(57)【要約】本開示は、翻訳後修飾を標識部分で置き換えることによってペプチドにおけるアミノ酸残基を選択的に標識する方法、および当該ペプチドを配列決定して当該アミノ酸残基の位置および翻訳後修飾の同一性を得る方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、治療目的に使用され得るペプチドにおける翻訳後修飾の位置、量、同一性、またはそれらの任意の組み合わせを同定する方法も提供する。2021530549.tif 000016
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸残基の翻訳後修飾を同定する方法であって、
（Ａ）標識試薬が前記ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸残基の翻訳後修飾と相互作用するような条件下で前記ペプチドまたはタンパク質を前記標識試薬で処理する工程であって、前記標識試薬またはその誘導体を前記アミノ酸残基に共有結合させて、標識されたペプチドまたはタンパク質を得る、工程、および
（Ｂ）標識された前記ペプチドまたはタンパク質を配列決定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記アミノ酸残基の前記翻訳後修飾が、リン酸化、グリコシル化、ニトロシル化、シトルリン化、スルフェニル化、またはトリメチル化である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標識試薬が、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、またはペプチド核酸である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記標識試薬がフルオロフォアである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドまたはタンパク質を前記標識試薬で処理する工程が、
（ｉ）前記ペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾が反応性基に変換されるような条件下で前記ペプチドまたはタンパク質を反応させて、反応性ペプチドまたはタンパク質を形成させることと、
（ｉｉ）前記標識試薬を前記反応性ペプチドまたはタンパク質と反応させて、標識された前記ペプチドまたはタンパク質を形成させることと
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記反応性ペプチドまたはタンパク質が、リン酸化翻訳後修飾を含む前記ペプチドまたはタンパク質を塩基で処理することによって形成される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記反応性ペプチドまたはタンパク質が、リン酸化翻訳後修飾を含む前記ペプチドまたはタンパク質を活性化剤および塩基で処理することによって形成される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記反応性ペプチドまたはタンパク質が、トリメチル翻訳後修飾を含む前記ペプチドまたはタンパク質を酸化銀（Ａｇ２Ｏ）で処理することによって形成される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記反応性ペプチドまたはタンパク質が、グリコシル化翻訳後修飾を含む前記ペプチドまたはタンパク質を酸化剤で処理することによって形成される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応性ペプチドまたはタンパク質が、ニトロシル化翻訳後修飾を含む前記ペプチドまたはタンパク質を還元剤で処理することによって形成される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応性ペプチドまたはタンパク質が、ニトロシル化翻訳後修飾を含む前記ペプチドまたはタンパク質をホスフィンで処理することによって形成される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドまたはタンパク質を前記標識試薬と接触させることが、翻訳後修飾を含む前記ペプチドまたはタンパク質をホスフィンと反応させることを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドまたはタンパク質を前記標識試薬と接触させることが、翻訳後修飾を含む前記ペプチドまたはタンパク質をグリオキサール基と反応させることを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記配列決定が、蛍光配列決定法を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記配列決定が、単一分子レベルでのものである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記蛍光配列決定法が、翻訳後修飾を含まない前記ペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を第２の標識試薬で標識することを含む、請求項１４または請求項１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドまたはタンパク質が、固体支持体に結合される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記蛍光配列決定法が、前記ペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基を除去することをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記蛍光配列決定法が、修飾された翻訳後修飾を含む標識されたアミノ酸が除去されるまで、前記ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸残基を連続的に除去することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記アミノ酸残基がエドマン分解によって除去される、請求項１８または請求項１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
Ｎ末端アミノ酸残基をチオ尿素および酸、マイクロ波照射、または熱で処理することによって前記アミノ酸残基が除去される、請求項１８または請求項１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記アミノ酸残基が酵素によって除去される、請求項１８または請求項１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ペプチドまたはタンパク質が生体サンプルから得られる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記生体サンプルが無細胞生体サンプルである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ペプチドまたはタンパク質の前記アミノ酸残基の翻訳後修飾と前記標識試薬との間に共有結合が形成される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記標識試薬またはその誘導体が、前記アミノ酸残基に直接共有結合する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記標識試薬またはその誘導体が、中間分子を介して前記アミノ酸残基に共有結合する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
対象における疾患または障害の状態を判定する方法であって、
（Ａ）請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法を使用して、タンパク質またはペプチドにおける１つまたは複数の翻訳後修飾のタイプ、同一性、量、または位置の変化を検出する工程、および
（Ｂ）少なくとも前記変化に従って、前記対象の疾患または障害の状態を判定する工程を含む、方法。
【請求項２９】
前記対象から生体サンプルを入手する工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記生体サンプルが無細胞生体サンプルである、請求項２８または請求項２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、１つ以上の翻訳後修飾が存在することを伝達する、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、１つ以上の翻訳後修飾が存在しないことを伝達する、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が哺乳動物である、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記翻訳後修飾のタイプ、同一性、量、または位置を決定する前に前記タンパク質を濃縮する工程をさらに含む、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記タンパク質が固体支持体上に固定される、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
対象における疾患または障害の状態を判定する方法であって、
前記疾患または障害に関連する請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法を使用して、タンパク質またはペプチドにおける翻訳後修飾のタイプ、同一性、量、または位置の変化を検出する工程
を含む、方法。
【請求項３７】
前記対象から生体サンプルを入手する工程をさらに含む、請求項３６に記載のアッセイ方法。
【請求項３８】
１つ以上の翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質を含む修飾されたペプチドまたはタンパク質であって、１つ以上の翻訳後修飾を含む前記ペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの翻訳後修飾が、少なくとも第１の標識部分で改変されており、それによって１つ以上の翻訳後修飾を含む標識されたペプチドまたはタンパク質を形成している、修飾されたペプチドまたはタンパク質。
【請求項３９】
少なくとも前記第１の標識部分がフルオロフォアである、請求項３８に記載の修飾されたペプチドまたはタンパク質。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの翻訳後修飾が、リン酸化、グリコシル化、ニトロシル化、シトルリン化、スルフェニル化、トリメチル化、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項３８または請求項３９のいずれかに記載の修飾されたペプチドまたはタンパク質。
【請求項４１】
リン酸化、グリコシル化、ニトロシル化、シトルリン化、スルフェニル化、またはトリメチル化からなる群より選択される各翻訳後修飾が、別個の標識部分によって改変されている、請求項４０に記載の修飾されたペプチドまたはタンパク質。
【請求項４２】
前記ペプチドまたはタンパク質が、固体支持体に隣接して固定される、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の修飾されたペプチドまたはタンパク質。
【請求項４３】
ペプチドまたはタンパク質を配列決定する方法であって、
（Ａ）無細胞生体サンプルを入手し、前記無細胞生体サンプルから前記ペプチドまたはタンパク質を分離する工程、
（Ｂ）翻訳後修飾に関連する前記ペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基と相互作用するのに十分な条件下で前記ペプチドまたはタンパク質を第１の標識部分で標識する工程であって、前記ペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの標識されたアミノ酸残基を形成させる、工程、
（Ｃ）前記ペプチドまたはタンパク質を、前記ペプチドまたはタンパク質から１つ以上の個々のアミノ酸残基を除去するのに十分な条件に供する工程、および
（Ｄ）前記少なくとも１つの標識されたアミノ酸残基からの少なくとも１つのシグナルを検出する工程であって、それによって前記ペプチドまたはタンパク質の配列を同定する、工程
を含む、方法。
【請求項４４】
前記アミノ酸残基の前記翻訳後修飾が、リン酸化、グリコシル化、ニトロシル化、シトルリン化、スルフェニル化、またはトリメチル化である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１の標識部分が、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、またはペプチド核酸である、請求項４３または請求項４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記ペプチドまたはタンパク質を前記第１の標識部分で標識する工程が、
（ｉ）前記ペプチドまたはタンパク質の前記翻訳後修飾が反応性基に変換されるような条件下で前記ペプチドまたはタンパク質を処理して、反応性ペプチドまたはタンパク質を形成させること、および
（ｉｉ）前記第１の標識部分を前記反応性ペプチドまたはタンパク質で処理して、標識されたペプチドまたはタンパク質を形成させること
を含む、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記配列決定が蛍光配列決定法を含む、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記配列決定が単一分子レベルでのものである、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記蛍光配列決定法が、前記ペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基を第２の標識試薬で標識することを含む、請求項４７または請求項４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記ペプチドまたはタンパク質が固体支持体に結合される、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記蛍光配列決定法が、前記ペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基を除去することをさらに含む、請求項４３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記蛍光配列決定法が、修飾された翻訳後修飾を含む標識されたアミノ酸が除去されるまで、前記ペプチドまたはタンパク質の各アミノ酸残基を連続的に除去することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ポリペプチド配列の同定のための方法であって、
（Ａ）対象の無細胞生体サンプルから第１のポリペプチドを得る工程、
（Ｂ）前記第１のポリペプチドを使用して、支持体に固定された第２のポリペプチドを生成する工程であって、前記第２のポリペプチドが、標識されたアミノ酸を含む、工程、
（Ｃ）前記第２のポリペプチドを、前記ポリペプチドからアミノ酸を除去するのに十分な条件に供する工程、および
（Ｄ）前記ポリペプチドからの前記アミノ酸の除去中または除去後に、標識された前記アミノ酸のうちの少なくともサブセットからのシグナルを検出する工程であって、それにより、前記第２のポリペプチドの配列を同定して、前記無細胞生体サンプルからの前記第１のポリペプチドの配列を決定する、工程
を含む、方法。
【請求項５４】
少なくとも１つの翻訳後修飾を含むかまたは含むと疑われるタンパク質またはペプチドを処理または分析するための方法であって、
（Ａ）前記タンパク質またはペプチドを配列決定する工程、および
（Ｂ）前記タンパク質もしくはペプチドまたはそれらの誘導体の少なくとも１つのアミノ酸サブユニットにおける前記少なくとも１つの翻訳後修飾を同定する工程
を含む、方法。
【請求項５５】
前記配列決定が、前記タンパク質またはペプチドを分解条件に供して、前記タンパク質またはペプチドからアミノ酸サブユニットを連続的に除去すること、および前記アミノ酸サブユニットのうちの少なくともサブセットを検出することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記タンパク質またはペプチドが、サンプルから得られ、かつ前記少なくとも１つの翻訳後修飾を標識するように処理される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記サンプルが無細胞サンプルである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記配列決定が、前記タンパク質またはペプチドの前記少なくとも１つの翻訳後修飾を標識で標識すること、および前記標識を検出し、それによって前記タンパク質またはペプチドの前記少なくとも１つの翻訳後修飾を同定することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
タンパク質またはペプチドを処理または分析するための方法であって、
前記タンパク質またはペプチドを、前記タンパク質またはペプチドの種々の翻訳後修飾を特異的に標識するのに十分な条件に供する工程、および
前記タンパク質またはペプチドの前記種々の翻訳後修飾に対応する標識を検出する工程であって、それにより、前記タンパク質またはペプチドの前記種々の翻訳後修飾を検出する、工程
を含む、方法。
【請求項６０】
前記種々の翻訳後修飾が、リン酸化、グリコシル化、ニトロシル化、シトルリン化、スルフェニル化、またはトリメチル化を含む、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年７月２３日に出願され、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国仮出願第６２／７０２，３１８号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された、グラント第Ｒ３５  ＧＭ１２２４８０号およびＯＤ００９５７２号に基づく政府支援によって行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、選択したアミノ酸の側鎖またはペプチドもしくはタンパク質のＮ末端およびＣ末端における化学部分の共有結合である。多くのタンパク質の活性および機能は、それらのＰＴＭの性質によって調節される。ＰＴＭのいくつかの非限定的な例には、リン酸化、グリコシル化、アルキル化、アシル化、ヒドロキシル化、または補因子もしくはヌクレオチドの結合が含まれる。多くの様々なタイプのＰＴＭのうち、化学修飾の重要な部類の１つであるリン酸化は、遍在性があり、広く研究されている。これは、細胞シグナル伝達および病状の診断における、それらの重要な役割のためである（Ａｒｄｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７；Ｓｔｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）。ＰＴＭによって修飾されたアミノ酸残基を検出してマッピングすることは、その知識を効果的な疾患治療へと転換する研究にとって、生物学的に重要である。
【０００４】
そのような例の１つは、リン酸化が可能な約２０個のチロシン残基を含む、タンパク質の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのＣ末端ドメインである。活性化細胞におけるこれらのリン酸化部位の組み合わせに応じて、下流のプロセスは、細胞増殖、分化、抗アポトーシス（生存）、接着、遊走、および血管新生の範囲で変動し得る（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）。したがって、これらの部位を理解してマッピングすることは、細胞シグナル伝達経路をよりよく理解するためだけでなく、現行の治療薬を発展させるためにも重要である。しかしながら、翻訳後修飾のマッピングは、それらの量が少なく、サンプルが不均一であるため、本質的に困難である。現行の方法は、ＰＴＭを定量的に決定することもできるが、ＰＴＭの特定の位置を正確に決定することはできない。したがって、タンパク質またはペプチドのＰＴＭの検出を改善することで可能になる同定方法への、満たされていないニーズが残っている。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、タンパク質またはペプチドの配列決定、および／またはタンパク質またはペプチドの同定のための方法およびシステムを提供する。本開示の方法およびシステムを使用して、翻訳後修飾およびそのような翻訳後修飾の位置を決定するために、タンパク質またはペプチドを配列決定することができる。
【０００６】
いくつかの態様では、本開示は、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸残基の翻訳後修飾を同定する方法であって、
（Ａ）標識試薬がペプチドまたはタンパク質のアミノ酸残基の翻訳後修飾と相互作用するような条件下でペプチドまたはタンパク質を標識試薬で処理する工程であって、標識試薬またはその誘導体をアミノ酸残基に共有結合させて、標識されたペプチドまたはタンパク質を得る、工程、および
（Ｂ）標識されたペプチドまたはタンパク質を配列決定する工程
を含む、方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、リン酸化、グリコシル化、ニトロシル化、シトルリン化、スルフェニル化、またはトリメチル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、チロシン、セリン、またはスレオニンのリン酸化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、セリンのリン酸化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、スレオニンのリン酸化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、Ｎ−グリコシル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、アスパラギンまたはアルギニンのグリコシル化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、Ｏ−グリコシル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、セリン、スレオニン、またはチロシンのグリコシル化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、トリメチル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、リジンのトリメチル化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、ニトロシル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、システインまたはチロシンのニトロシル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、システインのニトロシル化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、チロシンのニトロシル化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、シトルリン化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、スルフェニル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、システインのスルフェニル化である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、タンパク質のアミノ酸残基上にある。他の実施形態では、翻訳後修飾は、ペプチドのアミノ酸残基上にある。いくつかの実施形態では、標識試薬は、チオール基を含む。いくつかの実施形態では、標識試薬は、２つのチオール基を含む。いくつかの実施形態では、標識試薬は、スクシンイミジルエステルなどのアミン反応性基を含む。いくつかの実施形態では、標識試薬は、グリオキサール基を含む。いくつかの実施形態では、標識試薬は、１，３−ヘキサンジオンなどの１，３−シクロアルカンジオン基を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、標識試薬は、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、またはペプチド核酸である。いくつかの実施形態では、標識試薬は、フルオロフォアである。いくつかの実施形態では、標識試薬は、フルオロフォアを含むチオールである。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、ローダミン色素などのキサンテン色素である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、方法は、
（ｉ）ペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾が反応性基に変換されるような条件下でペプチドまたはタンパク質を反応させて、反応性ペプチドまたはタンパク質を形成させること；
（ｉｉ）標識試薬を反応性ペプチドまたはタンパク質と反応させて、標識されたペプチドまたはタンパク質を形成させること
を含む、ペプチドまたはタンパク質を標識試薬で処理をする工程を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、リン酸化翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質を塩基で処理することによって形成される。いくつかの実施形態では、塩基は、Ｂａ（ＯＨ）２などの希土類金属水酸化物である。
【００１２】
他の実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、リン酸化翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質を活性化剤および塩基で処理することによって形成される。いくつかの実施形態では、活性化剤は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミドである。いくつかの実施形態では、塩基は、イミダゾールなどのヘテロ芳香族塩基である。
【００１３】
他の実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、トリメチル翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質を酸化銀（Ａｇ２Ｏ）で処理することによって形成される。いくつかの実施形態では、トリメチル翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質は、熱の存在下で酸化銀で処理される。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、トリメチル翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質を塩基で処理することによって形成される。いくつかの実施形態では、塩基は、ジイソプロピルエチルアミンまたはトリメチルアミンなどの窒素塩基である。
【００１４】
他の実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、グリコシル化翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質を酸化剤で処理することによって形成される。いくつかの実施形態では、酸化剤は、過ヨウ素酸ナトリウムなどの超原子価ヨウ化物試薬である。
【００１５】
他の実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、ニトロシル化翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質を還元剤で処理することによって形成される。いくつかの実施形態では、還元剤は、ジチオスレイトールなどのジスルフィド還元剤である。いくつかの実施形態では、還元剤は、ヘムをさらに含む。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、ニトロシル化翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質をホスフィンで処理することによって形成される。いくつかの実施形態では、ホスフィンは、非置換もしくは置換トリアルキルホスフィン、または非置換もしくは置換トリアリールホスフィンである。いくつかの実施形態では、ホスフィンは、非置換または置換トリアリールホスフィンである。いくつかの実施形態では、ホスフィンは、非置換または置換トリフェニルホスフィンである。いくつかの実施形態では、方法は、ペプチドまたはタンパク質を標識試薬と接触させることを含み、翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質をホスフィンと反応させることを含む。いくつかの実施形態では、ホスフィンは、非置換もしくは置換トリアルキルホスフィン、または非置換もしくは置換トリアリールホスフィンである。いくつかの実施形態では、ホスフィンは、非置換または置換トリアリールホスフィンである。いくつかの実施形態では、ホスフィンは、非置換または置換トリフェニルホスフィンである。いくつかの実施形態では、ホスフィンが標識試薬に共有結合する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、方法は、ペプチドまたはタンパク質を標識試薬と接触させることを含み、翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質をグリオキサール基と反応させることを含む。いくつかの実施形態では、グリオキサール基が標識試薬に共有結合する。他の実施形態では、方法は、ペプチドまたはタンパク質を標識試薬と接触させることを含み、翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質を、１，３−シクロヘキサンジオンなどの１，３−シクロアルカンジオンと反応させることを含む。いくつかの実施形態では、１，３−シクロアルカンジオンが標識試薬に共有結合する。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質の反応性基は、二重結合である。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、チオレンクリック反応を含む標識試薬で処理されて、標識されたペプチドまたはタンパク質を形成する。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、オレフィンメタセシス試薬の存在下で、二重結合を有する標識試薬で処理されて、標識されたペプチドまたはタンパク質を形成する。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、付加環化反応を含む標識試薬で処理されて、標識されたペプチドまたはタンパク質を形成する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質の反応性基は、アルデヒドである。いくつかの実施形態では、標識試薬は、求核付加、求核置換、またはラジカル付加を含む反応性ペプチドまたはタンパク質の反応性基で処理される。いくつかの実施形態では、標識試薬は、反応性ペプチドまたはタンパク質の反応性基で処理されると、チオエーテルを形成する。いくつかの実施形態では、標識試薬は、ジチアンを形成する。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、標識試薬で処理されてアミド結合を形成する。いくつかの実施形態では、アミド結合の形成は、標識されたペプチドまたはタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、標識試薬で処理されて、ジスルフィド結合を形成する。いくつかの実施形態では、ジスルフィド結合の形成は、標識されたペプチドまたはタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、標識試薬で処理されて、ヘテロシクロアルカンを形成する。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキル基の形成は、標識されたペプチドまたはタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、標識試薬で処理されて、チオエーテル結合を形成する。いくつかの実施形態では、チオエーテル結合の形成は、標識されたペプチドまたはタンパク質を提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、配列決定は、蛍光配列決定法を含む。いくつかの実施形態では、配列決定は、単一分子レベルで行われる。いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、翻訳後修飾を含まないペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を、第２の標識試薬で標識することを含む。いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、翻訳後修飾を含まないペプチドまたはタンパク質の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの別個のアミノ酸を標識することを含む。いくつかの実施形態では、各アミノ酸は、異なる第２の標識試薬で標識される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、表面などの固体支持体に結合される。いくつかの実施形態では、固体支持体は、樹脂、ビーズ、または修飾ガラス表面である。いくつかの実施形態では、固体支持体は、アミノシリケート表面などの修飾ガラス表面である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、ペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、ペプチドまたはタンパク質の連続する２つ以上のアミノ酸残基を連続的に除去することを含む。いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、修飾された翻訳後修飾を含む標識されたアミノ酸が除去されるまで、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸残基を連続的に除去することを含む。いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、修飾された翻訳後修飾を含む標識されたアミノ酸が除去されるまで、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸残基の１〜２０個を連続的に除去することを含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、エドマン分解によって除去される。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、Ｎ末端アミノ酸残基をチオ尿素および酸、マイクロ波照射、または熱で処理することによって除去される。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、酵素によって除去される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、プロテアーゼによって消化される。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、翻訳後修飾を含むアミノ酸を標識する前に、プロテアーゼによって消化される。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、生体サンプルから得られる。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、無細胞生体サンプルである。いくつかの実施形態では、生体サンプルは血液に由来する。他の実施形態では、生体サンプルは尿に由来する。他の実施形態では、生体サンプルは粘液に由来する。他の実施形態では、生体サンプルは唾液に由来する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸残基の翻訳後修飾と標識試薬との間に共有結合が形成される。いくつかの実施形態では、標識試薬またはその誘導体は、前記アミノ酸残基に直接共有結合する。いくつかの実施形態では、標識試薬またはその誘導体は、中間分子を介して前記アミノ酸残基に共有結合する。
【００２３】
さらに別の態様では、本開示は、対象における疾患または障害の状態を判定する方法であって、
（Ａ）本明細書に記載の方法を使用して、タンパク質またはペプチドにおける１つまたは複数の翻訳後修飾のタイプ、同一性、量、または位置の変化を検出する工程、および
（Ｂ）少なくとも前記変化に従って、対象の疾患または障害の状態を判定する工程
を含む、方法を提供する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、方法は、対象から生体サンプルを入手する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、疾患または障害の状態を判定することは、疾患を有する患者の予後を判定することである。他の実施形態では、疾患または障害の状態を判定することは、疾患を有する患者を診断することである。他の実施形態では、疾患または障害の状態を判定することは、患者が疾患を患うリスクがあるかどうかを判定することである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、タンパク質またはペプチドの翻訳後修飾の変化は、タンパク質のリン酸化の変化である。他の実施形態では、タンパク質またはペプチドの翻訳後修飾の変化は、タンパク質のトリメチル化の変化である。他の実施形態では、タンパク質またはペプチドの翻訳後修飾の変化は、タンパク質のグリコシル化の変化である。他の実施形態では、タンパク質またはペプチドの翻訳後修飾の変化は、タンパク質のニトロシル化の変化である。いくつかの実施形態では、タンパク質またはペプチドの翻訳後修飾の変化は、タンパク質のシトルリン化の変化である。いくつかの実施形態では、タンパク質またはペプチドの翻訳後修飾の変化は、タンパク質のスルフェニル化の変化である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、生体サンプルは、唾液、粘液、尿、血清、血漿、または全血などの無細胞生体サンプルである。いくつかの実施形態では、この方法は、１つ以上の翻訳後修飾が存在することを伝達する。いくつかの実施形態では、この方法は、２つ以上の翻訳後修飾が存在することを伝達する。いくつかの実施形態では、この方法は、１つ以上の翻訳後修飾が存在しないことを伝達する。いくつかの実施形態では、この方法は、１つ以上の翻訳後修飾が存在しないこと、および１つ以上の翻訳後修飾が存在することを伝達する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、この方法は、タンパク質の翻訳後修飾のタイプを伝達する。いくつかの実施形態では、この方法は、タンパク質の翻訳後修飾の同一性を伝達する。いくつかの実施形態では、この方法は、タンパク質の翻訳後修飾の量を伝達する。いくつかの実施形態では、この方法は、タンパク質の翻訳後修飾の位置を伝達する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、この方法は、翻訳後修飾のタイプ、同一性、量、または位置を決定する前に、タンパク質を濃縮する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、生体サンプルの精製によって濃縮される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、翻訳後修飾のタイプまたは同一性を決定する前に分解される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、プロテアーゼによって分解される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、固体支持体上に固定される。いくつかの実施形態では、固体支持体は表面である。いくつかの実施形態では、固体支持体は、樹脂、ビーズ、または修飾ガラス表面である。いくつかの実施形態では、固体支持体は、アミノシリケート表面などの修飾ガラス表面である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、この方法は、２つ以上のペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾のタイプ、同一性、量、または位置を決定することを含む。
【００３１】
さらに別の態様では、本開示は、対象における疾患または障害の状態を判定するための方法であって、
疾患または障害に関連する本明細書に記載の方法を使用して、タンパク質またはペプチドにおける翻訳後修飾のタイプ、同一性、量、または位置の変化を検出する工程
を含む、方法を提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、方法は、対象から生体サンプルを入手する工程をさらに含む。
【００３３】
さらに別の態様では、本開示は、１つ以上の翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質を含む修飾されたペプチドまたはタンパク質を提供する。ここで、１つ以上の翻訳後修飾を含む前記ペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの翻訳後修飾は、少なくとも第１の標識部分で改変され、それにより、１つ以上の翻訳後修飾を含む標識されたペプチドまたはタンパク質を形成する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、少なくとも第１の標識部分はフルオロフォアである。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、ペプチドまたはタンパク質の１つ以上のアミノ酸残基に結合した第２の標識部分を含む。いくつかの実施形態では、第２の標識部分はフルオロフォアである。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの翻訳後修飾は、リン酸化、グリコシル化、ニトロシル化、シトルリン化、スルフェニル化、トリメチル化、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、リン酸化、グリコシル化、ニトロシル化、シトルリン化、スルフェニル化、またはトリメチル化からなる群より選択される各翻訳後修飾は、別個の標識部分によって改変されている。いくつかの実施形態では、修飾されたペプチドまたはタンパク質は、３個のアミノ酸残基〜約２５０個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたペプチドまたはタンパク質は、５個のアミノ酸残基〜約１００個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたペプチドまたはタンパク質は、約７個のアミノ酸残基〜約５０個のアミノ酸残基を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、第１の標識試薬は、アミノ酸残基の翻訳後修飾を置き換える。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、タンパク質のアミノ酸残基上にある。他の実施形態では、翻訳後修飾は、ペプチドのアミノ酸残基上にある。いくつかの実施形態では、第１の標識試薬は、チオール基を含む。いくつかの実施形態では、第１の標識試薬は、２つのチオール基を含む。いくつかの実施形態では、第１の標識試薬は、スクシンイミジルエステルなどのアミン反応性基を含む。いくつかの実施形態では、第１の標識試薬は、グリオキサール基を含む。いくつかの実施形態では、第１の標識試薬は、１，３−ヘキサンジオンなどの１，３−シクロアルカンジオン基を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、第１または第２の標識試薬は、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、またはペプチド核酸である。いくつかの実施形態では、第１または第２の標識試薬のうちの１つは、フルオロフォアである。いくつかの実施形態では、標識試薬は、フルオロフォアを含むチオールである。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、ローダミン色素などのキサンテン色素である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、第２の標識部分は、第１の標識部分とは異なるタイプのペプチドまたはタンパク質のアミノ酸に結合している。いくつかの実施形態では、方法は、ペプチドまたはタンパク質の１つ以上の別個のアミノ酸に付着した、１つ以上のさらなる標識部分をさらに含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、固体支持体に隣接して固定される。いくつかの実施形態では、固体支持体は表面である。いくつかの実施形態では、固体支持体は、樹脂、ビーズ、または修飾ガラス表面である。いくつかの実施形態では、固体支持体は、アミノシリケート表面などの修飾ガラス表面である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、プロテアーゼによって分解された。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、ペプチドまたはタンパク質のリン酸化である。他の実施形態では、翻訳後修飾は、ペプチドまたはタンパク質のトリメチル化である。他の実施形態では、翻訳後修飾は、ペプチドまたはタンパク質のグリコシル化である。他の実施形態では、翻訳後修飾は、ペプチドまたはタンパク質のニトロシル化である。他の実施形態では、翻訳後修飾は、ペプチドまたはタンパク質のシトルリン化である。他の実施形態では、翻訳後修飾は、ペプチドまたはタンパク質のスルフェニル化である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、チロシン、セリン、またはスレオニンのリン酸化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、セリンのリン酸化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、スレオニンのリン酸化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、Ｎ−グリコシル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、アスパラギンまたはアルギニンのグリコシル化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、Ｏ−グリコシル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、セリン、スレオニン、またはチロシンのグリコシル化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、トリメチル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、リジンのトリメチル化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、ニトロシル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、システインまたはチロシンのニトロシル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、システインのニトロシル化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、チロシンのニトロシル化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、シトルリン化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、スルフェニル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、システインのスルフェニル化である。
【００４１】
別の態様では、本開示は、ペプチドまたはタンパク質を配列決定する方法であって、
（Ａ）無細胞生体サンプルを入手し、無細胞生体サンプルからペプチドまたはタンパク質を分離する工程、
（Ｂ）翻訳後修飾に関連するペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基と相互作用するのに十分な条件下で、ペプチドまたはタンパク質を第１の標識部分で標識する工程であって、ペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの標識されたアミノ酸残基を形成させる、工程、
（Ｃ）ペプチドまたはタンパク質を、ペプチドまたはタンパク質から１つ以上の個々のアミノ酸残基を除去するのに十分な条件に供する工程、および
（Ｄ）少なくとも１つの標識されたアミノ酸残基からの少なくとも１つのシグナルを検出する工程であって、それによってペプチドまたはタンパク質の配列を同定する、工程
を含む、方法を提供する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、リン酸化、グリコシル化、ニトロシル化、シトルリン化、スルフェニル化、またはトリメチル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、チロシン、セリン、またはスレオニンのリン酸化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、セリンのリン酸化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、スレオニンのリン酸化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、Ｎ−グリコシル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、アスパラギンまたはアルギニンのグリコシル化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、Ｏ−グリコシル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、セリン、スレオニン、またはチロシンのグリコシル化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、トリメチル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、リジンのトリメチル化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、ニトロシル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、システインまたはチロシンのニトロシル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、システインのニトロシル化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、チロシンのニトロシル化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、シトルリン化である。他の実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、スルフェニル化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の翻訳後修飾は、システインのスルフェニル化である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、標識試薬は、アミノ酸残基の翻訳後修飾を置き換える。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、タンパク質のアミノ酸残基上にある。他の実施形態では、翻訳後修飾は、ペプチドのアミノ酸残基上にある。いくつかの実施形態では、標識試薬は、チオール基を含む。いくつかの実施形態では、標識試薬は、２つのチオール基を含む。いくつかの実施形態では、標識試薬は、スクシンイミジルエステルなどのアミン反応性基を含む。いくつかの実施形態では、標識試薬は、グリオキサール基を含む。いくつかの実施形態では、標識試薬は、１，３−ヘキサンジオンなどの１，３−シクロアルカンジオン基を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、標識試薬は、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、またはペプチド核酸である。いくつかの実施形態では、標識試薬は、フルオロフォアである。いくつかの実施形態では、標識試薬は、フルオロフォアを含むチオールである。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、ローダミン色素などのキサンテン色素である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、方法は、ペプチドまたはタンパク質を第１の標識部分で標識する工程をさらに含み、当該工程は以下を含む。
（ｉ）ペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾が反応性基に変換されるような条件下でペプチドまたはタンパク質を処理して、反応性ペプチドまたはタンパク質を形成させること、
（ｉｉ）第１の標識部分を反応性ペプチドまたはタンパク質で処理して、標識されたペプチドまたはタンパク質を形成させること。
【００４６】
いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、リン酸化翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質を塩基で処理することによって形成される。いくつかの実施形態では、塩基は、Ｂａ（ＯＨ）２などの希土類金属水酸化物である。
【００４７】
他の実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、リン酸化翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質を活性化剤および塩基で処理することによって形成される。いくつかの実施形態では、活性化剤は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミドである。いくつかの実施形態では、塩基は、イミダゾールなどのヘテロ芳香族塩基である。
【００４８】
他の実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、トリメチル翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質を酸化銀（Ａｇ２Ｏ）で処理することによって形成される。いくつかの実施形態では、トリメチル翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質は、熱の存在下で酸化銀で処理される。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、トリメチル翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質を塩基で処理することによって形成される。いくつかの実施形態では、塩基は、ジイソプロピルエチルアミンまたはトリメチルアミンなどの窒素塩基である。
【００４９】
他の実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、グリコシル化翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質を酸化剤で処理することによって形成される。いくつかの実施形態では、酸化剤は、過ヨウ素酸ナトリウムなどの超原子価ヨウ化物試薬である。
【００５０】
他の実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、ニトロシル化翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質を還元剤で処理することによって形成される。いくつかの実施形態では、還元剤は、ジチオスレイトールなどのジスルフィド還元剤である。いくつかの実施形態では、還元剤は、ヘムをさらに含む。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、ニトロシル化翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質をホスフィンで処理することによって形成される。いくつかの実施形態では、ホスフィンは、非置換もしくは置換トリアルキルホスフィン、または非置換もしくは置換トリアリールホスフィンである。いくつかの実施形態では、ホスフィンは、非置換または置換トリアリールホスフィンである。いくつかの実施形態では、ホスフィンは、非置換または置換トリフェニルホスフィンである。いくつかの実施形態では、方法は、ペプチドまたはタンパク質を標識試薬と接触させることを含み、翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質をホスフィンと反応させることを含む。いくつかの実施形態では、ホスフィンは、非置換もしくは置換トリアルキルホスフィン、または非置換もしくは置換トリアリールホスフィンである。いくつかの実施形態では、ホスフィンは、非置換または置換トリアリールホスフィンである。いくつかの実施形態では、ホスフィンは、非置換または置換トリフェニルホスフィンである。いくつかの実施形態では、ホスフィンが標識試薬に共有結合する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、方法は、ペプチドまたはタンパク質を標識試薬と接触させることを含み、翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質をグリオキサール基と反応させることを含む。いくつかの実施形態では、グリオキサール基が標識試薬に共有結合する。他の実施形態では、方法は、ペプチドまたはタンパク質を標識試薬と接触させることを含み、翻訳後修飾を含むペプチドまたはタンパク質を、１，３−シクロヘキサンジオンなどの１，３−シクロアルカンジオンと反応させることを含む。いくつかの実施形態では、１，３−シクロアルカンジオンが標識試薬に共有結合する。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質の反応性基は、二重結合である。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、チオレンクリック反応を含む標識試薬で処理されて、標識されたペプチドまたはタンパク質を形成する。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、オレフィンメタセシス試薬の存在下で、二重結合を有する標識試薬で処理されて、標識されたペプチドまたはタンパク質を形成する。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、付加環化反応を含む標識試薬で処理されて、標識されたペプチドまたはタンパク質を形成する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質の反応性基は、アルデヒドである。いくつかの実施形態では、標識試薬は、求核付加、求核置換、またはラジカル付加を含む反応性ペプチドまたはタンパク質の反応性基で処理される。いくつかの実施形態では、標識試薬は、反応性ペプチドまたはタンパク質の反応性基で処理されると、チオエーテルを形成する。いくつかの実施形態では、標識試薬は、ジチアンを形成する。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、標識試薬で処理されてアミド結合を形成する。いくつかの実施形態では、アミド結合の形成は、標識されたペプチドまたはタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、標識試薬で処理されて、ジスルフィド結合を形成する。いくつかの実施形態では、ジスルフィド結合の形成は、標識されたペプチドまたはタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、標識試薬で処理されて、ヘテロシクロアルカンを形成する。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキル基の形成は、標識されたペプチドまたはタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、反応性ペプチドまたはタンパク質は、標識試薬で処理されて、チオエーテル結合を形成する。いくつかの実施形態では、チオエーテル結合の形成は、標識されたペプチドまたはタンパク質を提供する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、配列決定は、蛍光配列決定法を含む。いくつかの実施形態では、配列決定は、単一分子レベルで行われる。いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、翻訳後修飾を含まないペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を、第２の標識試薬で標識することを含む。いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、翻訳後修飾を含まないペプチドまたはタンパク質の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの別個のアミノ酸を標識することを含む。いくつかの実施形態では、各アミノ酸は、異なる第２の標識試薬で標識される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、表面などの固体支持体に結合される。いくつかの実施形態では、固体支持体は、樹脂、ビーズ、または修飾ガラス表面である。いくつかの実施形態では、固体支持体は、アミノシリケート表面などの修飾ガラス表面である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、ペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、ペプチドまたはタンパク質の連続する２つ以上のアミノ酸残基を連続的に除去することを含む。いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、修飾された翻訳後修飾を含む標識されたアミノ酸が除去されるまで、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸残基を連続的に除去することを含む。いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、修飾された翻訳後修飾を含む標識されたアミノ酸が除去されるまで、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸残基の１〜２０個を連続的に除去することを含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、エドマン分解によって除去される。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、Ｎ末端アミノ酸残基をチオ尿素および酸、マイクロ波照射、または熱で処理することによって除去される。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、酵素によって除去される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、プロテアーゼによって消化される。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、翻訳後修飾を含むアミノ酸を標識する前に、プロテアーゼによって消化される。
【００５７】
さらに別の態様では、本開示は、ポリペプチド配列同定のための方法であって、
（Ａ）対象の無細胞生体サンプルから第１のポリペプチドを得る工程、
（Ｂ）前記第１のポリペプチドを使用して、標識されたアミノ酸を含む、支持体に固定された第２のポリペプチドを生成する工程、
（Ｃ）前記第２のポリペプチドを、前記ポリペプチドからアミノ酸を除去するのに十分な条件に供する工程、および
（Ｄ）前記ポリペプチドからの前記アミノ酸の除去中または除去後に、標識された前記アミノ酸の少なくともサブセットからのシグナルを検出する工程であって、それにより、前記第２のポリペプチドの配列を同定して、前記無細胞生体サンプルからの前記第１のポリペプチドの配列を決定する、工程
を含む、方法を提供する。
【００５８】
いくつかの実施形態では、前記第２のポリペプチドの、最も少ないタイプのアミノ酸が標識される。いくつかの実施形態では、前記第１のポリペプチドは、タンパク質である。
【００５９】
さらに別の態様では、本開示は、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む、または含むことが疑われるタンパク質またはペプチドを処理または分析するための方法であって、
（Ａ）前記タンパク質またはペプチドを配列決定する工程、および
（Ｂ）前記タンパク質もしくはペプチドまたはそれらの誘導体の少なくとも１つのアミノ酸サブユニットにおける前記少なくとも１つの翻訳後修飾を同定する工程
を含む、方法を提供する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、前記配列決定は、前記タンパク質またはペプチドを分解条件に供して、前記タンパク質またはペプチドからアミノ酸サブユニットを連続的に除去すること、および前記アミノ酸サブユニットの少なくともサブセットを検出することを含む。いくつかの実施形態では、前記ペプチドまたはタンパク質の全てのアミノ酸サブユニットより少ないものが標識され、前記配列決定が、前記アミノ酸サブユニットのサブセットを検出することを含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの翻訳後修飾は、前記配列決定中に同定される。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの翻訳後修飾は、前記配列決定の前に同定される。いくつかの実施形態では、前記タンパク質またはペプチドは、サンプルから得られ、前記少なくとも１つの翻訳後修飾を標識するために処理される。いくつかの実施形態では、前記サンプルは、無細胞サンプルである。いくつかの実施形態では、前記配列決定は、前記タンパク質またはペプチドの前記少なくとも１つの翻訳後修飾を標識で標識すること、および前記標識を検出して、それによって前記タンパク質またはペプチドの前記少なくとも１つの翻訳後修飾を同定することを含む。
【００６１】
さらに別の態様では、本開示は、タンパク質またはペプチドを処理または分析するための方法であって、前記タンパク質またはペプチドを、前記タンパク質またはペプチドの種々の翻訳後修飾を特異的に標識するのに十分な条件に供する工程、および前記タンパク質またはペプチドの前記種々の翻訳後修飾に対応する標識を検出する工程であって、それにより前記タンパク質またはペプチドの前記種々の翻訳後修飾を検出する、工程を含む、方法を提供する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、前記種々の翻訳後修飾は、リン酸化、グリコシル化、ニトロシル化、シトルリン化、スルフェニル化、またはトリメチル化を含む。
【００６３】
本明細書で使用される場合、特定の成分に関して「本質的に含まない」とは、特定の成分が組成物に存在しない、またはその成分が汚染物質として、もしくは微量で存在することを指し得る。組成物の予想外の汚染に起因する特定の成分の総量は、０．１％未満であり得る。いくつかの実施形態では、組成物の特定の成分は、いかなる量でも標準的な分析方法で検出され得ない。
【００６４】
本明細書の明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を指すことができる。本明細書の明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「含む」という単語と併せて使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という単語は、１つまたは複数を指すことができる。本明細書で使用される場合、明細書および特許請求の範囲において、「別の」または「さらなる」は、少なくとも２つ目またはそれ以上を指すことができる。
【００６５】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「約」という用語は、方法を使用して測定される値が、デバイスの誤差の固有の変動性、または研究対象間に存在する変動性を含むことを示すために使用される。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、記載された値の±５％を指す。
【００６６】
本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。詳細な説明および特定の実施例は、特定の実施形態を示しながら、例示として与えられている。なぜなら、この詳細な説明から精神および範囲内での様々な変更および修正が明らかになるからである。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれている。本開示は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。
【００６８】
【図１】合成ＣＴＤヘプタッドペプチドのホスホセリン残基の蛍光配列決定による正確な同定。（上）ホスホセリンは、２番目の位置に存在する。（下）ホスホセリンは、５番目の位置に存在する。各実験からの２つの個々のペプチド分子についての代表的な未加工の画像データを示す。個々の分子につき、ペプチド分子を中心とした連続するＴＩＲＦ顕微鏡写真（各々３×３ミクロンの正方形に対応）の水平ストリップとして画像を構成した。各画像は、エドマン化学のラウンド後にその分子から発せられた蛍光の、１つの連続的な観察を表す。蛍光色素が付着したアミノ酸が除去されるエドマンサイクル後に蛍光が急激に減少し、その結果、元のペプチドのリン酸化残基のアミノ酸配列位置が明らかになる。ヒートマップは、頻度ヒストグラムを示し、エドマン分解サイクルごとに蛍光を失った個々のペプチド分子のカウント数をバックグラウンドカウント数に対して集計する。２番目の位置（上）および５番目の位置（下）でのリン酸化セリン残基は、蛍光配列決定法で分析した場合、それぞれ２番目と５番目の位置での蛍光消失のカウント数が大幅に上昇している。
【００６９】
【図２】２つの生体サンプル間の蛍光配列決定の位置カウント数を示している。２つの異なるＨＥＫ−２９３Ｔサンプルからのタンパク質を消化し、標識し、蛍光配列決定プラットフォームで配列決定した。リードカウント数は、これらの生物学的反復の間で高度に相関していることが観察された（ピアソン係数０．９５８２）。データはカウントされ、ｌｏｇ１０スケールでプロットされている。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
例示的な実施形態の説明
いくつかの態様では、本開示は、ペプチドまたはタンパク質における翻訳後修飾（ＰＴＭ）をタイプ分け、同定、定量化、または位置特定する方法を提供する。これらの方法を使用して、ペプチドまたはタンパク質のＰＴＭ、例えばリン酸化、グリコシル化、またはアルキル化などのタイプ、場所、量、または位置を決定することができる。これらの方法は、フルオロフォアなどの標識部分による翻訳後修飾の標識を含むものなど、蛍光配列決定法と組み合わせて使用することができる。これらの方法は、ペプチドまたはタンパク質からの１つ以上のアミノ酸残基の除去をさらに含み得る。いくつかの態様では、これらの方法を使用して、患者における疾患または障害の進行または状態を判定することができる。
【００７１】
Ｉ．ペプチド配列決定法
蛍光配列決定、質量分析、核酸配列からのペプチド配列の同定、およびエドマン分解など、ペプチドの配列を同定する多くの方法が存在する。蛍光配列決定は、目的のタンパク質の配列決定に単一分子解像度を提供することがわかっている（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ、２０１０、米国特許第９，６２５，４６９号、米国特許出願第１５／４６１，０３４号、米国特許出願第１５／５１０，９６２号）。蛍光配列決定の特徴の１つは、ペプチド配列の特定のアミノ酸残基にフルオロフォアまたは他の標識を導入することである。これには、固有の標識部分を有する１つ以上のアミノ酸残基の導入が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の異なるアミノ酸残基が、標識部分で標識されている。使用できる標識部分には、フルオロフォア、発色団、または消光物質が含まれる。これらのアミノ酸残基の各々は、システイン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、トリプトファン、チロシン、セリン、スレオニン、アルギニン、ヒスチジン、メチオニン、アスパラギン、およびグルタミンを含み得る。これらのアミノ酸残基の各々は、異なる標識部分で標識され得る。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸およびグルタミン酸、またはアスパラギンおよびグルタミンなど複数のアミノ酸残基が、同じ標識部分で標識され得る。この技術は、上記のような標識部分を用いて使用され得るが、合成オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸などの他の標識部分を蛍光配列決定に似た方法で使用することもできると考えられる。特に、本出願で使用される標識部分は、１つ以上のアミノ酸残基を除去する条件に好適に耐え得る。本発明の方法で使用され得る可能性のある標識部分のいくつかの非限定的な例には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、Ａｔｔｏ色素、ローダミン色素、または他の類似の色素など、赤色から赤外スペクトルで蛍光シグナルを発するものが含まれる。アミノ酸残基を除去する条件に耐えられたこれらの色素の個々の例には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、ローダミンＢ、テトラメチルローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｔｔｏ６４７Ｎ、および（５）６−ナフトフルオレセインが含まれる。他の態様では、標識部分は、蛍光ペプチドまたはタンパク質または量子ドットであり得ることが企図される。
【００７２】
あるいは、合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体を、ペプチドの標識部分として使用することができる。例えば、チオール化オリゴヌクレオチドは、本発明の方法を使用してペプチドに結合され得る。一般的に利用可能なチオール修飾は、５’チオール修飾、３’チオール修飾、およびジチオール修飾であり、これらの修飾のそれぞれを使用して、ペプチドを修飾することができる。上記のようにペプチドにオリゴヌクレオチドを結合させた後、ペプチドをエドマン分解にさらすことができ（Ｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９５０）、オリゴヌクレオチドを使用して、残りのペプチド配列中の特定のアミノ酸残基の存在を判定することができる。他の実施形態では、標識部分は、ペプチド核酸であり得る。ペプチド核酸は、特定のアミノ酸残基のペプチド配列に結合していてもよい。
【００７３】
蛍光配列決定の１つの要素は、エドマン分解などの技術による標識されたペプチドの除去、および特定のアミノ酸が切断されたことを示す蛍光の減少を検出するための、その後の視覚化である。各アミノ酸残基の除去は、エドマン分解およびタンパク質分解切断など、様々な技術で行われる。いくつかの実施形態では、技術は、エドマン分解を使用して末端アミノ酸残基を除去することを含む。他の実施形態では、この技術は、酵素を使用して末端アミノ酸残基を除去することを含む。これらの末端アミノ酸残基は、ペプチド鎖のＣ末端またはＮ末端のいずれかから除去することができる。エドマン分解が使用される状況では、ペプチド鎖のＮ末端のアミノ酸残基が除去される。
【００７４】
いくつかの態様では、ペプチド配列を配列決定または画像化する方法は、ペプチドを表面上に固定することを含み得る。ペプチドは、システイン残基、Ｎ末端、またはＣ末端を使用して固定されることができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、システイン残基を表面と反応させることによって固定される。いくつかの実施形態では、本開示は、可視スペクトル、赤外スペクトル、またはそれらの組み合わせを光学的に透過し、１．３〜１．６の屈折率を有し、厚さが１０〜５０ｎｍであり、有機溶媒およびトリフルオロ酢酸などの強酸、またはそれらの任意の組み合わせに対して化学的に耐性を有するような表面上に、ペプチドを固定することを企図する。多様な基板（フルオロポリマー（Ｔｅｆｌｏｎ−ＡＦ（Ｄｕｐｏｎｔ）、Ｃｙｔｏｐ（登録商標）（旭硝子、日本））、芳香族ポリマー（ポリキシレン（Ｐａｒｙｌｅｎｅ，Ｋｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ポリスチレン、ポリメチルアクリテート）および金属表面（金コーティング））、コーティングスキーム（スピンコーティング、浸漬コーティング、金属の電子ビーム蒸着、熱蒸着およびプラズマ化学気相成長法）および機能性付与方法（ポリアリルアミングラフト化、ＰＥＣＶＤでのアンモニアガス使用、長鎖末端官能化フルオラスアルカンのドーピングなど）が、有用な表面として本明細書に記載の方法で使用することができる。Ｃｙｔｏｐ（登録商標）で作られた厚さ２０ｎｍの光学的に透明なフルオロポリマー表面を、本明細書に記載の方法で使用することができる。本明細書で使用される表面は、配列決定のためのペプチド、および選択のための修飾された標的を分離する様々なフルオロアルカンでさらに誘導体化され得る。あるいは、アミノシラン修飾表面を、本明細書に記載の方法で使用することができる。他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ビーズ、樹脂、ゲル、石英粒子、ガラスビーズ、またはそれらの組み合わせの表面にペプチドを固定することを含み得る。いくつかの非限定的な例では、方法は、Ｔｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）ビーズ、Ｔｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）樹脂、または他の類似のビーズもしくは樹脂の表面に固定されたペプチドを使用することを企図している。本明細書で使用される表面は、ポリエチレングリコールなどのポリマーでコーティングされ得る。他の実施形態では、表面はアミン官能化されている。他の実施形態では、表面はチオール官能化されている。
【００７５】
これらの配列決定技術の各々は、ペプチド配列を画像化して、ペプチド配列上の１つ以上の標識部分の存在を決定することを含む。いくつかの実施形態では、これらの画像は、アミノ酸残基それぞれの除去後に撮影され、ペプチド配列中の特定のアミノ酸の位置を決定するために使用される。いくつかの実施形態では、方法により、ペプチド配列中の特定のアミノ酸の位置を解明することができる。これらの方法を使用して、ペプチド配列中の特定のアミノ酸残基の位置を決定でき、またはこれらの結果を使用して、ペプチド配列中のアミノ酸残基の全リストを決定できる。この方法は、ペプチド配列中の１つ以上のアミノ酸残基の位置を判定し、これらの位置を特定のペプチド配列と比較し、ペプチド配列中のアミノ酸残基の全リストを決定することを含み得る。
【００７６】
いくつかの態様では、方法は、翻訳後修飾を含まない１つ以上のさらなるアミノ酸残基を標識することを含み得る。これらのアミノ酸は、翻訳後修飾を含むアミノ酸残基を標識するために使用される標識とは異なる標識部分で標識され得る。ペプチド上の複数の位置が標識されている場合、アミノ酸は、システイン、リジン、Ｎ末端、Ｃ末端、側鎖にカルボン酸基を有するアミノ酸、トリプトファン、または任意のそれらの組み合わせ、の順序で標識されていると考えられる。これらの特定のアミノ酸のうちの１つ以上が標識され得るか、またはこれらのアミノ酸残基のすべてが異なる標識で標識され得ることが考えられる。
【００７７】
いくつかの態様では、配列決定技術で使用される画像化方法は、蛍光測定法および蛍光顕微鏡法など、種々の異なる方法を含み得る。蛍光法は、蛍光偏光、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または時間分解蛍光などの蛍光技術を使用することができる。いくつかの実施形態では、蛍光顕微鏡法を使用して、単一分子量における１つ以上のフルオロフォアの存在を決定することができる。このような画像化法を使用して、特定のペプチド配列上の標識の有無を決定することができる。アミノ酸残基の除去およびペプチド配列の画像化のサイクルを繰り返した後、ペプチド中の標識されたアミノ酸残基の位置を決定することができる。
【００７８】
ＩＩ．翻訳後修飾
いくつかの態様では、本発明の方法は、ペプチド配列の翻訳後修飾の存在および位置、場所、量、タイプ、またはそれらの任意の組み合わせを標識および決定することを含む。翻訳後修飾は、タンパク質またはペプチドの酵素的または非酵素的修飾による、タンパク質またはペプチドの共有結合修飾を指すために使用される。本明細書で使用される場合、翻訳後修飾には、天然修飾および非天然修飾の両方が含まれる。翻訳後修飾は、アミノ酸の側鎖への修飾またはペプチド（またはアミド）結合の切断を含む、または酸化ストレスの結果としての様々な異なるタイプの共有結合修飾を説明するために使用され得る。多くの場合、翻訳後修飾は、アミノ酸の側鎖に付加される。求核性側鎖を含むアミノ酸のこれらの側鎖は、多くの場合、翻訳後修飾の部位である。修飾され得るアミノ酸の側鎖には、アミノ酸のセリン、スレオニン、およびチロシンのヒドロキシル基、アミノ酸のリジン、アルギニン、およびヒスチジンのアミン基、システインのチオール基、ならびにアスパラギン酸およびグルタミンのカルボン酸基などの求核性部位が含まれる。
【００７９】
翻訳後修飾のいくつかの非限定的な例には、メチル基などの１つ以上のアルキルを導入するために使用され得るアルキル化、１つまたは複数のアシル基を導入するために使用され得る、アセチル化などのアシル化、ホルミル化、または脂肪酸によるアシル化、またはイソプレノイド基を導入するプレニル化など、疎水性基の付加が含まれる。他の翻訳後修飾には、フラビン部分、ヘム部分、リポイル化、またはジフタミド形成など、補因子または翻訳因子の導入が含まれ得る。他の翻訳後修飾は、ＳＵＭＯタンパク質を付加するＳＵＭＯ化、またはタンパク質ユビキチンを付加するユビキチン化など、他のタンパク質の導入を含み得る。
【００８０】
翻訳後修飾は、既存のアミノ酸残基への化学基の導入をさらに含み得る。アミノ酸残基を修飾するために使用できる化学基のいくつかの非限定的な例には、アシル化、アルキル化、アミド結合調合、カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、リン酸化、ニトロシル化、スルフィニル化、スルフェニル化、硫酸化、またはスクシニル化が含まれる。いくつかの実施形態では、本方法を使用して、これらの翻訳後修飾の１つ以上の存在を決定することができる。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、リシン残基の側鎖にモノ、ジ、またはトリメチルアミン基を導入するためのアルキル化、特にメチル化である。他の実施形態では、翻訳後修飾は、チロシン、スレオニン、またはセリン残基、特にスレオニンもしくはセリン残基のヒドロキシル基のリン酸化である。さらに別の実施形態では、翻訳後修飾は、アミノ酸の側鎖中の窒素または酸素原子のグリコシル化である。
【００８１】
本明細書に記載の翻訳後修飾を有するペプチドまたはタンパク質は、生体サンプルから得ることができる。これらの生体サンプルは、動物または植物の供給源から入手することができる。１つの潜在的な動物供給源は、ヒトから得られたサンプルなどの哺乳動物供給源である。ヒト供給源は、乳児、青年、または成人のヒトから入手できる。これらの生体サンプルには、無細胞サンプルが含まれ得る。無細胞サンプルは、細胞を含まない、実質的に細胞を含まない、または本質的に細胞を含まないサンプルであり得る。無細胞生体サンプルは、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸分子（例えば、リボ核酸分子またはデオキシリボ核酸分子）、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。サンプルが無細胞として表示され、さらに無細胞と見なされても、サンプルには少数の細胞または細胞細片が含まれる場合がある。例えば、これらのサンプルは、サンプル１ミリリットルあたり約５０細胞以下、１ミリリットルあたり約４５細胞以下、１ミリリットルあたり約４０細胞以下、１ミリリットルあたり約３５細胞以下、１ミリリットルあたり約３０細胞以下、１ミリリットルあたり約２５細胞以下、１ミリリットルあたり約２０細胞以下、１ミリリットルあたり約１５細胞以下、１ミリリットルあたり約１０細胞以下、１ミリリットルあたり約５細胞以下、１ミリリットルあたり約１細胞、またはそれ未満を含み得る。いくつかの実施形態では、これらのサンプルは、１ミリリットルあたり約１細胞以上、１ミリリットルあたり約５細胞以上、１ミリリットルあたり約１０細胞以上、１ミリリットルあたり約１５細胞以上、１ミリリットルあたり約２０細胞以上、１ミリリットルあたり約２５細胞以上、１ミリリットルあたり約３０細胞以上、１ミリリットルあたり約３５細胞以上、１ミリリットルあたり約４０細胞以上、１ミリリットルあたり約４５細胞以上、１ミリリットルあたり約４５細胞以上、１ミリリットルあたり約５０細胞、またはそれより多くを含み得る。そのような無細胞サンプルは、例えば、血液（例えば、全血）、血清、血漿、唾液、尿、または粘液を含み得る。
【００８２】
ＩＩＩ．定義
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、一般に、少なくとも１つのアミノ基、−ＮＨ２（イオン化形態−ＮＨ３＋で存在し得る）と、１つのカルボキシル基、−ＣＯＯＨ（イオン化形態−ＣＯＯ−で存在し得る）とを含み、カルボン酸が中性ｐＨで脱プロトン化されて、ＮＨ２ＣＨＲＣＯＯＨの基本式を有する、有機化合物を指す。したがってアミノ酸およびペプチドは、Ｎ（アミノ）末端残基領域およびＣ（カルボキシ）末端残基領域を有する。アミノ酸のタイプには、哺乳動物の生物学的タンパク質の大部分を構成するため「天然」と見なされる少なくとも２０種類が含まれ、リジン、システイン、チロシン、スレオニンなどのアミノ酸が含まれる。アミノ酸は、その側鎖に基づいて、アスパラギン酸またはアスパルテート（Ａｓｐ；Ｄ）およびグルタミン酸またはグルタメート（Ｇｌｕ；Ｅ）など、（中性ｐＨで）カルボン酸基を有するもの、ならびにリシン（Ｌｙｓ；Ｌ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）など、（中性ｐＨで）塩基性アミノ酸であるものなどにグループ化してもよい。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「末端」という用語は、単数の末端および複数の末端として言及される。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「側鎖」または「Ｒ」という用語は、アルファ炭素に結合した（アミノ酸のアミンおよびカルボン酸基に結合した）、アミノ酸の各タイプに独自性を与える固有の構造を指す。Ｒ基は、リジン（＋）、アルギニン（＋）、ヒスチジン（＋）、アスパラギン酸（−）およびグルタミン酸（−）などの正または負に帯電した荷電極性側鎖など、様々な形状、サイズ、電荷、および反応性を有する。アミノ酸は、リジンのように塩基性であることも、またはグルタミン酸のように酸性であることもできる。非荷電極性側鎖は、ヒドロキシル、アミド、またはチオール基、例えば、化学的反応性側鎖を有するシステイン、すなわち別のシステイン、セリン（Ｓｅｒ）および異なるサイズのヒドロキシルＲ側鎖を有するスレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびチロシン（Ｔｙｒ）と結合を形成できるチオール基を有する。非極性疎水性アミノ酸側鎖には、アミノ酸グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、および、アラニンのメチル基からロイシンおよびイソロイシンの異性体ブチル基までのサイズの脂肪族炭化水素側鎖を有するイソロイシンが含まれる。メチオニン（Ｍｅｔ）は、チオールエーテル側鎖を有し、プロリン（Ｐｒｏ）は、環状ピロリジン側基を有する。フェニルアラニン（そのフェニル部分を含む）（Ｐｈｅ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）（そのインドール基を含む）には芳香族側基が含まれており、嵩高さおよび非極性を特徴とする。
【００８５】
アミノ酸は、例えば、システイン；Ｃｙｓ；Ｃ、リジン；Ｌｙｓ；Ｋ、トリプトファン；Ｔｒｐ；Ｗのように、それぞれ名前、３文字のコード、または１文字のコードで言及することもできる。
【００８６】
アミノ酸は、非必須か必須かは生物によって、または様々な発達段階によって異なり得るという警告と共に、栄養的に必須または非必須として分類することができる。特定の生物にとって非必須または条件付きアミノ酸は、典型的には、いくつかの遺伝子によってコード化される酵素を使用する経路で基質がタンパク質合成を可能にすると、体内で適切に合成されるアミノ酸である。必須アミノ酸とは、生物がｄｅ  ｎｏｖｏ経路を通して自然に生成できない、または十分に生成できないアミノ酸、例えば、ヒトのリジンなどである。ヒトは、合成サプリメント、肉、植物およびその他の生物を含む食物から必須アミノ酸を摂取する。
【００８７】
「非天然」アミノ酸とは、自然にコード化されない、または遺伝暗号において見られない、哺乳動物および植物のｄｅ  ｎｏｖｏ経路を通して生成されないアミノ酸である。それらは、天然のアミノ酸には通常見られない、またはめったに見られない側鎖を付加することによって合成され得る。
【００８８】
本明細書で使用される場合、２０個の標準的な生物学的アミノ酸のようにα炭素ではなくβ炭素にそれらのアミノ基が結合しているβアミノ酸は、非天然アミノ酸である。通常、自然に発生するβアミノ酸は、β−アラニンである。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列」、「ペプチド」、「ペプチド配列」、「ポリペプチド」、および「ポリペプチド配列」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ペプチド（アミド）結合またはペプチドの類似体結合によって共有結合されている、少なくとも２つのアミノ酸またはアミノ酸類似体を指す。ペプチドという用語は、アミノ酸またはアミノ酸類似体のオリゴマーおよびポリマーを含む。ペプチドという用語はまた、一般にペプチドと呼ばれる分子を含み、これは、一般に約２〜約２０個のアミノ酸を含む。ペプチドという用語はまた、一般にポリペプチドと呼ばれる分子を含み、これは、一般に約２０〜約５０個のアミノ酸を含む。ペプチドという用語はまた、一般にタンパク質と呼ばれる分子を含み、これは、一般に約５０〜約３０００個のアミノ酸を含む。ペプチドのアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸であり得る。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、合成、組換え、または自然発生であり得る。合成ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで人工的に生成されるペプチドである。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「サブセット」という用語は、個々のペプチド分子のＮ末端のアミノ酸残基を指す。Ｎ末端リジン残基を有する個々のペプチド分子の「サブセット」は、リジンではないＮ末端残基を有する個々のペプチド分子の「サブセット」とは区別される。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「置換されている」という用語は、化合物において、親分子の１つ以上の水素原子が、当該化合物の本質的な機能を実質的に変化させない別の基で置き換えられていることを指し得る。より具体的には、「置換されている」という用語は、言及されている基が、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、−ＯＨ、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルスルホン、アリールスルホン、−ＣＮ、アルキン、Ｃ１−Ｃ６アルキルアルキン、ハロ、アシル、アシルオキシ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−アルキル、ニトロ、ハロアルキル、フルオロアルキル、ならびに一置換および二置換アミノ基を含むアミノ（例、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−Ｎ（Ｒ）２）、ならびにそれらの保護された誘導体から選択される１つ以上のさらなる基で、個別にかつ独立して置換されていてもよいことを意味する。例えば、置換基は、ＬｓＲｓであり得、各Ｌｓは、結合、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ−、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、または−（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）から独立して選択され、各Ｒｓは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、（Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル）、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、およびＣ１−Ｃ６ヘテロアルキルの中から独立して選択される。上記の置換基の保護誘導体を形成し得る保護基は、上記のＧｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓなどの出典にて見出される。可能な化学基の非限定的なリストには、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２ＣＨ３、−ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＮＨＣＨ３、−ＮＨＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２が含まれる。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「蛍光」という用語は、異なる波長の光を吸収した物質による可視光の放射を指す。いくつかの実施形態では、蛍光は、特定の波長での蛍光発光に基づいて、非破壊的な生体分子の追跡、分析、または追跡および分析の組み合わせの方法を提供する。タンパク質（抗体を含む）、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド（一本鎖および二本鎖プライマーを含む）は、フルオロフォアと呼ばれる様々な外因性蛍光分子で「標識」され得る。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「単一分子レベルでの」ペプチドの配列決定は、多様なペプチド分子の混合物中の個々の（すなわち、単一の）ペプチド分子から得られるアミノ酸配列情報を指す。本開示は、個々のペプチド分子から得られるアミノ酸配列情報が、個々のペプチド分子の完全な、または連続したアミノ酸配列である方法に限定されない場合がある。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質の同定を可能にする、部分的なアミノ酸配列情報が得ることで十分である。例えば、個々のペプチド分子内の特定のアミノ酸残基（すなわち、リジン）のパターンを含む部分的なアミノ酸配列情報は、個々のペプチド分子を独自的に識別するのに十分であり得る。例えば、個々のペプチド分子内のリジン分子の分布を示す、Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｌｙｓなどのアミノ酸のパターンを、所与の生物の特定のプロテオームに対して検索して、個々のペプチド分子を特定することができる。単一分子レベルでのペプチドの配列決定が、個々のペプチド分子のリジン残基のパターンを特定することに限定されることは意図されていない。任意のアミノ酸残基（複数のアミノ酸残基を含む）の配列情報を使用して、多様なペプチド分子の混合物中の個々のペプチド分子を同定することができる。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「単一分子分解」は、多様なペプチド分子の混合物中の個々のペプチド分子からデータ（例えば、アミノ酸配列情報を含む）を取得する能力を指す。１つの非限定的な例において、多様なペプチド分子の混合物は、固体表面（例えば、スライドガラス、または表面が化学的に修飾されたスライドガラスを含む）に固定され得る。一実施形態では、これは、ガラス表面全体に分布する複数の個々の（すなわち、単一の）ペプチド分子の蛍光強度を同時に記録する能力を含み得る。多くの光学デバイスが、この方法で適用され得る。例えば、全反射照明および増強電荷結合素子（ＣＣＤ）検出器を備えた従来の顕微鏡を利用できる（Ｂｒａｓｌａｙｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００３を参照）。高感度ＣＣＤカメラによる画像化により、機器は、表面全体に分布する複数の個々の（つまり単一の）ペプチド分子の蛍光強度を同時に記録することができる。一実施形態では、画像収集は、光を２つのバンドパスフィルタ（各蛍光分子に適切なもの）に通して、ＣＣＤ表面に２つの並んだ画像として記録するイメージスプリッタを使用して実施することができる。自動フォーカス制御を備えた電動顕微鏡ステージを使用してフローセルの複数のステージ位置を画像化すると、１回の実験で数百万（またはそれ以上）の個々の単一ペプチドを配列決定できる。
【００９５】
帰属確率質量関数−所定の蛍光配列における、そのソースタンパク質の事後確率質量関数、つまり、確認された蛍光配列ｆｉの場合の、各ソースタンパク質ｐｉの確率Ｐ（ｐｉ／ｆｉ）のセット。
【実施例】
【００９６】
ＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本開示の特定の実施形態を実証するために含まれている。以下の実施例に開示される技術は、本開示の実施においてうまく機能するように発明者によって発見された技術を示す。しかしながら、本開示に照らして、開示の精神および範囲から逸脱することなく、やはり同様のまたは類似の結果を得るために、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができる。
【００９７】
［実施例１］単一分子感度でのタンパク質の翻訳後リン酸化の位置のマッピング。
材料および方法
リン酸化ペプチド合成および精製のための標識プロトコル：  すべてのペプチドは、自動化された固相ペプチド合成機（Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅマイクロ波ペプチド合成機、ＣＥＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、標準のＦｍｏｃ化学で合成した。標準のＦｍｏｃ−アミノ酸ビルディングブロックおよびＦｍｏｃ−Ｏ−ベンジルホスホセリン（カタログ番号：０３７３４）は、ＣｈｅｍＩｍｐｅｘ  Ｉｎｃ（ＩＬ、ＵＳＡ）から購入した。ペプチドは、ＴＦＡ、水、トリイソプロピルシラン（体積比９．５：０．２５：０．２５の混合物）を含む酸切断カクテルを使用して切断および脱保護した。窒素で乾燥させてＴＦＡを除去した後、ペプチドを冷エーテルで沈殿させ、８０００ｒｃｆで１０分間遠心分離した。ペレットをアセトニトリル／水（体積比１：１の混合物）に再懸濁し、１０ｍＬ／分の流量で動作するＡｇｉｌｅｎｔ（登録商標）Ｚｏｒｂａｘ（登録商標）カラム（４．６×２５０ｍｍ）を備えた高速液体クロマトグラフィー（島津製作所）で、５〜９５％メタノール（０．１％ギ酸）のグラジエントで９０分にわたり精製した。ペプチドを含む画分を収集し、凍結乾燥前にロータリーエバポレーターを使用して体積を減らした。
【００９８】
色素チオール試薬の合成：  ３ｍｇのＡｔｔｏ６４７Ｎ−ＮＨＳ（カタログ番号：ＡＤ６４７Ｎ３５；Ａｔｔｏ−ｔｅｃ）を１５０μＬの塩基性システアミン溶液（１５００μＬの乾燥ＤＭＦ中に５．１ｍｇのシステアミンおよび７．５μＬのＤＩＰＥＡ）と混合した。混合物を３時間インキュベートし、Ａｔｔｏ６４７Ｎ−Ｓ−Ｓ−Ａｔｔｏ６４７Ｎ生成物を質量分析によって確認した（スキーム１）。生成物を、それぞれ２００μｇの試薬を含むガラスバイアルに分注した。単一色素チオール試薬Ａｔｔｏ６４７Ｎ−ＳＨは、Ａｔｔｏ６４７Ｎ−Ｓ−Ｓ−Ａｔｔｏ６４７Ｎ試薬を、１ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）と反応させ、６０°Ｃで１時間インキュベートすることによって調製した。
【００９９】
色素チオール試薬によるリン酸基の標識：  リン酸化ペプチドを、１００μＬのアセトニトリルと水との混合液（体積比１：１）に溶解した。この溶液に、４６μＬの飽和水酸化バリウムおよび４μＬの４Ｍ水酸化ナトリウムを添加し、室温で３時間インキュベートした。次に、１００μＬのＤＭＦ、１００μＬの水、および１．４ｍｇのＴＣＥＰをペプチド溶液に添加した。混合物全体を２００μｇの色素チオール試薬に移し、一晩インキュベートした。色素チオール試薬を混合物に添加する前に、色素チオール試薬のジスルフィド結合を切断するためにＴＣＥＰを添加することができる。次に、反応物の全含有物をアセトニトリル／水混合物（体積比１：１）で２ｍＬに希釈し、ＨＰＬＣで分離した（上記のように）。次に、蛍光画分を、ＨＰＬＣのダイオードアレイ検出器によって６４０  ｎｍの吸光度でモニターし、リン酸化ペプチドに該当する場合、収集した。保持時間５４分および５５分に存在し、未反応の色素チオール試薬に該当する２つの特徴的なピークは、収集しなかった。ＨＰＬＣ精製後、標識リン酸化ペプチドを凍結乾燥した。ペプチドのＮ末端は、標識されたペプチドをＤＭＦに可溶化し、混合物をｔｅｒｔ−ブチルＮ−スクシンイミジルカーボネートと共に一晩インキュベートすることにより、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（「Ｂｏｃ」）保護基によって保護された。溶液を希釈し、２００μｇまたは２ｍＭに分注した。
【０１００】
標識されたペプチドの検出：  軽微な変更を加えて、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、米国特許第９，６２５，４６９号、米国特許出願第１５／４６１，０３４号、米国特許出願第１５／１５０，９６２号にあるように、標識されたペプチドを検出した。これらの軽微な変更は、次のとおりである。（ａ）ペプチドは、固体基板上でペプチドのカルボキシル末端を介して、アミン官能化スライドガラスに固定された。（ｂ）実験サイクルの前に、ペプチドのアミン末端を保護する「Ｂｏｃ」基を、固定されたペプチドを９０％のトリフルオロ酢酸と共に４０°Ｃで５時間インキュベートすることによって脱保護した。（ｃ）メタノールに溶解した１ｍＭのトロロックス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）をイメージングバッファーとして使用した。
【０１０１】
パン（Ｐａｎ）リン酸化標識のためのさらなる標識ストラテジー
任意の修飾アミノ酸（セリン、スレオニン、チロシン、ヒスチジン）に存在するリン酸基は、ＥＤＣ／イミダゾール反応機構で標識され得る（スキーム１に示す）。この反応はオリゴヌクレオチドについて記載されており、アミノ酸のピロリン酸の標識にも同様に使用でき、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３に採用されている。リン酸化ペプチドは、ＰＢＳバッファー（例えば、＜１０ｍＭ）などのｐＨ７．５バッファー中で０．１Ｍのイミダゾール、０．１ＭのＥＤＣ、および０．２５Ｍのドナーアミン（フルオロフォア）と反応させる。反応は、５０°Ｃで２０分間維持する。続いて、標識されたペプチドを精製し、単一分子配列決定法によって配列決定する。
スキーム１：リン酸化アミノ酸残基のパン（Ｐａｎ）修飾
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【０１０２】
結果および考察
チオール結合を介したフルオロフォアのベータ除去およびマイケル付加は、リン酸化ペプチドを蛍光標識することが記載されている（Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、米国特許第７，４７６，６５６号）。しかしながら、配列決定に適した色素および適切な官能基ハンドルの両方を含む、Ａｔｔｏ６４７Ｎ−チオール色素試薬など、蛍光配列決定での使用に適したチオール色素試薬は、容易に入手できない。したがって、Ａｔｔｏ６４７Ｎ−Ｓ−Ｓ−Ａｔｔｏ６４７Ｎを、Ａｔｔｏ６４７Ｎ−ＮＨＳとシステアミンとの反応によって合成した（スキーム２）。水の存在はＮＨＳ色素を加水分解し、反応収率の大幅な低下につながり得るため、この反応は非還元かつ無水条件で実行した。
スキーム２：Ａｔｔｏ６４７Ｎ−Ｓ−Ｓ−Ａｔｔｏ６４７Ｎの調製
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【０１０３】
標識および蛍光配列決定手順を検証および最適化するために、ヘプタッドペプチドの３つのリン酸化変異体、ＹｐＳＰＴＳＰＳ、ＹＳＰＴｐＳＰＳ、およびＹｐＳＰＴｐＳＰＳを合成した。式中、ｐＳはホスホセリンである。次に、これらのヘプタッドをベータ除去およびそれに続くマイケル付加によって標識し、リン酸化セリン残基をＡｔｔｏ６４７Ｎ−チオール色素で蛍光的かつ共有結合的に標識した（スキーム３を参照）。
スキーム３：標識リン酸化セリン残基の調製
2021530549.tif 000005
【０１０４】
次に、標識ヘプタッドをＨＰＬＣで精製し、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ、２０１０、米国特許第９，６２５，４６９号、米国特許出願第１５／４６１０３４号、米国特許出願第１５／１５０，９６２号に記載されている蛍光配列決定によって配列決定するために、アミノシランガラス表面上に固定した。説明したように、ペプチドの均一な集団の蛍光配列決定は、頻度ヒストグラムによって最もよく説明できる。エドマン分解サイクル後、個々のペプチド分子を画像化し、整列させることにより、エドマンサイクル後に蛍光を消失したペプチド分子のカウント数を取得できる。次に、蛍光を消失したペプチドのカウント数をエドマンサイクルの関数として集計することにより、頻度ヒストグラムを取得できる。光退色および色素消失のために発生するバックグラウンドカウント数を差し引くことにより、有意な消失事象のカウント数を表すことができる（図１）。図１から明らかなように、ペプチドの２番目の位置のホスホセリンに対応する２回目のエドマンサイクル後、および５番目の位置のホスホセリンに対応する５回目のエドマンサイクル後のペプチド蛍光が減少している。これらの結果は、蛍光標識のチオール結合、およびその後のさらなる蛍光配列決定サイクルを使用して、タンパク質における翻訳後リン酸化修飾の位置をマッピングできることを示す。
【０１０５】
細胞から抽出されたタンパク質のリン酸化残基を同定するために使用される方法の例は、本明細書に記載されている。ヒト胎児腎臓２９３トランスジェニック（ＨＥＫ−２９３Ｔ）細胞を培養し、修飾ＲＩＰＡバッファーを使用して溶解した。タンパク質は、標識する前に定量化し、細胞溶解物から単離した。次にタンパク質を変性させ、プロテアーゼであるトリプシンで、トリプシン酵素とタンパク質との比率１：５０で消化した。消化後、１０ｋＤａフィルタを使用して、フィルタにかけて除去した。次に、溶液中のすべてのリン酸化セリンおよびスレオニンを、以下の技術を使用して標識した。リン酸化残基は、Ｂａ（ＯＨ）２を使用してベータ除去変異体に変換した。次に、マイケル付加反応を使用して、フルオロフォアＡｔｔｏ６４７Ｎをベータ除去残基へのチオール修飾と結合させた。次に、蛍光標識されたペプチドを精製し、凍結乾燥した。
【０１０６】
精製されたペプチドサンプルを、アミンで官能化されたスライド表面上に結合させ、蛍光配列決定プラットフォームで配列決定した。配列決定されたサンプルについて、すべてのアミノ酸位置にわたる蛍光滴をカウントした。この実験は、同じ方法で調製および配列決定された、同じ細胞タイプの異なる生体サンプル（ＨＥＫ−２９３Ｔ）を使用して繰り返され、生物学的反復のソースとして機能した。これらのサンプルの配列を決定し、すべてのアミノ酸位置にわたる蛍光滴をカウントした。次に、第１の生体サンプルおよび第２の生体サンプルからのカウント数を互いに対してプロットして、図２に示すプロットを作成した。一貫したパターンは、細胞から得られたタンパク質の複数のリン酸化残基を示し、細胞のリン酸化状態のプロファイルとして機能する。４桁に及ぶ結果の定量的性質は、定量的リン酸化プロテオミクスでの使用を示唆している。
【０１０７】
［実施例２］単一分子感度でのタンパク質の翻訳後グリコシル化の位置のマッピング。
材料および方法
１，３−ジチオール修飾フルオロフォアの合成：  Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドを使用して、リポ酸をｔｅｒｔ−ブチル（２−アミノエチル）カルバメートと反応させた（スキーム４）。次に、サンプルをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解してジエチルエーテルで沈殿させることにより、Ｂｏｃ保護基を除去した。次に、この反応の生成物である５−［１，２］ジチオラン−３−イル−ペンタン酸（２−アミノ−エチル）−アミドを、ＨＰＬＣで精製した（上記のように）。
スキーム４：ジチオールを含むフルオロフォアの調製
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【０１０８】
次に、５−［１，２］ジチオラン−３−イル−ペンタン酸（２−アミノ−エチル）−アミド生成物を、９．５ｍｇの５−［１，２］ジチオラン−３−イル−ペンタン酸（２−アミノ−エチル）−アミドをＤＩＰＥＡの８ｍＭ溶液４００μＬに溶解した１０ｍｇのＮＨＳ−ＴＭＲと共にジメチルホルムアミド中に溶解し、一晩振とうすることで、ＮＨＳ活性化テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）とカップリングさせた（スキーム３）。この反応の生成物をＨＰＬＣで精製し（上記のように）、次にこの１，２−ジチオラン生成物を、アルデヒドへのカップリングのための反応性部分を形成するために、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を使用してジチオラン基を１，３−ジチオールに還元した（スキーム３）。
【０１０９】
糖中の１，２−ジオールのアルデヒドへの変換：  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを過ヨウ素酸ナトリウムで処理し（スキーム５）、１，２−ジオールの切断をＬＣＭＳおよびＮＭＲで検証する。グリコシル化ペプチドは、同様に処理して１，２−ジオール基を切断し、フルオロフォア結合のためにグリコシル化ペプチドを調製する。
スキーム５：１，２−ジオールのジアルデヒドへの変換
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【０１１０】
結果および考察
蛍光配列決定は、タンパク質／ペプチド分子の少量の変動を同定することができ、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ、２０１０、米国特許第９，６２５，４６９号、米国特許出願第１５／４６１０３４号、米国特許出願第１５／１５０，９６２号に記載されている。この方法は、ペプチド鎖におけるアミノ酸の位置を決定するための、フルオロフォアによるアミノ酸の特異的な標識に依存する。この方法も同様に拡張して、糖に特異的なフルオロフォアの使用によって修飾されたアミノ酸の位置を同定することができる。
【０１１１】
グリオコシル化アミノ酸の標識の概念は、２段階プロセスである。最初の段階では、糖部分のアルコール基をアルデヒドに酸化する。次に、２番目の段階では、ジチオール試薬を糖分子のアルデヒド基と反応させる。１，３−ジチアンは配列決定条件に供されても分解しないことが示されているため、本発明者らは、グリコシル化アミノ酸を標識するために１，３−ジチオールテザーを有するようにフルオロフォアを修飾する方法を特定した。
【０１１２】
１，３−ジチオールテザーフルオロフォアの調製：  リポ酸は、一方の末端に保護された１，２−ジチオランを有し、もう一方の末端にカルボン酸を有するので、カップリング化学の優れた候補であると判断した。リポ酸とＮＨＳ活性化テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）とをスキーム４に従って反応させ、１，３−ジチオール修飾フルオロフォアを生成した。この１，３−ジチオール修飾フルオロフォア（スキーム４、化合物１０）は、グリコシル化ペプチドとすぐに反応して、エドマン型の安定した１，３−ジチアンを形成できる。この方法を使用して、Ａｔｔｏ６５７Ｎなど任意のＮＨＳ活性化フルオロフォアを、１，３−ジチオールテザーに結合できることに注意することが重要である。
【０１１３】
糖中の１，２−ジオールのアルデヒドへの変換：  残りの糖構造を維持しながら１，２−ジオールをアルデヒドに酸化的に切断するのに、過ヨウ素酸ナトリウムが使用できることを確認するために、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを選択した。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、過ヨウ素酸ナトリウムで処理され（スキーム５）、１，２−ジオールの切断は、ＬＣＭＳおよびＮＭＲで検証する。興味深いことに、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの環上の１，２−ジオールは、互いに共有結合した２つのアルデヒドを生成する（スキーム５）。これにより、フルオロフォアが酸化種に結合する機会が増え、ペプチドの同じ位置での２つのフルオロフォアの結合につながる可能性がある。よって、視野の明るさが増し、糖ペプチドの蛍光配列決定の助けになり得る。
【０１１４】
グリコシル化アミノ酸の蛍光配列決定：  １，２−ジオールを酸化的に切断するこのスキームを糖タンパク質および糖ペプチドに適用して、フルオロフォア結合の基質を提供できると考えられる。フルオロフォア結合の後、これらの結合した糖タンパク質または糖ペプチドを蛍光配列決定によって配列決定することができる。標識グリコシル化残基の位置を決定するために、蛍光配列決定を上記のように実施することができる。この標識および配列決定スキームは、グリコシド結合のタイプに不変であり、既知のタンパク質またはペプチドでのグリコシル化残基の位置を決定するためのｄｅ  ｎｏｖｏ方法を提供する。
【０１１５】
［実施例３］単一分子感度での翻訳後リジントリメチル化の位置のマッピング。
材料および方法
色素チオール試薬の合成：  翻訳後リン酸化の検出用に調製したとおり、３ｍｇのＡｔｔｏ６４７Ｎ−ＮＨＳ（カタログ番号：ＡＤ６４７Ｎ３５；Ａｔｔｏ−ｔｅｃ）を１５０μＬの塩基性システアミン溶液（１５００μＬの乾燥ＤＭＦ中、５．１ｍｇのシステアミンおよび７．５μＬのＤＩＰＥＡ）と混合した。混合物を３時間インキュベートし、Ａｔｔｏ６４７Ｎ−Ｓ−Ｓ−Ａｔｔｏ６４７Ｎ生成物を質量分析によって確認した（図１）。生成物を、それぞれ２００μｇの試薬を含むガラスバイアルに分注した。単一色素チオール試薬Ａｔｔｏ６４７Ｎ−ＳＨは、Ａｔｔｏ６４７Ｎ−Ｓ−Ｓ−Ａｔｔｏ６４７Ｎ試薬を１ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）と反応させ、６０°Ｃで１時間インキュベートすることによって調製した。
【０１１６】
ホフマン脱離およびペプチドとフルオロフォアとの反応：  ホフマン脱離反応で使用される技術、およびＢｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７からの技術を利用し、トリメチル化リジン残基にアルケンを生成するために、ペプチドを熱および酸化銀またはＤＩＰＥＡで処理する。（スキーム６）。次に、これらのアルケン含有ペプチドを、Ａｔｔｏ６４７Ｎ−ＳＨなどのチオール結合フルオロフォアと上記のように反応させて、リジントリメチル化の部位がフルオロフォアで標識されたペプチドを生成することができる。
スキーム６：トリメチル化アミノ酸残基の標識
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【０１１７】
予想される結果
蛍光配列決定は、ペプチド上の蛍光標識されたアミノ酸残基の位置を単一分子の感度で正確にマッピングすることが示されており、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ、２０１０、米国特許第９，６２５，４６９号、米国特許出願第１５／４６１０３４号、米国特許出願第１５／１５０，９６２号に記載されているように、リジントリメチル化の同定に有用であり得る。フルオロフォアのトリメチル化リジン残基への特異的結合は、蛍光配列決定技術を拡張して、ヒストンタンパク質のトリメチル化マークをマッピングし、それによってヒストンコードの同定を支援する。
【０１１８】
ホフマン脱離化学を使用して、トリメチル化リジン残基を反応性アルケン基に修飾することができ、これにより、上記のようにチオール基を含むフルオロフォアによる効率的な標識が可能になる。次に、標識されたペプチドを蛍光配列決定法によって配列決定して、単一分子解像度でトリメチル化リジンの位置を取得することができる。
【０１１９】
［実施例４］単一分子感度での翻訳後ニトロシル化の位置のマッピング
一酸化窒素（ＮＯ）は、一酸化窒素シンテターゼとして知られる酵素のファミリーによって合成される細胞シグナル伝達分子である。ＮＯは、金属タンパク質と反応できるか、または酸化もしくは反応性窒素種の生成を介してチロシンおよびシステイン残基を共有結合的に修飾することができる。ニトロシル化は、システインのＳ−ニトロシル化の、またはチロシン残基のニトロ化の共有結合付加を生成するカテゴリーの翻訳後修飾である（スキーム７を参照）。修飾を検出および定量化することは、ストレスまたは炎症中のシグナル伝達プロセスの理解の向上、および診断の発展に関係する（Ａｂｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）。ニトロシル化の部位を同定するためのペプチド質量分析の使用は、（ａ）ニトロ基の不安定な性質、および（ｂ）極めて少ない修飾量（チロシン残基１０６あたり１つと推定される）のために困難である（Ｚｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）。したがって、単一分子蛍光配列決定法は、チロシンまたはシステインにおける低レベルのニトロシル化修飾を検出および定量化するための理想的な解決策を提供する。
スキーム７：ニトロシル化アミノ酸の形成
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反応性ＮＯ種によるＳ−ニトロシル化システイン（Ａ）および３−ニトロシルチロシン（Ｂ）の形成
【０１２０】
蛍光配列決定による他の翻訳後修飾の部位の定量化に使用される原理と類似した、ニトロシル修飾を特異的に標的とする標識反応が開発された。２つの異なるタイプのニトロシル修飾を標的にするためのストラテジーを以下に説明する。
【０１２１】
Ａ．システイン−Ｓ−ニトロシル化
ＳＮＯ修飾の生体直交型標識は、１段階のジスルフィド形成を伴う有機ホスフィンベースの反応（Ｄｅｖａｒｉｅ−Ｂａｅｚ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３）によって実証されている。同じ反応原理を使用した、スキーム７で提案されたＳ−ニトロシル化システイン残基にフルオロフォア（試薬２Ｂ）を共有結合させる、１段階反応。試薬の部類は、末端ハンドル（アルキン、アジド）を有する有機ホスフィン基、またはフルオロフォア試薬を含む。末端ハンドルへの２段階反応、すなわち、初めに非蛍光試薬による反応、その後のフルオロフォア反応により、Ｓ−ニトロシルに特異的なフルオロフォアの共役付加が生成される。これらのアミノ酸の修飾に関連する技術の一般的な概要は、次のとおりである。
１．  タンパク質／ペプチドの単離タンパク質は、分子生物学で一般的なプロトコル（Ｌｅｅ、２０１７）を使用して細胞から収集され、トリプシンやＧｌｕＣなどの一般的なプロテアーゼによってペプチドへと消化される。いくつかのシナリオでは、冷メタノール（−２０°Ｃ）または他の細胞固定方法で細胞を処理することにより、細胞を固定することが可能である。固定後、細胞を試薬と直接反応させて、表面にアクセス可能なＰＴＭを標識することができる。
２．  遊離チオールの遮断Ｓ−ニトロシル化標識反応を実行するには、システインに存在する遊離チオールを遮断する必要がある。手順で使用される２つの一般的な試薬は、ヨードアセトアミドおよびＮ−メチルマレイミドである。ペプチドでチオールを遮断するために、２〜２０ｍＭの試薬をｐＨ７．５のバッファーで使用する。
３．  ＳＮＯ基の標識最大３ｍＭの試薬（フルオロフォア含有または非含有）をペプチドまたは固定化細胞と共に、室温で約３０分〜約２時間インキュベートする。過剰な試薬は、すすぎ／ＨＰＬＣ分離または透析など他の方法によって分離する。
４．  配列決定配列決定は、蛍光標識されたペプチドに実施する。
スキーム８：ニトロシル化チロシンの標識
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ペプチドまたはタンパク質の３−ニトロチロシン残基を、フルオロフォアで標識するための技術の概略図。（１）ニトロ化チロシン（この例ではＮ末端残基として示す）は、ペプチドに存在するすべての遊離アミンをアセチル化するＮＨＳ−アセテートと反応させる（２）。沸騰条件下でヘム／ＤＴＴを添加すると、ニトロ基がアミン部分に変換される（３）。このアミン基は、フルオロフォア−スクシンイミジルエステルと反応して、３−ニトロチロシン残基を共有結合的に標識する（４）。蛍光標識されたペプチドは、分析のために蛍光配列決定にかけることができる。
【０１２２】
したがって、この方法は、修飾の残基の位置を特定し、システイン残基のＰＴＭ標識の化学量論を定量化することができる。文献（Ｄｅｖａｒｉｅ−Ｂａｅｚ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３）に示されるようなデヒドロアラニン形成など、フルオロフォアと中間ホスフィン付加物との核酸連結の他の変形を実施することができる。
【０１２３】
Ｂ．  チロシンのニトロ化
質量分析プロテオミクスで使用される、ニトロチロシンの一般的な化学的誘導体化ストラテジーは、２段階プロセスである。第１の段階は、ニトロ基をアミノ基に還元した後、特殊な試薬でアミノ基を共有結合的に標識することである。この段階の前に、ペプチド／タンパク質の他のアミノ基は、通常はアセチル化によって遮断される（Ａｂｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０；Ｄｅｖａｒｉｅ−Ｂａｅｚ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３）。このストラテジー（スキーム８を参照）は、蛍光配列決定用に別個のフルオロフォアでニトロチロシン基を標識するために、直接応用することができる。蛍光配列決定用途でニトロチロシンを標識する方法は、次のとおりである。
１．  タンパク質／ペプチドの単離されたタンパク質およびペプチドは、リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）に可溶化される。消化されたタンパク質またはペプチドは、分析前に凍結乾燥することができる。ペプチドのおおよその濃度は、１０μＭである。
２．  アミンのアセチル化すべての遊離アミンおよびその他の求核試薬は、１９０μＬのニトロ化ペプチドをＮＨＳ−アセテート（最終濃度２５ｍＭ）と共に室温で２時間インキュベートすることによりアセチル化する。Ｏ−アセチル化を逆転させ、反応物を１５分間煮沸することにより、過剰な試薬を加水分解した。
３．  ニトロチロシンのアミノチロシンへの還元ＤＴＴ（最終濃度：：２０ｍＭ）およびヘミン（２５μＭ）をサンプルに添加し、沸騰水浴中で１５分間インキュベートした。
４．  蛍光標識Ａｔｔｏ−ＮＨＳまたは他のフルオロフォア−ＮＨＳ（２ｍＭ）を溶液に添加し、室温で２時間インキュベートした。過剰な色素は、ＨＰＬＣまたは他の分離方法によって、蛍光配列決定の前に除去した。
スキーム９：ニトロシル化システインの標識
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Ｓ−ニトロシル化システインの選択的標識のためのワンポット反応の概略図。（Ａ）遊離チオールのアルキル化後、有機ホスフィン試薬の使用が、ジスルフィド結合をもたらす。（Ｂ）ホスフィン基に連結されたフルオロフォアを有する試薬の、一般的な例を提供する。
【０１２４】
上記のセクションで説明したワンポットプロセスは、ペプチドおよびタンパク質のニトロチロシンの位置特定および定量化に非常に適している。
【０１２５】
［実施例５］単一分子感度での翻訳後シトルリン化の位置のマッピング。
シトルリン化は、酵素タンパク質アルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によって引き起こされる翻訳後修飾であり、アルギニン側鎖がシトルリンに変換される（脱イミノ化と呼ばれるプロセス）。変換により、１Ｄａの質量変化、正電荷および２つの潜在的な水素結合ドナーの消失が生じる。この修飾は、タンパク質の構造および安定性に大きな影響を及ぼし、自己免疫疾患、神経変性疾患、および腫瘍生物学に関係している（Ｇｙｏｒｇｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）。小さな質量変化は、ペプチド質量分析において未修飾アルギニン残基の同位体分布と重複するため、その同定が困難となる。ＰＴＭの他の課題と同様に、少量のシトルリン化残基の位置特定および定量化のためのアッセイを開発することが重要である。
【０１２６】
シトルリン化残基を標的とするための化学選択的ストラテジーが、実証されている。フェニルグリオキサール試薬は、アルギニン（塩基性下）およびシトルリン（酸性条件下）と反応して、５員環を形成する。酸性条件下では、試薬はさらにホモシトルリンおよびシステインに結合するが、システインで形成されたチオヘミアセタール環は、中性ｐＨで加水分解される。フェニルグリオキサール試薬を使用して、シトルリン化残基をローダミンで蛍光標識する方法が説明されている（Ｂｉｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）。この手順は、次のように蛍光配列決定に応用される（スキーム１０を参照）。
１．  タンパク質／ペプチドの単離十分に最適化された標準的な手順に従って、単離されたタンパク質を消化するか、またはペプチドを単離する。約５０μＭのシトルリン化ペプチドを凍結乾燥、または５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ  ７．５）中で可溶化する。
２．  システインのチオール基は、ヨードアセトアミドまたは蛍光色素を使用してキャップし、これでシトルリン特異的試薬の交差反応性を防ぐ。２ｍＭのヨードアセトアミドによって、タンパク質消化物のチオール基がアルキル化される。
３．  シトルリン含有ペプチドを、５ｍＭのフェニルグリオキサール試薬および２０％のトリクロロ酢酸（ｐＨ＜１）と共に、３７°Ｃで３時間インキュベートした。
４．  フェニルグリオキサール試薬は、フルオロフォアと直接結合するか、またはその後のフルオロフォアとの反応のためのハンドル（クリックハンドル）を含むことができる。
５．  過剰な試薬は、蛍光配列決定のための標識シトルリン化ペプチドから取り除かれる。
スキーム１０：シトルリン化修飾されたアミノ酸の標識
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ローダミン−フェニルグリオキサール試薬によるシトルリン化残基の選択的標識。（Ａ）シトルリン化残基の標識のための反応条件（Ｂ）蛍光配列決定用のシトルリン化残基の蛍光標識に使用されるローダミン−フェニルグリオキサール試薬
【０１２７】
［実施例６］単一分子感度での翻訳後スルフェニル化の位置のマッピング。
スルフェン酸は、穏やかな酸化環境でのチオール側鎖の反応で形成される、システイン残基の特異的な酸化的修飾の１つである。修飾は、活性酸素種形成の初期段階、ジスルフィド結合形成の形成の中間段階の読み出しであり、レドックスシグナル伝達にも関与する（Ｐｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。質量分析計で一般的に使用されるイオン化条件下での結合の不安定な性質は、修飾の位置特定および定量化を非常に困難にする。しかしながら、基の反応性により、修飾ペプチドの化学的結合および濃縮（Ｐｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００７；Ｒｅｄｄｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）が実行可能になる。原理は、スルフェン酸と、いくつかの蛍光試薬に結合したジメドン（５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン）との選択的反応である（スキーム１１を参照）。さらに、ビオチン標識試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；カタログ番号ＮＳ１２２６−１ＭＧ）を使用することもできる。
スキーム１１：スルフェン酸修飾されたアミノ酸の標識
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１，３−シクロヘキサンジオン試薬誘導体によるスルフェン酸の選択的標識を示す反応。（Ａ）ジメドン（５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン）の使用により、高収率の反応が実証された。（Ｂ）蛍光配列決定に適した、スルフェン酸修飾の標識のためのローダミン誘導体の例
【０１２８】
以下は、蛍光配列決定用に誘導体化ローダミンでペプチドのスルフェン酸を標識するための反応方法である。
１．  タンパク質／ペプチドの単離標準化された一般的な手順を使用して、タンパク質を消化するか、またはペプチドを単離した。約１〜１０μｍｏｌのペプチドを凍結乾燥、またはリン酸バッファー（ｐＨ  ７；２５ｍＭ）および１ｍＭのＥＤＴＡで可溶化した。
２．  スルフェン酸の標識蛍光試薬を５ｍＭの濃度まで添加し、３７°Ｃで２時間インキュベートした。試薬は、アジドハンドルを含むもの、およびリンカーと特異的に反応するフルオロフォアを含むものが半分ずつであってもよい。
３．  過剰な試薬およびフルオロフォアは、蛍光配列決定の前に取り除かれる。
【０１２９】
種々の試薬および反応機構が関与する他の多くの標識反応も実証されている（Ｇｕｐｔａ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｏｌｌ、２０１４）。
【０１３０】
［実施例７］バイオマーカーとしての翻訳後修飾の測定
上記のように、リン酸化状態などの翻訳後修飾の正確な部位は、タンパク質の機能に影響を及ぼし、信頼できる病状の指標として役立ち得る。そのような分子の１つであるトロポニンは、心臓の調節不全の診断バイオマーカーである（Ｗｉｊｎｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）。しかしながら、リン酸化の部位特異的な性質は、心不全を理解し、治療するための重要な診断かつ治療マーカーである（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）。トロポニン分子のリン酸化状態および部位に応じて、診断は、運動（ｅｘｅｒｃｉｓｅ）から心筋症と同等の重度の病状にまで変動し得る。
【０１３１】
上に提示された方法を容易に利用して、多くの潜在的なリン酸化関連バイオマーカーのリン酸化状態を評価することができる。第１段階は、目的のタンパク質、つまりトロポニンに対して標準的な抗体プルダウンを実施することである。次に、濃縮されたタンパク質は、ＧｌｕＣまたはトリプシンなどのプロテアーゼを使用してより短いペプチドに消化され、特定の長さのペプチドを生成できる。次に、リン酸化部位は、実施例１に記載されているように、ペプチド分子上で標識することができる。これにより、蛍光配列決定によって翻訳後修飾の正確な位置の特定および定量化が可能になり、現行の診断テスト、例えば、サンプル中のトロポニンまたはリン酸化トロポニンのレベル測定に使用されるような半定量的抗体アッセイなどを超える、大きな利点をもたらす。この方法論は、タンパク質のメチル化またはグリコシル化の評価にも同様に適用でき、タンパク質の翻訳後修飾を特徴とする疾患の新しいバイオマーカーを提供する。
【０１３２】
本明細書で開示および特許請求される方法はすべて、本開示に照らして過度の実験を行うことなく、作成および実行され得る。組成物および方法は、特定の実施形態に関して説明されてきたが、本開示の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法および技術、または方法の技術の順序に変形を適用することができる。より具体的には、同じまたは類似の結果が達成される場合、化学的および生理学的の両方に関連する特定の薬剤が、本明細書に記載の薬剤の代わりになり得ることは明らかであろう。そのようなすべての類似の代替物および修正は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神、範囲および概念の範囲内であると見なされる。
【０１３３】
参考文献
以下の参考文献は、手順またはその他の詳細の補足を本明細書に記載されているものに提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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