(57)【要約】  本発明は生物医学の技術分野に属し、ヒアルロン酸に基づく両性イオンポリマーブラシおよびその製造方法と応用を開示する。前記両性イオンポリマーブラシの構造は式Ｉに示す構造であり、ここで、ｎは６０〜１５０の整数であり、ここで、ｘは５８９〜６８６の整数であり、ｙは１２５〜２３０の整数である。本発明は両性イオンポリマーブラシの製造方法を開示する。本発明の両性イオンポリマーブラシは、骨関節炎の病理学的進行を遅らせることができ、軟骨再生を促進し、さらに骨関節炎を治療し、関節などのインプラントからの摩耗粉の生成や引き起こされる関連疾患の状況を改善し、そして軟骨修復材料と結合し、その摩擦力学的特性を改善し、より良い修復効果の目的を達成することができる。且つ前記両性イオンポリマーブラシは、軟骨内のタンパク質と選択的に結合することができ、優れた潤滑効果を有する。本発明の方法は、単純で、操作が便利で、精製が容易であり、高収率などの利点がある。2021529237.tif 000007【選択図】なし
2021529237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１の構造を有し、
ここで、ｎは６０〜１５０の整数であり、ここで、ｘは５８９〜６８６の整数であり、ｙは１２５〜２３０の整数であることを特徴とするヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシ。
【化１】
2021529237.tif 000006
【請求項２】
下記のステップ（１）〜（３）を含むことを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの製造方法。
ステップ（１）ヒアルロン酸とアジピン酸ジヒドラジドを反応させ、アミノ修飾ヒアルロン酸を得る。
ステップ（２）２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンは重合モノマーとし、開始剤と鎖転移剤の作用下で、可逆的付加開裂鎖転移ラジカル重合の後、末端にカルボキシル基を有するポリ（２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン）を製造する。
ステップ（３）上記アミノ修飾ヒアルロン酸、末端にカルボキシル基を有するポリ（２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン）と活性剤を混合し、水溶液体系中で反応させ、ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシを得る。
【請求項３】
ステップ（１）の前記反応は、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の作用下で行い、反応系のｐＨは４．７〜４．８５であり、ステップ（３）の反応系のｐＨ値は５〜７であることを特徴とする請求項２に記載のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの製造方法。
【請求項４】
ステップ（１）の前記ヒアルロン酸とアジピン酸ジヒドラジドの質量比は１：４〜１：１８であり、
ステップ（３）のアミノ修飾ヒアルロン酸と末端にカルボキシル基を有するポリ（２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン）の用量は、アミノ基とカルボキシル基のモル比は１：（１．１〜２）である条件を満足させることを特徴とする請求項２に記載のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの製造方法。
【請求項５】
ステップ（２）の前記鎖転移剤は、４−シアノ−４−（フェニルチオホルミルチオ）ペンタン酸であり、
ステップ（２）の前記開始剤は、４，４’−アゾ（４−シアノ吉草酸）であり、ステップ（３）の前記活性剤は、１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドＥＤＣおよびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドＮＨＳであることを特徴とする、請求項２に記載のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの製造方法。
【請求項６】
前記鎖転移剤と前記２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンのモル比は、１：（１００〜２００）であり、前記開始剤と鎖転移剤のモル比は１：（２〜１０）であり、使用する活性剤ＥＤＣとＮＨＳの質量比は１：１〜１：２であることを特徴とする請求項５に記載のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの製造方法。
【請求項７】
ステップ（２）の前記重合温度は６０〜７０℃であり、重合時間は６〜２４時間であり、
ステップ（２）の前記重合に使用される溶媒は、エタノール、水、メタノールのうちの一種以上であり、
ステップ（３）の前記反応温度は２５〜３５℃であり、反応時間は１８〜３６時間であり、
ステップ（１）の前記反応温度は２５〜３５℃であることを特徴とする請求項２に記載のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの生物医学分野における使用。
【請求項９】
前記ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシは、骨関節炎を治療するための薬物、プロテーゼの潤滑摩擦性能を改善するための潤滑剤の製造に特に適し、且つ、軟骨修復材料と結合して摩擦力学的特性を改善することを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシは、軟骨修復材料のバイオニック潤滑剤または軟骨修復材料の摩擦性能を改善するための修飾材料として特に使用することを特徴とする請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物医学の技術分野に属し、特に、ヒアルロン酸に基づく両性イオンポリマーブラシおよびその製造方法と生物医学分野での応用に関する。本発明のポリマーブラシは、骨関節炎の進行を遅らせることと、骨関節炎を治療するための薬物を製造することに特に適し、関節などのインプラントからの摩耗粉の生成や引き起こされる関連疾患の状況を改善する潤滑剤であり、そして軟骨修復材料と結合し、そしてその摩擦力学的特性を改善し、より良い修復効果を達成することができる。
【背景技術】
【０００２】
関節軟骨は、可動関節の骨の末端を包む特殊な結合組織の層であり、その主な機能には、衝撃吸収と潤滑の提供を含む。しかし、無血管、無神経、無免疫細胞などの特徴により、一旦外部の機械的刺激などの要素で損傷すると、自然に修復することが難しく、軟骨機能の低下、さらには喪失することにより、さまざまな関節疾患を引き起こす。天然関節滑膜液の主成分には、ヒアルロン酸、タンパク質（主にアルブミンとγ−グロブリン）、ルブリシン、アグリカン、リン脂質が含まれる。剪断作用下で、天然関節滑膜液の主成分は自己組織化を起こし、ヒアルロン酸を主鎖とし、ルブリシンとアグリカンを側鎖とするボトルブラシのような構造の高分子に組み合わされ、この高分子はコネキシンを介して軟骨表面に結合し、さらにリン脂質と組み合わされ、関節の可動中に境界潤滑剤として作用して、軟骨間の摩擦を効果的に低減し、人間の健康的な生活を保証する。骨関節炎は、摩耗変性関節炎とも呼ばれ、軟骨変性による軟骨潤滑性の低下によって引き起こされる典型的な関節疾患であり、非常に高い発病率を示し、関連する調査によると、５５歳以上の場合、発病率は８０％まで達する。骨関節炎の主な臨床症状は、関節の痛み、こわばり、軟骨の局所的変質、摩耗、可動制限、さらには重度の機能障害である。摩耗によって生成された摩耗粉は、軟骨分解に関連する経路を活性化し、たとえば、軟骨マトリックスを分解するマトリックスメタロプロテイナーゼ１３の分泌が上昇し、軟骨の破壊と劣化がさらに加速し、軟骨の摩耗が激しくなり、さらに多くの摩耗粉が発生し、悪循環を引き起こす。
【０００３】
軟骨の潤滑性を改善し、軟骨摩耗粉の発生を減らし、骨関節炎の病理進行を遅らせ、さらに骨関節炎の治療目的を達成するために、国内外の多くの研究グループがバイオニック潤滑に関する研究を行ってきた。しかし、現在の研究の多くは、関節滑膜液中の単一成分、例えば、ルブリシン、アグリカンなどのバイオニック構造上に対して焦点を合わせ、一方で、前記で形成されたヒアルロン酸を主鎖とし、ルブリシンまたはアグリカンを側鎖とするボトルブラシ状の高分子が、優れた軟骨潤滑性を実現する作用があることを充分に理解されておらず、また一方、製造されたバイオニック潤滑剤は、軟骨表面に効果的に結合できないか、あるいは結合方法が破壊的または不安定である。この背景のもと、このボトルブラシ状の高分子に基づくバイオニック潤滑剤を設計合成する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記従来技術の欠点と欠陥を克服するため、本発明の主な目的は、ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）に基づく両性イオンポリマーブラシを提供することである。
【０００５】
本発明の別の目的は、上記のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの製造方法を提供することである。
【０００６】
本発明のさらに別の目的は、上記のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの生物医学分野での応用を提供することであり、骨関節炎を治療するための薬物および、またはプロテーゼの潤滑摩擦性能を改善するための潤滑剤の製造に特に適し、あるいは、軟骨修復材料を変更するために使用し、摩擦力学的特性を改善する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的は、以下の手段を通じて実現し、
ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシは、以下の式１に示す構造を有し、
【化１】
2021529237.tif 000003
ここで、ｎは６０〜１５０の整数であり、ここで、ｘは５８９〜６８６の整数であり、ｙは１２５〜２３０の整数である。
【０００８】
前記ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの製造方法は、以下のステップを含む。
ステップ（１）ヒアルロン酸とアジピン酸ジヒドラジドを反応させ、アミノ修飾ヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＤＨ）を得る。
ステップ（２）２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンは重合モノマーとし、開始剤と鎖転移剤の作用下で、可逆的付加開裂鎖転移ラジカル重合の後、末端にカルボキシル基を有するポリ（２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）を製造する。
ステップ（３）上記アミノ修飾ヒアルロン酸ＨＡ−ＡＤＨ、末端にカルボキシル基を有するポリ（２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン）ＰＭＰＣと活性剤を混合し、水溶液体系中で反応させ、ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシを得る。
【０００９】
ステップ（１）の前記反応は、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の作用下で行われ、
ステップ（１）の前記反応の温度は２５〜３５℃であり、反応系のｐＨは好ましくは４．７〜４．８５である。前記反応は、反応系のｐＨ値が変化しなくなるまで反応することが好ましい。
【００１０】
ステップ（１）の前記ヒアルロン酸とアジピン酸ジヒドラジドの用量は任意の比率であり得、質量比は好ましくは１：４〜１：１８である。
【００１１】
ステップ（２）の前記鎖転移剤は、好ましくは、４−シアノ−４−（フェニルチオホルミルチオ）ペンタン酸（ＣＴＰ）であり、前記２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンＭＰＣとＣＴＰのモル比は、好ましくは１００：１〜２００：１である。
【００１２】
ステップ（２）の前記開始剤は、好ましくは４，４’−アゾ（４−シアノ吉草酸）（ＡＣＶＡ）であり、前記ＡＣＶＡとＣＴＰのモル比は１：（２〜１０）であり、好ましくは１：２である。
【００１３】
ステップ（２）の前記重合温度は６０〜７０℃であり、重合時間は６〜２４時間である。
【００１４】
ステップ（２）の前記重合に使用される溶媒は、エタノール、水、メタノールなどであり、好ましくはメタノールを溶媒として使用する。
【００１５】
ステップ（３）で使用されるアミノ修飾ヒアルロン酸と末端にカルボキシル基を有するＰＭＰＣの量は、任意の比率にすることができ、または、構造設計の要件に基づき調整することができ、アミノ基とカルボキシル基のモル比は、好ましくは１：（１．１〜２）である。
【００１６】
ステップ（３）の前記活性剤は、好ましくは１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）であり、使用する活性剤ＥＤＣとＮＨＳの質量比は、好ましくは１：１―１：２であり、
ステップ（３）の前記反応温度は２５〜３５℃であり、反応時間は１８〜３６時間であり、反応条件は、より好ましくは、３０℃のもとで２４時間の反応である。
【００１７】
ステップ（３）の反応系のｐＨ値は５〜７であり、好ましくはｐＨ値５．５〜６である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシは、天然の関節髄膜液の成分に基づき剪断作用下で組み合わせ形成されたボトルブラシ状高分子のバイオニック潤滑剤であり、潤滑を改善する効果があり、ヒアルロン酸と単一の滑膜液成分に対するバイオニック潤滑剤の欠点を克服するだけでなく、また、自然の軟骨で重要な役割を果たすボトルブラシ状高分子構造および成分におけるバイオニクスを実現し、より優れた潤滑効果を達成し、したがって、生物医学の分野で応用でき、骨関節炎を治療するための薬物を製造するのに特に適し、関節などのインプラントの潤滑および摩擦特性を改善する潤滑剤であり、そして軟骨修復材料と結合し、その摩擦力学的特性を改善できる。
【００１９】
本発明の両性イオンポリマーブラシは、バイオニック潤滑剤として使用する。
【００２０】
本発明は従来技術と比較して、以下の利点および有益な効果を有する。
【００２１】
（１）本発明は、ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの製造方法で、簡単なルート、便利な操作、簡単な精製、高収率などの利点がある。
【００２２】
（２）本発明は、ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシが、自然の関節に形成された主鎖としてヒアルロン酸を用いたボトルブラシ状の複合構造高分子のバイオニクスであり、単一成分のバイオニクスではなく、さらに優れた潤滑効果を有する。
【００２３】
（３）本発明は、ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシは、選択的に軟骨のタンパク質と結合し、軟骨と結合の方法は自然で無害である。
【００２４】
（４）本発明は、ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシは、骨関節炎の病理進行を緩和するために現在臨床的に使用されているヒアルロン酸よりも、さらに優れた治療効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１−（１）】両性イオンポリマーブラシの合成経路模式図であり、アジピン酸ジヒドラジド修飾ヒアルロン酸の反応模式図である。
【図１−（２）】両性イオンポリマーブラシの合成経路模式図であり、２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンの重合反応図である。
【図１−（３）】両性イオンポリマーブラシの合成経路模式図であり、両性イオンポリマーブラシの製造反応図である。
【図２−（１）】実施形態１で得られた両性イオンポリマーブラシのＮＭＲスペクトルであり、図のＨＰＭは、両性イオンポリマーブラシで、ＰＭＰＣは、末端にカルボキシル基を持つポリ（２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン）で、ＨＡ−ＡＤＨは、アミノ修飾ヒアルロン酸である。
【図２−（２）】実施形態１で得られた両性イオンポリマーブラシの赤外線スペクトルであり、図のＨＰＭは、両性イオンポリマーブラシで、ＰＭＰＣは、末端にカルボキシル基を持つポリ（２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン）で、ＨＡ−ＡＤＨは、アミノ修飾ヒアルロン酸である。
【図３】実施形態１で得られた両性イオンポリマーブラシの潤滑効果であり、ＨＰＭは両性イオンポリマーブラシであり、ＨＡはヒアルロン酸である。
【図４】実施形態１で得られた骨関節炎の緩和に対する両性イオンポリマーブラシの効果図である（スケールバーは５００μｍ）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、実施形態と図面と併せて本発明に対しさらに詳細に説明されるが、本発明の実施方式はこれらに限定されない。以下の実施形態の試薬はすべて市販されている。
【００２７】
本発明のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの合成路線模式図は図１に示し、ここで、図１−（１）は、アジピン酸ジヒドラジド修飾ヒアルロン酸の反応模式図であり、１−（２）は２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンの重合反応模式図であり、１−（３）は、両性イオンポリマーブラシの製造反応模式図である。
【００２８】
［実施例１：ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの製造方法］
（１）分子量１００〜１５０万のヒアルロン酸１００ｍｇを脱イオン水２０ｍＬに溶かし、攪拌して溶解し、ヒアルロン酸溶液を得、１．７３６ｇのアジピン酸ジヒドラジドをヒアルロン酸溶液と混合し、アジピン酸ジヒドラジドとヒアルロン酸の質量比は１７．３６：１で、１Ｍ塩酸で溶液のｐＨを４．７５に調整し、０．１９１ｇの１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）を固体として加え、溶液のｐＨを４．７５に調整し続け、３０℃でｐＨ値が変わらなくなるまで反応させ、透析凍結乾燥し、アミノ修飾ヒアルロン酸を得る。
【００２９】
（２）１０ｇの２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）を３０ｍＬの無水メタノールに溶解し、３７．５ｍｇの４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（ＡＣＶＡ）を計量し開始剤とし、７５ｍｇの４−シアノ−４（フェニルチオホルミルチオ）ペンタン酸（ＣＴＰ）を鎖転移剤とし、開始剤と鎖転移剤をＭＰＣの無水メタノール溶液に加え、攪拌後溶解後に密封し、氷浴下で、窒素で４０分間脱酸する。
【００３０】
（３）脱酸素化されたＭＰＣ溶液を６０℃に予熱したオイルバスで１２時間反応させ、液体窒素クエンチング反応させ、室温に戻った後、１Ｌアセトンで沈殿させ、上澄みを流し込んだ後、３０℃で真空乾燥し、末端にカルボキシル基を有するポリ（２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）７．９８１ｇを得る。
【００３１】
（４）ステップ（１）の製品１００ｍｇとステップ（３）の製品２ｇを脱イオン水に溶解し、溶液のｐＨを５．５に調整し、３０℃で、ｐＨ＝５．５で２４時間反応させたＥＤＣ／ＮＨＳ６０ｍｇ（１：１、モル比）を加え、前記アミノ修飾ヒアルロン酸と末端にカルボキシル基を有するＰＭＰＣのアミノ基とカルボキシル基のモル比は１：１．５であり、反応終了後、透析凍結乾燥し、ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシ１５４．１ｍｇを得る。
【００３２】
図２は実施形態１で得られた両性イオンポリマーブラシのＮＭＲスペクトル２−（１）と赤外線スペクトル２−（２）である。
【００３３】
［実施例２：ヒアルロン酸と２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸に基づくアニオン性ポリマーブラシの製造］
（１）分子量１００〜１５０万のヒアルロン酸１００ｍｇを脱イオン水２０ｍＬに溶かし、攪拌して溶解し、ヒアルロン酸溶液を得、４３５．４ｍｇのアジピン酸ジヒドラジドをヒアルロン酸溶液と混合し、アジピン酸ジヒドラジドとヒアルロン酸の質量比は４．３５：１で，１Ｍ塩酸で溶液のｐＨを４．８に調整し、３０ｍｇの１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）を固体として加え、溶液のｐＨを４．８に調整し続け、３０℃でｐＨ値が変わらなくなるまで反応させ、透析凍結乾燥し、アミノ修飾ヒアルロン酸を得る。
【００３４】
（２）２ｇの２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）を６ｍＬの無水メタノールに溶解し、７．５ｍｇの４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（ＡＣＶＡ）を計量し開始剤とし、１５ｍｇの４−シアノ−４（フェニルチオホルミルチオ）ペンタン酸（ＣＴＰ）を鎖転移剤とし、開始剤と鎖転移剤をＭＰＣの無水メタノール溶液に加え、攪拌後溶解後に密封し、氷浴下で、窒素で３０分間脱酸する。
【００３５】
（３）脱酸素化されたＭＰＣ溶液を６０℃に予熱したオイルバスで１２時間反応させ、液体窒素クエンチング反応させ、室温に戻った後、３００ｍＬアセトンで沈殿させ、上澄みを流し込んだ後、３０℃で真空乾燥し、末端にカルボキシル基を有するポリ（２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）１．５３５ｇを得る。
【００３６】
（４）ステップ（１）の製品５０ｍｇとステップ（３）の製品１ｇを脱イオン水に溶解し、溶液のｐＨを５．５に調整し、３０℃で、ｐＨ＝５．５で２４時間反応させたＥＤＣ／ＮＨＳ６０ｍｇ（１：１、モル比）を加え、前記アミノ修飾ヒアルロン酸と末端にカルボキシル基を有するＰＭＰＣのアミノ基とカルボキシル基のモル比は１：１．５とし、反応終了後、透析凍結乾燥し、ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシ８３．５ｍｇを得る。
【００３７】
［実施例３：ヒアルロン酸と２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸に基づくアニオン性ポリマーブラシの製造］
（１）分子量１００〜１５０万のヒアルロン酸１００ｍｇを脱イオン水２０ｍＬに溶かし、攪拌して溶解し、ヒアルロン酸溶液を得、８６８ｍｇのアジピン酸ジヒドラジドをヒアルロン酸溶液と混合し、アジピン酸ジヒドラジドとヒアルロン酸の質量比は８．６８：１で、１Ｍ塩酸で溶液のｐＨを４．８に調整し、６０ｍｇの１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）を固体として加え、溶液のｐＨを４．８に調整し続け、３０℃でｐＨ値が変わらなくなるまで反応させ、透析凍結乾燥し、アミノ修飾ヒアルロン酸を得る。
【００３８】
（２）５ｇの２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）を１５ｍＬの無水メタノールに溶解し、１９ｍｇの４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（ＡＣＶＡ）を計量し開始剤とし、３８ｍｇの４−シアノ−４（フェニルチオホルミルチオ）ペンタン酸（ＣＴＰ）を鎖転移剤とし、開始剤と鎖転移剤をＭＰＣの無水メタノール溶液に加え、攪拌後溶解後に密封し、氷浴下で、窒素で３０分間脱酸する。
【００３９】
（３）脱酸素化されたＭＰＣ溶液を６０℃に予熱したオイルバスで１２時間反応させ、液体窒素クエンチング反応させ、室温に戻った後、６００ｍＬアセトンで沈殿させ、上澄みを流し込んだ後、３０℃で真空乾燥し、末端にカルボキシル基を有するポリ（２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）３．６４３ｇを得る。
【００４０】
（４）ステップ（１）の製品１５０ｍｇとステップ（３）の製品３ｇを脱イオン水に溶解し、溶液のｐＨを５．５に調整し、３０℃で、ｐＨ＝５．５で２４時間反応させたＥＤＣ／ＮＨＳ６０ｍｇ（１：１、モル比）を加え、前記アミノ修飾ヒアルロン酸と末端にカルボキシル基を有するＰＭＰＣのアミノ基とカルボキシル基のモル比は１：１．５とし、反応終了後、透析凍結乾燥し、ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシ２０１ｍｇを得る。
【００４１】
［実施例４］
実施例１で製造されたポリマーブラシは、ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）摩擦摩耗試験機を使用し、その潤滑性能について検査し、具体的方法は以下の通りである。
【００４２】
（１）構成濃度は０．２ｍｇ／ｍＬのポリマーブラシＰＢＳ溶液であり、１ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ＰＢＳ溶液である。
【００４３】
（２）新鮮な豚の関節を取り、関節軟骨を取り除き、（軟骨に対しいかなる損傷も避ける）、軟骨を約１．５ｃｍ×１ｃｍの大きさにカットし、同時に、リングを使用して直径６ｍｍの軟骨釘をドリルし、０．５％パンクレアチンで３時間処理した後、骨関節炎の病変がある軟骨を模倣するために血清で洗浄し、表面が平らな軟骨シートを選び、そしてそれを病理的グレードのガラススライドに固定し、次に、固定された軟骨の病理学的グレードのガラススライドを直径１０ｍｍのペトリ皿に固定し、軟骨釘は摩擦摩耗試験機の固定具で固定する。次に、０．２ｍｇ／ｍＬのポリマーブラシＰＢＳ溶液、１ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ＰＢＳ溶液および天然ウシ関節滑膜液を添加し、異なる潤滑媒体の下で摩擦係数を測定し、測定を３回繰り返す。結果の要約は図３に示す。
【００４４】
図３から、ヒアルロン酸や天然ウシ関節滑膜液と比較して、ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの潤滑効果はさらに優れ、摩擦係数が明らかに低下する。
【００４５】
［実施例５］
実施例１で製造されたポリマーブラシはラット骨関節炎モデルを使用し、骨関節炎の進行を遅らせる効果を評価し、具体的方法は以下の通りである。
【００４６】
ＳＰＦグレードＳＤラット、雄、月齢４か月、２４匹。検疫合格後、すべての動物をｚｏｌｅｔｉｌ（４０ｍｇ／ｋｇ）とｘｙｌａｚｉｎｅ（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、ラットの右膝関節嚢を開き、スカルペルでその前十字靭帯を切断する。モデル化に成功し、そして生き残ったラットは、ランダムにＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４グループ、１グループごとに６匹に分ける。手術後、１４日目、２１日目、３５日目、４２日目に動物の右膝に関節腔注射を行い、グループＡのラットは、何も処理せずにブランクコントロールグループとし、グループＢのラットはＰＢＳ１００μＬを関節腔に注射し、グループＣのラットには、１００μＬのヒアルロン酸溶液を関節腔に注射し、グループＤのラットに、ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシ（ＨＰＭ）溶液１００μＬを関節腔に注射する。
【００４７】
［検査測定］
（１）動物の一般的な臨床状態を毎日観察と記録し、毎週１回動物の体重を測定する。
（２）手術後４９日目にラットを殺し、そしてその関節軟骨を取得し、すべての動物の左側の未手術関節から関節軟骨を取り、３匹の動物の左関節軟骨を参照グループとして取り、
（３）得られたラットの関節を脱灰脱水処理し、１５ｕｍ×１５ｕｍに軟骨サンプルをカットし、パラフィン包埋をし、次にトルイジンブルー染色をし、サフラニンＯ染色をし、ａｎｔｉ−ｃｏｌ  ２Ａ１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙで二型コラーゲンに対し染色し、
結果の要約は図４に示す。
【００４８】
図４から、ＳＤラットの前十字靭帯を切除して飼育した後、関節軟骨が明らかに薄くなり、軟骨の表面は粗く不均一、不連続で、局部軟骨は脱落し、骨関節炎の明らかな症状があり、骨関節炎のモデル造型が成功し、そして健康なラットの関節軟骨の表面が平らで滑らかであることを示している。ヒアルロン酸とＰＢＳ治療グループと比較して、ＨＰＭ治療グループの軟骨表面の粗く不均一な状況は明らかに改善し、ＯＡＲＳＩスコアも明らかに低下し、ＨＰＭの作用により、軟骨の摩耗および劣化の状況が効果的に改善され、そして、骨関節炎の病理学的進行を効果的に緩和することを示している。
【００４９】
［実施例６］
実施例１で製造されたポリマーブラシ（ＨＰＭ）に対し、ＶＰ−ＩＴＣ等温熱量計（ＭＩＣＲＯＣＡＬ、米国）を使用し、滑液と軟骨タンパク質との相互作用を研究する。具体的方法は以下の通りである。
【００５０】
（１）０．２ｍｇ／ｍＬのＨＰＭＰＢＳ溶液と０．２ｍｇ／ｍＬの酢酸溶液（酢酸濃度５ｍｇ／ｍＬ）、７ｍｇ／ｍＬと１１ｍｇ／ｍＬのアルブミンとγ−グロブリンＰＢＳ溶液、０．５ｍｇ／ｍＬの二型コラーゲン溶液（溶媒として５  ｍｇ／ｍＬの酢酸）、０．５フィブロネクチン溶液（溶媒としてＰＢＳ）を準備する。
【００５１】
（２）ＶＰ−ＩＴＣ等温熱量計滴定溶媒ＰＢＳと５ｍｇ／ｍＬの酢酸のブランク曲線を、実験的背景とする。
【００５２】
（３）ＨＰＭと各種タンパク質の相互作用曲線を別々に滴定し、前のステップに対応する実験的背景を差し引いた後、ＨＰＭと各種タンパク質との相互作用の結合定数を得る。
【００５３】
結果は表１に要約する。表１に示すように、ＨＰＭとアルブミン、グロブリン、フィブロネクチン、二型コラーゲンの結合定数は大きく異なり、二型コラーゲンとフィブロネクチンの結合定数は、アルブミンとグロブリンの結合定数とは桁違いに異なり、タンパク質選択の相互作用を示し、したがって軟骨のタンパク質に選択的に結合することができ、軟骨と結合する方法は自然で無害である。そしてヒアルロン酸はこの選択性を示さない。（ＨＡはヒアルロン酸である）
【００５４】
【表１】
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【００５５】
上記の実施形態は、本発明の好ましい実施方式であるが、本発明の実施形態は、上記の実施形態によって限定されず、その他の本発明の精神および原理から逸脱しない他の変更、修正、置換、組み合わせ、および簡略化は、同等の置換方法であり、すべて本発明の保護範囲に含まれる。
【００５６】
（付記）
（付記１）
式１の構造を有し、
ここで、ｎは６０〜１５０の整数であり、ここで、ｘは５８９〜６８６の整数であり、ｙは１２５〜２３０の整数であることを特徴とするヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシ。
【化２】
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【００５７】
（付記２）
下記のステップ（１）〜（３）を含むことを特徴とする付記１に記載のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの製造方法。
ステップ（１）ヒアルロン酸とアジピン酸ジヒドラジドを反応させ、アミノ修飾ヒアルロン酸を得る。
ステップ（２）２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンは重合モノマーとし、開始剤と鎖転移剤の作用下で、可逆的付加開裂鎖転移ラジカル重合の後、末端にカルボキシル基を有するポリ（２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン）を製造する。
ステップ（３）上記アミノ修飾ヒアルロン酸、末端にカルボキシル基を有するポリ（２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン）と活性剤を混合し、水溶液体系中で反応させ、ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシを得る。
【００５８】
（付記３）
ステップ（１）の前記反応は、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の作用下で行い、反応系のｐＨは４．７〜４．８５であり、ステップ（３）の反応系のｐＨ値は５〜７であることを特徴とする付記２に記載のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの製造方法。
【００５９】
（付記４）
ステップ（１）の前記ヒアルロン酸とアジピン酸ジヒドラジドの質量比は１：４〜１：１８であり、
ステップ（３）のアミノ修飾ヒアルロン酸と末端にカルボキシル基を有するポリ（２−メタクリロキシエチルホスホリルコリン）の用量は、アミノ基とカルボキシル基のモル比は１：（１．１〜２）である条件を満足させることを特徴とする付記２に記載のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの製造方法。
【００６０】
（付記５）
ステップ（２）の前記鎖転移剤は、４−シアノ−４−（フェニルチオホルミルチオ）ペンタン酸であり、
ステップ（２）の前記開始剤は、４，４’−アゾ（４−シアノ吉草酸）であり、ステップ（３）の前記活性剤は、１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドＥＤＣおよびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドＮＨＳであることを特徴とする、付記２に記載のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの製造方法。
【００６１】
（付記６）
前記鎖転移剤と前記２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンのモル比は、１：（１００〜２００）であり、前記開始剤と鎖転移剤のモル比は１：（２〜１０）であり、使用する活性剤ＥＤＣとＮＨＳの質量比は１：１〜１：２であることを特徴とする付記５に記載のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの製造方法。
【００６２】
（付記７）
ステップ（２）の前記重合温度は６０〜７０℃であり、重合時間は６〜２４時間であり、
ステップ（２）の前記重合に使用される溶媒は、エタノール、水、メタノールのうちの一種以上であり、
ステップ（３）の前記反応温度は２５〜３５℃であり、反応時間は１８〜３６時間であり、
ステップ（１）の前記反応温度は２５〜３５℃であることを特徴とする付記２に記載のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの製造方法。
【００６３】
（付記８）
付記１に記載のヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシの生物医学分野における使用。
【００６４】
（付記９）
前記ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシは、骨関節炎を治療するための薬物、プロテーゼの潤滑摩擦性能を改善するための潤滑剤の製造に特に適し、且つ、軟骨修復材料と結合して摩擦力学的特性を改善することを特徴とする付記８に記載の使用。
【００６５】
（付記１０）
前記ヒアルロン酸と２−メタクリロキシエチルホスホリルコリンに基づく両性イオンポリマーブラシは、軟骨修復材料のバイオニック潤滑剤または軟骨修復材料の摩擦性能を改善するための修飾材料として特に使用することを特徴とする付記８に記載の使用。
【図１−（１）】
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【図１−（２）】
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【図１−（３）】
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【図２−（１）】
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【図２−（２）】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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