(57)【要約】本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのハイスループットＤＮＡアセンブリ反応のための方法、組成物、およびキットを記載する。本開示は、事前検証したＣＲＩＳＰＲプロトスペーサー／プロトスペーサー隣接モチーフ配列組み合わせを含むクローニングタグセグメントに挟まれたモジュラー挿入ＤＮＡ部分を含むモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物をさらに記載する。ＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａのハイスループット法もまた開示する。
2021533773.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞遺伝子の発現をモジュレートするための組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物であって、前記構築物がＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含み、前記マルチクローン部位が、
ａ）少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、ここで、各ｃＴＡＧが、
ｉ）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含み；ここで、前記検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内で固有のものである、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位
を含む、少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）；および
ｂ）１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分であって；
ｉ）ここで、前記別個のｃＴＡＧの各々が、前記１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分の各々の周囲の隣接した位置に分布する、１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分
を含み、
ここで、前記構築物が、さらに、
ｃ）触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする第１の核酸；
ｄ）前記（ｃ）の触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をＤＮＡ標的部位に動員することができるガイドＲＮＡをコードする第２の核酸
を含む、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項２】
前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が第１の複製起点を含む、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項３】
前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が１つを超える複製起点を含む、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項４】
前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、第１の複製起点および第２の複製起点を含む、請求項２に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項５】
前記第１の複製起点が、Ｅ．ｃｏｌｉ内でプラスミドを維持することができる、請求項２に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項６】
前記第２の複製起点が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ内でプラスミドを維持することができる、請求項４または５に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項７】
前記第１の複製起点がＥ．ｃｏｌｉ内でプラスミドを維持することができ、第２の複製起点がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内でプラスミドを維持することができ、第３の複製起点がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ内でプラスミドを維持することができる、請求項２に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項８】
前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、選択マーカーをコードする挿入部分を含む、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項９】
少なくとも１つの複製起点が、前記ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位内の挿入部分内に含まれる、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項１０】
前記第１の核酸が、前記ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位内の挿入部分内に含まれる、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項１１】
前記第１の核酸を含む前記挿入部分が、選択マーカーをさらに含む、請求項１０に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項１２】
前記第２の核酸が、前記ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位内の挿入部分内に含まれる、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項１３】
前記第２の核酸を含む前記挿入部分が、選択マーカーをさらに含む、請求項１２に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項１４】
前記第１の核酸および前記第２の核酸が、前記ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位内の前記核酸自体の挿入部分内に各々含まれる、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項１５】
前記第１の核酸および前記第２の核酸を含む前記挿入部分が、選択マーカーをそれぞれ含む、請求項１４に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項１６】
前記第１の核酸を含む前記挿入部分中に含まれる前記選択マーカーと、前記第２の核酸を含む前記挿入部分中に含まれる前記選択マーカーが異なる、請求項１５に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項１７】
前記第１の核酸および前記第２の核酸が、前記ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位内の同一の前記挿入部分内に含まれる、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項１８】
前記第１の核酸が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項１９】
前記第１の核酸が、ターミネーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項２０】
前記第２の核酸が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項２１】
前記第２の核酸が、ターミネーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項２２】
前記プロモーターが異種プロモーターである、請求項１８および２０のいずれか１項に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項２３】
前記プロモーターが構成性プロモーターである、請求項１８および２０のいずれか１項に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項２４】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項１８および２０のいずれか１項に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項２５】
前記第１の核酸が、転写活性化タンパク質に翻訳的に融合される触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項２６】
前記第１の核酸が、転写不活性化タンパク質に翻訳的に融合される触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項２７】
前記第１の核酸が、転写リプレッサーに翻訳的に融合される触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項２８】
前記構築物が、（ｅ）転写活性化タンパク質をコードする第３の核酸であって、発現したときに、前記転写活性化タンパク質自体、前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合することができる前記第３の核酸をさらに含む、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項２９】
前記構築物が、（ｅ）転写不活性化タンパク質をコードする第３の核酸であって、発現したときに、前記転写不活性化タンパク質自体、触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合することができる前記第３の核酸をさらに含む、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項３０】
前記構築物が、（ｅ）転写リプレッサータンパク質をコードする第３の核酸であって、発現したときに、前記転写リプレッサータンパク質自体、触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合することができる前記第３の核酸をさらに含む、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項３１】
前記転写活性化タンパク質は、それ自体が、連結アプタマーを介するか、タンパク質間相互作用によって前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合する、請求項２８に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項３２】
前記転写不活性化タンパク質は、それ自体が、連結アプタマーを介するか、タンパク質間相互作用によって前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合する、請求項２９に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項３３】
前記転写リプレッサータンパク質は、それ自体が、連結アプタマーを介するか、タンパク質間相互作用によって前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合する、請求項３０に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項３４】
前記第２の核酸が、アプタマー自体が転写活性化タンパク質に結合することができる前記アプタマーに作動可能に連結されているガイドＲＮＡをコードする、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項３５】
前記第２の核酸が、アプタマー自体が転写不活性化タンパク質に結合することができる前記アプタマーに作動可能に連結されているガイドＲＮＡをコードする、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項３６】
前記第２の核酸が、アプタマー自体が転写リプレッサータンパク質に結合することができる前記アプタマーに作動可能に連結されているガイドＲＮＡをコードする、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項３７】
前記転写活性化タンパク質が、ＶＰ１６、ＶＰ６４、およびＶＰ１６０、ＶＰＲからなる群から選択される、請求項２５、２８、３１、および３４のいずれか１項に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項３８】
前記転写不活性化タンパク質が、Ｍｘｉ１、Ｔｂｘ３、ＫＲＡＢ、ＥｎＲ、およびＳＩＤからなる群から選択される、請求項２６、２９、３２、および３５、および１６．１のいずれか１項に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項３９】
前記転写リプレッサータンパク質が、Ｍｘｉ１、Ｔｂｘ３、ＫＲＡＢ、ＥｎＲ、およびＳＩＤからなる群から選択される、請求項２７、３０、３３、および３６のいずれか１項に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項４０】
前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が環状である、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項４１】
前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が線状である、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項４２】
前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、生物のゲノムに組み入れられている、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項４３】
前記別個のｃＴＡＧのうちの少なくとも１つが、少なくとも２つの検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項４４】
前記ＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのためのものである、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項４５】
前記ＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのためのものである、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項４６】
前記別個のｃＴＡＧのうちの少なくとも１つが、低頻度の（８塩基長以上の）制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項４７】
各々のｃＴＡＧが、低頻度の（８塩基長以上の）制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項４８】
前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、変異したＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項４９】
前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、変異したＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項５０】
前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、表１のベクター中に含まれるｄＣａｓ９遺伝子から選択される、請求項１に記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項５１】
前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ））、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ０Ａ１８２ＤＷＥ３（Ａ０Ａ１８２ＤＷＥ３＿９ＦＩＲＭ））、およびＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｕ２ＵＭＱ６（ＣＰＦ１  ＡＣＩＳＢ）からなる群から選択される、請求項１に記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項５２】
前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素がＡｓＣｐｆ１（Ｄ９０８Ａ）である、請求項１に記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項５３】
前記組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、前記（ｃ）の触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をＤＮＡ標的部位に動員することができる１つを超えるガイドＲＮＡをコードする、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項５４】
前記ガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つが、前記構築物中にコードされる別のガイドＲＮＡと異なる配列を含む、請求項５３に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項５５】
前記ガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つが、前記構築物中にコードされる別のガイドＲＮＡと異なるＤＮＡ標的部位配列を標的にする、請求項５３に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項５６】
前記組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、１つを超える触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項５７】
前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素のうちの少なくとも１つが、前記構築物中にコードされる別の触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素と異なる配列を含む、請求項５６に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項５８】
前記ｃＴＡＧのうちの１つまたは複数が、配列番号６５〜７４、７８〜８１、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の挿入部分。
【請求項５９】
請求項１〜５７のいずれか１項に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を含む宿主細胞。
【請求項６０】
１またはそれを超える宿主細胞遺伝子の発現をモジュレートするハイスループット法であって、請求項１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を前記宿主細胞に導入するステップを含み；ここで、前記ガイドＲＮＡの前記ＤＮＡ標的部位が前記宿主細胞ゲノム内にある、ハイスループット法。
【請求項６１】
前記組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物のうちの少なくとも１つの挿入部分が、前記宿主細胞のゲノムに組み入れられている、請求項６０に記載のハイスループット法。
【請求項６２】
前記組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、染色体外ＤＮＡとして前記宿主細胞中に残存する、請求項６０に記載のハイスループット法。
【請求項６３】
請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、前記宿主細胞に導入されている、請求項６０に記載のハイスループット法。
【請求項６４】
前記宿主細胞を、前記誘導性プロモーターの発現を増加させることができる化合物と接触させるステップをさらに含む、請求項６３に記載のハイスループット法。
【請求項６５】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントをスクリーニングするための組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物であって、前記構築物がＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含み、前記マルチクローン部位が、
ａ）少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、ここで、各ｃＴＡＧが、
ｉ）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含み；ここで、前記検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内で固有のものである、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位
を含む、少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）；および
ｂ）１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分であって；
ｉ）ここで、前記別個のｃＴＡＧの各々が、前記１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分の各々の周囲の隣接した位置に分布する、１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分
を含み、
ここで、前記構築物が、さらに、
ｃ）タンパク質をコードする第１の核酸；
ｄ）ＤＮＡ標的部位に結合することができるガイドＲＮＡをコードする第２の核酸
を含む、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項６６】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントをスクリーニングするための組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物であって、前記構築物がＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含み、前記マルチクローン部位が、
ａ）少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、ここで、各ｃＴＡＧが、
ｉ）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含み；ここで、前記検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内で固有のものである、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位
を含む、少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）；および
ｂ）１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分であって；
ｉ）ここで、前記別個のｃＴＡＧの各々が、前記１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分の各々の周囲の隣接した位置に分布する、１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分
を含み、
ここで、前記構築物が、さらに、
ｃ）ＣＲＩＳＰＲ酵素、またはＣＲＩＳＰＲ機能性を有すると思われる酵素（「推定ＣＲＩＳＰＲ酵素」）をコードする第１の核酸；
ｄ）ＤＮＡ標的部位に結合することができるガイドＲＮＡをコードする第２の核酸
を含む、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項６７】
請求項６６に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を含む宿主細胞。
【請求項６８】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントをスクリーニングするハイスループット法であって、
ａ）請求項６６に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するステップであって；ここで、前記ガイドＲＮＡの前記ＤＮＡ標的部位が前記宿主細胞ゲノム内にある、導入するステップ；および
ｂ）前記ＤＮＡ標的部位で生じたＤＮＡ切断の程度を測定するステップ
を含む、ハイスループット法。
【請求項６９】
宿主細胞遺伝子の発現をモジュレートするか、前記宿主細胞のゲノムを操作するための組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物であって、前記構築物がＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含み、前記マルチクローン部位が、
ａ）少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、ここで、各ｃＴＡＧが、
ｉ）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含み；ここで、前記検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内で固有のものである、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位
を含む、少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）；および
ｂ）１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分であって；
ｉ）ここで、前記別個のｃＴＡＧの各々が、前記１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分の各々の周囲の隣接した位置に分布する、１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分
を含み、
ここで、前記１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分が、ＣＲＩＳＰＲ機能のモジュレーターをコードするＤＮＡを含む、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項７０】
ＣＲＩＳＰＲ機能のモジュレーターをコードする前記ＤＮＡを含む前記挿入部分が、選択マーカーをさらに含む、請求項６９に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項７１】
前記ＣＲＩＳＰＲ機能のモジュレーターが、複製起点、選択マーカー、対抗選択マーカー、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質、プロモーター、ターミネーター、ｄＣａｓ９タンパク質、ｄＣｐｆ１タンパク質、バーコード、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、ＤＮＡドナー、および多重化ゲノム編集を容易にするタンパク質からなる群から選択される、請求項７０に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項７２】
請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を含む宿主細胞。
【請求項７３】
前記宿主細胞が、触媒的に活性なＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸分子および前記触媒的に活性なＣＲＩＳＰＲ酵素をＤＮＡ標的部位に動員することができるガイドＲＮＡを含む、請求項７２に記載の宿主細胞。
【請求項７４】
前記宿主細胞が、触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸分子および前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をＤＮＡ標的部位に動員することができるガイドＲＮＡを含む、請求項７２に記載の宿主細胞。
【請求項７５】
前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、転写活性化タンパク質に翻訳的に融合されている、請求項７４に記載の宿主細胞。
【請求項７６】
前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、転写不活性化タンパク質に翻訳的に融合されている、請求項７４に記載の宿主細胞。
【請求項７７】
前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、転写リプレッサータンパク質に翻訳的に融合されている、請求項７４に記載の宿主細胞。
【請求項７８】
前記宿主細胞が、転写活性化タンパク質をコードする核酸分子であって、発現したときに、前記転写活性化タンパク質自体、前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合することができる前記核酸分子をさらに含む、請求項７４に記載の宿主細胞。
【請求項７９】
前記宿主細胞が、転写不活性化タンパク質をコードする核酸分子であって、発現したときに、前記転写不活性化タンパク質自体、前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合することができる前記核酸分子をさらに含む、請求項７４に記載の宿主細胞。
【請求項８０】
前記宿主細胞が、転写リプレッサータンパク質をコードする核酸分子であって、発現したときに、前記転写リプレッサータンパク質自体、前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合することができる前記核酸分子をさらに含む、請求項７４に記載の宿主細胞。
【請求項８１】
前記転写活性化タンパク質は、それ自体が、連結アプタマーを介するか、タンパク質間相互作用によって前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合する、請求項７８に記載の宿主細胞。
【請求項８２】
前記転写不活性化タンパク質は、それ自体が、連結アプタマーを介するか、タンパク質間相互作用によって前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合する、請求項７９に記載の宿主細胞。
【請求項８３】
前記転写リプレッサータンパク質は、それ自体が、連結アプタマーを介するか、タンパク質間相互作用によって前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合する、請求項８０に記載の宿主細胞。
【請求項８４】
前記ガイドＲＮＡが、アプタマー自体が転写活性化タンパク質に結合することができる前記アプタマーに作動可能に連結されている、請求項８１に記載の宿主細胞。
【請求項８５】
前記ガイドＲＮＡが、アプタマー自体が転写不活性化タンパク質に結合することができる前記アプタマーに作動可能に連結されている、請求項８２に記載の宿主細胞。
【請求項８６】
前記ガイドＲＮＡが、アプタマー自体が転写リプレッサータンパク質に結合することができる前記アプタマーに作動可能に連結されている、請求項８３に記載の宿主細胞。
【請求項８７】
前記転写活性化タンパク質が、ＶＰ１６、ＶＰ６４、およびＶＰ１６０、ＶＰＲからなる群から選択される、請求項７５、８１、および８４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項８８】
前記転写不活性化タンパク質が、Ｍｘｉ１、Ｔｂｘ３、ＫＲＡＢ、ＥｎＲ、およびＳＩＤからなる群から選択される、請求項７６、８２、および８５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項８９】
前記転写活性化タンパク質が、Ｍｘｉ１、Ｔｂｘ３、ＫＲＡＢ、ＥｎＲ、およびＳＩＤからなる群から選択される、請求項７７、８３、および８６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項９０】
前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が環状である、請求項６９に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項９１】
前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が線状である、請求項６９に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項９２】
前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、生物のゲノムに組み入れられている、請求項６９に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項９３】
前記別個のｃＴＡＧのうちの少なくとも１つが、少なくとも２つの検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、請求項６９に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項９４】
前記ＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのためのものである、請求項６９に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項９５】
前記ＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのためのものである、請求項６９に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項９６】
前記別個のｃＴＡＧのうちの少なくとも１つが、低頻度の（８塩基長以上の）制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、請求項６９に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項９７】
前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、変異したＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項７３に記載の宿主細胞。
【請求項９８】
前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、変異したＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、請求項７３に記載の宿主細胞。
【請求項９９】
前記宿主細胞が１つを超えるガイドＲＮＡを含む、請求項７３に記載の宿主細胞。
【請求項１００】
前記ガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つが、別のガイドＲＮＡと異なる配列を含む、請求項９９に記載の宿主細胞。
【請求項１０１】
前記ガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つが、別のガイドＲＮＡと異なるＤＮＡ標的部位配列を標的にする、請求項９９に記載の宿主細胞。
【請求項１０２】
前記宿主細胞が、１つを超える触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、請求項７４に記載の宿主細胞。
【請求項１０３】
前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素のうちの少なくとも１つが、前記構築物中にコードされる別の触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素と異なる配列を含む、請求項１０２に記載の宿主細胞。
【請求項１０４】
前記ｃＴＡＧのうちの１つまたは複数が、配列番号６５〜７４、７８〜８１、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６６に記載の挿入部分。
【請求項１０５】
１またはそれを超える宿主細胞遺伝子の発現をモジュレートするハイスループット法であって、請求項６６に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するステップを含み；ここで、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的部位が前記宿主細胞ゲノム内にある、ハイスループット法。
【請求項１０６】
前記組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物のうちの少なくとも１つの挿入部分が、前記宿主細胞のゲノムに組み入れられている、請求項１０５に記載のハイスループット法。
【請求項１０７】
前記挿入部分がＣＲＩＳＰＲタンパク質の機能を制御する、請求項１０５または１０６に記載のハイスループット法。
【請求項１０８】
前記挿入部分がガイドＲＮＡの発現を制御する、請求項１０５または１０６に記載のハイスループット法。
【請求項１０９】
前記組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、染色体外ＤＮＡとして前記宿主細胞中に残存する、請求項１０５または１０６に記載のハイスループット法。
【請求項１１０】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントをスクリーニングするための組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物であって、前記構築物がＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含み、前記マルチクローン部位が、
ａ）少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、ここで、各ｃＴＡＧが、
ｉ）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含み；ここで、前記検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内で固有のものである、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位
を含む、少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）；および
ｂ）１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分であって；
ｉ）ここで、前記別個のｃＴＡＧの各々が、前記１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分の各々の周囲の隣接した位置に分布する、１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分
を含み、
ここで、前記構築物が、さらに、
ｃ）ＣＲＩＳＰＲ酵素、またはＣＲＩＳＰＲ機能性を有すると思われる酵素（「推定ＣＲＩＳＰＲ酵素」）をコードする第１の核酸；および
ｄ）ＤＮＡ標的部位に結合することができるガイドＲＮＡをコードする第２の核酸
を含む、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
【請求項１１１】
宿主細胞におけるＣＲＩＳＰＲ活性をスクリーニングするハイスループット法であって、
ａ）請求項６５または６６に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を前記宿主細胞に導入するステップであって；ここで、ガイドＲＮＡの前記ＤＮＡ標的部位が前記宿主細胞ゲノム内にある、導入するステップ；および
ｂ）前記ＤＮＡ標的部位で生じたＤＮＡ切断の程度を測定するステップ
を含む、ハイスループット法。
【請求項１１２】
宿主細胞におけるＣＲＩＳＰＲｉ活性をスクリーニングするハイスループット法であって、
ａ）請求項６５または６６に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を前記宿主細胞に導入するステップであって；ここで、ガイドＲＮＡの前記ＤＮＡ標的部位が前記宿主細胞ゲノム内にある、導入するステップ；および
ｂ）前記ＤＮＡ標的部位で生じた転写モジュレーションの程度を測定するステップ
を含む、ハイスループット法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月１５日出願の米国特許仮出願第６２／７６４，６７２号の優先権の利益を主張し、この仮出願は、その全て（全ての説明、参考文献、図面、および特許請求の範囲が含まれる）が、すべての目的のために、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
政府の資金提供
本発明は、ＤＡＲＰＡによって授与された共同契約番号ＨＲ００１１−１５−９−００１４の政府支援を用いて実施した。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表に関する陳述
本出願に添付の配列表を、書面の代わりにテキスト形式で提供し、この配列表は、本明細書中で参考として援用される。配列表を含むテキストファイルのファイル名は、ＺＹＭＲ＿０３０＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは７９９ｋｂであり、２０１９年８月１４日に作成し、ＥＦＳ−Ｗｅｂから電子的に提出している。
【０００４】
分野
本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのガイドされた遺伝子配列編集のために使用されるシステム、方法、および組成物に関する。本開示は、とりわけ、ＤＮＡクローニングの改善、オリゴヌクレオチドのアセンブリ、および微生物の改善のためのガイドされた配列編集複合体を使用する方法を記載する。また、本開示は、変異体ＣＲＩＳＰＲ酵素を介した宿主細胞遺伝子の発現をモジュレートするハイスループット法を記載する。
【背景技術】
【０００５】
背景
生物学において関心が持たれている主な分野は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子配列の標的改変である。実際に、学術的および商業的な遺伝子研究における最も大きな障害のうちの１つは、新規の遺伝子構築物を生成することができるまたはその後に試験前に改変することができる速度である。
【０００６】
現在利用可能なクローニング技術は、制限部位の認識またはＤＮＡハイブリッド形成および増幅に依存しており、時間がかかり、信頼性が低く、その後の改変が困難であることが証明されている。クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）遺伝子編集システムの発見は、研究者にさらなる遺伝子改変手段を提供した。しかしながら、これらの新規のアプローチでさえ、ハイスループットモジュラークローニングに応用するには依然として実用的ではない。
【０００７】
例えば、研究者は、触媒的に活性であるか、不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素を使用することにより、標的にした遺伝子発現の抑制（ＣＲＩＳＰＲｉ）または活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）を首尾よく実施することが可能である。しかしながら、これらの技術は、依然として、ＣＲＩＳＰＲに適用するには技術的に限界があり、したがって、ハイスループットに適用するように最適化されていない。
【０００８】
ＣＲＩＳＰＲの編集位置は、例えば、しばしば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の位置に制限される。ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡのデザインおよび遺伝子ターゲティングは共に時間がかかる上に高価であり得、また、低効率となりやすく、オフターゲット変異を生じる可能性がある。
【０００９】
したがって、標的にした遺伝子配列の変更および遺伝子発現のモジュレーションのための組成物および方法を改善する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
開示の概要
いくつかの実施形態では、本開示は、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を利用したｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのハイスループットＤＮＡアセンブリ反応のための方法、組成物、およびキットを教示する。
【００１１】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、事前検証したＣＲＩＳＰＲプロトスペーサー／プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列組み合わせを含むクローニングタグセグメントに挟まれたモジュラー挿入ＤＮＡ部分を含むＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを用いたＤＮＡの消化を教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、タイプＩＩ−クラス２  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を用いたＤＮＡ消化を教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、タイプＶ−クラス２  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを用いたＤＮＡ消化を教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを用いたＤＮＡ消化を教示する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含む組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物であって、前記マルチクローン部位は、ａ）少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、ここで、各ｃＴＡＧが、ｉ）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含み；ここで、前記検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内で固有のものである、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）；およびｂ）１またはそれを超えるＤＮＡ挿入配列であって；ｉ）ここで、前記ｃＴＡＧの各々が、前記１またはそれを超えるＤＮＡ挿入配列の各々の周囲の隣接した位置に分布し；ｉｉ）ここで、前記ＤＮＡ挿入配列のうちの少なくとも１つが選択マーカーを含む、１またはそれを超えるＤＮＡ挿入配列を含む、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物は環状である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物は線状である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物は、生物のゲノムに組み入れられている。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、別個のｃＴＡＧのうちの少なくとも１つは、少なくとも２つの検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、ＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのためのものである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、ＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つは、ＲＮＡまたはＤＮＡにガイドされるヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ）のためのものである。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、別個のｃＴＡＧのうちの少なくとも１つは、低頻度の（８塩基長以上の）制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。
【００２０】
いくつかの態様では、本開示は、「メガモジュラー」構築物としての組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を指す。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を教示し、前記方法は、ａ）ｉ）複数のＤＮＡ挿入部分であって、ここで、各ＤＮＡ挿入部分が２つのクローニングタグ（ｃＴＡＧ）に挟まれており、各ｃＴＡＧが、１）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含む、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、複数のＤＮＡ挿入部分；ｉｉ）前記複数のＤＮＡ挿入部分のうちの少なくとも２つに存在する前記ｃＴＡＧのうちの少なくとも１つを標的にする１またはそれを超えるＣＲＩＳＰＲ複合体であって、各ＣＲＩＳＰＲ複合体が、１）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、および２）前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを前記標的にされたｃＴＡＧのうちの１つに動員することができるガイドＲＮＡまたは複数のガイドＲＮＡを含む、１またはそれを超えるＣＲＩＳＰＲ複合体を含む混合物を形成するステップであって、前記混合物を、前記複数のＤＮＡ挿入部分のうちの少なくとも２つにおいて標的にされたｃＴＡＧ（複数可）が消化可能な条件下でインキュベートして、突出している末端（overhanging  end）を生成する、形成するステップ、およびｂ）適合性の突出している末端のハイブリッド形成およびハイブリッド形成した末端の共有結合（covalent  joining）が可能な条件下にて、（ａ）で生成された消化産物をインキュベートするステップであって、ここで、得られた組換え核酸分子が、本方法でライゲーションされる元の挿入部分の完全なｃＴＡＧ配列を含む、インキュベートするステップを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を教示し、ここで、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼはＣｐｆ１である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を教示し、ここで、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡにガイドされたエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を教示し、ここで、前記方法は、ｉ）ライゲーション前に消化されたｃＴＡＧ配列をＣＲＩＳＰＲ複合体から分離するステップ、またはｉｉ）ライゲーション前にＣＲＩＳＰＲ複合体を不活化するステップを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を教示し、ここで、分離ステップはＤＮＡ精製ステップを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を教示し、ここで、不活化ステップは、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の熱不活化または化学的不活化を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を教示し、ここで、複数のＤＮＡ挿入部分のうちの各々のための２つのｃＴＡＧがｃＴＡＧ対を形成し、ここで、前記ｃＴＡＧ対が本方法でライゲーションされるＤＮＡ挿入部分の全ての他のｃＴＡＧ対と比較して固有のものである。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を教示し、ここで、各ｃＴＡＧ対中のｃＴＡＧのうちの少なくとも１つは、異なるｃＴＡＧ対中の少なくとも１つの他のｃＴＡＧと同一である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＮＡ配列の編集方法を教示し、前記方法は、ａ）反応物に、ｉ）本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物：ｉｉ）置換ＤＮＡ挿入部分であって、ここで、前記置換ＤＮＡ挿入部分が第１および第２の挿入ｃＴＡＧに挟まれ；１）ここで、前記第１の挿入ｃＴＡＧが、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物の別個のｃＴＡＧのうちの１つの検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位（複数可）を含み、前記第２の挿入ｃＴＡＧが、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物の別の別個のｃＴＡＧの検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位（複数可）を含む、置換ＤＮＡ挿入部分；ならびにｉｉｉ）それぞれ第１および第２の挿入ｃＴＡＧを標的にする第１および第２のＣＲＩＳＰＲ複合体であって、各ＣＲＩＳＰＲ複合体が、１）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、および２）前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを前記標的にされた挿入ｃＴＡＧのうちの１つに動員することができるガイドＲＮＡを含み；ここで、第１および第２のＣＲＩＳＰＲ複合体が第１および第２の挿入ｃＴＡＧおよびその対応する別個のｃＴＡＧを切断して、突出している末端を生成する、第１および第２のＣＲＩＳＰＲ複合体を導入するステップ、およびｂ）置換ＤＮＡ挿入部分およびモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を、生成された消化ｃＴＡＧと、（ａ）適合性の突出している末端のハイブリッド形成およびハイブリッド形成した末端の共有結合が可能な条件下でインキュベートするステップであって；ここで、得られた編集されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、本方法でライゲーションされる元の挿入部分の完全なｃＴＡＧ配列を含む、インキュベートするステップを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＮＡ配列の編集方法を教示し、ここで、前記ステップ（ｂ）の反応物は機能的リガーゼを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＮＡ配列の編集方法を教示し、前記方法は、ａ）反応物に、ｉ）本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物；ｉｉ）モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物中の２つの別個のｃＴＡＧを標的にする少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲ複合体であって、各ＣＲＩＳＰＲ複合体が、１）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、および２）前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを前記標的にされた別個のｃＴＡＧのうちの１つに動員することができるガイドＲＮＡを含む、少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲ複合体を導入するステップであって、ここで、前記第１および第２のＣＲＩＳＰＲ複合体が前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物中の２つの別個のｃＴＡＧを切断し、ここで、得られた別個のｃＴＡＧが突出末端（overhang  end）を含む、導入するステップ、およびｂ）第２の反応物に、ｉ）（ａ）で生成された消化ｃＴＡＧを有するモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物；およびｉｉ）置換ＤＮＡ挿入部分であって、ここで、前記置換ＤＮＡ挿入部分が第１および第２の挿入ｃＴＡＧに挟まれ；１）ここで、前記第１の挿入ｃＴＡＧが、（ａ）で切断された未消化の別個のｃＴＡＧのうちの１つのポリヌクレオチド配列を含み、前記第２の挿入ｃＴＡＧが、（ａ）で切断された別の未消化の別個のｃＴＡＧのポリヌクレオチド配列を含み；２）ここで、前記第１および第２の挿入ｃＴＡＧが、（ａ）由来の別個のｃＴＡＧの突出末端と適合する突出末端を含む、置換ＤＮＡ挿入部分を、適合性の突出している末端のハイブリッド形成およびハイブリッド形成した末端の共有結合が可能な条件下で導入するステップを含み；ここで、前記得られた編集されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、（ａ）で標的にされた元の未消化の別個のｃＴＡＧの完全な配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＮＡ配列の編集方法を教示し、ここで、前記ステップ（ｂ）の反応物は機能的リガーゼを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＮＡ配列の編集方法を教示し、ここで、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼはＣｐｆ１である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＮＡ配列の編集方法を教示し、ここで、ステップ（ａ）は、２つの切断された別個のｃＴＡＧを一本鎖エキソヌクレアーゼで消化し、それにより、突出末端を有する別個のｃＴＡＧが産生されるステップをさらに含む。いくつかの態様では、エキソヌクレアーゼステップの後にポリメラーゼ及びリガーゼを用いてジャンクションを修復するために、リガーゼおよびポリメラーゼを添加してもよい。いくつかの態様では、この反応を、Ｃａｓ９消化された平滑末端の切断物を使用して行うこともできる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＮＡ配列の編集方法を教示し、ここで、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含む組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を含む宿主細胞ゲノムを提供し、前記マルチクローン部位は、ａ）少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、ここで、各ｃＴＡＧは、ｉ）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含み；ここで、前記検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内で固有のものである、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）；およびｂ）１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分であって；ｉ）ここで、前記別個のｃＴＡＧの各々が、１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分の各々の周囲の隣接した位置に分布する、１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を提供し、前記方法は、ａ）ｉ）２つのクローニングタグ（ｃＴＡＧ）に挟まれた複数のＤＮＡ挿入部分であって、各ｃＴＡＧが、１）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含む、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位；および２）低頻度の（８塩基以上）制限酵素認識部位であって、ここで、少なくとも２つの挿入部分のうちのｃＴＡＧのうちの少なくとも１つが、同一の制限酵素部位を含む、低頻度の（８塩基以上）制限酵素認識部位を含む、２つのクローニングタグ（ｃＴＡＧ）に挟まれた複数のＤＮＡ挿入部分；ｉｉ）前記複数のＤＮＡ挿入部分のうちの少なくとも２つにおける前記低頻度の制限酵素部位を標的にする１またはそれを超える制限酵素を含む混合物を、前記複数のＤＮＡ挿入部分のうちの少なくとも２つにおける１またはそれを超える制限酵素による標的にされたｃＴＡＧの消化が可能な条件下でインキュベートして、消化されたＤＮＡ末端を有する挿入部分を生成するステップ；およびｂ）ＤＮＡ挿入部分（複数可）を、消化されたＤＮＡ末端の共有結合が可能な条件下にてステップ（ａ）で生成された消化されたＤＮＡ末端とインキュベートするステップを含み；ここで、前記得られた組換え核酸分子は、本方法で共有結合される元の挿入部分の完全なｃＴＡＧ配列を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＮＡ配列の編集方法を提供し、前記方法は、ａ）ｉ）請求項１に記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物であって、ここで、別個のｃＴＡＧのうちの少なくとも２つが低頻度の（８塩基以上）制限酵素認識部位を含む、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物；ｉｉ）置換ＤＮＡ挿入部分であって、ここで、前記置換ＤＮＡ挿入部分が第１および第２の挿入ｃＴＡＧに挟まれ；１）ここで、前記第１の挿入ｃＴＡＧが、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物の別個のｃＴＡＧのうちの１つの低頻度の制限酵素認識部位を含み、前記第２の挿入ｃＴＡＧが、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物の別の別個のｃＴＡＧの低頻度の制限酵素認識部位を含む、置換ＤＮＡ挿入部分；およびｉｉｉ）前記第１および第２の挿入ｃＴＡＧ中の低頻度の制限酵素部位を標的にする１またはそれを超える制限酵素を提供するステップであって；ここで、部分（ｉ）および（ｉｉ）を、単一または別個の反応で部分（ｉｉｉ）と各々インキュベートし；ここで１またはそれを超える制限酵素は、第１および第２の挿入ｃＴＡＧおよびその対応する別個のｃＴＡＧの低頻度の制限酵素認識部位を切断して、消化されたＤＮＡ末端を生成する、提供するステップ、およびｂ）置換ＤＮＡ挿入部分およびモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を、ステップ（ａ）で生成された消化されたＤＮＡ末端と、消化されたＤＮＡ末端の共有結合が可能な条件下でインキュベートするステップを含み；ここで、得られた編集されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物は、本方法で共有結合される元の挿入部分の完全なｃＴＡＧ配列を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を提供し、前記方法は、ａ）ｉ）複数のＤＮＡ挿入部分であって、ここで、各ＤＮＡ挿入部分が２つのクローニングタグ（ｃＴＡＧ）に挟まれており、各ｃＴＡＧが、１）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含む、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位を含み；ここで、前記ＤＮＡ挿入部分のうちの少なくとも２つが同一のｃＴＡＧを共有する、複数のＤＮＡ挿入部分；ｉｉ）一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）エキソヌクレアーゼを含む混合物を、前記少なくとも２つのＤＮＡ挿入部分中の共有ｃＴＡＧの消化が可能な条件下でインキュベートし、それにより、少なくとも２つのＤＮＡ挿入部分中に適合性の突出ＤＮＡ末端を生成するステップ、およびｂ）ＤＮＡ挿入部分を（ａ）で生成された消化されたｃＴＡＧと、前記少なくとも２つのＤＮＡ挿入部分の前記適合性の突出ＤＮＡ末端のハイブリッド形成および共有結合が可能な条件下でインキュベートするステップを含み；ここで、得られた組換え核酸分子は、消化前に共有ｃＴＡＧの完全なｃＴＡＧ配列を含む。この反応を、ジャンクションを固定するために使用されるポリメラーゼおよび／またはリガーゼを用いて行うこともできる。さらに、予め消化したベクターを用いてこれを行うことができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞遺伝子の発現をモジュレートするか、宿主細胞のゲノムを操作するための組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、前記構築物はＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含み、前記マルチクローン部位は、ａ）少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、各ｃＴＡＧが、ｉ）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含み；ここで、前記検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内で固有のものである、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）；およびｂ）１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分であって；ｉ）ここで、前記別個のｃＴＡＧの各々が、前記１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分の各々の周囲の隣接した位置に分布する、１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分を含み；ここで、１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分は、ＣＲＩＳＰＲ機能のモジュレーターのＤＮＡを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本開示の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物は、ＣＲＩＳＰＲ機能のモジュレーターをコードするＤＮＡを含み、選択マーカーをさらに含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、ＣＲＩＳＰＲ機能のモジュレーターは、複製起点、選択マーカー、対抗選択マーカー、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質、プロモーター、ターミネーター、ｄＣａｓタンパク質、ｄＣｐｆ１タンパク質、バーコード、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、ＤＮＡドナー、および多重化を容易にするタンパク質からなる群から選択される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書中に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を含む宿主細胞を教示する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞を教示し、ここで、前記宿主細胞は、触媒的に活性なＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸分子および触媒的に活性化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をＤＮＡ標的部位に動員することができるガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞を教示し、ここで、前記宿主細胞は、触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸分子および前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をＤＮＡ標的部位に動員することができるガイドＲＮＡを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞を教示し、ここで、触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、転写活性化タンパク質に融合されている。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞を教示し、ここで、前記宿主細胞は、転写活性化タンパク質をコードする核酸分子であって、発現したときに、前記転写活性化タンパク質自体、触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合することができる前記核酸分子をさらに含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞を教示し、ここで、転写活性化タンパク質は、それ自体が、連結アプタマーを介するか、タンパク質間相互作用によって触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞を教示し、ここで、ガイドＲＮＡは、アプタマー自体が転写活性化タンパク質に結合することができる前記アプタマーに作動可能に連結されている。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞を教示し、ここで、転写活性化タンパク質は、ＶＰ１６、ＶＰ６４、およびＶＰ１６０からなる群から選択される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物は環状である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物は線状である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物は、生物のゲノムに組み入れられている。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、別個のｃＴＡＧのうちの少なくとも１つは、少なくとも２つの検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、ＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのためのものである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、ＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つは、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのためのものである。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、別個のｃＴＡＧのうちの少なくとも１つは、低頻度の（８塩基長以上の）制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、変異したＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、変異したＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞を教示し、ここで、前記宿主細胞は、１つを超える核酸ガイドＲＮＡを含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞を教示し、ここで、ガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つは、別のガイドＲＮＡと異なる配列を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞を教示し、ここで、ガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つは、別のガイドＲＮＡと異なるＤＮＡ標的部位配列を標的にする。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞を教示し、ここで、前記宿主細胞は、１つを超える触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞を教示し、ここで、触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素のうちの少なくとも１つは、構築物中にコードされる別の触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素と異なる配列を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本開示は、挿入部分を教示し、ここで、ｃＴＡＧのうちの１つまたは複数は、配列番号６５〜７４、７８〜８１、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本開示は、１またはそれを超える宿主細胞遺伝子の発現をモジュレートするハイスループット法を教示し、前記方法は、本開示の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するステップを含み；ここで、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的部位は、宿主細胞ゲノムにある。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本開示は、１またはそれを超える宿主細胞遺伝子の発現をモジュレートするハイスループット法を教示し、ここで、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物のうちの少なくとも１つの挿入部分は、前記宿主細胞のゲノムに組み入れられている。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本開示は、１またはそれを超える宿主細胞遺伝子の発現をモジュレートするハイスループット法を教示し、ここで、挿入部分はＣＲＩＳＰＲタンパク質の機能を制御する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本開示は、１またはそれを超える宿主細胞遺伝子の発現をモジュレートするハイスループット法を教示し、ここで、挿入部分は、ｇＲＮＡの機能を制御する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本開示は、１またはそれを超える宿主細胞遺伝子の発現をモジュレートするハイスループット法を教示し、ここで、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物は、染色体外ＤＮＡとして宿主細胞中に残存する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントをスクリーニングするための組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、前記構築物は、ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含み、前記マルチクローン部位は、ａ）少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、ここで、各ｃＴＡＧは、ｉ）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含み；ここで、前記検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内で固有のものである、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）；およびｂ）１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分であって；ｉ）ここで、前記別個のｃＴＡＧの各々が、前記１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分の各々の周囲の隣接した位置に分布する、１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分を含み、ここで、前記構築物は、さらに、ｃ）ＣＲＩＳＰＲ酵素、またはＣＲＩＳＰＲ機能性を有すると思われる酵素（「推定ＣＲＩＳＰＲ酵素」）をコードする第１の核酸；およびｄ）ＤＮＡ標的部位に結合することができるガイドＲＮＡをコードする第２の核酸を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞におけるＣＲＩＳＰＲ活性をスクリーニングするハイスループット法を教示し、前記方法は、ａ）本開示の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を前記宿主細胞に導入するステップであって；ここで、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的部位が宿主細胞ゲノム内にある、導入するステップ；およびｂ）前記ＤＮＡ標的部位で生じたＤＮＡ切断の程度を測定するステップを含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞におけるＣＲＩＳＰＲｉ活性および／またはＣＲＩＳＰＲａ活性をスクリーニングするハイスループット法を教示し、前記方法は、ａ）本開示の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するステップであって；ここで、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的部位が宿主細胞ゲノム内にある、導入するステップ；およびｂ）前記ＤＮＡ標的部位で生じた転写モジュレーションの程度を測定するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１−１】図１Ａ〜Ｃは、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの比較を示す。図１Ａ−Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの複合体によって標的ｄｓＤＮＡに動員される。図１Ｂ−Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼも、シングル−ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として公知の人為的に融合されたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ配列によって標的ｄｓＤＮＡに動員され得る。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、平滑末端を産生する。図１Ｃ−Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのみは、ｃｒＲＮＡガイドポリ−リボヌクレオチドを必要とする。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼによる切断は、５’オーバーハングを有する二本鎖切断を生じさせる。
【図１−２】図１Ａ〜Ｃは、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの比較を示す。図１Ａ−Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの複合体によって標的ｄｓＤＮＡに動員される。図１Ｂ−Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼも、シングル−ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として公知の人為的に融合されたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ配列によって標的ｄｓＤＮＡに動員され得る。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、平滑末端を産生する。図１Ｃ−Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのみは、ｃｒＲＮＡガイドポリ−リボヌクレオチドを必要とする。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼによる切断は、５’オーバーハングを有する二本鎖切断を生じさせる。
【００７４】
【図２−１】図２Ａ〜Ｃは、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物を利用した本発明のクローニング法の実施形態を示す。図２Ａ−本開示に従ってＣａｓ９ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼを用いて容易に変更することができるモジュラーＣＲＩＳＰＲプラスミドの略図。前記ように、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物を、「メガモジュラー」構築物と称することができる。数字によって表された交換可能な部分は、文字によって表されたインバリアントｃＴＡＧ配列に挟まれている。部分は、予めアセンブリされていても、ｃＴＡＧ配列同一性に基づいてｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブリされても良い。例示的な挿入部分を、図２Ａの右側に示す。図２Ｂ−ｃＴＡＧでのＣａｓ９切断、Ｃｐｆ１切断、または制限エンドヌクレアーゼ切断などのいくつかのストラテジーを使用して、プラスミド全体の再アセンブリを必要とせずに個々の部分を置換することができる。ｃＴＡＧ配列は、１またはそれを超えるクローニング部位（Ｃａｓ９部位、Ｃｐｆ１部位、制限部位、および／または組換え部位が含まれるが、これらに限定されない）を含んでよい。図２Ｃ−生物のゲノムに組み入れられると、ｃＴＡＧは、事前検証したＣａｓ９またはＣｐｆ１ランディング部位としての役割を果たし続けることができ、それにより、事前検証した直交ｇＲＮＡ配列を用いてゲノムに組み入れられたＤＮＡを置換、挿入、または除去することができる。
【図２−２】図２Ａ〜Ｃは、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物を利用した本発明のクローニング法の実施形態を示す。図２Ａ−本開示に従ってＣａｓ９ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼを用いて容易に変更することができるモジュラーＣＲＩＳＰＲプラスミドの略図。前記ように、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物を、「メガモジュラー」構築物と称することができる。数字によって表された交換可能な部分は、文字によって表されたインバリアントｃＴＡＧ配列に挟まれている。部分は、予めアセンブリされていても、ｃＴＡＧ配列同一性に基づいてｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブリされても良い。例示的な挿入部分を、図２Ａの右側に示す。図２Ｂ−ｃＴＡＧでのＣａｓ９切断、Ｃｐｆ１切断、または制限エンドヌクレアーゼ切断などのいくつかのストラテジーを使用して、プラスミド全体の再アセンブリを必要とせずに個々の部分を置換することができる。ｃＴＡＧ配列は、１またはそれを超えるクローニング部位（Ｃａｓ９部位、Ｃｐｆ１部位、制限部位、および／または組換え部位が含まれるが、これらに限定されない）を含んでよい。図２Ｃ−生物のゲノムに組み入れられると、ｃＴＡＧは、事前検証したＣａｓ９またはＣｐｆ１ランディング部位としての役割を果たし続けることができ、それにより、事前検証した直交ｇＲＮＡ配列を用いてゲノムに組み入れられたＤＮＡを置換、挿入、または除去することができる。
【００７５】
【図３−１】図３Ａ〜Ｄは、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物を利用した本発明のクローニング法の実施形態を示す。図３Ａ−本開示に従ってＣａｓ９ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼを用いて容易に変更することができるモジュラーＣＲＩＳＰＲプラスミドの略図。数字によって表された交換可能な部分は、文字によって表されたインバリアントｃＴＡＧ配列に挟まれている。部分は、予めアセンブリされていても、ｃＴＡＧ配列同一性に基づいてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブリされても良い。例示的な挿入物を、図３Ａの右側に示す。図３Ｂ−ｃＴＡＧでのＣａｓ９切断、Ｃｐｆ１切断、または制限エンドヌクレアーゼ切断などのいくつかのストラテジーを使用して、プラスミド全体の再アセンブリを必要とせずに個々の部分を置換することができる。ｃＴＡＧ配列は、１またはそれを超えるクローニング部位（Ｃａｓ９部位、Ｃｐｆ１部位、制限部位、および／または組換え部位が含まれるが、これらに限定されない）を含んでよい。図３Ｃ−本開示の挿入部分を除去するか、既存のモジュラープラスミド由来のスタッファー配列を付加する方法を示す。図３Ｄ−本開示のモジュラープラスミドの挿入部分は、モジュラーＣＲＩＳＰＲベクターの一部または全部の宿主細胞のゲノムへの組み入れのための配列としての役割を果たし得る。
【図３−２】図３Ａ〜Ｄは、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物を利用した本発明のクローニング法の実施形態を示す。図３Ａ−本開示に従ってＣａｓ９ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼを用いて容易に変更することができるモジュラーＣＲＩＳＰＲプラスミドの略図。数字によって表された交換可能な部分は、文字によって表されたインバリアントｃＴＡＧ配列に挟まれている。部分は、予めアセンブリされていても、ｃＴＡＧ配列同一性に基づいてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブリされても良い。例示的な挿入物を、図３Ａの右側に示す。図３Ｂ−ｃＴＡＧでのＣａｓ９切断、Ｃｐｆ１切断、または制限エンドヌクレアーゼ切断などのいくつかのストラテジーを使用して、プラスミド全体の再アセンブリを必要とせずに個々の部分を置換することができる。ｃＴＡＧ配列は、１またはそれを超えるクローニング部位（Ｃａｓ９部位、Ｃｐｆ１部位、制限部位、および／または組換え部位が含まれるが、これらに限定されない）を含んでよい。図３Ｃ−本開示の挿入部分を除去するか、既存のモジュラープラスミド由来のスタッファー配列を付加する方法を示す。図３Ｄ−本開示のモジュラープラスミドの挿入部分は、モジュラーＣＲＩＳＰＲベクターの一部または全部の宿主細胞のゲノムへの組み入れのための配列としての役割を果たし得る。
【図３−３】図３Ａ〜Ｄは、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物を利用した本発明のクローニング法の実施形態を示す。図３Ａ−本開示に従ってＣａｓ９ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼを用いて容易に変更することができるモジュラーＣＲＩＳＰＲプラスミドの略図。数字によって表された交換可能な部分は、文字によって表されたインバリアントｃＴＡＧ配列に挟まれている。部分は、予めアセンブリされていても、ｃＴＡＧ配列同一性に基づいてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブリされても良い。例示的な挿入物を、図３Ａの右側に示す。図３Ｂ−ｃＴＡＧでのＣａｓ９切断、Ｃｐｆ１切断、または制限エンドヌクレアーゼ切断などのいくつかのストラテジーを使用して、プラスミド全体の再アセンブリを必要とせずに個々の部分を置換することができる。ｃＴＡＧ配列は、１またはそれを超えるクローニング部位（Ｃａｓ９部位、Ｃｐｆ１部位、制限部位、および／または組換え部位が含まれるが、これらに限定されない）を含んでよい。図３Ｃ−本開示の挿入部分を除去するか、既存のモジュラープラスミド由来のスタッファー配列を付加する方法を示す。図３Ｄ−本開示のモジュラープラスミドの挿入部分は、モジュラーＣＲＩＳＰＲベクターの一部または全部の宿主細胞のゲノムへの組み入れのための配列としての役割を果たし得る。
【図３−４】図３Ａ〜Ｄは、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物を利用した本発明のクローニング法の実施形態を示す。図３Ａ−本開示に従ってＣａｓ９ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼを用いて容易に変更することができるモジュラーＣＲＩＳＰＲプラスミドの略図。数字によって表された交換可能な部分は、文字によって表されたインバリアントｃＴＡＧ配列に挟まれている。部分は、予めアセンブリされていても、ｃＴＡＧ配列同一性に基づいてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブリされても良い。例示的な挿入物を、図３Ａの右側に示す。図３Ｂ−ｃＴＡＧでのＣａｓ９切断、Ｃｐｆ１切断、または制限エンドヌクレアーゼ切断などのいくつかのストラテジーを使用して、プラスミド全体の再アセンブリを必要とせずに個々の部分を置換することができる。ｃＴＡＧ配列は、１またはそれを超えるクローニング部位（Ｃａｓ９部位、Ｃｐｆ１部位、制限部位、および／または組換え部位が含まれるが、これらに限定されない）を含んでよい。図３Ｃ−本開示の挿入部分を除去するか、既存のモジュラープラスミド由来のスタッファー配列を付加する方法を示す。図３Ｄ−本開示のモジュラープラスミドの挿入部分は、モジュラーＣＲＩＳＰＲベクターの一部または全部の宿主細胞のゲノムへの組み入れのための配列としての役割を果たし得る。
【００７６】
【図４】図４は、実施例１のワンポットｉｎ  ｖｉｔｒｏモジュラーＣＲＩＳＰＲクローニングを示す。具体的には、ワンポット反応における一方のプラスミドから他方のプラスミドへの挿入物の移行によるプラスミド１３００１００９０８６の生成を示す。この反応の詳細を、実施例１に記載する。
【００７７】
【図５】図５は、実施例２のｉｎ  ｖｉｔｒｏモジュラーＣＲＩＳＰＲクローニング法の実施形態を示す。各パネルは、実施例２に記載の実験デザインの実例を提供する。クロラムフェニコール耐性遺伝子を、カナマイシン耐性バックボーンプラスミドにクローン化して、二重耐性プラスミドを作出した。次いで、二重耐性プラスミドを細菌に形質転換し、その後に抗生物質カナマイシンおよびクロラムフェニコールを増加させた培地中で培養した。耐性コロニーは、Ｃｐｆ１クローニングアセンブリが成功したことを示していた。
【００７８】
【図６】図６は、実施例２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  モジュラーＣＲＩＳＰＲクローニング法の結果を示す。ｙ軸は、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを増加させた培地中で回収された成長コロニー数を表す。耐性コロニーは、Ｃｐｆ１クローニングアセンブリの成功を示す。結果は、二重耐性プラスミドのリガーゼ依存性アセンブリを示す。
【００７９】
【図７】図７は、ｐＪＤＩ４２７のベクターマップを示す。Ｃｐｆ１アセンブリで使用したＣＲＩＳＰＲランディング部位に、ｃＴＡＧ  ＭおよびｃＴＡＧ  Ｎとラベリングしている。関連する配列情報を、配列番号１０２に見出すことができる。
【００８０】
【図８】図８は、ｐＪＤＩ４２９のベクターマップを示す。Ｃｐｆ１アセンブリで使用したＣＲＩＳＰＲランディング部位に、ｃＴＡＧ  ＮおよびｃＴＡＧ  Ｏとラベリングしている。関連する配列情報を、配列番号１０３に見出すことができる。
【００８１】
【図９】図９は、ｐＪＤＩ４３０のベクターマップを示す。Ｃｐｆ１アセンブリで使用したＣＲＩＳＰＲランディング部位に、ｃＴＡＧ  ＰおよびｃＴＡＧ  Ｎとラベリングしている。関連する配列情報を、配列番号１０４に見出すことができる。
【００８２】
【図１０】図１０は、ｐＪＤＩ４３１のベクターマップを示す。Ｃｐｆ１アセンブリで使用したＣＲＩＳＰＲランディング部位に、ｃＴＡＧ  ＰおよびｃＴＡＧ  Ｏとラベリングしている。関連する配列情報を、配列番号１０５に見出すことができる。
【００８３】
【図１１】図１１は、ｐＪＤＩ４３２のベクターマップを示す。Ｃｐｆ１アセンブリで使用したＣＲＩＳＰＲランディング部位に、ｃＴＡＧ  ＭおよびｃＴＡＧ  Ｎとラベリングしている。関連する配列情報を、配列番号１０６に見出すことができる。
【００８４】
【図１２】図１２は、ｐＪＤＩ４３４のベクターマップを示す。Ｃｐｆ１Ｃアセンブリで使用したＣＲＩＳＰＲランディング部位に、ｃＴＡＧ  ＮおよびｃＴＡＧ  Ｏとラベリングしている。関連する配列情報を、配列番号１０７に見出すことができる。
【００８５】
【図１３】図１３は、ｐＪＤＩ４３５のベクターマップを示す。Ｃｐｆ１アセンブリで使用したＣＲＩＳＰＲランディング部位に、ｃＴＡＧ  ＰおよびｃＴＡＧ  Ｎとラベリングしている。関連する配列情報を、配列番号１０８に見出すことができる。
【００８６】
【図１４】図１４は、ｐＪＤＩ４３６のベクターマップを示す。Ｃｐｆ１アセンブリで使用したＣＲＩＳＰＲランディング部位に、ｃＴＡＧ  ＰおよびｃＴＡＧ  Ｏとラベリングしている。関連する配列情報を、配列番号１０９に見出すことができる。
【００８７】
【図１５】図１５は、本開示の方法に従ったモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物の遺伝子編集の例を示す。具体的には、図１５は、実施例３のメガモジュラーデザインを使用した制限酵素消化およびライゲーションによるプラスミドアセンブリを示す。図１５は、モジュラーＣＲＩＳＰＲプラスミドバックボーンｐ１３００２８３３９１および適合性ＧＦＰ含有挿入ＤＮＡ部分を制限酵素ＡｐａＩおよびＰｖｕＩで各々消化して、適合性クローニングタグ末端を作出することを示す。消化されたバックボーンおよび挿入物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでライゲーションして、新規のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物を作出する。
【００８８】
【図１６】図１６は、ｄＣａｓ９のＤＮＡへのｇＲＮＡによる結合を示す略図である。
【００８９】
【図１７】図１７Ａ〜Ｂは、実施例５に記載のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＣＲＩＳＰＲｉテクノロジーの検証を示す。図１７Ａは、標的遺伝子の転写を不活化させるｄＣａｓ９発現ベクターの略図である。図１７Ｂは、ＷＴ菌株またはパプリカ産生菌株で発現された種々のガイドＲＮＡを使用して併せて発現されたｄＣａｓ９を使用した遺伝子転写の抑制を示す。７つの生物学的反復物についてのゲーティングした生細胞の蛍光の中央値を示す。
【００９０】
【図１８】図１８Ａ〜Ｂは、ＣＲＩＳＰＲｉ／ＣＲＩＳＰＲａライブラリーの潜在性を示す。図１８Ａは、単一のプロモーターを標的にするＣＲＩＳＰＲｉ／ＣＲＩＳＰＲａライブラリーを示す。図１８Ｂは、ゲノム全体で複数のプロモーターを標的にするＣＲＩＳＰＲｉ／ＣＲＩＳＰＲａライブラリーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
詳細な説明
定義
以下の用語は当業者に十分に理解されていると考えられるが、ここに開示した主題の説明を容易にするために、以下に定義を記載する。
【００９２】
用語「ａ」または「ａｎ」は、その実体の１つまたはそれより多くを指し、すなわち、複数の参照対照を指すことができる。そのようなものとして、用語「ａ」または「ａｎ」、「１またはそれを超える」および「少なくとも１つの」は、本明細書中で互換的に使用される。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」で修飾された「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」という言及は、１つまたはたった１つのエレメントが存在することが文脈上明確に必要でない限り、１つを超えるエレメントが存在する可能性を排除しない。
【００９３】
用語「原核生物」は当該分野で認識されており、核を含まない生物を指す。原核生物は、一般に、２つのドメイン（細菌および古細菌）のうちの１つに分類される。古細菌ドメインと細菌ドメインとの決定的な相違は、１６ＳリボゾームＲＮＡ中のヌクレオチド塩基配列の根本的相違に基づく。
【００９４】
「真核生物」は、その細胞が膜内に封入された状態の核および他のオルガネラを含む任意の生物である。真核生物は、分類群ユーカリアまたはユーカリオタに属する。真核細胞を原核細胞（前記細菌および古細菌）と区別する決定的な特徴は、真核細胞が膜結合オルガネラ、特に、遺伝子材料を含み、核膜に囲い込まれた核を有するという点である。
【００９５】
用語「古細菌」は、メンドシクテス門に分類される生物を指し、典型的には特異な環境下で見出され、いくつかの判定基準（リボゾームタンパク質数および細胞壁中のムラミン酸の欠如が含まれる）によって残りの原核生物と区別される。ｓｓｒＲＮＡ分析に基づいて、古細菌は、以下の２つの系統学的に別個の群からなる：クレンアーケオタおよびユリアーケオタ。これらの生理学に基づいて、古細菌を、以下の３つのタイプに整理することができる：メタン生成菌（メタンを産生する原核生物）；高度好塩菌（非常に高い塩（ＮａＣｌ）濃度で生存する原核生物）；および高度（超）好熱菌（非常に高い温度で生存する原核生物）。細菌と区別する古細菌の統一的な特徴（すなわち、細胞壁中にムレインを含まないこと、エステル結合膜脂質など）に加えて、これらの原核生物は、その特定の生息地に適合する固有の構造的性質または生化学的性質を示す。クレンアーケオタは、主に超好熱性硫黄依存性原核生物からなり、ユリアーケオタは、メタン生成菌および高度好塩菌を含む。
【００９６】
「細菌」または「真正細菌」は、原核生物のドメインを指す。細菌は、以下の少なくとも１１の別個の群を含む：（１）グラム陽性（グラム＋）細菌であって、以下の２つの主な亜門が存在する：（１）高Ｇ＋Ｃ群（放線菌類、マイコバクテリア、小球菌など）（２）低Ｇ＋Ｃ群（バチルス、クロストリジウム、ラクトバチルス、ブドウ球菌、レンサ球菌、マイコプラズマ類）；（２）プロテオバクテリア、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性菌（ほとんどの「一般的な」グラム陰性菌が含まれる）；（３）藍色細菌、例えば、酸素放出型光合成生物；（４）スピロヘータおよび関連する種；（５）プランクトミセス；（６）バクテロイデス、フラボバクテリウム；（７）クラミジア；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光合成生物も含まれる）；（１０）放射線抵抗性小球菌および関連菌；（１１）サーモトガおよびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ。
【００９７】
用語「遺伝子改変された宿主細胞」、「組換え宿主細胞」、および「組換え菌株」は、本明細書中で互換的に使用され、これらの用語は、本開示のクローニング法および形質転換法によって遺伝子改変されている宿主細胞を指す。したがって、これらの用語には、元となる天然に存在する微生物と比較して、遺伝子型および／または表現型が変化するか、改変されるか、異なる（例えば、遺伝子改変が微生物のコード核酸配列に影響を及ぼす場合）ように遺伝子が変更、改変、または操作されている宿主細胞（例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞、ＣＨＯ、ヒト細胞など）が含まれる。これらの用語が、問題の特定の組換え微生物だけでなく、かかる微生物の子孫または潜在的子孫も指すと理解される。
【００９８】
用語「遺伝子操作された」は、（例えば、核酸の挿入または欠失による）宿主細胞のゲノムの任意の操作を指してもよい。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、「選択マーカー」は、多くは特定の条件下で分子（例えば、レプリコン）または分子を含む細胞を選択することが可能な核酸セグメントである。これらのマーカーは、活性（ＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質の産生などであるが、これらに限定されない）をコードすることができるか、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機化合物および有機化合物、または組成物などの結合部位を提供することができる。選択マーカーの例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：（１）本来ならば有毒な化合物（例えば、抗生物質）に対する耐性を提供する産物をコードする核酸セグメント；（２）本来ならばレシピエント細胞中で欠如している産物（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）をコードする核酸セグメント；（３）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする核酸セグメント；（４）容易に同定することができる産物（例えば、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および細胞表面タンパク質などの表現型マーカー）をコードする核酸セグメント；（５）本来ならば細胞の生存および／または機能に有害な他の産物に結合する産物をコードする核酸セグメント；（６）見ることができるか選択可能な表現型を生じる、本来ならば任意の核酸セグメントの活性を阻害する核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）をコードする核酸セグメント；（７）基質を改変する他の産物に結合する産物（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）をコードする核酸セグメント；（８）所望の分子（例えば、特異的タンパク質結合部位）を単離するか同定するために使用することができる核酸セグメント；（９）本来ならば非機能性であり得る特異的ヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント（例えば、分子亜集団のＰＣＲ増幅用）；および（１０）存在しない場合に特定の化合物に耐性または感受性を直接または間接的に付与する核酸セグメント。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、「対抗選択マーカー（counterselectable  marker）」または「対抗選択マーカー（counterselection  marker）」は、選択の際に宿主生物を排除するか、その成長を阻害する核酸セグメントである。いくつかの実施形態では、本開示の対抗選択マーカーは、細胞を、１またはそれを超える化学物質／成長条件／遺伝的背景に対して感受性にする。いくつかの実施形態では、本開示の対抗選択マーカーは毒性遺伝子である。いくつかの実施形態では、対抗選択マーカーは、誘導性プロモーターによって発現される。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」は、多量体形態の任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）、またはそのアナログを指す。この用語は、分子の一次構造を指し、そのため、二本鎖および一本鎖のＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖のＲＮＡが含まれる。また、この用語は、改変された核酸（メチル化および／またはキャッピングされた核酸、改変された塩基、バックボーン改変などを含む核酸など）が含まれる。用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用される。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連するＤＮＡの任意のセグメントを指す。したがって、遺伝子には、その発現に必要なコード配列および／または制御配列が含まれるが、これらに限定されない。また、遺伝子には、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントが含まれ得る。遺伝子を、種々の供給源から得ることができるか（目的の供給源からのクローニングまたは既知もしくは推定される配列情報からの合成が含まれる）、所望のパラメーターを有するようにデザインされた配列を含んでもよい。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、用語「相同性の」または「ホモログ」または「オルソログ」は、当該分野で公知であり、共通の祖先またはファミリーメンバーを共有し、配列同一度に基づいて決定される関連配列を指す。用語「相同性」、「相同性の」、「実質的に類似の」、および「実質的に対応する」は、本明細書中で互換的に使用される。これらの用語は、核酸断片であって、１またはそれを超えるヌクレオチド塩基が変化しても、前記核酸断片が、遺伝子発現を媒介するか、ある特定の表現型を産生する能力に影響を及ぼさない核酸断片を指す。また、これらの用語は、最初の未改変の断片と比較して、得られた核酸断片の機能特性を実質的に変更させない１またはそれを超えるヌクレオチドの欠失または挿入などの本開示の核酸断片の改変を指す。したがって、当業者が認識するように、本開示が特定の例示的配列を超える配列を包含すると理解される。これらの用語は、一方の種、亜種、変種、培養変種、または菌株で見出される遺伝子と、別の種、亜種、変種、培養変種、または菌株における対応するか等価な遺伝子との間の関係を説明している。この開示の目的のために、相同配列を比較する。「相同配列」または「ホモログ」または「オルソログ」は、機能的に関連すると思われるか、考えられるか、知られている。機能的な関係を、いくつかの方法のうちのいずれか１つで示すことができ、これらの方法には、以下が含まれるが、これらに限定されない：（ａ）配列同一度および／または（ｂ）同一または類似の生物学的機能。好ましくは、（ａ）および（ｂ）の両方を示す。相同性を、当該分野で容易に入手可能なソフトウェアプログラム（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７１８，Ｔａｂｌｅ  ７．７１で考察されたものなど）を使用して決定することができる。いくつかのアラインメントプログラムは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．）、ＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、およびＡｌｉｇｎＸ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを使用したＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）である。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチドの変化」は、例えば、当該分野で十分に理解されているヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入を指す。例えば、変異は、サイレントな置換、付加、または欠失を生じるが、コードされるタンパク質の性質もしくは活性またはタンパク質の作製方法を変更しない変更を含む。
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質改変」は、当該分野で十分に理解されている例えば、アミノ酸置換、アミノ酸の改変、欠失、および／または挿入を指す。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、核酸またはポリペプチドの「少なくとも一部」または「断片」という用語は、かかる配列の特徴を示す最小サイズの部分、または全長分子の任意のより大きな断片（全長分子またはそれ未満の断片）を意味する。本開示のポリヌクレオチドの断片は、遺伝子制御エレメントの生物学的に活性な一部をコードし得る。遺伝子制御エレメントの生物学的に活性な一部を、本明細書中に記載のように遺伝子制御エレメントを含む本開示のポリヌクレオチドのうちの１つの一部を単離し、活性を評価することによって調製することができる。同様に、ポリペプチドの一部は、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸などから全長ポリペプチドまでであってよい。使用すべき一部の長さは、特定の用途に依存する。ハイブリッド形成プローブとして有用な核酸の一部は、１２ヌクレオチドほどの短さであってよく；いくつかの実施形態では、２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの一部は、４アミノ酸ほどの短さであってよい。全長ポリペプチドの機能を果たすポリペプチドの一部は、一般に、４アミノ酸より長い。
【０１０７】
本明細書中に開示のポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために、オリゴヌクレオチドプライマーを、ｃＤＮＡまたは目的の任意の生物から抽出したゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応で用いるためにデザインすることができる。ＰＣＲプライマーのデザイン方法およびＰＣＲクローニング法は、一般に、当該分野で公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に開示されている。Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９５）ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＩｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９９）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）も参照のこと。公知のＰＣＲ法には、対合プライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、および部分ミスマッチプライマーなどを使用した方法が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
本明細書中で使用される用語「プライマー」は、増幅標的にアニーリングしてＤＮＡポリメラーゼを結合させ、それにより、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの重合のための作用物質（agent  for  polymerization）の存在ならびに適切な温度およびｐＨ）におかれた場合にＤＮＡ合成開始点としての機能を果たすことができるオリゴヌクレオチドを指す。（増幅）プライマーは、好ましくは、増幅効率を最大にするために一本鎖である。好ましくは、プラマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合のための作用物質の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、多数の要因（温度およびプライマーの組成（Ａ／Ｔ含量対Ｇ／Ｃ含量）が含まれる）に依存する。双方向プライマーの対は、ＰＣＲ増幅などのＤＮＡ増幅分野で一般に使用される１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマーからなる。
【０１０９】
用語「ストリンジェンシー」または「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」は、ハイブリッドの安定性に影響を及ぼすハイブリッド形成条件（例えば、温度、塩濃度、ｐＨ、およびホルムアミド濃度など）を指す。これらの条件は、プライマーまたはプローブのその標的核酸配列への特異的結合を最大にし、かつ非特異的結合を最小にするように経験的に最適化される。使用される用語は、プローブまたはプライマーが、他の配列よりも検出可能に大きな程度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）に、その標的配列にハイブリッド形成すると考えられる条件の言及を含む。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、環境によって異なる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリッド形成する。一般に、ストリンジェントな条件は、確定したイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔｍは、５０％の相補標的配列が完全に適合したプローブまたはプライマーにハイブリッド形成する（確定したイオン強度およびｐＨ下での）温度である。典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０Ｍ  Ｎａ＋イオン未満、典型的には、約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａ＋イオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、長いプローブまたはプライマー（例えば、５０ヌクレオチド超）については少なくとも約６０℃である条件である。ホルムアミドなどの不安定化剤を添加してストリンジェントな条件を得てもよい。例示的な低ストリンジェントな条件または「ストリンジェンシーが低下した条件」には、３０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液を用いた３７℃でのハイブリッド形成および４０℃での２×ＳＳＣを用いた洗浄が含まれる。例示的な高ストリンジェンシー条件には、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳを用いた３７℃でのハイブリッド形成および０．１×ＳＳＣを用いた６０℃での洗浄が含まれる。ハイブリッド形成手技は当該分野で周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１に記載されている。いくつかの実施形態では、ストリンジェントな条件は、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．５〜２０％（０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％など）のドデシル硫酸ナトリウムを含む０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ  ７．２）を用いた４５℃でのハイブリッド形成、その後の０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを含む５×ＳＳＣを用いた５５℃〜６５℃での洗浄である。
【０１１０】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に同一の」は、ヌクレオチドの変動が１、２、３、４、５、６、または７個以下の２つのポリヌクレオチド配列を指す。ｃＴＡＧの文脈で使用される場合、実質的に同一のという用語は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲランディング部位中のＣＲＩＳＰＲ切断を抑制するようにデザインされたｃＴＡＧのうちの１つのＰＡＭ領域またはプロトスペーサー領域の変異を除いて、同一と考えられる２つのｃＴＡＧを示す。実質的に同一のという用語を用語「部分的な」配列またはｃＴＡＧと併せて使用する場合、この組み合わせは、一方のｃＴＡＧがＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼによって消化されている上記の２つの実質的に同一のｃＴＡＧの間の比較を指す。したがって、この用語は、ＰＡＭ領域またはプロトスペーサー領域の変異を除いて、記載のｃＴＡＧが第２のｃＴＡＧ（未消化形態）と同一であることを示すために使用される。
【０１１１】
本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を調節することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、近位エレメントおよびより遠位のエレメントからなってよく、後者のエレメントを、しばしば、エンハンサーと称する。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの生来のエレメントまたはプロモーターの組織特異性レベルを増強するために挿入された異種エレメントであってよい。
【０１１２】
本明細書中で使用される場合、用語「異種」は、特定の生物中に天然に見出されない核酸配列を指す。
【０１１３】
本明細書中で使用される場合、用語「内因性」、「内因性遺伝子」は、天然に存在する遺伝子コピーを指す。
【０１１４】
本明細書中で使用される場合、用語「天然に存在する」は、天然に存在する供給源に由来する遺伝子または配列を指す。いくつかの実施形態では、天然に存在する遺伝子は、供給源の生物内にその内因性の環境で存在していようと、異なる生物中に導入されるときの「異種」の環境に置かれる場合であろうとそれとは無関係に、野生型遺伝子（非導入遺伝子）を指す。したがって、本開示のために、「天然に存在しない」配列は、公知の天然配列と異なる配列を有するように合成されているか、変異されているか、そうでなければ改変されている配列である。いくつかの実施形態では、改変は、タンパク質レベルでの改変であってよい（例えば、アミノ酸置換）。他の実施形態では、改変は、タンパク質配列にいかなる影響を及ぼすことのないＤＮＡレベルでの改変（例えば、コドン最適化）であってよい。いくつかの実施形態では、天然に存在しない配列は、構築物であってよい。
【０１１５】
本明細書中で使用される場合、用語「外因性」は、用語「異種」と互換的に使用され、天然供給源以外のいくつかの供給源に由来する物質を指す。例えば、用語「外因性タンパク質」または「外因性遺伝子」は、非天然の供給源または位置に由来し、生物システムに人為的に供給されているタンパク質または遺伝子を指す。内因性遺伝子の人為的に変異したバリアントは、本開示の目的のために「外因性」とみなされる。
【０１１６】
本明細書中で使用される場合、句「組換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、および「組換えＤＮＡ構築物」は、本明細書中で互換的に使用される。組換え構築物は、核酸断片の人為的組み合わせ（例えば、自然界では一緒には見出されない制御配列およびコート配列）を含む。例えば、キメラ構築物は、異なる供給源由来の制御配列およびコード配列、または同一の供給源に由来するが、天然に見出される様式とは異なる様式で配置された制御配列およびコード配列を含んでよい。かかる構築物自体を使用しても、ベクターと併せて使用してもよい。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、当業者に周知のように、宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は、本開示の単離した核酸断片のうちのいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換し、選択し、増殖させるために、ベクター上に存在しなければならない遺伝子エレメントに精通している。また、当業者は、異なる非依存性の形質転換事象によって異なるレベルおよびパターンの発現が得られ（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１−２４１８；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８−８６）、したがって、所望の発現レベルおよび発現パターンを示す系統を得るために、複数の事象をスクリーニングしなければならないことを認識する。かかるスクリーニングを、とりわけ、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現の免疫ブロッティング分析、または表現型分析によって行うことができる。ベクターは、自律複製するか、宿主細胞の染色体に組み入れることができるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、および人為染色体などであり得る。また、ベクターは、自己複製しない裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同一ストランド内にＤＮＡおよびＲＮＡから構成されるポリヌクレオチド、ポリ−リジンコンジュゲートＤＮＡもしくはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはリポソームコンジュゲートＤＮＡなどであり得る。本明細書中で使用される場合、用語「発現」は、機能的な最終生成物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆体または成熟））の産生を指す。
【０１１７】
用語「作動可能に連結された」は、本文脈では、本開示によるプロモーターポリヌクレオチドの、さらなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、前記さらなるポリヌクレオチドが転写される連続的配置を意味する。いくつかの実施形態では、本開示のプロモーター配列は、遺伝子の５’ＵＴＲ、すなわち読み取り枠の直前に挿入される。他の実施形態では、本開示の作動可能に連結されたプロモーター配列および遺伝子配列は、１またはそれを超えるリンカーヌクレオチドによって分離されている。ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（（ＰＡＭ）の文脈での用語「作動可能に連結された」は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ複合体によって高効率で切断され得る近位に配置されたプロトスペーサー／ＰＡＭ組み合わせ配列を指す。ガイドＲＮＡ／アプタマーの文脈での用語「作動可能に連結された」は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に動員する一方で、また、そのアプタマー配列を介して第２のエフェクターペプチドを動員することができる（例えば、アプタマーによって標的にされた転写活性化ドメインを動員することができる）ガイドＲＮＡを指す。ターミネーター配列の文脈での用語「作動可能に連結された」は、上流配列の転写を終了させるためのターミネーター配列の配置を意味する。いくつかの実施形態では、ターミネーター配列は、遺伝子またはオペロンの末端に配置される。
【０１１８】
用語「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」は、標的ＤＮＡ配列とのハイブリッド形成およびＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの動員を担うＲＮＡ鎖を指す。ｃｒＲＮＡは、天然に存在しても、任意の公知のＲＮＡ産生方法にしたがって合成されてもよい。
【０１１９】
用語「ガイド配列」または「スペーサー」は、標的ＤＮＡとのハイブリッド形成を担うｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の一部を指す。
【０１２０】
用語「プロトスペーサー」は、ｃｒＲＮＡまたはガイド鎖によって標的とされるＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、プロトスペーサー配列は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のｃｒＲＮＡガイド配列とハイブリッド形成する。
【０１２１】
用語「シード領域」は、ＤＮＡ配列ＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質複合体の間の最初の複合体形成を担うリボ核酸配列を指す。シード領域と標的ＤＮＡ配列との間のミスマッチは、ｃｒＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ配列の残部よりも標的部位の認識および切断に大きな影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡのシード領域中の単一のミスマッチは、ＣＲＩＳＰＲ複合体をその結合部位で不活化させることができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのシード領域は、ＰＡＭに隣接するプロトスペーサー標的配列の一部に対応する（ハイブリッド形成する）最後の約１２ｎｔのガイド配列の３’の一部に沿って配置されている。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのシード領域は、ＰＡＭに隣接するプロトスペーサー標的配列の一部に対応する（ハイブリッド形成する）最初の約５ｎｔの５’部分の一部に沿って配置されている。
【０１２２】
用語「標的部位」は、ＣＲＩＳＰＲの文脈において、ガイドＲＮＡ（例えば、シングル−ガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡ）がＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（活性、または他の種類）をＤＮＡの一部に動員することができるようにガイドＲＮＡがその対応するシード領域と複合体形成する遺伝子座を意味する。
【０１２３】
用語「ｔｒａｃｒＲＮＡ」は、トランスにコード化された低分子ＲＮＡを指す。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡと相補的であり、ｃｒＲＮＡと塩基対合してｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを形成し、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを標的配列に動員させることができる。
【０１２４】
本明細書中で使用される用語「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを標的配列に動員することができるＲＮＡ配列または配列の組み合わせを指す。したがって、本明細書中で使用される場合、ガイドＲＮＡは、天然または合成のｃｒＲＮＡ（例えば、Ｃｐｆ１用）、天然または合成のｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（例えば、Ｃａｓ９用）、またはシングル−ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。したがって、ガイドＲＮＡの発現またはこれをコードするヌクレオチドを列挙している請求項は、シングル−ガイドＲＮＡ配列、ｃｒＲＮＡ、および／または別個の分子としてのｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの両方の発現／コードを指すことができる。
【０１２５】
本明細書中で使用される用語「ＣＲＩＳＰＲランディング部位」は、ＣＲＩＳＰＲ複合体が標的にすることができるＤＮＡ配列を指す。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲランディング部位は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ複合体が切断することができる近位に配置されたプロトスペーサー／プロトスペーサー隣接モチーフ組み合わせ配列を含む。用語「検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位」は、前記配列の高効率の切断を誘導することができるガイドＲＮＡが存在するＣＲＩＳＰＲランディング部位を指す。したがって、検証済みのという用語は、配列がＣＲＩＳＰＲ複合体によって切断可能であることが以前に示されていることを意味すると解釈されるべきである。各々の「検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位」は、定義上は、検証に関連する試験されたガイドＲＮＡの存在を確認する。用語「検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位」は、高効率かつ信頼できるＤＮＡ切断標的としての機能を果たすことを明確な目的として、ランディング部位が人為的にデザインされ、ＤＮＡ配列に付加されることを意味するとさらに理解されるべきである。したがって、本開示の「検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位」は、既存のプラスミド中の、ＣＲＩＳＰＲターゲティング部位として最初にデザインされていなかったが、プラスミドのカスタムＣＲＩＳＰＲ複合体ターゲティング領域の作出によってその後に切断される配列を除外する。
【０１２６】
用語「付着末端（複数可）」は、配列突出（sequence  overhang）を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子の末端を指す。いくつかの実施形態では、付着末端は、５’または３’配列突出を有するｄｓＤＮＡ分子の末端であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の付着末端は、同一分子または他の分子の適合性付着末端とハイブリッド形成することができる。したがって、１つの実施形態では、第１のＤＮＡ断片の３’上の付着末端は、第２のＤＮＡ断片上の適合性付着末端とハイブリッド形成してもよい。いくつかの実施形態では、これらのハイブリッド形成した付着末端を、リガーゼによって繋ぎ合わせることができる。他の実施形態では、付着末端は、ライゲーション前にｄｓＤＮＡ分子を完成するためにオーバーハングの伸長を必要とする可能性がある。用語「遺伝子スカー（複数可）」は、ＤＮＡ操作法によって核酸配列に導入された任意の望ましくない配列を指す。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、制限酵素結合部位、クローニングに適応するための配列アダプターまたはスペーサー、ＴＡ−部位、ＮＨＥＪ由来のスカー残存物などの遺伝子スカー（genetic  scar）を教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、スカーレスクローニング法および遺伝子編集法を教示する。
【０１２７】
本明細書中で使用される場合、用語「標的にされた」は、一方の物質または分子が他方の物質または分子と、標的にされない物質または分子が排除されるような特異度で相互作用する見込みを指す。例えば、本開示にしたがって第２のポリヌクレオチドを標的にする第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドと、配列特異的様式で（例えば、ワトソン・クリック塩基対合を介して）ハイブリッド形成するようにデザインされている。いくつかの実施形態では、選択されたハイブリッド形成領域は、ハイブリッド形成が１またはそれを超える標的にされた領域に固有のものとなるようにデザインされる。第２のポリヌクレオチドは、そのターゲティング配列（ハイブリッド形成領域）が変異する場合、または、そうでなければ第２のポリヌクレオチドから除去／分離される場合に、第１のターゲティングポリヌクレオチドの標的でなくなり得る。
【０１２８】
本開示は、「メガモジュラー」構築物またはデザインとして教示および記載したユニバーサルモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物またはデザインを指す。
【０１２９】
ＤＮＡヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＮＡヌクレアーゼを利用した遺伝子編集／クローニングのための方法および組成物を教示する。ＣＲＩＳＰＲ複合体、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、およびＦｏｋＩ制限酵素は、遺伝子編集ツールとして使用されている配列特異的ヌクレアーゼのうちの一部である。これらの酵素は、そのヌクレアーゼ活性が、目的の配列を認識するように操作されたガイド領域との相互作用によって所望の標的遺伝子座を標的にすることができる。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集法を教示する。
【０１３０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＲＩＳＰＲベースの編集の原理は、天然の細胞ＤＮＡ修復システムに大いに依拠する。ヌクレアーゼによって導入された二本鎖ｄｓＤＮＡ切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）もしくは相同組換え修復（ＨＤＲ）、または一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、またはマイクロホモロジー末端結合（ＭＭＥＪ）のいずれかによって修復される。
【０１３１】
ＨＤＲは、標的にされたＤＮＡ切断部位の周囲の領域に相同な配列を含む鋳型ＤＮＡに依拠する。細胞修復タンパク質は、外因性に供給されたＤＮＡ配列または内因性ＤＮＡ配列と、ｄｓＤＮＡ切断を修復するためのＤＮＡ切断周囲の部位との間の相同性を使用し、切断部を鋳型ＤＮＡ上の配列で置き換える。しかしながら、鋳型ＤＮＡの組み入れに失敗すると、ＮＨＥＪ、ＭＭＥＪ、またはＳＳＡを生じ得る。ＮＨＥＪ、ＭＭＥＪ、およびＳＳＡは、標的部位でのヌクレオチドの挿入または欠失（インデル）を伴うことが多い誤りがちな過程であり、それにより、フレームシフト変異または未熟な終止コドンの挿入によってゲノムの標的にされた領域の遺伝子ノックアウト（サイレンシング）が生じる。また、Ｃｐｆ１媒介編集は、エンドヌクレアーゼによって作出され、その後にライゲーションされるオーバーハングの従来のハイブリッド形成を介して機能することができる。
【０１３２】
また、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、本開示の以後の節で考察するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ操作に有用である。
【０１３３】
ＣＲＩＳＰＲシステム
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）およびＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）エンドヌクレアーゼは、本来、ウイルスおよびプラスミドの侵入から防御するための、細菌および古細菌が進化させた適応免疫系として発見された。細菌における天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、１またはそれを超えるＣａｓ遺伝子および１またはそれを超えるＣＲＩＳＰＲアレイ（以前に遭遇したウイルスおよびプラスミドから獲得したゲノムターゲティング配列（スペーサーと呼ばれる）によって分離された塩基配列の短い回文配列リピートからなる）から構成される（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ，Ｂ．，ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２；４８２：３３１；Ｂｈａｙａ，Ｄ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０１１；４５：２３１；ａｎｄ  Ｔｅｒｍｓ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１；１４：３２１）。１またはそれを超えるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を保有する細菌および古細菌は、外来配列の短い断片（プロトスペーサー）を、宿主染色体のＣＲＩＳＰＲアレイの近位末端に組み入れることによってウイルスまたはプラスミドからの攻撃に応答する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が転写されると、以前に遭遇した侵入核酸に相補的な配列を含むＣＲＩＳＰＲ由来ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）のライブラリーが生成される（Ｈａｕｒｗｉｔｚ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２：３２９；１３５５；Ｇｅｓｎｅｒ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００１：１８；６８８；Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２：３３７；８１６−２１）。ｃｒＲＮＡによる標的認識は、標的ＤＮＡとの相補塩基対合によって生じ、それにより、Ｃａｓタンパク質を用いた外来配列の切断を指示する（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ．ａｌ．２０１２‘‘Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．’’Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２：３３７；８１６−８２１）。
【０１３４】
ＣＲＩＳＰＲシステムには少なくとも５つの主なタイプ（タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶ）および少なくとも１６の別個のサブタイプが存在する（Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３，７２２−７３６）。また、ＣＲＩＳＰＲシステムは、そのエフェクタータンパク質に基づいて分類される。クラス１システムはマルチサブユニットｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体を保有するのに対して、クラス２システムでは、エフェクター複合体の全ての機能が単一のタンパク質（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）によって実行される。いくつかの実施形態では、本開示は、タイプＩＩおよび／またはタイプＶ単一サブユニットエフェクターシステムの使用を教示する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、クラス２ＣＲＩＳＰＲシステムの使用を教示する。
【０１３５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９
いくつかの実施形態では、本開示は、タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムを使用した遺伝子編集方法を教示する。いくつかの実施形態では、タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ９酵素を使用する。タイプＩＩシステムは、ｉ）単一のエンドヌクレアーゼタンパク質、ｉｉ）トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、およびｉｉｉ）ｃｒＲＮＡの５’末端の約２０ヌクレオチド（ｎｔ）の部分が標的核酸と相補的なｃｒＲＮＡに依拠する。ＣＲＩＳＰＲ  ｃｒＲＮＡ鎖の標的ＤＮＡプロトスペーサーに相補的な領域を、本明細書中で「ガイド配列」と称する。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、タイプＩＩシステムのｔｒａｃｒＲＮＡ成分およびｃｒＲＮＡ成分を、シングル−ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）で置き換えることができる。ｓｇＲＮＡは、例えば、標的ＤＮＡ配列に相補的な少なくとも１２〜２０ヌクレオチド配列（ガイド配列）を含むヌクレオチド配列を含むことができ、その３’末端に一般的な足場ＲＮＡ配列を含むことができる。本明細書中で使用される場合、「一般的な足場ＲＮＡ」は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を模倣する任意のＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡとして機能する任意のＲＮＡ配列を指す。
【０１３７】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、平滑末端ＤＮＡ切断を生じさせ、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡオリゴの組み合わせによって標的ＤＮＡに動員され、前記組み合わせは、ＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲ複合体の相補的ハイブリッド形成を介してエンドヌクレアーゼを係留する（図１Ａ中の黒塗りの三角の矢印を参照のこと）。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ／エンドヌクレアーゼ複合体によるＤＮＡ認識には、標的プロトスペーサーの下流の標的ＤＮＡの３’部分にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（例えば、５’−ＮＧＧ−３’）とのさらなる相補的塩基対合が必要である（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２：３３７；８１６−８２１）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９によって認識されるＰＡＭモチーフは、Ｃａｓ９タンパク質によって異なる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、当業者は、本明細書中に開示のＣａｓ９が任意の供給源に由来するか単離された任意のバリアントであり得ることを認識することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６から選択される１またはそれを超える配列番号を含むことができる。他の実施形態では、本開示のＣａｓ９ペプチドは、以下に記載の機能的変異を含むが、これらに限定されない１またはそれを超える文献中に記載の変異を含むことができる：Ｆｏｎｆａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１４  Ｆｅｂ；４２（４）：２５７７−９０；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１４  Ｆｅｂ  ２７；１５６（５）：９３５−４９；Ｊｉｎｅｋ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２  ３３７：８１６−２１；およびＪｉｎｅｋ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４  Ｍａｒ  １４；３４３（６１７６）；また、２０１３年３月１５日出願の米国特許出願第１３／８４２，８５９号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと；さらに、米国特許第８，６９７，３５９；８，７７１，９４５号；同第８，７９５，９６５号；同第８，８６５，４０６号；同第８，８７１，４４５号；同第８，８８９，３５６号；同第８，８９５，３０８号；同第８，９０６，６１６号；同第８，９３２，８１４号；同第８，９４５，８３９号；同第８，９９３，２３３号；および同第８，９９９，６４１号（これら全てが本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書中に開示のシステムおよび方法を、二本鎖ヌクレアーゼ活性を有する野生型Ｃａｓ９タンパク質、一本鎖ニッカーゼとして作用するＣａｓ９変異体、または改変されたヌクレアーゼ活性を有する他の変異体と共に使用することができる。
【０１４０】
本開示は、本明細書の以後の節にさらに記載の触媒的に不活化されたＣａｓ９変異体の使用をさらに想定する。いくつかの実施形態では、用語「触媒的に不活化された」または「触媒的に不活性な」ＣＲＩＳＰＲは、ＤＮＡａｓｅ触媒ドメインが非機能的である（すなわち、酵素がもはやＤＮＡを切断しない）ＣＲＩＳＰＲタンパク質を指す。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、ｄＣａｓ９変異体を教示する。Ｃａｓ９におけるヌクレアーゼを低下させるか排除する変異体の非限定的なリストには、以下が含まれる：Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、もしくはＡ９８７、またはＣａｓ９ホモログまたはオルソログ中の対応する位置の変異。変異（複数可）には、任意の天然アミノ酸（例えば、アラニン）もしくは非天然アミノ酸との置換または欠失が含まれ得る。例示的なヌクレアーゼ欠陥ｄＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ＆Ｈ８４０Ａである（Ｊｉｎｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２  Ａｕｇ．１７；３３７（６０９６）：８１６−２１；Ｑｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｆｅｂ．２８；１５２（５）：１１７３−８３）。ｄＣａｓ９バリアントの非限定的なリストを、表１に提供する。
【表１−１】
2021533773.tif 000003
【表１−２】
2021533773.tif 000004
【表１−３】
2021533773.tif 000005
【表１−４】
2021533773.tif 000006
【表１−５】
2021533773.tif 000007
【表１−６】
2021533773.tif 000008
【０１４１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１
他の実施形態では、本開示は、タイプＶ  ＣＲＩＳＰＲシステムを使用した遺伝子編集法を教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ由来のＣＲＩＳＰＲ  １（Ｃｐｆ１）の使用方法を教示する。
【０１４２】
本開示のＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｉ）単一のエンドヌクレアーゼタンパク質、およびｉｉ）ｃｒＲＮＡの３’末端の一部が標的核酸に相補的なガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含む。このシステムでは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡによって標的ＤＮＡに直接動員される（図１Ｂ中の黒塗りの三角の矢印を参照のこと）。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１のガイド配列は、検出可能なＤＮＡ切断を達成するためには少なくとも１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、または１６ｎｔでなければならず、有効なＤＮＡ切断を達成するためには最小で１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、または１８ｎｔでなければならない。
【０１４３】
本開示のＣｐｆ１システムは、種々の方法でＣａｓ９と異なる。第１に、Ｃａｓ９と異なり、Ｃｐｆ１は、切断のために個別のｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡは、約４２〜４４塩基長ほどの短さであり得、そのうちの２３〜２５ｎｔがガイド配列であり、１９ｎｔが構成性ダイレクトリピート配列である。対照的に、Ｃａｓ９  ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡ合成配列との組み合わせは、約１００塩基長であり得る。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃｐｆ１のｃｒＲＮＡを「ガイドＲＮＡ」という。
【０１４４】
第２に、Ｃｐｆ１は、その標的の５’上流にある「ＴＴＮ」ＰＡＭモチーフを好む。これは、Ｃａｓ９システムの標的ＤＮＡの３’にある「ＮＧＧ」ＰＡＭモチーフと対照的である。いくつかの実施形態では、ガイド配列直前のウラシル塩基を置換することはできない（Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．２０１５．‘‘Ｃｐｆ１  Ｉｓ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍ’’Ｃｅｌｌ  １６３，７５９−７７１（その全体が全ての目的のために本明細書中で参考として援用される））。
【０１４５】
第３に、Ｃｐｆ１の切断部位は約３〜５塩基ずれており、それにより、「付着末端」が作出される（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６．‘‘Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｐｆ１  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ’’２０１６年６月６日にオンライン公開）。約３〜５ｎｔのオーバーハングを有するこれらの付着末端は、ＮＨＥＪ媒介ライゲーションを容易にし、適合する末端を有するＤＮＡ断片の遺伝子編集を改善すると考えられる。切断部位は、標的ＤＮＡの３’末端にあり，ＰＡＭが存在する５’末端より遠位である。切断の位置は、通常は、非ハイブリッド形成鎖上の１８番目の塩基およびｃｒＲＮＡにハイブリッド形成した相補鎖上の対応する２３番目の塩基に続く（図１Ｂ）。
【０１４６】
第４に、Ｃｐｆ１複合体において、「シード」領域は、ガイド配列の最初の５ｎｔ以内にある。Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡシード領域は、変異に対する感受性が高く、この領域中の単一の塩基置換でさえ切断活性を劇的に減少させ得る（Ｚｅｔｓｃｈｅ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．２０１５‘‘Ｃｐｆ１  Ｉｓ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍ’’Ｃｅｌｌ  １６３，７５９−７７１を参照のこと）。Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ標的と異なり、切断部位およびＣｐｆ１システムのシード領域は重複しないことが重要である。Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡターゲティングオリゴのデザインに関するさらなるガイダンスは、（Ｚｅｔｓｃｈｅ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．２０１５．‘‘Ｃｐｆ１  Ｉｓ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍ’’Ｃｅｌｌ  １６３，７５９−７７１）で利用可能である。
【０１４７】
当業者は、本明細書中に開示のＣｐｆ１が任意の供給源に由来するか単離された任意のバリアントであり得ることを認識する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のＣｐｆ１ペプチドは、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４から選択される１またはそれを超える配列番号、またはこれらの任意のバリアントを含むことができる。
【０１４８】
本開示は、本明細書の以後の節にさらに詳細に記載している触媒的に不活化されたＣｐｆ１変異体の使用をさらに想定する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、ｄＣｐｆ１変異体を教示する。いくつかの実施形態では、本開示のｄＣｐｆ１は、以下を含む：ｄｄＣｐｆ１（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．‘‘Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ  ｄｄＣｐｆ１’’Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ３，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  １７０１８（２０１７）；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ））、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ０Ａ１８２ＤＷＥ３（Ａ０Ａ１８２ＤＷＥ３＿９ＦＩＲＭ））、およびＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｕ２ＵＭＱ６（ＣＰＦ１  ＡＣＩＳＢ）。いくつかの実施形態では、本開示のｄＣｐｆ１は、触媒ドメインＡｓＣｐｆ１の変異によって生成される（Ｄ９０８Ａ  Ｙａｍａｎｏ，Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．，Ｈｉｒａｎｏ，Ｈ．，Ｓｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｅｄｏｒｏｖａ，Ｉ．，Ｎａｋａｎｅ，Ｔ．，Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．，Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｐｆ１  ｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  Ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ．Ｃｅｌｌ，１６５，９４９−９６２。
【０１４９】
リガーゼ
いくつかの実施形態では、本開示は、標的化Ｃｐｆ１複合体を介して標的ＤＮＡを切断し、次いで、得られた付着末端をＤＮＡ挿入物とライゲーションする方法を教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡを切断するためのＣｐｆ１複合体および前記ＤＮＡを「繋ぎ」戻すためのリガーゼを提供する方法を教示する。他の実施形態では、本開示は、係留されたリガーゼ酵素を含む改変Ｃｐｆ１複合体を教示する。
【０１５０】
本明細書中で使用される場合、用語「リガーゼ」は、多くの酵素試薬または非酵素試薬を含むことができる。例えば、リガーゼは、適切な存在下で、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはハイブリッドにおける隣接ヌクレオチドの３’−ＯＨと５’−リン酸との間のホスホジエステル結合を形成する酵素ライゲーション試薬または触媒である。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本開示は、酵素リガーゼの使用を教示する。適合する温度感受性酵素リガーゼには、バクテリオファージＴ４リガーゼおよびＥ．ｃｏｌｉリガーゼが含まれるが、これらに限定されない。熱安定性リガーゼには、Ａｆｕリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｔｆｌリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔｔｈ  ＨＢ８リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ種ＡＫ１６Ｄリガーゼ、およびＰｆｕリガーゼが含まれるが、これらに限定されない（例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ／２０００／０２６３８１号、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７６（２）：２４５−２５４，（１９８９）、およびＬｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４（１５）：３０７１−３０７８（１９９６）を参照のこと）。当業者は、好熱性および超好熱性の生物（例えば、真正細菌および古細菌のある特定の種）から多くの熱安定性リガーゼを得ることができること；かかるリガーゼを開示の方法およびキットで使用することができることを認識する。いくつかの実施形態では、可逆的に不活化された酵素（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号を参照のこと）を、本教示のいくつかの実施形態で使用することができる。
【０１５２】
他の実施形態では、本開示は、化学的ライゲーション剤の使用を教示する。化学的ライゲーション剤には、制限されないが、活性化剤、縮合剤、および還元剤（カルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、Ｎ−シアノイミダゾール、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）など）、ならびに紫外線が含まれる。オートライゲーション（すなわち、ライゲーション剤の非存在下での自発的ライゲーション）も、本明細書中の教示の範囲内にある。化学的ライゲーション法の詳細なプロトコールおよび適切な反応基の説明を、特に、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２７：８７５−８１（１９９９）；Ｇｒｙａｚｎｏｖ  ａｎｄ  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２１：１４０３−０８（１９９３）；Ｇｒｙａｚｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：２３６６−６９（１９９４）；Ｋａｎａｙａ  ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：７４２３−３０（１９８６）；Ｌｕｅｂｋｅ  ａｎｄ  Ｄｅｒｖａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：３００５−０９（１９９２）；Ｓｉｅｖｅｒｓ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｋｉｅｄｒｏｗｓｋｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：２２１−２４（１９９４）；Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３３００−０４（１９９９）；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｋｏｏｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２３２６−３３（１９９４）；Ｐｕｒｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：３７１３−１９（１９９２）；Ａｓｈｌｅｙ  ａｎｄ  Ｋｕｓｈｌａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：２９２７−３３（１９９１）；Ｃｈｕ  ａｎｄ  Ｏｒｇｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３６７１−９１（１９８８）；Ｓｏｋｏｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２３２：１５３−５５（１９８８）；Ｎａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｇｉｌｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：２７２２−２８（１９６６）；および米国特許第５，４７６，９３０号に見出すことができる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本開示の方法、キット、および組成物はまた、フォトライゲーション反応に適合する。ライゲーション剤として適切な波長の光を使用したフォトライゲーションも、教示の範囲内にある。いくつかの実施形態では、フォトライゲーションは、ヌクレオチドアナログ（４−チオチミジン、５−ビニルウラシルおよびその誘導体、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない）を含むプローブを含む。いくつかの実施形態では、ライゲーション剤は、以下を含む：（ａ）ＵＶ−Ａ範囲の光（約３２０ｎｍ〜約４００ｎｍ）、ＵＶ−Ｂ範囲の光（約２９０ｎｍ〜約３２０ｎｍ）、またはその組み合わせ、（ｂ）約３００ｎｍと約３７５ｎｍとの間の波長を有する光、（ｃ）約３６０ｎｍ〜約３７０ｎｍの波長を有する光；（ｄ）約３６４ｎｍ〜約３６８ｎｍの波長を有する光、または（ｅ）約３６６ｎｍの波長を有する光。いくつかの実施形態では、フォトライゲーションは可逆的である。フォトライゲーションの説明を、特に、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４２：３９−４０（１９９９）；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．１：１８５−８６（２００１）；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｓｕｐｐｌ．，２：１５５−５６（２００２）；Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２６：３３００−０４（１９９８）、およびワールド・ワイド・ウェブ上の以下：ｓｂｃｈｅｍ．ｋｙｏｔｏ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓａｉｔｏ−ｌａｂに見出すことができる。
【０１５４】
ユニバーサルモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物およびその使用
いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡ構築物のモジュラーアセンブリのストラテジーを記載する。いくつかの実施形態では、本開示のＤＮＡアセンブリ法は、任意の構築物（プラスミド、低分子線状ＤＮＡ、および形質転換された染色体遺伝子座が含まれる）に適用可能である。
【０１５５】
複数の態様では、本発明者らは、かかるユニバーサルモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を「メガモジュラー」デザインと呼ぶ。
【０１５６】
従来のＤＮＡ編集およびアセンブリ技術の短所
従来の多成分ＤＮＡクローニングストラテジーは、複合体配列を用いて多成分ＤＮＡ構築物を有効にアセンブリして改変する能力に限界がある。例えば、制限酵素クローニングは、各々のＤＮＡ挿入物のクローニング接合部に適切に配置された固有の制限酵素認識部位および最終ベクター内のその目的部位の利用能によって制限される。Ｇａｔｅｗａｙクローニングテクノロジーは、多成分アセンブリのために利用可能な固有の組換え部位数が比較的少ないので、同様に限度がある。
【０１５７】
従来のＤＮＡアセンブリ技術の別の弱点は、配列編集能力が構築時間に制限されることが多い点である。例えば、リガーゼサイクリング反応（ＬＣＲ）などの効率的アセンブリストラテジーの産物は、最初のアセンブリが完了すると容易に改変されない（Ｋｏｋ，Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４‘‘Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｒｅｌｉａｂｌｅ  ＤＮＡ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｖｉａ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ’’ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，３（２）：９７−１０６）。従来の制限酵素クローニングには類似の懸念があり、制限部位を含むポリヌクレオチドがアセンブリされている構築物に挿入されると、または前記構築物が前記部位を多く含む染色体に組み入れられる場合に、その共通の制限認識部位が固有のクローニング点として機能するのを止めてしまう。したがって、連続制限クローニングによって産生されたベクターは、クローニング過程がかなり進行した時点での配列の修復またはアップデートのための選択肢が非常に少ない。
【０１５８】
従来のＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡアセンブリ技術などのより最近のテクノロジーでさえも、依然として類似の複雑さ、事前にアセンブリした構築物／ベクターデザインで反復することの容易さ、および速度の限界が問題となっている（Ｗａｎｇ，ＪＷ．ｅｔ  ａｌ．，２０１５‘‘ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆｏｒ  ｓｅａｍｌｅｓｓ  ｃｌｏｎｉｎｇ’’ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ  ５８，Ｎｏ．４：１６１−１７０）。ＣＲＩＳＰＲクローニングには、適合性プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣を標的にする機能的ガイドＲＮＡのデザインが必要である。標的部位内で適切なＰＡＭ配列を利用できるようにすると、ゲノムまたは構築物内の可能なＤＮＡ挿入位置の数にデザインがかなり制限される。
【０１５９】
さらに、ガイドＲＮＡ配列をデザインして試験することは、多成分アセンブリにおいて技術上非常に困難である。当業者は、例えば、全てのｇＲＮＡ配列が機能的なわけではなく、ＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡアセンブリを有効に実行するには時折複数のｇＲＮＡ配列バリアントをデザインおよび検証する必要があり得ることを認識する。単一のｇＲＮＡ配列を望ましく改変できず、最初のクローニングプランには含まれてはいなかったアセンブリ成分の再デザインがその後に必要となり得る場合、これらの制限は多成分アセンブリにおいて特に厄介である。そのため、多成分アセンブリのあらゆるジャンクションについて複数のカスタムガイドＲＮＡを必要とする技術の適用は、非常に高価であり、厄介であり、非実用的でもあり得る。
【０１６０】
モジュラーＣＲＩＳＰＲタグアセンブリベクターおよびその使用方法
いくつかの実施形態では、本開示は、上記の従来の技術に関連する多くの制限を克服するＤＮＡアセンブリ法を教示する。いくつかの実施形態では、本開示はまた、本発明の方法と共に使用するためのモジュラーＣＲＩＳＰＲアセンブリの構築物、組成物、およびキットを教示する。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本開示は、１またはそれを超えるＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位（ｃＭＣＳ）を含むＤＮＡ構築物を教示する。いくつかの実施形態では、本開示のｃＭＣＳは、記載したＤＮＡ構築物の一部のみを示す（すなわち、構築物の一部のみを本開示の方法にしたがって容易に編集可能である）。他の実施形態では、本開示のｃＭＣＳは、ＤＮＡ構築物全体が容易に編集可能なように、構築物全体のうちの重要な場所に配置される。したがって、いくつかの実施形態では、モジュラーｃＴＡＧベクターの全ての機能的部分（例えば、アセンブリに必要な全ての起点、マーカー、カーゴ、エレメント）が挿入ＤＮＡ部分内に含まれ、これらの部分を本開示の遺伝子編集法を介して容易に交換することができる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本開示のｃＭＣＳは、１またはそれを超えるクローニングタグ（ｃＴＡＧ）を含み、これらの各々が少なくとも１つの検証済みのＣＲＩＳＰＲターゲティング部位を含む。いくつかの実施形態では、本開示のｃＭＣＳは、各々がｃＴＡＧ対に挟まれたＤＮＡ挿入部分をさらに含み、その結果、１またはそれを超えるｃＴＡＧを標的にする１種または複数種のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼでｃＭＣＳを消化すると前記隣接挿入部分が放出され、適合性ドナーＤＮＡ部分が挿入可能である。
【０１６３】
本明細書の図２および３は、本開示の方法に従ったモジュラーＣＲＩＳＰＲアセンブリプラスミド構築物の実施形態を示す。開示のプラスミドの例は、図２Ａにおいて各々がｃＴＡＧ対（タグＡ〜Ｈ）に挟まれた一連のＤＮＡ挿入物（図２Ａ中の部分１〜８）を含む。適切なＣＲＩＳＰＲ／ガイド配列複合体でこの例のｃＴＡＧ  ＡおよびＢを消化すると、プラスミドの部分２が放出され、それにより、所望の特徴を有する置き換え用部分２挿入物が挿入される。
【０１６４】
当業者は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのベクターの配列特異的モジュラークローニング／編集が可能という本明細書中に記載のベクター系の利点を直ちに認識する。以下の節は、開示のモジュラークローニングベクターの種々の態様、ならびに分子生物学、遺伝子療法、および遺伝子編集へのその種々の適用の概要を説明する。
【０１６５】
モジュラーＣＲＩＳＰＲベクター挿入部分
いくつかの実施形態では、本開示の挿入部分は、ＣＲＩＳＰＲ消化後の相同組換え挿入のためのドナーＤＮＡ配列である。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の挿入部分の配列は、消化されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物の末端に対して十分な相同性を有する配列に挟まれた、前記配列の相同組換え、ハイブリッド形成、および挿入を誘発するための目的の挿入配列を含む。
【０１６６】
他の実施形態では、本開示の挿入部分は、（例えば、Ｃｐｆ１消化、制限酵素消化、ギブソンアセンブリ、または他のハイブリッド形成ベースのアセンブリ（ＬＣＲが含まれる）の後に）付着末端を介してハイブリッド形成およびライゲーションすることができるドナーＤＮＡ配列である。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の挿入部分の配列は、消化されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物の末端に対して十分な相同性を有する配列に挟まれた、付着末端のハイブリッド形成を可能にするための目的の挿入配列を含む。
【０１６７】
さらに他の実施形態では、本開示の挿入部分は、平滑末端ライゲーションのためのドナーＤＮＡ配列である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物は、任意の挿入部分の配列と適合する。したがって、本発明のベクターの部分は、制限されないが、選択マーカー、複製起点、プロモーター、ターミネーター配列；他の制御配列、バーコード、組換え部位、または使用者が目的とする他の配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の挿入部分は、相同組換えおよび１またはそれを超える遺伝子座への挿入を誘発するための相同配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、前記相同組換え挿入部分は、他の挿入部分に先行するか後に続き、また、前記他の挿入部分は、組換え事象を介してゲノムに挿入される。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本開示は、各挿入部分が単一の配列（例えば、目的のたった１つのプロモーターまたはたった１つのゲノム、図２Ａのパート８を参照のこと）を含むことを教示する。他の実施形態では、本開示は、１またはそれを超える挿入部分が、プロモーター−目的の遺伝子（ＧＯＩ）組み合わせ、マルチサブユニットキメラタンパク質融合物、または、さらには構築物全体などの複数のエレメントを含んでよいことを教示する（プロモーター−ＧＯＩ−ターミネーター組み合わせを含む図２Ａの部分５を参照のこと）。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本開示は、組み合わせていない個々の挿入部分を教示する。すなわち、いくつかの実施形態では、本開示は、１つまたは複数の非連結挿入部分を教示する（組み合わせていない挿入部分のリストを示す図２Ａの右側を参照のこと）。いくつかの実施形態では、本開示は、前記複数の部分を１またはそれを超えるモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物にアセンブリする方法を教示する。いくつかの態様では、本開示は、メガモジュラー構築物をアセンブリするためのキットを教示する。
【０１７１】
他の実施形態では、本開示は、部分的または完全にアセンブリされたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれを超えるアセンブリした挿入部分、およびその間の任意の範囲を含むモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示する。また、本開示は、前記挿入部分を含むキットを教示する。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、前記アセンブリしたか部分的にアセンブリしたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物は線状である。いくつかの実施形態では、前記アセンブリしたか部分的にアセンブリしたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物は環状である（例えば、プラスミド）。いくつかの実施形態では、前記アセンブリしたか部分的にアセンブリしたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物は、ゲノムＤＮＡに組み入れられている。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本開示の構築物は、さらなるクローニングのためのプレースホルダーとして短いスペーサー配列のみを最初に含む（図３Ｃ中の「スタッファー」配列を参照のこと）。いくつかの実施形態では、挿入部分のプレースホルダーは、小型で無作為化された配列である。他の実施形態では、本開示のベクターは、１またはそれを超える予め選択した挿入ＤＮＡ部分を最初に含む。例えば、いくつかの実施形態では、モジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物は、少なくとも１つの選択マーカーおよび／または少なくとも１つの複製起点を最初に含む。
【０１７４】
適切な選択マーカーには、抗生物質耐性を付与する遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー、毒性遺伝子、表現型マーカー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、制限エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ切断部位、酵素切断部位、タンパク質結合部位、およびＰＣＲプライマー配列に相補的な配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７５】
適切な抗生物質耐性遺伝子には、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７６】
本発明のある特定の実施形態では、対抗選択マーカーは毒性遺伝子である。適切な毒性遺伝子には、ｃｃｄＢ遺伝子、１またはそれを超えるｔｅｒ部位に結合するｔｕｓタンパク質をコードする遺伝子、ｋｉｃＢ遺伝子、ｓａｃＢ遺伝子、ＡＳＫ１遺伝子、ΦＸ１７４  Ｅ遺伝子、およびＤｐｎＩ遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、毒性選択マーカーの存在は、挿入されなかったか、挿入に失敗したことを示す指標としての機能を果たす。また、毒性選択マーカーは、毒性遺伝子が依然として存在する未改変ベクターを保有する細胞を死滅させることによって陽性細胞の未改変親ベクターのバックグラウンドを減少させる働きもし得る。
【０１７７】
本開示の方法のさらなる実施形態では、モジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物は、１種または複数種の毒性遺伝子および１種または複数種の抗生物質耐性遺伝子の両方を含んでよい。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、モジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物は、少なくとも１つの制御配列を最初に含む。いくつかの実施形態では、本開示は、制限されないが、マトリックス結合領域、発現インシュレーター配列、発現エンハンサー配列、プロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ターミネーター配列、終止コドン、開始コドンなどを含むベクターを教示する。いくつかの実施形態では、モジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物は、前記構築物の染色体挿入を容易にするための配列（例えば、ｔ−ＤＮＡボーダー、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ、または染色体配列に対する相同末端）を最初に含む。いくつかの実施形態では、染色体挿入のための配列は、モジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物全体が生物のゲノムに挿入されるように配置されている。他の実施形態では、染色体挿入のための配列は、モジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物の一部のみが挿入されるように配置されている（図３Ｄを参照のこと）。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本開示の挿入部分は、追加のｃＴＡＧをさらに含むことができる。挿入部分を介してｃＴＡＧを付加すると、利用可能なクローニングスキームの複雑さを増大させることができ、置き換えることができる挿入部分の利用可能数の増大によって構築物のサイズを拡大することもできる。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本開示の挿入部分は、従来のクローニング部位を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、ｇａｔｅｗａｙ組換え部位、制限部位、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ部位、または他の従来のクローニング部位を含む挿入部分を教示する。いくつかの実施形態では、本開示の挿入部分は、ｇｏｌｄｅｎ  ｇａｔｅクローニングのための配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の挿入部分は、従来の制限酵素クローニングのための配列を含むことができる。他の実施形態では、本開示の挿入部分は、ｇａｔｅｗａｙクローニングのための配列を含むことができる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本開示は、従来のＤＮＡ構築物から挿入部分を産生する方法を教示する。すなわち、いくつかの実施形態では、本開示は、従来のＤＮＡ構築物に（例えば、オリゴ、ＰＣＲ断片、プラスミド、または他の利用可能なＤＮＡセグメントに）ｃＴＡＧを付加する方法を教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）、プロモーターなどの単一の成分にｃＴＡＧを付加する方法を教示する。他の実施形態では、本開示は、マルチエレメント構築物にｃＴＡＧＳを付加する方法を教示する。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＮＡバーコードの使用を教示する。いくつかの実施形態では、本開示のバーコードは、ＤＮＡベクター中に存在する場合にデータベース中のベクターに関する情報を調査するために使用することができる固有の一連のＤＮＡヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ベクターの存在を、データベース中のベクターの履歴（種々の成分の供給源ならびにベクターの産生時期および産生者が含まれる）と関連づけることができる。また、バーコードを使用して、他の方法で同一のＤＮＡ片を区別することができる（分子カウントまたは他の類似の適用に必要な場合など）。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、本開示のバーコードを、ベクター全体と関連付けることができる。他の実施形態では、本開示は、挿入部分へのバーコードの組み入れを教示する。いくつかの実施形態では、本開示のバーコードは、１またはそれを超えるｃＴＡＧ中に存在する。特定の実施形態では、挿入部分中のバーコードを使用して、挿入部分によってコードされる異なるＣＲＩＳＰＲ酵素またはガイドＲＮＡを標識することができる。いくつかの実施形態では、バーコードを配列決定することにより、本来ならば挿入部分全体またはベクター／構築物全体の配列決定を必要とするであろう情報を得ることができる。
【０１８４】
当業者は、挿入部分を構築する方法を認識する。例えば、いくつかの実施形態では、ｃＴＡＧを、前記ｃＴＡＧを含むプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、ＤＮＡ分子に組み込んでよい。他の実施形態では、従来のクローニング技術（例えば、制限酵素、Ｇｉｂｓｏｎ、または他のアセンブリ法）によってｃＴＡＧを組み込んでよい。さらに他の実施形態では、平滑末端ライゲーションによってｃＴＡＧを組み込んでよい。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、本開示の挿入部分は、広い種適合範囲を有し得る（例えば、マーカーは、複数の生物で有効にするための原核生物および真核生物の発現配列の両方を含んでよい）。他の実施形態では、本開示の挿入部分は、生物への適用性が単一の種／属／科／目／綱／門／界またはドメイン内に制限されるようにデザインされている。いくつかの実施形態では、例えば、複製起点部分は、単一の種、または種の群のみにおいてプラスミドを維持することができる場合がある。他の実施形態では、蛍光マーカーは、原核生物ドメインおよび真核生物ドメインの両方にわたって機能するようにコドン最適化されてよい。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、標的配列のＰＡＭから３〜４ヌクレオチド上流を切断する。したがって、Ｃａｓ９複合体によるｃＴＡＧ消化により、標的のＰＡＭ配列またはプロトスペーサー配列を喪失することによってｃＴＡＧ機能が喪失され得る。いくつかの実施形態では、本開示は、挿入（例えば、以前に喪失したＰＡＭ配列またはプロトスペーサー配列の挿入による）の際にドナー挿入配列がｃＴＡＧ配列を再構築するようにドナー挿入配列をデザインすることによって前記ｃＴＡＧ配列の機能性を維持する方法を教示する。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼによって切断された配列が同様に提供されることが想定される。
【０１８７】
図２Ｂは、本明細書中に開示したｃＴＡＧ修復の概念を示す。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼでの挿入部分２の切断もｃＴＡＧ  ＡおよびＢの一部を喪失させる。相同組換えを介した挿入部分２ａ〜２ｄのうちのいずれか１つのその後の挿入により、全長ｃＴＡＧ配列に回復する。
【０１８８】
当業者は、挿入部分にはほぼ無限の選択肢があることを認識する。前記挿入物のリストは、例示を意図し、本明細書中に開示の方法、キット、および構築物の適用性が制限されると決して解釈されるべきではない。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本開示の挿入部分自体が、ＣＲＩＳＰＲ酵素、触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素、または推定ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードすることができる。
【０１９０】
本明細書中で使用される場合、用語「推定ＣＲＩＳＰＲ酵素」は、ＣＲＩＳＰＲ様機能をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは宿主細胞で示すことができると考えられるタンパク質を指す。当業者は、ペプチドを推定ＣＲＩＳＰＲ酵素に分類することができる種々の方法を認識する。いくつかの実施形態では、推定ＣＲＩＳＰＲ酵素は、そのようにして１またはそれを超える既知のＣＲＩＳＰＲ酵素との配列または構造の相同性に基づいて分類される。他の実施形態では、推定ＣＲＩＳＰＲ酵素は、その１またはそれを超えるガイドＲＮＡと相互作用する能力に基づいて分類される。他の実施形態では、推定ＣＲＩＳＰＲ酵素は、酵素をコードするＤＮＡが宿主細胞のＣＲＩＳＰＲ免疫に影響をおよぼすことが見出される機能増減ライブラリーの遺伝子スクリーニングの結果に基づいて分類される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書中に開示のモジュラーベクターを使用して、推定ＣＲＩＳＰＲ酵素ライブラリーをスクリーニングして、１またはそれを超える宿主細胞におけるＣＲＩＳＰＲ活性を有する有益な酵素を同定することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、１またはそれを超えるガイドＲＮＡ配列と組み合わせて推定ＣＲＩＳＰＲ酵素を試験し、標的切断の程度を測定することによる、推定ＣＲＩＳＰＲ酵素を検証するためのハイスループット法を教示する。標的切断を、当業者に公知の任意の方法（標的遺伝子の発現喪失の測定、または例えば消化した産物のゲル上の泳動、消化した産物の配列決定、もしくは未消化の標的ＤＮＡのみを増幅するようにデザインしたＰＣＲ反応の実施による消化の測定が含まれる）によって測定することができる。
【０１９１】
モジュラーＣＲＩＳＰＲクローニングタグ
いくつかの実施形態では、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物は、１またはそれを超えるクローニングタグ（ｃＴＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれを超えるｃＴＡＧを含む。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本開示は、各ｃＴＡＧが少なくとも１つの検証済みのＣＲＩＳＰＲプロトスペーサー／ＰＡＭ組み合わせ配列（「ＣＲＩＳＰＲランディング部位」）を含むことを教示する。すなわち、いくつかの実施形態では、ｃＴＡＧは、少なくとも１つの実験的に検証済みの高効率ＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む。いくつかの実施形態では、本開示のｃＴＡＧは、ウェットベンチ実験（例えば、前記ＣＲＩＳＰＲランディング部位を標的にするＣＲＩＳＰＲ複合体を用いたｃＴＡＧ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断）によって検証され得る。他の実施形態では、ｃＴＡＧ検証は、論文審査のあるジャーナルにおける切断の報告から想定され得る。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、本開示のｃＴＡＧは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超えるＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲランディング部位は、相互に重複する。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲランディング部位は、ｃＴＡＧ内の別個の非重複領域を占める。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲランディング部位は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ切断のいずれかに特異的であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲランディング部位は、任意の他の現在のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼまたは依然として発見されていないＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼに特異的であり得る。
【０１９４】
他の実施形態では、本開示は、単一のｃＴＡＧ中の多クローニング部位を異なる生物にわたって機能するようにデザインすることができることを教示する。したがって、いくつかの実施形態では、ＨＲ機構を欠くか、下方制御する生物においてｃＴＡＧ  Ｃｐｆ１ランディング部位が好まれる可能性がある。他の実施形態では、ｃＴＡＧの制限部位は、最初のｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニングに好ましいかもしれず、一方、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ランディング部位は、選択された真核生物におけるｉｎ  ｖｉｖｏで生じるより複雑な編集に好ましいかもしれない。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本開示は、ｃＴＡＧが１またはそれを超える非ＣＲＩＳＰＲクローニング配列を含んでよいことを教示する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のｃＴＡＧは、制限酵素部位、組換え部位、トポイソメラーゼ部位、スプライシング部位、およびＣｒｅ−Ｌｏｘ部位からなる群から選択される１またはそれを超えるエレメントを含んでよい。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、適切な制限酵素部位には、制限されないが、以下からなる群から選択される制限酵素によって認識される部位が含まれる：ＡａＩＩ、ＡａｒＩ、ＡａｓＩ、ＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＢ７Ｉ、ＡｃｃＩ、ＡｃｃＩＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｃｕＩ、ＡｄｅＩ、ＡｆｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｈｄＩ、ＡｌｅＩ、ＡｌｏＩ、ＡｌｕＩ、Ａｌｗ２１Ｉ、Ａｌｗ２６Ｉ、Ａｌｗ４４Ｉ、ＡｌｗＩ、ＡｌｗＮＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｐｅＫＩ、ＡｐｏＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｅＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｅＩ、ＢａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｕＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｌＩ、ＢｃｎＩ、ＢｃｕＩ、ＢｆａＩ、ＢｆｉＩ、ＢｆｍＩ  ＢｆｒＢＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｆｕＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｐＩ、Ｂｍｅ１３９０Ｉ、Ｂｍｅ１５８０Ｉ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｍｔＩ、ＢｏｘＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｌＩ、ＢｐｍＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、Ｂｐｕ１１０２Ｉ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓａＭＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＤＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＪＩ、ＢｓｅＬＩ、ＢｓｅＭＩ、ＢｓｅＭＩＩ、ＢｓｅＮＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｅＳＩ、ＢｓｅＸＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｇＩ、Ｂｓｈ１２３６Ｉ、Ｂｓｈ１２８５Ｉ、ＢｓｈＮＩ、ＢｓｈＴＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｏＢＩ、Ｂｓｐ１９Ｉ、Ｂｓｐ１２０Ｉ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、Ｂｓｐ１４０７Ｉ、Ｂｓｐ１４３Ｉ、Ｂｓｐ１４３ＩＩ、Ｂｓｐ６８Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＬＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＰＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｐＴＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＳＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｓＳＩ、Ｂｓｔ１１０７Ｉ、Ｂｓｔ９８Ｉ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＯＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｓｔＹＩ、ＢｓｔＺＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｂｓｕ１５Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｓｕＲＩ、ＢｔｇＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＢｖｅＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣａｉＩ、ＣｆｏＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ、Ｃｆｒ１３Ｉ、Ｃｆｒ４２Ｉ、Ｃｆｒ９Ｉ、ＣｆｒＩ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、Ｃｓｐ４５Ｉ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＣｓｐＩ、ＣｓｐＣＩ、ＣｖｉａＩＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＣｖｉＱＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｐｎＩＩ、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、Ｅａｍ１１０４Ｉ、Ｅａｍ１１０５Ｉ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｌ１３６ＩＩ、ＥｃｌＨＫＩ、Ｅｃｏ１０５Ｉ、Ｅｃｏ１３０Ｉ、Ｅｃｏ１４７Ｉ、Ｅｃｏ２４Ｉ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｃｏ３２Ｉ、Ｅｃｏ４７Ｉ、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、Ｅｃｏ７２Ｉ、Ｅｃｏ８１Ｉ、Ｅｃｏ８８Ｉ、Ｅｃｏ９１Ｉ、ＥｃｏｌＣＲＩ、ＥｃｏＮＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｈｅＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｔＩ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｏｋＩ、ＦｓｅＩ、Ｆ���ｐＩ、ＦｓｐＡＩ、ＧｓｕＩ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎ１Ｉ、Ｈｉｎ４Ｉ、Ｈｉｎ６Ｉ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｈＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、Ｈｐｙ８Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＡＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＨｐｙＦ１０ＶＩ、Ｈｓｐ９２Ｉ、Ｈｓｐ９２ＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、ＫａｓＩ、Ｋｐｎ２Ｉ、ＫｐｎＩ、ＫｓｐＡＩ、ＬｗｅＩ、ＭｂｉＩ、ＭｂｏＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｉｓＩ、ＭｌｕＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍｐｈ１１０３Ｉ、ＭｓｃＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｌＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＩ、ＭｓｓＩ、ＭｕｎＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＭｖａＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｉＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｄｅＩＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｈｅＩ、ＮｈｅＩ−ＨＦ、ＮｌａＩＩＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮｍｕＣＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＮｓｉＩ、ＮｓｐＩ、ＯｌｉＩ、ＰａｃＩ、ＰａｅＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰａｇＩ、ＰａｕＩ、ＰｃｉＩ、ＰｄｉＩ、ＰｄｍＩ、Ｐｆｌ２３ＩＩ、ＰｆｌＦＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｆｏＩ、ＰｈｏＩ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｐｉＩ、ＰｐｕＭＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｉＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、Ｐｓｐ５ＩＩ、ＰｓｐＧＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｓｐＸＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｕＩ、ＰｓｙＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＰｖｕＩＩ−ＨＦ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ、ＳａｐＩ、ＳａｔＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｂｆＩ、ＳｃａＩ、ＳｃａＩ−ＨＦ、ＳｃｈＩ、ＳｃｒＦＩ、ＳｄａＩ、ＳｄｕＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｆｃＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｆＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｉｎＩ、ＳｍａＩ、ＳｍｉＩ、ＳｍｌＩ、ＳｍｕＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｐｈＩ−ＨＦ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＳｔｙＩ、ＳｗａＩ、ＴａａＩ、ＴａｉＩ、ＴａｑαＩ、ＴａｑＩ、ＴａｓＩ、ＴａｔＩ、ＴａｕＩ、ＴｆｉＩ、ＴｌｉＩ、Ｔｒｕ１Ｉ、Ｔｒｕ９１、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＴｓｐＭＩ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＴｕｒｂｏＮａｅＩ、ＴｕｒｂｏＮａｒＩ、Ｖａｎ９１Ｉ、ＶｓｐＩ、ＸａｇＩ、ＸａｐＩ、ＸｂａＩ、ＸｃｅＩ、ＸｃｍＩ、ＸｈｏＩ、ＸｈｏＩＩ、ＸｍａＩ、ＸｍａＪＩ、ＸｍｉＩ、ＸｍｎＩおよびＺｒａＩ。また、複数の態様は、ホーミングエンドヌクレアーゼ（Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＰＩ−ＰｓｐＩなど）を含む。これらの酵素の対応する切断部位は、当該分野で公知である。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本開示は、８ヌクレオチド長より長いかまたはそれに等しい部位を認識する低頻度の制限酵素（８以上の制限酵素）の使用を教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、各ｃＴＡＧにおける単一の低頻度の制限部位の使用を教示する。他の実施形態では、本開示のｃＴＡＧは、２またはそれを超える制限部位を含んでよい。以下の表２は、本発明のｃＴＡＧのリストを提供し、その各々の低頻度の制限酵素部位を太字で示す。
【表２】
2021533773.tif 000009
【０１９８】
いくつかの実施形態では、本発明での使用に適切な組換え部位には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位、ａｔｔＲ部位、ｌｏｘ部位、ｐｓｉ部位、ｔｎｐＩ部位、ｄｉｆ部位、ｃｅｒ部位、ｆｒｔ部位、ならびにこれらの変異体、バリアント、および誘導体。本発明のある特定の実施形態では、トポイソメラーゼ認識部位は、存在する場合、タイプＩＢトポイソメラーゼであり得るタイプＩトポイソメラーゼによって認識されて結合する。タイプＩＢトポイソメラーゼの適切なタイプには、真核生物タイプＩトポイソメラーゼおよびポックスウイルストポイソメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポックスウイルストポイソメラーゼの適切なタイプには、ワクシニアウイルス、ショープ線維腫ウイルス、ＯＲＦウイルス、鶏痘ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、およびアムサクタモーレイ（Ａｍｓａｃｔａ  ｍｏｒｒｅｉ）エントモポックスウイルスなどのウイルスによって産生されたか、前記ウイルスから単離されたポックスウイルストポイソメラーゼが含まれるが、これに限定されない。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲおよび非ＣＲＩＳＰＲクローニング部位のｃＴＡＧ配置を、使用者の好みに応じた順序にすることができる。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ結合部位が挿入部分から最も離れるような順序にするべきであることを教示する。１つの例示的な実施形態では、ｃＴＡＧを、５’から３’への方向に以下の通りに配置することができる：（部分Ｉ）−［Ｒ１−Ａ１−Ｃ−Ａ２−Ｒ２］−（部分ＩＩ）（式中、Ｒ＝制限部位、Ａ＝リコンビナーゼ部位、およびＣ＝ＣＲＩＳＰＲランディング部位）。いくつかの実施形態では、Ｃは、複数の重複部位、または連続的なＣＲＩＳＰＲおよび／もしくは制限ランディング部位を含んでよい。いくつかの実施形態では、本開示のｃＴＡＧ上のクローニング部位の配置は、対称的である（すなわち、対称的な順序のクローニング部位タイプが得られる）。
【０２００】
他の実施形態では、本開示のｃＴＡＧ上のクローニング部位の配置は、非対称であってよい。例えば、別の例示的な実施形態では、ｃＴＡＧを、５’から３’への方向に以下の通りに配置することができる：（パートＩ）−［Ｒ１−Ａ１−Ｃ１−Ｃ２］−（パートＩＩ）（式中、Ｒ＝制限部位、Ａ＝リコンビナーゼ部位、およびＣ１−２＝ＣＲＩＳＰＲランディング部位（複数可））。さらに他の実施形態では、ｃＴＡＧを、５’から３’への方向に以下の通りに配置することができる：ｉ）（パートＩ）−［Ｒ１−Ｃ１−Ｃ２］−（パートＩＩ）、ｉｉ）（パートＩ）−［Ｒ１−Ｃ１］−（パートＩＩ）、ｉｉｉ）（パートＩ）−［Ｃ１−Ｃ２］−（パートＩＩ）、またはその逆の順序（式中、Ｒ＝制限部位、Ａ＝リコンビナーゼ部位、およびＣ１−２＝ＣＲＩＳＰＲランディング部位（複数可））。
【０２０１】
当業者は、種々のｃＴＡＧ配置の利点および適用を認識する。例えば、単一タグの実施形態では、モジュラー構築物は、単一のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ消化を用いて挿入可能であるが、第２の隣接ｃＴＡＧ部位を欠くために、（例えば、追加のｃＴＡＧのさらなる消化を用いずに）前記挿入物の除去や置換は不可能である。いくつかの実施形態では、本開示は、挿入された部分自体がｃＭＣＳ内の挿入部分の可能な配置数を拡大するための追加のｃＴＡＧを含んでよいことを教示する。
【０２０２】
他の実施形態では、本開示は、モジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物から１またはそれを超える挿入部分を除去する方法を教示する。いくつかの実施形態では、モジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物の２またはそれを超えるｃＴＡＧは、適合性末端を作出することができる制限酵素結合部位を含む。いくつかの実施形態では、制限酵素部位は同一である。他の実施形態では、制限酵素部位は別個であるが、結果として得られた前記部位の消化によってハイブリッド形成およびライゲーションのための適合性末端が生成される。いくつかの実施形態では、モジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物の欠失部分の制限部位は、得られたリガンド構築物が依然として同一の挿入部分対ｃＴＡＧＳ比を維持するように、２またはそれを超えるｃＴＡＧＳの他の末端に配置される。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物内の欠失のために使用される制限酵素部位が、適合性末端が得られる任意の制限酵素であり得ることを教示する。他の実施形態では、本開示は、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物内の欠失のために使用される制限酵素部位が、適合性末端が得られる任意の低頻度の８塩基以上の制限酵素であり得ることを教示する。選択された実施形態では、本開示は、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物内の欠失のために使用される制限酵素部位がＩ−ＳｃｅＩおよびＰＩ−ＰｓｐＩであり得ることを教示する。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本開示は、ｃＴＡＧ対を作出するための各挿入部分に隣接した２つのｃＴＡＧを有するモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物を教示する。いくつかの実施形態では、前記ｃＴＡＧ対は、挿入部分を選択的に切断する／置き換えることが可能である。例えば、図２Ｂ中に示すように、ｃＴＡＧ  ＡおよびＢを標的にするエンドヌクレアーゼでモジュラーＣＲＩＳＰＲプラスミドを消化すると、挿入部分２が特異的に除去される。
【０２０５】
上で考察されるように、本開示の選択した実施形態は、エンドヌクレアーゼ切断後にｃＴＡＧ機能を修復する置換挿入部分を提供する。したがって、図２Ｂに示すように、置換挿入部分２ａ〜２ｄは、モジュラーＣＲＩＳＰＲプラスミドに挿入された際にｃＴＡＧ  ＡおよびＢ機能を修復する配列を含む。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、本開示は、ｃＴＡＧが挿入部分の方向性を調節することもできることを教示する。挿入部分中のｃＴＡＧ末端とモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物中の切断されたｃＴＡＧとの間の配列相同性は、相同組換えまたはハイブリッド形成（例えば、Ｇｉｂｓｏｎアプローチにおける）のいずれかによってＣａｓ９切断配列の挿入方向性を決定する。また、Ｃｐｆ１配列の挿入方向性は、いずれかのｃＴＡＧ上のＣｐｆ１付着末端のワトソン・クリックハイブリッド形成を介して調節され得る。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、また、本開示は、別のｃＴＡＧ配置を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物は、例えばネステッドｃＴＡＧを使用するための方向性が得られるようにデザインされ得る。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで多成分アセンブリが可能な共有オーバーハング「タグ」領域に基づいた成分ベースのＣＲＩＳＰＲアセンブリを教示する。いくつかの実施形態では、本開示のタグは、さらなるクローニングまたはＤＮＡ構築物からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡアセンブリを容易にするためのＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む。ＤＮＡ構築物が宿主生物のゲノムに組み入れられる場合、予め選択されたＣａｓ９またはＣｐｆ１ランディング部位は、容易な遺伝子変更を促進し得る。一連の実験において、アセンブリストラテジーにより、複数の生物で使用することができる複数および複数のタイプのＤＮＡ成分を含むＤＮＡプラスミドを構築することができる。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、このアセンブリストラテジーを使用して、任意の望ましい一連のＤＮＡ成分群（代謝経路が含まれる）をコードするプラスミドをアセンブリし、迅速に再アセンブリすることができる。他の実施形態では、また、ｃＴＡＧを組み入れプラスミド中にデザインすることにより、ＤＮＡ成分を宿主生物のゲノムの内外で直接交換することもでき、それにより、さらなるプラスミドをクローン化する必要性が回避される。
【０２１０】
ｃＴＡＧ配列のデザインアルゴリズム
いくつかの実施形態では、本開示は、ｃＴＡＧ内のＣＲＩＳＰＲランディング部位を容易にするようにデザインされたアルゴリズムを教示する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲランディング部位は、既存配列から同定された配列である。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、特定のＣＲＩＳＰＲ酵素に望ましいガイド配列長およびＣＲＩＳＰＲモチーフ配列（ＰＡＭ、プロトスペーサー隣接モチーフ）に基づいて入力ＤＮＡ配列の両方の鎖上の候補ＣＲＩＳＰＲ標的配列が同定されるようにソフトウェアプログラムの使用をデザインすることを教示する。例えば、ＰＡＭ配列ＴＴＮを有するＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｕ１１２由来のＣｐｆ１の標的部位は、入力配列上および入力配列の逆相補配列上の両方で５’−ＴＴＮ−３’を検索することによって同定され得る。ＰＡＭ配列ＴＴＴＮを有するＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．由来のＣｐｆ１の標的部位は、入力配列上および入力配列の逆相補配列上の両方で５’−ＴＴＴＮ−３’を検索することによって同定され得る。同様に、ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ１のＣａｓ９の標的部位は、入力配列上および入力配列の逆相補配列上の両方で５’−Ｎｘ−ＮＮＡＧＡＡＷ−３’を検索することによって同定され得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９のＰＡＭ配列は５’−ＮＧＧ−３’である。
【０２１１】
同様に、ＰＡＭ配列ＮＧＧＮＧを有するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲのＣａｓ９の標的部位は、入力配列上および入力配列の逆相補配列上の両方で５’−Ｎ、−ＮＧＧＮＧ−３’を検索することによって同定され得る。
【０２１２】
他の実施形態では、本開示は、スクラッチからＣＲＩＳＰＲランディング部位をデザインする方法を教示する。当業者は、本開示のガイドＲＮＡと併せてＣＲＩＳＰＲランディング部位をデザインすることが容易に可能である。ここで、得られたプロトスペーサー配列は、上記のように、所望のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼに適切なＰＡＭモチーフと組み合わせられている。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７８、７９、８０、８１、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含むｃＴＡＧを教示する。
【０２１４】
ゲノム中にＤＮＡ標的部位が複数出現すると非特異的にゲノム編集される場合があるので、全ての潜在的な部位の同定後に、本開示は、いくつかの実施形態では、関連する参照ゲノムまたはモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物中の出現回数に基づいた配列のフィルタリングを教示する。配列特異性が「シード」配列（Ｃｐｆ１媒介性切断のためのガイド配列の最初の５ｎｔなど）によって決定されるＣＲＩＳＰＲ酵素について、フィルタリングステップは、同一のシードを有する異なる配列をフィルタリングして除去することもできる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、アルゴリズムツールは、特定のガイド配列の潜在的なオフターゲット部位を同定することもできる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃａｓ−Ｏｆｆｉｎｄｅｒを使用して、Ｃｐｆ１の潜在的なオフターゲット部位を同定することができる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６．‘‘Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｐｆ１  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ’’２０１６年６月６日にオンライン公開を参照のこと）。任意の他の公的に入手可能なＣＲＩＳＰＲデザイン／同定ツールも使用してよい（例えば、Ｚｈａｎｇ  ｌａｂのｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕツール（Ｈｓｕ，ｅｔ  ａｌ．２０１３‘‘ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＲＮＡ＿ｇｕｉｄｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ’’Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３１，８２７−８３２を参照のこと）が含まれる）。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、使用者は、シード配列の長さを選択することが可能な場合がある。また、使用者は、フィルタを通過させるためにゲノム中のシード：ＰＡＭ配列の発生数を特定することが可能な場合がある。デフォルトは、固有の配列をスクリーニングすることである。フィルタリングレベルは、シード配列の長さおよびゲノム中の前記配列の出現数の両方の変化によって変更される。プログラムは、さらに、またはあるいは、同定された標的配列（複数可）の逆相補物を提供することによって、報告された標的配列（複数可）に相補的な一連のガイド配列を提供し得る。
【０２１７】
モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物のクローニング
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を使用した新規の組換え核酸分子の調製方法を教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＮＡ部分のアセンブリ方法を教示する。各方法を以下で説明する。
【０２１８】
ＤＮＡアセンブリ法
いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＮＡ部分のモジュラーアセンブリ法を教示する。いくつかの実施形態では、本開示のＤＮＡアセンブリ法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、ｉ）少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ複合体と共に少なくとも２つの挿入部分のＤＮＡを含む混合物を形成するステップ、およびｉｉ）前記混合物を、挿入ＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ消化条件下でインキュベートするステップ、ｉｉｉ）その後に、前記２つの挿入部分のＤＮＡの各々の消化に由来する適合性付着末端をハイブリッド形成するステップ、およびｉｖ）前記ハイブリッド形成した末端を相互にライゲーションして新規の組換え核酸を作出する、ライゲーションするステップを教示する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の挿入部分のＤＮＡは、共に消化される。他の実施形態では、本開示は、各挿入部分のＤＮＡを、同一または異なるＣＲＩＳＰＲ複合体で個々に消化する方法を教示する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの挿入部分は、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって消化されない。いくつかの実施形態では、本開示は、エキソヌクレアーゼ処理が（以後の節に記載の二重ＣＲＩＳＰＲ消化のために）ステップｉｉｉ）のハイブリッド形成前に行われることを教示する。
【０２１９】
さらに他の実施形態では、本開示は、挿入部分の末端をｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼに曝露すること、および得られた付着末端をハイブリッド形成し、その後にポリメラーゼで最適に満たすこと、およびライゲーションによる挿入部分のギブソン様結合を教示する。いくつかの実施形態では、１またはそれを超える挿入部分は、ｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼ処理前にｄｓＤＮＡエキソヌクレアーゼに曝露される。いくつかの実施形態では、本開示は、１種または複数種のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼによって消化されている（例えば、以後の節に記載の二重ＣＲＩＳＰＲ消化）挿入部分またはモジュラーＣＲＩＳＰＲベクターのギブソン様結合を教示する。
【０２２０】
以下の節は、本開示の挿入部分およびモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物をアセンブリおよび編集することができる種々の方法を実証している一連の実例を提供する。下記の技術のリストは、本開示の配列の有用性を強調している一連の実例を提供しているが、本発明の制限を意図しない。当業者は、本開示にしたがって挿入部分をアセンブリおよび編集可能な他の技術を認識する。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃｐｆ１および／またはＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが関与する方法を記載する。これらの特異的ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの言及は例示であり、特許請求の範囲で特定しない限り、本発明の限定を意図しない。当業者は、他の既存のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼまたはこれまでに発見されていないＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの本開示の構築物および方法に対する適合性を直ちに認識する。Ｃｐｆ１の言及は、互い違いのＤＮＡ切断（staggered  DNA  cleavage）を触媒して付着ＤＮＡ末端を産生することができる任意の現在知られているか、発見されていないＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの使用を包含すると解釈され得る。Ｃａｓ９の言及は、同様に、ｄｓＤＮＡの平滑末端切断を触媒することができる任意の現在知られているか、発見されていないＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの使用を包含すると解釈され得る。
【０２２２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｐｆ１
いくつかの実施形態では、本開示のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡアセンブリは、下記のＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて行われる。第１に、２またはそれを超える挿入部分を、少なくとも２つの挿入部分の間で共通するｃＴＡＧを標的にするＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体とインキュベートする。いくつかの実施形態では、挿入部分を、単一の混合物中で共にインキュベートする。他の実施形態では、挿入部分を、異なる混合物中でインキュベートする。
【０２２３】
第２に、いくつかの実施形態では、消化された産物を精製して、活性ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを除去する。いくつかの実施形態では、精製は、消化された挿入部分からの活性Ｃｐｆ１複合体の分離を含む。いくつかの実施形態では、ゲル精製またはカラム精製などのＤＮＡ精製によってこれを行うことができる。他の実施形態では、熱不活化または化学的不活化などによるＣｐｆ１不活化によって精製を行うことができる。
【０２２４】
第３に、消化された挿入部分を、Ｃｐｆ１複合体によって作出された適合性付着末端のハイブリッド形成に適切な条件でインキュベートする。次いで、ハイブリッド形成された末端を、任意の公知のライゲーション法（本開示の最初の部分に記載の方法が含まれる）にしたがってライゲーションする。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲおよびリガーゼクローニング法（「ＣＬＩＣ」と称される）を使用したＤＮＡアセンブリを教示する（ＵＳ１６／３１０，８９５；ＷＯ／２０１８／０１３９９０（これらの両方の全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０２２６】
ＣＬＩＣ技術では、ポリヌクレオチドを標的にするｃｒＲＮＡは、除去されたＤＮＡ断片の外側に向かって切断するように、欠失が予定されているＤＮＡ挿入領域（例えば、マルチクローン部位「ＭＣＳ」）の内側部分に対して逆方向で結合するようにデザインされる。また、ポリヌクレオチドを標的にする個別のｃｒＲＮＡは、反応中にＤＮＡ結合部位を除去するためにＤＮＡ挿入物（例えば、目的の遺伝子「ＧＯＩ」）の外側の末端を標的にするようにデザインされる。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡガイド配列は、同一であり得る。
【０２２７】
ｃｒＲＮＡ結合部位を逆方向にデザインすると、前記部位が切断過程で除去され、それにより適合性配列のオーバーハングに挟まれた２つのＤＮＡ断片が同一反応においてシームレスにライゲーションされることが確実になる。
【０２２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃａｓ９
他の実施形態では、本開示のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡアセンブリは、下記のＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて行われる。第１に、２またはそれを超える挿入部分を、少なくとも２つの挿入部分の間で共通するｃＴＡＧを標的にするＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ複合体とインキュベートする。いくつかの実施形態では、挿入部分を、単一の混合物中で共にインキュベートする。他の実施形態では、挿入部分を、異なる混合物中でインキュベートする。
【０２２９】
第２に、いくつかの実施形態では、消化された産物を精製して、活性ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを除去する。いくつかの実施形態では、精製は、消化された挿入部分からの活性Ｃａｓ９複合体の分離を含む。いくつかの実施形態では、ゲル精製またはカラム精製などのＤＮＡ精製によってこれを行うことができる。他の実施形態では、熱不活化または化学的不活化などによるＣａｓ９不活化によって精製を行うことができる。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９消化産物の第３のステップは、平滑末端ライゲーションに適切な条件で挿入部分をインキュベートすることである。
【０２３１】
二重ＣＲＩＳＰＲアセンブリ
他の実施形態では、本開示はまた、少なくとも１つの共有ｃＴＡＧ配列を有するＣＲＩＳＰＲ消化された挿入部分の小片のギブソンアセンブリタイプのアセンブリ法（例えば、異なるＣＲＩＳＰＲランディング部位で消化された適合性ｃＴＡＧのアセンブリ）を教示する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、下記の二重ＣＲＩＳＰＲ消化アセンブリを教示する。
【０２３２】
第１に、２またはそれを超える挿入部分を、少なくとも２つの挿入部分の間で共通の前記ｃＴＡＧ内の各部分に隣接する２つの異なるＣＲＩＳＰＲランディング部位を標的にする２つのＣＲＩＳＰＲ複合体とインキュベートする。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、２つの異なるＣＲＩＳＰＲランディング部位は共に消化される。他の実施形態では、個別の容器中で、一方の挿入部分のＤＮＡが、一方のＣＲＩＳＰＲランディング部位を標的にする一方のＣＲＩＳＰＲ複合体で消化され、他方の挿入部分のＤＮＡが、第２のＣＲＩＳＰＲランディング標的部位を標的にする異なるＣＲＩＳＰＲ複合体で消化される。いずれの場合にも、これらの消化の結果は、２つの挿入ＤＮＡ  ｃＴＡＧの各々における共有のｃＴＡＧが、互いに重複する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｂｐの配列を含むことになる。
【０２３４】
例えば、例示的な実施形態では、２つの挿入ＤＮＡ部分の間の共有ｃＴＡＧは、５’から３’への方向に以下の通りに配置される：（パートＩ）−［Ｒ１−Ｃ１−Ｃ２］−（パートＩＩ）（式中、Ｒ＝制限部位、Ｃ１＝第１のＣＲＩＳＰＲランディング部位、およびＣ２＝第２のＣＲＩＳＰＲランディング部位）。この例示的な実施形態では、３’共有ｃＴＡＧを有する第１の挿入ＤＮＡ部分は、Ｃ２を標的にするＣＲＩＳＰＲ複合体で消化され、５’共有ｃＴＡＧを有する第２の挿入ＤＮＡ部分は、Ｃ１を標的にするＣＲＩＳＰＲ複合体で消化される。これにより、Ｃ１−Ｃ２にわたる重複配列を有する２つのＤＮＡ挿入部分が得られる。
【０２３５】
第２に、いくつかの実施形態では、消化された産物を精製して、活性ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを除去する。いくつかの実施形態では、精製は、消化された挿入部分からの活性ＣＲＩＳＰＲ複合体の分離を含む。いくつかの実施形態では、ゲル精製またはカラム精製などのＤＮＡ精製によってこれを行うことができる。他の実施形態では、熱不活化または化学的不活化などによるＣＲＩＳＰＲ不活化によって精製を行うことができる。
【０２３６】
第３に、いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ消化された挿入部分をｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼとインキュベートして、２つの挿入ＤＮＡ部分の間に重複する付着末端を作出する。
【０２３７】
第４に、消化された挿入部分を、ＣＲＩＳＰＲ複合体／エキソヌクレアーゼ消化によって作出された適合性付着末端のハイブリッド形成に適切な条件でインキュベートする。次いで、ハイブリッド形成された末端を、任意の公知のライゲーション法（本開示の最初の部分に記載の方法が含まれる）にしたがってライゲーションする。いくつかの実施形態では、ハイブリッド形成された部分を、ライゲーション前に任意の欠損した配列ギャップを満たすためにポリメラーゼとインキュベートする。
【０２３８】
架橋によるアセンブリ
他の実施形態では、本開示は、挿入部分の消化されたｃＴＡＧ配列と重複する架橋配列を含む第３のＤＮＡ配列の付加によるＣａｓ９消化された部分のギブソンアセンブリを教示する。
【０２３９】
この実例では、両方の挿入部分を、同一のＣＲＩＳＰＲランディング部位を標的にする同一のＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ複合体で消化する。この実施形態では、得られた消化されたｃＴＡＧは、重複配列を持たない。したがって、いくつかの実施形態では、第３のステップは、３’または５’オーバーハングのいずれかを作出するためにｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼでさらに消化されるべきＣａｓ９消化された挿入部分のためのものである。次いで、エキソヌクレアーゼ消化された挿入部分を、ＣＲＩＳＰＲ複合体およびエキソヌクレアーゼ消化の組み合わせによって作出された適合性付着末端のハイブリッド形成に適切な条件下で架橋配列とインキュベートする。次いで、ハイブリッド形成された末端を、任意の公知のライゲーション法（本開示の最初の部分に記載の方法が含まれる）にしたがってライゲーションする。いくつかの実施形態では、本開示のエキソヌクレアーゼを、第２のステップ前に行う。
【０２４０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＨＤＲ
他の実施形態では、本開示は、ＨＤＲ複合体を用いてＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼによって消化された挿入部分のＤＮＡの末端をｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブリする方法であって、それにより、前記消化された挿入部分の組換えを誘発する、方法を教示する。
【０２４１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え
いくつかの実施形態では、本開示のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＤＮＡアセンブリを、下記のＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体またはＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて行う。１つの実施形態では、少なくとも１つの共有ｃＴＡＧを有する２またはそれを超える挿入部分を、宿主細胞に導入する。いくつかの実施形態では、相同な共有ｃＴＡＧ配列を有するＤＮＡ挿入部分の存在は、相同組換えアセンブリ（例えば、酵母相同組換え）を誘発するのに十分である。
【０２４２】
例えば、いくつかの実施形態では、２つの挿入ＤＮＡ部分の間の少なくとも１つの共有ｃＴＡＧ配列をアセンブリして、線状構築物を産生することができる。この例示的な実施形態では、２つの残存する外側のｃＴＡＧを、細胞内の別のベクターのｃＴＡＧと組換える（例えば、既存のプラスミドまたは染色体への挿入）ようにデザインすることもできる。他の実施形態では、２つの部分を、２つの挿入ＤＮＡ部分の間の第２の共有ｃＴＡＧの組換えによって環状構築物にさらにアセンブリすることができる。アセンブリした構築物を、アセンブリのために使用した生物において使用することができるか、いくつかの実施形態では、精製して、第２の生物に形質転換することができる（例えば、酵母におけるアセンブリおよびその後の細菌への形質転換）。
【０２４３】
他の実施形態では、共有ｃＴＡＧを有する１またはそれを超える挿入部分を、宿主細胞への導入前に消化することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、放出された部分のｉｎ  ｖｉｖｏアセンブリ前により大きなベクターから挿入部分を放出させるためのＣＲＩＳＰＲ消化を教示する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９を用いて消化する。他の実施形態では、Ｃｐｆ１を用いて消化する。他の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼを用いて消化する。いくつかの実施形態では、挿入部分のＣＲＩＳＰＲ消化を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。いくつかの実施形態では、アセンブリ宿主細胞への挿入部分の形質転換前に、消化産物を精製して活性ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを除去する。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、精製ステップを、ゲル精製またはカラム精製などのＤＮＡ精製によって行うことができる。他の実施形態では、熱不活化または化学的不活化などによるＣＲＩＳＰＲ不活化によって精製を行うことができる。
【０２４５】
ｉｎ  ｖｉｖｏライゲーション
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼによる再切断から挿入部分を保護する方法を教示する。いくつかの実施形態では、本開示の挿入部分を、ＤＮＡ配列の化学修飾を介してエンドヌクレアーゼ切断から保護してよい。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを教示する。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、多部分ＤＮＡアセンブリに特に有用である。
【０２４７】
本明細書の図２Ａは、本開示の方法にしたがった多部分ＤＮＡアセンブリの実例を提供する。この例では、各々が２つのｃＴＡＧ（タグＡ〜Ｈ）を有する一連の８つのＤＮＡ部分（部分１〜８）がｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み合わされており、次いで、自己アセンブリすることが可能である（上記のように、ｉｎ  ｖｉｖｏでの相同組換えまたはライゲーションのいずれかによる）。
【０２４８】
ＤＮＡ編集法
いくつかの実施形態では、本開示は、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を編集する方法を教示する。いくつかの実施形態では、本開示のＤＮＡ編集方法は、上記のＤＮＡアセンブリ法と同一の原理を適用するが、１またはそれを超える既存のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を編集することを目的とする。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、本開示のＤＮＡ編集方法をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、ｉ）モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物および少なくとも１つの挿入ＤＮＡ部分を、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ複合体と共に含む混合物を形成するステップ、およびｉｉ）前記混合物を、挿入ＤＮＡのｃＴＡＧ、および対応するモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物ｃＴＡＧのＣＲＩＳＰＲ消化条件下でインキュベートするステップ、その後に、ｉｉｉ）前記ｃＴＡＧの各々の消化によって産生された適合性付着末端（Ｃｐｆ１の場合）をハイブリッド形成するステップ、およびｉｖ）前記ハイブリッド形成した末端（すなわち、Ｃａｓ９を使用する場合、平滑末端）を相互にライゲーションして新規の組換え核酸を作出するステップを教示する。いくつかの実施形態では、ステップｉｉｉ）のハイブリッド形成の前にエキソヌクレアーゼ処理を行う（以後の節に記載の二重ＣＲＩＳＰＲ消化のために）。いくつかの実施形態では、本開示の消化を、挿入部分のＤＮＡおよびモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物について個別に行う。いくつかの実施形態では、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物のみをＣＲＩＳＰＲ複合体で消化する。
【０２５０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｐｆ１
いくつかの実施形態では、本開示のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ編集方法を、下記のＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて行う。第１に、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物および少なくとも１つの挿入ＤＮＡ部分を、挿入部分のｃＴＡＧを標的にするＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体、およびモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内のその対応するタグとインキュベートする。いくつかの実施形態では、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡおよび挿入部分のＤＮＡの消化を個別の反応で行う。
【０２５１】
第２に、いくつかの実施形態では、消化された産物を精製して、活性ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを除去する。いくつかの実施形態では、精製は、消化されたヌクレオチドからの活性Ｃｐｆ１複合体の分離を含む。いくつかの実施形態では、ゲル精製またはカラム精製などのＤＮＡ精製によってこれを行うことができる。他の実施形態では、熱不活化または化学的不活化などによるＣｐｆ１不活化によって精製を行うことができる。
【０２５２】
第３に、消化されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物および挿入部分を、Ｃｐｆ１複合体によって作出された適合性付着末端のハイブリッド形成に適切な条件でインキュベートする。次いで、ハイブリッド形成された末端を、任意の公知のライゲーション法（本開示の最初の部分に記載の方法が含まれる）にしたがってライゲーションする。
【０２５３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃａｓ９
他の実施形態では、本開示のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ編集方法を、下記のＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて行う。第１に、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物および少なくとも１つの挿入ＤＮＡ部分を、挿入部分のｃＴＡＧを標的にするＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ複合体、およびモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内のその対応するタグとインキュベートする。いくつかの実施形態では、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡおよび挿入部分のＤＮＡの消化を個別の反応で行う。
【０２５４】
第２に、いくつかの実施形態では、消化された産物を精製して、活性ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを除去する。いくつかの実施形態では、精製は、消化されたヌクレオチドからの活性Ｃａｓ９複合体の分離を含む。いくつかの実施形態では、ゲル精製またはカラム精製などのＤＮＡ精製によってこれを行うことができる。他の実施形態では、熱不活化または化学的不活化などによるＣａｓ９不活化によって精製を行うことができる。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９消化産物の第３のステップは、平滑末端ライゲーションに適切な条件で挿入部分をインキュベートすることである。
【０２５６】
ギブソン編集
他の実施形態では、本開示はまた、ＣＲＩＳＰＲ消化された構築物および／またはインタクトな重複ｃＴＡＧ配列を含む未消化挿入部分の配列のギブソンアセンブリタイプの編集方法を教示する。したがって、いくつかの実施形態では、第３のステップは、３’または５’オーバーハングのいずれかを作出するための、ｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼでさらに消化されるべきＣａｓ９消化したモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物および挿入部分（複数可）のためのステップである。いくつかの実施形態では、本開示は、ｓｓＤＮＡ消化前に非ＣＲＩＳＰＲ消化した挿入部分を短縮するためのｄｓＤＮＡエキソヌクレアーゼ消化を教示する。
【０２５７】
次いで、エキソヌクレアーゼ消化されたＤＮＡ切片を、ＣＲＩＳＰＲ複合体およびエキソヌクレアーゼ消化の組み合わせによって作出された適合性付着末端のハイブリッド形成に適切な条件下でインキュベートする。次いで、ハイブリッド形成された末端を、任意の公知のライゲーション法（本開示の最初の部分に記載の方法が含まれる）にしたがってライゲーションする。いくつかの実施形態では、ハイブリッド形成されたＤＮＡを、ライゲーション前に欠損したＤＮＡ切片を満たすためにポリメラーゼとインキュベートする。いくつかの実施形態では、本開示のエキソヌクレアーゼ消化を、ＣＲＩＳＰＲ不活化ステップ前に行う。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、消化された配列のライゲーションは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じ得る。
【０２５９】
他の実施形態では、本開示は、ＨＤＲ複合体を用いてＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼによって消化されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物の末端および少なくとも１つの未消化の挿入物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブリする方法であって、それにより、前記消化されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物および少なくとも１つの挿入ＤＮＡ部分の組換えを誘発する、方法を教示する。
【０２６０】
本開示のＤＮＡ編集方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ挿入部分は、第２のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内に含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＤＮＡ編集方法は、一方のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物からの他方へのＤＮＡ挿入部分の移行を含む。
【０２６１】
宿主細胞中でのＣＲＩＳＰＲ活性をモジュレートするためのモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物の使用
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞中でＣＲＩＳＰＲ活性をモジュレートするための組成物および方法を教示する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を教示し、ここで、前記構築物はＣＲＩＳＰＲ機能の１またはそれを超えるモジュレーターのための核酸を含む。
【０２６２】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＲＩＳＰＲ機能のモジュレーター」は、染色体外ベクター中に存在する場合、または、宿主細胞のゲノムに組み入れられる場合に、宿主細胞中でＣＲＩＳＰＲ活性を改変（例えば、増加または減少）する任意の配列を指すと広く解釈すべきである。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ機能のモジュレーターが、複製起点、選択マーカー、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質、プロモーター、ターミネーター、ｄＣａｓタンパク質、ｄＣｐｆ１タンパク質、バーコード、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、ＤＮＡドナー、および多重化を容易にするタンパク質からなる群から選択されることを教示する。
【０２６３】
特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ機能のモジュレーターは、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質である（Ｐａｗｌｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，‘‘Ａｎｔｉ−ＣＲＩＳＰＲ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ’’Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  １６，Ｊａｎ  ２０１８，ｐｐ  １２−１６）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ適応免疫系は、細菌および古細菌で広く認められる。しかしながら、最近の研究において、ＣＲＩＳＰＲシステムが細菌免疫の長期的な進化に及ぼす影響が最小であることが示されており、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ免疫回避においてファージおよび他の可動遺伝因子を補助する抗ＣＲＩＳＰＲ因子の存在が示唆される。
【０２６４】
現在までに、タイプＩおよびタイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに対して記載された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、２１の固有のファミリーが存在している。過去数年にわたり、遺伝子研究、生化学研究、および構造研究の組み合わせの使用によっていくつかの抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質についての作用機序が決定されている。いくつかの抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＤＮＡ結合の干渉によってＣＲＩＳＰＲ酵素機能を負に制御する。他の抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質はＣＲＩＳＰＲ酵素の二量体化を誘発するため、遺伝子編集への有用性が低い。さらに他の抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質はＣＲＩＳＰＲ酵素のエンドヌクレアーゼ活性を遮断するため、二本鎖ＤＮＡ切断を作製する能力が低い。いくつかの実施形態では、本開示は、ネイティブＣＲＩＳＰＲシステムに影響を及ぼすか、外因性に付加したＣＲＩＳＰＲ複合体の影響をさらに改変することによって宿主ＣＲＩＳＰＲ活性をモジュレートするための抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の使用を教示する。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ機能のモジュレーターを、宿主細胞中のＣＲＩＳＰＲ活性を「微調整する」ために使用する。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ機能のモジュレーターを、宿主細胞中のＣＲＩＳＰＲ活性を低下させるために使用する。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ機能のモジュレーターを、宿主細胞中のＣＲＩＳＰＲ活性を増加させるために使用する。
【０２６６】
１つの実例では、本開示は、宿主細胞の形質転換率を改善するための抗ＣＲＩＳＰＲ酵素の使用を教示する。いくつかの種では、ＣＲＩＳＰＲは、形質転換への障壁を表す。本開示は、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の使用によってＣＲＩＳＰＲベースの先天免疫を取り除くと、遺伝子操作を受け入れることが可能ないくつかの微生物種を作製することができることを教示する。最近の報告では、ファージ由来の種々の抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質が記載されている（Ｂｏｎｄｙ−Ｄｅｎｏｍｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１３  Ｎａｔｕｒｅ  ４９３：４２９−４３２）。形質転換への障壁を克服するための抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の使用は、以下のいくつかの利点がある：第１に、宿主生物中のＣＲＩＳＰＲシステムの存在を、ゲノムＤＮＡ配列分析によって容易に決定することができること。第２に、抗ＣＲＩＳＰＲの共発現に宿主ゲノムの経験的操作が必要ないこと。第３に、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の誘導発現により、プラスミドをネガティブ選択することが可能であること（すなわち、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質発現が遮断されたときにプラスミドがＣＲＩＳＰＲ依存様式で破壊される）。
【０２６７】
１つの実施形態では、目的の１種の抗生物質耐性遺伝子および抗生物質耐性遺伝子（複数種可）と共に１種または複数種の抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードするプラスミドを、新規の宿主に形質転換し、形質転換体を、抗生物質耐性に基づいて選択する。抗生物質耐性クローンの存在および抗ＣＲＩＳＰＲ遺伝子発現がオフになったときの抗生物質耐性の喪失は、形質転換障壁が有効に排除されたことを示す表現型である。第２の実施形態では、遺伝子発現が確立する前にプラスミドが活性ＣＲＩＳＰＲシステムによって制限されないことを確実にするために、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質を前記プラスミドで共形質転換する。本開示の組成物および方法と適合する抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の非限定的なリストを、表３に提供する。
【表３−１】
2021533773.tif 000010
【表３−２】
2021533773.tif 000011
【表３−３】
2021533773.tif 000012
【０２６８】
ＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａへの適用におけるモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物の使用
緒言／背景
代謝操作は、分子の代謝、制御、および異化に直接的および間接的の両方において関与する重要遺伝子の変更に依拠するところが大きい。例えば、代謝経路の競合で使用される補因子または代謝前駆体の抜き取りに関与する遺伝子の発現を減少させるのに有用であることが多い。しかしながら、メタボロームの複雑さが下方制御に必要な正確な遺伝子および細胞毒性を制限しながら収量を増加させるために必要な至適下方制御量の両方を経験的に予想することを困難にしている。代謝産物産生における上位性または非相加的な性質または複数の遺伝子の変化が、有利であり得る変化のセットの予測をさらに複雑にする。
【０２６９】
したがって、制御ネットワークの迅速でハイスループットな試料採取が可能なテクノロジーおよび方法論が非常に必要とされている。発現を変更することができるストラテジーは多数存在する。遺伝子コピー数の変更、遺伝子の好ましいコドン使用頻度の変化、遺伝子を駆動するプロモーター強度の変化、ｍＲＮＡのリボゾーム結合部位の変更、およびｍＲＮＡ転写物の制御の全てが遺伝子発現の変化をもたらすために使用されている。しかしながら、これらの変化の各々が、遺伝子変更に依拠する。使用される生物に応じて、ゲノム編集は、時間がかかり、労力を要し、しばしば非効率的なプロセスである。この両方が、試験することができる変化の範囲を制限し、多くの生物において、複数のゲノムの変化が同時に多発するのを阻止する。
【０２７０】
遺伝子変更の代替手段として、多くの研究者は、原核生物において転写を抑制するために触媒的に不活化されたＣａｓ９（ｄＣａｓ９）を使用している。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの原核生物では、プロモーターまたは遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）に向けられたｄＣａｓ９は、転写の開始および伸長を遮断することができる。また、最近の刊行物では、触媒的に不活化されたｄＣａｓ９遺伝子に転写活性化サブユニットを融合することによって遺伝子を上方制御することができることが示唆されている。下方制御のために異なる遺伝子を標的するガイドＲＮＡのライブラリーは、変化を有利にするためにスクリーニングまたは選択されている。最後に、原核生物遺伝子の活性化は、Ｅ．ｃｏｌｉではロースループットであることが実証されている。
【０２７１】
しかしながら、首尾の良いハイスループットの代謝操作キャンペーンにこれらのテクノロジーを統合する必要がある。さらに、これらの異なるストラテジーを組み合わせ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの非標準の生物に適用する必要がある。巨大な一連のｄＣａｓ９によるガイドＲＮＡライブラリーを代謝操作キャンペーンに適用するニーズは満たされていない。
【０２７２】
本開示は、試験することができる転写撹乱の数を大いに増加させる一方で、行う必要のある労力を要する遺伝子変更の数を低減するスクリーニングツールとしてのＣａｓ９またはｄＣａｓ９の使用を記載する。本開示は、ＣＲＩＳＰＲｉ／ＣＲＩＳＰＲａに適用するための本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物の能力および柔軟性を活用することによってこれらの懸念に対処する。これらのアプローチを、単独で使用してよく、または、ある特定の実施形態では、宿主ゲノム配列由来の発現を制御し、また、ゲノム配列を改変するために、ゲノム改変のためのＣＲＩＳＰＲアプローチと組み合わせることができる。例えば、本開示の構築物は、活性または不活性なＣＲＩＳＰＲタンパク質の両方をコードするＤＮＡを含むことができるか、異なる構築物が異なるＣＲＩＳＰＲ（例えば、不活性および活性な）ＣＲＩＳＰＲ形態を含む複数の構築物を産生することができる。
【０２７３】
技術の概要
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲｉ（ＣＲＩＳＰＲ干渉）およびＣＲＩＳＰＲａ（ＣＲＩＳＰＲ活性化）テクノロジーを介した宿主細胞遺伝子の発現をモジュレートする方法を教示する。いくつかの実施形態では、本開示のテクノロジーは、もはや二本鎖ＤＮＡ切断を生成しないように変異されているが、依然としてＤＮＡ標的部位に、その対応するガイドＲＮＡによって結合することができる触媒的に不活化された（すなわち、ヌクレアーゼ非活性化）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを利用する。いくつかの実施形態では、本開示は、これらの触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素を、「デッドＣＲＩＳＰＲ」、または「ｄＣＲＩＳＰＲ」酵素と称する。特異的ＣＲＩＳＰＲ酵素（デッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）またはデッドＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）など）の言及において修飾語「デッド（dead）」を使用してもよい。
【０２７４】
いかなる１つの理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、本テクノロジーのｄＣＲＩＳＰＲ酵素が、ガイドＲＮＡを介して触媒的に不活化されたｄＣＲＩＳＰＲ酵素を標的ＤＮＡ配列に動員し、それにより、ｄＣＲＩＳＰＲ酵素が宿主細胞の特定の遺伝子の転写機構と相互作用することを可能にすることによって機能すると考える。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲｉ法は、転写に必要な標的ＤＮＡ配列を占有し、それによって標的にされた遺伝子の転写を遮断するｄＣＲＩＳＰＲ酵素を利用する（Ｌ．Ｓ．Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，‘‘Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．’’Ｃｅｌｌ．１５２，１１７３−１１８３（２０１３）；Ｌ．Ａ．Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，‘‘ＣＲＩＳＰＲ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．’’Ｃｅｌｌ．１５４，４４２−４５１（２０１３）も参照のこと）。他の実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲｉ法は、翻訳的に融合されるか、１またはそれを超える転写抑制ドメインに係留されるｄＣＲＩＳＰＲ酵素を利用するか、あるいは、転写抑制ドメインを（例えば、以下に考察のように、アプタマーを介して係留された）標的部位に動員することができる改変されたガイドＲＮＡを利用する。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲａ法は、ガイドＲＮＡがプロモーター領域に向かわせることができる異なる転写活性化ドメインに翻訳的に融合されるか、そうでなければ係留されるｄＣＲＩＳＰＲ酵素を使用する（Ａ．Ｗ．Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，‘‘Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−ｏｎ，ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ．’’Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３，１１６３−１１７１（２０１３）を参照のこと；Ｌ．Ａ．Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，‘‘Ｇｅｎｏｍｅ−Ｓｃａｌｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．’’Ｃｅｌｌ．１５９，６４７−６６１（２０１４）も参照のこと）。他の実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲａ法は、（例えば、以下に考察されるように、アプタマーを介して係留された）標的遺伝子の発現を上方制御するためにさらなる転写活性化ドメインを動員する改変されたガイドＲＮＡを利用する。
【０２７７】
さらに他の実施形態では、本開示の発明は、他の制御因子を標的ＤＮＡ部位に動員するためのｄＣＲＩＳＰＲ酵素およびガイドＲＮＡの開発も想定する。上記で考察している転写リプレッサーまたは活性化ドメインの動員に加えて、本開示のｄＣＲＩＳＰＲ酵素およびガイドＲＮＡを、ＤＮＡメチル化、クロマチンリモデラー、ユビキチン化、ｓｕｍｏ化の範囲の活性を有するタンパク質を動員するように改変することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のｄＣＲＩＳＰＲ酵素およびガイドＲＮＡを、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、脱アミノ化活性、ジムスターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、グルコシラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ｓｕｍｏ化活性、脱ｓｕｍｏ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、リモデリング活性、プロテアーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ヒドロラーゼ活性、リアーゼ活性、イソメラーゼ活性、シンターゼ活性、シンテターゼ活性、脱ミリストイル化活性、シチジンデアミナーゼ活性、およびこれらの任意の組み合わせを有する因子を動員するように改変することができる。
【０２７８】
他の実施形態では、本開示のｄＣＲＩＳＰＲ酵素およびガイドＲＮＡを、１種または複数種のマーカー遺伝子／組成物（蛍光タンパク質、金粒子、放射性同位体、ＧＵＳ酵素、または検出され得る他の公知の生物学的組成物もしくは合成組成物など）を動員するように改変することができる。この最後の実施形態により、研究者は宿主細胞のゲノム領域をタグ化および追跡することが可能である。本明細書中で使用される場合、用語「シス制御因子」は、本開示のｄＣＲＩＳＰＲまたはガイドＲＮＡによって動員することができる生物学的組成物または合成組成物のうちのいずれかを指す。
【０２７９】
ハイスループットＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａベクター
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞のハイスループットＣＲＩＳＰＲｉ／ＣＲＩＳＰＲａ遺伝子操作のためのベクター、キット、および方法を教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、本出願で考察されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物が効率的にゲノム全域にわたって遺伝子発現を改変する（増加または減少させる）能力を活用する。いくつかの実施形態では、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれを超える遺伝子の発現を一度にモジュレートする（増加または減少させる）ことができる。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示のＣＲＩＳＰＲｉまたはＣＲＩＳＰＲａシステムをコードする核酸を含むモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物を教示する。いくつかの実施形態では、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物は、ｉ）ｄＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする第１の核酸配列、およびｉｉ）ｄＣＲＩＳＰＲ酵素をＤＮＡ標的部位に動員することができるガイドＲＮＡをコードする第２の核酸を含む。他の実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲａ／ＣＲＩＳＰＲｉシステムの１またはそれを超える部分を、これらの部分が宿主中にすでに存在するか、そうでなければ、個別のベクターによって提供されることになっている場合、ベクターから除外してよいことを教示する。したがって、いくつかの実施形態では、モジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物は、ｄＣＲＩＳＰＲ酵素をコードしない。他の実施形態では、モジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物は、ガイドＲＮＡをコードしない。
【０２８１】
当業者は、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物が２種以上のｄＣＲＩＳＰＲ酵素および／または２種以上のガイドＲＮＡをコードし得ることを認識する（例えば、図１８Ａ〜Ｂを参照のこと）。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、ｄＣＲＩＳＰＲ酵素および／またはガイドＲＮＡをコードする核酸は、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物の１またはそれを超える挿入部分に含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物により、使用者が、異なるガイドＲＮＡ（例えば、異なる遺伝子を標的にするガイドＲＮＡ）をコードするか、上記で考察のように異なるシス制御因子を動員することができるアプタマーをコードするか、異なるｄＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、上記で考察のように、種々のシス制御因子とのｄＣａｓ９、またはｄＣｐｆ１、またはｄＣＲＩＳＰＲタンパク質の融合物）をコードする挿入部分を付加するか差し引くように構築物を迅速かつ効率的に改変することが可能になる。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、本開示は、モジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物の挿入部分が単一のコード配列のみを含むことを教示する。すなわち、いくつかの実施形態では、本開示の挿入部分は、単一のｄＣＲＩＳＰＲのみをコードするか、単一のガイドＲＮＡのみをコードする。他の実施形態では、本開示は、所望の遺伝子の組み合わせを有する挿入部分を教示する。例えば、いくつかの実施形態では、挿入部分を、複数のガイドＲＮＡ（生合成経路中の２またはそれを超える遺伝子を標的にするガイドＲＮＡなど）をコードするようにデザインすることができる。他の実施形態では、単一の挿入部分を、２種以上のｄＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするようにデザインすることができる。いくつかの実施形態では、他の遺伝子はまた、ガイドＲＮＡまたはｄＣＲＩＳＰＲ酵素のいずれかと組み合わせてコードされ得る。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、本開示の挿入部分は、例えば、挿入部分を含む細胞を同定するために構築物によってコードされる１またはそれを超える成分と関連し得る（すなわち、その存在を実証するために使用することができる）選択マーカーをコードするようにデザインされる。したがって、いくつかの実施形態では、挿入部分を、特定のｄＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列と共に選択マーカーを含むようにデザインすることができる。本開示は、挿入部分のブロック（例えば、特異的生合成経路を標的にするガイドＲＮＡのブロック、または１種または複数種のシス制御因子をコードする挿入部分のブロックなど）の選択のための選択マーカーの使用をさらに想定する。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、本開示の挿入部分は、挿入部分の発現に必要な全てのエレメントを含む、自己完結型であるようにデザインされる。すなわち、いくつかの実施形態では、本開示の挿入部分は、宿主細胞機序によって発現されるべき挿入部分に必要な全てのプロモーターおよび／またはターミネーターを含む（必ずしもプラスミドの維持に必要な複製起点または選択マーカーをカウントしない）。他の実施形態では、本発明の挿入部分の発現は、異なる挿入部分中に配置されたプロモーター配列またはターミネーター配列（挿入部分をコードする遺伝子のすぐ上流に配置された配列、または単一の挿入部分中の、または１つを超える挿入部分にわたる多シストロン性ｍＲＮＡをコードする核酸の最初に配置された配列など）に依拠する。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、本開示は、モジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物の１またはそれを超える挿入部分の発現を駆動するための誘導性プロモーターの使用を教示する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、ｄＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸の発現を駆動するための誘導性プロモーターの使用を教示する。他の実施形態では、本開示は、ガイドＲＮＡをコードする核酸の発現を駆動するための誘導性プロモーターの使用を教示する。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、モジュラーｃＴＡＧベクターの全ての機能的部分（例えば、全ての起点、マーカー、カーゴ、プロモーター、ターミネーター、およびアセンブリに必要な全てのエレメント）が挿入ＤＮＡ部分に含まれ、これらの部分を、本開示のＤＮＡアセンブリまたは遺伝子編集方法によって容易に交換することができる。したがって、特定の実施形態では、本開示のモジュラー構築物は、ｄＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸に作動可能に連結された異なるプロモーターまたはターミネーターの迅速な切り替えおよび試験が可能である。他の具体的な実施形態では、本開示のモジュラー構築物は、ｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸に作動可能に連結された異なるプロモーターまたはターミネーターの迅速な切り替えおよび試験が可能である。
【０２８８】
複製起点
いくつかの実施形態では、本開示は、１またはそれを超える種内でプラスミドを維持する（すなわち、複製し続ける）ための複製起点の使用を教示する。当業者は、種々の利用可能な複製起点配列に精通している。細菌、古細菌、真核生物、および多細胞生物の複製起点に共通の特徴は、Ｌｅｏｎａｒｄ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｌｉ，‘‘ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｒｉｇｉｎｓ’’Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２０１３  Ｏｃｔ；５（１０）で考察されている。共通の複製起点の非限定的なリストを、以下の表４に提供する。
【表４】
2021533773.tif 000013
【０２８９】
シス制御因子（転写モジュレーター）の係留
いくつかの実施形態では、本開示は、転写モジュレーターの使用を教示する。したがって、いくつかの実施形態では、シス制御因子は転写モジュレーターである。いくつかの実施形態では、転写モジュレーターは、本開示のＣＲＩＳＰＲｉ／ＣＲＩＳＰＲａ法によって標的にされた遺伝子の発現をさらに抑制するか、あるいは、活性化する能力に基づいて選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、転写モジュレーターのｄＣＲＩＳＰＲ酵素でつなぐことまたはそれと翻訳的に融合すること（すなわち、融合構築物の使用による）を教示する。
【０２９０】
融合構築物は、一般に、標準的な技術を使用して調製され得る。例えば、ペプチド成分をコードするＤＮＡ配列は、個別にアセンブリされ、挿入部分などの適切な構築物にライゲーションされ得る。ライゲーションされたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳制御エレメントに作動可能に連結される。あるペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’または３’末端は、ペプチドリンカーを用いるか用いずに、配列の読み枠が一致するように第２のペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’または５’末端にそれぞれライゲーションされる。これにより、両方のペプチド成分の生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質に翻訳可能である。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、ｄＣＲＩＳＰＲ酵素および転写モジュレータードメインは、ペプチドリンカーを介して連結される。ペプチドリンカー配列は、確実に各ペプチドがその二次構造および三次構造に折りたたまれるのに十分な距離で、第１および第２のペプチド成分が分離するために使用されてよい。かかるペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を使用して、融合タンパク質に組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の要因に基づいて選択され得る：（１）柔軟性の拡張高次構造をとる能力；（２）第１および第２のペプチド上の機能性領域と相互作用することができる二次構造をとる能力；および（３）ペプチド機能性領域と反応し得る疎水性残基または荷電残基の欠如。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基、およびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａなどの他の中性付近のアミノ酸を、リンカー配列中に使用してもよい。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、本開示は、転写モジュレータードメインをｄＣＲＩＳＰＲに係留するためのタンパク質間相互作用ドメインの使用を教示する。したがって、いくつかの実施形態では、ｄＣＲＩＳＰＲ酵素の配列は、転写モジュレーター（または他のシス制御因子）に翻訳的に融合される第２のタンパク質間相互作用ドメイン（ＰＰ２）と二量体化することができる第１のタンパク質間相互作用ドメイン（ＰＰ１）に翻訳的に融合される。ｄＣＲＩＳＰＲ−ＰＰ１およびＰＰ２−転写モジュレーターの各々は発現された場合に二量体化するため、転写モジュレーターをＤＮＡ標的部位に動員する。当業者は、ｉｎ−ｖｉｖｏ二量体を作出するための天然に存在するか、合成のタンパク質間相互作用ドメインの使用方法を承知している（Ｇｉｅｓｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６‘‘Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒｓ．’’Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ２：２００６．００１１を参照のこと）。
【０２９３】
他の実施形態では、本開示はまた、１種または複数種のシス制御因子を動員することができるＲＮＡアプタマーを有する改変されたガイドＲＮＡを教示する。本開示のＲＮＡアプタマーは、ガイドＲＮＡの５’または３’末端に作動可能に連結され得、ＤＮＡ標的部位へのｄＣＲＩＳＰＲ結合に影響を及ぼさないようにデザインされる。その代わりに、ＲＮＡアプタマーは、１種または複数種のシス制御因子（転写モジュレーターなど）を動員するためのさらなる係留部位を提供する。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、本開示は、１種または複数種のシス制御因子と直接相互作用するようにデザインされた専用のＲＮＡアプタマーを教示する。他の実施形態では、本開示は、特異的配列を標的にする公知のアプタマーの使用を教示する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、検証済みのＲＮＡアプタマーを有するガイドＲＮＡを想定し、アプタマーは次にその天然の標的に結合し、次に１種または複数種のシス制御因子に翻訳的に融合される（すなわち、ガイド＿ＲＮＡ−アプタマー−アプタマー＿標的−シス＿制御＿因子）。いくつかの実施形態では、シス制御因子を係留するためのＲＮＡアプタマーを組み込んでいるガイドＲＮＡは、足場ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）と称されている（Ｚａｌａｔａｎ  ＪＧ，ｅｔ  ａｌ．‘‘Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．’’Ｃｅｌｌ．２０１５；１６０：３３９−３５０）。ｓｃＲＮＡは、直交作用するタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを用いてガイドＲＮＡ配列を伸長することによってデザインされる。各ｓｃＲＮＡは、ＤＮＡ標的認識および特異的なリプレッサータンパク質またはアクチベータータンパク質の動員の両方に関する情報をコードすることができる。モジュラー様式でＤＮＡターゲティング配列またはＲＮＡアプタマーを変化させることにより、複数のｄＣａｓ９−ｓｃＲＮＡは、同一細胞中で複数の遺伝子を同時に活性化するか抑制することができる。
【０２９５】
例えば、ＭＳ２アプタマーをガイドＲＮＡに付加することによって、相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）システムと称される改良が行われた。ＭＳ２アプタマーは、ｐ６５ＡＤおよび熱ショック因子１（ＨＳＦ１）に融合した同族ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）を動員するようにデザインされていた（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６‘‘Ｂｅｙｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ；ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ’’Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌ  Ｂｉｏｌ  Ｊａｎ  １７（１）５−１５）。ＳＡＭテクノロジーは、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４と共に、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４のみと比較して内因性遺伝子活性化をさらに増加させ、１０個の遺伝子を同時に活性化させることが示された（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．‘‘Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｃｏｍｐｌｅｘ．’’Ｎａｔｕｒｅ．２０１４；５１７：５８３−５８８）。他の検証済みのアプタマー−足場タンパク質組み合わせ（ＰＰ７またはｃｏｍなど）の使用によって類似の結果が達成され得る（Ｚａｌａｔａｎ  ＪＧ，ｅｔ  ａｌ．‘‘Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．’’Ｃｅｌｌ．２０１５；１６０：３３９−３５０）。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、本開示はまた、ｄＣＲＩＳＰＲ酵素を１種または複数種のシス制御因子に係留することができる両側性アプタマーの使用を想定する。本開示の両側性アプタマーは、上記で考察したアプタマーと同様に機能するが、ｄＣＲＩＳＰＲタンパク質およびシス制御因子の両方に結合することができる。１つの実例では、ｄＣＲＩＳＰＲ酵素はＭＳ２コートタンパク質ドメインに翻訳的に融合され、シス制御エレメント（ＶＰ１６ドメイン）はＰＰ７ドメインに翻訳的に融合される。両側性ＲＮＡアプタマーは、一方の末端にＭＳ２結合ドメインを含み、ＰＰ７結合ドメインを他方の末端に含む。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の両側性アプタマーは、以下の遺伝子構造を形成すると予想される：ｄＣＲＩＳＰＲ−アプタマー＿標的−アプタマー＿サイド１−アプタマー＿サイド２−アプタマー＿標的−シス＿制御＿因子。
【０２９７】
本開示の発明に適合する転写活性化ドメインの非限定的なリストは、以下を含む：ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ１６０、ＥＢＮＡ２、Ｅ１Ａ、Ｇａｌ４、Ｏａｆ１、Ｌｅｕ３、Ｒｔｇ３、Ｐｈｏ４、Ｇｌｎ３、Ｇｃｎ４、Ｇｌｉ３、Ｐｉｐ２、Ｐｄｒ１、Ｐｄｒ３、Ｌａｃ９、Ｔｅａ１、ｐ５３、ＮＦＡＴ、Ｓｐ１（例えば、Ｓｐ１ａ）、ＡＰ−２（例えば、Ａｐ−２ａ）、Ｓｏｘ２、ＮＦ−κＢ、ＭＬＬ／ＡＬＬ、Ｅ２Ａ、ＣＲＥＢ、ＡＴＦ、ＦＯＳ／ＪＵＮ、ＨＳＦ１、ＫＬＦ２、ＮＦ−１Ｌ６、ＥＳＸ、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ２、ＳＭＡＤ、ＣＴＦ、ＨＯＸ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ４、ＶＰＲ、ＲｐｏＺ、またはＮａｎｏｇの転写制御ドメインの断片および転写制御機能を有するドメインの断片。いくつかの実施形態では、転写アクチベーターはＶＰＲである（Ｋｉａｎｉ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，‘‘Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ，ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ’’Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，１０５１−１０５４（２０１５）を参照のこと）。
【０２９８】
本開示の発明に適合する転写リプレッサーの非限定的なリストは、以下を含む：とりわけ、Ｍｘｉ１、Ｔｂｘ３、ＫＲＡＢ（Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス、Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｊ．Ｆ，ｅｔ  ａｌ．‘‘Ｋｒｕｐｐｅｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂｏｘｅｓ  ａｒｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ．’’Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，４５０９−４５１３（１９９４））、ＥｎＲ、またはＳＩＤ、ＳＩＤ４Ｘ（短いペプチドリンカーによって連結された４つのＳＩＤドメインの縦列反復）、ＰＩＥ−１、ＩＡＡ２８−ＲＤ。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、本開示の転写活性化ドメインは、表５の活性化ドメインを含む。９アミノ酸トランス活性化ドメイン（９ａａＴＡＤ）は、酵母においてＧａｌ４、Ｏａｆ１、Ｌｅｕ３、Ｒｔｇ３、Ｐｈｏ４、ＧＩｎ３、Ｇｃｎ４で示され、哺乳動物においてｐ５３、ＮＦＡＴ、ＮＦ−κＢ、およびＶＰ１６で示される真核生物転写因子の大きなスーパーファミリーに共通する新規のドメインを規定する。（酸性および親水性のトランス活性化ドメインの両方についての）予想される９ａａＴＡＤは、ＥｘＰＡＳｙ（商標）データベースＥＭＢｎｅｔ（商標）データベースからオンラインで入手可能である。
【表５】
2021533773.tif 000014
【０３００】
ガイドＲＮＡ多重化システム
いくつかの実施形態では、本開示は、ガイドＲＮＡ多重化システムの使用を教示する。すなわち、いくつかの実施形態では、本開示は、例えば複数のプロモーターまたは多シストロン性転写物を使用して１つを超えるガイドＲＮＡを発現する方法を教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃｓｙ４マルチプレックスシステムの使用を教示する。Ｃｓｙ４は、過剰発現した場合、２８塩基Ｃｓｙ４認識部位の間に差し込まれたｇＲＮＡを効率的に切断する。また、ＣｐｆＩは、複数のｇＲＮＡをプロセシングすることができる（Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．２０１８．，‘‘Ｈｉｇｈｌｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９  ｇＲＮＡ  ａｒｒａｙｓ’’ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  １３（９）：ｅ０１９８７１４（全ての目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。Ｃｓｙ４または他の多重化システムが発現されない場合、ｇＲＮＡを放出することができず、時間的および／または空間的な調節がシステムに加えられる。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、リボヌクレアーゼ認識部位に挟まれている。リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅと略される）は、ＲＮＡの加水分解を触媒するヌクレアーゼである。リボヌクレアーゼは、エンドリボヌクレアーゼまたはエキソリボヌクレアーゼであり得る。エンドリボヌクレアーゼは、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡのいずれかを切断する。エキソリボヌクレアーゼは、ＲＮＡの５’末端または３’末端のいずれかから末端ヌクレオチドを除去することによってＲＮＡを分解する。いくつかの実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、Ｃｓｙリボヌクレアーゼ認識部位（例えば、Ｃｓｙ４リボヌクレアーゼ認識部位）に挟まれている。Ｃｓｙ４は、特定のＲＮＡ配列を認識し、ＲＮＡを切断し、上流断片は結合状態を維持するエンドリボヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃｓｙリボヌクレアーゼ（例えば、Ｃｓｙ４リボヌクレアーゼ）は、操作した核酸転写物からガイドＲＮＡを放出させるために使用される。したがって、いくつかの実施形態では、細胞を、Ｃｓｙ４または他のＣａｓ６リボヌクレアーゼ認識部位に挟まれたガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む操作された構築物およびＣｓｙ４または他のＣａｓ６リボヌクレアーゼをコードする操作された核酸で共トランスフェクトされる。あるいは、またはさらに、細胞は、Ｃｓｙ４または他のＣａｓ６リボヌクレアーゼを安定に発現し得るか、安定に発現するように改変され得る。いくつかの実施形態では、Ｃｓｙリボヌクレアーゼ（例えば、Ｃｓｙ４リボヌクレアーゼ）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、またはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓに由来する。他のリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ認識部位が本明細書中で企図される（例えば、Ｍｏｊｉｃａ，Ｆ．Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ａｒｃｈａｅａ，Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒｏｄｏｌｐｈｅ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｏｏｓｔ，Ｊｏｈｎ（Ｅｄｓ．），２０１３，ＩＳＢＮ  ９７８−３−６４２−３４６５７−６（前記文献のリボヌクレアーゼ／認識部位に関する主題が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、リボヌクレアーゼ認識部位（例えば、Ｃｓｙ４リボヌクレアーゼ認識部位）は、１０〜５０ヌクレオチド長である。例えば、Ｃｓｙリボヌクレアーゼ認識部位は、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２０〜５０、２０〜４０、または２０〜３０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃｓｙリボヌクレアーゼ認識部位は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、Ｃｓｙリボヌクレアーゼ認識部位（例えば、Ｃｓｙ４リボヌクレアーゼ認識部位）は、２８ヌクレオチド長である。Ｃｓｙホモログも本明細書中で企図される（例えば、Ｍｏｊｉｃａ，Ｆ．Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ａｒｃｈａｅａ，Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒｏｄｏｌｐｈｅ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｏｏｓｔ，Ｊｏｈｎ（Ｅｄｓ．），２０１３，ＩＳＢＮ  ９７８−３−６４２−３４６５７−６（前記文献のリボヌクレアーゼ／認識部位に関する主題が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。米国特許第９，７４５，６１０号および米国特許出願公開第２０１７／０２２４９９号（その各々全体が、全ての目的のために本明細書中で参考として援用される）も参照される。
【０３０３】
発現、精製、および送達
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をコードするベクター、構築物、および核酸配列の方法および組成物を教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質のトランスジェニック発現または一過性発現のためのプラスミドを教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書中に記載の１種または複数種の他のポリペプチド（リガーゼ、リンカー、およびＮＬＳが含まれるが、これらに限定されない）のタンパク質融合物のインフレーム配列を含むキメラのＣａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質をコードするプラスミドを教示する。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、本開示のプラスミドおよびベクターは、Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１タンパク質（複数可）をコードし、本開示のｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ、および／またはドナー挿入配列もコードする。他の実施形態では、操作された複合体の異なる成分を、１種または複数種の別個のプラスミド中でコードすることができる。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、本開示のプラスミドを、複数の種にわたって使用することができる。したがって、ある特定の実施形態では、単一のプラスミドを、挿入部分を複数の種（例えば、複数の細菌種、例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＥ．ｃｏｌｉ）に導入することが可能であるようにデザインすることができる。他の実施形態では、本開示のプラスミドは、形質転換される生物に適合されている。いくつかの実施形態では、本開示の配列を、その遺伝子が編集されることになっている生物中で発現されるようにコドン最適化される。当業者は、遺伝子編集のために適切に発現するプロモーターを使用することの重要性を認識する。いくつかの実施形態では、異なる種のためのプラスミドは、異なるプロモーターが必要である。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、本開示のプラスミドおよびベクターは、目的の細胞中で選択的に発現される。したがって、いくつかの実施形態では、本出願は、異所性プロモーター、組織特異的プロモーター、発生学的に制御されるプロモーター、または誘導性プロモーターの使用を教示する。いくつかの実施形態では、本開示はまた、ターミネーター配列の使用を教示する。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、本開示はまた、Ｃｐｆ１および／またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質を発現および精製する方法を教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、本開示のタンパク質が市販のタンパク質産生および精製キットまたはサービスのうちのいずれかによって産生され得ることを教示する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）、グルタチオンｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、または他の精製タグキメラ融合物を有するベクターへのＣａｓ９および／またはＣｐｆ１のクローニング方法を教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、種々の原核生物および真核生物、ならびに無細胞タンパク質産生系を教示する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１中でのタンパク質発現プラスミドの発現を教示する。いくつかの実施形態では、タンパク質産生系は、タンパク質への有毒作用を低下させるために誘導性である。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、ＩＰＴＧまたはアラビノース誘導系を使用する方法を教示する。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、本開示はまた、アフィニティタグ（Ｈｉｓ−ニッケル、ＧＳＴ−グルタチオンなど）を含む種々のタンパク質精製スキームを教示する。いくつかの実施形態では、本開示は、タンパク質精製のための未変性条件および変性条件の両方を教示する。
【０３０９】
他の実施形態では、本開示は、１またはそれを超えるタンパク質産生サービス（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標）、およびＮｏｖｏＰｒｏｔｅｉｎ（登録商標）が含まれるが、これらに限定されない）によるＣａｓ９および／またはＣｐｆ１の産生を教示する。
【０３１０】
形質転換
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書中に開示のプラスミドおよびベクターの形質転換の使用を教示する。当業者は、本明細書の他の部分に記載の任意の公知のシステムによって、本開示のプラスミドを細胞に形質転換することができることを認識する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、粒子衝突による形質転換、化学的形質転換、アグロバクテリウム形質転換、ナノスパイク形質転換、エレクトロポレーション、およびウイルス形質転換を教示する。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、本開示のベクターを、種々の技術（形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃、またはＴｉ媒介遺伝子移入が含まれる）のうちのいずれかを使用して宿主細胞に導入してもよい。特定の方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，１９８６‘‘Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ’’）。他の形質転換法には、例えば、酢酸リチウム形質転換およびエレクトロポレーションが含まれる（例えば、Ｇｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：６９−７４（１９９２）；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ．１５３：１６３−１６８（１９８３）；およびＢｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４：１８２−１８７（１９９１）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、形質転換された宿主細胞を、組換え宿主株と呼ぶ。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の９６ウェルプレートロボティクスプラットフォームおよび液体処理機を使用した細胞のハイスループット形質転換を教示する。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、本開示は、外因性タンパク質（Ｃｐｆ１／Ｃａｓ９およびＤＮＡリガーゼ）、ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃＲＮＡ／ガイドＲＮＡ）、およびＤＮＡ（挿入ＤＮＡ部分またはモジュラーＣＲＩＳＰＲ構築物）を細胞内に得る方法を教示する。これを達成するための種々の方法は以前に記載されており、タンパク質／ＲＮＡ／ＤＮＡの直接トランスフェクションまたはＤＮＡ形質転換後のＲＮＡおよびタンパク質の細胞内発現が含まれる（Ｄｉｃａｒｌｏ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．‘‘Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．’’Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２０１３）．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１３５；Ｒｅｎ，Ｚ．Ｊ．，Ｂａｕｍａｎｎ，Ｒ．Ｇ．＆Ｂｌａｃｋ，Ｌ．Ｗ．‘‘Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｌｉｎｅａｒ  ＤＮＡｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ：ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｔ４  ｐｈａｇｅ  ｈｏｃ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｖｅｃｔｏｒ．’’Ｇｅｎｅ  １９５，３０３−３１１（１９９７）；Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｓｔａａｈｌ，Ｂ．Ｔ．，Ａｌｌａ，Ｒ．Ｋ．＆Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．‘‘Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｉｍｉｎｇ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．’’Ｅｌｉｆｅ  ３，ｅ０４７６６（２０１４））。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、本開示は、１種または複数種の上記の選択マーカーを用いた形質転換された細胞のスクリーニングを教示する。１つのかかる実施形態では、カナマイシン耐性マーカー（ＫａｎＲ）を含むベクターで形質転換された細胞を、有効量のカナマイシン抗生物質を含む培地にプレートする。カナマイシン添加培地上で視覚可能なコロニー形成単位は、そのゲノム内にベクターカセットが組み込まれていると推定される。所望の配列の挿入を、ＰＣＲ、制限酵素分析、および／または関連挿入部位の配列決定によって確認することができる。
【０３１５】
他の実施形態では、本開示の複合体の一部または全体を、細胞に直接送達させることができる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、本開示のポリペプチドおよび核酸の発現および精製を教示する。当業者は、タンパク質および核酸の多数の精製方法を認識する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドを、細菌系、酵母系、植物細胞系、または動物細胞系などの誘導性または構成性のタンパク質産生系を介して発現することができる。いくつかの実施形態では、本開示はまた、アフィニティタグによるタンパク質もしくはポリペプチドの精製、またはカスタム抗体精製を教示する。他の実施形態では、本開示はまた、ポリヌクレオチドの化学合成法を教示する。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、当業者は、遺伝子発現のためのウイルスベクターまたはプラスミドを使用して、本開示の複合体を送達させることができることを認識する。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を使用してリボ核タンパク質複合体を被包することができ、本明細書中に開示の精製されたリボ核タンパク質複合体を精製し、エレクトロポレーションまたはインジェクションを介して細胞に送達させることができる。
【０３１７】
キット
いくつかの実施形態では、本開示は、上記の方法および組成物に開示の任意の１またはそれを超えるエレメントを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットはモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物およびキットを使用するための指示ならびに任意の必要とされる試薬または反応物を含む。いくつかの実施形態では、本出願における上述のように、ベクター系は、（ａ）モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物（ｂ）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼタンパク質および必要とされる標的ガイドＲＮＡ（複数可）（または前記物質をコードする配列）を含むＣＲＩＳＰＲ複合体、および、必要に応じて、（ｃ）挿入ＤＮＡ部分を含む。
【０３１８】
エレメントは、個々にまたは組み合わせて提供されてよく、任意の適切な容器中（バイアル、ボトル、チューブなど）または宿主細胞中またはプラスミド中などに提供されてよい。いくつかの実施形態では、キットは、１またはそれを超える言語、例えば、１つを超える言語の指示を含む。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書中に記載の１またはそれを超えるエレメントを利用する過程で使用するための１またはそれを超える試薬（例えば、精製されたＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ）を含む。試薬は、適切な容器中で提供されてよい。例えば、キットは、１またはそれを超える反応緩衝液または保存緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイで使用可能な形態、または使用前に１またはそれを超える他の成分を添加する必要がある形態（例えば、濃縮液の形態または凍結乾燥形態）で提供してよい。緩衝液は、任意の緩衝液（炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。いくつかの実施形態では、緩衝液はアルカリ性である。いくつかの実施形態では、緩衝液のｐＨは、約７〜約１０である。いくつかの実施形態では、キットは、ｃｒＲＮＡ配列および制御エレメントを作動可能に連結するためにベクターに挿入するためのｃｒＲＮＡ配列に対応する１またはそれを超えるオリゴヌクレオチドを含む。
【実施例】
【０３２０】
以下の実施例は、本開示の種々の実施形態を示すために記載しており、いかなる様式においても本開示を制限することを意図しない。特許請求の範囲によって定義される本開示の意図の範囲内に含まれる変更および他の用途が、当業者に認識される。
【０３２１】
実施例１：ワンポットｉｎ  ｖｉｔｒｏモジュラーＣＲＩＳＰＲクローニング
本実施例は、ワンポット反応における一方のプラスミドから他方のプラスミドへの挿入の移行によるプラスミド１３００１００９０８６（配列番号８２）の生成を記載する。図４を参照のこと。
【０３２２】
両方のプラスミドは、目的の領域に隣接するクローニングタグを保有している（ｃＴＡＧ  Ｋ（配列番号７８）／ｃＴＡＧ  Ｌ（配列番号７９）およびｃＴＡＧ  Ｋ’（配列番号８０）／ｃＴＡＧ  Ｌ’（配列番号８１））。編集されたプラスミドに対するクローニング反応を駆動するために、Ｃｐｆ１スペーサーは、レシピエントプラスミドおよびドナープラスミドに対して反対方向に存在する（それぞれ、Ｋ／Ｋ’およびＬ／Ｌ’）。このインサイド・アウト／アウトサイド・イン消化は、最終産物中のＣｐｆ１スペーサーを除去し、所望の産物の再切断を排除する（‘４８５プラスミドにおけるインサイド・アウト消化および‘７８４プラスミドにおけるアウトサイド・イン消化を示す図４の曲がった矢印を参照のこと）。Ｃａｓ９スペーサーは、この部位での反復編集が依然として可能である。したがって、メガモジュラー構築物は、迅速なシングルポット反応スキームが可能であり、反復編集することができる。
【０３２３】
Ｃｐｆ１タンパク質はＧｅｎｓｃｒｉｐｔが合成し、ｃｒＲＮＡはＳｙｎｔｈｅｇｏが合成した。ワンポット切断／ライゲーション反応のために、ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ１およびｃｒＲＮＡ３）と複合体化したＣｐｆ１タンパク質を、ＡＴＰを含む緩衝液中のプラスミド（１３０００７８９４８５−配列番号８３および１３０００８２３７８４−配列番号８４）およびＤＮＡリガーゼに添加した。これらの成分を、切断およびライゲーションのために最適化された温度でサイクリングした。
【０３２４】
反応物をＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、陽性クローンを配列決定して、新規の挿入物の挿入およびＣｐｆ１スペーサーの喪失を確認した。
【０３２５】
欠失のために、使用したクローニングタグ内のＣｐｆ１部位は、プラスミドを閉鎖するための適合性オーバーハングを生成しなければならない。ｃＴＡＧ  Ｌ’を、２つのＣｐｆ１スペーサー（オーバーハングがｃＴＡＧ  Ｋ’と不適合な場合の一方の挿入用スペーサー、およびオーバーハングがｃＴＡＧ  Ｋ’と適合する場合の第２の欠失用スペーサー）を含むようにデザインした。
【０３２６】
実施例２：ｉｎ  ｖｉｔｒｏモジュラーＣＲＩＳＰＲクローニング
本実施例を、ＣＲＩＳＰＲクローニングの柔軟性を実証するためにデザインした。最初のステップとして、カナマイシンまたはクロラムフェニコール耐性遺伝子をコードするいくつかの耐性プラスミドを、ソースベクターｐｚＨＲ０３９（配列番号１００）および１３０００２２３３７０（配列番号１０１）からそれぞれ作出した。カナマイシン耐性プラスミドを、ＧＦＰ遺伝子に隣接する種々のＣｐｆ１ランディング部位を含むように各々デザインした（これらのプラスミドは、消化されたときに、「カナマイシン耐性プラスミドバックボーン」を産生する）。クロラムフェニコール耐性プラスミドを、クロラムフェニコール耐性遺伝子に隣接する種々のＣｐｆ１ランディング部位を含むように各々デザインした（これらのプラスミドは、消化されたときに、「クロラムフェニコール耐性挿入物」を産生する）。本実施例で使用した各プラスミドの配列およびベクターマップを、表６に開示する。
【０３２７】
各カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性プラスミドを、タイプＩＩ制限酵素（それぞれ、ＫｐｎＩ−ＨＦおよびＰｖｕＩ−ＨＦ（共にＮＥＢから市販されている）で最初に線状化した。各プラスミド上のＫｐｎＩおよびＰｖｕＩ制限部位の位置を、図７〜１４に提供したベクターマップ中に示す。線状化後、耐性プラスミドは、細菌宿主系における自己複製がもはや不可能であった。
【０３２８】
次いで、線状化した耐性プラスミドを、１５μｇ（最終濃度１．５８μＭ）のＣｐｆ１酵素および下記の２μＬの５μＭの各ガイドＲＮＡ（最終濃度０．１６７μＭ）の予めインキュベートした混合物と６０μＬ反応物中で混合して、活性ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成した。
【０３２９】
本実施例で使用したＣｐｆ１酵素を、ＩＤＴから購入した。Ｃｐｆ１は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）に由来した。酵素を、１のＮ末端核局在化配列（ＮＬＳ）および１のＣ末端ＮＬＳ、ならびに３のＮ末端ＦＬＡＧタグおよびＣ末端６−Ｈｉｓタグを含むようにさらに改変した。
【０３３０】
本実施例で使用したガイドＲＮＡを、ＩＤＴからカスタムオーダーした。各ガイドＲＮＡを、線状化した耐性プラスミド内に位置する異なるＣＲＩＳＰＲランディング部位を標的にするようにデザインした。本実施例では、バックボーンプラスミドのＣｐｆ１ランディング部位を切り出したが、挿入物のライゲーションの際に修復した。表６は、使用した各ガイドＲＮＡのガイド配列部分を提供する。したがって、混合物中のＣＲＩＳＰＲ複合体を、各カナマイシン耐性プラスミドからＧＦＰ遺伝子を切り取ってカナマイシン耐性プラスミドバックボーンが生成されるようにデザインした（図５の第２パネルを参照のこと）。また、混合物中のＣＲＩＳＰＲ複合体を、クロラムフェニコール耐性プラスミドからクロラムフェニコール耐性遺伝子を切り取ってクロラムフェニコール耐性挿入物が生成されるようにデザインした（図５の第２パネルを参照のこと）。各反応物のカナマイシン耐性プラスミドバックボーンおよびクロラムフェニコール耐性挿入物を、「二重耐性」カナマイシンおよびクロラムフェニコールプラスミドを産生するための末端がハイブリッド形成されると考えられる適合性オーバーハングが生成されるように同様にデザインした。
【０３３１】
Ｃｐｆ１およびガイドＲＮＡを含む線状化耐性プラスミド混合物を、製造者が推奨するＣｐｆ１緩衝液中にて３７℃で３時間インキュベートした。選択した反応物をアガロースゲルで泳動し、得られた断片を、標準的なＤＮＡ抽出キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｋｉｔ、製造者の指示にしたがって使用）を使用して精製した。精製済み（対照）および未精製（試験）。
【０３３２】
カナマイシン耐性プラスミドバックボーンおよびクロラムフェニコール耐性挿入（各々が２つの適合性Ｃｐｆ１付着末端を含む）を含むＤＮＡ断片を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢから購入）を含むか含まない新規の反応物中で組み合わせ、ＮＥＢ１０−Ｂ細胞（ＮＥＢから購入）に形質転換した。形質転換した細胞を、機能的な耐性プラスミドを含まない任意の細胞の成長を阻止するようにデザインされたカナマイシンおよびクロラムフェニコールの両方を増加させた培地上にプレートした。
【０３３３】
個々のクローンをＳａｎｇｅｒ配列決定に供して、Ｃｐｆ１クローニングのジャンクションを確認した。また、回収したコロニーを、表６に記載のプライマーを使用したＰＣＲによって検証した。図５は、上記のようにプラスミドをＣｐｆ１消化前に線状化したことを除いた、上記の一般的な実験デザインを示す。
【表６−１】
2021533773.tif 000015
【表６−２】
2021533773.tif 000016
【表６−３】
2021533773.tif 000017
【表６−４】
2021533773.tif 000018
【０３３４】
この実験の結果を、表７および図６に示す。各形質転換の反応数を表７の上の横列に沿って示し、使用したガイドＲＮＡを表７の左側の列に沿って列挙する。リガーゼを使用した場合と使用しない場合の同一のＣｐｆ１反応を比較すると、リガーゼ酵素の存在下では形質転換体が９．９倍であり、これは、コロニー成長がＣｐｆ１消化後の二重カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性プラスミドの形成に起因することを示していた。リガーゼなしの反応は、反応が特異的であることを確証するためにデザインされた対応対照であり、夾雑レベルの未消化耐性プラスミドの存在に単純に起因しなかった。
【０３３５】
１６個の個々のコロニーをサンガー法で配列決定して、上流および下流のクローニングジャンクションの両方を検証した。配列決定された７つの上流ジャンクションのうちの７つ、および９つの下流ジャンクションのうちの８つにおいて、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いた反応由来のＣｐｆ１媒介クローンが、信頼できる消化およびライゲーションを示した。
【０３３６】
反応物７１および７２を、ＤＮＡゲル精製ステップに供さなかったＣｐｆ１消化したプラスミドで形質転換した。しかしながら、Ｃｐｆ１酵素を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ添加前に、供給者の指示にしたがって熱不活化した（反応物７２）。反応物７１および７２は、同一のリガーゼ依存性を示した。
【表７】
2021533773.tif 000019
【０３３７】
ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４２２４５号（ＷＯ２０１８／０１３９９０Ａ１号、米国特許仮出願第６２／３６２，９０９号の優先権を主張する）の開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０３３８】
実施例３：メガモジュラーデザインを用いた制限酵素消化およびライゲーションによるプラスミドアセンブリ
本実施例は、本開示の方法にしたがったモジュラーＣＲＩＳＰＲベクターの遺伝子編集を記載する。図１５は、本実施例に記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲプラスミド１３０００４４４５９１の遺伝子編集を示す。プラスミドバックボーンを、事前に構築されたプラスミドから「スタッファー」挿入ＤＮＡ部分を除去することによって最初に調製した。スタッファー挿入ＤＮＡ部分を、スタッファー部分の隣接クローニングタグ（ｃＴＡＧ）Ｄ（配列番号６８）およびＥ（配列番号６９）を制限酵素ＡｐａＩおよびＰｖｕＩで消化することによって除去した。得られた断片をゲル電気泳動によって分離し、プラスミドバックボーンに対応する所望の８．３ｋｂ断片をゲルから切り出し、標準的なシリカ膜カラムを使用して抽出した。
【０３３９】
モジュラーＣＲＩＳＰＲベクターの新規の挿入物を生成するために、ｃＴＡＧ  ＤおよびｃＴＡＧ  Ｅに挟まれた所望の挿入ＤＮＡ部分を、ユニバーサルｃＴＡＧオリゴであるｔａｇＤ＿ＦＷＤ（配列番号７５）およびｔａｇＥ＿ＲＥＶ（配列番号７６）を使用してＰＣＲ増幅した。得られた挿入物は、ｃＴＡＧ  ＤおよびｃＴＡＧ  Ｅに挟まれたＧＦＰマーカー遺伝子を含んでいた。得られたＰＣＲ断片を、ｃＴＡＧ  Ｄ配列内を切断するＡｐａＩ酵素およびｃＴＡＧ  Ｅ配列内を切断するＰｖｕＩ  酵素で消化した。消化された挿入ＤＮＡ部分を、標準的なシリカ膜カラムを使用して精製した。
【０３４０】
精製したモジュラーＣＲＩＳＰＲベクターバックボーンおよび挿入ＤＮＡ部分を、リガーゼを使用して単一の反応物に組み合わせて環状プラスミドを生成した。得られた編集されたＧＦＰ含有プラスミド１３０００４４４５９１の配列を、（配列番号７７）に提供する。
【０３４１】
実施例４：メガモジュラーデザインを用いた酵母相同組換えによるプラスミドアセンブリ
プラスミド１３０００２８３３９９（配列番号８５）を、メガモジュラータグに挟まれたＰＣＲ断片の酵母相同組換えによってアセンブリした。所望のアセンブリ用構築物を、これらの構築物が特異的メガモジュラータグに挟まれるような方法でＰＣＲによって増幅した。これらのタグにより、タグ自体が相同組換えのための重複相同領域としての機能を果たすので、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの断片の定方向アセンブリが可能であった。具体的には、以下の通りメガモジュラータグに挟まれた５つの断片を、ＰＣＲによって増幅した：タグＡ−断片１−タグＢ；タグＢ−断片２−タグＣ；タグＣ−断片３−タグＤ；タグＤ−断片４−タグＥ；およびタグＥ−断片５−タグＦ。これらの断片を、酵母複製起点およびＴＲＰ栄養要求性選択マーカー、ならびに一方の末端のタグＡおよび他方の末端のタグＦを含む線状化したアセンブリベクターと共に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに形質転換した。環状化したアセンブリされたプラスミドを、トリプトファンを欠く培地でのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ成長によって選択した。これらのプラスミドを回収し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中で増幅させ、正確な高次構造を配列決定によって確認した。
【０３４２】
実施例５：ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおけるＣＲＩＳＰＲｉの確証
本開示のＣＲＩＳＰＲｉ法を、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの非標準種で試験した。ＣＲＩＳＰＲｉシステムの構成要素を、ｄＣａｓ９およびガイドＲＮＡをコードする単一の試験ベクターにクローン化した。試験ベクター中のガイドＲＮＡを、標的にされたプロモーターが「パプリカ」赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をコードする遺伝子に作動可能に連結した第２の構築物のプロモーター領域を標的にするようにデザインした。ガイドＲＮＡがパプリカＲＦＰを標的にしない個別の配列である第２の対照ベクターを生成した。
【０３４３】
上記の試験ベクターおよび対照ベクターを、野生型（ＷＴ）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株および上記のプロモーター−ＲＦＰ構築物を含むｐｃｇ２６１３−パプリカ菌株の両方ならびに前記ＲＦＰ構築物を欠くＷＴ菌株に形質転換した（図１７Ａ中の実験デザインを参照のこと）。培養物を、ｐＢＡＤプロモーターを介してｄＣａｓ９を誘導するために２％アラビノースを補充した培地中にて３０℃で４８時間成長させた。次いで、７つの生物学的反復物についてのゲーティングした生細胞の蛍光の中央値を記録した。実験結果を図１７Ｂに示す。ＷＴ株は、いかなるＲＦＰ蛍光も示さなかった。対照ＣＲＩＳＰＲｉプラスミドを含むｐｃｇ２６１３株は、正常レベルのＲＦＰ蛍光を示した。しかしながら、試験ＣＲＩＳＰＲｉプラスミドは、ＲＦＰ遺伝子発現のノックダウンに成功した。
発明のさらなる実施形態
本開示が企図する他の主題を、以下の番号を付けた実施形態に示す：
実施形態１．  宿主細胞遺伝子の発現をモジュレートするための組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物であって、前記構築物がＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含み、前記マルチクローン部位が、
ａ）少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、ここで、各ｃＴＡＧが、
ｉ）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含み；ここで、前記検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内で固有のものである、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位
を含む、少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）；および
ｂ）１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分であって；
ｉ）ここで、前記別個のｃＴＡＧの各々が、前記１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分の各々の周囲の隣接した位置に分布する、１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分
を含み、
ここで、前記構築物が、さらに、
ｃ）触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする第１の核酸；
ｄ）前記（ｃ）の触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をＤＮＡ標的部位に動員することができるガイドＲＮＡをコードする第２の核酸
を含む、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１．１．  前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が第１の複製起点を含む、実施形態１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１．２．  前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が１つを超える複製起点を含む、実施形態１〜１．１のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１．３．  前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、第１の複製起点および第２の複製起点を含む、実施形態１〜１．２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１．４．  前記第１の複製起点が、Ｅ．ｃｏｌｉ内でプラスミドを維持することができる、実施形態１．１および１．３のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１．５．  前記第２の複製起点が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ内でプラスミドを維持することができる、実施形態１．１、１．３および１．４のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１．６．  前記第１の複製起点がＥ．ｃｏｌｉ内でプラスミドを維持することができ、第２の複製起点がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内でプラスミドを維持することができ、第３の複製起点がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ内でプラスミドを維持することができる、実施形態１〜１．４のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１．７．  前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、選択マーカーをコードする挿入部分を含む、実施形態１〜１．６のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１．８．  少なくとも１つの複製起点が、前記ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位内の挿入部分内に含まれる、実施形態１〜１．７のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態２．  前記第１の核酸が、前記ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位内の挿入部分内に含まれる、実施形態１〜１．８のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態３．  前記第１の核酸を含む前記挿入部分が、選択マーカーをさらに含む、実施形態２に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態４．  前記第２の核酸が、前記ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位内の挿入部分内に含まれる、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態５．  前記第２の核酸を含む前記挿入部分が、選択マーカーをさらに含む、実施形態４に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態６．  前記第１の核酸および前記第２の核酸が、前記ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位内の前記核酸自体の挿入部分内に各々含まれる、実施形態１〜１．８のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態７．  前記第１の核酸および前記第２の核酸を含む前記挿入部分が、選択マーカーをそれぞれ含む、実施形態６に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態８．  前記第１の核酸を含む前記挿入部分中に含まれる前記選択マーカーと、前記第２の核酸を含む前記挿入部分中に含まれる前記選択マーカーが異なる、実施形態５〜７のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態９．  前記第１の核酸および前記第２の核酸が、前記ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位内の同一の前記挿入部分内に含まれる、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１０．  前記第１の核酸が、プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１０．１．  前記第１の核酸が、ターミネーターに作動可能に連結されている、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１１．  前記第２の核酸が、プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１〜１０．１のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１１．１．  前記第２の核酸が、ターミネーターに作動可能に連結されている、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１２．  前記プロモーターが異種プロモーターである、実施形態１０〜１１．１のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１２．１．  前記プロモーターが構成性プロモーターである、実施形態１０〜１２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１２．２．  前記プロモーターが誘導性プロモーターである、実施形態１０〜１２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１３．  前記第１の核酸が、転写活性化タンパク質に翻訳的に融合される触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする、実施形態１〜１２．２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１３．１．  前記第１の核酸が、転写不活性化タンパク質に翻訳的に融合される触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする、実施形態１〜１２．２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１３．２．  前記第１の核酸が、転写リプレッサーに翻訳的に融合される触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする、実施形態１〜１２．２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１４．  前記構築物が、（ｅ）転写活性化タンパク質をコードする第３の核酸であって、発現したときに、前記転写活性化タンパク質自体、前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合することができる前記第３の核酸をさらに含む、実施形態１〜１２．２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１４．１．  前記構築物が、（ｅ）転写不活性化タンパク質をコードする第３の核酸であって、発現したときに、前記転写不活性化タンパク質自体、触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合することができる前記第３の核酸をさらに含む、実施形態１〜１２．２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１４．２．  前記構築物が、（ｅ）転写リプレッサータンパク質をコードする第３の核酸であって、発現したときに、前記転写リプレッサータンパク質自体、触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合することができる前記第３の核酸をさらに含む、実施形態１〜１２．２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１５．  前記転写活性化タンパク質は、それ自体が、連結アプタマーを介するか、タンパク質間相互作用によって前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合する、実施形態１４に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１５．１．  前記転写不活性化タンパク質は、それ自体が、連結アプタマーを介するか、タンパク質間相互作用によって前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合する、実施形態１４．１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１５．２．  前記転写リプレッサータンパク質は、それ自体が、連結アプタマーを介するか、タンパク質間相互作用によって前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合する、実施形態１４．２に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１６．  前記第２の核酸が、アプタマー自体が転写活性化タンパク質に結合することができる前記アプタマーに作動可能に連結されているガイドＲＮＡをコードする、実施形態１〜１２．２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１６．１．  前記第２の核酸が、アプタマー自体が転写不活性化タンパク質に結合することができる前記アプタマーに作動可能に連結されているガイドＲＮＡをコードする、実施形態１〜１２．２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１６．２．  前記第２の核酸が、アプタマー自体が転写リプレッサータンパク質に結合することができる前記アプタマーに作動可能に連結されているガイドＲＮＡをコードする、実施形態１〜１２．２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１７．  前記転写活性化タンパク質が、ＶＰ１６、ＶＰ６４、およびＶＰ１６０、ＶＰＲからなる群から選択される、実施形態１３、１４、１５、および１６のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１７．１．  前記転写不活性化タンパク質が、Ｍｘｉ１、Ｔｂｘ３、ＫＲＡＢ、ＥｎＲ、およびＳＩＤからなる群から選択される、実施形態１３．１、１４．１、１５．１、および１６．１のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１７．２．  前記転写リプレッサータンパク質が、Ｍｘｉ１、Ｔｂｘ３、ＫＲＡＢ、ＥｎＲ、およびＳＩＤからなる群から選択される、実施形態１３．２、１４．２、１５．２、および１６．２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１８．  前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が環状である、実施形態１〜１７．２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態１９．  前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が線状である、実施形態１〜１７．２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態２０．  前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、生物のゲノムに組み入れられている、実施形態１〜１７．２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態２１．  前記別個のｃＴＡＧのうちの少なくとも１つが、少なくとも２つの検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態２２．  前記ＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのためのものである、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態２３．  前記ＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのためのものである、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態２４．  前記別個のｃＴＡＧのうちの少なくとも１つが、低頻度の（８塩基長以上の）制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態２４．１．  各々のｃＴＡＧが、低頻度の（８塩基長以上の）制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態２５．  前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、変異したＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、実施形態１〜２４．１のいずれか１つに記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態２６．  前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、変異したＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、実施形態１〜２４．１のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態２７．  前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、表１のベクター中に含まれるｄＣａｓ９遺伝子から選択される、実施形態１〜２４．１のいずれか１つに記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態２８．  前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ））、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ０Ａ１８２ＤＷＥ３（Ａ０Ａ１８２ＤＷＥ３＿９ＦＩＲＭ））、およびＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｕ２ＵＭＱ６（ＣＰＦ１  ＡＣＩＳＢ）からなる群から選択される、実施形態１〜２４．１のいずれか１つに記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態２９．  前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素がＡｓＣｐｆ１（Ｄ９０８Ａ）である、実施形態１〜２４．１のいずれか１つに記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態３０．  前記組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、前記（ｃ）の触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をＤＮＡ標的部位に動員することができる１つを超えるガイドＲＮＡをコードする、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態３１．  前記ガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つが、前記構築物中にコードされる別のガイドＲＮＡと異なる配列を含む、実施形態３０に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態３２．  前記ガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つが、前記構築物中にコードされる別のガイドＲＮＡと異なるＤＮＡ標的部位配列を標的にする、実施形態３０または３１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態３３．  前記組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、１つを超える触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態３４．  前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素のうちの少なくとも１つが、前記構築物中にコードされる別の触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素と異なる配列を含む、実施形態３３に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態３５．  前記ｃＴＡＧのうちの１つまたは複数が、配列番号６５〜７４、７８〜８１、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態１〜３４のいずれか１つに記載の挿入部分。
実施形態３５．５．  実施形態１〜３５のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を含む宿主細胞。
実施形態３６．  １またはそれを超える宿主細胞遺伝子の発現をモジュレートするハイスループット法であって、実施形態１〜３５のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を前記宿主細胞に導入するステップを含み；ここで、前記ガイドＲＮＡの前記ＤＮＡ標的部位が前記宿主細胞ゲノム内にある、ハイスループット法。
実施形態３７．  前記組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物のうちの少なくとも１つの挿入部分が、前記宿主細胞のゲノムに組み入れられている、実施形態３６に記載のハイスループット法。
実施形態３８．  前記組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、染色体外ＤＮＡとして前記宿主細胞中に残存する、実施形態３６に記載のハイスループット法。
実施形態３９．  実施形態１０〜１２．２のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、前記宿主細胞に導入されている、実施形態３６に記載のハイスループット法。
実施形態４０．  前記宿主細胞を、前記誘導性プロモーターの発現を増加させることができる化合物と接触させるステップをさらに含む、実施形態３９に記載のハイスループット法。
実施形態４１．  ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントをスクリーニングするための組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物であって、前記構築物がＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含み、前記マルチクローン部位が、
ａ）少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、ここで、各ｃＴＡＧが、
ｉ）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含み；ここで、前記検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内で固有のものである、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位
を含む、少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）；および
ｂ）１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分であって；
ｉ）ここで、前記別個のｃＴＡＧの各々が、前記１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分の各々の周囲の隣接した位置に分布する、１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分
を含み、
ここで、前記構築物が、さらに、
ｃ）タンパク質をコードする第１の核酸；
ｄ）ＤＮＡ標的部位に結合することができるガイドＲＮＡをコードする第２の核酸
を含む、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態４１．１．  ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントをスクリーニングするための組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物であって、前記構築物がＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含み、前記マルチクローン部位が、
ａ）少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、ここで、各ｃＴＡＧが、
ｉ）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含み；ここで、前記検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内で固有のものである、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位
を含む、少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）；および
ｂ）１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分であって；
ｉ）ここで、前記別個のｃＴＡＧの各々が、前記１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分の各々の周囲の隣接した位置に分布する、１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分
を含み、
ここで、前記構築物が、さらに、
ｃ）ＣＲＩＳＰＲ酵素、またはＣＲＩＳＰＲ機能性を有すると思われる酵素（「推定ＣＲＩＳＰＲ酵素」）をコードする第１の核酸；
ｄ）ＤＮＡ標的部位に結合することができるガイドＲＮＡをコードする第２の核酸
を含む、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態４１．２．  実施形態４１または４１．１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を含む宿主細胞。
実施形態４２．
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントをスクリーニングするハイスループット法であって、
ａ）実施形態４１または４１．１に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するステップであって；ここで、前記ガイドＲＮＡの前記ＤＮＡ標的部位が前記宿主細胞ゲノム内にある、導入するステップ；および
ｂ）前記ＤＮＡ標的部位で生じたＤＮＡ切断の程度を測定するステップ
を含む、ハイスループット法。
実施形態４３．
宿主細胞遺伝子の発現をモジュレートするか、前記宿主細胞のゲノムを操作するための組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物であって、前記構築物がＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含み、前記マルチクローン部位が、
ａ）少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、ここで、各ｃＴＡＧが、
ｉ）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含み；ここで、前記検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内で固有のものである、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位
を含む、少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）；および
ｂ）１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分であって；
ｉ）ここで、前記別個のｃＴＡＧの各々が、前記１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分の各々の周囲の隣接した位置に分布する、１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分
を含み、
ここで、前記１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分が、ＣＲＩＳＰＲ機能のモジュレーターをコードするＤＮＡを含む、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態４４．  ＣＲＩＳＰＲ機能のモジュレーターをコードする前記ＤＮＡを含む前記挿入部分が、選択マーカーをさらに含む、実施形態４３に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態４５．  前記ＣＲＩＳＰＲ機能のモジュレーターが、複製起点、選択マーカー、対抗選択マーカー、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質、プロモーター、ターミネーター、ｄＣａｓ９タンパク質、ｄＣｐｆ１タンパク質、バーコード、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、ＤＮＡドナー、および多重化ゲノム編集を容易にするタンパク質からなる群から選択される、実施形態４３または４４に記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態４６．  実施形態４３〜４５のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を含む宿主細胞。
実施形態４７．  前記宿主細胞が、触媒的に活性なＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸分子および前記触媒的に活性なＣＲＩＳＰＲ酵素をＤＮＡ標的部位に動員することができるガイドＲＮＡを含む、実施形態４６に記載の宿主細胞。
実施形態４８．  前記宿主細胞が、触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸分子および前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素をＤＮＡ標的部位に動員することができるガイドＲＮＡを含む、実施形態４６記載の宿主細胞。
実施形態４９．  前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、転写活性化タンパク質に翻訳的に融合されている、実施形態４８に記載の宿主細胞。
実施形態４９．１．  前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、転写不活性化タンパク質に翻訳的に融合されている、実施形態４８に記載の宿主細胞。
実施形態４９．２．  前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、転写リプレッサータンパク質に翻訳的に融合されている、実施形態４８に記載の宿主細胞。
実施形態５０．  前記宿主細胞が、転写活性化タンパク質をコードする核酸分子であって、発現したときに、前記転写活性化タンパク質自体、前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合することができる前記核酸分子をさらに含む、実施形態４８に記載の宿主細胞。
実施形態５０．１．  前記宿主細胞が、転写不活性化タンパク質をコードする核酸分子であって、発現したときに、前記転写不活性化タンパク質自体、前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合することができる前記核酸分子をさらに含む、実施形態４８に記載の宿主細胞。
実施形態５０．２．  前記宿主細胞が、転写リプレッサータンパク質をコードする核酸分子であって、発現したときに、前記転写リプレッサータンパク質自体、前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合することができる前記核酸分子をさらに含む、実施形態４８に記載の宿主細胞。
実施形態５１．  前記転写活性化タンパク質は、それ自体が、連結アプタマーを介するか、タンパク質間相互作用によって前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合する、実施形態５０に記載の宿主細胞。
実施形態５１．１．  前記転写不活性化タンパク質は、それ自体が、連結アプタマーを介するか、タンパク質間相互作用によって前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合する、実施形態５０．１に記載の宿主細胞。
実施形態５１．２．  前記転写リプレッサータンパク質は、それ自体が、連結アプタマーを介するか、タンパク質間相互作用によって前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素に結合する、実施形態５０．２に記載の宿主細胞。
実施形態５２．  前記ガイドＲＮＡが、アプタマー自体が転写活性化タンパク質に結合することができる前記アプタマーに作動可能に連結されている、実施形態５１に記載の宿主細胞。
実施形態５２．１．  前記ガイドＲＮＡが、アプタマー自体が転写不活性化タンパク質に結合することができる前記アプタマーに作動可能に連結されている、実施形態５１．１に記載の宿主細胞。
実施形態５２．２．  前記ガイドＲＮＡが、アプタマー自体が転写リプレッサータンパク質に結合することができる前記アプタマーに作動可能に連結されている、実施形態５１．３に記載の宿主細胞。
実施形態５３．  前記転写活性化タンパク質が、ＶＰ１６、ＶＰ６４、およびＶＰ１６０、ＶＰＲからなる群から選択される、実施形態４９、５１、および５２のいずれか１つに記載の宿主細胞。
実施形態５３．１．  前記転写不活性化タンパク質が、Ｍｘｉ１、Ｔｂｘ３、ＫＲＡＢ、ＥｎＲ、およびＳＩＤからなる群から選択される、実施形態４９．１、５１．１、および５２．１のいずれか１つに記載の宿主細胞。
実施形態５３．２．  前記転写活性化タンパク質が、Ｍｘｉ１、Ｔｂｘ３、ＫＲＡＢ、ＥｎＲ、およびＳＩＤからなる群から選択される、実施形態４９．２、５１．２、および５２．２のいずれか１つに記載の宿主細胞。
実施形態５４．  前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が環状である、実施形態４３〜４５のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態５５．  前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が線状である、実施形態４３〜４５のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態５６．  前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、生物のゲノムに組み入れられている、実施形態４３〜４５のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態５７．  前記別個のｃＴＡＧのうちの少なくとも１つが、少なくとも２つの検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、実施形態４３〜４５および５４〜５６のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態５８．  前記ＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのためのものである、実施形態４３〜４５および５４〜５７のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態５９．  前記ＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼのためのものである、実施形態４３〜４５および５４〜５８のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態６０．  前記別個のｃＴＡＧのうちの少なくとも１つが、低頻度の（８塩基長以上の）制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、実施形態４３〜４５および５４〜５９のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態６１．  前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、変異したＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、実施形態４７〜５３．２のいずれか１つに記載の宿主細胞。
実施形態６２．  前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、変異したＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、実施形態４８〜５３．２のいずれか１つに記載の宿主細胞。
実施形態６３．  前記宿主細胞が１つを超える核酸ガイドＲＮＡを含む、実施形態４７〜５３．２および６１〜６２のいずれか１つに記載の宿主細胞。
実施形態６４．  前記ガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つが、別のガイドＲＮＡと異なる配列を含む、実施形態６３に記載の宿主細胞。
実施形態６５．  前記ガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つが、別のガイドＲＮＡと異なるＤＮＡ標的部位配列を標的にする、実施形態６４に記載の宿主細胞。
実施形態６６．  前記宿主細胞が、１つを超える触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、実施形態４８〜５３．２および６１〜６５のいずれか１つに記載の宿主細胞。
実施形態６７．  前記触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素のうちの少なくとも１つが、前記構築物中にコードされる別の触媒的に不活化されたＣＲＩＳＰＲ酵素と異なる配列を含む、実施形態６６に記載の宿主細胞。
実施形態６８．  前記ｃＴＡＧのうちの１つまたは複数が、配列番号６５〜７４、７８〜８１、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態４３〜６７のいずれか１つに記載の挿入部分。
実施形態６９．  １またはそれを超える宿主細胞遺伝子の発現をモジュレートするハイスループット法であって、実施形態４３〜４５および５４〜６０のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するステップを含み；ここで、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的部位が前記宿主細胞ゲノム内にある、ハイスループット法。
実施形態７０．  前記組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物のうちの少なくとも１つの挿入部分が、前記宿主細胞のゲノムに組み入れられている、実施形態６９に記載のハイスループット法。
実施形態７１．  前記挿入部分がＣＲＩＳＰＲタンパク質の機能を制御する、実施形態６９または７０に記載のハイスループット法。
実施形態７２．  前記挿入部分がｇＲＮＡの機能を制御する、実施形態６９または７０に記載のハイスループット法。
実施形態７３．  前記組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物が、染色体外ＤＮＡとして前記宿主細胞中に残存する、実施形態６９または７０に記載のハイスループット法。
実施形態７４．  ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントをスクリーニングするための組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物であって、前記構築物がＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含み、前記マルチクローン部位が、
ａ）少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、ここで、各ｃＴＡＧが、
ｉ）１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、各々が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサー配列を含み；ここで、前記検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位のうちの少なくとも１つが前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物内で固有のものである、１またはそれを超える検証済みのＣＲＩＳＰＲランディング部位
を含む、少なくとも２つの別個のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）；および
ｂ）１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分であって；
ｉ）ここで、前記別個のｃＴＡＧの各々が、前記１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分の各々の周囲の隣接した位置に分布する、１またはそれを超えるＤＮＡ挿入部分
を含み、
ここで、前記構築物が、さらに、
ｃ）ＣＲＩＳＰＲ酵素、またはＣＲＩＳＰＲ機能性を有すると思われる酵素（「推定ＣＲＩＳＰＲ酵素」）をコードする第１の核酸；および
ｄ）ＤＮＡ標的部位に結合することができるガイドＲＮＡをコードする第２の核酸
を含む、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物。
実施形態７５．  宿主細胞におけるＣＲＩＳＰＲ活性をスクリーニングするハイスループット法であって、
ａ）実施形態４３〜４５、５４〜６０および７４のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を前記宿主細胞に導入するステップであって；ここで、ガイドＲＮＡの前記ＤＮＡ標的部位が前記宿主細胞ゲノム内にある、導入するステップ；および
ｂ）前記ＤＮＡ標的部位で生じたＤＮＡ切断の程度を測定するステップ
を含む、ハイスループット法。
実施形態７６．  宿主細胞におけるＣＲＩＳＰＲｉ活性をスクリーニングするハイスループット法であって、
ａ）実施形態４３〜４５、５４〜６０および７４のいずれか１つに記載の組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ構築物を前記宿主細胞に導入するステップであって；ここで、ガイドＲＮＡの前記ＤＮＡ標的部位が前記宿主細胞ゲノム内にある、導入するステップ；および
ｂ）前記ＤＮＡ標的部位で生じた転写モジュレーションの程度を測定するステップ
を含む、ハイスループット法。
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【０３４４】
参照による援用
本明細書中に引用された全ての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、全ての目的のためにその全体が参考として援用される。しかしながら、本明細書中に引用された任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、前記文献が有効な先行技術を構成することや、任意の国家の周知の一般的知識の一部を形成することの承認や示唆の任意の形態と見なされず、また見なされないものとする。本出願は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１７５７３号の全体を、全ての目的のために参照として援用する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2021533773.tif 000041
【図１８Ａ−Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021533773.tif 000044
2021533773.tif 000045
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