(57)【要約】【解決手段】本願は、免疫療法の分野に関し、より具体的には、養子細胞療法用細胞の製造に関する。本明細書では、養子移植に向けた細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ持続性を向上するための組成物および方法が提供される。これは、養子細胞療法を受けた被検体のＮＫ細胞によって引き起こされるクリアランスを受けにくい細胞を作ることによって達成される。【選択図】図１
2021505208.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外在性核酸分子と、以下の少なくとも１つと、を含む遺伝子操作された免疫細胞：
‐不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子；
‐１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の阻害剤。
【請求項２】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５およびＵＬＢＰ６から選択される、請求項１に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項３】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢから選択される一方または両方である、請求項１または２に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項４】
前記１つ以上の阻害剤は、ＲＮＡ阻害剤、抗体およびペプチド阻害剤から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項５】
前記外在性核酸分子は、キメラ抗原受容体またはＴＣＲをコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項６】
免疫細胞を、ＮＫ細胞によるクリアランスを受けにくくする方法であって、前記免疫細胞において１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドを阻害することを含む、方法。
【請求項７】
前記免疫細胞は、外在性核酸分子をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記外在性核酸分子は、キメラ抗原受容体またはＴＣＲをコードする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記阻害は、１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの遺伝子不活性化を介して、または、ＮＫＧ２Ｄリガンド阻害剤を投与することによるものである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンド阻害剤は、１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対するｓｈＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドの阻害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで前記細胞の製造中に行われる、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
医薬品として使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
癌治療に使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
癌を治療する方法であって、請求項１に記載の細胞を、それを必要とする被検体に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、免疫療法の分野に関し、より具体的には、養子細胞療法用細胞の製造に関する。本明細書では、養子移植に向けた細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ持続性を向上するための組成物および方法が提供される。これは、養子細胞療法を受けた被検体のＮＫ細胞によって引き起こされるクリアランスを受けにくい細胞を作ることによって達成される。
【背景技術】
【０００２】
養子細胞療法または養子細胞移植（ＡＣＴ）は、特に癌治療において、重要な治療パラダイムになりつつある。ＡＣＴは、患者への細胞移植、最も典型的には、免疫細胞移植を指す。これら細胞は、患者由来（自己由来治療法）、または、別の個体由来（同種異系由来治療法）である。この治療法の最終目標は、免疫機能および特性を向上させ、癌免疫療法において、癌に対する免疫反応を高めることである。ＡＣＴでは、Ｔ細胞が最もよく使われるが、ＮＫ細胞、リンパ球（例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ））、樹状細胞および骨髄細胞などの他の免疫細胞型も用いて行われる。
【０００３】
ＡＣＴを受けた被検体に注入された細胞（あるいは自己由来治療法の場合、再注入された細胞）は、その被検体において増殖および存続することが理想的である。この目的のため、免疫細胞空間の再増殖に競合する免疫細胞が確実に存在しないよう、ネオアジュバント治療法として、リンパ球枯渇法がよく用いられる。これは、移植の場合と同様、適応免疫系と自然免疫系の両方により、免疫反応が非自己注入細胞に対しても高められる可能性があるため、同種異系由来治療法では特に重要である。骨髄除去（骨髄細胞を殺傷する大量化学療法）が使われる場合もある。しかし、リンパ球枯渇法や骨髄除去法はかなり劇的な対策であるため、免疫系に対する影響により、深刻な副作用が発生することも多い。それにもかかわらず、これらの方法は、現在の治療パラダイムでは、宿主対移植片反応を避けるために常に含められる。このような反応は、自己由来治療法でも起こる。改変免疫細胞は、適応免疫系によってそのまま認識されるが、誘導性自己抗原の存在により、引き続き自然免疫系の攻撃も受ける場合がある。これらは、「異常な」自己のマーカーであり、その発現は、ストレス条件下で誘導される。残念ながら、養子細胞移植に適するよう患者細胞を形質導入および培養することによっても、誘導性自己抗原の存在は増加する。このため、注入されたＡＣＴ細胞に対する自然免疫系の反応を防止または減少することが有益であると思われる。これにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＣＴ細胞の持続性が増加し、この治療法の恩恵も増加すると思われる。これにより、リンパ球枯渇法や骨髄破壊治療法の必要性が減少し、ＡＣＴを受けた患者の副作用も減ることが理想的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、ｉｎ  ｖｉｖｏ持続性が高められた養子細胞移植用免疫細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この目的は、これら細胞に対する自然免疫反応、特に、誘導性自己抗原の認識に伴う自然免疫反応を減少することによって達成される。特によく知られている誘導性自己抗原の認識に伴う受容体は、ＮＫＧ２Ｄである。ＡＣＴに向けた免疫細胞における１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドを不活性化することにより、ＮＫ媒介免疫反応用のこれら細胞が、少なくとも部分的にマスクされることがわかった。この結果、ＡＣＴ細胞の殺傷が減り、ｉｎ  ｖｉｖｏ持続性が延びる。
【０００６】
このため、外在性核酸分子と、以下の少なくとも１つと、を含む遺伝子操作された免疫細胞が提供される：
‐不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子；
‐１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の阻害剤。
【０００７】
特定の実施形態によれば、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５およびＵＬＢＰ６から選択される。さらなる特定の実施形態によれば、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢから選択される一方または両方である。
【０００８】
特定の実施形態によれば、１つ以上の阻害剤は、ＲＮＡ阻害剤、抗体およびペプチド阻害剤から選択される。他の特定の実施形態によれば、不活性化するように操作された遺伝子は、Ｃｒｉｓｐｒ／ＣＡＳ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼまたはＭｅｇａＴＡＬ技術を使って不活性化される。
【０００９】
さらなる特定の実施形態によれば、外在性核酸分子は、キメラ抗原受容体またはＴＣＲをコードする。
【００１０】
さらに特定の実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲである。
【００１１】
さらなる態様によれば、免疫細胞を、ＮＫ細胞によるクリアランスを受けにくくする方法であって、前記免疫細胞において１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドを阻害することを含む、方法が提供される。
【００１２】
特定の実施形態によれば、免疫細胞は、外在性核酸分子をさらに含む。またさらなる特定の実施形態によれば、外在性核酸分子は、キメラ抗原受容体またはＴＣＲをコードする。
【００１３】
特定の実施形態によれば、１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの阻害は、１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの遺伝子不活性化（例えば、Ｃｒｉｓｐｒ／ＣＡＳ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼまたはＭｅｇａＴＡＬ技術を使った）を介して、または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンド阻害剤（例えば、ＲＮＡ阻害剤、抗体またはペプチド阻害剤）を投与することによるものである。さらに特定の実施形態によれば、ＮＫＧ２Ｄリガンド阻害剤は、１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対するｓｈＲＮＡである。特定の実施形態によれば、ＮＫＧ２Ｄリガンド阻害剤は、ＭＩＣＡおよび／またはＭＩＣＢに対するｓｈＲＮＡである。
【００１４】
以下の点に留意されたい。ｓｈＲＮＡは、そのまま投与してもよく、または、ウィルスベクターの一部（例えば、レトロウィルスベクターまたはレンチウィルスベクター）であってもよい。このような場合、１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の阻害剤は、典型的には、遺伝子操作された免疫細胞に導入される外在性核酸として提供される。
【００１５】
特定の実施形態によれば、ＮＫＧ２Ｄリガンドの阻害（すなわち、遺伝子を不活性化する操作、または、１つ以上の阻害剤の添加）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで細胞の製造中に行われる。これら細胞の製造は、投与工程を含まない。
【００１６】
またさらなる態様によれば、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞または組成物は、医薬品として使用するために提供される。これらは癌の治療に特に適している。
【００１７】
これは、癌の治療方法を提供すると記載することと同等であり、当該癌の治療方法は、外在性核酸分子と、以下の少なくとも１つと、を含む遺伝子操作された免疫細胞を、それを必要とする被検体に投与することを含む：
‐不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子；
‐１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の阻害剤。
【００１８】
上記治療方法は、自己由来の方法（被検体が自身の体に由来する細胞を受け取る）であってもよく、または、同種異系由来の方法（免疫細胞が被検体ではないドナーに由来する）であってもよい。
【００１９】
特定の実施形態によれば、ＮＫＧ２Ｄリガンドの阻害（すなわち、遺伝子を不活性化する操作、または、１つ以上の阻害剤の添加）は、その薬が患者に投与されている間も続けられる。（例えば、リガンドがノックアウトされる、または、例えば、ｓｈＲＮＡが導入され、恒常的に発現されるため）。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＣＤ４＋（Ａ）Ｔ細胞およびＣＤ８＋（Ｂ）Ｔ細胞の表面上におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現。
【図２】ＭＩＣＡとＭＩＣＢの両方を標的とするｓｈＲＮＡのスクリーニング。選択されたｓｈＲＮＡでコトランスフェクションした時に残存するＭＩＣＡ／ＢまたはＭＩＣＢのタンパク質発現率。
【図３】１つのＣＡＲ＋ｓｈＲＮＡ ベクターの設計。
【図４】ＭＩＣＡ／Ｂを標的とするｓｈＲＮＡの共発現は、フラトリサイドを減少させる。
【図５】フラトリサイドの減少により、癌細胞の殺傷が増加する。
【図６】ＭＩＣＡ／Ｂを標的とするｓｈＲＮＡは、ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲ―Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ 生着を向上させる。
【図７】ＭＩＣＡ／Ｂに対するｓｈＲＮＡがある場合とない場合のＮＫＲ２で治療したマウスＡＭＬモデルにおける日別の腫瘍負荷。ＢＬＩ＝生物発光強度。
【図８】ＭＩＣＡ／Ｂに対するｓｈＲＮＡがある場合とない場合のＭＯＣＫ細胞またはＮＫＲ２で治療したマウスＡＭＬモデルの生存率曲線。
【図９】ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞の対照またはｓｈＲＮＡと比較した、Ｃｒｉｓｐｒ／ＣａｓによるＭＩＣＡタンパク質の阻害。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
本発明を特定の実施形態に基づいて、いくつかの図面を参照しながら説明するが、本発明はこれら実施形態に限定されず、特許請求の範囲のみによって限定される。特許請求の範囲に記載の参照符号は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。図面は、単に概略を示すものであって限定するものではない。図面では、例示のために、構成要素の大きさが強調されている場合があり、厳密に図示したものではない。本明細書および特許請求の範囲で使われる「備える」という用語は、他の構成要素やプロセスを排除するものではない。数量が特定されていない名詞は、特に明記されていない限り、その名詞の複数を含むものとする。
【００２２】
さらに、明細書および特許請求の範囲に記載の「第１」、「第２」、「第３」などの用語は、類似の要素を区別するのに用いられるのであって、必ずしも順序や時系列を表すものではない。このように用いられる用語は適切な状況下で交換可能であり、本明細書に記載の発明の実施形態は、本明細書に記載または図示されるものとは別の順序で実施可能であることを理解されたい。
【００２３】
下記の用語または定義は、本発明の理解を助けることを目的として提示しているだけである。
【００２４】
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で用いられる用語はすべて、本発明の技術における当業者が理解するのと同じ意味を持つ。当該技術の定義および用語について、実務者は、具体的に下記文献を参照されたい。
ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ著『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第４版』，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１２）
Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ著『Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １１４まで）』，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１６）
本明細書で提示される定義は、当業者が理解する範囲よりも狭い範囲に解釈されるべきではない。
【００２５】
本明細書で用いられる「免疫細胞」という用語は、免疫系（適応免疫系または自然免疫系のいずれかであり得る）の一部である細胞を指す。特に想定される免疫細胞として、リンパ球、単球、マクロファージおよび樹状細胞を含む白血球細胞（白血球）が挙げられる。特に想定されるリンパ球として、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞が挙げられ、最も特に想定されるのはＴ細胞である。本明細書で用いられる免疫細胞は、典型的には、養子細胞移植用に製造される免疫細胞（自己由来移植または同種異系由来移植のいずれか）である。養子移植の状況において、免疫細胞は、典型的には、初代細胞（すなわち、ヒトまたは動物の組織から直接単離された後、培養されていないまたは短時間培養された細胞）であり、細胞株（すなわち、長期間にわたって継続的に継代され、ホモ接合体遺伝子型特性および表現型特性を獲得した細胞）ではない点に留意されたい。特定の実施形態によれば、免疫細胞は初代細胞である。別の特定の実施形態によれば、免疫細胞は、細胞株由来の細胞ではない。
【００２６】
免疫細胞に関連して本明細書で用いられる「外在性」という用語は、個々の生体細胞に存在して活動するが、当該細胞の外由来である物質（内在性因子とは逆）物質を指す。このため、「外在性核酸分子」という表現は、典型的には形質導入またはトランスフェクションを介して免疫細胞に導入された核酸分子を指す。
【００２７】
本明細書で用いられる「内在性」という用語は、個々の生体細胞に存在して活動し、当該細胞の内由来である（このため、典型的には、非形質導入細胞または非トランスフェクション細胞において生成される）因子または物質を指す。
【００２８】
本願で用いられる単数の「ＮＫＧ２Ｄリガンド」または複数の「ＮＫＧ２Ｄリガンド」という用語は、ヒト遺伝子ＭＩＣＡ（遺伝子ＩＤ：１００５０７４３６）、ＭＩＣＢ（遺伝子ＩＤ：４２７７）、ＵＬＢＰ１（遺伝子ＩＤ：８０３２９）、ＵＬＢＰ２（遺伝子ＩＤ：８０３２８）、ＵＬＢＰ３（遺伝子ＩＤ：７９４６５）、ＵＬＢＰ４またはＲＡＥＴ１Ｅ（遺伝子ＩＤ：１３５２５０）、ＵＬＢＰ５またはＲＡＥＴ１Ｇ（遺伝子ＩＤ：３５３０９１）、ＵＬＢＰ６またはＲＡＥＴ１Ｌ（遺伝子ＩＤ：１５４０６４）、およびこれらの遺伝子産物（または、他の種の細胞が用いられる場合、関連相同体）を指す。「遺伝子産物」という用語の範囲には、少なくともＲＮＡ（遺伝子から転写された）およびタンパク質（ＮＫＧ２Ｄリガンド遺伝子によってコードされ、転写ＲＮＡから翻訳された）が包含される。
【００２９】
本明細書で用いられる「ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する阻害剤」または「ＮＫＧ２Ｄリガンド阻害剤」は、ＮＫＧ２Ｄリガンドを介したシグナル伝達を防止、阻害または減少する分子を指す。阻害は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで、例えば、転写または翻訳の防止、接触阻害、競合阻害または別の手段を介して起こり得る。
【００３０】
本願で用いられる「１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの阻害」という用語は、ＤＮＡレベル（ＮＫＧ２Ｄリガンドの遺伝子産物の形成を阻害することによって、すなわち、転写を防止または妨害することによって）、ＲＮＡレベル（ｍＲＮＡを中和または不安定化して、翻訳を防止または妨害することによって）、または、タンパク質レベル（１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドを中和または阻害することによって、または、翻訳プロセス中に新生タンパク質を標的とすることによって）のいずれかで、１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの遺伝子産物の機能を妨害することを指す。タンパク質レベルでの中和は、細胞表面で（例えば、受容体リガンド相互作用を阻害することによって）、または、タンパク質が表面で発現する前（例えば、細胞内小器官にタンパク質を保持することにより）に達成することができる。典型的には、１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの阻害の最終的な機能的効果は、ＮＫＧ２Ｄ媒介シグナルを介したＮＫ細胞活性化の阻害である。
【００３１】
１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの阻害は、必ずしも、ＮＫＧ２Ｄ誘導シグナルの完全な除去を意味するわけではないが、これも同様に想定される。特に、アンチセンスＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ、また、抗体でも同様に、阻害は、多くの場合、完全な阻害ではなく部分的な阻害であることが知られている。しかし、機能性ＮＫＧ２Ｄリガンドレベルを下げることは、免疫細胞が一掃される可能性を下げるため、完全な阻害が達成されない場合であっても有益な効果を奏する可能性がある。
【００３２】
このため、特定の実施形態によれば、この阻害により、１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの遺伝子産物の１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％または最大で１００％の減少がもたらされる。ＮＫＧ２Ｄリガンド遺伝子産物のレベルを測定する方法は、当業者に公知であり、これらを阻害剤の添加前と後に測定して、機能性遺伝子産物のレベルの減少を評価、または、リガンドが阻害されない適切な対照細胞と比較することができる。同様に、阻害により、ＮＫＧ２Ｄリガンドが阻害されない細胞と比較して、ＮＫ細胞媒介溶解が、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％または最大で１００％の減少をもたらす可能性がある。
【００３３】
本明細書で用いられる「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、少なくとも、抗原（例えば、抗体または受容体由来であり得る）に対して特異性を有する結合部と、免疫細胞（例えば、ＣＤ３ゼータ鎖）でシグナルを伝達することができるシグナル伝達部とを有するキメラ受容体（すなわち、ソースが異なる部分からなる）を指す。本明細書で用いられる「ＴＣＲ」は、Ｔ細胞受容体を指す。養子細胞移植の状況において、これは、典型的には、遺伝子操作されたＴＣＲ、すなわち、特定の抗原、最も典型的には、腫瘍抗原を認識するように遺伝子操作されたＴＣＲを指す。
【００３４】
本明細書で用いられる「クリアランス」という用語は、循環、組織または体から細胞を除去することを指し、最も典型的には、例えば、循環から、導入免疫細胞を除去することを指す。この文脈における「ＮＫ細胞によるクリアランス」は、ナチュラルキラー細胞を介したクリアランス、典型的には、これら細胞の溶解またはアポトーシスの誘導によりＮＫ細胞が他の細胞を一掃または殺傷することを意味する。
【００３５】
ＮＫＧ２Ｄリガンドが不活性化または阻害された免疫細胞がＮＫ細胞によるクリアランスを受けにくく、活性状態をより長く維持するため、治療により効果的であることを示すのは本願が最初である。これは、養子細胞移植（すなわち、ＡＣＴ細胞の製造プロセス）に適するよう免疫細胞（患者細胞またはドナー細胞）を形質導入および培養することにより、ＮＫＧ２Ｄリガンドを含む誘導性自己抗原の存在も増加し、これが、事実上、ＮＫ細胞による循環からのクリアランスの原因であると思われるという知見に基づいている。
【００３６】
このため、本発明の目的は、不活性化するように操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする少なくとも１つ以上の内在性遺伝子、および／または、１つ以上の内在性ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の阻害剤を含む、遺伝子操作された免疫細胞を提供することである。
【００３７】
以下の点に留意されたい。ＮＫＧ２Ｄは、誘導性自己抗原の認識に関与する受容体の中で最もよく研究された受容体であるが、このファミリーにおいて、この受容体だけが、ストレス誘導リガンド（または誘導性自己抗原または異常な自己のマーカー、本明細書ではすべて同じものとして使われている）を認識するのではない。誘導性自己抗原に結合可能な他のナチュラルキラー細胞受容体は、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｈ（ＮＫＧ２Ｄ同様、すべてＣＤ９４分子）またはＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４などの天然細胞毒性受容体（ＮＣＲ）であり、上記方法および組成物は、必要な変更を加えて、このようなキメラ受容体に対しても使用可能であることが想定される。このため、このため、本願でＮＫＧ２Ｄが使われる場合は必ず、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｈ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４にも適用される。ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２ＦおよびＮＫＧ２Ｈ用のリガンドは、非古典的ＭＨＣグリコプロテインのクラスＩ（ヒトではＨＬＡ―Ｅ）である点に留意されたい。
【００３８】
これらの遺伝子操作された細胞は、クリアランスを受けにくいため、本発明の目的はまた、免疫細胞を、ＮＫ細胞によるクリアランスを受けにくくする方法であって、免疫細胞において１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドを阻害する工程を含む方法を提供することである。この阻害は、遺伝子不活性化、または、細胞にＮＫＧ２Ｄリガンド阻害剤が存在することにより達成することができる。以下の点に留意されたい。ＮＫ細胞のクリアランスは、体内で起こるプロセスであるが、本明細書で提供される方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏの方法である。実際、阻害工程は、（遺伝子操作／不活性化、または、阻害分子の導入のいずれかにより）ＡＣＴに適切な細胞の製造プロセス中に起こるし、体外で行われ、すなわち、（ＡＣＴ細胞を受け取る）患者または（治療法が自己由来または同種異系由来のいずれかに応じて同一人物または異なる人物である免疫細胞のソースとなる）ドナーの体内ではない。換言すると、本明細書に記載の方法は、免疫細胞の製造中に適用可能である。典型的には、養子移植のために、細胞が調製または培養される時に免疫細胞の製造がおこなわれる。これは、自己由来養子移植（被検体が、修飾および／または増殖された自身の細胞を受け取る）であっても、同種異系由来養子移植（被検体が、異なる個体から細胞を受け取る）であってもよい。このため、特定の実施形態によれば、免疫細胞を、ＮＫ細胞によるクリアランスを受けにくくするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法が提供され、これら方法は、患者に対する投与を包含しない。
【００３９】
細胞は、典型的には、外在性核酸分子をさらに含む。特定の実施形態によれば、核酸分子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴＣＲをコードする。このＣＡＲまたはＴＣＲは、適切な標的を標的にすることができる。最も典型的には、ＣＡＲまたはＴＣＲは、腫瘍標的を標的にする。限定されない例示として、ＣＡＲまたはＴＣＲは、例えば、Ｂ７Ｈ６、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ＣＤ７、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０（ＴＮＦＳＦ７）、ＣＤ１２３（ＩＬ３Ｒアルファ）、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ＣＬＤ１８（クローディン１８、スプライス変異体２）、ＣＬＬ１、ｃＭＥＴ、ＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖｌｌｌ、ＥｐＣＡＭ、ＥｒｂＢ１２３、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、葉酸受容体アルファ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＨＥＲＩ、ＨＥＲ２（また、Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ２またはＣＤ３４０）、ＩＬ−１Ａ、ＩＬ１３Ｒアルファ２（ＣＤ２１３Ａ２）、カッパ軽鎖、Ｌｌ−ＣＡＭ、ＬｅＹ、メソテリン、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＰＩＧＦ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ−１またはＶＥＧＦＲ２を標的にすることができる。
【００４０】
阻害は、複数の方法で起こり得る。
いくつか例示すると、接触阻害（競合阻害または非競合阻害）、リガンドまたは受容体の発現を妨害することによる阻害、リガンドまたは受容体の局在（例えば、細胞表面への移動を妨げる）の妨害、リガンドまたは受容体に結合することによる阻害あるいは両者の相互作用を妨げることによる阻害、下流シグナル伝達の阻害が挙げられる。
【００４１】
１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの永続的阻害は、典型的には、遺伝子ノックダウンによって達成される。実際、遺伝子編集は、遺伝子操作されたＴ細胞における標的抗原の発現を特異的に排除する可能性のある方法であることがわかっている（Ｇｏｍｅｓ−Ｓｉｌｖａ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｌｏｏｄ，  ２０１７）。しかし、８つの異なるリガンドの起こり得る発現を考慮すると、これら多型標的すべてを排除する遺伝子編集技術は課題であるため、１つだけまたは少数のリガンドを永続的に不活性化する必要がある場合が、特に想定される。遺伝子阻害（すなわち、遺伝子を不活性化するための操作）は、他のアプローチで置き換えまたは補完できる。
【００４２】
一般に、機能阻害は３つのレベルで達成することができる。１つ目は、ＤＮＡレベルで、例えば、前記免疫細胞における遺伝子（典型的には、ＮＫＧ２Ｄリガンド遺伝子）を除去または破壊することにより、あるいは、転写の発生を防ぐ（いずれの場合も、遺伝子産物の合成を妨げる）ことにより達成することができる。２つ目は、ＲＮＡレベルで、例えば、効率的な翻訳の発生を防ぐことにより（これは、ｍＲＮＡの不安定化を介して行われるため、転写から翻訳が起こる前に分解される）、あるいは、ｍＲＮＡにハイブリダイズすることにより達成することができる。３つ目は、タンパク質レベルで、例えば、タンパク質に結合する、その機能を阻害する、タンパク質を異なる細胞位置で保持する、および／または、分解のためにタンパク質をマーキングすることにより達成することができる。
【００４３】
阻害がＤＮＡレベルで達成される場合、遺伝子治療法を使って遺伝子をノックアウトまたは破壊することによって行うことができる。これは、典型的には、永続的阻害になるため、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの阻害が特に想定される。本明細書で用いられる「ノックアウト」は、遺伝子ノックダウン、すなわち、限定されるものではないが、レトロウイルス遺伝子移植を含む当該技術において既知の技術による、点突然変異、挿入、欠失、フレームシフトまたはミスセンス突然変異などの突然変異によって遺伝子をノックアウトできることである。遺伝子をノックアウトできる別の方法は、遺伝子操作されたヌクレアーゼを使用することである。このような遺伝子操作されたヌクレアーゼとしては、限定されるものではないが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ｍｅｇａＴＡＬおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが挙げられる。
【００４４】
微生物種でよく見られるメガヌクレアーゼは、核酸において部位特異的二本鎖切断を生じるための非常に長い認識配列（＞１４ｂｐ）を持つという特有の特性を有する。これにより、メガヌクレアーゼは、自然に標的配列に対して非常に特異的になり、突然変異誘発およびハイスループットスクリーニングを介して、特有の配列を認識するハイブリッドメガヌクレアーゼ変異体が得られる。メガヌクレアーゼとは対照的に、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ技術の背景にある概念は、非特異的ＤＮＡ切断酵素に基づいており、これはその後、ジンクフィンガーおよび転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）などのペプチドを認識する特異的ＤＮＡ配列に連結され得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することにより生成される人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、所望のＤＮＡ配列を標的にするよう遺伝子操作することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、複雑なゲノム内の特有の配列を標的にすることができる。内在性ＤＮＡ修復機構を利用することにより、これら試薬を使って、高等生物のゲノムを正確に改変することができる。ＴＡＬＥＮは、ジンクフィンガーと似た働きをするが、ＤＮＡ認識用転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に依存する。ＴＡＬＥは、アミノ酸と認識ヌクレオチド対との１対１の認識率を有する繰り返し単位である。ＴＡＬＥは繰り返しパターンで発生するため、異なる組み合わせを試して、多種多様な配列特異性を創出することができる。
【００４５】
ＭｅｇａＴＡＬは、ＤＮＡ標的酵素の２つの異なるクラスの組み合わせに由来する。メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼともいう）は、同じドメインでＤＮＡ認識およびヌクレアーゼ機能の両方の利点を有する単一ペプチド鎖である。しかし、メガヌクレアーゼ標的認識は、修飾が難しく、他のゲノム標的エンドヌクレアーゼよりも特異性が低下しオンターゲット切断効率が低いことが多い。転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターは、標的ＤＮＡ二本鎖切断を達成するために、別々のＤＮＡエンドヌクレアーゼドメインに連結されたＤＮＡ認識タンパク質である。メガヌクレアーゼとは対照的に、ＴＡＬは、特異的ＤＮＡ配列を標的にするよう容易に遺伝子操作される。現在のプラットフォームは、各ＴＡＬエフェクターが非特異的ＤＮＡ切断ドメインに共役している１対のＴＡＬエフェクターに依存しており、ＤＮＡ切断は、両方のＴＡＬエフェクターがそれぞれの配列に結合し、２つのエンドヌクレアーゼドメインが二量化してＤＮＡを切断する場合にのみ起こる。しかし、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、オフターゲット活性をもたらすことが可能であり、メガヌクレアーゼよりもはるかに大きく、２つの別々のタンパク質の送達を必要とする。ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬエフェクターとメガヌクレアーゼとが一体化したものである。
【００４６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ／  Ｃｒｉｓｐｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、原核細胞の防御機構の改定版を用いたゲノム編集技術であり、生体内の遺伝子の永続的な組み換えが可能となる。合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合化したＣａｓ（典型的にはＣａｓ９）ヌクレアーゼを細胞に送達することにより、細胞のゲノムを所望の位置で切断することができ、既存遺伝子の除去および／または新たな遺伝子の追加が可能となる。
【００４７】
免疫細胞における１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンド遺伝子の遺伝子ノックダウンは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５およびＵＬＢＰ６の任意の組み合わせの阻害を意味し得るため、１、２、３、４、５、６、７または８つの遺伝子のノックアウトを意味し得る。
【００４８】
ＮＫＧ２Ｄリガンドの遺伝子不活性化とは別に、１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの阻害は、阻害剤を用いた（典型的には一過性）阻害によっても達成することができる。阻害剤は、免疫細胞での１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの阻害によって機能し得るが、ＮＫＧ２Ｄリガンドの適切な局在の阻害によっても機能し得る。
【００４９】
阻害剤を阻害／導入する時間枠は、典型的には、ＡＣＴ用免疫細胞の製造の時間枠と一致する。これら製造プロトコルでは、工程の数および／または工程の順序が変わる場合もあるが、典型的には、形質導入工程（例えば、ＣＡＲを、単離された免疫細胞に導入する）、増殖工程（細胞を培養して増殖させる）および採取工程（患者に投与する前または（凍結）保存のために、細胞を単離して再処方または濃縮する）を含む。阻害剤を導入する工程（または、遺伝子不活性化のために遺伝子操作する工程）は、特に形質導入工程と一致する。
【００５０】
阻害の１つの形態は、一過性の遺伝子不活性化による。一過性の遺伝子不活性化は、例えば、免疫細胞におけるアンチセンスＲＮＡの発現を介して、または、前記細胞にアンチセンスＲＮＡを投与することにより達成し得る。アンチセンス構築物は、例えば、発現プラスミドとして送達することができ、細胞で転写されると、標的ｍＲＮＡ（ここでは、ＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡ）の少なくとも特有の部分に相補するＲＮＡを産生する。
【００５１】
遺伝子発現のより迅速な阻害方法は、ＤＮＡからなるより短いアンチセンスオリゴマーの使用、または、ホスホロチエート、２’―Ｏ―アルキルリボヌクレオチドキメラ、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルフォリノなどの他の合成構造型の使用に基づく。ＲＮＡオリゴマー、ＰＮＡおよびモルフォリノを除いて、他のアンチセンスオリゴマーはすべて、ＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性標的切断の機構を介して、真核細胞で作用する。ＰＮＡおよびモルフォリノは、相補ＤＮＡおよびＲＮＡ標的に高い親和性と特異性で結合するため、ＲＮＡ翻訳機構の単純な立体遮断を介して作用し、ヌクレアーゼの攻撃に対して完全な耐性を持つようになる。「アンチセンスオリゴマー」は、長さが少なくとも約１０ヌクレオチドのオリゴマーを含むアンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０または５０ヌクレオチドを含む。アンチセンスアプローチは、ＦＭＲ１のポリヌクレオチド配列によってコードされるｍＲＮＡに相補されるオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか、あるいはその誘導体）の設計を含む。アンチセンスＲＮＡを細胞に導入し、相補ｍＲＮＡと塩基対形成して翻訳機構を物理的に妨害することにより相補ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。このため、この効果は化学量論的である。絶対相補性が好ましいが、必要ではない。本明細書で用いられるＲＮＡの一部に「相補する」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズ可能であり安定した二本鎖を形成するのに十分な相補性を有する配列を意味し、二本鎖アンチセンスポリヌクレオチド配列の場合、二本鎖ＤＮＡの一本鎖をテストしてもよく、または、三本鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度と、アンチセンスポリヌクレオチド配列の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズするポリヌクレオチド配列が長いほど、それが含み得るＲＮＡとの塩基ミスマッチが増え、安定した二本鎖（または場合によっては三本鎖）が形成された状態になる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を求めるための標準的な手順を用いることにより、ミスマッチの許容可能な程度を確認することができる。メッセージの５’末端（例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）からＡＵＧ翻訳開始コドンを含む）に相補されるオリゴマーは、翻訳を阻害するのに最も効率的に作用するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに相補する配列も、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに効果的であることが最近わかった（Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３７２，３３３〜３３５）。このため、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲのいずれか、すなわち、標的遺伝子の非コード領域に相補するオリゴマーをアンチセンスアプローチに用いて、標的遺伝子によりコードされる前記内在性ｍＲＮＡの翻訳を阻害できる可能性がある。前記ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに相補するオリゴマーは、ＡＵＧ開始コドンの補体を当然含む。ｍＲＮＡコード領域に相補されるアンチセンスオリゴマーは、効率の悪い翻訳阻害剤であるが、本発明で用いることができる。前記ｍＲＮＡの５’，３’または非コード領域のどちらかにハイブリダイズす���よう設計する際、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有する必要があり、好ましくは、１５〜約５０ヌクレオチドの長さを有するオリゴマーである。特定の実施形態では、オリゴマーは、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有する。関連する方法では、アンチセンスＲＮＡの代わりにリボザイムを使用する。リボザイムは、特異的ＲＮＡ配列を標的にするよう設計され得る酵素様切断特性を有する触媒ＲＮＡ分子である。マウス、ゼブラフィッシュおよびショウジョウバエにおいて、リボザイムを用いた一時的かつ組織特異的遺伝子不活性化を含む標的遺伝子不活性化の成功が報告されている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、転写後遺伝子抑制の一形態である。ＲＮＡ干渉の現象が最初に観察され記載されたのは、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）であり、外在性二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、標的ＲＮＡの急速な分解を誘導する機構を介して相同配列を含む遺伝子の活性を特異的かつ強力に破壊することが示された。いくつかの報告において、遺伝子不活性化の空間的および／または時間的制御を実証する実験を含む、植物（シロイヌナズナ）、原生動物（ブルーストリパノソーマ）、無脊椎動物（ショウジョウバエ）および脊椎動物種（ゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエル）を含む他の生物における同じ触媒現象が記載されている。配列特異的メッセンジャーＲＮＡ分解のメディエーターは、より長いｄｓＲＮＡからのリボヌクレアーゼＩＩＩ切断によって生成される低干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。一般的に、ｓｉＲＮＡの長さは、２０〜２５ヌクレオチドの間である（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ４１１、４９４〜４９８）。ｓｉＲＮＡは、典型的には、センスＲＮＡ鎖と、標準Ｗａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対相互作用（以下「塩基対形成」という）によって一緒にアニーリングされた相補アンチセンスＲＮＡ鎖とを含む。センス鎖は、標的ｍＲＮＡに含まれる標的配列と同一の核酸配列を含む。本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、２つの相補一本鎖ＲＮＡ分子を含むことができ、または、２つの相補部分が塩基対を形成し、一本鎖の「ヘアピン」領域（しばしば「ｓｈＲＮＡ」と呼ばれる）によって共有結合された単一分子を含むことができる。遺伝子抑制には、急なヘアピンカーブを有するこれら人工ＲＮＡ分子が特に想定され、ｓｉＲＮＡという用語に含まれる。「単離される」という用語は、人間の介入を介して自然状態から改変または除去されることを意味する。例えば、生きている動物に自然に存在するｓｉＲＮＡは、「単離されない」が、合成ｓｉＲＮＡや、その自然状態の共存物質から部分的または完全に分離されたｓｉＲＮＡは、「単離される」。単離されたｓｉＲＮＡは、実質的に精製された形態で、または、例えば、ｓｉＲＮＡが送達された細胞などの非自然環境で存在することができる。
【００５２】
本発明のｓｉＲＮＡは、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡまたは組換え産生されたＲＮＡ、ならびに、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって改変され、自然発生のＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含むことができる。このような改変として、例えば、ｓｉＲＮＡの末端やｓｉＲＮＡの１つ以上の内部ヌクレオチドへの非ヌクレオチド物質の付加（ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化耐性にする改変を含む）が含まれ得る。
【００５３】
本発明のｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖は、３’オーバーハングも含むことができる。「３’オーバーハング」は、ＲＮＡ鎖の３’末端から延出する少なくとも１つの非対ヌクレオチドを指す。このため、一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡは、長さが１〜約６ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含む）、好ましくは、長さが１〜約５ヌクレオチド、より好ましくは、長さが１〜約４ヌクレオチド、特に好ましくは、長さが約１〜約４ヌクレオチドである少なくとも１つの３’オーバーハングを含む。
【００５４】
ｓｉＲＮＡ分子の両方の鎖が３’オーバーハングを含む実施形態において、オーバーハングの長さは、各鎖で同じであっても異なってもよい。最も好ましい実施形態では、３’オーバーハングは、ｓｉＲＮＡの両方の鎖に存在し、長さは２ヌクレオチドである。本発明のｓｉＲＮＡの安定性を高めるため、３’オーバーハングを分解に対して安定化させることもできる。一実施形態では、オーバーハングは、アデノシンヌクレオチドまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含めることにより安定化される。
【００５５】
あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、３’オーバーハングにおける２’デオキシチミジンによるウリジンヌクレオチドの置換は、許容範囲内であり、ＲＮＡｉ分解の効率に影響を及ぼさない。具体的には、２’デオキシチミジンに２’ヒドロキシルが存在しないことにより、組織培養培地における３’オーバーハングのヌクレアーゼ耐性が著しく高められる。
【００５６】
ｓｉＲＮＡは、複数の当業者に既知の技術を使って得ることができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、当該技術において既知の方法で化学的に合成または組換えて産生することができる。好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトと、従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置とを使って化学的に合成される。ｓｉＲＮＡは、２つの別個の相補ＲＮＡ分子または２つの相補領域を有する単一のＲＮＡ分子として合成することができる。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の商業サプライヤーとして以下が挙げられる。
Ｐｒｏｌｉｇｏ（ハンブルグ、ドイツ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ラファイエット、コロラド州、米国）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、ロックフォード、イリノイ州、米国）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（スターリング、バージニア州、米国）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（アッシュランド、マサチューセッツ州、米国）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（グラスゴー、英国）。
【００５７】
あるいは、ｓｉＲＮＡは、適切なプロモーターを使って、組み換え環状または線状ＤＮＡプラスミドから発現させることもできる。プラスミドから本発明のｓｉＲＮＡを発現するのに適切なプロモーターとして、例えば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の技量の範囲内である。本発明の組み換えプラスミドは、特定の組織または特定の細胞内環境においてｓｉＲＮＡを発現させるための誘導または調節可能なプロモーターも含むことができる。組み換えプラスミドから発現されるｓｉＲＮＡは、標準的な技術で、培養細胞発現系から単離可能であり、または、細胞内、例えば、乳房組織やニューロンで発現可能である。
【００５８】
本発明のｓｉＲＮＡは、組み換えウィルスベクターから細胞内で発現させることもできる。組み換えウィルスベクターは、本発明のｓｉＲＮＡをコードする配列と、ｓｉＲＮＡ 配列を発現するのに適切なプロモーターとを含む。適切なプロモーターとして、例えば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の技量の範囲内である。本発明の組み換えウィルスベクターは、腫瘍が局在する組織においてｓｉＲＮＡを発現させるための誘導または調節可能なプロモーターも含むことができる。
【００５９】
本明細書で用いられるｓｉＲＮＡの「有効量」は、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解を生じるのに十分な量、または、ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンド誘導性シグナル伝達を減少するのに十分な量である。標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解は、上述したようなｍＲＮＡまたはタンパク質を単離および定量するための標準的な技術を使って、被検体の細胞にある標的ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定することによって検出することができる。
【００６０】
ゼブラフィッシュおよびカエルにおけるモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ  Ｈの厳格性が低い要件によってもたらされる他のｍＲＮＡ分子の非標的特異的切断による多数の非特異的効果を含むＲＮａｓｅ  Ｈコンピテントアンチセンスオリゴヌクレオチドの限定を解消することがわかっている。このため、モルフォリノオリゴマーは、アンチセンス分子の重要な新しいクラスを表す。本発明のオリゴマーは、当該技術において既知の標準的な方法で合成し得る。例えば、ホスホロチオアートオリゴマーは、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．による（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６，（３２０９〜３０２１）に記載の方法で合成し得る。メチルホスホナートオリゴマーは、制御された細孔ガラスポリマー支持体を用いて調製され得る（Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）米国科学アカデミー紀要８５、７４４８〜７４５１）。モルフォリノオリゴマーは、ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒによる米国特許第５，２１７，８６６号および第５，１８５，４４４号に記載の方法で合成し得る。
【００６１】
阻害、具体的に、一過性阻害は、タンパク質レベルで阻害剤によって達成することもできる。その典型的な例として、１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する抗体がある。
【００６２】
「抗体」という用語は、ＮＫＧ２Ｄリガンドまたはその機能性誘導体に対して特異的であることを特徴とする抗体に関し、前記抗体は、モノクローナル抗体；または、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）または一本鎖Ｆｖ型のその抗原結合フラグメント、または、それに由来する組み換え抗体であることが好ましい。本発明のこれら抗体（標的タンパク質に対して調製された特異的ポリクローナル抗血清やその機能性誘導体を含む）は、他のタンパク質に対する交差反応性を有しない。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、古典的な方法で、動物、具体的には、標的タンパク質またはその機能性誘導体に対して免疫化されたマウスやラットの脾細胞および骨髄腫細胞株の細胞から形成されやすく、動物を免疫化するのに最初に用いた標的タンパク質またはその機能性誘導体を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの能力によって選択されるハイブリドーマによって産生することができる。本発明のこの実施形態に係るモノクローナル抗体は、Ｈ鎖およびＬ鎖をコードするマウスおよび／またはヒトゲノムＤＮＡ配列またはＨ鎖およびＬ鎖をコードするｃＤＮＡクローンから逸脱した、組み換えＤＮＡ技術を用いて作成されたマウスモノクローナル抗体をヒト化したものであってもよい。あるいは、本発明のこの実施形態に係るモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体であってもよい。このようなヒトモノクローナ抗体は、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３６０５に記載の重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）再増殖により、または、米国特許第５，５４５，８０６号に記載のヒト抗体の産生が可能な遺伝子導入非ヒト動物を使って調製される。また、これらモノクローナル抗体に由来するフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２およびｓｃＦｖ（「一本鎖可変フラグメント」）は、本来の結合特性を保持するのであれば、本発明の一部を形成する。このようなフラグメントは、通常、例えば、パパイン、ペプシン、または、他のプロテアーゼによる抗体の酵素消化によって生成される。モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、様々な用途のために改変できることが当業者に知られている。本発明に関与する抗体は、酵素型、蛍光型または放射性型の適切な標識で標識することができる。特定の実施形態では、標的タンパク質、または、その機能性フラグメントに対する前記抗体は、ラクダ由来である。ラクダ抗体は、ＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９４／０４６７８およびＷＯ９７／４９８０５に十分に記載されている。
【００６３】
タンパク質レベルでのＮＫＧ２Ｄリガンドの他の阻害剤としては、限定されるものではないが、ＮＫＧ２Ｄリガンドのペプチド阻害剤、ＮＫＧ２Ｄリガンドのペプチドアプタマー（Ｔｏｍａｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００６）阻害剤およびタンパク質干渉剤やＰｅｐｔ−ｌｎｓ（商標）が挙げられ、これらは、ＷＯ２００７／０７１７８９やＷＯ２０１２／１２３４１９に記載されており、その内容を参照により本明細書に援用するものとする。
【００６４】
タンパク質レベルの別の阻害方法は、分泌輸送を干渉することである。これにより、リガンドが細胞膜に輸送されない。典型的には、これは一時的な阻害の形態であり、細胞に適切なシグナルが与えられると、正常な細胞位置に戻すことができるが、そのようなシグナルが与えられないと、阻害は永続する。この原理に基づいた方法の一例として、ＲＵＳＨ（選択的フックを用いた保持）システム（Ｂｏｎｃｏｍｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２０１２およびＷＯ２０１０１４２７８５）が挙げられる。
【００６５】
小分子阻害剤（例えば、小有機分子）および他の薬物候補は、例えば、組み合わせ産物および天然産物ライブラリから得ることができる。
【００６６】
このため、ＮＫＧ２Ｄリガンド阻害剤は、典型的には、ｓｉＲＮＡ、抗体、ペプチド阻害剤から選択され、より具体的には、ｓｉＲＮＡまたは抗体から選択され、最も具体的には、１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対するｓｉＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）分子から選択される。
【００６７】
養子療法には多くの異なる種類の免疫細胞が使われるため、本明細書に記載の方法でも使われることが想定される。免疫細胞としては、限定されるものではないが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、リンパ球、樹状細胞、骨髄細胞、幹細胞、ｉＰＳＣが挙げられる。後者の２つはそれ自体免疫細胞ではないが、免疫療法のための養子細胞移植に使うことができる（例えば、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２０１４；Ｔｈｅｍｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ２０１５参照）。典型的には、製造は、幹細胞またはｉＰＳＣで始まる（または免疫細胞からｉＰＳＣへの脱分化工程で始まることもある）が、製造には、投与前に免疫細胞に分化する工程が必然的に伴う。本発明の方法は、製造プロセス（すなわち、投与前の工程）に関するため、本明細書では、養子移植のための免疫細胞の製造に使われる幹細胞およびｉＰＳＣｓは、免疫細胞であるとみなされる。特定の実施形態によれば、当該方法で想定される幹細胞は、ヒト胚の破壊工程に関与しない。
【００６８】
本発明の方法で使われる細胞として、Ｔ細胞およびＮＫ細胞が特に想定される。さらなる態様によれば、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞は、医薬品として使用するために提供される。またさらなる態様によれば、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞は、炎症性疾患、癌、または、感染症（例えば、ウィルス性、細菌性、真菌性感染症）から選択される疾患の治療に使用するために提供される。細胞治療法はかなり高額であるため、生命を脅かす疾患が特に想定される。このため、最も具体的には、本明細書に記載の細胞および組成物は、癌治療に使用するために提供される。原則的に、すべての癌を治療することができる。限定されるものではないが、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、食道癌、膠芽細胞腫、頭部および頸部癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、胃癌および甲状腺癌が含まれる。最も特に想定される癌として、白血病（ＡＭＬを含む）、多発性骨髄腫、膀胱癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌および膵臓癌が挙げられる。
【００６９】
「免疫細胞は、治療に使用するために提供される」は、これら免疫細胞を、それを必要とする被検体に投与する工程を備えた疾患治療方法を提供がされるというのと同じ意味である。このため、これら実施形態によれば、当該細胞を、それを必要とする被検体に投与することを備えた、炎症性疾患の治療方法が提供される。同様に、当該細胞を、それを必要とする被検体に投与することを備えた、癌の治療方法が提供される。同様に、当該細胞を、それを必要とする被検体に投与することを備えた、感染症の治療方法が提供される。
【００７０】
遺伝子操作された免疫細胞を被検体に投与する工程を備えた、それを必要とする被検体における癌の治療方法であって、前記免疫細胞は、外在性核酸分子と、以下の少なくとも１つとを含有する、癌の治療方法が特に想定される：
‐不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子；
‐１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の阻害剤。
【００７１】
最も具体的に、外在性核酸分子は、キメラ抗原受容体またはＴＣＲをコードする。そのようなＣＡＲやＴＣＲの典型的な標的は上記に列記している。
【００７２】
免疫細胞は、当該細胞が投与される被検体からの自己由来であっても、同種異系由来、すなわち、異なる被検体からの由来であってもよい。
【００７３】
本発明に係る細胞および方法について、特定の実施形態、特定の構成、ならびに物質および／または分子について説明したが、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、形態および詳細において様々な変更や変形が可能である。以下の実施例は、特定の実施形態をさらに説明するために提示するのであって、本願を限定解釈するものではない。本願は、請求項の範囲によってのみ限定される。
【００７４】
実施例
《実施例１》
Ｔ細胞の活性化は、特定のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を誘導する。
この実施例では、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体（すなわち、キメラ抗原受容体をコードする外在性核酸分子）と、１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上のｓｈＲＮＡとを含む、遺伝子操作された免疫細胞、より具体的には、Ｔ細胞の生成を示す。これらｓｈＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（ＳＭＡＲＴベクター）から得られる。
【００７５】
最初の工程として、どのＮＫ細胞受容体用リガンドが、Ｔ細胞上、具体的には、活性化したＴ細胞上でもっともよく発現するのか評価した。理由は、ＮＫ細胞受容体用リガンドは、これら細胞をＮＫ媒介殺傷の標的にするリガンドだからである。特に注目は、ＮＫＧ２Ｄリガンドであり、これらは、特異的に誘導されることが知られている。実際、ＮＫＧ２Ｄは、腫瘍には広く存在するが、健常組織にはほとんど存在しない８つの異なるストレス誘導リガンド（ＮＫＧ２ＤＬ）に結合することが知られている。我々は、活性化時にＴ細胞で発現する鍵となるＮＫＧ２ＤＬを特定することを目的とした。０日目に、ＯＫＴ３と抗ＣＤ３抗体で、ＰＢＭＣを活性化した。一日おきに、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の表面の８つのＮＫＧ２ＤＬの発現を評価した（図１）。活性化時、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の細胞表面上でＭＩＣＡ／ＢおよびＭＩＣＢをアップレギュレートした。活性化後２〜４日目に発現がピークに達した。その後、１０日目まで発現は低下した。ＵＬＢＰ１およびＵＬＢＰ２が低レベルで発現したが、ＵＬＢＰ２はＣＤ４＋Ｔ細胞に限定されていた（図１）。Ｔ細胞上での他のリガンドの発現の証拠はほとんどなかった。
【００７６】
次に、配列の類似性が高いため、単一のｓｈＲＮＡによるＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ両方の特異的標的化が実現可能であることを調べた。初期Ｔ細胞に異なるｓｈＲＮＡを形質導入し、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢタンパク質の発現を評価した。このスクリーニングにより、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの細胞表面発現を減少させる２つのｓｈＲＮＡが特定された（図２および表１）。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
《実施例２》
ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢを標的とするｓｈＲＮＡの共発現は、Ｔ細胞のＮＫ受容体媒介殺傷を減少し、腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺傷を改善する。
【００７９】
ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲをコードし、実施例１で特定されたｓｈＲＮＡ候補を共発現する単一のレトロウィルスベクターを遺伝子操作した。設計は、図３に示す。ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲは、Ｔ細胞にＮＫ受容体結合特異性を与えるため、これら細胞は、ＮＫクリアランス（すなわち、ＮＫ細胞によるＴ細胞の殺傷）の効果を模倣することができる。ここで、ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲは、Ｔ細胞上で発現するＮＫＧ２Ｄリガンドを認識し、これら細胞を排除する。この「自己殺傷」すなわち「同一細胞による殺傷」は、フラトリサイドと呼ばれる。我々は、細胞増殖率を用いて、ＮＫＧ２ＤベースのＣＡＲまたはｓｈＲＮＡを共発現するＴ細胞で遺伝子操作されたＴ細胞におけるフラトリサイドのレベルを評価した（図４）。ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲおよびｓｈＲＮＡをコードする単一レトロウィルスベクターの遺伝子操作により、ｓｈＲＮＡなしの細胞と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏフラトリサイドがかなり減少したＴ細胞が生成され（図４）、ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲＴ細胞の増殖率が上がり、対照Ｔ細胞のものに近づいた。このため、ＮＫＧ２Ｄリガンドを阻害することにより、ＮＫ受容体による殺傷が起こりにくい細胞にすることができた。
【００８０】
続いて、ＭＩＣＡ／Ｂを標的とするｓｈＲＮＡがある場合とない場合のＮＫＧ２ＤベースのＣＡＲＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍効果を評価した。ｓｈＲＮＡのない細胞は、異なるＴＡＬエフェクター／標的（Ｅ：Ｔ）比で、ＡＭＬ  ＨＬ―６０細胞の特異的殺傷を示した。しかし、ＭＩＣＡ／ＢｓｈＲＮＡ＃２（標的配列ＣＣＡＧＧＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＣＴＧＴ）または＃４（標的配列ＡＡＧＡＣＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＴＡＴＣ）の共発現は、特に、低いＥ：Ｔ比で、癌細胞の殺傷を改善した（図５Ａ）。ｓｈＲＮＡの発現により、共培養２４時間後のＴ細胞が回復したため（図５Ｂ）、この標的細胞殺傷の改善は、フラトリサイドの減少（ＮＫ細胞殺傷の減少の代用マーカー）によるものである可能性が高い。
【００８１】
《実施例３》
ＩＭＫＧ２Ｄリガンドの阻害は、ＣＡＲＴ細胞の持続性を高め、腫瘍負荷を減少させ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存率を延ばす。
【００８２】
これまでの研究で、キメラＮＫＧ２Ｄ抗原受容体（ＮＫＲ２ともいう）を発現する細胞の生着は限定されており、これは、一過性の抗腫瘍活性に貢献する可能性があることがわかった。ＣＡＲ―Ｔ細胞上でのＮＫＧ２ＤＬの発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生着の減少に貢献するという仮説を立てた。これを評価するため、ＩＶ注入を１回行ったＮＳＧマウスで、ＣＡＲ  Ｔ細胞の長期持続性を評価した。
【００８３】
この研究の包括的目的は、静脈内（ＩＶ）注入を１回行った後のＮＯＤ  ＳＣＩＤガンマ―ｃ―／―（非肥満性糖尿病重症複合免疫不全症ガンマ、ＮＳＧ）マウスのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の長期持続性を評価することであった。特有のドナー（５つの異なるｓｈＲＮＡを有するＭｏｃｋ  Ｔ細胞、ＮＫＲ―２Ｔ細胞およびＮＫＲ２細胞）から生成される７つの異なるＴ細胞治療法の血液において持続性を評価した。ＣＡＲＴ細胞のＩＶ注入前２４時間以内にＮＳＧマウスを照射した。これら高度免疫不全マウスでは、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が不足しており、多数のサイトカインシグナル伝達経路も不足していたため、ヒト細胞の生着が可能であった。
【００８４】
７つの異なるＴ細胞治療法の持続性の評価は、４匹のマウスからなる７つのグループ（３匹のマウスからなるＭｏｃｋ  Ｔ細胞で治療したグループを除く）において、関連するＴ細胞（１０×１０６細胞／マウス）のＩＶ注入を１回行い、注入後８週間行った。３匹のマウスからなる１つのグループには、ビヒクルが注入され、Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞が注入されたマウス同様、対照として用いた。
【００８５】
細胞の長期持続性を評価するため、８週間の間、週に１度、フローサイトメトリーを行って、血中のヒトＴ細胞の生着を検出した（ＩＶ注入後、１、６、１３、２０、２７、３４、４１、４８および５５日目）。
【００８６】
プロトコル
１日目、すべてのマウスを照射した。マウスは、照射器Ｘ―ＲＡＤ３２０に入れた。マウスは、ケージで麻酔せず、１．４４ＧｙでＸ線照射した。照射は、７０ｃｍのＸ線管で０．５Ｇｙ／ｍｉｎの線量率および下記のパラメータを用いたマウス照射の標準プロトコルで行った。
‐１２．５ｍＡ（アンペア数）
‐３２０ｋＶ（電圧値）
【００８７】
０日目に、各細胞型（異なるｓｈＲＮＡを有するＭｏｃｋ  Ｔ細胞、ＮＫＲ―２Ｔ細胞および５ＮＫＲ―２Ｔ細胞）５０×ｌ０６細胞／バイアルで２バイアルを解凍し、下記のプロトコルに従った注入のために調製した。
‐水浴において＋３７℃でＸ―ｖｉｖｏ１５培地（ゲンタマイシンおよびフェノールレッドを含まないＸ―ＶＩＶＯ１５）を予熱した。
‐Ｘ―ｖｉｖｏ１５培地に、５０ｍｇ／ｍｌに濃縮された１％のゲンタマイシンと、熱不活性化した５％のヒト男性ＡＢ血清（ＨＳ）とを補充した（すなわち、１０ｍｌのゲンタマイシンと、５０ｍｌのＨＳを、１０００ｍｌボトルのＸ―ｖｉｖｏ１５培地に加えた）。
‐凍結細胞を含有するバイアルを＋３７℃の水浴に移し、小さな氷のかけらが残るまで解凍した。
‐バイアルを除染してラミナーフードに移した。
‐Ｔ細胞の各バイアルに、１ｍｌの冷たい純ＨＳを１滴ずつ加えた。
‐８ｍｌ×予め加温した完全Ｘ―ｖｉｖｏ１５培地の解凍バイアルの数を、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに入れた（Ｔ細胞２バイアルで１６ｍｌ）。
‐細胞を、これら５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移し、Ｔ細胞全体を移すために、１ｍｌの細胞懸濁液でクライオバイアルを洗い流した。
‐５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブを４００ｇで５分間遠心分離に供し、その後、上清を慎重に除去した。
‐１０ｍｌ×完全Ｘ―ｖｉｖｏ１５培地の解凍バイアルの数を加えた（Ｔ細胞２バイアルで２０ｍｌ）。
‐５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブを４００ｇで５分間、２回目の遠心分離に供し、上清を慎重に除去した。
‐その後、各細胞型の細胞を、６００ｍｌのＨＢＳＳで再懸濁させた（Ｔ細胞１バイアルあたり３００μｌのＨＢＳＳ）。
‐１０μｌの細胞のアリコートを、１０μｌのトリパンブルーで希釈し、細胞数をカウントし、自動セルカウンターを使って生存率を求めた。
‐最後に、ＩＶ注入セッション（２００μｌ／マウス）のために、ＨＢＳＳで細胞濃度を５０×１０６細胞／ｍｌに調整した。
【００８８】
残りの解凍細胞を用いてフローサイトメトリーパネル検証を行った。
【００８９】
１ｍｌの使い捨てのプラスチック注射器と２６Ｇ針を用いて、ビヒクルと、被験物質と、基準物質とを、１つの尾静脈にＩＶ注入により投与した。１グループあたり１本の注射器を用いた。１、６、１３、２０、２７、３４、４１、４８および５５日目に、すべてのグループ（グループ１〜８）の各マウスの全血（ＷＢ）を採取した。
【００９０】
ＷＢは、毛管を介して、麻酔されたマウスの後眼窩洞により（イソフルラン１〜３%）で採取した。
【００９１】
約１５０μｌの血液を採取し、２０μｌのヘパリンで予めヘパリン化したマイクロ遠心分離管に入れた。
【００９２】
動物を、麻酔下（イソフルランとキャリアガスである酸素との混合物）で頚椎脱臼によって安楽死させた。
【００９３】
フローサイトメトリー分析を、１、６、１３、２０、２７、３４、４１および４８日目に３０のサンプルについて行い、５５日目に２９のサンプルについて行った。
【００９４】
マウス細胞を排除するため、抗ヒトＣＤ４５（ｈＣＤ４５）、抗ｈＣＤ３、抗ｈＣＤ３１４、抗ｈＣＤ１９、抗ｈＭＩＣＡ／Ｂおよび抗マウス（ｍＣＤ４５）ｍＡｂを含有する表２に記載のｍＡｂの組み合わせを用いて染色した後、ＷＢでヒトＴ細胞を検出した。
【００９５】
下記の染色プロトコルに従って染色を行った。
‐赤血球溶解
‐細胞洗浄
‐１０μｇ／ｍＬのマウスＦｃブロックを用いて＋４℃の暗所で１０分間インキュベート
‐抗体の混合物を用いて＋４℃の暗所で２０分間細胞をインキュベート
‐細胞洗浄
‐２５０μｌの固定バッファで細胞を再懸濁
‐ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターで１００，０００の生存事象またはチューブの総数を獲得。
【００９６】
【表２】
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【００９７】
データ
図６に示されるように、ＮＫＧ２ＤＣＡＲＴ細胞は、ＮＳＧマウスにおいて２４日の持続性を示した。ＭＩＣＡ／Ｂを標的とするｓｈＲＮＡ＃２の共発現により、４１日目まで生着が向上した。注目すべきは、ｓｈＲＮＡ＃４の共発現により、すべての動物において、実験終了まで、末梢血におけるＣＡＲ―Ｔ細胞の持続性が、少なくとも２倍増加した。これらデータは、ＮＫＧ２Ｄリガンドの阻害により、ＣＡＲ−Ｔ細胞の持続性が本当に延びることを実証している。
【００９８】
次の工程として、ｓｈＲＮＡによるこれらＣＡＲ―Ｔ細胞の持続性が延びたことにより、抗腫瘍活性に対する効果が得られるのかどうか評価した。この目的のため、ＡＭＬモデルを用いた。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、骨髄性前駆細胞の異常増殖によって特徴付けられる血液癌である。ＡＭＬは、最も一般的な成人急性白血病であり、小児白血病の約２０％を占める。細胞毒性化学療法によるＭＬの治療は、高い寛解率を達成するが、患者の約７５％が、初期治療に反応しないか、または、初期治療の後に再発し、患者のほとんどは疾患により死亡する。
【００９９】
ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＴＨＰ―１―ｌｕｃ―ＧＦＰ細胞株（急性単球性白血病―ＡＭＬサブタイプ５）を使って、免疫不全マウスＮＯＤ  ＳＣＩＤガンマ―ｃ―／―（非肥満性糖尿病重症複合免疫不全症ガンマ、ＮＳＧ）マウスにおいて、ＡＭＬに対するＮＫＲ―２  ＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍効果を評価した。
【０１００】
ＮＫＲ―２（遮断ｍＡｂを用いた培養プロセスで生成されたＮＫＧ２Ｄ  ＮＫ受容体に基づいてキメラ受容体をコードするレトロウィルスベクターで遺伝子的に修飾されたヒトＴ細胞）およびＮＫＲ―２ｓｈＲＮＡ  Ｔ細胞（ＮＫＧ２Ｄ  ＮＫ受容体と、２ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＭＩＣＡ／Ｂ（ｓｈＲＮＡ＃２または＃４のいずれか）を標的とする１つの短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）候補とに基づいてキメラ受容体をコードするレトロウィルスベクターで遺伝子的に修飾されたヒトＴ細胞）の効果を、このマウスモデルで評価した。
【０１０１】
１つの基準物質（Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞）およびビヒクルも注入され、対照として使われた。
【０１０２】
腫瘍細胞の注入後７日目に、被験物質、基準物質およびビヒクルをＩＶ投与した。
【０１０３】
異なるＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果を、ｉｎ  ｖｉｖｏ 生物発光イメージングで評価した。動物個体におけるＴＨＰ―１―ｌｕｃ―ＧＦＰ細胞増殖および播種の可視化および定量化を、ＩＶ注入後８週間の間に８回（４、８、１３、２２、２９、３６、４３および５７日目）行った。
【０１０４】
分析を完了させるために、全血（ＷＢ）のフローサイトメトリーを、腫瘍細胞注入後８週間の間に７回（８、１３、２２、２９、３６、４３および５７日目）行った。
【０１０５】
さらに、各マウスの臨床状態を、臨床スコアおよび１週間に３回測定した体重（ＢＷ）に基づいて、異常な臨床兆候を検出するために評価した。
【０１０６】
材料および方法のほとんどは、本明細書で上述したものである。このモデルでは、０日目に、ＴＨＰ―ｌ―ｌｕｃ―ＧＦＰ細胞（５×１０６細胞／マウス）が２５匹のマウスにＩＶ注入され、続いて７日目に、関連するビヒクル、Ｍｏｃｋ細胞またはＣＡＲＴ細胞が注入された。
【０１０７】
図７に示されるように、腫瘍負荷が、具体的に、より長い時間枠において減少している事実によって証拠づけられるように、ＭＩＣＡ／Ｂに対するｓｈＲＮＡを有するＮＫＲ２細胞は、腫瘍増殖を減速させるように思われる。図８に示されるように、ＭＯＣＫ細胞で治療したマウスはすべて１９日目までに、腫瘍で死亡した。これに対し、ＣＡＲで治療したマウスは、３０日目まで生存した。ＮＫＧ２Ｄリガンドに対するｓｈＲＮＡの添加により、すべてのマウスの生存期間が３０日を超えることはなかったが、マウスは、ＣＡＲのみ注入されたものと比較して、死に始めるのが著しく遅かった。これは、生存に対するｓｈＲＮＡの恩恵が増加していることを示している。侵攻性の低い腫瘍モデルや注入を繰り返すことにより、この恩恵はさらに向上する可能性がある。
【０１０８】
《実施例４》
ＣｒｉｓｐｒによるＮＫＧ２Ｄリガンドの阻害
ｉｎ  ｖｉｖｏ応用のためのＮＫＧ２Ｄリガンドに対するｓｈＲＮＡの恩恵を考慮し、ＮＫＧ２Ｄリガンドの遺伝子ノックアウトも実現可能かどうかを評価した。この目的のため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａを用いて、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ遺伝子をノックアウトした（これら２つのリガンドのみを阻害する恩恵は既に示したが、８つの遺伝子すべてをノックアウトすることは、 技術的に困難であり、コストの点で商業的魅力はない）。
【０１０９】
選択された標的配列を表３に示し、ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞のＭＩＣＡの阻害を示す予備データを図９に示す。興味深いことに、ＣＲＩＳＰＲ媒介ノックダウンは、実際に、ＭＩＣＡタンパク質の発現を、ｓｈＲＮＡ阻害剤を有するＮＫＲ２細胞と同程度まで低下させる。
【０１１０】
【表３】
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【０１１１】
結論
上記結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において、ＣＡＲＴ細胞におけるＮＫ受容体リガンドの発現を減少またはなくす恩恵を実証している。今後の実験では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ媒介ノックアウトのデータの拡大に焦点を当てるとともに、他のＣＡＲおよび異なる腫瘍モデルに対する技術の利用にも焦点を当てる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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