(57)【要約】  本発明は、［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン系化合物結晶形およびその調製方法を開示し、さらに、Ａ２Ａ受容体関連疾患を治療するための薬物の調製における前記の結晶形の使用も開示する。（Ｉ）2021522335.tif 000012【選択図】なし
2021522335.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ線粉末回折パターンが、１１．３０±０．２°、１６．９０±０．２°、２２．５２±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
【化１】
2021522335.tif 000011
化合物１の結晶形Ａ。
【請求項２】
Ｘ線粉末回折パターンが、８．０８±０．２°、１１．３０±０．２°、１４．００±０．２°、１６．９０±０．２°、１８．３０±０．２°、２２．５２±０．２°、２３．１５±０．２°、２５．２６±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
請求項１に記載の化合物１の結晶形Ａ。
【請求項３】
図１に示すＸＲＰＤパターンを有する、
請求項２に記載の化合物１の結晶形Ａ。
【請求項４】
示差走査熱量測定曲線が、１９８．６１℃±２℃に吸熱ピークの開始点を有する、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物１の結晶形Ａ。
【請求項５】
図２に示すＤＳＣパターンを有する、
請求項４に記載の化合物１の結晶形Ａ。
【請求項６】
熱重量分析曲線が、１９９．８０℃±３℃で０．４４２３％の重量損失を有する、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物１の結晶形Ａ。
【請求項７】
図３に示すＴＧＡパターンを有する、
請求項６に記載の化合物１の結晶形Ａ。
【請求項８】
Ａ２Ａ受容体関連疾患を治療するための医薬品の調製における、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物１の結晶形Ａの使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願への相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１８年０４月２８日に出願された、出願番号がＣＮ２０１８１０３９９８７６．６である特許出願の優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン系化合物の結晶形およびその調製方法に関し、さらに、Ａ２Ａ受容体関連疾患を治療するための医薬品の調製における前記の結晶形の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
アデノシンＡ２Ａ受容体は、ヒト組織に広く分布している。この受容体は、脾臓、胸腺、白血球、血小板、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、および嗅球などの組織や臓器で高度に発現している。また、心臓、肺、血管、および脳などの他の部分でも発現している。アデノシンＡ２Ａ受容体は一般に、他のＧＰＣＲと共存して結合し、ヘテロダイマーを形成する。例えば、Ａ２Ａ受容体は、ドーパミンＤ２、カンナビノイドＣＢ１、グルタミン酸ｍＧｌｕＲ５などとヘテロダイマーを形成することができる。アデノシンＡ２Ａ受容体は、血管拡張の調節、新しい血管の形成のサポート、炎症による損傷からの体組織の保護などの生命活動において重要な役割を果たす。アデノシンＡ２Ａ受容体は、大脳基底核の間接経路の活動にも影響を及ぼす。
【０００４】
固形腫瘍において、細胞組織の分解および低酸素環境は、大量のＡＴＰの分解を引き起こし、その結果、細胞外のアデノシンの濃化を引き起こし、濃度が異常に高く、正常値の１０〜２０倍になる。高濃度のアデノシンがＡ２Ａ受容体に結合することで、アデノシンシグナル伝達経路を活性化することができる。このシグナル伝達経路は、体組織が損傷したときに免疫抑制によって体組織を保護するメカニズムである。アデノシンシグナル伝達経路の活性化は、自然免疫応答の長期的な抑制につながり、免疫寛容を生み出す可能性があり、さらに悪性腫瘍の制御されない成長につながる可能性がある。白血球（例えば、リンパ球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞など）におけるアデノシンとＡ２Ａ受容体との結合は、免疫系におけるこれらの白血球のエフェクターとしての機能を阻害する。アデノシンがＡ２Ａ受容体に結合することで、ＣＤ３９、ＣＤ７３、およびＣＴＬＡ４（Ｔ細胞チェックポイント）の発現が増加し、それによって、より強力な免疫抑制性を持つＴｒｅｇ細胞がより多く生成する。Ａ２Ａ受容体のアデノシンシグナル伝達経路を遮断することで、免疫系に対する抑制効果が低下し、Ｔ細胞の免疫機能が強化される。したがって、腫瘍の成長を阻害する可能性のある負のフィードバックメカニズムと考えられている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、化合物１の結晶形Ａを提供する。そのＸ線粉末回折パターンは、１１．３０±０．２°、１６．９０±０．２°、２２．５２±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する。
【化１】
2021522335.tif 000003
【０００６】
本発明の一部の実施形態において、前記の化合物１の結晶形Ａを提供する。そのＸ線粉末回折パターンは、８．０８±０．２°、１１．３０±０．２°、１４．００±０．２°、１６．９０±０．２°、１８．３０±０．２°、２２．５２±０．２°、２３．１５±０．２°、２５．２６±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する。
【０００７】
本発明の一部の実施形態において、前記の化合物１の結晶形Ａを提供する。そのＸＲＰＤパターンを図１に示す。
【０００８】
本発明の一部の実施形態において、前記の化合物１の結晶形Ａを提供する。そのＸＲＰＤパターンの解析データを表１に示す。
【表１】
2021522335.tif 000004
【０００９】
本発明の一部の実施形態において、前記の化合物１の結晶形Ａを提供する。その示差走査熱量測定曲線は、１９８．６１℃±２℃に吸熱ピークの開始点を有する。
【００１０】
本発明の一部の実施形態において、前記の化合物１の結晶形Ａを提供する。そのＤＳＣパターンを図２に示す。
【００１１】
本発明の一部の実施形態において、前記の化合物１の結晶形Ａを提供する。その熱重量分析（ＴＧＡ）曲線は、１９９．８０℃±３℃で０．４４２３％の重量損失を有する。
【００１２】
本発明の一部の実施形態において、前記の化合物１の結晶形Ａを提供する。そのＴＧＡパターンを図３に示す。
【００１３】
また、本発明は、Ａ２Ａ受容体関連疾患を治療するための医薬品の調製における前記の化合物１の結晶形Ａの使用を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
化合物１の結晶形Ａは、安定した特性、低い吸湿性、および良好なドラッガビリティを有する。本発明の化合物１の結晶形Ａは、良好な安定性およびドラッガビリティを有し、腫瘍微小環境におけるＡ２Ａ受容体への高濃度のアデノシンの結合によって活性化されるアデノシンシグナル伝達経路に対して顕著な阻害効果を有する。また、ＣＴ−２６マウスにおける結腸直腸癌モデルによると、化合物１の結晶形Ａが腫瘍に対して顕著な阻害効果を有することが見出された。
【００１５】
定義と説明
特に断らない限り、本明細書で使用される以下の用語および語句は、以下の意味を有する。特定の用語や語句は、特定の定義がなければ、不明瞭または不明確であると見なされるべきではなく、通常の意味で理解されるべきである。本明細書に商品名が記載されている場合、対応する商品またはその有効成分を指すものである。
【００１６】
本発明の中間化合物は、以下に列挙される特定の実施形態、それらを他の化学合成方法と組み合わせることにより形成される実施形態、および当業者に周知の同等の代替方法を含む、当業者に周知の様々な合成方法によって調製することができる。好ましい実施形態は、本発明の実施例を含むが、これらに限定されない。
【００１７】
本明細書に開示される特定の実施形態における化学反応は、本発明の化学変化および必要とされる試薬や材料に適する適切な溶媒中で行う。本発明の化合物を得るために、当業者が、既存の実施形態に基づいて合成工程または反応スキームを変更または選択する必要がある場合がある。
【００１８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明を限定するものではない。
【００１９】
本発明で使用されるすべての溶媒は市販されるものであり、さらに精製することなく使用される。
【００２０】
本発明は以下の略語を使用する。ＤＭＦはジメチルホルムアミドを表し；Ｐｄ（ＰＰｈ３）４はテトラキス（トリフェニルホスフィノ）パラジウムを表し；ＥｔＯＨはエタノールを表し；ＮａＯＨは水酸化ナトリウムを表し；ＭＴＢＥはメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを表す。
【００２１】
化合物は手動またはＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）ソフトウェアによって命名され、市販の化合物は供給業者のカタログ名を使用する。
【００２２】
本発明における粉末Ｘ線回折（Ｘ−ｒａｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ，ＸＲＰＤ）方法
約１０〜２０ｍｇのサンプルをＸＲＰＤ分析に使用した。
詳細なＸＲＰＤパラメータは以下の通りである。
ライトチューブ：Ｃｕ、ｋ２、（λ＝１．５４０５６Å）
ライトチューブ電圧：４０ｋＶ、ライトチューブ電流：４０ｍＡ
発散スリット：０．６０ｍｍ
検出器スリット：１０．５０ｍｍ
散乱防止スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲：３または４〜４０ｄｅｇ
ステップサイズ：０．０２ｄｅｇ
ステップ長さ：０．１２秒
サンプルディスクの回転速度：１５ｒｐｍ
【００２３】
本発明における示差走査熱量測定（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ，ＤＳＣ）法
サンプル（０．５〜１ｍｇ）を採取し、ＤＳＣアルミニウムポットに入れて試験を行った。方法は、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で２５℃から３００℃または３５０℃にサンプルを加熱した。
【００２４】
本発明における熱重量分析（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＴＧＡ）法
サンプル（２〜５ｍｇ）を採取し、ＴＧＡプラチナポットに入れて試験を行った。２５ｍＬ／ｍｉｎのＮ２の条件下、室温から３００℃または２０％の重量損失まで、１０℃／ｍｉｎの昇温速度でサンプルを加熱した。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、化合物１の結晶形ＡのＣｕ−Ｋα放射線によるＸＲＰＤパターンである。
【図２】図２は、化合物１の結晶形ＡのＤＳＣ曲線である。
【図３】図３は、化合物１の結晶形ＡのＴＧＡ曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の内容をよりよく理解するために、特定の実施例によって本発明をさらに説明するが、これらの特定の実施形態は、本発明の内容を限定するものではない。
【００２７】
実施例１：化合物Ｃの調製
【化２】
2021522335.tif 000005
【００２８】
工程１：
無水テトラヒドロフラン（２４Ｌ）を５０Ｌの高／低温ジャケット付き反応釜に投入し、化合物ａ（２４６４．８４ｇ、１３．５８ｍｏｌ、１当量）を秤量し、バッチで反応釜に加えた。窒素流の保護下で、反応系の温度を０℃まで冷却した。真空で減圧し、メチルマグネシウムクロリドのテトラヒドロフラン溶液（６．７９Ｌ、２０．３７ｍｏｌ、３．０Ｍ、１．５０当量）を１Ｌの等圧滴下ロートに加え、窒素ガスの保護下で反応釜にゆっくりと滴下し、反応液の内部温度を０〜５℃に制御した。Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（３１５．２５ｇ、２７１．５４ｍｍｏｌ、０．０２当量）を秤量し、バッチで反応釜に加えた。窒素流の保護下で、反応液の温度を７０±５℃に加熱して、攪拌して１６時間反応させた。ＨＰＬＣおよびＬＣＭＳで反応の完了をモニタリングした。反応液を室温まで冷却し、１５００ｍＬの氷水にゆっくりと注ぎ、さらに氷水に２００ｇの塩化アンモニウムを添加し、３０分間攪拌した後、濾過させ、濾液を減圧下で濃縮して、ほとんどの溶媒を除去した。ウォーターポンプを使用して減圧し、生成物を減圧蒸留（１１０℃）して、黄色の液体として化合物ｂ（１８３２．９１ｇ、収率：６９．４８％）を得た。
ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ）：ｍ／ｚ：１６２．１［Ｍ＋１］．
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．７３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４８−７．４６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３３−７．３１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），２．６２（ｓ，３Ｈ）
【００２９】
工程２：
ＭＴＢＥ（４０００ｍＬ）を５Ｌの反応フラスコに投入し、ビス（ピナコラート）ジボロン（３８５．８１ｇ、１．５２ｍｏｌ、０．６当量）を秤量して反応フラスコに加え、４−４’−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２’−ビピリジン（６．７３ｇ、２５．０７ｍｍｏｌ、０．０１当量）およびジ（１，５−シクロオクタジエン）ジ−μ−メトキシジイリジウム（Ｉ）（６．７３ｇ、１０．１５ｍｍｏｌ、０．００４当量）を秤量して反応フラスコに加え、反応フラスコ内の空気を窒素ガスで置換し、反応液を７０±５℃で０．５時間攪拌した。１Ｌの等圧滴下ロートで化合物ｂ（４０８．００ｇ、２．５３ｍｏｌ、１当量）を反応釜にゆっくりと加えた後、反応フラスコ内の空気を窒素ガスで置換し、反応液を７０±５℃で攪拌して１６時間反応させた。ＨＰＬＣおよびＬＣＭＳで反応の完了をモニタリングした。反応液を室温まで冷却し、減圧下で濃縮して、溶媒を除去し、残留物をｎ−ヘプタン：酢酸エチル＝１０：１（３Ｌ）の混合物で溶解した。シリカゲル（１００−２００メッシュ、２．５Ｋｇ）で充填したクロマトグラフィーカラムに注ぎ、減圧下で吸引濾過した。シリカゲルフィルターケーキを酢酸エチルで洗浄し、減圧下で濾液を濃縮して、白色固体として化合物ｃ（５６７．１１ｇ、収率：７８．０１％）を得た。
ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ）：ｍ／ｚ：２８８．２［Ｍ＋１］．
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．８３（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ），２．６５（ｓ，３Ｈ），１．３７（ｓ，１２Ｈ）．
【００３０】
実施例２：化合物１およびその結晶形Ａの調製
【化３】
2021522335.tif 000006
【００３１】
工程１：
メタノール（３０Ｌ）を５０Ｌの反応釜に投入し、３５℃で化合物ｄ（３３００．０８ｇ、２０．１２ｍｏｌ、１．０当量）を加え、メタノール（３Ｌ）で反応釜の周囲の壁の固体を濯いだ後、純度９８％のヒドラジン水和物（２．９９Ｌ、６０．３７ｍｏｌ、３．０当量）を加え、３５℃で反応系を２２．５５時間攪拌し、ＬＣＭＳおよびＨＰＬＣで反応の完了をモニタリングした。反応液を濾過し、フィルターケーキを回収、乾燥して、黄色固体の化合物として化合物ｅ（３４０２．８４ｇ、粗生成物）を得た。
ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ）：ｍ／ｚ：１６０．１［Ｍ＋１］．
１ＨＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．１３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．３５（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），５．９６（ｓ，１Ｈ），４．２４（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）
【００３２】
工程２：
化合物ベンジルオキシ酢酸（１．９７Ｌ、１３．７４ｍｏｌ、１．０２当量）を５０Ｌの反応釜に投入した後、テトラヒドロフラン（６Ｌ）を加え、Ｎ，Ｎ−カルボニルジイミダゾール（２２３０．００ｇ、１３．７４ｍｏｌ、１．０２当量）をバッチでゆっくりと加え、気泡が発生した。反応フラスコを大気に開放したままにして、テトラヒドロフラン（３Ｌ）を追加し、１９℃で３．１７時間攪拌した後、３０℃に保ちながら、化合物ｅ（２１５０．００ｇ、１３．４７ｍｏｌ、１当量）をバッチでゆっくりと添加し、最後にテトラヒドロフラン（１．７５Ｌ）で周囲の壁の化合物を濯いだ。１５〜１６℃で攪拌して１９．７８時間反応させた。ＬＣＭＳおよびＨＰＬＣで反応がほぼ完了したことをモニタリングした。反応液を濃縮乾固した後、調製したクエン酸水溶液（３００ｇのクエン酸を８Ｌの水に溶解）を加え、１６℃で攪拌し、混合物を濾過し、フィルターケーキをメタノール（１０Ｌ）でスラリー化した後、濾過した。フィルターケーキを回収し、乾燥させて、黄色の固体として化合物ｆ（２８７６．００ｇ、収率：６９．３７）を得た。
ＬＣＭＳ  （５−９５ＡＢ）：ｍ／ｚ：３０８．２［Ｍ＋１］．
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ４−ＭｅＯＨ）：δ  ７．４７−７．２７（ｍ，５Ｈ），５．９６（ｓ，１Ｈ），４．６７（ｓ，２Ｈ），４．１２（ｓ，  ２Ｈ）
【００３３】
工程３：
２０℃で化合物ヘキサメチルジシラザン（１８．９Ｌ、９０．０９ｍｏｌ、１３．２１当量）およびＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（１６．８Ｌ、６７．９３ｍｏｌ、９．９６当量）を５０Ｌの反応釜に投入した後、化合物ｆ（２１００．００ｇ、６．８２ｍｏｌ、１当量）を加え、１２０℃で攪拌して２２．７７時間反応させ、ＬＣＭＳおよびＨＰＬＣで反応の完了をモニタリングした。反応液を２０℃に冷却した後、攪拌を停止し、反応液を排除した。内部温度を１５〜２５℃に保ちながら、排除された反応液をバッチでゆっくりと反応釜内の水（１６．８Ｌ）とメタノール（１６．８Ｌ）との混合溶液に添加した。反応のグエンチによって黄色の固体が生成された。濾過して、フィルターケーキを回収し、乾燥させ、黄色の固体として化合物ｇ（１４８０．７２ｇ、収率：７４．９０％）を得た。
ＬＣＭＳ  （５−９５ＡＢ）：ｍ／ｚ：２９０．０［Ｍ＋１］．
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．３８（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），７．４３−７．２３（ｍ，５Ｈ），７．０３（ｓ，１Ｈ），４．６８（ｓ，２Ｈ），４．６１（ｓ，２Ｈ）．
【００３４】
工程４：
化合物ｇ（１０８０．００ｇ、３．７３ｍｏｌ、１．０当量）を１，４−ジオキサン（１０．８Ｌ）および水（２．１６Ｌ）に加えた後、フェニルボロン酸（３５０．７８ｇ、２．８８ｍｏｌ、１．０５当量）および炭酸カリウム（７５７．３４ｇ、５．４８ｍｏｌ、２．０当量）を添加し、窒素ガス保護下で触媒であるＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（３０．０７ｇ、０．０４ｍｏｌ、０．０１５当量）を加え、窒素ガス保護下で外部温度を１１０℃に設定し、１６．７２時間攪拌した。ＬＣＭＳおよびＨＰＬＣで反応の完了をモニタリングした。濃縮して溶媒を除去した後、酢酸エチル：ｎ−ヘプタン：水（６００ｍｌ：６００ｍｌ：６００ｍｌ）を添加して、攪拌しながらスラリー化させ、濾過し、５００ｍｌの水でフィルターケーキを１回洗浄し、フィルターケーキを乾燥した。黒褐色の固体として化合物ｈ（１５０１．４１ｇ、粗生成物）を得た。
ＬＣＭＳ  （５−９５ＡＢ）：ｍ／ｚ：３３２．２［Ｍ＋１］．
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．１２−８．１５（ｍ，２Ｈ），８．００（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），７．５８−７．４３（ｍ，４Ｈ），７．４２−７．２７（ｍ，５Ｈ），４．７３（ｓ，２Ｈ），４．６６（ｓ，２Ｈ）
【００３５】
工程５：
化合物ｈ（１５００．００ｇ、４．５３ｍｏｌ、１．０当量）に塩酸（１０．５Ｌ）を加え、４０℃で２９．１３時間攪拌し、ＬＣＭＳおよびＨＰＬＣで反応がほぼ完了したことをモニタリングした。反応液を濾過し、フィルターケーキを乾燥させ、氷水浴で水酸化ナトリウムの固体によって母液をｐＨ７−８に調整し、攪拌しながら固体を析出し、濾過し、フィルターケーキを乾燥した。フィルターケーキを合わせて、黄色の固体として化合物ｉ（１１６０．００ｇ、粗生成物）を得た。
ＬＣＭＳ  （５−９５ＡＢ）：ｍ／ｚ：２４２．２［Ｍ＋１］．
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．１０−８．１４（ｍ，２Ｈ），７．９４（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），７．５４−７．３９（ｍ，４Ｈ），５．６０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），４．６６（ｓ，２Ｈ）
【００３６】
工程６：
化合物ｉ（４００．９０ｇ、１．６６ｍｏｌ、１．０当量）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２Ｌ）に加えた後、Ｎ−ヨードスクシンイミド（５６０．００ｇ、２．４９ｍｏｌ、１．５当量）を３Ｌの三つ口フラスコに添加し、１０℃で４４．４７時間攪拌し、ＬＣＭＳおよびＨＰＬＣで反応の完了をモニタリングした。反応液を水（６Ｌ）に加え、撹拌しながら大量の固体を析出させ、濾過して、フィルターケーキを水（１Ｌ）で１回洗浄した。フィルターケーキを乾燥して、黄褐色の固体として化合物ｊ（６５２．２２ｇ、粗生成物）を得た。
ＬＣＭＳ  （５−９５ＡＢ）：ｍ／ｚ：３６８．１［Ｍ＋１］．
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．１１（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），７．６１−７．５６（ｍ，２Ｈ），７．５１−７．４３（ｍ，３Ｈ），５．６３（ｂｒｓ，１Ｈ），４．６６（ｓ，２Ｈ）。
【００３７】
工程７：
化合物ｊ（２５０．００ｇ、６８０．９４ｍｍｏｌ、１．０当量）を１，４−ジオキサン（２．５Ｌ）および水（０．５Ｌ）に溶解した後、化合物ｃ（２５４．９８ｇ、８８８．１５ｍｍｏｌ、１．２当量）およびリン酸カリウム（２８９．０８ｇ、１．３６ｍｏｌ、２当量）を順次に加え、窒素ガス保護下で１，１−ビス（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）フェロセン二塩化パラジウム（１３．３１ｇ，２０．４２ｍｍｏｌ，０．０３当量）を加え、１１０℃に昇温して１６時間反応させた。サンプルを採取して、ＬＣＭＳおよびＨＰＬＣで反応の完了をモニタリングした。反応液を減圧下で濃縮乾固し、酢酸エチル（２．０Ｌ）および水（３．０Ｌ）で固体を抽出し、毎回酢酸エチル（２．０Ｌ）を加えて抽出し、４回抽出し、有機相を合わせた後、５．０Ｌのｎ−ヘプタンを添加して均一に攪拌し、化合物の溶液をシリカゲル（３Ｋｇ、２００〜３００メッシュ）で濾過し、２０Ｌの洗浄剤（酢酸エチル：１５Ｌ、ｎ−ヘプタン：５Ｌ）を調製してフィルターケーキを洗浄し、濾液を合わせ、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固させた。乾固された固体を１．０Ｌの酢酸エチルに加え、７５℃に加熱し、完全に溶解させ、温度を保ちながら、ｎ−ヘプタン（３．０Ｌ）をゆっくりと滴下し、白色の固体を析出させ、２０℃に冷却し、濾過した。固体を０．５Ｌのエタノールに加え、７５℃に加熱し、完全に溶解させ、温度を保ちながら、水（３．６Ｌ）をゆっくりと滴下し、白色の固体を析出させ、３０℃に冷却し、濾過し、固体を０．９Ｌのエタノールに加え、７５℃に加熱し、完全に溶解させ、温度を保ちながら、水（２．０Ｌ）をゆっくりと滴下し、白色の固体を析出させ、３０℃に冷却し、濾過し、固体をオーブンで乾燥して、化合物１の結晶形Ａ（１５０．０９ｇ，収率：５５％）を得た。
ＬＣＭＳ  （１０−８０ＡＢ）：ｍ／ｚ：４０１．２［Ｍ＋１］
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．２９（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），７．５６（ｓ，１Ｈ），７．２４−７．４４（ｍ，６Ｈ），５．５６（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），４．６６（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．４８（３Ｈ，ｓ）
【００３８】
実験例１：化合物１の結晶形Ａの溶解度の測定
約２．０ｍｇの化合物１の結晶形Ａを並行して秤量し、ガラスバイアルに入れた。表２に記載される様々な単一溶媒または混合溶媒を少量ずつに加え、化合物の溶解を観察しながら振とうした。化合物の溶解度は、秤量した化合物の重量および添加した対応の溶媒の体積に基づいて計算した。詳細な結果を表２に示す。
【表２】
2021522335.tif 000007
【００３９】
結論：化合物１の結晶形Ａは、上記の溶媒に良好な溶解度を有する。
【００４０】
実験例２：生体外活性実験
ヒトアデノシンＡ２ａ受容体のカルシウムフラックスアッセイ
【００４１】
細胞：
Ａ２ａを安定して発現する細胞株は、Ｓｈａｎｇｈａｙ ＷｕＸｉ ＡｐｐＴｅｃによって構築され、宿主細胞はＣＨＯ細胞であった。
【００４２】
アッセイキット：
Ｆｌｕｏ−４  Ｄｉｒｅｃｔキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｆ１０４７１）。キットに含まれる蛍光検出試薬（カルシウムイオンに特異的に結合して蛍光シグナルを増加させることができる）を細胞と適切な時間でインキュベートした後、化合物を添加して細胞を刺激し、細胞内カルシウムフラックスを変化させることで、蛍光シグナルの変化を引き起こし、化合物のアゴニスト活性または阻害活性の強さを反映した。
【００４３】
細胞培養培地：
Ｆ１２＋１０％ウシ胎児血清＋ジェネティシン３００μｇ／ｍｌ＋ブラストサイジン２μｇ／ｍｌ
【００４４】
化合物希釈用緩衝液：
毎回使用前に調製されたＨａｎｋｓ平衡塩緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ。
【００４５】
アゴニスト：
ＮＥＣＡ（Ｓｉｇｍａ−Ｅ２３８７）
【００４６】
参照化合物（拮抗薬）：
ＣＧＳ−１５９４３（シグマ−Ｃ１９９）
【００４７】
化合物の希釈：
試験化合物をＤＭＳＯに溶解して、１０ｍＭのストック溶液を調製した。ＤＭＳＯで試験化合物を０．２ｍＭに希釈し、また、ＤＭＳＯで参照化合物ＣＧＳ−１５９４３を０．０１５ｍＭに希釈した。次に、ＥＣＨＯで３倍の連続勾配希釈し、１０個の濃度を得た。得られた希釈液９００ｎｌを化合物プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−７８１２８０）に移し、化合物希釈用緩衝液３０μｌを加えた。試験化合物の最終的な開始濃度は１μＭであり、ＣＧＳ−１５９４３の最終的な開始濃度は０．０７５μＭであった。
【００４８】
測定方法：
細胞調製：
凍結保存されたＡ２Ａ細胞を融解させた後、培養培地に１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、２０μｌ／ウェルで３８４ウェルのポリリジン被覆の細胞プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−７８１９４６）に播種し、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターで一晩インキュベートした。
前日に調製した細胞プレートをインキュベーターから取り出し、２０μｌの２Ｘ  Ｆｌｕｏ−４  ＤｉｒｅｃｔＴＭバッファーを各ウェルに加えた。細胞プレートを５％ＣＯ２、３７℃インキュベーターで５０分間インキュベートした後、室温で１０分間放置した。
【００４９】
アゴニストＮＥＣＡのＥＣ８０の測定：
アゴニストＮＥＣＡの希釈：開始濃度が０．１５ｍＭであるＮＥＣＡを、Ｅｃｈｏで３倍の連続勾配希釈させ、１０個の濃度を得た。次に、得られた希釈液９００ｎＬを対応する化合物プレートに移した後、３０μｌの化合物希釈用緩衝液を、対応する化合物プレートに添加した。最終的な開始濃度は７５０ｎＭであった。
ＦＬＩＰＲ機器に備えたソフトウェアが実行された。設定したプログラムに従って、１０μｌの化合物希釈用緩衝液を細胞プレートに加え、蛍光シグナルを読み取った。次に、所定濃度の参照化合物としてのアゴニスト１０μｌを細胞プレートに加え、蛍光シグナルを読み取った。その後、ソフトウェアの「Ｍａｘ−Ｍｉｎ」および「Ｒｅａｄ  ９０  ｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  ａｌｌｏｗｅｄ」メソッドによってデータをエクスポートし、Ａ２Ａ細胞株のＥＣ８０を算出し、６Ｘ  ＥＣ８０濃度のアゴニストを調製した。対応する細胞の６Ｘ  ＥＣ８０濃度の参照化合物としてのアゴニストを緩衝塩溶液で調製し、対応する化合物プレートに３０μｌ／ウェルで添加した。
【００５０】
試験化合物のＩＣ５０の測定：
ＦＬＩＰＲ機器に備えたソフトウェアが実行された。設定したプログラムに従って、１０μｌの所定濃度の試験化合物および参照化合物を細胞プレートに添加し、蛍光シグナルを読み取った。さらに、６Ｘ  ＥＣ８０濃度の参照化合物としてのアゴニスト１０μｌを細胞プレートに添加し、蛍光シグナルを読み取った。化合物のアゴニスト検出において、ソフトウェアの「Ｍａｘ−Ｍｉｎ」および「Ｒｅａｄ  １  ｔｏ  ９０」メソッドによってデータをエクスポートした。化合物の拮抗薬検出において、ソフトウェアの「Ｍａｘ−Ｍｉｎ」および「Ｒｅａｄ  ９０  ｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  ａｌｌｏｗｅｄ」メソッドによってデータをエクスポートした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０でデータを解析し、試験化合物のＩＣ５０値を算出した。
【表３】
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【００５１】
結論：表３に示されるように、化合物１は、アデノシンＡ２ａ受容体に対して優れた拮抗活性を示す。
【００５２】
実験例３：化合物の薬物動態の評価
実験目的：雌Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける化合物のインビボでの薬物動態を試験する。
実験材料：
Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、１５〜３０ｇ、７〜９週齢、上海霊暢）
実験手順：
げっ歯類動物における静脈内注射および経口投与の後の化合物の薬物動態特徴を、標準的なプロトコルによって試験した。実験において、候補化合物は、単回静脈内注射によってマウスに投与される透明な溶液に調製され、また、単回経口投与によってマウスに投与される均一な懸濁液に調製された。静脈内注射用の溶媒は５％のＤＭＳＯ／９５％の１０％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬであり、経口投与用の溶媒は１％のＴｗｅｅｎ  ８０、９％のＰＥＧ４００、および９０％の水であった。２４時間以内に全血サンプルを採取し、３０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上澄みを分離して血漿サンプルを得た。内部標準を含む２０倍量のアセトニトリル溶液を加えてタンパク質を沈殿させ、遠心分離し、上澄みを取り出し、それに等量の水を添加して遠心分離した。上澄みを取り出し、サンプルとして注入し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法により血中薬物濃度を定量分析した。さらに、ピーク濃度、ピーク時間、クリアランス率、半減期、薬物−時間曲線下面積、バイオアベイラビリティなどの薬物動態パラメータを算出した。
実験の結果：
【表４】
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結論：化合物１は、マウスにおいて優れた薬物動態学的指標を示す。
【００５３】
実験例４：ＣＴ−２６モデルにおける化合物１の結晶形Ａのインビボでの薬力学の研究
実験材料：
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雌、７週齢、体重約１６〜２０ｇ）を、ＳＰＦクラスの動物室の飼育環境において、換気された単一のケージ（ケージあたり５匹のマウス）で飼育した。すべてのケージ、床敷および水は、使用前に消毒された。すべての動物は、標準の認定された市販の実験室用飼料を自由で摂取することができる。合計８０匹のマウスをＳｈａｎｇｈａｉ  Ｓｌａｃｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ社から購入した。抗ＰＤ−１抗体は、ＢｉｏＸｃｅｌｌ社から、ＲＭＰ−１４のクローンそして製品番号ＢＰ０１４６で購入した。０．１ｍＬの３×１０５個のＣＴ２６細胞を各マウスの右背側部に皮下接種し、ランダムに群分けして投与した。
実験方法：
ＣＴ２６細胞を各ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右背側部に皮下接種して、インビボでの薬力学を試験した。実験において、試験化合物を２２日間連続して毎日経口投与し、ａｎｔｉ−ＰＤ−１抗体を週に１回連続３週間投与した。腫瘍の体積はノギスで週に２回測定され、体積は立方ミリメートルとして、次の式で計算された。Ｖ＝Ｖ＝０．５ａ×ｂ２、ここで、ａおよびｂはそれぞれ腫瘍の長径および短径である。抗腫瘍効果は、化合物で処理された動物の腫瘍の平均体積増加を、未処理の動物の腫瘍の平均体積増加で割ることによって決定された。（ＢＩＤは１日２回を意味する。）
実験の結果：表５に示した。
【表５】
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実験結論：
化合物１の結晶形Ａ（５０ｍｇ／Ｋｇ、ＢＩＤ）は、単剤として抗腫瘍効果を有する。化合物１の結晶形Ａ（５０ｍｇ／Ｋｇ、ＢＩＤ）とａｎｔｉ−ＰＤ−１（５ｍｇ／Ｋｇ、ＱＷ）の併用は、顕著な抗腫瘍効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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