(57)【要約】本開示は腫瘍微小環境における望ましい免疫細胞を選択的に活性化するための抗体腫瘍ターゲティングアセンブリ複合体（ATTAC）を提供する。2021529779.tif 000065
2021529779.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a.標的指向された免疫細胞結合作用物質を含む第1の成分であって、
i. がんを標的とする能力を有するターゲティング部分；
ii. 該第1の成分の一部ではない第2の免疫細胞エンゲージングドメインに結合した場合に免疫エンゲージング活性を示す能力を有する、第1の免疫細胞エンゲージングドメイン
を含む、該第1の成分、
b. 選択的な免疫細胞結合作用物質を含む、第2の成分であって、
i. 免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する免疫細胞選択部分；
ii. 該第1の免疫細胞エンゲージングドメインに結合した場合に免疫細胞エンゲージング活性を示す能力を有する、第2の免疫細胞エンゲージングドメイン
を含み、
該第1の免疫細胞エンゲージングドメインと該第2の免疫細胞エンゲージングドメインが、どちらも不活性結合パートナーに結合していない場合に、結合する能力を有する、
該第2の成分
を含む、患者における該がんを処置するための作用物質であって、
該第1の免疫細胞エンゲージングドメインまたは該第2の免疫細胞エンゲージングドメインのうちの少なくとも一方が、
不活性結合パートナーが除去されない限り該第1の免疫細胞エンゲージングドメインと該第2の免疫細胞エンゲージングドメインとが互いに結合しないように、該不活性結合パートナーに結合しており、かつ
不活性結合パートナーとそれが結合する該免疫細胞エンゲージングドメインとを分離する切断部位をさらに含み、
該切断部位が、
i. がん細胞によって発現される酵素によって切断されるか、
iii. がん細胞内部でのpH感受性切断反応によって切断されるか、
iv. 補体依存性切断反応によって切断されるか、または
v. 該作用物質中の該ターゲティング部分と同じもしくは異なるターゲティング部分によってがん細胞に共局在化されたプロテアーゼによって切断される、
該作用物質。
【請求項２】
前記第1の成分が前記第2の成分に共有結合していない、請求項1記載の作用物質。
【請求項３】
前記第1の成分が前記第2の成分に共有結合している、請求項1記載の作用物質。
【請求項４】
前記免疫細胞エンゲージングドメインが、互いに結合している場合に、前記免疫細胞の表面に発現する抗原に結合する能力を有する、請求項1記載の作用物質。
【請求項５】
免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する前記免疫細胞選択部分が、T細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、好中球、好酸球、好塩基球、γδT細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT細胞）、または操作された免疫細胞を選択的に標的とする、請求項1記載の作用物質。
【請求項６】
免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する前記免疫細胞選択部分がT細胞を選択的に標的とし、任意で、該T細胞がCD8＋T細胞またはCD4＋T細胞である、請求項5記載の作用物質。
【請求項７】
前記免疫細胞選択部分が、CD8、CD4、もしくはCXCR3を標的とするか、または制御性T細胞には特異的に結合しない、請求項1記載の作用物質。
【請求項８】
前記免疫細胞エンゲージングドメインが、互いに結合している場合に、CD3またはTCRに結合する能力を有する、請求項1記載の作用物質。
【請求項９】
前記免疫細胞選択部分がアプタマーまたは抗体もしくはその抗原特異的結合フラグメントを含み、任意で、該アプタマーまたは抗体もしくはその抗原特異的結合フラグメントがT細胞上の抗原に特異的に結合する、請求項1記載の作用物質。
【請求項１０】
前記ターゲティング部分がアプタマーまたは抗体もしくは抗原特異的結合フラグメントであり、任意で、該アプタマーまたは抗体もしくはその抗原特異的結合フラグメントががん抗原に特異的に結合する、請求項1記載の作用物質。
【請求項１１】
前記ターゲティング部分が前記がん上の標的に結合し、該標的が、IL-2受容体、IL-4、IL-6、メラニン細胞刺激ホルモン受容体（MSH受容体）、トランスフェリン受容体（TR）、葉酸受容体1（FOLR）、葉酸ヒドロキシラーゼ（FOLH1）、EGF受容体、PD-L1、PD-L2、IL-13R、CXCR4、IGFR、またはCD40Lを含む、請求項1記載の作用物質。
【請求項１２】
一方の免疫細胞エンゲージングドメインがVHドメインを含み、かつ他方の免疫細胞エンゲージングドメインがVLドメインを含み、任意で、少なくとも1つの不活性結合パートナーがVHドメインまたはVLドメインである、請求項1記載の作用物質。
【請求項１３】
前記第1の免疫細胞エンゲージングドメインおよび/または第2の免疫細胞エンゲージングドメインが、不活性結合パートナーに結合しており、かつ切断部位によってそれから分離され、任意で、少なくとも1つの切断部位がプロテアーゼ切断部位である、請求項1記載の作用物質。
【請求項１４】
a. 前記免疫細胞エンゲージングドメインがVHドメインである場合、前記不活性結合パートナーがVLドメインであり、かつ
b. 前記免疫細胞エンゲージングドメインがVLドメインである場合、前記不活性結合パートナーがVHドメインである、
請求項13記載の作用物質。
【請求項１５】
前記第1の成分が、切断部位を含むリンカーによって前記第2の成分に共有結合しており、任意で、該切断部位がプロテアーゼ切断部位である、請求項3記載の作用物質。
【請求項１６】
a. 標的指向された免疫細胞結合作用物質を含む第1の成分であって、
i. がんを標的とする能力を有するターゲティング部分；
ii. 該第1の成分の一部ではない第2の免疫細胞エンゲージングドメインに結合した場合に免疫エンゲージング活性を示す能力を有する、第1の免疫細胞エンゲージングドメイン；
iii. 該第1の免疫細胞エンゲージングドメインと不活性結合パートナーとを分離し、
1. がん細胞によって発現される酵素によって切断されるか、
2. がん細胞内部でのpH感受性切断反応によって切断されるか、
3. 補体依存性切断反応によって切断されるか、または
4. 作用物質中の該ターゲティング部分と同じもしくは異なるターゲティング部分によってがん細胞に共局在化されたプロテアーゼによって切断される、
切断部位
を含む、該第1の成分
を含み、選択的な免疫細胞結合作用物質を含む、該がんを処置するためのキットまたは組成物において使用するための作用物質であって、
該切断部位の切断が、該不活性結合パートナーの喪失を引き起こし、該作用物質の一部ではない該第2の免疫細胞エンゲージングドメインへの結合を可能にする、
該作用物質。
【請求項１７】
請求項1記載の作用物質の第1の成分および第2の成分をコードする核酸分子のセット。
【請求項１８】
請求項1記載の作用物質を投与する工程を含み、任意で、がんが、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎がん、黒色腫、肺がん、前立腺がん、精巣がん、甲状腺がん、脳がん、食道がん、胃がん、膵がん、結腸直腸がん、肝がん、白血病、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、リンパ増殖性障害、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患、または前悪性疾患のうちのいずれか1つである、患者における該がんを処置する方法。
【請求項１９】
前記患者が腫瘍中に制御性T細胞を有する場合、前記選択的な免疫細胞結合作用物質が、制御性免疫細胞上に存在するマーカー（CD4およびCD25を含むが、それらに限定されない）を標的としない、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
請求項1記載の作用物質を患者に投与する工程を含む、該患者の免疫応答をがんにターゲティングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第119条（e）に基づき、2018年7月2日に出願された米国仮出願第62/693,125号の恩典を主張し、この米国仮特許出願の内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
説明
分野
本願は、がんを処置するための標的指向された免疫細胞エンゲージング作用物質（targeted immune cell engaging agent）に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
がんは、多くの命を奪い、苦難と、経済的影響をもたらす。がんを標的とするための免疫治療戦略は、トランスレーショナル臨床研究の活発な一領域になっている。
【０００４】
免疫治療のために他のさまざまなアプローチが探索されてきたが、これらの先行アプローチの多くは、特定のがん細胞に対する十分な特異性を欠いている。例えば、標的細胞上の異なる抗原に結合するscFv部分と、相補的デミボディ（demibody）との対形成を可能にするFcドメインと、相補的デミボディ上の別の結合パートナーとの会合を形成する能力を有する結合パートナーとをそれぞれが有するデミボディが設計されている。WO 2007/062466（特許文献1）。しかしこれらのデミボディは、必ずしもがん細胞特異的ではなく、同じ抗原を発現する他の細胞にも結合し、それらに対する活性を有しうる。第1の抗原に結合するターゲティング部分と機能ドメインの第1のフラグメントとを有する第1のポリペプチドを、第2の抗原に結合するターゲティング部分と機能ドメインの第1のフラグメントに相補的である機能ドメインの第2のフラグメントとを有する第2のポリペプチドと共に提供する、WO 2013/104804（特許文献2）も参照されたい。このアプローチも同様に、必ずしもがん細胞特異的ではなく、同じ抗原を発現する他の細胞にも結合し、それらに対する活性を有しうる。
【０００５】
他の人々によって二重特異性T細胞エンゲージング抗体（Bispecific T-cell Engaging Antibody:BiTE）が提案されているが、これらのコンストラクトは腫瘍環境に対して十分には特異的でないことが多い。加えて、BiTEは制御性T細胞（Treg）を活性化して、腫瘍部位における望ましくないTreg活性を増進する場合もある。例えばTregの刺激は、ある特定の患者において、抑制性Tregの高レベルな増殖と、HPD（hyperprogressive disease）と呼ばれる急速ながん進行に関連付けられている（Kamada et al.,PNAS 116（20）:9999-10008（2019）（非特許文献1）参照）。HPDの具体例は抗PD-1抗体で処置された患者に認められており、これはある特定の腫瘍浸潤性PD-1＋Treg細胞を活性化し、拡大増殖させるが、Tregを刺激する他の手段も一部の患者において同様の望ましくない効果を有することが懸念される。
【０００６】
T細胞ががん細胞に標的指向させるように、より高い特異性を利用する他のアプローチは、どのT細胞ががんの部位に到達するかまたはどのT細胞ががんの部位で活性化されるかを選択するための手段を、何も有しない。WO 2017/087789（特許文献3）。患者のがんを処置するための免疫腫瘍学的アプローチに利することのないT細胞を含めて、すべてのT細胞を活性化する。
【０００７】
CD3を介してT細胞を活性化する現行の二重特異性抗体アプローチには2つの問題がある。そのうちの１つ目は免疫応答の過剰活性化である。広くは議論されていないが、これらの作用物質は信じられないほど強力であり、全抗体（whole antibody）による治療と比べて極めて低い用量で与えられる。これは、一つには、これらの試薬（reagent）がCD3への結合によって理論上あらゆるT細胞を活性化できるという事実に起因することになる。ある人がウイルス感染を起こすと、その人のT細胞のうち、1〜10％前後が活性化され、その人は免疫応答ゆえの嗜眠および体調不良を覚える。さらに多くのT細胞が活性化されると、それが、サイトカイン放出症候群（cytokine release syndrome:CRS）や稀には死亡を含む、より大きな問題につながりうる。CRSは、生物製剤が標的とする細胞からのサイトカインの放出によっても、動員された免疫エフェクター細胞からのサイトカイン放出によっても、トリガーされうる。したがって、これらの系を使用することで活性化されるT細胞の総数を制限する必要がある。
【０００８】
現行のBiTE治療に付随する2つ目の問題は、BiTEが結合した標的細胞の近傍に存在するあらゆるT細胞のCD3特異的活性化である。どの細胞がBiTEに結合するかに応じて、CD4 T細胞（ヘルパー、制御性、TH17など）およびCD8 T細胞を含む多くの免疫細胞が、CD3活性化に応答する。これは、CD8 T細胞および細胞傷害性CD4 T細胞などのT細胞の細胞溶解機能を阻害する制御性T細胞およびTH17 T細胞などといった望ましくないT細胞の活性化ゆえに、BiTEの効力が失われることを意味しうる。CD8＋T細胞だけを活性化するなど、特定タイプのT細胞だけを活性化する治療があれば、それによっても、治療は改良されると考えられる。この問題に対する解決策が、これまでに当技術分野において提案されたことはない。本発明によってのみ、本発明者らは、望ましくないものに対する特異性を提供するための腫瘍ターゲティングが存在しかつ望ましくないがん細胞の部位で結合して望ましくないがん細胞を殺滅する望ましい免疫細胞に選択的に結合するための第2の部分が存在する系の利益を発見した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO 2007/062466
【特許文献２】WO 2013/104804
【特許文献３】WO 2017/087789
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Kamada et al.,PNAS 116（20）:9999-10008（2019）
【発明の概要】
【００１１】
概要
本明細書に従い、本願は、抗体腫瘍ターゲティングアセンブリ複合体（tumor-targeting assembly complex:ATTAC）を用いるがん処置の作用物質および方法を記載する。
【００１２】
いくつかの態様において、患者におけるがんを処置するための作用物質は、（a）標的指向された免疫細胞結合作用物質を含む第1の成分であって、（i）がんを標的とする能力を有するターゲティング部分と；（ii）第1の成分の一部ではない第2の免疫細胞エンゲージングドメインに結合した場合に免疫エンゲージング活性を示す能力を有する、第1の免疫細胞エンゲージングドメインとを含む、第1の成分、（b）選択的な免疫細胞結合作用物質を含む第2の成分であって、（i）免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する免疫細胞と；（ii）第1の免疫細胞エンゲージングドメインに結合した場合に免疫細胞エンゲージング活性を示す能力を有する、第2の免疫細胞エンゲージングドメインとを含む、第2の成分を含み、第1の免疫細胞エンゲージングドメインと第2の免疫細胞エンゲージングドメインは、どちらも不活性結合パートナーに結合していない場合に、結合する能力を有し、第1の免疫細胞エンゲージングドメインまたは第2の免疫細胞エンゲージングドメインのうちの少なくとも一方は、不活性結合パートナーが除去されない限り第1の免疫細胞エンゲージングドメインと第2の免疫細胞エンゲージングドメインとが互いに結合しないように不活性結合パートナーに結合しており、かつ、第1の不活性結合パートナーとそれが結合する免疫細胞エンゲージングドメインとを分離する切断部位をさらに含み、該切断部位は、（i）がん細胞によって発現される酵素によって切断されるか、（ii）がん細胞内部でのpH感受性切断反応によって切断されるか、（iii）補体依存性切断反応によって切断されるか、または（iv）当該作用物質中のターゲティング部分と同じもしくは異なるターゲティング部分によってがん細胞に共局在化されたプロテアーゼによって切断される。
【００１３】
いくつかの態様において、第1の成分は第2の成分に共有結合していない。いくつかの態様において、第1の成分は第2の成分に共有結合している。
【００１４】
いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインは、互いに結合している場合に、免疫細胞の表面に発現する抗原に結合する能力を有する。いくつかの態様において、免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する免疫細胞選択部分は、T細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、好中球、好酸球、好塩基球、γδT細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT細胞）、または操作された免疫細胞を選択的に標的とする。
【００１５】
いくつかの態様において、免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する免疫細胞選択部分は、T細胞を選択的に標的とする。いくつかの態様において、T細胞は細胞傷害性T細胞である。いくつかの態様において、細胞傷害性T細胞はCD8＋T細胞である。いくつかの態様において、T細胞はヘルパーT細胞である。いくつかの態様において、ヘルパーT細胞はCD4＋T細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞選択部分は、CD8、CD4、またはCXCR3を標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞選択部分は、制御性T細胞には特異的に結合しない。いくつかの態様において、免疫細胞選択部分は、TH17細胞には特異的に結合しない。いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインは、互いに結合している場合に、CD3に結合する能力を有する。いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインは、互いに結合している場合に、TCRに結合する能力を有する。
【００１６】
いくつかの態様において、免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する免疫細胞選択部分は、ナチュラルキラー細胞を選択的に標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞選択部分は、CD2またはCD56を標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインは、互いに結合している場合に、NKG2D、CD16、NKp30、NKp44、NKp46またはDNAMに結合する能力を有する。
【００１７】
いくつかの態様において、免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する免疫細胞選択部分は、マクロファージを選択的に標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞選択部分は、CD14、CD11b、またはCD40を標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインは、互いに結合している場合に、CD89（Fα受容体1）、CD64（Fcγ受容体1）、CD32（Fcγ受容体2A）、またはCD16a（Fcγ受容体3A）に結合する能力を有する。
【００１８】
いくつかの態様において、免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する免疫細胞選択部分は、好中球を選択的に標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞選択部分はCD15を標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインは、互いに結合している場合に、CD89（FcαR1）、FcγRI（CD64）、FcγRIIA（CD32）、FcγRIIIA（CD16a）、CD11b（CR3、αMβ2）、TLR2、TLR4、CLEC7A（デクチン1）、ホルミルペプチド受容体1（formyl peptide receptor 1:FPR1）、ホルミルペプチド受容体2（FPR2）またはホルミルペプチド受容体3（FPR3）に結合する能力を有する。
【００１９】
いくつかの態様において、免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する免疫細胞選択部分は、好酸球を選択的に標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞選択部分は、CD193、シグレック-8、またはEMR1を標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインは、互いに結合している場合に、CD89（Fcα受容体1）、FcεRI、FcγRI（CD64）、FcγRIIA（CD32）、FcγRIIIB（CD16b）、またはTLR4に結合する能力を有する。
【００２０】
いくつかの態様において、免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する免疫細胞選択部分は、好塩基球を選択的に標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞選択部分は、2D7、CD203c、またはFcεRIαを標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインは、互いに結合している場合に、CD89（Fcα受容体1）またはFcεRIに結合する能力を有する。
【００２１】
いくつかの態様において、免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する免疫細胞選択部分は、γδT細胞を選択的に標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞選択部分はγδTCRを標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインは、互いに結合している場合に、γδTCR、NKG2D、CD3複合体（CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD3η）、4-1BB、DNAM-1、またはTLR（TLR2、TLR6）に結合する能力を有する。
【００２２】
いくつかの態様において、免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する免疫細胞選択部分は、ナチュラルキラーT細胞を選択的に標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞選択部分はVα24またはCD56を標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインは、互いに結合している場合に、αβTCR、NKG2D、CD3複合体（CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD3η）、4-1BB、またはIL-12Rに結合する能力を有する。
【００２３】
いくつかの態様において、免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する免疫細胞選択部分は、操作された免疫細胞を選択的に標的とする。いくつかの態様において、操作された免疫細胞は、CAR T細胞、CARナチュラルキラー細胞、CARナチュラルキラーT細胞、またはCAR γδT細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞選択部分は、CAR、または免疫細胞上に発現したマーカーを標的とする。いくつかの態様において、免疫選択部分はLNGFRまたはCD20を標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインは、互いに結合している場合に、操作された免疫細胞によって発現される抗原に結合する能力を有する。いくつかの態様において、操作された免疫細胞によって発現される抗原はCD3である。
【００２４】
いくつかの態様において、免疫細胞選択部分は、抗体またはその抗原特異的結合フラグメントを含む。いくつかの態様において、抗体またはその抗原特異的結合フラグメントは、T細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはその抗原特異的結合フラグメントは、細胞傷害性T細胞上またはヘルパーT細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはその抗原特異的結合フラグメントは、マクロファージ上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはその抗原特異的結合フラグメントは、ナチュラルキラー細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはその抗原特異的結合フラグメントは、好中球上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはその抗原特異的結合フラグメントは、好酸球上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはその抗原特異的結合フラグメントは、γδT細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはその抗原特異的結合フラグメントは、ナチュラルキラーT細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体またはその抗原特異的結合フラグメントは、操作された免疫細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、操作された免疫細胞は、CAR T細胞、CARナチュラルキラー細胞、CARナチュラルキラーT細胞、またはCAR γδT細胞である。
【００２５】
いくつかの態様において、免疫選択部分はアプタマーを含む。いくつかの態様において、アプタマーは、T細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、アプタマーは、細胞傷害性T細胞上またはヘルパーT細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、アプタマーは、マクロファージ上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、アプタマーは、ナチュラルキラー細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、アプタマーは、好中球上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、アプタマーは、好酸球上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、アプタマーは、γδT細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、アプタマーは、ナチュラルキラーT細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、アプタマーは、操作された免疫細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、操作された免疫細胞は、CAR T細胞、CARナチュラルキラー細胞、CARナチュラルキラーT細胞、またはCAR γδT細胞である。
【００２６】
いくつかの態様において、アプタマーはDNAを含む。いくつかの態様において、アプタマーはRNAを含む。いくつかの態様において、アプタマーは一本鎖である。いくつかの態様において、アプタマーは、ランダム候補ライブラリーから選択された選択的な免疫細胞結合特異的アプタマーである。
【００２７】
いくつかの態様において、ターゲティング部分は抗体または抗原特異的結合フラグメントである。いくつかの態様において、抗体またはその抗原特異的結合フラグメントはがん抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、ターゲティング部分はアプタマーである。いくつかの態様において、アプタマーはがん抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、アプタマーはDNAを含む。いくつかの態様において、アプタマーはRNAを含む。いくつかの態様において、アプタマーは一本鎖である。いくつかの態様において、アプタマーは、ランダム候補ライブラリーから選択された標的細胞特異的アプタマーである。いくつかの態様において、アプタマーは抗EGFRアプタマーである。いくつかの態様において、抗EGFRアプタマーは、SEQ ID NO:95〜164のうちのいずれか1つを含む。いくつかの態様において、アプタマーは1ピコモル濃度〜500ナノモル濃度のKdでがん細胞上のがんに結合する。いくつかの態様において、アプタマーは1ピコモル濃度〜100ナノモル濃度のKdでがんに結合する。
【００２８】
いくつかの態様において、ターゲティング部分は、IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、トランスフェリン、葉酸、EGF、TGF、PD1、IL-13、幹細胞因子、インスリン様成長因子（IGF）、またはCD40を含む。いくつかの態様において、ターゲティング部分は、IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、トランスフェリン、葉酸、EGF、TGF、PD1、IL-13、幹細胞因子、インスリン様成長因子（IGF）、またはCD40の完全長配列を含む。いくつかの態様において、ターゲティング部分は、IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、トランスフェリン、葉酸、EGF、TGF、PD1、IL-13、幹細胞因子、インスリン様成長因子（IGF）、またはCD40の切断型、類似体、変異体、または誘導体を含む。いくつかの態様において、ターゲティング部分はがん上の標的に結合し、該標的は、IL-2受容体、IL-4、IL-6、メラニン細胞刺激ホルモン受容体（MSH受容体）、トランスフェリン受容体（TR）、葉酸受容体1（FOLR）、葉酸ヒドロキシラーゼ（FOLH1）、EGF受容体、PD-L1、PD-L2、IL-13R、CXCR4、IGFR、またはCD40Lを含む。
【００２９】
いくつかの態様において、一方の免疫細胞エンゲージングドメインはVHドメインを含み、他方の免疫細胞エンゲージングドメインはVLドメインを含む。いくつかの態様において、第1の免疫細胞結合パートナーは、不活性結合パートナーに結合しており、かつ切断部位によってそれから分離される。
【００３０】
いくつかの態様において、第2の免疫細胞結合パートナーは、不活性結合パートナーに結合しており、かつ切断部位によってそれから分離される。
【００３１】
本願は、第1の免疫細胞結合パートナーが、不活性結合パートナーに結合しており、かつ第1の切断部位によってそれから分離され、かつ、第2の免疫細胞結合パートナーが、不活性結合パートナーに結合しており、かつ第2の切断部位によってそれから分離される、作用物質も記載する。
【００３２】
いくつかの態様において、第1の切断部位と第2の切断部位は同じ切断部位である。いくつかの態様において、第1の切断部位と第2の切断部位は異なる切断部位である。
【００３３】
いくつかの態様において、少なくとも1つの切断部位はプロテアーゼ切断部位である。
【００３４】
いくつかの態様において、がん細胞によって発現される少なくとも1つの酵素はプロテアーゼである。
【００３５】
いくつかの態様において、少なくとも1つの不活性結合パートナーは、免疫細胞エンゲージングドメインに特異的に結合する。いくつかの態様において、少なくとも1つの不活性結合パートナーはVHドメインまたはVLドメインである。
【００３６】
いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインがVHドメインである場合、不活性結合パートナーはVLドメインであり、かつ免疫細胞エンゲージングドメインがVLドメインである場合、不活性結合パートナーはVHドメインである。
【００３７】
本願は、選択的な免疫細胞結合作用物質を含む、がんを処置するための二成分系において使用するための作用物質も記載し、該作用物質が、（a）標的指向された免疫細胞結合作用物質を含む第1の成分であって、（i）がんを標的とする能力を有するターゲティング部分；（ii）第1の成分の一部ではない第2の免疫細胞エンゲージングドメインに結合した場合に免疫エンゲージング活性を示す能力を有する、第1の免疫細胞エンゲージングドメインを含む、第1の成分、（b）第1の免疫細胞エンゲージングドメインと不活性結合パートナーとを分離する切断部位、を含み、該切断部位が、（i）がん細胞によって発現される酵素によって切断されるか、（ii）がん細胞内部でのpH感受性切断反応によって切断されるか、（iii）補体依存性切断反応によって切断されるか、または（iv）当該作用物質中のターゲティング部分と同じもしくは異なるターゲティング部分によってがん細胞に共局在化されたプロテアーゼによって切断され、該切断部位の切断が、不活性結合パートナーの喪失を引き起こし、当該作用物質の一部ではない第2の免疫細胞エンゲージングドメインへの結合を可能にする。
【００３８】
いくつかの態様において、第1の成分は、切断部位を含むリンカーによって第2の成分に共有結合している。
【００３９】
いくつかの態様において、切断部位はプロテアーゼ切断部位である。
【００４０】
いくつかの態様において、プロテアーゼ切断部位は血中で切断されうる。いくつかの態様において、プロテアーゼ切断部位は、トロンビン、好中球エステラーゼ、またはフューリンの切断部位である。
【００４１】
いくつかの態様において、プロテアーゼ切断部位は腫瘍関連プロテアーゼによって切断されうる。いくつかの態様において、腫瘍関連プロテアーゼ切断部位はSEQ ID NO:1〜84のうちのいずれか1つを含む。
【００４２】
本願は、前記作用物質の第1の成分および第2の成分をコードする核酸分子のセットも記載する。
【００４３】
本願は、選択的な免疫細胞結合作用物質をコードする核酸分子も記載する。
【００４４】
本願は、本明細書に記載の作用物質を投与する工程を含む、患者におけるがんを処置する方法も記載する。
【００４５】
いくつかの態様において、患者が腫瘍中に制御性T細胞を有する場合、選択的な免疫細胞結合作用物質は制御性免疫細胞上に存在するマーカー（CD4およびCD25を含むが、それらに限定されない）を標的としない。
【００４６】
いくつかの態様において、選択的な免疫細胞結合作用物質は、TH17細胞上に存在するマーカーを標的としない。いくつかの態様において、選択的な免疫細胞結合作用物質は、腫瘍細胞を溶解の標的とするT細胞を活性化する。
【００４７】
いくつかの態様において、患者が腫瘍中に制御性T細胞を有する場合、免疫細胞選択部分は、CD8に特異的に結合することにより、CD8＋T細胞を標的とする。
【００４８】
いくつかの態様において、患者が腫瘍中に制御性T細胞を有する場合、免疫細胞選択部分は、CXCR3に特異的に結合することにより、CD8＋T細胞およびCD4＋T細胞を標的とする。
【００４９】
いくつかの態様において、がんは、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎がん、黒色腫、肺がん、前立腺がん、精巣がん、甲状腺がん、脳がん、食道がん、胃がん、膵がん、結腸直腸がん、肝がん、白血病、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、リンパ増殖性障害、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患または前悪性疾患のうちのいずれか1つである。
【００５０】
本願は、本明細書に記載の作用物質を患者に投与する工程を含む、患者の免疫応答をがんにターゲティングする方法も記載する。
【００５１】
さらなる目的および利点は、一部は以下の説明に示され、一部は以下の説明から自明であるか、実施によって理解されうる。目的および利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘する要素および組合せを使って、実現され、達成されるであろう。
【００５２】
上記の概説および以下の詳細な説明は、単なる例示および解説であり、特許請求の範囲の限定ではないことを理解すべきである。
【００５３】
本明細書に組み入れられて本明細書の一部を構成する添付の図面は、1つ（いくつか）の態様を図解し、本明細書と共に、本明細書に記載の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図1A〜1Bは、患者におけるがんを処置するための作用物質の模式図である。図1A（時点1）に示すように、本作用物質は、標的指向された免疫細胞結合作用物質を含む第1の成分（ATTAC1）および選択的な免疫細胞結合作用物質を含む第2の成分（ATTAC2）で構成される。ATTAC1は、がん細胞に特異的に結合し（丸および丸い結合部分）、ATTAC2は免疫細胞に特異的に結合する（正方形および正方形の結合部分）。ATTAC1とATTAC2は、どちらも、免疫細胞エンゲージング活性を示す能力を有する免疫細胞エンゲージングドメインの半分（豆状の形で表されている）を含む。ATTAC1とATTAC2はどちらも、互いに結合していない限り、免疫細胞エンゲージング活性を示す能力を有しない。したがって「標的指向された免疫細胞結合作用物質」とは、がん細胞へのターゲティング能を有し、かつ選択的な免疫細胞結合作用物質に結合している場合に免疫細胞エンゲージング活性を示す能力を有する作用物質を意味するものとする。同様に、「選択的な免疫細胞結合作用物質」とは、あるタイプの免疫細胞に選択的に結合する能力を有し、かつ標的指向された免疫細胞結合作用物質に結合している場合に免疫細胞エンゲージング活性を示す能力を有する作用物質を意味するものとする。免疫エンゲージングドメインの少なくとも一方、任意で両方が、不活性結合パートナーによって遮蔽される（ここでは両方が遮蔽されているものとして図示されている）。少なくとも一方（または任意で両方）の不活性結合ドメインが切断部位の切断によって除去されるまでは、免疫活性部分（三角形で表されている）は、エンゲージしていない状態を保つ。各不活性結合パートナーと免疫細胞エンゲージングドメインとを分離する切断部位は長方形で表されている。図1B（時点2）に示すとおり、不活性結合パートナーの酵素的切断は、第1の免疫細胞エンゲージングドメインと第2の免疫エンゲージングドメインとが会合することで、免疫細胞上の抗原（三角形で表されている）への免疫細胞エンゲージングドメイン（ここではVH-VL）の結合を介して免疫細胞を特異的に活性化することを可能にする。これはがん細胞の破壊をもたらす。
【図２】図2A〜2Bは、WO 2017/087789において議論されている二成分構造、すなわちT細胞エンゲージング抗体回路（T-cell engaging antibody circuit:TEAC）の特異性の論理制御（図2A）を、本明細書に記載の本ATTAC構造（図2B）と比較して表している。TEACでは、（i）がんを標的とする能力を有するターゲティング部分（「抗原1」）と（ii）切断部位（「プロテアーゼ1」）とをどちらも有する第1の成分、および（i）がんを標的とする能力を有するターゲティング部分（「抗原2」）と（ii）随意の切断部位（「プロテアーゼ2」）とを有する第2の成分が用いられた。本ATTAC構造は、がんに対する第2の成分の特異性を排除し（抗原2を標的とする部分はもはや含まれていない）、免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する免疫細胞選択部分（「免疫細胞マーカー」）で、それを置き換えている。ATTACでは、少なくとも第1の成分または第2の成分が切断部位を含み、ここでは切断部位が第1の成分上に示され、第2の成分では随意である。逆の構成も適用される。
【図３】図3A〜3CはTEACによるT細胞活性化を表す。これらは、FITCコンジュゲート抗体でT細胞を標識しても、腫瘍細胞表面上のCD3分子を認識し、それに応答して活性化された状態になるそれらの能力は変化しないことを示している。T細胞をさまざまなFITCコンジュゲート抗体で標識し、標的細胞（MCF-7）をEpCAM VH（SEQ ID NO:166）TEAC成分およびEpCAM VL（SEQ ID NO:167）TEAC成分（20G6）で標識した。対照はBiTE（SEQ ID NO:168）で標識した。図3AはTEAC標識腫瘍細胞でのIFNγ放出を表す。図3B（CD4 T細胞）および図3C（CD8 T細胞）は、T細胞活性化を、バックグラウンドを上回る平均蛍光強度（MFI）をリードアウトとして使用するCD69フローサイトメトリー染色によって示している。T細胞をFITCコンジュゲート抗体で標識しても、EpCAM TEAC成分対に対する強いT細胞応答があった。結合した抗体によるブロッキングはなかった。TEACはCD4細胞とCD8細胞をどちらも活性化し、それらを区別しなかった。どちらの細胞タイプもCD3を発現するからである。この対照実験は、TEACがCD4とCD8の間で選択的でないこと、およびFITCモデルを使っても予想される結果は変化しなかったことを表している。FITCモデルの使用はT細胞活性化を妨げない。図3A〜Cにみられるこれらの結果は、完全な抗CD3活性化ドメインが腫瘍細胞上に存在する場合の、すべてのT細胞サブセット（CD4およびCD8）の活性化を実証している。
【図４】図4A〜4Cは、腫瘍細胞がATTAC成分を1つだけ有し、T細胞が抗FITC ATTAC成分を有する実験設計を使った、ATTACによる選択的T細胞活性化を示す。T細胞をさまざまなFITCコンジュゲート抗体でPL標識してから、抗FITC ATTAC成分（CD3 VL（20G6）;SEQ ID NO:165）で標識し、標的細胞（MCF-7）はEpCAM VH ATTAC成分（20G6;SEQ ID NO:166）で標識した。図4AはATTAC標識腫瘍細胞でのIFNγ放出を表す。図4B（CD4 T細胞）および図4C（CD8 T細胞）は、T細胞活性化を、バックグラウンドを上回るMFIをリードアウトとして使用するCD69フローサイトメトリー染色によって示している。CD8、CD52、およびCXCR3に結合するFITCコンジュゲート抗体でT細胞を標識した場合に、EpCAM ATTAC成分/FITC ATTAC成分対に対する強いT細胞応答があった。抗CD8 FITCコンジュゲート抗体を使用した場合は、CD4 T細胞の活性化を伴わないCD8 T細胞の選択的活性化が起きた（図4Bおよび4Cの矢印で示す）。
【図５】図5A〜5IはT細胞表面におけるT細胞タンパク質発現と、CD52、CD8およびCXCR3への（FITCを介した）ATTAC成分の結合だけがT細胞活性化を可能にすることとを表している。図5A（CD5）、図5B（CD8）、図5C（CD28）、図5D（CD45RO）、図5E（CD52）、図5F（HLA-DR）、図5G（CD19）、図5H（CD278（ICOS））および図5I（CD279（PD-1））に示すように、一連のT細胞抗原を試験した。
【図６】図6A〜6Fは、TEACによるCD4 T細胞活性化がFITC抗体では阻害されないことを表している。T細胞をさまざまなFITCコンジュゲート抗体で標識し、標的細胞（MCF-7）を抗EpCAM VH TEAC成分および抗EpCAM VL TEAC成分（20G6）で標識した。図6Aはインターフェロンγ放出を示す。非標識T細胞（図6B）またはCD-19標識（図6C）、CD52標識（図6D）もしくはCD8標識（Hit8a、6E）について、フローサイトメトリー生データを示す。図6Fは、CD4 T細胞に関するフローサイトメトリーデータを照合している。T細胞をFITCコンジュゲート抗体で標識しても、EpCAM TEAC成分対に対する強いT細胞応答があった。結合した抗体によるブロッキングはなかった。
【図７】図7A〜7Fは、TEACによるCD8 T細胞活性化がFITC抗体では阻害されないことを表している。パネルの選定は図6A〜6Fに記載するとおりである。T細胞をFITCコンジュゲート抗体で標識しても、EpCAM TEAC成分対に対する強いT細胞応答があった。結合した抗体によるブロッキングはなかった。
【図８】図8A〜8Fは、ATTACによる選択的CD4 T細胞活性化を表す。パネルの選定は図6A〜6Fに記載するとおりである。CD8、CD52またはCXCR3に結合するFITCコンジュゲート抗体でT細胞を標識した場合に、EpCAM ATTAC成分/FITC ATTAC成分対に対する強いT細胞応答があった。抗CD52 FITCコンジュゲート抗体または抗CXCR3 FITCコンジュゲート抗体を使用した場合に、CD4 T細胞の活性化があった。
【図９】図9A〜9Fは、ATTACによる選択的CD8 T細胞活性化を表す。パネルの選定は図6A〜6Fに記載するとおりである。CD8、CD52またはCXCR3に結合するFITCコンジュゲート抗体でT細胞を標識した場合に、EpCAM ATTAC成分/FITC ATTAC成分対に対する強いT細胞応答があった。抗CD52 FITCコンジュゲート抗体、抗CXCR3 FITCコンジュゲート抗体、または4種類の抗CD8 FITCコンジュゲート抗体を使用した場合に、CD8 T細胞の活性化があった。
【図１０】図10Aおよび10BはEpCAM発現腫瘍細胞でのFACS結果を表す。EpCAMを過剰発現するMDA-MB-231細胞を抗EpCAM VHおよびVLで標識することで、エンテロキナーゼ（プロテアーゼ）によって切断される抗CD8 ATTAC成分の結合ドメインを形成させた。T細胞（図11D）またはPBMC内のT細胞（図11C）の活性化の対照には、T細胞のみ、EpCAM BiTE（SEQ ID NO:168）の存在下（陽性対照）、または無処理標的MDA-MB-231細胞と共に培養した場合（陰性対照）の、インターフェロン放出を含めた。EpCAM VHは、抗EpCAM ATTAC1（EpCAMがん抗原を標的とし抗CD3 VHドメインを含有する成分（SEQ ID NO:166））を指す。CD8 VLは、抗CD8 ATTAC2（CD8を標的とし抗CD3 VLドメインを含有する成分（SEQ ID NO:170））を指す。
【図１２】図12A〜12CはATTACの濃度依存性を表す。EpCAMを過剰発現するMDA-MB-231細胞を一連の濃度のEpCAM VH ATTAC成分で標識した。T細胞または健常ドナーPBMCを一連の濃度の抗CD8 VL ATTAC成分（SEQ ID NO:172）で標識した。図12Aは、細胞を一晩共培養し、T細胞活性化をIFNγ放出によってアッセイした結果を表す。EpCAM×20G6-Vhは抗EpCAMおよび抗CD3 VH ATTAC成分を指し、CD8×20G6-VLは抗CD8および抗CD3 VL ATTAC成分を指す。このアッセイにおいて優勢なATTAC成分があるかどうかを決定するために、両ATTAC成分の濃度を等しく保つことはしなかった。抗CD8 ATTAC成分の不活性結合ドメインをエンテロキナーゼ（プロテアーゼ）で切断した。図12Bは両ATTAC成分の濃度を増加させた結果を表す。対照には、単独で培養するか、EpCAM BiTE（SEQ ID NO:168）の存在下で培養するか（陽性対照）、無処理標的MDA-MB-231細胞と共に培養した場合（陰性対照）の、PBMC中のT細胞からのインターフェロン放出を含めた（図12C）。
【図１３】図13Aおよび13Bは、腫瘍細胞に結合するATTAC1とT細胞に結合したFITCコンジュゲート抗体に結合するATTAC2とを使った、混合T細胞活性化アッセイにおけるCD4 T細胞またはCD8 T細胞のどちらか一方の活性化を示している。PBMCをCD4-FITC、CD8-FITCまたはCD19-FITC（陰性対照）で標識し、ATTAC1に結合した腫瘍細胞と共に培養した。抗CD4-FITCをT細胞に結合させた場合はCD4 T細胞だけが活性化され、抗CD8 FITCをT細胞に結合させた場合はCD8 T細胞だけが活性化される。これにより、T細胞のサブセットへのATTAC2の結合はATTAC2と結合しているT細胞だけを活性化しATTAC2によって結合していない他のT細胞サブセットは活性化しないという概念が確認される。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
配列の説明
表1Aは、本明細書において言及するある特定の配列の一覧である。表1Bは、本明細書において使用するある特定のコンストラクト配列の一覧である。
【００５６】
（表１Ａ）配列および配列番号の説明
2021529779.tif 000003
2021529779.tif 000004
2021529779.tif 000005
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【００５７】
（表１Ｂ）コンストラクトおよび配列番号の説明
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2021529779.tif 000011
2021529779.tif 000012
【００５８】
態様の説明
I. ATTAC
ATTACという用語は、抗体腫瘍ターゲティングアセンブリ複合体を指す。本願は、複合体（complex）という単語を使用することにより、完全な機能的分子（すなわち「複合体」）を作るには第1の成分と第2の成分とがどちらも必要であることをいう。複合体という用語は、（i）がん細胞上の抗原発現、（ii）プロテアーゼ位置および（iii）望ましい免疫細胞上の免疫細胞マーカーに基づくブール演算子論理も指す。本発明者らは、論理ゲート構築を応用することにより、T細胞エンゲージング抗体に伴う現下の課題の多くを取り除く。
【００５９】
ATTACとは、がん抗原に結合する1つのATTAC成分と、がん抗原には結合せず、その代わりに免疫細胞を選択的に標的とする1つのATTAC成分とを使用することを指す。したがってATTAC成分は、並列配置を有する（ATTAC対の構成要素がどちらもがん抗原に結合した、先行作用物質などの場合）のではなく、トランス配置を有する。
【００６０】
ATTAC成分またはATTAC対において、
（a）標的指向された免疫細胞結合作用物質を含む第1の成分は、
i. がんを標的とする能力を有するターゲティング部分、
ii. 第1の成分の一部ではない第2の免疫細胞エンゲージングドメインに結合した場合に免疫細胞エンゲージング活性を示す能力を有する、第1の免疫細胞エンゲージングドメイン
を含み、かつ
（b）選択的な免疫細胞結合作用物質を含む第2の成分は、
i. 免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する免疫細胞選択部分、
ii. 第1の免疫細胞エンゲージングドメインに結合した場合に免疫細胞エンゲージング活性を示す能力を有する、第2の免疫細胞エンゲージングドメイン
を含み、
第1の免疫細胞エンゲージングドメインと第2の免疫細胞エンゲージングドメインは、どちらも不活性結合パートナーに結合していない場合に、結合する能力を有する。
【００６１】
第1の免疫細胞エンゲージングドメインまたは第2の免疫細胞エンゲージングドメインの少なくとも一方は、不活性結合パートナーが除去されない限り第1の免疫細胞エンゲージングドメインと第2の免疫細胞エンゲージングドメインとが互いに結合しないように、不活性結合パートナーに結合している。不活性結合パートナーが存在する場合、それは、不活性結合パートナーとそれが結合している免疫細胞エンゲージングドメインとを分離する切断部位によって免疫細胞エンゲージングドメインに結合しており、該切断部位は、
a. がん細胞によって発現される酵素によって切断されるか、
b. がん細胞内部でのpH感受性切断反応によって切断されるか、
c. 補体依存性切断反応によって切断されるか、または
d. 当該作用物質中のターゲティング部分と同じもしくは異なるターゲティング部分によってがん細胞に共局在化されたプロテアーゼによって切断される。
【００６２】
A. 単一ポリペプチド鎖または二成分
いくつかの態様において、第1の成分は第2の成分に共有結合している。いくつかの態様において、第1の成分は第2の成分に共有結合していない。
【００６３】
いくつかの態様において、ATTACは2つの別個の成分で構成される。言い換えると、ATTACは、別個のポリペプチドである第1の成分と第2の成分とで構成されうる。
【００６４】
いくつかの成分において、ATTACは単一ポリペプチド鎖で構成される。いくつかの態様において、第1の成分と第2の成分は単一のアミノ酸配列内に含有される。
【００６５】
ATTACが単一ポリペプチド鎖で構成される場合、第1の成分と第2の成分はリンカーによって分離されうる。いくつかの態様において、このリンカーは第1の成分と第2の成分とを共有結合で結合する。いくつかの態様において、このリンカーは切断可能なリンカーを含む。いくつかの態様において、第1の成分と第2の成分の間の切断可能なリンカーはプロテアーゼ切断部位を含む。
【００６６】
いくつかの態様において、第1の成分と第2の成分とを共有結合で結合するリンカー内に含まれる切断部位は、プロテアーゼ切断部位である。使用されうる例示的プロテアーゼ切断部位をいくつかSEQ ID NO:1〜84に挙げるが、本発明はこの一組のプロテアーゼ切断部位に限定されるわけではなく、他のプロテアーゼ切断部位も用いられうる。
【００６７】
いくつかの態様において、第1の成分と第2の成分とを共有結合で結合するリンカー内に含まれる切断部位は、腫瘍関連プロテアーゼ切断部位である。腫瘍関連プロテアーゼは腫瘍と関連するものである。いくつかの態様において、腫瘍関連プロテアーゼは、身体の他の領域と比べて、腫瘍における発現が高い。表3Aに腫瘍関連プロテアーゼの例を挙げるが、腫瘍における発現を伴うプロテアーゼはどれでも、本発明の腫瘍関連プロテアーゼ切断部位を選択するために使用してよい。
【００６８】
いくつかの態様において、第1の成分と第2の成分とを共有結合で結合するリンカー内に含まれる切断部位は、血中に見いだされるプロテアーゼにとっての切断部位である。血中に見いだされる例示的なプロテアーゼとして、トロンビン、好中球エラスターゼ、およびフューリンが挙げられる。
【００６９】
B. 免疫細胞選択部分
いくつかの態様において、ATTACは、特定の免疫細胞に特異的な免疫細胞選択部分を含む。いくつかの態様において、免疫細胞選択部分は、CD8＋T細胞、CD4＋T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、γδT細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT細胞）または操作された免疫細胞に特異的である。操作された免疫細胞とは、新しい特異性を有する操作された受容体を伴う免疫細胞を指す。操作された免疫細胞の例として、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞、CAR NK、CAR NKT、またはCAR γδT細胞が挙げられる。
【００７０】
いくつかの態様において、免疫細胞選択部分は腫瘍抗原ではない免疫細胞マーカーを標的とする。いくつかの態様において、免疫細胞選択部分は、がん細胞ではない免疫細胞へのATTACのターゲティングを可能にする。いくつかの態様において、免疫細胞選択部分は、ATTACをリンパ腫にも骨髄腫にも白血病にも標的指向させない。いくつかの態様において、ATTACは固形腫瘍（言い換えると免疫細胞の腫瘍ではない任意の腫瘍）を標的とする。
【００７１】
いくつかの態様において、免疫細胞選択部分は、制御性T細胞には特異的に結合しない。いくつかの態様において、免疫細胞選択部分は、TH17細胞には特異的に結合しない。いくつかの態様において、選択的な免疫細胞結合作用物質は制御性免疫細胞上に存在するマーカー（CD4およびCD25を含むが、それらに限定されない）を標的としない。
【００７２】
表2に、さまざまな望ましい免疫細胞に関して、代表的な免疫細胞選択部分をいくつか列挙する。
【００７３】
（表２）免疫細胞選択部分
2021529779.tif 000013
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【００７４】
C. がんを標的とする能力を有するターゲティング部分
ターゲティング部分は、標的指向された免疫細胞エンゲージング作用物質を含む第1の成分において、がん細胞の局所環境に当該作用物質を送達することによって機能し、限局的処置戦略を可能にする。ある特定の態様において、ターゲティング部分は、がん細胞に特異的に結合することによってがん細胞を標的とする。いくつかの例において、ターゲティング部分は、不活性結合パートナーが第1の免疫細胞エンゲージングドメインに結合している場合でも、がん細胞に特異的に結合する。
【００７５】
ある特定の態様において、ターゲティング部分は抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗原結合フラグメントとは、がん細胞上の標的に対するその結合活性を保っている任意の抗体フラグメント、例えばscFvまたは他の機能的フラグメントを意味し、これには、軽鎖を欠く免疫グロブリン、VHH、VNAR、Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv、抗体フラグメント、ダイアボディ、scAB、単一ドメイン重鎖抗体、単一ドメイン軽鎖抗体、Fd、CDR領域、または抗原もしくはエピトープに結合する能力を有する抗体の任意の部分もしくはペプチド配列が含まれる。VHHおよびVNARは古典的抗体の代替物であり、たとえそれらが異なる種（それぞれラクダ科動物およびサメ以外の種）で生産されたとしても、それらを抗体の抗原結合フラグメントに含めることにする。「完全長抗体」という具体的注記がある場合を除き、本願が抗体という場合、それは、本質的に、その抗原結合フラグメントへの言及を包含する。
【００７６】
ある特定の抗体標的（括弧内にがん細胞タイプの例を付す）としては、Her2/Neu（上皮悪性疾患）、CD22（B細胞、自己免疫または悪性）、EpCAM（CD326）（上皮悪性疾患）、EGFR（上皮悪性疾患）、PSMA（前立腺がん）、CD30（B細胞性悪性疾患）、CD20（B細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、CD33（骨髄性悪性疾患）、膜型lgE（アレルギーB細胞）、lgE受容体（CD23）（アレルギー疾患における肥満細胞またはB細胞）、CD80（B細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、CD86（B細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、CD2（T細胞性またはNK細胞リンパ腫）、CA125（卵巣がんを含む複数のがん）、炭酸脱水酵素IX（腎細胞がんを含む複数のがん）、CD70（B細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、CD74（B細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、CD56（T細胞またはNK細胞リンパ腫）、CD40（B細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、CD19（B細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、c-met/HGFR（消化管および肝臓の悪性疾患、TRAIL-R1（卵巣がんおよび結腸直腸がんを含む複数の悪性疾患）、DRS（卵巣がんおよび結腸直腸がんを含む複数の悪性疾患）;PD-1（B細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、PD1L（上皮腺がんを含む複数の悪性疾患）、IGF-1R（上皮腺がんを含む大半の悪性疾患）、VEGF-R2（上皮腺がんを含む悪性疾患の大部分に関連する脈管構造、前立腺幹細胞抗原（PSCA）（前立腺腺がん）、MUC1（上皮悪性疾患）、CanAg（大腸がんおよび膵臓がんなどの腫瘍）、メソテリン（中皮腫ならびに卵巣腺がんおよび膵臓腺がんを含む多くの腫瘍）、P-カドヘリン（乳腺がんを含む上皮悪性疾患）、ミオスタチン（GDF8）（肉腫ならびに卵巣腺がんおよび膵臓腺がんを含む多くの腫瘍）、Cripto（TDGF1）（大腸がん、乳がん、肺がん、卵巣がんおよび膵がんを含む上皮悪性疾患）、ACVRL1/ALK1（白血病およびリンパ腫を含む複数の悪性疾患）、MUC5AC（乳腺がんを含む上皮悪性疾患）、CEACAM（乳腺がんを含む上皮悪性疾患）、CD137（B細胞またはT細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、CXCR4（B細胞またはT細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、ニューロピリン1（肺がんを含む上皮悪性疾患）、グリピカン（肝臓がん、脳がんおよび乳がんを含む複数のがん）、HER3/EGFR（上皮悪性疾患）、PDGFRa（上皮悪性疾患）、EphA2（神経芽細胞腫、黒色腫、乳がんおよび小細胞肺がんを含む複数のがん）、CD38（骨髄腫）、CD138（骨髄腫）、α4-インテグリン（AML、骨髄腫、CLL、および大半のリンパ腫）を挙げることができる。
【００７７】
ある特定の様態では、抗体として、セツキシマブなどの抗上皮成長因子受容体抗体、抗Her2抗体、リツキシマブなどの抗CD20抗体、イノツズマブ、G544またはBU59などの抗CD22抗体、抗CD70抗体、hp67.6またはゲムツズマブなどの抗CD33抗体、GP1.4およびSM3などの抗MUC1抗体、抗CD40抗体、抗CD74抗体、抗P-カドヘリン抗体、抗EpCAM抗体、抗CD138抗体、抗E-カドヘリン抗体、（抗CEA抗体、抗FGFR3抗体、およびナタリズマブなどの抗α4-インテグリン抗体が挙げられる。
【００７８】
表3Aに、がんタイプ、考えられるターゲティング部分、およびそれらのがんタイプによって発現されるプロテアーゼの非限定的な例を示す。がんに関連するプロテアーゼは腫瘍関連プロテアーゼと呼ぶことができる。ATTACを調製するために、がんを同定し、（所望に応じて）ターゲティング部分のための標的を選択し、また（所望に応じて）そのがんタイプのための1種類または2種類のプロテアーゼも選択しうる。
【００７９】
（表３Ａ）がんタイプ、ターゲティング部分のための標的、および切断部位を切断することができるプロテアーゼの連係
2021529779.tif 000021
2021529779.tif 000022
【００８０】
表3Bには、さまざまなターゲティング部分の標的となりうるがんについて、一部のターゲティング部分はいくつかの異なるタイプのがんを標的とすることが可能でありうるという事実を含めて、追加情報を示す。ATTACにおいて、第1の成分はがんを標的とする能力を有するターゲティング部分を含むと考えられる。
【００８１】
（表３Ｂ）ターゲティング部分候補
2021529779.tif 000023
2021529779.tif 000024
【００８２】
腫瘍抗原に結合し腫瘍細胞に対して特異性を有する抗体は当技術分野において周知である。腫瘍抗原に結合し本発明においてターゲティング部分として使用することができる例示的抗体に関する選択された刊行物を、表3Cに要約する。
【００８３】
（表３Ｃ）腫瘍抗原に結合する抗体に関する選択された刊行物
2021529779.tif 000025
2021529779.tif 000026
2021529779.tif 000027
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2021529779.tif 000036
【００８４】
FDAはがん処置用の承認された抗体薬の一覧を整備しており、その多くはがん抗原に結合し、この文脈において用いることができる。FDAウェブサイトでOrange Book OnlineまたはDrug＠FDAを参照されたい。FDAは、clinicaltrials.govデータベースにおいて、進行中の臨床試験の一覧も整備しており、それは疾患名で検索することができる。表3Dに、腫瘍細胞に対して特異性を有する承認された抗体の代表的なリストを示す。表3Eに、腫瘍細胞に対して特異性を有する開発中の抗体の代表的リストを示す。
【００８５】
（表３Ｄ）がん適応症に関して承認された代表的抗体
2021529779.tif 000037
2021529779.tif 000038
【００８６】
（表３Ｅ）がん適応症のために開発中の抗体
2021529779.tif 000039
2021529779.tif 000040
【００８７】
当技術分野において周知の他の抗体も、所与のがんを標的とするためのターゲティング部分として使用しうる。抗体およびそれらの各抗原としては、ニボルマブ（抗PD-1 Ab）、TA99（抗gp75）、3F8（抗GD2）、8H9（抗B7-H3）、アバゴボマブ（abagovomab）（抗CA-125（模倣物））、アデカツムマブ（adecatumumab）（抗EpCAM）、アフツズマブ（抗CD20）、アラシズマブペゴール（抗VEGFR2）、アルツモマブペンテテート（抗CEA）、アマツキシマブ（抗メソテリン）、AME-133（抗CD20）、アナツモマブメフェナトクス（anatumomab mafenatox）（抗TAG-72）、アポリズマブ（抗HLA-DR）、アルシツモマブ（抗CEA）、バビツキシマブ（抗ホスファチジルセリン）、ベクツモマブ（抗CD22）、ベリムマブ（抗BAFF）、ベシレソマブ（抗CEA関連抗原）、ベバシズマブ（抗VEGF-A）、ビバツズマブメルタンシン（bivatuzumab mertansine）（抗CD44 v6）、ブリナツモマブ（抗CD19）、BMS-663513（抗CD137）、ブレンツキシマブベドチン（抗CD30（TNFRSF8））、カンツズマブメルタンシン（抗ムチンCanAg）、カンツズマブラブタンシン（抗MUC1）、カプロマブペンデチド（抗前立腺がん細胞）、カルルマブ（抗MCP-1）、カツマキソマブ（抗EpCAM、CD3）、cBR96-ドキソルビシンイムノコンジュゲート（抗ルイス-Y抗原）、CC49（抗TAG-72）、セデリズマブ（抗CD4）、Ch. 14.18（抗GD2）、ch-TNT（抗DNA関連抗原）、シタツズマブボガトクス（citatuzumab bogatox）（抗EpCAM）、シクスツムマブ（抗IGF-1受容体）、クリバツズマブテトラキセタン（抗MUC1）、コナツムマブ（抗TRAIL-R2）、CP-870893（抗CD40）、ダセツズマブ（抗CD40）、ダクリズマブ（抗CD25）、ダロツズマブ（抗インスリン様成長因子I受容体）、ダラツムマブ（抗CD38（サイクリックADPリボースヒドロラーゼ））、デムシズマブ（抗DLL4）、デツモマブ（detumomab）（抗B-リンパ腫細胞）、ドロジツマブ（抗DR5）、デュリゴツマブ（duligotumab）（抗HER3）、デュシギツマブ（dusigitumab）（抗ILGF2）、エクロメキシマブ（抗GD3ガングリオシド）、エドレコロマブ（抗EpCAM）、エロツズマブ（抗SLAMF7）、エルシリモマブ（elsilimomab）（抗IL-6）、エナバツズマブ（抗TWEAK受容体）、エノチクマブ（抗DLL4）、エンシツキシマブ（抗5AC）、エピツモマブシツキセタン（epitumomab cituxetan）（抗エピシアリン）、エプラツズマブ（抗CD22）、エルツマキソマブ（抗HER2/neu、CD3）、エタラシズマブ（抗インテグリンαvβ3）、ファラリモマブ（faralimomab）（抗インターフェロン受容体）、ファーレツズマブ（抗葉酸受容体1）、FBTA05（抗CD20）、フィクラツズマブ（抗HGF）、フィギツムマブ（抗IGF-1受容体）、フランボツマブ（抗TYRP1（糖タンパク質75））、フレソリムマブ（抗TGFβ）、フツキシマブ（futuximab）（抗EGFR）、ガリキシマブ（抗CD80）、ガニツマブ（抗IGF-I）、ゲムツズマブオゾガマイシン（抗CD33）、ギレンツキシマブ（抗炭酸脱水酵素9（CA-IX））、グレンバツムマブベドチン（抗GPNMB）、グセルクマブ（抗IL13）、イバリズマブ（抗CD4）、イブリツモマブチウキセタン（抗CD20）、イクルクマブ（抗VEGFR-1）、イゴボマブ（igovomab）（抗CA-125）、IMAB362（抗CLDN18.2）、IMC-CS4（抗CSF1R）、IMC-TR1（TGFβRII）、イムガツズマブ（抗EGFR）、インクラクマブ（抗セレクチンP）、インダツキシマブ（indatuximab）ラブタンシン（抗SDC1）、イノツズマブオゾガマイシン（抗CD22）、インテツムマブ（抗CD51）、イピリムマブ（抗CD152）、イラツムマブ（抗CD30（TNFRSF8））、KM3065（抗CD20）、KW-0761（抗CD194）、LY2875358（抗MET）ラベツズマブ（抗CEA）、ランブロリズマブ（抗PDCD1）、レクサツムマブ（抗TRAIL-R2）、リンツズマブ（抗CD33）、リリルマブ（抗KIR2D）、ロルボツズマブメルタンシン（抗CD56）、ルカツムマブ（抗CD40）、ルミリキシマブ（抗CD23（IgE受容体））、マパツムマブ（抗TRAIL-R1）、マルジェツキシマブ（抗ch4D5）、マツズマブ（抗EGFR）、マブリリムマブ（抗GMCSF受容体a鎖）、ミラツズマブ（抗CD74）、ミンレツモマブ（minretumomab）（抗TAG-72）、ミツモマブ（抗GD3ガングリオシド）、モガムリズマブ（抗CCR4）、モキセツモマブシュードトクス（抗CD22）、ナコロマブタフェナトクス（nacolomab tafenatox）（抗C242抗原）、ナプツモマブエスタフェナトクス（抗5T4）、ナルナツマブ（抗RON）、ネシツムマブ（抗EGFR）、ネスバクマブ（抗アンジオポエチン2）、ニモツズマブ（抗EGFR）、ニボルマブ（抗IgG4）、ノフェツモマブメルペンタン、オクレリズマブ（抗CD20）、オカラツズマブ（抗CD20）、オララツマブ（抗PDGF-Rα）、オナルツズマブ（抗c-MET）、オンツキシズマブ（ontuxizumab）（抗TEM1）、オポルツズマブモナトクス（抗EpCAM）、オレゴボマブ（抗CA-125）、オトラーツズマブ（otlertuzumab）（抗CD37）、パンコマブ（pankomab）（抗腫瘍特異的MUC1グリコシル化）、パルサツズマブ（parsatuzumab）（抗EGFL7）、パスコリズマブ（抗IL-4）、パトリツマブ（抗HER3）、ペンツモマブ（pemtumomab）（抗MUC1）、ペルツズマブ（抗HER2/neu）、ピディリズマブ（抗PD-1）、ピナツズマブベドチン（抗CD22）、ピンツモマブ（pintumomab）（抗腺がん抗原）、ポラツズマブベドチン（抗CD79B）、プリツムマブ（pritumumab）（抗ビメンチン）、PRO131921（抗CD20）、キリズマブ（抗IGHE）、ラコツモマブ（抗N-グリコリルノイラミン酸）、ラドレツマブ（radretumab）（抗フィブロネクチンエキストラドメイン-B）、ラムシルマブ（抗VEGFR2）、リロツムマブ（抗HGF）、ロバツムマブ（抗IGF-1受容体）、ロレデュマブ（roledumab）（抗RHD）、ロベリズマブ（抗CD11およびCD18）、サマリズマブ（抗CD200）、サツモマブペンデチド（抗TAG-72）、セリバンツマブ（抗ERBB3）、SGN-CD19A（抗CD19）、SGN-CD33A（抗CD33）、シブロツズマブ（sibrotuzumab）（抗FAP）、シルツキシマブ（抗IL-6）、ソリトマブ（solitomab）（抗EpCAM）、ソンツズマブ（sontuzumab）（抗エピシアリン）、タバルマブ（抗BAFF）、タカツズマブテトラキセタン（抗α-フェトプロテイン）、タプリツモマブパプトクス（taplitumomab paptox）（抗CD19）、テリモマブアリトクス（telimomab aritox）、テナツモマブ（tenatumomab）（抗テネイシンC）、テネリキシマブ（抗CD40）、テプロツムマブ（抗CD221）、TGN1412（抗CD28）、チシリムマブ（抗CTLA-4）、ティガツズマブ（抗TRAIL-R2）、TNX-650（抗IL-13）、トシツモマブ（抗CS20）、トベツマブ（抗CD140a）、TRBS07（抗GD2）、トレガリズマブ（tregalizumab）（抗CD4）、トレメリムマブ（抗CTLA-4）、TRU-016（抗CD37）、ツコツズマブセルモロイキン（抗EpCAM）、ウブリツキシマブ（抗CD20）、ウレルマブ（抗4-1BB）、バンチクツマブ（抗Frizzled受容体）、バパリキシマブ（vapaliximab）（抗AOC3（VAP-1））、バテリズマブ（vatelizumab）（抗ITGA2）、ベルツズマブ（抗CD20）、ベセンクマブ（抗NRP1）、ビジリズマブ（抗CD3）、ボロシキシマブ（抗インテグリンα5β1）、ボルセツ��マブマホドチン（抗CD70）、ボツムマブ（抗腫瘍抗原CTAA16.88）、ザルツムマブ（抗EGFR）、ザノリムマブ（抗CD4）、ザツキシマブ（zatuximab）（抗HER1）、ジラリムマブ（ziralimumab）（抗CD147（ベイシジン））、RG7636（抗ETBR）、RG7458（抗MUC16）、RG7599（抗NaPi2b）、MPDL3280A（抗PD-L1）、RG7450（抗STEAP1）およびGDC-0199（抗Bcl-2）が挙げられる。
【００８８】
これらの抗原に結合する抗体も、ターゲティング部分として、とりわけ、注記したがんタイプに対して使用しうる:アミノペプチダーゼN（CD13）、アネキシンA1、B7-H3（CD276、さまざまながん）、CA125（卵巣がん）、CA15-3（がん）、CA19-9（がん）、L6（がん）、ルイスY（がん）、ルイスX（がん）、αフェトプロテイン（がん）、CA242（結腸直腸がん）、胎盤性アルカリホスファターゼ（がん）、前立腺特異抗原（前立腺）、前立腺酸性ホスファターゼ（前立腺）、上皮成長因子（がん）、CD2（ホジキン病、NHLリンパ腫、多発性骨髄腫）、CD3イプシロン（T細胞リンパ腫、肺がん、乳がん、胃がん、卵巣がん、自己免疫疾患、悪性腹水）、CD19（B細胞性悪性疾患）、CD20（非ホジキンリンパ腫、B細胞性新生物、自己免疫疾患）、CD21（B細胞リンパ腫）、CD22（白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、SLE）、CD30（ホジキンリンパ腫）、CD33（白血病、自己免疫疾患）、CD38（多発性骨髄腫）、CD40（リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病（CLL））、CD51（転移性黒色腫、肉腫）、CD52（白血病）、CD56（小細胞肺がん、卵巣がん、メルケル細胞がん、および液性腫瘍（liquid tumor）、多発性骨髄腫）、CD66e（がん）、CD70（転移性腎細胞がんおよび非ホジキンリンパ腫）、CD74（多発性骨髄腫）、CD80（リンパ腫）、CD98（がん）、CD123（白血病）、ムチン（がん）、CD221（固形腫瘍）、CD22（乳がん、卵巣がん）、CD262（NSCLCおよび他のがん）、CD309（卵巣がん）、CD326（固形腫瘍）、CEACAM3（結腸直腸がん、胃がん）、CEACAM5（CEA、CD66e）（乳がん、結腸直腸がんおよび肺がん）、DLL4（A-様-4（A-like-4））、EGFR（さまざまながん）、CTLA4（黒色腫）、CXCR4（CD184、血液腫瘍（heme-oncology）、固形腫瘍）、エンドグリン（CD105、固形腫瘍）、EPCAM（上皮細胞接着分子、膀胱がん、頭頸部がん、大腸がん、NHL  前立腺がんおよび卵巣がん）、ERBB2（肺がん、乳がん、前立腺がん）、FCGR1（自己免疫疾患）、FOLR（葉酸受容体、卵巣がん）、FGFR（がん）、GD2ガングリオシド（がん）、G-28（細胞表面抗原糖脂質、黒色腫）、GD3イディオタイプ（がん）、熱ショックタンパク質（がん）、HER1（肺がん、胃がん）、HER2（乳がん、肺がんおよび卵巣がん）、HLA-DR10（NHL）、HLA-DRB（NHL、B細胞白血病）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（がん）、IGF1R（固形腫瘍、血液がん）、IL-2受容体（T細胞白血病およびリンパ腫）、IL-6R（多発性骨髄腫、RA、キャッスルマン病、IL6依存性腫瘍）、インテグリン（αvβ3、α5β1、α6β4、α11β3、α5β5、αvβ5、さまざまながん用）、MAGE-1（がん）、MAGE-2（がん）、MAGE-3（がん）、MAGE4（がん）、抗トランスフェリン受容体（がん）、p97（黒色腫）、MS4A1（膜貫通（membrane-spanning）4-ドメインサブファミリーAメンバー1、非ホジキンB細胞リンパ腫、白血病）、MUC1（乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、気管支がんおよび胃腸がん）、MUC16（CA125）（卵巣がん）、CEA（結腸直腸がん）、gp100（黒色腫）、MARTI（黒色腫）、MPG（黒色腫）、MS4A1（膜貫通4-ドメインサブファミリーA、小細胞肺がん、NHL）、ヌクレオリン、Neuがん遺伝子産物（がん）、P21（がん）、ネクチン-4（がん）、抗（N-グリコリルノイラミン酸）のパラトープ（乳がん、黒色腫がん）、PLAP様精巣アルカリホスファターゼ（卵巣がん、精巣がん）、PSMA（前立腺腫瘍）、PSA（前立腺）、ROB04、TAG72（腫瘍関連糖タンパク質72、AML、胃が���、結腸直腸がん、卵巣がん）、T細胞膜貫通タンパク質（がん）、Tie（CD202b）、組織因子、TNFRSF10B（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー10B、がん）、TNFRSF13B（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー13B、多発性骨髄腫、NHL、他のがん、RAおよびSLE）、TPBG（栄養芽層糖タンパク質、腎細胞がん）、TRAIL-R1（腫瘍壊死アポトーシス誘導性リガンド受容体1、リンパ腫、NHL、結腸直腸がん、肺がん）、VCAM-1（CD106、黒色腫）、VEGF、VEGF-A、VEGF-2（CD309）（さまざまながん）。他にもいくつかの腫瘍関連抗原標的について総説がある（Gerber,et al,mAbs 2009 1:247-253、Novellino et al,Cancer Immunol Immunother. 2005 54:187-207、Franke,et al,Cancer Biother Radiopharm. 2000,15:459-76、Guo,et al.,Adv Cancer Res. 2013;119:421-475、Parmiani et al. J Immunol. 2007 178:1975-9）。これらの抗原の例として、分化抗原群（Cluster of Differentiation）（CD4、CDS5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD14、CD15、CD16、CDw17、CD18、CD21、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD31、CD32、CD34、CD35、CD36、CD37、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD53、CD54、CD55、CD58、CD59、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD79、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD106、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD147、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD166、CD168、CD184、CDw186、CD195、CD202（a、b）、CD209、CD235a、CD271、CD303、CD304）、アネキシンA1、ヌクレオリン、エンドグリン（CD105）、ROB04、アミノ-ペプチダーゼN、-様-4（-like 4）（DLL4）、VEGFR-2（CD309）、CXCR4（CD184）、Tie2、B7-H3、WT1、MUC1、LMP2、HPV E6 E7、EGFRvIII、HER-2/neu、イディオタイプ、MAGE A3、p53非突然変異体、NY-ESO-1、GD2、CEA、MelanA/MART1、Ras突然変異体、gp100、p53突然変異体、プロテイナーゼ3（PR1）、bcr-abl、チロシナーゼ、サバイビン、hTERT、肉腫転座切断点、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG（TMPRSS2 ETS融合遺伝子）、NA17、PAX3、ALK、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、ポリシアル酸、MYCN、RhoC、TRP-2、GD3、フコシルGM1、メソテリン、PSCA、MAGE A1、sLe（a）、CYPIB I、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、炭酸脱水酵素IX、PAXS、OY-TES1、精子タンパク質17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE1、B7H3、レグマイン、Tie2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2、およびFos関連抗原1が挙げられる。
【００８９】
いくつかの態様では、がんを標的とする能力を有するターゲティング部分が抗体ではなく、別のタイプのターゲティング部分である。がんを標的とする能力を有するターゲティング部分は、DNAアプタマー、RNAアプタマー、アルブミン、リポカリン、フィブロネクチン、アンキリン、CH1/2/3スキャフォールド（アブデュリン（abdurin）（IgG CH2スキャフォールド））、フィノマー（fynomer）、オーボディ（Obody）、DARPin、ノッチン（knotin）、アビマー、アトリマー（atrimer）、アンチカリン（anticallin）、アフィリン（affilin）、アフィボディ（affibody）、二環状ペプチド、cys-ノット（cys-knot）、FN3（アドネクチン、セントリリン（centryrin）、プロネクチン（pronectin）、TN3）およびクニッツ（Kunitz）ドメインを含めて、幅広く公知である。これらおよび他の非抗体スキャフォールド構造は、がん細胞へのターゲティングのために使用しうる。より小さい非抗体スキャフォールドは血流から迅速に除去され、モノクローナル抗体よりも短い半減期を有する。それらは、毛細管内腔から血管内皮および基底膜を通って素早く管外遊出するので、組織浸透も速い。Vazquez-Lombardi et al.,Drug Discovery Today 20（1）:1271-1283（2015）参照。がんを標的とする非抗体スキャフォールドのうちいくつかは既に臨床開発中であり、他の候補も前臨床段階にある。Vazquez-Lombardiの表1参照。
【００９０】
（表４Ａ）非抗体スキャフォールドおよび対応する標的
2021529779.tif 000041
【００９１】
別の態様において、ターゲティング部分は、がん細胞上に発現することが公知であるタンパク質の結合パートナーでありうる。そのような発現レベルには過剰発現が含まれうる。例えば、表4に記載の結合パートナーは、がん細胞上の以下の標的に結合しうる。
【００９２】
（表４Ｂ）非抗体結合パートナーおよび対応する標的
2021529779.tif 000042
【００９３】
結合パートナーは、表4Bに列挙した結合パートナーの完全長配列または野生型配列を含む必要はない。必要なことは、結合パートナーが、がん細胞上の標的に結合すること、したがって当技術分野において周知の切断型、類似体、変異体および誘導体を含みうることだけである。
【００９４】
加えて、いくつかの態様において、結合パートナーは、がん細胞上に発現することが公知のタンパク質に結合する能力を有するアプタマーでありうる。がん細胞などのがん細胞に結合するアプタマーは周知であり、それらを設計するための方法は公知である。
【００９５】
細胞ベースのSELEXシステムを使用して、ランダム候補ライブラリーから標的細胞特異的アプタマーのパネルを選択しうる。ssDNAプールまたはssRNAプールを結合緩衝液に溶解し、変性させてから、標的細胞と共にインキュベートしうる。洗浄後に、結合したDNAまたはRNAを加熱によって溶離し、次に（所望であれば）陰性細胞と共にインキュベートし、遠心分離し、上清を取り出す。ビオチン標識プライマーを使ったPCRで上清を増幅しうる。選択されたセンスssDNAまたはssRNAは、ストレプトアビジン被覆ビーズを使って、アンチセンスビオチン化鎖から分離されうる。アフィニティーを増加させるために、洗浄時間、緩衝液の体積および洗浄回数を増加させることによって、洗浄強度を増加させうる。所望の選択回数後に、選択されたssDNAまたはssRNAのプールをPCR増幅し、大腸菌（E. coli）にクローニングし、配列決定することができる。Shangguan et al.,Aptamers evolved from live cells as effective molecular probes for cancer study,PNAS 103（32:11838-11843（2006）、Lyu et al,Generating Cell Targeting Aptamers for Nanotherapeutics Using Cell-SELEX,Theranostics 6（9）:1440-1452（2016）を参照されたい。また、Li et al.,Inhibition of Cell Proliferation by an Anti-EGFR Aptamer,PLoS One 6（6）:e20229（2011）も参照されたい。これらの参照文献におけるアプタマーを設計するための具体的アプローチおよびがん細胞に結合する具体的アプタマーは、参照により、本明細書に組み入れられる。
【００９６】
例えばアプタマーはSEQ ID NO:94〜164を含みうる。いくつかの態様において、アプタマーはSEQ ID NO:95を含みうる。これらのアプタマーはEGFRを指向するものであり、がん細胞上に提示される標的に結合することができるアプタマーの代表例として掲載しているにすぎない。Zhu et al.,Progress in Aptamer Mediated Drug Delivery Vehicles for Cancer Targeting,Theranostics 4（9）:931-944（2014）に記載されているように、がん細胞上の他の標的に対する他のアプタマーも、同様に、本明細書における説明の一部であり、参照により本明細書に組み入れられる。
【００９７】
いくつかの態様において、本明細書において使用されるアプタマーは、がん細胞上の標的に、ナノモル濃度範囲またはピコモル濃度範囲（例えば1ピコモル濃度〜500ナノモル濃度または1ピコモル濃度〜100ナノモル濃度）のKdで結合する。
【００９８】
さらなる具体的ターゲティング部分として、表4Cに掲載するものが挙げられる。
【００９９】
（表４Ｃ）ターゲティング分子となりうる非免疫グロブリンおよび抗体の抗原結合フラグメントの選択された例
2021529779.tif 000043
【０１００】
D. 免疫細胞エンゲージングドメイン
免疫細胞エンゲージングドメイン機能は、第1の免疫細胞エンゲージングドメインが第2の免疫細胞エンゲージングドメインに結合した場合に、免疫細胞エンゲージング活性を示す能力を有する。不活性結合パートナーが除去された場合に、第1の免疫細胞エンゲージングドメインと第2の免疫細胞エンゲージングドメインとが互いに対を形成すると、それらは免疫細胞に結合することができる。この結合は免疫細胞の活性化をもたらすことができる。
【０１０１】
第1の免疫細胞エンゲージングドメインと第2の免疫細胞エンゲージングドメインの対形成がない場合、第1の免疫細胞エンゲージングドメインと第2の免疫細胞エンゲージングドメインはどちらも単独では免疫細胞に結合することができない。
【０１０２】
いくつかの態様において、免疫細胞は、T細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、γδT細胞、NKT細胞、または操作された免疫細胞である。いくつかの態様において、第1の免疫細胞エンゲージングドメインと第2の免疫細胞エンゲージングドメインは、互いに対を形成した場合に、免疫細胞を活性化することができる。
【０１０３】
1. T細胞エンゲージングドメイン
いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインはT細胞エンゲージングドメインである。標的指向されたT細胞エンゲージング作用物質（targeted T-cell engaging agent）は第1のT細胞エンゲージングドメインを含むが、これは、単独ではT細胞をエンゲージすることができない。その代わりに、第1のT細胞エンゲージングドメインは、標的指向されたT細胞エンゲージング作用物質の一部ではない第2のT細胞エンゲージングドメインに結合した場合に、活性を示す能力を有する。したがって、第1のT細胞エンゲージングドメインと第2のT細胞エンゲージングドメインは、単独ではT細胞エンゲージング活性を有しないが、互いに対を形成した場合にはその活性を有する、任意の二部分でありうる。言い換えると、第1のT細胞エンゲージングドメインと第2のT細胞エンゲージングドメインは、機能的に活性なタンパク質の相補的な半分同士である。
【０１０４】
二成分系において2つのT細胞エンゲージングドメインが互いに会合すると、それらは、T細胞表面上のCD3抗原および/またはT細胞受容体に結合して、T細胞を活性化しうる。CD3はすべてのT細胞上に存在し、γ、δ、ε、ζ、およびηと呼ばれるサブユニットからなる。TCR受容体複合体の他の成分が存在しなくても、CD3の細胞質テールがあれば、T細胞活性化に必要なシグナルを伝達するには十分である。通常、T細胞の細胞傷害性の活性化は、第1に、TCRと、別個の細胞上にあってそれ自身が外来抗原に結合している主要組織適合遺伝子複合体（MHC）タンパク質との結合に依存する。通常の状況では、この最初のTCR-MHC結合が起こった場合にのみ、T細胞クローン拡大と最終的にはT細胞細胞傷害性の原因となるCD3依存的シグナリングカスケードが起こりうる。しかし、本態様のいくつかでは、本二成分系がCD3および/またはTCRに結合すれば、別途TCR-MHCが存在しなくても、免疫シナプス形成を模倣するCD3分子および/またはTCR分子の架橋ゆえに、細胞傷害性T細胞の活性化が起こりうる。これは、T細胞が、クローン非依存的に、すなわちT細胞が担持する特異的TCRクローンには依存せずに、細胞傷害性に活性化されうることを意味する。これは、特定のクローンアイデンティティを有する特定のT細胞だけではなく、T細胞コンパートメント全体の活性化を可能にする。
【０１０５】
いくつかの態様において、第1のT細胞エンゲージングドメインはVHドメインであり、第2のT細胞エンゲージングドメインはVLドメインである。別の態様において、第1のT細胞エンゲージングドメインはVLドメインであり、第2のT細胞エンゲージングドメインはVHドメインである。そのような態様において、第1のT細胞エンゲージングドメインと第2のT細胞エンゲージングドメインは、互いに対を形成した場合に、scFvを含みうる（これは、VHとVLとが単鎖構成でないという事実を別にすれば、scFvと等価であることを意味するものとする）。
【０１０６】
第1のT細胞エンゲージングドメインと第2のT細胞エンゲージングドメインがVHドメインとVLドメインの対である場合、それらVHドメインとVLドメインは、T細胞表面上に発現する抗原、例えばCD3またはTCRに特異的でありうる。抗原がCD3である場合、T細胞エンゲージングドメイン候補の一つは、ムロモナブ（ムロモナブ-CD3またはOKT3）、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビジリズマブ、フォラルマブ（foralumab）またはSP34に由来しうる。当業者は、承認された治療薬であるか、ヒト患者での臨床試験が既に行われているものを含めて、広範囲にわたる抗CD3抗体を知っているであろう（Kuhn and Weiner Immunotherapy 8（8）:889-906（2016）参照）。表5に、例示的な抗CD3抗体に関して、選択された刊行物を挙げる。
【０１０７】
（表５）例示的な抗CD3抗体の特異性を示す選択された参照文献
2021529779.tif 000044
2021529779.tif 000045
【０１０８】
αβTCRおよびγδTCRを含むTCRに対して特異性を有する抗体も周知である。表6に、例示的な抗TCR抗体に関して、選択された刊行物を挙げる。
【０１０９】
（表６）例示的な抗TCR抗体の特異性を示す選択された参照文献
2021529779.tif 000046
【０１１０】
2. ナチュラルキラー細胞エンゲージングドメイン
いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインはナチュラルキラー細胞エンゲージングドメインである。二成分系において2つのナチュラルキラー細胞エンゲージングドメインが互いに会合すると、それらは、NK細胞表面上の抗原に結合して、これらの細胞をエンゲージしうる。いくつかの態様において、NK細胞表面上の抗原は、NKG2D、CD16、NKp30、NKp44、NKp46またはDNAMでありうる。
【０１１１】
いくつかの態様では、二成分系の半分をナチュラルキラー細胞上の表面タンパク質に結合させ、その系の他方の半分をがん細胞に結合させることで、ナチュラルキラー細胞の特異的エンゲージメントが可能になる。ナチュラルキラー細胞のエンゲージメントは、それらの活性化につながり、ナチュラルキラー細胞媒介性の細胞傷害とサイトカイン放出を誘導することができる。
【０１１２】
ATTACにおいて2つのナチュラルキラー細胞エンゲージングドメインが互いに会合すると、ナチュラルキラー細胞は、がん特異的ATTAC成分によって結合しているがん細胞を特異的に溶解しうる。がん細胞の殺滅は、パーフォリン/グランザイム系によって、またはFasL-Fasエンゲージメントによって媒介されうる。この潜在的細胞傷害性機能の他にも、ナチュラルキラー細胞は、極近傍におけるマクロファージおよび樹状細胞を活性化して抗がん免疫応答を強化することができるインターフェロンγおよび腫瘍壊死因子αを含む炎症誘発性サイトカインを分泌することもできる。
【０１１３】
いくつかの態様において、第1のナチュラルキラー細胞エンゲージングドメインはVHドメインであり、第2のナチュラルキラー細胞エンゲージングドメインはVLドメインである。別の態様において、第1のナチュラルキラー細胞エンゲージングドメインはVLドメインであり、第2のナチュラルキラー細胞エンゲージングドメインはVHドメインである。そのような態様において、第1のナチュラルキラー細胞エンゲージングドメインと第2のナチュラルキラー細胞エンゲージングドメインは、互いに対を形成した場合に、scFvを含みうる（これは、VHとVLとが単鎖構成でないという事実を別にすれば、scFvと等価であることを意味するものとする）。
【０１１４】
第1のナチュラルキラー細胞エンゲージングドメインと第2のナチュラルキラー細胞エンゲージングドメインがVHドメインとVLドメインの対である場合、VHドメインとVLドメインは、ナチュラルキラー細胞表面上に発現する抗原、例えばNKG2D、CD16、NKp30、NKp44、NKp46およびDNAMに対して特異的でありうる。
【０１１５】
表7に、ナチュラルキラー細胞表面上に発現する抗原に特異的ないくつかの例示的抗体に関して、選択された刊行物を挙げる。
【０１１６】
（表７）ナチュラルキラー細胞上の表面抗原に対する例示的抗体の特異性を示す選択された参照文献
2021529779.tif 000047
2021529779.tif 000048
2021529779.tif 000049
2021529779.tif 000050
【０１１７】
3. マクロファージエンゲージングドメイン
いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインはマクロファージエンゲージングドメインである。本明細書にいう「マクロファージ」とは、単核食細胞系の任意の細胞、例えば群化系列決定済み（grouped lineage-committed）骨髄前駆体、循環単球、常在マクロファージ、および樹状細胞（DC）などを指す。常在マクロファージの例としてはクッパー細胞およびミクログリアを挙げることができる。
【０１１８】
二成分系において2つのマクロファージエンゲージングドメインが互いに会合すると、それらはマクロファージ表面上の抗原に結合して、これらの細胞をエンゲージしうる。いくつかの態様において、マクロファージ表面上の抗原は、CD89（Fcα受容体1）、CD64（Fcγ受容体1）、CD32（Fcγ受容体2A）、またはCD16a（Fcγ受容体3A）でありうる。
【０１１９】
いくつかの態様では、二成分系の半分をマクロファージ上の表面タンパク質に結合させ、その系の他方の半分をがん細胞に結合させることで、マクロファージの特異的エンゲージメントが可能になる。マクロファージのエンゲージメントはマクロファージによるがん細胞の貪食につながりうる。
【０１２０】
いくつかの態様において、マクロファージ表面上の抗原への結合を介したマクロファージ貪食は、マクロファージによる腫瘍細胞殺滅方法であることが以前に示されているFc受容体結合に依存しない。通常は、がん細胞が全抗体によって結合しており、その抗体のFc部分がFc受容に結合して、貪食を誘導する。
【０１２１】
いくつかの態様では、マクロファージ表面上のtoll様受容体のエンゲージメント（特許出願US20150125397A1参照）がマクロファージのエンゲージメントにつながる。
【０１２２】
ATTACにおいて2つのマクロファージエンゲージングドメインが互いに会合すると、がん特異的ATTAC成分によって結合しているがん細胞のマクロファージによる貪食が誘導されうる。
【０１２３】
いくつかの態様において、第1のマクロファージエンゲージングドメインはVHドメインであり、第2のマクロファージエンゲージングドメインはVLドメインである。別の態様において、第1のマクロファージエンゲージングドメインはVLドメインであり、第2のマクロファージエンゲージングドメインはVHドメインである。そのような態様において、第1のマクロファージエンゲージングドメインと第2のマクロファージエンゲージングドメインは、互いに対を形成した場合に、scFvを含みうる（これは、VHとVLとが単鎖構成でないという事実を別にすれば、scFvと等価であることを意味するものとする）。
【０１２４】
第1のマクロファージエンゲージングドメインと第2のマクロファージエンゲージングドメインがVHドメインとVLドメインの対である場合、VHドメインとVLドメインはマクロファージ表面上に発現する抗原、例えばCD89（Fcα受容体1）、CD64（Fcγ受容体1）、CD32（Fcγ受容体2A）、およびCD16a（Fcγ受容体3A）またはtoll様受容体に対して特異的でありうる。
【０１２５】
表8に、マクロファージ表面上に発現する抗原に特異的ないくつかの例示的抗体に関して、選択された刊行物を挙げる。
【０１２６】
（表８）マクロファージ上の表面抗原に対する例示的抗体の特異性を示す選択された参照文献
2021529779.tif 000051
2021529779.tif 000052
2021529779.tif 000053
2021529779.tif 000054
【０１２７】
4. 好中球エンゲージングドメイン
いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインは好中球エンゲージングドメインである。二成分系において2つの好中球エンゲージングドメインが互いに会合すると、それらは好中球表面上の抗原に結合して、これらの細胞をエンゲージしうる。いくつかの態様において、好中球表面上の抗原は、CD89（FcαR1）、FcγRI（CD64）、FcγRIIA（CD32）、FcγRIIIA（CD16a）、CD11b（CR3、αMβ2）、TLR2、TLR4、CLEC7A（デクチン1）、ホルミルペプチド受容体1（FPR1）、ホルミルペプチド受容体2（FPR2）またはホルミルペプチド受容体3（FPR3）でありうる。
【０１２８】
いくつかの態様では、二成分系の半分を好中球上の表面タンパク質に結合させ、その系の他方の半分をがん細胞に結合させることで、好中球の特異的エンゲージメントが可能になる。好中球のエンゲージメントは貪食および細胞取込みにつながりうる。
【０１２９】
ATTACにおいて2つの好中球エンゲージングドメインが互いに会合すると、好中球は標的細胞を呑み込みうる。
【０１３０】
いくつかの態様において、第1の好中球エンゲージングドメインはVHドメインであり、第2の好中球エンゲージングドメインはVLドメインである。別の態様において、第1の好中球エンゲージングドメインはVLドメインであり、第2の好中球エンゲージングドメインはVHドメインである。そのような態様において、第1の好中球エンゲージングドメインと第2の好中球エンゲージングドメインは、互いに対を形成した場合に、scFvを含みうる（これは、VHとVLとが単鎖構成でないという事実を別にすれば、scFvと等価であることを意味するものとする）。
【０１３１】
第1の好中球エンゲージングドメインと第2の好中球エンゲージングドメインがVHドメインとVLドメインの対である場合、VHドメインとVLドメインは好中球表面上に発現する抗原、例えばCD89（FcαR1）、FcγRI（CD64）、FcγRIIA（CD32）、FcγRIIIA（CD16a）、CD11b（CR3、αMβ2）、TLR2、TLR4、CLEC7A（デクチン1）、FPR1、FPR2またはFPR3に対して特異的でありうる。
【０１３２】
表9に、好中球表面上に発現する抗原に特異的ないくつかの例示的抗体に関して、選択された刊行物を挙げる。
【０１３３】
（表９）好中球上の表面抗原に対する例示的抗体の特異性を示す選択された参照文献
2021529779.tif 000055
2021529779.tif 000056
【０１３４】
5. 好酸球エンゲージングドメイン
いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインは好酸球エンゲージングドメインである。二成分系において2つの好酸球エンゲージングドメインが互いに会合すると、それらは好酸球表面上の抗原に結合して、これらの細胞をエンゲージしうる。いくつかの態様において、好酸球表面上の抗原はCD89（Fcα受容体1）、FcεRI、FcγRI（CD64）、FcγRIIA（CD32）、FcγRIIIB（CD16b）またはTLR4でありうる。
【０１３５】
いくつかの態様では、二成分系の半分を好酸球上の表面タンパク質に結合させ、その系の他方の半分をがん細胞に結合させることで、好酸球の特異的エンゲージメントが可能になる。好酸球のエンゲージメントは、脱顆粒、ならびにECPおよび好酸球由来神経毒として公知の、予め形成されたカチオンタンパク質、例えばEPO、主要塩基性タンパク質1（MBP1）および好酸球関連リボヌクレアーゼ（eosinophil-associated ribonuclease:EAR）の放出につながりうる。
【０１３６】
ATTACにおいて2つの好中球エンゲージングドメインが互いに会合すると、好中球は標的細胞を貪食するか、好中球細胞外トラップ（neutrophil extracellular traps:NETs）を分泌し、最終的に、その呼吸バーストカスケードを活性化して、貪食した細胞を殺滅しうる。
【０１３７】
いくつかの態様において、第1の好酸球エンゲージングドメインはVHドメインであり、第2の好酸球エンゲージングドメインはVLドメインである。別の態様において、第1の好酸球エンゲージングドメインはVLドメインであり、第2の好酸球エンゲージングドメインはVHドメインである。そのような態様において、第1の好酸球エンゲージングドメインと第2の好酸球エンゲージングドメインは、互いに対を形成した場合に、scFvを含みうる（これは、VHとVLとが単鎖構成でないという事実を別にすれば、scFvと等価であることを意味するものとする）。
【０１３８】
第1の好酸球エンゲージングドメインと第2の好酸球エンゲージングドメインがVHドメインとVLドメインの対である場合、VHドメインとVLドメインは好酸球表面上に発現する抗原、例えばCD89（Fcα受容体1）、FcεRI、FcγRI（CD64）、FcγRIIA（CD32）、FcγRIIIB（CD16b）またはTLR4に対して特異的でありうる。
【０１３９】
表10に、好酸球表面上に発現する抗原に特異的ないくつかの例示的抗体に関して、選択された刊行物を挙げる。
【０１４０】
（表１０）好酸球上の表面抗原に対する例示的抗体の特異性を示す選択された参照文献
2021529779.tif 000057
【０１４１】
6. 好塩基球エンゲージングドメイン
いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインは好塩基球エンゲージングドメインである。二成分系において2つの好塩基球エンゲージングドメインが互いに会合すると、それらは好塩基球表面上の抗原に結合して、これらの細胞をエンゲージしうる。いくつかの態様において、好塩基球表面上の抗原はCD89（Fcα受容体1）またはFcεRIでありうる。
【０１４２】
いくつかの態様では、二成分系の半分を好塩基球上の表面タンパク質に結合させ、その系の他方の半分をがん細胞に結合させることで、好塩基球の特異的エンゲージメントが可能になる。好塩基球のエンゲージメントは、ヒスタミン、プロテオグリカンおよびタンパク質分解酵素などといった好塩基球顆粒成分の放出につながりうる。それらはロイコトリエン（LTD-4）およびサイトカインも分泌する。
【０１４３】
ATTACにおいて2つの好塩基球エンゲージングドメインが互いに会合すると、好塩基球は脱顆粒しうる。
【０１４４】
いくつかの態様において、第1の好塩基球エンゲージングドメインはVHドメインであり、第2の好塩基球エンゲージングドメインはVLドメインである。別の態様において、第1の好塩基球エンゲージングドメインはVLドメインであり、第2の好塩基球エンゲージングドメインはVHドメインである。そのような態様において、第1の好塩基球エンゲージングドメインと第2の好塩基球エンゲージングドメインは、互いに対を形成した場合に、scFvを含みうる（これは、VHとVLとが単鎖構成でないという事実を別にすれば、scFvと等価であることを意味するものとする）。
【０１４５】
第1の好塩基球エンゲージングドメインと第2の好塩基球エンゲージングドメインがVHドメインとVLドメインの対である場合、VHドメインとVLドメインは好塩基球表面上に発現する抗原、例えばCD89（Fcα受容体1）またはFcεRIに対して特異的でありうる。
【０１４６】
表11に、好塩基球表面上に発現する抗原に特異的ないくつかの例示的抗体に関して、選択された刊行物を挙げる。
【０１４７】
（表１１）好塩基球上の表面抗原に対する例示的抗体の特異性を示す選択された参照文献
2021529779.tif 000058
【０１４８】
7. γδT細胞
いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインはγδT細胞エンゲージングドメインである。本明細書にいうγδT細胞とは、1つのガンマ鎖（γ）と1つのデルタ鎖（δ）とで構成されているTCRを有するT細胞を指す。
【０１４９】
二成分系において2つのγδT細胞エンゲージングドメインが互いに会合すると、それらはγδT細胞表面上の抗原に結合して、これらの細胞をエンゲージしうる。いくつかの態様において、γδT細胞表面上の抗原はγδTCR、NKG2D、CD3複合体（CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD3η）、4-1BB、DNAM-1、またはTLR（例えばTLR2、TLR6）でありうる。
【０１５０】
いくつかの態様では、二成分系の半分をγδT細胞上の表面タンパク質に結合させ、その系の他方の半分をがん細胞に結合させることで、γδT細胞の特異的エンゲージメントが可能になる。γδT細胞のエンゲージメントは、標的細胞の細胞溶解、ならびにTNFαおよびIFNγなどの炎症誘発性サイトカインの放出につながりうる。
【０１５１】
ATTACにおいて2つのγδT細胞エンゲージングドメインが互いに会合すると、γδT細胞は標的細胞を殺滅しうる。
【０１５２】
いくつかの態様において、第1のγδT細胞エンゲージングドメインはVHドメインであり、第2のγδT細胞エンゲージングドメインはVLドメインである。別の態様において、第1のγδT細胞エンゲージングドメインはVLドメインであり、第2のγδT細胞エンゲージングドメインはVHドメインである。そのような態様において、第1γδT細胞エンゲージングドメインと第2のγδT細胞エンゲージングドメインは、互いに対を形成した場合に、scFvを含みうる（これは、VHとVLとが単鎖構成でないという事実を別にすれば、scFvと等価であることを意味するものとする）。
【０１５３】
第1のγδT細胞エンゲージングドメインと第2のγδT細胞エンゲージングドメインがVHドメインとVLドメインの対である場合、VHドメインとVLドメインはγδT細胞表面上に発現する抗原、例えばγδTCR、NKG2D、CD3複合体（CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD3η）、4-1BB、DNAM-1、またはTLR（TLR2、TLR6）に対して特異的でありうる。
【０１５４】
表12に、γδT細胞表面上に発現する抗原に特異的ないくつかの例示的抗体に関して、選択された刊行物を挙げる。
【０１５５】
（表１２）ガンマ-デルタ（γδ）T細胞上の表面抗原に対する例示的抗体の特異性を示す選択された参照文献
2021529779.tif 000059
【０１５６】
8. ナチュラルキラーT細胞（NKT細胞）
いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインはNKTエンゲージングドメインである。NKT細胞とは、Vα24およびVβ11 TCR受容体を発現するT細胞を指す。
【０１５７】
二成分系において2つのNKTエンゲージングドメインが互いに会合すると、それらはNKT表面上の抗原に結合して、これらの細胞をエンゲージしうる。いくつかの態様において、NKT表面上の抗原はαβTCR、NKG2D、CD3複合体（CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD3η）、4-1BB、またはIL-12Rでありうる。
【０１５８】
いくつかの態様において、二成分系の半分をNKT上の表面タンパク質に結合させ、その系の他方の半分をがん細胞に結合させることで、NKTの特異的エンゲージメントが可能になる。NKTのエンゲージメントは標的細胞の細胞溶解につながりうる。
【０１５９】
ATTACにおいて2つのNKTエンゲージングドメインが互いに会合すると、NKTは標的細胞の細胞溶解および炎症誘発性サイトカインの放出を誘導しうる。
【０１６０】
いくつかの態様において、第1のNKTエンゲージングドメインはVHドメインであり、第2のNKTエンゲージングドメインはVLドメインである。別の態様において、第1のNKTエンゲージングドメインはVLドメインであり、第2のNKTエンゲージングドメインはVHドメインである。そのような態様において、第1のNKTエンゲージングドメインと第2のNKTエンゲージングドメインは、互いに対を形成した場合に、scFvを含みうる（これは、VHとVLとが単鎖構成でないという事実を別にすれば、scFvと等価であることを意味するものとする）。
【０１６１】
第1のNKTエンゲージングドメインと第2のNKTエンゲージングドメインがVHドメインとVLドメインの対である場合、VHドメインとVLドメインはNKT表面上に発現する抗原、例えばαβTCR、NKG2D、CD3複合体（CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD3η）、4-1BB、またはIL-12Rに対して特異的でありうる。
【０１６２】
表13に、NKT表面上に発現する抗原に特異的ないくつかの例示的抗体に関して、選択された刊行物を挙げる。
【０１６３】
（表１３）NKT細胞上の表面抗原に対する例示的抗体の特異性を示す選択された参照文献
2021529779.tif 000060
【０１６４】
9. 操作された免疫細胞
いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインは操作された免疫細胞エンゲージングドメインである。
【０１６５】
いくつかの態様において、操作された免疫細胞はキメラ抗原受容体（CAR）細胞である。いくつかの態様において、CARは、免疫細胞によって天然に発現される受容体に一部由来するシグナリングドメインに融合された、腫瘍抗原にタイトに結合する能力を有する細胞外ドメイン（例えばscFv）を含む。例示的なCARは、Facts about Chimeric Antigen Receptor（CAR）T-Cell Therapy,Leukemia and Lymphoma Society,December 2017に記載されている。CARは、腫瘍抗原に特異的なscFV領域、細胞内共刺激ドメイン、ならびにリンカーおよび膜貫通領域を含みうる。例えばCAR T細胞中のCARは、T細胞受容体に一部由来するシグナリングドメインに融合された腫瘍抗原の細胞外ドメインを含みうる。CARは、CD28、4-1BBまたはOX40などの共刺激ドメインも含みうる。いくつかの態様において、免疫細胞によって発現されるCARが腫瘍標的抗原に結合すると、免疫細胞の活性化、増殖および標的細胞の排除がもたらされる。したがって、それぞれのscFV領域、細胞内共刺激ドメイン、ならびにリンカーおよび膜貫通領域が異なる一連のCARを使って、操作された免疫細胞を生成させうる。
【０１６６】
例示的な操作された免疫細胞として、CAR T細胞、CAR NK細胞、CAR NKT細胞、およびCAR γδ細胞が挙げられる。いくつかの態様において、操作された免疫細胞は患者自身の免疫細胞に由来する。いくつかの態様において、患者の腫瘍は、CARのscFVに結合する腫瘍抗原を発現する。
【０１６７】
今までに研究されたCAR標的候補として、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、ROR1、Igk軽鎖、BCMA、LNGFR、およびNKG2Dが挙げられる。ただし、CAR技術を用いて、一連の腫瘍抗原に対する操作された免疫細胞を開発することができると考えられる。
【０１６８】
いくつかの態様において、操作された免疫細胞は遺伝子操作された免疫細胞である。
【０１６９】
二成分系において2つの操作された免疫細胞エンゲージングドメインが互いに会合すると、それらは操作された免疫細胞表面上の抗原に結合して、これらの細胞をエンゲージしうる。いくつかの態様において、操作された免疫細胞表面上の抗原は、T細胞、NK細胞、NKT細胞またはγδ細胞に対する特異性を有する、本願に具陳するエンゲージメントドメインでありうる。
【０１７０】
いくつかの態様では、二成分系の半分を操作された免疫細胞上の表面タンパク質に結合させ、その系の他方の半分をがん細胞に結合させることで、操作された免疫細胞の特異的エンゲージメントが可能になる。操作された免疫細胞のエンゲージメントは、これらの細胞のエフェクター応答の活性化、例えばそれぞれの標的の細胞溶解およびサイトカインの放出につながりうる。
【０１７１】
ATTACにおいて2つの操作された免疫細胞エンゲージングドメインが互いに会合すると、操作された免疫細胞は標的細胞を殺滅しうる。
【０１７２】
いくつかの態様において、第1の操作された免疫細胞エンゲージングドメインはVHドメインであり、第2の操作された免疫細胞エンゲージングドメインはVLドメインである。別の態様において、第1の操作された免疫細胞エンゲージングドメインはVLドメインであり、第2の操作された免疫細胞エンゲージングドメインはVHドメインである。そのような態様において、第1の操作された免疫細胞エンゲージングドメインと第2の操作された免疫細胞エンゲージングドメインは、互いに対を形成した場合に、scFvを含みうる（これは、VHとVLとが単鎖構成でないという事実を別にすれば、scFvと等価であることを意味するものとする）。
【０１７３】
第1の操作された免疫細胞エンゲージングドメインと第2の操作された免疫細胞エンゲージングドメインがVHドメインとVLドメインの対である場合、VHドメインとVLドメインは、操作に使用した細胞のタイプに基づいて、操作された免疫細胞表面上に発現する抗原に対して特異的でありうる。
【０１７４】
E. 不活性結合パートナー
ATTACは、少なくとも1つの不活性結合パートナーであって、それが結合する免疫細胞エンゲージングドメインに結合して、ある特定の条件が生じない限り、それが別の免疫エンゲージングドメインに結合することを妨げる能力を有する、該不活性結合パートナーも含む。免疫細胞エンゲージングドメインは、それが少なくとも1つの不活性結合パートナーに結合している場合には、免疫細胞エンゲージング活性を有しない。
【０１７５】
言い換えると、少なくとも1つの不活性結合パートナーは、免疫エンゲージングドメインがその相補的対（他方の免疫細胞エンゲージングドメイン）に結合するのを阻止して、2つのドメインが互いに接合して免疫細胞エンゲージング活性を有するのを妨げることにより、免疫エンゲージングドメインの機能を失わせる。したがって不活性結合パートナーは、不活性結合パートナーが除去されない限り免疫細胞エンゲージングドメインが他方の免疫細胞エンゲージングドメインに結合しないように、免疫細胞エンゲージングドメインに結合する。本願では、結合しないという文言によって、非特異的結合または低レベルの結合（例えば≦1％、≦5％、≦10％）が排除されることはない。
【０１７６】
いくつかの態様では、第1の免疫細胞エンゲージングドメインが不活性結合パートナーに結合している。第1の免疫細胞エンゲージングドメインに結合している不活性結合パートナーは、第1の免疫細胞エンゲージングドメインが第2の免疫細胞結合ドメインに結合することを妨げる。
【０１７７】
いくつかの態様では、第2の免疫細胞エンゲージングドメインが不活性結合パートナーに結合している。第2の免疫細胞エンゲージングドメインに結合している不活性結合パートナーは、第2の免疫細胞エンゲージングドメインが第1の免疫細胞結合ドメインに結合することを妨げる。
【０１７８】
いくつかの態様において、第1の免疫細胞エンゲージングドメインと第2の免疫細胞エンゲージングドメインはどちらも不活性結合パートナーに結合している。第1の免疫細胞エンゲージングドメインと第2の免疫細胞エンゲージングドメインとに結合している不活性結合パートナーは、それら2つの免疫細胞エンゲージングドメインが互いに結合するのを妨げる。
【０１７９】
いくつかの態様において、不活性結合パートナーは免疫細胞エンゲージングドメインに特異的に結合する。
【０１８０】
いくつかの態様において、少なくとも1つの不活性結合パートナーはVHドメインまたはVLドメインである。いくつかの態様において、ATTAC中の免疫細胞エンゲージングドメインがVHドメインである場合、不活性結合パートナーはVLドメインであることができ、第1の免疫細胞エンゲージングドメインがVLドメインである場合、不活性結合パートナーはVHドメインであることができる。
【０１８１】
第1の成分がターゲティング部分とVL免疫細胞エンゲージングドメインとVH不活性結合パートナーとを含む場合、いくつかの態様において、VH不活性結合パートナーは、VL免疫細胞エンゲージングドメインへの結合に関して、VL免疫細胞エンゲージングドメインが第2の成分中のそのパートナーVH免疫細胞エンゲージングドメインに対して有する平衡解離定数よりも大きな平衡解離定数を有する。いくつかの態様において、前記の一文は、VHをVLと入れ替えた場合にも等しく当てはまり、その逆もまた成り立つ。
【０１８２】
不活性結合パートナーを免疫細胞エンゲージングドメインとのミスペア形成パートナーとしてコンストラクトに使用することにより、より安定で、製造がより容易なコンストラクトがもたらされると考えられる。いくつかの態様において、第1の免疫結合ドメインと第2の免疫結合ドメインはどちらも、本明細書に記載の不活性結合パートナーに結合していてよい。いくつかの態様では、免疫結合ドメインのうちの一方だけが、不活性結合パートナーに結合している。
【０１８３】
1. 不活性結合パートナーとしての不活化されたVHドメインまたはVLドメイン
いくつかの態様において、免疫細胞エンゲージングドメインがVHドメインまたはVLドメインである場合、不活性結合パートナーは、免疫細胞結合ドメインと対を形成することで機能的抗体を形成して免疫細胞抗原に結合することができる対応するVLドメインまたはVHドメインに対して、相同性を有する。この免疫細胞抗原は、T細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、好中球、好酸球、好塩基球、γδT細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT細胞）、または操作された免疫細胞を含む任意の免疫細胞上に存在する抗原でありうる。いくつかの態様において、この免疫細胞抗原はCD3である。
【０１８４】
いくつかの態様において、不活性結合パートナーは、標的抗原への結合を阻害するように不活性結合パートナー中に作られた1つまたは複数の突然変異ゆえに、その対応する免疫細胞エンゲージングドメインのVLまたはVHと対を形成した場合に、抗原に特異的に結合することができないVHまたはVLである。いくつかの態様において、不活性結合パートナーのVHまたはVLは、免疫細胞抗原に特異的なVHまたはVLとは、1つまたは複数のアミノ酸が異なりうる。言い換えると、標的免疫細胞抗原に特異的なVHまたはVLに、1つまたは複数の突然変異を加えることで、不活性結合パートナーを生成させうる。
【０１８５】
これらの突然変異は、例えば、免疫細胞抗原に特異的なVHまたはVLのポリペプチド配列における、不活性結合パートナーを生成させるための置換、挿入または欠失でありうる。いくつかの態様では、不活性結合パートナーを生成させるために、免疫細胞抗原に特異的なVHまたはVL中の突然変異を、CDR1、CDR2またはCDR3内に作りうる。いくつかの態様において、不活性結合パートナーとして使用されるVHまたはVLは、免疫細胞エンゲージングドメインと対を形成する能力を保ちうるが、結果として生じる対形成したVH/VLドメインは、免疫細胞抗原への結合が低減している。いくつかの態様において、不活性結合パートナーは、その対応する免疫細胞エンゲージングドメインに結合するために正常なアフィニティーを有するが、対を形成したVH/VLの免疫細胞抗原に対する結合アフィニティーは、対を形成したVH/VLであって不活性結合パートナーの突然変異を含まないものと比較して低い。例えばこの低いアフィニティーは、免疫細胞抗原に対する20分の1、100分の1、または1000分の1の結合でありうる。
【０１８６】
いくつかの態様において、第1の免疫細胞結合ドメインは、免疫細胞抗原に特異的なVHであり、不活性結合パートナーは、対を形成したVH/VLが抗原に結合しないかその結合が減少するような1つまたは複数の突然変異を有する、同じ抗原に対するVLドメインである。いくつかの態様において、第1の免疫細胞結合ドメインは、免疫細胞抗原に特異的なVLであり、不活性結合パートナーは、対を形成したVH/VLが抗原に結合しないかその結合が減少するような1つまたは複数の突然変異を有する、同じ抗原に対するVHドメインである。
【０１８７】
いくつかの態様において、第2の免疫細胞結合ドメインは、免疫細胞抗原に特異的なVHであり、不活性結合パートナーは、対を形成したVH/VLが抗原に結合しないかその結合が減少するような1つまたは複数の突然変異を有する、同じ抗原に対するVLドメインである。いくつかの態様において、第2の免疫細胞結合ドメインは、免疫細胞抗原に特異的なVLであり、不活性結合パートナーは、対を形成したVH/VLが抗原に結合しないかその結合が減少するような1つまたは複数の突然変異を有する、同じ抗原に対するVHドメインである。
【０１８８】
2. 無関係な抗体から得られる不活性結合パートナー
いくつかの態様において、不活性結合パートナーとして使用されるVHまたはVLは、免疫細胞エンゲージングドメインのVLまたはVHとは無関係である。言い換えると、不活性結合パートナーは、免疫細胞エンゲージングドメインのVLまたはVHと通常会合する対応するVHまたはVLに対して、配列相同性をほとんどまたはまったく有しなくてもよい。いくつかの態様において、不活性結合パートナーとして使用されるVHまたはVLは、免疫細胞エンゲージングドメインとして使用されるVLまたはVHとは異なる抗体またはscFvに由来しうる。
【０１８９】
両方の成分が不活性結合パートナーを有する場合、いくつかの態様において、一方の成分のVH不活性結合パートナーと他方の成分のVL不活性結合パートナーとは、異なる抗体に由来しうる。
【０１９０】
F. 切断部位
概要として、切断部位は、（i）がん細胞によって発現される酵素によって切断されるか、（ii）がん細胞内部でのpH感受性切断反応によって切断されるか、（iii）補体依存性切断反応によって切断されるか、または（iv）当該作用物質中のターゲティング部分と同じもしくは異なるターゲティング部分によってがん細胞に共局在化されたプロテアーゼによって切断されうる。いくつかの態様において、切断部位はプロテアーゼ切断部位である。
【０１９１】
切断部位は、第1の免疫細胞エンゲージングドメインから不活性結合パートナーを遊離させるように機能する。切断部位は、さまざまな形で機能して、がん細胞の微小環境において免疫細胞エンゲージングドメインの一方または両方から不活性結合パートナーを遊離させることができる。切断は、用いる戦略に応じて、がん細胞の内側またはがん細胞の外側で起こりうる。切断ががん細胞の外側で起こる場合、免疫細胞エンゲージングドメインは、まず細胞内に内部移行して古典的抗原プロセシング経路にエンゲージすることなく、提示されうる。
【０１９２】
ある特定の態様において、少なくとも1つの切断部位は、がん細胞によって発現される酵素によって切断されうる。例えば、がん細胞はプロテアーゼなどのある特定の酵素を発現することが公知であり、この戦略では、ATTACの1つまたは複数の切断部位を切断するために、それらを用いうる。非限定的な例として、例えばカテプシンBは、なかんずくFR、FK、VA、およびVRを切断し、カテプシンDは
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を切断し、ADAM28は
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を切断し、MMP2は
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を切断する。表1Aまたは表3Aに列挙した他の切断部位も用いうる。がんと関連するプロテアーゼ切断部位およびプロテアーゼは当技術分野において周知である。Oncomine（www.oncomine.org）はオンラインのがん遺伝子発現データベースであるので、本発明の作用物質ががん処置用である場合、当業者は、所与のがんタイプを処置するのに適切であると考えられる特定のプロテアーゼ切断部位（または2つのプロテアーゼ切断部位）を同定するために、Oncomineデータベースを検索しうる。これに代わるデータベースとして、European Bioinformatic Institute（www.ebi.ac.uk）、特に（www.ebi.ac.uk/gxa）が挙げられる。プロテアーゼデータベースには、ExPASy Peptide Cutter（ca.expasy.org/tools/peptidecutter）およびPMAP.Cut DB（cutdb.burnham.org）がある。
【０１９３】
いくつかの態様において、少なくとも1つの切断部位は、がん細胞内部でのpH感受性切断反応によって切断されうる。ATTACが細胞中に内部移行する場合、切断反応は、細胞の内側で起こり、がん細胞の外側の微小環境と細胞の内部との間のpHの変化によってトリガーされうる。具体的には、いくつかのがんタイプは、がん細胞の内部に酸性環境を有することが公知である。そのようなアプローチは、内部がん細胞タイプが、細胞外微小環境とは、例えば特に糖衣とは特徴的に異なるpHを有する場合に用いられうる。どの細胞でもリゾチームではpH切断が起こりうるので、pH感受性切断部位を使用する場合、ターゲティング作用物質の選択は、所望であれば、より高い特異性を必要としうる。例えば、pH感受性切断部位を使用する場合、がん細胞だけに結合するかがん細胞に著しく優先的に結合するターゲティング作用物質（例えば肺がんの処置の場合はメソテリンに結合する抗体など）が望ましいと考えられる。
【０１９４】
ある特定の態様において、少なくとも1つの切断部位は、補体依存的切断反応によって切断されうる。ATTACががん細胞に結合すると、患者の補体カスケードがトリガーされうる。そのような場合は、補体プロテアーゼに感受性である切断部位を使用することにより、補体カスケードを使って、第1の免疫細胞エンゲージングドメインから不活性結合パートナーを切断しうる。例えばC1rおよびC1sならびにC3コンバターゼ（C4B,2aおよびC3b,Bb）はセリンプロテアーゼである。C3/C5およびC5も補体プロテアーゼである。同様に補体カスケードに関与してC4およびC2のC4b2b（C3コンバターゼ）への切断を担うセリンプロテアーゼであるマンノース関連結合タンパク質（MASP）も、使用しうる。限定するわけではないが、例えばC1sはYLGRSYKVおよびMQLGRXを切断する。MASP2はSLGRKIQIを切断すると考えられる。補体成分C2aと補体因子BbはGLARSNLDEを切断すると考えられる。
【０１９５】
いくつかの態様において、少なくとも1つの切断部位は、ATTAC中のターゲティング部分と同じまたは異なるターゲティング部分によってがん細胞に共局在化されたプロテアーゼによって切断されうる。例えばプロテアーゼをがん細胞の微小環境に送達するターゲティング作用物質にプロテアーゼをコンジュゲートすることにより、任意のプロテアーゼをがん細胞の微小環境に同時に向かわせうる。ターゲティング作用物質は、本明細書に記載の任意のターゲティング作用物質でありうる。プロテアーゼはペプチドリンカーまたは化学リンカーを介したターゲティング作用物質への付加が可能であり、ターゲティング作用物質に結合していても、十分な酵素活性を維持しうる。
【０１９６】
いくつかの態様において、第1の成分と第2の成分はどちらも不活性結合パートナーとミスペア形成している。いくつかの態様において、第1の成分中および第2の成分中のプロテアーゼ切断部位は同じである。別の態様において、第1の成分中および第2の成分中のプロテアーゼ切断部位は、同じプロテアーゼのための異なる切断部位である。別の態様において、第1の成分中および第2の成分中のプロテアーゼ切断部位は、異なるプロテアーゼのための切断部位である。2種類の異なるプロテアーゼを用いるいくつかの態様において、がん細胞は両方のプロテアーゼを発現する。
【０１９７】
いくつかの態様において、第1の成分では、未切断状態にある不活性結合パートナーは、VLまたはVH免疫エンゲージングドメインが、第2の成分中のそのパートナー、それぞれVHまたはVL免疫細胞エンゲージングドメインに、特異的に結合するのを妨害する。いくつかの態様において、未切断状態にある不活性結合パートナーは、VLまたはVH免疫細胞エンゲージングドメインの、未切断状態における第2の成分中のそのパートナー、それぞれVHまたはVL免疫細胞エンゲージングドメインに対する解離定数（Kd）が、VLまたはVH免疫細胞エンゲージングドメインの、切断された状態における第2の成分中のそのパートナー、それぞれVHまたはVL免疫細胞エンゲージングドメインに対するKdの少なくとも100倍になるように、VLまたはVH免疫細胞エンゲージングドメインが、第2の成分中のそのパートナー、それぞれVHまたはVL免疫細胞エンゲージングドメインに結合するのを阻害する。
【０１９８】
G. リンカー
切断部位に加えて、リンカーは、任意で、ATTACの別々の部分を一緒に結合させるためにも使用しうる。リンカーとは、これらの部分を一緒に結合させる任意の化学部分を包含するものとする。いくつかの態様において、リンカーはフレキシブルリンカーでありうる。リンカーとしては、ペプチド、ポリマー、ヌクレオチド、核酸、多糖、および脂質有機種（例えばポリエチレングリコール）が挙げられる。いくつかの態様において、リンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは約2〜100、10〜50、または15〜30アミノ酸長でありうる。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、少なくとも10アミノ酸長、少なくとも15アミノ酸長または少なくとも20アミノ酸長、かつ80アミノ酸長以下、90アミノ酸長以下、または100アミノ酸長以下である。いくつかの態様において、リンカーは、単一のまたは反復する
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配列を有する、ペプチドリンカーである。
【０１９９】
いくつかの態様において、リンカーはマレイミド（MPA）リンカーまたはSMCCリンカーである。
【０２００】
H. 作製方法
本明細書に記載のATTACは遺伝子工学の技法を使って作製することができる。具体的には、適切な宿主において核酸を発現させることでATTACを生産しうる。例えば、ATTACを、その構成部分およびリンカーのすべてを含めてコードする核酸配列を含むベクターを調製し、そのベクターを使って適切な宿主細胞を形質転換しうる。
【０２０１】
ベクターには、宿主の性質および宿主に核酸を導入する方法ならびにエピソーム維持が望ましいのか組込みが望ましいのかに依存して、さまざまな調節要素も使用しうる。
【０２０２】
マレイミドリンカーまたはSMCCリンカーを使用するなど、化学的連結技法も用いられうる。
【０２０３】
結合パートナーがアプタマーである例の場合、アプタマーをタンパク質に、すなわち免疫細胞エンゲージングドメインにコンジュゲートする方法は、当業者には理解されるであろう。アプタマーは、チオール結合または他の標準的コンジュゲーション化学を使ってコンジュゲートしうる。アプタマーを免疫細胞エンゲージングドメインに取り付けるために、マレイミド、スクシンイミド、またはSH基をアプタマーに付加しうる。
【０２０４】
II. 薬学的組成物
ATTACは薬学的組成物として用いられうる。したがって、それらは薬学的に許容される担体を使って調製しうる。例えば非経口投与が望まれる場合、ATTACは、滅菌パイロジェンフリー注射用水または滅菌パイロジェンフリー食塩水に入れて提供されうる。あるいは、ATTACは、滅菌液状担体を加えて再懸濁するための凍結乾燥型で提供されうる。
【０２０５】
III. ATTACの使用方法
本明細書に記載のATTACは、各成分をさまざまな態様で上に詳述したとおり、少なくとも第1の成分と第2の成分とを含むATTACを患者に投与する工程を含む、がん細胞の存在を特徴とする患者における疾患を処置する方法において使用しうる。加えて、本明細書に記載の作用物質は、患者にATTACを投与する工程を含む、患者自身の免疫応答をがん細胞にターゲティングする方法においても使用しうる。
【０２０６】
いくつかの態様において、患者はがんまたは認識された前悪性状態を有する。いくつかの態様において、患者は、検出不可能ながんを有するが、がんのリスクの増加と関連する突然変異を有することを含めて、がんを発症するリスクが高い。いくつかの態様において、がんを発症するリスクが高い患者は、トランスフォーメーションのリスクが高い前悪性腫瘍を有する。いくつかの態様において、がんを発症するリスクが高い患者は、高いリスクに関連する遺伝子プロファイルを有する。いくつかの態様において、患者におけるがんまたは前悪性状態の存在は、循環腫瘍DNA（circulating tumor DNA:ctDNA）または循環腫瘍細胞の存在に基づいて決定される。いくつかの態様において、処置は先制的または予防的である。いくつかの態様において、処置はがんの発生または再発を原則または阻止する。
【０２０７】
患者に投与される作用物質の量は、問題の状態を処置するための有効量が与えられるように、患者の医師が選択しうる。ATTACの第1の成分と第2の成分は同じ製剤に入れて投与するか、2つの異なる製剤に入れて、患者において活性であるように十分に近接した時間内に投与しうる。
【０２０８】
処置を受ける患者はヒトでありうる。患者は霊長類または哺乳動物でありうる。あるいは、患者は動物、例えば家畜（例えばイヌまたはネコ）、実験動物（例えば実験用齧歯類、例えばマウス、ラットまたはウサギ）または農業上重要な動物（ウマ、ウシ、ヒツジまたはヤギ）でありうる。
【０２０９】
がんは固形悪性疾患または非固形悪性疾患でありうる。がんは、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎がん、黒色腫、肺がん、前立腺がん、精巣がん、甲状腺がん、脳がん、食道がん、胃がん、膵がん、結腸直腸がん、肝がん、白血病、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、リンパ増殖性障害、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患および前悪性疾患など、任意のがんでありうる。
【０２１０】
いくつかの態様において、ATTACで処置される患者は、高レベルの制御性T細胞の存在を特徴とする腫瘍を有する（Fridman WH et al.,Nature Reviews Cancer 12:298-306（2012）の表1参照）。制御性T細胞の存在量が高いことを特徴とする腫瘍を有する患者において、ATTAC治療は、T細胞を非選択的に標的とする他の治療、例えば非選択的BiTEよりも有利でありうる。いくつかの態様において、ATTAC治療は制御性T細胞のエンゲージメントを回避する。いくつかの態様において、活性化されるT細胞の少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％は制御性T細胞ではない。いくつかの態様において、ATTAC治療では制御性T細胞は活性化されない。
【０２１１】
いくつかの態様において、バイオマーカーの存在は、ATTACを受ける患者を選択するために使用される。当技術分野では、www.cancer.gov/about-cancer/diagnosis-staging/diagnosis/tumor-markers-fact-sheetに記載されているものなど、多種多様な腫瘍マーカーが公知である。いくつかの態様において、腫瘍マーカーは、ALK遺伝子の再編成または過剰発現、α-フェトプロテイン、β-2-ミクログロブリン、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、BRCA1またはBRCA2遺伝子突然変異、BCR-ABL融合遺伝子（フィラデルフィア染色体）、BRAF V600突然変異、C-kit/CD117、CA15-3/CA27.29、CA19-9、CA-125、カルシトニン、がん胎児性抗原（CEA）、CD20、クロモグラニンA（CgA）、染色体3、7、17または9p21、上皮起源の循環腫瘍細胞（CELLSEARCH（登録商標））、サイトケラチンフラグメント21-1、EGFR遺伝子突然変異分析、エストロゲン受容体（ER）/プロゲステロン受容体（PR）、フィブリン/フィブリノゲン、HE4、HER2/neu遺伝子増幅またはタンパク質過剰発現、免疫グロブリン、KRAS遺伝子突然変異分析、乳酸デヒドロゲナーゼ、ニューロン特異エノラーゼ（neuron-specific enolase:NSE）、核マトリックスタンパク質22、プログラム死リガンド1（programmed death ligand 1:PD-L1）、前立腺特異抗原（prostate-specific antigen:PSA）、チログロブリン、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（urokinase plasminogen activator:uPA）、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター（plasminogen activator inhibitor:PAI-1）、5タンパク質シグネチャー（OVA1（登録商標））、21遺伝子シグネチャー（Oncotype DX（登録商標））、または70遺伝子シグネチャー（Mammaprint（登録商標））である。
【０２１２】
ATTACは、単独で投与するか、他の形態の治療、例えば外科手術、放射線、従来の化学治療または免疫治療などと一緒に投与しうる。
【０２１３】
いくつかの態様において、免疫治療はチェックポイント遮断である。チェックポイント遮断とは、免疫機能を抑制する阻害性チェックポイント分子を阻害または遮断する作用物質を指す。いくつかの態様において、チェックポイント遮断は、CTLA4、PD1、PD-L1、LAG3、CD40、TIGIT、TIM3、VISTAまたはHLA-Gを標的とする。
【０２１４】
いくつかの態様において、免疫治療は、免疫サイトカインまたはサイトカイン融合物である。サイトカインとは、免疫系を活性化し調節するために身体が天然に作る細胞シグナリングタンパク質を指す。サイトカイン融合物とは、あるサイトカインの全部または一部を含む操作された分子を指す。例えばサイトカイン融合物は、腫瘍へのターゲティングを可能にする抗体、例えばダルロイキン（Darleukin）（Zegers et al.（2015）Clin. Cancer Res.,21,1151-60参照）、テロイキン（Teleukin）（WO2018087172参照）に取り付けられた、あるサイトカインの全部または一部を含みうる。
【０２１５】
いくつかの態様において、免疫治療はがん治療ワクチン接種である。いくつかの態様において、がん治療ワクチン接種はがんと闘うための身体の自然防御を増強する。これらは、共通する腫瘍抗原（例えばE6、E7、NY-ESO、MUC1またはHER2）に対するものであるか、または個別化された突然変異ネオ抗原（mutational neoantigen）に対するものであることができる。
【実施例】
【０２１６】
実施例1: ATTACによるT細胞の標識
ATTACプラットフォームの初期試験を容易にして実証実験を行うために、FITCを用いるモデル系を使用した。免疫細胞を免疫細胞マーカーに対するFITC標識抗体で染色し、初期試験には抗FITC ATTAC成分を使用した。
【０２１７】
したがって、このモデルでは抗FITC ATTAC成分（SEQ ID NO:165）がアダプターATTAC成分として働くことにより、まず、FITC標識抗体を使って、関心対象の免疫細胞上のさまざまな標的抗原を標識することができる。アダプターATTAC成分を使用するということは、免疫細胞表面上の多数の抗原を、必要な2つの成分のうちの半分を構成する1つのATTAC成分を使ってアッセイできることを意味する。こうすれば、免疫細胞は、FITC標識抗体が関心対象の細胞に結合している場合にのみ、抗FITC ATTAC成分で標識されると考えられる。抗FITC ATTAC成分は免疫細胞活性化ドメインの半分を含有し、免疫細胞活性化ドメインのもう一つの半分は、望ましくない腫瘍細胞上の抗原に結合している第2のATTAC成分に由来することになる。
【０２１８】
この実験において、本発明者らは、T細胞（4×106個）を計数し、RPMI＋10％NBS中で2回洗浄した。T細胞を1mlあたり2.6×106個になるように再懸濁し、95μlを15ml Falconチューブに加え、5μlのFITC抗体を加えた後（無処理T細胞には何も加えない）、室温で30分インキュベートした。
【０２１９】
5mlの培地を加えて遠沈することにより、過剰の抗体を洗い流した。上清を除去し、残りの培地（80ul前後）に細胞を再懸濁した。各チューブに100ulの培地を加えた。
【０２２０】
20μlの抗FITC ATTAC成分（SEQ ID NO:165-300μg/ml）を最終濃度が30μg/mlになるように各チューブに加え、室温で30分インキュベートした。
【０２２１】
5mlの培地を加えて遠沈することにより、過剰のATTAC成分を洗い流した。上清を除去し、細胞を1mlあたり0.3×106個になるように再懸濁し、96ウェルU底プレートに1ウェルあたり100μlずつを加えた。
【０２２２】
結果として、T細胞が、抗FITC ATTAC成分を介して、CD3-VL（20G6抗CD3クローン由来）で標識された。
【０２２３】
実施例2: ATTACによる腫瘍細胞の標識
望ましくない腫瘍細胞を、ATTACの組合せで標識するか、またはEpCAMに結合し細胞表面でプロセシングされると結合し直して機能的抗CD3活性化ドメインを生じるT細胞エンゲージング抗体（TEAC）成分で標識する。TEACとは、両方の成分ががん細胞を標的とするキットまたは組成物を指す（WO2017/087789参照）。TEACは、ATTACに含まれている免疫細胞選択部分を欠く。この対形成はサイトカイン分泌によるT細胞応答を生成するので、この対形成を陽性対照として使用した。
【０２２４】
抗FITC ATTAC成分を有するT細胞と抗EpCAM ATTAC成分を有する腫瘍細胞とが互いに混合されると、機能的な抗CD3 VH-VLドメインが生じて、求められているT細胞サブセットを活性化するように、抗FITC ATTAC成分との対を形成させるために、望ましくない腫瘍細胞を、腫瘍細胞上のEpCAMに結合し細胞表面でプロセシングされると対応するCD3ドメインを抗FITC ATTAC成分に提示するATTAC成分で標識した。MCF-7細胞（12×106個）を計数し、RPMI＋10％NBS中で2回洗浄した。
【０２２５】
160μlあたり300,000細胞になるように培地に再懸濁し、（i）EpCAM VH TEAC成分（SEQ ID NO:166）およびEpCAM VL TEAC成分（SEQ ID NO:167）（これらの成分は、両成分ががん細胞を標的とした場合に、［対照として使用した］TEACを形成し、どちらの成分も、免疫細胞選択部分は含有しない）、ならびに（ii）EpCAM VH ATTAC成分（SEQ ID NO:166）のみというラベルを貼った2本の15ml Falconチューブに、2.56mlを加えた。また、別の2本のFalconチューブ、（iii）BiTE標識（SEQ ID NO:168）および（iv）無処理には、160ulを加えた。
【０２２６】
320μlのEpCAM-20G6 VL TEAC成分（300μg/ml）と320μlのEpCAM-20G6 VH TEAC成分（300μg/ml）を互いに混合し、640μlをチューブ（i）に加えた。320ulのEpCAM-20G6 VH ATTAC成分（300μg/ml）をチューブ（ii）に加えた。各ATTAC/TEAC成分の最終濃度は30μg/mlであった。室温で30分間インキュベートした。
【０２２７】
5mlの培地を加えて遠沈することにより、過剰のATTAC/TEAC成分を洗い流した。上清を除去し、細胞を1mlあたり1×106個になるように再懸濁し、既にT細胞（上記参照）が入っている各ウェルに100μlずつ加えた。
【０２２８】
チューブ（i）では、腫瘍細胞が、VHとVLの両方を含有するTEAC成分で標識された。チューブ（ii）では、腫瘍細胞が、抗CD3のVHドメインを含有するEpCAM ATTAC成分だけで標識され、これは、T細胞上に見いだすことができる抗CD3のVLドメインを補完することができる。
【０２２９】
実施例3: 対照
完全な抗CD3分子が腫瘍細胞の表面上にあれば、T細胞は活性化された状態になりうることを実証するために、陽性対照として、腫瘍細胞をBiTE（SEQ ID NO:168）で標識した。腫瘍細胞表面上に抗CD3分子がなければT細胞活性化は起きないことを実証するために、陰性対照として、T細胞を無処理の腫瘍細胞と共にインキュベートした。
【０２３０】
BiTE処理細胞の場合は、20μlのBiTE（SEQ ID NO:168-20μg/ml）を加えた。BiTEの最終濃度は2μg/mlであった。室温で30分間インキュベートした。
【０２３１】
5mlの培地を加えて遠沈することにより、過剰のBiTEを洗い流した。上清を除去し、細胞を1mlあたり1×106個になるように再懸濁し、1ウェルあたり100ulずつ加えた。
【０２３２】
無処理の標的細胞には何も加えなかった。室温で30分間インキュベートした。
【０２３３】
5mlの培地を加え、遠沈した。上清を除去し、細胞を1mlあたり1×106個になるように再懸濁し、1ウェルあたり100ulずつ加えた。
【０２３４】
プレートを37℃で一晩インキュベートし、100μlの上清をIFN-γELISAに使用し、次に細胞を三つ組のウェルからプールし、FACS染色に使用した。
【０２３５】
実施例4: IFN-γELISA
IFN-γELISAアッセイには、ThermoFisher製のキット（カタログ番号88-7316-77）を使用した。
【０２３６】
IFNγアッセイ一般の背景:インビトロでのサイトカインマーカーの発現、例えばIFNγ発現は、T細胞応答に関して予測的価値を有することが公知であり、したがってインビボ結果を予測する。Ghanekar et al.,Clin Diag Lab Immunol j 8（3）:628-31（2001）に記載されているように、サイトカインフローサイトメトリー（cytokine flow cytometry:CFC）によって測定されるCD8＋T細胞におけるIFNγ発現は、細胞傷害性Tリンパ球の応答に関する代用マーカーである。Ghanekarの628頁。CD8＋T細胞によるIFNγの発現とCTLエフェクター細胞の活性との間に強い相関があることが、先行研究によって示された。Ghanekarの630頁。IFNγ発現に関するデータを使用すれば、臨床の場でのCD8＋T細胞応答の評価における確度を高めうることが、先行技術によって示された。同上書631頁。これは、本明細書におけるサイトカイン発現アッセイが、インビボ応答および臨床的応答に関して予測的価値を有することは、公知であったことを実証している。IFNγ発現を評価する方法は複数あるので、本明細書における方法は、Ghanekarの方法工程に厳密に従うものではないが、Ghanekarは、IFNγ発現がT細胞活性の代用データであることを実証している。
【０２３７】
実施例5: フローサイトメトリー
細胞を3mlのFACS緩衝液（PBS＋2％血清）中で洗浄し、上清を捨てた。細胞をCD3、CD4、CD8およびCD69（T細胞活性化マーカー）に対する抗体で30分間染色した。FACS緩衝液を使って過剰の抗体を洗い流した。フローサイトメーターでの実験に先だって細胞を濾過した。
【０２３８】
実施例6: 結果
図3A〜3CにTEACによる選択的T細胞活性化の結果を示す。この実験は、FITCコンジュゲート抗体でT細胞を標識しても、腫瘍細胞表面上のCD3分子を認識し、それに応答して活性化された状態になるそれらの能力は変化しないことを実証している。標的細胞は、EpCAM-CD3VH TEAC成分とEpCAM-CD3VL TEAC成分とに結合する（したがって抗CD3分子の両半分を有する）ことになる。図3Aに示すように、予想どおり、IFNγ放出量は、TEAC標識腫瘍細胞を使ったすべての試験にわたって、よく似ており、したがってT細胞表面上のFITCコンジュゲート抗体の明白な阻害効果はない。すなわち結合している抗体による遮断はない。
【０２３９】
対照はうまく機能してBiTEによる強いT細胞活性化を与え、非標識標的細胞（細胞表面に抗CD3がないもの）と共にインキュベートした場合には、T細胞活性化は起きない。したがって、より具体的に述べると、この対照実験は、TEACがCD4とCD8の間で選択的でないこと、およびFITCモデルを使っても予想される結果は変化しなかったことを表している。FITCモデルの使用はT細胞活性化を妨げない。図3A〜Cにみられるこれらの結果は、完全な抗CD3活性化ドメインが腫瘍細胞上に存在する場合の、すべてのT細胞サブセット（CD4およびCD8）の活性化を実証している。
【０２４０】
図3Bおよび3Cは、T細胞活性化を、バックグラウンドを上回る平均蛍光強度をリードアウトとして使用するCD69フローサイトメトリー染色によって示している。IFNγ結果と同様に、ここでも、T細胞を標識する抗体の阻害効果はないことが、CD4 T細胞の活性化（図3B）によって実証された。同様の結果はCD8 T細胞でも見ることができる（図3C）。
【０２４１】
図4A〜4CはATTACによる選択的T細胞活性化のさらなる証拠を提供する。同じ実験のこの部分は図3に示す部分の繰り返しであるが、この場合は、腫瘍細胞は1つのATTAC成分（EpCAM VH（SEQ ID NO:166））;抗CD3分子の半分）だけを有し、T細胞は抗FITC ATTAC成分（抗FITC VH（SEQ ID NO:165））;抗CD3分子の相補的半分）を有する。T細胞活性化の代用データとしてのIFNγ結果（図4A）を見ると、T細胞をCD52、CD8およびCXCR3で標識した場合にのみ、T細胞活性化が起きている。CD8、CD52およびCXCR3に結合するFITCコンジュゲート抗体でT細胞が標識されている場合に、EpCAM ATTAC成分/FITC ATTAC成分対に対する強いT細胞応答が見られた。図4B（CD4 T細胞）および図4C（CD8 T細胞）は、T細胞活性化を、バックグラウンドを上回るMFIをリードアウトとして使用するCD69フローサイトメトリー染色によって示している。抗CD8 FITC ATTAC成分を使用した場合にCD8 T細胞の選択的活性化が見られ、CD4 T細胞の活性化はなかった（図4Bと図4Cの矢印を対比参照されたい）。
【０２４２】
したがって、列挙したタンパク質をすべてのT細胞がその細胞表面に発現するにもかかわらず（図5A〜図5I）、CD52、CD8およびCXCR3へのATTAC成分の（FITCを介した）結合だけが、T細胞活性化を可能にした。
【０２４３】
実験を実行する前にFITCコンジュゲート抗体で染色されたT細胞は、抗FITC ATTAC成分が結合するためのFITCがT細胞上に存在することを示している。
【０２４４】
また、図4Bおよび4Cは、T細胞活性化を、バックグラウンドを上回る平均蛍光強度をリードアウトとして使用するCD69フローサイトメトリーによって実証している。CD4 T細胞とCD8 T細胞はどちらも、CD52、CD5、CXCR3、およびHLA-DRを発現すると考えられる。したがって、これらの抗体で標識されたCD4 T細胞とCD8 T細胞の両方の活性化を示す結果が予想され、それはIFNγELISAの結果と合致する。
【０２４５】
CD8標識での図4Bおよび4Cの結果がここでは最も重要である。それらは、ATTACが、あるT細胞タイプを別のT細胞タイプと比較して特異的に活性化できることを実証しているからである。T細胞のすべてをCD8-FITC ATTAC成分および抗FITC ATTAC成分で標識した場合、これらのタンパク質はCD8 T細胞にのみ結合し、CD4 T細胞には結合しないと考えられる。すべてのT細胞を、相補的ATTAC成分を発現する腫瘍細胞と共に一晩インキュベートすると、フローサイトメトリーから、CD4 T細胞の活性化はないが、CD8 T細胞の活性化は起こることが、CD69染色によってわかる。
【０２４６】
図6A〜8Fの結果は、上記と同じプロトコールを使用しているが、図3A〜Cおよび図4A〜Cに示す実験とは、実験の実行に先だって新鮮単離無刺激T細胞を使用し、T細胞標識のために、より多くのFITCコンジュゲート抗体を添加する点だけが異なる。
【０２４７】
図6A〜6Fは、TEACによる選択的T細胞活性化がFITC抗体によって遮断されないことのさらなる証拠を提供している。
【０２４８】
標的細胞はEpCAM-CD3VHとEpCAM-CD3VLをどちらも有する（したがって抗CD3分子の両半分を有する）。図6Aは、予想どおり、IFNγ放出量が、EpCAM VH/VL TEAC対標識腫瘍細胞を使ったすべての試験にわたって、よく似ており、したがってT細胞表面上のFITCコンジュゲート抗体の明白な阻害効果はないこと、すなわち結合している抗体による遮断はないことを示している。
【０２４９】
図6Aにおける対照はうまく機能してBiTEによる強いT細胞活性化を与え、非標識標的細胞（細胞表面に抗CD3がないもの）と共にインキュベートした場合には、T細胞活性化は起きない。
【０２５０】
図6B〜6Eは、代表的な生データフローサイトメトリープロットであり、図6Fは、CD4 T細胞に関するT細胞活性化データを照合している。図6B〜6Eに示す破線のプロットは、バックグラウンドCD69活性化レベルとしての役割を果たす無処理T細胞のCD69染色を示している。図6B〜6Eにおける実線のプロットは、ATTAC標識腫瘍細胞と共に一晩インキュベートされたT細胞のCD69染色を示している。図6B〜6Eは、代表的な生データフローサイトメトリープロットを提示しており、照合されたデータが図6Fに提示されている。
【０２５１】
予想どおり、両TEAC成分が腫瘍細胞に結合しているときは、すべての抗体標識T細胞間で、よく似たCD4 T細胞活性化が起きる。
【０２５２】
図7A〜7Fは、図6A〜Fと同様の情報を提供しているが、CD8 T細胞を対象としている。図7Fは、両TEAC成分が腫瘍細胞に結合しているときの、すべての抗体標識T細胞にわたってよく似たCD8 T細胞活性化を示している。図7B〜7Eは、代表的な生データフローサイトメトリープロットを提示しており、照合されたデータが図7Fに提示されている。
【０２５３】
図8A〜8Fは追加情報を提供しており、図6A〜6Fおよび7A〜7Fに基づくが、この場合は、腫瘍細胞は1つのATTAC成分（抗CD3分子の半分）によって結合しており、T細胞は抗FITC ATTAC成分（抗CD3分子の相補的な半分）によって結合している。T細胞活性化の代用データとしてのIFNγ結果を見ると、T細胞をCD52、CD8（4つの異なる抗CD8抗体クローン）およびCXCR3で標識した場合にのみ、T細胞活性化が起きている（図8A）。ここでも、図8B〜8Eは、代表的な生データフローサイトメトリープロットを提示しており、照合されたデータが図8Fに提示されている。
【０２５４】
CD4 T細胞の活性化はCD52抗体およびCXCR3抗体と結合している場合にのみ見られ、CD8抗体を含む他の抗体が結合している場合には、CD4 T細胞の活性化は見られなかった。
【０２５５】
図9A〜9Fは、図8A〜8Fに示したものと似た実験であるが、CD8 T細胞に関するものを示している。照合されたデータ（図9F）に示すように、CD52抗体およびCXCR3抗体は、それらがCD4 T細胞を活性化するのと同じようにCD8 T細胞を活性化したが、この場合は、CD8抗体も同様にCD8 T細胞を活性化した。
【０２５６】
これらのデータは、T細胞表面上に抗CD3 VLを用意する手段としてCD8 FITC抗体と抗FITC ATTAC成分とを使用し、それが、その場で、腫瘍細胞表面上に存在する抗CD3 VHとの対をEpCAM ATTAC成分の結合によって形成できるようにすることで、CD4 T細胞ではなくCD8 T細胞の特異的活性化が起きることを裏付けている。
【０２５７】
実施例7. 抗CD8 ATTACを使ったFACs分析実験
FITCを用いるモデル系ではなく、免疫細胞への直接ターゲティングによる実験を行った。
【０２５８】
ATTACは2つの成分を含む。これらの実施例では、便宜上、標的指向された免疫細胞結合作用物質を含む第1の成分をATTAC1と呼び、選択された免疫細胞への結合作用物質を含む第2の成分をATTAC2と呼ぶ。
【０２５９】
いくつかの実施例では、がんを標的とする能力を有するターゲティング部分を含む成分を、やはりがんを標的とする能力を有するターゲティング部分を含む第2の成分と一緒に使用することで、TEACを生成させた。TEACは本明細書では対照として使用される。TEAC対照は、両成分ががん細胞を標的とする場合に誘導される活性を示す。
【０２６０】
EpCAMを過剰発現するMDA-MB-231細胞を、抗EpCAM ATTAC1（抗CD3 VHドメインを含有する（SEQ ID NO:166））で標識し、過剰のATTAC成分を洗浄によって除去した。
【０２６１】
健常ドナーからの末梢血単核球（PBMC）を抗CD8 ATTAC2（抗CD3 VLドメインを含有する（SEQ ID NO:170））で標識し、過剰のATTAC成分を洗浄によって除去した。
【０２６２】
対照細胞は抗EpCAM TEACで標識した。抗EpCAM TEACを使用する実験の場合（SEQ ID NO:166およびSEQ ID NO:167）、免疫細胞に結合するターゲティング部分はなく、両方の成分が腫瘍細胞上のEpCAMに結合することになる。したがってこの対照実験では、TEAC対は免疫細胞選択部分による特異性を付与しないと考えられる。
【０２６３】
次にPBMCを、1:2のPBMC対腫瘍細胞比で、腫瘍細胞と共培養した。ATTACは、外因性プロテアーゼ（エンテロキナーゼ）の添加によってタンパク質分解的な活性化が可能であり、混合された細胞にそのプロテアーゼを添加するか、または添加しなかった。次に、共培養細胞を37℃で一晩インキュベートした。
【０２６４】
インキュベーション後に、共培養された細胞をFACS緩衝液（PBS＋2％血清）中で洗浄し、CD4 T細胞サブセットおよびCD8 T細胞サブセットの（CD69染色の増加によって測定される）T細胞活性化のレベルを確かめるために、CD3 APC-Cy7、CD4 PE、CD8 APCおよびCD69 FITCを使ってフローサイトメトリー用に標識した。
【０２６５】
エンテロキナーゼ（プロテアーゼ）を加えると、抗EpCAM ATTAC1および抗CD8 ATTAC2による処理後に、CD8 T細胞の活性化の増加が見られた（図10B、破線）。外因性プロテアーゼを添加しなかった標識PBMC（図10B、実線）、または無処理PBMC（塗りつぶされたヒストグラム）の場合、このATTAC対では、活性化はなかった。これらの結果により、ATTAC活性にはタンパク質分解的活性化が必要であることが確認される。さらにまた、抗EpCAM ATTAC1および抗CD8 ATTAC2の処理後に、プロテアーゼの存在下でCD4 T細胞サブセットの活性化はなく（図10A、破線）、結果は無処理PBMC（塗りつぶされたヒストグラム）に似ていた。
【０２６６】
腫瘍細胞表面において機能的な抗CD3部分が形成するように、TEACの両成分を腫瘍細胞に結合させると（TEAC成分対がどちらもEpCAMに結合する対照）、CD69染色で測定すると、CD4 T細胞（図10A、点線）とCD8 T細胞（図10B、点線）の両方が活性化される。
【０２６７】
これらの結果は、EpCAM ATTAC VH（ATTAC1）＋CD8 ATTAC VL（ATTAC2）による処理が、プロテアーゼの存在下でCD8 T細胞を活性化し、CD4 T細胞は活性化しないことを示している。対照的に、EpCAM TEAC成分対による処理は、CD4 T細胞とCD8 T細胞をどちらも活性化する。
【０２６８】
このように、ATTACは、抗腫瘍免疫応答の成功にとって決定的に重要なCD8 T細胞を特異的に活性化するために使用することができる。
【０２６９】
実施例8. 抗CD8 ATTACを使ったインターフェロンγ放出実験
腫瘍細胞抗原を標的とするATTAC1と免疫細胞抗原を標的とするATTAC2との活性を評価するために、インターフェロンγ放出も使用した。この実施例において、ATTAC1は、腫瘍細胞上に発現するEpCAMを標的とすることによってがんを標的とする能力を有するターゲティング部分と、抗CD3 VHドメインとを含む。ATTAC2は、CD8を標的とすることによって免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する免疫細胞選択部分と、抗CD3 VHドメインとを含む。
【０２７０】
腫瘍細胞を一連の濃度の抗EpCAM ATTAC1（抗EpCAM機能と抗CD3 VHドメインの両方を含有する（SEQ ID NO:166）;「EpCAM VH」と名付ける）で標識し、過剰のATTAC成分を洗浄によって除去した。健常ドナーからのPBMC（図11A）または培養T細胞（図11B）を一連の濃度の抗CD8 ATTAC2（抗CD8機能と抗CD3 VLドメインの両方を含有する（SEQ ID NO:170）;「CD8 VL」と名付ける）で標識し、過剰のATTAC成分を洗浄によって除去した。次に、PBMCまたはT細胞を、1:4のPBMC対腫瘍細胞比で、腫瘍細胞と共培養した。ATTACは、外因性プロテアーゼ（エンテロキナーゼ）の添加によってタンパク質分解的な活性化が可能であり、混合された細胞にそのプロテアーゼを添加するか、または添加しなかった。次に、共培養細胞を37℃で一晩インキュベートした。
【０２７１】
共培養に続いて、上清を、活性化T細胞によるサイトカイン放出を表すインターフェロンγ（IFN-γ）の存在についてアッセイした。細胞を外因性プロテアーゼの存在下で培養すると、PBMC（図11A）と培養T細胞（図11B）のどちらによるインターフェロンγ放出にも、用量依存的増加があったが、プロテアーゼが存在しない場合はインターフェロンγ放出の増加がない。PBMCにおけるインターフェロンγのベースラインレベルが培養T細胞と比べて高いのは、PBMC試料におけるNK細胞の存在によるのかもしれない。NK細胞はインターフェロンγを産生することができるからである。
【０２７２】
図11Aおよび11Bの結果は、T細胞応答の生成におけるATTACのタンパク質分解的活性化の必要性を実証している。さらに、ATTAC応答は用量依存的であった。
【０２７３】
実験対照では、T細胞（図11D）またはPBMC培養物中のT細胞（図11C）を、単独で、または無処理の腫瘍細胞と共に（標的＋T細胞群）インキュベートした場合に、インターフェロンγ放出による測定で、T細胞活性化はなかった。陽性対照として、EpCAM結合性二重特異性T細胞エンゲージャ（bi-specific T cell engager:BiTE;SEQ ID NO:168）で標識された腫瘍細胞と共に培養すると、T細胞が活性化された。
【０２７４】
実施例9. ATTACの濃度依存性の解析
ATTAC1が腫瘍細胞抗原を標的とし、ATTAC2が免疫細胞抗原を標的とする、ATTAC対の濃度依存性を試験した。
【０２７５】
腫瘍細胞を、一連の濃度の抗EpCAM ATTAC1（抗CD3 VHドメインを含有する;SEQ ID NO:166）で標識し、過剰のATTAC成分を洗浄によって除去した。健常ドナーからのPBMC（図12A）を、一連の濃度の抗CD8 ATTAC2（抗CD3 VLドメインを含有する;SEQ ID NO:170）で標識し、過剰のATTAC成分を洗浄によって除去した。T細胞活性化（インターフェロンγに関してアッセイすることによるもの）が2つのATTAC成分の一方に傾いているかどうかを決定するために、ATTAC1とATTAC2を等モル濃度に保つのではなく、ATTAC1とATTAC2の濃度を異なるモル比にした。腫瘍細胞とPBMCの両方がそれぞれのATTAC成分で標識されたら、細胞を37℃で一晩共培養した。
【０２７６】
このデータは、ATTAC1とATTAC2の濃度が等モル濃度で増加した場合の、強いT細胞活性化を実証している（図12A）。濃度がATTAC1またはATTAC2のどちらか一方に傾いているときは、T細胞活性化のレベルが減少する。これは、（PBMC内の）T細胞の最も強い活性化は等モル濃度のATTAC1とATTAC2とで見られることを示唆している。図12Bは、等モル濃度のATTAC1とATTAC2との増加（図12Aにおいて破線で表されるもの）に伴うT細胞活性化の増加が、使用したどちらかのATTAC成分への傾きを示さなかったこと、およびATTAC1とATTAC2がT細胞の活性化においてどちらも等しく重要であることを示している。
【０２７７】
図12Cは、単独で培養するか無処理標的細胞と共に培養したPBMC中のT細胞からのインターフェロン放出に関する対照データを示す。陽性対照として、図12Cは、培養標的細胞をBiTE（SEQ ID NO:168）で標識した場合の、PBMC中のT細胞からの強いインターフェロンγ放出を示している。
【０２７８】
実施例10. ATTACによるT細胞サブセットの選択的活性化
FITCを用いるモデル系でも、T細胞サブセットの選択的活性化を試験した。
【０２７９】
腫瘍細胞を抗EpCAM ATTAC1（抗CD3 VHドメインを含有する（SEQ ID NO:166））で標識し、過剰のATTAC成分を洗浄によって除去した。健常ドナーからのPBMCを、CD4、CD8またはCD19に対するFITCコンジュゲート抗体で標識し、過剰の抗体を洗浄によって除去した。PBMCを、抗FITC ATTAC2（抗CD3 VLドメインを含有する（SEQ ID NO:165））でさらに標識し、過剰のATTAC成分を洗浄によって除去した。次にPBMCを、1:2のPBMC対腫瘍細胞比で、腫瘍細胞と共培養した。ATTACは、外因性プロテアーゼ（エンテロキナーゼ）の添加によってタンパク質分解的な活性化が可能であり、混合された細胞にそのプロテアーゼを添加した。次に、共培養細胞を37℃で一晩インキュベートした。
【０２８０】
これらの実験では、FITCで標識されたCD19細胞が陰性対照である。なぜなら、CD19を発現する細胞は、通常、CD3を発現しないからである。したがって、CD19陽性細胞への抗FITC ATTAC成分の結合は、ATTAC成分対からの対形成した抗CD3 VH/VLによる活性化にはつながらないと考えられる。
【０２８１】
インキュベーション後に、共培養された細胞をFACS緩衝液（PBS＋2％血清）中で洗浄し、CD4 T細胞サブセットおよびCD8 T細胞サブセットの（CD69染色の増加によって測定される）T細胞活性化のレベルを確かめるために、CD3 APC-Cy7、CD4 PE、CD8 APCおよびCD69 BV421を使ってフローサイトメトリー用に標識した。過剰の抗体を洗浄によって除去し、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。PBMCを抗CD4 FITC抗体で標識した場合は、CD4 T細胞だけが（無処理T細胞のバックグラウンド活性化と比較して）有意に活性化された（図13A）。この例では、抗CD3 VLドメインを含有する抗FITC ATTAC2がCD4 T細胞だけに結合して、T細胞のこのサブセットが活性化された。抗CD8 FITC抗体または抗CD19 FITC抗体で標識されたPBMCはCD4 T細胞の有意な活性化を引き起こさなかった。なぜならCD4細胞はこれらの抗原を発現しないからである。
【０２８２】
対照的に、PBMCを抗CD8 FITC抗体で標識した場合は、CD8 T細胞だけが（無処理T細胞のバックグラウンド活性化と比較して）有意に活性化された（図13B）。この例では、抗CD3 VLドメインを含有する抗FITC ATTAC2がCD8 T細胞だけに結合して、T細胞のこのサブセットが活性化された。抗CD4 FITC抗体または抗CD19 FITC抗体で標識されたPBMCはCD8 T細胞の活性化を引き起こさなかった。なぜならCD8細胞はこれらの抗原を発現しないからである。
【０２８３】
これらのデータは、より複雑なT細胞混合物内の特定のT細胞サブセットを活性化するATTACの能力を示している。図13Aおよび13Bに示すように、同じ標的細胞および同じPBMCを使用した場合でさえ、異なるATTAC2成分を使用して、免疫細胞の異なるサブセットを活性化することができた。
【０２８４】
免疫細胞の特定のサブセットの選択的活性化は治療的に有用であると考えられる。例えば、細胞傷害性T細胞だけを活性化するATTACは、制御性T細胞などの望ましくないT細胞の活性化を回避すると考えられる。さらに、腫瘍関連プロテアーゼによる切断を必要とするATTACの使用は、腫瘍微小環境内の免疫細胞の活性化を可能にすることができる。このようにして、ATTACは、腫瘍微小環境内で免疫細胞の特定のサブセットを活性化するための特異性を提供することができた。
【０２８５】
実施例11. SEQ ID NO:169およびSEQ ID NO:170などの抗CD8 ATTACを用いる理論的ATTAC実験
末梢血単核球を抗CD8 ATTAC成分で標識し、過剰のATTAC成分を洗浄によって除去する。抗CD8 ATTAC成分は、抗CD3活性化ドメインの半分（VL）を含有する。望ましくない腫瘍細胞株は、抗CD3活性化ドメインの対応する半分（VH）を含有する抗EpCAM ATTAC成分（SEQ ID NO:166）で標識されると考えられる。そうすれば、ATTACは、末梢血単核球内のCD8 T細胞上のCD3を特異的に活性化することができると考えられる。CD8 T細胞の活性化は、IFNγ分泌に関するELISAによってアッセイするか、CD69およびCD38などの活性化マーカーをアッセイするフローサイトメトリーによってアッセイすることができる。
【０２８６】
実施例12. SEQ ID NO:171などの抗CD4 ATTACを用いる理論的ATTAC実験
末梢血単核球を抗CD4 ATTAC成分で標識し、過剰のATTAC成分を洗浄によって除去する。抗CD4 ATTAC成分は、抗CD3活性化ドメインの半分（VL）を含有する（SEQ ID NO:166）。望ましくない腫瘍細胞株は、抗CD3活性化ドメインの対応する半分（VH）を含有する抗EpCAM ATTAC成分で標識されると考えられる。そうすれば、ATTACは、末梢血単核球内のCD4 T細胞上のCD3を特異的に活性化することができると考えられる。CD4 T細胞の活性化は、IFNγ分泌に関するELISAによってアッセイするか、CD69およびCD38などの活性化マーカーをアッセイするフローサイトメトリーによってアッセイすることができる。
【０２８７】
実施例13. 態様
以下の番号付き項目は本明細書に記載の態様であるが、ここに具陳する態様は限定するものではない。
項目1. a. 標的指向された免疫細胞結合作用物質を含む第1の成分であって、
i. がんを標的とする能力を有するターゲティング部分；
ii. 該第1の成分の一部ではない第2の免疫細胞エンゲージングドメインに結合した場合に免疫エンゲージング活性を示す能力を有する、第1の免疫細胞エンゲージングドメイン
を含む、該第1の成分、
b. 選択的な免疫細胞結合作用物質を含む第2の成分であって、
i. 免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する免疫細胞選択部分；
ii. 該第1の免疫細胞エンゲージングドメインに結合した場合に免疫細胞エンゲージング活性を示す能力を有する、第2の免疫細胞エンゲージングドメイン
を含み、
該第1の免疫細胞エンゲージングドメインと該第2の免疫細胞エンゲージングドメインが、どちらも不活性結合パートナーに結合していない場合に、結合する能力を有する、
該第2の成分
を含む、患者における該がんを処置するための作用物質であって、
該第1の免疫細胞エンゲージングドメインまたは該第2の免疫細胞エンゲージングドメインのうちの少なくとも一方が、
不活性結合パートナーが除去されない限り該第1の免疫細胞エンゲージングドメインと該第2の免疫細胞エンゲージングドメインとが互いに結合しないように、該不活性結合パートナーに結合しており、かつ
不活性結合パートナーとそれが結合する該免疫細胞エンゲージングドメインとを分離する切断部位をさらに含み、
該切断部位が、
1. がん細胞によって発現される酵素によって切断されるか、
2. がん細胞内部でのpH感受性切断反応によって切断されるか、
3. 補体依存性切断反応によって切断されるか、または
4. 該作用物質中の該ターゲティング部分と同じもしくは異なるターゲティング部分によってがん細胞に共局在化されたプロテアーゼによって切断される、
該作用物質。
項目2. 前記第1の成分が前記第2の成分に共有結合していない、項目1の作用物質。
項目3. 前記第1の成分が前記第2の成分に共有結合している、項目1の作用物質。
項目4. 前記免疫細胞エンゲージングドメインが、互いに結合している場合に、前記免疫細胞の表面に発現する抗原に結合する能力を有する、項目1〜項目3のいずれかの作用物質。
項目5. 免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する前記免疫細胞選択部分が、T細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、好中球、好酸球、好塩基球、γδT細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT細胞）、または操作された免疫細胞を選択的に標的とする、項目1〜項目4のいずれかの作用物質。
項目6. 免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する前記免疫細胞選択部分がT細胞を選択的に標的とする、項目5の作用物質。
項目7. 前記T細胞が細胞傷害性T細胞である、項目6の作用物質。
項目8. 前記細胞傷害性T細胞がCD8＋T細胞である、項目7の作用物質。
項目9. 前記T細胞がヘルパーT細胞である、項目6の作用物質。
項目10. 前記ヘルパーT細胞がCD4＋T細胞である、項目9の作用物質。
項目11. 前記免疫細胞選択部分がCD8、CD4、またはCXCR3を標的とする、項目6〜項目10のいずれかの作用物質。
項目12. 前記免疫細胞選択部分が制御性T細胞に特異的に結合しない、項目6〜項目11のいずれかの作用物質。
項目13. 前記免疫細胞選択部分がTH17細胞に特異的に結合しない、項目6〜項目12のいずれかの作用物質。
項目14. 前記免疫細胞エンゲージングドメインが、互いに結合している場合に、CD3に結合する能力を有する、項目6〜項目13のいずれかの作用物質。
項目15. 前記免疫細胞エンゲージングドメインが、互いに結合している場合に、TCRに結合する能力を有する、項目6〜項目13のいずれかの作用物質。
項目16. 免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する前記免疫細胞選択部分がナチュラルキラー細胞を選択的に標的とする、項目5の作用物質。
項目17. 前記免疫細胞選択部分がCD2またはCD56を標的とする、項目16の作用物質。
項目18. 前記免疫細胞エンゲージングドメインが、互いに結合している場合に、NKG2D、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、またはDNAMに結合する能力を有する、項目16〜項目17のいずれかの作用物質。
項目19. 免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する前記免疫細胞選択部分がマクロファージを選択的に標的とする、項目5の作用物質。
項目20. 前記免疫細胞選択部分がCD14、CD11b、またはCD40を標的とする、項目19の作用物質。
項目21. 前記免疫細胞エンゲージングドメインが、互いに結合している場合に、CD89（Fcα受容体1）、CD64（Fcγ受容体1）、CD32（Fcγ受容体2A）、またはCD16a（Fcγ受容体3A）に結合する能力を有する、項目19〜項目20のいずれかの作用物質。
項目22. 免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する前記免疫細胞選択部分が好中球を選択的に標的とする、項目5の作用物質。
項目23. 前記免疫細胞選択部分がCD15を標的とする、項目22の作用物質。
項目24. 前記免疫細胞エンゲージングドメインが、互いに結合している場合に、CD89（FcαR1）、FcγRI（CD64）、FcγRIIA（CD32）、FcγRIIIA（CD16a）、CD11b（CR3、αMβ2）、TLR2、TLR4、CLEC7A（デクチン1）、ホルミルペプチド受容体1（FPR1）、ホルミルペプチド受容体2（FPR2）、またはホルミルペプチド受容体3（FPR3）に結合する能力を有する、項目22〜項目23のいずれかの作用物質。
項目25. 免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する前記免疫細胞選択部分が好酸球を選択的に標的とする、項目5の作用物質。
項目26. 前記免疫細胞選択部分が、CD193、シグレック-8、またはEMR1を標的とする、項目25の作用物質。
項目27. 前記免疫細胞エンゲージングドメインが、互いに結合している場合に、CD89（Fcα受容体1）、FcεRI、FcγRI（CD64）、FcγRIIA（CD32）、FcγRIIIB（CD16b）、またはTLR4に結合する能力を有する、項目25〜項目26のいずれかの作用物質。
項目28. 免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する前記免疫細胞選択部分が好塩基球を選択的に標的とする、項目5の作用物質。
項目29. 前記免疫細胞選択部分が、2D7、CD203c、またはFcεRIαを標的とする、項目28の作用物質。
項目30. 前記免疫細胞エンゲージングドメインが、互いに結合している場合に、CD89（Fcα受容体1）またはFcεRIに結合する能力を有する、項目28〜項目29のいずれかの作用物質。
項目31. 免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する前記免疫細胞選択部分がγδT細胞を選択的に標的とする、項目5の作用物質。
項目32. 前記免疫細胞選択部分がγδTCRを標的とする、項目31の作用物質。
項目33. 前記免疫細胞エンゲージングドメインが、互いに結合している場合に、γδTCR、NKG2D、CD3複合体（CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD3η）、4-1BB、DNAM-1、またはTLR（TLR2、TLR6）に結合する能力を有する、項目31〜項目32のいずれかの作用物質。
項目34. 免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する前記免疫細胞選択部分がナチュラルキラーT細胞を選択的に標的とする、項目5の作用物質。
項目35. 前記免疫細胞選択部分がVα24またはCD56を標的とする、項目34の作用物質。
項目36. 前記免疫細胞エンゲージングドメインが、互いに結合している場合に、αβTCR、NKG2D、CD3複合体（CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD3η）、4-1BB、またはIL-12Rに結合する能力を有する、項目34〜項目35のいずれかの作用物質。
項目37. 免疫細胞を選択的に標的とする能力を有する前記免疫細胞選択部分が、操作された免疫細胞を選択的に標的とする、項目5の作用物質。
項目38. 前記操作された免疫細胞が、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞、CARナチュラルキラー細胞、CARナチュラルキラーT細胞、またはCAR γδT細胞である、項目37の作用物質。
項目39. 前記免疫細胞選択部分が、CAR、または免疫細胞上に発現したマーカーを標的とする、項目37〜項目38の作用物質。
項目40. 前記免疫選択部分がLNGFRまたはCD20を標的とする、項目37〜項目39の作用物質。
項目41. 前記免疫細胞エンゲージングドメインが、互いに結合している場合に、前記操作された免疫細胞によって発現される抗原に結合する能力を有する、項目37〜項目40の作用物質。
項目42. 前記操作された免疫細胞によって発現される抗原がCD3である、項目37〜項目41の作用物質。
項目43. 前記免疫細胞選択部分が抗体またはその抗原特異的結合フラグメントを含む、項目1〜項目42のいずれかの作用物質。
項目44. 前記抗体またはその抗原特異的結合フラグメントがT細胞上の抗原に特異的に結合する、項目43の作用物質。
項目45. 前記抗体またはその抗原特異的結合フラグメントが、細胞傷害性T細胞上またはヘルパーT細胞上の抗原に特異的に結合する、項目43のいずれかの作用物質。
項目46. 前記抗体またはその抗原特異的結合フラグメントがマクロファージ上の抗原に特異的に結合する、項目43の作用物質。
項目47. 前記抗体またはその抗原特異的結合フラグメントがナチュラルキラー細胞上の抗原に特異的に結合する、項目43の作用物質。
項目48. 前記抗体またはその抗原特異的結合フラグメントが好中球上の抗原に特異的に結合する、項目43の作用物質。
項目49. 前記抗体またはその抗原特異的結合フラグメントが好酸球上の抗原に特異的に結合する、項目43の作用物質。
項目50. 前記抗体またはその抗原特異的結合フラグメントがγδT細胞上の抗原に特異的に結合する、項目43の作用物質。
項目51. 前記抗体またはその抗原特異的結合フラグメントがナチュラルキラーT細胞上の抗原に特異的に結合する、項目43の作用物質。
項目52. 前記抗体またはその抗原特異的結合フラグメントが、操作された免疫細胞上の抗原に特異的に結合する、項目43の作用物質。
項目53. 前記操作された免疫細胞が、CAR T細胞、CARナチュラルキラー細胞、CARナチュラルキラーT細胞、またはCAR γδT細胞である、項目43の作用物質。
項目54. 前記免疫選択部分がアプタマーを含む、項目1〜項目42のいずれかの作用物質。
項目55. 前記アプタマーがT細胞上の抗原に特異的に結合する、項目54の作用物質。
項目56. T細胞が細胞傷害性T細胞またはヘルパーT細胞である、項目55の作用物質。
項目57. 前記アプタマーがマクロファージ上の抗原に特異的に結合する、項目54の作用物質。
項目58. 前記アプタマーがナチュラルキラー細胞上の抗原に特異的に結合する、項目54の作用物質。
項目59. 前記アプタマーが好中球上の抗原に特異的に結合する、項目54の作用物質。
項目60. 前記アプタマーが好酸球上の抗原に特異的に結合する、項目54の作用物質。
項目61. 前記アプタマーがγδT細胞上の抗原に特異的に結合する、項目54の作用物質。
項目62. 前記アプタマーがナチュラルキラーT細胞上の抗原に特異的に結合する、項目54の作用物質。
項目63. 前記アプタマーが、操作された免疫細胞上の抗原に特異的に結合する、項目54の作用物質。
項目64. 前記操作された免疫細胞が、CAR T細胞、CARナチュラルキラー細胞、CARナチュラルキラーT細胞、またはCAR γδT細胞である、項目54の作用物質。
項目65. 前記アプタマーがDNAを含む、項目54〜項目64のいずれかの作用物質。
項目66. 前記アプタマーがRNAを含む、項目54〜項目64のいずれかの作用物質。
項目67. 前記アプタマーが一本鎖である、項目65〜項目66のいずれかの作用物質。
項目68. 前記アプタマーが、ランダム候補ライブラリーから選択された選択的な免疫細胞結合特異的アプタマーである、項目54〜項目67のいずれかの作用物質。
項目69. 前記ターゲティング部分が抗体または抗原特異的結合フラグメントである、項目1〜項目68のいずれかの作用物質。
項目70. 前記抗体またはその抗原特異的結合フラグメントが、がん抗原に特異的に結合する、項目69の作用物質。
項目71. 前記ターゲティング部分がアプタマーである、項目1〜項目68のいずれかの作用物質。
項目72. 前記アプタマーが、がん抗原に特異的に結合する、項目71の作用物質。
項目73. 前記アプタマーがDNAを含む、項目71〜項目72のいずれかの作用物質。
項目74. 前記アプタマーがRNAを含む、項目71〜項目72のいずれかの作用物質。
項目75. 前記アプタマーが一本鎖である、項目73〜項目74のいずれかの作用物質。
項目76. 前記アプタマーが、ランダム候補ライブラリーから選択された標的細胞特異的アプタマーである、項目71〜項目75のいずれかの作用物質。
項目77. 前記アプタマーが抗EGFRアプタマーである、項目71〜項目76のいずれかの作用物質。
項目78. 前記抗EGFRアプタマーがSEQ ID NO:95〜164のうちのいずれか1つを含む、項目77のいずれかの作用物質。
項目79. 前記アプタマーが1ピコモル濃度〜500ナノモル濃度のKdで前記がん細胞上のがんに結合する、項目71〜項目78のいずれかの作用物質。
項目80. 前記アプタマーが1ピコモル濃度〜100ナノモル濃度のKdで前記がんに結合する、項目71〜項目79のいずれかの作用物質。
項目81. 前記ターゲティング部分が、IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、トランスフェリン、葉酸、EGF、TGF、PD1、IL-13、幹細胞因子、インスリン様成長因子（IGF）、またはCD40を含む、項目1〜項目68のいずれかの作用物質。
項目82. 前記ターゲティング部分が、IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、トランスフェリン、葉酸、EGF、TGF、PD1、IL-13、幹細胞因子、インスリン様成長因子（IGF）、またはCD40の完全長配列を含む、項目1〜項目68のいずれかの作用物質。
項目83. 前記ターゲティング部分が、IL-2、IL-4、IL-6、α-MSH、トランスフェリン、葉酸、EGF、TGF、PD1、IL-13、幹細胞因子、インスリン様成長因子（IGF）、またはCD40の切断型、類似体、変異体、または誘導体を含む、項目1〜項目68のいずれかの作用物質。
項目84. 前記ターゲティング部分が前記がん上の標的に結合し、該標的が、IL-2受容体、IL-4、IL-6、メラニン細胞刺激ホルモン受容体（MSH受容体）、トランスフェリン受容体（TR）、葉酸受容体1（FOLR）、葉酸ヒドロキシラーゼ（FOLH1）、EGF受容体、PD-L1、PD-L2、IL-13R、CXCR4、IGFR、またはCD40Lを含む、項目1〜項目68のいずれかの作用物質。
項目85. 一方の免疫細胞エンゲージングドメインがVHドメインを含み、かつ他方の免疫細胞エンゲージングドメインがVLドメインを含む、項目1〜項目84のいずれかの作用物質。
項目86. 第1の免疫細胞結合パートナーが、不活性結合パートナーに結合しており、かつ切断部位によってそれから分離される、項目1〜項目85のいずれかの作用物質。
項目87. 第2の免疫細胞結合パートナーが、不活性結合パートナーに結合しており、かつ切断部位によってそれから分離される、項目1〜項目86のいずれかの作用物質。
項目88. a. 前記第1の免疫細胞結合パートナーが不活性結合パートナーに結合しており、かつ第1の切断部位によってそれから分離され、かつ
b. 前記第2の免疫細胞結合パートナーが、該不活性結合パートナーに結合しており、かつ第2の切断部位によってそれから分離される、
項目1〜項目87のいずれかの作用物質。
項目89. 前記第1の切断部位および第2の切断部位が同じ切断部位である、項目88の作用物質。
項目90. 前記第1の切断部位および第2の切断部位が異なる切断部位である、項目88の作用物質。
項目91. 少なくとも1つの切断部位がプロテアーゼ切断部位である、項目1〜項目90のいずれかの作用物質。
項目92. 前記がん細胞によって発現される少なくとも1つの酵素がプロテアーゼである、項目1〜項目91のいずれかの作用物質。
項目93. 少なくとも1つの不活性結合パートナーが前記免疫細胞エンゲージングドメインに特異的に結合する、項目1〜項目92のいずれかの作用物質。
項目94. 少なくとも1つの不活性結合パートナーがVHドメインまたはVLドメインである、項目93の作用物質。
項目95. a. 前記免疫細胞エンゲージングドメインがVHドメインである場合、前記不活性結合パートナーがVLドメインであり、かつ
b. 前記免疫細胞エンゲージングドメインがVLドメインである場合、前記不活性結合パートナーがVHドメインである、
項目94の作用物質。
項目96. 前記第1の成分が、切断部位を含むリンカーによって前記第2の成分に共有結合している、項目3の作用物質。
項目97. 前記切断部位がプロテアーゼ切断部位である、項目96の作用物質。
項目98. 前記プロテアーゼ切断部位が血中で切断されうる、項目97の作用物質。
項目99. 前記プロテアーゼ切断部位が、トロンビン、好中球エステラーゼ、またはフューリンの切断部位である、項目98の作用物質。
項目100. 前記プロテアーゼ切断部位が腫瘍関連プロテアーゼによって切断されうる、項目97の作用物質。
項目101. 前記腫瘍関連プロテアーゼ切断部位がSEQ ID NO:1〜84のうちのいずれか1つを含む、項目100の作用物質。
項目102. a. 標的指向された免疫細胞結合作用物質を含む第1の成分であって、
i. がんを標的とする能力を有するターゲティング部分；
ii. 該第1の成分の一部ではない第2の免疫細胞エンゲージングドメインに結合した場合に免疫エンゲージング活性を示す能力を有する、第1の免疫細胞エンゲージングドメイン
を含む、該第1の成分、
b. 第1の免疫細胞エンゲージングドメインと不活性結合パートナーとを分離し、
i. がん細胞によって発現される酵素によって切断されるか、
ii. がん細胞内部でのpH感受性切断反応によって切断されるか、
iii. 補体依存性切断反応によって切断されるか、または
iv. 作用物質中の該ターゲティング部分と同じもしくは異なるターゲティング部分によってがん細胞に共局在化されたプロテアーゼによって切断される、
切断部位
を含み、選択的な免疫細胞結合作用物質を含む、患者における該がんを処置するための作用物質であって、
該切断部位の切断が、該不活性結合パートナーの喪失を引き起こし、該作用物質の一部ではない該第2の免疫細胞エンゲージングドメインへの結合を可能にする、
該作用物質。
項目103. 項目1〜項目101のいずれかの作用物質の第1の成分および第2の成分をコードする核酸分子のセット。
項目104. 項目102の選択的な免疫細胞結合作用物質をコードする核酸分子。
項目105. 項目1〜項目101のいずれかの作用物質を投与する工程を含む、患者におけるがんを処置する方法。
項目106. 前記患者が腫瘍中に制御性T細胞を有する場合、前記選択的な免疫細胞結合作用物質が、制御性免疫細胞上に存在するマーカー（CD4およびCD25を含むが、それらに限定されない）を標的としない、項目105の方法。
項目107. 前記選択的な免疫細胞結合作用物質が、TH17細胞上に存在するマーカーを標的としない、項目105〜項目106のいずれかの方法。
項目108. 前記選択的な免疫細胞結合作用物質が、腫瘍細胞を溶解の標的とするT細胞を活性化する、項目105〜項目107のいずれかの方法。
項目109. 前記患者が腫瘍中に制御性T細胞を有する場合、前記免疫細胞選択部分が、CD8に特異的に結合することにより、CD8＋T細胞を標的とする、項目105〜項目108のいずれかの方法。
項目110. 前記患者が腫瘍中に制御性T細胞を有する場合、前記免疫細胞選択部分が、CXCR3に特異的に結合することにより、CD8＋T細胞およびCD4＋T細胞を標的とする、項目105〜項目108のいずれかの方法。
項目111. 前記がんが、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎がん、黒色腫、肺がん、前立腺がん、精巣がん、甲状腺がん、脳がん、食道がん、胃がん、膵がん、結腸直腸がん、肝がん、白血病、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、リンパ増殖性障害、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患、または前悪性疾患のうちのいずれか1つである、項目105〜項目110のいずれかの方法。
項目112. 項目1〜項目101のいずれかの作用物質を患者に投与する工程を含む、該患者の免疫応答をがんにターゲティングする方法。
【０２８８】
等価物
上述の明細は、当業者が前記態様を実施することを可能とするのに十分であると考えられる。上記の説明および実施例は、ある特定の態様を詳述し、本発明者らによって想定される最良の形態を記載している。しかしながら、上記が文書中にどれほど詳細に書かれていたとしても、前記態様は、多くの方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲およびその任意の等価物に従って解釈されるべきであることは理解されるであろう。
【０２８９】
本明細書において使用する約という用語は、明示的に示されているか否かを問わず、例えば整数、分数および百分率を含む、数値を指す。一般に、約という用語は、当業者なら具陳されている値と等価である（例えば同じ機能または結果を有する）とみなすであろう数値範囲（例えば具陳されている範囲の±5〜10％）を指す。少なくともおよび約などの用語が数値または範囲のリストの前に付されている場合、それらの用語は、そのリストの値または範囲のすべてを修飾する。場合によっては、約という用語は、直近の有効数字に丸められた数値を含みうる。
【図１Ａ】
2021529779.tif 000066
【図１Ｂ】
2021529779.tif 000067
【図２】
2021529779.tif 000068
【図３】
2021529779.tif 000069
【図４】
2021529779.tif 000070
【図５Ａ】
2021529779.tif 000071
【図５Ｂ】
2021529779.tif 000072
【図５Ｃ】
2021529779.tif 000073
【図５Ｄ】
2021529779.tif 000074
【図５Ｅ】
2021529779.tif 000075
【図５Ｆ】
2021529779.tif 000076
【図５Ｇ】
2021529779.tif 000077
【図５Ｈ】
2021529779.tif 000078
【図５Ｉ】
2021529779.tif 000079
【図６−１】
2021529779.tif 000080
【図６−２】
2021529779.tif 000081
【図６−３】
2021529779.tif 000082
【図７−１】
2021529779.tif 000083
【図７−２】
2021529779.tif 000084
【図７−３】
2021529779.tif 000085
【図８−１】
2021529779.tif 000086
【図８−２】
2021529779.tif 000087
【図８−３】
2021529779.tif 000088
【図９−１】
2021529779.tif 000089
【図９−２】
2021529779.tif 000090
【図９−３】
2021529779.tif 000091
【図１０】
2021529779.tif 000092
【図１１】
2021529779.tif 000093
【図１２】
2021529779.tif 000094
【図１３】
2021529779.tif 000095
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月6日(2021.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021529779000001.app
【国際調査報告】
2021529779.tif 000096
2021529779.tif 000097
2021529779.tif 000098