(57)【要約】  本発明は、抗ＣＤ２  ＣＡＲなどのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、遺伝子編集または遺伝子サイレンシングされた免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのような操作された免疫細胞は、ＣＤ２発現を欠く。また、本明細書で提供されるのは、癌治療においてそのような細胞を使用する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作された免疫細胞であって、
（ｉ）ＣＤ２標的化ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、
（ｉｉ）前記細胞内で内因性ＣＤ２発現を下方制御するための標的ＣＤ２核酸配列の遺伝子修飾と、を含む、操作された免疫細胞。
【請求項２】
前記遺伝子修飾が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択されるシステムを使用するゲノム編集を含む、請求項１に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３】
前記遺伝子修飾が、短いヘアピンＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｓｄＲＮＡ、短い阻害性ＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡからなる群から選択されるシステムを使用する遺伝子サイレンシングを含む、請求項１に記載の操作された免疫細胞。
【請求項４】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、配列番号４４〜４７からなる群から選択される核酸配列に対応するガイドＲＮＡを含む、請求項２に記載の操作された免疫細胞。
【請求項５】
前記ＣＤ２標的化ドメインが、配列番号１８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列とを含む、ｓｃＦｖを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項６】
前記ＣＤ２標的化ドメインが、配列番号２０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列とを含む、ｓｃＦｖを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項７】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８αのヒンジ−膜貫通ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項８】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインからなる群から選択される１つ以上を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項９】
前記ＣＡＲが、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１０】
前記操作された免疫細胞が、ＣＤ２＋細胞の細胞毒性を誘発する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１１】
前記操作された免疫細胞が、相当する免疫細胞と実質的に同等の速度で増殖する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１２】
前記操作された免疫細胞が、同種異系細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１３】
前記操作された免疫細胞が、自家細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１４】
前記操作された免疫細胞が、操作されたＴ細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１５】
前記操作された免疫細胞が、操作されたガンマ−デルタＴ細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１６】
前記操作された免疫細胞が、操作されたＮＫ細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１７】
細胞局在化ドメインのＮ末端に連結された一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む遮断ポリペプチドをさらに含み、
前記ｓｃＦｖが細胞表面分子に結合し、前記細胞局在化ドメインが、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記遮断ポリペプチドが、前記操作された細胞の細胞内に留まり、前記操作された細胞内で内因性細胞表面分子に結合する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１８】
前記ＥＲ保持配列が、ＫＤＥＬ（配列番号２４）、ＫＫＸＸ（配列番号２６）、およびＫＫＭＰ（配列番号２７）（式中、Ｘが任意のアミノ酸である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または前記ゴルジ体保持配列が、ＹＧＲＬ（配列番号４０）、ＹＱＲＬ（配列番号４１）、ＹＫＧＬ（配列番号４２）、およびＹＸＸＬ（配列番号４３）（式中、Ｘが任意のアミノ酸である）からなる群から選択される、請求項１７に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１９】
前記遮断ポリペプチドが、前記ｓｃＦｖと、ＫＫＭＰもしくはＫＫＴＮを含む前記ＥＲ保持配列ドメイン、またはＹＧＲＬ、ＹＱＲＬ、ＹＫＧＬを含む前記ゴルジ体保持配列ドメインのいずれかとの間に連結された膜貫通ドメインをさらに含み、前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、およびＦＧＦＲ２Ｂからなる群のうちのいずれか１つから選択される膜貫通ドメインである、請求項１７または１８に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２０】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８αのヒンジ−膜貫通ドメインを含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞のうちの少なくとも１つ、または請求項１〜２０のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞の単離された集団を含む、医薬組成物。
【請求項２２】
癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞を含む、治療有効量の組成物を前記対象に投与し、それにより癌の治療を必要とする対象において癌を治療することを含む、方法。
【請求項２３】
前記組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が、Ｔ細胞悪性腫瘍またはＣＤ２関連癌である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｔ細胞悪性腫瘍または前記ＣＤ２関連癌が、Ｔ細胞白血病Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、初期Ｔ細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞前リンパ腫性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ性白血病、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、ＣＴＣＬの任意のサブタイプ、菌状息肉症、セザリー症候群、原発性皮膚ガンマ−デルタＴ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）のＴ系統サブセットを伴う悪性腫瘍、特に明記されていない末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、および未分化大細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与が、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射および／もしくは手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、ならびに髄腔内投与からなる群から選択されるいずれか１つによる、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の前記ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、発現ベクター組成物。
【請求項２８】
ヒトＣＤ２遺伝子に相補的なガイドＲＮＡのポリヌクレオチドと、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、を含む１つ以上の発現ベクターを含む発現ベクター組成物であって、前記ガイドＲＮＡの前記ポリヌクレオチドが、配列番号４４〜４７からなる群から選択されるいずれか１つを含む、発現ベクター組成物。
【請求項２９】
請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の前記遮断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、発現ベクター組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞を産生するための方法であって、請求項２７に記載の発現ベクター組成物、および請求項２８に記載の発現ベクター組成物を免疫細胞に導入することを含む、方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の発現ベクター組成物を前記免疫細胞に導入することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
導入することが、前記発現ベクター組成物を同時にまたは連続的に前記免疫細胞に導入することを含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月２３日出願の米国仮出願第６２／６７５，５２５号の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年５月２３日作成の当該ＡＳＣＩＩコピーは、「１１９４１９＿５００５＿ＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称であり、４４．０キロバイトのサイズである。
【０００３】
本明細書に記載の発明は、一般に、ＣＤ２遺伝子修飾による、ＣＤ２発現を欠くキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）の臨床的に有効な集団に関する。本発明はまた、Ｔ細胞悪性腫瘍を治療するためのそのようなＣＡＲ−Ｔ細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子操作された免疫細胞は、癌および自己免疫疾患の強力な新しい治療法である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴリンパ球を用いた最近の臨床試験の結果は、このアプローチの力の説得力のある実証を提供した。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、免疫細胞をリダイレクトして、腫瘍細胞を特異的に認識して死滅させることができる。ＣＡＲは、膜貫通ドメインを介してシグナル伝達分子に連結された抗体の単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）で構成される人工的な多分子タンパク質である。ｓｃＦｖがその同族抗原をライゲーションすると、シグナル伝達がトリガーされ、ＣＡＲ発現細胞傷害性Ｔリンパ球による腫瘍細胞の死滅を引き起こす（Ｅｓｈｈａｒ  Ｚ，Ｗａｋｓ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ。９０（２）：７２０−７２４，１９９３、Ｇｅｉｇｅｒ  ＴＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１０）：５９３１−５９３９，１９９９、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．９（３）：２７９−２８６，２００３、Ｃｏｏｐｅｒ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １０１（４）：１６３７−１６４４，２００３，Ｉｍａｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１８：６７６−６８４，２００４）。ＣＡＲ発現自己Ｔリンパ球を用いた臨床試験では、Ｂ細胞難治性白血病およびリンパ腫の患者で陽性反応が示されている（例：Ｔｉｌｌ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １１９（１７）：３９４０−３９５０，２０１２、Ｍａｕｄｅ  ＳＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３７１（１６）：１５０７−１５１７，２０１４）。
【０００５】
表面分子ＣＤ１９に特異的なＣＡＲ−Ｔ細胞は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫などの治療抵抗性のＣＤ１９陽性悪性腫瘍の患者で形態学的および分子的寛解を誘発することが示されている。他の悪性腫瘍は、異なる抗原に対してリダイレクトされたＴ細胞によって攻撃され得る。したがって、腫瘍学における遺伝子工学的細胞療法の可能な応用は広範囲である。
【０００６】
ＣＡＲ−Ｔ細胞注入の初期の臨床経験も潜在的な限界を特定しており、これは治療効果を著しく低下させ、開発を妨げる可能性がある。主要な問題は、がん患者から収集された免疫細胞の適応度が変化し、インビボで拡大し、抗腫瘍効果を発揮する予測不可能な能力をもたらすことである。この変動により、最も効果的な細胞用量の特定が複雑になり、短命で効果のない細胞産物の注入につながり、最終的には一貫した「生体薬（ｌｉｖｉｎｇ  ｄｒｕｇ）」の開発が妨げられる可能性がある。健康なドナーからのＴリンパ球の使用は、有効性と一貫性を改善するはずであるが、ドナーリンパ球注入の重大な、そして潜在的に致命的な結果である移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを伴う。そのような同種異系環境では、不可欠な細胞によって発現される組織抗原を認識する能力を抑制するために、注入されるＴ細胞に対して追加の修飾が必要である。
【０００７】
遺伝子編集のための実用的な方法論の出現は、癌の細胞療法に適用可能な治療細胞工学の新しい機会を開いた。ジンクフィンガーメガヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムを使用して、ＴＣＲαβ鎖をコードする遺伝子を削除して、アロ反応性を欠くＴ細胞を誘導することができながら、他の遺伝子を標的として、拒絶反応を遅らせることができる。ＴＣＲαおよびＣＤ５２遺伝子座のＴＡＬＥＮ欠失と抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現を使用した報告は、ＣＡＲ発現と遺伝子編集を組み合わせることは、技術的には難しいものの、臨床現場で実現可能であることを示している。
【０００８】
要するに、癌および自己免疫疾患の患者に対する新しい治療法の選択肢について、未だ対処されていない重要なニーズがある。
【発明の概要】
【０００９】
一態様では、本明細書で提供されるのは、ＣＤ２遮断ポリペプチド、標的ＣＤ２核酸配列の遺伝子修飾、およびＣＤ２に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、操作された免疫細胞である。
【００１０】
本発明は、操作された免疫細胞であって、
（ｉ）ＣＤ２標的化ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、と、
（ｉｉ）当該細胞内で内因性ＣＤ２発現を下方制御するための標的ＣＤ２核酸配列の遺伝子修飾と、を含む、操作された免疫細胞について記載する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の遺伝子修飾は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択されるシステムを使用するゲノム編集を含む。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、配列番号４４〜４７からなる群から選択される核酸配列に対応するガイドＲＮＡを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、短いヘアピンＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｓｄＲＮＡ、短い阻害性ＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡからなる群から選択されるシステムを使用する遺伝子サイレンシングを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２標的化ドメインは、配列番号１８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列と、を含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２標的化ドメインは、配列番号２０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列と、を含むｓｃＦｖを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８αのヒンジ−膜貫通ドメインを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインからなる群から選択される１つ以上を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、相当する免疫細胞と実質的に同等の速度で増殖する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、相当する免疫細胞と実質的に同等の速度で増殖する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、同種異系細胞である。ある実施形態では、操作された免疫細胞は、自己細胞である。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、操作されたＴ細胞である。特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、操作されたＮＫ細胞である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された免疫細胞のうちのいずれかは、細胞局在化ドメインのＮ末端に連結された一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む遮断ポリペプチドをさらに含み、当該ｓｃＦｖが、細胞表面分子に結合し、当該細胞局在化ドメインが、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該遮断ポリペプチドが、当該操作された細胞内で細胞に留まり、操作された細胞内で内因性細胞表面分子に結合する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、遮断ポリペプチドのＥＲ保持配列は、ＫＤＥＬ（配列番号２４）、ＫＫＸＸ（配列番号２６）、およびＫＫＭＰ（配列番号２７）（式中、Ｘが任意のアミノ酸である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または当該ゴルジ体保持配列は、ＹＧＲＬ（配列番号４０）、ＹＱＲＬ（配列番号４１）、ＹＫＧＬ（配列番号４２）、およびＹＸＸＬ（配列番号４３）（式中、Ｘが任意のアミノ酸である）からなる群から選択される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、遮断ポリペプチドは、当該ｓｃＦｖと、ＫＫＭＰもしくはＫＫＴＮを含む当該ＥＲ保持配列ドメイン、またはＹＧＲＬ、ＹＱＲＬ、ＹＫＧＬを含む当該ゴルジ体保持配列ドメインのいずれかとの間に連結された膜貫通ドメインをさらに含み、当該膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、およびＦＧＦＲ２Ｂからなる群のうちのいずれか１つから選択される膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αのヒンジ−膜貫通ドメインを含む。
【００２２】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の操作された免疫細胞のうちの少なくとも１つを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書で概説される操作された免疫細胞のうちのいずれか１つの単離された集団を含む。
【００２３】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の操作された免疫細胞のうちのいずれか１つを含む、治療有効量の組成物を対象に投与し、それにより癌の治療を必要とする対象において癌を治療することを含む、癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載の操作された免疫細胞の集団の治療用組成物を投与することを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、組成物はまた、薬学的に許容される担体を含む。言い換えれば、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の操作された免疫細胞のうちの少なくとも１つを含む医薬組成物である。場合によっては、医薬組成物はまた、薬学的に許容される担体を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、癌は、Ｔ細胞悪性腫瘍またはＣＤ２関連癌である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍またはＣＤ２関連癌は、Ｔ細胞白血病Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、初期Ｔ細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞前リンパ腫性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ性白血病、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、ＣＴＣＬの任意のサブタイプ、菌状息肉症、セザリー症候群、原発性皮膚ガンマ−デルタＴ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）のＴ系統サブセットを伴う悪性腫瘍、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、特に明記されていないＰＴＣＬ（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、および未分化大細胞リンパ腫からなる群から選択される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、投与は、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射および／もしくは手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、または髄腔内投与からなる群から選択される、いずれか１つによる。
【００２７】
本明細書で提供されるのは、本明細書で概説されるＣＡＲのうちのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、発現ベクター組成物である。
【００２８】
また、本明細書で提供されるのは、ヒトＣＤ２遺伝子に相補的なＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであり、ポリヌクレオチドが、配列番号４４〜４７からなる群から選択される核酸配列に対応する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、本明細書で概説される遮断ポリペプチドのうちのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、発現ベクター組成物である。
【００３０】
一態様では、本発明は、実施形態のうちのいずれか１つの操作された免疫細胞を産生するための方法について記載する。そのような方法は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（または発現ベクター組成物）、および１つ以上のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む発現ベクター（または発現ベクター組成物）を免疫細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はまた、遮断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（または発現ベクター組成物）を導入することを含む。いくつかの実施形態では、導入は、発現ベクターまたは発現ベクター組成物を当該免疫細胞に同時にまたは連続的に導入することを含む。
【００３１】
本発明は、表面受容体発現の遮断のための単純かつ効果的な方法であるを提供する。タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）という名前の特定の構築物は、標的タンパク質の細胞膜への輸送を防ぐ。ＰＥＢＬ構築物は、エクスビボで細胞を処理して免疫細胞の機能を最適化するために、遺伝子修飾構築物と容易に組み合わせることができ、既存の大規模ｃＧＭＰグレードのプロトコルに組み込むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本明細書に記載の例示的な抗ＣＤ２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物の概略を示す。
【図２】Ｊｕｒｋａｔ細胞における抗ＣＤ２  ＣＡＲの発現を示す。抗ＣＤ２  ＣＡＲは、抗ＣＤ２モノクローナル抗体９．６系抗ＣＤ２  ｓｃＦｖを含む。９．６の詳細な説明は、例えば、Ｋａｍｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１９８１，１５３：２０７−２１２に見出すことができる。細胞は、ＣＡＲ構築物とＧＦＰ、またはＧＦＰのみ（「モック」）を含むベクターで形質導入されている。フローサイトメトリーのドットプロットは、抗ＣＤ２  ＣＡＲ発現を示している。抗ヤギ抗マウス抗体ＡＰＣ（ＧＡＭ−ＡＰＣ）を使用した。  ９．６および９−１抗ＣＤ２モノクローナル抗体の詳細な説明は、例えば、Ｋａｍｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１９８１，１５３：２０７−２１２、およびＢｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩ，１９８６，ｅｄｓ．Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，Ｅ．Ｌ．，Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．，Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．，＆Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．Ｄ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．５３−６６にそれぞれ見出すことができる。
【図３】抗ＣＤ２  ＣＡＲの発現が、ＣＤ２＋標的細胞の存在下で活性化マーカーの発現を誘発したことを示す。棒グラフは、９．６抗ＣＤ２  ＣＡＲを発現する細胞の存在下にあるとき、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞株のＣＤ２５＋細胞およびＣＤ６９＋細胞の数が増加したことを示している。
【図４】Ｔ細胞上での９．６抗ＣＤ２  ＣＡＲ構築物の発現を示す。Ｔ細胞は、ＣＡＲ構築物とＧＦＰ、またはＧＦＰのみ（「モック」）を含むベクターで形質導入されている。フローサイトメトリーのドットプロットは、抗ＣＤ２  ＣＡＲ発現を示している。抗ヤギ抗マウス抗体ＡＰＣ（ＧＡＭ−ＡＰＣ）を使用した。
【図５】標的細胞（ＣＤ２＋標的細胞）に対する９．６抗ＣＤ２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞の細胞毒性活性を示す。共培養実験では、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  ｍＲＮＡまたはＧＦＰのみのｍＲＮＡのいずれかで電気穿孔したＣＡＲまたはモック形質導入Ｔ細胞の細胞毒性が示された。ＣＡＲ  Ｔ細胞および標的を１：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）でプレーティングした。数日間の共培養後、生存可能な標的細胞の数を決定した。棒グラフは、９．６抗ＣＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＣＤ２＋標的細胞に対して細胞毒性を発揮したことを示している。ＣＤ１０７ａは、刺激に続くＣＤ８＋Ｔ細胞の脱顆粒化およびＮＫ細胞の機能的活性のマーカーを表す。棒グラフは、ＧＦＰのみと比較して、９．６抗ＣＤ２  ＣＡＲを発現するとＣＤ１０７ａ＋細胞の割合がより高いことを示している。
【図６】本明細書に記載の抗ＣＤ２タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）構築物の例示的な実施形態を提供する。９．６ＰＥＢＬ  Ｉ構築物は、ＣＤ８αシグナルペプチドと、リンカーを介してＶＨドメインに接続されたＶＬドメインを含む９．６抗ＣＤ２  ｓｃＦｖと、ＥＲ保持ドメインと、を含む。９．６ＰＥＢＬ  ＩＩ構築物は、ＣＤ８αシグナルペプチドと、リンカーを介してＶＨドメインに接続されたＶＬドメインを含む９．６抗ＣＤ２  ｓｃＦｖと、ＣＤ８αヒンジ−膜貫通ドメインと、ＥＲ保持ドメインと、を含む。９−１ＰＥＢＬ  Ｉ構築物は、ＣＤ８αシグナルペプチドと、リンカーを介してＶＨドメインに接続されたＶＬドメインを含む９−１抗ＣＤ２  ｓｃＦｖと、ＥＲ保持ドメインと、を含む。９−１ＰＥＢＬ  ＩＩ構築物は、ＣＤ８αシグナルペプチドと、リンカーを介してＶＨドメインに接続されたＶＬドメインを含む９−１抗ＣＤ２  ｓｃＦｖと、ＣＤ８αヒンジ−膜貫通ドメインと、ＥＲ保持ドメインと、を含む。  ９．６抗ＣＤ２モノクローナル抗体および９−１抗ＣＤ２モノクローナル抗体の詳細な説明は、例えば、Ｋａｍｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１９８１，１５３：２０７−２１２、およびＢｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩ，１９８６，ｅｄｓ．Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，Ｅ．Ｌ．，Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．，Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．，＆Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．Ｄ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．５３−６６にそれぞれ見出すことができる。９．６ｓｃＦｖは、休止Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞の両方でＣＤ２を認識し結合する。また、ＣＤ５８のＣＤ２への結合を阻害（遮断）する。９−１ｓｃＦｖは、活性化Ｔ細胞上のＣＤ２を認識し結合する。ＣＤ５８のＣＤ２への結合は遮断しない。
【図７】９．６抗ＣＤ２  ＰＥＢＬ  Ｉ、９．６抗ＣＤ２  ＰＥＢＬ  ＩＩ、９−１抗ＣＤ２  ＰＥＢＬ  Ｉ、９−１抗ＣＤ２ＰＥＢＬ  ＩＩ、またはＧＦＰのみ（「モック」）で形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞における、ＣＤ２の表面および細胞内発現のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞における９．６抗ＣＤ２ＰＥＢＬ  ＩＩ構築物の発現は、ＣＤ２の発現を下方制御した。
【図８】９．６抗ＣＤ２  ＰＥＢＬ  ＩＩ構築物を電気穿孔したＴ細胞におけるＣＤ２の表面発現のフローサイトメトリードットプロットを示す。データは、電気穿孔されたＴ細胞によるＣＤ２発現の下方制御（部分的な下方制御）を示している。
【図９】ＣＤ２遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系ゲノム編集を受け、９．６抗ＣＤ２  ＰＥＢＬ  ＩＩ構築物を発現する、操作されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ２の表面および細胞内発現のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。
【図１０】ＣＤ２遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系ゲノム編集を受けたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ２切断産物を示す。
【図１１】フローサイトメトリーによって測定した、形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞上でのＣＤ２の発現を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＭＯＩ  １または５で示されたレンチウイルスで形質導入し、形質導入の８日後にＣＤ２発現についてフローサイトメトリーによって分析した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の例示的な実施形態の説明は以下の通りである。
【００３４】
Ｉ．導入
本発明は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞の表面分子の迅速かつ効率的な下方制御を可能にする方法を提供する。本発明の一実施形態で提供されるのは、遺伝子修飾（例えば、遺伝子編集または遺伝子サイレンシング）を介して、ＣＤ２を発現しないＣＤ２特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞であるＣＤ２ΔＣＤ２ＣＡＲ−Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２ΔＣＤ２ＣＡＲ−Ｔ細胞はまた、別の細胞表面分子、または限定されないがサイトカインなどの分泌分子の発現を遮断する、本明細書で概説されるＰＥＢＬ構築物を発現する。遺伝子修飾を介したＣＤ２遮断は永続的であり、他の表面分子の発現には影響を与えない。ＣＤ２ΔＣＤ２ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む相当するＴ細胞と同様に生存および増殖することができる。
【００３５】
ＩＩ．定義
本発明の実施は、他に示されない限り、当技術分野の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を用いるであろう。そのような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬ，２０００，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  ｓｏｎ  Ｉｎｃ，Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，ＵＳＡ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，１９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ｊ．Ａｂｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｉｍｏｎ，ｅｄｓ．−ｉｎ−ｃｈｉｅｆ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、具体的にはＶｏｌｓ．１５４および１５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．）およびＶｏｌ．１８５，”Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）、ならびにＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照されたい。
【００３６】
本開示をより容易に理解することができるようにするために、特定の用語をまず定義する。本出願で使用される場合、本明細書で明示的に提供される場合を除き、次の各用語は、以下に記載される意味を有するものとする。追加の定義は、本出願全体にわたり記載されている。
【００３７】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、およびｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、多くの本開示で使用される用語の一般的な辞書を当業者に提供する。
【００３８】
態様が「含む」という言葉で本明細書に記載されている場合は常に、「からなる」および／または「本質的にからなる」に関して記載されている類似の態様もまた提供されることが理解される。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「操作された免疫細胞」とは、天然に存在する免疫細胞と比較して、遺伝的に修飾された免疫細胞を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、複数のヌクレオチドモノマー（例えば、リボヌクレオチドモノマーまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー）を含むポリマーを指す。「核酸」には、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子が含まれる。核酸分子は、天然に存在する、組換え、または合成のものであり得る。さらに、核酸分子は、一本鎖、二本鎖または三本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、核酸分子を修飾することができる。二本鎖ポリマーの場合、「核酸」は分子の片方または両方の鎖を指す。
【００４１】
核酸に関する「ヌクレオチド配列」という用語は、リン結合（例えば、ホスホジエステル、アルキルおよびアリールホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル結合）および／または非リン結合（例えば、ペプチドおよび／またはスルファメート結合）などの共有結合により接合された連続した一連のヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、例えば、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列は、異種配列（例えば、異なる種または細胞型起源の遺伝子）である。
【００４２】
「ヌクレオチド」および「ヌクレオチドモノマー」という用語は、天然に存在するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー、ならびにその天然に存在しない誘導体および類似体を指す。したがって、ヌクレオチドには、例えば、天然に存在する塩基（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、またはデオキシシチジン）を含むヌクレオチド、および当技術分野で既知の修飾塩基を含むヌクレオチドが含まれ得る。
【００４３】
当業者によって理解されるように、いくつかの態様では、核酸はプラスミド配列をさらに含む。プラスミド配列は、例えば、プロモーター配列、選択マーカー配列、および遺伝子座標的配列からなる群から選択される１つ以上の配列を含むことができる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードする遺伝子は、「ＰＥＢＬをコードする遺伝子」、「ＰＥＢＬをコードするポリヌクレオチド」、「ＰＥＢＬをコードする核酸」などと称されることがある。
【００４５】
特定の実施形態では、標的結合分子は抗体またはその抗原結合フラグメントである。本明細書で使用する「抗体」とは、無傷の抗体または抗体の抗原結合フラグメントを意味し、無傷の抗体または修飾されたまたは操作された、またはヒト抗体である抗原結合フラグメントを含む。修飾されたまたは操作された抗体の例は、キメラ抗体、ヒト化抗体、マルチパラトピック抗体（例えば、バイパラトピック抗体（ｂｉｐａｒａｔｏｐｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））、および多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））である。抗原結合フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）および二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）が含まれる。
【００４６】
「二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントである。フラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）中に軽鎖可変領域（ＶＬ）に接続された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメインをペアリングするには短すぎるリンカーを使用すると、ドメインは別のチェーンの相補ドメインとペアリングさせられ、２つの抗原結合部位が作成される。二重特異性抗体は、例えば、特許文献ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、およびＨｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８に記載されている。
【００４７】
特定の実施形態では、抗体は三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）または四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）である。三重特異性抗体および四重特異性抗体を設計および生産する方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２４８（ｌ−２）：４７−６６，２００１を参照されたい。
【００４８】
「ドメイン抗体フラグメント」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントである。場合によっては、２つ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーと共有結合して、二価ドメイン抗体フラグメントを作成する。二価ドメイン抗体フラグメントの２つのＶＨ領域は、同じ抗原または異なる抗原を標的とし得る。
【００４９】
いくつかの実施形態では、抗体は修飾または操作されている。修飾または操作された抗体の例には、キメラ抗体、マルチパラトピック抗体（例えば、バイパラトピック抗体）、および多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））が含まれる。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「マルチパラトピック抗体」とは、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む抗体を意味し、少なくとも１つの単一ドメイン抗体は抗原上の第１の抗原決定基に対するものであり、少なくとも１つの他の単一ドメイン抗体は同じ抗原上の第２の抗原決定基に対するものである。したがって、例えば、「バイパラトピック」抗体は、抗原上の第１の抗原決定基に対する少なくとも１つの単一ドメイン抗体と、同じ抗原上の第２の抗原決定基に対する少なくとも１つのさらなる単一ドメイン抗体を含む。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「多特異性抗体」とは、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む抗体を意味し、少なくとも１つの単一ドメイン抗体は第１の抗原に対するものであり、少なくとも１つの他の単一ドメイン抗体は第２の抗原に対するものである（第１の抗原とは異なる）。したがって、例えば、「二重特異性」抗体は、第１の抗原に対する少なくとも１つの単一ドメイン抗体と、例えば第１の抗原とは異なる、第２の抗原に対する少なくとも１つのさらなる単一ドメイン抗体を含む抗体である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、モノクローナル抗体、例えばマウスモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体を産生する方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。
【００５３】
「Ｆａｂフラグメント」は、１つの軽鎖と１つの重鎖のＣＨ１および可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
【００５４】
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含む。２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合と、ＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって結合している。
【００５５】
「Ｆａｂ’フラグメント」には、１つの軽鎖と、ＶＨドメインとＣＨＩドメイン、およびＣＨＩドメインとＣＨ２ドメイン間の領域を含む１つの重鎖の一部が含まれ、２つのＦａｂ’フラグメントの２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されＦ（ａｂ’）２分子を形成する。
【００５６】
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、２つの軽鎖とＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメイン間の定常領域の一部を含む２つの重鎖を含み、２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって結合された２つのＦａｂ’フラグメントで構成されている。
【００５７】
「Ｆｖ領域」は、重鎖と軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠いている。
【００５８】
特定の実施形態では、標的結合分子は単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ抗体」）である。ｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体フラグメントを指し、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成できるようにするＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。ＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０１６４９および米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号も参照されたい。
【００５９】
「配列同一性」という用語は、デフォルトギャップ重量を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列されると、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、少なくとも、例えば、７０％の配列同一性、または少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９０％以上の配列同一性を共有することを意味する。配列比較では、通常、１つの配列が参照配列（親配列など）として機能し、試験配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピューターに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００６０】
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似法の検索により、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、ウィスコンシン州マディソン）により、または目視検査により（一般的にＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｈ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）行うことができる。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適切なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公開されている（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＮＣＢＩインターネットサーバーから公開されている）。通常、デフォルトのプログラムパラメータを使用して配列比較を実行できるが、カスタマイズされたパラメータも使用できる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。
【００６１】
本明細書で使用する場合、ＰＥＢＬ遺伝子に関連する「作動可能に連結された」とは、１つ以上の局在化ドメインをコードする１つ以上の遺伝子に隣接するフレームに（例えば、リンカーなしで）標的結合分子を直接コードする遺伝子を指す。あるいは、標的結合分子をコードする遺伝子は、本明細書に記載されるように、リンカー配列を介して１つ以上の局在化ドメインをコードする１つ以上の遺伝子に接続されてもよい。
【００６２】
本明細書で使用する場合、タンパク質に関連する「連結された」とは、第１のドメイン、例えば標的結合分子の、第２のドメイン、例えば局在化ドメインへの接合を指す。リンカーはアミノ酸配列であり得る。当技術分野で周知の様々な適切なリンカーを使用して、標的結合分子を局在化ドメインにつなぐことができる。例えば、変動する長さの親水性残基からなるポリペプチド、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３５）ポリペプチド（ｎが、例えば３〜１２の整数である）などの天然に存在しないペプチドを、包括的に、本発明に従って使用することができる。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、臨床的に許容される基準に従って、医学的状態が改善される程度まで、医学的状態（例えば、Ｔ細胞悪性腫瘍に関係する状態）に対抗することを指す。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス）を指す。特定の実施形態では、対象はヒトである。「治療を必要とする対象」とは、Ｔ細胞を誘発して悪性腫瘍Ｔ細胞に対して特異的な細胞毒性を発揮することにより治療（例えば、改善、寛解、予防）することができる疾患または状態を、有するかまたは発症するリスクがある対象（例えば、患者）を指す。
【００６５】
本明細書で定義されるように、「治療有効量」とは、対象に投与されたときに、投与条件下で対象において所望の治療効果を達成する（Ｔ細胞悪性腫瘍に関連する状態を治療する）のに十分な量を指す。投与される薬剤の有効量は、本明細書で提供されるガイダンスおよび当技術分野で知られている他の方法を使用して、および例えば、選択された特定の薬剤、対象の年齢、感受性、薬物に対する耐性および全体的な健康状態を含むいくつかの要因に依存して、通常の技能の臨床医が決定できる。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「治療効果の増強」とは、宿主における移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の低減、宿主による拒絶の低減もしくは排除、宿主における生存期間の延長、宿主における腫瘍による阻害の低減、宿主における自己殺傷（ｓｅｌｆ−ｋｉｌｌｉｎｇ）の低減、宿主における炎症カスケードの低減、または宿主におけるＣＡＲ媒介シグナル伝達の持続のうちの１つ以上を指す。
【００６７】
ＩＩＩ．タンパク質発現ブロッカー
本明細書に記載の方法は、細胞表面分子または分泌分子などの特定の標的タンパク質の迅速な除去または不活性化を可能にする。本方法は、除去、中和、または遮断される標的（例えば、タンパク質）に結合する標的結合分子を含むポリペプチド構築物に一部依存する。標的結合分子は、用途に応じて、ゴルジ体、小胞体、プロテアソーム、または細胞膜などの特定の細胞区画にポリペプチドを導くドメイン（例えば、局在化ドメインまたは細胞内保持ドメイン）に連結されている。簡単にするために、局在化ドメインに連結された標的結合分子は、本明細書では「タンパク質発現ブロッカー」または「ＰＥＢＬ」と称されることがある。いくつかの実施形態では、ＰＥＢＬはまた、シグナルペプチドドメインを含む。さらに他の実施形態では、ＰＥＢＬは、膜貫通ドメインを含むか、または細胞局在化ドメインは、膜貫通ドメインを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＰＥＢＬは、細胞表面分子または分泌分子からなる群から選択される標的分子に結合する。場合によっては、標的分子は、限定されないが、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３５、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、および形質転換成長因子（ＴＧＦ）−βなどのサイトカインである。場合によっては、標的分子は、Ｔ細胞などの免疫細胞上に発現するＣＤタンパク質（ＣＤ抗原）である。場合によっては、ＣＤタンパク質は、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１３、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１７、ＣＤ１１９、ＣＤ１２２、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５８、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤ１８３、ＣＤ１８５、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９６、ＣＤ２１２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１８、ＣＤ２２３、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２７５、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ３０５、ＣＤ３１４、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３５５、およびＣＤ３６０からなる群から選択される。
【００６９】
ＰＥＢＬの非限定的な例を図６に示し、例示的なアミノ酸および核酸配列を表１に提供する。
【表１−１】
2021525067.tif 000002
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
2021525067.tif 000006
【００７０】
活性化された免疫細胞によるサイトカインの分泌は、免疫細胞療法の深刻な悪影響をもたらすことが示されている、サイトカイン放出症候群およびマクロファージ活性化症候群を引き起こす（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１４，１２４（２）：１８８−１９５）。
【００７１】
いくつかの実施形態では、標的結合分子は、ＣＤタンパク質、例えば、ヒトＣＤ２タンパク質に特異的に結合する分子である。場合によっては、標的結合分子は、抗ＣＤ２抗体またはＣＤ２に結合する抗原結合フラグメントである。
【００７２】
Ｔ細胞上で発現されるリガンド（例えば、ペプチドまたは抗原）への結合時に免疫応答を活性化または不活性化することができるそのような適切な結合分子はすべて、「標的結合分子」と総称される。当業者に理解されるように、標的結合分子は、抗体または抗原結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）を含む必要はなく、むしろ、標的分子に結合する標的結合分子の部分は、例えば、受容体−リガンド対の受容体、または受容体−リガンド対のリガンドに由来し得る。
【００７３】
本明細書に記載のＰＥＢＬの標的結合分子は、標的細胞表面分子に結合する抗体に由来し得る。場合によっては、ＰＥＢＬの標的結合分子は、ＣＤ２に結合する抗体に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２に結合する抗体は、抗ＣＤ２モノクローナル抗体９．６またはその変異体である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２に結合する抗体は、抗ＣＤ２モノクローナル抗体９．６のヒト化変異体である。他の実施形態では、ＣＤ２に結合する抗体は、抗ＣＤ２モノクローナル抗体９−１である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２に結合する抗体は、抗ＣＤ２モノクローナル抗体９−１のヒト化変異体である。
【００７４】
９．６および９−１の詳細な説明は、例えば、Ｋａｍｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１９８１，１５３：２０７−２１２およびＢｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩ、１９８６、ｅｄｓ．Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，Ｅ．Ｌ．，Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．，Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．，＆Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．Ｄ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．５３−６６にそれぞれ見出すことができる。
【００７５】
ヒト化抗体とは、標的抗原（例えば、ヒトＣＤ２）に結合することができ、実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するフレームワーク（ＦＲ）領域、および実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、免疫グロブリンアミノ酸配列変異体またはそのフラグメントを指す。したがって、ヒト化抗体９−１は、ＣＤ２に結合することができ、これは、実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するＦＲ領域と、実質的にマウス抗体９−１のアミノ酸配列を有するＣＤＲとを含む。同様に、ヒト化抗体９．６は、ＣＤ２に結合することができ、これは、実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するＦＲ領域と、実質的にマウス抗体９．６のアミノ酸配列を有するＣＤＲとを含む。
【００７６】
一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてもしくは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応するか、またはＦＲ領域のすべてもしくは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ）のうちの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリンの、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含むであろう。通常、抗体は、軽鎖、ならびに少なくとも重鎖の可変ドメインの両方を含むであろう。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域を含み得る。
【００７７】
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む任意のクラスの免疫グロブリン、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択することができる。通常、定常ドメインは、ヒト化抗体が細胞毒性活性を呈することが望まれる補体結合定常ドメインであり、クラスは、典型的にはＩｇＧ１である。そのような細胞毒性活性が望ましくない場合、定常ドメインは、ＩｇＧ２クラスのものであってもよい。ヒト化抗体は、２つ以上のクラスまたはアイソタイプからの配列を含むことができ、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当該技術分野の範囲内である。
【００７８】
ヒト化抗体のＦＲおよびＣＤＲ領域は、親配列に正確に対応する必要はなく、例えば、インポートＣＤＲまたはコンセンサスＦＲは、少なくとも１つの残基の置換、挿入、または削除によって変異誘発され、それによりその位置のＣＤＲまたはＦＲ残基が、コンセンサスまたはインポート抗体のいずれにも対応していない場合がある。しかしながら、そのような突然変異は、広範囲に及ばないであろう。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも７５％、より多くの場合９０％、最も好ましくは９５％超が、親ＦＲおよびＣＤＲ配列の残基に対応するであろう。
【００７９】
一般に、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列および様々な概念的なヒト化産物の分析プロセスによって産生される。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元コンフォメーション構造を例示および表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの画面上での検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析を可能にする。
【００８０】
抗原結合（例えば、細胞表面分子結合）に影響を与える残基は、正または負の意味で、候補免疫グロブリンの抗原親和性または抗原特異性を実質的に担う残基であると定義される。場合によっては、コンセンサスおよびインポート配列からのＦＲ残基の選択および組み合わせが、所望の免疫グロブリン特徴を得るために実行される。そのような望ましい特徴としては、標的抗原に対する親和性の増加およびより高い特異性が挙げられるが、状況によっては反対の効果が望まれる場合があることが想定される。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与えることに直接かつ最も実質的に関与している（が、すべてのＣＤＲ残基がそのように関与しているわけではなく、したがってコンセンサス配列に置換する必要はない）。しかしながら、ＦＲ残基はまた、顕著な効果を有し、少なくとも３つの方式での影響を発揮することができる。それらは、抗原に非共有結合的に直接結合することができ、ＣＤＲ残基と相互作用することができ、重鎖と軽鎖の境界に影響を与えることができる。
【００８１】
典型的には、隣接するＣＤＲの空間的位置、ならびに標的抗原の寸法および構造から抗原の位置を補完する必要がある。一般に、塩橋の形成、水素結合、または疎水性相互作用することができるヒト化抗体残基のみが、非共有抗原結合に関与する可能性があるが、しかしながら抗原から空間的に３．２オングストローム以下離れた原子を有する残基はまた、抗原と非共有結合的に相互作用し得る。そのような残基は、典型的には、チロシン、アルギニン、およびリジンなど、最大のかさを有する側鎖を有する比較的大きなアミノ酸である。また３次元モデリングによって視覚化されるように、抗原結合ＦＲ残基はまた、典型的には、ＣＤＲドメインから溶媒中に約７オングストロームおよびＣＤＲドメインのいずれかの側に約７オングストローム延在するＣＤＲの溶媒配向面を取り囲むエンベロープに配向される側鎖を有するであろう。
【００８２】
ＣＤＲと相互作用する残基は、一般に、ＣＤＲポリペプチド骨格のコンフォメーションに影響を与えるか、またはＣＤＲ残基側鎖と非共有結合を形成するかのいずれかの残基である。コンフォメーションに影響を与える残基は、通常、任意のＣＤＲ骨格原子の空間位置を約０．２オングストローム超変化させる残基である。ＣＤＲ配列の骨格原子は、例えば、ベータシート、ヘリックス、ループなどの組織化された構造を中断または修飾する残基によって置き換えられる。隣接する配列のコンフォメーションに大きな影響を発揮し得る残基としては、プロリンおよびグリシンが挙げられ、どちらも骨格に屈曲を導入することができる。骨格原子を置き換えることができる他の残基は、塩橋および水素結合に関与することができるものである。
【００８３】
ＣＤＲ側鎖と相互作用する残基は、ＣＤＲ側鎖との非共有結合、一般に塩橋または水素結合のいずれかを形成すると合理的に予想される残基である。そのような残基は、それらの側鎖の三次元的な位置によって識別される。塩橋またはイオンブリッジは、互いに約２．５〜３．２オングストローム以内に位置し、反対の電荷を担持する２つの側鎖、例えばリシニルとグルタミルの対の間に形成されると予想することができる。水素結合は、セリルまたはスレオニルとアスパルチルまたはグルタミルなどの残基対（または他の水素受容残基）の側鎖間に形成されると予想することができる。そのような対は、タンパク質化学の分野で周知であり、候補抗体の三次元モデリングにおいて当業者には明らかであろう。
【００８４】
所与の置換の正確な影響がどのようなものであるかを事前に予測することは完全には可能でないので、置換を行い、所望の特徴について候補抗体を評価する必要があり得る。しかしながら、これらのステップは、それ自体が日常的であり、当該技術分野の範囲内である。
【００８５】
ＣＤＲおよびＦＲ残基は、標準的な配列定義（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．（１９８７）、および構造的定義（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）に従って決定される。これらの２つの方法でのＣＤＲ識別にわずかな差異が生じる場合、構造的定義が優先されるが、配列定義方法で識別された残基は、コンセンサス配列にインポートするフレームワーク残基を決定するための重要なＦＲ残基と見なされる。
【００８６】
一般に、インポート抗体をヒト化する最初のステップは、インポート配列を組み込むためのコンセンサスアミノ酸配列を導出することである。次に、上記の方法を使用して、これらの配列のモデルが生成される。特定の実施形態では、コンセンサスヒト配列は、Ｋａｂａｔらの配列編集における最も豊富なサブクラスに由来する（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７））。これらのステップは異なる順序で行うことができるが、典型的には、候補ヒト化抗体の構造は、対応するヒトＣＤＲ全体が除去された後、非ヒトインポート配列からコンセンサスヒト構造に少なくとも１つのＣＤＲを転送することによって作り出される。ヒト化抗体は、配列変動（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７））によって定義されるように、または構造変動（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．＆Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって定義されるように、ＣＤＲ内の位置での非ヒトインポート残基のヒト置換を含み得る。非ヒトインポート残基とヒトコンセンサスフレームワーク残基との間の差異を個々に調査して、ＣＤＲコンフォメーションおよび／または抗原への結合に対するそれらの考えられる影響を決定する。そのような考えられる影響の調査は、望ましくは、モデリングを通じて、特定の位置でのアミノ酸の特徴を調べることによって実行されるか、または特定のアミノ酸の置換もしくは突然変異誘発の効果を評価することを通じて実験的に決定される。
【００８７】
いくつかの実施形態では、インポート非ヒト抗体およびヒト抗体のアミノ酸配列を含むヒト化抗体は、以下のステップ：（ａ）インポート抗体可変ドメインおよびコンセンサスヒト可変ドメインの少なくとも一部のアミノ酸配列を得るステップと、（ｂ）インポートおよびヒト可変ドメイン配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を特定するステップと、（ｃ）対応するヒトＣＤＲアミノ酸配列をインポートＣＤＲアミノ酸配列で置換するステップと、（ｄ）インポート抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）およびコンセンサス抗体の対応するＦＲのアミノ酸配列を整列させるステップと、（ｅ）対応するコンセンサス抗体残基と非相同である、整列させたＦＲ配列におけるインポート抗体ＦＲ残基を特定するステップと、（ｆ）非相同インポートアミノ酸残基が次の効果：（１．）抗原に直接非共有結合する、（２．）ＣＤＲと相互作用する、または（３．）ＶＬ−ＶＨ界面に関与する、のうちの少なくとも１つを有すると合理的に予想されるかどうかを決定することと、（ｇ）これらの効果のうちの少なくとも１つを有すると合理的に予想される任意の非相同インポート抗体アミノ酸残基について、コンセンサス抗体ＦＲ配列の対応するアミノ酸残基をその残基で置換するステップと、を利用して作製される。
【００８８】
任意選択的に、ステップ（ｅ）で特定された任意の非相同残基がドメインの表面に露出しているか、またはドメイン内に埋もれているかを決定し、残基が露出しているがステップ（ｆ）で特定されたいずれの効果も有さない場合は、コンセンサス残基を保持してもよい。
【００８９】
ヒト化抗体を生成するための方法の追加の説明は、例えば、ＵＳ６，０５４，２９７、ＵＳ６，４０７，２１３、およびＵＳ６，７１９，９７１に見出され、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＰＥＢＬの標的結合分子は、配列番号１８に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号１９に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するＶＬドメインと、を含む抗ＣＤ２一本鎖可変フラグメントを含む。場合によっては、リンカーは、ｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインとを接続する。ＶＨ−ＶＬリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３５）リンカー（式中、ｎが、１〜６、例えば、１、２、３、４、５、または６の範囲であり得る）であり得る。他の例では、ＶＨ−ＶＬリンカーは、任意のＧＳリンカーまたは当業者に既知の他の柔軟なリンカーであり得る。場合によっては、ＶＨドメインは、配列番号１８に記載の配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含む。場合によっては、ＶＬドメインは、配列番号１９に記載の配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ＰＥＢＬの標的結合分子は、配列番号２０に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号２１に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するＶＬドメインと、を含む抗ＣＤ２一本鎖可変フラグメントを含む。場合によっては、リンカーは、ｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインとを接続する。ＶＨ−ＶＬリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３５）リンカー（式中、ｎが、１〜６、例えば、１、２、３、４、５、または６の範囲であり得る）であり得る。他の例では、ＶＨ−ＶＬリンカーは、任意のＧＳリンカーまたは当業者に既知の他の柔軟なリンカーであり得る。
【００９２】
場合によっては、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖは、ヒト免疫細胞のＣＤ２への結合に適合する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１８に記載の配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含み、ＶＬドメインは、配列番号１９に記載の配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含み、それにより、ＣＤ２発現がヒト免疫細胞で遮断、低減、または減少される。他の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２０に記載の配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含み、ＶＬドメインは、配列番号２１に記載の配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含み、それにより、ＣＤ２発現がヒト免疫細胞で遮断、低減、または減少される。
【００９３】
様々な実施形態では、本明細書に記載のＰＥＢＬの標的結合分子は、配列番号２２に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を含む抗ＣＤ２  ｓｃＦｖを含む。様々な他の実施形態では、標的結合分子は、配列番号２３に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を含む抗ＣＤ２  ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖは、配列番号２２の変異体であり、配列番号２２の抗ＣＤ２  ｓｃＦｖと同じ結合活性を有する。他の実施形態では、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖは、配列番号２３の変異体であり、配列番号２３の抗ＣＤ２  ｓｃＦｖと同じ結合活性を有する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ＰＥＢＬのｓｃＦｖは、抗ＣＤ２抗体の可変重鎖配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のｓｃＦｖは、抗ＣＤ２抗体の可変軽鎖配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する可変軽鎖配列を含む。例えば、抗ＣＤ２抗体は、当業者によって認識されるそのようないずれかのものであり得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ２抗体または抗ＣＤ２  ｓｃＦｖは、そのヒト化変異体である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ＰＥＢＬの抗ＣＤ２  ｓｃＦｖは、休止Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞の細胞内ＣＤ２に結合する。他の実施形態では、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖは、活性化Ｔ細胞の細胞内ＣＤ２に結合する。特定の実施形態では、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖは、活性化Ｔ細胞の細胞内ＣＤ２に結合し、休止Ｔ細胞では結合しない。特定の実施形態では、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖは、免疫細胞の細胞内ＣＤ２に結合する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖは、ＣＤ５８のＣＤ２結合を阻害または遮断する。他の実施形態では、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖは、ＣＤ５８のＣＤ２結合を遮断または阻害しない。
【００９７】
細胞局在化ドメインは、保持シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞局在化ドメインは、保持シグナル伝達ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。場合によっては、細胞局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、またはプロテアソーム局在化配列を含む。細胞局在化ドメインは、タンパク質が細胞によって分泌されるのを防止するかまたは妨げるアミノ酸配列を含んでもよい。細胞局在化ドメインは、細胞内区画にタンパク質を保持するアミノ酸配列を含んでもよい。場合によっては、細胞局在化ドメインは、ＥＲまたはゴルジ体の膜などの細胞膜にタンパク質のアンカーを保持するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、保持シグナル伝達ドメインは、ＫＤＥＬ配列（配列番号２４）、ＫＫＤ／Ｅ配列（配列番号２５）、ＫＫＸＸ配列（配列番号２６）、ＫＫＭＰ配列（配列番号２７）、またはＹＱＲＬ配列（配列番号２８）（式中、Ｘが任意のアミノ酸配列を表す）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、保持シグナル伝達ドメインがＫＫＸＸまたはＫＫＭＰを含む場合、細胞局在化ドメインは、限定されないが、配列番号１５の配列などの、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインをさらに含む。場合によっては、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号１４のＥＲ保持ドメインのＮ末端に連結されている。
【００９８】
いくつかの実施形態では、細胞局在化ドメインは、ＫＤＥＬ配列（配列番号２４）を含む。特定の実施形態では、細胞局在化ドメインは、ＡＥＫＤＥＬの配列（配列番号２９）を含む。様々な実施形態では、細胞局在化ドメインは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＥＫＤＥＬ（配列番号３０）の配列を含む。特定の実施形態では、細胞局在化ドメインは、ＫＫＭＰ配列（配列番号２７）を含む。いくつかの実施形態では、細胞局在化ドメインは、ＬＹＫＹＫＳＲＲＳＦＩＥＥＫＫＭＰの配列（配列番号３１）およびＫＫＭＰ配列（配列番号２７）を含む。
【００９９】
特定の実施形態では、細胞局在化ドメインは、所望の機能を有する限り、配列番号３０に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、細胞局在化ドメインは、所望の機能を有する限り、配列番号３１に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ＥＲ保持配列は、ＫＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＫＭＰ、およびＫＫＴＮ（式中、Ｘが任意のアミノ酸であり得る）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ゴルジ体保持配列は、ＹＧＲＬ（配列番号４０）、ＹＱＲＬ（配列番号４１）、ＹＫＧＬ（配列番号４２）、およびＹＸＸＬ（配列番号４３）（式中、Ｘが任意のアミノ酸であり得る）からなる群から選択される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、プロテアソーム局在化は、ｓｃＦｖ配列を、２１（ＴＲＩＭ２１）標的化ドメイン配列を含む三者モチーフに連結し、ヒトＴＲＩＭ２１  Ｅ３ユビキチンリガーゼタンパク質をコードする配列を共発現することによって達成される。ＴＲＩＭ２１は、抗体のＦｃドメインに高い親和性で結合し、ユビキチン−プロテオソーム複合体を動員して、抗体に結合した分子（例えばタンパク質およびペプチド）を分解することができる。ＴＲＩＭ２１標的化ドメイン配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４などのヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）定常領域（Ｆｃ）遺伝子の群から選択されるアミノ酸配列をコードし、ｓｃＦｖおよびＦｃドメインを含む融合タンパク質を形成するために使用される。この実施形態では、外因的に発現するＴＲＩＭ２１タンパク質は、標的タンパク質（例えば、ＣＤ２）に結合したｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質に結合し、複合体をプロテアソームに導いて分解する。
【０１０２】
ヒトＴＲＩＭ２１  Ｅ３リガーゼタンパク質のアミノ酸配列の詳細は、ＮＣＢＩタンパク質データベースでは、例えば、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００３１３２．２に見出すことができる。ヒトＴＲＩＭ２１  Ｅ３リガーゼタンパク質をコードする核酸配列の詳細は、ＮＣＢＩタンパク質データベースでは、例えば、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００３１４１．３に見出すことができる。
【０１０３】
膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＩＣＯＳ、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメイン、またはヒンジと膜貫通ドメインとの組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。ＣＤ８αに由来するヒンジおよび膜貫通ドメインは、ＥＲまたはゴルジ体保持シグナル伝達ドメインに連結されている。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインまたはヒンジ、および膜貫通ドメインは、所望の機能を有する限り、配列番号１５に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、リンカーを介して保持シグナル伝達ドメインに連結されている。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖのＶＬドメインおよびＶＨドメインは、リンカーによって接続されている。膜貫通ドメインと保持シグナル伝達ドメインとの間のリンカーは、ｓｃＦｖのリンカーと同じ配列である。場合によっては、膜貫通ドメインと保持シグナル伝達ドメインとの間のリンカーは、ｓｃＦｖのリンカーとは異なる配列を有する。リンカーの非限定的な例としては、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３２）、（ＧＧＳＧ）ｎ（配列番号３３）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（配列番号３４）、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３５）（式中、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）が挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３６）、または（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号３７）である。リンカーの長さの変動は、活性を保持するかまたは増強でき、活性研究において優れた有効性を生じる。
【０１０６】
特定の実施形態では、リンカーは、例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３８）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３９）を含む。様々な実施形態では、約５〜約１００アミノ酸の長さを有するペプチドリンカーを、包括的に、本発明で使用することができる。特定の実施形態では、約２０〜約４０アミノ酸の長さを有するペプチドリンカーを本発明で使用することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸、または少なくとも４０アミノ酸の長さを有するペプチドリンカーを本発明で使用することができる。当業者によって理解されるように、そのようなリンカー配列およびそのようなリンカー配列の変異体は、当技術分野で知られている。リンカー配列を組み込む構築物を設計する方法、および機能性を評価する方法は、当業者に容易に利用可能である。
【０１０７】
特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αシグナル伝達ペプチドに由来する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１１に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。シグナルペプチドは、標的結合分子に対してＮ末端に位置し得る。
【０１０８】
当業者が理解するであろうように、特定の実施形態では、本明細書に開示の様々な構成要素の配列（例えば、シグナルペプチド、ｓｃＦｖ、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、リンカー、局在化ドメイン、およびそれらの組み合わせ）のうちのいずれかが、本明細書に開示の特定の対応する配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１０９】
本明細書に記載のＰＥＢＬの例示的な実施形態を、表１に提供する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２  ＰＥＢＬをコードする核酸配列は、表１に記載の１つ以上の核酸配列を含む。特定の実施形態では、抗ＣＤ２  ＰＥＢＬは、配列番号６またはそのコドン最適化変異体に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、抗ＣＤ２  ＰＥＢＬは、配列番号７またはそのコドン最適化変異体に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２  ＰＥＢＬは、配列番号８、またはそのコドン最適化変異体に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、抗ＣＤ２  ＰＥＢＬは、配列番号９またはそのコドン最適化変異体に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。例えば、抗ＣＤ２  ＰＥＢＬをコードする核酸配列は、ヒト細胞、例えば、ヒト免疫細胞において所望の発現または活性を得るために修飾され得る。
【０１１１】
任意の標的タンパク質に対する抗体およびその抗体フラグメントを産生する方法は、当技術分野で周知であり、通例のものである。さらに、本明細書に例示されるように、様々な標的、例えばＣＤ２に対する市販の抗体を使用して、本明細書に例示されるＰＥＢＬ分子を生成することができる。本明細書に例示されるように、当技術分野で周知の抗体、ならびにそれから誘導される抗体のフラグメント（例えばｓｃＦｖ）を本発明で使用することができる。
【０１１２】
当業者によって理解されるように、キメラ抗原受容体および／またはＰＥＢＬ分子は、本明細書に開示される標的ならびに本明細書に開示される標的の変異体に結合するように設計され得る。例として、キメラ抗原受容体および／またはＰＥＢＬ分子は、ＣＤ２、またはその天然に存在する変異体分子に結合するように設計することができる。そのような天然に存在する変異体は、分子の野生型と同じ機能を持つことができる。他の実施形態では、変異体は、分子の野生型と比較して変化する機能を有することができる（例えば、病的状態を与える）。
【０１１３】
当業者によって理解されるように、組み合わせが機能的なＰＥＢＬを産生する限り、ＰＥＢＬ分子構築物の様々な構成要素は、異なる組み合わせで（例えば、異なるリンカー、異なる局在化配列、異なるｓｃＦｖなどを含むように）置換することができる。特定の構築物の機能性を評価する方法は、本明細書に開示されているように、当業者の範囲内である。
【０１１４】
ＩＶ．キメラ抗原受容体
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、単一の融合分子の１つ以上のシグナル伝達ドメインに関連する標的化部分からなる合成受容体である。一般に、ＣＡＲの結合部分は、柔軟なリンカーによって接合されているモノクローナル抗体の軽く可変的なフラグメントを含む、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインからなる。第一世代のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの細胞質領域またはＦｃ受容体ガンマ鎖に由来してきた。第一世代のＣＡＲは、Ｔ細胞の細胞毒性をうまくリダイレクトすることが示されているが、しかしながら、インビボでの長期的な展開および抗腫瘍活性を提供することはできなかった。ＣＡＲ修飾Ｔ細胞の生存率を増強し、増殖を増加するために、ＣＤ２８、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む共刺激分子からのシグナル伝達ドメインが、単独（第２世代）または組み合わせ（第３世代）に追加されている。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、一本鎖ＣＡＲに加えて、多鎖ＣＡＲである。多鎖ＣＡＲまたは多重特異性ＣＡＲは、異なる標的に同時に結合し、それにより免疫細胞の活性化および機能を増大させるための、いくつかの（例えば、２つ以上の）細胞外抗原（リガンド）結合ドメインを含む。場合によっては、細胞外抗原結合ドメインは、同じ膜貫通ポリペプチド上にタンデムに配置され、任意選択的にリンカーによって分離することができる。他の例では、多鎖ＣＡＲを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に、異なる細胞外抗原結合ドメインを配置してもよい。一本鎖ＣＡＲと同様に、多鎖ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、Ｆｃ受容体またはＴ細胞受容体、および抗原受容体の結合に続いてシグナル伝達を開始するために協調して作用する共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体、ならびに同じ機能的能力としての任意の合成配列であってもよい。
【０１１６】
シグナル伝達ドメインは、抗原依存性の一次活性化を開始するものと、抗原非依存的様式で作用して二次または共刺激シグナルを提供するものの、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列を含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られているシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明で使用されるＩＴＡＭの非限定的な例としては、非限定的な例として、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＦｃＲイプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものを挙げることができる。シグナル伝達ドメインはまた、共刺激シグナル分子を含み得る。二重特異性または多重特異性ＣＡＲの追加の説明は、ＷＯ２０１４／４０１１９８８に記載されており、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０１１７】
したがって、一実施形態では、本発明は、キメラ抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、ＣＤ２に結合する局在化ドメインに連結された標的結合分子（例えば、ＰＥＢＬ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、を含む、操作された免疫細胞に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＤ２に結合するキメラ抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）と、ＣＤ２に結合する局在化ドメインに連結された標的結合分子（例えば、ＰＥＢＬ）と、を含む、操作された免疫細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）に関する。ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＤ２  ＣＡＲは、別の細胞の細胞表面上のＣＤ２に結合し、ＣＤ２  ＰＥＢＬ、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞内コンパートメントに位置するＣＤ２に結合する。そのため、ＣＤ２  ＰＥＢＬは、他のＣＤ２結合ＣＡＲによるＣＡＲ−Ｔ細胞のフラトリサイドを防止する。
【０１１８】
本発明の特定の態様では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞の表面上に発現するＣＤ分子、例えばＣＤ２に結合する。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ９９、ＣＤ１２７、またはＣＤ１３７に結合する。
【０１１９】
ＣＡＲのＣＤ２結合ドメインは、抗ＣＤ２抗体またはＣＤ２に結合する抗原結合フラグメントであり得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２に結合する抗体は、抗ＣＤ２モノクローナル抗体９．６である。他の実施形態では、ＣＤ２に結合する抗体は、抗ＣＤ２モノクローナル抗体９−１である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２に結合する抗体は、抗ＣＤ２モノクローナル抗体９．６またはその変異体である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２に結合する抗体は、抗ＣＤ２モノクローナル抗体９．６のヒト化変異体である。他の実施形態では、ＣＤ２に結合する抗体は、抗ＣＤ２モノクローナル抗体９−１である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２に結合する抗体は、抗ＣＤ２モノクローナル抗体９−１のヒト化変異体である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２結合ドメインは、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、本発明のｓｃＦｖは、抗ＣＤ２抗体の可変重鎖配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のｓｃＦｖは、抗ＣＤ２抗体の可変軽鎖配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する可変軽鎖配列を含む。例えば、抗ＣＤ２抗体は、当業者によって認識されるそのようないずれかのものであり得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２一本鎖可変フラグメントは、配列番号１８に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号１９に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するＶＬドメインと、を含み得る。場合によっては、リンカーは、ｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインとを接続する。ＶＨ−ＶＬリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３５）リンカー（式中、ｎが、１〜６、例えば、１、２、３、４、５、または６の範囲であり得る）であり得る。ＶＨ−ＶＬリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３５）リンカー（式中、ｎが、１〜６、例えば、１、２、３、４、５、または６の範囲であり得る）であり得る。他の例では、ＶＨ−ＶＬリンカーは、任意のＧＳリンカーまたは当業者に既知の他の柔軟なリンカーであり得る。
【０１２２】
場合によっては、ＶＨドメインは、配列番号１８に記載の配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含む。場合によっては、ＶＬドメインは、配列番号１９に記載の配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖは、配列番号２０に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号２１に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するＶＬドメインと、を含む。場合によっては、リンカーは、ｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインとを接続する。ＶＨ−ＶＬリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３５）リンカー（式中、ｎが、１〜６、例えば、１、２、３、４、５、または６の範囲であり得る）であり得る。他の例では、ＶＨ−ＶＬリンカーは、任意のＧＳリンカーまたは当業者に既知の他の柔軟なリンカーであり得る。
【０１２４】
場合によっては、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖは、ヒト免疫細胞のＣＤ２への結合に適合する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１８に記載の配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含み、ＶＬドメインは、配列番号１９に記載の配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含み、それにより、ＣＤ２発現がヒト免疫細胞で遮断、低減、または減少される。他の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２０に記載の配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含み、ＶＬドメインは、配列番号２１に記載の配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含み、それにより、ＣＤ２発現がヒト免疫細胞で遮断、低減、または減少される。
【０１２５】
様々な実施形態では、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖは、配列番号２２に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を含む。様々な他の実施形態では、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖは、配列番号２３に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖは、配列番号２２の変異体であり、配列番号２２の抗ＣＤ２  ｓｃＦｖと同じ結合活性を有する。他の実施形態では、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖは、配列番号２３の変異体であり、配列番号２３の抗ＣＤ２  ｓｃＦｖと同じ結合活性を有する。
【０１２６】
ＰＥＢＬのＣＤ２結合ドメインは、ＣＡＲの抗ＣＤ２結合ドメインと同じＣＤ２のエピトープに結合することができる。他の場合、ＰＥＢＬの抗ＣＤ２結合ドメインは、ＣＡＲのＣＤ２結合ドメインとは異なるＣＤ２のエピトープに結合することができる。ＰＥＢＬのＣＤ２結合ドメインおよびＣＡＲのＣＤ２結合ドメインのアミノ酸配列は、実質的に同一であり得る。または、ＰＥＢＬのＣＤ２結合ドメインおよびＣＡＲのＣＤ２結合ドメインのアミノ酸配列は、異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＢＬのＣＤ２結合ドメインの配列は、ＣＡＲのＣＤ２結合ドメインに対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する。
【０１２７】
ＣＡＲの例示的な実施形態を図１に示し、例示的なアミノ酸および核酸配列を表１に提供する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２  ＣＡＲをコードする核酸配列は、表１に記載の１つ以上の核酸配列を含む。特定の実施形態では、抗ＣＤ２  ＣＡＲは、配列番号１０またはそのコドン最適化変異体に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。例えば、抗ＣＤ２  ＣＡＲをコードする核酸配列は、ヒト細胞、例えば、ヒト免疫細胞において所望の発現または活性を得るために修飾され得る。
【０１２９】
当業者が理解するであろうように、特定の実施形態では、本明細書に開示の様々な構成要素の配列（例えば、シグナルペプチド、ｓｃＦｖ、細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）、膜貫通ドメイン、リンカー、およびそれらの組み合わせ）のうちのいずれかが、本明細書に開示の特定の対応する配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインは、所望の機能を有する限り、配列番号１６に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１３１】
特定の実施形態では、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、またはＣＤ２などの共刺激分子からの別の細胞内シグナル伝達ドメインによって置き換えることができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、またはＣＤ２の細胞内シグナル伝達ドメインに対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有し得る。任意選択的に、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインはまた、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、またはＣＤ２などの共刺激分子からの別の細胞内シグナル伝達ドメイン（またはそれらの一部）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、追加の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、またはＣＤ２の細胞内シグナル伝達ドメインに対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）細胞内シグナル伝達ドメインは、所望の機能を有する限り、配列番号１７に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１３３】
場合によっては、細胞内シグナル伝達ドメインは、所望の機能を有する限り、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部を含む。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭに対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、所望の機能を有する限り、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０、またはＨ２−Ｋｂに対して少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ＣＤ８アルファ（ＣＤ８α）ヒンジおよび膜貫通ドメインは、所望の機能を有する限り、配列番号１１に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１３５】
本発明での使用に適したヒンジおよび膜貫通配列は、当技術分野では既知であり、例えば、その全体が参照により組み込まれる公開第ＷＯ２０１６／１２６２１３号に提供されている。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２  ＣＡＲのヒンジおよび膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＩｇＧ、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ２Ｂからのシグナル伝達ドメイン（例えば、膜貫通ドメイン）、または別の膜貫通タンパク質を含み得る。膜貫通ドメインは、天然に存在しない疎水性タンパク質セグメントであってもよい。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ＣＤ８アルファ（ＣＤ８α）シグナルペプチドは、所望の機能を有する限り、配列番号１１に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１３８】
Ｖ．操作された免疫細胞
本明細書で提供されるのは、標的ＣＤ２核酸配列の遺伝子修飾、およびＣＤ２に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、操作された免疫細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞はまた、遮断ポリペプチドを含む。そのような操作された免疫細胞は、内因性ＣＤ２発現を欠き、ＣＤ２に結合するＣＡＲを発現する。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、標的ＣＤ２核酸配列の遺伝子修飾は、ＣＤ２発現の不活性化を生じる。場合によっては、遺伝子修飾は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびメガヌクレアーゼからなるグループから選択されるシステムを使用する遺伝子編集を含む。場合によっては、遺伝子修飾は、短いヘアピンＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｓｄＲＮＡ、短い阻害性ＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡからなる群から選択されるシステムを使用する遺伝子サイレンシング（一過性の遺伝子サイレンシングなど）を含み得る。いくつかの実施形態では、内因性ＣＤ２発現は、操作された免疫細胞において遮断される。例えば、細胞表面上でのＣＤ２タンパク質発現は、遺伝子修飾によって遮断または防止される。場合によっては、細胞における（例えば、細胞の細胞内環境における）ＣＤ２タンパク質発現は、遺伝子修飾によって遮断または防止される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２タンパク質の内因性発現は、操作された免疫細胞において遮断または防止される。
【０１４０】
内因性ＣＤ２発現の遮断は、少なくとも６か月間持続することができる。内因性ＣＤ２発現の遮断は、少なくとも１２か月間持続することができる。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、相当する免疫細胞と実質的に同等の速度で増殖する。
【０１４１】
したがって、一実施形態では、本発明は、ＣＤ２  ＣＡＲを発現し、内因性ＣＤ２表面発現を欠くように遺伝子修飾されている、操作された免疫細胞に関する。特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、操作されたＴ細胞、操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、操作されたＮＫ／Ｔ細胞、操作された単球、操作されたマクロファージ、または操作された樹状細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来Ｔ細胞である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書で概説されるものなど、細胞表面または分泌分子に結合するＰＥＢＬを発現する、操作された免疫細胞について記載する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞はまた、標的ＣＤ２核酸配列の遺伝子修飾を含む。場合によっては、ＣＤ２を標的とした遺伝子修飾は、ＣＲＩＳＰＲ系遺伝子修飾である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２のＣＲＩＳＰＲ系遺伝子修飾は、配列番号４４〜４７のうちの１つ以上のガイドＲＮＡ配列を利用する。場合によっては、ＣＤ２を標的とした遺伝子修飾は、ＴＡＬＥＮ系またはＺＦＮ系遺伝子修飾である。特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、操作されたＴ細胞、操作されたγδ  Ｔ細胞、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞、操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、操作されたＮＫ／Ｔ細胞、操作された単球、操作されたマクロファージ、または操作された樹状細胞である。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＤ２に結合するＣＡＲを発現し、本明細書で概説されるものを含む操作された免疫細胞を対象とする。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列番号５の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲを発現する。特定の実施形態では、操作された細胞は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＡＲを発現する。特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、操作されたＴ細胞、操作されたγδ  Ｔ細胞、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞、操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、操作されたＮＫ／Ｔ細胞、操作された単球、操作されたマクロファージ、または操作された樹状細胞である。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書で概説されるものを含む、ＣＤ２に結合するＣＡＲおよびＣＤ２に結合するＰＥＢＬを発現する操作された免疫細胞を対象とする。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、配列番号５に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲに加えて、配列番号１〜４のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むＰＥＢＬを発現する。特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＡＲに加えて、配列番号１〜４のうちのいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＰＥＢＬを発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞はまた、標的ＣＤ２核酸配列（例えば、内因性ＣＤ２遺伝子座）の遺伝子修飾を含む。場合によっては、ＣＤ２を標的とした遺伝子修飾は、ＣＲＩＳＰＲ系遺伝子修飾である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２のＣＲＩＳＰＲ系遺伝子修飾は、配列番号４４〜４７のうちの１つ以上のガイドＲＮＡ配列を利用する。
【０１４５】
場合によっては、操作された免疫細胞は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＰＥＢＬと、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＣＡＲと、を発現する。場合によっては、操作された免疫細胞は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＰＥＢＬと、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＣＡＲと、を発現する。場合によっては、操作された免疫細胞は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＰＥＢＬと、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＣＡＲと、を発現する。場合によっては、操作された免疫細胞は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＰＥＢＬと、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＣＡＲと、を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、配列番号１のＰＥＢＬと、配列番号５のＣＡＲと、を発現する。。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、配列番号１のＰＥＢＬと、配列番号５のＣＡＲと、を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、配列番号２のＰＥＢＬと、配列番号５のＣＡＲと、を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、配列番号３のＰＥＢＬと、配列番号５のＣＡＲと、を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、配列番号４のＰＥＢＬと、配列番号５のＣＡＲと、を発現する。いくつかの実施形態では、そのような操作された免疫細胞はまた、標的ＣＤ２核酸配列の遺伝子修飾を含む。場合によっては、ＣＤ２を標的とした遺伝子修飾は、ＣＲＩＳＰＲ系遺伝子修飾である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２のＣＲＩＳＰＲ系遺伝子修飾は、配列番号４４〜４７のうちの１つ以上のガイドＲＮＡ配列を利用する。特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、操作されたＴ細胞、操作されたγδ  Ｔ細胞、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞、操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、操作されたＮＫ／Ｔ細胞、操作された単球、操作されたマクロファージ、または操作された樹状細胞である。
【０１４６】
本明細書で概説するＰＥＢＬは、標的タンパク質の細胞膜への輸送を妨げる。例えば、上記の標的分子に導かれるＰＥＢＬは、ＥＲに保持される。したがって、細胞表面上での標的の発現が抑制される場合には、ＰＥＢＬは、操作された免疫細胞に免疫表現型の変化を引き起こさない。また、ＰＥＢＬは、操作された免疫細胞の増殖に影響を与えない。いくつかの実施形態では、ＰＥＢＬは、抗ＣＤ２−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲなどのＣＡＲと共発現する。
【０１４７】
特定の実施形態で提供されるのは、操作された免疫細胞であって、局在化ドメインに連結された標的結合分子（例えば、ＰＥＢＬ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、標的結合分子が、標的分子に結合する抗体であり、局在化ドメインが、小胞体（ＥＲ）配列、ゴルジ体保持配列、プロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナルドメインを含む、操作された免疫細胞である。場合によっては、ＰＥＢＬはまた、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインを含む。
【０１４８】
場合によっては、操作された細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。特定の場合、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ２に結合する抗体を含む。特定の実施形態では、標的結合分子に関連するＣＤ２に結合する抗体は、表１に記載のＶＨ配列およびＶＬ配列を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、標的ＣＤ２核酸配列の遺伝子修飾を含む。場合によっては、ＣＤ２を標的とした遺伝子修飾は、ＣＲＩＳＰＲ系遺伝子修飾である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２のＣＲＩＳＰＲ系遺伝子修飾は、配列番号４４〜４７の核酸配列に対応する１つ以上のガイドＲＮＡ配列を利用する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、操作されたＴ細胞、操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、操作されたＮＫ／Ｔ細胞、操作された単球、操作されたマクロファージ、または操作された樹状細胞である。場合によっては、操作された免疫細胞は同種異系細胞である。他の場合、操作された免疫細胞は自己細胞である。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも６ヶ月間、ＣＤ２表面発現を欠く。他の実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも１２ヶ月間、ＣＤ２表面発現を欠く。特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも２０ヶ月間、ＣＤ２表面発現を欠く。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも２４ヶ月間、ＣＤ２表面発現を欠く。
【０１５２】
特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、相当する免疫細胞と比較して実質的に等しい速度で増殖する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２遺伝子の遺伝子修飾を担持し、ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞（例えば、ＣＤ２ΔＣＤ２ＣＡＲ−Ｔ細胞）およびは、対応するＣＡＲを発現する免疫細胞（例えば、ＣＤ２ＣＡＲ−Ｔ細胞）と同様に増殖する。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本発明の操作された免疫細胞は治療効果が増強される。そのような操作された免疫細胞は、対象において癌を治療するために使用することができる。特定の実施形態では、癌は、ＣＤ２関連癌またはＴ細胞悪性腫瘍、例えば、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞前リンパ腫性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ性白血病、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、ＣＴＣＬのサブタイプ、菌状息肉症、セザリー症候群、原発性皮膚ガンマ−デルタＴ細胞リンパ腫、限定されないが、特に明記されていない末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、および未分化大細胞リンパ腫を含む、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）のＴ系統サブセットを伴う悪性腫瘍、などのＴ細胞白血病またはＴ細胞リンパ腫である。特定の実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍は、初期Ｔ細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ−ＡＬＬ）である。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２遺伝子の遺伝子修飾を担持し、ＣＡＲを発現し、ＰＥＢＬを発現する本発明の操作された免疫細胞（例えば、ＣＤ２Δ＿ＰＥＢＬ＿ＣＤ２ＣＡＲ−Ｔ細胞）は、対応するＣＡＲ（例えば、ＣＤ２ＣＡＲ−Ｔ細胞）を発現する免疫細胞と比較して、増強したかまたは増加した治療効果を有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲおよび抗ＣＤ２  ＰＥＢＬを発現する操作された免疫細胞は、対応するＣＡＲを発現する免疫細胞に相当する治療効果を有する。
【０１５５】
別の実施形態では、本発明は、本発明の操作された免疫細胞を産生するための方法であって、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、ＣＤ２遺伝子修飾のための１つ以上のヌクレオチド配列を含む核酸とを免疫細胞に導入することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２の遺伝子修飾のためのヌクレオチド配列は、Ｃａｓタンパク質またはその変異体をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２の遺伝子修飾のためのヌクレオチド配列は、配列番号４４〜４７からなる群から選択されるいずれか１つに対応するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本方法はまた、局在化ドメインに連結された標的結合分子（例えば、ＰＥＢＬ分子）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入し、それにより、操作された免疫細胞を産生することを含む。
【０１５６】
特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、操作されたＴ細胞、操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、操作されたＮＫ／Ｔ細胞、操作された単球、操作されたマクロファージ、または操作された樹状細胞である。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、任意のタイプのＴ細胞である。特定の実施形態では、操作されたＴ細胞は、ガンマ−デルタ（γδ）Ｔ細胞である。特定の実施形態では、操作されたＴ細胞は、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞から産生される。
【０１５７】
特定の実施形態では、ヌクレオチド配列を含む核酸は、エクスビボで免疫細胞に導入される。他の実施形態では、ヌクレオチド配列を含む核酸は、インビボで免疫細胞に導入される。
【０１５８】
導入されるヌクレオチド配列を含む核酸は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体および局在化ドメインに連結された標的結合分子（例えばｓｃＦｖ）を含む単一のバイシストロン性構築物であり得る。本明細書に記載されるように、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（例えばＣＡＲ）および標的結合分子（例えばｓｃＦｖ）をコードする２つのｃＤＮＡの間に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチドコード領域部位を挿入することにより、単一のバイシストロン性構築物を調製することができる。２つ以上の標的を削除するためのトリシストロン性送達システムの設計も実行可能でなければならない。あるいは、個々の構築物（例えば、ＣＡＲおよびＰＥＢＬ）の別々の形質導入（同時または連続）を実施することができる。
【０１５９】
外因性核酸を導入する方法は本明細書に例示されており、当技術分野で周知である。薬剤／化学物質および分子（タンパク質および核酸）の細胞内部または細胞内区画への送達を可能にするために、リポソーム送達手段、高分子担体、化学担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、ナノ粒子、エマルション、非限定的な例として天然のエンドサイトーシスまたは食作用経路、ならびに電気穿孔などの物理的方法を含む、当該技術分野で既知の任意の手段を使用することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば電気穿孔によって細胞に直接導入されるｍＲＮＡ形態下でトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのうちの１つ以上を含むウイルスベクターは、トランスフェクションの標準的な手段の代替物である。ウイルス形質導入のための方法は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、限定されないが、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを含むウイルスベクターは、操作された細胞のゲノムへの安定した組み込みのために使用される。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列、ＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列、およびＣＤ２の遺伝子修飾のためのヌクレオチド配列（複数可）は、連続的に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列、ＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列は、同時に導入され、ＣＤ２の遺伝子修飾のためのヌクレオチド配列（複数可）は、。特定の場合、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列とＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列は機能的に連結されており、したがって単一の発現ベクターまたはプラスミドに導入することができる。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、限定されないが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、およびそれらの任意の組み合わせを含む、１つ以上のサイトカインの存在下で培養される。場合によっては、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増強または誘発することができる薬剤の存在下で培養される。場合によっては、免疫細胞は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の分子に結合する薬剤および／またはＣＤ２８に結合する薬剤の存在下で培養される。特定の実施形態では、操作された免疫細胞を培養する方法は、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）、ＣＤ９５（Ａｐｏ−／Ｆａｓ）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＩＣＯＳ、ＬＡＴ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、およびＨＶＥＭからなる群から選択される分子の存在下で培養することを含む。特定の実施形態では、培養する方法は、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）、ＣＤ９５（Ａｐｏ−／Ｆａｓ）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＩＣＯＳ、ＬＡＴ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、またはＨＶＥＭに結合する薬剤の存在下で培養することを含む。本明細書に記載の操作された免疫細胞を培養するための追加の方法は、例えば、ＵＳ２０１９／０１３６１８６、ＵＳ２０１９／００６２７０６、およびＵＳ２０１７／００３７３６９に見出すことができる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が得られる。いくつかの実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ヒト対象から採取される。いくつかの実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なヒト対象から採取される。いくつかの実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、本明細書に記載のいずれかを含む、癌を有するヒト対象から採取される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の正の選択は、製造業者の推奨に従って、（ａ）ＣＤ３マイクロビーズ、または（ｂ）ＣＤ４およびＣＤ８マイクロビーズの両方のいずれかを用いて実行される。場合によっては、細胞は、滅菌濾過したＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡを含む、ＭＡＣＳ緩衝液８０μｌあたり１×１０７個の細胞で再懸濁し、細胞懸濁液８０μｌあたり２０μｌのマイクロビーズで標識される。細胞を４℃で１５分間インキュベートし、次いでＭＡＣＳ緩衝液で洗浄する。標識された細胞を、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に通過させ、正に選択したＴ細胞をＬＳカラムに向かわせ、収集チューブへ溶出させる。単離されたＴ細胞を洗浄し、１ミリリットルあたり１×１０６個の細胞の密度の３％のヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地に再懸濁させる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、１×１０６個のＴ細胞あたり１０μｌのＴ  Ｃｅｌｌ  ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化させ、（ａ）１２０ＩＵ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−２、または（ｂ）１２．５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−７および１２．５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−１５、のいずれかと共に培養する。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、選択および活性化の１日後（１日目）、Ｔ細胞は、静的な形質導入を使用して１〜１０のＭＯＩ（例えば、ＭＯＩ１、ＭＯＩ２、ＭＯＩ３、ＭＯＩ４、ＭＯＩ５、ＭＯＩ６、ＭＯＩ７、ＭＯＩ８、ＭＯＩ９、およびＭＯＩ１０）のレンチウイルスで形質導入される。場合によっては、Ｔ細胞培養物は、培養培地１ミリリットルあたり０．５〜２×１０６個のＴ細胞の細胞密度で、監視および維持される。未使用のＩＬ−２またはＩＬ−７、およびＩＬ−１５サイトカインを、３〜４日ごとに培養物に添加してもよい。いくつかの実施形態では、形質導入の１０日後（１１日目）に、展開したＴ細胞が採取される。場合によっては、展開したＴ細胞は、機能アッセイおよびフローサイトメトリーによる表現型分析を使用して分析される。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、レンチウイルスは、ＣＤ２遺伝子編集または遺伝子サイレンシングのための１つ以上の構築物を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスは、本明細書に記載のＣＡＲのための１つ以上の構築物を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスは、本明細書に記載のＰＥＢＬのための１つ以上の構築物を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２ΔＣＤ２−ＣＡＲ細胞は、２つ以上の連続したレンチウイルス形質導入で生成される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、初日（１日目）にＣＤ２遺伝子編集構築物（例えば、ＣＤ２−ＣＲＩＳＰＲ  ｓｇＲＮＡ構築物）をコードするレンチウイルスベクターで形質導入され、続いて最初の形質導入の３日後（４日目）に、ＣＤ２−ＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターで２回目の形質導入をされる。得られた形質導入されたＣＤ２ΔＣＤ２−ＣＡＲ細胞は、最初の形質導入の約５〜１０日以上後に採取することができる。
【０１６５】
様々な態様では、本明細書に記載の操作された免疫細胞を産生するためのキットも提供される。本キットは、例えば、同種異系または自己エフェクターＴ細胞を産生するために使用することができる。
【０１６６】
したがって、本明細書で提供されるのは、ＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むキットである。いくつかの実施形態では、ＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、を含む、キット。キットは、本明細書に記載の実施形態のいずれかに従って設計することができる。
【０１６７】
特定の実施形態では、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列および／またはＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列は、例えば、クローニングおよび／または発現を可能にする配列（例えば、プラスミドまたはベクター配列）をさらに含む。例えば、ヌクレオチド配列は、例えば細胞（例えば免疫細胞）へのトランスフェクションのために他のプラスミドとして、および／または発現ベクターへのクローニングを容易にするためにプラスミドの一部として提供され得る。特定の実施形態では、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列およびＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列は、単一のプラスミドまたはベクターで提供される。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、別個のプラスミドまたは発現ベクター上で提供される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ウイルス発現のために選択される。
【０１６８】
通常、キットは使いやすさのために区画化されており、試薬が入った１つ以上の容器を含むことができる。特定の実施形態では、キットの構成要素はすべて一緒に包装される。あるいは、キットの１つ以上の個別の構成要素を、他のキットの構成要素とは別のパッケージで提供できる。キットには、キットの構成要素を使用するための指示も含まれ得る。
【０１６９】
ＶＩ．ゲノム編集
本明細書で提供されるのは、標的ＣＤ２核酸配列の遺伝子修飾を含む、操作された免疫細胞である。上記のように、エフェクターＴ細胞上の免疫分子の発現の下方制御は、例えばメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、およびジンクフィンガーヌクレアーゼを用いる遺伝子編集方法を含む、多様な他の既知の方法に従って達成することができる。したがって、特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、修飾により標的遺伝子またはタンパク質を非機能的にする修飾遺伝子をさらに含む。例として、本発明の操作された免疫細胞は、ＣＤ２タンパク質の発現を防止または低減する、および／またはＣＤ２タンパク質がＣＡＲによって認識または干渉されるのを（例えば、構造的に）阻害する、修飾された（例えば、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して修飾された）（例えば、非機能性）ＣＤ２遺伝子をさらに含む。そのような方法を使用して遺伝子発現を改変する方法は、容易に入手可能であり、当技術分野で周知である。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞におけるＣＤ２遺伝子は、１つの標的遺伝子（すなわち、ＣＤ２）における切断を特異的に触媒するレアカッティングエンドヌクレアーゼを使用して不活性化され、それにより当該標的遺伝子を不活性化する。レアカッティングエンドヌクレアーゼによって引き起こされる核酸鎖切断は、通常、相同組換えまたは非相同末端接合（ＮＨＥＪ）の異なるメカニズムを通じて修復される。しかしながら、ＮＨＥＪは不完全な修復プロセスであり、多くの場合切断部位にＤＮＡ配列の変化を生じる。メカニズムは、直接のリライゲーション（Ｃｒｉｔｃｈｌｏｗ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ  １９９８）を通じて、またはいわゆるマイクロホモロジーが媒介する末端接合（Ｍａ，Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２００３）を介して、２つのＤＮＡ末端の残りの部分を再接合することに関与する。非相同末端接合（ＮＨＥＪ）を介した修復は、多くの場合、小さな挿入または削除を生じ、特定の遺伝子ノックアウトの作製に使用することができる。当該修飾は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、削除、または付加であり得る。切断誘発性突然変異誘発事象、すなわち、ＮＨＥＪ事象に連続する突然変異誘発事象が発生した細胞は、当技術分野で周知の方法によって特定および／または選択することができる。
【０１７１】
特定の実施形態では、そのような免疫細胞をゲノム編集するための方法は、次のステップ：（１）好ましくは細胞培養物または末梢血試料から免疫細胞を提供するステップ、（ｂ）ＤＮＡ切断によって、好ましくは免疫細胞のＣＤ２遺伝子をそれぞれ二本鎖切断することによって、選択的に不活性化することができるレアカッティングエンドヌクレアーゼを当該免疫細胞に導入するステップ、および（ｃ）得られた免疫細胞を展開させるステップ、のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、本方法はまた、得られた免疫細胞の集団を選別して、不活性化されたＣＤ２遺伝子を含む実質的に純粋な免疫細胞の集団を得ることを含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞のＣＤ２遺伝子は、ＣＤ２に特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して不活性化される。ＺＦＮは、選択した遺伝子の標的部位、および切断ドメインまたは切断ハーフドメインに結合するように操作されたジンクフィンガータンパク質を含む。場合によっては、ＺＦＮは、ヒトＣＤ２遺伝子の標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０１７３】
ジンクフィンガー結合ドメインは、選択した配列に結合するように操作することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。操作方法としては、限定されないが、合理的な設計および様々なタイプの選択が挙げられる。合理的な設計としては、例えば、トリプレット（またはカルテット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が挙げられ、各トリプレットまたはカルテットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはカルテット配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連する。例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、共同所有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびにＷＯ９８／３７１８６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／８８１９７、およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共同所有のＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＺＦＮおよび方法は、当業者に既知であり、ＵＳ２００５／００６４４７４およびＵＳ２００６／０１８８９８７に詳細に記載されている。ＺＦＮの追加の説明は、例えば、ＵＳ２０１４／００３０２４０に見出すことができる。
【０１７４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を使用して免疫細胞の標的遺伝子を不活性化する方法は、例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１６／０２７２９９９号、同第ＵＳ２０１７／０２０４３７２号、および同第ＵＳ２０１７／０１１９８２０号に記載されている。内因性遺伝子を不活性化するためのジンクフィンガーヌクレアーゼ系は、米国特許第８，７３５，１５３号の明細書に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系ゲノム編集システムは、Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１：３９７−４０５、国際特許公開第ＷＯ２０１８／０７３３９３号、および米国特許公開第ＵＳ２０１６／０１２０９０６に記載されている。
【０１７５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的遺伝子の変化（ゲノム修飾）を誘発するシステムである。Ｃａｓ９タンパク質による標的認識には、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）内の「シード」配列と、ｇＲＮＡ結合領域の上流にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む保存されたマルチヌクレオチドが必要である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、細胞株、初代細胞、および操作された細胞のｇＲＮＡを再設計することにより、実質的に任意のＤＮＡ配列を切断するように操作できる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、単一のＣａｓ９タンパク質を２つ以上のｇＲＮＡと同時発現させることにより、複数のゲノム遺伝子座を同時に標的とすることができ、このシステムを、複数の遺伝子編集または標的遺伝子の相乗的活性化に独自に適合させている。遺伝子発現の阻害に使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの例は、米国公開番号２０１４／００６８７９７および米国特許番号８，６９７，３５９および８，７７１，９４５に記載されている。このシステムは、ＲＮＡ誘導Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを利用してエラーを起こしやすい修復経路をトリガーしてフレームシフト変異を引き起こすＤＮＡ二本鎖切断を導入する永続的な遺伝子破壊を誘導する。場合によっては、限定するものではないが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２しても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｔ７、Ｆｏｋ１、当技術分野で知られている他のヌクレアーゼ、その相同体、またはその修飾型を含む他のエンドヌクレアーゼも使用することができる。
【０１７６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子破壊は、標的遺伝子に特異的なｇＲＮＡ配列とＣａｓエンドヌクレアーゼが細胞に導入され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的遺伝子に二本鎖切断を導入できる複合体を形成するときに発生する。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列および標的遺伝子に特異的なガイド核酸配列を含む１つ以上の発現ベクターを含む。ガイド核酸配列は遺伝子に特異的であり、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって誘導される二本鎖切断の遺伝子を標的とする。ガイド核酸配列の配列は、遺伝子の遺伝子座内にあってもよい。一部の実施形態では、ガイド核酸配列は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、またはそれ以上のヌクレオチド長である。ガイド核酸配列には、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、それらの組み合わせ（ＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）やロックド核酸（ＬＮＡ）などの合成ヌクレオチドを含む配列が含まれる。ガイド核酸配列は、単一分子または二重分子であり得る。一実施形態では、ガイド核酸配列は単一のガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号４４〜４７からなる群から選択される１つ以上であり得る。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、本発明の操作された免疫細胞は、ヒトＣＤ２遺伝子を不活性化するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを介して修飾することができる。ヒトＣＤ２遺伝子のゲノム構造および配列の詳細は、例えば、ＮＣＢＩ遺伝子データベースでは、遺伝子ＩＤ９１４に見出すことができる。
【０１７８】
特定の標的遺伝子をノックアウトするための市販のキット、ｇＲＮＡベクターおよびドナーベクターは、例えばＯｒｉｇｅｎｅ（メリーランド州ロックビル）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ジョージア州アトランタ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＡＢＭ；ブリティッシュコロンビア州リッチモンド）、ＢｉｏＣａｔ（ドイツ、ハイデルベルク）またはその他から入手できる。例えば、ＣＲＩＳＰＲを介してＣＤ２をノックアウトするための市販のキットまたはキット構成要素としては、例えば、各々Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能なカタログ番号ｓｃ−４０２１０５、ｓｃ−４１９５３７、ｓｃ４１９５３７などとして入手可能なものが挙げられる。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、任意のゲノム編集システムを使用して、本明細書で概説される核酸のうちのいずれかを免疫細胞、例えば（限定されないが、ガンマ−デルタＴ細胞を含む）Ｔ細胞およびＮＫ細胞のゲノムに導入してもよい。
【０１８０】
ＣＤ２の遺伝子サイレンシングは、当業者によって認識されている任意の方法に従って実行することができる。場合によっては、ＣＤ２  ＲＮＡ分子を標的とした短いヘアピンＲＮＡが使用される。ＣＤ２を標的としたＲＮＡｉとして市販されている試薬としては、例えば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからカタログ番号ｓｃ−２９９７０として入手可能なものが挙げられる。
【０１８１】
ＶＩＩ．治療の方法
一態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、局在化ドメインに連結された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、癌を治療するための操作された免疫細胞の使用であって、治療量の操作された免疫細胞を、癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用に関する。いくつかの実施形態では、癌は、Ｔ細胞悪性腫瘍である。特定の実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍は、初期Ｔ細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ−ＡＬＬ）である。特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射、および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、または髄腔内投与により投与される。
【０１８２】
他の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、局在化ドメインに連結された標的結合分子（例えば、ｓｃＦｖ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、自己免疫障害を治療するための操作された免疫細胞の使用であって、治療量の操作された免疫細胞を、自己免疫障害の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用に関する。
【０１８３】
他の態様では、本発明はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、局在化ドメインに連結されたＣＤ２に対する標的結合分子（例えば、抗ＣＤ２  ｓｃＦｖ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、感染性疾患を治療するための操作された免疫細胞の使用であって、治療量の操作された免疫細胞を、感染性疾患の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用に関する。
【０１８４】
いくつかの態様では、操作された免疫細胞は、対象への注入によって投与される。免疫細胞（例えば、同種異系または自己免疫細胞）を注入する方法は、当技術分野で知られている。病気の症状を改善するために、十分な数の細胞がレシピエントに投与される。典型的には、１０７〜１０１０個の細胞の投与量、例えば、１０９個の細胞の投与量が、で１回の設定で注入される。注入は、１回の１０９個の細胞用量として、または数回に分けた１０９個の細胞用量として投与される。注入の頻度は、３〜３０日ごと、または必要に応じて、または必要ならばより長い間隔にすることができる。注入の量は、一般に、対象ごとに少なくとも１回の注入であり、好ましくは、許容されるように、または疾患の症状が改善されるまで、少なくとも３回の注入である。細胞は、５０〜２５０ｍｌ／時間の速度で静脈内に注入することができる。他の適切な投与様式には、動脈内注入、腫瘍への直接注射および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、髄腔内投与、および眼内投与が含まれる。本発明をそのような送達様式に適合させる方法は、当業者に容易に利用可能である。
【０１８５】
いくつかの態様で提供されるのは、本明細書に記載の操作された免疫細胞のうちのいずれか１つを含む、操作された免疫細胞の実質的に純粋な集団であって、操作された免疫細胞の少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上がＣＤ２発現を欠く、集団である。場合によっては、実質的に純粋な集団は、少なくとも８０％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上がＣＤ２発現を欠く、操作された免疫細胞を含む。
【０１８６】
また、他の態様で提供されるのは、癌または自己免疫障害の治療を必要とする対象において癌または自己免疫障害を治療する方法であって、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかを有する治療量の操作された免疫細胞を対象に投与し、それにより癌または自己免疫障害の治療を必要とする対象において癌または自己免疫障害を治療することを含む、方法である。いくつかの態様で提供されるのは、癌または自己免疫障害の治療を必要とする対象において癌または自己免疫障害を治療する方法であって、本明細書に記載の実施形態うちのいずれかを有する治療量の操作された免疫細胞の実質的に純粋な集団を対象に投与し、それにより癌または自己免疫障害の治療を必要とする対象において癌または自己免疫障害を治療することを含む、方法である。
【０１８７】
特定の実施形態では、本方法は、本明細書に記載されるように、局在化ドメインに連結されたＣＤ２に対する標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む、治療量の操作された免疫細胞を投与することを含む。場合によっては、第２の核酸はＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ２などのサイトカインに結合する抗体を含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、治療を必要とする対象に対して自己細胞である。他の実施形態では、操作された免疫細胞は、治療を必要とする対象に対して同種異系である。
【０１８９】
特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、腫瘍への直接注射および／または手術後の腫瘍母地の灌流、人工スキャフォールドにおける腫瘍部位での移植、髄腔内投与、ならびに眼内投与によって対象に投与される。
【０１９０】
特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、対象への注入によって投与される。免疫細胞（例えば、同種異系または自己免疫細胞）を注入する方法は、当技術分野で知られている。病気の症状を改善するために、十分な数の細胞がレシピエントに投与される。典型的には、１０７〜１０１０個の細胞の投与量、例えば、１０９個の細胞の投与量が、で１回の設定で注入される。注入は、１回の１０９個細胞用量として、または数回に分けた１０９個の細胞用量として投与される。注入の頻度は、毎日、２〜３０日ごと、または必要に応じて、または必要ならばより長い間隔にすることができる。注入の量は、一般に、対象ごとに少なくとも１回の注入であり、好ましくは、許容されるように、または疾患の症状が改善されるまで、少なくとも３回の注入である。細胞は、５０〜２５０ｍｌ／時間の速度で静脈内に注入することができる。他の適切な投与様式には、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、髄腔内投与が含まれる。本発明をそのような送達様式に適合させる方法は、当業者に容易に利用可能である。
【０１９１】
特定の実施形態では、本発明による癌の治療方法は、少なくとも１つの他の既知の癌療法、例えば化学療法と組み合わされる。いくつかの実施形態では、本発明による癌を治療する方法は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴに対する抗体などの負のチェックポイント調節因子、または別の免疫チェックポイント分子を抑制する薬剤と治療的に組み合わせられる。この組み合わせは、リンパ腫内にしばしば存在する免疫抑制環境に起因して、Ｔ細胞リンパ腫を治療するときに特に効果的であり得る。
【０１９２】
また、他の態様で提供されるのは、癌を治療するための本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかを有する操作された免疫細胞の使用であって、治療量の操作された免疫細胞を癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用である。
【０１９３】
特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射、および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、または髄腔内投与により投与される。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、対象は、本明細書で概説される操作された免疫細胞の投与（例えば、注入）の前に、非骨髄破壊的化学療法で治療される。いくつかの実施形態では、非骨髄破壊的化学療法は、６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（操作された免疫細胞注入の２７日および２６日前）のシクロホスファミドおよび２５ｍｇ／ｍ２／日で５日間（操作された免疫細胞注入の２７日〜２３日前）のフルダラビンである。対象は、１つ以上のリンパ枯渇（例えば、免疫抑制コンディショニング）剤を投与される。プレコンディショニング剤の非限定的な例としては、シクロホスファミド、フルダラビン、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の前に患者をコンディショニングするための詳細な方法は、例えば、ＵＳ９，８５５，２９８に見出され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９５】
追加のプレコンディショニング方法は、Ｇａｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１１，６０，７５−８５、Ｍｕｒａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｏｎｃｏｌ．，２００６，３，６６８−６８１、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００８，２６，５２３３−５２３９、およびＤｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００５，２３，２３４６−２３５７に記載されており、これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、非骨髄破壊的化学療法および操作された免疫細胞の注入を受けた後、対象は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはそれらの任意の組み合わせなどのサイトカインの静脈内投与を受ける。いくつかの実施形態では、非骨髄破壊的化学療法を受けた後、患者は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはそれらの任意の組み合わせと組み合わせて、操作された免疫細胞の集団を受け取る。場合によっては、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはそれらの任意の組み合わせは、細胞の集団の後に投与される。特定の場合では、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはそれらの任意の組み合わせは、細胞の集団と同時に投与される。ＩＬ−２としては、ＩＬ−２（アルデスケウキン（ａｌｄｅｓｋｅｕｋｉｎ））、そのバイオシミラー、またはその変異体が挙げられる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、限定されないが、本明細書に記載の治療上有効な操作された免疫細胞の集団の投与後、その日に静脈内投与を開始するなどの、高用量ＩＬ−２レジメンを含み、ＩＬ−２が、０．０３７ｍｇ／ｋｇまたは０．０４４ｍｇ／ｋｇ  ＩＵ／ｋｇ（患者の体重）の用量で、８時間ごとに１５分間のボーラス静脈内注入を使用して許容範囲まで、最大１４回投与される。９日間の休止の後、スケジュールはさらに１４回、合計最大２８回繰り返され得る。
【０１９８】
他の実施形態では、ＩＬ−２は、６時間にわたって約１８×１０６ＩＵ／ｍ２の用量、続いて１２時間にわたって１８×１０６ＩＵ／ｍ２の用量、続いて２４時間にわたって１８×１０６ＩＵ／ｍ２の用量、続いて７２時間にわたって１８ｘ１０６ＩＵ／ｍ２の用量で静脈内投与される。そのような治療レジメンは、２８日ごとに最大４サイクル繰り返され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２レジメンは、１日目の１８，０００，０００ＩＵ／ｍ２、２日目の９，０００，０００ＩＵ／ｍ２、３日目、および４日目の４，５００，０００ＩＵ／ｍ２を含む。別の実施形態では、ＩＬ−２レジメンは、０．１０ｍｇ／日〜５０ｍｇ／日の用量で、１、２、４、６、７、１４、または２１日ごとにペグ化ＩＬ−２を投与することを含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞または操作された免疫細胞の集団は、抗体もしくは操作された細胞もしくは受容体などの別の治療的介入、または細胞毒性剤もしくは治療剤などの薬剤と同時に、または任意の順序で連続してなど、併用治療の一部として投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の追加の治療剤と共に、または別の治療的介入に関連して、同時にまたは任意の順序で連続して、のいずれかで同時投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞集団が１つ以上の追加の治療剤の効果を増強するように、またはその逆であるように、十分に時間的に近接して別の治療と同時投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の追加の治療剤の前に投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の追加の治療剤の後に投与される。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の薬剤は、例えば、持続性を増強するために、ＩＬ−２などのサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、方法は、化学療法剤の投与を含む。いくつかの実施形態では、治療剤は、限定されないが、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴに対する抗体などの負のチェックポイント調節因子、または別の免疫チェックポイント分子を抑制する。
【０２００】
本明細書に記載の操作された免疫細胞の投与に続いて、いくつかの実施形態における操作された細胞集団の生物学的活性は、例えば、多数の既知の方法のうちのいずれかによって測定される。評価するパラメータとしては、インビボでの例えば画像による、またはエクスビボでの例えばＥＬＩＳＡもしくはフローサイトメトリーによる、操作されたもしくは天然のＴ細胞または他の免疫細胞の、抗原への特異的結合が挙げられる。特定の実施形態では、標的細胞を破壊するために操作された細胞の能力は、例えば、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３２（７）：６８９−７０２（２００９）、およびＨｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８５（１）：２５−４０（２００４）に記載の細胞毒性アッセイなどの当技術分野で既知の任意の適切な方法を使用して測定することができる。特定の実施形態では、細胞の生物学的活性は、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、およびＴＮＦなどの１つ以上のサイトカインの発現および／または分泌を評価することによって測定される。いくつかの態様では、生物学的活性は、癌の負荷（ｃａｎｃｅｒ  ｂｕｒｄｅｎ）または負荷（ｌｏａｄ）の低減などの臨床転帰を評価することによって測定される。
【０２０１】
ＶＩＩＩ．本発明の例示的な実施形態
一態様では、本発明は、抗ＣＤ２一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメイン、ＣＤ８αヒンジ−膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、抗ＣＤ２−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。
【０２０２】
任意の実施形態のポリヌクレオチドの、ＣＡＲの当該抗ＣＤ２  ｓｃＦｖドメインは、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列番号２２または配列番号２３の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。任意の実施形態のポリヌクレオチドの、ＣＡＲの当該ＣＤ８αヒンジ−膜貫通ドメインは、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列番号１５の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。任意の実施形態のポリヌクレオチドの、ＣＡＲの当該４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列番号１６の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。任意の実施形態のポリヌクレオチドの、ＣＡＲの当該ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、少なくとも９０％の配列番号１７の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。任意の実施形態のポリヌクレオチドの、ＣＡＲは、配列番号５に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＣＡＲは、配列番号１０のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する、核酸配列を含む。
【０２０３】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドのうちのいずれか１つを含む、単離されたウイルスベクターである。本発明のいくつかの態様では、本明細書で概説されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドのうちのいずれか１つを含む単離されたウイルスベクターは、免疫細胞に導入される。
【０２０４】
また本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の抗ＣＤ２−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζキメラ抗原受容体を含む操作された免疫細胞である。任意の実施形態の操作された免疫細胞は、操作された同種異系細胞である。任意の実施形態の操作された免疫細胞は、操作された自己細胞である。任意の実施形態の操作された免疫細胞は、操作されたＴ細胞である。任意の実施形態の操作された免疫細胞は、操作されたＮＫ細胞である。
【０２０５】
細胞局在化ドメインのＮ末端に連結されたＣＤ２に結合する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むＣＤ２遮断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書で提供される単離されたウイルスベクターであって、細胞局在化ドメインが、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該ＣＤ２遮断ポリペプチドが、細胞内で内因性ＣＤ２に結合する、ウイルスベクター。
【０２０６】
実施形態のうちのいずれか１つの単離されたウイルスベクターの、当該ｓｃＦｖは、（ｉ）配列番号１８に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と配列番号１９に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列、または（ｉｉ）配列番号２０に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と配列番号２１に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列、を含む。
【０２０７】
実施形態のうちのいずれか１つの単離されたウイルスベクターの、当該ＥＲ保持配列は、ＫＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＫＭＰ、およびＫＫＴＮ（式中、Ｘが任意のアミノ酸であり得る）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または当該ゴルジ体保持配列は、ＹＧＲＬ（配列番号４０）、ＹＱＲＬ（配列番号４１）、ＹＫＧＬ（配列番号４２）、およびＹＸＸＬ（配列番号４３）（式中、Ｘが任意のアミノ酸であり得る）からなる群から選択される。実施形態のうちのいずれか１つの単離されたウイルスベクターの、当該ＣＤ２遮断ポリペプチドは、当該ｓｃＦｖと、ＫＫＭＰもしくはＫＫＴＮを含む当該ＥＲ保持配列ドメイン、またはＹＧＲＬ、ＹＱＲＬ、ＹＫＧＬを含む当該ゴルジ体保持配列ドメインとの間に連結された膜貫通ドメインをさらに含み、当該膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、およびＦＧＦＲ２Ｂのうちのいずれか１つから選択される膜貫通ドメインである。実施形態のうちのいずれか１つの単離されたウイルスベクターの、当該膜貫通ドメインは、ＣＤ８αのヒンジ−膜貫通ドメインを含む。
【０２０８】
実施形態のうちのいずれか１つの単離されたウイルスベクターの、当該ＣＤ２遮断ポリペプチドは、配列番号１〜４からなる群から選択されるいずれか１つに対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２遮断ポリペプチドは、配列番号６〜９のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２０９】
本発明のいくつかの態様では、本明細書で概説されるＣＤ２遮断ポリペプチドのうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたウイルスベクターは、免疫細胞に導入される。
【０２１０】
また、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のＣＤ２遮断ポリペプチドを含む操作された免疫細胞である。任意の実施形態の操作された免疫細胞は、操作された同種異系細胞である。任意の実施形態の操作された免疫細胞は、操作された自己細胞である。任意の実施形態の操作された免疫細胞は、操作されたＴ細胞である。任意の実施形態の操作された免疫細胞は、操作されたＮＫ細胞である。
【０２１１】
一態様では、本明細書で提供されるのは、細胞局在化ドメインに連結された標的結合分子を含むポリペプチドを含む操作された免疫細胞であって、標的結合分子が、ＣＤ２タンパク質（例えば、ヒトＣＤ２タンパク質）に結合する抗体であり、細胞局在化ドメインが、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、局在化ドメインに連結された標的結合分子が、操作された細胞によって分泌されない、操作された免疫細胞である。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２タンパク質（例えば、ヒトＣＤ２タンパク質）に結合する抗体は、抗ＣＤ２一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列と、を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１８に記載の可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号１９に記載の可変軽鎖（ＶＬ）配列と、を含む。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列と、を含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２０に記載の可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２１に記載の可変軽鎖（ＶＬ）配列と、を含む。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、細胞局在化ドメインは、ＫＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＫＭＰ、またはＫＫＴＮ（式中、Ｘが任意のアミノ酸であり得る）から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、標的結合分子と細胞局在化ドメインとの間に連結された膜貫通ドメインをさらに含む。場合によっては、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する。
【０２１５】
特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来するヒンジ−膜貫通ドメインを含む。
【０２１６】
様々な実施形態では、操作された免疫細胞のポリペプチドは、配列番号１または配列番号３に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ポリペプチドは、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列を含み得る。
【０２１７】
特定の実施形態では、操作された免疫細胞のポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含み得る。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む。特定の例では、ＣＡＲは、抗ＣＤ２−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲである。抗ＣＤ２−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲは、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。抗ＣＤ２−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲは、ＣＤ２（例えば、ヒトＣＤ２）に結合することができる。場合によっては、そのような抗ＣＤ２−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲは、「ＣＤ２  ＣＡＲ」と称され得る。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ２＋細胞の細胞毒性を誘発する。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、内因性ＣＤ２発現は、操作された免疫細胞において遮断される。内因性ＣＤ２発現の遮断は、少なくとも６か月間持続することができる。内因性ＣＤ２発現の遮断は、少なくとも１２か月間持続することができる。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、相当する免疫細胞と実質的に同等の速度で増殖する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、操作された同種異系細胞または操作された自己細胞である。他の実施形態では、操作された免疫細胞は、ガンマ−デルタＴ細胞などの操作されたＴ細胞である。
【０２２２】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、癌または自己免疫疾患の治療を必要とする対象において癌または自己免疫疾患を治療する方法であって、本明細書に記載の操作された免疫細胞のうちのいずれか１つを含む、治療量の組成物を対象に投与し、それにより癌または自己免疫疾患の治療を必要とする対象において癌または自己免疫疾患を治療することを含む、方法である。場合によっては、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。癌は、Ｔ細胞悪性腫瘍またはＣＤ２関連癌であり得る。一実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍は、初期Ｔ細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ−ＡＬＬ）または別のＴ細胞白血病である。別の実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍は、限定されないが、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、菌状息肉症、セザリー症候群、または末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）を含む、リンパ腫である。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、投与は、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射および／もしくは手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、または髄腔内投与による。
【０２２４】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、細胞局在化ドメインに連結された標的結合分子を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。場合によっては、標的結合分子は、ＣＤ２タンパク質（例えば、ヒトＣＤ２タンパク質）に結合する抗体であり、細胞局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、局在化ドメインに連結された標的結合分子は、操作された細胞によって分泌されない。
【０２２５】
特定の実施形態では、ＣＤ２タンパク質（例えば、ヒトＣＤ２タンパク質）に結合する抗体は、抗ＣＤ２一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１８に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号１９に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列と、を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１８に記載の可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号１９に記載の可変軽鎖（ＶＬ）配列と、を含む。
【０２２６】
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２０に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２１に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列と、を含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２０に記載の可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２１に記載の可変軽鎖（ＶＬ）配列と、を含む。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、細胞局在化ドメインは、ＫＤＥＬ、ＫＫＸＸ、ＫＫＭＰ、またはＫＫＴＮ（式中、Ｘが任意のアミノ酸であり得る）から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、標的結合分子と細胞局在化ドメインとの間に連結された膜貫通ドメインをさらに含む。場合によっては、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する。
【０２２８】
特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来するヒンジ−膜貫通ドメインを含む。
【０２２９】
特定の実施形態では、操作された免疫細胞のポリペプチドは、配列番号１または配列番号３に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ポリペプチドは、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列を含み得る。
【０２３０】
様々な実施形態では、操作された免疫細胞のポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含み得る。
【０２３１】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＰＥＢＬは、配列番号６〜９のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つを含む発現ベクターである。場合によっては、発現ベクターはまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む。ＣＡＲは、抗ＣＤ２−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲであり得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲは、配列番号５に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号１０のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する核酸配列を含む。場合によっては、発現ベクターは、配列番号１０の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号６〜９のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する核酸配列を含む。場合によっては、発現ベクターは、配列番号６〜９のうちのいずれか１つの核酸配列を含む。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される本明細書に記載の発現ベクターのうちのいずれか１つを含む宿主細胞。
【０２３５】
さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、操作された免疫細胞を産生するための方法であって、本明細書に開示のポリヌクレオチドまたは発現ベクターのうちのいずれか１つを免疫細胞に導入することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、内因性ＣＤ２発現は、操作された免疫細胞において遮断される。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、操作された同種異系細胞または操作された自己細胞である。他の実施形態では、操作された免疫細胞は、ガンマ−デルタＴ細胞などの操作されたＴ細胞である。
【０２３６】
一態様では、本明細書で提供されるのは、抗ＣＤ２一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメイン、ＣＤ８αヒンジ−膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、単離された抗ＣＤ２−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子である。抗ＣＤ２一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメインは、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列番号２２または配列番号２３の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ＣＤ８αヒンジ−膜貫通ドメインは、少なくとも９０％の配列番号１５の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列番号１６の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列番号１７の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、単離されたＣＡＲ分子は、配列番号５に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の単離されたＣＡＲ分子のうちのいずれか１つをコードする単離された核酸分子である。抗ＣＤ２−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲは、ＣＤ２（例えば、ヒトＣＤ２）に結合することができる。
【０２３７】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、抗ＣＤ２一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメイン、ＣＤ８αヒンジ−膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、抗ＣＤ２−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むポリペプチドを含む、操作された免疫細胞である。抗ＣＤ２−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲは、ＣＤ２（例えば、ヒトＣＤ２）に結合することができる。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメインは、少なくとも９０％の配列番号２２または配列番号２３の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ−シグナル伝達ドメインは、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列番号１５の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列番号１６の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、少なくとも９０％の配列番号１７の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＣＡＲ分子は、配列番号５に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＣＡＲ分子は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＣＡＲ分子は、配列番号１０の核酸配列を含む。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、操作された同種異系細胞または操作された自己細胞である。他の実施形態では、操作された免疫細胞は、ガンマ−デルタＴ細胞などの操作されたＴ細胞である。
【０２４０】
ＷＯ２０１６／１２６２１３およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６３０４８の明細書、特許請求の範囲、および図などの内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２４１】
実施例１：効果的なキメラ抗原受容体療法のためのＴ細胞におけるＣＤ２発現の遮断
本実施例は、強力な抗ＣＤ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞を生じる、第２世代のＣＡＲと組み合わせた新規の方法を用いるＣＤ２発現の遮断を示す。この実用的な戦略は、癌患者に新しい治療オプションを提供する。
【０２４２】
図１は、例示的な抗ＣＤ２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。抗ＣＤ２モノクローナル抗体９．６のｓｃＦｖは、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＤ８αヒンジ−膜貫通ドメイン、ならびに以前実験室で開発した抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３  ＣＡＲの４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内ドメインに接合した。抗ＣＤ２モノクローナル抗体９．６または９−１のｓｃＦｖは、ＣＤ８αシグナルペプチド、および局在化ドメイン、および任意選択的にＣＤ８αヒンジ−膜貫通ドメインをコードする配列に接合した。これらを、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ベクターにサブクローニングした。場合によっては、ＭＳＣＶは、ＭＳＣＶ−内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）−ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レトロウイルスベクターである。
【０２４３】
９．６抗ＣＤ２  ＣＡＲレトロウイルスベクター構築物をＪｕｒｋａｔ細胞（白血病細胞株）に形質導入した。レトロウイルス上清の調製および形質導入は、当業者に既知の標準的なプロトコルに従って実行した。発現結果を図２に示す。
【０２４４】
また、ＣＤ２遺伝子を有するＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞には、９．６抗ＣＤ２  ＣＡＲレトロウイルスベクター構築物を形質導入した。得られた細胞は、１０％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で維持した。９．６抗ＣＤ２の活性を評価した。図３は、抗ＣＤ２  ＣＡＲが、ＣＤ２標的細胞の存在下でＣＤ２およびＣＤ６９（活性化マーカー）の発現を誘発したことを示している。
【０２４５】
末梢血Ｔリンパ球における抗ＣＤ２  ＣＡＲの効果を決定するために、抗ＣＤ２  ＣＡＲをレトロウイルス形質導入または電気穿孔によって初代Ｔ細胞に導入した。図４は、ＣＡＲ発現を示す。
【０２４６】
図５は、ＣＤ２＋標的細胞（ＭＯＬＴ−４）を、抗ＣＤ２  ＣＡＲで形質導入したか、またはＧＦＰのみを含むベクターで形質導入した、Ｊｕｒｋａｔ細胞と共培養したときの抗ＣＤ２  ＣＡＲの機能を示す。場合によっては、細胞は、１：１のＥ：Ｔで共培養した。結果は、９．６抗ＣＤ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＣＤ２＋標的細胞に対して細胞毒性を発揮することを示している。
【０２４７】
図６は、抗ＣＤ２  ＰＥＢＬ構築物の例示的な実施形態を示す。９．６ＰＥＢＬおよび９−１ＰＥＢＬを、Ｊｕｒｋａｔ細胞にレトロウイルスで形質導入した。図７のヒストグラムは、ＣＤ２発現の下方制御を示している。
【０２４８】
図８は、９．６ＰＥＢＬＩＩが、ヒト末梢血Ｔ細胞におけるＣＤ２発現を下方制御することを示している。
【０２４９】
Ｊｕｒｋａｔ細胞は、内因性ＣＤ２発現を不活性化するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を受けた。加えて、遺伝子編集されたＪｕｒｋａｔ細胞に抗ＣＤ２  ＰＥＢＬを形質導入した。図９のヒストグラムは、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ２の下方制御を示している。図１０は、遺伝子編集されたＪｕｒｋａｔ細胞における切断産物を示している。
【０２５０】
実施例２：Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ２の遺伝子修飾
本実施例は、ＣＲＩＳＰＲ系プラットフォームを使用する、Ｊｕｒｋａｔ細胞における内因性ＣＤ２発現の下方制御を示す。
【０２５１】
これらのｇＲＮＡ配列をＷＴ  ＳｐＣａｓ９と共に使用して、ゲノム編集のためにＤＳＢを導入した。これらのｓｇＲＮＡ配列は、Ｓａｎｊａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４  Ａｕｇ，１１（８）：７８３−４に記載および検証されている。
【０２５２】
【表２】
2021525067.tif 000007
【０２５３】
レンチウイルス構築物
４つすべてのＣＤ２  ＣＲＩＳＰＲ  ｓｇＲＮＡ構築物を、ＧｅｎｓｃｒｉｐｔによってｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ  ｖ２レンチウイルスベクターにクローニングした。
【０２５４】
細胞培養
２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−３２１６）は、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で維持した。Ｊｕｒｋａｔ−Ｅ６細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、および１ｘＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）で維持した。
【０２５５】
ウイルス産生
２９３Ｔ細胞は、１：４の比率のＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のレンチウイルストランスファーベクターおよびＶｉｒａｐｏｗｅｒパッケージングプラスミドミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にコトランスフェクトした。トランスフェクション培地は、トランスフェクションの６時間後に１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含む新鮮なＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）と交換した。３日後、ウイルス上清を回収し、０．４５μＭのフィルターに通し、次いでＬｅｎｔｉ−Ｘ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して１００倍に濃縮した。濃縮したウイルスストックを、使用まで−１４０℃で保存した。
【０２５６】
２９３Ｔ細胞でのウイルス滴定
５μｇ／ｍＬポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下の異なる量のレンチウイルスで、２９３Ｔ細胞を形質導入した。１５時間一晩培養した後、形質導入培地を除去し、３７℃で１時間、新鮮な培養培地中１０Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で細胞を処理した。次いで、さらなる培養のために、１０％ＦＢＳを含む新鮮なＤＭＥＭと培地を交換した。形質導入の≧７２時間後に、形質導入された細胞を分析のために採取した。ウイルス力価は、ＲＴ−ｑＰＣＲを使用して決定した。
【０２５７】
積分単位（ＩＵ）力価は、等式：［ＩＵ／ｍｌ＝（試料あたりの２９３Ｔ細胞数×ゲノムあたりのプロウイルス遺伝子コピー数）÷ウイルス量（ｍＬ）］を使用して、ゲノムＤＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲデータから計算した。ＩＵ力価は、プロウイルス遺伝子のコピー数とウイルス量との線形範囲内の試料を使用して計算した。
【０２５８】
Ｊｕｒｋａｔ形質導入
ＭＯＩ１または５のレンチウイルスベクターで、Ｊｕｒｋａｔ細胞を形質導入した。形質導入の≧７２時間後に、形質導入された細胞を分析のために採取した。
【０２５９】
フローサイトメトリー
抗体の染色および洗浄は、染色緩衝液（１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．２％ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウム）で実行する。細胞を氷上で抗体と共に２０分間インキュベートし、３回洗浄した。次の抗体：抗ヒトＣＤ２−ＰＥ（クローンＲＰＡ−２．１０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ１２−００２９−４２）、抗ヒトＣＤ３  ｅＦｌｕｏｒ７８０（クローンＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ４７−００３７−４２）を染色に使用した。ＤＡＰＩは、生／死の識別のために２μｇ／ｍＬで使用した。染色された細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーターで収集し、ＦｌｏｗＪｏｖ１０ソフトウェアで分析した。
【０２６０】
リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）
ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＲＮａｓｅ  Ａ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。すべてのキットは、製造業者の推奨に従って使用した。ＲＴ−ｑＰＣＲは、ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でｉＴａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、実行した。
【０２６１】
使用したプライマーは、ＲＰＰＨ１−Ｆ：５’−ＡＧＣＴＴＧＧＡＡＣＡＧＡＣＴＣＡＣＧＧ−３’（配列番号４８）、ＲＰＰＨ１−Ｒ：５’−ＡＡＴＧＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧＴＡＧＴ−３’（配列番号４９）、ＷＰＲＥ−Ｆ：５’−ＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴ−３’（配列番号５０）、ＷＰＲＥ−Ｒ：５’−ＧＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＣＡ−３’（配列番号５１）、ＶＳＶＧ−Ｆ：５’−ＡＧＧＧＡＡＣＴＧＴＧＧＧＡＴＧＡＣＴＧ−３’（配列番号５２）、およびＶＳＶＧ−Ｒ：５’−ＧＡＡＣＡＣＣＴＧＡＧＣＣＴＴＴＧＡＧＣ−３’（配列番号５３）であった。すべてのアッセイプライマーは、９０％〜１１０％のプライマー効率を有した。
【０２６２】
すべての遺伝子の倍率変化は、等式：［倍率変化＝２＾−（Ｃｔ（標的遺伝子）−Ｃｔ（ハウスキーピング遺伝子））］を使用して、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。標的遺伝子のコピー数は、ＲＮａｓｅＰのゲノムコピー数に対して正規化した。
【０２６３】
図１１は、フローサイトメトリーによって測定した、形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞上でのＣＤ２の発現を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＭＯＩ  １または５で示されたレンチウイルスで形質導入し、形質導入の８日後にＣＤ２発現についてフローサイトメトリーによって分析した。
【０２６４】
ＭＯＩ１でＣＤ２  ｓｇＲＮＡ１を担持するレンチウイルスで形質導入した１２．２％のＪｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ２ノックダウンを呈した。ＭＯＩ５でレンチウイルスを形質導入した２６．９％のＪｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ２ノックダウンを呈した。
【０２６５】
ＭＯＩ１でＣＤ２  ｓｇＲＮＡ２を担持するレンチウイルスで形質導入した２６．５％のＪｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ２ノックダウンを呈した。ＭＯＩ５でレンチウイルスを形質導入した５３．２％のＪｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ２ノックダウンを呈した。
【０２６６】
ＭＯＩ１でＣＤ２  ｓｇＲＮＡ４を担持するレンチウイルスで形質導入した１４．１％のＪｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ２ノックダウンを呈した。ＭＯＩ５でレンチウイルスを形質導入した３５．８％のＪｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ２ノックダウンを呈した。
【０２６７】
ＭＯＩ１でＣＤ２  ｓｇＲＮＡ５を担持するレンチウイルスで形質導入した４４．８％のＪｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ２ノックダウンを呈した。ＭＯＩ５でレンチウイルスを形質導入した７１．７％のＪｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ２ノックダウンを呈した。
【０２６８】
データは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系遺伝子修飾を受けたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ２発現（例えば、細胞表面発現）の効果的な低減または減少を示している。
【０２６９】
本明細書で引用されたすべての特許、公開された出願および参考文献の教示は、その全体が参照により組み込まれる。
【０２７０】
本発明をその例示的な実施形態を参照して特に示し、説明したが、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更を行うことができることを当業者は理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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