(57)【要約】  本発明は、とりわけ、細胞、組織、臓器又は生物中の核酸を検出及び／又は定量するための技術を提供する。逐次バーコード化を通して、本発明は、多数の標的、例えば転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座のハイスループットプロファイリングのための方法を提供する。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、切断可能リンカーを介して結合配列と連結されたシグナル部分を含む。
2021505152.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、逐次ハイブリダイゼーション方法：
ａ）標的核酸分子を複数の一次プローブと接触させる工程であって、各一次プローブは、以下：
標的核酸分子内の相補的標的配列に結合する一次結合配列、及び
一次結合配列の一端に連結され、一次結合配列に連結された１つ以上の結合標的を含む、一次結合配列の一端に連結された第一の突出配列
を含む、工程；
ｂ）標的核酸分子を第一の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブが、シグナル部分を含み、各読み出しプローブが、複数の一次プローブのうちの一次プローブのうちの１つ以上の結合標的の第一の結合標的と相互作用し、
シグナル部分が、第一の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブと、複数の一次プローブのうちの一次プローブのうちの１つ以上の結合標的のうちの第一の結合標的との相互作用時に、第一の検出可能な可視シグナルを放出することができる、
工程；
ｃ）第一の複数の読み出しプローブと複数の一次プローブとの間の相互作用が、第一の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｂ）の後の標的核酸分子をイメージングする工程；
ｄ）標的核酸分子、複数の一次プローブ、及び第一の複数の読み出しプローブと変性剤を含む溶液と接触させる工程であって、溶液と標的核酸分子、複数の一次プローブ、及び第一の複数の読み出しプローブとの接触が、複数の一次プローブと標的核酸分子との相互作用を妨害しないが、複数の一次プローブと第一の複数の読み出しプローブの除去を可能にする第一の複数の読み出しプローブとの間の相互作用を妨害する、工程；
ｅ）標的核酸分子を第二の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブは、シグナル部分を含み、各読み出しプローブは、第一の複数の読み出しプローブの第二の結合標的と相互作用し、
シグナル部分は、第二の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブの相互作用時に、第二の検出可能な可視シグナルを放出することが可能である、
工程；及び
ｆ）第二の複数の読み出しプローブと複数の一次プローブとの間の相互作用が、第二の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｅ）の後の標的核酸分子をイメージングする工程。
【請求項２】
以下をさらに含む、請求項１に記載の方法：
ｇ）標的核酸分子、複数の一次ブリッジプローブ、及び第二の複数の読み出しプローブを、変性剤を含む溶液と接触させる工程であって、溶液と標的核酸分子、複数の一次プローブ、及び第二の複数の読み出しプローブとの接触が、複数の一次プローブと標的核酸分子との相互作用を妨害しないが、第二の複数の読み出しプローブの除去を可能にする複数の一次ブリッジプローブと第二の複数の読み出しプローブとの間の相互作用を妨害する、工程；
ｈ）標的核酸分子を第三の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブは、シグナル部分を含み、各読み出しプローブは、一次プローブの１つ以上の結合標的の第三の結合標的と相互作用し、
シグナル部分は、第三の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブの相互作用時に、第三の検出可能な可視シグナルを放出することが可能である
工程；及び
ｉ）第三の複数の読み出しプローブと複数の一次プローブとの間の相互作用が、第三の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｈ）の後の標的核酸分子をイメージングする工程。
【請求項３】
いくつかの実施形態において、複数の一次プローブにおける各一次プローブは、さらに、一次結合配列の他端に連結された第二の突出配列を含み、一次結合配列に直列に連結され、連結された１つ以上の追加の結合標的を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
以下の工程をさらに含む、請求項３記載の方法：
ｃ１）工程ｃ）の後に、標的核酸分子を第四の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブはシグナル部分を含み、各読み出しプローブは、複数の一次プローブにおける一次プローブの第二のオーバーハング配列の第一の追加の結合標的と相互作用する、工程；及び
ｃ２）複数の一次プローブにおける第四の複数の読み出しプローブと一次プローブの第二のオーバーハング配列との間の相互作用が、第四の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｃ１）の後の標的核酸分子をイメージングする工程；
ここで、ｃ１）〜ｃ２）の工程が、方法の工程ｄ）の前に起こる。
【請求項５】
以下の工程をさらに含む、請求項４記載の方法：
ｅ１）工程ｅ）の後に、標的核酸分子を第５の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブはシグナル部分を含み、各読み出しプローブは、複数の一次プローブにおける一次プローブの第二のオーバーハング配列の第二の追加の結合標的と相互作用する、工程；及び
ｅ２）複数の一次プローブにおける第５の複数の読み出しプローブと一次プローブの第二のオーバーハング配列との間の相互作用が、第５の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｅ１）の後に標的核酸分子をイメージングする工程。
【請求項６】
任意の複数の読み出しプローブ中の各読み出しプローブは、複数の一次プローブ中のその結合標的にハイブリダイズすることによって、その結合標的と相互作用する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
任意の複数の読み出しプローブ中の各読み出しプローブは、以下：（ｉ）複数の一次プローブの一次プローブの第一のオーバーハング配列の全て又は一部に相補的な配列、及び（ｉｉ）読み出しプローブが結合する配列を含むブリッジプローブにハイブリダイズすることによって、その結合標的と相互作用する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的核酸分子が、ＲＮＡ又はＤＮＡである、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記標的核酸分子が、インタクトな細胞内にある、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記インタクトな細胞が、原核細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記インタクトな細胞が、真核細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記インタクトな細胞が、哺乳動物細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記インタクトな細胞が、ヒト細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
以下を含む、逐次ハイブリダイゼーション方法：
ａ）標的分子と複数の一次抗体とを接触させる工程であって、各一次抗体は、直列に連結され、一次抗体に連結された１つ以上の結合標的を含む、工程；
ｂ）標的分子を第一の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブは、シグナル部分を含み、各読み出しプローブは、複数の一次抗体の一次抗体の第一の結合標的の第一の結合標的と相互作用し、
シグナル部分は、第一の複数の読み出しプローブから複数の一次抗体の第一の結合標的への各読み出しプローブの相互作用時に第一の検出可能な可視シグナルを放出することが可能である、工程；
ｃ）工程ｂ）の後の標的分子をイメージングして、第一の複数の読み出しプローブと複数の一次抗体との間の相互作用が、第一の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるようにする工程；
ｄ）標的分子及び複数の一次抗体を第一の複数の読み出しプローブと変性剤を含む溶液と接触させる工程であって、溶液と標的分子、複数の一次抗体及び第一の複数の読み出しプローブとの接触では、複数の一次抗体と標的分子との相互作用が妨害されないが、第一の複数の一次抗体と第一の複数の読み出しプローブとの間の相互作用を妨害し、第一の複数の読み出しプローブの除去を可能にする、工程；
ｅ）標的分子及び複数の一次抗体を第二の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブはシグナル部分を含み、各読み出しプローブは、複数の一次抗体の一次抗体の第二の結合標的と相互作用し、
シグナル部分は、各読み出しプローブと複数の一次抗体の第二の結合標的との相互作用時に、第二の検出可能な可視シグナルを放出することが可能である、工程；及び
ｆ）第二の複数の読み出しプローブと複数の一次抗体との間の相互作用が、第二の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｅ）の後の標的核酸分子をイメージングする工程。
【請求項１５】
以下の工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法：
ｇ）標的分子、複数の一次抗体、及び第二の複数の読み出しプローブを変性剤を含む溶液と接触させる工程であって、溶液と標的分子、複数の一次抗体、及び第二の複数の読み出しプローブとの接触は、複数の一次抗体と標的分子との相互作用を妨害しないが、第二の複数の読み出しプローブの除去を可能にする複数の一次抗体と第二の複数の読み出しプローブとの間の相互作用を破壊する、工程；
ｈ）標的分子及び複数の一次抗体と第三の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブは、シグナル部分を含む工程であって、各読み出しプローブは、複数の一次抗体の一次抗体の第三の結合標的と相互作用し、
シグナル部分は、第三の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブの相互作用時に、第三の検出可能な可視シグナルを発することが可能である、工程；及び
ｉ）第三の複数の読み出しプローブと複数の一次抗体との間の相互作用が第三の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｈ）の後の標的核酸分子をイメージングする工程。
【請求項１６】
任意の複数の読み出しプローブ中の各読み出しプローブが、複数の一次抗体中のその結合標的にハイブリダイズすることによって、その結合標的と相互作用する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
任意の複数の読み出しプローブにおける各読み出しプローブが、以下：
（ｉ）複数の一次抗体の一次抗体の１つ以上の結合標的に相補的な配列、及び
（ｉｉ）読み出しプローブが結合する配列、
を含む橋梁プローブにハイブリダイズすることによって、その結合標的と相互作用する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的分子が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はタンパク質である、請求項１４〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記標的分子が、インタクトな細胞内にある、請求項１４〜１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記インタクトな細胞が、原核細胞である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記インタクトな細胞が、真核細胞である、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記インタクトな細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記インタクトな細胞が、ヒト細胞である、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
前記１つ以上の結合標的が、３つ以上の結合標的を含む、請求項１又は１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記追加の１つ以上の結合標的が、３つ以上の読み出し結合標的を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記変性剤がホルムアミドである、請求項１〜２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記変性剤が尿素である、請求項１〜２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記ホルムアミドが６０％（ｖ／ｖ）％の濃度で前記溶液中に存在する、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記ホルムアミドが６０％（ｖ／ｖ）未満のパーセント濃度で前記溶液中に存在する、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
前記ホルムアミドが約３０％及び６０％（ｖ／ｖ）の間のパーセント濃度で前記溶液中に存在する、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
前記ホルムアミドが約３５％及び６０％（ｖ／ｖ）の間のパーセント濃度で存在する、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記ホルムアミドが約４０％及び６０％（ｖ／ｖ）の間のパーセント濃度で存在する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記ホルムアミドが約４５％及び６０％（ｖ／ｖ）の間のパーセント濃度で存在する、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記ホルムアミドが約５０％及び６０％（ｖ／ｖ）の間のパーセント濃度で存在する、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記ホルムアミドが約５５％及び６０％（ｖ／ｖ）の間のパーセント濃度で存在する、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記読み出しプローブが、長さ１７ヌクレオチドである、請求項１〜３５のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
前記読み出しプローブが、長さ１７ヌクレオチド未満である、請求項１〜３５のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
前記読み出しプローブが、長さ１０及び１７ヌクレオチドの間である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記読み出しプローブが、長さ１１及び１７ヌクレオチドの間である、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記読み出しプローブが、長さ１２及び１７ヌクレオチドの間である、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記読み出しプローブが、長さ１３及び１７ヌクレオチドの間である、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記読み出しプローブが、長さ１４及び１７ヌクレオチドの間である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記読み出しプローブが、長さ１５及び１７ヌクレオチドの間である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記読み出しプローブが、長さ１０ヌクレオチド未満である、請求項１〜３５のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
前記読み出しプローブが、長さ５及び１０ヌクレオチドの間である、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記読み出しプローブが、長さ６及び９ヌクレオチドの間である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記読み出しプローブが、長さ７〜８ヌクレオチドである、請求項４６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１７年１２月８日に出願した米国仮出願第６２／５９６，３３７号の利益を主張し、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究又は開発の記載）
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号第ＨＤ０７５６０５号に基づく政府支援にて作成された。米国政府は、本発明にある一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
細胞の転写プロファイリングは、多くの目的に不可欠である。単一細胞中の多重ｍＲＮＡを解像することができる顕微鏡イメージングは、転写物の存在量と局在化に関する貴重な情報を提供することができ、これは細胞同定の分子的基礎を理解し、疾患の治療を開発するために重要である。したがって、例えば顕微鏡イメージングによる、細胞中のプロファイル転写物のための新規かつ改良された方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
（本発明の概要）
本発明は、特に単一細胞について、細胞中の転写物又はＤＮＡ遺伝子座をプロファイリングするための現存の技術に関連する難題又は欠陥に関するある一定の洞察を提供する。そして、本発明は、単一細胞のものを含めた、有効なこのようなプロファイリングを達成するための新規の技術を提供する。提供される技術は、例えば、単離された細胞、組織中の細胞、器官中の細胞、及び／又は生物体中の細胞のプロファイリングのためを含めて、広く有益である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
例えば、本発明は、単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ又はｑＰＣＲといった現存の技術が、単離され、マルチウェルフォーマットに入れられることになる単一細胞を必要とするという洞察を提供し、これは、コストがかかり、労働集約的であり、アーティファクトを生じやすい複数工程プロセスである。さらに、本発明は、ｍＲＮＡを最初にＤＮＡ鋳型に変換するために酵素反応を用いる現存のｉｎ  ｓｉｔｕシークエンシング技術は、高度に非効率的であり得（例えば、ｍＲＮＡからＤＮＡへの変換プロセスにおいて）、それゆえ、しばしば、ＲＮＡの小画分のみしか変換及び検出されないことを、認識する。本発明は、ＲＴに対して１％及びＰＬＡに対して１０％と見積もられるこのような低効率の主要な欠点面の一つが、遺伝子発現計測において顕著なノイズ及びバイアスを導入し得るという、特別な洞察を提供する。本発明はさらに、単一分子蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｓｍＦＩＳＨ）を利用する現存のスペクトルｍＲＮＡバーコード化技術は、スケールアップのために別個のフルオロフォアを必要とし、生成できるバーコードの数が制限される可能性があることを認識する。ｓｍＦＩＳＨはまた、ハイブリダイゼーションの間にプローブをバーコード化サブセットに分割することを必要とする。ｓｍＦＩＳＨは、しばしば標的に２つ以上の色を使用するため、画像中に物体が高密度になり、データ解析の複雑さを増大し得る。
【０００６】
とりわけ、本発明は、例えば、転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座をプロファイリングするための新規の技術を提供し、それらは、本発明に先立つ方法に関連する問題の一つ以上又は全てを克服する。いくつかの実施形態において、本発明は、異なる標的の多重化を可能にする逐次バーコード化スキームを介して、細胞中の多重標的、例えば転写物又はＤＮＡ座位を検出する方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本発明は、以下の工程を含む方法を提供する：
（ａ）複数の核酸を含む細胞を、第一の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと接触させることを含む第一の接触工程を実行する工程であって、その各々が核酸を標的とし、検出可能な部分で標識され、それゆえに、組成物は、少なくとも以下を含む、工程：
（ｉ）第一の核酸を標的とし、第一の検出可能な部分で標識された第一のオリゴヌクレオチド；及び
（ｉｉ）第二の核酸を標的とし、第二の検出可能な部分で標識された第二のオリゴヌクレオチド；
（ｂ）第一の複数のオリゴヌクレオチドによるそれらの標的との相互作用が検出されるように、第一の接触工程の後に細胞をイメージングする工程；
（ｃ）細胞を、第二の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと接触させることを含む第二の接触工程を実施する工程であって、第二の複数は、第一の複数によって標的とされる重複する核酸を標的とするオリゴヌクレオチドを含み、それゆえに、第二の複数は、少なくとも以下を含む、工程：
（ｉ）第一のオリゴヌクレオチドと配列が任意で同一である、第一の核酸を標的とする、第三のオリゴヌクレオチド；及び
（ｉｉ）第二のオリゴヌクレオチドと配列が任意で同一である、第二の核酸を標的とする、第四のオリゴヌクレオチド、
であって、第二の複数は、第二の複数中に存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、第一の複数中の同一の核酸を標的とする対応するオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能部分で標識されている点で第一の複数とは異なり、それゆえに、第二の複数中で、以下である、工程：
（ｉｉｉ）第三のオリゴヌクレオチドは、第一の検出可能な部分、第二の検出可能な部分又は第三の検出可能な部分で標識される；かつ
（ｉｖ）第四のオリゴヌクレオチドは、第一の検出可能な部分、第二の検出可能な部分、第三の検出可能な部分、又は第四の検出可能な部分で標識される、
であって、第三のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能な部分で標識されるか、又は第四のオリゴヌクレオチドは、第二のオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能な部分で標識されるか、又はその両方である、工程；
（ｄ）第二の複数のオリゴヌクレオチドによるそれらの標的との相互作用が検出されるように、第二の接触工程の後に細胞をイメージングする工程；及び
（ｅ）第一及び第二の複数の核酸によって標的とされる重複核酸を標的とするオリゴヌクレオチドを含む新規の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドとの、各回ごとでの、接触及びイメージング工程を、任意で繰り返す工程であって、各々の利用された複数は、同じ核酸を標的とするオリゴヌクレオチドの検出可能な部分標識における少なくとも１つの差異のために、互いに利用された複数とは異なる、工程。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は（例えば、図１に示されるように）、以下の工程を含む方法を提供する：
（ａ）複数の転写物及びＤＮＡ遺伝子座を含む細胞と、第一の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を含む第一の接触工程を実施する工程であって、その各々が転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、検出可能な部分で標識され、それゆえに、組成物は、少なくとも以下を含む、工程：
（ｉ）第一の転写物又はＤＮＡ座を標的とし、第一の検出可能な部分で標識された第一のオリゴヌクレオチド；及び
（ｉｉ）第二の転写物又はＤＮＡ座を標的とし、第二の検出可能な部分で標識された第二のオリゴヌクレオチド；
（ｂ）第一の複数のオリゴヌクレオチドとそれらの標的による認識が検出されるように、第一の接触工程の後の細胞をイメージングする工程；
（ｃ）細胞を、第二の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む第二の接触工程を実施する工程であって、第二の複数は、第一の複数によって標的とされる重複する転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする複数のオリゴヌクレオチドを含み、それゆえに、第二の複数は、少なくとも以下を含む、工程：
（ｉ）第一のオリゴヌクレオチドと配列が任意で同一であり、第一の転写物又はＤＮＡ座を標的とする、第三のオリゴヌクレオチド；及び
（ｉｉ）第二のオリゴヌクレオチドと配列が任意で同一であり、第二の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする、第四のオリゴヌクレオチド、
であって、第二の複数は、第二の複数中に存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、第一の複数中の同一の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする対応するオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能な部分で標識されている点で第一の複数とは異なり、それゆえに、第二の複数中で、以下である、工程：
（ｉｉｉ）第三のオリゴヌクレオチドは、第一の検出可能な部分、第二の検出可能な部分又は第三の検出可能な部分で標識される；かつ
（ｉｖ）第四のオリゴヌクレオチドは、第一の検出可能な部分、第二の検出可能な部分、第三の検出可能な部分、又は第四の検出可能な部分で標識される、
であって、第三のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能な部分で標識されるか、又は第四のオリゴヌクレオチドは、第二のオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能な部分で標識されるか、又はその両方である、工程；
（ｄ）第二の複数のオリゴヌクレオチドによるそれらの標的との認識が検出されるように、第二の接触工程の後の細胞をイメージングする工程；及び
（ｅ）第一及び第二の複数によって標的とされる重複転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とするオリゴヌクレオチドを含む新規の複数の検出可能な標識オリゴヌクレオチドとの、各回ごとでの、接触及びイメージング工程を、任意で繰り返す工程であって、各々が利用された複数は、同じ転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とするオリゴヌクレオチドの検出可能な部分標識における少なくとも１つの差異のために、互いに利用された複数とは異なる、工程。
【０００９】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドによって標的とされた核酸は、転写物及び／又はＤＮＡ座であるか、又は転写物及び／又はＤＮＡ座を含む。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドによって標的とされた核酸は、転写物であるか、又は転写物を含む。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドによって標的とされた核酸は、転写物である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドによって標的とされた核酸は、ＤＮＡ遺伝子座であるか、又はＤＮＡ遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドによって標的とされた核酸は、ＤＮＡ座である。いくつかの実施形態において、接触工程で使用される複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの各々は、同じ転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする。
【００１０】
いくつかの実施形態において、接触工程で利用される複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドのセットと称される。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドのセットの標的は、標的のセットと称される。いくつかの実施形態において、セット内の標的は、転写物であるか、又は転写物を含む。いくつかの実施形態において、セット内の標的は転写物である。いくつかの実施形態において、セット内の各標的は、転写物であるか、又は転写物を含む。いくつかの実施形態において、セット内の各標的は転写物である。いくつかの実施形態において、セット中の標的は、ＤＮＡ遺伝子座であるか、又はＤＮＡ遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、セット内の標的は、ＤＮＡ遺伝子座である。いくつかの実施形態において、セット内の各ターゲットは、ＤＮＡ遺伝子座であるか、又はＤＮＡ遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、セット内の各標的は、ＤＮＡ遺伝子座である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、任意に、イメージング工程の後に、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する工程を含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、各イメージング工程の後に、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する工程を含む。いくつかの態様において、除去する工程は、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを消化する酵素と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、除去する工程は、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドをＤＮａｓｅと接触させることを含む。いくつかの実施形態において、除去する工程は、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドをＲＮａｓｅと接触させる工程を含む。いくつかの実施形態において、除去する工程は、光退色を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、各セットは、同一の転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、同一の転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とするセット中の２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同一の検出可能なシグナルを産生する。いくつかの実施形態において、同一の転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とするセット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは全て、同一の検出可能なシグナルを産生する。検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドがフルオロフォアで標識されるいくつかの実施形態において、検出可能なシグナルは、特定の色彩である。いくつかの実施形態において、同一の転写物及び／又はＤＮＡ座を標的とする集合中の検出可能に標識された全てのオリゴヌクレオチドは、同一の検出可能な色彩を提供するフルオロフォアで標識される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、同一の転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とするセット中の２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同一の検出可能な標識を有する。いくつかの実施形態において、同一の転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とするセット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは全て、同一の検出可能な標識を有する。いくつかの実施形態において、同一の転写物及び／又はＤＮＡ座を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドはすべて同一のフルオロフォアを有する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本発明は、提供された方法を実施するために有用な組成物を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明は、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供し、その各々は、核酸を標的とし、検出可能な部分で標識され、それゆえに、組成物は、少なくとも以下を含む：
（ｉ）第一の検出可能な部分で標識された第一のオリゴヌクレオチドを標的とする第一の核酸；及び
（ｉｉ）第二の検出可能な部分で標識した第二のオリゴヌクレオチドを標的とする第二の核酸。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明は、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含むキットを提供し、その各々は、核酸を標的とし、検出可能な部分で標識され、それゆえに、キットは、少なくとも以下を含み：
（ｉ）第一の核酸を標的とし、第一の検出可能な部分で標識された第一のオリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）第二の核酸を標的とし、第二の検出可能な部分で標識した第二のオリゴヌクレオチド。
（ｉｉｉ）第一の核酸を標的とし、第一、第二又は第三の検出可能な部分で標識される、第一のオリゴヌクレオチドと任意に配列が同一である、第三のオリゴヌクレオチド；
（ｉｖ）核酸を標的とし、第一、第二、第三又は第四の検出可能な部分で標識される、第二のオリゴヌクレオチドと任意に配列が同一である、第四のオリゴヌクレオチド、
第三のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能な部分で標識されるか、又は第四のオリゴヌクレオチドは、第二のオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能な部分、又はその両方で標識される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、フルオロフォアであるか、又はフルオロフォアを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、２つ以上の核酸（「標的」）を標的とする。いくつかの実施形態において、標的は、転写物であるか、又は転写物を含む。いくつかの実施形態において、標的は、転写物である。いくつかの実施形態において、標的は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的は、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的は、ｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的は、ｒＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的は、非コードＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的は、ＤＮＡ座であるか、又はＤＮＡ座を含む。いくつかの実施形態において、転写物は、ＤＮＡ遺伝子座である。いくつかの実施形態において、標的は、転写物の遺伝子座である。いくつかの実施形態において、遺伝子のスプライシングバリアントといった、ＤＮＡ配列の異なる転写物は、異なる標的を構成し、ここで、バリアントの１つ以上を独立して標的とし、検出又は定量化することができる。いくつかの実施形態において、本発明は、個々のスプライシング変異体を検出する方法、組成物又はキットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するための方法、組成物、又はキットを提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、提供された方法は、標的、例えば、転写物又はＤＮＡ座を定量化する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、同じ標的を標的とするオリゴヌクレオチドは、同じ配列セットを有する、すなわち、異なる工程で適用される場合、オリゴヌクレオチド間の差異は、配列ではなく、部分内である。
【００２１】
一態様において、本明細書中に開示されるのは、複数の一次プローブ、第一の複数のブリッジプローブ、及び第一の複数の読み出しプローブを含む組成物である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、複数の一次プローブ中の各一次プローブは：標的核酸分子中の相補的標的配列に結合する一次結合配列、及び一次結合配列の一端と接続された第一の突出配列を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、第一の複数のブリッジプローブにおける各々のブリッジプローブは、複数の一次プローブの一次プローブの第一のオーバーハング配列の全て又は一部に特異的に結合する結合配列、及び直列に接続されかつ結合配列に連結された１つ以上の読み出し結合標的を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、第一の複数の読み出しプローブにおける各読み出しプローブは：第一の複数のブリッジプローブのブリッジプローブの１つ以上の読み出し結合標的の第一の読み出し結合標的に特異的に結合する読み出し結合配列、及び切断可能リンカーを介して読み出し結合配列に連結されたシグナル部分を含む。
【００２５】
これらの実施形態では、シグナル部分は、第一の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブが、１つ以上の読み出し結合標的のうちの１つの第一の読み出し結合標的に結合すると、第一の検出可能な可視シグナルを放出することができる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、組成物はさらに：第二の複数の読み出しプローブを含み、ここで、各読み出しプローブは、第一の複数のブリッジプローブのブリッジプローブ中の１つ以上の読み出し結合標的の第二の読み出し結合標的に特異的に結合する読み出し結合配列、及び切断可能リンカーを介して読み出し結合配列に連結されたシグナル部分を含む。
【００２７】
これらの実施形態では、シグナル部分は、第二の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブが、１つ以上の読み出し結合標的の第二の読み出し結合標的に結合すると、第二の検出可能な可視シグナルを放出することができる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、組成物はさらに：一次結合配列の他端に連結された第二の突出配列を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、組成物はさらに：第二の複数のブリッジプローブを含み、ここで、各ブリッジプローブは、複数の一次プローブの一次プローブの第二のオーバーハング配列の全て又は一部に特異的に結合する結合配列、及び直列に接続されかつ結合配列に連結された１つ以上の追加の読み出し結合標的を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、該組成物はさらに：第三の複数の読み出しプローブを含み、ここで、各読み出しプローブは、第二の複数のブリッジプローブのブリッジプローブ中の１つ以上の追加の読み出し結合標的の第一の追加の読み出し結合標的に特異的に結合する読み出し結合配列、及び切断可能リンカーを介して読み出し結合配列に連結されたシグナル部分を含む。
【００３１】
これらの実施形態では、シグナル部分は、第三の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブが、１つ以上の追加の読み出し結合標的の第一の追加の読み出し結合標的に結合すると、第三の検出可能な可視シグナルを放出することができる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、組成物はさらに：第四の複数の読み出しプローブを含む。第四の複数の読み出しプローブ中の各読み出しプローブは、第二の複数のブリッジプローブのブリッジプローブ中の１つ以上の追加の読み出し結合標的の第二の追加の読み出し結合標的に特異的に結合する読み出し結合配列、及び切断可能リンカーを介して読み出し結合配列に連結されたシグナル部分を含む。
【００３３】
これらの実施形態では、シグナル部分は、第四の複数の読み取りプローブからの各読み取りプローブが、１つ以上の追加の読み取り結合標的の第二の追加の読み取り結合標的に結合すると、第四の検出可能な可視シグナルを放出することができる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、切断可能リンカーは、酵素切断可能リンカー、求核剤／塩基類感受性リンカー、還元感受性リンカー、光切断可能リンカー、求電子剤／酸感受性リンカー、金属支援型切断可能リンカー、及び酸化感受性リンカーからなる群から選択される。
【００３５】
いくつかの実施形態において、切断可能リンカーは、ジスルフィド結合又は核酸制限部位である。いくつかの実施形態において、１つ以上の読み出し結合標的は、３つ以上の読み出し結合標的を含む。
【００３６】
第二のオーバーハングが存在するいくつかの実施形態において、追加の１以上の読み出し結合ターゲットは、３以上の読み出し結合ターゲットを含む。
【００３７】
一態様において、本明細書中に開示されるのは、複数の一次プローブ、第一の複数のブリッジプローブ、及び第一の複数の読み出しプローブを利用する逐次ハイブリダイゼーション方法である。いくつかの実施形態において、方法は、以下の工程を含む：
ａ）標的核酸分子を複数の一次プローブと接触させる工程を含む工程であって、各一次プローブは：標的核酸分子内の相補的標的配列に結合する一次結合配列、及び一次結合配列の一端に連結された第一のオーバーハング配列を含む、工程；
ｂ）工程ａ）の後、標的核酸分子を第一の複数のブリッジプローブと接触させる工程であって、各ブリッジプローブは：複数の一次プローブの一次プローブの第一のオーバーハング配列の全て又は一部に特異的に結合する結合配列、及び直列に接続されかつ結合配列に連結された１つ以上の読み出し結合標的を含む、工程；及び
ｃ）工程ｂ）の後、標的核酸分子を第一の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブは：複数の一次プローブの一次プローブの第一の読み出し結合標的の第一の読み出し結合標的に特異的に結合する読み出し結合配列、及び切断可能リンカーを介して読み出し結合配列に連結されるシグナル部分を含む、工程。
【００３８】
これらの実施形態では、シグナル部分は、第一の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブが、第一の複数のブリッジプローブのブリッジプローブの１つ以上の読み出し結合標的の第一の読み出し結合標的に結合すると、第一の検出可能な可視シグナルを放出することができる。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、以下の工程を含む：
ｃ１）第一の複数の読み出しプローブと一次ブリッジプローブの１つ以上の読み出し結合標的の第一の読み出し結合標的との間の相互作用が、第一の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｃ）の後に標的核酸分子をイメージングする工程；及び
ｃ２）工程ｃ１）の後に、を適用してリンカーを切断し、それによって、一次の複数の読み出しプローブ中の各読み出しプローブからシグナル部分を除去する工程。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに：ｄ）工程ｃ）の後に、標的核酸分子を第二の複数の読み出しプローブと接触させる工程を含む。それぞれの読み出しプローブは、ブリッジプローブの１つ以上の読み出し結合標的の第二の読み出し結合標的に特異的に結合する読み出し結合配列、及び切断可能リンカーを介して読み出し結合配列に連結されたシグナル部分を含む。
【００４１】
これらの実施形態では、シグナル部分は、第二の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブが、第一の複数のブリッジプローブのブリッジプローブの１つ以上の読み出し結合標的の第二の読み出し結合標的に結合すると、第二の検出可能な可視シグナルを放出することができる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、以下を含む：
ｄ１）第二の複数の読み出しプローブとブリッジプローブの１つ以上の読み出し結合標的の第二の読み出し結合標的との間の相互作用が、第二の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｄ）の後に標的核酸分子をイメージングする工程；及び
ｄ２）リンカーを切断するために切断剤を適用し、それによって、第二の複数の読み出しプローブにおける各読み出しプローブからシグナル部分を除去する工程。
【００４３】
いくつかの実施形態において、複数の一次プローブにおける各一次プローブは：一次結合配列の他端に連結された第二の突出配列をさらに含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、該方法は：ｅ）工程ｄ）の後に、標的核酸分子を第二の複数のブリッジプローブと接触させる工程をさらに含む。それぞれのブリッジプローブは：複数の一次プローブの一次プローブの第二オーバーハング配列の全て又は一部に特異的に結合する結合配列、及び直列に接続されかつ結合配列に連結された１以上の追加の読み出し結合標的を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本方法は：ｆ）工程ｅ）の後に、標的核酸分子を第三の複数の読み出しプローブと接触させる工程をさらに含む。それぞれの読み出しプローブは、第二の複数のブリッジプローブ中のブリッジプローブの１つ以上の追加の読み出し結合標的の第一の追加の読み出し結合標的に特異的に結合する読み出し結合配列、及び切断可能リンカーを介して読み出し結合配列に連結されたシグナル部分を含む。
【００４６】
これらの実施形態では、シグナル部分は、第三の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブが、１つ以上の追加の読み出し結合標的の第一の追加の読み出し結合標的に結合すると、第三の検出可能な可視シグナルを放出することができる。［００４７］いくつかの実施形態において、本方法はさらに、以下を含む：
ｆ１）第三の複数の読み出しプローブと、第二の複数のブリッジプローブ中のブリッジプローブの１つ以上の追加の読み出し結合標的の第一の追加の読み出し結合標的との間の相互作用が、第三の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｆ）の後に、標的核酸分子をイメージングする工程；及び
ｆ２）切断剤を適用してリンカーを切断し、それによって、第三の複数の読み出しプローブ中の各読み出しプローブからシグナル部分を除去する工程。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本方法は：ｇ）工程ｆ）の後に、標的核酸分子を第四の複数の読み出しプローブと接触させる工程をさらに含む。それぞれの読み出しプローブは、第二の複数のブリッジプローブ中のブリッジプローブの１つ以上の追加の読み出し結合標的の第二の追加の読み出し結合標的に特異的に結合する読み出し結合配列、及び切断可能リンカーを介して読み出し結合配列に連結されたシグナル部分を含む。
【００４８】
これらの実施形態では、シグナル部分は、第四の複数の読み取りプローブからの各読み取りプローブが、１つ以上の追加の読み取り結合標的の第二の追加の読み取り結合標的に結合すると、第四の検出可能な可視シグナルを放出することができる。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、以下を含む：
ｈ１）第四の複数の読み出しプローブと第二の複数のブリッジプローブ中のブリッジプローブの１つ以上の追加の読み出し結合標的の第二の追加の読み出し結合標的との間の相互作用が、第四の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｇ）の後に標的核酸分子をイメージングする工程；及び
ｈ２）リンカーを切断するために切断剤を適用し、それによって、第四の複数の読み出しプローブ中の各読み出しプローブからシグナル部分を除去する工程。
【００５０】
いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、ｍＲＮＡ又はＤＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、インタクトな哺乳動物細胞内にある。いくつかの実施形態において、インタクトな哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
【００５１】
これらの実施形態において、切断可能リンカーは、酵素切断可能リンカー、求核剤／塩基類感受性リンカー、還元感受性リンカー、光切断可能リンカー、求電子剤／酸感受性リンカー、金属支援型切断可能リンカー、及び酸化感受性リンカーからなる群から選択される。これらの実施形態では、切断可能リンカーはジスルフィド結合又は核酸制限部位である。これらの実施形態では、１つ以上の読み出し結合標的は、３つ以上の読み出し結合標的を含む。
【００５２】
第二のオーバーハングが存在するこれらの実施形態において、追加の１以上の読み出し結合標的は、３以上の読み出し結合標的を含む。
【００５３】
一態様において、本明細書中に開示されるのは、複数の一次プローブ及び第一の複数の読み出しプローブを含む組成物である。これらの実施態様において、各一次プローブは、標的核酸分子中の相補的標的配列に結合する一次結合配列、及び一次結合配列の一端に連結された第一の突出配列を含み、ここで、第一の突出配列は、直列に連結された１以上の読み出し結合標的を含む。また、これらの実施形態において、各読み出しプローブは、第一のオーバーハング配列中の１つ以上の読み出し結合標的の第一の読み出し結合標的に特異的に結合する読み出し結合配列、及び切断可能リンカーを介して読み出し結合配列に連結されたシグナル部分を含む。これらの実施形態では、シグナル部分は、第一の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブが、１つ以上の読み出し結合標的のうちの１つの第一の読み出し結合標的に結合すると、第一の検出可能な可視シグナルを放出することができる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、組成物はさらに、第二の複数の読み出しプローブを含み、ここで、各読み出しプローブは、第一のオーバーハング配列中の１つ以上の読み出し結合標的の第二の読み出し結合標的に特異的に結合する読み出し結合配列、及び切断可能リンカーを介して読み出し結合配列に連結されたシグナル部分を含む。これらの実施形態では、シグナル部分は、第二の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブが、１つ以上の読み出し結合標的の第二の読み出し結合標的に結合すると、第二の検出可能な可視シグナルを放出することができる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、一次プローブは、一次結合配列の他端に連結された第二のオーバーハング配列をさらに含み、ここで、第二のオーバーハング配列は、直列に連結された１つ以上の追加の読み出し結合標的を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、組成物はさらに、第三の複数の読み出しプローブを含み、ここで、各読み出しプローブは、第二のオーバーハング配列中の１つ以上の追加の読み出し結合標的の第一の追加の読み出し結合標的に特異的に結合する読み出し結合配列、及び切断可能リンカーを介して読み出し結合配列に連結されたシグナル部分を含む。これらの実施形態では、シグナル部分は、第三の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブが、１つ以上の追加の読み出し結合標的の第一の追加の読み出し結合標的に結合すると、第三の検出可能な可視シグナルを放出することができる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、組成物はさらに、第四の複数の読み出しプローブを含み、ここで、各読み出しプローブは、第二のオーバーハング配列中の１つ以上の追加の読み出し結合標的の第二の追加の読み出し結合標的に特異的に結合する読み出し結合配列、及び切断可能リンカーを介して読み出し結合配列に連結されたシグナル部分を含む。これらの実施形態では、シグナル部分は、第四の複数の読み取りプローブからの各読み取りプローブが、１つ以上の追加の読み取り結合標的の第二の追加の読み取り結合標的に結合すると、第四の検出可能な可視シグナルを放出することができる。
【００５８】
本明細書中に開示される任意の実施形態において、切断可能リンカーは、酵素切断可能リンカー、求核剤／塩基類感受性リンカー、還元感受性リンカー、光切断可能リンカー、求電子剤／酸感受性リンカー、金属支援型切断可能リンカー、及び酸化感受性リンカーからなる群から選択される。
【００５９】
本明細書中に開示される任意の実施形態において、切断可能リンカーは、ジスルフィド結合又は核酸制限部位である。
【００６０】
本明細書中に開示される任意の実施形態において、１以上の読み出し結合標的は、３以上の読み出し結合標的を含む。
【００６１】
第二のオーバーハング配列が存在する実施形態では、追加の１以上の読み出し結合標的は、３以上の読み出し結合標的を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、ｍＲＮＡ又はＤＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、インタクトな哺乳動物細胞内にある。いくつかの実施形態において、インタクトな哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
【００６３】
一態様では、本明細書中に開示されるのは、複数の一次プローブ及び最初の複数の読み出しプローブを利用する逐次ハイブリダイゼーション方法である。本方法は、以下の工程を含む：
ａ）標的核酸分子を複数の一次プローブと接触させる工程。各一次プローブは、標的核酸分子内の相補的標的配列に結合する一次結合配列、及び一次結合配列の一端に連結された第一の突出配列を含み、第一の突出配列は、直列に連結された１つ以上の読み出し結合標的を含む；及び
ｂ）工程ａ）の後に、標的核酸分子を第一の複数の読み出しプローブと接触させる工程。
各読み出しプローブは、複数の一次プローブの一次プローブの１つ以上の読み出し結合標的の第一の読み出し結合標的に特異的に結合する読み出し結合配列、及び切断可能リンカーを介して読み出し結合配列に連結されたシグナル部分を含む。
【００６４】
これらの実施形態では、シグナル部分は、第一の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブが、１つ以上の読み出し結合標的のうちの１つの第一の読み出し結合標的に結合すると、第一の検出可能な可視シグナルを放出することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本方法は、以下の工程をさらに含む：
ｂ１）一次の複数の読み出しプローブと一次のブリッジプローブの１つ以上の読み出し結合標的の一次の読み出し結合標的との間の相互作用が、一次の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｂ）の後に標的核酸分子をイメージングする工程；及び
ｂ２）切断剤を適用してリンカーを切断し、それによって、一次の複数の読み出しプローブ中の各読み出しプローブからシグナル部分を除去する工程。
【００６６】
いくつかの実施形態において、方法はさらに、以下の工程を含む：ｃ）工程ｂ）の後に、標的核酸分子を第二の複数の読み出しプローブと接触させる工程。各読み出しプローブは、一次プローブの１つ以上の読み出し結合標的の第二の読み出し結合標的に特異的に結合する読み出し結合配列、及び切断可能リンカーを介して読み出し結合配列に連結されたシグナル部分を含む。
【００６７】
これらの実施形態では、シグナル部分は、第二の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブが、１つ以上の読み出し結合標的の第二の読み出し結合標的に結合すると、第二の検出可能な可視シグナルを放出することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、以下の工程を含む：
ｃ１）第二の複数の読み出しプローブと、一次プローブの１つ以上の読み出し結合標的の第二の読み出し結合標的との間の相互作用が、第二の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｃ）後の標的核酸分子をイメージングする工程；及び
ｃ２）切断剤を適用してリンカーを切断し、それによって、第二の複数の読み出しプローブ中の各読み出しプローブからシグナル部分を除去する工程、を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態において、複数の一次プローブにおける各一次プローブは、一次結合配列の他端に連結された第二のオーバーハング配列をさらに含み、ここで、第二のオーバーハング配列は、直列に連結された１つ以上の追加の読み出し結合標的を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、以下の工程を含む：ｄ）工程ｃ）の後に、標的核酸分子を第三の複数の読み出しプローブと接触させる工程。各読み出しプローブは、一次プローブの１つ以上の追加読み出し結合標的の最初の追加読み出し結合標的に特異的に結合する読み出し結合配列、及び切断可能リンカーを介して読み出し結合配列に連結されたシグナル部分を含む。
【００７１】
これらの実施形態では、シグナル部分は、第三の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブが、１つ以上の追加の読み出し結合標的の第一の追加の読み出し結合標的に結合すると、第三の検出可能な可視シグナルを放出することができる。［００７３］いくつかの実施形態において、本方法はさらに、以下の工程を含む：
ｄ１）第二の複数の読み出しプローブと、一次プローブの１つ以上の読み出し結合標的の第二の読み出し結合標的との間の相互作用が、第二の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｄ）後に標的核酸分子をイメージングする工程；及び
ｄ２）リンカーを切断するために切断剤を適用し、それによって、第二の複数の読み出しプローブ中の各読み出しプローブからシグナル部分を除去する工程。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、以下の工程を含む：ｅ）工程ｄ）の後に、標的核酸分子を第四の複数の読み出しプローブと接触させる工程。各読み出しプローブは、一次プローブの１つ以上の追加の読み出し結合標的の第二の追加の読み出し結合標的に特異的に結合する読み出し結合配列、及び一次プローブの読み出し結合標的に連結されたシグナル部分を含み、これらの実施形態では、シグナル部分は、第四の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブの１つ以上の追加の読み出し結合標的の第二の追加の読み出し結合標的への結合に際して、第四の検出可能な可視シグナルを放出することが可能である。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、以下の工程を含む：
ｅ１）第四の複数の読み出しプローブと、第四の検出可能な可視シグナルの存在によって、一次プローブの１つ以上の追加の読み出し結合標的の第二の追加の読み出し結合標的との間の相互作用が検出されるように、工程ｄ）の後にｍＲＮＡをイメージングする工程；及び
ｅ２）切断剤を適用してリンカーを切断し、それによって、第四の複数の読み出しプローブ中の各読み出しプローブからシグナル部分を除去する工程、を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、ｍＲＮＡ又はＤＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、インタクトな哺乳動物細胞内にある。いくつかの実施形態において、インタクトな哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
【００７５】
いくつかの実施形態において、切断可能リンカーは、酵素切断可能リンカー、求核剤／塩基類感受性リンカー、還元感受性リンカー、光切断可能リンカー、求電子剤／酸感受性リンカー、金属支援型切断可能リンカー、及び酸化感受性リンカーからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、切断可能リンカーは、ジスルフィド結合又は核酸制限部位である。
【００７６】
いくつかの実施形態において、１つ以上の読み出し結合標的は、３つ以上の読み出し結合標的を含む。
【００７７】
第二のオーバーハング配列が存在するいくつかの実施形態において、追加の１以上の読み出し結合標的は、３以上の読み出し結合標的を含む。［００８１］一態様において、本明細書中に開示されるのは、第一の複数の核酸検出プローブと、第一の複数のエクステンダープローブ｛ＥＰ１、ＥＰ２、・・・、ＥＰｎ｝の集団によって形成される伸長可能シグナルモチーフとを含む組成物である。いくつかの実施形態において、第一の複数の核酸検出プローブ中の各々の核酸検出プローブは：第一の標的配列に結合する結合配列を含む結合領域；及び切断可能リンカーで結合領域に連結された開始剤配列を含む。いくつかの実施形態において、エクステンダープローブの各集団は、それぞれ、ＥＰ１、ＥＰ２、・・・、ＥＰｎによって表され、ここで、ＥＰ１における各エクステンダープローブは：開始剤配列の全て又は一部に結合する結合配列；ＥＰ２及びその後のエクステンダープローブの集団におけるエクステンダープローブのための１つ以上の標的配列、ならびに第一の検出可能なシグナルを放出することができるシグナル部分を含む。いくつかの実施形態において、ＥＰ２における各プローブ及びその後のエクステンダープローブの集団は：前のエクステンダー配列の全て又は一部に結合する結合配列；エクステンダープローブのその後の集団におけるプローブのための１つ以上の標的配列；及び第一の検出可能なシグナルを放出することができるシグナル部分を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態において、第一の標的配列は、標的核酸分子に直接結合する一次プローブ内にある。いくつかの実施形態において、第一の標的配列は、標的核酸分子に直接結合する一次プローブに結合する二次プローブ内にある。いくつかの実施形態において、一次の標的配列は、標的核酸分子に直接結合する一次プローブに結合する第二のプローブに結合する第三のプローブ内にある。
【００７９】
いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、ｍＲＮＡ又はＤＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、インタクトな哺乳動物細胞内にある。いくつかの実施形態において、インタクトな哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、切断可能リンカーは、酵素切断可能リンカー、求核剤／塩基類感受性リンカー、還元感受性リンカー、光切断可能リンカー、求電子剤／酸感受性リンカー、金属支援型切断可能リンカー、及び酸化感受性リンカーからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、切断可能リンカーは、ジスルフィド結合又は核酸制限部位である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、複数のエクステンダープローブの各エクステンダープローブは、核酸検出プローブ中の開始剤配列の全部又は一部に相補的な結合配列を含み、ここで、各エクステンダープローブはヘアピン構造を形成し、開始剤配列の存在は、ヘアピン構造をアンフォールドし、ハイブリダイゼーション鎖状反応を開始させる。
【００８２】
いくつかの実施形態において、組成物は、さらに、第二の複数の核酸検出プローブと、第二の複数のエクステンダープローブ｛ＥＰ１’、ＥＰ２’、．．．、ＥＰｎ’｝の集団によって形成される伸長可能シグナルモチーフとを含む。いくつかの実施形態において、第二の複数の核酸検出プローブ中の各々の核酸検出プローブは：第二の標的配列に結合する結合配列を含む結合領域；及び切断可能リンカーで結合領域に連結された開始剤配列を含む。いくつかの実施形態において、エクステンダープローブの各集団は、それぞれ、ＥＰ１’、ＥＰ２’、・・・、ＥＰｎ’によって表され、ここで、ＥＰ１’における各エクステンダープローブは：開始剤配列の全て又は一部に結合する結合配列；ＥＰ２’及びエクステンダープローブのその後の集団におけるエクステンダープローブのための１つ以上の標的配列；ならびに第二の検出可能なシグナルを放出することができるシグナル部分を含む。いくつかの実施形態において、ＥＰ２’及びその後のエクステンダープローブ集団における各プローブは：前のエクステンダー配列の全て又は一部に結合する結合配列；エクステンダープローブのその後の集団におけるプローブのための１つ以上の標的配列；及び第二の検出可能なシグナルを放出することができるシグナル部分を含む。
【００８３】
一態様では、本明細書中に開示されるのは、逐次ハイブリダイゼーション方法である。本方法は、以下の工程を含む：
ａ）標的核酸分子を第一の複数の核酸検出プローブと接触させる工程、及び
ｂ）工程ａ）の後に、標的核酸分子を第一の複数のエクステンダープローブ｛ＥＰ１、ＥＰ２、・・・、ＥＰｎ｝と接触させる工程。
いくつかの実施形態において、第一の複数の核酸検出プローブ中の各々の核酸検出プローブは：第一の標的配列に結合する結合配列を含む結合領域；及び切断可能リンカーで結合領域に連結された開始剤配列を含む。いくつかの実施形態において、エクステンダープローブの各集団は、それぞれ、ＥＰ１、ＥＰ２、・・・、ＥＰｎによって表され、ここで、ＥＰ１における各エクステンダープローブは：開始剤配列の全て又は一部に結合する結合配列；ＥＰ２及びその後のエクステンダープローブの集団におけるエクステンダープローブのための１つ以上の標的配列；ならびに第一の検出可能なシグナルを放出することができるシグナル部分を含む。いくつかの実施形態において、ＥＰ２における各プローブ及びその後のエクステンダープローブの集団は：前のエクステンダー配列の全て又は一部に結合する結合配列；エクステンダープローブのその後の集団におけるプローブのための１つ以上の標的配列；及び第一の検出可能なシグナルを放出することができるシグナル部分を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、該方法はさらに、以下を含む：
ｂ１）工程ｂ）の後に標的核酸分子をイメージングし、それゆえに、第一の複数の核酸検出プローブと第一の標的配列との間の相互作用が、第一の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるようにする工程；及び
ｂ２）切断剤を適用して、リンカーを切断し、それによって、伸長可能なシグナルモチーフを排除する工程。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本方法は：ｃ）標的核酸分子を第二の複数の核酸検出プローブと接触させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、第二の複数の核酸検出プローブ中の各々の核酸検出プローブは：第二の標的配列に結合する結合配列を含む結合領域；及び切断可能リンカーで結合領域に連結された開始剤配列を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、方法はさらに：ｄ）工程ｃ）の後に、標的核酸分子を、それぞれＥＰ１’、ＥＰ２’、・・・・、ＥＰｎ’で表されるエクステンダープローブの第二の複数の集団と接触させる工程であって、エクステンダープローブの各集団は、それぞれＥＰ１’、ＥＰ２’、・・・、及びＥＰｎ’で表される工程を含む。いくつかの実施形態において、ＥＰ１’における各エクステンダープローブは：開始剤配列の全部又は一部に結合する結合配列；ＥＰ２’及びその後のエクステンダープローブの集団におけるエクステンダープローブのための１つ以上の標的配列；及び第二の検出可能なシグナルを放出することができるシグナル部分を含む。いくつかの実施形態において、ＥＰ２’及びその後のエクステンダープローブ集団における各プローブは：前のエクステンダー配列の全て又は一部に結合する結合配列；エクステンダープローブのその後の集団におけるプローブのための１つ以上の標的配列；及び第二の検出可能なシグナルを放出することができるシグナル部分を含む。
【００８７】
いくつかの実施形態において、該方法はさらに、以下を含む：
ｄ１）工程ｄ）の後に標的核酸分子をイメージングし、それゆえに、第二の複数の核酸検出プローブと第二の標的配列との間の相互作用が、第二の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるようにする工程；及び
ｄ２）切断剤を適用して、リンカーを切断し、それによって、伸長可能なシグナルモチーフを排除する工程。
【００８８】
いくつかの実施形態において、第二の標的配列は、標的核酸分子に直接結合する一次プローブ内にある。いくつかの実施形態において、第二の標的配列は、標的核酸分子に直接結合する一次プローブに結合する二次プローブ内にある。いくつかの実施形態において、第二の標的配列は、標的核酸分子に直接結合する一次プローブに結合する二次プローブに結合する三次プローブ内にある。
【００８９】
以下の工程を含む逐次ハイブリダイゼーション方法も提供される：
ａ）標的分子と複数の一次抗体とを接触させる工程であって、各一次抗体は、直列に連結され、一次抗体に連結された１つ以上の結合標的を含む、工程；
ｂ）標的分子を第一の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブは、シグナル部分を含み、各読み出しプローブは、複数の一次抗体の一次抗体の第一の結合標的の第一の結合標的と相互作用し、
シグナル部分は、第一の複数の読み出しプローブから複数の一次抗体の第一の結合標的への各読み出しプローブの相互作用時に第一の検出可能な可視シグナルを放出することが可能である、工程；
ｃ）工程ｂ）の後の標的分子をイメージングして、第一の複数の読み出しプローブと複数の一次抗体との間の相互作用が、第一の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるようにする工程；
ｄ）標的分子及び複数の一次抗体を第一の複数の読み出しプローブと変性剤を含む溶液と接触させる工程であって、溶液と標的分子、複数の一次抗体及び第一の複数の読み出しプローブとの接触では、複数の一次抗体と標的分子との相互作用が妨害されない、工程；
ｅ）標的分子及び複数の一次抗体を第二の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブはシグナル部分を含み、各読み出しプローブは、複数の一次抗体の一次抗体の第二の結合標的と相互作用し、
シグナル部分は、各読み出しプローブと複数の一次抗体の第二の結合標的との相互作用時に、第二の検出可能な可視シグナルを放出することが可能である、工程；及び
ｆ）第二の複数の読み出しプローブと複数の一次抗体との間の相互作用が、第二の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｅ）の後の標的核酸分子をイメージングする工程。
【００９０】
いくつかの実施形態において、方法はさらに、以下の工程を含む：
ｇ）標的分子、複数の一次抗体、及び第二の複数の読み出しプローブを変性剤を含む溶液と接触させる工程であって、溶液と標的分子、複数の一次抗体、及び第二の複数の読み出しプローブとの接触は、複数の一次抗体と標的分子との相互作用を妨害しない、工程；
ｈ）標的分子及び複数の一次抗体と第三の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブは、シグナル部分を含む工程であって、各読み出しプローブは、複数の一次抗体の一次抗体の第三の結合標的と相互作用し、
シグナル部分は、第三の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブの相互作用時に、第三の検出可能な可視シグナルを発することが可能である、工程；及び
ｉ）第三の複数の読み出しプローブと複数の一次抗体との間の相互作用が第三の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｈ）の後の標的核酸分子をイメージングする工程。
【００９１】
いくつかの実施形態において、任意の複数の読み出しプローブ中の各読み出しプローブは、複数の一次抗体中のその結合標的にハイブリダイズすることにより、その結合標的と相互作用する。いくつかの実施形態において、任意の複数の読み出しプローブにおける各読み出しプローブは、（ｉ）複数の一次抗体の一次抗体の１つ以上の結合標的に相補的な配列、及び（ｉｉ）読み出しプローブが結合する配列を含むブリッジプローブにハイブリダイズすることによって、その結合標的と相互作用する。
【００９２】
いくつかの実施形態において、標的分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はタンパク質である。
【００９３】
いくつかの実施形態において、標的分子はインタクトな細胞内にある。インタクトな細胞は、原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、又はヒト細胞であり得る。
【００９４】
次の工程を含む逐次ハイブリダイゼーション方法も提供される：
ａ）標的核酸分子を複数の一次プローブと接触させる工程であって、各一次プローブは、以下：
（ｉ）標的核酸分子内の相補的標的配列に結合する一次結合配列、及び
（ｉｉ）一次結合配列の一端に連結され、一次結合配列に連結された１つ以上の結合標的を含む、一次結合配列の一端に連結された第一の突出配列
を含む、工程；
ｂ）標的核酸分子を第一の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブが、シグナル部分を含み、各読み出しプローブが、複数の一次プローブのうちの一次プローブのうちの１つ以上の結合標的の第一の結合標的と相互作用し、
シグナル部分が、第一の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブと、複数の一次プローブのうちの一次プローブのうちの１つ以上の結合標的のうちの第一の結合標的との相互作用時に、第一の検出可能な可視シグナルを放出することができる、
工程；
ｃ）第一の複数の読み出しプローブと複数の一次プローブとの間の相互作用が、第一の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｂ）の後の標的核酸分子をイメージングする工程；
ｄ）標的核酸分子、複数の一次プローブ、及び第一の複数の読み出しプローブと変性剤を含む溶液と接触させる工程であって、溶液と標的核酸分子、複数の一次プローブ、及び第一の複数の読み出しプローブとの接触が、複数の一次プローブと標的核酸分子との相互作用を妨害しない、工程；
ｅ）標的核酸分子を第二の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブは、シグナル部分を含み、各読み出しプローブは、第一の複数の読み出しプローブの第二の結合標的と相互作用し、
シグナル部分は、第二の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブの相互作用時に、第二の検出可能な可視シグナルを放出することが可能である、
工程；及び
ｆ）第二の複数の読み出しプローブと複数の一次プローブとの間の相互作用が、第二の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｅ）の後の標的核酸分子をイメージングする工程。
【００９５】
いくつかの実施形態において、方法は、以下の工程をさらに含む：
ｇ）標的核酸分子、複数の一次ブリッジプローブ、及び第二の複数の読み出しプローブを、変性剤を含む溶液と接触させる工程であって、溶液と標的核酸分子、複数の一次プローブ、及び第二の複数の読み出しプローブとの接触が、複数の一次プローブと標的核酸分子との相互作用を妨害しない、工程；
ｈ）標的核酸分子を第三の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブは、シグナル部分を含み、各読み出しプローブは、一次プローブの１つ以上の結合標的の第三の結合標的と相互作用し、
シグナル部分は、第三の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブの相互作用時に、第三の検出可能な可視シグナルを放出することが可能である
工程；及び
ｉ）第三の複数の読み出しプローブと複数の一次プローブとの間の相互作用が、第三の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｈ）の後の標的核酸分子をイメージングする工程。
【００９６】
いくつかの実施形態において、複数の一次プローブにおける各一次プローブは、さらに、一次結合配列の他端に連結された第二の突出配列を含み、一次結合配列に直列に連結され、連結された１つ以上の追加の結合標的を含む。
【００９７】
いくつかの実施形態において、方法は、以下の工程をさらに含む：
ｃ１）工程ｃ）の後に、標的核酸分子を第四の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブはシグナル部分を含み、各読み出しプローブは、複数の一次プローブにおける一次プローブの第二のオーバーハング配列の第一の追加の結合標的と相互作用する、工程；及び
ｃ２）複数の一次プローブにおける第四の複数の読み出しプローブと一次プローブの第二のオーバーハング配列との間の相互作用が、第四の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｃ１）の後の標的核酸分子をイメージングする工程；
ここで、ｃ１）〜ｃ２）の工程が、方法の工程ｄ）の前に起こる。
【００９８】
いくつかの実施形態において、方法は、以下の工程をさらに含む：
ｅ１）工程ｅ）の後に、標的核酸分子を第５の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブはシグナル部分を含み、各読み出しプローブは、複数の一次プローブにおける一次プローブの第二のオーバーハング配列の第二の追加の結合標的と相互作用する、工程；及び
ｅ２）複数の一次プローブにおける第５の複数の読み出しプローブと一次プローブの第二のオーバーハング配列との間の相互作用が、第５の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｅ１）の後に標的核酸分子をイメージングする工程。
【００９９】
上述の方法のいくつかの例において、任意の複数の読み出しプローブ中の各読み出しプローブは、複数の一次プローブ中のその結合標的にハイブリダイズすることによって、その結合標的と相互作用する。上述の方法のいくつかの例において、任意の複数の読み出しプローブ中の各読み出しプローブは、以下：（ｉ）複数の一次プローブの一次プローブの第一のオーバーハング配列の全て又は一部に相補的な配列、及び（ｉｉ）読み出しプローブが結合する配列を含むブリッジプローブにハイブリダイズすることによって、その結合標的と相互作用する。
【０１００】
第二のオーバーハング配列の１つ以上のさらなる結合標的は、第四の複数の読み出しプローブからの読み出しプローブと、又は第一の複数の読み出しプローブからの読み出しプローブと相互作用する。いくつかの実施形態では、第四の複数の読み出しプローブ又は第５の複数の読み出しプローブからの読み出しプローブからの相互作用
【０１０１】
いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡ分子である。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、標的核酸分子はインタクトな細胞内にある。インタクトな細胞は、原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、又はヒト細胞であり得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、１つ以上の結合標的は、３つ以上の結合標的を含む。いくつかの実施形態において、追加の１つ以上の結合標的は、３つ以上の読み出し結合標的を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、変性剤はホルムアミドである。いくつかの実施形態において、ホルムアミドは、６０％（ｖ／ｖ）のパーセント濃度で溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、ホルムアミドは、６０％（ｖ／ｖ）未満のパーセント濃度で溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、ホルムアミドは、約３０％と６０％（ｖ／ｖ）の間のパーセント濃度で溶液中に存在する。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、長さが１７ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、１０と１７ヌクレオチドの間の長さである。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、長さが１０ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、５と１０ヌクレオチドの間の長さである。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、ｍＲＮＡ又はＤＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、インタクトな哺乳動物細胞内にある。いくつかの実施形態において、インタクトな哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、切断可能リンカーは、酵素切断可能リンカー、求核剤／塩基類感受性リンカー、還元感受性リンカー、光切断可能リンカー、求電子剤／酸感受性リンカー、金属支援型切断可能リンカー、及び酸化感受性リンカーからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、切断可能リンカーは、ジスルフィド結合又は核酸制限部位である。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、複数のエクステンダープローブの各エクステンダープローブは、核酸検出プローブ中の開始剤配列の全て又は一部に相補的な結合配列を含み、各エクステンダープローブは、ヘアピン構造を形成し、開始剤配列の存在は、ヘアピン構造をほどかせ、ハイブリダイゼーション鎖状反応を開始する。
【０１０９】
本明細書中に開示される組成物及び方法は、インタクトな細胞内又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ設定において、任意の適当な細胞標的を同定するために、逐次ハイブリダイゼーションで使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞標的は、ｍＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、細胞標的はタンパク質であり得る。例えば、最初の標的結合一次プローブは、その後の結合のために核酸配列と結合した抗体であり得る。
【０１１０】
当業者は、本明細書中に開示される実施形態は、適用可能な場合、任意の態様で適用又は組み合わせることができることを理解するであろう。
【０１１１】
（定義）
動物：本明細書中で使用する場合、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを指し、いくつかの実施形態において、「動物」は、発生の任意のステージでのヒトを指し、いくつかの実施形態において、「動物」は、発生の任意のステージでの、ヒト以外の動物を指す。いくつかの実施形態において、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／又はブタ）である。いくつかの実施形態において、動物は、哺乳類、トリ、爬虫類、両生類、魚、及び／又は虫を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、及び／又はクローンであってもよい。
【０１１２】
およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）：本明細書中で使用されるように、数に関する「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」又は「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、特に明記しない限り、又は文脈から明白でない限り（このような数が可能な値の０％未満又は１００％を超える場合を除いて）、数の５％、１０％、１５％、又は２０％のいずれかの方向（より大きい又はより小さい）に入る数を含むように一般的にとらえられる。いくつかの実施形態では、用量に関する「約」という用語の使用は、±５ｍｇ／ｋｇ／日を意味する。
【０１１３】
相同性：「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つの核酸分子間の配列類似性を意味する。相同性及び同一性は、比較の目的で並べることができる各配列中の位置を比較することによってそれぞれ決定することができる。比較された配列中の当量の位置が同じ塩基類によって占められた場合、分子はその位置で同一である；同じ又は類似の核酸残留分によって占められた当量部位（例えば立体的及び／又は電子的性質において類似）の場合、分子はその位置で相同（類似）と呼ぶことができる。相同性／類似性又は同一性のパーセンテージとしての表現は、比較された配列によって共有される位置における同一又は類似の核酸の数の機能を意味する。「無関係」又は「非相同」である配列は、本明細書中に記載される配列と４０％未満の同一性、３５％未満の同一性、３０％未満の同一性、又は２５％未満の同一性を共有する。２つの配列を比較すると、残留分（アミノ酸又は核酸）が存在しないか、余分な残留分が存在すると、同一性及び相同性／類似性も低下する。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、用語「相同性」は、類似の機能又はモチーフを有する遺伝子を同定するために使用される配列類似性の数学的に基づく比較を記載する。明細書中に記載される核酸配列は、例えば、他のファミリーメンバー、関連配列又は相同体を同定するために、公開データベースに対する検索を行うための「クエリー配列」として使用することができる。いくつかの実施形態において、このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．    ２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）を用いて実施することができる。いくつかの実施形態において、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ  ＝１２で行うことができる。いくつかの実施形態では、比較目的のためにギャップアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されているように、ギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの初期パラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ）を使用することができる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。
【０１１５】
同一性：本明細書中で使用される場合、「同一性」とは、配列が配列マッチングを最大にするように整列された場合、すなわちギャップ及び挿入を考慮に入れた場合に、２つ以上の配列中の対応する位置における同一のヌクレオチド残留分の割合を意味する。同一性は、（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１；  ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．，  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，  ４８：  １０７３  （１９８８）、に記載されるもの生含むが、これらに限定されない。同一性を決定する方法は、試験した配列間で最大のマッチを与えるようにデザインされる。さらにまた、同一性を測定する方法は、公に入手できるコンピュータプログラムに集成されている。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータプログラム方法には、ＧＣＧプログラム包装体（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：  ３８７  （１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ  （Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−４１０  （１９９０）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：  ３３８９−３４０２  （１９９７））．ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及びその他の情報源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  ２０８９４；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−４１０  （１９９０）から公開されている。よく知られたＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、同一性を決定することもできる。
【０１１６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：本明細書中で使用される「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、及び／又は微生物）内ではなく、人工環境、例えば、試験管又は反応容器、細胞培養などにおいて起こる事象を意味する。
【０１１７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ：本明細書中で使用される場合、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、及び／又は微生物）内で起こる事象を意味する。
【０１１８】
オリゴヌクレオチド：「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドモノマーのポリマー又はオリゴマーを指し、ヌクレオチド、修飾核酸塩基、糖、修飾糖、リン酸ブリッジ、又は修飾ブリッジの任意の組合せを含む。本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドは、様々な長さのものであり得る。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約２〜約２００ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。様々な関連した実施形態では、オリゴヌクレオチド、一本鎖、二本鎖、及び三本鎖の長さは、約４〜約１０ヌクレオチド、約１０〜約５０ヌクレオチド、約２０〜約５０ヌクレオチド、約１５〜約３０ヌクレオチド、約２０〜約３０ヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは約９から約３９ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも４ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも６ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも７ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも８ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも９ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１２ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも２０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも２５ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも３０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１８ヌクレオチドの相補的ストランドの二本鎖である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２１ヌクレオチドの相補的ストランドの二本鎖である。
【０１１９】
所定の（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）：所定による（ｂｙ  ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）とは、例えば、ランダムに起こる又は達成されることとは対照的に、意図的に選択されることを意味する。特定のオリゴヌクレオチドを意図的に生成するように制御することができないプロセスを通して生成されたことがあるために、特定の個々のオリゴヌクレオチドを含み得る組成物は、「所定の（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）」組成物ではない。いくつかの実施形態において、所定の（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）組成物は、意図的に複製することができるものである（例えば、制御されたプロセスの反復を通して）。
【０１２０】
試料（ｓａｍｐｌｅ）：本明細書中で使用される場合、「試料（ｓａｍｐｌｅ）」という語は、本明細書中に記載されるように、利害関係源から得られるか又は誘導される生物学的試料を意味する。いくつかの実施形態において、利害関係源は、動物又はヒトなどの微生物を含む。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、生物学的組織又は流体を含む。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、骨髄；血液；血球；腹水；組織又は細針生検試料；体液を含む細胞；遊離浮遊核酸；痰；唾液；唾液；尿；脳脊髄液、腹膜液；胸水；リンパ液；婦人科体液；皮膚スワブ；膣スワブ；口腔スワブ；鼻腔スワブ；乳管洗浄又は気管支肺胞洗浄などの洗浄液又は洗浄液；吸引物；擦過物；骨髄試験片；組織生検試験片；外科的試験片；糞便、他の体液、分泌物、及び／又は排泄物；及び／又はそれらからの細胞などであるか、又はそれらを含む。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、個体から得られた細胞であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態において、試料は、任意の適切な手段によって利害関係源から直接得られる「一次試料」である。例えば、いくつかの実施形態において、一次試料は、生検（例えば、細針吸引又は組織生検）、外科手術、体液（例えば、血液、リンパ液、糞便など）の収集などからなる群から選択される方法によって得られる「一次生物学的試料」である。いくつかの実施形態において、文脈から明らかになるであろうように、「試料」という用語は、一次試料を（例えば、１以上の成分を除去することにより及び／又は１以上の薬剤を追加することにより）加工することにより得られる調製物を指す。そのような「加工された試料」は、例えば、試料から抽出された、又は一次試料をｍＲＮＡの増幅または逆転写、特定の成分の単離及び／又は精製などの技術にかけることによって得られた核酸またはタンパク質を含んでもよい。
【０１２１】
被検者（ｓｕｂｊｅｃｔ）：本明細書中で使用される場合、「被検者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」又は「試験被検者（ｔｅｓｔ  ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は、提供された化合物又は組成物が、本明細書中に開示された方法に従って、例えば、実験、診断、予防、及び／又は治療のために投与される任意の生物を意味する。典型的な被検者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトのような哺乳類；昆虫；線虫；など）及び植物が含まれる。いくつかの実施形態において、被検者は、疾病、障害、及び／又は状態に罹患している、及び／又は罹患しやすいことがある。
【０１２２】
実質的に：本明細書中で使用される場合、用語「実質的に」とは、関心のある特徴又は特性の全部又はほぼ全部の範囲又は程度を示す定性的条件を意味する。生物学的技術における通常の技術者は、生物学的及び化学的現象が、たとえあったとしても、完全に完成し、かつ／又は絶対結果を達成し、又は回避することはまれであることを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、本明細書では、多くの生物学的及び／又は化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捉えるために使用される。
【０１２３】
罹患している（ｓｕｆｆｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ）：疾患、障害、および／または状態に「罹患している（ｓｕｆｆｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ）」個体は、疾患、障害、および／または状態の１つ以上の条件を有すると診断されているか、及び／又はそれを示している。
【０１２４】
かかりやすい（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ｔｏ）：疾患、障害、及び／又は状態に「かかりやすい（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ｔｏ）」個人は、一般市民のメンバーよりも疾患、障害、及び／又は状態を発症するリスクが高い者である。  いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／又は状態にかかりやすい個体は、疾患、障害、及び／又は状態と診断されていない可能性がある。  いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／又は状態にかかりやすい個体は、疾患、障害、及び／又は状態の症状を示し得る。  いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／又は状態にかかりやすい個体は、疾患、障害、及び／又は状態の症状を示さない場合がある。  いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／又は状態にかかりやすい個体は、疾患、障害、及び／又は状態を発症する。  いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／又は状態にかかりやすい個体は、疾患、障害、及び／又は状態を発症しないであろう。
【０１２５】
治療する（ｔｒｅａｔ）：本明細書中で使用される場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状又は特徴を部分的に又は完全に緩和、改善、緩和、阻害、予防、発症の遅延、重症度の低減、及び／又は発症率の低減をするために使用される任意の方法を指す。治療は、疾病、障害、及び／又は状態の徴候を示さない被検者に投与され得る。いくつかの実施形態において、治療は、疾患、障害、及び／又は状態の初期徴候のみを示す被検者に、例えば、疾患、障害、及び／又は状態に関連する病理を発症する危険性を低下させる目的で投与され得る。
【０１２６】
野生型：本明細書中で使用される場合、「野生型」という用語は、「正常」（突然変異体、疾患、改変などと対照的に）状態又は文脈において自然界で見出されるような構造及び／又は活性を有するエンティティを指すその技術的に理解された意味を有する。当業者は、野生型遺伝子及びポリペプチドがしばしば複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在することを理解するであろう。
【０１２７】
特許又は出願ファイルには、色彩で実行された少なくとも１つの図が含まれている。色彩図面を伴う本特許又は特許出願公開の写しは、請求及び必要な手数料の納付により、特許商標庁によって提供される。
【０１２８】
当業者は、以下に記載される図は、例示目的のためのみであることを理解するであろう。これらの図は、本教示の範囲を如何に限定することを意図したものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、本開示によって提供される方法論の模式図を表す。
【図２】提供された方法の例示的な逐次バーコード化。（ａ）逐次バーコード化の模式図。ハイブリダイゼーションの各ラウンドにおいて、複数のプローブ（例えば、２４）を各転写物物上でハイブリダイゼーションし、イメージングし、次いでＤＮａｓｅＩ処理によりストリッピングした。同じプローブ配列を異なるラウンドのハイブリダイゼーションで使用することができるが、プローブは異なるフルオロフォアにカップリングされた。（ｂ）複合体４色彩ＦＩＳＨ  複数のイースト細胞上の３回のハイブリダイゼーションから得られたデータ。１２の遺伝子は２ラウンドのハイブリダイゼーションによりコードされ、３回目のハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション１と同じプローブを用いた。枠付き領域は各画像の右下角で拡大した。マッチングスポットを示し、バーコードを抽出した。共局在化をもたない斑点は、理論的に制限されることを意図していないが、誤ったハイブリダイゼーションと同様に、細胞中のプローブの非特異的結合に起因する可能性がある。各バーコードの数を定量し、単一細胞における対応する転写産物の存在量を提供した。（ｃ）例示的なバーコードｍＲＮＡ  １：黄−青−黄、ｍＲＮＡ  ２：緑−紫緑、ｍＲＮＡ  ３：紫−青−紫、ｍＲＮＡ  ４：青−紫−青。
【図３】逐次ハイブリッド化とバーコード化の模式図。（ａ）逐次ハイブリッド化とバーコード化の模式図。（ｂ）細胞のＦＩＳＨ画像の模式図。ハイブリダイゼーションのたびに、同じスポットが検出されたが、転写物に関連する染料は変化した。ｍＲＮＡの同一性はハイブリダイズした染料の時間的配列にコードされていた。
【図４】例示的なオリゴヌクレオチド調製物元のオリゴヌクレオチド（図に例示するようにプローブ）ライブラリーは、いくつかのプローブサブ−ライブラリーを含む。それぞれのサブライブラリーは、ＰＣＲを用いてサブ−ライブラリーを増幅するために使用することができる特異的な一連のプライマーを有する。所望のサブ−ライブラリーが増幅されると、製品はニッキングエンザイムとインキュベートされる。この酵素はプローブストランド上のホスホジエステル結合を認識部位で切断する。得られた製品を変性させ、変性ゲル上でそれを走行させることにより、所望のプローブ配列を放出させることができる。次に、プローブバンドをゲルから切り出して抽出することができる。抽出した製品をハイブリダイゼーションに用いることができる。
【図５】図５は、切断可能なジスルフィドリンカーを介して染料に結合したＤＮＡプローブを合成するための例示的な反応スキームを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、遺伝子特異的一次プローブ、二次ブリッジプローブ及び三次読み出しプローブを用いる逐次バーコード法の例示的実施形態を示す模式図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、２つのオーバーハング配列を有する一次プローブを用いる逐次バーコード法の例示的実施形態を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、先行技術の方法に従って実施される例示的なハイブリダイゼーション鎖状反応を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、例示的な読出しプローブを示す図を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、切断可能リンカーを有する読み出しプローブに基づく例示的なハイブリダイゼーション鎖状反応を示す。
【図８】図８は、目的の核酸分子をターゲティングするための例示的な再ハイブリダイゼーションスキームの模式図である。
【図９】図９は、目的のタンパク質分子をターゲティングするための例示的な再ハイブリダイゼーションスキームの模式図である。
【図１０】図１０は、本明細書中に記載されるような読み出しプローブの除去を伴う逐次ハイブリダイゼーションを例示する共焦点画像の代表的なセットである。
【図１１】図１１は、標的分子を検出するためのオリゴヌクレオチド結合抗体を用い、かつ本明細書中に記載されるようなハイブリダイゼーションのラウンド間の読み出しプローブの除去を伴う逐次ハイブリダイゼーションプロトコルを示す共焦点画像の代表的なセットである。
【発明を実施するための形態】
【０１３０】
（特定の実施形態の詳細な説明）
実施形態は、細胞中の核酸（例えば、転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座）をプロファイリングするための新規の方法、組成物及び／又はキットに関する。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、本明細書中で提供される方法は、細胞中の核酸（例えば、転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座）をプロファイリングするための方法である。いくつかの実施形態において、方法は、単一細胞における複数の標的をプロファイリングする。提供された方法は、とりわけ、多数の標的（転写物、ＤＮＡ遺伝子座又はそれらの組合せ）を、逐次バーコード化を通して、限られた数の検出可能な標識でプロファイリングすることができる。
【０１３２】
図１は、本明細書中に開示された実施形態に従った方法論を示す。図１に示されるように、標識プローブとの複数回のハイブリダイゼーション（接触工程）が、細胞内に存在する標的分子（例えば、ｍＲＮＡ）を検出する方法論が本明細書中に提供される。例えば、図１に示されているように、細胞内で核酸標的とハイブリダイズするプローブのセットが提供され、プローブ（すなわち、異なる標的とハイブリダイズする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド）が単一のセット内で標識され、さらに、少なくとも１つのプローブが異なる組で異なって標識される。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、例えば、図１に示すように、本明細書中で提供されるのは、以下の工程を含む方法である：
（ａ）複数の転写物及びＤＮＡ遺伝子座を含む細胞と、第一の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を含む第一の接触工程を実施する工程であって、その各々が転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、検出可能な部分で標識され、それゆえに、組成物が、少なくとも以下を含む、工程：
（ｉ）第一の転写物又はＤＮＡ座を標的とし、第一の検出可能な部分で標識された第一のオリゴヌクレオチド；及び
（ｉｉ）第二の転写物又はＤＮＡ座を標的とし、第二の検出可能な部分で標識された第二のオリゴヌクレオチド；
（ｂ）第一の複数のオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションがそれらの標的と検出されるように、第一の接触工程の後の細胞をイメージングする工程；
（ｃ）細胞を第二の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む第二の接触工程を実施する工程であって、第二の複数は、第一の複数によって標的とされる重複転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする複数のオリゴヌクレオチドを含み、それゆえに、第二の複数は、少なくとも以下を含む、工程：
（ｉ）第一のオリゴヌクレオチドと配列が任意に同一であり、第一の転写物又はＤＮＡ座を標的とする第三のオリゴヌクレオチド；及び
（ｉｉ）任意には第二のオリゴヌクレオチドと配列が同一であり、第二の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする、第四のオリゴヌクレオチド、
であって、第二の複数は、第二の複数の中に存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、第一の複数の中の同一の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする対応するオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能な部分で標識されている点で第一の複数とは異なり、それゆえに、第二の複数中で、以下である、工程：
（ｉｉｉ）第三のオリゴヌクレオチドは、第一の検出可能な部分、第二の検出可能な部分又は第三の検出可能な部分で標識される；かつ
（ｉｖ）第四のオリゴヌクレオチドは、第一の検出可能な部分、第二の検出可能な部分、第三の検出可能な部分、又は第四の検出可能な部分で標識される、
であって、第三のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能な部分で標識されるか、又は第四のオリゴヌクレオチドは、第二のオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能な部分で標識されるか、又はその両方である、工程；
（ｄ）第二の複数のオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションがそれらの標的と検出されるように、第二の接触工程の後に細胞をイメージングする工程；及び
（ｅ）第一及び第二の複数によって標的とされる重複転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とするオリゴヌクレオチドを含む新規の複数の検出可能な標識オリゴヌクレオチドとの、各回ごとでの、接触及びイメージング工程を、任意で繰り返す工程であって、各々が利用された複数は、同じ転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とするオリゴヌクレオチドの検出可能な部分標識における少なくとも１つの差異のために、互いに利用された複数とは異なる、工程。
【０１３４】
前述の実施形態では、方法は、以下の工程をさらに含む：
（ｆ）複数の核酸を含む細胞と複数の中間オリゴヌクレオチドとを接触させる工程を含む接触工程を実施する工程であって、それらの各々は：
（ｉ）核酸を標的とし、検出可能な部分で任意に標識される；かつ
（ｉｉ）標的とのハイブリダイゼーション後の突出配列を含む
工程；及び
（ｇ）任意に、標的との中間オリゴヌクレオチド間の相互作用が検出されるように、細胞をイメージングする工程。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、工程（ｆ）及び任意に工程（ｇ）は、工程（ａ）の前に実施される。いくつかの実施形態において、工程（ｆ）は、工程（ａ）を実施する。いくつかの実施形態において、除去工程は、中間オリゴヌクレオチドを保存する。
【０１３６】
本明細書中では、以下の工程を含む逐次ハイブリダイゼーション方法も提供される：
ａ）標的分子と複数の一次抗体とを接触させる工程であって、各一次抗体は、直列に連結され、一次抗体に連結された１つ以上の結合標的を含む、工程；
ｂ）標的分子を第一の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブは、シグナル部分を含み、各読み出しプローブは、複数の一次抗体の一次抗体の第一の結合標的の第一の結合標的と相互作用し、
シグナル部分は、第一の複数の読み出しプローブから複数の一次抗体の第一の結合標的への各読み出しプローブの相互作用時に第一の検出可能な可視シグナルを放出することが可能である、工程；
ｃ）工程ｂ）の後の標的分子をイメージングして、第一の複数の読み出しプローブと複数の一次抗体との間の相互作用が、第一の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるようにする工程；
ｄ）標的分子及び複数の一次抗体を第一の複数の読み出しプローブと変性剤を含む溶液と接触させる工程であって、溶液と標的分子、複数の一次抗体及び第一の複数の読み出しプローブとの接触では、複数の一次抗体と標的分子との相互作用が妨害されない、工程；
ｅ）標的分子及び複数の一次抗体を第二の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブはシグナル部分を含み、各読み出しプローブは、複数の一次抗体の一次抗体の第二の結合標的と相互作用し、
シグナル部分は、各読み出しプローブと複数の一次抗体の第二の結合標的との相互作用時に、第二の検出可能な可視シグナルを放出することが可能である、工程；及び
ｆ）第二の複数の読み出しプローブと複数の一次抗体との間の相互作用が、第二の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｅ）の後の標的核酸分子をイメージングする工程。
【０１３７】
前述の実施形態では、標的分子は核酸又はタンパク質であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、標的分子はＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態において、標的分子はＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態において、標的分子はＲＮＡ転写物である。いくつかの実施形態において、標的分子はタンパク質である。
【０１３８】
また、本明細書中で提供されるのは、以下の工程を含む逐次ハイブリダイゼーション方法である：
ａ）標的核酸分子を複数の一次プローブと接触させる工程であって、各一次プローブは、以下：
（ｉ）標的核酸分子内の相補的標的配列に結合する一次結合配列、及び
（ｉｉ）一次結合配列の一端に連結され、一次結合配列に連結された１つ以上の結合標的を含む、一次結合配列の一端に連結された第一の突出配列
を含む、工程；
ｂ）標的核酸分子を第一の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブが、シグナル部分を含み、各読み出しプローブが、複数の一次プローブのうちの一次プローブのうちの１つ以上の結合標的の第一の結合標的と相互作用し、
シグナル部分が、第一の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブと、複数の一次プローブのうちの一次プローブのうちの１つ以上の結合標的のうちの第一の結合標的との相互作用時に、第一の検出可能な可視シグナルを放出することができる、
工程；
ｃ）第一の複数の読み出しプローブと複数の一次プローブとの間の相互作用が、第一の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｂ）の後の標的核酸分子をイメージングする工程；
ｄ）標的核酸分子、複数の一次プローブ、及び第一の複数の読み出しプローブと変性剤を含む溶液と接触させる工程であって、溶液と標的核酸分子、複数の一次プローブ、及び第一の複数の読み出しプローブとの接触が、複数の一次プローブと標的核酸分子との相互作用を妨害しない、工程；
ｅ）標的核酸分子を第二の複数の読み出しプローブと接触させる工程であって、各読み出しプローブは、シグナル部分を含み、各読み出しプローブは、第一の複数の読み出しプローブの第二の結合標的と相互作用し、
シグナル部分は、第二の複数の読み出しプローブからの各読み出しプローブの相互作用時に、第二の検出可能な可視シグナルを放出することが可能である、
工程；及び
ｆ）第二の複数の読み出しプローブと複数の一次プローブとの間の相互作用が、第二の検出可能な可視シグナルの存在によって検出されるように、工程ｅ）の後の標的核酸分子をイメージングする工程。
【０１３９】
前述の実施形態では、標的核酸分子は、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（例えば、ＲＮＡ転写産物を含む）であってもよい。
【０１４０】
本明細書中に開示される実施形態では、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、検出可能な部分で標識される。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、１つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、２つ以上の検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、１つの検出可能な部分を有する。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、２つ以上の検出可能な部分を有する。
【０１４１】
本明細書中に開示される実施形態では、シグナル部分を有するプローブは、シグナル部分で標識されるか、又はシグナル部分に連結される。いくつかの実施形態において、シグナル部分を有するプローブは、１つのシグナル部分を含む。いくつかの実施形態において、シグナル部分を有するプローブは、２つ以上のシグナル部分を含む。いくつかの実施形態において、シグナル部分を有するプローブは、１つのシグナル部分を有する。いくつかの実施形態において、シグナル部分を有するプローブは、２つ以上のシグナル部分を有する。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、検出可能な部分又はシグナル部分は、フルオロフォアであるか、又はそれを含む。シグナル部分を有する例示的に検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド又はプローブは、フルオロフォアで標識することができ、限定されるものではないが、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）用のプローブを含む。当業者に広く知られかつ実施されるように、実施しているＦＩＳＨは、とりわけ、特定のＤＮＡ配列又はＲＮＡ標的の有無を検出し、局在化するために使用される。検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドをデザインし、調製する方法は、当該分野で広く知られており、これには、例えば、米国特許出願公開第２０１２−０１４２０１４号に記載されているものが含まれるが、これらに限定されるものではない。しかしながら、フルオロフォアの利用可能性のような制限のために、ＦＩＳＨは、与えられた実験において限られた数の標的をプロファイリングするためにのみ使用することができる。異なる標的を多重化するための逐次バーコーディングを通して、ここに開示される方法は、ＦＮまでの多数の標的をプロファイリングすることができ、ここでＦは検出可能な部分のタイプの数（ＦＩＳＨ、フルオロフォアの場合）であり、Ｎは接触工程の数（ＦＩＳＨ、ハイブリダイゼーションの場合）である。たとえば、Ｆが４個、Ｎが８個の場合、トランスクリプトームのほぼ全体（４８＝６５，５３６）をプロファイリングすることができる。いくつかの実施形態において、Ｆは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、Ｆは３である。いくつかの実施形態において、Ｆは４である。いくつかの実施形態において、Ｆは５である。いくつかの実施形態において、Ｆは６である。いくつかの実施形態において、Ｆは７である。いくつかの実施形態において、Ｆは８である。いくつかの実施形態において、Ｆは９である。いくつかの実施形態において、Ｆは１０である。いくつかの実施形態において、Ｆは１１である。いくつかの実施形態において、Ｆは１２である。いくつかの実施形態において、Ｆは１３である。いくつかの実施形態において、Ｆは１４である。いくつかの実施形態において、Ｆは１５である。いくつかの実施形態において、Ｆは１５より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは２である。いくつかの実施形態において、Ｎは２より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは３である。いくつかの実施形態において、Ｎは３より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは４である。いくつかの実施形態において、Ｎは４より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは５である。いくつかの実施形態において、Ｎは５より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは６である。いくつかの実施形態において、Ｎは６より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは７である。いくつかの実施形態において、Ｎは７より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは８である。いくつかの実施形態において、Ｎは８より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは９である。いくつかの実施形態において、Ｎは９より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは１０である。いくつかの実施形態において、Ｎは１０より大きい。いくつかの実施形���において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１００の標的を標的とする。
【０１４３】
接触工程において、シグナル部分を有する検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド又はプローブを、その標的への結合の前、同時又はその後に標識することができる。いくつかの実施形態において、フルオロフォア標識オリゴヌクレオチドのようなシグナル部分を有する検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド又はプローブは、その標的への結合に先立って標識される。いくつかの実施形態において、シグナル部分を有する検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド又はプローブは、その標的への結合と同時に標識される。いくつかの実施形態において、シグナル部分を有する検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド又はプローブは、その標的への結合に続いて標識される。いくつかの実施形態において、シグナル部分を有する検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド又はプローブは、ハイブリダイゼーション鎖状反応（ＨＣＲ）による直交増幅を通して、ハイブリダイゼーションに続いて標識される（Ｃｈｏｉ，  ＨＭ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１０  Ｎｏｖ；２８（１１）：１２０８−１２）。いくつかの実施形態において、シグナル部分を有する検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド又はプローブは、部分、例えば核酸配列を含み、イメージング工程においてシグナルを提供し得る１以上の部分は、オリゴヌクレオチドに直接又は間接的に連結し得る。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、同じ種類の標識を、異なる標的のために異なるプローブ又はオリゴヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態において、同じ標的のためのプローブ又はオリゴヌクレオチドは、接触工程（検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドのセット）で使用される複数の検出可能に標識されたプローブ又はオリゴヌクレオチドにおいて同じ標識を有する。各標的は、ラウンドの接触及びイメージングの後、ラベルの独自の組合せ（逐次バーコード化）を有し、それゆえに、標的に対して、情報、例えば、定量的及び／又は空間的情報を得ることができる。例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド又はシグナル部分を有するプローブを標識するためにフルオロフォアを使用する場合、Ｎ回工程の後、標的は、Ｆ１Ｆ２．．．ＦＮの逐次バーコードであって、Ｆｎは、ｎ番目のイメージングにおいて標的に使用されるフルオロフォアの色彩である逐次バーコードを有するであろう。１つの標的は、バーコードの違い（例：ＲｅｄＢｌｕｅＲｅｄとＲｅｄＲｅｄＢｌｕｅの比較）によって他の標的と鑑別できる。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される標識は、フルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒｓ、ＡＴＴＯ染料、又はそれらの任意のアナログもしくは誘導体を含むが、これらに限定されない、１つ以上の蛍光染料であるか、又はそれらを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される標識は、フルオレセインのフルオレセイン及び化学誘導体；エオシン；カルボキシフルオレセイン；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）；エリスロシン；ローズベンガル；細菌緑膿菌から分泌されるフルオレセイン；メチレンブルー；レーザー染料；ローダミン染料（例えば、ローダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３、オーラミンＯ、スルフォルホダミン１０１、スルフォルホダミンＢ、及びテキサスレッド）を含むが、これらに限定されない。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される標識は、ＡＴＴＯ染料；アクリジン色素（例：アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ；７−アミノアクチノマイシンＤ；８−アニリノナフタレン−１−スルホネート；オーラミン−ローダミン染色；ベンザントロン；５，１２−ビス（フェニルエチニル）ナフタセン；９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン；ブラックライトペイント；虹；カルセイン；カルボキシフルオレセイン；カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル；カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；１−クロロ−９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン；２−クロロ−９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン；２−クロロ−９，１０−ジフェニルアントラセン；クマリン；シアニン色素（Ｃｙ３およびＣｙ５などのシアニン、ＤｉＯＣ６、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）；ＤＡＰＩ、ダーククエンチャー、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ、Ｆｌｕｏ−４、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ；フルオロン染料（例：カルセイン、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル、エオシン、エオシンＢ、エオシンＹ、エリスロシン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、メルセインイエローブロイン、フルオレセインフルオレセイン）フルオロジェイド染色；Ｆｕｒａ−２；フラ−２−アセトキシメチルエステル；緑色蛍光タンパク質、ヘキスト染色、インディアンイエロー、インド−１、ルシファーイエロー、ルシフェリン、メロシアニン、蛍光増白剤、オキサジン染料（例、クレシルバイオレット、ナイルブルー、ナイルレッド）；ペリレン；フェナントリジン染料（臭化エチジウムおよびヨウ化プロピジウム）。フロキシン、フィコビリン、フィコエリトリン、フィコエリスロビリン、ピラニン、ローダミン、ローダミン１２３、ローダミン６Ｇ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＲｏＧＦＰ、ルブレン、ＳＹＢＲグリーンＩ、（Ｅ）−スチルベン、（Ｚ）−スチルベン、スルホホダミン１０１、スルホホタミンＢ、シンホルホダミンＢテトラフェニルブタジエン、テトラナトリウムトリス（バソフェナントロリンジスルホネート）ルテニウム（ＩＩ）、テキサスレッド、ＴＳＱ、ウンベリフェロン、又は黄色蛍光タンパク質を含むが、これらに限定されない。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、本発明の標識は、蛍光染料のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒファミリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン）を含むが、これらに限定されない。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ染料は蛍光顕微鏡や細胞生物学における細胞及び組織ラベルとして広く用いられている。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ一連の励起スペクトルと発光スペクトルは可視スペクトルを被覆部し、赤外に広がる。ファミリーの個々のメンバーには、その励磁最大値（ｎｍ）に大まかにしたがって番号をつける。ある種のアレキサフッ素染料は、クマリン、ローダミン、キサンテン（フルオレセインなど）、シアニン染料のスルホン化によって合成される。いくつかの実施形態において、スルホン化は、アレキサフルオロ染料を負電荷及び親水性にする。いくつかの実施形態において、アレキサフルオロ染料は、同等の興奮及び放射の一般的な染料（例えば、フルオレセイン、ローダミン）、及びある程度はより新規のシアニン一連よりも安定で、より明るく、ｐＨ感受性が低い。例示的なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ染料は、Ａｌｅｘａ−３５０、Ａｌｅｘａ−４０５、Ａｌｅｘａ−４３０、Ａｌｅｘａ−４８８、Ａｌｅｘａ−５００、Ａｌｅｘａ−５１４、Ａｌｅｘａ−５３２、Ａｌｅｘａ−５４６、Ａｌｅｘａ−５５５、Ａｌｅｘａ−５６８、Ａｌｅｘａ−５９４、Ａｌｅｘａ−６１０、Ａｌｅｘａ−６３３、Ａｌｅｘａ−６４７、Ａｌｅｘａ−６６０、Ａｌｅｘａ−６８０、Ａｌｅｘａ−７００、又はＡｌｅｘａ−７５０を含むが、これらに限定されない。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、標識は、蛍光染料のＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒファミリー（ダイオミックス及びサーモフィッシャーサイエンティフィック）の１つ以上を含むことができる。例示的ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒファミリー染料は、ＤｙＬｉｇｈｔ−３５０、ＤｙＬｉｇｈｔ−４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ−４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ−５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ−５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ−６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ−６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ−６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ−７５０、又はＤｙＬｉｇｈｔ−８００を含むが、これらに限定されない。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、検出可能又はシグナル部分は、ナノ材料であるか、又はナノ材料を含む。いくつかの実施形態において、検出可能又はシグナル部分は、ナノ粒子であるか、又は圧縮する。いくつかの実施形態において、検出可能又はシグナル部分は、量子ドットであるか、又は量子ドットを含む。いくつかの実施形態において、検出可能又はシグナル部分は量子ドットである。いくつかの実施形態において、検出可能又はシグナル部分は、量子ドットを含む。いくつかの実施形態において、検出可能又はシグナル部分は、金ナノ粒子であるか、又は金ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、検出可能又はシグナル部分は金ナノ粒子である。いくつかの実施形態において、検出可能又はシグナル部分は金ナノ粒子を含む。
【０１５１】
当業者は、いくつかの実施形態において、特定の周期における特定のプローブ又はオリゴヌクレオチドのためのラベル又はシグナル部分の選択は、例えば、大きさ、生成されるシグナルの種類、プローブに付着又はプローブに組み込まれるマナー、細胞内での位置を含む細胞成分の特性、細胞の特性、分析される相互作用の種類などを含む様々な因子に基づいて決定され得ることを理解する。
【０１５２】
例えば、いくつかの実施形態において、プローブは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ−エステル）反応性基を有するように合成されたＣｙ３又はＣｙ５のいずれかで標識される。ＮＨＳ−酸エステルは脂肪族アミン基と容易に反応するので、ヌクレオチドはアミノアルキル基で修飾することができる。これは、合成反応の際にアミノアルキル修飾ヌクレオチドを取り込むことによって行うことができる。いくつかの実施形態において、標識は、クエンチング効果を避けるために６０塩基類ごとに使用される。
【０１５３】
シグナル部分を有する検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド又はプローブは、標的、例えば転写物又はＤＮＡ遺伝子座とハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態において、標的は、転写物であるか、又は転写物を含む。いくつかの実施形態において、標的は転写物である。いくつかの実施形態において、転写物はＲＮＡである。いくつかの実施形態において、転写物はｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、転写物はｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、転写物はｒＲＮＡである。いくつかの実施形態において、転写物はｓｎＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは非コードＲＮＡである。例示的な非コード化ＲＮＡ型は、長い非コード化ＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、小さな核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）及び他の短いＲＮＡを含むがこれらに限定されない、当技術分野で広く知られている。いくつかの実施形態において、ＲＮＡはｌｎｃＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡはｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡはｐｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡはｓｎｏＲＮＡである。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、標的は、ＤＮＡ座であるか、又はＤＮＡ座を含む。いくつかの実施形態において、標的がＤＮＡ遺伝子座である場合、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、任意に１つ以上のＲＮＡヌクレオチド又はＲＮＡセグメントを含む。検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ配列を含むが、ＤＮＡターゲット分解することなくイメージング後に、例えばＲＮＡ特異的酵素消化を通して選択的に除去することができる。ＲＮＡを特異的に分解するが、ＤＮＡを分解しない例示的な酵素には、ＲＮａｓｅＡ及びＲＮａｓｅＨなどの種々のＲＮａｓｅが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、シグナル部分を有する検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド又はプローブは、その標的、例えば、転写物又はＤＮＡ座に直接ハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、シグナル部分を有する検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド又はプローブは、１以上の中間体、例えば、オリゴヌクレオチドへの結合又はハイブリダイゼーションを介して、標的と特異的に相互作用し（認識し）、それ以外は標的と特異的に連結する。いくつかの実施形態において、中間オリゴヌクレオチドは、相補的配列を有する第二オリゴヌクレオチド（「ブリッジオリゴヌクレオチド」、「ブリッジプローブ」、又は「読み出しプローブ」とも呼ばれる）がそれに結合できるように、その標的に対してオーバーハングでハイブリダイズされる。例えば、いくつかの実施形態において、中間オリゴヌクレオチド（本明細書中では「一次プローブ」とも呼ばれる）は、標的分子に対してハイブリダイズされ、ここで、中間オリゴヌクレオチドは、（ｉ）中間オリゴヌクレオチドのオーバーハング配列の一部に相補的な配列及び（ｉｉ）検出可能又はシグナル部分を含む読み出しプローブが中間オリゴヌクレオチドに結合できるような少なくとも１つのオーバーハング配列を含む。いくつかの実施形態において、中間オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのオーバーハング配列は、ブリッジプローブの配列に相補的であり、ブリッジプローブは、読み出しプローブの配列に相補的な配列を含む工程であって、読み出しプローブは、（ｉ）ブリッジプローブの一部に相補的な配列、及び（ｉｉ）検出可能又はシグナル部分を含む。次に、読み出しプローブは、中間オリゴヌクレオチドに連結又は結合しているブリッジプローブとの結合を介して中間オリゴヌクレオチドと相互作用する。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、中間体は、核酸を標的とし、検出可能又はシグナル部分で任意に標識され、標的とのハイブリダイゼーション後のオーバーハング配列を含む。いくつかの実施形態において、中間体は、標的、オーバーハング配列、及び任意に検出可能又はシグナル部分にハイブリダイズする配列を含む。いくつかの実施形態において、中間体は、標的及び突出配列にハイブリダイズする配列を含む。いくつかの実施形態において、中間体は、検出可能又はシグナル部分を有さない。いくつかの実施形態において、第二のオリゴヌクレオチドは、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第二の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、染料で標識される。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ＨＣＲ重合体で標識される。いくつかの実施形態において、標的に結合した中間オリゴヌクレオチドは、複数の接触、除去及び／又は画像工程を通して保存される；逐次バーコードは、接触及び画像工程においてブリッジプローブを通して中間オリゴヌクレオチドに連結される検出可能な標識の組合せを通して提供される。例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが読み出しプローブとして使用される場合、バーコードは、そのオーバーハング配列を通して中間オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドによって提供される。イメージング工程の後、読出オリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載されているように、任意に除去される。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、中間オリゴヌクレオチドと直接相互作用する。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、ブリッジプローブと相互作用し、それは相互作用するか又は相互作用するオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、１つの中間オリゴヌクレオチドが標的のために使用される。いくつかの実施形態において、２つ以上の中間オリゴヌクレオチドが標的のために使用される。いくつかの実施形態において、標的のために３つ以上の中間オリゴヌクレオチドが使用される。いくつかの実施形態において、４つ以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、５つ以上の中間オリゴヌクレオチドが標的のために使用される。いくつかの実施形態において、６つ以上の中間オリゴヌクレオチドが標的に使用される。いくつかの実施形態において、７つ以上の中間オリゴヌクレオチドが標的のために使用される。いくつかの実施形態において、８以上の中間オリゴヌクレオチドが標的に使用される。いくつかの実施形態において、９以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、１０以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、１１以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、１２以上の中間オリゴヌクレオチドが標的のために使用される。いくつかの実施形態において、１３以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、１４以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、１５以上の中間オリゴヌクレオチドが標的のために使用される。いくつかの実施形態において、１６以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、１７以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、１８以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、１９以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、２０以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、２１以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、２２以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、２３以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、２４以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、２５以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、３０以上の中間オリゴヌクレオチドが標的のために使用される。いくつかの実施形態において、４０以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に使用する。いくつかの実施形態において、５０以上の中間オリゴヌクレオチドが標的に使用される。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、各中間体オリゴヌクレオチドは、標的の異なる配列とハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、標的の各中間オリゴヌクレオチドは、同じオーバーハング配列を含む。いくつかの実施形態において、標的についての各検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、標的のすべての中間オリゴヌクレオチドによって共有される同じオーバーハング配列に相補的な同じ配列を含む。いくつかの実施形態において、中間オリゴヌクレオチドは、標的に相補的な配列、及び検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドに相補的な配列を含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、提供された技術は、スプライシング変異、ＲＮＡ編集、オリゴヌクレオチド修飾、又はそれらの組合せの結果として形成される異なる転写物をプロファイリングするために使用される。いくつかの実施形態において、標的は、ＲＮＡスプライシングバリアントである。いくつかの実施形態において、提供された技術は、遺伝子の１つ以上のスプライシングバリアント、例えば、遺伝子の１つ以上のスプライシングバリアントの位置及び量をプロファイリングする。いくつかの実施形態において、提供される方法又は組成物は、異なるスプライシングバリアントをプロファイリングする。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異体を含むエキソンは、逐次ハイブリダイゼーション及びバーコード化によって標的と及びバーコード化される。いくつかの実施形態において、スプライシングバリアントは、スプライシングに起因する１つ以上の識別可能な配列を含み、そのような配列を標的とする。いくつかの実施形態において、エキソン及び／又は識別可能な配列を標的とすることにより、提供される技術は、１つ以上の特異的スプライシングバリアント、又はｍＲＮＡの全体スプライシングレパートリーをプロファイリングすることができる。当技術分野で広く知られているように、ｍＲＮＡスプライシングは、例えば、自閉症又はダウン症候群のような神経疾患のような、多数の生物学的プロセス及び疾患に重要である。細胞間の密着性や共生を担う分子はスプライシングを受け、その欠陥が脳内で誤ったワイヤリングを生じ、疾患を引き起こすことが知られている。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、配列編集、化学修飾及び／又はそれらの組合せによって引き起こされる配列修飾を標的とする。いくつかの実施形態において、改変された核酸標的は、場合によっては変換処理の後に、非改変標的と比較して１つ以上の異なる相補的配列とハイブリダイズし、改変された核酸と選択的にハイブリダイズする１つ以上のオリゴヌクレオチドを用いてプロファイリングされる。いくつかの実施形態において、標的は、ＲＮＡ編集によるＲＮＡである（Ｂｒｅｎｎｉｃｋｅ，  Ａ．，  Ａ．  Ｍａｒｃｈｆｅｌｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）．  “ＲＮＡ  ｅｄｉｔｉｎｇ"．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２３  （３）：  ２９７-  ３１６）。いくつかの実施形態において、提供された技術は、ＲＮＡ編集によって形成される異なるＲＮＡ変異体をプロファイリングする。いくつかの実施形態において、提供された技術は、改変オリゴヌクレオチドをプロファイリングする。いくつかの実施形態において、提供された技術プロファイルは、メチル化ＲＮＡである（Ｓｏｎｇ  ＣＸ，  Ｙｉ  Ｃ，  Ｈｅ  Ｃ．  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｒｅｃｅｎｔｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１２  Ｎｏｖ；３０（１１）：１１０７−１６）。いくつかの実施形態において、提供された技術は、メチル化ＤＮＡをプロファイリングする。いくつかの実施形態において、標的は一塩基多型（ＳＮＰ）である。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、標的をプロファイリングすることにより、提供された技術は、とりわけ、標的の定量的及び／又は位置決めの情報を、場合によっては、単一細胞、組織、臓器、又は生物において提供する。いくつかの実施形態において、転写物のプロファイリングを用いて、細胞、組織、臓器又は生物内の遺伝子発現の空間的−時間的パターンを定性的及び／又は定量的に定義することができる。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、セット中の各検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、異なる標的、例えば、転写物、ＤＮＡ座、又はタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、セット中の２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を有する。いくつかの実施形態において、２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ転写物を標的とする。いくつかの実施形態において、２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じＤＮＡ座を標的とする。いくつかの実施形態では、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００個の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的である。いくつかの実施形態において、２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、５つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、１０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、１５以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、２０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、２５以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、３０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、３５以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、４０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じターゲットをターゲットとする。いくつかの実施形態において、４５以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、５０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、６０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、７０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、８０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、９０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、１００以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約１〜１０個の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約５〜１５の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約１０〜２０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約１５〜２５の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約２０〜３０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約２５〜３５個の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約３０〜４０個の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約３５〜４５の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約４０〜５０個の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約４５〜５５の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約５０〜７０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約６０〜８０個の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約７０〜９０個の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約８０〜１００の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、同じ標的に対して複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを使用すると、シグナル強度が増加する。いくつかの実施形態において、同じ標的を標的とするセット中の各検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、標的の異なる部分と相互作用する。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、セット中の標的に対する全ての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同一の検出可能な部分を有する。いくつかの実施形態において、検出可能に標識された全てのオリゴヌクレオチドは、同じ方法で標識される。いくつかの実施形態において、標的のための検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは全て同じフルオロフォアを有する。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、標的のための検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、標的の標的領域内に配置される。標的領域はさまざまな長さをもつことができる。いくつかの実施形態において、標的と領域は約２０ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約３０ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約４０ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約５０ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約６０ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約８０ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約１００ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約１５０ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約２００ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約２５０ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約３００ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約３５０ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約４００ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約４５０ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約５００ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約６００ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約７００ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約８００ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約９００ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的と領域は約１０００ｂｐの長さである。いくつかの実施形態において、標的のための検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、標的上で互いに近接して配置される。
【０１６６】
当業者が理解しているように、イメージング工程には異なる技術を用いることができる。  例示的な方法には、エピフルオレセンス顕微鏡、共焦点顕微鏡、様々なタイプのスーパー分解能顕微鏡（ＰＡＬＭ／ＳＴＯＲＭ、ＳＳＩＭ／ＧＳＤ／ＳＴＥＤ）、及び光学シート顕微鏡（ＳＰＩＭ及び他）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６７】
例示的な超分解能技術には、Ｉ５Ｍ及び４Ｐｉ顕微鏡、刺激放出減少顕微鏡（ＳＴＥＤＭ）、基底状態破壊顕微鏡（ＧＳＤＭ）、空間構造照明顕微鏡（ＳＳＩＭ）、光活性化局在化顕微鏡（ＰＡＬＭ）、可逆飽和光学直鎖状蛍光転移（ＲＥＳＯＬＦＴ）、全内部反射蛍光マイクロスコープ（ＴＩＲＦＭ）、蛍光−ＰＡＬＭ（ＦＰＡＬＭ）、ストッカス光学再構成顕微鏡（ＳＴＯＲＭ）、ワンナノメータ精度（ＦＩＯＮＡ）による蛍光画像、及びそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。例えば：Ｃｈｉ，  ２００９  ”Ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：  ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｉｍｉｔｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６（１）：１５−１８；  Ｂｌｏｗ  ２００８，  ”Ｎｅｗ  ｗａｙｓ  ｔｏ  ｓｅｅ  ａ  ｓｍａｌｌｅｒ  ｗｏｒｌｄ，”  Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：８２５−８２８；  Ｈｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  ”Ｆａｒ−Ｆｉｅｌｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｎａｎｏｓｃｏｐｙ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：  １１５３；  Ｒ．  Ｈｅｉｎｔｚｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｆｉｃｚ，  ２００６，  ”Ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔ  ｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，”  Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５（４）：２８９−３０１；  Ｇａｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  ”Ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏ  ｔｏ  ｎａｎｏ：  ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ    ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，”  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：３−１２；  ａｎｄ  Ｂｅｗｅｒｓｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  ”Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｉ５Ｍ  ａｎｄ  ４Ｐｉ−ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，”  ２２２（２）：１０５−１１７；  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，  ２００４，  ”Ｍａｎ  ｔｈｅ  Ｎａｎｏｓｃｏｐｅｓ，”  ＪＣＢ  １６４（３）：３３７−３４０。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、電子顕微鏡（ＥＭ）が、使用される。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、イメージング工程は、標的を検出する。いくつかの実施形態において、イメージング工程は、標的を局在化する。いくつかの実施形態において、イメージング工程は、標的の三次元空間情報を提供する。いくつかの実施形態において、イメージング工程は、標的を定量化する。複数の接触及びイメージング工程を用いることにより、提供される方法は、驚くほど高いスループットで多数の標的に対する空間的及び／又は定量的な情報を提供することができる。例えば、検出可能に異なるタイプのＦ標識を使用する場合、Ｎ接触及びイメージング工程後に、ＦＮ標的までの空間的及び／又は定量的情報を得ることができる。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、接触及び／又はイメージング工程の前又は後に追加の工程を含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、各イメージング工程の後に、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する工程を含む。いくつかの態様において、除去する工程は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを分解することを含む。いくつかの実施形態において、除去する工程は、標的を著しく劣化させず、それゆえに、標的を、所望であれば次の接触及び／又はイメージング工程に使用することができる。いくつかの態様において、除去する工程は、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを消化する酵素と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、除去する工程は、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドをＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅと接触させる工程を含む。例えば、いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ配列を含み、ＤＮａｓｅは、その分解のために使用され；いくつかの他の実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ配列を含み、ＲＮａｓｅは、その分解のために使用される。いくつかの実施形態において、除去する工程は、検出可能な部分を分解することを含む。いくつかの実施形態において、除去する工程は、光退色を含む。いくつかの態様において、除去する工程は、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを変性剤と接触させて、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと中間プローブ又は標的核酸との間の相互作用を妨害することを含む。変性剤及び組成物が本明細書中に開示される。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの１セットの標的は、別のセットの標的でもある。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの１セットの標的は、別のセットの標的と重複する。いくつかの実施形態において、オーバーラップは１０％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは２０％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは３０％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは４０％以上である。いくつかの実施形態において、重複は５０％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは６０％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは７０％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは８０％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは９０％以上である。いくつかの実施形態において、重複は９１％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは９２％以上である。いくつかの実施形態において、重複は９３％以上である。いくつかの実施形態において、重複は９４％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは９０％以上である。いくつかの実施形態において、重複は９５％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは９６％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは９７％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは９８％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは９９％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは９９．５％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは９９．６％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは９９．７％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは９９．８％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは９９．９％以上である。いくつかの実施形態において、オーバーラップは１００％である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの１セットの標的は、別のセットの標的と同じである。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの各セットは、同じ標的を標的とする。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、第一の転写物又はＤＮＡ遺伝子座（第一の標的）を標的とする第二の接触工程における第三の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、任意に、第一の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする第一の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと同一の配列を有する。いくつかの実施形態において、配列は同一である。いくつかの実施形態において、配列は異なる。同様に、いくつかの実施形態において、第二の転写物又はＤＮＡ遺伝子座（第一の標的）を標的とする第二の接触工程における第四の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、任意に、第一の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする第二の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと同一の配列を有する。いくつかの実施形態において、配列は同一である。いくつかの実施形態において、配列は異なる。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、第二の複数の中に存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、第一の複数の中の同じ転写物又はＤＮＡ座を標的とする対応するオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能な部分で標識される点で、第二の複数は第一の複数と異なる。いくつかの実施形態において、複数中に存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、別の複数中の同じ転写物又はＤＮＡ座を標的とする対応するオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能な部分で標識される点で、各複数の検出可能な標識オリゴヌクレオチドは別のものとは異なる。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは［Ｓ］−［Ｌ］の構造を有し、［Ｓ］は、オリゴヌクレオチド配列であり、［Ｌ］は、検出可能な部分又は検出可能な部分の組合せである。いくつかの実施形態において、［Ｌ］は、検出可能な標識の複数の単位、例えば、フルオロフォアを含み、それらの各単位は、オリゴヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチド部分、例えば［Ｓ］と独立して結合する。いくつかの実施形態において、同一の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドに結合された各検出可能な標識は、同一の検出可能なシグナルを提供する。いくつかの実施形態において、同一のオリゴヌクレオチド配列に結合した検出可能な標識はすべて同一である。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、同じ標的を標的とするオリゴヌクレオチドは、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの２つ以上のセットの間で同一の配列セットを有し、すなわち、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの間に差異があれば、その差異は、配列ではなく、検出可能な部分内にある。例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの１セットにおいて、第一の標的を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、全て同じ検出可能な部分、又は検出部分［Ｌ］１の組合せを有する：
［Ｓ］１−［Ｌ］１、［Ｓ］２−［Ｌ］１、．．．、［Ｓ］ｎ−［Ｌ］１、ここで、ｎは、標的、例えば、３〜５０の整数に対する検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの数である。
【０１７６】
同じ標的を標的とするオリゴヌクレオチドが異なって標識される、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの別のセットでは、同じ標的を標的とするオリゴヌクレオチドは、同じオリゴヌクレオチド配列のセット（［Ｓ］１、［Ｓ］２、．．．、［Ｓ］ｎ）を有するが、まだ異なる［Ｌ］２：
［Ｓ］１−［Ｌ］２、［Ｓ］２−［Ｌ］２、・・・、［Ｓ］ｎ−［Ｌ］２、ここで、［Ｌ］１は［Ｌ］２と検出可能な差がある。
【０１７７】
例えば、２工程の２ラベル４標的（ＦＮ＝２２＝４）プロセスであって、各セットにおいて同一の標的を標的とする検出可能なラベルオリゴヌクレオチドがすべて、独立して同一の検出可能な部分を有する、プロセスを以下に提供する：
工程１．検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの第一の複数（Ｐ１）と標的を接触させる工程：
標的Ｔ１：［Ｓ］Ｐ１−Ｔ１−１［Ｌ］１、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ１−２［Ｌ］１、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ１−３［Ｌ］１、・・・、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ１−Ｐ１Ｔ１［Ｌ］１、ここで、Ｐ１Ｔ１は、第一の複数におけるＴ１を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの数であり、［Ｌ］１は、第一の検出可能な標識である；
標的Ｔ２：［Ｓ］Ｐ１−Ｔ２−１［Ｌ］１、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ２−２［Ｌ］１、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ２−３［Ｌ］１、・・・、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ２−Ｐ１Ｔ２［Ｌ］１（ここで、Ｐ１Ｔ２は、最初の複数におけるＴ２を標的とする検出可能な標識オリゴヌクレオチドの数である）；
標的Ｔ３：［Ｓ］Ｐ１−Ｔ３−１［Ｌ］２、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ３−２［Ｌ］２、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ３−３［Ｌ］２、．．．、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ３−Ｐ１Ｔ３［Ｌ］２、ここで、Ｐ１Ｔ３は最初の複数におけるＴ３を標的とする検出可能な標識オリゴヌクレオチドの数であり、［Ｌ］２は［Ｌ］１とは検出可能に異なる標識である；
標的Ｔ４：［Ｓ］Ｐ１−Ｔ４−１［Ｌ］２、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ４−２［Ｌ］２、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ４−３［Ｌ］２、・・・、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ４−Ｐ１Ｔ４［Ｌ］２、ここで、Ｐ１Ｔ４は、第一の複数におけるＴ４を標的とする検出可能な標識オリゴヌクレオチドの数である。
工程２：イメージング；
工程３：標的からＰ１を除去する；
工程４：検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの第二の複数（Ｐ２）と標的を接触させる工程：
標的Ｔ１：［Ｓ］Ｐ２−Ｔ１−１［Ｌ］１、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ１−２［Ｌ］１、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ１−３［Ｌ］１、・・・、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ１−Ｐ２Ｔ１［Ｌ］１（ここで、Ｐ２Ｔ１は、第二の複数におけるＴ１を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの数である）；
標的Ｔ２：［Ｓ］Ｐ２−Ｔ２−１［Ｌ］２、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ２−２［Ｌ］２、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ２−３［Ｌ］２、．．．、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ２−Ｐ２Ｔ２［Ｌ］２、ここで、Ｐ２Ｔ２は、第二の複数におけるＴ２を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの数である；
標的Ｔ３：［Ｓ］Ｐ２−Ｔ３−１［Ｌ］１、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ３−２［Ｌ］１、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ３−３［Ｌ］１、・・・、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ３−Ｐ２Ｔ３［Ｌ］１であり、ここで、Ｐ２Ｔ３は、第二の複数におけるＴ３を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの数である；
標的Ｔ４：［Ｓ］Ｐ２−Ｔ４−１［Ｌ］２、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ４−２［Ｌ］２、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ４−３［Ｌ］２、．．．、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ４−Ｐ２Ｔ４［Ｌ］２、ここで、Ｐ２Ｔ４は、第二の複数におけるＴ４を標的とする検出可能な標識オリゴヌクレオチドの数である。
工程５：イメージング。
【０１７８】
２つのイメージング工程の後、各ターゲットは独自の逐次バーコードを有する：
Ｔ１：［Ｌ］１［Ｌ］１；
Ｔ２：［Ｌ］１［Ｌ］２；
Ｔ３：［Ｌ］２［Ｌ］１；及び
Ｔ４：［Ｌ］２［Ｌ］２。
いくつかの実施形態において、追加のバーコード、Ｔ１−−、Ｔ２−−、−−Ｔ１、−−Ｔ２も使用することができ、ここで、−−は、その工程のためのシグナルがないことを示す。
【０１７９】
上記の例示のプロセスにおいて、Ｐ１Ｔ１、Ｐ１Ｔ２、Ｐ１Ｔ３、Ｐ１Ｔ４、Ｐ２Ｔ１、Ｐ２Ｔ２、Ｐ２Ｔ３及びＰ２Ｔ４の各々は、独立して自然数（０より大きい整数）である。いくつかの実施形態において、Ｐ１Ｔ１＝Ｐ２Ｔ１である。いくつかの実施形態において、Ｐ１Ｔ２＝Ｐ２Ｔ２である。いくつかの実施形態において、Ｐ１Ｔ３＝Ｐ２Ｔ３である。いくつかの実施形態において、Ｐ１Ｔ４＝Ｐ２Ｔ４である。いくつかの実施形態において、１つの検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが標的に使用される。いくつかの実施形態において、２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが標的に使用される。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、同一の標的を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、各複数において同一の配列セットを有する。例えば、上記の例における標的Ｔ１について、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ１−１〜［Ｓ］Ｐ１−Ｔ１−Ｐ１Ｔ１の各々は、独立して［Ｓ］Ｐ２−Ｔ１−１〜［Ｓ］Ｐ２−Ｔ１−Ｐ２Ｔ１の１つと同じ配列を有し、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ１−１〜［Ｓ］Ｐ２−Ｔ１−Ｐ２Ｔ１の各々は、独立して［Ｓ］Ｐ１−Ｔ１−１〜［Ｓ］Ｐ１−Ｔ１−Ｐ１Ｔ１の１つと同じ配列を有する。いくつかの実施形態において、同一の標的を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、各複数において異なる配列セットを有する。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、本明細書中で提供される方法は、任意に、イメージング工程の後に、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する工程を含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、イメージング工程の後の除去工程を含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、各イメージング工程の後で、最後のイメージング工程を除去工程含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、各イメージング工程後の除去工程を含む。
【０１８２】
本明細書中に開示される方法における除去工程は、種々の目的の１つ以上に役立つことができる。いくつかの実施形態において、除去工程は、標的が別の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと相互作用するために利用可能であるように、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを標的から除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、１つの複数の検出可能な標識オリゴヌクレオチドの検出可能な部分が、標的に結合した別の複数の検出可能な標識オリゴヌクレオチドの検出を妨害しないように、複数の検出可能な標識オリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも８０％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも８５％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９０％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９１％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９２％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９３％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９４％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの態様において、除去工程は、少なくとも９５％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９６％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９７％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９８％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９９％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９９．１％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９９．２％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９９．３％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９９．４％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９９．５％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、検出可能なシグナルの少なくとも８０％を除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、検出可能なシグナルの少なくとも８５％を除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、検出可能なシグナルの少なくとも９０％を除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、検出可能なシグナルの少なくとも９１％を除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、検出可能なシグナルの少なくとも９２％を除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、検出可能なシグナルの少なくとも９３％を除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、検出可能なシグナルの少なくとも９４％を除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、検出可能なシグナルの少なくとも９５％を除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、検出可能なシグナルの少なくとも９６％を除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、検出可能なシグナルの少なくとも９７％を除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、検出可能なシグナルの少なくとも９８％を除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、検出可能なシグナルの少なくとも９９％を除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、検出可能なシグナルの少なくとも９９．５％を除去する。いくつかの実施形態において、除去工程は、検出可能なシグナルの１００％を除去する。いくつかの実施形態において、除去工程の後、イメージング工程によってシグナルを検出することはできない。
【０１８３】
除去工程は、任意に、さらなる使用のために標的（例えば、転写物又はＤＮＡ遺伝子座）を保存し、例えば、さらなる接触及び／又はイメージング工程によるさらなる検出又は定量化を行う。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも８０％の標的を保存する。保存された標的の割合は、例えば、除去工程の前後に収集されたデータを比較することによって測定することができ、場合によっては同じ接触プロトコール及びイメージングプロトコルを使用する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも８５％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９０％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９１％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９２％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９３％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９４％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去工程は少なくとも９５％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９６％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９７％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９８％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去工程は、少なくとも９９％の標的を保存する。
【０１８４】
検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する方法は、当該技術分野で公知のものを含むことができる。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを分解する工程を含む除去工程。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、酵素消化によって除去される。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを消化する酵素と接触させる工程を含む除去工程。
【０１８５】
好適な酵素は当技術分野で広く使用されている。例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド及び／又は標的のタイプに応じて、ＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅのいずれかを使用することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的を検出／定量するためのＤＮＡ配列を含む検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮａｓｅ、例えばＤＮａｓｅＩによって消化される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡターゲット検出／定量するためのＲＮＡ配列を含む検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅによって消化される。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ遺伝子座を標的とするために使用される。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、標的に結合、ハイブリダイズ、又は他の方法で連結されたオリゴヌクレオチドのような１以上の中間体への結合又はハイブリダイゼーションを介して、その標的と相互作用する。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、標的にハイブリダイズした中間オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを通して標的と相互作用し、ここで、中間オリゴヌクレオチドは、標的に相補的な配列、及び検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドに相補的な配列（オーバーハング）を含む。いくつかの実施形態において、除去工程は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去し、任意に中間オリゴヌクレオチドを無傷に保つ。いくつかの実施形態において、除去工程は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去し、中間オリゴヌクレオチドを無傷に保つ。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、化学的又は酵素的斜視で中間体とは異なるため、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを選択的に除去することができる。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、除去工程は、標的分子、１つ以上の中間体、及び検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを、ホルムアミドを含む溶液と接触させることを含み、ここで、ホルムアミドは、約６０％（ｖ／ｖ）以下の濃度で溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、ホルムアミドは約６０％（ｖ／ｖ）の濃度で溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、ホルムアミドは約６０％（ｖ／ｖ）未満の濃度で溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、ホルムアミドは約４０％〜６０％（ｖ／ｖ）の濃度で溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、ホルムアミドは約４５％〜６０％（ｖ／ｖ）の濃度で溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、ホルムアミドは約５０％〜６０％（ｖ／ｖ）の濃度で溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、ホルムアミドは約５５％〜６０％（ｖ／ｖ）の濃度で溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、ホルムアミドは、約４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、又は６０％（ｖ／ｖ）の濃度で溶液中に存在する。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、除去工程は、標的分子、１つ以上の中間体、及び検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを、尿素を含む溶液と接触させることを含み、ここで、尿素は、約２Ｍ〜５Ｍの濃度で溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、尿素は約２Ｍ〜４Ｍの濃度で液中に存在する。いくつかの実施形態において、尿素は、約２Ｍ〜３Ｍの濃度で液中に存在する。いくつかの実施形態において、尿素は、約５Ｍ、４．５Ｍ、４Ｍ、３．５Ｍ、３Ｍ、２．５Ｍ、又は２Ｍの濃度で液中に存在する。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、標的分子、１つ以上の中間体、及び検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドとホルムアミドを含む液との間の接触を含む除去工程は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと１つ以上の中間体との間の相互作用を選択的に妨害する。例えば、除去工程は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと１種以上の中間体との間の相互作用を、標的分子と１種以上の中間体との間の相互作用に影響を及ぼすことなく選択的に妨害することができる。このような実施形態では、検出可能な標識オリゴヌクレオチドが１つ以上の中間体との相互作用から離脱、非結合、及び／又は除去される間に、より多くの中間体のうちの１つが標的分子に結合したままであることができる。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、中間体ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、以下：（ｉ）オーバーハング配列に相補的な配列を含む核酸配列、及び（ｉｉ）検出可能なシグナル、を含む読み出しプローブが結合できるように、オーバーハング配列（例えば、２０ｎｔ）とＤＮＡ座に対してハイブリダイズするために使用される。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、約１７ヌクレオチド又はそれ以下の長さの核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、約１７ヌクレオチドの長さの核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、約１７ヌクレオチド以下又は長さが短い核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、約１０〜１７ヌクレオチドの長さの核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、約１１〜１７ヌクレオチドの長さの核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、約１２〜１７ヌクレオチドの長さの核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、約１３〜１７ヌクレオチドの長さの核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、約１４〜１７ヌクレオチドの長さの核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、約１５〜１７ヌクレオチドの長さの核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、長さが約１０ヌクレオチド未満の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、約５〜１０ヌクレオチドの長さの核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、約６〜９ヌクレオチドの長さの核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、約７〜８ヌクレオチドの長さの核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、読み出しプローブは、長さが約１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、又は５ヌクレオチドの核酸配列を含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、中間体ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ配列を含むブリッジオリゴヌクレオチド及び相補的配列（例えば、ＲＮＡブリッジプローブ）と結合できるように、突出部（例えば、２０ｎｔ）とＤＮＡ座に対してハイブリダイズするために使用される。ＲＮＡブリッジプローブは、染料又はＨＣＲ重合体（これもＤＮＡとすることができる）で直接的に標識することができる。イメージング後、ＲＮａｓｅを用いて、ＲＮＡブリッジプローブを消化し、一方、ＤＮＡプローブをそのままＤＮＡ座上でハイブリダイズさせたままにすることができる。このような方法は、複数の利点を提供する。例えば、その後の接触工程は、突出部を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズするＲＮＡブリッジプローブのみを含み、二本鎖ＤＮＡを融解させ、ＤＮＡオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることを避け、これは困難な過程であり得る。さらに、オーバーハングは、同じ遺伝子を標的とするすべてのＤＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、２０〜４０）について同じにすることができ、それゆえに、ハイブリダイゼーションのラウンド当たり、遺伝子当たり１種類のＲＮＡブリッジプローブのみが必要となる。異なるハイブリダイゼーション（接触工程）で色彩を切り替えるために、異なるラベル又は異なるＨＣＲ重合体でＲＮＡブリッジプローブを変えることができる。特異的に除去することができるＤＮＡブリッジプローブ、例えば、ブリッジ上のＥｃｏＲＩ又はＨＣＲヘアピンのような特異的な酵素制限部位を用いることもできる。細胞を適当なヌクレアーゼとインキュベートすることにより、ＤＮＡ座及び／又はそれら上でハイブリダイズしたプローブに影響を及ぼすことなく、検出可能な全ての部分を消化することができる。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは５’リン酸化を含み、ラムダエキソヌクレアーゼによって分解され得るが、一方、中間オリゴヌクレオチドは５’−リン酸化されず、ラムダエキソヌクレアーゼによって分解され得ない。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ウラシルを含む。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドはウラシルを含有し、ＵＳＥＲ（商標）酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、イプスウィッチ、マサチューセッツ、ＭＡ、米国）によって分解することができ、一方、中間オリゴヌクレオチドはウラシルを含有せず、ＵＳＥＲ（商標）酵素によって分解することができない。いくつかの実施形態において、中間オリゴヌクレオチドのオーバーハングに対してハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、オーバーハングに対してハイブリダイズした場合に陥凹した３’−末端を有する。中間オリゴヌクレオチドとハイブリッドするときに検出可能なラベルを付したオリゴヌクレオチドで、エキソヌクレアーゼＩＩＩによって選択的に消化することができるときに、３’エンドに後退したもの。３’末端が陥凹していない中間オリゴヌクレオチドや３’末端がＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖にある中間オリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼＩＩＩの活性がはるかに弱いため、そのままに保つことができる。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、酵素が関与する場合、除去工程は、最適な結果を生じる温度で実施される。いくつかの実施形態において、除去工程は約３７℃で実施される。いくつかの実施形態において、除去工程は室温で実施される。いくつかの実施形態において、ラムダエキソヌクレアーゼによる消化は、約３７℃で実施される。いくつかの実施形態において、ＵＳＥＲ（商標）酵素による消化は、約３７℃で実施される。いくつかの実施形態において、ＵＳＥＲ（商標）酵素による消化は室温で行われる。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼＩＩＩによる消化は、約３７℃で実施される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼＩＩＩによる消化は室温で実施される。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド結合のための中間オリゴヌクレオチド及びオーバーハング配列の使用は、様々な利点を提供する。いくつかの実施形態において、オーバーハング配列と検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションの動力学は、中間オリゴヌクレオチドと標的との間の動力学よりも速い。いくつかの実施形態において、標的についての全ての中間オリゴヌクレオチドは、同じオーバーハング配列を含み、標的についての全ての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じオーバーハング配列に結合するための同じ相補的配列を含む。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドのセットと中間オリゴヌクレオチドのセットとの間のハイブリダイゼーションは、中間オリゴヌクレオチドのセットと標的のセットとの間のハイブリダイゼーションよりも最大で約２０〜４０倍速い。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと中間オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションは、中間オリゴヌクレオチドと標的との間のハイブリダイゼーションの約１２時間までと比較して、３０分で行うことができる。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、鎖置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去するための除去工程において使用される。いくつかの実施形態において、熱を用いて、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去工程で解離させる。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、除去工程は、光退色を含む。いくつかの実施形態において、光退色は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドのフルオロフォアなどの染料を破壊する。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの第一及び第二のセットは、各標的の異なる配列を標的とし、第一の画像工程の後の除去工程は任意である。例えば、１つの戦略は、同じＲＮＡを異なるＤＮＡプローブ（検出可能に標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチド）で標的とすることであり、それゆえに、第一の複数のプローブは、ＲＮＡ上の１セットの配列を標的とすることができ、第二の複数のプローブは、同じＲＮＡ上の別の組配列を標的とする。第一のハイブリダイゼーション（接触）では、第一の複数のプローブを使用する。次に、これらをイメージングし、場合によっては光退色させるか、ＤＮａｓｅによって消化するか、又はオリゴもしくは染料のいずれかを破壊する他の方法を用いることができる。第二のプローブセットは、第一のプローブセットからの干渉なしにハイブリダイゼーションされ、イメージングされ得る。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、方法は、任意に、肝硬変、光学顕微鏡検査、ＣＬＡＲＩＴＹ、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、組織、臓器又は生物における標的の直接プロファイリングを可能にする。いくつかの実施形態において、臓器は、脳である。いくつかの実施形態において、提供された方法は、インタクトな脳又は組織における転写物の直接イメージングを可能にする。いくつかの実施形態において、提供される方法は、ＨＣＲをさらに含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、光学シート顕微鏡をさらに含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、ＣＬＡＲＩＴＹをさらに含む。
【０２００】
本明細書中に開示される方法は、先行技術で使用される方法よりも多くの利点を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、提供された方法は、妥当なコストでハイスループットを提供する。いくつかの実施形態において、提供される方法は、標的の変態又は増幅なしに標的の直接プロービングを提供する。いくつかの実施形態において、提供された方法は、多数の検出可能な標識の必要なしに、迅速なスケールアップを可能にする。いくつかの実施形態において、提供される方法は、複数の標識を同じ標的に適用することができ、したがってシグナル強度を増加させることができる。いくつかの実施形態において、提供される方法は、利点の組合せを提供する。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、本明細書中で提供されるのは、例えば提供される方法で使用するための、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含む組成物である。例示的組成物は、本明細書の例示的な方法実施形態に記載されるものを含むが、これらに限定されない。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、本明細書中では、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含み、その各々が核酸を標的とし、検出可能な部分で標識され、それゆえに、組成物が少なくとも以下を含む組成物が提供される：
（ｉ）第一の核酸を標的とし、第一の検出可能な部分で標識された第一のオリゴヌクレオチド；及び
（ｉｉ）第二の核酸を標的とし、第二の検出可能な部分で標識した第二のオリゴヌクレオチド。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、本明細書中では、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、各々が転写物又はＤＮＡ座を標的とし、検出可能な部分で標識され、それゆえに、組成物が少なくとも以下を含む、組成物が提供される：
（ｉ）第一の転写物又はＤＮＡ座を標的とし、第一の検出可能な部分で標識された第一のオリゴヌクレオチド；及び
（ｉｉ）第二の転写物又はＤＮＡ座を標的とし、第二の検出可能な部分で標識した第二のオリゴヌクレオチド。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるキットは、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含み、その各々が転写物又はＤＮＡ座を標的とし、検出可能な部分で標識され、それゆえにキットが少なくとも以下を含む：
（ｉ）第一の転写物又はＤＮＡ座を標的とし、第一の検出可能な部分で標識された第一のオリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）第二の転写物又はＤＮＡ座を標的とし、第二の検出可能な部分で標識した第二のオリゴヌクレオチド。
（ｉｉｉ）第一のオリゴヌクレオチドと任意に配列が同一であり、第一の転写物又はＤＮＡ座を標的とし、第一、第二又は第三の検出可能な部分で標識される第三のオリゴヌクレオチド；及び
（ｉｖ）任意に第二のオリゴヌクレオチドと配列が同一であり、第二の転写物又はＤＮＡ座を標的とし、第一、第二、第三又は第四の検出可能な部分で標識される、第四のオリゴヌクレオチド、
ここで、第三のオリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能な部分で標識されるか、又は第四のオリゴヌクレオチドは第二のオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能な部分、又はその両方で標識される。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、組成物中の同じ標的（転写物又はＤＮＡ遺伝子座）を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ検出可能なシグナルを提供する部分、又はイメージング工程において分化できない検出可能なシグナルで標識される。いくつかの実施形態において、組成物中の同じ標的を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ検出可能な部分で標識される。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、フルオロフォアであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、フルオロフォアである。例示的なフルオロフォアは、広く知られており、当技術分野で使用されており、例えば、フルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ｆｌｕｏｒｓ、ＡＴＴＯ染料、又はそれらの任意のアナログもしくは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、第一及び第二の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、異なる標的を標的とする。いくつかの実施形態において、第一及び第二の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、２つ以上の標的、例えば、転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、２つ以上の転写物を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、２つ以上のＤＮＡ遺伝子座を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも４つの標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも９つの標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１６の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも２５の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも３６の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも５０の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１００の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも２００の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも５００の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０００の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも５０００の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０，０００の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも５０，０００の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１００，０００の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１，０００，０００の標的を標的とする。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、異なるオリゴヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、第一及び第二の検出可能な部分は異なる。いくつかの実施形態において、第一及び第二の検出可能な部分は同一である。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、１０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、２０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、３０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、４０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、５０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、６０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、６５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、６８％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、７０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第一及び第二のオリゴヌクレオチドは、９０％未満の配列同一性を共有する。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他の任意のオリゴヌクレオチドと５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他の任意のオリゴヌクレオチドと１０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他の任意のオリゴヌクレオチドと２０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他の任意のオリゴヌクレオチドと３０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他の任意のオリゴヌクレオチドと４０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他の任意のオリゴヌクレオチドと５０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他の任意のオリゴヌクレオチドと５５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他の任意のオリゴヌクレオチドと６０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他の任意のオリゴヌクレオチドと６５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他の任意のオリゴヌクレオチドと６８％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他の任意のオリゴヌクレオチドと７０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他の任意のオリゴヌクレオチドと８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他の任意のオリゴヌクレオチドと９０％未満の配列同一性を共有する。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、組成物又はキットは、同じ標的を標的とする２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、５、１０、２０、３０、４０、５０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。
【０２１２】
検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、様々な適当な長さのものであり得る。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１５塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１６塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１７塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１８塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１９塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２０塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２１塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２２塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも２３塩基類対の長さである。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２４塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２５塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも２６塩基類対の長さである。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２７塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも２８塩基類対の長さである。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２９塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも３０塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも３５塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも４０塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも５０塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、約１５〜２５塩基類対の長さである。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、約２０〜３０塩基類対の長さである。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、約２５〜３５塩基類対の長さである。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、約３０〜４０塩基類対の長さである。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、約３５〜４５塩基類対の長さである。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、約４０〜５０塩基類対の長さである。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが約１５〜３０塩基類対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、約２０〜３０塩基類対の長さである。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、約１５〜３５塩基類対の長さである。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、約２０〜３５塩基類対の長さである。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、２つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、３つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、４つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、５つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、６つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、７つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、８つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、９つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、１０の検出可能な部分を含む。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの検出可能な部分を含む。いくつかの態様において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの検出可能な部分を含む。いくつかの態様において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも４つの検出可能な部分を含む。いくつかの態様において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも５つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも６つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも７つの検出可能な部分を含む。いくつかの態様において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも８個の検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも９つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０の検出可能な部分を含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、組成物は以下をさらに含む：
（ｉｉｉ）第一のオリゴヌクレオチドと配列が任意に同一であり、第一の転写物又はＤＮＡ座を標的とする、第三のオリゴヌクレオチド；及び
（ｉｖ）第二のオリゴヌクレオチドと配列が任意に同一であり、第二の転写物又はＤＮＡ座を標的とする、第四のオリゴヌクレオチド
ここで第三のオリゴヌクレオチドが第一のオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能部分で標識されるか、又は第四のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能部分で標識されるか、又はその両方である。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、第三のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドと配列が同一である。いくつかの実施形態において、第三のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドと重複する配列を含む。いくつかの実施形態において、第三のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドと５０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第三のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドと４０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第三のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドと３０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第三のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドと２０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第三のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドと１０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第三のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドと５％未満の配列同一性を有する。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、第四のオリゴヌクレオチドは、第二のオリゴヌクレオチドと配列が同一である。いくつかの実施形態において、第四のオリゴヌクレオチドは、第二のオリゴヌクレオチドと重複する配列を含む。いくつかの実施形態において、第四のオリゴヌクレオチドは、第二のオリゴヌクレオチドと５０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第四のオリゴヌクレオチドは、第二のオリゴヌクレオチドと４０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第四のオリゴヌクレオチドは、第二のオリゴヌクレオチドと３０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第四のオリゴヌクレオチドは、第二のオリゴヌクレオチドと２０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第四のオリゴヌクレオチドは、第二のオリゴヌクレオチドと１０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第四のオリゴヌクレオチドは、第二のオリゴヌクレオチドと５％未満の配列同一性を有する。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、第三のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能な部分で標識される。いくつかの実施形態において、第四のオリゴヌクレオチドは、第二のオリゴヌクレオチドとは異なる検出可能な部分で標識される。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における５％検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における１０％検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における２０％検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における３０％検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における４０％検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における５０％検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における６０％検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における７０％検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における８０％検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における９０％検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における少なくとも５個の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における少なくとも１０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、予め決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における少なくとも２０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における少なくとも３０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、予め決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における少なくとも４０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における少なくとも５０個の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、予め決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における少なくとも６０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における少なくとも７０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、予め決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における少なくとも８０の検出可能な標識オリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における少なくとも９０個の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、予め決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法における少なくとも各検出可能な標識オリゴヌクレオチドの量があらかじめ決定される。
【０２２１】
いくつかの実施形態において、１つの標的に対して２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、標的のための全ての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの総量があらかじめ決定される。いくつかの実施形態において、標的のためのすべての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの総量が予め決定され、ここで、標的のための検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの各々の量は、独立してかつ任意に予め決定される。いくつかの実施形態において、複数の標的の各々に対する全ての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの総量は、独立して事前に決定される。いくつかの実施形態において、複数の対象は少なくとも２つの標的を有する。いくつかの実施形態において、複数の対象は少なくとも５つの標的を有する。いくつかの実施形態において、複数の対象は少なくとも１０の標的を有する。いくつかの実施形態において、複数の対象は少なくとも５０の標的を有する。いくつかの実施形態において、複数の対象は少なくとも１００の標的を有する。いくつかの実施形態において、複数の対象は少なくとも５００の標的を有する。いくつかの実施形態において、複数の対象は少なくとも１，０００の標的を有する。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法の標的は、予め決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法の少なくとも１０の標的が予め決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法の少なくとも５０の標的が予め決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法の少なくとも１００の標的が予め決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法の少なくとも１，０００の標的が予め決定される。いくつかの実施形態において、複数の、組成物、キット又は方法のＦＮ標的までを事前に決定し、ここで、Ｆは複数性における検出可能な部分の数であり、Ｎはイメージング工程の数である。
【０２２３】
検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを合成する方法は広く知られており、当該技術分野で実用化されている。例えば、Ｌｕｂｅｃｋ，  Ｅ．  ＆  Ｃａｉ，  Ｌ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，  ７４３-４８  （２０１２）を参照。オリゴヌクレオチドはまた、様々なベンダーから市販されている。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを調製するために使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法は、中間オリゴヌクレオチドを調製するために使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法は、ブリッジオリゴヌクレオチドを調製するために使用することができる。
【０２２４】
いくつかの実施形態において、第一の配列を有する標的核酸を調製する方法であって、以下の工程を含む方法が本明細書中で提供される：
１）第一の配列を含む第一の核酸を提供する工程であって、第一の配列は、両端でニッキングエンドヌクレアーゼ部位によって隣接される、工程；
２）第一の核酸又は第一の核酸の一部を増幅して、第一の配列及び隣接するニッキングエンドヌクレアーゼ部位を含む第二の核酸を提供する工程；及び
３）第二の核酸を隣接するニッキングエンドヌクレアーゼ部位に対応する１以上のニッキングエンドヌクレアーゼと接触させる工程。
【０２２５】
いくつかの実施形態において、第一の配列を有する標的核酸は、一本鎖である。いくつかの実施形態において、増幅工程は、ポリメラーゼ鎖状反応（ＰＣＲ）を含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、さらに、二本鎖第二核酸が変性され、２つのストランドが一本鎖になる、変性の工程を含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、第一の配列を有する核酸を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第二の核酸は、ニッキングエンドヌクレアーゼと接触する前に、任意に修飾される。いくつかの実施形態において、提供される方法は、第一の配列を有する核酸を標識することをさらに含む。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、２つの隣接エンドヌクレアーゼ部位は同一である。いくつかの実施形態において、同じニッキングエンドヌクレアーゼ部位に対応する１つのニッキングエンドヌクレアーゼが使用される。いくつかの実施形態において、２つの隣接エンドヌクレアーゼ部位は異なる。いくつかの実施形態において、それぞれが独立にニッキングエンドヌクレアーゼ部位に対応する２つのニッキングエンドヌクレアーゼが使用される。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、提供された技術のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプールから生成される。いくつかの実施形態において、このようなプールは市販されている。いくつかの実施形態における最初のＤＮＡオリゴヌクレオチドプールは、サブセットに組織化された最大１２，０００以上の異なる一本鎖配列からなる。各配列は、ニッキングエンドヌクレアーゼ部位及び前後進プライマー配列が所望の配列（例えば、プローブ配列）に隣接するように設計される。前後進プライマー配列は、所望の配列を有するどのサブセットに属するかを特定する。プライマー対を用いて、ポリメラーゼ鎖状法を用いてサブセットを増幅することができる。ＰＣＲ反応の産物は、ニッキングエンドヌクレアーゼ核により孤立し消化される。ニッキング酵素によるインキュベーション時間は、酵素の使用量及び回収されたＤＮＡの量に基づいて変化する。いくつかの実施形態において、約１０単位の酵素が約１時間で約１μｇのＤＮＡを消化する。次に、試料を精製し、緩衝液、例えば２×ローディング緩衝液（９６％ホルムアミド／２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）及び水中で再構成して、最終ローディング緩衝液（４８％ホルムアミド／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を作製し、例えば９５℃に加熱してＤＮＡを完全に変性させることによって変性させる。変性したＤＮＡを精製し、所望の製品を単離する。いくつかの実施形態において、純化及び／又は単離は、電気泳動を含む。例示的なプロセスを図２５に示す。
【０２２８】
いくつかの実施形態において、本明細書中で提供されるのは、第一の配列を有する標的核酸を調製する方法であって、以下の工程を含む：
１）第一の配列又はその相補的配列を含む第一の核酸を提供する工程であって、第一の配列又はその相補的配列は、少なくとも１つの制限部位に隣接している、工程；
２）第一の核酸又は第一の核酸の一部を増幅して、第一の配列及び少なくとも１つの隣接制限部位を含む第二の核酸を提供する工程；及び
３）及び第二の核酸を少なくとも１つの隣接制限部位に対応する制限酵素と接触させて、陥凹末端を含む第三の核酸を提供する工程；
４）第三の核酸をヌクレアーゼと接触させて、第一の配列を含むストランドを保持しながら、もしあれば、相補的配列を含むストランドを選択的に消化する工程。
【０２２９】
いくつかの実施形態において、第一の配列又はその相補的配列は、各末端の制限部位に独立して隣接している。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、本明細書中で提供されるのは、第一の配列を有する標的核酸を調製する方法であって、以下の工程を含む：
１）第一の配列又はその相補的配列を含む第一の核酸を提供する工程であって、第一の配列又はその相補的配列は、両端の制限部位に隣接している、工程；
２）第一の核酸又は第一の核酸の一部を増幅して、第一の配列及び隣接制限部位を含む第二の核酸を提供する工程；及び
３）及び第二の核酸を隣接制限部位に対応する制限酵素と接触させて、陥凹末端を含む第三の核酸を提供する工程；
４）第三の核酸をヌクレアーゼと接触させて、第一の配列を含むストランドを保持しながら、もしあれば、相補的配列を含むストランドを選択的に消化する工程。
【０２３１】
いくつかの実施形態において、第一の配列を有する標的核酸は、一本鎖である。いくつかの実施形態において、増幅工程は、ＰＣＲを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、第一の配列を有する核酸を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第二の核酸は、制限酵素と接触する前に任意に修飾される。いくつかの実施形態において、第三の核酸は、ヌクレアーゼと接触する前に任意に修飾される。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼＩＩＩであり、これは３’−凹部末端を有するストランドを優先的に分解し、５’−凹部末端を有するストランドを保存することができる。いくつかの実施形態において、制限酵素は、５’−凹部末端を生成する。いくつかの実施形態において、制限酵素は、３’−凹部末端を生成する。いくつかの実施形態において、相補的配列は、制限消化後に３’凹部末端を有する。いくつかの実施形態において、相補的配列を含むストランドは制限消化後に３’凹部末端を有し、第一配列を含むストランドは制限消化後に５’凹部末端を有する。いくつかの実施形態において、提供される方法は、第一の配列を有する核酸を標識することをさらに含む。
【０２３２】
いくつかの実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、ｓｅｑＦＩＳＨ又は中間オリゴヌクレオチドのためのプローブは、ｅｘｏＩＩＩヌクレアーゼ消化などのヌクレアーゼ消化を用いて生成することができる。増幅（例えば、ＰＣＲ）製品上の２つのニック部位の代わりに、プローブ及び／又はアダプター配列に隣接する２つの制限部位を使用することができる。いくつかの実施形態において、一方の制限部位は３’凹部末端を残し、他方は５’凹部末端を残す。たとえば、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩは５’凹部末端を残し、ＢｍｔＩとＰａｃＩは３’凹部末端を残す。このような制限酵素は広く知られており、当技術分野で使用されている。エキソヌクレアーゼIIIは３’凹部末端を優先的に分解し、５’凹部末端とのストランドを保存する。これは、ＰＣＲ及び制限ヌクレアーゼを用いてオリゴヌクレオチドプールから一本鎖プローブを生成する別の機構を提供する。
【０２３３】
いくつかの実施形態において、提供される標的核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸は、第一の配列と同じ配列を有する。いくつかの実施形態において、標的核酸は中間オリゴヌクレオチドであり、標的、例えば、転写物又はＤＮＡ座にハイブリダイズする第一の配列、及び第二のオリゴヌクレオチド、例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする第二の配列を含む。いくつかの実施形態において、標的核酸は、標的にハイブリダイズする第一の配列、及びＨＣＲによって標識された検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする第二の配列を含む中間オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的核酸はブリッジプローブである。
【０２３４】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、疾患の診断に使用され、ここで、疾患は、転写物又はＤＮＡ遺伝子座の異常な数に関連する。いくつかの実施形態において、提供される方法は、治療のための被検者を選択するために使用される。いくつかの実施形態において、提供される方法は、治療レジメンをモニタリングするために使用される。いくつかの実施形態において、提供方法におけるセルは、被検者由来である。いくつかの実施形態において、提供方法における細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、提供方法における細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、提供方法におけるセルは、被検者由来である。いくつかの実施形態において、提供方法における細胞は、動物由来である。いくつかの実施形態において、提供方法におけるセルは、ヒト被検者由来である。いくつかの実施形態において、提供方法における細胞は、ヒト被検者から単離される。いくつかの実施形態において、提供方法における細胞は、疾患組織、又は疾患に感受性である組織由来である。同時に多くの標的を検出及び定量化することが可能であることから、提供される方法は、診断、治療モニタリング及び患者の層別化のための著しい利点を提供する。
【０２３５】
いくつかの実施形態において、提供される技術は、任意にプロファイリングタンパク質、神経活動、及び／又は構造配置を含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、同じ試料におけるプロファイリングタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、同じ試料における神経活動のプロファイリングを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プロファイリング構造配置を含む。
【０２３６】
一態様において、本明細書中に開示されるのは、切断可能リンカーを有する読み出しプローブである。図５は、ジスルフィドリンカーで読み出しプローブを合成するための例示的な化学反応を示す。
【０２３７】
一態様において、逐次バーコードＦＩＳＨ（ｓｅｑＦＩＳＨ）は、切断可能リンカーを介してシグナル部分と結合される核酸読み取りプローブを使用することによって実施される。酵素切断可能リンカー、求核剤／塩基類感受性リンカー、還元感受性リンカー、光切断可能リンカー、求電子剤／酸感受性リンカー、金属支援切断可能リンカー、又は酸化感受性リンカーを含むが、これらに限定されない、任意の好適な切断可能リンカーを使用することができる。例示的なリンカーは、Ｌｅｒｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  ”Ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｌｉｎｋｅｒｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，”  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：５７１-５８２に見いだすことができ、これらは本明細書中に全体的に組み込まれる。
【０２３８】
いくつかの実施形態において、切断可能リンカーはジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、切断可能リンカーは、核酸制限部位である。いくつかの実施形態において、切断可能リンカーは、プロテアーゼ切断部位である。
【０２３９】
核酸読み出しプローブを利用する例示的なシステムを図６Ａに示す。図に示すように、遺伝子特異的一次プローブは、標的部位、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ設定下でｍＲＮＡ分子中に結合する。図６Ａに示される例示的な実施形態では、遺伝子特異的一次プローブ、二次ブリッジプローブ及び三次読み出しプローブを用いて、逐次バーコード化が実施される。たとえば、ジスルフィド結合を介して染料と結合したＤＮＡ読み出しプローブを用いて、逐次バーコードＦＩＳＨ（ｓｅｑＦＩＳＨ）を行う。本法は、遺伝子特異的一次プローブのハイブリダイゼーション、続いて読み出し結合位置を有する二次ブリッジプローブ、及びジスルフィド結合染料を有する独特の三次読み出しプローブを含む。いったんイメージングされると、ＴＣＥＰ／ＤＴＴのような還元剤を用いて、蛍光シグナルを除去することができる。その後のハイブリダイゼーションは、そのシグナルが以前のラウンドのハイブリダイゼーションからの蛍光シグナルによって妨害されない蛍光シグナルを提供する。二次ブリッジプローブは、本明細書中に開示される除去工程（例えば、ホルムアミド溶液）によって除去することができ、新規の一組の二次ブリッジプローブによって置換することができる。結合配列の他に、一次プローブはさらに、結合配列の一端に突出配列を含む。いくつかの実施形態において、第二のオーバーハング配列は、結合配列の他端に含まれる。
【０２４０】
いくつかの実施形態において、オーバーハング配列は、１つ以上の核酸読み取りプローブが結合する１つ以上の標的配列を含む。いくつかの実施形態において、各標的配列は、特異的読み出し結合配列を有する読み出しプローブのセットと独自に相互作用する。本明細書中に開示されるように、オーバーハング配列は、２つの標的配列、３つの標的配列、５つ以下の標的配列、７つ以下の標的配列、又は１０以下の標的配列を含み得る。いくつかの実施形態において、突出配列は、１０以上の標的配列を含むことができる。２つのオーバーハング配列がある場合にも、同様の配置を実施することができる。
【０２４１】
いくつかの実施形態において、オーバーハング配列は、図６Ａに示されるように、１つ又は複数の読み出しプローブが結合するための標的配列を提供するブリッジプローブに結合する。ブリッジプローブは、中間径ブリッジプローブ又は二次ブリッジプローブと相互に呼ぶことができる。ブリッジプローブは、一次プローブ中のオーバーハング配列の全て又は一部に結合する結合配列を含む。いくつかの実施形態において、ブリッジプローブは、さらに、直列に接合構造であり、結合配列に連結された１以上の読み出し結合標的を含む。
【０２４２】
いくつかの実施形態において、図６Ｂに示されるように、２つのブリッジプローブは、２つのオーバーハング配列を介して同一の一次プローブに結合することができる。例えば、２つのオーバーハング配列を有する一次プローブにおいて、各々のオーバーハング配列は、独特の三次読み出しプローブ結合位置を含む二次ブリッジプローブに結合することができる。この説明では、それぞれの二次ブリッジプローブは、３つの（３）一意三次読み出しプローブ結合位置を含む。しかしながら、二次ブリッジプローブは、任意の数の独特な三次読み出しプローブ結合位置、例えば、１個から１０個又はそれより多くの読み出しプローブ結合位置を含むことができる。例えば、二次ブリッジプローブは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０以上の三次読み出しプローブ結合位置を含むことができ、図６Ｂに図示される例では、４種類の色彩のフルオロフォアが使用される。４種類のフルオロフォア色彩を用いることにより、このデザインでバーコードの数を４６＝４０９６のバーコードに拡大することができる。
【０２４３】
本明細書中に開示されるように、ブリッジプローブは、２つの読み取り結合標的、３つの読み取り結合標的、５つ以下の読み取り結合標的、７つ以下の読み取り結合標的、又は１０つ以下の読み取り結合標的を含み得る。いくつかの実施形態において、オーバーハング配列は、１０以上の読み出し結合標的を含むことができる。オーバーハング配列に結合した２つのブリッジプローブが存在する場合にも、同様の配置を実施することができる。
【０２４４】
読み出しプローブを利用する例示的な再ハイブリダイゼーションスキームを図６Ａ及び６Ｂに示す。たとえば、最初のリハイブリダイゼーション（ｈｙｂ１）は、遺伝子比一次プローブの標的ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションから始まる。それぞれの遺伝子特異的一次プローブは、二次ブリッジプローブがハイブリダイズできる１つ以上の「突出」配列を含む。二次ブリッジには二つ以上の三次読み出し結合位置があり、これが効率的で迅速なリブリダイゼーションの鍵となる。最初のハイブリダイゼーションでは、青色染料と結合した独特の三次読み出しプローブを、二次ブリッジプローブ上の独特の結合部位にハイブリダイズさせる。イメージングされると、試料は、ジスルフィド結合染料を切断するために、ＴＣＥＰ又はＤＴＴなどの還元剤で処理される。その後、試料を洗浄緩衝液で洗浄する。２回目のハイブリダイゼーションでは、赤い染料をもつ独特の三次読み取りプローブの第二の組が、二次ブリッジ上の独特の結合部位にハイブリダイズする。２回のハイブリダイゼーションの後、特定のｍＲＮＡを赤とブルーの色彩バーコードでバーコード化する。ハイブリダイゼーションのさらなるラウンドを適用して、より高度なバーコード配列を作製することができる。技術的には、このリブリダイゼーション法によるｓｅｑＦＩＳＨのスケーリングファクターは、そのユニークな三次プローブ結合部位の数を有する利用可能な二次ブリッジの数に依存する。たとえば、２つの二次ブリッジに８つの独特な三級読み取り結合位置（Ｎ＝８）を組み込み、４つのフルオロフォア（Ｆ＝４）をもつと、６４，０００以上の独特なバーコード（ＦＮ＝４８＝６５，５３６）を生成できる。さらに、ブリッジプローブが使用される実施形態では、高濃度のホルムアミドで二次ブリッジを除去し、別の独特な一連の二次ブリッジで流して水垢処理を継続することができ、これにより水垢ファクターの上限がさらに増大する。
【０２４５】
一態様では、ハイブリダイゼーション鎖状反応（ＨＣＲ）に基づいて、逐次ハイブリダイゼーション反応中のハイブリダイゼーションの各ラウンド中に可視シグナルを増幅するための方法及び系が本明細書中に開示される。ＨＣＲの例示的な実施形態を図７Ａに示す。ハイブリダイゼーション１回目の間に、突出開始剤配列を有するプローブが、ｍＲＮＡ又はＤＮＡのような核酸標的分子に付加される。また、開始剤配列の配列と相補的な配列を有するヘアピン核酸プローブも加えられる。開始剤配列の存在はヘアピン核酸プローブのアンフォールディングを引き起こし、自己集合伸長ＨＣＲ重合体を結果鎖状反応をもたらす。各ヘアピン核酸プローブはシグナルを有するため、自己集合拡張ＨＣＲ重合体はシグナルの増幅及び標的部位のより良い検出をもたらす。
【０２４６】
図７Ｂは、切断可能リンカーを埋め込まれた例示的な読み出しプローブを示す。ここで、切断可能リンカーはジスルフィド結合である。切断可能リンカーの一端において、本明細書中に開示されるような読み取りプローブは、それが特定の核酸標的に結合することを可能にする結合配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸標的は、ｍＲＮＡ又はＤＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸標的は、インタクトな細胞内又は細胞抽出物の一部としてである。いくつかの実施形態において、核酸標的は、ｍＲＮＡ中の標的部位に直接結合する一次結合プローブ内にある。いくつかの実施形態において、核酸標的は、ｍＲＮＡ中の標的部位に直接結合する一次結合プローブに結合する二次結合プローブ内にある。いくつかの実施形態において、核酸標的は、三次又は四次結合プローブ内にある。当業者は、この原則を結合及び相互作用のあらゆる水準に適用することができる。
【０２４７】
切断可能リンカーの他端には、本明細書中に開示されるような読み出しプローブは、ＨＣＲ開始剤配列をさらに含む。部分的又は完全な相補的配列を有するヘアピン核酸に曝露されると、開始剤配列は、複数エクステンダープローブにより形成されるシグナルモチーフを可能にする椅子反応を引き起こすことができる。各エクステンダープローブは、シグナル部分を含む。複数エクステンダープローブを凝集すると、シグナルの検出が強化される。
【０２４８】
逐次ハイブリダイゼーション処理中に複数のエクステンダープローブでシグナルモチーフを形成するための例示的なスキームを図７Ｃに示す。ハイブリダイゼーションの第一ラウンドの間に、包埋された切断可能リンカーを有する核酸検出プローブは、核酸標的配列内の第一の標的部位に結合する。いくつかの実施形態において、核酸検出プローブの第一の標的配列への最初の結合後に、エクステンダープローブが添加される。いくつかの実施形態において、エクステンダープローブは、凝集したポリマーが反応混合物に添加される以前に凝集体を形成し、核酸検出プローブ中の模倣剤配列に結合する。
【０２４９】
いくつかの実施形態において、エクステンダープローブは、読み出しプローブ中の開始剤配列に部分的又は完全に相補的な配列をそれぞれ含む標準ヘアピンプローブである。これらの実施形態において、エクステンダープローブは、互いに非常に類似又は同一である。得られた伸長可能なシグナルモチーフのサイズは、添加される伸長剤プローブの濃度又は絶対量によって制御され得る。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、異なるタイプの核酸配列を含むエクステンダープローブを使用して、制御されたシグナル増幅を達成することができる。例えば、もしエクステンダープローブの５つの集団が使用される：  ｛ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４、及びＥＰ５｝ならば、シグナルは５回増幅することができる。エクステンダープローブの第一の集団は、開始剤配列の全部又は一部に結合する結合配列を含む。エクステンダープローブの第二の集団は、エクステンダー配列の第一の集団の領域に結合する結合配列を含む。エクステンダープローブの第三の集団は、エクステンダー配列の第二の集団の領域に結合する結合配列を含む。エクステンダープローブの第四の集団は、エクステンダー配列の第三の集団の領域に結合する結合配列を含む。エクステンダープローブの第５の集団は、エクステンダー配列の第四の集団の領域に結合する結合配列を含む。直鎖状増幅のこのような実施形態では、得られた伸長可能なシグナルモチーフの大きさは、提供される伸長プローブの集団の数によって制御することができる。
【０２５１】
いくつかの実施形態において、エクステンダープローブは、後続のエクステンダープローブを結合するための複数の結合部位を含み得る。例えば、開始剤配列への結合に加えて、ＥＰ１は、ＥＰ２に対する２つ以上の結合部位を含むことができ、したがって、シグナルのさらなる増幅を可能にする。この型の増幅はどのレベルでも起こりうる。例えば、上記の例では、後続又は下流のエクステンダープローブのための複数の結合部位を、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、又はＥＰ４のいずれか１つ又は組合せで実施することができる。例えば、ＥＰ２、ＥＰ３、又はＥＰ４由来のエクステンダープローブは、すべてＥＰ１の標的部位に結合することができ、それが次に開始剤配列に結合する。
【０２５２】
いくつかの実施形態において、増幅は複数のレベルで起こる。一般に、エクステンダープローブのｍ個体群が存在する場合、その後又は下流のエクステンダープローブのための複数の結合部位は、ＥＰ１、ＥＰ２、・・・、又はＥＰｍ−１のいずれか１つ又は組合せで実施される。さらに、複数結合位置が存在する場合には、それらを直列に連結するか、又は非直鎖状様式（例えば、分枝又は円形配列）で配列することができる。結合部位の数及び構成に依存して、得られる伸長可能なシグナルモチーフは、スティック、ボール、ネット、又は他の適用可能な形態であり得る。
【０２５３】
当業者は、最適なイメージング作用のための最適なシグナル対ノイズ比率を達成するために、任意の適当な数のエクステンダープローブ集団を追加することができることを理解するであろう。例えば、増量プローブは、５個以下、７個以下、数個以下、１０個以下、１５個以下、２０個以下、２５個以下、３０個以下、４０個以下、５０個以下の集団を含むことができる。
【０２５４】
いくつかの実施形態において、増量プローブは、開始剤配列を有する読み出しプローブと混合される前に一緒に混合される。いくつかの実施形態において、読み出しプローブがその核酸標的にすでに結合している開始剤配列を有する読み出しプローブに、エクステンダープローブを逐次的に付加する。
【０２５５】
図７Ｃに示すように、画像解析後、読み出しプローブ中の結合配列と模倣配列との間のリンカーを切断するために、切断剤を適用することができる。次に増幅されたポリマーを切断し、洗い流すことができる。
【０２５６】
再ブリダイゼーションの第二ラウンドの間に、新規の核酸検出プローブが適用される。新規の核酸検出プローブは、核酸標的配列中の第二の異なる標的部位に結合する異なる結合配列を含む。新規の核酸検出プローブはまた、切断可能リンカー及び開始剤配列を含む。開始剤配列は、前の一組の核酸検出プローブからの開始剤配列と同一であっても異なっていてもよい。
【０２５７】
シグナル検出を増強するために増幅されたポリマーを形成するために、前述のように、新規のエクステンダープローブを使用する。画像解析後、増幅された重合体の新規のセットを切断し、洗い流すことができる。異なるタイプの可視シグナルを有するエクステンダープローブを用いることにより、バーコードを核酸標的に対して確立することができる。核酸標的内の標的部位の利用可能性に応じて、より錯体バーコードを作成するために複数回のハイブリダイゼーションを行うことができる。例えば、３ラウンドのハイブリダイゼーション、４ラウンドのハイブリダイゼーション、５ラウンドのハイブリダイゼーション、７ラウンド以下のハイブリダイゼーション、１０ラウンド以下のハイブリダイゼーション、１２ラウンド以下のハイブリダイゼーション、１５ラウンド以下のハイブリダイゼーション、２０ラウンド以下のハイブリダイゼーション、３０ラウンド以下のハイブリダイゼーション、４０ラウンド以下のハイブリダイゼーション、又は５０ラウンド以下のハイブリダイゼーションがあり得る。
【０２５８】
本明細書中に開示される組成物及び方法は、インタクトな細胞内又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ設定において、任意の適当な細胞標的を同定するために、逐次ハイブリダイゼーションで使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞標的は、ｍＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、細胞標的はタンパク質であり得る。例えば、最初の標的結合一次プローブは、その後の結合のために核酸配列と結合した抗体であり得る。
【０２５９】
本明細書中に開示される方法は、多種多様な試料に適用可能である。例えば、ＨＣＲ−ｓｅｑＦＩＳＨは脳スライスにおいて作用し、ＳＰＩＭは明確性脳スライスにおいて単一ｍＲＮＡをロバストに検出することができる。いくつかの実施形態において、提供される技術は、神経変性疾患のマウスモデル、又はヒト脳における標的のプロファイリングに有用である。本明細書中に開示される方法及び組成物に先立つ他の技術は、同じ品質及び量のデータを提供することができない。
【実施例】
【０２６０】
前述は、本発明の一定の非限定的実施形態の説明であった。したがって、本明細書中に記載される本発明の実施形態は、本発明の原理の適用の単なる例示であることを理解されたい。ここで図示された実施形態の詳細に言及することは、クレームの範囲を限定することを意図していない。追加例は、例えば、米国特許公開第２０１６０３６９３２９号に記載される。
【０２６１】
（実施例１）
（逐次ハイブリダイゼーション及びバーコード化による核酸のＩＮ  ＳＩＴＵプロファイリング）
本明細書の非限定的な例に記載されているように、細胞、例えば、ｍＲＮＡ中の核酸は、工程（図２（ａ）及び３）の接触、イメージング及び除去の逐次ラウンドを通して提供される方法によってプロファイリングされた。転写産物が細胞内で固定されるにつれて、対応する蛍光スポットは、複数回のハイブリダイゼーションの間、適所に留まり、そして、フルオロフォア配列を読み取るために整列することができる。この逐次バーコードは、ｍＲＮＡを独自に同定するように設計されている。
【０２６２】
ハイブリダイゼーションの各ラウンドの間、各転写物は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドのセット、この場合、単一タイプのフルオロフォアで標識されたＦＩＳＨプローブによって標的とされた。試料をイメージングし、次にＤＮａｓｅＩで処理してＦＩＳＨプローブを除去した。その後のラウンドで、ｍＲＮＡは同じオリゴヌクレオチド配列群をもつＦＩＳＨプローブとハイブリッド形成されたが、今度は別の染料で標識された。ＦＮとして利用可能なバーコードの数であって、Ｆはフルオロフォアの数、Ｎはハイブリダイゼーション回数である。たとえば、４染料では、８ラウンドのハイブリダイゼーションがトランスクリプトームのほぼ全体を覆うことができる（４８＝６５，５３６）。
【０２６３】
いくつかの実施形態において、異なるｍＲＮＡ種を識別するために、ｍＲＮＡは、逐次ラウンドのハイブリダイゼーションを用いて、ＦＩＳＨプローブなどの検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドでバーコードされる。ハイブリダイゼーションのラウンドの間、各転写物は、単一のタイプのフルオロフォアで標識された、複数の、例えば２４のＦＩＳＨプローブのセットによって標的とされる。試料をイメージングし、酵素分解によりＦＩＳＨプローブを除去する。その後、同じＦＩＳＨプローブとハイブリッド形成されるが、現在では別の染料で標識されることもある。転写産物が細胞内で固定されるにつれて、単一のｍＲＮＡに対応する蛍光スポットは、複数ラウンドのハイブリダイゼーションの間、その場に留まり、色彩配列を読み取るように並べることができる。したがって、各ｍＲＮＡ種にはユニークなバーコードが付与される。特定の細胞中の各転写物の数は、対応するバーコードの数を数えることによって決定することができる。例示的なプロセスを図１、２、及び３に示され、本明細書中に開示された方法に基づく実施の例（ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｅｘａｍｐｌｅｓ）は、例えば米国特許公開第２０１６−０３６９３２９号に提供される。
【０２６４】
（実施例２）
（オリゴヌクレオチド調製）
一組の配列をＰＣＲで増幅した（図４）。生成物を単離し、例えば、５容量の沈殿緩衝液（３０：１  ＥｔＯＨ：１Ｍ  ＮａＯＡｃ）を用いて−２０℃で少なくとも１０分間沈殿させた。沈殿混合物を１０分間遠心分離した。上澄み液を捨て、オリゴヌクレオチドペレットを適当な単位の酵素でニッキング酵素緩衝液中で再構成した。これは、約１０単位の酵素が１時間で約１μｇのＤＮＡを消化することに基づいている。インキュベーション時間が経過したら、試料を再度沈殿させ、２×ローディング緩衝液（９６％ホルムアミド／２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）及び水中で再構成し、最終ローディング緩衝液（４８％ホルムアミド／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を作製した。試料を９５℃に加熱してＤＮＡを完全に変性させた。次に変性したＤＮＡを変性アクリルアミドゲル（８Ｍ尿素１０〜１２％アクリルアミド）に装填した。ゲルを２５０Ｖで１時間泳動するか、又は所望に応じて最適化した。電気泳動後、１×ｓｙｂｒ金を用いてゲルを１５分間染色した後、可視化した。適切なバンドを切り出し、粉砕し、ＤＩ水中で２時間インキュベートした。培養後、試料を再度沈殿させた後、真空柱を用いて精製した。図２６に示すように、カラムを３０μＬのＲＮａｓｅ自由水で溶出して最終製品を得た。
【０２６５】
いくつかの実施形態において、本明細書中に例示される方法は、ニッキングエンドヌクレアーゼ部位の代わりに制限部位を使用することができる。図２５の増幅工程と同様に、一組の配列をＰＣＲにより増幅し、５’−末端に隣接するＢａｍＨＩ部位、及び３’−末端に隣接するＡａｔＩＩ部位を有する。ＰＣＲ産物を５容量の沈殿緩衝液（３０：１  ＥｔＯＨ：１Ｍ  ＮａＯＡｃ）で−２０℃で少なくとも１０分間沈殿させ、単離した後、ＢａｍＨＩ及びＡａｔＩＩで消化する。この生成物を再び精製し、エキソＩＩＩ消化に供する。消化された核酸を除去すると、製品オリゴヌクレオチドが得られる。
【０２６６】
（ＤＮＡプローブ−ジスルフィド−染料共役体の合成）
【０２６７】
ジスルフィド結合によって連結された読み出しプローブ−染料共役体を合成するための例示的な図式。チオール修飾ＤＮＡプローブは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからその酸化型でオーダーされた。１０ｎモルのチオール修飾ＤＮＡプローブを３７℃で３０分間１０ｍＭのＴＣＥＰで処理した。還元工程及びゲルカラム精製後、ＤＮＡプローブを１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１ｘ  ＰＢＳ液中の３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）リンカー５０当量と混合した。この混合物を室温で少なくとも２時間反応させた。反応直後、スピンカラム精製し、１００ｕｇのカダベリン染料を含む６０ｕＬの１×ＰＢＳに再懸濁した。この反応を室温で少なくとも４時間進行させた後、エタノール−沈殿精製を行い、ＨＰＬＣ精製した。最終製品の濃度はＮａｎｏｄｒｏｐを用いて決定した。
【０２６８】
技術的には、染料とチオール修飾ＤＮＡプローブの間を連結できるヘテロ二官能性架橋試薬があれば、このリハイブリダイゼーションの仕組みに役立つであろう。３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）リンカーとＮＨＳ酸エステル染料を用いてＤＮＡプローブ−ジスルフィド−染料共役体を合成した。
【０２６９】
（実施例３）
（ハイブリダイゼーションラウンド間の読み出しプローブの選択的除去による逐次ハイブリダイゼーションを用いた核酸標的分子の検出）
例示的な逐次ハイブリダイゼーション及びバーコーディングプロトコルにおいて、標的分子に影響を及ぼすことなく、又は標的分子と複数の一次核酸プローブとの間の相互作用を妨害することなく、読み出しプローブを選択的に除去する効率的な方法が組み込まれた。この例では、Ｒｌｉｍ  ｍＲＮＡを検出するために、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）上で逐次ハイブリダイゼーション及びバーコード化を行った。例えば、図８に示される例示的なプロセスを参照のこと。
【０２７０】
マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）におけるＲｌｉｍ  ｍＲＮＡ転写物を、複数の一次核酸（ｓｓＤＮＡ）プローブで標的とし、ここで、特有配列を有する各一次核酸プローブは、特有標的ｍＲＮＡ分子にハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの最初のラウンド（ｈｙｂ  １）では、長さが１５ヌクレオチドで、Ｃｙ３Ｂで標識した読み出しプローブを標的ｍＲＮＡと接触させ、一次プローブと結合させた。読み出しプローブのハイブリダイゼーション及び画像に続いて、スライドを５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド溶液で室温で５分間洗浄した。ホルムアミド洗浄後、２回目のハイブリダイゼーション（ｈｙｂ  ２）において、長さ１５ヌクレオチドでＣｙ３Ｂで標識した２組目の読み出しプローブを固定細胞と接触させた。ｈｙｂ  ２のイメージング後、ホルムアミドによる洗浄を行った。その後のハイブリダイゼーション及びイメージングの各ラウンドを、ｈｙｂ  ２１までのホルムアミド洗浄工程で追跡し、ここで、２０ラウンドのハイブリダイゼーション、イメージング、及び洗浄後に、同じ細胞をｈｙｂ  １と同じプローブで標的とした。図１０は、記載されたプロトコールで得られた代理人共焦点画像のセットを示す。同じコントラストレベルのｚ積層蛍光画像の最大輝度突起部として画像を示した。
【０２７１】
（実施例４）
（ハイブリダイゼーションラウンド間の読み出しプローブの選択的除去による逐次ハイブリダイゼーションを用いた抗体による標的分子の検出）
１つ以上の目的の標的分子は、本明細書中に開示されるような逐次ハイブリダイゼーション方法を使用して、試料又は細胞中で検出され得る。標準的なプロトコールを用いて、試料を固着して調製し、試料中の標的分子を特異的に検出する一次抗体液と接触させる。一次抗体は、長さが１７ヌクレオチド以下の核酸読み取り配列を含む。次いで、結合一次抗体を有する標的分子を、本明細書中に開示される逐次ハイブリダイゼーション方法を用いて、例えば、一意フルオロフォアで標識された読み出しプローブなどの検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドで検出又はバーコード化することができる。読み出しプローブには、一次抗体上の読み出し配列と相補的な配列が含まれる。１ラウンドのハイブリダイゼーションと画像の間に、試料をホルムアミド溶液（例えば、５０％ｖ／ｖ）で洗浄して、ハイブリダイゼーションの前に各々のハイブリダイゼーションラウンドの読み出しプローブを選択的に除去し、その後のハイブリダイゼーションラウンドでその後の読み出しプローブのセットとハイブリダイゼーションする。試料中の１つ以上の標的分子は、目的のタンパク質であり得る。例えば、図９に示される例示的なプロセスを参照のこと。
【０２７２】
特定の例を図１１に示す。この例では、抗体のプールをオリゴヌクレオチドと結合させた。抗体１（「ＡＢ１」）はオリゴヌクレオチド１に、抗体２（「ＡＢ２」）はオリゴヌクレオチド２に結合し、以下同様であった。次いで、抗体溶液を固定細胞に適用し、本明細書中に開示した逐次ハイブリダイゼーション方法を用いて一次抗体を検出した。ハイブリダイゼーションのラウンドと画像の間に、細胞を３０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド溶液で洗浄して、ハイブリダイゼーションの前に各ハイブリダイゼーションラウンドの読み出しプローブを選択的に除去し、その後のハイブリダイゼーションラウンドでその後の読み出しプローブのセットを用いた。読み出しプローブの長さは１２ヌクレオチドであった。この例は、逐次ハイブリダイゼーションが、単一の抗体だけでなく、細胞中の標的分子を検出するための複数の抗体で実施できることを例示する。
【０２７３】
（均等）
本発明のいくつかの例示的な実施形態を説明した後、例示としてのみ提示された、前述は単に例示的なものであり、限定的なものではないことは、当業者には明らかであるはずである。多数の改変及び他の例示的な実施形態は、当業者の範囲内にあり、本発明の範囲内に入ると考えられる。特に、本明細書中に示される例の多くは、方法行為又はシステム元素の特定の組合せを含むが、それらの行為及びそれらの元素は、同じ目的を達成するために他の方法で組み合わせることができることを理解すべきである。１つの実施形態と接合構造してのみ考察されている行為、元素、及び特徴は、他の実施形態において同様の役割から除外されることを意図していない。さらに、以下の請求項に引用される１つ以上の手段−プラス機能制限については、その手段は、引用された機能を実行するために本明細書中に開示される手段に限定されることを意図していないが、引用された機能を実行するために現在又は後に開発された任意の手段を範囲内でカバーすることを意図している。
【０２７４】
クレーム要素を修正するクレームにおける「第一」、「第二」、「第三」等の序列用語の使用は、クレーム要素自体が、あるクレーム要素の優先度（ｐｒｉｏｒｉｔｙ）、優先性（ｐｒｅｃｅｄｅｎｃｅ）、又は方法の行為が行われる時間的順序を意味するものではなく、ある名称を有するクレーム要素と同一名称を有する別の要素（ただし、序列用語の使用のため）とを区別するためのラベルとして単に使用される。同様に、ａ）、ｂ）、等、又はｉ）、ｉｉ）、等の使用は、それ自体、特許請求の範囲における優先順位、優先順位、又は工程の順序を意味するものではない。同様に、明細書においてこれらの用語を使用すること自体は、要求される優先度（ｐｒｉｏｒｉｔｙ）、優先性（ｐｒｅｃｅｄｅｎｃｅ）、又は順序を意味するものではない。
【０２７５】
前記の明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。本発明は、実施例が本発明の一態様の単一の説明として意図され、他の機能的に当量な実施例が本発明の範囲内にあるため、提供される実施例によって範囲が限定されるものではない。本明細書中に示され記載されたものに加えて、本発明の種々の変形は、前記の記載から当業者には明らかになり、特許請求範囲の範囲内に入るであろう。本発明の利点及び目的は、必ずしも本発明の各実施形態によって包含されるわけではない。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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2021505152.tif 000019
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