(57)【要約】  本発明は、一連のヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体を提供し、これらの抗体は同じ可変領域および異なる定常領域を有し、可変領域はヒトＩＬ−４Ｒに特異的に結合し、定常領域は独特の機構を介して抗体全体の活性に影響を与える。本発明に係る一連の抗体は、アトピー性皮膚炎、喘息などのＩＬ−４Ｒ過剰発現に起因する疾患の治療に有用であり、臨床での実用化が期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）重鎖相補性決定領域としてアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で表されるＨＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で表されるＨＣＤＲ２及びアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で表されるＨＣＤＲ３と、
ｂ）軽鎖相補性決定領域としてアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で表されるＬＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で表されるＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で表されるＬＣＤＲ３と
を含むことを特徴とする、ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１に記載のヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項２に記載のヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体は、マウス由来の抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１に記載のヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗体は、ＩｇＧ１型の抗体又はＩｇＧ４型の抗体である、請求項１に記載のヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体及シングルドメイン抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載のヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
前記ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片は、ＩＬ−４とＩＬ−４Ｒの相互作用を遮断可能である、請求項１に記載のヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
前記ヒトＩＬ−４Ｒに結合する結合抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で表され、若しくは重鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で表される、請求項１に記載のヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
前記ヒトＩＬ−４Ｒに結合する結合抗体又はその抗原結合断片は、重鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で表され、軽鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で表され、若しくは重鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で表され、軽鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で表され、若しくは重鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で表され、軽鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で表される、請求項８に記載のヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記ヒトＩＬ−４Ｒに結合する結合抗体又はその抗原結合断片は、Ｆｃフラグメントを含み、前記Ｆｃフラグメントは、変異サイトとしてＳ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆを含む、請求項１〜９の何れか１項に記載のヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
単離されたヌクレオチドであって、
前記請求項１〜１０の何れか１項に記載のヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表され且つ重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表され且つ軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を有し、若しくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で表され且つ重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で表され且つ軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１１に記載のヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１１又は請求項１２に記載のヌクレオチドを含んでなることを特徴とする、発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の発現ベクターを含んでなることを特徴とする、ホスト細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１０の何れか１項に記載のヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片を製造する方法であって、
発現条件下で前記請求項１４に記載のホスト細胞を培養することにより、前記ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片を発現するステップａと、
ステップａで発現したヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片を分離精製するステップｂと、を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜１０の何れか１項に記載ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなることを特徴とする、薬物組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１０の何れか１項に記載のヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片または請求項１６に記載の薬物組成物の、ＩＬ−４Ｒ過剰発現に起因する疾患を治療するための薬物の製造における用途。
【請求項１８】
前記ＩＬ−４Ｒ過剰発現に起因する疾患は、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー反応、好酸球性食道炎、皮膚感染症または鼻ポリープである、請求項１７に記載の用途。
【請求項１９】
請求項１〜１０の何れか１項に記載のヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片の活性を高める方法であって、
前記ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片は、Ｆｃフラグメントであり、前記Ｆｃフラグメントは、変異サイトとしてＳ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆを含むことを特徴とする、方法。
【請求項２０】
ＩＬ−４Ｒα細胞外領域におけるアミノ酸残基Ｌ３９、Ｆ４１、Ｌ４２、Ｌ４３、Ｄ７２およびＹ７４に特異的に結合することを特徴とする、ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体工学の分野に属し、より具体的にはヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体、その製造方法と用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−４受容体（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＩＬ−４Ｒ）は、α鎖およびγｃ鎖からなるヘテロダイマーであり、そのうちα鎖（ＩＬ−４Ｒα）はインターロイキン−４（ＩＬ−４）に特異的に結合し、そしてγｃ鎖と三元複合体を形成してＩＬ−４による増殖促進および遺伝子転写活性化の信号を伝達する。インターロイキン−１３受容体（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＩＬ−１３Ｒ）は、ＩＬ−１３Ｒα１鎖およびＩＬ−４Ｒα鎖からなるヘテロダイマーであり、そのうちＩＬ−１３Ｒα１はインターロイキン−１３に特異的に結合し、そしてＩＬ−４Ｒα鎖と三元複合体を形成してＩＬ−１３による増殖促進および遺伝子転写活性化の信号を伝達する。ＩＬ−４及びＩＬ−１３は、例えばアレルギー性皮膚炎や喘息など、アレルギー症の病態機構において重要な役割を果たす。
【０００３】
現在市販のデュピルマブ（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ、商品名：ＤＵＰＩＸＥＮＴ）注射液は、ＩＬ−４Ｒα鎖を標的とするモノクローナル抗体薬品であり、リジェネロン社（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）とサノフィ・アベンティス社（Ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）が共同開発したものである。デュピルマブは、完全ヒトＩｇＧ４型のモノクローナル抗体であり、分子量が約１４７ｋＤａであり、ＩＬ−４及びＩＬ−１３受容体複合体が何れも認識しうるＩＬ−４Ｒαサブユニットに特異的に結合することにより、ＩＬ−４およびＩＬ−１３サイトカインを介した炎症反応を抑制することができる。デュピルマブは、それぞれ２０１７年３月２８日、２０１７年９月２７日および２０１８年１月１９日付で米国ＦＤＡ、欧州ＥＭＡ及び日本ＰＭＤＡにより販売が認められ、適応症として局部治療で制御不能又は効果不十分な中程度から重度のアトピー性皮膚炎を持つ成人患者を治療するために用いられ、局部治療でコルチコステロイドとの併用については特に制限がない。
【０００４】
近頃の２つの第ＩＩＩ相試験（Ｃａｓｔｒｏ  Ｍ，Ｃｏｒｒｅｎ  Ｊ，Ｐａｖｏｒｄ  Ｉ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｉｎ  ｍｏｄｅｒａｔｅ−ｔｏ−ｓｅｖｅｒｅ  ｕｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ａｓｔｈｍａ［Ｊ］．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１８；３７８：２４８６−２４９６，ＤＯＩ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１８０４０９２）から、プラセボを投与した対照組の患者に比べ、デュピルマブ治療を受けた患者が重度喘息の悪化率が著しく低下し、同時に肺機能および喘息に対する制御がより優れ、かつ好酸性顆粒球レベルが高い患者に対してより優れた効果を示すことが実証された。これらの治験結果に鑑み、デュピルマブを中程度から重度の喘息を患う成人患者および青少年（１２歳以上）の追加維持治療に用いる一部変更承認申請（ｓＢＬＡ）がアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認められた。
【０００５】
現在、デュピルマブはＦＤＡからアトピー性皮膚炎の治療用で市販許可を取得し、後には中程度から重度の喘息の治療用で承認が得られる見通しもある。ところが、新規でありながら特異性が高く、かつ優れた効果を示すＩＬ−４Ｒαを標的とする薬品に対して依然として期待が高く、同類薬品に対する国内市場の需要を満たし、アレルギー性自己免疫疾患を持つ患者の生活品質を高め、患者の需要に対応できるようにすることが求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の技術課題を解決するため、本発明者は、抗原免疫からハイブリドーマの選別、抗体の発現と精製、生物活性の同定に至るまで鋭意研究を重ねることによりヒトＩＬ−４Ｒに特異的に結合するマウス由来４−２号抗体を選別して取得し、さらに該にマウス由来の抗体基づきキメラ抗体４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ１、ヒト化抗体４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１及び４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４を構築した。また、実験結果からキメラ抗体４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ１、ヒト化抗体４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１及び４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４がＩＬ−４とＩＬ−４Ｒの相互作用を効果的に遮断し、かつＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のＣＤ２３発現およびＩｇＥ分泌を阻害する活性を有することが実証された。このことから、本発明に係るヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体（以下、「ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体」とも称する）がＩＬ−４Ｒ過剰発現患者を治療するための薬品製造に有用であると考えられる
【０００７】
また、抗体エピトープの解析から、本発明の抗体がＩＬ−４Ｒα細胞外領域におけるアミノ酸残基Ｌ３９、Ｆ４１、Ｌ４２、Ｌ４３、Ｄ７２及びＹ７４に特異的に結合することが実証された。
【０００８】
そこで、本発明の第１側面では、ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０００９】
本発明の第２側面では、上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片をコードする単離されたヌクレオチドを提供する。
【００１０】
本発明の第３側面では、上記ヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００１１】
本発明の第４側面では、上記発現ベクターを含むホスト細胞を提供する。
【００１２】
本発明の第５側面では、上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する。
【００１３】
本発明の第６側面では、上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片を含む薬物組成物を提供する。
【００１４】
本発明の第７側面では、上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片、又は上記薬物組成物の用途を提供する。
【００１５】
本発明の第８側面では、上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片の活性を高める方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成するため、本発明の第１側面では、ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片は、
ａ）重鎖相補性決定領域としてアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で表されるＨＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で表されるＨＣＤＲ２及びアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で表されるＨＣＤＲ３と、
ｂ）軽鎖相補性決定領域としてアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で表されるＬＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で表されるＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で表されるＬＣＤＲ３と、を含む。
【００１７】
本発明によれば、上記抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。好ましくは、上記抗体はモノクローナル抗体である。
【００１８】
本発明によれば、上記抗体は、マウス由来抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体などである。
【００１９】
本発明によれば、上記抗体は、ＩｇＧ１型の抗体又はＩｇＧ４型の抗体である。
【００２０】
本発明によれば、上記抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）及びシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）などから選ばれる。
【００２１】
本発明によれば、上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片は、ＩＬ−４とＩＬ−４Ｒの相互作用を遮断することができる。
【００２２】
本発明の一好適な実施形態では、上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域のアミノ酸配列がＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表される、軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で表される。本発明のもう１つの好適は実施形態では、上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で表される。
【００２３】
本発明の一好適な実施形態では、上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片は、重鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で表され、軽鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で表される。本発明のもう１つの好適は実施形態では、上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片は、重鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で表され、軽鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で表される。本発明のもう１つの好適は実施形態では、上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片は、重鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で表され、軽鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で表される。
【００２４】
本発明の一好適な実施形態では、上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片は、Ｆｃフラグメントを含み、上記Ｆｃフラグメントは、変異サイトとしてＳ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆを含む。
【００２５】
本発明の第２側面では、単離されたヌクレオチドを提供し、上記ヌクレオチドは、上記何れか１項に記載のヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片をコードする。
【００２６】
本発明の一好適な実施形態では、上記ヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されて重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表されて軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を有する。本発明のもう１つの好適は実施形態では、上記ヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で表されて重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で表されて軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００２７】
本発明の第３側面では、上記何れか１項に記載のヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００２８】
本発明の第４側面では、上記発現ベクターを含むホスト細胞を提供する。
【００２９】
本発明の第５側面では、上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片を製造する方法を提供し、前記方法は、発現条件下で上記ホスト細胞を培養することにより、上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片を発現するステップａと、ステップａで発現したヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片を分離精製するステップｂと、を含む。
【００３０】
本発明の第６側面では、上記何れか１項に記載のヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片、及び薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。
【００３１】
本発明の第７側面では、上記何れか１項に記載のヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片又は上記薬物組成物の、ＩＬ−４Ｒ過剰発現に起因する疾患を治療するための薬物製造における使用を提供する。
【００３２】
さらに、本発明は、ＩＬ−４Ｒ過剰発現に起因する疾患を治療する方法を提供し、該治療方法は、本発明に係るヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片、または上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片を含む薬物組成物を患者に投与することを含む。
【００３３】
さらに、本発明は、ＩＬ−４Ｒ過剰発現に起因する疾患を治療するための抗体又はその抗原結合断片、または上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片を含む薬物組成物を提供する。
【００３４】
本発明の一好適な実施形態では、上記ＩＬ−４Ｒ過剰発現に起因する疾患としては、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー反応、好酸球性食道炎、皮膚感染症および鼻ポリープなどが挙げられる。
【００３５】
本発明の第８側面では、上記何れか１項に記載のヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片の活性を高める方法を提供し、上記ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片は、変異サイトとしてＳ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆを含むことを特徴とするＦｃフラグメントを含む。
【発明の効果】
【００３６】
本発明において一連のヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体を製造し、これらの抗体は、可変領域が同じであるが定常領域が異なり、可変領域はヒトＩＬ−４Ｒに特異的に結合可能であり、定常領域は独特の作用機能を利用することにより抗体全体の活性に影響を与える。本発明に係る抗体は、ＩＬ−４Ｒ過剰発現に起因する疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、喘息など）を治療するための薬物製造に有用であり、臨床で応用価値が高く実用化が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対するＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ｈＦｃおよびＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ＦＬＡＧの阻害効果を、ＴＦ−１細胞を用いて測定したときの結果を示す図である。
【図２】ＩＬ−４Ｒ抗原に対する精製されたマウス由来の抗ヒトＩＬ−４Ｒモノクローナル抗体の相対結合親和性を、ＥＬＩＳＡで測定したときの結果を示す図である。
【図３】ＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する精製されたマウス由来の抗ヒトＩＬ−４Ｒモノクローナル抗体の阻害効果を、ＴＦ−１細胞を用いて測定したときの結果を示す図である。
【図４】ＩＬ−４Ｒ抗原に対する４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ１及び４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１の相対結合親和性を、ＥＬＩＳＡで測定したときの結果を示す図である。
【図５】ＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ１及び４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１の阻害効果を、ＴＦ−１細胞を用いて測定したときの結果を示す図である。
【図６】ＩＬ−１３が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ１及び４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１の阻害効果を、ＴＦ−１細胞を用いて測定したときの結果を示す図である。
【図７−１】ＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１及び４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４の阻害効果を、ＴＦ−１細胞を用いて測定したときの結果をそれぞれ示す。
【図７−２】ＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１及び４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４の阻害効果を、ＴＦ−１細胞を用いて測定したときの結果をそれぞれ示す。
【図７−３】ＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１及び４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４の阻害効果を、ＴＦ−１細胞を用いて測定したときの結果をそれぞれ示す。
【図８】ＩＬ−４とＩＬ−４Ｒの相互作用に対する４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４及び４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦの阻害活性を、ＥＬＩＳＡで測定したときの結果を示す図である。
【図９】ＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦの阻害効果を、ＴＦ−１細胞を用いて測定したときの結果を示す図である。
【図１０−１】ＩＬ−４が誘導するＰＢＭＣのＣＤ２３発現に対する４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４及び４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦの阻害効果を、ＰＢＭＣを用いて測定したときの結果をそれぞれ示す。
【図１０−２】ＩＬ−４が誘導するＰＢＭＣのＣＤ２３発現に対する４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４及び４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦの阻害効果を、ＰＢＭＣを用いて測定したときの結果をそれぞれ示す。
【図１０−３】ＩＬ−４が誘導するＰＢＭＣのＣＤ２３発現に対する４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４及び４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦの阻害効果を、ＰＢＭＣを用いて測定したときの結果をそれぞれ示す。
【図１１−１】ＩＬ−４が誘導するＰＢＭＣのＩｇＥ分泌に対する４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４及び４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦの阻害効果を、ＰＢＭＣを用いて測定したときの結果をそれぞれ示す。
【図１１−２】ＩＬ−４が誘導するＰＢＭＣのＩｇＥ分泌に対する４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４及び４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦの阻害効果を、ＰＢＭＣを用いて測定したときの結果をそれぞれ示す。
【図１２】４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４の薬物動態特性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明において、「抗体（Ａｂ）」および「免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）」とは、同じ構造特徴を有する約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同じ軽鎖（Ｌ）と２つの同じ重鎖（Ｈ）とで構成される。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合を介して重鎖に結合し、異なる免疫グロブリンにとって同型重鎖のジスルフィド結合数が異なる。各重鎖および軽鎖は、規則的な間隔で鎖内ジスルフィド結合を有し、重鎖の一端に可変領域（ＶＨ）を有し、可変領域に続いて定常領域を有する。各軽鎖の一端に可変領域（ＶＬ）を有し、他端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域と重鎖の第１定常領域が対向し、かつ軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域が対向して構成される。また、本発明の抗体としては、マウス由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などが挙げられ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２種類の抗体からなる多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体の抗原結合断片などが含まれる。
【００３９】
本発明において、「モノクローナル抗体」とは、基本的に均一である群から得られる抗体を指し、すなわち極一部が自然変異を形成する以外、該群に含まれる単一抗体が同じである。モノクローナル抗体は、１つの抗原サイトを高い特異性で認識して結合する。そして、通常のポリクローナル抗体製剤（通常、異なる決定基を認識する複数種類の抗体を含む）と異なり、各モノクローナル抗体は、抗原の単一決定基を認識して結合する。こうした特異性以外でも、モノクローナル抗体の利点としてはハイブリドーマを培養することにより得られ、他の免疫グロブリンによって汚染されないことが挙げられる。また、「モノクローナル」とは抗体の特性を指し、すなわちほぼ均一な抗体群から得られ、何ら特別な方法で製造されたものと解釈してはいけない。
【００４０】
本発明において、「マウス由来の抗体」とはラットやモウス由来の抗体を指し、マウス由来の抗体が好ましい。本発明に係るマウス由来の抗体は、ヒトＩＬ−４Ｒの細胞外領域を抗原としてマウスを免疫し、ハイブリドーマ細胞を選別して得られたものである。好ましくは、本発明のマウス由来の抗体は、４−２号抗体である。
【００４１】
本発明において、「キメラ抗体」とは、ある種に由来の重鎖および軽鎖の可変領域配列と、別の種に由来の定常領域配列とを含む抗体を指し、例えば、ヒト定常領域と連結したマウス重鎖および軽鎖の可変領域を備える抗体が挙げられる。好ましくは、本発明のキメラ抗体は、マウス由来の抗体４−２号抗体の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列と、ヒト定常領域とを繋ぐことで得られる。より好ましくは、本発明のキメラ抗体としては、重鎖がマウス由来の抗体４−２号抗体の重鎖可変領域配列とヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）定常領域を繋ぐことで得られ、軽鎖がマウス由来の抗体４−２号抗体の軽鎖可変領域配列とヒトｋａｐｐａ鎖を繋ぐことで得られる。より好ましくは、本発明のキメラ抗体は、４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ１である。
【００４２】
本発明において、「ヒト化抗体」とは、ＣＤＲがヒト以外の動物（例えば、マウス）の抗体から得られ、抗体分子においてＣＤＲ以外の部分（フレームワーク領域および定常領域を含む）がヒト抗体から得られるものを指す。なお、フレームワーク領域のアミノ酸残基については、結合性が維持できる限り種々の変更を加えることができる。好ましくは、本発明のヒト化抗体は、マウス由来の抗体である４−２号抗体のＣＤＲ領域とヒト由来の抗体の非ＣＤＲ領域を組み合せ、さらに埋込み残基、ＣＤＲ領域に直接作用する残基、並びに４−２号抗体のＶＬとＶＨの空間構造に対して重要な影響を与える残基に対して復帰変異を導入することで得られる。より好ましくは、本発明のヒト化抗体は、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４である。
【００４３】
本発明において、「結合」、「特異的結合」および「特異的に結合する」とは、分子同士の規則的な結合反応を指すものであり、例えば抗体とそれに対等する抗原との反応が挙げられる。抗体は、通常であれば約１０−５Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で、例えば約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍや１０−１０Ｍ、又はそれ以下の解離定数（ＫＤ）でそれに対等する抗原に結合することができる。
【００４４】
本発明において、「ＫＤ」とは特定抗体と抗原が相互作用するときの解離定数を指し、抗体と抗原の結合親合力を意味するものである。解離定数が低いほど，抗体と抗原の結合が強く、抗体と抗原の親合力が高くなる。抗体は、通常であれば以約１０−５Ｍ未満の解離定数で、例えば約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ又は或それ以下の解離定数で抗原（例えば、ＩＬ−４Ｒタンパク質）に結合することができ、解離定数としては、例えば表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を利用してＢＩＡＣＯＲＥ測定装置で測定することができる。
【００４５】
本発明において、「抗原結合断片」とは、ヒトＩＬ−４Ｒのエピトープに特異的に結合しうる抗体断片を指す。本発明の抗原結合断片としは、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）などが挙げられる。Ｆａｂ断片は、抗体をパパインで消化して得られ、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体をペプシンで消化して得られる。Ｆｖ断片は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が非共有結合を介して緊密に連結したダイマーである。一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を１５〜２０個のアミノ酸からなるペプチドリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）で連結した抗体である。シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は重鎖のみで形成され、ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）又は重鎖抗体とも呼ばれ、その抗原結合領域はヒンジ領域を介してＦｃ領域に連結したシングルドメインである。
【００４６】
本発明において、「可変」とは、抗体可変領域の一部に配列上差異があり、特定抗原に対する各抗体の結合性や特異性を決定する構成である。しかしながら、可変度は、抗体可変領域全体に渡って均一に分布せず、軽鎖および重鎖の可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と称される３つのフラグメントに集中して存在する。可変領域で保存性が比較的高い部分は、フレームワーク領域（以下、「ＦＲ領域」とも称する）と称される。天然重鎖および軽鎖の可変領域にそれぞれ４つのＦＲ領域を含み、これらのＦＲ領域はｐ折り畳み構造を形成し、接続リングを形成する３つのＣＤＲによって互いに連結され、ある状況では部分的なｐ折り畳み構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域を介して緊密に隣接し、かつ他鎖のＣＤＲと共同で抗体の抗原結合サイトを形成する［Ｋａｂａｔ等，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１-３２４２、第Ｉ巻６４７-６６９頁（１９９１）］。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接に関与せず、例えば抗体依存性細胞介在性の細胞毒性（ＡＤＣＣ，ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ）などの他の生体作用機序を示す。
【００４７】
本発明において、「Ｆｃフラグメント」とは、パパインで抗体を２つの完全に一致したＦａｂフラグメントと一个Ｆｃフラグメントに分解したものを指し、Ｆｃフラグメントが所謂結晶性フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ，Ｆｃ）であり、抗体のＣＨ２およびＣＨ３構造領域で構成される。Ｆｃフラグメントは、抗原への結合活性がなく、抗体とエフェクター分子又は細胞が互いに作用する部分である。
【００４８】
本発明において、「ヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体」又は「抗ヒトＩＬ−４Ｒ抗体」とは、ヒトＩＬ−４Ｒに特異的に結合する抗体を指す。好ましくは、前記ヒトＩＬ−４Ｒは、ヒトＩＬ−４Ｒの細胞外領域である。より好ましくは、前記ヒトＩＬ−４Ｒの細胞外領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表されるアミノ酸配列を有する。また、本発明のヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片は、ＩＬ−４とＩＬ−４Ｒの相互作用に対して阻害活性を示すことが好ましい。
【００４９】
本発明において、発現ベクターについては特に制限がなく、例えばｐＴＴ５、ｐＳＥＣｔａｇ系、ｐＣＤＮＡ系ベクター及び他の哺乳動物発現系に用いるベクターなどを使用することができ、発現ベクターには、適切な転写および翻訳調節配列が連結された融合ＤＮＡ配列が含まれる。
【００５０】
本発明に適用可能なホスト細胞として、上記発現ベクターを発現しうる細胞が挙げられ、例えば、哺乳類動物や昆虫ホスト細胞培養系を利用して本発明の融合タンパク質を発現してもよく、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＢＨＫなどの真核細胞も本発明に利用可能である。
【００５１】
本発明において、「薬物組成物」とは、本発明のヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容可能な担体とからなる薬物製剤を指し、本発明に係る薬物組成物は、安定な治療効果を確保することができ、同時に本発明のヒトＩＬ−４Ｒの結合抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸コア配列の構造完全性を維持することができ、さらにタンパク質の多官能基が分解（例えば、凝集、脱アミノ化や酸化）から免れるようにすることができる。
【００５２】
本発明において、「ＩＬ−４Ｒ過剰発現に起因する疾患」とは、異常病態の細胞におけるＩＬ−４Ｒ発現レベルが同じ組織の正常細胞におけるＩＬ−４Ｒ発現レベルを越えることを意味する。本発明のＩＬ−４Ｒ過剰発現に起因する疾患については特に制限がないが、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー反応、好酸球性食道炎、皮膚感染症、鼻ポリープなどが挙げられる。
【００５３】
以下、実施例、実験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例、実験例に制限されない。以下において、ベクター及びプラスミドの構築方法、タンパク質をコードする遺伝子を前記ベクターやプラスミドに導入する方法や、プラスミドをホスト細胞に導入する方法など、従来より周知の操作方法については説明を省略する。これらの操作は当業者が熟知し、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｉｓ，Ｔ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓなどの出版物に詳細な説明がある。
【００５４】
実施例１：マウス由来の抗ヒトＩＬ−４Ｒモノクローナル抗体の選別と調製
１．１、ＩＬ−４Ｒ抗原及び陽性対照物抗体デュピルマブの調製
抗原としてヒトＩＬ−４Ｒα細胞外領域（ＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ）の配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇに登録されているものを使い、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表される。該アミノ酸配列については、コドンを最適化した後に全遺伝子を合成して原核発現ベクターに導入した。組換えＰＣＲ法を利用してＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤコーディング領域の末端に１つのｈＦｃ（ＩｇＧ１）又はＦＬＡＧタグを付け、そしてｐＴＴ５一過性発現ベクター（ＮＲＣ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）に導入した。標準手順に従って上記ベクターをＨＥＫ２９３細胞（ＮＲＣ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）に導入し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で５日間培養した後、上澄み液からＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ｈＦｃ及びＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ＦＬＡＧ抗原を分離精製した。そして、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ及びａｎｔｉ−ＦＬＡＧカラムを用いて上記抗原を精製した。
【００５５】
陽性対照物抗体であるデュピルマブの重鎖および軽鎖配列は、ＷＨＯ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（２０１３，２７（３）：２８４−２８５）に記載され、該抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子を合成し、それぞれヒト重鎖ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）および軽鎖Ｋａｐｐａ定常領域と組み合せた後、ｐＴＴ５一過性発現ベクターに導入してＨＥＫ２９３Ｅ系で発現し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムで精製した。
【００５６】
上記タンパク質を精製し、ＴＦ−１細胞を用いてＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対するＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ｈＦｃ、ＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ＦＬＡＧおよびデュピルマブの阻害作用を測定した。具体的には、対数増殖期のＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ社製）を３７℃に予め加温したＲＰＭＩ１６４０完全培地（Ｇｉｂｃｏ社製のＲＰＭＩ１６４０基本培地に１０％のウシ胎児血清を含む）で２回洗い、１０００ｒｐｍ、５分間遠心した。ＴＦ−１細胞数を計測し、ＲＰＭＩ１６４０完全培地で適切な密度に調整して１００００個／１５０μｌ／ウェルの量で９６ウェルプレートに播種した。ＲＰＭＩ１６４０完全培地にＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を濃度が８０ｎｇ／ｍｌになるように加え、ＩＬ−４を含む培地でヒトＩＬ−４Ｒ抗原（ＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ｈＦｃおよびＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ＦＬＡＧ）および陽性対照物抗体であるデュピルマブを適宜希釈した後、適切な倍率で９つの濃度勾配を希釈した。そして、希釈済みの抗原と抗体を９６ウェル細胞培養用プレートに各ウェル当たり５０μｌずつ注入し、さらに９６ウェルプレートの周囲に２００μｌ／ウェルの蒸留水を補充し、３７℃、５％のＣＯ２条件のインキュベータで４日間培養した。４日後、９６ウェルプレートの各ウェルに２０μｌのＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）溶液を加え、３７℃のインキュベータで引続き８時間培養した。十分振り混ぜてからプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）でＯＤ４５０値を測定し、測定データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で解析し、用量反応曲線を作成してＩＣ５０を算出した。
【００５７】
図１に示すように、ＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ｈＦｃ、ＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ＦＬＡＧおよびデュピルマブは何れもＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖を効果的に阻害することができ、ＩＣ５０はそれぞれ２８０．２ｎｇ／ｍｌ、３１５．１ｎｇ／ｍｌおよび５０２．８ｎｇ／ｍｌであった。
【００５８】
１．２、抗原によるマウス免疫
実施例１．１で調製したＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ｈＦｃ抗原を生理食塩水で適切な濃度に希釈した後、同量のフロイント完全アジュバントと混ぜ合わせ、超音波で完全に乳化してから４〜５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（上海霊暢バイオテック社製、動物製造許可証番号：ＳＣＸＫ（滬）２０１３−００１８）に１匹ごとに５０μｇ抗原／１００μｌ、皮下数箇所に注射した。３週間後、タンパク質とフロイント不完全アジュバントを同量で混ぜ合わせて超音波で完全に乳化し、マウス皮下の数箇所に注射して免疫を行い、２週間後に再び同じ免疫操作を繰り返した。３回目免疫が終わってから７日目にマウスから採血し、血清を分離してＥＬＩＳＡ法で血清抗体価を測定した。血清抗体価が１０００００を越えるマウスについては、抗体価を測定して１週間後に抗原タンパク質１０μｇを生理食塩水１００μＬに溶かしたものを尾静脈注射で補足免疫を行った。
【００５９】
血清抗体価は、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。具体的には、炭酸ナトリウム緩衝液（１．５９ｇのＮａ２ＣＯ３、２．９３ｇのＮａＨＣＯ３を純水１Ｌに溶かしたもの）を用いてＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ｈＦｃを１０００ｎｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μｌずつ分注した。室温で４時間インキュベートし、０．０５％のＴｗｅｅｎ-２０を含むＰＢＳＴ緩衝液（０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌおよび０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ-２０を純水１０００ｍｌに調製したもの）でプレートを洗い流した。ウェルを１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳＴでブロッキングし、ＰＢＳＴで洗い流してから段階的に希釈したマウス血清を入れて一定時間かけてインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗い、適宜希釈したＨＲＰ標識のヒツジ抗マウス二次抗体を加えて一定時間かけてインキュベートした。プレートを洗い流して着色液［基質着色液Ａ：酢酸ナトリウム３水和物１３．６ｇ、クエン酸１水和物１．６ｇ、３０％の過酸化水素水０．３ｍｌを純水５００ｍｌで調製したもの、基質着色液Ｂ：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム０．２ｇ、クエン酸１水和物０．９５ｇ、グリセリン５０ｍｌ、ＴＭＢ０．１５ｇを純水５００ｍｌで調製したもの、使用に先立って基質着色液Ａと基質着色液Ｂを１：１の体積比で混合］を入れて着色させ、終止液（２Ｍの硫酸溶液）を加えて反応を中止させた。プレートリーダーでＯＤ４５０値を測定し、測定データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で解析し、用量反応曲線を作成して血清抗体価を算出した。
【００６０】
１．３、ハイブリドーマの調製と選別
マウスに対して補足免疫を行い、３日後に脾細胞を取って融合を行った。具体的には、成長状態が良好なハイブリドーマｓｐ２／０細胞（中国科学院典型培養物保存委員会の細胞バンクより入手）を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータで培養し、融合前日に培養液を１回変えた。融合および選別は、以下のようにして行われた。マウス脾臓を取って研磨、洗浄して細胞数を計測し、脾細胞とｓｐ２／０細胞を２:１の割合で混ぜ合わせて１５００ｒｐｍ、７分間遠心した。上澄み液を取り除き、細胞を２０ｍｌの融合緩衝液（ＢＴＸ社製）で洗い、１０００ｒｐｍ、５分間遠心し、こうした洗浄処理を３回繰り返した。細胞を融合緩衝液２ｍｌに分散して密度が１×１０７個／ｍｌになるようにし、この分散液２ｍｌを取って電気細胞融合装置ＥＣＭ２００１に設置して３０秒、指定条件で（ＡＣ６０Ｖ，３０Ｓ；ＤＣ１７００Ｖ，４０μＳ，３Ｘ；ＰＯＳＴ  ＡＣ６０Ｖ，３Ｓ）細胞融合を行った。融合が終わると、ゆっくりと細胞を３７℃に予め加温し且つ１０％血清（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に移し、室温で引き続き６０分間放置した。細胞を１０４個／１００μｌ／ウェルの量で９６ウェルプレートに播種し、翌日に各ウェルに２×ＨＡＴ（Ｇｉｂｃｏ社製）および１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を１００μｌ追加補充した。融合から４日目に１×ＨＡＴおよび１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を半分変え、７日目に１×ＨＡＴおよび１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を全部新しく変えた。融合から９日目にサンプルを取ってＥＬＩＳＡで測定し、陽性ハイブリドーマを２４ウェルプレートで拡大培養し、さらに有限希釈法によってサブクローン化することで目的抗体を安定に発現するハイブリドーマ株を選別し、これらのサブクローンを拡大培養し、冷凍して保存ライブラリとした。前記ハイブリドーマ細胞株を無血清培地ＨｙｂｒｉＧＲＯ  ＳＦ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）７日間培養し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇカラムで上澄み液からマウス由来の抗ヒトＩＬ−４Ｒモノクローナル抗体を精製した。
【００６１】
ＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ｈＦｃをＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ＦＬＡＧに変えた以外、上記１．２の方法と同様にしてＥＬＩＳＡ法で測定を行った。
【００６２】
１．４、ＥＬＩＳＡ測定
ＥＬＩＳＡ法で上記マウス由来の抗ヒトＩＬ−４Ｒモノクローナル抗体とＩＬ−４Ｒ抗原の相対結合親和性を測定した。
【００６３】
炭酸ナトリウム緩衝液を用いてＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ｈＦｃを１００ｎｇ／ｍｌに希釈し、ヒトＩＬ−４Ｒに結合しないマウス由来の抗体を陰性対照物とした以外、上記１．２の方法と同様にして測定を行った。図２に示すように、ＥＣ５０値に基づき相対結合親和性の比較的高い抗体を選んで次の選別に用いた。
【００６４】
１．５、ＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する阻害効果
ＴＦ−１細胞を用いてＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する上記マウス由来の抗ヒトＩＬ−４Ｒモノクローナル抗体の阻害活性を測定した。測定は、上記１．１と同様にして行った。
【００６５】
図３に示すように、ＩＣ５０値に基づき阻害効果が比較的強いモノクローナル抗体を選んで次の実験に用いた。
【００６６】
実施例２：マウス由来の抗ヒトＩＬ−４Ｒモノクローナル抗体のヒト化
２．１、マウス由来の抗ヒトＩＬ−４Ｒモノクローナル抗体の可変領域配列の確定
実施例１の１．４及び１．５のＥＬＩＳＡ測定結果と細胞レベルの評価実験結果に基づき、クローン番号２１、３１、４０及び４−２を選出して候補抗体とした。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて上記４つのモノクローナル抗体に対応するハイブリドーマ細胞株から全ＲＮＡを抽出し、逆転写キット（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、文献記載のプライマーペア（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ  １，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒｏｌａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｆａｎ  Ｄｕｅｂｅｌ，p３２３）を用いてＰＣＲ法でマウス由来の抗ヒトＩＬ−４Ｒモノクローナル抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の遺伝子を増幅し、ＰＣＲ産物をｐＭＤ１８-Ｔベクターに導入して配列解析を行い、可変領域の遺伝子配列を確定した。各クローンの可変領域配列を対比解析したところ、４−２号抗体の配列がヒト化に適することが分かり、そこで４−２号クローンを最終の候補抗体とした。該４−２号クローンの配列としては、重鎖可変領域の遺伝子配列が全長３６０ｂｐであり、１２０個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表され、軽鎖可変領域の遺伝子配列が全長３１８ｂｐであり、１０６個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で表される。
【００６７】
２．２、マウス由来の抗ヒトＩＬ−４Ｒモノクローナル抗体のヒト化
上記軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列を解析し、ＫＡＢＡＴ法則に従って４−２号抗体の３つの抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を確定した。そのうち重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列としてＨＣＤＲ１がＤＤＹＩＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）であり、ＨＣＤＲ２がＷＩＦＰＧＮＧＮＳＹＹＮＥＫＦＫＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）であり、ＨＣＤＲ３がＧＬＶＲＹＲＡＬＦＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）であり、軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列としてＬＣＤＲ１がＲＡＳＳＳＩＮＹＭＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）であり、ＬＣＤＲ２がＡＡＳＮＬＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）であり、ＬＣＤＲ３がＱＱＷＳＳＹＰＩＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）であった。
【００６８】
ＮＣＢＩ  ＩｇＢｌａｓｔを利用してヒトＩｇＧ生殖系配列（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ）と相同性対比を行い、ＩＧＨＶ１−３＊０１を選んで重鎖ＣＤＲ移植テンプレートとし、マウス由来の４−２号抗体の重鎖ＣＤＲをＩＧＨＶ１−３＊０１のフレームワーク領域に導入することで重鎖ＣＤＲ移植抗体を形成し、同時にヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＫＶ１−１６＊０１を選んで軽鎖ＣＤＲ移植テンプレートとし、マウス由来の４−２号抗体の軽鎖ＣＤＲをＩＧＫＶ１−１６＊０１のフレームワーク領域に導入することで軽鎖のＣＤＲ移植抗体を形成し、こうして得られた抗体を４−２−Ｇｒａｆｔｅｄと定義した。さらに、一部フレームワーク領域のアミノ酸サイトに復帰変異を導入し、ここで復帰変異とは、人由来フレームワーク領域の一部アミノ酸残基をマウス由来フレームワーク領域の同一サイトのアミノ酸残基に変えることを意味する。復帰変異に際して、アミノ酸配列に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、サイトの位置をＫＡＢＡＴナンバリングで表記した。重鎖可変領域配列については、ＫＡＢＡＴナンバリングの第４８位のＭをマウス由来のＶ、第６７位のＶをＡ、第６９位のＩをＬ、第７１位のＲをＶ、第７３位のＴをＫ、第９１位のＹをＦにそれぞれ変えることが好ましく、軽鎖可変領域配列については、ＫＡＢＡＴナンバリングの第３６位のＦをＹ、第４６位のＳをＰ、第４７位のＬをＷにそれぞれ変えることが好ましい。上記可変領域遺伝子配列は、蘇州ＧＥＮＥＷＩＺ社がＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓのコドン使用好みを参考にしてコドンを最適化して合成したものであった。以上のようにして得られたヒト化重鎖可変領域配列をヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）定常領域とつなぎ、得られた遺伝子をそれぞれ４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＨＣおよび４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４−ＨＣと命名した。また、ヒト化軽鎖可変領域をヒトＫａｐｐａ鎖の定常領域とつなぎ、得られた遺伝子を４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＬＣと命名した。なお、マウス由来の重鎖可変領域配列をヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）定常領域とそれぞれつなぎ、得られた遺伝子をそれぞれ４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ１−ＨＣおよび４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ４−ＨＣと命名し、マウス由来の軽鎖可変領域とヒトＫａｐｐａ鎖の定常領域とつなぎ、得られた遺伝子を４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＬＣと命名した。
【００６９】
このように、４−２号抗体のヒト化重鎖可変領域の遺伝子配列は全長３６０ｂｐであり、１２０個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で表される。また、ヒト化軽鎖可変領域の遺伝子配列は全長３１８ｂｐであり、１０６個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で表される。ヒト化重鎖可変領域をヒトＩｇＧ１定常領域とつなぎ、４４７個のアミノ酸残基からなる４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＨＣ重鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）が得られ、ヒト化重鎖可変領域をヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）定常領域とつなぎ、４４７個のアミノ酸残基からなる４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４−ＨＣ重鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）が得られた。また、軽鎖可変領域をヒトＫａｐｐａ定常領域とつなぎ、２１３個のアミノ酸残基からなる４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＬＣ軽鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）が得られた。
【００７０】
上記抗体の軽鎖および重鎖遺伝子をｐＴＴ５発現ベクターに導入し、上記軽鎖および重鎖発現ベクターを組み合せてＨＥＫ２９３Ｅ系に一過的に導入して抗体を発現させた。ＨＥＫ２９３細胞は、Ｆｒｅｅ  Ｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地で培養し、ＰＥＩ法によってプラスミドを細胞に導入し、５日後に上澄み液を回収してＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムで抗体を精製した。４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＨＣおよび４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４−ＨＣをそれぞれ４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＬＣと組み合せて発現することにより得られた抗体を、それぞれ４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４と命名し、なお、４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ１−ＨＣを４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＬＣと組み合せて発現することにより得られた抗体を、４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ１と命名した。
【００７１】
実施例３：キメラ抗体４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ１およびヒト化抗体４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１の生体活性評価
３．１、ＥＬＩＳＡ法による測定
本実施例では、ＥＬＩＳＡ法を利用して４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ１および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１とＩＬ−４Ｒ抗原の相対結合親和性を測定した。具体的には、ＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ｈＦｃをＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ＦＬＡＧ（炭酸ナトリウム緩衝液でＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ＦＬＡＧを１００ｎｇ／ｍｌに希釈したもの）に変え、かつＨＲＰ標識のヒツジ抗マウス二次抗体をＨＲＰ標識のヒツジ抗二次抗体に変え、ヒトＩＬ−４Ｒに結合しないヒト化抗体を陰性対照物とした以外、実施例１の１．２と同様にして測定した。
【００７２】
図４に示すように、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ１およびデュピルマブは、何れも抗原ＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ＦＬＡＧに効率よく結合することができ、ＥＣ５０がそれぞれ１２．３９ｎｇ／ｍｌ、１１．８１ｎｇ／ｍｌおよび１２．５２ｎｇ／ｍｌであった。
【００７３】
３．２、ＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する阻害効果
ＴＦ−１細胞を用い、ＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ１および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１の阻害活性を測定した。  測定は、ＩＬ−４を含まないがヒトＩＬ−４Ｒに結合しない抗体を含むものを陰性対照物とし、ＩＬ−４を含み且つヒトＩＬ−４Ｒに結合しない抗体を含むものを陽性対照物とした以外、実施例１の１．１と同様であった。
【００７４】
図５に示すように、デュピルマブ、４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ１および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１は、何れもＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖を効果的に抑制することができ、ＩＣ５０がそれぞれ２８９．４ｎｇ／ｍｌ、２２５．２ｎｇ／ｍｌおよび２０７．４ｎｇ／ｍｌであった。
【００７５】
３．３、ＩＬ−１３が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する阻害効果
ＴＦ−１細胞を用い、ＩＬ−１３が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ１および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１の阻害活性を測定した。
【００７６】
具体的には、ＩＬ−４をＩＬ−１３に変え、ＩＬ−１３を含まないがヒトＩＬ−４Ｒに結合しない抗体を含むものを陰性対照物とし、ＩＬ−１３を含み且つヒトＩＬ−４Ｒに結合しない抗体を含むものを陽性対照物とした以外、実施例１の１．１と同様であった。
【００７７】
図６に示すように、デュピルマブ、４−２−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＩｇＧ１および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１は、何れもＩＬ−１３が誘導するＴＦ−１細胞増殖を効果的に抑制することができ、ＩＣ５０がそれぞれ７３．８ｎｇ／ｍｌ、８１．６ｎｇ／ｍｌおよび３４．３ｎｇ／ｍｌであった。
【００７８】
実施例４：ヒト化抗体４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４の生体活性評価
４．１、ＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する阻害効果
ＴＦ−１細胞検出するヒト化抗体４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４対ＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する阻害活性を測定した。具体的には、ＩＬ−４を含まないがヒトＩＬ−４Ｒに結合しない抗体を含むもの陰性対照物とし、ＩＬ−４を含み且つヒトＩＬ−４Ｒに結合しない抗体を含むものを陽性対照物とした以外、実施例１の１．１と同様であった。
【００７９】
図７−１に１回目の実験結果が示され、デュピルマブ、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４によってＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖が抑制されるときのＩＣ５０がそれぞれ８４１．６ｎｇ／ｍｌ、５６０．６ｎｇ／ｍｌおよび１２９１ｎｇ／ｍｌであった。図７−２に２回目の重複実験結果が示され、デュピルマブ、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４によってＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖が抑制されるときのＩＣ５０がそれぞれ６１６．１ｎｇ／ｍｌ、４２６．９ｎｇ／ｍｌおよび１１１３ｎｇ／ｍｌであった。図７−３に３回目の重複実験結果が示され、デュピルマブ、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４によってＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖が抑制されるときのＩＣ５０がそれぞれ６８７．１ｎｇ／ｍｌ、５２０．４ｎｇ／ｍｌおよび１１４５ｎｇ／ｍｌであった。
【００８０】
３回独立して行われた重複実験から、生体活性が高い順で４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１＞デュピルマブ＞４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４であることが確認できた。３回の実験結果を統計学的に分析したところ、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１とデュピルマブの間に有意差があり（Ｐ＝０．０２６＜０．０５、統計法はＴ−ｔｅｓｔであり、Ｐ＜０．０５である場合に統計学的に有意差があると認められる）、生体活性において４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１がデュピルマブを上回ることが確認できた。
【００８１】
４．２、Ｂｉａｃｏｒｅ測定
４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４とＩＬ−４Ｒとの親合力については、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて測定した。
【００８２】
具体的には、Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に含まれる活性化試薬ＥＤＣ／ＮＨＳおよびブロッキング試薬Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを用い、捕捉分子であるＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇを共有結合を介してチップ表面に結合させた。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、ＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇが結合したＣＭ５チップを利用してＩＬ−４Ｒ抗体を捕捉し、さらにＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ＦＬＡＧを注入して結合―解離曲線を作成した。６Ｍの塩酸グアニジニウムからなる再生化緩衝液で洗ってからサイクリングをもう１回繰り返し、最後にＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてデータ解析を行った。下記表１に、測定結果を示す。
【００８３】
【表１】
2021519605.tif 000002
【００８４】
実験結果から、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４およびデュピルマブは、ＩＬ−４Ｒに対する親合力がそれぞれ７．１７Ｅ−１０、６．９２Ｅ−１０および６．７１Ｅ−１０と同等のレベルにあり、且つ４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４がデュピルマブに比べてより迅速にＩＬ−４Ｒに結合できることが確認できた。
【００８５】
実施例５：ヒト化抗ヒトＩＬ−４Ｒ抗体のＳＥＬＦ変異体の調製
実施例の４の４．１の実験結果が示すように、ＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する阻害活性では４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１に比べて４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４のほうがやや弱く、また、実施例の４の４．２でＢｉａｃｏｒｅを用いる親合力測定の結果が示すように、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４のＩＬ−４Ｒに対する親合力がほぼ同じであることから、上述のＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する阻害活性差が親合力と緊密な相関性がないのが分かり、実施例の４の４．１の実験で４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  −ＩｇＧ１と４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４との活性差が恐らく抗体Ｆｃフラグメントの差異によるものと考えられる。
【００８６】
Ｘｅｎｃｏｒ社が提出した米国特許出願公開第２００９０１３６４８５Ａ１号の記載によれば、抗体のＦｃフラグメント定常領域に変異としてＳ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ（つまり、第２６７位のＳをＥ、第３２８位のＬをＦに変える）を導入するとき、ＦｃフラグメントとＣＤ３２分子（Ｆｃ受容体分子の１つである）との相互作用を約４００倍高めることができる（Ｃｈｕ  Ｓ  Ｙ，Ｖｏｓｔｉａｒ  Ｉ，Ｋａｒｋｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｏｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＤ１９  ａｎｄ  ＦｃγＲＩＩｂ  ｗｉｔｈ  Ｆｃ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８，４５（１５）：３９２６−３９３３．）。本発明においても変異としてＳ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆを４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＨＣのＦｃフラグメントコーディング領域に導入し、これらの変異を導入した抗体重鎖遺伝子を４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＨＣ−ＳＥＬＦと名づけた。そして、実施例１の１．１および実施例２の２．２と同様にして、該重鎖遺伝子と４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＬＣを組合わせてＨＥＫ２９３Ｅ細胞で発現させて精製した。このようにして得られた抗体変異体を、それぞれ４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦと定義した。本実施例において、抗体配列のアミノ酸位置はＥｕコーディング法を採用し、具体的にはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌを参照することができ、そのうち４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦ抗体重鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で表される。
【００８７】
実施例６：ヒト化抗ヒトＩＬ−４Ｒ抗体のＳＥＬＦ変異体及び非ＳＥＬＦ変異体の生体活性評価
６．１、ＩＬ−４とＩＬ−４Ｒ相互作用に対する阻害活性
ＥＬＩＳＡ法を利用して、ＩＬ−４とＩＬ−４Ｒの相互作用に対する４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦの阻害活性を測定した。
【００８８】
ヒトＩＬ−４配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇに登録された配列を使い、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０で表される。該アミノ酸配列については、コドンを最適化した後、全遺伝子を合成して原核クローニングベクターに導入した。組換えＰＣＲ法を利用して、ヒトＩＬ−４コーディング領域の末端に１つのｈＦｃ（ＩｇＧ１）タグを添加し、遺伝子を構築してｐＴＴ５一過性発現ベクターに導入した。標準操作手順に従って上記ベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地で培養し、５日後に上澄み液から発現したＩＬ−４−ｈＦｃを精製した。上記抗原をｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを用いてそれぞれ精製し、精製済みのＩＬ−４−ｈＦｃを測定阻害用のリガンドとした。ＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ｈＦｃについては透析して濃度を確定した後、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ社製、カタログ番号：Ｈ１７５９−１００ＭＧ）でビオチン化することにより標識した。
【００８９】
炭酸ナトリウム緩衝液を用いてＩＬ−４−ｈＦｃを２０００ｎｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μｌずつ加え、室温で４時間インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むリン酸塩緩衝液（ＰＢＳＴ）でプレートを洗い流し、各ウェルに１％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳＴを加えてブローキングし、ＰＢＳＴでプレートを洗い流した。ＰＢＳＴでビオチン化ＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ｈＦｃを終濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなるように希釈し、この溶液で測定用抗体を適宜希釈し、９６ウェルプレートにおいて希釈して濃度勾配を形成し、希釈済の抗体を、上記ＩＬ−４−ｈＦｃでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで洗い流し、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴでＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを１：１０００の比で希釈して１ウェル当たり１００μｌずつ加え、３７℃、３０分間インキュベートした。着色液（ＴＭＢ基質溶液）を１ウェル当たり１００μｌずつ加え、室温で１〜５分間程度インキュベートした後、各ウェルに終止液を５０μｌずつ加えて着色反応を停止させた。プレートリーダーでＯＤ４５０値を測定し、測定データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で解析し、用量反応曲線を作成してＩＣ５０を算出した。そのうち、ヒトＩＬ−４Ｒに結合しないヒト化抗体を陰性対照物とした。
【００９０】
図８に示すように、デュピルマブ、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦは、何れもＩＬ−４とＩＬ−４Ｒの相互作用を効果的に阻害することができ、ＩＣ５０がそれぞれ１３７．９ｎｇ／ｍｌ、１４０．３ｎｇ／ｍｌ、１３８．３ｎｇ／ｍｌおよび１４４．１ｎｇ／ｍｌであった。以上のことから、ＩＬ−４とＩＬ−４Ｒの相互作用に対する阻害活性からしてデュピルマブ、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦがほぼ同じレベルにあり、明らかな差がないのが確認できた。
【００９１】
６．２、ＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する阻害効果
ＴＦ−１細胞を用い、ＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖に対する４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦの阻害活性を測定した。このとき、ＩＬ−４を含まないがヒトＩＬ−４Ｒに結合しない抗体を含むものを陰性対照物とし、ＩＬ−４およびヒトＩＬ−４Ｒに結合しない抗体を含むものを陽性対照物とした以外、実施例１の１．１と同様にして測定を行った。
【００９２】
図９に示すように、デュピルマブ、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦは、ＩＬ−４が誘導するＴＦ−１細胞増殖を抑制するときのＩＣ５０がそれぞれ１００８ｎｇ／ｍｌ、６６７．７ｎｇ／ｍｌ、２７８２ｎｇ／ｍｌおよび２９１．９ｎｇ／ｍｌであり、阻害活性が高い順からして４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦ＞４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１＞デュピルマブ＞４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４であった。
【００９３】
６．３、ＩＬ−４が誘導するＰＢＭＣのＣＤ２３発現に対する阻害効果
ＩＬ−４は、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のＣＤ２３発現を誘導することができ、ＣＤ２３は、アレルギー反応と関連性を示す低結合性のＩｇＥ受容体である。ここで、ＰＢＭＣを用い、ＩＬ−４が誘導するＰＢＭＣＣＤ２３発現に対する４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦの阻害活性を測定した。
【００９４】
Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅを用いてヒト全血からＰＢＭＣを分離し、細胞数を計測してからＲＭＰＩ−１６４０完全培地（１０％のウシ胎児血清を含む）で丸底の９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに２×１０５個細胞、１５０μｌずつ播種した。ＩＬ−４をＲＭＰＩ−１６４０で８０ｎｇ／ｍｌに希釈し、こうして得られた培地を用いて抗ＩＬ−４Ｒ抗体を希釈して濃度勾配を形成した。上記９６ウェルプレートにＲＰＭＩ−１６４０で濃度勾配に希釈した抗ＩＬ−４Ｒ抗体とＩＬ−４の混合液を５０μｌ加え、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに置いて２日間インキュベートした。２日後、ＰＥ標識のマウス抗ヒトＣＤ２３抗体で上記細胞を染色し、染色後に４％のパラホルムアルデヒドを加えて固定した。３００ｇで遠心し、洗浄を行ってからフローサイトメータ（ＣｙｔｏＦＬＥＸ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）でＰＥチャネルの蛍光強度を測定し、ＦＣＳ／ＳＳＣ又はＣＤ１４蛍光強度を利用して単核球を確定した。フローサイトメータ付属のソフトで実験データを処理して平均蛍光強度を算出し、測定データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で解析し、用量反応曲線を作成してＩＣ５０を算出した。
【００９５】
図１０−１に、１回目実験の結果を示す。図１０−１に示すように、デュピルマブ、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦは、何れもＩＬ−４が誘導するＰＢＭＣのＣＤ２３発現を効果的に抑制することができ、ＩＣ５０がそれぞれ９０．９１ｎｇ／ｍｌ、２９．３８ｎｇ／ｍｌ、２３２．１ｎｇ／ｍｌおよび７．４０４ｎｇ／ｍｌであった。図１０−２に、２回目重複実験の結果を示す。図１０−２に示すように、ＩＬ−４が誘導するＰＢＭＣのＣＤ２３発現に対するデュピルマブ、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦのＩＣ５０がそれぞれ２０．６５ｎｇ／ｍｌ、３．５６ｎｇ／ｍｌ、３４．００ｎｇ／ｍｌおよび０．４９ｎｇ／ｍｌであった。２回にわたって独立して行った重複実験から、生体活性が高い順で４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦ＞４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１＞デュピルマブ＞４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４であることが確認でき、そのうち２回実験で使った血液は異なるドナーから集めたものであった。
【００９６】
上述の実験結果を検証するため、さらにＨｉｓｔｏｐａｑｕｅを用いて６名の異なるドナーの血液からＰＢＭＣを分離し、細胞数を計測してからＲＭＰＩ−１６４０完全培地で丸底の９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに２×１０５個細胞ずつ播種した。そして、抗ＩＬ−４Ｒ抗体（終濃度が２５ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（終濃度が２０ｎｇ／ｍｌ）を加え、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに置いて２日間インキュベートした。２日後、上記実験方法に従ってフローサイトメータでＣＤ２３の発現状況を確認した。そのうち、陰性対照物としてＩＬ−４を含まないがヒトＩＬ−４Ｒに結合しない抗体を含むものを使い、陽性対照物としてＩＬ−４を含み且つヒトＩＬ−４Ｒに結合しない抗体を含むものを使った。図１０−３に実験結果を示す。図１０−３に示すように、４−２抗体の生体活性は高い順で４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦ＞４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１＞４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４であり、統計学的に有意差があった（統計法はＴ−ｔｅｓｔであり、Ｐ＜０．０５の場合、統計学的に有意差があると見なされる）。
【００９７】
６．４、ＩＬ−４が誘導するＰＢＭＣのＩｇＥ分泌に対する阻害効果
ＩＬ−４は、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のＩｇＥ分泌を誘導することができ、ＩｇＥ分子はアレルギー反応と緊密な関連性を示す。本実験では、ＰＢＭＣを用いてＩＬ−４が誘導するＰＢＭＣのＩｇＥ分泌に対する４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦの阻害効果を評価した。
【００９８】
Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅを用いてヒト全血からＰＢＭＣを分離し、細胞数を計測してからＲＭＰＩ−１６４０完全培地（１０％のウシ胎児血清を含む）で丸底の９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに２×１０５個細胞、１５０μｌずつ播種した。ＩＬ−４をＲＭＰＩ−１６４０で８０ｎｇ／ｍｌに希釈し、同時にデキサメタゾンを加えて終濃度が４００ｎｇ／ｍｌになるようにし、こうして得られた培地でＩＬ−４Ｒ抗体を希釈して濃度勾配を形成した。上記９６ウェルプレートに、ＲＰＭＩ−１６４０で濃度勾配を形成した抗ＩＬ−４Ｒ抗体、ＩＬ−４とデキサメタゾンノの混合溶液を５０μｌ加え、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータに置いて１４日間インキュベートした。１４日後、上澄み液を取って抗ヒトＩｇＥ抗体を捕捉抗体とし、ビオチン標識の抗ヒトＩｇＥ抗体を検出抗体とし、二重抗体サンドイッチ法を利用して上澄み液におけるＩｇＥ分泌量を測定した。測定データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で整理解析し、用量反応曲線を作成してＩＣ５０を算出した。
【００９９】
図１１−１に、１回目実験の結果を示す。図１１−１に示すように、デュピルマブ、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦは、何れもＩＬ−４が誘導するＰＢＭＣのＩｇＥ分泌を効果的に抑制することができ、ＩＣ５０がそれぞれ９９５．７ｎｇ／ｍｌ、４４８．０ｎｇ／ｍｌ、１９５３ｎｇ／ｍｌおよび５０．８５ｎｇ／ｍｌであった。図１１−２に、２回目重複実験の結果を示す。図１１−２に示すように、ＩＬ−４が誘導するＰＢＭＣのＩｇＥ分泌に対するデュピルマブ、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４および４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦのＩＣ５０がそれぞれ１８９．４ｎｇ／ｍｌ、６１．３４ｎｇ／ｍｌ、４１２．９ｎｇ／ｍｌおよび２６．６１ｎｇ／ｍｌであった。２回にわたって独立して行った重複実験から、活性が高い順で４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１−ＳＥＬＦ＞４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ１＞デュピルマブ＞４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４であることが確認でき、そのうち２回実験で使った血液は異なるドナーから集めたものであった。
【０１００】
実施例７：ヒト化抗ヒトＩＬ−４Ｒ抗体の薬物動態
本実施例では、ラットを動物モデルとし、本発明に係る４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４を静脈注射（Ｉ．Ｖ．）にて投与する際の薬物動態を検討した。
【０１０１】
具体的には、体重約２００ｇのラット４匹を１組とし、ラットに抗ＩＬ−４Ｒ抗体を静脈注射にて１ｍｇ投与した。投与後の所定時間で眼窩採血を行い、血液が自然に凝固してから遠心して血清を回収した。血清中の抗体濃度は、以下の通りにして測定した。ＥＬＩＳＡプレートを、濃度が１００ｎｇ／ｍｌ、１ウェル当たり１００μｌのＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ＦＬＡＧでコーティングし、そして１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴでブローキングした。適宜希釈したラット血清を加え、一定時間かけてインキュベートした後、プレートを洗い流してＨＲＰ標識のヒツジ抗ヒト二次抗体（Ｓｉｇｍａ社製、該抗体は種交差性を考慮して吸着処理を行い、ラット由来の抗体に結合しないものである）を加え、さらに一定時間かけてインキュベートした。プレートを洗い流し、着色液を加えて反応させ、終止液を加えて反応を終止させてＯＤ４５０を測定した。標準検量線を用いてＯＤ４５０を抗体濃度に変換し、測定データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で整理解析し、Ｐｈｏｅｎｉｘソフトでラット体内における抗体薬物の半衰期を算出した。
【０１０２】
図１２に示すように、静脈注射後の薬物動態実験結果から、４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４抗体は、ラット体内において陽性対照物であるデュピルマブ並みの半衰期を有し、各自の半衰期がそれぞれ２８２．４時間、２８１．６時間であることが確認できた。
【０１０３】
実施例８：ヒト化抗ヒトＩＬ−４Ｒ抗体のエピトープ解析
文献報道［Ｚｈａｎｇ  Ｊ  Ｌ，Ｓｉｍｅｏｎｏｗａ  Ｉ，Ｗａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−４  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α  ｃｈａｉｎ  ｉｓ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｂｙ  ｔｗｏ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ［Ｊ］．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，３１５（３）：３９９−４０７．］によれば、ＩＬ−４Ｒαの細胞外領域（アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表される）においてＩＬ−４結合に重要であるアミノ酸残基としては、Ｆ１３、Ｍ１４、Ｓ１５、Ｌ３９、Ｆ４１、Ｌ４２、Ｌ４３、Ｄ６６、Ｄ６７、Ｖ６８、Ｄ６９、Ｓ７０、Ｄ７２、Ｎ７３、Ｙ７４、Ｋ９１、Ｐ９２、Ｓ９３、Ｅ９４、Ｄ１２５、Ｎ１２６、Ｙ１２７、Ｌ１２８、Ｙ１２９およびＹ１８３である。本実施例では、部位特異的変異法を利用して上記アミノ酸残基をそれぞれアラニンに変え、一連のＩＬ−４Ｒα変異体を構築した。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞で上記ＩＬ−４Ｒα変異体をそれぞれ発現し、ニッケルカラムで変異体を精製し、得られたＩＬ−４Ｒα変異体を用い、１ウェル当たり１０ｎｇの量でプレートをコーティングした。そして、ＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−ｈＦｃを上記ＩＬ−４Ｒα変異体に変え、かつＨＲＰ標識のヒツジ抗マウス二次抗体をＨＲＰ標識のヒツジ抗ヒト二次抗体に変えた以外、実施例１の１．２と同様にＥＬＩＳＡ法を利用して各ＩＬ−４Ｒα変異体二対する４−２−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ＩｇＧ４  （４−２−Ｈｕ−ＩｇＧ４）およびデュピルマブの結合強度を測定した。測定結果は、下記表２に示す。
【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
表２において、「＋」とは抗体と変異体の結合が著しく低下し、野生型ＩＬ−４Ｒαの場合に比べてＥＣ５０の上昇が３倍以上越えること意味し、「−」とは抗体と変異体の結合が顕著な変化を示さず、野生型ＩＬ−４Ｒαの場合に比べてＥＣ５０の上昇が３倍未満であることを意味する。
【０１０６】
以上の実験結果から、３つのＩＬ−４Ｒα変異体Ｌ３９Ａ、Ｄ７２ＡおよびＹ７４Ａに対して４−２−Ｈｕ−ＩｇＧ４及びデュピルマブの結合が著しくて低下し、アミノ酸残基Ｌ３９、Ｄ７２及びＹ７４が４−２−Ｈｕ−ＩｇＧ４、デュピルマブとＩＬ−４Ｒαとの結合に必須であることが確認できた。また、４−２−Ｈｕ−ＩｇＧ４の場合、３つのＩＬ−４Ｒα変異体Ｆ４１Ａ、Ｌ４２ＡおよびＬ４３Ａに対する結合が著しくて低下するが、デュピルマブの場合、ＩＬ−４Ｒα変異体に対する結合が顕著な変化を示さないため、３つのアミノ酸残基Ｆ４１、Ｌ４２およびＬ４３が４−２−Ｈｕ−ＩｇＧ４とＩＬ−４Ｒαとの結合に必須であり、デュピルマブとＩＬ−４Ｒαとの結合に必須でないことが確認できた。上記結果から、４−２−Ｈｕ−ＩｇＧ４とデュピルマブは、異なるエピトープでＩＬ−４Ｒαに結合することが実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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