(57)【要約】  本発明は、グリチルリチンとヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体と粘度調整剤とを含む組成物を開示する。本発明に従う組成物はそのバイオアベイラビリティを有意に改善するので、よって、組成物はグリチルリチンが用いられる全ての化粧品および治療用途への有利な利用を見出す。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリチルリチンと、ヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体と、タマリンド種子多糖、ＰＶＰ、カルボキシビニルポリマー、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ムコ多糖、セルロースおよびエステル、天然ガムおよびそれらのエステル、ペクチン、ポリアクリレート、ならびにそれらの混合物から選択される粘度調整剤と、を含む組成物。
【請求項２】
前記グリチルリチンが前記組成物の重量に基づいて最高で５．０ｗｔ％、好ましくは０．０５〜３．０ｗｔ％の濃度である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体が前記組成物の重量に基づいて最高で５．０ｗｔ％、好ましくは０．０１〜３．０ｗｔ％の濃度である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記粘度調整剤が前記組成物の重量に基づいて最高で５．０ｗｔ％、好ましくは０．０１〜３．０ｗｔ％の濃度である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記粘度調整剤が、前記組成物の重量に基づいて好ましくは０．０５〜２．０ｗｔ％の濃度のタマリンド種子多糖、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの混合物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
グリチルリチンおよびヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体が１：１から１：２０、好ましくは１：１から１：１０、より好ましくは１：１から１：５の重量比である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
グリチルリチンおよび粘度調整剤が５：１から１：１５、好ましくは３：１から１：１０、より好ましくは２：１から１：５の重量比である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
ヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体および粘度調整剤が１：２から１０：１、好ましくは１：１から５：１、より好ましくは１：１から３：１の重量比である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が４〜７、好ましくは５．５〜６．５のｐＨを有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
さらに緩衝液を含み、前記緩衝液がクエン酸−クエン酸ナトリウム、酢酸−酢酸ナトリウム、ホウ酸−ホウ酸ナトリウム、クエン酸−リン酸水素二ナトリウム（「マッキルベイン緩衝液」としてもまた公知）、クエン酸−リン酸一カリウム−ホウ酸−ジエチルバルビツール酸、ＴＲＩＳ−ホウ酸、およびそれらの混合物から選択され、好ましくは前記緩衝液がクエン酸−クエン酸ナトリウムである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
眼疾患の処置への使用のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物と眼科的に受け入れられる賦形剤とを含む眼用製品。
【請求項１３】
前記眼用製品が涙液代用物、洗眼液、懸濁液、アイスプレー、フォーム剤、含浸ワイプ、スプレーパッチ、またはそれらの組み合わせであり、好ましくは涙液代用物である、請求項１２に記載の眼用製品。
【請求項１４】
皮膚科、婦人科、耳鼻咽喉科、または歯科病理の局所処置への使用のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
局所外用使用のための製品のスージング剤としての請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物の化粧品使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリチルリチンとヒアルロン酸と粘度調整剤とを含む組成物に関する。本発明に従う組成物はそのバイオアベイラビリティを有意に改善するので、よって、組成物はグリチルリチンが用いられる全ての化粧品および治療用途への有利な利用を見出す。
【背景技術】
【０００２】
グリチルリチン（またはグリチルリチン酸（glycyrrhizic acid）もしくはグリチルリチン酸（glycyrrhizinic acid））は、甘草エキスの活性成分を構成するトリテルペノイドサポニングリコシドである：
【化１】
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【０００３】
グリチルリチンはグリチルリチン酸二カリウム（dipotassium glycyrrhizate）（またはグリチルリチン酸二カリウム（dipotassium glycyrrhizinate））およびグリチルリチン酸（glycyrrhizate）（モノ）アンモニウム（またはグリチルリチン酸（glycyrrhizinate）（モノ）アンモニウムもしくはＧＡ）などの塩の形態でもまた利用可能である。酸形態では、それは特に水溶性ではないが、しかしながら、カリウム塩は水溶性であり：
【化２】
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（モノ）アンモニウム塩は希釈された酸性または塩基性溶液に可溶である：
【化３】
2021530521.tif 000005
【０００４】
グリチルリチンが加水分解されるときには、もたらされるアグリコンは、エノキソロンとしてもまた公知の１８β−グリチルレチン酸（glycyrrhetinic acid）（またはグリチルレチン酸（glycyrrhetic acid））である：
【化４】
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【０００５】
食品の分野では、グリチルリチンは甘味料として使用される。なぜなら、それはサッカロースよりも最高で５０倍甘く、後者と比較して、甘いフレーバーはより遅く知覚されるが、口中でより長く続くからである。
【０００６】
薬理学の分野においては、この化合物は去痰薬としておよび消化性潰瘍のケースにおける胃保護薬として用いられる。
【０００７】
さらにその上、グリチルリチンは抗炎症および消炎作用を有する；実際に、グリチルレチン酸は１１ベータヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによるコルチゾールからコルチゾンへの変換を阻害し、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βなどの炎症性サイトカインの産生を阻害するということが強調されている（非特許文献１）。
【０００８】
最近、この薬物の消炎作用を担うさらなるメカニズム、つまり好中球による強力な炎症性物質のクラスであるフリーラジカルの産生を阻害するグリチルリチンの能力が同定された。しかしながら、分子はこれらの細胞の食作用および走化性に有意に影響することはできないように見える。
【０００９】
白血球によって産生されるフリーラジカルはニキビおよび酒さの場合における濾胞上皮へのダメージの主な原因の１つであるということを指摘することは興味深い。
【００１０】
さらにその上、この化合物は臨床的には慢性肝炎およびアレルギー性障害の処置のために用いられる。グリチルリチン注射が慢性Ｃ型肝炎の患者に投与され、その長期使用は肝細胞癌の発生を防止することに有効である。しかしながら、繰り返しの有痛性の静脈内注射は慢性肝炎の患者のクオリティ・オブ・ライフを縮減した。また、注射治療はヘルスケアワーカーにとって感染のリスクを伴う。よって、経口投与が採用されてきたが、グリチルリチンのバイオアベイラビリティは極めて低いことが判明している。
【００１１】
文献はグリチルリチンのバイオアベイラビリティを改善するための種々の試みの報告を提供している；例えば、非特許文献２はグリチルリチンの種々の投与経路を比較し、経鼻経路および直腸経路がとりわけ局所透過促進剤などの脂肪酸塩の存在下において経口経路よりも良好であるということを結論づけている。
【００１２】
それでも、これらの投与経路は患者にとっていくらかは不快であり、いずれにせよ、内用かまたは外用かにかかわらず局所的な処置が必要である場合には好適ではない。
【００１３】
よって、本発明に従う課題は、特に局所外用経路によって投与されるときに、グリチルリチンのバイオアベイラビリティを増大させることである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】シャオイン・ファン（Xiaoying Huang）ら著，「核内因子カッパーＢシグナル経路を制御することによるマウスのリポ多糖誘発性の急性肺損傷に対するグリチルリチン酸一アンモニウムの抗炎症効果（Anti-Inflammatory Effects of Monoammonium Glycyrrhizinate on Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice through Regulating Nuclear Factor-Kappa B Signaling Pathway）」エビデンス・ベース・コンプルメンタリー・アンド・オルターナティブ・メディシン（Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine），２０１５年；２０１５年号：ＩＤ２７２４７４
【非特許文献２】佐々木ら著，「ラットにおける種々の血管外投与経路による不良に吸収されるグリチルリチンのバイオアベイラビリティの改善（Improvement in the bioavailability of poorly absorbed glycyrrhizin via various non-vascular administration routes in rats）」，インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス（International Journal of Pharmaceutics），２００３年１０月２０日；第２６５巻（１−２）：ｐ．９５−１０２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
請求項１に記されている通り、前記課題は、グリチルリチンと、ヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体と、タマリンド種子多糖、ＰＶＰ、カルボキシビニルポリマー、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ムコ多糖、セルロースおよびそのエステル、天然ガムおよびそれらのエステル、ペクチン、ポリアクリレート、ならびにそれらの混合物から選択される粘度調整剤とを含む組成物によって達成された。
【００１６】
本発明の目的のためには、用語「グリチルリチン」は、グリチルリチン酸、その塩、好ましくはカリウムおよびアンモニウム塩、その加水分解形態、好ましくはグリチルレチン酸、ならびにそれらの混合物を包含することが意味される。
【００１７】
別の態様では、本発明は眼疾患の処置への前記組成物の使用に関する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は前記組成物を含む眼用製品に関する。
【００１９】
別の態様では、本発明は皮膚科、婦人科、耳鼻咽喉科、または歯科病理の局所処置への前記組成物の使用に関する。
【００２０】
なおさらなる態様では、本発明は、特に局所外用使用のための製品のスージング剤としての、前記組成物の化粧品使用に関する。
【００２１】
本発明の特徴および利点は、限定しない例として提供されかつ本明細書に添付の図面に例示される実施形態の次の詳細な記載から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、元のままの状態のＧＡの１ＮＭＲスペクトルと比較して、０．１％ＧＡを含む組成物の１ＮＭＲスペクトル（ａ）および０．２％ＧＡを含む組成物の１ＮＭＲスペクトル（ｂ）を示している。
【図２】図２は、０．１％ＧＡ（ａ）および０．２％ＧＡ（ｂ）を水中に含む組成物の緩和時間Ｔ１およびＴ２１ＮＭＲの間の比較を示している。
【図３】図３は、０．１％ＧＡ（ａ）および０．２％ＧＡ（ｂ）をクエン酸緩衝液中に含む組成物の緩和時間Ｔ１およびＴ２１ＮＭＲの間の比較を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
よって、本発明は、グリチルリチンと、ヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体と、タマリンド種子多糖、ＰＶＰ、カルボキシビニルポリマー、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ムコ多糖、セルロースおよびエステル、天然ガムおよびそれらのエステル、ペクチン、ポリアクリレート、ならびにそれらの混合物から選択される粘度調整剤とを含む組成物に関する。
【００２４】
好ましくは、前記グリチルリチンは前記組成物の重量に基づいて最高で５．０ｗｔ％の濃度である。
【００２５】
より好ましくは、前記グリチルリチンは前記組成物の重量に基づいて０．０５〜３．０ｗｔ％の濃度である。
【００２６】
用語「ヒアルロン酸塩」では、それはヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸鉄、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸コバルト、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム、またはそれらの混合物が意味される。
【００２７】
用語「ヒアルロン酸誘導体」は：
−  ＥＰ０２１６４５３Ｂ１にもまた記載されている通りの、一部または全てのカルボン酸基が脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、環式脂肪族、複素環系アルコールによってエステル化されるヒアルロン酸エステル、
−  ＥＰ０３４１７４５Ｂ１にもまた記載されている通りの、カルボン酸基の一部または全てが同じ多糖鎖またはさらなる鎖からのアルコール基によってエステル化される自己架橋ヒアルロン酸エステル、
−  ＥＰ０２６５１１６Ｂ１にもまた記載されている通りの、カルボン酸基の一部または全てが脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、環式脂肪族、または複素環系ポリアルコールによってエステル化され、スペーサー鎖の手段による架橋を生成する、架橋ヒアルロン酸化合物、
−  ＷＯ９６／３５７２０７にもまた記載されている通りの、ヒアルロン酸とのまたは部分的なもしくは完全なヒアルロン酸エステルとのコハク酸ヘミエステルまたはコハク酸重金属塩、
−  ＷＯ９５／２５７５１にもまた記載されている通りのＯ−硫酸化誘導体またはＷＯ／１９９８／０４５３３５にもまた記載されている通りのＮ−硫酸化誘導体、およびそれらの混合物、
を含むことが意味される。
【００２８】
好ましくは、前記ヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体の重量平均分子量は２００〜１５００ｋＤａ、より好ましくは６００〜１０００ｋＤａである。
【００２９】
好ましくは、前記ヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体は前記組成物の重量に基づいて最高で５．０ｗｔ％の濃度である。
【００３０】
より好ましくは、前記ヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体は前記組成物の重量に基づいて０．０１〜３．０ｗｔ％の濃度である。
【００３１】
好ましい実施形態では、組成物はヒアルロン酸を含む。
【００３２】
特に好ましい実施形態では、前記ヒアルロン酸は前記組成物の重量に基づいて０．１〜２．０ｗｔ％の濃度である。
【００３３】
用語「タマリンド種子多糖」はタマリンダス・インディカの種子から得られ得る多糖部分を意味し、以降では簡潔さのために「ＴＳＰ」ともまた言われる（英語の用語「タマリンダス・インディカ種子多糖」から）。
【００３４】
それが公知である通り、タマリンド樹はインド、アフリカ、および極東において一般的である。そこでは、それは本質的に食品目的で栽培される。元々は副産物であった種子は、その後、場合によっては粗挽き生成物（現在では「生タマリンドガム」または「タマリンドナッツ粉末」として公知）へと粉砕されて、とりわけ、それがそれぞれ糸のサイジング剤としておよび糊付け剤として用いられる繊維および製紙産業への、ならびにそれがアルギン酸、ペクチン、グアーガム、または粗挽きローカストビーンなどのさらなる多糖製品と同様に、増粘剤、ゲル化剤、安定剤、および結合剤としてあらゆる種類の製品に用いられる食品産業への種々の使用を見出している。典型的には、生タマリンドガム（例えば、日本国大阪を拠点とする大日本製薬株式会社によって生産されるグリロイド（登録商標）として市販）は、６５〜７３ｗｔ％の多糖に加えて、１５〜２３％タンパク質材料、３〜８％油脂、および２〜４％灰分、ならびに微量の生の繊維、タンニン、およびさらなる不純物をもまた含有する。
【００３５】
１つの有利な態様は、ＴＳＰ溶液は（例えば、２０分に渡る１２０℃での）オートクレーブの通過によって滅菌されることに好適であり、例えばヒアルロン酸で起こることとは違って熱分解を受けることがないということである。単純にオートクレーブの通過による滅菌の可能性は、ＴＳＰに基づく調製物を特に生産の観点から便利にする。
【００３６】
さらにその上、ＴＳＰは有意なムコミメティック、粘膜付着、および生体接着特性を実証している。
【００３７】
ＴＳＰは精製された中性の水溶性多糖画分であり、ガラクトキシログルカンのポリマー分子を含む。これは非常に親水性であり、グルコース繰り返し単位から形成された線状の主鎖に取り付けられた分岐構造を特徴とする。これはキシロースの小さい単糖単位およびキシロース−ガラクトースの二糖単位からなる。後者のケースでは、ガラクトースは側鎖の末端にある。３つのモノマーは３：１：２のモル比で存在し、種子の構成成分のおよそ６５％を構成する：
【化５】
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【００３８】
観察され得る通り、「ムチン様の」分子構造は、前記ムチンとの種々の種類の結合の形成に由来する多糖の優良な粘膜付着特性を決定する。
【００３９】
ＴＳＰは、化学的方法および酵素的方法の手段によって、プロテアーゼをまたはプロテアーゼおよび高強度超音波の組み合わせを用いて単離され得る。化学的方法では、２０ｇのタマリンド種子粉末が２００ｍｌの冷蒸留水に追加されて懸濁液を調製し、これはそれから８００ｍｌの沸騰蒸留水に注加される。このようにして形成された溶液は２０分に渡って沸騰するように放置され、連続的に撹拌される；一晩静置した後に、前記溶液は５０００ｒｐｍで２０分に渡って遠心を受ける。上清が分離され、前記上清の量の２倍に達する体積の純粋なアルコールに注加される。このようにして沈殿物が得られ、これはそれから純粋なエタノールによって洗浄され、風乾される。最終的に、乾燥されたポリマーは粉砕され、ふるい分けされ、使用まで乾燥器内で保存される。酵素的方法では、種子から得られた粉末はエタノールと混合され、それからプロテアーゼによって処置される；その後に、前記粉末が遠心され、沈殿のためにエタノールが上清に追加される。最終的に、ポリマーは分離および乾燥される。
【００４０】
好ましくは、ＴＳＰの重量平均分子量は４５０〜７５０ｋＤａである。
【００４１】
好ましくは、前記粘度調整剤は前記組成物の重量に基づいて最高で５．０ｗｔ％の濃度である。
【００４２】
より好ましくは、前記粘度調整剤は前記組成物の重量に基づいて０．０１〜３．０ｗｔ％の濃度である。
【００４３】
好ましい実施形態では、前記粘度調整剤は、前記組成物の重量に基づいてより好ましくは０．０５〜２．０ｗｔ％の濃度のＴＳＰ、ＣＭＣ、またはそれらの混合物である。
【００４４】
より好ましい実施形態では、前記粘度調整剤はＴＳＰを前記組成物の重量に基づいて好ましくは０．０５〜２．０ｗｔ％の濃度で含む。代替的には、前記粘度調整剤は次の１つ以上とのＴＳＰの混合物を含む：ＰＶＰ、カルボキシビニルポリマー、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ムコ多糖、セルロースおよびそのエステル、天然ガムおよびそれらのエステル、ペクチン、およびポリアクリレート。
【００４５】
前記粘度調整剤が前記組成物の重量に基づいて好ましくは０．０５〜２．０ｗｔ％の濃度のＴＳＰである組成物が特に好ましい。
【００４６】
好ましくは、グリチルリチンおよびヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体は、１：１から１：２０、より好ましくは１：１から１：１０の重量比である。
【００４７】
好ましい実施形態では、グリチルリチンおよびヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体は１：１から１：５の重量比である。
【００４８】
好ましくは、グリチルリチンおよび粘度調整剤は、５：１から１：１５、より好ましくは３：１から１：１０の重量比である。
【００４９】
好ましい実施形態では、グリチルリチンおよび粘度調整剤は２：１から１：５の重量比である。
【００５０】
好ましくは、ヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体および粘度調整剤は１：２から１０：１、より好ましくは１：１から５：１の重量比である。
【００５１】
好ましい実施形態では、ヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体および粘度調整剤は１：１から３：１の重量比である。
【００５２】
好ましくは、本発明の組成物は４〜７のｐＨを有する。
【００５３】
より好ましくは、本発明の組成物は５．５〜６．５のｐＨを有する。
【００５４】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、選択されたｐＨを維持するための用をなす緩衝液を含む。
【００５５】
好ましくは、緩衝液は組成物の重量に基づいて最高で５ｗｔ％の濃度である。
【００５６】
より好ましくは、緩衝液は組成物の重量に基づいて２．０〜４．０ｗｔ％の濃度である。
【００５７】
特に好ましい実施形態では、緩衝液は組成物の重量に基づいて１．５〜２．５ｗｔ％の濃度である。
【００５８】
好ましくは、前記緩衝液は、クエン酸−クエン酸ナトリウム、酢酸−酢酸ナトリウム、ホウ酸−ホウ酸ナトリウム、クエン酸−リン酸水素二ナトリウム（「マッキルベイン緩衝液」としてもまた公知）、クエン酸−リン酸一カリウム−ホウ酸−ジエチルバルビツール酸、ＴＲＩＳ−ホウ酸、およびそれらの混合物から選択される。
【００５９】
好ましい実施形態では、前記緩衝液はクエン酸−クエン酸ナトリウムである。
【００６０】
特に好ましい実施形態では、ｐＨはおよそ６であり、緩衝液はクエン酸−クエン酸ナトリウムである。
【００６１】
さらなる実施形態では、本発明の組成物は、２５℃において測定されると、０．１〜２．０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは０．２〜１．５ｍＳ／ｃｍの導電率を特徴とする。次の例で分かるであろう通り、導電率がより高ければ、ヒアルロニダーゼの解重合作用はより高く、導電率がより低ければ、ヒアルロニダーゼの解重合作用はより低いということが観察された。これは、要件に応じて、製品の用量を限定することが必要である化粧品、生薬製品、医療用デバイス、もしくは医薬品などの利用については上に記されている範囲の下限に近い値へと、または化粧品もしくは医薬品調製物の頻用が必要である利用については上限に近い値へと、導電率が調節され得るということを意味する。
【００６２】
本発明の組成物が緩衝液を含むときには、導電率は、その中に含有される酸化合物および塩化合物の間の重量比を変えることによって調節され得る。例えば、緩衝液がクエン酸−クエン酸ナトリウムであるときには、クエン酸およびクエン酸ナトリウムの間の重量比が変えられる：クエン酸の数量を増大させることによって、導電率は縮減される；クエン酸ナトリウムの数量を増大させることによって、導電率は増大させられる。
【００６３】
本発明の組成物のさらに好ましい実施形態では、水はその中に存在する唯一の溶媒である。
【００６４】
さらに好ましい実施形態では、本発明の組成物は保存料または着色料を含まない。
【００６５】
好ましい組成物は４〜７のｐＨを有し、組成物の重量に基づいて：
−  最高で５．０ｗｔ％のグリチルリチンと、
−  最高で５．０ｗｔ％のヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体と、
−  最高で５．０ｗｔ％の粘度調整剤と、
−  水と、
を含む。
【００６６】
５．５〜６．５のｐＨを有し、かつ組成物の重量に基づいて：
−  ０．０５〜３．０ｗｔ％のグリチルリチンと、
−  ０．０１〜３．０ｗｔ％のヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体と、
−  ０．０１〜３．０ｗｔ％の粘度調整剤と、
−  最高で５ｗｔ％の緩衝液と、
−  水と、
を含む組成物がより好ましい。
【００６７】
５．５〜６．５のｐＨを有し、かつ組成物の重量に基づいて：
−  ０．０５〜３．０ｗｔ％のグリチルリチンと、
−  ０．０１〜３．０ｗｔ％のヒアルロン酸と、
−  ０．０１〜３．０ｗｔ％のＴＳＰ、ＣＭＣ、またはそれらの混合物と、
−  ２．０〜４．０ｗｔ％のクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液と、
−  水と、
を含む組成物がなおより好ましい。
【００６８】
ｐＨ５．５〜６．５のｐＨを有し、かつ組成物の重量に基づいて：
−  ０．０５〜３．０ｗｔ％のグリチルリチンと、
−  ０．０１〜３．０ｗｔ％のヒアルロン酸と、
−  ０．０１〜３．０ｗｔ％のＴＳＰと、
−  ２．０〜４．０ｗｔ％のクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液と、
−  水と、
を含む組成物がさらにより好ましい。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、グリチルリチンと、ヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体と、タマリンド種子多糖、ＰＶＰ、カルボキシビニルポリマー、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ムコ多糖、セルロースおよびエステル、天然ガムおよびそれらのエステル、ペクチン、ポリアクリレート、ならびにそれらの混合物から選択される粘度調整剤とから本質的になる。表現「から本質的になる」は、上で列記されている３つの構成成分が本発明の組成物中に存在する唯一の活性成分であるということを意味し、いずれかのさらなる構成成分または賦形剤はそれらの作用に干渉せず、水混和性および水溶性である。
【００７０】
さらなる実施形態では、本発明の組成物は、グリチルリチンと、ヒアルロン酸またはその塩もしくは誘導体と、タマリンド種子多糖、ＰＶＰ、カルボキシビニルポリマー、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ムコ多糖、セルロースおよびエステル、天然ガムおよびそれらのエステル、ペクチン、ポリアクリレート、ならびにそれらの混合物から選択される粘度調整剤とからなる。
【００７１】
本発明の組成物は一般公知の方法によって調製され得る。実際に、構成成分は、例えば、撹拌下で次々に追加され、そのままで、または１つ以上の賦形剤と共に混合され得る。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、一般公知の方法に従って、例えばガンマ線による処置によって使用前に滅菌される。
【００７３】
別の態様では、本発明は眼疾患の処置への前記組成物の使用に関する。
【００７４】
用語「眼疾患」は、眼の表面を冒す炎症状態、例えばドライアイ症候群、シェーグレン症候群、ぶどう膜炎、結膜炎、角膜炎、角結膜炎、春季カタル、角膜潰瘍、アトピー性角結膜炎、瘢痕性結膜炎、眼瞼炎、角膜炎、兎眼、眼内炎、上強膜炎、および強膜炎を意味する。
【００７５】
なおさらなる態様では、本発明は前記組成物を含む眼用製品に関する。
【００７６】
前記眼用製品は涙液代用物、洗眼液、懸濁液、アイスプレー、フォーム剤、ウェットワイプ、スプレーオンパッチ、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００７７】
好ましい実施形態では、前記眼用製品は涙液代用物である。
【００７８】
下で提供される例で分かるであろう通り、物理化学的およびレオロジー的観点からのみならず、全体として、その構成成分の相乗性に由来する有効性の観点から、本発明の組成物はいくつもの利点をオファーする。実際に、第１に、本発明の組成物はグリチルリチンのバイオアベイラビリティを増大させ、第２に、グリチルリチンおよび粘度調整剤の共存は、眼の表面に通常存在しかつヒアルロン酸を分解する酵素であるヒアルロニダーゼの効果を阻害し、このようにして後者の耐久性および有効性を増大させ、結果的に、製品の繰り返し投与を成す必要を縮減する。
【００７９】
本発明の組成物を含む眼用製品の好ましい実施形態では、粘度調整剤は、前記組成物の重量に基づいてより好ましくは０．０５〜２．０ｗｔ％の濃度のＴＳＰ、ＣＭＣ、またはそれらの混合物である。
【００８０】
より好ましい実施形態では、前記粘度調整剤は、前記組成物の重量に基づいて好ましくは０．０５〜２．０ｗｔ％の濃度のＴＳＰを含む。
【００８１】
代替的には、前記粘度調整剤は次の１つ以上とのＴＳＰの混合物を含む：ＰＶＰ、カルボキシビニルポリマー、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ムコ多糖、セルロースおよびそれらのエステル、天然ガムおよびそのエステル、ペクチン、およびポリアクリレート。
【００８２】
前記粘度調整剤が前記組成物の重量に基づいて好ましくは０．０５〜２．０ｗｔ％の濃度のＴＳＰである組成物が特に好ましい。
【００８３】
さらに、本発明に従う眼用製品は、ユニットドーズ形態でもまた、眼科的に受け入れられる賦形剤を含み得る。用語「眼科的に受け入れられる賦形剤」は、眼の外側表面への投与のための組成物への使用にとって好適な化合物または混合物を意味する。例えば、この種類の賦形剤は概して有害な反応をユーザに引き起こさず、眼の表面における活性成分の作用をも有意に阻害しない。
【００８４】
好適な賦形剤は抗酸化剤、ゲル化剤、封鎖剤、結合剤、潤滑剤、増粘剤、張度調整剤、フィルム形成物質、およびそれらの混合物である。
【００８５】
従って、好適な抗酸化剤はメタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、グルコース、システイン、およびそれらの混合物である。
【００８６】
好適な封鎖剤は、ＥＤＴＡならびにその一ナトリウム、二ナトリウム、およびカリウム塩、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸、ヘキサメチレンジアミンテトラメチルホスホン酸、エチレンジアミンテトラメチルホスホン酸、アミノトリメチレンホスホン酸、ならびにそれらの混合物である。
【００８７】
好ましくは、封鎖剤はＥＤＴＡ、その一ナトリウム、二ナトリウム、およびカリウム塩、ならびにそれらの混合物である。
【００８８】
好適な張度調整剤は、無機塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、および塩化カルシウム、またはポリオールもしくは糖、例えばグリセロール、プロピレングリコール、エリスリトール、マンニトール、ソルビトール、およびトレハロース、またはアミノ酸、例えばカルニチンおよびベタインである。
【００８９】
さらなる態様では、本発明は、皮膚科、婦人科、耳鼻咽喉科、または歯科病理の局所処置への前記組成物の使用に関する。
【００９０】
なおさらなる態様では、本発明は、特に局所外用使用のための製品のスージング剤としての、前記組成物の化粧品使用に関する。
【００９１】
実際に、本発明の組成物に含有されるグリチルリチンは、敏感なおよびデリケートな皮膚の処置および保護が意図される製品に有用であり得る。なぜなら、それは、例えば小児のための調合物において、アフターシェーブにおいて、ならびにアフターサン製品において、炎症した、発赤した、またはアトピー性および脂漏性皮膚炎ならびに概して刺激に弱い皮膚のための製品において、スージング剤として有効であるからである。それは小さいドーズ（０．５および１％の間）においてさえもその活性を成し、そのレベルでは、それはいずれかの副作用を有さない。よって、それは、低いパーセンテージの１８β−グリチルレチン酸を含有しかつ最終製品に見栄えのしない暗色を持たせ得る甘草エキスの使用を廃する。
【００９２】
医薬品または化粧品組成物が局所外用または内用経路によって投与されるべきであるときには、前記組成物は好ましくは溶液、ローション、エマルション、懸濁液、ゲル、軟膏、クリーム、ペースト、溶液スプレー、経皮パッチ、スプレーオンパッチ、フォーム剤、またはウェットワイプの形態であり、組成物は好ましくは懸濁液であるかまたは１つ以上の好適な賦形剤中に溶解される。
【００９３】
これらの投与形態にとって好適である賦形剤の例は、鉱油、液体パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、乳化ワックス、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、セチルステアリルアルコール、ステアリン酸、ステアリン酸グリセリル、ラウリルサルコシン酸ナトリウム、グリセリン、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリエチレングリコール、デンプン、カーボポール、カルボマー、メチルパラベン、ポロキサマー４０７、マクロゴール４００、精製ベントナイト、プロピルパラベン、プロピオン酸ミリスチル、ジメチコン、二酸化チタン、アニオン性、カチオン性、および非イオン性界面活性剤、水、ならびにそれらの混合物である。
【００９４】
好ましくは、本発明に従う医薬品または化粧品組成物は局所外用経路によって投与されるべきである。
【００９５】
上で報告されている通りの組成物の構成成分の、ならびにそれを含有する製品、それらの調製および使用の好ましい態様の全ての組み合わせは、本明細書によって開示されておりかつ類似に好ましいと見なされるであろうということは理解されるはずである。
【００９６】
上で開示されている本発明の組成物、調製プロセス、および使用の好ましい態様の全ての組み合わせは本明細書に記載される通り理解されるであろうということもまた理解されるはずである。
下は、例示目的のために提供される本発明の実施例である。
【実施例】
【００９７】
材料
【００９８】
【表１】
2021530521.tif 000008
【００９９】
ＨＡＳ、ＴＳＰ、およびＧＡを含む組成物の調製
０．４％のＨＡＳおよび０．２％のＴＳＰに達する最終含量（重量／体積パーセンテージとして与えられる）で、組成物をｄＨ２Ｏおよびクエン酸緩衝液によって調製した；一方で、ＧＡを異なる濃度で追加した（０．０５％、０．１％、および０．２％重量／体積）。
ステップ１：およそ４００ｍｇのＨＡＳを１００ｍｌフラスコ内の３０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解し、それから、それの完全な溶解を保証するために室温で２４ｈに渡って撹拌下に放置した。
ステップ２：クエン酸緩衝液の構成成分（２．８ｇマンニトール、０．８ｇクエン酸ナトリウム、０．０１ｇクエン酸）を秤量し、室温において３０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解した；これの後に、２００ｍｇのＴＳＰを磁石撹拌下において追加し、同じ温度を維持した。完全な溶解後に、ステップ２において、ステップ１を追加した。Ｈ２Ｏ中の組成物では、２００ｍｇのＴＳＰをｄＨ２Ｏ中にのみ溶解した。
ステップ３：およそ４００ｍｇを５０ｍｌ丸底フラスコに秤取し、これをその後に２０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に温めて（油浴の手段によって５０℃）溶解することによって、２％重量／体積のＧＡのストック溶液を調製した；一度溶液が冷却したら、次のサンプルを取り、これらをその後にステップ２に追加した：
−  ０．２％ＧＡの組成物では１０ｍｌ；
−  ０．１％ＧＡの組成物では５ｍｌ；
−  ０．０５％ＧＡの組成物では２．５ｍｌ。
追加後に、組成物をｄＨ２Ｏによってメスアップし（１００ｍｌ）、調製の最後に、ｐＨを測定し、クエン酸緩衝液中の組成物ではおよそ６．５および水中のものではおよそ５を得た。
【０１００】
例１：クエン酸緩衝液中のＨＡＳ、ＴＳＰ、および０．１％ＧＡの組成物
ステップ１：０．４００３ｇのＨＡＳを秤量し、室温において３０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解した。
ステップ２：クエン酸緩衝液の構成成分を秤量し（２．８００３ｇマンニトール、０．８００２ｇクエン酸ナトリウム、０．０１０３ｇクエン酸）、室温において３０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解した；これの後に、０．２００４ｇのＴＳＰを追加し、完全な溶解後に、ステップ１を追加した。
ステップ３：０．４００４ｇのＧＡを秤量し、油浴の手段による５０℃の温度への加熱によって２０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解した。
完全な可溶化後に、ストック溶液を放置して冷却させた後に、５ｍｌのステップ３をステップ２に追加した。
最終的に、溶液をｄＨ２Ｏによってメスアップした（１００ｍｌ）。最終ｐＨ：６．９７。
【０１０１】
例２：水中のＨＡＳ、ＴＳＰ、および０．１％ＧＡの組成物
ステップ１：０．４００５ｇのＨＡＳを秤量し、室温において３０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解した。
ステップ２：０．２００２ｇのＴＳＰを秤量し、室温において３０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解した。完全な溶解後に、ステップ１を追加した。
ステップ３：０．４００２ｇのＧＡを秤量し、油浴の手段による５０℃の温度への加熱によって２０ｍｌのＨ２Ｏ中に溶解した。
完全な可溶化後に、ストック溶液を放置して冷却させた後に、５ｍｌのステップ３をステップ２に追加した。最終的に、溶液をｄＨ２Ｏによってメスアップした（１００ｍｌ）。最終ｐＨ：５．７０。
【０１０２】
ＨＡＳ、ＣＭＣ、およびＧＡを含む組成物の調製
０．４％のＨＡＳおよび０．２％のＣＭＣに達する最終含量（重量／体積パーセンテージとして与えられる）で、組成物をｄＨ２Ｏおよびクエン酸緩衝液によって調製した；一方で、ＧＡを異なる濃度で追加した（０．０５％、０．１％、および０．２％重量／体積）。
ステップ１：およそ４００ｍｇのＨＡＳを１００ｍｌフラスコ内の３０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解し、それから、それの完全な溶解を保証するために室温において２４ｈに渡って撹拌下に放置した。
ステップ２：クエン酸緩衝液の構成成分を秤量し（２．８ｇマンニトール、０．８ｇクエン酸ナトリウム、０．０１ｇクエン酸）、ｄＨ２Ｏ中に溶解した；これの後に、磁石撹拌下においてかつ室温で、２００ｍｇのＣＭＣを追加した。完全な溶解後に、ステップ１をステップ２に追加した。Ｈ２Ｏ中の組成物では、２００ｍｇのＣＭＣをｄＨ２Ｏ中にのみ溶解した。
ステップ３：およそ４００ｍｇを５０ｍｌ丸底フラスコに秤取し、これをその後に２０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に温めて（油浴の手段によって５０℃）溶解することによって、２％重量／体積のＧＡのストック溶液を調製した；一度溶液が冷却したら、次のサンプルを取り、これらをその後にステップ２に追加した：
−  ０．２％のＧＡの組成物では１０ｍｌ；
−  ０．１％のＧＡの組成物では５ｍｌ；
−  ０．０５％のＧＡの組成物では２．５ｍｌ。
追加後に、組成物をｄＨ２Ｏによってメスアップした（１００ｍｌ）。調製の終わりに、ｐＨを測定し、クエン酸緩衝液中の組成物ではおよそ６．５および水中のものではおよそ５を得た。
【０１０３】
例３：クエン酸緩衝液中の組成物ＨＡＳ、ＣＭＣ、および０．１％ＧＡ
ステップ１：０．４００７ｇのＨＡＳを秤量し、室温において３０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解した。
ステップ２：クエン酸緩衝液の構成成分を秤量し（２．８００１ｇマンニトール、０．８００８ｇクエン酸ナトリウム、０．０１０７ｇクエン酸）、室温において３０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解した。これの後に、０．２００４ｇのＣＭＣを追加し、完全な溶解後に、ステップ１を追加した。
ステップ３：０．４００４ｇのＧＡを秤量し、油浴の手段による５０℃の温度への加熱によって２０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解した。
完全な可溶化後に、ストック溶液を放置して冷却させた後に、５ｍｌのステップ３をステップ２に追加した。最終的に、溶液をｄＨ２Ｏによってメスアップした（１００ｍｌ）。最終ｐＨ：６．６３。
【０１０４】
例４：水中のＨＡＳ、ＣＭＣ、および０．１％ＧＡの組成物
ステップ１：０．４００６ｇのＨＡＳを秤量し、室温において３０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解した。
ステップ２：０．２００９ｇのＣＭＣを秤量し、室温において３０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解した。完全な溶解後に、ステップ１を追加した。
ステップ３：０．４００４ｇのＧＡを秤量し、油浴の手段による５０℃の温度への加熱によって２０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解した。
完全な可溶化後に、ストック溶液を放置して冷却させた後に、５ｍｌのステップ２をステップ１に追加した。最終的に、溶液をｄＨ２Ｏによってメスアップした（１００ｍｌ）。最終ｐＨ：５．０５。
【０１０５】
緩衝液改変評価
０．４％のＨＡＳおよび０．２％のＴＳＰに達する最終含量（重量／体積パーセンテージとして与えられる）で、クエン酸ナトリウムの濃度が改変された組成物を調製した；一方で、ＧＡを異なる濃度で追加した（０．０５％、０．１％、および０．２％重量／体積）。
ステップ１：およそ４００ｍｇのＨＡＳを１００ｍｌフラスコ内の３０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解し、それから、それの完全な溶解を保証するために室温において２４ｈに渡って撹拌下に放置した。
ステップ２：クエン酸緩衝液の構成成分を秤量し（２．８ｇマンニトール、０．２ｇクエン酸ナトリウム、０．０１ｇクエン酸）、ｄＨ２Ｏ中に溶解した；これの後に、磁石撹拌下においてかつ室温で、２００ｍｇのＴＳＰを追加した。完全な溶解後に、ステップ２にステップ１を追加した。Ｈ２Ｏ中の組成物では、２００ｍｇのＴＳＰをｄＨ２Ｏ中にのみ溶解した。
ステップ３：およそ４００ｍｇを５０ｍｌ丸底フラスコに秤取し、これをその後に２０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に温めて（油浴の手段によって５０℃）溶解することによって、２％重量／体積のＧＡのストック溶液を調製した；一度溶液が冷却したら、次のサンプルを取り、これらをその後にステップ２に追加した：
−  ０．２％のＧＡの組成物では１０ｍｌ；
−  ０．１％のＧＡの組成物では５ｍｌ；
−  ０．０５％のＧＡの組成物では２．５ｍｌ。
追加後に、組成物をｄＨ２Ｏによってメスアップした（１００ｍｌ）。調製の終わりに、ｐＨを測定し、クエン酸緩衝液中の組成物ではおよそ６．５および水中のものではおよそ５を得た。
【０１０６】
例５：改変クエン酸緩衝液中のＨＡＳ、ＴＳＰ、および０．１％ＧＡの組成物
ステップ１：０．４００４ｇのＨＡＳを秤量し、室温において３０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解した。
ステップ２：クエン酸緩衝液の構成成分を秤量し（２．８００９ｇマンニトール、０．２００９ｇ三塩基性クエン酸ナトリウム、０．０１０８ｇクエン酸）、室温において３０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解した。これの後に、０．２００７ｇのＴＳＰを追加し、完全な溶解後に、ステップ１を追加した。
ステップ３：０．４００４ｇのＧＡを秤量し、油浴の手段による５０℃の温度への加熱によって２０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解した。
完全な可溶化後に、ストック溶液を放置して冷却させた後に、５ｍｌのステップ３をステップ２に追加した。最終的に、溶液をｄＨ２Ｏによってメスアップした（１００ｍｌ）。最終ｐＨ：６．０２。
【０１０７】
キャラクタリゼーション：
サイズ排除クロマトグラフィー
マルチ検出器システムと併せたサイズ排除クロマトグラフィーの手段によって、次のクロマトグラフィー条件で、ＨＡＳ、ＴＳＰ、ＧＡ、ＣＭＣ、組成物、および最後に酵素消化の産物の分子量の分布のキャラクタリゼーションが成された：
−  装置：ＯｍｎｉＳＥＣシステム（マルバーン・パナリティカル・インスツルメンツ、英国）；
−  検出器：屈折率、光散乱（９０°および７°）、および粘度計；
−  カラム：直列の２つのカラムＴＳＫ−ＧＭＰＷＸＬ（７ｍｍのＩＤ×３０ｃｍのＬ、１３μｍの粒子径）；
−  移動相：ＮａＮＯ３０．１Ｍ＋ＮａＮ３０．０５％；
−  温度：４０℃；
−  流量：０．６ｍｌ／ｍｉｎ；
−  注入体積：１００μｌ；
−  クロマトグラフィー通過の時間長：６０ｍｉｎ；
ＯｍｎｉＳＥＣ−ｖ１０．３１ソフトウェアを用いて、次のｄｎ／ｄｃ値を設定して、データを取得および処理した：ＨＡＳについては０．１５５、ＴＳＰについては０．１６４、ＣＭＣについては０．１６、および組成物については０．１５９。
装置は標準の分子量、既知の多分散性、および固有粘度（ＰｏｌｙＣＡＬ−Ｐｕｌ５７ｋ、マルバーン・パナリティカル・インスツルメンツ、英国）によってキャリブレーションした。
【０１０８】
サンプルの調製：
ＨＡＳ、ＴＳＰ、およびＣＭＣサンプルを秤量し、移動相中にそれぞれおよそ４ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、および２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した；注入前に、およそ０．５ｍｇ／ｍｌを移動相によって希釈した。組成物および酵素消化の産物は移動相によって０．８および０．６ｍｇ／ｍｌの間の最終濃度に希釈された。
【０１０９】
導電率、動的光散乱（ＤＬＳ）、およびゼータ電位
ＨＡＳ、ＴＳＰ、ＧＡ、ＣＭＣ、および組成物のサイズ測定（Ｒｈ、ｎｍ）および表面電荷測定（ゼータ電位、Ｚｐ、ｍＶ）は、ゼータサイザー（マルバーン・パナリティカル）によって次の装置条件で取った：
【０１１０】
サイズ測定
−  基剤：マンニトール０．１５（温度：２５．０℃；ＲＩ１．３３４；粘度：０．９６３９ｍＰＡ＊ｓ）およびマンニトール０．０１５（温度：２５．０℃；ＲＩ１．３３０；粘度：０．８９７５ｍＰＡ＊ｓ）
−  温度：２５℃
−  １ｍｌの最小体積の使い捨てポリスチレンキュベット
−  測定角：１７３℃後方散乱（ＮＩＢＳデフォルト）
−  測定数：５
−  ソフトウェア：ゼータサイザーソフトウェアｖ７．１２
【０１１１】
ゼータ電位の測定
−  基剤：マンニトール０．１５（温度：２５．０℃；ＲＩ１．３３４；粘度：０．９６３９ｍＰＡ＊ｓ；比誘電率：７８．５）およびマンニトール０．０１５（温度：２５．０℃；ＲＩ１．３３０；粘度：０．８９７５ｍＰＡ＊ｓ；比誘電率：７８．５）
−  測定モデル：スモルコフスキー（Ｆ（ｋａ）値：１．５０）
−  温度：２５℃
−  拡散バリア法およびＭＰＴ−２オートタイトレータと適合するゼータ電位測定用使い捨てキュベット
−  測定数：５
−  ソフトウェア：ゼータサイザーソフトウェア７．１２
【０１１２】
調製サンプル：
組成物は元のままの状態で分析し、脱イオン水によって１：１０に希釈した。ＨＡＳ、ＴＳＰ、およびＣＭＣのサンプルを秤量し、クエン酸緩衝液中に溶解し、およそ４ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、および２ｍｇ／ｍｌの濃度を得、元のままの状態の組成物の分析のために２時間に渡って撹拌下に放置し、それから、組成物をＨ２Ｏによって１：１０に希釈した。
【０１１３】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ
５００ＭＨｚ（１Ｈ）で作動しかつ５ｍｍクライオプローブＴＣＩを備えたＡｖａｎｃｅスペクトロメータによって、次の条件で、溶液の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した：
−  パルスシークエンス：ｚｇｃｐｐｒ
−  温度：３００°Ｋ
−  スキャン数：１６
−  リサイクル時間（Ｄ１）：１２ｓｅｃ
−  パルス角（Ｐ１）：９０℃
−  溶媒：Ｄ２Ｏ
−  オートマティックＡｂｓ
−  装置参照：ＴＳＰを０ｐｐｍに対してキャリブレーション
−  フーリエ変換のサイズ：１３２Ｋ
−  処理ソフトウェア：ブルカーＴＯＰＳＰＩＮ４．０２
全てのスペクトルは、ＥＭ関数（指数関数）によって、かつバックグラウンドノイズの縮減のためにＬＢ０．３Ｈｚによって処理した。
【０１１４】
Ｔ１−ＮＭＲ
５００ＭＨｚ（１Ｈ）で作動するスペクトロメータによって、次の条件で、Ｔ１の計算のための１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを取得した：
−  パルスシークエンス：ｃｐｍｇ（Ｃａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ）
−  温度：３００°Ｋ
−  スキャン数：２０
−  リサイクル時間（Ｄ１）：３０ｓｅｃ
−  エコー時間（Ｄ２０）：２ｍｓｅｃ
−  パルス角（Ｐ１）：９０°および１８０°
−  溶媒：Ｄ２Ｏ
−  装置参照：ＴＳＰを０ｐｐｍに対してキャリブレーション
データの再処理のためには、ブルカーＴＯＰＳＰＩＮ４．０２をソフトウェアとしてＴ１Ｔ２計算ルーチンまたはダイナミクス・センターと共に用いた。
【０１１５】
Ｔ２−ＮＭＲ
５ｍｍクライオプローブＴＣＩを備えた５００ＭＨｚ（１Ｈ）で作動するスペクトロメータおよび５００ＭＨｚ（１Ｈ）で作動するスペクトロメータによって、次の条件で、Ｔ２の計算のための１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを取得した：
−  パルスシークエンス：：Ｔ１ＩＲ
−  温度：３００°Ｋ
−  スキャン数：１０
−  リサイクル時間（Ｄ１）：３０ｓｅｃ
−  パルス角（Ｐ１）：１８０°
−  溶媒：Ｄ２Ｏ
−  装置参照：ＴＳＰを０ｐｐｍに対してキャリブレーション
データの再処理のためには、ブルカーＴＯＰＳＰＩＮ４．０２をソフトウェアとしてＴ１Ｔ２計算ルーチンまたはダイナミクス・センターと共に用いた。
【０１１６】
１Ｈ、Ｔ１、およびＴ２スペクトルのための調製サンプル：
４ｍｇ（ＨＡＳ）および２ｍｇ（ＴＳＰおよびＣＭＣ）を秤量し、１ｍｌのＤ２Ｏまたは１ｍｌのクエン酸緩衝液中に溶解した；その後に、サンプルを凍結乾燥し、もう一度１ｍｌのＤ２Ｏ中に溶解した。それから、４ｍｇ／ｍｌのＧＡストック溶液を調製し、Ｄ２Ｏおよび緩衝液両方によって希釈し、２ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、および０．５ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。組成物のサンプルの調製のためには、１ｍｌを各サンプルから取り、その後に凍結乾燥し、１ｍｌのＤ２Ｏ中に溶解した。
最終的に、０．６ｍｌを各サンプルから取り、それから５ｍｍのＮＭＲ管に移した。
【０１１７】
結果：
【０１１８】
【表２】
2021530521.tif 000009
【０１１９】
上で示されているクロマトグラフィーデータから分かる通り、ＧＡの存在は、実験作業に用いられた濃度では、ＨＡＳ＋ＴＳＰ複合物またはＨＡＳ＋ＣＭＣ複合物どちらかの物理化学的特性、例えば分子量および粘度を変化させない。
【０１２０】
【表３】
2021530521.tif 000010
【０１２１】
上で示されているデータから、ＨＡＳおよびＴＳＰだけを有する組成物に対して、ＧＡの存在はポリマーマトリックスのコンフォメーションを有意に変化させるということが分かる：ＧＡの濃度が増大すると、流体力学的半径および表面電荷は両方とも減少する。
【０１２２】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）
１ＮＭＲの結果：
０．０５％よりも上の濃度では、ＧＡは溶液よりもゲルと適合するスペクトルを有するということが観察された。
ＨＡＳ（０．４％）およびＴＳＰ（０．２％）の存在下では、ＧＡのＮＭＲプロファイルは変化する。これは、とりわけ水中で、かつ好ましくは０．０５％よりも上の濃度において、２つの多糖がそれの分散をより容易にするということを示唆する。
また、ＮＭＲは調合物のキャラクタリゼーションおよび定量にとって良好な分析アプローチであることが判明している。実際に、図１で分かる通り、０．１％濃度（ａ）から０．２％濃度（ｂ）への変更によって、ＧＡシグナルの幅広化が観察され得る。これは、ＨＡＳおよびＴＳＰの存在下における溶液中の分子のより多大な可溶性および溶解に帰せられた。
【０１２３】
Ｔ１およびＴ２の結果：
図２および３の参照によると、ＨＡＳ（０．４％）およびＴＳＰ（０．２％）の存在下では次のことが観察された：
１）ＧＡシグナルの平均Ｔ２は、水およびクエン酸緩衝液両方において、ＨＡＳだけまたはＴＳＰだけの追加によって増大し、ＨＡＳ＋ＴＳＰ混合物ではより多大な値を得た。この増大は、ＨＡＳ＋ＴＳＰの存在下におけるＧＡ分子のより多大な運動性および水溶液中のより良好な分散に帰せられた。
２）水中では（図２）、Ｔ１値よりも多大なＴ２値は液体よりもゲルの挙動と適合するスピードを意味する。
３）水中では（図２）、調合物ＨＡＳ＋ＴＳＰ＋ＧＡのＧＡシグナルの平均Ｔ１値は元のままの状態のＧＡよりも少しである。この結果は溶液よりもむしろ固体／ゲルの運動のスピードと適合する挙動を裏付けている。
４）クエン酸緩衝液中では（図３）、ＧＡシグナルの平均のＴ１およびＴ２値は異なる調合物において元のままの状態のＧＡに似通っている。
５）緩衝液中のＴ２の値（図３）は水中のＴ２の値（図２）よりも多大であり、イオン強度の変化によるＧＡ分子のより良好な分散を意味する。
６）緩衝液中では（図３）、水中で見出される違い（図２）はより有意ではない。
【０１２４】
酵素消化
先に記載された方法を踏襲して調製されたｄＨ２Ｏ中およびクエン酸緩衝液中の両方の組成物に対して、酵素消化試験を成した。
２０ｍｇのＨｙａを秤量し、室温において２ｍｌの水中に溶解した；それから、０．１ｍｌを取り、組成物の５０ｍｌサンプルに追加した（１０／０．１に達するＨＡＳ／Ｈｙａ重量比）。２４時間の過程に渡って３８℃において消化を行い、１ｍｌサンプルを１５および３０分に、それから最初の６ｈに渡って毎時間、および２４時間後に一度取ることによって分子量の縮減をモニタリングした）。各サンプリング後に、サンプリングされた溶液を１００℃において撹拌下で５分に渡って放置して酵素を変性し、それから濾過して酵素沈殿物を除去した（フィルター：ＬＬＧシリンジフィルター、ＣＡポアサイズ０．２０μｍ、直径１３ｍｍ）。
【０１２５】
パーセンテージとしての経時的な分子量の減少の計算：
（Ｍｗｔ０−Ｍｗｔｎ）／Ｍｗｔ０×１００
【０１２６】
結果：
【０１２７】
【表４】
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【０１２８】
【表５】
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【０１２９】
【表６】
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【０１３０】
【表７】
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【０１３１】
上で示されている結果に基づいて、異なる組成物について観察されたパーセンテージの減少を下で比較している：
【０１３２】
【表８】
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【０１３３】
【表９】
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【０１３４】
【表１０】
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【０１３５】
【表１１】
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【０１３６】
上で示されている結果に基づいて、異なる組成物について観察されたパーセンテージの減少を下で比較している：
【０１３７】
【表１２】
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【０１３８】
【表１３】
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【０１３９】
【表１４】
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【０１４０】
【表１５】
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【０１４１】
【表１６】
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【０１４２】
上で示されているデータからは、クエン酸緩衝液の濃度の改変がＨＡＳの解重合に対する有意な減速効果を有するということが観察された；特にＨＡＳ＋ＴＳＰ＋ＧＡ０．１％調合物では、２２ｈ後に、分子量の減少は５７％だけである。
【０１４３】
それから、本発明に従う組成物に対するインパクトを評価するために、異なる緩衝液によって試験を実施した。
【０１４４】
次の緩衝液を調製し、用いた：
緩衝液１：２．８％マンニトール、０．８％クエン酸ナトリウム、０．０１％クエン酸
緩衝液２：２．８％マンニトール、０．２％クエン酸ナトリウム、０．０１％クエン酸
緩衝液３：２．８％マンニトール、０．２％クエン酸ナトリウム、０．００２５％クエン酸
緩衝液４：２．８％マンニトール、０．４％クエン酸ナトリウム、０．００５％クエン酸
緩衝液５：２．８％マンニトール、０．２６６％クエン酸ナトリウム、０．００３３％クエン酸
【０１４５】
【表１７】
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【０１４６】
それから、ＨＡＳ、ＴＳＰ、ＧＡを含む組成物を調製し、それらは上に記されている異なる緩衝液によって調合した。
これらの試験の結果を下の表に示している：
【０１４７】
【表１８】
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【０１４８】
概して、一方では減少するように見えたそれが０．２％で存在するときを除いて、導電率は多糖およびＧＡの存在下では増大するということが観察された。酢酸ナトリウムを減少させると、導電率は減少したが、クエン酸は効果が観察されなかった。
【０１４９】
ＨＡＳ＋ＴＳＰ＋ＧＡ０．２％を含む組成物をさらに調べて、異なる緩衝液の存在下における経時的な平均分子量傾向を評価した：
【０１５０】
【表１９】
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【０１５１】
上に記されているデータからは、クエン酸緩衝液中における消化の最初の６時間に、ＧＡおよびＴＳＰの存在はヒアルロニダーゼによるＨＡＳの解重合を減速させるということが観察された；それでも、２２時間後に、解重合は完全であった。
【０１５２】
一方で、水中の調合物中のＧＡおよびＴＳＰの組み合わせ効果はヒアルロニダーゼの作用をほぼ全く遮断した。これの結果として、ＨＡＳの分子量の減少は観察されなかった。
【０１５３】
よって、必要に応じて、ｐＨおよびイオン強度両方ならびに緩衝液の存在および非存在を調節し、結果的に、ヒアルロニダーゼがＨＡＳに対して有する効果に加えて、ＧＡのバイオアベイラビリティを調節することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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