(57)【要約】ヒト上皮成長因子２（ＨＥＲ２）として公知のタンパク質は、乳癌細胞で発現され、その発現は侵襲性の腫瘍増殖と相関している。本発明は、ヒトＨＥＲ２（単一特異性抗体）またはＡＰＬＰ２（単一特異性抗体）に結合する新規の全長ヒト（ＩｇＧ）抗体を提供する。本発明はまた、ＨＥＲ２及びＡＰＬＰ２の両方に結合し、かつＨＥＲ２発現腫瘍の存在下でＡＰＬＰ２複合体を介してＨＥＲ２の内部移行及び分解を媒介する新規の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）も提供する。ヒトＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びヒトＨＥＲ２に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子及びＡＤＣが記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＡＰＬＰ２に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びヒトＨＥＲ２に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子。
【請求項２】
前記第２の抗原結合ドメインが、ヒトＨＥＲ２を発現するヒト細胞に結合する、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
前記第１の抗原結合ドメインがＡＰＬＰ２に低い親和性で結合する、請求項１または請求項２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
前記第１の抗原結合ドメイン及び前記第２の抗原結合ドメインのそれぞれが完全にヒトである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
前記抗原結合分子が、細胞上に発現されたヒトＡＰＬＰ２及びヒトＨＥＲ２の両方に結合し、その細胞においてＡＰＬＰ２の内部移行及び／またはＨＥＲ２の分解を誘導する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
前記抗体が、ヒトＡＰＬＰ２を発現するがヒトＨＥＲ２を発現しない細胞によって内部移行されない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
前記抗体が完全にヒトである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
前記第１の抗原結合ドメインがＡＰＬＰ２に低い親和性で結合し、前記第２の抗原結合ドメインがＨＥＲ２に高い親和性で結合して、ＨＥＲ２への前記第２の抗原結合ドメインの親和性が、ＡＰＬＰ２への前記第１の抗原結合ドメインの結合力を増大させる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
前記第１の抗原結合ドメインが、表面プラズモン共鳴または同等のアッセイによって測定した場合、約１００ｎＭ〜約１μＭのＫＤでヒトＡＰＬＰ２に結合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
前記第１の抗原結合ドメインが、表面プラズモン共鳴または同等のアッセイによって測定した場合、約１００ｎＭ〜約２００ｎＭのＫＤでヒトＡＰＬＰ２に結合する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
前記第１の抗原結合ドメインが、表面プラズモン共鳴または同等のアッセイによって測定した場合、約２００ｎＭ〜約８００ｎＭのＫＤでヒトＡＰＬＰ２に結合する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
前記第１の抗原結合ドメインが、表面プラズモン共鳴または同等のアッセイによって測定した場合、約８００ｎＭ〜約１μＭのＫＤでヒトＡＰＬＰ２に結合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
前記第２の抗原結合ドメインが、表面プラズモン共鳴または同等のアッセイによって測定した場合、１０ｎＭ未満のＫＤでヒトＨＥＲ２に結合する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
前記第２の抗原結合ドメインが、表面プラズモン共鳴または同等のアッセイによって測定した場合、約３ｎＭ〜約５ｎＭのＫＤでヒトＨＥＲ２に結合する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
前記第１の抗原結合ドメインが約１００ｎＭ〜約１μＭのＫＤでヒトに結合し、前記第２の抗原結合ドメインが１０ｎＭ未満のＫＤでヒトに結合し、ここで、ＫＤが表面プラズモン共鳴または同等のアッセイによって測定される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
前記第１の抗原結合ドメインが、表２に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む抗体または抗原結合フラグメントに由来し、かつ前記第２の抗原結合ドメインが、表１に記載されているＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む抗体または抗原結合フラグメントに由来する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
ヒトＡＰＬＰ２への結合について、表２に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と競合する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
前記参照抗体が、配列番号２６／１０、３４／１０、及び４２／１０からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１９】
表２に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と同じ、ヒトＡＰＬＰ２上のエピトープに結合する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０】
配列番号２６／１０、３４／１０、及び４２／１０からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と同じ、ヒトＡＰＬＰ２上のエピトープに結合する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２１】
前記抗原結合分子が、ヒト乳癌異種移植片を保有する免疫無防備状態のマウスにおいて腫瘍増殖を阻害する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２２】
二重特異性抗体またはその二重特異性抗原結合フラグメントである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子であって、ヒトＨＥＲ２に特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号２及び１８からなる群より選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）由来の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）を含み、
ヒトＨＥＲ２に特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号２及び１８からなる群より選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）由来の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号１０からなるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）由来の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む、前記二重特異性抗原結合分子。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子であって、ヒトＨＥＲ２に特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、３つの重鎖相補性決定領域（Ａ２−ＨＣＤＲ１、Ａ２−ＨＣＤＲ２及びＡ２−ＨＣＤＲ３）、ならびに３つの軽鎖相補性決定領域（Ａ２−ＬＣＤＲ１、Ａ２−ＬＣＤＲ２及びＡ２−ＬＣＤＲ３）を含み、ここで、Ａ２−ＨＣＤＲ１が、配列番号４及び２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ａ２−ＨＣＤＲ２が、配列番号６及び２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ａ２−ＨＣＤＲ３が、配列番号８及び２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ａ２−ＬＣＤＲ１が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、Ａ２−ＬＣＤＲ２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、かつＡ２−ＬＣＤＲ３が配列番号１６のアミノ酸配列を含む、前記二重特異性抗原結合分子。
【請求項２５】
ヒトＨＥＲ２に特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号１８／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子であって、ヒトＡＰＬＰ２に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、表２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）由来の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、ならびに表２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）由来の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む、前記二重特異性抗原結合分子。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子であって、ヒトＡＰＬＰ２に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号２６、３４及び４２からなる群より選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）由来の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）由来の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む、前記二重特異性抗原結合分子。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子であって、ヒトＡＰＬＰ２に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、３つの重鎖相補性決定領域（Ａ１−ＨＣＤＲ１、Ａ１−ＨＣＤＲ２及びＡ１−ＨＣＤＲ３）、ならびに３つの軽鎖相補性決定領域（Ａ１−ＬＣＤＲ１、Ａ１−ＬＣＤＲ２及びＡ１−ＬＣＤＲ３）を含み、
ここで、Ａ１−ＨＣＤＲ１が、配列番号２８、３６、及び４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＨＣＤＲ２が、配列番号３０、３８、及び４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＨＣＤＲ３が、配列番号３２、４０及び４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＬＣＤＲ１が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＬＣＤＲ２が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、かつＡ１−ＬＣＤＲ３が配列番号１６のアミノ酸配列を含む、前記二重特異性抗原結合分子。
【請求項２９】
ヒトＡＰＬＰ２に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号２６／１０、３４／１０、及び４２／１０からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子であって、ヒトＡＰＬＰ２に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが３つの重鎖相補性決定領域（Ａ１−ＨＣＤＲ１、Ａ１−ＨＣＤＲ２及びＡ１−ＨＣＤＲ３）、ならびに３つの軽鎖相補性決定領域（Ａ１−ＬＣＤＲ１、Ａ１−ＬＣＤＲ２及びＡ１−ＬＣＤＲ３）を含み、ヒトＨＥＲ２に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、３つの重鎖相補性決定領域（Ａ２−ＨＣＤＲ１、Ａ２−ＨＣＤＲ２及びＡ２−ＨＣＤＲ３）、ならびに３つの軽鎖相補性決定領域（Ａ２−ＬＣＤＲ１、Ａ２−ＬＣＤＲ２及びＡ２−ＬＣＤＲ３）を含み、
ここで、Ａ１−ＨＣＤＲ１が、配列番号２８、３６及び４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＨＣＤＲ２が、配列番号３０、３８、及び４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＨＣＤＲ３が、配列番号３２、４０、及び４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＬＣＤＲ１が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＬＣＤＲ２が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、かつＡ１−ＬＣＤＲ３が配列番号１６のアミノ酸配列を含み、かつ
ここで、Ａ２−ＨＣＤＲ１が、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、Ａ２−ＨＣＤＲ２が、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、Ａ２−ＨＣＤＲ３が、配列番号２４のアミノ酸配列を含み、Ａ２−ＬＣＤＲ１が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、Ａ２−ＬＣＤＲ２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、かつＡ２−ＬＣＤＲ３が配列番号１６のアミノ酸配列を含む、前記二重特異性抗原結合分子。
【請求項３１】
ヒトＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号３６−３８−３０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲを含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子であって、前記第２の抗原結合ドメインが、３つの重鎖相補性決定領域（Ａ２−ＨＣＤＲ１、Ａ２−ＨＣＤＲ２及びＡ２−ＨＣＤＲ３）及び３つの軽鎖相補性決定領域（Ａ２−ＬＣＤＲ１、Ａ２−ＬＣＤＲ２及びＡ２−ＬＣＤＲ３）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＨＥＲ２への結合について競合し、ここで、Ａ２−ＨＣＤＲ１は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、Ａ２−ＨＣＤＲ２が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、Ａ２−ＨＣＤＲ３が配列番号２４のアミノ酸配列を含み、Ａ２−ＬＣＤＲ１が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、Ａ２−ＬＣＤＲ２が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、かつＡ２−ＬＣＤＲ３が配列番号１６のアミノ酸配列を含む、前記二重特異性抗原結合分子。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子であって、前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＨＥＲ２への結合について競合する、前記二重特異性抗原結合分子。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子であって、前記第１の抗原結合ドメインが、３つの重鎖相補性決定領域（Ａ１−ＨＣＤＲ１、Ａ１−ＨＣＤＲ２及びＡ１−ＨＣＤＲ３）及び３つの軽鎖相補性決定領域（Ａ１−ＬＣＤＲ１、Ａ１−ＬＣＤＲ２及びＡ１−ＬＣＤＲ３）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＡＰＬＰ２への結合について競合し、ここで、Ａ１−ＨＣＤＲ１が、配列番号２８、３６、及び４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＨＣＤＲ２が、配列番号３０、３８及び４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＨＣＤＲ３が、配列番号３２、４０、及び４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＬＣＤＲ１が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＬＣＤＲ２が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、かつＡ１−ＬＣＤＲ３が配列番号１６のアミノ酸配列を含む、前記二重特異性抗原結合分子。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子であって、前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号２６、３４及び４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、ならびに配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＡＰＬＰ２への結合について競合する、前記二重特異性抗原結合分子。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子であって、前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号３４のアミノ酸を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＡＰＬＰ２への結合について競合し、かつここで、前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び配列番号１０のアミノ酸を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＨＥＲ２への結合について競合する、前記二重特異性抗原結合分子。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子及び細胞毒性剤を含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、任意に、前記二重特異性抗原結合分子及び前記細胞毒性剤が、リンカーを介して共有結合されており、ここで、任意に前記細胞毒性剤がメイタンシノイドであり、任意に前記メイタンシノイドがＤＭ１またはＤＭ４であり、任意に前記リンカーがＳＭＣＣであり、かつ任意に前記細胞毒性剤がＤＭ１であり、かつ前記リンカーがＳＭＣＣである、前記抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
【請求項３８】
表２に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と、ヒトＡＰＬＰ２への結合について競合する、単離された抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３９】
前記第１の抗原結合ドメインが、約１００ｎＭ〜約１μＭのＫＤでヒトＡＰＬＰ２に結合し、任意に、前記第１の抗原結合ドメインが、約１００ｎＭ〜約２００ｎＭのＫＤでヒトＡＰＬＰ２に結合し、任意に、表面プラズモン共鳴または同等のアッセイによって測定した場合、前記第１の抗原結合ドメインが約２００ｎＭ〜約８００ｎＭのＫＤでヒトＡＰＬＰ２に結合し、任意に前記第１の抗原結合ドメインが、表面プラズモン共鳴または同等のアッセイで測定した場合、約８００ｎＭ〜約１μＭのＫＤでヒトＡＰＬＰ２に結合する、請求項３８に記載の抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４０】
前記参照抗体が、配列番号２６／１０、３４／１０、及び４２／１０からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項３８または請求項３９に記載の抗ＡＰＬＰ２抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４１】
表２に記載されているＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と同じ、ヒトＡＰＬＰ２上のエピトープに結合する、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の抗ＡＰＬＰ２抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４２】
請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の抗ＡＰＬＰ２抗体または抗原結合フラグメント、及び細胞毒性剤を含み、前記二重特異性抗原結合分子及び細胞毒性剤が、リンカーを介して共有結合されている抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
【請求項４３】
請求項１〜３６に記載の二重特異性抗原結合分子、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の単離された抗ＡＰＬＰ２抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項３７もしくは請求項４２に記載のＡＤＣ、ならびに薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む、薬学的組成物。
【請求項４４】
対象におけるがんを治療するための方法であって、請求項４３に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４５】
前記がんが、前立腺癌、膀胱癌、頸部癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮癌、及び卵巣癌からなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記がんが乳癌であり、任意にＩＨＣ２＋乳癌である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ＨＥＲ２の発現に関連する疾患または障害の治療における請求項４３に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項４８】
前記疾患または障害ががんである、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
がんの治療における使用のための医薬の製造のための、請求項１〜３６に記載の二重特異性抗原結合分子、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の単離された抗ＡＰＬＰ２抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項３７もしくは請求項４２に記載のＡＤＣの使用であって、任意に、前記がんが乳癌である、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に特異的な抗体、及びその抗原結合フラグメント、ならびにそれらの使用方法に関する。本発明はまた、ＨＥＲ２及びアミロイド前駆体様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）に結合する二重特異性抗原結合分子、ならびにそれらの使用方法に関する。本発明はさらに、抗ＨＥＲ２抗体、または抗ＨＥＲ２／抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗体、またはそれらのフラグメント及び治療薬（例えば、細胞毒性薬）を含む抗体薬物コンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）は、いくつかのがん細胞の表面に見られるチロシンキナーゼ受容体成長促進タンパク質であり、悪性の疾患に関連している。乳癌の約５分の１がＨＥＲ２を過剰発現している。ＨＥＲ２陽性と見なすには、腫瘍細胞は通常、免疫組織化学（ＩＨＣ）または蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の２つの方法のいずれかによって試験される。ＩＨＣ試験の結果は、０、ＩＨＣ１＋、ＩＨＣ２＋、またはＩＨＣ３＋として報告される。ＩＨＣ３＋の所見は、ＨＥＲ２陽性と見なされる。ＩＨＣ２＋の所見は境界線であり、通常、陽性のＦＩＳＨ試験によって確認される。
【０００３】
ＨＥＲ２は、乳癌において臨床的に検証された抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）標的である。最大の抗腫瘍効果を達成するために、ＡＤＣは、ＨＥＲ２に特異的に結合し、細胞内に内部移行する必要があり、ＡＤＣのプロセシングにより、毒素がサイトゾルに放出される。高度な腫瘍特異性及び表面発現レベルが、優れたＡＤＣ標的の本質的な特徴であることは公知であるが、ＡＤＣ標的の輸送特性は十分な調査はされていない。
【０００４】
例えば、強力な毒素メイタンシン「ＤＭ１」（トラスツズマブ−エムタンシン、またはＴ−ＤＭ１）にコンジュゲートしたＨＥＲ２標的化抗体は、転移性乳癌の治療について承認されている。しかし、ＨＥＲ２の非効率的なリソソーム輸送によって、Ｔ−ＤＭ１の有効性は、非常に高レベルのＨＥＲ２（ＩＨＣ  ３＋、またはＦＩＳＨ増幅率＞２）を発現する患者に制限される。中間のＨＥＲ２レベル（ＩＨＣ２＋）を発現する腫瘍の退縮を効率的に誘発するＨＥＲ２−ＡＤＣの生成に向けて多大な努力が向けられている。これらの取り組みは、より強力な毒素の使用及び／またはＨＥＲ２の内部移行の促進に依存している。
【０００５】
ＡＰＬＰ２は、チロシンベースの内部移行シグナルを有するシングルパス膜貫通タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ０６４８１）である。複数のＡＰＬＰ２アイソフォームが報告されている（Ｌｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６  Ｆｅｂ  １５；６６（４）：１９９０−９、Ｐａｎｄｅｙ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６  Ａｐｒ  １２；７（１５）：１９４３０−４４．ｄｏｉ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．７１０３）。ＡＰＬＰ２は、正常組織で遍在的に発現し、特定のがんで過剰発現することが報告されている（Ｐａｎｄｅｙ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１５  Ｆｅｂ  １０；６（４）：２０６４−７５．）。細胞内小胞における細胞内局在と一致して、ＡＰＬＰ２は、原形質膜から効率的に内部移行され、急速なリソソーム分解の標的となる。ＡＰＬＰ２の示唆される生物学的機能は、ＰＣＳＫ９及びＭＨＣクラスＩのリソソーム標的化及び分解を促進することである（ＤｅＶｒａｙ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１３  Ａｐｒ  １２；２８８（１５）：１０８０５−１８．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１３．４５３３７３．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｆｅｂ  １９．、Ｔｕｌｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００９  Ｄｅｃ４；２８４（４９）：３４２９６−３０７．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１０９．０３９７２７．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｏｃｔ  ６）。
ＨＥＲ２の内部移行及び／またはリソソームへの輸送を増強する抗原結合分子は、ＨＥＲ２発現細胞の特異的な標的化及び殺滅が望まれる場合に有用な治療法を提供するであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６  Ｆｅｂ  １５；６６（４）：１９９０−９、Ｐａｎｄｅｙ
【非特許文献２】Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６  Ａｐｒ  １２；７（１５）：１９４３０−４４．ｄｏｉ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．７１０３
【非特許文献３】Ｐａｎｄｅｙ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１５  Ｆｅｂ  １０；６（４）：２０６４−７５．
【非特許文献４】ＤｅＶｒａｙ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１３  Ａｐｒ  １２；２８８（１５）：１０８０５−１８．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１３．４５３３７３．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｆｅｂ  １９．
【非特許文献５】Ｔｕｌｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００９  Ｄｅｃ４；２８４（４９）：３４２９６−３０７．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１０９．０３９７２７．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｏｃｔ  ６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様では、本発明は、ヒトＨＥＲ２及びヒトＡＰＬＰ２に結合する二重特異性抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。本発明のこの態様による二重特異性抗体は、とりわけ、例えば、ＨＥＲ２または抗体の分解及びリソソーム輸送が有益または望ましい状況下で、細胞、例えば、二重特異性抗体の内部移行を刺激するＨＥＲ２及びＡＰＬＰ２を発現する、乳癌細胞を標的とするために有用である。例えば、二重特異性抗体は、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、薬物コンジュゲートの放出及び標的細胞毒性のために、乳房腫瘍細胞などの特定のＨＥＲ２発現細胞のリソソームに向け得る。本発明はまた、ヒトＨＥＲ２に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントも提供する。本発明のこの態様による抗体は、とりわけ、ＨＥＲ２を発現する細胞を標的化するために有用である。本発明はまた、ヒトＡＰＬＰ２に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントも提供する。本発明のこの態様による抗体は、とりわけ、ＡＰＬＰ２による細胞への結合分子の迅速な内部移行のために、ＡＰＬＰ２、及び標的抗原、例えば、ＨＥＲ２を発現する細胞を標的とするために有用である。
【０００８】
本発明の例示的な抗ＨＥＲ２抗体を、表１に列挙する。表１は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のアミノ酸及び核酸配列識別子、ならびに例示的な抗ＨＥＲ２抗体の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、及び軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）も示す。
【０００９】
本発明は、表１に列挙された任意のＨＣＶＲアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含むＨＣＶＲを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１０】
本発明はまた、表１に列挙された任意のＬＣＶＲアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含むLＣＶＲを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１１】
本発明はまた、表１に列挙された任意のＬＣＶＲアミノ酸配列と対になっている、表１に列挙された任意のＨＣＶＲアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明は、表１に列挙された、任意の例示的な抗ＨＥＲ２抗体内に含まれるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号２／１０（例えば、Ｈ４Ｈ１３５０５０Ｐ２）及び１８／１０（例えば、Ｈ４Ｈ１３０５５Ｐ２）からなる群より選択される。
【００１２】
本発明はまた、表１に列挙された任意のＨＣＤＲ１アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１３】
本発明はまた、表１に列挙された任意のＨＣＤＲ２アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１４】
本発明はまた、表１に列挙された任意のＨＣＤＲ３アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１５】
本発明はまた、表１に列挙された任意のＬＣＤＲ１アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１６】
本発明はまた、表１に列挙された任意のＬＣＤＲ２アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１７】
本発明はまた、表１に列挙された任意のＬＣＤＲ３アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む、軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１８】
本発明はまた、表１に列挙された任意のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と対になっている、表１に列挙された任意のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明は、表１に列挙された任意の例示的な抗ＨＥＲ２抗体に含まれるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号２／１０（例えば、Ｈ４Ｈ１３５０５０Ｐ２）及び１８／１０（例えば、Ｈ４Ｈ１３０５５Ｐ２）からなる群より選択される。
【００１９】
本発明はまた、表１に列挙された任意の例示的な抗ＨＥＲ２抗体内に含まれる６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号４−６−８−１２−１４−１６（例えば、Ｈ４Ｈ１３０５０Ｐ２）及び２０−２２−２４−１２−１４−１６（例えば、Ｈ４Ｈ１３０５５Ｐ２）からなる群より選択される。
【００２０】
関連する実施形態において、本発明は、表１に列挙された任意の例示的な抗ＨＥＲ２抗体によって定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含まれる６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。例えば、本発明は、配列番号２／１０（例えば、Ｈ４Ｈ１３５０５０Ｐ２）及び１８／１０（例えば、Ｈ４Ｈ１３０５５Ｐ２）からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含まれるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法及び技術は、当該技術分野で周知であり、本明細書に開示される特定のＨＣＶＲ及び／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために使用され得る。ＣＤＲの境界を識別するために使用され得る例示的な規則としては、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、及びＡｂＭ定義が挙げられる。一般論として、Ｋａｂａｔの定義は、配列の変動性に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造ループ領域の位置に基づいており、ＡｂＭの定義はＫａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａのアプローチ間の妥協点である。例えば、Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７）、及びＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９２６８−９２７２（１９８９）を参照のこと。抗体内のＣＤＲ配列を特定するための公開データベースも利用可能である。
【００２１】
本発明はまた、抗ＨＥＲ２抗体またはその一部をコードする核酸分子も提供する。例えば、本発明は、表１に列挙された任意のＨＣＶＲアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表１に列挙された任意のＨＣＶＲ核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００２２】
本発明はまた、表１に列挙された任意のＬＣＶＲアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表１に列挙された任意のＬＣＶＲ核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００２３】
本発明はまた、表１に列挙された任意のＨＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表１に列挙された任意のＨＣＤＲ１核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００２４】
本発明はまた、表１に列挙された任意のＨＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表１に列挙された任意のＨＣＤＲ２核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００２５】
本発明はまた、表１に列挙された任意のＨＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表１に列挙された任意のＨＣＤＲ３核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００２６】
本発明はまた、表１に列挙された任意のＬＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表１に列挙された任意のＬＣＤＲ１核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００２７】
本発明はまた、表１に列挙された任意のＬＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表１に列挙された任意のＬＣＤＲ２核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００２８】
本発明はまた、表１に列挙された任意のＬＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表１に列挙された任意のＬＣＤＲ３核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００２９】
本発明はまた、ＨＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ここで、ＨＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３）を含み、ここで、このＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に列挙されている任意の例示的な抗ＨＥＲ２抗体によって定義される。
【００３０】
本発明はまた、ＬＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ここで、ＬＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含み、ここで、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に記載されている任意の例示的な抗ＨＥＲ２抗体によって定義される。
【００３１】
本発明はまた、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子を提供し、ここで、このＨＣＶＲは、表１に列挙された任意のＨＣＶＲアミノ酸配列のアミノ酸配列を含み、このＬＣＶＲは、表１に列挙された任意のＬＣＶＲアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表１に列挙された任意のＨＣＶＲ核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列、及び表１に列挙された任意のＬＣＶＲ核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。本発明のこの態様によるある特定の実施形態において、この核酸分子は、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲをコードし、ここで、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、両方とも、表１に列挙された同じ抗ＨＥＲ２抗体に由来する。
【００３２】
本発明はまた、抗ＨＥＲ２抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現し得る組換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上記の任意核酸分子、すなわち、表１に記載の任意のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲ配列をコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターを含む。本発明の範囲内にはまた、そのようなベクターが導入された宿主細胞、ならびに抗体または抗体フラグメントの産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養すること、そのように産生された抗体及び抗体フラグメントを回収することによって抗体またはその一部を産生する方法も含まれる。
【００３３】
本発明は、改変されたグリコシル化パターンを有する抗ＨＥＲ２抗体を含む。いくつかの実施形態では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための改変が有用であるか、またはオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠く抗体が、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増大させるために有用である場合がある（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ  ２７７：２６７３３を参照のこと）。他の用途では、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を改変するために、ガラクトシル化の改変を行ってもよい。
【００３４】
別の態様では、本発明は、ＨＥＲ２及び薬学的に許容される担体に特異的に結合する組換えヒト抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物を提供する。関連する態様において、本発明は、抗ＨＥＲ２抗体と第２の治療剤との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療剤は、抗ＨＥＲ２抗体と有利に組み合わされる任意の薬剤である。本発明の抗ＨＥＲ２抗体を含む追加の併用療法及び共製剤は、本明細書の他の場所に開示されている。
【００３５】
別の態様では、本発明は、本発明の抗ＨＥＲ２抗体を使用してＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞を標的化／殺滅するための治療方法を提供し、この治療方法は、治療有効量の本発明の抗ＨＥＲ２抗体を含む薬学的組成物を、それを必要とする対象へ投与することを含む。場合によっては、この抗ＨＥＲ２抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、乳癌の治療に使用してもよく、またはＡＤＣＣを増大させるための改変Ｆｃドメイン（例えば、Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ  ２７７：２６７３３を参照のこと）、放射免疫療法、抗体薬物コンジュゲート、または腫瘍切除の効率を高めるための他の方法を含むがこれに限定されない方法によって、より細胞毒性になるように改変してもよい。
【００３６】
本発明はまた、ＨＥＲ２発現細胞に関連するか、またはそれによって引き起こされる疾患または障害（例えば、がん）の治療のための薬剤の製造における本発明の抗ＨＥＲ２抗体の使用を含む。一態様では、本発明は、医薬で使用するための、本明細書に開示されるような、抗ＨＥＲ２抗体もしくは抗原結合フラグメント、または二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体を含む化合物に関する。一態様では、本発明は、医薬で使用するための、本明細書に開示されるような抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む化合物に関する。
【００３７】
さらに別の態様では、本発明は、例えば、画像化試薬などの診断用途のための単一特異性抗ＨＥＲ２抗体を提供する。
【００３８】
さらに別の態様では、本発明は、抗ＡＰＬＰ２抗体または本発明の抗体の抗原結合部分を使用して、リソソームへのＨＥＲ２内部移行及び／またはリソソームによる分解を増強するための治療方法を提供し、この治療方法は、抗体を含む治療有効量の薬学的組成物を投与することを含む。
【００３９】
別の態様において、本発明は、表面プラズモン共鳴または同等のアッセイによって測定した場合、１０ｎＭ未満のＫＤでＨＥＲ２に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の態様において、本発明は、ＦＡＣＳ分析または同等のアッセイによって測定した場合、５０ｎＭ未満のＥＣ５０でＨＥＲ２発現細胞に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の態様では、本発明は、ＨＥＲ２発現細胞のリソソームに結合して内部移行する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２発現細胞は、ＩＨＣ２＋分類を有する。
【００４０】
本発明はさらに、表１に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と、ヒトＨＥＲ２への結合について競合する抗体または抗原結合フラグメントを提供する。別の態様において、本発明は、配列番号２／１０（例えば、Ｈ４Ｈ１３５０５０Ｐ２）及び１８／１０（例えば、Ｈ４Ｈ１３０５５Ｐ２）からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と、ヒトＨＥＲ２への結合について競合する抗体または抗原結合フラグメントを提供する。
【００４１】
本発明はさらに、抗体または抗原結合フラグメントを提供し、ここで、抗体またはその抗原結合フラグメントは、表１に記載されるようなＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と同じ、ヒトＨＥＲ２上のエピトープに結合する。別の態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０（例えば、Ｈ４Ｈ１３５０５０Ｐ２）及び１８／１０（例えば、Ｈ４Ｈ１３０５５Ｐ２）からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と同じ、ヒトＨＥＲ２上のエピトープに結合する。
【００４２】
本発明はさらに、ヒトＨＥＲ２に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは、表１に記載されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び表１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む。別の態様では、単離された抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０（例えば、Ｈ４Ｈ１３５０５０Ｐ２）及び１８／１０（例えば、Ｈ４Ｈ１３０５５Ｐ２）からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖及び軽鎖のＣＤＲを含む。さらに別の態様において、単離された抗体または抗原結合フラグメントは、それぞれ、配列番号４−６−８−１２−１４−１６（例えば、Ｈ４Ｈ１３０５０Ｐ２）及び２０−２２−２４−１２−１４−１６（例えば、Ｈ４Ｈ１３０５５Ｐ２）からなる群より選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む。別の態様では、本発明は、ヒトＨＥＲ２に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは、以下を含む：（ａ）配列番号４、６、８、２０、２２、２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及び（ｂ）配列番号１２、１４、１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）。さらなる態様において、単離された抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０（例えば、Ｈ４Ｈ１３５０５０Ｐ２）及び１８／１０（例えば、Ｈ４Ｈ１３０５５Ｐ２）からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【００４３】
別の態様によれば、本発明は、抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメント及び治療剤（例えば、細胞毒性剤）を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメント及び細胞毒性剤は、本明細書で考察されるように、リンカーを介して共有結合されている。様々な実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書に記載の抗ＨＥＲ２抗体またはフラグメントのいずれであってもよい。
【００４４】
別の態様において、本発明は、ヒトアミロイド前駆体様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを提供し、これらの抗体及び抗原結合フラグメントは、ＡＰＬＰ２に対して低い親和性を有する。本発明のこの態様による抗体は、とりわけ、標的及びＡＰＬＰ２が同じ細胞、例えば腫瘍細胞によって発現される場合に、別の標的、例えば、ＨＥＲ２の内部移行及び／または分解を特異的に指示するために有用である。しかし、それらの低い親和性に起因して、そのような抗ＡＰＬＰ２抗体は、それ自体で不活性のままであり、例えば、標的化アームによって結合された標的及びＡＰＬＰ２の両方の細胞による発現がない、例えば、二重特異性抗体として、標的化アームとの会合がない場合に結合し得ない。したがって、本発明の一態様は、腫瘍関連抗原と腫瘍細胞上のＡＰＬＰ２との結合力駆動型ペアリングに有効な二重特異性抗原結合分子を提供する。したがって、本発明のこの態様はまた、ヒトＡＰＬＰ２及びヒト標的、例えば、ＨＥＲ２に結合する二重特異性抗体及びその抗原結合フラグメントも提供する。本発明のこの態様による二重特異性抗体は、とりわけ、例えば、ＡＰＬＰ２の分解及び／またはリソソーム輸送または抗体が有益または望ましいものである状況下で、二重特異性抗体の内部移行を刺激する、ＡＰＬＰ２及びＨＥＲ２を発現する細胞、例えば、乳癌細胞を標的とするために有用である。例えば、二重特異性抗体は、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、薬物コンジュゲートの放出及び標的細胞毒性のために、乳房腫瘍細胞などの特定のＨＥＲ２発現細胞のリソソームに向け得る。
【００４５】
本発明の例示的な抗ＡＰＬＰ２抗体を表２に列挙する。表２は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のアミノ酸及び核酸配列識別子、ならびに例示的な抗ＡＰＬＰ２抗体の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、及び軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）も示す。
【００４６】
本発明は、表２に列挙された任意のＨＣＶＲアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含むＨＣＶＲを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００４７】
本発明はまた、表２に列挙された任意のＬＣＶＲアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含むＬＣＶＲを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００４８】
本発明はまた、表２に列挙された任意のＬＣＶＲアミノ酸配列と対になっている表２に列挙された任意のＨＣＶＲアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明は、表２に列挙された任意の例示的な抗ＡＰＬＰ２抗体に含まれるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号２６／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３６２Ｐ２）、３４／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３８７Ｐ２）、及び４２／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３７１Ｐ２）からなる群より選択される。
【００４９】
本発明はまた、表２に列挙された任意のＨＣＤＲ１アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、その実質的に同様の配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００５０】
本発明はまた、表２に列挙された任意のＨＣＤＲ２アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、その実質的に同様の配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００５１】
本発明はまた、表２に列挙された任意のＨＣＤＲ３アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、その実質的に同様の配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００５２】
本発明はまた、表２に列挙された任意のＬＣＤＲ１アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００５３】
本発明はまた、表２に列挙された任意のＬＣＤＲ２アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００５４】
本発明はまた、表２に列挙された任意のＬＣＤＲ３アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む、軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００５５】
本発明はまた、表２に列挙された任意のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と対になっている、表２に列挙された任意のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明は、表２に記載されている任意の例示的な抗ＡＰＬＰ２抗体に含まれるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号２６／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３６２Ｐ２）、３４／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３８７Ｐ２）、及び４２／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３７１Ｐ２）からなる群より選択される。
【００５６】
本発明はまた、表２に列挙されている任意の例示的な抗ＡＰＬＰ２抗体内に含まれる６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む、抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号２８−３０−３２−１２−１４−１６（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３６２Ｐ２）、３６−３８−４０−１２−１４−１６（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３８７Ｐ２）、及び４４−４６−４８−１２−１４−１６（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３７１Ｐ２）からなる群より選択される。
【００５７】
関連する実施形態において、本発明は、表２に列挙されている任意の例示的な抗ＡＰＬＰ２抗体内によって定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含まれる６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。例えば、本発明は、配列番号２６／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３６２Ｐ２）、３４／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３８７Ｐ２）、及び４２／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３７１Ｐ２）からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含まれる、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法及び技術は、当該技術分野で周知であり、本明細書に開示される特定のＨＣＶＲ及び／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために使用してもよい。ＣＤＲの境界を識別するために使用し得る例示的な規則としては、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、及びＡｂＭ定義が挙げられる。一般論として、Ｋａｂａｔの定義は配列の変動性に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は構造ループ領域の位置に基づいており、ＡｂＭの定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａのアプローチ間の妥協点である。例えば、Ｋａｂａｔ、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７）、及びＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９２６８−９２７２（１９８９）を参照のこと。抗体内のＣＤＲ配列を特定するための公開データベースも利用可能である。
【００５８】
本発明はまた、抗ＡＰＬＰ２抗体またはその一部をコードする核酸分子を提供する。例えば、本発明は、表２に列挙された任意のＨＣＶＲアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙された任意のＨＣＶＲ核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００５９】
本発明はまた、表２に列挙された任意のＬＣＶＲアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙された任意のＬＣＶＲ核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００６０】
本発明はまた、表２に列挙された任意のＨＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙された任意のＨＣＤＲ１核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００６１】
本発明はまた、表２に列挙された任意のＨＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙された任意のＨＣＤＲ２核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００６２】
本発明はまた、表２に列挙された任意のＨＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙された任意のＨＣＤＲ３核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００６３】
本発明はまた、表２に列挙された任意のＬＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙された任意のＨＣＤＲ１核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００６４】
本発明はまた、表２に列挙された任意のＬＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙された任意のＬＣＤＲ２核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００６５】
本発明はまた、表２に列挙された任意のＬＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙された任意のＬＣＤＲ３核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００６６】
本発明はまた、ＨＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ここで、このＨＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３）を含み、ここで、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表２に列挙された任意の例示的な抗ＡＰＬＰ２抗体によって定義される。
【００６７】
本発明はまた、ＬＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ここで、ＬＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含み、ここで、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列セットは、表２に列挙された任意の例示的な抗ＡＰＬＰ２抗体によって定義される。
【００６８】
本発明はまた、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子を提供し、ここで、ＨＣＶＲは、表２に列挙された任意のＨＣＶＲアミノ酸配列のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、表２に列挙された任意のＬＣＶＲアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙された任意のＨＣＶＲ核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列、及び表２に列挙された任意のＬＣＶＲ核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。本発明のこの態様によるある特定の実施形態において、この核酸分子は、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲをコードし、ここで、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、両方とも、表２に列挙された同じ抗ＡＰＬＰ２抗体に由来する。
【００６９】
本発明はまた、抗ＡＰＬＰ２抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現し得る組換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上記の任意核酸分子、すなわち、表２に記載の任意のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲ配列をコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターを含む。本発明の範囲内にはまた、そのようなベクターが導入された宿主細胞、ならびに抗体または抗体フラグメントの産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって抗体またはその一部を産生し、そのように生成された抗体及び抗体フラグメントを回収する方法も含まれる。
【００７０】
本発明は、改変されたグリコシル化パターンを有する抗ＡＰＬＰ２抗体を含む。いくつかの実施形態では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための改変が有用である場合もあるし、またはオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠く抗体が、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増大させるために有用である場合もある（Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ  ２７７：２６７３３を参照のこと）。他の用途では、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を改変するために、ガラクトシル化の改変を行ってもよい。
【００７１】
別の態様では、本発明は、ＡＰＬＰ２及び薬学的に許容される担体に特異的に結合する組換えヒト抗体またはそのフラグメントを含む薬学的組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、抗ＡＰＬＰ２抗体と第２の治療剤との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療剤とは、抗ＡＰＬＰ２抗体と有利に組み合わされる任意の薬剤である。本発明の抗ＡＰＬＰ２抗体を含む追加の併用療法及び共製剤は、本明細書の他のいずれかの場所に開示されている。
【００７２】
別の態様では、本発明は、本発明の抗ＡＰＬＰ２抗体を使用してＡＰＬＰ２を発現する腫瘍細胞を標的化／殺滅するための治療方法を提供し、この治療方法は、治療有効量の、本発明の抗ＡＰＬＰ２抗体を含む薬学的組成物を、それを必要とする対象へ投与することを含む。場合によっては、抗ＡＰＬＰ２抗体（またはその抗原結合フラグメント）を乳癌の治療に使用してもよく、またはＡＤＣＣを増大させるための改変Ｆｃドメイン（例えば、Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ  ２７７：２６７３３を参照のこと）、放射免疫療法、抗体薬物コンジュゲート、または腫瘍切除の効率を高めるための他の方法、を含むがこれに限定されない方法によってより細胞毒性になるように改変してもよい。
【００７３】
本発明はまた、ＡＰＬＰ２発現細胞に関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患または障害（例えば、がん）の治療のための医薬の製造における本発明の抗ＡＰＬＰ２抗体の使用を含む。一態様では、本発明は、医薬で使用するための、本明細書に開示されるような抗ＡＰＬＰ２抗体もしくは抗原結合フラグメント、または二重特異性抗ＡＰＬＰ２ｘＡＰＬＰ２抗体を含む化合物に関する。一態様では、本発明は、医薬で使用するための、本明細書に開示されるような抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む化合物に関する。
【００７４】
さらに別の態様では、本発明は、例えば、画像化試薬などの診断用途のための単一特異性抗ＡＰＬＰ２抗体を提供する。
【００７５】
さらに別の態様では、本発明は、抗ＡＰＬＰ２抗体または本発明の抗体の抗原結合部分を使用して、リソソームへのＡＰＬＰ２内部移行及び／またはリソソームによる分解を増強するための治療方法を提供し、この治療方法は、抗体を含む治療有効量の薬学的組成物を投与することを含む。
【００７６】
別の態様において、本発明は、表面プラズモン共鳴または同等のアッセイによって測定した場合、１００ｎＭを超えるＫＤでＡＰＬＰ２発現細胞に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の態様において、本発明は、ＦＡＣＳ分析によって測定した場合、１００ｎＭを超えるＥＣ５０でＡＰＬＰ２発現細胞に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の態様では、本発明は、抗体が同じ細胞上で発現されるＨＥＲ２にも結合する場合に、ＡＰＬＰ２発現細胞のリソソームに結合し、そこに内部移行される、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００７７】
本発明はさらに、表２に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体とヒトＡＰＬＰ２への結合について競合する抗体または抗原結合フラグメントを提供する。別の態様において、本発明は、配列番号２６／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３６２Ｐ２）、３４／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３８７Ｐ２）及び４２／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３７１Ｐ２）からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体とヒトＡＰＬＰ２への結合について競合する抗体または抗原結合フラグメントを提供する。
【００７８】
本発明はさらに、抗体または抗原結合フラグメントを提供し、ここで、この抗体またはその抗原結合フラグメントは、表２に記載されるようなＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と同じ、ヒトＡＰＬＰ２上のエピトープに結合する。別の態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２６／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３６２Ｐ２）、３４／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３８７Ｐ２）、及び４２／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３７１Ｐ２）からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と同じ、ヒトＡＰＬＰ２上のエピトープに結合する。
【００７９】
本発明はさらに、ヒトＡＰＬＰ２に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、この抗体または抗原結合フラグメントは、以下を含む：表２に記載されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び表２に記載されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲ。別の態様では、この単離された抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２６／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３６２Ｐ２）、３４／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３８７Ｐ２）、及び４２／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３７１Ｐ２）からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖及び軽鎖のＣＤＲを含む。さらに別の態様では、この単離された抗体または抗原結合フラグメントは、それぞれ、配列番号２８−３０−３２−１２−１４−１６（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３６２Ｐ２）、３６−３８−４０−１２−１４−１６（Ｈ４ｘＨ２１３８７Ｐ２）及び４４−４６−４８−１２−１４−１６（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３７１Ｐ２）からなる群より選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む。別の態様において、本発明は、ヒトＡＰＬＰ２に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、この抗体または抗原結合フラグメントは、以下を含む：（ａ）配列番号２８、３０、３２、３６、３８、４０、４４、４６、及び４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、ならびに（ｂ）配列番号１２、１４、１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）。さらなる態様において、この単離された抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２６／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３６２Ｐ２）、３４／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３８７Ｐ２）、及び４２／１０（例えば、Ｈ４ｘＨ２１３７１Ｐ２）からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【００８０】
別の態様によれば、本発明は、抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメント及び治療剤（例えば、細胞毒性剤）を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメント及び細胞毒性剤は、本明細書での考察どおり、リンカーを介して共有結合されている。様々な実施形態において、抗ＡＰＬＰ２抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書に記載の抗ＡＰＬＰ２抗体またはフラグメントのいずれであってもよい。
【００８１】
別の態様によれば、本発明は、ＨＥＲ２及びＡＰＬＰ２に結合する二重特異性抗原結合分子（例えば、抗体）を提供する。このような二重特異性抗原結合分子はまた、本明細書では「抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質」、「抗ＨＥＲ２／抗ＡＰＬＰ２二重特異性分子」、「抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性分子」、または「ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２  ｂｓＡｂ」とも呼ばれる。抗ＨＥＲ２／抗ＡＰＬＰ２二重特異性分子の抗ＨＥＲ２部分は、ＨＥＲ２（例えば、乳房腫瘍）を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）を標的化するのに有用であり、二重特異性分子の抗ＡＰＬＰ２部分は、結合したＨＥＲ２分子の内部移行及び／または分解に有用であり、これにより、該当する場合、この薬物コンジュゲートが放出され得る。腫瘍細胞、例えば乳癌細胞へのＨＥＲ２及びＡＰＬＰ２の同時結合は、抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合分子の内部移行を促進し、薬物とコンジュゲートすると、薬物による標的腫瘍細胞の細胞毒性を媒介し得る薬物である。したがって、本発明の抗ＨＥＲ２／抗ＡＰＬＰ２二重特異性分子は、とりわけ、ＨＥＲ２発現腫瘍（例えば、乳癌）に関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患及び障害を治療するために有用である。
【００８２】
本発明のこの態様による二重特異性抗原結合分子は、ヒトＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びＨＥＲ２に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。本発明は、抗ＨＥＲ２／抗ＡＰＬＰ２二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体、二重特異性結合分子など）を含み、各抗原結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と対になった重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。本発明のある特定の例示的な実施形態では、抗ＡＰＬＰ２抗原結合ドメイン及び抗ＨＥＲ２抗原結合ドメインはそれぞれ、共通のＬＣＶＲと対になっている異なる別個のＨＣＶＲを含む。例えば、本明細書の実施例２に示されるように、二重特異性抗体は、ＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン（この第１の抗原結合ドメインは、抗ＡＰＬＰ２抗体に由来するＬＣＶＲ（例えば、抗ＨＥＲ２抗原結合ドメインに含まれるのと同じＬＣＶＲ）と対になった抗ＡＰＬＰ２抗体由来のＨＣＶＲを含む）、及びＨＥＲ２抗体に特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン（この第２の抗原結合ドメインは、抗ＨＥＲ２抗体に由来するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含む）を含んで構築された。言い換えれば、本明細書に開示される例示的な分子において、抗ＡＰＬＰ２抗体由来のＨＣＶＲと抗ＨＥＲ２抗体由来のＬＣＶＲとの対形成は、ＡＰＬＰ２に特異的に結合する（しかしＨＥＲ２には結合しない）抗原結合ドメインを作成する。そのような実施形態では、第１及び第２の抗原結合ドメインは、別個の抗ＡＰＬＰ２及び抗ＨＥＲ２  ＨＣＶＲを含むが、共通のＬＣＶＲを共有する。このＬＣＶＲのアミノ酸配列は、例えば、配列番号１０に示され、対応するＣＤＲ（すなわち、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１２−１４−１６に示されている。遺伝子改変マウスを使用して、２つの異なるヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントの１つに由来する可変ドメインを含む同一の軽鎖と会合する２つの異なる重鎖を含む完全ヒト二重特異性抗原結合分子を産生し得る。あるいは、可変重鎖を１つの一般的な軽鎖と対にして、宿主細胞での組換え発現を介して産生してもよい。したがって、本発明の抗体は、単一の再配列された軽鎖に関連する免疫グロブリン重鎖を含み得る。いくつかの実施形態において、この軽鎖は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む。他の実施形態では、この軽鎖は、ヒトＪκ５またはヒトＪκ１遺伝子セグメントと再配列されたヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む。
【００８３】
本発明は、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性分子を提供し、ここでＡＰＬＰ２に特異的に結合するこの第１の抗原結合ドメインは、任意のＨＣＶＲアミノ酸配列、任意のＬＣＶＲアミノ酸配列、任意のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対、任意の重鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ２−ＣＤＲ３アミノ酸配列、または表２に示す任意の軽鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ２−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【００８４】
さらに、本発明は、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性分子を提供し、ＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表２及び３に記載されるような任意のＨＣＶＲアミノ酸配列を含む。ＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインはまた、本明細書の表２に記載されるような任意のＬＣＶＲアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態によれば、ＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表２に記載されるようなＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対のいずれかを含む。本発明はまた、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性分子を提供し、ＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表２に記載の重鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ２−ＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか、及び／または本明細書の表１に記載の軽鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ２−ＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含む。
【００８５】
ある特定の実施形態によれば、本発明は、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性分子を提供し、ＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表２において記載されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００８６】
本発明はまた、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性分子を提供し、ここでＡＰＬＰ２に特異的に結合するこの第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表１、２、及び３に示されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００８７】
本発明はまた、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性分子を提供し、ここでＡＰＬＰ２に特異的に結合するこの第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表１、２、及び３に示されるようなＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列対を含む。
【００８８】
本発明はまた、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性分子を提供し、ここでＡＰＬＰ２に特異的に結合するこの第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれに実質的に同様の配列、ならびに本明細書の表１、２、及び３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を含む。
【００８９】
ある特定の実施形態において、ＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表２及び３に記載されるようなＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
【００９０】
本発明はまた、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を提供し、ここでＡＰＬＰ２に特異的に結合するこの第１の抗原結合ドメインは、本明細書の表２及び３に記載されるようなアミノ酸、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン、表２及び３に記載のアミノ酸、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン、２及び３に記載のアミノ酸、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン、本明細書の表１、２、及び３に記載のアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン、本明細書の表１、２、及び３に記載のアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメイン、ならびに表１、２、及び３に記載のアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを含む。
【００９１】
本発明のある特定の非限定的で例示的な抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、それぞれ、本明細書の表２及び３に記載のアミノ酸配列を有する、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含むＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインを含む。
【００９２】
本発明はさらに、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここでヒトＡＰＬＰ２に特異的に結合するこの第１の抗原結合ドメインは、表２及び表３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）由来の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、ならびに表１、表２及び／または表３に記載のアミノ酸配列を含む共通軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）由来の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む。
【００９３】
別の態様において、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ヒトＡＰＬＰ２に特異的に結合するこの第１の抗原結合ドメインは、配列番号２６、３４、及び４２からなる群より選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）由来の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）由来の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む。
【００９４】
本発明はさらに、ヒトＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、３つの重鎖相補性決定領域（Ａ１−ＨＣＤＲ１、Ａ１−ＨＣＤＲ２及びＡ１−ＨＣＤＲ３）及び３つの軽鎖相補性決定領域（Ａ１−ＬＣＤＲ１、Ａ１−ＬＣＤＲ２及びＡ１−ＬＣＤＲ３）を含む、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、Ａ１−ＨＣＤＲ１は、配列番号２８、３６、及び４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＨＣＤＲ２は、配列番号３０、３８、及び４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＨＣＤＲ３は、配列番号３２、４０、及び４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＬＣＤＲ１は配列番号１２のアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＬＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、Ａ１−ＬＣＤＲ３は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
【００９５】
さらなる態様において、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ヒトＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号２６／１０、３４／１０、及び４２／１０からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む。
【００９６】
別の態様において、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ヒトＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、３つの重鎖相補性決定領域（Ａ１−ＨＣＤＲ１、Ａ１−ＨＣＤＲ２及びＡ１−ＨＣＤＲ３）及び３つの軽鎖相補性決定領域（Ａ１−ＬＣＤＲ１、Ａ１−ＬＣＤＲ２及びＡ１−ＬＣＤＲ３）を含み、ここでヒトＨＥＲ２に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、３つの重鎖相補性決定領域（Ａ２−ＨＣＤＲ１、Ａ２−ＨＣＤＲ２及びＡ２−ＨＣＤＲ３）及び３つの軽鎖相補性決定領域（Ａ２−ＬＣＤＲ１、Ａ２−ＬＣＤＲ２及びＡ２−ＬＣＤＲ３））を含む。ここで、Ａ１−ＨＣＤＲ１は、配列番号２８、３６、及び４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。Ａ１−ＨＣＤＲ２は、配列番号３０、３８、及び４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。Ａ１−ＨＣＤＲ３は、配列番号３２、４０、及び４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。Ａ１−ＬＣＤＲ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。Ａ１−ＬＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。及びＡ１−ＬＣＤＲ３は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。及びここで、Ａ２−ＨＣＤＲ１は、配列番号４及び２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。Ａ２−ＨＣＤＲ２は、配列番号６及び２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。Ａ２−ＨＣＤＲ３は、配列番号８及び２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。Ａ２−ＬＣＤＲ１は配列番号１２のアミノ酸配列を含む。Ａ２−ＬＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。及びＡ２−ＬＣＤＲ３は配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
【００９７】
より多くの実施形態において、本発明の例示的な抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、ヒトＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号２８−３０−３２、３６−３８−４０、及び４４−４６−４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲを含む二重特異性抗原結合分子を含む。
【００９８】
本発明はまた、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性分子を提供し、ここで、ＨＥＲ２に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号２及び１８からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。
【００９９】
本発明はまた、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性分子を提供し、ここで、ＨＥＲ２に特異的に結合するこの第２の抗原結合ドメインは、配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
【０１００】
本発明はまた、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性分子を提供し、ここで、ＨＥＲ２に特異的に結合するこの第２の抗原結合ドメインは、配列番号２／１０及び１８／１０からなる群より選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列対を含む。
【０１０１】
本発明はまた、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性分子を提供し、ここで、ＨＥＲ２に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それに対して実質的に同様の配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン、及び配列番号１２のアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを含む。
【０１０２】
ある特定の実施形態において、ＨＥＲ２に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１８／１０からなる群より選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
【０１０３】
本発明はまた、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ＨＥＲ２に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号４及び２０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン、配列番号６及び２２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン、配列番号８及び２４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン、配列番号１２のアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン、ならびに配列番号１４のアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメイン、ならびに配列番号１６のアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを含む。
【０１０４】
本発明のある特定の非限定的で例示的な抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、それぞれ、配列番号２０−２２−２４−１２−１４−１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含むＨＥＲ２に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。
【０１０５】
関連する実施形態において、本発明は、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含み、ＨＥＲ２に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１８／１０からなる群より選択される重鎖及び軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列内に含まれる重鎖及び軽鎖ＣＤＲドメインを含む。
【０１０６】
別の態様において、本発明は、ヒトＡＰＬＰ２に結合する第１の抗原結合ドメイン及びヒトＨＥＲ２に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を提供し、この第２の抗原結合ドメインは、本発明の抗ＨＥＲ２抗体のいずれか１つの抗体または抗原結合フラグメント由来である。さらなる態様において、本発明は、ヒトＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びヒトＨＥＲ２に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１０７】
本発明はさらに、ヒトＡＰＬＰ２を発現するヒト細胞及び／またはカニクイザルＡＰＬＰ２を発現するカニクイザル細胞に結合する二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様では、この二重特異性抗原結合分子は、ヒトＨＥＲ２を発現するヒト細胞及び／またはカニクイザルＨＥＲ２を発現するカニクイザル細胞に結合する。
【０１０８】
別の態様において、本発明は、ヒト乳癌異種移植片を有する免疫無防備状態のマウスにおける腫瘍増殖を阻害する二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１０９】
ある特定の実施形態において、本発明の抗ＡＰＬＰ２抗体、その抗原結合フラグメント及びその二重特異性抗体は、生殖系列配列と親抗体配列との間の差異に基づいて段階的に親のアミノ酸残基を置換することによって作製された。したがって、抗ＡＰＬＰ２抗体は、ＣＤＲのアミノ酸残基を置換して、ＡＰＬＰ２への親和性結合をさらに低くすることによって改変してもよい。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、この第２の抗原結合ドメインは、３つの重鎖相補性決定領域（Ａ２−ＨＣＤＲ１、Ａ２−ＨＣＤＲ２及びＡ２−ＨＣＤＲ３）及び３つの軽鎖相補性決定領域（Ａ２−ＬＣＤＲ１、Ａ２−ＬＣＤＲ２及びＡ２−ＬＣＤＲ３）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＨＥＲ２への結合について競合し、ここで、Ａ２−ＨＣＤＲ１は、配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。Ａ２−ＨＣＤＲ２は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。Ａ２−ＨＣＤＲ３は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。Ａ２−ＬＣＤＲ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。Ａ２−ＬＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。及び、Ａ２−ＬＣＤＲ３は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、この第２の抗原結合ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＨＥＲ２への結合について競合する。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、この第１の抗原結合ドメインは、３つの重鎖相補性決定領域（Ａ１−ＨＣＤＲ１、Ａ１−ＨＣＤＲ２及びＡ１−ＨＣＤＲ３）及び３つの軽鎖相補性決定領域（Ａ１−ＬＣＤＲ１、Ａ１−ＬＣＤＲ２及びＡ１−ＬＣＤＲ３）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＡＰＬＰ２への結合について競合し、ここで、Ａ１−ＨＣＤＲ１は、配列番号２８、３６、及び４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。Ａ１−ＨＣＤＲ２は、配列番号３０、３８、及び４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。Ａ１−ＨＣＤＲ３は、配列番号３２、４０及び４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。Ａ１−ＬＣＤＲ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。Ａ１−ＬＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。及び、Ａ１−ＬＣＤＲ３は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、第１の抗原結合ドメインは、ヒトＡＰＬＰ２への結合について、配列番号２６、３４、及び４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む参照抗原結合タンパク質と競合する。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、第１の抗原結合ドメインは、配列番号２６、３４、及び４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、ならびに配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＡＰＬＰ２への結合について競合する、及びここで、この第２の抗原結合ドメインは、配列番号２及び１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＨＥＲ２への結合について競合する。
【０１１３】
一態様では、本発明は、抗ＨＥＲ２抗原結合分子または抗ＨＥＲ２／抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗原結合分子、及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。本発明はさらに、対象におけるがんを治療するための方法を提供し、この方法は、抗ＨＥＲ２抗原結合分子または抗ＨＥＲ２／抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗原結合分子、及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、このがんとは、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮癌、及び卵巣癌からなる群より選択される。場合によっては、このがんは乳癌である。場合によっては、この乳癌はＩＨＣ２＋乳癌である。
【０１１４】
別の態様において、本発明は、本明細書に開示される抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子（本明細書の表１及び２に記載のポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む）、ならびに表３に見られる組み合わせなどの、その任意の機能的組み合わせまたは配置で表１及び２に記載の２つ以上のポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本発明の核酸を保有する組換え発現ベクター、及びそのようなベクターが導入された宿主細胞もまた、抗体の産生を可能にし、産生された抗体を回収する条件下で宿主細胞を培養することによって抗体を産生する方法と同様に、本発明に含まれる。
【０１１５】
本発明は、ＡＰＬＰ２に特異的に結合する任意の前述の抗原結合ドメインが、ＨＥＲ２に特異的に結合する任意の前述の抗原結合ドメインと組み合わされるか、接続されるか、さもなければ会合されて、ＡＰＬＰ２及びＨＥＲ２に結合する二重特異性抗原結合分子を形成する、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含む。
【０１１６】
本発明は、改変されたグリコシル化パターンを有する抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含む。いくつかの用途では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための改変が有用である場合もあるし、またはオリゴ糖鎖に存在するフコース部分を欠く抗体は、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増大させるために有用である場合もある（Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ  ２７７：２６７３３を参照のこと）。他の用途では、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を改変するために、ガラクトシル化の改変を行ってもよい。
【０１１７】
別の態様によれば、本発明は、抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメント及び治療剤（例えば、細胞毒性剤）を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメント及び細胞毒性剤は、本明細書で考察されるように、リンカーを介して共有結合されている。様々な実施形態において、抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書に記載の抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体またはフラグメントのいずれであってもよい。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、この細胞毒性剤は、オーリスタチン、メイタンシノイド、ツブリシン、トマイマイシン、カリケアマイシン、またはドラスタチン誘導体から選択される。場合によっては、細胞毒性剤は、ＭＭＡＥもしくはＭＭＡＦから選択されたオーリスタチン、またはＤＭ１もしくはＤＭ４から選択されたメイタンシノイドである。いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、本明細書で考察されるように、式の構造を有するメイタンシノイドである。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、この細胞毒性剤は、以下の構造：
【化１】
2021523100.tif 000002
を有するメイタンシノイドである。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、この細胞毒性剤は、以下の構造：
【化２】
2021523100.tif 000003
を有するメイタンシノイドである。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、この抗体薬物コンジュゲートは、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗原結合タンパク質もしくは抗ＨＥＲ２抗体、またはそのフラグメント、及び
【化３】
2021523100.tif 000004
を含み、
ここで、
【化４】
2021523100.tif 000005
は、抗体またはそのフラグメントに対する結合である。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、この抗体薬物コンジュゲートは、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗原結合タンパク質もしくは抗ＨＥＲ２抗体、またはそのフラグメント、及び
【化５】
2021523100.tif 000006
を含み、
【０１２３】
ここで、
【化６】
2021523100.tif 000007
は、抗体またはそのフラグメントに対する結合である。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、この抗体薬物コンジュゲートは、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗原結合タンパク質または抗ＨＥＲ２抗体もしくはそのフラグメント、及び
【化７】
2021523100.tif 000008
その混合物を含み、
ここで、
【化８】
2021523100.tif 000009
は、抗体またはそのフラグメントに対する結合である。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、この結合は、システイン残基の硫黄成分を介して抗体またはそのフラグメントと接触する。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、この結合は、リジン残基の窒素成分を介して抗体またはそのフラグメントと接触する。
【０１２７】
上記または本明細書で考察される抗体薬物コンジュゲートの様々な実施形態のいずれにおいても、抗体薬物コンジュゲートは、抗ＨＥＲ２×抗ＡＰＬＰ２抗原結合タンパク質、または抗ＨＥＲ２抗体もしくはそのフラグメント１つあたり１〜１０の細胞毒性剤を含み得る。
【０１２８】
別の態様では、本発明は、本明細書に開示されるような抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子と第２の治療剤との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療剤は、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子と有利に組み合わされる任意の薬剤である。抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子と有利に組み合わされ得る例示的な薬剤は、本明細書の他のいずれかに詳細に考察されている。
【０１２９】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を使用して、ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞を標的化／殺滅するための治療方法を提供し、この治療方法は、治療有効量の本発明の抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物を、それを必要とする対象に対して投与することを含む。
【０１３０】
本発明はまた、ＨＥＲ２発現細胞に関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患または障害の治療のための薬剤の製造における本発明の抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子の使用を含む。
【０１３１】
他の実施形態は、次の詳細な説明の検討から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】抗ＡＰＬＰ２、抗ＨＥＲ２、または抗ＧＡＰＤＨ抗体で染色された様々な組織のウエスタンブロットを示す。
【図２】非常に低レベルから高レベルまでのＨＥＲ２を発現する乳癌細胞への二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体の結合（上のパネル）、及びＨＥＲ２またはＡＰＬＰ２の総細胞発現（ウエスタンブロット（ＷＢ）正規化強度、ｘ軸）との抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体細胞表面結合の相関（ＭＦＩ／核。ＡＰＬＰ２ｘＨＥＲ２（Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ）、ｙ軸）を示す（下のパネル）。
【図３】可溶性ＨＥＲ２（ＨＥＲ２．ｍｍｈ）及び／またはＡＰＬＰ２（ＡＰＬＰ２．ｍｍｈ）の有無における、ＨＥＲ２発現ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞への二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体の結合を示す。
【図４】対応する単一特異性抗体と結合した後の細胞受容体ＡＰＬＰ２及びＨＥＲ２のリソソーム内部移行（上のパネル）及びタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド（Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｍｉｄｅ）（ＣＨＸ）の添加後のＡＰＬＰ２及びＨＥＲ２受容体の分解（下のパネル）を示す。
【図５】対照抗体、抗ＨＥＲ２抗体、または二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体（２５０１４、２５０１８、２５０２０、２５０１７、２５０１９、及び２５０２１））とのインキュベーション後に抗ＨＥＲ２または抗アクチン抗体で染色されたＴ４７Ｄ乳癌細胞株からの全溶解物のウエスタンブロットを示す。
【図６】乳癌細胞単層（上及び中央のパネル）または乳癌細胞スフェロイド（下のパネル）による二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体（２５０１４、２５０１８、２５０２０）の内部移行を示す。
【図７−１】アイソタイプ対照ＤＭ１結合抗体、ＨＥＲ２／Ｔ対照ＤＭ１結合抗体、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２（２５０１８及び２５０１９）ＤＭ１結合抗体及び二重特異性のＡＰＬＰ２ｘ対照ＤＭ１結合抗体の乳癌細胞株のパネルにおけるインビトロ殺滅曲線を示す。
【図７−２】アイソタイプ対照ＤＭ１結合抗体、ＨＥＲ２／Ｔ対照ＤＭ１結合抗体、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２（２５０１８及び２５０１９）ＤＭ１結合抗体及び二重特異性のＡＰＬＰ２ｘ対照ＤＭ１結合抗体の乳癌細胞株のパネルにおけるインビトロ殺滅曲線を示す。
【図７−３】アイソタイプ対照ＤＭ１結合抗体、ＨＥＲ２／Ｔ対照ＤＭ１結合抗体、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２（２５０１８及び２５０１９）ＤＭ１結合抗体及び二重特異性のＡＰＬＰ２ｘ対照ＤＭ１結合抗体の乳癌細胞株のパネルにおけるインビトロ殺滅曲線を示す。
【図７−４】アイソタイプ対照ＤＭ１結合抗体、ＨＥＲ２／Ｔ対照ＤＭ１結合抗体、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２（２５０１８及び２５０１９）ＤＭ１結合抗体及び二重特異性のＡＰＬＰ２ｘ対照ＤＭ１結合抗体の乳癌細胞株のパネルにおけるインビトロ殺滅曲線を示す。
【図８−１】アイソタイプ対照ＤＭ１結合抗体、ＨＥＲ２／Ｔ対照ＤＭ１結合抗体、または二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２（２５０１８または２５０１９）ＤＭ１結合抗体で処置されたマウスにおけるＪＩＭＴ−１腫瘍体積を提供する。
【図８−２】アイソタイプ対照ＤＭ１結合抗体、ＨＥＲ２／Ｔ対照ＤＭ１結合抗体、または二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２（２５０１８または２５０１９）ＤＭ１結合抗体で処置されたマウスにおけるＪＩＭＴ−１腫瘍体積を提供する。
【図８−３】アイソタイプ対照ＤＭ１結合抗体、ＨＥＲ２／Ｔ対照ＤＭ１結合抗体、または二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２（２５０１８または２５０１９）ＤＭ１結合抗体で処置されたマウスにおけるＪＩＭＴ−１腫瘍体積を提供する。
【図９−１】アイソタイプ対照ＤＭ１結合抗体、ＨＥＲ２／Ｔ対照ＤＭ１結合抗体、または二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２（２５０１８）ＤＭ１結合抗体で処置されたマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−３６１腫瘍体積を提供する。
【図９−２】アイソタイプ対照ＤＭ１結合抗体、ＨＥＲ２／Ｔ対照ＤＭ１結合抗体、または二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２（２５０１８）ＤＭ１結合抗体で処置されたマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−３６１腫瘍体積を提供する。
【図１０】ＡＰＬＰ２ｈｕ／ｈｕマウスにおける二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体（２５０１４、２５０１８、２５２０２０）及びアイソタイプ対照抗体の薬物動態プロファイルを提供する。
【発明を実施するための形態】
【０１３３】
本明細書で提供されるのは、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体が、ＨＥＲ２の内部移行、リソソーム輸送、及び分解を増大させたことの実証である。さらに、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、インビトロ及びインビボでＴ−ＤＭ１よりも有意に強力であった。さらに、ＡＰＬＰ２アームの親和性が低く、そのため、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ−ＡＤＣは、ＨＥＲ２発現を欠くか、または最小限のＨＥＲ２発現である細胞の最小限の内部移行及び細胞毒性を示す。ＡＰＬＰ２は、ほとんどの乳癌細胞株、ＰＤＸモデル、及び試験された患者試料で発現していることがわかり（データは示していない）、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２−ＡＤＣが、ＩＨＣ２＋と見なされる患者を含み、幅広いＨＥＲ２陽性乳癌患者に利益をもたらす可能性があることが示唆されている。
【０１３４】
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、記載された特定の方法及び実験条件に限定されず、したがって、そのような方法及び条件は変動し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することを目的とするに過ぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを意図しないことも理解されたい。
【０１３５】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用される場合、その値が列挙された値から１％未満変化し得ることを意味する。例えば、「約１００」という表現には、９９と１０１、及びその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）が含まれる。
【０１３６】
本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法及び材料を本発明の実施または試験に使用し得るが、好ましい方法及び材料をここで説明する。本明細書に記載されている全ての特許、出願、及び非特許刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３７】
定義
「ＡＰＬＰ２」という表現には、ヒトにおいてＡＰＬＰ２遺伝子によってコードされ、配列番号５０として示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。ＡＰＬＰ２は遍在的に発現され、グルコース及びインスリン恒常性の重要なモジュレーターである。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、及びタンパク質フラグメントへの全ての言及は、非ヒト種に由来するものとして明示的に指定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質フラグメントのヒトバージョンを指すものとする。したがって、「ＡＰＬＰ２」という表現は、例えば「マウスＡＰＬＰ２」、「サルＡＰＬＰ２」などの非ヒト種に由来するものとして指定されない限り、ヒトＡＰＬＰ２を意味する。
【０１３８】
「ＡＰＬＰ２に結合する抗体」または「抗ＡＰＬＰ２抗体」という句は、単一のＡＰＬＰ２サブユニット（例えば、イプシロン、デルタ、ガンマまたはゼータ）を特異的に認識する抗体及びその抗原結合フラグメント、ならびに２つのＡＰＬＰ２サブユニットの二量体複合体（例えば、ガンマ／イプシロン、デルタ／イプシロン、及びゼータ／ゼータＡＰＬＰ２二量体）を特異的に認識する抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、可溶性ＡＰＬＰ２及び／または細胞表面に発現されたＡＰＬＰ２に結合し得る。可溶性ＡＰＬＰ２には、天然のＡＰＬＰ２タンパク質と、膜貫通ドメインを欠いているか、そうでなければ細胞膜と結合していない組換えＡＰＬＰ２タンパク質バリアント（例えば、単量体及び二量体ＡＰＬＰ２構築物など）が含まれる。
【０１３９】
「細胞表面発現ＡＰＬＰ２」という表現は、ＡＰＬＰ２タンパク質の少なくとも一部が細胞膜の細胞外側に露出され、抗体の抗原結合部分にアクセス可能であるように、インビトロまたはインビボで細胞の表面に発現される、１つ以上のＡＰＬＰ２タンパク質（複数可）を指す。「細胞表面発現ＡＰＬＰ２」は、細胞膜の機能的Ｔ細胞受容体の文脈内に含まれるＡＰＬＰ２タンパク質を含む。「細胞表面発現ＡＰＬＰ２」という表現は、細胞の表面上のホモ二量体またはヘテロ二量体の一部として発現されるＡＰＬＰ２タンパク質（例えば、ガンマ／イプシロン、デルタ／イプシロン、及びゼータ／ゼータＡＰＬＰ２二量体）を含む。「細胞表面発現ＡＰＬＰ２」という表現はまた、他のＡＰＬＰ２鎖タイプなしで、細胞の表面上でそれ自体によって発現されるＡＰＬＰ２鎖（例えば、ＡＰＬＰ２−イプシロン、ＡＰＬＰ２−デルタまたはＡＰＬＰ２−ガンマ）を含む。「細胞表面発現ＡＰＬＰ２」は、通常ＡＰＬＰ２タンパク質を発現する細胞の表面に発現されるＡＰＬＰ２タンパク質を含んでもよいし、またはそれからなってもよい。あるいは、「細胞表面発現ＡＰＬＰ２」は、通常はその表面にヒトＡＰＬＰ２を発現しないが、その表面にＡＰＬＰ２を発現するように人工的に操作された細胞の表面に発現されるＡＰＬＰ２タンパク質を含んでもよいし、またはそれからなってもよい。
【０１４０】
「ＨＥＲ２」または「ヒト上皮成長因子受容体２」という表現は、ヒト上皮成長因子受容体ファミリーのメンバーを指す。このがん遺伝子の増幅または過剰発現は、特定の悪性のタイプの乳癌の発症及び進行に重要な役割を果たすことが示されている。近年、このタンパク質は、乳癌患者の約３０％にとって重要なバイオマーカー及び治療の標的となっている。ＨＥＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４９として示されている。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、及びタンパク質フラグメントへの全ての言及は、非ヒト種由来であると明示しない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質フラグメントのヒトバージョンを指すものとする。したがって、「ＨＥＲ２」という表現は、例えば「マウスＨＥＲ２」、「サルＨＥＲ２」などの非ヒト種に由来するものとして指定されない限り、ヒトＨＥＲ２を意味する。
【０１４１】
「ＨＥＲ２に結合する抗体」または「抗ＨＥＲ２抗体」という句は、ＨＥＲ２を特異的に認識する抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。
【０１４２】
「抗原結合分子」という用語は、抗体及び抗体の抗原結合フラグメント、例えば、二重特異性抗体を含む。
【０１４３】
「アビディティ」という用語は、その所望の効果を達成するために、抗原結合分子が標的関与の閾値に到達する能力を指す。複数の標的抗原及び多重特異性抗原結合分子の文脈における「アビディティ（結合力）駆動型結合」または「アビディティ（結合力）駆動型ペアリング（対合）」という句は、多重特異性抗原結合分子が少なくとも２つの一価結合アームを提供して、第１の結合アーム（複数可）が、高い親和性で第１の標的抗原に結合する作用機序を指す。第２の結合アーム（複数可）は、両方の抗原が同じ細胞上に存在するなど、互いに近接していない限り、第２の結合アームが第２の標的抗原に結合しないように、低い親和性で第２の標的抗原に結合する。したがって、第１の標的抗原への高親和性結合は、第２の結合アームに対する低親和性アームの結合力を増大させ、第２の標的への結合を媒介する（Ｒｈｏｄｅｎ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｙ  ２０，２０１６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２９１，１１３３７−１１３４７，２０１６年３月２８日に最初に公開ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１６．７１４２８７、Ｊａｒａｎｔｏｗ，Ｓ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ９，２０１５，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２９０（４１）：２４６８９−７０４．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１５．６５１６５３．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ａｕｇ  １０）。一例では、ＨＥＲ２×ＡＰＬＰ２二重特異性抗体は、高いＨＥＲ２親和性（例えば、３〜５ｎＭ）及び低いＡＰＬＰ２親和性（例えば、１４５〜９７６ｎＭ）を示す。提案された作用機序は、高親和性ＨＥＲ２アームを使用してＨＥＲ２陽性腫瘍細胞に結合するＨＥＲ２  ｘ  ＡＰＬＰ２二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）を提供する。これにより、ＡＰＬＰ２に対する低親和性ＡＰＬＰ２アームの結合力が高まり、第２の標的への結合を媒介してＨＥＲ２の望ましい内部移行をもたらす。したがって、ＡＰＬＰ２の内部移行の際に、複合体全体（すなわち、ＡＰＬＰ２標的、ＨＥＲ２×ＡＰＬＰ２  ｂｓＡｂ及びＨＥＲ２標的）は、リソソーム分解のために内部移行される。
【０１４４】
ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２  ｂｓＡｂが標的細胞と相互作用する程度は、ＨＥＲ２との相互作用によって決定されることが観察された。１つの理論に拘束されることなく、ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２  ｂｓＡｂの高親和性ＨＥＲ２アームとＨＥＲ２受容体との間の最初の相互作用により、ｂｓＡｂの局所的な細胞表面濃度が増大する。続いて、ｂｓＡｂは、その低親和性ＡＰＬＰ２アームでＡＰＬＰ２に接触し、二重受容体結合力（ｄｕａｌ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｖｉｄｉｔｙ）によりＡＰＬＰ２−ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２ｂｓＡｂ−ＨＥＲ２複合体が形成される。この複合体はその後、細胞の表面からリソソーム区画へのＡＰＬＰ２を介した内部移行を受ける。
【０１４５】
「抗体」という用語は、特定の抗原（例えば、ＨＥＲ２またはＡＰＬＰ２）に特異的に結合するか、または相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む任意の抗原結合分子または分子複合体を指す。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重鎖（Ｈ）鎖及び２つの軽鎖（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）で構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化されてもよい。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。本発明の異なる実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗ＡＰＬＰ２抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよいし、または天然もしくは人工的に改変されてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲのサイドバイサイド分析に基づいて定義され得る。
【０１４６】
「抗体」という用語はまた、完全な抗体分子の抗原結合フラグメントを含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得られる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、抗体可変及び任意に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む、タンパク質分解消化または組換え遺伝子工学技術などの任意の適切な標準技術を使用して、完全な抗体分子から誘導され得る。そのようなＤＮＡは、公知であるか、及び／または、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成されてもよい。ＤＮＡは、化学的に、または分子生物学技術を使用して、例えば、１つ以上の可変及び／または定常ドメインを、適切な構成に配置するため、またはコドンを導入するため、システイン残基を作成するため、アミノ酸を改変、追加または削除するためなどのために配列決定されて操作され得る。
【０１４７】
抗原結合フラグメントの非限定的な例としては、以下が挙げられる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント、及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基または拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位。他の操作された分子、例えば、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小さいモジュラー免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインもまた、「抗原結合フラグメント」という表現に含まれる。
【０１４８】
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。この可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであり得、一般には、１つ以上のフレームワーク配列に隣接するかまたはそれとインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインに関連するＶＨドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、ＶＨ及びＶＬドメインは、任意の適切な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は、二量体であってもよく、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＬ二量体を含んでもよい。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のＶＨまたはＶＬドメインを含んでもよい。
【０１４９】
ある特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見出され得る、可変ドメイン及び定常ドメインの非限定的で例示的な構成には、以下が含まれる：（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬ。上記の例示的な構成のいずれかを含む、可変ドメイン及び定常ドメインの任意の構成において、可変ドメイン及び定常ドメインは、互いに直接連結されてもよいし、または完全もしくは部分的なヒンジもしくはリンカー領域によって連結されてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子内の隣接する可変ドメイン及び／または定常ドメイン間の可塑性または半可塑性の結合をもたらす少なくとも２つ（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれ以上）のアミノ酸からなってもよい。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いに、及び／または、１つ以上の単量体ＶＨもしくはＶＬドメインと（例えば、ジスルフィド結合（複数可）によって）非共有結合して、上記に列挙された可変及び定常ドメイン構成のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含んでもよい。
【０１５０】
完全な抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは、単一特異性であっても、または多重特異性（例えば、二重特異性）であってもよい。抗体の多重特異性抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、ここで各可変ドメインは、別個の抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合し得る。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む任意の多重特異性抗体フォーマットは、当該技術分野で利用可能な慣用的な技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合フラグメントの状況での使用に適合され得る。
【０１５１】
本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して機能し得る。「補体依存性細胞媒介細胞毒性」（ＣＤＣ）は、補体の存在下での本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介細胞傷害（毒性）」（ＡＤＣＣ）とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上で結合した抗体を認識し、それにより標的細胞の溶解をもたらす細胞媒介性の反応を指す。ＣＤＣ及びＡＤＣＣは、当該技術分野において周知で利用可能なアッセイを使用して測定され得る。（例えば、米国特許第５，５００，３６２号及び同第５，８２１，３３７号、ならびにＣｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６を参照のこと）。抗体の定常領域は、抗体が補体を固定し、細胞依存性細胞傷害を媒介する能力において重要である。したがって、抗体のアイソタイプは、抗体が細胞毒性を媒介することが望ましいか否かに基づいて選択され得る。
【０１５２】
本発明のある特定の実施形態において、本発明の抗ＨＥＲ２単一特異性抗体または抗ＨＥＲ２／抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗体は、ヒト抗体である。「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を指す。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発、またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。しかし、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図していない。
【０１５３】
本発明の抗体は、いくつかの実施形態において、組換えヒト抗体であり得る。「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって、調製、発現、作成または単離されている全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体（以下でさらに説明される）、組換えから単離された抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリー（以下でさらに説明）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５を参照）または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作成または単離された抗体を含むものとする。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する。しかし、ある特定の実施形態において、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発に（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物が使用される場合、インビボ体細胞変異誘発に）供され、したがって、ヒト生殖細胞系列のＶＨ及びＶＬ配列に由来し、関連しているが、インビボでのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に自然には存在しない可能性がある組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列が配列決定される。
【０１５４】
ヒト抗体は、ヒンジの不均一性に関連する２つの形態で存在し得る。一形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されている、約１５０〜１６０ｋＤａの安定な４本鎖構築物を含む。第２の形態では、二量体は鎖間ジスルフィド結合を介して結合せず、共有結合した軽鎖及び重鎖（半抗体）から構成される約７５〜８０ｋＤａの分子が形成される。これらの形態は、アフィニティー精製後でさえ分離が極めて困難であった。
【０１５５】
様々なインタクトなＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現の頻度は、限定するものではないが、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造の違いに起因する。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一のアミノ酸置換は、第２の形態（Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３０：１０５）の出現を、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して通常観察されるレベルまで有意に減少し得る。本発明は、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域に１つ以上の変異を有する抗体を包含し、これは、例えば、生成において、所望の抗体形態の収量を改善するために望ましい場合がある。
【０１５６】
本発明の抗体は、単離された抗体であり得る。「単離された抗体」とは、その自然環境の少なくとも１つの成分から同定され、分離されるか、及び／または回収された抗体を指す。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が天然に存在するかもしくは天然に産生される組織または細胞から分離または除去された抗体が、本発明の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体はまた、組換え細胞内のインサイチュでの抗体を含む。単離された抗体とは、少なくとも１つの精製または単離工程に供された抗体である。ある特定の実施形態によれば、単離された抗体とは、他の細胞物質及び／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【０１５７】
本発明はまた、ＨＥＲ２に結合するワンアーム（ｏｎｅ−ａｒｍ）抗体を含む。「ワンアーム抗体」という用語は、単一の抗体の重鎖及び単一の抗体の軽鎖を含む抗原結合分子を指す。本発明のワンアーム抗体は、表１に記載されるようなＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のいずれを含んでもよい。
【０１５８】
本明細書に開示される抗ＨＥＲ２または抗ＨＥＲ２／抗ＡＰＬＰ２抗体は、抗体が由来した、対応する生殖系列配列と比較して、重鎖及び／または軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域における１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公開されている抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認され得る。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体及びその抗原結合フラグメントを含み、１つ以上のフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来する生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）に対して、または別のヒト生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）に対して、または対応する生殖細胞系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に対して変異されている（このような配列変化は、本明細書では「生殖細胞変異」として総称的に言及される）。本明細書に開示される重鎖及び軽鎖可変領域配列から始めて、当業者は、１つ以上の個々の生殖細胞変異またはそれらの組み合わせを含む多数の抗体及び抗原結合フラグメントを容易に生成し得る。ある特定の実施形態において、ＶＨ及び／またはＶＬドメイン内のフレームワーク及び／またはＣＤＲ残基の全ては、抗体が由来する元の生殖系列配列に見出される残基に変異して戻される。他の実施形態では、ある特定の残基のみが元の生殖系列配列に変異して戻される（例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内もしくはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見られる変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内に見られる変異残基のみ）。他の実施形態では、フレームワーク及び／またはＣＤＲ残基（複数可）のうちの１つ以上が、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体がもともと由来する生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）に変異されている。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内の２つ以上の生殖細胞変異の任意の組み合わせを含み得、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖細胞配列の対応する残基に変異されるが、一方、元の生殖細胞系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持されるか、または異なる生殖細胞系列配列の対応する残基に変異される。一旦得られれば、１つ以上の生殖細胞変異を含む抗体及び抗原結合フラグメントを、１つ以上の所望の特性、例えば、結合特異性の改善、結合親和性の増大、拮抗的またはアゴニスト的な生物学的特性の改善または増強（場合によって）、免疫原性の低下などについて容易に試験し得る。この一般的な方法で得られた抗体及び抗原結合フラグメントは、本発明内に含まれる。
【０１５９】
本発明はまた、１つ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む抗ＨＥＲ２または抗ＨＥＲ２／抗ＡＰＬＰ２抗体を含む。例えば、本発明は、本明細書の表１に記載されているか、または本明細書の表２及び３に記載されている、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０以下、８以下、６以下、４以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＨＥＲ２または抗ＨＥＲ２／抗ＡＰＬＰ２抗体を含む。
【０１６０】
「エピトープ」という用語は、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域における特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原が、複数のエピトープを有する場合がある。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合する場合があり、異なる生物学的効果を有する場合がある。エピトープは、立体配座または線形のいずれであってもよい。立体配座（コンフォメーション）エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並置されたアミノ酸によって生成される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖の隣接するアミノ酸残基によって生成されるものである。ある特定の状況において、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
【０１６１】
「実質的同一性」または「実質的に同一」という用語は、核酸またはそのフラグメントを指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適に整列される場合、以下に考察されるように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐのような任意の周知の配列同一性のアルゴリズムによって測定した場合、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、ある特定の例において、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じか、または実質的に同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
【０１６２】
ポリペプチドに適用される場合、「実質的類似性」または「実質的に類似」という用語は、デフォルトのギャップ重みを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列された場合、２つのペプチド配列が少なくとも９５％の配列同一性を、さらにより好ましくは、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的なアミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変更しない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似度は、置換の保存的性質を補正するために上方に調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照のこと。同様の化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、以下が挙げられる（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（５）塩基性の側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩、ならびに（７）硫黄含有側鎖はシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸塩−アスパラギン酸塩、及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保守的な置換は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５に開示されている、ＰＡＭ２５０対数尤度行列に正の値を持つ任意の変更である。「適度に保守的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列に負でない値を持つ任意の変更のことである。
【０１６３】
配列同一性とも呼ばれるポリペプチドの配列類似性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠失、及びその他の改変に割り当てられた類似性の尺度を使用して、同様の配列を照合する。例えば、ＧＣＧソフトウェアには、Ｇａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムが含まれており、これによって、デフォルトのパラメーターを使用して、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間、または野生型タンパク質とそのムテインとの間の、配列相同性または配列同一性を決定し得る。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるデフォルトまたは推奨パラメーターを使用したＦＡＳＴＡを使用しても比較され得る。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリ配列と検索配列との間の最良の重複の領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する（上記のＰｅａｒｓｏｎ（２０００））。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトのパラメーターを使用するコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２を参照のこと。
【０１６４】
生殖系列変異
本明細書に開示される抗ＡＰＬＰ２抗体は、抗体が由来する対応する生殖系列配列と比較して、重鎖可変ドメインのフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域における１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を含み得る。
【０１６５】
本発明はまた、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗ＡＰＬＰ２抗体、及びその抗原結合フラグメントを含み、ここで１つ以上のフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来する生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）に対して、または別のヒト生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）に対して、または対応する生殖細胞系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に対して変異しており（そのような配列変化は、本明細書では総称的に「生殖細胞変異」と呼ばれる）、ＡＰＬＰ２抗原への弱い結合も検出可能な結合も有さない。ＡＰＬＰ２を認識するいくつかのそのような例示的な抗体は、本明細書の表２に記載されている。
【０１６６】
さらに、本発明の抗体は、フレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内の２つ以上の生殖細胞変異の任意の組み合わせを含み得、例えば、ある特定の個々の残基が特定の生殖細胞配列の対応する残基に変異され、一方で、元の生殖細胞系列配列とは異なる、ある特定の他の残基は、維持されるか、または異なる生殖細胞系列配列の対応する残基に対して変異されている。一旦、得られれば、１つ以上の生殖細胞変異を含む抗体及び抗原結合フラグメントを、結合特異性の改善、結合親和性の弱さまたは低下、薬物動態特性の改善または増強、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について試験し得る。本開示のガイダンスが与えられたこの一般的な方式で得られた抗体及び抗原結合フラグメントは、本発明に含まれる。
【０１６７】
本発明はまた、１つ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む抗ＡＰＬＰ２及び／または抗ＨＥＲ２抗体も含む。例えば、本発明は、本明細書の表１、２、及び３に記載されているＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０以下、８以下、６以下、４以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する、抗ＡＰＬＰ２及び／または抗ＨＥＲ２抗体を含む。本発明の抗体及び二重特異性抗原結合分子は、個々の抗原結合ドメインが誘導された、対応する生殖系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域における１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を含むが、一方で、例えば、ＡＰＬＰ２への所望の弱い〜検出不可能な結合を維持または改善している。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させず、すなわち、アミノ酸置換は、抗ＡＰＬＰ２結合分子の場合、所望の弱い〜検出不能な結合親和性を維持または改善する。同様の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、以下が挙げられる（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（５）塩基性の側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩、ならびに（７）硫黄含有側鎖はシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換の群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸塩−アスパラギン酸塩、及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保守的な置換は、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列に正の値を有する任意の変更である。「適度に保守的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列に負でない値を有する任意の変更のことである。
【０１６８】
本発明はまた、ＡＰＬＰ２抗原に対する望ましい弱い親和性を維持または改善しながら、本明細書に開示されるＨＣＶＲ及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと実質的に同一であるＨＣＶＲ及び／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を含む。アミノ酸配列を指す場合の「実質的な同一性」または「実質的に同一」という用語は、デフォルトのギャップ重みを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列された場合、２つのアミノ酸配列が少なくとも９５％の配列同一性を、さらにより好ましくは、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似度は、置換の保存的性質を補正するために上方に調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照のこと。
【０１６９】
配列同一性とも呼ばれるポリペプチドの配列類似性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠失、及びその他の改変に割り当てられた類似性の尺度を使用して、同様の配列を照合する。例えば、ＧＣＧソフトウェアには、Ｇａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムが含まれており、これによって、デフォルトのパラメーターを使用して、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間、または野生型タンパク質とそのムテイン間の、配列相同性または配列同一性を決定し得る。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるデフォルトまたは推奨パラメーターを使用したＦＡＳＴＡを使用して比較してもよい。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリ配列と検索配列との間の最良の重複の領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する（上記のＰｅａｒｓｏｎ（２０００））。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトのパラメーターを使用するコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２を参照のこと。
【０１７０】
一旦得られると、１つ以上の生殖細胞変異を含む抗原結合ドメインを、１つ以上のインビトロアッセイを利用して、結合親和性の低下について試験した。特定の抗原を認識する抗体は、通常、抗原に対する高い（すなわち強い）結合親和性を試験することによって、その目的に関してスクリーニングされるが、本発明の抗体は、弱い結合を示すか、または検出可能な結合を示さない。この一般的な方法で得られた１つ以上の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子もまた、本発明に包含され、結合力駆動型腫瘍療法として有利であることが見出された。
【０１７１】
予期しない利益、例えば、改善された薬物動態特性及び患者への低い毒性は、本明細書に記載の方法によって本発明の抗体をさらに改変することから実現され得る。
【０１７２】
抗体の結合特性
抗体、免疫グロブリン、抗体結合フラグメント、またはＦｃ含有タンパク質の、例えば、細胞表面タンパク質またはそのフラグメントなどの所定の抗原のいずれかへの結合の文脈における「結合」という用語は、典型的には、抗体−抗原相互作用など、少なくとも２つの実体または分子構造間の相互作用または関連を指す。
【０１７３】
例えば、結合親和性は、典型的には、抗原をリガンドとして使用し、及び抗体、Ｉｇ、抗体結合フラグメント、またはＦｃ含有タンパク質を分析物（または抗リガンド）として使用して、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００機器の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定される場合、約１０−７Ｍ以下、例えば、約１０−８Ｍ以下、例えば、約１０−９Ｍ以下のＫＤ値に対応する。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）結合アッセイなどの細胞ベースの結合戦略も慣用的に使用されており、細胞表面に発現するタンパク質に関する結合特性データを提供する。ＦＡＣＳデータは、放射性リガンド競合結合及びＳＰＲなどの他の方法とよく相関する（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，ＣＡ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７，２０１（２）：２２３−３１、Ｇｅｕｉｊｅｎ，ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５，３０２（１−２）：６８−７７）。
【０１７４】
したがって、本発明の抗体または抗原結合タンパク質は、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合について、その親和性よりも少なくとも１０倍低いＫＤ値に対応する親和性を有する所定の抗原または細胞表面分子（受容体）に結合する。本発明によれば、非特異的抗原よりも１０倍以下低いＫＤ値に対応する抗体の親和性は、検出不可能な結合と見なされ得るが、そのような抗体は、本発明の二重特異性抗体を産生するための第２の抗原結合アームと対になり得る。
【０１７５】
「ＫＤ」または「ＫＤ」のモル（Ｍ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数、または抗原に結合する抗体もしくは抗体結合フラグメントの解離平衡定数を指す。ＫＤと結合親和性との間には反比例の関係があるため、ＫＤ値が小さいほど、親和性は高く、すなわち強くなる。したがって、「より高い親和性」または「より強い親和性」という用語は、相互作用を形成するより高い能力に、したがってより小さなＫＤ値に関連し、逆に、「より低い親和性」または「より弱い親和性」という用語は、相互作用を形成する能力が低いこと、したがってより大きなＫＤ値に関する。いくつかの状況では、別の相互作用パートナー分子（例えば、抗原Ｙ）に対する分子（例えば抗体）の結合親和性と比較して、相互作用パートナー分子（例えば、抗原Ｘ）に対する特定の分子（例えば抗体）の結合親和性（またはＫＤ）が高いことは、より小さなＫＤ（より高いまたはより強い親和性）で、より大きなＫＤ値（より低いまたはより弱い親和性）を割ることによって決定される結合比として表され得、場合によって、例えば５倍または１０倍大きい結合親和性として表される。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、二重特異性抗原結合分子またはそのコンジュゲートは、ＡＰＬＰ２へのその結合親和性の１０倍を超える結合親和性（ＫＤ値）でＨＥＲ２に結合する。このように、二重特異性分子は、ＡＰＬＰ２へのその結合親和性よりもＨＥＲ２への結合親和性がはるかに強い。場合によっては、結合親和性は、３７℃での表面プラズモン共鳴アッセイまたは同等のアッセイによって測定される。
【０１７７】
「ｋｄ」（秒−１または１／ｓ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数、または抗体または抗体結合フラグメントの解離速度定数を指す。このような値はまた、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
【０１７８】
用語「ｋａ」（Ｍ−１×秒−１または１／Ｍ）は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度定数、または抗体もしくは抗体結合フラグメントの会合速度定数を指す。
【０１７９】
「ＫＡ」（Ｍ−１または１／Ｍ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の会合平衡定数、または抗体もしくは抗体結合フラグメントの会合平衡定数を指す。会合平衡定数は、ｋａをｋｄで割ることによって得られる。
【０１８０】
「ＥＣ５０」または「ＥＣ５０」という用語は、最大有効濃度の半分を指し、これは、指定された曝露時間後にベースラインと最大の中間の応答を誘導する抗体の濃度を含む。ＥＣ５０は本質的に、最大効果の５０％が観察される抗体の濃度を表す。ある特定の実施形態において、ＥＣ５０値は、例えば、ＦＡＣＳ結合アッセイで決定した場合、ＡＰＬＰ２または腫瘍関連抗原を発現する細胞への最大の半分の結合を与える本発明の抗体の濃度に等しい。したがって、結合の減少または弱化は、ＥＣ５０の増大、または最大有効濃度値の半分で観察される。
【０１８１】
一実施形態では、結合の減少は、最大量の半分の標的細胞への結合を可能にするＥＣ５０抗体濃度の増大として定義され得る。
【０１８２】
二重特異性抗原結合分子
本発明の抗体は、単一特異性であっても、二重特異性であっても、または多重特異性であってもよい。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的である場合もあれば、複数の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含む場合もある。例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９、Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８−２４４。本発明の抗ＨＥＲ２単一特異性抗体または抗ＨＥＲ２／抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗体は、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結されてもよいし、またはそれらと共発現されてもよい。例えば、抗体またはそのフラグメントは、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合などによって）１つ以上の他の分子実体、例えば、別の抗体または抗体フラグメントに機能的に連結されて、二重特異性抗体または第２もしくは追加の結合特異性を有する多重特異性抗体を生成し得る。
【０１８３】
本明細書における「抗ＡＰＬＰ２抗体」または「抗ＨＥＲ２抗体」という表現の使用は、単一特異性抗ＡＰＬＰ２または抗ＨＥＲ２抗体、ならびにＡＰＬＰ２結合アーム及びＨＥＲ２結合アームを含む二重特異性抗体の両方を含むものとする。したがって、本発明は、免疫グロブリンの一方のアームがヒトＡＰＬＰ２に結合し、免疫グロブリンの他方のアームがヒトＨＥＲ２に特異的である二重特異性抗体を含む。ＡＰＬＰ２結合アームは、本明細書の表１、２及び３に記載されるようなＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のいずれを含んでもよい。
【０１８４】
ある特定の実施形態において、ＡＰＬＰ２結合アームは、ヒトＡＰＬＰ２に結合し、そしてＡＰＬＰ２及びそれに結合した抗体の内部移行を誘導する。ある特定の実施形態において、ＡＰＬＰ２結合アームは、ヒトＡＰＬＰ２に弱く結合し、ＡＰＬＰ２及びそれに結合した抗体の内部移行を誘導する。他の実施形態では、ＡＰＬＰ２結合アームは、ヒトＡＰＬＰ２に弱く結合し、二重特異性または多重特異性抗体という状況では、腫瘍関連抗原発現細胞殺滅を誘導する。他の実施形態では、ＡＰＬＰ２結合アームは、ヒト及びカニクイザル（サル）ＡＰＬＰ２に結合するか、または弱く会合するが、結合相互作用は、当該技術分野で公知のインビトロアッセイでは検出できない。ＨＥＲ２結合アームは、本明細書の表１に記載されるようなＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のいずれを含んでもよい。ＨＥＲ２結合アームは、本明細書の実施例４に記載の表面プラズモン共鳴アッセイなどのインビトロ親和性結合アッセイで測定した場合、１０ｎＭ  ＫＤ未満の結合親和性を有する任意の抗ＨＥＲ２抗体を含んでもよい。
【０１８５】
ある特定の例示的な実施形態によれば、本発明は、ＡＰＬＰ２及びＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む。そのような分子は、本明細書では、例えば、「抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２」、または「抗ＡＰＬＰ２ｘＨＥＲ２」または「ＡＰＬＰ２ｘＨＥＲ２」二重特異性分子、または他の同様の用語（例えば、抗ＨＥＲ２／抗ＡＰＬＰ２）と呼ばれ得る。
【０１８６】
「ＨＥＲ２」という用語は、非ヒト種（例えば、「マウスＨＥＲ２」、「サルＨＥＲ２」など）に由来するものとして指定されない限り、ヒトＨＥＲ２タンパク質を指す。ヒトＨＥＲ２タンパク質は、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有する。
【０１８７】
ＡＰＬＰ２及びＨＥＲ２に特異的に結合する前述の二重特異性抗原結合分子は、インビトロの親和性結合アッセイにより測定した場合、約４０または５０ｎＭを超えるＫＤを示すなどの弱い結合親和性でＡＰＬＰ２に結合する、抗ＡＰＬＰ２抗原結合分子を含み得る。場合によっては、ＡＰＬＰ２結合アームは、（例えば、表面プラズモン共鳴アッセイので測定されるものとして）約１００ｎＭを超える、約２００ｎＭを超える、約３００ｎＭを超える、約４００ｎＭを超える、約５００ｎＭを超える、または約１μＭを超えるＫＤまたはＥＣ５０でＡＰＬＰ２に結合する。場合によっては、第１の抗原結合ドメインは、ＡＰＬＰ２に特異的に結合する（例えば、ヒトＡＰＬＰ２とカニクイザルＡＰＬＰ２のいずれかまたは両方とも、親和性が弱いか測定不能で結合する）。
【０１８８】
ＡＰＬＰ２及びＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子は、インビトロ結合アッセイによって測定した場合、二重特異性抗原結合分子がＨＥＲ２に結合するよりも１０倍以上弱い結合で、ＡＰＬＰ２に結合し得る。場合によっては、二重特異性抗原結合分子は、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞ベース結合アッセイ（すなわちＦＡＣＳ）などのインビトロの結合アッセイで測定した場合、約２０倍超弱い、または２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、または２００倍弱いＫＤまたはＥＣ５０でＡＰＬＰ２に結合する。
【０１８９】
「抗原結合分子」という表現は、単独で、または１つ以上の追加のＣＤＲ及び／またはフレームワーク領域（ＦＲ）と組み合わせて、特定の抗原に特異的に結合する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むかまたはそれらからなるタンパク質、ポリペプチドまたは分子複合体を指す。ある特定の実施形態において、抗原結合分子は、それらの用語が本明細書の他の場所で定義されているように、抗体または抗体のフラグメントである。
【０１９０】
「二重特異性抗原結合分子」という表現は、少なくとも第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインを含むタンパク質、ポリペプチド、または分子複合体を指す。二重特異性抗原結合分子内の各抗原結合ドメインは、単独で、または１つ以上の追加のＣＤＲ及び／またはＦＲと組み合わせて、特定の抗原に特異的に結合する、少なくとも１つのＣＤＲを含む。本発明の文脈において、第１の抗原結合ドメインは、第１の抗原（例えば、ＡＰＬＰ２）に特異的に結合し、第２の抗原結合ドメインは、第２の別個の抗原（例えば、ＨＥＲ２）に特異的に結合する。
【０１９１】
本発明のある特定の例示的な実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体の各抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＲ）を含む。第１及び第２の抗原結合ドメイン（例えば、二重特異性抗体）を含む二重特異性抗原結合分子の文脈において、第１の抗原結合ドメインのＣＤＲは、接頭辞「Ａ１」で指定され得、かつ第２の抗原結合ドメインのＣＤＲは、接頭辞「Ａ２」で指定され得る。したがって、第１の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書では、Ａ１−ＨＣＤＲ１、Ａ１−ＨＣＤＲ２、及びＡ１−ＨＣＤＲ３と呼ばれ得る。そして、第２の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書では、Ａ２−ＨＣＤＲ１、Ａ２−ＨＣＤＲ２、及びＡ２−ＨＣＤＲ３と呼ばれ得る。
【０１９２】
第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、互いに直接的または間接的に接続されて、本発明の二重特異性抗原結合分子を形成し得る。あるいは、第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれ、別個の多量体化ドメインに接続され得る。ある多量体化ドメインと別の多量体化ドメインとの会合は、２つの抗原結合ドメイン間の会合を促進し、それにより、二重特異性抗原結合分子を形成する。「多量体化ドメイン」は、同じまたは類似の構造または構成の第２の多量体化ドメインと会合する能力を有する、任意の高分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸である。例えば、多量体化ドメインは、免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであり得る。多量体化成分の非限定的な例は、免疫グロブリンのＦｃ部分（ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む）、例えば、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選択されるＩｇＧのＦｃドメイン、ならびに各アイソタイプ群内の任意のアロタイプである。
【０１９３】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、典型的には、２つの多量体化ドメイン、例えば、それぞれが別個の抗体重鎖の個々の部分である２つのＦｃドメインを含むであろう。第１及び第２の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４などの同じＩｇＧアイソタイプのものであり得る。あるいは、第１及び第２の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４などのような異なるＩｇＧアイソタイプのものであり得る。
【０１９４】
ある特定の実施形態において、多量体化ドメインは、Ｆｃフラグメント、または少なくとも１つのシステイン残基を含む長さが１〜約２００アミノ酸のアミノ酸配列である。他の実施形態では、多量体化ドメインは、システイン残基、または短いシステイン含有ペプチドである。他の多量体化ドメインには、ロイシンジッパー、ヘリックスループモチーフ、もしくはコイルドコイルモチーフを含むか、またはそれらからなるペプチドまたはポリペプチドが含まれる。
【０１９５】
任意の二重特異性抗体フォーマットまたは技術を使用して、本発明の二重特異性抗原結合分子を作製し得る。例えば、第１の抗原結合特異性を有する抗体またはそのフラグメントは、第２の抗原結合特異性を有する別の抗体または抗体フラグメントなどの１つ以上の他の分子実体に機能的に連結され得（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合などによって）、二重特異性抗原結合分子を生成し得る。本発明の文脈で使用され得る特定の例示的な二重特異性フォーマットとしては、限定するものではないが、例えば、ｓｃＦｖベースまたはダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、クアドロマ、ノブ−イントゥ−ホール、一般的な軽鎖（例えば、ノブ−イントゥ−ホールが付いた一般的な軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、及びＭａｂ２二重特異性フォーマット（前述のフォーマットの概説については、例えば、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ  ４：６，１−１１、及びそこに引用されている参考文献を参照）が挙げられる。
【０１９６】
本発明の二重特異性抗原結合分子の文脈において、多量体化ドメイン、例えば、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの天然に存在するバージョンである野生型と比較して、１つ以上のアミノ酸変化（例えば、挿入、欠失または置換）を含み得る。例えば、本発明は、ＦｃとＦｃＲｎとの間の改変された結合相互作用（例えば、増強または減少）を有する改変されたＦｃドメインをもたらすＦｃドメインにおける１つ以上の改変を含む、二重特異性抗原結合分子を含む。一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、ＣＨ２またはＣＨ３領域における改変を含み、この改変は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲のエンドソームにおいて）、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増大させる。そのようなＦｃ改変の非限定的な例としては、例えば、位置２５０（例えば、ＥまたはＱ）、２５０及び４２８（例えば、ＬまたはＦ）、２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４（例えば、ＳまたはＴ）、及び２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）、あるいは位置４２８及び／または４３３（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）及び／または４３４（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）での改変、あるいは位置２５０及び／または４２８での改変、あるいは、位置３０７または３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び４３４での改変が挙げられる。一実施形態では、この改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）改変、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の変更、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例えば、４３４Ｙ）の改変、２５２、２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）の改変、２５０Ｑ及び４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）、ならびに３０７及び／または３０８の改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。
【０１９７】
本発明はまた、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を含み、ここで、第１及び第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸が互いに異なり、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、アミノ酸の相違がない二重特異性抗体と比較して、プロテインＡへの二重特異性抗体の結合を減少させる。一実施形態では、第１のＩｇ  ＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる、ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を低減または無効にする変異を含む。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる、ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。例えば、米国特許第８，５８６，７１３号を参照のこと。第２のＣＨ３内に見られ得るさらなる改変には、以下が挙げられる：ＩｇＧ１抗体の場合はＤ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる。ＥＵで、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２抗体の場合はＮ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ。ＥＵで、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉ）、ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる。ＥＵで、Ｑ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）。
【０１９８】
ある特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、複数の免疫グロブリンアイソタイプに由来するＦｃ配列を組み合わせたキメラであり得る。例えば、キメラＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域に由来するＣＨ２配列の一部または全部、及びヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４に由来するＣＨ３配列の一部または全部を含み得る。キメラＦｃドメインはまた、キメラヒンジ領域を含んでもよい。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」配列を、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列と組み合わせて含み得る。本明細書に記載の抗原結合分子のいずれかに含まれてもよいキメラＦｃドメインの特定の例は、Ｎ末端からＣ末端まで、以下を含む：［ＩｇＧ４  ＣＨ１］−［ＩｇＧ４上部ヒンジ］−［ＩｇＧ２下部ヒンジ］−［ＩｇＧ４  ＣＨ２］−［ＩｇＧ４  ＣＨ３］。本明細書に記載の抗原結合分子のいずれかに含めてもよいキメラＦｃドメインの別の例は、Ｎ末端からＣ末端まで、以下を含む：［ＩｇＧ１  ＣＨ１］−［ＩｇＧ１上部ヒンジ］−［ＩｇＧ２下部ヒンジ］−［ＩｇＧ４  ＣＨ２］−［ＩｇＧ１  ＣＨ３］。本発明の抗原結合分子のいずれかに含めることができるキメラＦｃドメインのこれら及び他の例は、２０１４年８月２８日に公開された米国公開２０１４／０２４３５０４に記載されており、これはその全体が本明細書に組み込まれる。これらの一般的な構造配列を有するキメラＦｃドメイン、及びそのバリアントは、Ｆｃ受容体結合が変化している可能性があり、これは次にＦｃエフェクター機能に影響を与える。
【０１９９】
ある特定の実施形態において、本発明は、重鎖定常領域（ＣＨ）領域が、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、または配列番号７８のいずれか１つと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む抗体重鎖を提供する。いくつかの実施形態において、重鎖定常領域（ＣＨ）領域は、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、または配列番号７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２００】
他の実施形態では、本発明は、Ｆｃドメインが、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、または配列番号７７のうちのいずれか１つと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、抗体重鎖を提供する。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、または配列番号７７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２０１】
配列バリアント
本発明の抗体及び二重特異性抗原結合分子は、個々の抗原結合ドメインが由来する対応する生殖系列配列と比較して、重鎖及び／または軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域における１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公的な抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって、容易に確認され得る。本発明の抗原結合分子は、本明細書に開示される例示的なアミノ酸配列のいずれかに由来する抗原結合ドメインを含み得、ここで、１つ以上のフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来する生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）に対して、または別のヒト生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）に対して、または対応する生殖細胞系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に対して変異される（そのような配列変化は、本明細書では総称して「生殖細胞変異」と呼ばれる）。本明細書に開示される重鎖及び軽鎖可変領域配列から始めて、当業者は、１つ以上の個々の生殖細胞変異またはそれらの組み合わせを含む、多数の抗体及び抗原結合フラグメントを容易に産生し得る。ある特定の実施形態において、ＶＨ及び／またはＶＬドメイン内のフレームワーク及び／またはＣＤＲ残基の全ては、抗原結合ドメインがもともと由来した元の生殖系列配列に見出される残基へ変異して戻される。他の実施形態では、ある特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内もしくはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見られる変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内に見られる変異残基のみが元の生殖系列配列へ変異して戻される。他の実施形態では、フレームワーク及び／またはＣＤＲ残基（複数可）のうちの１つ以上が、異なる生殖系列配列（すなわち、抗原結合ドメインがもともと由来する生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へ変異されている。さらに、抗原結合ドメインは、フレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内の２つ以上の生殖細胞変異の任意の組み合わせを含み得、例えば、ここで、ある特定の個々の残基が特定の生殖細胞配列の対応する残基に変異し、一方、元の生殖細胞系列配列と異なるある特定の他の残基は維持されるか、または異なる生殖細胞系列配列の対応する残基に変異される。一旦得られれば、１つ以上の生殖細胞変異を含む抗原結合ドメインを、結合特異性の改善、結合親和性の増大、拮抗的またはアゴニスト的生物学的特性の改善または増強（場合によっては）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について容易に試験し得る。この一般的な方法で得られた１つ以上の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子は、本発明に含まれる。
【０２０２】
本発明はまた、一方または両方の抗原結合ドメインが、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む、抗原結合分子を含む。例えば、本発明は、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０以下、８以下、６以下、４以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する、抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を含む。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されているものである。一般に、保存的なアミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変更しない。同様の化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、以下が挙げられる（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩、ならびに（７）硫黄含有側鎖はシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換の群は以下である：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸塩−アスパラギン酸塩、及びアスパラギン−グルタミン。あるいは、保守的な置換は、参照により本明細書に組み入れられる、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列に正の値を有する任意の変更である。「適度に保守的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列に負でない値を有する任意の変更である。
【０２０３】
本発明はまた、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと実質的に同一である、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を含む。アミノ酸配列を指す場合の「実質的な同一性」または「実質的に同一」という用語は、デフォルトのギャップ重みを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列された場合、２つのアミノ酸配列が少なくとも９５％の配列同一性を共有し、さらにより好ましくは、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似度は、置換の保存的性質を補正するために上方に調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７〜３３１を参照のこと。
【０２０４】
配列同一性とも呼ばれるポリペプチドの配列類似性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠失、及びその他の改変に割り当てられた類似性の尺度を使用して、同様の配列を照合する。例えば、ＧＣＧソフトウェアには、Ｇａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムが含まれており、これによって、デフォルトのパラメーターを使用して、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間、または野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性または配列同一性を決定し得る。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるデフォルトまたは推奨パラメーターを使用したＦＡＳＴＡを使用して比較され得る。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリ配列と検索配列との間の最良の重複の領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する（上記のＰｅａｒｓｏｎ（２０００））。本発明の配列を、異なる生物からの多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトのパラメーターを使用するコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２を参照のこと。
【０２０５】
ｐＨ−依存性結合
本発明は、ｐＨ依存性結合特徴を有する抗ＨＥＲ２抗体、及び抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含む。例えば、本発明の抗ＨＥＲ２抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでＨＥＲ２への結合の低下を示し得る。あるいは、本発明の抗ＨＥＲ２抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでＨＥＲ２への結合の増強を示し得る。「酸性ｐＨ」という表現は、約６．２未満、例えば、約６．０、５．９５、５、９、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０、またはそれ未満のｐＨ値を含む。「中性ｐＨ」という表現は、約７．０〜約７．４のｐＨを意味する。「中性ｐＨ」という表現は、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、及び７．４のｐＨ値を含む。
【０２０６】
特定の例において、「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでの結合の低下」は、中性ｐＨでその抗原に結合する抗体のＫＤ値に対する、酸性ｐＨでのその抗原に結合する抗体のＫＤ値の比に関して（またはその逆）表される。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントは、その抗体またはその抗原結合フラグメントが、約３．０以上という酸性／中性ＫＤ比を示す場合、本発明の目的に関しては、「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＨＥＲ２への結合の低下」を示すと見なされ得る。ある特定の例示的な実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントの酸性／中性ＫＤ比は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．０以上であり得る。
【０２０７】
ｐＨ依存性結合特徴を有する抗体は、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでの特定の抗原への結合の減少（または増強）について抗体の集団をスクリーニングすることによって得てもよい。さらに、アミノ酸レベルでの抗原結合ドメインの改変は、ｐＨ依存性の特徴を有する抗体を生じ得る。例えば、抗原結合ドメインの１つ以上のアミノ酸（例えば、ＣＤＲ内）をヒスチジン残基で置換することにより、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで抗原結合が低下した抗体を得てもよい。
【０２０８】
Ｆｃ領域を含む抗体
本発明のある特定の実施形態によれば、抗ＨＥＲ２抗体、及び抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体に対する抗体の結合を増強または減少させる、１つ以上の変異を含むＦｃドメインを含んで提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に変異を含む抗体を含み、ここで、この変異（複数可）は、酸性環境において（例えば、ｐＨ範囲が約５．５〜約６．０であるエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増大させる。そのような変異は、動物に投与された場合、抗体の血清半減期の増大を生じ得る。そのようなＦｃ改変の非限定的な例としては、例えば、位置２５０（例えば、ＥまたはＱ）、２５０及び４２８（例えば、ＬまたはＦ）、２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４（例えば、ＳまたはＴ）、及び２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での改変、あるいは、位置４２８及び／または４３３（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）及び／または４３４（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）での改変、あるいは位置２５０及び／または４２８での改変、あるいは、位置３０７または３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び４３４での改変が挙げられる。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）改変、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例えば、４３４Ｙ）の改変、２５２、２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）の改変、２５０Ｑ及び４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）、ならびに３０７及び／または３０８の改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。
【０２０９】
例えば、本発明は、抗ＨＥＲ２抗体、及び抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含み、これは、以下からなる群より選択される変異の１つ以上の対または群を含むＦｃドメインを含む：２５０Ｑ及び２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ２４８Ｌ）、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ）、４２８Ｌ及び４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ）、ならびに４３３Ｋ及び４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ）。前述のＦｃドメイン変異、及び本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異の全ての可能な組み合わせが、本発明の範囲内で企図される。
【０２１０】
抗体及び二重特異性抗原結合分子の生物学的特徴
本発明は、高い親和性（例えば、ナノモルからサブナノモルのＫＤ値）でヒトＨＥＲ２に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。
【０２１１】
本発明はまた、ヒト乳癌異種移植片を有する免疫無防備状態のマウスにおける腫瘍増殖を阻害する抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子も含む。（例えば、実施例１２及び１３を参照のこと）。
【０２１２】
本発明は、治療状況及び所望の特定の標的化特性に応じて、中程度または低い親和性でヒトＡＰＬＰ２に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。例えば、一方のアームがＡＰＬＰ２に結合し、もう一方のアームが標的抗原（例えば、ＨＥＲ２）に結合する、二重特異性抗原結合分子の状況では、標的抗原結合アームが標的抗原に高い親和性で結合することが望ましい場合があるが、抗ＡＰＬＰ２アームは中程度または低い親和性でのみＡＰＬＰ２に結合する。このようにして、標的抗原を発現する細胞への抗原結合分子の優先的標的化は、一般的／非標的化ＡＰＬＰ２結合及びそれに関連する結果として生じる有害な副作用を回避しながら達成され得る。
【０２１３】
本発明は、ヒトＡＰＬＰ２及びヒトＨＥＲ２に同時に結合し得る、二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）を含む。ＡＰＬＰ２を発現する細胞と相互作用する結合アームは、適切なインビトロの結合アッセイで測定した場合、結合が弱い〜検出不能である場合がある。二重特異性抗原結合分子がＡＰＬＰ２及び／またはＨＥＲ２を発現する細胞に結合する程度は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって評価され得る。
【０２１４】
本発明はまた、ＨＥＲ２発現細胞及び細胞株（例えば、乳管腺癌Ｔ４７Ｄ細胞）に結合する抗体、抗原結合フラグメント、及びそれらの二重特異性抗体も含み、ＥＣ５０値は、細胞膜結合抗原との抗体相互作用を測定するＦＡＣＳ結合アッセイ、または実質的に同様のアッセイを使用して決定した場合、約１ｎＭ〜５０ｎＭの間である。ある特定の実施形態において、ＨＥＲ２発現細胞及び細胞株（例えば、Ｔ４７Ｄ細胞）に結合する抗体、抗原結合フラグメント、及びそれらの二重特異性抗体は、ＦＡＣＳ結合アッセイまたは実質的に同様のアッセイを使用して決定した場合、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３ｎＭ、または約２ｎＭ、約１ｎＭというＥＣ５０値を有する。
【０２１５】
本発明は、弱い（すなわち、低い）か、または検出不能な親和性でさえヒトＡＰＬＰ２に結合する、抗体、抗原結合フラグメント、及びそれらの二重特異性抗体を含む。ある特定の実施形態によれば、本発明は、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約１００ｎＭ超えるＫＤでヒトＡＰＬＰ２に（例えば、３７℃で）結合する抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴（例えば、ｍＡｂキャプチャーまたは抗原キャプチャーフォーマット）、または実質的に同様のアッセイによって測定した場合、約１１０ｎＭ超、少なくとも１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ超、約１４０ｎＭ超、約１５０ｎＭ超、少なくとも１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ超、約１８０ｎＭ超、約１９０ｎＭ超、約２００ｎＭ超、約２５０ｎＭ超、約３００ｎＭ超、約４００ｎＭ超、約５００ｎＭ超、約６００ｎＭ超、約７００ｎＭ超、約８００ｎＭ超、約９００ｎＭ超、または約１μＭ超、または検出不能な親和性のＫＤでＡＰＬＰ２に結合する。
【０２１６】
本発明は、サル（すなわちカニクイザル）ＡＰＬＰ２に弱い（すなわち低い）または検出不能な親和性で結合する抗体、抗原結合フラグメント、及びそれらの二重特異性抗体を含む。
【０２１７】
本発明は、本明細書の実施例３によって定義されるアッセイフォーマットまたは実質的に同様のアッセイによって測定した場合、ヒトＨＥＲ２発現細胞（例えば、Ｔ４７Ｄ細胞）に結合し、それらによって内部移行される抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含む。本発明は、ヒトＨＥＲ２への結合に特異的な抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、本明細書の実施例３によって定義されるアッセイフォーマットまたは実質的に同様のアッセイによって測定した場合、ＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現されるヒトＨＥＲ２に結合する。ある特定の実施形態において、本発明の抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、本明細書における実施例３によって定義されるアッセイフォーマットまたは実質的に同様のアッセイによって測定した場合、ＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現されるヒトＨＥＲ１、ヒトＨＥＲ２、またはヒトＨＥＲ４に結合しない。
【０２１８】
本発明は、ＨＥＲ２発現（例えば、ＪＩＭＴ−１）腫瘍増殖を阻害し得る、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含む（例えば、実施例１０を参照のこと）。例えば、ある特定の実施形態によれば、抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇまたは約０．０１ｍｇ／ｋｇの用量での単回投与は、例えば、本明細書において実施例１０に示されるような、標準的なキャリパー測定方法を用いて対象で検出した場合、腫瘍移植の４６日後に測定したとき、アイソタイプ対照二重特異性抗体を投与した動物と比較して腫瘍サイズの低下を生じる。
【０２１９】
本発明はまた、インビボＨＥＲ２陽性乳癌異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲートを含む（例えば、実施例１２及び１３を参照、または実質的に同様のアッセイにおいて）。ある特定の実施形態において、化合物Ｉとの抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲートが提供され、ここで腫瘍移植後１３日目に投与される１０、２０、または４０ｍｇ／ｋｇの１回投与は、インビボＨＥＲ２陽性乳癌異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する。ある特定の実施形態において、化合物Ｉとの抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲートが提供され、移植後１４日目に投与される５または２０ｍｇ／ｋｇでの１回の用量が、インビボＨＥＲ２陽性の乳癌異種移植モデルにおいてＪＩＭＴ−１及び／またはＭＤＡ−ＭＢ−３６１腫瘍増殖を阻害する。ある特定の実施形態において、化合物Ｉとの抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲートが提供され、ここで移植後１７日目に投与される１５０μｇ／ｋｇでの１回の用量が、インビボＨＥＲ２陽性乳癌異種移植モデルにおけるＪＩＭＴ−１及び／またはＭＤＡ−ＭＢ−３６１腫瘍増殖を阻害する。他の実施形態において、化合物ＩＩとの抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲートが提供され、移植後２９日目に少なくとも２．５ｍｇ／ｋｇの１用量が投与され、インビボＨＥＲ２陽性の乳癌異種移植モデルにおけるＪＩＭＴ−１及び／またはＭＤＡ−ＭＢ−３６１腫瘍増殖を阻害する。
【０２２０】
エピトープマッピング及び関連の技術
本発明の抗原結合分子が結合するＡＰＬＰ２及び／またはＨＥＲ２上のエピトープは、ＡＰＬＰ２またはＨＥＲ２タンパク質の３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）のアミノ酸の単一の連続した配列からなり得る。あるいは、エピトープは、ＡＰＬＰ２またはＨＥＲ２の複数の非隣接アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなり得る。本発明の抗体は、単一のＡＰＬＰ２鎖内に含まれるアミノ酸（例えば、ＡＰＬＰ２−イプシロン、ＡＰＬＰ２−デルタまたはＡＰＬＰ２−ガンマ）と相互作用する場合もあるし、または２つ以上の異なるＡＰＬＰ２鎖上のアミノ酸と相互作用する場合もある。「エピトープ」という用語は、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域内の特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原が複数のエピトープを有する場合がある。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合する場合があり、異なる生物学的効果を有する場合がある。エピトープは、立体配座または線形のいずれであってもよい。コンフォメーションエピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並置されたアミノ酸によって生成される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖の隣接するアミノ酸残基によって生成されるものである。特定の状況において、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
【０２２１】
当業者に公知の様々な技術を使用して、抗体の抗原結合ドメインがポリペプチドまたはタンパク質内の「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」か否かを決定し得る。例示的な技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．，ＮＹ）に記載されているような慣用的なクロスブロッキングアッセイ、アラニンスキャニング変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３−４６３）、及びペプチド切断分析が挙げられる。さらに、エピトープ切除、エピトープ抽出、及び抗原の化学改変などの方法を使用してもよい（Ｔｏｍｅｒ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：４８７−４９６）。抗体の抗原結合ドメインが相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用できる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般論として、水素／重水素交換法では、目的のタンパク質を重水素標識した後、抗体を重水素標識タンパク質に結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移して、抗体によって保護されている残基（重水素標識されたまま）を除く全ての残基で水素−重水素交換が発生するようにする。抗体の解離後、標的タンパク質を、プロテアーゼ切断及び質量分析に供し、それにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識残基が明らかになる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７（２）：２５２−２５９、Ｅｎｇｅｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ−２６５Ａを参照のこと。抗原／抗体複合体のＸ線結晶学はまた、エピトープマッピングの目的で使用されてもよい。
【０２２２】
本発明は、本明細書に記載の特定の例示的な抗体のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＨＥＲ２抗体（例えば、本明細書の表１に記載の任意のアミノ酸配列を含む抗体）をさらに含む。同様に、本発明はまた、ＨＥＲ２への結合について本明細書に記載の任意の特定の例示的な抗体と競合する抗ＨＥＲ２抗体（例えば、本明細書の表１に記載のアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）を含む。
【０２２３】
本発明はまた、ヒトＡＰＬＰ２及び／またはカニクイザルＡＰＬＰ２に低いかまたは検出可能な結合親和性で特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びヒトＨＥＲ２に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を含み、ここでこの第１の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の特定の例示的なＡＰＬＰ２特異的抗原結合ドメイン（例えば、本明細書の表２に記載のアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと同じ、ＡＰＬＰ２上のエピトープに結合するか、及び／またはここで、この第２の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の特定の例示的なＨＥＲ２特異的抗原結合ドメインのいずれかと同じ、ＨＥＲ２上のエピトープに結合する。
【０２２４】
同様に、本発明はまた、ヒトＡＰＬＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びヒトＨＥＲ２に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を含み、ここでこの第１の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の特定の例示的なＡＰＬＰ２特異的抗原結合ドメインのいずれかとＡＰＬＰ２に対する結合について競合するか、及び／またはこの第２の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の特定の例示的なＨＥＲ２特異的抗原結合ドメインのいずれかとＨＥＲ２への結合について競合する。
【０２２５】
特定の抗原結合分子（例えば、抗体）またはその抗原結合ドメインが、当該技術分野で公知の慣用的な方法を用いることによって、本発明の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合するか、またはそれと結合について競合するか否かを容易に決定し得る。例えば、試験抗体が本発明の参照二重特異性抗原結合分子と同じ、ＨＥＲ２（またはＡＰＬＰ２）上のエピトープに結合するか否かを決定するために、参照二重特異性分子は、最初にＨＥＲ２タンパク質（またはＡＰＬＰ２タンパク質）に結合され得る。次に、試験抗体がＨＥＲ２（またはＡＰＬＰ２）分子に結合する能力を評価する。参照二重特異性抗原結合分子との飽和結合に続いて試験抗体がＨＥＲ２（またはＡＰＬＰ２）に結合可能である場合、試験抗体は参照二重特異性抗原結合分子とは異なるＨＥＲ２（またはＡＰＬＰ２）のエピトープに結合すると結論付けることができる。一方、参照二重特異性抗原結合分子との飽和結合後に試験抗体がＨＥＲ２（またはＡＰＬＰ２）分子に結合できないならば、その試験抗体は、本発明の参照二重特異性抗原結合分子によって結合されるエピトープと同じ、ＨＥＲ２（またはＡＰＬＰ２）のエピトープに結合し得る。次に、追加のルーチン実験（例えば、ペプチド変異及び結合分析）を実行して、観察された試験抗体の結合の欠如が、実際に参照二重特異性抗原結合分子と同じエピトープへの結合に起因するか、または立体的ブロッキング（または別の現象）が、観察された結合の欠如の原因であるかを確認してもよい。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、または当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを使用して実施してもよい。本発明のある特定の実施形態によれば、例えば、１つの抗原結合タンパク質の１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍過剰が、競合的結合アッセイで測定した場合、他方の結合を少なくとも５０％、好ましくは７５％、９０％、さらには９９％阻害する場合、同じ（または重複する）エピトープに２つの抗原結合タンパク質が結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５−１５０２を参照のこと）。あるいは、一方の抗原結合タンパク質の結合を減少または排除する抗原の本質的に全てのアミノ酸変異が、他方の結合を減少または排除する場合、２つの抗原結合タンパク質は同じエピトープに結合すると見なされる。一方の抗原結合タンパク質の結合を減少または排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の結合を減少または排除する場合、２つの抗原結合タンパク質は「重複するエピトープ」を有すると見なされる。
【０２２６】
抗体またはその抗原結合ドメインが参照抗原結合分子との結合について競合するか否かを決定するために、上記の結合方法論を２つの方向で実施する：第１の方向では、参照抗原結合分子は、飽和条件下でＨＥＲ２タンパク質（またはＡＰＬＰ２タンパク質）に結合し、続いてＨＥＲ２（またはＡＰＬＰ２）分子への試験抗体の結合を評価することが可能である。第２の方向では、試験抗体は、飽和条件下でＨＥＲ２（またはＡＰＬＰ２）分子に結合し得、その後、参照抗原結合分子のＨＥＲ２（またはＡＰＬＰ２）分子への結合の評価が続く。両方の方向で、最初の（飽和）抗原結合分子のみがＨＥＲ２（またはＡＰＬＰ２）分子に結合できる場合、試験抗体及び参照抗原結合分子は、ＨＥＲ２（またはＡＰＬＰ２）への結合について競合すると結論付けられる。当業者によって理解されるように、参照抗原結合分子との結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合する必要はないが、重複または隣接するエピトープに結合することによって、参照抗体の結合を立体的に遮断し得る。
【０２２７】
抗原結合ドメインの調製及び二重特異性分子の構築
特定の抗原に特異的な抗原結合ドメインは、当該技術分野で公知の任意の抗体生成技術によって調製され得る。一旦得られれば、２つの異なる抗原（例えば、ＡＰＬＰ２及びＨＥＲ２）に特異的な２つの異なる抗原結合ドメインを、慣用的な方法を使用して本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために、互いに対して適切に配置し得る。（本発明の二重特異性抗原結合分子を構築するために使用し得る例示的な二重特異性抗体フォーマットの考察は、本明細書の他のいずれかに示される）。ある特定の実施形態において、本発明の多重特異性抗原結合分子の１つ以上の個々の成分（例えば、重鎖及び軽鎖）は、キメラ、ヒト化、または完全ヒト抗体に由来する。そのような抗体を作製するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子の重鎖及び／または軽鎖のうちの１つ以上は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術を使用して調製し得る。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）テクノロジー（またはその他のヒト抗体生成テクノロジー）を使用して、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有している、特定の抗原（例えば、ＡＰＬＰ２またはＨＥＲ２）に対する高親和性キメラ抗体を、最初に単離する。この抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付けられ、選択される。マウス定常領域は、本発明の二重特異性抗原結合分子に組み込み得る完全ヒト重鎖及び／または軽鎖を生成するために、所望のヒト定常領域で置き換える。
【０２２８】
遺伝子操作された動物を使用して、ヒト二重特異性抗原結合分子を作製してもよい。例えば、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変配列を再配列及び発現し得ない遺伝子改変マウスを使用してもよく、ここではこのマウスは、内因性マウスカッパ遺伝子座でマウスカッパの定常遺伝子に作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン配列によってコードされる１つまたは２つのヒト軽鎖可変ドメインのみを発現する。このような遺伝子改変マウスを使用して、重鎖及び軽鎖の可変領域を単離し、完全にヒトの二重特異性抗原結合分子を産生してもよい。このように、完全にヒトの二重特異性抗原結合分子は、同じ軽鎖に会合する２つの異なる重鎖を含む。（例えば、ＵＳ  ２０１１／０１９５４５４を参照のこと）。完全ヒトとは、抗体またはその抗原結合フラグメントまたは免疫グロブリンドメインを指し、これは抗体、またはその抗原結合フラグメントまたは免疫グロブリンドメインの各ポリペプチドの全長にわたって、ヒト配列に由来するＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含む。場合によっては、完全にヒトの配列は、ヒトに内因性のタンパク質に由来する。他の例では、完全にヒトのタンパク質またはタンパク質配列は、各構成要素配列がヒト配列に由来するキメラ配列を含む。いずれの理論にも拘束されないが、キメラタンパク質またはキメラ配列は、一般に、例えば、任意の野生型のヒト免疫グロブリン領域またはドメインと比較して、構成要素配列の接合部における免疫原性エピトープの生成を最小限に抑えるように設計されている。
【０２２９】
二重特異性抗原結合分子は、プロテインＡへのその結合を無効にする改変Ｆｃドメインを有する１つの重鎖で構築され得、したがって、ヘテロ二量体タンパク質を生じる精製方法を可能にする。例えば、米国特許第８，５８６，７１３号を参照のこと。したがって、二重特異性抗原結合分子は、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインを含み、この第１及び第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸が互いに異なり、ここで少なくとも１つのアミノ酸の違いが、アミノ酸の相違を欠く二重特異性抗体と比較した、プロテインＡに対する二重特異性抗体の結合を減少させる。一実施形態では、第１のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、プロテインＡに結合し、第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる。ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を低減または無効にする変異／改変を含む。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる。ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含んでもよい。
【０２３０】
生物学的等価物
本発明は、本明細書に開示される例示的な分子のものとは異なるが、ＡＰＬＰ２及び／またはＨＥＲ２に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有する抗原結合分子を包含する。そのようなバリアント分子は、親配列と比較した場合、アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含み得るが、記載された二重特異性抗原結合分子の生物学的活性と本質的に同等である生物学的活性を示す。
【０２３１】
本発明は、本明細書に記載の任意の例示的な抗原結合分子のいずれかと生物学的に同等である抗原結合分子を含む。２つの抗原結合タンパク質または抗体は、例えば、それらが、単一用量または複数用量のいずれでも、同様の実験条件下で、同じモル用量で投与された場合、吸収の速度及び程度が有意な相違を示さない、薬学的な等価物または薬学的な代替物である場合、生物学的等価物であると見なされる。一部の抗原結合タンパク質は、吸収の程度は同等だが、吸収の程度は等価でない場合は、等価物であるか、または代替医薬品と見なされ、それでも生物学的に同等であると見なされることができ、これは、吸収速度のそのような違いは意図的であり、ラベリングに反映されており、例えば慢性的な使用において有効な体内薬物濃度を達成するために必須ではなく、研究された特定の医薬品にとって医学的に重要でないと見なされるためである。
【０２３２】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、及び効力に臨床的に意味のある相違がない場合、生物学的に等価である。
【０２３３】
一実施形態では、患者が参照生成物と生物学的生成物との間で１回以上切り替えることができ、これが、免疫原性の臨床的に有意な変化を含む有害作用のリスクの予想される増大もなく、または有効性の低下もないものである（そのような切り替えなしの継続的な治療と比較して）場合、２つの抗原結合タンパク質は生物学的に等価である。
【０２３４】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、それらが両方とも、使用条件（複数可）に対する共通の機序または作用機序によって、そのような機序が知られている範囲で作用する場合、生物学的に同等である。
【０２３５】
生物学的等価性は、インビボ及びインビトロの方法によって実証され得る。生物学的等価性の測定としては、例えば、（ａ）抗体またはその代謝物の濃度が時間の関数として血液、血漿、血清、または他の生体液中で測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ試験、（ｂ）ヒトのインビボのバイオアベイラビリティデータと相関しており、それを合理的に予測できるインビトロの試験、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理効果が時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ試験、ならびに（ｄ）抗原結合タンパク質の安全性、有効性またはバイオアベイラビリティもしくは生物学的等価性を確立する、十分に管理された臨床試験が挙げられる。
【０２３６】
本明細書に記載の例示的な二重特異性抗原結合分子の生物学的等価バリアントは、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うか、または生物学的活性に必要のない末端もしくは内部の残基もしくは配列を削除することによって構築され得る。例えば、生物学的活性に必須ではないシステイン残基を削除するか、他のアミノ酸に置き換えて、再生時に不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋が形成されるのを防いでもよい。他の文脈において、生物学的に等価の抗原結合タンパク質は、分子のグリコシル化特徴を改変するアミノ酸変更、例えば、グリコシル化を排除または除去する変異を含む、本明細書に記載の例示的な二重特異性抗原結合分子のバリアントを含み得る。
【０２３７】
種選択性及び種交差反応性
本発明のある特定の実施形態によれば、ヒトＡＰＬＰ２に結合するが他の種からのＡＰＬＰ２には結合しない抗原結合分子が提供される。また、ヒトＨＥＲ２に結合するが他の種由来のＨＥＲ２には結合しない抗原結合分子も提供される。本発明はまた、ヒトＡＰＬＰ２及び１つ以上の非ヒト種由来のＡＰＬＰ２に結合する抗原結合分子、ならびに／またはヒトＨＥＲ２に、及び１つ以上の非ヒト種由来のＨＥＲ２に結合する抗原結合分子も含む。
【０２３８】
本発明のある特定の例示的な実施形態によれば、ヒトＡＰＬＰ２及び／またはヒトＨＥＲ２に結合し、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーのＡＰＬＰ２及び／またはＨＥＲ２のうちの１つ以上に結合してもよいし、または結合しなくてもよい、抗原結合分子が提供される。例えば、本発明の特定の例示的な実施形態では、ヒトＡＰＬＰ２及びカニクイザルＡＰＬＰ２に結合する第１の抗原結合ドメイン、ならびにヒトＨＥＲ２に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０２３９】
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
本発明は、細胞毒性剤、化学療法薬、免疫抑制剤または放射性同位元素などの治療部分にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメントを含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。治療部分にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメントも提供される。一般論として、ＡＤＣは以下を含む：Ａ−［Ｌ−Ｐ］ｙ、ここで、Ａは抗原結合分子、例えば、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体、またはそのフラグメント（例えば、表１または２に列挙された任意のＨＣＤＲ３アミノ酸配列から選択される少なくともＨＣＤＲ３を含むフラグメント）、Ｌはリンカーであり、Ｐはペイロードまたは治療部分（例えば、細胞毒性剤）であり、ｙは１から３０までの整数である。
【０２４０】
様々な実施形態において、ＡＤＣは、ＨＣＶＲアームのＣＤＲ、及び表３に記載の配列番号のアミノ酸配列を有する同じＬＣＶＲアーム（例えば、ＨＣＶＲ１−ＨＣＶＲ２−ＬＣＶＲ配列番号２−２６−１０、２−３４−１０、２−４２−１０、１８−２６−１０、１８−３４−１０、または１８−４２−１０）表３に記載、または２つの特定のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（例えば、配列番号２／１０及び２６／１０、２／１０及び３４／１０、２／１０及び４２／１０、１８／１０及び２６／１０、１８／１０及び３４／１０、または１８／１０及び４２／１０）を含む、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。場合によっては、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはフラグメントは、表１及び２に示される配列番号（例えば、配列番号４−６−８−１２−１４−１６及び２８−３０−３２−１２−１４−１６）のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ及びＬＣ−ＣＤＲを含む。別の実施形態において、ＡＤＣは、表３に記載の配列番号（例えば、配列番号２／１０及び２６／１０、２／１０及び３４／１０、２／１０及び４２／１０、１８／１０及び２６／１０、１８／１０及び３４／１０、または１８／１０及び４２／１０）のアミノ酸配列を有する、ＨＣＶＲアーム及び同じＬＣＶＲアームを含む抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【０２４１】
様々な実施形態において、ＡＤＣは、表１に記載される配列番号（例えば、配列番号２、１８及び１０）のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲ、または特定のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（例えば、配列番号２／１０または１８／１０）を含む抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。場合によっては、抗ＨＥＲ２抗体またはフラグメントは、表１に記載の配列番号（例えば、配列番号４−６−８−１２−１４−１６、２０−２２−２４−１２−１４−１６）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。場合によっては、抗ＨＥＲ２抗体またはフラグメントは、表１に記載の配列番号（例えば、配列番号２、１８及び１０）のアミノ酸配列、または特定のアミノ酸配列対（例えば、配列番号２／１０及び１８／１０）を有するＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを含む。
【０２４２】
細胞毒性剤としては、チューブリン相互作用剤及びＤＮＡ損傷剤が挙げられるがこれらに限定されない、細胞の成長、生存能力または増殖に有害である任意の薬剤が挙げられる。本開示のこの態様に従って抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされ得る適切な細胞毒性剤及び化学療法剤の例としては、例えば、１−（２クロロエチル）−１，２−ジメタンスルホニルヒドラジド、１，８−ジヒドロキシ−ビシクロ［７．３．１］トリデカ−４，９−ジエン−２，６−ジイン−１３−オン、１−デヒドロテストステロン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、９−アミノカンプトテシン、アクチノマイシンＤ、アマニチン、アミノプテリン、アンギジン、アントラサイクリン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、オーリスタチン、ブレオマイシン、ブスルファン、酪酸、カリケアマイシン（例えば、カリケアマイシンγ１）、カンプトテシン、カルミノマイシン、カルムスチン、セマドチン、シスプラチン、コルヒチン、コンブレタスタチン、シクロホスファミド、シタラビン、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デカルバジン、ジアセトキシペンチルドキソルビシン、ジブロモマンニトール、ジヒドロキシアントラシンジオン、ジソラゾール、ドラスタチン（例えば、ドラスタチン１０）、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、エキノマイシン、エレウテロビン、エメチン、エポチロン、エスペラマイシン、エストラムスチン、エチジウムブロマイド、エトポシド、フルオロウラシル、ゲルダナマイシン、グラミシジンＤ、グルココルチコイド、イリノテカン、キネシン紡錘体タンパク質（ＫＳＰ）阻害剤、レプトマイシン、ロイロシン、リドカイン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メイタンシノイド、メクロレタミン、メルファラン、メルカトプリン、メトプテリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、ポドフィロトキシン、プロカイン、プロプラノロール、プテリジン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、リゾキシン、ストレプトゾトシン、タリソマイシン、タキソール、テノポシド、テトラカイン、チオエパクロラムブシル、トマイマイシン、トポテカン、チューブリシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、及び任意の前述の誘導体が挙げられる。
【０２４３】
ある特定の実施形態によれば、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされる細胞毒性剤は、ＤＭ１またはＤＭ４などのメイタンシノイド、トマイマイシン誘導体、またはドラスタチン誘導体である。ある特定の実施形態によれば、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされる細胞毒性剤は、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、またはそれらの誘導体などのオーリスタチンである。当該技術分野で公知である他の細胞毒性剤は、例えば、リシン、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素、シュードモナス外毒素、リシン、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、ブリオジン、サポリン、ヤマゴボウ毒素（すなわち、フィラカトキシン及びフィトラシゲニン）などのタンパク質毒素、ならびにＳａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２０１３，１３８４５２−４６９に記載の毒性剤などの他の毒性剤を含み、本開示の範囲内で企図されている。
【０２４４】
ある特定の実施形態において、細胞毒性剤は、メイタンシノイド、例えば、メイタンシンの誘導体である。適切なメイタンシノイドとしては、ＤＭ１、ＤＭ４、またはそれらの誘導体、立体異性体、もしくは同位体分子種が挙げられる。適切なメイタンシノイドとしてはまた、限定するものではないが、全体が参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／１４５０９０Ａ１、ＷＯ２０１５／０３１３９６Ａ１、ＵＳ２０１６／０３７５１４７Ａ１、及びＵＳ２０１７／０２０９５９１Ａ１に開示されているものが挙げられる。
【０２４５】
いくつかの実施形態において、メイタンシノイドは以下の構造を有し：
【化９】
2021523100.tif 000010
式中、Ａは、任意に置換されているアリーレンまたはヘテロアリーレンである。
【０２４６】
いくつかの実施形態において、メイタンシノイドは以下の構造を有し：
【化１０】
2021523100.tif 000011
式中、Ａは、任意に置換されているアリーレンまたはヘテロアリーレンである。
【０２４７】
いくつかの実施形態において、メイタンシノイドは以下の構造を有し：
【化１１】
2021523100.tif 000012
式中、ｎは、１〜１２の整数であり、Ｒ１は、アルキルである。
【０２４８】
いくつかの実施形態において、メイタンシノイドは以下である：
【化１２】
2021523100.tif 000013
【化１３】
2021523100.tif 000014
【化１４】
2021523100.tif 000015
【化１５】
2021523100.tif 000016
【０２４９】
いくつかの実施形態において、メイタンシノイドは：
【化１６】
2021523100.tif 000017
である。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、メイタンシノイドは：
【化１７】
2021523100.tif 000018
である。
【０２５１】
１つ以上の放射性核種にコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体を含む抗体−放射性核種コンジュゲート（ＡＲＣ）も本明細書で提供される。本開示のこの態様の文脈で使用され得る例示的な放射性核種としては、限定するものではないが、例えば、２２５Ａｃ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、２２７Ｔｈ、２２２Ｒｎ、２２３Ｒａ、２２４Ｒａ、及び９０Ｙが挙げられる。
【０２５２】
本明細書で提供されるある特定の実施形態では、リンカー分子を介して細胞毒性剤（例えば、上記で開示された細胞毒性剤のいずれか）にコンジュゲートされた抗ＭＥＴ抗体または抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗原結合タンパク質を含むＡＤＣが提供される。リンカーは、本明細書に記載の抗体または抗原結合タンパク質を、治療部分、例えば、細胞毒性剤と連結、接続、または結合する任意の基または部分である。適切なリンカーは、それぞれの内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｌ．，Ｅｄ．；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０１３、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；Ｄｕｃｒｙ，Ｌ．，Ｅｄ．，；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２０１３、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｓｈｅｎ，Ｗ．−Ｃ．，  ａｎｄ  Ｚａｒｏ，Ｊ．Ｌ．，Ｅｄｓ．；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０１５，に見出され得る。一般に、本明細書に記載の抗体コンジュゲートに適した結合剤リンカーは、抗体の循環半減期を利用するのに十分に安定であり、同時に、コンジュゲートの抗原媒介性内部移行後にそのペイロードを放出し得るリンカーである。リンカーは、切断可能であっても、切断不可能であってもよい。切断可能なリンカーには、内部移行に続く細胞内代謝によって切断されるリンカー、例えば、加水分解、還元、または酵素反応による切断が含まれる。切断不可能なリンカーとしては、内部移行後の抗体のリソソーム分解を介して付着したペイロードを放出するリンカーが挙げられる。適切なリンカーとしては、限定するものではないが、酸に不安定なリンカー、加水分解に不安定なリンカー、酵素的に切断可能なリンカー、還元に不安定なリンカー、自己犠牲リンカー、及び切断不可能なリンカーが挙げられる。適切なリンカーとしては、また、限定するものではないが、ペプチド、グルクロニド、スクシンイミド−チオエーテル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）単位、ヒドラゾン、マル−カプロイル単位、ジペプチド単位、バリン−シトルリン単位、及びパラ−アミノベンジル（ＰＡＢ）単位であるか、またはそれらを含むリンカーが挙げられる。
【０２５３】
当該技術分野で公知の任意のリンカー分子またはリンカー技術を使用して、本開示のＡＤＣを作成または構築し得る。ある特定の実施形態において、リンカーは、切断可能なリンカーである。他の実施形態によれば、リンカーは、切断不可能なリンカーである。本開示の文脈で使用し得る例示的なリンカーとしては、例えば、ＭＣ（６−マレイミドカプロイル）、ＭＰ（マレイミドプロパノイル）、ｖａｌ−ｃｉｔ（バリン−シトルリン）、ｖａｌ−ａｌａ（バリン−アラニン）、ｖａｌ−ｇｌｙ（バリン−グリシン）、プロテアーゼ切断可能リンカーのジペプチド部位、ａｌａ−ｐｈｅ（アラニン−フェニルアラニン）、プロテアーゼ切断可能リンカーのジペプチド部位、ＰＡＢ（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）、ＳＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート）、ＳＭＣＣ（Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート）、ならびにそれらのバリアント及び組み合わせを含むか、それからなるリンカーが挙げられる。本開示の文脈で使用され得るリンカーの追加の例は、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許第７，７５４，６８１号及びＤｕｃｒｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２０１０，２１：５−１３、及びそこに引用されている参考文献に示されている。
【０２５４】
ある特定の実施形態において、リンカーは、生理学的条件において安定である。ある特定の実施形態では、リンカーは切断可能であり、例えば、酵素の存在下で、または特定のｐＨ範囲もしくは値で、少なくともペイロード部分を放出し得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、酵素切断可能な部分を含む。例示的な酵素切断可能部分としては、限定するものではないが、ペプチド結合、エステル結合、ヒドラゾン、及びジスルフィド結合が挙げられる。いくつかの実施形態において、リンカーは、カテプシン切断可能なリンカーを含む。
【０２５５】
いくつかの実施形態において、リンカーは、切断不可能な部分を含む。
【０２５６】
適切なリンカーとしては、また単一の結合剤、例えば抗体の２つのシステイン残基に化学的に結合しているリンカーも含まれるが、これらに限定されない。このようなリンカーは、コンジュゲーションプロセスの結果として破壊される抗体のジスルフィド結合を模倣するのに役立ち得る。
【０２５７】
いくつかの実施形態において、リンカーは、１つ以上のアミノ酸を含む。適切なアミノ酸としては、天然、非天然、標準、非標準、タンパク新生、非タンパク新生、及びＬ−またはＤ−α−アミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、リンカーは、アラニン、バリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、またはシトルリン、その誘導体、またはそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態において、アミノ酸の１つ以上の側鎖は、以下に記載される側鎖基に連結されている。いくつかの実施形態において、リンカーは、バリン及びシトルリンを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、リジン、バリン、及びシトルリンを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、リジン、バリン、及びアラニンを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、バリン及びアラニンを含む。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、リンカーは、自己犠牲基を含む。自己犠牲基は、当業者に公知の任意のそのような基であり得る。特定の実施形態では、自己犠牲基は、ｐ−アミノベンジル（ＰＡＢ）、またはその誘導体である。有用な誘導体としては、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）が挙げられる。当業者は、自己犠牲基が、ペイロードからリンカーの残りの原子を放出する化学反応を実行し得ることを認識するであろう。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、リンカーは以下であり：
【化１８】
2021523100.tif 000019
式中、
【化１９】
2021523100.tif 000020
は、抗体または抗原結合タンパク質に（例えば、リジン残基を介して）対する結合であり、かつ
【化２０】
2021523100.tif 000021
は、細胞毒性剤（例えば、ＤＭ１）に対する結合である。いくつかの実施形態において、リンカーは以下であり：
【化２１】
2021523100.tif 000022
式中、
【化２２】
2021523100.tif 000023
は、抗体または抗原結合タンパク質に（例えば、リジン残基を介して）対する結合であり、かつ
【化２３】
2021523100.tif 000024
は、細胞毒性剤（例えば、ＤＭ１）に対する結合である。ある特定の実施形態では、リンカーは：
【化２４】
2021523100.tif 000025
である。
【０２６０】
ある特定の実施形態では、リンカーは：
【化２５】
2021523100.tif 000026
である。
【０２６１】
いくつかの実施形態において、リンカーは、マレイミジルメチル−４−トランス−カルボヘキサンカルボキシスクシネート：
【化２６】
2021523100.tif 000027
由来である。
【０２６２】
いくつかの実施形態において、リンカーは以下であり：
【化２７】
2021523100.tif 000028
式中、
【化２８】
2021523100.tif 000029
は、抗体または抗原結合タンパク質に（例えば、リジン残基を介して）対する結合であり、かつ
【化２９】
2021523100.tif 000030
は、細胞毒性剤（例えば、以下の構造を有する化合物：
【化３０】
2021523100.tif 000031
）に対する結合である。
【０２６３】
本開示は、リンカーが、抗体または抗原結合分子内の特定のアミノ酸での付着を通じて、抗ＨＥＲ２×抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗原結合タンパク質または抗ＨＥＲ２抗体を薬物または細胞毒素に接続する、ＡＤＣを含む。この態様の文脈で使用され得る例示的なアミノ酸付着、例えば、リジン（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、ＵＳ２０１０／０１２９３１４、Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２００８，１９：３５８−３６１、ＷＯ２００５／０８９８０８、米国特許第５，７１４，５８６号、及びＵＳ２０１３／０１０１５４６を参照のこと）、システイン（例えば、ＵＳ２００７／０２５８９８７、ＷＯ２０１３／０５５９９３、ＷＯ２０１３／０５５９９０、ＷＯ２０１３／０５３８７３、ＷＯ２０１３／０５３８７２、ＷＯ２０１１／１３０５９８、ＵＳ２０１３／０１０１５４６、及び米国特許第７，７５０，１１６号を参照のこと）、セレノシステイン（例えば、ＷＯ２００８／１２２０３９、及びＨｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、２００８，１０５：１２４５１−１２４５６を参照のこと）、ホルミルグリシン（例えば、Ｃａｒｒｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００７，３：３２１−３２２、Ａｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，２０１３、１１０：４６−５１、及びＲａｂｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１２，１０：１０５２−１０６７を参照のこと）、非天然アミノ酸（例えば、ＷＯ２０１３／０６８８７４、及びＷＯ２０１２／１６６５５９を参照のこと）、及び酸性アミノ酸（例えば、ＷＯ２０１２／０５９８２を参照のこと）。リンカーはまた、炭水化物への付着を介して抗原結合タンパク質にコンジュゲートされてもよい（例えば、ＵＳ２００８／０３０５４９７、ＷＯ２０１４／０６５６６１、及びＲｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ＆Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，１３：１２７−１３０を参照のこと）及びジスルフィドリンカー（例えば、ＷＯ２０１３／０８５９２５、ＷＯ２０１０／０１０３２４、ＷＯ２０１１／０１８６１１、及びＳｈａｕｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００６、２：３１２−３１３を参照のこと）。部位特異的コンジュゲーション技術を使用して、抗体または抗原結合タンパク質の特定の残基にコンジュゲーションを向けてもよい（例えば、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１６）３６（Ｓｕｐｐｌ  １）：１００を参照のこと）。部位特異的コンジュゲーション技術には、限定するものではないが、トランスグルタミナーゼを介したグルタミンコンジュゲーションが挙げられる（例えば、Ｓｃｈｉｂｌｉ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒ  Ｅｄ．２０１０，４９，９９９５を参照のこと）。
【０２６４】
ある特定の実施形態によれば、本開示は、ＡＤＣを提供し、ここで、本明細書に記載の抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗原結合タンパク質または抗ＨＥＲ２抗体は、その開示が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１４／１４５０９０に記載のリンカー薬物組成物にコンジュゲートされている（例えば、化合物「７」はまた、本明細書では「Ｍ００２６」とも呼ばれ、以下に示される）。
【化３１】
2021523100.tif 000032
【０２６５】
本明細書に開示される抗ＨＥＲ２×抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗原結合タンパク質または抗ＨＥＲ２抗体を含む、抗体薬物コンジュゲートも本明細書で提供され、ここで、当該抗ＨＥＲ２×抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗原結合タンパク質または抗ＨＥＲ２抗体は細胞毒性剤にコンジュゲートされている。ある特定の実施形態において、この細胞毒性剤は、メイタンシノイドである。ある特定の実施形態において、メイタンシノイドは、以下の式：
【化３２】
2021523100.tif 000033
を有する化合物であり、
式中、ｎは、１〜１２の整数であり、Ｒ１はアルキルである。ある特定の実施形態では、メイタンシノイドは、
【化３３】
2021523100.tif 000034
である。ある特定の実施形態において、この細胞毒性剤はメイタンシノイドであり、メイタンシノイドは、切断不可能なリンカーを介して抗体に共有結合されている。ある特定の実施形態において、細胞毒性剤はメイタンシノイドであり、メイタンシノイドは、切断可能なリンカーを介して抗体に共有結合されている。
【０２６６】
一実施形態では、この抗体は、以下にコンジュゲートされ：
【化３４】
2021523100.tif 000035
式中、
【化３５】
2021523100.tif 000036
は、抗体に対する結合である。
【０２６７】
一実施形態では、この抗体は、以下にコンジュゲートされ：
【化３６】
2021523100.tif 000037
式中、
【化３７】
2021523100.tif 000038
は、抗体に対する結合である。
【０２６８】
一実施形態では、この抗体は、以下に対してコンジュゲートされ：
【化３８】
2021523100.tif 000039
式中、
【化３９】
2021523100.tif 000040
は、抗体に対する結合である。
【０２６９】
一実施形態では、この抗体は、以下に対してコンジュゲートされ：
【化４０】
2021523100.tif 000041
式中、
【化４１】
2021523100.tif 000042
は、抗体に対する結合である。
【０２７０】
いくつかの実施形態において、これらのコンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ−［Ｌ−Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、本明細書において記載されるような抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗原結合タンパク質または抗ＨＥＲ２抗体であり、
Ｌはリンカーであり、
Ｐａｙは、細胞毒性剤であり、かつ
ｎは１〜１０の整数である。
【０２７１】
いくつかの実施形態において、Ａｂは、表１または３に記載される任意の抗体または抗原結合タンパク質である。
【０２７２】
いくつかの実施形態において、Ｐａｙｌｏａｄ（ペイロード）は、メイタンシノイドである。
【０２７３】
いくつかの実施形態において、Ｐａｙは：
【化４２】
2021523100.tif 000043
であり、
式中、Ｒ１はアルキルである。
【０２７４】
いくつかの実施形態において、Ｐａｙは：
【化４３】
2021523100.tif 000044
である。
【０２７５】
いくつかの実施形態において、Ｐａｙは：
【化４４】
2021523100.tif 000045
である。
【０２７６】
いくつかの実施形態において、ｎは、２〜５の整数である。
【０２７７】
いくつかの実施形態において、−Ｌ−Ｐａｙは：
【化４５】
2021523100.tif 000046
であり、
式中、
【化４６】
2021523100.tif 000047
は、抗体に対する結合である。
【０２７８】
いくつかの実施形態において、−Ｌ−Ｐａｙは：
【化４７】
2021523100.tif 000048
であり、
式中
【化４８】
2021523100.tif 000049
は、抗体に対する結合である。
【０２７９】
いくつかの実施形態において、−Ｌ−Ｐａｙは、
【化４９】
2021523100.tif 000050
であり、
式中、
【化５０】
2021523100.tif 000051
は、抗体に対する結合である。
【０２８０】
いくつかの実施形態において、−Ｌ−Ｐａｙは：
【化５１】
2021523100.tif 000052
であり、
式中、
【化５２】
2021523100.tif 000053
は、
抗体に対する結合である。
【０２８１】
いくつかの実施形態において、−Ｌ−Ｐａｙは：
【化５３】
2021523100.tif 000054
であり、
式中、
【化５４】
2021523100.tif 000055
は、抗体に対する結合である。
【０２８２】
本発明は、抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメント、及びＤＭ１などであるがこれらに限定されない治療剤（「Ｐａｙ」）（例えば、細胞毒性剤）を含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。いくつかの実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗原結合フラグメント及び細胞毒性剤（ＤＭ１などであるがこれに限定されない）は、ＳＭＣＣなどであるがこれに限定されないリンカー（「Ｌ」）を介して共有結合される。様々な実施形態において、ＡＤＣは、
表１に記載の配列番号（例えば、配列番号２、１８及び１０）のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲ、特定のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（例えば、配列番号２／１０または１８／１０）、及び／または表１に示される配列番号（例えば、配列番号４−６−８−１２−１４−１６、２０−２２−２４−１２−１４−１６）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、を含む抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに
メイタンシノイド、任意にＤＭ１、を含み、
任意に、ここでこの抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメント及びメイタンシノイドは、リンカー、例えば、ＳＭＣＣを介して共有結合されている。
【０２８３】
いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、表１に記載の配列番号（例えば、配列番号２、１８及び１０）のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲ、特定のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（例えば、配列番号２／１０または１８／１０）、及び／または表１に記載の配列番号（例えば、配列番号４−６−８−１２−１４−１６、２０−２２−２４−１２−１４−１６）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、
【化５５】
2021523100.tif 000056
にコンジュゲートされた、抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【０２８４】
いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、表１に記載の配列番号（例えば、配列番号２、１８及び１０）のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲ、特定のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（例えば、配列番号２／１０または１８／１０）、及び／または表１に記載される配列番号（例えば、配列番号４−６−８−１２−１４−１６、２０−２２−２４−１２−１４−１６）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに
【化５６】
2021523100.tif 000057
を含み、
式中、
【化５７】
2021523100.tif 000058
は、抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメントに対する結合である。
【０２８５】
いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、表１に記載される、配列番号（例えば、配列番号２、１８及び１０）のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲ、特定のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（例えば、配列番号２／１０または１８／１０）、及び／または配列番号（例えば、配列番号４−６−８−１２−１４−１６、２０−２２−２４−１２−１４−１６）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに
【化５８】
2021523100.tif 000059
を含み、
式中、
【化５９】
2021523100.tif 000060
は、抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメントに対する結合である。
【０２８６】
いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、表１に記載の配列番号（例えば、配列番号２、１８及び１０）のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲ、特定のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（例えば、配列番号２／１０または１８／１０）、及び／または表１に記載されている配列番号（例えば、４−６−８−１２−１４−１６、２０−２２−２４−１２−１４−１６）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに
【化６０】
2021523100.tif 000061
を含み、
式中、
【化６１】
2021523100.tif 000062
は、抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメントに対する結合である。
【０２８７】
様々な実施形態において、ＡＤＣは、表１に記載の配列番号（例えば、配列番号２、１８及び１０）のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲ、または特定のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（例えば、配列番号２／１０または１８／１０）を含む、抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。場合によっては、抗ＨＥＲ２抗体またはフラグメントは、表１に記載の配列番号（例えば、配列番号４−６−８−１２−１４−１６、２０−２２−２４−１２−１４−１６）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。場合によっては、抗ＨＥＲ２抗体またはフラグメントは、表１に記載の配列番号（例えば、配列番号２、１８及び１０）のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ、または特定のアミノ酸配列対（例えば、配列番号２／１０及び１８／１０）を含む。
【０２８８】
様々な実施形態において、ＡＤＣは、ＨＣＶＲアームのＣＤＲ、及び表３に記載の配列番号のアミノ酸配列を有する同じＬＣＶＲアーム（例えば、ＨＣＶＲ１−ＨＣＶＲ２−ＬＣＶＲ配列番号２−２６−１０、２−３４−１０、２−４２−１０、１８−２６−１０、１８−３４−１０、または１８−４２−１０を有する）、または２つの特定のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（例えば、配列番号２／１０及び２６／１０、２／１０及び３４／１０、２／１０及び４２／１０、１８／１０及び２６／１０、１８／１０及び３４／１０、または１８／１０及び４２／１０）を含む、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。場合によっては、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはフラグメントは、表１及び２に記載の配列番号（例えば、配列番号４−６−８−１２−１４−１６及び２８−３０−３２−１２−１４−１６）のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ及びＬＣ−ＣＤＲを含む。別の実施形態において、ＡＤＣは、ＨＣＶＲアーム、及び表３に記載の配列番号（例えば、配列番号２／１０及び２６／１０、２／１０及び３４／１０、２／１０及び４２／１０、１８／１０及び２６／１０、１８／１０及び３４／１０、または１８／１０及び４２／１０）のアミノ酸配列を有する同じＬＣＶＲアームを含む、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【０２８９】
いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびにＤＭ１などであるがこれに限定されない治療剤（「Ｐａｙ」）（例えば、細胞毒性剤）を含む。いくつかの実施形態において、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメント及び細胞毒性剤（ＤＭ１などであるがこれに限定されない）は、限定するものではないが、ＳＭＣＣなど、リンカー（「Ｌ」）を介して共有結合されている。様々な実施形態において、ＡＤＣは、
表３に記載の配列番号のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲアーム及び同じＬＣＶＲアームのＣＤＲ（例えば、ＨＣＶＲ１−ＨＣＶＲ２−ＬＣＶＲ配列番号２−２６−１０、２−３４−１０、２−４２−１０、１８−２６−１０、１８−３４−１０、または１８−４２−１０を有する）、２つの特定のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（例えば、配列番号２／１０及び２６／１０、２／１０及び３４／１０、２／１０及び４２／１０、１８／１０及び２６／１０、１８／１０及び３４／１０、または１８／１０及び４２／１０）、表１及び２に記載の配列番号のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ及びＬＣ−ＣＤＲ（例えば、配列番号４−６−８−１２−１４−１６及び２８−３０−３２−１２−１４−１６）、ならびに／または表３に記載の配列番号のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲアーム及び同じＬＣＶＲアーム（例えば、配列番号２／１０及び２６／１０、２／１０及び３４／１０、２／１０及び４２／１０、１８／１０及び２６／１０、１８／１０及び３４／１０、または１８／１０及び４２／１０）を含む、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに
メイタンシノイド、任意にＤＭ１、
を含み、
任意に、この抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメント及びメイタンシノイドが、リンカー、例えば、ＳＭＣＣを介して共有結合されている。
【０２９０】
いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、表３に記載する配列番号のアミノ酸配列を有する、ＨＣＶＲアーム及び同じＬＣＶＲアームのＣＤＲ（例えば、ＨＣＶＲ１−ＨＣＶＲ２−ＬＣＶＲ配列番号２−２６−１０、２−３４−１０、２−４２−１０、１８−２６−１０、１８−３４−１０、または１８−４２−１０を有する）、２つの特定のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（例えば、配列番号２／１０及び２６／１０、２／１０及び３４／１０、２／１０及び４２／１０、１８／１０及び２６／１０、１８／１０及び３４／１０、または１８／１０及び４２／１０）、表１及び２に記載の配列番号のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ及びＬＣ−ＣＤＲ（例えば、配列番号４−６−８−１２−１４−１６及び２８−３０−３２−１２−１４−１６）、及び／または表３に記載の配列番号のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲアーム及び同じＬＣＶＲアーム（例えば、配列番号２／１０及び２６／１０、２／１０及び３４／１０、２／１０及び４２／１０、１８／１０及び２６／１０、１８／１０及び３４／１０、または１８／１０及び４２／１０）を含む、以下
【化６２】
2021523100.tif 000063
にコンジュゲートされた、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【０２９１】
いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、表３に記載の配列番号のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲアーム及び同じＬＣＶＲアームのＣＤＲ（例えば、ＨＣＶＲ１−ＨＣＶＲ２−ＬＣＶＲ配列番号２−２６−１０、２−３４−１０、２−４２−１０、１８−２６−１０、１８−３４−１０、または１８−４２−１０）、２つの特定のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（例えば、配列番号２／１０及び２６／１０、２／１０及び３４／１０、２／１０及び４２／１０、１８／１０及び２６／１０、１８／１０及び３４／１０、または１８／１０及び４２／１０）、表１及び２に記載の配列番号のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ及びＬＣ−ＣＤＲ（例えば、配列番号４−６−８−１２−１４−１６及び２８−３０−３２−１２−１４−１６）、及び／または表３に記載の配列番号のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲアーム及び同じＬＣＶＲアーム（例えば、配列番号２／１０及び２６／１０、２／１０及び３４／１０、２／１０及び４２／１０、１８／１０及び２６／１０、１８／１０及び３４／１０、または１８／１０及び４２／１０）を含む、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに
【化６３】
2021523100.tif 000064
を含み、
式中、
【化６４】
2021523100.tif 000065
は、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメントに対する結合である。
【０２９２】
いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、表３に記載の配列番号のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲアーム及び同じＬＣＶＲアームのＣＤＲ（例えば、ＨＣＶＲ１−ＨＣＶＲ２−ＬＣＶＲ配列番号２−２６−１０、２−３４−１０、２−４２−１０、１８−２６−１０、１８−３４−１０、または１８−４２−１０）、２つの特定のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（例えば、配列番号２／１０及び２６／１０、２／１０及び３４／１０、２／１０及び４２／１０、１８／１０及び２６／１０、１８／１０及び３４／１０、または１８／１０及び４２／１０）、表１及び２に記載の配列番号のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ及びＬＣ−ＣＤＲ（例えば、配列番号４−６−８−１２−１４−１６及び２８−３０−３２−１２−１４−１６）、及び／または表３に記載の配列番号のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲアーム及び同じＬＣＶＲアーム（例えば、配列番号２／１０及び２６／１０、２／１０及び３４／１０、２／１０及び４２／１０、１８／１０及び２６／１０、１８／１０及び３４／１０、または１８／１０及び４２／１０）、を含む抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに
【化６５】
2021523100.tif 000066
を含み、
式中、
【化６６】
2021523100.tif 000067
は、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメントに対する結合である。
【０２９３】
いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、表３に記載の配列番号のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲアーム及び同じＬＣＶＲアームのＣＤＲ（例えば、ＨＣＶＲ１−ＨＣＶＲ２−ＬＣＶＲ配列番号２−２６−１０、２−３４−１０、２−４２−１０、１８−２６−１０、１８−３４−１０、または１８−４２−１０）、２つの特定のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（例えば、配列番号２／１０及び２６／１０、２／１０及び３４／１０、２／１０及び４２／１０、１８／１０及び２６／１０、１８／１０及び３４／１０、または１８／１０及び４２／１０）、表１及び２に記載の配列番号のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ及びＬＣ−ＣＤＲ（例えば、配列番号４−６−８−１２−１４−１６及び２８−３０−３２−１２−１４−１６）、ならびに／または表３に記載の配列番号のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲアーム及び同じＬＣＶＲアーム（例えば、配列番号２／１０及び２６／１０、２／１０及び３４／１０、２／１０及び４２／１０、１８／１０及び２６／１０、１８／１０及び３４／１０、または１８／１０及び４２／１０）を含む抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに
【化６７】
2021523100.tif 000068
を含み、
式中、
【化６８】
2021523100.tif 000069
は、抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２抗体またはその抗原結合フラグメントに対する結合である。
【０２９４】
本明細書に記載の抗体薬物コンジュゲートは、当業者に公知のコンジュゲーション条件を使用して調製され得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００３，２１，７，７７８を参照のこと）。いくつかの実施形態において、抗ＨＥＲ２×抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗原結合タンパク質または抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲートは、本明細書に記載の抗ＨＥＲ２×抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗原結合タンパク質または抗ＨＥＲ２抗体を、所望のリンカー及び細胞毒性剤を含む化合物と接触させることによって調製され、ここで当該リンカーは、抗体または抗原結合タンパク質と反応するある部分、例えば、抗体または抗原結合タンパク質の所望の残基で、その部分を有する。
【０２９５】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の抗ＨＥＲ２×抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗原結合タンパク質または抗ＨＥＲ２抗体を、以下の式Ａ１を有する化合物
【化６９】
2021523100.tif 000070
及び水性希釈液と接触させることを含む抗体薬物コンジュゲートを調製するためのプロセスである。
【０２９６】
いくつかの実施形態において、式Ａ１の化合物は、化学量論的に過剰に存在する。いくつかの実施形態において、式Ａ１の化合物は、５〜６倍の化学量論的に過剰で存在する。いくつかの実施形態において、水性希釈剤は、ＨＥＰＥＳを含む。いくつかの実施形態において、水性希釈剤は、ＤＭＡを含む。
【０２９７】
いくつかの実施形態において、式Ａ１の化合物は、式Ａ２またはＡ３の化合物である：
【化７０】
2021523100.tif 000071
【０２９８】
いくつかの実施形態において、式Ａ２の化合物は、立体的に純粋なＡ３である。いくつかの実施形態において、式Ａ１の化合物は、式Ａ１またはＡ２の化合物を含み、ここで、Ａ１またはＡ２の化合物は、５０％を超えるジアステレオマー過剰率で存在する。ある特定の実施形態において、ジアステレオマー過剰率は、７０％を超える。ある特定の実施形態において、ジアステレオマー過剰率は、９０％を超える。ある特定の実施形態において、ジアステレオマー過剰率は、９５％を超える。構造Ａ１、Ａ２、及びＡ３は、個別にまたは総称的にＳＭＣＣ−ＤＭ１として知られている。
【０２９９】
「ジアステレオマー過剰率」という用語は、組成物中の残りのジアステレオマーと比較した、所望の単一のジアステレオマーのモル分率の間の相違を指す。ジアステレオマー過剰率は次のように計算される：（単一のジアステレオマーの量）−（他のジアステレオマーの量）／１。例えば、９０％の１及び１０％の２、３、４、またはそれらの混合物を含む組成物は、８０％のジアステレオマー過剰率を有する［（９０−１０）／１］。９５％の１及び５％の２、３、４、またはそれらの混合物を含む組成物は、９０％［（９５−５）／１］のジアステレオマー過剰率を有する。９９％の１及び１％の２、３、４、またはそれらの混合物を含む組成物は、９８％［（９９−１）／１］のジアステレオマー過剰率を有する。ジアステレオマー過剰率は、１、２、３、または４のいずれかについて同様に計算され得る。
【０３００】
いくつかの実施形態において、式Ａ１の化合物は、式（ａ）の化合物：
【化７１】
2021523100.tif 000072
と式（ｂ）の化合物
【化７２】
2021523100.tif 000073
とを、シリカゲル及び希釈液の存在下で接触させることによって調製される。いくつかの実施形態において、この希釈液は、有機溶媒及び水を含む。
【０３０１】
本明細書に提供されるのはまた、以下のプロセスによって調製される生成物である：
（ｉ）式（ａ）の化合物：
【化７３】
2021523100.tif 000074
と、式（ｂ）の化合物：
【化７４】
2021523100.tif 000075
とを、シリカゲル及び希釈液の存在下で接触させて、中間体を合成することと、
（ｉｉ）本明細書に記載の抗ＨＥＲ２ｘ抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗原結合タンパク質または抗ＨＥＲ２抗体とこの中間体及び水性希釈液とを接触させること。
【０３０２】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の抗ＨＥＲ２×抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗原結合タンパク質または抗ＨＥＲ２抗体を、以下の式Ｂ：
【化７５】
2021523100.tif 000076
を有する化合物と接触させることを含む、抗体薬物コンジュゲートを調製するためのプロセスであり、
式中、ＬＧは、脱離基、及び水性希釈液である。
【０３０３】
いくつかの実施形態において、式Ｂの化合物は、化学量論的に過剰に存在する。いくつかの実施形態において、式Ｂの化合物は、５〜６倍の化学量論的過剰で存在する。いくつかの実施形態において、水性希釈剤は、ＨＥＰＥＳを含む。いくつかの実施形態において、水性希釈剤は、ＤＭＡを含む。いくつかの実施形態において、−Ｃ（Ｏ）−ＬＧは、エステル、例えば、ＮＨＳまたはペンタフルオロフェニルエステルである。
【０３０４】
いくつかの実施形態において、式Ｂの化合物は、化合物Ｉとして公知の式Ｂ１の化合物である：
【化７６】
2021523100.tif 000077
【０３０５】
いくつかの実施形態において、式Ｃの化合物は、化合物ＩＩとして公知である：
【化７７】
2021523100.tif 000078
【０３０６】
薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、抗体または抗原結合フラグメントにコンジュゲートした薬物の平均数であり、これは、ＡＤＣの効力、力価、及び薬物動態に重要な影響を有する。様々な実施形態において、ＤＡＲは、１抗体あたり１、２、３、４、５、６、７、または８個の薬物分子からのものである。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは１から４である。ある特定の実施形態では、ＤＡＲは２〜４である。ある場合には、ＤＡＲは２〜３である。ある場合には、ＤＡＲは３〜４である。ある実施形態では、ＤＡＲは、１〜１０、１〜２０または１〜３０（すなわち、１抗体またはその抗原結合フラグメントあたり１〜３０の薬物分子）である。
【０３０７】
治療の処方及び投与
本発明は、本発明の抗原結合分子を含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、改善された移動、送達、耐性などを提供する適切な担体、賦形剤、及び他の薬剤と共に処方される。多数の適切な処方が、全ての医薬品化学者に公知の処方集に見出され得る：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質類、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標），Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡなど）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型及び油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１も参照のこと。
【０３０８】
患者に投与される抗原結合分子の用量は、患者の年齢及びサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変化し得る。好ましい用量は、通常、体重または体表面積に従って計算される。本発明の二重特異性抗原結合分子が成人患者の治療目的で使用される場合、本発明の二重特異性抗原結合分子を、通常、体重１ｋｇあたり約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、または約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇの単回用量で静脈内投与することが有利であり得る。状態の重症度に応じて、治療の頻度及び期間を調整してもよい。二重特異性抗原結合分子を投与するための効果的な投与量及びスケジュールは、経験的に決定され得る。例えば、患者の進行は、定期的なアセスメントによってモニターされ得、それに応じて用量が調整され得る。さらに、投与量の種間での拡大縮小は、当該技術分野で周知の方法を使用して実施され得る（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
【０３０９】
様々な送達システムが公知であり、本発明の薬学的組成物、例えば、リポソームへのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現し得る組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシスを投与するために使用され得る（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）。導入の方法としては、限定するものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられる。組成物は、任意の便利な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与してもよく、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与してもよい。投与は全身的であっても、または局所的であってもよい。
【０３１０】
本発明の薬学的組成物は、標準的な針及び注射器を用いて皮下または静脈内に送達され得る。さらに、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本発明の薬学的組成物を送達する際の用途を容易に有する。そのようなペン送達デバイスは、再利用可能であっても、または使い捨て可能であってもよい。再利用可能なペン送達デバイスは、一般に、薬学的組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の全ての薬学的組成物が一旦投与され、カートリッジが空になったら、その空のカートリッジは容易に廃棄され得、薬学的組成物を含む新しいカートリッジと交換され得る。その後、ペン送達デバイスは再利用され得る。使い捨てペン送達デバイスには、交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスは、デバイス内のリザーバーに保持された薬学的組成物が事前に充填されている。リザーバーから薬学的組成物が一旦、空になれば、そのデバイス全体が廃棄される。
【０３１１】
多数の再利用可能なペン及び自動注射器送達デバイスは、本発明の薬学的組成物の皮下送達において用途を有する。例としては、限定するものではないが、ほんの数例を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が、挙げられる。本発明の薬学的組成物の皮下送達に用途を有する使い捨てペン送達デバイスの例としては、限定するものではないが、ほんの数例を挙げれば、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）、及びＨＵＭＩＲＡ（商標）Ｐｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  ＩＬ）が挙げられる。
【０３１２】
ある特定の状況において、薬学的組成物は、制御放出システムで送達され得る。一実施形態では、ポンプを使用してもよい（Ｌａｎｇｅｒ，前出、Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用してもよい。Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照のこと。さらに別の実施形態では、制御放出システムは、組成物の標的の近くに配置してもよく、したがって、全身用量のほんの一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，前出，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８を参照のこと）。他の制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３による概説で考察されている。
【０３１３】
注射可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内及び筋肉内注射、点滴注入などのための剤形を含み得る。これらの注射可能な調製物は、公に知られている方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、例えば、上記の抗体またはその塩を、注射に従来使用されている滅菌水性媒体または油性媒体中に溶解、懸濁、または乳化することによって調製され得る。注射用の水性媒体として、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤を含む等張液などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］などのような適切な可溶化剤と組み合わせて使用され得る。油性媒体として、例えば、ゴマ油、大豆油などを使用し、これらは、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。このようにして調製された注射剤は、好ましくは、適切なアンプルに充填される。
【０３１４】
有利には、上記の経口または非経口使用のための薬学的組成物は、有効成分の用量に適合するのに適した単位用量の剤形に調製される。単位用量におけるそのような剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、注射（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含まれる前述の抗体の量は、一般に、単位用量において１剤形あたり約５〜約５００ｍｇである。特に注射の形態では、前述の抗体は、約５〜約１００ｍｇで、及び他の剤形では約１０〜約２５０ｍｇで含まれることが好ましい。
【０３１５】
抗原結合分子の治療用途
本発明は、それを必要とする対象に、抗ＨＥＲ２抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはＡＰＬＰ２及びＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む治療用組成物を投与することを含む方法を含む。この治療用組成物は、本明細書に開示される抗体または二重特異性抗原結合分子のいずれか、及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含み得る。「それを必要とする対象」という表現は、がんの１つ以上の症状または徴候を示すヒトまたは非ヒト動物（例えば、腫瘍を発現するか、または以下に記載の任意のがんに罹患している対象）、またはそうでない場合、ＨＥＲ２活性の阻害もしくは低下、またはＨＥＲ２＋細胞（例えば、乳癌細胞など）の枯渇から恩恵を受けるであろうヒトまたは非ヒト動物を意味する。
【０３１６】
本発明の抗体及び二重特異性抗原結合分子（及びそれを含む治療用組成物）は、とりわけ、免疫応答の刺激、活性化及び／または標的化が有益である任意の疾患または障害を治療するために有用である。特に、本発明の抗ＨＥＲ２抗体または抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、ＨＥＲ２発現もしくは活性、またはＨＥＲ２＋細胞の増殖に関連するか、またはそれらによって媒介される任意の疾患または障害の治療、予防及び／または改善のために使用され得る。本発明の治療方法が達成される作用機序としては、例えば、ＣＤＣ、アポトーシス、ＡＤＣＣ、食作用による、またはこれらの機構の２つ以上の組み合わせによる、エフェクター細胞の存在下でのＨＥＲ２を発現する細胞の殺滅が挙げられる。本発明の二重特異性抗原結合分子を使用して阻害または殺滅され得る、ＨＥＲ２を発現する細胞としては、例えば、乳房腫瘍細胞が挙げられる。
【０３１７】
本発明の抗原結合分子は、例えば、前立腺、膀胱、子宮頸部、肺、結腸、腎臓、乳房、膵臓、胃、子宮、及び／または卵巣に生じる原発性及び／または転移性腫瘍を治療するために使用され得る。ある特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合分子は、以下のがんのうちの１つ以上を治療するために使用される：前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮癌、及び卵巣癌。本発明のある特定の実施形態によれば、抗ＨＥＲ２抗体または抗ＨＥＲ２／抗ＡＰＬＰ２二重特異性抗体は、ＩＨＣ２＋以上である乳癌細胞に罹患している患者を治療するために有用である。本発明の他の関連する実施形態によれば、本明細書に開示される抗ＨＥＲ２抗体または抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を、ＩＨＣ２＋以上である乳癌細胞に罹患している患者に投与することを含む方法が提供される。腫瘍スキャンなどのような当該技術分野で公知の分析／診断方法を使用して、患者が去勢抵抗性の腫瘍を抱えているか否かを確認し得る。
【０３１８】
本発明はまた、対象における残存がんを治療するための方法を含む。「残存がん」という用語は、抗がん療法による治療後の対象における１つ以上のがん性細胞の存在または持続を意味する。
【０３１９】
ある特定の態様によれば、本発明は、本明細書の他の場所に記載の抗ＨＥＲ２または二重特異性抗原結合分子の１つ以上を、対象が乳癌（例えば、ＩＨＣ２＋乳癌）であると決定された後の対象に投与することを含む、ＨＥＲ２発現に関連する疾患または障害（例えば、乳癌）を治療するための方法を提供する。例えば、本発明は、抗ＨＥＲ２抗体または抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を、対象がホルモン療法（例えば、抗アンドロゲン療法）を受けてから１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間または４週間、２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、８ヶ月、１年、またはそれ以上後に患者に投与することを含む、乳癌を治療するための方法を含む。
【０３２０】
併用療法及び処方物
本発明は、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて、本明細書に記載の例示的な抗体及び二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む、薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。本発明の抗原結合分子と組み合わされ得るか、または組み合わせて投与され得る例示的な追加の治療剤としては、例えば、ＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体［例えば、セツキシマブまたはパニツムマブ］またはＥＧＦＲの小分子阻害剤［例えば、ゲフィチニブまたはエルロチニブ］）、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４などの別のＥＧＦＲファミリーメンバーのアンタゴニスト（例えば、抗ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３もしくは抗ＥｒｂＢ４抗体またはＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３もしくはＥｒｂＢ４活性の小分子阻害剤）、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアンタゴニスト（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体）、ｃＭＥＴアンタゴニスト（例えば、抗ｃＭＥＴ抗体）、ＩＧＦ１Ｒアンタゴニスト（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、Ｂ−ｒａｆ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０）、ＰＤＧＦＲ−α阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ−α抗体）、ＰＤＧＦＲ−β阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ−β抗体）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−トラップ、例えば、米国特許第７，０８７，４１１号を参照のこと（本明細書では「ＶＥＧＦ阻害性融合タンパク質」とも呼ばれる）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブまたはパゾパニブ））、ＤＬＬ４アンタゴニスト（例えば、ＲＥＧＮ４２１などのＵＳ２００９／０１４２３５４に開示された抗ＤＬＬ４抗体）、Ａｎｇ２アンタゴニスト（例えば、Ｈ１Ｈ６８５ＰなどのＵＳ２０１１／００２７２８６に開示されている抗Ａｎｇ２抗体）、ＦＯＬＨ１（ＰＳＭＡ）アンタゴニスト、ＰＲＬＲアンタゴニスト（例えば、抗ＰＲＬＲ抗体）、ＨＥＲ１またはＨＥＲ２アンタゴニスト（例えば、抗ＨＥＲ１抗体または抗ＨＥＲ２抗体）、ＴＭＰＲＳＳ２アンタゴニスト（例えば、抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体）、ＭＳＬＮアンタゴニスト（例えば、抗ＭＳＬＮ抗体）、ＣＡ９アンタゴニスト（例えば、抗ＣＡ９抗体）、ウロプラキンアンタゴニスト（例えば、抗ウロプラキン抗体）などが挙げられる。本発明の抗原結合分子と組み合わせて有益に投与され得る他の薬剤としては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８などのサイトカインに、またはそれらのそれぞれの受容体に結合する、小分子サイトカイン阻害剤及び抗体を含むサイトカイン阻害剤が挙げられる。本発明の薬学的組成物（例えば、本明細書に開示されるような抗ＡＰＬＰ２／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物）はまた、「ＩＣＥ」：イホスファミド（例えば、Ｉｆｅｘ（登録商標））、カルボプラチン（例えば、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、エトポシド（例えば、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（登録商標）、Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標）、ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標）、ＶＰ−１６）、「ＤＨＡＰ」：デキサメタゾン（例えば���Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））、シタラビン（例えば、Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標）、シトシンアラビノシド、ａｒａ−Ｃ）、シスプラチン（例えば、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）−ＡＱ）、及び「ＥＳＨＡＰ」：エトポシド（例えば、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（登録商標）、Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標）、ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標）、ＶＰ−１６）、メチルプレドニゾロン（例えば、Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標））、高用量シタラビン、シスプラチン（例えば、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）−ＡＱ）から選択される１つ以上の治療的組み合わせを含む治療レジメンの一部として投与され得る。
【０３２１】
本発明はまた、本明細書に記載の抗原結合分子のいずれかと、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ−ｒａｆ、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ＦＯＬＨ１（ＰＳＭＡ）、ＰＲＬＲ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＭＳＬＮ、ＣＡ９、ウロプラキン、または任意の前述のサイトカインのうちの１つ以上の阻害剤とを含む治療的組み合わせを含み、ここでこの阻害剤はアプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ナノボディまたは抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ、ｄＡｂフラグメント、または他の操作された分子、例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ及び最小認識単位）である。本発明の抗原結合分子はまた、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド及び／またはＮＳＡＩＤと組み合わせて投与及び／または共処方され得る。本発明の抗原結合分子はまた、放射線治療及び／または従来の化学療法も含む治療レジメンの一部として投与されてもよい。
【０３２２】
追加の治療的に活性な成分（複数可）は、本発明の抗原結合分子の投与の直前、同時、または直後に投与され得る、（本開示の目的に関しては、そのような投与レジメンは、追加の治療的に活性な成分と「組み合わせて」抗原結合分子の投与と見なされる）。
【０３２３】
本発明は、本発明の他の場所に記載されるように、本発明の抗原結合分子が１つ以上の追加の治療的に活性な成分（複数可）と共処方される薬学的組成物を含む。
【０３２４】
投与レジメン
本発明のある特定の実施形態によれば、複数用量の抗原結合分子（例えば、抗ＨＥＲ２抗体またはＨＥＲ２及びＡＰＬＰ２に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子）を、対象に、定義された時間経過にわたって投与してもよい。本発明のこの態様による方法は、本発明の抗原結合分子の複数回投与を対象に連続的に投与することを含む。「連続投与」という句は、抗原結合分子の各用量が、異なる時点で、例えば、所定の間隔（例えば、時間、日、週、または月）で隔てられた異なる日に、対象に投与されることを意味する。本発明は、患者に抗原結合分子の単一の初期用量、続いて抗原結合分子の１つ以上の二次用量、及び任意に続いて抗原結合分子の１つ以上の三次用量を連続的に投与することを含む方法を含む。
【０３２５】
「初期用量」、「二次用量」、及び「三次用量」という用語は、本発明の抗原結合分子の投与の時間的順序を指す。したがって、「初期用量」とは、治療レジメンの開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも呼ばれる）である。「二次用量」とは、最初の用量の後に投与される用量である。「三次用量」とは、二次用量の後に投与される用量である。初回、二次、及び三次用量は、全て同じ量の抗原結合分子を含んでもよいが、一般に投与の頻度に関して互いに異なってもよい。しかしながら、ある特定の実施形態において、初期、二次及び／または三次用量に含まれる抗原結合分子の量は、治療の過程中に互いに変化する（例えば、任意に上下に調整される）。ある特定の実施形態において、２つ以上（例えば、２、３、４、または５）の用量は、治療レジメンの開始時に「負荷用量」として投与され、その後、引き続く用量が、より低い基準頻度で投与される（例えば、維持用量」）。
【０３２６】
本発明の１つの例示的な実施形態において、各二次及び／または三次用量は、直前の投与から１〜２６（例えば、１、１１／２、２、２１／２、３、３１／２、４、４１／２、５、５１／２、６、６１／２、７、７１／２、８、８１／２、９、９１／２、１０、１０１／２、１１、１１１／２、１２、１２１／２、１３、１３１／２、１４、１４１／２、１５、１５１／２、１６、１６１／２、１７、１７１／２、１８、１８１／２、１９、１９１／２、２０、２０１／２、２１、２１１／２、２２、２２１／２、２３、２３１／２、２４、２４１／２、２５、２５１／２、２６、２６１／２、またはそれ以上）週後に投与される。「直前の用量」という句は、一連の複数回の投与において、介在する用量なしで、連続した直後の用量の投与の前に患者に投与される抗原結合分子の用量である。
【０３２７】
本発明のこの態様による方法は、抗原結合分子（例えば、抗ＨＥＲ２抗体または特異的にＨＥＲ２とＡＰＬＰ２に結合する二重特異性抗原結合分子）の任意の回数の二次及び／または三次用量を患者に投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、単一の二次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上）の二次用量が患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態では、単一の三次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上）の三次用量が患者に投与される。
【０３２８】
複数の二次用量を含む実施形態において、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各二次用量は、直前の用量の１〜２週間後に患者に投与され得る。同様に、複数の三次用量を含む実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各三次用量は、直前の用量の２〜４週間後に患者に投与され得る。あるいは、二次及び／または三次用量が患者に投与される頻度は、治療レジメンの過程にわたって変化し得る。投与の頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師による治療の過程で調整され得る。
【０３２９】
抗体の診断的使用
本発明の抗ＨＥＲ２抗体はまた、例えば診断目的のために、試料中のＨＥＲ２またはＨＥＲ２発現細胞を検出及び／または測定するためにも使用され得る。例えば、抗ＨＥＲ２抗体またはそのフラグメントは、ＨＥＲ２の異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現、発現の欠如など）を特徴とする状態または疾患を診断するために使用され得る。ＨＥＲ２の例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を、本発明の抗ＨＥＲ２抗体と接触させることを含み得、ここで、抗ＨＥＲ２抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識される。あるいは、非標識抗ＨＥＲ２抗体は、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体と組み合わせて、診断用途で使用されてもよい。検出可能な標識またはレポーター分子は、放射性同位元素、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉ、蛍光または化学発光部分、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、もしくはローダミン、または、酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼであってもよい。本発明の抗ＨＥＲ２抗体の別の例示的な診断用途としては、対象における腫瘍細胞の非侵襲的同定及び追跡を目的とした、８９Ｚｒ標識抗体、例えば８９Ｚｒ−デスフェリオキサミン標識抗体（例えば、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージング）が挙げられる。（例えば、Ｔａｖａｒｅ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１６  Ｊａｎ  １；７６（１）：７３−８２、及びＡｚａｄ，ＢＢ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６  Ｍａｒ  １５；７（１１）：１２３４４−５８を参照のこと）。試料中のＨＥＲ２を検出または測定するために使用され得る特定の例示的なアッセイとしては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０３３０】
本発明によるＨＥＲ２診断アッセイで使用され得る試料としては、正常または病理学的条件下で、検出可能な量のＨＥＲ２タンパク質またはそのフラグメントを含む、患者から入手可能な任意の組織または流体試料が挙げられる。一般に、健康な患者（例えば、異常なＨＥＲ２レベルまたは活性に関連する疾患または状態に罹患していない患者）から得られた特定の試料中のＨＥＲ２のレベルを測定して、ＨＥＲ２のベースラインまたは標準のレベルを最初に確立する。次に、このベースラインレベルのＨＥＲ２を、ＨＥＲ２関連疾患（例えば、ＨＥＲ２発現細胞を含む腫瘍）または状態を有すると疑われる個体から得られた試料中で測定されたＨＥＲ２のレベルと比較してもよい。
【０３３１】
本発明は、多数の実施形態を参照して具体的に示され、説明されてきたが、形態及び詳細の変更が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される種々の実施形態に対して行われ得ること、本明細書に開示される種々の実施形態が、特許請求の範囲に対する制限として機能することを意図するものではないことが当業者によって理解される。
【実施例】
【０３３２】
以下の実施例は、当業者に、本発明の方法及び組成物を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を提供するために提示されており、本発明者が自身の発明と考える範囲を限定することを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保するための努力がなされてきたが、いくつかの実験誤差と偏差を考慮する必要がある。別段示さない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、かつ圧力は大気圧またはそれに近い。
【０３３３】
実施例１：抗ＨＥＲ２、抗ＡＰＬＰ２、及び抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体の生成
抗ＨＥＲ２または抗ＡＰＬＰ２抗体は、マウス（例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖及びヒトカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む操作されたマウス）を、それぞれ、ヒトＨＥＲ２の細胞外ドメイン（アミノ酸配列ＮＰ＿００４４３９．２（配列番号５１）のＴ２３−Ｔ６５２のアミノ酸）またはヒトＡＰＬＰ２の細胞外ドメイン（アミノ酸配列ＮＰ＿００１６３３．１（配列番号５２）のアミノ酸Ｇ３２−Ｓ６９２））のいずれかで免疫することによって得られた。ヒトＨＥＲ２及びヒトＡＰＬＰ２抗原のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４９及び配列番号５０として示されている。
【０３３４】
免疫化に続いて、脾細胞を各マウスから収集し、（１）マウス骨髄腫細胞と融合して、それらの生存能力を維持して、ハイブリドーマ細胞を形成し、ヒトＨＥＲ２特異性についてスクリーニングするか、または（２）反応性抗体（抗原陽性Ｂ細胞）に結合して同定する選別試薬として、ヒトＨＥＲ２フラグメントまたはヒトＡＰＬＰ２フラグメントのいずれかを使用して、Ｂ細胞（ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１に記載されるように）を選別した。
【０３３５】
ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する、ヒトＨＥＲ２またはヒトＡＰＬＰ２に対するキメラ抗体を、最初に、単離した。抗ＨＥＲ２特異的結合ドメイン及び抗ＡＰＬＰ２特異的結合ドメインを含む二重特異性抗体を、標準的な分子クローニング方法論によって組換え的に構築し、ＣＨＯ細胞で発現し、ここで、抗ＨＥＲ２抗原結合ドメイン及び抗ＡＰＬＰ２抗原結合ドメインそれぞれが、共通の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と対になった異なる別個の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。例示された二重特異性抗体において、分子は、抗ＨＥＲ２抗体由来の重鎖、抗ＡＰＬＰ２抗体由来の重鎖、及び抗ＨＥＲ２抗体と抗ＡＰＬＰ２抗体の両方に共通の軽鎖（例えば、配列番号１０を参照）を利用して構築し、ＣＨＯ細胞で発現した。場合によっては、二重特異性抗体は、抗ＨＥＲ２抗体由来の重鎖、抗ＡＰＬＰ２抗体由来の重鎖、及び抗ＨＥＲ２抗体由来の軽鎖、抗ＡＰＬＰ２抗体由来の軽鎖、または無差別であるか、もしくは様々な重鎖アーム、例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５もしくはＶκ３−２０Ｊκ１（例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４を参照のこと）と効果的に対になることが公知である別の抗体軽鎖を利用して構築されてもよい。
【０３３６】
抗体は、親和性、選択性などを含む望ましい特性について特徴付けられ、選択された。
【０３３７】
必要に応じて、マウス定常領域を、所望のヒト定常領域、例えば、野生型ヒトＣＨまたは改変ヒトＣＨ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプ）、及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で置き換えて、完全ヒト抗ＨＥＲ２、完全ヒト抗ＡＰＬＰ２抗体、または完全ヒト二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体を生成した。選択される定常領域は、特定の用途に応じて変化し得るが、高親和性の抗原結合及び標的特異性の特徴が可変領域に存在する。「Ｈ４」または「Ｈ４Ｈ」で始まる抗体名の指定またはＩＤ番号は、完全なヒト抗体を示す。抗体はＢ細胞ソーティング法により同定され、「Ｐ」または「Ｐ２」で終わる抗体ＩＤ番号で指定される。二重特異性抗体は、「Ｄ」で終わる抗体ＩＤ番号で指定される。
【０３３８】
この実施例の方法に従って生成された例示的な抗ＨＥＲ２、抗ＡＰＬＰ２、及び抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体の特定の生物学的特性は、以下に記載される実施例に詳細に記載されている。
【０３３９】
実施例２：抗体の特徴付け
実施例２．１  抗ＨＥＲ２抗体の特徴付け
抗ＨＥＲ２抗体の重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸及び核酸の配列
表１は、本明細書に開示される二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体を生成するために使用される、選択された抗ＨＥＲ２抗体の重鎖もしくは軽鎖可変領域（それぞれ、ＨＣＶＲまたはＬＣＶＲ）、または重鎖または軽鎖のＣＤＲ（それぞれ、ＨＣＤＲ及びＬＣＤＲ）をコードする核酸（ＮＡ）配列及び括弧内にはそのアミノ酸（ＡＡ）配列の配列識別子を示す。
【表１】
2021523100.tif 000079
【０３４０】
実施例２．２  抗ＡＰＬＰ２抗体の特徴付け
抗ＡＰＬＰ２抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域アミノ酸及び核酸配列
表２は、本明細書に開示される二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体を生成するために使用される、選択された抗ＡＰＬＰ２抗体の、重鎖もしくは軽鎖可変領域（それぞれ、ＨＣＶＲまたはＬＣＶＲ）、または重鎖もしくは軽鎖のＣＤＲ（それぞれＨＣＤＲ及びＬＣＤＲ）をコードする核酸（ＮＡ）配列及び括弧内にはそのアミノ酸（ＡＡ）配列の配列識別子を示す。
【表２】
2021523100.tif 000080
【０３４１】
実施例２．３  抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体の特徴付け
抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域アミノ酸及び核酸の配列
本明細書に記載されているのは、ＨＥＲ２及びＡＰＬＰ２に結合する二重特異性抗原結合分子である。このような二重特異性抗原結合分子は、本明細書では、二重特異性「抗ＨＥＲ２／抗ＡＰＬＰ２」または「抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２」抗体、抗原結合タンパク質または分子とも呼ばれる。抗ＨＥＲ２／抗ＡＰＬＰ２二重特異性分子の抗ＨＥＲ２部分は、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を発現する腫瘍細胞を標的とするのに有用であり、二重特異性分子の抗ＡＰＬＰ２部分は、ＨＥＲ２のリソソームへの内部移行を媒介し、ＨＥＲ２の分解を媒介するために有用である。
【０３４２】
以下の実施例に記載される二重特異性抗体は、ヒトＨＥＲ２及びヒトＡＰＬＰ２の細胞外部分に対して様々な結合親和性を有する抗ＨＥＲ２及び抗ＡＰＬＰ２結合アームからなる（上記の実施例１〜２を参照のこと）。２０１４年８月２８日に公開された米国特許出願公開第ＵＳ２０１４０２４３５０４Ａ１号に記載されているように、野生型カッパＣＬ及び改変（キメラ）ＩｇＧ４  ＣＨドメインを有する、例示的な二重特異性抗体を製造した。
【０３４３】
構築された様々な抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性抗体の抗原結合ドメインの構成要素の要約を表３に示す。
表３：
【表３−１】
2021523100.tif 000081
【表３−２】
2021523100.tif 000082
【０３４４】
表３に列挙された軽鎖は、二重特異性抗体のＨＥＲ２及びＡＰＬＰ２標的化アームの両方に共通であった。表１は、抗ＨＥＲ２アーム（すなわち、ＨＣＶＲは、Ｈ４Ｈ１３０５０Ｐ２またはＨ４Ｈ１３０５５Ｐ２に由来する）の様々な重鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列識別子、ならびにそれらに対応するＣＤＲを示しており、表３で特徴付けられる二重特異性抗体を構築する。表２は、この実施例の二重特異性抗体の抗ＡＰＬＰ２アームの様々な重鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列識別子、ならびにそれらの対応するＣＤＲを示している。
【０３４５】
実施例２．４  対照抗体の特徴付け
本明細書の以下の実施例で言及されるアイソタイプ対照抗体は、ヒトＡＰＬＰ２またはＨＥＲ２との交差反応性を伴わない、無関係の抗原、すなわちＦｅｌＤ１（ネコアレルギー）抗原と相互作用するアイソタイプ適合（改変ＩｇＧ４）抗体である。
【０３４６】
本明細書の以下の実施例において言及されるＨＥＲ２／Ｔ対照抗体は、トラスツズマブとして公知の抗体に由来する組換え的に作製された抗ＨＥＲ２抗体である。
【０３４７】
Ｈ４Ｈ２８６９７Ｄと呼ばれる二重特異性抗ＦｅｌＤ１ｘＡＰＬＰ２は、本明細書に記載の同じ方法によって、本明細書の上記に言及したアイソタイプ対照抗体に由来するＦｅｌＤ１に結合する第１の重鎖アーム及びＨ４Ｈ１３０５５Ｐ親抗体に由来するＡＰＬＰ２に結合する第２の重鎖アームを用いて構築した。
【０３４８】
実施例３：可溶性短縮型ヒトＨＥＲ２またはＡＰＬＰ２タンパク質へのバイオコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）ＫＤの結合
精製された抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性及び親抗体に結合するＨＥＲ２及びＡＰＬＰ２の平衡解離定数（ＫＤ値）を、Ｂｉａｃｏｒｅ４０００機器を使用したリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用して決定した。Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面は、最初に、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ、カタログ番号ＢＲ−１００８−３９）とのアミンカップリングによって誘導体化して、抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性モノクローナル抗体を捕捉した。全ての結合研究は、０．０１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ  ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．０５％ｖ／ｖ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＨＢＳ−Ｐ泳動用緩衝液）中で、３７℃で実施した。異なる濃度の試薬、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグで発現されたヒトＨＥＲ２細胞外ドメイン（ｈＨＥＲ２−ＭＭＨ、配列番号５３）またはＣ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグで発現されたヒトＡＰＬＰ２細胞外ドメイン（ｈＡＰＬＰ２−ＭＭＨ、配列番号５４）を、ＨＢＳ−Ｐ泳動用緩衝液（３００ｎＭ〜３．７ｎＭの範囲、３倍希釈）中で、抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性抗体で捕捉された表面上に３０μＬ／分の流速で４分間注入し、ＨＢＳ−Ｐ泳動用緩衝液でのそれらの解離を１０分間モニターした。速度論的会合速度定数（ｋａ）及び解離速度定数（ｋｄ）は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ２．０ｃカーブフィッティングソフトウェアを使用して、リアルタイムセンサーグラムを１：１結合モデルにフィッティングすることによって決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）及び解離半減期（ｔ１／２）は、反応速度定数から以下のように計算された：
【数１】
2021523100.tif 000083
【０３４９】
３７℃での本発明の異なる抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性抗体及びそれらの親抗体へのｈＨＥＲ２−ＭＭＨ、またはｈＡＰＬＰ２−ＭＭＨ結合の結合速度論的パラメーターを、表４及び５に示す。３７℃で、ｈＨＥＲ２−ＭＭＨは、表４に示すように、３．３７ｎＭ〜５．１５ｎＭの範囲のＫＤ値で本発明の全ての抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性抗体に結合した。ｈＨＥＲ２−ＭＭＨは、４．１１ｎＭ及び５．２０ｎＭというＫＤ値で全ての抗ＨＥＲ２親抗体に結合した。抗ＡＰＬＰ２親抗体はいずれもｈＨＥＲ２−ＭＭＨへの結合を示さなかった。３７℃で、表５Ａに示すように、ｈＡＰＬＰ２−ＭＭＨは、１４５ｎＭ〜９７６ｎＭの範囲のＫＤ値で、本発明の全ての抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性抗体に結合した。ｈＡＰＬＰ２−ＭＭＨは、１４５ｎＭ〜８９９ｎＭの範囲のＫＤ値で全ての抗ＡＰＬＰ２親抗体に結合した。抗ＨＥＲ２親抗体はいずれもｈＡＰＬＰ２ＭＭＨへの結合を示さなかった。２５℃で、表５Ｂに示すように、ｈＡＰＬＰ２−ＭＭＨは、８．５ｎＭ〜１７．２ｎＭの範囲のＫＤ値で、本発明の全ての抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性抗体に結合した。ｈＡＰＬＰ２−ＭＭＨは、１１．２ｎＭ〜２１．７ｎＭの範囲のＫＤ値で全ての抗ＡＰＬＰ２親抗体に結合した。
【表４−１】
2021523100.tif 000084
【表４−２】
2021523100.tif 000085
【表５Ａ】
2021523100.tif 000086
２つの二重特異性抗体（Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ及びＨ４Ｈ２５０１９Ｄ）は、１００〜２００ｎＭの範囲内で低い親和性でＡＰＬＰ２に結合するが、ＨＥＲ２へのそれらの抗体の結合親和性は、１０ｎＭ未満（それぞれ４．２１及び５．１５ｎＭ）であることに注意のこと。２つの二重特異性抗体（Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ及びＨ４Ｈ２５０１７Ｄ）は、２００〜３００ｎＭの範囲内で適度に低い親和性でＡＰＬＰ２に結合するが、ＨＥＲ２へのそれらの抗体の結合親和性は、１０ｎＭ未満、さらには５ｎＭ未満（それぞれ３．３７及び４．８５ｎＭ）である。最後に、２つの二重特異性抗体（Ｈ４Ｈ２５０２０Ｄ及びＨ４Ｈ２５０２１Ｄ）は、８００ｎＭ〜１μＭの範囲内でＡＰＬＰ２に対して非常に低い結合親和性を示し、１０ｎＭ未満（それぞれ４．２０及び５．１５ｎＭ）でやはりＨＥＲ２に対して強い結合親和性を示す。表４及び表５の両方を参照のこと。
【表５Ｂ】
2021523100.tif 000087
【０３５０】
実施例４：がん細胞株及び正常な初代培養物におけるＨＥＲ２及びＡＰＬＰ２の相対的発現
１１個のがん細胞株［ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−１３２）、Ｔ４７Ｄ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−１３３）、トランスジェニックＨＥＲ２及びＣａｓ９を過剰発現するＴ７Ｄ、ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−２２）、ＪＩＭＴ−１（ＤＳＭＺ、カタログ番号ＡＣＣ５８９）、ＢＴ４８３（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−１２１）、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−２７）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−２６）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−１３１）、ＳＫ−ＢＲ３（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−３０）、及びＮＣＩ−Ｎ８７（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ５８２２）、ならびに二つ（２）の正常な初代培養物［正常な肺上皮（ＮＬＥ。ＡＴＣＣ、カタログ番号ＰＣＳ−３００−０１０）及び正常な乳房上皮（ＮＢＥ。ＡＴＣＣ、カタログ番号ＰＣＳ−６００−０１０）］におけるＨＥＲ２及びＡＰＬＰ２の相対的発現を決定するために、ウエスタンブロット分析を行った。分析のために、細胞を、６ウェルの細胞培養プレートに１×１０６細胞／ウェルで、表６の各細胞株／培養について説明されている、それらの適切な培地にプレートし、５％ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートした。
【表６】
2021523100.tif 000088
【０３５１】
インキュベーション後、細胞を培養培地中のＤＰＢＳ（ＤＰＢＳ／ＣＭ）で１回洗浄し、そして氷上に置いた。続いて、ＤＰＢＳ／ＣＭを、１５０ｕＬの溶解緩衝液［１３ｍＬの１ｘＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号ＢＰ−１１６）、２００ｕＬプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１８６１２８０）、５ｍＬの４ｘＬａｅｍｍｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００７）、及び２ｍＬの１０ｘ還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００９）からなる］で置き換えた。続いて細胞をこすり取り、次に試料を、１つの穴／ウェルを備えたフィルムで覆われた、深さ１．２ｍＬの９６ウェルプレートに移した。そのプレートを５０％のパワーで１０回（毎回１秒）超音波処理した。超音波処理後、そのプレートを８０℃の水浴中で１０分間煮沸した。その後、試料を凍結した。その後、試料を解凍し、各試料２０ｕＬを、くさび型４〜１２％ＴＲＩＳ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＸＰ０４１２５ＢＯＸ）にロードし、１５０Ｖで１〜１．５時間泳動した。次に、そのゲルをｉＢｌｏｔ２ドライブロッティングシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＩＢ２１００１）を使用してＰＶＤＦメンブレン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＩＢ２４００１）に転写した。次に、そのメンブレンを、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２８３７６）中の５％ミルク（ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号１７０−６４０４）で、室温で１〜３時間、ブロックした。ＴＢＳ中に２．５％ミルク及び０．１％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８０７４）を含む溶液中の一次抗体［ウサギ抗ＨＥＲ２抗体（Ｄａｋｏ、カタログ番号Ａ０４８５２９）またはマウス抗ＡＰＬＰ２抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＡＢＮ７８２）］を、次に、メンブレンに添加し、４℃で一晩インキュベートした。次に、そのメンブレンを室温で５分間、ＴＢＳで３回洗浄した。その後、ＴＢＳ中に２．５％のミルク及び０．１％のＴｗｅｅｎを含む溶液中で、抗ウサギＨＲＰ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｗ４０１Ｂ）または抗マウスＨＲＰ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｗ４０２Ｂ）のいずれか、及び抗アクチン−ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−４７７７９）を一緒に、次いで、このメンブレンに添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、このメンブレンを、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＴＢＳで、室温で５分間２回洗浄し、次にＴＢＳを用いて室温で５分間さらに２回洗浄した。次に、ＥＣＬ検出試薬（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＲＰＮ２１０６）を使用してブロットを発色させ、Ａｚｕｒｅ  Ｃ３００イメージャーで画像化した。バンドの定量化（平均蛍光強度からバックグラウンドを引いたもの）は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実行した。定量化のために、ＨＥＲ２／アクチン及びＡＰＬＰ２／アクチンの比率を決定し、その後、最高値に正規化し、これは、ＨＥＲ２／アクチンの場合はＳＫ−ＢＲ−３、及びＡＰＬＰ２／アクチンの場合はＪＩＭＴ−１であった。（図１を参照のこと。）
【０３５２】
１１個のがん細胞株及び２つの正常な初代培養物におけるアクチンレベルと比較したＨＥＲ２及びＡＰＬＰ２発現レベルを表７に示す。
【表７】
2021523100.tif 000089
【０３５３】
実施例５：ＨＥＲ２発現細胞への二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体の結合は、抗ＨＥＲ２アームによって媒介され、それに依存する
本明細書に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２分子が様々なレベルのＨＥＲ２を発現する細胞株に結合する能力を試験するために、ハイコンテントイメージングアッセイを実施した。このアッセイには、８つのがん細胞株［ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１３２）、Ｔ４７Ｄ（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１３３）、ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−２２）、ＪＩＭＴ−１（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ５８９）、ＢＴ−４８３（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１２１）、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−２７）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１３１）、及びＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−３０）］及び２つの正常な初代培養物［正常な肺上皮（ＮＬＥ。ＡＴＣＣ（登録商標）、カタログ番号ＰＣＳ−３００−０１０）及び正常な乳房上皮（Ｎｏｒｍａｌ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）（ＮＢＥ。ＡＴＣＣ（登録商標）、カタログ番号ＰＣＳ−６００−０１０）］を使用した。細胞を、コラーゲンでコーティングされた、ブラックウォールの９６ウェル光学プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５５９３６）に、それらの適切な培養培地中で１ウェルあたり２．５×１０５細胞でプレートし、これは、表６の各細胞株／培養で説明されており、５％ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートした。
【０３５４】
翌日、細胞を、４℃で５０μＬのＤＭＥＭ中で、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ６４７標識（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号Ａ３７５７３）二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２分子（Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０２０Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１７Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１９Ｄ、及びＨ４Ｈ２５０２１Ｄ）と共に１時間インキュベートした。その後、細胞を冷ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで２回洗浄した。冷ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに対して、ＤＰＢＳ／ＣＭ中の８％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１５７１０）＋０．１５％サポニン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ４５２１）＋２０ｕｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ、＃Ｈ３５６９）で構成される１００μＬの溶液を添加し、室温で２０分間インキュベートして、細胞を固定して透過処理し、一方で細胞の核を染色した。その後、その溶液を、ＤＰＢＳ／ＣＭに置き換えた。Ｉｍａｇｅ  ＸｐｒｅｓｓＭｉｃｒｏ自動顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、各細胞タイプへの二重特異性抗体の結合を測定した。蛍光標識されたＡＰＬＰ２ｘＨＥＲ２二重特異性抗体の細胞への結合（表８）は、実施例４で決定されたＨＥＲ２発現レベルに正比例した。（図２もまた参照のこと。）
【表８−１】
2021523100.tif 000090
【表８−２】
2021523100.tif 000091
【表８−３】
2021523100.tif 000092
【０３５５】
ＨＥＲ２及びＡＰＬＰ２の両方を発現する細胞への本明細書に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質の各アームの結合の寄与を試験するために、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−２７）乳癌細胞株を使用して競合結合アッセイを実施した。このアッセイでは、細胞を、コラーゲンコーティングされたブラックウェルの９６ウェル光学プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５５９３６）に、適切な培養培地（前の例で説明）で１ウェルあたり２．５×１０５細胞でプレートし、５％ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートした。翌日、その細胞を４℃で３０分間冷蔵した。６７μＭのＡｌｅｘａ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号Ａ３７５７３）で標識された二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体（Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０２０Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１７Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１９Ｄ、またはＨ４Ｈ２５０２１Ｄ）の溶液、または１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中の抗体なし（ブランク）を４℃で準備した。各抗体溶液に対して、ＰＢＳのみ、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグ（ｈＨＥＲ２−ＭＭＨ、配列番号５３）のみで発現したヒトＨＥＲ２細胞外ドメイン、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグ（ｈＡＰＬＰ２−ＭＭＨ、配列番号５４）のみで発現したヒトＡＰＬＰ２細胞外ドメイン、またはｈＨＥＲ２−ＭＭＨとｈＡＰＬＰ２−ＭＭＨの組み合わせを、３３３ｍＭの濃度で添加した。インキュベーション及び培地を除去した後、５０μＬ／ウェルの二重特異性抗体、及び可溶性タンパク質溶液を、４℃で３０分間細胞に添加した。続いて、細胞を、１０％ＦＢＳを含む１５０μＬ／ウェルのＤＭＥＭで、４℃で１０分間洗浄した。この洗浄後、５０μＬの固定緩衝液［培養培地に９ｍＬのＰＢＳ（ＰＢＳ／ＣＭ）、３ｍＬの１６％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１５７１０）及び１０μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ（最終濃度）、（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ、カタログ番号Ｈ３５６９）を含む］を各ウェルに加え、室温で２０分間インキュベートした。次に、固定緩衝液を除去し、１００ｕＬのＤＰＢＳ／ＣＭを添加し、画像を取得する前に室温で約２０分間インキュベートさせた。Ｉｍａｇｅ  ＸｐｒｅｓｓＭｉｃｒｏ自動顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、各細胞タイプへの二重特異性抗体の結合を測定した。取得したデータは、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して分析した。二重特異性抗体の結合シグナルは、二重特異性抗体が存在しない場合（ブランクと呼ばれる）に得られたシグナルに対して正規化した。
【０３５６】
可溶性ｈＨＥＲ２−ＭＭＨの存在は、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１乳癌細胞への試験された各二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体の結合を有意に阻害したが、そのような効果は、可溶性ｈＡＰＬＰ２−ＭＭＨでは見られなかった。（以下の表９及び図３も参照のこと）。
【表９−１】
2021523100.tif 000093
【表９−２】
2021523100.tif 000094
【０３５７】
これらのデータは、本明細書に記載の二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体の結合が、抗ＡＰＬＰ２アームではなく、抗ＨＥＲ２アームによって主に媒介されることを示している。したがって、ＡＰＬＰ２へのより低い結合を含む記載された特性を有する二重特異性抗原結合分子は、ＡＰＬＰ２及びＨＥＲ２の両方を発現する細胞に特異的に結合するが、ＡＰＬＰ２のみを発現する細胞への結合を減少させることが期待される。
【０３５８】
実施例６：ＨＥＲ２ではなくＡＰＬＰ２が急速に内部移行され、分解される
ＡＰＬＰ２及びＨＥＲ２抗体が、Ｔ４７Ｄ細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１３３）に内部移行する能力を、表６に従って培地中で培養したＴ４７Ｄ細胞で試験した。Ｔ４７Ｄ細胞を、コラーゲンコーティングした９６ウェル光学プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５５９３６）に、培地中５０，０００細胞／ウェルでプレートし、５％ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を１ｍｇ／ｍｌフルオレセイン標識デキストランと共に、３７℃で６０分間インキュベートした。ＣＦ５９４標識抗ＡＰＬＰ２（Ｒ＆Ｄ  ＭＡＢ４９４５１）または抗ＨＥＲ２（ＨＥＲ２／Ｔ対照）抗体を、デキストランと共に６７ｎＭで、５、１０、２０、３０、４５、または６０分間インキュベートし、その後、細胞を１回洗浄し、温かい（３７℃）培地で１０分間インキュベートした。その後、細胞をＤＰＢＳ＋カルシウム／マグネシウム（ＣＭ）中の４％ＰＦＡで、室温で１０分間固定し、ＤＰＢＳ／ＣＭで２回洗浄した。
【０３５９】
取得は、ＬＳＭ７８０  Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡を用いて実施した。取得した画像は、Ｚｅｉｓｓ  Ｚｅｎソフトウェアを使用して分析した。内部移行された抗体のリソソームへの輸送は、共焦点スタック内の蛍光デキストランピクセルと抗体ピクセルの共局在化によって定量化した。その抗体がリソソームと共局在するまでの時間（分）を表１０に示す。
【表１０−１】
2021523100.tif 000095
【表１０−２】
2021523100.tif 000096
【０３６０】
さらに、ＡＰＬＰ２及びＨＥＲ２の分解速度を、Ｔ４７Ｄ細胞で試験した。アッセイでは、Ｔ４７Ｄ細胞を、６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３５１６）に１０６細胞／ウェルでプレートした。この細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ＦＢＳ＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１０ｍＭのＨＥＰＥＳ＋１０ｕｇ／ｍＬのインスリン＋５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンからなる培地中で、５％ＣＯ２中３７℃で一晩増殖させた。翌日、細胞を５０ｕｇ／ｍｌシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ＃Ｃ４８５９−１ＭＬ）で０、０．５、１．５、２．５、３．５、４．５、及び５．５時間処理した。インキュベーション後、細胞を、１ｍｌのＤＰＢＳ／ＣＭで１回洗浄し、続いて氷上に置き、次にＤＰＢＳ／ＣＭを、８００ｕＬの溶解緩衝液［１ｘＲＩＰＡ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号ＢＰ−１１６）＋プロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、１８６１２８０）で置き換え、細胞をこすり取り、溶解物を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。その後、その試料を２５パルスで超音波処理し、各パルスは５０％のパワーで１秒である。その後、試料を−２０℃で凍結した。その後、試料を解凍し、各試料の５２ｕｌを、２０ｕｌ  ４ｘＬａｅｍｍｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＰ０００７）＋８ｕＬ  １０ｘ還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００９）］と混合した。試料を９５℃で１０分間煮沸し、１４０００ＲＰＭで、１０分間室温で遠心分離した。各試料４０ｕＬを、３つのウェッジ４−２０％ＴＲＩＳ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＸＰ０４１２５ＢＯＸ）にロードし、１５０Ｖで泳動した。次に、ゲルを、ｉＢｌｏｔ２ドライブロッティングシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＩＢ２１００１）を備えた２つのＰＶＤＦメンブレン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＩＢ２４００１）に転写した。次に、メンブレンを、ＴＢＳ中の５％ミルク（ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号１７０−６４０４）で、室温で３時間ブロックした。一次抗体、ウサギ抗ＨＥＲ２抗体（Ｄａｋｏ、カタログ番号Ａ０４８５２９）またはウサギ抗ＡＰＬＰ２抗体（ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１４０６２４）が含有される２．５％ミルク＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８０７４）を含む、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２８３７６）を、次いでメンブレンに添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、そのメンブレンを室温で５分間、ＴＢＳで３回洗浄した。その後、抗ウサギＨＲＰ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｗ４０１１）及び抗アクチン−ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−４７７７９）が含有される２．５％ミルク＋０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＴＢＳを、メンブレンに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、そのメンブレンをＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎで、室温で５分間２回洗浄し、次に室温で５分間、ＴＢＳを用いてさらに２回洗浄した。次いで、ＥＣＬ検出試薬（ＧＥヘルスケア、カタログ番号ＲＰＮ２１０６）を使用してブロットを作成し、Ａｚｕｒｅ  Ｃ３００イメージャーで画像化した。バンドの定量化（平均蛍光強度からバッ���グラウンドを引いたもの）は、ＩｍａｇｅＪを使用して実行した。表１１は、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）処理後のＨＥＲ２、ＡＰＬＰ、またはＴ４７Ｄ細胞を、ＣＨＸ接触のない細胞に正規化してまとめたものである。
【表１１】
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【０３６１】
表１０に示されるように、ＡＰＬＰ２のリソソーム輸送は、ＨＥＲ２のそれよりも有意に速かった。表１１に示すように、ＡＰＬＰ２は急速な代謝回転を受けたが、ＨＥＲ２はそうではなかった。シクロヘキシミド処理は、５．５時間後に２２％のＨＥＲ２分解のみを誘発したが、９４％のＡＰＬＰ２分解が同じ時間で見られた。ＡＰＬＰ２の８８％は、わずか１．５時間で分解した（図４も参照のこと）。
【０３６２】
実施例７：二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体の結合後の細胞表面発現ＨＥＲ２の分解
ＨＥＲ２を分解する二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質または適切な結合タンパク質対照の能力を、表７に列挙された乳腺腫瘍細胞株と比較してより低いレベルのＨＥＲ２を発現するＴ４７Ｄ細胞で試験した。このアッセイのために、Ｔ４７Ｄ細胞を、コラーゲンコーティングされた９６ウェル光学プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５５９３６）に２５，０００細胞／ウェルでプレートした。この細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ＦＢＳ＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋１０ｕｇ／ｍＬインスリン＋５ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンからなる培地中で、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。翌日、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質（Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１９Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０２０Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１７Ｄ、及びＨ４Ｈ２５０２１Ｄ）、単一特異性抗ＨＥＲ２結合タンパク質（ＨＥＲ２／Ｔ対照及びＨ４Ｈ１３０５５Ｐ）またはアイソタイプ対照結合タンパク質を、１０μｇ／ｍＬの最終濃度で細胞に添加した。結合タンパク質を、細胞上で、５％ＣＯ２中３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を氷上でカルシウム及びマグネシウムを含むＤＰＢＳの溶液（ＤＰＢＳ／ＣＭ）１００μＬで１回洗浄し、その後、ＤＰＢＳ／ＣＭ溶液を、溶解緩衝液８０μＬ［６５００ｕＬ  １ｘ  ＲＩＰＡ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号ＢＰ−１１６）、６５ｕＬプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、１８６１２８０）、２５００ｕＬの４ｘＬａｅｍｍｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＰ０００７）及び１０００μＬ  １０ｘ還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００９）］で置き換えた。バッファーを加えた後、プレートをオービタルプレートシェーカー（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ＳＩ  ０４０１）で中速（約１２５０ＲＰＭ）、４℃で３０分間、インキュベートした。その後、試料を−２０℃で凍結した。その後、試料を解凍し、４０００ＲＰＭで、４℃で１０分間遠心分離した後、ＰＣＲプレートに移し、サーモサイクラーで、８５℃で１０分間煮沸した。次いで、その試料を４０００ＲＰＭで１０秒間、４℃で遠心分離した。各試料４０μＬを、くさび型４〜１２％ＴＲＩＳ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＸＰ０４１２５ＢＯＸ）にロードし、１５０Ｖで泳動した。次いで、そのゲルを、ｉＢｌｏｔ２ドライブロッティングシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＩＢ２１００１）を使用してＰＶＤＦメンブレン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＩＢ２４００１）に転写した。次いで、ＴＲＩＳ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２８３７６）中の５％ミルク（ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号１７０−６４０４）で、室温で１〜３時間、そのメンブレンをブロックした。メンブレンは、２．５％ミルク＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８０７４）を含むＴＢＳ中で、一次ウサギ抗ＨＥＲ２抗体（Ｄａｋｏ、カタログ番号Ａ０４８５２９）と共に４℃で一晩インキュベートした。続いて、そのメンブレンを室温で５分間、ＴＢＳで３回洗浄した。��の後、抗ウサギＨＲＰ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｗ４０１Ｂ）及び抗アクチン−ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−４７７７９）が含有される２．５％ミルク＋０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＴＢＳを、このメンブレンに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、そのメンブレンをＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎで、室温で５分間２回洗浄し、次にＴＢＳを用いて室温で５分間さらに２回洗浄した。次いで、ＥＣＬ検出試薬（ＧＥヘルスケア、カタログ番号ＲＰＮ２１０６）を使用してブロットを発色させ、Ａｚｕｒｅ  Ｃ３００イメージャーで画像化した。バンドの定量化（平均蛍光強度からバックグラウンドを引いたもの）は、ＩｍａｇｅＪを使用して実行した。
【０３６３】
表１２に示されるように、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質（Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１９Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０２０Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１７Ｄ、及びＨ４Ｈ２５０２１Ｄ）は、ＨＥＲ２分解を誘導し、ＨＥＲ２発現の約１２％〜３８％がＴ４７Ｄ細胞に残った。対照的に、単一特異性抗ＨＥＲ２抗体、ＨＥＲ２／Ｔ対照及びＨ４Ｈ１３０５５Ｐ（試験抗体Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０２０Ｄ、及びＨ４Ｈ２５０２１Ｄの抗ＨＥＲ２結合アームが由来）は、ＨＥＲ２分解を誘導し、それぞれ、ＨＥＲ２発現の約７３％及び９０％がＴ４７Ｄ細胞に残っていた。アイソタイプ対照はＨＥＲ２分解を誘発しなかった。図５も参照のこと。
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【０３６４】
最も注目すべきことに、Ｈ４ｘＨ２１３８７Ｐ２  ＡＰＬＰ２アームを含み、１００〜２００ｎＭのＡＰＬＰ２への結合親和性を有する、２つの抗ＡＰＬＰ２ｘＨＥＲ２二重特異性抗体、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ及びＨ４Ｈ２５０１９Ｄは、他の二重特異性抗体と比較して、Ｔ４７Ｄ細胞において最も効率的にＨＥＲ２分解を誘導し、細胞は２０％未満の残りのＨＥＲ２発現を示す。単一特異性抗体（ＨＥＲ２／Ｔ及びＨ４Ｈ１３０５５Ｐ親抗体）によるＨＥＲ２分解は、二重特異性抗体Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ及びＨ４Ｈ２５０１９Ｄよりも５０％超効率が低かった。
【０３６５】
実施例８：ＡＰＬＰ２に対するＡＰＬＰ２アームの親和性は、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体内部移行の効率を調節する
ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞単層またはＭＤＡ−ＭＢ−３６１腫瘍スフェロイドに内部移行する二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体のサブセットの能力を試験した。アッセイでは、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−２７）を、それぞれコラーゲンコーティングした９６ウェル光学プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５５９３６）に、２５，０００細胞／ウェルで、またはＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）９６Ｗｅｌｌ  Ｂｌａｃｋ  Ｃｌｅａｒ  Ｒｏｕｎｄ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｓｐｈｅｒｏｉｄ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃４５２０）に、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで１，０００細胞／ウェルで、プレートして、５％ＣＯ２中３７℃で一晩（細胞の場合）または３日間（腫瘍スフェロイドの場合）インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、冷（４℃）培地で３０分間インキュベートし、スフェロイドを温かい（３７℃）培地で３時間インキュベートし、各培地には１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号Ａ３７５７３）標識された抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質（Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１８ＤまたはＨ４Ｈ２５０２０Ｄ）が含まれている。その後、細胞を冷（４℃）培地で１回または２回洗浄した。
【０３６６】
洗浄後、細胞を室温の基本上皮培地（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＰＣＳ−６００−０３０）に入れ、次いで、ライブ画像取得を、Ｚｅｉｓｓ  Ｓｐｉｎｎｉｎｇ  Ｄｉｓｃ共焦点顕微鏡で１〜２分後に開始した。スフェロイドは、４％ＰＦＡ＋０．０７５％サポニン＋１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔで固定し、その後ＤＰＢＳで洗浄した。スフェロイドの中心からの共焦点画像は、Ｚｅｉｓｓ  Ｓｐｉｎｎｉｎｇ  Ｄｉｓｃ共焦点顕微鏡で取得した。取得した画像は、Ｚｅｉｓｓ  Ｚｅｎソフトウェアを使用して分析した。ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞に内部移行された二重特異性の量は、任意の単位で表しており、１分あたりで表１３に示している。
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【０３６７】
表１３に示されるように、同じＨＥＲ２アーム及び異なるＡＰＬＰ２アームを含む３つの二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体は、細胞によって内部移行され、腫瘍スフェロイドの中心に浸透した。図６を参照のこと。Ｈ４ｘＨ２１３８７Ｐ２  ＡＰＬＰ２アームを含むＨ４Ｈ２５０１８Ｄは、細胞内小胞の数の増大（矢印）の存在によって証明された、最速の内部移行率（表１３）及びＨ４Ｈ２４０２０Ｄよりも効率的な内部移行を示した。図６（下部パネル）を参照のこと。理論に拘束されることを望まないが、このデータは、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質の内部移行が、ＡＰＬＰ２アームの内部移行反応速度論、及び二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質がＨＥＲ２アームを使用して細胞表面に結合し、その後ＡＰＬＰ２アームを使用して内部移行される作用機序に依存し得ることを示唆している。
【０３６８】
実施例９：薬物コンジュゲート抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質の生成及び特徴付け
薬物コンジュゲーションの２つの方法を使用した。第１の方法では、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ８．０、及び１０〜１５％（ｖ／ｖ）ＤＭＡ中の抗体（１０〜２０ｍｇ／ｍＬ）を、５〜６倍過剰のＳＭＣＣ−ＤＭ１または（化合物Ｉ、）とリジンを介して、周囲温度で２時間、コンジュゲートさせた。（２０１７年１１月１５日に出願されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６１７５７のように、本明細書に記載の抗体または二重特異性抗原結合タンパク質を、式Ｂを有する化合物と接触させることを含むプロセスも参照のこと。）第２の方法では、抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）含有の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５を、３７℃で、３０分間、１ｍＭジチオスレイトールで処理した。ゲル濾過（Ｇ−２５、ｐＨ４．５酢酸ナトリウム）の後、マレイミドリンカーペイロード誘導体化合物ＩＩ（ＷＯ２０１６１６０６１５の化合物６０も参照）（１．２当量／ＳＨ基）ＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍｌ）を、還元抗体に添加し、その混合物を１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を使用してｐＨ７．０に調整して、還元された鎖間システインにコンジュゲートさせた。
【０３６９】
各コンジュゲートは、サイズ排除クロマトグラフィーまたは広範な限外濾過によって精製し、次いで滅菌濾過した。タンパク質濃度は、ＵＶスペクトル分析によって決定した。サイズ排除ＨＰＬＣにより、使用した全てのコンジュゲートが９５％を超えて単量体であることが確認された。全てのコンジュゲート抗体は、Ｈａｍｂｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００４  Ｏｃｔ  １５；１０（２０）：７０６３−７０）に従うリンカーペイロード負荷値（薬物対抗体比、ＤＡＲ値）についてＵＶによって、及び／または天然対コンジュゲートの質量差を使用した質量分析によって、分析した。その結果は、表１４にまとめられている。
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【０３７０】
コンジュゲーションの第１の方法のための抗体へのリンカーペイロードの負荷を決定するために、コンジュゲートを、脱グリコシル化し、ＬＣ−ＭＳによって分析した。簡単に説明すると、５０μｇのコンジュゲートを、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で最終濃度１ｍｇ／ｍＬに希釈した。１０μＬのＰＮＧａｓｅＦ溶液［ＰＮＧａｓｅＦ溶液は、１５０μＬのＰＮＧａｓｅ  Ｆストック（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｐ０７０４Ｌ）及び８５０μＬのｍｉｌｌｉ−Ｑ水を加えることによって調製し、よく混合した］を希釈したコンジュゲート溶液に加え、次いで３７℃で一晩インキュベートした。各試料５μＬをＬＣ−ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｎａｔ  Ｇ２−Ｓｉ）に注入し、０．１ｍＬ／分の勾配移動相２０〜４０％で２５分かけて溶出した（移動相Ａ：０．１％ｖ／ｖギ酸含有Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ｖ／ｖギ酸含有アセトニトリル）。ＬＣ分離は、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  Ｃ４カラム（１．０  Ｘ  ５０ｍＭ、１．７μＭ）で、８０℃で達成した。Ｍａｓｓｌｙｎｘソフトウェアを使用して質量分析スペクトルをデコンボリューションし、次の式を使用して薬物対抗体比（ＤＡＲ）を計算した。
【０３７１】
分布ピークの完全性（ＰＩ）による薬物（Ｄｎ）の相対パーセント（％）：
Ｄｎ％＝ＰＩｎ／Σ（ＰＩ０＋ＰＩ１＋ＰＩ２．．．．．．．＋ＰＩｉ）×１００（ｎ＝０，１，２，３，…，ｉ）
【０３７２】
平均ＤＡＲ計算：
ＤＡＲ＝Σ（１×Ｄ１％＋２×Ｄ２％＋３×Ｄ３％＋．．．．．．＋ｉ×Ｄｉ％）
【０３７３】
コンジュゲーションの第２の方法のための抗体へのリンカーペイロードの負荷を決定するために、コンジュゲートを脱グリコシル化し、還元し、そしてＬＣ−ＭＳによって分析した。簡単に説明すると、５０μｇのコンジュゲートを、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて最終濃度１ｍｇ／ｍＬに希釈した。１０μＬのＰＮＧａｓｅＦ溶液［ＰＮＧａｓｅＦ溶液は、１５０μＬのＰＮＧａｓｅ  Ｆストック（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｐ０７０４Ｌ）及び８５０μＬのｍｉｌｌｉ−Ｑ水を加えることによって調製し、よく混合した］を、希釈したコンジュゲート溶液に加え、次いで３７℃で一晩インキュベートした。得られた材料が、最終ＴＣＥＰ濃度が２０ｍＭになるように、２．４μＬの０．５ＭのＴＣＥＰを試料に添加し、次いで、これを５０℃で３０分間インキュベートした。各試料１０μＬを、ＬＣ−ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｎａｔ  Ｇ２−Ｓｉ）に注入し、０．１ｍＬ／分の勾配移動相２０〜４０％を使って、２５分かけて溶出した（移動相Ａ：０．１％ｖ／ｖのギ酸含有Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ｖ／ｖのギ酸含有アセトニトリル）。ＬＣ分離は、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  Ｃ４カラム（１．０  Ｘ  ５０ｍＭ、１．７μＭ）で、８０℃で達成された。
【０３７４】
質量分析スペクトルを、デコンボリューションして、リンカーペイロード値＝０及び１の軽鎖（Ｌ）、ならびにリンカーペイロード値＝０、１、２及び３の重鎖（Ｈ）によって表される軽鎖及び重鎖のピークを同定した。各種の強度値から、ホモダイマーまたはヘテロダイマー抗体コンジュゲートについて以下の式を使用して、薬物対抗体比（ＤＡＲ）を計算した。デコンボリューションされた各ピークの強度を計算に使用した。
【化７８】
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【０３７５】
実施例１０：ＳＭＣＣ−ＤＭ１、化合物Ｉコンジュゲート、または化合物ＩＩコンジュゲート抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質のインビトロの細胞毒性
ＳＭＣＣ−ＤＭ１、化合物Ｉまたは化合物ＩＩ毒素のいずれかとコンジュゲートした二重特異性ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のＩＣ５０を比較するために、インビトロ細胞毒性アッセイを実施した。このアッセイは、ＡＤＣ濃度を下げて６日間処理したＪＩＭＴ−１細胞で実施し、処理後に核を数えることで細胞生存率を測定した。アッセイでは、ＪＩＭＴ−１（ＤＳＭＺ、カタログ番号ＡＣＣ５８９）を、コラーゲンコーティングされた９６ウェル光学プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５５９３６）に３×１０３細胞／ウェルで播種し、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、及び１０ｕｇ／ｍＬインスリンを含む培地中で一晩、５％ＣＯ２中３７℃で増殖させた。翌日、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２  ＡＤＣ（Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、Ｈ４Ｈ２５０１９Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−化合物Ｉ、Ｈ４Ｈ２５０１９Ｄ−化合物Ｉ、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−化合物ＩＩ、Ｈ４Ｈ２５０１９Ｄ−化合物ＩＩ）またはＳＭＣＣ−ＤＭ１、化合物Ｉ、もしくは化合物ＩＩのいずれかとコンジュゲートした非結合対照抗体のいずれかを、ＤＭＥＭ及び１０％ＦＢＳ中で、６６．６７ｎＭ〜０．０１ｎＭの範囲の最終濃度で細胞に添加し、次いで、６日間インキュベートした。インキュベーション後、１１０ｕＬの核染色液［０．１５％サポニン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ４５２１）及び２０ｕｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ、カタログ番号Ｈ３５６９）を含む８％パラホルムアルデヒド５０ｍＬ］を各ウェルに加え、室温で１５〜２５分間インキュベートした。続いて、培地及び染色剤を除去し、カルシウム及びマグネシウムを含むＤＰＢＳ（ＤＰＢＳ／ＣＭ）を使用して、このウェルを１回洗浄した。洗浄後、ウェルを、ＤＰＢＳ／ＣＭに入れた。次いで、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓＭｉｃｒｏ自動顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で１０倍の対物レンズを使用して、１ウェルあたり９つの視野を画像化した。ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、取得した画像から核を定量化した。ＩＣ５０値は、１０ポイントの応答曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）での２相減衰方程式から決定された。全てのＩＣ５０値はｎＭ濃度で表される。
【表１５】
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【０３７６】
表１５に示されるように、ＤＭ１とコンジュゲートした二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質（Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及びＨ４Ｈ２５０１９Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）は両方とも、それぞれ０．０７ｎＭ及び０．１３ｎＭのＩＣ５０値で殺滅を示した。化合物Ｉまたは化合物ＩＩのいずれかとコンジュゲートされたＨ４Ｈ２５０１８Ｄ及びＨ４Ｈ２５０１９Ｄは、それぞれのＤＭ１コンジュゲートと匹敵するＩＣ５０値を示した。ＳＭＣＣ−ＤＭ１、化合物Ｉ、または化合物ＩＩのいずれかとコンジュゲートした非結合対照抗体は、効率の低い殺滅を示し、ＩＣ５０値は１５〜＞６７ｎＭの範囲であった。
【０３７７】
実施例１１：二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２  ＡＤＣは、単一特異性抗ＨＥＲ２抗体と比較して、ＨＥＲ２発現細胞に対してより大きな標的細胞毒性を示す。
実験１
バイオアッセイ細胞を殺滅する本発明のＨＥＲ２×ＡＰＬＰ２二重特異性抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の能力を試験するために、インビトロ細胞毒性アッセイを実施した。このアッセイは、ＡＤＣ濃度を下げて６日間処理した、様々なレベルのＨＥＲ２発現を伴う細胞で実施し、処理後に核を数えることで細胞生存率を測定した。アッセイには、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−２６）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−１３２）、ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−２２）、Ｔ４７Ｄ細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１３３）、ＪＩＭＴ−１（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ５８９）、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−２７）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−１３１）、またはＳＫＢＲ３（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−３０）のいずれかをコラーゲンでコーティングした９６ウェル光学プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５５９３６）に３×１０３細胞／ウェルで播種し、表６による培地中で３７℃、５％ＣＯ２中で一晩培養した。翌日、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２  ＡＤＣ（Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及びＨ４Ｈ２５０１９Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）、二重特異性抗ＦｅｌＤ１ｘＡＰＬＰ２  ＡＤＣ（Ｈ４Ｈ２８６９７Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）、ＨＥＲ２／Ｔ対照Ａｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、またはアイソタイプ対照−ＳＭＣＣ−ＤＭ１を、ＤＭＥＭ及び１０％ＦＢＳ中で６６．６７ｎＭ〜０．０１ｎＭの範囲の最終濃度で、細胞に添加し、次いで６日間インキュベートした。インキュベーション後、１１０ｕＬの核染色液［０．１５％サポニンを含む８％パラホルムアルデヒド５０ｍＬ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ４５２１）及び２０ｕｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｓｈｔ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ、カタログ番号Ｈ３５６９）］を各ウェルに加え、室温で１５〜２５分間インキュベートした。続いて、培地及び染色剤を除去し、カルシウム及びマグネシウムを含むＤＰＢＳ（ＤＰＢＳ／ＣＭ）を使用して、ウェルを１回洗浄した。洗浄後、そのウェルを、ＤＰＢＳ／ＣＭに入れた。次に、Ｉｍａｇｅ  ＸｐｒｅｓｓＭｉｃｒｏ自動顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で１０倍の対物レンズを使用して、１ウェルあたり９つの視野を画像化した。ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、取得した画像から核を定量化した。ＩＣ５０値は、１０ポイントの応答曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）での２相減衰方程式から決定された。全てのＩＣ５０値はｎＭ濃度で表される。そのデータは表１６Ａに要約されている。図７もまた参照のこと。
【表１６Ａ−１】
2021523100.tif 000108
【表１６Ａ−２】
2021523100.tif 000109
【０３７８】
表１６Ａ及び図７に示されるように、非常に低いＨＥＲ２レベルを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞において、抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質ＡＤＣ、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−ＤＭ１及びＨ４Ｈ２５０１９Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、ＩＣ５０値が５〜９ｎＭという殺滅を示した。同じ細胞で、ＨＥＲ２／Ｔ対照−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣは、１０〜２５ｎＭのＩＣ５０値で効率の低い殺滅を示した。アイソタイプ対照−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣは、１８〜３５ｎＭのＩＣ５０値で効率の低い殺滅を示した。
【０３７９】
低ＨＥＲ２レベルを発現するＭＣＦ−７及びＴ４７Ｄ細胞において、抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質ＡＤＣ二重特異性ＡＤＣ、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及びＨ４Ｈ２５０１９Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、２ｎＭのＩＣ５０値で殺滅を示した。同じ細胞で、ＨＥＲ２／Ｔ対照−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣは、１０〜４０ｎＭのＩＣ５０値で効率の低い殺滅を示した。アイソタイプ対照−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣは、３０〜５０ｎＭというＩＣ５０値で効率の低い殺滅を示した。
【０３８０】
中間ＨＥＲ２レベルを発現するＪＩＭＴ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞において、抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質ＡＤＣ、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及びＨ４Ｈ２５０１９Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、０．０３〜０．８ｎＭの間というＩＣ５０値での殺滅を示した。同じ細胞で、ＨＥＲ２／Ｔ対照−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣ及び抗ＦｅｌＤ１ｘＡＰＬＰ２  ＡＤＣ（Ｈ４Ｈ２８６９７Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）は、それぞれ０．２５〜５ｎＭ及び２〜５ｎＭというＩＣ５０値で効率の低い殺滅を示した。アイソタイプ対照−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣは、８〜３０ｎＭというＩＣ５０値で効率の低い殺滅を示した。
【０３８１】
高いＨＥＲ２レベルを発現するＳＫ−ＢＲ−３細胞において、抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質ＡＤＣ、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及びＨ４Ｈ２５０１９Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は両方とも、それぞれ０．０２ｎＭ及び０．０３ｎＭというＩＣ５０値で殺滅を示した。同じ細胞で、ＨＥＲ２／Ｔ対照−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣは、０．１ｎＭというＩＣ５０値で効率の低い殺滅を示した。アイソタイプ対照−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣは、１０ｎＭのＩＣ５０値で効率の低い殺滅を示した。
【０３８２】
抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質ＡＤＣ、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及びＨ４Ｈ２５０１９Ｄ  ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、試験された全ての細胞株において、ＨＥＲ２対照Ａｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣよりも強力な細胞殺滅を誘導した。抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質ＡＤＣは、非常に低いＨＥＲ２レベルを発現する細胞を殺滅するのに、より高いＨＥＲ２レベルの細胞を殺滅するほど効率的ではなかった。二重特異性抗ＦＥＬＤ１ｘＡＰＬＰ２結合タンパク質は、中間のＨＥＲ２レベルを発現する細胞株の殺滅をほとんど誘発せず、ＡＰＬＰ２アームだけでは効率的な細胞殺滅を駆動するのに十分ではなかったことが示されている。
【０３８３】
実験２
異なるＡＰＬＰ２アームからなる本発明のＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）がバイオアッセイ細胞を殺滅する能力を試験するために、インビトロ細胞毒性アッセイを実施した。このアッセイは、ＡＤＣ濃度を下げて６日間処理した様々なレベルのＨＥＲ２発現を伴う細胞で実施し、その細胞生存率を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏｗ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ７５７１）でＡＴＰ産生を測定することにより処理後に測定した。
【０３８４】
アッセイについては、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−２６）、ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−２２）、Ｔ４７Ｄ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−１３３）、ＺＲ７５−１（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ１５００）、ＪＩＭＴ１（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ５８９）、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−２７）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−１３１）、ＳＫＢＲ３（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−３０）またはＮ８７（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ５８２２）を、コラーゲンでコーティングされた９６ウェル光学プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５５９３６）に３×１０３個の細胞／ウェルで播種した。
【０３８５】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を、ＤＭＥＭ及び１０％ＦＢＳを含む培地で培養した。ＭＣＦ−７は、ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、及び１０ｕｇ／ｍＬインスリンを含む培地中で培養した。Ｔ４７Ｄ細胞は、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び１０ｕｇ／ｍＬインスリンを含む培地中で培養した。ＳＫＢＲ３は、１０％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙを含む培養培地であった。ＺＲ７５−１及びＮ８７は、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳを含む培地中で培養した。ＪＩＭＴ１細胞は、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、及び１０ｕｇ／ｍＬのインスリンを含む培地中で培養した。
【０３８６】
翌日、ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性ＡＤＣ（Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ−ＤＭ１、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−ＤＭ１及びＨ４Ｈ２５０２０Ｄ−ＤＭ１）、外因性標的×ＡＰＬＰ２  ＡＤＣ（Ｈ４Ｈ２８６９５Ｄ−ＤＭ１、Ｈ４Ｈ２８６９７Ｄ−ＤＭ１及びＨ４Ｈ２８６９６Ｄ−ＤＭ１）、ＨＥＲ２対照Ａｂ−ＤＭ１、またはアイソタイプ対照−ＤＭ１を、ＤＭＥＭ及び１０％ＦＢＳ中で６６．６７ｎＭ〜０．０１ｎＭの範囲の最終濃度で細胞に添加し、次いで、６日間インキュベートした。インキュベーション後、１００ｕＬのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏｗ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７１）を、各ウェルに添加し、オービタルシェーカー（４００ＲＰＭ）で、室温で５分間インキュベートした。発光は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ３リーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で定量した。ＩＣ５０値は、１０ポイントの応答曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）での２相減衰方程式から決定した。全てのＩＣ５０値は、ｎＭ濃度で表される。
【０３８７】
表１６Ｂに示されるように、高いＨＥＲ２レベル（ＳＫＢＲ３及びＮ８７）を発現する細胞株において、ＨＥＲ２−ＡＤＣ及び３つのＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性ＡＤＣは、０．００４〜０．０５ｎＭの範囲のＩＣ５０値で同程度に効率的な細胞殺滅を誘導したが、アイソタイプ対照−ＡＤＣは、７ｎＭのＩＣ５０値で非効率的な細胞殺滅を誘導した。中間のＨＥＲ２レベルを発現する細胞株（ＭＤＡＭＢ４５３、ＭＤＡＭＢ３６１、ＪＩＭＴ１、及びＺＲ７５１）では、強力なＡＰＬＰ２アームを備えたＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性ＡＤＣ、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄが、中程度及び弱いＡＰＬＰ２アーム、Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ及びＨ４Ｈ２５０２０Ｄを備えたＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性ＡＤＣよりも、０．０４〜０．１５ｎＭの範囲のＩＣ５０値でより効率的な細胞殺滅を誘導し、これは、ＩＣ５０  ０．０６〜３ｎＭというＩＣ５０値で殺滅を示した。中間のＨＥＲ２レベルを発現する細胞株（ＭＤＡＭＢ４５３、ＭＤＡＭＢ３６１、ＪＩＭＴ１、及びＺＲ７５１）では、ＨＥＲ２−ＡＤＣは、３つの二重特異性のいずれよりも効率の低い細胞殺滅を誘発した。これらの細胞では、アイソタイプ対照−ＡＤＣは、１〜３０ｎＭの範囲のＩＣ５０値で非効率的な細胞殺滅を誘発した。低ＨＥＲ２レベルを発現する細胞株では（Ｔ４７Ｄ及びＭＣＦ７）、アイソタイプ対照−ＡＤＣ、ＨＥＲ２−ＡＤＣ、ならびに中程度及び弱いＡＰＬＰ２アームを備えたＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性ＡＤＣは、１０〜７０ｎＭの範囲のＩＣ５０値で非効率的な細胞殺滅を誘発した。強力なＡＰＬＰ２アームを備えたＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性ＡＤＣは、他のＡＤＣよりもわずかに強力な殺滅を示したが、その効果は３．５〜５ｎＭの範囲のＩＣ５０値で制限されていた。非常に低いＨＥＲ２レベルを発現する細胞株（ＭＤＡＭＢ２３１）では、ＡＤＣのいずれも効率的な殺滅を誘発しなかった。試験した全ての細胞株で、中程度または弱い一価ＡＰＬＰ２−ＡＤＣは、ＩＣ５０値が６ｎＭを超えるアイソタイプ対照ＡＤＣと重複する、非効率的な細胞殺滅を誘発したが、強い一価ＡＰＬＰ２−ＡＤＣは、ＩＣ５０値が２ｎＭを超える限定的な殺滅効果を示した。
【表１６Ｂ−１】
2021523100.tif 000110
【表１６Ｂ−２】
2021523100.tif 000111
【表１６Ｂ−３】
2021523100.tif 000112
【０３８８】
結論として、ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２−ＡＤＣは、試験された細胞株を殺滅する際に、高ＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２−ＡＤＣと同じくらい効率的であり、中間のＨＥＲ２発現細胞においてより効率的であった。正常細胞におけるＨＥＲ２発現よりもわずかに高い、低いＨＥＲ２レベルを発現する細胞では、ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２−ＡＤＣは、細胞殺滅がないことに限定されていることを示した。一価のＡＰＬＰ２−ＡＤＣは、試験した任意の細胞株で効率的な細胞殺滅を誘導するのに十分ではなかった。
【０３８９】
実施例１２：二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２  ＡＤＣは、単一特異性抗ＨＥＲ２抗体と比較して、ＪＩＭＴ−１腫瘍退縮のインビボモデルにおいて、より大きな標的細胞毒性を示す。
例示的な二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の有効性をさらに試験するために、インビボ異種移植腫瘍研究を実施した。アッセイには、８週齢の雌性ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｎ＝７０）を使用した。ＪＩＭＴ−１（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ５８９）細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５４２３４）及び１５０ｕＬの細胞と混合し、５×１０６個の細胞を含むマトリゲル懸濁液を、ＳＣＩＤマウスに注入した。３週間後、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２  ＡＤＣ（Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及びＨ４Ｈ２５０１９Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）、ＨＥＲ２対照−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、及びアイソタイプ対照−ＳＭＣＣ−ＤＭ１を、１０ｍｇ／ｋｇ（１治療群あたりｎ＝６）で、腫瘍サイズに基づいて無作為化したＳＣＩＤマウスに皮下投与した。最初の投与から３３日後、２回目の投与を全ての群に投与した。各マウスの異種移植片のサイズは、Ｃａｌｉｐｅｒ（Ｒｏｂｏｚ、カタログ番号ＲＳ６４６６）を使用して、最初のＡＤＣ投与後１日目〜８３日目まで週に２回測定した。測定された各時点の１治療群あたりの平均腫瘍サイズを、表１７Ａに示す。
【表１７Ａ−１】
2021523100.tif 000113
【表１７Ａ−２】
2021523100.tif 000114
【０３９０】
二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２  Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣを投与されたマウスでは、ＪＩＭＴ−１異種移植片サイズが１６ｍｍ３未満の平均サイズに有意かつ持続的に減少したことが見られた。二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２  Ｈ４Ｈ２５０１９Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣを投与されたマウスでは、ＪＩＭＴ−１異種移植片のサイズが最小の平均サイズである７７ｍｍ３まで有意に減少することが見られたが、異種移植片のサイズは後で４３７ｍｍ３に再成長した。ＨＥＲ２／Ｔ対照−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣを投与されたマウスでは、ＪＩＭＴ−１異種移植片のサイズが最小の平均サイズである１４０ｍｍ３に減少することが見られたが、その後、異種移植片のサイズは１６００ｍｍ３を超えて再成長した。アイソタイプ対照−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣを投与されたマウスでは、各測定を通じてＪＩＭＴ−１異種移植片のサイズが１９３３ｍｍ３の平均サイズに増大することが見られた。図８を参照のこと。
【０３９１】
同様の実験において、ＪＩＭＴ−１（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ５８９）細胞を、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５４２３４）及び１５０ｕＬの細胞と混合し、５×１０６個の細胞を含むマトリゲル懸濁液を、ＳＣＩＤマウスに注射した。移植後１１日及び２５日に、抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性ＡＤＣ（Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ−ＤＭ１、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−ＤＭ１、及びＨ４Ｈ２５０２０Ｄ−ＤＭ１）、抗ＡＰＬＰ２ｘ無関係なＡｂ対照ＡＤＣ（Ｈ４Ｈ２８６９５Ｄ−ＤＭ１、Ｈ４Ｈ２８６９６Ｄ−ＤＭ１、及びＨ４Ｈ２８６９７Ｄ−ＤＭ１）、ＨＥＲ２対照−ＤＭ１、及びアイソタイプ対照−ＤＭ１を、腫瘍サイズに基づいて無作為化されたＳＣＩＤマウスに１０ｍｇ／ｋｇ（１治療群あたりｎ＝６）で皮下投与した。各マウスの異種移植片サイズは、移植後１１、１３、１６、１９、２３、２５、３０、３３、３７、４４、４８、５３、５６、５９、６８、及び７４日目に、Ｃａｌｉｐｅｒ（Ｒｏｂｏｚ、カタログ番号ＲＳ６４６６）を使用して測定した。測定された各時点の１治療群あたりの平均腫瘍サイズを、表１７Ｂに示す。
【０３９２】
抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性ＡＤＣ、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−ＤＭ１を投与されたマウスは、ＪＩＭＴ−１異種移植片サイズの平均サイズ９３ｍｍ３への有意な減少を示した。抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性ＡＤＣ、Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ−ＤＭ１及びＨ４Ｈ２５０２０Ｄ−ＤＭ１を投与されたマウスは、ＪＩＭＴ１異種移植片の腫瘍停滞を示し、これは３０日間、平均サイズ２００ｍｍ３という処置前に近いままであった。対照的に、アイソタイプ対照−ＤＭ１  ＡＤＣまたはＨＥＲ２対照−ＤＭ１  ＡＤＣのいずれかを投与されたマウスでは、各測定を通じてＪＩＭＴ−１異種移植片のサイズが、３０日目までに４００ｍｍ３超、５３日目で１０００ｍｍ３超という平均サイズに増大することが見られた。抗ＡＰＬＰ２ｘ無関係のＡｂ対照ＡＤＣを投与されたマウスでは、ＪＩＭＴ−１異種移植片のサイズが増大することが見られ、腫瘍の停滞がほとんどなく、３０日目までに２８３〜３６６ｍｍ３、及び５３日目で８００ｍｍ３超という平均サイズまで増大した。
【表１７Ｂ】
2021523100.tif 000115
【０３９３】
実施例１３：二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２  ＡＤＣは、単一特異性抗ＨＥＲ２抗体と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１腫瘍退縮のインビボのモデルにおいてより大きな標的細胞毒性を示す
例示的な二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の有効性をさらに試験するために、インビボ異種移植腫瘍研究を実施した。要するに、６週齢の雌性ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｎ＝６０）にエストロゲンペレット（０．７２ｍｇ／ペレット。Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、カタログ番号ＮＥ−１２１）を皮下移植した。翌日、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−２７）をマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５４２３４）と混合し、５×１０６個の細胞を含むマトリゲル懸濁液を有する１５０μＬの細胞を、ＳＣＩＤマウスに注射した。１２日後、二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２  ＡＤＣ（Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）、ＨＥＲ２／Ｔ対照−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、及びアイソタイプ対照−ＤＭ１を、腫瘍サイズに基づいて無作為化されたＳＣＩＤマウスに１０ｍｇ／ｋｇ（１治療群あたりｎ＝７）で皮下投与した。各マウスの異種移植片サイズは、Ｃａｌｉｐｅｒ（Ｒｏｂｏｚ、カタログ番号ＲＳ６４６６）を使用して、ＡＤＣ投与後１日目〜９５日目まで測定した。
【０３９４】
測定された各時点についての１治療群あたりの腫瘍サイズの平均（ＡＶＧ）及び標準偏差（ＳＤ）を表１８に示す。
【表１８−１】
2021523100.tif 000116
【表１８−２】
2021523100.tif 000117
【０３９５】
二重特異性抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２  Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣを投与されたマウスでは、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１異種移植片のサイズの有意でかつ持続的な減少が見られた。ＨＥＲ２対照−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣを投与されたマウスでは、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１異種移植片のサイズが、８３ｍｍ３という最小の平均サイズまでの減少が見られたが、その後、異種移植片のサイズは、７４４ｍｍ３を超えて再成長した。アイソタイプ対照−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣを投与されたマウスでは、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１異種移植片のサイズが、各測定を通じて、平均サイズ２０４１ｍｍ３まで増大することが見られた。
【０３９６】
実施例１３：ヒト化ＡＰＬＰ２マウスにおける抗Ｈｅｒ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）の薬物動態学的評価
３つの抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性抗体（Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０２０Ｄ）及びｈＩｇＧ４Ｐ二価の非結合アイソタイプ対照の薬物動態の評価を、マウスＡＰＬＰ２の代わりに、ヒトＡＰＬＰ２の発現についてホモ接合性のマウスで実施した（ＡＰＬＰ２ｈｕ／ｈｕマウス）。１群あたり５匹のマウスのコホートは、各抗体の単回皮下（ＳＣ）５ｍｇ／ｋｇ用量を投与された。血液試料は、投与後６時間、ならびに１、２、３、４、７、１０、１４、２１、及び３０日目に採取された。血液は血清に処理され、分析されるまで８０℃で凍結された。Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０２０Ｄ及びアイソタイプ対照抗体の血清濃度は、ＧｙｒｏＬａｂ  ｘＰｌｏｒｅプラットフォーム（Ｇｙｒｏｓ）を使用して測定した。
【０３９７】
ジャイロ技術は、レーザー誘起蛍光検出を伴う自動イムノアッセイのためにアフィニティーフロースルーフォーマットを使用する。試料は、複数の放射状に配置されたナノリットルスケールのアフィニティーキャプチャーカラムを含む、コンパクトディスクにロードされる。液体の流れは、遠心力及び毛細管力によって制御される。
【０３９８】
簡単に言えば、リン酸緩衝化生理食塩水中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で構成される、緩衝液（抗体希釈緩衝液）中で１００μｇ／ｍＬに希釈されたビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ４／ＩｇＧ１特異的モノクローナル抗体を、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ（Ｄｙｎｏｓｐｈｅｒｅｓ（商標））が事前に充填されたアフィニティーカラムを備えた、Ｇｙｒｏｌａｂ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ２００コンパクトディスクで捕捉した。このアッセイでキャリブレーションに使用した標準は、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０２０Ｄ、または０．４８８〜２０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度のアイソタイプ対照抗体であった。標準試料と血清試料の段階希釈は、０．１％ＮＭＳを含むＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡで構成される緩衝液（希釈緩衝液）で調製した。１：５０に希釈された血清試料の一重項及び標準の複製が、室温でコンパクトディスク上の抗ヒトＩｇＧ４／ＩｇＧ１特異的ｍＡｂでコーティングされたアフィニティーカラムに捕捉された。Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０２０Ｄ、またはアイソタイプ対照抗体は、Ｒｅｘｘｉｐ  Ｆ緩衝液（Ｇｙｒｏｓ、カタログ番号Ｐ０００４８２５）で希釈した０．５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ−６４７結合マウス抗ヒトカッパモノクローナル抗体の添加により検出され、得られた蛍光シグナルを、ＧｙｒｏＬａｂ  ｘＰｌｏｒｅ機器による応答単位（ＲＵ）で記録した。キャリブレーションに使用されたそれぞれの抗体標準の最低濃度は、アッセイのダイナミックレンジ内にあり、アッセイの検出下限（ＬＬＯＱ）［０．０２μｇ／ｍＬ］として定義された。試料濃度は、Ｇｙｒｏｌａｂ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅの５パラメーターロジスティックカーブフィットを使用して作成された標準カーブからの補間によって決定された。２回の反復実験からの平均濃度を報告した。
【０３９９】
ＰＫパラメーターは、Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェアバージョン６．３（Ｃｅｒｔａｒａ，Ｌ．Ｐ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）及び血管外投薬モデルを使用する非コンパートメント分析（ＮＣＡ）によって決定された。各抗体のそれぞれの平均濃度値を使用して、血清中の観察された最大濃度（Ｃｍａｘ）、観察された推定半減期（ｔ１／２）、及び最後の測定可能な濃度までの時間に対する濃度曲線下の面積（ＡＵＣｌａｓｔ）を含む全てのＰＫパラメーターは、線形補間及び均一な重み付けを使用した線形台形公式を使用して決定された。
【０４００】
ＡＰＬＰ２ｈｕ／ｈｕマウスにおける抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性抗体の投与後、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０２０Ｄは全て、血清中で抗体の異なる最大濃度（Ｃｍａｘ）を示した。Ｈ４Ｈ２５０２０ＤのＣｍａｘ濃度は４７μｇ／ｍＬであったが、Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄは、３５μｇ／ｍＬで１．３低い濃度を示し、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄは、１２μｇ／ｍＬで最低のＣｍａｘを示した（Ｈ４Ｈ２５０２０Ｄより４倍低い）。Ｈ４Ｈ２５０２０Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ、及びＨ４Ｈ２５０１８Ｄは全て、アイソタイプ対照抗体よりも低いＣｍａｘ濃度（それぞれ１．７、２．３、６．５倍）を示した。Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０２０Ｄは全て、アイソタイプ対照抗体と比較してより速い薬物クリアランスを示し、これによって標的を介したクリアランスが示唆されている。Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ及びＨ４Ｈ２５０２０ＤのＰＫは、迅速な抗体クリアランスを特徴とし、それぞれ２１日目及び３０日目に抗体濃度は検出不能である。さらに、Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ及びＨ４Ｈ２５０２０Ｄは両方とも、Ｔ１／２が４日であるＨ４Ｈ２５０１４ＤまたはＴ１／２が約１１日であるアイソタイプ対照と比較して、それぞれ１．６日及び１．８日という貧弱な半減期（Ｔ１／２）を有している。Ｈ４Ｈ２５０１８Ｄ、Ｈ４Ｈ２５０２０Ｄ、及びＨ４Ｈ２５０１４Ｄは全て、アイソタイプ対照抗体（１０７０ｄ＊μｇ／ｍＬ）よりも低い薬物曝露（ＡＵＣ、それぞれ３４、２１２、２３４ｄ＊μｇ／ｍＬ）を示す。Ｈ４Ｈ２５０１４Ｄ及びアイソタイプ対照の平均終末抗体濃度は、それぞれ０．６７μｇ／ｍＬ及び１３．１μｇ／ｍＬであった。
【０４０１】
総抗ＨＥＲ２ｘＡＰＬＰ２二重特異性抗体濃度のデータの要約を表１９に示しており、平均ＰＫパラメーターを表２０に記載しており、平均総抗体濃度対時間を図１０に示す。
【表１９−１】
2021523100.tif 000118
【表１９−２】
2021523100.tif 000119
【表２０】
2021523100.tif 000120
【０４０２】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な改変が、前述の説明及び添付の図から当業者に明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図１】
2021523100.tif 000121
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【配列表】
2021523100000001.app
【国際調査報告】
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