(57)【要約】組織を含む試料から単一細胞、核、細胞内成分、および生体分子を収集および調製するため、および、いくつかの態様においては当該単一細胞を使用してオルガノイドまたは微小組織を形成させるための、システム、方法、および装置が記載されている。当該システムは、組織の酵素的および/または物理的破砕を実施して組織を単一細胞へと解離させ、その後、懸滴法を使用してオルガノイドまたは微小組織を形成させることができる。2021525550.tif 000003
2021525550.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) (i) それぞれがカートリッジと係合するように構成されており、かつ1つまたは複数の流体ポートを含む、1つまたは複数のカートリッジインタフェース；
(ii) (1) 液体および/または気体の1つまたは複数のソース；
(2) 該ソースおよび該カートリッジインタフェースにおける流体ポートと連通する、1つまたは複数の流体ライン；ならびに
(3) 該ソースから該1つまたは複数の流体ポートの中および/または外へと液体および/または気体を移動させるように構成されている、1つまたは複数のポンプ
を含む、流体工学サブシステム；
(iii) カートリッジインタフェースと係合したカートリッジにおいて組織破砕装置を動かすためのアクチュエータ（たとえば、機械式、空気圧式、電磁式、または油圧式アクチュエータ）を含むサブシステム
を含む機器と、
(b) それぞれが該カートリッジインタフェースのうちの1つと係合する1つまたは複数のカートリッジであって、各カートリッジが、
(i) 該カートリッジインタフェースにおける該流体ポートと連通する、1つまたは複数のカートリッジポート；
(ii) 開口と、該開口中に配置された、組織の機械的破砕のために構成されている組織破砕装置とを含む、前処理チャンバであって、該カートリッジが該カートリッジインタフェースと係合すると、該組織破砕装置が該アクチュエータと係合して該アクチュエータによって駆動される、前処理チャンバ；ならびに
(iii) 該前処理チャンバおよび1つまたは複数のカートリッジポートと連通し、かつ該前処理チャンバから生物学的材料の懸濁液を収集するように構成されている、処理チャンバ
を含む、1つまたは複数のカートリッジと
を含む、システム。
【請求項２】
前記機器が、
・流体ラインを通る前記1つまたは複数のポンプからの正圧もしくは負圧および/または前記1つもしくは複数の流体ラインに接続する1つもしくは複数の容器を前記流体ポートへと方向付けるように構成されている、0、1つ、または複数の弁
をさらに含む、請求項1記載のシステム。
【請求項３】
前記機器が、
・磁場のソースを含む磁気処理モジュールであって、該ソースが、係合したカートリッジの処理チャンバ内に磁場を形成するように配置されている、磁気処理モジュール
をさらに含む、請求項1記載のシステム。
【請求項４】
前記機器が、
・計測サブシステム
をさらに含む、請求項1記載のシステム。
【請求項５】
前記機器が、
・プロセッサおよびメモリを含む制御サブシステムであって、該メモリが、該プロセッサによって実行されると前記システムを作動させるコードを含む、制御サブシステム
をさらに含む、請求項1記載のシステム。
【請求項６】
前記機器が、
・前記1つまたは複数のポンプと連通する廃棄物容器
をさらに含む、請求項1記載のシステム。
【請求項７】
前記機器が、
前記カートリッジのチャンバ内の温度を調節するように構成されている、温度サブシステム
をさらに含む、請求項1記載のシステム。
【請求項８】
前記温度サブシステムが、温度調節素子（たとえば、ペルチェ、抵抗加熱器、循環流体）、該温度調節素子を制御するためのコントローラ、および該温度調節素子と前記カートリッジのチャンバとの間で熱を伝達する熱伝達素子を含む、請求項7記載のシステム。
【請求項９】
前記アクチュエータが、スロット付き、フィリップス、コードレックス、トライウィング、スパナ、およびヘックスから選択されるドライブヘッドを含む、請求項1記載のシステム。
【請求項１０】
前記少なくとも1つのポンプがシリンジポンプを含む、請求項1記載のシステム。
【請求項１１】
前記ポンプが、流体ラインを介して、前記処理チャンバと連通するカートリッジポートと係合する前記カートリッジインタフェースにおける流体ポートと連通し、該流体ラインを介して加えられる真空が、前記前処理チャンバから該処理チャンバの中へと流体を引き込む、請求項1記載のシステム。
【請求項１２】
前記ポンプが、第一の流体ラインを介して流体の容器と連通し、かつ第二のラインを介して、前記前処理チャンバまたは前記処理チャンバと連通するカートリッジポートと係合する前記カートリッジインタフェースにおける流体ポートと連通し、該第一の流体ラインを介して加えられる負圧が容器から流体を引き出し、該第二の流体ラインを介して加えられる正圧が該流体を該前処理チャンバまたは該処理チャンバの中へと押し込む、請求項1記載のシステム。
【請求項１３】
各カートリッジインタフェースが、前記前処理チャンバに直接的に試薬を導入するように構成されている該前処理チャンバにおけるポートと連通する試薬入口ポートをさらに含む、請求項1記載のシステム。
【請求項１４】
前記前処理チャンバが、流体ラインを介して直接的に前記処理チャンバと連通するか、または該前処理チャンバおよび該処理チャンバそれぞれにおけるポートと連通するインタフェースにおける1つまたは複数の流体ラインを介して間接的に該処理チャンバと連通する、請求項1記載のシステム。
【請求項１５】
前記前処理チャンバが直接のカートリッジポートを含まない、請求項1記載のシステム。
【請求項１６】
前記カートリッジが、前記カートリッジインタフェースまたは環境と連通する1つ、2つ、3つ、または4つのいずれか以下のポートを含む、請求項1記載のシステム。
【請求項１７】
前記カートリッジが、前記カートリッジインタフェースまたは環境と連通する複数のポートを含み、少なくとも1つのポートがキャップによって覆われている、請求項1記載のシステム。
【請求項１８】
前記組織破砕装置が、
(i) シース、
(ii) 該シース内で滑動するように構成されているプランジャであって、アクチュエータと係合するためのカプラと、組織を破砕するためのヘッドとを含む、プランジャ、および
(iii) 該プランジャを後退位置へと付勢するバイアス機構、たとえばばね、であって、すなわち、該プランジャを前進位置へ動かすためには駆動が必要である、バイアス機構
を含む、請求項1記載のシステム。
【請求項１９】
前記プランジャが、前記シースの縦軸を中心に回転することもできる、請求項18記載のシステム。
【請求項２０】
前記ヘッドが周縁部を有し、該ヘッドが前記前処理チャンバ内で動くとき、該周縁部が、該ヘッドと該前処理チャンバの壁との間に、たとえば、細胞、核、または細胞の微小構造が該ヘッドと該壁との間を破裂することなく通過することを可能にするのに十分な、約25ミクロン〜400ミクロンのギャップを提供する、請求項18記載のシステム。
【請求項２１】
前記ヘッドが、組織を破砕するための隆起特徴を含む破砕面を含む、請求項18記載のシステム。
【請求項２２】
前記プランジャが、前記アクチュエータと係合するための特徴を含む上面を含む、請求項18記載のシステム。
【請求項２３】
前記組織破砕装置が、前記前処理チャンバ内の座部、たとえば環状座部上に位置付けられる、請求項1記載のシステム。
【請求項２４】
前記組織破砕装置が、前記前処理チャンバ内の座部、たとえば環状座部上に位置付けられる、請求項18記載のシステム。
【請求項２５】
前記組織破砕装置ヘッドが環状のベベル面を含み、
前記前処理チャンバ内の座部が、前記プランジャが該前処理チャンバの底部に向けて動かされるときに、該ヘッドと該前処理チャンバの壁との間に画定された環状のギャップが存在し、かつ該ヘッドの破砕面と該前処理チャンバの該底部との間にはギャップが存在しないかまたは画定された最小限のギャップしか存在しないように、該ベベル面と嵌合するように構成されている、
請求項24記載のシステム。
【請求項２６】
前記前処理チャンバが、組織を破砕するための隆起特徴を含む底面を含む、請求項1記載のシステム。
【請求項２７】
前記前処理チャンバが、該前処理チャンバの側面のポートを前記処理チャンバの上部のポートに接続する流体チャネルを介して、該処理チャンバと連通する、請求項1記載のシステム。
【請求項２８】
前記処理チャンバが、前記前処理チャンバから該処理チャンバに入る生物学的材料の懸濁液を濾過するために配置されたストレーナ（たとえば、フィルタまたはメッシュスクリーン）をさらに含む、請求項1記載のシステム。
【請求項２９】
前記処理チャンバがカートリッジポートと連通し、該カートリッジポートが、該カートリッジポートに真空が加えられると前記前処理チャンバ内の液体が該処理チャンバ内へと引き込まれるように構成されている、請求項1記載のシステム。
【請求項３０】
前記カートリッジが真空トラップをさらに含み、該真空トラップが、前記カートリッジポートおよび前記処理チャンバと流体的に接続されており、かつそれらの間に配置されている、請求項29記載のシステム。
【請求項３１】
前記処理チャンバがドレイン区分およびより狭いスロット区分を含み、該処理チャンバが、該ドレイン区分内の流体を該スロット区分へと方向付けるように構成されている傾斜した床面を含む、請求項1記載のシステム。
【請求項３２】
前記処理チャンバが、生物学的材料の懸濁液を収集するための凹部を含む、請求項1記載のシステム。
【請求項３３】
前記処理チャンバが、該処理チャンバに流体を導入するように構成されているカートリッジポートと連通する、請求項1記載のシステム。
【請求項３４】
前記処理チャンバが、流体チャネルを介して前記前処理チャンバと連通するポートを含むカバーを含む、請求項1記載のシステム。
【請求項３５】
別の態様において、前記前処理チャンバが、シール（たとえば脆いシールまたは隔膜）を含むカバーを含み、該シールが取り外されるかまたは開けられる（たとえば穿孔される）と、該前処理チャンバへのアクセスが可能になる。
【請求項３６】
前記処理チャンバが、シール（たとえば脆いシール）を含むカバーを含み、該シールが取り外されるかまたは開けられる（たとえば穿孔される）と、該処理チャンバへのアクセスが可能になる、請求項1記載のシステム。
【請求項３７】
前記カートリッジが、
・前記処理チャンバと流体的に接続された1つまたは複数の廃棄物チャンバ
をさらに含む、請求項1記載のシステム。
【請求項３８】
前記カートリッジが、該カートリッジおよび/またはその使用に関する情報を含む識別子（たとえば、バーコード、RFID、EE PROM）をさらに含み、前記機器が、該識別子の情報を読み取るためのリーダを含む、請求項1記載のシステム。
【請求項３９】
液体および/または気体の1つまたは複数の前記ソースが流体工学サブシステムに含まれている、請求項1記載のシステム。
【請求項４０】
(a) 前記前処理チャンバが組織サンプルを含む、請求項1記載のシステムを提供する工程；
(b) 前記アクチュエータを使用して前記組織破砕装置を作動させることによって該組織サンプルを破砕して、生物学的材料の懸濁液を生成する工程；および
(c) 流体工学サブシステムを使用して、該生物学的材料の懸濁液を該前処理チャンバから前記処理チャンバ内へと移動させる工程
を含む、方法。
【請求項４１】
(d) 前記生物学的材料の懸濁液を前記処理チャンバから取り出す工程
をさらに含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
前記前処理チャンバが、細胞外マトリックスを消化するための1つまたは複数の酵素をさらに含む、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
前記前処理チャンバが、細胞膜を溶解するための1つまたは複数の界面活性剤をさらに含む、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
前記前処理チャンバが、組織破砕中または組織破砕後のRNAまたは他の生体分子の分解速度を低下させる粘性を有する液体をさらに含む、請求項40記載の方法。
【請求項４５】
前記破砕が、前記ヘッドの破砕面を前記前処理チャンバの底面から所定の距離に配置し、該前処理チャンバ内で該ヘッドを回転させて組織を破砕することを含む、請求項40記載の方法。
【請求項４６】
前記破砕が、前記ヘッドの破砕面を前記前処理チャンバの底面に対して複数の異なるギャップ距離で配置し、各ギャップ距離において該ヘッドを回転させることを含む、請求項40記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも1つのギャップ距離において、前記破砕ヘッドの少なくともいくらかの部分が前記底面のいくらかの部分と接触する、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
前記面の平坦部分と前記チャンバの底部の平坦部分との間の最大ギャップ距離が、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、500μm、250μm、100μm、75μm、50μm、25μm、20μm、15μm、10μm、5μm、4μm、3μm、2μm、または1μmのいずれか以下である、請求項46記載の方法。
【請求項４９】
粉砕面の平坦部分と前記チャンバの底部の平坦部分との間の複数のギャップ距離が、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のいずれかであり、最大ギャップ距離が、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、500μm、250μm、100μm、75μm、50μm、25μm、20μm、15μm、10μm、5μm、4μm、3μm、2μm、または1μmのいずれか以下である、請求項46記載の方法。
【請求項５０】
・前記組織破砕装置を用いて組織を破砕する工程；
・破砕された該組織を、細胞外マトリックスを消化する少なくとも1つの酵素とともにインキュベートする工程；および
・インキュベートされた該組織を該組織破砕装置を用いて破砕する工程
を含む、請求項46記載の方法。
【請求項５１】
前記流体工学サブシステムが、前記処理チャンバと連通するカートリッジポートに真空を適用して、前記生物学的材料の懸濁液を移動させる、請求項40記載の方法。
【請求項５２】
前記カートリッジがストレーナをさらに含み、前記処理チャンバに入る前記生物学的材料の懸濁液が濾過されて粒子状物質が除去される、請求項40記載の方法。
【請求項５３】
前記生物学的材料の懸濁液を移動させた後、前記流体工学サブシステムを使用して、カートリッジポートを介して前記前処理チャンバに液体を導入する工程と、次いで、該流体工学サブシステムを使用して、該液体を前記処理チャンバの中へ移動させる工程とをさらに含む、請求項40記載の方法。
【請求項５４】
前記流体工学サブシステムを使用して、1つまたは複数の試薬を含む1つまたは複数の液体をカートリッジポートを介して前記処理チャンバに導入する工程をさらに含む、請求項40記載の方法。
【請求項５５】
前記試薬が、酵素を含むか、または結合物質（たとえば、細胞表面もしくは核の表面の標的、ウイルス、または他の生物学的標的に対する結合物質）を含む粒子を含む、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
前記組織が標的細胞を含み、前記方法が、
・前記処理チャンバ内の前記生物学的材料の懸濁液を、標的細胞に結合しかつ該生物学的材料の懸濁液内で結合した標的細胞を隔離する結合物質を含む固体粒子と接触させる工程
をさらに含む、請求項40記載の方法。
【請求項５７】
結合した前記標的細胞を前記懸濁液から分離する工程をさらに含む、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
前記組織が腫瘍組織であり、前記標的細胞が腫瘍浸潤リンパ球である、請求項56記載の方法。
【請求項５９】
前記標的細胞が、幹細胞または部分的に分化した細胞である、請求項56記載の方法。
【請求項６０】
・前記生物学的材料の懸濁液の細胞、核、ミトコンドリア、または他の細胞小器官における1つまたは複数の遺伝子の発現を決定する工程
をさらに含む、請求項40記載の方法。
【請求項６１】
前記1つまたは複数の遺伝子が、複数の遺伝子を含むパネルである、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
前記パネルが、標的細胞型、たとえば、肝細胞、ニューロン、腎糸球体壁細胞、心筋細胞を識別する遺伝子を含む、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
前記パネルが、CRISPR改変標的細胞を識別する遺伝子を含む、請求項61記載の方法。
【請求項６４】
前記パネルが、細胞がストレス、たとえばアノイキスを受けたときに差次的に発現する遺伝子を含む、請求項61記載の方法。
【請求項６５】
様々な組織破砕条件下で複数の組織サンプルそれぞれについて生物学的材料の懸濁液を調製する工程、および事前に破砕された組織サンプル中の細胞の遺伝子発現プロファイルにもっとも近いかまたはそれからもっと遠い遺伝子発現プロファイルを有する細胞または核を生成する条件を同定する工程を含む、請求項61記載の方法。
【請求項６６】
前記パネルが、1つまたは複数のハウスキーピング遺伝子、たとえばActb、gapdhを含む、請求項61記載の方法。
【請求項６７】
(i) (1) 開口と、該開口中に配置された、組織の機械的破砕のために構成されている組織破砕装置と、(2) 前処理チャンバポートとを含む、前処理チャンバ；
(ii) 流体ラインを介して該前処理チャンバポートと連通する処理チャンバポートを含む、処理チャンバ；ならびに
(iii) 該処理チャンバと連通するカートリッジポートであって、該カートリッジポートに加えられる真空が該前処理チャンバから該処理チャンバの中へと材料を引き込む、カートリッジポート
を含む、カートリッジ。
【請求項６８】
前記カートリッジポートが、直接的に、または真空トラップを介して、前記処理チャンバと連通する、請求項67記載のカートリッジ。
【請求項６９】
(i) 開口と、該開口中に配置された、組織の機械的破砕のために構成されている組織破砕装置とを含む、前処理チャンバ；
(ii) 該前処理チャンバと連通する、ストレーナを含む濾過チャンバ；
(iii) 該濾過チャンバと連通する、第一の処理チャンバ；
(iv) 該第一の処理チャンバと連通する、任意選択の第二の処理チャンバ；
(v) 該処理チャンバおよび存在する場合は該第二の処理チャンバと連通する、1つまたは複数のカートリッジポート
を含む、カートリッジ。
【請求項７０】
(vi) 前記第一の処理チャンバおよび存在する場合は前記第二の処理チャンバと連通する、1つまたは複数の廃棄物チャンバ
をさらに含む、請求項69記載のカートリッジ。
【請求項７１】
前記第一の処理チャンバが、前記濾過チャンバからの液体の懸滴を生成するように構成されている要素（たとえばノズル）を含む、請求項69記載のカートリッジ。
【請求項７２】
(a) 組織を含む、請求項69記載のカートリッジを提供する工程；
(b) 前記組織破砕装置を用いて該組織を破砕して細胞懸濁液を生成する工程；
(c) 前記ストレーナを用いて該細胞懸濁液を濾過して、濾過された細胞懸濁液を生成する工程；および
(d) 要素を使用して、該濾過された細胞懸濁液から懸滴を形成させる工程
を含む、微小組織を創製する方法。
【請求項７３】
前記微小組織がオルガノイドである、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
・前記懸滴を形成した後、該懸滴中の細胞の生存を支持するために前記処理チャンバに液体または気体を加える工程
をさらに含む、請求項72記載の方法。
【請求項７５】
(a) (i) それぞれがカートリッジと係合するように構成されており、かつ1つまたは複数の流体ポートを含む、1つまたは複数のカートリッジインタフェース；
(ii) カートリッジインタフェースと係合したカートリッジにおいて組織破砕装置を動かすためのアクチュエータ（たとえば、機械式、空気圧式、電磁式、または油圧式アクチュエータ）を含む、モジュール
を含む機器と、
(b) それぞれが該カートリッジインタフェースのうちの1つと係合する1つまたは複数のカートリッジであって、各カートリッジが、
(i) 開口と、該開口中に配置された、組織の機械的破砕のために構成されている組織破砕装置とを含む、前処理チャンバ
を含む、1つまたは複数のカートリッジと
を含む、システム。
【請求項７６】
前記カートリッジが、前記前処理チャンバ以外のチャンバを含まない、請求項75記載のシステム。
【請求項７７】
(i) 開口と、該開口中に配置された、組織の機械的破砕のために構成されている組織破砕装置とを含む、前処理チャンバ
を含む、カートリッジ。
【請求項７８】
(i) シース、
(ii) 該シース内で滑動するように構成されているプランジャであって、アクチュエータと係合するためのカプラと、組織を破砕するためのヘッドとを含む、プランジャ、および
(iii) 該プランジャを後退位置へと付勢するバイアス機構、たとえばばね、であって、すなわち、該プランジャを前進位置へ動かすためには駆動が必要である、バイアス機構
を含む、組織破砕装置。
【請求項７９】
前記シースが、前記組織破砕装置を座部上に位置付けるように適合されたシーター要素を含む、請求項78記載の組織破砕装置。
【請求項８０】
前記シーター要素が、環状リング上に位置付けられるように適合されたフランジを含む、請求項78記載の組織破砕装置。
【請求項８１】
前記シーター要素が、1つまたは複数のスロット内に位置付けられるように適合された1つまたは複数のタブを含む、請求項78記載の組織破砕装置。
【請求項８２】
(a) 組織を含む、本明細書に記載されているカートリッジを提供する工程；
(b) 組織破砕装置を用いて該組織を破砕して細胞懸濁液を生成する工程；
(c) ストレーナを用いて該細胞懸濁液を濾過して、濾過された細胞懸濁液を生成する工程；
(d) 濾過された細胞懸濁液から幹細胞を選択する工程；および
(e) 該選択された幹細胞を取り出すか、または該カートリッジ内で成長させる工程
を含む、微小組織を創製する方法。
【請求項８３】
(a) 組織を含む、本明細書に記載されているカートリッジを提供する工程；
(b) 組織破砕装置を用いて該組織を破砕して細胞懸濁液を生成する工程；
(c) ストレーナを用いて該細胞懸濁液を濾過して、濾過された細胞懸濁液を生成する工程；
(d) 濾過された細胞懸濁液からの細胞を幹細胞へと分化させる工程；および
(e) 分化した幹細胞を該カートリッジ内で成長させるか、または取り出す工程
を含む、微小組織を創製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照：
本出願は、2018年6月1日に出願された米国特許仮出願第62/679,466号の優先日の恩典を主張する。
【０００２】
連邦政府資金援助を受けた研究開発に関する声明（該当する場合）：
本研究は、一部、交付番号RH010129の下、国立衛生研究所のNational Human Genome Research Instituteによる支援を受けたものである。
【０００３】
請求項に係る発明が共同研究契約の範囲内の活動の結果として成された場合の共同研究契約の当事者の名称：
なし。
【０００４】
「配列表」の参照：
なし。
【０００５】
A) 発明の分野
本発明は、生物学的材料からのサンプル調製の分野に関する。より具体的には、本発明は、固体組織を処理して単一細胞、核、生体分子、および生体分析用の処理済みサンプルにすること、ならびに単一細胞を使用してオルガノイドおよび他の微小組織を形成させることに関する。
【背景技術】
【０００６】
B) 関連技術の説明
単一細胞および細胞群の分析は、細胞が個々にどのように機能するかを吟味および理解するための情報と、アンサンブル測定において集計された個々の細胞反応の範囲への先例のない洞察とを提供する。電気生理学、フローサイトメトリー、イメージング、質量分析法（Lanni, E.J., et. al. J Am Soc Mass Spectrom. 2014; 25(11):1897-907）、マイクロアレイ（Wang L and KA Janes. Nat Protoc. 2013; 8(2):282-301）および次世代シーケンシング（NGS）（Saliba A.E., et. al. Nucleic Acids Res. 2014; 42(14):8845-60）のための単一細胞法が開発され、根本的な細胞のプロセス、機能、および相互接続ネットワークの理解増大の原動力となっている。アンサンブル測定から個々のプロセスおよび機能が理解され、識別されると、今度はその個々の情報が、細胞間でネットワークプロセスが作用するやり方の発見を導くことができる。ネットワークは、組織、臓器、多細胞生物、共生生物、バイオフィルム、表面、環境、または細胞が生存して相互作用する任意の場所に存在し得る。
【０００７】
組織のモデルシステムは、組織の機能、発達および調節を理解するのに重要なツールである。治療法を開発するための化合物の基礎研究、コンパニオン診断およびスクリーニングのために、改良されたモデルシステムが開発される必要がある。歴史的に、知識を得、組織機能をモデル化するために、モデル細胞株の二次元培養が、通常は一度に1つの細胞型だけで使用されてきた。しかし、固体組織は、複数の細胞型の間の複雑な相互作用を伴う三次元（3D）構造である。二次元モデルは、細胞間の相互作用および細胞に対する細胞外マトリックスの影響を欠くといえる。
【０００８】
微小組織と呼ぶことができる組織の3D構造を、懸滴を含む多くの技術を使用することにより、またはMatricelもしくはハイドロゲルで構成されている3D支持体を使用して、実際の組織をよりよく模倣することができる小さなスフェロイドおよび他の形状を創製することにより、構築することができる。通常、サイズは3D構造への栄養素の拡散によって制限される。場合によっては、3Dは、幹細胞を組み込む状態で創製され、オルガノイドと呼ばれることができる（N. de Souza, Organoids. Nature Methods volume 15, page 23 (2018); "Method of the Year 2017:Organoids" Nature Methods 2018/01/03/online, 15 http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.4575. 10.1038/nmeth.4575; Yin, Xiaolei et al. Engineering Stem Cell Organoids, Cell Stem Cell, Volume 18, Issue 1, 25-38）。オルガノイドは有望な技術であるが、オルガノイドの創製は、プロセスのばらつき、および通常は組織に直接由来するわけではない細胞を使用するという欠点を抱えている。本発明は、2D表面、3Dオルガノイド、および細胞懸濁液中で細胞を成長させることを含む複数の用途のために固体組織から細胞を遊離させるという課題を解決する。
【０００９】
単一細胞の次世代シーケンシング（NGS）が、細胞および組織の既知知識を急速に変化させ、新たな細胞型を発見し、細胞および組織がどのように機能するかの多様性の理解を高めている。シングルセルNGS RNAシーケンシング（Saliba A.E., et. al., Nucleic Acids Res. 2014; 42(14):8845-60）（Shapiro E. et. al., Nat Rev Genet. 2013; 14(9):618-30）が、細胞発現の複雑さならびに細胞間および細胞型間の異種性を解明している（Buettner F. et. al., Nat Biotechnol. 2015; 33(2):155-60）。インサイチューシーケンシング（Ke R et. al., Nat Methods. 2013; 10(9):857-60）、（Lee JH, et. al., Nat Protoc. 2015; 10(3):442-58）（Lee JH, et. al., Science. 2014, 21; 343(6177):1360-3）が、固定細胞を直接シーケンシングする実行可能性を示した。しかし、RNAの場合、インサイチューシーケンシングでは、はるかに少ないリードしか生成されず、低存在量転写産物の検出に対して偏りが生じる。組織における既知の位置から、単一細胞からmRNAを捕捉するために光活性化可能なタグが使用されているが（Lovatt, D., et. al., Nat Methods. 2014; 11(2):190-6）、捕捉のスループット性が低く、細胞の収集は自動的ではない。
【００１０】
NGS市場は過去10年間で爆発的に成長し、ムーアの法則を超えるコスト削減およびスループット性の増大を実現した。その用途は、全ゲノムシーケンシングからRNA-Seq、ChIP-Seq、エクソームシーケンシング、今ではシングルセルシーケンシング、単一核シーケンシング、ATAC-Seqおよび多くの他のエキサイティングな用途にまで拡大した。NGSのパワーおよび低いコストは、生命科学を大きく変化させ、精密医療が始まるにつれ、トランスレーショナル医療および診療所へと移行している。近年まで、本質的にすべてのNGS解析は、数多くの細胞の核酸がプールされた「バルクサンプル」の解析であった。単一細胞懸濁液ならびに単一細胞ライブラリーおよび元の未処理の新鮮な試料から出発するバルクライブラリーならびに凍結組織およびホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織のバンクのサンプル調製を統合するシステムが必要とされている。本発明は、システム、カートリッジおよびプロセスが、単一細胞、単一核、および核酸を含む多くのタイプの試料からの固体組織を処理することを可能にする。
【００１１】
シングルセルシーケンシングが、細胞および組織の既知知識を急速に変化させ、新たな細胞型を発見し、細胞および組織がどのように機能するかの多様性の理解を高めている。シングルセルRNAシーケンシング（Shapiro E. Biezuner T, Linnarsson S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 2013; 14(9):618-30. PMID:23897237）が、細胞発現の複雑さならびに細胞間および細胞型間の大きな異種性に光を当てた（Buettner F. Natarajan KN, Casale FP, Proserpio V, Scialdone A, Theis FJ, Teichmann SA, Marioni JC, Stegle O. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 2015; 33(2):155-60. PMID:25599176）。シングルセルシーケンシング（Wang., Y. and N.E. Navin. Advanced and Applications of single-cell sequencing technologies. Molecular Cell. 2015. 58:598-609. PMID 26000845）は、発達、脳の構造および機能、腫瘍の進行および抵抗性、免疫遺伝学などに応用されている。
【００１２】
ナノポアなどのNGSおよび次次世代シーケンシング（NNGS）を使用する単一細胞核酸シーケンシング技術および方法が急速に進化している。一般的な構成要素は、細胞および分子ごとのマーカーまたはバーコードと、NGSおよびNNGS（まとめてNGSと呼ぶ）ライブラリーの調製および解析のためのサンプルのRNAシーケンシング、増幅、およびプーリングのための逆転写酵素との組み込みである。ウェル中の単離された単一細胞から出発して、個々の細胞および分子のためのバーコードが、逆転写酵素鋳型スイッチングにより、プーリングおよびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅（Islam S. et. al. Genome Res. 2011; 21(7):1160-7)(Ramskold D. et. al. Nat Biotechnol. 2012; 30(8):777-82）の前に、または線形増幅のバーコード化ポリTプライマー（Hashimshony T. et. al. Cell Rep. 2012 Sep 27; 2(3):666-73）およびユニークな分子識別子（Jaitin D.A. et. al. Science. 2014; 343(6172):776-9）上で組み込まれている。
【００１３】
先駆的な研究は、マイクロノズルを使用して（Geng T. et. al. Anal Chem. 2014; 86(1):703-12）ナノ小滴を生成し、放出されたプライマー（inDrop）（Klein A. M. et. al. Cell. 2015; 161(5):1187-201）または常磁性ビーズに結合したプライマー（DropSeq）（Macosko E.Z. et. al. Cell. 2015; 161(5):1202-14）からの細胞および分子バーコードを組み込む逆転写によって単一細胞からのmRNAの高度に並列的な処理を実施している。Fekete R. A. and A. Nguyen（米国特許第8,288,106号、2012年10月16日）によって記載された溶解条件および逆転写酵素が、計装、化学、ワークフロー、反応条件、フローセル設計および他の教示を含め、参照により本明細書に組み入れられる。inDropおよびDropSeqはいずれもスケーラブルな手法であり、スケールを、以前に解析されていた細胞100sから1,000s以上まで変化させる。
【００１４】
シングルセルシーケンシングは今や、生物学者、ゲノム科学者、および臨床医に新たな情報を提供しており、シングルセル市場は爆発的に成長しており、おそらくは、生命科学および医学における次の大きな突破口となる。複数の会社が、単一細胞懸濁液を採取し、ロバストなNGSシーケンシングおよび解析パイプラインによって解析されるシングルセルRNAシーケンシング（scRNA-Seq）ライブラリーを創製するためのシステムを提供している。NGSシングルセルシーケンシングのための単一細胞懸濁液を生成するための上流プロセスを統合する、または組織から単一細胞または単核ライブラリーまでを統合したシステムは存在しない。
【００１５】
固体および液体組織からの単一細胞もしくは核または核酸の生成は通常、プロセス統合なしで使用されるいくつかの装置を用いながら手動で実行される。穏やかな機械的破断と酵素的解離との組み合わせが、最高の生存率および最小の細胞ストレス反応を有する単一細胞を生成することが示された（Quatromoni JG, Singhal S, Bhojnagarwala P, Hancock WW, Albelda SM, Eruslanov E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. J Leukoc Biol. 2015 Jan; 97(1):201-9. doi:10.1189/jlb.5TA0814-373. Epub 2014 Oct 30）。
【００１６】
様々な組織を解離させるための多くのマニュアルプロトコルが存在する。たとえば、Jungblut M., Oeltze K., Zehnter I., Hasselmann D., Bosio A. (2009). Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator. JoVE. 29, doi:10.3791/1266; Stagg AJ, Burke F, Hill S, Knight SC. Isolation of Mouse Spleen Dendritic Cells. Protocols, Methods in Molecular Medicine. 2001:64:9-22. Doi:10.1385/1592591507; Lancelin, W., Guerrero-Plata, A. Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (57), e3563, 2011. DOI:10.3791/3563; Smedsrod B, Pertoft H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. J Leukocyte Biol. 1985:38:213-30; Meyer J, Gonelle-Gispert C, Morel P, Buhler L Methods for Isolation and Purification of Murine Liver Sinusoidal Endothelial Cells: A Systematic Review. PLoS ONE 11(3) 2016:e0151945. doi:10.1371/journal.pone.0151945; Kondo S. Scheef EA, Sheibani N, Sorenson CM. "PECAM-1 isoform-specific regulation of kidney endothelial cell migration and capillary morphogenesis", Am J Physiol Cell Physiol 292:C2070-C2083, (2007); doi:10.1152/ajpcell.00489.2006; Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (79), e50154, doi:10.3791/50154 (2013); Volovitz I Shapira N, Ezer H, Gafni A, Lustgarten M, Alter T, Ben-Horin I, Barzilai O, Shahar T, Kanner A, Fried I, Veshchev I, Grossman R, Ram, Z. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single cells. BMC Neuroscience (2016) 17:30 doi:10.1186/s12868-016-0262-y; F. E Dwulet and M.E. Smith, "Enzyme composition for tissue dissociation", United States Patent 5,952,215, September 14, 1999。
【００１７】
たとえば、関心対象の固体組織を通常、解体した後、1〜5mmのピースへと手でミンチする、またはブレンダタイプの破砕装置を使用する。コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、パパイン、プロテアーゼ、DNアーゼなどの酵素または酵素の混合物を加え、試料を、通常は解離を支援するために振とうまたは回転させながらインキュベートして、組織から単一細胞または核を調製する。多くの手法においては、試料を複数回摩砕する、または機械的に破砕する。機械的破砕は、オリフィス、粉砕、ホモジナイズ、組織をスクリーンまたはフィルタに押し通すこと、音波破砕、ブレンディング、ビーズ破砕、組織を解離させる特徴を有するロータおよび組織を物理的に破砕して単一細胞を生成するのに役立つ他の方法を介し得る。
【００１８】
解離の後、いくつかの態様においては、解離したサンプルをフィルタ、たとえば70μmフィルタに通して、細胞またはデブリの塊を保持する。単一細胞または核を含有する濾液をさらに処理して、培地またはバッファを交換し；酵素を加え、除き、または不活性化し；細胞または生体分子を濃縮し、赤血球を溶解し、または特定の細胞型を捕捉し得る。処理は通常、遠心分離および再懸濁、密度勾配または抗体もしくは他のアフィニティー捕捉リガンドまたは蛍光活性化セルソーティング（FACS）もしくは他の方法を使用する特定の細胞型の磁気ビーズ捕捉の複数の工程を含む。単一細胞懸濁液の力価および生存率は通常、顕微鏡および血球計数盤を用いる光学イメージングまたは自動化された計器を使用して測定される。多くの場合、生存率は、トリパンブルーまたは蛍光色素を使用して測定される。精度管理は、BioAnalyzerなどの機器上でのゲル電気泳動による核酸の特性評価または逆転写酵素および定量的ポリメラーゼ連鎖反応法（RT-qPCR）もしくは他の適切な方法を使用する特定の遺伝子の発現の決定を含むことができる。
【００１９】
速やかな核の生成は遺伝子発現のスナップショットを与えることができる（Habib N, Li Y, Heidenreich M, Swiech L, Avraham-Davidi I, Trombetta JJ, Hession C, Zhang F, Regev A. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 2016 Aug 26; 353(6302):925-8. doi:10.1126/science.aad7038. Epub 2016 Jul 28; Grindberg RV, Yee-Greenbaum JL, McConnell MJ, Novotny M, O'Shaughnessy AL, Lambert GM, Arauzo-Bravo MJ, Lee J, Fishman M, Robbins GE, Lin X, Venepally P, Badger JH, Galbraith DW, Gage FH, Lasken RS. RNA-sequencing from single nuclei. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Dec 3; 110(49):19802-7. doi:10.1073/pnas.1319700110. Epub 2013 Nov 18）。
【００２０】
組織からの核の生成は、細胞を溶解するが核を溶解しない界面活性剤を含むバッファの存在下、ダウンス型ホモジナイザを使用して実行することができる。核はまた、単一細胞懸濁液から出発して（CG000124_SamplePrepDemonstratedProtocol_-_Nuclei_RevB, 10x Genomics, https://assets.contentful.com/an68im79xiti/6FhJX6yndYy0OwskGmMc8l/48c341c178feafa3ce21f5345ed3367b/CG000124_SamplePrepDemonstratedProtocol_-_Nuclei_RevB.pdf）、溶解バッファ、たとえばヌクレアーゼフリー水中10mMトリスHCl、10mM NaCl、3mM MgCl2および0.005％Nonidet P40の添加および氷上で5分間のインキュベーション、次いで核をペレット化するための遠心分離、次いで再懸濁バッファ、たとえば1.0％BSAおよび0.2U/μl RNアーゼ阻害剤を含む1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）への再懸濁により、調製することもできる。核を繰り返しペレット化し、再懸濁させて精製してもよいし、密度勾配法または他の精製法を使用してもよい。核懸濁液の力価および生存率は通常、顕微鏡および血球計数盤を用いる光学イメージングまたは自動化された計器を使用して測定され、生存率は、トリパンブルーまたは蛍光色素を使用して測定される。
【００２１】
組織からの単一細胞および核を生成し、特性評価するための多工程ワークフローは通常、プロセス統合なしで、いくつかの装置を使用して手動で実行され、シングルセルシーケンシングのスケーラビリティーおよびSample-to-Answerシステムを創製するための下流プロセスとの統合を制限している。それは労を要し、熟練した技術者または科学者を必要とし、単一細胞の質における、ひいては下流ライブラリー、解析およびデータにおけるばらつきを生じさせる。必要とされる複数の工程および技能は、同じ試料からでさえ、生成される単一細胞または核の異なる質を招くことができ、臨床有用性を制限する。今日、高質な単一細胞の生成は何ヶ月もの最適化を要することがある。
【００２２】
特に臨床の場で慣例的な単一細胞調製を実行する前には標準化が必要である。加えて、プロセスの長さおよび解離のプロセスは、潜在的に長い処理時間によって増強する処置のストレスに反応して生理機能を変化させ、RNA、タンパク質、脂質および代謝産物などの生体分子の発現を変化させる組織および細胞を招くことがある。ある決定的な最近の洞察は、細胞処理方法、たとえば細胞を組織から解離させるためのプロテアーゼの使用（Lacar B, Linker SB, Jaeger BN, Krishnaswami S, Barron J, Kelder M, Parylak S, Paquola A, Venepally P, Novotny M, O'Connor C, Fitzpatrick C, Erwin J, Hsu JY, Husband D, McConnell MJ, Lasken R, Gage FH. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nat Commun. 2016 Apr 19; 7:11022. doi:10.1038/ncomms11022. PMID:27090946）が、細胞をストレス下に置くことによって遺伝子発現を変化させて、真のトランスクリプトームの解析を混乱させ得るということである。
【００２３】
将来、真のsample-to-answer固体組織−単一細胞／核NGS解析システムを生成するために下流NGS解析との完全なプロセスまたは物理的統合を達成する前に、ワークフローを簡単化するためにロバストな自動化されたサンプル調製が必要である。広い範囲の生物および組織からの広い範囲の組織を投入し、高質な単一細胞または核懸濁液を、介入なしで、懸濁液に許容可能な生存率で、かつ遺伝子発現パターンに対する最小限の変化で生成するロバストなプロセスおよび自動化されたシステムが必要である。
【００２４】
標準化されたプロセスを達成するためには、使い捨てカートリッジを用いて組織からの細胞または核のサンプル調製を自動化するシステムが必要である。場合によっては、カートリッジ中にマイクロ弁を使用することができる。マイクロ弁は、機械式（熱空気圧式、空気圧式、形状記憶合金）、非機械式（ハイドロゲル、ゾルゲル、パラフィンおよび氷）および外部（モジュール内蔵式、空気圧式および非空気圧式）マイクロ弁で構成される（C. Zhang, D. Xing, and Y. Li., Micropumps, microvalves, and micromixers within PCR microfluidic chips: Advances and trends. Biotechnology Advances. Volume 25, Issue 5, September-0ctober 2007, Pages 483-514; Diaz-Gonzalez M., C. Fernandez-Sanchez, and A. Baldi A. Multiple actuation microvalves in wax microfluidics. Lab Chip. 2016 Oct 5; 16(20):3969-3976; Kim J., Stockton AM, Jensen EC, Mathies RA. Pneumatically actuated microvalve circuits for programmable automation of chemical and biochemical analysis. Lab Chip. 2016 Mar 7; 16(5):812-9. doi:10.1039/c5lc01397f; Samad MF, Kouzani AZ. Design and analysis of a low actuation voltage electrowetting-on-dielectric microvalve for drug delivery applications. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2014; 2014:4423-6. doi:10.1109/EMBC.2014.6944605; Samad MF, Kouzani AZ. Design and analysis of a low actuation voltage electrowetting-on-dielectric microvalve for drug delivery applications. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2014; 2014:4423-6. doi:10.1109/EMBC.2014.6944605; Lee E, Lee H, Yoo SI, Yoon J. Photothermally triggered fast responding hydrogels incorporating a hydrophobic moiety for light-controlled microvalves. ACS Appl Mater Interfaces. 2014 Oct 8; 6(19):16949-55. doi:10.1021/am504502y. Epub 2014 Sep 25; Liu X, Li S. An electromagnetic microvalve for pneumatic control of microfluidic systems. J Lab Autom. 2014 Oct; 19(5):444-53. doi:10.1177/2211068214531760. Epub 2014 Apr 17; Desai AV, Tice JD, Apblett CA, Kenis PJ. Design considerations for electrostatic microvalves with applications in poly(dimethylsiloxane)-based microfluidics. Lab Chip. 2012 Mar 21; 12(6):1078-88. doi:10.1039/c2lc21133e. Epub 2012 Feb 3; Kim J, Kang M, Jensen EC, Mathies RA Lifting gate polydimethylsiloxane microvalves and pumps for microfluidic control. Anal Chem. 2012 Feb 21; 84(4):2067-71. doi:10.1021/ac202934x. Epub 2012 Feb 1; Lai H, Folch A. Design and dynamic characterization of "single-stroke" peristaltic PDMS micropumps. Lab Chip. 2011 Jan 21; 11 (2):336-42. doi:10.1039/c0lc00023j. Epub 2010 Oct 19に記載）。本明細書に記載されているシステム態様は、弁なしでカートリッジを作動させることもできるし、流れを方向付けるために弁がカートリッジに組み込まれることもできる。
【００２５】
カートリッジと機器流体光学部品との間の流体接続は、参照により組み入れられる、Jovanovich, S. B. et. al. Capillary valve, connector, and router. February 20, 2001、米国特許第6,190,616号およびJovanovich, S. B. et. al. Method of merging chemical reactants in capillary tubes, April 22, 2003、米国特許第6,551,839号およびJovanovich, S., I. Blaga, and R. McIntosh. Integrated system with modular microfluidic components、米国特許第7,244,961号（2007年7月17日）、ならびにモジュラーマイクロ流体コネクタおよびモジュラーマイクロ流体コネクタの詳細、たとえば、多方弁、ルータ、および他の機能としてのそれらの使用、たとえば、フロースルー反応を実行するためのマイクロ流体回路および内反射面を有するフローセルを記載するそれらの教示によって教示されているように、ばね押しコネクタおよびモジュラーマイクロ流体コネクタの使用によって達成することができる。
【００２６】
細胞または沈殿物を拘束し、洗浄し、核酸および他の生体分子を表面に溶離させるための常磁性ビーズの表面化学および条件は十分に理解されており（Boom, W. R. et. al.米国特許第5,234,809号、1993年8月10日）、（Reeve, M. and P. Robinson米国特許第5,665,554号、1997年9月9日）、（Hawkins, T., 米国特許第5,898,071号、1999年4月27日）、（McKernan, K. et. al., 米国特許第6,534,262号、2003年3月18日）、（Han, Z., 米国特許第8,536,322号、2013年9月17日）、（Dressman et al., "Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variation" Proc. Natl. Acad. Sci. 100(15):8817-8822 (2003)）、（Ghadessy et al., "Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replication", Proc. Natl. Acad. Sci. 98(8):4552-4557 (2000)）、（Tawfik and Griffiths, "Man-made cell-like compartments for molecular evolution" Nat. Biotech. 16(7):652-656 (1998)）、（Williams et al., "Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR" Nat. Meth. 3(7):545-550 (2006)）、多くの化学が可能であり、本開示の範囲内である。
【発明の概要】
【００２７】
本明細書に開示されるものは、生体分析または微小組織もしくはオルガノイドの形成のための、元のサンプルまたは処理済みのサンプルを処理するサンプル処理システムである。当該サンプル処理システムプロセスは、酵素的および機械的破砕機構と、統合された流体プロセスとで構成される。本発明は、とりわけ、組織または他の生物学的サンプルを含む固体、液体、または気体サンプルを投入し、生体分析および他の分析のためにサンプルを処理するサンプル処理システムの実現を可能にする。
【００２８】
いくつかの態様において、サンプルまたは試料は組織試料である。組織は、ヒト、動物または植物組織などの任意のソースに由来することができる。組織の例は、非限定的に、生検サンプル、コア生検サンプル、穿刺吸引物、細胞集塊、臓器断片、全血、骨髄、バイオフィルムまたは任意の他の固体、半固体、ゼラチン状、凍結もしく固定された三次元または二次元の細胞マトリックスを含む。別の態様において、放出される核酸は、膜、チップ表面、ビーズ、表面、フローセル、または粒子に結合する。語「試料」は、サンプルおよび組織試料を指すために使用される。
【００２９】
1つの態様において、サンプル処理システムは組織処理に使用される。組織処理システム態様は、固体または液体組織および他のサンプルを、機械的および酵素的または化学的プロセスにより、単一細胞、核、細胞小器官および生体分子へと処理して、懸濁液中の単一細胞、核、細胞内成分および生体分子、たとえば、DNAおよびRNAで構成されている核酸で構成されている高分子；タンパク質；炭水化物；脂質；複数のタイプの高分子を有する生体分子；代謝産物；ならびに他の生物学的成分、たとえば懸濁液中の、溶液中の、または表面に付着した、生体分析のための天然産物を生成することができるフレキシブルで拡張可能なシステムとして実現することができる。いくつかの態様において、組織処理システムは、アフィニティー精製または他の精製を実行して、細胞型、細胞小器官、たとえば核、ミトコンドリア、リボソームもしくは他の細胞小器官または細胞外流体を濃縮する、または枯渇させる。いくつかの態様において、組織処理システムはNGSライブラリー調製を実行することができる。いくつかの態様において、組織処理システムは、組織を、サンガー、NGS、NNGSおよび他の核酸シーケンシング技術を含むシーケンシング、タンパク質シーケンシングまたはプロテオーム解析もしくは他の解析法のための単一細胞ライブラリーへと処理する。
【００３０】
本明細書に開示されるものは、試料（すなわち組織、バイオフィルム、細胞またはウイルスを有する他の多次元マトリックス、液体）からサンプルを採取し、単一細胞または核を懸濁液中または表面上に調製する、または試料を生体分子、たとえば、DNAおよびRNAで構成される核酸で構成される高分子；タンパク質；炭水化物；脂質；複数のタイプの高分子を有する生体分子；代謝産物；ならびに他の生物学的成分、たとえば天然産物へとさらに処理するための全体工程の2つ以上を統合するサンプル処理システムの様々な態様である。いくつかの態様において、試料は、NGSシーケンシングライブラリーへと処理されることもできるし、分析システムと完全に統合されてsample-to-answerシステム、たとえばsample-to-answerゲノムシステムを生成することもできる。
【００３１】
いくつかの態様において、サンプル処理システムは、下流生体分析と統合されてsample-to-answerシステムを創製することができる。サンプル処理システムの好ましい態様においては、組織処理システム処理態様が核酸生体分析システムと統合されて、組織からの核酸をシーケンシングする。「統合」は、ワークフローが直接的にインタフェースすること、あるいは他の文脈においては、物理的システムが直接的にインタフェースする、またはシステム、機器、もしくは装置に組み込まれることを指すために使用される。1つの態様において、組織処理システムは核酸シーケンサと統合されてsample-to-answerシステムを生成する。
【００３２】
1つの態様においては、組織処理システムを、懸滴法または他の方法を使用してカートリッジ内で直接的に微小組織またはオルガノイドを創製するために使用することもできるし、システムの産出物を、カートリッジから微小組織またはオルガノイドを創製するための出発点として使用することもできる。
【００３３】
サンプル処理システムは、処理または分析を実行する複数のサブシステムおよびモジュールを有することができる。サンプル処理システムの好ましい態様においては、1つまたは複数のカートリッジが処理ワークフローにおける1つまたは複数の工程を実行する。いくつかの態様において、カートリッジは、2つ以上のサンプルを処理することができる複数の処理部位、たとえば処理チャンバを有する。いくつかの態様においては、キャップが、物理的解離サブシステムからのカートリッジ上の機械的破砕を、処理チャンバにおける酵素的・化学的解離サブシステムに結合する。いくつかの態様においては、酵素的・化学的解離サブシステムからの試薬が、流体工学サブシステムにより、カートリッジに、試料を破砕して解離させ、細胞、細胞内成分、および生体分析のための生体分子を処理するための前処理チャンバおよび処理チャンバとして使用される領域に送られる。
【００３４】
流体の添加は流体工学サブシステムによって制御することができ、完全なシステムは、モニタ、埋め込みディスプレイ、タッチスクリーンで構成されている装置を介するユーザインターフェースを含むことができる制御サブシステム中のソフトウェアによって；またはシステムもしくは付属装置、たとえば携帯電話またはマイクを介する音声コマンドを通して制御される。いくつかの例において、制御サブシステムは、研究室情報管理システム、他の機器、データベース、分析ソフトウェア、Eメールおよび他のアプリケーションへのインタフェースを含むことができる。
【００３５】
いくつかの態様において、解離の量が解離中に定間隔でモニタされ、いくつかの例においては、処理中、計測サブシステムを使用して生存率が測定される。解離および/または生存の程度は、主解離コンパートメント内で測定することもできるし、別個のコンパートメントまたはチャネル中で測定することもできるし、外部計器中で測定することもできる。
【００３６】
いくつかの態様においては、さらなる処理またはイメージングのために、細胞イメージング溶液、たとえば細胞型特異的な抗体、染剤または他の試薬を組織または単一細胞もしくは核に加えることができる。イメージングは、細胞、細胞内構造または組織学的もしくは他のデータを捕捉することができる。いくつかの態様においては、イメージを解析して、サンプル処理システムの動作およびワークフローを決定木、ハッシュテーブル、機械学習または人工知能に送ることができる。
【００３７】
いくつかの態様において、懸濁液中または表面上の単一細胞または核は、細胞型、核、核酸または他の生体分子を精製する、または枯渇させるための磁気処理モジュールを使用する磁気ビーズまたは粒子技術を使用してさらに処理される。
【００３８】
語「単一化細胞」は、単一細胞として処理されることができるような、懸濁液中もしくは表面上またはウェル、たとえばマイクロウェルもしくはナノウェル中の単一細胞を指すために使用される。語「単一化細胞」はまた、単一核を包含するように使用されることもある。
【００３９】
1つの態様において、試料は、組織の物理的解離と酵素的解離の両方を実行するカートリッジに加えられる。いくつかの態様においては、シンギュレータシステムが、細胞を単一化するプロセスにおける工程として摩砕および他の物理的解離モダリティを実行する。物理的解離モダリティは、試料を、スクリーン、フィルタ、オリフィス、粉砕、ブレンディング、音波破砕、スメアリング、ビーズ破砕、および組織を物理的に破砕して単一細胞もしくは核または核酸もしくは他の生体分子を生成しやすくするための当業者に公知の他の方法に通すことを含む。
【００４０】
1つの態様において、試料は、核への組織の物理的解離と化学的解離の両方を実行するカートリッジに加えられる。いくつかの態様においては、シンギュレータシステムが、核懸濁液を生成するプロセスにおける工程として摩砕および他の物理的解離モダリティを実行する。物理的解離モダリティは、試料を、スクリーン、フィルタ、オリフィス、ギャップ、粉砕、ブレンディング、音波破砕、スメアリング、ビーズ破砕および組織を物理的に破砕して、組織の化学処理を使用するとき核もしくは核酸または他の生体分子を生成しやすくするための当業者に公知の他の方法に通すことを含む。
【００４１】
1つの態様において、サンプル処理システムはシンギュレータシステム態様である。記載されているシンギュレータシステムは、生の未処理サンプルまたは他の一次もしくは二次サンプルを投入し、単一細胞もしくは核分析のために、または、たとえば、抗体またはセルソーティングもしくは増殖によって特定の細胞型を精製するためのさらなる処理、ライブラリー調製または多くの他の用途のためにすぐ使える単一細胞または核を産出する。シンギュレータシステム態様は、試料、たとえば組織、血液、体液または細胞を含有する他の液体もしくは固体から単一細胞または核を解離させて、単一細胞または核を懸濁液中、表面上、マトリックス中または他の産出物の形態で生成する。好ましい単一化システム記載態様において、組織および/または他の試料を投入し、好ましくは既知の力価の単一細胞または核を、培地を添加されたバッファ、たとえば2％ウシ胎児血清を添加されたハンクスバッファ中に産出するカートリッジがある。
【００４２】
いくつかの態様において、サンプル処理システム、たとえばシンギュレータシステム態様は、核酸を保存し、凝集を防ぐための酵素をはじめとする酵素を使用して、細胞を単一化するプロセスを支援する。酵素および添加物は、非限定的に、コラゲナーゼ（たとえばコラゲナーゼタイプI、II、III、IVなど）、エラスターゼ、トリプシン、パパイン、tyrpLE、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン、中性プロテアーゼ、プロナーゼ、リベラーゼ、クロストリパイン、カゼイナーゼ、中性プロテアーゼ（Dispase（登録商標））、DNアーゼ、プロテアーゼXIV、RNアーゼ阻害剤または他の酵素、プロテアーゼ阻害剤、活性部位阻害剤、EDTA、EGTA、生化学物質または化学物質、たとえばTriton X-100、Nonidet P40、界面活性剤、界面活性物質などで構成される。他の態様においては、様々な試薬または試薬の混合物が順次に加えられて、生物学的サンプルまたは試料を単一細胞懸濁液へと解離させる。
【００４３】
いくつかの態様において、サンプル処理システム、たとえばシンギュレータシステム態様は、化学物質、酵素または両方を使用して、固体組織から核単離溶液中で核を生成するプロセスを支援し、組織解離を支援して、核酸を保存し、凝集を防ぐ。化学物質は、非限定的に、界面活性剤、界面活性物質、非イオン性界面活性物質、Triton X-100、Tween、Brij、CHAPS、Nonidet P40、Igepal、グリコシド、HEGA、MEGAまたはジギトニンで構成され；酵素は、コラゲナーゼ（たとえばコラゲナーゼタイプI、II、III、IVなど）、エラスターゼ、トリプシン、パパイン、tyrpLE、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン、中性プロテアーゼ、プロナーゼ、リベラーゼ、クロストリパイン、カゼイナーゼ、中性プロテアーゼ（Dispase（登録商標））、DNアーゼ、プロテアーゼXIVまたは他の酵素で構成される。いくつかの態様においては、阻害剤、たとえばRNアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、活性部位阻害剤、またはRNアーゼに必須のイオンを封鎖またはキレート化する生化学物質（EDTAもしくはEGTAまたはクエン酸ナトリウムを含む）を、溶液中で使用することができる。いくつかの態様においては、スペルミンもしくはスペルミジンまたは酪酸ナトリウムまたはオルトバナジン酸ナトリウムまたはフッ化ナトリウムが核単離溶液または核貯蔵溶液に含まれる。他の態様においては、様々な試薬または試薬の混合物が順次に加えられて生物学的サンプルまたは試料を単一細胞懸濁液へと解離させた後、単一細胞が核へと処理される。いくつかの態様においては、フィコールまたはグリコールまたはデキストランまたはスクロースまたはトレハロースまたはポリエチレングリコールまたはセルロースまたはRNアーゼもしくはDNアーゼまたは生体分子を分解する他の酵素もしくは化合物の拡散速度を下げるための他の化合物で構成される化学物質を使用して、溶液の粘性が高められる。いくつかの態様において、バッファ中の対イオンは酢酸イオンである。
【００４４】
いくつかの態様において、シンギュレータシステムは、既知の力価および生存率の細胞懸濁液を生成する。いくつかの態様において、シンギュレータシステムは、サンプルの生存率および/または単一化の量をモニタし、たとえば単一細胞または核の生成による解離のモニタリングによって処理時間および酵素または他の解離剤の濃度を調節する。モニタリングは、リアルタイム、定間隔もしくは終点またはそれらの任意の組み合わせであることができる。
【００４５】
シンギュレータシステムは、いくつかの態様において、組織を解離させるための試薬のセットから選択を行い、システムによってモニタされる単一細胞の生成または細胞の生存率にしたがって、いくつかの例においてはリアルタイムで、定間隔で、または終点として調節を行うことができる。シンギュレータシステムによって生成された単一細胞懸濁液は、治療用途の細胞を生成するために、たとえば新たな組織および/または臓器および/または生物を再成長させるために使用することができる。
【００４６】
シンギュレータシステムは、既存の技術に対して利点を有し、いくつかの態様においては試料をNGSライブラリーまたは他の調製物へと処理することができる自動化され、標準化された機器の中で、組織から単一細胞、核または生体分子を生成することができる。シンギュレータシステムは、ユーザ、たとえば研究者、臨床医、法科学者および多くの学問分野が生体サンプルに対して同一の処理を実行することを可能にして、ユーザ間のばらつきおよび手動処理のスループット性の制約を減らす。
【００４７】
単一化システムの態様は、DNAシーケンシング、DNAマイクロアレイ、RNAシーケンシング、質量分析法、ラマン分光法、電気生理学、フローサイトメトリー、マスサイトメトリーおよび当業者に周知の他の多くの分析法、たとえば多次元分析法（たとえばLC/MS、CE/MSなど）で構成される方法による分析のために単一細胞もしくは核または核酸を調製することができる。加えて、懸濁液中または表面もしくはマトリックス上の単一細胞は、さらなる細胞、たとえばCRISPRなどの方法によって遺伝子改変された細胞、操作されたウイルスまたは核酸配列を組織培養で成長させるために、または研究および治療目的のために組織または臓器を成長させるために使用することができる。
【００４８】
記載されているシンギュレータシステム態様は、NGSシーケンサとNNGSシーケンサの両方による市販の下流ライブラリー調製および解析と適合性である。語「NGS」は、NGSもしくはNNGSシーケンサのいずれかまたはサンプル調製法を意味するために適宜に使用される。本明細書において考えられるように、「次世代シーケンシング」または「次次世代シーケンシング」とは、高スループットシーケンシング、たとえば大規模並列シーケンシング（たとえば、少なくとも1,000、10万、100万、1000万、1億または10億のポリヌクレオチド分子を同時に（または続けざまに）シーケンシングする）を指す。シーケンシング法としては、高スループットシーケンシング、パイロシーケンシング、合成によるシーケンシング、単一分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、RNA-Seq（Illumina）、Digital Gene Expression（Helicos）、次世代シーケンシング、Single Molecule Sequencing by Synthesis（SMSS）（Helicos）、大規模並列シーケンシング、Clonal Single Molecule Array（Solexa）、ショットガンシーケンシング、マクサム・ギルバートまたはサンガーシーケンシング、プライマウォーキング、PacBioを使用するシーケンシング、SOLiD、Ion Torrent、Genius（GenapSys）、DNAナノボールシーケンシング（Complete Genomics）またはナノポア（たとえばOxford Nanopore, Roche）プラットフォームおよび当技術分野において公知の任意の他のシーケンシング法があるが、これらに限定されない。
【００４９】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、本明細書に部分的または完全に記載され、任意の該当する図面に示される装置、組成物または製造物品ならびにそれらに対する任意の改善、強化および変形（1つまたは複数の態様における1つまたは複数の特徴を含む）である。
【００５０】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、本明細書に部分的または完全に記載され、任意の該当する図面に示される装置、組成物または製造物品ならびにそれらに対する任意の改善、強化および変形（すべての特徴を含む）である。
【００５１】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、本明細書に部分的または完全に記載され、任意の該当する図面に示される操作または生成の方法またはプロセスならびにそれらに対する任意の改善、強化および変形（1つまたは複数の態様における1つまたは複数の特徴を含む）である。
【００５２】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、本明細書に部分的または完全に記載され、任意の該当する図面に示される操作または生成の方法またはプロセスならびにそれらに対する任意の改善、強化および変形（すべての特徴を含む）である。
【００５３】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、本明細書に部分的または完全に記載され、任意の該当する図面に示される任意のプロセスから生成された、または結果的に得られた産物、組成物または製造物品ならびにそれらに対する任意の改善、強化および変形である。
【００５４】
1つの態様において、単一細胞懸濁液は、シーケンシング、次世代シーケンシング、次次世代シーケンシング、タンパク質シーケンシング、プロテオーム解析、ゲノム解析、遺伝子発現、遺伝子マッピング、炭水化物特性評価およびプロファイリング、脂質特性評価およびプロファイリング、フローサイトメトリー、イメージング、DNAもしくはRNAマイクロアレイ解析、代謝プロファイリング、機能もしく質量分析またはそれらの組み合わせをはじめとする下流解析のための生体分析モジュールのために調製される。
【００５５】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、処理工程とでサンプル成分の分析情報、たとえばその生存率、単一細胞または核の解離の程度を相関させ、解析し、記憶し、可視化し、酵素活性の経時的変化および/または量および/または元の生物学的試料の物理的破砕を計測するデータ解析システムである。別の局面において、本明細書に提供されるものは、サンプル成分の分析情報を相関させ、解析し、記憶し、可視化し、サンプルのメタデータを下流または上流研究室情報システムとで共有するデータ解析システムである。
【００５６】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、処理工程とでサンプル成分の分析情報、たとえばその生存率、単一細胞または核の解離の程度を相関させ、解析し、記憶し、可視化し、酵素活性の経時的変化および/または量および/または元の生物学的試料の物理的破砕を計測し、分析情報から処理パラメータを調節するデータ解析システムである。
【００５７】
シンギュレータシステムは、シングルセルNGSワークフローのうち、自動化されていない唯一の部分を自動化し、標準化する新規なプラットフォームである。これは幅広い影響を及ぼす。プロセス標準化は、ラボ間または研究者間でのデータ比較にとってきわめて重要になる。Human Cell Atlasプロジェクトは、複数の国の結果をオープンデータベース中で自由に共有することを意図する。しかし、完全なプロセスの標準化なしでは、直接比較は、組織から単一細胞または核を生成する最初の処理工程からの大きく異なる影響をこうむる。加えて、単一細胞または核シーケンシングが臨床的に関連するようになると、単一細胞または核の生成の標準化および作業単純化は、シンギュレータシステムなどの自動化された機器によって実行されなければならなくなる。
【００５８】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、(a) (i) カートリッジと係合するように構成されている1つまたは複数のカートリッジインタフェース；(ii) (1) 1つまたは複数の液体および/または気体を収容する1つまたは複数の容器；(2) 容器をカートリッジインタフェースにおける流体ポートと接続する1つまたは複数の流体ライン；ならびに(3) 液体および/または気体を流体ポートの中および/または外へと移動させるように構成されている1つまたは複数のポンプを含む、流体工学サブシステム；(iii) アクチュエータを含む1つまたは複数の機械的サブシステム；(iv) 任意選択で、磁力のソースを含む1つまたは複数の磁気処理モジュール（磁力は、1つまたは複数の処理チャンバ内に磁場を形成するように配置されている）；(v) 任意選択で、1つまたは複数の計測モジュール；(vi) 任意選択で、プロセッサおよびメモリを含む1つまたは複数の制御サブシステム（メモリは、プロセッサによって実行されるとシステムを作動させるコードを含む）を含む機器と；(b) それぞれがカートリッジインタフェースの1つと係合し、それぞれが、(i) サンプル入口ポート；(ii) カートリッジインタフェースにおける流体ポートと連通する1つまたは複数のカートリッジポート；(iii) サンプル入口ポートおよび少なくとも1つのカートリッジポートと連通し、組織の機械的破砕のために構成されている組織破砕装置を含む前処理チャンバ（組織破砕装置は、カートリッジがカートリッジインタフェースと係合すると、アクチュエータと係合し、アクチュエータによって駆動される）；(iv) 任意選択で前処理または処理チャンバと合わさって、破砕された組織から細胞および/または核を分離するように構成されている、前処理チャンバと連通する濾過チャンバ；(v) 濾過チャンバと連通し、任意選択で、1つまたは複数のカートリッジポートと連通し、分離された細胞および/または核に対して1つまたは複数の処理工程を実行するように構成されている処理チャンバ；および(vi) 任意選択で、処理チャンバと流体的に接続された1つまたは複数の廃棄物チャンバを含む1つまたは複数のカートリッジとを含むシステムである。1つの態様において、組織破砕装置はグラインダ、ペッスル、または可変オリフィスを含む。別の態様において、システムはさらにバーコードリーダを含む。別の態様において、システムは、細胞もしくは核の力価、凝集および/または生存率または生体分子の性質を計測するための光学イメージングを実行する計測モジュールを含む。別の態様において、システムは計測モジュールおよび制御システムを含み、計測モジュールは、1つまたは複数のタイムポイントで、処理チャンバ内のサンプルの特徴を計測し、制御システムは、サンプルの状態、たとえば生存率または単一細胞もしくは核の解離の程度を測定し、処理パラメータを調節するコードを含む。別の態様において、システムはさらに、(c) 1つまたは複数の解析モジュールを含み、該解析モジュールの投入ポートは処理チャンバと流体連通している。別の態様において、解析モジュールは、核酸およびその付加物（たとえばエピジェネティック修飾物）のDNAまたはRNAシーケンシング、次世代DNAまたはRNAシーケンシング、次次世代DNAまたはRNAシーケンシング；核酸およびその付加物のナノポアシーケンシング、核酸およびその付加物のシングルセルDNAシーケンシング；核酸およびその付加物の単一核RNAシーケンシング；PCR、ドロップレットデジタルPCR、qPCR、RT-qPCR；ゲノム解析、遺伝子発現解析、遺伝子マッピング、DNAフラグメントマッピング；光学および質量分析イメージングを含むイメージング；DNAまたはRNAマイクロアレイ解析；核酸およびその付加物の蛍光、ラマン、光学、質量分析および他の検出モダリティ（標識ありまたはなし）；タンパク質およびペプチドならびにそれらの付加物および修飾物のプロテオーム解析、たとえば蛍光、ラマン、光学、質量分析、タンパク質シーケンシングおよび他の検出モダリティ；炭水化物特性評価およびプロファイリング、たとえば炭水化物およびその付加物ならびに他の共有結合ポリマーのシーケンシング、蛍光、ラマン、光学、質量分析および他の検出モダリティ；脂質特性評価およびプロファイリング、たとえば脂質およびその付加物ならびに他の共有結合ポリマーのシーケンシング、蛍光、ラマン、光学、質量分析および他の検出モダリティ；フローサイトメトリー；細胞の特性評価およびプロファイリング、たとえば細胞およびその付加物ならびに他の共有結合ポリマーの蛍光、ラマン、光学、質量分析およびの他の検出モダリティ；代謝プロファイリング、たとえば代謝物およびその付加物ならびに他の共有結合ポリマーのシーケンシング、蛍光、ラマン、光学、質量分析および他の検出モダリティ；タンパク質間相互作用を含む機能分析；細胞、細胞小器官および生体分子のバイオインフォマティクス解析；ならびに質量分析および他の解析法の1つまたは複数から選択される解析を実行する。
【００５９】
別の態様において、カートリッジインタフェースは、流体工学サブシステムおよび機械モジュールと係合し、任意選択で温度制御される、カートリッジを機器中に配置する手段を含む。別の態様において、カートリッジは使い捨てである。
【００６０】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、(a) 組織サンプルを前処理チャンバに提供する工程；(b) 前処理チャンバ内で組織の機械的および酵素的・化学的破砕を自動的に実行して、遊離した細胞および/または核およびデブリを含む破砕組織を生成する工程；(c) 破砕組織を、ストレーナおよび/またはフィルタを含む濾過チャンバの中に自動的に移動し、その中で、遊離した細胞および/または核をデブリから分離する工程；および(d) 遊離した細胞および/または核を、好ましい態様においては濾過チャンバと組み合わされることができる処理チャンバの中に自動的に移動する工程を含む方法である。別の態様において、自動的に移動する工程はさらに、処理チャンバ内で、遊離した細胞および/または核に対して少なくとも1つの処理工程を実行することを含む。別の態様において、処理は、(I) 細胞を溶解すること；(II) 細胞を捕捉すること；(III) 核酸を単離すること；(IV) タンパク質を単離すること；(V) RNAをcDNAへ転換すること；(VI) アダプタ標識された核酸の1つまたは複数のライブラリーを調製すること；(VII) PCRまたは他のDNA増幅法を実行すること；(VIII) 個々の細胞または個々の核を、ナノドロップもしくはナノボーラスもしくはナノウェル中に、または細胞または核の間での関心対象の分子の拡散を抑制するアガロースなどの媒体中に単離すること；および（IX）遊離した細胞および/または核を産出容器、たとえば8ウェルストリップチューブ、マイクロタイタプレート、エッペンドルフチューブ、カートリッジ中のチャンバまたは細胞懸濁液を受けることができる他の容器の中に産出することから選択される、1つまたは複数の自動的に実行されるプロセスを含む。別の態様において、方法はさらに、遊離した細胞および/または核を、細胞および/または核に対してアフィニティーを有する部分を含む、磁気的に引き寄せられる粒子に結合させ、処理チャンバに磁力を加えて、捕捉された細胞および/または核を固定化することにより、処理チャンバ内で自動的に捕捉する工程を含む。別の態様において、方法はさらに、前処理チャンバ内で細胞および/または核力価を自動的にモニタし、力価が所望のレベルに達したならば、組織を解離させるために使用された解離溶液をバッファに交換する工程を含む。別の態様において、方法はさらに、前処理チャンバ内または処理チャンバ内でバイオアッセイを自動的にモニタする工程を含む。
【００６１】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、(i) サンプル入口ポート；(ii) 任意選択で、カートリッジインタフェースにおける流体ポートと連通するように構成されている1つまたは複数のカートリッジポート；(iii) サンプル入口ポートおよび少なくとも1つのカートリッジポートと連通し、組織の機械的破砕のために構成されている組織破砕装置を含む前処理チャンバ（組織破砕装置は、カートリッジがカートリッジインタフェースと係合すると、アクチュエータと係合し、アクチュエータによって駆動される）；(iv) 任意選択で前処理または処理チャンバと組み合わされることができる、破砕された組織から細胞を分離するように構成されている、前処理チャンバと連通する濾過チャンバ；(v) 濾過チャンバと連通し、任意選択で、1つまたは複数のカートリッジポートと連通し、分離された細胞に対して1つまたは複数の処理工程を実行するように構成されている処理チャンバ；および(vi) 任意選択で、処理チャンバと流体的に接続された1つまたは複数の廃棄物チャンバを含むカートリッジである。別の態様において、カートリッジはさらに、サンプル入口を開閉するキャップを含む。別の態様において、キャップは、たとえば軸を中心に回転方向かつ軸に沿って前後に動く組織破砕要素を含む。別の態様において、カートリッジはさらにホルダを含む。別の態様において、カートリッジはさらに、トップピースおよびボトムピースを含み、トップピースおよびボトムピースは、トップピースおよび/またはボトムピースがホルダに対して動くことを許すコラプシブルな要素によって接続されている。別の態様において、ホルダはメッシュスクリーンを含む。別の態様において、カートリッジはさらに、前処理チャンバ内で組織を粉砕するための粉砕要素を含む。別の態様において、カートリッジはさらに、カートリッジおよび/またはその使用に関する情報を含む識別子、たとえばバーコードまたは他の識別システムを含む。別の態様において、カートリッジはさらに、前処理チャンバ内で滑動するように構成されているプランジャを含む。別の態様において、カートリッジは1つまたは複数の弁を有する。
【００６２】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、(a) 内腔を含むフレキシブルチューブを介して流体的に接続された第一の容器および第二の容器；(b) フレキシブルチューブを締め付けるように配置された調節可能なクランプ（クランプの調節が内腔の断面積を変化させる）；および(c) 一方の容器中の液体をフレキシブルチューブを介して他方の容器の中へ押し込むように構成されている、第一および/または第二の容器と機能的に連結された1つまたは複数のポンプまたは装置を含む、組織を破砕するための可変オリフィス装置である。別の態様において、調節可能なクランプは、モータに機能的に連結された偏心カムを含み、カムの回転がクランプを開閉させる。
【００６３】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、(a) 内腔を含むフレキシブルチューブを介して流体的に接続された第一の容器および第二の容器を含む可変オリフィス装置を提供する工程；(b) 組織を含むサンプルを、一方の容器からフレキシブルチューブを介してもう一方の容器へと移動させる工程；(c) 内腔の断面積を減らし、一方の容器からフレキシブルチューブを介してもう一方の容器へとサンプルを移動させる工程；(d) 工程(c) を一回または複数回繰り返して組織を破砕する工程を含む、組織を破砕する方法である。
【００６４】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、(a) (i) それぞれがカートリッジと係合するように構成されており、かつ1つまたは複数の流体ポートを含む、1つまたは複数のカートリッジインタフェース；(ii) (1) 液体および/または気体の1つまたは複数のソース；(2) 該ソースおよび該カートリッジインタフェースにおける流体ポートと連通する、1つまたは複数の流体ライン；ならびに(3) 該ソースから該1つまたは複数の流体ポートの中および/または外へと液体および/または気体を移動させるように構成されている1つまたは複数のポンプを含む、流体工学サブシステム；(iii) カートリッジインタフェースと係合したカートリッジにおいて組織破砕装置を動かすためのアクチュエータ（たとえば、機械式、空気圧式、電磁式、または油圧式アクチュエータ）を含むサブシステムを含む機器と、(b) それぞれがカートリッジインタフェースのうちの1つと係合する1つまたは複数のカートリッジであって、各カートリッジが、(i) 該カートリッジインタフェースにおける流体ポートと連通する1つまたは複数のカートリッジポート；(ii) 開口と、該開口中に配置された、組織の機械的破砕のために構成されている組織破砕装置とを含む、前処理チャンバ（カートリッジがカートリッジインタフェースと係合すると、組織破砕装置がアクチュエータと係合してアクチュエータによって駆動される）；ならびに(iii) 該前処理チャンバおよび1つまたは複数のカートリッジポートと連通し、かつ該前処理チャンバから生物学的材料の懸濁液を収集するように構成されている、処理チャンバを含む、1つまたは複数のカートリッジとを含む、システムである。1つの態様において、前記機器は、流体ラインを通る1つもしくは複数のポンプからの正圧または負圧および/または1つもしくは複数の流体ラインに接続する1つもしくは複数の容器を流体ポートへと方向付けるように構成されている、0、1つ、または複数の弁をさらに含む。別の態様において、機器はさらに、磁場のソースを含む磁気処理モジュールを含み、ソースは、係合したカートリッジの処理チャンバ内に磁場を形成するように配置されている。別の態様において、機器はさらに計測サブシステムを含む。別の態様において、機器はさらに、プロセッサ、メモリおよびローカルまたはリモートデータベースを含む制御サブシステムを含み、メモリは、プロセッサによって実行されるとシステムを作動させるコードを含み、システムからの機器プロセスおよび解析結果の情報をデータベースに記憶することができる。別の態様において、機器はさらに、1つまたは複数のポンプと連通する廃棄物容器を含む。別の態様において、機器はさらに、カートリッジのチャンバ内の温度を調節するように構成されている温度サブシステムを含む。別の態様において、温度サブシステムは、温度調節素子（たとえばペルチェ、抵抗加熱器、循環流体）と、温度調節素子を制御するためのコントローラと、温度調節素子とカートリッジチャンバとの間で熱を伝達する熱伝達素子とを含む。別の態様において、温度サブシステムは、温度調節素子（たとえばペルチェ、抵抗加熱器、循環流体）と、温度調節素子を制御するためのコントローラと、温度調節素子と試薬および試薬容器との間で熱を伝達する熱伝達素子とを含む。別の態様において、アクチュエータは、スロット付き、フィリップス、コードレックス、トライウィング、スパナおよびヘックスから選択されるドライブヘッドを含む。別の態様において、少なくとも1つのポンプはシリンジポンプを含む。別の態様において、ポンプは、流体ラインを介して、処理チャンバと連通するカートリッジポートと係合するカートリッジインタフェースにおける流体ポートと連通し、流体ラインを介して加えられる真空が前処理チャンバから処理チャンバの中へと流体を引き込む。別の態様において、ポンプは、第一の流体ラインを介して流体の容器と連通し、第二のラインを介して、前処理チャンバまたは処理チャンバと連通するカートリッジポートと係合するカートリッジインタフェースにおける流体ポートと連通し、第一の流体ラインを介して加えられる負圧が容器から流体を引き出し、第二の流体ラインを介して加えられる正圧が流体を前処理チャンバまたは処理チャンバの中へと押し込む。別の態様において、各カートリッジインタフェースはさらに、試薬を前処理チャンバに直接的に導入するように構成されている前処理チャンバ中のポートと連通する試薬入口ポートを含む。別の態様において、前処理チャンバは、流体ラインを介して直接的に処理チャンバと連通するか、または前処理チャンバおよび処理チャンバそれぞれにおけるポートと連通するインタフェースにおける1つまたは複数の流体ラインを介して間接的に処理チャンバと連通する。別の態様において、前処理チャンバは直接のカートリッジポートを含まない。別の態様において、カートリッジは、カートリッジインタフェースまたは環境と連通する1つ、2つ、3つまたは4つのいずれか以下のポートを含む。別の態様において、カートリッジは、カートリッジインタフェースまたは環境と連通する複数のポートを含み、少なくとも1つのポートがキャップによって覆われている。別の態様において、組織破砕装置は、(i) シース、(ii) 該シース内で滑動するように構成されているプランジャであって、アクチュエータと係合するためのカプラと、組織を破砕するためのヘッドとを含む、プランジャ、および(iii) 該プランジャを後退位置へと付勢するバイアス機構、たとえばばね（すなわち、該プランジャを前進位置へ動かすためには駆動が必要である）を含む。別の態様において、プランジャはまた、シースの軸を中心に回転することができる。別の態様において、ヘッドは周縁部を有し、ヘッドが前処理チャンバ内で動くとき、周縁部が、ヘッドと前処理チャンバの壁との間に、たとえば、細胞もしくは核または細胞の微小構造がヘッドと壁との間を破裂することなく通過することを可能にするのに十分な、約25ミクロン〜400ミクロンのギャップを提供する。別の態様において、ヘッドは、組織を破砕するための隆起特徴を含む破砕面を含む。別の態様において、プランジャは、アクチュエータと係合するための特徴を含む上面を含む。別の態様において、組織破砕装置は前処理チャンバ内の座部、たとえば環状座部上に位置付けられる。別の態様において、組織破砕装置ヘッドは環状のベベル面を含み、前処理チャンバ内の座部は、プランジャが前処理チャンバの底部に向けて動かされるときに、ヘッドと前処理チャンバの壁との間に環状のギャップが画定され、かつヘッドの破砕面と前処理チャンバの底部との間にはギャップが存在しないかまたは最小限しか画定されないように、ベベル面と嵌合するように構成されている。別の態様において、前処理チャンバは、組織を破砕するための隆起特徴を含む底面を含む。別の態様において、前処理チャンバは、前処理チャンバの側面のポートを処理チャンバの上部のポートに接続する流体チャネルを介して処理チャンバと連通する。別の態様において、処理チャンバはさらに、前処理チャンバから処理チャンバに入る生物学的材料の懸濁液を濾過するために配置されたストレーナ（たとえばフィルタまたはメッシュスクリーン）を含む。別の態様において、処理チャンバはカートリッジポートと連通し、カートリッジポートは、真空がカートリッジポートに加えられると、前処理チャンバ内の液体が処理チャンバの中へ引き込まれるように構成されている。別の態様において、カートリッジはさらに、カートリッジポートおよび処理チャンバと流体的に接続され、それらの間に配置された真空トラップを含む。別の態様において、処理チャンバはドレイン区分およびより狭いスロット区分を含み、処理チャンバは、ドレイン区分内の流体をスロット区分へと方向付けるように構成されている傾斜した床面を含む。別の態様において、処理チャンバは、生物学的材料の懸濁液を収集するための凹部を含む。別の態様において、処理チャンバは、流体を処理チャンバに導入するように構成されているカートリッジポートと連通する。別の態様において、処理チャンバは、流体チャネルを介して前処理チャンバと連通するポートを含むカバーを含む。別の態様において、前処理チャンバは、シール（たとえば脆いシールまたは隔膜）を含むカバーを含み、該シールが取り外されるかまたは開けられる（たとえば穿孔される）と、該処理チャンバへのアクセスが可能になる。別の態様において、処理チャンバは、シール（たとえば脆いシールまたは隔膜）を含むカバーを含み、該シールが取り外されるかまたは開けられる（たとえば穿孔される）と、該処理チャンバへのアクセスが可能になる。別の態様において、カートリッジはさらに、処理チャンバと流体的に接続された1つまたは複数の廃棄物チャンバを含む。別の態様において、カートリッジは、カートリッジおよび/またはその使用に関する情報を含む識別子（たとえば、バーコード、RFID、EE PROM）をさらに含み、機器は、識別子中の情報を読み取るためのリーダを含む。別の態様において、液体および/または気体の1つまたは複数のソースは流体工学サブシステムに含まれている。
【００６５】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、(a) 前処理チャンバが組織サンプルを含む、本明細書に開示されるシステムを提供する工程；(b) アクチュエータを使用して組織破砕装置を作動させることによって組織サンプルを破砕して、生物学的材料の懸濁液を生成する工程；および(c) 流体工学サブシステムを使用して、生物学的材料の懸濁液を前処理チャンバから処理チャンバの中へ移動させる工程を含む方法である。1つの態様において、方法はさらに、生物学的材料の懸濁液を処理チャンバから取り出す工程を含む。別の態様において、前処理チャンバはさらに、細胞外マトリックスを消化するための1つまたは複数の酵素を含む。別の態様において、前処理チャンバはさらに、細胞膜を溶解するための1つまたは複数の界面活性剤を含む。別の態様において、前処理チャンバはさらに、組織破砕中または組織破砕後のRNAまたは他の生体分子の分解速度を低下させる粘性を有する液体を含む。別の態様において、破砕は、ヘッドの破砕面を前処理チャンバの底面から所定の距離に配置し、前処理チャンバ内でヘッドを回転させて組織を破砕することを含む。別の態様において、破砕は、ヘッドの破砕面を前処理チャンバの底面に対して複数の異なるギャップ距離で配置し、各ギャップ距離においてヘッドを回転させることを含む。別の態様において、少なくとも1つのギャップ距離で、破砕ヘッドの少なくともいくらかの部分が底面のいくらかの部分と接触する。別の態様において、ヘッド面の平坦部分とチャンバの底部の平坦部分との間の最大ギャップ距離は、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、500μm、250μm、100μm、75μm、50μm、25μm、20μm、15μm、10μm、5μm、4μm、3μm、2μm、または1μmのいずれか以下である。別の態様において、ヘッド面の平坦部分とチャンバの底部の平坦部分との間の複数のギャップ距離は、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のいずれかであり、最大ギャップ距離は、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、500μm、250μm、100μm、75μm、50μm、25μm、20μm、15μm、10μm、5μm、4μm、3μm、2μm、または1μmのいずれか以下である。別の態様において、方法は、組織破砕装置を用いて組織を破砕する工程；破砕された組織を、細胞外マトリックスを消化する少なくとも1つの酵素とともにインキュベートする工程；およびインキュベートされた組織を組織破砕装置を用いて破砕する工程を含む。別の態様において、流体工学サブシステムは、処理チャンバと連通するカートリッジポートに真空を適用して、生物学的材料の懸濁液を移動させる。別の態様において、カートリッジはさらにストレーナを含み、処理チャンバに入る生物学的材料の懸濁液が濾過されて粒子状物質、たとえば細胞もしくは核の集塊または細胞内生体分子が除去される。別の態様において、方法はさらに、生物学的材料の懸濁液を移動させた後、流体工学サブシステムを使用して、液体をカートリッジポートを介して前処理チャンバに導入し、次いで、流体工学サブシステムを使用して、液体を処理チャンバの中へ移動させる工程を含む。別の態様において、方法はさらに、流体工学サブシステムを使用して、1つまたは複数の試薬を含む1つまたは複数の液体をカートリッジポートを介して処理チャンバに導入する工程を含む。別の態様において、試薬は、酵素を含む、または結合物質（たとえば、細胞表面もしくは核の表面もしくはウイルスの表面の標的または他の生物学的標的に対する結合物質）を含む粒子を含む。別の態様において、組織は標的細胞を含み、方法はさらに、処理チャンバ内の生物学的材料の懸濁液を、標的細胞に結合しかつ生物学的材料の懸濁液内で結合した標的細胞を隔離する結合物質を含む固体粒子と接触させる工程を含む。別の態様において、方法はさらに、結合した標的細胞を懸濁液から分離する工程を含む。別の態様において、組織は腫瘍組織であり、標的細胞は腫瘍浸潤リンパ球である。別の態様において、標的細胞は幹細胞または部分的に分化した細胞である。別の態様において、方法はさらに、生物学的材料の懸濁液の細胞、核、ミトコンドリア、または他の細胞小器官における1つまたは複数の遺伝子の発現を決定する工程を含む。別の態様において、1つまたは複数の遺伝子は、複数の遺伝子を含むパネルである。別の態様において、パネルは、標的細胞型、たとえば肝細胞、ニューロン、腎糸球体壁細胞、心筋細胞を識別する遺伝子を含む。別の態様において、パネルは、CRISPR改変標的細胞を識別する遺伝子を含む。別の態様において、パネルは、細胞がストレス、たとえばアノイキスを受けたときに差次的に発現する遺伝子を含む。別の態様において、方法は、様々な組織破砕条件下で複数の組織サンプルそれぞれについて生物学的材料の懸濁液を調製する工程、および事前に破砕された組織サンプル中の細胞の遺伝子発現プロファイルにもっとも近いかまたはそれからもっと遠い遺伝子発現プロファイルを有する細胞または核を生成する条件を同定する工程を含む。別の態様において、パネルは、1つまたは複数のハウスキーピング遺伝子、たとえば、細胞ストレス状態にかかわらず細胞中で比較的一定のレベルで構成的に発現する遺伝子、たとえばActb、gapdhを含む。
【００６６】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、(i) (1) 開口と、開口中に配置された、組織の機械的破砕のために構成されている組織破砕装置と、(2) 前処理チャンバポートとを含む前処理チャンバ；(ii) 流体ラインを介して前処理チャンバポートと連通する処理チャンバポートを含む処理チャンバ；および(iii) 処理チャンバと連通するカートリッジポート（カートリッジポートに加えられる真空が前処理チャンバから処理チャンバの中へと材料を引き込む）を含むカートリッジである。1つの態様において、カートリッジポートは、直接的に、または真空トラップを介して、処理チャンバと連通する。
【００６７】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、(i) 開口と、開口中に配置された、組織の機械的破砕のために構成されている組織破砕装置とを含む前処理チャンバ；(ii) 前処理チャンバと連通する、ストレーナを含む濾過チャンバ；(iii) 濾過チャンバと連通する第一の処理チャンバ；(iv）第一の処理チャンバと連通する任意選択の第二の処理チャンバ；(v) 処理チャンバおよび第二の処理チャンバ（あるならば）と連通する1つまたは複数のカートリッジポートを含むカートリッジである。
【００６８】
1つの態様において、カートリッジはさらに、第一の処理チャンバおよび第二の処理チャンバ（あるならば）と連通する1つまたは複数の廃棄物チャンバを含む。1つの態様において、第一の処理チャンバは、濾過チャンバからの液体の懸滴を生成するように構成されている要素（たとえばノズル）を含む。
【００６９】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、(a) 組織を含む、本明細書に記載されているカートリッジを提供する工程；(b) 組織破砕装置を用いて組織を破砕して細胞懸濁液を生成する工程；(c) ストレーナを用いて細胞懸濁液を濾過して、濾過された細胞懸濁液を生成する工程；および(d) 要素を使用して、濾過された細胞懸濁液から懸滴を形成させる工程を含む、微小組織を創製する方法である。1つの態様において、微小組織はオルガノイドである。別の態様において、方法はさらに、懸滴を形成した後、懸滴中の細胞の生存を支援するための液体または気体を処理チャンバに加える工程を含む。
【００７０】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、(a) 組織を含む、本明細書に記載されているカートリッジを提供する工程；(b) 組織破砕装置を用いて組織を破砕して細胞懸濁液を生成する工程；(c) ストレーナを用いて細胞懸濁液を濾過して、濾過された細胞懸濁液を生成する工程；(d) 濾過された細胞懸濁液から幹細胞を選択する工程；および(e) 選択された幹細胞を取り出す、またはカートリッジ内で成長させる工程を含む、微小組織を創製する方法である。
【００７１】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、(a) 組織を含む、本明細書に記載されているカートリッジを提供する工程；(b) 組織破砕装置を用いて組織を破砕して細胞懸濁液を生成する工程；(c) ストレーナを用いて細胞懸濁液を濾過して、濾過された細胞懸濁液を生成する工程；(d) 濾過された細胞懸濁液からの細胞を幹細胞へと分化させる工程；および(e) 分化した幹細胞をカートリッジ内で成長させる、または取り出す工程を含む、微小組織を創製する方法である。
【００７２】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、(a) (i) それぞれがカートリッジと係合するように構成されており、1つまたは複数の流体ポートを含む、1つまたは複数のカートリッジインタフェース；(ii) カートリッジインタフェースと係合したカートリッジにおいて組織破砕装置を動かすためのアクチュエータ（たとえば、機械式、空気圧式、電磁式、または油圧式アクチュエータ）を含むモジュールを含む機器と；(b) それぞれが、カートリッジインタフェースの1つと係合し、それぞれが、(i) 開口と、開口中に配置された、組織の機械的破砕のために構成されている組織破砕装置とを含む前処理チャンバを含む、1つまたは複数のカートリッジとを含むシステムである。1つの態様において、カートリッジは前処理チャンバ以外のチャンバを含まない。
【００７３】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、(i) 開口と、開口中に配置された、組織の機械的破砕のために構成されている組織破砕装置とを含む前処理チャンバを含むカートリッジである。
【００７４】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、(i) シース、(ii) 該シース内で滑動するように構成されているプランジャであって、アクチュエータと係合するためのカプラと、組織を破砕するためのヘッドとを含む、プランジャ、および(iii) 該プランジャを後退位置へと付勢するバイアス機構、たとえばばね（すなわち、該プランジャを前進位置へ動かすためには駆動が必要である）を含む組織破砕装置である。1つの態様において、シースは、組織破砕装置を座部上に位置付けるように適合されたシーター要素を含む。別の態様において、シーター要素は、環状リング上に位置付けられるように適合されたフランジを含む。別の態様において、シーター要素は、1つまたは複数のスロット内に位置付けられるように適合された1つまたは複数のタブを含む。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
当業者は、以下に説明される図面が例示のみを目的とすることを理解するであろう。図面は、本教示の範囲をいかなるふうにも限定することを意図しない。
【００７６】
【図１】試料または組織試料を生体分析のための生体成分、たとえば単一細胞または核へと処理するサンプル処理システムを示す。
【図２】組織試料を生体分析のための生体成分、たとえば単一細胞または核などへと処理する組織処理システムを示す。
【図３】試料または組織試料からたとえば単一細胞もしくは核または生体分子を生成するためのシンギュレータシステムのワークフローの概要を示す。
【図４】シンギュレータシステムおよびいくつかの例示的なモジュールの態様の概要を示す。組織試料または他の試料は、1つまたは複数のカートリッジおよび物理的解離サブシステム、酵素的および化学的解離サブシステム、計測サブシステム、流体サブシステム、制御サブシステムまたは磁気モジュールのうちの1つまたは複数の使用を通して、単一細胞、核、核酸、単一細胞ライブラリー、微小組織、オルガノイドおよび他の生物学的材料へと処理される。
【図５】固体組織試料を単一細胞、核および他の生体分子へと解離させるための、機能的モジュールおよび機械的破砕および例示的な酵素製剤のいくつかの例示的なモダリティを示す、プロトタイプの細胞単一化モジュールの全体設計概念を示す。
【図６】固体組織試料を単一細胞、核および他の生体分子へと解離させるための、機器中に位置する酵素および試薬のバンクによって単一カートリッジ中で機械的破砕を行う単一サンプル単一化システムの例を示す。
【図７】機器から離れて試薬モジュール中に位置する酵素および試薬のバンクによって単一カートリッジ中で機械的破砕を行う単一サンプル単一化システムの別の例を示す。
【図８】図8AおよびBは、固体組織試料を単一細胞、核および他の生体分子へと解離させるための単一サンプル単一化システムのための試薬モジュールの例を示す。
【図９】カートリッジを使用して固体組織試料を単一細胞、核および他の生体分子へと解離させるための単一サンプル単一化システムの例の正面を示す。
【図１０】単一サンプル単一化システムの例の背面を示す。
【図１１】2つのカートリッジを使用して固体組織試料を単一細胞、核および他の生体分子へと解離させるための二サンプル単一化システムの例を示す。
【図１２】固体組織試料を単一細胞、核、および他の生体分子へと処理するための、前処理チャンバ、処理チャンバ、および真空トラップチャンバを有するカートリッジの例を示す。
【図１３】図13A〜Cは、固体組織試料を単一細胞、核、および他の生体分子へと処理するための、前処理チャンバ、処理チャンバ、および真空トラップチャンバを有するカートリッジを有するキャップの例ならびにキャップのアセンブリの詳細を示す。
【図１４】図14A〜Bは、破砕装置のヘッドを前処理チャンバ内でセンタリングし、底部ギャップおよび側方ギャップを破砕装置ヘッドと前処理チャンバの壁との間にセットするように設計された特徴を有する組織破砕装置の例を示す。
【図１５】図15A〜Dは、ポートカバー保定シリンダまたはクリンプまたは熱かしめポートカバー保定シリンダによってポート上に固定される低デュロメータのポートカバーを示す。
【図１６】図16A〜Eは、ロータモータアダプタならびに固体組織試料を単一細胞、核、および他の生体分子へと処理するための前処理、処理および真空トラップチャンバを有するカートリッジと係合するキャップを示す。
【図１７】例示的なセットアップで試薬を装填された試薬モジュールを示す。
【図１８】図18Aは、シンギュレータシステム上で解離したマウス腎臓の単一細胞懸濁液の例を示す。図18Bは、シンギュレータシステム上で解離したマウス腎臓の核懸濁液の例を示す。
【図１９】図19Aは、組織の処理を懸滴法によるオルガノイドの形成と統合する垂直カートリッジの例を示す。図19Bは、例示的な垂直カートリッジの背面の図である。
【図２０】懸滴がノズル上に形成されている垂直カートリッジの拡大図を示す。
【図２１】ストレス誘導性遺伝子発現変化を計測するのに有用な遺伝子のパネルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
発明の詳細な説明
NGS、質量分析、FACSおよび他の最新の高スループット分析システムが生命科学および医学を革命的に変化させた。情報の進歩は、生物の総体レベルから組織、そして今や単一細胞分析へと進んでいる。タンパク質発現、炭水化物、脂質および個々の細胞の代謝を含むゲノム、プロテオームの単一細胞分析は、基本的な科学的知識を提供し、研究および臨床能力を革命的に変えている。
【００７８】
試料：本明細書において使用される語「試料」は、遺伝物質を含有するインビトロ細胞、細胞培養物、ウイルス、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、身体サンプルまたは組織サンプルを指す。特定の態様において、試料の遺伝物質はRNAを含む。他の態様において、試料の遺伝物質はDNAまたはRNAとDNAの両方である。特定の態様において、遺伝物質は改変されている。特定の態様において、組織試料は、対象から単離された細胞を含む。対象は、試料を単離することができる元の任意の生物を含む。生物の非限定的な例は、原核生物、真核生物または古細菌、たとえば細菌、真菌、動物、植物または原生生物を含む。動物は、たとえば哺乳動物または非哺乳動物であることができる。哺乳動物は、たとえばウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒトまたはげっ歯類、たとえばマウスまたはラットであることができる。特定の局面において、組織試料はヒト組織サンプルである。組織試料は、液体、たとえば血液サンプル、赤血球、白血球、血小板、血漿、血清であることができる。試料は、他の非限定的な態様において、唾液、頬、喉または鼻腔スワブ、穿刺吸引物、組織プリント、脳脊髄液、粘液、リンパ、糞便、尿、皮膚、脊髄液、腹膜液、リンパ液、房水もしくは硝子体液、滑液、涙、精液、膣液、肺滲出液、漿液、臓器、気管支肺胞洗浄液、腫瘍、凍結細胞またはインビトロ細胞培養物の成分であることができる。他の局面において、組織試料は、固体組織サンプルもしくは凍結組織サンプルまたは生検サンプル、たとえば穿刺吸引物もしくはコア生検材料または切除もしくは他の臨床または獣医学的試料である。なおさらなる局面において、試料はウイルス、古細菌、細菌または真菌を含む。試料は、エクスビボ組織もしくはサンプルまたはレーザキャプチャマイクロダイセクションによって得られた試料であることができる。試料は、米国特許出願公開第2003/0170617号（2003年1月28日出願）に記載されているものを含む固定試料またはFFPE試料であることができる。
【００７９】
いくつかの態様において、単一細胞は、1つまたは複数のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは他の高分子を含む生体分子に関してさらに分析することができる。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの態様において、ポリペプチドは酵素、抗原、ホルモンまたは抗体を含むことができる。いくつかの態様において、1つまたは複数の生体分子は、RNA、mRNA、ｃDNA、DNA、ゲノムDNA、マイクロRNA、長い非コードRNA、リボソームRNA、転移RNA、葉緑体DNA、ミトコンドリアDNAまたは他の核酸、たとえば修飾核酸および核酸とタンパク質または他の高分子との複合体を含むことができる。
【００８０】
態様および実施形態は、必ずしも互いに包含的または排他的である必要はなく、同じ態様または実施形態との関連において提示されるのか、異なる態様または実施形態との関連において提示されるのかにかかわらず、矛盾しない、または他のやり方で可能である任意のやり方で組み合わされてもよいことが当業者には容易に明らかであろう。1つの態様または実施形態の記載は、他の態様および/または実施形態に関して制限的であることを意図したものではない。また、本明細書の他の箇所に記載されている任意の1つまたは複数の機能、工程、操作または技法が、代替の実施形態においては、「発明の概要」に記載された任意の1つまたは複数の機能、工程、操作または技術と組み合わされてもよい。したがって、上記態様および実施形態は、限定的ではなく例示的である。
【００８１】
組織処理システムの1つのバージョンが、すべての趣旨に関して全体として参照により本明細書に組み入れられる、2017年11月29日に出願された国際特許出願PCT/US2017/063811（WO2018/102471）（Jovanovich, Chear, McIntosh, Pereira, and Zaugg, "Method and Apparatus for Processing Tissue Samples"）に記載されている。
【００８２】
図1は、試料101を投入し、それを処理して、生体分析のための生物学的材料、たとえば単一細胞1000または核1050、微小組織6001、オルガノイド6002または細胞内成分1060で構成される他の生体成分および生体分子1070、たとえば高分子1071およびDNA1073とRNA1074とで構成される核酸1072；タンパク質1075；炭水化物1076；脂質1077；複数のタイプの高分子1071を含む生体分子1070；代謝産物1078；ならびに他の生物学的成分、たとえば天然物1079を生成することができるサンプル処理システム50を示す。
【００８３】
図2は、組織試料120および他の試料101を投入し、それらを処理して、生体分析のための生物学的材料、たとえば単一細胞1000または核1050、微小組織6001、オルガノイド6002または細胞内成分1060で構成される他の生体成分および生体分子1070、たとえば高分子1071およびDNA1073とRNA1074とで構成される核酸1072；タンパク質1075；炭水化物1076；脂質1077；複数のタイプの高分子1071を含む生体分子1070；代謝産物1078；ならびに他の生物学的成分、たとえば天然物1079を生成することができる組織処理システム80を示す。
【００８４】
図3を参照すると、単一化システム100が、1つまたは複数の試料101または組織試料120を受け入れ、それを処理して、生体分析のための生物学的材料、たとえば単一細胞1000または核1050、微小組織6001、オルガノイド6002または細胞内成分1060で構成される他の生体成分および生体分子1070、たとえば高分子1071およびDNA1073とRNA1074とで構成される核酸1072ならびに単一細胞ライブラリー1200を生成する。
【００８５】
図4を参照すると、いくつかの態様において、単一化システム100処理はシステム中のカートリッジ200中で実行される。組織試料120または他の試料101が、1つまたは複数のカートリッジ200と、物理的解離サブシステム300、酵素的・化学的解離サブシステム400、計測サブシステム500、流体工学サブシステム600、制御サブシステム700、温度サブシステム1475および磁気モジュール900の1つまたは複数との使用を通して、単一細胞1000、核1050、核酸1072、単一細胞ライブラリー1200、単一核ライブラリー1250、バルクライブラリー1210または細胞内成分1060で構成される他の生体成分または生体分子1070、たとえば高分子1071およびDNA1073とRNA1074とで構成される核酸1072または微小組織6001もしくはオルガノイド6002へと転換される。
【００８６】
物理的解離サブシステム300（前処理チャンバ、組織破砕装置およびアクチュエータを含むことができる）は、試料をオリフィスに通すこと、粉砕、組織を解離させるための特徴を有するかまたは有しないロータを回転させること、組織を解離させるための特徴を有するかまたは有しないヘッドを動かすこと、組織をフィルタまたはスクリーンまたはメッシュまたはストレーナに押し通すこと、ペッスルまたはダウンス様要素を動かすこと、音波破砕、ブレンディング、ホモジナイズ、ビーズ破砕、圧力および単一細胞または核を生成しやすくするために組織を物理的に破砕するための当業者に公知の他の方法により、物理的破砕を実行することができる。
【００８７】
酵素的・化学的解離サブシステム400（流体（たとえば1つまたは複数の酵素または化学物質を含む）のソースと、液体を前処理または他のチャンバに送る、流体工学サブシステムおよびカートリッジインタフェースの部分とを含む、または使用することができる）が、非限定的にコラゲナーゼ（たとえばコラゲナーゼタイプI、II、III、IVなど）、エラスターゼ、トリプシン、パパイン、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン、中性プロテアーゼ、クロストリパイン、カゼイナーゼ、中性プロテアーゼ（Dispase（登録商標））、DNアーゼ、プロテアーゼXIV、RNアーゼ阻害剤、DNアーゼ阻害剤または他の酵素、生化学物質または化学物質、たとえばEDTA、EGTA、プロテアーゼ阻害剤、バッファ、酸または塩基で構成される試薬の調合物または成分の混合物を加えることにより、酵素的破砕を実行することができる。
【００８８】
別の局面において、酵素的・化学的解離サブシステム400は、組織または細胞完全性を破砕し得る化学物質の調合物、たとえばTriton X-100、Tween、Nonident P40、他の界面活性物質もしくは界面活性剤、ジギトキンまたは組織を細胞へと解離させる、または組織もしくは単一細胞1000懸濁液から直接的に核もしくは他の細胞小器官を生成することができる生体分子もしくは化学物質を加えることにより、化学的破砕または化学的・酵素的破砕を実行することができる。多くの異なる核単離溶液412が、NSTバッファ（146mM NaCl、10mMトリス塩基、pH7.8、1mM CaCl2、21mM MgCl2、0.05％BSA、0.2％Nonidet P-40）（L. Martelotto, T Baslan, J, Kendall, F. C Geyer, K. A Burke, L. Spraggon, S. Piscuoglio, K. Chadalavada, G. Nanjangud, C. Ng, P. Moody, S. D'Italia, L. Rodgers, H. Cox, A. da Cruz Paula, A. Stepansky, M. Schizas, H. Y. Wen, T. A King, L. Norton, B. Weigelt, J. B Hicks, and J. S. Reis-Filho. Whole-genome single-cell copy number profiling from formalin-fixed paraffin-embedded samples. Nat Med. 2017 March; 23(3):376-385. doi:10.1038/nm.4279）またはホモジナイゼーションバッファ（10mMトリス、pH8.0、250mMスクロース、25mM KCl、5mM MgCl2、0.1％Triton-X 100（v/v）、0.4U/μL RNasin Plus RNase阻害剤（Promega）、1×プロテアーゼ阻害剤、0.2U/μL Superasin（ThermoFisher）、10ng/mL Hoechst 33342および0.1μM DTT）（Krishnaswami SR, Grindberg RV, Novotny M, Venepally P, Lacar B, Bhutani K, Linker SB, Pham S, Erwin JA, Miller JA, Hodge R, McCarthy JK, Kelder M, McCorrison J, Aevermann BD, Fuertes FD, Scheuermann RH, Lee J, Lein ES, Schork N, McConnell MJ, Gage FH, Lasken RS. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nat Protoc. 2016 Mar; 11(3):499-524. doi:10.1038/nprot.2016.015. PMID:26890679）または核ホモジナイゼーションバッファ（10mM HEPES-KOH、pH7.9、25mM KCl、1mM EDTA、2Mスクロース、10％グリセロール、0.15mMスペルミン、0.5mMスペルミジン、10mM NaF、1mMオルトバナデート、1mM PMSF、0.5mM DTTおよび1×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma））（Ling G, Waxman DJ. Isolation of nuclei for use in genome-wide DNase hypersensitivity assays to probe chromatin structure. Methods Mol Biol. 2013; 977:13-9. doi:10.1007/978-1-62703-284-1_2. PubMed PMID:23436350; PubMed Central PMCID:PMC3815455)または0.1×溶解バッファ（1mMトリスHCl、pH7.4、1mM NaCl、0.3mM MgCl2、0.01％Tween-20、0.01％Nonldent P40、0.001％ジギトニン、0.1％ウシ血清アルブミン）（Demonstrated Protocol- Nuclei Isolation from Mouse Brain Tissue for Single Cell ATAC Sequencing, Rev A, 10x Genomics）または1×NIB:（10mM MES-KOH（pH5.4）、10mM NaCl、10mM KCl、2.5mM EDTA、250mMスクロース、0.1mMスペルミン、0.5mMスペルミジン、1mM DTT）（S. Sikorskaite, M.-L. Rajamaki, D. Baniulis, V. Stanys and J. PT Valkonen. Protocol: Optimised methodology for isolation of nuclei from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families. Plant Methods 2013, 9:31 http://www.plantmethods.com/content/9/1/31）をはじめとして、開発されている。
【００８９】
同様に、多くの異なる核貯蔵溶液413が、Nuclei Wash and Resuspension Buffer（1×PBS、1％BSAおよび0.2u/mL RNアーゼ阻害剤含有（Sigma-Aldrich 3335399001））（Demonstrated Protocol- Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing, Rev B, 10x Genomics）または核貯蔵バッファ（20mMトリスHCl、pH8.0、75mM NaCl、0.5mM EDTA、50％（v/v）グリセロール、1mM DTTおよび0.1mM PMSF）（Ling G, Waxman DJ. Isolation of nuclei for use in genome-wide DNase hypersensitivity assays to probe chromatin structure. Methods Mol Biol. 2013; 977:13-9. doi:10.1007/978-1-62703-284-1_2. PubMed PMID:23436350; PubMed Central PMCID:PMC3815455）または核貯蔵バッファ（20％グリセロール、20mM HEPES-KOH（pH7.2）、5mM MgCl2、1mM DTT）（S. Sikorskaite, M.-L. Rajamaki, D. Baniulis, V. Stanys and J. PT Valkonen. Protocol: Optimised methodology for isolation of nuclei from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families. Plant Methods 2013, 9:31 http://www.plantmethods.com/content/9/1/31）またはNSB（166.6mMスクロース、5mM MgCl2、10mMトリスバッファ、pH8.0）（Krishnaswami SR, Grindberg RV, Novotny M, Venepally P, Lacar B, Bhutani K, Linker SB, Pham S, Erwin JA, Miller JA, Hodge R, McCarthy JK, Kelder M, McCorrison J, Aevermann BD, Fuertes FD, Scheuermann RH, Lee J, Lein ES, Schork N, McConnell MJ, Gage FH, Lasken RS. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nat Protoc. 2016 Mar; 11 (3):499-524. doi:10.1038/nprot.2016.015. PMID:26890679）をはじめとして、開発されている。
【００９０】
他の態様においては、生物学的サンプルまたは試料を単一細胞または核へと解離させるために様々な試薬または試薬の混合物が順次に加えられる。物理的および酵素/化学的解離ならびに他のサブシステムは、互いから切り離されていることもできるし、同じ位置にあることもできる（たとえば、同時または順次にサンプルに作用する）。前処理、濾過および処理チャンバは、互いから切り離されていることもできるし、同じ位置にあることもできる（たとえば、同時または順次にサンプルに作用する）。
【００９１】
いくつかの態様においては、解離の量が解離中に定間隔で、または終点でモニタされ、いくつかの例においては、生存率が、処理中、計測サブシステム500を使用して測定される。計測サブシステム500は、明視野、位相差、蛍光、化学発光、近視野、ラマンもしくは他の光学読出しまたは光学計測もしくは電気計測、たとえば細胞がセンサを通過するときの導電率の変化のインピーダンス計測または熱もしくは他のタイプの計測を使用して細胞をイメージングする光学イメージング装置であることができる。他の態様において、計測サブシステム500は、質量分析計、マスサイトメータまたは質量を測定する他のシステムであることができる。
【００９２】
流体の付加および移動は、流体工学サブシステム600によって実行することができる。流体工学サブシステム600は、ポンプ、たとえばシリンジポンプ、ピエゾポンプ、電気浸透流ポンプ、蠕動ポンプ、オンカートリッジポンプ・弁、マイクロポンプ、圧力、気力学または当業者に周知の他の構成部品を使用することができる。
【００９３】
単一化システム100は、ユーザインタフェース740で構成されることができる制御サブシステム700中のソフトウェアにより、モニタ、組み込みディスプレイまたはタッチスクリーン730を通して制御されることができる。場合によっては、制御サブシステム700は、研究室情報管理システム、他の機器、分析ソフトウェア、表示ソフトウェア、データベース、電子メールおよび他のアプリケーションへのインタフェースを含むことができる。制御サブシステム700は、動作を制御する制御ソフトウェア725およびスクリプトを含むことができ、いくつかの態様において、スクリプトは操作者によって修正、創製または編集されることができる。
【００９４】
単一化システム100は、システムの様々なパーツの温度、たとえば試薬貯蔵部の温度、流体ラインの温度またはカートリッジ200の温度をセットすることができる、温度調節のための温度サブシステム1475を有することができる。温度サブシステム1475は、抵抗加熱器、ペルチェ、循環流体または当業者に周知の他の方法で構成される装置からの加熱および/または冷却を、温度感知素子、たとえばサーミスタ、熱電対、熱応答性変色などおよび温度制御盤とともに使用することができる。
【００９５】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、生物学的サンプルの解離のための装置であって、(i) 生物学的サンプルまたは試料101；(ii) 組織を解離させることができるカートリッジ200；(iii) 必要に応じてカートリッジ200を作動させ、流体を提供するための機器；(iv) 力価、凝集および/または生存率またはリアルタイムPCRを計測するための、光学イメージングなどの計測モジュール500；(v) 所望の力価におけるバッファまたは増殖培地のための解離溶液の交換；および(vi) 産出容器、たとえばカートリッジ中のチャンバ、8ウェルストリップチューブ、マイクロタイタプレート、エッペンドルフチューブ、ナノウェルまたは細胞懸濁液もしくはオルガノイド6002もしくは微小組織6001を受けることができる他の容器を含む装置である。
【００９６】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、生物学的サンプルの解離および単一細胞1000もしくは核1050懸濁液またはマッチしたバルク核酸1010もしくは単一細胞ライブラリー1200もしくはマッチしたバルクライブラリー1210の生成のための装置であって、(i) 生物学的サンプルまたは試料を投入するためのチャンバまたは区域；(ii) 組織または試料を解離させることができるカートリッジ；(iii) 必要に応じてカートリッジを作動させ、流体を提供するための機器；(iv) 力価、凝集および/または生存率または1つまたは複数の生体分子1070の量を計測するための、光学イメージングなどの計測モジュール；(v) 所望の力価におけるバッファまたは増殖培地のための解離溶液の交換；(vi) 産出容器、たとえば8ウェルストリップチューブ、マイクロタイタプレート、エッペンドルフチューブ、カートリッジ中のチャンバまたは細胞懸濁液を受けることができる他の容器中の、単一細胞1000もしくは核1050懸濁液または単一細胞ライブラリー1200およびマッチしたバルク核酸ライブラリー1210の生成を含む装置である。
【００９７】
さらに図4を参照すると、磁気処理モジュール900は、生体分析のための単一細胞1000または細胞型もしくは核1050または細胞内成分で構成されている他の生体成分1060および生体分子1070、たとえば高分子1071およびDNA1073とRNA1074とで構成される核酸1072；タンパク質1075；炭水化物1076；脂質1077；複数のタイプの高分子1071を含む生体分子1070；代謝産物1078；ならびに他の生物学的成分、たとえば天然物1079を分離するために、ビーズと呼ばれる磁性および常磁性の粒子または表面またはビーズの磁気処理を使用することができる。磁気処理モジュールは、カートリッジのパーツ、たとえば処理チャンバもしくは他のチャンバまたはチャンバの一部に磁場を導入することができる。この磁場を使用して、磁場中の磁性および常磁性物質、たとえば粒子、ビーズ、表面に磁力を加えることができる。このような粒子は、チャンバ内の流体から隔離され、最終的には流体から分離されることができる。いくつかの態様において、ビーズは、化学的条件とともに生物学的材料の精製を容易にする表面化学を有する。他の態様において、ビーズは、特定の生物学的材料、たとえば細胞型、細胞小器官、核酸1072、核1050、または組織もしくはサンプルの他の成分を特異的に精製する、抗体、アプタマー、生体分子などで構成されるアフィニティー分子を有する。
【００９８】
別の局面において、本明細書に提供されるものは、生物学的サンプルの解離および単一細胞または単一核ライブラリー調製のための装置であって、(i) 生物学的サンプルまたは試料を投入するためのチャンバまたは区域；(ii) 組織試料120を単一細胞1000または単一核1050へと解離させた後、単一細胞ライブラリー1200または単一核ライブラリー1250を生成することができるカートリッジ200；(iii) 必要に応じてカートリッジ200を作動させ、流体を提供するための機器；(iv) 力価、凝集および/または生存率を計測するための、光学イメージングなどの計測サブシステム500；(v) 所望の力価におけるバッファのための解離溶液の交換；(vi) 磁気分離、規格化、精製およびたとえば核酸を精製し、酵素的反応、たとえばライブラリー調製反応を結合するための他の磁気プロセスならびに単一細胞または核を単離状態で生成することを含む他のプロセス、たとえばナノドロップ、ナノボーラス、またはアガロース、ポリエチレングリコールおよび他の化学物質および核酸を遅らせる物質を含む物理的分離または溶解を実行するための、磁気処理または他の処理チャンバまたはチューブ；(vii) 産出容器、たとえば8ウェルストリップチューブ、マイクロタイタプレート、エッペンドルフチューブ、カートリッジ中のチャンバまたは細胞懸濁液を受けることができる、ナノウェルを含む他の容器を含む装置である。
【００９９】
別の態様において、本明細書に提供されるものは、組織を単一細胞へと解離させた後、その単一細胞1000を使用して、カートリッジ200上で微小組織6001またはオルガノイド6002を形成する、または、カートリッジ200外で微小組織6001またはオルガノイド6002を創製するための装置および方法である。
【０１００】
単一化システム100の基本要素は、分析される試料101および検体に依存して、複数の方法で構成されることができる。以下の実施例には、多数の構成のうちのいくつかが詳細に記載されているが、本発明は、当業者には明らかであるように、決してこれらの構成に限定されない。単一化システム100は、新鮮な組織；急速凍結組織；組織のミクロトームスライス（クライオ、レーザまたは振動）；固定組織；FFPE；外科的切除、生検、穿刺吸引によって得られたバルク材料；表面からのサンプルおよび他のマトリックスで構成される多くの異なるタイプの試料101を受け入れることができる。
【０１０１】
生の固体組織を単一細胞1000懸濁液へと処理することからワークフローを開始することによる、微小組織6001またはオルガノイド6002のための単一細胞サンプル調製中、ギャップを埋める必要がある。本開示は、ひとたびプロセスが開始されたならば操作者による介入をほとんどまたはまったく要することなく、組織試料120および他のサンプルを単一細胞1000懸濁液へと処理した後、微小組織6001またはオルガノイド6002を形成するシステムを生成する方法を教示する。これは、大きく異なる出発組織のタイプに適合することを必要とし、様々な要件が組織、種、年齢および状態に依存する。いくつかの態様においては、細胞を使用して、シーケンシングまたはフローサイトメトリーによって特性評価することができる腫瘍浸潤リンパ球を単離する、またはリンホカイン、たとえばインターロイキン-1とともに培養して治療用腫瘍浸潤リンパ球を生成する。そして、治療用腫瘍浸潤リンパ球を患者に注入して、腫瘍細胞を溶解し、疾患の進行を阻止することができる。
【０１０２】
本発明においては、多くの態様が可能であり、2017年11月29日に出願された特許出願第PCT/US2017/063811号（Jovanovich, Chear, McIntosh, Pereira, and Zaugg, "Method and Apparatus for Processing Tissue Samples"）および2018年6月1日に出願された特許仮出願第62/679,466号（Jovanovich, "Method and Apparatus for Processing Tissue Samples）から参照により組み入れられる。すべての内容が、それらの中で使用されている番号システムとともに、全体として本明細書に組み入れられる。一連の態様として、増大する能力を有するシステムを開発することができ、6つの態様が記載されている：2つの態様は単一サンプルシンギュレータシステム2000として記載され、1つの態様は、2サンプルシンギュレータシステム2200、4サンプルシンギュレータシステム2400、強化型シンギュレータシステム2500およびシングルライブラリアン3000態様として記載されている。
【０１０３】
本開示は、単一細胞1000を創製し、次いで微小組織6001またはオルガノイド6002を生成するための完全なプロセスを単一のシンギュレータシステム100システム態様において自動化し、統合し、重要なことに、標準化する方法を記載する。シンギュレータシステム100は、その使いやすさおよび高い性能により、基礎研究者、学生およびトランスレーショナル研究者ならびに臨床医などの能力を大きく高める。
【０１０４】
使い捨てカートリッジ設計
カートリッジ200は、組織を単一細胞1000懸濁液または核1050へと処理するために使用することができ、好ましくは使い捨てである。微小組織6001またはオルガノイド6002の生成のための単一細胞懸濁液1000を生成するための主なワークフロー工程は、まず、酵素的解離によって固体組織を機械的に破砕すること、および濾過して集塊を除くことである。
【０１０５】
図5を参照すると、カートリッジ200は、試料101を投入し、生存可能な単一化細胞1000を産出し、生存可能な単一化細胞は、微小組織6001またはオルガノイド6002を創製するために使用される、または、いくつかの態様においては、図19および20に示すように、カートリッジ200中で懸滴6200によって使用される。使い捨てカートリッジ200は、組織のタイプおよび状態にしたがって、機械的破砕および酵素的または化学的解離によって複数のタイプのサンプルを処理することが望ましい。カートリッジ200は、組織を可能な限り速やかかつ穏やかに処理し、操作者を、処理される組織に曝露せず、かつ低コストで製造可能であるように設計することができる。広範囲の組織およびそれらの個々の要件を受け入れるために、複数の機械的方法が必要になることもある。非限定的に、可変オリフィス490、回転プランジャ336による粉砕、ペッスル361およびプランジャ362を使用する濾過・フィルタリングを含む複数の異なる機械的破砕方法ならびに他の機械的方法に容易に適合させることができる設計が示される。
【０１０６】
カートリッジ200は、3D印刷、シングルプルまたはダブルプルおよび低労力アセンブリによるプラスチックの射出成形または流体層および他の層の積層アセンブリ、方法の組み合わせ、ならびに当業者に周知の他の方法のために設計されることができる。流体は、シリンジポンプ2130によってカートリッジ200に送られることもできるし、カートリッジ200に事前に装填されていることもできるし、多くの組み合わせであることもできる。いくつかの態様において、フレキシブルチューブ493が、チャンバ同士を接続することができ、流れを方向付けるための簡単なピンチ弁491を創製する、または、蠕動ポンプを創製するために使用されることもできる。他の態様において、カートリッジ200においてチャネルが創製され、弁（たとえば空気圧弁または他の弁）が組み込まれてもよい。
【０１０７】
シンギュレータシステムの態様
図2に示すような組織処理システム80としてのサンプル処理システム50の1つの態様において、シンギュレータシステム100は、科学者が固体または液体組織からの単一細胞1000または核1050懸濁液、アフィニティー精製された単一細胞1100、アフィニティー精製された核1105、核酸1072およびバルクライブラリー1210の生成および/または解析を簡単化し、標準化するための、強力な統合されたtissue-to-genomicsまたはsample-to-other answer（ゲノミクス、プロテミクス、メタボロミクスまたはエピジェネティクス、マルチオミクスなど）解析機能を実行することができる。当業者には明白であるように、生成される生物学的材料、たとえば単一細胞1000、核1050、核酸1072、単一細胞ライブラリー1200、単一核ライブラリー1250、バルクライブラリー1210または細胞内成分1060で構成される他の生体成分または生体分子1070、たとえば高分子1071およびDNA1073とRNA1074とで構成される核酸1072または微小組織6001もしくはオルガノイド6002はまた、多くのゲノミクス、細胞生物学、プロテオミクス、メタボロミクスおよび他の解析法に使用されることもできる。
【０１０８】
シンギュレータシステム100は、液体または固体組織からの生物学的材料の調製を、核酸およびその付加物、たとえばエピジェネティック修飾物のDNAまたはRNAシーケンシング；次世代DNAまたはRNAシーケンシング、次次世代DNAまたはRNAシーケンシング；核酸およびその付加物のナノポアシーケンシング；核酸およびその付加物のシングルセルDNAシーケンシング；核酸およびその付加物の単一核RNAシーケンシング；PCR、ドロップレットデジタルPCR、qPCR、RT-qPCR；ゲノミクス解析、遺伝子発現解析、遺伝子マッピング、DNAフラグメントマッピング；光学および質量分析イメージングを含むイメージング；DNAまたはRNAマイクロアレイ解析；核酸およびその付加物の蛍光、ラマン、光学、質量分析および他の検出モダリティ（標識ありまたはなし）；タンパク質およびペプチドならびにそれらの付加物および修飾物の蛍光、ラマン、光学、質量分析、タンパク質シーケンシングおよび他の検出モダリティを含むプロテオミクス解析（標識ありまたはなし）；炭水化物およびその付加物ならびに他の共有結合ポリマーのシーケンシング、蛍光、ラマン、光学、質量分析および他の検出モダリティを含む炭水化物特性評価およびプロファイリング（標識ありまたはなし）；脂質およびその付加物ならびに他の共有結合ポリマーのシーケンシング、蛍光、ラマン、光学、質量分析および他の検出モダリティを含む脂質特性評価およびプロファイリング（標識ありまたはなし）；フローサイトメトリー；細胞およびその付加物ならびに他の共有結合ポリマーの蛍光、ラマン、光学、質量分析および他の検出モダリティを含む細胞の特性評価およびプロファイリング（標識ありまたはなし）；代謝産物およびその付加物ならびに他の共有ポリマーのシーケンシング、蛍光、ラマン、光学、質量分析および他の検出モダリティを含む代謝プロファイリング（標識ありまたはなし）；タンパク質間相互作用、脂質間相互作用、タンパク質−DNA間相互作用、RNA−RNA間相互作用および生物学的材料に由来する分子間の他の相互作用を含む機能分析（標識ありまたはなし）；細胞、細胞小器官および生体分子のバイオインフォマティクス解析；ならびに質量分析法および他の分析法の1つまたは複数から選択される分析を実行する計測サブシステム500と統合することができる。
【０１０９】
この好ましい態様において、細胞単一化モジュール800および磁気処理モジュール900は、単一サンプルシンギュレータシステム2000または2サンプルシンギュレータシステム2200または4サンプルシンギュレータシステム2400または4つよりも多いサンプルを処理する他のシンギュレータシステムへと統合される。機械的および酵素的解離が、1つまたは複数の前処理チャンバ440中の使い捨てカートリッジ200中で実行されて、単一細胞懸濁液1000または核懸濁液1200、核酸1072、生体分子1070、細胞内成分1060または前処理からの他の産物を生成する。サンプルは、その後、1つまたは複数の処理チャンバ460中、任意選択の、表面抗原によるビーズベースの細胞型アフィニティー精製によって処理されて、アフィニティー精製された単一細胞懸濁液1100または核懸濁液を生成することができ、核抗原1105または核酸1072により、生体分子1070、細胞内成分1060を、精製されたmRNA、NGSライブラリーまたは他のサンプルタイプへとさらに処理することができる。いくつかの態様においては、前処理440および処理チャンバ460および濾過チャンバ450および真空トラップチャンバ468および廃棄物チャンバ430または他のチャンバの1つまたは複数を組み合わせることができる。
【０１１０】
好ましい態様において、単一サンプルシンギュレータシステム2000は、試薬411が、オンボードにある、または試薬モジュール1430中、単一サンプルシンギュレータ機器2050に隣接する状態で、かつ、カートリッジ200が、組織試料120のための多種多様な処理必要性を受け入れるために1つまたは複数の組織特異的な機械的破砕モダリティを組み込む状態で設計されたものである。システムは、生の未処理組織サンプルを投入し、オフデバイスでのシングルセルNGSライブラリーへの処理のためにすぐ使える懸濁状態の単一細胞1000または核1050を産出することもできるし、システム上で単一細胞1000または核1050をバルクライブラリーへと処理することもできるし、処理された組織の解析を実行することもできる。
【０１１１】
実施例：微小組織またはオルガノイドを創製するための単一サンプル単一化システム
シンギュレータシステム100は、組織を機械的に破砕し、破砕された組織をカートリッジ200中で単一細胞1000へと酵素的に解離させることができる。1つの態様として図5に示すような細胞単一化モジュール800または図6に示すような単一サンプルシンギュレータシステム2000は、物理的解離サブシステム300と酵素的・化学的解離サブシステム400とを組み合わせて、単一細胞1000または核1050懸濁液を生成することができる。機器は、機械的運動および流体工学をカートリッジに提供し、他方でカートリッジが組織を単一細胞1000または核1050へと機械的および酵素的または化学的に処理する。機器または試薬モジュール1430上には複数の試薬411を、必要に応じて冷却しながら、貯蔵することができる。単一細胞1000懸濁液は、他方で、微小組織6001またはオルガノイド6002を生成するために使用することができる。
【０１１２】
図5に概念的に示す細胞単一化モジュール800は、カートリッジ200上の試料101の機械的破砕を組み合わせ、プロトコルにしたがって酵素的または化学的溶解溶液410および他の流体を加え、サンプルの動き、圧力および温度を制御する。細胞単一化モジュール800は、z軸ステッパ2110を、キャップ210を介して結合された回転モータ2120とともに使用しながら、非限定的にシリンジプランジャ、ペッスル、ダウンス型ペッスル、またはグラインダで構成される機械的組織破砕要素を動かす、または回転させることができる。
【０１１３】
「スキン」でパッケージングされた単一サンプルシンギュレータシステム2000デザインの1つの態様の3D CAD表現が図6に示されており、別の態様が図7、8、9および10に示されている。両態様とも、制御ソフトウェア725によって制御される、たとえば6方弁を有する分解能が1.6μLのシリンジポンプ（C2400MP、TriContinent）に基づく流体工学と統合された2軸機械運動（Z軸ステッパ2110および回転モータ2120）を有する。
【０１１４】
図6を参照すると、オペレーティングシステム（たとえばWindows 10）と、85GバイトのHD（Beelink、AP42）とを有するコンピュータ720が、10インチのタッチスクリーン730（eleduino、Raspberry Pi10）上またはタブレット750上のディスプレイとともに、システムを制御するための制御ソフトウェア725を稼働させることができる。シャシ1010が、部品およびシステムの外部ケースを取り付けるためのフレームワークを提供する。
【０１１５】
図6に示す単一サンプルシンギュレータシステム2000の態様は、試薬ブロック415からカートリッジ200へと液体、圧力、または真空を供給するための、単一の6方弁2140を有する単一のシリンジポンプ2130を含む、流体工学サブシステム600を有する。1つの態様において、カートリッジ200は2つの前処理チャンバ440および単一の処理チャンバ460を有する。好ましい態様において、磁気処理モジュール900が、ソフトウェア制御下、磁力をカートリッジ200に加えて、単一細胞1000、たとえば幹細胞および他のタイプの細胞、核1050、微小組織6001、オルガノイド6002、核酸1072、生体分子1070、細胞内成分1060、または他の産物を精製し、分析するための、常磁性ビーズ、常磁性面、常磁性ナノ粒子および他の磁性または常磁性粒子の使用を可能にすることができる。
【０１１６】
ケースを有する単一サンプルシンギュレータシステム2000の好ましい態様が図7に示されている。この態様は試薬モジュール1430を有し、試薬モジュールは、図7に示すように単一サンプルシンギュレータ機器2050から切り離され、電力および制御が単一サンプルシンギュレータ機器2050によって提供されることもできるし、別個の電源およびプロセッサを使用することもできるし、図6に示すように、試薬モジュール1430が単一の機器ケース内に統合されることもできる。
【０１１７】
図8Aに示すように、好ましい態様において、試薬モジュール1430は、温度配給プレート1421に取り付けられた試薬ペルチェ1420を有する。試薬ペルチェ1420の温度は、コンピュータ720および制御ソフトウェア725の制御下、熱電対またはサーミスタであり得る温度センサ1417をモニタすることによって、またはサーモクロミック面の光学検出もしくは他の方法によって変化させて、試薬貯蔵チャンバ1419内の温度配給プレート1421を加熱または冷却することができる。好ましい態様において、図8Aに示すように、試薬ペルチェ1420は、試薬411のセットを温度制御試薬貯蔵チャンバ1419中で4℃に維持し、室温試薬貯蔵チャンバ1418は、試薬411の第二のセットを周囲温度に維持する。態様が、1つまたは複数の試薬を収容する1つまたは複数の温度制御チャンバを有することができることが当業者には明白であろう。
【０１１８】
図8Bを参照すると、試薬貯蔵チャンバ1419は断熱材1422および蓋1423を有する。流体バンドル1424がシリンジポンプ2130を試薬モジュール1430と流体接続する。1つの態様において、単一サンプルシンギュレータ機器2050上の試薬ペルチェリレーボード2240からの電力・制御バンドル1425が試薬ペルチェ1420を制御する。別の態様において、試薬モジュール1430は、別個に電源にプラグインすることによって給電され、試薬ペルチェ1420は、別個のマイクロプロセッサによって制御されて、試薬モジュール1430が単一サンプルシンギュレータ機器2050から独立して作動することを可能にし、チューブ、1/16IDタイゴンチューブまたは他のチューブ、毛管、マイクロチップ、または他の流体容器で構成されている流体バンドル1424によって流体的に接続されている。いくつかの態様において、試薬容器1426は、試薬容器蓋1427を有し、容器内の試薬の量をたとえば重量または光学部品もしくは他の電磁計測法を使用する位相インタフェースまたは導電率によってモニタする、または試薬容器1426の正体をRFID、EEPROMまたは他の識別技術によって決定するための1つまたは複数の試薬容器センサ1428を含有する。試薬容器センサ1428からの情報は、システムログに記憶することもできるし、試薬容器センサ1428の問題または他の動作、たとえば試薬411を交換する必要性をユーザに警告するために使用することもできる。いくつかの態様において、試薬容器蓋1427は、チューブまたは毛管またはフィッティングを挿入することを可能にし得る1つまたは複数の開口または任意選択のフィルタを有する穴を有する。好ましい態様において、試薬モジュール1430は試薬ペルチェ排出ダクト1417を有する。
【０１１９】
図9を参照すると、好ましい態様において、単一サンプルシンギュレータ機器2050はz軸ステッピングモータ2110を有し、このモータは、シャシ1010に取り付けられた逆「U」字形構造フレーム1020に取り付けられたz軸ステッピングモータスライド2111に取り付けられた回転モータ2120の垂直位置を制御する任意選択のエンコーダを有し得る。力ゲージがzステージステッパ2110に組み込まれて、試料101にかかる機械的力の力フィードバック制御を提供することができる。これは、非常に穏やかな機械的処理工程を保証するのに役立つことができる。シリンジポンプ2130が、チューブもしくは毛管もしくはマイクロチップ、または6方弁2141および6方弁2142を有する他の流体コネクタと流体的に接続して、試薬モジュール1430からカートリッジ200（図示せず）へと試薬、圧力、または真空を供給する。
【０１２０】
カートリッジ200は、カートリッジ200を正確に保持するように設計されているカートリッジスライド1450上のカートリッジレシーバトレー1510の中に配置され、カートリッジスライドレール1480上、カートリッジスライド1450上のカートリッジレシーバトレー1510中のカートリッジ200を、ばね式カートリッジスライドノブ1452がカートリッジスライド1450の穴の中にロックされるまで動かすことにより挿入すると、前処理チャンバ440の中心が回転モータ2120の回転モータ軸2121の中心と、1または5または10または15または20または25または50または100または250μmまたはより大きな距離の範囲内で同心になり、カートリッジ200が熱伝導プレート1470の近くまたはそれと接する状態に保持され、カートリッジインタフェース1500のポゴピン1415と流体接続する。
【０１２１】
温度調節サブシステム1475が、ボード2250の制御下、カートリッジペルチェ1440または他の温度調節装置、たとえばストリップ抵抗加熱器、循環流体などによって熱伝導プレート1470を所与の温度にセットして、前処理チャンバ440および処理チャンバ460中のカートリッジ温度をセットすることができる。いくつかの態様において、前処理チャンバ440内の温度と処理チャンバ460内の温度とは別々にセットすることができる。
【０１２２】
好ましい態様において、カートリッジ挿入時、カートリッジ200上の流体ポートが、ばね式ポゴピン1415と結合して、流体、気体、または真空をカートリッジ200に接続する。別の態様において、カートリッジ挿入後、ポゴピン1415またはカニューレ1416が動かされてカートリッジ200と接続する。別の態様においては、以下に説明するように、シリンジポンプ2130からの流体ラインに接続されたカニューレ1416が、機器の熱伝導プレート1470または他の部分に堅く取り付けられた状態で保持され、カートリッジ200は、カートリッジ挿入後にカニューレ1416と共に封を形成する可撓性材料をカートリッジポート上に有する。カートリッジポートは、カートリッジの外に通じるポートである。カートリッジポートは、チャンバ中のポートであることによって直接的にチャンバと連通してもよいし、たとえば、ポートを含みかつ関心対象のチャンバと連通する別のチャンバを介して間接的に、当該関心対象のチャンバと連通してもよい。
【０１２３】
図9に示す単一サンプルシンギュレータシステム2000の態様は磁気処理モジュール900を有し、磁石910が、制御ソフトウェア725の制御下、制御装置2122を使用して、逆「U」字形構造フレーム1020に取り付けられた磁気アクチュエータ935によって動かされる。磁石910は、図9に示すカートリッジ200から遠く離れ、カートリッジ200中の任意の磁気ビーズ685と相互作用しないことができ、または、伸長位置において、磁石910は、磁気ビーズ685の磁気捕捉および処理のために、カートリッジ200の近くまで動かされる。
【０１２４】
図10を参照すると、好ましい態様において、単一サンプルシンギュレータシステム2000は、回転モータ制御装置2122、z軸ステッパ制御装置2112、24V〜5Vステップダウン電源2230、および24V〜12Vステップダウン電源2225を含む電子部品710を取り付ける背面構造フレーム1021を構造フレーム1020上に有する。ヒューズ761および電源スイッチ760に接続するプラグ762に24V電源をプラグインすることによって、単一サンプルシンギュレータシステム2000に電力を供給することができる。6方弁2141および2142は、ボード2210および2212によって制御される。試薬ペルチェリレーボード2240が試薬ペルチェ1420を制御することができる。
【０１２５】
1つまたは複数のカートリッジを同時に処理するシンギュレータシステムが本発明の範囲内である。図11は、2つの試料101を2つのカートリッジ200中で処理することができる2サンプルシンギュレータ機器2200を示す。図11に示す態様は2つのz軸ステッピングモータ2110を有し、これらのモータが、シャシ1010に取り付けられた逆「M」字形構造フレーム1025に取り付けられた2つのz軸ステッパスライド2111に取り付けられた2つの回転モータ2120の垂直位置を独立して制御する。シリンジポンプ2130が、チューブもしくは毛管もしくはマイクロチップ、または6方弁2141および6方弁2142を有する他の流体コネクタと流体的に接続し、熱伝導プレート前処理チャンバ440および処理チャンバ460の上方に取り付けられたポゴピン1415（図示せず）を介して試薬モジュール1430（図示せず）からカートリッジ200へと液体、圧力、または真空を供給する。第三の6方弁（図示せず）が第二のカートリッジインタフェース1500に流体を提供することができる。
【０１２６】
カートリッジ200は、1つまたは複数の前処理チャンバ440と、0、1つまたは複数の処理チャンバ460と、0、1つまたは複数の他のチャンバ（たとえば、カートリッジ廃棄物チャンバ435または真空トラップチャンバ468）とを有することができる。
【０１２７】
好ましい態様において、図12および13に示すように、試料101または組織試料120がサンプル入口ポート425を通してカートリッジ200の前処理チャンバ440に加えられた後、組織破砕装置とも呼ばれるキャップ210が前処理チャンバ440の上に配置される。カートリッジ200が機器に挿入された後、ポゴピン1415、カニューレ1416、または他の流体コネクタがカートリッジポート470の0、1つまたは複数と接続して試薬を前処理チャンバ440に供給し、カートリッジポート485と接続して試薬または真空を処理チャンバ460に供給し、カートリッジ真空トラップポート467と接続して真空を真空トラップチャンバ468に供給する。
【０１２８】
図12に示す好ましい態様は、前処理チャンバニップル471と、処理チャンバ460に挿入されたストレーナ2711の上に配置された蓋ニップル452とをつなぐチューブであることができる流体ライン453を使用して前処理チャンバ440を処理チャンバ460に流体的に接続し、別個の濾過チャンバ450の必要性を除く。他の態様において、ストレーナ2711は、インラインフィルタとして、たとえば、前処理チャンバ440の出口に取り付けられたSwinneyフィルタホルダ347または流体ライン453に組み込まれることもできるし、蓋462に取り付けられることもできる。蓋462は、キャップ465が蓋462の上に閉じられたときに処理チャンバ460および真空トラップチャンバ468の真空密封を作り出し、超音波溶接、グルー、エポキシ、接着剤、および真空密封を作り出すための他の方法によってカートリッジボディ201に取り付けられることができ、ストレーナ2711の交換を妨げて、カートリッジ200の1回のみの使用を保証する。
【０１２９】
いくつかの態様において、カートリッジ200は、ピンチ弁491であることができるオンカートリッジ弁を流体ライン（たとえば流体ライン453）上に有することができ、機器が、この弁を作動させてラインを開閉する、または「T」分岐および2つのラインを使用することにより、流体を異なる経路に通して、たとえば光学イメージングシステム520に送る。別の態様においては、流体ライン（たとえば流体ライン453）を部分的に閉じて、部分的に解離した組織を破砕することができる可変オリフィス2160を創製することができる。アクチュエータが、カートリッジ200中のチューブを開閉することもできるし、望むならば可変オリフィス装置2150を使用して可変オリフィス2160を作動させることもできる。他の態様において、カートリッジ200は、小型化された空気圧弁、すなわちマイクロ弁であることができるオンカートリッジ弁を有することができる。いくつかの態様において、マイクロ流体力学またはマイクロチップが流体ラインに使用される。好ましい態様においては、カートリッジ200上に弁はなく、すべての流体制御が機器から行われる。
【０１３０】
図13Aを参照すると、真空トラップポート467または試薬ポート485に真空が加えられると、単一細胞懸濁液1000、核1050、ならびに他の細胞内成分1060および生体分子1070を含む液体が、前処理チャンバ440から流体ライン453およびストレーナ2711を通して処理チャンバ460の濾過ドレイン451および産出コレクタ領域461に引き込まれる。ストレーナ2711は、生物学的材料の懸濁液を濾過するために、2、5、10、15、20、25、30、40、50、70、100、125、200μmまたはより大きい孔径を有することができる。複数の直列型または積み重ね型ストレーナ2711を用いて、解離した組織試料110の様々なサイズの成分を連続的に除去することができる。キャップカプラ211およびヘッド218を備えたキャップ210が、サンプル入口ポート425にすぐに挿入可能な状態で示されている。ヘッド218は、組織、臓器、微小組織6001、オルガノイド6002、または他の生物学的材料の機械的破砕を支援する隆起特徴355を含むことができる、組織を破砕するための表面を有することができる。
【０１３１】
図13Bおよび図13Cを参照すると、キャップカプラ（「ドライブヘッド」とも呼ばれる）211は、1つの態様ではキャップシース穴214を有するキャップシース212内に保持されている。キャップカプラ211はキャップシャフト216に取り付けられ、このキャップシャフトはキャップシース穴214を通過してヘッド218に取り付けられ、このヘッドは、粉砕歯355を備えたロータ353であり得る。キャップシャフト216に取り付けられたキャップカプラ211とヘッド218とのアセンブリが、可動式機械的組織破砕装置345の一種であるプランジャ336と呼ばれる。
【０１３２】
図14Aを参照すると、好ましい態様において、キャップシャフト216に取り付けられたヘッド218は、前処理チャンバ440内でのヘッド218のセンタリング性を改善し、それにより行程の最下部でのサイドギャップ221の均一性を改善するように設計された、外向きに傾斜した環状のヘッド特徴356を有する。z軸ステッピングモータ2110が下降し、キャップカプラ211が回転モータカプラ2125によって押し下げられると、ヘッド218は、図14Bに示すように下降して、外向きに傾斜した環状の特徴356が前処理チャンバ440の内壁にある内向きに傾斜した環状の前処理装置チャンバ特徴357と係合して、センタリングされたヘッド218を作り出す。ヘッド218のセンタリングは、ヘッド218と前処理チャンバ440の内壁との間に均一なサイドギャップ221を作り出す。加えて、ヘッド211の高さが、内向きに傾斜した特徴357よりも下の前処理チャンバ440の高さよりも小さい場合、外向きに傾斜した環状のヘッド特徴356と内向きに傾斜した環状の前処理チャンバ特徴357との係合は均一なボトムギャップ222をセットする。サイドギャップおよびボトムギャップのサイズは、様々な細胞型または様々なサイズの核もしくは細胞内細胞小器官または多細胞構造、たとえば腸陰窩に合わせて最適化することができる。加えて、内向きに傾斜した環状の前処理装置チャンバ特徴357上にヘッド218が位置付けられたときに、破砕された組織の通過を可能にするために、内向きに傾斜した環状の前処理装置チャンバ特徴357は、同じまたは異なる深さの区分を有するように溝を付けられることができる。可動式機械的破砕装置345のヘッド218と内壁との間のサイドギャップ221は、好ましくは、1μmまたは2μmまたは5μmまたは10μmまたは15μmまたは20μmまたは25μmまたは30μmまたは40μmまたは50μmまたは75μmまたは100μmまたは150μmまたは200μmまたは250μmまたは500μmおよび1000μmまたはより大きいサイズならびにそれらの間の任意のサイズである。可動式機械的破砕装置345のヘッド218の底と前処理チャンバ440の底との間のボトムギャップ222は、好ましくは、1μmまたは2μmまたは5μmまたは10μmまたは15μmまたは20μmまたは25μmまたは30μmまたは40μmまたは50μmまたは75μmまたは100μmまたは150μmまたは200μmまたは250μmまたは500μmおよび1000μmまたはより大きいサイズならびにそれらの間の任意のサイズである。いくつかの態様においては、同じ直径の前処理チャンバ440と共に使用するために異なるヘッドを選択して、異なるサイドギャップ221またはボトムギャップ222を作り出し、製造および在庫管理の要件を簡素化することができる。また、ヘッドの平坦面と前処理チャンバの平坦な底面との間のギャップを防ぐかまたは画定する溝またはハーフドームまたは他の構造の位置によって、ヘッドの平坦面と前処理チャンバの平坦な底面との間のボトムギャップを制限することができる。
【０１３３】
図15を参照すると、カートリッジ200へのポートの0、1つまたは複数が、可撓性または低デュロメータ、たとえば非限定的に40〜100デュロメータのポートカバー442を有することができる。図15Aおよび切欠き図15Bに示すように、ポートカバー442をポートとポートカバー保持シリンダ441との間の空間に挿入して、ポートカバー442を、たとえば図示するように、試薬添加ポート470上の定位置に固定することができる。ポートカバー中心穴446よりも大きい外径を有する流体カニューレ1416または流体ポゴピン1415が、ポートカバー442によって覆われるポートと係合することができ、相対的に低いデュロメータのおかげで、ポートカバー442は、流体カニューレ1416または流体ポゴピン1415によって変形されて、流体カニューレ1416または流体ポゴピン1415の周囲にシールを創製する。いくつかの構成においては、変形を使用してばねの必要性を除くことができ、流体ポゴピン1415に代えて非可動性流体カニューレ1416を使用することができる。図15Cは、クリンプシール443によって保持されたポートカバー442を示す。図15Dは、ポートカバー442よりも高いポートカバー保持シリンダ442を形成し、ポートカバー保持シリンダ442を融解させて、ポートカバー442を保持する熱かしめリップ444を形成することによって保持されたポートカバー442を示す。
【０１３４】
好ましい態様において、単一サンプルシンギュレータ機器2050は、機械的処理のためのアクチュエータを有し、このアクチュエータは、回転モータ2120の垂直位置を制御するステッピングモータ2110と、回転モータカプラ2125に取り付けられた回転モータシャフト2121とを有し、回転モータカプラは、他方で、カートリッジ200に挿入されたとき、キャップ210のカプラ211と機械的に結合することができる。カプラは、任意の適切な形態、たとえばスロット、フィリップスヘッド、コードレックス、トライウィング、スパナおよびヘックスをとるドライブヘッドを有することができる。回転モータカプラ2125は、下降および低速回転などの動きによってキャップカプラ211と可逆的に係合する1つまたは複数の切子面を有する。図16Aに示すように、好ましい態様において、回転モータカプラ2125は、キャップ210中のキャップカプラ211と係合するための1つのブレードを有する。図16Bの切欠きに示すように、ステッピングモータ2110が下降すると、回転モータシャフト2121に取り付けられた回転モータカプラ2125がキャップ210中のキャップカプラ211と係合し、回転モータカプラ2125がキャップカプラ溝217と整列しないならば、回転モータカプラ2125はキャップカプラ溝217に直接的に入ることはできない。好ましい態様において、キャップカプラ211は、キャップカプラ溝217の両側に2つの面を有し、これらの面は、キャプカプラ211をはさんで反対方向に傾斜して、各側が、キャップカプラ溝217の各側で、より高い壁およびより低い壁を有するようになっている。回転モータシャフト2121が右回り方向（上から見て）に回転するとき、回転モータカプラ2125ブレードは右回り方向に回転し、キャップカプラ溝217の壁の高い側と遭遇し、キャップカプラ211を右回りに回転させ始める。ステッピングモータ2110が下降すると、図16Cに示すように、回転モータカプラ2125はキャップカプラ溝217と係合する。図16Dに示すように、ステッピングモータ2110が下降し続けると、回転モータ2120と、回転モータカプラ2125に取り付けられた回転モータシャフト2121とが下降してキャップカプラ溝217を押し、キャップカプラ211がキャップばね213をキャップシース212の底に対して圧縮し、ヘッド218を下降させる。図16Eに示すように、ヘッド218は下降して、ステータ354であることができる前処理チャンバ440の底に近づき、または接触し、ヘッド218が回転して組織を破砕することができる。ステッピングモータ2110が上昇すると、回転モータ2120および回転モータカプラ2125が上昇し、キャップばね213が圧縮解除されてキャップカプラ211を回転モータカプラ2125に押し当てて係合を継続させる。
【０１３５】
単一サンプルシンギュレータ機器2050の別の態様においては、ステッピングモータ2110が、可動式破砕装置345に磁気的に結合されている回転モータ2120の垂直位置を制御し、磁性または常磁性要素が、キャップカプラ211の一部として、または可動式破砕装置345もしくはヘッド218の一部として、キャップ210に埋め込まれている。
【０１３６】
回転モータカプラ2125が機械的結合、磁気結合、空気圧もしくは流体結合または他の結合法によってキャップカプラ211と係合し、回転モータ2120が回転すると、可動式破砕装置325およびヘッド218が回転する。ステッピングモータ2110が、回転モータ2120の垂直位置、ひいては回転モータカプラ2125の垂直位置を制御して、前処理チャンバ440中で可動式破砕装置345およびヘッド218を上下させる。回転モータ2120の回転とステッピングモータ2110の動きを組み合わせると、可動式組織破砕装置345およびヘッド218の数多くの動きのパターンが可能になる。
【０１３７】
前処理チャンバ440の内壁は、多くの異なる形状に具現化することができる。前処理チャンバ440の内壁は、異なる深さの区分を有するように溝を付けられることができる。好ましい態様において、内壁は円形のプロファイルを有することができ、可動機械的組織破砕装置345のヘッド218と内壁との間の最大ギャップは、好ましくは、1μmまたは2μmまたは5μmまたは10μmまたは15μmまたは20μmまたは25μmまたは30μmまたは40μmまたは50μmまたは75μmまたは100μmまたは150μmまたは200μmまたは250μmまたは500μmおよび1000μmまたはより大きいサイズならびにそれらの間の任意のサイズである。
【０１３８】
可動式組織破砕装置345は、多くの異なるプロファイルの多くの異なる形状に具現化されることができる。1つの態様において、可動式組織破砕装置345は、ロータ353であるヘッド218を有することができ、任意選択の特徴、たとえばロータ353の底の粉砕歯355および前処理チャンバ440の底の上面にあるステータ354上の粉砕歯355を有して、組織試料120の大きな破片のより小さな破片への粉砕または単一細胞1000もしくは核1050または生体分子1070への解離を支援する。図13および14に示すように、ヘッド218の側面は、内部ギャップ221を創製するための円柱であることができ、円柱の長さにわたって内壁がある。ヘッド218を回転させることなくヘッド218を上下させ、ひいてはヘッドを可動式破砕装置345として使用することにより、システムは、摩砕によって試料101を処理することができる。別の態様において、ヘッド218の側面はボール様構造を形成して、内壁とで小さな区域のギャップを創製することができ、前処理チャンバ440の底は、ボール様構造と合致するように丸められて、ダウンス型機械的組織破砕装置345を創製することができる。他の態様においては、可動式組織破砕装置345の側面プロファイルおよび前処理チャンバ440の内壁を変更することにより、同じまたは異なるサイズのギャップを有する複数の領域を創製することができる。
【０１３９】
組織の破砕は複数の破砕工程を含むことができ、各工程が、ヘッドをチャンバの床から異なる距離に配置して異なるサイズのギャップを生成することを含む。通常、各位置でヘッドが回転して、破砕または混合をさらに促進する。特定の態様においては、組織を単一細胞1000もしくは核1050または他の生物学的材料へと破砕する前に、臓器を破砕装置によって自動的にミンチ処理することができる。そのような方法は第一の破砕工程を含むことができ、この工程は、ヘッドを、チャンバの床から複数の異なる距離にセットし、各ギャップ距離で回転させて、酵素がアクセスするためのより大きな表面積およびより短い距離を組織に提供することを含むことができる。次の工程は、自動ミンチ処理された臓器を酵素または化学物質とともにインキュベートして、組織を単一細胞1000または核1050へと破砕することを含むことができる。次の工程は第二の破砕工程を含むことができ、この工程もまた、ヘッドをチャンバの床から複数の異なる距離にセットし、ヘッドを回転させることを含むことができる。
【０１４０】
実施例：新鮮なマウス腎臓からの単一細胞懸濁液の生成
単一サンプルシンギュレータシステム2000は、数多くの構成で作動することができる。一例として、操作者が、新鮮なマウス腎臓試料101を単一細胞懸濁液1000へと処理し、試薬モジュール1430に貯蔵された試薬を使用することを望むことがある。操作者は、図13Aに示すように、カートリッジ200からキャップ210を取り外し、マウス腎臓全体またはマウス腎臓の一部または事前にミンチ処理された腎臓の一部をサンプル入口ポート425に加える。キャップシース212の底部が前処理チャンバ440内の環状座部上に位置付けられるように、可動式破砕装置であるキャップ210を前処理チャンバ440上に再配置する。組織試料を有する今や完全なカートリッジをカートリッジレシーバトレー1510に配置し、カートリッジスライド1450とともに単一サンプルシンギュレータ機器2050に挿入する。タブレット750上のユーザインターフェース740を通して適切なプロトコルが選択された後、単一サンプルシンギュレータ機器2050は、熱伝達プレートを加熱して前処理チャンバ440を37℃に保持し、次いで腎臓試料101を処理し始める。
【０１４１】
電子ボードの初期化後、z軸ステッピングモータ2110が回転モータ2120を下に動かして、回転モータカプラ2125をキャップカプラ211と係合させる。次いで、制御ソフトウェア725が正しい弁設定を選択して、図17に示すように、試薬モジュール1430の温度制御された試薬貯蔵チャンバ1419中のポジション3からマウス腎臓試薬溶液2mLを引き出し、ポート470に通して、マウスの腎臓が配置されている前処理チャンバ440に送る。
【０１４２】
プロトコルによって選択された場合、組織を細かく砕くための自動ミンチ処置は、z軸ステッピングモータ2110が回転モータ2120、ひいては機械的破砕装置およびヘッド218（ロータ353として機能する）を前処理チャンバ440の底から1.5mmまで動かすことによって実行され、次いで、ロータ353が95rpmで右回りに4秒間、次いで左回りに4秒間、動かされる。ロータ353は底から0.6mmまで下げられ、95rpmで右回りに4秒間、左回りに4秒間、回転する。ロータ353は底から0.3mmまで下げられ、95rpmで右回りに4秒間、左回りに4秒間回転して、プロトコルの標準的な自動ミンチ処理部分を完了する。
【０１４３】
次いで、マウス腎臓の場合、今や自動ミンチ処理された腎臓試料101を連続的に上部浸漬混合しながら20分間インキュベートする。上部浸漬混合においては、ロータ353が、腎臓試料101が前処理チャンバ440中にある状態でマウス腎臓試薬溶液の上1/3の中へ下げられ、回転モータ210が連続浸漬混合モードでロータ353を95rpmで右回りに回転させる間に、酵素製剤が固体組織中の細胞外マトリックスを消化して細胞を遊離させる。
【０１４４】
20分後、ロータ353を底から4.2mmになる（約20％が、腎臓試料101を含むマウス腎臓試薬溶液に浸漬する）まで下げることによって組織を機械的に破砕し、ロータ353を95rpmで右回りに4秒間、次いで左回りに4秒間、回転させて最初の機械的破砕サイクルを実行する。第二の破砕サイクルは、ロータ353を1.5mm下げ、95rpmで右回りに4秒間、そして左回りに4秒間、回転させることによって実行される。第三の破砕サイクルは、ロータ353を0.9mm下げ、95rpmで右回りに4秒間、次いで左回りに4秒間、回転させることによるサイクルである。次いで、第四および第五の破砕サイクルは、それぞれの破砕サイクルで、ロータ353を0.6mm下げ、95rpmで右回りに4秒間、左回りに4秒間、次いで右回りに4秒間、そして左回りに4秒間、回転させることによって実行される。第六の破砕サイクルの場合、ロータ353を0.3mm上げ、次いで、95rpmで右回りに4秒間、左回りに4秒間、右回りに4秒間、そして左回りに4秒間、回転させる。第七の破砕サイクルの場合、ロータ353を0.6mm下げ、95rpmで右回りに4秒間、左回りに4秒間、右回りに4秒間、そして左回りに4秒間、回転させる。最後の第八の破砕サイクルの場合、ロータ353を0.3mm下げて前処理チャンバ440の底面と接触させ、95rpmで右回りに4秒間、左回りに4秒間、右回りに4秒間、そして左回りに4秒間、回転させる。他の多くの可能な破砕プロファイルが本発明によって可能になる。
【０１４５】
機械的組織破砕は2つの場所で発生する：第一に、ロータ353の底にある粉砕歯355と、ステータ354の頂部にある相補的な粉砕歯355によってボトムギャップ222中の固体組織を機械的に解離させ、第二に、ロータ353の周縁部と前処理チャンバ440の内壁との間のギャップが、組織を破砕するためのオリフィスとして作用する。
【０１４６】
次いで、ロータ353が前処理チャンバ440の底に配置された状態で、シリンジポンプ2130が適切な6方弁設定を通して真空トラップポート467において真空引きを行い、解離したマウス腎臓単一細胞懸濁液をライン453および70μmストレーナ2711に引き込むと、それが濾過ドレイン451を下って処理チャンバ460内の産出コレクタ領域461に出る。
【０１４７】
制御ソフトウェア725が、図17に示すように試薬モジュール1430の室温試薬貯蔵チャンバ1418中のポジション13から2mLのHBSS-Ca-Mgを引き出し、それをポート470に通して前処理チャンバ440に送るように弁設定の選択をセットする。ロータ353を動かして、残りの解離した細胞をHBSS-Ca-Mgと混合することができ、次いで、ロータ353が前処理チャンバ440の底に位置する状態で、シリンジポンプ2130が、適切な6方弁設定を通して真空トラップポート467において真空引きを行い、HBSS-Ca-Mgおよび残りの解離したマウス腎臓単一細胞懸濁液をライン453および70μmストレーナ2711に通し、濾過ドレイン451を下らせて、処理チャンバ460の産出コレクタ領域461に引き込む。次いで、このプロセスを繰り返して、第二の2mLのHBSS-Ca-Mgを前処理チャンバ440に通して処理チャンバ460に送達し、引き込む。次いで、処理チャンバキャップ465を開き、ピペッタを使用して産出コレクタ領域461から懸濁液を抜き取ることにより、マウス腎臓単一細胞1000懸濁液をピペットアウトすることができる。
【０１４８】
マウス腎臓単一細胞1000懸濁液を300gで5分間遠心分離して細胞をペレットとして収集し、赤血球をRBC溶解バッファで5分間溶解し、懸濁液を300gで5分間遠心分離して細胞を収集することができる。一例として、262mgのマウス腎臓がこのプロセスによって単一細胞懸濁液1000を生成し、その細胞力価は、図18Aに示すようなトリパンブルー染色を用いるCountess IIでの計数による測定で14,670,000であり、生存率85.5％であった。
【０１４９】
他の組織または臓器が様々な混合モードから恩恵を受け得る。単一サンプルシンギュレータシステム2000は、複数の混合モダリティを実行するように設計されている。たとえば、頂部混合は、ヘッド218の底を底から15mm上に配置し、ヘッド218を回転させて、酵素的または化学的溶解溶液410を試料101と混合するように設計されている。浅い浸漬混合は、ヘッド218を連続的に回転させながら底から17.7mm上から16.8mm上まで下げ、再び上に戻すことによって実行することができる。摩砕混合は、ヘッド218を回転させることなく底から12.3mm上から底から0.3mm上まで下げることによって実行することができる。他の多くの混合モダリティが可能になる。
【０１５０】
実施例：新鮮な凍結ヒト脳からの単一核懸濁液の生成
単一サンプルシンギュレータシステム2000は、核1050懸濁液を生成するために、数多くの構成で作動することができる。一例として、操作者が、新鮮なマウス腎臓試料101を単一核懸濁液1050へと処理し、試薬モジュール1430に貯蔵された試薬を使用することを望むことがある。操作者は、図13に示すように、カートリッジ200からキャップ210を取り外し、マウス腎臓全体または腎臓の一部または事前にミンチ処理された腎臓の一部をサンプル入口ポート425に加える。破砕装置であるキャップ210を前処理チャンバ440上に戻し、組織試料101を有する今や完全なカートリッジをカートリッジレシーバトレー1510に配置し、カートリッジスライド1450とともに単一サンプルシンギュレータ機器2050に挿入する。タブレット750上のユーザインターフェース740を通して適切なプロトコルが選択された後、単一サンプルシンギュレータ機器2050は、熱伝達プレート1070を冷却して前処理チャンバ440および処理チャンバ460を4℃に保持し、次いで腎臓試料101を処理し始める。熱伝達プレート1470はまた、必要に応じて予熱または予冷されることもできる。
【０１５１】
ボードの初期化後、z軸ステッピングモータ2110が回転モータ210を下に動かして、回転モータカプラ2125をキャップカプラ211と係合させる。次いで、制御ソフトウェア725が正しい弁設定を選択して、図17に示すように、試薬モジュール1430の温度制御された試薬貯蔵チャンバ1419中のポジション1から2mLの核単離溶液412を引き出し、ポート470に通して前処理チャンバ440に送る。
【０１５２】
次いで、ヘッド218（ロータ353として機能する）を底から4.2mmになる（約20％が、腎臓試料101を含む核単離溶液412に浸漬する）まで下げることによって組織を機械的に破砕し、次いで、可動式機械的破砕装置345を用いて、ロータ353として機能するヘッド218を135rpmで右回りに4秒間、次いで左回りに4秒間、回転させることで第一の機械的破砕サイクルを実行する。第二の破砕サイクルは、ロータ353を1.5mm下げ、135rpmで右回りに4秒間、次いで左回りに4秒間、回転させることによるサイクルである。第三の破砕サイクルは、ロータ353を0.9mm下げ、135rpmで右回りに4秒間、次いで左回りに4秒間、回転させることによるサイクルである。次いで、第四および第五の破砕サイクルは、それぞれの破砕サイクルで、ロータ353を0.6mm下げ、135rpmで右回りに4秒間、左回りに4秒間、右回りに4秒間、そして左回りに4秒間、回転させることによって実行される。第六の破砕サイクルの場合、ロータ353を0.3mm上げ、次いで、135rpmで右回りに4秒間、左回りに4秒間、右回りに4秒間、そしで左回りに4秒間、回転させる。第七の破砕サイクルの場合、ロータ353を0.6mm下げ、135rpmで右回りに4秒間、左回りに4秒間、右回りに4秒間、そして左回りに4秒間、回転させる。第八の破砕サイクルの場合、ロータ353を0.3mm下げ、135rpmで右回りに4秒間、左回りに4秒間、右回りに4秒間、そして左回りに4秒間、回転させる。
【０１５３】
機械的組織破砕は、ここでもまた、ロータ353の底で粉砕歯355によって発生し、かつ、ステータ354の頂部で相補的な粉砕歯355によって発生し、ボトムギャップ222中の固体組織およびサイドギャップ221中でロータ353の周縁部と前処理チャンバ440の内壁との間を通過する任意の組織を機械的に解離させる。
【０１５４】
次いで、ロータ353が前処理チャンバ440の底に配置された状態で、シリンジポンプ2130が適切な6方弁設定を通して真空トラップポート467において真空引きを行い、解離したマウス腎臓核懸濁液をライン453に通し、処理チャンバ460中の40μmストレーナ2711に通し、濾過ドレイン451を下らせ、産出コレクタ領域461に引き込む。
【０１５５】
制御ソフトウェア725が、図17に示すように試薬モジュール1430の温度制御試薬貯蔵チャンバ1419中のポジション2から2mLの核貯蔵溶液413を引き出し、それをポート470に通して前処理チャンバ440に送るように弁設定の選択をセットする。ロータ353を動かして、残りの解離した核1050を核貯蔵溶液413と混合することができ、次いで、ロータ353が前処理チャンバ440の底に位置する状態で、シリンジポンプ2130が、適切な6方弁設定を通して真空トラップポート467において真空引きを行い、核貯蔵溶液413および残りの解離したマウス腎臓単一核1050懸濁液をライン453および40μmストレーナ2711に通し、濾過ドレイン451を下らせて、産出コレクタ領域461に引き込む。次いで、処理チャンバキャップ465を開き、産出コレクタ領域461から細胞懸濁液を抜き取ることにより、マウス腎臓単一核1050懸濁液をピペットアウトすることができる。
【０１５６】
マウス腎臓単一細胞1050懸濁液を500gで5分間遠心分離して細胞をペレットとして収集した後、核貯蔵溶液413または他の媒体中に再懸濁させることができる。一例として、このプロセスによって生成された108mgのマウス腎臓が核懸濁液1050を生産し、その力価は、トリパンブルー染色を用いるCountess IIでの計数による測定で24,225,000であった。核懸濁液1050の写真が図18Bに示されている。
【０１５７】
実施例：FFPE組織を細胞または核へと処理する
FFPE組織は一般的に、病理学者が生検サンプルを検査するために使用される。FFPE組織の大規模なバンクは、癌を含む多くの疾患状態からの組織サンプルのアーカイブを含む。現在、FFPEから単一の細胞または核を単離することは困難であり、自動化されていない。
【０１５８】
1つの態様においては、FFPEブロックからの1つまたは複数の薄い切片をカートリッジ200中に加え、キャップ210を加え、カートリッジ200を単一サンプルシンギュレータ機器2050に入れる。いくつかの態様において、カートリッジ200は、前処理チャンバニップル471を通り抜ける解離していない薄いFFPE切片の損失を防ぐために、前処理チャンバニップル471に通じるチャネルの中または上に追加されたフィルタ、たとえば25μmフィルタを有する。
【０１５９】
適切な細胞または核FFPEプロトコルを選択した後、試薬モジュール1430の適切なセットアップを使用して、機器は、たとえば、試薬モジュール1430から2mLのキシロールを加え、室温または他の温度で、10秒、30秒、1分、5分、10分、15分、30分またはより長い期間から選択される期間、インキュベートすることができる。次いで、キシロールを、前記のように処理チャンバ460に引き込み、キシロールを用いてプロセスをさらに2回繰り返す。キシレン、ヒストレンおよび他の適合性の溶媒をキシロールに代えて用いることもできる。いくつかの態様において、処理チャンバ460の容積は、脱パラフィン材料を受け入れるために拡大される。他の態様においては、別個の廃棄物チャンバが追加され、流れを廃棄物チャンバまたは処理チャンバ460のいずれかへと方向付けるためにピンチ弁491が使用される。
【０１６０】
次いで、機器は、たとえば、試薬モジュール1430から2mLの100％エタノールをカートリッジ200に加え、室温または他の温度で、10秒、30秒、1分、5分、10分、15分、30分またはより長い期間から選択される期間、インキュベートすることにより、逆連続エタノール洗浄を実行することができる。次いで、前記のように100％エタノールを処理チャンバ460に引き込み、100％エタノールを用いてプロセスをさらに0回、1回またはより多く繰り返す。
【０１６１】
機器は、試薬モジュール1430から2mLの70％エタノールをカートリッジ200に加え、室温または他の温度で、10秒、30秒、1分、5分、10分、15分、30分またはより長い期間から選択される期間、インキュベートすることができる。次いで、前記のように70％エタノールを処理チャンバ460に引き込み、70％エタノールを用いてプロセスをさらに0回、1回またはより多く繰り返す。
【０１６２】
機器は、試薬モジュール1430から2mLの50％エタノールをカートリッジ200に加え、室温または他の温度で、10秒、30秒、1分、5分、10分、15分、30分またはより長い期間から選択される期間、インキュベートすることができる。次いで、前記のように50％エタノールを処理チャンバ460に引き込み、50％エタノールを用いてプロセスをさらに0回、1回またはより多く繰り返す。いくつかの態様においては、30％エタノール工程または他のさらなる逆連続エタノール洗浄工程を加えることもできる。いくつかの態様において、エタノール洗浄液および他の溶液は、PBS、ウシ血清アルブミン、RNアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤または他の補助物質を添加されることができる。
【０１６３】
機器は、2mLの精製水、たとえばRNアーゼ阻害剤を含む再蒸留水を試薬モジュールからカートリッジ200に加え、4℃、室温または他の温度で、10秒、30秒、1分、5分、10分、15分、30分、60分、2時間、4時間、8時間、12時間、24時間の範囲から選択される期間、インキュベートすることができる。次いで、前記のように水を処理チャンバ460に引き込み、精製水を用いてプロセスをさらに0回、1回またはより多く繰り返す。処理チャンバ460中の廃棄物は、この時点で除去することもできるし、廃棄物チャンバに送られていないならば、必要に応じて以前に除去することもできる。
【０１６４】
次いで、脱パラフィン処理されたFFPEを様々な方法によって処理することができる。1つの方法においては、最大2mLのプロテイナーゼK溶液（0.005％プロテイナーゼK、30U/mgタンパク質、50mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（pH7.0）、10mM EDTAおよび10mM塩化ナトリウム）を任意選択のDNアーゼとともに添加し、37℃または最高60℃または他の温度で、1分、5分、10分、15分、30分、60分、2時間、4時間、8時間、12時間、24時間の範囲から選択される期間、インキュベートすることにより、酵素消化を実行する。
【０１６５】
細胞を生成する場合には、残留細胞外マトリックスを溶解するための最大2mLの溶液の添加によって、たとえば非限定的にコラゲナーゼ（たとえばコラゲナーゼタイプI、II、III、IVなど）、エラスターゼ、トリプシン、パパイン、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン、中性プロテアーゼ、クロストリパイン、カゼイナーゼ、中性プロテアーゼ（Dispase（登録商標））、DNアーゼ、プロテアーゼXIV、RNアーゼ阻害剤または他の酵素、生化学物質または化学物質、たとえばEDTA、プロテアーゼ阻害剤、バッファ、酸または塩基で構成される試薬の調合物または成分の混合物を加えることにより、プロテイナーゼK溶液を希釈することができる。1つの態様においては、PBS/0.5mM CaCl2中に1mg/mlのCollagenase/Dispase（Roche）および100単位/mlのHyaluronidase（Calbiochem）を含有する酵素カクテル2mLを任意選択のDNアーゼとともに添加し、37℃または他の温度で、1分、5分、10分、15分、30分、60分、2時間、4時間、8時間、12時間、24時間の範囲から選択される期間、インキュベートする。次いで、遊離した単一細胞1000懸濁液を、前記のように70μmフィルタに通しながら処理チャンバ460に引き込み、取り出す。次いで、遊離した細胞を300rpmで5分間遠心分離し、PBSまたはHBSSなどのバッファ中に再懸濁させ、任意選択で70μmまたは他のフィルタに通して再度濾過する。その後、下流処置に適切なさらなる処理を実行することができる。
【０１６６】
核を生成する場合には、2mLの核分離バッファ412、たとえばNSTバッファ（146mM NaCl、10mMトリス塩基、pH7.8、1mM CaCl2、21mM MgCl2、0.05％BSA、0.2％Nonidet P-40）をプロテイナーゼK溶液に加え、1分、5分、10分、15分、30分、60分、2時間、4時間、8時間、12時間または24時間の範囲から選択される期間、インキュベートすることができる。次いで、遊離した核1050の懸濁液を、前記のように40μmまたは他のフィルタに通しながら処理チャンバ460に引き込み、取り出す。次いで、遊離した核を500rpmで5分間遠心分離し、核貯蔵バッファ413中に再懸濁させ、任意選択で40μmまたは他のフィルタに通して再度濾過する。その後、下流手順に適切なさらなる処理を実行することができる。
【０１６７】
シンギュレータシステム中の垂直カートリッジを使用して微小組織またはオルガノイドを生成する例
カートリッジ200の別の好ましい態様が図19AおよびBに示されている。この垂直カートリッジ200は、射出成形された後、ヒートシール可能なプラスチックラミネートなどの材料でシールされる、またはレーザ溶接される、または超音波溶接される、またはカートリッジ200をシールするための他の手段によってシールされるように設計されている。カートリッジは、処理工程中の改善された混合を促進する、サンプルを処理するための2つの処理チャンバ460を有する。
【０１６８】
図19AおよびBを参照すると、一般的なプロセスフローは以下のとおりである。操作者が、上記のように、組織試料120をサンプル入口ポート425に通して前処理チャンバ440に挿入し、キャップ210（図示せず）をカートリッジ200上に配置し、カートリッジ200をシンギュレータシステム100、組織処理システム80またはサンプル処理システム50に挿入する。適切なプログラムの選択の後、機器が、回転モータカプラ2125（図示せず）を介するキャップ210への機械的接続および流体/気体入口/出口480への流体/気体接続を行う。機器はまた、前処理チャンバ440ならびに2つの処理チャンバ461および462を、カートリッジ200の背面から、前記流体チャンバを加熱または冷却することができるカートリッジペルチェ1440などの素子と接触させる。
【０１６９】
適切な酵素的または化学的溶解溶液410が、流体工学サブシステム600により、試薬モジュール1430から、流体/気体入口/出口480から流体チャネル441を通って前処理チャンバ440の中に移動される。溶液は、前処理チャンバ440と係合する温度調節サブシステム1475の作用によって加熱または冷却され得る。酵素的または化学的溶解溶液410は、組織試料120を細胞懸濁液1000または核懸濁液1050へと解離するのに役立つ酵素または化学物質を含み得る。次いで、グラインダロータ420として作用するキャップ410中の組織破砕装置がシンギュレータシステム100によって機械的に回され、上下に動かされ、それにより、組織試料120は、ヘッド218上の粉砕特徴（前処理チャンバ440の底にあるグラインダロータ420およびグラインダステータ421であることができる）の作用によってますます小さな破片へと分離される。単一細胞1000または核懸濁液1050生成は、粉砕要素と、試薬411、たとえば本明細書に記載されている酵素もしくは化学物質または酵素と化学物質との組み合わせへの組織試料120のインキュベーション/曝露との複合作用によって達成される。組織破砕が十分に進行した後、グラインダロータ420は、グラインダステータ421に接触するまで完全に下降することができ、それにより、酵素溶解溶液410中の単一化された細胞1000または化学溶解溶液414中の核懸濁液1050は、ロータと前処理チャンバ440の壁との間のサイドギャップ211を通ってグラインダロータ420の周囲および上に押し出される。
【０１７０】
次いで、すべての流体/気体入口/出口480がシリンジポンプ2130および適切な弁によってシールされ、チャネル446または444を介して負圧を加えることにより、単一化細胞1000もしくは核1050の懸濁液または核酸1072は、前処理チャンバ440からチャネル442を介して濾過チャンバ450へと引き込まれ、次いでチャネル443を介して処理チャンバ461へと引き込まれる。濾過チャンバ450中のフィルタは、解離していない組織、細胞凝集体、および大きなデブリが処理チャンバ461に入るのを防ぐ。廃棄物チャンバ431は、任意の液体が流体/気体入口/出口480を通って出てシンギュレータシステム100に入るのを防ぐための液体吸収剤または固体吸収剤を含むことができる。
【０１７１】
単一細胞1000懸濁液から微小組織6001またはオルガノイド6002を生成するには、図20の、図19の拡大部に示すように、チャネル443の端部にあるノズル6100を使用して、微小組織6001またはオルガノイド6002を生成することができる懸滴6200を創製することができる。これは、濾過チャンバ450からの流れを制御して、ノズル6100上に小滴が形成されるまで単一細胞1000懸濁液をやさしく引くことによって達成される。処理チャンバ461は、蒸発を制御するために懸滴6200に水分補給を提供するために、いくつかの態様においては5％CO2で飽和した水またはバッファで事前に満たしておくことができる。機器によるカートリッジ200の温度制御により、微小組織6001またはオルガノイド6002を所望の温度（たとえば37℃）でインキュベートすることができる。インキュベーションは、処理チャンバ461上のシールを取り外すかまたはカートリッジの設計によってはそれを切り開くことによって微小組織6001またはオルガノイド6002を採取する前の数分間、数時間、または数日間であることができる。他の態様において、懸滴6200が微小組織6001またはオルガノイド6002を形成したならば、真空引きにより、または流体をチャネル442を通じてチャネル441に押し込むことにより、処理チャンバ461中の懸滴6200を放出することができる。微小組織6001またはオルガノイド6002が処理チャンバ461に入ったならば、チャネル444または他のチャネルを介して無菌増殖培地を供給することにより、微小組織6001またはオルガノイド6002をさらに成長させることができる。
【０１７２】
望むならば、チャネル444および445に代替の負（および/または正）圧を加えてサンプルを処理チャンバ461からチャネル448に通して処理チャンバ462へと前後に動かすことにより、微小組織6001またはオルガノイド6002を任意の追加される試薬と混合することもできる。さらなる処理が望まれない場合、操作者は、処理チャンバ461または前処理チャンバ462の上壁の開口または処理チャンバキャップ465（図示せず）を通して、またはカートリッジ200の表面のシールを取り外すことにより、微小組織6001またはオルガノイド6002を抜き取ることができる。
【０１７３】
微小組織6001またはオルガノイド6002はまた、幹細胞などの特定の細胞型のポジティブセレクションもしくは枯渇のために、または細胞を洗浄する、および/もしくはバッファを交換するために、磁気ビーズの使用によって垂直カートリッジ200において処理することができる。微小組織6001またはオルガノイド6002は、磁気ビーズに結合した細胞特異的アフィニティー試薬を使用することによってさらに処理することもできる。たとえば、細胞型特異的アフィニティー磁気ビーズおよび反応溶液を、チャネル444から処理チャンバ461に注入する。ビーズは、上記のようにチャネル448を通して混合することにより、微小組織6001またはオルガノイド6002とともにインキュベートされ、それにより、磁気ビーズはその標的細胞に結合する。次いで、磁石910を処理チャンバ462の前面に適用すると、それにより、磁気ビーズ（および付着した微小組織6001またはオルガノイド6002）が処理チャンバ462壁に引き付けられ、保持される。特定の標的を含有しない微小組織6001またはオルガノイド6002は、チャネル447および449を介して負圧を加えることによって廃棄物チャンバ432に引き込まれる。廃棄物チャンバ432は、任意選択で、液体または固体の吸収性物質を含むこともできる。
【０１７４】
同時に、またはその後、洗浄溶液をチャネル444に注入し、チャネル446に真空を適用することによってチャンバ462に引き込み、前記のような混合、磁気の解除/適用、および廃棄物チャンバ432への液体の引き込みの組み合わせにより、磁石910に付いたビーズを洗浄することができる。このプロセスを1回またはより多く繰り返すことができる。
【０１７５】
微小組織6001またはオルガノイド6002を所望の産出媒体に入れた後、磁石910を解放し、細胞をチャネル448に通して前後に動かすことによって混合することによって均一に再懸濁させ、次いで微小組織6001またはオルガノイド6002を処理チャンバ461または462のいずれかに引き込む。次いで、操作者は、フォイルシールまたはセプタムまたは処理チャンバキャップ465または他の機構（図示せず）によって覆われた処理チャンバ461または462の上壁中の開口を通して微小組織6001またはオルガノイド6002を抜き取ることができる。望むならば、他の処理/反応/流体要素をカートリッジに加えて、タンジェンシャルフロー濾過、光学インタロゲーション、ライブラリー調製および核酸精製をはじめとするさらなる処理モードを可能にすることができる。
【０１７６】
また、同様の処理方法を使用して、微小組織6001またはオルガノイド6002を特定の培地、バッファまたはMatricelなどの成長溶液に再懸濁させたり、マスタグまたは蛍光色素またはラマン標識または他の標識などの化学物質で標識を実行したりすることもできる。加えて、同様の方法を使用して、潜在的な治療用化合物または成長もしくは生存能力の阻害因子のスクリーニングを含め、単一細胞1000もしくは核1050または微小組織6001もしくはオルガノイド6002を化学的または生化学的に修飾することができる。いくつかの態様においては、計測サブシステム500がカートリッジ200中の微小組織6001またはオルガノイド6002にインタロゲートすることができる。
【０１７７】
別の態様においては、単一細胞1000懸濁液を処理チャンバ461に直接的に引き込み、前記のような磁気ビーズ処理により、幹細胞を精製するとともに非幹細胞を除去する。別の態様においては、単一細胞1000懸濁液を処理チャンバ461に直接的に引き込み、幹細胞へと化学的に誘導する、または転写因子を用いる、または4つの転写因子Oct4、Sox2、cMyc、Klf4のレトロウイルス媒介性発現を用いる。他の多くのモダリティが可能である。
【０１７８】
実施例：核および細胞内成分中の生体分子の分解の減少
核単離中および単離後の核中のRNAの分解がRNAの量および表現を変化させることがある。分解は組織特異的であり、現在、RNアーゼ活性が高い組織、たとえば膵臓からのトランスクリプトームの単一核シーケンシングを妨げることができる。同様に、RNAまたは他の細胞内成分からの他の生体分子、たとえば核およびミトコンドリアが単離処置中に分解することもある。RNAおよび固体組織サンプルから単離されたタンパク質、脂質、多糖類などで構成されている他の生体分子の質を改善する方法が記載されている。
【０１７９】
試薬を単独で、または機械的破砕技術と組み合わせて使用して固体組織を核へと解離させる現在の方法は、RNAがひどく分解する結果を招くおそれがあり、したがって、下流ゲノミクス解析には使えない。RNAの質を維持するための現在の方法は、高濃度のRNアーゼ阻害剤の使用、低温での操作実行および速やかな操作実行を含む。核内のRNAに対するRNアーゼの作用は急速な酵素反応である。RNアーゼに結合するRNアーゼ阻害剤の添加は、高レベルのRNアーゼ活性を示す組織タイプには無効であることがある。4℃で操作を実行すると酵素活性の速度を下げることができるが、ここでもまた、組織サンプル中に高レベルのRNアーゼがあるならば、RNアーゼ阻害剤の存在下でさえ、単に温度を下げるだけでは、RNAを分解から十分に保護することはできない。また、1〜1000mgの範囲の固体組織サンプルから核を単離するには0.5〜5mlの総試薬量を必要とし得、RNアーゼ阻害試薬を一般的な1単位/マイクロリットル濃度で含めるには1サンプルあたり数百ドルのコストを要することがある。
【０１８０】
本発明は、分解速度を低下させるための添加物の使用を記載する。1つの方法においては、プロテイナーゼK、セリンプロテアーゼまたは他のプロテアーゼを添加して、細胞外マトリックスから放出される、または細胞膜の溶解時に放出されるRNアーゼまたはDNアーゼを分解する。
【０１８１】
別の態様においては、核または他の細胞内成分の単離中、粘度を高めるための試薬を添加し、それによってDNアーゼ、RNアーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼおよび他の分解酵素の拡散速度を低下させ、ひいては、核、ミトコンドリアまたは他の細胞内成分の単離処置中のRNA分解または他の生体分子分解のレベルを低下させる。そのような添加物の例は、クラウディング剤ならびにフィコール、デキストラン、スクロース、トレハロース、セルロースおよびポリエチレングリコールで構成される生体適合性高分子量ポリマーを含むが、これらに限定されない。使用されるそのような試薬の一般的な濃度はおよそ0.01％〜50％w/vであるが、これらに限定されない。
【０１８２】
固体組織または事前に調製された単一細胞懸濁液から核を単離するために適用される方法の好ましい態様は、組織サンプルから核を単離するために使用される核単離溶液412、核貯蔵溶液413または両方に添加物の1つまたは複数を含めることである。たとえば、核を単離するためにシンギュレータシステム100を使用する場合、核単離溶液412が5％w/vフィコールを添加されてもよいし、核貯蔵溶液413が5％w/vフィコールを有してもよい。また、これらの溶液の一方または両方が、1つまたは複数のプロテアーゼ阻害剤と、SUPERase・In RNase Inhibitor、RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor、RNAsecure RNase Inactivation Reagent、Recombinant RNase Inhibitorをはじめとする1つまたは複数のRNアーゼ阻害試薬と、ヌクレオチドおよび無機ホスフェートをはじめとする小分子試薬とを含んでもよい。
【０１８３】
新鮮または急速冷凍マウス腎組織300mgからのマウス腎臓核の改善された単離のためのプロトコルは以下で構成され得る。
【０１８４】
1）核単離溶液412および核貯蔵溶液413に添加物を加えて、試薬モジュール1430に対する粘性を高める。
【０１８５】
2）4℃に予冷されたカートリッジ200に新鮮または急速冷凍マウス腎組織試料120を入れ、組織破砕キャップ210を加える。
【０１８６】
3）カートリッジ200を、4℃の動作温度にセットされた単一サンプルシンギュレータ機器2050に入れる。
【０１８７】
4）ソフトウェアユーザインタフェース740から核単離プロトコルを選択し、「実行」を選択する。すると、シンギュレータが、2mLの核単離溶液412を前処理チャンバ440中のマウス腎組織試料120に送達し；135rpmで組織を機械的に破砕し；サンプルを40ミクロンストレーナに通しながら処理チャンバ460に引き込み；2mLの核貯蔵溶液413を前処理チャンバ440に加えて残留物をすすぎ、界面活性剤の最終濃度を下げて破砕を終わらせ；加えた核貯蔵溶液413をフィルタに通しながら処理チャンバ460の中へ引き込む。
【０１８８】
5）次いで、サンプルカートリッジ200を単一サンプルシンギュレータ機器2050から取り出し、核1050懸濁液を5mlチューブの中にピペットで移し、2mLの4℃核貯蔵バッファ413を加える。次いで、サンプルを4℃で5分間、500gで遠心分離する。上清みをピペットアウトし、廃棄する。次いで、核ペレットを1mLの核貯蔵バッファ413中に再懸濁させる。
【０１８９】
実施例：解離法の性能を最適化するための遺伝子発現パネル
無傷の組織を単一細胞へと破砕すると、アノイキスまたは他のストレス反応経路として知られるプロセスを通して細胞における転写変化を誘導することができる。このような変化が、細胞死を招く、または後のゲノミクスもしくはプロテオミクス解析を混乱させるおそれがある。アノイキスまたは他の細胞ストレス経路に関与することが知られる標的化遺伝子のパネルに対する定量的PCR（qPCRアッセイ）を使用して、解離によって生成された単一細胞における解離関連の転写変化を特性評価することができる。qPCRデータはまた、解離プロセスを知らせ、最適化してストレス誘導変化を減らすために使用することもできる。特定の細胞ストレス経路をモニタするための遺伝子のパネルは記載されているが、アノイキス誘導ストレスまたは機械的および/または酵素的/化学的組織破砕から生じるストレスを知らせるために創製されたものはない。
【０１９０】
qPCRパネルは、解離した細胞の混合物中に存在する特定の細胞型もしくは細胞サブタイプを識別する、または単離された個々の細胞を特性評価するために使用することができる。細胞識別情報は他方で、目的の細胞型の解離プロセスを知らせ、最適化するために使用することができる。
【０１９１】
パネルはまた、単一細胞とは対照的に、核から単離されたRNAを特性評価するために使用されてもよい。核を単離するためのプロセスは、細胞を単離するプロセスよりもはるかに速やかであることができる。より短い処理時間は、遺伝子発現データにおいて顕著な細胞ストレスの量を減らし得る。加えて、単離された核は細胞質からのRNAを有さず、したがって、補足的なデータを提供する。qPCRデータはまた、解離プロセスを知らせ、最適化して、ストレス誘導変化を減らす、または核に特異的な起源細胞型を識別するために使用することもできる。
【０１９２】
表1に示す細胞ストレスの例示的なパネルの構造は、細胞ストレスに関連する遺伝子を増幅するために選択され、ゲノムDNAではなくRNA配列を増幅するように最適化されたPCRプライマのコレクションである。パネルは、1〜200超の遺伝子からなることができ、内部コントロールとして使用される少なくとも1つのハウスキーピング遺伝子を含み得る。
【０１９３】
パネルを使用するためには、シンギュレータシステム100をはじめとする装置を使用して固体組織から細胞を単離した後、ユーザが、既知の数の細胞もしくは核または既知の量の単離されたRNAにおける細胞ストレス反応または細胞同一性に関与する遺伝子のパネルに対してRT-qPCRを実行する。遺伝子発現のレベルを測定し、(1) 細胞ストレス反応によって発現が影響を受けない、いわゆるハウスキーピング遺伝子の発現レベルと比較してもよいし、(2) 異なる単離プロトコルを使用して単離された細胞から得られた遺伝子発現のレベルと比較してもよいし、(3) 特定の細胞型の有無を識別するために使用してもよい。また、他の分析が可能である。
【０１９４】
細胞ストレス反応への関与が疑われる38の遺伝子および内部コントロールとして使用される2つのハウスキーピング遺伝子を含む遺伝子パネルの一例が以下に示される。これらの遺伝子は、大部分の組織中で広く発現する理由から選択されたものであり、多様な組織サンプルに由来する細胞とでパネルを使用することを可能にする。表1に示すパネルは、マウス組織とで使用するために開発されたものである。＊でマークされた遺伝子はコントロールハウスキーピング遺伝子である。
【０１９５】
一例として、ユーザは、シンギュレータシステム100とマウス肝臓のためのプロトコルとを使用して、新鮮なマウス肝臓サンプルを細胞の懸濁液へと破砕する。次いで、ユーザは、細胞懸濁液1000をシンギュレータサンプルカートリッジ200から取り出す。Countess、血球計数盤、FACSまたは類似の方法を使用して細胞濃度を測定した後、ユーザは、「Cells to Ct」キット（Invitrogen）または細胞溶解、cDNA合成およびパネルにリストされた遺伝子のためのプライマセットを用いるqPCRを実行するための代替法を用いることもできる。あるいはまた、ユーザは、RNA単離キット、たとえばRNA Easyキット（Qiagen）を使用して、分離された細胞からRNAを精製することもできるし、あるいはまた、RNA濃度および純度を定量化した後、遺伝子のパネルを使用してcDNA合成およびqPCR実験を実行することもできる。qPCR増幅は、使用されるキットまたは方法に適切なサーマルサイクリングプロファイルを用いてリアルタイムPCR機器上で実行される。qPCR実験は、各遺伝子のサイクルしきい（Ct）値を返し、これらのデータを使用して相対的な遺伝子発現パターンを評価することができる。
【０１９６】
細胞のアポトーシスまたは壊死の計測に基づくものを含む、細胞ストレス反応の他のアッセイが利用可能である。表1に記載されているパネルは、既知であるか、特性評価されていないかにかかわらず、いくつかの細胞ストレス経路にまたがる遺伝子を表し、特に組織破砕プロセスに対する細胞ストレス反応を計測するために使用され得るという点で特有である。これは、1つまたは限られた数の定められたストレス遺伝子または経路をモニタするのではなく、複数のストレス経路をトリガし得る、組織解離に反応し得る一連の遺伝子を包含するように設計されている。
【０１９７】
実施例：遺伝子編集法の程度および特異度の決定
研究用途と臨床用途の両方のために生物学的システムを実験的に操作するために、CRISPR、TALENSおよび他の遺伝子編集技術がますます使用されている。そのような操作の成否の主要な指標は、効果的に改変されたゲノムを有する細胞の数およびオフターゲット編集とは対照的に所望の位置におけるそのような改変の特異度である。オフターゲット遺伝子編集は、疾患の原因となる変化を細胞にもたらすおそれがある。バルク組織のDNAまたはRNAシーケンシングを用いる場合、稀なイベントは観測されないことがあるため、編集の浸透度または特異度を評価することは困難である。シングルセルシーケンシング技術を使用して遺伝子編集の評価を実行することが重要である。
【０１９８】
この例においては、生物学的試験対象、たとえば非限定的に細胞培養物、付着細胞、オルガノイド、モデル生物またはヒト患者を遺伝子編集プロセスで処理した。処理の後、細胞または組織のサンプルを試験生物または培地から取り出す。サンプル、たとえば組織試料120または微小組織6001もしくはオルガノイド6002をシンギュレータ100または代替の組織破砕装置中で処理して細胞または核の懸濁液を得る。次いで、細胞または核を単一細胞または単一核DNAまたはRNAシーケンシングに付して、編集されたゲノムの有無および単一細胞集団内の表現を決定する。
【０１９９】
別段の指定がない限り、本明細書において使用される以下の意味が当てはまる。語「〜し得る」とは、強制的な意味（すなわち、〜しなければならないを意味する）ではなく、許可的な意味（すなわち、〜する能力を有することを意味する）で使用される。語「含む」、「包含する」などは、非限定的に含むことを意味する。単数形の冠詞は複数の指示対象を含む。したがって、たとえば、「ある要素」の参照は、1つまたは複数の要素のための他の語句、たとえば「1つまたは複数の」の使用にもかかわらず、2つ以上の要素の組み合わせを含む。語「または」は、別段の指示がない限り、非排他的である、すなわち「および」と「または」の両方を包含する。
【０２００】
本明細書において使用される語「含む」、「包含する」、「有する」またはそれらの任意の変形は、非排他的包含をカバーすることを意図する。たとえば、一連の特徴を含むあるプロセス、方法、物品または装置は、必ずしも、そのような特徴だけを含むことに限定されず、明示的には挙げられてない、またはそのようなプロセス、方法、物品または装置に固有である他の特徴をも含み得る。さらに、そうではないことが明示的に述べられない限り、「または」は、非排他的論理和を指し、排他的論理和を指さない。たとえば、条件AまたはBは以下のいずれか1つによって満たされる：Aが真であり（または存在し）、Bが偽である（または存在しない）、Aが偽であり（または存在せず）、Bが真である（または存在する）、およびAとBの両方が真である（または存在する）。複数の意味と単数の意味の両方が含まれ得る。修飾語句と一連の構成要素との間の語「のいずれか」とは、その修飾語が、一連の構成要素の各要素を修飾することを意味する。したがって、たとえば、語句「1、2、または3の少なくともいずれか」とは、「少なくとも1、少なくとも2、または少なくとも3」を意味する。語「〜から本質的になる」とは、記載されている要素と、請求される組み合わせの基本的かつ新規な特徴に実質的に影響しない他の要素との包含をいう。
【０２０１】
本明細書において上記および下記で参照されるすべての特許、特許出願、公開出願、学術論文および他の刊行物は全体として参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に記載されている定義および/または説明が、参照により本明細書に組み入れられる特許、特許出願、公開出願および他の刊行物に記載された定義と相反する、または他のやり方で矛盾する場合、本明細書に記載されている定義および/または説明が、参照により組み入れられる定義にまさる。
【０２０２】
詳細な説明および図面は、本発明を開示された特定の形態に限定することを意図したものではなく、逆に、特許請求の範囲によって定められる発明の精神および範囲に入るすべての変形、等価物および代替物を包含することを意図するということが理解されるべきである。詳細な説明を考慮すると、当業者には、本発明の様々な局面のさらなる変形および代替態様が明らかになるであろう。したがって、詳細な説明および図面は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実施する一般的なやり方を当業者に教示する目的のものである。本明細書に示され、記載されている本発明の形態は、態様の例として受け取られるべきであることが理解されるべきである。発明の詳細な説明の恩典を受けた後、当業者には明らかであるように、本明細書に例示され、記載されているものに代わる要素および材料が使用されてもよく、部品およびプロセスが逆にされ、または省略されてもよく、発明の特定の特徴が独立して利用されてもよい。特許請求の範囲に記載されている発明の精神および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載されている要素に変更を加えてもよい。本明細書において使用される見出しは編成目的のものであり、説明の範囲を制限するために使用されることを意図したものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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