(57)【要約】  本発明は、組換え抗体を提供する。前記組換え抗体は、抗ＰＤ−１抗体及びヒトＳＩＲＰＡ細胞外ドメインを含む。前記ヒトＳＩＲＰＡ細胞外ドメインのＮ末端は、前記抗ＰＤ−１抗体の重鎖のＣ末端に結合される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＰＤ−１抗体と；
ヒトシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）細胞外セグメントと、
を含む組換え抗体であって、
前記ヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントのＮ末端は、前記抗ＰＤ−１抗体の重鎖のＣ末端に接続されることを特徴とする組換え抗体。
【請求項２】
前記抗ＰＤ−１抗体が、ＰＤ−１に対するＩｇＧ様抗体である請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項３】
前記抗ＰＤ−１抗体が、Ｈ８抗体である請求項２に記載の組換え抗体。
【請求項４】
前記組換え抗体が、更にリンカーを含み、
前記リンカーのＮ末端が、前記抗ＰＤ−１抗体の重鎖のＣ末端に接続され、前記リンカーのＣ末端が、前記ヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントのＮ末端に接続される請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項５】
前記リンカーが、配列番号１のアミノ酸配列を含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖と；
配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖と、
を含むことを特徴とする組換え抗体。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の組換え抗体をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項８】
前記核酸が、配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を含む請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
抗ＰＤ−１抗体をコードする第１の核酸分子と；
ヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントをコードする第２の核酸分子と、
を含むことを特徴とするコンストラクト。
【請求項１０】
前記コンストラクトが、前記第１の核酸分子に機能可能に結合される第１のプロモーターを更に含む請求項９に記載のコンストラクト。
【請求項１１】
前記第１のプロモーターが、Ｕ６、Ｈ１、ＣＭＶ、ＥＦ−１、ＬＴＲ、又はＲＳＶプロモーターから選択される請求項１０に記載のコンストラクト。
【請求項１２】
前記コンストラクトが、更に第３の核酸分子を含み、
前記第３の核酸分子が、前記第１の核酸分子と前記第２の核酸分子との間に配置され、前記リンカーをコードするように構成される請求項９に記載のコンストラクト。
【請求項１３】
前記リンカーが、配列番号１のアミノ酸配列を含む請求項１２に記載のコンストラクト。
【請求項１４】
前記コンストラクトのベクターが、非病原性ウイルスベクターである請求項９に記載のコンストラクト。
【請求項１５】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はアデノウイルス関連ウイルスベクターから選択される少なくとも１つを含む請求項１４に記載のコンストラクト。
【請求項１６】
請求項１から６のいずれかに記載の組換え抗体を調製する方法であって、前記方法が、
請求項９から１５のいずれかに記載のコンストラクトを哺乳類細胞に導入することと；
タンパク質の発現と分泌に適した条件下で前記哺乳類細胞を培養し、前記組換え抗体を得ることと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記哺乳類細胞が、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＳ、２９３Ｆ、及び２９３Ｔから選択される少なくとも１つを含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項９から１５のいずれかに記載のコンストラクト、請求項１から６のいずれかに記載の組換え抗体、又は請求項７から８のいずれかに記載の核酸を含むことを特徴とする癌を治療する治療組成物。
【請求項１９】
癌に罹患する患者に、請求項９から１５のいずれかに記載のコンストラクト、請求項１から６のいずれかに記載の組換え抗体、又は請求項７から８のいずれかに記載の核酸を投与することを含むことを特徴とする癌を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、免疫学及び抗体工学技術の分野、特に、ＰＤ−１及びＣＤ４７に対する二重特異性抗体、及びその適用に関する。より具体的には、本開示は、組換え抗体、核酸、コンストラクト、組換え抗体を調製する方法、癌を治療する治療組成物、及び癌を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は近年、世界中で主要な死因の１つになっている。世界保健機関の報告によれば、２０１５年の世界の癌による死亡者数は約８８０万人に達し、年間の総死亡者数の約６分の１を占めている。２０１５年には、中国で新たに診断された癌の症例は、約４２９万２０００人、癌による死亡は２８１万４０００人であった。中国では、癌の発生率は依然として上昇している。
【０００３】
現在、癌治療は主に手術、放射線療法、化学療法に焦点を当てているが、従来の治療法は、腫瘍特異性が低く、毒性と副作用が大きいという欠点がある。したがって、癌を治療するためのより高い特異性を有する、より安全でより効果的な方法が強く求められている。近年、癌のメカニズムに関する理解が深まるにつれ、特定の抗体を使用して腫瘍の成長を阻害する分子標的療法が徐々に登場している。このような状況下、主に細胞工学技術と遺伝子工学技術をベースとした抗体工学技術により調製された抗体医薬は、高い特異性、顕著な治療効果、低い毒性及び少ない副作用などの利点を示し、それによって癌治療のための非常に広い将来性を有する。最近では、免疫チェックポイントの発見により、免疫チェックポイントを標的とする特定の抗体が開発され、腫瘍細胞の免疫逃避を阻害し、免疫療法を新しい段階に押し上げている。
【０００４】
免疫システムでは、ＭＨＣ−ＴＣＲ複合体によって提供される最初の刺激シグナルだけでなく、抗原提示細胞の表面上の分子によって提供される２番目の刺激シグナル（即ち、共刺激シグナル）にも依存して、Ｔ細胞の活性化は複雑化される。このような共刺激シグナルがないと、Ｔ細胞の無反応、寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、アポトーシスを引き起こす。プログラム死（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ）受容体−１（ＰＤ−１、ＣＤ２７９としても知られている）及びそのリガンド（ＰＤ−１のリガンド１及びリガンド２、即ちＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２）は、このような阻害性の共刺激分子である。
【０００５】
ヒトＰＤ−１は、ＣＤ２８ファミリーのタイプＩ膜貫通型糖タンパク質に属し、分子量は約５５ｋＤａである。ヒトＰＤ−１は、細胞内ドメインに２つのチロシン残基（即ち、Ｙ２２３及びＹ２４８）を含み、それぞれＮ末端免疫受容体チロシン系抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ、モチーフＶＤＹＧＥＬ）及びＣ末端免疫受容体チロシン系スイッチモチーフ（ＩＴＳＭ、モチーフＴＥＹＡＴＩ）の形成に関与する。ＩＴＩＭモチーフは、細胞内ＳＨＰ−２を動員し、下流のタンパク質をリン酸化し、ＢＣＲ又はＴＣＲ受容体シグナル伝達を減少させ、最終的にリンパ球の増殖、サイトカインの産生を抑制し、細胞分裂周期の停止を誘発する。ヒトＰＤ−１は、細胞外領域にＩｇＶ様ドメインを有する。このようなＩｇＶ様ドメインは、複数の糖鎖付加部位を含み、高度にグリコシル化され、主にリガンドとの結合に関与し、Ｔ細胞の活性化を抑制する機能を発揮する。二量体形態で存在する他の共刺激分子とは異なり、ＰＤ−１は、ＰＤ−１の細胞外領域がシステイン残基を欠くので、単量体として存在することができる。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞、並びに単球、樹状細胞（ＤＣ）及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）で発現される。
【０００６】
ＰＤ−１の２つのリガンド（即ち、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４、及びＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−ＤＣとしても知られる）は、Ｂ７タンパク質ファミリーのメンバーに属するタイプＩ糖タンパク質である。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１の主なリガンドは、ＩｇＶ様領域、ＩｇＣ様領域、膜貫通型領域、及び細胞質領域を含み、前記細胞質領域は細胞内シグナル伝達に関与し、前記ＩｇＶ様領域及び前記ＩｇＣ様領域は、細胞間シグナル伝達に関与する。ＰＤ−１の発現は、インターロイキン４（ＩＬ−４）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）などの幾つかの炎症性因子によって積極的に調節される。活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、種々の腫瘍細胞での発現に加えて、ＰＤ−Ｌ１は、心臓、血管、胎盤、骨格筋、肺、肝臓、脾臓、胸腺などの非リンパ系臓器でも広く発現される。ＰＤ−Ｌ２は、主に活性化マクロファージ、ＤＣ、及び僅かな腫瘍細胞で発現される。
【０００７】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路の免疫抑制効果は、様々な免疫障害、例えば自己免疫疾患の発生と発症に重要な役割を果たす。ＰＤ−１を欠くマウスは、遅延した臓器特異的な自己免疫を示す。ＰＤ−１の欠如は、エリテマトーデスＬＰＲマウスモデル及び自己免疫疾患を含む糖尿病ＮＯＤマウスモデルで、加速された組織特異的な自己免疫特性を示す。更に、ＰＤ−１を過剰発現する機能不全の細胞障害性リンパ球細胞（ＣＴＬ）は、ＨＩＶ、ＨＢＶなどのウイルスによる慢性感染症で見られるが、ブロッキングＰＤ−１シグナルは、ＣＴＬの機能を逆転させ、ウイルスを除去する。
【０００８】
腫瘍細胞は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路の免疫抑制によって免疫逃避を実行する。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、メラノーマ、リンパ腫、乳癌、白血病、種々の尿路腫瘍、消化管腫瘍、生殖器系腫瘍など、様々な腫瘍細胞がＰＤ−Ｌ１の発現をアップレギュレートすることができる。過剰発現されたＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞の表面上のＰＤ−１受容体と相互作用し、それによってＰＤ−１のＩＴＳＭドメインにおけるチロシンがリン酸化され、下流のホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）とチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）の脱リン酸化を引き起こし、それによって、下流のＡＫＴ、ＥＲＫ、及び他の経路の活性化を阻害し、最終的に、Ｔ細胞の活性化に必要とされる遺伝子及びサイトカインの転写及び翻訳を阻害する。一方、ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞でＰＤ−１の蓄積を引き起こし、細胞周期の停止とＧ０／Ｇ１期の細胞の大量蓄積をもたらすことが研究によって示されている。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路の活性化が、特定のＣＴＬのアポトーシスをもたらすことがあり、それによってＣＴＬの細胞損害性殺傷効果の感度を低下させ、腫瘍細胞の免疫逃避を促進することが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験とマウスモデルによっても見出される。要約すると、腫瘍細胞は、Ｔ細胞の表面上でＰＤ−１と相互作用するＰＤ−Ｌ１を発現させることにより、Ｔ細胞の活性化、増殖及び腫瘍殺傷能力を阻害することができる。
【０００９】
したがって、腫瘍免疫において重要な役割を果たすＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路は、腫瘍免疫療法における新しい分子標的となっている。腫瘍細胞によるＴ細胞（即ち、主要な細胞性免疫細胞）の阻害は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路を遮断することにより遮断されることができる抗ＰＤ−１抗体と抗ＰＤ−Ｌ１抗体の開発は、腫瘍免疫療法の研究における一般的な研究の方向になっている。米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可された、ＰＤ−１を標的にするモノクローナル抗体としては、ＭｅｒｃｋからのＫｅｙｔｒｕｄａ（ペンブロリズマブ）及びＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂからのＯｐｄｉｖｏ（ニボルマブ）が挙げられる。ＰＤ−Ｌ１を標的にするモノクローナル抗体としては、ＲｏｃｈｅからのＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（アテゾリズマブ）、Ｐｆｉｚｅｒ及びＭｅｒｃｋによって製造されたＢａｖｅｎｃｉｏ（アベルマブ）、及びＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａからのＩｍｆｉｎｚｉ（デュルバルマブ）が挙げられる。これらのモノクローナル抗体は、メラノーマ並びに転移性扁平上皮非小細胞肺癌、及び化学療法後に進行した他の腫瘍（即ち、モノクローナル抗体が最初に適用された癌）においてだけでなく、新たに適用されたホジキンリンパ腫、腎癌、胃癌、肛門癌、肝臓癌、結腸直腸癌等においても、既に良好な臨床結果を達成している。更に、幾つかの抗ＰＤ−１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、腫瘍の治療のための臨床試験に入っている。
【００１０】
現在、免疫療法の最大の制限は、ＰＤ−１に対して１５％〜５０％の有効性であるといった、低い有効性である。研究のエビデンスは、成功した癌免疫療法は、腫瘍の局所免疫応答のみを誘発するのではなく、全身免疫応答を誘発できるかどうかに依存することを示す。免疫システムへの刺激時に全身免疫応答を生成することは、免疫療法の有効性を顕著に向上させることが期待されている。
【発明の概要】
【００１１】
本開示は、関連技術における技術的問題の１つを少なくともある程度解決することを目的とする。
【００１２】
１つの態様においては、組換え抗体が本開示で提供される。本開示の実施形態においては、前記組換え抗体は、抗ＰＤ−１抗体と、ヒトシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）細胞外セグメントと、を含み、前記ヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントのＮ末端は、前記抗ＰＤ−１抗体の重鎖のＣ末端に接続される。本実施形態に係る組換え抗体は、ＰＤ−１及びＣＤ４７の両方を標的とすることができるので、単一の標的に対する抗体よりも免疫システムへの刺激を顕著に増強し、より強力な腫瘍抑制能力を発揮することができる。
【００１３】
本開示の実施形態においては、上記の組換え抗体は、下記の追加の技術的特徴の少なくとも１つを更に含むことができる。
【００１４】
本開示の実施形態においては、前記抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１に対するＩｇＧ様抗体である。好ましくは、ＩｇＧ様抗体は、ＩｇＧ４サブタイプである。ＩｇＧ４は、Ｆａｂアーム交換（Ｆａｂ−ａｒｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）により、容易に不完全な抗体を形成する。ＩｇＧ４サブタイプ抗体のＳ２２８Ｐ修飾は、Ｆａｂアーム交換を効果的に減少させ、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の効果を効果的に回避することができる。
【００１５】
本開示の実施形態においては、前記抗ＰＤ−１抗体は、Ｈ８抗体であり、特許出願２０１６１０２０７７４１．６号及びＰＣＴ／ＣＮ２０１６／１０３８１４に記載される内容を参照する。
【００１６】
本開示の実施形態においては、前記組換え抗体は、更にリンカーを含み、前記リンカーのＮ末端は、前記抗ＰＤ−１抗体の重鎖のＣ末端に接続され、前記リンカーのＣ末端は、前記ヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントのＮ末端に接続され、タンパク質の立体障害の相互作用効果を回避し、更にタンパク質フォールディングを促進する。
【００１７】
本開示の実施形態においては、前記リンカーは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【化１】
2021505149.tif 000002
【００１８】
第２の態様においては、組換え抗体が本開示で提供される。本開示の実施形態においては、前記組換え抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【化２】
2021505149.tif 000003
【００１９】
実施形態に係る組換え抗体は、ＰＤ−１及びＣＤ４７の両方を標的とすることができ、それによって免疫システムへの刺激を顕著に増強し、単一の標的に対する抗体よりも強い腫瘍抑制能力を示すことができる。
【００２０】
第３の態様においては、核酸が本開示で提供される。本開示の実施形態においては、前記核酸は、上記に記載されるように、前記組換え抗体をコードする。実施形態に係る核酸によってコードされた前記組換え抗体は、ＰＤ−１及びＣＤ４７の両方を標的とすることができ、それによって免疫システムへの刺激を顕著に増強し、単一の標的に対する抗体よりも強い腫瘍抑制能力を示すことができる。
【００２１】
本開示の実施形態においては、上記に記載される核酸は、下記の追加の技術的特徴の少なくとも１つを更に含むことができる。
【００２２】
本開示の実施形態においては、前記核酸は、配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を含む。
【化３】
2021505149.tif 000004
【００２３】
実施形態に係る核酸によってコードされた組換え抗体は、ＰＤ−１及びＣＤ４７の両方を標的とすることができ、それによって免疫システムへの刺激を顕著に増強し、単一の標的に対する抗体よりも強い腫瘍抑制能力を示すことができる。
【００２４】
第４の態様においては、コンストラクトが本開示で提供される。本開示の実施形態においては、前記コンストラクトは、前記抗ＰＤ−１抗体をコードする第１の核酸分子と、前記ヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントをコードする第２の核酸分子とを含む。実施形態におけるコンストラクトがレシピエント細胞に導入された後、発現された組換え抗体は、ＰＤ−１及びＣＤ４７の両方を標的とすることができ、それによって免疫システムへの刺激を顕著に増強し、単一の標的に対する抗体よりも強い腫瘍抑制能力を示すことができる。
【００２５】
本開示の実施形態においては、上記に記載されたコンストラクトは、下記の追加の技術的特徴の少なくとも１つを更に含むことができる。
【００２６】
本開示の実施形態においては、前記コンストラクトは、前記第１の核酸分子に機能可能に結合される第１のプロモーターを更に含む。前記第１のプロモーターは、前記第１の核酸分子及び前記第２の核酸分子の発現を効果的に開始することができ、それによって上記の組換え抗体の発現を達成することができる。
【００２７】
本開示の実施形態においては、上記に記載されたコンストラクトは、下記の追加の技術的特徴の少なくとも１つを更に含むことができる。
【００２８】
本開示の実施形態においては、前記第１のプロモーターは、Ｕ６、Ｈ１、ＣＭＶ、ＥＦ−１、ＬＴＲ、又はＲＳＶプロモーターから選択される。本発明者らは、Ｕ６、Ｈ１、ＣＭＶ、ＥＦ−１、ＬＴＲ、又はＲＳＶプロモーターが、前記第１の核酸分子及び前記第２の核酸分子の発現を効果的に開始することができ、前記第１の核酸分子及び前記第２の核酸分子の発現効率も顕著に改善する。
【００２９】
本開示の実施形態においては、前記コンストラクトは、第３の核酸分子を更に含み、前記第３の核酸分子は、前記第１の核酸分子と前記第２の核酸分子との間に配置され、前記リンカーをコードするように構成される。したがって、前記第１の核酸分子によって発現される前記第１のタンパク質と前記第２の核酸分子によって発現される前記第２のタンパク質は、前記リンカーを介して共に結合されることができ、融合タンパク質として機能し、有効性を示す。
【００３０】
本開示の実施形態においては、前記リンカーは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
本開示の実施形態においては、前記コンストラクトのベクターは、非病原性ウイルスベクターである。本実施形態におけるコンストラクトのベクターの病原部位は、改変又は変異されているので、前記ベクターは非病原性ウイルスである。したがって、本実施形態に係る非病原性ウイルスベクターを介した治療は、安全性が高いものである。
【００３２】
本開示の実施形態においては、前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はアデノウイルス関連ウイルスベクターから選択される少なくとも１つを含む。上記に記載されたベクターは、レシピエント細胞での運搬された核酸の非常に効率的な発現を、高い処理効率で実現することができる。
【００３３】
第５の態様においては、上記に記載された組換え抗体を調製する方法が、本開示で提供される。本開示の実施形態においては、前記方法は、前記コンストラクトを哺乳類細胞に導入することと、タンパク質の発現と分泌に適した条件下で前記哺乳類細胞を培養し、前記組換え抗体を得ることと、を含む。実施形態に係る方法は、上記に記載された組換え抗体を簡単かつ効率的に得ることができる。上記に記載されるように、前記組換え抗体は、ＰＤ−１及びＣＤ４７の両方を標的とすることができ、それによって免疫システムへの刺激を顕著に増強し、単一の標的に対する抗体よりも強い腫瘍抑制能力を示すことができる。
【００３４】
本開示の実施形態においては、上記に記載された方法は、下記の追加の技術的特徴の少なくとも１つを更に含むことができる。
【００３５】
本開示の実施形態においては、前記哺乳類細胞は、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＳ、２９３Ｆ、及び２９３Ｔから選択される少なくとも１つを含む。
【００３６】
第６の態様においては、癌を治療する治療組成物が、本開示で提供される。本開示の実施形態においては、前記治療組成物は、上記に記載されるコンストラクト、組換え抗体、又は核酸を含む。実施形態に係る治療組成物は、癌における顕著に増加した治療効果を示す。
【００３７】
本開示の実施形態においては、患者に投与される治療組成物は、生体適合性溶液又は薬学的に許容される担体中で適用されることが好ましい。調製された様々な治療組成物は、生理食塩水、等張食塩水、又は当業者にとって明らかな他の製剤などの薬学的又は生理学的に許容される担体に、懸濁又は溶解されることができる。適切な担体は、大部分は投与経路に依存する。他の水性又は非水性等張滅菌注射液及び水性又は非水性滅菌懸濁液は、薬学的に許容される担体である。
【００３８】
第７の態様においては、癌を治療する方法が、本開示で提供される。本開示の実施形態においては、前記方法は、癌に罹患する患者に上記に記載されたコンストラクト、組換え抗体、又は核酸を投与することを含む。本開示の実施形態に係る方法は、癌における顕著に増加した治療効果を示す。
【００３９】
上記に基づいて、本開示の１つの目的は、ＰＤ１及びＣＤ４７の両方を標的とすることができる新規の二重特異性抗体を提供することである。
【００４０】
インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）としても知られるＣＤ４７は、分子量が約５０ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質であり、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する。ＣＤ４７は、Ｎ末端細胞外ＩｇＶドメイン、５つの高疎水性の膜貫通型セグメント、及びＣ末端細胞質領域を含み、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ１）、及びインテグリンと相互作用することができ、Ｔ細胞、単球などの免疫細胞の食作用及び膜貫通型遊走の制御に関与する。
【００４１】
ＣＤ１７２ａ又はＳＨ２ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ基質−１（ＳＨＰＳ−１）としても知られる、ＣＤ４７リガンド、即ちＳＩＲＰαタンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属している膜貫通型糖タンパク質であり、ＳＩＲＰαタンパク質のＮ末端は、ＣＤ４７に結合されている。ＳＩＲＰαタンパク質は、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、マスト細胞、顆粒球、神経細胞、及び造血幹細胞で広く発現されるが、他の細胞ではあまり発現されない。ＳＩＲＰαタンパク質のＣＤ４７への結合は、Ｃ末端細胞質領域で免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）のリン酸化をもたらし、チロシンホスファターゼＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２の動員及びリン酸化が起こり、下流のシグナル伝達経路を活性化させ、それによってマクロファージの食作用を阻害する。
【００４２】
ＣＤ４７は、様々な種類の細胞の表面で広く発現され、「ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ」シグナルを放出する。ＣＤ４７は、細胞表面上の重要な自己標識タンパク質であり、マクロファージの食作用を調節するための重要なシグナルを放出する。ＣＤ４７は、マクロファージの表面上のＳＩＲＰαタンパク質に結合し、ＩＴＩＭのリン酸化、その後ＳＨＰ−１タンパク質の動員を引き起こし、一連のカスケード反応を生成し、それによってマクロファージの食作用を阻害することができる。ＣＤ４７は、アクティブな赤血球で高度に発現され、老化した赤血球で低く発現されているので、マクロファージによる特定の攻撃と老化した赤血球のクリアランスを可能にする。腫瘍細胞がＣＤ４７（「ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ」シグナルを放出する）を用いて、体の免疫システムの攻撃から逃れることができることが見出されている。別の研究によって、ＣＤ４７は、１９８０年代にヒト卵巣癌の腫瘍抗原として最初に同定されたことが示され、その後ＣＤ４７は、正常細胞よりも顕著に高い発現レベルで、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、及び他の固形腫瘍を含む、様々なヒト腫瘍タイプで発現されることも見出された。したがって、ＣＤ４７のシグナル伝達経路とそのリガンドＳＩＲＰαタンパク質は、腫瘍細胞の免疫逃避を阻害するための新しいターゲットになっている。近年、このシグナル伝達経路に基づく医薬品開発が注目され続けている。
【００４３】
腫瘍の免疫逃避を抑制する薬物を介して、ＣＤ４７のＳＩＲＰαタンパク質への結合を遮断する様々なメカニズムがある。第１に、ＣＤ４７のＳＩＲＰαタンパク質への結合を物理的に遮断すると、非自然免疫に属する抗体のＦｃフラグメントによって媒介される細胞損害性効果に依存しないマクロファージ上のＳＩＲＰαタンパク質の抑制を緩和することができる。Ｆｃフラグメントを欠く抗ＣＤ４７抗体は、依然としてマクロファージによる腫瘍のクリアランスを促進できることが発見された。第二に、ブロッキングＣＤ４７は、マクロファージに依存することなく、腫瘍のアポトーシスを直接誘導することができる。第三に、抗ＣＤ４７抗体は、抗原提示を誘発し、ＳＩＲＰαを発現するＴ細胞とＤＣ細胞両方の活性化によって、抗腫瘍適応免疫を開始することができる。ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間のシグナル伝達経路を遮断すると、サイトカイン産生とＤＣ成熟の阻害を緩和することができる。ＤＣ細胞は、ＣＤ４７抗体と食細胞との相乗効果を介して腫瘍細胞を殺傷することができ、腫瘍関連抗原をＣＤ８＋Ｔ細胞に提示し、それによって腫瘍にＣＤ８＋Ｔ細胞の特定の殺傷効果を及ぼす。
【００４４】
したがって、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα抗体は、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１抗体の後の重要な次世代腫瘍免疫抑制薬製品である。ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１には類似点があり、例えば、これらのいずれも転写因子ｍｙｃによって調節され、様々な腫瘍細胞で広く発現されている。幾つかの態様においては、ＣＤ４７抗体は、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１抗体よりも有望である場合がある。具体的には、ＣＤ４７は、ＰＤ−Ｌ１よりも広く発現され、殆ど全ての腫瘍細胞で高度に発現され、有効性の範囲が広いことを示す。更に、ＣＤ４７抗体は、ＰＤ−１抗体よりも多様なメカニズムを介して腫瘍抑制を発揮する。例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４などの従来の免疫抑制剤に対する抗体が、Ｔ細胞を腫瘍特異的に殺傷しないことは、組織のごく一部にしか効果を示さないなど、限られた機能のための重要な理由であることができ、一方、ＣＤ４７抗体は、マクロファージによって媒介される非適応免疫を開始できるだけでなく、マクロファージ、ＤＣ細胞などの抗原提示を介して、腫瘍細胞の特定の殺傷を開始することもできる。しかし、ＣＤ４７は、その広範な発現により、様々な組織での非免疫シグナルの調節も伴い、それによって、ＣＤ４７シグナルを遮断すると、マクロファージが自身の正常組織を広範囲に攻撃する、又は非免疫調節障害をもたらすことがある。マクロファージによる食作用は、ＣＤ４７などで発現される「ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ」シグナルとカルレティキュリン（ＣＲＴ）などで発現される「ｅａｔ  ｍｅ」シグナルの相乗効果を必要とする。一般に、腫瘍細胞は、ＣＲＴを高度に発現するが、正常細胞は、ＣＲＴ及び「ｅａｔ  ｍｅ」シグナルを発現しないので、ＣＤ４７は、ヒトの大脳皮質、小脳、その他の健康な組織に広く存在しているものの、ＣＤ４７抗体は、正常組織で限られた遮断効果しか示さない。しかしながら、第Ｉ相臨床試験の臨床データによれば、放射線療法と化学療法を受けた患者は、アップレギュレートされた「ｅａｔ  ｍｅ」シグナルを発現する。ＣＤ４７抗体治療後、ＣＤ４７＋赤血球が枯渇され、主な副作用として一過性貧血を引き起こすことがある。
【００４５】
ＣＤ４７抗体療法は、ＤＣ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を介して腫瘍を殺傷する効果を発揮する。ＤＣ細胞は、ＣＤ４７抗体と食細胞の相乗効果を介して、腫瘍細胞を殺傷することができ、腫瘍関連抗原をＣＤ８＋Ｔ細胞に提示し、それによって腫瘍にＣＤ８＋Ｔ細胞の特定の殺傷効果を発揮する。腫瘍細胞は、ＣＤ４７の発現をアップレギュレートして、マクロファージを欺くが、ＣＤ４７抗体は、ＣＤ４７によって発現される「ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ」シグナルを遮断して、マクロファージによる食作用を発揮させることができる。本開示の組換え抗体は、ＰＤ−１及びＣＤ４７の両方を標的とすることができ、それによって免疫システムへの刺激を顕著に増強し、より強力な腫瘍抑制能力を示すことができ、次世代の免疫チェックポイント阻害剤として役立つ。
【００４６】
本開示の更なる態様及び利点は、部分的に下記の説明に記載され、幾つかは、下記の説明から明らかになるか、又は本開示の実施から理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、本開示の実施形態に係る、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＨＸ００９−５の同定を示す結果である。
【図２】図２は、本開示の実施形態に係る、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによるＨＸ００９−５の同定を示す結果である。
【図３】図３は、本開示の実施形態に係る、ＰＤ−１に対するＨ８及びＨＸ００９−５の親和性に関する実験結果を示す図である。
【図４】図４は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５又はＨ８によって、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の結合の阻害に関する結果を示す図である。
【図５】図５は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５又はＨ８によって、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との間の結合の阻害に関する結果を示す図である。
【図６】図６は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５とｈＣＤ４７との間の結合に関する実験結果を示す図である。
【図７】図７は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５によるＣＤ４７とＳＩＲＰＡとの間の結合の抑制に関する実験結果を示す図である。
【図８】図８は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５とＣＤ１６ａとの間に結合がない場合の実験結果を示す図である。
【図９】図９は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５とＣＤ３２ａとの間に結合がない場合の実験結果を示す図である。
【図１０】図１０は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５とＣＤ３２ｂとの間に結合がない場合の実験結果を示す図である。
【図１１】図１１は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５とＣＤ６４との間に結合がない場合の実験結果を示す図である。
【図１２】図１２は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５又はＨ８によるＩＬ−２の分泌のためのＴリンパ球の刺激に関する実験結果を示す図である。
【図１３】図１３は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５によって生成された赤血球凝集反応がないことに関する実験結果を示す図である。
【図１４】図１４は、本開示の実施形態に係る、経時における腫瘍体積の変化に関する結果を示す図である。
【図１５】図１５は、本開示の実施形態に係る、経時における腫瘍体積の変化に関する結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本開示の実施例は、下記に詳細に記載される。
【００４９】
本開示の実施例を詳細に参照する。当業者であれば、以下の実施例は説明のためのものであり、本開示の範囲を限定するものと解釈されることができないことを理解するであろう。具体的な技術又は条件が実施例において明記されていない場合、当技術分野における文献（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｈｕａｎｇ  ＰＴにより翻訳）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓを参照）に記載されている技術又は条件に従って、又は製品の説明書に従って、工程が行われる。試薬又は機器の製造元が明記されていない場合、試薬又は機器は、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｏｍｐａｎｙから商業的に利用可能であることがある。
【実施例】
【００５０】
以下の実施例で使用される細胞株及び一般的な実験技術は、以下のとおりである。
【００５１】
実施例１  ＰＤ−１／ＣＤ４７二重特異性抗体のタンパク質発現
ヒト化抗体Ｈ８（抗ＰＤ−１  ＩｇＧ抗体）に基づき、特定のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＲＧＥＴＧＰ）を介して、ヒトシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰＡ、ＮＰ＿５４２９７０．１）膜外ドメイン（３２ａａ−１３７ａａ）をＨ８重鎖のＣ末端と結合させることにより、二重特異性抗体ＨＸ００９−５を得て、それにより二重特異性抗体は、目的のタンパク質であるＰＤ−１及びＣＤ４７の両方を標的にする。
【００５２】
実践の操作においては、ヒト化抗体Ｈ８の軽鎖をコードする核酸の全配列を合成し、その後ベクターに挿入することにより、発現ベクター１を得て；Ｈ８重鎖をコードする核酸の全配列及びリンカー−ＳＩＲＰＡ（１０８ｍｅｒ）をコードする核酸の全配列も合成し、前記Ｈ８重鎖をコードする核酸は、前記発現ベクター１に直接挿入され、抗ＰＤ１モノクローナル抗体Ｈ８を発現する発現ベクター２を得た。オーバーラップＰＣＲによる融合後、抗ＰＤ１モノクローナル抗体Ｈ８の重鎖とリンカー−ＳＩＲＰＡとの融合ペプチドをコードする核酸を発現ベクター１に挿入し、それによって二重特異性抗体ＨＸ００９−５を発現する発現ベクター３を得た。その後、発現ベクター２及び発現ベクター３から抽出したＤＮＡを、それぞれ哺乳類細胞（２９３細胞）にトランスフェクトした。このようなトランスフェクションにより、抗体は哺乳類細胞で発現され、細胞から分泌された。その後、抗体Ａアフィニティクロマトグラフィカラムにおける精製の後、タンパク質Ｈ８及びＨＸ００９−５を得た。ＨＸ００９−５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ標準分析技術による品質同定後の後続の薬力学研究に用いられた。
【００５３】
図１及び図２は、それぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣによるＨＸ００９−５の同定を示す結果である。
【００５４】
図１は、ＨＸ００９−５の同定のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。図１においては、レーン１は、ＨＸ００９−５（還元された）を表し；レーン２は、Ｈ８（還元された）を表し；レーンＭは、タンパク質マーカー（１８．４ＫＤａ；２５ＫＤａ；３５ＫＤａ；４５ＫＤａ；６６．２ＫＤａ）を表し；レーン３は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）バッファを示す。図１に示されるように、抗体ＨＸ００９−５の候補サンプルは、比較的高い全体の純度を示す。
【００５５】
図２は、ＨＸ００９−５の同定におけるＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果である。図２に示されるように、抗体は、積分定量により、全体の純度が９８．２％であることが確認されている。
【００５６】
ＨＸ００９−５の重鎖のアミノ酸配列
【化４】
2021505149.tif 000005
可変領域に下線が引かれる。
【００５７】
ＨＸ００９−５の重鎖をコードする核酸配列
【化５】
2021505149.tif 000006
【００５８】
ＨＸ００９−５の軽鎖のアミノ酸配列
【化６】
2021505149.tif 000007
可変領域に下線が引かれる。
【００５９】
ＨＸ００９−５の軽鎖をコードする核酸配列
【化７】
2021505149.tif 000008
【００６０】
実施例２  ＨＸ００９−５二重特異性抗体のＥＬＩＳＡ結合アッセイ
１．Ｈ８及びＨＸ００９−５のＰＤ−１結合ＥＬＩＳＡアッセイ
実施例１で得られたＨ８抗体及びＨＸ００９−５抗体との間で、ＰＤ−１結合アッセイ及びＰＤ−Ｌ１競合アッセイを含む、直接の比較を行った。詳細は下記の通りである。
【００６１】
ＰＤ−１結合アッセイのための具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
ＥＬＩＳＡプレートを０．２５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度でｈＰＤ−１−ｈｉｓ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）を用いて、ｈＰＤ−１−ｈｉｓ抗原で塗布したＥＬＩＳＡプレートを３７℃で２時間ブロッキングし、その後１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
３）一次抗体とのインキュベーション
Ｈ８抗体及びＨＸ００９−５抗体を、それぞれ２μｇ／ｍｌから１：５ずつ段階希釈し、それぞれの抗体に対する７つの勾配抗体溶液を得た。各抗体のための７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロールをブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
４）二次抗体とのインキュベーション
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、二次抗体として、１：１００００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）（ウェル当たり１００μｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）発色（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ）
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）としての３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウェル当たり１００μｌ添加し、５分間〜１５分間室温でインキュベーションした。
６）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
７）読み（ｒｅａｄｉｎｇ）
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００６２】
表１及び図３に示されるように、ＰＤ−１に結合するＨ８及びＨＸ００９−５のＥＣ５０値はいずれも０．０５ｎＭであると計算されることができる。図３は、Ｈ８のＣ末端でのリンカー−ＳＩＲＰＡ（１０８ｍｅｒ）との融合は、抗体ＨＸ００９−５にＰＤ−１への結合親和性における変化をもたらさないことを示す。
【表１】
2021505149.tif 000009
【００６３】
２．Ｈ８及びＨＸ００９−５のＰＤ−Ｌ１競合ＥＬＩＳＡアッセイ
具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり５０μｌ）の濃度でｈＰＤ−１−ｈＩｇＧＦｃ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、３７℃で２時間、１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）で、塗布した９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをブロッキングし、その後１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄した。
３）一次抗体とのインキュベーション
Ｈ８抗体及びＨＸ００９−５抗体を、それぞれ６μｇ／ｍｌから１：３ずつ段階希釈し、それぞれの抗体に対する７つの勾配抗体溶液を得た。各抗体のための７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロール（ウェル当たり５０μｌ）をブロッキングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、室温で１０分間インキュベーションした。
４）リガンドとのインキュベーション
ウェル当たり５０μｌで、０．６μｇ／ｍｌのＰＤ−Ｌ１−ｍＩｇＧ２ａＦｃ溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）二次抗体とのインキュベーション
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、二次抗体としての１：５０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）（ウェル当たり５０μｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
６）発色
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり５０μｌ添加し、５分間〜１５分間室温でインキュベーションした。
７）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
８）読み
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００６４】
結果を表２及び図４に示す。ＨＸ００９−５抗体及びＨ８抗体は、ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合の阻害に関して、１．５ｎＭ及び１．０ｎＭのそれぞれのＩＣ５０値を示し、Ｈ８のＣ末端でリンカー−ＳＩＲＰＡ（１０８ｍｅｒ）との融合は、抗体ＨＸ００９−５にＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合の阻害における明らかな変化をもたらさない。
【表２】
2021505149.tif 000010
【００６５】
３．Ｈ８及びＨＸ００９−５のＰＤ−Ｌ２競合ＥＬＩＳＡアッセイ
具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１．０μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のｈＰＤ−１−ｈＩｇＧＦｃ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、３７℃で２時間、１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）で、塗布した９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをブロッキングし、その後１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで４回洗浄した。
３）一次抗体とのインキュベーション
Ｈ８抗体及びＨＸ００９−５抗体を、それぞれ２０μｇ／ｍｌから１：３ずつ段階希釈し、それぞれの抗体に対する７つの勾配抗体溶液を得た。各抗体のための７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロール（ウェル当たり５０μｌ）をブロッキングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、室温で１０分間インキュベーションした。
４）リガンドとのインキュベーション
０．６μｇ／ｍｌのＰＤ−Ｌ２−ｈｉｓ  ｔａｇ溶液をウェル当たり５０μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）二次抗体とのインキュベーション
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで５回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、１：７５０希釈（ウェル当たり５０μｌ）で、二次抗体としてのＨＲＰ結合抗−ｈｉｓ  ｔａｇマウスモノクローナル抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
６）発色
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで６回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり１００μｌ添加し、３０分間室温でインキュベーションした。
７）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
８）読み
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００６６】
結果を表３及び図５に示す。ＨＸ００９−５抗体及びＨ８抗体は、ＰＤ−Ｌ２へのＰＤ−１結合の阻害に関して、１．５ｎＭ及び２．７ｎＭのそれぞれのＩＣ５０値を示し、Ｈ８のＣ末端でリンカー−ＳＩＲＰＡ（１０８ｍｅｒ）との融合は、抗体ＨＸ００９−５にＰＤ−Ｌ２へのＰＤ−１結合の阻害における明らかな変化をもたらさない。
【表３】
2021505149.tif 000011
【００６７】
４．ＨＸ００９−５のＣＤ４７結合ＥＬＩＳＡアッセイ
実施例１で得たＨＸ００９−５抗体のＣＤ４７結合ＥＬＩＳＡアッセイを行った。詳細は下記に示される。
【００６８】
具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
ＥＬＩＳＡプレートを０．２５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のＣＤ４７抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
３７℃で２時間、１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）で、ＣＤ４７抗原で塗布したＥＬＩＳＡプレートをブロッキングし、その後１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
３）一次抗体とのインキュベーション
ＨＸ００９−５抗体を、それぞれ１０μｇ／ｍｌから１：５ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロールを、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
４）二次抗体とのインキュベーション
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、二次抗体として、１：１００００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）（ウェル当たり１００μｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）発色
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり１００μｌ添加し、５分間〜１５分間室温でインキュベーションした。
６）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
７）読み
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００６９】
結果を表４及び図６に示す。ＨＸ００９−５とｈＣＤ４７との間の結合におけるＥＣ５０は、０．６ｎＭである。
【表４】
2021505149.tif 000012
【００７０】
５．ＨＸ００９−５のＳＩＰＲＡ競合ＥＬＩＳＡアッセイ
具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを０．２５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のＣＤ４７抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、３７℃で２時間、１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）で、塗布した９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをブロッキングし、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで４回洗浄した。
３）一次抗体とのインキュベーション
ＨＸ００９−５抗体を、３０μｇ／ｍｌから１：３ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロール（ウェル当たり５０μｌ）を、ブロッキングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、室温で１０分間インキュベーションした。
４）リガンドとのインキュベーション
０．６μｇ／ｍｌのＳＩＲＰＡ−ｈｉｓ  ｔａｇ溶液をウェル当たり５０μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）二次抗体とのインキュベーション
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで５回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、１：７５０希釈（ウェル当たり５０μｌ）で、二次抗体としてのＨＲＰ結合抗−ｈｉｓ  ｔａｇマウスモノクローナル抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
６）発色
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで６回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり１００μｌ添加し、３０分間室温でインキュベーションした。
７）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
８）読み
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００７１】
表５及び図７に示される結果は、ＨＸ００９−５が、２１ｎＭのＩＣ５０で、ＣＤ４７とＳＩＲＰＡとの間の結合を阻害することを示す。
【表５】
2021505149.tif 000013
【００７２】
実施例３  ＨＸ００９−５Ｆｃフラグメントの有効性における研究
ＨＸ００９−５（実施例１で得られた）のＦｃフラグメントの有効性を調査するために、個々のＦＣ受容体に対するＨＸ００９−５の結合能力の決定について、それぞれのＦｃ受容体（ＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、及びＣＤ６４）の親和性を試験した。詳細は下記に示される。
【００７３】
１．ＣＤ１６ａに対するＨＸ００９−５の親和性のアッセイ
Ｆｃ受容体ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａとしても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃフラグメントに結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与することができる。治療用モノクローナル抗体とＦｃ受容体との間の結合能力は、抗体の安全性と有効性に影響を与える。本実施例では、ＨＸ００９−５のＣＤ１６ａへの親和性をＥＬＩＳＡにより試験し、ＨＸ００９−５のＦｃ受容体ＣＤ１６ａへの結合能力を評価した。
【００７４】
ＨＸ００９−５抗体（実施例１で得られた）は、ＨＸ００６抗体（ＩｇＧ１サブタイプ）と比較して、ＥＬＩＳＡによりＣＤ１６ａへの結合が検出された。詳細は下記に示される。
【００７５】
具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
ＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のＣＤ１６ａ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
ＣＤ１６ａ抗原で塗布したＥＬＩＳＡプレートを、１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）で、３７℃で２時間ブロッキングし、その後１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
３）一次抗体とのインキュベーション
ＨＸ００９−５抗体を、それぞれ１０μｇ／ｍｌから１：５ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロールを、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
４）二次抗体とのインキュベーション
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、二次抗体として、１：８０００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）（ウェル当たり１００μｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）発色
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり１００μｌ添加し、３０分間室温でインキュベーションした。
６）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
７）読み
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００７６】
表６及び図８に示される結果は、ＨＸ００９−５とＣＤ１６ａとの間に顕著な結合がないことを示す。
【表６】
2021505149.tif 000014
【００７７】
２．ＣＤ３２ａに対するＨＸ００９−５の親和性のアッセイ
ＨＸ００９−５抗体（実施例１で得られた）は、ＨＸ００６抗体（ＩｇＧ１サブタイプ）と比較して、ＥＬＩＳＡによりＣＤ３２ａへの結合が検出された。詳細は下記に示される。
【００７８】
具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
ＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のＣＤ３２ａ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
ＣＤ３２ａ抗原で塗布したＥＬＩＳＡプレートを１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）で、３７℃で２時間ブロッキングし、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
３）一次抗体とのインキュベーション
ＨＸ００９−５抗体を、それぞれ１０μｇ／ｍｌから１：５ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロールを、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
４）二次抗体とのインキュベーション
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、１：８０００希釈（ウェル当たり１００μｌ）で、二次抗体としてのヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）発色
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり１００μｌ添加し、３０分間室温でインキュベーションした。
６）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
７）読み
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００７９】
表７及び図９に示される結果は、ＨＸ００９−５とＣＤ３２ａとの間に顕著な結合がないことを示す。
【表７】
2021505149.tif 000015
【００８０】
３．ＣＤ３２ｂに対するＨＸ００９−５の親和性のアッセイ
ＨＸ００９−５抗体（実施例１で得られた）は、ＨＸ００６抗体（ＩｇＧ１サブタイプ）と比較して、ＥＬＩＳＡによりＣＤ３２ｂへの結合が検出された。詳細は下記に示される。
【００８１】
具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
ＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のＣＤ３２ｂ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
ＣＤ３２ｂ抗原で塗布したＥＬＩＳＡプレートを１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）で、３７℃で２時間ブロッキングし、その後１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
３）一次抗体とのインキュベーション
ＨＸ００９−５抗体を、それぞれ１０μｇ／ｍｌから１：５ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロールを、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
４）二次抗体とのインキュベーション
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、１：８０００希釈（ウェル当たり１００μｌ）で、二次抗体としてのヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）発色
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり１００μｌ添加し、３０分間室温でインキュベーションした。
６）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
７）読み
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００８２】
表８及び図１０に示される結果は、ＨＸ００９−５とＣＤ３２ｂとの間に顕著な結合がないことを示す。
【表８】
2021505149.tif 000016
【００８３】
４．ＣＤ６４に対するＨＸ００９−５の親和性のアッセイ
ＨＸ００９−５抗体（実施例１で得られた）は、ＨＸ００６抗体（ＩｇＧ１サブタイプ）と比較して、ＥＬＩＳＡによりＣＤ６４への結合が検出された。詳細は下記に示される。
【００８４】
具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
ＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のＣＤ６４抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
ＣＤ６４抗原で塗布したＥＬＩＳＡプレートを１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）で、３７℃で２時間ブロッキングし、その後１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
３）一次抗体とのインキュベーション
ＨＸ００９−５抗体を、それぞれ１０μｇ／ｍｌから１：５ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロールを、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
４）二次抗体とのインキュベーション
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、１：８０００希釈（ウェル当たり１００μｌ）で、二次抗体としてのヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）発色
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり１００μｌ添加し、３０分間室温でインキュベーションした。
６）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
７）読み
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００８５】
表９及び図１１に示される結果は、ＨＸ００９−５とＣＤ６４との間に顕著な結合がないことを示す。
【表９】
2021505149.tif 000017
【００８６】
実施例４  混合リンパ球反応（ＭＬＲ）による二重特異性抗体と抗ＰＤ１抗体との生物活性
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって、Ｔリンパ球を刺激して、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γを分泌する能力は、ＨＸ００９−５（実施例１で得られた）とＨ８との間で検出された。詳細を下記に示す。
【００８７】
混合リンパ球反応では、別の個体からの樹状細胞（ＤＣ）と混合した後、Ｔ細胞（ＴＣ）を刺激し、ＤＣ提示によってＩＬ−２及びＩＦＮ−γを分泌した。最初に、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４によってＤＣに分化するように、血中の単球を誘導した。その後、ＤＣは、ＴＮＦａによって刺激されて成熟した。細胞培養の上澄み中のＩＬ−２及びＩＦＮ−γの分泌レベルは、成熟ＤＣと異種性ＴＣを混合して５日後に検出した。具体的には、１×１０５細胞／ウェルの濃度でのＴＣと１×１０４細胞／ウェルの濃度でのＤＣを９６ウェルプレートで混合し、１０Ｍ〜０．０９７６５６２５ｎＭの８つの勾配濃度の抗体を添加した。５日後、ＩＬ−２検出キットを用いて、上澄みのＩＬ−２含有量を定量化した。
【００８８】
図１２は、それぞれＨ８抗体及びＨＸ００９−５抗体によって刺激されたＴリンパ球におけるＩＬ−２の分泌レベルを示す。図１２から分かるように、Ｈ８抗体及びＨＸ００９−５抗体は、Ｔリンパ球を効果的に刺激して、ＩＬ−２を分泌することができ、Ｈ８のＣ末端におけるリンカー−ＳＩＲＰＡ（１０８ｍｅｒ）との融合が、Ｔリンパ球を刺激してＩＬ−２を分泌することにおける変化を抗体ＨＸ００９−５にもたらさないことを示す。
【００８９】
実施例５  ＨＸ００９−５による赤血球凝集反応についての研究
具体的な工程は、下記の通りである。
１．ボランティアから、５ｍｌの末梢血を５ｍｌのヘパリンで抗凝固剤処置した管に集め、穏やかに振盪して十分に接触させた。１５ｍｌの遠心管に移し、穏やかな振盪下で、９ｍｌのＰＢＳと混合した後、末梢血を２１００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
２．赤血球層の上にある白血球を含む上澄みを捨て、再懸濁するために１２ｍｌのＰＢＳを添加し、その後１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
３．赤血球層の上にある上澄みを捨て、再懸濁するために１２ｍｌのＰＢＳを添加し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
４．工程３を２回繰り返した。
５．上澄みを捨てた後、１ｍｌの赤血球懸濁液を１５ｍｌの遠心管に移し、９ｍｌのＰＢＳと混合し、ＰＢＳ中１０％の赤血球として使用時に備えて調製した。
６．ＰＢＳ中１０％赤血球１ｍｌを、新しい１５ｍｌの遠心管内で９ｍｌのＰＢＳと混合し、使用時に備えてＰＢＳ中１％赤血球を得た。
７．様々な試験サンプルの調製
１）ＨＸ００９−５を９．１ｍｇ／ｍｌから０．９ｍｇ／ｍｌまで希釈し、更に１：３に段階希釈し、１２個の勾配濃度を得た。
２）Ｈ８を１０ｍｇ／ｍｌから０．９ｍｇ／ｍｌまで希釈し、更に１：３に段階希釈し、１２個の勾配濃度を得た。
３）ポテト（ｐｏｔａｔｉｏｎ）レクチン抽出溶液を１：３に段階希釈し、８個の勾配濃度を得た。
４）ＰＢＳをブランクコントロールとした。
【００９０】
９６ウェルＵ底プレートのＢ１からＧ１２までの各ウェルに、ＰＢＳ中１％の赤血球５０μｌ及び５０ｍｌの試験サンプルを以下の表１０に示されるパターンで添加し、５％、ＣＯ２のインキュベーターにおいて一晩３７℃でインキュベーションした。
【００９１】
２４時間のインキュベーションした後、ゲルイメージングアナライザーによる観察を行うために、９６ウェルプレートを取り出した。表１０及び図１３に示されるように、最初の４つの濃度でのポテトレクチン抽出溶液（ポジティブコントロールとして）を添加したウェルでは、明らかな赤血球凝集反応が観察され；一方、Ｈ８、ＨＸ００９−５、又はＰＢＳを様々な濃度で添加したウェルでは赤血球凝集反応は観察されず、赤血球凝集反応がＨＸ００９−５によって引き起こされていないことを示す。
【表１０】
2021505149.tif 000018
【００９２】
実施例６  ヒト未分化大細胞リンパ腫（ＫＡＲＰＡＳ−２９９）を皮下移植したＭｉｘｅｎｏモデルにおけるＨＸ００９−５の抗腫瘍有効性
ヒト未分化大細胞リンパ腫（ＫＡＲＰＡＳ−２９９）を皮下移植したＭｉｘｅｎｏモデルにおけるＨ８及びＨＸ００９−５（実施例１で得られた）の抗腫瘍有効性における研究について、ヒト腫瘍移植モデルをＮＳＧマウスで樹立した。詳細は下記に示される。
【００９３】
ＮＯＤ／Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌの欠損／変異によって特徴づけられるＮＳＧマウスは、ヒトの細胞や組織に対する拒絶が殆ど存在しないので、現時点でヒトの細胞移植に最も適した免疫不全のマウスモデルとして使用される。したがって、本発明者らは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＮＳＧマウスに養子的に導入することにより樹立された移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルにおけるＨＸ００９−５のｉｎ  ｖｉｖｏ薬力学を調査する。ＮＳＧマウスに基づくヒト腫瘍移植モデル（Ｍｉｘｅｎｏモデル）によって、本発明者らは、ヒト未分化大細胞リンパ腫（ＫＡＲＰＡＳ−２９９）を皮下移植したＭｉｘｅｎｏモデルにおけるＨＸ００９−５の抗腫瘍有効性を調査する。
【００９４】
０日目に、ＫＡＲＰＡＳ−２９９細胞を３０匹のＮＣＧマウスの右背中に皮下接種した。接種から６日目に、腫瘍体積が６０ｍｍ３の平均値に達したときに、３０匹のＮＣＧマウスを５つのグループに分け、各グループに６匹のマウスとした。ドナーＡに由来するヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、尾静脈を介して各グループの３匹のマウス（「Ａ」とマークされている）に移植し；一方、ドナーＢに由来するヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、各グループの残りの３匹のマウス（「Ｂ」とマークされている）に尾静脈を介して移植した。それぞれのドナーからのＰＢＭＣを注射用ＰＢＳに懸濁した（注射量は、０．１ｍｌ／マウス）であった。図１１に示されるように、腫瘍細胞の接種から６日目、９日目、１３日目、１６日目、１９日目、及び２２日目の６回、尾静脈を介して５つのグループのマウスに、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇの個々の用量でのＨＸ００９−５、及びポジティブコントロールとしての１０ｍｇ／ｋｇでのＨ８（表１１ではＨＸ００８とも示される）；並びにコントロールとしての５ｍｇ／ｋｇでのアイソフォーム抗体（ヒトＩｇＧ４）をそれぞれ投与した。治療評価は、相対腫瘍抑制率（ＴＧＩＲＴＶ）で行い、安全性評価は体重と死亡率との変化で行った。
【表１１】
2021505149.tif 000019
注：薬物投与量は、１０μｌ／ｇである。ｎは動物の数を表す。０日目は、腫瘍細胞が接種された日である。ｉ．ｖ．は、尾静脈を介した投与を表す。
【００９５】
図１４及び図１５は、５つのグループにおける腫瘍体積の経時的な変化を示す。ＰＢＭＣが接種され、アイソフォーム抗体（ヒトＩｇＧ４）が投与されたコントロール群に対して、ＨＸ００９−５又はＨ８の投与は、明らかな抗腫瘍有効性を示し、ＨＸ００９−５の用量依存性が観察された。即ち、投与用量が多いほど、腫瘍抑制が大きくなる。同じ用量下で、ＨＸ００９−５は、Ｈ８よりも更に強い抗腫瘍有効性を示し、ＰＤ１／ＣＤ４７二重標的抗体がＰＤ１単一の標的抗体より優れていることを示す。
【００９６】
「実施形態」、「幾つかの実施形態」、「１つの実施形態」、「他の例」、「例」、「具体的な例」、又は「幾つかの例」など本明細書中の参照は、実施形態又は例に関連して記載される特定の部分、構造、材料、又は特徴が本開示の少なくとも１つの実施形態又は例中に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通して様々な場所で記載される「幾つかの実施形態においては」、「１つの実施形態においては」、「実施形態においては」、「他の実施形態においては」、「例においては」、「具体的な例においては」、又は「幾つかの例においては」などの表現の出現は、必ずしも本開示の実施形態又は例と同じものを意味しているわけではない。更に、特定の部分、構造、材料、又は特徴は、１つ以上の実施形態又は例において任意の好適な方法で組合せてもよい。
【００９７】
説明的な実施形態を示し、記載してきたが、上記実施形態が、本開示を限定するように解釈されることができないこと、及び、実施形態について、本開示の範囲において、変更、代替、及び改変を行うことができることが当業者によって理解されよう。
【図１】
2021505149.tif 000020
【図２】
2021505149.tif 000021
【図３】
2021505149.tif 000022
【図４】
2021505149.tif 000023
【図５】
2021505149.tif 000024
【図６】
2021505149.tif 000025
【図７】
2021505149.tif 000026
【図８】
2021505149.tif 000027
【図９】
2021505149.tif 000028
【図１０】
2021505149.tif 000029
【図１１】
2021505149.tif 000030
【図１２】
2021505149.tif 000031
【図１３】
2021505149.tif 000032
【図１４】
2021505149.tif 000033
【図１５】
2021505149.tif 000034
【配列表】
2021505149000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月23日(2020.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＰＤ−１抗体と；
ヒトシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）細胞外セグメントと、
を含む組換えタンパク質であって、
前記ヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントのＮ末端は、前記抗ＰＤ−１抗体の重鎖のＣ末端に接続されることを特徴とする組換えタンパク質。
【請求項２】
前記抗ＰＤ−１抗体が、ＰＤ−１に対するＩｇＧ様抗体である請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３】
前記抗ＰＤ−１抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む請求項２に記載の組換えタンパク質。
【請求項４】
前記組換えタンパク質が、更にリンカーを含み、
前記リンカーのＮ末端が、前記抗ＰＤ−１抗体の重鎖のＣ末端に接続され、前記リンカーのＣ末端が、前記ヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントのＮ末端に接続される請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項５】
前記リンカーが、配列番号１のアミノ酸配列を含む請求項４に記載の組換えタンパク質。
【請求項６】
前記ヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントが、配列番号７のアミノ酸配列を含む請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖と；
配列番号３のアミノ酸配列を含む、前記抗ＰＤ−１抗体の重鎖と前記ヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントとの融合ペプチドと、
を含む請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の組換えタンパク質をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項９】
前記核酸が、
前記抗ＰＤ−１抗体の軽鎖をコードする第１のヌクレオチド配列と；
前記抗ＰＤ−１抗体の重鎖と前記ヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントとの融合ペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列と、
を含む請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
前記核酸が、
配列番号２の抗ＰＤ−１抗体の軽鎖をコードする配列番号４の第１のヌクレオチド配列と；
配列番号３の前記抗ＰＤ−１抗体の重鎖とヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントとの融合ペプチドをコードする配列番号５の第２のヌクレオチド配列と、
を含む請求項８に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項１から７のいずれかに記載の抗ＰＤ−１抗体の軽鎖をコードする第１の核酸分子と；
請求項１又は７のヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントと前記抗ＰＤ−１抗体の重鎖との融合ペプチドをコードする第２の核酸分子と、を含むコンストラクトであって、
任意に、前記コンストラクトが、前記第１の核酸分子に機能可能に結合されるプロモーターを更に含み、好ましくは、前記プロモーターが、Ｕ６、Ｈ１、ＣＭＶ、ＥＦ−１、ＬＴＲ、又はＲＳＶプロモーターから選択されることを特徴とするコンストラクト。
【請求項１２】
前記コンストラクトのベクターが、非病原性ウイルスベクターであり、
好ましくは、前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はアデノウイルス関連ウイルスベクターから選択される少なくとも１つを含む請求項１１に記載のコンストラクト。
【請求項１３】
請求項１から７のいずれかに記載の組換えタンパク質を調製する方法であって、前記方法が、
請求項１１から１２のいずれかに記載のコンストラクトを哺乳類細胞に導入することと；
タンパク質の発現と分泌に適した条件下で前記哺乳類細胞を培養し、前記組換えタンパク質を得ることと、
を含み、
好ましくは、前記哺乳類細胞が、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＳ、２９３Ｆ、及び２９３Ｔから選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１から７のいずれかに記載の組換えタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする癌を治療する治療組成物。
【請求項１５】
癌を治療する医薬の製造のための請求項１から７のいずれかに記載の組換えタンパク質の使用であって、前記使用が、癌に罹患する患者に、前記組換えタンパク質又は前記組換えタンパク質を含む治療組成物を投与することを含むことを特徴とする使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、免疫学及び抗体工学技術の分野、特に、ＰＤ−１及びＣＤ４７に対する二重特異性抗体、及びその適用に関する。より具体的には、本開示は、組換え抗体、核酸、コンストラクト、組換え抗体を調製する方法、癌を治療する治療組成物、及び癌を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は近年、世界中で主要な死因の１つになっている。世界保健機関の報告によれば、２０１５年の世界の癌による死亡者数は約８８０万人に達し、年間の総死亡者数の約６分の１を占めている。２０１５年には、中国で新たに診断された癌の症例は、約４２９万２０００人、癌による死亡は２８１万４０００人であった。中国では、癌の発生率は依然として上昇している。
【０００３】
現在、癌治療は主に手術、放射線療法、化学療法に焦点を当てているが、従来の治療法は、腫瘍特異性が低く、毒性と副作用が大きいという欠点がある。したがって、癌を治療するためのより高い特異性を有する、より安全でより効果的な方法が強く求められている。近年、癌のメカニズムに関する理解が深まるにつれ、特定の抗体を使用して腫瘍の成長を阻害する分子標的療法が徐々に登場している。このような状況下、主に細胞工学技術と遺伝子工学技術をベースとした抗体工学技術により調製された抗体医薬は、高い特異性、顕著な治療効果、低い毒性及び少ない副作用などの利点を示し、それによって癌治療のための非常に広い将来性を有する。最近では、免疫チェックポイントの発見により、免疫チェックポイントを標的とする特定の抗体が開発され、腫瘍細胞の免疫逃避を阻害し、免疫療法を新しい段階に押し上げている。
【０００４】
免疫システムでは、ＭＨＣ−ＴＣＲ複合体によって提供される最初の刺激シグナルだけでなく、抗原提示細胞の表面上の分子によって提供される２番目の刺激シグナル（即ち、共刺激シグナル）にも依存して、Ｔ細胞の活性化は複雑化される。このような共刺激シグナルがないと、Ｔ細胞の無反応、寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、アポトーシスを引き起こす。プログラム死（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ）受容体−１（ＰＤ−１、ＣＤ２７９としても知られている）及びそのリガンド（ＰＤ−１のリガンド１及びリガンド２、即ちＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２）は、このような阻害性の共刺激分子である。
【０００５】
ヒトＰＤ−１は、ＣＤ２８ファミリーのタイプＩ膜貫通型糖タンパク質に属し、分子量は約５５ｋＤａである。ヒトＰＤ−１は、細胞内ドメインに２つのチロシン残基（即ち、Ｙ２２３及びＹ２４８）を含み、それぞれＮ末端免疫受容体チロシン系抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ、モチーフＶＤＹＧＥＬ）及びＣ末端免疫受容体チロシン系スイッチモチーフ（ＩＴＳＭ、モチーフＴＥＹＡＴＩ）の形成に関与する。ＩＴＩＭモチーフは、細胞内ＳＨＰ−２を動員し、下流のタンパク質をリン酸化し、ＢＣＲ又はＴＣＲ受容体シグナル伝達を減少させ、最終的にリンパ球の増殖、サイトカインの産生を抑制し、細胞分裂周期の停止を誘発する。ヒトＰＤ−１は、細胞外領域にＩｇＶ様ドメインを有する。このようなＩｇＶ様ドメインは、複数の糖鎖付加部位を含み、高度にグリコシル化され、主にリガンドとの結合に関与し、Ｔ細胞の活性化を抑制する機能を発揮する。二量体形態で存在する他の共刺激分子とは異なり、ＰＤ−１は、ＰＤ−１の細胞外領域がシステイン残基を欠くので、単量体として存在することができる。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞、並びに単球、樹状細胞（ＤＣ）及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）で発現される。
【０００６】
ＰＤ−１の２つのリガンド（即ち、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４、及びＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−ＤＣとしても知られる）は、Ｂ７タンパク質ファミリーのメンバーに属するタイプＩ糖タンパク質である。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１の主なリガンドは、ＩｇＶ様領域、ＩｇＣ様領域、膜貫通型領域、及び細胞質領域を含み、前記細胞質領域は細胞内シグナル伝達に関与し、前記ＩｇＶ様領域及び前記ＩｇＣ様領域は、細胞間シグナル伝達に関与する。ＰＤ−１の発現は、インターロイキン４（ＩＬ−４）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）などの幾つかの炎症性因子によって積極的に調節される。活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、種々の腫瘍細胞での発現に加えて、ＰＤ−Ｌ１は、心臓、血管、胎盤、骨格筋、肺、肝臓、脾臓、胸腺などの非リンパ系臓器でも広く発現される。ＰＤ−Ｌ２は、主に活性化マクロファージ、ＤＣ、及び僅かな腫瘍細胞で発現される。
【０００７】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路の免疫抑制効果は、様々な免疫障害、例えば自己免疫疾患の発生と発症に重要な役割を果たす。ＰＤ−１を欠くマウスは、遅延した臓器特異的な自己免疫を示す。ＰＤ−１の欠如は、エリテマトーデスＬＰＲマウスモデル及び自己免疫疾患を含む糖尿病ＮＯＤマウスモデルで、加速された組織特異的な自己免疫特性を示す。更に、ＰＤ−１を過剰発現する機能不全の細胞障害性リンパ球細胞（ＣＴＬ）は、ＨＩＶ、ＨＢＶなどのウイルスによる慢性感染症で見られるが、ブロッキングＰＤ−１シグナルは、ＣＴＬの機能を逆転させ、ウイルスを除去する。
【０００８】
腫瘍細胞は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路の免疫抑制によって免疫逃避を実行する。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、メラノーマ、リンパ腫、乳癌、白血病、種々の尿路腫瘍、消化管腫瘍、生殖器系腫瘍など、様々な腫瘍細胞がＰＤ−Ｌ１の発現をアップレギュレートすることができる。過剰発現されたＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞の表面上のＰＤ−１受容体と相互作用し、それによってＰＤ−１のＩＴＳＭドメインにおけるチロシンがリン酸化され、下流のホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）とチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）の脱リン酸化を引き起こし、それによって、下流のＡＫＴ、ＥＲＫ、及び他の経路の活性化を阻害し、最終的に、Ｔ細胞の活性化に必要とされる遺伝子及びサイトカインの転写及び翻訳を阻害する。一方、ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞でＰＤ−１の蓄積を引き起こし、細胞周期の停止とＧ０／Ｇ１期の細胞の大量蓄積をもたらすことが研究によって示されている。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路の活性化が、特定のＣＴＬのアポトーシスをもたらすことがあり、それによってＣＴＬの細胞損害性殺傷効果の感度を低下させ、腫瘍細胞の免疫逃避を促進することが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験とマウスモデルによっても見出される。要約すると、腫瘍細胞は、Ｔ細胞の表面上でＰＤ−１と相互作用するＰＤ−Ｌ１を発現させることにより、Ｔ細胞の活性化、増殖及び腫瘍殺傷能力を阻害することができる。
【０００９】
したがって、腫瘍免疫において重要な役割を果たすＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路は、腫瘍免疫療法における新しい分子標的となっている。腫瘍細胞によるＴ細胞（即ち、主要な細胞性免疫細胞）の阻害は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路を遮断することにより遮断されることができる抗ＰＤ−１抗体と抗ＰＤ−Ｌ１抗体の開発は、腫瘍免疫療法の研究における一般的な研究の方向になっている。米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可された、ＰＤ−１を標的にするモノクローナル抗体としては、ＭｅｒｃｋからのＫｅｙｔｒｕｄａ（ペンブロリズマブ）及びＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂからのＯｐｄｉｖｏ（ニボルマブ）が挙げられる。ＰＤ−Ｌ１を標的にするモノクローナル抗体としては、ＲｏｃｈｅからのＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（アテゾリズマブ）、Ｐｆｉｚｅｒ及びＭｅｒｃｋによって製造されたＢａｖｅｎｃｉｏ（アベルマブ）、及びＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａからのＩｍｆｉｎｚｉ（デュルバルマブ）が挙げられる。これらのモノクローナル抗体は、メラノーマ並びに転移性扁平上皮非小細胞肺癌、及び化学療法後に進行した他の腫瘍（即ち、モノクローナル抗体が最初に適用された癌）においてだけでなく、新たに適用されたホジキンリンパ腫、腎癌、胃癌、肛門癌、肝臓癌、結腸直腸癌等においても、既に良好な臨床結果を達成している。更に、幾つかの抗ＰＤ−１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、腫瘍の治療のための臨床試験に入っている。
【００１０】
現在、免疫療法の最大の制限は、ＰＤ−１に対して１５％〜５０％の有効性であるといった、低い有効性である。研究のエビデンスは、成功した癌免疫療法は、腫瘍の局所免疫応答のみを誘発するのではなく、全身免疫応答を誘発できるかどうかに依存することを示す。免疫システムへの刺激時に全身免疫応答を生成することは、免疫療法の有効性を顕著に向上させることが期待されている。
【発明の概要】
【００１１】
本開示は、関連技術における技術的問題の１つを少なくともある程度解決することを目的とする。
【００１２】
１つの態様においては、組換え抗体（即ち、組換えタンパク質）が本開示で提供される。本開示の実施形態においては、前記組換え抗体は、抗ＰＤ−１抗体と、ヒトシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）細胞外セグメントと、を含み、前記ヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントのＮ末端は、前記抗ＰＤ−１抗体の重鎖のＣ末端に接続される。本実施形態に係る組換え抗体は、ＰＤ−１及びＣＤ４７の両方を標的とすることができるので、単一の標的に対する抗体よりも免疫システムへの刺激を顕著に増強し、より強力な腫瘍抑制能力を発揮することができる。
【００１３】
本開示の実施形態においては、上記の組換え抗体は、下記の追加の技術的特徴の少なくとも１つを更に含むことができる。
【００１４】
本開示の実施形態においては、前記抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１に対するＩｇＧ様抗体である。好ましくは、ＩｇＧ様抗体は、ＩｇＧ４サブタイプである。ＩｇＧ４は、Ｆａｂアーム交換（Ｆａｂ−ａｒｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）により、容易に不完全な抗体を形成する。ＩｇＧ４サブタイプ抗体のＳ２２８Ｐ修飾は、Ｆａｂアーム交換を効果的に減少させ、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の効果を効果的に回避することができる。
【００１５】
本開示の実施形態においては、前記抗ＰＤ−１抗体は、ＨＸ００８  １８Ａ１０抗体（即ち、本明細書では、Ｈ８抗体とも呼ばれる）であり、特許出願２０１６１０２０７７４１．６号及びＰＣＴ／ＣＮ２０１６／１０３８１４に記載される内容を参照する。
【００１６】
本開示の実施形態においては、前記組換え抗体は、更にリンカーを含み、前記リンカーのＮ末端は、前記抗ＰＤ−１抗体の重鎖のＣ末端に接続され、前記リンカーのＣ末端は、前記ヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントのＮ末端に接続され、タンパク質の立体障害の相互作用効果を回避し、更にタンパク質フォールディングを促進する。
【００１７】
本開示の実施形態においては、前記リンカーは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【化１】
2021505149.tif 000035
【００１８】
第２の態様においては、組換え抗体が本開示で提供される。本開示の実施形態においては、前記組換え抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖（即ち、抗ＰＤ１抗体の軽鎖）及び配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【化２】
2021505149.tif 000036
【００１９】
前記第１の態様及び本実施形態における開示によれば、前記組換え抗体の前記抗ＰＤ−１抗体は、上記に記載される配列番号３のアミノ酸配列に含まれる、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖を含むことが示される。
【化３】
2021505149.tif 000037
【００２０】
前記第１の態様及び本実施形態における開示によれば、前記組換え抗体の前記ヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントは、上記に記載される配列番号３のアミノ酸配列に含まれる、配列番号７のアミノ酸配列を含むことが示される。
【化４】
2021505149.tif 000038
【００２１】
実施形態に係る組換え抗体は、ＰＤ−１及びＣＤ４７の両方を標的とすることができ、それによって免疫システムへの刺激を顕著に増強し、単一の標的に対する抗体よりも強い腫瘍抑制能力を示すことができる。
【００２２】
第３の態様においては、核酸が本開示で提供される。本開示の実施形態においては、前記核酸は、上記に記載されるように、前記組換え抗体をコードする。実施形態に係る核酸によってコードされた前記組換え抗体は、ＰＤ−１及びＣＤ４７の両方を標的とすることができ、それによって免疫システムへの刺激を顕著に増強し、単一の標的に対する抗体よりも強い腫瘍抑制能力を示すことができる。
【００２３】
本開示の実施形態においては、上記に記載される核酸は、下記の追加の技術的特徴の少なくとも１つを更に含むことができる。
【００２４】
本開示の実施形態においては、前記核酸は、配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を含む。
【化５】
2021505149.tif 000039
【００２５】
前記第１の態様、前記第２の態様、及び本実施形態における開示によれば、配列番号４のヌクレオチド配列が、前記第２の態様に記載される配列番号２の抗ＰＤ−１抗体の軽鎖をコードすることが示される。
【化６】
2021505149.tif 000040
【００２６】
前記第１の態様、前記第２の態様、及び本実施形態における開示によれば、配列番号５のヌクレオチド配列が、前記第２の態様に記載される配列番号３の組換え抗体の重鎖をコードすることが示される。
【００２７】
本実施形態によれば、前記第２の態様に記載される配列番号６のアミノ酸配列を含む前記抗ＰＤ−１抗体の重鎖が、上記に記載される配列番号５のヌクレオチド配列に含まれる配列番号８のヌクレオチド配列によってコードされていることが示される。
【化７】
2021505149.tif 000041
【００２８】
本実施形態によれば、前記第１の態様に記載される配列番号１のアミノ酸配列を含む前記リンカーが、上記に記載される配列番号５のヌクレオチド配列に含まれる配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされていることが示される。
【化８】
2021505149.tif 000042
【００２９】
本実施形態によれば、前記第２の態様に記載される配列番号７のアミノ酸配列を含む前記ヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントが、上記に記載される配列番号５のヌクレオチド配列に含まれる配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされていることが示される。
【化９】
2021505149.tif 000043
【００３０】
実施形態に係る核酸によってコードされた組換え抗体は、ＰＤ−１及びＣＤ４７の両方を標的とすることができ、それによって免疫システムへの刺激を顕著に増強し、単一の標的に対する抗体よりも強い腫瘍抑制能力を示すことができる。
【００３１】
第４の態様においては、コンストラクトが本開示で提供される。本開示の実施形態においては、前記コンストラクトは、前記抗ＰＤ−１抗体をコードする第１の核酸分子と、前記ヒトＳＩＲＰＡ細胞外セグメントをコードする第２の核酸分子とを含む。実施形態におけるコンストラクトがレシピエント細胞に導入された後、発現された組換え抗体は、ＰＤ−１及びＣＤ４７の両方を標的とすることができ、それによって免疫システムへの刺激を顕著に増強し、単一の標的に対する抗体よりも強い腫瘍抑制能力を示すことができる。
【００３２】
本開示の実施形態においては、上記に記載されたコンストラクトは、下記の追加の技術的特徴の少なくとも１つを更に含むことができる。
【００３３】
本開示の実施形態においては、前記コンストラクトは、前記第１の核酸分子に機能可能に結合される第１のプロモーターを更に含む。前記第１のプロモーターは、前記第１の核酸分子及び前記第２の核酸分子の発現を効果的に開始することができ、それによって上記の組換え抗体の発現を達成することができる。
【００３４】
本開示の実施形態においては、上記に記載されたコンストラクトは、下記の追加の技術的特徴の少なくとも１つを更に含むことができる。
【００３５】
本開示の実施形態においては、前記第１のプロモーターは、Ｕ６、Ｈ１、ＣＭＶ、ＥＦ−１、ＬＴＲ、又はＲＳＶプロモーターから選択される。本発明者らは、Ｕ６、Ｈ１、ＣＭＶ、ＥＦ−１、ＬＴＲ、又はＲＳＶプロモーターが、前記第１の核酸分子及び前記第２の核酸分子の発現を効果的に開始することができ、前記第１の核酸分子及び前記第２の核酸分子の発現効率も顕著に改善する。
【００３６】
本開示の実施形態においては、前記コンストラクトは、第３の核酸分子を更に含み、前記第３の核酸分子は、前記第１の核酸分子と前記第２の核酸分子との間に配置され、前記リンカーをコードするように構成される。したがって、前記第１の核酸分子によって発現される前記第１のタンパク質と前記第２の核酸分子によって発現される前記第２のタンパク質は、前記リンカーを介して共に結合されることができ、融合タンパク質として機能し、有効性を示す。
【００３７】
本開示の実施形態においては、前記リンカーは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００３８】
本開示の実施形態においては、前記コンストラクトのベクターは、非病原性ウイルスベクターである。本実施形態におけるコンストラクトのベクターの病原部位は、改変又は変異されているので、前記ベクターは非病原性ウイルスである。したがって、本実施形態に係る非病原性ウイルスベクターを介した治療は、安全性が高いものである。
【００３９】
本開示の実施形態においては、前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はアデノウイルス関連ウイルスベクターから選択される少なくとも１つを含む。上記に記載されたベクターは、レシピエント細胞での運搬された核酸の非常に効率的な発現を、高い処理効率で実現することができる。
【００４０】
第５の態様においては、上記に記載された組換え抗体を調製する方法が、本開示で提供される。本開示の実施形態においては、前記方法は、前記コンストラクトを哺乳類細胞に導入することと、タンパク質の発現と分泌に適した条件下で前記哺乳類細胞を培養し、前記組換え抗体を得ることと、を含む。実施形態に係る方法は、上記に記載された組換え抗体を簡単かつ効率的に得ることができる。上記に記載されるように、前記組換え抗体は、ＰＤ−１及びＣＤ４７の両方を標的とすることができ、それによって免疫システムへの刺激を顕著に増強し、単一の標的に対する抗体よりも強い腫瘍抑制能力を示すことができる。
【００４１】
本開示の実施形態においては、上記に記載された方法は、下記の追加の技術的特徴の少なくとも１つを更に含むことができる。
【００４２】
本開示の実施形態においては、前記哺乳類細胞は、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＳ、２９３Ｆ、及び２９３Ｔから選択される少なくとも１つを含む。
【００４３】
第６の態様においては、癌を治療する治療組成物が、本開示で提供される。本開示の実施形態においては、前記治療組成物は、上記に記載されるコンストラクト、組換え抗体、又は核酸を含む。実施形態に係る治療組成物は、癌における顕著に増加した治療効果を示す。
【００４４】
本開示の実施形態においては、患者に投与される治療組成物は、生体適合性溶液又は薬学的に許容される担体中で適用されることが好ましい。調製された様々な治療組成物は、生理食塩水、等張食塩水、又は当業者にとって明らかな他の製剤などの薬学的又は生理学的に許容される担体に、懸濁又は溶解されることができる。適切な担体は、大部分は投与経路に依存する。他の水性又は非水性等張滅菌注射液及び水性又は非水性滅菌懸濁液は、薬学的に許容される担体である。
【００４５】
第７の態様においては、癌を治療する方法が、本開示で提供される。本開示の実施形態においては、前記方法は、癌に罹患する患者に上記に記載されたコンストラクト、組換え抗体、又は核酸を投与することを含む。本開示の実施形態に係る方法は、癌における顕著に増加した治療効果を示す。
【００４６】
上記に基づいて、本開示の１つの目的は、ＰＤ１及びＣＤ４７の両方を標的とすることができる新規の二重特異性抗体を提供することである。
【００４７】
インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）としても知られるＣＤ４７は、分子量が約５０ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質であり、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する。ＣＤ４７は、Ｎ末端細胞外ＩｇＶドメイン、５つの高疎水性の膜貫通型セグメント、及びＣ末端細胞質領域を含み、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ１）、及びインテグリンと相互作用することができ、Ｔ細胞、単球などの免疫細胞の食作用及び膜貫通型遊走の制御に関与する。
【００４８】
ＣＤ１７２ａ又はＳＨ２ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ基質−１（ＳＨＰＳ−１）としても知られる、ＣＤ４７リガンド、即ちＳＩＲＰαタンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属している膜貫通型糖タンパク質であり、ＳＩＲＰαタンパク質のＮ末端は、ＣＤ４７に結合されている。ＳＩＲＰαタンパク質は、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、マスト細胞、顆粒球、神経細胞、及び造血幹細胞で広く発現されるが、他の細胞ではあまり発現されない。ＳＩＲＰαタンパク質のＣＤ４７への結合は、Ｃ末端細胞質領域で免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）のリン酸化をもたらし、チロシンホスファターゼＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２の動員及びリン酸化が起こり、下流のシグナル伝達経路を活性化させ、それによってマクロファージの食作用を阻害する。
【００４９】
ＣＤ４７は、様々な種類の細胞の表面で広く発現され、「ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ」シグナルを放出する。ＣＤ４７は、細胞表面上の重要な自己標識タンパク質であり、マクロファージの食作用を調節するための重要なシグナルを放出する。ＣＤ４７は、マクロファージの表面上のＳＩＲＰαタンパク質に結合し、ＩＴＩＭのリン酸化、その後ＳＨＰ−１タンパク質の動員を引き起こし、一連のカスケード反応を生成し、それによってマクロファージの食作用を阻害することができる。ＣＤ４７は、アクティブな赤血球で高度に発現され、老化した赤血球で低く発現されているので、マクロファージによる特定の攻撃と老化した赤血球のクリアランスを可能にする。腫瘍細胞がＣＤ４７（「ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ」シグナルを放出する）を用いて、体の免疫システムの攻撃から逃れることができることが見出されている。別の研究によって、ＣＤ４７は、１９８０年代にヒト卵巣癌の腫瘍抗原として最初に同定されたことが示され、その後ＣＤ４７は、正常細胞よりも顕著に高い発現レベルで、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、及び他の固形腫瘍を含む、様々なヒト腫瘍タイプで発現されることも見出された。したがって、ＣＤ４７のシグナル伝達経路とそのリガンドＳＩＲＰαタンパク質は、腫瘍細胞の免疫逃避を阻害するための新しいターゲットになっている。近年、このシグナル伝達経路に基づく医薬品開発が注目され続けている。
【００５０】
腫瘍の免疫逃避を抑制する薬物を介して、ＣＤ４７のＳＩＲＰαタンパク質への結合を遮断する様々なメカニズムがある。第１に、ＣＤ４７のＳＩＲＰαタンパク質への結合を物理的に遮断すると、非自然免疫に属する抗体のＦｃフラグメントによって媒介される細胞損害性効果に依存しないマクロファージ上のＳＩＲＰαタンパク質の抑制を緩和することができる。Ｆｃフラグメントを欠く抗ＣＤ４７抗体は、依然としてマクロファージによる腫瘍のクリアランスを促進できることが発見された。第二に、ブロッキングＣＤ４７は、マクロファージに依存することなく、腫瘍のアポトーシスを直接誘導することができる。第三に、抗ＣＤ４７抗体は、抗原提示を誘発し、ＳＩＲＰαを発現するＴ細胞とＤＣ細胞両方の活性化によって、抗腫瘍適応免疫を開始することができる。ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間のシグナル伝達経路を遮断すると、サイトカイン産生とＤＣ成熟の阻害を緩和することができる。ＤＣ細胞は、ＣＤ４７抗体と食細胞との相乗効果を介して腫瘍細胞を殺傷することができ、腫瘍関連抗原をＣＤ８＋Ｔ細胞に提示し、それによって腫瘍にＣＤ８＋Ｔ細胞の特定の殺傷効果を及ぼす。
【００５１】
したがって、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα抗体は、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１抗体の後の重要な次世代腫瘍免疫抑制薬製品である。ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１には類似点があり、例えば、これらのいずれも転写因子ｍｙｃによって調節され、様々な腫瘍細胞で広く発現されている。幾つかの態様においては、ＣＤ４７抗体は、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１抗体よりも有望である場合がある。具体的には、ＣＤ４７は、ＰＤ−Ｌ１よりも広く発現され、殆ど全ての腫瘍細胞で高度に発現され、有効性の範囲が広いことを示す。更に、ＣＤ４７抗体は、ＰＤ−１抗体よりも多様なメカニズムを介して腫瘍抑制を発揮する。例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４などの従来の免疫抑制剤に対する抗体が、Ｔ細胞を腫瘍特異的に殺傷しないことは、組織のごく一部にしか効果を示さないなど、限られた機能のための重要な理由であることができ、一方、ＣＤ４７抗体は、マクロファージによって媒介される非適応免疫を開始できるだけでなく、マクロファージ、ＤＣ細胞などの抗原提示を介して、腫瘍細胞の特定の殺傷を開始することもできる。しかし、ＣＤ４７は、その広範な発現により、様々な組織での非免疫シグナルの調節も伴い、それによって、ＣＤ４７シグナルを遮断すると、マクロファージが自身の正常組織を広範囲に攻撃する、又は非免疫調節障害をもたらすことがある。マクロファージによる食作用は、ＣＤ４７などで発現される「ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ」シグナルとカルレティキュリン（ＣＲＴ）などで発現される「ｅａｔ  ｍｅ」シグナルの相乗効果を必要とする。一般に、腫瘍細胞は、ＣＲＴを高度に発現するが、正常細胞は、ＣＲＴ及び「ｅａｔ  ｍｅ」シグナルを発現しないので、ＣＤ４７は、ヒトの大脳皮質、小脳、その他の健康な組織に広く存在しているものの、ＣＤ４７抗体は、正常組織で限られた遮断効果しか示さない。しかしながら、第Ｉ相臨床試験の臨床データによれば、放射線療法と化学療法を受けた患者は、アップレギュレートされた「ｅａｔ  ｍｅ」シグナルを発現する。ＣＤ４７抗体治療後、ＣＤ４７＋赤血球が枯渇され、主な副作用として一過性貧血を引き起こすことがある。
【００５２】
ＣＤ４７抗体療法は、ＤＣ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を介して腫瘍を殺傷する効果を発揮する。ＤＣ細胞は、ＣＤ４７抗体と食細胞の相乗効果を介して、腫瘍細胞を殺傷することができ、腫瘍関連抗原をＣＤ８＋Ｔ細胞に提示し、それによって腫瘍にＣＤ８＋Ｔ細胞の特定の殺傷効果を発揮する。腫瘍細胞は、ＣＤ４７の発現をアップレギュレートして、マクロファージを欺くが、ＣＤ４７抗体は、ＣＤ４７によって発現される「ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ」シグナルを遮断して、マクロファージによる食作用を発揮させることができる。本開示の組換え抗体は、ＰＤ−１及びＣＤ４７の両方を標的とすることができ、それによって免疫システムへの刺激を顕著に増強し、より強力な腫瘍抑制能力を示すことができ、次世代の免疫チェックポイント阻害剤として役立つ。
【００５３】
本開示の更なる態様及び利点は、部分的に下記の説明に記載され、幾つかは、下記の説明から明らかになるか、又は本開示の実施から理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、本開示の実施形態に係る、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＨＸ００９−５の同定を示す結果である。
【図２】図２は、本開示の実施形態に係る、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによるＨＸ００９−５の同定を示す結果である。
【図３】図３は、本開示の実施形態に係る、ＰＤ−１に対するＨ８及びＨＸ００９−５の親和性に関する実験結果を示す図である。
【図４】図４は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５又はＨ８によって、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の結合の阻害に関する結果を示す図である。
【図５】図５は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５又はＨ８によって、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との間の結合の阻害に関する結果を示す図である。
【図６】図６は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５とｈＣＤ４７との間の結合に関する実験結果を示す図である。
【図７】図７は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５によるＣＤ４７とＳＩＲＰＡとの間の結合の抑制に関する実験結果を示す図である。
【図８】図８は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５とＣＤ１６ａとの間に結合がない場合の実験結果を示す図である。
【図９】図９は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５とＣＤ３２ａとの間に結合がない場合の実験結果を示す図である。
【図１０】図１０は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５とＣＤ３２ｂとの間に結合がない場合の実験結果を示す図である。
【図１１】図１１は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５とＣＤ６４との間に結合がない場合の実験結果を示す図である。
【図１２】図１２は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５又はＨ８によるＩＬ−２の分泌のためのＴリンパ球の刺激に関する実験結果を示す図である。
【図１３】図１３は、本開示の実施形態に係る、ＨＸ００９−５によって生成された赤血球凝集反応がないことに関する実験結果を示す図である。
【図１４】図１４は、本開示の実施形態に係る、経時における腫瘍体積の変化に関する結果を示す図である。
【図１５】図１５は、本開示の実施形態に係る、経時における腫瘍体積の変化に関する結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本開示の実施例は、下記に詳細に記載される。
【００５６】
本開示の実施例を詳細に参照する。当業者であれば、以下の実施例は説明のためのものであり、本開示の範囲を限定するものと解釈されることができないことを理解するであろう。具体的な技術又は条件が実施例において明記されていない場合、当技術分野における文献（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｈｕａｎｇ  ＰＴにより翻訳）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓを参照）に記載されている技術又は条件に従って、又は製品の説明書に従って、工程が行われる。試薬又は機器の製造元が明記されていない場合、試薬又は機器は、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｏｍｐａｎｙから商業的に利用可能であることがある。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例で使用される細胞株及び一般的な実験技術は、以下のとおりである。
【００５８】
実施例１  ＰＤ−１／ＣＤ４７二重特異性抗体のタンパク質発現
ヒト化抗体Ｈ８（抗ＰＤ−１  ＩｇＧ抗体）に基づき、特定のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＲＧＥＴＧＰ）を介して、ヒトシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰＡ、ＮＰ＿５４２９７０．１）膜外ドメイン（３２ａａ−１３７ａａ）をＨ８重鎖のＣ末端と結合させることにより、二重特異性抗体ＨＸ００９−５を得て、それにより二重特異性抗体は、目的のタンパク質であるＰＤ−１及びＣＤ４７の両方を標的にする。
【００５９】
実践の操作においては、ヒト化抗体Ｈ８の軽鎖をコードする核酸の全配列を合成し、その後ベクターに挿入することにより、発現ベクター１を得て；Ｈ８重鎖をコードする核酸の全配列及びリンカー−ＳＩＲＰＡ（１１８ｍｅｒ）をコードする核酸の全配列も合成し、前記Ｈ８重鎖をコードする核酸は、前記発現ベクター１に直接挿入され、抗ＰＤ１モノクローナル抗体Ｈ８を発現する発現ベクター２を得た。オーバーラップＰＣＲによる融合後、抗ＰＤ１モノクローナル抗体Ｈ８の重鎖とリンカー−ＳＩＲＰＡとの融合ペプチドをコードする核酸を発現ベクター１に挿入し、それによって二重特異性抗体ＨＸ００９−５を発現する発現ベクター３を得た。その後、発現ベクター２及び発現ベクター３から抽出したＤＮＡを、それぞれ哺乳類細胞（２９３細胞）にトランスフェクトした。このようなトランスフェクションにより、抗体は哺乳類細胞で発現され、細胞から分泌された。その後、抗体Ａアフィニティクロマトグラフィカラムにおける精製の後、タンパク質Ｈ８及びＨＸ００９−５を得た。ＨＸ００９−５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ標準分析技術による品質同定後の後続の薬力学研究に用いられた。
【００６０】
図１及び図２は、それぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣによるＨＸ００９−５の同定を示す結果である。
【００６１】
図１は、ＨＸ００９−５の同定のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。図１においては、レーン１は、ＨＸ００９−５（還元された）を表し；レーン２は、Ｈ８（還元された）を表し；レーンＭは、タンパク質マーカー（１８．４ＫＤａ；２５ＫＤａ；３５ＫＤａ；４５ＫＤａ；６６．２ＫＤａ）を表し；レーン３は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）バッファを示す。図１に示されるように、抗体ＨＸ００９−５の候補サンプルは、比較的高い全体の純度を示す。
【００６２】
図２は、ＨＸ００９−５の同定におけるＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果である。図２に示されるように、抗体は、積分定量により、全体の純度が９８．２％であることが確認されている。
【００６３】
ＨＸ００９−５の重鎖のアミノ酸配列
【化１０】
2021505149.tif 000044
可変領域に下線が引かれる。
【００６４】
ＨＸ００９−５の重鎖をコードする核酸配列
【化１１】
2021505149.tif 000045
【００６５】
ＨＸ００９−５の軽鎖のアミノ酸配列
【化１２】
2021505149.tif 000046
可変領域に下線が引かれる。
【００６６】
ＨＸ００９−５の軽鎖をコードする核酸配列
【化１３】
2021505149.tif 000047
【００６７】
実施例２  ＨＸ００９−５二重特異性抗体のＥＬＩＳＡ結合アッセイ
１．Ｈ８及びＨＸ００９−５のＰＤ−１結合ＥＬＩＳＡアッセイ
実施例１で得られたＨ８抗体及びＨＸ００９−５抗体との間で、ＰＤ−１結合アッセイ及びＰＤ−Ｌ１競合アッセイを含む、直接の比較を行った。詳細は下記の通りである。
【００６８】
ＰＤ−１結合アッセイのための具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
ＥＬＩＳＡプレートを０．２５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度でｈＰＤ−１−ｈｉｓ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）を用いて、ｈＰＤ−１−ｈｉｓ抗原で塗布したＥＬＩＳＡプレートを３７℃で２時間ブロッキングし、その後１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
３）一次抗体とのインキュベーション
Ｈ８抗体及びＨＸ００９−５抗体を、それぞれ２μｇ／ｍｌから１：５ずつ段階希釈し、それぞれの抗体に対する７つの勾配抗体溶液を得た。各抗体のための７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロールをブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
４）二次抗体とのインキュベーション
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、二次抗体として、１：１００００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）（ウェル当たり１００μｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）発色（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ）
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）としての３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウェル当たり１００μｌ添加し、５分間〜１５分間室温でインキュベーションした。
６）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
７）読み（ｒｅａｄｉｎｇ）
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００６９】
表１及び図３に示されるように、ＰＤ−１に結合するＨ８及びＨＸ００９−５のＥＣ５０値はいずれも０．０５ｎＭであると計算されることができる。図３は、Ｈ８のＣ末端でのリンカー−ＳＩＲＰＡ（１１８ｍｅｒ）との融合は、抗体ＨＸ００９−５にＰＤ−１への結合親和性における変化をもたらさないことを示す。
【表１】
2021505149.tif 000048
【００７０】
２．Ｈ８及びＨＸ００９−５のＰＤ−Ｌ１競合ＥＬＩＳＡアッセイ
具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり５０μｌ）の濃度でｈＰＤ−１−ｈＩｇＧＦｃ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、３７℃で２時間、１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）で、塗布した９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをブロッキングし、その後１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄した。
３）一次抗体とのインキュベーション
Ｈ８抗体及びＨＸ００９−５抗体を、それぞれ６μｇ／ｍｌから１：３ずつ段階希釈し、それぞれの抗体に対する７つの勾配抗体溶液を得た。各抗体のための７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロール（ウェル当たり５０μｌ）をブロッキングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、室温で１０分間インキュベーションした。
４）リガンドとのインキュベーション
ウェル当たり５０μｌで、０．６μｇ／ｍｌのＰＤ−Ｌ１−ｍＩｇＧ２ａＦｃ溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）二次抗体とのインキュベーション
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、二次抗体としての１：５０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）（ウェル当たり５０μｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
６）発色
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり５０μｌ添加し、５分間〜１５分間室温でインキュベーションした。
７）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
８）読み
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００７１】
結果を表２及び図４に示す。ＨＸ００９−５抗体及びＨ８抗体は、ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合の阻害に関して、１．５ｎＭ及び１．０ｎＭのそれぞれのＩＣ５０値を示し、Ｈ８のＣ末端でリンカー−ＳＩＲＰＡ（１１８ｍｅｒ）との融合は、抗体ＨＸ００９−５にＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合の阻害における明らかな変化をもたらさない。
【表２】
2021505149.tif 000049
【００７２】
３．Ｈ８及びＨＸ００９−５のＰＤ−Ｌ２競合ＥＬＩＳＡアッセイ
具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１．０μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のｈＰＤ−１−ｈＩｇＧＦｃ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、３７℃で２時間、１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）で、塗布した９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをブロッキングし、その後１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで４回洗浄した。
３）一次抗体とのインキュベーション
Ｈ８抗体及びＨＸ００９−５抗体を、それぞれ２０μｇ／ｍｌから１：３ずつ段階希釈し、それぞれの抗体に対する７つの勾配抗体溶液を得た。各抗体のための７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロール（ウェル当たり５０μｌ）をブロッキングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、室温で１０分間インキュベーションした。
４）リガンドとのインキュベーション
０．６μｇ／ｍｌのＰＤ−Ｌ２−ｈｉｓ  ｔａｇ溶液をウェル当たり５０μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）二次抗体とのインキュベーション
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで５回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、１：７５０希釈（ウェル当たり５０μｌ）で、二次抗体としてのＨＲＰ結合抗−ｈｉｓ  ｔａｇマウスモノクローナル抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
６）発色
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで６回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり１００μｌ添加し、３０分間室温でインキュベーションした。
７）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
８）読み
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００７３】
結果を表３及び図５に示す。ＨＸ００９−５抗体及びＨ８抗体は、ＰＤ−Ｌ２へのＰＤ−１結合の阻害に関して、１．５ｎＭ及び２．７ｎＭのそれぞれのＩＣ５０値を示し、Ｈ８のＣ末端でリンカー−ＳＩＲＰＡ（１１８ｍｅｒ）との融合は、抗体ＨＸ００９−５にＰＤ−Ｌ２へのＰＤ−１結合の阻害における明らかな変化をもたらさない。
【表３】
2021505149.tif 000050
【００７４】
４．ＨＸ００９−５のＣＤ４７結合ＥＬＩＳＡアッセイ
実施例１で得たＨＸ００９−５抗体のＣＤ４７結合ＥＬＩＳＡアッセイを行った。詳細は下記に示される。
【００７５】
具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
ＥＬＩＳＡプレートを０．２５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のＣＤ４７抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
３７℃で２時間、１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）で、ＣＤ４７抗原で塗布したＥＬＩＳＡプレートをブロッキングし、その後１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
３）一次抗体とのインキュベーション
ＨＸ００９−５抗体を、それぞれ１０μｇ／ｍｌから１：５ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロールを、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
４）二次抗体とのインキュベーション
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、二次抗体として、１：１００００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）（ウェル当たり１００μｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）発色
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり１００μｌ添加し、５分間〜１５分間室温でインキュベーションした。
６）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
７）読み
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００７６】
結果を表４及び図６に示す。ＨＸ００９−５とｈＣＤ４７との間の結合におけるＥＣ５０は、０．６ｎＭである。
【表４】
2021505149.tif 000051
【００７７】
５．ＨＸ００９−５のＳＩＰＲＡ競合ＥＬＩＳＡアッセイ
具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを０．２５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のＣＤ４７抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、３７℃で２時間、１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）で、塗布した９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをブロッキングし、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで４回洗浄した。
３）一次抗体とのインキュベーション
ＨＸ００９−５抗体を、３０μｇ／ｍｌから１：３ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロール（ウェル当たり５０μｌ）を、ブロッキングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、室温で１０分間インキュベーションした。
４）リガンドとのインキュベーション
０．６μｇ／ｍｌのＳＩＲＰＡ−ｈｉｓ  ｔａｇ溶液をウェル当たり５０μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）二次抗体とのインキュベーション
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで５回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、１：７５０希釈（ウェル当たり５０μｌ）で、二次抗体としてのＨＲＰ結合抗−ｈｉｓ  ｔａｇマウスモノクローナル抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
６）発色
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで６回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり１００μｌ添加し、３０分間室温でインキュベーションした。
７）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
８）読み
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００７８】
表５及び図７に示される結果は、ＨＸ００９−５が、２１ｎＭのＩＣ５０で、ＣＤ４７とＳＩＲＰＡとの間の結合を阻害することを示す。
【表５】
2021505149.tif 000052
【００７９】
実施例３  ＨＸ００９−５Ｆｃフラグメントの有効性における研究
ＨＸ００９−５（実施例１で得られた）のＦｃフラグメントの有効性を調査するために、個々のＦＣ受容体に対するＨＸ００９−５の結合能力の決定について、それぞれのＦｃ受容体（ＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、及びＣＤ６４）の親和性を試験した。詳細は下記に示される。
【００８０】
１．ＣＤ１６ａに対するＨＸ００９−５の親和性のアッセイ
Ｆｃ受容体ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａとしても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃフラグメントに結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与することができる。治療用モノクローナル抗体とＦｃ受容体との間の結合能力は、抗体の安全性と有効性に影響を与える。本実施例では、ＨＸ００９−５のＣＤ１６ａへの親和性をＥＬＩＳＡにより試験し、ＨＸ００９−５のＦｃ受容体ＣＤ１６ａへの結合能力を評価した。
【００８１】
ＨＸ００９−５抗体（実施例１で得られた）は、ＨＸ００６抗体（ＩｇＧ１サブタイプ）と比較して、ＥＬＩＳＡによりＣＤ１６ａへの結合が検出された。詳細は下記に示される。
【００８２】
具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
ＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のＣＤ１６ａ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
ＣＤ１６ａ抗原で塗布したＥＬＩＳＡプレートを、１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）で、３７℃で２時間ブロッキングし、その後１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
３）一次抗体とのインキュベーション
ＨＸ００９−５抗体を、それぞれ１０μｇ／ｍｌから１：５ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロールを、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
４）二次抗体とのインキュベーション
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、二次抗体として、１：８０００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）（ウェル当たり１００μｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）発色
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり１００μｌ添加し、３０分間室温でインキュベーションした。
６）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
７）読み
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００８３】
表６及び図８に示される結果は、ＨＸ００９−５とＣＤ１６ａとの間に顕著な結合がないことを示す。
【表６】
2021505149.tif 000053
【００８４】
２．ＣＤ３２ａに対するＨＸ００９−５の親和性のアッセイ
ＨＸ００９−５抗体（実施例１で得られた）は、ＨＸ００６抗体（ＩｇＧ１サブタイプ）と比較して、ＥＬＩＳＡによりＣＤ３２ａへの結合が検出された。詳細は下記に示される。
【００８５】
具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
ＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のＣＤ３２ａ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
ＣＤ３２ａ抗原で塗布したＥＬＩＳＡプレートを１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）で、３７℃で２時間ブロッキングし、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
３）一次抗体とのインキュベーション
ＨＸ００９−５抗体を、それぞれ１０μｇ／ｍｌから１：５ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロールを、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
４）二次抗体とのインキュベーション
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、１：８０００希釈（ウェル当たり１００μｌ）で、二次抗体としてのヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）発色
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり１００μｌ添加し、３０分間室温でインキュベーションした。
６）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
７）読み
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００８６】
表７及び図９に示される結果は、ＨＸ００９−５とＣＤ３２ａとの間に顕著な結合がないことを示す。
【表７】
2021505149.tif 000054
【００８７】
３．ＣＤ３２ｂに対するＨＸ００９−５の親和性のアッセイ
ＨＸ００９−５抗体（実施例１で得られた）は、ＨＸ００６抗体（ＩｇＧ１サブタイプ）と比較して、ＥＬＩＳＡによりＣＤ３２ｂへの結合が検出された。詳細は下記に示される。
【００８８】
具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
ＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のＣＤ３２ｂ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
ＣＤ３２ｂ抗原で塗布したＥＬＩＳＡプレートを１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）で、３７℃で２時間ブロッキングし、その後１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
３）一次抗体とのインキュベーション
ＨＸ００９−５抗体を、それぞれ１０μｇ／ｍｌから１：５ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロールを、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
４）二次抗体とのインキュベーション
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、１：８０００希釈（ウェル当たり１００μｌ）で、二次抗体としてのヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）発色
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり１００μｌ添加し、３０分間室温でインキュベーションした。
６）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
７）読み
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００８９】
表８及び図１０に示される結果は、ＨＸ００９−５とＣＤ３２ｂとの間に顕著な結合がないことを示す。
【表８】
2021505149.tif 000055
【００９０】
４．ＣＤ６４に対するＨＸ００９−５の親和性のアッセイ
ＨＸ００９−５抗体（実施例１で得られた）は、ＨＸ００６抗体（ＩｇＧ１サブタイプ）と比較して、ＥＬＩＳＡによりＣＤ６４への結合が検出された。詳細は下記に示される。
【００９１】
具体的な工程は、下記の通りである。
１）抗体コーティング
ＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のＣＤ６４抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
２）ブロッキング
ＣＤ６４抗原で塗布したＥＬＩＳＡプレートを１％ＢＳＡ（ＰＢＳバッファで希釈）で、３７℃で２時間ブロッキングし、その後１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
３）一次抗体とのインキュベーション
ＨＸ００９−５抗体を、それぞれ１０μｇ／ｍｌから１：５ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。７つの勾配抗体溶液及びブランクＰＢＳコントロールを、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
４）二次抗体とのインキュベーション
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、１：８０００希釈（ウェル当たり１００μｌ）で、二次抗体としてのヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
５）発色
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり１００μｌ添加し、３０分間室温でインキュベーションした。
６）発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
７）読み
マイクロプレートリーダー上で、４５０ｎｍの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
【００９２】
表９及び図１１に示される結果は、ＨＸ００９−５とＣＤ６４との間に顕著な結合がないことを示す。
【表９】
2021505149.tif 000056
【００９３】
実施例４  混合リンパ球反応（ＭＬＲ）による二重特異性抗体と抗ＰＤ１抗体との生物活性
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって、Ｔリンパ球を刺激して、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γを分泌する能力は、ＨＸ００９−５（実施例１で得られた）とＨ８との間で検出された。詳細を下記に示す。
【００９４】
混合リンパ球反応では、別の個体からの樹状細胞（ＤＣ）と混合した後、Ｔ細胞（ＴＣ）を刺激し、ＤＣ提示によってＩＬ−２及びＩＦＮ−γを分泌した。最初に、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４によってＤＣに分化するように、血中の単球を誘導した。その後、ＤＣは、ＴＮＦａによって刺激されて成熟した。細胞培養の上澄み中のＩＬ−２及びＩＦＮ−γの分泌レベルは、成熟ＤＣと異種性ＴＣを混合して５日後に検出した。具体的には、１×１０５細胞／ウェルの濃度でのＴＣと１×１０４細胞／ウェルの濃度でのＤＣを９６ウェルプレートで混合し、１０Ｍ〜０．０９７６５６２５ｎＭの８つの勾配濃度の抗体を添加した。５日後、ＩＬ−２検出キットを用いて、上澄みのＩＬ−２含有量を定量化した。
【００９５】
図１２は、それぞれＨ８抗体及びＨＸ００９−５抗体によって刺激されたＴリンパ球におけるＩＬ−２の分泌レベルを示す。図１２から分かるように、Ｈ８抗体及びＨＸ００９−５抗体は、Ｔリンパ球を効果的に刺激して、ＩＬ−２を分泌することができ、Ｈ８のＣ末端におけるリンカー−ＳＩＲＰＡ（１１８ｍｅｒ）との融合が、Ｔリンパ球を刺激してＩＬ−２を分泌することにおける変化を抗体ＨＸ００９−５にもたらさないことを示す。
【００９６】
実施例５  ＨＸ００９−５による赤血球凝集反応についての研究
具体的な工程は、下記の通りである。
１．ボランティアから、５ｍｌの末梢血を５ｍｌのヘパリンで抗凝固剤処置した管に集め、穏やかに振盪して十分に接触させた。１５ｍｌの遠心管に移し、穏やかな振盪下で、９ｍｌのＰＢＳと混合した後、末梢血を２１００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
２．赤血球層の上にある白血球を含む上澄みを捨て、再懸濁するために１２ｍｌのＰＢＳを添加し、その後１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
３．赤血球層の上にある上澄みを捨て、再懸濁するために１２ｍｌのＰＢＳを添加し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
４．工程３を２回繰り返した。
５．上澄みを捨てた後、１ｍｌの赤血球懸濁液を１５ｍｌの遠心管に移し、９ｍｌのＰＢＳと混合し、ＰＢＳ中１０％の赤血球として使用時に備えて調製した。
６．ＰＢＳ中１０％赤血球１ｍｌを、新しい１５ｍｌの遠心管内で９ｍｌのＰＢＳと混合し、使用時に備えてＰＢＳ中１％赤血球を得た。
７．様々な試験サンプルの調製
１）ＨＸ００９−５を９．１ｍｇ／ｍｌから０．９ｍｇ／ｍｌまで希釈し、更に１：３に段階希釈し、１２個の勾配濃度を得た。
２）Ｈ８を１０ｍｇ／ｍｌから０．９ｍｇ／ｍｌまで希釈し、更に１：３に段階希釈し、１２個の勾配濃度を得た。
３）ポテト（ｐｏｔａｔｉｏｎ）レクチン抽出溶液を１：３に段階希釈し、８個の勾配濃度を得た。
４）ＰＢＳをブランクコントロールとした。
【００９７】
９６ウェルＵ底プレートのＢ１からＧ１２までの各ウェルに、ＰＢＳ中１％の赤血球５０μｌ及び５０μｌの試験サンプルを以下の表１０に示されるパターンで添加し、５％、ＣＯ２のインキュベーターにおいて一晩３７℃でインキュベーションした。
【００９８】
２４時間のインキュベーションした後、ゲルイメージングアナライザーによる観察を行うために、９６ウェルプレートを取り出した。表１０及び図１３に示されるように、最初の４つの濃度でのポテトレクチン抽出溶液（ポジティブコントロールとして）を添加したウェルでは、明らかな赤血球凝集反応が観察され；一方、Ｈ８、ＨＸ００９−５、又はＰＢＳを様々な濃度で添加したウェルでは赤血球凝集反応は観察されず、赤血球凝集反応がＨＸ００９−５によって引き起こされていないことを示す。
【表１０】
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【００９９】
実施例６  ヒト未分化大細胞リンパ腫（ＫＡＲＰＡＳ−２９９）を皮下移植したＭｉｘｅｎｏモデルにおけるＨＸ００９−５の抗腫瘍有効性
ヒト未分化大細胞リンパ腫（ＫＡＲＰＡＳ−２９９）を皮下移植したＭｉｘｅｎｏモデルにおけるＨ８及びＨＸ００９−５（実施例１で得られた）の抗腫瘍有効性における研究について、ヒト腫瘍移植モデルをＮＳＧマウスで樹立した。詳細は下記に示される。
【０１００】
ＮＯＤ／Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌの欠損／変異によって特徴づけられるＮＳＧマウスは、ヒトの細胞や組織に対する拒絶が殆ど存在しないので、現時点でヒトの細胞移植に最も適した免疫不全のマウスモデルとして使用される。したがって、本発明者らは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＮＳＧマウスに養子的に導入することにより樹立された移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルにおけるＨＸ００９−５のｉｎ  ｖｉｖｏ薬力学を調査する。ＮＳＧマウスに基づくヒト腫瘍移植モデル（Ｍｉｘｅｎｏモデル）によって、本発明者らは、ヒト未分化大細胞リンパ腫（ＫＡＲＰＡＳ−２９９）を皮下移植したＭｉｘｅｎｏモデルにおけるＨＸ００９−５の抗腫瘍有効性を調査する。
【０１０１】
０日目に、ＫＡＲＰＡＳ−２９９細胞を３０匹のＮＣＧマウスの右背中に皮下接種した。接種から６日目に、腫瘍体積が６０ｍｍ３の平均値に達したときに、３０匹のＮＣＧマウスを５つのグループに分け、各グループに６匹のマウスとした。ドナーＡに由来するヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、尾静脈を介して各グループの３匹のマウス（「Ａ」とマークされている）に移植し；一方、ドナーＢに由来するヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、各グループの残りの３匹のマウス（「Ｂ」とマークされている）に尾静脈を介して移植した。それぞれのドナーからのＰＢＭＣを注射用ＰＢＳに懸濁した（注射量は、０．１ｍｌ／マウス）であった。図１１に示されるように、腫瘍細胞の接種から６日目、９日目、１３日目、１６日目、１９日目、及び２２日目の６回、尾静脈を介して５つのグループのマウスに、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇの個々の用量でのＨＸ００９−５、及びポジティブコントロールとしての１０ｍｇ／ｋｇでのＨ８（表１１ではＨＸ００８とも示される）；並びにコントロールとしての５ｍｇ／ｋｇでのアイソフォーム抗体（ヒトＩｇＧ４）をそれぞれ投与した。治療評価は、相対腫瘍抑制率（ＴＧＩＲＴＶ）で行い、安全性評価は体重と死亡率との変化で行った。
【表１１】
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注：薬物投与量は、１０μｌ／ｇである。ｎは動物の数を表す。０日目は、腫瘍細胞が接種された日である。ｉ．ｖ．は、尾静脈を介した投与を表す。
【０１０２】
図１４及び図１５は、５つのグループにおける腫瘍体積の経時的な変化を示す。ＰＢＭＣが接種され、アイソフォーム抗体（ヒトＩｇＧ４）が投与されたコントロール群に対して、ＨＸ００９−５又はＨ８の投与は、明らかな抗腫瘍有効性を示し、ＨＸ００９−５の用量依存性が観察された。即ち、投与用量が多いほど、腫瘍抑制が大きくなる。同じ用量下で、ＨＸ００９−５は、Ｈ８よりも更に強い抗腫瘍有効性を示し、ＰＤ１／ＣＤ４７二重標的抗体がＰＤ１単一の標的抗体より優れていることを示す。
【０１０３】
「実施形態」、「幾つかの実施形態」、「１つの実施形態」、「他の例」、「例」、「具体的な例」、又は「幾つかの例」など本明細書中の参照は、実施形態又は例に関連して記載される特定の部分、構造、材料、又は特徴が本開示の少なくとも１つの実施形態又は例中に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通して様々な場所で記載される「幾つかの実施形態においては」、「１つの実施形態においては」、「実施形態においては」、「他の実施形態においては」、「例においては」、「具体的な例においては」、又は「幾つかの例においては」などの表現の出現は、必ずしも本開示の実施形態又は例と同じものを意味しているわけではない。更に、特定の部分、構造、材料、又は特徴は、１つ以上の実施形態又は例において任意の好適な方法で組合せてもよい。
【０１０４】
説明的な実施形態を示し、記載してきたが、上記実施形態が、本開示を限定するように解釈されることができないこと、及び、実施形態について、本開示の範囲において、変更、代替、及び改変を行うことができることが当業者によって理解されよう。
【国際調査報告】
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