(57)【要約】  本発明は、標的細胞におけるＦＮＤＣ３Ｂの発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチドは、ＦＮＤＣ３ＢプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡにハイブリダイズする。本発明は更にオリゴヌクレオチドのコンジュゲート及び薬学的組成物並びにオリゴヌクレオチドを使用する肝細胞癌又は急性骨髄性白血病などのがんの治療方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂ標的核酸に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％の相補性を有する１０〜３０ヌクレオチド長の連続したヌクレオチド配列を含む、１０〜５０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、細胞において、哺乳動物のＦＮＤＣ３Ｂをコードする標的核酸の発現を低下させることができる、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
連続したヌクレオチド配列が、配列番号：１、２、３、４、５、６、７及び８からなる群から選択される配列、又はその天然起源の変異体に、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
連続したヌクレオチド配列が、哺乳動物のＦＮＤＣ３Ｂをコードする標的核酸に完全に相補的である、請求項１又は２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
連続したヌクレオチド配列が、哺乳動物のＦＮＤＣ３Ｂをコードする標的核酸（例えば配列番号：１）のプレｍＲＮＡに存在するイントロン領域に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、請求項１から３の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
連続したヌクレオチド配列が、配列番号：１の位置１４５〜７２８２４、配列番号：１の位置７２９６４〜９３８４４、及び配列番号：１の位置９３９２０〜１４７０８４から選択されるヒトＦＮＤＣ３ＢのプレｍＲＮＡに存在するイントロン領域に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、請求項１から４の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
連続したヌクレオチド配列が、配列番号：１の哺乳動物のＦＮＤＣ３Ｂをコードする標的核酸のヒトプレｍＲＮＡのヌクレオチド１４５〜７２８２４に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、請求項１から５の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
連続したヌクレオチド配列が、配列番号９、１０、１９又は２０に対して完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、請求項１から５の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
連続したヌクレオチド配列が、配列番号：１の位置５４３６６〜５４３８５、５４４０７〜５４４２６、５４４４８〜５４４６７、５４４８９〜５４５０８、５４５３０〜５４５４９、５４５７１〜５４５９０、５４６１２〜５４６３１；５４３６７〜５４３８４、５４４０８〜５４４２５、５４４４９〜５４４６６、５４４９０〜５４５０７、５４５３１〜５４５４８、５４５７２〜５４５８９、５４６１３〜５４６３０；５４３６８〜５４３８３、５４４０９〜５４４２４、５４４５０〜５４４６５、５４４９１〜５４５０６、５４５３２〜５４５４７、５４５７３〜５４５８８、５４６１４〜５４６２９；５４３６６〜５４３７９、５４４０７〜５４４２０、５４４４８〜５４４６１、５４４８９〜５４５０２、５４５３０〜５４５４３、５４５７１〜５４５８４、５４６１２〜５４６２５；３５１０１６〜３５１０３３；３５１０１６〜３５１０２９；３５１０１６〜３５１０３５；及び３５１０１８〜３５１３３からなる群から選択される配列番号：１の標的領域に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、請求項１から７の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
連続したヌクレオチド配列が、配列番号：１の標的核酸の、１４〜２０などの、１０〜２２ヌクレオチド長の標的領域に対して、完全に相補的などの少なくとも９０％相補的であり、標的領域が標的核酸にわたって少なくとも２回繰り返される、請求項１から８の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
連続したヌクレオチド配列が、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７及び１８からなる群から選択される配列と１００％同一であるなど、少なくとも９０％同一である、請求項１から９の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
連続したヌクレオチド配列が、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７及び１８からなる群から選択される配列からなるか又はそれを含む、請求項１から１０の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
連続したヌクレオチド配列が、一又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項１から１１の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
一又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、請求項１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
一又は複数の修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、請求項１２又は１３の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
連続したヌクレオチド配列が少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１から１４の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
連続したヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも９０％、例えば全てが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１から１５の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨを動員することができる、請求項１から１６の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列が、式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’のギャップマーからなるか又はそれを含み、領域Ｆ及びＦ’が独立して１〜８のヌクレオシドを含み、そのうち１〜５が２’糖修飾ヌクレオシドであり、Ｆ及びＦ’領域の５’及び３’末端を定め、ＧはＲＮアーゼＨを動員することができる６〜１７ヌクレオシドの領域、例えば６〜１７のＤＮＡヌクレオシドを含む領域である、請求項１から１７の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列が、ＧａａｔｔｔｇｃｔａｇｔｇｇｔｇｇｔＧＧ（化合物ＩＤ １１＿１）；ＧＣＴａｇｔｇｇｔｇｇｔＧＧ（化合物ＩＤ １２＿１）；ＡＡＴｔｔｇｃｔａｇｔｇｇｔｇＧＴＧ（化合物ＩＤ １３＿１）；ＡＴＴＴｇｃｔａｇｔｇｇｔｇＧＴ（化合物ＩＤ １４＿１）；ＴＴａｔｔｔｃｔａｃａｇｔｔｔｃｃＡＧＡ（化合物ＩＤ １５＿１）；ＡＴＴＴｃｔａｃａｇｔｔｔｃｃＡＧＡ（化合物ＩＤ １６＿１）；ＣＴａｃａｇｔｔｔｃＣＡＧＡ（化合物ＩＤ １７＿１）；及びＡＴＴＴｃｔａｃａｇｔｔｔＣＣＡ（化合物ＩＤ １８＿１）からなる群から選択され；ここで、大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドなどのＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、場合によっては全てのＬＮＡ Ｃは５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１から１８の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１から１９の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも一つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲート。
【請求項２１】
請求項１から１９の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項２０に記載のコンジュゲートの薬学的に許容される塩。
【請求項２２】
請求項１から１９の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項２０に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む薬学的組成物。
【請求項２３】
哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂを発現している標的細胞における哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂの発現を阻害するためのインビボ又はインビトロ方法であって、請求項１から１９の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２０に記載のコンジュゲート、請求項２１に記載の塩、又は請求項２２に記載の薬学的組成物を有効な量で前記細胞に投与することを含む方法。
【請求項２４】
請求項１から１９の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項２０に記載のコンジュゲート、請求項２１に記載の薬学的に許容される塩、又は請求項２２に記載の薬学的組成物の治療的又は予防的有効量を、疾患に罹患しているか又は罹患しやすい対象に投与することを含む、疾患の治療又は予防方法。
【請求項２５】
疾患が、急性骨髄性白血病、肝細胞癌などの、がんからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
医薬において使用するための、請求項１から１９の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２０に記載のコンジュゲート、請求項２１に記載の薬学的に許容される塩、又は請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
肝細胞癌又は急性骨髄性白血病などの、がんの治療又は予防に使用するための、請求項１から１９の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２０に記載のコンジュゲート、請求項２１に記載の薬学的に許容される塩、又は請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
肝細胞癌又は急性骨髄性白血病などの、がんの治療又は予防のための医薬の調製のための、請求項１から１９の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２０に記載のコンジュゲート、請求項２１に記載の薬学的に許容される塩、又は請求項２２に記載の薬学的組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物のＦＮＤＣ３Ｂ（３Ｂを含むフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン又はＦＡＤ１０４）転写物に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）と治療におけるそれらの使用に関する。そのようなオリゴヌクレオチドは、細胞内のＦＮＤＣ３Ｂ転写物を減少させるために使用することができ、ＦＮＤＣ３Ｂの発現の調節が達成される。ＦＮＤＣ３Ｂの発現の調節は、肝細胞癌及び／又は急性骨髄性白血病などのがんのような、ある範囲の医学的障害に有益である。
【背景技術】
【０００２】
Cai C等, Cell Cycle, 2012 May 1; 11(9):1773-81 は、ＦＮＤＣ３Ｂの増幅と過剰発現が発癌ドライバーであり、特に肝細胞癌における腫瘍原性表現型の維持に必要とされることを開示している。その論文は、ＦＮＤＣ３ＢのｓｈＲＮＡを介した阻害に言及している。
ＲＮＡ干渉を介したＦＮＤＣ３Ｂの阻害は、低分子ヘアピン型ＲＮＡによるものがChin-Hui Lin, Oncotarget. 2016 Aug 2; 7(31): 49498-49508において言及されている。ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ化合物は開示されていないようである。
【０００３】
国際公開第２０１０１１０３４６号は、白血病マーカー遺伝子（ＦＮＤＣ３Ｂなど）から選択される遺伝子の発現を阻害することができる物質又は前記遺伝子の翻訳産物の活性を阻害することができる物質を活性成分として含む、白血病幹細胞を標的とするＡＭＬ（急性骨髄性白血病）のための治療剤を開示している。特定のｓｉＲＮＡ化合物は開示されていないようである。
【０００４】
同じＲＮＡにおける反復部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、インビトロトランスフェクション実験の幾つかの場合に、標的ｍＲＮＡのダウンレギュレーションに対して増強された効力を有していることが示されている。これは、ＧＣＧＲ、ＳＴＳＴ３、ＭＡＰＴ、ＯＧＦＲ、及びＢＯＫ ＲＮＡの場合に当てはまる（Vickers等. PLOS one, October 2014, Volume 9, Issue 10）。国際公開第２０１３／１２０００３号はまた反復ターゲティングによるＲＮＡの調節に言及している。
【発明の目的】
【０００５】
ＦＮＤＣ３Ｂは多くのがんの発生と進行に関与している。本発明は、インビボ又はインビトロで、ＦＮＤＣ３Ｂ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。従って、本発明は、既知のがん治療との併用療法において潜在的に使用することができ、がん、特に急性骨髄性白血病及び／又は肝細胞癌などのがんの症状を潜在的に緩和することができる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂ核酸に相補的であり、それを標的とするオリゴヌクレオチドと、その使用を提供する。
本発明は、標的哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂ核酸に存在する所定の領域又は配列に相補的である連続したヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂ核酸を発現している細胞において哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂ核酸を阻害することができる。
【０００７】
本発明は、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂ核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、そのインビトロ及びインビボでの使用と、医薬におけるそれらの使用を提供する。
本発明は、ＦＮＤＣ３Ｂ核酸を標的とするオリゴヌクレオチドと、ＦＮＤＣ３Ｂの機能に関連する疾患を治療し又は予防し、又はその疾患の症状を緩和するためのそれらの使用に関する。
【０００８】
従って、第一の態様では、本発明は、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂ核酸に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％の相補性を有する、１０〜３０ヌクレオチド長の連続したヌクレオチド配列を含む、１０〜５０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、細胞において、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂをコードする標的核酸の発現を低下させることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００９】
従って、更なる態様では、本発明は、連続したヌクレオチド配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８からなる群から選択される配列、又はそれらの天然起源の変異体に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１０】
従って、更なる態様では、本発明は、配列番号１などのヒトＦＮＤＣ３Ｂ標的核酸に完全に相補的である１０〜３０ヌクレオチド長の連続したヌクレオチド配列を含む、１０〜３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、細胞におけるヒトＦＮＤＣ３Ｂの発現を低下させることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１１】
更なる態様では、本発明は、連続したヌクレオチド配列が配列番号１の一を超える領域に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１２】
更なる態様では、本発明は、連続したヌクレオチド配列が、配列番号：１の位置５４３６６〜５４３８５、５４４０７〜５４４２６、５４４４８〜５４４６７、５４４８９〜５４５０８、５４５３０〜５４５４９、５４５７１〜５４５９０、５４６１２〜５４６３１；５４３６７〜５４３８４、５４４０８〜５４４２５、５４４４９〜５４４６６、５４４９０〜５４５０７、５４５３１〜５４５４８、５４５７２〜５４５８９、５４６１３〜５４６３０；５４３６８〜５４３８３、５４４０９〜５４４２４、５４４５０〜５４４６５、５４４９１〜５４５０６、５４５３２〜５４５４７、５４５７３〜５４５８８、５４６１４〜５４６２９；５４３６６〜５４３７９、５４４０７〜５４４２０、５４４４８〜５４４６１、５４４８９〜５４５０２、５４５３０〜５４５４３、５４５７１〜５４５８４、５４６１２〜５４６２５；３５１０１６〜３５１０３３；３５１０１６〜３５１０２９；３５１０１６〜３５１０３５；３５１０１８〜３５１３３からなる群から選択される配列番号：１の領域に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１３】
更なる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列が、ＧａａｔｔｔｇｃｔａｇｔｇｇｔｇｇｔＧＧ（化合物ＩＤ １１＿１）；ＧＣＴａｇｔｇｇｔｇｇｔＧＧ（化合物ＩＤ １２＿１）；ＡＡＴｔｔｇｃｔａｇｔｇｇｔｇＧＴＧ（化合物ＩＤ １３＿１）；ＡＴＴＴｇｃｔａｇｔｇｇｔｇＧＴ（化合物ＩＤ １４＿１）；ＴＴａｔｔｔｃｔａｃａｇｔｔｔｃｃＡＧＡ（化合物ＩＤ １５＿１）；ＡＴＴＴｃｔａｃａｇｔｔｔｃｃＡＧＡ（化合物ＩＤ １６＿１）；ＣＴａｃａｇｔｔｔｃＣＡＧＡ（化合物ＩＤ １７＿１）；及びＡＴＴＴｃｔａｃａｇｔｔｔＣＣＡ（化合物ＩＤ １８＿１）からなる群から選択され；ここで、大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドなどのＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、場合によっては全てのＬＮＡ Ｃは５−メチルシトシンであり、化合物はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１４】
更なる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列が、ＧａａｔｔｔｇｃｔａｇｔｇｇｔｇｇｔＧＧ（化合物ＩＤ １１＿１）；ＧＣＴａｇｔｇｇｔｇｇｔＧＧ（化合物ＩＤ １２＿１）；ＡＡＴｔｔｇｃｔａｇｔｇｇｔｇＧＴＧ（化合物ＩＤ １３＿１）；ＡＴＴＴｇｃｔａｇｔｇｇｔｇＧＴ（化合物ＩＤ １４＿１）；ＴＴａｔｔｔｃｔａｃａｇｔｔｔｃｃＡＧＡ（化合物ＩＤ １５＿１）；ＡＴＴＴｃｔａｃａｇｔｔｔｃｃＡＧＡ（化合物ＩＤ １６＿１）；ＣＴａｃａｇｔｔｔｃＣＡＧＡ（化合物ＩＤ １７＿１）；及びＡＴＴＴｃｔａｃａｇｔｔｔＣＣＡ（化合物ＩＤ １８＿１）からなる群から選択され；ここで、大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ Ｃは５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１５】
更なる態様では、本発明は、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合された少なくとも一つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲートを提供する。
更なる態様では、本発明は、本発明に係るオリゴヌクレオチド又は本発明に係るコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む薬学的組成物を提供する。
更なる態様では、本発明は、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートの薬学的に許容される塩を提供する。
【００１６】
更なる態様では、本発明は、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂを発現している標的細胞において哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂの発現を阻害するための方法、例えば、インビボ又はインビトロ方法であって、本発明に係るオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、薬学的に許容される塩、又は薬学的組成物を有効量で前記細胞に投与することを含む方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、治療的又は予防的有効量の本発明に係るオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、薬学的に許容される塩、又は薬学的組成物を、疾患に罹患しているか又は罹患しやすい対象に投与することを含む、疾患を治療し又は予防するための方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、肝細胞癌又は急性骨髄性白血病などのがんの治療又は予防のための医薬を調製するための、オリゴヌクレオチド、コンジュゲート、薬学的に許容される塩、又は薬学的組成物の使用を提供する。
【００１７】
［定義］
［オリゴヌクレオチド］
ここで使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、二以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者によって一般に理解されているように定義される。そのような共有結合したヌクレオシドは、核酸分子又はオリゴマーと呼ばれることもある。オリゴヌクレオチドは、通例、固相化学合成とそれに続く精製によって研究室において作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及される場合、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分又はその修飾の配列又は順序に言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは人工のものであり、化学的に合成され、典型的には精製され又は単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、一又は複数の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含みうる。
【００１８】
［アンチセンスオリゴヌクレオチド］
ここで使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸を発現している細胞において、標的核酸、特に標的核酸上の連続した配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的には二本鎖ではないため、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、内部又は相互の自己相補性の程度がオリゴヌクレオチドの全長にわたって５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重構造（同じオリゴヌクレオチドの二分子間の二重鎖）を形成できることが理解される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは人工のものであり、化学的に合成され、典型的には精製され又は単離される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一又は複数の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含みうる。
【００１９】
［連続したヌクレオチド配列］
「連続したヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、ここでは、「連続した核酸塩基配列」という用語及び「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に使用される。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが連続したヌクレオチド配列を構成する。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、Ｆ−Ｇ−Ｆ’ギャップマー領域などの連続したヌクレオチド配列を含み、更なるヌクレオチド、例えば、連続したヌクレオチド配列に官能基を結合させるために使用されうるヌクレオチドリンカー領域を場合によっては含みうる。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。
【００２０】
［ヌクレオチド］
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明の目的では、天然起源のヌクレオチドと非天然起源のヌクレオチドの双方を含む。天然では、ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分及び一又は複数のリン酸基（これはヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた互換的に「単位」又は「モノマー」と呼ばれうる。
【００２１】
［修飾ヌクレオシド］
ここで使用される「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分又は（ヌクレオ）塩基部分の一又は複数の修飾の導入により等価なＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施態様では、修飾ヌクレオシドは修飾糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語はまた「ヌクレオシドアナログ」又は修飾「単位」又は修飾「モノマー」という用語とここでは互換的に使用されうる。未修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、ここではＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと呼ばれる。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を含むヌクレオシドは、ワトソン・クリックの塩基対形成を許容する場合、なお一般的にＤＮＡ又はＲＮＡと呼ばれる。
【００２２】
［修飾ヌクレオシド間結合］
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、二つのヌクレオシドを一緒に共有結合させるホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に一般的に理解されるように定義される。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含みうる。幾つかの実施態様では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる。天然起源のオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合には、隣接するヌクレオシド間にホスホジエステル結合を形成するリン酸基が含まれる。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボでの使用のためのオリゴヌクレオチドを安定にするのに特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの領域、例えば、ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内並びに修飾ヌクレオシドの領域、例えば領域Ｆ及びＦ’でのヌクレアーゼ切断から保護するのに役立ちうる。
【００２３】
一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、例えば、ヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性である一又は複数の修飾ヌクレオシド間結合などの、天然ホスホジエステルから修飾された一又は複数のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、血清中でオリゴヌクレオチドをインキュベートすることによって、又はヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えば、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を使用することによって決定され得、双方とも当該技術分野で周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強することができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と呼ばれる。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチド内のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％、又はその連続したヌクレオチド配列が修飾され、オリゴヌクレオチド内のヌクレオシド間結合の例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、又は例えば少なくとも９０％、又はその連続したヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合の全て、又はその連続したヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。幾つかの実施態様では、コンジュゲートのような、非ヌクレオチド官能基に本発明のオリゴヌクレオチドを連結するヌクレオシドが、ホスホジエステルでありうることが認識される。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチドでの使用に好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートである。
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態及び製造の容易さのために特に有用である。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチド内のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％、又はその連続したヌクレオチド配列が、ホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチド内のヌクレオシド間結合の例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％又は例えば少なくとも９０％、又はその連続したヌクレオチド配列が、ホスホロチオエートである。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合の全て、又はその連続したヌクレオチド配列が、ホスホロチオエートである。幾つかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロジチオエート結合（群）に加えて、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合と少なくとも一つのホスホジエステル結合、例えば２、３又は４のホスホジエステル結合の両方を含む。ギャップマーオリゴヌクレオチドでは、ホスホジエステル結合は、存在する場合、ギャップ領域Ｇの連続したＤＮＡヌクレオシド間には適切には位置していない。
【００２５】
ホスホロチオエート結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、ギャップマーの領域Ｇなどの標的核酸と二重鎖を形成するときにヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域において特に有用である。しかしながら、ホスホロチオエート結合はまた非ヌクレアーゼ動員領域及び／又は親和性増強領域、例えばギャップマーの領域Ｆ及びＦ’においても有用でありうる。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、幾つかの実施態様では、領域Ｆ又はＦ’、あるいは領域Ｆ及びＦ’の両方に一又は複数のホスホジエステル結合を含み得、領域Ｇ内の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートでありうる。
有利には、オリゴヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列中の全てのヌクレオシド間結合、又はオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である。
【００２６】
欧州特許出願公開第２７４２１３５号に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステル及びホスホロチオエート以外）、例えば欧州特許出願公開第２７４２１３５号によれば、例えば他のＤＮＡホスホロチオエートギャップ領域で許容されうる、アルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間を含みうることが認識される。
【００２７】
［核酸塩基］
核酸塩基という用語は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成するヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えば、ウラシル、チミン及びシトシン）部分を含む。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然起源の核酸塩基とは異なりうるが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能的である修飾核酸塩基をまた包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン及びヒポキサンチンなどの天然起源の核酸塩基、並びに非天然起源の変異体の両方を指す。そのような変異体は、例えばHirao等 (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055及びBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記載されている。
【００２８】
幾つかの実施態様では、核酸塩基部分は、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−メチルシトシン、５−チオゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル ５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、２’チオ−チミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン及び２−クロロ−６−アミノプリンから選択されるヌクレオベースなどの置換プリン又は置換ピリミジンなどの修飾プリン又はピリミジンにプリン又はピリミジンを変えることによって修飾される。
【００２９】
核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基の文字コード、例えば  Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵによって示すことができ、各文字は、等価な機能の修飾核酸塩基を場合によっては含みうる。例えば、例示されたオリゴヌクレオチドでは、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５−メチルシトシンから選択される。場合によっては、ＬＮＡギャップマーでは、５−メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用されうる。
【００３０】
［修飾オリゴヌクレオチド］
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、一又は複数の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記述する。「キメラ」オリゴヌクレオチドという用語は、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。
【００３１】
［相補性］
「相補性」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対形成の能力を記述する。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）とアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含みうることが理解され、例えば、５−メチルシトシンがシトシンの代わりにしばしば使用され、よって相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基間のワトソン・クリック塩基対形成を包含する（例えば、Hirao等 (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 pp 2055及びBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1を参照）。
【００３２】
ここで使用される「相補性％」という用語は、連続したヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、標的配列又は配列モチーフ）に相補的である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）中の連続したヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセント）を指す。従って、相補性のパーセントは、（標的配列５’−３’及び３’−５’のオリゴヌクレオチド配列と整列した場合）二つの配列間で（ワトソン・クリック塩基対から）相補的である整列した核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの全数で割り、１００を掛けることにより計算される。そのような比較では、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドはミスマッチと呼ばれる。連続したヌクレオチド配列の相補性％の計算では、挿入と欠失は許容されない。相補性を決定する際、ワトソン・クリック塩基対形成を形成する核酸塩基の機能的能力が維持される限り、核酸塩基の化学修飾は無視されることが理解される（例えば、５’−メチルシトシンは、同一性％を計算する目的ではシトシンと同一であると見なされる）。
【００３３】
「完全に相補的」という用語は、１００％の相補性を指す。
次は、標的核酸に完全に相補的である本発明に係るオリゴヌクレオチドの例である。
次は、標的核酸（配列番号：６）に完全に相補的であるオリゴヌクレオチド（配列番号：１５）の例である。
５' ＣＡＡＣＡＴＧＣＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ ３’（配列番号：６）
３' ＣＧＡＧＣＣＧＧＡＣＡＡＴＧＴＧＴＧＴＧ ５'（配列番号：１５）
【００３４】
［同一性］
ここで使用される「同一性」という用語は、連続したヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）と同一である核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）における連続したヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。従って、同一性パーセントは、（本発明の化合物の連続したヌクレオチド配列及び参照配列における）二つの配列間で同一（マッチ）である整列された塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドの全数で割り、１００を掛けることによって計算される。従って、同一性パーセント＝（マッチ×１００）／整列領域（例えば、連続したヌクレオチド配列）の長さ。挿入及び欠失は、連続したヌクレオチド配列の同一性のパーセントの計算では許可されない。同一性を決定する際、ワトソン・クリック塩基対形成を形成する核酸塩基の機能的能力が維持されている限り、核酸塩基の化学修飾は無視される（例えば、５−メチルシトシンは同一性％を計算する目的ではシトシンと同一であると見なされる）。
【００３５】
［ハイブリダイゼーション］
ここで使用される「ハイブリダイズする（hybridizing）」又は「ハイブリダイズする（hybridizes）」という用語は、反対のストランド上の塩基対間に水素結合を形成し、それにより二本鎖を形成する二つの核酸鎖（例えばオリゴヌクレオチドと標的核酸）として理解されるべきである。二つの核酸鎖間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。それは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二本鎖になる温度として定義される融解温度（Ｔｍ）によってしばしば記述される。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密には比例しない（Mergny及びLacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537）。標準状態のギブス自由エネルギーΔＧ°が、結合親和性のより正確な表示であり、ΔＧ°＝−ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）に関係し、ここで、Ｒはガス定数、Ｔは絶対温度である。従って、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の反応の非常に低いΔＧ°が、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃の反応に関連するエネルギーである。オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションは自発反応であり、自発反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Hansen等, 1965,Chem. Comm. 36-38及びHoldgate等, 2005, Drug Discov Todayに記載されているような等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法を使用することにより、実験的に測定することができる。当業者には、ΔＧ°測定のために市販の機器が利用可能であることが分かるであろう。ΔＧ°は、Sugimoto等, 1995, Biochemistry 34:11211-11216及びMcTigue等, 2004, Biochemistry 43:5388-5405によって記載されている適切に導出された熱力学的パラメーターを使用し、SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465によって記載されている隣接モデルを使用して数値的に推定することもできる。ハイブリダイゼーションによってその意図された核酸標的を調節する可能性を有するためには、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜３０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドに対して−１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。幾つかの実施態様では、ハイブリダイゼーションの度合い又は強度は、標準状態のギブス自由エネルギーΔＧ°によって測定される。オリゴヌクレオチドは、８〜３０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドの場合、−１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば−１５ｋｃａｌ未満、例えば−２０ｋｃａｌ未満、例えば−２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズしうる。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、−１０〜−６０ｋｃａｌ、例えば−１２〜−４０、例えば−１５〜−３０ｋｃａｌ又は−１６〜−２７ｋｃａｌ、例えば−１８〜−２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。
【００３６】
［標的核酸］
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂをコードする核酸であり、例えば、遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列でありうる。従って、標的はＦＮＤＣ３Ｂ標的核酸と呼ばれる場合がある。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂのエキソン領域を標的としうるか、又は、例えば、ＦＮＤＣ３ＢプレｍＲＮＡ中の任意のイントロン領域を標的としうる（例えば、表１を参照のこと）。
2021505175.tif 000002
【００３７】
適切には、標的核酸は、ＦＮＤＣ３Ｂタンパク質、特にヒトＦＮＤＣ３Ｂなどの哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂ（例えば、ヒト、サル、マウス及びラットＦＮＤＣ３ＢのｍＲＮＡ及びプレｍＲＮＡ配列を提供する表２及び３を参照）をコードする。
幾つかの実施態様では、標的核酸は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７及び８又はそれらの天然起源の変異体（例えば、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂタンパク質をコードする配列）からなる群から選択される。
【００３８】
標的核酸は、幾つかの実施態様では、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂタンパク質、例えばヒトＦＮＤＣ３Ｂ、例えばヒトプレｍＲＮＡ配列をコードするＲＮＡ又はＤＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ、例えば成熟ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ、例えば配列番号：１として開示されているもの又は配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６及び配列番号：７に開示されているヒト成熟ｍＲＮＡ又はそれらの天然起源の変異体（例えば、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂタンパク質をコードする配列）でありうる。
【００３９】
本発明のオリゴヌクレオチドを研究又は診断に用いる場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ又はＤＮＡもしくはＲＮＡに由来する合成核酸でありうる。
【００４０】
インビボ又はインビトロ適用の場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には、ＦＮＤＣ３Ｂ標的核酸を発現している細胞においてＦＮＤＣ３Ｂ標的核酸の発現を阻害することができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続した配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さにわたって測定すると、場合によっては一つ又は二つのミスマッチを除き、場合によってはオリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの任意の官能基に連結しうるヌクレオチドベースのリンカー領域、又は他の非相補的末端ヌクレオチド（例えば、領域Ｄ’又はＤ”）を除外して、ＦＮＤＣ３Ｂ標的核酸に典型的には相補的である。標的核酸は、幾つかの実施態様では、ＲＮＡ又はＤＮＡ、例えば成熟ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡなどのメッセンジャーＲＮＡでありうる。幾つかの実施態様では、標的核酸は、ヒトＦＮＤＣ３Ｂなどの哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ又はＤＮＡ、例えば、配列番号１として開示されているものなどのヒトＦＮＤＣ３ＢプレｍＲＮＡ配列である。例示的な標的核酸に関する更なる情報は表２及び３に提供される。
【００４１】
2021505175.tif 000003
2021505175.tif 000004
【００４２】
［標的配列］
ここで使用される「標的配列」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的である核酸塩基配列を含む、標的核酸に存在するヌクレオチドの配列を指す。幾つかの実施態様では、標的配列は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列に相補的である核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に、標的ヌクレオチド配列、標的配列又は標的領域と呼ばれる場合がある。幾つかの実施態様では、標的配列は、単一のオリゴヌクレオチドの連続した相補的配列よりも長く、例えば、本発明の幾つかのオリゴヌクレオチドによって標的化されうる標的核酸の好ましい領域を表しうる。
【００４３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ここに記載される標的配列などの標的核酸に相補的である連続したヌクレオチド配列を含む。
オリゴヌクレオチドが相補的である標的配列は、一般に、少なくとも１０ヌクレオチドの連続した核酸塩基配列を含む。連続したヌクレオチド配列は、１０〜５０のヌクレオチド、例えば１２〜３０、例えば１４〜２０、例えば１５〜１８の連続したヌクレオチドである。
【００４４】
本発明の一実施態様では、標的配列は配列番号：９である。
本発明の別の実施態様では、標的配列は配列番号：１０である。
本発明の別の実施態様では、標的配列は配列番号：１９である。
本発明の別の実施態様では、標的配列は配列番号：２０である。
【００４５】
［反復標的領域］
標的領域又は標的配列は、標的核酸に対して独特でありうる（一回だけ存在）。
【００４６】
本発明の幾つかの態様では、標的領域は、標的核酸のスパンにわたって少なくとも２回繰り返される。本発明に包含されるところの繰り返されるとは、異なる位置で標的核酸に生じる、少なくとも１０、例えば少なくとも１１、又は少なくとも１２のヌクレオチド長の少なくとも二つの同一のヌクレオチド配列（標的領域）が存在することを意味する。各反復標的領域は、標的核酸の連続した配列上の少なくとも一つの核酸塩基によって同一領域から分離され、標的核酸内の異なる非重複位置に配置させられる。
【００４７】
［標的細胞］
ここで使用される「標的細胞」という用語は、標的核酸を発現している細胞を指す。幾つかの実施態様では、標的細胞は、インビボ又はインビトロでありうる。幾つかの実施態様では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞又はラット細胞、又は霊長類細胞、例えばサル細胞又はヒト細胞である。
好ましい実施態様では、標的細胞は、ＦＮＤＣ３Ｂ ｍＲＮＡ、例えばＦＮＤＣ３ＢプレｍＲＮＡ又はＦＮＤＣ３Ｂ成熟ｍＲＮＡを発現する。ＦＮＤＣ３Ｂ ｍＲＮＡのポリＡテールは、アンチセンスオリゴヌクレオチドターゲティングでは無視される。
【００４８】
［天然起源の変異体］
「天然起源の変異体」という用語は、標的核酸と同じ遺伝子座に由来し、標的核酸と同じ染色体位置及び方向からの方向性転写物であるが、例えば同じアミノ酸をコードするコドンの多重度を引き起こす遺伝コードの縮重のため、又はプレｍＲＮＡの選択的スプライシング、又は一塩基多型などの多型の存在、及び対立遺伝子変異体のため、異なる場合があるＦＮＤＣ３Ｂ遺伝子又は転写物の変異体を指す。従って、オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸とその天然起源の変異体を標的としうる。
【００４９】
幾つかの実施態様では、天然起源の変異体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７又は８からなる群から選択される標的核酸などの、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂ標的核酸に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性を有する。
【００５０】
［発現の調節］
ここで使用される「発現の調節」という用語は、オリゴヌクレオチドの投与前のＦＮＤＣ３Ｂの量と比較した場合の、ＦＮＤＣ３Ｂの量を変えるオリゴヌクレオチドの能力の総称として理解されるべきである。あるいは、発現の調節は、対照実験を参照することによって決定されうる。一般に、対照は、生理食塩水組成物で処理された標的細胞又は非標的化オリゴヌクレオチド（モック）で処理された標的細胞であると理解される。
【００５１】
本発明に係る調節は、例えばｍＲＮＡの分解又は転写の遮断によって、ＦＮＤＣ３Ｂの発現を阻害し、ダウンレギュレートし、低減させ、抑制し、除去し、停止させ、遮断し、防止し、少なくし、回避し又は終結させるアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力として理解されるものとする。
【００５２】
［高親和性修飾ヌクレオシド］
高親和性修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、例えば、融解温度（Ｔｍ）によって測定した、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシド当たり、＋０．５〜＋１２℃、より好ましくは＋１．５〜＋１０℃、最も好ましくは＋３〜＋８℃の融解温度の増加をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野で知られており、例えば、多くの２’置換ヌクレオシド並びにロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる（例えば、Freier及びAltmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213を参照）。
【００５３】
［糖修飾］
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見出されるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する一又は複数のヌクレオシドを含みうる。
リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが、主に、親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの所定の特性を改善する目的で作製されている。
【００５４】
そのような修飾には、ヘキソース環（ＨＮＡ）、又はリボース環のＣ２炭素とＣ４炭素の間にビラジクル架橋を典型的には有する二環式環（ＬＮＡ）、又はＣ２炭素とＣ３炭素の間の結合を典型的には欠く非結合リボース環（例えばＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドには、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ核酸の場合、糖部分が非糖部分で置換されているヌクレオシドもまた含まれる。
【００５５】
［２’修飾ヌクレオシド］
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位置にＨ又は−ＯＨ以外の置換基を有するか（２’置換ヌクレオシド）、又は例えばＬＮＡ（２’−４’ビラジクル架橋）ヌクレオシドなどの２’炭素とリボース環の２番目の炭素の間に架橋を形成することができる２’結合ビラジクルを含むヌクレオシドである。
【００５６】
実際、２’置換ヌクレオシドの開発に多くの焦点が費やされており、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合、多数の２’置換ヌクレオシドが有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、結合親和性の向上及び／又はヌクレアーゼ耐性の増加をオリゴヌクレオチドにもたらしうる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、及び２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドである。更なる例については、例えばFreier及びAltmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213、及びDeleavey及びDamha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照のこと。以下に、幾つかの２置換修飾ヌクレオシドの例を示す。
【００５７】
2021505175.tif 000005
本発明との関連では、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡのような２’架橋ヌクレオシドを含まない。
【００５８】
［ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡ）］
「ＬＮＡヌクレオシド」は、リボース環の立体構造を制限し又はロックする、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’及びＣ４’を連結するビラジカル（「２’−４’架橋」とも呼ばれる）を含む２’修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドはまた文献では架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれている。リボースの立体構造のロックは、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の増強（二重鎖安定化）に関連している。これは、オリゴヌクレオチド／相補二重鎖の融解温度を測定することにより、常套的に決定することができる。
【００５９】
非限定的な例示的ＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Morita等, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76、Seth等 J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81及びMitsuoka等, Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238に開示されている。
【００６０】
２’−４’架橋は２〜４の架橋原子を含み、特に式−Ｘ−Ｙ−であり、ＸはＣ４’に連結され、ＹはＣ２’に連結されており、
ここで、
Ｘは酸素、硫黄、−ＣＲａＲｂ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（＝ＣＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−ＳＯ２−、−ＮＲａ−；−Ｏ−ＮＲａ−、−ＮＲａ−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｊ）−、Ｓｅ、−Ｏ−ＮＲａ−、−ＮＲａ−ＣＲａＲｂ−、−Ｎ（Ｒａ）−Ｏ−又は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり；
Ｙは酸素、硫黄、−（ＣＲａＲｂ）ｎ−、−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−ＳＯ２−、−ＮＲａ−、−Ｃ（＝Ｊ）−、Ｓｅ、−Ｏ−ＮＲａ−、−ＮＲａ−ＣＲａＲｂ−、−Ｎ（Ｒａ）−Ｏ−又は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり；
但し、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−Ｏ−、Ｓｉ（Ｒａ）２−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−ＳＯ２−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−又は−Ｓｅ−Ｓｅ−ではなく；
Ｊは酸素、硫黄、＝ＣＨ２又は＝Ｎ（Ｒａ）であり；
Ｒａ及びＲｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、−ＯＣ（＝Ｘａ）Ｒｃ、−ＯＣ（＝Ｘａ）ＮＲｃＲｄ及び−ＮＲｅＣ（＝Ｘａ）ＮＲｃＲｄから独立して選択され；
又は二つのジェミナルなＲａ及びＲｂが一緒になって、置換されていてもよいメチレンを形成し；
又は二つのジェミナルなＲａ及びＲｂが、それらが結合している炭素原子と一緒になって、−Ｘ−Ｙ−の炭素原子が一つだけのシクロアルキル又はハロシクロアルキルを形成し；
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシ及び置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシリル、アリール及びヘテロアリールから独立して選択される１〜３の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル及びメチレンであり；
Ｘａは酸素、硫黄又は−ＮＲｃであり；
Ｒｃ、Ｒｄ、及びＲｅは、水素及びアルキルから独立して選択され；かつ
ｎは１、２、又は３である。
【００６１】
本発明の更なる特定の実施態様では、Ｘは、酸素、硫黄、−ＮＲａ−、−ＣＲａＲｂ−又は−Ｃ（＝ＣＲａＲｂ）−、特に酸素、硫黄、−ＮＨ−、−ＣＨ２−又は−Ｃ（＝ＣＨ２）−、より具体的には酸素である。
本発明の別の特定の実施態様では、Ｙは、−ＣＲａＲｂ−、−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−又は−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−、特に−ＣＨ２−ＣＨＣＨ３−、−ＣＨＣＨ３−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−又は−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−（ＣＲａＲｂ）ｎ−、−Ｓ−ＣＲａＲｂ−、−Ｎ（Ｒａ）ＣＲａＲｂ−、−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−、−Ｏ−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、−Ｃ（＝ＣＲａＲｂ）−ＣＲａＲｂ−、−Ｎ（Ｒａ）ＣＲａＲｂ−、−Ｏ−Ｎ（Ｒａ）−ＣＲａＲｂ−又は−Ｎ（Ｒａ）−Ｏ−ＣＲａＲｂ−である。
【００６２】
本発明の特定の実施態様では、Ｒａ及びＲｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル及びアルコキシアルキル、特に水素、ハロゲン、アルキル及びアルコキシアルキルからなる群から独立して選択される。
本発明の別の実施態様では、Ｒａ及びＲｂは、水素、フルオロ、ヒドロキシル、メチル及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、特に水素、フルオロ、メチル及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３からなる群から独立して選択される。
有利には、−Ｘ−Ｙ−のＲａ及びＲｂの一方は上で定義された通りであり、他のものは全て同時に水素である。
本発明の更なる特定の実施態様では、Ｒａは水素又はアルキル、特に水素又はメチルである。
本発明の別の特定の実施態様では、Ｒｂは水素又はアルキル、特に水素又はメチルである。
本発明の特定の実施態様では、Ｒａ及びＲｂの一方又は両方は水素である。
本発明の特定の実施態様では、Ｒａ及びＲｂの一方のみが水素である。
本発明の特定の一実施態様では、Ｒａ及びＲｂの一方はメチルであり、他のものは水素である。
本発明の特定の実施態様では、Ｒａ及びＲｂは、両方とも同時にメチルである。
【００６３】
本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３）−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｃ（＝ＣＨ２）ＣＨ２−、−Ｃ（＝ＣＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｎ（ＯＣＨ３）ＣＨ２−又は−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２−である。
本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、ここで、Ｒａ及びＲｂは、水素、アルキル及びアルコキシアルキル、特に水素、メチル及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３からなる群から独立して選択される。
特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−、特に−Ｏ−ＣＨ２−である。
【００６４】
２’−４’架橋は、式（Ａ）及び式（Ｂ）にそれぞれ示されるように、リボース環の面の下（ベータ−Ｄ−立体構造）又はリボース環の面の上（アルファ−Ｌ−立体構造）に配置されうる。
本発明に係るＬＮＡヌクレオシドは、特に式（Ａ）又は（Ｂ）のものであり、
2021505175.tif 000006
ここで、
Ｗは酸素、硫黄、−Ｎ（Ｒａ）−又は−ＣＲａＲｂ−、特に酸素であり；
Ｂは核酸塩基又は修飾核酸塩基であり；
Ｚは、隣接ヌクレオシド又は５’末端基へのヌクレオシド間結合であり；
Ｚ＊は、隣接ヌクレオシド又は３’末端基へのヌクレオシド間結合であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は、水素、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アジド、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル及びアリールから独立して選択され；かつ
Ｘ、Ｙ、Ｒａ及びＲｂは上で定義された通りである。
【００６５】
特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒａは水素又はアルキル、特に水素又はメチルである。別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒｂは水素又はアルキル、特に水素又はメチルである。更なる特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒａ及びＲｂの一方又は両方が水素である。特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒａ及びＲｂの一方のみが水素である。特定の一実施態様では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒａ及びＲｂの一方はメチルであり、他のものは水素である。特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒａ及びＲｂは両方とも同時にメチルである。
【００６６】
更なる特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒａは水素又はアルキル、特に水素又はメチルである。別の特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒｂは水素又はアルキル、特に水素又はメチルである。特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒａ及びＲｂの一方又は両方が水素である。特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒａ及びＲｂの一方のみが水素である。特定の一実施態様では、Ｘの定義において、Ｒａ及びＲｂの一方はメチルであり、他のものは水素である。特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒａ及びＲｂは両方とも同時にメチルである。
【００６７】
更なる特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒａは水素又はアルキル、特に水素又はメチルである。別の特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒｂは水素又はアルキル、特に水素又はメチルである。特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒａ及びＲｂの一方又は両方が水素である。特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒａ及びＲｂの一方のみが水素である。特定の一実施態様では、Ｙの定義において、Ｒａ及びＲｂの一方はメチルであり、他のものは水素である。特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒａ及びＲｂは両方とも同時にメチルである。
【００６８】
本発明の特定の実施態様では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は、水素及びアルキル、特に水素及びメチルから独立して選択される。
本発明の更に特定の有利な実施態様では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は、全て同時に水素である。
本発明の別の特定の実施態様では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て同時に水素であり、Ｒ５及びＲ５＊の一方は水素であり、他のものは上で定義された通りであり、特にアルキル、より特定的にはメチルである。
【００６９】
本発明の特定の実施態様では、Ｒ５及びＲ５＊は、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシアルキル及びアジド、特に水素、フルオロ、メチル、メトキシエチル及びアジドから独立して選択される。本発明の特に有利な実施態様では、Ｒ５及びＲ５＊の一方が水素であり、他のものはアルキル、特にメチル、ハロゲン、特にフルオロ、アルコキシアルキル、特にメトキシエチル又はアジドであり；又はＲ５及びＲ５＊は両方が同時に水素又はハロゲンであり、特に両方が同時に水素又はフルオロである。そのような特定の実施態様では、Ｗは有利には酸素であり得、−Ｘ−Ｙ−は有利には−Ｏ−ＣＨ２−でありうる。
【００７０】
本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て同時に水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、全てが出典明示によりここに援用される国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号及び国際公開第２００４／０４６１６０号に開示されており、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ及びアルファ−Ｌ−オキシＬＮＡヌクレオシドのような当該分野で一般に知られているものを含む。
【００７１】
本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て同時に水素である。そのようなチオＬＮＡヌクレオシドは、出典明示によりここに援用される国際公開第９９／０１４２２６号及び国際公開第２００４／０４６１６０号に開示されている。
本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−ＮＨ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て同時に水素である。そのようなアミノＬＮＡヌクレオシドは、出典明示によりここに援用される国際公開第９９／０１４２２６号及び国際公開第２００４／０４６１６０号に開示されている。
【００７２】
本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−又は−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て同時に水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、出典明示によりここに援用される国際公開第００／０４７５９９号及びMorita等, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76に開示されており、２’−Ｏ−４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）として当該分野で一般に知られているものを含む。
本発明の別の特定の実施態様では、ーＸ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は同時に全て水素であり、Ｒ５及びＲ５＊の一方は水素であり、他のものは水素ではなく、例えばアルキル、例えばメチルである。そのような５’置換ＬＮＡヌクレオシドは、出典明示によりここに援用される国際公開第２００７／１３４１８１号に開示されている。
【００７３】
本発明の別の特定の実施態様では、ーＸ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、Ｒａ及びＲｂの一方又は両方は水素ではなく、特にメチルなどのアルキルであり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て同時に水素であり、Ｒ５及びＲ５＊の一方は水素であり、他のものは水素ではなく、特にアルキル、例えばメチルである。そのようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドは、出典明示によりここに援用される国際公開第２０１０／０７７５７８号に開示されている。
本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨＲａ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て同時に水素である。そのような６’−置換ＬＮＡヌクレオシドは、出典明示により両方がここに援用される国際公開第２０１０／０３６６９８号及び国際公開第２００７／０９００７１号に開示されている。そのような６’置換ＬＮＡヌクレオシドでは、Ｒａは特にメチルなどのＣ１−Ｃ６アルキルである。
【００７４】
本発明の別の特定の実施態様では、ーＸ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３）−である（「２’Ｏ−メトキシエチル二環式核酸」、Seth等 J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81）。
本発明の別の特定の実施態様では、ーＸ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−である（「２’Ｏ−エチル二環式核酸」、Seth等, J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81）。
本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３）−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て同時に水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドはまた当該技術分野において環状ＭＯＥ（ｃＭＯＥ）として知られており、国際公開第２００７／０９００７１号に開示されている。
【００７５】
本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−である。
本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−である（Seth等, J. Org. Chem 2010 op. cit.）。
本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て同時に水素である。そのような６’−メチルＬＮＡヌクレオシドは、当該技術分野ではｃＥＴヌクレオシドとしても知られており、出典明示により両方がここに援用される国際公開第２００７／０９００７１号（ベータ−Ｄ）及び国際公開第２０１０／０３６６９８号（アルファ−Ｌ）に開示されているように、（Ｓ）−ｃＥＴ又は（Ｒ）−ｃＥＴジアステレオ異性体の何れかでありうる。
【００７６】
本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、ＲａもＲｂも水素ではなく、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て同時に水素である。特定の実施態様では、Ｒａ及びＲｂは両方とも同時にアルキルであり、特に両方とも同時にメチルである。そのような６’−二置換ＬＮＡヌクレオシドは、出典明示によりここに援用される国際公開第２００９／００６４７８号に開示されている。
本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨＲａ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て同時に水素である。そのような６’−置換チオＬＮＡヌクレオシドは、出典明示によりここに援用される国際公開第２０１１／１５６２０２号に開示されている。そのような６’−置換チオＬＮＡの特定の実施態様では、Ｒａはアルキル、特にメチルである。
【００７７】
本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｃ（＝ＣＨ２）Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（＝ＣＨＦ）Ｃ（ＲａＲｂ）−又は−Ｃ（＝ＣＦ２）Ｃ（ＲａＲｂ）−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は同時に全て水素である。Ｒａ及びＲｂは、有利には、水素、ハロゲン、アルキル及びアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロ及びメトキシメチルから独立して選択される。特に、Ｒａ及びＲｂは同時に水素又はメチルであるか、又はＲａ及びＲｂの一方は水素であり、他のものはメチルである。そのようなビニルカルボＬＮＡヌクレオシドは、双方が出典明示によりここに援用される国際公開第２００８／１５４４０１号及び国際公開第２００９／０６７６４７号に開示されている。
本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｎ（ＯＲａ）−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て同時に水素である。特定の実施態様では、Ｒａはメチルなどのアルキルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドはＮ置換ＬＮＡとしても知られており、出典明示によりここに援用される国際公開第２００８／１５０７２９号に開示されている。
【００７８】
本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−Ｎ（Ｒａ）−、−Ｎ（Ｒａ）−Ｏ−、−ＮＲａ−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−又は−ＮＲａ−ＣＲａＲｂ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て同時に水素である。Ｒａ及びＲｂは、有利には、水素、ハロゲン、アルキル及びアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロ及びメトキシメチルから独立して選択される。特定の実施態様では、Ｒａはメチルなどのアルキルであり、Ｒｂは水素又はメチル、特に水素である。（Seth等, J. Org. Chem 2010 op. cit.）。
本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−である（Seth等, J. Org. Chem 2010 op. cit.）。
本発明の特定の実施態様では、Ｒ５及びＲ５＊は、両方とも同時に水素である。本発明の別の特定の実施態様では、Ｒ５及びＲ５＊の一方は水素であり、他のものはメチルなどのアルキルである。そのような実施態様では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は特に水素であり得、−Ｘ−Ｙ−は特に−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−ＣＨＣ（Ｒａ）３−、例えば−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−でありうる。
【００７９】
本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、例えば−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て同時に水素である。そのような特定の実施態様では、Ｒａは、特にメチルなどのアルキルであり、Ｒｂは水素又はメチル、特に水素でありうる。そのようなＬＮＡヌクレオシドはまた立体構造的に制限されたヌクレオチド（ＣＲＮ）としても知られており、出典明示によりここに援用される国際公開第２０１３／０３６８６８に開示されている。
本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、例えば−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は全て同時に水素である。Ｒａ及びＲｂは、有利には、水素、ハロゲン、アルキル及びアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロ及びメトキシメチルから独立して選択される。そのような特定の実施態様では、Ｒａは、特にメチルなどのアルキルであり、Ｒｂは水素又はメチル、特に水素でありうる。 そのようなＬＮＡヌクレオシドはまたＣＯＣヌクレオチドとしても知られており、出典明示によりここに援用されるMitsuoka等, Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238に開示されている。
【００８０】
特に明記しない限り、ＬＮＡヌクレオシドはベータ−Ｄ又はアルファ−Ｌの立体異性体でありうることが認識される。
本発明のＬＮＡヌクレオシドの特定の例を、スキーム１に提示する（ここで、Ｂは上で定義された通りである）。
2021505175.tif 000007
特定のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、６’−メチル−ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）−６’−メチル−ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡである。
【００８１】
［化学基の定義］
本明細書において、「アルキル」という用語は、単独で又は組み合わせて、１〜８個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基、特に１〜６個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基、より特定的には１〜４個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基を意味する。直鎖及び分岐鎖Ｃ１−Ｃ８アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、異性ペンチル、異性ヘキシル、異性ヘプチル及び異性オクチル、特にメチル、エチル、プロピル、ブチル及びペンチルである。アルキルの特定の例は、メチル、エチル及びプロピルである。
「シクロアルキル」という用語は、単独で又は組み合わせて、３〜８個の炭素原子を有するシクロアルキル環、特に３〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル環を意味する。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル及びシクロオクチル、より特定的にはシクロプロピル及びシクロブチルである。「シクロアルキル」の特定の例は、シクロプロピルである。
【００８２】
「アルコキシ」という用語は、単独で又は組み合わせて、式アルキル−Ｏ−の基を意味し、ここで「アルキル」という用語は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃブトキシ及びｔｅｒｔブトキシなどの以前に与えられた意味を有する。特定の「アルコキシ」は、メトキシ及びエトキシである。メトキシエトキシは、「アルコキシアルコキシ」の特定の例である。
「オキシ」という用語は、単独で又は組み合わせて、−Ｏ−基を意味する。
「アルケニル」という用語は、単独で又は組み合わせて、オレフィン結合と最大８個、好ましくは最大６個、特に好ましくは最大４個の炭素原子を含む直鎖又は分岐炭化水素残基を意味する。アルケニル基の例は、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル及びイソブテニルである。
【００８３】
「アルキニル」という用語は、単独で又は組み合わせて、三重結合と最大８個、好ましくは最大６個、特に好ましくは最大４個の炭素原子を含む直鎖又は分岐炭化水素残基を意味する。
「ハロゲン」又は「ハロ」という用語は、単独で又は組み合わせて、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素、特にフッ素、塩素又は臭素、より特定的にはフッ素を意味する。「ハロ」という用語は、別の基と組み合わせて、少なくとも１個のハロゲンを有し、特に１〜５個のハロゲン、特に１〜４個のハロゲン、すなわち１、２、３又は４個のハロゲンで置換された前記基の置換を示す。
【００８４】
「ハロアルキル」という用語は、単独で又は組み合わされて、少なくとも１個のハロゲンで置換され、特に１〜５個のハロゲン、特に１〜３個のハロゲンで置換されたアルキル基を示す。ハロアルキルの例には、モノフルオロ−、ジフルオロ−又はトリフルオロ−メチル、−エチル又は−プロピル、例えば３，３，３−トリフルオロプロピル、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、フルオロメチル又はトリフルオロメチルが含まれる。フルオロメチル、ジフルオロメチル及びトリフルオロメチルは特定の「ハロアルキル」である。
「ハロシクロアルキル」という用語は、単独で又は組み合わせて、少なくとも１個のハロゲンで置換され、特に１〜５個のハロゲン、特に１〜３個のハロゲンで置換された上で定義されたシクロアルキル基を示す。「ハロシクロアルキル」の特定の例は、ハロシクロプロピル、特にフルオロシクロプロピル、ジフルオロシクロプロピル及びトリフルオロシクロプロピルである。
【００８５】
「ヒドロキシル」及び「ヒドロキシ」という用語は、単独で又は組み合わせて、−ＯＨ基を意味する。
「チオヒドロキシル」及び「チオヒドロキシ」という用語は、単独で又は組み合わせて、−ＳＨ基を意味する。
「カルボニル」という用語は、単独で又は組み合わせて、−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。
「カルボキシ」又は「カルボキシル」という用語は、単独で又は組み合わせて、−ＣＯＯＨ基を意味する。
「アミノ」という用語は、単独で又は組み合わせて、第一級アミノ基（−ＮＨ２）、第二級アミノ基（−ＮＨ−）、又は第三級アミノ基（−Ｎ−）を意味する。
「アルキルアミノ」という用語は、単独で又は組み合わせて、上で定義された一又は二のアルキル基で置換された上で定義されたアミノ基を意味する。
【００８６】
「スルホニル」という用語は、単独で又は組み合わせて、−ＳＯ２基を意味する。
「スルフィニル」という用語は、単独で又は組み合わせて、−ＳＯ−基を意味する。
「スルファニル」という用語は、単独で又は組み合わせて、−Ｓ−基を意味する。
「シアノ」という用語は、単独で又は組み合わせて、−ＣＮ基を意味する。
「アジド」という用語は、単独又は組み合わせて、−Ｎ３基を意味する。
「ニトロ」という用語は、単独で又は組み合わせて、ＮＯ２基を意味する。
「ホルミル」という用語は、単独で又は組み合わせて、−Ｃ（Ｏ）Ｈ基を意味する。
「カルバモイル」という用語は、単独で又は組み合わせて、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２基を意味する。
「カバミド」という用語は、単独で又は組み合わせて、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２基を意味する。
【００８７】
「アリール」という用語は、単独で又は組み合わせて、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル及びホルミルから独立して選択される１〜３の置換基で置換されていてもよい６〜１０個の炭素環原子を含む一価芳香族炭素環式単環又は二環式環系を示す。アリールの例には、フェニル及びナフチル、特にフェニルが含まれる。
「ヘテロアリール」という用語は、単独で又は組み合わせて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２、３又は４個のヘテロ原子を含み、残りの環原子が、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル及びホルミルから独立して選択される１〜３の置換基で置換されていてもよい炭素である、５〜１２個の環原子の一価の芳香族複素環式単環式又は二環式環系を示す。ヘテロアリールの例には、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、イソオキサゾリル、ベンゾフラニル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、カルバゾリル又はアクリジニルが含まれる。
【００８８】
「ヘテロシクリル」という用語は、単独で又は組み合わせて、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２、３又は４個の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子が、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル及びホルミルから独立して選択される１〜３の置換基で置換されていてもよい炭素である、４〜１２個、特に４〜９個の環原子の一価飽和又は部分不飽和単環式又は二環式環系を意味する。単環式飽和ヘテロシクリルの例は、アゼチジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロ−チエニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル、アゼパニル、ジアゼパニル、ホモピペラジニル、又はオキサゼパニルである。二環式飽和ヘテロシクロアルキルの例は、８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、キヌクリジニル、８−オキサ−３−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル、３−オキサ−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル、又は３−チア−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニルである。部分的に不飽和のヘテロシクロアルキルの例は、ジヒドロフリル、イミダゾリニル、ジヒドロ−オキサゾリル、テトラヒドロ−ピリジニル又はジヒドロピラニルである。
【００８９】
［薬学的に許容される塩］
「薬学的に許容される塩」という用語は、生物学的又はその他の点で望ましくないものではない、遊離塩基又は遊離酸の生物学的有効性及び特性を保持する塩を指す。塩は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、特に塩酸と、有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ−アセチルシステインで形成される。加えて、これらの塩は、遊離酸への無機塩基又は有機塩基の付加から調製されうる。無機塩基から誘導される塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩が含まれるが、これらに限定されない。有機塩基から誘導される塩には、限定されないが、一級、二級、及び三級アミンの塩、天然起源の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、Ｎ−エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂が含まれる。式（Ｉ）の化合物は、双性イオンの形態でも存在しうる。式（Ｉ）の化合物の特に好ましい薬学的に許容される塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸及びメタンスルホン酸の塩である。
【００９０】
［保護基］
「保護基」という用語は、単独で又は組み合わせて、化学反応が別の保護されていない反応部位で選択的に実施できるように、多官能性化合物の反応部位を選択的にブロックする基を意味する。保護基は除去できる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基又はヒドロキシ保護基である。
【００９１】
［ヌクレアーゼ媒介分解］
ヌクレアーゼ媒介分解とは、そのような配列と二重鎖を形成するときに、相補的ヌクレオチド配列の分解を媒介することができるオリゴヌクレオチドを指す。
幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ媒介分解を介して機能し得、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、例えばＲＮアーゼＨを動員することができる。ヌクレアーゼ媒介機構を介して作用するオリゴヌクレオチドの例は、典型的には少なくとも５又は６のＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、親和性増強ヌクレオシド、例えばギャップマー、ヘッドマー及びテールマーによって片側又は両側に隣接するオリゴヌクレオチドである。
【００９２】
［ＲＮアーゼＨ活性及び動員］
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮアーゼＨ活性とは、相補的ＲＮＡ分子との二重鎖にあるときにＲＮアーゼＨを動員するその能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮアーゼＨを動員する能力を決定するために使用されうる、ＲＮアーゼＨ活性を決定するためのインビトロ方法を提供する。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸配列が提供された場合、それが、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド内の全てのモノマー間にホスホロチオエート結合を持つＤＮＡモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第０１／２３６１３号（出典明示によりここに援用される）の実施例９１〜９５によって提供される方法を使用して、決定される初期速度の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％又は２０％を超える、ｐｍｏｌ／ｌ／ｍｉｎで測定された、初期速度を有しているならば、ＲＮアーゼＨを動員することができると見なされる。ＲＨアーゼＨ活性の決定において使用するために、組換えヒトＲＮアーゼＨ１がＬｕｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ（Lucerne, Switzerland）から入手できる。
【００９３】
［ギャップマー］
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続したヌクレオチド配列は、ギャップマーでありうる。アンチセンスギャップマーは、ＲＮアーゼＨ媒介分解を介して標的核酸を阻害するために一般的に使用される。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、’５→３’方向に、５’−フランク、ギャップ及び３’−フランク、Ｆ−Ｇ−Ｆ’の少なくとも３つの異なる構造領域を含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨを動員できるようにする連続したＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域は、一又は複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’フランキング領域（Ｆ）と、一又は複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’フランキング領域（Ｆ’）に隣接する。領域Ｆ及びＦ’における一又は複数の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する（すなわち、親和性増強糖修飾ヌクレオシドである）。幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’における一又は複数の糖修飾ヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡ及び２’−ＭＯＥから独立して選択されるなどの高親和性２’糖修飾である。
【００９４】
ギャップマーデザインにおいて、ギャップ領域の最も５’側及び３’側のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、それぞれ５’（Ｆ）又は３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置される。フランクは、ギャップ領域から最も遠い端部、すなわち、５’フランクの５’末端及び３’フランクの３’末端に少なくとも一つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって更に定義されうる。
領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’は連続したヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続したヌクレオチド配列は、式Ｆ−Ｇ−Ｆ’のギャップマー領域を含みうる。
【００９５】
ギャップマーデザインＦ−Ｇ−Ｆ’の全長は、例えば、１２〜３２ヌクレオシド、例えば１３〜２４、例えば１４〜２２ヌクレオシド、例えば１４〜１７、例えば１６〜１８ヌクレオシドでありうる。
例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、次の式によって表すことができる：
Ｆ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’１−８、例えば
Ｆ１−８−Ｇ７−１６−Ｆ’２−８
但し、ギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長は少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長である。
領域Ｆ、Ｇ及びＦ’は以下に更に定義され、式Ｆ−Ｇ−Ｆ’に組み込むことができる。
【００９６】
［ギャップマー−領域Ｇ］
ギャップマーの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがヒトＲＮアーゼＨ１などのＲＮアーゼＨを動員できるようにするヌクレオシド、典型的にはＤＮＡヌクレオシドの領域である。ＲＮアーゼＨは、ＤＮＡとＲＮＡの間の二重鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素的に切断する細胞酵素である。適切には、ギャップマーは、少なくとも５又は６の連続したＤＮＡヌクレオシド長、例えば、５〜１６の連続したＤＮＡヌクレオシド長、例えば、６〜１５の連続したＤＮＡヌクレオシド長、例えば７〜１４の連続したＤＮＡヌクレオシド長、例えば８〜１２の連続したＤＮＡヌクレオチド長、例えば８〜１２の連続したＤＮＡヌクレオチド長のギャップ領域（Ｇ）を有しうる。ギャップ領域Ｇは、幾つかの実施態様では、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６の連続したＤＮＡヌクレオシドからなりうる。ギャップ領域のシトシン（Ｃ）ＤＮＡは、幾つかの例ではメチル化されている場合があり、そのような残基は、５−メチル−シトシン（ｍｅＣ又はｃの代わりにｅを伴う）としてアノテートされている。ギャップ内のシトシンＤＮＡのメチル化は、潜在的な毒性を減らすためにｃｇジヌクレオチドがギャップに存在する場合に有利であり、修飾はオリゴヌクレオチドの有効性に有意な影響を与えない。
【００９７】
幾つかの実施態様では、ギャップ領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６の連続したホスホロチオエート結合ＤＮＡヌクレオシドからなりうる。幾つかの実施態様では、ギャップ内の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【００９８】
伝統的なギャップマーにはＤＮＡギャップ領域があるが、ギャップ領域内で使用されるとＲＮアーゼＨ動員を可能にする修飾ヌクレオシドの多くの例がある。ギャップ領域内に含まれる場合にＲＮアーゼＨを動員できると報告されている修飾ヌクレオシドには、例えば、アルファ−Ｌ−ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ（両方とも出典明示によりここに援用されるＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９及び Vester等, Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300に記載）、ＡＮＡ及び２’Ｆ−ＡＮＡなどのアラビノース由来ヌクレオシド（Mangos等 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661）、ＵＮＡ（アンロックド核酸）（出典明示によりここに援用されるFluiter等, Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039に記載）が含まれる。ＵＮＡはアンロックド核酸であり、典型的にはリボースのＣ２とＣ３の間の結合が除去され、アンロックド「糖」残基を形成する。このようなギャップマーにおいて使用される修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域に導入されたときに２’エンド（ＤＮＡ様）構造を採用するヌクレオシド、つまりＲＮアーゼＨ動員を可能にする修飾でありうる。幾つかの実施態様では、ここに記載されるＤＮＡギャップ領域（Ｇ）は、ギャップ領域に導入されると２’エンド（ＤＮＡ様）構造を採用する１〜３の糖修飾ヌクレオシドを場合によっては含みうる。
【００９９】
［領域Ｇ−「ギャップブレーカー」］
あるいは、幾つかのＲＮアーゼＨ活性を保持しながら、ギャップマーのギャップ領域に３’エンド立体構造を付与する修飾ヌクレオシドの挿入に関する多くのレポートがある。一又は複数の３’エンド修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を有するそのようなギャップマーは、「ギャップブレーカー」又は「ギャップ破壊」ギャップマーと呼ばれ、例えば、国際公開第２０１３／０２２９８４号が参照される。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨ動員を可能にするために、ギャップ領域内にＤＮＡヌクレオシドの十分な領域を保持する。ＲＮアーゼＨを動員するギャップブレーカーオリゴヌクレオチドデザインの能力は、典型的には、配列特異的であり又は化合物特異的でさえある−幾つかの例では標的ＲＮＡのより特異的な切断をもたらすＲＮアーゼＨを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドを開示している、Rukov等 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487を参照のこと。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で使用される修飾ヌクレオシドは、例えば、３’エンド立体構造を与える修飾ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−メチル（ＯＭｅ）又は２’−Ｏ−ＭＯＥ（ＭＯＥ）ヌクレオシド、又はベータ−Ｄ ＬＮＡヌクレオシド（ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’の間の架橋がベータ立体構造にある）、例えばベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ又はＳｃＥＴヌクレオシドでありうる。
【０１００】
上述の領域Ｇを含むギャップマーと同様に、ギャップブレーカー又はギャップ破壊ギャップマーのギャップ領域には、ギャップの５’末端に（領域Ｆの３’ヌクレオシドに隣接）ＤＮＡヌクレオシドと、ギャップの３’末端に（領域Ｆ’の５’ヌクレオシドに隣接）ＤＮＡヌクレオシドがある。破壊ギャップを含むギャップマーは、典型的には、ギャップ領域の５’末端又は３’末端の何れかに、少なくとも３つ又は４つの連続したＤＮＡヌクレオシドの領域を保持する。
【０１０１】
ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドの例示的なデザインには、
Ｆ１−８−［Ｄ３−４−Ｅ１−Ｄ３−４］−Ｆ’１−８
Ｆ１−８−［Ｄ１−４−Ｅ１−Ｄ３−４］−Ｆ’１−８
Ｆ１−８−［Ｄ３−４−Ｅ１−Ｄ１−４］−Ｆ’１−８
が含まれ、ここで、領域Ｇは括弧［Ｄｎ−Ｅｒ−Ｄｍ］内にあり、ＤはＤＮＡヌクレオシドの連続した配列、Ｅは修飾ヌクレオシド（ギャップブレーカー又はギャップ破壊ヌクレオシド）、並びにＦ及びＦ’はここで定義されるフランキング領域であり、但し、ギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長は少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長である。
【０１０２】
幾つかの実施態様では、ギャップ破壊ギャップマーの領域Ｇは、少なくとも６つのＤＮＡヌクレオシド、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６のＤＮＡヌクレオシドを含む。上述のように、ギャップ領域ＧがＲＮアーゼＨ動員を媒介することができるという条件下で、ＤＮＡヌクレオシドは連続していてもよいし、又は場合によっては一又は複数の修飾ヌクレオシドが散在していてもよい。
【０１０３】
［ギャップマー−フランキング領域，Ｆ及びＦ’］
領域Ｆは、領域Ｇの５’ＤＮＡヌクレオシドに直ぐに隣接して配置されている。領域Ｆの最も３’側のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、又はＬＮＡヌクレオシドである。
領域Ｆ’は、領域Ｇの３’ＤＮＡヌクレオシドに直ぐに隣接して配置されている。領域Ｆ’の最も５’側のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、又はＬＮＡヌクレオシドである。
【０１０４】
領域Ｆは、１〜８の連続したヌクレオチド長、例えば２〜６、例えば３〜４の連続したヌクレオチド長である。有利には、領域Ｆの最も５’側のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆの２つの最も５’側のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆの最も５’側のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆの２つの最も５’側のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆの２つの最も５’側のヌクレオシドは、２つの３’ＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆの最も５’側のヌクレオシドは、ＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドである。
【０１０５】
領域Ｆ’は、２〜８の連続したヌクレオチド長、例えば３〜６、例えば４〜５の連続したヌクレオチド長である。有利には、実施態様では、領域Ｆ’の最も３’側のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆ’の２つの最も３’側のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆ’の２つの最も３’側のヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆ’の最も３’側のヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆ’の２つの最も３’側のヌクレオシドは、２つのＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆ’の最も３’側のヌクレオシドは、ＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドである。
【０１０６】
領域Ｆ又はＦ’の長さが１である場合、それは有利にはＬＮＡヌクレオシドであることに留意されたい。
幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’は、独立して、糖修飾ヌクレオシドの連続した配列からなるか又はそれを含む。幾つかの実施態様では、領域Ｆの糖修飾ヌクレオシドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位及び２’−フルオロ−ＡＮＡ単位から独立して選択されうる。
【０１０７】
幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’は、独立して、ＬＮＡ及び２’置換修飾ヌクレオシドの両方を含む（混合ウイングデザイン）。
幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’は、ＭＯＥのみ、又はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡのみ、又はＳｃＥＴのみなど、糖修飾ヌクレオシドの一つのタイプのみからなる。そのようなデザインは、均一フランク又は均一ギャップマーデザインとも呼ばれる。
幾つかの実施態様では、領域Ｆ又はＦ’、又はＦ及びＦ’の全てのヌクレオシドが、例えばベータ−Ｄ−ＬＮＡ、ＥＮＡ又はＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択されるようなＬＮＡヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆは、１〜５、例えば２〜４、例えば３〜４、例えば１、２、３、４又は５の連続したＬＮＡヌクレオシドからなる。幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の全てのヌクレオシドが、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドである。
【０１０８】
幾つかの実施態様では、領域Ｆ又はＦ’、又はＦ及びＦ’の全てのヌクレオシドが、ＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆは、１、２、３、４、５、６、７、又は８の連続したＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドからなる。幾つかの実施態様では、フランキング領域の一つのみが、ＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドからなりうる。幾つかの実施態様では、ＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドからなるのは５’（Ｆ）フランキング領域であるが、３’（Ｆ’）フランキング領域は、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド又はｃＥＴヌクレオシドなどの少なくとも一つのＬＮＡヌクレオシドを含む。幾つかの実施態様では、ＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドからなるのは３’（Ｆ’）フランキング領域であるが、５’（Ｆ）フランキング領域は、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド又はｃＥＴヌクレオシドなどの少なくとも一つのＬＮＡヌクレオシドを含む。
【０１０９】
幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の全ての修飾ヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ、ＥＮＡ又はＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択されるようなＬＮＡヌクレオシドであり、領域Ｆ又はＦ’、又はＦ及びＦ’は場合によってはＤＮＡヌクレオシド（交互フランク、より詳細についてはこれらの定義を参照）を含みうる。幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の全ての修飾ヌクレオシドはベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、領域Ｆ又はＦ’、又はＦ及びＦ’は場合によってはＤＮＡヌクレオシド（交互フランク、より詳細についてはこれらの定義を参照）を含みうる。
幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の最も５’側及び３’側のヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド又はＳｃＥＴヌクレオシドなどのＬＮＡヌクレオシドである。
【０１１０】
幾つかの実施態様では、領域Ｆと領域Ｇの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。幾つかの実施態様では、領域Ｆ’と領域Ｇの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。幾つかの実施態様では、領域Ｆ又はＦ’、Ｆ’及びＦ’のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
更なるギャップマーデザインは、出典明示によりここに援用される国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第２００７／１４６５１１号及び国際公開第２００８／１１３８３２号に開示されている。
【０１１１】
［ＬＮＡギャップマー］
ＬＮＡギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の何れか一方又は両方がＬＮＡヌクレオシドを含むか又はそれからなるギャップマーである。ベータ−Ｄ−オキシギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の何れか一方又は両方がベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか又はそれからなるギャップマーである。
幾つかの実施態様では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］１−５−［ｒｅｇｉｏｎ Ｇ］−［ＬＮＡ］１−５であり、ここで、ｒｅｇｉｏｎ Ｇ（領域Ｇ）は、ギャップマー領域Ｇの定義において定義された通りである。
【０１１２】
［ＭＯＥギャップマー］
ＭＯＥギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。幾つかの実施態様では、ＭＯＥギャップマーは、デザイン［ＭＯＥ］１−８−［Ｒｅｇｉｏｎ Ｇ］−［ＭＯＥ］１−８、例えば［ＭＯＥ］２−７−［Ｒｅｇｉｏｎ Ｇ］５−１６−［ＭＯＥ］２−７、例えば［ＭＯＥ］３−６−［Ｒｅｇｉｏｎ Ｇ］−［ＭＯＥ］３−６のものであり、ｒｅｇｉｏｎ Ｇ（領域Ｇ）はギャップマーの定義において定義されている通りである。５−１０−５デザインのＭＯＥギャップマー（ＭＯＥ−ＤＮＡ−ＭＯＥ）は、当該技術分野で広く使用されている。
【０１１３】
［混合ウイングギャップマー］
混合ウィングギャップマーは、領域ＦとＦ’の一方又は両方が２’置換ヌクレオシド、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位及び２’−フルオロ−ＡＮＡ単位からなる群から独立して選択される２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマーである。領域Ｆ及びＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が少なくとも一つのＬＮＡヌクレオシドを含む幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群から独立して選択される。領域Ｆ及びＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が少なくとも二つのＬＮＡヌクレオシドを含む幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドが、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群から独立して選択される。幾つかの混合ウィング実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方が、一又は複数のＤＮＡヌクレオシドを更に含みうる。
混合ウイングギャップマーデザインは、両方が出典明示によりここに援用される国際公開第２００８／０４９０８５号及び国際公開第２０１２／１０９３９５号に開示されている。
【０１１４】
［交互フランクギャップマー］
フランキング領域は、ＬＮＡ及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含み得、ＬＮＡ−ＤＮＡ−ＬＮＡヌクレオシドの交互モチーフを含むので、「交互フランク」と呼ばれる。このような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と呼ばれる。よって、「交互フランクギャップマー」は、フランク（Ｆ又はＦ’）の少なくとも一つがＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含むＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆ又はＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が、ＬＮＡヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施態様では、フランキング領域Ｆ又はＦ’、又はＦ及びＦ’の両方が、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆ及び／又はＦ’領域の最も５’側及び３’側のヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである。
【０１１５】
交互フランクＬＮＡギャップマーは国際公開第２０１６／１２７００２号に開示されている。
交互フランクを含むオリゴヌクレオチドは、フランク（Ｆ又はＦ’）の少なくとも一つがＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含むＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆ又はＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が、ＬＮＡヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施態様では、フランキング領域Ｆ又はＦ’、又はＦ及びＦ’の両方が、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆ及び／又はＦ’領域の最も５’側及び３’側のヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである。
【０１１６】
幾つかの実施態様では、領域Ｆ又はＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が、ＬＮＡヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施態様では、フランキング領域Ｆ又はＦ’、又はＦ及びＦ’の両方が、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆ又はＦ’領域の最も５’側及び３’側のヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである。ＬＮＡ−ＤＮＡ−ＬＮＡヌクレオシドの交互モチーフを含むため、ＬＮＡヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含むフランキング領域は、交互フランクと呼ばれる。交互フランクＬＮＡギャップマーは国際公開第２０１６／１２７００２号に開示されている。
交互フランク領域は、例えば１から２又は１又は２又は３の連続したＤＮＡヌクレオシドなど、最大３の連続したＤＮＡヌクレオシドを含みうる。
【０１１７】
交互フランクは、例えば、
［Ｌ］１−３−［Ｄ］１−４−［Ｌ］１−３
［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−２−［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−２−［Ｌ］１−２
のように、ある数のＬＮＡヌクレオシド（Ｌ）とそれに続くある数のＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）を表す一連の整数としてアノテートされうる。
オリゴヌクレオチドデザインにおいて、これらはしばしば２−２−１が５’［Ｌ］２−［Ｄ］２−［Ｌ］３’を表し、１−１−１−１−１が５’［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］３’を表すような数として表される。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドにおけるフランク（領域Ｆ及びＦ’）の長さは、独立して、３〜１０のヌクレオシド、例えば４〜８、例えば５〜６のヌクレオシド、例えば４、５、６又は７の修飾ヌクレオシドでありうる。幾つかの実施態様では、ギャップマーオリゴヌクレオチド内のフランクの一方のみが交互になり、他方がＬＮＡヌクレオチドで構成される。更なるエキソヌクレアーゼ耐性を付与するために、３’フランク（Ｆ’）の３’末端に少なくとも二つのＬＮＡヌクレオシドを配置することが有利な場合がある。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドの幾つかの例は次の通りである：
［Ｌ］１−５−［Ｄ］１−４−［Ｌ］１−３−［Ｇ］５−１６−［Ｌ］２−６
［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−２−［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−２−［Ｌ］１−２−［Ｇ］５−１６−［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−３−［Ｌ］２−４
［Ｌ］１−５−［Ｇ］５−１６−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］２
但し、ギャップマーの全長は少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長である。
【０１１８】
［オリゴヌクレオチドの領域Ｄ’又はＤ”］
本発明のオリゴヌクレオチドは、幾つかの実施態様では、標的核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列、例えばギャップマーＦ−Ｇ−Ｆ’と、更なる５’及び／又は３’ヌクレオシドとを含むか又はそれらからなりうる。更なる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であってもなくてもよい。そのような更なる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、ここでは領域Ｄ’及びＤ”と呼ばれる場合がある。
領域Ｄ’又はＤ”の追加は、ギャップマーなどの連続したヌクレオチド配列をコンジュゲート部分又は別の官能基に結合させる目的で使用されうる。連続したヌクレオチド配列をコンジュゲート部分と結合させるために使用される場合、生体的に切断可能なリンカーとして機能しうる。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ保護を提供するために、又は合成もしくは製造を容易にするために使用されうる。
【０１１９】
領域Ｄ’とＤ”は、領域Ｆの５’末端又は領域Ｆ’の３’末端にそれぞれ結合されて、次の式Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”又はＤ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”のデザインを作製できる。この例では、Ｆ−Ｇ−Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部であり、領域Ｄ’又はＤ”はオリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。
領域Ｄ’又はＤ”は、独立して、標的核酸に対して相補的又は非相補的でありうる、１、２、３、４又は５の更なるヌクレオチドを含みうるか又はそれらからなりうる。Ｆ又はＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチド、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ又はこれらの塩基修飾型ではない。Ｄ’又はＤ’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体的に切断可能なリンカーとして機能しうる（リンカーの定義を参照）。幾つかの実施態様では、更なる５’及び／又は３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で連結され、ＤＮＡ又はＲＮＡである。領域Ｄ’又はＤ”としての使用に適したヌクレオチドベースの生体的に切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これには、例として、ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドが含まれる。ポリオリゴヌクレオチドコンストラクトにおける生体的に切断可能なリンカーの使用は、国際公開第２０１５／１１３９２２号に開示されており、そこでは、それらは単一のオリゴヌクレオチド内で複数のアンチセンスコンストラクト（例えば、ギャップマー領域）を連結するために使用されている。
【０１２０】
一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続したヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’及び／又はＤ”を含む。
幾つかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、次の式によって表すことができる：
Ｆ−Ｇ−Ｆ’；特にＦ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’２−８
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、特にＤ’１−３−Ｆ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’２−８
Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”、特にＦ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’２−８−Ｄ”１−３
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”、特にＤ’１−３−Ｆ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’２−８−Ｄ”１−３
幾つかの実施態様では、領域Ｄ’と領域Ｆとの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。幾つかの実施態様では、領域Ｆ’と領域Ｄ”の間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。
【０１２１】
［コンジュゲート］
ここで使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第三の領域）に共有結合されたオリゴヌクレオチドを指す。
【０１２２】
本発明のオリゴヌクレオチドと一又は複数の非ヌクレオチド部分とのコンジュゲーションは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取り込み又は安定性に影響を与えることによって、オリゴヌクレオチドの薬理作用を改善しうる。幾つかの実施態様では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排出、透過性、及び／又は細胞取り込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改変し又は増強する。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織又は細胞型にターゲティングし、それにより、その器官、組織又は細胞型におけるオリゴヌクレオチドの効果を増強しうる。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織又は器官におけるオリゴヌクレオチドの活性、例えば非標的細胞型、組織、又は器官におけるオフターゲット活性又は活性を低下させうる。出典明示によりここに援用される国際公開第９３／０７８８３号及び国際公開第２０１３／０３３２３０号は適切なコンジュゲート部分を提供する。更に適切なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）に結合することができるものである。特に、三価のＮ−アセチルガラクトサミンコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰｒへの結合に適している。例えば、国際公開第２０１４／０７６１９６号、国際公開第２０１４／２０７２３２号及び国際公開第２０１４／１７９６２０号を参照のこと（出典明示によりここに援用される、特に、国際公開第２０１４／０７６１９６号の図１３又は国際公開第２０１４／１７９６２０号のクレーム１５８〜１６４）。
【０１２３】
オリゴヌクレオチドコンジュゲートとその合成は、それぞれが出典明示によりその全体がここに援用されるManoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke編, Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001及びManoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103による網羅的な概説にまた報告されている。
【０１２４】
一実施態様では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えばカプシド）又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１２５】
［リンカー］
結合又はリンカーは、一つの対象の化学基又はセグメントを一又は複数の共有結合を介して別の対象の化学基又はセグメントに連結する２個の原子間の接続である。コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドに直接に又は連結部分（例えば、リンカー又はテザー）を介して結合させることができる。リンカーは、第三の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第一の領域、例えば標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続したヌクレオチド配列（領域Ａ）に共有結合させ、これにより、領域ＡからＣの末端の一つを連結するのに役立つ。
本発明の幾つかの実施態様では、本発明のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続したヌクレオチド配列（領域Ａ又は第一の領域）とコンジュゲート部分（領域Ｃ又は第三の領域）の間に位置するリンカー領域（第二の領域又は領域Ｂ及び／又は領域Ｙ）を場合によっては含みうる。
【０１２６】
領域Ｂは、通常遭遇するか又は哺乳動物の体内で遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか又はそれからなる生体的に切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、哺乳動物細胞において見出されるか又は遭遇するものに類似する化学的条件、例えばｐＨ、温度、酸化又は還元条件又は薬剤、及び塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在もまた含まれる。一実施態様では、生体的に切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断に感受性である。好ましい実施態様では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、１〜１０のヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオシド、より好ましくは２〜６のヌクレオシド、最も好ましくは少なくとも二つの連続したホスホジエステル結合を含む２〜４の結合ヌクレオシド、例えば少なくとも３又は４又は５の連続したホスホジエステル結合を含む。好ましくは、ヌクレオシドはＤＮＡ又はＲＮＡである。ホスホジエステルを含有する生体的に切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号（出典明示によりここに援用される）に更に詳細に記載されている。
【０１２７】
コンジュゲートはまた非生体切断性リンカーを介してオリゴヌクレオチドに連結され得、又は幾つかの実施態様では、コンジュゲートは、生体的に切断可能なリンカー（領域Ｙ）に共有結合される非切断性リンカーを含みうる。必ずしも生体的に切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃ又は第三の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａ又は第一の領域）に共有結合させる役割を果たすリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位又はアミノアルキル基などの繰り返し単位の鎖構造又はオリゴマーを含みうる。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、次の領域要素Ａ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｙ−Ｃ、Ａ−Ｙ−Ｂ−Ｃ又はＡ−Ｙ−Ｃから構築することができる。幾つかの実施態様では、非切断性リンカー（領域Ｙ）は、アミノアルキル、例えば、Ｃ６〜Ｃ１２アミノアルキル基を含む、Ｃ２〜Ｃ３６アミノアルキル基である。好ましい実施態様では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。コンジュゲートリンカー基は、アミノ修飾オリゴヌクレオチド、及びコンジュゲート基上の活性化エステル基の使用を介して、オリゴヌクレオチドに常套的に結合されうる。
【０１２８】
［治療］
ここで使用される「治療」という用語は、既存の疾患（例えば、ここで言及される疾患又は障害）の治療、又は疾患の防止（prevention）、すなわち予防（prophylaxis）の両方を指す。従って、ここで言及される治療は、幾つかの実施態様では、予防的でありうることが認識されるであろう。
【発明の詳細な説明】
【０１２９】
［本発明のオリゴヌクレオチド］
本発明は、ＦＮＤＣ３Ｂの発現を阻害することができるオリゴヌクレオチドに関する。阻害は、ＦＮＤＣ３Ｂをコードするか、又はＦＮＤＣ３Ｂの調節に関与する標的核酸にハイブリダイズすることにより達成されうる。標的核酸は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７及び８からなる群から選択される配列などの哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂ配列でありうる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＦＮＤＣ３Ｂを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１３０】
幾つかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的発現を阻害し又は低減させることによって標的の発現を調節することができる。好ましくは、そのような発現の阻害は、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０％であり、標的の通常の発現レベルと比較してより好ましくは少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の阻害である。幾つかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＨｅＬａ細胞を使用して、インビトロでＦＮＤＣ３Ｂ ｍＲＮＡの発現レベルを少なくとも６０％又は少なくとも７０％阻害することが可能でありうる。幾つかの実施態様では、本発明の化合物は、ＨｅＬａ細胞を使用して、インビトロでＦＮＤＣ３Ｂタンパク質の発現レベルを少なくとも５０％阻害することが可能でありうる。適切には、実施例は、ＦＮＤＣ３Ｂ ＲＮＡ又はタンパク質阻害を測定するために使用されうるアッセイを提供する（例えば、実施例１）。標的調節は、オリゴヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる。幾つかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、ＦＮＤＣ３Ｂの発現の所望の調節を示すのになお十分でありうる。ミスマッチから生じる結合親和性の低下は、オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド数の増加、及び／又はオリゴヌクレオチド配列内に存在するＬＮＡを含む２’糖修飾ヌクレオシドなどの標的への結合親和性を増加させることができる修飾ヌクレオシドの数の増加によって有利に補償されうる。
【０１３１】
本発明の一態様は、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂをコードする標的核酸に対して、完全な相補性などの少なくとも９０％の相補性を有する、１０〜３０ヌクレオチド長の連続したヌクレオチド配列を含む、１０〜５０、例えば１０〜３０のヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、細胞において、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂをコードする標的核酸の発現を低下させることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【０１３２】
本発明の一態様は、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂをコードする標的核酸に対して、完全な相補性などの少なくとも９０％の相補性を有する、１２〜２２のヌクレオチド長の連続したヌクレオチド配列を含む、１０〜３０のヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、細胞において、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂをコードする標的核酸の発現を低下させることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【０１３３】
幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸又は標的配列と少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、又は１００％相補的である、１０〜３０のヌクレオチド長、例えば１２〜２２のヌクレオチド長の連続したヌクレオチド配列を含む。
【０１３４】
好ましい実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列は、標的核酸又は標的配列に完全に相補的（１００％相補的）であるか、又は幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間に一つ又は二つのミスマッチを含みうる。
本発明の別の態様は、連続したヌクレオチド配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８からなる群から選択される配列、又はその天然起源の変異体に対して少なくとも９０％相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【０１３５】
幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチド配列又は連続したヌクレオチド配列は、配列番号：１及び配列番号：８に存在する対応する標的配列に完全に相補的など、少なくとも９０％相補的又は少なくとも９５％相補的である。幾つかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続した配列は、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂをコードする標的核酸に完全に相補的である。
好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド配列又は連続したヌクレオチド配列は、配列番号：１及び配列番号：８に存在する対応する標的配列に１００％相補的である。
【０１３６】
本発明の別の態様は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、連続したヌクレオチド配列は、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂをコードする標的核酸（例えば、配列番号１）のプレｍＲＮＡに存在するイントロン領域に対して完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である。
配列番号：１のイントロンの位置は、ＦＮＤ３ＢプレｍＲＮＡの異なるスプライシングに応じて変わりうることが理解されるべきである。本発明の文脈において、最終ＲＮＡ産物（成熟ｍＲＮＡ）の成熟中にＲＮＡスプライシングによってプレｍＲＮＡから除去される遺伝子配列又はプレｍＲＮＡ中の任意のヌクレオチド配列は、配列番号：１のそれらの位置に関係なくイントロンである。表１は、配列番号：１の最も一般的なイントロン領域を提供する。
【０１３７】
好ましい実施態様では、本発明は、連続したヌクレオチド配列が、配列番号：１の位置１４５〜７２８２４、配列番号：１の位置７２９６４〜９３８４４、及び配列番号：１の位置９３９２０〜１４７０８４から選択される、ヒトＦＮＤＣ３ＢのプレｍＲＮＡに存在するイントロン領域に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【０１３８】
別の好ましい実施態様では、本発明は、連続したヌクレオチド配列が、配列番号：１など、ＦＮＤＣ３Ｂをコードする標的核酸のヒトプレｍＲＮＡの位置１４５〜７２８２４に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
別の好ましい実施態様では、本発明は、連続したヌクレオチド配列が、配列番号９に対して完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
別の好ましい実施態様では、本発明は、連続したヌクレオチド配列が、配列番号１０に対して完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
別の好ましい実施態様では、本発明は、連続したヌクレオチド配列が、配列番号１９に対して完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
別の好ましい実施態様では、本発明は、連続したヌクレオチド配列が、配列番号２０に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【０１３９】
幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチド又は連続したヌクレオチド配列は、標的核酸の領域に相補的であり、標的核酸領域は、配列番号：１の位置５４３６６〜５４３８５、５４４０７〜５４４２６、５４４４８〜５４４６７、５４４８９〜５４５０８、５４５３０〜５４５４９、５４５７１〜５４５９０、５４６１２〜５４６３１；５４３６７〜５４３８４、５４４０８〜５４４２５、５４４４９〜５４４６６、５４４９０〜５４５０７、５４５３１〜５４５４８、５４５７２〜５４５８９、５４６１３〜５４６３０；５４３６８〜５４３８３、５４４０９〜５４４２４、５４４５０〜５４４６５、５４４９１〜５４５０６、５４５３２〜５４５４７、５４５７３〜５４５８８、５４６１４〜５４６２９；５４３６６〜５４３７９、５４４０７〜５４４２０、５４４４８〜５４４６１、５４４８９〜５４５０２、５４５３０〜５４５４３、５４５７１〜５４５８４、５４６１２〜５４６２５、３５１０１６〜３５１０３３；３５１０１６〜３５１０２９；３５１０１６〜３５１０３５；３５１０１８〜３５１３３からなる群から選択される。
【０１４０】
本発明の一態様によれば、標的配列は、標的核酸内で繰り返され、すなわち、少なくとも１０のヌクレオチド長の少なくとも二つの同一の標的ヌクレオチド配列（標的領域）が、標的核酸の異なる位置に生じる。反復標的領域は一般に１０〜５０ヌクレオチド、例えば１１〜３０ヌクレオチド、例えば１２〜２５ヌクレオチド、例えば１３〜２２ヌクレオチド、例えば１４〜２０ヌクレオチド、例えば１５〜１９ヌクレオチド、例えば１６〜１８ヌクレオチドである。好ましい実施態様では、反復標的領域は、１４〜２０ヌクレオチドである。
【０１４１】
一態様では、本発明は、連続したヌクレオチド配列が、配列番号：１の標的核酸にわたって少なくとも２回繰り返される標的領域に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。この効果は、（同じ配列を持つ）幾つかのオリゴヌクレオチド化合物が同じ標的核酸上の一又は複数の標的領域に（同時に）ハイブリダイズできるため、オリゴヌクレオチドが細胞又は動物又はヒトに投与されたとき標的核酸の複数の切断事象を生じうることである。
幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチド又は連続したヌクレオチド配列は、少なくとも３つの反復標的領域、例えば少なくとも４、５、６、７、８、９又は１０の反復標的領域、又は１０を超える反復標的領域で繰り返される標的領域に完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である。
【０１４２】
更なる実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：１の標的核酸の１０〜２２、例えば１４〜２０のヌクレオチド長の標的領域に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である連続したヌクレオチド配列を含み、ここで、標的領域は、標的核酸のイントンにわたって少なくとも２回以上繰り返される。
幾つかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列は、配列番号：１０の少なくとも６つの反復標的領域に対して相補的である。
幾つかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜３５のヌクレオチド長、例えば１０〜３０、例えば１１〜２２、例えば１２〜２０、例えば１４〜１８又は１４〜１６の連続したヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる。有利には、オリゴヌクレオチドは、１４〜２０のヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる。
【０１４３】
ここに示されるあらゆる範囲は、範囲の終点を含むことを理解されたい。
【０１４４】
幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列は、２２以下のヌクレオチド、例えば２０以下のヌクレオチド、例えば１８以下のヌクレオチド、例えば１８未満、例えば１４、１５、１６又は１７のヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。
【０１４５】
幾つかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列は、配列番号：１１〜１８からなる群から選択される配列に対して、少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１０〜３０ヌクレオチド長のヌクレオチドを含むか又はそれらからなる。
幾つかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列は、配列番号：１５〜１８から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１０〜３０の連続したヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
幾つかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列は、配列番号：１１〜１４から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１０〜３０の連続したヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる。
【０１４６】
幾つかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列は、配列番号：１５〜１８から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１２〜２０の連続したヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる。
幾つかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列は、配列番号：１１〜１４から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１２〜２０の連続したヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる。
【０１４７】
幾つかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列は、配列番号：１５〜１８から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する１４〜２０の連続したヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる。
幾つかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列は、配列番号：１１〜１４から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する長さ１４〜２０の連続したヌクレオチドを含むか又はそれらからなる。
幾つかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列（モチーフ配列）は、配列番号：１５〜１８から選択される配列からなる。
幾つかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列（モチーフ配列）は、配列番号：１１〜１４から選択される配列からなる。
【０１４８】
連続した核酸塩基配列（モチーフ配列）を修飾して、例えば、ヌクレアーゼ耐性及び／又は標的核酸への結合親和性を増加させることができることが理解される。修飾は、定義と次の段落に記載している。表４に、各モチーフ配列の好ましいデザインを列挙する。
修飾ヌクレオシド（例えば、高親和性修飾ヌクレオシド）がオリゴヌクレオチド配列に組み込まれるパターンは、一般にオリゴヌクレオチドデザインと呼ばれる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを用いてデザインされる。有利には、高親和性修飾ヌクレオシドが使用される。
【０１４９】
一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１の修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５又は少なくとも１６の修飾ヌクレオシドを含む。一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、１〜１０の修飾ヌクレオシド、例えば２〜９の修飾ヌクレオシド、例えば３〜８の修飾ヌクレオシド、例えば４〜７の修飾ヌクレオシド、例えば６又は７の修飾ヌクレオシドを含む。適切な修飾は、「定義」セクションに「修飾ヌクレオシド」、「高親和性修飾ヌクレオシド」、「糖修飾」、「２’糖修飾」、及び「ロックド核酸（ＬＮＡ）」として記載している。
【０１５０】
一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシドなどの一又は複数の糖修飾ヌクレオシドを含む。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される一又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。修飾ヌクレオシドの一又は複数がロックド核酸（ＬＮＡ）である場合が有利である。
【０１５１】
更なる実施態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。適切なヌクレオシド間修飾は、「定義」セクションに「修飾ヌクレオシド間結合」として記載している。連続したヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも７５％、例えば全てがホスホロチオエート又はボラノホスフェートヌクレオシド間結合である場合が有利である。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドの連続した配列中の全てのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である。
【０１５２】
幾つかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのＬＮＡヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、又は８のＬＮＡヌクレオシド、例えば２〜６のＬＮＡヌクレオシド、例えば３〜７のＬＮＡヌクレオシド、４〜８のＬＮＡヌクレオシド、又は３、４、５、６、７又は８のＬＮＡヌクレオシドを含む。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチド中の修飾ヌクレオシドの少なくとも７５％はＬＮＡヌクレオシドであり、例えば修飾ヌクレオシドの８０％、例えば８５％、例えば９０％がＬＮＡヌクレオシドである。また更なる実施態様では、オリゴヌクレオチド中の全ての修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである。更なる実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡと、次のＬＮＡヌクレオシドの一又は複数の両方を含みうる：チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、ＳｃＥＴ及び／又はＥＮＡで、ベータ−Ｄ又はアルファ−Ｌ配置又はその組み合わせの何れか。更なる実施態様では、全てのＬＮＡシトシン単位は５−メチル−シトシンである。オリゴヌクレオチド又は連続したヌクレオチド配列のヌクレアーゼ安定性にとって、ヌクレオチド配列の５’末端に少なくとも一つのＬＮＡヌクレオシドがあり３’末端に少なくとも二つのＬＮＡヌクレオシドがあることが有利である。
本発明の一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨを動員することができる。
【０１５３】
本発明において、有利な構造デザインは、「定義」セクションに、例えば「ギャップマー」、「ＬＮＡギャップマー」、「ＭＯＥギャップマー」及び「混合ウイングギャップマー」「交互フランクギャップマー」として記載されているギャップマーデザインである。ギャップマーデザインには、均一フランク、混合ウイングフランク、交互フランク、ギャップブレーカーデザインのギャップマーが含まれる。本発明では、本発明のオリゴヌクレオチドがＦ−Ｇ−Ｆ’デザインのギャップマーである場合が有利である。幾つかの実施態様では、ギャップマーは、均一フランクを有するＬＮＡギャップマーである。
本発明の幾つかの実施態様では、ＬＮＡギャップマーは、次の均一フランクデザイン３−１２−３、３−９−２、４−１０−２、又は４−９−３から選択される。
【０１５４】
［本発明の例示的な化合物］
例示されたオリゴヌクレオチド化合物において、大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ Ｃは５−メチルシトシンであり、５−メチルＤＮＡシトシンはギャップ領域に存在し得、「ｅ」又はｍｃによって表され得、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
本発明の幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ−ＩＤ番号：１１＿１；１２＿１；１３＿１及び１４＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物の群から選択される。
本発明の一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ−ＩＤ番号：１３＿１又は１４＿１である。
本発明の幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ−ＩＤ番号１５＿１；１６＿１；１７＿１；１８＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物の群から選択される。
【０１５５】
［製造方法］
更なる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドに含まれる共有結合した連続したヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホラミダイト化学を使用する（例えば、Caruthers等, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, pp 287-313を参照）。更なる実施態様では、この方法は、連続したヌクレオチド配列をコンジュゲート部分（リガンド）と反応させることを更に含む。更なる態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートオリゴヌクレオチドを、薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造する方法が提供される。
【０１５６】
［薬学的塩］
更なる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの薬学的に許容される塩を提供する。好ましい実施態様では、薬学的に許容される塩は、ナトリウム又はカリウム塩である。
【０１５７】
［薬学的組成物］
更なる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドコンジュゲート又はその塩の何れかと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む薬学的組成物を提供する。薬学的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施態様では、薬学的に許容される希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、５０〜３００μＭ溶液の濃度で薬学的に許容される希釈剤中で使用される。
【０１５８】
本発明での使用に適した製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17版, 1985に見出される。薬物送達の方法の簡単な概説については、例えば、Langer（Science 249:1527-1533, 1990）を参照のこと。国際公開第２００７／０３１０９１号は、薬学的に許容される希釈剤、担体及びアジュバントの更に適切で好ましい例を提供する（出典明示によりここに援用される）。適切な投薬量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療薬との組み合わせ、プロドラッグ製剤もまた国際公開第２００７／０３１０９１号に提供されている。
【０１５９】
本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、薬学的組成物又は製剤の調製のために、薬学的に許容される活性又は不活性物質と混合されうる。薬学的組成物の製剤化のための組成物及び方法は、限定されないが、投与経路、疾患の程度、又は投与される用量を含む多くの基準に依存する。
【０１６０】
これらの組成物は、一般的な滅菌技術によって滅菌されうるか、又は滅菌濾過されうる。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装されるか、又は凍結乾燥され得、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３〜１１、より好ましくは５〜９又は６〜８、最も好ましくは７〜８、例えば７〜７．５である。得られた固体形態の組成物は、錠剤又はカプセルの密封包装などのように、それぞれが一定量の上記薬剤を含む複数の単回用量単位に包装されうる。固体形態の組成物はまた局所適用可能なクリーム又は軟膏用にデザインされた圧搾可能なチューブなどのフレキシブルな量の容器に包装することもできる。
【０１６１】
幾つかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートはプロドラッグである。特にオリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、コンジュゲート部分は、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、オリゴヌクレオチドから切断される。
【０１６２】
［用途］
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療及び予防のための研究試薬として利用されうる。
研究では、このようなオリゴヌクレオチドを使用して、細胞（例えば、インビトロ細胞培養）及び実験動物におけるＦＮＤＣ３Ｂタンパク質の合成を特異的に調節し、標的の機能分析又は治療的介入のための標的としてのその有用性の評価を促進することができる。典型的には、標的調節は、タンパク質を産生するｍＲＮＡを分解又は阻害し、それによりタンパク質形成を防止することによって、又はタンパク質を産生する遺伝子又はｍＲＮＡのモジュレーターを分解又は阻害することによって達成される。プレｍＲＮＡを標的とし、それにより成熟ｍＲＮＡの形成を防ぐことにより、更なる利点が達成されうる。
【０１６３】
本発明のオリゴヌクレオチドを研究又は診断に用いる場合、標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡに由来する合成核酸又はｃＤＮＡでありうる。
【０１６４】
本発明は、ＦＮＤＣ３Ｂを発現している標的細胞におけるＦＮＤＣ３Ｂの発現を調節するためのインビボ又はインビトロ方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドを有効量で前記細胞に投与することを含む方法を提供する。
【０１６５】
幾つかの実施態様では、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、インビトロ細胞培養物又は哺乳動物の組織の一部を形成するインビボ細胞でありうる。好ましい実施態様では、標的細胞は、胃、腸、肝臓、肺、膵臓、ランゲルハンス島、胎盤、又は精巣に存在するか、あるいはそれらから単離又は誘導される。
【０１６６】
診断では、オリゴヌクレオチドを使用して、ノーザンブロッティング、インサイツハイブリダイゼーション又は類似の技術により、細胞及び組織におけるＦＮＤＣ３Ｂの発現を検出し定量することができる。
治療では、疾患又は障害を有すると疑われる動物又はヒトを、ＦＮＤＣ３Ｂの発現を低下させることにより治療できる。
【０１６７】
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、薬学的塩又は薬学的組成物の治療的又は予防的有効量を、疾患に罹患しているか又は罹患しやすい対象に投与することを含む、疾患を治療し又は予防するための方法を提供する。
【０１６８】
本発明はまた医薬として使用するための、ここに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、薬学的塩、組成物又はコンジュゲートに関する。
本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は薬学的組成物は、典型的には有効量で投与される。
本発明はまたここで言及される障害の治療のための医薬の製造のため、又はここで言及される障害の治療方法のための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。
【０１６９】
ここで言及される疾患又は障害は、ＦＮＤＣ３Ｂの発現の増加と関連している。
本発明の方法は、好ましくは、ＦＮＤＣ３Ｂの異常に高いレベル及び／又は活性によって引き起こされる疾患に対する治療又は予防に用いられる。
本発明は更にＦＮＤＣ３Ｂの異常に高いレベル及び／又は活性の治療のための医薬の製造のための、ここで記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、薬学的塩又は薬学的組成物の使用に関する。
一実施態様では、本発明は、肝細胞癌及び／又は急性骨髄性白血病などのがんから選択される疾患又は障害の治療に使用するためのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は薬学的組成物に関する。
【０１７０】
［投与］
非限定的な実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、薬学的塩又は薬学的組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入を含む非経口経路により投与される。非限定的な一実施態様では、活性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは静脈内投与される。
【０１７１】
幾つかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は薬学的組成物は、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５〜５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、週１回、２週ごと、３週ごと、又は月１回でありうる。
本発明はまた医薬が静脈内投与用の剤形である医薬の製造のための、記載された本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。
【０１７２】
［併用療法］
幾つかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は薬学的組成物は、別の治療剤との併用治療で使用するためのものである。治療剤は、例えば、上述の疾患又は障害の標準的な治療剤でありうる。
【０１７３】
［実施態様］
本発明の次の実施態様は、ここに記載されている任意の他の実施態様と組み合わせて使用されうる。
１．哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂをコードする標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性を有する１０〜３０ヌクレオチド長の連続したヌクレオチド配列を含む、１０〜５０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、細胞において、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂをコードする標的核酸の発現を低下させることができる、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
２．連続したヌクレオチド配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８からなる群から選択される配列、又はその天然起源の変異体に少なくとも９０％相補的である、実施態様１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３．連続したヌクレオチド配列が、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂをコードする標的核酸に完全に相補的である、実施態様１又は２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４．連続したヌクレオチド配列が、哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂ標的核酸のプレｍＲＮＡに存在するイントロン領域（例えば配列番号１）に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、実施態様１から３の何れか一に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５．連続したヌクレオチド配列が、配列番号：１の位置１４５〜７２８２４、配列番号：１の位置７２９６４〜９３８４４、及び配列番号：１の位置９３９２０〜１４７０８４から選択されるヒトＦＮＤＣ３ＢのプレｍＲＮＡに存在するイントロン領域に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、実施態様１から４の何れか一に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６．連続したヌクレオチド配列が、配列番号：１などの哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂをコードする標的核酸のヒトプレｍＲＮＡの位置１４５〜７２８２４に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、実施態様１から５の何れか一に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７．連続したヌクレオチド配列が、配列番号９に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、実施態様１から６の何れか一に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
８．連続したヌクレオチド配列が、配列番号：１の位置５４３６６〜５４３８５、５４４０７〜５４４２６、５４４４８〜５４４６７、５４４８９〜５４５０８、５４５３０〜５４５４９、５４５７１〜５４５９０、５４６１２〜５４６３１；５４３６７〜５４３８４、５４４０８〜５４４２５、５４４４９〜５４４６６、５４４９０〜５４５０７、５４５３１〜５４５４８、５４５７２〜５４５８９、５４６１３〜５４６３０；５４３６８〜５４３８３、５４４０９〜５４４２４、５４４５０〜５４４６５、５４４９１〜５４５０６、５４５３２〜５４５４７、５４５７３〜５４５８８、５４６１４〜５４６２９；５４３６６〜５４３７９、５４４０７〜５４４２０、５４４４８〜５４４６１、５４４８９〜５４５０２、５４５３０〜５４５４３、５４５７１〜５４５８４、５４６１２〜５４６２５；３５１０１６〜３５１０３３；３５１０１６〜３５１０２９；３５１０１６〜３５１０３５；及び３５１０１８〜３５１３３からなる群から選択される配列番号：１の標的領域に対して、完全に相補的など、少なくとも９０％相補的である、実施態様１から７の何れか一に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
９．連続したヌクレオチド配列が、配列番号１の一を超える標的領域に対して完全に相補的など、少なくとも９０％相補的であり、前記一又は複数の標的領域が互いに同一である、実施態様１から８の何れか一に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１０．オリゴヌクレオチドが、−１０ｋｃａｌ未満のΔＧ°で配列番号：１〜８からなる群から選択される標的核酸にハイブリダイズすることができる、実施態様１から３のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１１．標的核酸がＲＮＡである、実施態様９又は１０のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１２．ＲＮＡがｍＲＮＡである、実施態様１１のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１３．ｍＲＮＡがプレＲＮＡ又は成熟ＲＮＡである、実施態様１２のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１４．連続したヌクレオチド配列が少なくとも１０の連続したヌクレオチド、特に１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９の連続したヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる、実施態様１から１３の何れか一のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１５．連続したヌクレオチド配列が１２〜２２のヌクレオチドを含むか又はそれらからなる、実施態様１から１３の何れか一のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１６．連続したヌクレオチド配列が１２〜１８のヌクレオチドを含むか又はそれからなる、実施態様１から１５の何れか一のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１７．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１０〜３５ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる、実施態様１から１６の何れか一のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１８．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１１〜２２ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる、実施態様１から１７の何れか一のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１９．オリゴヌクレオチドが１２〜１８ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる、実施態様１７から１９の何れか一のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２０．オリゴヌクレオチド又は連続したヌクレオチド配列が一本鎖である、実施態様１から１９の何れか一のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２１．オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡでも自己相補的でもない、実施態様１から２０の何れか一のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２２．連続したヌクレオチド配列が、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７及び１８から選択される配列を含むか又はそれらからなる、実施態様１から２１のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２３．連続したヌクレオチド配列が、それが相補的である標的核酸と比較して、ゼロから３のミスマッチを有する、実施態様１から２２の何れか一のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２４．連続したヌクレオチド配列が、標的核酸と比較して一つのミスマッチを有する、実施態様２３のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２５．連続したヌクレオチド配列が、標的核酸と比較して２つのミスマッチを有する、実施態様２３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２６．連続したヌクレオチド配列が標的核酸配列に完全に相補的である、実施態様２３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２７．一又は複数の修飾ヌクレオシドを含む、実施態様１から２６のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２８．一又は複数の修飾ヌクレオシドが高親和性修飾ヌクレオシドである、実施態様２７のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２９．一又は複数の修飾ヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドである、実施態様２７又は２８のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３０．一又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、実施態様２９のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３１．一又は複数の修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、実施態様２７から３０のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３２．修飾ＬＮＡヌクレオシドがオキシ−ＬＮＡである、実施態様３１のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３３．修飾ヌクレオシドがベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、実施態様３２のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３４．修飾ヌクレオシドがチオ−ＬＮＡである、実施態様３１のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３５．修飾ヌクレオシドがアミノ−ＬＮＡである、実施態様３１のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３６．修飾ヌクレオシドがｃＥＴである、実施態様３１のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３７．修飾ヌクレオシドがＥＮＡである、実施態様３１のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３８．修飾ＬＮＡヌクレオシドが、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、ベータ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−アミノ−ＬＮＡ、ベータ−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−チオ−ＬＮＡ、（Ｓ）ｃＥＴ、（Ｒ）ｃＥＴベータ−Ｄ−ＥＮＡ及びアルファ−Ｌ−ＥＮＡから選択される、実施態様３１のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３９．オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施態様１から３８の何れか一のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４０．修飾ヌクレオシド間結合がヌクレアーゼ耐性である、実施態様３９のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４１．連続したヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％がホスホロチオエートヌクレオシド間結合又はボラノホスフェートヌクレオシド間結合である、実施態様３９又は４０のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４２．連続したヌクレオチド配列内の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施態様３９又は４０のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４３．アンチセンスオリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨを動員することができる、実施態様１から４２のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４４．アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列がギャップマーを含む、実施態様４３のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４５．アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列が、式５’−ＦＧ−Ｆ’−３’のギャップマーからなるか又はそれを含み、領域Ｆ及びＦ’が独立して１〜７の修飾ヌクレオシドを含むか又はそれらからなり、Ｇが、６〜１７のＤＮＡヌクレオシドを含む領域など、ＲＮアーゼＨを動員することができる６〜１７ヌクレオシドの領域である、実施態様４３又は４４のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４６．修飾ヌクレオシドが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される２’糖修飾ヌクレオシドである、実施態様４５のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４７．領域Ｆ及びＦ’における修飾ヌクレオシドの一又は複数がＬＮＡヌクレオシドである、実施態様４５又は４６のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４８．領域Ｆ及びＦ’における全ての修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、実施態様４７のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４９．領域Ｆ及びＦ’がＬＮＡヌクレオシドからなる、実施態様４８のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５０．領域Ｆ及びＦ’における全ての修飾ヌクレオシドがオキシ−ＬＮＡヌクレオシドである、実施態様４７から４９のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５１．領域Ｆ又はＦ’の少なくとも一つが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ及び２’−フルオロ−ＤＮＡからなる群から独立して選択される少なくとも一つの２’置換修飾ヌクレオシドを更に含む、実施態様４７のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５２．領域Ｇ内のＲＮアーゼＨ動員ヌクレオシドが、ＤＮＡ、アルファ−Ｌ−ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ、ＡＮＡ及び２’Ｆ−ＡＮＡ及びＵＮＡから独立して選択される、実施態様４７から５１のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５３．領域Ｇ内のヌクレオシドが、ＤＮＡ及び／又はアルファ−Ｌ−ＬＮＡヌクレオシドである、実施態様５２のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５４．領域Ｇが少なくとも７５％のＤＮＡヌクレオシドからなる、実施態様５２又は５３のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５５．アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続したヌクレオチド配列が、ＧａａｔｔｔｇｃｔａｇｔｇｇｔｇｇｔＧＧ；ＧＣＴａｇｔｇｇｔｇｇｔＧＧ；ＡＡＴｔｔｇｃｔａｇｔｇｇｔｇＧＴＧ；ＡＴＴＴｇｃｔａｇｔｇｇｔｇＧＴ；ＴＴａｔｔｔｃｔａｃａｇｔｔｔｃｃＡＧＡ；ＡＴＴＴｃｔａｃａｇｔｔｔｃｃＡＧＡ；ＣＴａｃａｇｔｔｔｃＣＡＧＡ；及びＡＴＴＴｃｔａｃａｇｔｔｔＣＣＡからなる群から選択され；ここで、大文字がベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドなどのＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字がＤＮＡヌクレオシドを表し、場合によっては全てのＬＮＡ Ｃが５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施態様１から５４の何れか一に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５６．オリゴヌクレオチドが、ＣＭＰ ＩＤ番号：１１＿１；１２＿１；１３＿１；１４＿１；１５＿１；１６＿１；１７＿１及び１８＿１から選択される、実施態様５５のオリゴヌクレオチド。
５７．請求項１から５６の何れか一に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも一つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲート。
５８．コンジュゲート部分が、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素、ビタミン、ウイルスタンパク質又はそれらの組み合わせから選択される、実施態様５７のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
５９．コンジュゲート部分がアシアロ糖タンパク質受容体に結合することができる、実施態様５７又は５８のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
６０．アンチセンスオリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分との間に位置するリンカーを含む、実施態様５７から５９の何れか一のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
６１．リンカーが生理学的に不安定なリンカーである、実施態様６０のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
６２．生理学的に不安定なリンカーがヌクレアーゼ感受性リンカーである、実施態様６１のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
６３．オリゴヌクレオチドが式Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’又はＦ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”を有し、ここでＦ、Ｆ’及びＧが実施態様４７から５６に記載の通りであり、Ｄ’又はＤ”がホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する１、２又は３のＤＮＡヌクレオシドを含む、実施態様６１又は６２のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
６４．実施態様１から５６の何れか一に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施態様５７から６３の何れかに記載のコンジュゲートの薬学的に許容される塩。
６５．実施態様１から５６のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施態様５７から６３のコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む薬学的組成物。
６６．ヌクレオチド単位を反応させ、それによりオリゴヌクレオチドに含まれる共有結合した連続したヌクレオチド単位を形成することを含む、実施態様１から５６の何れか一のアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造する方法。
６７．連続したヌクレオチド配列を非ヌクレオチド結合部分と反応させることを更に含む、実施態様６６の方法。
６８．オリゴヌクレオチドを薬学的に許容される希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントと混合することを含む、実施態様６５の組成物の製造方法。
６９．哺乳動物ＦＮＤＣ３Ｂを発現している標的細胞におけるＦＮＤＣ３Ｂの発現を低下させるためのインビボ又はインビトロ方法であって、実施態様１から５６のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施態様５７から６３のコンジュゲート又は実施態様６４の薬学的に許容される塩又は実施態様６５の薬学的組成物を有効量で前記細胞に投与することを含む方法。
７０．実施態様１から５６のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施態様５７から６３のコンジュゲート又は実施態様６４の薬学的に許容される塩又は実施態様６５の薬学的組成物の治療的又は予防的有効量を、疾患に罹患しているか又は罹患しやすい対象に投与することを含む、疾患を治療し、緩和し又は予防するための方法。
７１．対象における疾患の治療、緩和又は予防のための医薬として使用するための、実施態様１から５６のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施態様５７から６３のコンジュゲート又は実施態様６４の薬学的に許容される塩又は実施態様６５の薬学的組成物。
７２．実施態様１から５６のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は実施態様５７から６３のコンジュゲート又は実施態様６４の薬学的に許容される塩の、対象における疾患の治療、緩和又は予防のための医薬の調製のための使用。
７３．疾患がＦＮＤＣ３Ｂのインビボ活性に関連する、実施態様７０から７２の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用。
７４．疾患がＦＮＤＣ３Ｂ遺伝子の過剰発現及び／又はＦＮＤＣ３Ｂタンパク質の異常なレベルに関連する、実施態様７０から７３の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用。
７５．ＦＮＤＣ３Ｂ遺伝子発現が、実施態様１から５６のオリゴヌクレオチド又は実施態様５７から６３のコンジュゲート又は実施態様６４の薬学的に許容される塩又は実施態様６５の薬学的組成物なしの発現と比較して、少なくとも３０％、又は少なくとも又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％減少する、実施態様７４の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用。
７６．疾患が、急性骨髄性白血病及び肝細胞癌から選択されるがんである、実施態様７０から７４の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用。
７７．対象が哺乳動物である、実施態様７０から７６の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用。
７８．哺乳動物がヒトである、実施態様７７の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用。
【実施例】
【０１７４】
［材料及び方法］
2021505175.tif 000008
【０１７５】
モチーフ配列とは、オリゴヌクレオチドに存在する核酸塩基の連続した配列を表す。
デザインとは、ギャップマーデザインＦ−Ｇ−Ｆ’を指し、ここで、各数は、連続した修飾ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドの数（最初の数＝５’フランク）と、続くＤＮＡヌクレオシドの数（二番目の数＝ギャップ領域）と、続く修飾ヌクレオシドの数、例えば２’糖修飾ヌクレオシド（三番目の数＝３’フランク）が続き、場合によっては、ＤＮＡ及びＬＮＡの更なる反復領域が先行するか又は後に続くが、これらは、必ずしも標的核酸に相補的である連続した配列の一部ではない。
オリゴヌクレオチド化合物は、モチーフ配列の特定のデザインを表している。大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ Ｃは５−メチルシトシンであり、５−メチルＤＮＡシトシンは「ｅ」で表され、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０１７６】
［オリゴヌクレオチド合成法］
オリゴヌクレオチド合成法は当該技術分野で一般に知られている。以下は、適用されうるプロトコルである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用される装置、サポート及び濃度に関して僅かに変わりうる方法によって作製されている場合がある。
オリゴヌクレオチドは、１μｍｏｌスケールにおいてＯｌｉｇｏｍａｋｅｒ４８でホスホラミダイトアプローチを使用し、ウリジンユニバーサルサポート上で合成される。合成の終わりに、６０℃において５〜１６時間、アンモニア水を使用して、オリゴヌクレオチドを固体サポートから切断する。オリゴヌクレオチドは逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）又は固相抽出によって精製され、ＵＰＬＣによって特徴付けられ、分子量が更にＥＳＩ−ＭＳによって確認される。
【０１７７】
［オリゴヌクレオチドの伸長］
β−シアノエチル−ホスホラミダイト（ＤＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ−Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｔ、ＬＮＡ−５−メチル−Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ｇ（ｄｍｆ）、又はＬＮＡ−Ｔ）のカップリングは、アセトニトリル中０．１Ｍの５’−Ｏ−ＤＭＴ保護アミダイトの溶液と活性剤としてアセトニトリル中のＤＣＩ（４，５−ジシアノイミダゾール）（０．２５Ｍ）を使用して実施される。最終サイクルでは、例えばコンジュゲート基を結合させるためのＣ６リンカー又はコンジュゲート基自体のような、所望の修飾を施したホスホラミダイトを使用できる。ホスホロチオエート結合を導入するためのチオール化は、水素化キサンタン（アセトニトリル／ピリジン９：１中に０．０１Ｍ）を使用して実施される。ホスホジエステル結合は、ＴＨＦ／ピリジン／水７：２：１中０．０２Ｍのヨウ素を使用して導入することができる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に典型的に使用されるものである。
固相合成コンジュゲーション後では、市販のＣ６アミノリンカーホルホラミダイトを固相合成の最後のサイクルで使用でき、脱保護及び固体サポートからの切断後、アミノ結合脱保護オリゴヌクレオチドが単離される。コンジュゲートは、標準的な合成方法を使用して官能基の活性化を介して導入される。
【０１７８】
［ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製］
粗化合物は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ １０μ １５０×１０ｍｍカラムでの分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。０．１Ｍの酢酸アンモニウムｐＨ８及びアセトニトリルを５ｍＬ／ｍｉｎの流量でバッファーとして使用する。収集された画分を凍結乾燥させ、精製された化合物が典型的には白色固形物として得られる。
【０１７９】
［略語］
ＤＣＩ：４，５−ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
【０１８０】
［Ｔｍアッセイ］
オリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的（リン酸結合、ＰＯ）二重鎖を５００ｍｌのＲＮａｓｅフリー水で３ｍＭに希釈し、５００ｍｌの２×Ｔｍ−バッファー（２００ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と混合する。溶液を９５℃まで３分間加熱してから、室温で３０分間アニールする。二重鎖融解温度（Ｔｍ）は、ＰＥ Ｔｅｍｐｌａｂソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、ペルチェ温度プログラマーＰＴＰ６を備えたＬａｍｂｄａ４０ ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で測定する。温度を２０℃から９５℃に上げ、ついで２５℃に下げ、２６０ｎｍで吸収を記録する。一次導関数と、融解とアニーリングの両方の極大値を使用して、二重鎖Ｔｍを評価する。
【０１８１】
実施例１−インビトロでの有効性と効力の試験
一つの領域を標的とするオリゴヌクレオチド並びにＦＮＤＣ３Ｂ（配列番号：１）上の互いに同一である少なくとも二つの標的領域を標的とするオリゴヌクレオチドを、ＨｅＬａ細胞におけるインビトロ実験で試験した。ＥＣ５０（効力）と最大ｋｄ（有効性）を、単一ターゲティング及び反復ターゲティングオリゴヌクレオチドについて評価した。
【０１８２】
［細胞株］
ＨｅＬａ細胞株をＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から購入し、サプライヤーが推奨するように５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーターに維持した。アッセイでは、サプライヤーが推奨するように１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むイーグル最小必須培地（Ｓｉｇｍａ，Ｍ４６５５）の９６マルチウェルプレートに２５００細胞／ウェルを播種した。
【０１８３】
［オリゴヌクレオチドの効力と有効性］
オリゴヌクレオチドを添加する前に、細胞を２４時間インキュベートした。オリゴヌクレオチドをＰＢＳに溶解し、０．０１、０．０３１、０．１、０．３１、１、３．２１、１０、及び３２．１μＭのオリゴヌクレオチドの最終濃度で細胞に添加し、最終培養容量は１００μｌ／ウェルであった。オリゴヌクレオチド化合物を添加してから３日後に細胞を収集し、製造元の説明書に従って、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｐｒｏ９６ ＲＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。標的転写物レベルを、テクニカルデュプレックス及び生物学的トリプレックスセットアップで、ＶＩＣラベル付きＧＡＰＤＨコントロールプローブとのマルチプレックス反応で、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＦＡＭラベル付きＴａｑＭａｎアッセイを使用して定量化した。対象の標的転写物ＦＮＤＣ３Ｂ（Ｈｓ００９８１５５０＿ｍ１）とハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（４３２６３１７Ｅ ＶＩＣＲ／ＭＧＢプローブ）のＴａｑＭａｎプライマーアッセイ。オリゴヌクレオチドのＥＣ５０及び有効性を、対照サンプルの％として表５に示す。
ＥＣ５０の計算はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で実施した。最大ＦＮＤＣ３Ｂノックダウンレベルは、表５に対照の％として示している。
2021505175.tif 000009
【配列表】
2021505175000001.app
【国際調査報告】
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2021505175.tif 000012
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