(57)【要約】  本発明は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であって、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とL−イソロイシンエチルエステルとのモル比が１：０．３〜１：２．０（モル／モル）の結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物、並びにそれらを製造する方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であって、５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルとのモル比が１：０．３〜１：２．０（モル／モル）の結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。
【請求項２】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルとのモル比が、１：０．５〜１：１．５（モル／モル）である請求項１に記載の結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。
【請求項３】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルとのモル比が、１：０．７５〜１：１．５（モル／モル）である請求項１または２に記載の結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。
【請求項４】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルの比が、約1：1（モル／モル）である先行する請求項の少なくとも１項に記載の結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。
【請求項５】
前記塩が、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩であり、５．８、６．９、１４．０、１７．５、および２２．２に位置するピ−クから選択される少なくとも１つの特徴的なピ−ク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ａ）、ことを特徴とする先行する請求項の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項６】
前記塩が、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩であり、５．８、６．９、１４．０、１７．５、および２２．２に位置するピ−クから選択される少なくとも３つの特徴的なピ−ク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ａ）、ことを特徴とする、先行する請求項の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項７】
前記塩が、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−イソロイシンエチルエステルの塩であり、５．８、６．９、８．５、１２．５、１２．９、１４．０、1４．９、１６．２、１７．５、１７．９、１８．９、１９．２、２２．２、２４．４、２５．４、２５．８、２５．９、および３４．６（形態Ａ）に位置するピ−クから選択される少なくとも1つの特徴的ピ−ク（２θ±0．2θ （ＣｕＫα放射）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有することを特徴とする、先行する請求項の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項８】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩が、実質的に図１に示されるようなＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ａ）、ことを特徴とする先行する請求項の少なくとも１つの結晶塩。
【請求項９】
前記塩が、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩であり、１６０７、１５７１、１５０６、１２５０、および６５０に位置するピ−クから選択される少なくとも1つの特徴的なピ−ク（波数、cm-1±２cm-1で表したとき）を有するラマンスペクトルを有する（形態Ａ）、ことを特徴とする先行する請求項の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項１０】
前記塩が、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩であり、２９６１、２９３８、１６０７、１５７１、１５０６、１４６８、１３３２、１２５０、１１５３、９２２、８６０および６５０（形態A）に位置するピ−クから選択される少なくとも1つの特徴的なピ−ク（波数、cm-1±２cm-1で表したとき）を有するラマンスペクトルを有することを特徴とする、先行する請求項の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項１１】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩が、実質的に図４に示されるようなラマンスペクトルを有する（形態Ａ）、ことを特徴とする前記請求項の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項１２】
前記塩が、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩であり、５．３、７．０、１４．０、１７．７、および２４．５に位置するピ−クから選択される少なくとも１つの特徴的なピ−ク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態B）、ことを特徴とする請求項１〜４の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項１３】
前記塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩であり、５．３、７．０、１４．０、１７．７、および２４．５に位置するピ−クから選択される少なくとも３つの特徴的なピ−ク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ｂ）、ことを特徴とする請求項１〜４または１２の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項１４】
前記塩が、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩であり、５．３、７．０、８．４、１３．０、１３．２、１４．０、１４．７、１５．９、１７．４、１７．７、１８．１、１８．７、２０．７、２１．２、２２．９、２４．５、および２５．４に位置するピ−クから選択される少なくとも１つの特徴的ピ−ク（２θ±０．２θ（ＣｕＫα放射）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ｂ）、ことを特徴とする請求項１〜４、１２または１３の少なくとも1項に記載の結晶塩。
【請求項１５】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩が、実質的に図２に示されるようなＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ｂ）、ことを特徴とする、請求項１〜４、１１〜１３または１４の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項１６】
前記塩が、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩であり、７．０、８．８、１４．０、１７．６、２０．２、２３．４および２６．９に位置するピ−クから選択される少なくとも1つの特徴的なピ−ク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ｃ）、ことを特徴とする請求項１〜４の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項１７】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩であり、７．０、８．８、１４．０、１７．６、２０．２、２３．４および２６．９に位置するピ−クから選択される少なくとも３つの特徴的なピ−ク（２θ±０．２°２θ （ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ｃ）、ことを特徴とする請求項１〜４または１６の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項１８】
前記塩が、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩であり、５．３、７．０、８．８、１１．２、１３．０、１４．０、１５．１、１５．９、１６．８、１７．４、１７．６、２０．２、２０．５、２０．８、２１．２、２１．４、２３．４、２４．５、２６．９、および３２．２に位置するピ−クから選択される少なくとも1つの特徴的なピ−ク（２θ±０．２θ （ＣｕＫα放射）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態C）、ことを特徴とする請求項１〜４、１６または１７の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項１９】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩が、実質的に図３に示されるようなＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ｃ）、ことを特徴とする請求項１〜４、１６〜１７または１８の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項２０】
少なくとも９９％以上の化学的、立体異性的および結晶純度を有する先行する請求項の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項２１】
請求項１〜２０の少なくとも1項に記載の５−メチル−（６Ｓ）テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩を製造する方法であって、以下の工程、
i) ５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の水中混合物を調製し、Ｌ−イソロイシンエチルエステルを、任意選択で適切な溶媒または溶媒の混合物中で、添加する工程、
ii）塩基を、任意選択で適切な溶媒または溶媒の混合物中で、添加して溶解させる工程、
iii) 組成物を少なくとも６０℃に加熱する工程、
iv) ｐＨを４〜７の範囲に調整するための適切な酸を添加する工程、
v) 結晶化させ、混合物を１℃〜３０℃の温度に冷却し、任意選択で得られた懸濁液を最終温度で撹拌する工程、および
vi）得られた固体材料を単離し、任意選択で生成物を乾燥させる工程、
を含む方法。
【請求項２２】
工程ii）において、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステル塩酸塩とのモル比が１：１〜１：３の範囲であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程i）において、水中の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の混合物をその場で調製することを特徴とする、請求項２１および／または２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程i) において、Ｌ−イソロイシンエチルエステルがその塩化水素塩の形で使用されることを特徴とする請求項２１〜２３記載の方法。
【請求項２５】
工程ii）において、水酸化ナトリウム水溶液を用いて化合物の溶解を可能にし、工程iv）において、塩酸水溶液を用いてｐＨを調整することを特徴とする請求項２１〜２４の方法。
【請求項２６】
工程ii）において、塩基の添加後のｐＨが６．５〜９．０の範囲であることを特徴とする請求項２１〜２５の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項２７】
工程iii）において、木炭を添加し、次いで溶液を清澄濾過することを特徴とする請求項２１〜２６の少なくとも1項に記載の方法。
【請求項２８】
前記溶媒が水であることを特徴とする請求項２１〜２７の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項２９】
工程iv）において、酸の添加によって達成されるｐＨ値が５．４〜６．４の範囲であることを特徴とする、請求項２１〜２８の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項３０】
工程iii）、iv）および／またはv）において、種結晶が添加されることを特徴とする請求項２１〜２９の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜２０の少なくとも1項に記載の５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩、および任意選択で１以上の複数の許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物、食品添加物および／または調製物。
【請求項３２】
錠剤、カプセル、経口液体製剤、粉末、凍結乾燥物、顆粒、ロゼンジ、再構成可能な粉末、注射または注入可能な溶液または懸濁液または坐剤の形態で請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
少なくとも1つの追加の治療薬をさらに含む、請求項３１または３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
経口、非経口、筋肉内、脊髄内、髄腔内、髄腔内、歯周、局所または直腸投与の医薬組成物である請求項３１〜３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
請求項１〜２０の少なくとも1項に記載の５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩の、薬物の製造のための成分としての、および／または食品添加物としての使用。
【請求項３６】
貧血、神経管欠損、心血管疾患、うつ病、認知障害、アルツハイマ−病および骨粗鬆症のホモシステイン低下の治療に使用するための、および／または低血漿および／または低赤血球葉酸および／または低脳脊髄液葉酸および／または低末梢または中枢神経系葉酸の食事管理に使用するための、請求項１〜２０の少なくとも1項に記載の５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸およびL−イソロイシンエチルエステルの結晶塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸（Ｎ−［４−［［（２−アミノ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−５−メチル４−オキソ−（６Ｓ）−プテリジニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸）およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テトラヒドロ葉酸塩は、主に５−ホルミルテトラヒドロ葉酸（ロイコボリンおよびロボロイコボリン）のカルシウム塩として、５−メチルテトラヒドロ葉酸（メタフォリン（登録商標））のカルシウム塩として、または５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸（モデュフォリン（登録商標））の硫酸塩として使用される。最も突出した使用分野は、巨赤芽球性葉酸貧血の治療のために、葉酸アンタゴニスト、特に癌治療におけるアミノプテリンおよびメトトレキセ−トの適合性を増加させるための解毒剤として（「葉酸拮抗剤レスキュ−」）、フッ化ピリミジンの治療効果を増加させるために、および乾癬および関節リウマチのような自己免疫疾患の治療のために、例えばトリメトプリム−スルファメトキサゾ−ルのような突然変異に対するある種の駆虫剤の適合性を増加させるために、および化学療法におけるジデアザテトラヒドロ葉酸の毒性を減少させるために、使用される。
【０００３】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩は、特に薬物として、および食品添加物として、ビタミン調剤として、神経管欠損の予防のために、うつ病の治療のために、およびホモシステインレベルに影響を及ぼすために使用される。
【０００４】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびその塩は、極めて不安定であることが知られている。特に、それらは、酸化に対して非常に敏感であり（この点に関して、A.L.Fitzhugh、Pteridines 4（4),187-191(1993）も参照のこと）、したがって、医薬活性成分または食品添加物に許容される純度レベルで製造することが困難である。
【０００５】
５−メチルテトラヒドロ葉酸およびその塩の不安定性を克服するために、酸素をできるだけ完全に排除する、またはアスコルビン酸もしくは還元Ｌ−グルタチオンなどの酸化防止剤を添加するなどの様々な方法が使用されてきた。
【０００６】
米国特許第６，４４１，１６８号は、５−メチルテトラヒドロ葉酸のアルカリ土類塩、特にカルシウム塩、その結晶化およびその使用を開示している。５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のこのような結晶性カルシウム塩の欠点は、それが４つまでの多形変異の結晶形態で存在することである。従って、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩の製造方法は、非常に正確に制御されなければならない。さらに、米国特許第６，４４１，１６８号の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩は、典型的には結晶格子中に、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸１当量当たり少なくとも１当量であるが４当量までの水をそのすべての多形形態で含有する。
【０００７】
ＵＳ ２０１６２０７９２５Ａ１は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と共にＬ−アスパラギンまたはＬ−アルギニンを含む噴霧乾燥または煮詰組成物を特許請求している。しかしながら、開示された組成物は単純な非化学量論的混合物であり、非晶質状態で存在する。
【０００８】
薬学的に有用な化合物の新しい結晶形態は、薬学的および／またはビタミン／医学的食品の性能プロフィ−ルを改善する機会を提供する。それは、製剤科学者が改善された特性を有する新しい投薬形態を設計するために利用可能な材料の蓄積を広げる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の根底にある技術的課題は、当該技術分野で知られている５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩の欠点を克服する、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸を含む結晶形態の提供である。
【００１０】
さらに、新しい結晶形態はしばしば、所望の異なる物理的性質および／または生物学的特性を示し、これは、規制の承認に必要とされる純度レベルおよび均一性まで、活性化合物の製造または処方を補助し得る。
【００１１】
テトラヒドロ葉酸塩の安定性のために、貯蔵時に低い吸水性を有し、製造中に十分に乾燥させることができる化合物を提供することが常に目標である。加えて、周囲条件下で多量の水を吸収しない薬剤物質が非常に望まれている。特に、環境の相対湿度の変化による含水量の大きな変化が剤形に関して高い精度を達成することをより困難にするため、環境の相対湿度が変化したときに含水量を変化させない物質が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この技術的課題は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルを含み、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルとのモル比が１：０．３〜１：２．０（モル／モル）である結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物によって解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩（形態Ａ）のＰＸＲＤパタ−ンを示す図である。
【図２】５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩（形態Ｂ）のＰＸＲＤパタ−ンを示す図である。
【図３】５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩（形態Ｃ）のＰＸＲＤパタ−ンを示す図である。
【図４】５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩（形態Ａ）のＦＴ−ラマンスペクトルを示す図である。
【図５】５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩、または５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルの塩（形態Ａ）の動的水蒸気収着分析の結果を示す図である。
【図６】５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルの塩の２５℃／６０％rhでの長期安定性を示す図である。
【図７】５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルの塩の２５℃／６０％rhでの長期安定性（主要分解生成物［MeFox］）を示す図である。
【図８】５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルの塩の４０℃／７５％rhでの長期安定性を示す図である。
【図９】５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルの塩の４０℃／７５％rhでの長期安定性（主要分解生成物［MeFox］）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の固体形態は改善された薬理学的特徴を有し、したがって、改善された薬物生成物を調節および設計するための強化された可能性を提供する。当該技術分野で知られている５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の結晶性多形形態と比較して、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルとの結晶塩の水吸着は、有意に低く、変化する相対湿度条件下での吸着水の量の変化は有意にそれほど顕著ではないため、製剤中の標的剤形レベルに対する実質的に改善された制御をもたらす。
【００１５】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩の別の有利な態様は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の高い化学的および光学的純度が１回の結晶化工程で達成され得ることである。
【００１６】
従って、９５％のジアステレオ異性純度を示すテトラヒドロ葉酸ベンゼンスルホネ−トから出発して、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩を９９％を超えるジアステレオ異性純度で単回結晶化させることができる。他方、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩を結晶化する場合、最終生成物が９９％を超えるジアステレオ異性純度を示すには、出発物質は少なくとも９７．０％のジアステレオ異性純度を有する必要がある。
【００１７】
典型的には、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルとのモル比が１：０．３〜１：２．０（モル／モル）である。
【００１８】
好ましくは、結晶塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルとのモル比が１：０．５〜１：１．５（モル／モル）である。
【００１９】
さらにより好ましくは、結晶塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルとのモル比が１：０．７５〜１：１．５（モル／モル）である。
【００２０】
さらに好ましい実施形態では、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルとのモル比が１：０．７５〜１：１．２５（モル／モル）である。
【００２１】
最も好ましくは、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルの比が約１：１（モル／モル）である。
【００２２】
好ましくは、塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、５．８、６．９、１４．０、１７．５、および２２．２に位置するピ−クから選択される少なくとも1つの特徴的なピ−ク（２θ±０．２°２θ （ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有し、以下、（形態Ａ）と称する。
【００２３】
より好ましくは、塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、５．８、６．９、１４．０、１７．５、および２２．２に位置するピ−クから選択される少なくとも3つの特徴的なピ−ク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態A）。さらにより好ましくは、塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、５．８、６．９、１４．０、１７．５、および２２．２にピ−ク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ａ）。
【００２４】
さらにより好ましくは、塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、５．８、６．９、８．５、１２．５、１２．９、１４．０、１４．９、１６．２、１７．５、１７．９、１８．９、１９．２、２２．２、２４．４、２５．４、２５．８、２５．９、および３４．６に位置するピ−クから選択される少なくとも1つの特徴的なピ−ク（２θ±０．２°２θ （ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ａ）。
【００２５】
最も好ましくは、塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、実質的に図１に示されるようなＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ａ）。
【００２６】
あるいは、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩がラマン分光法によって特徴付けることができ、それによって好ましくは塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、１６０７、１５７１、１５０６、１２５０、および６５０に位置するピ−クから選択される少なくとも1つの特徴的なピ−ク（波数、cm-1±２cm-1で表したとき）を有するラマンスペクトルを有する（形態Ａ）。
【００２７】
より好ましくは、塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、１６０７、１５７１、１５０６、１２５０、および６５０に位置するピ−クから選択される少なくとも３つの特徴的なピ−ク（波数、cm-１±２cm-１で表したとき）を有するラマンスペクトルを有する（形態Ａ）。さらにより好ましくは、塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶塩であり、Ｌ−イソロイシンエチルエステルは１６０７、１５７１、１５０６、１２５０、および６５０にピ−ク（波数、cm-１±２cm-１で表したとき）を有するラマンスペクトルを有する（形態Ａ）。
【００２８】
さらにより好ましくは、塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、２９６１、２９３８、１６０７、１５７１、１５０６、１４６８、１３３２、１２５０、１１５３、９２２、８６０、および６５０に位置するピ−クから選択される少なくとも1つの特徴的なピ−ク（波数、cm-１±２cm-１で表したとき）を有するラマンスペクトルを有する（形態Ａ）。
【００２９】
最も好ましくは、塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、実質的に図４に示されるようなラマンスペクトルを有する（形態Ａ）。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、５．３、７．０、１４．０、１７．７、および２４．５に位置するピ−クから選択される少なくとも１つの特徴的なピ−ク（２θ±０．２°２θ （ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有し、以下、形態Ｂと称する。
【００３１】
より好ましくは、塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、５．３、７．０、１４．０、１７．７、および２４．５に位置するピ−クから選択される少なくとも３つの特徴的なピ−ク（２θ±０．２°２θ （ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ｂ）。さらにより好ましくは、塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、５．３、７．０、１４．０、１７．７、および２４．５にピ−ク（２θ±０．２°２θ （ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ｂ）。
【００３２】
さらにより好ましくは、塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶塩であり、Ｌ−イソロイシンエチルエステルは５．３、７．０、８．４、１３．０、１３．２、１４．０、１４．７、１５．９、１７．４、１７．７、１８．１、１８．７、２０．７、２１．２、２２．９、２４．５、および２５．４に位置するピ−クから選択される少なくとも1つの特徴的なピ−ク（２θ±０．２°２θ （ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ｂ）。
【００３３】
最も好ましくは、塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、実質的に図２に示されるようなＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ｂ）。
【００３４】
形態Ａは錠剤製剤に適しているが、形態Ｂは水性環境において安定であり、したがって高い水分活性を示す軟膏、懸濁液またはクリ−ム製剤によく適している。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、７．０、８．８、１４．０、１７．６、２０．２、２３．４、および２６．９に位置するピ−クから選択される少なくとも1つの特徴的なピ−ク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有し、以下、形態Ｃと称する。
【００３６】
より好ましくは、塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、７．０、８．８、１４．０、１７．６、２０．２、２３．４、および２６．９に位置するピ−クから選択される少なくとも３つの特徴的なピ−ク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ｃ）。さらにより好ましくは、塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、７．０、８．８、１４．０、１７．６、２０．２、２３．４、および２６．９に特徴的なピ−ク（２θ±０．２°２θ （ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ｃ）。
【００３７】
さらにより好ましくは、この塩が５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、５．３、７．０、８．８、１１．２、１３．０、１４．０、１５．１、１５．９、１６．８、１７．４、１７．６、２０．２、２０．５、２０．８、２１．２、２１．４、２３．４、２４．５、２６．９、および３２．２に位置するピ−クから選択される少なくとも1つの特徴的ピ−ク（２θ±０．２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態C）。
【００３８】
最も好ましくは、塩は５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩であり、実質的に図３に示されるようなＰＸＲＤパタ−ンを有する（形態Ｃ）。
【００３９】
さらにより好ましくは、前述の結晶塩が少なくとも９９重量％以上の化学的および／または立体異性的純度を有する。
【００４０】
また、例えば、温度／湿度が制御された環境または相対湿度が一般に非常に高い熱帯諸国で配合するために物質を取り扱う場合、水分含量が非常に低く、特に水を吸収／脱着する傾向が低い５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸を含む形態を有することも有利である。５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−イソロイシンエチルエステルの塩は一般に１％未満の水分含量を示し、一方、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩は、一般に１０％を超える水分含量を有する。結果を実施例９にそれぞれ視覚的に示す。図５。
【００４１】
さらに、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩の非常に低い含水量に加えて、この塩はまた、驚くべきことに、広範囲の湿度にわたって水を吸収／脱着するのが特に低い傾向を示す。したがって、相対湿度２０〜７５％rhの最も関連する範囲にわたって、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−イソロイシンエチルエステル（形態Ａ）の塩の水分含量を５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の水分含量と比較すると、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−イソロイシンエチルエステル（形態Ａ）の塩の水分含量は０．８％未満変化し、それに対して、従来技術による５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の水分含量は６％を超えて変化する。結果を、それぞれ実施例９に視覚的に示す。図５。この結果は当業者にとって非常に驚くべきものであり、米国特許第6,441,168号B1の教示を考慮すると予想することができなかった。さらに、本発明の形態は、本発明の根底にある技術的課題を明らかに解決する。
【００４２】
さらに、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩は、以前から知られているカルシウム塩よりもはるかに良好な安定性を示している。したがって、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルの塩は２５℃／６０％rhで１２ヵ月間保存した場合、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の相対含量（開始時の初期含量に対して測定）が依然として９８％w／wを超えるのに対し、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の相対含量は、９ヵ月に達する前にすでに９８％w／w未満に減少している。結果を、それぞれ実施例１０（表４ｂ）に視覚的に示す。図６.並行して、４α−ヒドロキシ−５−メチル−ＴＨＦ［MeFox］の主要分解生成物ピラジノ−ｓ−トリアジン誘導体の含有量は２５℃／６０％rhで１２か月間貯蔵した場合、０．０５％未満のレベルであるが、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩のMeFoxの含有量は９か月に達する前に既に０．６％を超えて増加している。結果を実施例１０（表５）にそれぞれ視覚的に示す。図７。
【００４３】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩の驚くほど高い安定性は４０℃／７５％rhでの安定性値を比較した場合に、さらに特に強調される。これらの上昇した条件下でさえ、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩は、１２ヶ月にわたって貯蔵された場合、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の相対含有量（開始時の初期含有量に対して測定）が９９％を超えるのに対して、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の相対含有量は同じ条件で貯蔵された場合、９ヶ月に達する前に既に９９％未満に減少している。結果を、それぞれ実施例１０（表６ｂ）に視覚的に示す。図８。並行して、４α−ヒドロキシ−５−メチル−ＴＨＦ［MeFox］の主要分解生成物ピラジノ−ｓ−トリアジン誘導体の含有量は２５℃／６０％rhで１２か月間貯蔵した場合、０．０６％のレベルであるが、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩に対するMeFoxの含有量は９か月に達する前にすでに０．６％以上に増加している。結果を、それぞれ実施例１０(表７)に視覚的に示す。図９。したがって、本発明の形態は、これらの条件下でも改善された貯蔵安定性を示す。これらの改善された特性は、US 6,441,168 B1の教示を念頭に置いても導き出すことはできなかった。
【００４４】
本発明のさらなる側面は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩を製造する方法であり、以下の工程、
i) ５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の水中混合物を調製し、任意選択で適当な溶媒または溶媒混合物中で、Ｌ−イソロイシンエチルエステルを添加する工程、
ii) 塩基を、任意選択で適切な溶媒または溶媒の混合物中で、添加して溶解を達成する工程、
iii)  組成物を少なくとも６０℃に加熱する工程、
iv) ｐＨを４〜７の範囲に調整するための適切な酸を添加する工程、
v) 結晶化させ、混合物を１℃〜３０℃の温度に冷却し、任意選択で得られた懸濁液を最終温度で撹拌する工程、
vi）得られた固体材料を単離し、任意選択で生成物を乾燥させる工程、
を含む方法である。
【００４５】
驚くべきことに、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩は光学純度９５．０％の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、すなわち（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の光学純度９５．０％のみの（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸ベンゼンスルホネ−トからその場で形成されたものから調製された場合であっても、高度に効率的に、かつ高い化学的、立体異性および結晶純度で、開示された方法に従って得ることができる。従って、９５．０％の（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸ベンゼンスルホネ−トの光学純度から出発すると、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩の光学純度は９９％を超える。一般に、開示された方法に従って調製された５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩は、９９％を超える、好ましくは９９．５％を超える光学純度、および９８％を超える、好ましくは９９％を超える、さらにより好ましくは９９．５％を超える化学純度を有する。
【００４６】
好ましくは工程i）において、水中の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の混合物は、不活性雰囲気中でホルムアルデヒドおよび水素化ホウ素ナトリウムを使用することによって還元メチル化に供されることにより（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸ベンゼンスルホン酸（EP 0,495,204 B1に従って調製される）からその場で調製される。
【００４７】
好ましくは工程i）において、Ｌ−イソロイシンエチルエステルはその塩酸塩の形態で添加される。
【００４８】
好ましくは、工程i）における５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステル塩酸塩のモル比が１：１〜１：３の範囲である。
【００４９】
好ましくは工程ii）において、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の溶解を可能にするために使用される塩基はアルカリ金属水酸化物である。より好ましくは工程ii）において、塩基はＮａＯＨ、ＫＯＨおよび／またはそれらの混合物である。工程ii）において、塩基は水酸化ナトリウム水溶液であることが最も好ましい。
【００５０】
さらにより好ましくは工程ii）または工程iii）において、塩基の添加後のｐＨは６．５〜９．０の範囲である。
【００５１】
最も好ましくは、工程i）および／または工程ii）で使用される溶媒は水である。
【００５２】
任意選択で、工程iii）において、木炭を添加し、次いで溶液を透明に濾過する。
【００５３】
好ましくは、工程iv）において、水性塩酸が適切な酸として使用される。
【００５４】
より好ましくは工程iv）において、酸の添加によって達成されるｐＨ値は４．４〜６．４の範囲に設定される。最も好ましくは、工程iv）において、酸の添加後、ｐＨは５．４〜６の範囲である。
【００５５】
工程iii）、iv）および／またはv）において、種結晶を添加することができ、所望の形態のさらにより好ましい種結晶である。
【００５６】
本発明のさらなる側面は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩、および任意選択で１以上の許容可能な賦形剤、を含む医薬組成物、食品添加物および／または調製物である。
【００５７】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩は、薬物の製造のための成分として、および／または食品添加物として使用することができる。
【００５８】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩は、貧血、神経管欠損（ＮＴＤ）、心血管疾患（ＣＶＤ）、うつ病、アルツハイマ−病および骨粗鬆症の治療および／または低血漿および／または低赤血球葉酸（医療用食品）の食事管理に用いることができる。
【００５９】
本発明による医薬組成物は、あらゆる投与様式、好ましくは経口、非経口、筋肉内、脊髄内、髄腔内、歯周、局所または直腸投与に適用することができる。
【００６０】
要約すると、本発明の５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩によって提供される特性のプロフィ−ルは、薬剤または食品添加物としての使用に有利である。特に、５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩を結晶化させた場合、安定性の増強、２０％から７５％の相対湿度までの環境における水分含量の低い変化、および光学的純度の増加は、当業者によって予想され得なかった。
【実施例】
【００６１】
粉末Ｘ線回折
Ｍｙｔｈｅｎ１Ｋ検出器を備えたStoe Stadi P；Cu−Ｋα１放射線；標準測定条件：伝送； ４０ ｋＶおよび４０ｍＡ管出力；湾曲Ｇｅモノクロメ−タ−；０．０２°２θステップサイズ、４８秒ステップ時間、１．５〜５０．５°２θ走査範囲；検出器モ−ド：ステップ走査；１°２θ検出器ステップ；標準試料調製：１０〜２０ｍｇ試料を２つのアセテ−トフォイルの間に置く；試料ホルダ−： Stoe透過試料ホルダ−；測定中に試料を回転させた。全ての試料の調製および測定は、周囲空気雰囲気中で行った。
【００６２】
ＴＧ−ＦＴＩＲ
熱重量測定は、Bruker FTIR分光計ベクタ−２２（ピンホ−ルを有する試料パン、Ｎ２大気、熱速度１０ Ｋ／分）に連結したNetzsch Thermo−Microbalance TG ２０９を用いて行った。
ＤＶＳ
ＤＶＳ測定は、代表的には、ＰｒｏＵｍｉｄ(以前の"Projekt Messtechnik")、August-Nagel-Str.23, 89079 Ulm (ドイツ）製のＳＰＳ１１−１００n "Sorptions Pruｆｓｙｓｔｅｍ"を用いて実施する。
ラマン分光法
FT−Ｒａｍａｎスペクトルは、１０６４nmで動作する近赤外Nd：YAGレ−ザ−および液体窒素冷却ゲルマニウム検出器を有するBruker MultiRAM FT−RamanまたはBruker RFS 100 FT−Ramanシステム上に記録された。２cm-1の分解能を持つ６４個のスキャンが３５００〜−５０cm-1の範囲で蓄積されたが、フィルタカットオフ効果により１００ cm-1以上のデ−タのみが評価された。公称レ−ザ出力は、通常、１００または３００mWである。
【００６３】
実施例1：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩(形態A)の種結晶なしの調製
２０．０mlの水中の２．００ｇの５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸（分析： ９５．６％w／w）の懸濁液を７０℃に加熱し、２．１３gのＬ−イソロイシンエチルエステル塩酸塩を添加した。懸濁液中の温度は６５℃であり、水酸化ナトリウムを３０％(w/w)濃水溶液で添加した。合計で０．９５ｇの３０％水酸化ナトリウム溶液を添加した。水酸化ナトリウムを添加すると、本質的に透明な溶液が得られ、これは徐々に濃厚な懸濁液に変化した。懸濁液を２０．０mlの水で希釈し、ヒ−タ−のスイッチを切って、混合物を約2時間以内に周囲温度まで冷却させた。懸濁液を有する反応器を氷／水浴中で30時間以内に約１０℃にさらに冷却し、次いでフリットガラスフィルタ−で濾過し、５mlの冷水で洗浄した。固体生成物を真空乾燥機中で３５℃で約２０時間乾燥し、粉末X線回折により試験し、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸・Ｌ−イソロイシンエチルエステル塩・形態Aと同定した。形態Ａの粉末Ｘ線回折パタ−ンを図１に示し、表１に示した2θ角でピ−クを示した。ＨＰＬＣ分析は、純度が９８．６５％面積であることを示した。
【００６４】
【表１−１】
2021530466.tif 000002
【００６５】
【表１−２】
2021530466.tif 000003
【００６６】
実施例２：播種による５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩(形態A)の調製
１５gの５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸（分析： ９５．４％w／w、６Ｓ−ジアステレオ異性体： ９７．７４％）に、窒素雰囲気下で２２５gの水を添加した。水酸化ナトリウム水溶液（３０％w／w）の添加によりｐＨを６．５に調整した。混合物を６６℃に加熱し、さらに水酸化ナトリウム水溶液（30％w／w）を添加してｐＨを６．５に保った。水７５g中のＬ−イソロイシンエチルエステル塩酸塩１５．２gの溶液を６６℃で添加した。５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸・Ｌ−イソロイシンエチルエステル塩・形態Ａを６６℃で播種した後、混合物を６６℃で１６時間撹拌した。混合物を１℃に冷却し、一方、１モル濃度の塩酸水溶液を添加することによってｐＨを５．７に調整した。１℃で１時間撹拌した後、結晶性物質を吸引濾過によって単離し、１℃に予冷した４４gの水で洗浄した。材料を真空中３６℃で２２時間乾燥させて、理論収率の７５％に相当する１４．６gの５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸Ｌ−イソロイシンエチルエステル塩を得た（修正分析）。（単離生成物の分析デ−タ：純度： ９８．９％面積、分析：１：１塩に相当する７３．９５ ％w／w５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸、乾燥損失（残留水）：１．２％ w/w、（6S）−ジアステレオ異性体： ９９．８％。TG−FTIR分析は、１５０℃での質量損失が約０．２％以下であるので、得られた固体生成物が本質的に水を含まないことを示した。H−NMR分光分析では、５−メチル−（６Ｓ）−テトラフォロ葉酸のL−イソロイシンエチルエステルに対するモル比が約１：１であることが示された。図１に示すような粉末X線回折パタ−ンは形態Aに相当する。
【００６７】
実施例３：５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩(形態A)の調製
１．９２gの５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸（４mmol）を８．０mlの１N ＮａＯＨに溶解した。溶液を８０℃に加熱した。１．２８gのＬ−イソロイシンエチルエステル塩酸塩（〜６．５mmol）を６．０mlの水に溶解し、５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸と共に溶液に添加した。溶液を約１５分以内に６０℃に冷却し、実施例１に従って得られた５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸・Ｌ−イソロイシンエチルエステル塩・形態Ａの約１０〜２０mgを播種した。ｐＨの試験は典型的には７のｐＨを示し、次いで２．０mlの１Ｎ ＨＣｌを滴下した。懸濁液が形成され、混合物を１５℃／時の速度で５℃に冷却した。５℃で約３０分間撹拌した後、懸濁液を濾過し、固体生成物を４０℃の真空下で２４時間乾燥した。試料の粉末Ｘ線回折は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸・Ｌ−イソロイシンエチルエステル塩・形態Ａが得られたことを示した。
【００６８】
実施例４：５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩(形態B)の調製
６．０mlの水および４５２mgの５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸・Ｌ−イソロイシンエチルエステル塩・形態Ａの混合物に、６．０mlのＬ−イソロイシンエチルエステル塩酸塩の水溶液および２．０mlのエタノ−ルの０．５M溶液を室温で添加した。０．２５０mlの１Ｎ ＮａＯＨを添加することによってｐＨをｐＨ＝〜６−７に調整し、次いで混合物を７５℃に加熱した。わずかに黄色の懸濁液の温度を７５℃で３０分間維持した。次に、混合物を約３時間以内に２５℃に冷却した。２５℃での撹拌を約４時間継続し、ＰＰ５５５−Ｐ４０ａと呼ばれる固体試料を遠心濾過によって回収し、乾燥せずにＰＸＲＤによって試験した。固体生成物は、５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸・Ｌ−イソロイシンエチルエステル塩・形態Bとして同定された。
【００６９】
【表２−１】
2021530466.tif 000004
【００７０】
【表２−１】
2021530466.tif 000005
【００７１】
実施例５：５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩(形態C)の調製
８１mgのアモルファス５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸・Ｌ−イソロイシンエチルエステル塩（水−ジオキサン４：１溶液の凍結乾燥によって製造）に、１．０mlのエタノ−ル−水２：１（体積比）を添加し、混合物を室温で2日間撹拌した。次いで、懸濁液を濾過し、固体を粉末X線回折に供した。粉末X線回折は、形態Cと称する結晶形が得られることを示した。１H−NMR分光分析は、５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸とL−イソロイシンエチルエステルとのモル比が約２．８：１であることを示した。
【００７２】
【表３−１】
2021530466.tif 000006
【００７３】
【表３−２】
2021530466.tif 000007
【００７４】
実施例６：（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸ベンゼンスルホネ−トからその場で形成された５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸からの５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩の調製
２０gの（６S）−テトラヒドロ葉酸ベンゼンスルホネ−ト（EP 0 495 204に従って調製、分析：テトラヒドロ葉酸： ７２．２％w／w、（６Ｓ）−ジアステレオ異性体： ９５．９％）および５０gの水の混合物に、２０〜３０℃で９．９mLの水酸化ナトリウム水溶液（３０％w／w水酸化ナトリウム）を撹拌しながら添加した。次に、０．８３mLの１モル水酸化ナトリウム水溶液を添加し、混合物を０〜５℃に冷却した。０〜５℃で、３．１３mLのホルムアルデヒド水溶液（濃度： ３６．９％w／w）を添加し、１時間撹拌した後、０．３１mLの水酸化ナトリウム水溶液（３０％w／w水酸化ナトリウム）を添加し、続いて、１４gの水、１．７gの水酸化ナトリウム水溶液（３０％w／w水酸化ナトリウム）および３．０７gの水素化ホウ素ナトリウムの混合物を添加した。混合物を約６３℃に加熱し、９０分間撹拌した。周囲温度に冷却した後、７．９mLの塩酸水溶液（３７％w／w）を添加し、続いて４．１mLの水酸化ナトリウム水溶液（３０％w／w水酸化ナトリウム）を添加した。少量の四ホウ酸ナトリウムを加え、混合物を０〜５℃に冷却し、そして約２２時間撹拌した。固体を濾過（吸引）により除去し、５gの水で洗浄した。濾液に、撹拌しながら周囲温度で１５．８６gのＬ−イソロイシンエチルエステル塩酸塩と３０gの水との混合物を添加した。混合物を約６６℃に加熱し、少量の結晶性５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸・Ｌ−イソロイシンエチルエステル塩・形態Aを播種のために添加した。約６６℃で、塩酸の１モル水溶液２７．１mLを添加した。懸濁液が形成された。約９０分以内に、混合物を約２０℃に冷却しながら、さらに３３．２mLの塩酸の１モル水溶液を添加した。結晶化した生成物を濾過（吸引）により単離し、氷浴中で予備冷却した８４mLの水で洗浄した。生成物を室温で真空（１０mbar）中で約６０時間乾燥させて、８８．１％修正分析化学収率に相当する１７．２gの５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステル形態A（分析５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸： ７４．０％w／w、純度： ９８．６％面積、（６S）−ジアステレオ異性体： ９９．５％）の結晶塩を得た。
【００７５】
実施例７：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩の調製
１６７０gの水に２５０gの５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸（分析： ９６．２％w／w）および２５６．１gのＬ−イソロイシンエチルエステル塩酸塩を周囲温度で撹拌しながら添加した。５００gの水を添加し、水酸化ナトリウム水溶液（３０％w／w水酸化ナトリウム）１３４．６mLを添加することによってｐＨを７．３に調整した。混合物を撹拌しながら約６６℃に加熱し、少量の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステル塩形態Aの塩を播種のために添加した。６６℃で、３８５mLの塩酸の１モル水溶液を約３０分以内に添加した。約９０分以内に、混合物を約２０℃に冷却しながら、さらに３６５mLの１モル濃度の塩酸水溶液を加えた。結晶化した生成物を濾過（吸引）により単離し、氷浴中で予備冷却した７３３gの水で洗浄した。生成物を真空（１０mbar）中で約４０℃で約６０時間乾燥させて、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの結晶塩形態A（分析５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸： ７４．３％w／w、純度： ９８．７％面積）３００．８gを得たが、これは９２．９％修正分析化学収率に相当する。
【００７６】
実施例８：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩の調製
反応容器中の２５０．５kgの水に、３１．０kgの５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸（分析： ９６．８％w／w、６S−ジアステレオ異性体： ９８．３％）および３２．０kgのＬ−イソロイシンエチルエステル塩酸塩を周囲温度で撹拌しながら添加した。１６．5kgの水を添加し、１８．６kgの水酸化ナトリウム水溶液（３０％w／w水酸化ナトリウム）を添加することによってｐＨをｐＨ＝７．３に調整した。混合物を撹拌しながら約６６℃に加熱し、固体を濾過によって除去した。フィルタ−を反応容器を介して２０．３kgの水で洗浄した。濾液および洗浄液を結晶化容器中で合わせ、約６５℃に加熱した。３７．５gの５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステル形態Aを播種のために添加した。６４．５kgの１M塩酸水溶液を約６５℃で３０分以内に添加した。混合物を９０分以内に２０℃に冷却し、１．５kgの１M塩酸水溶液を添加することによってｐＨをｐＨ=５．４に調整した。混合物を約２０℃で1時間撹拌し、そして結晶化生成物を遠心分離により単離した。生成物を、約３℃に予備冷却した４５kgの水で洗浄した。次いで、生成物を真空中５０℃で１７時間乾燥させて、修正分析収率６０．８％に相当する２３．６３kgの５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸・Ｌ−イソロイシンエチルエステル・形態Ａ（分析：５−メチルテトラヒドロ葉酸７７．２％w／w、６Ｓ−ジアステレオ異性体： ９９．５％）を得た。この実施例の収率は、結晶化生成物の一部が技術的欠陥のために遠心分離中に失われたので、代表的ではない。
【００７７】
実施例９：吸湿性および含水量（ＤＶＳ実験）
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩の試料の含水率を測定したところ、含水率は１２．４％であった。実施例１または２に従って調製した５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸・Ｌ−イソロイシンエチルエステル塩・形態Ａの試料のＴＧ-ＦＴＩＲ分析は、試料が本質的に水を含まないことを示した。
【００７８】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩の試料および実施例１または２に従って調製した５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸・Ｌ−イソロイシンエチルエステル塩・形態Ａ（それぞれ約２０mg）の試料を、０〜７５％rhの相対湿度範囲内で動的水蒸気収着分析（ＤＶＳ）によって試験した。ＤＶＳ測定は、ProUmid（以前の「Projekt Messtechnik」）、August−Nagel−Str23, 89079 Ulm (ドイツ）のSPS11−100n「Sorptions Prufsystem」を用いて実施した。測定は以下のように行った：試料を、微量天秤の上にあるアルミニウムまたは白金ホルダ−上に置き、所定の湿度プログラムを開始する前に５０％RHで平衡化させた：
(1)  ５０％相対湿度（ＲＨ）で５時間、その後、
(2)  毎時５％の速度で５０ →０％の相対湿度へ走査し、
(3)  ＲＨを０％で５時間一定に保ち、
(4)  毎時５％の割合でＲＨを７５％に上げ、
(5)  ７５％の一定ＲＨを５時間維持し、
(6)  毎時５％の割合で５０％ＲＨへスキャンする。
【００７９】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸・Ｌ−イソロイシンエチルエステル塩・形態Ａの結果をカルシウム塩の結果と比較すると、５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸・Ｌ−イソロイシンエチルエステル塩・形態Aの水分含量は、試験範囲内で０．８％未満変化し、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の水分含量は６％以上変化した。結果を図５に視覚的に示す。
【００８０】
実施例１０：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩の安定性
本発明の化合物である５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩の長期安定性を、EP 1,044,975 B1に従って調製した５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩の長期安定性と比較するために、それぞれの安定性デ−タを種々の温度および湿度で得た。
【００８１】
(a)  ５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とL−イソロイシンエチルエステルの塩の２５℃／６０％rhでの安定性
文献手順（EP 1,044,975 B1）に従って調製した５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩、ならびに５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩形態Ａを、２５℃／６０％rhで保存した。試料中に残存する５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の含有量を、定期的な間隔でＨＰＬＣによって測定した。結果を表４ａおよび図６に示す。残存する５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の含有量も、調製時の初期値（％相対）と比較した。結果を表４ｂに示す。さらに、主要分解産物である４α−ヒドロキシ−５−メチル−ＴＨＦ（MeFox）のピラジノ−ｓ−トリアジン誘導体の含有量を、周期的間隔でＨＰＬＣによって測定し、絶対値(％w/w)として表示した。結果を表５および図７に示した。
【００８２】
【表４】
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【００８３】
【表５】
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【００８４】
【表６】
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【００８５】
(b)５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とL−イソロイシンエチルエステルの塩の４０℃／７５％rhでの安定性
文献手順（EP 1,044,975 B1）に従って調製した５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩、ならびに５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステル形態Aの塩を、４０℃／７５％rhで保存した。試料中に残存する５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の含有量を、定期的な間隔でHPLCによって測定した。結果を表６ａおよび図８に示す。残存する５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の含有量も、調製時の初期値（％相対）と比較した。結果を表６ｂに示す。さらに、主要分解産物である４α−ヒドロキシ−５−メチル−ＴＨＦ（MeFox）のピラジノ−ｓ−トリアジン誘導体の含有量を、周期的間隔でＨＰＬＣによって測定し、絶対値（％ w/w)として表示した。結果を表７および図９に示した。
【００８６】
【表７】
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【００８７】
【表８】
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【００８８】
【表９】
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【００８９】
表４〜７は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および本発明に開示されるＬ−イソロイシンエチルエステルの塩の安定性デ−タを用いて、i）５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩と比較して、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩の安定性に顕著な差があり、ii）５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩が、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩よりも長期間にわたってはるかに安定であることを明らかに示している。
【００９０】
実施例１１：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−イソロイシンエチルエステルの塩の異性体濃縮
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸から出発するＬ−イソロイシンエチルエステルとの塩を調製する場合、以下の異性体濃縮を得ることができる（ＨＰＬＣで測定）。
【００９１】
【表１０】
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【００９２】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とＬ−イソロイシンエチルエステルの塩をその場で調製した５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸ベンゼンスルホネ−トから出発して調製する場合、以下の異性体濃縮を得ることができる（ＨＰＬＣで測定）。
【００９３】
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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