(57)【要約】  本開示は、あらかじめ定義された構造に又は標的構造の結合パートナーにフォールド可能なアミノ酸配列又はアミノ酸配列のライブラリーを構築する方法に関する。本方法は、タンパク質構造空間が高度に反復発生する構造ビルディングブロックで構成されたモジュラーであるという概念に基づく。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的構造を複数の構造モチーフに分解する工程と、
構造データベースで前記複数の構造モチーフの各々に対する複数の構造マッチを同定する工程と、
前記複数の構造マッチの各々を用いて配列−構造関係への少なくとも１つの非局所エネルギー寄与の値を推測する工程と、
少なくとも１つの候補アミノ酸配列を発生させる工程であって、前記候補アミノ酸配列が設計可能な性質を有する（たとえば、前記標的構造の結合パートナーにフォールド可能である）、工程と、
を含む、アミノ酸配列のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ設計法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの非局所エネルギー寄与が、前記複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置を取り囲む骨格のコンティグストレッチに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの非局所エネルギー寄与が、前記複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置に配列近接ではなく空間近接する骨格に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの非局所エネルギー寄与が、前記複数の構造モチーフの１つ内の結合残基対に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の構造マッチの各々を用いて配列−構造関係への少なくとも１つの局所エネルギー寄与の値を取得する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの局所エネルギー寄与が、前記複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置の骨格角度に由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記骨格角度がφ角、ψ角、又はω角である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的構造がタンパク質の３次構造である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記標的構造がタンパク質複合体の４次構造である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
標的構造を複数の構造モチーフに分解する工程と、
構造データベースで前記複数の構造モチーフの各々に対する複数の構造マッチを同定する工程と、
エネルギー寄与の階層に従って前記複数の構造マッチの各々を用いて配列−構造関係へのエネルギー寄与の値のセットを逐次推測する工程であって、前記階層が、
ｉ．前記複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置について少なくとも１つの局所エネルギー寄与、
ｉｉ．前記単一設計位置を取り囲む骨格のコンティグストレッチ、
ｉｉｉ．前記単一設計位置に配列近接ではなく空間近接する骨格、及び
ｉｖ．前記単一設計位置を含む結合残基対、
の少なくとも２つを含む、工程と、
設計可能な性質を有する（たとえば、前記標的構造の結合パートナーにフォールド可能である）少なくとも１つの候補アミノ酸配列を発生させる工程と、
を含む、アミノ酸配列のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ設計法。
【請求項１１】
前記階層が、
ｖ．前記単一設計位置を含む残基のトリプレット
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの局所エネルギー寄与が、前記複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置の骨格角度に由来する、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの局所エネルギー寄与が、前記複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置の埋没状態に由来する、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的構造がタンパク質の３次構造である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的構造がタンパク質複合体の４次構造である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
標的構造にフォールド可能なアミノ酸配列のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ設計のための命令がエンコードされた非一時コンピューター可読記憶媒体であって、前記命令がプロセッサーにより実行可能であり且つ請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法を含む、非一時コンピューター可読記憶媒体。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項において発生させた前記候補アミノ酸配列をコードする核酸配列を提供することと、
前記核酸配列を宿主細胞に導入することと、
前記候補アミノ酸配列を発現させることと、
を含む、標的構造の結合パートナーにフォールドするタンパク質の製造法。
【請求項１８】
前記候補アミノ酸配列が前記標的構造の前記結合パートナーにフォールドするかを決定することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質が、酵素、抗体、レセプター、輸送タンパク質、ホルモン、成長因子、及びそれらの断片からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法により生成されたタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１８年５月３１日出願の米国仮特許出願第６２／６７８，５８８号（その全内容は参照により本明細書に完全に組み込まれる）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府委託の研究又は開発
本発明は、国立科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）により付与されたＤＭＲ１５３４２４６及び国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により付与されたＰ２０ＧＭ１１３１３２に基づいて政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に関する一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、計算タンパク質設計に関し、特定的には、あらかじめ定義された構造に又は標的構造の結合パートナーにフォールド可能なタンパク質を設計するための方法、デバイス、及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００４】
計算タンパク質設計（ＣＰＤ）は、あらかじめ定義された構造（標的）にフォールドするアミノ酸配列を見いだすタスクである。１９９０年代中期に最初に定式化されたＣＰＤへの現代のアプローチの背景にある基本概念は、物理原理から基本タンパク質現象（たとえば、フォールディング及び結合）のアミノ酸配列決定基をキャプチャーすることである。具体的には、目標は、根底にある原子間相互作用をモデリングすることにより標的構造中のいずれかのタンパク質配列の自由エネルギーを近似することである。そうするための計算手順は、スコアリング機能といわれる。スコアリング機能が手に入れば、所与の標的にとくに有利なエネルギーを有する配列を探索することによりＣＰＤを実施可能である。
【０００５】
実際には、多くの課題が伝統的ＣＰＤの確度を制限して究極的に低ロバスト性をもたらす。設計との関連では、正確な自由エネルギーを計算するのに十分な詳細レベルでタンパク質構造の物理をモデリングすることは、現在のところ実現不可能である。そのため、予測能力を強く制限する物理ベーススコアリング機能では、かなりの近似を行わなければならない。代替案として、いくつかの基本物理現象は、知識ベースポテンシャル（統計ポテンシャルとしても知られる）を介して経験的にモデリング可能である。この場合、特異的な構造上の特徴（たとえば、互いに特定距離にある２つの特異的原子）の有利性を導出するために原子相互作用のエネルギーを評価する代わりに、頻度の高いものほど有利であると仮定することにより、既知のタンパク質構造中のこうした特徴の頻度を測定してその経験的有利性を定量する。たとえば、骨格二面角、原子間距離、及び充填密度、結合配向、残基埋没状態、及び残基間接触など、単純な構造上の特徴が統計ポテンシャルを構築するために活用されてきた。物理ベース機能、統計機能、又はハイブリッドエネルギー機能に依拠するかにかかわらず、ＣＰＤの基本的問題が残る。つまり、原子間相互作用の詳細は現実には究極的に配列−構造関係（すなわち、どの配列が所与の構造にフォールドするか）を具体化するが、それにもかかわらずそれはこうした関係から取り出される非常に多くの工程である。そのため、原子論的現象のモデリングの誤差がたとえ少量であっても、合わさるとアミノ酸配列の究極的予測ではかなりの誤差になる可能性がある。既存のポテンシャルの誤差が小さくなく且つランダムでもなく、むしろ、コンフィギュレーションエントロピー、アンフォールド状態の自由エネルギー、又は溶媒の存在などの寄与が多くの場合完全に失われることに関連して、大きく且つ系統的であるという事実により、このことはさらに悪化する。実は、基本的原子間相互作用及び他のエネルギー寄与が加成性であるという基本仮定でさえも、単なる近似にすぎない。たとえば、所与のコンフィギュレーションアンサンブルのタンパク質配列の自由エネルギーは、とくに溶媒の効果を考慮したとき、その原子間相互作用の加法関数ではないことが知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そのため、ＣＰＤの成功率が有意に高くなるようにスコアリング機能問題に対処する新たな方法を提供するタンパク質設計へのアプローチの必要性が当技術分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、根底にある原子論的物理をモデリングすることにより間接的に導くのではなく、既存のタンパク質構造から配列対構造関係を直接観測することに基づく新たなＣＰＤ法を提供する。タンパク質構造は、天然アミノ酸の配列で実現可能であるという意味で、ある特定の骨格ジオメトリーのみが許容される（すなわち設計可能である）準離散空間を表す。２次、３次、及び４次構造状況をキャプチャーするタンパク質データバンク（ＰＤＢ）の各残基を取り囲む局所骨格構造モチーフは、系統的に特徴付けられてきた（１）。本明細書では総称して「ＴＥＲＭ」（３次モチーフの略であるが、以上に述べたようにこのモチーフは２次、３次、及び４次構造をキャプチャーする）というこうしたモチーフは、非関連タンパク質に渡って天然で高度に再使用される。たとえば、わずか約６００ＴＥＲＭあればサブÅ分解能で既知の構造ユニバースの５０％を記述するのに十分である（１）。構造空間のこの明白な縮重のおかげで、ＴＥＲＭは、配列−構造関係の基本ルールを効果的にキャプチャーする。この理由は、各モチーフが多くの場合何千もの異なる配列／構造状況のＰＤＢで何回も現れることにある。こうした多くのマッチ配列の解析により、対応するＴＥＲＭにより表される構造フラグメントの配列決定基を抽出可能である。
【０００８】
本明細書に提供されるアプローチには、当該技術の現状を凌駕する少なくとも３つの利点が存在する。第１に、本明細書に記載の方法は、天然タンパク質で観測される配列−構造関係の証明済みルールに基づいて配列を設計する。すなわち、設計手順に向けて考慮されるＴＥＲＭマッチ配列はすべて、標的構造の一部である対応する骨格コンフォメーションを真に形成することが、アプリオリに分かる。既知のビルディングブロックからのこのタイプの設計は、既存の方法よりもかなり高い成功率を期待できることを意味する（このことは本明細書に開示される確証試験で観測された）。第２に、同様に既存のタンパク質構造に基づく統計スコアリング機能との関連で、本明細書に記載の方法は、距離や角度などの基本的な構造上の特徴の優先度間に加成性及び非依存性を仮定しない。その代わりに、ＴＥＲＭベース配列−構造優先度を直接観測することにより、本方法は、複数の寄与の集団作用を（黙示的に）説明する。最後に、ＴＥＲＭベースアプローチは、タンパク質がスタティック分子ではなくコンフォメーションアンサンブルとして室温で存在することを認識する新規な方法を提供する。この理由は、配列統計（及び究極的にはスコアリング機能）がＴＥＲＭマッチにより表される構造アンサンブル、すなわち、構造データベース（たとえば、天然タンパク質を含む構造データベース）に見いだされる類似の骨格コンフィギュレーションの厳密ではないが近似インスタンスから生じることにある。そのため、ＴＥＲＭベース設計は、特定フリーズ骨格コンフィギュレーションだけでなくタンパク質構造状態のより適切な表現である近似コンフィギュレーションのアンサンブルにも適合可能なアミノ酸配列の同定を可能にする。骨格フレキシビリティーをモデリングする必要性に対処するアプローチは、既存のＣＰＤ法との関連で提案されてきたが、かなりの計算コストを招くほか、まさに背景のセクションで考察したスコアリング確度（究極的にはロバスト性）の制限を受ける。
【０００９】
一態様では、本開示は、ホリスティック原子論的定義構造環境との関連で配列統計を得ることに基づくタンパク質設計へのアプローチを提供する。このアプローチは、少なくとも基本的構造記述子の加成性の仮定の必要性だけでなくタンパク質構造の天然縮重の認識及び利用の必要性も回避するので有利である。実は、このアプローチの優れた性能は、タンパク質構造ユニバースがある特定の骨格ジオメトリーのみが許容される（すなわち設計可能である）準離散空間を表すというその認識に（少なくとも部分的に）起因しうる。そのため、本開示は、精密に定義された詳細構造環境の統計を活用するタンパク質設計へのアプローチを提供する。
【００１０】
他の一態様では、本開示は、アミノ酸配列のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ設計法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、標的構造を複数の構造モチーフに分解する工程と、構造データベースで複数の構造モチーフの各々に対する複数の構造マッチを同定する工程と、複数の構造マッチの各々を用いて配列−構造関係への少なくとも１つの非局所エネルギー寄与の値を推測する工程と、少なくとも１つの候補アミノ酸配列を発生させる工程と、を含む。ある特定の実施形態では、候補アミノ酸配列は設計可能な性質を有する。ある特定の実施形態では、候補アミノ酸配列は、標的構造の結合パートナーにフォールド可能なタンパク質である。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの非局所エネルギー寄与は、複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置を取り囲む骨格のコンティグストレッチ（たとえば、（ｉ−ｎ）〜（ｉ＋ｎ）であり、式中、ｉは所与の位置であり、且つｎは制御可能パラメーターである）に由来する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの非局所エネルギー寄与は、複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置に配列近接ではなく空間近接する骨格に由来する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの非局所エネルギー寄与は、複数の構造モチーフの１つ内の結合残基対に由来する。ある特定の実施形態では、本方法は、複数の構造マッチの各々を用いて配列−構造関係への少なくとも１つの局所エネルギー寄与の値を取得する工程をさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、少なくとも１つの局所エネルギー寄与は、複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置の骨格角度に由来する。いくつかのかかる実施形態では、骨格角度はφ角、ψ角、又はω角である。ある特定の実施形態では、標的構造はタンパク質の３次構造である。ある特定の実施形態では、標的構造はタンパク質複合体の４次構造である。
【００１１】
さらに他の一態様では、本開示は、アミノ酸配列のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ設計法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、標的構造を複数の構造モチーフに分解する工程と、構造データベースで複数の構造モチーフの各々に対する複数の構造マッチを同定する工程と、エネルギー寄与の階層に従って複数の構造マッチの各々を用いて配列−構造関係へのエネルギー寄与の値のセットを逐次推測する工程であって、階層が、（ｉ）複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置について少なくとも１つの局所エネルギー寄与、（ｉｉ）単一設計位置を取り囲む骨格のコンティグストレッチ、（ｉｉｉ）単一設計位置に配列近接ではなく空間近接する骨格、及び（ｉｖ）単一設計位置を含む結合残基対、の少なくとも２つを含む、工程と、少なくとも１つの候補アミノ酸配列を発生させる工程と、を含む。ある特定の実施形態では、候補アミノ酸配列は、標的構造の結合パートナーにフォールド可能なタンパク質である。ある特定の実施形態では、階層は高次寄与をさらに含む。ある特定の実施形態では、階層は、（ｖ）単一設計位置を含む残基のトリプレットをさらに含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの局所エネルギー寄与は、複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置の骨格角度に由来する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの局所エネルギー寄与は、複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置の埋没状態に由来する。ある特定の実施形態では、標的構造はタンパク質の３次構造である。ある特定の実施形態では、標的構造はタンパク質複合体の４次構造である。
【００１２】
さらに他の一態様では、本開示は、標的構造の結合パートナーにフォールド可能なアミノ酸配列のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ設計のための命令がエンコードされた非一時コンピューター可読記憶媒体を提供する。命令は、プロセッサーにより実行可能であり且つ本明細書に開示される方法を含む。
【００１３】
さらに他の一態様では、本開示は、標的構造の結合パートナーにフォールドするタンパク質の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、本明細書に開示されるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ設計法により発生させた候補アミノ酸配列をコードする核酸配列を提供することと、核酸配列を宿主細胞に導入することと、候補アミノ酸配列を発現させることと、を含む。ある特定の実施形態では、本方法は、候補アミノ酸配列が標的構造の結合パートナーにフォールドするかを決定することをさらに含む。
【００１４】
さらに他の一態様では、本開示は、本明細書に開示される方法により生成されたタンパク質を提供する。
【００１５】
本明細書に記載の態様のいずれかのある特定の実施形態では、タンパク質は、酵素、抗体、レセプター、輸送タンパク質、ホルモン、成長因子、及びそれらの断片からなる群から選択される。
【００１６】
本明細書に記載の態様のいずれかのある特定の実施形態では、タンパク質は標的構造の設計変異体である。いくつかのかかる実施形態では、標的構造は、蛍光タンパク質、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）、及びＰＤＺドメイン含有タンパク質からなる群から選択される。
【００１７】
本明細書に記載の態様のいずれかのある特定の実施形態では、標的構造は蛍光タンパク質である。いくつかのかかる実施形態では、蛍光タンパク質は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）である。
【００１８】
本明細書に記載の態様のいずれかのある特定の実施形態では、標的構造はＧタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）である。いくつかのかかる実施形態では、ＧＰＣＲは、β−１アドレナリン作動性レセプターなどのアドレナリン作動性レセプターである。
【００１９】
本明細書に記載の態様のいずれかのある特定の実施形態では、標的構造はＰＤＺドメイン含有タンパク質である。いくつかのかかる実施形態では、ＰＤＺドメイン含有タンパク質は、Ｎａ＋／Ｈ＋交換体レギュラトリー因子２（ＮＨＥＲＦ−２）（Ｅ３ＫＡＲＰ、ＳＩＰ−１、及びＴＫＡ−１とも呼ばれる）である。いくつかのかかる実施形態では、ＰＤＺドメイン含有タンパク質は、膜関連グアニル酸キナーゼ（ＭＡＧＩ−３）である。
【００２０】
本明細書に記載の態様のいずれかのある特定の実施形態では、標的構造の結合パートナーは、ＰＤＺドメインに結合するタンパク質又は他の分子である。いくつかのかかる実施形態では、標的構造の結合パートナーは、リゾホスファチジン酸レセプター２（ＬＰＡ２）である。
【００２１】
本発明のこれらの及び他の目的は、以下のパラグラフに記載される。これらの目的は、本発明の範囲を狭くするものとみなすべきでない。
【００２２】
本発明をより良く理解するために、以下の図面に示される実施形態を参照しうる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本技術の模範的実施形態に係るフローチャートを示す。
【図２−１】図２Ａ及び２Ｂは、本技術の模範的実施形態に係るフローチャートを示す。
【図２−２】図２Ａ及び２Ｂは、本技術の模範的実施形態に係るフローチャートを示す。
【図３】図３は、本技術の模範的実施形態に係るフローチャートを示す。
【図４−１】図４は、模範的計算タンパク質設計法の模式図である。
【図４−２】図４は、模範的計算タンパク質設計法の模式図である。
【図５】図５は、模範的標的構造ｍＣｈｅｒｒｙの全表面再設計を示す。左側パネルは、設計の変動が許容された６４表面位置を灰色球として示す。中間パネル及び右側パネルは、真空静電位を疑似色で表してそれぞれ元のｍＣｈｅｒｒｙ及び再設計変異体の表面を示す。
【図６】図６は、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質のサイズ排除クロマトグラムを示す。トップパネルは、野生型ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＬＯＶ２融合タンパク質（後者はＷａｎｇら（２）により記載される）を含有する標準のクロマトグラムを示す。ボトムパネルは、野生型と同一の体積近くに溶出することを示す単独再設計ｍＣｈｅｒｒｙ変異体のクロマトグラムを示す。標準に基づいて、ダイマータンパク質は、点線で表される体積で溶出すると予想されるので、設計オリゴマー化の可能性は排除される。そのため、サイズ排除クロマトグラフィーは、設計ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質が溶液中でモノマーであることを示す。
【図７】図７は、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の吸収スペクトルを示す。トップパネルは、野生型及び再設計ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の吸収スペクトル（それぞれ左側及び右側のＹ軸に吸光度値が示される）を比較して両者が類似のスペクトル形状を呈することを示す。ボトムパネルは、等価タンパク質濃度で測定された両タンパク質の蛍光スペクトルを比較する。再設計ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質は、フルオロフォアの光の性質を保存する。
【図８】図８は、ｍＣｈｅｒｒｙ及び模範的設計変異体の化学変性を示す。フォールド度は、５８７ｎｍのクロモフォア吸光度によりモニターした。クロモフォアは、水に暴露されると迅速に加水分解するので、これは感度の良い構造メトリックを構成する。データはヒル式に当てはめられ、半変性濃度が凡例に記される。
【図９】図９は、β１アドレナリン作動性レセプターＧＰＣＲ（ＰＤＢエントリー４ＢＶＮ）の結晶構造を示し、細胞外境界及び細胞質膜境界の近似位置が赤線及び青線で表される（左側パネル）。中間パネル及び右側パネルは、それぞれ野生型ＧＰＣＲ及びその再設計カウンターパートの真空中の静電表面電位を示す（同一配向で）。
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｂａｋｅｒらが設計研究で標的とした４つの異なるトポロジーを例示する（３）。図１０Ｅ〜１０Ｆは、本明細書に記載の模範的設計法を用いて計算されたＸ軸上の各設計の長さを規格化したスコア（そのそれぞれの骨格について）と、Ｙ軸上の各配列の実験的導出安定性スコアと、の相関を示す。散布プロットの点の色はデータ密度を表し、赤色は最高密度を表し、且つ青色は最低密度を表す。平均曲線は、スコアの１０進行ウィンドウの安定性スコアを平均することにより得られた丸と共に黒線で示される。図１０Ｉ〜１０Ｌは、それぞれ図１０Ｅ〜１０Ｆの場合と同一のプロットを示すが、ロゼッタ法を用いて計算されたスコアをＸ軸上に示す。いずれの場合も、本明細書に開示される模範的設計法を用いて計算されたスコアが呈する相関は、ロゼッタを用いて計算されたスコアの場合を有意に凌駕する。事実上、ロゼッタでは４つの場合のうち３つで、相関は、誤った兆候であるか又は統計的に有意でないかのどちらかである（「Ｘ」で表されるパネル）。一方、本明細書に開示される模範的設計法では、相関は、常に適正な兆候であり且つ統計的にかなり有意である（黒色チェックマークで表される）。そのため、本明細書に開示されるＴＥＲＭベース法により計算された統計エネルギーは、設計品質を表す。
【図１０−２】図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｂａｋｅｒらが設計研究で標的とした４つの異なるトポロジーを例示する（３）。図１０Ｅ〜１０Ｆは、本明細書に記載の模範的設計法を用いて計算されたＸ軸上の各設計の長さを規格化したスコア（そのそれぞれの骨格について）と、Ｙ軸上の各配列の実験的導出安定性スコアと、の相関を示す。散布プロットの点の色はデータ密度を表し、赤色は最高密度を表し、且つ青色は最低密度を表す。平均曲線は、スコアの１０進行ウィンドウの安定性スコアを平均することにより得られた丸と共に黒線で示される。図１０Ｉ〜１０Ｌは、それぞれ図１０Ｅ〜１０Ｆの場合と同一のプロットを示すが、ロゼッタ法を用いて計算されたスコアをＸ軸上に示す。いずれの場合も、本明細書に開示される模範的設計法を用いて計算されたスコアが呈する相関は、ロゼッタを用いて計算されたスコアの場合を有意に凌駕する。事実上、ロゼッタでは４つの場合のうち３つで、相関は、誤った兆候であるか又は統計的に有意でないかのどちらかである（「Ｘ」で表されるパネル）。一方、本明細書に開示される模範的設計法では、相関は、常に適正な兆候であり且つ統計的にかなり有意である（黒色チェックマークで表される）。そのため、本明細書に開示されるＴＥＲＭベース法により計算された統計エネルギーは、設計品質を表す。
【図１０−３】図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｂａｋｅｒらが設計研究で標的とした４つの異なるトポロジーを例示する（３）。図１０Ｅ〜１０Ｆは、本明細書に記載の模範的設計法を用いて計算されたＸ軸上の各設計の長さを規格化したスコア（そのそれぞれの骨格について）と、Ｙ軸上の各配列の実験的導出安定性スコアと、の相関を示す。散布プロットの点の色はデータ密度を表し、赤色は最高密度を表し、且つ青色は最低密度を表す。平均曲線は、スコアの１０進行ウィンドウの安定性スコアを平均することにより得られた丸と共に黒線で示される。図１０Ｉ〜１０Ｌは、それぞれ図１０Ｅ〜１０Ｆの場合と同一のプロットを示すが、ロゼッタ法を用いて計算されたスコアをＸ軸上に示す。いずれの場合も、本明細書に開示される模範的設計法を用いて計算されたスコアが呈する相関は、ロゼッタを用いて計算されたスコアの場合を有意に凌駕する。事実上、ロゼッタでは４つの場合のうち３つで、相関は、誤った兆候であるか又は統計的に有意でないかのどちらかである（「Ｘ」で表されるパネル）。一方、本明細書に開示される模範的設計法では、相関は、常に適正な兆候であり且つ統計的にかなり有意である（黒色チェックマークで表される）。そのため、本明細書に開示されるＴＥＲＭベース法により計算された統計エネルギーは、設計品質を表す。
【図１０−４】図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｂａｋｅｒらが設計研究で標的とした４つの異なるトポロジーを例示する（３）。図１０Ｅ〜１０Ｆは、本明細書に記載の模範的設計法を用いて計算されたＸ軸上の各設計の長さを規格化したスコア（そのそれぞれの骨格について）と、Ｙ軸上の各配列の実験的導出安定性スコアと、の相関を示す。散布プロットの点の色はデータ密度を表し、赤色は最高密度を表し、且つ青色は最低密度を表す。平均曲線は、スコアの１０進行ウィンドウの安定性スコアを平均することにより得られた丸と共に黒線で示される。図１０Ｉ〜１０Ｌは、それぞれ図１０Ｅ〜１０Ｆの場合と同一のプロットを示すが、ロゼッタ法を用いて計算されたスコアをＸ軸上に示す。いずれの場合も、本明細書に開示される模範的設計法を用いて計算されたスコアが呈する相関は、ロゼッタを用いて計算されたスコアの場合を有意に凌駕する。事実上、ロゼッタでは４つの場合のうち３つで、相関は、誤った兆候であるか又は統計的に有意でないかのどちらかである（「Ｘ」で表されるパネル）。一方、本明細書に開示される模範的設計法では、相関は、常に適正な兆候であり且つ統計的にかなり有意である（黒色チェックマークで表される）。そのため、本明細書に開示されるＴＥＲＭベース法により計算された統計エネルギーは、設計品質を表す。
【図１０−５】図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｂａｋｅｒらが設計研究で標的とした４つの異なるトポロジーを例示する（３）。図１０Ｅ〜１０Ｆは、本明細書に記載の模範的設計法を用いて計算されたＸ軸上の各設計の長さを規格化したスコア（そのそれぞれの骨格について）と、Ｙ軸上の各配列の実験的導出安定性スコアと、の相関を示す。散布プロットの点の色はデータ密度を表し、赤色は最高密度を表し、且つ青色は最低密度を表す。平均曲線は、スコアの１０進行ウィンドウの安定性スコアを平均することにより得られた丸と共に黒線で示される。図１０Ｉ〜１０Ｌは、それぞれ図１０Ｅ〜１０Ｆの場合と同一のプロットを示すが、ロゼッタ法を用いて計算されたスコアをＸ軸上に示す。いずれの場合も、本明細書に開示される模範的設計法を用いて計算されたスコアが呈する相関は、ロゼッタを用いて計算されたスコアの場合を有意に凌駕する。事実上、ロゼッタでは４つの場合のうち３つで、相関は、誤った兆候であるか又は統計的に有意でないかのどちらかである（「Ｘ」で表されるパネル）。一方、本明細書に開示される模範的設計法では、相関は、常に適正な兆候であり且つ統計的にかなり有意である（黒色チェックマークで表される）。そのため、本明細書に開示されるＴＥＲＭベース法により計算された統計エネルギーは、設計品質を表す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、それぞれ、ヒトＰｉｎ１ＷＷドメインの変異体（ＰＤＢエントリー２ＺＱＴを用いてモデリングした）、ヒトＹｅｓ関連タンパク質６５ＷＷドメインの変異体（ＰＤＢエントリー４ＲＥＸを用いてモデリングした）、ビリンヘッドピースヘリカルサブドメインの変異体（残基４２〜７６、ＰＤＢエントリー１ＶＩＩを用いてモデリングした）、及び周辺サブユニット結合ドメインファミリーメンバーＢＢＬの変異体（モデリングされたＰＤＢエントリー２ＷＸＣ）に対応する。各データ点は、単一配列変異体に対応し、その熱力学的安定性が本明細書に記載の模範的設計法を用いて計算されたそのスコアに対してプロットされる。熱力学的安定性は、図１１Ａ、１１Ｃ、及び１１Ｄではアンフォールディングの自由エネルギーにより表され、且つ図１１Ｂでは明白な融解温度により表される。最良当てはめ線は、二重平方加重関数によるロバスト線形回帰を用いて生成される。ピアソン相関は、各パネルのタイトルに示される。テューキーフェンスアプローチを用いて同定された外れ値の点は、赤色輪郭で記され相関係数の計算に含まれない。そのため、本明細書に開示されるＴＥＲＭベース法により計算されたスコアは、熱力学的安定性と相関する。
【図１２】図１２は、新規なＰＤＺ結合モードを設計する手順を示す。すべてのパネルで、Ｎ２Ｐ２は緑色で示され、且つ結合ペプチド（ＰＤＢエントリー２ＨＥ４由来）は黒色で示される。図１２Ａは、完成ＴＥＲＭ（シアン色スティック）を示し、一方のセグメントは結合ペプチドにオーバーラップし、且つ他方のセグメントは結合ポケットの外側でＮ２Ｐ２表面領域との接触（赤色で記された接触位置）を形成する。図１２Ｂは、ライブラリーの他のＴＥＲＭを用いて完成ＴＥＲＭと元の結合ペプチドとを結合する複数の手段を示す。図１２Ｃは、設計配列と共に最終骨格テンプレートを示す。
【図１３】図１３は、Ｎ２Ｐ２（左側）及びＭ３Ｐ６（右側）に対する設計ペプチドのＦＰベース阻害アッセイによるプロットを示す。阻害定数はプロット上に示される。
【図１４】図１４Ａは、Ｒｏｃｋｌｉｎら（３）により標的とされたｄｅ  ｎｏｖｏ設計構造の骨格を示す。図１４Ｂは、この骨格に対して本明細書に開示される模範的設計法を用いて設計された配列の構造モデルを示す（配列はボトムに示される）。全４０位置は、いずれかの天然アミノ酸を取り入れることが許容された。図１４Ｃは、標的骨格（緑色）とＢａｋｅｒらによる対応する設計の実験的決定構造（シアン色）（３）との重ね合わせを示す。この構造（ＰＤＢコード５ＵＰ５）は、構造予測法ＨＨＰｒｅｄ（４）により生成された設計配列のトップヒットである。２番ヒットはＰＤＢエントリー１ＵＴＡであり、その関連部分（シアン色）は、標的骨格（緑色）上に重ね合わせて図１４Ｄに示される）。そのため、本明細書に開示される模範的設計法は、ｄｅ  ｎｏｖｏ発生構造の設計に適用可能である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本詳細な説明は、特定使用の要件に最適となりうるように当業者が本発明をその多くの形態で適合させ適用しうるように、本発明、その原理、及びその実用的適用を当業者に熟知してもらうことを意図するにすぎない。本説明及びその具体例は、例示目的のみを意図するにすぎない。したがって、本発明は、本特許出願に記載の実施形態に限定されるものではなく、各種変更を行いうる。
【００２５】
少なくとも一態様では、本開示は、アミノ酸配列の設計法を提供する。本方法は、標的構造の３次構造モチーフ又は４次構造モチーフなどの適切に定義された構造モチーフ（すなわち、１つ以上のディスジョイント骨格セグメントを含む、構造から切り出された骨格フラグメント）への構造マッチから少なくとも１つの非局所擬エネルギー寄与の値を推測することを含む。ある特定の実施形態では、設計アミノ酸配列は、標的構造の結合パートナーにフォールドするタンパク質である。
【００２６】
ある特定の実施形態では、非局所擬エネルギー寄与は、自己骨格寄与、近傍骨格寄与、対寄与、及び／又はトリプレット（若しくは高次）寄与である。
【００２７】
ある特定の実施形態では、非局所擬エネルギー寄与の値は、構造マッチの配列統計から推測される。好ましい実施形態では、構造マッチ内の配列統計は、構造モチーフ内に含有されるアミノ酸位置により駆動される（たとえば、アミノ酸対は、対応する位置対が構造モチーフ内に含有される場合に限り配列統計に影響を及ぼす）。
【００２８】
ある特定の実施形態では、構造マッチは、構造データベースを検索することにより得られる。いくつかのかかる実施形態では、構造データベースは、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）である。他のかかる実施形態では、構造データベースは、たとえば膜貫通タンパク質のみを含有する専用データベースである。
【００２９】
ある特定の実施形態では、標的構造は複数の構造モチーフに分解される。いくつかのかかる実施形態では、標的構造はタンパク質であり、且つ構造モチーフは２次及び３次構造モチーフを含む。いくつかのかかる実施形態では、標的構造はタンパク質複合体であり、且つ構造モチーフは２次、３次、及び／又は４次構造モチーフを含む。ある特定の実施形態では、標的構造の所与の残基ｉに対する構造モチーフは、自己骨格（たとえば、残基ｉ−２〜ｉ＋２）及び近傍骨格（たとえば、ｉが接触を形成可能な全残基を取り囲む骨格）を含む。
【００３０】
ある特定の実施形態では、本方法は、構造マッチから少なくとも１つの局所擬エネルギー寄与の値を推測することをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、局所擬エネルギー寄与は、所与のアミノ酸残基ｉの二面角及び／又は埋没状態からの寄与である。そのため、ある特定の実施形態では、本方法は、非局所擬エネルギー寄与及び局所擬エネルギー寄与の各々の値のセットを推測することを含む。いくつかのかかる実施形態では、擬エネルギー寄与は、階層：（１）局所擬エネルギー寄与及び（２）非局所擬エネルギー寄与に従って推測される。たとえば、階層は、（ｉ）構造マッチ内の単一アミノ酸残基（たとえば、所与の残基ｉ）について少なくとも１つの局所擬エネルギー寄与、（ｉｉ）単一アミノ酸残基を取り囲む骨格のコンティグストレッチ（たとえば、（ｉ−ｎ）〜（ｉ＋ｎ）、ただし、ｉは所与の位置であり、且つｎは制御可能パラメーターである）、（ｉｉｉ）単一アミノ酸残基に配列近接ではなく空間近接する骨格（たとえば、ｉが接触を形成可能な全残基を取り囲む骨格）、及び／又は（ｉｖ）単一設計位置を含む結合残基対、の少なくとも２つを含みうる。他の例として、階層は、（ｉ）標的構造の特定設計位置のアミノ酸の骨格二面角、たとえば、φ角、ψ角、及び／又はω角、（ｉｉ）特定設計位置のアミノ酸の埋没状態、（ｉｉｉ）単一アミノ酸残基を取り囲む骨格のコンティグストレッチ、（ｉｖ）設計位置に配列近接ではなく空間近接する骨格、及び／又は（ｖ）設計位置のアミノ酸を含む結合残基対、からの擬エネルギー寄与を含みうる。高次寄与を後で階層に含めることにより、かかる寄与は、低次寄与によりすでに記載されるものを凌駕する（必要な範囲内でのみ）補正子としてのみ使用される。こうして、擬エネルギー寄与は階層で考慮され、前のものによりまだキャプチャーされていないものを記述するためにのみ各次のタイプの寄与が導入される。ある特定の実施形態では、階層中の最初の寄与は、統計ノイズに比較的影響されずに最高信頼度効果が最初にキャプチャーされるように最強配列統計に関連するものであるので、局所寄与及び非局所寄与の階層的考慮は有益である。
【００３１】
好ましい実施形態では、高次擬エネルギー寄与は必要なときのみ考慮される（すなわち、両者が観測を等しく記載する場合、低次擬エネルギー寄与のみを含むモデルは、高次寄与をも含むものよりも好ましい）。いくつかのかかる実施形態では、高次擬エネルギー寄与は、低次寄与に対する補正子として作用する。たとえば、対エネルギーは、自己寄与で満足に記載されない配列統計の態様を記述するためにのみ必要とされる。
【００３２】
本明細書に開示される各種態様では、構造モチーフとくに３次及び／又は４次構造モチーフに基づくタンパク質設計は、標的構造のフリーズ骨格コンフィギュレーションだけでなく近似コンフィギュレーションのアンサンブルにも適合可能なアミノ酸配列、すなわち、タンパク質構造状態の適切な表現の選択を可能にする。
【００３３】
Ａ．計算タンパク質設計
図１は、たとえば標的構造の結合パートナーにフォールドするタンパク質などのアミノ酸配列の設計法１００のフロー図を示す。ボックス１０２に示されるように、標的構造は、複数の２次、３次、又は４次構造モチーフに分解される。かかる分解は、（ｉ）標的構造の結合残基及び／又は（ｉｉ）標的構造の残基−骨格作用のグラフ表現によりガイドしうる。たとえば、各２次、３次、又は４次構造モチーフは、標的構造の結合残基を表すグラフの結合サブグラフを表す１アミノ酸残基以上のセットを取り囲んで形成される。ある特定の実施形態では、標的構造は、標的構造の記述に必要なわずかな３次（又は４次）構造モチーフに分解される。
【００３４】
ボックス１０４に示されるように、３次（又は４次）構造モチーフが同定されたら、構造マッチを同定するために構造データベースが検索される。構造データベースは、たとえば全ＰＤＢ又はＰＤＢのフィルタードサブセットでありうる。構造データベースは、たとえばローカル及び／又はリモートメモリーに記憶しうる。構造データベースに記憶されたデータは、いずれかの好適なフォーマットでありうる。ある特定の実施形態では、構造データベースを検索するためにＭＡＳＴＥＲなどの検索エンジンが利用される。ある特定の実施形態では、検索エンジンは、２次、３次（又は４次）構造モチーフをクエリーとして取り込んで、所与の根平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）閾値内でクエリーにマッチする断片のすべてを構造データベースから返す。構造マッチを含有する結果セットは、ＲＭＳＤの増加などにより順序付けうる。
【００３５】
ボックス１０６では、局所擬エネルギー寄与が推測される。局所擬エネルギー寄与は、標的中の所与の位置の単一アミノ酸の骨格二面角（すなわち、φ角、ψ角、若しくはω角）又は所与の目標位置の単一アミノ酸の埋没状態に関連しうる。局所擬エネルギー寄与は、ＰＤＢ内の対応する構造環境の配列統計から推測しうる。
【００３６】
ボックス１０８では、非局所擬エネルギー寄与が推測される。非局所擬エネルギー寄与は、単一設計位置を取り囲む骨格のコンティグストレッチ、単一設計位置に配列近接ではなく空間近接する骨格、及び／又は単一設計位置を含む結合残基対に関連しうる。非局所擬エネルギー寄与は、適切に構築されたＴＥＲＭへの構造マッチの配列統計から推測しうる。
【００３７】
ボックス１１０では、最適アミノ酸配列又はアミノ酸配列のセットが選択されている。最適アミノ酸配列又はアミノ酸配列のセットを選択するために、さまざまな最適化法を使用可能である。たとえば、設計問題への拘束の導入を可能にする整数線形プログラミング（ＩＬＰ）アプローチを使用しうる（たとえば、配列対称性の拘束、荷電／極性残基の数の拘束、又はいくつかの出発配列と比べて突然変異した残基の制限など）。他の例として、自己無撞着平均場（ＳＣＭＦ）又はビリーフプロパゲーション（ＢＰ）の技術を使用しうる。さらに他の例として、シミュレーテッドアニーリングモンテカルロ（ＭＣ）を使用しうる。
【００３８】
図２Ａは、構造マッチの配列統計及び環境から擬エネルギー寄与を推測する方法２００のフロー図を示す。
【００３９】
ボックス２０２では、局所擬エネルギー寄与が推測される。局所擬エネルギー寄与は、構造マッチ内の単一設計位置の骨格角度、たとえば、φ角、ψ角、及び／若しくはω角、並びに／又は単一設計位置の埋没状態に由来しうる。局所擬エネルギー寄与は、構造マッチの配列統計から推測しうる。
【００４０】
ボックス２０４では、少なくとも１つの非局所擬エネルギー寄与が推測される。たとえば、少なくとも１つの非局所擬エネルギー寄与は、単一設計位置を取り囲む骨格のコンティグストレッチに由来しうる。
【００４１】
後続の非局所擬エネルギー寄与は、ブロック２０４により示されるように推測しうる。後続の非局所擬エネルギー寄与は、たとえば、単一設計位置に配列近接ではなく空間近接する骨格、単一設計位置を含む結合残基対、及び／又は単一設計位置を含む残基トリプレットでありうる。
【００４２】
最適アミノ酸配列又はアミノ酸配列のセットは、ブロック２０８により示されるように選択される。最適アミノ酸配列又はアミノ酸配列のセットを選択するために、さまざまな最適化法、たとえば、限定されるものではないが以上に記載したＩＬＰ、ＳＣＭＦ、ＢＰ、又はＭＣのアプローチを使用可能である。
【００４３】
ある特定の実施形態では、たとえば図２Ａに示される実施形態では、複数の非局所擬エネルギー寄与がブロック２０４により示されるように推測される。たとえば、複数の非局所擬エネルギー寄与は、（ｉ）単一設計位置を取り囲む骨格のコンティグストレッチ、（ｉｉ）単一設計位置に配列近接ではなく空間近接する骨格、（ｉｉｉ）単一設計位置を含む結合残基対、及び／又は（ｉｖ）単一設計位置を含む残基トリプレットに由来しうる。いくつかのかかる実施形態では、上述した寄与（ｉ）〜（ｉｖ）の各々は特定順序で計算される。しかしながら、かかる実施形態では、後続の寄与は、すでに説明及び観測されたものとの差のみを説明しなければならない。そのため、階層中の後続の寄与は、おそらく徐々に小さくなりうるとともに、記述すべきものが多く残されていない場合には有意性のないものに近づくことさえもありうる。たとえば、後続の寄与は、最終にはゼロ又は実質的にゼロになりうるとともに、その場合にはほとんど計算されなかったようになる。
【００４４】
図２Ｂは、構造マッチの配列統計及び環境から擬エネルギー寄与を推測する方法２００のフロー図を示す。
【００４５】
ボックス２０２では、局所擬エネルギー寄与が推測される。局所擬エネルギー寄与は、構造マッチ内の単一設計位置の骨格角度、たとえば、φ角、ψ角、及び／若しくはω角、並びに／又は単一設計位置の埋没状態に由来しうる。局所擬エネルギー寄与は、構造マッチの配列統計から推測しうる。
【００４６】
ボックス２０４では、第１の非局所擬エネルギー寄与が推測される。たとえば、第１の非局所擬エネルギー寄与は、単一設計位置を取り囲む骨格のコンティグストレッチに由来しうる。
【００４７】
決定ダイヤモンド２０６により示されるように、代替応答は、いずれかの位置優先度が未解明のままであるかに依存して現れる。位置優先度が未解明の場合、ブロック２０４により示されるように後続の非局所擬エネルギー寄与が推測される。後続の非局所擬エネルギー寄与は、たとえば、単一設計位置に配列近接ではなく空間近接する骨格、単一設計位置を含む結合残基対、及び／又は単一設計位置を含む残基トリプレットでありうる。位置優先度が未解明のままでない場合、ブロック２０８により示されるように最適アミノ酸配列又はアミノ酸配列のセットが選択される。最適アミノ酸配列又はアミノ酸配列のセットを選択するために、さまざまな最適化法、たとえば、限定されるものではないが以上に記載したＩＬＰ、ＳＣＭＦ、ＢＰ、又はＭＣのアプローチを使用可能である。
【００４８】
図３は、構造マッチの配列統計及びマッチング環境から擬エネルギー寄与を推測する方法３００のフロー図を示す。
【００４９】
ボックス３０２では、局所擬エネルギー寄与が推測される。局所擬エネルギー寄与は、構造マッチ内の単一設計位置の骨格角度、たとえば、φ角、ψ角、及び／若しくはω角、並びに／又は単一設計位置の埋没状態に由来しうる。局所擬エネルギー寄与は、構造マッチの配列統計から推測しうる。ボックス３０４では、単一設計位置を取り囲む骨格のコンティグストレッチから非局所擬エネルギー寄与が推測される（すなわち自己骨格寄与）。ボックス３０６、単一設計位置に配列近接ではなく空間近接する骨格から非局所擬エネルギー寄与が推測される（すなわち近傍骨格寄与）。ボックス３０８では、単一設計位置を含む結合残基対から非局所擬エネルギー寄与が推測される（すなわち結合対寄与）。ボックス３１０では、単一設計位置を含む残基トリプレットから非局所擬エネルギー寄与（すなわちトリプレット又は他の高次の寄与）が任意選択的に推測される。
【００５０】
こうして、擬エネルギー寄与は階層で推測され、前のものによりまだキャプチャーされていないものを記述するためにのみ各次のタイプの寄与が導入される。
【００５１】
図４は、３次／４次構造モチーフに基づく模範的計算タンパク質設計法の模式図を示す。図４に示されるように、標的構造は、（ａ）グラフＧとして示されるその結合残基及び（ｂ）グラフＢとして示される残基−骨格作用のグラフ表現によりガイドされて、２次／３次／４次構造モチーフに分解しうる。各構造モチーフへの構造マッチは、構造データベースから同定しうる。標的構造中の配列−構造関係を支配する擬エネルギー寄与の値を導出するために、構造マッチにより示唆される配列アライメントを使用しうる。擬エネルギー寄与の値が与えられれば、コンビナトリアル最適化を用いて最適アミノ酸配列又は最適アミノ酸配列のライブラリーを生成しうる。
【００５２】
ある特定の実施形態では、図１〜４との関連で記載されるアクティビティーの少なくとも一部分は、１つ以上の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、ディスクリートロジックを介して、及び／又は１つ以上のサーバー若しくはコンピューター、たとえば、プロセッサーとメモリーとを有するコンピューティングデバイスにより実行可能ソフトウェアを用いて、実現しうる。プロセッサーは、いずれかのカスタムメイド又は市販のプロセッサー、たとえば、Ｉｎｔｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＣｏｒｅシリーズ、ｖＰｒｏ、Ｘｅｏｎ、若しくはＩｔａｎｉｕｍプロセッサー、又はＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．製のＰｈｅｎｏｍ、Ａｔｈｌｏｎ、Ｓｅｍｐｒｏｎ、若しくはＯｐｔｅｒｏｎシリーズプロセッサーなどでありうる。プロセッサーはまた、ユニゾンで動作する複数の並列又は分散プロセッサーを相当しうる。
【００５３】
メモリー中のソフトウェアは、１つ以上の個別のプログラム又はアプリケーションを含みうる。プログラムは、論理機能を実現するための実行可能命令の順序付けられたリストを有しうる。ソフトウェアは、サーバー又はコンピューターの好適なオペレーティングシステム、たとえば、Ａｐｐｌｅ，Ｉｎｃ．製のｍａｃＯＳ、ＯＳＸ、ＭａｃＯＳＸ、及びｉＯＳ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＷｉｎｄｏｗｓ、ＷｉｎｄｏｗｓＰｈｏｎｅ、及びＷｉｎｄｏｗｓ１０Ｍｏｂｉｌｅ、Ｕｎｉｘオペレーティングシステム、Ｕｎｉｘデリバティブ（たとえば、ＢＳＤ又はＬｉｎｕｘ）、並びにＧｏｏｇｌｅ，Ｉｎｃ．製のＡｎｄｒｏｉｄを含みうる。オペレーティングシステムは、他のコンピュータープログラムの実行を本質的に制御し、スケジューリング、入出力制御、ファイル・データ管理、メモリー管理、及び通信制御、並びに関連サービスを提供する。
【００５４】
一般的には、本実施形態に係るコンピュータープログラム製品又はコンピューター可読記憶媒体は、コンピューター可読プログラムコードを内蔵するコンピューター使用可能記憶媒体（たとえば、標準的ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、光ディスク、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）ドライブなど）を含み、コンピューター可読プログラムコードは、以下に記載の方法を実現するプロセッサー（たとえば、オペレーティングシステムに接続して動作するもの）により実行されるように適合化される。これに関連して、プログラムコードは、いずれかの所望の言語で実現しうるとともに、マシンコード、アセンブリーコード、バイトコード、解釈可能ソースコードなど（たとえば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ、Ａｃｔｉｏｎｓｃｒｉｐｔ、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ−Ｃ、Ｊａｖａｓｃｒｉｐｔ、ＣＳＳ、ＸＭＬ、及び／又はその他を介して）として実現しうる。
【００５５】
メモリーは、揮発性メモリーエレメント（たとえば、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ、たとえば、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＳＤＲＡＭなど））及び不揮発性メモリーエレメント（たとえば、ＲＯＭ、ハードドライブ、フラッシュドライブ、ＣＤＲＯＭなど）のいずれか１つ又はそれらの組合せを含みうる。それは電子型、磁気型、光学型、及び／又は他の型の記憶媒体を組み込みうる。メモリーは、各種コンポーネントが互いに離れて位置するがそれでもなおプロセッサーによりにアクセスされる分散アーキテクチャーを有しうる。こうした他のコンポーネントは、ネットワーク上の他のどこかに位置するデバイス上に又はクラウド配置で常駐しうる。
【００５６】
サーバー又はコンピューターは、たとえば、ネットワークを介してデータを送信したり受信したりするトランシーバーを含みうる。トランシーバーは、無線接続及び／又は有線（たとえばＥｔｈｅｒｎｅｔ）接続を介してデータを受信したり伝送したりするように適合化しうる。トランシーバーは、ＩＥＥＥ８０２．１１規格又は他の規格に準拠して機能しうる。より特定的には、トランシーバーは、サーバー又はコンピューターを追加のデバイス又はコンポーネントに通信接続するために１つ以上のセルサイト又はベースステーションを含むワイドエリアネットワークで通信するように構成されたＷＷＡＮトランシーバーでありうる。さらに、トランシーバーは、サーバー又はコンピューターをローカルエリアネットワーク及び／又はパーソナルエリアネットワークたとえばＢｌｕｅｔｏｏｔｈネットワークに接続するように構成されたＷＬＡＮ及び／又はＷＰＡＮトランシーバーでありうる。
【００５７】
Ａ１．標的構造の分解及び構造マッチの同定
少なくとも一態様では、本開示は、計算タンパク質設計法を提供する。本方法は、標的構造を複数の構造モチーフに分解することを含む。ある特定の実施形態では、標的構造はタンパク質の３次構造である。ある特定の実施形態では、標的構造はタンパク質複合体の４次構造である。
【００５８】
ある特定の実施形態では、複数の構造モチーフは、標的構造中の各残基及び各結合残基対をカバーする。たとえば、すべての残基及びすべての結合残基対は、複数の構造モチーフ中の少なくとも１つの構造モチーフによりカバーしうる。
【００５９】
ある特定の実施形態では、標的構造を複数の構造モチーフに分解する工程は、標的構造中の結合残基を同定することを含む。かかる結合残基は、直接的又は間接的な物理的相互作用を介して又は実験的証拠を介して互いに影響を及ぼすアミノ酸をホスト可能な位置対を見いだすことにより標的構造中で同定しうる。いくつかの実施形態では、所与の構造内の結合残基を同定するために接触度が使用される。
【００６０】
たとえば、所与の位置対ｉ及びｊが接触を形成可能であるかを決定する一方法は、最初に、骨格と衝突しない両位置のすべての可能な回転異性体（すべてのアミノ酸の）を見いだし、次いで、密に接近する非水素原子を有するｉ及びｊで回転異性体の組合せの加重分率すなわち接触度を計算する。
【００６１】
接触度を計算する模範式は以下の通りである。
【００６２】
【数１】
2021525917.tif 000003
【００６３】
式中、Ｒｉ（ａ）は、位置ｉのアミノ酸ａの側鎖回転異性体のセットであり（骨格と衝突する回転異性体の廃棄後）、Ｉｉｊ（ｒｉ、ｒｊ）は、両回転異性体ｒｉ及びｒｊが互いの存在に強く影響を及ぼす可能性があるか（３Å以内の非水素原子対を有するか）の指標となるバイナリー変数であり、Ｐｒ（ａ）は、構造データベース中のアミノ酸ａの頻度であり、且つｐ（ｒｉ）は、回転異性体ｒｉの確率である。回転異性体及びその確率は、いずれかの骨格ライブラリーから採用可能である。たとえば、Ｄｕｎｂｒａｃｋらは骨格依存ライブラリーを開発した（Ｓｈａｐｏｖａｌｏｖ  ＭＶ  ＆  Ｄｕｎｂｒａｃｋ  ＲＬ，Ｊｒ．（２０１１）Ａ  ｓｍｏｏｔｈｅｄ  ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｏｔａｍｅｒ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｋｅｒｎｅｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １９（６）：８４４−８５８）。構築によって値ｃ（ｉ、ｊ）は０〜１で変動し、大きな数は、より平衡を保って互いに影響を及ぼす位置対に対応する。
【００６４】
ある特定の実施形態では、設計計算の目的で位置対が結合されているとみなすべきであることを同定するために接触度カットオフが使用される。たとえば、接触度カットオフは、約０．０１〜約０．２又は代替的に約０．０１〜０．１又は代替的に約０．０１〜０．０５でありうる。いくつかのかかる実施形態では、接触度カットオフは約０．０１である。他のかかる実施形態では、接触度カットオフは約０．０５である。
【００６５】
ある特定の実施形態では、標的構造を複数の構造モチーフに分解する工程は、（ｉ）標的構造の結合残基及び／又は（ｉｉ）標的構造の残基−骨格作用のグラフ表現によりガイドされる。模範的グラフＧ及びＢは図４に示される。グラフＧでは、ノードは残基を表し、且つエッジは結合を示し、そしてエッジ加重は任意選択的に結合の強度を表す。グラフＢでは、ノードは残基を表し、且つ有向エッジａ→ｂは、ｂの骨格がａのアミノ酸選択に影響を及ぼしうることを示す。
【００６６】
ある特定の実施形態では、（ｉ）標的構造の結合残基及び／又は（ｉｉ）標的構造の残基−骨格作用のグラフ表現から導出されるサブグラフは、構造モチーフを同定する。いくつかのかかる実施形態では、複数の構造モチーフ中の各構造モチーフは、結合残基のグラフ表現の結合サブグラフを表す１残基以上のセットを取り囲んで形成される。
【００６７】
ある特定の実施形態では、２次構造モチーフは、残基（ｉ−ｎ）〜（ｉ＋ｎ）（ただし、ｎは制御可能パラメーターである）を含むように所与の残基ｉを取り囲んで定義され、我々はこれをｉのシングルトンモチーフと呼ぶ。たとえば、ｎは１〜１０、たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０でありうる。いくつかのかかる実施形態では、ｎは１である。他のかかる実施形態では、ｎは２である。
【００６８】
ある特定の実施形態では、３次又は４次構造モチーフは、所与の残基ｉを取り囲んで、より好ましくは残基ｉの局所骨格（たとえば、（ｉ−ｎ）〜（ｉ＋ｎ）、ただし、ｉは所与の位置であり、且つｎは制御可能パラメーターである）を取り囲んで定義される。たとえば、構造モチーフを同定するプロセスは、孤立した残基ｉ（たとえば１ノードサブグラフ）を含みうるとともに、残基ｉが有向エッジを有するいくつかの又はすべてのノード（グラフＢに関して、かかるセットはβ（ｉ）と呼びうる）を考慮しうる。
【００６９】
ある特定の実施形態では、構造モチーフは、標的構造の結合残基のグラフ表現（たとえばグラフＧ）で各エッジに対して定義される。いくつかのかかる実施形態では、構造モチーフは、対をなすさらには関連するシングルトンモチーフの各残基を含む。
【００７０】
少なくとも一態様では、本開示は、計算タンパク質設計法を提供する。本方法は、構造データベースで複数の構造モチーフの各々に対する複数の構造マッチを同定することを含む。
【００７１】
ある特定の実施形態では、構造データベースはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）である。他のかかる実施形態では、構造データベースは、たとえば膜貫通タンパク質などのある特定のタンパク質のみを含有する専用データベースである。
【００７２】
いくつかのかかる実施形態では、高品質フィルターが構造データベースに適用される。たとえば、高品質フィルターは、高品質構造データのみを検索に利用可能であることを保証しうる。模範的高品質フィルターは、特定分解能たとえば２．６Å又はそれよりも良好な分解能でＸ線結晶解析により解明されたエントリーのみを利用可能にする。いくつかのかかる実施形態では、冗長性フィルターが構造データベースに適用される。たとえば、冗長性フィルターは、不要な繰返しを除去してデータベース検索の計算時間を節約しうる。模範的冗長性フィルターは、過度に冗長な生物学的ユニット、たとえば、すでに含まれる生物学的ユニットに対する特定配列（％）アイデンティティーを有するものを除去する。特定配列（％）アイデンティティーは、たとえば、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、又は＞９０％でありうる。
【００７３】
ある特定の実施形態では、複数の構造マッチは、構造データベースを検索することにより得られる。構造データベースを検索する模範的検索エンジンＭＡＳＴＥＲは、Ｚｈｏｕ  Ｊ  ＆  Ｇｒｉｇｏｒｙａｎ  Ｇ（２０１４）Ｒａｐｉｄ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４（４）：５０８−５２４に記載されている。ある特定の実施形態では、クエリーは、小さな根平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）で構造モチーフの骨格にアライメントするデータベースからの骨格部分構造を包含する。いくつかのかかる実施形態では、水素原子は、ＲＭＳＤを計算するとき除外される。いくつかのかかる実施形態では、検索結果は、ＲＭＳＤの増加により順序付けられる。
【００７４】
ある特定の実施形態では、複数の構造マッチは、ある特定の閾値未満のＲＭＳＤを有する構造マッチを含む。模範的なサイズ及び複雑性依存ＲＭＳＤカットオフ関数は以下の通りである。
【００７５】
【数２】
2021525917.tif 000004
【００７６】
ただし、ｄは、モチーフの自由度の有効数であり、ｎｋは、モチーフのｋ番目のコンティグセグメントの長さであり、Ｎは、モチーフの全長（すなわちＮ＝Σｋｎｋ）であり、Ｌは、相関長（同一ポリペプチド鎖の残基間の空間相関度を記述するパラメーター）であり、且つσｍは、プラトーパラメーターである。ある特定の実施形態では、Ｌは約２０であり、且つσｍは約１．０Åである。
【００７７】
ある特定の実施形態では、複数の構造マッチはＮマッチを含む。ただし、Ｎは、後続の擬エネルギー計算に必要な所望のサンプルサイズに基づいて選択可能である。たとえば、Ｎは、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、又は少なくとも２０００でありうる。いくつかのかかる実施形態では、Ｎは２００である。いくつかのかかる実施形態では、Ｎは１０００である。
【００７８】
ある特定の実施形態では、構造マッチは、冗長性に関してスクリーニングされる。いくつかのかかる実施形態では、構造マッチは、配列冗長性に関してスクリーニングされる。いくつかのかかる実施形態では、構造マッチは、構造冗長性に関してスクリーニングされる。
【００７９】
たとえば、配列冗長性のスクリーニングは、マッチｍ中の各ディスジョイントセグメントを取り囲む局所配列ウィンドウを考慮に入れることと、ニードルマン・ブンシュアルゴリズム及びＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを介してアライメントすることにより、これらとすでに得られているマッチ（μ）の各々の対応する局所配列断片とを比較することと、を含みうる。局所配列ウィンドウは、ｍの起源の構造中の１５先行残基及び１５後続残基を有する対象セグメントとして定義可能である。いくつかのかかる実施形態では、いずれかの局所配列ウィンドウアライメントが約１０−３未満、代替的に約１０−４未満、代替的に約１０−５未満、又は代替的に約１０−６未満のｐ値を有する場合、マッチｍはマッチμに対して冗長であるとみなしうる。アライメントｐ値は、アライメントスコアに基づいて計算しうるとともに、同一長さの配列（データベースアミノ酸頻度を用いて選択される）間のアライメントが同様に又はより良好にスコア付けされる確率を表しうる。
【００８０】
他の例として、構造冗長性のスクリーニングは、対応するクエリー
【００８１】
【数３】
2021525917.tif 000005
【００８２】
にアライメントする残基のいずれかに結合されるマッチｍの起源の構造中のすべての残基を同定することと、その近接残基のうちいくつがμの近接残基に良好にアライメントするか（特定閾値未満の骨格ＲＭＳＤを有するものとして定義される）をｍ及びμの両方がクエリーモチーフに最適にアライメントされるときの配向で計算することにより、マッチｍとすでに得られているマッチμの各々とを比較することと、を含みうる。これとの関連で、マッチｍとすでに得られているマッチμとの間の構造環境類似性を計算する模範的関数は以下の通りである。
【００８３】
【数４】
2021525917.tif 000006
【００８４】
いくつかのかかる実施形態では、Ｓｍ，μが特定カットオフ超である場合、マッチｍはマッチμに対して冗長であるとみなしうる。たとえば、特定カットオフは、少なくとも０．１、少なくとも０．２、又は少なくとも０．３でありうる。いくつかのかかる実施形態では、特定カットオフは０．２である。
【００８５】
Ａ２．擬エネルギー寄与の計算
少なくとも一態様では、本開示は、３次又は４次構造モチーフへの複数の構造マッチの各々で配列−構造関係への少なくとも１つの非局所エネルギー寄与の値を推測する方法を提供する。
【００８６】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの非局所エネルギー寄与は、複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置を取り囲む骨格のコンティグストレッチに由来する（すなわち自己骨格寄与）。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの非局所エネルギー寄与は、複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置に配列近接ではなく空間近接する骨格に由来する（すなわち近傍骨格寄与）。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの非局所エネルギー寄与は、複数の構造モチーフの１つ内の結合残基対に由来する（すなわち対寄与）。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの非局所エネルギー寄与の値は、構造モチーフ及びその構造マッチを解析することにより設計計算を実施しつつオンザフライで計算される。
【００８７】
ある特定の実施形態では、本方法は、複数の構造マッチの各々を用いて配列−構造関係への少なくとも１つの局所エネルギー寄与の値を取得することをさらに含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの局所エネルギー寄与は、複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置の骨格角度に由来する。いくつかのかかる実施形態では、骨格角度はφ角、ψ角、又はω角である。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの局所エネルギー寄与は、複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置の埋没状態に由来する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの局所エネルギー寄与の値は、データベースに基づいてあらかじめ計算される。
【００８８】
ある特定の実施形態では、本方法は、エネルギー寄与の階層に従って複数の構造マッチの各々を用いて配列−構造関係へのエネルギー寄与の値のセットを逐次推測することを含み、階層は、
ｉ．複数の構造モチーフの１つ内の単一設計位置について少なくとも１つの局所エネルギー寄与、
ｉｉ．単一設計位置を取り囲む骨格のコンティグストレッチ、
ｉｉｉ．単一設計位置に配列近接ではなく空間近接する骨格、
ｉｖ．単一設計位置を含む結合残基対、及び
ｖ．単一設計位置を含む残基トリプレット
の少なくとも２つを含む。
【００８９】
Ａ２Ａ．骨格角度
ある特定の実施形態では、本方法は、少なくとも１つの局所エネルギー寄与の値を推測することを含む。いくつかのかかる実施形態では、局所擬エネルギー寄与は、骨格φ（ファイ）及びψ（プサイ）二面角の異なるアミノ酸の傾向を記述する。いくつかのかかる実施形態では、骨格φ及びψ二面角の異なるアミノ酸の傾向を記述する擬エネルギー寄与は、エネルギー寄与の階層の第１層である。
【００９０】
ある特定の実施形態では、φ及びψ骨格角度からの擬エネルギー寄与は、φ／ψ位相空間をビン（たとえば１０°×１０°のビン）にスプリットすることと、そのφ及びψ角の値に基づいて構造データベース中の各残基を対応するビンに帰属することと、により推測される。骨格二面角ビンＢｉφψに関連するアミノ酸ａの擬ポテンシャルの値を計算する模範的関数は以下の通りである。
【００９１】
【数５】
2021525917.tif 000007
【００９２】
ただし、ｆ（ａ，Ｂｉφψ）は、構造データベース中のタンパク質内でアミノ酸ａがこのビンに見いだされる頻度であり、
【００９３】
【数６】
2021525917.tif 000008
【００９４】
Ｎ（ａａ，Ｂｉφψ）は、アミノ酸ａａがビンＢｉφψに見いだされる回数である。
【００９５】
ある特定の実施形態では、本方法は、少なくとも１つの局所エネルギー寄与の値を推測することを含む。いくつかのかかる実施形態では、局所擬エネルギー寄与は、異なる骨格ω（オメガ）二面角に対するアミノ酸の優先度を記述する。いくつかのかかる実施形態では、異なる骨格ω二面角に対するアミノ酸の優先度を記述する擬エネルギー寄与は、エネルギー寄与の階層の第２層である（たとえば、局所擬エネルギー寄与が骨格φ（ファイ）及びψ（プサイ）二面角の異なるアミノ酸の傾向を記述することを熟慮した後でのみ考慮される）。
【００９６】
ある特定の実施形態では、ω二面角からの擬エネルギー寄与は、ω位相空間をビンにスプリットすることと、そのω角の値に基づいて構造データベース中の各残基を対応するビンに帰属することと、により推測される。ω角は、部分二重結合特性を有するペプチド結合の周りで定義されるので、ω角は典型的には平面的であり、最も一般的には１８０°近くの値を有するが（トランスペプチド結合）、一般に（ただし排他的ではない）Ｐｒｏ又はＧｌｙアミノ酸で約０°の値も現れる（シスペプチド結合）。そのため、いくつかのかかる実施形態では、本方法は、ω角の非一様ビニングを含み、ビン幅は少なくとも１°であるが、各ビンに十分な数の構造データベース残基を有するのに必要とされる程度に大きい。
【００９７】
ω角ビンＢｉωに関連するアミノ酸ａの擬ポテンシャルの値を計算する模範的関数は以下の通りである。
【００９８】
【数７】
2021525917.tif 000009
【００９９】
式中、Ｎ（ａ，Ｂｉω）は、アミノ酸ａがビンＢｉωに見いだされる回数であり、Ｎｅ（ａ，Ｂｉω）は、既知の擬エネルギー寄与（たとえばφ／ψエネルギー）に基づいて、ａがビンに見いだされると予想される回数であり、且つεωは、低占有ビンからの過剰統計ノイズを防止する擬カウントとして作用する。いくつかのかかる実施形態では、εωは１である。
【０１００】
Ｎｅ（ａ，Ｂｉω）の模範的関数は以下の通りである。
【０１０１】
【数８】
2021525917.tif 000010
【０１０２】
式中、外側の和は、ωビンＢｉωに分類されるすべての天然残基にわたり、内側の和は、集合ＡＡで表されるすべての天然アミノ酸にわたり、且つＢφψ（κ）は、残基κが分類されるφ／ψビンである。内側の部分は、ビン中の各残基のφ／ψ環境でａを観測する予想確率を表す（すべての可能なアミノ酸にわたる）。以上の式の予想による補正は、ＥωがＥφψに対する補正子としてのみ作用し、データでまだ説明されていないもののみを説明することを保証する。
【０１０３】
Ａ２Ｂ．埋没状態
ある特定の実施形態では、本方法は、少なくとも１つの局所エネルギー寄与の値を推測することを含む。いくつかのかかる実施形態では、局所擬エネルギー寄与は、残基の一般的環境（すなわち埋没状態）に由来する。いくつかのかかる実施形態では、残基の埋没状態からの擬エネルギー寄与は、エネルギー寄与の階層の後続寄与である（たとえば、骨格φ及びψ二面角の異なるアミノ酸の傾向を記述する局所擬エネルギー寄与と、異なる骨格ω二面角に対するアミノ酸の優先度を記述する局所擬エネルギー寄与と、を熟慮した後でのみ考慮される）。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、埋没状態からの擬エネルギー寄与は、構造データベース中の全残基について環境記述子ｅを計算することと、ｅに従って残基をビニングすることと、により推測される。単一体（自己）寄与として残基の埋没状態からの寄与をキャプチャーするために、環境記述子は配列非依存環境記述子でありうる。
【０１０５】
環境ビンＢｉｅに関連するアミノ酸ａの擬ポテンシャルの値を計算する模範的関数は以下の通りである。
【０１０６】
【数９】
2021525917.tif 000011
【０１０７】
式中、Ｎ（ａ，Ｂｉｅ）は、アミノ酸ａがビンＢｉｅに見いだされる回数であり、Ｎｅ（ａ，Ｂｉｅ）は、既知の擬エネルギー寄与（たとえばφ／ψエネルギー及びωエネルギー）に基づいて、ａがビンに見いだされると予想される回数であり、且つεｅは、低占有ビンからの過剰統計ノイズを防止する擬カウントとして作用する。いくつかのかかる実施形態では、εｅは１である。
【０１０８】
Ｎｅ（ａ，Ｂｉｅ）の模範的関数は以下の通りである。
【０１０９】
【数１０】
2021525917.tif 000012
【０１１０】
式中、外側の和は、環境ビンＢｉｅに帰属されるすべての天然残基にわたり、且つＢω（κ）は、残基κがマップされるωビンである。以上の式の予想による補正は、階層の早期に考慮された擬エネルギー寄与（たとえば、Ｅφψ及び／又はＥω）によりすでに説明されるものに対する補正子としてのみＥｅが作用することを保証する。
【０１１１】
さまざまな配列非依存環境記述子ｅを使用しうる。一実施形態では、配列非依存環境記述子は、残基を取り囲む容積が非占有でその回転異性体に利用可能な程度を決定するために、所与の位置及びその周囲のすべての天然アミノ酸のすべての可能な回転異性体を考慮する「残基自由度」でありうる。所与の残基ｉの自由度の模範的関数Ｆ（ｉ）は以下の通りである。
【０１１２】
【数１１】
2021525917.tif 000013
【０１１３】
式中
【０１１４】
【数１２】
2021525917.tif 000014
【０１１５】
式中、Ｒｉ（ａ）は、位置ｉのアミノ酸ａの側鎖回転異性体のセットであり（骨格と衝突する回転異性体の廃棄後）、Ｉｉｊ（ｒｉ、ｒｊ）は、両回転異性体ｒｉ及びｒｊが互いの存在に強く影響を及ぼす可能性があるか（３Å以内の非水素原子対を有するか）の指標となるバイナリー変数であり、Ｐｒ（ａ）は、構造データベース中のアミノ酸ａの頻度であり、且つｐ（ｒｉ）は、回転異性体ｒｉの確率であり、また、ｐｃ（ｒｉ）は、回転異性体ｒｉの「衝突確率質量」（すなわち、他の位置の回転異性体とどの程度衝突する可能性があるか）である。
【０１１６】
Ａ２Ｃ．自己骨格
ある特定の実施形態では、本方法は、少なくとも１つの非局所擬エネルギー寄与の値を推測することを含む。いくつかのかかる実施形態では、非局所擬エネルギー寄与は、所与の位置で単一設計位置を取り囲む骨格のコンティグストレッチに由来する（すなわち自己骨格寄与）。いくつかのかかる実施形態では、自己骨格寄与は、エネルギー寄与の階層の後続寄与である（たとえば、１つ以上の局所擬エネルギー寄与を考慮した後でのみ考慮される）。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、自己骨格寄与は、位置ｐを取り囲む骨格の局所コンティグストレッチが、φ／ψ、ω、及び埋没状態の優先度によりすでにキャプチャーされるものを超えて、そのアミノ酸優先度をどのようにモジュレートするかをキャプチャーする。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、自己骨格寄与は、位置ｐ及びその周囲コンティグ骨格断片を含む構造モチーフＴｐを標的構造から切り出すことと、構造データベースでＴｐへの構造マッチを同定することと、により推測される。構造マッチのセットをＭｐという。
【０１１９】
位置ｐのアミノ酸ａの自己骨格寄与の値を計算する模範的関数は以下の通りである。
【０１２０】
【数１３】
2021525917.tif 000015
【０１２１】
式中、Ｎ（ａ，Ｍｐ）は、アミノ酸ａが構造マッチＭｐのセット内のｐに対応する位置で観測される回数であり、且つＮｅ（ａ，Ｍｐ）は、既知の擬エネルギー寄与（たとえば、φ／ψ、ω、及び／又は環境エネルギー）に基づいてａがこの位置にあると予想される回数であり、且つεｏは、擬カウントとして作用する。いくつかのかかる実施形態では、εｏは１である。
【０１２２】
Ｎｅ（ａ，Ｍｐ）の模範的関数は以下の通りである。
【０１２３】
【数１４】
2021525917.tif 000016
【０１２４】
式中、外側の和は、Ｍｐ中のマッチにわたり、ｍｐは、Ｔｐ中の位置ｐにアライメントするマッチｍ中の残基であり、且つＢｅ（ｍｐ）は、マッチｍの起源の構造中のその周囲に基づいてｍｐが属する環境ビンである。
【０１２５】
Ａ２Ｄ．近傍骨格
ある特定の実施形態では、本方法は、少なくとも１つの非局所擬エネルギー寄与の値を推測することを含む。いくつかのかかる実施形態では、非局所擬エネルギー寄与は、所与の位置で単一設計位置に配列近接ではなく空間近接する骨格に由来する（すなわち近傍骨格寄与）。いくつかのかかる実施形態では、近傍骨格寄与は、エネルギー寄与の階層の後続寄与である（たとえば、１つ以上の局所擬エネルギー寄与及び自己骨格寄与を考慮した後でのみ考慮される）。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、近傍骨格寄与は、位置ｐに配列近接ではなく密に空間近接する骨格セグメントの存在によりもたらされる位置ｐのアミノ酸優先度のいずれかのさらなるモジュレーションをキャプチャーする。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、近傍骨格寄与は、位置ｐ、その周囲コンティグ骨格セグメント、及びｐに密に空間（配列ではない）近接する骨格セグメントを含む構造モチーフＴ’ｐ，ｔを標的構造から切り出すことと、構造データベースでＴ’ｐ，ｔへの構造マッチを同定することと、により推測され、下付き文字ｔは、複数のかかる構造モチーフが可能であることを表す。構造マッチのセットをＭ’ｐ，ｔという。
【０１２８】
Ｔ’ｐ，ｔ中のアミノ酸ａの近傍骨格寄与の値を計算する模範的関数は以下の通りである。
【０１２９】
【数１５】
2021525917.tif 000017
【０１３０】
式中、Ｎ（ａ，Ｍ’ｐ，ｔ）は、アミノ酸ａが構造マッチＭ’ｐ，ｔのセット内のｐに対応する位置で観測される回数であり、且つＮｅ（ａ，Ｍ’ｐ，ｔ）は、既知の擬エネルギー寄与（たとえば、φ／ψ、ω、環境、及び／又は自己骨格エネルギー）に基づいてａがこの位置にあると予想される回数であり、且つεｎは、擬カウントとして作用する。いくつかのかかる実施形態では、εｎは１である。
【０１３１】
Ｎｅ（ａ，Ｍ’ｐ，ｔ）の模範的関数は以下の通りである。
【０１３２】
【数１６】
2021525917.tif 000018
【０１３３】
式中、外側の和は、Ｍ’ｐ，ｔ中のマッチにわたり、及び
【０１３４】
【数１７】
2021525917.tif 000019
【０１３５】
は、マッチｍの起源の構造に基づいて残基ｍｐ中のアミノ酸ａの自己骨格擬エネルギーを表す。
【０１３６】
Ａ２Ｅ．対
ある特定の実施形態では、本方法は、少なくとも１つの非局所擬エネルギー寄与の値を推測することを含む。いくつかのかかる実施形態では、非局所擬エネルギー寄与は、標的構造中の結合残基対（ｐ，ｑ）に由来する（すなわち対擬エネルギー寄与）。いくつかのかかる実施形態では、対寄与は、エネルギー寄与の階層の後続寄与である（たとえば、１つ以上の局所擬エネルギー寄与、自己骨格寄与、及び／又は近傍骨格寄与を考慮した後でのみ考慮される）。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、対寄与は、位置ｐ及びｑを含む構造モチーフ
【０１３８】
【数１８】
2021525917.tif 000020
【０１３９】
を標的構造から切り出すことと、構造データベースで
【０１４０】
【数１９】
2021525917.tif 000021
【０１４１】
への構造マッチを同定することと、により推測される。構造マッチのセットを
【０１４２】
【数２０】
2021525917.tif 000022
【０１４３】
という。
【０１４４】
それぞれ
【０１４５】
【数２１】
2021525917.tif 000023
【０１４６】
の位置ｐ及びｑのアミノ酸ａ及びｂの対寄与の値を計算する模範的関数は以下の通りである。
【０１４７】
【数２２】
2021525917.tif 000024
【０１４８】
式中、
【０１４９】
【数２３】
2021525917.tif 000025
【０１５０】
は、アミノ酸ａ及びｂが構造マッチ
【０１５１】
【数２４】
2021525917.tif 000026
【０１５２】
のセット内のｐ及びｑに対応する位置で観測される回数であり、且つ
【０１５３】
【数２５】
2021525917.tif 000027
【０１５４】
は、既知の擬エネルギー寄与（たとえば、φ／ψ、ω、環境、自己骨格、及び／又は近傍骨格エネルギー）に基づいて、（ａ，ｂ）対がこれらの位置にあると予想される回数であり、且つεｐは、擬カウントとして作用する。いくつかのかかる実施形態では、εｐは１である。
【０１５５】
【数２６】
2021525917.tif 000028
【０１５６】
の模範的関数は以下の通りである。
【０１５７】
【数２７】
2021525917.tif 000029
【０１５８】
式中、簡潔さを期して、Ｅｌｏ（ａ│ｍｐ）は、マッチｍの位置ｐにアライメントされた位置のアミノ酸ａに関連するこれまでに考慮されたすべての低次寄与の合計擬エネルギーを表し、
【０１５９】
【数２８】
2021525917.tif 000030
【０１６０】
且つ
【０１６１】
【数２９】
2021525917.tif 000031
【０１６２】
は、構造モチーフの個別結合位置の周辺アミノ酸分布を保存するために含めうる任意選択的調整エネルギーである。
【０１６３】
Ａ２Ｆ．トリプレット
ある特定の実施形態では、本方法は、少なくとも１つの非局所擬エネルギー寄与の値を推測することを含む。いくつかのかかる実施形態では、非局所擬エネルギー寄与は、標的構造中の残基トリプレット（ｐ，ｑ，ｒ）に由来する（すなわちトリプレット擬エネルギー寄与）。いくつかのかかる実施形態では、トリプレット寄与は、エネルギー寄与の階層の後続寄与である（たとえば、１つ以上の局所擬エネルギー寄与、自己骨格寄与、近傍骨格寄与、及び／又は対寄与を考慮した後でのみ考慮される）。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、トリプレット寄与は、位置ｐ、ｑ、及びｒを含む構造モチーフ
【０１６５】
【数３０】
2021525917.tif 000032
【０１６６】
を標的構造から切り出すことと、構造データベースで
【０１６７】
【数３１】
2021525917.tif 000033
【０１６８】
への構造マッチを同定することと、により推測される。構造マッチのセットを
【０１６９】
【数３２】
2021525917.tif 000034
【０１７０】
という。
【０１７１】
それぞれ
【０１７２】
【数３３】
2021525917.tif 000035
【０１７３】
の位置ｐ、ｑ、及びｒのアミノ酸ａ、ｂ、及びｃの対寄与の値を計算する模範的関数は以下の通りである。
【０１７４】
【数３４】
2021525917.tif 000036
【０１７５】
式中、
【０１７６】
【数３５】
2021525917.tif 000037
【０１７７】
は、トリプレット（ａ、ｂ、ｃ）が構造マッチ
【０１７８】
【数３６】
2021525917.tif 000038
【０１７９】
のセット内の（ｐ，ｑ，ｒ）に対応する位置で観測される回数であり、且つ
【０１８０】
【数３７】
2021525917.tif 000039
【０１８１】
は、（ａ，ｂ，ｃ）トリプレットが既知の擬エネルギー寄与（たとえば、φ／ψ、ω、環境、自己骨格、近傍骨格、及び／又は対エネルギー）に基づいてこれらの位置にあると予想される回数であり、且つεｔは、擬カウントとして作用する。いくつかのかかる実施形態では、εｔは１である。
【０１８２】
【数３８】
2021525917.tif 000040
【０１８３】
の模範的関数は以下の通りである。
【０１８４】
【数３９】
2021525917.tif 000041
【０１８５】
式中、簡潔さを期して、Ｅｌｏ（ａ，ｂ，ｃ│ｍｐ，ｑ，ｒ）は、マッチｍの位置ｐ、ｑ、及びｒにアライメントされた位置のアミノ酸ａに関連するこれまでに考慮されたすべての低次寄与の合計擬エネルギーを表し、
【０１８６】
【数４０】
2021525917.tif 000042
【０１８７】
及び
【０１８８】
【数４１】
2021525917.tif 000043
【０１８９】
は、
【０１９０】
【数４２】
2021525917.tif 000044
【０１９１】
中の位置対のペアワイズアミノ酸分布を拘束するために含めうる任意選択的調整エネルギーである。
【０１９２】
Ａ３．タンパク質最適化
少なくとも一態様では、本開示は、標的構造の結合パートナーにフォールド可能なアミノ酸配列又はアミノ酸配列のライブラリーを決定する方法を提供する。アミノ酸配列のライブラリーは、たとえば、多くとも約５０％、代替的に多くとも約６０％、代替的に多くとも約７０％、代替的に多くとも約８０％、又は代替的に多くとも約９０％の配列同一性を互いに有するアミノ酸配列のセットを含みうる。ある特定の実施形態では、アミノ酸配列のセットは、コアジェネリック配列の変異体を含む。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、標的構造の結合パートナーにフォールド可能なアミノ酸配列又はアミノ酸配列のライブラリーを決定するために最適化アプローチが使用される。たとえば、擬エネルギー寄与のすべての値を計算し、任意選択的に自己、対、及び可能な限り高次の擬エネルギー寄与の表に体系化したら、最適化アプローチのホストを用いて最適アミノ酸配列を推測可能である。ある特定の実施形態では、整数線形プログラミング（ＩＬＰ）アプローチが使用される。ＩＬＰアプローチは、設計問題への拘束の導入を可能にする（たとえば、配列対称性の拘束、荷電／極性若しくは疎水性残基の数の拘束、又はいくつかの出発配列と比べて突然変異した残基の制限）。ある特定の実施形態では、代替最適化法、たとえば、自己無撞着平均場（ＳＣＭＦ）又はシミュレーテッドアニーリングモンテカルロ（ＭＣ）が使用される。ある特定の実施形態では、絶対グローバル最適配列の同定は必要でなく、いずれかの近似〜最適配列があれば十分である。
【０１９４】
Ｂ．タンパク質発現
ある特定の態様では、本明細書に記載の方法の産物は、発現さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ実験手順を用いた最適化が推奨されるアミノ酸配列又はアミノ酸配列のライブラリー若しくはセットである。
【０１９５】
さらなる態様では、本開示は、本明細書に提供される計算設計タンパク質をコードする核酸配列を提供する。かかる核酸配列は、コードタンパク質の発現及び／又は精製を促進するのに有用な追加の配列、たとえば、限定されるものではないが、ポリＡ配列、改変コザック配列、及びエピトープタグをコードする配列、移出シグナル、及び分泌シグナル、核局在化シグナル、及び形質膜局在化シグナルをさらに含みうる。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、核酸配列は、ベクター（たとえば、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、又は遺伝子工学で従来から使用されている他のベクター）に含有される。いくつかのかかる実施形態では、ベクターは、好適な宿主細胞でコード領域の適正発現を可能にする発現制御エレメントを含む。計算設計タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された「制御エレメント」は、計算設計タンパク質の発現を誘発可能なさらなる核酸配列である。たとえば、制御エレメントは、さまざまな構成的プロモーター、たとえば、限定されるものではないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、若しくはアクチン、又は誘導性プロモーター、たとえば、限定されるものではないが、テトラサイクリン若しくはステロイドにより駆動されるプロモーター、のいずれかを含みうる。制御エレメントは、その発現をダイレクトする機能がある限り、タンパク質をコードする核酸配列とのコンティグである必要はない。そのため、たとえば、プロモーター配列と核酸配列との間に非翻訳であるが転写される介在配列を存在させることが可能であり、それでもなおプロモーター配列は、コード配列に「作動可能に連結された」とみなすことが可能である。他のかかる制御配列としては、限定されるものではないが、開始シグナル、ポリアデニル化シグナル、終止シグナル、及びリボソーム結合部位が挙げられる。ある特定の実施形態では、ベクターは、好適な宿主細胞内で且つ好適な条件下でベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などのさらなる遺伝子を含む。核酸分子を含むベクターの構築のための、適切に選択された宿主細胞内へのベクターの導入のための、又は核酸分子の発現を誘発若しくは達成するための、核酸分子の構築方法は、当技術分野で周知である。
【０１９７】
他の一態様では、本開示は、本明細書に開示される核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞のどちらかでありうる。宿主細胞は、一過的又は安定的にトランスフェクト可能である。原核細胞及び真核細胞への発現ベクターのかかるトランスフェクションは、当技術分野で公知のいずれかの技術、たとえば、限定されるものではないが、標準的細菌トランスフォーメーション、リン酸カルシウム共沈、電気穿孔、又はリポソーム媒介、ＤＥＡＥデキストラン媒介、ポリカチオン媒介、若しくはウイルス媒介のトランスフェクションを介して達成可能である。
【０１９８】
さらなる態様では、本開示は、計算設計タンパク質の生成方法を提供する。本方法は、（ａ）タンパク質の発現を助長する条件下でタンパク質をコードする核酸配列を含む宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）任意選択的に発現タンパク質を回収する工程と、を含む。そのため、ある特定の実施形態では、計算設計タンパク質の生成方法は、少なくとも１つのアミノ酸配列を設計及び選択することと、発現系でアミノ酸配列を発現させることにより計算設計タンパク質を生成することと、を含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸配列は、標的構造の結合パートナーにフォールド可能なタンパク質である。
【０１９９】
いくつかのかかる実施形態では、本方法は、少なくとも１つの候補アミノ酸配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで発生させることと、候補アミノ酸配列をコードする核酸配列を宿主細胞に導入することと、候補アミノ酸配列を発現させること、を含む。いくつかのかかる実施形態では、本方法は、候補アミノ酸配列が標的構造の結合パートナーにフォールドするかを決定することをさらに含む。かかる決定は、タンパク質結合を評価するための生化学的及び／又は生物物理学的方法をはじめとする既知の方法により行うことが可能である。
【０２００】
ある特定の実施形態では、計算設計タンパク質は、酵素、抗体、レセプター、リガンド、輸送タンパク質、ホルモン、成長因子、及びそれらの断片である。いくつかのかかる実施形態では、抗体はヒト抗体である。いくつかのかかる実施形態では、計算設計タンパク質は、一本鎖抗体（たとえば一本鎖Ｆｖ）である。いくつかのかかる実施形態では、計算設計タンパク質は、抗原結合抗体フラグメント、たとえば、Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントである。
【０２０１】
Ｃ．定義
本明細書で用いられる場合、「接触度」とは、所与の位置対ｉ及びｊが接触を確立するのに有利と思われる状況を意味する。接触度は、「結合残基」を同定するために使用可能である。
【０２０２】
本明細書で用いられる場合、「結合残基」とは、たとえば標的構造中のアミノ酸残基対を意味し、この対では一方の残基のアミノ酸のアイデンティティーは、他方の残基のアミノ酸のアイデンティティーに依存する。
【０２０３】
本開示では、選言命題の使用は、連言命題を含むことが意図される。定冠詞又は不定冠詞の使用は、カーディナリティーを表すことが意図されない。特定的には、「ｔｈｅ」オブジェクト又は「ａ」及び「ａｎ」オブジェクトへの参照は、可能な複数のかかるオブジェクトの１つを意味することも意図される。さらに、接続詞「ｏｒ（又は）」は、相互排他的選択肢ではなく同時に存在する特徴を伝えるために用いうる。言い換えると、接続詞「ｏｒ（又は）」は、「ａｎｄ／ｏｒ（及び／又は）」を含むものと理解すべきである。「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（〜を含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（〜を含む）」、及び「ｉｎｃｌｕｄｅ（〜を含む）」という用語は包括的であり、それぞれ、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（〜を含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」、及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（〜を含む）」と同一範囲を有する。
【０２０４】
以上に記載の実施形態、とくにいずれかの「好ましい」実施形態は、実現可能例であり、単に本発明の原理を明確に理解すべく示される。本明細書に記載の技術の趣旨及び原理から実質的に逸脱することなく、以上に記載の実施形態に多くの変更及び修正を加えうる。修正はすべて、本開示の範囲内で本明細書に含まれるとともに以下の特許請求の範囲により保護されることが意図される。
【実施例】
【０２０５】
Ｄ．実施例
以下の実施例は、単なる例示にすぎず、なんら本開示を限定的なものではない。
【０２０６】
実施例１：表面再設計（リサーフェイシング）
タンパク質表面（すなわち、溶媒に暴露される残基のセット）は、多くの生物物理学的性質、たとえば、溶解性、免疫原性、自己会合、アグリゲーション傾向、さらには安定性及びフォールド特異性を決定するうえで重要である。したがって、これら性質の１つ以上をモジュレートするために、その全体の構造及び機能を保存しつつ、所与のタンパク質の表面を単に再設計することが有用なこともある。本実施例は、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）の表面を再設計（リサーフェイシング）するタスクを記述する。ＲＦＰは、可視スペクトルの赤色部分（約６００ｎｍ）の近傍に集中する発光スペクトルを有して天然で蛍光を発するタンパク質である。他の蛍光タンパク質（ＦＰ）と同様に、ＲＰＦは、生物学的イメージングタグとして光学実験にきわめて有用である［１］。したがって、（多くの場合高濃度で）機能しなければならない環境（又は細胞型）に依存してＲＦＰの表面残基をモジュレートすることが有用でありうる。
【０２０７】
設計テンプレートとしてＲＦＰ  ｍＣｈｅｒｒｙ（ＰＤＢコード２Ｈ５Ｑ［２］）の結晶構造を使用した。構造中の合計６４位置を表面上にあるものとしてマニュアルで選択した（０．４２超の自由度の値を有する位置におおよそ対応する）。これらは図５（左側パネル）に球として示される。この後、本明細書に記載の模範的ＴＥＲＭベース法を用いて、２０天然アミノ酸間で変動する表面位置のすべてに対応する統計エネルギー表を計算し、残りの位置をＰＤＢエントリー２Ｈ５Ｑ中のそれらのアイデンティティーに固定した。したがって、得られたエネルギー表は、２０６４≒２×１０８３配列の配列空間を記述した。整数線形プログラミングを用いてこの空間全体にわたり最適化し、最低全統計エネルギースコアを有する単一配列を見いだした。得られた配列は、ｍＣｈｅｒｒｙの出発配列と比較して表１に示される。元のｍＣｈｅｒｒｙ構造及び得られた設計モデル構造の真空中表面静電位は、図５で比較される（中間パネル及び右側パネル）。明らかに、設計配列は、表面の静電的性質及び形状への有意な撹乱を呈する。事実上、６４可変位置のうち合計４８位置は設計で変化する。
【０２０８】
【表１】
2021525917.tif 000045
【０２０９】
設計で可変としてマークされた位置は下線付きであり、且つ設計配列で突然変異したものはボールド体でマークされる。
【０２１０】
設計を確証するために、配列をＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中にクローニングし、続いて、標準的な分子生物学的及び生物物理学的技術を用いて発現及び精製を行った。
【０２１１】
高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）は、タンパク質が（少なくとも１０μＭの濃度で）天然ｍＣｈｅｒｒｙとまったく同様に溶液中でモノマーであることを示した（図６参照）。
【０２１２】
４８突然変異を保有するにもかかわらず且つ光学的性質の保存が設計拘束ではなかったという事実にもかかわらず（構造の保存のみ拘束）、設計は、依然として元のタンパク質に特有の桃色を呈した（図７参照、トップ）。さらに、設計タンパク質は、依然として蛍光を発し、発光スペクトルは、ｍＣｈｅｒｒｙとほぼ同一の形状を呈した（図７参照、ボトム）。最後に、グアニジニウム塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）による化学変性は、タンパク質の構造が元のｍＣｈｅｒｒｙとほぼ同程度に良好にそのクロモフォアを保護することを明らかにした（それ自体きわめて安定な高度工学操作タンパク質）（図８）。そのため、あらゆる手段により、４８位置が元のｍＣｈｅｒｒｙと異なる設計タンパク質は、出発構造さらには機能さえも保存した。かかる多様性を生成する能力は、一連の所望の性質を有するＲＦＰ又は他のタンパク質の変異体を迅速に工学操作するために容易に活用可能である。
【０２１３】
実施例２：膜タンパク質の可溶化のためのリサーフェイシング
とくに、リサーフェイシングアプローチは、水性溶液への溶解性に関して膜タンパク質を再設計するために使用可能である（５）。水溶性タンパク質は、膜貫通（ＴＭ）タンパク質よりも発現、精製、及び操作がかなり容易であるので、治療剤を標的化する課題がより容易になる。そのため、膜タンパク質の水溶性アナログを生成する能力は、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）などの主要なバイオメディカル関連標的に対する薬剤及び抗体を同定するプロセスをかなり単純化可能であろう。
【０２１４】
この目的に合わせたＴＥＲＭベース設計の使用は、水への可溶化時に溶媒暴露されるであろうＴＭタンパク質構造の表面上の脂質に面している位置を同定することと、以上の実施例１で利用した標準的手順を介してそれらを再設計することと、を含む。
【０２１５】
相互作用表面位置間のアミノ酸の組合せの特異的選択は、既知の水溶性タンパク質構造の類似の構造環境の配列統計を観測及び「学習」する結果として得られた。これは本明細書に開示される設計手順の一部でありうる。
【０２１６】
図９は、ＧＰＣＲβ−１アドレナリン作動性レセプター（ＰＤＢコード４ＢＶＮ、左側パネル参照）の結晶構造に本プロセスを適用した結果を示す。図９の中間パネルと右側パネルとを比較すると、脂質二重層との相互作用に理想な主に疎水性のものから、水との相互作用に好適な親水性のものに、タンパク質の表面が設計プロセスにより変換されたことは明らかである。そのため、本明細書に記載の方法は、水への溶解性に関してＧＰＣＲなどのタンパク質をリサーフェイスするのに有用である。
【０２１７】
実施例３：ＴＥＲＭベース法により計算された統計エネルギースコアは設計品質を示す
本実施例では、何千ものｄｅ  ｎｏｖｏ設計タンパク質配列に関する既存の発表データを利用して、より良好な統計エネルギースコアがより高い設計成功率を表す傾向があるか及び設計タンパク質のより良好な品質に相関するかを決定した。特定的には、Ｂａｋｅｒらにより発表されたデータを使用した。そこでは、フォールドされた安定なプロテアーゼ耐性構造を形成する能力に関して、４つの識別可能なトポロジー（図１０Ａ〜１０Ｄ参照）の合計約１５，０００ｄｅ  ｎｏｖｏ設計配列が高スループットで試験された（３）。これらの設計の各々は、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｄｅｓｉｇｎソフトウェアスイート（６）により所望の標的骨格と良好に適合可能であると予測された配列を呈したが、ほとんどの設計はフォールドに失敗した。
【０２１８】
本実施例は、本明細書に開示される設計法が成功又は失敗の設計をより良好に識別可能であるかを試験しようと試みたものである。この目的で、Ｂａｋｅｒらにより投入された約１５，０００骨格構造の各々につき模範的設計法を用いて（それらの設計の各々につき１つずつ）（３）、標的モデルのいずれに対してもいずれかの天然アミノ酸配列の評価を可能にした。各設計配列に対してそのそれぞれの骨格で本明細書に開示される模範的設計法を用いてエネルギースコアを計算し、異なるトポロジーに渡って比較を容易にするために配列長で除算した。図１０Ｅ〜１０Ｈは、４つのトポロジーの各々につき、得られたスコアと実験上の「安定性スコア」（Ｂａｋｅｒらが高スループットで設計安定性を推定するために開発し熱力学的安定性に密に相関することが示されたプロテアーゼ耐性ベースメトリック）との間の相関を示す。明らかなように、ＴＥＲＭベーススコアと実験スコアとの間にロバストな相関が存在した（ｐ値はすべての場合にきわめて有意である。図１０Ｅ〜１０Ｈの凡例を参照されたい）。これとは対照的に、各配列に対して計算されたロゼッタスコア（同様にＢａｋｅｒらにより発表された）を考慮した場合、相関はすべての場合に有意により弱かった（図１０Ｉ〜１０Ｌを参照されたい）。事実上、４つのトポロジーのうち３つでは、相関係数は、統計的に有意でないか（図１０Ｋで０．１のｐ値）誤った符号であるか（図１０Ｊ及び１０Ｌで期待される負ではなく正の相関）のどちらかであった。
【０２１９】
Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｄｅｓｉｇｎは、計算タンパク質設計で現在の最新技術に相当する（７）。そのため、ＴＥＲＭベーススコアリングは、既存の設計方法によりキャプチャーできない方法で構造−配列関係を統合することが、この結果から示唆される。さらに、ここで解析された約１５，０００設計配列は、ＴＥＲＭベーススコアリングではなくＲｏｓｅｔｔａ  Ｄｅｓｉｇｎに基づいて最適化された。事実上、ＴＥＲＭベース最良スコアリング配列は、常にロゼッタベース設計と平均で８４％異なっていた（すなわち、Ｒｏｓｅｔｔａベース選択配列とＴＥＲＭベース選択配列との間で平均で位置の約１６％が同一であったにすぎない）。それ自体の予測配列ランドスケープの最適性領域とは異なる配列でさえも定量的にスコア付けする本明細書に開示されるＴＥＲＭベース法の能力は、本方法の一般性及びそれが定量する配列−構造関係のユニバーサル適用性をさらに確証する。
【０２２０】
図１１は、本明細書に開示される模範的方法を用いて計算されたスコアが、４天然ドメインの１２０配列変異体を用いて熱力学的安定性に密に相関したことをさらに示す。これらは、高スループット実験安定性スコアの定量的性質を確立するためにＲｏｃｋｌｉｎらが使用したのと同一の変異体である（３）。ＴＥＲＭベーススコアと熱力学的実験との間の密な相関は、ＴＥＲＭベース法をさらに確証し、ＴＥＲＭベーススコアの最適化がロバストな汎用タンパク質設計ストラテジーであることを示唆する。
【０２２１】
実施例４：新規な結合モードの設計
タンパク質−タンパク質相互作用は、生細胞の内部論理配線を効果的に提供し、細胞がその内部又は周囲のイベントをどのように感知しそれに反応するかを規定する。多くの細胞タンパク質−タンパク質相互作用は、専用のタンパク質相互作用ドメインによりコードされる。これらに包含されるものとしては、パートナータンパク質のＣ末端テールに特異的に結合し最後の６〜１０アミノ酸を特異的に認識するモジュールであるＰＤＺドメインが挙げられる（８、９）。ヒトゲノム中には２５０超のＰＤＺドメインが存在し、それらは細胞シグナリング及び局在化に広く関与する（８）。そのため、特異的ＰＤＺドメインを認識し阻害する分子は、大きなバイオメディカルニーズを呈する。しかしながら、ＰＤＺドメインの結合ポケットは構造的に保存され、多くのドメインがオーバーラップ結合特異性を呈するので、結合ポケットの外側のあまり保存されない領域を標的とすれば、より良好な阻害選択性を達しうる。
【０２２２】
本実施例では、２つのヒトＰＤＺドメイン、すなわち、タンパク質ＮＨＥＲＦ−２の第２のＰＤＺドメイン（Ｎ２Ｐ２）及びタンパク質ＭＡＧＩ−３の第６のＰＤＺドメイン（Ｍ３Ｐ６）を利用した。両ドメインは、リゾホスファチジン酸レセプター２（ＬＰＡ２２）のＣ末端を認識し、両方とも結腸癌に関連するシグナル伝達に関与する（１０〜１３）。しかしながら、ＬＰＡ２２へのＮ２Ｐ２の結合は腫瘍形成活性を増強するが、Ｍ３Ｐ６の結合はそれを阻害する（１２）。そのため、Ｍ３Ｐ６に勝るＮ２Ｐ２の選択的阻害は、結腸癌に対する可能性のある治療経路として妥当である（１４）。
【０２２３】
両ドメインは天然で同一配列（ＬＰＡ２２のＣ末端）を認識するので、保存結合ポケットの外側でＮ２Ｐ２との接触を形成するように、ＴＥＲＭベースストラテジーを利用して既知のＮ２Ｐ２結合ペプチド（ＰＤＢエントリー２ＨＥ４中のＮ２Ｐ２の複合構造から取り出した）を伸長させた。ストラテジーは、Ｎ２Ｐ２の既存の構造を完成させるのに好適なマルチセグメントＴＥＲＭを同定した。すなわち、ＴＥＲＭは、Ｎ２Ｐ２の表面領域に良好にアライメントするセグメントのサブセットを有し（インターフェースアンカー）、残りのセグメントは、推定インターフェースを形成し（インターフェースシード）、そしてＴＥＲＭ配列統計は、Ｎ２Ｐ２アンカー領域の配列に適合可能である（図１２参照）。次いで、アンカー／シードの組合せをマニュアルで選択し（Ｍ３Ｐ６と対比して保存されない残基にマッピングするＮ２Ｐ２アンカー領域に基づく）、そして中程度に良好にオーバーラップするＴＥＲＭにより既存の結合ペプチドに結合させた（図１２参照）。最後に、得られた骨格構造（図１２に示される）を本明細書に開示される模範的設計法を用いた設計に付し、実験的特徴付けに関して最適配列を選択した。
【０２２４】
精製設計ペプチドを市販品として入手し、Ｎ２Ｐ２及びＭ３Ｐ６の両方へのその親和性を我々の前の研究と同様に蛍光偏光（ＦＰ）阻害アッセイにより調べた（１５）。Ｎ２Ｐ２への親和性は１μＭ程度であったが、Ｍ３Ｐ６との検出可能な相互作用は存在しなかったことが、図１３によりを示される。比較すると、ＬＰＡ２（Ｎ２Ｐ２及びＭ３Ｐ６の両方の天然パートナー）のＣ末端６マーのペプチドは、Ｎ２Ｐ２に約１／３０の弱い結合をするが、Ｎ２Ｐ２及びＭ３Ｐ６に対してほぼ等しい親和性を呈する（１５）。そのため、設計された新規な結合モードは、改善された親和性及び劇的に改善された選択性の両方を示す。
【０２２５】
実施例５：構造のｄｅ  ｎｏｖｏ設計
本明細書に開示されるフレームワークは、既存のタンパク質フォールドに由来するかｄｅ  ｎｏｖｏで構築されたかにかかわらず、任意の構造に適用可能である。例として、図１４Ａは、Ｒｏｃｋｌｉｎらが配列の設計に最近成功した計算発生骨格を示す（３）。この構造又はいずれかの他の新規な骨格は、以上に記載の方法を用いて設計可能である。この特異的骨格では、いずれかの天然アミノ酸を位置のいずれかで選択した場合（約１０５２の全配列空間）、図１４Ｂに示される解が最適として選択された。設計配列のモデリングされた構造は、生物物理学的に適正であるように見えた（図１４Ｂ参照）。さらに、モデリングされた配列と既知構造のタンパク質との間の離れた相同性を同定する能力に依拠する強力な構造予測法であるＨＨｐｒｅｄ（４、１６）に設計配列を付したところ、ＰＤＢエントリー５ＵＰ５が最近接マッチングとして明らかにされた（９７％超の確率及び９０％のアライメントカバレッジを有する）（Ｒｏｃｋｌｉｎら（３）により設計された対応する配列のまさに実験における構造）（図１４Ｃ参照）。重要なこととして、５ＵＰ５それ自体は、ＴＥＲＭベース配列統計においてクエリーが行われたタンパク質のデータベースで使用されなかった（それ自体ｄｅ  ｎｏｖｏ設計であるので、そのホモログはデータベース中にも存在しなかった）。これは、本明細書に開示される模範的方法を用いて設計された配列がたとえば標的構造にフォールドする可能性などの必要な特徴を有することを示唆する強力な証拠である。付随的に、ＨＨｐｒｅｄにより明らかにされた第２のマッチであるＰＤＢエントリー１ＵＴＡは、標的を強く連想させるフォールドを有する天然構造である（図１４Ｄ参照）。
【０２２６】
参照文献
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１０．  Ｏｈ  ＹＳ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）ＮＨＥＲＦ２  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ＬＰＡ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ−ｂｅｔａ３  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２４（１１）：５０６９−５０７９．
１１．  Ｙｕｎ  ＣＣ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＬＰＡ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８９（１）：Ｃ２−１１．
１２．  Ｌｅｅ  ＳＪ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＭＡＧＩ−３  ｃｏｍｐｅｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ＮＨＥＲＦ−２  ｔｏ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ＬＰＡ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４０（３）：９２４−９３４．
１３．  Ｗｉｌｌｉｅｒ  Ｓ，Ｂｕｔｔ  Ｅ，＆  Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ  ＴＧ（２０１３）Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ（ＬＰＡ）ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ：  ａ  ｆｏｃｕｓｓｅｄ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＬＰＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  １７００  ｃａｎｃｅｒ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０５（８）：３１７−３３３．
１４．  Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａ＋／Ｈ＋  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ２  ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｂｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｔ３  ａｎｄ  ＣＤ２４．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３１０（８）：Ｇ５８６−５９８．
１５．  Ｚｈｅｎｇ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｉｍｉｌａｒ  ＰＤＺ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ａｎ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４２７（２）：４９１−５１０．
１６．  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ａ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  Ｒｅｉｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ＭＰＩ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｔｏｏｌｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｎｅｗ  ＨＨｐｒｅｄ  Ｓｅｒｖｅｒ  ａｔ  ｉｔｓ  Ｃｏｒｅ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．
【０２２７】
以上の詳細な説明及び付随する実施例は、単なる例示にすぎず、添付の特許請求及びその均等物によってのみ定義される本発明の範囲を限定するものとみなすべきではないと理解される。開示された実施形態に対する各種の変更及び修正は当業者には明らかであろう。かかる変更及び修正は、限定されるものではないが、化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、製剤、若しくは方法に関するもの、又は本発明の有用なかかる変更及び修正のいずれかの組合せを含めて、その趣旨及び範囲から逸脱することなく行いうる。
【０２２８】
以上で引用された参照文献（特許及び非特許）はすべて、参照により本特許出願に組み込まれる。それらの参照文献の考察は、それらの著者らによりなされた主張を単にまとめることが意図される。いずれかの参照文献（又はいずれかの参照文献の一部分）が関連先行技術であること（又はまったく先行技術ではないこと）を容認するものではない。出願人は、引用された参照文献の正確性及び妥当性を検証する権利を留保する。
【図１】
2021525917.tif 000046
【図２−１】
2021525917.tif 000047
【図２−２】
2021525917.tif 000048
【図３】
2021525917.tif 000049
【図４−１】
2021525917.tif 000050
【図４−２】
2021525917.tif 000051
【図５】
2021525917.tif 000052
【図６】
2021525917.tif 000053
【図７】
2021525917.tif 000054
【図８】
2021525917.tif 000055
【図９】
2021525917.tif 000056
【図１０−１】
2021525917.tif 000057
【図１０−２】
2021525917.tif 000058
【図１０−３】
2021525917.tif 000059
【図１０−４】
2021525917.tif 000060
【図１０−５】
2021525917.tif 000061
【図１１】
2021525917.tif 000062
【図１２】
2021525917.tif 000063
【図１３】
2021525917.tif 000064
【図１４】
2021525917.tif 000065
【配列表】
2021525917000001.app
【国際調査報告】
2021525917.tif 000066
2021525917.tif 000067