体の活性化時間の評価
実施例３の方法で６ウェルの細胞培養プレートを処理し、ｈＭＳＣを１０５細胞／ウェルの細胞密度で、Ｉ型コラーゲン、ｈＥ−ｃａｄ−ＦｃとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃで修飾した培養用プレートの表面に別々に接種した。細胞は維持用培地にて細胞インキュベーターに（３７℃、５％ＣＯ２）４ｈ培養した。Ｉ型コラーゲンで修飾した基材表面に接種した細胞は、１０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、米国、商品番号ＡＦ−１００−１５）を含む維持用培地にて培養して、ｈＥ−ｃａｄ−ＦｃとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃで別々修飾した基材表面に接種した細胞は、維持用培地（ＥＧＦを含まない）にて培養した。培養開始後０分間、１０分間、３０分間、６０分間、９０分間と１２０分間に、１００μＬ細胞強力溶解液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．）で細胞を溶解して、タンパク質を以下のように抽出した。異なるサンプルについて、異なる時点の総ＥＧＦ受容体（ｔｏｔａｌ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＳＴ、米国、１：１０００で希釈する）とＥＧＦリン酸化受容体（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒ  １０６８、１０６８位にリン酸化され、ＣＳＴ、米国、１：１０００で希釈する）の発現の状況を、ウエスタンブロットで検出した。結果を図５に示す。
【００７８】
タンパク質の抽出：
［１］２×１０６細胞に対して１００μＬの溶解液を加える割合で、溶解液を加えた。セルスクリーパーで細胞をさらに溶解させ、細胞の中の全部タンパク質を放出させ、４℃、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を得た；
［２］上清の中のタンパク質の含有率を、ＢＣＡキット（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、商品番号Ｐ００１０）にて検出した；
［３］上清に１：５の割合で５×ローディングバッファー（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、商品番号Ｐ００１５）を加えて、５分間沸騰させた。沸騰させたタンパク質は、ウェル毎に２０μｇタンパク質のインジェクションになるように、単独で−８０℃冷蔵庫に保存し、細胞の全部タンパク質の抽出を完成した。
【００７９】
図５から分かるように、培地に添加したＥＧＦによる刺激によって、コラーゲンで修飾された基材においてｈＭＳＣのＥＧＦ受容体のリン酸化は、６０分間以内に活性化状態を維持していた。６０分間後、ＥＧＦ受容体のリン酸化の活性化が消えて始めた。また、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃで修飾された基材表面においてｈＭＳＣ  ＥＧＦ受容体のリン酸化が、２ｈ以内にずっと活性化状態を維持していた。ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃで修飾された基材表面においてｈＭＳＣのＥＧＦ受容体のリン酸化は、活性化しなかった。これは、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃが、ＥＧＦ受容体及びそのリン酸化を特異性的、持続的に活性化できることを示した。
【００８０】
実施例５．ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃで修飾された基材表面において、異なる濃度のＥＧＦはｈＭＳＣの定向分化に与える影響
実施例３に記載のように調製したｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃで修飾された６穴プレートの表面に、１０５細胞／ウェルの細胞密度で、ｈＭＳＣを接種した。維持用培地でオーバーナイト培養した後、違うウェルに１．５  ｍＬの異なる濃度（０ｎｇ／ｍＬ、５  ｎｇ／ｍＬ、１０  ｎｇ／ｍＬ、１５  ｎｇ／ｍＬ、２０  ｎｇ／ｍＬと２５  ｎｇ／ｍＬ）のＥＧＦを含む肝定向分化用培地（ＤＦ１２＋２％ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ４＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ＋１＊ＩＴＳ、この中で、ＦＧＦ４は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ製、米国、商品番号は１００−３１；ＨＧＦは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ製、米国、商品番号は１００−３９Ｈ；ＩＴＳは、シグマ製、米国、商品番号はＩ３１４６）を加えた。両日毎に培地を交換した。７日間培養した後、タンパク質を抽出して、ウエスタンブロットにて違うサンプルのＯｃｔ４（Ａｂｃａｍ、米国、１：１０００で希釈する）、総ＥＧＦ受容体（ＣＳＴ、米国、１：１０００で希釈する）、リン酸化−ＥＧＦ受容体Ｔｙｒ  １０６８（ＣＳＴ、米国、１：１０００で希釈する）、ＣＫ１８（Ａｂｃａｍ、米国、１：１０００で希釈する）、及びＣＫ１９（Ａｂｃａｍ、米国、１：１０００で希釈する）の発現状況を検出した。結果を図６に示す。
【００８１】
図６から分かるように、分化用培地を加えた１週間後、ＥＧＦを含まない分化用培地の試験群には、肝細胞へ定向分化誘導効率が最も高くなる。これは、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ基材は、ｈＭＳＣから肝細胞への定向分化の過程の中で、ＥＧＦの関連機能を代わって、ＥＧＦ受容体のリン酸化を持続的刺激させ、ｈＭＳＣから肝細胞への分化誘導効率を上げた。
【００８２】
実施例６．ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃで修飾された基材表面に固定した異なる濃度のｈＶＥＧＦ−ＦｃがｈＭＳＣの定向分化への影響
０μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬの異なる終濃度でｈＶＥＧＦ−Ｆｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、金斯瑞会社で合成した）を含むように、（ここで、ｈＶＥＧＦの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１）ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液（終濃度が１０μｇ／ｍＬ）を調製した。１０５細胞／ウェルの細胞密度でｈＭＳＣを培養用プレートに接種し、維持用培地でオーバーナイト培養した後、内皮細胞分化用培地（ＤＦ１２＋２％ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、ＦＧＦ２、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ製、米国、商品番号１００−１８Ｂ）に交換して培養し、両日毎に換液した。７日間培養した後、ウエスタンブロットにて各サンプルのＯｃｔ４（Ａｂｃａｍ、ＭＡ、米国、１：１０００で希釈する）、総ＶＥＧＦ受容体（ＣＳＴ、米国、１：１０００で希釈する）、リン酸化−ＶＥＧＦ受容体Ｔｙｒ  １１７５（ＣＳＴ、米国、１：１０００で希釈する）、ＣＤ３１（ＣＳＴ、米国、１：１０００で希釈する）及びｈＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（Ａｂｃａｍ、米国、１：１０００で希釈する）の発現状況を検出した。結果を図７に示す。図７から分かるように、分化用培地を加えた１週間後、ｈＶＥＧＦ−Ｆｃの固定量が２μｇ／ｍＬである場合、ｈＭＳＣから血管内皮様細胞への分化効率は最も高くなる。これは、ｈＭＳＣから血管内皮様細胞へ分化誘導する過程において、一定濃度のｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ基材とｈＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質は、その分化の調節に協力する役割を果たし、それらはＶＥＧＦ受容体のリン酸化を持続的に刺激でき、ｈＭＳＣから血管内皮様細胞へ分化誘導する効率を上げることを証明した。
【００８３】
異なる修飾を持つ基材表面に使用する分化用培地として最も好ましい成分は以下の通りである。
（１）コラーゲン：ＤＦ１２＋２％ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−４＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ＋１＊ＩＴＳ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ＋４０ｎｇ／ｍＬ  ｈＶＥＧＦ
（２）ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ：ＤＦ１２＋２％ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−４＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ＋１＊ＩＴＳ＋４０ｎｇ／ｍＬ  ｈＶＥＧＦ
（３）ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ：ＤＦ１２＋２％ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−４＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ＋１＊ＩＴＳ。
【００８４】
実施例７．異なる修飾を持つ基材表面においてｈＭＳＣから肝細胞へ分化誘導する誘導の検出
実施例３の方法に従い、それぞれコラーゲン溶液とｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃで修飾した６ウェルの細胞培養プレートを調製した。ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ終濃度が１０μｇ／ｍＬ、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ終濃度が１０μｇ／ｍＬ且つｈＶＥＧＦ−Ｆｃ終濃度が２μｇ／ｍＬである混合溶液により修飾した６ウェルの細胞培養プレートを調製した。ｈＭＳＣを１０５細胞／ウェルの細胞密度で培養用プレート表面に接種して、維持用培地でオーバーナイト培養した後、特定の分化用培地（培地の成分は、実施例６の培地（１）−（３）を参考する）に交換した。両日毎に換液、２８日間連続培養を行って、０日目、７日目、１４日目、２１日目と２８日目に細胞の形態を観察した。図８から分かるように、分化用培地を加えた後、異なる基材表面におけるｈＭＳＣはいすれも形態改変が始め、分化１周時点で細胞の収縮が現れ、分化４周時点で細胞が卵円形を呈した。分化の過程全体にわたって、融合蛋白質基材の表面は、細胞数がコラーゲン群より顕著に多く、形態の改変もより早く起こった。これは、融合蛋白質はｈＭＳＣの定向分化を促進でき、分化効率を上げることを証明した。同時に、前記時点で各群の細胞ＲＮＡを抽出して逆転写して、ＰＣＲにて関連する胚葉遺伝子、肝細胞遺伝子、肝極性タンパク質遺伝子、代謝酵素遺伝子と内皮細胞遺伝子の発現状況を検出した。関連する遺伝子のプライマー配列、アニーリング温度は下表に示す。
【００８５】
Ｏｃｔ４、ＦｏｘＡ２、Ｓｏｘ１７とβ−アクチン（内部標準）のＰＣＲ増幅結果、分化時間に従うｍＲＮＡの相対発現量は、図９に示す（特に指定しない限り、以下実施例には、Ｃは、コラーゲン表面に培養した細胞を表し、ＥはｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ表面に培養した細胞を表し、Ｅ＋Ｖは、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ表面に培養した細胞を表す）。
ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＡＦＰ、ＡＬＢとβ−アクチン（内部標準）のＰＣＲ増幅結果、分化時間に従うｍＲＮＡの相対発現量は、図１０に示す。
ＯＡＴＰ、ＭＲＰ２とβ−アクチン（内部標準）のＰＣＲ増幅結果、分化時間に従うｍＲＮＡの相対発現量は、図１１に示す。
Ｇ６Ｐａｓｅ、α１−ＡＴとβ−アクチン（内部標準）のＰＣＲ増幅結果、分化時間に従うｍＲＮＡの相対発現量は、図１２に示す。
ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリン、ＶＥＧＦＲ２とβ−アクチン（内部標準）のＰＣＲ増幅結果、分化時間に従うｍＲＮＡの相対発現量は、図１３に示す。
【００８６】
ＰＣＲの結果から、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃで共同修飾された基材表面、及びｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃで修飾された基材表面でｈＭＳＣを培養することは、ｈＭＳＣの肝様細胞マーカーであるＡＦＰ、ＡＬＢと血管内皮様細胞マーカーであるＣＤ３１の発現を著しく向上でき、細胞極性タンパク質であるＯＡＴＰとＭＲＰ２の発現と維持を促進でき、細胞が肝機能に係るいくつかの代謝酵素であるＧ６Ｐａｓｅとα１−ＡＴを発現することを促進させ、また、共同修飾された基材表面における分化誘導効率は、一番よいであることが分かった。また、図１３から、血管内皮様細胞のマーカーであるＣＤ３１は、１週間の時点で発現が始まり、その発現時間は肝様細胞マーカーであるＡＬＢとＡＦＰの発現時間より早く（図１０）、肝臓の体内発生過程と似ている（即ち、まず内皮細胞を発生、形成し、その後、上皮細胞を発生、形成して）ことが分かった。そのため、かかる融合蛋白質の基材表面には、ｈＭＳＣが融合蛋白質によってｈＭＳＣの自己分泌、パラクリン等の機能を調節し、細胞の外界微小環境を生体工学的構築でき、肝細胞の体内発生の過程を模倣することを可能にし、分化効率を上げて、分化時間を短くでき、得た細胞はよりよく肝様細胞と血管様内皮細胞としての機能を維持、発現できることが証明された。
【００８７】
前記時点で細胞上清を採取して、ＥＬＩＳＡにてＡＬＢとＵｒｅａの発現量を検出した。ＥＬＩＳＡの結果を図１４に示す。図１４から分かるように、分化後の細胞のアルブミンの分泌とＵｒｅａの合成について、Ｅｌｉｓａにて検出した場合、その発現量は分化１４日目から段階的に高まり、また、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ群の発現量は、一貫してｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃおよびコラーゲン群より高いことを見出す。
【００８８】
【表１５】
2021519603.tif 000017
【００８９】
実施例８．異なる修飾を持つ基材表面においてｈＭＳＣから肝細胞への定向分化誘導の検出--免疫蛍光染色
実施例７の方法に従いレーザー共焦点細胞培養ディッシュを処理して、異なる分化誘導培地によりｈＭＳＣを分化誘導培養して、２８日間連続的培養を行った後、免疫蛍光染色した。細胞を固定して、開孔され、ブロックした後、希釈した１００μＬ  ＡＬＢ抗体（Ａｂｃａｍ、米国）を１：５００の希釈割合で加えて、４℃でオーバーナイトインキュベートした。その後、１００μＬ  ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国、商品番号Ａ２７０３４）を１：１０００の希釈割合で加えて、３７℃で２ｈ室温でインキュベートした。その後ＤＡＰＩを含む蛍光褪色防止用剤（Ａｎｔｉ−Ｆａｄｅ  Ｍｏｕｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、米国、商品番号０１００−２０）を加えて、４℃、暗所で保存した。レーザー共焦点顕微鏡（ライカ）で写真を取った。結果を図１５に示す。
【００９０】
図１５から分かるように、ｈＭＳＣが異なる基材表面に連続的分化４周の時点で、免疫蛍光染色の結果から、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃで共同修飾した基材表面において、細胞が肝様細胞のマーカーであるＡＬＢ（矢印で示す）をより多く発現し、これは、かかる基材表面においてｈＭＳＣから肝様細胞への定向分化効率が最も高い、かつその肝機能の発現も最も強いことを証明した。
【００９１】
免疫蛍光染色の工程は以下の通りである。 
［１］培地を棄て、冷い０．０１Ｍ  ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、ＰＢＳを棄て、新たに配製した４％パラホルムアルデヒドを加えて、室温で１０分間インキュベートした；
［２］パラホルムアルデヒドを棄て、冷い０．０１Ｍ  ＰＢＳで細胞を３回洗浄した。標的タンパク質が細胞質にいる場合、０．１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳ溶液で室温１０分間インキュベートして、冷い０．０１Ｍ  ＰＢＳで細胞を３回洗浄することを必要があり、標的タンパク質が細胞フィルムにいる場合、前記工程は不要である；
［３］１０％のヤギ血清で室温３０分間インキュベートして、上清を棄て、第一抗体（ＡＬＢ抗体）が１：５００の割合で０．０１Ｍ  ＰＢＳ溶液により希釈した後、細胞培養ディッシュに加えて、４℃でオーバーナイトした；
［４］上清を棄て、０．０１Ｍ  ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、毎回５分間である；
［５］第二抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体）は１：５００の割合で０．０１Ｍ  ＰＢＳ溶液により希釈した後、細胞培養ディッシュに加えて、３７℃、暗所で２ｈインキュベートした；
［６］上清を棄て、暗所で、０．０１Ｍ  ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、毎回５分間である；
［７］上清を棄て、ＤＡＰＩを含む蛍光褪色防止用剤を加え、４℃、暗所で保存した。レーザー共焦点顕微鏡（ライカ）で写真を取った。
【００９２】
実施例９．異なる修飾を持つ基材表面において細胞の定向分化誘導の機序についての検討--サイトカイン、基材タンパク質の分泌、及び分化の調節に関連するタンパク質の発現
実施例７の方法に従い細胞を培養して、分化誘導させ、０日目、７日目、１４日目、２１日目と２８日目でＲＮＡとタンパク質を抽出した。抽出したＲＮＡを逆転写して、蛍光定量ＰＣＲで関連サイトカインと基材タンパク質の発現状況（プライマー配列およびアニーリング温度は実施例３参照）を検出した。得たデータは、コラーゲン群をコントロール群として、２−ΔΔＣｔ法で処理した；抽出したタンパク質は、ウエスタンブロットにてβ−カテニン（ＢＤ、米国、１：１０００で希釈する）、α−カテニン（ＢＤ、米国、１：１０００で希釈する）、総ＶＥＧＦ受容体２（ＣＳＴ、米国、１：１０００で希釈する）、リン酸化−ＶＥＧＦ受容体（Ｔｙｒ  １１７５位してリン酸化）（ＣＳＴ、米国、１：１０００で希釈する）、総ＥＧＦ受容体（ＣＳＴ、米国、１：１０００で希釈する）とリン酸化−ＥＧＦ受容体（Ｔｙｒ  １０６８位のさらなるリン酸化）（ＣＳＴ、米国、１：１０００で希釈する）の発現状況を検出した。
【００９３】
図１６から分かるように、分化の過程には細胞のβ−カテニンの発現が持続的な低下すること、また、ｈＥ−ｃａｄ−ＦｃとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃで共同修飾した基材表面において、細胞が発現したβ−カテニンのレベルが最も低くことは、ｈＭＳＣから上皮細胞への分化に寄与する。同時に、外来の可溶性ＥＧＦとＶＥＧＦを加えていない場合、コラーゲン群とｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾群と比べて、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃで共同修飾群の細胞において、ＥＧＦ受容体とＶＥＧＦ受容体のリン酸化の継続的なポジティブな発現は、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃが、ＥＧＦ受容体とＶＥＧＦ受容体を持続的活性化させてでき、ｈＭＳＣから上皮細胞と内皮細胞への分化に寄与することを証明した。
【００９４】
図１７から、分化誘導過程において、コラーゲン表面と比べて、融合蛋白質表面に培養したｈＭＳＣが、細胞外マトリクスタンパク質成分（フィブロネクチン、コラーゲンおよびラミニン）を持続的に高発現し、サイトカイン（ＴＧＦβとＨＧＦ）、ＩＬ−６を分化誘導の初期に高発現し、ＶＥＧＦが経時的に低発現したことが分かった。かかる結果から、融合蛋白質基材は、幹細胞の分泌機能を調節し、そして細胞の微小環境を再構成する機能を有しており、それは肝臓の発生経過を生体工学的模倣して、幹細胞を上皮と内皮細胞へ定向分化誘導することの制御に寄与することがわかった。
【００９５】
実施例１０．異なる修飾を持つ基材表面において細胞の定向分化誘導の機序についての検討--ＹＡＰタンパク質の発現と分布
実施例３の方法と同様にしてレーザー共焦点細胞培養ディッシュを処理して、維持用培地によりｈＭＳＣを４８時間培養した後、実施例８の方法で免疫蛍光染色した。１００μＬ希釈したＹＡＰ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、米国）を１：１０００の希釈割合で加えて、４℃でオーバーナイト培養した。１００μＬ  ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国、商品番号Ａ３２７２３）を１：１０００の希釈割合で加えて、３７℃で室温２ｈインキュベートした。ＤＡＰＩを含む蛍光褪色防止用剤（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、米国、商品番号０１００−２０）を加えて、４℃、暗所で保存した。レーザー共焦点顕微鏡（ライカ）で写真を取った。結果を図１８に示す。
【００９６】
図１８から分かるように、ｈＭＳＣを融合蛋白質修飾した基材表面に培養した場合、ＹＡＰタンパク質は、細胞質においてより多い分布したことを見える。なお、ＴＣＰＳ基材とコラーゲン基材表面に培養した場合、ＹＡＰタンパク質は細胞核と細胞質に同様に分布するようになる。これら結果によると、融合蛋白質で修飾された基材は、細胞中のＹＡＰタンパク質の分布を調節できるので、幹細胞を上皮細胞への分化誘導を促進することを示している。
【００９７】
実施例１１．異なる修飾を持つ基材表面において細胞の定向分化誘導の機序についての検討--ＭＥＴ経路に関連する遺伝子の発現
実施例７の方法と同様にして細胞を培養して、分化誘導させ、０日目、７日目、１４日目、２１日目と２８日目でＲＮＡを抽出して逆転写した。ＰＣＲで関連遺伝子の発現状況（プライマー配列、アニーリング温度は下表に示す）を検出し、結果を図１９に示す。図１９から分かるように、融合蛋白質は肝細胞核内転写因子であるＨＮＦ４αの発現を促進できるから、さらに細胞がα−カテニンとＥ−カドヘリンを発現することを促進し、細胞がＳｎａｉｌ、ビメンチンとＴｗｉｓｔを発現することを抑え、細胞がＭＥＴ形質転換することを促進する。
【００９８】
【表１６】
2021519603.tif 000018
【００９９】
実施例１２．ＰＬＧＡマイクロビーズ表面に融合蛋白質の固定および安定性の検出
実施例３の方法に従い、終濃度が１０μｇ／ｍＬ  ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ、１０μｇ／ｍＬのｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃと、終濃度がそれぞれ０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬと２５μｇ／ｍＬのｈＶＥＧＦ−Ｆｃの混合溶液を、それぞれ調製した。１ｍｇ  ＰＬＧＡマイクロビーズの粉末（ｓｉｇｍａ、米国、商品番号８０５１１４）を、前記混合溶液にそれぞれ浸漬して、十分に振盪した後、３７℃の水平ロータリーシェーカーに入れて、１５０ｒｐｍで２ｈインキュベートした。上清を棄て、ＰＢＳにて振盪して、安定的に固定されなかった融合蛋白質を洗浄して除去した（３回）。その後、固定量の検出を行いた。３００μＬ  ５％ＢＳＡ溶液を加えて、３７℃の水平ロータリーシェーカーに置いて、１５０ｒｐｍで２ｈブロックした。１００μＬ希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ａｂｃａｍ、米国）を１：１００００の希釈割合で加えて、３７℃の水平ロータリーシェーカーに置いて、１５０ｒｐｍ、暗所で１ｈブロックした。０．０１Ｍ  ＰＢＳで５回洗浄した後、チューブ毎に３００μＬ  ＴＭＢ（索莱宝、商品番号ＰＲ１２００）発色液を加えて、３７℃水平ロータリーシェーカーに置いて１５０ｒｐｍ、暗所で３０分間反応した。３００μＬ停止液を加えて、２００μＬ溶液を取って９６穴プレートに加えた。４５２ｎｍで吸光度の値を測定し、マイクロビーズ表面に３つの種類の融合蛋白質を共同固定させる場合の最大固定量を検定した。その後、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ、ｈＶＥ−ｃａｄ−ＦｃとｈＶＥＧＦ−Ｆｃを前記方法に従って、最大固定量でＰＬＧＡ表面に共同固定し、それぞれＰＢＳ、ＤＦ１２培地、ＤＦ１２＋１０％ＦＢＳによって、２８日間浸漬した後、上清の吸光度を前記方法に従って、０、７、１４、２１、２８日目にそれぞれ検出することで、マイクロビーズ表面に対して融合蛋白質の固定時間を評価した。それぞれ、ＤｙＬｉｇｈｔＴＭ５５０  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、商品番号８４５３０）、ＤｙＬｉｇｈｔＴＭ４８８  Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、商品番号５３０２５）とＤｙＬｉｇｈｔＴＭ４０５  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、商品番号５３０２０）を使用して、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ、ｈＶＥ−ｃａｄ−ＦｃとｈＶＥＧＦ−Ｆｃを標識して（標識の手順は以下の通りである）、最大固定量に応じて３種類の蛍光標識タンパク質をＰＬＧＡマイクロビーズ表面に共同固定し、レーザー共焦点顕微鏡で融合蛋白質がマイクロビーズ表面での分布を観察した。結果を図２０に示す。
【０１００】
図２０から分かるように、１０μｇ／ｍＬ  ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃと１０μｇ／ｍＬ  ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃを同じＰＬＧＡマイクロビーズ表面に共同固定した後、システム全体の吸光度は、ＶＥＧＦ−Ｆｃ濃度の向上に伴ってますます増加した。３種類の融合蛋白質が同時にマイクロビーズ表面に固定されることが証明した；常用されるＰＢＳ、培地、又は血清を含む培地に一定期間浸漬した場合、上清の吸光度がほとんど変化しないことを見出して、融合蛋白質がマイクロビーズ表面に４週間まで安定に存在できることが証明した；フルオレセイン付ける融合蛋白質をマイクロビーズ表面に固定して、レーザー共焦点にて検定することで、３種類の融合蛋白質はマイクロビーズ表面に均一に分布できることがわかった。
【０１０１】
融合蛋白質の蛍光標識工程は以下の通りである。
［１］４０μＬ  ０．６７Ｍホウ酸塩バッファーを取って、５００μＬ  ２ｍｇ／ｍＬ融合蛋白質溶液と均一に混合した；
［２］前記溶液を、予め蛍光染料５０μｇを装填した試験管に加えて、軽くボルテックスして、ピペットでピペッティングして均一に混合し、暗所で室温６０分間インキュベートした；
［３］均一に混合した吸着レジンを２５０μＬ取って、遠心分離カラムを入れた遠心分離チューブに入れて、１０００ｇで１分間遠心分離し、上清を棄て、遠心分離カラムを新たな遠心分離チューブに移した；
［４］２５０μＬ  前記工程［２］の反応後の溶液を工程［３］の遠心分離カラムに加え、わずかにボルテックスして、反応液と吸着レジンとを混合させた；
［５］１０００ｇで１分間遠心分離して、精製した溶液を収集して、融合蛋白質の標識を完成し、４℃又は−８０℃、暗所で保存した。
【０１０２】
実施例１３．細胞凝集体の調製、ＰＬＧＡマイクロビーズと細胞との混合比率の選択
８×１０５  ｈＭＳＣ細胞とＰＬＧＡマイクロビーズをそれぞれ、３：１、１：１と１：３の割合で混合して、ＡｇｇｒｅｗｅｌｌＴＭ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、商品番号２７８４５）培養用プレートに加えて、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、細胞インキュベーターに置いて、３７℃でオーバーナイト培養した。顕微鏡で細胞凝集体の形態を観察した。結果を図２１に示す。図２１から分かるように、マイクロビーズと細胞との割合は、１：１−１：３にいる場合、１８時間のインキュベーション後に得た凝集体は、完全な構造を有し、大きさがそろった。
【０１０３】
その後、１０００μＬの尖端を切り落としたピペットチップで凝集体を吹き出し、１５ｍＬ遠心分離チューブに入れて、自然沈降によって沈殿物を収集した。２００μＬ  ２％アルギン酸の溶液で沈殿物を再縣濁して、０．１Ｍ  ＣａＣｌ２溶液に滴下して１０分間インキュベートすることで、アルギン酸のハイドロゲルを形成した。上清を棄て、アルギン酸のハイドロゲルを生理食塩水で洗浄し、異なる割合のマイクロビーズを含む細胞凝集体を６ウェルの培養用プレートに入れて、分化用培地（ＤＦ１２＋２％ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−４＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ＋１＊ＩＴＳ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ＋４０ｎｇ／ｍＬ  ｈＶＥＧＦ）で７日間連続培養し、２日毎に培地を交換した。７日目に０．１Ｍ  ＥＤＴＡ溶液でアルギン酸ハイドロゲルを溶解した。細胞凝集体を収集して、１ｍＬ  Ｔｒｉｚｏｌを加えてＲＮＡを抽出した。実施例７の方法に従い、上皮細胞の遺伝子と内皮細胞に関連遺伝子の発現を検定した。結果を図２２に示す。図２２から分かるように、定向分化誘導培地を加えて１週間培養した時点に、マイクロビーズとｈＭＳＣとの割合は１：３であれば、凝集体が肝様細胞遺伝子（ＣＫ１８、ＡＬＢとＡＳＧＰＲ）と血管内皮様細胞遺伝子（ＣＤ３１とＶＥＧＦＲ２）を発現する能力は最も強くことを観察された。これは、ここで幹細胞の凝集体の、上皮細胞と内皮細胞への分化効率が最も高いのを証明した。よって、次の試験に該割合を選用した。
【０１０４】
実施例１４．ＰＬＧＡマイクロビーズ表面において融合蛋白質の異なる濃度の選択
ｈＥ−ｃａｄ−ＦｃとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃは、濃度で３：１（ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ：１５μｇ／ｍＬ、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ：５μｇ／ｍＬ）、１：１（ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ：１０μｇ／ｍＬ、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ：１０μｇ／ｍＬ）と１：３（ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ：５μｇ／ｍＬ、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ：１５μｇ／ｍＬ）になるように希釈された後、終濃度で２μｇ／ｍＬのｈＶＥＧＦ−Ｆｃを加えて、実施例１２の方法にて、それぞれ、前記異なる配合比率の融合蛋白質でＰＬＧＡマイクロビーズを修飾し、１０μｇ／ｍＬコラーゲンでＰＬＧＡマイクロビーズを修飾した。その後、マイクロビーズとｈＭＳＣはｈＭＳＣ：マイクロビーズ＝３：１の割合で混合した。細胞凝集体は実施例１３の方法にて調製して分化誘導した。７日目に、実施例７の方法と同様にＲＮＡを抽出して逆転写して、関連遺伝子の発現を検出した。結果を図２３に示す（ここで、ｍｃｐはコラーゲン修飾マイクロビーズを含む細胞凝集体を示し、Ｅ：ＶＥ／ＶＥＧＦ−Ｆｃは、２種類の融合蛋白質が異なる割合で同じマイクロビーズを修飾したものを含む細胞凝集体を示す）。図２３から、定向分化誘導培地を加えて１週間培養した時点に、同じＰＬＧＡマイクロビーズ表面のｈＥ−ｃａｄ−ＦｃとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの割合は１：１であれば、凝集体が肝様細胞遺伝子（ＨＮＦ４α、ＡＬＢ、ＯＡＴＰ、α１−ＡＴとＧ６Ｐａｓｅ）と血管内皮様細胞遺伝子（ＣＤ３１とＶＥ−カドヘリン）の発現能力は最も強くことを観察された。これは、ここで幹細胞の凝集体の、肝様細胞と血管内皮様細胞への分化効率が最も高いことを証明した。よって、次の試験に該割合を選用した。
【０１０５】
実施例１５．異なる融合蛋白質で修飾されたマイクロビーズの間の割合の決定
実施例１２の方法で、１０μｇ／ｍＬコラーゲン溶液でＰＬＧＡマイクロビーズを修飾しており、１０μｇ／ｍＬ  ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液でｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾ＰＬＧＡマイクロビーズを調製し、１０μｇ／ｍＬ  ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃと２μｇ／ｍＬ  ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ溶液でｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ修飾ＰＬＧＡマイクロビーズを調製した。そして、２種類のマイクロビーズは３：１、１：１と１：３の割合で混合した。ｈＭＳＣは、ｈＭＳＣ：マイクロビーズ＝３：１の割合でマイクロビーズと混合した。細胞凝集体は、実施例１３の方法で調製して分化誘導した。７日目に、実施例７の方法と同様にＲＮＡを抽出して逆転写して、関連遺伝子の発現を検出した。結果を図２４に示す（ここで、ｍｃｐは、コラーゲン修飾マイクロビーズを含む細胞凝集体、ｍＥｐ：ｍ（ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐは、融合蛋白質修飾マイクロビーズを異なる割合で含有している細胞凝集体を示す）。図２４から分かるように、定向分化誘導培地を加えて１週間培養した、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾ＰＬＧＡマイクロビーズとｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ修飾マイクロビーズとの割合は１：１である場合、凝集体の、肝様細胞遺伝子（ＨＮＦ４α、ＯＡＴＰとＡＳＧＰＲ）と血管内皮様細胞遺伝子（ＣＤ３１）の発現能力が最も強く、肝様細胞と血管内皮様細胞への分化効率が最も高くなることを観察された。よって、次の試験に該割合を選用した。
【０１０６】
実施例１６．凝集体についての定向分化誘導の検討
実施例１２の方法に従い、異なるタンパク質溶液（ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質、又はコラーゲン）で修飾したマイクロビーズを調製した。修飾の実情は以下の通りである。 
（１）１０μｇ／ｍＬコラーゲンでＰＬＧＡマイクロビーズを修飾した；
（２）同じＰＬＧＡマイクロビーズに対して、１０μｇ／ｍＬ  ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ、１０μｇ／ｍＬ  ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃと２μｇ／ｍＬ  ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質で共同修飾した；
（３）一部のＰＬＧＡマイクロビーズは、１０μｇ／ｍＬ  ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃで修飾し、別の一部のＰＬＧＡマイクロビーズは１０μｇ／ｍＬ  ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃと２μｇ／ｍＬ  ｈＶＥＧＦ−Ｆｃで修飾し、２種類のマイクロビーズを等割合で混合した。
【０１０７】
実施例１３の方法で、細胞は、ｈＭＳＣ：マイクロビーズ＝３：１の割合でマイクロビーズと共混して、コラーゲン修飾マイクロビーズを含む凝集体（ｍｃｐと略記）、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ、ｈＶＥ−ｃａｄ−ＦｃおよびｈＶＥＧＦ−Ｆｃの共同修飾マイクロビーズを含む凝集体（（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと略記）、異なる融合蛋白質で個別に修飾したマイクロビーズを、等しい割合で混合したものを含む凝集体（（ｍＥ＋ｍＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと略記）、のいろいろ凝集体を調製した。マイクロビーズを含まないｈＭＳＣの凝集体（ｍと略記）を対照として、次の特定の分化用培地で２８日間連続的培養を行った。０日目、７日目、１４日目、２１日目と２８日目でＲＮＡを抽出してＰＣＲで検出した。具体的プライマーの配列は、実施例７に示す。結果を図２５に示す。
【０１０８】
図２５から分かるように、融合蛋白質を含む凝集体には、ＦｏｘＡ２とＳｏｘ１７がより早く発現された。これは、融合蛋白質は内胚葉への分化がより早く開始できるのを証明した。融合蛋白質を含む凝集体には、肝細胞関連遺伝子であるＨＮＦ４α、ＣＫ１８、ＡＦＰとＡＬＢおよび内皮細胞関連遺伝子であるＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンとＶＥＧＦ受容体２がより早く発現された。これは、融合蛋白質が幹細胞から上皮細胞と内皮細胞への分化誘導を促進できることを証明した。融合蛋白質を含む凝集体には、肝細胞極性タンパク質遺伝子（ＭＲＰ２、ＯＡＴＰとＡＳＧＰＲ）と関連代謝酵素の関連遺伝子（Ｇ６Ｐａｓｅとα１−ＡＴ）がより早く発現された。これは、融合蛋白質は、肝細胞構造と機能を促進できるのを証明した。実施例７の２Ｄ培養方式に比べて、凝集体の分化効率が顕著に高まり、所要の分化時間が大きく短縮した。２Ｄ培養と比べて、３Ｄ培養は肝細胞極性遺伝子であるＯＡＴＰとＭＲＰ２の発現を著しく向上できる、且つ、細胞は内、外来性の環境要素との協調はより有効であり、胆管上皮細胞への定向分化を促進する；融合蛋白質を同じＰＬＧＡマイクロビーズ表面に共同固定したものを含むｈＭＳＣ凝集体には、細胞分化に係る指標が効率よく発現され、ｈＭＳＣ凝集体の定向分化誘導が促進された。
【０１０９】
分化用培地：
ｍ、ｍｃｐ：ＤＦ１２＋２％ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−４＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ＋１＊ＩＴＳ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ＋４０ｎｇ／ｍＬ  ｈＶＥＧＦ；
ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ、（ｍＥ＋ｍＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ：ＤＦ１２＋２％ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−４＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ＋１＊ＩＴＳ。
【０１１０】
実施例１７．オルガノイドの染色
実施例１６の方法で、４種類の凝集体（それぞれ、ｍ、ｍｃｐ、ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと（ｍＥ＋ｍＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ）を調製して分化誘導した。２週間分化誘導した後、０．９％ＮａＣｌ溶液を含む０．１Ｍ  ＥＤＴＡ溶解液でアルギン酸を溶解して、凝集体の沈殿物を収集した。以下の全ての工程には、ＰＢＳＢ溶液（０．０１Ｍ  ＰＢＳ溶液、５％ＢＳＡを含む）で処理したピペットチップで作業を行った。冷たい０．０１Ｍ  ＰＢＳ溶液でオルガノイドを３回洗い、上清を棄て、３００μＬ最近配製した４％パラホルムアルデヒド溶液を加えて、室温で少なくとも３０分間インキュベートした。沈殿物を収集して冷たい０．０１Ｍ  ＰＢＳ溶液でオルガノイドを３回洗い、上清を棄て、３００μＬ  ＰＢＳＤＴ溶液（０．０１Ｍ  ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋１％ヤギブロック血清＋０．５％トリトンＸ−１００＋１％ＤＭＳＯ）を加えて、４℃でブロックしてオーバーナイトした。上清を棄て、ＰＢＳＤＴ溶液により一定の割合で希釈した第一抗体（希釈の割合は、以下で説明する）１００μＬを加えて、４℃で２４−４８ｈ反応した。上清を棄て、冷たい０．０１Ｍ  ＰＢＳ溶液でオルガノイドを３回洗い、上清を棄て、ＰＢＳＤＴ溶液により一定の割合で希釈した第二抗体（希釈の割合は、以下で説明する）１００μＬを加えた。上清を棄て、冷たい０．０１Ｍ  ＰＢＳ溶液でオルガノイドを３回洗い、上清を棄てＤＡＰＩを含む蛍光褪色防止用剤１００μＬを加えて、４℃、暗所で保存した。レーザー共焦点顕微鏡（ライカ）で写真を取って観察した。結果を図２６に示す。異なる材を含むｈＭＳＣ凝集体が２週間連続分化誘導した際の免疫蛍光染色の結果から、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃを共同固定した基材表面には、細胞がより多くの肝様細胞のマーカーであるＡＬＢおよび内皮細胞のマーカーＣＤ３１（矢印で示す）を発現したことを分かった。該基材表面では、ｈＭＳＣから肝様細胞および内皮様細胞への分化効率最も高いことが証明された。
【０１１１】
【表１７】
2021519603.tif 000019
【０１１２】
実施例１８．内皮細胞共培養系との対比
ｈＭＳＣは２：８割合で臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、サイヤジェンバイオ）と混合して、ａｇｇｒｅｗｅｌｌ培養用プレートに８×１０５個を加え（ＨＭと略記）、好適化した試験群であるｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと（ｍＥ＋ｍＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと比較した。細胞は、実施例１６の方法にて定向分化誘導培地で２週間連続培養した。２周の時点に、サンプルのＲＮＡおよび培地上清を抽出し、関連遺伝子の発現状況（ＡＬＢ、ＭＲＰ２、ＯＡＴＰ、α１−ＡＴ、ＣＤ３１とＶＥ−カドヘリン）をそれぞれＰＣＲで検出し、ＡＬＢの細胞分泌能をＥＬＩＳＡで検出した。結果を図２７に示す。
【０１１３】
図２７から分かるように、配向誘導培地を加えた２週間後、ＰＣＲにて以下の結果が示された。対照群ＨＭは、試験群に比べて関連した内皮細胞マーカーであるＣＤ３１とＶＥ−カドヘリンをより良く発現した。また、融合蛋白質表面で２週間分化誘導された試験群にはＣＤ３１とＶＥ−カドヘリン陽性細胞が出現するので、凝集体内に内皮様細胞の存在が示された。また、試験群は、肝分化機能に関連する遺伝子（ＡＬＢ、ＭＲＰ２とα１−ＡＴ）の発現レベルはＨＭ群よりも高く。さらに、ＥＬＩＳＡで肝の分化機能を示したアルブミンの分泌を検出した。その結果から、試験群はＨＭ対照群より顕著に良く、また、ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ群には、肝細胞に関連する指標の発現レベルが最も高いことを示した。
【０１１４】
実施例１９．異なる修飾を持つ基材表面においてｈＭＳＣから膵島細胞への分化誘導能力の確認
実施例７の方法に従い、異なる融合蛋白質修飾を持つ６ウェルの細胞培養プレートを調製した。１０５細胞／ウェルの細胞密度でｈＭＳＣを培養用プレート表面に接種して、維持用培地でオーバーナイト培養した後、特定の分化用培地（１０  ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ、１０  ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２、１０  ｍＭニコチンアミド、１Ｘ  ＩＴＳ−Ｇ  ＤＭＥＭ分化用培地で一周間定向誘導され、その後、１０  ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ、１０  ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２、１０  ｍＭニコチンアミド、１Ｘ  ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ分化用培地に交換して両周間配向誘導された）に交換して両日毎に培地を交換し、２１日間連続培養した。実施例７の方法に従い、２１日目にＲＮＡを抽出した、ＰＣＲで関連遺伝子の発現状況を検出した。結果を図２８に示す。図２８から分かるように、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃで修飾した基材表面にｈＭＳＣを培養することは、ｈＭＳＣから膵島様細胞への分化効率と膵島様細胞の成熟度にも著しく向上できる。膵臓の発生過程において、上皮細胞から分泌したシグナル分子、内皮細胞から分泌したシグナル分子は、内分泌細胞と外分泌細胞運命の調節過程に極めて重要な役割を担っている。なお、成熟した膵島の中、膵島β細胞で分泌したインシュリン、又はα細胞で分泌したグルカゴンは、いずれも内皮シグナルおよび血管ネットワークを介する必要がある。図２８に示す結果から、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質の存在により、特に、内皮シグナルと内皮細胞の存在下、増殖因子と結合して細胞が異なる運命への分化を促進することが推定された。膵島細胞がin vitroで機能の維持について新しい方案を提供する。
【０１１５】
【表１８】
2021519603.tif 000020
【０１１６】
実施例２０．凝集体から内皮細胞への定向分化誘導の検討
実施例１２の方法に従い、１０μｇ／ｍＬ  ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃと２μｇ／ｍＬ  ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ溶液でｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ修飾ＰＬＧＡマイクロビーズを調製した。異なる凝集体は、実施例１３の方法に従い、細胞を、ｈＭＳＣ：マイクロビーズ＝３：１の割合でマイクロビーズと共混して調製した。マイクロビーズを含まない細胞凝集体（ｍと略記）と、ＰＬＧＡマイクロビーズを含む細胞凝集体（ｍｐと略記）は、対照群とし；ｈＶＥ−ｃａｄ−ＦｃとｈＶＥＧＦ−Ｆｃで共同修飾したマイクロビーズを含む細胞凝集体（ｍｖｐと略記）は、リサーチ群とし、内皮定向分化誘導培地（ＤＦ１２＋２％ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２）で培養して、両日毎に換液し、連続分化誘導されて７日間培養した。７日目に、ＲＮＡとタンパク質を抽出し、ＰＣＲで関連した内皮細胞マーカー（ｖＷＦ、ＣＤ３１とＶＥ−カドヘリン）の発現、細胞が分泌した基材と因子（フィブロネクチン、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＩＧＦＢＰ−３とアンジオポエチン）の変化を検出した。具体的なプライマー配列は実施例３、実施例７および下表を参照する；ウエスタンブロットにより関連した内皮細胞マーカーであるＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンとｖＷＦ（Ａｂｃａｍ、米国、１：１０００で希釈する）の発現状況を検出した。結果を図２９に示す。
【０１１７】
図２９Ａから分かるように、ｍ群とｍｐ群に比べて、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ修飾ＰＬＧＡマイクロビーズを含む細胞凝集体のｍｖｐ群には、ｖＷＦ、ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリン等の内皮細胞マーカーの発現能力が、遺伝子の層面とタンパク質の層面でいずれも明確に向上した。よって、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃ融合蛋白質が、ｈＭＳＣから血管内皮様細胞に分化誘導して内皮細胞マーカーを発現することを著しく促進できることが示された。かつ、分化誘導時間の延長につれて、対照群に比べて、ｍｖｐリサーチ群の細胞の内皮細胞マーカー発現量は持続に上昇した。よって、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ／ｈＶＥＧＦ−Ｆｃが、培地の中の分化因子と協調でき、ｈＭＳＣから内皮細胞への分化及びその機能の発現を持続促進することが示された。図２９Ｂから分かるように、分化誘導する過程の初期において、ｍｖｐ群の細胞におけるフィブロネクチン、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＩＧＦＢＰ−３および血管新生素等のサイトカインの発現レベルは、２つの対照群より高いである。よって、融合蛋白質が、細胞により内皮特異性関連サイトカインと細胞外マトリクスの分泌を著しい改善できるから、内皮細胞微小環境を構築して、ｈＭＳＣから内皮細胞への分化を促進することが示された。
【０１１８】
【表１９】
2021519603.tif 000021
【０１１９】
実施例２１  ＰＡＭＡＭ／ヒアルロン酸ハイドロゲルについての機能化修飾
Ｇ５−Ａｃ−ＤＶＳ、Ｇ５−Ａｃ−ＤＶＳ−ＲＧＤ，Ｇ５−Ａｃ−ＤＶＳ−Ｆｃ−ｂｐの合成は、以下の通りである。 ５代目のＰＡＭＡＭ（ＰＡＭＡＭ  Ｇ５）デンドリマー（５０２ｍｇ、０．０１９７  ｍｍｏｌ、Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ，ＵＳＡより購入）をメタノール（６０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（２５９ｍＬ、１．８４６  ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１０分間攪拌した。反応混合液へ無水酢酸（１４０ｍＬ、１．４７７  ｍｍｏｌ）のメタノール（４０ｍＬ）溶液を滴下した。オーバーナイト反応して、分子量カットオフ１００００のフィルムで透析し、ＰＢＳ（１０ｍＬ×３回）と脱イオン水（１０ｍＬ×３回）で洗浄した。凍結乾燥して、Ｇ５−Ａｃ産物が得られた。
【０１２０】
Ｇ５−Ａｃ（３３３ｍｇ、０．０１１６  ｍｍｏｌ）は脱イオン水（２０ｍＬ）に溶解した。２−サブアンモニアヒドロクロライドチオール（８０．０５  ｍｇ、０．５８２  ｍｍｏｌ）を加えた。窒素ガスによるシールドで室温２４時間反応した。分子量カットオフ１００００のフィルムで透析し、ＰＢＳ（１０ｍＬ×３回）と脱イオン水（１０ｍＬ×３回）で洗浄した。凍結乾燥して、Ｇ５−Ａｃ−ＳＨ産物が得られた。
Ｇ５−Ａｃ−ＳＨ（２１３．４  ｍｇ、０．００６６１  ｍｍｏｌ）は脱イオン水（１５ｍＬ）に溶解した。ジビニルスルフォン（ＤＶＳ、１３２．５μＬ、１．３２１  ｍｍｏｌ）を加えた。窒素ガスによるシールドで室温２日間反応した。分子量カットオフ１００００のフィルムで透析し、ＰＢＳ（１０ｍＬ×３回）と脱イオン水（１０ｍＬ×３回）で洗浄した。凍結乾燥して、Ｇ５−Ａｃ−ＤＶＳが得られた。
【０１２１】
Ｇ５−Ａｃ−ＤＶＳ（５８．５  ｍｇ、０．００１６６  ｍｍｏｌ）は脱イオン水（５ｍＬ）に溶解した。ＲＧＤポリペプチドＣＧＲＧＤＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２、６．９  ｍｇ、０．０１１６  ｍｍｏｌ）は脱イオン水（１ｍＬ）に溶解した。２種溶液を混合した。室温で１時間反応した。分子量カットオフ１００００のフィルムで透析し、ＰＢＳ（１０ｍＬ×３回）と脱イオン水（１０ｍＬ×３回）で洗浄した。凍結乾燥して、Ｇ５−Ａｃ−ＤＶＳ−ＲＧＤが得られた。
【０１２２】
Ｇ５−Ａｃ−ＤＶＳ（１６４ｍｇ、０．００５１３  ｍｍｏｌｅ）、Ｆｃ結合ポリペプチド（４．８３  ｍｇ，０．００５１３  ｍｍｏｌ、ＣＨＷＲＧＷＶ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３、ここで、Ｆｃ−ｂｐと略記）を、それぞれ、無酸素の水５ｍＬと１ｍＬに溶解した。そして、ポリペプチド溶液は、ゆっくり樹枝状分子溶液に添加しながら攪拌した。混合溶液は、室温で攪拌して１時間反応した。反応した混合液は、分子量カットオフ１００００のフィルムでろ過した。残余は、それぞれ、ＰＢＳ（１５ｍＬ×３回）とウォーター（１５ｍＬ×３回）で洗浄した。最後、凍結乾燥して、収率９５．９％のＧ５−Ａｃ−ＤＶＳ−Ｆｃ−ｂｐ産物が得られた。合成経路図は図３０−Ａに示す。核磁気共鳴の水素スペクトルは図３０−ｂに示す。
【０１２３】
ヒアルロン酸ハイドロゲルの機能化修飾は以下の通りである。
はじめに、Ｇ５−Ａｃ−ＤＶＳ−Ｆｃ−ｂｐデンドリマー２５ｍｇを５００μＬ無酸素ＰＢＳに完溶して、使用に備える。前記溶液５０μＬを取って、その中に初濃度２００μｇ／ｍＬであるｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質１０μＬを加えて、３７℃で１ｈインキュベートした。その後、５０μＬチオール化のヒアルロン酸（Ｂｉｏ  Ｔｉｍｅ  Ｉｎｃ）を加えて、９６穴プレートにいれた。対照群には、Ｇ５−Ａｃ−ＤＶＳデンドリマーを用いており、それ以外の作業工程は同じのものである。安定なハイドロゲルを形成した後、ウェル毎に１００μＬ  ＰＢＳを加えてハイドロゲルを完全に浸かるように浸漬し、１、３、５、７、１０、１４日目にそれぞれ上清を取って、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）方法にてｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質の放出した量を検出した。方法はキットの説明に従って、具体的に以下である：標品ウェルは：ウェル毎に希釈した標品５０μＬを加え、ゼロウェルとしては、標品／サンプル希釈液５０μＬを加え、その後、酵素標識試薬５０μＬを加えた。サンプルウェルは：サンプル５０μＬを加えて、その後、酵素標識試薬５０μＬを加えた。軽く振いて、カバーフィルムを被せて、３７℃で６０分間インキュベートした。カバーフィルムを慎重に剥がし、液体を棄て、ドライまでに振り回し、ウェル毎に洗い液を満ちるように注ぐ、３０秒静置して洗い液を棄て、５回を繰り返し、叩いて水分を取り除く。ウェル毎に、先ず発色剤Ａ  ５０μＬを加えて、そして発色剤Ｂ  ５０μＬを加え、軽く振盪してよく混ぜ、３７℃、暗所で１０分間発色した。ウェル毎に停止液５０μＬを加えて、反応を停止させた。４５２ｎｍで吸光度を測定した。結果から、Ｆｃ−ｂｐの接続を利用したｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃは、２週間内のハイドロゲルへの固定率が８５％程度になっており、Ｆｃ−ｂｐの接続を利用しなかったｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃは、ハイドロゲルへの固定率がわずかに４０％程になったことがわかった（図３０−Ｃ）。前記２種類の方式で修飾したハイドロゲルの前液は、それぞれ、均一にするように４８穴プレートに加えた。安定なハイドロゲルを形成した後、ウェル毎に２×１０４のＨＵＶＥＣ（米国ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ会社）、ｈＭＳＣ細胞（広州Ｓａｉｙｅ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）を別々に接種した。２４時間後に、相差顕微鏡で２種類の細胞の接着及び形態の特徴を別々に観察した。その結果は、Ｆｃ−ｂｐを利用したｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃによる固定手段で修飾したハイドロゲルが、無Ｆｃ−ｂｐのハイドロゲル系より、細胞の接着を著しく促進できることを示している（図３０−Ｄ）。
【０１２４】
実施例２２  融合蛋白質で機能的に修飾されたヒアルロン酸ハイドロゲルの物理化学的特性の特性化
２種類のハイドロゲルを調製した。
その１種は、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質修飾ハイドロゲルである：Ｇ５−Ａｃ−ＤＶＳ−Ｆｃ−ｂｐデンドリマー２５ｍｇを５００μＬ無酸素ＰＢＳに完溶して、使用に備えて、前記溶液５０μＬを取って、初濃度２００μｇ／ｍＬのｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質１０μＬを加えて、室温で１ｈインキュベートし、５０μＬチオール化ヒアルロン酸を加えて、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質修飾ハイドロゲルを形成した。
もう１種は、非修飾ハイドロゲルである。Ｇ５−Ａｃ−ＤＶＳデンドリマー２５ｍｇを５００μＬ無酸素ＰＢＳに完溶して、使用に備えて、前記溶液５０μＬを取って、その中に５０μＬチオール化ヒアルロン酸を加えて、非修飾ハイドロゲルを形成した。
【０１２５】
ハイドロゲルの分解試験は以下の通りである。 ２種類のハイドロゲルを、それぞれ、ＰＢＳ、ヒアルロニダーゼ（Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．Ｌｔｄ．）、ＨＵＶＥＣ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ会社、５００ｍＬ  基礎培地、２５ｍＬ  ＦＢＳ，５ｍＬ  内皮細胞増殖因子、５ｍＬ  ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）上清、ｈＭＳＣ培地（ＤＭＥＭ培地とＦ１２培地が１：１で混合した物からなる、ＨｙＣｌｏｎｅ）上清の中の２週間浸漬した。ハイドロゲルの初期重さをＭ０とし、１、３、５、７、１０、１４日目の時点にそれぞれ吸収紙で余分なＰＢＳを吸い出した。残余なハイドロゲルの重さを計量してＭｔをとし、式Ｍ％＝（Ｍ０−Ｍｔ）／Ｍ０にした。結果から、ハイドロゲルは、ＰＢＳの中の場合はほぼ分解しないで、ヒアルロニダーゼの溶液の場合、２４時間内にほぼ完全に分解しており、細胞培地上清の場合、７０％程までに分解したことがわかった。ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾を経ったハイドロゲルは、分解性が改変しない（図３１−Ａ）。
【０１２６】
ハイドロゲルの膨潤性の試験は以下の通りである。 二つの群の異なるハイドロゲルは、それぞれ、ＰＢＳに２週間完全に浸かるように浸漬した。ハイドロゲルの初期重さをＭ０とし、１、３、５、７、１０、１４日目の時点にそれぞれ吸収紙で余分なＰＢＳを軽く吸い出した。残余なハイドロゲルの重さを計量してＭｔとし、算出方法は前記同様にした。ハイドロゲルは、ＰＢＳ溶液にはほぼ膨潤しないから、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾を経った後、ハイドロゲルの膨潤性が改変しない（図３１−Ｂ）。
【０１２７】
ハイドロゲルのレオロジーの試験には、前記２種ハイドロゲルの前液サンプル（融合蛋白質修飾ハイドロゲル、非修飾ハイドロゲル）それぞれ５００μＬを用意し、レオメーター（ＡＲ  ２０００ｅｘ）でハイドロゲルの粘弾性を検出した。先ず、空気圧縮機を開いて、エアータンク圧力が自動的に上昇した。エアータンク圧力が０．５ＭＰになった時、出力圧力を０．４５ＭＰにするように時計回りに調節して、レオメーターの圧力調節弁を点検して３０  Ｐｉｓにするように５分間安定させた。次に、循環水を開いて、エアベアリングの安全ロックを検出し、平行な治具プレートを取り付けた。そして、レオメーターのホストコンピューターを開いて、レオロジーのプログラムをコンピューターで試験して、機器のブレを直した；最後に、試験の要求によって一定のパラメータを設け、サンプルを配製して試験を始また。具体的パラメータ設置は：平行な治具プレート４ｃｍ、隙間設置  ５００μｍ、温度  ２５℃である。ダイナミックタイムスキャン：時間  ７２００  ｓ、２０  ｓおきに1つのポイントを取り戻し、周波数は１  ｒａｄ／ｓであり、応力は１％である；ひずみスキャン範囲は０．１−１０％で、周波数  １ｒａｄ／ｓである；動態周波数スキャン範囲は０．１−１００  ｒａｄ／ｓで、応力は１％である。サンプルを測定する際は、５００μＬ被検試料を取ってトレイに入れ、平行な治具プレートの間の隙間を５００ｕｍに低めて、サンプルの測定を始まった。結果から、ヒアルロン酸の溶液はハイドロゲルを形成でき、形成したハイドロゲルの粘弾性が良い、かつ、一定の機械的応力強度を有することと、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾をした後、ハイドロゲルのレオロジー特性は改変しないことがわかった（図３１−Ｃ）。
【０１２８】
ハイドロゲルの表面の外観特徴について、２つの群のハイドロゲルのサンプル各２００μＬを用意して真空下で冷凍乾燥処理した。乾燥した多孔ハイドロゲルを立方体の形状になるように切断した。両面テープで、サンプルを観察面が上にいるように、走査型電子顕微鏡の銅の板に張り付けた。ＳＥＭ（ＱＵＡＮＴＡ  ２００，ＦＥＩ）でのスキャンの結果から、ハイドロゲルの内部には比較的な均質な孔隙率を持つ構造が有しており、修飾前、後のハイドロゲルの外観特徴には著しい変化がないことがわかった（図３１−Ｄ）。その中、左１は、対照群のハイドロゲルであり、左２はその局所拡大図であり、左３はｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質修飾ハイドロゲルであり、左４はその局所拡大図である。
【０１２９】
実施例２３  融合蛋白質で機能的に修飾されたハイドロゲルによるＨＵＶＥＣの生存の影響の検討
試験サンプルの調製は以下の通りである。 試験には、３つの群に分け、（１）対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）群には、Ｇ５−Ａｃ−ＤＶＳデンドリマー２５ｍｇを５００μＬ無酸素ＰＢＳに完溶して、使用に備えて、５０μＬ前記溶液を取って、その中に５０μＬチオール化のヒアルロン酸を加えて、単独ハイドロゲル系を形成した；（２）ＲＧＤ群には、Ｇ５−Ａｃ−ＤＶＳ−ＲＧＤデンドリマー２５ｍｇを５００μＬ無酸素ＰＢＳに完溶して、使用に備えて、５０μＬ前記溶液を取って，その中に５０μＬチオール化のヒアルロン酸を加えて、ＲＧＤ修飾ハイドロゲル系を形成した；（３）ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ群には、Ｇ５−Ａｃ−ＤＶＳ−Ｆｃ−ｂｐデンドリマー２５ｍｇを５００μＬ無酸素ＰＢＳに完溶して、使用に備えて、５０μＬ前記溶液を取って，を加えて１０μＬ初濃度２００μｇ／ｍＬしたｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ、室温で１ｈインキュベートした。その中に５０μＬチオール化のヒアルロン酸を加えて、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾ハイドロゲル系を形成した；
【０１３０】
細胞の光学顕微鏡の観察試験：前もって用意した３つの群の異なるハイドロゲルの前液サンプル１００μＬを、均一にするように９６穴プレートに加えて、３７℃で１０分間インキュベートして、安定なハイドロゲルになるまで待っていた。ウェル毎に細胞１×１０４個を播種し、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養して、細胞が７２時間培養した際に、倒立相差顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＣＫＸ４１）にて細胞の外観特徴を観察した。結果から、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾ハイドロゲル群において、ＨＵＶＥＣの外観には、毛細血管様構造と類似のものが現れていることがわかった（図３２−Ａ）。
【０１３１】
細胞の生存死亡の染色試験は以下の通りである。 細胞が７２時間培養した際に、細胞培地を吸い出し、ＰＢＳで細胞を洗浄して、細胞生存死亡染色液を調製した：２μＬ  ２ｍＭ  ＥｔｈＤ−ＩＩＩドープ＋０．５μＬ  ４ｍＭ  Ｃａｌｃｅｉｎ  Ａｍドープ＋１ｍＬ  ＰＢＳ。ウェル毎に１００μＬ生存死亡染色液を加えて、細胞インキュベーターに３０分間放置して、ＰＢＳで３回洗浄した。蛍光顕微鏡で観察した。結果から、対照群に比べて、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾ハイドロゲルは細胞の生存能力を著しく増強させたことがわかった（図３２−Ｂに示す）。
【０１３２】
細胞の増殖試験。前もって用意した３つの群の異なるハイドロゲルの前液サンプル１００μＬを、均一にするように９６穴プレートに加えて、３７℃で１０分間インキュベートして、安定なハイドロゲルになるまで待っていた。ウェル毎に細胞１×１０４個を播種し、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養して、細胞の増殖能をそれぞれ、４、２４、４８、７２時間にＣＣＫ−８試験にて検出した。詳細は以下の通りである。 先ず、細胞培地を吸い出し、ＰＢＳで細胞を洗浄して、前もって調製したＣＣＫ−８溶液（１００μＬ毎に１０μＬ  ＣＣＫ−８ドープ（ＣＡ１２１０，Ｓｏｌａｒｂｉｏ）と９０μＬ  ＥＣＭ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ会社）を含む）をウェル毎に１００μＬで加えて、３７℃で４時間インキュベートした。前記培養したＣＣＫ−８溶液は、新たな９６穴プレートに移行され、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度の値を測定した。結果から、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾ハイドロゲルは細胞の接着及び増殖を促進できることがわかった（図３２−Ｃ）。
【０１３３】
細胞骨格の染色試験は以下の通りである。 ３種類の異なるハイドロゲルの前液を均一にするようにレーザー共焦点ディシュに加えて、安定なハイドロゲルになるまで待っていた。ディシュ毎に３×１０４個のＨＵＶＥＣを播種して、細胞を７２時間に培養した。上清である細胞培地を軽く吸い出し、３７℃に予熱したＰＢＳで細胞を洗浄して、４％パラホルムアルデヒドで細胞を１０分間固定した。０．１％トリトンｘ−１００で細胞を１０分間膜透過処理して、１％ウシ血清アルブミンにより室温で４０分間ブロックした。ＦＩＴＣ−ファロイジン（シグマ）で細胞骨格マイクロフィラメントを染色した。最後に、ＤＡＰＩ（シグマ）で細胞核を染色した。結果から、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃで機能的に修飾されたハイドロゲルは、細胞骨格の伸び広がりを著しく促進できることがわかった（図３２−Ｄ）。
【０１３４】
ハイドロゲルによるＨＵＶＥＣの３次元での成長の影響の検討。３種類の異なる群に分けたハイドロゲルの前液を、それぞれ１００μＬを取って、群に各１０５つ個のＨＵＶＥＣを加えて、軽くピペッティングして均一に混合して９６穴プレートに加えた。ハイドロゲルを形成した後、ＥＣＭ培地を加えて、細胞の増殖能をそれぞれ、１、３、５、７日目にＣＣＫ−８にて検出した。試験方法は前記同様にした。結果から、対照群に比べて、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾ハイドロゲルは細胞の増殖を著しく促進できることがわかった（図３２−Ｅ）。また、７日目に、細胞は生存死亡染色試験を行って、試験方法は前記同様にした。結果から、対照群に比べて、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ機能化修飾ハイドロゲルはＨＵＶＥＣの増殖能を著しく増強させたことがわかった（図３２−Ｆ）。
【０１３５】
実施例２４  融合蛋白質で機能的に修飾されたハイドロゲルによるＨＵＶＥＣの血管機能化に対する影響
実施例２３に記載した３種類の異なる修飾ハイドロゲルの前液を、各２００μＬを用意し、均一にするように６穴プレートに加えた。安定なハイドロゲルを形成した後、ウェル毎に１×１０５個のＨＵＶＥＣを播種して、分別、２４、４８、７２時間に細胞タンパク質を抽出した。詳細は以下の通りである。 培地を捨てて、ＰＢＳで細胞を洗浄した。ＲＩＰＡ（シグマ）で氷の上に細胞を溶解させて、１３０００  ｒｐｍで溶解液を収集して、１０分間遠心分離した。上清を収集してローディングバッファーを加えて５分間沸騰させ、−２０℃で保存して使用に備える。８％−１０％のゲルで電気泳動して、異なる分子量を持つタンパク質を分離した。ゲルの中のタンパク質を湿式転移法で、ＰＶＤＦフィルムに電気転移した。フィルムはブロックして、抗ｖＷＦ、抗ｅＮＯＳの第一抗体（Ａｂｃａｍ）を加えて、４℃でオーバーナイトした。ＰＢＳＴでフィルムを洗浄して、ＩｇＧ−ＨＲＰ第二抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を加えて、室温で２時間インキュベートして、ＰＢＳＴでフィルムを洗浄して、ＥＣＬ発光にてタンパク質の発現を検出した。結果から、対照群とＲＧＤ群に比べて、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾したハイドロゲルは、ＨＵＶＥＣにおいてｖＷＦおよびｅＮＯＳタンパク質の発現を著しく促進できることがわかった（図３３−Ａ、Ｂ）。
【０１３６】
異なる修飾ハイドロゲルの前液を均一にするように９６穴プレートに加えた。安定なハイドロゲルを形成した後、ウェル毎に１×１０４ＨＵＶＥＣｓ細胞を播種して、分別、４ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈに細胞のＮＯ放出量を検出した。詳細は以下の通りである。 ＨＵＶＥＣから培地の上清を採取して、ＮＯキット（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、中国）のガイド説明に従って検出して、ＯＤ５４０で吸光度の値を検出した。結果から、対照群とＲＧＤハイドロゲル群に比べて、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質で機能的に修飾されたハイドロゲルはＮＯの放出を著しく促進できることがわかった（図３３−Ｃ）。
【０１３７】
異なる修飾ハイドロゲルの前液を、各１００μＬで均一にするように共焦点ディシュに加えた。安定なハイドロゲルを形成した後、ディシュ毎に２×１０４個のＨＵＶＥＣを播種した。７２時間後に、細胞が低密度リポタンパク質（Ａｃ−ＬＤＬ）に対する貪食の状況を検出した。詳細は以下の通りである。 細胞を培養した７２時間に、元の細胞培地を除去して、ＰＢＳで洗浄して、新たな細胞培地に蛍光タグ付ける低密度リポタンパク質（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を加えて、５時間程度培養した。培地を除去して、ＰＢＳで細胞を洗浄して、予熱した４％パラホルムアルデヒドで細胞を１０分間固定した。ＰＢＳで洗浄して、ＤＡＰＩで細胞核を１０分間染色して、ＰＢＳで洗浄して、レーザー共焦点顕微鏡にて観察した。結果から、対照群とＲＧＤハイドロゲル群に比べて、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ機能化修飾ハイドロゲルは、ＨＵＶＥＣのＡｃ−ＬＤＬに対する貪食能を著しく増強させたことがわかった（図３３−Ｄ）。
【０１３８】
実施例２５．クリヒドラジド化ヒアルロン酸のデザインと合成
ＡＤＨ（アジピン酸ジヒドラジド）、ＮＨＳ−ＡＣ（Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド）により、ヒアルロン酸鎖に対して二段修飾することで、ヒアルロン酸鎖にクリヒドラジド基による修飾が付与された。詳細は以下の通りである。
【０１３９】
１ｇの分子量が９１ＫＤであるヒアルロン酸（ＨＡ、山東福瑞▲だ▼生物科技有限会社）粉末を精確に１ｇ称量して、その核磁気共鳴の水素スペクトルは図３４−ａに示す。２００ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏを加えて、攪拌して十分に溶解した。溶液に１８ｇのＡＤＨ粉末を加えて、十分に溶解したまで攪拌して、さらに、２ｇのＥＤＡＣ（触媒）粉末を加えて、十分に溶解したまで攪拌した。ｐＨを４．７５に調節して、それぞれ、反応した１０分間、３０分間、１時間、２時間後に溶液のｐＨを４．７５に調節して、オーバーナイト反応した。二日目に、溶液のｐＨを７になるまで調節して、透析工程を始まった：透析液は、それぞれ、１００ｍＭの塩化ナトリウム溶液（４８時間）、１／５のエタノール溶液（４８時間）、ｄｄＨ２Ｏ（４８時間）である。透析の終了後、粉末を凍結乾燥して、粉末の質量を称量した。また、核磁気共鳴の水素スペクトルにてＡＤＨの置換度を検出し、図３４−ｂのＡ，Ｂに示す。ＨＡ−ＡＤＨ産物を得た。
【０１４０】
０．５  ｇのＨＡ−ＡＤＨ産物を称量して、１００ｍｌ  ｄｄＨ２Ｏを加えて溶解し、それに質量比で：ｍＨＡ−ＡＤＨ：ｍＮＨＳ−ＡＣ＝４：３のＮＨＳ−ＡＣを加えて、十分に溶解した。ｐＨを７．２０に調節して、反応が始まった。それぞれ、反応の開始後１０分間、３０分間、１時間、２時間の各時点で溶液のｐＨを４．７５に調整して、オーバーナイト反応した。二日目に、透析工程を始まった：透析液は、１００ｍＭの塩化ナトリウム溶液で４８時間透析して、ｄｄＨ２Ｏで４８時間透析した。透析の終了後、粉末を凍結乾燥して、粉末の質量を称量した。また、核磁気共鳴の水素スペクトルにてＡｃ基（図３４ｃ中のＣ、Ｄの二つのピーク）の置換度を検出した。この工程において全部の反応工程の温度は、室温に制御した。ＨＡ−ＡＣを得た。
【０１４１】
実施例２６．クリヒドラジド化ヒアルロン酸のｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質修飾
ｈＶＥ−ｃａｄ／Ｆｃ−結合（−）前液の調製：１００μＬ  ５％溶液あたりに５μＬの１０ｍｇ／ｍＬ  ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質を加えて、よく混ぜ、３７℃で３０分間反応した。
ｈＶＥ−ｃａｄ／Ｆｃ−結合（＋）前液の調製：１００μＬ  ５％溶液あたりに濃度が４ｍｇ／ｍＬのＦｃ−結合ポリペプチド２μＬ、５ｕＬの１０ｍｇ／ｍＬ  ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質を加えて、よく混ぜ、３７℃で３０分間反応した。ＥＬＩＳＡ法にてｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質の固定量を検定した。具体的方法は以下の通りである。それぞれ５０μＬ前液を取って、架橋剤であるジチオスレイトール（ＤＴＴ）（索莱宝生物有限会社より購入）を加えて、よく混ぜ、９６穴プレートにいれてゲル化させた。ゲル化の終了後、ｈＶＥ−カドヘリン  ＥＬＩＳＡテストキット（索莱宝生物有限会社）で検定を行った。ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ修飾クリヒドラジド化ヒアルロン酸ハイドロゲル、ｈＶＥ−ｃａｄ−ＦｃとＦｃ−ｂｐの組み合わせで修飾クリヒドラジド化ヒアルロン酸ハイドロゲルに、それぞれ２００μＬ  ＰＢＳ溶液を加えてインキュベートした。複数の時点である１，３，５，７日間に、異なる溶液から上清を採取して、上清に残存したｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ融合蛋白質をキットで特定し、その長期安定性を検出した。図３５に示すように、Ｆｃ−ｂｐが添加されていないハイドロゲル群に比べて、ｈＶＥ−ｃａｄ−ＦｃとＦｃ−ｂｐの組み合わせで修飾ハイドロゲル群において、７日目までｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの９０％が残存しており、Ｆｃ−ｂｐが添加されていないハイドロゲル群において、７日目までｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの残存量が５０％に低下した。これは、Ｆｃ−ｂｐの添加が、ハイドロゲルのｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの長期担持安定性を著しく増加できるのを証明した。
【０１４２】
実施例２７．クリヒドラジド化ヒアルロン酸ハイドロゲルの物理化学的特性の特性化
ＭＭＰｓ応答性破断ポリペプチドを含む、両端にチオール化した架橋剤をデザインし、ハイドロゲルの濃度、架橋密度、修飾因子によるハイドロゲルの理化学的キャラクターに対する影響を調べた。
架橋剤であるＭＭＰ−２応答性ポリペプチド（ＣＲＧＤＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）とＤＴＴの両者は、分別、無酸素の無菌ＰＢＳで所要濃度（それぞれ、最終濃度１６０ｍＭ及び２９２ｍＭ）に希釈した。
実施例２５で調製したクリヒドラジド化ヒアルロン酸の溶液１００ｕＬ毎に、０．４５  ｇ／ｍＬ  ＤＴＴ溶液をそれぞれ３ｕＬ、６ｕＬ加えて、架橋度は分別、５０％と１００％になって、よく混ぜ、３７度に置いて３０分間反応させることより、架橋度の異なるハイドロゲルを作製した。
ＤＤＴとＭＭＰ−２により架橋したハイドロゲルのゲル化の前、後のゲル状態を巨視的観察して写真を撮った図であり、図３６−Ａの左は、ＤＴＴにより架橋したハイドロゲルを示し；図３６−Ａの右は、ＭＭＰ−２応答性ポリペプチドで架橋したハイドロゲルを示す。
【０１４３】
ハイドロゲルの前液（Ｆｃ−ｂｐを含む）に、ＭＭＰ−２応答性ポリペプチド架橋剤（クリヒドラジド化ヒアルロン酸の溶液１００μＬあたり、濃度０．２５  ｇ／ｍＬの溶液５μＬを加え）ならびにＤＴＴ架橋剤（クリヒドラジド化ヒアルロン酸１００μＬあたり、０．４５  ｇ／ｍＬの溶液６μＬを加え）を加えて、３７℃で３０分間反応した。ＤＴＴ、ＤＴＴ＋ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃ、ＭＭＰ、ＭＭＰ＋ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの４つのハイドロゲルを生成した。ハイドロゲルにそれぞれ１ｍＬ  ＰＢＳ溶液を加えて、ゲルが十分に膨潤させた。ゲルの膨潤過程において、異なる時点でゲルの質量を秤量して、膨潤性試験を行った。また、以上の試験工程に従って、低、高の２種類の架橋密度（それぞれ、架橋度５０％、１００％）でハイドロゲルの膨潤性試験を行って、架橋密度がゲル安定性に及ぼす影響を観察した。別々、ＤＴＴ架橋ハイドロゲル系、ＭＭＰ−２応答性ポリペプチド架橋ハイドロゲル系を合成した。両方のハイドロゲルは、いずれもＰＢＳ溶液に長期にわたって安定に存在可能である（図３６−Ｂの左）；また、両方のクリヒドラジド化ヒアルロン酸の溶液は、いずれもＤＴＴ又はＭＭＰ架橋剤を加えた後の３０分間でゲル化できる（図３６−Ｂの右）。ＤＴＴ、ＭＭＰ応答性ポリペプチドで架橋したハイドロゲルの両者は、いずれも良好な膨潤性を有しており、また、ｈＶＥ−ｃａｄ−Ｆｃの添加はハイドロゲル自体の膨潤性に影響を与えない（図３６−Ｃ）。
【０１４４】
実施例２８．オルガノイドにおける胆管上皮細胞の免疫蛍光染色
肝オルガノイドの免疫蛍光染色は、実施例１７の方法に従って行った。肝オルガノイドをブロックして、ＰＢＳＤＴ溶液により一定の割合で希釈した第一抗体（希釈の割合は、以下で説明する）を加えて、４℃で２４−４８ｈ反応した後上清を棄て、オルガノイドを冷い０．０１Ｍ  ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。上清を棄て、ＰＢＳＤＴ溶液により一定の割合で希釈した第二抗体（希釈の割合は、以下で説明する）１００μＬを加えた。上清を棄て、冷い０．０１Ｍ  ＰＢＳ溶液でオルガノイドを３回洗い、上清を棄て、ＤＡＰＩを含む蛍光褪色防止用剤１００μＬを加えて、４℃、暗所で保存した。レーザー共焦点顕微鏡（ライカ）で写真を取って観察した。結果を図３７に示す。異なる素材を含むｈＭＳＣ凝集体は２週間連続分化誘導した場合、免疫蛍光染色から分かるように、ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ群において、細胞が肝細胞のマーカーであるＣＫ１８、胆管上皮細胞のマーカーであるＣＫ１９（矢印で示す）がより多く発現され、また、胆管様上皮細胞は、肝様細胞のまわりに比較的な均一に分布できる。これは、かかる基材表面において、ｈＭＳＣから肝様細胞および胆管様上皮細胞への分化効率が最も高くなること、３種類の融合蛋白質がマイクロビーズ表面に均一に分布する場合、細胞がより生体工学的な自己組織挙動を示したことを証明した。
また、２−３つの肝オルガノイドが集合した場合、互いに相互作用してつながって、一定のネットワーク構造が形成される。かかるネットワーク構造は、ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ群においてより顕著であり（図３８）、胆管似た樹状構造を形成できる。
【０１４５】
【表２０】
2021519603.tif 000022
【０１４６】
実施例２９  肝オルガノイドにおいて肝様細胞と内皮様細胞の割合
２週間分化誘導した肝オルガノイドは、ＰＢＳＢでブロックした１．５  ｍＬ遠心分離チューブに収集され、チューブ毎に１  ｍＬ  Ｃｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、商品番号０７１７４）を加えて１０分間消化した。ＰＢＳＢでブロックした１  ｍＬチップを用いて、オルガノイドを単個の細胞に分散するまでピペッティング繰り返し、１  ｍＬ予熱した新しい完全培地を加えて、消化を停止させた。１０００×ｇで５分間遠心分離して、沈殿物を収集した。沈殿物に１  ｍＬ最近配製した４％パラホルムアルデヒドを加えて、３７℃１０分間固定した。上清を棄て、ＰＢＳＢ溶液で細胞を３回洗浄し、１０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を棄て、沈殿物に１  ｍＬ  ９０％冷メタノールを加えて、氷の上に置いて３０分間インキュベートして開孔された；４℃、１０００×ｇで５分間遠心分離して、上清を棄て、ＰＢＳＢで細胞を洗浄して、一回を繰り返し、遠心分離して上清を棄て、室温で０．５％ＢＳＡ溶液により１０分間ブロックした；１：１００の割合で、分別、ウサギ抗ヒトＡＬＢ第一抗体（Ａｂｃａｍ会社、米国）、マウス抗ヒトＣＤ３１第一抗体（ＣＳＴ会社、米国）を加えて、室温で１  インキュベートした；１０００×ｇで５分間遠心分離して、上清を棄て、ＰＢＳＢ溶液で細胞を洗浄して、一回を繰り返した後、１：１０００の割合で特異的Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８マーカーヤギ抗マウス第二抗体又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８マーカーヤギ抗ウサギ第二抗体を加えて、室温、暗所でインキュベート３０分間；１０００×ｇで５分間遠心分離して、上清を棄て、ＰＢＳＢ溶液で細胞を洗浄して、一回を繰り返した；１  ｍＬ  ０．０１  Ｍ  ＰＢＳで沈殿物を再縣濁して、メッシュでフローサイト用チューブにろ過して、フローサイトメーターにてサンプルの中の陽性細胞の発現量を分析した。
【０１４７】
図３９に示すように、ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ群において、肝様細胞と内皮様細胞への分化効率が最も高いで、それぞれ、７７．１％と１４．９％になって、肝臓内の２種の細胞のパーセンテージ含有率に、かなり近づいている。（ｍＥ＋ｍＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ群において、細胞の約６５．５％が肝様細胞に分化誘導しており、細胞の１０．６％が内皮様細胞に分化誘導しており、分化効率はｍ群とｍｃｐ群より顕著に高く。フローサイトメトリーの結果から、融合蛋白質で基材を修飾したマイクロビーズは、ｈＭＳＣｓ凝集体から肝オルガノイドへの分化の過程において、肝様細胞と内皮様細胞への分化効率を向上できることが分かった。
【０１４８】
実施例３０  肝オルガノイドのグリコーゲン貯蔵とインドシアニングリーンの摂取、放出能の検出
２週間分化誘導した肝オルガノイドは、パラフィン切片を作製した。キシレンで脱ロウして、グラデーションエタノールで水に戻した。サンプルを過ヨウ素酸の溶液に入れ、室温で１５〜２０分間酸化して、７０％のエタノール溶液で２回洗った；サンプルにＳｃｈｉｆｆ溶液を加えて、室温、暗所で１０〜２０分間浸漬して染色された；上清を棄て、重亜硫酸ナトリウム溶液で細胞を２回、毎回２分間で洗浄し、７０％エタノール溶液で２分間洗った；室温、ヘマトキシリン染液で１〜２分間二重染色され、塩酸−エタノール溶液で２ｓ分化誘導させて、水道水で２分間すすいだ後、蒸留水で２回洗って、エタノールでグラジェント脱水して風乾させ、中性ガムでカバーグラス封入した。立体顕微鏡で観察して写真を撮った。
【０１４９】
２週間分化誘導した肝オルガノイドには、１  ｍｇ／ｍＬ  インドシアニングリーン溶液を含む培地を加えて、細胞インキュベーターで１ｈ培養した；無菌ＰＢＳＢで細胞を３回洗浄した後、相差顕微鏡で写真を撮った；ＰＢＳＢを棄てて、インドシアニングリーンを含まない新しい培地を加えて、細胞インキュベーターでオーバーナイト培養した。その後、無菌ＰＢＳＢで細胞を３回洗浄して、相差顕微鏡で観察して写真を撮った。
【０１５０】
グリコーゲン貯蔵とインドシアニングリーンの摂取、放出能は、肝細胞の機能を評価ために常用される検出手段である。よって、ＰＡＳ染色とインドシアニングリーンの摂取、放出試験にて、肝オルガノイドの関連機能を考察した。図４０Ａからわかるように、融合蛋白質表面修飾ＰＬＧＡマイクロビーズ（ｍＥ＋ｍＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ群、ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ群）を含む肝オルガノイドは、ＰＡＳ染料で赤紫色に染色可能であることから、更なる優れたグリコーゲン貯蔵能を有することが証明された。また、（ｍＥ＋ｍＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ群とｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ群において、肝オルガノイドがより多いインドシアニングリーン染料を摂取できるので深い緑を呈しており、新しい培地に交換を行って培養した場合、肝オルガノイドがインドシアニングリーンを放出し得る（図４０  Ｂ）。以上結果から、融合蛋白質表面修飾されたマイクロビーズを含む肝オルガノイドは、貯蔵、摂取、放出能を有することが証明された。
【０１５１】
実施例３１  肝オルガノイドの極性タンパク質、代謝酵素の発現
２週間分化誘導した肝オルガノイドにおいて、薬物代謝に関連したタンパク質であるＭＲＰ２及び代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４の発現と分布は、実施例１７と２８の方法で免疫蛍光染色法にて考察した。レーザー共焦点顕微鏡のより、４８８  ｎｍ、５６１  ｎｍと紫外励起光に観察して写真を撮った。抗体の希釈割合は下表に示す。
【０１５２】
ヒト体内の薬物代謝の中心として、薬物の肝臓代謝が肝細胞表面の極性膜タンパク質と代謝酵素の発現を依存している。免疫蛍光染色には（図４１と図４２）、ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ群と（ｍＥ＋ｍＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ群の多くの肝様細胞は、ＭＲＰ２とＣＹＰ３Ａ４に対する特異性抗体により認識された。以上結果から、融合蛋白質表面修飾マイクロビーズを含むｈＭＳＣｓ凝集体から分化誘導した肝オルガノイドは、薬物代謝と緊密に関連している肝細胞膜タンパク質と、Ｉ相酵素であるＣＹＰ３Ａ４を発現でき、細胞の薬物代謝に寄与することがわかった。
【０１５３】
【表２１】
2021519603.tif 000023
【０１５４】
実施例３２  肝オルガノイドのドラッグ感受性の検出
培地で、異なる濃度のアセトアミノフェンとイソニコチン酸ヒドラジッド（０  ｍＭ、０．３９  ｍＭ、０．７８１２５  ｍＭ、１．５６２５  ｍＭ、３．１２５  ｍＭ、６．２５  ｍＭ、１２．５  ｍＭ、２５  ｍＭと５０  ｍＭ）を含む培養液を、それぞれ配製した。それを融合蛋白質を含む肝オルガノイドに別々加えて、２４  ｈ培養した。各群の各ドラッグのＩＣ５０値は、ＣＣＫ−８法にて検定した。ＩＣ５０値のドラッグ濃度を基準とし、ドラッグ濃度が該濃度の２倍、０．５倍である培養液を培地でそれぞれ配製した。それを融合蛋白質を含む肝オルガノイドに加えて２４  ｈ培養した。上清を棄て、０．０１  Ｍ  無菌ＰＢＳで肝オルガノイドを３回洗浄した。１００  ｎＭ  ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒＴＭＲｅｄ  ＣＭＸＲｏｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  、米国、商品番号Ｍ７５１２）、と５  ｍＭ  ＣｅｌｌＲＯＸＴＭＯｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  、米国、商品番号Ｃ１０４４４）を含む培地で、３７℃で、３０分間インキュベートした。培養上清を棄てて、０．０１  Ｍ  無菌ＰＢＳで３回洗浄して、最近配製した４％パラホルムアルデヒド固定後ＰＢＳＢで３回洗浄した。ＤＡＰＩを含む蛍光褪色防止用剤で二重染色され、２４  ｈ以内にレーザー共焦点顕微鏡で４８８  ｎｍ、５６１  ｎｍと紫外励起光でサンプルを観察して写真を撮った。
【０１５５】
ＣＣＫ８の検出結果から、ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ群の細胞に対して、アセトアミノフェンの半数阻害濃度であるＩＣ５０値は、０．５３７  ｍｍｏｌ／Ｌであり、イソニコチン酸ヒドラジッドか細胞の半数致死率を達成するＩＣ５０値は、２．７７５  ｍｍｏｌ／Ｌであり；（ｍＥ＋ｍＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ群の細胞に対して、アセトアミノフェンの半数致死率を達成するＩＣ５０値は、３．２７３  ｍｍｏｌ／Ｌであり、イソニコチン酸ヒドラジッドの細胞の半数阻害濃度であるＩＣ５０値は５．２２６  ｍｍｏｌ／Ｌであることが分かった。（ｍＥ＋ｍＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ群に比べて、ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ群において、アセトアミノフェン、イソニコチン酸ヒドラジッドのＩＣ５０値がいずれも低下した。これから、ｍ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐ群は、肝毒性ドラッグに対する敏感性がより高くであり、そして、イソニコチン酸ヒドラジッドに比べて、アセトアミノフェンが肝オルガノイドに対してよりひどいダメージを与えることが証明された。その後、ＲＯＳ検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  会社、商品番号Ｃ１０４４４）、Ｍｉｔｒｏ検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  会社、商品番号Ｍ７５１２）で、異なるモデルドラッグによる肝オルガノイドのＲＯＳの生成、肝細胞のミトコンドリアに与えるダメージをそれぞれ評価した。図４３と図４４から分かるように、ドラッグの濃度が高くなるにつれて、ＲＯＳのレベルは上げ続けて、緑の蛍光の強さは上げ続けて、一方で、ミトコンドリアの膜電位が低下して、赤の蛍光の強さは減少し続けた。これは、ドラッグの濃度が高くなるにつれて、肝細胞を与えるダメージも上げ続けて、用量依存性を呈することを証明した。また、肝オルガノイドは、肝毒性モデルドラッグに対して一定の感受性を有し、ドラッグ毒性の有効評価手段として有用である。
【０１５６】
実施例３３  胚性幹細胞から肝オルガノイドへの分化の検討
異なるマウス胚性幹細胞（中国科学院典型的培養物寄託委員会細胞バンク）の凝集体は、実施例１６の方法で調製した。即ち：コラーゲン修飾マイクロビーズを含む胚性幹細胞の凝集体（ｅｃｐと略記）；ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃ、ｈＶＥ−ｃａｄ−ＦｃとｈＶＥＧＦ−Ｆｃで共同修飾されたマイクロビーズを含む胚性幹細胞の凝集体（ｅ（Ｅ／ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと略記）；と等割合を混合した異なる融合蛋白質それぞれ修飾されたマイクロビーズを含む胚性幹細胞の凝集体（ｅ（Ｅ＋ＶＥ／ＶＥＧＦ）ｐと略記）である。マイクロビーズを含まない胚性幹細胞の凝集体（ｅと略記）をｃｏｎｔｒｏｌとして、下表に示す定向分化誘導培地で２１日間連続的培養を行って分化誘導した。２１日目にＲＮＡを抽出して、ＰＣＲテストを行った。具体的プライマー配列は、下表に示す。結果を図４５に示す。
【０１５７】
図４５から分かるように、融合蛋白質を含む凝集体は、内胚葉細胞マーカーであるＦｏｘＡ２の発現能力、肝細胞関連遺伝子マーカーであるＨＮＦ４αの発現能力、成熟肝細胞遺伝子マーカーであるＡＬＢの発現能力、内皮細胞関連遺伝子マーカーであるＣＤ３１の発現能力、肝細胞極性タンパク質遺伝子マーカーであるＯＡＴＰの発現能力と肝細胞関連代謝酵素に関連する遺伝子マーカーであるＧ６ｐａｓｅの発現能力が、その他の両群より顕著に高いである。これは、融合蛋白質が細胞分化因子と協調して、胚性幹細胞の凝集体が一定の構造と機能を有する肝オルガノイドに分化誘導されることを促進できるのを証明した。
【０１５８】
【表２２】
2021519603.tif 000024
【０１５９】
【表２３】
2021519603.tif 000025
【図１】
2021519603.tif 000026
【図２Ａ】
2021519603.tif 000027
【図２Ｂ】
2021519603.tif 000028
【図３】
2021519603.tif 000029
【図４】
2021519603.tif 000030
【図５】
2021519603.tif 000031
【図６】
2021519603.tif 000032
【図７】
2021519603.tif 000033
【図８】
2021519603.tif 000034
【図９】
2021519603.tif 000035
【図１０】
2021519603.tif 000036
【図１１】
2021519603.tif 000037
【図１２】
2021519603.tif 000038
【図１３】
2021519603.tif 000039
【図１４】
2021519603.tif 000040
【図１５】
2021519603.tif 000041
【図１６】
2021519603.tif 000042
【図１７】
2021519603.tif 000043
【図１８】
2021519603.tif 000044
【図１９】
2021519603.tif 000045
【図２０】
2021519603.tif 000046
【図２１】
2021519603.tif 000047
【図２２】
2021519603.tif 000048
【図２３】
2021519603.tif 000049
【図２４】
2021519603.tif 000050
【図２５】
2021519603.tif 000051
【図２６】
2021519603.tif 000052
【図２７】
2021519603.tif 000053
【図２８】
2021519603.tif 000054
【図２９Ａ】
2021519603.tif 000055
【図２９Ｂ】
2021519603.tif 000056
【図３０】
2021519603.tif 000057
【図３１】
2021519603.tif 000058
【図３２】
2021519603.tif 000059
【図３３】
2021519603.tif 000060
【図３４Ａ】
2021519603.tif 000061
【図３４Ｂ】
2021519603.tif 000062
【図３４Ｃ】
2021519603.tif 000063
【図３５】
2021519603.tif 000064
【図３６Ａ】
2021519603.tif 000065
【図３６Ｂ】
2021519603.tif 000066
【図３６Ｃ】
2021519603.tif 000067
【図３７】
2021519603.tif 000068
【図３８】
2021519603.tif 000069
【図３９】
2021519603.tif 000070
【図４０】
2021519603.tif 000071
【図４１】
2021519603.tif 000072
【図４２】
2021519603.tif 000073
【図４３】
2021519603.tif 000074
【図４４】
2021519603.tif 000075
【図４５】
2021519603.tif 000076
【配列表】
2021519603000001.app
【国際調査報告】
2021519603.tif 000077
2021519603.tif 000078
2021519603.tif 000079
2021519603.tif 000080
2021519603.tif 000081
2021519603.tif 000082