(57)【要約】  配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの遺伝子配列及びその使用。ヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅをコードする核酸を含む融合核酸。核酸または融合核酸を含む組換え発現ベクター。核酸または融合核酸を宿主に導入することによって得られる形質転換体。ＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの遺伝子の不活性化に基づく非ヒト哺乳類ＡＤＯＡモデル（このモデルのＡＤＯＡの病理学的徴候は、ヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅをコードする組換え発現ベクターを使用することで効果的に改善され得る）。ヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅをコードする核酸の発現レベルは高まり、それ故に、ミトコンドリアにおいて得られるヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅが増加し得、これによってＡＤＯＡ等の眼疾患が良好に治療され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅをコードするヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号１に示される前記ヌクレオチド配列との同一性が≧９５％、好ましくは≧９８％、より好ましくは≧９９％であるヌクレオチド配列と、
（ｃ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列と、
（ｄ）配列番号２に示される前記ヌクレオチド配列との同一性が≧９５％、好ましくは≧９８％、より好ましくは≧９９％であるヌクレオチド配列と、
からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む、前記ヌクレオチド配列。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１に示されるものである、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
請求項１に記載のヌクレオチド配列を含む、融合核酸。
【請求項４】
前記融合核酸が、５’末端から３’末端の向きで式Ｉ：
Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３（Ｉ）
の構造を有し、
式中、
それぞれの「−」が、独立して、結合またはヌクレオチドリンカー配列であり、
Ｚ１が、存在しないか、または５’−ＵＴＲ配列であり、
Ｚ２が、請求項１に記載のヌクレオチド配列であり、
Ｚ３が、３’−ＵＴＲ配列である、請求項３に記載の融合核酸。
【請求項５】
請求項１に記載のヌクレオチド配列または請求項３に記載の融合核酸を含む、ベクター。
【請求項６】
ベクターが、プラスミドまたはウイルスベクターから選択され、好ましくは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項４に記載のベクター。
【請求項７】
前記ベクターが、ＡＡＶベクターであり、血清型が、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
前記ベクターが、前記ヌクレオチド配列または前記融合核酸が挿入されたＡＡＶベクターである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
前記ベクターが、ＤＮＡウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターから選択される、請求項５に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項５に記載のベクター、または請求項１に記載の外来性ヌクレオチド配列もしくは請求項３に記載の融合核酸を含む宿主細胞であって、前記外来性ヌクレオチド配列または前記融合核酸が、前記宿主細胞の染色体に組み込まれたものである、前記宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、２９３Ｔ細胞、光受容細胞（錐体細胞及び／または桿体細胞を含む）、他の視細胞（双極細胞など）、（視）神経細胞、またはそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記ベクターが、対象における視力回復及び／または眼疾患治療のための調製物または組成物の調製に使用される、請求項５〜９のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項１３】
（ａ）請求項５〜９のいずれか１項に記載のベクターと、（ｂ）医薬的に許容可能な担体または医薬品添加物と、を含む、医薬調製物。
【請求項１４】
前記医薬調製物の剤形が、凍結乾燥調製物、液体調製物、またはそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項１３に記載の医薬調製物。
【請求項１５】
前記医薬調製物中の前記（ａ）ベクターの含量が、１×１０９〜１×１０１６個ウイルス／ｍＬであり、好ましくは１×１０１１〜１×１０１３個ウイルス／ｍＬであり、より好ましくは２×１０１１〜１×１０１２個ウイルス／ｍＬである、請求項１３に記載の医薬調製物。
【請求項１６】
前記医薬調製物が、眼疾患の治療に使用され、好ましくは網膜神経節細胞のアポトーシスの治療に使用される、請求項１３に記載の医薬調製物の使用。
【請求項１７】
前記医薬調製物が、遺伝性視神経症の治療に使用され、好ましくは常染色体優性視神経萎縮（ＡＤＯＡ）の治療に使用される、請求項１３に記載の医薬調製物の使用。
【請求項１８】
ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの発現及び／または活性を長期的に増加させるための方法であって、前記方法が、請求項５〜９に記載のベクターを導入すること、及び／または請求項１３〜１５に記載の医薬調製物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
請求項５〜９のいずれか１項に記載のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、治療方法。
【請求項２０】
組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅを調製するための方法であって、前記方法が、請求項１０に記載の宿主細胞を培養し、それによって前記組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅを得ることを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的調製物の分野に関し、具体的には、組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの遺伝子配列及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
常染色体優性視神経萎縮（ＡＤＯＡ）は、最も一般的な形態の原発性遺伝性視神経症であり、その罹患率は約１：１２，０００〜１：５０，０００である。ＡＤＯＡの発症は小児期に潜行する。ＡＤＯＡの臨床的特徴は、軽度から中等度の漸進的視力低下、色覚異常、中心視野欠損、及び視神経乳頭耳側蒼白によって顕在化する。乳頭血管束が最初に損傷を受け、上行性視神経萎縮及び視神経の髄鞘の消失が続発する。
【０００３】
ＡＤＯＡは、ミトコンドリア内膜タンパク質をコードする遺伝子及び遺伝子座が変異することによって誘発され、こうした遺伝子が主にＯＰＡ１〜ＯＰＡ８であることが国外の学者によって決定されている。ＯＰＡ１〜ＯＰＡ８の中で、ＡＤＯＡ患者の約７５％が、ＯＰＡ１が保有するヘテロ接合型優性変異と関連することが最初に確認されており、エクソンの７４０及び２７９４にこうした部位変異が見られることが最も一般的である。ＯＰＡ１タンパク質は、ミトコンドリア内膜に位置し、エネルギー代謝及びアポトーシスを制御し、クリステ及びｍｔＤＮＡの完全性を維持し、ＧＴＰａｓｅ活性を有する。変異ＯＰＡ１がコードするタンパク質は、完全なＧＴＰａｓｅドメインには通常は満たない様々な短縮型のものであり、このことはアレルの欠失に相当し、これによってＯＰＡ１の量が大きく減少する結果、いわゆるハプロタイプ不全を招くことでミトコンドリア機能が損なわれることがＡＤＯＡの発症機序である。断片化したミトコンドリアは、ＡＴＰを視神経細胞に正常に供給できず、ＲＧＣ細胞が徐々にアポトーシスを起こし、これによって患者がＡＤＯＡを発症する。
【０００４】
現在のところ、ＡＤＯＡに対する治療手段は存在せず、ＡＤＯＡは、世界が認知する遺伝性視神経症の１つである。遺伝子治療の開発に伴って、ＡＤＯＡの遺伝子治療が可能になってはいるが、そこでの問題は、様々な形態のＯＰＡ１エクソンスプライシング及び様々な形態の変異が、様々な型及び変異形態の病原性タンパク質を生じさせ、その結果、ある特定の遺伝子薬を全ての患者の治療に使用することが不可能なことである。
【０００５】
国外の研究では、ＯＰＡ１変異によって誘発されるＡＤＯＡの発症機序が研究され、様々な形態のＯＰＡ１転写産物及びＯＰＡ１遺伝子産物が分析され、組換えＯＰＡ１タンパク質のよりよい精製方法が探求されている。更に、家族歴を調査及び解析することで、不完全なＯＰＡ１を保有しているかどうかのスクリーニング、同定、及び診断をどのように行うかについても探求されている。更に、ＯＰＡ１変異によって誘発されるＡＤＯＡの予後的な遺伝子診断及び治療についても期待が寄せられている。しかしながら、現在のところ、アデノ随伴ウイルスベクターを使用して行うヒトミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅのいずれかの型の遺伝子の組換え、並びにその産生及び使用についての報告は存在しない。
【０００６】
従って、この分野では、良好な治療効果を有するヒトミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅのための発現系及び調製方法を開発する必要に迫られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、良好な治療効果を有するヒトミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅのための発現系、及びその調製方法を提供することである。
【０００８】
本発明の目的は、ヒトミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅをコードする最適化核酸配列、ベクター、及びその調製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様は、ヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅをコードするヌクレオチド配列を提供し、このヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列との同一性が≧９５％、好ましくは≧９８％、より好ましくは≧９９％であるヌクレオチド配列と、
からなる群から選択される。
【００１０】
別の好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列には、ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、又はｍＲＮＡ配列が含まれる。
【００１１】
別の好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列には、一本鎖配列及び二本鎖配列が含まれる。
【００１２】
別の好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列には、配列番号１と完全に相補的なヌクレオチド配列が含まれる。
【００１３】
別の好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるものであり、
位置１〜２８８は、ＭＩＳをコードする配列であり、
位置２８９〜２７７２は、ＧＴＰａｓｅドメイン、中央ダイニンドメイン、及びＧＴＰａｓｅエフェクタードメインをコードする配列であり、
位置２７７３〜２７７５は、終止コドンである。
【００１４】
別の好ましい実施形態では、配列番号１の配列は、配列番号１の位置１〜２８８に示されるＭＩＳをコードする配列と、配列番号１の位置２８９〜２７７２に示されるＧＴＰａｓｅドメイン、中央ダイニンドメイン、及びＧＴＰａｓｅエフェクタードメインをコードする配列と、を含む。
【００１５】
別の好ましい実施形態では、配列番号２の配列は、配列番号２の位置１〜２８８に示されるＭＩＳをコードする配列と、配列番号２の位置２８９〜２７７２に示されるＧＴＰａｓｅドメイン、中央ダイニンドメイン、及びＧＴＰａｓｅエフェクタードメインをコードする配列と、を含む。本発明は、ＭＩＳを独立してコードするヌクレオチド配列（配列番号１または配列番号２の位置１〜２８８）と、ＧＴＰａｓｅドメイン、中央ダイニンドメイン、及びＧＴＰａｓｅエフェクタードメインを独立してコードするヌクレオチド配列（配列番号１または配列番号２の位置２８９〜２７７２または位置２８９〜２７７５）と、も提供する。
【００１６】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に記載のヌクレオチド配列を含む融合核酸を提供する。
【００１７】
別の好ましい実施形態では、融合核酸は、ＵＴＲ配列、プロモーター配列、又はそれらの組み合わせ、からなる群から選択される配列をさらに含む。
【００１８】
別の好ましい実施形態では、ＵＴＲ配列は、３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含む。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、ＵＴＲ配列は、構造を安定化させるためのポリＡ配列を含む。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、融合核酸は、５’末端から３’末端の向きで式Ｉ：
Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３    （Ｉ）
の構造を有し、
式中、
それぞれの「−」は、独立して、結合またはヌクレオチドリンカー配列であり、
Ｚ１は、存在しないか、または５’−ＵＴＲ配列であり、
Ｚ２は、本発明の第１の態様に記載のヌクレオチド配列であり、
Ｚ３は、３’−ＵＴＲ配列である。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、Ｚ１は、５’−ＵＴＲ配列である。
【００２２】
別の好ましい実施形態では、それぞれのヌクレオチドリンカー配列の長さは、１〜３０ｎｔであり、好ましくは１〜１５ｎｔであり、より好ましくは３〜６ｎｔである。
【００２３】
別の好ましい実施形態では、ヌクレオチドリンカー配列は、制限エンドヌクレアーゼを介する消化によって形成されるヌクレオチドリンカー配列に由来する。
【００２４】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様によるヌクレオチド配列を含むベクター、又は本発明の第２の態様による融合核酸を含むベクターを提供する。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、ベクターは、１つ以上のプロモーター（核酸配列に機能可能なように連結される）、エンハンサー、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、複製起点、選択可能マーカー、核酸制限酵素認識部位、及び／又は相同組換え部位を含む。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、ベクターは、プラスミド及びウイルスベクターからなる群から選択される。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又はそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。好ましくは、ベクターは、ＡＡＶベクターである。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、又はそれらの組み合わせから選択される。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、ベクターには、ＤＮＡウイルス及びレトロウイルスベクターが含まれる。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、ベクターは、本発明の第１の態様に記載のヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクターもしくは当該ヌクレオチド配列が挿入されたＡＡＶベクターであるか、又は本発明の第２の態様に記載の融合核酸を含むＡＡＶベクターもしくは当該融合核酸が挿入されたＡＡＶベクターである。好ましくは、ベクターは、ＡＡＶベクタープラスミドｐＳＮａＶである。
【００３１】
別の好ましい実施形態では、ベクターは、組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの発現に使用される。
【００３２】
本発明の第４の態様は、宿主細胞を提供し、当該宿主細胞は、本発明の第３の態様に記載のベクターを含むか、または当該宿主細胞は、本発明の第１の態様に記載のヌクレオチド配列もしくは本発明の第２の態様に記載の融合核酸を有し、このヌクレオチド配列または融合核酸は、当該宿主細胞の染色体に外来性に組み込まれたものである。
【００３３】
別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞であり、こうした哺乳類には、ヒト及び非ヒト哺乳類が含まれる。
【００３４】
別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、２９３Ｔ細胞、光受容細胞（錐体細胞及び／又は桿体細胞を含む）、他の視細胞（双極細胞など）、（視）神経細胞、又はそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。
【００３５】
別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、桿体細胞、錐体細胞、オン型双極細胞、オフ型双極細胞、水平細胞、神経節細胞、アマクリン細胞、又はそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。好ましくは、宿主細胞は、（網膜）神経節細胞である。
【００３６】
本発明の第５の態様は、対象における視力回復及び／又は眼疾患治療のための調製物又は組成物の調製における本発明の第３の態様に記載のベクターの使用を提供する。
【００３７】
別の好ましい実施形態では、眼疾患は、網膜症である。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、調製物または組成物は、遺伝性視神経症の治療に使用され、好ましくは常染色体優性視神経萎縮（ＡＤＯＡ）の治療に使用される。
【００３９】
別の好ましい実施形態では、調製物又は組成物は、網膜神経節細胞のアポトーシスの治療に使用される。
【００４０】
本発明の第６の態様は、（ａ）本発明の第３の態様に記載のベクターと、（ｂ）医薬的に許容可能な担体または医薬品添加物と、を含む医薬調製物を提供する。
【００４１】
別の好ましい実施形態では、医薬調製物の剤形は、凍結乾燥調製物、液体調製物、又はそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又はそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。好ましくは、ベクターは、ＡＡＶベクターである。
【００４３】
別の好ましい実施形態では、医薬調製物中のベクターの含量は、１×１０９〜１×１０１６個ウイルス／ｍＬであり、好ましくは１×１０１〜１×１０１３個ウイルス／ｍＬであり、より好ましくは２×１０１１〜１×１０１２個ウイルス／ｍＬである。
【００４４】
別の好ましい実施形態では、医薬調製物は、眼疾患の治療に使用され、好ましくは網膜神経節細胞のアポトーシスの治療に使用される。
【００４５】
別の好ましい実施形態では、医薬調製物は、遺伝性視神経症の治療に使用され、好ましくは常染色体優性視神経萎縮（ＡＤＯＡ）の治療に使用される。
【００４６】
別の好ましい実施形態では、医薬調製物は、眼球におけるミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの発現及び／又は活性を顕著に増加させ得る。
【００４７】
本発明の第７の態様は、ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの発現及び／又は活性を長期的に増加させるための方法を提供し、この方法は、本発明の第３の態様に記載のベクターを導入すること、及び／又は本発明の第６の態様に記載の医薬調製物を投与することを含む。
【００４８】
別の好ましい実施形態では、方法は、細胞中に産生するＡＴＰの量を効果的に増加させ、及び／又はミトコンドリアのアポトーシスを効果的に抑制し得る。
【００４９】
別の好ましい実施形態では、方法は、ＧＴＰａｓｅの発現及び／又は活性を持続的に上方制御し得る。
【００５０】
本発明の第８の態様は、治療方法を提供し、この治療方法は、本発明の第３の態様に記載のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００５１】
別の好ましい実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。好ましくは、ベクターは、ＡＡＶベクターである。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、ベクターは、それを必要とする対象の眼に導入される。
【００５３】
別の好ましい実施形態では、それを必要とする対象には、ヒト及び非ヒト哺乳類が含まれる。
【００５４】
別の好ましい実施形態では、治療方法は、眼疾患を治療するための方法である。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、眼疾患は、遺伝性視神経症であり、好ましくは常染色体優性視神経萎縮（ＡＤＯＡ）である。
【００５６】
治療方法は、眼球におけるミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの発現及び／又は活性を効果的に増加させ得る。
【００５７】
治療方法は、眼球におけるミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの発現及び／又は活性を、最大６ヶ月間、好ましくは最大３ヶ月間、効果的に増加させ得る。
【００５８】
治療方法は、網膜中のＡＴＰ含量を効果的に増加させ、及び／又はミトコンドリアのアポトーシスを効果的に抑制し得る。
【００５９】
本発明の第９の態様は、組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅを調製するための方法を提供し、この方法は、本発明の第４の態様に記載の宿主細胞を培養し、それによって組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅを得ることを含む。
【００６０】
本発明の第１０の態様は、ＯＰＡ１遺伝子の発現又は活性が低下しているＡＤＯＡ（常染色体優性視神経萎縮）の細胞モデルを提供する。
【００６１】
別の好ましい実施形態では、細胞には、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）が含まれる。
【００６２】
別の好ましい実施形態では、ＯＰＡ１遺伝子は、発現しないか、又は完全に不活性である。
【００６３】
本発明の第１１の態様は、ＡＤＯＡ（常染色体優性視神経萎縮）の細胞モデルを調製するための方法を提供し、この方法は、細胞を提供し、細胞中のＯＰＡ１遺伝子に点変異を導入してＯＰＡ１遺伝子の点変異を有する細胞を得ること、及びスクリーニングを介して点変異陽性のモノクローナル細胞を得ること、を含む。
【００６４】
別の好ましい実施形態では、ＯＰＡ１遺伝子点変異は、Ｑ（グルタミン）２８５終結点変異（Ｓｔｏｐ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を指す。
【００６５】
別の好ましい実施形態では、細胞には、ＲＧＣ細胞が含まれる。
【００６６】
本発明の第１２の態様は、ＧＲＣ細胞におけるＯＰＡ１遺伝子の発現及び／又は活性が低下しているＡＤＯＡ（常染色体優性視神経萎縮）の非ヒト哺乳類モデルを提供する。
【００６７】
別の好ましい実施形態では、ＯＰＡ１遺伝子は、点変異を有し、具体的にはＱ（グルタミン）２８５終結点変異を有する。
【００６８】
本発明の第１３の態様は、ＡＤＯＡ（常染色体優性視神経萎縮）の非ヒト哺乳類モデルを調製するための方法を提供し、この方法は、下記のステップを含む：
（ａ）非ヒト哺乳類細胞を提供し、細胞中のＯＰＡ１遺伝子に点変異を導入し、それによってＯＰＡ１遺伝子の点変異を有する細胞を得るステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られたＯＰＡ１遺伝子の点変異を有する細胞を使用することによってＯＰＡ１遺伝子の点変異を有する動物モデルを調製するステップ。
【００６９】
別の好ましい実施形態では、ＯＰＡ１遺伝子の点変異は、ヘテロ接合型又はホモ接合型である。
【００７０】
別の好ましい実施形態では、ＯＰＡ１タンパク質の位置２８５のグルタミン部位には、転写が終結するように変異が導入される。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、非ヒト哺乳類は、げっ歯類または霊長類であり、こうしたげっ歯類または霊長類には、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、及びサルが含まれる。
【００７２】
別の好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）は、
（ｂ１）ＯＰＡ１遺伝子のキメラ点変異を獲得している動物モデルを調製した後、交雑を介してＯＰＡ１遺伝子のホモ接合型点変異またはヘテロ接合型点変異を有する動物モデルを得るステップ
を含む。
【００７３】
別の好ましい実施形態では、方法は、
（１）ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９技術を使用することによってＯＰＡ１の位置２８５のＱ（グルタミン）を変異させて終止（即ち、Ｑ２８５終止）点変異を有する組換えプラスミドを構築し、相同組換えを介する変異導入に対する選択可能マーカーを有するＤＮＡ配列で置き換えてＯＰＡ１のＱ２８５終止点変異陽性のモノクローナル胚性幹細胞を得ること、
（２）ステップ（１）において得られたＯＰＡ１点変異を有するマウス胚性幹細胞クローンを使用することによってキメラマウスを調製し、得ること、
（３）ステップ（２）において得られたキメラマウスを正常な野生型マウスと交配させ、繁殖させ、ＯＰＡ１点変異を獲得したヘテロ接合型マウス、即ちＯＰＡ１のＱ２８５終結点変異を有するマウスモデルを子孫からスクリーニングすること、
を含む。
【００７４】
別の好ましい実施形態では、ヘテロ接合型マウスを交配及び繁殖させ、その子孫から、ＯＰＡ１点変異を獲得したホモ接合型マウスがスクリーニングされる。
【００７５】
上記のさまざまな技術的特徴、及び本明細書に具体的に後述されるさまざまな技術的特徴（実施例等）は全て、新たな技術的解決法又は好ましい技術的解決法が得られるように、本発明の範囲内で互いに組み合わせ可能であることを理解されたい。スペースの制限があるため、そうしたものが本明細書に重複して記載されることはない。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの最適化ヌクレオチド配列と原型遺伝子配列との間でオープンリーディングフレーム配列を比較したものを示す。これら２つの配列の間の相同性は、７２．２５％（２００５／２７７５）であり、これらの配列の間で同一の塩基は
【数１】
2021533801.tif 000002
によって示される。上段横列は最適化オープンリーディングフレームヌクレオチド配列であり、下段横列はヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの原型遺伝子配列（非最適化野生型コード配列）である。
【図２】ＯＰＡ１アイソフォーム２の転写物のタンパク質構造の模式図を示す。
【図３】組換えクローンからスクリーニングされた約３０００ｂｐの標的バンドを有する正しいクローンを示す。Ｍ：タンパク質マーカー、レーン１：ｒＡＡＶ２／２−ｈＯＰＡ１アイソフォーム２の正しい組換えクローン、レーン２：陽性対照、レーン３：陰性対照。
【図４】組換えアデノ随伴ウイルスプラスミドｐＳＮａＶ／ｒＡＡＶ２／２−ｈＯＰＡ１の構造の模式図を示す。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によってｒＡＡＶ２／２−ｈＯＰＡ１アイソフォーム２の純度を検出するためにクマシーブリリアントブルーでの染色を行った結果を示す。図中、レーン１：タンパク質マーカー、レーン２：ｒＡＡＶ２／２−ｈＯＰＡ１アイソフォーム２。
【図６】硝子体切除術用レンズ下でのウサギの眼の眼底写真を示し、図中、Ａは、ｒＡＡＶ２／２−ＺｓＧｒｅｅｎを注射した群（対照群）であり、Ｂは、ｒＡＡＶ２／２−最適化ｈＯＰＡ１アイソフォーム２を注射した群（実験群Ａ）である。
【図７】ウサギの眼球切片の免疫蛍光検出を示し、図中、実験群Ａは、ｒＡＡＶ２／２−最適化ｈＯＰＡ１アイソフォーム２を注射した群であり、実験群Ｂは、ｒＡＡＶ２／２−原型ｈＯＰＡ１アイソフォーム２を注射した群である。
【図８】硝子体切除術用レンズ下でのウサギの眼のＯＣＴ写真を示す。図中、Ａは、ｒＡＡＶ２／２−ＺｓＧｒｅｅｎを注射した群（対照群）であり、Ｂは、ｒＡＡＶ２／２−最適化ｈＯＰＡ１アイソフォーム２を注射した群（実験群Ａ）である。
【図９】顕微鏡下で観察されたウサギの眼球のＨＥ切片中の網膜を示す。図中、Ａは、ｒＡＡＶ２／２−ＺｓＧｒｅｅｎを注射した群（対照群）であり、Ｂは、ｒＡＡＶ２／２−最適化ｈＯＰＡ１アイソフォーム２を注射した群（実験群Ａ）である。
【図１０】異なるプラスミドを注射したウサギの眼球の網膜中のｈＯＰＡ１タンパク質の相対発現量をリアルタイム蛍光ＰＣＲで検出した結果を示す。実験群Ａは、ｒＡＡＶ２／２−最適化ｈＯＰＡ１アイソフォーム２を注射した群であり、実験群Ｂは、ｒＡＡＶ２／２−原型ｈＯＰＡ１アイソフォーム２を注射した群であり、対照群は、ｒＡＡＶ２／２−ＺｓＧｒｅｅｎを注射した群である。
【図１１】異なるプラスミドを注射したウサギの眼球の網膜中のｈＯＰＡ１タンパク質をウエスタンブロットで検出した結果を示す。実験群Ａは、ｒＡＡＶ２／２−最適化ｈＯＰＡ１アイソフォーム２を注射した群であり、実験群Ｂは、ｒＡＡＶ２／２−原型ｈＯＰＡ１アイソフォーム２を注射した群であり、対照群は、ｒＡＡＶ２／２−ＺｓＧｒｅｅｎを注射した群である。
【図１２】ＡＤＯＡ（常染色体優性視神経萎縮）のモデルマウスの構築を示す。
【図１３】ＡＤＯＡ（常染色体優性視神経萎縮）の点変異のモデルマウスの遺伝子型を同定したものを示す。
【図１４】投与後のマウスの網膜中のＡＴＰ含量の変化を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって検出したものを示す。
【図１５】透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって観察されたミトコンドリアの形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
広範かつ徹底的な研究を経て、本発明者らは、組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅ（ＯＰＡ１）の遺伝子コード配列に対して的を絞った最適化を施す設計を適用し、その結果、哺乳類細胞（ヒト細胞など）におけるＯＰＡ１タンパク質の効率的な転写及び効率的な発現に特に適したヌクレオチド配列（配列番号１）を得ると共に、組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅのための組換え発現ベクターを構築している。非最適化コード配列と比較すると、特別に最適化されたＯＰＡ１コード配列（配列番号１）の転写効率はわずかに改善しており、加えて、その発現量は５倍超に顕著に増加していることから、この最適化配列が哺乳類細胞（特にヒト細胞）における発現に非常に適しており、ＡＤＯＡ及び他の眼疾患を効果的に治療し得るものであることが実験結果から示されている。本発明は、これに基づいて、本発明者らによって達成されたものである。
【００７８】
定義
本開示の理解を容易にするために、ある特定の用語が最初に定義される。本出願で使用される下記の用語はそれぞれ、本明細書にその他の明確な記載がない限り、以下に与えられる意味を有するものとする。他の定義は、本出願を通じて記載される。
【００７９】
「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値または組成の許容可能な誤差範囲の中に値または組成が含まれることを指し得、このことは、そうした値又は組成がどのように測定又は決定されるかに部分的には依存することになる。例えば、本明細書で使用される「約１００」という表現は、９９〜１０１の値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を全て含む。
【００８０】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）））」という用語は、オープン、半クローズド、及びクローズドであり得る。換言すれば、これらの用語は、「から本質的になる」、又は「からなる」も含む。
【００８１】
配列同一性は、所定の比較領域（参照ヌクレオチド配列または参照タンパク質の長さの５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％であり得る）に沿ってアライメントされた２つの配列を比較し、同一の残基が出現する位置の数を決定することによって決定される。通常、配列同一性は、パーセントとして表現される。ヌクレオチド配列の配列同一性の測定は、当業者によく知られる方法である。
【００８２】
本明細書で使用される「対象」及び「それを必要とする対象」という用語は、任意の哺乳類または非哺乳類を指す。哺乳類には、限定されないが、ヒト、脊椎動物（げっ歯類、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、及びヤギなど）が含まれる。
【００８３】
ＯＰＡ１（視神経萎縮１）
本明細書で使用される「（組換え）ヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅ」、「視神経萎縮タンパク質１」、「ＯＰＡ１（タンパク質）」、「ｈＯＰＡ１（タンパク質）」、「ポリペプチド」、「本発明のポリペプチド」、及び「本発明のタンパク質」という用語は、同じ意味を有し、本明細書で互換的に使用され得る。ＯＰＡ１は、ミトコンドリア内膜に位置するＧＴＰａｓｅ活性を有する膜貫通タンパク質であり、このタンパク質は、ミトコンドリア移入配列（ＭＩＳ）を有するＮ末端膜貫通領域と、膜貫通領域（ＴＲ）及び疎水性領域（ＨＲ）と、ＧＴＰａｓｅドメインと、中央ダイニンドメインと、ＧＴＰａｓｅエフェクタードメイン（ＧＥＤ）を有するＣ末端と、を含む。ＯＰＡ１のＭＩＳポリペプチドを機能は、ＧＴＰタンパク質をミトコンドリアに導くことである。
【００８４】
ＡＤＯＡは、ミトコンドリア内膜タンパク質をコードする遺伝子及び遺伝子座が変異することによって誘発され、こうした遺伝子が主にＯＰＡ１〜ＯＰＡ８であることが国外の学者によって決定されている。ＯＰＡ１〜ＯＰＡ８の中で、ＡＤＯＡ患者の約７５％が、ＯＰＡ１が保有するヘテロ接合型優性変異と関連することが初期に確認されており、エクソン７４０及びエクソン２７９４にこうした部位変異が生じることが最も一般的である。ＯＰＡ１タンパク質は、ミトコンドリア内膜に位置し、エネルギー代謝及びアポトーシスを制御し、クリステ及びｍｔＤＮＡの完全性を維持し、ＧＴＰａｓｅ活性を有する。変異ＯＰＡ１がコードするタンパク質は、完全なＧＴＰａｓｅドメインには通常は満たないさまざまな短縮型のものであり、このことはアレルの欠失に相当し、これによってＯＰＡ１の量が大きく減少する結果、いわゆるハプロタイプ不全を招くことでミトコンドリア機能が損なわれることがＡＤＯＡの発症機序である。断片化したミトコンドリアは、ＡＴＰを視神経細胞に正常に供給できず、ＲＧＣ細胞が徐々にアポトーシスを起こし、これによって患者がＡＤＯＡを発症する。
【００８５】
アデノ随伴ウイルス
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、アデノ随伴ウイルスとしても知られ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科のＤｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属する。ＡＡＶは、これまでに発見された中で最も単純な型の一本鎖ＤＮＡ不完全ウイルスであり、その複製にはヘルパーウイルス（通常はアデノウイルス）が関与する必要がある。ＡＡＶは、両末端に位置する逆位反復配列（ＩＴＲ）中にｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子をコードする。ＩＴＲは、ウイルスの複製及びパッケージングにおいて決定的な役割を果たす。ｃａｐ遺伝子は、ウイルスカプシドタンパク質をコードし、ｒｅｐ遺伝子は、ウイルス複製及び組み込みに関与する。ＡＡＶは、さまざまな細胞に感染し得る。
【００８６】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、非病原性野生型アデノ随伴ウイルスに由来する。ｒＡＡＶは、良好な安全性、宿主細胞の範囲の広さ（分裂細胞及び非分裂細胞）、免疫原性の低さ、インビボで外来遺伝子を長期的に発現させる能力、及び他の特徴を有することから、最も有望な遺伝子導入ベクターの１つと見なされており、遺伝子治療及びワクチン研究において世界的に広く使用されている。１０年を超える研究を経て、組換えアデノ随伴ウイルスの生物学的特徴は深く理解されており、特に、さまざまな細胞、組織、及びインビボ実験におけるその適用効果の側面において多くのデータが蓄積している。医学的な研究では、ｒＡＡＶは、さまざまな疾患のための遺伝子治療の研究（インビボ実験及びインビトロ実験を含む）において使用されている。同時に、ｒＡＡＶは、特徴的な遺伝子導入ベクターとして、遺伝子機能研究、疾患モデル構築、及び遺伝子ノックアウトマウスの調製、ならびに他の局面においても広く使用されている。
【００８７】
本発明の好ましい実施形態では、ベクターは、組換えＡＡＶベクターである。ＡＡＶは、それが感染する細胞のゲノムに安定的かつ部位特異的な様式で組み込まれ得る比較的小さなＤＮＡウイルスである。ＡＡＶは、細胞の増殖、形態、または分化に全く影響を及ぼすことなく幅広い範囲の細胞に感染する能力を有し、ヒト病理に関与しないものと思われる。ＡＡＶのゲノムは、クローニングされ、シークエンシングされ、特徴付けられている。ＡＡＶは、約４，７００の塩基を含み、約１４５塩基の末端逆位反復（ＩＴＲ）領域を各末端に含む。この領域は、ウイルスの複製起点として働く。ゲノムの残部は、カプシド形成機能を有する２つの重要な領域に分かれる：ウイルス複製及びウイルス遺伝子発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含むゲノム左側部分、ならびにウイルスカプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含むゲノム右側部分。
【００８８】
ＡＡＶベクターは、当該技術分野の標準的な方法を使用して調製され得る。任意の血清型のアデノ随伴ウイルスが適している。ベクターを精製するための方法は、例えば、米国特許第６，５６６，１１８号、同第６，９８９，２６４号、及び同第６，９９５，００６号において見つけることができ、これらの文献の開示内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ハイブリッドベクターの調製は、例えば、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７０９１号に記載されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。インビトロ及びインビボでの遺伝子導入のためのＡＡＶ由来のベクターの使用についての説明はなされている（例えば、国際特許出願公開公報第ＷＯ９１／１８０８８号及び同第ＷＯ９３／０９２３９号、米国特許第４，７９７，３６８号、同第６，５９６，５３５号、及び同第５，１３９，９４１号、ならびに欧州特許第０，４８８，５２８号を参照のこと（これらの文献はすべて、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。こうした特許刊行物では、ｒｅｐ遺伝子及び／またはｃａｐ遺伝子を欠失させ、目的遺伝子によって置き換えた様々なＡＡＶ由来コンストラクト、並びにこうしたコンストラクトを目的遺伝子のインビトロでの輸送（培養細胞への移入）及びインビボでの輸送（生物体への直接的な移入）に使用することについて記載されている。複製欠損型組換えＡＡＶは、ヒトヘルパーウイルス（アデノウイルスなど）を感染させた細胞株に下記のプラスミドを共トランスフェクションすることによって調製され得る：２つのＡＡＶ末端逆位反復（ＩＴＲ）領域が隣接する目的核酸配列を含むプラスミド、ならびにＡＡＶカプシド形成遺伝子（ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子）を保有するプラスミド。その後、得られたＡＡＶ組換え体が、標準的な手法によって精製される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、組換えベクターは、カプシド形成に供されてウイルス粒子（例えば、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６を含む）とされる。したがって、本開示は、本明細書の記載のベクターのいずれかを含む組換えウイルス粒子（それが組換えポリヌクレオチドを含むことから、組換えと呼ばれる）を含む。そのような粒子の生成方法は、当該技術分野で知られており、米国特許第６，５９６，５３５号に記載されている。
【００９０】
核酸コード配列
本発明が解決すべき技術的課題は、先行技術では組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの発現量が低く、治療効果が不十分であるという技術的欠点を克服することである。本発明の目的は、組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの最適化遺伝子配列を提供することである。組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの遺伝子は、配列番号１に示されるサイズが２，７７５ｂｐの最適化ＣＤＳヌクレオチド配列（コドンＡＴＧから始まり、９２４アミノ酸をコードする）を有し、当該配列中、１〜２８８ｂｐは、ＯＰＡ１−ＭＩＳのコード配列（ＧＴＰタンパク質がミトコンドリアに入ってその生理学的機能を発揮するように導く働きをするアミノ酸数９６のペプチド鎖をコードする）であり、２８９〜２，７７２ｂｐは、ＧＴＰ機能性タンパク質として働くアミノ酸数８２８のペプチド鎖をコードし、最後の３ｂｐは、終止コドンである。本発明の最適化ＯＰＡ１遺伝子配列（配列番号１）は、ＯＰＡ１タンパク質の発現効率を高め、患者の視神経節細胞において生理学的役割を担うＯＰＡ１タンパク質の存在量が増えることが研究によって明らかとなっている。
【００９１】
本発明のヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅをコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列番号１に示される。別の好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列との同一性が≧９５％、好ましくは≧９８％、より好ましくは≧９９％であるものである。本発明では、ヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅをコードする核酸は、ＯＰＡ１−最適化遺伝子またはＯＰＡ１−最適化核酸とも呼ばれる。
【００９２】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態ものであり得る。別の好ましい実施形態では、ヌクレオチドは、ＤＮＡである。ＤＮＡの形態には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡが含まれる。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。本発明のヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードする。ＯＰＡ１−ＭＩＳシグナルペプチドは、タンパク質がミトコンドリアに入るように導き、プロテアーゼによる加水分解を受けた後、成熟ＯＰＡ１アイソフォーム２タンパク質がミトコンドリアに入って役割を果たす。
【化１】
2021533801.tif 000003
【００９３】
核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＰＮＡであり得る。核酸配列は、ゲノム、組換え、または合成のものであり得る。核酸配列は、単離または精製されたものであり得る。核酸配列は、一本鎖または二本鎖であり得る。好ましくは、核酸配列は、本明細書に記載の感光性タンパク質をコードすることになる。核酸配列は、クローニングによって得ることができ、こうしたクローニングは、例えば、制限酵素消化、ライゲーション、及びゲル電気泳動を含む標準的な分子クローニング技術を使用して行われ、こうした分子クローニング技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。核酸配列は単離することができ、この単離は、例えば、ＰＣＲ技術を使用して行わる。単離は、任意の不純物から核酸配列が分離されており、当該核酸配列の供給源では当該核酸配列と結び付いた状態で天然には見られる他の核酸配列及び／またはタンパク質から当該核酸配列が分離されていることを意味する。好ましくは、核酸配列は、細胞物質、培養培地、または精製／生成過程に由来する他の化学物質も含まないことになる。核酸配列は、合成のものであり得、例えば、直接的な化学合成によって生成される。核酸配列は、ネイキッド核酸として提供され得るか、またはタンパク質もしくは脂質との複合体として提供され得る。
【００９４】
本発明の全長ヌクレオチド配列またはその断片は、通常、ＰＣＲ増幅方法、組換え方法、または人工的な合成方法によって得ることができる。ＰＣＲ増幅方法については、公開された関連ヌクレオチド配列、特にオープンリーディングフレーム配列に従ってプライマーを設計することができ、商業的に利用可能なｃＤＮＡライブラリーまたは当業者に知られる従来の方法によって調製されるｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして使用することができ、関連配列は、増幅によって得られる。配列が比較的長い場合、２種類以上のＰＣＲ増幅を実施した後、個々の増幅断片を正しい順序で繋ぎ合わせることが必要な場合が多い。現在では、発明のポリペプチド（またはその断片もしくは誘導体）をコードするＤＮＡ配列を化学合成によって完全に得ることができる。その後、当該技術分野で知られるさまざまな現存ＤＮＡ分子（またはベクターなど）及び細胞にＤＮＡ配列を導入することができる。
【００９５】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明のベクターまたはポリペプチドコード配列を使用して遺伝子操作によって生成される宿主細胞にも関する。上述のポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞は、単離されたものであり得る。
【００９６】
本明細書で使用される「単離された」は、物質がその元の環境（物質が天然物質である場合、元の環境は天然環境を指す）から分離されていることを指す。例えば、生細胞中で天然状態にあるポリヌクレオチド及びポリペプチドは、分離及び精製されていないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドでも、天然状態では共存する他の物質からそれが分離されているなら、そうしたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは分離及び精製されている。
【００９７】
本発明の好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるものである。
【００９８】
関連配列が得られると、組換え方法を使用して関連配列を大規模に得ることができる。このことは、通常、関連配列をベクターにクローニングした後、ベクターを細胞に導入し、次に、従来の方法によって増殖させた宿主細胞から関連配列を単離することによって行われる。
【００９９】
さらに、人工的な合成方法を使用して関連配列を合成することもでき、この合成は、特に、当該断片の長さが短い場合に可能である。通常、非常に長い配列を有する断片は、複数の小さな断片を最初に合成した後、それらの断片をライゲーションすることによって得ることができる。
【０１００】
本発明の遺伝子を得るには、好ましくは、ＰＣＲ技術を使用してＤＮＡ／ＲＮＡを増幅する方法が使用される。ＰＣＲに使用されるプライマーは、本明細書に開示の本発明の配列情報に従って適切に選択され得ると共に、従来の方法によって合成され得る。増幅されたＤＮＡ／ＲＮＡ断片は、従来の方法（ゲル電気泳動など）によって分離及び精製され得る。
【０１０１】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターまたはタンパク質コード配列を使用して遺伝子操作によって生成される宿主細胞、及び組換え技術を介して宿主細胞を使用してＯＰＡ１タンパク質を発現させるための方法にも関する。
【０１０２】
本発明のＯＰＡ１タンパク質を発現する宿主細胞（哺乳類細胞など）は、従来の組換えＤＮＡ技術を介して本発明のポリヌクレオチド配列を使用して得ることができる。一般に、本発明の第１の態様に記載のポリヌクレオチドまたは本発明の第３の態様に記載のベクターを宿主細胞に導入するステップが含められる。
【０１０３】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、及び適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターの構築には、当業者によく知ら得る方法が使用され得る。こうした方法には、インビトロの組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、及びインビボの組換え技術が含まれる。ＤＮＡ配列は、発現ベクター中の適切なプロモーターに有効に連結されてｍＲＮＡ合成を導き得る。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写ターミネーターも含む。
【０１０４】
さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞を選択するための表現型形質を与えるための１つ以上の選択可能マーカー遺伝子を含み、こうしたものは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素、ネオマイシン耐性、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはＥ．ｃｏｌｉについては、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性などである。
【０１０５】
上記の適切なＤＮＡ配列及び適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターは、適切な宿主細胞の形質転換に使用することができ、その結果、当該宿主細胞は、ポリペプチドを発現するようになり得る。
【０１０６】
宿主細胞は、原核細胞、下等真核細胞、または高等真核細胞（哺乳類細胞（ヒト細胞及び非ヒト哺乳類細胞を含む）など）であり得る。代表的な例は、動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＣＯＳ７細胞、または２９３細胞など）である。本発明の好ましい実施形態では、２９３Ｔ細胞、光受容細胞（錐体細胞及び／または桿体細胞を含む）、他の視細胞（双極細胞など）、ならびに神経細胞が宿主細胞として選択される。別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、桿体細胞、錐体細胞、オン型双極細胞、オフ型双極細胞、水平細胞、神経節細胞、アマクリン細胞、またはそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。
【０１０７】
組換えＤＮＡを使用する宿主細胞の形質転換は、当業者によく知られる従来の手法によって実施され得る。宿主が原核生物（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなど）である場合、対数増殖期を選び、ＣａＣｌ２法による処理を経て、ＤＮＡを受け入れる能力を有するコンピテント細胞を収集することができ、この過程において使用される関連ステップは当該技術分野でよく知られている。別の方法は、ＭｇＣｌ２を使用するものである。必要に応じて、電気穿孔によって形質転換を実施することもできる。宿主が真核生物である場合、下記のＤＮＡトランスフェクション方法が選択され得る：リン酸カルシウム共沈殿法、及び従来の機械的方法（マイクロインジェクション、電気穿孔、リポソームパッケージングなど）。
【０１０８】
得られる形質転換体は、本発明の遺伝子によってコードされるタンパク質を発現するように従来の方法によって培養され得る。培養において使用される培地は、使用される宿主細胞に応じて、さまざまな従来の培養培地から選択され得る。培養は、宿主細胞の増殖に適した条件の下で実施される。宿主細胞が増殖して適切な細胞密度に達した時点で、適切な方法（温度変換または化学的誘導など）を使用して選択プロモーターでの誘導が行われ、細胞の培養がさらに一定期間行われる。
【０１０９】
上記の方法では、ポリペプチドは、細胞内もしくは細胞膜上に発現するか、または細胞外に分泌され得る。必要に応じて、タンパク質の物理的特性、化学的特性、及び他の特性を使用してさまざまな分離方法によってタンパク質が分離及び精製され得る。こうした方法は、当業者によく知られている。こうした方法の例としては、限定されないが、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤を用いる処理（塩析方法）、遠心分離、浸透による細胞破壊、超音波処理（ｕｌｔｒａ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、超遠心分離、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及びさまざまな他の液体クロマトグラフィー手法、ならびにこうした方法の組み合わせが挙げられる。
【０１１０】
配列の最適化
本発明では、哺乳類細胞での発現に特に適した組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの最適化コード配列が提供され、このコード配列は、配列番号１に示される。
【０１１１】
本明細書で使用される「最適化されたＯＰＡ１コード配列」及び「最適化されたＯＰＡ１コード遺伝子」は、組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅをコードするヌクレオチド配列を指し、このヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードする。
【０１１２】
本発明では、組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの野生型ＤＮＡコード配列（非最適化ＤＮＡコード配列）は配列番号２に示される。この非最適化野生型ＤＮＡコード配列の発現量は非常に少ない。
【０１１３】
野生型Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ：ＯＰＡ１アイソフォーム２  ＣＤＳ  ２７７５ｂｐ
【化２】
2021533801.tif 000004
【０１１４】
本発明では、遺伝子発現及びタンパク質局在化に影響を与える配列断片が最適化されており、こうした配列断片の最適化には、限定されないが、コドン使用頻度の偏り、発現の妨げになる二次構造（ヘアピン構造など）の除去、ならびにＧＣ含量の変更、ＣｐＧジヌクレオチドの含量の変更、ｍＲＮＡの二次構造の変更、潜在性スプライス部位の変更、初期ポリアデニル化部位の変更、配列内リボソーム進入部位及び配列内リボソーム結合部位の変更、負のＣｐＧアイランドの変更、ＲＮＡの不安定領域の変更、反復配列（直列反復配列、逆位反復配列など）の変更、及びクローニングに影響し得る制限酵素認識部位の変更、が含まれる。配列番号１に示される特別に最適化されたＤＮＡコード配列は、分析及び実験的スクリーニングを介して最終的に得られたものである。この配列は特別に最適化されており、その結果、その転写レベルはわずかに上昇し、その発現量は顕著に増加する。配列番号１に示される特別に最適化されたコード配列と、配列番号２に示される野生型コード配列との類似性は７２．２５％（２００５／２７７５）であり、このことは図１に示される。
【０１１５】
最適化Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ：ＯＰＡ１アイソフォーム２  ＣＤＳ  ２７７５ｂｐ
【化３】
2021533801.tif 000005
【０１１６】
融合核酸
本発明は、本発明の第１の態様に記載のヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅをコードする核酸配列を含む融合核酸も提供する。
【０１１７】
本明細書で使用される「融合核酸」は、異なる供給源に由来する２つ以上のヌクレオチド配列をライゲーションすることによって形成される核酸を指すか、または同じ供給源に由来する２つ以上のヌクレオチド配列を、それらの天然での配置とは異なるように互いにライゲーションすることによって形成される核酸を指す。
【０１１８】
別の好ましい実施形態では、融合核酸は、ＵＴＲ配列、プロモーター配列、またはそれらの組み合わせ、からなる群から選択される配列をさらに含む。
【０１１９】
好ましくは、融合核酸は、ヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅをコードする核酸に機能可能なように連結されたＵＴＲ配列を有する。
【０１２０】
別の好ましい実施形態では、ＵＴＲ配列は、３’−ＵＴＲ及び／または５’−ＵＴＲを含む。
【０１２１】
別の好ましい実施形態では、ＵＴＲ配列は、構造を安定化させるためのポリＡ配列を含む。
【０１２２】
別の好ましい実施形態では、融合核酸は、５’末端から３’末端の向きで式Ｉ：
Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３（Ｉ）
の構造を有し、
式中、
それぞれの「−」は、独立して、結合またはヌクレオチドリンカー配列であり、
Ｚ１は、５’−ＵＴＲ配列であり、
Ｚ２は、本発明の第１の態様に記載のヌクレオチド配列であり、
Ｚ３は、３’−ＵＴＲ配列である。
【０１２３】
発現ベクター及び宿主細胞
本発明は、ＯＰＡ１タンパク質のための発現ベクターも提供し、この発現ベクターは、本発明の最適化されたＯＰＡ１コード配列を含む。
【０１２４】
当業者なら、提供される配列情報を用いれば、利用可能なクローニング手法を使用して細胞への形質導入に適した核酸配列またはベクターを得ることができる。
【０１２５】
好ましくは、ＯＰＡ１タンパク質をコードする核酸配列は、ベクターとして提供され、好ましくは、発現ベクターとして提供される。好ましくは、ＯＰＡ１タンパク質をコードする核酸配列は、遺伝子治療ベクターとして提供され得、好ましくは、網膜標的細胞における形質導入及び発現に適した遺伝子治療ベクターとして提供され得る。こうしたベクターは、ウイルス性または非ウイルスのもの（例えば、プラスミド）であり得る。ウイルスベクターには、下記のウイルスに由来するものが含まれる：アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（変異形態を含む）、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ＭＭＬＶ、ＧａＬＶ、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ＨＩＶ、ポックスウイルス、及びＳＶ４０。ウイルスベクターは複製欠損型であり得ると想定されるが、好ましくは、そうしたウイルスベクターは複製欠陥型であり、そうしたウイルスベクターは複製する能力を有するか、または条件的に複製する能力を有する。ウイルスベクターは、通常、標的網膜細胞のゲノムに組む込まれることなく染色体外に存在する状態を維持し得る。ＯＰＡ１タンパク質をコードする核酸配列を網膜標的細胞に導入する上で好ましいウイルスベクターはＡＡＶベクター（自己相補型アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）など）である。特定のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ血清型２〜ＡＡＶ血清型１２）またはこうした血清型のいずれか１つの改変バージョン（ＡＡＶ  ４ＹＦベクター及びＡＡＶ  ７ｍ８ベクターを含む）を使用することで、選択的標的化を達成することができる。
【０１２６】
ウイルスベクターは、任意の不要な配列が欠失するように改変され得る。例えば、ＡＡＶに関しては、ＩＸ遺伝子、Ｅ１ａ遺伝子、及び／またはＥ１ｂ遺伝子のすべてまたは一部が欠失するようにウイルスが改変され得る。野生型ＡＡＶについては、ヘルパーウイルス（アデノウイルスなど）が存在しなければ、その複製効率は非常に低い。組換えアデノ随伴ウイルスについては、好ましくは、複製遺伝子及びカプシド遺伝子はトランス（ｐＲｅｐ／Ｃａｐプラスミド）で提供され、ＡＡＶゲノムの２つのＩＴＲのみが残され、ビリオンにパッケージングされる一方で、必要なアデノウイルス遺伝子は、アデノウイルスまたは別のプラスミドによって提供される。同様の改変をレンチウイルスベクターに施すこともできる。
【０１２７】
ウイルスベクターは、細胞に入る能力を有する。一方で、非ウイルスベクター（プラスミドなど）については、それを薬剤と混合することで、標的細胞によるウイルスベクターの取り込みを促進させることができる。そのような薬剤には、ポリカチオン性の薬剤が含まれる。任意選択で、送達系（リポソームベースの送達系など）が使用され得る。本発明において使用するためのベクターは、好ましくは、インビボまたはインビトロでの使用に適するものであり、好ましくは、ヒトでの使用に適するものである。
【０１２８】
ベクターは、好ましくは、網膜標的細胞において核酸配列が発現するように導くための制御配列を１つ以上含むことになる。こうした制御配列には、核酸配列に機能可能なように連結されたプロモーター、エンハンサー、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、複製起点、核酸制限酵素認識部位、及び相同組換え部位が含まれ得る。ベクターは、選択可能マーカーも含み得、これによって、例えば、増殖系（例えば、細菌細胞）または網膜標的細胞でのベクターの発現が決定される。
【０１２９】
「機能可能なように連結された」は、核酸配列が、それが機能可能なように連結された配列と機能的に関連し、その結果、それらの配列が互いの発現または機能に影響を及ぼす様式で連結されていることを意味する。例えば、プロモーターに機能可能なように連結された核酸配列は、その発現パターンが当該プロモーターによって影響を受けることになる。
【０１３０】
プロモーターは、その連結対象である核酸配列の発現を媒介する。プロモーターは、構成的または誘導性であり得る。プロモーターは、内部網膜細胞における遍在性の発現または神経細胞特異的な発現を生じさせ得る。後者の場合、プロモーターは、細胞型特異的な発現（例えば、視神経節細胞に特異的な発現）を生じさせ得る。当業者なら適切なプロモーターの知見を有しているであろう。例えば、適切なプロモーターは、Ｌ７、ｔｈｙ−１、リカバリン、カルビンジン、ヒトＣＭＶ、ＧＡＤ−６７、ニワトリβ−アクチン、ｈＳｙｎ、Ｇｒｍ６、及びＧｒｍ６エンハンサーＳＶ４０融合タンパク質からなる群から選択され得る。標的化は、細胞特異的プロモーターを使用して達成され得る。こうした細胞特異的プロモーターは、視神経細胞を選択的に標的とするためのＧｒｍ６−ＳＶ４０などである。このＧｒｍ６プロモーターは、Ｇｒｍ６遺伝子の２００塩基対のエンハンサー配列とＳＶ４０真核生物プロモーターとの融合体であり、Ｇｒｍ６遺伝子は、ｍＧｌｕＲ６（視神経細胞に特有の代謝型グルタミン酸受容体）をコードする。Ｇｒｍ６遺伝子の好ましい供給源は、マウス及びヒトである。遍在性の発現は、幅広い型の神経細胞において機能するプロモーターを使用して達成することができ、こうしたプロモーターの例は、当該技術分野で知られており、利用可能である。そのような例の１つはＣＡＧである。ＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶ初期エンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターとの融合体である。
【０１３１】
適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それが機能可能なように連結される任意のポリヌクレオチド配列を高いレベルで発現させる能力を有する強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子−１α（ＥＦ−１α）である。しかしながら、他の構成的プロモーター配列が使用されることもあり得、こうした構成的プロモーター配列には、限定されないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター（限定されないがアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘムプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターなど）が含まれる。さらに、本発明は、構成的プロモーターの適用に限定されるべきものではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部と見なされる。誘導性プロモーターを使用することで、誘導性プロモーターに機能可能なように連結されたポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が望まれるときにオンにし、当該発現が望まないときには当該発現をオフにすることが可能な分子スイッチが得られる。誘導性プロモーターの例としては、限定されないが、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
【０１３２】
哺乳類細胞（好ましくはヒト細胞、より好ましくはヒト視神経細胞、または光受容細胞）におけるＯＰＡ１タンパク質の発現には、多くの発現ベクターを使用することができる。本発明では、好ましくは、アデノ随伴ウイルスが発現ベクターとして使用される。
【０１３３】
本発明は、組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの遺伝子を組換えで適用するためのアデノ随伴ウイルスベクターを構築するための方法も提供し、この方法は、組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの遺伝子を保有する組換えアデノ随伴ウイルスベクターの迅速かつ容易な構築を可能にするものであり、これがパッケージングされることで複製欠陥型アデノ随伴ウイルスベクターが得られる。
【０１３４】
本発明は、ＯＰＡ１タンパク質を発現させるための宿主細胞も提供する。好ましくは、宿主細胞は、ＯＰＡ１タンパク質の発現量を増加させる哺乳類細胞（好ましくはヒト細胞、より好ましくはヒト視神経細胞、または光受容細胞）である。
【０１３５】
調製物及び組成物
本発明は、（ａ）本発明の第３の態様によるベクターと、（ｂ）医薬的に許容可能な担体または医薬品添加物と、を含む調製物または組成物を提供する。
【０１３６】
別の好ましい実施形態では、医薬調製物は、眼疾患の治療に使用される。
【０１３７】
別の好ましい実施形態では、医薬調製物は、遺伝性視神経症の治療に使用され、好ましくは常染色体優性視神経萎縮（ＡＤＯＡ）の治療に使用される。
【０１３８】
本発明に記載の医薬組成物中の「活性成分」は、本発明のベクター（ウイルスベクター（アデノ随伴ウイルスベクターを含む）など）を指す。本発明に記載の「活性成分」、調製物、及び／または組成物は、眼疾患の治療に使用され得る。「安全かつ有効な量」は、重篤な副作用を生じさせることなく活性成分が病状または症状を明らかに改善し得る量を意味する。「医薬的に許容可能な担体または医薬品添加物」は、ヒトへの使用に適しており、さらには純度が十分であり、毒性が十分に低いものでなくてはならない１つ以上の適合性の固体または液体の賦形剤またはゲル物質を意味する。本明細書に記載の「適合性」は、組成物中の個々の成分が本発明の活性成分と組み合わさり、活性成分の薬物効果を明らかに低減することなく互いに組み合わさり得ることを意味する。
【０１３９】
組成物は、液体または固体（粉末、ゲル、またはペーストなど）であり得る。好ましくは、組成物は、液体であり、好ましくは注射用液体である。当業者なら、適切な医薬品添加物の知見を有しているであろう。
【０１４０】
本発明では、担体は、網膜下投与または硝子体内投与によって眼に投与され得る。いずれの投与様式でも、担体は、好ましくは、注射用液体として提供される。好ましくは、注射用液体は、カプセルまたはシリンジとして提供される。
【０１４１】
医薬的に許容可能な担体の例としては、セルロース及びその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースナトリウム、酢酸セルロース、及び同様のものなど）、ゼラチン、タルク、固体滑沢剤（ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなど）、硫酸カルシウム、植物油（大豆油、ゴマ油、ピーナッツ油、オリーブ油、及び同様のものなど）、ポリオール（プロピレングリコール、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、及び同様のものなど）、乳化剤（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）など）、湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウムなど）、着色剤、香味剤、安定化剤、抗酸化剤、保存剤、発熱性物質非含有水、ならびに同様のものが挙げられる。
【０１４２】
組成物には、生理学的に許容可能な滅菌水溶液もしくは滅菌非水溶液、分散液、懸濁液、または乳濁液、及び注射用の滅菌溶液または滅菌分散液へと再構成するための滅菌粉末が含まれ得る。適切な水性及び非水性の担体、希釈剤、溶媒、または医薬品添加物には、水、エタノール、ポリオール、及びそれらの適切な混合物が含まれる。
【０１４３】
本発明によって提供されるＯＰＡ１をコードする核酸または融合核酸は、インビトロまたはインビボでＯＰＡ１タンパク質またはＯＰＡ１融合タンパク質を生成し得、融合タンパク質、または融合タンパク質を含む調製物を使用して、常染色体優性視神経萎縮（ＡＤＯＡ）を治療するための薬物が調製され得る。
【０１４４】
ヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅをコードする最適化核酸は、その発現量が高まり、それによって、翻訳されるＯＰＡ１タンパク質が増加するものであり、最適化ＯＰＡ１タンパク質中のＭＩＳ配列は、ＧＴＰ機能性タンパク質がミトコンドリアに入るように正確に導き得るものであり、それ故に、ミトコンドリアにトランスフェクションされるＧＴＰａｓｅが増加する。本発明の核酸を含む薬剤は、ウサギの眼の硝子体腔に注射され、薬剤は、硝子体腔中の活性を維持し、核酸は、視神経細胞にトランスフェクションされる。先行技術と比較すると、ＯＰＡ１をコードする最適化核酸から発現するＯＰＡ１タンパク質は増加しており、これによって、常染色体優性視神経萎縮（ＡＤＯＡ）をより良く治療することができる。
【０１４５】
先行技術と比較すると、本発明は、主に、下記の利点を有する：
１．本発明の組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅ（ＯＰＡ１）の遺伝子コード配列は、ＯＰＡ１中のＭＩＳコード配列及びＧＴＰａｓｅドメインコード配列の最適化を含めて、特別に最適化されている。ＯＰＡ１の非最適化ＤＮＡコード配列と比較して、発現量は顕著に増加し、ミトコンドリアにトランスフェクションされるＯＰＡ１タンパク質は増加する。最適化配列では、ＯＰＡ１タンパク質の発現量が顕著に増加し、ＯＰＡ１タンパク質が高い生物学的活性を有することが確保される。
２．本発明の最適化ＯＰＡ１コード遺伝子（配列番号１）または融合核酸は、良好な安全性を伴って常染色体優性視神経萎縮（ＡＤＯＡ）を効果的に治療し得る。
３．本発明は、ＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの遺伝子の不活性化に基づくＡＤＯＡの非ヒト哺乳類モデルを提供し、このモデルは、網膜ＡＴＰ含量の低下及びミトコンドリアのアポトーシス性変化を含めて、常染色体優性視神経萎縮（ＡＤＯＡ）と同様の病理学的徴候を示し、常染色体優性視神経萎縮（ＡＤＯＡ）についての実験的研究、評価、または薬物スクリーニングに使用できるものである。
４．本発明によって提供されるｒＡＡＶ２−ｈＯＰＡ１組換えアデノ随伴ウイルスは、ＡＤＯＡ（常染色体優性視神経萎縮）の点変異のモデルマウスの病状に対して顕著かつ効果的な改善作用を有し、改善作用を継続的に与えることができ、単回投与から３ヶ月で、モデルマウスにおける当該疾患の影響を完全かつ効果的に好転させることができるものである。
【実施例】
【０１４６】
本発明は、下記の具体的な実施例と関連付けてさらに例示される。こうした実施例は、単に、本発明の例示にすぎず、本発明の範囲の限定を意図するものではないことを理解されたい。下記の実施例において具体的に記載されない特定の条件を伴う実験方法は、一般に、従来の条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の条件など）に従うものであるか、または製造者によって推奨される条件に従うものである。パーセント及び分率はすべて、別段の指定がない限り、重量によって計算されたものである。
【０１４７】
実施例１  組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの遺伝子のための組換えアデノ随伴ウイルスベクターの構築、ならびにそのウイルスパッケージング方法及び精製方法
【０１４８】
１．ヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターの構築
【０１４９】
１）ベクターの構築
組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの特別に最適化された遺伝子（配列番号：１）に対して２つの制限酵素消化部位（ＫｐｎＩ及びＳａｌＩ）を追加した。あるいは、この新規の遺伝子に沿ってプライマーを設計して当該遺伝子をＰＣＲによって増幅することで産物を得た。この産物及びｐＳＮａＶプラスミドベクターを、ＫｐｎＩ及びＳａｌＩでの二重消化にそれぞれ供し、消化産物を回収し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて一晩ライゲーションした。ライゲーション産物でコンピテント細胞の形質転換を行うことで、組換えｐＳＮａＶ／ｒＡＡＶ２／２−ｈＯＰＡ１アイソフォーム２を得た（図２）。
【０１５０】
２）組換え体のスクリーニング及び同定
３７℃での培養後、青色プラーク及び白色のプラークがＬＢプレート上に現れ、白色のプラークを組換えクローンとした。白色のコロニーをピッキングして取り出し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍで８時間培養した。培養した細菌懸濁物からプラスミドを抽出し、プラスミド抽出ステップでは、Ｂｉｏｍｉｇａの説明を参照した。プラスミド１μＬをテンプレートとし、以下の特別なプライマーを使用した：
１Ｆ：５’−ＡＴＧＴＧＧＣＧＡＣＴＡＣＧＴＣＧ−３’（配列番号４）；
１Ｒ：５’−ＴＴＡＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＡＧ−３’（配列番号５）；
【表１】
2021533801.tif 000006
【０１５１】
ＰＣＲ産物を電気泳動によって検出した。結果を図３に示される。サイズが約３０００ｂｐの目的のバンドを得た。同定の結果、クローンが目的遺伝子を含むことが示された。
【０１５２】
３）細菌懸濁物の保存、ＰＣＲ増幅、及びその断片シークエンシング
同定した細菌懸濁物１ｍＬを滅菌グリセロールと１：３の比でピペッテイングして混合し、−８０℃で保存した。細菌懸濁物をシークエンシングに供し、シークエンシングによって得られた配列を、組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの遺伝子とアライメントし、正しい配列を有する組換えアデノ随伴ウイルスプラスミドｐＳＮａＶ／ｒＡＡＶ２／２−ｈＯＰＡ１を得ることに成功した（図４）。
【０１５３】
２．ｒＡＡＶ２／２−ｈＯＰＡ１アイソフォーム２組換えアデノ随伴ウイルスのエンベロープ形成
【０１５４】
１）トランスフェクションの前日に、２２５ｃｍ２の細胞培養フラスコに３．０×１０７個細胞／ｍＬの播種密度で２９３Ｔ細胞を播種し（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ血清を培地とした）、５％ＣＯ２を含むインキュベーター中、３７℃で一晩培養した。
【０１５５】
２）トランスフェクションの日に培地を交換し、新鮮なウシ血清１０％含有ＤＭＥＭ培地を用いて培養を継続した。細胞が８０〜９０％に増殖した時点で培養培地を捨て、ＰｌａｓｍｉｄＴｒａｎｓＩＩ（ＶＧＴＣ）トランスフェクションキットを使用してトランスフェクションを実施した。具体的なステップは下記の通りである：
（ａ）各トランスフェクションフラスコからプラスミドｐＡｄＨｅｌｐｅｒ、プラスミドｐＡＡＶ−ｒ２ｃ５、及びプラスミドｐＳＮａＶ−ｈＯＰＡ１を取り出し、必要な比となるように１．５ｍＬの滅菌Ｅｐチューブ中でＤＭＥＭ＋ＰｌａｓｍｉｄＴｒａｎｓＩＩ（ＶＧＴＣ）（トランスフェクション試薬）と混合し、試薬Ａと命名した。次に、この試薬Ａをそのまま室温で１０〜１５分間保持した。
（ｂ）試薬Ａを３０ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％ウシ血清と混合し、試薬Ｂと命名した。
（ｃ）試薬Ｂを細胞培養フラスコに均等に添加し、５％ＣＯ２を含むインキュベーター中、３７℃で培養を継続した。
（ｄ）トランスフェクションから１６時間後に完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ血清）を添加して培地交換を行った。
【０１５６】
３）トランスフェクションから４８時間後に細胞を収集した。
【０１５７】
４）収集した細胞をＰＢＳ中に懸濁し、凍結解凍処理に３回反復して供した。
【０１５８】
３．ｒＡＡＶ２／２−ｈＯＰＡ１アイソフォーム２ウイルスの精製及び濃縮
クロロホルム処理−ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿−クロロホルム抽出という３つのステップを使用してｒＡＡＶ２／２−ｈＯＰＡ１ウイルスの分離、濃縮、及び精製を行った。総回収率＝最終産物中のウイルス粒子数／出発材料中のウイルス粒子数。
【０１５９】
４．ウイルスの純度及び力価の検証
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の分離ゲル及び濃縮ゲルをロードし、その際、分離ゲルの濃度は１０％とした。試料１５μｇを各試料ウェルにそれぞれ添加した。電気泳動後、クマシーブリリアントブルーでゲルを染色し、対応する脱染溶液を用いて、バックグラウンドが下がって明瞭なバンドが出現するまでゲルを脱染した（図５）。
【０１６０】
結果は図５に示され、ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３＝１：１：１０となり、これらのバンドは明瞭であり、この比は正常であり、不純物バンドは存在せず、純度は９９％超であった。
【０１６１】
ｒＡＡＶ２／２−ｈＯＰＡ１アイソフォーム２の力価の決定に関しては、蛍光定量的ＰＣＲ法を用いてｒＡＡＶ２／２−ｈＯＰＡ１アイソフォーム２の物理的力価を決定した。
【０１６２】
実験材料：ＳＹＢＲＩＩ（ｔａｋａｒａ）、目的断片に対するプライマー（２０μＭ）、ウイルスパッケージングのための目的プラスミド（濃度既知）、決定対象のウイルス、ＰＣＲ８連チューブ（Ｂｉｏ−ｒｅｄ）。
【０１６３】
実験方法：１μｌのテンプレート、７μｌのＳＹＢＲＩＩ、０．２５μｌのプライマー１、及び０．２５μｌのプライマー２を取り、１４μｌに達するまでヌクレアーゼ非含有水を添加した。
【０１６４】
ＰＣＲ反応条件：予備変性：９５℃１０分、サイクル：９５℃１５秒、６０℃１分。
【０１６５】
最終的に、ゲノム力価を１×１０１２ｖｇ／ｍＬと決定した。
【０１６６】
実施例２：ＡＤＯＡ（常染色体優性視神経萎縮）に対するｒＡＡＶ２／２−ｈＯＰＡ１組換えアデノ随伴ウイルスの効果に関する実験
【０１６７】
１．ウサギの眼の硝子体腔への注射
２４匹のウサギを３群に分け、これら３群には、実験群Ａ、実験群Ｂ、及び対照群を含めた。ｒＡＡＶ２／２−最適化ｈＯＰＡ１アイソフォーム２、ｒＡＡＶ２／２−原型ｈＯＰＡ１アイソフォーム２、及びｒＡＡＶ−ＺｓＧｒｅｅｎを、それぞれ５０μｌ（１×１０１２ｖｇ／ｍＬ）用意し、角膜縁から３ｍｍ離れた毛様体の平坦部を刺すことによって硝子体腔に注射した。
【０１６８】
２．細隙灯検査、眼圧検査、眼底写真検査
２つのウサギ群に対して、それぞれ細隙灯検査及び眼圧検査を、手術から１日目、３日目、７日目、及び３０日目に行った。手術から１ヶ月後の眼底写真に示されるように、すべてのウサギについて、明らかな異常、結膜の充血及び分泌物、眼内炎、ならびに眼圧の上昇は認められなかった。
【０１６９】
この結果は図６に示される：すべてのウサギについて、網膜血管及び視神経に明らかな合併症または損傷は認められず、このことは、硝子体腔への通常の標準的注射が、明らかな炎症反応または他の合併症を誘発しないことを示している。
【０１７０】
３．網膜の蛍光写真
硝子体腔注射から３０日後、ＺｓＧｒｅｅｎ群（対照群）の網膜の蛍光写真から、網膜上での良好なＧＦＰ発現が示され、このことは、ＧＦＰをトランスフェクションしてウサギの眼の硝子体に送り込むためのベクターとしてｒＡＡＶが機能したことを示しており、これによって、ｒＡＡＶ２／２−ｈＯＰＡ１アイソフォーム２組換え遺伝子が網膜上に発現し得ることが実証された。
【０１７１】
４．ｈＯＰＡ１の免疫蛍光検出
硝子体腔注射から３０日後、実験群Ａ及び実験群Ｂならびに対照群の眼球を剥がし、パラフィン切片とした。これらのパラフィン切片を６５℃の乾燥器中に入れて２時間乾燥させ、脱パラフィン処理に供してから水に浸し、ＰＢＳで３回（各５分間）すすいだ。切片をＥＤＴＡ緩衝液に浸してマイクロ波による修復に供した後、中程度の熱で煮沸し、その後に静置して１０分間の間隔を空けてから、沸騰に至るまで切片に低度の熱を加え、その後に電源を切った。自然冷却後、切片をＰＢＳで３回洗浄（各５分間）した。切片を３％の過酸化水素溶液に浸し、室温で１０分間インキュベートした。切片をＰＢＳで３回洗浄（各５分間）し、スピン乾燥後に５％のＢＳＡで２０分間ブロッキングした。ＢＳＡ溶液を除去した後、希釈した一次抗体を各切片に５０μｌ添加して組織を覆い、４℃で一晩静置した。次に、切片をＰＢＳで３回洗浄（各５分間）した。ＰＢＳ溶液を除去し、対応する種の蛍光二次抗体を各切片に５０μｌ〜１００μｌ添加し、遮光しながら切片を室温で５０分〜１時間インキュベートした。遮光しながら切片をＰＢＳで３回洗浄（各５分間）した。ＰＢＳ溶液を除去した。ＤＡＰＩを各切片に５０〜１００μｌ添加して、遮光しながら核を５分間染色した。切片をＰＢＳで３回洗浄（各５分間）した。切片がわずかに乾燥した後、抗蛍光消光マウント媒体を切片にマウントし、写真撮影の準備が整うまで遮光しながら４℃で保管した。
【０１７２】
網膜の抗ｈＯＰＡ１免疫蛍光の結果は図７に示され、実験群Ａの蛍光強度は、実験群Ｂのものと比較して顕著に高く、有意差及び１倍超の増加を伴っていた。実験群Ａの網膜上でのｈＯＰＡ１の発現量は、対照群及び実験群Ｂのものと比較して有意に高いことが示された。
【０１７３】
５．ＯＣＴ検出
実験群Ａ及び実験群Ｂの網膜神経線維束の厚さは、それぞれ６７．５５μｍ及び６６．００μｍであり、有意差を伴わないことが結果から示された（Ｐ＞０．０５、図８）。
【０１７４】
６．ＨＥ検出
実験群及び対照群における網膜神経節細胞の数は実質的に同じであり、構造は完全なものであることがＨＥの結果から示され、このことは、ｒＡＡＶ−ｈＯＰＡ１組換え遺伝子が安全であり、網膜に損傷を与えなかったことを示している（図９）。
【０１７５】
７．ｈＯＰＡ１の発現を検出するためのリアルタイムＰＣＲ
最初に、ＮＣＢＩの保存ドメイン解析ソフトウェアを使用してｈＯＰＡ１の保存構造を解析することで、設計プライマーを用いて増幅される断片が確実に非保存領域に位置するものとなるようにした。次に、蛍光定量的ＰＣＲのプライマー設計原理に従ってＰｒｉｍｅｒ  ｐｒｅｍｉｅｒ５を使用してプライマーを設計した：
【化４】
2021533801.tif 000007
【０１７６】
１）ＲＮＡの抽出及び逆転写
ＴＲＩＺＯＬキットを使用して、異なる実験群のウサギ網膜から全ＲＮＡを抽出し、逆転写を実施してｃＤＮＡテンプレートを得た。
【０１７７】
２）蛍光定量的ＰＣＲの反応系及び反応手順
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで蛍光定量的ＰＣＲを実施した。１２．５μＬのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｍｉｘ、８μＬのｄｄＨ２Ｏ、プライマーペア（各１μＬ）、２．５μＬのｃＤＮＡ試料を０．２ｍＬのＰＣＲ反応チューブに添加し、系全体を２５μＬとした。目的遺伝子及び内部参照遺伝子（ウサギアクチン）の増幅に各試料を使用し、各遺伝子の増幅は３連で実施した。実際に試料を添加する際には、誤差低減のために、各ＰＣＲ反応チューブに共通する試薬については、それらの試薬をひとまとめにしてから分注することができる。試料添加完了後に蛍光定量的ＰＣＲを実施した。
【０１７８】
増幅は、下記の反応手順に従って実施した：予備変性９５℃１秒、変性９４℃１５秒、アニーリング５５℃１５秒、及び伸長７２℃４５秒のサイクルを全部で４０回実施し、各サイクルの伸長段階の間に蛍光シグナルを収集した。反応完了後、９４℃〜５５℃での融解曲線を解析した。
【０１７９】
２−ΔΔＣＴ相対的定量法（Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）を使用して遺伝子発現量の差異を調べた。この方法では、標準曲線を作成する必要はなく、ハウスキーピング遺伝子（ウサギアクチン）を内部参照遺伝子として使用した。機器に付属の解析ソフトウェアは、発現値を自動生成することができる。
【０１８０】
結果は図１０に示され、実験群Ａ及び実験群ＢにおけるｈＯＰＡ１遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量は共に、対照群におけるｈＯＰＡ１遺伝子の相対発現量と比較して多く、実験群ＡのｍＲＮＡの相対発現レベルは、実験群Ｂのものと比較してわずかに高い。
【０１８１】
８．ｈＯＰＡ１タンパク質の発現を検出するためのウエスタンブロット
異なる実験群のウサギの眼球の網膜を剥がし、対応する体積のＲＩＰＡ溶解溶液を１００μＬ／組織５０ｍｇとなるように添加した後、ホモジナイザーを用いて均質化し、遠心分離して上清を収集した。ＢＣＡ法によってタンパク質濃度を決定した後、総タンパク質量が５０μｇとなるように実験群及び対照群の試料ロード体積を計算し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動及びウエスタンブロットを実施した。抗体とのインキュベート後、ＥＣＬでの発色を実施した。
【０１８２】
結果は図１１に示され、ウエスタンブロットによる実験群ＡのｈＯＰＡ１の相対発現レベル（１．１３）は、実験群Ｂのもの（０．１９）及び対照群のもの（０．０５）と比較して有意（有意差Ｐ＞０．０５）に高く、このことは、実験群Ａの網膜上のｈＯＰＡ１の発現レベルが有意に増加したことを示しており、この発現レベルは、実験群Ｂ及び対照群のものと比較して、それぞれ約５倍及び２２倍高いものであった。
【０１８３】
実施例３：ＡＤＯＡ（常染色体優性視神経萎縮）に対するｒＡＡＶ２−ｈＯＰＡ１組換えアデノ随伴ウイルスの長期的効果に関する実験
【０１８４】
１．マウスの眼の硝子体腔への注射
野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対して硝子体腔を介する投与を行い、当該マウスを無作為に群分けした（マウス２匹／ケージ）。この投与では、濃度を２Ｅ１１ｖｇ／ｍｌとし、体積を１μＬとしてｒＡＡＶ２／２−ＯＰＡ１を硝子体下注射によって投与した。投与後、マウスを７日群、１５日群、２０日群、３０日群、４５日群、６０日群、及び９０日群に分けた。指定日に達した時点で、異なる群のマウスを屠殺し、眼球試料を採取し、関連する検出及び解析を実施した。
【０１８５】
２．ｈＯＰＡ１の発現を検出するためのリアルタイムＰＣＲ
実施例２に記載の方法及びステップと同様に、全ＲＮＡ抽出、ＲＮＡの濃度決定及び電気泳動による同定、逆転写、ならびにリアルタイムＰＣＲによる同定を実施した。その際、以下のプライマー配列を使用した：
【化５】
2021533801.tif 000008
【０１８６】
以下の反応条件を使用した：予備変性９５℃３分、変性９５℃１０秒、アニーリング６０℃１５秒、及び伸長７２℃２５秒のサイクルを４０回行う反応手順に従って増幅を実施し、各サイクルの伸長段階の間に蛍光シグナルを収集した。反応完了後、９５℃〜６０℃での融解曲線を解析した。
【０１８７】
２−ΔΔＣＴ相対的定量法（Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）を使用して遺伝子発現量の差異を調べた。この方法では、標準曲線を作成する必要はなく、ハウスキーピング遺伝子（アクチン）を内部参照遺伝子として使用した。機器に付属の解析ソフトウェアは、発現値を自動生成することができる。
【０１８８】
結果は図１１に示される：ｒＡＡＶ２−ＯＰＡ１ウイルスを使用してマウスの眼の硝子体腔への注射を行った後、７日目、１５日目、２０日目、３０日目、４５日目、６０日目、及び９０日目にＲＴ−ＰＣＲによって検出した目的遺伝子はすべて、そのレベルが投与前と比較して高まっており、２０日目〜３０日目付近の発現量が最も多かった。
【０１８９】
実施例４：ＡＤＯＡ（常染色体優性視神経萎縮）のモデルマウスの構築及び同定
【０１９０】
１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を利用してマウスＯＰＡ１  Ｑ２８５終結点変異導入を実施し、エクソン８（高度に保存されたＧＴＰａｓｅ領域（エクソン８〜１６））を変異エクソンとした。ＮＧＧで終結する標的を変異部位に設計し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の作用で切断した。約１２０ｂｐのドナーをインビトロで構築し、この外来性ドナーを、相同組換えによって切断部位に挿入した。ガイドＲＮＡの設計、ＯＰＡ１構造、及び設計方針は図１２に示される。
【０１９１】
下記の配列中：コード領域（大文字）、非コード領域（黒色）、及びイントロン領域（小文字）
【化６】
2021533801.tif 000009
【０１９２】
２．ＡＤＯＡ（常染色体優性視神経萎縮）のモデルマウスの構築
【０１９３】
（１）ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９技術を使用して、ＯＰＡ１  Ｑ２８５終結点変異を有する組換えプラスミドを構築した後、相同組換えを介する変異導入に対する選択可能マーカーを有するＤＮＡ配列で置き換えてＯＰＡ１  Ｑ２８５終止点変異陽性のモノクローナル胚性幹細胞を得た。
【０１９４】
（２）ステップ（１）で得たＯＰＡ１点変異を有するマウス胚性幹細胞クローンを使用することによってキメラマウスを調製した。
【０１９５】
（３）ステップ（２）で得たキメラマウスを正常な野生型マウスと交配させた後に繁殖させ、ＯＰＡ１点変異を有するヘテロ接合型マウスが得られるように子孫をスクリーニングした。
【０１９６】
（４）ステップ（３）で得られたヘテロ接合型マウスの相互交配によってＯＰＡ１  Ｑ（グルタミン）２８５終結点変異を有するホモ接合型マウスを獲得し、それによってＯＰＡ１  Ｑ（グルタミン）２８５終結点変異のマウスモデルを得た。
【０１９７】
３．ＡＤＯＡ（常染色体優性視神経萎縮）の点変異のモデルマウスの同定
【０１９８】
３．１  ゲノムＤＮＡの抽出
【０１９９】
（１）消化：生後１週間以内のマウスからマウス足指を０．５ｃｍ切除し、１．５ｍｌのＥＰチューブに添加し、軽く遠心分離した後、溶解溶液（製剤：１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．５％のＳＤＳ、１．１７ｇ／１００ｍｌのＮａＣｌ）を５００μｌ添加し、０．５μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、及び１ｍＭのＣａＣｌ２、５０％のグリセロールを含む緩衝液に２０ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解させたもの（−２０℃保存））を０．５μｌ添加し、均一に混合し、水浴中、５５℃で一晩消化した。
【０２００】
（２）イソプロパノール沈殿によるＤＮＡ抽出：
１）水浴ケトルから遠心管を取り出し、室温で１０〜１５分間静置して試料温度を室温にさげ、遠心管を反転させて均一に混合した。１３，０００ｒｐｍ、室温での遠心分離を１５分間実施した。
２）上清４００μｌをピペットで別の新たな遠心管に移した。等体積のイソプロパノールを添加し、直ちに遠心管を穏やかに上下に反転させて完全に混合した。白色の綿状沈殿が出現した時点で、１２０００ｒｐｍ、室温での遠心分離を１０分間実施し、上清を捨てた。
３）氷冷７５％エタノールを遠心管に７００μｌ添加して産物をすすぎ、遠心管を穏やかに上下に反転させて均一に混合した。１２０００ｒｐｍ、室温での遠心分離を５分間実施し、すべての上清を捨てた。
４）遠心管を反転させて吸収紙上に置いてエタノールを吸収させた。風乾後、ＤＮＡを５０μｌの滅菌ｄｄＨ２Ｏに溶解し、５５℃で２時間溶解させた（ただちに使用しない場合は−２０℃で保存した）。
５）ＤＮＡの濃度を決定し、ＤＮＡを１００〜２００ｎｇ取り分け、ＰＣＲテンプレートとして使用した。
【０２０１】
３．２  プライマー及びＰＣＲ反応
ＰＣＲ増幅を介して、Ｑ２８５部位を含む核酸増幅産物（長さ５３０ｂｐ）が得られるようにプライマーペアを合成した。
【０２０２】
３．３  同定結果
マウスの全ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ産物をシークエンシングした。
【０２０３】
結果は図１３に示され、これによって、位置２８５の塩基ＣがＴに変異していることが示され、このことは、点変異マウスが良好に調製されたことを示している。
【０２０４】
実施例５：ｒＡＡＶ２−ｈＯＰＡ１組換えアデノ随伴ウイルス用いるＡＤＯＡ（常染色体優性視神経萎縮）の点変異を有するモデルマウスの改善に関する実験
【０２０５】
１．方法
ＯＰＡ１変異マウスをマウス２匹／ケージとし、３群に分けた。ｒＡＡＶ−ＯＰＡｌ濃度を２Ｅ１１ｖｇ／ｍｌ、投与体積を１μＬとして、マウスの硝子体下への注射を行った。１ヶ月後及び３ヶ月後に、異なる群のマウスを屠殺して眼球試料を得た。ＯＰＡ変異群に１μＬのＰＢＳを硝子体下注射し、野生型マウスをマウス２匹／ケージとし、１μＬのＰＢＳを硝子体下注射し、対照群とした。ＡＴＰ含量の変化及びミトコンドリア形態観察について検出及び分析を実施した。
【０２０６】
２．高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による、投与後のマウスの網膜中のＡＴＰ含量の変化
【０２０７】
２．１  投与後の野生型マウス及びＯＰＡ１変異マウスの網膜を取り出し、予備冷却したＰＢＳで１回洗浄し、液体窒素中に入れた。
【０２０８】
２．２  ＡＴＰの抽出
【０２０９】
（１）液体窒素粉砕を行った。
【０２１０】
（２）１ｍｌの氷冷フェノール−ＴＥ（ＤＴＴ含有）、２００μｌのクロロホルム、及び１５０μｌの超純水を添加した後、４℃で２０秒間振とう及び混合して均一化を行い、１０，０００ｇでの遠心分離を１０分間実施した。
【０２１１】
（３）水相を２００μｌ取り分け、孔径０．２２μｍのフィルター膜でろ過し、機器にロードしてＡＴＰをＨＰＬＣによって検出した。
【０２１２】
（４）ＢＣＡ法を使用してタンパク質濃度を決定した。
【０２１３】
２．３  クロマトグラフィー分析法
クロマトグラフィーカラム：ＳｅｐａｘＧＰ−Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）
移動相Ａ：１５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１５ｍＭのＫＣＬ、及びｐＨを６．０に調整するために使用した０．１ＭのＫＯＨ
移動相Ｂ：アセトニトリル含有率１５％、移動相Ａ含有率８５％とした混合液
ロード体積：２０μｌ
検出波長：２５４ｎｍ
勾配溶出条件：
【表２】
2021533801.tif 000010
【０２１４】
結果は図１４に示される：対照群のＯＰＡ１変異マウスにおけるＡＴＰ含量は減少する一方で、マウスの眼球の硝子体腔にｒＡＡＶ２−ＯＰＡ１ウイルスを注射した実験群では、投与後にＡＴＰ含量が正常レベルにまで増加することがＨＰＬＣ検出によって明らかとなり、このことは、ＡＴＰ含量がＯＰＡ１投与後に回復し得ることを示している。
【０２１５】
投与から１ヶ月後及び投与から３ヶ月後に、マウスの眼球中のＡＴＰ含量が経時的に増加したことが図１４から見て取れ、ＯＰＡ１変異マウスの眼球中のＡＴＰ含量は、投与から３ヶ月後までには野生型マウスの眼球のＡＴＰ含量と等しくなっており、このことは、ｒＡＡＶ２−ＯＰＡ１ウイルスを使用することで、疾患の発生が効果的に好転したことを示唆している。
【０２１６】
３．透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるミトコンドリアの形態の観察
マウス眼球を取り出した後、これらのマウス眼球を、それぞれ２．５％のグルタルアルデヒドに浸漬し、一晩固定化し、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液で３回洗浄（各１５分間）し、オスミウム酸で２時間固定化し、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液で３回洗浄（各１５分間）し、エタノール（５０％、７０％、８０％、９０％、１００％）を使用して濃度勾配脱水を実施し、その後、純粋アセトンの使用に切り替え、純粋アセトンで２回脱水を行った。各ステップには１５分かけた。８１２樹脂：アセトンを３：１、３：２、及び３：３の比で使用して濃度勾配浸透処理を実施した後（各ステップには４０分かけた）、純粋な包埋剤を用いる４５℃での一晩の包埋、６０℃での重合、切片作成、染色、及び透過型電子顕微鏡下での観察を実施した。
【０２１７】
結果は図１５に示される。ＯＰＡ１変異マウスではミトコンドリアのクリステの消失がＴＥＭ電子顕微鏡法によって観察され、このことは、アポトーシスが生じていることを示している。投与から１ヶ月後に、ＯＰＡ１変異マウスではミトコンドリアのクリステの回復が観察され、さらに、３ヶ月には顕著な回復が観察され、このことは、ｒＡＡＶ２−ＯＰＡ１ウイルスを使用することで、疾患の発生が効果的に好転したことを示唆している。
【０２１８】
考察
眼疾患の治療において遺伝子治療が迅速に開発されれば、ＡＤＯＡの治癒は困難なことではなくなるであろう。ヒトの眼とウサギ眼とは、解剖学的形態及び体積が類似していることから、本発明ではｒＡＡＶ２／２−ｈＯＰＡ１アイソフォーム２の硝子体腔注射のためのモデルとしてウサギの眼を使用した。この実験では、注射用量、安全性レベル、及び術後合併症を調べ、将来の臨床試験のための重要な基準が得られた。すべてのウサギに細隙灯検査及び眼圧検査を実施し、これらのウサギについて、明らかな異常、結膜の充血及び分泌物、眼内炎、ならびに眼圧の上昇は認められなかった。手術から１ヶ月後に撮影した眼底写真から、すべてのウサギについて、明らかな合併症または網膜血管及び視神経の損傷は認められないことが示され、このことは、この実験が安全であったことを示唆している。
【０２１９】
免疫蛍光、リアルタイム定量的ＰＣＲ、及びウエスタンブロットの結果は、ウサギの網膜上にｈＯＰＡ１が安定的に発現し得ることを実証し得るものである。ＡＤＯＡ病変は視神経乳頭周辺の網膜神経節細胞のアポトーシスを誘発し得ることから、ｒＡＡＶ−ＺｓＧｒｅｅｎ群の網膜切片では視神経乳頭周辺の網膜中での安定的な蛍光発現が検出され得る。ｈＯＰＡ１の蛍光染色の結果は、ｈＯＰＡ１が網膜神経節細胞に到達し得ることを実証し得るものであり、このことは、ｒＡＡＶ２／２−ｈＯＰＡ１アイソフォーム２が患者の眼の疾患領域に到達し得ることを示している。眼底写真及びＯＣＴの結果からは、５×１０１０ｖｇ／ｍＬのｒＡＡＶ２／２−ｈＯＰＡ１アイソフォーム２の単回の硝子体腔注射が安全であり、網膜毒性を有さず、将来の臨床試験に使用し得るものであることが示された。
【０２２０】
本発明において参照される文書はすべて、参照によって各文書が個別に組み込まれるのと同様に、参照によって本出願に組み込まれる。さらに、上述の本発明の教示内容を読むことで、当業者なら本発明に対してさまざまな変更または改変を施すことができ、こうした均等形態もまた、本出願の添付の特許請求の範囲によって定義される範囲に含まれることを理解されたい。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2021533801.tif 000024
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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