(57)【要約】  完全に化学的に安定化されている新規のオリゴヌクレオチドが提供される。完全に化学的に安定化されているオリゴヌクレオチドを使用する方法も提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１４個の連続したヌクレオチド、５’末端及び３’末端と；
少なくとも８５％の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド修飾と
を含むオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの前記５’末端からの位置２及び１４の前記ヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
標的に対する完全な又は完全ではない相補性を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記標的は、哺乳動物又はウイルスｍＲＮＡを含む、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドの前記５’末端からの位置２０の前記ヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドの前記３’末端からの位置１〜７の１つ以上のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドの前記３’末端からの位置１〜６又は前記３’末端からの位置１〜７の前記ヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドの前記５’末端からの位置２及び１４の前記ヌクレオチドは、２’−Ｆ修飾若しくは２’−Ｈ修飾又は２’−ＯＨ部分を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドの前記５’末端からの位置２及び１４の前記ヌクレオチドは、２’−Ｆ修飾を含む、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドの前記５’末端からの位置２及び１４の前記ヌクレオチドは、２’−Ｈ修飾を含む、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドの前記５’末端からの位置２及び１４の前記ヌクレオチドは、２’−ＯＨ部分を含む、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
少なくとも９０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
少なくとも１３個の連続したヌクレオチド並びに５’末端及び３’末端を含む相補的な第２のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも８０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも９０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記第２のオリゴヌクレオチドは、１００％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記３’末端からの位置７、９、１０及び１１の前記ヌクレオチドの１つ以上は、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記３’末端からの位置７、１０及び１１の前記ヌクレオチドの１つ以上は、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記３’末端からの位置７、１０及び１１の前記ヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
第２のオリゴヌクレオチドの前記３’末端からの位置１及び２の前記ヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
第２のオリゴヌクレオチドの前記３’末端からの位置１及び２の前記ヌクレオチド並びに第２のオリゴヌクレオチドの前記５’末端からの位置１及び２の前記ヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
前記第２のオリゴヌクレオチドは、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記３’末端に疎水性分子を含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
１５〜２２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
２０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
２２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
前記第２のオリゴヌクレオチドは、１５〜２０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
前記第２のオリゴヌクレオチドは、１５個の連続したヌクレオチドを含む、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
前記第２のオリゴヌクレオチドは、１８個の連続したヌクレオチドを含む、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
前記第２のオリゴヌクレオチドは、２０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記第２のオリゴヌクレオチドは、前記第１のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドとの間に１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記１つ以上のヌクレオチドミスマッチは、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記５’末端からの位置２、６及び１２に存在する、請求項３０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
前記ヌクレオチドミスマッチは、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記５’末端からの位置２、６及び１２に存在する、請求項３０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の１つ以上のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３４】
疾患又は障害を処置又は管理する方法であって、前記処置又は管理を必要とする対象に、治療的に有効な量の、請求項３３に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項３５】
アンチセンス鎖及びセンス鎖を含む二本鎖核酸構造であって、
前記アンチセンス鎖は、少なくとも１４個の連続したヌクレオチド、５’末端及び３’末端を含み、且つ標的に対する相補性を有し；
前記センス鎖は、少なくとも１３個の連続したヌクレオチド、５’末端及び３’末端を含み、且つ前記アンチセンス鎖に対する相補性を有し；
前記アンチセンス鎖は、少なくとも８５％の２’−Ｏ−メチル修飾を含み；及び
前記アンチセンス鎖の前記５’末端からの位置２及び１４の前記ヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む、二本鎖核酸構造。
【請求項３６】
前記アンチセンス鎖は、前記標的に対する完全な又は完全ではない相補性を含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項３７】
前記標的は、哺乳動物又はウイルスｍＲＮＡを含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項３８】
前記アンチセンス鎖の前記５’末端からの位置２０の前記ヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項３９】
前記アンチセンス鎖の前記３’末端からの位置１〜７の１つ以上のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項４０】
前記アンチセンス鎖の前記３’末端からの位置１〜６又は前記３’末端からの位置１〜７の前記ヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項４１】
前記アンチセンス鎖の前記５’末端からの位置２及び１４の前記ヌクレオチドは、２’−Ｆ修飾若しくは２’−Ｈ修飾又は２’−ＯＨ部分を含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項４２】
前記アンチセンス鎖の前記５’末端からの位置２及び１４の前記ヌクレオチドは、２’−Ｆ修飾を含む、請求項４１に記載の二本鎖核酸。
【請求項４３】
前記アンチセンス鎖の前記５’末端からの位置２及び１４の前記ヌクレオチドは、２’−Ｈ修飾を含む、請求項４１に記載の二本鎖核酸。
【請求項４４】
前記アンチセンス鎖の前記５’末端からの位置２及び１４の前記ヌクレオチドは、２’−ＯＨ部分を含む、請求項４１に記載の二本鎖核酸。
【請求項４５】
前記アンチセンス鎖は、少なくとも９０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項４６】
前記センス鎖は、少なくとも８０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項４７】
前記センス鎖は、少なくとも９０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項４８】
前記センス鎖は、１００％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項４９】
前記センス鎖の前記３’末端からの位置７、９、１０及び１１の１つ以上のヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項５０】
前記センス鎖の前記３’末端からの位置７、９、１０及び１１の前記ヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項５１】
前記センス鎖の前記３’末端からの位置７、１０及び１１の前記ヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項５２】
センス鎖の前記３’末端からの位置１及び２の前記ヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項５３】
センス鎖の前記３’末端からの位置１及び２の前記ヌクレオチド並びにセンス鎖の前記５’末端からの位置１及び２の前記ヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項５４】
前記センス鎖は、前記センス鎖の前記３’末端に疎水性分子を含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項５５】
前記アンチセンス鎖は、１５〜２２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項５６】
前記アンチセンス鎖は、２０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項５５に記載の二本鎖核酸。
【請求項５７】
前記アンチセンス鎖は、２２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項５５に記載の二本鎖核酸。
【請求項５８】
前記センス鎖は、１５〜２０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項５９】
前記センス鎖は、１５個の連続したヌクレオチドを含む、請求項５８に記載の二本鎖核酸。
【請求項６０】
前記センス鎖は、１８個の連続したヌクレオチドを含む、請求項５８に記載の二本鎖核酸。
【請求項６１】
前記センス鎖は、２０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項５８に記載の二本鎖核酸。
【請求項６２】
前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖と前記センス鎖との間に１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項６３】
前記１つ以上のヌクレオチドミスマッチは、センス鎖の前記５’末端からの位置２、６及び１２に存在する、請求項６２に記載の二本鎖核酸。
【請求項６４】
前記ヌクレオチドミスマッチは、前記センス鎖の前記５’末端からの位置２、６及び１２に存在する、請求項６２に記載の二本鎖核酸。
【請求項６５】
前記アンチセンス鎖は、５’ホスフェート、５’−アルキルホスホネート、５’アルキレンホスホネート又は５’アルケニルホスホネートを含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸。
【請求項６６】
前記アンチセンス鎖は、５’ビニルホスホネートを含む、請求項６５に記載の二本鎖核酸。
【請求項６７】
４〜１６個のホスホロチオエート結合を含む、請求項３５〜６６のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
【請求項６８】
８〜１３個のホスホロチオエート結合を含む、請求項３５〜６６のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
【請求項６９】
１５塩基対〜２０塩基対の二本鎖領域を含む、請求項３５〜６８のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
【請求項７０】
１５塩基対の二本鎖領域を含む、請求項３５〜６８のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
【請求項７１】
１８塩基対の二本鎖領域を含む、請求項３５〜６８のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
【請求項７２】
２０塩基対の二本鎖領域を含む、請求項３５〜６８のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
【請求項７３】
アンチセンス鎖及びセンス鎖を含む二本鎖核酸構造であって、
前記アンチセンス鎖は、少なくとも１４個の連続したヌクレオチド、５’末端及び３’末端を含み、且つ標的に対する相補性を有し；
前記センス鎖は、少なくとも１３個の連続したヌクレオチド、５’末端及び３’末端を含み、且つ前記アンチセンス鎖に対する相補性を有し；
前記アンチセンス鎖は、少なくとも８５％の２’−Ｏ−メチル修飾を含み；
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記５’末端からの位置２及び１４の前記ヌクレオチドは、２’−Ｆで修飾されており；
前記センス鎖は、１００％の２’−Ｏ−メチル修飾を含み；及び
前記アンチセンス鎖の前記３’末端からの位置１〜６又は前記３’末端からの位置１〜７の前記ヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている、二本鎖核酸構造。
【請求項７４】
請求項３５〜７３のいずれか一項に記載の１つ以上の化学修飾された二本鎖核酸及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項７５】
疾患又は障害を処置又は管理する方法であって、前記処置又は管理を必要とする対象に、治療的に有効な量の、請求項７４に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項７６】
２つ以上の二本鎖核酸を含む、細胞内でＲＮＡサイレンシングを媒介することができる分枝状オリゴヌクレオチド化合物であって、前記核酸（Ｎ）は、リンカー（Ｌ）、スペーサー（Ｓ）及び任意選択的に分岐点（Ｂ）から選択される１つ以上の部分によって互いに連結されており、
各二本鎖核酸は、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各アンチセンス鎖は、少なくとも１４個の連続したヌクレオチド、５’末端及び３’末端を含み、且つ少なくとも１つのアンチセンス鎖は、少なくとも８５％の２’−Ｏ−メチル修飾を含み；
前記少なくとも１つのアンチセンス鎖の前記５’末端からの位置２及び１４の前記ヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含み；
少なくとも１つのアンチセンス鎖の前記３’末端からの位置１〜７の１つ以上のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている、分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項７７】
各アンチセンス鎖は、少なくとも８５％の２’−Ｏ−メチル修飾を含み；
各アンチセンス鎖の前記５’末端からの位置２及び１４の前記ヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含み；及び／又は
各アンチセンス鎖の前記３’末端からの位置１〜７の１つ以上のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている、請求項７６に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項７８】
前記センス及びアンチセンス鎖の前記５’末端からの位置１及び２の前記ヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている、請求項７６に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項７９】
各二本鎖核酸は、独立して、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の前記３’末端又は前記５’末端においてリンカー、スペーサー又は分岐点に連結されている、請求項７６に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項８０】
前記分枝状オリゴヌクレオチド化合物の末端の５’位置に取り付けられた疎水性部分をさらに含む、請求項７６に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項８１】
前記疎水性部分は、アルキル、アルケニル若しくはアリール部分；ビタミン若しくはコレステロール誘導体；親油性アミノ酸；又はこれらの組合せを含む、請求項８０に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項８２】
各リンカーは、独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミダート、エステル、アミド、トリアゾール又はこれらの組合せから選択され；
前記リンカーのいずれかの炭素又は酸素原子は、任意選択的に、窒素原子で置換されているか、ヒドロキシル置換基を有するか、又はオキソ置換基を有する、請求項７６〜８１のいずれか一項に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項８３】
前記アンチセンス鎖の前記５’末端からの位置２０の前記ヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む、請求項７６〜８２のいずれか一項に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項８４】
前記センス鎖の前記３’末端からの位置７、１０及び１１の前記ヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む、請求項７６〜８３のいずれか一項に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項８５】
前記非２’−Ｏ−メチル修飾は、２’−Ｆ修飾若しくは２’−Ｈ修飾又は２’−ＯＨ部分を含む、請求項７６〜８３のいずれか一項に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項８６】
前記非２’−Ｏ−メチル修飾は、２’−Ｆ修飾を含む、請求項８５に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項８７】
前記非２’−Ｏ−メチル修飾は、２’−Ｈ修飾を含む、請求項８５に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項８８】
２’−ＯＨ部分を含む、請求項８５に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項８９】
前記アンチセンス鎖は、少なくとも９０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項７６〜８８のいずれか一項に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項９０】
前記センス鎖は、少なくとも８０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項７６〜８９のいずれか一項に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項９１】
前記センス鎖は、少なくとも９０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項７６〜８９のいずれか一項に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項９２】
前記センス鎖は、１００％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項７６〜８９のいずれか一項に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項９３】
アンチセンス鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項７６〜９２のいずれか一項に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項９４】
センス鎖は、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項７６〜９３のいずれか一項に記載の分枝状オリゴヌクレオチド化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月２３日出願の米国仮特許出願第６２／７２１，９９３号明細書の利益を主張し、この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府によって資金提供された研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された認可番号ＮＳ１０４０２２、ＨＤ０８６１１１及びＯＤ０２００１２の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、完全に化学修飾されたヌクレオチドからなる、ＲＮＡサイレンシング、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に有用な新規のオリゴヌクレオチドに関する。化学修飾されたヌクレオチド及びリンカーは、予想外に高い有効性、吸収及び組織分布を達成するようにパターン化されている。
【背景技術】
【０００４】
化学修飾リボヌクレオチド（例えば、２’−フルオロ修飾及び２’−メトキシ修飾）及び／又は化学修飾リンカー（例えば、ホスホロチオエート修飾）を含むオリゴヌクレオチドは、対応する非修飾オリゴヌクレオチドと比較してヌクレアーゼ耐性の増大を示す一方、ＲＮＡｉを促進する能力を維持していることが知られている。例えば、Ｆｏｓｎａｕｇｈ，ｅｔ  ａｌ．（米国特許出願公開第２００３／０１４３７３２号明細書）を参照されたい。交互に起こる化学修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが知られている。例えば、Ｂｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許出願公開第２００８／０１１９４２７号明細書）を参照されたい。治療的ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の疎水性修飾が知られている。例えば、Ｋｈｖｏｒｏｖａ，  ｅｔ  ａｌ．（国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００９／００５２４７号明細書）を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
効率的なＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）エントリ、最小免疫応答及びオフターゲット効果、製剤化なしでの効率的な細胞吸収並びに効率的且つ特異的な組織分布によって特徴付けられる自己送達オリゴヌクレオチドが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、オリゴヌクレオチド治療薬の新しいクラスとして機能することができる化学修飾オリゴヌクレオチドの発見に基づく。驚くべきことに、アンチセンス鎖の５’末端からの位置２及び１４に非２’−Ｏ−メチル修飾（例えば、２’−フルオロ修飾、２’−Ｈ修飾又は２’−ＯＨ部分等）を有する、ほぼ完全に２’−Ｏ−メチル修飾された非対称ｓｉＲＮＡは、有効性特性の予想外の向上をもたらすことが発見された。この修飾パターンを用いて、以下に限定されないが、非対称のｓｉＲＮＡ、対称のｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡインヒビタ、スプライススイッチング、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる種々のオリゴヌクレオチド治療薬の有効性を増大させることができる。
【０００７】
したがって、一態様において、本発明は、少なくとも１４個の連続したヌクレオチド、５’末端及び３’末端と；少なくとも８５％の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド修飾とを含むオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの５’末端からの位置２及び１４のヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。
【０００８】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。
【０００９】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的に対する完全な又は完全ではない相補性を含む。
【００１０】
特定の実施形態において、標的は、哺乳動物又はウイルスｍＲＮＡを含む。
【００１１】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’末端からの位置２０のヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【００１２】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの３’末端からの位置１〜７の１つ以上のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。
【００１３】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの３’末端からの位置１〜６又は３’末端からの位置１〜７のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。
【００１４】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’末端からの位置２及び１４のヌクレオチドは、２’−Ｆ修飾若しくは２’−Ｈ修飾又は２’−ＯＨ部分を含む。
【００１５】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’末端からの位置２及び１４のヌクレオチドは、２’−Ｆ修飾を含む。
【００１６】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’末端からの位置２及び１４のヌクレオチドは、２’−Ｈ修飾を含む。
【００１７】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’末端からの位置２及び１４のヌクレオチドは、２’−ＯＨ部分を含む。
【００１８】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも９０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。
【００１９】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１３個の連続したヌクレオチド並びに５’末端及び３’末端を含む相補的な第２のオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００２０】
特定の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも８０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも９０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、１００％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。
【００２１】
特定の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端からの位置７、９、１０及び１１のヌクレオチドの１つ以上は、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【００２２】
特定の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端からの位置７、１０及び１１のヌクレオチドの１つ以上は、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【００２３】
特定の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端からの位置７、１０及び１１のヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【００２４】
特定の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端からの位置１及び２のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。
【００２５】
特定の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端からの位置１及び２のヌクレオチド並びに第２のオリゴヌクレオチドの５’末端からの位置１及び２のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。
【００２６】
特定の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に疎水性分子を含む。
【００２７】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１５〜２２個の連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２０個の連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２２個の連続したヌクレオチドを含む。
【００２８】
特定の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、１５〜２０個の連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、１５個の連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、１８個の連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、２０個の連続したヌクレオチドを含む。
【００２９】
特定の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとの間に１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含む。特定の実施形態において、１つ以上のヌクレオチドミスマッチは、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端からの位置２、６及び１２に存在する。特定の実施形態において、ヌクレオチドミスマッチは、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端からの位置２、６及び１２に存在する。
【００３０】
一態様において、本発明は、先に記載される１つ以上のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される担体を含むオリゴヌクレオチド医薬組成物を提供する。
【００３１】
一態様において、本発明は、疾患又は障害を処置又は管理する方法であって、そのような処置又は管理を必要とする対象に、治療的に有効な量の、先の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００３２】
一態様において、本発明は、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含む二本鎖核酸構造であって、アンチセンス鎖は、少なくとも１４個の連続したヌクレオチド、５’末端及び３’末端を含み；センス鎖は、少なくとも１３個の連続したヌクレオチド、５’末端及び３’末端を含み、且つアンチセンス鎖に対する相補性を有し；アンチセンス鎖は、少なくとも８５％の２’−Ｏ−メチル修飾を含み；及びアンチセンス鎖の５’末端からの位置２及び１４のヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む、二本鎖核酸構造を提供する。
【００３３】
特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、標的に対する完全な又は完全ではない相補性を含む。
【００３４】
特定の実施形態において、標的は、哺乳動物又はウイルスｍＲＮＡを含む。
【００３５】
特定の実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端からの位置２０のヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【００３６】
特定の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端からの位置１〜７の１つ以上のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。
【００３７】
特定の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端からの位置１〜６又は３’末端からの位置１〜７のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。
【００３８】
特定の実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端からの位置２及び１４のヌクレオチドは、２’−Ｆ修飾若しくは２’−Ｈ修飾又は２’−ＯＨ部分を含む。
【００３９】
特定の実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端からの位置２及び１４のヌクレオチドは、２’−Ｆ修飾を含む。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端からの位置２及び１４のヌクレオチドは、２’−Ｈ修飾を含む。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端からの位置２及び１４のヌクレオチドは、２’−ＯＨ部分を含む。
【００４０】
特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、少なくとも９０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。
【００４１】
特定の実施形態において、センス鎖は、少なくとも８０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、少なくとも９０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、１００％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。
【００４２】
特定の実施形態において、センス鎖の３’末端からの位置７、９、１０及び１１の１つ以上のヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾又は部分を含む。特定の実施形態において、センス鎖の３’末端からの位置７、１０及び１１のヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾又は部分を含む。特定の実施形態において、センス鎖の３’末端からの位置７、１０及び１１のヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【００４３】
特定の実施形態において、センス鎖の３’末端からの位置１及び２のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。特定の実施形態において、センス鎖の３’末端からの位置１及び２のヌクレオチド並びにセンス鎖の５’末端からの位置１及び２のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。特定の実施形態において、センス鎖は、センス鎖の３’末端に疎水性分子を含む。
【００４４】
特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、１５〜２２個の連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、２０個の連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、２２個の連続したヌクレオチドを含む。
【００４５】
特定の実施形態において、センス鎖は、１５〜２０個の連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、１５個の連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、１８個の連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、２０個の連続したヌクレオチドを含む。
【００４６】
特定の実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖とセンス鎖との間に１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含む。特定の実施形態において、１つ以上のヌクレオチドミスマッチは、センス鎖の５’末端からの位置２、６及び１２に存在する。特定の実施形態において、ヌクレオチドミスマッチは、センス鎖の５’末端からの位置２、６及び１２に存在する。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、５’ホスフェート、５’−アルキルホスホネート又は５’アルキレンホスホネートを含む。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、５’ビニルホスホネートを含む。
【００４７】
特定の実施形態において、二本鎖核酸は、４〜１６個のホスホロチオエート結合を含む。特定の実施形態において、二本鎖核酸は、８〜１３個のホスホロチオエート結合を含む。
【００４８】
特定の実施形態において、二本鎖核酸は、１５塩基対〜２０塩基対の二本鎖領域を含む。特定の実施形態において、二本鎖核酸は、１５塩基対の二本鎖領域を含む。特定の実施形態において、二本鎖核酸は、１８塩基対の二本鎖領域を含む。特定の実施形態において、二本鎖核酸は、２０塩基対の二本鎖領域を含む。
【００４９】
別の態様において、本発明は、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含む二本鎖核酸構造であって、アンチセンス鎖は、少なくとも１４個の連続したヌクレオチド並びに５’末端及び３’末端を含み；センス鎖は、少なくとも１３個の連続したヌクレオチド、５’末端及び３’末端を含み、且つアンチセンス鎖に対する相補性を有し；アンチセンス鎖は、少なくとも８５％の２’−Ｏ−メチル修飾を含み；第１のオリゴヌクレオチドの５’末端からの位置２及び１４のヌクレオチドは、２’−Ｆで修飾されており；センス鎖は、１００％の２’−Ｏ−メチル修飾を含み；及びアンチセンス鎖の３’末端からの位置１〜６又は３’末端からの位置１〜７のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている、二本鎖核酸構造を提供する。
【００５０】
別の態様において、本発明は、先に記載される１つ以上の化学修飾された二本鎖核酸及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００５１】
別の態様において、本発明は、疾患又は障害を処置又は管理する方法であって、そのような処置又は管理を必要とする対象に、治療的に有効な量の、先の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００５２】
別の態様において、本発明は、２つ以上の二本鎖核酸を含む、細胞内でＲＮＡサイレンシングを媒介することができる分枝状オリゴヌクレオチド化合物であって、核酸（Ｎ）は、リンカー（Ｌ）、スペーサー（Ｓ）及び任意選択的に分岐点（Ｂ）から選択される１つ以上の部分によって互いに連結されており、各二本鎖核酸は、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各アンチセンス鎖は、少なくとも１４個の連続したヌクレオチド、５’末端及び３’末端を含み、且つ少なくとも１つのアンチセンス鎖は、少なくとも８５％の２’−Ｏ−メチル修飾を含み；少なくとも１つのアンチセンス鎖の５’末端からの位置２及び１４のヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含み；少なくとも１つのアンチセンス鎖の３’末端からの位置１〜７の１つ以上のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている、分枝状オリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【００５３】
特定の実施形態において、各アンチセンス鎖は、少なくとも８５％の２’−Ｏ−メチル修飾を含み；各アンチセンス鎖の５’末端からの位置２及び１４のヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含み；及び／又は各アンチセンス鎖の３’末端からの位置１〜７の１つ以上のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。
【００５４】
特定の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の５’末端からの位置１及び２のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。
【００５５】
特定の実施形態において、各二本鎖核酸は、独立して、センス鎖又はアンチセンス鎖の３’末端又は５’末端においてリンカー、スペーサー又は分岐点に連結されている。
【００５６】
特定の実施形態において、化合物は、分枝状オリゴヌクレオチド化合物の末端の５’位置に取り付けられた疎水性部分をさらに含む。
【００５７】
特定の実施形態において、疎水性部分は、アルキル、アルケニル若しくはアリール部分；ビタミン若しくはコレステロール誘導体；親油性アミノ酸；又はこれらの組合せを含む。
【００５８】
特定の実施形態において、各リンカーは、独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミダート、エステル、アミド、トリアゾール又はこれらの組合せから選択され；リンカーのいずれかの炭素又は酸素原子は、任意選択的に、窒素原子で置換されているか、ヒドロキシル置換基を有するか、又はオキソ置換基を有する。
【００５９】
特定の実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端からの位置２０のヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【００６０】
特定の実施形態において、センス鎖の３’末端からの位置７、１０及び１１のヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾又は部分を含む。
【００６１】
特定の実施形態において、非２’−Ｏ−メチル修飾は、２’−Ｆ修飾若しくは２’−Ｈ修飾又は２’−ＯＨ部分を含む。特定の実施形態において、非２’−Ｏ−メチル修飾は、２’−Ｆ修飾を含む。特定の実施形態において、非２’−Ｏ−メチル修飾は、２’−Ｈ修飾を含む。特定の実施形態において、非２’−Ｏ−メチル修飾は、２’−ＯＨ部分を含む。
【００６２】
特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、少なくとも９０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。
【００６３】
特定の実施形態において、センス鎖は、少なくとも８０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、少なくとも９０％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、１００％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２個の連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の連続したヌクレオチドを含む。
【００６４】
本発明の前述及び他の特徴並びに利点は、添付の図面と組み合わせて例示的実施形態の以下の詳細な説明からより詳細に理解されることになる。本特許又は出願ファイルは、有色で作成された少なくとも１つの図面を含む。有色の図面を有する本特許又は特許出願公報のコピーは、入手を要請し、必要な手数料を支払えば、特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、特定の例示的な実施形態に従う、ガイド（アンチセンス）鎖の位置２及び１４に２つの２’−フルオロ修飾を含有する、完全に化学的に安定化されたｓｉＲＮＡパターン（パターン１）を概略的に示す（上部）。また、位置２及び１４がリボース（中央部）及びＤＮＡ（下部）で修飾されている２’−フルオロフリー配置を示す。図１は、パターン１Ａ〜パターン１Ｆを概略的に示し、それぞれガイド（アンチセンス）鎖の位置２及び１４において２’−ＯＭｅ修飾を欠いている。また、パターン１Ｂ、パターン１Ｄ及びパターン１Ｆは、ガイド鎖の３’末端ヌクレオチドにおいて２’−ＯＭｅ修飾を欠いている。パターン１Ａ及びパターン１Ｂは、２０ヌクレオチドガイド鎖及び１５ヌクレオチドパッセンジャ（センス）鎖を有するｓｉＲＮＡを示す。パターン１Ｃ及びパターン１Ｄは、２０ヌクレオチドガイド鎖及び１８ヌクレオチドパッセンジャ（センス）鎖を有するｓｉＲＮＡを示す。パターン１Ｅ及びパターン１Ｆは、２２ヌクレオチドガイド鎖及び２０ヌクレオチドパッセンジャ（センス）鎖を有するｓｉＲＮＡを示す。
【図２】図２は、特定の例示的な実施形態に従う糖修飾を示す。
【図３】図３は、特定の例示的な実施形態に従うオリゴヌクレオチド骨格結合を示す。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｃは、２’−Ｏ’メチル含量の増大に伴う、ｓＦＬＴ１ｉ１３  ｍＲＮＡサイレンシングの有効性の増大を示す。図４Ａは、ＨｅＬａ細胞を示し、及び図４Ｂは、Ｏ−メチルリッチｓｉＲＮＡ及び対照ｓｉＲＮＡにより、示す濃度において７２時間処理したメラノーマ細胞を示す。図４Ｃは、Ｆ２、１４  ｓｉＲＮＡ（円）、Ｆ２、４、５、６、８、１４  ｓｉＲＮＡ（正方形）及び対照ｓｉＲＮＡ（三角形）を概略的に示す。ｍＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ（図４Ａ）又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０（図４Ｂ）アッセイ系を用いて測定した。データを対照リポーター（図４Ａ）、ハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）（図４Ｂ）に対して標準化して、非処理対照の％としてグラフ化した。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｃは、２’−Ｏ’メチル含量の増大に伴う、ｓＦＬＴ１ｉ１３  ｍＲＮＡサイレンシングの有効性の増大を示す。図４Ａは、ＨｅＬａ細胞を示し、及び図４Ｂは、Ｏ−メチルリッチｓｉＲＮＡ及び対照ｓｉＲＮＡにより、示す濃度において７２時間処理したメラノーマ細胞を示す。図４Ｃは、Ｆ２、１４  ｓｉＲＮＡ（円）、Ｆ２、４、５、６、８、１４  ｓｉＲＮＡ（正方形）及び対照ｓｉＲＮＡ（三角形）を概略的に示す。ｍＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ（図４Ａ）又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０（図４Ｂ）アッセイ系を用いて測定した。データを対照リポーター（図４Ａ）、ハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）（図４Ｂ）に対して標準化して、非処理対照の％としてグラフ化した。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、２’−Ｏ’メチル含量の増大に伴う、ｓＦＬＴｅ１５ａ  ｍＲＮＡサイレンシングの有効性の増大を示す。図５Ａは、ＨｅＬａ細胞を示し、及び図５Ｂは、Ｏ−メチルリッチｓｉＲＮＡ及び対照ｓｉＲＮＡにより、示す濃度において７２時間処理したメラノーマ細胞を示す。ｍＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ（図５Ａ）又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０（図５Ｂ）アッセイ系を用いて測定した。データを対照リポーター（図５Ａ）、ハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）（図５Ｂ）に対して標準化して、非処理対照の％としてグラフ化した。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、Ｏ−メチルリッチＤＣＡ化合物及びＰＣ  ＤＣＡ化合物が、Ｐ２コレステロールと比較して、１／２の投薬にもかかわらず、肝臓（Ａ）、腎臓（Ｂ）及び胎盤（Ｃ）において増大した又は類似のＡＳ蓄積を示すことを示す。ＣＤ１妊娠マウスを、Ｏ−メチルリッチｓｉＲＮＡ及びＰ２  ｓｉＲＮＡにより、示す濃度において処理して、組織を、示す時点において収集した。ｓｉＲＮＡガイド鎖を、組織内でペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションアッセイを用いて測定した。ｓＦＬＴ１−２２８３  Ｏ−メチルリッチ：２０ｍｇ／ｋｇ＊、１２０時間の用量；ｓＦＬＴ１−２５１９  Ｏ−メチルリッチ：２０ｍｇ／ｋｇ＊、１２０時間の用量。ｓＦＬＴ１−２２８３  Ｐ２：２０ｍｇ／ｋｇ＊＊、１２０時間の用量。＊４０ｍｇ／ｋｇは、ｓＦＬＴ１−Ｘ  ｓｉＲＮＡの総用量（２０ｍｇ／ｋｇ  ｓＦＬＴ１−２２８３＋Ｅ１４の２０ｍｇ／ｋｇ  ｓＦＬＴ１−２５１９ａ）であった。＊＊２０ｍｇ／ｋｇは、ｓＦＬＴ１−２２８３  ｓｉＲＮＡの総用量（Ｅ１４の１０ｍｇ／ｋｇ  ｓＦＬＴ１−２２８３＋Ｅ１５の１０ｍｇ／ｋｇ  ｓＦＬＴ１−２２８３）であった。
【図７】図７は、Ｏ−メチルリッチＤＣＡ化合物及びＰＣ  ＤＣＡ化合物が、Ｐ２  Ｃｈｏｌと比較して、胎盤において増大した又は類似のＡＳ蓄積を示したことを示す。ＣＤ１妊娠マウスを、Ｏ−メチルリッチｓｉＲＮＡ及びＰ２  ｓｉＲＮＡにより、示す濃度において処理して、組織を、示す時点において収集した。ｓｉＲＮＡガイド鎖を、組織内でペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションアッセイを用いて測定した。ｓＦＬＴ１−２２８３  Ｏ−メチルリッチ：２０ｍｇ／ｋｇ＊、１２０時間の用量；ｓＦＬＴ１−２５１９  Ｏ−メチルリッチ：２０ｍｇ／ｋｇ＊、１２０時間の用量；ｓＦＬＴ１−２２８３  Ｐ２：１０ｍｇ／ｋｇ＊＊、１２０時間の用量；ｓＦＬＴ１−２５１９  Ｐ２：１０ｍｇ／ｋｇ＊＊、１２０時間の用量。＊４０ｍｇ／ｋｇは、ｓＦＬＴ１−Ｘ  ｓｉＲＮＡの総用量（２０ｍｇ／ｋｇ  ｓＦＬＴ１−２２８３＋Ｅ１４の２０ｍｇ／ｋｇ  ｓＦＬＴ１−２５１９ａ）であった。＊＊２０ｍｇ／ｋｇは、ｓＦＬＴ１−Ｘ  ｓｉＲＮＡの総用量（１０ｍｇ／ｋｇ  ｓＦＬＴ１−２２８３＋１０ｍｇ／ｋｇ  ｓＦＬＴ１−２５１９）であった。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、ＰＰＩＢ  Ｐ２と比較して、収集までの時間が長引いたにもかかわらず、肝臓及び胎盤におけるＡＳ蓄積の増大を示すＯ−メチルリッチ化合物を示す。ＣＤ１妊娠マウスを、Ｏ−メチルリッチｓＦＬＴ１  ｓｉＲＮＡ及びＰ２  ＰＰＩＢ  ｓｉＲＮＡにより、示す濃度において処理して、組織を、示す時点において収集した。ｓｉＲＮＡガイド鎖を、組織内でペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションアッセイを用いて測定した。ＰＰＩＢ  Ｐ２：２０ｍｇ／ｋｇ、４８時間の用量；ｓＦＬＴ１−Ｘ  Ｏ−メチルリッチ：２０ｍｇ／ｋｇ＊、１２０時間の用量。＊４０ｍｇ／ｋｇは、ｓＦＬＴ１−Ｘ  ｓｉＲＮＡの総用量（２０ｍｇ／ｋｇ  ｓＦＬＴ１−２２８３＋Ｅ１４の２０ｍｇ／ｋｇ  ｓＦＬＴ１−２５１９）であった。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｂは、パターン１ＡによるｓＦＬＴ１ｉ１３  ｍＲＮＡサイレンシングのインビトロ有効性を示す。図９Ａは、ＨｅＬａ細胞を示し、及び図９Ｂは、パターン１Ａ及び対照ｓｉＲＮＡにより、示す濃度において７２時間処理したＷＭ−１１５細胞を示すｍＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ系（図９Ａ）又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０アッセイ系（図９Ｂ）を用いて測定した。データを対照リポーター（ｆＬｕｃ）（図９Ａ）又はハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）（図９Ｂ）に対して標準化して、非処理対照の％としてグラフ化した。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｂは、パターン１ＡによるｓＦＬＴ１ｉ１３  ｍＲＮＡサイレンシングのインビトロ有効性を示す。図９Ａは、ＨｅＬａ細胞を示し、及び図９Ｂは、パターン１Ａ及び対照ｓｉＲＮＡにより、示す濃度において７２時間処理したＷＭ−１１５細胞を示すｍＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ系（図９Ａ）又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０アッセイ系（図９Ｂ）を用いて測定した。データを対照リポーター（ｆＬｕｃ）（図９Ａ）又はハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）（図９Ｂ）に対して標準化して、非処理対照の％としてグラフ化した。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｂは、パターン１ＡによるｓＦＬＴｅ１５ａ  ｍＲＮＡサイレンシングのインビトロ有効性を示す。図１０Ａは、ＨｅＬａ細胞を示し、及び図１０Ｂは、パターン１Ａ及び対照ｓｉＲＮＡにより、示す濃度において７２時間処理したＷＭ−１１５細胞を示す。ｍＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ系（図１０Ａ）又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０アッセイ系（図１０Ｂ）を用いて測定した。データを対照リポーター（ｆＬｕｃ）（図１０Ａ）又はハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）（図１０Ｂ）に対して標準化して、非処理対照の％としてグラフ化した。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｂは、パターン１ＡによるｓＦＬＴｅ１５ａ  ｍＲＮＡサイレンシングのインビトロ有効性を示す。図１０Ａは、ＨｅＬａ細胞を示し、及び図１０Ｂは、パターン１Ａ及び対照ｓｉＲＮＡにより、示す濃度において７２時間処理したＷＭ−１１５細胞を示す。ｍＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ系（図１０Ａ）又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０アッセイ系（図１０Ｂ）を用いて測定した。データを対照リポーター（ｆＬｕｃ）（図１０Ａ）又はハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）（図１０Ｂ）に対して標準化して、非処理対照の％としてグラフ化した。
【図１１Ａ】図１１Ａは、パターン１Ａ  ＤＣＡ化合物及びＰＣ  ＤＣＡ化合物が、コレステロールコンジュゲートを有する対照パターンと比較して、１／２の投薬にもかかわらず、肝臓、腎臓及び胎盤において増大したガイド鎖蓄積を示すことを示す。パターン１Ａ及び対照の概略図を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、パターン１Ａ  ＤＣＡ化合物及びＰＣ  ＤＣＡ化合物が、コレステロールコンジュゲートを有する対照パターンと比較して、１／２の投薬にもかかわらず、肝臓、腎臓及び胎盤において増大したガイド鎖蓄積を示すことを示す。対照と比較した、肝臓、腎臓及び胎盤における増大したガイド鎖蓄積を示す。ＣＤ１妊娠マウスを、パターン１Ａ又は対照ｓｉＲＮＡにより、示す濃度において処理して、組織を、示す時点において収集した。ｓｉＲＮＡガイド鎖を、組織内でペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションアッセイを用いて測定した。ｓＦＬＴ１−２２８３  Ｏ−メチルリッチ：２０ｍｇ／ｋｇ＊、１２０時間の用量；ｓＦＬＴ１−２２８３対照：２０ｍｇ／ｋｇ＊＊、１２０時間の用量。＊４０ｍｇ／ｋｇは、ｓＦＬＴ１−Ｘ  ｓｉＲＮＡの総用量（２０ｍｇ／ｋｇのｓＦＬＴ１−２２８３＋Ｅ１４の２０ｍｇ／ｋｇ  ｓＦＬＴ１−２５１９ａ）であった。＊＊２０ｍｇ／ｋｇは、ｓＦＬＴ１−２２８３  ｓｉＲＮＡの総用量（Ｅ１４の１０ｍｇ／ｋｇ  ｓＦＬＴ１−２２８３＋Ｅ１５の１０ｍｇ／ｋｇ  ｓＦＬＴ１−２２８３）であった。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、パターン１Ａ  ＤＣＡ化合物及びＰＣ  ＤＣＡ化合物が、コレステロールコンジュゲートを有する対照パターンと比較して、１／２の投薬にもかかわらず、肝臓、腎臓及び胎盤において増大したガイド鎖蓄積を示すことを示す。対照と比較した、胎盤における増大したガイド鎖蓄積を示す。条件は、ｓＦＬＴ１−２２８３対照に１０ｍｇ／ｋｇ＊＊（１２０時間の用量）において投薬したこと以外、図１１Ｂと同じである。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、パターン１Ａ  ＤＣＡ化合物及びＰＣ  ＤＣＡ化合物が、コレステロールコンジュゲートを有する対照パターンと比較して、１／２の投薬にもかかわらず、肝臓、腎臓及び胎盤において増大したガイド鎖蓄積を示すことを示す。対照と比較した、肝臓における増大したガイド鎖蓄積及び胎盤における類似のガイド鎖蓄積を示す。条件は、ＨＴＴ−１０１５０  ＤＣＡ及びＰＣ−ＤＣＡ対照を用いた（２０ｍｇ／ｋｇ＊＊、４８時間の用量）こと以外、図１１Ｂと同じである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、パターン１Ｂ  ＰＣ  ＤＣＡ  ｓｉＲＮＡが、コレステロール又はＰＣ  ＤＣＡコンジュゲートを有する対照パターンと比較して、１／２の投薬にもかかわらず、胎盤において増大したガイド鎖蓄積を示すことを示す。パターン１Ｂ及び対照の概略図を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、パターン１Ｂ  ＰＣ  ＤＣＡ  ｓｉＲＮＡが、コレステロール又はＰＣ  ＤＣＡコンジュゲートを有する対照パターンと比較して、１／２の投薬にもかかわらず、胎盤において増大したガイド鎖蓄積を示すことを示す。対照と比較した、胎盤における増大したガイド鎖蓄積を示す。ＣＤ１妊娠マウスをパターン１Ｂ又は対照ｓｉＲＮＡで処理して、組織を収集した。ｓｉＲＮＡガイド鎖を、組織内でペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションアッセイを用いて測定した。ｓＦＬＴ１−２５１９  Ｏ−メチルリッチ：２０ｍｇ／ｋｇ＊、１２０時間の用量；ｓＦＬＴ１−２２８３対照：２０ｍｇ／ｋｇ＊＊、１２０時間の用量；ＨＴＴ−１０１５０対照ＰＣ  ＤＣＡ：２０ｍｇ／ｋｇ、４８時間の用量。＊４０ｍｇ／ｋｇは、ｓＦＬＴ１−Ｘ  ｓｉＲＮＡの総用量（２０ｍｇ／ｋｇのｓＦＬＴ１−２２８３＋Ｅ１４の２０ｍｇ／ｋｇ  ｓＦＬＴ１−２５１９ａ）であった。＊＊２０ｍｇ／ｋｇは、ｓＦＬＴ１−２２８３  ｓｉＲＮＡの総用量（Ｅ１４の１０ｍｇ／ｋｇ  ｓＦＬＴ１−２２８３＋Ｅ１５の１０ｍｇ／ｋｇ  ｓＦＬＴ１−２２８３）であった。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ガイド鎖の位置２０に２’−ＯＭｅを有する又は有しないｓｉＲＮＡによる、ｓＦＬＴ１ｉ１３、ｓＦＬＴ１ｅ１５ａ及びＨＴＴ  ｍＲＮＡサイレンシングのインビトロ有効性を示す。図１３Ａ、図１３Ｃ及び図１３Ｄは、ＨｅＬａ細胞を示し、及び図１３Ｂは、ガイド鎖内の２’−ＯＭｅ含量が５０〜５５％であるｓｉＲＮＡにより、示す濃度において７２時間処理したＷＭ−１１５細胞を示す。図１３Ｄは、２０ヌクレオチドアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡを、２１ヌクレオチドアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡと比較している。ｍＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０アッセイ系を用いて測定した。データを対照リポーター（ｆＬｕｃ）又はハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）に対して標準化して、非処理対照の％としてグラフ化した。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ガイド鎖の位置２０に２’−ＯＭｅを有する又は有しないｓｉＲＮＡによる、ｓＦＬＴ１ｉ１３、ｓＦＬＴ１ｅ１５ａ及びＨＴＴ  ｍＲＮＡサイレンシングのインビトロ有効性を示す。図１３Ａ、図１３Ｃ及び図１３Ｄは、ＨｅＬａ細胞を示し、及び図１３Ｂは、ガイド鎖内の２’−ＯＭｅ含量が５０〜５５％であるｓｉＲＮＡにより、示す濃度において７２時間処理したＷＭ−１１５細胞を示す。図１３Ｄは、２０ヌクレオチドアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡを、２１ヌクレオチドアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡと比較している。ｍＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０アッセイ系を用いて測定した。データを対照リポーター（ｆＬｕｃ）又はハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）に対して標準化して、非処理対照の％としてグラフ化した。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ガイド鎖の位置２０に２’−ＯＭｅを有する又は有しないｓｉＲＮＡによる、ｓＦＬＴ１ｉ１３、ｓＦＬＴ１ｅ１５ａ及びＨＴＴ  ｍＲＮＡサイレンシングのインビトロ有効性を示す。図１３Ａ、図１３Ｃ及び図１３Ｄは、ＨｅＬａ細胞を示し、及び図１３Ｂは、ガイド鎖内の２’−ＯＭｅ含量が５０〜５５％であるｓｉＲＮＡにより、示す濃度において７２時間処理したＷＭ−１１５細胞を示す。図１３Ｄは、２０ヌクレオチドアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡを、２１ヌクレオチドアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡと比較している。ｍＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０アッセイ系を用いて測定した。データを対照リポーター（ｆＬｕｃ）又はハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）に対して標準化して、非処理対照の％としてグラフ化した。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ガイド鎖の位置２０に２’−ＯＭｅを有する又は有しないｓｉＲＮＡによる、ｓＦＬＴ１ｉ１３、ｓＦＬＴ１ｅ１５ａ及びＨＴＴ  ｍＲＮＡサイレンシングのインビトロ有効性を示す。図１３Ａ、図１３Ｃ及び図１３Ｄは、ＨｅＬａ細胞を示し、及び図１３Ｂは、ガイド鎖内の２’−ＯＭｅ含量が５０〜５５％であるｓｉＲＮＡにより、示す濃度において７２時間処理したＷＭ−１１５細胞を示す。図１３Ｄは、２０ヌクレオチドアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡを、２１ヌクレオチドアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡと比較している。ｍＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０アッセイ系を用いて測定した。データを対照リポーター（ｆＬｕｃ）又はハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）に対して標準化して、非処理対照の％としてグラフ化した。
【図１４】例となる修飾されたサブユニット間リンカーを示す。
【図１５】二分岐ｓｉＲＮＡ化学骨格の例を示す。
【図１６】ある種の例示的な実施形態によるオリゴヌクレオチド分岐モチーフを示す。二重らせんは、オリゴヌクレオチドを表す。異なるリンカー、スペーサー及び分岐点の組合せは、多様な分岐ｈｓｉＲＮＡ構造の生成を可能にする。
【図１７】コンジュゲートされた生理活性部分を有する本発明の分岐オリゴヌクレオチドを示す。
【図１８】例示的なアミダイトリンカー、スペーサー及び分岐部分を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
本明細書中で提供されるのは、化学的に完全に安定化されており、且つアンチセンス鎖の位置２及び１４に２つの非２’−Ｏ−メチル修飾（例えば、２’−フルオロ修飾）のみを含有する、新規の化学配置を含むオリゴヌクレオチドである（図１）。科学理論によって拘束されることを意図するものではないが、アンチセンス鎖の位置２及び１４は、ＡＧＯ２との直接的な接触を形成する。予想外にも、この化学配置は、ｍＲＮＡサイレンシングに関連して完全に機能的であることが発見された。また、位置２及び１４がリボース及び／又はＤＮＡで修飾されている２’−フルオロフリー配置も発見された。本明細書中に記載される新規のオリゴヌクレオチドの使用は、インビボでの有効性の期間を延ばすだけでなく、高いパーセンテージの２’−フルオロ修飾を含むオリゴヌクレオチドの毒性についての懸念を引き下げることとなる。
【００６７】
定義
本明細書で別段の定義がない限り、本明細書で使用される科学用語及び専門用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。任意の潜在的多義性の場合、本明細書で提供される定義は、任意の辞書又は外的な定義よりも優先される。文脈によって別段の要求がない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。「又は」の使用は、他で示されない限り「及び／又は」を意味する。用語「含んでいる」並びに「含む」及び「含まれる」などの他の形の使用は、限定するものではない。特に明記しない限り、本明細書中で用いられる単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、複数の参照を含む。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は、複数のタンパク質分子を含む。
【００６８】
通常、本明細書中に記載される細胞培養及び組織培養、分子生物学、免疫学、細菌学、遺伝学、タンパク質及び核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法は、当技術分野において周知であり、且つ一般的に使用されるものである。本明細書中で提供される方法及び技術は、通常、特に明記しない限り、当技術分野において周知である従来の方法に従い、且つ本明細書を通して引用及び考察されている種々の一般的でより具体的な参考文献に記載されているように実行される。酵素反応及び精製技術は、メーカーの仕様書に従い、当技術分野において一般的に達成されるように又は本明細書中に記載されるように実行される。本明細書中に記載される分析化学、合成有機化学、医薬及び薬化学に関連して用いられる命名法並びにこれらのラボ手順及びラボ技術は、当技術分野で周知であり、且つ一般的に使用されるものである。標準的な技術が化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化及び送達並びに患者の処置に用いられる。
【００６９】
本開示がより容易に理解されるように、選抜した用語を以下に定義する。
【００７０】
用語「相補的な」は、ワトソン−クリック塩基対形成を示すヌクレオチド間の関係又はワトソン−クリック塩基対形成を介してハイブリダイズして二本鎖核酸を形成するオリゴヌクレオチドを指す。用語「相補性」は、別のオリゴヌクレオチドと部分的に又は完全に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、センス鎖又はアンチセンス鎖）の状態を指す。第２のオリゴヌクレオチドに対して相補性があると本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドと１００％（完全な相補性）、＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％又は＞５０％相補的であり得る。したがって、第２のオリゴヌクレオチドに対して相補性が１００％未満であると本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、相補性が完全ではない。
【００７１】
オリゴヌクレオチド配列に関連して本明細書で使用されるとおり、「Ａ」は、塩基アデニン（例えば、アデノシン又はその化学修飾された誘導体）を含むヌクレオシドを表し、「Ｇ」は、塩基グアニン（例えば、グアノシン又はその化学修飾された誘導体）を含むヌクレオシドを表し、「Ｕ」は、塩基ウラシル（例えば、ウリジン又はその化学修飾された誘導体）を含むヌクレオシドを表し、且つ「Ｃ」は、塩基シトシン（例えば、シチジン又はその化学修飾された誘導体）を含むヌクレオシドを表す。
【００７２】
本明細書中で用いられる用語「３’末端」は、そのリボース環の３’炭素に非修飾ヒドロキシル基を含有する核酸の末端を指す。３’末端は、別の分子、例えば疎水性分子又は別の核酸に（例えば、リンカーを介して）共有結合され得る。
【００７３】
本明細書中で用いられる用語「５’末端」は、そのリボース環の５’炭素にリン酸基が取り付けられた核酸の末端を指す。５’末端は、疎水性部分、ホスホネート部分、リンカー部分、アルキレン部分又はアルケニル部分によってさらに修飾され得る。
【００７４】
本明細書中で用いられる用語「ヌクレオシド」は、複素環塩基及びその糖で構成される分子を指す。
【００７５】
本明細書中で用いられる用語「ヌクレオチド」は、典型的には、その３’又は５’糖ヒドロキシル基上にリン酸基又はホスホロチオエート基を有するヌクレオシドを指す。
【００７６】
「標的特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する標的ｍＲＮＡ配列に十分に相補的な配列」である鎖を有するＲＮＡｉ剤、例えばｓｉＲＮＡは、鎖が、ＲＮＡｉによって標的ｍＲＮＡの破壊を引き起こすのに十分な配列を有することを意味する。
【００７７】
本明細書で使用する場合、用語「単離ＲＮＡ」（例えば、「単離ｓｉＲＮＡ」、「単離ｓｉＲＮＡ」又は「単離ｓｉＲＮＡ前駆体」）は、組換え技術によって生成される場合に他の細胞性材料若しくは培養物を実質的に含まないか、又は化学的に合成される場合に化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まないＲＮＡ分子を指す。
【００７８】
用語「識別ＲＮＡサイレンシング」は、「第１の」又は「標的」ポリヌクレオチド配列の発現を実質的に阻害する一方、「第２の」又は「非標的」ポリヌクレオチド配列の発現を実質的に阻害しない（例えば、両方のポリヌクレオチド配列が同じ細胞中に存在するとき）ＲＮＡ分子の能力を指す。ある種の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子に対応するが、非標的ポリヌクレオチド配列は、非標的遺伝子に対応する。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、標的アレルに対応するが、非標的ポリヌクレオチド配列は、非標的アレルに対応する。ある種の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の調節領域（例えば、プロモータ又はエンハンサーエレメント）をコードするＤＮＡ配列である。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡである。
【００７９】
本明細書中で用いられる用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する低分子干渉ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡ分子は、長さが（通常、１５〜３０塩基対で）変動し得、且つ標的ｍＲＮＡに対して様々な程度の相補性を有し得る。用語「ｓｉＲＮＡ」は、２つの別個の鎖の二重鎖及び二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成し得る一本鎖を含む。
【００８０】
本明細書中で用いられる用語「アンチセンス鎖」は、標的遺伝子又はｍＲＮＡに対してある程度の相補性を有し、且つｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖に対して相補性を有するｓｉＲＮＡ二重鎖の鎖を指す。アンチセンス鎖のヌクレオチド位置は、アンチセンス鎖の５’末端又はアンチセンス鎖の３’末端を基準にし得る。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの位置２及び１４は、アンチセンス鎖の５’末端から数えたときの２番目及び１４番目のヌクレオチドに相当する。
【００８１】
本明細書中で用いられる用語「センス鎖」は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に対して相補性を有するｓｉＲＮＡ二重鎖の鎖を指す。センス鎖のヌクレオチド位置は、センス鎖の５’末端又はセンス鎖の３’末端を基準にし得る。例えば、センス鎖の３’末端からの位置７、１０及び１１は、センス鎖の３’末端から数えたときの７番目、１０番目及び１１番目のヌクレオチドに相当する。任意選択的に、センス鎖が３’一本鎖オーバーハング領域を含む場合、３’末端を基準にして本明細書中に記載される位置は、センス鎖の二本鎖領域の３’末端を基準にする。
【００８２】
本明細書中で用いられる用語「オーバーハング」又は「テール」は、センス鎖及びアンチセンス鎖の一方又は両方の３’末端において、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はそれを超える連続して起こるヌクレオチドであって、一本鎖である、すなわちｓｉＲＮＡ二重鎖の他方の鎖に塩基対形成されていない（すなわち他方の鎖と二重鎖を形成していない）ヌクレオチドを指す。
【００８３】
本明細書で使用する場合、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「ＡＳＯ」は、有効な様式、例えば標的ｍＲＮＡの翻訳及び／又は標的プレｍＲＮＡのスプライシングを阻害するのに有効な様式で標的ＲＮＡの領域を遮断するために、ＲＮＡ（例えば、ＳＮＰ含有ｍＲＮＡ又はＳＮＰ含有プレｍＲＮＡ）を標的化する十分な配列相補性を有する核酸（例えば、ＲＮＡ）を指す。「標的ＲＮＡと十分に相補的な配列」を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス剤が、別の方法でスプライシングを調節するであろうタンパク質のための結合部位をマスクするのに十分な配列を有すること、並びに／又はアンチセンス剤が、リボソームのための結合部位をマスクするのに十分な配列を有すること、並びに／又はアンチセンス剤が、スプライシング及び／又は翻訳を妨げる標的化されるＲＮＡの三次元構造を改変するのに十分な配列を有することを意味する。
【００８４】
特定の例示的な実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、非対称的である。特定の例示的な実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、対称的である。
【００８５】
特定の例示的な実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、約８〜２０ヌクレオチド長若しくはヌクレオチド類似体長、約１０〜１８ヌクレオチド長若しくはヌクレオチド類似体長、約１２〜１６ヌクレオチド長若しくはヌクレオチド類似体長又は約１３〜１５ヌクレオチド長若しくはヌクレオチド類似体長の二重鎖領域（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０塩基対の二重鎖領域）を含む。特定の例示的な実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、１３〜２５塩基対の二重鎖領域を含む。特定の例示的な実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、１５〜２０塩基対の二重鎖領域を含む。特定の例示的な実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、１５塩基対の二重鎖領域を含む。
【００８６】
特定の例示的な実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、１つ又は２つのオーバーハングを含む。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡの各オーバーハングは、少なくとも約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９又は約１０個の連続して起こるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡの各オーバーハングは、約４、約５、約６又は約７ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、センス鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖オーバーハングと同じ数のヌクレオチド長である。他の実施形態において、センス鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖オーバーハングよりもヌクレオチドが少ない。他の実施形態において、アンチセンス鎖オーバーハングは、センス鎖オーバーハングよりもヌクレオチドが少ない。特定の実施形態において、オーバーハング領域内の各ヌクレオチドは、その隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介してコンジュゲートしている。
【００８７】
特定の例示的な実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖を含み、それぞれ独立して、長さが１０若しくは約１０；１５若しくは約１５；２０若しくは約２０；２５若しくは約２５；又は３０若しくは約３０ヌクレオチドである。特定の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖を含み、それぞれ独立して、長さが１５〜２５若しくは約１５〜２５又は約２５ヌクレオチドである。特定の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、それぞれ独立して、２０又は約２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、長さが同じである。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、長さが異なる。
【００８８】
特定の例示的な実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、長さが１５ヌクレオチドを超え、且つ少なくとも８５％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含むか又はそれからなるアンチセンス鎖及び長さがアンチセンス鎖よりも短いセンス鎖を含み、センス鎖の長さは、少なくとも約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドである。特定の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、長さが約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドであるアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、少なくとも８５％の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有し、且つ長さが約１８〜約２５ヌクレオチドであるアンチセンス鎖及び長さが約１３〜約２０ヌクレオチドであるセンス鎖を含む。特定の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、約２０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖及び約１５ヌクレオチド長のセンス鎖を含む。特定の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、約２０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖及び約１８ヌクレオチド長のセンス鎖を含む。
【００８９】
特定の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、約２２ヌクレオチド長のアンチセンス鎖及び約２０ヌクレオチド長のセンス鎖を含む。
【００９０】
本明細書中で用いられる用語「化学修飾ヌクレオチド」、「ヌクレオチド類似体」、「改変ヌクレオチド」又は「修飾ヌクレオチド」は、非標準ヌクレオチドを指し、天然に存在しないリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。例示的なヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの特定の化学特性を改変するように任意の位置において修飾されるが、その意図される機能を実行するヌクレオチド類似体の能力を保持する。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例として、５位置、例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン、５−プロピンウリジン、５−プロペニルウリジン等；６位置、例えば６−（２−アミノ）プロピルウリジン；８−位置（アデノシン及び／又はグアノシンについて）、例えば８−ブロモグアノシン、８−クロログアノシン、８−フルオログアノシン等が挙げられる。また、ヌクレオチド類似体は、デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシン；Ｏ−及びＮ−修飾された（例えば、アルキル化された、例えばＮ６−メチルアデノシン又はそれ以外に当技術分野において知られているものとしての）ヌクレオチド；並びに他のヘテロ環式に修飾されたヌクレオチド類似体、例えばＨｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，２０００  Ａｕｇ．１０（４）：２９７−３１０に記載されるものが挙げられる。
【００９１】
また、ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの糖部分に修飾を含み得る。例えば、２’ＯＨ−基（２’−ヒドロキシ）は、Ｈ（２’−デオキシ）、ＯＲ、Ｒ、Ｆ（２’−フルオロ）、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲ又はＯＲから選択される基によって置換され得、Ｒは、置換された又は置換されていないＣ１〜Ｃ６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール等である。他の考えられる修飾として、米国特許第５，８５８，９８８号明細書及び米国特許第６，２９１，４３８号明細書に記載されるものが挙げられる。
【００９２】
本明細書中で用いられる用語「代謝的に安定化された」は、天然の２’−ヒドロキシル基を２’−Ｏ−メチル基又は２’−フルオロ基で置換する２’−リボース修飾を含有するＲＮＡ分子を指す。同様に、用語「安定化された」は、２’−ヒドロキシル基を、２’−Ｏ−メチル基又は２’−Ｏ−メチルでなく、且つ２−ヒドロキシルでない基で置換する２’−リボース修飾を含有するＲＮＡ分子を指す。用語「完全に安定化された」又は「完全に修飾された」は、各位置において２’−修飾を含有し、且つ典型的には少なくとも８５％が２’−Ｏ−メチル修飾されているＲＮＡ分子を指す。特定の実施形態において、完全に安定化されたＲＮＡ分子は、１、２又は３つの非２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、例えば２’−Ｆ又は２’−Ｈ修飾されたヌクレオチドを含有し得る。用語「ほぼ完全に安定化された」又は「ほぼ完全に修飾された」は、２’−修飾を有しない１つ、２つ又は３つの位置を含有し、且つ典型的には少なくとも８５％が２’−Ｏ−メチル修飾されているＲＮＡ分子を指す。本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、安定化され得、代謝的に安定化され得、ほぼ完全に安定化され得、且つ／又は完全に安定化され得る。
【００９３】
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡの二重鎖領域は、１つ若しくは２つの２’−フルオロ修飾及び／又は少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％若しくは少なくとも約９４％の２’−メトキシ（２’−Ｏ−メチル）修飾を含む。特定の例示的な実施形態において、アンチセンス鎖は、２つの２’−フルオロ修飾及び少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％又は少なくとも約９４％の２’−メトキシ修飾を含む。特定の例示的な実施形態において、センス鎖は、２つの２’−フルオロ修飾及び少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の２’−メトキシ修飾を含む。特定の例示的な実施形態において、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％又は少なくとも約９４％の２’−メトキシ修飾を含む一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。
【００９４】
特に例示的な実施形態において、５’末端からの位置２及び１４でのそれぞれのヌクレオチドの２’−フルオロ修飾並びに他の各ヌクレオチド位置での２’−メトキシ修飾を含むオリゴヌクレオチドが提供される。特定の例示的な実施形態において、３つの２’−フルオロ修飾及び少なくとも約８５％の非２’−フルオロ修飾（例えば、少なくとも約８５％の２’−メトキシ修飾）を含むアンチセンス鎖が提供される。特定の例示的な実施形態において、２つ又は３つの非２’−Ｏ−メチル修飾（２’−Ｆ、２’−Ｈ又は２’−ＯＨ）及び少なくとも約８５％の２’−メトキシ修飾を含むアンチセンス鎖が提供される。
【００９５】
本明細書中で用いられる用語「ホスホロチオエート」は、リン酸基の１つ以上の酸素を硫黄と置換することによって修飾されているヌクレオチドのリン酸基を指す。ホスホロチオエートは、カチオン対イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム又はマグネシウム等）をさらに含む。用語「ホスホロチオエート化されたヌクレオチド」は、別のヌクレオチドへの１つ又は２つのホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドを指す。特定の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡの一本鎖テールは、ホスホロチオエート化されたヌクレオチドを含むか又はそれからなる。特定の実施形態において、本明細書中に記載される二本鎖オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエート化されたヌクレオチドを二本鎖領域内に含む。特定の実施形態において、本明細書中に記載される二本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖領域内の１、２、３、４又は５つのホスホロチオエート化されたヌクレオチド及びホスホロチオエート化されたヌクレオチドを含むか又はそれからなる１つ以上の一本鎖テールを含む。
【００９６】
一部の実施形態において、本明細書中に記載される化合物、オリゴヌクレオチド及び核酸は、図３に示される１つ以上のヌクレオチド間結合を含むように修飾され得る。特定の実施形態において、本明細書中に記載される化合物、オリゴヌクレオチド及び核酸は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択される１つ以上のヌクレオチド間結合を含む。
【００９７】
例えば、ホスホジエステル及びホスホロチオエートが挙げられる、本明細書中に提供される特定のヌクレオチド間結合は、生理的ｐＨで−１の形式電荷を含むこと及び前記形式電荷がカチオン部分、例えばアルカリ金属、例えばナトリウム若しくはカリウム、アルカリ土類金属、例えばカルシウム若しくはマグネシウム又はアンモニウムイオン若しくはグアニジニウムイオンによって均衡が保たれることとなることが理解される。
【００９８】
本明細書中で用いられる用語「脂質製剤」は、リポソーム製剤を指し得、例えばリポソームを用いて、細胞中への核酸の侵入を促進するような核酸との凝集体が形成される。理論によって拘束されるものではないが、リポソームは、細胞中への侵入に有用であり、なぜなら、リン脂質二重層は、細胞膜のリン脂質二重層と容易にマージすることによって核酸が細胞に侵入することができるからである。
【００９９】
ｓｉＲＮＡパターン１
パターン１及び例示的なパターン１Ａ〜パターン１Ｆ実施形態が以下に再現され、「ｍＮ」は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、「ｘＮ」は、非２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、例えば２’−フルオロ修飾ヌクレオチド又は２’−デオキシ修飾ヌクレオチドであり、「＃」は、ホスホロチオエート骨格修飾であり、及び「Ｎ」は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択されるヌクレオチドである。
パターン１
アンチセンス５’〜３’
（ｍＮ）（ｘＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｘＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）
センス５’〜３’
（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）
【０１００】
特定の実施形態において、上述のパターン１は、２０〜２２ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み得、アンチセンス鎖は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドにより３’末端から伸長されている。２０ヌクレオチドアンチセンス鎖が先で示されている。特定の実施形態において、上述のパターン１は、１５〜２０ヌクレオチドのセンス鎖を含み得、センス鎖は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドにより３’末端から伸長されている。１５ヌクレオチドセンス鎖が先で示されている。特定の実施形態において、上述のアンチセンス鎖は、５’末端及び／又は３’末端において１つ以上のホスホロチオエート結合＃を含み得る。特定の実施形態において、上述のセンス鎖は、５’末端及び／又は３’末端において１つ以上のホスホロチオエート結合＃を含み得る。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドは、５’ビニルホスホネート、５’ＯＨ又は５’ホスホロチオエート（５’ＰＳ）を含み得る。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドは、非２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み得る。さらなる実施形態において、パターン１のｓｉＲＮＡは、２つ以上の連結されたパターン１  ｓｉＲＮＡを含む分枝状ｓｉＲＮＡ構造であり得る。特定の実施形態において、パターン１  ｓｉＲＮＡは、センス鎖の３’末端を介して２つのｓｉＲＮＡをリンカーが連結する２つのパターン１  ｓｉＲＮＡを含むジ分枝状パターン１  ｓｉＲＮＡである。
【０１０１】
例示的なパターン１実施形態（パターン１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ及び１Ｆ）を以下に示す。
パターン１Ａ
アンチセンス５’〜３’（２０ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｘＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｘＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
センス５’〜３’（１５ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
パターン１Ｂ
アンチセンス５’〜３’（２０ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｘＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｘＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｘＮ）
センス５’〜３’（１５ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
パターン１Ｃ
アンチセンス５’〜３’（２０ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｘＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｘＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
センス５’〜３’（１８ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
パターン１Ｄ
アンチセンス５’〜３’（２０ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｘＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｘＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｘＮ）
センス５’〜３’（１８ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
パターン１Ｅ
アンチセンス５’〜３’（２２ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｘＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｘＮ）（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
センス５’〜３’（２０ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
パターン１Ｆ
アンチセンス５’〜３’（２２ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｘＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｘＮ）（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｘＮ）
センス５’〜３’（２０ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
【０１０２】
ｓｉＲＮＡ設計
一部の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、センス鎖及び相補的なアンチセンス鎖からなるｓｉＲＮＡ二重鎖であり、アンチセンス鎖は、ＲＮＡｉを媒介するのに十分なｍＲＮＡとの相補性を有する。特定の例示的な実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は、独立して、約１０〜５０以上のヌクレオチド長であり、すなわち、各鎖は、独立して、１０〜５０ヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体若しくはヌクレオチド及びヌクレオチド類似体の組合せ）を含む。他の例示的な実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、長さが約１６〜３０ヌクレオチドであり、例えば独立して各鎖において１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドであり、鎖の一方は、ＲＮＡｉを媒介するのに十分に標的領域と相補的である。
【０１０３】
特定の例示的な実施形態において、鎖は、鎖がアニールされた場合、４、５、６、７、８、９１０個又はそれを超える残基のオーバーハングが二重鎖の一方又は両方の末端において起こるように、鎖がアラインしない一方又は両方の末端に少なくとも４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える塩基がある（すなわちそのために相補的な塩基が対向する鎖内に出現しない）ようにアラインされる。特定の例示的な実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０〜５０以上のヌクレオチド長を有し、すなわち、各鎖は、独立して、１０〜５０ヌクレオチド（若しくはヌクレオチド類似体又はヌクレオチド及びヌクレオチド類似体の組合せ）を含む。特に例示的な実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、独立して、各鎖において約１６〜３０、例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド長を有し、鎖の一方は、標的配列と実質的に相補的であり、及び他方の鎖は、第１の鎖と同一であるか又は実質的に同一である。
【０１０４】
他の例示的な実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、長さが約１５〜約２５若しくは約１６〜約２５であるか、又は例えば独立して各鎖において１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドを有し、鎖の一方は、ＲＮＡｉを媒介するのに十分に標的領域と相補的である。特定の例示的な実施形態において、鎖は、鎖がアニールされた場合、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える残基のオーバーハングが二重鎖の一方又は両方の末端において起こるように、鎖がアラインしない一方又は両方の末端に少なくとも４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える塩基がある（すなわちそのために相補的な塩基が対向する鎖内に出現しない）ようにアラインされる。
【０１０５】
通常、ｓｉＲＮＡは、当技術分野において知られているあらゆる方法を用いることにより、例えば以下のプロトコルを用いることにより設計することができる。
【０１０６】
１．ｓｉＲＮＡは、標的配列に特異的であるべきである。第１の鎖は、標的配列と相補的であるべきであり、及び他方の鎖は、第１の鎖と実質的に相補的である。例示的な標的配列は、標的遺伝子、例えば突然変異を含む標的遺伝子の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）又はイントロン領域から選択される。これらの部位でのｍＲＮＡの切断は、対応する突然変異タンパク質の翻訳を消失させるべきである。標的遺伝子の他の領域由来の標的配列も標的化に適している。センス鎖が標的配列に基づいて設計される。さらに、Ｇ／Ｃ含量がより低い（３５〜５５％）ｓｉＲＮＡは、Ｇ／Ｃ含量が５５％よりも高いものよりも活性であり得る。したがって、一実施形態において、本発明は、Ｇ／Ｃ含量が３５〜５５％である核酸分子を含む。
【０１０７】
２．ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、選択された標的部位の配列に基づいて設計される。特定の例示的な実施形態において、センス鎖は、約１３〜約２０、約１３〜約１８、約１３〜約１５、約１５〜約２０又は約１５〜約１８ヌクレオチド、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、約１９〜２５ヌクレオチド、例えば１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、１９、２０又は２１ヌクレオチドを含む。しかしながら、当業者であれば、長さが１９ヌクレオチド未満、例えば長さが１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８ヌクレオチドであるか、又は２５ヌクレオチドを超えるｓｉＲＮＡもＲＮＡｉを媒介するように機能し得ることを認識するであろう。したがって、そのような長さのｓｉＲＮＡも、ＲＮＡｉを媒介する能力を保持するのであれば、本発明の範囲内である。より長いＲＮＡサイレンシング剤が特定の哺乳動物細胞内でインターフェロン又はプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）応答を誘発することが実証された（これは、不所望であり得る）。特定の例示的な実施形態において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ＰＫＲ応答を誘発しない（すなわち十分に短い長さのものである）。しかしながら、より長いＲＮＡサイレンシング剤が、例えば、ＰＲＫ応答を生じさせることができない細胞型において、又はＰＫＲ応答が代替手段によって下方制御されているか若しくは低下している状況において有用であり得る。
【０１０８】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介することができるほど十分な標的配列との相補性を有する。一般に、標的遺伝子のＲＩＳＣ媒介切断をもたらすのに十分である、標的遺伝子の標的配列部分に同一のヌクレオチド配列を含有するｓｉＲＮＡが特に適している。したがって、例示的な実施形態において、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的の一部に対して十分に同一な配列を有するように設計されている。例えば、センス鎖は、標的部位に対して１００％の同一性を有し得る。しかしながら、１００％の同一性は、必要とされない。センス鎖と標的ＲＮＡ配列との間で８０％を超える同一性、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性が特に適している。本発明は、ＲＮＡｉの効率及び特異性を増強する特定の配列変異を許容することができる利点がある。一実施形態において、センス鎖は、標的領域、例えば野生型対立遺伝子と突然変異対立遺伝子間で少なくとも１つの塩基対が異なる標的領域、例えば機能獲得突然変異を含む標的領域との、４、３、２、１又は０個のミスマッチヌクレオチドを有し、及び他方の鎖は、第１の鎖と同一であるか又は実質的に同一である。さらに、１又は２つのヌクレオチドの小さい挿入又は欠失を伴うｓｉＲＮＡ配列もＲＮＡｉを媒介するために効果的であり得る。代わりに、ヌクレオチド類似体置換又は挿入を伴うｓｉＲＮＡ配列は、阻害のために効果的であり得る。
【０１０９】
配列同一性は、配列比較及び当技術分野において知られるアラインメントアルゴリズムによって決定され得る。２つの核酸配列（又は２つのアミノ酸配列）の同一性パーセントを決定するため、配列は、最適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップは、最適なアラインメントのために第１の配列又は第２の配列に導入され得る）。次に、対応するヌクレオチド（又はアミノ酸）位置でのヌクレオチド（又はアミノ酸残基）が比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じ残基によって占められる場合、これらの分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり（すなわちパーセント（％）相同性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）、任意選択的に導入されるギャップの数及び／又は導入されるギャップの長さに関してスコアにペナルティーを課す。
【０１１０】
配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。一実施形態では、アラインメントは、低い程度の同一性を有する部分（すなわち局所的アラインメント）に対してではなく、十分な同一性を有して整列された配列の特定の部分に対して発生した。配列の比較のために利用される局所的アラインメントアルゴリズムの例示的な非限定的例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７の場合のように修飾された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。
【０１１１】
別の実施形態では、アラインメントは、適切なギャップを導入することによって最適化され、同一性パーセントは、整列された配列の長さに対して決定される（すなわちギャップ付きアラインメント）。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るため、ギャップ付きＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２において記載されるとおりに利用され得る。別の実施形態では、アラインメントは、適切なギャップを導入することによって最適化され、同一性パーセントは、整列された配列の全長に対して決定される（すなわちグローバルアラインメント）。配列のグローバル比較のために利用される数学的アルゴリズムの例示的な非限定的例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティー及び４のギャップペナルティーが使用され得る。
【０１１２】
３．ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖又はガイド鎖は、ルーチン的に、センス鎖と同じ長さであり、且つ相補的ヌクレオチドを含む。一実施形態において、ｓｉＲＮＡの鎖は、４〜１５、例えば４、５、６又は７ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するように対形成される。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖又はガイド鎖は、センス鎖よりも長い。
【０１１３】
４．当技術分野において知られる任意の方法を使用して、適切なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラットなど）に対して潜在的な標的を比較し、他のコード配列と有意な相同性を有する任意の標的配列を考慮から除外する。そのような配列相同性検索のための１つのそのような方法は、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ウェブサイトで利用可能なＢＬＡＳＴとして知られる。
【０１１４】
５．評価のためのその判定基準を満たす１つ以上の配列を選択する。
【０１１５】
ｓｉＲＮＡの設計及び使用についてのさらなる一般的な情報は、Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｋａｌｉｓｈｅ  Ｃｈｅｍｉｅウェブサイトで利用可能な「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」において見出され得る。
【０１１６】
代わりに、ｓｉＲＮＡは、標的配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列（又はオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義され得る（例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１２〜１６時間の５０℃又は７０℃でのハイブリダイゼーション、続いて洗浄する）。追加の例示的なハイブリダイゼーション条件は、１ｘＳＳＣ中における７０℃若しくは１ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド中における５０℃でのハイブリダイゼーション後の０．３ｘＳＳＣ中における７０℃での洗浄又は４ｘＳＳＣ中における７０℃若しくは４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド中における５０℃でのハイブリダイゼーションに続く１ｘＳＳＣ中における６７℃での洗浄を含む。５０塩基対長より短いと予測されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低くあるべきであり、Ｔｍは、以下の式に従って決定される。１８塩基対長より短いハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８〜４９塩基対長のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、Ｎは、ハイブリッド中の塩基の数であり、且つ［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液（１ｘＳＳＣ＝０．１６５Ｍに関する［Ｎａ＋］）中のナトリウムイオンの濃度である。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件の追加の例は、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，９章及び１１章並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２．１０節及び６．３〜６．４節において提供される。
【０１１７】
陰性対照ｓｉＲＮＡは、選択されたｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、適切なゲノムに対して有意な配列相補性を有するべきではない。そのような陰性対照は、選択されたｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を無作為に混ぜることによって設計され得る。相同性検索は、陰性対照が適切なゲノムにおける任意の他の遺伝子に対する相同性を確実に欠くように実施され得る。加えて、陰性対照ｓｉＲＮＡは、１つ以上の塩基ミスマッチを配列に導入することによって設計され得る。
【０１１８】
６．ｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡ（例えば、野生型又は変異体標的ｍＲＮＡ）を破壊する有効性を検証するため、ｓｉＲＮＡは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を用いるインビトロｍＲＮＡ発現系において標的ｃＤＮＡとインキュベートされ得る。３２Ｐで放射標識された新たに合成された標的ｍＲＮＡは、アガロースゲル上でオートラジオグラフにより検出される。切断された標的ｍＲＮＡの存在は、ｍＲＮＡヌクレアーゼ活性を示す。好適な対照は、ｓｉＲＮＡの省略及び非標的ｃＤＮＡの使用を含む。代わりに、対照ｓｉＲＮＡは、選択されたｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、適切な標的遺伝子に対して有意な配列相補性を有しないように選択される。そのような陰性対照は、選択されたｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を無作為に混ぜることによって設計され得る。相同性検索は、陰性対照が適切なゲノムにおける任意の他の遺伝子に対する相同性を確実に欠くように実施され得る。加えて、陰性対照ｓｉＲＮＡは、１つ以上の塩基ミスマッチを配列に導入することによって設計され得る。
【０１１９】
修飾ヌクレオチド
一実施形態において、オリゴヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡは、１つ以上の化学修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、化学修飾ヌクレオチドからなる。特定の例示的な実施形態において、オリゴヌクレオチドの＞９０％、＞９８％、＞９７％、＞９６％、＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％又は＞５０％が化学修飾ヌクレオチドを含む。特定の例示的な実施形態において、オリゴヌクレオチドの１００％が化学修飾ヌクレオチドを含む。
【０１２０】
一実施形態において、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ１つ以上の化学修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドが化学修飾されている。一実施形態において、アンチセンス鎖は、２’−メトキシヌクレオチド及び２’−フルオロヌクレオチドを含む。一実施形態において、センス鎖は、２’−メトキシヌクレオチドを含む。一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の５’末端からの位置１及び２のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。一実施形態において、５’末端及び３’末端のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。
【０１２１】
送達及び分布
別の態様において、本明細書中で提供されるのは、患者において、本明細書中に記載される核酸を特定の器官に選択的に送達する方法であって、患者に、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドが選択的に送達されるように投与することを含む方法である。一実施形態において、器官は、肝臓である。別の実施形態において、器官は、腎臓である。別の実施形態において、器官は、脾臓である。別の実施形態において、器官は、心臓である。別の実施形態において、器官は、脳である。別の実施形態において、器官は、胎盤である。
【０１２２】
本明細書中に記載される組成物は、代謝的に安定化されたオリゴヌクレオチドの単純で効率的な非毒性の送達を促進し、且つ広範な組織内での治療標的の有力なサイレンシングをインビボで促進する。
【０１２３】
別の態様において、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載される化合物の、標的器官、組織又は細胞への選択的インビボ送達の方法であって、化合物を対象に投与することを含む方法である。
【０１２４】
一実施形態において、方法は、標的器官に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９９％選択的である、すなわち対象に投与されるオリゴヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９９％が標的器官に位置決めされる。
【０１２５】
特定の例示的な実施形態において、化合物又は医薬組成物は、静脈内注射、腹腔内注射、頭蓋内注射、髄腔内注射、線条体内注射又は脳室内注射によって投与される。特定の実施形態において、化合物又は医薬組成物は、脳室内注射によって投与される。
【０１２６】
合成オリゴヌクレオチドは、カチオンリポソームトランスフェクション及びエレクトロポレーションが挙げられる、当技術分野において知られている方法によって細胞中に送達することができる。標的遺伝子のより長い期間の抑制を得、且つ特定の状況下での送達を促進するために、１つ以上のオリゴヌクレオチドが細胞内で組換えＤＮＡ構築体から発現され得る。細胞内でのより長期の標的遺伝子抑制を可能にする、細胞内で組換えＤＮＡ構築体からオリゴヌクレオチド二重鎖、例えばｓｉＲＮＡ二重鎖を発現させるそのような方法は、当技術分野において知られており、哺乳動物Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータ系（例えば、機能的二本鎖ｓｉＲＮＡを発現することができるＨ１又はＵ６／ｓｎＲＮＡプロモータ系（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，２００２、前掲）；（Ｂａｇｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、前掲；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、前掲；Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、前掲；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、前掲；Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、前掲）が挙げられる。ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩによる転写終結がＤＮＡ鋳型内の４つの連続Ｔ残基のランにおいて起こって、ｓｉＲＮＡ転写産物を特定の配列において終わらせる機構を実現する。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の配列と５’−３’の向きに且つ３’−５’の向きに相補的であり、及びｓｉＲＮＡの２つの鎖は、同じ構築体又は別個の構築体において発現され得る。Ｈ１又はＵ６  ｓｎＲＮＡプロモータによって駆動されて、細胞内で発現されるヘアピンｓｉＲＮＡは、標的遺伝子発現を阻害することができる（Ｂａｇｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、前掲；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、前掲；Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、前掲；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、前掲；Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、前掲）。また、Ｔ７プロモータの制御下のｓｉＲＮＡ配列を含有する構築体は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｊａｃｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、前掲）を発現するベクターにより細胞中にコトランスフェクトされた場合、機能的ｓｉＲＮＡを形成する。単一の構築体は、標的をコードする遺伝子の複数の領域等、ｓｉＲＮＡをコードする複数の配列を含有して、同じ遺伝子又は複数の遺伝子を標的化し得、且つ例えば別々のＰｏｌ  ＩＩＩプロモータ部位によって駆動され得る。
【０１２７】
また、ウイルス媒介送達機構を用いて、例えばＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩプロモータ転写制御下のオリゴヌクレオチドを有する組換えアデノウイルスを生成することによる（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、前掲）、オリゴヌクレオチドの発現による標的遺伝子の特異的サイレンシングを誘導することができる。これらの組換えアデノウイルスによるＨｅＬａ細胞の感染により、内因性標的遺伝子発現が減弱し得る。オリゴヌクレオチドの標的遺伝子を発現するトランスジェニックマウス中への組換えアデノウイルスベクターの注入により、標的遺伝子発現がインビボで引き下げられる。同上。動物モデルにおいて、全胚エレクトロポレーションにより、合成ｓｉＲＮＡを移植後マウス胚中に効率的に送達することができる（Ｃａｌｅｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。成熟マウスにおいて、ｓｉＲＮＡの効率的な送達を「高圧」送達技術（尾静脈を介した動物中への大容量のオリゴヌクレオチド含有溶液の迅速な注入（５秒以内））によって達成することができる（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、前掲；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、前掲；Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。また、ナノ粒子及びリポソームを用いて、オリゴヌクレオチドを動物中に送達することができる。特定の例示的な実施形態において、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）及びその関連ベクターを用いて、１つ以上のｓｉＲＮＡを細胞中、例えば神経細胞（例えば、脳細胞）中に送達することができる（米国特許出願公開第２０１４／０２９６４８６号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１８６１０３号明細書、米国特許出願公開第２００８／０２６９１４９号明細書、米国特許出願公開第２００６／００７８５４２号明細書及び米国特許出願公開第２００５／０２２０７６６号明細書）。
【０１２８】
一実施形態において、本明細書中で提供されるオリゴヌクレオチドは、１、２又は３つの非２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、及び少なくとも８５％が２’−Ｏ−メチル修飾されているアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡである。特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、２’−メトキシ−ヌクレオチド及び２’−フルオロ−ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、２’−メトキシ−ヌクレオチド及び２’−デオキシヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、２’−メトキシ−ヌクレオチド及び２’−ＯＨヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、完全に化学修飾されており、アンチセンス鎖の５’末端からの位置２及び１４及び任意選択的に位置２０以外、全ての位置に２’−メトキシ−ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、完全に化学修飾されており、アンチセンス鎖内において、アンチセンス鎖の５’末端からの位置２、１４及び任意選択的に２０以外、全ての位置に２’−メトキシ−ヌクレオチドを、且つセンス鎖内において、全ての位置に２’−メトキシヌクレオチドを含む。任意選択的に、アンチセンス鎖の位置２及び１４及び任意選択的に位置２０が２’−フルオロ修飾されている。
【０１２９】
一実施形態において、本明細書中で提供されるオリゴヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている１つ以上のヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡである。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端からの位置１及び２のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端からの位置１〜７のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端からの位置１〜８のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。特定の実施形態において、センス鎖の５’末端からの位置１、２及び３のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。特定の実施形態において、センス鎖の３’末端からの位置１、２及び３のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。特定の実施形態において、センス鎖の５’末端からの位置１及び２のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。特定の実施形態において、センス鎖の３’末端からの位置１及び２のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。
【０１３０】
本明細書中で提供される二本鎖ＲＮＡの一実施形態において、
（１）第１のオリゴヌクレオチドは、完全に化学修飾されており、アンチセンス鎖の５’末端からの位置２及び１４及び任意選択的に位置２０以外、全ての位置に２’−メトキシ−ヌクレオチドを含み；
（２）第２のオリゴヌクレオチドは、完全に化学修飾されており、センス鎖の全ての位置に２’−メトキシ−ヌクレオチドを含み；
（３）第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合を介して連結されており、５’末端からの位置１〜２及び／又は３’末端からの位置１〜８のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されており；及び
（４）第２のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合を介して連結されており、３’末端からの位置１、２及び３並びに／又は３’末端からの位置１、２及び３のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。
【０１３１】
二本鎖ＲＮＡの一実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドよりもリボヌクレオチドが３〜７個多い。
【０１３２】
一実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖であり、及び第２のオリゴヌクレオチドは、センス鎖である。
【０１３３】
修飾オリゴヌクレオチド
本発明のある種の態様では、本明細書に記載される本発明のＲＮＡサイレンシング剤（又はその任意の部分）、例えばｓｉＲＮＡは、ＲＮＡサイレンシング剤の活性がさらに改善されるように修飾され得る。例えば、上記のＲＮＡサイレンシング剤は、本明細書に記載される修飾のいずれかで修飾され得る。修飾は、部分的には、標的の識別をさらに高めること、薬剤の安定性を高めること（例えば、分解を防止すること）、細胞内取込みを促進すること、標的効率を高めること、結合（例えば、標的に対する）の効力を改善すること、薬剤に対する患者の耐性を改善すること及び／又は毒性を低減することに役立ち得る。
【０１３４】
１）標的の識別を高める修飾
ある種の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、単一ヌクレオチドの標的識別を高める不安定化ヌクレオチドで置換され得る（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、２００７年１月２５日に出願された米国特許出願公開第１１／６９８，６８９号明細書、２００６年１月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／７６２，２２５号明細書及び２０１９年８月９日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第１９／４６０１３号明細書を参照されたい）。このような修飾は、非標的ｍＲＮＡ（例えば、野生型ｍＲＮＡ）に対するオリゴヌクレオチドの特異性を消失させるのに十分であり得るが、標的ｍＲＮＡ（例えば、機能獲得変異体ｍＲＮＡ）に対するオリゴヌクレオチドの特異性に認識できるほどに影響を及ぼさない。
【０１３５】
ある種の例示的な実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、そのアンチセンス鎖中の少なくとも１つのユニバーサルヌクレオチドの導入によって修飾される。ユニバーサルヌクレオチドは、４つの通常のヌクレオチド塩基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）のいずれかと無差別に塩基対形成できる塩基部分を含む。ユニバーサルヌクレオチドは、通常、それがＲＮＡ二本鎖又はＲＮＡサイレンシング剤及び標的ｍＲＮＡのガイド鎖によって形成される二本鎖の安定性に対して相対的に低い効果を有するため、特に好適である。例示的なユニバーサルヌクレオチドとしては、デオキシイノシン（例えば、２’−デオキシイノシン）、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２’−アザ−２’−デオキシイノシン、ＰＮＡ−イノシン、モルホリノ−イノシン、ＬＮＡ−イノシン、ホスホロアミダート−イノシン、２’−Ｏ−メトキシエチル−イノシン及び２’−ＯＭｅ−イノシンからなる群から選択されるイノシン塩基部分又はイノシン類似体塩基部分を有するものが挙げられる。特定の例示的な実施形態では、ユニバーサルヌクレオチドは、イノシン残基又は天然に存在するその類似体である。
【０１３６】
特定の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチド（すなわち疾患に関連する多型を認識するヌクレオチド）から５ヌクレオチド以内への少なくとも１つの不安定化ヌクレオチドの導入によって修飾される。例えば、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから５、４、３、２又は１ヌクレオチド以内の位置に導入され得る。例示的な実施形態において、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから３ヌクレオチドの位置に（すなわち不安定化ヌクレオチドと特異性決定ヌクレオチドとの間に２つの安定化ヌクレオチドがあるように）導入される。２つの鎖又は鎖部分（例えば、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ）を有するＲＮＡサイレンシング剤において、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドを含有しない鎖又は鎖部分内に導入され得る。特定の例示的な実施形態において、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドを含有する同じ鎖又は鎖部分内に導入される。
【０１３７】
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、特異性決定ヌクレオチドから１１ヌクレオチド以内（例えば、疾患関連多型（例えば、ＳＮＰ位置ヌクレオチド）を認識するヌクレオチドから１１ヌクレオチド以内）での少なくとも１つの不安的化ヌクレオチドの導入によって修飾される。例えば、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ヌクレオチド以内にある位置で導入され得る。例示的な実施形態では、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから３ヌクレオチドにある位置で導入される（すなわち不安定化ヌクレオチド及び特異性決定ヌクレオチド間に２つの安定化ヌクレオチドが存在するように）。２つの鎖又は鎖部分（例えば、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ）を有するＲＮＡサイレンシング剤において、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドを含有しない鎖又は鎖部分において導入され得る。特定の例示的な実施形態では、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドを含有する同じ鎖又は鎖部分において導入される。
【０１３８】
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、式１：
【化１】
2021533804.tif 000003
（式中、
Ｄは、Ｏ、ＯＣＨ２、ＯＣＨ、ＣＨ２及びＣＨからなる群から選択され；
Ｃは、Ｏ−、ＯＨ、ＯＲ１、ＮＨ−、ＮＨ２、Ｓ−及びＳＨからなる群から選択され；
Ａは、Ｏ及びＣＨ２からなる群から選択され；
Ｒ１は、保護基であり；
【化２】
2021533804.tif 000004
は、任意選択的な二重結合であり；及び
サブユニット間は、２つの任意選択的に修飾されたヌクレオシドを架橋している）
の修飾されたサブユニット間結合の導入によって修飾される。
【０１３９】
ある実施形態では、Ｃは、Ｏ−であり、Ａ又はＤのいずれかは、Ｏではない。
【０１４０】
ある実施形態では、Ｄは、ＣＨ２である。
【０１４１】
一実施形態において、Ｄは、Ｏである。
【０１４２】
一実施形態において、Ｄは、ＯＣＨ２である。
【０１４３】
別の実施形態では、式ＶＩＩＩの修飾されたサブユニット間結合は、式２：
【化３】
2021533804.tif 000005
の修飾されたサブユニット間結合である。
【０１４４】
別の実施形態では、式ＶＩＩＩの修飾されたサブユニット間結合は、式３：
【化４】
2021533804.tif 000006
の修飾されたサブユニット間結合である。
【０１４５】
別の実施形態では、式ＶＩＩＩの修飾されたサブユニット間結合は、式４：
【化５】
2021533804.tif 000007
の修飾されたサブユニット間結合である。
【０１４６】
別の実施形態では、修飾されたサブユニット間結合は、式５：
【化６】
2021533804.tif 000008
の修飾されたサブユニット間結合である。
【０１４７】
別の実施形態では、修飾されたサブユニット間結合は、式６：
【化７】
2021533804.tif 000009
の修飾されたサブユニット間結合である。
【０１４８】
別の実施形態では、式ＶＩＩの修飾されたサブユニット間結合は、式７：
【化８】
2021533804.tif 000010
の修飾されたサブユニット間結合である。
【０１４９】
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、図１４のサブユニット間リンカーの１つ以上の導入によって修飾される。例示的な実施形態では、図１４のサブユニット間リンカーは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドと、アンチセンス鎖のＳＮＰ位置ヌクレオチドに直接的に隣接し、且ついずれかの側の位置にあるヌクレオチドとの間に挿入される。
【０１５０】
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、以下の式：
【化９】
2021533804.tif 000011
を有するサブユニット間リンカーにおける１つ以上のビニルホスホネート（ＶＰ）モチーフの導入によって修飾される。
【０１５１】
ある種の実施形態では、ＶＰモチーフは、オリゴヌクレオチド、例えばＲＮＡの任意の位置で挿入される。例えば、２０ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドに関して、ＶＰモチーフは、位置１−２、２−３、３−４、４−５、５−６、６−７、７−８、８−９、９−１０、１０−１１、１１−１２、１２−１３、１３−１４、１４−１５、１５−１６、１６−１７、１７−１８、１８−１９又は１９−２０及びこれらの任意の組合せで挿入され得る。
【０１５２】
ある種の例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、アンチセンス鎖の位置１−２、５−６、６−７、１０−１１、１８−１９及び／又は１９−２０の１つ以上で挿入される。
【０１５３】
他の例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、アンチセンス鎖の位置１−２、６−７、１０−１１及び／又は１９−２０の１つ以上で挿入される。
【０１５４】
例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、アンチセンス鎖のＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣（すなわちＳＮＰ位置ヌクレオチドと、それに直接的に隣接し、且ついずれかの側の位置にあるヌクレオチドとの間）に挿入される。別の例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、アンチセンス鎖のＭＭ位置ヌクレオチドの隣（すなわちＭＭ位置ヌクレオチドと、それに直接的に隣接し、且ついずれかの側の位置にあるヌクレオチドとの間）に挿入される。
【０１５５】
２）効力及び特異性を高める修飾
ある種の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡは、非対称設計規則に従ってＲＮＡｉを媒介する効力及び特異性の増強を促進するように改変され得る（米国特許第８，３０９，７０４号明細書、同第７，７５０，１４４号明細書、同第８，３０４，５３０号明細書、同第８，３２９，８９２号明細書及び同第８，３０９，７０５号明細書を参照されたい）。そのような改変は、センス鎖に有利なようにｓｉＲＮＡ（例えば、本発明の方法を使用して設計されたｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡから生成されたｓｉＲＮＡ）のアンチセンス鎖のＲＩＳＣへの侵入を促進し、その結果、アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡの切断又は翻訳抑制を優先的に誘導し、したがって標的切断及びサイレンシングの効率を増大させるか又は改善する。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤の非対称は、ＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖５’末端（ＡＳ５’）とセンス鎖３’末端（Ｓ３’）との間の塩基対強度を、前記サイレンシング剤のアンチセンス鎖３’末端（ＡＳ３’）とセンス鎖５’末端（Ｓ’５）との間の結合強度又は塩基対強度に対して低下させることによって高められる。
【０１５６】
一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡの非対称は、第１又はアンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖部分の５’末端との間より、第１又はアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間でＧ：Ｃ塩基対が少なくなるように高められ得る。別の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称は、第１又はアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間に少なくとも１つのミスマッチ塩基対があるように高められ得る。ある種の例示的な実施形態では、ミスマッチ塩基対は、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ及びＵ：Ｕからなる群から選択される。他の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡの非対称は、第１又はアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間に少なくとも１つのゆらぎ塩基対、例えばＧ：Ｕがあるように高められ得る。他の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称は、希少ヌクレオチド、例えばイノシン（Ｉ）を含む少なくとも１つの塩基対があるように高められ得る。ある種の例示的な実施形態では、塩基対は、Ｉ：Ａ、Ｉ：Ｕ及びＩ：Ｃからなる群から選択される。さらに別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡの非対称は、修飾ヌクレオチドを含む少なくとも１つの塩基対があるように高められ得る。ある種の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２−アミノ−Ｇ、２−アミノ−Ａ、２，６−ジアミノ−Ｇ及び２，６−ジアミノ−Ａからなる群から選択される。
【０１５７】
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、以下の式：
【化１０】
2021533804.tif 000012
を有するＶＰモチーフの導入によってオリゴヌクレオチドにおける１つ以上のサブユニット間結合で改変される。
【０１５８】
３）安定性の増強を有するＲＮＡサイレンシング剤
本明細書に記載されるＲＮＡサイレンシング剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、細胞培養のための血清又は増殖培地における安定性を改善するようにさらに修飾され得る。安定性を増強するため、３’残基は、分解に対して安定化され得、例えば、それらは、プリンヌクレオチド、特にアデノシン又はグアノシンヌクレオチドからなるように選択され得る。代わりに、修飾された類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば２’−デオキシチミジンによるウリジンの置換は、許容され、且つＲＮＡ干渉の効率に影響を及ぼさない。
【０１５９】
例示的な態様では、本発明は、対応する未修飾のＲＮＡサイレンシング剤と比較してインビボでの安定性が増強されるような、第２の鎖及び／又は第１の鎖が、内部ヌクレオチドの修飾ヌクレオチドによる置換によって修飾される第１及び第２の鎖を含むＲＮＡサイレンシング剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）を特徴とする。本明細書で定義されるとおり、「内部」ヌクレオチドは、核酸分子、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端以外の任意の位置に存在するものである。内部ヌクレオチドは、一本鎖分子内又は二本鎖又は二重鎖分子の鎖内に存在し得る。一実施形態では、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、少なくとも１つの内部ヌクレオチドの置換によって修飾される。別の実施形態では、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個以上の内部ヌクレオチドの置換によって修飾される。別の実施形態では、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、内部ヌクレオチドの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の置換によって修飾される。さらに別の実施形態では、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、内部ヌクレオチドの全ての置換によって修飾される。
【０１６０】
本発明の例示的な実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド類似体を含有し得る。ヌクレオチド類似体は、標的特異的サイレンシング活性、例えばＲＮＡｉ媒介性活性又は翻訳抑制活性が例えばＲＮＡサイレンシング剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）の５’末端及び／又は３’末端の領域において実質的に生じない位置に位置し得る。特に、末端は、修飾されたヌクレオチド類似体を組み込むことによって安定化され得る。
【０１６１】
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、以下の式：
【化１１】
2021533804.tif 000013
を有するＶＰモチーフの導入によってオリゴヌクレオチドにおける１つ以上のサブユニット間結合で改変される。
【０１６２】
様々なオリゴヌクレオチド型（例えば、ギャップマー、ミックスマー、ｍｉＲＮＡ阻害剤、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（「ＳＳＯ」）、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴヌクレオチド（「ＰＭＯ」）、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」）など）は、任意選択的に、修飾（例えば、化学修飾）並びに／又は本明細書及び例えば各々が全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第１５／０８９，４２３号明細書；米国特許出願公開第１５／２３６，０５１号明細書；米国特許出願公開第１５／４１９，５９３号明細書；米国特許出願公開第１５／６９７，１２０号明細書及び米国特許第９，８０９，８１７号明細書；及び米国特許出願公開第１５／８１４，３５０号明細書及び米国特許第９，８６２，３５０号明細書において記載されるコンジュゲートの様々な組合せを利用して、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドにおいて使用され得る。
【０１６３】
例示的なヌクレオチド類似体としては、糖及び／又は骨格修飾リボヌクレオチド（すなわちホスフェート−糖骨格に対する修飾を含む）が挙げられる。例えば、天然のＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素又は硫黄ヘテロ原子の少なくとも１つを含むように修飾され得る。例示的な骨格修飾リボヌクレオチドにおいて、隣接リボヌクレオチドに連結するホスホジエステル基は、修飾基、例えばホスホチオエート基によって置き換えられる。例示的な糖−修飾リボヌクレオチドにおいて、２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２又はＯＮから選択される基によって置き換えられ、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、及びハロは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである。特定の例示的な実施形態に従う適切な糖の修飾の例が図２に示されている。
【０１６４】
特定の実施形態では、修飾は、２’−フルオロ、２’−アミノ及び／又は２’−チオ修飾である。特定の例示的な修飾としては、２’−フルオロ−シチジン、２’−フルオロ−ウリジン、２’−フルオロ−アデノシン、２’−フルオロ−グアノシン、２’−アミノ−シチジン、２’−アミノ−ウリジン、２’−アミノ−アデノシン、２’−アミノ−グアノシン、２，６−ジアミノプリン、４−チオ−ウリジン及び／又は５−アミノ−アリル−ウリジンが挙げられる。特定の実施形態では、２’−フルオロリボヌクレオチドは、あらゆるウリジン及びシチジンである。追加の例示的な修飾としては、５−ブロモ−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、５−メチル−シチジン、リボ−チミジン、２−アミノプリン、２’−アミノ−ブチリル−ピレン−ウリジン、５−フルオロ−シチジン及び５−フルオロ−ウリジンが挙げられる。２’−デオキシ−ヌクレオチド及び２’−Ｏｍｅヌクレオチドも本発明の修飾ＲＮＡサイレンシング剤中で使用され得る。追加の修飾残基としては、デオキシ−脱塩基、イノシン、Ｎ３−メチル−ウリジン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン、プソイドウリジン、プリンリボヌクレオシド及びリバビリンが挙げられる。ある種の例示的な実施形態では、２’部分は、連結部分が２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドであるようにメチル基である。
【０１６５】
例示的な実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡサイレンシング剤は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。ＬＮＡは、ヌクレアーゼ活性に抵抗し（高度に安定である）、且つｍＲＮＡのための単一ヌクレオチド識別を有する糖修飾ヌクレオチドを含む（Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（２００５），３３（１）：４３９−４４７；Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：７９６７−７９７５，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：７４−８１）。これらの分子は、２’−デオキシ−２’’−フルオロウリジンなどの可能な修飾とともに２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸を有する。さらに、ＬＮＡは、糖部分を３’−エンド立体構造に限定し、それにより塩基対形成のためにヌクレオチドを事前に構築し、且つ１塩基当たり１０℃もオリゴヌクレオチドの融解温度を上昇させることにより、オリゴヌクレオチドの特異性を増大させる。
【０１６６】
別の例示的な実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡサイレンシング剤は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ＰＮＡは、ヌクレオチドの糖−ホスフェート部分がヌクレアーゼ消化に対して高度に抵抗性であり、且つ分子への結合特異性の改善を施すポリアミド骨格を形成できる中性２−アミノエチルグリシン部分と置き換えられる修飾ヌクレオチドを含む（Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２００１），２５４：１４９７−１５００）。
【０１６７】
核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち天然に存在する核酸塩基の代わりに少なくとも１つの天然に存在しない核酸塩基を含有するリボヌクレオチドも例示される。塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性を遮断するように修飾され得る。例示的な修飾核酸塩基としては、５位で修飾されたウリジン及び／又はシチジン、例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシン及び／又はグアノシン、例えば８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシン；Ｏ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンが挙げられ、好適であるが、これらに限定されない。上記の修飾が組み合わせられ得ることが留意されるべきである。
【０１６８】
他の実施形態では、架橋は、ＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態を改変する、例えば体内での半減期を増大させるために利用され得る。したがって、本発明は、核酸の２つの相補鎖を有するＲＮＡサイレンシング剤を含み、２つの鎖は、架橋される。本発明は、別の部分（例えば、ペプチドなどの非核酸部分）、有機化合物（例えば、色素）などに（例えば、その３’末端で）コンジュゲートされるか又はコンジュゲートされないＲＮＡサイレンシング剤も含む。このようにしてｓｉＲＮＡ誘導体を修飾することは、対応するｓｉＲＮＡと比較して、得られるｓｉＲＮＡ誘導体の細胞内取込みを改善するか若しくは細胞における標的化活性を増強する場合があるか、細胞内でのｓｉＲＮＡ誘導体の追跡に有用であるか、又は対応するｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡ誘導体の安定性を改善する。
【０１６９】
他の例示的な修飾としては、（ａ）２’修飾、例えばセンス鎖又はアンチセンス鎖、特にセンス鎖上のＵ上での２’ＯＭｅ部分の提供又は３’オーバーハングでの２’ＯＭｅ部分の提供、例えば３’末端で（３’末端は、分子の３’原子又は最も３’の部分、例えば文脈によって示されるとおり最も３’のＰ又は２’位を意味する）；（ｂ）骨格の修飾、例えばホスフェート骨格におけるＯのＳによる置換を有する、例えばＵ若しくはＡ若しくはその両方でのホスホロチオエート修飾の提供、特にアンチセンス鎖上；例えば、ＰのＳによる置換を有する；（ｃ）ＵのＣ５アミノリンカーによる置換；（ｄ）ＡのＧによる置換（特定の実施形態では、配列変化は、アンチセンス鎖ではなく、センス鎖上に位置する）；及び（ｄ）２’、６’、７’又は８’位での修飾が挙げられる。例示的な実施形態は、これらの修飾の１つ以上が、アンチセンス鎖ではなく、センス鎖上に存在するものであるか、又はアンチセンス鎖がより少ないそのような修飾を有する実施形態である。さらに他の例示的な修飾としては、３’オーバーハング、例えば３’末端におけるメチル化Ｐの使用；２’修飾の組合せ、例えば２’ＯＭｅ部分及び骨格の修飾の提供、例えばＰのＳによる置換を有する、例えばホスホロチオエート修飾の提供又は３’オーバーハング、例えば３’末端でのメチル化Ｐの使用；３’アルキルによる修飾；３’オーバーハング、例えば３’末端での脱塩基ピロリドンによる修飾；ナプロキセン、イブプロフェン又は３’末端で分解を阻害する他の部分による修飾が挙げられる。
【０１７０】
４）細胞取込みを高める修飾
他の実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡサイレンシング剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、例えば、標的細胞（例えば、神経細胞）による細胞取込みを増強するために化学部分で修飾され得る。したがって、本発明は、別の部分（例えば、ペプチドなどの非核酸部分）、有機化合物（例えば、色素）などに（例えば、その３’末端で）コンジュゲートされるか又はコンジュゲートされないｓｉＲＮＡを含む。コンジュゲーションは、例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．：４７（１），９９−１１２（２００１）（ポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）ナノ粒子にロードされた核酸を記載する）；Ｆａｔｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５３（１−３）：１３７−４３（１９９８）（ナノ粒子に結合された核酸を記載する）；Ｓｃｈｗａｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．５  Ｓｕｐｐｌ．４：５５−８（１９９４）（挿入剤、疎水性基、ポリカチオン又はＰＡＣＡナノ粒子に連結された核酸を記載する）；及びＧｏｄａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２（２）：４０４−１０（１９９５）（ナノ粒子に連結された核酸を記載する）の方法を使用して、当技術分野において知られる方法によって行われ得る。
【０１７１】
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤に対する修飾は、オリゴヌクレオチドの１つ以上のサブユニット間リンカーにおいてＶＰモチーフを含み、ＶＰモチーフは、以下の式：
【化１２】
2021533804.tif 000014
を有する。
【０１７２】
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、親油性部分にコンジュゲートされる。一実施形態では、親油性部分は、カチオン性基を含むリガンドである。別の実施形態では、親油性部分は、ｓｉＲＮＡの一方又は両方の鎖に結合される。例示的な実施形態では、親油性部分は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の一方の末端に結合される。別の例示的な実施形態では、親油性部分は、センス鎖の３’末端に結合される。ある種の実施形態では、親油性部分は、コレステロール、ビタミンＤ、ＤＨＡ、ＤＨＡｇ２（ＰＣ  ＤＨＡ）、ＤＣＡ、ＤＣＡｇ２（ＰＣ  ＤＣＡ）、ＥＰＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＡ、葉酸又はカチオン性色素（例えば、Ｃｙ３）からなる群から選択される。
【０１７３】
５）テザーリガンド
他の要素が本発明のＲＮＡサイレンシング剤に繋ぎ止められ得る。例えば、安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織若しくは細胞型への標的化又は細胞透過性を、例えばエンドサイトーシス依存的又は非依存的機構によって改善するためにＲＮＡサイレンシング剤に繋ぎ止められたリガンドである。リガンド及び関連する修飾はまた、配列特異性を増大させることができ、結果的にオフサイト標的化を減少させることができる。テザーリガンドは、干渉物質として機能できる１つ以上の修飾塩基又は糖を含み得る。ある種の例示的な実施形態では、これらは、ＲＮＡサイレンシング剤／標的二本鎖のバルジなどの内部領域に位置する。干渉物質は、芳香族、例えば多環式芳香族又は複素環式芳香族化合物であり得る。多環式干渉物質は、スタッキング能を有することができ、且つ２、３又は４つの縮合環を有する系を含むことができる。本明細書に記載されるユニバーサル塩基がリガンド上に含まれ得る。一実施形態では、リガンドは、標的核酸の切断によって標的遺伝子阻害に寄与する切断基を含み得る。切断基は、例えば、ブレオマイシン（例えば、ブレオマイシン−Ａ５、ブレオマイシン−Ａ２又はブレオマイシン−Ｂ２）、ピレン、フェナントロリン（例えば、Ｏ−フェナントロリン）、ポリアミン、トリペプチド（例えば、ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｌｙｓトリペプチド）又は金属イオンキレート化基であり得る。金属イオンキレート化基は、Ｌｕ（ＩＩＩ）などの遊離金属イオンによるバルジの部位での標的ＲＮＡの選択的切断を促進できる、例えばＬｕ（ＩＩＩ）又はＥＵ（ＩＩＩ）大環状錯体、Ｚｎ（ＩＩ）  ２，９−ジメチルフェナントリン誘導体、Ｃｕ（ＩＩ）テルピリジン又はアクリジンを含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリガンドは、標的ＲＮＡの、例えばバルジ領域での切断を促進するＲＮＡサイレンシング剤に繋ぎ止められ得る。例えば、１，８−ジメチル−１，３，６，８，１０，１３−ヘキサアザシクロテトラデカン（サイクラム）は、標的ＲＮＡ切断を促進するペプチドに（例えば、アミノ酸誘導体によって）コンジュゲートされ得る。テザーリガンドは、ハイブリダイゼーション特性の改善又は配列特異性の改善を有するＲＮＡサイレンシング剤をもたらし得るアミノグリコシドリガンドであり得る。例示的なアミノグリコシドとしては、グリコシル化ポリリジン、ガラクトシル化ポリリジン、ネオマイシンＢ、トブラマイシン、カナマイシンＡ並びにネオ−Ｎ−アクリジン、ネオ−Ｓ−アクリジン、ネオ−Ｃ−アクリジン、トブラ−Ｎ−アクリジン及びカナＡ−Ｎ−アクリジンなどのアミノグリコシドのアクリジンコンジュゲートが挙げられる。アクリジン類似体の使用は、配列特異性を増大させることができる。例えば、ネオマイシンＢは、ＤＮＡと比較してＲＮＡについて高い親和性を有するが、配列特異性が低い。アクリジン類似体であるネオ−５−アクリジンは、ＨＩＶ  Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）についての親和性の増大を有する。いくつかの実施形態では、アミノグリコシドリガンドのグアニジン類似体（グアニジノグリコシド）は、ＲＮＡサイレンシング剤に繋ぎ止められる。グアニジノグリコシドにおいて、アミノ酸上のアミン基は、グアニジ��基と交換される。グアニジン類似体の結合は、ＲＮＡサイレンシング剤の細胞透過性を増強することができる。テザーリガンドは、オリゴヌクレオチド剤の細胞取込みを増強できるポリ−アルギニンペプチド、ペプトイド又はペプチド模倣体であり得る。
【０１７４】
例示的なリガンドは、介在性テザーを介して、典型的には共有結合的にリガンドコンジュゲート担体に直接的又は間接的に結合される。例示的な実施形態では、リガンドは、介在性テザーを介して担体に結合される。例示的な実施形態では、リガンドは、組み込まれるＲＮＡサイレンシング剤の分布、標的化又は寿命を改変する。例示的な実施形態では、リガンドは、例えば、そのようなリガンドを欠く種と比較して、選択された標的、例えば分子、細胞又は細胞型、区画、例えば細胞又は器官の区画、組織、器官又は体の領域に対する親和性の増強をもたらす。
【０１７５】
例示的なリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション及び特異性特性を改善することができ、且つ結果として生じる天然若しくは修飾ＲＮＡサイレンシング剤又は本明細書に記載される単量体及び／若しくは天然若しくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含むポリマー分子のヌクレアーゼ抵抗性も改善し得る。リガンドは、一般に、例えば取込みを増強するための治療的修飾因子；例えば、分布をモニタリングするための診断用化合物又はレポーター基；架橋剤；ヌクレアーゼ抵抗性付与部分；及び天然又は異例の核酸塩基を含み得る。一般的な例としては、親油性物質、脂質、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えばサルササポゲニン、フリーデリン、エピフリエデラノール誘導体化リトコール酸）、ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール）、炭水化物、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的化分子、ポリカチオン性物質、ペプチド、ポリアミン及びペプチド模倣体が挙げられる。リガンドは、天然に存在する物質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）又はグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン又はヒアルロン酸）；アミノ酸又は脂質を含み得る。リガンドは、合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸などの組換え又は合成分子でもあり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コグリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー又はポリホスファジンであるポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩又はアルファヘリックスペプチドが挙げられる。
【０１７６】
リガンドは、標的化基、例えば細胞又は組織標的化剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質、例えば腎臓細胞などの特定の細胞型に結合する抗体も含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパレート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン又はＲＧＤペプチド若しくはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えば、アクリジン及び置換アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン、フェナントロリン、ピレン）、ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｌｙｓトリペプチド、アミノグリコシド、グアニジウムアミノグリコシド、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えばコレステロール（及びそのチオ類似体）、コール酸、コラン酸、リトコール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、グリセロール（例えば、エステル（例えば、モノ、ビス又はトリス脂肪酸エステル、例えばＣ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９又はＣ２０脂肪酸）及びそのエーテル、例えばＣ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９又はＣ２０アルキル；例えば、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、１，３−ビス−Ｏ（オクタデシル）グリセロール）、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ステアリン酸（例えば、グリセリルジステアリン酸）、オレイン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル又はフェノキサジン）及びペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ナプロキセン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環状分子のＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ又はＡＰが挙げられる。
【０１７７】
リガンドは、タンパク質、例えば糖タンパク質又はペプチド、例えばコリガンド又は抗体、例えば癌細胞、内皮細胞又は骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体に対して特異的な親和性を有する分子であり得る。リガンドは、ホルモン及びホルモン受容体も含み得る。それらは、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、コファクター、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース又は多価フコースなどの非ペプチド性種も含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼの活性化因子又はＮＦ−κＢの活性化因子であり得る。
【０１７８】
リガンドは、細胞へのＲＮＡサイレンシング剤の取込みを、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、例えば細胞の微小管、マイクロフィラメント及び／又は中間径フィラメントを破壊することにより増大させることができる物質、例えば薬物であり得る。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン又はミオセルビンであり得る。リガンドは、例えば、炎症反応を活性化することにより、ＲＮＡサイレンシング剤の細胞への取込みを増大させることができる。そのような効果を有することになる例示的なリガンドは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、インターロイキン−１ベータ又はガンマインターフェロンを含む。
【０１７９】
一態様では、リガンドは、脂質又は脂質系分子である。そのような脂質又は脂質系分子は、通常、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。リガンドに結合するＨＳＡは、標的組織、例えば体の非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分布を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合できる他の分子もリガンドとして使用され得る。例えば、ネプロキシン又はアスピリンが使用され得る。脂質又は脂質系リガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する抵抗性を増大させることができ、（ｂ）標的細胞又は細胞膜への標的化又は輸送を増大させることができ、且つ／又は（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡへの結合を調整するために使用され得る。脂質系リガンドを使用して、標的組織へのコンジュゲートの結合を調節、例えば制御することができる。特定の実施形態では、脂質系リガンドは、ＨＳＡに結合する。しかしながら、ＨＳＡリガンド結合を元に戻すことができないほど親和性が強くないことが望まれる。別の例示的な実施形態では、脂質系リガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか又は決して結合しない。
【０１８０】
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば増殖性細胞によって取り入れられる部分、例えばビタミンである。これらは、例えば、悪性又は非悪性型、例えば癌細胞の望まれない細胞増殖によって特徴付けられる障害を治療するのに特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ及びＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、Ｂビタミン、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール又は癌細胞によって取り入れられる他のビタミン若しくは栄養素が挙げられる。ＨＳＡ及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
【０１８１】
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、典型的にはらせん状細胞透過剤である。ある種の例示的な実施形態では、薬剤は、両親媒性である。例示的な薬剤は、ｔａｔ又はアンテナペディアなどのペプチドである。薬剤がペプチドである場合、それは、修飾され得、ペプチド模倣体、逆転異性体、非ペプチド又はプソイドペプチド結合及びＤ−アミノ酸の使用を含む。らせん状薬剤は、通常、典型的には親油性面及び疎油性面を有するアルファヘリックス薬剤である。
【０１８２】
リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書でオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然のペプチドと同様に既定の三次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチド及びペプチド模倣体のオリゴヌクレオチド剤への結合は、細胞認識及び吸収を高めることによってなど、ＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチド又はペプチド模倣体部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０アミノ酸長であり得る。ペプチド又はペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド又は疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、規制ペプチド又は架橋ペプチドであり得る。ペプチド部分は、Ｌーペプチド又はＤ−ペプチドであり得る。別の選択肢において、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。ペプチド又はペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー又はｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリー（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４，１９９１）から同定されるペプチドなど、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る。例示的な実施形態では、組み込まれた単量体単位を介してＲＮＡサイレンシング剤に繋ぎ止められたペプチド又はペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド又はＲＧＤ模倣物などの細胞標的化ペプチドである。ペプチド部分は、約５アミノ酸から約４０アミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、例えば、安定性を増大させるか又は立体構造特性を誘導する構造修飾を有し得る。下記の構造修飾のいずれかが利用され得る。
【０１８３】
６）疎水性部分
本明細書で提供されるＲＮＡサイレンシング剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）のある種の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、１つ以上の疎水性部分にコンジュゲートされる（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／０３１９３３号パンフレットを参照されたい）。ある実施形態では、疎水性部分は、低密度リポタンパク質及び／又は中間密度リポタンパク質に対する親和性を有する。関連する実施形態では、疎水性部分は、３個未満の二重結合を有する飽和又は不飽和部分である。
【０１８４】
別の実施形態では、疎水性部分は、高密度リポタンパク質に対する親和性を有する。関連する実施形態では、疎水性部分は、３個以上の二重結合を有する（例えば、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の二重結合を有する）多価不飽和部分である。特定の実施形態では、疎水性部分は、３個の二重結合を有する多価不飽和部分である。特定の実施形態では、疎水性部分は、４個の二重結合を有する多価不飽和部分である。特定の実施形態では、疎水性部分は、５個の二重結合を有する多価不飽和部分である。特定の実施形態では、疎水性部分は、６個の二重結合を有する多価不飽和部分である。
【０１８５】
別の実施形態では、疎水性部分は、脂肪酸、ステロイド、セコステロイド、脂質、ガングリオシド及びヌクレオシド類似体並びにエンドカンナビノイドからなる群から選択される。
【０１８６】
別の実施形態では、疎水性部分は、神経調節性脂質、例えばエンドカンナビノイドである。エンドカンナビノイドの非限定的な例としては、アナンダミド、アラキドノイルエタノールアミン、２−アラキドノイルグリセリルエーテル（ノラジンエーテル）、２−アラキドノイルグリセリルエーテル（ノラジンエーテル）、２−アラキドノイルグリセロール及びＮ−アラキドノイルドーパミンが挙げられる。
【０１８７】
別の実施形態では、疎水性部分は、オメガ−３脂肪酸である。オメガ−３脂肪酸の非限定的な例としては、ヘキサデカトリエン酸（ＨＴＡ）、アルファ−リノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、ティムノドン酸）、ヘネイコサペンタエン酸（ＨＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、イワシ酸）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、セルボン酸）、テトラコサペンタエン酸及びテトラコサヘキサエン酸（ニシン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８８】
別の実施形態では、疎水性部分は、オメガ−６脂肪酸である。オメガ−６脂肪酸の非限定的な例としては、リノール酸、ガンマ−リノール酸（ＧＬＡ）、エイコサジエン酸、ジホモ−ガンマ−リノール酸（ＤＧＬＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸（オズボンド酸）、テトラコサテトラエン酸及びテトラコサペンタエン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
別の実施形態では、疎水性部分は、オメガ−９脂肪酸である。オメガ−９脂肪酸の非限定的な例としては、オレイン酸、エイコセン酸、ミード酸、エルカ酸及びネルヴォン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
別の実施形態では、疎水性部分は、コンジュゲートされたリノレン酸である。コンジュゲートされたリノレン酸の非限定的な例としては、α−カレンジン酸、β−カレンジン酸、ジャカル酸、α−エレオステアリン酸、β−エレオステアリン酸、カタルプ酸及びプニカ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９１】
別の実施形態では、疎水性部分は、飽和脂肪酸である。飽和脂肪酸の非限定的な例としては、カプリル酸、カプリン酸、ドコサン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸及びセロチン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９２】
別の実施形態では、疎水性部分は、ルメレン酸、α−パリナリン酸、β−パリナリン酸、ボセオペンタエン酸、ピノレン酸及びポドカルプ酸からなる群から選択される酸である。
【０１９３】
別の実施形態では、疎水性部分は、ドコサン酸（ＤＣＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、疎水性部分は、ドコサン酸（ＤＣＡ）である。別の特定の実施形態では、疎水性部分は、ＤＨＡである。別の特定の実施形態では、疎水性部分は、ＥＰＡである。
【０１９４】
別の実施形態では、疎水性部分は、セコステロイドである。特定の実施形態では、疎水性部分は、カルシフェロールである。別の実施形態では、疎水性部分は、コレステロール以外のステロイドである。
【０１９５】
特定の実施形態では、疎水性部分は、コレステロールではない。
【０１９６】
別の実施形態では、疎水性部分は、アルキル鎖、ビタミン、ペプチド又は生理活性コンジュゲートであり、スフィンゴ糖脂質、多価不飽和脂肪酸、セコステロイド、ステロイドホルモン又はステロール脂質を含むが、これらに限定されない。
【０１９７】
一実施形態において、本明細書中で提供されるオリゴヌクレオチドは、１つ以上の化学修飾ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡである。特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、２’−メトキシ−ヌクレオチド及び２’−フルオロ−ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、２’−メトキシ−ヌクレオチド及び２’−デオキシヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、２’−メトキシ−ヌクレオチド及び２’−リボースを含む。特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、完全に化学修飾されており、アンチセンス鎖の５’末端からの位置２及び１４以外、全ての位置に２’−メトキシ−ヌクレオチドを含む。
【０１９８】
一実施形態において、本明細書中で提供されるオリゴヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている１つ以上のヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡである。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端からの位置１及び２のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端からの位置１〜８のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。特定の実施形態において、センス鎖の５’末端からの位置１、２及び３のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。特定の実施形態において、センス鎖の３’末端からの位置１、２及び３のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。
【０１９９】
本明細書中で提供される二本鎖ＲＮＡの一実施形態において、
（１）第１のオリゴヌクレオチドは、完全に化学修飾されており、アンチセンス鎖の５’末端からの位置２及び１４以外、全ての位置に２’−メトキシ−ヌクレオチドを含み；
（２）は、完全に化学修飾されており、全ての位置に２’−メトキシ−ヌクレオチドを含み；
（３）第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合を介して連結されており、５’末端からの位置１〜２及び／又は３’末端からの位置１〜８のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されており；及び
（４）第２のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合を介して連結されており、３’末端からの位置１、２及び３並びに／又は３’末端からの位置１、２及び３のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。
【０２００】
二重鎖ＲＮＡの一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドより３〜７個多いリボヌクレオチドを有する。
【０２０１】
一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖であり、第２のオリゴヌクレオチドは、センス鎖である。
【０２０２】
７）分岐オリゴヌクレオチド
上で開示されるとおりの２つ以上のＲＮＡサイレンシング剤、例えばｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドコンストラクトは、リンカー、スペーサー及び分岐点から独立して選択される１つ以上の部分によって互いに連結され、それにより２つ以上のＲＮＡサイレンシング剤を含有する分岐オリゴヌクレオチドを形成し得る。図１５は、２つのｓｉＲＮＡを送達するための例示的なジ−ｓｉＲＮＡ二分岐骨格を示す。代表的な実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドの核酸は、それぞれアンチセンス鎖（又はその部分）を含み、アンチセンス鎖は、ヘテロ接合型一塩基多型に対する十分な相補性を有して、ＲＮＡに媒介されるサイレンシング機構（例えば、ＲＮＡｉ）を媒介する。他の実施形態では、アンチセンス転写物をサイレンシングするためのセンス鎖（又はその部分）を含む核酸を特徴とする分岐オリゴヌクレオチドの第２の型が提供され、センス鎖は、アンチセンス転写物に対する十分な相補性を有して、ＲＮＡに媒介されるサイレンシング機構を媒介する。さらなる実施形態では、両方の型の核酸、すなわちアンチセンス鎖（又はその部分）及びセンス鎖（又はその部分）を含むオリゴヌクレオチドを含む核酸を含む分岐オリゴヌクレオチドの第３の型が提供される。
【０２０３】
例示的な実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドは、リンカーを通して結合された２〜８個のＲＮＡサイレンシング剤を有し得る。リンカーは、疎水性であり得る。特定の実施形態では、本出願の分岐オリゴヌクレオチドは、２〜３個のオリゴヌクレオチドを有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、独立して、実質的な化学的安定化を有する（例えば、成分塩基の少なくとも４０％が化学的に修飾される）。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、完全な化学的安定化を有する（すなわち成分塩基の全てが化学的に修飾される）。いくつかの実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドは、それぞれ独立して２〜２０個のヌクレオチドを有する１つ以上の一本鎖ホスホロチオエートテールを含む。特定の実施形態では、各一本鎖テールは、８〜１０個のヌクレオチドを有する。
【０２０４】
ある種の実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドは、３つの特性によって特徴付けられる：（１）分岐構造、（２）完全な代謝安定化、及び（３）ホスホロチオエートリンカーを含む一本鎖テールの存在。特定の実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドは、２又は３つの分岐を有する。分岐構造の全体的なサイズの増大は、取込みの増加を促進すると考えられる。また、活性の特定の理論に束縛されることなく、複数の隣接する分岐（例えば、２又は３）は、各分岐に協同的に作用させ、したがって内部移行、輸送及び放出の速度を劇的に高めることができると考えられる。
【０２０５】
分岐オリゴヌクレオチドは、様々な構造的に多様な実施形態において提供される。図３６に示されるとおり、例えばいくつかの実施形態では、分岐点で結合された核酸は、一本鎖であり、且つｍｉＲＮＡ阻害剤、ギャップマー、ミックスマー、ＳＳＯ、ＰＭＯ又はＰＮＡからなる。これらの一本鎖は、それらの３’又は５’末端で結合され得る。ｓｉＲＮＡ及び一本鎖オリゴヌクレオチドの組合せも二重の機能のために使用され得る。別の実施形態では、ギャップマー、ミックスマー、ｍｉＲＮＡ阻害剤、ＳＳＯ、ＰＭＯ及びＰＮＡと相補的な短い核酸は、これらの活性一本鎖核酸を運び、且つ分布及び細胞内部移行を高めるために使用される。短い二本鎖領域は、分岐構造の細胞への内部移行時の迅速な解離のために低い融解温度（Ｔｍ  約３７℃）を有する。
【０２０６】
図１７に示されるとおり、ジ−ｓｉＲＮＡ分岐オリゴヌクレオチドは、化学的に多様なコンジュゲートを含み得る。コンジュゲートされた生理活性リガンドは、細胞特異性を高め、且つ膜会合、内部移行及び血清タンパク質結合を促進するために使用され得る。コンジュゲーションのために使用されることになる生理活性部分の例は、ＤＨＡｇ２、ＤＨＡ、ＧａｌＮＡｃ及びコレステロールを含む。これらの部分は、連結リンカー又はスペーサーのいずれかを通してジ−ｓｉＲＮＡに結合され得るか、又は別の遊離ｓｉＲＮＡ末端に結合された追加のリンカー又はスペーサーを介して付加され得る。
【０２０７】
分岐構造の存在は、同一の化学組成の非分岐化合物と比較して１００倍を超えて脳における組織保持のレベルを改善するが、これは、細胞保持及び分布の新しい機構を示唆している。分岐オリゴヌクレオチドは、予想外にも、脊髄及び脳全体にわたる均一な分布を有する。さらに、分岐オリゴヌクレオチドは、予想外にも、様々な組織への効率的な全身送達及び非常に高いレベルの組織蓄積を呈する。
【０２０８】
分岐オリゴヌクレオチドは、ＡＳＯ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤、スプライススイッチング、ＰＭＯ、ＰＮＡを含む様々な治療用核酸を含む。いくつかの実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドは、コンジュゲートされた疎水性部分をさらに含み、且つインビトロ及びインビボでの前例のないサイレンシング及び効力を呈する。
【０２０９】
リンカー
分岐オリゴヌクレオチドのある実施形態では、各リンカーは、独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミダート、エステル、アミド、トリアゾール又はこれらの組合せから選択され；リンカーのいずれかの炭素又は酸素原子は、任意選択的に、窒素原子と置き換えられるか、ヒドロキシル置換基を有するか、又はオキソ置換基を有する。一実施形態では、各リンカーは、エチレングリコール鎖である。別の実施形態では、各リンカーは、アルキル鎖である。別の実施形態では、各リンカーは、ペプチドである。別の実施形態では、各リンカーは、ＲＮＡである。別の実施形態では、各リンカーは、ＤＮＡである。別の実施形態では、各リンカーは、ホスフェートである。別の実施形態では、各リンカーは、ホスホネートである。別の実施形態では、各リンカーは、ホスホロアミダートである。別の実施形態では、各リンカーは、エステルである。別の実施形態では、各リンカーは、アミドである。別の実施形態では、各リンカーは、トリアゾールである。別の実施形態では、各リンカーは、図１７の式から選択される構造である。
【０２１０】
別の態様において、本明細書では、式（Ｉ）：
Ｌ−（Ｎ）ｎ  （Ｉ）
（式中、Ｌは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミダート、エステル、アミド、トリアゾール又はこれらの組合せから選択され、式（Ｉ）は、任意選択的に、１つ以上の分岐点Ｂ及び１つ以上のスペーサーＳをさらに含み；Ｂは、それぞれの存在に関して独立して、多価有機種又はその誘導体であり；Ｓは、それぞれの存在に関して独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミダート、エステル、アミド、トリアゾール又はこれらの組合せから選択され；Ｎは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡ二本鎖であり、アンチセンス鎖は、アレル多型を含む遺伝子の領域と実質的に相補的な相補性の領域を含み、アンチセンス鎖は、アレル多型と相補的である、５’末端から２〜７位にある一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチド；及び遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置するミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチドを含む）
の分岐オリゴヌクレオチド化合物が提供される。例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２、４又は６位にあり、及びミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置する。
【０２１１】
センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、１つ以上の化学修飾を含み；及びｎは、２、３、４、５、６、７又は８である。
【０２１２】
ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、表１の式（Ｉ−１）〜（Ｉ−９）から選択される構造を有する。
【０２１３】
【表１】
2021533804.tif 000015
【０２１４】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−１）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−２）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−３）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−４）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−５）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−６）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−７）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−８）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−９）である。
【０２１５】
式（Ｉ）の化合物のある実施形態では、各リンカーは、独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミダート、エステル、アミド、トリアゾール又はこれらの組合せから選択され；リンカーのいずれかの炭素又は酸素原子は、任意選択的に、窒素原子と置き換えられるか、ヒドロキシル置換基を有するか、又はオキソ置換基を有する。式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、各リンカーは、エチレングリコール鎖である。別の実施形態では、各リンカーは、アルキル鎖である。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、ペプチドである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、ＲＮＡである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、ＤＮＡである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、ホスフェートである。別の実施形態では、各リンカーは、ホスホネートである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、ホスホロアミダートである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、エステルである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、アミドである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、トリアゾールである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、図３６の式から選択される構造である。
【０２１６】
式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、Ｂは、多価有機種である。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、Ｂは、多価有機種の誘導体である。式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、Ｂは、トリオール又はテトラオール誘導体である。別の実施形態では、Ｂは、トリ−又はテトラ−カルボン酸誘導体である。別の実施形態では、Ｂは、アミン誘導体である。別の実施形態では、Ｂは、トリ−又はテトラ−アミン誘導体である。別の実施形態では、Ｂは、アミノ酸誘導体である。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、Ｂは、図１８の式から選択される。
【０２１７】
多価有機種は、炭素及び３つ以上の結合価を含む部分（すなわち上で定義されるとおりのＳ、Ｌ又はＮなどの部分との結合点）である。多価有機種の非限定的な例としては、トリオール（例えば、グリセロール、フロログルシノールなど）、テトラオール（例えば、リボース、ペンタエリスリトール、１，２，３，５−テトラヒドロキシベンゼンなど）、トリ−カルボン酸（例えば、クエン酸、１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸、トリメシン酸など）、テトラ−カルボン酸（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸、ピロメリト酸など）、三級アミン（例えば、トリプロパルギルアミン、トリエタノールアミンなど）、トリアミン（例えば、ジエチレントリアミンなど）、テトラミン並びにヒドロキシル、チオール、アミノ及び／又はカルボキシル部分の組合せを含む種（例えば、リジン、セリン、システインなどのアミノ酸）が挙げられる。
【０２１８】
式（Ｉ）の化合物のある実施形態では、各核酸は、１つ以上の化学修飾されたヌクレオチドを含む。式（Ｉ）の化合物のある実施形態では、各核酸は、化学修飾されたヌクレオチドからなる。式（Ｉ）の化合物のある種の実施形態では、各核酸の＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％又は＞５０％は、化学修飾されたヌクレオチドを含む。
【０２１９】
式（Ｉ）の化合物の特定の実施形態において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンス鎖）は、完全に安定化されているか又はほぼ完全に安定化されている。式（Ｉ）の化合物の特定の実施形態において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンス鎖）は、完全に安定化されているか又はほぼ完全に安定化されている。式（Ｉ）の化合物の特定の実施形態において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンス鎖）は、少なくとも８５％の２’−Ｏ−メチルを含む。式（Ｉ）の化合物の特定の実施形態において、各核酸は、少なくとも８５％の２’−Ｏ−メチルを含む。式（Ｉ）の化合物の特定の実施形態において、各核酸は、少なくとも９０％の２’−Ｏ−メチルを含む。式（Ｉ）の化合物の特定の実施形態において、各核酸は、少なくとも８５％の２’−Ｏ−メチルを含み、少なくとも１つのアンチセンス鎖又は各アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端からの位置２及び１４及び任意選択的に位置２０に非２’−Ｏ−メチルを含む。式（Ｉ）の化合物の特定の実施形態において、各核酸は、少なくとも８５％、９０％又は９５％の２’−Ｏ−メチルを含み、少なくとも１つのアンチセンス鎖又は各アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端からの位置２及び１４及び任意選択的に位置２０に非２’−Ｏ−メチルを含み、且つセンス鎖は、完全に２’−Ｏ−メチル修飾されている。
【０２２０】
一実施形態において、各アンチセンス鎖は、独立して、表２の基から選択される５’末端基Ｒを含む。
【０２２１】
【表２】
2021533804.tif 000016
【０２２２】
一実施形態では、Ｒは、Ｒ１である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ２である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ３である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ４である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ５である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ６である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ７である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ８である。
【０２２３】
式（ＩＩ）の構造
ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）：
【化１３】
2021533804.tif 000017
（式中、Ｘは、各存在に関して独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン及びその化学修飾された誘導体から選択され；Ｙは、各存在に関して独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン及びその化学修飾された誘導体から選択され；−は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し；＝は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し；及び−−−は、各存在に関して個別に、塩基対形成相互作用又はミスマッチを表す）
の構造である。
【０２２４】
ある種の実施形態では、式（ＩＩ）の構造は、ミスマッチを含有しない。一実施形態では、式（ＩＩ）の構造は、１個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、２個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、３個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、４個のミスマッチを含有する。ある実施形態では、各核酸は、化学修飾されたヌクレオチドからなる。
【０２２５】
特定の実施形態において、式（ＩＩ）の構造のＸの１００％、＞９５％、＞９０％又は＞８５％が化学修飾ヌクレオチドである。
【０２２６】
式（ＩＩＩ）の構造
ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩＩ）：
【化１４】
2021533804.tif 000018
（式中、
【化１５】
2021533804.tif 000019
は、各存在に関して独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；Ｘは、各存在に関して独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドであり；
【化１６】
2021533804.tif 000020
は、各存在に関して独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；及びＹは、各存在に関して独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドである）
の構造を有する。
【０２２７】
ある実施形態では、Ｘは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンからなる群から選択される。ある実施形態では、Ｘは、２’−Ｏ−メチル修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンからなる群から選択される。ある実施形態では、Ｙは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンからなる群から選択される。ある実施形態では、Ｙは、２’−Ｏ−メチル修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンからなる群から選択される。
【０２２８】
ある種の実施形態では、式（ＩＩＩ）の構造は、ミスマッチを含有しない。一実施形態では、式（ＩＩＩ）の構造は、１個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、２個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、３個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、４個のミスマッチを含有する。
【０２２９】
式（ＩＶ）の構造
ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＶ）：
【化１７】
2021533804.tif 000021
（式中、Ｘは、各存在に関して独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン及びその化学修飾された誘導体から選択され；Ｙは、各存在に関して独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン及びその化学修飾された誘導体から選択され；−は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し；＝は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し；及び−−−は、各存在に関して個別に、塩基対形成相互作用又はミスマッチを表す）
の構造を有する。
【０２３０】
ある種の実施形態では、式（ＩＶ）の構造は、ミスマッチを含有しない。一実施形態では、式（ＩＶ）の構造は、１個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、２個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、３個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、４個のミスマッチを含有する。ある実施形態では、各核酸は、化学修飾されたヌクレオチドからなる。
【０２３１】
特定の実施形態において、式（ＩＶ）の構造は、ミスマッチを含有しない。一実施形態において、式（ＩＶ）の構造は、１つのミスマッチを含有する。別の実施形態において、式（ＩＶ）の化合物は、２つのミスマッチを含有する。別の実施形態において、式（ＩＶ）の化合物は、３つのミスマッチを含有する。別の実施形態において、式（ＩＶ）の化合物は、４つのミスマッチを含有する。
【０２３２】
特定の実施形態において、式（ＩＶ）の構造のＸの１００％、＞９５％、＞９０％又は＞８５％が化学修飾ヌクレオチドである。
【０２３３】
式（Ｖ）の構造
ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｖ）：
【化１８】
2021533804.tif 000022
（式中、
【化１９】
2021533804.tif 000023
は、各存在に関して独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；Ｘは、各存在に関して独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドであり；
【化２０】
2021533804.tif 000024
は、各存在に関して独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；及びＹは、各存在に関して独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドである）
の構造を有する。
【０２３４】
ある種の実施形態では、Ｘは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンからなる群から選択される。ある実施形態では、Ｘは、２’−Ｏ−メチル修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンからなる群から選択される。ある実施形態では、Ｙは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンからなる群から選択される。ある実施形態では、Ｙは、２’−Ｏ−メチル修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンからなる群から選択される。
【０２３５】
一実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｖａ）の構造を有する。これは、Ｌ−［ｓｉＲＮＡ］ｎであり、ｓｉＲＮＡは、本明細書中に記載されるパターン１Ａ〜Ｆのいずれか１つ以上を有するｓｉＲＮＡを含む。特定の実施形態において、式（Ｖａ）の各ｓｉＲＮＡは、同一である。特定の実施形態において、式（Ｖａ）の各ｓｉＲＮＡは、同一でない。
【０２３６】
可変リンカー
式（Ｉ）の化合物のある実施形態では、Ｌは、Ｌ１：
【化２１】
2021533804.tif 000025
の構造を有する。
【０２３７】
Ｌ１のある実施形態では、Ｒは、Ｒ３であり、及びｎは、２である。
【０２３８】
式（ＩＩ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。式（ＩＩＩ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。式（ＩＶ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。式（Ｖ）又は（Ｖａ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。式（ＶＩ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。式（ＶＩ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。
【０２３９】
式（Ｉ）の化合物のある実施形態では、Ｌは、Ｌ２：
【化２２】
2021533804.tif 000026
の構造を有する。
【０２４０】
Ｌ２のある実施形態では、Ｒは、Ｒ３であり、及びｎは、２である。式（ＩＩ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。式（ＩＩＩ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。式（ＩＶ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。式（Ｖ）又は（Ｖａ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。式（ＶＩ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。式（ＶＩ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。
【０２４１】
１０）送達系
さらなる態様では、本明細書では、式（ＶＩ）：
Ｌ−（ｃＮＡ）ｎ  （ＶＩ）
（式中、Ｌは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミダート、エステル、アミド、トリアゾール又はこれらの組合せから選択され、式（ＶＩ）は、任意選択的に、１つ以上の分岐点Ｂ及び１つ以上のスペーサーＳをさらに含み；Ｂは、各存在に関して独立して、多価有機種又はその誘導体であり；Ｓは、各存在に関して独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミダート、エステル、アミド、トリアゾール又はその組合せから選択され；各ｃＮＡは、独立して、１つ以上の化学修飾を含む担体核酸であり；及びｎは、２、３、４、５、６、７又は８である）
の構造を有する治療用核酸のための送達系が提供される。
【０２４２】
送達系の一実施形態では、Ｌは、エチレングリコール鎖である。送達系の別の実施形態では、Ｌは、アルキル鎖である。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ペプチドである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ＲＮＡである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ＤＮＡである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ホスフェートである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ホスホネートである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ホスホロアミダートである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、エステルである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、アミドである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、トリアゾールである。
【０２４３】
送達系の一実施形態では、Ｓは、エチレングリコール鎖である。別の実施形態では、Ｓは、アルキル鎖である。送達系の別の実施形態では、Ｓは、ペプチドである。別の実施形態では、Ｓは、ＲＮＡである。送達系の別の実施形態では、Ｓは、ＤＮＡである。送達系の別の実施形態では、Ｓは、ホスフェートである。送達系の別の実施形態では、Ｓは、ホスホネートである。送達系の別の実施形態では、Ｓは、ホスホロアミダートである。送達系の別の実施形態では、Ｓは、エステルである。別の実施形態では、Ｓは、アミドである。別の実施形態では、Ｓは、トリアゾールである。
【０２４４】
送達系の一実施形態では、ｎは、２である。送達系の別の実施形態では、ｎは、３である。送達系の別の実施形態では、ｎは、４である。送達系の別の実施形態では、ｎは、５である。送達系の別の実施形態では、ｎは、６である。送達系の別の実施形態では、ｎは、７である。送達系の別の実施形態では、ｎは、８である。
【０２４５】
ある種の実施形態では、各ｃＮＡは、＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％又は＞５０％の化学修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、各ｃＮＡは、２’位置において完全に又はほぼ完全に化学修飾されており、及び少なくとも８５％が２’−Ｏ−メチル修飾されている。
【０２４６】
一実施形態において、式（ＶＩ）の化合物は、表３の式（ＶＩ−１）〜式（ＶＩ−９）から選択される構造を有する。
【０２４７】
【表３】
2021533804.tif 000027
【０２４８】
ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−１）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−２）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−３）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−４）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−５）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−６）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−７）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−８）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−９）の構造である。
【０２４９】
ある実施形態では、式（ＶＩ）（例えば、式（ＶＩ−１）〜（ＶＩ−９）を含む）の化合物、各ｃＮＡは、独立して、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施形態では、各ｃＮＡは、独立して、化学修飾されたヌクレオチドからなる。
【０２５０】
ある実施形態では、送達系は、ｎ個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含み、各ＮＡは、標的遺伝子の領域と実質的に相補的な相補性の領域を含む。また、各ＮＡは、少なくとも１つのｃＮＡにハイブリダイズされる。一実施形態では、送達系は、２個のＮＡで構成される。別の実施形態では、送達系は、３個のＮＡで構成される。別の実施形態では、送達系は、４個のＮＡで構成される。別の実施形態では、送達系は、５個のＮＡで構成される。別の実施形態では、送達系は、６個のＮＡで構成される。別の実施形態では、送達系は、７個のＮＡで構成される。別の実施形態では、送達系は、８個のＮＡで構成される。
【０２５１】
ある実施形態では、各ＮＡは、独立して、少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施形態では、各ＮＡは、独立して、１６〜２０個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施形態では、各ＮＡは、独立して、１６個の連続したヌクレオチドを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、１７個の連続したヌクレオチドを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、１８個の連続したヌクレオチドを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、１９個の連続したヌクレオチドを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、２０個の連続したヌクレオチドを含む。
【０２５２】
ある実施形態では、各ＮＡは、少なくとも２個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、少なくとも３個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、少なくとも４個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、少なくとも５個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、少なくとも６個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。ある実施形態では、オーバーハングのヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して連結される。
【０２５３】
ある実施形態では、各ＮＡは、独立して、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ、ギャップマー、ミックスマー又はガイドＲＮＡからなる群から選択される。一実施形態では、各ＮＡは、独立して、ＤＮＡである。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、アンタゴｍｉＲである。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、ｍｉＲＮＡである。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、ギャップマーである。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、ミックスマーである。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、ガイドＲＮＡである。ある実施形態では、各ＮＡは、同じである。ある実施形態では、各ＮＡは、同じではない。
【０２５４】
ある実施形態では、ｎ個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む送達系は、本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）及びその実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、２個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）及びその実施形態から選択される構造を有する。別の実施形態では、送達系は、３個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）及びその実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、４個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）及びその実施形態から選択される構造を有する。一実施形態において、送達系は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）及び本明細書中に記載されるそれらの５つの治療核酸（ＮＡ）をさらに含む実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、６個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）及びその実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、７個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）及びその実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、８個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）及びその実施形態から選択される構造を有する。
【０２５５】
一実施形態では、送達系は、構造Ｌ１又はＬ２のリンカーをさらに含む式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）から選択される構造を有し、Ｒは、Ｒ３であり、及びｎは、２である。別の実施形態では、送達系は、構造Ｌ１のリンカーをさらに含む式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）から選択される構造を有し、Ｒは、Ｒ３であり、及びｎは、２である。別の実施形態では、送達系は、構造Ｌ２のリンカーをさらに含む式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）から選択される構造を有し、Ｒは、Ｒ３であり、及びｎは、２である。
【０２５６】
医薬組成物及び投与の方法
一態様において、本明細書では、治療有効量の、本明細書に記載されるとおりの１つ以上のＲＮＡサイレンシング剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。別の特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されるとおりの式Ｉ〜ＶＩの化合物及び薬学的に許容される担体を含む。
【０２５７】
本発明は、本明細書中に記載される予防的処置及び／又は治療的処置のための上記の剤の使用に関する。したがって、本発明の調節因子（例えば、ｓｉＲＮＡ剤）は、投与に適した医薬組成物中に組み込まれ得る。そのような組成物は、典型的に、核酸分子、タンパク質、抗体又は調節化合物及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書中で用いられる文言「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与と適合するあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤並びに吸収遅延剤等を含むことが意図される。医薬的に活性な物質のためのそのような媒体及び剤の使用は、当技術分野において周知である。従来のいずれかの媒質又は剤が活性化合物と適合しないのでなければ、組成物におけるそれらの使用が意図される。また、補足の活性化合物が組成物中に組み込まれ得る。
【０２５８】
本発明の医薬組成物は、その目的の投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内（ＩＶ）、皮内、皮下（ＳＣ又はＳＱ）、腹腔内、筋肉内、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）及び経粘膜投与が挙げられる。非経口、皮内又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などの緩衝液及び塩化ナトリウム又はブドウ糖などの浸透圧の調整用薬剤を含み得る。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整され得る。非経口製剤は、アンプル、ディスポーザブルシリンジ又はガラス若しくはプラスチック製の複数回投与バイアル内に封入され得る。
【０２５９】
注射用途に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散体及び注射用滅菌溶液又は分散体の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与のために好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合、組成物は、無菌でなければならず、また容易に注射できる程度の流体でなければならない。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコールなど）及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散体の場合に必要とされる粒径の維持及び界面活性剤の使用により維持され得る。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張化剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含むことによりもたらされ得る。
【０２６０】
注射用滅菌溶液は、必要に応じて上に列挙された成分の１つ又は組合せによる適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、その後、滅菌濾過を施すことによって調製され得る。一般に、分散体は、塩基性分散媒体及び上に列挙されたものに由来する必要な他の成分を含有する無菌溶媒に活性化合物を組み込むことにより調製される。注射用滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、例示的な調製方法は、活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末を、予め滅菌濾過されたそれらの溶液から生成する真空乾燥及びフリーズドライである。
【０２６１】
そのような化合物の毒性及び治療的有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死をもたらす用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を求めるための、細胞培養又は実験動物において標準的な医薬手順によって求めることができる。毒作用及び治療効果間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きい治療指標を示す化合物が特に適している。有毒な副作用を示す化合物が用いられ得るが、そのような化合物を、罹患組織の部位に向けて、非感染細胞に対する潜在的損傷を最小にすることによって副作用を減らす送達系を設計するように配慮すべきである。
【０２６２】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトで使用するための投与量の範囲を構築する際に使用され得る。そのような化合物の投与量は、通常、毒性がほとんど又は全くなく、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。本発明の方法で使用される任意の化合物のために、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから概算することができる。用量は、細胞培養で決定されるとおりのＥＣ５０（すなわち最大半量の応答を達成する試験化合物の濃度）を含む循環する血漿中の濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて構築され得る。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【０２６３】
治療方法
一態様では、疾患又は障害のリスクのある（又はそれになりやすい）対象を治療する予防的且つ治療的方法の両方を提供する。
【０２６４】
本明細書で使用する場合、「治療」又は「治療すること」は、疾患若しくは障害、疾患若しくは障害の症状又は疾患に対する素因を治癒させるか、治すか、軽減するか、緩和するか、変化させるか、矯正するか、寛解させるか、改善するか又は影響を及ぼすための、患者への治療剤（例えば、ＲＮＡ剤又はベクター又はそれをコードする導入遺伝子）の適用又は投与或いは疾患若しくは障害、疾患若しくは障害の症状又は疾患若しくは障害に対する素因を有する患者に由来する単離された組織又は細胞株への治療剤の適用又は投与として定義される。
【０２６５】
特定の実施形態において、本発明は、中枢神経系の疾患又は障害を本開示のオリゴヌクレオチドで処置する方法を提供する。オリゴヌクレオチド、例えば二本鎖核酸のアンチセンス鎖は、中枢神経系の疾患又は障害に関係する標的遺伝子に対して十分な相補性を有し得る。特定の実施形態において、標的遺伝子は、Ｈｔｔ、ＡｐｏＥ又はＣ９ＯＲＦ７２である。特定の実施形態において、中枢神経系の疾患又は障害は、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）又はアルツハイマー病である。
【０２６６】
一態様では、本発明は、対象において、上記のとおりの疾患又は障害を、対象に治療剤（例えば、ＲＮＡｉ剤又はベクター又はそれをコードする導入遺伝子）を投与することによって予防するための方法を提供する。疾患のリスクのある対象は、例えば、本明細書に記載されるとおりの診断又は予後アッセイのいずれか又は組合せによって同定され得る。予防剤の投与は、疾患又は障害の症状の特徴の顕在化前に行うことができ、その結果、疾患又は障害が予防されるか、又は代わりにその進行が遅延される。
【０２６７】
本発明の別の態様は、対象を治療的に治療する方法に関し、すなわち疾患又は障害の症状の発症を変化させる。例示的な実施形態では、本発明の調節的な方法は、機能獲得変異体を発現する細胞を、遺伝子内の１つ以上の標的配列に特異的な治療剤（例えば、ｓｉＲＮＡ又はベクター又はそれをコードする導入遺伝子）と接触させることを含み、その結果、遺伝子による配列特異的な干渉が果たされる。これらの方法は、インビトロで（例えば、細胞を薬剤とともに培養することによって）又は代わりにインビボで（例えば、対象に薬剤を投与することによって）実施され得る。
【０２６８】
神経細胞への取込みの増強のために修飾されたオリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇ当たり約１．４ｍｇ未満又は体重１ｋｇ当たり１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５若しくは０．００００１ｍｇ未満及び体重１ｋｇ当たり２００ｎｍｏｌ未満のＲＮＡ剤（例えば、約４．４×１０１６コピー）又は体重１ｋｇ当たり１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎｍｏｌｅ未満のＲＮＡサイレンシング剤の単位用量で投与され得る。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内又は筋肉内、髄腔内又は脳への直接的な）、吸入投与又は局所適用によって投与され得る。特に好適な投与量は、２、１又は０．１ｍｇ／体重のｋｇ未満である。
【０２６９】
オリゴヌクレオチドの器官への直接的な送達は、１器官当たり約０．００００１ｍｇ〜約３ｍｇ又は１器官当たり約０．０００１〜０．００１ｍｇ、１器官当たり約０．０３〜３．０ｍｇ、１つの眼当たり約０．１〜３．０ｍｇ若しくは１器官当たり約０．３〜３．０ｍｇの程度の投与量であり得る。投与量は、神経疾患又は障害を治療又は予防するのに有効な量であり得る。一実施形態では、単位用量は、１日１回よりも少ない頻度、例えば２日、４日、８日又は３０日毎より少ない頻度で投与される。別の実施形態では、単位用量は、ある頻度で投与されない（例えば、規則的な頻度ではない）。例えば、単位用量は、１回投与され得る。一実施形態では、有効用量は、他の従来の治療モダリティーとともに投与される。
【０２７０】
一実施形態では、対象は、初回用量及び１回以上の維持用量のオリゴヌクレオチドを投与される。維持用量は、一般に、初回用量未満、例えば初回用量の２分の１未満である。維持レジメンは、１日当たり０．０１μｇ〜１．４ｍｇ／体重のｋｇの範囲の用量、例えば１日当たり体重の１ｋｇ当たり１０、１、０．１、０．０１、０．００１又は０．００００１ｍｇで対象を治療することを含み得る。維持用量は、通常、５、１０又は３０日毎に１回以下投与される。さらに、治療レジメンは、特定の疾患、その重症度及び患者の全体的な状態の性質に依存して変動することになる期間にわたって続き得る。ある種の例示的な実施形態では、投与量は、１日当たり１回以下、例えば２４、３６又は４８時間以上当たり１回以下、例えば５又は８日毎に１回以下送達され得る。治療後、患者は、患者の状態の変化及び病状の症状の軽減ついてモニターされ得る。化合物の投与量は、患者が目下の投与量レベルに著しく応答しない場合に増加され得るか、又は病状の症状の軽減が観察される場合、病状が切除された場合若しくは望ましくない副作用が観察される場合に用量を減少させ得る。
【０２７１】
有効量は、所望される又は特定の状況下で適切であると考えられる単回用量又は２回以上の用量で投与することができる。繰り返される又は頻繁な点滴を促進することが所望される場合、送達デバイス、例えばポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、嚢内又は包内）又はリザーバーの移植が得策であり得る。一実施形態において、医薬組成物は、複数のＲＮＡサイレンシング剤種を含む。別の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤種は、天然に存在する標的配列に関して、別の種とオーバーラップせず、且つ隣接しない配列を有する。別の実施形態において、複数のＲＮＡサイレンシング剤種は、天然に存在する様々な標的遺伝子に特異的である。別の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤は、対立遺伝子特異的である。別の実施形態において、複数のＲＮＡサイレンシング剤種は、２つ以上の標的配列（例えば、２、３、４、５、６つ又はそれを超える標的配列）を標的化する。
【０２７２】
処置が成功した後、患者に、病状の再発を予防するための維持療法を経験させることが所望され得、本発明の化合物は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇに及ぶ維持用量で投与される（米国特許第６，１０７，０９４号明細書を参照されたい）。
【０２７３】
別の態様において、本明細書中で提供されるのは、疾患又は障害を処置又は管理する方法であって、そのような処置又は管理を必要とする患者に、治療的に有効な量の、本明細書中に記載される化合物、オリゴヌクレオチド若しくは核酸又は前記化合物、オリゴヌクレオチド若しくは核酸を含む医薬組成物を投与することを含む方法である。
【０２７４】
特定の例示的な実施形態において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を含む組成物を対象の神経系に種々の経路によって送達することができる。例示的な経路としては、髄腔内、実質部（例えば、脳内）、経鼻及び眼球への送達が挙げられる。組成物は、例えば、静脈内、皮下又は筋肉内注射によっても全身的に送達され得、これは、ＲＮＡサイレンシング剤の末梢ニューロンへの送達に特に有用である。送達の例示的な経路は、脳、例えば脳の脳室若しくは視床下部への又は脳の側方若しくは背側領域への直接的なものである。神経細胞送達のためのＲＮＡサイレンシング剤は、投与に好適な医薬組成物に組み込まれ得る。
【０２７５】
例えば、組成物は、ＲＮＡサイレンシング剤の１つ以上の種及び薬学的に許容される担体を含み得る。本発明の医薬組成物は、局所性又は全身性の治療が所望されるかどうかに依存して且つ治療されることになる領域に依存して、いくつかの様式で投与され得る。投与は、局所的（眼部、鼻腔内、経皮を含む）、経口又は非経口であり得る。非経口投与は、点滴静脈内注射、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射、髄腔内又は脳室内（例えば、側脳室内）投与を含む。ある種の例示的な実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、本明細書に記載される様々な好適な組成物及び方法を使用して、血液脳関門（ＢＢＢ）を通して送達される。
【０２７６】
送達の経路は、患者の障害に依存し得る。本発明のｓｉＲＮＡに加えて、患者は、第２の療法、例えば対症療法及び／又は疾患特異的療法を施され得る。第２の療法は、例えば、対症（例えば、症状を軽減するため）、保護（例えば、疾患進行を遅らせるか又は止めるため）又は回復性（例えば、疾患プロセスを元に戻すため）であり得る。
【０２７７】
ＲＮＡサイレンシング剤は、脳の神経細胞に送達され得る。血液脳関門を越える組成物の通過を必要としない送達方法が利用され得る。例えば、ＲＮＡサイレンシング剤を含有する医薬組成物は、疾患に冒された細胞を含有する領域への直接的な注射によって患者に送達され得る。例えば、医薬組成物は、脳への直接的な注射によって送達され得る。注射は、脳の特定の領域（例えば、黒質、皮質、海馬、線条体又は淡蒼球）への定位的な注射によるものであり得る。ＲＮＡサイレンシング剤は、中枢神経系の複数の領域（例えば、脳の複数の領域及び／又は脊髄）に送達され得る。ＲＮＡサイレンシング剤は、脳の拡散した領域に送達され得る（例えば、脳の皮質への拡散した送達）。
【０２７８】
一実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、カニューレ又は組織、例えば脳、例えば脳の黒質、皮質、海馬、線条体若しくは淡蒼球に移植された１つの末端を有する他の送達デバイスの方法によって送達され得る。カニューレは、ＲＮＡサイレンシング剤のリザーバーに連結され得る。流動又は送達は、ポンプ、例えばＡｌｚｅｔポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）などの浸透圧ポンプ又はミニポンプによって媒介され得る。一実施形態では、ポンプ及びリザーバーは、組織から離れた領域、例えば腹部に移植され、送達は、ポンプ又はリザーバーから放出部位に導く導管によって行われる。脳への送達のためのデバイスは、例えば、米国特許第６，０９３，１８０号明細書及び同第５，８１４，０１４号明細書において記載される。
【０２７９】
本発明のｓｉＲＮＡは、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切ることができるようにさらに修飾され得る。例えば、ＲＮＡサイレンシング剤は、薬剤が関門を横切ることを可能にする分子にコンジュゲートされ得る。そのような修飾ＲＮＡサイレンシング剤は、任意の所望の方法、例えば脳室内若しくは筋肉内注射又は肺性送達などによって投与され得る。
【０２８０】
ある種の実施形態では、エキソソームを使用して、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を送達する。エキソソームは、ＢＢＢを通過することができ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、化学療法剤及びタンパク質を全身注射後にニューロンに特異的に送達することができる（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  Ｌ，Ｓｅｏｗ  Ｙ，Ｙｉｎ  Ｈ，Ｂｅｔｔｓ  Ｃ，Ｌａｋｈａｌ  Ｓ，Ｗｏｏｄ  ＭＪ．（２０１１）．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ａｐｒ；２９（４）：３４１−５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１８０７；Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  Ｓ，Ｌｅｅ  Ｙ，Ｌａｋｈａｌ−Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ  Ｓ，Ｌｉ  Ｊ，Ｓｅｏｗ  Ｙ，Ｇａｒｄｉｎｅｒ  Ｃ，Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  Ｌ，Ｓａｒｇｅｎｔ  ＩＬ，Ｗｏｏｄ  ＭＪ．（２０１１）．Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２  Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２−２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１；ＥＬ  Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  Ｓ，Ｍａｅｇｅｒ  Ｉ，Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ  ＸＯ，Ｗｏｏｄ  ＭＪ．（２０１３）．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１３  Ｍａｙ；１２（５）：３４７−５７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ３９７８；Ｅｌ  Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  Ｓ，Ｌａｋｈａｌ  Ｓ，Ｍａｅｇｅｒ  Ｉ，Ｗｏｏｄ  ＭＪ．（２０１３）．Ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｃｒｏｓｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂａｒｒｉｅｒｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１３  Ｍａｒ；６５（３）：３９１−７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０８．００８を参照されたい）。
【０２８１】
ある種の実施形態では、１つ以上の親油性分子を使用して、本発明のＲＮＡサイレンシング剤のＢＢＢを越えた送達が可能になる（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔ（２０１１））。次に、ＲＮＡサイレンシング剤は、例えば、親油性偽装物の酵素分解によって活性化されて、薬物をその活性形態に放出するであろう。
【０２８２】
ある種の実施形態では、１つ以上の受容体媒介性の透過性化合物を使用して、ＢＢＢの透過性を増加させて、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の送達を可能にすることができる。これらの薬物は、内皮細胞間の緊密な接合点をゆるめる血液中の浸透圧を増大させることによってＢＢＢの透過性を一時的に増大させる（Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ（２０１２））。緊密な接合点をゆるめることにより、ＲＮＡサイレンシング剤の通常の静脈内注射が実施され得る。
【０２８３】
ある種の実施形態では、ナノ粒子に基づく送達系を使用して、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、ＢＢＢを越えて送達する。本明細書で使用する場合、「ナノ粒子」は、典型的には、固体、生分解性、コロイド系であり、薬物又は遺伝子担体として広く研究されている高分子ナノ粒子を指す（Ｓ．Ｐ．Ｅｇｕｓｑｕｉａｇｕｉｒｒｅ，Ｍ．Ｉｇａｒｔｕａ，Ｒ．Ｍ．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，ａｎｄ  Ｊ．Ｌ．Ｐｅｄｒａｚ，“Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，”Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４，ｎｏ．２，ｐｐ．８３−９３，２０１２）。高分子ナノ粒子は、天然ポリマー及び合成ポリマーの２つの主要な部類に分類される。ｓｉＲＮＡ送達のための天然ポリマーとしては、シクロデキストリン、キトサン及びアテロコラーゲンが挙げられるが、これらに限定されない（Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｌｉ，Ｙ．Ｈａｎ，Ｌ．Ｈ．Ｌｉａｎｇ，ａｎｄ  Ａ．Ｊｉ，“Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｖｏｌ．１１，ｎｏ．２，ｐｐ．１８２−１９６，２０１０）。合成ポリマーとしては、集中的に研究されてきたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ（ｄｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）及びデンドリマーが挙げられるが、これらに限定されない（Ｘ．Ｙｕａｎ，Ｓ．Ｎａｇｕｉｂ，ａｎｄ  Ｚ．Ｗｕ，“Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．８，ｎｏ．４，ｐｐ．５２１−５３６，２０１１）。ナノ粒子及び他の好適な送達系の概説については、Ｊｏｎｇ−Ｍｉｎ  Ｌｅｅ，Ｔａｅ−Ｊｏｎｇ  Ｙｏｏｎ，ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ−Ｓｅｏｋ  Ｃｈｏ，“Ｒｅｃｅｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｂａｓｅｄ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ｖｏｌ．２０１３，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ７８２０４１，１０  ｐａｇｅｓ，２０１３．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１３／７８２０４１（全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。
【０２８４】
本発明のＲＮＡサイレンシング剤を眼球に投与して、例えば網膜障害、例えば網膜症を治療することができる。例えば、医薬組成物は、眼の表面又は近くの組織、例えば眼瞼の内部に適用され得る。それらは、例えば、噴霧により、液滴において、洗眼薬又は軟膏剤として局所的に適用され得る。軟膏剤又は滴下可能な液体は、塗布器又は点眼容器など、当技術分野において知られる眼性送達系によって送達され得る。そのような組成物は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はポリ（ビニルアルコール）などの粘液模倣物、ソルビン酸、ＥＤＴＡ又は塩化ベンジルクロムなどの保存剤並びに通常の量の希釈剤及び／又は担体を含み得る。医薬組成物はまた、眼の内部に投与され得、且つ選択された領域又は構造にそれを導入できる針又は他の送達デバイスによって導入され得る。ＲＮＡサイレンシング剤を含有する組成物は、眼パッチを介しても適用され得る。
【０２８５】
一般に、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、任意の好適な方法によって投与され得る。本明細書で使用する場合、局所送達は、眼、粘膜、体腔の表面を含む身体の任意の表面又は任意の内表面へのＲＮＡサイレンシング剤の直接的な適用を指し得る。局所投与のための製剤は、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、液滴、噴霧剤及び液体を含み得る。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要であるか又は望ましい場合がある。局所投与は、対象の表皮若しくは真皮又はその特定の層或いは根底にある組織にＲＮＡサイレンシング剤を選択的に送達する手段としても使用され得る。
【０２８６】
髄腔内又は脳室内（例えば、側脳室内）投与のための組成物は、緩衝液、希釈剤及び他の好適な添加剤を含有し得る滅菌水溶液を含み得る。髄腔内又は脳室内投与のための組成物は、通常、例えばＲＮＡサイレンシング剤に結合した親油性部分のみならず、トランスフェクション試薬又は追加の親油性部分を含まない。
【０２８７】
非経口投与のための製剤は、緩衝液、希釈剤及び他の好適な添加剤を含有し得る滅菌水溶液を含み得る。脳室内注射は、例えば、リザーバーに取り付けられた、脳室内カテーテルによって促進され得る。静脈内での使用のために、溶質の総濃度は、調製物を等張にするように制御されるべきである。
【０２８８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、肺性送達によって対象に投与され得る。肺性送達組成物は、分散体内の組成物が、肺胞領域を通して血液循環に直接的に容易に吸収され得る肺に到達できるように分散体の吸入によって送達され得る。肺性送達は、肺の疾患を治療する全身送達及び局所送達の両方にとって効率的であり得る。一実施形態では、肺性送達によって投与されるＲＮＡサイレンシング剤は、血液脳関門を横切ることができるように修飾されている。
【０２８９】
肺性送達は、噴霧、エアロゾル化、ミセル及び乾燥粉末系製剤の使用を含む様々な手法によって行われ得る。送達は、液体噴霧器、エアロゾル系吸入器及び乾燥粉末分散デバイスにより行われ得る。定量デバイスが特に好適である。噴霧器又は吸入器を使用する利点の１つは、デバイスが独立型であるため汚染の可能性が最小化されることである。乾燥粉末分散体デバイスは、例えば、乾燥粉末として容易に製剤化され得る薬物を送達する。ＲＮＡサイレンシング剤組成物は、単独で又は好適な粉末担体と組み合わせて凍結乾燥又は噴霧乾燥された粉末として安定的に保管され得る。吸入のための組成物の送達は、デバイスに組み込まれるとき、エアロゾル薬物の投与中の患者に対する用量の追跡、服薬遵守の監視及び／又は用量の誘発を可能にするタイマー、用量カウンター、時間測定デバイス又は時間表示器を含み得る投与タイミング要素によって媒介され得る。
【０２９０】
担体として有用な医薬賦形剤の種類としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定剤、炭水化物などの充填剤、アミノ酸及びポリペプチド；ｐＨ調整剤又は緩衝液；塩化ナトリウムなどの塩などが挙げられる。これらの担体は、結晶形態若しくは非結晶形態であり得るか、又はその２つの混合物であり得る。
【０２９１】
特に有用な充填剤としては、適合性の炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸又はこれらの組合せが挙げられる。好適な炭水化物としては、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖類；ラクトース、トレハロースなどの二糖類；２−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン；及びラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなどの多糖類；マンニトール、キシリトールなどのアルジトールが挙げられる。炭水化物の特に好適な基としては、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリン及びマンニトールが挙げられる。好適なポリペプチドとしては、アスパルテームが挙げられる。アミノ酸としては、アラニン及びグリシンが挙げられ、グリシンが好ましい。
【０２９２】
ｐＨ調整剤又は緩衝液としては、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどの有機酸及び塩基から調製される有機酸塩が挙げられ、クエン酸ナトリウムが好ましい。
【０２９３】
本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、経口及び経鼻送達によって投与され得る。例えば、これらの膜を通して投与される薬物は、迅速な作用発現を有し、治療的な血漿レベルをもたらし、肝代謝の初回通過効果を回避し、且つ不適な胃腸管（ＧＩ）環境への薬物の暴露を回避する。追加の利点は、膜部位への容易なアクセスを含み、その結果、薬物が容易に適用され、局在化され、且つ除去され得る。一実施形態では、経口又は経鼻送達によって投与されるＲＮＡサイレンシング剤は、血液脳関門を横切ることができるように修飾されている。本開示に記載される方法は、本明細書中で開示される特定の方法及び実験条件に限定されないことが理解されるべきである。したがって、方法及び条件は、異なり得る。また、本明細書中で用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、限定であることを意図されていないことが理解されるべきである。
【０２９４】
さらに、本明細書中に記載される実験は、特に明記しない限り、従来の分子細胞生物学的技術及び免疫学的技術を当技術分野の範囲内で使用する。そのような技術は、当業者に周知であり、且つ文献において詳細に説明されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９８７−２００８）（全ての増刊を含む）、ＭＲ  Ｇｒｅｅｎ及びＪ．ＳａｍｂｒｏｏｋによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）並びにＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２０１３，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照されたい。
【０２９５】
本明細書に記載される方法の他の好適な変更形態及び適応形態は、本明細書で開示される実施形態の範囲から逸脱することなく、好適な均等物を使用して行われ得ることが当業者に容易に明らかであろう。ある種の実施形態を詳細に記載してきたが、例示のためのみに含まれ、且つ限定することが意図されない以下の実施例を参照することにより、それらがより明確に理解されるであろう。
【実施例】
【０２９６】
実施例１．２’−フルオロ修飾を減らした２’−Ｏ−メチルリッチｈｓｉＲＮＡの有効性
２’−フルオロ修飾（位置２及び１４での２’−フルオロ修飾（円）又は位置２、４、６、８及び１４での２’−フルオロ修飾（正方形））を減らしたＯ−メチルリッチ非対称ｈｓｉＲＮＡ（図４Ｃ）を、サイレンシング有効性について、２’−Ｏ−メチル／２’−フルオロ修飾パターンが交互に起こる（三角形）対照ｈｓｉＲＮＡ（図４Ｃ）と比較して分析した。
【０２９７】
ｓＦＴＬ１  ｉ１３  ｍＲＮＡをサイレンシングする個々のｈｓｉＲＮＡの有効性を判定した（図４Ａ、図４Ｂ）。また、ｓＦＴＬ１  ｅ１５ａ  ｍＲＮＡをサイレンシングする個々のｈｓｉＲＮＡの有効性も判定した（図５Ａ、図５Ｂ）。これらのデータは、最小の２’−フルオロ修飾を有するＯ−メチルリッチ非対称完全修飾ｓｉＲＮＡが、２つの異なる細胞株にわたり、２つの異なるアッセイを用いて、インビトロでの有効性特性において予想外の向上を得たことを実証している。
【０２９８】
ｓＦＬＴ１  ｉ１３＿２２８３＿  Ｏ−メチルリッチアンチセンス鎖：
ＶＰ（ｍＵ）＃（ｆＡ）＃（ｍＡ）（ｆＡ）（ｆＵ）（ｆＵ）（ｍＵ）（ｍＧ）（ｍＧ）（ｍＡ）（ｍＧ）（ｍＡ）（ｍＵ）＃（ｆＣ）＃（ｍＣ）＃（ｍＧ）＃（ｍＡ）＃（ｍＧ）＃（ｍＡ）＃（ｍＧ）。
【０２９９】
ｓＦＬＴ１  ｉ１３＿２２８３  Ｏ−メチルリッチセンス鎖：
（ｍＧ）＃（ｍＧ）＃（ｍＡ）（ｍＵ）（ｍＣ）（ｍＵ）（ｍＣ）（ｍＣ）（ｍＡ）（ｍＡ）（ｍＡ）（ｍＵ）（ｍＵ）＃（ｍＵ）＃（ｍＡ）。
【０３００】
ｓＦＬＴ１  ｅ１５ａ＿２５１９＿ＯＭＥアンチセンス鎖：
ＶＰ（ｍＵ）＃（ｆＡ）＃（ｍＵ）（ｍＡ）（ｍＡ）（ｍＡ）（ｍＵ）（ｍＧ）（ｍＧ）（ｍＵ）（ｍＡ）（ｍＧ）（ｍＣ）＃（ｆＵ）＃（ｍＡ）＃（ｍＵ）＃（ｍＧ）＃（ｍＡ）＃（ｍＵ）＃（ｍＧ）。
【０３０１】
ｓＦＬＴ１  ｅ１５ａ＿２５１９＿ＯＭＥセンス鎖：
（ｍＵ）＃（ｍＡ）＃（ｍＧ）（ｍＣ）（ｍＵ）（ｍＡ）（ｍＣ）（ｍＣ）（ｍＡ）（ｍＵ）（ｍＵ）（ｍＵ）（ｍＡ）＃（ｍＵ）＃（ｍＡ）。
【０３０２】
実施例２．２’−フルオロ修飾を減らした２’−Ｏ−メチルリッチｈｓｉＲＮＡの組織分布
ＤＣＡ修飾又はＰＣ−ＤＣＡ修飾を含むＯ−メチルリッチ非対称ｈｓｉＲＮＡをＣＤ１妊娠マウスに投与して、その組織分布を評価した。Ｏ−メチルリッチＤＣＡ  ｈｓｉＲＮＡ及びＯ−メチルリッチ−ＰＣ−ＤＣＡ  ｈｓｉＲＮＡは、非メチルリッチ対照ｈｓｉＲＮＡと比較して、半分の投薬にもかかわらず、肝臓、腎臓及び胎盤において増大した又は類似のガイド鎖蓄積を実証した（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ）。
【０３０３】
ＣＤ１妊娠マウスをＯ−メチルリッチｓｉＲＮＡ及びＰ２  ｓｉＲＮＡで処置して、その胎盤分布を評価した。Ｏ−メチルリッチ−ＤＣＡ化合物及びＯ−メチルリッチＥ−ＰＣ  ＤＣＡ化合物は、Ｐ２−Ｃｈｏｌ  ｈｓｉＲＮＡと比較して、胎盤において増大した又は類似のガイド鎖蓄積を実証した（図７）。
【０３０４】
ＣＤ１妊娠マウスをＯ−メチルリッチｓＦＬＴ１  ｓｉＲＮＡ及びＰ２  ＰＰＩＢ  ｓｉＲＮＡで処置して、その組織分布を評価した。Ｏ−メチルリッチ化合物は、ＰＰＩＢ  Ｐ２と比較して、肝臓及び胎盤において増大したガイド鎖蓄積を実証した（図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ）。
【０３０５】
実施例３．２’−フルオロ修飾を減らした２’−Ｏ−メチルリッチｈｓｉＲＮＡの有効性−パターン１
実施例１のＯ−メチルリッチ非対称ｈｓｉＲＮＡパターンを「Ａ」変異体、「Ｂ」変異体、「Ｃ」変異体、「Ｄ」変異体、「Ｅ」変異体及び「Ｆ」変異体で設計した（図１）。
【０３０６】
パターン１：
パターン１Ａ−２０ヌクレオチドガイド（アンチセンス）鎖及び１５ヌクレオチドパッセンジャ（センス）鎖を有するｓｉＲＮＡ。ガイド鎖の５’末端からの位置２及び１４での２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾なし。パッセンジャ鎖の２’−ＯＭｅ修飾１００％。
【０３０７】
パターン１Ｂ−２０ヌクレオチドガイド（アンチセンス）鎖及び１５ヌクレオチドパッセンジャ（センス）鎖を有するｓｉＲＮＡ。ガイド鎖の５’末端からの位置２、１４及び２０での２’−ＯＭｅ修飾なし。パッセンジャ鎖の２’−ＯＭｅ修飾１００％。
【０３０８】
パターン１Ｃ−２０ヌクレオチドガイド（アンチセンス）鎖及び１８ヌクレオチドパッセンジャ（センス）鎖を有するｓｉＲＮＡ。ガイド鎖の５’末端からの位置２及び１４での２’−ＯＭｅ修飾なし。パッセンジャ鎖の２’−ＯＭｅ修飾１００％。
【０３０９】
パターン１Ｄ−２０ヌクレオチドガイド（アンチセンス）鎖及び１８ヌクレオチドパッセンジャ（センス）鎖を有するｓｉＲＮＡ。ガイド鎖の５’末端からの位置２、１４及び２０での２’−ＯＭｅ修飾なし。パッセンジャ鎖の２’−ＯＭｅ修飾１００％。
【０３１０】
パターン１を以下で再現する。「ｍＮ」は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、「ｆＮ」は、２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、「＃」は、ホスホロチオエート骨格修飾であり、及び「Ｎ」は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択されるヌクレオチドである。
パターン１Ａ
アンチセンス５’〜３’（２０ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｆＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｆＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
センス５’〜３’（１５ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
パターン１Ｂ
アンチセンス５’〜３’（２０ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｆＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｆＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｆＮ）
センス５’〜３’（１５ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
パターン１Ｃ
アンチセンス５’〜３’（２０ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｆＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｆＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
センス５’〜３’（１８ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
パターン１Ｄ
アンチセンス５’〜３’（２０ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｆＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｆＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｆＮ）
センス５’〜３’（１８ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
パターン１Ｅ
アンチセンス５’〜３’（２２ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｆＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｆＮ）（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
センス５’〜３’（２０ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
パターン１Ｆ
アンチセンス５’〜３’（２２ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｆＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｆＮ）（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｆＮ）
センス５’〜３’（２０ヌクレオチド）
（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）（ｍＮ）＃（ｍＮ）＃（ｍＮ）
【０３１１】
インビトロサイレンシング−パターン１Ａ：
ｓＦＴＬ１  ｉ１３  ｍＲＮＡ及びｓＦＴＬ１  ｅ１５ａ  ｍＲＮＡをサイレンシングするパターン１Ａ  ｈｓｉＲＮＡのインビトロ有効性を判定した（図９Ａ、図９Ｂ、図１０Ａ、図１０Ｂ）。パターン１Ａ（ガイド鎖内の２’Ｏ−Ｍｅ含量９０％）は、ガイド鎖内５０％の対照ｓｉＲＮＡと類似のサイレンシング有効性を有する。これらのデータは、最小の２’−フルオロ修飾を有するＯ−メチルリッチ非対称完全修飾ｓｉＲＮＡが、２つの異なる細胞株にわたり、２つの異なるアッセイを用いて、２つの異なるｍＲＮＡ標的配列を標的化する、インビトロでの有効性特性における予想外の向上を得たことを実証している。
【０３１２】
インビボ組織蓄積  −  パターン１Ａ及び１Ｂ：
ｓＦＴＬ１  ｉ１３  ｍＲＮＡを標的化するパターン１Ａ  ｈｓｉＲＮＡのインビボ組織蓄積を判定した（図１１Ａ〜図１１Ｄ）。ＤＣＡ修飾又はＰＣ−ＤＣＡ修飾及び５’ビニルホスホネートを含むパターン１Ａ  ｈｓｉＲＮＡ（ｓＦｌｔ１−２２８３  ２’−ＯＭｅ）をＣＤ１妊娠マウスに投与して、その組織分布を評価した。Ｏ−メチルリッチＤＣＡ  ｈｓｉＲＮＡ及びＯ−メチルリッチ−ＰＣ−ＤＣＡ  ｈｓｉＲＮＡは、非メチルリッチ対照ｈｓｉＲＮＡと比較して、半分の投薬にもかかわらず、肝臓、腎臓及び胎盤において増大した又は類似のガイド鎖蓄積を実証した。Ｈｔｔ  ｍＲＮＡを標的化するさらなる対照ｓｉＲＮＡ（ＨＴＴ−１０１５０）を含めた。配列を以下に示す。
ＨＴＴ−１０１５０アンチセンス鎖：
ＵＵＡＡＵＣＵＣＵＵＵＡＣＵＧＡＵＡＵＡ
ＨＴＴ−１０１５０  ｍＲＮＡ標的配列：
ＵＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡ
【０３１３】
また、ｓＦＴＬ１  ｅ１５ａ  ｍＲＮＡを標的化するパターン１Ｂ  ｈｓｉＲＮＡのインビボ組織蓄積を判定した（図１２Ａ、図１２Ｂ）。パターン１Ｂ  Ｏ−メチルリッチ−ＰＣ−ＤＣＡ  ｈｓｉＲＮＡ（ｓＦｌｔ１−２５１９  ２’−ＯＭｅ）は、非メチルリッチ対照ｈｓｉＲＮＡと比較して、胎盤において増大した又は類似のガイド鎖蓄積を実証した。ｈｓｉＲＮＡの様々な変異体を試験した。図１２Ｂに示すように、「２０／１５マー」は、２０ヌクレオチドアンチセンス／１５ヌクレオチドセンスｓｉＲＮＡを表し、「２０／１８マー」は、２０ヌクレオチドアンチセンス／１８ヌクレオチドセンスｓｉＲＮＡを表し、「５’ＶＰ」は、５’端末ビニルホスホネート修飾を有するｓｉＲＮＡを表し、「５’ＯＨ」は、５’端末２’−ＯＨを有するｓｉＲＮＡを表し、「５’ＰＳ」は、５’末端ホスホロチオエートを有するｓｉＲＮＡを表し、及び「低ＰＳ」は、アンチセンス鎖及びセンス鎖の５’末端及び３’末端からの位置１及び２にホスホロチオエート修飾を有するｓｉＲＮＡを表す。
【０３１４】
実施例４．２’−フルオロ修飾を減らした２’−Ｏ−メチルリッチｈｓｉＲＮＡの有効性−ガイド鎖位置２０の役割
ガイド鎖の５’末端からの位置２０の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を有する及び有さないｈｓｉＲＮＡのインビトロ有効性を判定した（図１３Ａ〜図１３Ｄ）。
【０３１５】
ｓＦＴＬ１  ｉ１３、ｓＦＴＬ１  ｅ１５ａ及びＨｔｔ  ｍＲＮＡをサイレンシングするガイド鎖内の２’−Ｏ−Ｍｅ含量が５０〜５５％であるｈｓｉＲＮＡをＨｅｌａ細胞（図１３Ａ、図１３Ｃ及び図１３Ｄ）及びＷＭ−１１５細胞（図１３Ｂ）に用いた。これらのデータは、２’−Ｏ−Ｍｅ含量が５０〜５５％である場合、ガイド鎖の５’末端からの位置２０での２’−Ｏ−Ｍｅの欠如がサイレンシング有効性を増大させることを実証している。これは、位置２０での２’−フルオロ修飾により実証されたが、以下に限定されないが、２’−Ｈ又は２’−ＯＨを有する非修飾リボースが挙げられる他のタイプのヌクレオチド修飾にも当てはまり得る。このサイレンシング効果の増大は、２’−ＯＭｅ含量がそれぞれ５０〜５５％である２つの異なる化学修飾パターンにより実証された。図１３Ｄは、２１ヌクレオチドアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡに関連して、位置２０での２’−フルオロの役割を実証しており、２０ヌクレオチドアンチセンス鎖と類似の結果を示す。
【０３１６】
本出願を通して引用され得る全ての参考文献（文献参照、特許、特許出願及びウェブサイトを含む）の内容は、そこに引用された参考文献と同様に、いかなる目的のためにも、それらの全体が参照により明示的に本明細書によって組み込まれる。本開示は、別段の指示がない限り、当技術分野でよく知られる免疫学、分子生物学及び細胞生物学の従来技術を採用することになる。
【０３１７】
本開示は、その趣旨又は本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態において具体化され得る。したがって、前述の実施形態は、本開示の限定ではなく、例示的な全ての観点において考えられることになる。したがって、本開示の範囲は、前述の記載ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、そのため、特許請求の範囲の趣旨及び均等性の範囲内に収まる全ての変化形態が本明細書に包含されることになると意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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