(57)【要約】  シアリル化糖の発酵産生の方法及び該方法で使用するために遺伝子操作された微生物細胞であって、該遺伝子操作された微生物細胞が、シアリル化糖を生産するために、（ｉ）グルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼを含むシアル酸生合成経路、（ｉｉ）シチジン５’−モノホスホ（ＣＭＰ）−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ、及び（ｉｉｉ）シアリルトランスフェラーゼを含むもの、並びに栄養組成物を提供するための該シアリル化オリゴ糖の使用が開示される。
2021525522.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む糖の発酵産生のための方法であって、
ａ）以下を含む、少なくとも１つの遺伝子操作された微生物細胞を提供するステップ
（ｉ）グルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼを含むシアル酸生合成経路、
（ｉｉ）シチジン５’−モノホスホ−（ＣＭＰ）−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ、及び
（ｉｉｉ）異種シアリルトランスフェラーゼ、
ｂ）前記少なくとも１つの遺伝子操作された微生物細胞を、発酵ブロス中で、少なくとも１つのＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む前記糖の産生を許容する条件下で培養するステップ、並びに任意選択的に
ｃ）少なくとも１つのＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む前記糖を回収するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
少なくとも１つのＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む糖の発酵産生のための遺伝子操作された微生物細胞であって、
（ｉ）グルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼを含む合成シアル酸生合成経路、
（ｉｉ）シチジン５’−モノホスホ−（ＣＭＰ）−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ、及び
（ｉｉｉ）異種シアリルトランスフェラーゼ
を含む、遺伝子操作された微生物細胞。
【請求項３】
前記シアル酸生合成経路が、ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸ホスファターゼ及びＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ、並びに／又はｂ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸エピメラーゼ及びＮ−アセチル−マンノサミン−６−リン酸ホスファターゼをさらに含む、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載の遺伝子操作された微生物細胞。
【請求項４】
前記遺伝子操作された微生物細胞が、
ｉ）配列番号９１で表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ）配列番号９２で表されるヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号９１で表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列類似性を有するヌクレオチド配列、
ｉｖ）配列番号９２で表されるヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列類似性を有するヌクレオチド配列、
ｖ）ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．及びｉｖ．のヌクレオチド配列のいずれか１つと相補的なヌクレオチド配列、及び
ｖｉ）ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．、ｉｖ．及びｖ．のヌクレオチド配列のいずれか１つの断片
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、かつ発現する核酸分子を含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載された方法又は請求項２若しくは３に記載された遺伝子操作された微生物細胞。
【請求項５】
前記遺伝子操作された微生物細胞が、
Ｉ．配列番号１〜３３のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列を含むか、又はこれからなるポリペプチド、
ＩＩ．配列番号１〜３３のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むか、又はこれからなるポリペプチド、
ＩＩＩ．Ｉ．及びＩＩ．のポリペプチドのいずれか１つの断片
からなる群より好ましく選択される異種シアリルトランスフェラーゼを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法又は請求項２〜４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物細胞。
【請求項６】
前記遺伝子操作された微生物細胞が、
ｉ．配列番号１〜３３のいずれか１つで表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ．配列番号３４〜６６のいずれか１で表されるヌクレオチド配列、
ｉｉｉ．配列番号１〜３３のいずれか１つで表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％の配列類似性を有するヌクレオチド配列、
ｉｖ．配列番号３４〜６６で表されるヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも８０％の配列類似性を有するヌクレオチド配列、
ｖ．ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．及びｉｖ．のヌクレオチド配列のいずれか１つと相補的なヌクレオチド配列、及び
ｉｖｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．、ｉｖ．及びｖ．のヌクレオチド配列のいずれか１つの断片
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、かつ発現する核酸分子を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法又は請求項２〜５のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物細胞。
【請求項７】
受容体分子が、N−アセチルグルコサミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ラクトース、ラクツロース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ラクツロース、メリビオース、ラフィノース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、６’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、３’−ガラクトシルラクトース、６’−ガラクトシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、２’３−ジコシルラクトース、３−フコシル−３’−シアリルラクトース、３−フコシル−６’−シアリルラクトース、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｃ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ及びラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法又は請求項２〜６のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物細胞。
【請求項８】
前記発酵ブロスが、少なくとも１つの炭素源を含有し、前記少なくとも１つの炭素源が、好ましくは、グルコース、フルクトース、スクロース、グリセロール及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの遺伝子操作された微生物細胞が、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸からなる群から選択される１つ以上の非存在下及び／又は添加なしで培養される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む前記糖が、３’−シアリルガラクトース、６’−シアリルガラクトース、３’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、６’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｃ、フコシル−シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ、フコシル−シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ、フコシル−シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｃ、ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース、フコシルジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースＩ、フコシルジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースＩＩからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
全細胞発酵方法におけるシアリル化糖の産生のための、請求項２〜７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物細胞の使用。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により、又は請求項２〜７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物細胞の使用により産生されたシアリル化糖。
【請求項１３】
栄養組成物の製造のための、請求項１２に記載のシアリル化糖の使用。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法により、又は請求項２〜７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物細胞により産生された少なくとも１つのシアリル化糖、好ましくは少なくとも１つのシアリル化オリゴ糖を含む、栄養組成物。
【請求項１５】
医薬、薬物、製剤、乳児用調製物及び栄養補助食品からなる群から選択される、請求項１４に記載の栄養組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
本発明は、シアリル化糖の発酵産生のための方法、及びその中で使用される組換え又は遺伝子操作された微生物細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに１５０を超える構造的に異なるヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）が同定されている。ＨＭＯは総人乳栄養素のわずかな量に過ぎないが、母乳で育てられている乳幼児の発達に対するそれらの有益な効果は過去数十年にわたって明らかになった。
【０００３】
ＨＭＯの中で、シアリル化ＨＭＯ（ＳＨＭＯ）が腸管病原性細菌及びウイルスに対する耐性を後押しすることが観察された。興味深いことに、最近の研究はさらに、早産児において最も一般的で致死的な疾患の１つである壊死性腸炎に対する長鎖ＳＨＭＯの保護効果を実証した。さらに、ＳＨＭＯは、乳幼児の脳の発達及びその認知能力を支援すると考えられている。また、シアリル化オリゴ糖は、大腸菌、コレラ菌及びサルモネラ菌をはじめとする様々な病原性微生物のエンテロトキシンを中和することが示されている。さらに、シアリル化オリゴ糖は、ピロリ菌による消化管のコロニー形成を妨げ、それによって胃潰瘍及び十二指腸潰瘍を予防又は抑制することがわかった。
【０００４】
シアリル化オリゴ糖の中で、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｃ及びジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースは人乳中に最も多く存在する要素である。
【０００５】
シアリル化オリゴ糖は複雑な構造を持つので、その化学的あるいは（化学−）酵素的合成は困難であり、立体化学の制御、特定の結合の形成、原料の入手可能性等多くの難点を伴う。その結果、市販のシアリル化オリゴ糖は、天然源での量が少ないため、非常に高価であった。
【０００６】
このため、シアリル化オリゴ糖を産生する微生物の代謝工学における努力がなされてきた。何故ならばこのアプローチが工業規模でＨＭＯを産生するための最も有望な方法であるからである。微生物発酵によるＳＨＭＯの産生のために、微生物は、典型的には、外因性シアル酸の存在下で培養される。
【０００７】
国際公開ＷＯ２００７／１０１８６２Ａ１号は、微生物を培養培地中で培養することによって細胞内ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃプールに依存するシアリル化オリゴ糖の大規模なインビボ合成のための方法を開示しており、ここで、微生物は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼ、シアル酸シンターゼ、ＧｌｃＮＡｃ−６−リン酸２エピメラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼをコードする異種遺伝子を含む。さらに、シアル酸アルドラーゼ（ＮａｎＡ）及びＭａｎＮａｃキナーゼ（ＮａｎＫ）をコードする内在性遺伝子を欠失させた。
【０００８】
国際公開ＷＯ２０１４／１５３２５３Ａ１号には、シアリル化オリゴ糖を産生するように細菌を操作する方法及び組成物、並びに細菌中でシアリル化オリゴ糖を産生する方法が開示されており、この細菌は、外因性シアリルトランスフェラーゼ、欠損シアル酸異化経路、シアル酸合成能、及び機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含み、ここで前記細菌はラクトースの存在下で培養される。シアル酸合成能は、外因性ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼ、外因性シアル酸シンターゼ、及び外因性ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼを発現することを含む。
【０００９】
しかし、発酵中に外因性シアル酸の存在及び／又は添加を必要としない微生物発酵によりシアル化オリゴ糖を産生することが望ましい。また、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）の細胞内プールにアクセスする必要なく微生物によりシアル化オリゴ糖を産生することが望ましく、何故ならばこれは細胞にとってエネルギー的に有益であると考えられているためである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００７／１０１８６２号
【特許文献２】国際公開第２０１４／１５３２５３号
【発明の概要】
【００１１】
概要
この目的は、特に、外因性シアル酸の添加を必要としないシアリル化糖の全細胞発酵生産の方法を提供することにより、及び外因性シアル酸の非存在下でシアリル化糖を合成することができる遺伝子操作された微生物細胞により解決される。
【００１２】
一態様によれば、（ａ）（ｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＮＡｃ）の細胞内生合成のためのシアル酸生合成経路であって、グルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼを含むシアル酸生合成経路、（ｉｉ）シチジン５’−モノホスホ−（ＣＭＰ）−シアル酸シンテターゼ、（ｉｉｉ）異種シアリルトランスフェラーゼを含む少なくとも１つの遺伝子操作された微生物細胞を提供するステップ、ｂ）該少なくとも１つの遺伝子操作された微生物細胞を、発酵ブロス中で、及び該シアリル化糖の産生を許容する条件下で培養するステップ、並びに任意選択的ｃ）該シアリル化糖を回収することを含むシアリル化糖の産生方法が提供される。
【００１３】
別の態様によれば、シアリル化糖を産生するための遺伝子操作された微生物細胞が提供され、ここで、該微生物細胞は、（ｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸の細胞内生合成のためのシアル酸生合成経路であって、グルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼを含むシアル酸生合成経路、（ｉｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸をシチジン５’−一リン酸塩に移してＣＭＰ活性化Ｎ−アセチルノイラミン酸を生成するためのシチジン５’−モノホスホ−（ＣＭＰ）−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ、及び（ｉｉｉ）異種シアリルトランスフェラーゼを含む。
【００１４】
別の態様によると、本発明による方法又は遺伝子操作された微生物細胞によって産生可能なシアル化糖が提供される。
【００１５】
別の態様によれば、栄養組成物、好ましくは乳児用組成物を製造するための、本発明による方法又は遺伝子操作された微生物細胞によって産生されるシアリル化糖の使用が提供される。
【００１６】
さらに別の態様によれば、本発明による方法又は遺伝子操作された微生物細胞によって産生された少なくとも１種のシアリル化糖を含む栄養組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】シアリル化糖の発酵産生のために遺伝子操作された微生物細胞によっ使用され得るシアル酸生合成経路であって、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを利用するシアル酸生合成経路の模式図である。
【図２】シアリル化糖の発酵産生のために本発明の遺伝子操作された微生物細胞によって使用され得るシアル酸生合成経路の模式図である。
【図３】シアリル化糖の発酵産生のために本発明の遺伝子操作された微生物細胞によって使用され得る別のシアル酸生合成経路の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
第一の態様によれば、シアリル化糖の発酵産生のための方法が提供される。この方法は、ａ）シアリル化糖を合成することができる少なくとも１つの遺伝子操作された微生物細胞を、提供するステップであって、該少なくとも１つの遺伝子操作された微生物細胞は、（ｉ）グルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼを含むシアル酸生合成経路、（ｉｉ）シチジン５’−モノホスホ−（ＣＭＰ）−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ、及び（ｉｉｉ）異種シアリルトランスフェラーゼを含むステップ、ｂ）該少なくとも１つの遺伝子操作された微生物細胞を、発酵ブロス中で、該シアリル化糖の産生を許容する条件下で培養するステップ、任意選択的にｃ）該シアリル化糖を回収するステップを含む。
【００１９】
したがって、第２の態様において、本発明はまた、シアリル化糖の発酵産生のための、遺伝子操作された微生物細胞に関するものであり、ここで、該微生物細胞は、（ｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸の細胞内生合成のためのシアル酸生合成経路であって、グルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼを含むシアル酸生合成経路、（ｉｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸をシチジン５’−一リン酸塩に移してＣＭＰ活性化シアル酸を生成するためのシチジン５’−モノホスホ−（ＣＭＰ）−シアル酸シンテターゼ、及び（ｉｉｉ）供与体基質としてのＣＭＰ活性化シアル酸から受容体分子にＮ−アセチルノイラミン酸部分を移すためのシアリルトランスフェラーゼであって、受容体分子は糖分子であるシアリルトランスフェラーゼを含み、シアリル化糖の細胞内生合成をもたらす。
【００２０】
遺伝子操作された微生物細胞はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを利用しないＮ−アセチルノイラミン酸の細胞内生合成のためのシアル酸生合成経路を含む。この遺伝子操作された微生物細胞は、グルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼによるＮ−アセチルノイラミン酸の細胞内生合成のためのシアル酸生合成経路を含む。Ｎ−アセチルノイラミン酸の細胞内生合成にグルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼを用いるシアル酸生合成経路は、シアル酸の生合成にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを利用しない（図２及び図３）。
【００２１】
シアル酸生合成経路は、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼ及びＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの酵素活性を有する。シアル酸生合成経路はさらに、ａ）グルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルフルコサミン−６−リン酸ホスファターゼ及びＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼの酵素活性（図２）、及び／又はｂ）グルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチル−グルコサミン−６−リン酸エピメラーゼ及びＮ−アセチルマンノサミン−６−リン酸ホスファターゼの酵素活性（図３）を有する。したがって、遺伝子操作された微生物細胞が、ホスホグルコサミンムターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ  Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼの酵素活性と、それに付随するＵＤＰの放出（図１）を細胞内シアル酸生合成のために有する必要はない。このため、追加的及び／又は代替的な実施形態において、シアル酸を合成することができる遺伝子操作された微生物細胞は、ホスホグルコサミンムターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ  Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの酵素活性からなる群から選択される１つ以上の酵素活性と、それに付随するＵＤＰの放出とを有さない。
【００２２】
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１６）という酵素は、グルタミンを用いてフルクトース−６−リン酸塩（Ｆｒｃ−６Ｐ）からグルコサミン−６−リン酸塩（ＧｌｃＮ−６Ｐ）への変換を触媒する。この酵素反応は、典型的にはヘキソサミン生合成経路の最初のステップであると考えられている。グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼの別名は、Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼ、ＧＦＡＴ、グルコサミン−６−リン酸シンターゼ、ヘキソースリン酸アミノトランスフェラーゼ、及びＬ−グルタミン−Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼである。
【００２３】
追加的及び／又は代替的な実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼ、好ましくは異種グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼ、より好ましくは大腸菌（大腸菌ＧｌｍＳ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ１７１６９、配列番号６７）、又は大腸菌ＧｌｍＳの機能的バリアントに由来するグルタミン：フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼを有する。最も好ましくは、機能的バリアントは、野生型酵素が示すようにグルコサミン−６−リン酸塩阻害に対して有意に低下した感受性を示す大腸菌ＧｌｍＳの型である。グルコサミン−６−リン酸塩阻害に対して有意に低下した感受性を示す大腸菌ＧｌｍＳの機能的バリアントの例は、配列番号６８によって表される。
【００２４】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼ、好ましくは大腸菌グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼＧｌｍＳ（配列番号６９）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列は、野生型酵素（ｇｌｍＳ＊５４又はｇｌｍＳ＊（配列番号７０で表される）と比較してグルコサミン−６−リン酸塩阻害に対して有意に低下した感受性を示す大腸菌ＧｌｍＳの型である。
【００２５】
したがって、追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、
ｉ）配列番号６７及び配列番号６８のいずれか１つによって表される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ）配列番号６９及び配列番号７０のいずれか１つによって表されるヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号６７及び配列番号６８のいずれか１つによって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｉｖ）配列番号６９及び配列番号７０のいずれか１つによって表されるヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｖ）ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．及びｉｖのヌクレオチド配列のいずれか１つと相補的なヌクレオチド配列、
ｖｉ）ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．、ｉｖ．及びｖ．のヌクレオチド配列のいずれか１つの断片
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、かつ発現する核酸分子を含み、該ヌクレオチド配列は、細胞内グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼ活性を提供するために、遺伝子操作された微生物細胞において該ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を実施する少なくとも１つの核酸発現制御配列に操作可能に結合される。
【００２６】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、グルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する。前記グルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性は、ＧｌｃＮ−６ＰをＮ−アセチルグルコサミン−６−リン酸塩（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ）に変換する。グルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの一例は出芽酵母Ｇｎａ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ４３５７７、配列番号７７）である。
【００２７】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、グルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、好ましくは異種グルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、より好ましくは出芽酵母Ｇｎａ１（配列番号７８で表されるようなヌクレオチド配列によってコードされる）又はその機能的バリアントを含む。
【００２８】
したがって、追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、
ｉ）配列番号７７によって表される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ）配列番号７８によって表されるヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号７７によって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｉｖ）配列番号７８によって表されるヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｖ）ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．及びｉｖのヌクレオチド配列のいずれか１つと相補的なヌクレオチド配列、
ｖｉ）ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．、ｉｖ．及びｖ．のヌクレオチド配列のいずれか１つの断片
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、かつ発現する核酸分子を含み、該ヌクレオチド配列は、細胞内グルコサミン：フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼ活性を提供するために、遺伝子操作された微生物細胞において該ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を実施する少なくとも１つの核酸発現制御配列に操作可能に結合される。
【００２９】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸ホスファターゼ活性を有する。前記Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸ホスファターゼ活性は、ＧｌｃＮＡｃ−６ＰをＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に変換する。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸ホスファターゼの例は、ＧｌｃＮＡｃへのＧｌｃＮＡｃ６Ｐの変換を触媒するＨＡＤ様上科の糖ホスファターゼである。酵素のＨＡＤ様上科は細菌の酵素であるハロ酸デヒドロゲナーゼにちなんで命名され、ホスファターゼを含む。ＧｌｃＮＡｃへのＧｌｃＮＡｃ６Ｐの変換を触媒するＨＡＤ型上科の適切なホスファターゼを、フルクトース−１−リン酸ホスファターゼ（ＹｑａＢ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ７７４７５、配列番号７９）及びアルファ−Ｄ−グルコース１−リン酸ホスファターゼ（ＹｉｈＸ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０Ａ８Ｙ３、配列番号８０）からなる群から選択することができる。大腸菌ＹｑａＢ及び大腸菌ＹｉｈＸ酵素は、ＧｌｃＮＡｃ６Ｐにも作用すると考えられている（Ｌｅｅ，Ｓ．−Ｗ．及びＯｈ，Ｍ．−Ｋ．（２０１５）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２８：１４３−１５０）。
【００３０】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、ＧｌｃＮＡｃへのＧｌｃＮＡｃ−６Ｐの変換を触媒するＨＡＤ様上科の糖ホスファターゼは、遺伝子操作された微生物細胞における異種酵素である。追加的及び／又は代替的な実施形態において、ＧｌｃＮＡｃへのＧｌｃＮＡｃ６Ｐの変換を触媒するＨＡＤ様上科の糖ホスファターゼは、大腸菌ＹｑａＢ、大腸菌ＹｉｈＸ、及びそれらの機能的バリアントからなる群から選択される。
【００３１】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、ＧｌｃＮＡｃへのＧｌｃＮＡｃ６Ｐの変換を触媒するＨＡＤ様上科の糖ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ発現する核酸分子を含む。追加的及び／又は代替的な実施形態において、ＧｌｃＮＡｃへのＧｌｃＮＡｃ６Ｐの変換を触媒するＨＡＤ様上科の糖ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列である。追加的及び／又は代替的な実施形態において、ＧｌｃＮＡｃへのＧｌｃＮＡｃ６Ｐの変換を触媒するＨＡＤ様上科の糖ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列は、大腸菌フルクトース−１−リン酸ホスファターゼ又は大腸菌アルファ−Ｄ−グルコース１−リン酸ホスファターゼ又はこれら２つの酵素のうちの１つの機能的断片をコードする。
【００３２】
大腸菌ＹｑａＢは、配列番号８１で表されるヌクレオチド配列によってコードされており、大腸菌ＹｉｈＸは、配列番号８２で表されるヌクレオチド配列によってコードされる。したがって、追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、
ｉ）配列番号７９及び配列番号８０のいずれか１つによって表される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ）配列番号８１及び配列番号８２のいずれか１つによって表されるヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号７９及び配列番号８０のいずれか１つによって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｉｖ）配列番号８１及び配列番号８２のいずれか１つによって表されるヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｖ）ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．及びｉｖのヌクレオチド配列のいずれか１つと相補的なヌクレオチド配列、
ｖｉ）ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．、ｉｖ．及びｖ．のヌクレオチド配列のいずれか１つの断片
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、かつ発現する核酸分子を含み、該ヌクレオチド配列は、ＧｌｃＮＡｃへのＧｌｃＮＡｃ６Ｐの変換を触媒する細胞内糖ホスファターゼ活性を提供するために、遺伝子操作された微生物細胞において該ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を実施する少なくとも１つの核酸発現制御配列に操作可能に結合される。
【００３３】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、ＧｌｃＮＡｃへのＧｌｃＮＡｃ６Ｐの変換を触媒するＨＡＤ様上科の糖ホスファターゼ又は該ＨＡＤホスファターゼの機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み、及び／又はＨＡＤ様の糖ホスファターゼを含むように、自然に存在しない微生物を遺伝子操作した。
【００３４】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する。Ｎ−セチルグルコサミン２−エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．８）はＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）へのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の変換を触媒する酵素である。本酵素は炭水化物及びその誘導体に作用するラセマーゼである。この酵素クラスの系統名はＮ−アシル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼである。この酵素は、アミノ−糖代謝及びヌクレオチド−糖代謝に関与し、好ましくは異種Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼである。
【００３５】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ、好ましくは異種Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼを含む。Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼの例は、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、アカリオクロリス種（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ノストク種（Ｎｏｓｔｏｃ）、ノストク・プンクチフォルメ（ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、バクテロイデス・オバツス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ）又はシネコシスティス種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）から説明された。適切なＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼの例は、遺伝子ＢＡＣＯＶＡ＿０１８１６（配列番号８５）によってコードされるＢ．オバツスＡＴＣＣ８４８３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ７ＬＶＧ６、配列番号８３）のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼである。別の例はシネコシスティス種（ＰＣＣ６８０３株）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ７４１２４、配列番号８４）のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼであり、これはレニン結合タンパク質としても知られており、ｓｌｒ１９７５遺伝子（配列番号８６）によってコードされる。
【００３６】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ、好ましくはＢ．オバツスＡＴＣＣ８４８３又はシネコシスティス種（ＰＣＣ６８０３株）のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ、又はその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。
【００３７】
したがって、追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、
ｉ）配列番号８３及び配列番号８４のいずれか１つによって表される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ）配列番号８５及び配列番号８６のいずれか１つによって表されるヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号８３及び配列番号８４のいずれか１つによって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｉｖ）配列番号８５及び配列番号８６のいずれか１つによって表されるヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｖ）ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．及びｉｖのヌクレオチド配列のいずれか１つと相補的なヌクレオチド配列、
ｖｉ）ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．、ｉｖ．及びｖ．のヌクレオチド配列のいずれか１つの断片
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、かつ発現する核酸分子を含み、該ヌクレオチド配列は、細胞内Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を提供するために、遺伝子操作された微生物細胞において該ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を実施する少なくとも１つの核酸発現制御配列に操作可能に結合される。
【００３８】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸エピメラーゼ活性及びＮ−アセチルマンノサミン−６−リン酸ホスファターゼ活性を有する。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファターゼエピメラーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸塩（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ）をＮ−アセチルマンノサミン−６−リン酸塩（ＭａｎＮＡｃ−６Ｐ）に変換し、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−リン酸ホスファターゼは、ＭａｎＮＡｃ−６Ｐを脱リン酸化してＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）を与える。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸エピメラーゼ活性及びＮ−アセチルマンノサミン−６−リン酸ホスファターゼ活性を有することにより、Ｎｅｕ５Ａｃ産生のためにＭａｎＮＡｃを提供する追加的又は代替的な方法が提供される。
【００３９】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸エピメラーゼを含む。適切なＮ−アセチルグルコサミン−６−リン酸エピメラーゼの例は、大腸菌ｎａｎＥ遺伝子（配列番号８８）によってコードされる大腸菌ＮａｎＥ（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  Ｐ０Ａ７６１、配列番号８７）である。
【００４０】
したがって、追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列、好ましくは大腸菌ＮａｎＥをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ発現する核酸分子を含む。
【００４１】
したがって、追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、
ｉ）配列番号８７によって表される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ）配列番号８８によって表されるヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号８７によって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｉｖ）配列番号８８によって表されるヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｖ）ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．及びｉｖのヌクレオチド配列のいずれか１つと相補的なヌクレオチド配列、
ｖｉ）ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．、ｉｖ．及びｖ．のヌクレオチド配列のいずれか１つの断片
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、かつ発現する核酸分子を含み、該ヌクレオチド配列は、細胞内Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸エピメラーゼ活性を提供するために、遺伝子操作された微生物細胞において該ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を実施する少なくとも１つの核酸発現制御配列に操作可能に結合される。
【００４２】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−リン酸ホスファターゼを含む。
【００４３】
したがって、追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−リン酸ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ発現する核酸分子を含む。
【００４４】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、シアル酸シンターゼ活性を含む。シアル酸シンターゼは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）へのＭａｎＮＡｃとホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）の縮合を触媒する。
【００４５】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、シアル酸シンターゼ又はその機能的バリアント、好ましくは異種シアル酸シンターゼを含む。シアル酸シンターゼの例は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ブチリビブリオ・プロテオクラスティカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、メタノブレビバクター・ルミナティウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｔｉｕｍ）、アセトバクテリウム・ウッディー（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ）、デスルフォバクラ・トルオリカ（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｕｌａ  ｔｏｌｕｏｌｉｃａ）、大腸菌、プレボテラ・ニグレセンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｎｉｇｅｓｃｅｎｓ）、ハロルハブヅス・ティアマテ（Ｈａｌｏｒｈａｂｄｕｓ  ｔｉａｍａｔｅａ）、デスルフォティグヌム・ホスフィトキシダンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｉｇｎｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｉｔｏｘｉｄａｎｓ）、又はカンディダツス・スカリンドゥア種（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｓｃａｌｉｎｄｕａ）、イディオマリナ・ロイヒエンシス（Ｉｄｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）又はナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のような種々の細菌種から知られている。好ましくは、シアル酸シンターゼは、Ｃ．ジェジュニｎｅｕＢ遺伝子（配列番号９０）によってコードされるＣ．ジェジュニのＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼＮｅｕＢ（配列番号８９）である。
【００４６】
したがって、追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、
ｉ）配列番号８９によって表される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ）配列番号９０によって表されるヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号８９によって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｉｖ）配列番号９０によって表されるヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｖ）ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．及びｉｖのヌクレオチド配列のいずれか１つと相補的なヌクレオチド配列、
ｖｉ）ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．、ｉｖ．及びｖ．のヌクレオチド配列のいずれか１つの断片
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、かつ発現する核酸分子を含み、該ヌクレオチド配列は、細胞内Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ活性を提供するために、遺伝子操作された微生物細胞において該ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を実施する少なくとも１つの核酸発現制御配列に操作可能に結合される。
【００４７】
遺伝子操作された微生物細胞は、シチジン５’−一リン酸塩をＮ−アセチルノイラミン酸に移してＣＭＰ活性化Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃ）を生成するためのシチジン５’−モノホスホ−（ＣＭＰ）−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ活性を有する。いくつかの５’−モノホスホ−（ＣＭＰ）−シアル酸シンテターゼが当技術分野で知られ、記載されており、例えば、大腸菌、ナイセリア・メニンギティディス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス種等由来の５’−モノホスホ（ＣＭＰ）−シアル酸シンテターゼがある。
【００４８】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、シチジン５’−モノホスホ−（ＣＭＰ）−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ、好ましくは異種シチジン５’−モノホスホノ−（ＣＭＰ）−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセテーゼ、より好ましくは大腸菌由来のＮ−アセチルノイラミン酸シチジルトランスフェラーゼＮｅｕＡを含む。大腸菌ＮｅｕＡ（ＵｎｉｔＰｒｏｔＫＢ−Ｐ１３２６６、配列番号９１）は、大腸菌ｎｅｕＡ遺伝子（配列番号９２）によってコードされている。
【００４９】
したがって、追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、
ｉ）配列番号９１によって表される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ）配列番号９２によって表されるヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号９１によって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｉｖ）配列番号９２によって表されるヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｖ）ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．及びｉｖのヌクレオチド配列のいずれか１つと相補的なヌクレオチド配列、
ｖｉ）ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．、ｉｖ．及びｖ．のヌクレオチド配列のいずれか１つの断片
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、かつ発現する核酸分子を含み、該ヌクレオチド配列は、Ｎ−アセチルノイラミン酸シチジルトランスフェラーゼ活性を提供するために、遺伝子操作された微生物細胞において該ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を実施する少なくとも１つの核酸発現制御配列に操作可能に結合される。
【００５０】
遺伝子操作された微生物細胞は、シアリルトランスフェラーゼ活性、好ましくは異種シアリルトランスフェラーゼ活性、より好ましくはα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ活性及び／又はα−２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性からなる群から選択されるシアリルトランスフェラーゼ活性を有する。シアリルトランスフェラーゼ活性は、Ｎ−アセチルノイラミン酸部分をＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃから受容体分子に移すことができ、ここで、受容体分子は糖分子であり、シアリル化糖を提供する。
【００５１】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、少なくとも１種のシアリルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくとも１種の異種シアリルトランスフェラーゼを含み、ここで、シアリルトランスフェラーゼは、供与体基質としてのＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃから受容体糖へＮｅｕＮＡｃ部分を移すためのα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性及び／又はα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ活性及び／又はα−２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性を有することができる。
【００５２】
本明細書中で使用される「シアリルトランスフェラーゼ」という用語は、シアリルトランスフェラーゼ活性を有することができるポリペプチドを指す。「シアリルトランスフェラーゼ活性」とは、シアル酸残基、好ましくはＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）残基を供与体基質から受容体分子へ移すことを指す。「シアリルトランスフェラーゼ」という用語は、本明細書に記載されているシアリルトランスフェラーゼの機能的断片、本明細書に記載されているシアリルトランスフェラーゼの機能的バリアント、及び該機能的バリアントの機能的断片を含む。この点で「機能的」とは、断片及び／又はバリアントがシアリルトランスフェラーゼ活性を有することができることを意味する。シアリルトランスフェラーゼの機能的断片は、自然に存在する遺伝子によってコードされるシアリルトランスフェラーゼの切断型を包含し、この切断型はシアリルトランスフェラーゼ活性を有することができる。切断型の例は典型的にはポリペプチドを特定の細胞内局在化に導く、いわゆるリーダー配列を含まないシアリルトランスフェラーゼである。典型的には、そのようなリーダー配列は、その細胞内輸送の間にポリペプチドから除去され、自然界に存在する成熟シアリルトランスフェラーゼにも存在しない。
【００５３】
異種シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸残基を供与体基質から受容体分子に移すことができる。異種シアリルトランスフェラーゼに関して「できる」という用語は、異種シアリルトランスフェラーゼのシアリルトランスフェラーゼ活性を指し、異種シアリルトランスフェラーゼがその酵素活性を有するためには適切な反応条件が必要であるという条件を指す。適切な反応条件が欠ける場合、異種シアリルトランスフェラーゼはその酵素活性を持たないが、その酵素活性を保持し、適切な反応条件が回復するとその酵素活性を有する。適切な反応条件は、適切な供与体基質の存在、適切な受容体分子の存在、例えば、−一価又は二価イオン等の必須補因子の存在、適切な範囲のｐＨ値、適切な温度等を含む。異種シアリルトランスフェラーゼの酵素反応に影響するありとあらゆる因子の最適値を満たす必要はないが、反応条件は異種シアリルトランスフェラーゼがその酵素活性を及ぼすようなものでなければならない。したがって、「できる」という用語は、異種シアリルトランスフェラーゼの酵素活性が不可逆的に損なわれたあらゆる条件を除外し、また異種シアリルトランスフェラーゼのそのような条件への曝露を除外する。その代わりに、「できる」とは、シアリルトランスフェラーゼが酵素活性を有する、すなわち、許容反応条件（シアリルトランスフェラーゼがその酵素活性を及ぼすために必要な全ての要件）をシアリルトランスフェラーゼに提供するなら、そのシアリルトランスフェラーゼ活性を有することを意味する。
【００５４】
シアリルトランスフェラーゼは、それらが形成する糖結合の種類について区別することができる。本明細書中で使用される「α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ」及び「α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性」という用語は、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン又は受容体分子のガラクトース残基又はＮ−アセチルガラクトサミン残基にα−２，３結合を有するシアル酸残基を付加するポリペプチド及びそれらの酵素活性を指す。同様に、「α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ」及び「α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ活性」という用語は、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン又は受容体分子のガラクトース残基又はＮ−アセチルガラクトサミン残基にα−２，６結合を有するシアル酸残基を付加するポリペプチド及びそれらの酵素活性を指す。同様に、「α−２，８−シアリルトランスフェラーゼ」及び「α−２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性」という用語は、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン又は受容体分子のガラクトース残基又はＮ−アセチルガラクトサミン残基にα−２，８結合を有するシアル酸残基を付加するポリペプチド及びそれらの酵素活性を指す。
【００５５】
したがって、追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、
Ｉ．配列番号１〜３３のいずれか１つによって表される、アミノ酸配列を含むか、これからなるポリペプチド、
ＩＩ．配列番号１〜３３のいずれか１つによって表される、アミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これからなるペプチド、
ＩＩＩ．Ｉ．及びＩＩ．のポリペプチドのいずれか１つの断片
からなる群から好ましくは選択される異種シアリルトランスフェラーゼを含む。
【００５６】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、異種シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ発現する核酸分子を含むように形質転換されている。好ましくは、ヌクレオチド配列は、表１から推測できる。追加的及び／又は代替的な実施形態において、このヌクレオチド配列は、
ｉ．配列番号１〜３３のいずれか１つによって表される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ．配列番号３４〜６６のいずれか１つによって表されるヌクレオチド配列、
ｉｉｉ．配列番号１〜３３のいずれか１つによって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｉｖ．配列番号３４〜６６によって表されるヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｖ．ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．及びｉｖのヌクレオチド配列のいずれか１つと相補的なヌクレオチド配列、
ｖｉ．ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．、ｉｖ．及びｖ．のヌクレオチド配列のいずれか１つの断片
からなる群から選択され、該ヌクレオチド配列は、シアリルトランスフェラーゼ活性を提供するために、遺伝子操作された微生物細胞において該ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を実施する少なくとも１つの核酸発現制御配列に操作可能に結合される。
【００５７】
【表１】
2021525522.tif 000003
2021525522.tif 000004
【００５８】
表１：シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列の一覧。シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を、野生型タンパク質コード領域と比較して、全長構築物（ＦＬ）として、又は予測シグナルペプチド（Δ）なしでクローニングした。Δの後ろの数は、対応する配列から欠失したＮ末端アミノ酸を示す。
【００５９】
「配列番号１〜３３のいずれか１つ」という表現は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３からなる群のいずれか１つを指す。同じ原則が、「配列番号３４〜６６のいずれか１つ」という表現にもあてはまる。一般的に言えば、「配列番号Ｘ〜Ｚのいずれか１つ」という表現であって、「Ｘ」及び「Ｚ」が自然数を表すものは、ＸからＺまでの識別番号を含む「配列番号」のいずれか１つによって表される全ての配列（ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列）を指す。
【００６０】
さらに、遺伝子操作された微生物細胞は、異種シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を発現するように遺伝子操作されている。この目的のために、異種シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、遺伝子操作された細胞において、異種シアリルトランスフェラーゼをコードする該ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を実施する少なくとも１つの発現制御に操作可能に結合される。
【００６１】
本明細書中で使用される「操作可能に結合される」という用語は、異種シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、核酸発現制御配列（プロモーター、オペレーター、エンハンサー、調節因子、転写因子結合部位のアレイ、転写ターミネーター、リボソーム結合部位等）間の機能的結合を指し、ここで、発現制御配列は、異種シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列に対応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼす。したがって、「プロモーター」という用語は、ＤＮＡポリマー中の遺伝子に通常「先行」し、ｍＲＮＡへの転写の開始部位を提供するＤＮＡ配列を指定する。「調節因子」ＤＮＡ配列も、通常、所定のＤＮＡポリマー中の遺伝子の「上流」に位置し（すなわち、先行し）、転写開始の頻度（又は速度）を決定するタンパク質と結合する。「プロモーター／調節因子」又は「制御」ＤＮＡ配列と総称される、機能的ＤＮＡポリマー中の選択された遺伝子（又は一連の遺伝子）に先行するこれらの配列は、遺伝子の転写（及び最終的な発現）が起こるか否かを決定するために協働する。ＤＮＡポリマー中の遺伝子に「続き」、ｍＲＮＡへの転写の終了のシグナルを提供するＤＮＡ配列は、転写「ターミネーター」配列と呼ばれる。
【００６２】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有することができる異種シアリルトランスフェラーゼは、
Ｉ．配列番号１〜２７のいずれか１つによって表される、アミノ酸配列を含むか、これからなるポリペプチド、
ＩＩ．配列番号１〜２７のいずれか１つによって表される、アミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これからなるペプチド、
ＩＩＩ．Ｉ．及びＩＩ．のポリペプチドのいずれか１つの断片
からなる群から選択される。
【００６３】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有することができる異種シアリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み、ここで、少なくとも１つのヌクレオチド配列は、
ｉ．配列番号１〜２７のいずれか１つによって表される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ．配列番号３４〜６０のいずれか１つによって表されるヌクレオチド配列、
ｉｉｉ．配列番号１〜２７のいずれか１つによって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｉｖ．配列番号３４〜６０によって表されるヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｖ．ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．及びｉｖのヌクレオチド配列のいずれか１つと相補的なヌクレオチド配列、
ｖｉ．ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．、ｉｖ．及びｖ．のヌクレオチド配列のいずれか１つのいずれか１つの断片
からなる群から選択され、該ヌクレオチド配列は、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を提供するために、遺伝子操作された微生物細胞において該ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を実施する少なくとも１つの核酸発現制御配列に操作可能に結合される。
【００６４】
追加的及び／又は代替的な実施態様において、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有することができる異種シアリルトランスフェラーゼは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いるＬＬＴシアリル化の定量分析による配列番号２７で表されるシアリルトランスフェラーゼの相対的効力と比較して、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１０，０００倍の相対的効力を有する。
【００６５】
別の実施形態において、異種シアリルトランスフェラーゼは、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ活性を有することができる。
【００６６】
追加的な実施形態において、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ活性を有することができる異種シアリルトランスフェラーゼは、
Ｉ．配列番号２８〜３３のいずれか１つによって表される、アミノ酸配列を含むか、これからなるポリペプチド、
ＩＩ．配列番号２８〜３３のいずれか１つによって表される、アミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これからなるペプチド、
ＩＩＩ．Ｉ．及びＩＩ．のポリペプチドのいずれか１つの断片
からなる群から好ましくは選択される。
【００６７】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ活性を有することができる異種シアリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み、ここで少なくとも１つのヌクレオチド配列は、
ｉ．配列番号２８〜３３のいずれか１つによって表される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ．配列番号６１〜６６のいずれか１つによって表されるヌクレオチド配列、
ｉｉｉ．配列番号２８〜３３のいずれか１つによって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｉｖ．配列番号６１〜６６によって表されるヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｖ．ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．及びｉｖのヌクレオチド配列のいずれか１つと相補的なヌクレオチド配列、
ｖｉ．ｉ．、ｉｉ．、ｉｉｉ．、ｉｖ．及びｖ．のヌクレオチド配列のいずれか１つの断片
からなる群から選択され、該ヌクレオチド配列は、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ活性を提供するために、遺伝子操作された微生物細胞において該ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を実施する少なくとも１つの核酸発現制御配列に操作可能に結合される。
【００６８】
追加的及び／又は代替的な実施態様において、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ活性を有することができる異種シアリルトランスフェラーゼは、ＬＮＴシアリル化の定量分析による配列番号３３で表されるシアリルトランスフェラーゼの相対的効力と比較して、少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも２００倍、最も好ましくは少なくとも３００倍の相対的効力を有する。
【００６９】
追加的及び／又は代替的な実施態様において、異種シアリルトランスフェラーゼは、α−２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性を有することができる。α−２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性を有することができる異種シアリルトランスフェラーゼの例は、カンピロバクター・ジェジュニＯＨ４３８４のシアリルトランスフェラーゼＣｓｔＩＩである。
【００７０】
シアリルトランスフェラーゼは、例えばＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）残基のようなシアル酸残基を、例えばＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃのような供与体基質から受容体分子に移すことができる。受容体分子は糖分子であり、好ましくは表２に示す糖分子である。
【００７１】
【表２】
2021525522.tif 000005
2021525522.tif 000006
【００７２】
表２：シアリル化糖の産生のための受容体基質として用いられ得る糖の一覧。シアリル化糖自体もまた、さらなるシアリル化糖の産生のための受容体基質として使用され得る。
【００７３】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、受容体分子は単糖であり、好ましくはＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトース及びＮ−アセチルガラクトサミンからなる群から選択される単糖である。
【００７４】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、受容体分子は二糖であり、好ましくはラクトース、ラクツロース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ラクツロース及びメリビオースからなる群から選択される二糖である。
【００７５】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、受容体分子は三糖であり、好ましくはラフィノース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、６’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、３’−ガラクトシルラクトース及び６’−ガラクトシルラクトースからなる群から選択される三糖である。
【００７６】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、受容体分子は四糖であり、好ましくはラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、２’３−ジフコシルラクトース、３−フコシル−３’−シアリルラクトース及び３−フコシル−６’−シアリルラクトースからなる群から選択される四糖である。
【００７７】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、受容体分子は五糖であり、好ましくはシアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｃ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ及びラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶからなる群から選択される五糖である。
【００７８】
本明細書において言及される酵素に関して本明細書で使用される「機能的バリアント」という用語は、活性を喪失することなく指定された酵素のポリペプチドバリアントを指し、そのポリペプチドバリアントは、指定された酵素のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を共有する。このことは、これらのポリペプチドが由来するゲノム配列データにある程度のばらつきがある可能性、また、これらのポリペプチドに存在するアミノ酸のいくつかが、酵素の触媒活性に大きな影響を与えずに置換できる可能性を考慮に入れている。
【００７９】
「機能的バリアント」という用語はまた、触媒活性の有意な損失を伴わない酵素の切断されたバリアントを表す、指定された酵素のポリペプチドバリアントを含む。したがって、切断されたバリアントのアミノ酸配列は、１つ、２つ又は３つ以上の連続したアミノ酸の伸長が存在しないという点で、指定された酵素のアミノ酸配列とは異なる可能性がある。切断はアミノ末端（Ｎ末端）、カルボキシル末端（Ｃ末端）及び／又は指定された酵素のアミノ酸配列内であり得る。
【００８０】
「操作可能に結合された」という用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸配列との間の機能的結合を指し、ここで、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼす。
【００８１】
前記酵素をコードする１つ以上の遺伝子を既に保有し、かつＮｅｕＮＡｃ、ＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃ及び／又はシアリル化糖を産生するのに十分な方法で前記遺伝子を発現する微生物細胞は、シアル酸生合成を完了し、シアル酸部分を糖受容体に移すように遺伝子操作される必要はないが、それにもかかわらず、例えばグルタミン：フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼ、グルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸ホスファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ並びに／又はＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの量等、前記１つ以上の遺伝子産物の細胞内濃度を増加させるように前記遺伝子の１つ以上の発現レベルを変化させるように遺伝子操作されてもよく、その結果、遺伝子操作された細胞においてＮｅｕ５Ａｃ生合成速度を増加させ、その結果シアリル化糖の速度を増加させることができる。
【００８２】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、該細胞の野生型よりも多くのＰＥＰを合成する。追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、増強されたＰＥＰ生合成経路を有するように遺伝子操作されている。好ましくは、遺伝子操作された微生物細胞は、例えばホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子をコードするｐｐｓＡ遺伝子が過剰発現される、及び／又は自然に存在しない微生物がホスホエノールピルビン酸シンターゼ又はその機能的バリアントの発現を可能にするヌクレオチド配列の少なくとも１つの追加コピーを含むという点で、向上したホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性を有するように遺伝子操作されている。ｐｐｓＡの過剰発現は、シアル酸の産生のためにより多くのＰＥＰが利用できるように、細胞内ＰＥＰ合成を高める。例えば適切なホスホエノールピルビン酸シンターゼは大腸菌のＰｐｓＡである。
【００８３】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、大腸菌ＰｐｓＡ又はその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。大腸菌ＰｐｓＡ又はその機能的バリアントをコードする前記ヌクレオチド配列は、大腸菌ｐｐｓＡ遺伝子と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００８４】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、スクロースパーミアーゼ、スクロースヒドロラーゼ、フルクトキナーゼ、Ｌ−グルタミン：Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼ、グルコサミン−６−リン酸−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、シアル酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼからなる群から選択される酵素活性を有することができるポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子をさらに含んでおり、これらの遺伝子の少なくとも１つ、好ましくは全てが、野生型微生物細胞と比較して遺伝子操作された微生物細胞内で過剰発現される。
【００８５】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞の前駆細胞株において自然に生じるシアル酸異化経路が、遺伝子操作された微生物細胞において障害される。
【００８６】
前記方法及び遺伝子操作された微生物細胞の追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、遺伝子操作された微生物細胞の前駆細胞と比較して、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（例えば、ＮａｇＡ）、Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ（例えば、ＮａｇＫ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（＝Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、例えばＮａｎＡ等）、β−ガラクトシダーゼ、グルコサミン−６−リン酸デアミナーゼ、Ｎ−アセチル−グルコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ及び／又はＮ−アセチルマンノサミン−６−リン酸エピメラーゼからなる群から選択される１つ以上の酵素活性を欠くか、又は該活性が低下している。
【００８７】
前記方法及び遺伝子操作された微生物細胞の追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース−１−リン酸グアノシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ及びフコースキナーゼ／Ｌ−フコース−１−リン酸グアニルトランスフェラーゼからなる群から選択される酵素活性を有することができるポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子をさらに含む。
【００８８】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、機能的ラクトースパーミアーゼ、機能的シアル酸トランスポーター（エクスポーター）からなる群から選択される少なくとも１つを含み、好ましくは機能的ラクトースパーミアーゼ、機能的スクロースパーミアーゼ、機能的シアル酸トランスポーター（エクスポーター）からなる群から選択される１つをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、かつ発現し、好ましくはこれらのヌクレオチド配列の少なくとも１つが細胞内で過剰発現される。
【００８９】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、ＰＥＰを消費しない機構により前記唯一の炭素源を細胞内に移すことができるようにさらに組み換えられる。
【００９０】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、機能的スクロース利用システムを有する。前記機能的スクロース利用システムは、外因的に供給されたスクロースの細胞持ち込み及びその加水分解を可能にし、得られた単糖であるグルコース及びフルクトースを、遺伝子操作された細胞の代謝によって及び所望のシアリル化オリゴ糖産生のために代謝的に利用することができるようにする。
【００９１】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、機能的スクロース利用システムを有するように遺伝子組み換えされている。追加的及び／又は代替的な実施形態において、自然に存在しない微生物のスクロース利用システムは、スクロースプロトン共輸送系、フルクトキナーゼ、インベルターゼ及びスクロースオペロンリプレッサーを含む。
【００９２】
適切なスクロースプロトン共輸送系はＣｓｃＢであり、大腸菌のｃｓｃＢ遺伝子によってコードされており、例えば大腸菌のｃｓｃＢ遺伝子によってコードされている大腸菌のＣｓｃＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ３００００）である。
【００９３】
適切なフルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４）は、ｃｓｃＫ遺伝子によってコードされるＣｓｃＫであり、例えば大腸菌のｃｓｃＫ遺伝子によってコードされる大腸菌のＣｓｃＫ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ４０７１３）である
【００９４】
β−Ｄ−フルクトフラノシド中の末端非還元β−Ｄ−フルクトフラノシド残基を加水分解する適切なインベルターゼ（ＥＣ３．２．１．２６）はＣｓｃＡであり、例えば大腸菌のｃｓｃＡ遺伝子によってコードされる大腸菌のＣｓｃＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｏ８６０７６）である。
【００９５】
適切なスクロースオペロンリプレッサーは、ｃｓｃＲ遺伝子によってコードされるＣｓｃＲであり、例えば大腸菌のｃｓｃＲ遺伝子によってコードされる大腸菌のＣｓｃＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ６２６０４）である。
【００９６】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された細胞は、スクロースプロトン共輸送系、フルクトキナーゼ、インベルターゼ及びスクロースオペロンリプレッサー又はこれらのタンパク質のいずれか１つの機能的バリアントを有するように遺伝子操作されている。
【００９７】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された細胞は、スクロースプロトン共輸送系、フルクトキナーゼ、インベルターゼ及びスクロースオペロンリプレッサーの発現のために、スクロースプロトン共輸送系、フルクトキナーゼ、インベルターゼ及びスクロースオペロンリプレッサーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を有するように遺伝子操作されている。追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された細胞は、遺伝子ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、ｃｓｃＡ、好ましくは大腸菌遺伝子ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＲを発現するように遺伝子操作されている。
【００９８】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、ＣｓｃＢ、ＣｓｃＫ、ＣｓｃＡ又はＣｓｃＲの機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ大腸菌ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、ｃｓｃＡ又はｃｓｃＲと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００９９】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、自然に存在しない微生物は、β−ガラクトシドパーミアーゼ及びβ−ガラクトシダーゼを発現する。
【０１００】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、自然には存在しない微生物は、β−ガラクトシドパーミアーゼ、好ましくは大腸菌ラクトースパーミアーゼＬａｃＹ（配列番号９３）又はその機能的バリアント、及びβ−ガラクトシダーゼ、好ましくは大腸菌ＬａｃＺ（配列番号９５）又はその機能的バリアントを発現するように遺伝子操作されている。追加的及び／又は代替的な実施形態において、自然に存在しない微生物は、β−ガラクトシドパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列、好ましくは大腸菌ＬａｃＹ（配列番号９４）又はその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列、及び／又はβ−ガラクトシダーゼをコードするヌクレオチド配列、好ましくは大腸菌ＬａｃＺ（配列番号９６）又はその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を保有するように遺伝子操作されている。
【０１０１】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、大腸菌ＬａｃＹ又はその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列は、大腸菌ＬａｃＹと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１０２】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、大腸菌ＬａｃＺ又はその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列は、大腸菌ＬａｃＺと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１０３】
ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを産生することができ、かつ機能的β−ガラクトシドパーミアーゼ及び機能的β−ガラクトシダーゼを発現する自然に存在しない微生物は、唯一の炭素源としてのラクトース上で前記自然に存在しない微生物の培養を可能にする。
【０１０４】
シアリル化糖を生産できる遺伝子操作された微生物細胞は、任意選択的に追加の特徴を含むことができ、これらの追加の特徴を有するように遺伝子操作され得る。これらの追加の特徴は、より高いシアリル化糖収率をもたらす自然に存在しない微生物の生産性を向上させると考えられる。
【０１０５】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、ＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコース−１−リン酸トランスフェラーゼ活性を消失させるために、好ましくは、ｗｃａＪ遺伝子若しくはその機能的バリアントを欠失させることにより、ｗｃａＪ遺伝子若しくはその機能的バリアントの発現を損なうことにより、又は改変されたヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドがＷｃａＪの酵素活性を有さないように、そのタンパク質コード領域に突然変異を導入することによりＷｃａＪ酵素の活性を消失させることにより遺伝子操作されている。ＷｃａＪはＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコース−１−リン酸トランスファーゼをコードする。前記ＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコース−１−リン酸トランスファーゼは、コラン酸生合成における最初の酵素である。
【０１０６】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）が欠失しているか、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）の発現が損なわれているか、又はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列が改変されており、改変されたヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドがβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を有さない点で、遺伝子操作された微生物細胞が遺伝子操作されている。
【０１０７】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、ガラクトースキナーゼをコードする遺伝子（例えばｇａｌＫ遺伝子）が欠失しているか、ｇａｌＫ遺伝子の発現が損なわれているか、又はｇａｌＫ遺伝子のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列が改変されており、改変されたヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドがガラクトースキナーゼの酵素活性を有さない点で、遺伝子操作された微生物細胞が遺伝子操作されている。ｇａｌＫ遺伝子／ＧａｌＫの欠失又は不活性化は、遺伝子操作された微生物細胞がシアリル化反応のみの受容体基質としてガラクトースを利用できる点で有利である。
【０１０８】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ｎａｇＡ）をコードする遺伝子が欠失しているか、その発現が損なわれているか、又はそのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列が改変されており、改変されたヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドがＮ−アセチルガラクトサミニダーゼの酵素活性を有さない点で、遺伝子操作された微生物細胞が遺伝子操作されている。ｎａｇＡ／ＮａｇＡの欠失又は不活性化は、遺伝子操作された微生物細胞がシアリル化反応のみの受容体としてＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃ−６−リン酸塩を利用できる点で有利である。
【０１０９】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、フコースイソメラーゼ活性を消失させるために、好ましくはｆｕｃＩ遺伝子の欠失によって、又はｆｕｃＩ遺伝子の発現を損なうことによって、又は改変されたヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドがフコースイソメラーゼ活性を有さないようにｆｕｃＩ遺伝子のタンパク質コード領域を改変することによって、遺伝子操作されている。例えば大腸菌のＬ−フコースイソメラーゼＦｕｃＩ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ６９９２２）は、大腸菌のｆｕｃＩ遺伝子によってコードされる。
【０１１０】
フクロキナーゼはフコースのリン酸化を触媒する。フクロキナーゼは、Ｌ−フコースからＬ−ラクトアルデヒド及びグリセロンリン酸塩を合成する副経路の第２の酵素である。大腸菌フクロキナーゼＦｕｃＫ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ１１５５３）は大腸菌ｆｕｃＫ遺伝子によってコードされる。また、大腸菌フクロキナーゼは、Ｄ−リブロース、Ｄ−キシルロース及びＤ−フルクトースを低効率ではあるが、リン酸化することができる。
【０１１１】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された細胞は、フコースイソメラーゼ活性を消失させるために、好ましくはｆｕｃＫ遺伝子の欠失によって、又はｆｕｃＫ遺伝子の発現を損なうことによって、又は改変されたヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドがフコースイソメラーゼ活性を有さないように、ｆｕｃＫ遺伝子のタンパク質コード領域に突然変異を導入することによって、遺伝子操作されている。
【０１１２】
Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−リン酸デアセチラーゼは次の反応、すなわちＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン６−リン酸＋Ｈ２Ｏ→Ｄ−ガラクトサミン６−リン酸塩＋酢酸塩を触媒する。Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−リン酸デアセチラーゼはａｇａＡ遺伝子によってコードされる。大腸菌では、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−リン酸デアセチラーゼＡｇａＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ４２９０６）は大腸菌ａｇａＡ遺伝子によってコードされる。
【０１１３】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−リン酸デアセチラーゼ活性を消失させるために、好ましくはａｇａＡ遺伝子の欠失、ａｇａＡ遺伝子の発現の障害、又は改変されたヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドがＮ−アセチルガラクトサミン−６−リン酸デアセチラーゼ活性を有さないようにａｇａＡ遺伝子のタンパク質コード領域に突然変異を導入することによって、遺伝子操作されている。
【０１１４】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、少なくとも１つの遺伝子操作された微生物細胞は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−ガラクトース及びＧＤＰ−フコースからなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド活性化糖の産生増加を有する。好ましくは、少なくとも１つの遺伝子操作された微生物細胞は、ヌクレオチド活性化糖の１つ以上の産生増加を有するようにさらに遺伝子操作されている。前記ヌクレオチド活性化糖の少なくとも１つの産生は、該ヌクレオチド活性化糖の少なくとも１つの産生増加を有するようにさらに遺伝子操作される前に、さらに遺伝子操作された微生物細胞の前駆細胞における同じヌクレオチド活性化糖の産生と比較して、さらなる遺伝子操作された細胞において増加する。
【０１１５】
追加的及び／又は代替的な実施態様において、少なくとも１つの微生物細胞は、Ｌ−グルタミン：Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチル−グルコサミン−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース−１−リン酸グアノシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ及びフコースキナーゼ／Ｌ−フコース−１−リン酸グアニルトランスフェラーゼからなる群から選択される酵素活性を有することができるポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するようにさらに遺伝子操作されている。
【０１１６】
現在、そして一般分野において理解されており、ここではそれぞれ本明細書で論じる全てのポリヌクレオチド又は核酸に関して、１つ以上の遺伝子又はポリペプチドの過剰発現は、１以上の遺伝子又はポリペプチドの過剰発現を有するようにさらに遺伝子操作される前に、さらなる遺伝子操作された微生物細胞の前駆細胞と比較して過剰発現する。
【０１１７】
前記遺伝子の１以上の過剰発現は、遺伝子操作された微生物細胞内の対応するポリペプチド、すなわち酵素の量を増加させ、そのため細胞内の対応する酵素活性を増加させて、シアリル化糖類の細胞内産生を高める。
【０１１８】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、少なくとも１つの遺伝子操作された細胞は、遺伝子操作される前の細胞と比較して、β−ガラクトシダーゼ活性、グルコサミン−６−リン酸デアミナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−リン酸エピメラーゼ及びＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼからなる群から選択される１つ以上の酵素活性を欠くか、又は該活性が低下している。
【０１１９】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、β−ガラクトシダーゼ、グルコサミン−６−リン酸デアミナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−リン酸エピメラーゼ及びＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子の１つ以上が、遺伝子操作された細胞のゲノムから欠失しているか、又はβ−ガラクトシダーゼ、グルコサミン−６−リン酸デアミナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−リン酸エピメラーゼ及びＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子の１つ以上の発現が、細胞のさらなる遺伝子操作によって遺伝子操作された細胞において不活性化又は少なくとも低下している。前記遺伝子の発現は、前記遺伝子の発現を低下させるようにさらに遺伝子操作される前に、さらなる遺伝子操作された細胞の前駆細胞と比較して、さらなる遺伝子操作された細胞において低下している。
【０１２０】
遺伝子操作された微生物細胞、好ましくは原核細胞。適切な微生物細胞には、酵母細胞、細菌細胞、古細菌細胞、藻類細胞、及び真菌細胞が含まれる。
【０１２１】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された微生物細胞は、細菌細胞であり、好ましくは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スポロラクトバチルス種（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクロモモスポラ種（Ｍｉｃｒｏｍｏｍｏｓｐｏｒａ）、ミクロコッカス種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ロドコッカス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、及びプセウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からなる群から選択される細菌細胞である。適切な細菌種は、バチルス・スブティリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアグランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ラテロスポルス（ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ミコイデス（ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・プミルス（ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・セレウス（ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・シルクランス（ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（ｂｉｆｉｄｕｍ）、シトラバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・セルロリティクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・リュングダリ（ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・オートエタノゲヌム（ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・サーモフィレス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、大腸菌、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ（ポントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））、ラクトバチルス・アシドフィルス（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブルエッキイ（ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、パントエア・シトレア（ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａｚ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、プロプリオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、プセウドモナス・フルオレセンス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、プセウドモナス・アエルギノーサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ストレプトコッカス・サーモフィレス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）及びキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である。
【０１２２】
代替的な実施態様において、遺伝子操作された細胞は、酵母細胞であり、好ましくは、サッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、特にサッカロマイセス・セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス種、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ）、特にピキア・パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア種（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ロドトルラ種（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、及びシゾサッカロマイセス種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される。
【０１２３】
遺伝子操作された細胞は、ＮｅｕＮＡｃ生合成経路、シチジン５’−モノホスホ（ＣＭＰ）−シアル酸シンテターゼ活性、及びシアリルトランスフェラーゼ活性を含むように遺伝子操作されている。
【０１２４】
本明細書中で使用される「遺伝子操作された」という用語は、分子生物学的方法を用いる微生物細胞の遺伝子構成の組み換えを指す。微生物細胞の遺伝子構成の組み換えは、遺伝子発現を媒介及び／又は制御するヌクレオチド、トリプレット、遺伝子、オープンリーディングフレーム、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター及び他のヌクレオチド配列を挿入、欠失、置き換え及び組み換えする、種の境界内及び／又は種の境界を越えた遺伝子の移入を含み得る。微生物細胞の遺伝子構成の組み換えは、特定の所望の特性を有する遺伝子組換え生物を生成することを目的とする。遺伝子操作された微生物細胞は、細胞の天然型（遺伝子操作されていない）には存在しない１つ以上の遺伝子を含むことができる。細胞の遺伝情報のヌクレオチド配列を挿入、欠失又は変更するために、外因性核酸分子（組換え、異種）を細胞の遺伝情報に導入する及び／又は外因性核酸分子（組換え、異種）を挿入するための技術は、当業者に知られている。遺伝子操作された微生物細胞は、細胞の天然型に存在する１つ以上の遺伝子を含むことができ、ここで、この遺伝子は人工的手段によって組み換えられ、微生物細胞に再導入される。「遺伝子操作された」という用語はまた、細胞に対して内因性である核酸分子を含み、かつ細胞からこの核酸分子を除去することなく組み換えられた微生物細胞を包含する。このような組み換えには、遺伝子置換、部位特異的突然変異、及び関連技術によって得られるものが含まれる。
【０１２５】
本明細書で使用される「異種性」という用語は、細胞又は生物にとって異物であるポリペプチド、アミノ酸配列、核酸分子又はヌクレオチド配列、すなわち、該細胞又は生物において自然には生じないポリペプチド、アミノ酸配列、核酸分子又はヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される「異種配列」又は「異種核酸」又は「異種ポリペプチド」とは、特定の宿主細胞（例えば、異なる種由来）にとって異物の供給源に由来するもの、又は、同一の供給源に由来する場合は、その原形から組み換えられたものである。したがって、プロモーターに操作可能に結合された異種核酸は、プロモーターが由来したものとは異なる供給源由来であるか、又は同じ供給源に由来する場合には、その原形から組み換えられる。異種配列は、例えば、トランスフェクション、形質転換、接合又は形質導入によって、宿主微生物である宿主細胞のゲノムに安定に導入され得、このようにして、遺伝子的に組み換えられた宿主細胞を表す。配列を導入する宿主細胞に依存する技術を適用することができる。様々な技術は当業者に知られており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．(１９８９)に開示されている。したがって、「異種ポリペプチド」は、細胞内で自然には生じないポリペプチドであり、「異種シアリルトランスフェラーゼ」は、微生物細胞内で自然には生じないシアリルトランスフェラーゼである。
【０１２６】
態様において、シアリル化糖を、本明細書に記載されているように遺伝子操作された微生物細胞を用いる発酵によって、すなわち、全細胞生体触媒作用によって産生することができる方法が提供される。シアリル化糖の産生は、発酵ブロスへのＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン及び／又はＮ−アセチルノイラミン酸の添加及び／又はシアリル化糖の細胞内生合成のためのＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン及び／又はＮ−アセチルノイラミン酸の存在下での遺伝子操作された微生物細胞の培養を必要としない。
【０１２７】
この方法では、少なくとも１つの遺伝子操作された微生物細胞を、発酵ブロス中で、及び少なくとも１つのＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む糖の産生を許容する条件下で培養する。
【０１２８】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、発酵ブロスは少なくとも１つの炭素源を含み、少なくとも１つの炭素源は、グルコース、フルクトース、スクロース、グリセロール及びそれらの組合せからなる群から選択されることが好ましい。
【０１２９】
この方法及び遺伝子組換え／遺伝子操作された微生物細胞は発酵ブロス中に炭素源を用いるが、Ｎ−アセチルノイラミン酸は該遺伝子操作された微生物細胞により細胞内で生産されるので、発酵ブロスにグルコサミン及び／又はＮ−アセチルノイラミン酸及び／又はＮ−アセチルグルコサミン及び／又はＮ−アセチルマンノサミンを加える必要はない。したがって、追加的及び／又は代替的な実施形態において、少なくとも１つの遺伝子操作された微生物細胞は、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸からなる群から選択される１つ以上の非存在下及び／又は添加なしで培養される。ガラクトースがシアリルトランスフェラーゼ反応の受容体基質として供給されない限り、遺伝子操作された微生物細胞をガラクトースの非存在下及び／又はガラクトースの添加なしで培養することができる。追加的及び／又は代替的な実施形態において、少なくとも１つの遺伝子操作された微生物細胞は、１つ以上の単糖（例えば、ガラクトース）、二糖（例えば、ラクトース）、三糖（例えば、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ）、四糖（例えば、ラクト−Ｎ−テトラオース）及び／又は五糖（例えば、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ）の存在下で培養される。
【０１３０】
追加的及び／又は代替的な実施形態によれば、少なくとも１つの遺伝子操作された微生物細胞は、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ラクトース、ラクツロース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ラクト−Ｎ−トリオース、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、６’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、３’−ガラクトシルラクトース、６’−ガラクトシルラクトース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、２’３−ジフコシルラクトース、３−フコシル−３’−シアリルラクトース、及び３−フコシル−６’−シアリルラクトースからなる群から選択される少なくとも１つの受容体基質の存在下で培養される。これらの基質は細胞内に取り込まれ、細胞内で受容体分子として用いられる。
【０１３１】
遺伝子操作された細胞は、成長、増殖及びシアリル化オリゴ糖の産生のための炭素源を必要とする。追加的及び／又は代替的な実施形態において、遺伝子操作された細胞は、例えばグリセロール、グルコース又はスクロースのような、安価な唯一の炭素源上で増殖することができる。前記唯一の炭素源は、遺伝子操作された細胞においてＣＭＰ−シアル酸生合成のための遊離体を提供する。したがって、シアリル化オリゴ糖の産生のために、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ又はグルコサミン（ＧｌｃＮ）の存在下で遺伝子操作された細胞を培養する必要はない。
【０１３２】
この方法は、発酵ブロス中でのその培養の間に、少なくとも１つの遺伝子操作された微生物細胞によって産生されたシアル化糖を回収する任意のステップを含む。シアリル化糖は、遺伝子操作された微生物細胞が、例えば遠心分離によって除去された後に発酵ブロスから回収することができ、及び／又は、例えば、細胞が遠心分離によって発酵ブロスから回収され、細胞溶解工程に供されるという点で、細胞から回収することができる。続いて、シアリル化糖は、当業者に既知の適切な技術によって、発酵ブロス及び／又は細胞溶解物からさらに精製することができる。適切な技術としては、精密ろ過、限外濾過、透析ろ過、模擬移動床型クロマトグラフィー、電気透析、逆浸透、ゲルろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー等が挙げられる。
【０１３３】
この方法及びこの方法で用いられる遺伝子操作された微生物細胞は、シアリル化糖の産生に用いられる。「シアリル化糖」という用語は、少なくとも１つのＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む糖分子を指す。
【０１３４】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、シアリル化糖はオリゴ糖である。本明細書で使用される「オリゴ糖」という用語は、単糖残基のポリマーであって、該ポリマーが少なくとも２つの単糖残基を含むが、１０を超える単糖残基を含まないもの、好ましくは７を超えない単糖残基を含むものを指す。オリゴ糖は単糖の直鎖であるか、又は分岐しているもののいずれかである。さらに、オリゴ糖の単糖残基は多数の化学修飾を特徴とし得る。したがって、オリゴ糖は１つ以上の非糖部分を含むことができる。本明細書で使用される「シアリル化オリゴ糖」という用語は、１つ以上のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含むオリゴ糖を指す。
【０１３５】
追加的及び／又は代替的な実施形態によれば、シアリル化オリゴ糖は、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース（ｌａｃｔｓｅ）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｃ、フコシル−シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ、フコシル−シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ、フコシル−シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｃ、ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース、フコシルジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースＩ、フコシルジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースＩＩ、３’−シアリルガラクトース、６’−シアリルガラクトース、３’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン及び６’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンからなる群から選択される。
【０１３６】
本発明の別の態様において、全細胞発酵法においてシアリル化糖の産生のための、本明細書に記載された遺伝子操作された微生物細胞の使用が提供され、すなわち、シアリル化糖は遺伝子操作された微生物細胞によって合成される。
【０１３７】
本発明の別の態様において、上記の方法によって、及び／又は先に本明細書に記載された遺伝子操作された微生物細胞を用いることによって産生されたシアリル化糖が提供される。追加的及び／又は代替的な実施形態において、シアリル化糖はシアリル化オリゴ糖であり、３’−シアリルラクトース、６’−−シアリルラクトース（ｌａｃｏｔｓｅ）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｃ、フコシル−シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ、フコシル−シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ、フコシル−シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｃ、ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース、フコシルジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースＩ、フコシルジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースＩＩ、３’−シアリルガラクトース、６’−シアリルガラクトース、３’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン及び６’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンからなる群から選択されるシアリル化オリゴ糖であることが好ましい。
【０１３８】
本発明の別の態様において、栄養組成物の製造のために、本明細書に先に記載された方法及び／又は本明細書に先に記載された遺伝子操作された微生物細胞を使用することによって産生されたシアリル化糖の使用が提供される。
【０１３９】
したがって、本発明の別の態様によれば、本明細書に先に記載された方法によって及び／又は遺伝子操作された微生物細胞によって産生された、少なくとも１つのシアリル化糖、好ましくは少なくとも１つのシアリル化オリゴ糖を含有する栄養組成物が提供される。追加的及び／又は代替的な実施形態において、シアリル化オリゴ糖は、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース（ｌａｃｏｔｓｅ）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｃ、フコシル−シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ、フコシル−シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ、フコシル−シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｃ、ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース、フコシルジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースＩ、フコシルジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースＩＩからなる群から選択される。
【０１４０】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、栄養組成物は、さらに少なくとも１つの中性ＨＭＯ、好ましくは２’−ＦＬを含む。
【０１４１】
追加的及び／又は代替的な実施形態において、栄養組成物は３−ＳＬ、６−ＳＬ及び２’−ＦＬを含む。
【０１４２】
追加の実施形態において、栄養組成物は、医薬、薬物、製剤、乳児用調製物及び栄養補助食品からなる群から選択される。
【０１４３】
栄養組成物は、液体形態で存在するか、又は粉末、顆粒、フレーク及びペレットを含むが、これらに限定されない固形形態で存在し得る。
【０１４４】
本発明は、特定の実施態様に関してさらに記載されるが、本発明は、これに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、説明及び特許請求の範囲における第１、第２等の用語は、類似の要素を区別するために使用され、時間的、空間的、ランク付け又は他のいずれかの方法で順番を記述するために使用されるものでは必ずしもない。このように使用される用語は、適切な状況下では互換可能であり、本明細書に記載されている本発明の実施形態は、ここに記載又は図示されている以外の順番で操作可能であることが理解されるべきである。
【０１４５】
特許請求の範囲において使用される「含む」という用語は、その後に列挙された手段に限定されると解釈されるべきではない。したがって、それは他の要素又はステップを除外しない。よって、記載された特徴、言及された整数、ステップ又は構成要素の存在を特定するものと解釈されるが、一つ以上の他の特徴、整数、ステップ若しくは構成要素、又はそれらの群の存在又は追加を排除するものではない。したがって、「手段Ａ及びＢを含む装置」という表現の範囲は、構成要素Ａ及びＢのみからなる装置に限定されるべきではない。それは、本発明に関して、装置の唯一の関連する構成要素がＡ及びＢであることを意味する。
【０１４６】
この明細書全体にわたる「１つの実施形態」又は「実施形態」に対する言及は、実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造又は特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、この明細書全体にわたる様々な場所における「１つの実施形態」又は「実施形態」という語句の外観は、必ずしも全てが同じ実施形態を参照しているわけではないが、それも可能である。さらに、特定の特徴、構造又は特性は、本開示から当業者に明らかなように、任意の適切な方法で、１つ以上の実施形態で組み合わされてもよい。
【０１４７】
同様に、本発明の例示的な実施形態の説明において、本発明の様々な特徴は、開示を合理化し、様々な発明の態様の１つ以上の理解を助ける目的で、時に単一の実施形態、図、又はその説明にまとめられることが認識されるべきである。しかし、開示のこの方法は、請求された発明が各請求項において明示されているものを超える特徴を必要とするという意図を反映していると解釈されるべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が示すように、先に開示した単一の実施形態の全ての特徴よりも少ない特徴に発明的要素が存在する。したがって、詳細な説明に続く特許請求の範囲はこの詳細な説明に明示的に組み込まれ、各請求項は本発明の別個の実施形態としてそれ自体に基づく。
【０１４８】
さらに、本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるが他の特徴ではないいくつかの特徴を含むが、異なる実施形態の特徴の組合せは、本発明の範囲内であることを意味し、当業者によって理解されるであろうように、異なる実施形態を形成する。例えば、以下の特許請求の範囲では、請求された実施形態のいずれかを任意の組み合わせで用いることができる。
【０１４９】
さらに、実施形態のいくつかは、本明細書中では、コンピュータシステムの処理装置によって、又は機能を実行する他の手段によって実施することができる方法又は方法の要素の組合せとして記述される。このように、このような方法又は方法の要素を実施するために必要な指示を有する処理装置は、方法又は方法の要素を実施するための手段を形成する。さらに、装置の実施形態の本明細書に記載された要素は、本発明を実施する目的で該要素によって実行される機能を実施するための手段の一例である。
【０１５０】
本明細書に提供された説明及び図において、多数の具体的な詳細が示される。しかし、本発明の実施形態を、こうした特定の詳細なしで実施し得るということが理解される。他の例では、この記述の理解を不明瞭にしないために、周知の方法、構造及び技術は詳細には示されていない。
【０１５１】
以後、本発明は、本発明のいくつかの実施形態の詳細な説明によって記述される。本発明の他の実施形態は、本発明の真の精神又は技術的教示から逸脱することなく、当業者の知識に従って構成することができ、本発明は添付の特許請求範囲の用語によってのみ限定されることは明らかである。
【実施例】
【０１５２】
図１〜３は、ＮｅｕＮＡｃ、ＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃ及びシアリル化糖の細胞内生合成の代替経路を表示するスキームを示す。
【０１５３】
本明細書に記載するように遺伝子組み換えされた細胞では、シアリル化糖類の発酵産生を達成することができる。提供された唯一の炭素源（例えば、スクロース）が微生物細胞に取り込まれ、代謝されてフルクトース６−リン酸塩が得られる（図１〜図３）。次に、Ｌ−グルタミン：Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧｌｍＳ）がフルクトース−６−リン酸塩をグルコサミン−６−リン酸塩へ変換し（図１〜図３）、これが次にグルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｇｎａ１）によってＮ−アセチルグルコサミン−６−リン酸塩へと代謝される（図２及び図３）。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸塩は、ｉ）Ｎ−アセチルマンノサミン−６−リン酸エピメラーゼ（ＮａｎＥ）によりＮ−アセチルマンノサミン−６−リン酸塩に、さらにＮ−アセチルマンノサミン−６−リン酸ホスファターゼによりＮ−アセチルマンノサミンに（図３）変換され、又はｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸塩ホスファターゼ（ＹｉｈＸ／ＹｑａＢ）によりＮ−アセチルグルコサミンに変換され、さらにＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ（Ｓｌｒ１９７５）によりＮ−アセチルマンノサミンへさらに代謝される(図２)。シアル酸シンターゼ（ＮａｎＡ）はＮ−アセチルマンノサミンをＮ−アセチルノイラミン酸に変換し、これがＣＭＰ−シアル酸シンテターゼによりＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸に変換される（図１〜図３）。受容体基質を培養ブロスに供給し、細胞内に取り込み、組換え宿主細胞によって改変又は新規に合成することができる。シアリルトランスフェラーゼ（ＳｉａＴ）が触媒する反応において受容体基質をＮ−アセチルノイラミン酸で結合し、シアリル化糖を作り、シアリル化糖は培養ブロス中に放出される。
【０１５４】
［実施例１：種々のシアリル化オリゴ糖の産生］
【０１５５】
特性決定された又は推定されるシアリルトランスフェラーゼの遺伝子配列を文献及び公的データベースから得た。シアリルトランスフェラーゼは、それらのシグナルペプチドが欠失するとより高い活性を示すとしばしば記載されているので、オンライン予測ツールＳｉｇｎａｌＰ（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１１年９月２９日、８（１０）：７８５−６）により対応するタンパク質配列を分析した。遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔの協働によって、注釈されているように、全長型として、あるいはシグナルペプチドが予測される場合には、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く切断されたバリアントとして合成した。
【０１５６】
シアリルトランスフェラーゼ１〜２６を、遺伝子特異的プライマーを用いてＳＬＩＣによりｐＤＥＳＴ１４にｎｅｕＡを有するオペロンとしてそれぞれサブクローニングし、一般種のプラスミド、すなわちｐＤＥＳＴ１４−ｓｉａＴ−ｎｅｕＡを得た。残りのシアル酸転移酵素２７〜１００を、制限部位ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを用いて、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔの協働によりプラスミドｐＥＴ１１ａに直接サブクローニングした。どちらの発現系もＩＰＴＧ誘導性遺伝子発現を可能にする。インビトロ活性スクリーニングのために、プラスミドをＬａｃＺ活性を欠く大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。
【０１５７】
ｓｉａＴ９（α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ）及びｓｉａＴ１８（α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ）発現のためのプラスミドを含む大腸菌株を、アンピシリン１００μｇ  ｍｌ−１を補充した２ＹＴ媒体２０ｍｌで満たした１００ｍｌ振盪フラスコ中で３０℃で増殖させた。培養物が０．１〜０．３のＯＤ６００に達すると、０．３ｍＭのＩＰＴＧの添加により遺伝子発現を誘導し、インキュベーションを１２〜１６時間継続した。細胞を遠心分離により回収し、ガラスビーズを用いて規定容量の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５中で機械的に破壊した。タンパク質抽出物は、アッセイを開始するまで氷上に保持した。インビトロアッセイを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ及び５〜２０ｍＭの適切な受容体基質を含む総容量２５μｌで実施した。アッセイを、３μｌタンパク質抽出物の添加で開始し、１６時間継続させた。シアリルトランスフェラーゼの活性により生じたシアリル化オリゴ糖の形成を薄層クロマトグラフィーで決定した。
【０１５８】
そこで、シリカゲル６０  Ｆ２５４（独国ダルムシュタットのＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）プレート上に試料を塗布した。移動相としてブタノール：アセトン：酢酸：Ｈ２Ｏ（３５／３５／７／２３（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））の混合物を用いた。分離した物質の検出のために、ＴＬＣプレートをチモール試薬（９５ｍｌのエタノールに溶かした０．５ｇのチモール、５ｍｌの硫酸添加）に浸し、加熱した。シアリル化された反応生成物は、その受容体基質よりも遅く進む。
【０１５９】
【表３】
2021525522.tif 000007
【０１６０】
表３：供給された受容体基質に依存する２つの例示的シアリルトランスフェラーゼのシアリルトランスフェラーゼ活性を決定するインビトロ分析。シアリル化糖の形成は薄層クロマトグラフィーで決定した。（＋）シアリル化反応生成物が検出可能であった。（−）シアリル化反応生成物は検出されなかった。
【０１６１】
両シアリルトランスフェラーゼは、ガラクトース又は少なくとも１つのガラクトース残基を含む多様なオリゴ糖をシアリル化することができた。反応にスクロースを適用した場合、シアリル化オリゴ糖は検出されなかった（表３）。
【０１６２】
［実施例２：Ｎ−アセチルノイラミン酸の産生のための大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の代謝工学］
【０１６３】
代謝工学は、特定の内在性遺伝子の突然変異生成及び欠失、並びに異種遺伝子のゲノム組み込みによって達成された。Ｅｌｌｉｓらによって記載されているように（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：  ６７４２−６７４６（２００１））、ミスマッチ−オリゴヌクレオチドを用いる突然変異生成によって遺伝子ｌａｃＺ及びａｒａＡを不活性化した。
【０１６４】
Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：６６４０−６６４５  （２０００））に従ってゲノム欠失を生じさせた。Ｎ−アセチルグルコサミンの分解を防止するために、以下の遺伝子、すなわちＮ−アセチルグルコサミン特異的ＰＴＳ酵素ＩＩ（ｎａｇＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ（ｎａｇＡ）、及びグルコサミン−６−リン酸デアミナーゼ（ｎａｇＢ）を大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）のゲノムから欠失させた。Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ｎａｎＫ）、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−リン酸エピメラーゼ（ｎａｎＥ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ｎａｎＡ）及びシアル酸パーミアーゼ（ｎａｎＴ）をコードする全Ｎ−アセチルノイラミン酸異化遺伝子クラスターも欠失させた。グルコサミンの取り込みを促進するホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系をコードする遺伝子ｍａｎＸ、ｍａｎＹ及びｍａｎＺも欠失させた。ｗｚｘＣ−ｗｃａＪ遺伝子も欠失させた。ｗｃａＪ遺伝子は、コラン酸合成の最初のステップを触媒するＵＤＰ−グルコース、すなわちウンデカプレニルリン酸グルコース−１−リン酸トランスフェラーゼをコードする（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９６、１７８：４８８５−４８９３）。さらに、遺伝子ｆｕｃＩ及びｆｕｃＫ及びａｇａＡを欠失させ、これらはそれぞれＬ−フコースイソメラーゼ、Ｌ−フクロースキナーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−リン酸デアセチラーゼをコードする。
【０１６５】
異種遺伝子のゲノムの組み込みは、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、米国）又はマリナートランスポザーゼＨｉｍａｒ１の高活性Ｃ９−突然変異体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９９、ＵＳＡ  ９６：１１４２８−１１４３３）のいずれかを用いて、転位によって達成した。ＥＺ−Ｔｎ５トランスポソームを作製するために、ＦＲＴ部位に隣接する抗生物質耐性マーカー（あるいは耐性マーカー遺伝子をｌｏｘ６６−ｌｏｘ７１部位に挟まれた）と共に目的の遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ生成物は、両末端にＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼの１９ｂｐモザイク末端認識部位を持っていた。目的のＨｉｍａｒ１トランスポザーゼを用いて組込むために、抗生物質耐性マーカーに隣接したＦＲＴ部位／ｌｏｘ６６−ｌｏｘ７１部位と共に同様に目的の発現構築物（オペロン）をクローン化し、アラビノース誘導性プロモーターＰａｒａＢの制御下でマリナートランスポザーゼＨｉｍａｒ１の高活性Ｃ９−変異体をコードするｐＥｃｏｍａｒベクターに移入した。全ての遺伝子を大腸菌での発現のためにコドンを最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ社により合成的に調製した。
【０１６６】
発現断片＜Ｐｔｅｔ−ｌａｃＹ−ＦＲＴ−ａａｄＡ−ＦＲＴ＞をＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼを用いて組み込んだ。大腸菌Ｋ１２  ＴＧ１由来のラクトースインポーターＬａｃＹ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＮ７２５８３）の遺伝子の組み込みに成功した後、プラスミドｐＣＰ２０上にコードされたＦＬＰリコンビナーゼによって耐性遺伝子をストレプトマイシン耐性クローンから排除した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０００、ＵＳＡ  ９７：６６４０−６６４５）。唯一の炭素源としてのスクロース上で前記株が増殖することを可能にするスクロースパーミアーゼ、フルクトキナーゼ、スクロースヒドロラーゼ、転写リプレッサの遺伝子（それぞれ遺伝子ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＲ）を含む大腸菌Ｗ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００２１８５．１）由来のｃｓｃ遺伝子クラスターも、をゲノムに挿入した。このクラスターを、プラスミドｐＥｃｏｍａｒ−ｃｓｃＡＢＫＲを用いた転位により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノムに組み込んだ。
【０１６７】
得られた株をさらに、以下の発現カセット、すなわち＜Ｐｔｅｔ−ｓｌｒ１９７５−ｇｎａ１−ｌｏｘ６６−ａａｃＣ１−ｌｏｘ７１＞（配列番号９７）、＜Ｐｔｅｔ−ｎｅｕＢ−ｌｏｘ６６−ｋａｎＲ−ｌｏｘ７１＞（配列番号９８）、＜Ｐｔｅｔ−ｓｌｒ１９７５−Ｐｔ５−ｎｅｕＢ−ＦＲＴ−ｄｈｆｒ−ＦＲＴ＞（配列番号９９）、＜Ｐｔｅｔ−ｇｌｍＳ＊−ｇｎａ１−ｌｏｘ６６−ａａｃＣ１−ｌｏｘ７１＞（配列番号１００）及び＜Ｐｔｅｔ−ｐｐｓＡ−ｌｏｘ６６−ａａｃＣ１−ｌｏｘ７１＞（配列番号１０１）のゲノム組み込みによりＮｅｕＮＡｃの産生のために組み換えた。ｄｈｆｒ発現カセットを除き、プラスミドｐＫＤ−Ｃｒｅ（配列番号１０２）を導入してゲノム（遺伝子組み込みの次のラウンド以前）から全ての抵抗マーカー遺伝子を段階的に除去し、次に３０℃でアンピシリン１００μｇ  ｍＬ−１及びの１００ｍＭのＬ−アラビノースを含む２ＹＴ寒天プレートでの選択を行った。その後、耐性クローンをアンピシリン及びゲノム組み込みに使用される選択的抗生物質を欠く２ＹＴ寒天プレートに移入した。このプレートを４２℃でインキュベートし、プラスミドの細胞を硬化させた。アンピシリン及び選択的抗生物質に感受性を示したクローンを用いて、さらなる実験及び組み換えを行った。
【０１６８】
遺伝子ｓｌｒ１９７５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＬ３５７２０）は、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３  Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼをコードする。遺伝子ｇｎａ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿１１６６３７）はサッカロマイセス・セレビシエ由来のグルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードする。遺伝子ｎｅｕＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３０５５７１）はカンピロバクター・ジェジュニ由来のシアル酸シンターゼをコードする。遺伝子ｇｌｍＳ＊は、大腸菌Ｌ−グルタミン：Ｄ-フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の変異型である（Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ  ２００５年５月；７（３）：２０１−１４）。遺伝子ｐｐｓＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＴ４３５２７）は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードする。
【０１６９】
＜Ｐｔｅｔ−ｓｌｒ１９７５−ｇｎａ１−ｌｏｘ６６−ａａｃＣ１−ｌｏｘ７１＞の生成のために、遺伝子ｓｌｒ１９７５及びｇｎａ１を構成的プロモーターＰｔｅｔの後にあるオペロンとしてサブクローニングし、ゲンタマイシン耐性遺伝子（ｌｏｘ６６／ｌｏｘ７１部位に挟まれている）に融合させ、平滑末端ライゲーションによりｐＥｃｏｍａｒベクターに挿入した。得られた発現カセットを、アラビノース誘導性プロモーターＰａｒａＢの制御下でベクターｐＥｃｏｍａｒ−ｓｌｒ１９５−ｇｎａ１−ａａｃＣ１及びマリナートランスポザーゼＨｉｍａｒ１の高活性Ｃ９−変異体を用いてゲノムに組み込んだ。
【０１７０】
＜Ｐｔｅｔ−ｎｅｕＢ−ｌｏｘ６６−ｋａｎＲ−ｌｏｘ７１＞の生成のために、ｎｅｕＢを構成的プロモーターＰｔｅｔの後ろにクローニングし、カナマイシン耐性遺伝子（ｌｏｘ６６／ｌｏｘ７１部位に挟まれている）に融合させた。得られた発現カセットを、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼを用いてゲノムに組み込んだ。＜Ｐｔｅｔ−ｓｌｒ１９７５−Ｐｔ５−ｎｅｕＢ−ＦＲＴ−ｄｈｆｒ−ＦＲＴ＞の生成のために、遺伝子ｓｌｒ１９７５及びｎｅｕＢをそれぞれ構成的プロモーターＰｔｅｔ及びＰｔ５の後ろに別々にサブクローニングし、トリメトプリム耐性遺伝子（ＦＲＴ部位に挟まれている）に融合させた。得られた発現カセットを、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼを用いることによってゲノムに組み込んだ。
【０１７１】
発現カセット＜Ｐｔｅｔ−ｇｌｍＳ＊−ｇｎａ１−ｌｏｘ６６−ａａｃＣ１−ｌｏｘ７１＞は、構成的プロモーターＰｔｅｔの後ろのオペロンとしてｇｌｍＳ＊及びｇｎａ１をクローニングすることによって作製した。この構築物をさらにゲンタマイシン耐性遺伝子（ｌｏｘ６６／ｌｏｘ７１部位に挟まれている）に融合させた。得られた発現カセットを、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼを用いることによってゲノムに組み込んだ。
【０１７２】
＜Ｐｔｅｔ―ｐｐｓＡ―ｌｏｘ６６―ａａｃＣ１―ｌｏｘ７１＞の生成のために、ｐｐｓＡ遺伝子を構成的プロモーターＰｔｅｔの後ろにクローン化し、ゲンタマイシン耐性遺伝子（ｌｏｘ６６／ｌｏｘ７１部位に挟まれている）に融合させた。得られた発現カセットを、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼを用いることによってゲノムに組み込んだ。
【０１７３】
要するに、累積的なゲノム組み換えにより、Ｎｅｕ５Ａｃ産生株大腸菌＃ＮＡＮＡ１を生じさせた。
【０１７４】
［実施例３：３’−シアリルラクトース産生のための微生物細胞株の生成及び培養］
【０１７５】
ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼを用いることにより、＜Ｐｔｅｔ−ｓｉａＴ９−Ｐｔ５−ｎｅｕＡ−ｌｏｘ６６−ａａｃＣ１−ｌｏｘ７１＞（配列番号：１０３）のゲノム組み込みによって、大腸菌＃ＮＡＮＡ１株をさらに組み換えて、３’−ＳＬ産生株を生じさせた。遺伝子ｓｉａＴ９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＦ９１１６０）は、大腸菌での発現のためにコドンを最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成的に調製し、ビブリオ種ＪＴ−ＦＡＪ−１６由来のα−２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードする。遺伝子ｎｅｕＡ  （ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３０５５７１）は、カンピロバクター・ジェジュニ由来のＣＭＰ−シアル酸シンテターゼをコードする。
【０１７６】
株の培養は９６ウェルプレートで行った。したがって、寒天プレートから、７ｇ  ｌ−１のＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、７ｇ  ｌ−１のＫ２ＨＰＯ４、２ｇ  ｌ−１のＫＯＨ、０．３ｇ  ｌ−１のクエン酸、５ｇ  ｌ−１のＮＨ４Ｃｌ、１ｍｌ−１の消泡剤、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、８ｍＭのＭｇＳＯ４、微量元素及び炭素源として２％のスクロースを含む最小培地２００μＬを含むマイクロタイタープレートに前記株の単一コロニーを移した。微量元素は、０．１０１g  ｌ−１のニトリロ三酢酸、ｐＨ６．５、０．０５６ｇ  ｌ−１のクエン酸アンモニウム第二鉄、０．０１ｇ  ｌ−１のＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ  ｌ−１のＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、０．００１ｇ  ｌ−１のＣｕＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ  ｌ−１のホウ酸、０．００９ｇ  ｌ−１のＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．００１ｇ  ｌ−１のＮａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ  ｌ−１のＮａ２ＳｅＯ３、０．００２ｇ  ｌ−１のＮｉＳＯ４×６Ｈ２Ｏからなった。培養は激しく振盪させながら３０℃で約２０時間行った。続いて、培養ブロス５０μＬをウェルあたり最小培地４００μＬを含むディープウェル９６ウェルプレート（２．０ｍＬ）に移した。
【０１７７】
さらに４８時間のインキュベーション後、培養を停止し、上清中の３’−シアリルラクトース濃度を質量分析法により決定した。質量分析はＬＣ  Ｔｒｉｐｌｅ−Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＭＳ検出システムを用いてＭＲＭ（多重反応モニタリング）により行った。前駆体イオンを選択して四重極１で分析し、ＣＩＤガスとしてアルゴンを用いた衝突セルで断片化が起こり、四重極３で断片イオンの選択を行う。培養上清をＨ２Ｏ（ＬＣ／ＭＳグレード）で１：１００で希釈した後のラクトース、３’−シアリルラクトース及び６’−シアリルラクトースのクロマトグラフィーによる分離を、ＸＢｒｉｄｇｅ  Ａｍｉｄｅガードカートリッジ（３．５μｍ、２．１  １０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ社、米国）を用いてＸＢｒｉｄｇｅ  Ａｍｉｄｅ  ＨＰＬＣカラム（３．５μｍ、２．１  ５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社、米国））で行った。ＨＰＬＣシステムのカラムオーブン温度は５０℃であった。移動相をアセトニトリル：Ｈ２Ｏと１０ｍＭの酢酸アンモニウムで構成した。１μｌの試料を装置に注入し、流速４００μｌ／分で３．６０分間ランを行った。ＥＳＩ正イオン化モードで３’−シアリルラクトース及び６’−シアリルラクトースをＭＲＭで分析した。質量分析計は単位分解能で操作した。シアリルラクトースはｍ／ｚ６５６．２［Ｍ＋Ｎａ］のイオンを形成する。シアリルラクトースの前駆体イオンを、衝突セル内で断片イオンｍ／ｚ６１２．１５、ｍ／ｚ３６５．１５及びｍ／ｚ３１４．１５へさらに断片化した。衝突エネルギー、Ｑ１及びＱ３  Ｐｒｅ  Ｂｉａｓを、各分析物に対して個々に最適化した。定量法は、市販の規格品（英国コンプトンのＣａｒｂｏｓｙｎｔｈ社）を用いて確立させた。培養終了時、培養上清中の３’−ＳＬ力価は約０．６ｇ  Ｌ−１に達した。
【０１７８】
［実施例４：６’−シアリルラクトース産生のための微生物細胞株の生成及び培養］
【０１７９】
大腸菌＃ＮＡＮＡ１株を、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼを用いて＜Ｐｔｅｔ−ｓｉａＴ１８−Ｐｔ５−ｎｅｕＡ−ｌｏｘ６６−ａａｃＣ１−ｌｏｘ７１＞（配列番号：１０４）のゲノム組み込みによってさらに組み換え、６’−ＳＬ産生株を得た。遺伝子ｓｉａＴ１８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ５００９４７）は、大腸菌での発現のためにコドンを最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成的に調製し、フォトバクテリウム・レイオグナティ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ）ＪＴ―ＳＨＩＺ―１１９由来のα−２，６−シアリルトランスフェラーゼをコードする。遺伝子ｎｅｕＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３０５５７１）は、カンピロバクター・ジェジュニ由来のＣＭＰ−シアル酸シンテターゼをコードする。
【０１８０】
実施例２に記載したように、この６’−ＳＬ産生株を用いて９６ウェルプレートでの培養を行った。培養終了時、培養上清中の６’−ＳＬ力価は約０．９ｇ  Ｌ−１に達した。
【０１８１】
［実施例５：シアリルラクトースを含む乳児用調製物の組成］
【０１８２】
【表４】
2021525522.tif 000008
【図１】
2021525522.tif 000009
【図２】
2021525522.tif 000010
【図３】
2021525522.tif 000011
【配列表】
2021525522000001.app
【国際調査報告】
2021525522.tif 000012
2021525522.tif 000013
2021525522.tif 000014