(57)【要約】  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を用いて標的細菌を死滅させるための方法および組成物が本明細書で提供される。操作されたバクテリオファージも開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細菌を死滅させるための方法であって、前記方法は：
（ａ）スペーサー配列またはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸であって、ここで、前記スペーサー配列は、前記標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である、第１の核酸と；
（ｂ）標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする第２の核酸と；
を含むバクテリオファージを、標的細菌に導入する工程を含み：
ここで、前記標的細菌は、前記スペーサー配列あるいはそれから転写された前記ｃｒＲＮＡを使用して、前記バクテリオファージの溶菌活性またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性によって死滅される、
方法。
【請求項２】
第１の核酸配列は、少なくとも１つの反復配列をさらに含むＣＲＩＳＰＲアレイである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記転写活性化因子は前記標的細菌に内因性である、請求項１−２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４】
前記転写活性化因子は前記標的細菌に外因性である、請求項１−２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
前記転写活性化因子はクオラムセンシング（ＱＳ）シグナルによって調節される、請求項２−４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
前記転写活性化因子は細菌膜のストレスの感知に関与するタンパク質である、請求項２−４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記転写活性化因子はＣｐｆ１を安定化するタンパク質である、請求項２−４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
前記転写活性化因子は代謝感知タンパク質である、請求項２−４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
前記代謝感知タンパク質はσ因子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記転写活性化因子は阻害要素の活性を妨害する、請求項２−４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記阻害要素は転写リプレッサーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記転写リプレッサーは全体的な転写リプレッサーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は前記標的細菌に内因性である、請求項１−１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は前記標的細菌に外因性である、請求項１−１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
前記標的ヌクレオチド配列は、前記標的遺伝子のためのプロモーター配列のすべてまたは一部を含む、請求項１−１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
前記標的ヌクレオチド配列は、前記標的遺伝子の転写領域のコード鎖上にあるヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む、請求項１−１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記標的ヌクレオチド配列は、前記標的細菌の生存に必要とされる必須遺伝子の少なくとも一部分である、請求項１−１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
前記必須遺伝子は、ｙｆａＰ、ｓｐｅＡ、ｆｔｓＺ、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、またはｎｕｓＧである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの反復配列は、その５’末端またはその３’末端のいずれかにおいて、少なくとも１つの前記スペーサー配列に作動可能に連結される、請求項２−１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
前記標的細菌は前記バクテリオファージの溶菌活性のみによって死滅される、請求項１−１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
前記標的細菌は前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性のみによって死滅される、請求項１−１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２２】
前記標的細菌は、前記バクテリオファージの溶菌活性と前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性の両方の組み合わせによって死滅される、請求項１−１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
前記標的細菌は、前記バクテリオファージの溶菌活性とは無関係に、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性によって死滅される、請求項１−１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性は、前記バクテリオファージの溶菌活性を補足または増強する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
スペーサーヌクレオチド配列は第２のスペーサー配列と重複する、請求項１−２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２６】
前記バクテリオファージの溶菌活性および前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性は相乗的である、請求項１−２５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
前記バクテリオファージの溶菌活性、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性、またはその両方は、前記バクテリオファージの濃度によって調節される、請求項１−２６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２８】
前記バクテリオファージは複数のバクテリア菌株に感染する、請求項１−２７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
前記バクテリオファージは偏性溶菌性バクテリオファージである、請求項１−２８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３０】
前記バクテリオファージは、溶菌性にされるテンペレートバクテリオファージである、請求項１−２８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１】
前記バクテリオファージは、前記バクテリオファージの溶菌活性および／または前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１アレイの活性によって引き起こされた細胞死を超えて、前記標的細菌に新しい特性を与えない、請求項１−３０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
前記標的細菌は、大腸菌、肺炎杆菌、サルモネラ菌、または志賀赤痢菌である、請求項１−３１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３３】
スペーサー配列またはｃｒＲＮＡをコードする前記第１の核酸は、非必須バクテリオファージ遺伝子に挿入される、請求項１−３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３４】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ４９である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ７５である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｈｏｃである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記バクテリオファージは、Ｇａｍタンパク質をコードする第３の核酸をさらに含む、請求項１−３８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４０】
バクテリオファージであって、前記バクテリオファージは：
（ａ）スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸であって、ここで、前記スペーサー配列は、標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である、第１の核酸と；
（ｂ）標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする第２の核酸と、を含み、
ここで、前記標的細菌は、前記スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡを使用して、前記バクテリオファージの溶菌活性またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性によって死滅される、
バクテリオファージ。
【請求項４１】
前記転写活性化因子はクオラムセンシング（ＱＳ）シグナルによって調節される、請求項４０に記載のバクテリオファージ。
【請求項４２】
前記転写活性化因子は細菌膜のストレスの感知に関与するタンパク質である、請求項４０に記載のバクテリオファージ。
【請求項４３】
前記転写活性化因子はＣｐｆ１を安定化するタンパク質である、請求項４０に記載のバクテリオファージ。
【請求項４４】
前記転写活性化因子は代謝感知タンパク質である、請求項４０に記載のバクテリオファージ。
【請求項４５】
前記代謝感知タンパク質はσ因子である、請求項４４に記載のバクテリオファージ。
【請求項４６】
前記転写活性化因子は、前記標的細菌の阻害要素の活性を妨害する、請求項４０に記載のバクテリオファージ。
【請求項４７】
前記阻害要素は転写リプレッサーである、請求項４６に記載のバクテリオファージ。
【請求項４８】
前記転写リプレッサーは全体的な転写リプレッサーである、請求項４７に記載のバクテリオファージ。
【請求項４９】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は前記標的細菌に内因性である、請求項４０−４８のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項５０】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は前記標的細菌に外因性である、請求項４０−４８のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項５１】
前記標的ヌクレオチド配列は、前記標的遺伝子のためのプロモーター配列のすべてまたは一部を含む、請求項４０−５０のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項５２】
前記標的ヌクレオチド配列は、前記標的遺伝子の転写領域のコード鎖上にあるヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む、請求項４０−５１のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項５３】
前記標的ヌクレオチド配列は必須である、請求項４０−５２のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項５４】
必須遺伝子は、ｙｆａＰ、ｓｐｅＡ、ｆｔｓＺ、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、またはｎｕｓＧである、請求項５３に記載のバクテリオファージ。
【請求項５５】
前記標的ヌクレオチド配列は非必須遺伝子である、請求項４０−５２のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項５６】
第１の核酸配列は、少なくとも１つの反復配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイである、請求項４０−５５のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項５７】
前記少なくとも１つの反復配列は、その５’末端またはその３’末端のいずれかにおいて、前記スペーサー配列に作動可能に連結される、請求項５６に記載のバクテリオファージ。
【請求項５８】
前記バクテリオファージは複数のバクテリア菌株に感染する、請求項４０−５７のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項５９】
前記バクテリオファージは偏性溶菌性バクテリオファージである、請求項４０−５８のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項６０】
前記バクテリオファージは、溶菌性にされるテンペレートバクテリオファージである、請求項４０−５８のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項６１】
前記テンペレートバクテリオファージは、１つ以上の溶原性遺伝子の除去、置換、または不活性化によって溶菌性にされる、請求項６０に記載のバクテリオファージ。
【請求項６２】
前記標的細菌は、大腸菌、肺炎杆菌、サルモネラ菌、または志賀赤痢菌である、請求項４０−６１のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項６３】
スペーサー配列またはｃｒＲＮＡをコードする前記第１の核酸は、非必須バクテリオファージ遺伝子に挿入される、請求項４０−６２のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項６４】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ４９である、請求項４０−６３のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項６５】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ７５である、請求項４０−６３のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項６６】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｈｏｃである、請求項４０−６３のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項６７】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である、請求項４０−６３のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項６８】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である、請求項４０−６３のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項６９】
Ｇａｍタンパク質をコードする第３の核酸をさらに含む請求項４０−６８のいずれか１つのバクテリオファージ。
【請求項７０】
細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性を調節するための方法であって、前記方法は：
標的細菌中の前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする核酸を含む、バクテリオファージを導入する工程を含む、
方法。
【請求項７１】
前記転写活性化因子はクオラムセンシング（ＱＳ）シグナルによって調節される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記転写活性化因子は、細菌膜へのストレスの感知に関与するタンパク質である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記転写活性化因子はＣｐｆ１を安定化するタンパク質である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記転写活性化因子は代謝感知タンパク質である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記代謝感知タンパク質はσ因子である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記転写活性化因子は阻害要素の活性を妨害する、請求項７０−７５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７７】
前記阻害要素は転写リプレッサーである、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記転写リプレッサーは全体的な転写リプレッサーである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は前記標的細菌に内因性である、請求項７０−７８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８０】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は前記標的細菌に外因性である、請求項７０−７８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８１】
前記バクテリオファージは複数のバクテリア菌株に感染する、請求項７０−８０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８２】
前記バクテリオファージは偏性溶菌性バクテリオファージである、請求項７０−８１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８３】
前記バクテリオファージは、溶菌性にされるテンペレートバクテリオファージである、請求項７０−８２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８４】
前記標的細菌は、大腸菌、肺炎杆菌、サルモネラ菌、または志賀赤痢菌である、請求項７０−８３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８５】
転写活性化因子をコードする前記核酸は、非必須バクテリオファージ遺伝子に挿入される、請求項７０−８４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８６】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ４９である、請求項７０−８５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８７】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ７５である、請求項７０−８５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８８】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｈｏｃである、請求項７０−８５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８９】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である、請求項７０−８５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９０】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である、請求項７０−８５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９１】
前記バクテリオファージは、Ｇａｍタンパク質をコードする第２の核酸をさらに含む、請求項７０−９０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９２】
標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする核酸を含む、バクテリオファージ。
【請求項９３】
前記転写活性化因子はクオラムセンシング（ＱＳ）シグナルによって調節される、請求項９２に記載のバクテリオファージ。
【請求項９４】
前記転写活性化因子は、細菌膜へのストレスの感知に関与するタンパク質である、請求項９２に記載のバクテリオファージ。
【請求項９５】
前記転写活性化因子はＣｐｆ１を安定化するタンパク質である、請求項９２に記載のバクテリオファージ。
【請求項９６】
前記転写活性化因子は代謝感知タンパク質である、請求項９２に記載のバクテリオファージ。
【請求項９７】
前記代謝感知タンパク質はσ因子である、請求項９３に記載のバクテリオファージ。
【請求項９８】
前記転写活性化因子は阻害要素の活性を妨害する、請求項９２−９７のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項９９】
前記阻害要素は転写リプレッサーである、請求項９８に記載のバクテリオファージ。
【請求項１００】
前記転写リプレッサーは全体的な転写リプレッサーである、請求項９９に記載のバクテリオファージ。
【請求項１０１】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は前記標的細菌に内因性である、請求項９２−１００のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１０２】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は前記標的細菌に外因性である、請求項９２−１００のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１０３】
前記バクテリオファージは複数のバクテリア菌株に感染する、請求項９２−１０２のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１０４】
前記バクテリオファージは偏性溶菌性バクテリオファージである、請求項９２−１０３のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１０５】
前記バクテリオファージは、溶菌性にされるテンペレートバクテリオファージである、請求項９２−１０３のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１０６】
前記標的細菌は、大腸菌、肺炎杆菌、サルモネラ菌、または志賀赤痢菌である、請求項９２−１０５のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１０７】
転写活性化因子をコードする前記核酸は、非必須バクテリオファージ遺伝子に挿入される、請求項９２−１０６のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１０８】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ４９である、請求項９２−１０７のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１０９】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ７５である、請求項９２−１０７のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１１０】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｈｏｃである、請求項９２−１０７のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１１１】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である、請求項３９−１０７のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１１２】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である、請求項３９−１０７のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１１３】
Ｇａｍタンパク質をコードする第２の核酸をさらに含む、請求項９２−１１２のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１１４】
標的細菌を死滅させる方法であって、前記方法は：
（ａ）溶菌活性と、
（ｂ）抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、
を含むバクテリオファージを、標的細菌に導入する工程を含み、
ここで、前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、前記バクテリオファージの前記溶菌活性を増強する、
方法。
【請求項１１５】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、遺伝子調節干渉を含むプロセスを使用して、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ヌクレアーゼ動員干渉を含むプロセスを使用して、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する、請求項１１５−１１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１８】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、短縮タンパク質、融合タンパク質、二量体タンパク質、または変異タンパク質である、請求項１１４−１１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１９】
前記バクテリオファージは、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする第２の核酸をさらに含む、請求項１１４−１１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２０】
前記ＣＲＩＳＰＲアレイは、前記標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である、少なくとも１つの反復配列および少なくとも１つのスペーサー配列を含む、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
バクテリオファージであって、前記バクテリオファージは：
（ａ）溶菌活性と、
（ｂ）抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、を含み、
ここで、前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、前記バクテリオファージの前記溶菌活性を増強する、
バクテリオファージ。
【請求項１２２】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する、請求項１２１に記載のバクテリオファージ。
【請求項１２３】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、遺伝子調節干渉を含むプロセスを使用して、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する、請求項１２２に記載のバクテリオファージ。
【請求項１２４】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ヌクレアーゼ動員干渉を含むプロセスを使用して、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する、請求項１１２または１２３に記載のバクテリオファージ。
【請求項１２５】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、短縮タンパク質、融合タンパク質、二量体タンパク質、または変異タンパク質である、請求項１２１−１２４のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１２６】
前記バクテリオファージは、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする第２の核酸をさらに含む、請求項１２１−１２４のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１２７】
前記ＣＲＩＳＰＲアレイは、前記標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である、少なくとも１つの反復配列および少なくとも１つのスペーサー配列を含む、請求項１２６に記載のバクテリオファージ。
【請求項１２８】
請求項４０−６９、９２−１１３、または１２１−１２７のいずれか１つに記載のバクテリオファージを被験体に投与する工程を含む、前記被験体の疾患を処置する方法。
【請求項１２９】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記疾患は細菌感染症である、請求項１２８−１２９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３１】
前記細菌感染症を引き起こす細菌は、アシネトバクター属、アクチノミセス属、バークホルデリア属、カンピロバクター属、カンジダ属、クロストリジウム属、コリネバクテリア属、コクシジオイデス属、クリプトコックス属、エンテロコッカス属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｃａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ属、ヘリコバクター属、クレブシェラ属、モラクセラ属、マイコバクテリウム属、ナイセリア属、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、シュードモナス属、サルモネラ属、セラチア属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、またはビブリオ属の細菌である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記細菌感染症を引き起こす細菌は、バークホリデリア・セパシア、クロストリジウム・ディフィシル、コリネバクテリウム・ミヌティシマム、偽ジフテリア菌、コリネバクテリウム・ストリアタム、大腸菌、インフルエンザ菌、肺炎杆菌、モラクセラ属種、結核菌、淋菌、髄膜炎菌、プレボテラ・メラニノゲニカス、ネズミチフス菌、サルモネラ・エンテリカ、志賀赤痢菌、霊菌、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカスアガラクティエ、表皮ブドウ球菌、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・ミチス、ストレプトコッカス・サングイス、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、コレラ菌、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ピロリ、またはクロストリジウム・ボルテアエである、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３３】
前記細菌は、少なくとも１つの抗生物質に耐性を示す薬剤耐性細菌である、請求項１３１または１３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３４】
前記細菌は、少なくとも１つの抗生物質に耐性を示す多剤耐性細菌である、請求項１３１−１３３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３５】
前記抗生物質は、セファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、コリスチン、アミノグリコシド、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またはメチシリンを含む、請求項１３３または１３４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３６】
前記投与する工程は、動脈内、静脈内、筋肉内、経口、皮下、吸入、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１２８−１３５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３７】
医薬組成物であって、前記医薬組成物は：
ａ．請求項４０−６９、９２−１１３、または１２１−１２７のいずれか１つに記載のバクテリオファージと；
ｂ．薬学的に許容可能な賦形剤と、
を含む、
医薬組成物。
【請求項１３８】
錠剤、液体、シロップ剤、経口製剤、静脈内製剤、鼻腔内製剤、眼製剤、耳製剤、皮下製剤、吸入可能な呼吸器製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である、請求項１３７に記載の医薬組成物。
【請求項１３９】
標的細菌を死滅させるための方法であって、前記方法は：
（ａ）スペーサー配列またはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸であって、ここで、前記スペーサー配列は、前記標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である、第１の核酸と；
（ｂ）外因性Ｃｐｆ１をコードする第２の核酸と；
を含む、バクテリオファージを標的細菌に導入する工程を含み、
ここで、前記標的細菌は、前記スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡおよび外因性Ｃｐｆ１を使用して、前記バクテリオファージの溶菌活性またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性によって死滅される、
方法。
【請求項１４０】
第１の核酸配列は、少なくとも１つの反復配列をさらに含むＣＲＩＳＰＲアレイである、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は前記標的細菌に内因性である、請求項１３９−１４０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４２】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は前記標的細菌に外因性である、請求項１３９−１４０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４３】
前記標的ヌクレオチド配列は、前記標的遺伝子のためのプロモーター配列のすべてまたは一部を含む、請求項１３９−１４２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４４】
前記標的ヌクレオチド配列は、前記標的遺伝子の転写領域のコード鎖上にあるヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む、請求項１３９−１４３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４５】
前記標的ヌクレオチド配列は、前記標的細菌の生存に必要とされる必須遺伝子の少なくとも一部分である、請求項１３９−１４４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４６】
前記必須遺伝子は、ｙｆａＰ、ｓｐｅＡ、ｆｔｓＺ、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、またはｎｕｓＧである、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記少なくとも１つの反復配列は、その５’末端またはその３’末端のいずれかにおいて、少なくとも１つのスペーサー配列に作動可能に連結される、請求項１４０−１４６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４８】
前記標的細菌はバクテリオファージの溶菌活性のみによって死滅される、請求項１３９−１４７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４９】
前記標的細菌は前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性のみによって死滅される、請求項１３９−１４７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５０】
前記標的細菌は、前記バクテリオファージの溶菌活性と前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性の両方の組み合わせによって死滅される、請求項１３９−１４７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５１】
前記標的細菌は、前記バクテリオファージの溶菌活性とは無関係に、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性によって死滅される、請求項１３９−１４７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５２】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性は、前記バクテリオファージの溶菌活性を補足または増強する、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
スペーサーヌクレオチド配列は第２のスペーサー配列と重複する、請求項１３９−１５２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５４】
前記バクテリオファージの溶菌活性および前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性は相乗的である、請求項１３９−１５３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５５】
前記バクテリオファージの溶菌活性、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性、またはその両方は、前記バクテリオファージの濃度によって調節される、請求項１３９−１５４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５６】
前記バクテリオファージは複数のバクテリア菌株に感染する、請求項１３９−１５５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５７】
前記バクテリオファージは偏性溶菌性バクテリオファージである、請求項１３９−１５６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５８】
前記バクテリオファージは、溶菌性にされるテンペレートバクテリオファージである、請求項１３９−１５６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５９】
前記バクテリオファージは、前記バクテリオファージの溶菌活性および／または前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１アレイの活性によって引き起こされた細胞死を超えて、前記標的細菌に新しい特性を与えない、請求項１３９−１５８のいずれか１つに記載に方法。
【請求項１６０】
前記標的細菌は、大腸菌、肺炎杆菌、サルモネラ菌、または志賀赤痢菌である、請求項１３９−１５９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６１】
スペーサー配列またはｃｒＲＮＡをコードする前記第１の核酸は、非必須バクテリオファージ遺伝子に挿入される、請求項１３９−１６０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６２】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ４９である、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ７５である、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６４】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｈｏｃである、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６５】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６６】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６７】
前記バクテリオファージは、Ｇａｍタンパク質をコードする第３の核酸をさらに含む、請求項１３９−１６６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６８】
バクテリオファージであって、前記バクテリオファージは：
（ａ）スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸であって、ここで、前記スペーサー配列は、標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である、第１の核酸と；
（ｂ）外因性Ｃｐｆ１をコードする第２の核酸と、を含み、
ここで、前記標的細菌は、前記スペーサー配列あるいはそれから転写された前記ｃｒＲＮＡおよび外因性Ｃｐｆ１を使用して、前記バクテリオファージの溶菌活性またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性によって死滅される、
バクテリオファージ。
【請求項１６９】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は前記標的細菌に内因性である、請求項１６８に記載のバクテリオファージ。
【請求項１７０】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は前記標的細菌に外因性である、請求項１６８に記載のバクテリオファージ。
【請求項１７１】
前記標的ヌクレオチド配列は、前記標的遺伝子のためのプロモーター配列のすべてまたは一部を含む、請求項１６８−１７０のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１７２】
前記標的ヌクレオチド配列は、前記標的遺伝子の転写領域のコード鎖上にあるヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む、請求項１６８−１７１のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１７３】
前記標的ヌクレオチド配列は必須である、請求項１６８−１７２のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１７４】
必須遺伝子は、ｙｆａＰ、ｓｐｅＡ、ｆｔｓＺ、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、またはｎｕｓＧである、請求項１７３に記載のバクテリオファージ。
【請求項１７５】
前記標的ヌクレオチド配列は非必須遺伝子である、請求項１６８−１７２のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１７６】
第１の核酸配列は、少なくとも１つの反復配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイである、請求項１６８−１７５のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１７７】
前記少なくとも１つの反復配列は、その５’末端またはその３’末端のいずれかにおいて、前記スペーサー配列に作動可能に連結される、請求項１７６に記載のバクテリオファージ。
【請求項１７８】
前記バクテリオファージは複数のバクテリア菌株に感染する、請求項１６８−１７７のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１７９】
前記バクテリオファージは偏性溶菌性バクテリオファージである、請求項１６８−１７８のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１８０】
前記バクテリオファージは、溶菌性にされるテンペレートバクテリオファージである、請求項１６８−１７８のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１８１】
前記テンペレートバクテリオファージは、１つ以上の溶原性遺伝子の除去、置換、または不活性化によって溶菌性にされる、請求項１８０に記載のバクテリオファージ。
【請求項１８２】
前記標的細菌は、大腸菌、肺炎杆菌、サルモネラ菌、または志賀赤痢菌である、請求項１６８−１８１のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１８３】
スペーサー配列またはｃｒＲＮＡをコードする前記第１の核酸は、非必須バクテリオファージ遺伝子に挿入される、請求項１６８−１８２のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１８４】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ４９である、請求項１６８−１８３のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１８５】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ７５である、請求項１６８−１８３のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１８６】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子はｈｏｃである、請求項１６８−１８３のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１８７】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である、請求項１６８−１８３のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１８８】
前記非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である、請求項１６８−１８３のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１８９】
Ｇａｍタンパク質をコードする第３の核酸をさらに含む、請求項１６８−１８８のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項１９０】
細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性を調節するための方法であって、前記方法は：
前記標的細菌中の前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための外因性Ｃｐｆ１をコードする核酸を含む、バクテリオファージを導入する工程を含む、
方法。
【請求項１９１】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は前記標的細菌に内因性である、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は前記標的細菌に外因性である、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９３】
前記バクテリオファージは複数のバクテリア菌株に感染する、請求項１９０−１９２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９４】
前記バクテリオファージは偏性溶菌性バクテリオファージである、請求項１９０−１９３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９５】
前記バクテリオファージは、溶菌性にされるテンペレートバクテリオファージである、請求項１９０−１９３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９６】
前記標的細菌は、大腸菌、肺炎杆菌、サルモネラ菌、または志賀赤痢菌である、請求項１９０−１９５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９７】
前記バクテリオファージは、Ｇａｍタンパク質をコードする第２の核酸をさらに含む、請求項１９０−１９６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９８】
標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための外因性Ｃｐｆ１をコードする核酸を含む、バクテリオファージ。
【請求項１９９】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は前記標的細菌に内因性である、請求項１９８に記載のバクテリオファージ。
【請求項２００】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は前記標的細菌に外因性である、請求項１９８に記載のバクテリオファージ。
【請求項２０１】
前記バクテリオファージは複数のバクテリア菌株に感染する、請求項１９８−２００のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項２０２】
前記バクテリオファージは偏性溶菌性バクテリオファージである、請求項１９８−２０１のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項２０３】
前記バクテリオファージは、溶菌性にされるテンペレートバクテリオファージである、請求項１９８−２０１のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項２０４】
前記標的細菌は、大腸菌、肺炎杆菌、サルモネラ菌、または志賀赤痢菌である、請求項１９８−２０３のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項２０５】
Ｇａｍタンパク質をコードする第２の核酸をさらに含む、請求項１９８−２０４のいずれか１つに記載のバクテリオファージ。
【請求項２０６】
請求項１６８−１８９、または１９８−２０５のいずれか１つに記載のバクテリオファージを被験体に投与する工程を含む、前記被験体の疾患を処置する方法。
【請求項２０７】
前記被験体が哺乳動物である、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２０８】
前記疾患は細菌感染症である、請求項２０６−２０７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０９】
前記細菌感染症を引き起こす細菌は、アシネトバクター属、アクチノミセス属、バークホルデリア属、カンピロバクター属、カンジダ属、クロストリジウム属、コリネバクテリア属、コクシジオイデス属、クリプトコックス属、エンテロコッカス属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｃａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ属、ヘリコバクター属、クレブシェラ属、モラクセラ属、マイコバクテリウム属、ナイセリア属、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、シュードモナス属、サルモネラ属、セラチア属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、またはビブリオ属の細菌である、請求項２０８に記載の方法。
【請求項２１０】
前記細菌感染症を引き起こす細菌は、バークホリデリア・セパシア、クロストリジウム・ディフィシル、コリネバクテリウム・ミヌティシマム、偽ジフテリア菌、コリネバクテリウム・ストリアタム、大腸菌、インフルエンザ菌、肺炎杆菌、モラクセラ属種、結核菌、淋菌、髄膜炎菌、プレボテラ・メラニノゲニカス、ネズミチフス菌、サルモネラ・エンテリカ、志賀赤痢菌、霊菌、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカスアガラクティエ、表皮ブドウ球菌、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・ミチス、ストレプトコッカス・サングイス、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、コレラ菌、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ピロリ、またはクロストリジウム・ボルテアエである、請求項２０８に記載の方法。
【請求項２１１】
前記細菌は、少なくとも１つの抗生物質に耐性を示す薬剤耐性細菌である、請求項２０９または２１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１２】
前記細菌は、少なくとも１つの抗生物質に耐性を示す多剤耐性細菌である、請求項２０９−２１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１３】
前記抗生物質は、セファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、コリスチン、アミノグリコシド、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またはメチシリンを含む、請求項２１１または２１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１４】
前記投与する工程は、動脈内、静脈内、筋肉内、経口、皮下、吸入、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２０６−２１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１５】
医薬組成物であって、前記医薬組成物は：
ａ．請求項１６８−１８９、または１９８−２０５のいずれか１つに記載のバクテリオファージと；
ｂ．薬学的に許容可能な賦形剤と、
を含む、
医薬組成物。
【請求項２１６】
錠剤、液体、シロップ剤、経口製剤、静脈内製剤、鼻腔内製剤、眼製剤、耳製剤、皮下製剤、吸入可能な呼吸器製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である、請求項２１５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１８年５月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／６７６，８１８に基づく利益を主張し、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載
本発明は、米国の国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって助成番号ＧＭ１１９５６１の下で米国政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有している。
【発明の概要】
【０００３】
ある実施形態では、標的細菌を死滅させるための方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、標的細菌を死滅させるための方法が本明細書に開示され、上記方法は：（ａ）スペーサー配列またはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸であって、ここで、上記スペーサー配列は、上記標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である、第１の核酸と；（ｂ）外因性Ｃｐｆ１をコードする第２の核酸と；を含む、バクテリオファージを標的細菌に導入する工程を含み、ここで、上記標的細菌は、スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡおよび外因性Ｃｐｆ１を使用して、バクテリオファージの溶菌活性またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性によって死滅される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする核酸は、標的細菌に導入されない。他の実施形態では、標的細菌を死滅させるための方法が本明細書に開示され、上記方法は、（ａ）スペーサー配列またはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸であって、ここで、上記スペーサー配列は、上記標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である、第１の核酸と；（ｂ）標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする第２の核酸と；を含むバクテリオファージを標的細菌に導入する工程を含み：ここで、上記標的細菌は、スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡを使用して、バクテリオファージの溶菌活性またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性によって死滅される。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、少なくとも１つの反復配列をさらに含むＣＲＩＳＰＲアレイである。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は標的細菌に内因性である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は標的細菌に外因性である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子はクオラムセンシング（ＱＳ）シグナルによって調節される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は細菌膜のストレスの感知に関与するタンパク質である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子はＣｐｆ１を安定化するタンパク質である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は代謝感知タンパク質（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）である。いくつかの実施形態では、代謝感知タンパク質はσ因子である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は阻害要素の活性を妨害する。いくつかの実施形態では、阻害要素は転写リプレッサーである。いくつかの実施形態では、転写リプレッサーは全体的な転写リプレッサーである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は標的細菌に内因性である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は標的細菌に外因性である。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のためのプロモーター配列のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子の転写領域のコード鎖上にあるヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、標的細菌の生存に必要とされる必須遺伝子の少なくとも一部分である。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、ｙｆａＰ、ｓｐｅＡ、ｆｔｓＺ、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、またはｎｕｓＧである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの反復配列は、その５’末端またはその３’末端のいずれかにおいて、少なくとも１つのスペーサー配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、標的細菌はバクテリオファージの溶菌活性のみによって死滅される。いくつかの実施形態では、標的細菌はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性のみによって死滅される。いくつかの実施形態では、標的細菌は、バクテリオファージの溶菌活性とＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性の両方の組み合わせによって死滅される。いくつかの実施形態では、標的細菌は、バクテリオファージの溶菌活性とは無関係に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性によって死滅される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性は、バクテリオファージの溶菌活性を補足または増強する。いくつかの実施形態では、スペーサーヌクレオチド配列は第２のスペーサー配列と重複する。いくつかの実施形態では、バクテリオファージの溶菌活性およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性は相乗的である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージの溶菌活性、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性、またはその両方は、バクテリオファージの濃度によって調節される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは複数のバクテリア菌株に感染する。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは偏性溶菌性バクテリオファージ（ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｌｙｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、溶菌性にされるテンペレートバクテリオファージである。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、バクテリオファージの溶菌活性および／またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１アレイの活性によって引き起こされた細胞死を超えて、標的細菌に新しい特性を与えない。いくつかの実施形態では、標的細菌は、大腸菌、肺炎杆菌、サルモネラ菌、または志賀赤痢菌である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列またはｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸は、非必須バクテリオファージ遺伝子に挿入される。いくつかの実施形態では、非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ４９である。いくつかの実施形態では、非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ７５である。いくつかの実施形態では、非必須バクテリオファージ遺伝子はｈｏｃである。いくつかの実施形態では、非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である。いくつかの実施形態では、非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、Ｇａｍタンパク質をコードする第３の核酸をさらに含む。
【０００４】
ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性を調節するための方法が、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性を調節するための方法は：標的細菌中の外因性Ｃｐｆ１をコードする核酸を含むバクテリオファージを導入する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする核酸は、標的細菌に導入されない。いくつかの実施形態では、細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性を調節するための方法は：標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする核酸を含む、バクテリオファージを導入する工程を含む。いくつかの実施形態では、転写活性化因子はクオラムセンシング（ＱＳ）シグナルによって調節される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、細菌膜へのストレスの感知に関与するタンパク質である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子はＣｐｆ１を安定化するタンパク質である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は代謝感知タンパク質である。いくつかの実施形態では、代謝感知タンパク質はσ因子である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は阻害要素の活性を妨害する。いくつかの実施形態では、阻害要素は転写リプレッサーである。いくつかの実施形態では、転写リプレッサーは全体的な転写リプレッサーである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は標的細菌に内因性である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は標的細菌に外因性である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは複数のバクテリア菌株に感染する。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは偏性溶菌性バクテリオファージである。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、溶菌性にされるテンペレートバクテリオファージである。いくつかの実施形態では、標的細菌は、大腸菌、肺炎杆菌、サルモネラ菌、または志賀赤痢菌である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子をコードする核酸は、非必須バクテリオファージ遺伝子に挿入される。いくつかの実施形態では、非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ４９である。いくつかの実施形態では、非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ７５である。いくつかの実施形態では、非必須バクテリオファージ遺伝子はｈｏｃである。いくつかの実施形態では、非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である。いくつかの実施形態では、非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、Ｇａｍタンパク質をコードする第２の核酸をさらに含む。
【０００５】
ある実施形態では、標的細菌を死滅させるための方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、標的細菌を死滅させる方法は：（ａ）溶菌活性と、（ｂ）抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列とを含むバクテリオファージを、標的細菌に導入する工程を含み、ここで、上記抗ＣＲＩＳＰＲのポリペプチは、上記バクテリオファージの溶菌活性を増強する。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、遺伝子調節干渉を含むプロセスを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ヌクレアーゼ動員干渉を含むプロセスを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、短縮タンパク質（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、融合タンパク質、二量体タンパク質、または変異タンパク質である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする第２の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である、少なくとも１つの反復配列および少なくとも１つのスペーサー配列を含む。
【０００６】
ある実施形態において、バクテリオファージが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは：（ａ）スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸であって、ここで、上記スペーサー配列は、標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である、第１の核酸と；（ｂ）標的細菌中の外因性Ｃｐｆ１をコードする第２の核酸と、を含み、ここで、上記標的細菌は、スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡおよび外因性Ｃｐｆ１を使用して、バクテリオファージの溶菌活性またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性によって死滅される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする核酸は、標的細菌に導入されない。他の実施形態では、バクテリオファージは：（ａ）スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸であって、ここで、上記スペーサー配列は、標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である、第１の核酸と；（ｂ）標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする第２の核酸とを含み、ここで、上記標的細菌は、スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡを使用して、バクテリオファージの溶菌活性またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性によって死滅される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子はクオラムセンシング（ＱＳ）シグナルによって調節される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は細菌膜のストレスの感知に関与するタンパク質である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子はＣｐｆ１を安定化するタンパク質である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は代謝感知タンパク質である。いくつかの実施形態では、代謝感知タンパク質はσ因子である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、標的細菌の阻害要素の活性を妨害する。いくつかの実施形態では、阻害要素は転写リプレッサーである。いくつかの実施形態では、転写リプレッサーは全体的な転写リプレッサーである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は標的細菌に内因性である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は標的細菌に外因性である。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のためのプロモーター配列のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子の転写領域のコード鎖上にあるヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は必須である。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、ｙｆａＰ、ｓｐｅＡ、ｆｔｓＺ、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、またはｎｕｓＧである。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列は非必須遺伝子である。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、少なくとも１つの反復配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの反復配列は、その５’末端またはその３’末端のいずれかにおいて、スペーサー配列に作動可能に連結される。いくつかの���施形態では、バクテリオファージは複数のバクテリア菌株に感染する。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは偏性溶菌性バクテリオファージである。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、溶菌性にされるテンペレートバクテリオファージである。いくつかの実施形態では、テンペレートバクテリオファージは、１つ以上の溶原性遺伝子の除去、置換、または不活性化によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態では、標的細菌は、大腸菌、肺炎杆菌、サルモネラ菌、または志賀赤痢菌である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列またはｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸は、非必須バクテリオファージ遺伝子に挿入される。いくつかの実施形態では、非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ４９である。いくつかの実施形態では、非必須バクテリオファージ遺伝子はｇｐ７５である。いくつかの実施形態では、非必須バクテリオファージ遺伝子はｈｏｃである。いくつかの実施形態では、非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である。いくつかの実施形態では、非必須バクテリオファージ遺伝子は、ｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、Ｇａｍタンパク質をコードする第３の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、被験体の疾患を処置する方法は、バクテリオファージを投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、被験体は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、疾患は細菌感染症である。いくつかの実施形態では、細菌感染症を引き起こす細菌は、アシネトバクター属、アクチノミセス属、バークホルデリア属、カンピロバクター属、カンジダ菌属、クロストリジウム属、コリネバクテリア属、コクシジオイデス属、クリプトコックス属、エンテロコッカス属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｃａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ（ヘモフィリス）属、ヘリコバクター属、クレブシェラ属、モラクセラ属、マイコバクテリウム属、ナイセリア属、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、シュードモナス属、サルモネラ属、セラチア属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、またはビブリオ属の細菌である。いくつかの実施形態では、細菌感染症を引き起こす細菌は、バークホリデリア・セパシア、クロストリジウム・ディフィシル、コリネバクテリウム・ミヌティシマム、偽ジフテリア菌  （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・ストリアタム、大腸菌、インフルエンザ菌、肺炎杆菌、モラクセラ属種、結核菌、淋菌、髄膜炎菌、プレボテラ・メラニノゲニカス（ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）、ネズミチフス菌、サルモネラ・エンテリカ、志賀赤痢菌、霊菌、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカスアガラクティエ、表皮ブドウ球菌、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・ミチス、ストレプトコッカス・サングイス、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、コレラ菌、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ピロリ、またはクロストリジウム・ボルテアエである。いくつかの実施形態では、細菌は、少なくと���１つの抗生物質に耐性を示す薬剤耐性細菌である。いくつかの実施形態では、細菌は、少なくとも１つの抗生物質に耐性を示す多剤耐性細菌である。いくつかの実施形態では、抗生物質は、セファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、コリスチン、アミノグリコシド、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またはメチシリンを含む。いくつかの実施形態では、投与は、動脈内、静脈内、筋肉内、経口、皮下、吸入、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、バクテリオファージおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、錠剤、液体、シロップ剤、経口製剤、静脈内製剤、鼻腔内製剤、眼製剤、耳製剤、皮下製剤、吸入可能な呼吸器製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である。
【０００７】
ある実施形態では、標的細菌中の外因性Ｃｐｆ１をコードする核酸を含むバクテリオファージが本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする核酸は、標的細菌に導入されない。ある実施形態では、標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする核酸を含むバクテリオファージが、本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子はクオラムセンシング（ＱＳ）シグナルによって調節される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、細菌膜へのストレスの感知に関与するタンパク質である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子はＣｐｆ１を安定化するタンパク質である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は代謝感知タンパク質である。いくつかの実施形態では、代謝感知タンパク質はσ因子である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は阻害要素の活性を妨害する。いくつかの実施形態では、阻害要素は転写リプレッサーである。いくつかの実施形態では、転写リプレッサーは全体的な転写リプレッサーである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は標的細菌に内因性である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は標的細菌に外因性である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは複数のバクテリア菌株に感染する。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは偏性溶菌性バクテリオファージである。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、溶菌性にされるテンペレートバクテリオファージである。いくつかの実施形態では、標的細菌は、大腸菌、肺炎杆菌、サルモネラ菌、または志賀赤痢菌である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子をコードする核酸は、非必須バクテリオファージ遺伝子に挿入される。いくつかの実施形態では、非必須遺伝子はｇｐ４９である。いくつかの実施形態では、非必須遺伝子はｇｐ７５である。いくつかの実施形態では、非必須遺伝子はｈｏｃである。いくつかの実施形態では、非必須遺伝子は、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である。いくつかの実施形態では、非必須遺伝子は、ｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、Ｇａｍタンパク質をコードする第２の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、被験体の疾患を処置する方法は、バクテリオファージを投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、被験体は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、疾患は細菌感染症である。いくつかの実施形態では、細菌感染症を引き起こす細菌は、アシネトバクター属、アクチノミセス属、バークホルデリア属、カンピロバクター属、カンジダ菌属、クロストリジウム属、コリネバクテリア属、コクシジオイデス属、クリプトコックス属、エンテロコッカス属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｃａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ属、ヘリコバクター属、クレブシェラ属、モラクセラ属、マイコバクテリウム属、ナイセリア属、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、シュードモナス属、サルモネラ属、セラチア属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、またはビブリオ属の細菌である。い���つかの実施形態では、細菌感染症を引き起こす細菌は、バークホリデリア・セパシア、クロストリジウム・ディフィシル、コリネバクテリウム・ミヌティシマム、偽ジフテリア菌、コリネバクテリウム・ストリアタム、大腸菌、インフルエンザ菌、肺炎杆菌、モラクセラ属種、結核菌、淋菌、髄膜炎菌、プレボテラ・メラニノゲニカス（ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）、ネズミチフス菌、サルモネラ・エンテリカ、志賀赤痢菌、霊菌、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカスアガラクティエ、表皮ブドウ球菌、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・ミチス、ストレプトコッカス・サングイス、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、コレラ菌、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ピロリ、またはクロストリジウム・ボルテアエである。いくつかの実施形態では、細菌は、少なくとも１つの抗生物質に耐性を示す薬剤耐性細菌である。いくつかの実施形態では、細菌は、少なくとも１つの抗生物質に耐性を示す多剤耐性細菌である。いくつかの実施形態では、抗生物質は、セファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、コリスチン、アミノグリコシド、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またはメチシリンを含む。いくつかの実施形態では、投与は、動脈内、静脈内、筋肉内、経口、皮下、吸入、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、バクテリオファージおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、錠剤、液体、シロップ剤、経口製剤、静脈内製剤、鼻腔内製剤、眼製剤、耳製剤、皮下製剤、吸入可能な呼吸器製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である。
【０００８】
ある実施形態において、バクテリオファージが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、（ａ）溶菌活性と、（ｂ）抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列とを含み、ここで、上記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、上記バクテリオファージの溶菌活性を増強する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする核酸は、標的細菌に導入されない。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、遺伝子調節干渉を含むプロセスを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ヌクレアーゼ動員干渉を含むプロセスを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、短縮タンパク質、融合タンパク質、二量体タンパク質、または変異タンパク質である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする第２の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である、少なくとも１つの反復配列および少なくとも１つのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、被験体の疾患を処置する方法は、バクテリオファージを投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、被験体は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、疾患は細菌感染症である。いくつかの実施形態では、細菌感染症を引き起こす細菌は、アシネトバクター属、アクチノミセス属、バークホルデリア属、カンピロバクター属、カンジダ菌属、クロストリジウム属、コリネバクテリア属、コクシジオイデス属、クリプトコックス属、エンテロコッカス属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｃａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ属、ヘリコバクター属、クレブシェラ属、モラクセラ属、マイコバクテリウム属、ナイセリア属、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、シュードモナス属、サルモネラ属、セラチア属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、またはビブリオ属の細菌である。いくつかの実施形態では、細菌感染症を引き起こす細菌は、バークホリデリア・セパシア、クロストリジウム・ディフィシル、コリネバクテリウム・ミヌティシマム、偽ジフテリア菌、コリネバクテリウム・ストリアタム、大腸菌、インフルエンザ菌、肺炎杆菌、モラクセラ属種、結核菌、淋菌、髄膜炎菌、プレボテラ・メラニノゲニカス、ネズミチフス菌、サルモネラ・エンテリカ、志賀赤痢菌、霊菌、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカスアガラクティエ、表皮ブドウ球菌、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・ミチス、ストレプトコッカス・サングイス、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、コレラ菌、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ピロリ、またはクロストリジウム・ボルテアエである。いくつかの実施形態では、細菌は、少なくとも１つの抗生物質に耐性を示す薬剤耐性細菌である。いくつかの実施形態では、細菌は、少なくとも１つの抗生物質に耐性を示す多剤耐性細菌である。いくつかの実施形態では、抗生物質は、セファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、コリスチン、アミノグリコシド、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またはメチシリンを含む。いくつかの実施形態では、投与は、動脈内、静脈内、筋肉内、経口、皮下、吸入、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、バクテリオファージおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、錠剤、液体、シロップ剤、経口製剤、静脈内製剤、鼻腔内製剤、眼製剤、耳製剤、皮下製剤、吸入可能な呼吸器製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本開示の特徴は、とりわけ添付の請求項に明記されている。本開示の特徴と利点についてのよりよい理解は、本開示の原則が用いられている例証的な実施形態と添付の図面を説明する以下の詳細な記載を参照することによって得られる：
【００１０】
【図１】ＣＲＩＳＰＲで増強されたバクテリオファージを操作するためのワークフロープロセスを説明する。
【図２】大腸菌ＭＧ１６５５における、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）＆Ｃａｓ１３ａ）媒介性死滅の比較を示す。図２のＡは、それぞれの核酸標的、ＰＡＭ、ｇＲＮＡ、および攻撃のメカニズムを有するＣａｓ９の特徴を示す。図２のＢは、それぞれの核酸標的、ＰＡＭ、スペーサー、および攻撃のメカニズムを有するＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）の特徴を示す。図２のＣは、それぞれの核酸標的、ＰＡＭ、スペーサー、および攻撃のメカニズムを有するＣａｓ１３ａの特徴を示す。図２のＤは、Ｃａｓ９を発現する細胞中で形質転換された様々なスペーサー（非必須および必須）を保有するＣＲＩＳＰＲアレイを示す。図２のＥは、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を発現する細胞中で形質転換された様々なスペーサー（非必須および必須）を保有するＣＲＩＳＰＲアレイを示す。図２のＦは、Ｃａｓ１３ａを発現する細胞中で形質転換された様々なスペーサー（非必須および必須）を保有するＣＲＩＳＰＲアレイを示す。大腸菌ＭＧ１６５５の野生型細胞における形質転換の平均のＣＦＵ数が、報告される。ＣＦＵ数は、ＮＴ（非標的スペーサー）と比較された。
【図３】大腸菌株におけるＣａｓ１３ａ媒介性死滅を示す。図３のＡは、大腸菌ＭＧ１６５５における、Ｃａｓ１３ａを構成的に発現する細胞中で形質転換されたｔｒｅｆおよびｅａｍＢ（非必須）ｓｐｅＡおよびｙｆａＰ（必須）を標的とする様々なスペーサーを保有する、ＣＲＩＳＰＲアレイを示す。図３のＢは、大腸菌ＢＷ２５１１３における、Ｃａｓ１３ａを構成的に発現する細胞中で形質転換されたｔｒｅｆおよびｅａｍＢ（非必須）ｓｐｅＡおよびｙｆａＰ（必須）を標的とする様々なスペーサーを保有する、ＣＲＩＳＰＲアレイを示す。図３のＣは、大腸菌ＢＷ２５１１３ΔｒｅｃＡにおける、Ｃａｓ１３ａを構成的に発現する細胞中で形質転換されたｔｒｅｆおよびｅａｍＢ（非必須）ｓｐｅＡおよびｙｆａＰ（必須）を標的とする様々なスペーサーを保有するＣＲＩＳＰＲアレイを示す。図３のＤは、大腸菌Ｏ９：ＨＳにおける、Ｃａｓ１３ａを構成的に発現する細胞中で形質転換されたｔｒｅｆおよびｅａｍＢ（非必須）ｓｐｅＡおよびｙｆａＰ（必須）を標的とする様々なスペーサーを保有する、ＣＲＩＳＰＲアレイを示す。図３のＥは、Ｅ．Ｅ２４３７Ａにおける、Ｃａｓ１３ａを構成的に発現する細胞中で形質転換されたｔｒｅｆおよびｅａｍＢ（非必須）ｓｐｅＡおよびｙｆａＰ（必須）を標的とする様々なスペーサーを保有する、ＣＲＩＳＰＲアレイを示す。ＣＦＵ数は、ＮＴ（非標的スペーサー）と比較される。
【図４】多重プラスミドを用いたＣａｓ１３ａによる死滅を示す。図４のＡは、構成的に発現されたＣａｓ１３ａを抱える多重化標的化プラスミドを有する大腸菌ＭＧ１６５５を示し、形質転換は、細胞が適切な抗生物質でＬＢ寒天プレート上でスポットされる場合、プラスミド標的化のためのスペーサーＳＰ１またはＳＰ２を用いて実行される。図４のＢは、構成的に表現するＣａｓ１３ａを抱える多重化標的化プラスミドを有する大腸菌ＭＧ１６５５野生型株を示し、形質転換は、プラスミド標的のためのスペーサーＳＰ１またはＳＰ２を用いて実行される。ＣＦＵ数は対照と比較される。
【図５】大腸菌ＭＧ１６５５ΔｒｅｃＡにおける、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、およびＣａｓ１３ａによる死滅に対するｒｅｃＡ媒介性ＤＮＡ修復の影響を示す。図５のＡは、Ｃａｓ９を構成的に発現する細胞中で形質転換された様々なスペーサー（非必須および必須）を保有するＣＲＩＳＰＲアレイの死滅効率を示す。図５のＢは、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を構成的に発現する細胞中で形質転換された様々なスペーサー（非必須および必須）を保有するＣＲＩＳＰＲアレイの死滅効率を示す。図５のＣは、Ｃａｓ１３ａを構成的に発現する細胞中で形質転換された様々なスペーサー（非必須および必須）を保有するＣＲＩＳＰＲアレイの死滅効率を示す。（大腸菌ＭＧ１６５５  ｒｅｃＡ突然変異細胞における形質転換の平均ＣＦＵ数が、報告される。）ＣＦＵ数は、ＮＴ（非標的スペーサー）と比較された。
【図６Ａ】タンパク質ｒｅｃＡを介するＤＮＡ損傷修復により、独立してＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を生き延びる細胞の特性を示す。図６Ａは非標的スペーサーで形質転換された細胞の細胞生存率を示す。
【図６Ｂ】タンパク質ｒｅｃＡを介するＤＮＡ損傷修復により、独立してＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を生き延びる細胞の特性を示す。図６Ｂは、ｔｒｅＦスペーサーで形質転換された細胞の細胞生存率を示す。
【図６Ｃ】タンパク質ｒｅｃＡを介するＤＮＡ損傷修復により、独立してＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を生き延びる細胞の特性を示す。図６Ｃは、ｙｆａＰスペーサーで形質転換された細胞の細胞生存率を示す。残存するコロニーのゲノムにおける４００ｂｐと共にスペーサーの部位が増幅され、遺伝子突然変異を確認した。
【図６Ｄ】タンパク質ｒｅｃＡを介するＤＮＡ損傷修復により、独立してＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を生き延びる細胞の特性を示す。図６Ｄは、非標的ＣＲＩＳＰＲアレイで形質転換された細胞における遺伝子突然変異を示す。
【図６Ｅ】タンパク質ｒｅｃＡを介するＤＮＡ損傷修復により、独立してＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を生き延びる細胞の特性を示す。図６Ｅは、ｔｒｅＦのＣＲＩＳＰＲアレイで形質転換された細胞における遺伝子突然変異を示す。
【図６Ｆ】タンパク質ｒｅｃＡを介するＤＮＡ損傷修復により、独立してＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を生き延びる細胞の特性を示す。図６Ｆは、非標的ＣＲＩＳＰＲアレイで形質転換された生存する細胞から単離されたＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）プラスミドのＲｕｖＣＩＩドメインにおける突然変異を示す。
【図６Ｇ】タンパク質ｒｅｃＡを介するＤＮＡ損傷修復により、独立してＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を生き延びる細胞の特性を示す。図６Ｇは、ｔｒｅＦのＣＲＩＳＰＲアレイで形質転換された生存する細胞からの単離されたＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）プラスミドのＲｕｖＣＩＩドメインにおける突然変異を示す。
【図６Ｈ】タンパク質ｒｅｃＡを介するＤＮＡ損傷修復により、独立してＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を生き延びる細胞の特性を示す。図６Ｈは、様々なスペーサー構成（反復およびスペーサー（ｔｒｅＦ＿ＲＳならびにｙｆａＰ＿ＲＳ）のみ、反復−スペーサー反復（ｔｒｅＦならびにｙｆａＰ）、および二重スペーサー（ｔｒｅＦ＋ｔｒｅＦならびにｙｆａＰ＋ｙｆａＰ））の死滅効率を示し、プロモーターを有するスペーサーの概略図がこの図の下部に示される。
【図６Ｉ】タンパク質ｒｅｃＡを介するＤＮＡ損傷修復により、独立してＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を生き延びる細胞の特性を示す。図６Ｉは、ｔｒｅＦ二重スペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイにおいて欠失している１つのスペーサー配列の割合を示す。
【図６Ｊ】タンパク質ｒｅｃＡを介するＤＮＡ損傷修復により、独立してＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を生き延びる細胞の特性を示す。図６Ｊは、ｙｆａＰ二重スペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイにおいて欠失している１つのスペーサー配列の割合を示す。
【図６Ｋ】タンパク質ｒｅｃＡを介するＤＮＡ損傷修復により、独立してＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を生き延びる細胞の特性を示す。図６Ｋは、ｔｒｅＦスペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイにおいて欠失しているスペーサー配列の割合を示す。
【図６Ｌ】タンパク質ｒｅｃＡを介するＤＮＡ損傷修復により、独立してＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を生き延びる細胞の特性を示す。図６Ｌは、ｙｆａＰスペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイにおいて欠失しているスペーサー配列の割合を示す。
【図７】反復およびスペーサー（Ｒ＿Ｓ）を有するＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）媒介性死滅を示す。図７のＡは、反復およびスペーサーの概略図を示す。図７のＢは、単一の反復を有するｔｒｅＦのスペーサーで形質転換された構成的に発現するＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を抱える、３つの大腸菌株（大腸菌ＢＷ２５１１３、大腸菌ＢＷ２５１１３ΔｒｅｃＡ、および大腸菌Ｅ２４３７７Ａ）の死滅効率を説明する。ＣＦＵ数は、ＮＴ（非標的スペーサー）と比較された。
【図８】死滅効率に対する、ＲｕｖＣの触媒残基の突然変異を有するＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）の効果を示す。図８のＡは、ＲｕｖＣ触媒残基を強調したＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）のドメイン構造を説明する。触媒残基Ｄ９１７およびＤ１２５５が変異された。図８のＢは、形質転換がｔｒｅＦ、ｅａｍＢ（非必須）、およびｙｆａＰ（必須）遺伝子のスペーサーを用いて実行された場合の、構成的に発現されたＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、Ｃａｓ１２ａＤ９１７Ａ、またはＣａｓ１２ａＤ１２５５Ａを抱える、大腸菌ＭＧ１６５５野生型株における死滅効率を示す。ＣＦＵ数は、ＮＴ（非標的スペーサー）と比較された。図８のＣは、形質転換がｔｒｅＦ、ｅａｍＢ（非必須）、およびｙｆａＰ（必須）遺伝子のスペーサーを用いて実行された場合の、構成的に発現されたＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、Ｃａｓ１２ａＤ９１７Ａ、またはＣａｓ１２ａＤ１２５５Ａを抱える、大腸菌ＭＧ１６５５  ｒｅｃＡ突然変異株における死滅効率を示す。ＣＦＵ数は、ＮＴ（非標的スペーサー）と比較された。
【図９】死滅効率に対するＣａｓ１３ａ触媒残基の突然変異の効果を示す。図９のＡは、ＨＥＰＮ触媒残基を強調したＣａｓ１３ａのドメイン構造を示す。触媒残基Ｒ５９７、Ｈ６０２、Ｒ１２７８、およびＨ１２８３が変異された。図９のＢは、形質転換がプラスミド標的のためのスペーサーＳＰ１あるいはＳＰ２を用いて実行された場合の、構成的に発現されたＣａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ａＲ５９７Ａ、Ｃａｓ１３ａＨ６０２Ａ、Ｃａｓ１３ａＲ１２７８Ａ、またはＣａｓ１３ａＨ１２８３Ａを抱える多重化標的化プラスミドを有する大腸菌ＭＧ１６５５野生型株における、死滅効率を示す。ＣＦＵ数は、ＮＴ（非標的スペーサー）と比較された。図９のＣは、形質転換がゲノム標的のためのスペーサーＳＰ１あるいはＳＰ２を用いて実行された場合の、構成的に発現されたＣａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ａＲ５９７Ａ、Ｃａｓ１３ａＨ６０２Ａ、Ｃａｓ１３ａＲ１２７８Ａ、またはＣａｓ１３ａＨ１２８３Ａを抱える大腸菌ＭＧ１６５５野生型株における、死滅効率を示す。ＣＦＵ数は、ＮＴ（非標的スペーサー）と比較された。
【図１０Ａ】病原体の広宿主域におけるＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）媒介性死滅を示す。大腸菌ＢＷ２５１１３における、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を構成的に発現する細胞中に様々なスペーサー（非必須および必須）を保有するＣＲＩＳＰＲアレイの死滅効率を示す。
【図１０Ｂ】病原体の広宿主域におけるＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）媒介性死滅を示す。大腸菌ＢＷ２５１１３ΔｒｅｃＡにおける、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を構成的に発現する細胞中に様々なスペーサー（非必須および必須）を保有するＣＲＩＳＰＲアレイの死滅効率を示す。
【図１０Ｃ】病原体の広宿主域におけるＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）媒介性死滅を示す。大腸菌Ｏ９：ＨＳにおける、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を構成的に発現する細胞中に様々なスペーサー（非必須および必須）を保有するＣＲＩＳＰＲアレイの死滅効率を示す。
【図１０Ｄ】病原体の広宿主域におけるＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）媒介性死滅を示す。大腸菌Ｅ２４３７Ａにおける、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を構成的に発現する細胞中に様々なスペーサー（非必須および必須）を保有するＣＲＩＳＰＲアレイの死滅効率を示す。
【図１０Ｅ】病原体の広宿主域におけるＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）媒介性死滅を示す。志賀赤痢菌における、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を構成的に発現する細胞中に様々なスペーサー（非必須および必須）を保有するＣＲＩＳＰＲアレイの死滅効率を示す。
【図１０Ｆ】病原体の広宿主域におけるＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）媒介性死滅を示す。肺炎杆菌における、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を構成的に発現する細胞中に様々なスペーサー（非必須および必須）を抱えるＣＲＩＳＰＲアレイの死滅効率を示す。
【図１０Ｇ】病原体の広宿主域におけるＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）媒介性死滅を示す。サルモネラ・エンテリカにおける、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を構成的に発現する細胞中に様々なスペーサー（非必須および必須）を保有するＣＲＩＳＰＲアレイの死滅効率を示す。ＣＦＵ数は、ＮＴ（非標的スペーサー）と比較された。
【図１１Ａ】サルモネラ・エンテリカ  ＬＴ２の増強された死滅を示す。Ｍｕ  Ｇａｍタンパク質が二本鎖の末端に特異的に結合し、相同組換え（ＨＲ）を介してＤＮＡを修理するＤＮＡ損傷修復タンパク質ＲｅｃＡを遮断し、それにより細胞死を促進することを示す概略図を示す。
【図１１Ｂ】サルモネラ・エンテリカ  ＬＴ２の増強された死滅を示す。形質転換がｔｒｅＦスペーサー（非必須）ｆｔｓＺスペーサー（必須）を有するＣＲＩＳＰＲアレイを用いて実行された場合の、構成的に表現するＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を抱えるサルモネラ・エンテリカ  ＬＴ野生型およびｒｅｃＡ突然変異株の死滅効率を示す。ＣＦＵ数は、サルモネラ・エンテリカ  ＬＴ２の増強された死滅を示す。ＮＴ（非標的スペーサー）と比較された。
【図１１Ｃ】サルモネラ・エンテリカ  ＬＴ２の増強された死滅を示す。単一スペーサーおよび多重スペーサーの概略図を示す。
【図１１Ｄ】サルモネラ・エンテリカ  ＬＴ２の増強された死滅を示す。形質転換が単一スペーサーおよび多重スペーサーのｔｒｅＦを用いて実行された場合の、構成的に表現するＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を抱えるサルモネラ・エンテリカ  ＬＴ野生型株の死滅効率を示す。ＣＦＵ数は、ＮＴ（非標的スペーサー）と比較された。
【図１１Ｅ】サルモネラ・エンテリカ  ＬＴ２の増強された死滅を示す。形質転換が単一スペーサーおよび多重スペーサーｔｒｅＦを用いて実行された場合の、構成的に表現するＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）およびＧａｍタンパク質を抱えるサルモネラ・エンテリカ  ＬＴ２野生型株の死滅効率を示す。ＣＦＵ数は、ＮＴ（非標的スペーサー）と比較された。
【図１２】ｒｄｇＣのアップレギュレーションが、大腸菌ＭＧ１６５５ΔｒｅｃＡのＣａｓ１３ａ媒介性死滅の原因になることを示す。ｒｄｇＣおよびｓｏｘＳのｍＲＮＡレベルは、Ｃａｓ１３ａを発現する大腸菌ＭＧ１６５５または大腸菌ＭＧ１６５５ΔｒｅｃＡおよび示された遺伝子を標的とする単一スペーサーのＣＲＩＳＰＲアレイにおけるｑＲＴ−ＰＣＲによって分析された。ＮＴ−非標的化。結果は、別個のコロニーから始まる３つの独立した実験を表す。
【図１３Ａ】プラスミドマップの概略図を示す。ｐＢＡＤ３３−Ｃｐｆ１の概略図を示す。
【図１３Ｂ】プラスミドマップの概略図を示す。ｐＢＡＤ３３−Ｃｐｆ１−ＭｕＧａｍの概略図を示す。
【図１３Ｃ】プラスミドマップの概略図を示す。ｐＡＣＹＣ１８４−Ｃａｓ９の概略図を示す。
【図１３Ｄ】プラスミドマップの概略図を示す。ｐＡＣＹＣ１８４−Ｃａｓ１３ａの概略図を示す。
【図１３Ｅ】プラスミドマップの概略図を示す。Ｃａｓ９のｓｇＲＮＡプラスミドの概略図を示す。
【図１３Ｆ】プラスミドマップの概略図を示す。Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）およびＣ２ｃ２（Ｃａｓ１３ａ）のスペーサー・プラスミドの概略図を示す。
【図１４Ａ】プラスミド発現Ｃｐｆ１および自己標的化ｃｒＲＮＡが、細胞死を引き起こすことを示す。ＣｐｆＩ単独ならびにｆｔｓＡあるいはｇｙｒＢを標的とするｃｒＲＮＡを有するＣｐｆＩのプラスミド形質転換を示し、および、ＣＰＦ１＋ｃｒＲＮＡで形質転換されたプラスミドによって標的とされる細菌ゲノムが細菌細胞死を引き起こすことを例証し、および、２つの緑膿菌株におけるファージ送達抗菌活性のためのヌクレアーゼとしてのその有用性をさらに示す。
【図１４Ｂ】プラスミド発現Ｃｐｆ１および自己標的化ｃｒＲＮＡが、細胞死を引き起こすことを示す。２つの緑膿菌株上の野生型緑膿菌ファージ、ＣｐｆＩをコードするファージ、およびＣｐｆＩ＋ｃｒＲＮＡをコードするファージの力価の比較を示す。緑膿菌ファージ（ｐ１０３２）は、Ｃｐｆ１をコードする配列を単独で、またはｆｔｓＡ  ｃｒＲＮＡと協力して保有するように操作され、それらの増幅する能力について評価した。その結果は、Ｃｐｆ１およびＣｐｆ１＋ｃｒＲＮＡの変異体が、最終的な力価増幅の点において、２つの緑膿菌株上の野生型対応物と同じ適応度を示したことを例証する。
【図１４Ｃ】プラスミド発現Ｃｐｆ１および自己標的化ｃｒＲＮＡが、細胞死を引き起こすことを示す。野生型緑膿菌ファージ、ｃｐｆＩをコードするファージ、およびｃｐｆＩ＋ｃｒＲＮＡをコードするファージによる、緑膿菌株ｃｆｕの低減の比較を示す。ｐ１０３２およびその操作された変異体は、感受性緑膿菌株（ｂ１１２７）でインキュベートされ、細菌ｃｆｕｓを数えるために様々な時間でサンプリングされた。
【図１５】ＰＡ１４についての、ｐ１１０６および操作されたファージのＣＦＵ低減アッセイを示す。ｐ１１０６およびその操作された変異体は、感受性緑膿菌株（ＰＡ１４、図１５のＡ）および非感受性株（ＬＦＰ１１６０、図１５のＢ）でインキュベートされ、細菌ＣＦＵを数えるために様々な時間でサンプリングされた。
【図１６】ファージｐ１０３２におけるＣｐｆ１およびｃｒＲＮＡの発現の検出のための例示的な概略図である。
【図１７】様々な時点のＣｐｆ１発現を示す。倍率変化は、個々の時点で感染していない対照との比較によって導き出された。倍率変化は、緑膿菌ハウスキーピング遺伝子、ｒｐｓＨと比較された。ＷＴファージに感染した細菌におけるバックグラウンド発現は最小限であった。Ｃｐｆ１は、ｃｒＰｈａｇｅにおいてのみ発現されるように思われ、このことは、ＣＰＦＩ発現を検出するためのプライマーの特異性を示している。
【図１８】Ｃｐｆ１がｃｒＰｈａｇｅにおいて発現されるように思われ、発現が、経時的に増加するように思われることを示す。倍率変化は、１５分の時点で感染していない対照との比較によって導き出された。倍率変化は、緑膿菌ハウスキーピング遺伝子、ｒｐｓＨと比較された。ＷＴファージに感染した細菌におけるバックグラウンド発現は最小限であった。
【図１９】様々な時点でのｃｒＲＮＡ発現を示す。倍率変化は、個々の時点で感染していない対照との比較によって導き出された。倍率変化は、緑膿菌ハウスキーピング遺伝子、ｒｐｓＨと比較された。ＷＴファージ感染細菌におけるバックグラウンド発現は最小限であった。ｃｒＲＮＡは、ｃｒＰｈａｇｅにおいて発現されるように思われる。
【図２０】ｃｒＲＮＡがｃｒＰｈａｇｅにおいて発現されるように思われ、発現が経時的に増加するように思われることを示す。倍率変化は、１５分の時点で感染していない対照との比較によって導き出された。倍率変化は、緑膿菌ハウスキーピング遺伝子、ｒｐｓＨと比較された。ＷＴファージに感染した細菌におけるバックグラウンド発現は最小限であった。
【図２１】様々な時点でのＷＴファージおよびｃｒＰｈａｇｅにおけるファージＤＮＡポリメラーゼの発現を示す。倍率変化は、個々の時点で感染していない対照との比較によって導き出された。倍率変化は、緑膿菌ハウスキーピング遺伝子、ｒｐｓＨと比較された。
【図２２】ＷＴファージおよびｃｒＰｈａｇｅにおけるファージＤＮＡポリメラーゼの発現を説明し、発現が経時的に増加することを例証する。倍率変化は、１５分の時点で感染していない対照との比較によって導き出された。倍率変化は、緑膿菌ハウスキーピング遺伝子、ｒｐｓＨと比較された。
【図２３】様々な時点での切断されていないｆｔｓＡの発現を示す。倍率変化は、個々の時点で感染していない対照との比較によって導き出された。倍率変化は、緑膿菌ハウスキーピング遺伝子、ｒｐｓＨと比較された。
【図２４】切断されていないｆｔｓＡ発現を示す。倍率変化は、１５分の時点で感染していない対照との比較によって導き出された。倍率変化は、緑膿菌ハウスキーピング遺伝子、ｒｐｓＨと比較された。
【図２５】様々な時点での切断されたｆｔｓＡの発現を示す。倍率変化は、個々の時点で感染していない対照との比較によって導き出された。倍率変化は、緑膿菌ハウスキーピング遺伝子、ｒｐｓＨと比較された。
【図２６】切断されたｆｔｓＡの発現を示す。倍率変化は、１５分の時点で感染していない対照との比較によって導き出された。倍率変化は、緑膿菌ハウスキーピング遺伝子、ｒｐｓＨと比較された。
【図２７】倍率変化による、切断された：切断されていないｆｔｓＡの比率を示す。ＤＮＡが切断されている場合、その比率は１未満である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
特に他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書における本開示の説明に使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、本開示を限定することを意図していない。
【００１２】
文脈が別段の指示をしない限り、本明細書に記載された本開示の様々な特徴が、任意の組み合わせで使用可能であることが特に意図される。さらに、本開示は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の特徴または特徴の組み合わせが、除外あるいは省略されることがさらに企図される。例示するために、組成物が構成要素Ａ、Ｂ、およびＣを含むと本明細書で記載される場合、Ａ、Ｂ、またはＣ、あるいはそれらの組み合わせが、単独でまたは任意の組み合わせで、省略もしくは放棄されることが特に意図される。
【００１３】
当業者は、文献の一貫性の欠如およびそのような用語を統一するための当技術分野における継続的な努力のために、様々なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系およびそれらの構成要素を示す用語の互換性を理解する。同様に、当業者は、文献における一貫性の欠如およびそのような用語を統一するための当技術分野における継続的な努力のために、様々な抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質を示す用語の互換性を理解する。
【００１４】
本明細書および添付の請求項で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明白に示していない限り、同様に複数形を含むように意図される。さらに、本明細書で使用されるように、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、代替（「あるいは（ｏｒ）」）において解釈された場合の組み合わせの不足と同様に、関連する表記された項目の１つ以上の全ての可能性のある組み合わせを指し、および含有する。
【００１５】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、本明細書で使用されるように、投与量あるいは期間などの測定可能な値を指す場合、所定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、＋０．５％、または±０．１％の変動を指す。本明細書で使用されるように、「ＸとＹの間」および「約ＸとＹの間」などの句は、ＸとＹを含むと解釈されるべきである。本明細書で使用されるように、「約ＸとＹの間」などの句は「約Ｘと約Ｙの間」を意味し、「約ＸからＹまで」などの句は「約Ｘから約Ｙまで」を意味する。
【００１６】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、ならびに「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」および「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」は、本明細書で使用されるように、記載される特徴、工程、操作、要素、および／または構成要素の存在を指定するが、１つ以上の他の特徴、工程、操作、要素、構成要素、および／またはその群の存在もしくは添加を排除しない。
【００１７】
本明細書で使用されるように、移行句「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、請求項の範囲が、請求項に記載される指定された材料あるいは工程および請求された開示の基本的かつ新しい特性に実質的に影響しないものを含有すると解釈されることを意味する。したがって、用語「本質的になる」は、本開示の請求項で使用される場合、「含む」と同等であると解釈されるようには意図されない。
【００１８】
用語「〜からなる（（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）および（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ））」は、本明細書で使用されるように、他に直接述べられていない任意の特徴、工程、操作、要素、および／または構成要素を除外する。「〜からなる」の使用は、その節において記載される範囲、特徴、工程、操作、要素、および／または構成要素のみを限定し、他の特徴、工程、操作、要素、のおよび／または構成要素を全体として請求項から除外する。
【００１９】
本明細書で使用されるように、「キメラ」は、少なくとも２つの構成要素が様々なソース（例えば、様々な生物、様々なコード領域）に由来する核酸分子あるいはポリペプチドを指す。
【００２０】
本明細書で使用されるように、「相補性」は、対照薬ヌクレオチド配列との１００％の相補性あるいは同一性を意味するか、あるいは、１００％未満の相補性（例えば、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％などの相補性）を意味する。相補性または相補可能は、突然変異に対して「相補性」であるか、または「相補である（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）」観点から使用され得る。
【００２１】
用語「相補的」または「相補性」は、本明細書で使用されるように、塩基対形成による許容される塩および温度条件下でのポリヌクレオチドの天然結合を指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。ヌクレオチドの一部のみが結合している２つの一本鎖分子間の相補性は、「部分的（ｐａｒｔｉａｌ）」であり、あるいは、２つの一本鎖分子間の相補性は、全相補性が一本鎖分子間に存在する場合には完全であり得る。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対する効果を有する。
【００２２】
本明細書で使用されるように、用語「遺伝子」は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉｃｒｏＲＮＡ、および調節ＲＮＡなどを産生するために使用することができる核酸分子を指す。遺伝子は、機能タンパク質または遺伝子産物を産生するために使用されても、なくてもよい。遺伝子は、コード領域および非コード領域の両方（例えば、イントロン、調節エレメント、プロモーター、エンハンサー、終止配列、および／または５’ならびに３’翻訳領域）を含む。遺伝子は「単離」され、それにより、その天然状態の核酸で通常見つかる構成要素を、実質的にあるいは本質的に含まない核酸を意味する。そのような構成要素は、他の細胞材料、組換え生産からの培地、および／または核酸を化学的に合成する際に使用される様々な化学物質を含む。
【００２３】
本明細書で使用されるように、「標的ヌクレオチド配列」は、組換えＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサー配列に相補的な標的遺伝子の部分を指す。
【００２４】
本明細書で使用されるように、「標的ＤＮＡ」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的領域」、または「ゲノム中の標的領域」は、ＣＲＩＳＰＲアレイ中のスペーサー配列に対して、十分に相補的であるか、あるいは実質的に相補的である（例えば、少なくとも７０％相補的である（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上））生物のゲノムの領域を指す。いくつかの実施形態では、標的領域は、生物のゲノム中のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列（標的領域のすぐ３’に位置するＰＡＭ配列）にすぐ隣接して位置する約１０〜約４０の連続したヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列はＰＡＭに隣接するか、またはＰＡＭの側面に位置する（ｆｌａｎｋｅｄ）。ＰＡＭはしばしば、特定のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に特異的であるが、ＰＡＭ配列は適切な方法によって決定される。したがって、例えば、実験的アプローチは、あらゆる可能なヌクレオチドの側面に位置する配列を標的とすること、および、標的ＤＮＡのインビトロの切断または標的プラスミドＤＮＡの形質転換などを介する標的化を受けない配列メンバーを同定することを含む。いくつかの実施形態では、計算論的アプローチは、天然スペーサーのＢＬＡＳＴ検索を実施して、バクテリオファージあるいはプラスミド中のもとの標的ＤＮＡ配列を同定することと、これらの配列を整列させて、標的配列に隣接している保存配列を決定することを含む。
【００２５】
本明細書で使用されるように、用語「プロトスペーサー隣接モチーフ」あるいは「ＰＡＭ」は、ガイドＲＮＡスペーサーと一致する配列に隣接する標的ＤＮＡ分子上に存在するＤＮＡ配列を指す。このモチーフは、その領域に相補的である結果として、スペーサー配列が結合する領域の隣の標的遺伝子に見られ、スペーサーヌクレオチド配列との塩基対形成が始まる点を特定する。Ｖ型系の場合、ＰＡＭは、スペーサーに一致する配列のすぐ３’に位置し、したがって、スペーサーヌクレオチド配列と塩基対形成する配列の５’に位置する。ＰＡＭの非限定的な例はＹＴＮを含み、ここで、Ｙはピリミジンであり、Ｎは任意の核酸塩基である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１の場合、ＰＡＭはＴＴＮまたはＴＴＴＶである。
【００２６】
本明細書で使用されるように「ＣＲＩＳＰＲアレイ」は、少なくとも２つの反復配列、あるいは各々の上記反復配列の各々の一部、および少なくとも１つのスペーサー配列を含む核酸分子を意味する。２つの反復配列のうちの１つ、またはその一部は、スペーサー配列の５’末端に連結され、および２つの反復配列の他方、またはその一部は、スペーサー配列の３’末端に連結される。組換えＣＲＩＳＰＲアレイでは、反復配列とスペーサー配列の組み合わせは、合成であり、人工的に作られ、自然界では見られない。いくつかの実施形態では、「ＣＲＩＳＰＲアレイ」は、５’〜３’の少なくとも１つの反復−スペーサー配列（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上の反復−スペーサー配列、およびその中の任意の範囲または値）を含む核酸構築物を指し、ここで、３’の大部分のアレイの反復スペーサー配列の３’末端は反復配列に連結され、それにより、前記アレイ中のスペーサーはすべて、５’末端および３’末端の両方上で反復配列の側面に位置する。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「スペーサー配列」または「スペーサー」は標的ＤＮＡに相補的なヌクレオチド配列（つまり、ゲノム中の標的領域あるいはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接している「プロトスペーサー配列」）を指す。スペーサー配列は、標的ＤＮＡに対して十分に相補的であるか、または実質的に相補的である（例えば、少なくとも約７０％相補的（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％あるいはそれ以上））。
【００２８】
本明細書で使用されるように「反復配列」は、例えば、野生型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の任意の反復配列、または「スペーサー配列」によって分離される合成ＣＲＩＳＰＲアレイの反復配列（例えば、反復−スペーサー反復配列）を指す。本開示に有用な反復配列は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の任意の既知の反復配列または後に同定される反復配列であるか、あるいは、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１）で機能するように設計された合成反復である。Ｃｐｆ１は本明細書においてＣａｓ１２ａとも呼ばれる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ａ、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣｐｆ１は、交換可能に使用される。Ｃｐｆ１は、５’のＴリッチプロトスペーサー隣接モチーフを認識するクラスＩＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼであり、ここで、二本鎖ＤＮＡ切断は５’オーバーハングを結果としてもたらす。Ｖ型系は、パルクバクテリア・バクテリウム（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７（ＰｂＣｐｆ１）、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７（Ｌｂ３Ｃｐｆ１）、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）（ＢｐＣｐｆ１）、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＷＡ＿３３＿１０（ＰｅＣｐｆ１）、アシダミノコッカス種  ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、ポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）（ＰｍＣｐｆ１）、ラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（  Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）（ＰｃＣｐｆ１）、プレボテーラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）（ＰｄＣｐｆ１）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７（ＭｂＣｐｆ１）、スミセラ種ＳＣ＿Ｋ０８Ｄ１７（ＳｓＣｐｆ１）、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）（ＬｉＣｐｆ１）、ラクノスピラ菌  ＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）  Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）（ＣＭｔＣｐｆ１）、およびユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）（ＥｅＣｐｆ１）を含む、いくつかの細菌において特定されている。Ｃｐｆ１のためのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、例えば、ラクノスピラ菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＷＰ＿０５１６６６１２８．１）、アシダミノコッカス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＷＰ＿０２１７３６７２２．１）、フランシセラ・ノビシダ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＡＶＣ４３８３３．１）、フランシセラ・ノビシダ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＷＰ００３０３４６４７）、野兎病菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＷＰ＿０７１３０４６２４．１）は、容易に利用可能である。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるように、Ｃｐｆ１は、さらに変異体、融合、およびそれに関連する核酸複合体を指す。
【００３０】
本明細書で使用されるように、用語「ＣＲＩＳＰＲファージ」、「ＣＲＩＳＰＲ増強ファージ（ＣＲＩＳＰＲ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｈａｇｅ）」、および「ｃｒＰｈａｇｅ」は、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含むバクテリオファージＤＮＡを含む、バクテリオファージの粒子を指す。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の少なくとも１つの構成要素（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ｃｒＲＮＡ；例えば、ｃｒＲＮＡ標的化の挿入を含むＰＩバクテリオファージ）をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のＣｐｆ１をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡ核酸配列は、細菌中の内因性染色体配列へと外因性Ｃｐｆ１の活性を向けて、二本鎖切断を引き起こすために使用される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の少なくとも１つの転写活性化因子をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドの少なくとも１つの構成要素をコードする。
【００３１】
本明細書で使用されるように、２つの核酸分子、ヌクレオチド配列、またはタンパク質配列の文脈における句「実質的に同一」、または「実質的な同一性」とは、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、あるいは外観検査によって測定されるような、最大の対応のために比較および整列される場合、少なくとも約５０％、５１％  ５２％  ５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％  ８６％  ８７％  ８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する、２つ以上の配列あるいはサブ配列を指す。いくつかの実施形態では、実質的な同一性は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する、２つ以上の配列あるいはサブ配列を指す。配列比較のために、典型的に、１つの配列は基準配列として作用し、それに対して試験配列が比較され得る。配列比較アルゴリズムを使用して、試験配列と基準配列をコンピュータに入力し、その後の座標が必要に応じて指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが指定される。その後、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００３２】
比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索法（ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ）などのツールによって、および随意に、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどのこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって、実施される。試験配列および基準配列の整列したセグメントのための「同一性フラクション」は、基準配列セグメント（つまり、全基準配列、基準配列のより小さな定義された部分）における構成要素の合計数で割られた、２つの整列した配列によって共有される同一の構成要素の数である。パーセント配列同一性は、同一性フラクションに１００を掛けたものとして表される。１つ以上のポリヌクレオチド配列の比較は、完全長のポリヌクレオチド配列あるいはその一部、またはより長いポリヌクレオチド配列に対するものである。いくつかの実施形態において、「パーセント同一性」はさらに、翻訳されたヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＸバージョン２．０を、ポリヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組換え核酸分子、ヌクレオチド配列、およびポリペプチドは「単離される」。「単離された」核酸分子、「単離された」ヌクレオチド配列、または「単離された」ポリペプチドは、その自然環境（ｎａｔｉｖｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）とは別に存在する核酸分子、ヌクレオチド配列、あるいはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子、ヌクレオチド配列あるいはポリペプチドは、例えば、自然発生の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離される精製された形態、例えば、細胞またはウイルスの構造成分、あるいはポリヌクレオチドに関連して一般的に見られる他のポリペプチドまたは核酸に存在する。代表的な実施形態では、単離された核酸分子、単離されたヌクレオチド配列、および／または単離されたポリペプチドは、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、あるいはそれよりも純粋である。
【００３４】
本明細書で使用されるように、用語「抗ＣＲＩＳＰＲ」または「Ａｃｒ」は、機能性の抗ＣＲＩＳＰＲ活性を有する任意のタンパク質あるいは遺伝子産物を指す。文献における一貫性の欠如により、当業者は、様々な抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質を示す用語の互換性を理解する。本明細書で使用されるように、例えば、Ａｃｒ１−Ｂｏの呼称はＡｃｒＩＩＣ１Ｂｏｅと交換可能であり、Ａｃｒ−２Ｎｍの呼称は、ＡｃｒＩＩＣ２Ｎｍｅと交換可能である。さらに、本明細書で使用されるように、Ａｃｒ８８ａ−３２の呼称はＡｃｒＥ２と交換可能である。抗ＣＲＩＳＰＲのタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系などの細菌ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の機能を妨げる活性を有する任意のバクテリオファージタンパク質である。抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の活性は、宿主菌が、侵入するバクテリオファージに対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ベースの防御を開始するのを防ぐ。
【００３５】
用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」によって、被験体の疾病の重症度が低下するか、あるいは少なくとも部分的に改善もしくは修正され、および、少なくとも１つの臨床症状におけるいくらかの軽減、緩和、あるいは減少が達成され、および／または疾患または疾病の進行を遅らせ、および／または疾患あるいは病気の発症を遅らせることが意図される。感染症、疾患、または疾病に関して、上記用語は、感染症、疾患、または疾病の症状あるいは他の徴候の減少を指す。いくつかの実施形態では、処置は、感染症、疾患、または疾病の症状あるいは他の徴候の少なくとも約５％、例えば、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％あるいはそれ以上の減少をもたらす。
【００３６】
本明細書で使用される「感染症」、「疾患」、または「疾病」に関する用語は、被験体の任意の有害な（ａｄｖｅｒｓｅ）、陰性の、あるいは有害な（ｈａｒｍｆｕｌ）生理学的状態を指す。いくつかの実施形態では、「感染症」、「疾患」、または「疾病」の源は、被験体における標的細菌集団の存在である。いくつかの実施形態では、細菌集団は、１つ以上の標的細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌集団中の１つ以上細菌は、１つ以上細菌の１つ以上の菌株を含む。いくつかの実施形態では、「感染症」、「疾患」、または「疾病」を引き起こす標的細菌集団は、急性あるいは慢性である。いくつかの実施形態では、「感染症」、「疾患」、または「疾病」を引き起こす標的細菌集団は、局地性あるいは全身性である。いくつかの実施形態では、「感染症」、「疾患」、または「疾病」を引き起こす標的細菌集団は特発性である。いくつかの実施形態では、「感染症」、「疾患」、または「疾病」を引き起こす標的細菌集団は、限定されないが、呼吸吸入（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）、食物摂取、皮膚感染および創傷感染、血流感染、中耳感染、胃腸管感染、腹膜感染、尿路感染、尿生殖路感染、口腔軟組織感染、腹腔内感染、表皮吸収あるいは粘膜吸収、眼感染（コンタクトレンズ汚染を含む）、心内膜炎、嚢胞性線維症における感染、関節装具、歯科インプラント、カテーテルと心臓用インプラントなどの留置医療機器の感染、性的接触、院内感染の細菌性肺炎および／またはと人工呼吸器関連細菌性肺炎を含む、手段によって獲得される。
【００３７】
本明細書で使用されるように、用語「バイオフィルム」は、多糖類のマトリックスに埋め込まれた微生物の蓄積を意味する。いくつかの実施形態では、バイオフィルムは固体生物あるいは非生物の表面に形成され、医学的に重要であり、身体における微生物感染の８０パーセント以上を占める。
【００３８】
用語「防ぐ（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「防ぐこと（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（ならびにその文法的変異）は、被験体における感染症、疾患、疾病、ならびに／あるいは臨床症状の発症の予防および／または遅延、および／または、疾患、疾病、および／または臨床症状の発症前に本明細書に開示される方法を実施しない場合に生じるものと比べて、感染症、疾患、疾病、ならびに／あるいは臨床症状の発症の重症度の低減を指す。したがって、いくつかの実施形態では、感染症を防ぐために、食物、表面、医療器具および装置は、本明細書に開示される組成物および方法によって処理される。
【００３９】
本明細書に開示される「被験体」は、細菌が関与する感染症、疾患、または疾病を有しているか、あるいは細菌が関与する感染症、疾患、または疾病になりやすい、あらゆる動物を含む。したがって、いくつかの実施形態では、被験体は、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、または魚である。哺乳類の被験体としては、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、ゴリラ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーなど）、イヌ、ネコ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジなど、ならびに実験動物（例えば、ラット、モルモット、マウス、スナネズミ、ハムスターなど）が挙げられる。鳥類の被験体としては、限定されないが、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ウズラ、キジと、ペットとして飼育されているトリ（例えば、インコ、オウム、コンゴウインコ、バタンインコ、カナリアなど）が挙げられる。いくつかの実施形態では、適切な被験体は、オスおよびメスの両方の、胚性の（例えば、子宮内あるいは卵内）、幼児の、若年期の、青年期の、成人の、ならびに老齢期の被験体を含む、あらゆる年齢の被験体を含む。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
【００４０】
「薬学的に許容可能な」とは、生物学的にあるいはその他の好ましくないものではない材料を意味し、つまり、その材料は、毒性などのいかなる好ましくない生物学的効果も引き起こさずに、被験体に投与される。
【００４１】
本明細書の発明の要約を含む、本明細書でより詳細に記載されるように、細菌を死滅させる方法（例えば、そのような標的細菌を死滅させる、例えば、そのような標的細菌を選択的に死滅させるのに適した、選択的に死滅させるように設計された、あるいは選択的に死滅させるのに適切なバクテリオファージなどを有する標的細菌）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系、バクテリオファージ（例えば、そのような標的細菌を死滅させる、例えば、そのような標的細菌を選択的に死滅させるのに適した、選択的に死滅させるように設計された、あるいは選択的に死滅させるのに適切な）、および、他の構成要素、工程、ならびに他の部分を、上記発明の概要、そうでなければ本明細書に記載されるように、個々に、あるいは組み合わせて調節する方法が本明細書で提供される。
【００４２】
特に、ある実施形態では、標的細菌を死滅させるための方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、標的細菌を死滅させるための方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、上記方法は、（ａ）スペーサー配列またはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸と、（ｂ）外因性Ｃｐｆ１をコードする第２の核酸とを含むバクテリオファージを、標的細菌に導入する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、（ａ）スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸と、（ｂ）標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする第２の核酸とを含むバクテリオファージを、標的細菌に導入する工程を含む。特定の実施形態では、スペーサー配列は、標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの特定の実施形態では、標的細菌は、スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡを使用して、バクテリオファージの溶菌活性、および／またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性によって死滅される。
【００４３】
ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性を調節するための方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性を調節するための方法は：外因性Ｃｐｆ１をコードする核酸を含むバクテリオファージを導入する工程を含む。いくつかの実施形態では、細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性を調節するための方法は：標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする核酸を含むバクテリオファージを導入する工程を含む。
【００４４】
ある実施形態では、標的細菌を死滅させるための方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、標的細菌を死滅させる方法は：（ａ）溶菌活性と、（ｂ）抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列とを含むバクテリオファージを、標的細菌に導入する工程を含み、ここで、上記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、バクテリオファージの溶菌活性を増強する。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、遺伝子調節干渉を含むプロセスを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ヌクレアーゼ動員干渉を含むプロセスを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する。
【００４５】
特定の実施形態では、バクテリオファージが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、スペーサー配列またはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸を含む。特定の実施形態では、スペーサー配列は、標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、外因性Ｃｐｆ１をコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする第２の核酸を含む。特定の実施形態では、標的細菌は、スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡを使用して、バクテリオファージの溶菌活性またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性によって死滅される。
【００４６】
ある実施形態では、外因性Ｃｐｆ１をコードする核酸を含むバクテリオファージがある。
【００４７】
ある実施形態では、標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする核酸を含むバクテリオファージがある。
【００４８】
ある実施形態では、バクテリオファージが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、（ａ）溶菌活性と、（ｂ）抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列とを含む。特定の実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、バクテリオファージの溶菌活性を増強する。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、遺伝子調節干渉を含むプロセスを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ヌクレアーゼ動員干渉を含むプロセスを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する。
【００４９】
ある実施形態では、本明細書で提供されるバクテリオファージは、標的細菌を選択的に死滅させ、例えば、標的細菌ではない細菌は、標的細菌よりも劣った比率、例えば、標的細菌と比べて、５０％未満の比率、２５％未満の比率、１０％未満の比率、あるいは約０％の比率（つまり、全くない）で死滅される。本明細書で提供されるある方法においてなど、いくつかの例では、非標的細菌の５０％未満が死滅し、５％未満、１０％未満、２０％未満、２５％未満などが死滅される。
【００５０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は、細菌および古細菌で見られる自然適応免疫系である。ＣＲＩＳＰＲ系は、後天性免疫の形態をもたらす、侵入するファージおよびプラスミドに対する防御に関与するヌクレアーゼ系である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲアレイの処理は限定されないが、以下の工程を含む：１）ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡへのＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸の転写；２）成熟ｃｒＲＮＡへのＣｐｆ１によるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ処理；３）Ｃｐｆ１との成熟ｃｒＲＮＡ複合体形成；４）複合体化された成熟ｃｒＲＮＡ／Ｃｐｆ１による標的認識；および５）二本鎖ＤＮＡ切断につながり、５’オーバーハングをもたらす、標的におけるヌクレアーゼ活性。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲアレイは、処理された成熟ｃｒＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、成熟ｃｒＲＮＡは、ファージまたは本明細書に記載される標的細菌に導入される。いくつかの実施形態では、ファージは、処理された成熟ｃｒＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、内因性または外因性のＣｐｆ１は、成熟ｃｒＲＮＡへとＣＲＩＳＰＲアレイを処理する。いくつかの実施形態では、外因性Ｃｐｆ１はファージに導入される。いくつかの実施形態では、ファージは外因性Ｃｐｆ１を含む。いくつかの実施形態では、外因性Ｃｐｆ１は標的細菌に導入される。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は標的細菌に内因性である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は標的細菌に外因性である。
【００５４】
ＣＲＩＳＰＲアレイ
Ｃｐｆ１と適合するＣＲＩＳＰＲアレイが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸は、標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である、少なくとも１つの反復配列および少なくとも１つのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイは任意の長さのものであり、かつ、１つ以上の標的遺伝子の使用によって標的細菌の死滅の所望のレベルを達成するのに必要な反復ヌクレオチド配列と交互になる任意の数のスペーサーヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、１〜約１００のスペーサーヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、その各々は、その５’末端およびその３’末端上で反復ヌクレオチド配列に連結される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組換えＣＲＩＳＰＲアレイは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上から本質的になるか、あるいはそれからなる。
【００５５】
スペーサーヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイは複数のスペーサーを含み、ここで、各スペーサーは、標的遺伝子の複数の遺伝子位置を標的とし、本明細書では多重スペーサーとも呼ばれる。いくつかの実施形態では、多重スペーサー（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｐａｃｅｒ）は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのスペーサーを含む。いくつかの実施形態において、多重スペーサーは、少なくとも４つのスペーサーを含む。４つの単一スペーサーと比較された４つのスペーサーを含む多重スペーサーの例が、図１１Ｃに示される。ある実施形態では、標的細菌を死滅させるための方法が本明細書に記載され、上記方法は、多重スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする核酸を含むベクターを投与する工程を含み、ここで上記多重スペーサー配列は、上記標的細菌中の標的遺伝子からの少なくとも２つの標的ヌクレオチド配列に相補的である少なくとも２つのスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、多重スペーサー配列は、必須遺伝子を標的とするスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、多重スペーサー配列は、必須遺伝子のみを標的とするスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、多重スペーサー配列は、非必須遺伝子を標的とするスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、多重スペーサー配列は、非必須遺伝子のみを標的とするスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、多重スペーサー配列は、必須遺伝子および非必須遺伝子を標的とするスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、多重スペーサーは、本明細書に記載される長さである。
【００５６】
スペーサー
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡと比較して、本明細書に記載されるスペーサー配列は、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、ミスマッチは隣接している。いくつかの実施形態では、ミスマッチは隣接していない。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、標的ＤＮＡに対して７０％の相補性を有する。いくつかの実施形態では、スペーサーヌクレオチド配列は、標的ＤＮＡに対して８０％の相補性を有する。いくつかの実施形態では、スペーサーヌクレオチド配列は、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対して、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補性である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、標的ＤＮＡに対して１００％の相補性を有する。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、少なくとも約８つのヌクレオチド〜約１５０のヌクレオチドの長さである標的ヌクレオチド配列の領域にわたって、完全な相補性あるいは実質的な相補性を有する。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、少なくとも約２０のヌクレオチド〜約１００のヌクレオチドの長さである標的ヌクレオチド配列の領域にわたって、完全な相補性または実質的な相補性を有する。いくつかの実施形態では、スペーサー配列の５’領域は、標的ＤＮＡに対して１００％相補的であるが、スペーサーの３’領域は、標的ＤＮＡに対して実質的に相補的であり、したがって、標的ＤＮＡに対するスペーサー配列の全体的な相補性は１００％未満である。例えば、いくつかの実施形態では、２０のヌクレオチドスペーサー配列の３’領域における最初の７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６のヌクレオチド（シード領域）は、標的ＤＮＡに対して１００％相補的であるが、上記スペーサー配列の５’領域中の残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡに対して実質的に相補的（例えば、少なくとも約７０％相補的）である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列の３’末端の最初の７〜１２のヌクレオチドは標的ＤＮＡに対して１００％相補的であるが、スペーサー配列の５’領域中の残りのヌクレオチドは標的ＤＮＡに対して実質的に相補的（例えば、少なくとも約５０％相補的（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％  ９８％  ９９％、またはそれ以上）である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列の３’末端の最初の７〜１０のヌクレオチドは標的ＤＮＡに対して７５％〜９９％相補的であるが、スペーサー配列の５’領域中の残りのヌクレオチドは標的ＤＮＡに対して少なくとも約５０％〜約９９％相補的である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列の３’末端の最初の７〜１０のヌクレオチドは標的ＤＮＡに対して１００％相補的であるが、スペーサー配列の５’領域中の残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡに対して実質的に相補的（例えば、少なくとも約７０％相補的）である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列の最初の１０のヌク��オチド（シード領域内の）は、標的ＤＮＡに対して１００％相補的であるが、スペーサー配列の５’領域中の残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡに対して実質的に相補的（例えば、少なくとも約７０％相補的）である。いくつかの実施形態において、スペーサー配列の５’領域（例えば、５’末端における最初の８つのヌクレオチド、５’末端における最初の１０のヌクレオチド、５’末端における最初の１５のヌクレオチド、５’末端における最初の２０のヌクレオチド）は、標的ＤＮＡに対して約７５％以上の相補性（７５％〜約１００％相補性）を有するが、スペーサー配列の残りは、標的ＤＮＡに対して約５０％以上の相補性を有する。いくつかの実施形態では、スペーサー配列の５’末端における最初の８つのヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列に対して１００％の相補性を有しているか、または１つあるいは２つの突然変異を有しており、したがって、標的ＤＮＡに対して、それぞれ約８８％相補的であるか、または約７５％相補的であるが、スペーサーヌクレオチド配列の残りは、標的ＤＮＡに対して少なくとも約５０％以上相補的である。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるスペーサー配列は、約１５のヌクレオチド〜約１５０のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、スペーサーヌクレオチド配列は、約１５のヌクレオチド〜約１００のヌクレオチドの長さである（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００のヌクレオチド以上）。いくつかの実施形態では、スペーサーヌクレオチド配列は、約８〜約１５０のヌクレオチド、約８〜約１００のヌクレオチド、約８〜約５０のヌクレオチド、約８〜約４０のヌクレオチド、約８〜約３０のヌクレオチド、約８〜約２５のヌクレオチド、約８〜約２０のヌクレオチド、約１０〜約１５０のヌクレオチド、約１０〜約１００のヌクレオチド、約１０〜約８０のヌクレオチド、約１０〜約５０のヌクレオチド、約１０〜約４０、約１０〜約３０、約１０〜約２５、約１０〜約２０、約１５〜約１５０、約１５〜約１００、約１５〜約５０、約１５〜約４０、約１５〜約３０、約２０〜約１５０のヌクレオチド、約２０〜約１００のヌクレオチド、約２０〜約８０のヌクレオチド、約２０〜約５０のヌクレオチド、約２０〜約４０、約２〜約３００、約２０〜約２５、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３２、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも４４、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０のヌクレオチドの長さ、またはそれ以上の長さ、およびその中の任意の範囲あるいは値の長さである。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上のスペーサーヌクレオチド配列の同一性は同じである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上のスペーサーヌクレオチド配列の同一性は異なる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上のスペーサーヌクレオチド配列の同一性は異なるが、１つ以上の標的ヌクレオチド配列に対して相補的である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上のスペーサーヌクレオチド配列の同一性は異なり、重複する配列である１つ以上の標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上のスペーサーヌクレオチド配列の同一性は異なり、重複する配列ではない１つ以上の標的ヌクレオチド配列に相補的である。
【００５９】
コドン最適化
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、および／または組換え核酸分子（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイを含むポリヌクレオチド、Ｃｐｆ１ポリペプチド、転写活性化因子をコードするポリヌクレオチドなど）は、対象の任意の種における発現に最適化されたコドンである。コドン最適化は、種特異的なコドン使用頻度表を使用した、コドン使用バイアスのためのヌクレオチド配列の修飾を含む。コドン使用頻度表は、対象の種で最も高度に発現した遺伝子の配列分析に基づいて生成される。ヌクレオチド配列が核において発現される場合、コドン使用頻度表は、対象の種で高度に発現した核内遺伝子の配列分析に基づいて生成される。ヌクレオチド配列の修飾は、種特異的なコドン使用頻度表を天然のポリヌクレオチド配列中に存在するコドンと比較することによって、決定される。ヌクレオチド配列のコドン最適化は、天然のヌクレオチド配列に対して、１００％未満（例えば、５０％、６０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％など）の同一性を有するヌクレオチド配列を結果としてもたらすが、もとのヌクレオチド配列によってコードされたものと同じ機能を有するポリペプチドを依然としてコードする。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド配列および／または組換え核酸分子は、対象の生物／種における発現に最適化されたコドンである。
【００６０】
反復ヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイの反復ヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の任意の既知の反復ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系からの天然反復の二次構造（例えば、内部ヘアピン）を含む、合成配列である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサーヌクレオチド配列は、反復配列のその５’末端〜３’末端に連結される。いくつかの実施形態では、スペーサーヌクレオチド配列は、その５’末端において、反復ヌクレオチド配列の３’末端の約１〜約８、約１〜約１０、または約１〜約１５のヌクレオチドに連結される。いくつかの実施形態では、反復ヌクレオチド配列の約１〜約８、約１〜約１０、約１〜約１５のヌクレオチドは、反復ヌクレオチド配列の３’末端の一部である。いくつかの実施形態では、スペーサーヌクレオチド配列は、その３’末端において、反復ヌクレオチド配列の５’末端に連結される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、その３’末端において、反復ヌクレオチド配列の５’末端の約１〜約８、約１〜約１０、または１〜約１５のヌクレオチドに連結される。いくつかの実施形態では、反復ヌクレオチド配列の約１〜約８、約１〜約１０、約１〜約１５のヌクレオチドは、反復ヌクレオチド配列の５’末端の一部である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるスペーサーヌクレオチド配列は、その５’末端において第１の反復ヌクレオチド配列に連結され、かつその３’末端において第２の反復ヌクレオチド配列に連結されて、反復−スペーサー−反復配列を形成する。  いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるスペーサーは、その５’末端において、第１の反復配列の３’末端の約１〜約８、約１〜約１０、または約１〜約１５のヌクレオチドに連絡され、および、その３’末端において、第２の反復配列の５’末端の約１〜約８、約１〜約１０、または約１〜約１５のヌクレオチドに連結される。いくつかの実施形態では、第１の反復配列の約１〜約８、約１〜約１０、約１〜約１５のヌクレオチドは、第１の反復ヌクレオチド配列の３’末端の一部である。いくつかの実施形態では、第１の第２の配列（ｆｉｒｓｔ  ｓｅｃｏｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の約１〜約８、約１〜約１０、約１〜約１５のヌクレオチドは、第２の反復ヌクレオチド配列の３’末端の一部である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるスペーサーヌクレオチド配列は、その５’末端において第１の反復ヌクレオチド配列の３’末端に連結され、および、その３’末端において第２の反復ヌクレオチド配列の５’末端に連結され、スペーサーヌクレオチド配列および第２の反復ヌクレオチド配列が反復されて、ｎが１から１００までの任意の整数であるように反復−（スペーサー−反復）ｎ配列を形成する。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に開示される反復−（スペーサー−反復）ｎ配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、あるいはそれ以上のスペーサーヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【００６３】
したがって、いくつかの実施形態では、反復配列は、野生型Ｃｐｆ１遺伝子座からの反復配列と同一であるか、または実質的に同一である。いくつかの実施形態では、反復配列は、野生型反復配列（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１  １、１２、１３、１４、１５以上の野生型反復配列の隣接するヌクレオチド）の一部を含む。いくつかの実施形態では、反復配列は、少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、またはそれ以上のヌクレオチド、あるいはその中の任意の範囲）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【００６４】
調節エレメント
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組換えＣＲＩＳＰＲアレイ、ヌクレオチド配列、および／または核酸分子は、様々な生物あるいは細胞における発現のための様々なプロモーター、ターミネーター、および他の調節エレメントに作動可能に関連する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロモーターおよび／またはターミネーターは、本明細書に開示される組換え核酸分子および／または組換えＣＲＩＳＰＲアレイに作動可能に連結される。本開示で有用なあらゆるプロモーターは使用され、例えば、対象の生物で機能的であるプロモーター、および、本明細書に記載されるような構成的プロモーター、誘導性プロモーター、発生調節されたプロモーター、組織に特異的／好ましいプロモーターなどを含む。本明細書で使用される調節エレメントは、内因性または異種である。いくつかの実施形態では、被験体生物に由来する内因性調節エレメントは、それが自然に発生しない遺伝学的状況（例えば、自然界で見られるものとは異なるゲノムにおける位置）に挿入され、それにより、組換え核酸または非天然核酸を産生する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される構築物の発現は、構成的であるか、誘導性であるか、一時的に調節されるか、発生調節されるか、または化学的に調節される。いくつかの実施形態では、構築物は、その構築物を、対象生物において機能的であるプロモーターに作動可能に連結することによって、構成的になるか、誘導性になるか、一時的に調節されるか、発生調節されるか、または化学的に調節される。いくつかの実施形態では、抑制は、本明細書に開示される組換え核酸構築物を、対象生物において機能的である誘導可性プロモーターに作動可能に連結することによって、可逆的になる。本明細書に記載されるプロモーターの選択は、発現のための定量的要件、時間的要件、および空間的要件に応じて、ならびに形質転換される宿主細胞に応じて変わる。
【００６６】
本明細書に開示される方法、バクテリオファージ、および組成物とともに使用される例示的なプロモーターは、細菌において機能的であるプロモーターを含む。例えば、Ｌ−アラビノース誘導性（ａｒａＢＡＤ、ＰＢＡＤ）プロモーター、任意のｌａｃプロモーター（ｌａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、Ｌ−ラムノース誘導性（ｒｈａＰＢＡＤ）プロモーター、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、λファージプロモーター（ｐＬｐＬ−９Ｇ−５０）、アンヒドロテトラサイクリン誘導性（ｔｅｔＡ）プロモーター、ｔｒｐ、Ｉｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｃａｄＡ、ｎａｒ、Ｉｐｐ−ｌａｃ、ｃｓｐＡ、１１−ｌａｃオペレーター、Ｔ３−オペレーター、Ｔ４遺伝子３２、Ｔ５−ｌａｃオペレーター、ｎｐｒＭ−ｌａｃオペレーター、Ｖｈｂ、プロテインＡ、コリネバクテリアの大腸菌様プロモーター（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｌ−Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｌｉｋｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）、ｔｈｒ、ｈｏｒｎ、ジフテリア毒素プロモーター、ｓｉｇ  Ａ、ｓｉｇ  Ｂ、ｎｕｓＧ、ＳｏｘＳ、ｋａｔｂ、αアミラーゼ（Ｐａｍｙ）、Ｐｔｍｓ、Ｐ４３（２つの重複するＲＮＡポリメラーゼσ因子認識部位、σΑ、σΒに含んだ）、Ｐｔｍｓ、Ｐ４３、ｒｐｌＫ−ｒｐｌＡ、フェレドキシンプロモーター、および／またはキシロースプロモーター。
【００６７】
いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターが使用される。ある実施形態では、化学調節プロモーターは、外因性化学調節因子の適用によって、生物中の遺伝子の発現を調節するために使用される。化学調節されたプロモーターの使用により、例えば、生物が誘導する化学物質で処置される場合のみ、本明細書に開示されるＲＮＡおよび／またはポリペプチドを合成することが可能になる。いくつかの実施形態では、化学誘導性プロモーターが使用される場合、化学物質の適用は遺伝子発現を誘発する。いくつかの実施形態では、化学抑制性プロモーターが使用され、化学物質の適用により遺伝子発現を抑制する。いくつかの実施形態では、プロモーターは光誘導性プロモーターであり、光の特定波長の適用により遺伝子発現を誘発する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、光抑制性プロモーターであり、光の特定波長の適用により遺伝子発現を抑制する。
【００６８】
形質転換
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるヌクレオチド配列、構築物、および発現カセットは、一過性に発現され、および／または宿主生物のゲノムへと安定して組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、当業者に既知の任意の方法によって細胞に導入される。形質転換の例示的な方法は、コンピテント細胞のエレクトロポレーションによる形質転換、コンピテント細胞による受動的取り込み（ｐａｓｓｉｖｅ  ｕｐｔａｋｅ）、コンピテント細胞の化学変換、および、細胞への核酸の導入を結果としてもたらす他の電気的、化学的、物理的（機械的）および／または生物学的な機構を含む（それらの任意の組み合わせを含む）。いくつかの実施形態では、細胞の形質転換は核形質転換を含む。いくつかの実施形態では、細胞の形質転換は、プラスミド形質転換およびプラスミド接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、１つを超えるヌクレオチド配列が導入される場合、ヌクレオチド配列は、単一の核酸構築物の一部として、または別個の核酸構築物として組み立てられ、同じまたは異なる核酸構築物上に位置する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、単一の形質転換事象、あるいは別個の形質転換事象において、対象の細胞へと導入される。
【００７０】
発現カセット
いくつかの実施形態では、核酸構築物は「発現カセット」であるか、または発現カセット内にある。本明細書で使用されるように、「発現カセット」は、対象のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に開示される組換え核酸分子およびＣＲＩＳＰＲアレイ）を含む組換え核酸分子を意味し、ここで、上記ヌクレオチド配列は、対照配列（例えば、プロモーター）と作動可能に少なくとも関連する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、本明細書に開示される組換え核酸分子および／または組換えＣＲＩＳＰＲアレイを発現するように設計される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、対象のヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラであり、これは、その成分の少なくとも１つがその他の成分の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。いくつかの実施形態では、発現カセットは自然発生するが、異種発現に有用な組換え形態で得られている。
【００７２】
いくつかの実施形態では、発現カセットは、選択された宿主細胞において機能的である、転写終止領域および／または翻訳終止領域（つまり、終止領域）を含む。いくつかの実施形態では、終止領域は、対象の異種ヌクレオチド配列を超えた転写の終止、および適切なｍＲＮＡポリアデニル化について責任を負う。いくつかの実施形態では、終止領域は、転写開始領域に固有であるか、対象の作動可能に連結されたヌクレオチド配列に固有であるか、宿主細胞に固有であるか、または別の源に由来する（つまり、プロモーターに対して、対象のヌクレオチド配列に対して、宿主に対して、外来性あるいは異種であるか、もしくはそれらの任意の組み合わせ）。いくつかの実施形態では、ターミネーターは、本明細書に開示される組換え核酸分子およびＣＲＩＳＰＲアレイに作動可能に連結される。
【００７３】
いくつかの実施形態では、発現カセットは、選択可能なマーカーのためのヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用されるように、「選択可能なマーカー」とは、発現されると、マーカーを発現する宿主細胞に明確な表現型を与え、したがって、そのような形質転換細胞を、マーカーを持たない細胞と区別することを可能にする、ヌクレオチド配列を意味する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、マーカーが、化学的な手段によって、例えば、選択的な薬剤（例えば、抗生物質）を使用することによって、選択された形質を与えるか否かに応じて、または、マーカーが単に、観察もしくは試験、例えば、スクリーニング（例えば、蛍光）によって識別することができる形質であるか否かに応じて、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーのいずれかをコードする。
【００７４】
ベクター
発現カセットに加えて、本明細書に記載される核酸分子およびヌクレオチド配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイを含むポリヌクレオチド、転写活性化因子をコードするポリヌクレオチド、Ｃｐｆ１をコードするポリヌクレオチド、または抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチド）は、ベクターに関連して使用される。用語「ベクター」は、核酸（複数可）を細胞へと移行するか、送達するか、または導入するための組成物を指す。ベクターは、移行されるか、送達されるか、導入されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子を含む。一般的なクラスのベクターの非限定的な例としては、限定されないが、自己伝達性あるいは可動性である場合とそうでない場合がある、二本鎖もしくは一本鎖の直鎖状あるいは環状の形態の、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、バクテリオファージ、人工染色体、またはアグロバクテリウムバイナリーベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターはバクテリオファージである。いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミドである。
【００７５】
本明細書で定義されるベクターは、細胞ゲノムへの組込み、あるいは染色体外の存在（例えば、複製開始点を有する自己複製プラスミド）のいずれかによって、原核生物あるいは真核生物の宿主を形質転換する。シャトルベクターがさらに含まれており、このことは、２つの異なる宿主生物において、自然に、または設計により、複製が可能なＤＮＡビヒクルを意味する。いくつかの実施形態では、シャトルベクターは、放線菌ならびに細菌および／または真核生物を複製する。いくつかの実施形態では、ベクター中の核酸は、適切なプロモーターあるいは宿主細胞における転写のための他の調節エレメントの制御下にあり、かつそれらに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ベクターは、複数の宿主において機能的である二機能性発現ベクター（ｂｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ベクターは、スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸を含み、ここで、上記スペーサー配列は、標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態では、ベクターは第２の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の核酸は、ＤＮＡ修復を阻害する遺伝子をコードする。いくつかの実施形態では、第２の核酸は外因性Ｃｐｆ１をコードする。いくつかの実施形態では、第２の核酸は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆｌ系の転写活性化因子をコードする。他の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ修復を阻害する遺伝子をコードする第２の核酸と、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆｌ系の転写活性化因子をコードする第３の核酸の両方を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、第１の外因性Ｃｐｆ１をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする第１の核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする第１の核酸を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復を阻害する遺伝子はＧａｍである。Ｇａｍは、Ｍｕファージのバクテリオファージタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｇａｍは、ｒｅｃＡが結合しているＤＮＡ二本鎖切断に結合し、ｒｅｃＡの機能を阻害して死滅効率を増強する。いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書においてＧａｍまたはＭｕ−Ｇａｍとも呼ばれる、Ｇａｍタンパク質をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｇａｍタンパク質の発現は、構成的プロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、Ｇａｍタンパク質の発現を制御する構成的プロモーターは、Ｃｐｆ１またはＣＲＩＳＰＲアレイの発現をさらに制御する。
【００７８】
ある実施形態では、標的細菌を死滅させるための方法が本明細書に記載され、上記方法は、Ｇａｍタンパク質をコードする第１の核酸と、スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第２の第１の核酸（ｓｅｃｏｎｄ  ｆｉｒｓｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）とを含む、ベクターを投与する工程を含み、ここで、上記スペーサー配列は、標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は多重スペーサー配列である。
【００７９】
修復機構
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、核酸の二本鎖切断（ＤＮＡ二本鎖切断／開裂）を引き起こす。いくつかの実施形態では、二本鎖切断は、例えば、非相同末端結合、マイクロホモロジー媒介末端結合、あるいは相同組換え修復によって修理される。非相同末端結合は、ドナーポリヌクレオチドを必要とせずに、切断の１つの末端を切断のもう１つの末端に直接ライゲーションすることによる、ＤＮＡにおける二本鎖切断の修復を指す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼＩＶは、補助因子ＸＲＣＣ４との複合体を形成し、ＤＮＡ切断の２つの末端を直接結合する。相同組換え修復は、修復のための鋳型の存在に依存する。ゲノム工学のいくつかの例では、ドナーポリヌクレオチドまたはその一部は切断に挿入される。いくつかの実施形態では、ＲｅｃＡは、二本鎖ＤＮＡ切断の修復を開始する。いくつかの実施形態では、ＡｄｄＡＢは、二本鎖ＤＮＡ切断の修復を開始する。いくつかの実施形態では、ＲｅｃＢＣＤ酵素は、相同組換えにより二本鎖ＤＮＡ切断の修復を開始する。いくつかの実施形態では、二本鎖切断を修復する酵素は、ヘリカーゼ・ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、リガーゼＡは二本鎖切断修復に関与する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される系は、二本鎖切断修復の阻害剤を送達するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される系は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系および二本鎖切断修復の阻害剤を送達するために使用される。いくつかの実施形態では、外因性分子はＤＮＡ修復を阻害する。いくつかの実施形態では、上記分子は、二本鎖切断の末端を結合し、二本鎖切断修復を阻害する、外因性タンパク質である。いくつかの実施形態では、上記タンパク質はＭｕファージＧａｍタンパク質である。いくつかの実施形態では、上記タンパク質はλファージＧａｍタンパク質である。いくつかの実施形態では、上記タンパク質はファージＴ７  ｇｐ５．９タンパク質である。いくつかの実施形態では、上記タンパク質は、ＲｅｃＡ、ｒｅｃＢＣＤ、またはＡｄｄＡＢ阻害剤である。いくつかの実施形態では、上記タンパク質はＲｅｃＡ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、上記タンパク質はｒｅｃＢＣＤ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、上記タンパク質はＡｄｄＡＢ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、二本鎖切断修復を阻害する本明細書に記載されるタンパク質は、標的細菌あるいは本明細書に開示されるバクテリオファージによって発現される。いくつかの実施形態では、標的細菌を死滅させるための方法が本明細書に記載され、上記方法は：スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸であって、上記スペーサー配列は、標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である、第１の核酸と；二本鎖切断修復を阻害するタンパク質をコードする第２の核酸とを含むバクテリオファージを、標的細菌に導入する工程を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、１つ以上の組成物、例えば、小有機分子、ペプチド、あるいは核酸を含み、それは二本鎖切断修復を阻害するか、減少させるか、無効にする。
【００８１】
バクテリオファージ
バクテリオファージまたは「ファージ」は、細菌ウイルスのグループを表し、環境源から設計あるいは供給される。個々のバクテリオファージ宿主域は通常狭く、このことは、ファージが、細菌種の１つの菌種あるいはわずかな菌種に高度に特異的であることを意味し、この特異性は抗菌作用においてファージを独特にする。バクテリオファージは、宿主の細胞機構に依存して複製する細菌ウイルスである。一般に、ファージは通常、３つのカテゴリー：溶菌性（ｌｙｔｉｃ）、溶原性（ｌｙｓｏｇｅｎｉｃ）、およびテンペレート（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）に分類される。溶菌性バクテリオファージは宿主細胞を感染させ、複製の多数のラウンド（ｒｏｕｎｄｓ）を経験し、細胞溶解を引き起こし、新しく作られたバクテリオファージ粒子を放出する。溶原性バクテリオファージは、細菌ゲノム内に、または、染色体外プラスミドとして、宿主細胞内に永久に存在する。テンペレートバクテリオファージは、溶菌性または溶原性であることが可能であり、細胞の増殖条件および生理的状態に応じて、他方に対して一方（ｏｎｅ  ｖｅｒｓｕｓ  ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ）を選択する。いくつかの実施形態では、溶原菌が悪条件にさらされるときはいつでも、溶原性状態は終了する。このプロセスは誘導と呼ばれる。溶原性状態の終了を支持する悪条件は、乾燥、ＵＶまたは電離放射線への曝露、および変異原性化学物質への暴露を含む。このことは、ファージ遺伝子の発現、組み込みプロセスの逆転（ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）、および溶菌増殖につながる。
【００８２】
バクテリオファージは、３つの一般的なアプローチを使用して、合成ＤＮＡをパッケージし、送達する。第１のアプローチ下では、合成ＤＮＡは、バクテリオファージゲノムにランダムに再結合され、それは通常、選択可能なマーカーに関与する。第２のアプローチ下では、ファージ内の制限部位は、インビトロで合成ＤＮＡを導入するために使用される。第３のアプローチ下では、ファージ・パッケージング部位および溶菌性の複製開始点を通常コードするプラスミドは、バクテリオファージ粒子の集合体の一部としてパッケージされる（ｐａｃｋａｇｅｄ）。結果として生じるプラスミドには、「ファージミド」という新語が作り出されている。
【００８３】
ファージは、進化上の理由で一定の菌株に制限されている。それらの遺伝子材料を不適合性の株に注入することは逆効果である。したがって、ファージは、制限された株の断面に特異的に感染するように進化してきた。しかし、それらの遺伝子材料を広範囲の細菌に注入するいくつかのファージが発見されている。典型例はＰＩファージであり、これは、さまざまなグラム陰性菌にＤＮＡを注入することが示されている。
【００８４】
いくつかの実施形態では、バクテリオファージまたはファージミドＤＮＡは、溶原性バクテリオファージまたはテンペレートバクテリオファージに由来する。いくつかの実施形態では、バクテリオファージまたはファージミドＤＮＡは、偏性溶菌性バクテリオファージ（ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｌｙｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）に由来する。いくつかの実施形態では、バクテリオファージまたはファージミドとしては、限定されないが、ＰＩファージ、Ｍｌ  ３ファージ、λファージ、Ｔ４ファージ、ΦＣ２ファージ、ΦＣＤ２７ファージ、ΦＮＭｌファージ、Ｂｃ４３１  ｖ３ファージ、Φ１０ファージ、Φ２５ファージ、Φ１５１ファージ、Ａ５１１様ファージ、Ｂ０５４、０１７６様ファージ、あるいはカンピロバクターファージ（ＮＣＴＣ  １２６７６およびＮＣＴＣ  １２６７７など）が挙げられる。いくつかの実施形態では、バクテリオファージはΦＣＤ１４６クロストリジウム・ディフィシル・バクテリオファージである。いくつかの実施形態では、バクテリオファージはΦＣＤ２４−２クロストリジウム・ディフィシル・バクテリオファージである。いくつかの実施形態では、バクテリオファージはＴ４大腸菌バクテリオファージである。いくつかの実施形態では、バクテリオファージはＴ７大腸菌バクテリオファージである。いくつかの実施形態では、バクテリオファージはＴ７ｍ大腸菌バクテリオファージである。
【００８５】
いくつかの実施形態では、複数のバクテリオファージがともに使用される。いくつかの実施形態では、ともに使用される複数のバクテリオファージは、サンプルまたは被験体内の同じあるいは異なる細菌を標的とする。いくつかの実施形態では、ともに使用されるバクテリオファージは、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージ、Ｔ７ｍファージ、または本明細書に記載されるバクテリオファージの任意の組み合わせを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、対象のバクテリオファージは、環境源または商業的研究ベンダー（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｅｎｄｏｒｓ）から得られる。いくつかの実施形態では、得られたバクテリオファージは、細菌およびそれらの関連する菌種のライブラリーに対して溶菌活性についてスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、スクリーニングされた細菌において一次抵抗（ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を生成する能力について、細菌およびそれらの関連する菌種のライブラリーに対してスクリーニングされる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、標的細菌を死滅させるための方法が本明細書に開示され、上記方法は：スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする核酸であって、ここで、上記スペーサー配列は、上記標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である、核酸と；上記標的細菌の溶解を誘導することができる遺伝子とを含むバクテリオファージを、標的細菌に導入する工程を含み、ここで、上記標的細菌は、スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡを使用して、バクテリオファージの溶菌活性またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性によって死滅される。いくつかの実施形態において、スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡをコードする核酸であって、ここで、上記スペーサー配列は、標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である、核酸と；上記標的細菌の溶解を誘導することができる遺伝子とを含むバクテリオファージが本明細書に開示され  ここで、上記標的細菌は、スペーサー配列あるいはそれから転写されたｃｒＲＮＡを使用して、上記バクテリオファージの溶菌活性またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性によって死滅される。
【００８８】
挿入部位
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸のバクテリオファージへの導入は、上記バクテリオファージの溶菌活性を妨害しない。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸のバクテリオファージへの導入は、上記バクテリオファージの溶菌活性を保護する。いくつかの実施形態では、核酸は、バクテリオファージゲノムへと挿入される。いくつかの実施形態では、核酸は、対象のオペロンの末端に転写ターミネーター部位でバクテリオファージゲノムに挿入される。いくつかの実施形態では、１つ以上の除去された非必須遺伝子の代わりとして、核酸がバクテリオファージゲノムに挿入される。いくつかの実施形態では、１つ以上の除去された溶原性遺伝子（ｌｙｓｏｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅｓ）の代わりとして、核酸がバクテリオファージゲノムに挿入される。いくつかの実施形態では、非必須遺伝子および／または溶原性遺伝子の核酸との置換は、バクテリオファージの溶菌活性に影響しない。いくつかの実施形態では、非必須遺伝子および／または溶原性遺伝子の核酸との置換は、バクテリオファージの溶菌活性を保護する。いくつかの実施形態では、非必須遺伝子および／または溶原性遺伝子の核酸との置換は、バクテリオファージの溶菌活性を増強する。いくつかの実施形態では、非必須遺伝子および／または溶原性遺伝子の核酸との置換は、溶原性バクテリオファージを溶菌性にする。
【００８９】
いくつかの実施形態では、核酸は、最初の位置でバクテリオファージゲノムへ導入される一方、１つ以上の非必須遺伝子および／または溶原性遺伝子は、別々の位置でバクテリオファージゲノムから別々に除去および／または不活性化される。いくつかの実施形態では、１つ以上の非必須遺伝子および／または溶原性遺伝子の除去および／または不活性化は、バクテリオファージの溶菌活性に影響しない。いくつかの実施形態では、１つ以上の非必須遺伝子および／または溶原性遺伝子の除去および／または不活性化は、バクテリオファージの溶菌活性を保護する。いくつかの実施形態では、１つ以上の非必須遺伝子および／または溶原性遺伝子の除去は、溶原性バクテリオファージを溶菌性バクテリオファージにする。同様に、いくつかの実施形態では、１つ以上の溶菌性遺伝子は、非溶菌性で溶原性のバクテリオファージを溶菌性バクテリオファージにするために、溶菌性バクテリオファージへと導入される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、前述の手段のいずれかによって溶菌性にされているテンペレートバクテリオファージである。いくつかの実施形態では、テンペレートバクテリオファージは、１つ以上の溶原性遺伝子の除去、置換、または不活性化によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態では、バクテリオファージの溶菌活性は、少なくとも１つの溶原性遺伝子の除去、置換、または不活性化によるものである。いくつかの実施形態では、テンペレートバクテリオファージは、１つ以上の溶原性遺伝子の除去、置換、または不活性化によって溶菌性にされ、および、標的細菌中の標的遺伝子における標的ヌクレオチド配列に相補的な少なくとも１つのスペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む。いくつかの実施形態では、テンペレートバクテリオファージは、１つ以上の溶原性遺伝子に向けられたスペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイを介した、１つ以上の溶原性遺伝子の除去、置換、または不活性化によって溶菌性にされ、および、標的細菌中の標的遺伝子における標的ヌクレオチド配列に相補的な少なくとも１つのスペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む。いくつかの実施形態では、溶原性遺伝子は、バクテリオファージ中の溶原性サイクルの保守において役割を果たす。いくつかの実施形態では、溶原性の遺伝子は、バクテリオファージ中の溶原サイクルの確立において役割を果たす。いくつかの実施形態では、溶原性遺伝子は、バクテリオファージにおける溶原サイクルの確立と、溶原サイクルの維持の両方において役割を果たす。いくつかの実施形態では、溶原性遺伝子はリプレッサー遺伝子である。いくつかの実施形態では、溶原性遺伝子はｃＩ  リプレッサー遺伝子である。いくつかの実施形態では、溶原性遺伝子は活性化遺伝子である。いくつかの実施形態では、溶原性遺伝子はｃＩＩ遺伝子である。いくつかの実施形態では、溶原性遺伝子はｌｅｘＡ遺伝子である。いくつかの実施形態では、溶原性遺伝子はｉｎｔ（インテグラーゼ）遺伝子である。いくつかの実施形態では、２つ以上の溶原性遺伝子は、除去されるか、置換されるか、あるいは不活性化され、バクテリオファージ溶原サイクルの停止および／または溶菌サイクルの誘導を引き起こす。いくつかの実施形態では、テンペレートバクテリオファージは、１つ以上の溶菌性遺伝子の挿入によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態では、テンペレートバクテリオファージは、溶菌サイクルの誘導に寄与する１つ以上の遺伝子の挿入によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態では、テンペレートバクテリオファージは、溶菌サイクルの誘導に寄与する１つ以上の遺伝子の発現を変えることによって溶菌性にされる。いくつかの実施形態では、テンペレートバクテリオファージは、表現型的に、溶原性バクテリオファージから溶菌性バクテリオファージに変化する。いくつかの実施形態では、テンペレートバクテリオファージは、環境の変化によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態では、環境の変化としては、限定されないが、温度、ｐＨあるいは栄養素、抗生物質、過酸化水素、外来性ＤＮＡ、またはＤＮＡ損傷剤への暴露、有機体炭素の存在、および重金属の存在（例えば、クロム（ＶＩ））の形態）におけ���変化が挙げられる。いくつかの実施形態では、溶菌性にされるテンペレートバクテリオファージは、溶原性状態に戻らないように妨げられる。いくつかの実施形態では、溶菌性にされるテンペレートバクテリオファージは、追加のＣＲＩＰＳＲアレイを導入することによって、溶原性状態に戻らないように妨げられる。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、バクテリオファージの溶菌活性および／またはＣＲＩＳＰＲアレイの活性によって引き起こされる細胞死を超えて、標的細菌に新しい特性を与えない。
【００９１】
いくつかの実施形態では、１つ以上の非必須遺伝子および／または溶原性遺伝子の置換、除去、不活性化、またはそれらの任意の組み合わせは、化学的な、生化学的な、および／または、任意の適切な方法によって達成される。いくつかの実施形態では、１つ以上の溶菌性遺伝子の挿入は、相同組換えによる、任意の適切な化学的な、生化学的な、および／または物理的な方法によって達成される。
【００９２】
いくつかの実施形態では、バクテリオファージは偏性溶菌性バクテリオファージである。いくつかの実施形態では、バクテリオファージはΦＣＤ１４６クロストリジウム・ディフィシル・バクテリオファージである。いくつかの実施形態では、バクテリオファージはΦＣＤ２４−２クロストリジウム・ディフィシル・バクテリオファージである。いくつかの実施形態では、バクテリオファージはＴ４大腸菌バクテリオファージである。いくつかの実施形態では、バクテリオファージはＴ７大腸菌バクテリオファージである。いくつかの実施形態では、バクテリオファージはＴ７ｍ大腸菌バクテリオファージである。
【００９３】
非必須遺伝子
いくつかの実施形態では、バクテリオファージから除去および／または置換されるべき非必須遺伝子は、ΦＣＤ１４６クロストリジウム・ディフィシル・バクテリオファージからのｇｐ４９である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージから除去および／または置換されるべき非必須遺伝子は、ΦＣＤ２４−２Ｃクロストリジウム・ディフィシル・バクテリオファージからのｇｐ７５である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージから除去および／または置換されるべき非必須遺伝子は、Ｔ４大腸菌バクテリオファージからのｈｏｃ遺伝子である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージから除去および／または置換されるべき非必須遺伝子は、Ｔ７大腸菌バクテリオファージからのｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、ｇｐ４．７、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージから除去および／または置換されるべき非必須遺伝子は、Ｔ７ｍ大腸菌バクテリオファージからのｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、あるいはそれらの任意の組み合わせである。
【００９４】
増強された溶菌性バクテリオファージ
外因性Ｃｐｆ１をコードする核酸を含むバクテリオファージを産生する方法が本明細書に開示される。さらに、外因性Ｃｐｆ１をコードする核酸を含むバクテリオファージが本明細書に開示される。
【００９５】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする核酸を含む、バクテリオファージを産生する方法が本明細書で開示される。さらに、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする核酸を含む、バクテリオファージが本明細書に開示される。
【００９６】
いくつかの実施形態では、バクテリオファージへのＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１のための転写活性化因子をコードする核酸の導入は、標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性を調節するために使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージによって導入された転写活性化因子は、標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の発現を増大させる。いくつかの実施形態では、第１のバクテリオファージによる転写活性化因子の導入による標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の増加した発現は、前の実施形態で記載されるＣＲＩＳＰＲアレイを含む第２の異なるバクテリオファージの致死性を高める。いくつかの実施形態では、第１のバクテリオファージによる転写活性化因子の導入による標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の増加した発現は、前の実施形態で記載されるあらかじめ処理された未成熟ｃｒＲＮＡまたは処理された成熟ｃｒＲＮＡを含む第２の異なるバクテリオファージの致死性を高める。
【００９７】
転写活性化因子による調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に加えて、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は、他の手段および制御機構よって厳密に制御される。クオラムセンシング（ＱＳ）は、個体群密度との遺伝子発現の調整を可能にする、細菌集団内の細菌間の化学コミュニケーションである。ＱＳは、細菌増殖中に生成され、蓄積された化学信号に依存する。閾値レベルに達すると、ＱＳシグナルは転写制御因子に結合し、細菌の遺伝子発現に影響を及ぼす。一部の細菌では、ＱＳシグナル伝達は、その発現を抑制解除することによって細菌を防御するために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を増強する。ＱＳシグナル伝達に加えて、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系発現の調節は、宿主菌の膜完全性における混乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ）に感受性があると考えられる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、転写活性化因子はＱＳシグナルを含む。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、宿主菌の膜に対するストレスを感知することに関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、Ｃｐｆ１を安定化させるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、代謝感知タンパク質である。いくつかの実施形態では、転写活性化因子あるいはその機能的断片をコードする核酸は、標的細菌へと導入される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子あるいはその機能的断片をコードする核酸は、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲアレイを介して標的細菌へと導入される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は：標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする核酸を含む、バクテリオファージを導入する工程を含む。いくつかの実施形態では、標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のための転写活性化因子をコードする核酸を含むバクテリオファージが、本明細書で開示される。
【００９９】
抗ＣＲＩＳＰＲアレイ
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、抗ＣＲＩＳＰＲをさらに含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は：溶菌活性と、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列とを含むバクテリオファージを、標的細菌に導入する工程を含み、ここで、上記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、上記バクテリオファージの溶菌活性を増強する。いくつかの実施形態において、本明細書にはバクテリオファージが開示され、上記バクテリオファージは：溶菌活性と、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列とを含み、ここで、上記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、上記バクテリオファージの溶菌活性を増強する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする核酸は、上記バクテリオファージまたは別のバクテリオファージの溶菌活性を直接増強する。いくつかの実施形態では、バクテリオファージの溶菌活性の増強は、宿主の標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性を阻害し、不活性化し、および／または抑制する抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドによるものである。抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、細菌ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の機能を防ぐ活性を有する任意のバクテリオファージタンパク質である。抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の活性は、宿主菌が、侵入するバクテリオファージに対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系ベースの防御を開始するのを防ぐ。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、遺伝子調節干渉を含むプロセスを使用して、宿主菌のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ヌクレアーゼ動員干渉を含むプロセスを使用して、宿主菌ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を不活性化する。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性を阻害し、不活性化し、および／または抑制する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、短縮されるか、変異させられるか、または対象の別のタンパク質に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、二量体タンパク質である。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ホモ二量体またはヘテロ二量体のタンパク質である。一実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ＡｃｒＩＩＣ１Ｂｏｅ、ＡｃｒＩＩＣ１Ｎｍｅ、ＡｃｒＩＩＣ２Ｎｍｅ、ＡｃｒＩＩＣ３Ｎｍｅ、ＡｃｒＩＩＣ４Ｈｐａ、ＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕ、またはその任意の機能的断片を含む。一実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、特異的親和性で、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系上の特異的結合部位に結合する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性を阻害するか、不活性化するか、または抑制し、ここで、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする核酸を含むバクテリオファージを標的とする。いくつかの実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性を阻害するか、不活性化するか、または抑制し、ここで、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は、第１のバクテリオファージとは異なる第２の直交バクテリオファージ（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）を標的とする。いくつかの実施形態では、第２の直交バクテリオファージは、第１のバクテリオファージとは異なる。いくつかの実施形態では、第１のバクテリオファージからの抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドによる標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系活性の阻害、不活性化、または抑制は、第１のバクテリオファージあるいは第２の直交バクテリオファージの活性を増強する。いくつかの実施形態では、第２の直交バクテリオファージは溶菌活性を有する。いくつかの実施形態では、第２の直交バクテリオファージは、本明細書で開示される実施形態のいずれかのバクテリオファージを含む。
【０１０４】
標的細菌を死滅させる方法
ある実施形態では、細菌を死滅させる方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、標的細菌の死滅は、バクテリオファージの溶菌活性によって達成される。いくつかの実施形態では、標的細菌の死滅は、標的細菌中の標的遺伝子における標的ヌクレオチド配列に相補的である少なくとも１つのスペーサーを含む、ＣＲＩＳＰＲアレイの活性によって達成される。いくつかの実施形態では、標的細菌の死滅は成熟ｃｒＲＮＡの活性によって達成される。いくつかの実施形態では、細菌の死滅は、細菌の標的遺伝子中の標的ヌクレオチド配列において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１ベースのエンドヌクレアーゼ活性および／または切断を指示することができる、処理されたｃｒＲＮＡを産生するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系による、ＣＲＩＳＰＲアレイの処理によって達成される。いくつかの実施形態では、標的細菌の死滅は、バクテリオファージの溶菌活性および／または非溶菌活性とは独立したＣＲＩＳＰＲアレイの活性によって達成される。いくつかの実施形態では、標的細菌の死滅は、本明細書に開示される任意の方法あるいは方法の組み合わせによるものである。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、細菌の死滅は、バクテリオファージの溶菌活性のみによって達成される。いくつかの実施形態では、細菌の死滅は、少なくとも１つのスペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸の活性のみによって達成される。いくつかの実施形態では、細菌の死滅は、成熟ｃｒＲＮＡをコードする核酸の活性のみによって達成される。いくつかの実施形態では、細菌の死滅は、バクテリオファージの溶菌活性、およびＣＲＩＳＰＲアレイまたは成熟ｃｒＲＮＡの活性の組み合わせによって達成される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージの溶菌活性の組み合わせによって、およびＣＲＩＳＰＲアレイをコードする第１の核酸の活性によって細菌を死滅させることは、相乗的である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイまたは成熟ｃｒＲＮＡの死滅活性は、バクテリオファージの溶菌活性を補足するか、あるいは増強する。いくつかの実施形態では、標的細菌の死滅は、２つ以上の系の相乗効果である。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、細菌の相乗的死滅は、バクテリオファージの濃度および／またはＣＲＩＳＰＲアレイの設計によって調節される。いくつかの実施形態では、細菌の相乗的死滅は、細菌に投与されたバクテリオファージの濃度を増大させることによって、ＣＲＩＳＰＲアレイの活性よりもバクテリオファージの溶菌活性による死滅の方を支持するように調節される。いくつかの実施形態では、細菌の相乗的死滅は、細菌に投与されたバクテリオファージの濃度を減少させることによって、ＣＲＩＳＰＲアレイの活性よりもバクテリオファージの溶菌活性による死滅の方を支持しないように調節される。いくつかの実施形態では、低濃度では、溶菌複製は、標的細菌の増幅および死滅を可能にする。いくつかの実施形態では、高濃度では、ファージの増幅は必要とされない。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、細菌の相乗的死滅は、ＣＲＩＳＰＲアレイの致死性を増大させるために、スペーサーの数、長さ、組成（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）、同一性、またはそれらの任意の組み合わせを変えることによって、バクテリオファージの溶菌活性よりもＣＲＩＳＰＲアレイの活性による死滅を支持するように調節される。いくつかの実施形態では、細菌の相乗的死滅は、ＣＲＩＳＰＲアレイの致死性を減少させるために、スペーサーの数、長さ、組成、同一性、またはそれらの任意の組み合わせを変えることによって、バクテリオファージの溶菌活性よりもＣＲＩＳＰＲアレイの活性による死滅の方を支持しないように調節される。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、死滅させられる細菌中の標的ヌクレオチド配列は、対象の任意の必須標的ヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列は非必須配列である。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のプロモーター、あるいはその補体をコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含むか、それから本質的になるか、もしくはそれからなる。いくつかの実施形態では、スペーサーヌクレオチド配列は、標的遺伝子のプロモーター、またはその一部分に相補的である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、ＤＮＡのコード鎖あるいは非コード鎖上に位置するヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子の転写された領域のコーディング上に位置するヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む。
【０１１０】
必須遺伝子は、その生存にとって重要な生物の任意の遺伝子である。しかし、必須であることは、生物が生きている状況に大きく依存する。例えば、デンプンを消化するために必要な遺伝子は、デンプンが唯一のエネルギー源である場合のみ必須である。いくつかの実施形態では、必須遺伝子としては、限定されないが、ｙｆａＰ、ｓｐｅＡ、ｆｔｓＺ、ａｃｐＰ、ｃｓｒＡ、ｅｎｏ、ｆｕｓＡ、ｇａｐＡ、ｇｌｙＱ、ｉｎｆＡ、ｎｕｓＧ、ｓｅｃＹ、ｔｒｍＤ、Ｔｓｆ、ｆｔｓＡ、またはその相同体が挙げられる。いくつかの実施形態では、非必須遺伝子は、生存にとって重要ではない生物の任意の遺伝子である。非必須遺伝子の例としては、限定されないが、ｔｒｅＦ、ｅａｍＢ、ｉｒｈＡ、ｌａｃＺ、ｓｏｘＳ、ｒｄｇＣ、ｚｗｆ１、ａｃｎＡ、または相同体が挙げられる。しかし、非本質的であることは、生物が生きている状況に大きく依存する。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、対象の標的遺伝子の非限定的な例は、転写制御因子、翻訳調節因子、ポリメラーゼ遺伝子、代謝酵素、輸送体、ＲＮａｓｅ、プロテアーゼ、ＤＮＡ複製酵素、ＤＮＡ修飾酵素またはＤＮＡ分解酵素、調節ＲＮＡ、転移ＲＮＡ、またはリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、細胞分裂、細胞構造、代謝、運動性、病原性、または毒性に関与する遺伝子である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、その機能がまだ特徴づけられていない仮定的遺伝子（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｇｅｎｅ）を含む。したがって、例えば、標的遺伝子は任意の細菌からの任意の遺伝子である。
【０１１２】
抗菌剤およびペプチド
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、抗菌性ペプチド、抗菌性ペプチドの機能的断片、または溶菌性遺伝子を発現するようにさらに遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、本明細書に開示される少なくとも１つの抗菌剤またはペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、核酸配列のタンパク質産物がファージ耐性菌を標的とするエンザイバイオティック（ｅｎｚｙｂｉｏｔｉｃ）をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、バイオフィルムマトリックスを破壊（ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｄｏｗｎ）または分解（ｄｅｇｒａｄｉｎｇ）するのを促進する酵素をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、Ｄｉｓｐｅｒｓｉｎ  Ｄアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン・グリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ、βグルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、またはリアーゼをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、酵素は、セルラーゼＡとも呼ばれる酵素のグリコシルヒドロキシラーゼ５ファミリーなどの、セルラーゼのグリコシルヒドロキシラーゼ・ファミリーなどのセルラーゼと；ポリグルコサミン（ｐｏｌｙｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）（ＰＧＡ）デポリメラーゼと；コラン酸（ｃｏｌａｎｉｃ  ａｃｉｄ）を分解する１，４−β−フコシド（ｆｕｃｏｓｉｄｅ）ヒドロラーゼの１，４−Ｌ−フコシド（ｆｕｃｏｄｉｓｅ）ヒドロラーゼ特徴、解重合アルギナーゼ（ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｚｉｎｇ  ａｌｇｉｎａｓｅ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ、またはそれらの組み合わせなどの、コロン酸デポリメラーゼ（ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、本明細書で開示される酵素を分泌する。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、抗菌剤またはペプチドは、本明細書で開示されるバクテリオファージによって発現および／または分泌される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、アンピシリン、ペニシリン、ペニシリン誘導体、セファロスポリン、モノバクタム、カルバペネム、オフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ガチフロキサシン、ノルフロキサシン、ロメフロキサシン、トロバフロキサシン（ｔｒｏｖａｆｌｏｘａｃｉｎ）、モキシフロキサシン、スパルフロキサシン、ゲミフロキサシン、パズフロキサシン、または本明細書に開示される任意の抗生物質などの抗生物質を分泌および発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、抗菌性ペプチドをコードする核酸配列を含むか、抗菌性ペプチドを発現するか、または標的細菌の死滅を支援あるいは増強するペプチドを分泌する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、ペプチドをコードする核酸配列、抗菌性ペプチドをコードする核酸配列を含むか、抗菌性ペプチドを発現するか、またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性を援助あるいは増強するペプチドを分泌する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、ペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、抗菌性ペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、抗菌性ペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性を援助または増強するペプチドを分泌する。
【０１１４】
用途
細菌感染症
細菌感染症を処置する方法が本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、ヒトもしくは動物の被験体において、本明細書に開示される細菌によって媒介または引き起こされる疾患あるいは疾病を処置するか、または防ぐ。そのような細菌は、典型的に、腸、口腔、肺、腋窩、眼、膣、肛門、耳、鼻、または咽喉の組織を含む、被験体の組織に接触している。いくつかの実施形態では、細菌感染症は、細菌の活性を調節することにより、および／または細菌を直接死滅させることにより処置される。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、細菌集団に存在する１以上の標的細菌は病原性である。いくつかの実施形態では、病原細菌は尿路疾患性である。いくつかの実施形態では、病原細菌は尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）である。いくつかの実施形態では、病原細菌は下痢原性である。いくつかの実施形態では、病原細菌は下痢原性大腸菌（ＤＥＣ）である。いくつかの実施形態では、病原細菌は志賀毒素産生性である。いくつかの実施形態では、病原細菌は志賀毒素産生性大腸菌（ＳＴＥＣ）である。いくつかの実施形態では、病原細菌は志賀毒素産生性である。いくつかの実施形態では、病原細菌は志賀毒素産生性大腸菌（ＳＴＥＣ）である。いくつかの実施形態では、病原細菌は志賀毒素産生性大腸菌（ＳＴＥＣ）である。いくつかの実施形態では、病原細菌は様々なＯ抗原：Ｈ抗原血清型大腸菌である。いくつかの実施形態では、病原細菌は腸管病原性である。いくつかの実施形態では、病原細菌は腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、病原細菌は、ＣＤ０４３、ＣＤ０５、ＣＤ０７３、ＣＤ０９３、ＣＤ１８０、ＣＤ１０６、ＣＤ１２８、ＣＤ１９９、ＣＤ１１１、ＣＤ１０８、ＣＤ２５、ＣＤ１４８、ＣＤ１５４、ＦＯＢＴ１９５、ＣＤ０３、ＣＤ０３８、ＣＤ１１２、ＣＤ１９６、ＣＤ１０５、ＵＫ１、ＵＫ６、ＢＩ−９、ＣＤ０４１、ＣＤ０４２、ＣＤ０４６、ＣＤ１９、またはＲ２０２９１を含む、クロストリジウム・ディフィシルの様々な菌種である。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、被験体の胃腸管における感染症、疾患、または疾病を処置するために使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、被験体のマイクロバイオームあるいは腸内細菌叢内の標的細菌を調節する、および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、被験体のマイクロバイオームあるいは腸内細菌叢内の複数の細菌から１以上の標的細菌を選択的に調節する、および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、被験体のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の複数の細菌から１以上の標的腸管病原性細菌を選択的に調節する、および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態では、標的腸管病原性細菌は腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、被験体のマイクロバイオームあるいは腸内細菌叢内の複数の細菌から１以上の標的下痢原性細菌を選択的に調節する、および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態では、標的下痢原性細菌は下痢原性大腸菌（ＤＥＣ）である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、被験体のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の複数の細菌から１以上の標的志賀毒素産生性細菌を選択的に調節する、および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態では、標的志賀毒素産生性細菌は志賀毒素産生性大腸菌（ＳＴＥＣ）である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、ＣＤ０４３、ＣＤ０５、ＣＤ０７３、ＣＤ０９３、ＣＤ１８０、ＣＤ１０６、ＣＤ１２８、ＣＤ１９９、ＣＤ１１１、ＣＤ１０８、ＣＤ２５、ＣＤ１４８、ＣＤ１５４、ＦＯＢＴ１９５、ＣＤ０３、ＣＤ０３８、ＣＤ１１２、ＣＤ１９６、ＣＤ１０５、ＵＫ１、ＵＫ６、ＢＩ−９、ＣＤ０４１、ＣＤ０４２、ＣＤ０４６、ＣＤ１９、あるいはＲ２０２９１を含む、被験体のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の１以上の標的腸管病原性クロストリジウム・ディフィシル細菌株を選択的に調節する、および／または死滅させるために使用される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、被験体の尿路における感染症、疾患、または疾病を処置するために使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、被験体の尿路細菌叢内の標的細菌を調節する、および／または死滅させるために使用される。尿路細菌叢としては、限定されないが、表皮ブドウ球菌、エンテロコッカス・フェカリス、および一部のα型溶血連鎖球菌が挙げられる。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、被験体の尿路細菌叢内の複数の細菌から１以上の標的尿路病原性細菌を選択的に調節する、および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態では、標的細菌は尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、被験体の皮膚における感染症、疾患、または疾病を処置するために使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、被験体の皮膚上の標的細菌を調節する、および／または死滅させるために使用される。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、被験体の粘膜における感染症、疾患、または疾病を処置するために使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、被験体の粘膜上の標的細菌を調節する、および／または死滅させるために使用される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、病原細菌は抗生物質耐性である。一実施形態では、病原細菌はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、細菌集団に存在する１以上の標的細菌は、バイオフィルムを形成する。いくつかの実施形態では、バイオフィルムは病原細菌を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、バイオフィルムを処置するために使用される。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、標的細菌はグラム陰性菌である。いくつかの実施形態では、グラム陰性菌は腸内細菌科の細菌である。いくつかの実施形態では、腸内細菌科はカルバペネム耐性腸内細菌である。いくつかの実施形態では、標的細菌はシアノバクテリアである。いくつかの実施形態では、標的細菌の非限定的な例は、アクチノミセス、アシネトバクター、バチルス、バークホルデリア、コリネバクテリア、カンピロバクター、クロストリジウム、クロストリジウム、大腸菌類、エンテロコッカス、ヘモフィルス、ヘリコバクター、クレブシェラ、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ミキソコッカス、ナイセリア、ポルフィロモナス、プレボテラ、シュードモナス、サルモネラ、セラチア、赤痢菌、ブドウ球菌、または連鎖球菌を含む属から選択される細菌種を含む。いくつかの実施形態では、コリネバクテリアは、コリネバクテリア群Ｇ１あるいはコリネバクテリア群Ｇ２である。いくつかの実施形態では、細菌は、大腸菌、サルモネラ・エンテリカ、志賀赤痢菌、枯草菌、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・ディフィシル、アシネトバクター・バウマンニ、結核菌、ミキソコッカス・ザンサス、黄色ブドウ球菌、化膿連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、表皮ブドウ球菌、ストレプトコッカス・サリバリウス、コリネバクテリウム・ミヌティシマム、偽ジフテリア菌、コリネバクテリウム・ストリアタム、肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミチス、ストレプトコッカス・サングイス、肺炎杆菌、緑膿菌、バークホリデリア・セパシア、霊菌、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、淋菌、ネズミチフス菌、プレボテラ・メラニノゲニカス、ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・フェリス、またはカンピロバクター・ジェジュニである。いくつかの実施形態では、細菌は薬剤耐性細菌である。いくつかの実施形態では、薬剤耐性細菌は少なくとも１つの抗生物質に耐性を示す。いくつかの実施形態では、抗生物質は、セファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、コリスチン、アミノグリコシド、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またはメチシリンである。薬剤耐性細菌の非限定的な例は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌である。標的細菌のさらなる非限定的な例は、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属を含むが、これらに限定されない乳酸菌；ジオバクター属、クロストリジウム属、またはラルストニア・ユートロファを含むが、これらに限定されないｅｌｅｃｔｒｏｆｕｅｌ菌種；または、例えば、植物ならびに哺乳動物上の病原性の細菌を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、標的細菌は大腸菌である。いくつかの実施形態では、標的細菌はクロストリジウム・ディフィシルである。いくつかの実施形態では、標的細菌は肺炎杆菌である。いくつかの実施形態では、標的細菌はサルモネラ・エンテリカである。いくつかの実施形態では、標的細菌は志賀赤痢菌である。いくつかの実施形態では、標的細菌は黄色ブドウ球菌である。いくつかの実施形態では、標的細菌はクロストリジウム・ボルテアエである。いくつかの実施形態では、標的細菌はエンテロコッカス属である。いくつかの実施形態では、標的細菌はアシネトバクター属にある。いくつかの実施形態では、標的細菌はシュードモナス属にある。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法および組成物は、獣医および医療用途、ならびに研究用途で使用するためのものである。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、ざ瘡および他の関連する皮膚感染症を処置する。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、標的細菌は多剤耐性（ＭＤＲ）細菌株である。ＭＤＲ株は、少なくとも１つの抗生物質に耐性を示す細菌株である。いくつかの実施形態では、細菌株は、セファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、コリスチン、アミノグリコシド、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またメチシリンなどの抗生物質クラスに耐性を示す。いくつかの実施形態では、細菌株は、セフトビプロール、セフタロリン、クリンダマイシン、ダルババンシン、ダプトマイシン、リネゾリド、ムピロシン、オリタバンシン、テジゾリド、テラバンシン、チゲサイクリン、バンコマイシン、アミノグリコシド、カルバペネム、セフタジジム、セフェピム、セフトビプロール、フルオロキノロン、ピペラシリン、チカルシリン、リネゾリド、ストレプトグラミン、チゲサイクリン、ダプトマイシン、またはそれらの任意の組み合わせなどの抗生物質に耐性を示す。ＭＤＲ株の例は、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、グラム陰性細菌を産生する基質特異性拡張型βラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）、グラム陰性（Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅｓ）を産生する肺炎桿菌カルバペネマーゼ（ＫＰＣ）、ならびに多剤耐性グラム陰性桿菌（ＭＤＲ  ＧＮＲ）ＭＤＲＧＮ細菌、エンテロバクター属種大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｅ．ｃｏｌｉ）、肺炎杆菌、アシネトバクター・バウマンニ、または緑膿菌を含む。
【０１２８】
環境療法
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、食物および農業の衛生（食肉、果物、および野菜の衛生を含む）、病院の衛生、家庭の衛生、車両と設備の衛生、産業衛生などにさらに使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、医学の、獣医の、畜産の環境、あるいは任意の細菌がヒトまたは動物に渡される任意の追加の環境から、抗生物質耐性あるいは他の好ましくない病原体を除去するために使用される。
【０１２９】
ヘルスケア機関におけるファージの環境適用は、内視鏡などの設備、および、殺菌するのが難しいか、あるいは不可能な病原体による院内感染の潜在的源であるＩＣＵなどの環境のためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるファージは、一般的に使用される殺菌剤に耐性を示すようになるシュードモナスなどの細菌属が存在する、設備あるいは環境を処理するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるファージ組成物は無生物を殺菌するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される環境は、ファージ力価を有する水溶液で噴霧されるか、塗布されるか、流される。ある実施形態では、本明細書に記載される溶液は、１０１−１０２０の間のプラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、いくつかの実施形態では、環境中へのバクテリオファージの分布を容易にするために乾燥分散剤を含む、エアロゾル化剤によって適用される。いくつかの実施形態では、物体（ｏｂｊｅｃｔｓ）は本明細書で開示されるバクテリオファージを含有する溶液に浸される。
【０１３０】
公衆衛生
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、様々な分野で衛生剤として使用される。「ファージ」または「バクテリオファージ」という用語が使用されてもよいが、適切な場合、この用語は、単一のバクテリオファージ、複数のバクテリオファージ、例えば、バクテリオファージ混合物、および、殺菌剤、洗浄剤、界面活性剤、水などの薬剤とバクテリオファージの混合物を含むように、広く解釈されるべきことに留意されたい。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、手術室、病室、待合室、研究室、または他の様々な病院設備を含む、病院施設を殺菌するために使用される。いくつかの実施形態では、この設備は、心電計、人工呼吸器、循環器系補助装置、動脈内バルーンポンプ、輸液用器具、他の患者の介護用装置、テレビ、モニター、リモートコントロール、電話、ベッドなどを含む。いくつかの状況では、バクテリオファージはエアロゾル・キャニスターによって適用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、トランスファービヒクル（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｈｉｃｌｅ）で、物体上のファージを拭くことにより適用される。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるバクテリオファージは、患者の介護装置と共に使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、患者間の内外面を清潔にするために、従来の人工呼吸器または  呼吸療法装置と共に使用される。人工呼吸器の例には、手術中に人工呼吸を支援する装置、無能力状態の患者の人工呼吸を支援する装置、および同様の装置が含まれる。いくつかの実施形態では、既存の療法は、自動装置あるいは電動装置、または救急処置室ならびに救急車で一般的に見られる手動バッグ型装置を含む。いくつかの実施形態では、呼吸療法は、慢性閉塞性肺疾患または喘息で一般的に使用されるような気管支拡張剤などの薬剤を導入するための吸入器、あるいは持続気道陽圧装置などの気道開存性を維持する装置を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるバクテリオファージは、表面を清潔にし、かつ脳膜炎または腸管感染症などの伝染性の高い細菌性疾患が存在する領域におけるコロニー形成された人々を処置するために使用される。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、給水（ｗａｔｅｒ  ｓｕｐｐｌｉｅｓ）は本明細書で開示される組成物で処理される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、汚染水、水槽中に見られる水、ウェル、リザーバー、汚水槽、水道、導管、および同様の配水装置を処理するために使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、水、油、冷却流体、および他の液体が収集プールに蓄積する工業用汚水槽に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、細菌増殖を減少させるために工業用の汚水槽に定期的に導入される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、家、アパート、コンドミニアム、寮、または任意の生活領域などの、生活領域を消毒するために使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、劇場、コンサートホール、博物館、駅、空港などの公共区域、ペットのベッドあるいはトイレなどのペット領域を消毒するために使用される。この能力において、バクテリオファージは、ポンプ噴霧器、エアロゾル容器、噴出ボトル、あらかじめ湿らせた濡れナプキンなどを含む従来の装置から分配され、消毒されるべき領域に直接適用され（例えば、噴霧され）、あるいはタオル、スポンジなどのトランスファービヒクルにより、その領域に移される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるファージは、キッチン、寝室、バスルーム、ガレージ、地下などを含む、家の様々な部屋に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるファージは、従来のクリーナーと同じ様式である。いくつかの実施形態では、ファージは、従来のクリーナーが適切なバクテリオファージの生物学的な活性を保護するように製剤化される場合に限り、従来のクリーナーと共に（従来のクリーナーの前に、後に、あるいは同時に）適用される。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、紙製品の処理中または処理完了後のいずれかで、紙製品の成分に添加される。本明細書で開示されるバクテリオファージが添加される紙製品としては、限定されないが、ペーパータオル、トイレットペーパ、ウェットティッシュが挙げられる。
【０１３７】
食品安全性
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるバクテリオファージは、汚染を防ぐために、任意の食品あるいは栄養補助食品に使用される。食品または医薬製品の例は、乳、ヨーグルト、凝乳、チーズ、発酵乳、乳ベースの発酵製品、アイスクリーム、発酵した穀物ベースの製品、乳ベースの粉末、乳児用調製乳または錠剤、液体懸濁液、乾燥経口サプリメント、湿性経口サプリメント、または乾燥経管栄養である。
【０１３８】
バクテリオファージ衛生に関する広い概念は、他の農業用途および生物に適用可能である。生産物は、果物と野菜、乳製品、および他の農産物を含む。例えば、切りたての生産物が、病原細菌で汚染された加工工場に頻繁に到着する。このことは、生産物に由来する食物に起因する病気につながっている。いくつかの実施形態では、農産物へのバクテリオファージ調製物の適用は、食物に起因する病気に関連する細菌の種への特異性を有する単一のファージあるいはファージ混合物の適用を介して、食物に起因する病気の可能性を実質的に減少させるか、または除去する。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、その時点での細菌汚染を減少させるか、または後の時点で汚染から保護するために、産生と処理の様々な段階で適用される。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、特定のバクテリオファージは、レストラン、食料雑貨店、生産物流通センターにおいて生産物に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、サラダバーの果物と野菜の内容に定期的にあるいは連続的に適用される。いくつかの実施形態では、サラダバーへの、もしくは食物アイテムの外部を殺菌するためのバクテリオファージの適用は、噴霧プロセスまたは吹き付けプロセス、あるいは洗浄プロセスである。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるバクテリオファージは、食肉、生産物、カットされた果物と野菜、および他の食料品を含む包装を含有する、マトリックスまたは支持媒体において使用される。いくつかの実施形態では、包装に適したポリマーに、バクテリオファージ調製物をしみ込ませる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるバクテリオファージは、農家および家畜飼料に使用される。いくつかの実施形態では、家畜を育てるファームでは、家畜は、それらの飲料水、食物、またはその両方においてバクテリオファージが与えられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるバクテリオファージは、屠殺体上に噴霧され、屠殺領域を殺菌するために使用される。
【０１４２】
生産物における生物防除剤としての特定のバクテリオファージの使用は、多くの利点をもたらす。例えば、バクテリオファージは、一般の化学的な殺菌剤が行う方法で天然のミクロフローラの生態的均衡を乱すことはないが、標的とされた食物に起因する病原体を特異的に溶解する、天然の無毒な産物である。化学的な殺菌剤と異なり、バクテリオファージは、それらの宿主菌と共に進化する天然物であるので、最近出現した耐性菌に対して活性な新しいファージは、いくつかの実施形態では、必要に応じて迅速に特定されるが、新しい有効な殺菌剤の特定は、はるかに長いプロセスであり、数年に及ぶ。
【０１４３】
医薬組成物
いくつかの実施形態では、本開示は、医薬組成物、および細菌、古細菌感染症を処置するか、または領域を殺菌するためにその医薬組成物を投与する方法を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体中に、上述される試薬のいずれかを含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組成物は、薬剤、医薬品、担体、アジュバント、分散剤、希釈液などを含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、適切な方法に従って医薬担体における投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物の製造では、バクテリオファージは、とりわけ、許容可能な担体と混合される。いくつかの実施形態では、担体は固体（粉体を含む）あるいは液体、またはその両方であり、好ましくは単位投与量組成物として製剤化される。いくつかの実施形態では、１以上のバクテリオファージは本明細書で開示される組成物に組み込まれ、薬学の任意の適切な方法によって調製される。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、被験体をインビボで処置する方法であり、上記方法は、薬学的に許容可能な担体中の本明細書で開示されるバクテリオファージを含む医薬組成物を、被験体に投与する工程を含み、ここで、上記医薬組成物は、治療上有効な量で投与される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージのそれを必要とするヒト被験者あるいは動物への投与は、当技術分野で既知の任意の手段によって行われる。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは経口投与用である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、カプセル剤、錠剤、および粉体などの固形剤形、または、エリキシル剤、シロップ剤、および懸濁液などの液体剤形で投与される。いくつかの実施形態では、頬側（舌下）投与に適している組成物および方法は、香料基剤（ｆｌａｖｏｒｅｄ  ｂａｓｅ）、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガント中のバクテリオファージを含むロゼンジと；ゼラチンならびにグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基材（ｉｎｅｒｔ  ｂａｓｅ）中のバクテリオファージを含む香錠とを含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本開示の方法および組成物は、バクテリオファージの無菌の水性および非水性の注射溶液を含む非経口投与に適している。いくつかの実施形態では、これらの調製物は、意図したレシピエントの血液と等張である。いくつかの実施形態では、これらの調製物は、組成物を意図したレシピエントの血液と等張にする抗酸化剤、緩衝剤、静菌、および溶質を含む。いくつかの実施形態では、水性および非水性の無菌の懸濁液は、懸濁化剤および増粘剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、単位投与用また複数回投与用の容器、例えば、密封したアンプルおよびバイアル中に提供され、使用の直前に無菌の液体担体、例えば、生理食塩水または注射用水の添加のみを必要とする冷凍乾燥（凍結乾燥）状態で保存される。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、直腸投与に適している方法および組成物は、単位用量座剤として提供される。いくつかの実施形態では、これらは、１つ以上の従来の固体担体、例えば、カカオバターとバクテリオファージを混合し、その後、結果として生じる混合物を形作ることにより調製される。いくつかの実施形態では、皮膚への局所適用に適している方法および組成物は、軟膏、クリーム、ローション剤、ペースト、ゲル、噴霧剤、エアロゾル、または油の形態である。いくつかの実施形態では、使用される担体は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮増強剤（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ）、およびそれらの２つ以上の組み合わせを含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、経皮的投与に適している方法および組成物は、レシピエントの表皮との長期間の密接な接触を維持するのに適した、別個のパッチとして提供される。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、経鼻投与に適しているか、他の方法で被験体の肺に投与された方法および組成物は、任意の適切な手段を含み、例えば、被験体が吸入するバクテリオファージ組成物を含む、呼吸性粒子のエアロゾル懸濁液によって投与される。いくつかの実施形態では、呼吸性粒子は液体または固体である。本明細書で使用されるように、「エアロゾル」は、任意のガス媒介懸濁相を含み、細気管支または鼻通路へ吸入されることができる。いくつかの実施形態では、液体粒子のエアロゾルは、圧力駆動エアロゾルネブライザーあるいは超音波ネブライザーを用いるなど、任意の適切な手段によって生成される。いくつかの実施形態では、組成物を含む固形粒子のエアロゾルは、医薬分野で既知の技術によって、任意の固体粒子薬剤のエアロゾル発生器を用いて生成される。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、物体あるいは被験体の表面への本明細書に開示されるバクテリオファージの投与に適している方法および組成物は、水溶液を含む。いくつかの実施形態では、そのような水溶液は、物体または被験体の表面上に噴霧される。いくつかの実施形態において、水溶液は、細菌を含む異物の破片からの被験体の物理的創傷を洗浄し、清潔にするために使用される。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、治療上有効な量で被験体に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される少なくとも１つのバクテリオファージ組成物は、医薬製剤として製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の本明細書で開示されるバクテリオファージを含む。いくつかの例では、医薬製剤は、本明細書に記載されるバクテリオファージ、および、賦形剤、希釈液、あるいは担体の少なくとも１つを含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、医薬製剤は賦形剤を含む。賦形剤は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９８６）に記載され、および、限定されないが、溶剤、分散媒、希釈液、あるいは他の液状ビヒクル、分散体もしくは懸濁補助（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ａｉｄｓ）、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、固体結合剤、および潤滑剤を含む。
【０１５５】
適切な賦形剤の非限定的な例としては、限定されないが、緩衝剤、防腐剤、安定化剤、結合剤、圧縮剤（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、潤滑剤、キレート剤、分散増強剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）、崩壊剤、香料、甘味剤、着色剤が挙げられる。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、賦形剤は緩衝剤である。適切な緩衝剤の非限定的な例としては、限定されないが、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、  重炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、および炭酸水素カルシウムが挙げられる。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、以下に表記される任意の１つ以上緩衝剤が挙げられる：炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化マグネシウム、乳酸マグネシウム、マグネシウムグルコメート（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｇｌｕｃｏｍａｔｅ）、水酸化アルミニウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、メタリン酸カリウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、酢酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、および他のカルシウム塩。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、賦形剤は防腐剤である。適切な防腐剤の非限定的な例としては、限定されないが、αトコフェロールとアスコルビン酸などの抗酸化剤、およびパラベン、クロロブタノール、ならびにフェノールなどの抗菌剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗酸化剤としては、限定されないが、ＥＤＴＡ、クエン酸、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、亜硫酸ナトリウム、ｐ−アミノ安息香酸、グルタチオン、没食子酸プロピル、システイン、メチオニン、エタノール、およびＮ−アセチルシステインが挙げられる。いくつかの実施形態では、防腐剤は、バリダマイシンＡ、ＴＬ−３、オルトバナジン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｏｒｔｈｏ  ｖａｎａｄａｔｅ）、フッ化ナトリウム、Ｎ−α−トシル−Ｐｈｅ−クロロメチルケトン、Ｎ−α−トシル−Ｌｙｓ−クロロメチルケトン、アプロチニン、フッ化フェニルメチルスルホニル、ジイソプロピルフルオロホスフェート、プロテアーゼ阻害剤、還元剤、アルキル化剤、抗菌剤、オキシダーゼ阻害剤、または他の阻害剤を含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、医薬製剤は賦形剤として結合剤を含む。適切な結合剤の非限定的な例は、デンプン、α化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、ナトリウム・カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｏｘｏａｚｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリビニルアルコール、Ｃ１２−Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、サッカライド、オリゴ糖、およびそれらの組み合わせを含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、医薬製剤中で使用される結合剤は、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、コムギデンプンなどのデンプン；ショ糖、グルコース、デキストロース、ラクトース、マルトデキストリンなどの糖；天然ゴムならびに合成ゴム；ゼラチン；微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロースなどのセルロース誘導体；ポリビニルピロリドン（ポビドン）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ワックス；炭酸カルシウム；リン酸カルシウム；ソルビトール、キシリトール、マンニトールなどのアルコール、ならびに水、またはそれらの組み合わせから選択される。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、医薬製剤は賦形剤として潤滑剤を含む。適切な潤滑剤の非限定的な例は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、硬化植物油、ステロテックス（ｓｔｅｒｏｔｅｘ）、ポリオキシエチレンモノステアレート、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、および軽油を含む。いくつかの実施形態では、医薬製剤中にある潤滑剤は、金属ステアリン酸塩類（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウムなど）、脂肪酸エステル（フマル酸ステアリルナトリウムなど）、脂肪酸（ステアリン酸など）、脂肪族アルコール、ベヘン酸グリセリル、鉱油、パラフィン、硬化植物油、ロイシン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ラウリル硫酸金属（ｍｅｔａｌｌｉｃ  ｌａｕｒｙｌ  ｓｕｌｐｈａｔｅｓ）（ラウリル硫酸ナトリウムなど）、ラウリル硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、およびタルク、またはそれらの組み合わせから選択される。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、賦形剤は香料を含む。いくつかの実施形態では、香料は、天然オイル；植物、葉、花、ならびに果物からの抽出物；および、これらの組み合わせを含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、賦形剤は甘味剤を含む。適切な甘味剤の非限定的な例は、グルコース（コーンシロップ）、デキストロース、転化糖、フルクトース、およびそれらの混合物（担体として使用されない場合）；サッカリン、ならびにナトリウム塩などのその様々な塩；アスパルテームなどのジペプチド甘味剤；ジヒドロカルコン化合物、グリチルリチン；ステビア（ステビオシド）；スクラロースなどのスクロースのクロロ誘導体；および、などの糖アルコール、ソルビトール、マンニトール、シリトール（ｓｙｌｉｔｏｌ）などを含む。
【０１６３】
いくつかの例では、医薬製剤は着色剤を含む。適切な着色剤の非限定的な例は、食品・医薬品・化粧品の着色料（ｆｏｏｄ，  ｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｓ）（ＦＤ＆Ｃ）、医薬品・化粧品の着色料（Ｄ＆Ｃ）、および外用薬・化粧品の着色料（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬製剤はキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、キレート剤は、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＤＴＡ）；ＥＤＴＡの二ナトリウム、三ナトリウム、四ナトリウム、二カリウム、三カリウム、ダイリチウム（ｄｉｌｉｔｈｉｕｍ）、およびジアンモニウム塩；ＥＤＴＡのバリウム、カルシウム、コバルト、銅、ジスプロシウム、ユウロピウム、鉄、インジウム、ランタン、マグネシウム、マンガン、ニッケル、サマリウム、ストロンチウム、または亜鉛キレートを含む。
【０１６５】
いくつかの例では、医薬製剤は希釈液を含む。希釈液の非限定的な例は、水、グリセロール、メタノール、エタノール、および他の同様の生体適合性の希釈液を含む。いくつかの実施形態では、希釈液は、酢酸、クエン酸、マレイン酸、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸、あるいは同様のものなどの水性酸である。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、医薬製剤は界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート）、ラウリル硫酸ナトリウム、フマル酸ステアリルナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ドキュセートナトリウム、四級アンモニウム化合物、Ｌ−ロイシンなどのアミノ酸、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のグリセリド、またはそれらの組み合わせから選択される。
【０１６７】
いくつかの例では、医薬製剤は追加の医薬品を含む。いくつかの実施形態では、追加の医薬品は抗生物質である。いくつかの実施形態では、抗生物質は、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン（第一世代、第二世代、第三世代、第四世代、第五世代のセファロスポリンを含む）、リンコサミド、マクロライド、モノバクタム、ニトロフラン、キノロン、ペニシリン、スルホンアミド、ポリペプチド、またはテトラサイクリンからなる群である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗生物質は、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、またはパロモマイシンなどのアミノグリコシドである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗生物質は、ゲルダナマイシンまたはハービマイシンなどのアンサマイシンである。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗生物質は、ロラカルベフなどのカルバセフェムである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗生物質は、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、またはメロペネムなどのカルバペネムである。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗生物質は、セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファロチン（Ｃｅｆａｌｏｔｉｎ）あるいはセファロチン（Ｃｅｆａｌｏｔｈｉｎ）などのセファロスポリン（第一世代）、もしくは代替的に、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、またはセフロキシムなどのセファロスポリン（第２世代）である。いくつかの実施形態では、抗生物質は、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフチブテン、セフチゾキシム、およびセフトリアキソンなどのセファロスポリン（第三世代）、または、セフェピムあるいはセフトビプロールなどのセファロスポリン（第四世代）である。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗生物質は、クリンダマイシンおよびアジスロマイシンなどのリンコサミド、または、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、およびスペクチノマイシンなどのマクロライドである。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗生物質は、アズトレオナムなどのモノバクタム、または、フラゾリドンあるいはニトロフラントインなどのニトロフランである。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗生物質は、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧまたはＶ、ピペラシリン、テモシリン、およびチカルシリンなどのペニシリンである。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗生物質は、マフェナイド、スルホンアミドクリソイジン（Ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｏｃｈｒｙｓｏｉｄｉｎｅ）、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム、あるいはトリメトプリム・スルファメトキサゾール合剤（コトリモキサゾール）（ＴＭＰ−ＳＭＸ）などのスルホンアミドである。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗生物質は、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、およびテマフロキサシンなどのキノロンである。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗生物質は、バシトラシン、コリスチン、またはポリミキシンＢなどのポリペプチドである。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗生物質は、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、またはオキシテトラサイクリンなどのテトラサイクリンである。
【０１７８】
投与量
本明細書に開示される組成物の投与の用量および持続時間は、被験体の年齢、被験体の体重、およびファージの耐性を含む、様々な要因に依存する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるバクテリオファージは、経口投与によって患者に投与される。いくつかの実施形態では、１０３〜１０２０の間のＰＦＵのファージの用量が与えられる。例えば、いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、１０３〜１０１１の間のＰＦＵの量が組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１０２２、１０２３、１０２４ＰＦＵ、あるいはそれ以上の量で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、１０１ＰＦＵより少ない量で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、１０１〜１０８、１０４〜１０９、１０５〜１０１０、あるいは１０７〜１０１１の間のＰＦＵの量で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、バクテリオファージまたは混合物は、それを必要とする被験体に、１日に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４回投与される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージまたは混合物は、それを必要とする被験体に、１週間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１回投与される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージまたは混合物は、それを必要とする被験体に、１ヵ月に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０回投与される。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組成物（バクテリオファージ）は、疾患または疾病の発生前に、発生中に、または発生後に投与される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージを含有する組成物を投与するタイミングは変わる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は予防薬として使用され、疾患あるいは疾病の発生を防ぐために、その疾患あるいは疾病の傾向がある被験体に継続的に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、症状の発症中、または発症後できるだけすぐに被験体に投与される。いくつかの実施形態では、上記組成物の投与は、症状の発症の最初の４８時間以内に、症状の発症の最初の２４時間以内に、症状の発症の最初の６時間以内に、および症状の発症の３時間以内に開始される。いくつかの実施形態では、上記組成物の初回投与は、本明細書に記載される任意の製剤を使用して、本明細書に記載される任意の経路によるなど、任意の実用的な経路を経由する。いくつかの実施形態では、上記組成物は、疾患あるいは疾病の発症が検出されたか、あるいは疑われた後に実行可能な限りすぐに、あるいは、例えば、約１か月から約３か月までなどの疾患の処置に必要な期間にわたって投与される。いくつかの実施形態では、処置の長さは各被験体で変わる。
【０１８０】
キット
本明細書で開示されるのは使用のためのキットである。いくつかの実施形態では、キットは、ＣＲＩＳＰＲアレイのための核酸構築物、外因性Ｃｐｆ１、転写活性化因子、および／または抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチド、ならびに細胞導入および／または被験体への投与に適した形態の、本明細書で開示されるバクテリオファージおよび／または他のベクター／発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、キットは他の治療剤、担体、緩衝剤、容器、投与のための装置などを含む。いくつかの実施形態では、キットは、標的遺伝子の発現の抑制および／または標的遺伝子の発現の抑制の調節のためのラベルおよび／または説明書を含む。いくつかの実施形態では、ラベルおよび／または説明書は、例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイのための核酸構築物、外因性Ｃｐｆ１、転写活性化因子、ならびに抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチド、ならびにバクテリオファージおよび／または任意の他のベクター／発現カセットの導入および／または投与の量、頻度、および方法に関する情報を含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、１つの標的細菌の死滅のためのキットが提供され、上記キットは、ＣＲＩＳＰＲアレイのための核酸構築物、外因性Ｃｐｆ１、転写活性化因子、および／または抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチド、ならびに、本明細書で開示される任意の実施形態による標的細菌の死滅を達成するのに必要なバクテリオファージおよび／または任意の他のベクター／発現カセットを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、キットは、標的細菌中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の活性を調節するために提供され、上記キットは、ＣＲＩＳＰＲアレイのための核酸構築物、外因性Ｃｐｆ１、転写活性化因子、および抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチド、ならびに、本明細書で開示される任意の実施形態による標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の調節を達成するのに必要なバクテリオファージおよび／または他のベクター／発現カセットを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、上記キットのＣＲＩＳＰＲアレイのための核酸構築物、外因性Ｃｐｆ１、転写活性化因子、および／または抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、単一のベクターもしくは発現カセット上に、または別個のベクターもしくは発現カセット上に、あるいは、単一のバクテリオファージもしくは複数のバクテリオファージ内に含まれる。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に開示される１以上のバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態では、キットは、使用のための説明書を含む。いくつかの実施形態では、方法を実行するための説明書は、適切な記録媒体に記録される。いくつかの実施形態では、その説明書は、紙またはプラスチックなどの基材に印刷される。いくつかの実施形態では、その説明書は、キットの容器あるいはその成分のラベルに添付文書としてキット中に存在する（つまり、包装または副次的な包装（ｓｕｂｐａｃｋａｇｉｎｇ）に関連する）。いくつかの実施形態では、その説明書は、適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。いくつかの実施形態では、実行命令はキット中に存在しないが、遠隔ソースから（例えば、インターネットを介して）命令を得るための手段が提供される。いくつかの実施形態では、キットは、説明書が見られるおよび／または説明書がダウンロードされるウェブアドレスを含む。
【０１８４】
本明細書で開示されるある実施形態では、それらの方法および組成物の両方において、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例が本開示の請求項の範囲を限定するように意図するものではなく、むしろ、ある実施形態の例示であると意図するものであることを理解されたい。当業者が思い浮かぶ、例証される方法のいかなる変形も、本開示の範囲内に入ることが意図される。
【０１８５】
実施例
実施例１：ＣＲＩＳＰＲを増強されたバクテリオファージの生成についての概観
ＣＲＩＳＰＲを増強されたバクテリオファージは、細胞溶解の生活環のための必須遺伝子を維持するバクテリオファージゲノムからＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ構築物を発現するように操作されたファージである。工程は、細菌に対する広い宿主域を備えたバクテリオファージおよびバクテリオファージのカクテルを、調達すること、単離させること、および、特定することを包含し、その後、細菌のゲノムを標的とする発現構築物（例えば、ｃｒＲＮＡ）を運ぶように各ファージを操作すること、および、臨床のリード候補として使用されるｃｒＰｈａｇｅの最適化された組み合わせを検証することが続く。いくつかの実施形態では、一般的なプロセスは、図１の工程１〜５で概略的に示される。工程１〜５は、野生型のバクテリオファージの適切な番号を特定するために設計される。：
【０１８６】
１．下の表１に提示された最小限の品質規格（溶原性がないこと、病原性遺伝子がないこと、または抗生物質抵抗性遺伝子がないこと）を満たす。
【０１８７】
【表１】
2021525105.tif 000003
【０１８８】
２．臨床分離株パネルのおよそ９０％以上に対する集合的な活性を有する。
【０１８９】
３．任意の単一のバクテリオファージに対する耐性の事象においてカクテルへの株感度を確かなものにするよう意図しながら、カクテル（２つ以上のファージの混合物）内の少なくとも２つのファージによる各株の感染を結果としてもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたカクテルは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００、またはそれより多くのバクテリオファージを含む。
【０１９０】
４．野生型のゲノムからｃｒＲＮＡ構築物を発現するために個々の候補バクテリオファージの遺伝子を操作することを含む。操作されたｃｒＰｈａｇｅが各々溶菌活性を保持することを意図する。宿主域とインビトロの有効性を評価するために、ｃｒＰｈａｇｅをインビトロの分析にかける。これらの研究は、ｃｒＰｈａｇｅが広い宿主域を保持し、そうでなければ、増殖性の溶菌感染がない状態において致死的なｃｒＲＮＡ構築物を形質導入する能力によって宿主域を拡張し、同族の野生型のバクテリオファージに対して各ｃｒＰｈａｇｅの致死性を改善したことを確認するように意図される。
【０１９１】
５．宿主域、生産上の制限、または非臨床の有効性を改善するように最適化されたカクテルで使用されるｃｒＰｈａｇｅを特定する。
【０１９２】
実施例２：細菌株と増殖条件
細菌株と増殖条件。本明細書に記載する実施例において使用される細菌株は、大腸菌ＭＧ１６５５、大腸菌ＢＷ２５１１３、大腸菌Ｏ９：ＨＳ、腸管出血性大腸菌（ＥＴＥＣ）Ｅ２４３７Ａ、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）血清型１  ＡＴＣＣ９３６１、クレブシェラ・ニューモニエ（肺炎杆菌）亜種ニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  ＡＴＣＣ７００７２１、またサルモネラ・エンテリカ  ＬＴ２、であった。大腸菌ＴＯＰ１０と大腸菌ＮＥＢをクローニングとベクター構築に使用し、適切な時に、抗生物質（５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、および２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）で補ったＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地において培養した。大腸菌、志賀赤痢菌、およびサルモネラ菌株を、すべて、ＬＢ培地（１０ｇ／リットルのトリプトン、５ｇ／リットルの酵母エキスと１０ｇ／リットルの塩化ナトリウム）中で、３７°Ｃおよび２５０ｒｐｍで、適切な抗生物質を伴って培養した。同じ株を適切な誘導物質で補われたＬＢ寒天プレートにまき（１．５％寒天を備えたＬＢ培地）、３７°Ｃでインキュベートした。肺炎杆菌を０．５％のＥＤＴＡ（ｒｅｆ．）で補われたＬＢ培地（１０ｇ／リットルのトリプトン、５ｇ／リットルの酵母エキス、および１０ｇ／リットルの塩化ナトリウム）において培養した。
【０１９３】
実施例３：プラスミドの構築およびクローニング
ｐＢＡＤ３３−Ｃａｓ１２ａについては、ｐＦｎＣｐｆ１（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃６９９７３）のテンプレートを使用してフランシセラ・ノビシダ菌Ｕ１１２からのＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）遺伝子をＰＣＲ増幅によって生成し、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）遺伝子の上流の構成型プロモーターＪ２３１０８によって、ｐＢＡＤ３３を連結した（図１３Ａ）。ｐＢＡＤ３３−Ｃｐｆ１−ＭｕＧａｍプラスミドを生成するために、化学的に合成したｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）によってＭｕ  Ｇａｍ配列を生成し、その後、ギブソン・アセンブリによってｐＢＡＤ３３−Ｃｐｆ１に挿入した（図１３Ｂ）。ＳｐｙＣａｓ９のためのｓｇＲＮＡを生成するために、構成的プロモーターを備えたｓｇＲＮＡをプラスミドへクローニングした。Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）およびＣａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）のためのスペーサーを生成するために、ｇｏｌｄｅｎ  ｇａｔｅ  アセンブリを使用した。Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）およびＣａｓ１３ａのための部位特異的突然変異誘発はすべて、Ｑ５Ｒ部位特異的突然変異誘発キット（ＮＥＢ）で行った。ガイドまたはＣＲＩＳＰＲアレイ・スペーサーを、２０ｎｔ（Ｃａｓ９用）、２５ｎｔ（Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）用）、または２６ｎｔ（Ｃａｓ１３ａ用）の長さであり、および、関心の標的遺伝子中にあるように設計した。特異的配列を同定するために、標的遺伝子中のＰＡＭを最初に同定した。その後、同定された配列がユニークかどうか決定するためにゲノム配列を調査した。ｓｇＲＮＡまたはスペーサー構築物を含むプラスミドの模式図を図１３に示す。
【０１９４】
実施例４：突然変異体の構築
大腸菌ＭＧ１６５５およびサルモネラ・エンテリカＬＴ２においてｒｅｃＡ欠失を生成するために、受容株大腸菌ＭＧ１６５５またはサルモネラ・エンテリカ  ＬＴ２に温度感受性ｐＫＤ４６プラスミドを形質転換した。細胞を回収し、および３０°Ｃで夜通しインキュベートした。受容株大腸菌ＭＧ１６５５またはサルモネラ・エンテリカ  ＬＴ２によってｐＫＤ４６プラスミドを含有している、形質転換したコロニーをリコンビニアリング（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）のために使用した。ｐＫＤ１３プラスミド（ＫａｎＲ）を用いる相同組換え（ＨＲ）カセットをＰＣＲ増幅によって調製し、フォワードプライマーとリバースプライマーは、ＦＲＴ−ｆｌａｎｋｅｄ抵抗カセットが後続するｒｅｃＡに隣接して５０−ｂｐ相同性アームを有する。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩとカラム精製でダイジェストし、ｐＫＤ４６を備えた菌株においてリコンビニアリングするために準備した。ｐＫＤ４６を含有している受容株の一つのコロニーを、アンピシリンを含有している３ｍｌのＬＢ培地に接種し、３０°Ｃで一夜の間成長させた。翌日、一夜の培養物の１００ｕｌをアンピシリンと０．２％アラビノースを含有している２５ｍｌＬＢ中で薄め戻した。アラビノースは、リコンビナーゼの発現を引き起こす。この混合物を３０°ＣにおいてＯＤ６００値０．６までインキュベートした。５０ｕｌの細胞を使用してエレクトロコンピテントセル（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）を調製してエレクトロポレーションし、そして、ＰＣＲ産物の１０〜１０００ｎｇのＤＮＡを調製し、リコンビニアリングした。細胞のみの陰性対照も含めた。５００ｕｌのＳＯＣを伴う細胞を回収し、および３７°Ｃで３〜４時間インキュベートした。回収した細胞からより高い温度によってｐＫＤ４６プラスミドを取り除き、次にその２５０ｕｌを３７°Ｃにおいてカナマイシン（ｐＫＤ１３）上にまいた。一次選択の後、カナマイシン・プレートおよびアンピシリン・プレート上で単一のコロニーの複製プレートを作った。細胞がアンピシリン中ではなくカナマイシン上で成長すると予想した。カナマイシン・プレート上だけで成長することができるコロニーを採取し、ＤＮＡを単離し、また、遺伝子ノックアウトを確認するためにＰＣＲを実行した。
【０１９５】
実施例５：形質転換アッセイ
ｐＣａｓ９、ｐＢＡＤ３３−Ｃｐｆ、またはｐＺ００３（Ｃａｓ１３ａ）プラスミド（様々なｓｇＲＮＡまたはスペーサー・プラスミドを備えた）を５０ｎｇのプラスミドＤＮＡを使用して、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、電気形質転換によって受容大腸菌株、志賀赤痢菌、肺炎杆菌とサルモネラ・エンテリカ  ＬＴ２中に形質転換し、そしてＳＯＣ培地４５０ｕｌ中で１時間、３７°Ｃ、２５０ｒｐｍで回復させた。回復期間の後、細胞を抗生物質を伴う適切な選択培地上にまき、または階段希釈でスポッティングした。ＣＦＵを、対照（非標的のｓｇＲＮＡまたはスペーサー）の形質転換で得られたＣＦＵの数値と比較した。変換はすべて、少なくとも３回よりも多く繰り返した。高い死滅効率を得るために、ｓｇＲＮＡまたはスペーサー・プラスミドをそれら自身の天然の宿主（志賀赤痢菌、肺炎杆菌とサルモネラ・エンテリカ）において形質転換し、精製した。その後、死滅アッセイを精製されたスペーサー・プラスミドを用いて実施した。
【０１９６】
実施例６：回避の確認および分析
ｔｒｅＦまたはｙｆａＰスペーサー・プラスミドを用いた死滅アッセイを生き延びたコロニーを適切な抗生物質を伴うＬＢ寒天平板へ再度ストリークした。翌日、一夜にわたって、抗生物質を伴う３ｍｌのＬＢ培地中に単一のコロニーを接種し、そして、光学濃度Ａ６００に基づいて増殖を評価した。測定可能な増殖を示す培養物は、非標的のスペーサーに対して（Ａ６００  １．０〜２．０）、ｔｒｅＦに対して（Ａ６００  ０．１〜０．４）、およびｙｆａＰに対して（Ａ６００  ０．１〜０．３）であった。その後、プラスミドを同じ培養物から単離して、直接配列決定に送るか、または、欠失した、あるいは変異したスペーサーを確認するために、スペーサー（ｔｒｅｆ  、またはｙｆａＰ）を増幅するＰＣＲを実施した。スペーサー（ｔｒｅＦとｙｆａＰ）のために使用されたプライマーは、特異的にスペーサー・プラスミドのプロモーターまたはターミネーターの内に結合した。データはすべて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、  米国カリフォルニア州サンディエゴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ／）を使用して、統計的に分析された。
【０１９７】
実施例７：Ｃａｓ９とＣａｓ１３ａに対するＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）の抗微生物活性の比較
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓに基づく抗生物質への代替エフェクターとして、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）をＣａｓ９およびＣａｓ１３ａ（図２のＡ−図２のＣ）と比較して調査した。本明細書において、Ｃａｓ１３ａはＣ２ｃ２とも呼ばれる。プラスミドに基づくＣＲＩＳＰＲアレイ（ｓｇＲＮＡまたはスペーサー）が大腸菌ＭＧ１６５５のゲノム全体にわたる１０の遺伝子を標的とするように設計し、これらの１０の遺伝子のうち８つ（ｔｒｅＦ、ｅａｍＢ、ｉｒｈＡ、ｌａｃＺ、ｓｏｘＳ、ｒｄｇＣ、ｚｗｆ１とａｃｎＡ）は非必須であり、また、２つ（ｙｆａＰとｓｐｅＡ）は必須であった。Ｃａｓ９をエフェクターとして使用した時、非標的のｓｇＲＮＡとの比較において、非必須遺伝子標的の死滅効率は１０３倍だけ増加し、その一方で、必須遺伝子の死滅効率は１０６倍だけ増加した（図２のＤ）。Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）をエフェクターとして使用した時、非標的のスペーサーとの比較において、非必須遺伝子標的と必須遺伝子標的を死滅させる効率の両方は１０３〜１０５倍だけ増加した（図２のＥ）。Ｃａｓ１３ａをエフェクターとして使用した場合、非必須と必須の遺伝子のいずれも、死滅効率についていかなる増加も示さず（図２のＦ）、そのことは、Ｃａｓ１３ａがＣａｓ９またはＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）との比較において、優れた抗生物質ではないことを例証した。これらの結果は、これらの３つのエンドヌクレアーゼの間で、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）が、標的とされた遺伝子が非必須か必須かにかかわらず、死滅効率における同様の増加を示したよりよい抗生物質であることを示す。これに対して、必須遺伝子を標的として、Ｃａｓ９をエフェクターとして使用した場合、非必須の遺伝子との比較においてより大きな死滅効率の増加を示した。
【０１９８】
Ｃａｓ１３ａに媒介された死滅を、大腸菌ＢＷ２５１１３、大腸菌ＢＷ２５１１３ΔｒｅｃＡ、大腸菌Ｏ９：ＨＳ、大腸菌Ｅ２４３７７Ａなどの他の大腸菌ホスト中で２つの非必須遺伝子（ｔｒｅＦとｅａｍＢ）と２つの必須の遺伝子（ｙｆａＰとｓｐｅＡ）を標的化することによってさらに調査したが、結果は、すべての大腸菌ホストの間で一貫していた（図３のＡ−図３のＥ）。正の対照については、多重化プラスミドは２つのスペーサー、ＳＰ１またはＳＰ２を標的とした。ＳＰ１とＳＰ２を標的とする死滅効率はおよそ１０４倍だけ増加した（図４のＡ−図４のＢ）。
【０１９９】
実施例８：Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）とＣａｓ９の回避機構の調査
Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）とＣａｓ１３ａの死滅効率における差、および、ｒｅｃＡによって制御されるそれらの修復機構をＣａｓ９と比較した。大腸菌ＭＧ１６５５ΔｒｅｃＡゲノム中の必須および非必須の標的遺伝子を変形する各エンドヌクレアーゼの死滅効率を図５のＡ−図５のＣに示す。Ｃａｓ９を発現する大腸菌細胞中で、１つの細胞も生き延びられず（図５のＡ）、そのことはＣａｓ９によるゲノム開裂がｒｅｃＡによって修復されることを例証した。しかしながら、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を発現する大腸菌細胞において、非必須遺伝子に対してまったく効果はなく、その一方で必須遺伝子は、Ｃａｓ９と同様に、死滅効率における増加を示し、および生き延びた細胞はなく（図５のＢ）、Ｃｐｆ１については、非必須遺伝子の修復機構がｒｅｃＡのみに依存するのではないこと、および、他の修復機構が存在することを示唆した。Ｃａｓ１３ａを発現する大腸菌細胞において、ｒｄｇＣを標的化することは、他の標的スペーサーおよび非標的スペーサーと比較して、死滅効率は１０３倍の増加を示した（図５のＣ）。ＲｄｇＣタンパク質はＲｅｃＡ機能の潜在的な負のレギュレーターであり、および、特定の実施形態では、一本鎖ＤＮＡ上で形成されたＲｅｃＡフィラメントによって触媒されたＤＮＡ鎖交換を相同の二重ＤＮＡに結合することによって阻害し、および、その結果として、ＲｅｃＡ核タンパク質フィラメントによってそのＤＮＡへのアクセスをブロックする。特定の実施形態では、ＲｄｇＣはまた、一本鎖の（ｓｓ）ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡに非特異的に結合し、および他の非標的ｍＲＮＡまたはｓｓＤＮＡを劣化させる。
【０２００】
Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を伴うｔｒｅＦおよびｙｆａＰスペーサーによって標的とされた４８の生き延びたコロニーの成長パターンを調査した。コロニーのおよそ７３〜８２％は非標的のスペーサーと比較して遅延された増殖（図６Ａ−図６Ｃ）を示し、そのことは、遺伝子の劣化の後に細胞の遅延された死滅が存続したことを示す。ｔｒｅＦとｙｆａＰのゲノムおよびプラスミドにおける突然変異も、同じ生き延びたコロニーにおけるＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）ＲｕｖＣ突然変異と同様に試験した。非標的のＣＲＩＳＰＲアレイまたはｔｒｅＦ  ＣＲＩＳＰＲアレイのいずれかを用いて形質転換した細胞では、遺伝子突然変異は見出されなかった（図６Ｄ−図６Ｅ）。同様に、非標的のＣＲＩＳＰＲアレイまたはｔｒｅＦ  ＣＲＩＳＰＲアレイを用いて形質転換した細胞のどちらの生き延びたコロニーから単離されたプラスミドのＲｕｖＣドメインでも、突然変異は見出されなかった（図６Ｆ−図６Ｇ）。Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）タンパク質のいかなる場所における有害突然変異も標的化を混乱させ、従って、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）タンパク質全体は細胞が生き延びた後に配列決定されるが、配列の変動は観察されないと考えられた。加えて、ガイドＲＮＡをコード化するＣＲＩＳＰＲアレイを、それが突然変異を被ったかどうか確かめるために試験した。成長欠陥を示さなかったｔｒｅＦとｙｆａＰの１２の生き延びたコロニーをスクリーニングし、そして、１１／１２と１２／１２のコロニーはアレイが突然変異を経験したＣＲＩＳＰＲプラスミドを内部に持つことがわかった。
【０２０１】
細胞がどのように生き延びることができたかさらに調査するために、大腸菌ＭＧ１６５５を死滅アッセイにおいて二重スペーサーのプラスミドを有するＣＲＩＳＰＲアレイを使用した。単一のスペーサーのプラスミドと比較して、二重スペーサーのプラスミドを有するＣＲＩＳＰＲアレイの死滅効率を図６Ｈに示す。配列決定された１０のコロニーのうち、第１のスペーサーは不変だったのに対し、配列決定されたコロニーのおよそ８〜９における第２のスペーサーは欠失していた（図６Ｉ−図６Ｌ）。反復とスペーサーのＣＲＩＳＰＲアレイだけを有する細胞は、スペーサー配列において変化を示さず、また、反復−スペーサー−反復のＣＲＩＳＰＲアレイについても同様であった（図７のＡ−図７のＢ）。二重スペーサーがあるＣＲＩＳＰＲアレイにおいて、１つのスペーサーはゲノムを標的化し、標的とするゲノムの領域を開裂する役割を果たし、一方で、別のスペーサーは再結合する役割、または死滅を促進するようにゲノムのどこか他の部分を標的化する役割を果たしていると推測されたが、正確な機構はなおも不明である。全体的に見て、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）による細胞生存は、１つのメカニズムによって制御されるのではないが、例えば、遅延された増殖、または欠失したスペーサー配列などの様々な方法によって制御される。
【０２０２】
Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）が非特異的にＲＮＡを劣化させる能力を持ち、ある機構がＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）の触媒残基ドメインによって制御されることは予め説明されていた。この現象のために、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）がＣａｓ９よりも高められた死滅効率を有すると推測した。このことを調査するために、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）のＤ９１７ドメインとＤ１２５５ドメインを突然変異させ（図８のＡ）、そして、ＣＲＩＳＰＲアレイを使用してｔｒｅＦ、ｅａｍＢ、およびｙｆａＰを標的化することにより、大腸菌ＭＧ１６５５と大腸菌ＭＧ１６５５のｒｅｃＡ突然変異体において、死滅実験を実行した。しかしながら、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）野生型株およびＲｕｖＩＩドメイン株においては、死滅効率への影響は観察されなかった（図８のＢ−図８のＣ）。結果は、より良い死滅効率はＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）の触媒ドメインに依存するものではないことを示した。同様の実験的なアプローチもＣａｓ１３ａについて実行し、ここでＨＥＰＮドメインをＲ５９７、Ｈ６０２、Ｒ１２７８、および、Ｈ１２８３（図９のＡ）において突然変異させ、プラスミド標的としてＳＰ１またはＳＰ２を標的とし（図９のＢ）、およびゲノム標的としてｓｏｘＳとｒｄｇＣを標的化する（図９のＣ）ことによって大腸菌ＭＧ１６５５の死滅実験を実行した。
【０２０３】
実施例９：他の大腸菌株とグラム陰性病原菌における、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を媒介とする死滅
大腸菌ＢＷ２５１１３、大腸菌Ｏ９：ＨＳ、大腸菌Ｅ２４３７Ａ（ＥＴＥＣ）、志賀赤痢菌、肺炎杆菌、およびサルモネラ・エンテリカなどの他のグラム陰性菌細菌性宿主に対するＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）の抗微生物アプローチの有用性は実証された。大腸菌ＢＷ２５１１３大腸菌ＢＷ２５１１３ΔｒｅｃＡ、大腸菌Ｏ９：ＨＳ、大腸菌Ｅ２４３７Ａ（ＥＴＥＣ）菌株については、ｔｒｅＦとｅａｍＢ（非必須）、およびｓｐｅＡとｙｆａＰ（必須）を標的化するＣＲＩＳＰＲアレイを設計した。大腸菌ＢＷ２５１１３株における死滅効率（図１０Ａ−図１０Ｂ）は、非必須と必須の両方の遺伝子について、大腸菌ＭＧ１６５５（図２のＤ−図２のＦ）と一致したが、大腸菌Ｏ９：ＨＳ（図１０Ｃ）および大腸菌Ｅ２４３７Ａ（ＥＴＥＣ）（図１０Ｄ）株においては、完全に死滅されることは必須遺伝子において増加し、および、標的とする非必須遺伝子については大腸菌ＭＧ１６５５と一致した。結果は、種が同じ属の場合でも、異なる種の修復機構には差異があることを示した。
【０２０４】
他のグラム陰性病原菌も調査した。志賀赤痢菌については、ｌａｃＺとｒｄｇＣ（非必須）およびｓｐｅＡとｆｔｓＺ（必須）を標的とするために、ＣＲＩＳＰＲアレイを使用した。肺炎杆菌については、ｌａｃＺとｒｄｇＣ（非必須）およびｒｐｏＥとｆｔｓＺ（必須）を標的とするためにＣＲＩＳＰＲアレイを使用した。サルモネラ・エンテリカについては、ｔｒｅＦとｓｏｘＳ（非必須）およびｓｐｅＡとｆｔｓＺ（必須）を標的とするために、ＣＲＩＳＰＲアレイを使用した。志賀赤痢菌における死滅効率は、必須遺伝子について増加したが、非必須遺伝子の死滅効率は１０３倍だけ増加した（図１０Ｅ）。非必須と必須の両方の遺伝子について肺炎杆菌における死滅効率は１０４倍だけ増加したが（図１０Ｆ）、そのことは細胞を死滅させるためにどの遺伝子が標的とされるか（非必須かそれとも必須か）は重要でないことを示した。サルモネラ・エンテリカの場合には、非必須遺伝子を標的とした細胞死滅は大腸菌株に比べて非常に乏しく、死滅効率は１０２〜１０３倍だけ増加し、一方、一方、必須遺伝子による標的は１０３〜１０４倍を示した。
【０２０５】
すべての菌株ついて、１つの修復機構は機能しなかった。菌株の間と同様に、属の間にもまた差異があった。
【０２０６】
実施例１０：Ｍｕ  Ｇａｍと多重スペーサーによるサルモネラ・エンテリカ  ＬＴ２の死滅の促進
ｔｒｅＦとｆｔｓＺを標的化するＣＲＩＳＰＲアレイによるｒｅｃＡ変異を有するサルモネラ・エンテリカ菌株の死滅効率を決定した。死滅効率は非標的スペーサーとの比較において１０４倍だけ増加し（図１１Ｂ）、それに対して野生型菌株は死滅効率において１０３倍の増加を示した（図１０Ｇ）。これらのデータは、サルモネラ生存コロニーがｒｅｃＡによって修復されることをと表わす。
【０２０７】
野生型菌株にいかなる突然変異も生じさせずに、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を使用してサルモネラ・エンテリカに対する効率的な抗生物質を作るために、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）と一緒にＧａｍを発現させる構成的プロモーターと共にＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）およびＧａｍを有するプラスミドベクターを構築した。ＧａｍはＭｕファージからのバクテリオファージタンパク質である。それはｒｅｃＡが結合したＤＮＡの二本鎖の割れ目に結合し、および、ｒｅｃＡの機能を阻害して死滅効率を高める（図１１Ａ）。Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）とＧａｍを有するサルモネラ・エンテリカ菌株は、ｒｅｃＡ突然変異体サルモネラ菌と同様に、死滅効率において１０４倍の増加を示した（図１１Ｂ）。これらのデータは、外因性タンパク質Ｇａｍが死滅効率を高め、および、効率を増加させるために親株においていかなるゲノム修飾も必要としなかったことを示す。
【０２０８】
同じプラスミド中で個別のスペーサーにおける４つのランダムな位置にあるか、または４つすべてのスペーサーにあるかどちらかの（多重スペーサーと呼ばれる）ｔｒｅＦ遺伝子を標的とするための、プラスミドベースのＣＲＩＳＰＲアレイを作成した（図１１Ｃ）。その後、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）タンパク質またはＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）をＧａｍと共に有するサルモネラ菌野生型菌株において、これらのプラスミドを用いた死滅実験を実行した。個別のスペーサーまたは多重スペーサーによって標的とされたＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を有する菌株、および遺伝子において、死滅効率は、１０〜１０２倍だけ増加した（図１１Ｄ）。同じ遺伝子を異なる位置で標的化することが単一のスペーサーより致死的であると期待したため、その結果は予期しなかった。Ｇａｍと共にＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を有し、個別のスペーサーまたは多重スペーサーによって標的とされたサルモネラ菌野生型菌株を用いて、個別のスペーサーに強力な死滅効率があり、および死滅効率は１０４倍だけ増加されることが発見され（図１１Ｅ）、および、より興味深いことに、多重スペーサーを用いて標的化することによって、１つのコロニーも生き延びなかった。
【０２０９】
実施例１１：ＣＰＦＩを発現したプラスミド、および強力に細胞死を誘発する自己標的化するｃｒＲＮＡｓ
プラスミドをコードするＣｐｆ１ヌクレアーゼ単独、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼとｆｔｓＡを標的とするｃｒＲＮＡ、または、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼとｇｙｒＢを標的とするｃｒＲＮＡを、エレクトロコンピテントの緑膿菌の中へ形質転換した。プラスミドの存在を決定するために、カルベニシリンを含有するプレート上に細菌を加えた。対照のＣｐｆ１プラスミドの形質転換が結果として、１形質転換あたり１０６ＣＦＵより大きくなった一方で、緑膿菌を標的とするｃｒＲＮＡを備えたプラスミドについては、耐カルベニシリン性のコロニーは、ひとつも回収されなかった（図１４Ａ）。ＣＰＦＩ＋ｃｒＲＮＡのプラスミド形質転換は、２つの異なる緑膿菌株において、細菌ゲノム標的化の致死性、および、ファージに送達される抗微生物活性のためのヌクレアーゼとしての有用性を例示する。
【０２１０】
２つのシュードモナス株ｂ１１２７とｂ１８４３を野生型の（ＷＴ）ファージ、Ｃｐｆ１を挿入されたファージ、または、Ｃｐｆ１と、ｆｔｓＡ標的化ｃｒＲＮＡとを備えたファージに感染させた。これらを１６時間増殖させ、細菌を濾過によって取り除き、そして、それらが増殖した菌株を含有している０．７５％の寒天重層上にファージの希釈物をプラーキング（ｐｌａｑｕｉｎｇ）することによりファージ濃度（ＰＦＵ／ｍｌ）を決定した。ファージｐ１０３２とＣＰＦＩを操作されたその変異体を、２つの異なる緑膿菌株における野生型の相当物として、それらの増幅する能力について評価し、および、ＣＰＦＩとＣＰＦＩ＋ｃｒＲＮＡ変異体が最終的な滴定濃度増幅の点で同じ適応度を示すことを実証した（図１４Ｂ）。
【０２１１】
ｐ１０３２と操作されたその変異体を感染しやすい緑膿菌株（ｂ１１２７）を用いてインキュベートし、そして、細菌ｃｆｕを列挙するように様々な時点でサンプリングを行った。３時間と８時間の両方で、細菌ｃｆｕは、野生型と操作された変異体を通じて一致した（図１４Ｃ）。
【０２１２】
実施例１２：ＷＴおよび操作されたｐ１１０６についての増殖曲線宿主域分析
表２は、野生型の緑膿菌ファージ、ＣｐｆＩをコードする緑膿菌ファージ、およびＣｐｆＩ＋ｃｒＲＮＡをコードする緑膿菌ファージについての増殖曲線宿主域分析を例示する。宿主域へのヒット（ｈｉｔ）は、増殖曲線下に０．７以下の相対的な面積を持っていることにより定義される。簡潔に述べると、ファージｐ１１０６とＣＰＦＩを操作されたその変異体は、緑膿菌株のサブセットと共にインキュベートされ、および、６００ｎｍの光学濃度でモニタリングされた。各増殖曲線下の面積を定量化し、その後、各株について、未処置の培養物の増殖曲線下の面積でその領域を割った。表示された値は曲線下の相対的な面積を表わし、および、０．７未満の値はファージの宿主域内にあると見なされる。野生型のｐ１１０６と操作されたその変異体の宿主域は類似しており、それが感染する菌株に関して、ファージの適応度がＣＰＦＩとｃｒＲＮＡの挿入によって不変だったことを実証している。
【０２１３】
【表２−１】
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【０２１４】
【表２−２】
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【０２１５】
実施例１３：操作されたファージについてわずかに減少した死滅を示す、ＰＡ１４に対するｐ１１０６ＣＦＵ減少アッセイ
ファージｐ１１０６とその操作された変異体を、感染しやすい緑膿菌株（ＰＡ１４）と感染しやすくない菌株（ＬＦＰ１１６０）を用いてインキュベートし、細菌ＣＦＵを列挙するように様々な時点でサンプリングを行った。ＰＡ１４に対し、３時間の減少は３つのファージすべてについて同様に見える（〜２ｌｏｇ）（図１５のＡ）。ＣＦＵは、感染しやすくない菌株において、すべての群について同値である（図１５のＢ）。
【０２１６】
実施例１４：リアルタイムＰＣＲによるファージ遺伝子発現
Ｃｐｆ１のｍＲＮＡと細菌のゲノム標的化ｃｒＲＮＡの発現レベルを決定し、かつバクテリオファージ感染の間のｔｓＡ切断のレベルを決定するために、研究を実施した。緑膿菌株ＬＦＰ１１６３、および２つのバクテリオファージ：野生型ｐ１０３２（ＷＴ）とｐ１０３２＿ｃｐｆ１＿ｆｕｌｌ構築物（ｃｒＰｈａｇｅ）を利用した。ＬＦＰ１１６３はＭＯＩ＝１でＷＴバクテリオファージあるいはｃｒＰｈａｇｅのいずれかに感染した。研究は感染していないＬＦＰ１１６３の対照も含んだ。緑膿菌ＬＦＰ１１６３／ｂ１８３４を一夜培養し、薄め戻し、増殖し、ＯＤ＝０．２５で感染させた。研究設計を図１６で例示する。
【０２１７】
プライマー：ｒｐｓＨ（ＰＡ遺伝子）、Ｃｐｆ１（ｃｒＰｈａｇｅ）、ｃｒＲＮＡ（ｃｒＰｈａｇｅ）、ＤＮＡ  ｐｏｌ（すべてのファージ）。
【０２１８】
１５分  ｐ．ｉ．、３０分  ｐ．ｉ．、４５分  ｐ．ｉ．、および６０分  ｐ．ｉ．にＲＮＡＰｒｏｔｅｃｔで細菌細胞を処置し、プロテイナーゼＫとリゾチームを用いる細菌細胞溶解が後続した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキットを用いてオンカラムＤＮａｓｅ処置の工程でＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度と品質（２６０／２８０の比率）をＮａｎｏＤｒｏｐによって決定した。ＢｉｏＲａｄ  ｉＳＣＲＩＰＴ  ｃＤＮＡ合成プロトコルを用いてＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。サイバーグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲによって標的のｍＲＮＡレベルを決定した：ｒｐｓＨ（細菌のハウスキーピング遺伝子）、Ｃｐｆ１、ｃｒＲＮＡ（細菌のゲノムを標的とする）、切断されていないｆｔｓＡ、切断されたｆｔｓＡ、およびファージＤＮＡポリメラーゼ（ファージ感染ポジティブコントロール）。ハウスキーピング対照としてｒｐｓＨを使用して、ΔΔＣＴ法によりデータを分析し、続いて倍率変化計算を行った。この実験を２度反復した。単離したＲＮＡのサブセットをＧｅｎｅＷｉｚ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−Ｓｅｑに送った。
【０２１９】
図１７のＡ、図１７のＢ、図１７のＣ、図１７のＤ、および図１８において、個々の時点で感染していない対照との比較によって倍率変化を得た。緑膿菌ハウスキーピング遺伝子、ｒｐｓに対して倍率変化を比較した。ＷＴファージに感染した細菌におけるバックグラウンド発現は最小限だった。Ｃｐｆ１をｃｒＰｈａｇｅにおいて発現させ、ＣＰＦＩ発現を検出するためのプライマーの特異性を確認した。
【０２２０】
図１９のＡ、図１９のＢ、図１９のＣ、図１９のＤ、および図２０において、個々の時点で感染していない制御部との比較によって倍率変化を得た。緑膿菌ハウスキーピング遺伝子、ｒｐｓＨに対して倍率変化を比較した。ＷＴファージに感染した細菌におけるバックグラウンド発現は最小限だった。ｃｒＰｈａｇｅ中でｃｒＲＮＡを発現させた。
【０２２１】
図２１のＡ、図２１のＢ、図２１のＣ、図２１のＤ、および図２２において、個々の時点で感染していない対照との比較によって倍率変化を得た。緑膿菌ハウスキーピング遺伝子、ｒｐｓＨに対して倍率変化を比較した。ファージＤＮＡポリメラーゼは、ＷＴファージとｃｒＰｈａｇｅの両方において発現されるように現われる。いくつか場合において、発現レベルはＷＴとｃｒＰｈａｇｅの間で非常に類似している。データは、発現が経時的に増加したことを示す（図２２）。
【０２２２】
図２３のＡ、図２３のＢ、図２３のＣ、図２３のＤ、および図２４において、個々の時点で感染していない対照との比較によって倍率変化を得た。緑膿菌ハウスキーピング遺伝子、ｒｐｓＨに対して倍率変化を比較した。切断されていないｆｔｓＡは、６０分  ｐ．ｉ．まですべての群において等しいレベルで発現されるように現われる（図２４）。
【０２２３】
図２５のＡ、図２５のＢ、図２５のＣ、図２５のＤ、および図２６において、個々の時点で感染していない対照との比較によって倍率変化を得た。緑膿菌ハウスキーピング遺伝子、ｒｐｓＨに対して倍率変化を比較した。切断されたｆｔｓＡは、６０分  ｐ．ｉ．まですべての群において等しいレベルで発現されるように現われる（図２６）。
【０２２４】
倍率変化による切断された／切断されていないｆｔｓＡの比を図２７に示す。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、感染していないサンプルでは、ｆｔｓＡの「切断されていない」と「切断された」の発現レベルに違いはない。いくつかの実施形態では、ＷＴファージに感染したサンプルでは、「切断されていない」と「切断された」の発現レベルに違いはない。いくつかの実施形態では、ｃｒＰｈａｇｅに感染したサンプルでは、「切断された」の発現の減少がある。いくつかの実施形態では、ｃｒＰｈａｇｅに感染したサンプルでは、「切断された」の発現の減少は、ｍＲＮＡの減少をもたらすＤＮＡの減少の結果である。いくつかの実施形態では、「切断されていない」ｆｔｓＡの発現の減少は、ＤＮＡの下流の切断に起因するｍＲＮＡの転写／安定性の減少による。いくつかの実施形態では、促進された死滅は「切断されていない」ｆｔｓＡの低下したレベルをもたらす。促進された死滅における「切断されていない」ｆｔｓＡの減少は細菌の死滅レベルによる場合がある。
【０２２６】
本開示の好ましい実施形態が本明細書中で示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないということは、当業者に明らかであろう。多くの変形、変更、および置き換えは、本開示から逸脱することなく、当業者によって想到されるものである。本明細書に記載される開示の実施形態の様々な代案が、本開示の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を定義するものであり、ならびに、この特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法および構造はそれによって包含されることが、意図されている。
【図１】
2021525105.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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