(57)【要約】本発明は、ＴＰＲドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減弱されている変異微生物を提供し、変異微生物が、それらが由来する野生型微生物と比較して、より高い脂質生産性を有し、かつ／または脂質への炭素分配の増加を呈する。また提供されるのは、変異微生物、変異微生物を生成するために使用されるガイドＲＮＡおよび核酸構築物を使用して脂質を生成する方法である。【選択図】図３
2021505158.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テトラトリコペプチドリピート（ＴＰＲ）ドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減弱されている変異微生物であって、
前記変異微生物および対照微生物が同一条件下で培養されると、
（ａ）前記対照微生物よりも少なくとも２５％多く脂質を生成し、かつ／または
（ｂ）前記対照微生物と比較して脂質への炭素分配の増加を呈する、変異微生物。
【請求項２】
前記ＴＰＲドメインが、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１に記載の変異微生物。
【請求項３】
前記ＴＰＲドメインが、配列番号１で示されるアミノ酸配列またはその保存的バリアントを含む、請求項１に記載の変異微生物。
【請求項４】
前記ＴＰＲドメインが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の変異微生物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の変異微生物。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、配列番号３で示されるアミノ酸配列またはその保存的バリアントを含む、請求項１に記載の変異微生物。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の変異微生物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する未知の機能のドメイン（ＤＵＦ４４７０）を含む、請求項１に記載の変異微生物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む未知の機能のドメイン（ＤＵＦ４４７０）またはその保存的バリアントを含む、請求項１に記載の変異微生物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する未知の機能のドメイン（ＤＵＦ４４７０）を含む、請求項１に記載の変異微生物。
【請求項１１】
不等毛類または藻類種におけるＮａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座またはシンテニー遺伝子座の遺伝子に対する、またはその遺伝子の発現に影響を与える、１つ以上の変異を含む、請求項１に記載の変異微生物。
【請求項１２】
配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を有するオープンリーディングフレームを含む遺伝子に対する変異、またはその発現に影響を与える変異を含む、請求項１１に記載の変異微生物。
【請求項１３】
前記１つ以上の変異が、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含む、ポリペプチドをコードする核酸に存在するか、またはその核酸の発現に影響を与える、請求項１１に記載の変異微生物。
【請求項１４】
前記１つ以上の変異が、前記Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８の前記遺伝子の前記ＤＵＦ４４７０ドメインにある、請求項１１に記載の変異微生物。
【請求項１５】
前記対照微生物が野生型微生物である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の変異微生物。
【請求項１６】
対照微生物よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、または少なくとも２００％多く、脂肪酸メチルエステル誘導体化脂質（ＦＡＭＥ脂質）を生成する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の変異微生物。
【請求項１７】
唯一の窒素源として硝酸塩を含む培地で培養されると、対照微生物よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、または少なくとも２００％多く、脂肪酸メチルエステル誘導体化脂質（ＦＡＭＥ脂質）を生成する、請求項１６に記載の変異微生物。
【請求項１８】
藻類であり、光独立栄養条件下で培養すると、対照藻類よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、または少なくとも２００％多く、ＦＡＭＥ脂質である、請求項１６または１７に記載の変異微生物。
【請求項１９】
前記対照微生物のＦＡＭＥ／ＴＯＣ比率よりも少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１２０％、少なくとも１４０％、少なくとも１６０％、少なくとも１８０％、少なくとも２００％、少なくとも２２０％、少なくとも２４０％、少なくとも２６０％、少なくとも２８０％、または少なくとも３００％高い、ＦＡＭＥ／ＴＯＣ比率を呈する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の変異微生物。
【請求項２０】
前記対照微生物に対して窒素が豊富である条件下で、前記対照微生物のＦＡＭＥ／ＴＯＣ比率よりも２０〜３００％高いＦＡＭＥ／ＴＯＣ比率を呈する、請求項１９に記載の変異微生物。
【請求項２１】
前記対照微生物に対して窒素が豊富である条件下で、約０．２５〜約０．７５、または約０．３〜約０．７のＦＡＭＥ／ＴＯＣ比率を呈する、請求項２０に記載の変異微生物。
【請求項２２】
脂質生成または生産性が、バッチ、半連続、または連続培養条件を使用して決定される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の変異微生物。
【請求項２３】
前記同一条件が、２ｍＭ未満のアンモニウムを含む培地で前記変異および対照微生物を培養することを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の変異微生物。
【請求項２４】
前記同一条件が、実質的に唯一の窒素源として硝酸塩を含む培地で前記変異および対照微生物を培養することを含む、請求項２３に記載の変異微生物。
【請求項２５】
前記同一条件が、前記対照微生物に対して栄養素が豊富な培地で、前記変異および対照微生物を培養することを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の変異微生物。
【請求項２６】
古典的に誘導された変異体または遺伝子操作された変異体である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の変異微生物。
【請求項２７】
ＴＰＲドメインを含むポリペプチドをコードする前記遺伝子、またはその発現に影響を与える遺伝子に変異を有し、
前記変異が、対照微生物における前記遺伝子の発現と比較して、ＴＰＲドメインを含むポリペプチドをコードする前記遺伝子の発現の減少を生じる、請求項２６に記載の変異微生物。
【請求項２８】
前記変異が、ノックダウン変異である、請求項２６に記載の変異微生物。
【請求項２９】
前記ノックダウン変異が、Ｃａｓ／ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して生成される、請求項２８に記載の変異微生物。
【請求項３０】
ＴＰＲドメインを有する前記ポリペプチドをコードする前記遺伝子、またはその発現に影響を与える遺伝子を標的とする、ＲＮＡｉ構築物、リボザイム構築物、またはアンチセンス構築物を含む、請求項２７に記載の変異微生物。
【請求項３１】
ＴＰＲドメインを含むポリペプチドをコードする前記遺伝子、またはその発現に影響を与える遺伝子にノックアウト変異を有する、請求項２７に記載の変異微生物。
【請求項３２】
前記ノックアウト変異が、部位特異的相同組換えによって生成される、請求項３１に記載の変異微生物。
【請求項３３】
前記ノックアウト変異が、部分的または完全な欠失、短縮、フレームシフト、または挿入変異によって前記遺伝子を破壊する、請求項３１または３２に記載の変異微生物。
【請求項３４】
前記ノックアウト変異が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、および／またはＣａｓ／ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して生成される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の変異微生物。
【請求項３５】
前記遺伝子へのＣａｓ／ＣＲＩＳＰＲが媒介する挿入を含む、請求項２９、３１、３３、および３４のいずれか一項に記載の変異微生物。
【請求項３６】
除草剤耐性、毒素耐性、向上した増殖特性、向上した光合成効率、向上した脂質生成もしくは蓄積、および／または特定の脂質の生成を与える、少なくとも１つの追加の遺伝子改変
を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の変異微生物。
【請求項３７】
藻類または不等毛類種である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の変異微生物。
【請求項３８】
アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）、アンフィプロラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、ベケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）、ボロディネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）、ボトリディウム（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）、クリコスファエラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）、シクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、デスモデスムス（Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、エリプソイドン（Ｅｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ユースティグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）、フラギラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）、フラギラロプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）、ハイメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ナノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、ナビキュラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）、オエドゴニウム（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、パリエトクロリス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、ファグス（Ｐｈａｇｕｓ）、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、シュードスタウラストラム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、シゾクラミデラ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ）、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）、アオミドロ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、タラシオシーラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）、ビスケリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）、およびボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）からなる群から選択される藻類種である、請求項３７に記載の変異微生物。
【請求項３９】
珪藻類（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔｅｓ）、真正眼点藻（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ）、黄緑色藻類（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔｅｓ）、褐藻類（ｐｈａｅｏｐｈｙｔｅｓ）、黄金色藻（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅｓ）、またはラフィド藻（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔｅｓ）からなる群から選択される不等毛類である、請求項３７に記載の変異微生物。
【請求項４０】
等毛類であり、さらに、ラビリンチュラ（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌａ）、ラビリンチュロイド（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）、およびウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）からなる群から選択される属のラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅ）種である、請求項３８に記載の変異微生物。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載の変異微生物の溶解物。
【請求項４２】
脂質を生成するために、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の変異微生物を培養培地で培養する工程を含む、脂質の生成方法。
【請求項４３】
前記微生物、前記培養培地、またはそれらの両方から脂質を単離する工程をさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記微生物が、バッチ、連続、または半連続培養条件を使用して培養される、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記微生物が藻類であり、前記培養工程が光独立栄養条件下である、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記微生物がラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅ）であり、前記培養工程が従属栄養条件下である、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ＣＲＩＳＰＲシステムのガイドＲＮＡであって、配列番号５に対応する配列を含む、ガイドＲＮＡ。
【請求項４８】
キメラガイドである、請求項４７に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項４９】
前記ガイドが、ｔｒａｃｒ配列を含まない、請求項４７に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項５０】
配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする自然発生する藻類遺伝子；前記Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座の遺伝子；および／または配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性の配列を含むオープンリーディングフレームを含む遺伝子、からの、または、それらに隣接する、ヌクレオチド配列を含む、相同組換えのための核酸構築物。
【請求項５１】
配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする自然発生する遺伝子；前記Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座の遺伝子；および／または配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＯＲＦを含む遺伝子、の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはリボザイムの発現のための、核酸構築物。
【請求項５２】
ＣＲＩＳＰＲシステムのガイドＲＮＡをコードする核酸分子であって、前記ガイドＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする自然発生する藻類遺伝子；前記Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座の遺伝子；および／または配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むオープンリーディングフレームを含む遺伝子、の少なくとも一部分を含む、核酸分子。
【請求項５３】
ＴＰＲドメインを含むポリペプチドの発現を減弱させる、１つ以上の変異および／または１つ以上の作用物質を前記微生物に導入する工程を含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の変異微生物を生成するための方法。
【請求項５４】
前記１つ以上の変異または作用物質が、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；前記Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座の遺伝子；および／または配列番号４のヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含む遺伝子、の発現に影響を与える、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記１つ以上の作用物質が、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、Ｃａｓ／ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素、および／または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムの構成要素からなる群から選択される、請求項５３または５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、参照によりその内容全体が本明細書の全体に組み込まれる２０１７年１２月８日出願の米国特許第６２／５９６，６７１号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
配列表の参照による組み込み
添付の配列表の内容は、参照により本出願に組み込まれる。名称ＳＧＩ２１３０＿１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ，ｔｘｔの添付の配列表テキストファイルは、２０１８年１１月１９日に作成され、５４ｋｂである。このファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＯＳを使用するコンピューターでＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄを使用してアクセスすることができる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、脂質生産性が増加されている藻類および不等毛類などの変異微生物、ならびに脂質の生成にそれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
脂質生合成を増加させることによって脂質生産性を改善するための様々な試みは、窒素同化もしくは脂質代謝のための酵素をコードする遺伝子、ならびに脂質貯蔵に関与するポリペプチドをコードする遺伝子の操作に焦点を合わせてきた。例えば、ＵＳ２０１４／０１６２３３０（特許文献１）は、硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子がＲＮＡｉ系のノックダウンによって減弱されているフェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）株について開示しており、Ｔｒｅｎｔａｃｏｓｔｅら（（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１１０：１９７４８−１９７５３）（非特許文献１）は、脂質異化に関与すると予測されるＴｈａｐｓ３＿２６４２９７遺伝子を標的とするＲＮＡｉ構築物で形質転換された珪藻について開示しており、ＷＯ２０１１／１２７１１８（特許文献２）は、オレオシン（脂質貯蔵タンパク質）をコードする遺伝子またはジアシルグリセロールトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）遺伝子をコードする遺伝子を用いるクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）の形質転換について開示している。いずれの場合も、脂質生成の増加が顕微鏡または親油性染料を用いた染色に基づいて主張されたが、操作された細胞による脂質生成の定量化は提供されず、バイオマス生産性と脂質生産性との間の経時的な関係性も決定されなかった。
【０００５】
Ｄａｂｏｕｓｓｉら２０１４（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍ．５：３８８１）（非特許文献２）は、ラミナリン（貯蔵炭水化物）合成の前駆体を提供すると考えられているＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｎｏｒｎｕｔｕｍのＵＧＰａｓｅ遺伝子の破壊により、脂質の蓄積の増加を生じることを報告している。しかしながら、ラミナリン含有量が影響を受けていること（または存在していることさえ）を示す生化学的データは示されず、脂質およびバイオマスの生産性は報告されなかった。同様に、いくつかのグループは、デンプンが不足したＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓの変異体における脂質蓄積の増加を報告している（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ８：１８５６−１８６８（非特許文献３）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．１２：３８７−３９１（非特許文献４））が、しかしながら脂質生産性を実際に測定したその後の報告書は、これらの株を光合成条件で増殖させると、増殖が損なわれたと結論付けた（Ｓｉａｕｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１１  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：７（非特許文献５）、Ｄａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｃｅｌｌ  １３：３９２−４００（非特許文献６））。これらの報告書は、１日１リットル当たりの生成されたトリグリセリド（ＴＡＧ）として測定された最も高い脂質生産性は、野生型の親株によって実際に達成されたものであると結論付けた。
【０００６】
ＷＯ２０１１／０９７２６１（特許文献３）およびＵＳ２０１２／０３２２１５７（特許文献４）は、アレスチンタンパク質をコードする「ＳＮ０３」と表される遺伝子が、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓで過剰発現すると、栄養素が豊富な条件下で脂質生成を増加させる役割を有することを報告している。しかしながら、ＳＮ０３遺伝子の過剰発現は、定量化されていない未確認の極性脂質の出現を生じ、ＴＡＧの増加を生じなかったことが観察された。ストレス誘導性脂質生合成を調節している可能性があると識別された別のポリペプチドについては、Ｂｏｙｌｅら（（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：１５８１１−１５８２５）（非特許文献７）によって記載されている。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓの「ＳＱＵＡＭＯＵＳＡ」ドメインポリペプチドをコードするＮＲＲ１遺伝子のノックアウトは、窒素欠乏下の野生型細胞と比較して脂質生合成の低下を生じたが、しかしながら、脂質生成の増加を実証する変異体は得られなかった。ＵＳ２０１０／０２５５５５０（特許文献５）は、藻類細胞における推定される転写因子（ＴＦ１、ＴＦ２、ＴＦ３、ＴＦ４、およびＴＦ５）の過剰発現が脂質生成を増加させることを示唆しているが、かかる株については開示されていない。
【０００７】
ＵＳ２０１７／００５８０３（特許文献６）は、硝酸塩を含む培地で培養すると、その減弱が変異藻類の脂質生産性の増加を生じる、ＺｙＣｙｓ調節因子遺伝子について開示している。この変異藻類は、野生型細胞のものの少なくとも８０％の割合でバイオマスを蓄積しながら、野生型前駆株の最大２倍多くの脂質を生成する増殖を、培養で実証した。ＵＳ２０１７／０１２１７４２（特許文献７）は、野生型藻類と比較して、バイオマス生産性の低下を最小限に抑えながら脂質生産性の上昇を実証する、ブロモドメインおよびＴＡＺジンクフィンガードメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減弱されている、変異藻類について開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＵＳ２０１４／０１６２３３０
【特許文献２】ＷＯ２０１１／１２７１１８
【特許文献３】ＷＯ２０１１／０９７２６１
【特許文献４】ＵＳ２０１２／０３２２１５７
【特許文献５】ＵＳ２０１０／０２５５５５０
【特許文献６】ＵＳ２０１７／００５８０３
【特許文献７】ＵＳ２０１７／０１２１７４２
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｒｅｎｔａｃｏｓｔｅら（（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１１０：１９７４８−１９７５３）
【非特許文献２】Ｄａｂｏｕｓｓｉら２０１４（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍ．５：３８８１）
【非特許文献３】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ８：１８５６−１８６８
【非特許文献４】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．１２：３８７−３９１
【非特許文献５】Ｓｉａｕｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１１  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：７
【非特許文献６】Ｄａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｃｅｌｌ  １３：３９２−４００
【非特許文献７】Ｂｏｙｌｅら（（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：１５８１１−１５８２５）
【発明の概要】
【００１０】
開示の概要
一態様では、本明細書で提供されるのは、テトラトリコペプチドリピート（ＴＰＲ）ドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減弱されている変異微生物であり、これは、変異微生物および対照微生物が同じ条件下で培養されるときなど、対照微生物よりも多く脂質を生成し、かつ／または対照微生物と比較して脂質への炭素分配の増加を呈する。いくつかの実施形態では、対照微生物は、野生型微生物である。いくつかの実施形態では、変異微生物は、対照微生物よりも少なくとも約５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、または少なくとも約２００％多く、脂肪酸メチルエステル誘導体化脂質（ＦＡＭＥ）を生成する。いくつかの実施形態では、ＴＰＲドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減弱されている変異微生物が、対照微生物よりも多くの脂質を生成する培養条件は、変異微生物および対照微生物の両方がバイオマスを生成する培養条件であり得る。例えば、培養条件は、対照微生物と比較して窒素が豊富であってもよく、対照微生物と比較して栄養素が豊富であってもよい。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異微生物は、対照微生物のＦＡＭＥ／ＴＯＣ比率よりも少なくとも約２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１２０％、少なくとも１４０％、少なくとも１６０％、少なくとも１８０％、少なくとも２００％、少なくとも２２０％、少なくとも２４０％、少なくとも２６０％、少なくとも２８０％、または少なくとも３００％高い（例えば、２０〜３００％高い）、ＦＡＭＥ対総有機炭素（ＴＯＣ）比率を呈する。いくつかの実施形態では、ＴＰＲドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減弱されている変異微生物が、対照微生物よりも高いＦＡＭＥ対ＴＯＣ比率を有する培養条件は、変異微生物および対照微生物の両方がバイオマスを生成する培養条件であり得る。例えば、培養条件は、対照微生物と比較して窒素が豊富であってもよく、対照微生物と比較して栄養素が豊富であってもよい。
【００１２】
上に示される遺伝子の「減弱された発現」とは、例えば、遺伝子によってコードされる機能性ポリペプチドが低下したレベルで（検出不可能なレベルであり得る）生成されるような、遺伝子の低下した発現が含まれる。減弱された発現にはまた、変異（欠失、短縮、またはフレームシフトなどされた）ポリペプチドが、非変異ポリペプチドと比較して機能が低下または変更されているように変異ポリペプチドが生成される場合の発現が含まれる。減弱された発現は、ポリペプチドをコードする遺伝子の変異の結果であってもよいか、またはポリペプチドをコードする遺伝子の発現を低下させるように設計された構築物、および例えばその遺伝子を標的とするＲＮＡｉ構築物などの発現もしくは送達の結果であってもよい。
【００１３】
いくつかの実施形態では、変異微生物は、古典的な変異誘発によって、または遺伝子操作技法によって生成される。いくつかの実施形態では、変異微生物は、ＧＡＦ（例えばＧＡＦ２）ドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子、またはその発現に影響を与える遺伝子に変異を有し得、その変異が、対照微生物における遺伝子の発現レベルと比較して、ＧＡＦドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルの減少を生じる。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、二重鎖破断を誘導する１つ以上の作用物質を使用して生成される。いくつかの実施例では、作用物質は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、および／またはＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＧＡＦドメインをコードする遺伝子の発現の減弱を生じる変異は、挿入変異である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、変異微生物は、任意の真核微生物であり、例示的な実施形態では、変異微生物は、不等毛類または藻類である。いくつかの実施形態では、変異微生物は、古典的な変異誘発によって、または遺伝子操作技法によって生成される。いくつかの実施形態では、変異微生物は、ＴＰＲドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子、またはその発現に影響を与える遺伝子に変異を有し、その変異が、対照微生物における遺伝子の発現と比較して、ＴＰＲドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子の発現の減少を生じる。いくつかの実施形態では、変異微生物は、ＴＰＲドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子に変異を有し、それにより低下したまたは軽微な活性を有する、短縮、内部欠失、および／またはフレームシフトされたポリペプチドを生じる。いくつかの実施形態では、変異微生物は、ＴＰＲドメイン含有ポリペプチドのアミノ酸配列を変更する１つ以上の点変異を有し、低下したまたは軽微な活性を有するポリペプチドを生じる。かかる点突然変異は、いくつかの実施形態では、ＴＰＲドメインにあり得る。様々な実施形態では、１つ以上の変異は、二重鎖破断を誘導する１つ以上の作用物質を使用して生成される。いくつかの実施例では、作用物質は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、および／またはＣａｓヌクレアーゼである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、変異微生物は、任意の真核微生物であり、例示的な実施形態では、変異微生物は、不等毛類または藻類である。いくつかの実施例例では、変異微生物は、珪藻、または真正眼点藻（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅ）種などの不等毛類藻類であり、例えば、アンフィプロラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、シクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、フラギラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）、フラギラロプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）、ナビキュラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）、またはタラシオシーラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）などの珪藻属の種であり得る。いくつかの例では、変異藻類は、クロリデラ（Ｃｈｌｏｒｉｄｅｌｌａ）、クロロブプトリス（Ｃｈｌｏｒｏｂｐｔｒｙｓ）、エリプソイディオン（Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｉｏｎ）、ユースティグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）、ゴニオクロリス（Ｇｏｎｉｏｃｈｌｏｒｉｓ）、モノドプシス（Ｍｏｎｏｄｏｐｓｉｓ）、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、シュードカラシオプシス（Ｐｓｅｕｄｏｃｈａｒａｃｉｏｐｓｉｓ）、シュードスタルアストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｒｕａｓｔｒｕｍ）、シュードテトラエドリエラ（Ｐｓｅｕｄｏｔｅｔｒａｅｄｒｉｅｌｌａ）、およびビスケリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）などの属に属するＥｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅなどのＥｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅである。
【００１６】
また、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される変異体を含むバイオマスである。さらに提供されるのは、本明細書で提供される変異体の抽出物である。抽出物は、限定されないが、膜、脂質、タンパク質、炭水化物、可溶性分子および不溶性分子を含む細胞構成要素の任意の組み合わせを含み得る、粗抽出物、または部分的に精製されたか、精製されたか、もしくは改良された抽出物であり得る。例えば、抽出物は、任意選択的に、限定されないが、選択的沈殿、高温もしくは低温処理、濾過、または遠心分離などの１つ以上の処理を施された抽出物であり得る。
【００１７】
本明細書に開示の変異微生物を使用して、脂質を生成する方法も含まれる。例えば、ＴＰＲドメインを含み、対照株よりも多くの脂質を生成するポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減弱されている本明細書で提供される変異微生物を、バッチ、半連続、または連続培養で培養して、１つ以上の脂質を生成することができる。方法は、培養物から（例えば、細胞、培養培地、または培養物全体から）１つ以上の脂質を単離することを含み得る。培養培地は、脂質生成期間中、窒素が豊富であってもよく、または窒素が制限されているか、もしくは窒素が欠乏していてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異微生物を培養して脂質を生成するために使用される培地は、実質的に唯一の窒素源として硝酸塩を含み得る。いくつかの実施例では、方法は、本明細書で提供される藻類変異体を光合成栄養条件下で培養することを含み得る。
【００１８】
ガイドＲＮＡを発現するためのＤＮＡ分子、脂質生成に影響を与えるＴＰＲドメイン含有タンパク質をコードする遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、および遺伝子操作技法を使用して変異微生物を生成するための核酸構築物も含まれる。ＴＲＰ含有遺伝子、例えば配列番号１に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、ＴＰＲドメインを含む遺伝子のコード領域に対する相同性を有してもよく、または５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、もしくは５’ＵＴＲの上流の遺伝子領域に対する相同性を有してもよい。
【００１９】
本開示のこれらおよび他の目的および特色は、添付の図面と併せて次の詳細な説明を閲読すると、より完全に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）遺伝子座Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８の遺伝子によってコードされるＴＰＲ−６０２９タンパク質の概略図である（配列番号４および配列番号２はそれぞれ遺伝子およびタンパク質を表す）。四角は、ＴＰＲドメイン（配列番号１）およびＤＵＦ４４７０ドメイン（配列番号３）の位置を表す。矢印は、ノックアウトＧＥ−１５３６０を生成するためにＣＲＩＳＰＲガイド配列の標的となる位置を指している。図は縮尺通りではない。
【図２】Ｃａｓ９をＮ．ｇａｄｉｔａｎａ野生型株ＷＴ−３７３０に導入して、Ｃａｓ９エディターラインＧＥ−１３０３８を生成するために使用される、ベクターｐＳＧＥ−６２０６の略図である。
【図３】親対照株ＧＥ−１３０３８（Ｃａｓ９母株）と比較した、Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ株ＧＥ−１５３６０（Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座でのＴＰＲ−６０２９遺伝子のノックアウト）での、７日間にわたるバッチアッセイでの日毎の平均ＦＡＭＥ生産性を示すグラフである。「Ａ」および「Ｂ」は、２つの培養物の複製物を指す。
【図４】ＴＰＲ−６０２９ノックアウト変異体および親Ｃａｓ９＋株ＧＥ−１３０３８を、硝酸塩のみを含む培地、ならびにアンモニウムのみ、または硝酸塩とアンモニウムのいずれかを含む培地でのバッチアッセイで増殖させたＮ．ｇａｄｉｔａｎａ培養物に存在する、ＦＡＭＥの日量を示すグラフである。
【図５】半連続アッセイにおける、野生型株ＷＴ−３７３０と比較したＮ．ｇａｄｉｔａｎａ  ＴＰＲ−６０２９ノックアウト変異体ＧＥ−１５３６０による日毎のＦＡＭＥ生成を示す。ＴＰＲノックアウトは、８日間のアッセイの各日に、より高いレベルのＦＡＭＥの生成を示した。株ＧＥ−１５５４５およびＧＥ１５５２５は、ＴＰＲ−６０２９遺伝子とは無関係の改変を有する遺伝子操作された株であった。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
定義
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含めて本出願が優先されるであろう。文脈によって別段必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００２２】
すべての見出しは閲読者の便宜のためのものであり、いかなる場合にも本発明を限定しない。本発明の態様または実施形態への言及は、記載の態様が、本発明の他の説明された態様または本発明の他の態様の特色と組み合わせることができないことを必ずしも示すものではない。本明細書で言及されるすべての出版物、特許、および他の参考文献は、あたかも各個々の出版物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、あらゆる目的でその全体が参照により組み込まれる。
【００２３】
本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの語句で使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」、および「Ｂ」を含むことが意図される。
【００２４】
「約」、「およそ」などの用語は、数値または範囲のリストの前にあると、あたかもリストまたは範囲の各個々の値よりもその用語が直ちに優先されるかのように、リストまたは範囲の各個々の値を独立して指す。これらの用語は、その値と同じ値が、まさにその値であるか、それに近いか、または同様であること指すことを意味する。「任意選択的な」または「任意選択的に」は、後で説明する事象または状況が発生してもしなくてもよく、説明に事象または状況が発生する場合と発生しない場合とが含まれることを意味する。例えば、任意選択的に組成物が組み合わせを含むことができるという語句は、組成物が異なる分子の組み合わせを含み得るか、または説明が組み合わせと組み合わせの不在との両方を含むような組み合わせ（すなわち、個々の一員の組み合わせ）を含まなくてもよいことを意味する。本明細書では、範囲は、約１つの特定の値から、および／または約別の特定の値までとして表現され得る。かかる範囲が表現される場合、別の態様は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表現される場合、約またはおよそという先行詞を使用することにより、特定の値が別の態様を形成することが理解されるであろう。さらに、各範囲の端点は、他の端点との関係、および他の端点とは無関係の両方の場合でも重要であることが理解されるであろう。加えて、範囲（例えば、９０〜１００％）は、範囲自体、ならびにあたかも各値が個々に列挙されたかのように範囲内の各独立した値を含むことを意味する。本出願内で提供されるすべての範囲は、別段具体的に示されない限り、範囲の上限および下限の値を含む。「組み合わせられた（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）」または「組み合わせで（ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」または「組み合わせで（ｉｎ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ）」という用語は、例えば、時間および／または物理性に関して、一緒に施与される剤の物理的組み合わせ、または２つ以上の剤の同時使用を指すことができる。
【００２５】
意図された意味についてさらなる説明のない、「実質的に同じ」または「実質的に同一」または「約」という特性への言及は、特性が１０％以内、好ましくは５％以内であり、参照値の２．５％以内であり得ることを意味することを意図する。特定の文脈における「実質的に」の意図された意味が示されていない場合、この用語は、本発明の主題の文脈において重要であると見なされる特徴にとって重要ではなく無関係な逸脱を含むために使用される。
【００２６】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドをコードする核酸分子（典型的にはＤＮＡであるが、任意選択的にＲＮＡ）または発現したＲＮＡの任意のセグメントを指すために広義に使用される。したがって、遺伝子は、発現したＲＮＡをコードする配列を含む（これは、ポリペプチドコード配列、または、例えばリボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、リボザイムなどの機能性ＲＮＡを含み得る）。遺伝子は、それらの発現に必要なまたは影響を与える調節配列、ならびに例えば、イントロン配列、５’または３’非翻訳配列などの、天然の状態のタンパク質またはＲＮＡコード配列に関連する配列をさらに含み得る。いくつかの実施例では、「遺伝子」は、イントロンを含んでも含まなくてもよい、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のタンパク質をコードする部分のみを指し得る。遺伝子は、好ましくは５０ヌクレオチド超の長さ、より好ましくは１００ヌクレオチド超の長さであり、例えば、１００ヌクレオチド〜１００，０００ヌクレオチドの長さ、または約２００ヌクレオチド〜約５０，０００ヌクレオチドの長さ、または例えば約２００ヌクレオチド〜約２５，０００ヌクレオチドの長さなどの、５０ヌクレオチド〜５００，０００ヌクレオチドの長さであり得る。遺伝子は、目的の源からのクローニング、または既知もしくは予測された配列情報からの合成を含む、多様な源から得ることができる。
【００２７】
「核酸」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のセグメントを指し、改変された骨格を有する核酸（例えば、ペプチド核酸、ロックド核酸、および他の改変核酸または核酸類似体（例えば、Ｅｆｉｍｏｖ  ａｎｄ  Ｃｈａｋｈｍａｋｈｃｈｅｖａ（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２８８：１４７−１６３））、または改変もしくは非自然発生核酸塩基も含む。核酸分子は、二重鎖、部分的な二重鎖、または単一鎖であり得、遺伝子またはその一部分を含む単一鎖核酸分子は、コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。核酸の配列はＤＮＡの形態で示され得るが、当業者は、対応するＲＮＡ配列が、チミンをウラシルに置き換えた、すなわち「ｔ」を「ｕ」に置き換えた同様の配列を有するであろうことを認識する。
【００２８】
核酸分子は、示された源に「由来し」得、示された源からの核酸セグメントの（全体的または部分的な）単離物を含む。核酸分子はまた、例えば、示されたポリヌクレオチド源からの、または例えば生物の種であり得る示されたポリヌクレオチド源に関連する配列に基づく、直接クローニング、ＰＣＲ増幅、または人工合成によって示された源に由来し得る。特定の源または種に由来する遺伝子または核酸分子はまた、源の核酸分子と比較して、配列改変を有する遺伝子または核酸分子を含む。例えば、源（例えば、特定の参照遺伝子）に由来する遺伝子または核酸分子は、意図せずにまたは意図的に導入された、源の遺伝子または核酸分子と比較して１つ以上の変異を含み得、置換、欠失、または挿入を含む１つ以上の変異が意図的に導入される場合、配列変更は、細胞もしくは核酸のランダムなもしくは標的化された変異によって、増幅もしくは他の遺伝子合成もしくは分子生物学技法によって、または化学的合成によって、またはそれらの任意の組み合わせによって導入することができる。機能性ＲＮＡまたはポリペプチドをコードする参照遺伝子または核酸分子に由来する遺伝子または核酸分子は、参照もしくは源の機能性ＲＮＡもしくはポリペプチド、またはそれらの機能性断片と少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する機能性ＲＮＡまたはポリペプチドをコードすることができる。例えば、機能性ＲＮＡまたはポリペプチドをコードする参照遺伝子または核酸分子に由来する遺伝子または核酸分子は、参照もしくは源の機能性ＲＮＡもしくはポリペプチド、またはそれらの機能性断片と少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する機能性ＲＮＡまたはポリペプチドをコードすることができる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「単離された」核酸またはタンパク質は、その自然環境、または核酸もしくはタンパク質が自然に存在する状況から取り出されている。例えば、単離されたタンパク質または核酸分子は、その天然または自然環境では関連している細胞または生物から取り出されている。単離された核酸またはタンパク質は、場合によっては、部分的にまたは実質的に精製され得るが、単離のために特定のレベルの精製は必要とされない。したがって、例えば、単離された核酸分子は、染色体、ゲノム、またはエピソームから切り出された、自然では組み込まれている核酸配列であり得る。
【００３０】
「精製された」核酸分子もしくはヌクレオチド配列、またはタンパク質もしくはポリペプチド配列は、細胞物質および細胞構成要素を実質的に含まない。精製された核酸分子またはタンパク質は、例えば、緩衝液または溶媒以外の化学物質を実質的に含まなくてもよい。「実質的に含まない」は、新規の核酸分子以外の他の構成要素が検出不可能であることを意味することを意図しない。
【００３１】
「自然発生」および「野生型」という用語は、自然発生する集団で最も頻繁に観察され、したがって「野生型」と任意に指定される、自然に見られる形態を指す。例えば、自然発生または野生型の核酸分子、ヌクレオチド配列、またはタンパク質は、天然の源に存在し得、そこから単離され得、人間の操作によって意図的に改変されていない。「野生型」はまた、１つ以上の特定のヌクレオチド位置における配列、または１つ以上の特定のコドン位置における配列、または１つ以上の特定のアミノ酸位置における配列を指し得る。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「減弱された」とは、量、程度、強度、または強さの低下を意味する。減弱された遺伝子発現は、問題の遺伝子の転写の、またはコードされるタンパク質の翻訳、折りたたみ、またはアセンブリの有意に低下した量および／または比率を指し得る。非限定的な例として、減弱された遺伝子は、完全な機能性オープンリーディングフレームをコードしない、または遺伝子調節配列の変更もしくは破壊に起因して発現が減少された、変異もしくは破壊されている遺伝子（例えば、部分的または完全な欠失、短縮、フレームシフト、または挿入変異によって破壊された遺伝子）であり得る。減弱された遺伝子はまた、例えば、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、またはリボザイムなどの、遺伝子の発現を低下させる構築物によって標的とされる遺伝子であり得る。減弱された遺伝子発現は、排除された、例えば有意でないかまたは検出不可能である量まで低下した遺伝子発現であり得る。減弱された遺伝子発現はまた、完全に機能性ではないかまたは非機能性のＲＮＡまたはタンパク質を生じる遺伝子発現であり得、例えば、減弱された遺伝子発現は、短縮型ＲＮＡおよび／またはポリペプチドを生じる遺伝子発現であり得る。
【００３３】
「外因性核酸分子」または「外因性遺伝子」は、細胞に導入されている（「形質転換を起こす」）核酸分子または遺伝子を指す。形質転換された細胞は、組換え細胞と称され得、その中に追加の外因性遺伝子（複数可）が導入され得る。核酸分子で形質転換された細胞の子孫もまた、それが外因性核酸分子を受け継いでいる場合、「形質転換された」と称される。外因性遺伝子または核酸分子は、形質転換された細胞と比較して、異なる（したがって「異種の」）種または同じ（したがって「相同の」）種に由来し得る。「内因性」核酸分子、遺伝子、またはタンパク質は、それが宿主で発生するか、または宿主によって自然に生成される、天然の核酸分子、遺伝子、またはタンパク質である。
【００３４】
「天然の」という用語は、本明細書では、宿主で自然発生する核酸配列またはアミノ酸配列を指すために使用される。「非天然の」という用語は、本明細書では、宿主で自然発生しない核酸配列またはアミノ酸配列を指すために使用される。したがって、「非天然」核酸分子は、宿主細胞に自然には存在しない核酸分子であり、例えば、非天然核酸分子は、それが導入される宿主細胞または微生物には外因性であり、宿主細胞または微生物と比較して異種であり得る。加えて、細胞から取り出され、実験室で操作を施され、ゲノムの配列または位置が非操作生物内のその位置と比較して異なるように、宿主細胞に導入または再導入された（すなわち、非形質転換生物では並置されていないかまたは操作可能に連結されていない配列と、並置されているかまたは操作可能に連結されている）核酸配列またはアミノ酸配列は、「非天然」と見なされる。非天然遺伝子にはまた、宿主ゲノムに組換えられている１つ以上の異種調節配列に操作可能に連結された、宿主微生物には内因性の遺伝子も含まれる。
【００３５】
「組換え」または「操作された」核酸分子は、ヒトの操作を通じて変更されている核酸分子である。非限定的な例として、組換え核酸分子には、（１）例えば、化学的もしくは酵素的技法を使用して（例えば、化学的核酸合成の使用によって、または核酸分子の複製、重合、消化（エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる）、ライゲーション、逆転写、転写、塩基改変（例えば、メチル化を含む）、組み込みもしくは組換え（相同および部位特異的組換えを含む）のための酵素の使用によって）インビトロで部分的もしくは完全に合成もしくは改変されている、（２）自然には結合していない、結合されたヌクレオチド配列を含む、（３）自然発生する核酸分子配列と比較して１つ以上のヌクレオチドを欠くように、分子クローニング技法を使用して操作されている、かつ／または４）自然発生する核酸配列と比較して１つ以上の配列変化もしくは再配置を有するように分子クローニング技法を使用して操作されている、任意の核酸分子が含まれる。非限定的な例としては、ｃＤＮＡは、インビトロポリメラーゼ反応（複数可）によって生成された、またはリンカーが結合された、またはクローニングベクターもしくは発現ベクターなどのベクターに組み込まれている任意の核酸分子であるので、組換えＤＮＡ分子である。
【００３６】
本明細書で使用される「組換えタンパク質」という用語は、アミノ酸が野生型タンパク質のものと異なるかどうかに関係なく、遺伝子操作によって生成されたタンパク質を指す。
【００３７】
生物に適用されるとき、組換え、操作、または遺伝子操作という用語には、異種または外因性の組換え核酸配列（例えば、非天然核酸配列）を生物に導入することによって操作されている生物を指し、遺伝子ノックアウト、標的変異、遺伝子置き換え、およびプロモーター置き換え、生物への合成遺伝子または核酸配列の欠失、破壊、または挿入、ならびに導入が含まれる。すなわち、組換え、操作、または遺伝子操作とは、ヒトの介入によって変更されている生物を指す。組換えまたは遺伝子操作された生物はまた、遺伝子「ノックダウン」のための構築物が導入されている生物であり得る。かかる構築物には、限定されないが、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、およびリボザイム構築物が含まれる。また、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮの活性、またはＣａｓ／ＣＲＩＳＰＲシステムによってゲノムが変更されている生物も含まれる。外因性または組換え核酸分子は、組換え／遺伝子操作された生物のゲノムに組み込むことができ、または他の場合では、宿主ゲノムに組み込まれなくてもよい。本明細書で使用される場合、「組換え微生物」または「組換え宿主細胞」には、本発明の組換え微生物の子孫または誘導体が含まれる。変異または環境の影響のいずれかに起因して、後継世代においてある特定の改変が発生し得るので、かかる子孫または誘導体は、実際には親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書で使用される用語の範囲内に依然含まれる。
【００３８】
「プロモーター」という用語は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することが可能な核酸配列を指す。プロモーターには、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで、転写の開始に必要な最小限の数の塩基または要素が含まれる。プロモーターは、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を司るタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）を含み得る。真核生物プロモーターは、常にではないが、多くの場合「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。原核生物プロモーターは、−１０および−３５の原核生物プロモーターコンセンサス配列を含有し得る。多様な異なる源からの構成的、誘導性、および抑制性プロモーターを含む多数のプロモーターが当技術分野では周知である。代表的な源には、例えば、藻類、ウイルス、哺乳動物、昆虫、植物、酵母、および細菌の細胞型が含まれ、これらの源からの好適なプロモーターは容易に入手可能であるか、またはオンラインで公開され入手可能な配列に基づいて、もしくは例えば、ＡＴＣＣなどの寄託機関、ならびに他の商業的もしくは個人の源から、合成して作製することができる。プロモーターは、単方向（一方向に転写を開始する）または双方向（いずれかの方向に転写を開始する）であり得る。プロモーターは、構成的プロモーター、抑制性プロモーター、または誘導性プロモーターであり得る。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する遺伝子の近位プロモーターに加えて、遺伝子の転写開始部位の、約１ｋｂ、約２ｋｂ、約３ｋｂ、約４ｋｂ、約５ｋｂ以上の範囲内にあり得る遺伝子の上流の追加の配列を含み得、追加の配列は、下流の遺伝子の転写速度、および任意選択的に、発生的、環境的、または生化学的（例えば、代謝）条件に対するプロモーターの応答性に影響を与えることができる。
【００３９】
用語「異種」は、ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチド、または酵素に関して使用されるとき、宿主生物種以外の源からの、または宿主生物種以外の源に由来するポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチド、または酵素を指す。対照的に、「相同の」ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチド、または酵素は、宿主生物種に由来するポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチド、または酵素を表すために本明細書で使用される。遺伝子調節配列または遺伝子配列を維持または操作するために使用される補助核酸配列（例えば、プロモーター、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ポリＡ付加配列、イントロン配列、スプライス部位、リボソーム結合部位、内部リボソーム進入配列、ゲノム相同領域、組換え部位など）について言及するとき、「異種」とは、調節または補助核酸配列が、構築物、ゲノム、染色体、またはエピソームで並置されている遺伝子と、調節配列または補助配列が自然には関連していないことを意味する。したがって、その自然の状態では（すなわち、非遺伝子操作生物のゲノムでは）操作可能に連結されていない遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターは、本明細書では、プロモーターが、連結される遺伝子と同じ種（または場合によっては同じ生物）に由来する場合でさえも、「異種プロモーター」と称される。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することを意図し、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線状に連結されたモノマー（アミノ酸）で構成されている分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つ以上の鎖を指し、生成物の特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の１つ以上の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のうちのいずれかの代わりに、またはこれらと交換可能に使用することができる。
【００４１】
遺伝子およびタンパク質の受託番号は、通常、遺伝子または種の名称の後に括弧で囲まれて提供され、アメリカ国立衛生研究所によって管理される国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で公開され入手可能な配列記録の独自の識別子である。「ＧｅｎＩｎｆｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ」（ＧＩ）配列識別番号は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に固有である。配列が何らかの方式で変化している場合、新しいＧＩ番号が割り当てられる。特定のＧｅｎＢａｎｋの記録に表示される配列の様々なＧＩ番号、バージョン番号、および更新日を追跡するのに、配列改訂履歴ツールが利用可能である。受託番号およびＧＩ番号に基づく核酸もしくは遺伝子配列またはタンパク質配列の検索および入手は、例えば、細胞生物学、生化学、分子生物学、および分子遺伝学の分野で周知である。遺伝子座識別子は、Ｃｏｒｔｅｇｇｉａｎｉ  Ｃａｒｐｉｎｅｌｌｉらの（２０１４）Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ  ７：３２３−３３５に記載され、ＣＲＩＢＩ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓゲノムポータルで、オンラインで入手可能な公開されたゲノムを指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチド配列に関する「同一性パーセント」または「相同性」という用語は、配列を最大パーセントの同一性に整列させ、最大パーセントの相同性を達成するように必要に応じてギャップを導入した後の、既知のポリペプチドと同一である候補配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。ポリペプチド配列では、Ｎ末端またはＣ末端の挿入または欠失は、相同性に影響を与えると解釈されるものではなく、ポリペプチド配列における約６５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、または約１０未満のアミノ酸残基の内部欠失および／または挿入は、比較されるアミノ酸（タンパク質）配列の相同性に影響を与えると解釈されるものではない。核酸配列では、５’末端または３’末端の挿入または欠失は、相同性に影響を与えると解釈されるものではなく、ポリペプチド配列における約２００未満、約１８０未満、約１５０未満、約１２０未満、約１００未満、約９０未満、約８０未満、約７０未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、または約３０未満のヌクレオチドの内部欠失および／または挿入は、比較される核酸配列の相同性に影響を与えると解釈されるものではない。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列レベルでの相同性または同一性は、配列類似性検索用に調整されている、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２、およびＫａｒｌｉｎ（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，２２６４−２２６８）のプログラムによって採用されるアルゴリズムを使用する、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）分析によって決定することができる。ＢＬＡＳＴプログラムによって使用されるアプローチは、最初に、同様のセグメントを、クエリー配列とデータベース配列との間のギャップの有無で検討し、次いで、識別されたすべて一致の統計的有意性を評価し、最後に事前に選択された有意性の閾値を満たす、一致するもののみを要約する。配列データベースの類似性検索における基本的な問題の考察については、Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６，１１９−１２９を参照されたい。ヒストグラム、説明、アライメント、期待値（すなわちデータベース配列に対する一致を報告するための統計的有意性閾値）、カットオフ、マトリックス、およびフィルター（低複雑性）の検索パラメータは、デフォルト設定にしてもよい。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘによって使用されるデフォルトのスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，１０９１５−１０９１９）であり、８５超の（ヌクレオチド塩基またはアミノ酸）長さのクエリー配列ではこれが推奨される。
【００４３】
ヌクレオチド配列を比較するために設計されたｂｌａｓｔｎでは、スコアリングマトリックスは、Ｍ（すなわち、一致する残基のペアのリワードスコア）対Ｎ（すなわち、一致しない残基のペナルティスコア）の比によって設定され、ＭおよびＮのデフォルト値は、それぞれ＋５および−４であり得る。４つのｂｌａｓｔｎパラメータは、次のように調節することができる：Ｑ＝１０（ギャップ作製ペナルティ）、Ｒ＝１０（ギャップ拡張ペナルティ）、ｗｉｎｋ＝１（クエリーに沿ってすべてのｗｉｎｋ番目の位置で単語ヒットを生成する）、およびｇａｐｗ＝１６（ギャップのあるアライメントが生成されるウィンドウ幅を設定する）。アミノ酸配列の比較のための同等のＢｌａｓｔｐパラメータ設定は、Ｑ＝９、Ｒ＝２、ｗｉｎｋ＝１、およびｇａｐｗ＝３２であってもよい。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で利用可能な配列間のベストフィット比較では、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ作製ペナルティ）、およびＬＥＮ＝３（ギャップ拡張ペナルティ）を使用してもよく、タンパク質比較における同等の設定は、ＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２であってもよい。
【００４４】
したがって、本発明のポリペプチドまたは核酸配列について言及するとき、完全長のポリペプチドもしくは核酸配列との、またはタンパク質全体のうちの少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０（例えば、少なくとも１００）以上のアミノ酸残基の連続的配列を含むそれらの断片との、少なくとも約５０％の配列同一性、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％（例えば、少なくとも５０％、７５％、または９０％のうちのいずれか）の配列同一性が含まれ；例えば、挿入および置換を含有する開示の配列（複数可）に対してＮ末端および／もしくはＣ末端にならびに／またはその中に、少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されている、そのような配列のバリアントが含まれる。考慮されるバリアントは、加えてまたは代替的に、例えば、相同組換えもしくは部位特異的もしくはＰＣＲ変異誘発による所定の変異を含有するもの、ならびに限定されないが本明細書に記載のものを含む他の種の対応するポリペプチドもしくは核酸、挿入および置換を含有するポリペプチドもしくは核酸のファミリーの対立遺伝子もしくは他の自然発生するバリアント、ならびに／または挿入および置換を含有する自然発生するアミノ酸以外の部分（例えば、酵素などの検出可能な部分）で、ポリペプチドが置換、化学的、酵素的、もしくは他の適切な手段によって、共有結合的に改変されている誘導体を含み得る。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」または「保存的変異」という語句は、共通の特性を有する別のアミノ酸による、１つのアミノ酸の置き換えを指す。個々のアミノ酸間の共通の特性を定義する機能的な方式は、相同の生物の対応するタンパク質間のアミノ酸の変化の正規化頻度を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ（１９７９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。かかる分析によれば、グループ内のアミノ酸が優先的に互いに交換され、したがって全体的なタンパク質構造への影響が互いに最も似ているアミノ酸のグループを、定義することができる（Ｓｃｈｕｌｚ（１９７９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。この様式で定義されたアミノ酸グループの例には、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓを含む「荷電／極性グループ」、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐを含む「芳香族または環状グループ」、ならびにＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｙｓを含む「脂肪族グループ」が含まれ得る。各グループ内では、サブグループも識別することができる。例えば、荷電／極性アミノ酸グループは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓを含む「正荷電サブグループ」、ＧｌｕおよびＡｓｐを含む「負荷電サブグループ」、ならびにＡｓｎおよびＧｌｎを含む「極性サブグループ」を含むサブグループに細分化することができる別の実施例では、芳香族または環状グループは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、およびＴｒｐを含む「窒素環サブグループ」、ならびにＰｈｅおよびＴｙｒを含む「フェニルサブグループ」を含むサブグループに細分化することができる。別のさらなる実施例では、脂肪族グループは、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅを含む「大きな脂肪族の非極性サブグループ」、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓを含む「脂肪族のわずかに極性サブグループ」、ならびにＧｌｙおよびＡｌａを含む「小残基サブグループ」を含むサブグループに細分化することができる。保存的変異の例には、限定されないが、正の電荷を維持することができるようにＡｒｇのＬｙｓへのまたはその逆、負の電荷を維持することができるようにＡｓｐのＧｌｕへのまたはその逆、遊離−ＯＨを維持することできるようにＴｈｒのＳｅｒへのまたはその逆、遊離−ＮＨ２を維持することができるようにＡｓｎのＧｌｎへのまたはその逆、などの上のサブグループ内のアミノ酸のアミノ酸置換が含まれる。「保存的バリアント」は、参照ポリペプチド（例えば、その配列が出版物もしくは配列データベースに開示されているポリペプチド、またはその配列が核酸シーケンシングによって決定されているポリペプチド）のうちの１つ以上のアミノ酸を、例えば、上で表現されたのと同じアミノ酸グループまたはサブグループに属する共通の特性を有するアミノ酸で置き換えるように置換されている、１つ以上のアミノ酸を含むポリペプチドである。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「発現」には、少なくともＲＮＡ生成のレベルでの遺伝子の発現が含まれ、「発現生成物」には、得られる生成物、例えば、発現した遺伝子のポリペプチドまたは機能性ＲＮＡ（例えば、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイムなど）が含まれる。「発現の増加」という用語は、ｍＲＮＡ生成の増加および／またはポリペプチド発現の増加を促進するための遺伝子発現の変更が含まれる。（遺伝子生成物の）「生成の増加」には、ポリペプチドの天然生成または酵素活性と比較して、ポリペプチド発現の量、ポリペプチドの酵素活性のレベル、または両方の組み合わせの増加が含まれる。
【００４７】
本発明のいくつかの態様は、特定のポリヌクレオチド配列の発現の部分的、実質的、または完全な欠失、サイレンシング、不活性化、または下方制御を含む。酵素の活性など、それらがコードするポリペプチドによって実施される活性に影響を与えるために、遺伝子を、部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活性化してもよいか、またはそれらの発現を下方制御してもよい。遺伝子の機能および／または発現を破壊する核酸配列の挿入（例えば、ウイルス挿入、トランスポゾン変異誘発、メガヌクレアーゼ操作、相同組換え、または当技術分野で既知の他の方法）によって、遺伝子を、部分的、実質的、または完全に欠失、サイレンシング、不活性化、または下方制御してもよい。「排除する」、「排除」、および「ノックアウト」という用語は、「欠失」、「部分的な欠失」、「実質的な欠失」、または「完全な欠失」という用語と交換可能に使用することができる。ある特定の実施形態では、ｃａｓ／ＣＲＩＳＰＲシステムを使用する、部位特異的相同組換えまたは標的組み込みまたは変異によって目的の微生物を操作して、目的の特定の遺伝子をノックアウトすることができる。さらに他の実施形態では、ｃａｓ／ＣＲＩＳＰＲシステム、ＲＮＡｉ、またはアンチセンスＤＮＡ（ａｓＤＮＡ）構築物を使用する、遺伝子調節領域への標的挿入または変異を使用して、目的の特定の遺伝子を部分的、実質的、または完全にサイレンシング、不活性化、または下方制御してもよい。
【００４８】
ある特定の核酸分子または特定のポリヌクレオチド配列のこれらの挿入、欠失、または他の改変は、「遺伝子改変（複数可）」または「形質転換（複数可）」を包含すると理解することができるので、得られた微生物株または宿主細胞が「遺伝子改変された」、「遺伝子操作された」または「形質転換された」と理解することができる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「上方制御された」または「上方制御」は、上方制御されていない同一遺伝子または酵素の発現または活性と比較した、目的の遺伝子または核酸分子の発現または酵素の活性の増加、例えば、遺伝子発現または酵素活性の増加を含む。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「下方制御された」または「下方制御」は、下方制御されていない同一遺伝子または酵素の発現または活性と比較した、目的の遺伝子または核酸分子の発現または酵素の活性の減少、例えば、遺伝子発現または酵素活性の減少を含む。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「変異体」は、例えば、ガンマ線照射、ＵＶ、または化学的変異原を使用する、古典的な変異誘発の結果である、遺伝子に変異を有する生物を指す。本明細書で使用される「変異体」はまた、その多くが、非限定的な例として、異なる時間的、生物学的、もしくは環境調節下での、および／もしくは自然発生するものとは異なる程度までの、遺伝子の発現、ならびに／または組換え細胞における自然発現しない遺伝子の発現、を含む過剰発現、ノックアウトおよびノックインを含む相同組換え（例えば、野生型ポリペプチドよりも大きいまたは小さい活性を有するポリペプチドおよび／またはドミナントネガティブポリペプチドをコードする遺伝子を用いる遺伝子置き換え）、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムなどを介した遺伝子減弱、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、および／もしくはＣＲＩＳＰＲ技術などを使用するゲノム操作を含む遺伝子操作の結果として、遺伝子の構造または発現が変更されている組換え細胞を指す。変異体はまた、生物、組織、もしくは細胞を核酸構築物で形質転換することによるランダムもしくは特異挿入による変異誘発によって、および／またはトランスポゾン変異誘発によって、生成されてもよい。したがって、変異体は、自然発生する生物ではない。目的の変異体生物は、典型的には、変異を欠く対応する野生型または前駆株のものとは異なる表現型を有し、この表現型は、増殖アッセイ、生成物分析、光合成特性、生化学アッセイなどによって評価することができるであろう。遺伝子について言及するとき、「変異体」とは、その遺伝子が、天然または野生型遺伝子と比較して少なくとも１つの塩基（ヌクレオチド）の変化、欠失、または挿入を有することを意味する。変異（１つ以上のヌクレオチドの変化、欠失、および／または挿入）は、遺伝子のコード領域にあってもよいか、またはイントロン、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、もしくはプロモーター領域、例えば翻訳開始部位の約１ｋｂ、約２ｋｂ、または約３ｋｂ、約４ｋｂ、または約５ｋｂ内にあってもよい。例えば、本明細書に開示の遺伝子の発現が減弱されている変異体は、非限定的な例では、既知のもしくは推定される転写開始部位の２ｋｂ以内、１．５ｋｂ以内、１ｋｂ以内、もしくは０．５ｋｂ以内、または翻訳開始部位の３ｋｂ以内、２．５ｋｂ以内、２ｋｂ以内、１．５ｋｂ以内、１ｋｂ以内、もしくは０．５ｋｂ以内など転写開始部位の遺伝子５’の領域への、１つ以上の核酸塩基の変化、および／または１つ以上の核酸塩基の欠失、および／または１つ以上の核酸塩基の挿入であり得る変異を有し得る。非限定的な例として、変異体遺伝子は、遺伝子の発現を増加または減少させることができるプロモーター領域内に変異、挿入、および／もしくは欠失を有する遺伝子であってもよいか、非機能性タンパク質、短縮型タンパク質、ドミナントネガティブタンパク質、および／もしくはタンパク質なしの生成を生じる欠失を有する遺伝子であってもよく、かつ／またはコードされたタンパク質のアミノ酸に変化をもたらすか、もしくは遺伝子転写物の異常なスプライシングを生じる１つ以上の点変異を有する遺伝子などであってもよい。
【００５２】
ポリペプチドの保存ドメインには、「ｃｄ」（保存ドメイン）データベース、ＣＯＧデータベース、ＳＭＡＲＴデータベース、ＰＲＫデータベース、ＴＩＧＲＦＡＭデータベース、または当技術分野で既知の他のデータベースで識別されたドメインが含まれる。アメリカ国立衛生研究所が後援する国立生物工学情報センターのウェブサイトは、保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）を含み、これについて、「古来のドメインの良好にアノテーションされた多数の配列アライメントモデルおよび完全長タンパク質のコレクションからなるタンパク質アノテーション資源。これらは、ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴを介してタンパク質配列の保存ドメインを迅速に識別するための位置特異的スコアマトリックス（ＰＳＳＭ）として利用可能であり、ドメイン境界を明示的に定義し、配列／構造／機能の関係性、ならびに多数の外部ソース（Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、ＣＯＧ、ＰＲＫ、ＴＩＧＲＦＡＭ）から取り込んだドメインモデルに関する見識を提供する情報を使用する、ＮＣＢＩが収集したドメインを含む。」ＮＣＢＩのｃｄｄデータベースで、配列を保存ドメインで検索することができる。Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４３（Ｄ）２２２−２２６を参照されたい。
【００５３】
「Ｐｆａｍ」という用語は、Ｐｆａｍコンソーシアムによって維持され、スポンサー付きのいくつかの世界的ウェブサイトで利用可能な、タンパク質ドメインおよびタンパク質ファミリーの大規模なコレクションを指す。Ｐｆａｍの最新リリースは、Ｐｆａｍ３１．０（２０１７年３月）である。Ｐｆａｍドメインおよびファミリーは、多数の配列アライメントおよび隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を使用して識別される。Ｐｆａｍ−Ａファミリーまたはドメイン割り当ては、タンパク質ファミリーの代表的な一員を使用して収集されたシードアライメント（ｓｅｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）によって生成された高品質の割り当てであり、シードアライメントに基づいて隠れマルコフモデルをプロファイルする。（別段明記されない限り、クエリータンパク質のＰｆａｍドメインまたはファミリーへの一致は、Ｐｆａｍ−Ａの一致である。）次いで、ファミリーに属するすべての識別された配列を使用して、ファミリーの完全アライメントを自動的に生成する（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６，３２０−３２２、Ｂａｔｅｍａｎ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６，２６３−２６６、Ｂａｔｅｍａｎ（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２，Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１３８−Ｄ１４１、Ｆｉｎｎ（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ  ３４，Ｄ２４７−２５１、Ｆｉｎｎ（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ  ３８，Ｄ２１１−２２２）。例えば、上の関連するウェブサイトのうちのいずれかを使用してＰｆａｍデータベースにアクセスすることによって、ＨＭＭＥＲ相同性検索ソフトウェア（例えば、オンラインで利用可能なＨＭＭＥＲ２、ＨＭＭＥＲ３、またはそれ以上のバージョン）を使用して、ＨＭＭでタンパク質配列を検索してもよい。クエリータンパク質をｐｆａｍファミリーである（または特定のＰｆａｍドメインを有する）として識別する重要な一致は、ビットスコアがＰｆａｍドメインの収集閾値以上であるものである。期待値（ｅ値）はまた、クエリータンパク質をＰｆａｍに含めるための、またはクエリータンパク質が特定のＰｆａｍドメインを有するかどうかを決定するための基準としても使用することができ、低いｅ値（１．０よりもかなり低い、例えば０．１未満または０．０１以下）は、一致が偶然に起因する確率が低いことを表す。
【００５４】
「ｃＤＮＡ」は、ＤＮＡ分子が、ｍＲＮＡ配列中にあるウリジンすなわちＵの代わりに、核酸塩基チミンすなわちＴを置換することを除いて、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部分を含むＤＮＡ分子である。ｃＤＮＡは、二重鎖、部分的な二重鎖、または単一鎖であり得、例えば、ｍＲＮＡ配列の相補体であり得る。好ましい実施例では、ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡが対応する自然発生する遺伝子（すなわち、生物のゲノムに発生する遺伝子）で発生する１つ以上のイントロン配列を含まない。例えば、ｃＤＮＡは、自然発生する遺伝子のイントロンの下流の配列に並置される、自然発生する遺伝子のイントロンの上流からの配列を有し得、自然のＤＮＡ分子では、上流および下流の配列は並置されない（すなわち、自然発生する遺伝子では、配列は並置されない）。ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡ分子の逆転写によって生成することができるか、または例えば、ｃＤＮＡ配列の知識に基づいて、化学的合成によって、および／もしくは１つ以上の制限酵素、１つ以上のリガーゼ、１つ以上のポリメラーゼ（限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用することができる高温耐性ポリメラーゼを含む）、１つ以上のリコンビナーゼなどを使用することによって合成することができ、ｃＤＮＡ配列の知識は、任意選択的にゲノム配列からのコード領域の識別に基づくか、または多数の部分的ｃＤＮＡの配列からコンパイルされ得る。
【００５５】
「対照細胞」または「対照微生物」は、変異微生物（遺伝子操作または変異微生物）が直接もしくは間接的に由来する野生型細胞もしくは微生物のいずれかであるか、または対照細胞もしくは微生物が、対象微生物が有する脂質生成の増加を生じる変異を有さないことを除いて、参照される変異細胞もしくは微生物と実質的に同一である（すなわち、同じ属および種、好ましくは同じ株の）細胞もしくは微生物である。例えば、変異微生物が（１）ＴＰＲドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子（例えば配列番号１または配列番号２）、（２）配列番号１に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＴＰＲドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子、（３）配列番号２に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、または（４）配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減弱されている場合、対照細胞は、対照微生物が（１）、（２）、（３）、または（４）の発現が減弱されていないことを除いて、変異微生物と実質的に同一であり得る場合。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「同じ条件」または「同じ培養条件」とは、実質的に同じ条件、すなわち存在し得る参照条件間の差が小さく、限定されないが脂質生成またはバイオマス生成を含む、物質的な方式で微生物の機能または特性に関係しないことを意味する。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「脂質」または「脂質類」とは、脂肪、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、ワックスエステル、アルカンおよびアルケンなどの脂肪酸誘導体、ステロール、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質、ならびにグリセロ脂質を指す。「ＦＡＭＥ脂質」または「ＦＡＭＥ」は、脂肪酸メチルエステル、例えば、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリド（ＴＡＧ）、ワックスエステル、およびリン脂質、ガラクト脂質などの膜脂質などに誘導体化することができるアシル部分を有する脂質を指す。
【００５８】
一実施例では、脂質生産性は、リットル当たりのミリグラム（ｍｇ／Ｌ）のＦＡＭＥ生産性として評価することができ、藻類では、１日１ｍ２当たりのグラム数（ｇ／ｍ２／日）として報告してもよい。一実施例では、本明細書で提供される半連続アッセイでは、入射放射の面積（例えば、半連続プロセスアッセイ（ＳＣＰＡ）のフラスコラックの開口部は、１１／２インチ×３３／８インチ、すなわち０．００３１４５ｍ２であり得る）を考慮することによって、ｍｇ／Ｌ値をｇ／ｍ２／日に変換することができ、培養物の体積は５５０ｍｌであり得る。生産性の値をｇ／ｍ２／日で得るには、ｍｇ／Ｌ値に、日毎の希釈率（３０％）および換算係数０．１７５を乗算してもよい。脂質またはそのサブカテゴリ（例えば、ＴＡＧまたはＦＡＭＥ）がパーセンテージとして参照される場合、そのパーセンテージは、別段示されない限り重量パーセントである。
【００５９】
「バイオマス」とは、生細胞または死細胞にかかわらず、細胞塊を指し、例えば、培養細胞中の吸引したペレットの重量として評価することができるが、より好ましくは当技術分野で既知の方法を使用する乾燥重量（例えば、培養試料またはペレット細胞の凍結乾燥物）、無灰乾燥重量（ＡＦＤＷ）、または総有機炭素（ＴＯＣ）である。バイオマスは、増殖許容条件下での培養物の増殖中に増加し、例えば、バッチ培養では「バイオマス蓄積」と称され得る。定常的または定期的な希釈を受ける連続または半連続培養では、培養物中に蓄積するであろう、生成されたバイオマスは培養物の希釈中に取り出される。したがって、これらの培養による日毎のバイオマス生産性（バイオマスの増加）は、「バイオマス蓄積」とも称され得る。バイオマス生産性は、リットル当たりのミリグラム（ｍｇ／Ｌ）のＴＯＣ生産性として評価することができ、藻類では、１日１メートル２当たりのグラム数（ｇ／ｍ２／日）として報告してもよい。本明細書で提供される半連続アッセイでは、入射放射の面積（１１／２インチ×３３／８インチ、すなわち０．００３１４５ｍ２のＳＣＰＡのフラスコラックの開口部）および培養物の体積（５５０ｍｌ）を考慮することによって、ｍｇ／Ｌ値をｇ／ｍ２／日に変換する。生産性の値をｇ／ｍ２／日で得るには、ｍｇ／Ｌ値に、日毎の希釈率（３０％）および換算係数０．１７５を乗算する。バイオマスがパーセンテージとして表される場合、パーセンテージは、別段示されない限り重量パーセントである。
【００６０】
本開示の文脈において、「窒素源」は、対象微生物によって摂取および代謝され得、増殖および繁殖のために生体分子に組み込まれ得る窒素源である。例えば、増殖のために微生物によって摂取および／または代謝されることができない窒素を含む化合物（例えば、Ｈｅｐｅｓ、Ｔｒｉｓなどの窒素含有生物学的緩衝液）は、本発明の文脈において窒素源とは見なされない。
【００６１】
本明細書で使用される場合「還元窒素」は、アンモニウム塩、アンモニア、尿素、アミド、またはアミノ酸（例えば、培養されている微生物によって摂取および代謝される、生体分子への組み込みのための窒素源を提供し、それにより増殖を支持することができるアミノ酸）の化学的形態にある窒素である。窒素源であり得るアミノ酸の例には、限定されないが、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、プロリン、リジン、アルギニン、アスパラギン、アラニン、およびグリシンが含まれ得る。微生物の培養培地に存在し得る窒素源の文脈における「非還元窒素」は、微生物による有機化合物への同化の前に還元されなければならない硝酸塩または亜硝酸塩を指す。
【００６２】
「（培養培地の）唯一の窒素源」は「実質的に唯一の窒素源」と交換可能に使用され、微生物によって代謝されることができる他の窒素源（すなわち、窒素源が微生物によって摂取されることができ、微生物によってタンパク質および核酸などの生体分子に組み込まれることができる窒素を提供する）が意図的に培養培地に添加されていないか、または他の窒素源が参照培地で培養される微生物もしくは細胞の増殖が有意に増加するのに十分な量で存在しないことを示す。本出願全体を通じて、簡潔にするために、「硝酸塩のみ」という用語は、硝酸塩が、増殖を支持するために微生物が利用可能な唯一の窒素源である、培養培地を特徴付けるために使用される。
【００６３】
同様に、「（培養培地の）唯一の炭素源」は、「実質的に唯一の炭素源」と交換可能に使用され、微生物によって代謝されることができる（すなわち生体分子の生成のためのエネルギーまたは炭素源として使用される）か、または生体分子に組み込まれる炭素のうちの５％超のパーセンテージで微生物もしくは細胞によって生成される脂質などの、生体分子に組み込まれるようになり得る他の炭素源が、参照培地で培養される微生物もしくは細胞の生産性、増殖、もしくは繁殖を有意に増加するのに十分な量で存在しないことを示す。
【００６４】
「窒素が豊富な」条件は、培地に（微生物によって使用されることができる形態の）追加の窒素を添加することによって、さらなる増殖または繁殖の利益が与えられない培地条件を指す。同様に、「栄養素が豊富な」条件とは、栄養素が増殖または繁殖を制限しない、すなわち、培地の栄養素が豊富なとき、培地に追加の栄養素（複数可）を追加することによって増殖または繁殖速度の改善を生じない培地条件を指す。「栄養素が豊富な」の文脈において、「栄養素」は、非限定的な例として、リン酸塩、硫黄、鉄、および任意選択的にシリカを含むが、エネルギー源として生物によって使用されることができる糖または有機酸などの炭素源を含まない。
【００６５】
本明細書で開示されるのは、微生物を操作、アッセイ、培養、および分析するための方法である。本明細書で示される本発明はまた、当技術分野で既知である細胞培養、微生物の形質転換、遺伝子操作、および生化学分析のための標準的な方法、技法、および試薬を利用する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定することを意図しない。本発明の他の特色および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００６６】
脂質生産性が増加されている変異微生物
テトラトリコペプチドリピート（ＴＰＲ）ドメインは、相互作用モジュールおよび多タンパク質複合体メディエーターとして機能する、広範なタンパク質に存在する構造モチーフである。ＴＰＲを有するポリペプチドは、細胞小器官標的化、およびタンパク質の取り込み、小胞の融合、および（Ｚｅｙｔｕｎｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２０（３）：３９７−４０５で考察されるような）生体鉱物化などの多様な生物学的プロセスを調節する。ＴＰＲドメインは、ｐｆａｍ１３４１４「ＴＰＲリピート」、または保存ドメインＣＯＧ０４５７、保存ドメインＣＤＤ２９０１５０、または保存ドメインＣＤＤ２７６８０９（「テトラトリコペプチドリピート」）として特徴付けることができる。あるいは、または加えて、ＴＰＲドメインは、保存ドメインｃｌ２６００５、ドメインのＰＬＮ０３０８８スーパーファミリーの一員である「ＳＧＴ１、ＳＫＰ１のＧ２対立遺伝子の抑制因子」ドメインとして特徴付けることができる。ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでのタンパク質配列のＢＬＡＳＴ検索は、典型的には、クエリー配列内に見られるドメインの概要を提供する。ポリペプチド配列は、例えばｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇまたはｎｃｂｉ（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）などの公開され入手可能なウェブサイトで、配列内のｐｆａｍドメインまたは保存ドメインを検索することによって、ＴＰＲドメインの存在を調べてもよい。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本開示は、変異微生物が、対照微生物と比較して、増加した脂質生産性を有し、かつ／または脂質への炭素分配の増加を呈する、ＴＰＲドメインを有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現および／または機能が減弱および／または変更されている変異微生物を提供する。また、提供されるのは、ＴＰＲドメインを有するポリペプチドの発現および／または機能に影響を与える遺伝子またはタンパク質の発現および／または機能が減弱および／または変更されている変異微生物である。
【００６８】
本明細書で提供されるように、「遺伝子の減弱された発現」または「減弱された遺伝子」は、遺伝子の不活性化または遺伝子の欠失に起因する減弱された発現を含む。非限定的な例として、発現が減弱されている遺伝子は、破壊された遺伝子、例えば、フレームシフトおよび／または停止コドンの導入によってリーディングフレームを破壊して、アミノ酸配列が変更されているタンパク質、および／または短縮型オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を生じ、それにより非機能性タンパク質を生じる、欠失または挿入変異を有する遺伝子であり得る。挿入による変異誘発はまた、ランダムもしくは古典的な変異誘発によるのか、または遺伝子操作によるのかどうかにかかわらず、任意の手段によることができ、様々な非限定的な実施例では、挿入変異は、トランスポザーゼ、導入されたＤＮＡのランダム挿入、相同組換え、またはＣａｓ／ＣＲＩＳＰＲシステムによって媒介されるＤＮＡの挿入の手段によってもよい。挿入変異が、リーディングフレームを変更するか、または１つ以上の停止コドンを導入することができる場合、挿入変異はまた、変異誘発および／もしくは古典的な変異誘発（例えば、化学物質または電離放射線への曝露）、または遺伝子操作を介し得る変異誘発に続く誤修復によって発生する挿入であり得る。減弱された遺伝子はまた、停止コドンの導入、（異なるアミノ酸配列を生じることができ、停止コドンも導入することができる）フレームシフトによって、および／またはポリペプチドからアミノ酸配列を欠失させることによってリーディングフレームを破壊して、アミノ酸配列が変更されている、かつ／または内部的に欠失された、もしくはＮもしくはＣ末端が短縮されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するタンパク質を生じる、欠失または挿入を有する破壊された遺伝子であり得る。破壊された遺伝子は、例えば１〜数千の塩基対の欠失または挿入を有し得る。欠失または挿入は、例えば、相同組換え／遺伝子置き換えを介して、Ｃａｓ／ＣＲＩＳＰＲシステムの活性によって、または古典的な変異誘発によって発生し得る。減弱された遺伝子はまた、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸を変化させる少なくとも１つの変異を含む、遺伝子であり得る。かかるアミノ酸配列の変化は、コードされたタンパク質の活性を変更することができる。ポリペプチド機能を減弱させる可能性がより高いアミノ酸配列の変化は、保存ドメインで発生し得、例えば、本明細書に開示のポリペプチドでは、アミノ酸を変更する変異は、ＴＰＲドメイン（例えば、ｐｆａｍ１３４１４、「ＴＰＲリピート」として特徴付けられるドメインで、もしくは保存ドメインＣＯＧ０４５７として、保存ドメインＣＤＤ２９０１５０として、保存ドメインＣＤＤ２７６８０９（「テトラトリコペプチドリピート」）として、もしくは保存ドメインｃｌ２６００５として発生し得るか、またはＤＵＦ４４７０ドメインで発生し得る。いくつかの実施例では、遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の低下または変更は、例えば脂質生成の増加および／または脂質への炭素分配の増加などの減弱された遺伝子を有する変異微生物の表現型の変更によって推定することができる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＴＰＲドメインおよび／もしくはＤＵＦ４４７０ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子の減弱された発現を実証するか、またはＴＰＲドメインおよび／もしくはＤＵＦ４４７０ドメインを有するタンパク質の発現もしくは機能が減弱されている変異体は、ＴＰＲドメインおよび／またはＤＵＦ４４７０ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子の非コード領域に変異を含む変異体であり得る。例えば、遺伝子は、ＴＰＲドメインおよび／もしくはＤＵＦ４４７０ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子の５’ＵＴＲ、５’上流領域（例えば、転写開始部位の上流）、３’ＵＴＲ、またはイントロンに、１つ以上の変更、挿入、または欠失されたヌクレオチドを含み得る。さらに、本明細書で提供される変異体における「遺伝子の減弱された発現」は、遺伝子に特異的なＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡなど、またはリボザイムから生じる減弱された発現を含む。
【００７０】
あるいは、またはＴＰＲドメインおよび／もしくはＤＵＦ４４７０ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現の減弱に加えて、本明細書で提供される変異微生物は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現および／または機能が減弱および／または変更されていてもよい。様々な実施形態では、かかる変異微生物は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現または機能が減弱されていない対照微生物と比較して、より多くの脂質を生成することができ、かつ／または脂質への炭素分配の増加を呈することができる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＴＰＲドメインを有するか、または配列番号１もしくは配列番号２に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ）の１２番染色体上のＮａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座に局在するか、または別の不等毛類（ストラメノパイル）、ＥｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅもしくはＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ種のシンテニー遺伝子である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＴＰＲドメインおよび／または配列番号１に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドはまた、ＤＵＦ４４７０として特徴付けられる未知の機能のドメイン、および／または配列番号２に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例示的な実施形態では、実質的に同一の培養条件下で野生型細胞よりも多くの脂質を生成する、本明細書で提供される変異体において発現または機能が減弱されているポリペプチドは、ＴＰＲドメイン（例えば、ｐｆａｍ１３４１４「ＴＰＲリピート」ドメインまたは保存ドメインＣＯＧ０４５７）を含み、さらにＤＵＦ４４７０として特徴付けられる未知の機能のドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異微生物は、配列番号１のアミノ酸配列もしくはその保存的バリアントを含むか、または配列番号２のアミノ酸配列もしくはその保存的バリアントを含むポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減弱されている。さらに、本明細書で提供される変異体において発現が減弱されているか、または発現もしくは機能が減弱されているポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、ＴＰＲドメイン（例えば、配列番号１、または配列番号１に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列）、およびＤＵＦ４４７０ドメイン（例えば、配列番号２、または配列番号２に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列）を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現および／または機能が減弱および／または変更されている、本明細書で提供される変異微生物は、配列番号３に対して５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有し得る。いくつかの実施例では、遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するコード配列（オープンリーディングフレーム）を有し得る。
【００７３】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異微生物は、ＴＰＲドメインを有し、かつ／またはＤＵＦ４４７０ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現および／または機能が減弱されており、遺伝子またはポリペプチドの発現または機能の低下により、ＴＰＲドメインおよび／またはＤＵＦ４４７０ドメインを含むポリペプチドの発現または機能が減弱されていない対照微生物よりも多く、脂質を生成する変異体を生じる。いくつかの実施形態では、ＴＰＲドメインおよび／またはＤＵＦ４４７０ドメインを有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現および／または機能が減弱および／または（かかる遺伝子の、限定されないが不活性化および／または欠失を含む）変更されている変異微生物では、ＴＰＲドメインおよび／またはＤＵＦ４４７０ドメインを有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルは、野生型微生物のものよりも少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上低い。いくつかの実施形態では、ＴＰＲドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子の検出可能な発現はない。
【００７４】
脂質の生成および／または脂質への炭素分配の増加は、微生物をバッチ、半連続、または連続培養条件下で培養することができる培養アッセイを使用して、測定することができる。ＴＰＲドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子が変異、破壊、または減弱されている本明細書で提供される変異微生物が、対照微生物よりも多くの脂質を生成する培養条件は、窒素が制限されていてもよいか（約５ｍＭ未満、約４ｍＭ未満、約３ｍＭ未満、約２ｍＭ未満、または約１ｍＭ未満の窒素、例えば、約０．１〜約４ｍＭ、または約０．２ｍＭ〜約３ｍＭの窒素、または約０．３〜約２．８ｍＭの窒素、または約０．３〜２ｍＭの窒素、例えば約０．３ｍＭ〜約１．５ｍＭの窒素、または約０．２ｍＭ〜約１ｍＭの窒素を有する）、または窒素が豊富であってもよいか、または例えば、培養培地中に約０．５ｍＭ未満、約０．４ｍＭ未満、約０．３ｍＭ未満、もしくは約０．２ｍＭ未満、もしくは約０．１ｍＭ未満の窒素を有するなど窒素が欠乏していてもよい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本開示で提供される変異微生物（例えば、古典的な変異誘発または遺伝子操作によって得られる微生物）は、任意選択的に対照微生物培養物がバイオマスを生成する条件であり得る実質的に同一の条件下で培養された対照微生物よりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、または少なくとも約２００％多く脂質を生成する。例えば、対照微生物培養物がバイオマスを生成する実質的に同一条件下で、変異微生物および対照微生物の両方が培養されると、変異微生物は、対照微生物よりも約２５％〜約２００％多く、約２５％〜約１７５％多く、約２５％〜約１５０％多く、約２５％〜約１２５％多く、約５０％〜約２００％多く、約５０％〜約１７５％多く、約５０％〜約１５０％多く、約５０％〜約１２５％多く、約７５％〜約２００％多く、または約７５％〜約１７５％多く、約７５％〜約１５０％多く、または約７５％〜約１２５％多く（例えば２５〜２５０％多く）、脂質を生成することができる。培養条件は、対照微生物に対して窒素が豊富であってもよく、栄養素が豊富であってもよい。いくつかの実施形態では、対照微生物は、変異体が直接的または間接的に由来する同じ種の野生型微生物である。
【００７６】
変異体が期間にわたって、日毎により高い平均脂質生産性を有することができる場合、本明細書で提供される変異微生物は、少なくとも約１日、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間の培養期間にわたって、例えば、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、または少なくとも約６０日の培養期間にわたって、または１８０日未満、１２０日未満、もしくは９０日未満であり得る期間にわたって、対照微生物よりも多い脂質生産性を実証することができる。いくつかの実施形態では、変異微生物および対照微生物が、対照微生物の増殖および繁殖を支持する実質的に同一条件下、例えば、対照微生物培養物がバイオマスを生成する条件下で培養されると、変異微生物によってより高い脂質生産性を実証することができる。いくつかの実施例では、本明細書で提供される変異微生物が対照微生物と比較してより高い脂質生産性を実証する培養期間は、例えば、本明細書で提供される変異微生物は、３〜９０日、３〜６０日、３〜３０日、または３〜１５日の培養期間中に、対照微生物よりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、または少なくとも約２００％多く脂質を生成することができる。例えば、本明細書で提供される変異微生物は、約５〜約９０日、約５〜約６０日、約５〜約３０日、または約５〜約１５日、または約７〜約９０日、約７〜約６０日、約７〜約３０日、約７〜約２０日、または約７〜約１５日の範囲の培養期間中に、対照微生物よりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、または少なくとも約２００％多く、脂質を生成することができる。いくつかの実施形態では、変異および対照微生物の両方がバイオマスを生成している培養条件下で５〜少なくとも３０日の培養期間の間、変異微生物は、対照微生物と比較して、約５％多く〜約２００％多く、約５％多く〜約１７５％多く、約５％多く〜約１５０％多く、約５％多く〜約１２５％多く、約２５％多く〜約２００％多く、約２５％多く〜約１７５％多く、約２５％多く〜約１５０％多く、約２５％多く〜約１２５％多く、約５０％多く〜約２００％多く、約５０％多く〜約１７５％多く、約５０％多く〜約１５０％多く、約５０％多く〜約１２５％多く、約７５％多く〜約２００％多く、または約７５％多く〜約１７５％多く、約７５％多く〜約１５０％、または約７５％多く〜約１２５％多く（例えば５〜２００％多く）、脂質を生成することができる。
【００７７】
培養によって生成される脂質の量は、当技術分野で既知の方法を使用して試料を取り出し、脂質を分析することによって評価することができる。生産性は、体積での生産性でもよく、例えば、培養物の生産性は、培養物１ミリリットルもしくはリットル当たりの重量として表してもよく、日毎の生産性（例えば、ｍｇ／リットル／日またはｇ／リットル／日）、例えば、培養の複数日（例えば、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日、またはそれ以上）にわたる日毎の平均生産性であってもよく、または定義された期間の間の培養物中の単位体積当たりの総生成量であってもよい。生産性は、好ましくは、培養期間中に複数回、例えば、少なくとも約２回または少なくとも約３回測定され、毎日、隔日、３日毎などで評価してもよい。
【００７８】
バイオマス生成は、例えば、総有機炭素（ＴＯＣ）を測定することによって、または乾燥重量、無灰乾燥重量（ＡＦＤＷ）を測定するなどの他の方法によって評価することができる。ＴＯＣを測定するための方法は、当技術分野で既知であり（例えば、米国特許第８，８３５，１４９号）、本明細書で提供されている。ＡＦＤＷを測定する方法も周知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，９４０，５０８号に見出すことができる。
【００７９】
微生物によって生成された脂質の量を測定する方法もまた、当技術分野で周知であり、本明細書の実施例で提供されている。例えば、抽出可能な総脂質は、例えば、Ｆｏｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９５７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６：４９７−５０９、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ（１９５９）Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１−９１７、またはＭａｔｙａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４９：１１３７−１１４６に従って決定することができ、脂質として存在するバイオマスのパーセンテージは、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴ−ＩＲ）（Ｐｉｓｔｏｒｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０３：１２３−１２９）を使用して評価することもできる。ＦＡＭＥおよびＴＡＧの重量分析に関する追加の参考文献は、例えば、米国特許第８，２０７，３６３号およびＷＯ２０１１／１２７１１８に提供されており、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８０】
様々な実施形態では、本明細書で提供される変異微生物は、対照微生物と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、または少なくとも約２００％多く脂質を生成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異体の脂質生成の増加は、対照微生物がバイオマスを生成している培養条件下であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、対照微生物および変異微生物の両方がバイオマスを生成している培養条件であり得る、対照微生物がバイオマスを生成している培養条件下で、変異微生物は、対照微生物と比較して約５％多く〜約２００％多く、約５％多く〜約１７５％多く、約５％多く〜約１５０％多く、約５％多く〜約１２５％多く、約２５％多く〜約２００％多く、約２５％多く〜約１７５％多く、約２５％多く〜約１５０％多く、約２５％多く〜約１２５％多く、約５０％多く〜約２００％多く、約５０％多く〜約１７５％多く、約５０％多く〜約１５０％多く、約５０％多く〜約１２５％多く、約７５％多く〜約２００％多く、または約７５％多く〜約１７５％多く、約７５％多く〜約１５０％、または約７５％多く〜約１２５％多く（例えば５〜２００％多く）脂質を生成することができる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、培養条件が、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約７日、少なくとも約１０日、少なくとも約１２日、または少なくとも約１４日の期間にわたり、対照微生物に対して窒素が豊富であり、好ましくは栄養素が豊富な培養条件である場合、変異微生物および対照微生物が同じ培養条件下で培養されると、本明細書で提供される変異微生物は、対照微生物と比較して、１日当たり平均して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、または少なくとも約２００％多く（例えば、少なくとも２５％、５０％、１００％、１５０％、または２００％多くのいずれか）のＦＡＭＥ脂質を生成する例えば、変異および対照微生物の両方がバイオマスを生成している培養条件下で、変異微生物は、対照微生物と比較して、１日当たり平均して約５％多く〜約２００％多く、約５％多く〜約１７５％多く、約５％多く〜約１５０％多く、約５％多く〜約１２５％多く、約２５％多く〜約２００％多く、約２５％多く〜約１７５％多く、約２５％多く〜約１５０％多く、約２５％多く〜約１２５％多く、約５０％多く〜約２００％多く、約５０％多く〜約１７５％多く、約５０％多く〜約１５０％多く、約５０％多く〜約１２５％多く、約７５％多く〜約２００％多く、または約７５％多く〜約１７５％多く、約７５％多く〜約１５０％、または約７５％多く〜約１２５％多く（例えば５〜２００％多く）、ＦＡＭＥ脂質を生成することができる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、培養条件は、アンモニウム塩などの還元窒素源を約５ｍＭ未満、約４．５ｍＭ未満、約４ｍＭ未満、約３．５ｍＭ未満、約３ｍＭ未満、約２．５ｍＭ未満、約２ｍＭ、約１．５ｍＭ未満、約１ｍＭ未満、約０．５ｍＭ未満（例えば、５ｍＭ未満）含むか、または実質的に含まない培養培地での培養を含み得る。例えば、アンモニウム濃度は、約０〜約５ｍＭ、約０〜約４．５ｍＭ、約０〜約４．０ｍＭ、約０〜約３．５ｍＭ、約０〜約３ｍＭ、約０〜約２．５ｍＭ、約０〜約２．０ｍＭ、約０〜約１．５ｍＭ、約０〜約１．０ｍＭ、または約０〜約０．５ｍＭ（例えば、０〜５ｍＭ）の範囲の濃度であってもよい。アンモニウム濃度は、約０．２〜約３ｍＭ、０．２〜約２．５ｍＭ、約０．２〜約２ｍＭ、約０．２〜約１．５ｍＭ、約０．２〜約１ｍＭ、約０．３〜約２．５ｍＭ、約０．３〜約２ｍＭ、約０．３〜約１．５ｍＭ、または約０．３〜約１ｍＭ（例えば、０．２〜３ｍＭ）の範囲の濃度であってもよい。さらなる実施例では、アンモニウム濃度は、約０．４ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約０．４〜約２ｍＭ、または約０．４ｍＭ〜約１．５ｍＭ（例えば、０．４〜２．５ｍＭ）の範囲の濃度であってもよい。あるいは、または加えて、培養条件は、実質的に唯一の窒素源として硝酸塩を含む培養培地で培養することを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異微生物は、変異微生物および対照微生物が同じ培養条件下で培養されると、対照微生物と比較して培養条件が窒素が豊富であり、栄養素が豊富な培養条件であり得る場合、対照微生物と比較して多く脂質。いくつかの実施例では、変異微生物は、変異および対照微生物の両方がバイオマスを生成している培養条件下で、対照微生物と比較して、多く脂質をすることができる。いくつかの実施例では、対照微生物は、野生型微生物、例えば、変異微生物が直接または間接的に由来する野生型微生物である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異微生物は、光独立栄養条件下で培養されると、対照藻類よりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約２５％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、または少なくとも約２００％多く（例えば、少なくとも２５％、５０％、１００％、１５０％、または２００％多く、のうちのいずれか）ＦＡＭＥ脂質を生成する藻類である。光独立栄養培養条件は、約５ｍＭ未満、約４．５ｍＭ未満、約４ｍＭ未満、約３．５ｍＭ未満、約３ｍＭ未満、約２．５ｍＭ未満のアンモニウム、約２．０ｍＭ未満、約１．５ｍＭ未満のアンモニウム、約１．０ｍＭ未満のアンモニウム、約０．５ｍＭ未満のアンモニウム（例えば５ｍＭ未満）を含むか、または実質的にはアンモニウムを含まず、かつ例えば、少なくとも約１．０ｍＭ、少なくとも約２．０ｍＭ、少なくとも約３．０ｍＭ、少なくとも約４．０ｍＭ、少なくとも約５．０ｍＭ、少なくとも約６．０ｍＭ、少なくとも約７．０ｍＭ、少なくとも約８．０ｍＭ、少なくとも約９．０ｍＭ、または少なくとも約１０．０ｍＭの硝酸塩（例えば少なくとも１．０ｍＭ）を含む、培地を含み得る。例えば、アンモニウム濃度は、約０〜約５ｍＭ、約０〜約４．５ｍＭ、約０〜約４．０ｍＭ、約０〜約３．５ｍＭ、約０〜約３ｍＭ、約０〜約２．５ｍＭ、約０〜約２．０ｍＭ、約０〜約１．５ｍＭ、約０〜約１．０ｍＭ、または約０〜約０．５ｍＭ（例えば、０〜５ｍＭ）の範囲の濃度であってもよい。アンモニウム濃度は、約０．２〜約３ｍＭ、０．２〜約２．５ｍＭ、約０．２〜約２ｍＭ、約０．２〜約１．５ｍＭ、約０．２〜約１ｍＭ、約０．３〜約２．５ｍＭ、約０．３〜約２ｍＭ、約０．３〜約１．５ｍＭ、または約０．３〜約１ｍＭ（例えば、０．２〜３ｍＭ）の範囲の濃度であってもよい。さらなる実施例では、アンモニウム濃度は、約０．４ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約０．４〜約２ｍＭ、または約０．４ｍＭ〜約１．５ｍＭ（例えば、０．４〜２．５ｍＭ）の範囲の濃度であってもよい。光合成独立栄養条件は、一定の明期下または日周サイクル下であり得る。日周サイクルの明期は、任意の長さのものであってもよく、２４時間サイクル当たり例えば約４時間〜約２２時間であってもよく、例えば約６時間〜約２０時間、例えば８時間〜約１８時間であってもよい。微生物は、自然光もしくは人工光、またはそれらの組み合わせに曝露され得る。利用可能な光の強度は、明期全体を通じて変動してもよい。
【００８４】
本明細書で提供される変異微生物は、同一条件下で培養された対照微生物と比較して、高い脂質への炭素分配を有し得る。いくつかの実施形態では、対照微生物および変異微生物の両方は、バイオマスを生成している。対照微生物と比較して脂質への炭素分配を増加されている変異体は、抽出可能な総脂質、総中性脂質、トリグリセリド、および／またはＦＡＭＥ誘導体化脂質への炭素分配を増加させることができる。
【００８５】
いくつかの実施例では、本明細書で提供される変異微生物は、変異微生物および対照微生物が同じ条件下で培養されると、対照微生物のものよりも少なくとも約５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１２０％、少なくとも１４０％、少なくとも１６０％、少なくとも１８０％、少なくとも２００％、少なくとも２２０％、少なくとも２４０％、少なくとも２６０％、少なくとも２８０％、または少なくとも３００％高い、生成されるＦＡＭＥ誘導体化脂質（「ＦＡＭＥ」）対生成されるバイオマス（例えば、ＴＯＣまたは無灰乾燥重量（ＡＦＤＷ））の量の比率を有し得る。例えば、対照微生物培養物がバイオマスを生成する条件であり得る実質的に同一条件下で、変異微生物および対照微生物の両方が培養されると、変異微生物は、対照微生物培養物と比較して、約２５％高い〜約３００％高い、約２５％高い〜約２７５％高い、約２５％高い〜約２５０％高い、約５％高い〜約２２５％高い、２５％高い〜２００％高い、約２５％高い〜約１７５％高い、約２５％高い〜約１５０％高い、約５０％高い〜約３００％高い、約５０％高い〜約２７５％高い、約５０％高い〜約２５０％高い、約５０％高い〜約２２５％高い、約５０％高い〜約２００％高い、約５０％高い〜約１７５％高い、約５０％高い〜約１５０％高い、約７５％高い〜約３００％高い、約７５％高い〜約２７５％高い、約７５％高い〜約２５０％高い、約７５％高い〜約２２５％高い、約７５％高い〜約２００％高い、約７５％高い〜約１７５％高い、または約７５％高い〜約１５０％高い（例えば２５〜３００％高い）脂質生産性である、生成されるＦＡＭＥ誘導体化脂質（「ＦＡＭＥ」）対生成されるバイオマス（例えば、ＴＯＣまたは無灰乾燥重量（ＡＦＤＷ））の量の比率を有し得る。脂質およびバイオマスの生成および／または生成は、例えば、当技術分野で既知であり、本明細書の実施例で実証されているように、重量分析によって評価することができる。
【００８６】
様々な実施例では、本明細書で提供される変異微生物のＦＡＭＥ／ＴＯＣ比率は、窒素が豊富な、例えば栄養素が豊富である条件下で培養されると、対照微生物がＴＲＰドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子が変異していないことを除いて変異微生物と実質的に同一の対照微生物と比較して、例えば少なくとも約０．３０、少なくとも約０．３５、少なくとも約０．４０、少なくとも約０．４５、少なくとも約０．５０、少なくとも約０．５５、少なくとも約０．６０、少なくとも約０．６５、少なくとも約０．７０、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８０、少なくとも約０．８５、または少なくとも約０．９０（例えば、少なくとも０．３０、０．５０、０．７５、または０．８０のうちのいずれか）であり得る。様々な実施例では、本明細書で提供される変異微生物のＦＡＭＥ／ＴＯＣ比率は、対照微生物と比較して窒素が豊富な、例えば栄養素が豊富である条件下で培養すると、例えば、約０．２５〜約０．８０、または約０．３０〜約０．８０、または約０．２５〜約０．７、または約約０．３０〜約０．７０であり得る。培養条件は、例えば、約５ｍＭ未満、約４．５ｍＭ未満、約４ｍＭ未満、約３．５ｍＭ未満、約３ｍＭ未満、約２．５ｍＭ未満、約２ｍＭ未満、約１．５ｍＭ未満、約１．０ｍＭ未満、または約０．５ｍＭ未満（例えば、５ｍＭ未満）のアンモニウムを含み、いくつかの実施例では、少なくとも約１．０ｍＭ、少なくとも約２．０ｍＭ、少なくとも約３．０ｍＭ、少なくとも約４．０ｍＭ、少なくとも約５．０ｍＭ、少なくとも約６．０ｍＭ、少なくとも約７．０ｍＭ、少なくとも約８．０ｍＭ、少なくとも約９．０ｍＭ、または少なくとも約１０．０ｍＭ（例えば、少なくとも１．０ｍＭ）の硝酸塩を含み得る、培養培地を含み得る。培養条件は、いくつかの実施例では、実質的にアンモニウムを含まなくてもよく、いくつかの実施例では、窒素源として還元窒素を実質的に含まなくてもよい。いくつかの実施例の培養物は、窒素源として硝酸塩を含み、これは、任意選択的に培養培地の実質的に唯一の窒素源であってもよい。例示的な実施形態では、変異微生物は、培養期間にわたって少なくとも約０．４の平均ＦＡＭＥ／ＴＯＣ比率を呈する。
【００８７】
本明細書で提供される、脂質生成が増加されている変異体の特性は、変異体と同じ種の野生型生物、好ましくは脂質過剰生成変異体の前駆株であり得る対照微生物の同じ特性と比較されている。あるいは、対照微生物は、対照微生物がより高い脂質生産性をもたらす変異を有さないことを除いて、変異微生物と実質的に同一である微生物であり得る。例えば、対照微生物は、本明細書に開示の脂質生産性が増加され、かつ／または脂質分配が増加されている変異体を生成するようにさらに変異もしくは操作されている、遺伝子操作微生物または古典的に変異させた生物であり得る。
【００８８】
いくつかの実施例では、対照微生物は、対照微生物が、脂質誘導を調節する遺伝子（すなわち、その変異が脂質生成の増加を生じる遺伝子）に変異を有さないことを除いて、変異微生物と実質的に同一である微生物であり得る。破壊されている、減弱されている、または直接もしくは間接的に遺伝子操作されている遺伝子（脂質誘導調節因子遺伝子の構造または発現に変更を生じる遺伝子）を有する脂質過剰生成変異体の特性はまた、（細胞が「野生型」であるかどうかにかかわらず）脂質誘導調節因子遺伝子の構造または発現に変更を生じる、破壊されている、減弱されている、または直接もしくは間接的に遺伝子操作されている脂質誘導調節因子遺伝子を有さない対照細胞の同じ特性と比較される。例えば、対照細胞は、１つ以上の非天然遺伝子を含む組換え細胞、またはその効果が評価されている脂質誘導調節因子遺伝子以外の遺伝子が変異した細胞などであり得る。
【００８９】
変異微生物は、例えば、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）、Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ、Ａｍｐｈｏｒａ、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、ベケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）、ボロディネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）、ボトリディウム（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）、クリコスファエラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ、デスモデスムス（Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、エリプソイドン（Ｅｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）、Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ、Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）、ハイメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）、Ｍｏｎｏｄｕｓ、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ナノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｎａｖｉｃｕｌａ、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）、オエドゴニウム（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、パリエトクロリス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、ファグス（Ｐｈａｇｕｓ）、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、シュードスタウラストラム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、シゾクラミデラ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ）、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ、アオミドロ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）、Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ、およびボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属のうちのいずれかの任意の種などの任意の真核生物微細藻類株のものであり得る。例えば、特に好適な種の非限定的な例には、例えば、Ａｍｐｈｏｒａ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ、Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ、Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ、Ｍｏｎｏｄｕｓ、Ｎａｖｉｃｕｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、もしくはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ、またはＥｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅ、例えばＥｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ、もしくはＶｉｓｃｈｅｒｉａ属のうちのいずれかの種などの珪藻が含まれる。
【００９０】
いくつかの実施例では、組換え藻類は、限定されないが、緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、クロロデンドロン藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｄｅｎｄｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、ペディノ藻綱（Ｐｅｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）、プレウラストルム藻綱（Ｐｌｅｕｒａｓｔｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、プラシノ藻綱（Ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）、およびトレボウクシア藻綱（Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ）網のうちのいずれかの微細藻類を含む緑藻、すなわち、緑色植物界のクロロファイト門の藻類の一員である。いくつかの実施例では、本明細書で提供される組換え藻類は、Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ、Ｃａｒｔｅｒｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ、Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ、Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ、Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｖｏｌｖｏｘ、ミクロモナス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ）、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  プラシノクラドゥス（Ｐｒａｓｉｎｏｃｌａｄｕｓ）  スケルフェリア（Ｓｃｈｅｒｆｆｅｌｉａ）、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ、Ｆｒａｎｃｅｉａ、Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ、またはＰｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ属のうちのいずれかの種などの、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ、またはＣｈｌｏｒｏｄｅｎｄｒｏｐｈｙｃｅａｅ網のうちのいずれかの一員である種であり得る。様々な実施例では、本明細書で提供される組換え藻類は、限定されないが、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ、Ｆｒａｎｃｅｉａ、Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ、またはＰｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａなどのＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅの種または株であり得る。
【００９１】
いくつかの実施例では、組換え藻類は、不等毛類藻類であり、珪藻類（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ、黄緑色藻類（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔｅｓ）、褐藻類（ｐｈａｅｏｐｈｙｔｅｓ）、黄金色藻（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅｓ）、またはラフィド藻（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔｅｓ）に属し得る。いくつかの実施例では、変異藻類は、限定されないが、Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ、Ａｍｐｈｏｒａ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ、Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ、Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ、Ｍｏｎｏｄｕｓ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｎａｖｉｃｕｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ、Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ、およびＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａなどの、ＢａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔｅまたはＥｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅ属に属する。いくつかの実施例では、変異藻類は、Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅであり、Ｃｈｌｏｒｉｄｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｐｔｒｙｓ、Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｉｏｎ、Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ、Ｇｏｎｉｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｍｏｎｏｄｏｐｓｉｓ、Ｍｏｎｏｄｕｓ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｃｈａｒａｃｉｏｐｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｒｕａｓｔｒｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｔｅｔｒａｅｄｒｉｅｌｌａ、およびＶｉｓｃｈｅｒｉａからなる群から選択される属に属する。いくつかの実施例では、変異藻類細胞は、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ種である。
【００９２】
あるいは、本明細書で提供される変異微生物は、例えば、ラビリンチュラ（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌａ）、ラビリンチュロイド（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）、およびウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属のうちのいずれかの種などの、ラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅ）微生物、例えばラビリンチュリッド（Ｌａｂｒｉｎｔｈｕｌｉｄｓ）またはスラウストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）の一員である、不等毛類であり得る。
【００９３】
変異体は、自然変異体、古典的に誘導された変異体、または調節因子遺伝子、例えばその遺伝子の発現が転写因子もしくは転写活性化因子をコードする遺伝子などの他の多くの遺伝子の発現に影響を与える遺伝子の発現が減弱されている、操作された変異体であり得る。
【００９４】
脂質生成を調節する遺伝子の発現が減弱されている変異微生物は、例えば、機能性タンパク質が生成されないようにポリペプチドのリーディングフレームが破壊されている「ノックアウト」変異体であり得る。例えば、遺伝子は、機能性タンパク質の作製を生じないリーディングフレームにおける挿入、欠失、または変異を含み得る。様々な実施例では、ノックアウト変異は、多くの場合必ずしも選択可能なマーカー遺伝子を含まなくともよいが、遺伝子への、例えば遺伝子のコード領域への配列の挿入によって生成され得る。かかる挿入は、例えば、ドナー断片を標的遺伝子座に組み込むＣａｓ／ＣＲＩＳＰＲシステムの使用によるものであってもよいか、または相同組換えによるものであってもよい。かかる挿入は、オープンリーディングフレームおよび／もしくはスプライシングシグナルを破壊するか、または非機能性融合タンパク質もしくは短縮型タンパク質を生成することができる。他の実施例では、変異微生物は、野生型細胞の発現レベルと比較して、遺伝子の発現が低下しているが排除されていない、例えば５％以下〜９５％以上、例えば５％〜９５％、または１０％〜９０％低下した「ノックダウン」変異体であり得る。ノックダウンは、遺伝子の非コード領域、例えば、遺伝子の５’もしくは３’領域で変異、挿入、もしくは欠失が発生するか、またはＲＮＡｉ、リボザイム、もしくはアンチセンス構築物などの標的遺伝子の発現を低下させる細胞中の発現構築物によって影響され得る、変異体であり得る。ＣＲＩＳＰＲシステムに加えて、相同組み込みを使用して、挿入変異体（ノックダウンまたはノックアウトのいずれか）を生成することができる。他の方法も知られており、当業者に広く利用可能であり、本明細書に記載の微生物とともに使用することができる。
【００９５】
本明細書で提供される変異微生物は、本明細書に開示のＴＰＲドメインを含むポリペプチドをコードする目的の微生物の、内因性遺伝子を標的とすることによって設計することができる。かかる遺伝子は、バイオインフォマティクス方法、分子生物学技法、およびそれらの組み合わせを使用して、目的の微生物で識別することができる。例えば、ＴＰＲドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子は、サザンハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションによるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、または例えば、縮重プローブおよび／もしくはプライマーを使用するＰＣＲを使用して識別することができる。公開または非公開データベースで利用可能なゲノム配列は、配列マッチング（例えば、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｔｂｌａｓｔｎ（翻訳されたヌクレオチド配列に対してクエリータンパク質配列）などのｂｌａｓｔプログラム）を実施するか、またはコードされるアミノ酸配列のドメイン構造を分析する、多数のプログラムのうちのいずれかによって検索することができる。例えば、ＨＭＭＥＲは、例えばｈｍｍｓｅａｒｃｈまたはｈｍｍｓｃａｎを含むゲノム配列のスキャンに使用することができる遺伝子によってコードされる構造的および機能性ドメインを分析するためのソフトウェアをオンラインで提供している。かかる検索はオンラインで行うことができる。ＭＵＳＣＬＥおよびｈｍｍａｌｉｇｎなどのプログラムも使用して、系統樹を構築してタンパク質間の関係性を決定することによって、本明細書に開示のタンパク質などのタンパク質のオーソログ（例えば、ＴＰＲドメイン（例えば、配列番号１、または配列番号１に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列）、および／またはＤＵＦ４４７０含有ポリペプチド（例えば、配列番号２、または配列番号２に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列）を有するポリペプチド）の検索に使用することができる。遺伝子標的化は、目的の微生物のゲノムで識別された配列を利用することができる。遺伝子を減弱の標的とするのに、遺伝子の完全な構造を解明する必要はない。例えば、限定されないが、（メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣａｓ／ＣＲＩＳＰＲシステムを使用する）ゲノム編集、ＲＮＡｉ構築物、アンチセンス構築物、相同組換え構築物、リボザイム構築物を含む、本明細書に開示の方法を使用して、遺伝子配列の一部分のみを、遺伝子減弱構築物および技法に採用することができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、除草剤耐性、毒素耐性、向上した増殖特性、向上した光合成効率、向上した脂質生成または蓄積、および特定の脂質の生成を与える、少なくとも１つの追加の遺伝子改変を有するように、変異微生物をさらに操作または変異させてもよい。
【００９７】
一態様では、上の実施形態に開示の変異微生物の溶解物が提供される。細胞溶解物を作製することは、当技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、変異微生物の溶解物は、変異微生物を洗剤、低張緩衝液、カオトロピック剤、酵素、例えばプロテアーゼ、もしくはそれらの任意の組み合わせを施すことによって、および／または超音波処理、凍結融解、液体窒素中でのビーズ破砕もしくは粉砕、もしくはそれらの任意の組み合わせなどの機械的手段によって作製することができる。溶解物は、粗溶解物であってもよく、または例えば、沈殿、沈降、遠心分離、濾過、もしくは透析によってさらに処理されている溶解物であってもよい。
【００９８】
遺伝子減弱
脂質生合成を調節する遺伝子の発現が減弱されている本明細書で提供される変異微生物は、ヒトの介入、例えば古典的な変異誘発または遺伝子操作によって生成される変異体である。例えば、本明細書で提供される変異微生物は、限定されないが、ＵＶ照射、ガンマ線照射、または化学的変異誘発、および例えば、ナイルレッドもしくはＢＯＤＩＰＹなどの親油性染料で染色することによる、脂質生成が増加されている変異体のスクリーニングを含む、任意の実行可能な変異誘発方法によって生成される変異体であり得る（例えば、Ｃａｂａｎｅｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１８４：４７−５２）であり得る。微生物株の変異体を生成するための方法は、周知である。
【００９９】
少なくとも約５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、または少なくとも２００％多く脂質を生成する本明細書で提供される変異体はまた、遺伝子操作された変異体、例えば、ＴＰＲドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子、またはＮａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座に局在する遺伝子もしくはそのオーソログ（例えば、配列番号１に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％を有するＴＰＲドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子、配列番号２に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するＴＰＲドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子、および／または配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するＤＵＦ４４７０ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子）が、ノックアウト、ノックダウン、および／または（例えば、野生型ポリペプチドと比較して活性が低下されているポリペプチドをコードし得る遺伝子の変異形態との）遺伝子置き換えのための相同組換えによって標的とされている変異体であってもよい。例えば、目的の微生物株は、配列をゲノム遺伝子座に挿入しそれによって遺伝子および／もしくはその発現を変更するように、ならびに／またはプロモーターを宿主微生物の遺伝子の遺伝子座に挿入して遺伝子座での特定の遺伝子もしくは遺伝子の組の発現に影響を与えるように、部位特異的相同組換えによって操作してもよい。
【０１００】
例えば、相同組換えによる遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックダウン、または遺伝子置き換えは、外来配列、典型的には、組み込まれた構築物の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子によって相同な配列が中断されている、変更されるゲノム領域に対して相同な配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）断片による形質転換によるものであり得る。外来配列または変異遺伝子配列のいずれかの側のゲノム相同フランキング配列は、例えば、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１，０００、少なくとも約１，２００、少なくとも約１，５００、少なくとも約１，７５０、または少なくとも約２，０００（例えば、少なくとも５０、１００、２００、５００、１０００、１５００、または２０００のうちのいずれか）ヌクレオチドの長さであり得る。外来遺伝子が標的遺伝子配列に隣接している遺伝子ノックアウトまたは遺伝子「ノックイン」構築物は、例えば相同組換えを受ける領域の外側に、任意選択的に線状化することができるベクターで提供することができるか、またはベクターに関連しない線状断片として提供することができ、例えば、ノックアウトまたはノックイン構築物は、限定されないが、ＰＣＲ生成物を含む単離または合成された断片であってもよい。場合によっては、選択可能なマーカーを再生成し、３つのクロスオーバー事象を介して目的の遺伝子の遺伝子座を破壊することができる、２つのＤＮＡ断片を導入することができるスプリットマーカーシステムを使用して、相同組換えによって遺伝子ノックアウトを生成することができる（Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２７３：１５７−１６３）。
【０１０１】
一態様では、本開示は、遺伝子改変生物、例えば配列番号１に対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するＴＰＲドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子、および／または配列番号２に対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するＤＵＦ４４７０ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子、および／または配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、および／または不等毛類もしくは藻類種のＮａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座もしくはシンテニー遺伝子座に局在する遺伝子、および／または配列番号４に対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するコード領域を有する遺伝子などの、脂質調節因子遺伝子の発現を減弱させるための１つ以上の遺伝子改変または変異を有する微生物を提供する。本明細書で使用される場合、遺伝子（例えば、「脂質調節因子遺伝子」）の発現および／または機能」を「減弱させる」または「変更する」とは、通常発現する完全な機能性タンパク質の生成、発現、および／または機能を低下させる任意の様式で、遺伝子の発現を低下または排除することを意味する。脂質調節因子遺伝子などの遺伝子を減弱させるための手段には、例えば、相同組換え構築物；ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９または他のｃａｓ酵素、例えばＣｐｆ１、Ｃｍｓ１、Ｃｓｍ１、もしくは他を含むＣＲＩＳＰＲシステム、ならびに任意選択的に標的部位に挿入するためのドナー断片；ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ構築物を含むＲＮＡｉ構築物；リボザイム構築物；ＴＡＬＥＮＳ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；およびメガヌクレアーゼが含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子は、例えば、相同組換えによって媒介される挿入もしくは遺伝子置き換えによって、および／またはメガヌクレアーゼ（例えば、ＷＯ２０１２／０１７３２９（ＵＳ２０１３／０１６４８５０およびＵＳ２０１６／０２７２９８０）を参照されたい、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１６：２６８−２７７、ＷＯ２０１２０１７３２９（ＵＳ２０１３／０１６４８５０およびＵＳ２０１２／０３２４６０３）、ＴＡＬＥＮ（ＷＯ２０１４／２０７０４３（ＵＳ２０１６／０１３０５９９）、ＷＯ２０１４／０７６５７１（ＵＳ２０１６／０２７２９８０））、またはＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、ＵＳ８，６９７，３５９、ＵＳ８，７９５，９６５、ＵＳ８，８８９，３５６、ＵＳ２０１６／０３０４８９３、ＵＳ２０１６／００９０６０３、ＵＳ２０１４／００６８７９７、ＵＳ２０１６／０２０８２４３、ＵＳ２０１７／０２３３７５６を参照されたい）のｃａｓタンパク質（例えばＣａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質、またはＣｓｍ１エフェクタータンパク質）などの二重鎖破断誘導剤の活性によって破壊することができる。当業者によって理解されるであろうように、破壊の他の方法は当技術分野で既知であり、本明細書では適切であろう。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、変異微生物は、不等毛類または藻類種におけるＮａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座またはシンテニー遺伝子座に局在する遺伝子に対する１つ以上の変異、またはその遺伝子の発現に影響を与える１つ以上の変異を有する。いくつかの実施形態では、変異微生物は、配列番号４に対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するオープンリーディングフレームを有する遺伝子に対する１つ以上の変異、またはその発現に影響を与える１つ以上の変異を有する。いくつかの実施形態では、変異微生物は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸に存在するかまたはその発現に影響を与える、１つ以上の変異を有する。いくつかの実施形態では、変異微生物は、ＤＵＦ４４７０ドメインをコードする配列（例えば、配列番号２、または配列番号２に対して少なくとも約５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも約９５％を有する配列）に、１つ以上の変異を有する。いくつかの実施形態では、変異微生物は、ＴＰＲドメインをコードする配列（例えば、配列番号１、または配列番号１に対して少なくとも約５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも約９５％を有する配列）に、１つ以上の変異を有する。
【０１０３】
完全な機能性脂質調節因子遺伝子が生成されないように、または破壊された脂質調節因子遺伝子を含まない対照微生物によって生成されるよりも少量で生成されるように、脂質調節因子遺伝子の発現が減弱されるように操作された組換え微生物は、遺伝子の発現を低下または壊滅する少なくとも１つの挿入、変異、または欠失を含む、破壊された脂質調節因子遺伝子を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上の変異（１つ以上のヌクレオチドの変化、欠失、および／または挿入）は、遺伝子のコード領域にあってもよいか、またはイントロン、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、もしくはプロモーター領域、例えば転写開始部位の約１ｋｂ以内、転写開始部位の約２ｋｂ以内、もしくは翻訳開始部位の約３ｋｂ以内にあってもよい。いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に開示の遺伝子の発現が減弱されている変異微生物は、非限定的な例では、既知のもしくは推定される転写開始部位の約２ｋｂ以内、約１．５ｋｂ以内、約１ｋｂ以内、もしくは約０．５ｋｂ以内、または翻訳開始部位の約３ｋｂ以内、約２．５ｋｂ以内、約２ｋｂ以内、約１．５ｋｂ以内、約１ｋｂ以内、もしくは約０．５ｋｂ以内などの転写開始部位の遺伝子５’の領域への、１つ以上の核酸塩基の変化、および／または１つ以上の核酸塩基の欠失、および／または１つ以上の核酸塩基の挿入であり得る、１つ以上の変異を有し得る。非限定的な例として、変異体遺伝子は、遺伝子の発現を増加または減少させることができるプロモーター領域内に変異、挿入、または欠失を有する遺伝子であってもよく、非機能性タンパク質、短縮型タンパク質、ドミナントネガティブタンパク質、またはタンパク質なしの生成を生じる欠失を有する遺伝子であってもよく、コードされたタンパク質のアミノ酸に変化をもたらすか、または遺伝子転写物の異常なスプライシングを生じる１つ以上の点変異を有する遺伝子などであってもよい。
【０１０４】
本明細書で参照され、Ｈｓｕらによって最近考察されたＣＲＩＳＰＲシステム（Ｃｅｌｌ  １５７：１２６２−１２７８，２０１４）は、ｃａｓヌクレアーゼポリペプチドまたは複合体に加えて、標的部位配列との相補性によってゲノム標的部位と相互作用する、（多くの場合「ｃｒＲＮＡ」と表される）標的指向ＲＮＡ；ｃａｓポリペプチドと複合体を形成し、かつ標的指向ｃｒＲＮＡと（相補性によって）結合する領域もまた含む、トランス活性化（「ｔｒａｃｒ」）ＲＮＡ、を含む。本開示は、ゲノム編集のためにｃａｓタンパク質を発現するかもしくはこれをトランスフェクトされる宿主株を同時形質転換することができる（または宿主株で発現することができる）２つのＲＮＡ分子（「ｃｒＲＮＡ」および「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）の使用、または、標的配列に相補的な配列、ならびにｃａｓタンパク質と相互作用する配列を含む単一ガイドＲＮＡの使用を企図する。すなわち、いくつかの戦略では、本明細書で使用されるＣＲＩＳＰＲシステムは、２つの別個のＲＮＡ分子（ＲＮＡポリヌクレオチド：「ｔｒａｃｒ−ＲＮＡ」；および「標的指向型（ｔａｒｇｅｔｅｒ）ＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」。以下参照されたい。）を含み得、本明細書では「二重分子ＤＮＡ標的指向ＲＮＡ」または「２分子ＤＮＡ標的指向ＲＮＡ」と称される。あるいは、実施例に実証されているように、ＤＮＡ標的指向ＲＮＡはまた、（標的に対して相同な（「ｃｒ」）配列に加えて）ｃａｓタンパク質との相互作用のためのトランス活性化配列を含み得、すなわちＤＮＡ標的指向ＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり得、本明細書では「キメラガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、または「ｓｇＲＮＡ」と称される。「ＤＮＡ標的指向ＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は包括的であり、二重分子ＤＮＡ標的指向ＲＮＡおよび単一分子ＤＮＡ標的指向ＲＮＡ（すなわちｓｇＲＮＡ）の両方を指す。単一分子ガイドＲＮＡおよび２つのＲＮＡシステムの両方は、文献、および例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号に詳述されている。本明細書で提示される方法および組成物のいくつかの実施形態は、例えば、配列番号５で示される配列を有する標的配列などの、Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座に局在する遺伝子の標的配列に対応する配列を有するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、キメラガイドである。他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ配列を含まない。任意のｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｍｓ１、Ｃｐｆ１、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、���２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、およびそれらのホモログ、またはそれらの改変バージョンを本明細書の方法に使用することができる。ｃａｓタンパク質は、非限定的な例として、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、または髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９タンパク質などのＣａｓ９タンパク質であり得る。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号で配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として提供されるＣａｓ９タンパク質、ならびに２つ以上のＣａｓ９タンパク質からのドメインを組み合わせてもよいキメラＣａｓ９タンパク質、ならびに識別されたＣａｓ９タンパク質のバリアントおよび変異体も考慮される。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、例えば、Ｃｐｆ１タンパク質（例えばＵＳ２０１６／０２０８２４３を参照されたい）またはＣｓｍ１タンパク質（例えばＵＳ２０１７／０２３３７５６を参照されたい）であり得る。
【０１０５】
Ｃａｓヌクレアーゼ活性は、標的ＤＮＡを開裂させて、二重鎖破断を生じる。次いでこれらの破断は、非相同末端結合または相同組換え修復の２つの方式のうちの１つにおける細胞によって修復される。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）では、二重鎖破断は、破断末端を互いに直接ライゲーションすることによって修復される。この場合、一部の核酸材料を喪失し得るが、新しい核酸材料がその部位に挿入されず、欠失または変更が生じ、多くの場合変異が生じる。相同組換え修復では、開裂した標的ＤＮＡ配列に対する相同性を有し得るドナーポリヌクレオチド（時折「ドナーＤＮＡ」または「編集ＤＮＡ」と称される）が、開裂した標的ＤＮＡ配列の修復のためのテンプレートとして使用され、ドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへの遺伝情報の移送を生じる。そのため、新しい核酸材料を部位に挿入／コピーすることができる。ＮＨＥＪおよび／または相同組換え修復（例えば、ドナーＤＮＡ分子の使用）に起因する標的ＤＮＡの改変は、例えば、遺伝子修正、遺伝子置き換え、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、遺伝子変異などをもたらすことができる。
【０１０６】
場合によっては、標的ＤＮＡ配列を開裂させ、外因的に提供されたドナーポリヌクレオチドの非存在下で細胞が配列を修復することを可能にすることによって、部位特異的改変ポリペプチド（例えば、ｃａｓヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ）によるＤＮＡの開裂を使用して、標的ＤＮＡ配列から核酸材料を欠失させることができる。かかるＮＨＥＪ事象は、遺伝子破壊を生じることができる開裂した末端の再結合の部位での変異（「誤修復」）を生じることができる。
【０１０７】
あるいは、ｃａｓヌクレアーゼを発現する細胞に、ドナーＤＮＡとともにＤＮＡ標的指向ＲＮＡが同時に施与される場合、主題の方法を使用して、核酸材料を標的ＤＮＡ配列に追加、すなわち挿入または置き換え（例えば、挿入による変異誘発による「ノックアウト」、またはタンパク質（例えば、選択可能なマーカー、および／または目的の任意のタンパク質）をコードする核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを「ノックイン」して、核酸配列を改変する（例えば変異を導入する）などすることができる。
【０１０８】
特定の実施形態では、ドナーＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ標的指向を使用して、遺伝子のコード領域の上流および遺伝子の推定される近位プロモーター領域の上流、例えば、脂質調節因子遺伝子のコード領域の開始ＡＴＧの少なくとも約５０ｂｐ、少なくとも約１００ｂｐ、少なくとも約１２０ｂｐ、少なくとも約１５０ｂｐ、少なくとも約２００ｂｐ、少なくとも約２５０ｂｐ、少なくとも約３００ｂｐ、少なくとも約３５０ｂｐ、少なくとも約４００ｂｐ、少なくとも約４５０ｂｐ、または少なくとも約５００ｂｐ（例えば、少なくとも５０、１００、２００、３００、４００、または５００ｂｐ）上流に挿入され得る遺伝子調節因子配列（例えばプロモーター）を含み得る。ドナーＤＮＡは、例えば、選択可能なマーカーまたは任意の好都合な配列などの、天然プロモーターを妨害することができる配列を含むことができる。脂質調節因子オープンリーディングフレームの開始ＡＴＧの上流（例えば、５’ＵＴＲまたは脂質調節因子遺伝子の転写開始部位の上流）に挿入された追加の配列は、内因性脂質調節因子遺伝子の発現を減少またはさらには排除することができる。あるいは、または加えて、天然脂質調節因子遺伝子は、その内因性プロモーターを、全体的または部分的に、より弱くもしくは異なって調節されたプロモーター、または非プロモーター配列によって置き換えられていてもよい。
【０１０９】
いくつかの実施例では、高効率ゲノム編集細胞株を生成するために宿主細胞に導入された核酸分子は、変異したＣａｓ９酵素が、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を開裂する能力を欠くように、対応する野生型酵素と比較して変異したＣａｓ９酵素をコードする。例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９のＲｕｖＣ  Ｉ触媒ドメインのアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を、両方の鎖を開裂するヌクレアーゼからニッカーゼ（単一鎖を開裂させる酵素）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする変異の他の例には、限定されないがＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、およびＮ８６３Ａが含まれる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＤＮＡ標的のそれぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖を標的とするガイド配列（複数可）、例えば２つのガイド配列と組み合わせて使用することができる。この組み合わせにより、両方の鎖に切れ込みを入れ、ＮＨＥＪを誘導するために使用することが可能になる。２つのニッカーゼ標的（近接しているが、ＤＮＡの異なる鎖を標的とする）を使用して、変異誘発性ＮＨＥＪを誘導することができる。ゲノム変異を達成するために両方の鎖を正確かつ特異的に開裂する必要があるので、対向する鎖を、ずれた位置（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）で開裂させる酵素を使用する遺伝子座のかかる標的化はまた、非標的開裂を低下させることができる。追加の実施例では、標的遺伝子の転写または翻訳開始部位の上流の配列を標的とする１つ以上のガイドＲＮＡも導入される場合、ＤＮＡを開裂させる能力が損なわれた変異体Ｃａｓ９酵素を細胞内で発現させてもよい。この場合、ｃａｓ酵素は標的配列に結合することができ、標的遺伝子の転写をブロックする（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５２：１１７３−１１８３）。遺伝子発現のこのＣＲＩＳＰＲ干渉はＲＮＡｉと称することができ、またＬａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８：２１８０−２１９６に詳述されている。場合によっては、Ｃａｓ９ポリペプチドなどのｃａｓポリペプチドは、例えば、（ｉ）Ｃａｓ９ポリペプチド（これは、任意選択的に上記のバリアントＣａｓ９ポリペプチドであってもよい）、および（ｂ）共有結合した異種ポリペプチド（「融合パートナー」とも称される）、を含む融合ポリペプチドである。異種核酸配列は、別の核酸配列に（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９融合ポリペプチドは、細胞内局在化を提供する異種配列とＣａｓ９ポリペプチドを融合することによって生成される（すなわち、異種配列は、細胞内局在化配列、例えば、核を標的とするための核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体を標的とするための葉緑体局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどである）。いくつかの実施形態では、異種配列は、追跡および／または精製（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ���ど；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグなど）を容易にするためのタグを提供することができる（すなわち、異種配列は検出可能な標識である）。
【０１１０】
例えば、宿主細胞は、例えば宿主細胞の脂質調節因子遺伝子の遺伝子座の一部分、もしくはそれに隣接する領域に対して相同な核酸配列を含む相同組換え用のベクターであり得るか、またはｃａｓタンパク質（例えばＣａｓ９タンパク質）、ＣＲＩＳＰＲキメラガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、および／もしくはｔｒａｃｒＲＮＡ、ＲＮＡｉ構築物（例えばｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、もしくはリボザイムのうちのいずれかもしくはそれらの組み合わせを発現するための発現ベクターであり得る、ベクター構築物で遺伝子操作（例えば、形質導入または形質転換またはトランスフェクト）されてもよい。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であってもよい。ゲノム編集のためのポリペプチドまたはＲＮＡの発現のためのベクターはまた、例えば、相同組換えによって、宿主への組み込みのために設計されてもよい。本明細書に記載のポリヌクレオチド配列、例えば、宿主脂質調節因子遺伝子配列（脂質調節因子コード配列の上流および下流にある配列を含む）に対する相同性を有する配列、ならびに任意選択的に選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して脂質調節因子遺伝子の減弱を引き起こすために採用することができる。
【０１１１】
いくつかの実施例の組換え微生物は、脂質調節因子遺伝子の発現を低下させたが壊滅することはできず、組換え微生物は、例えば、約２５％〜約２００％以上の脂質生成の増加を有し得る。例えば、脂質生成の増加は、対照微生物と比較して、約２５％多く〜約２００％多く、約２５％多く〜約１７５％多く、約２５％多く〜約１５０％多く、約２５％多く〜約１２５％多く、約５０％多く〜約２００％多く、約５０％多く〜約１７５％多く、約５０％多く〜約１５０％多く、約５０％多く〜約１２５％多く、約７５％多く〜約２００％多く、または約７５％多く〜約１７５％多く、約７５％多く〜約１５０％、または約７５％多く〜約１２５％多く（例えば２５〜２００％多く）てもよい。いくつかの実施例では、例えば、本明細書で提供される遺伝子改変微生物は、例えば、配列番号１に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するＴＰＲドメインなどのＴＰＲドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子、および／または配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するＴＰＲドメイン含有ポリペプチドをコードする遺伝子、および／または配列番号２に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するＤＵＦ４４７０ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子などの脂質調節因子遺伝子の発現を減弱させるための核酸構築物を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変微生物は、配列番号１もしくは配列番号１に対して少なくとも約５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも約９５％を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、および／または配列番号２もしくは配列番号２に対して少なくとも約５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも約９５％を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現を減弱させるための核酸構築物を含み得る。例えば、宿主微生物は、ＴＰＲドメインおよび／もしくはＤＵＦ４４７０ドメインを有するか、または配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする脂質調節因子遺伝子の発現を低下させる、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、またはアンチセンス分子の発現のための構築物を含み得る。いくつかの実施例では、本明細書で提供される組換え微生物は、脂質調節因子遺伝子の発現を低下させるために少なくとも１つの導入された（外因性または非天然）構築物を含み得る。
【０１１２】
いくつかの実施例では、脂質調節因子遺伝子発現を減弱させるが排除しないために、遺伝子改変を含まない対照細胞と比較して減少した脂質調節因子遺伝子の発現について、例えば、ＲＮＡ−Ｓｅｑまたは逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などの当技術分野で既知の方法を使用して遺伝子操作された株をスクリーニングしてもよい。本明細書で提供される遺伝子操作された株は、脂質調節因子をコードする遺伝子のｍＲＮＡの量、安定性、または翻訳性を低下させることによって遺伝子発現を減弱させるための構築物を含むように操作してもよい。例えば、藻類または不等毛類株などの微生物は、当技術分野で既知の方法を使用して、脂質調節因子遺伝子のｍＲＮＡを標的とするアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、またはリボザイム構築物で形質転換してもよい。例えば、遺伝子の転写領域のすべてまたは一部分を含むアンチセンスＲＮＡ構築物を微生物に導入して、遺伝子発現を減少させてもよい（Ｓｈｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１：１１６５−７８、Ｎｇｉａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：７７５−７８２、Ｏｈｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ  ２３６：１０７−１１２、Ｌａｖａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ７：ｅ３６８０６）。あるいは、または加えて、ＴＰＲドメインを有する遺伝子を標的とするＲＮＡｉ構築物（例えば、短いヘアピンＲＮＡをコードする構築物）を、藻類または不等毛類などの微生物に導入して、脂質調節因子遺伝子の発現を低下させてもよい（例えば、Ｃｅｒｒｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ（２０１１）１０：１１６４−１１７２、Ｓｈｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．４９：６９−８４を参照されたい）。
【０１１３】
リボザイムは、核酸を部位特異的様式で開裂させるＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有する。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、ある特定のリボザイムが、既知のリボヌクレアーゼのものよりも大きく、ＤＮＡ制限酵素のものに近い配列特異性を有するエンドヌクレアーゼとして作用することができることを報告している。触媒ＲＮＡ構築物（リボザイム）は、ｍＲＮＡ標的を開裂するために、本明細書で提供される遺伝子をコードするｍＲＮＡと塩基対を形成するように設計することができる。いくつかの実施例では、リボザイム配列をアンチセンスＲＮＡ構築物内に組み込んで、標的の開裂を媒介することができる。様々な種類のリボザイムを検討することができ、それらの設計および使用は当技術分野で既知であり、例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１に記載されている。リボザイムは、相補的な塩基対相互作用による部位へのアニーリングによって、所与の配列を標的とする。この標的化には、２つの相同性ストレッチが必要である。相同配列のこれらのストレッチは、上で定義された触媒リボザイム構造に隣接する。相同配列の各ストレッチの長さは、７〜１５ヌクレオチドに変動し得る。相同配列を定義するための唯一の要件は、標的ＲＮＡ上で、それらが開裂部位である特定の配列によって分離されていることである。ハンマーヘッドリボザイムでは、開裂部位は標的ＲＮＡ上のジヌクレオチド配列にあり、ウラシル（Ｕ）の後に、アデニン、シトシン、またはウラシル（Ａ、ＣまたはＵ）のいずれか続く（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：２２５０−６８）。任意の所与のＲＮＡで発生するこのジヌクレオチドの頻度は、統計的に１６のうち３である。したがって、１，０００塩基の所与のターゲットメッセンジャーＲＮＡでは、１８７のジヌクレオチド開裂部位が統計的に可能である。
【０１１４】
リボザイム指向性ＲＮＡ開裂活性の一般的な設計および最適化については詳細に議論されており（Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１、Ｓｙｍｏｎｓ（１９９２）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６１：６４１−７１、Ｃｈｏｗｒｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：２５８５６−６４、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）上記）、すべて参照によりその全体が組み込まれる。標的ＲＮＡの効率的な開裂のためのリボザイムの設計および試験は、当業者に周知のプロセスである。リボザイムを設計および試験するための科学的方法の例は、各々参照により組み込まれるＣｈｏｗｒｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）上記およびＬｉｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｕｓｓ（１９９５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：５４０−５１に記載されている。所与の遺伝子を下方制御する際に使用するための有効かつ好ましい配列の識別は、所与の配列を調製および試験することであり、当業者に既知の日常的に実施される「スクリーニング」方法である。ＲＮＡｉ構築物の使用は、例えば、上に引用された文献、ならびにＵＳ２００５／０１６６２８９およびＷＯ２０１３／０１６２６７（それらの両方は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。標的遺伝子に対する相同性を有する二重鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉ構築物、例えば、ＲＮＡｉ短いヘアピン（ｓｈ）構築物の発現によって、細胞に送達されるか、または細胞内で生成される。構築物は、標的遺伝子と同一であるか、または標的遺伝子の配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一である配列を含み得る。構築物は、標的遺伝子に対して相同な、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１ｋｂの配列（例えば、少なくとも２０、５０、１００、２００、４００、６００、８００、または１ｋｂの配列）を有し得る。発現ベクターは、ｓｈＲＮＡを生成する構築物などのＲＮＡｉ構築物の連続的または誘導可能な発現のために選択されたプロモーターを使用して操作することができる。
【０１１５】
遺伝子減弱のための核酸構築物、例えば、リボザイム、ＲＮＡｉ、またはアンチセンス構築物は、操作される微生物の内因性脂質調節因子遺伝子の配列のうちの少なくとも約一部分に対して、少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９の同一性または相補性を有する、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、または少なくとも約６０のヌクレオチドを含み得る。遺伝子減弱のための核酸構築物、例えば、リボザイム、ＲＮＡｉ、またはアンチセンス構築物は、Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座もしくはシンテニー遺伝子座に局在する遺伝子、または例えば配列番号１もしくは配列番号１に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有する配列などのＴＰＲドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子などの内因性脂質調節因子遺伝子に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードしている遺伝子など、自然発生する遺伝子の配列に対して、少なくとも８０％の同一性または相補性、例えば、少なくとも９５％または約１００％の同一性または相補性を有する、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、または少なくとも約６０のヌクレオチドを含み得る。例えば、遺伝子減弱のための核酸構築物、例えば、リボザイム、ＲＮＡｉ、またはアンチセンス構築物は、本明細書で提供される任意のものなど自然発生する脂質調節因子遺伝子の配列に対して少なくとも約８０％の同一性または相補性を有する、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、または少なくとも約６０のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド配列は、例えば、少なくとも約３０ヌクレオチド〜少なくとも約３キロベース、例えば、少なくとも約３０ヌクレオチド〜少なくとも約５０ヌクレオチドの長さ、少なくとも約５０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの長さ、少なくとも約１００ヌクレオチド〜少なくとも約５００ヌクレオチドの長さ、少なくとも約５００ヌクレオチド〜少なくとも約１ｋｂの長さ、少なくとも約１ｋｂ〜少なくとも約２ｋｂの長さ、または少なくとも約２ｋｂ〜少なくとも約５ｋｂの長さであり得る。例えば、アンチセンス配列は、少なくとも約１００ヌクレオチド〜少なくとも約１ｋｂの長さであり得る。例えば、遺伝子減弱のための核酸構築物、例えば、リボザイム、ＲＮＡｉ、またはアンチセンス構築物は、内因性脂質調節因子遺伝子またはその一部分に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、または少なくとも約９５％の同一性または相補性を有する、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、または少なくとも約１００のヌクレオチドを含み得る。
【０１１６】
アンチセンス、ＲＮＡｉ、またはリボザイム構築物で使用されるプロモーターは、宿主生物で機能的であり、標的遺伝子の発現を所望の量に低下させるのに必要な発現レベルに好適である、任意のものであってもよい。藻類および不等毛類で機能するプロモーターは、当技術分野で既知であり、本明細書で開示されている。構築物は、本明細書に開示の任意のものを含む実行可能な任意の方法を使用して、藻類を形質転換することができる。限定されないが、アンチセンス、ＲＮＡｉ、またはリボザイム構築物などの脂質調節因子遺伝子発現を減弱させるための核酸分子で形質転換された組換え生物または微生物は、例えば、遺伝子発現の減弱を生じる外因性核酸分子を含まない宿主生物または微生物と比較して、低下した葉緑素、増加した光合成効率、および培養物中の増加した生産性を含む、本明細書に記載の脂質調節因子変異体の特性を有し得る。
【０１１７】
核酸分子および構築物
また本明細書で提供されるのは、配列番号１〜３のうちの１つ以上に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子である。あるいは、または加えて、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号４に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を有する配列を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸分子によってコードされるポリペプチドは、ＴＰＲドメインおよび／またはＤＵＦ４４７０ドメインを含み得、配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも９９％を有し得る。
【０１１８】
様々な実施例では、核酸分子は、自然発生する遺伝子に存在する１つ以上のイントロンを欠くか、または代替的に自然発生する遺伝子には存在しない１つ以上のイントロンを含み得るｃＤＮＡであってもよいか、またはそれを含んでもよい。様々な実施例では、核酸分子は、自然発生する遺伝子と１００％同一ではない配列を有し得る。例えば、核酸分子は、コードされるポリペプチドの活性を低下させるか、または遺伝子によってコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を低下させる、自然発生する遺伝子と比較して変異を含み得る。
【０１１９】
様々な実施例では、核酸分子は、配列番号１、配列番号２、および／もしくは配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、ならびに／または配列番号４に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含む、ポリペプチドをコードする配列に操作可能に連結された、異種プロモーターを含み得る。あるいは、または加えて、核酸分子は、配列番号１、配列番号２、および／もしくは配列番号３（および／または配列番号１〜３のうちのいずれかの保存的バリアント）に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、ならびに／または配列番号４に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む、ポリペプチドをコードする配列を含むベクターを含み得る。
【０１２０】
本開示はまた、ＴＰＲドメインをコードする遺伝子の発現を減弱させるために設計された構築物を提供する。構築物は、様々な実施例では、ＣＲＩＳＰＲシステムのガイドＲＮＡをコードする配列、ＲＮＡｉ構築物、アンチセンス構築物、リボザイム構築物、または相同組換えのための構築物、例えば本明細書に開示のＴＰＲドメインをコードする遺伝子に対する相同性を有する１つ以上のヌクレオチド配列および／もしくは遺伝子が由来する天然ゲノムにおいてそれに隣接する配列を有する構築物であり得るかまたはそれらを含み得る。例えば、構築物は、ＴＰＲドメインを有し、かつ／またはＤＵＦ４４７０ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも一部分、例えば、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも一部分に対して相同な配列を含み得る。
【０１２１】
例えば、遺伝子減弱のための構築物は、センスまたはアンチセンス方向のいずれかの、ＴＰＲもしくはＤＵＦ４４７０ドメイン（例えば配列番号１または配列番号２）を有するポリペプチドをコードする遺伝子の、コード領域、イントロン、５’ＵＴＲ、プロモーター領域、もしくは３’ＵＴＲの少なくとも一部分、または配列番号１、配列番号２、および／もしくは配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチド、ならびに／または配列番号４に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する遺伝子の少なくとも一部分を含み得る。加えて、かかる構築物は、配列番号１〜３のうちのいずれかを有するポリペプチドおよび／またはその保存的バリアントをコードする遺伝子のコード領域、イントロン、５’ＵＴＲ、プロモーター領域、または３’ＵＴＲの少なくとも一部分を含み得る。
【０１２２】
さらなる実施例では、構築物は、配列番号４の少なくとも一部分に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を有するか、または配列番号１、配列番号２、および／もしくは配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するＴＰＲドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子を標的とするように設計された、（例えばＣＲＩＳＰＲシステムの）ガイドＲＮＡのインビトロまたはインビボ発現のために設計することができ、かつ／または例えばイントロン、５’ＵＴＲ、プロモーター領域、および／もしくは３’ＵＴＲを含む、ＴＰＲドメインおよび／もしくはＤＵＦ４４７０を有するポリペプチドをコードする遺伝子の一部分に対して相同な配列を含み得る。
【０１２３】
さらに別の実施例では、ＴＰＲドメイン含有ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を減弱させるための構築物は、ガイドＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得、配列は、アンチセンス方向でＴＰＲドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子の転写領域に対する相同性を有する。
【０１２４】
ＴＰＲドメインをコードする遺伝子、ならびに／または配列番号１、２、および／もしくは３に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を減弱させるための核酸構築物は、例えば少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、もしくは少なくとも約２５ヌクレオチドのＴＰＲドメインをコードする遺伝子の配列、ならびに／または配列番号１、２、および／もしくは３に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／または配列番号４の一部分に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する遺伝子を含み得る。
【０１２５】
一実施例では、本明細書で提供されるのは、配列番号４の少なくとも一部分に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有する核酸分子であり、核酸分子が、ＣＲＩＳＰＲシステムのガイドＲＮＡをコードする。核酸分子は、例えば、少なくとも約１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５のヌクレオチドの、限定されないが配列番号４などの自然発生するＴＰＲドメイン含有遺伝子の配列を含み得る。
【０１２６】
加えて、本明細書で提供されるのは、ＴＰＲドメイン、および／もしくは配列番号１および／もしくは２に対して少なくとも約６５％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも一部分、ならびに／または配列番号４の一部分に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する遺伝子を含み、かつ／またはそれらに相補的であり、かつ／またはそれらに特異性を有するアンチセンス、リボザイム、またはＲＮＡｉ構築物であり、異種プロモーターなどのプロモーターが、ＴＰＲドメイン含有遺伝子配列に操作可能に連結されており、ＴＰＲドメイン含有遺伝子配列がアンチセンス方向にある。加えて、本明細書で提供されるのは、配列番号４に対して少なくとも約６５％の同一性を有する遺伝子の少なくとも一部分、および／または配列番号４の一部分に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する遺伝子を含み、かつ／またはそれらに相補的であり、かつ／またはそれらに特異性を有するアンチセンス、リボザイム、またはＲＮＡｉ構築物である。
【０１２７】
さらに、本明細書で提供されるのは、配列番号１、配列番号２、および／もしくは配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする自然発生する藻類遺伝子、ならびに／またはＮａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座に局在する遺伝子、ならびに／または配列番号４に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＯＲＦを含む遺伝子からのまたはそれらに隣接するヌクレオチド配列を含み、かつ／またはそれらに相補的であり、かつ／またはそれらに特異性を有し、かつ／またはそれらを標的とする、相同組換えのための構築物である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、非限定的な例では、選択可能マーカーまたは検出可能マーカー遺伝子であり得る異種核酸配列と並置される。いくつかの実施形態では、相同組換えのための構築物は、配列番号１、配列番号２、および／もしくは配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする自然発生する藻類遺伝子、Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座に局在する遺伝子、ならびに／または配列番号４に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＯＲＦを含む遺伝子からのまたはそれらに隣接する、２つの核酸配列を含み、２つの配列が、遺伝子の遺伝子座への挿入のために異種配列に隣接している。
【０１２８】
当業者は、多数の形質転換方法を、微生物の遺伝子形質転換のために使用することができ、したがって、本発明の方法のために展開することができることを理解するであろう。「安定な形質転換」は、生物に導入される核酸構築物が生物のゲノムに組み込まれるか、または安定なエピソーム構築物の一部であり、その子孫に遺伝することが可能であることを意味することを意図する。「一過性形質転換」は、ポリヌクレオチドが生物に導入され、ゲノムに組み込まれないか、または連続世代によって確立されて安定的に遺伝するようにならないことを意味することを意図する。
【０１２９】
遺伝子形質転換は、導入遺伝子、核またはプラスミドのいずれかからの構築物の安定な挿入および／または発現を生じることができ、場合によっては導入遺伝子の一過性の発現を生じることができる。形質転換方法は、ガイドＲＮＡの導入またはＤＮＡの編集にも使用することができる。微細藻類の遺伝子形質転換は、少なくとも〜２２種の緑、赤、および茶色の藻類、珪藻、ユーグレナ、ならびに渦鞭毛藻類に属する、３０超の異なる微細藻類の株で成功したと報告されている（例えば、Ｒａｄａｋｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ，２０１０、およびＧｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１１を参照されたい）。かかる有用な形質転換方法の非限定的な例には、例えば、Ｄｕｎａｈａｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５（３）：４５２−４６０，１９９３、Ｋｉｎｄｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９０、Ｍｉｃｈａｅｌ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１３，４２７−４３５，１９９８によって報告されているような、ガラスビーズまたは炭化ケイ素ウィスカーの存在下での細胞の撹拌が含まれる。エレクトロポレーション技法は、例えば、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ種（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，４４：７６８−７６，２００８）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種（例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，３９：３６５−３７０，２００１、Ｃｈｏｗ  ａｎｄ  Ｔｕｎｇ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．９，７７８−７８０，１９９９を参照されたい）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（Ｓｈｉｍｏｇａｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４８：１８２１−１８２８，１９９８）、およびＤｕｎａｌｉｅｌｌａ（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３０（３）：１８５−１９２，２００５）を含むいくつかの微細藻類種の遺伝子形質転換に成功裏に使用されているパーティクルガン（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、遺伝子銃形質転換（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、またはバイオリスティックガン（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）などとも称されるマイクロプロジェクタイルボンバードメント（Ｍｉｃｒｏ−ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）は、例えばＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ（Ａｐｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５２：５７２−５７９，１９９６）、ＣｙｃｌｏｔｅｌｌａおよびＮａｖｉｃｕｌａ（Ｄｕｎａｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，３１：１００４−１０１２，１９９５）、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，３５：１１３−１２０，１９９９）、ならびにＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ種（Ｍｉｙａｇａｗａ−Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｃｏｌ．Ｒｅｓ．５９：１１３−１１９，２０１１）などの珪藻種、ならびにＣｈｌｏｒｅｌｌａ（Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈ，Ｂｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．２：２０９−２１６，１９９９）、およびＶｏｌｖｏｘ種（Ｊａｋｏｂｉ���ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｉｓｔ，１５５：３８１−９３，２００４）などの緑藻種を含む、いくつかの藻類種で成功裡に使用されている。加えて、例えば、Ｋｕｍａｒ，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．，１６６（３）：７３１−７３８，２００４、およびＣｈｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，Ｖｏｌ．３７，Ｓｕｐｐｌ．１１，２００１によって報告されているように、アグロバクテリウム媒介遺伝子移送技法もまた、微細藻類の遺伝子形質転換に有用であり得る。細菌種との結合はまた、例えば参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／０２４４７７０に開示のように、藻類への遺伝子および構築物の移送のために採用されてきた。
【０１３０】
本明細書に記載の形質転換ベクターまたは構築物は、典型的には、標的宿主細胞、例えば、藻類細胞に選択可能もしくはスコアリング可能な表現型を与えるマーカー遺伝子を含むか、またはマーカーを含む構築物で同時形質転換することができる。藻類の遺伝子形質転換体を効率的に単離するために、多数の選択可能なマーカーが成功裡に開発されている。一般的な選択可能なマーカーには、抗生物質耐性、蛍光マーカー、生化学マーカーが含まれる。ブラストシジン、ブレオマイシン（例えば、Ａｐｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，上記、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，上記、Ｆｕｈｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１９，３５３−６１，１９９９，Ｌｕｍｂｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１４（４）：４４１−４４７，１９９８、Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，３６：３７９−３８６，２０００を参照されたい）、スペクチノマイシン（Ｃｅｒｕｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４５：９７−１１０，１９９７、Ｄｏｅｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，３９，４９−６０，２００１、Ｆａｒｇｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９：６９８０−９０，１９９９）、ストレプトマイシン（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｉｓｔ，１５３：４０１−４１２，２００２）、パロモマイシン（Ｊａｋｏｂｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｉｓｔ，上記、Ｓｉｚｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２７７：２２１−２２９，２００１）、ノウルセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）（Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，上記）、Ｇ４１８（Ｄｕｎａｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，上記、Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２７２：３４１３−３４２３，２００５，Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，上記）、ハイグロマイシン（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，上記）、クロラムフェニコール（Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒ，２００５，上記）、および多数その他を含む微細藻類形質転換体の選択には、いくつかの異なる抗生物質耐性遺伝子が成功裡に使用されている。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓなどの微細藻類で使用するための追加の選択可能なマーカーは、カナマイシンに対する耐性およびアミカシン耐性（Ｂａｔｅｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６３：４０４−１０，２０００）、ゼオマイシンおよびフレオマイシン（例えば、ＺＥＯＣＩＮ（商標）フェオマイシンＤ１）耐性（Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５１：２３−３０，１９９６）、ならびにパラモマイシンおよびネオマイシン耐性（Ｓｉｚｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、上記）を提供するマーカーであり得る。使用されている他の蛍光マーカーまたは発色マーカーには、ルシフェラーゼ（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１：２３９−２５１，１９９９、Ｆｕｈｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００４、Ｊａｒｖｉｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：３１７−３２２，１９９１）、β−グルクロニダーゼ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ��，２００１，上記、Ｃｈｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，上記、Ｃｈｏｗ  ａｎｄ  Ｔｕｎｇ，１９９９，上記、Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈ，１９９９，上記、Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，上記、Ｋｕｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１：１６５−１６９，１９９４）、β−ガラクトシダーゼ（Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ．，１５：３４５−３４９，２００３、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，２１：１２１１−１２１６，２００３、Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１３：８７−８９，２００３）、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｈｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，上記、Ｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２００２，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２００２，５６，１４８，２１０）が含まれる。
【０１３１】
当業者は、本発明に従って、微細藻類種の形質転換システムのために、多様な既知のプロモーター配列を有用に展開することができることを容易に理解するであろう。例えば、微細藻類で導入遺伝子の発現を促進するために通常使用されるプロモーターには、渦鞭毛藻類および緑藻植物門の両方で使用されている、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター３５Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）の様々なバージョンが含まれる（Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１８：７７８−７８０，１９９９、Ｊａｒｖｉｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，３１７−３２１，１９９１、Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１３：４２７−４３５，１９９８）。シミアンウイルスからのＳＶ４０プロモーターはまた、いくつかの藻類で活性であると報告されている（Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ；，１５１  ３４５−３４９，２００３、Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ  ３９８−３９９，４６９−４７２、１９９９）。ＲＢＣＳ２（リブロース二リン酸カルボキシラーゼ、小サブユニット）（Ｆｕｈｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１９：３５３−３６１，１９９９）のプロモーター、およびＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓからのＰｓａＤ（ａｂｕｎｄａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｃｈａｉｘ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８１：５５５５−５５６０，２００１）も有用である。ＨＳＰ７０Ａ／ＲＢＣＳ２およびＨＳＰ７０Ａ／β２ＴＵＢ（チューブリン）の融合プロモーター（Ｓｃｈｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２１：１２１−１３１，２０００）はまた、導入遺伝子の発現を改善するために有用であり得、ＨＳＰ７０Ａプロモーターが他のプロモーターの上流に配置されたときの転写活性化因子として機能し得る。目的の遺伝子の高レベルの発現はまた、珪藻フコキサンチン−クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードするｆｃｐ遺伝子（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１：２３９−２５１，１９９９、Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．３６：３７９−３８６、２０００）、または、ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅビオラキサンチン−クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードするｖｃｐ遺伝子（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３１８，４８２号を参照されたい）のプロモーターの制御下で、例えば珪藻種でも達成することができる。必要な場合、誘導性プロモーターは、トランスジェニック微細藻類における遺伝子の迅速かつ厳密に制御された発現を提供することができる。例えば、硝酸レダクターゼをコードするＮＲ遺伝子のプロモーター領域を、かかる誘導性プロモーターとして使用することができる。ＮＲプロモーター活性は、典型的にはアンモニウムによって抑制され、アンモニウムが硝酸塩に置き換えられると誘導され（Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２７２：３４１３−３４２３，２００５）、したがって微細藻類細胞をアンモニウム／硝酸塩の存在下で増殖させると、遺伝子発現をスイッチオフまたはオ��することができる。「アンモニア抑制性亜硝酸塩／亜硫酸レダクターゼ」プロモーターと称されるアンモニウム抑制性Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓプロモーターは、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１７／００７３６９５に開示されている。本明細書で提供される構築物および形質転換システムでの使用を見出すことができる追加の藻類プロモーターには、米国特許第８，８３５，４１９号、米国特許第８，８８３，９９３号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／００２３０３５号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０３２３７８０号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３６３８９２号、米国特許出願公開第２０１７／０１５２５２０号、および米国特許出願公開第ＵＳ２０１７／０１１４１０７号に開示のものが含まれ、これらはすべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３２】
宿主細胞は、非形質転換細胞、または少なくとも１つの核酸分子ですでにトランスフェクトされている細胞のいずれかであり得る。例えば、脂質調節因子遺伝子の発現を減弱させるように操作された藻類宿主細胞は、限定されないが、１つ以上のタンパク質、色素、アルコール、または脂質などの目的の生体分子の生成の増加などの、任意の望ましい特性を与えるかまたは特性に寄与し得る、１つ以上の導入遺伝子をさらに含み得る。
【０１３３】
脂質を生成する方法
また、本明細書で提供されるのは、同じ条件下で培養されると、対照細胞と比較して脂質生産性が増加されている、本明細書で提供される変異微生物を培養することによって、脂質を生成する方法である。方法は、本明細書で提供される変異微生物を好適な培地で培養して脂質を生成することと、培養物からバイオマスまたは少なくとも１つの脂質を回収することと、を含む。いくつかの実施例では、微生物は藻類であり得、培養は光独立栄養培養であり得る。培養は、バッチ、半連続、または連続モードであり得る。
【０１３４】
いくつかの実施例では、変異微生物は、約５ｍＭ未満のアンモニウム、約４．５ｍＭ未満のアンモニウム、約４ｍＭ未満のアンモニウム、約３．５ｍＭ未満のアンモニウム、約３ｍＭ未満のアンモニウム、約２．５ｍＭ未満のアンモニウム、約２ｍＭ未満のアンモニウム、約１．５ｍＭ未満のアンモニウム、約１ｍＭ以下のアンモニウム、約０．５ｍＭ以下（例えば、５ｍＭ未満）のアンモニウムを含む、または実質的にアンモニウムを含まない培地で培養することができる。培養培地には、例えば、約０〜約５ｍＭのアンモニウム、約０〜約４．５ｍＭのアンモニウム、約０〜約４．０ｍＭのアンモニウム、約０〜約３．５ｍＭのアンモニウム、約０〜約３ｍＭのアンモニウム、約０〜約２．５ｍＭのアンモニウム、約０〜約２．０ｍＭのアンモニウム、約０〜約１．５ｍＭのアンモニウム、約０〜約１．０ｍＭのアンモニウム、約０〜約０．５ｍＭのアンモニウム、約０．２〜約３ｍＭのアンモニウム、約０．２〜約２．５ｍＭのアンモニウム、約０．２〜約２ｍＭのアンモニウム、約０．２〜約１．５ｍＭのアンモニウム、約０．２〜約１ｍＭのアンモニウム、約０．３〜約２．５ｍＭのアンモニウム、約０．３〜約２ｍＭのアンモニウム、約０．３〜約１．５ｍＭのアンモニウム、約０．３〜約１ｍＭのアンモニウム、約０．４ｍＭ〜約２．５ｍＭのアンモニウム、約０．４〜約２ｍＭのアンモニウム、または約０．４ｍＭ〜約１．５ｍＭ（例えば０〜５ｍＭ）のアンモニウムが含まれ得る。微生物は、硝酸塩を含む培地で培養することができ、いくつかの実施例では、硝酸塩は、培養培地の実質的に唯一の窒素源であり得るか、または約５ｍＭ未満のアンモニウム、約４．５ｍＭ未満のアンモニウム、約４ｍＭ未満のアンモニウム、約３．５ｍＭ未満のアンモニウム、約３ｍＭ未満のアンモニウム、約２．５ｍＭ未満のアンモニウム、約２ｍＭ未満のアンモニウム、約１．５ｍＭ未満のアンモニウム、約１ｍＭ以下のアンモニウム、約０．５ｍＭ以下（例えば５ｍＭの未満）アンモニウムに加えて存在し得るか、または実質的にアンモニウムを含まない。あるいは、または加えて、培養培地は尿素を含んでもよく、いくつかの実施例では、尿素は、培養培地の実質的に唯一の窒素源であり得る。
【０１３５】
脂質生成微生物は、フラスコまたはバイオリアクターを含む任意の好適な容器（複数可）で培養され得る。いくつかの実施例では、変異微生物は藻類であり、培養期間の少なくとも一部分の間光に曝露され、期間中に、藻類は人工光または自然光（または人工光が補充されている自然光）に曝露されてもよい。低光への応答が規制解除された変異藻類を含む培養物は、例えば、自然のまたはプログラムされた明／暗サイクルであり得る明／暗サイクルで培養され得、例示的な実施例として、１２時間の明所対１２時間の暗所、１４時間の明所対１０時間の暗所、１６時間の明所対８時間の暗所などを提供してもよい。あるいは、藻類変異体は、連続的に明所で培養してもよい。
【０１３６】
培養とは、選択および／または制御された条件の使用によって、１つ以上の細胞の増殖（例えば細胞サイズ、細胞内容物、および／または細胞活性の増加）および／または繁殖（例えば、有糸分裂を介した細胞数の増加）の意図的な養育を指す。増殖および繁殖の両方の組み合わせは、生育（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）と称され得る。本明細書で提供される微生物は、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、または少なくとも約１５日、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間以上の間培養され得る。培養は、任意選択的に、対照藻類に対して栄養素が豊富な培養培地で行ってもよい。
【０１３７】
組換え微生物の培養に使用することができる選択および／または制御された条件の非限定的な例は、（ｐＨ、イオン強度、および／または炭素源などの既知の特徴を有する）定義された培地、特定の温度、酸素分圧、二酸化炭素レベル、バイオリアクターでの増殖など、またはそれらの組み合わせの使用を含み得る。いくつかの実施形態では、微生物または宿主細胞は、光および還元炭素源の両方を使用して、混合栄養で増殖させることができる。あるいは、微生物または宿主細胞は、光栄養で培養してもよい。藻類株は、光栄養で増殖させると、エネルギー源として光を有利に使用することができる。微生物による生体分子の合成には、ＣＯ２または重炭酸塩などの無機炭素源を使用してもよい。本明細書で使用される場合、「無機炭素」には、生物によって持続可能なエネルギー源として使用されることができない炭素含有化合物または分子が含まれる。典型的には「無機炭素」は、ＣＯ２（二酸化炭素）、炭酸、重炭酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩など、またはそれらの組み合わせの形態であり得、持続可能なエネルギーのためにさらに酸化されることも、生物による還元力の源として使用されることもできない。光独立栄養で増殖させる微生物は、無機炭素が実質的に唯一の炭素源である培養培地で増殖させることができる。例えば、無機炭素が実質的に唯一の炭素源である培養では、培養培地に提供され得る任意の有機（還元）炭素分子または有機炭素化合物のいずれも、エネルギーとして細胞によって摂取および／もしくは代謝されることができず、かつ／または細胞培養物の増殖および生育のための持続可能なエネルギーを提供するのに十分な量で存在しない。
【０１３８】
本発明の方法に従って有用であり得る微生物および宿主細胞は、世界中の様々な場所および環境で見出すことができる。脂質および／または他の生成物の最適な増殖および生成のための特定の増殖培地は変動し得、脂質、タンパク質、色素、抗酸化剤などの生成物の増殖、繁殖、または生成を促進するために最適化することができる。場合によっては、微生物のある特定の株は、いくつかの阻害性の構成要素が存在するか、または微生物もしくは宿主細胞の特定の株のいくつかの本質的な栄養要件が存在しないので、特定の増殖培地で増殖させることが不可能な場合がある。
【０１３９】
固体および液体の増殖培地は、一般に、多種多様な微生物株に好適な特定の培地の調製に関する説明と同様に、多種多様な源から入手可能である。例えば、様々な淡水および塩水培地は、藻類を培養するための培地および方法についてのＢａｒｓａｎｔｉ（２００５）Ａｌｇａｅ：Ａｎａｔｏｍｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓに記載のものを含むことができる。藻類培地のレシピはまた、非限定的な例として、ＵＴＥＸ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ、およびＫａｔｅｄｒａ  Ｂｏｔａｎｉｋｙを含む、様々な藻類培養コレクションのウェブサイトで見出すことができる。
【０１４０】
培養方法は、任意選択的に１つ以上の遺伝子の発現を誘導すること、および／または微生物における代謝経路を調節することを含み得る。発現の誘導は、培養物に栄養素または化合物を添加すること、培養培地から１つ以上の構成要素を取り出すこと、光および／もしくは温度を増加または減少させること、ならびに／または目的の遺伝子の発現を促進する他の操作を含み得る。かかる操作は、目的の遺伝子に操作可能に連結された（異種）プロモーターの性質に大きく依存し得る。
【０１４１】
本発明のいくつかの実施形態では、脂質生産性が増加されている微生物は、人工光源を備え、かつ／または太陽光を含む光を透過するのに十分透明である１つ以上の壁を有するフォトバイオリアクターで培養して、許容可能な微生物の増殖および生育を可能にし、促進し、かつ／もしくは維持することができる。脂肪酸生成物またはトリグリセリドの生成のために、光合成微生物または宿主細胞は、加えてまたはあるいは、振盪フラスコ、試験管、バイアル、マイクロタイター皿、ペトリ皿など、またはそれらの組み合わせで培養することができる。
【０１４２】
加えてまたは代替的に、変異または組換え光合成微生物または宿主細胞は、池、運河、海上の増殖容器、壕、水路、水管など、またはそれらの組み合わせで増殖させることができる。かかるシステムでは、温度が調節されていない場合があるか、または様々な加熱もしくは冷却方法もしくは装置が採用され得る。標準的なバイオリアクターと同じように、限定されないが、空気、ＣＯ２濃縮空気、煙道ガスなど、またはそれらの組み合わせを含む、無機炭素源（限定されないが、ＣＯ２、重炭酸塩、炭酸塩など）を、培養物に供給してもよい。煙道ガスおよび／またはＣＯ２に加えてＣＯを含有し得る他の無機源を供給するとき、（光）バイオリアクターに導入されるＣＯレベルが、微生物の増殖、育成、および／または生存に関して危険な量および／または致死量を構成しないように、かかる源を前処理する必要があり得る。
【０１４３】
変異微生物は、限定されないが、脂質などの生成物の生成のための、ポリペプチドをコードする１つ以上の非天然遺伝子を任意選択的に含み得る。
【０１４４】
方法は、バイオマスまたは脂質を生成するために同じ条件下で培養すると、対照細胞と比較して脂質生産性が増加されている、本明細書で提供される変異微生物など、本明細書で提供される変異微生物を培養することを含む。脂質は、例えば、有機溶媒を使用する全培養物抽出によって、または脂質が抽出されるバイオマスを最初に単離することによって（例えばＨｕｓｓｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７５：３０４８−３０５７、Ｇｒｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ２０：４９１−５１５を参照されたい）など、当業者に既知の回収手段によって培養物から回収することができる。場合によっては、細胞の均質化によって脂肪酸生成物の回収率を向上することができる（Ｇｕｎｅｒｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ３３：２４３−２６０）。例えば、脂肪酸、脂肪酸誘導体、および／またはトリグリセリドなどの脂質は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年２月２９日出願の「Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ａｌｇａｅ」と題され、同時係属の共同譲渡された米国特許公開第ＵＳ２０１３／０２２５８４６号に記載のように、高温および／または高圧で溶媒を用いて藻類を抽出することによって、藻類から単離することができる。
【０１４５】
バイオマスは、例えば、遠心分離または濾過によって収穫することができる。バイオマスは、乾燥および／または凍結することができる。例えば、様々な脂質または１つ以上のタンパク質などのさらなる生成物は、バイオマスから単離することができる。また本明細書に記載されるのは、限定されないが、配列番号１に対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するＴＰＲドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子の変異、および／または配列番号２に対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の変異を含む脂質調節因子変異体などの、本明細書に開示の任意のものなどの脂質調節因子変異体のバイオマスを含む藻類バイオマスである。また本明細書に記載されるのは、限定されないが、配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するＤＵＦ４４７０ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子の変異を含む脂質調節因子変異体など、本明細書に開示の任意のものなど、脂質調節因子変異体のバイオマスを含む、藻類バイオマスである。
【０１４６】
本明細書で提供される藻類変異体の溶解物は、当技術分野で既知の方法を使用して生成することができる。非限定的な例として、かかる方法は、酵素（例えば、プロテアーゼまたは他の細胞壁消化酵素）、グアニジニウムもしくは尿素などのカオトロピック剤、例えば、０．１〜５％以上の範囲の濃度の洗剤、および／または限定されないが、乳鉢と乳棒での粉砕（任意選択的に凍結細胞を使用）、凍結融解、低張溶解、超音波処理、ビーズ破砕、加熱、高圧、キャビテーションなど、もしくはそれらの任意の組み合わせを含む、物理的破壊を使用することができる。溶解物は、任意選択的に、任意の重力、例えば、１〜１００，０００ｘｇ以上で遠心分離された溶解細胞の上清であり得る透明な溶解物であり得る。あるいは、または加えて溶解物は、濾過、透析、または濃縮された溶解物であってもよい。
【０１４７】
前述の実施形態のうちのいずれかに代えて、またはそれに加えて、本発明は次の実施形態を提供する。
【０１４８】
実施形態１は、ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減弱されているか、または遺伝子が破壊されている変異微生物であって、
ポリペプチドは、
任意選択的にＴＰＲドメインが、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する、ＴＰＲドメイン、および／または
任意選択的にＤＵＦ４４７０ドメインが、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する、ＤＵＦ４４７０ドメイン、
配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、
を含み、
変異微生物および対照微生物が同一条件下で培養されると、変異微生物は、任意選択的に対照微生物が野生型微生物である対照微生物よりも少なくとも約２５％多く脂質を生成し、かつ／または対照微生物と比較して脂質への炭素分配の増加を呈する。
【０１４９】
実施形態２は、変異微生物が、不等毛類もしくは藻類種におけるＮａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座もしくはシンテニー遺伝子座に局在する遺伝子に対する、もしくはその遺伝子の発現に影響を及ぼす１つ以上の変異を含み、かつ／または配列番号４に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するオープンリーディングフレームを含む遺伝子の発現に影響を与える１つ以上の変異を含む、実施形態１に記載の変異微生物である。
【０１５０】
実施形態３は、変異微生物が、変異微生物および対照微生物を同一条件下で培養すると、対照微生物よりも少なくとも約５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、もしくは少なくとも２００％多く脂肪酸メチルエステル誘導体化脂質（ＦＡＭＥ脂質）を生成し、かつ／または変異微生物および対照微生物を同一条件下で培養すると、対照微生物のＦＡＭＥ／ＴＯＣ比率よりも少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１２０％、少なくとも１４０％、少なくとも１６０％、少なくとも１８０％、少なくとも２００％、少なくとも２２０％、少なくとも２４０％、少なくとも２６０％、少なくとも２８０％、もしくは少なくとも３００％高いＦＡＭＥ／ＴＯＣ比率を呈する、実施形態１または実施形態２に記載の変異微生物である。
【０１５１】
実施形態４は、微生物が、藻類または不等毛類種であり、任意選択的に変異微生物が、Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ、Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ、Ａｍｐｈｏｒａ、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ、Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ、Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ、Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ、Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ、Ｃａｒｔｅｒｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ、Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ、Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｅｌｉｐｓｏｉｄｏｎ、Ｅｍｉｌｉａｎｉａ、Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ、Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ、Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ、Ｆｒａｎｃｅｉａ、Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ、Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ、Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ、Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ、Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ、Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ、Ｍｏｎｏｄｕｓ、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｎａｖｉｃｕｌａ、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ、Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ、Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｐａｓｃｈｅｒｉａ、Ｐａｖｌｏｖａ、Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｐｈａｇｕｓ、Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ、Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ、Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ、Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ、Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ、Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ、Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ、Ｖａｕｃｈｅｒｉａ、Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ、Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ、およびＶｏｌｖｏｘからなる群から選択される藻類種であるか、または任意選択的に変異微生物が、ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔｅｓ、ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ、ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔｅｓ、ｐｈａｅｏｐｈｙｔｅｓ、ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅｓ、もしくはｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔｅｓからなる群から選択される不等毛類であるか、または任意選択的に変異微生物が、Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌａ、Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ、もしくはＵｌｋｅｎｉａのＬａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅ種からなる群から選択される不等毛類である、変異微生物である。
【０１５２】
実施形態５は、同一培養条件が、２ｍＭ未満のアンモニウムを含む含む培養培地、任意選択的に硝酸塩が唯一の窒素源である培養培地を含み、かつ／または培養条件が、バッチ、半連続、もしくは連続培養条件のうちのいずれかである、実施形態１〜４のいずれかに記載の変異微生物である。
【０１５３】
実施形態６は、変異微生物が藻類であり、培養条件が光独立栄養条件である、実施形態５に記載の変異微生物である。
【０１５４】
実施形態７は、変異微生物が、古典的に誘導された変異体または遺伝子操作変異体であり、次のうちのいずれか１つ以上：
変異微生物が、任意選択的にＣａｓ／ＣＲＩＳＰＲシステム、ＲＮＡｉ構築物、リボザイム構築物、またはアンチセンス構築物を使用して生成されるノックダウン変異体である；
変異微生物がノックダウン変異体であり、変異が遺伝子の非コード領域への部分的または完全な欠失、短縮、フレームシフト、および／または挿入変異によって遺伝子を破壊する；
変異微生物がノックアウト変異体であり、任意選択的に部位特異的相同組換え、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、および／またはＣａｓ／ＣＲＩＳＰＲシステムによって生成される；ならびに
変異微生物がノックアウト変異体であり、変異が部分的または完全な欠失、短縮、フレームシフト、および／または挿入変異によって遺伝子を破壊する
が当てはまる、実施形態１〜６のいずれかに記載の変異微生物である。
【０１５５】
実施形態８は、変異微生物が、
除草剤耐性、毒素耐性、向上した増殖特性、向上した光合成効率、向上した脂質生成もしくは蓄積、および／または特定の脂質の生成を与える、少なくとも１つの追加の遺伝子改変
を含む、実施形態１〜７のいずれかに記載の変異微生物である。
【０１５６】
実施形態９は、変異微生物が脂質を生成し、任意選択的に微生物、培養培地、または両方から脂質を単離し、任意選択的に微生物が、バッチ、連続、または半連続培養条件を使用して培養される、
実施形態１〜８のいずれかに記載の変異微生物を培養培地中で培養する工程を含む、脂質を生成する方法である。
【０１５７】
実施形態１０は、微生物が藻類であり、培養が光独立栄養条件下である、実施形態９に記載の変異微生物である。
【０１５８】
実施形態１１は、微生物がＬａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅであり、培養が、従属栄養条件下である、実施形態９に記載の変異微生物である。
【０１５９】
実施形態１２は、ＣＲＩＳＰＲシステムのガイドＲＮＡであり、ガイドＲＮＡは、配列番号７で示される標的配列に対応する配列を含み、ガイドＲＮＡは、キメラガイドであるか、またはガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ配列を含まない。
【０１６０】
実施形態１３は、構築物が、配列番号１、配列番号２、および／もしくは配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする自然発生する藻類遺伝子、Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座に局在する遺伝子、ならびに／または配列番号４に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも約９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＯＲＦを含む遺伝子、からの、または、それらに隣接する、ヌクレオチド配列を含む、相同組換えのための核酸構築物である。
【０１６１】
実施形態１４は、核酸構築物が、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはリボザイムの発現のためであり、配列番号１、配列番号２、および／もしくは配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする自然発生する遺伝子、Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座に局在する遺伝子、ならびに／または配列番号４に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＯＲＦを含む遺伝子、の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【０１６２】
実施形態１５は、ガイドＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、および／もしくは配列番号３に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする自然発生する藻類遺伝子、Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座に局在する遺伝子、ならびに／または配列番号４に対して少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＯＲＦを含む遺伝子、の少なくとも一部分を含む、ＣＲＩＳＰＲのガイドＲＮＡをコードする核酸分子である。
【０１６３】
実施形態１６は、ＴＰＲドメインを含むポリペプチドの発現を減弱させる１つ以上の変異および／または１つ以上の作用物質を微生物に導入することによって変異微生物が生成され、１つ以上の変異が、配列番号１、配列番号２、および／もしくは配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座に局在する遺伝子、または配列番号４のヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含む遺伝子の発現に影響を与え、任意選択的に、１つ以上の作用物質が、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、Ｃａｓ／ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素、および／または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムの構成要素からなる群から選択される、本明細書に開示の変異微生物を生成するための方法が提供される。
【０１６４】
当業者によって理解されるであろうように、他の実施形態も本明細書で考慮される。ある特定の実施形態は、次の実施例でさらに説明されている。これらの実施形態は、例としてのみ提供されており、いかなる場合にも特許請求の範囲を限定することを意図しない。
【０１６５】
本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。すべての見出しは閲読者の便宜のためのものであり、いかなる場合にも本発明を限定しない。本発明の態様または実施形態への言及は、記載の態様が、本発明の他の説明された態様または本発明の他の態様の特色と組み合わせることができないことを必ずしも示すものではない。
【実施例】
【０１６６】
実施例で使用される培地
ＰＭ０６６培地は、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ  ｓａｌｔ中の微量の金属およびビタミンとともに唯一の窒素源として８．８ｍＭの硝酸塩、および０．４１７ｍＭのリン酸塩（ＰＯ４）を含む。ＰＭ０６６培地は、４ｍｌのキレート化金属ストック溶液および４ｍｌのビタミンストック溶液とともに、１．７５ＭのＮａＮＯ３ストック溶液（１４８．７ｇ／Ｌ）５．７１ｍｌ、および７７ｍＭのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏストック溶液（１７．５７ｇ／Ｌ）５．４１ｍｌを、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ  ｓａｌｔ溶液（３５ｇ／Ｌ）９８１ｍｌに添加することによって作製した。キレート化金属ストック溶液は、２．１８ｇのＮａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、１．５７５ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、３９．２ｍＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏストック溶液（０．９８ｇ／１００ｍｌ）５００μｌ、７７．５ｍＭのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏストック溶液（２．２３ｇ／１００ｍｌ）５００μｌ、４２．０ｍＭのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏストック溶液（１．００ｇ／１００ｍｌ）５００μｌ、９１０．０ｍＭのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏストック溶液（１８．０／１００ｍｌ）５００μｌ、２６．０ｍＭのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏストック溶液（０．６３ｇ／１００ｍｌ）５００μｌを４００ｍｌの水に添加し、５００ｍｌの最終体積にし、濾過滅菌することによって調製した。ビタミンストック溶液は、０．０５ｇのチアミンＨＣｌ、０．３７ｍＭのシアノコバラミンストック溶液（０．０５ｇ／１００ｍｌ）５００μｌ、および０．４１ｍＭのビオチンストック溶液（０．０１ｇ／１００ｍｌ）２．５ｍｌを４００ｍｌの水に添加し、最終体積を５００ｍｌにし、濾過滅菌することによって調製した。
【０１６７】
ＰＭ０６７培地は、窒素源を含まず（硝酸塩、アンモニウム、または尿素なし）、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ  ｓａｌｔ中の微量金属およびビタミンとともに、０．４１７ｍＭのリン酸塩（ＰＯ４）を含む。ＰＭ０６７培地は、４ｍｌのキレート化金属ストック溶液および４ｍｌビタミンストック溶液とともに、７７ｍＭのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏストック溶液（１７．５７ｇ／Ｌ）５．４１ｍｌを、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ  ｓａｌｔ溶液（３５ｇ／Ｌ）９８７ｍｌに添加することによって作製した。キレート化金属ストック溶液は、２．１８ｇのＮａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、１．５７５ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、３９．２ｍＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏストック溶液（０．９８ｇ／１００ｍｌ）５００μｌ、７７．５ｍＭのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏストック溶液（２．２３ｇ／１００ｍｌ）５００μｌ、４２．０ｍＭのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏストック溶液（１．００ｇ／１００ｍｌ）５００μｌ、９１０．０ｍＭのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏストック溶液（１８．０／１００ｍｌ）５００μｌ、２６．０ｍＭのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏストック溶液（０．６３ｇ／１００ｍｌ）５００μｌを４００ｍｌの水に添加し、５００ｍｌの最終体積にし、濾過滅菌することによって調製した。ビタミンストック溶液は、０．０５ｇのチアミンＨＣｌ、０．３７ｍＭのシアノコバラミンストック溶液（０．０５ｇ／１００ｍｌ）５００μｌ、および０．４１ｍＭのビオチンストック溶液（０．０１ｇ／１００ｍｌ）２．５ｍｌを４００ｍｌの水に添加し、最終体積を５００ｍｌにし、濾過滅菌することによって調製した。
【０１６８】
ＰＭ０７４は、１．３ｍｌのＰＲＯＬＩＮＥ（登録商標）Ｆ／２Ａｌｇａｅ  Ｆｅｅｄ  Ｐａｒｔ  Ａ（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１．３ｍｌのＰＲＯＬＩＮＥ（登録商標）Ｆ／２Ａｌｇａｅ  Ｆｅｅｄ  Ｐａｒｔ  Ｂ（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、最終体積１リットルのＩｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ  ｓａｌｔ（３５ｇ／Ｌ）（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｏｐｋａ，ＦＬ））の溶液に添加することによって作製した１０ＸＦ／２である、唯一の窒素源として硝酸塩を含む（「硝酸塩のみ」）窒素が豊富な培地である。Ｐｒｏｌｉｎｅ  ＡおよびＰｒｏｌｉｎｅ  Ｂは、一緒に８．８ｍＭのＮａＮＯ３、０．３６１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、１０×Ｆ／２微量金属、および１０ＸＦ／２ビタミン（「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ｅｄｓ：Ｓｍｉｔｈ  Ｗ．Ｌ．ａｎｄ  Ｃｈａｎｌｅｙ  Ｍ．Ｈ．）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ．ｐｐ２６−６０）に記載のＧｕｉｌｌａｒｄ（１９７５）海洋無脊椎動物の餌用の植物プランクトンの培養物）を含む。
【０１６９】
ＰＭ１２４培地は、５ｍＭのアンモニウムおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳが補充されているＰＭ０７４（ｐＨ８．０）である。これは、１０ｍｌのＨＥＰＥＳ（１Ｍ、ｐＨ８）および５ｍｌのＮＨ４ＣｌをＰＭ０７４レシピに添加することによって作製する（最終体積１Ｌ）。アンモニウムレベルを制御した追加の培地は、ＰＭ０７４のアンモニウム濃度を調節し、追加のＨｅｐｅｓ緩衝液を添加することによって、作製した。
【０１７０】
ＰＭ０６６、ＰＭ０７４、およびＰＭ１２４培地は、野生型Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓと比較して窒素が豊富かつ栄養素が豊富である。
【０１７１】
実施例１．
窒素飢餓中の下方制御されたポリペプチドの識別
Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓの様々な株が、窒素枯渇中に高レベルのトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）貯蔵脂質を蓄積し、ＴＡＧ合成につながる異なる代謝経路での遺伝子発現における、ＴＡＧ生成の増加と、ＴＡＧ蓄積と、推定される根本的な変化との間の相関関係が報告されている（Ｒａｄａｋｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３：６８６、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２６：１６４５−１６６５、Ｃｏｒｔｅｇｇｉａｎｉ  Ｃａｒｐｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ  ７：１６４５−１６６５）。脂質の生合成および蓄積に影響を与える調節因子をコードする遺伝子を識別するために、Ｎ枯渇（−Ｎ）を施されたＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ細胞の初期転写応答を分析した。Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓが貯蔵脂質の生合成を誘導する窒素飢餓下でのＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ細胞の遺伝子のＲＮＡ転写レベルを、増殖培地中の窒素の量を制限しないことを除いて同一条件下で増殖させたＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａの同じ株のＲＮＡ転写レベルと比較する、トランスクリプトミクスの比較実験を実施した。 
【０１７２】
野生型Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ（ＷＴ−３７３０）細胞を、栄養素が豊富な培地中で、１６時間明所（１２０μＥ）／８時間暗所のサイクルで光を制限（１．２５のＯＤまで）して増殖させ、光周期の初めに遠沈させ、窒素が豊富な培地ＰＭ０６６または窒素源を欠く培養培地（「窒素欠乏」または「−Ｎ」培地、ＰＭ０６７）のいずれかに再懸濁し、提供された光条件下で培養した。窒素が豊富な（＋Ｎ）培地または窒素が欠乏した（−Ｎ）培地で細胞を再懸濁した後、様々な時間間隔で取り出した試料からＲＮＡを単離した。脂質蓄積は、アッセイ全体を通して採取した試料から決定した。脂質蓄積（実施例３に記載のＦＡＭＥとして測定）は、３時間の時点で窒素欠乏培養物と窒素が豊富な培養物との間で区別不可能であったが、窒素欠乏培養物の１０時間でのＦＡＭＥ蓄積は、窒素豊富培養物のものの２倍であった。生物学的三つ組培養で処理を実施した。転写変化が代謝変化に先行するはずであるという仮定の下で、ｍＲＮＡ配列では３時間の時点を選択した。各処理の２つの試料の配列決定を行った。
【０１７３】
各藻類細胞培養物１０ｍｌを遠沈させ（４０００×ｇで５分間）、上清をデカントすることによって、ＲＮＡを単離した。１．８ｍｌの緩衝液Ａ（５ｍｌのＴＬＥ粉砕緩衝液、５ｍｌのフェノール、１ｍｌの１−ブロモ−３−クロロプロパン、および２０メルカプトエタノール、最終体積５０ｍｌのＴＬＥ粉砕緩衝液は、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）９ｍｌ、５ｍｌの１０％ＳＤＳ、７．５ＭのＬｉＣｌ ０．６ｍｌ、および０．５ＭのＥＤＴＡ ４５０μｌを含む）にペレットを再懸濁し、２００μｍのジルコニウムビーズおよそ０．５ｍｌを含有する、２ｍｌの微量エッペンチューブに移した。チューブを４℃で５分間激しくボルテックスし、次いで１１．８×ｇで２分間遠心分離した。次いで水層を取り出し、新しい２ｍｌチューブにピペッティングして、これに１ｍｌの２５：２４：１フェノール抽出緩衝液（２５ｍｌのフェノール（ｐＨ８．１）、２４ｍｌの１−ブロモ−３−クロロプロパン、および１ｍｌのイソアミルアルコール）を添加した。チューブを激しく振盪し、１１．８×ｇで２分間遠心分離した。遠心分離後、水層を取り出し、新しい２ｍｌのエッペンチューブにピペッティングし、これに１ｍｌの１−ブロモ−３−クロロプロパンを添加した。チューブを振盪し、再び１１．８×ｇで２分間遠心分離した。水層を新しいチューブに取り出し、０．３５６体積の７．５ＭのＬｉＣｌを添加した。チューブを１０〜１２回反転させ、−２０℃で一晩貯蔵した。翌日、試料を混合せずに室温に戻し、１６，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を取り出し、ペレットを氷冷した８０％エタノール１ｍＬで洗浄した。チューブを１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を取り出した後、風乾させた。最後に、ＲＮＡペレットを５０μｌの超純水に再懸濁した。製造業者の指示書に従ってＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーおよびＲＮＡ６０００ＬａｂＣｈｉｐを使用して、オンチップゲル電気泳動によってＲＮＡの品質を評価した。
【０１７４】
製造業者の指示書に従ってＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を利用して単離したＲＮＡから、次世代シーケンシングライブラリーを調製した。Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ）を使用して、ＴｒｕＳｅｑライブラリーを配列決定して、ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ手順を使用して１００ｂｐのペアエンドリードを生成した（Ｍｏｒｔａｚａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５：６２１−６２８に記載されている）。ＴｏｐＨａｔ（ｔｏｐｈａｔ．ｃｂｃｂ．ｕｍｄ．ｅｄｕ／）を使用して、マッピング可能なリードをＮ．ｇａｄｉｔａｎａ参照ゲノム配列に揃えた。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓソフトウェア（ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ．ｃｂｃｂ．ｕｍｄ．ｅｄｕ）のＣｕｆｆｄｉｆｆ構成要素を使用して、すべてのアノテーションされた遺伝子の発現レベルを算出した。ＴｏｐＨａｔおよびＣｕｆｆｌｉｎｋｓは、Ｔｒａｐｎｅｌｌら（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ７：５６２−５７８に記載されている。Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｅｄｇｅＲを使用して、異なる発現分析を実施した（ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４０：ｄｏｉ：１０／１０９３／ｎａｒ／ｇｋｓ０４２））。標準パラメータを使用して、各試料のすべての遺伝子について、１００万分の１キロベース当たりの断片（ＦＰＫＭ）の単位で発現レベルを報告した。ＦＰＫＭは、転写産物の長さの違いを正規化する、相対的な転写レベルの尺度である。
【０１７５】
ＴＰＲドメイン含有タンパク質をコードする遺伝子（Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座、本明細書ではＴＰＲ−６０２９遺伝子と称される）は、Ｎ豊富培養条件とＮ欠乏培養条件との間で差次的に発現されていると識別された。この遺伝子（配列番号４として提供されるｃＤＮＡ配列）は、ＴＰＲ（トリペンタコペプチドリピート）ドメイン（配列番号１）および未知の機能のドメイン（ＤＵＦ４４７０）（ｐｆａｍ  ＩＰＲ０２７９７４、配列番号２）を有する、ポリペプチド（配列番号３）をコードする。配列番号３のポリペプチドの図を、図１に提供する。
【０１７６】
実施例２．
ＮＡＮＮＯＣＨＬＯＲＯＰＳＩＳのＴＰＲドメイン含有タンパク質（ＮＡＧＡ＿１００１４８Ｇ８）をコードする遺伝子のノックアウト
ＴＰＲドメイン含有タンパク質をコードする遺伝子を、標的変異誘発によって機能的に切除またはノックアウトした、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａのトランスジェニック藻類株を作製した。野生型Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ株は、ＷＴ−３７３０と示す。ノックアウト変異体は、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して生成した。
【０１７７】
ノックアウト変異体は、発明者Ｊｏｈｎ  ＶｅｒｒｕｔｏおよびＥｒｉｃ  Ｍｏｅｌｌｅｒｉｎｇの名で２０１５年１２月３１日出願の、同時係属中の出願公開第ＵＳ２０１７／００７３６９５号「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｉｎ  ＶｉｖｏＧｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ」に開示の、高効率Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  Ｃａｓ９発現エディターラインを使用して作製した。化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）  Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする遺伝子を発現する株ＧＥ−６７９１を、挿入ノックアウトのためのキメラガイドＲＮＡおよびドナーＤＮＡを用いる形質転換用の宿主として使用した。株ＧＥ−６７９１は、次の３つの要素：
（１）Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ  ＲＰＬ２４プロモーター（配列番号１１）によって推進される、Ｎ末端核局在化シグナル（配列番号８）と、続いてＦＬＡＧタグ（配列番号９）と、ペプチドリンカー（配列番号１０として一緒に提供される）とをコードする配列を含む、Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａのためにコドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来Ｃａｓ９遺伝子（配列番号７）、を含有し、Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ双方向ターミネーター２（配列番号１２）によって末端処理された、Ｃａｓ９発現カセット；
（２）Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ  ＴＣＴＰプロモーター（配列番号１４）によって推進される、Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａのためにコドン最適化されたアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）由来ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子（配列番号１３）、を含有し、その後ＥＩＦ３ターミネーター（配列番号１５）が続く、選択可能なマーカー発現カセット；ならびに
（３）Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ  ４Ａ−ＩＩＩプロモーター（配列番号１７）によって推進される、Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａのためにコドン最適化されたＴｕｒｂｏＧＦＰ遺伝子（Ｅｖｒｏｇｅｎ（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ））（配列番号１６）、を含有し、Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ双方向ターミネーター５（配列番号１８）が続く、ＧＦＰレポーター発現カセット
を含むベクターｐＳＧＥ−６２０６（配列番号６、図２）で、野生型Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ株ＷＴ−３７３０を形質転換することにより生成した。形質転換は、本質的には、公開されている米国出願第ＵＳ２０１４／０２２０６３８号に開示のとおりである（「Ａｌｇａｌ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｈａｖｉｎｇ  ａ  ｌｏｃｋｅｄ−ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｌｉｇｈｔ  ａｃｃｌｉｍａｔｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ」、２０１３年１２月６日出願）。
【０１７８】
形質転換混合物を、１００ｍｇ／Ｌのブラストサイジンを含有するＰＭ０７４寒天培地にプレーティングした。分析およびアーカイブのために、得られたコロニーを選択培地にパッチした。パッチから少量のバイオマスを採取し、３００μｌの１×Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ  Ｓａｌｔ溶液（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，（Ａｐｏｐｋａ，ＦＬ））に、完全に再懸濁した。バイオマスを過剰に添加しないように注意して、薄緑色の再懸濁液を得た。この懸濁液を、４８８ｎｍレーザーおよび５３０／１０ｎｍフィルターを使用して、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を使用するフローサイトメトリーによって直接分析して、細胞当たりのＧＦＰ蛍光を測定した。遅い流体素子環境を使用して、各試料について１０，０００〜３０，０００の事象を記録した。野生型細胞によって実証されるよりも高い蛍光レベルにシフトした単一の蛍光ピークを有し、ウエスタンによるＣａｓ９タンパク質発現を実証する、本明細書でＧＥ−１３０３８と称される株を、Ｃａｓ９エディター株として選択し、本明細書に開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集による変異体生成に使用した。
【０１７９】
ＴＰＲドメイン含有タンパク質をコードする遺伝子（配列番号３をコードする「ＴＰＲ−６０２９」遺伝子）を、Ｃａｓ９が媒介するゲノム編集を使用する破壊の標的とした。簡単に言えば、ハイグロマイシン耐性発現カセットを標的として、未知の機能のドメイン（ＤＵＦ４４７０）をコードする遺伝子の一部分に挿入した（図１）。破壊のために、Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子を標的とするキメラガイドＲＮＡを生成するために、キメラガイドＲＮＡ生成用の２つのＤＮＡ構築物を作製し、ここでこのＤＮＡ分子は、Ｔ７プロモーターの下流に、操作したキメラガイド配列を含有した（ＳＧＩ−ＤＮＡ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））。第１の構築物では、キメラガイド配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９  ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）の上流にあるＴＰＲドメインをコードする、Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子配列内の配列に対して相同な２３ｂｐの標的配列（ＰＡＭ配列を含む、配列番号５）を含み、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）配列も含んだ。ガイドＲＮＡを合成するために、相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドから構成されるＤＮＡテンプレートをまず作製し、アニーリングさせて二重鎖ＤＮＡテンプレートを作り、これを、製造業者の指示書に従ってＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）＃ＡＭ１３５４Ｍ）を使用するインビトロ転写反応に使用して、キメラガイド配列を合成した。製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏ−Ｓｐｉｎ（商標）Ｖ−Ｅカラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＃Ｃ１０２４−２５）を使用して、得られたＲＮＡを精製した。
【０１８０】
標的Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座に挿入するためのドナー断片は、Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ  ＥＩＦ３プロモーター（配列番号２０）の下流にハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨｙｇＲ、配列番号１９）、および続いてＮ．ｇａｄｉｔａｎａ双方向ターミネーター２（配列番号１２）を含む、選択可能なマーカーカセットを含み、５’（配列番号２１）および３’（配列番号２２）末端で２７塩基対の識別配列を、プロモーター−ハイグロマイシン耐性遺伝子−ターミネーター配列全体に隣接させて、「Ｈｙｇ耐性カセットＮａｇａ＿１００１４８ｇ８」（配列番号２３）と称されるＤＮＡ断片を得た。
【０１８１】
Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座で遺伝子を標的とするノックアウトのために、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０２２０６３８に本質的に記載のように、遺伝子を標的とする精製した５μｇのキメラガイドＲＮＡ、および１μｇの選択可能なドナーＤＮＡ（Ｈｙｇ耐性カセットＮａｇａ＿１００１４８ｇ８、配列番号２３）を使用するエレクトロポレーションによって、Ｃａｓ９エディターラインＧＥ−１３０３８を形質転換した。エレクトロポレーションに続いて、ハイグロマイシン耐性カセットを組み込んだ形質転換体を選択するために、ハイグロマイシンを含有するＰＭ１２４寒天培地に細胞をプレーティングした。形質転換体を新しいプレートにパッチし、コロニーＰＣＲによって、Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座での遺伝子へのドナー断片の挿入についてスクリーニングした。
【０１８２】
コロニーＰＣＲスクリーニングでは、スクリーニングされるコロニーからの少量の細胞を、１００μｌの５％Ｃｈｅｌｅｘ１００Ｒｅｓｉｎ（ＢｉｏＲａｄ）／ＴＥ溶液に懸濁し、懸濁液を９９°Ｃで１０分間沸騰させた後、チューブを短時間回転させた。製造業者からのＱＩＡＧＥＮ  Ｆａｓｔ  Ｃｙｃｌｉｎｇ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で入手可能なハンドブック）に従ってＰＣＲ混合物および反応を設定および実施したＰＣＲ反応混合物に、１マイクロリットルの溶解物の上清を添加した。標的Ｎａｇａ＿１００１４８ｇ８遺伝子座へのドナー断片の挿入を検出するために使用したプライマーは、配列番号２４および配列番号２５であった。ＰＣＲに基づくコロニースクリーニングによって、ドナー断片のｃａｓ９特異的挿入により標的部位に挿入されている、ＴＰＲ−６０２９遺伝子のノックアウト株であるＧＥ−１５３６０を識別した（図１に矢印で示されている）。このノックアウト挿入変異体は、生産性アッセイでさらに試験した。
【０１８３】
実施例３．
バッチ生産性アッセイにおけるＮＡＧＡ＿１００１４８Ｇ８ノックアウト変異体
藻類増殖を支持することができる還元炭素源の非存在下で、細胞が利用可能な唯一の窒素源として８．８ｍＭの硝酸塩を含む、窒素が豊富な培地ＰＭ０７４において、変異体株をバッチ生産性アッセイで評価した（すなわち、光独立栄養条件下で生産性アッセイを行った）。接種後、操作されたノックアウト株および野生型株ＷＴ−３７３０を、１７５ｍｌのＰＭ０７４培地を含有する７５ｃｍ２の長方形の組織培養フラスコで７日間、三つ組培養のバッチアッセイで増殖させた。これらの条件下では、およそ３日目に培養培地で窒素が制限され始め、培養培地の窒素濃度はアッセイの残りの期間を通じて低下し続ける。ＬＥＤライトに対して最も狭い「幅」寸法に、フラスコを配置した。培養フラスコを不透明な白いプラスチックで覆って、照射が培養物に到達するように２１．１ｃｍ２の長方形の開口部を設けた。入射放射は、１６時間の明所：８時間の暗所サイクルにプログラムし、放射を０から１２００ｕＥまで直線的に増加させ、次いで４時間にわたって放射を１２００から０ｕＥまで直線的に減少させた。脱イオンＨ２Ｏを培養物に毎日添加して、蒸発による損失を補った。２５℃に設定した水浴によって、培養物の温度を調節した。培養物を０日目にＯＤ７３０が０．５になるように接種し、試料（５ｍｌ）を３、５、７日目に取り出して、脂質の尺度として細胞密度、および脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を評価した。サンプリングは、明所サイクルの終了３０分前に行った。
【０１８４】
ＦＡＭＥ分析は、ＧｅｎｅＶａｃ  ＨＴ−４Ｘを使用して乾燥させた２ｍｌの試料で実施した。乾燥させたペレットの各々に、５００ｍＭのＫＯＨメタノール溶液５００μＬ、０．０５％ブチル化ヒドロキシルトルエンを含有するテトラヒドロフラン２００μＬ、２ｍｇ／ｍｌ  Ｃ１１：０遊離脂肪酸／Ｃ１３：０トリグリセリド／Ｃ２３：０脂肪酸メチルエステル内部標準ミックス４０μＬ、およびガラスビーズ（直径４２５〜６００μｍ）５００μＬを添加した。バイアルは、上部が開口した、ＰＴＦＥセプタムで裏打ちされたキャップで蓋をし、ＳＰＥＸ  ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒに１．６５ｋｒｐｍで７．５分間置いた。次いで試料を８０℃で５分間加熱し、放冷した。誘導体化のために、メタノール中１０％の三フッ化ホウ素５００μＬを試料に添加し、その後８０℃で３０分間加熱した。チューブを放冷し、その後ヘプタン２ｍｌおよび５ＭのＮａＣｌ５００μＬを添加した。試料を２Ｋ  ｒｐｍで５分間ボルテックスし、最後に１Ｋ  ｒｐｍで３分間遠心分離した。Ｇｅｒｓｔｅｌ  ＭＰＳオートサンプラーを使用して、ヘプタン層をサンプリングした。定量化には、８０μｇのＣ２３：０ＦＡＭＥ内部標準を使用した。試料は、Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  １２７−３２１２  ＤＢ−ＦＦＡＰ、１０ｍ×１００μｍ×１００ｎｍカラム、およびＦＩＤ検出器を２６０°Ｃで使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  ７８９０Ａガスクロマトグラフィーシステムで分析した。流量は５００μＬ／分であり、一定の流量に制御して、担体としてＨ２を使用した。オーブンを０．９８分間１００℃に設定し、次いで１５．３０１℃／分で２３０℃に設定し、１．６６分間保持した。注入口は、４ｍｍのグラスウールが充填されたライナー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐ／Ｎ５１８３−４６４７）を収容し、２５０°Ｃに設定し、４０：１の分割比を使用した。注入量は９００ｎＬであった。
【０１８５】
バッチ生産性アッセイの結果を図３に提供する。変異体株ＧＥ−１５３６０によって生成されたＦＡＭＥの量は、親対照株ＧＥ−１３０３８（Ｃａｓ９エディター株）によって生成された量の２倍以上であった。
【０１８６】
追跡実験では、脂質誘導が増殖培地中のアンモニウム（５ｍＭ）によって抑制されることが示された（図４）。このアッセイでは、バッチ培養物は、窒素源として、硝酸塩のみ、硝酸塩とアンモニウム、またはアンモニウムのみのいずれかを含む。親Ｃａｓ９＋株は、アッセイの３〜７日目では、窒素源に関係なく本質的に同一のＦＡＭＥ生成量を示した。対照的に、ＴＲＰ−６０２９ノックアウト変異体ＧＥ−１５３６０は、硝酸塩のみの培地で増殖すると、親エディターラインＧＥ−１３０３８と比較して、アッセイの各日でＦＡＭＥ生成の著しい増加を示した。しかしながら、培養培地中のアンモニウムの存在によって、変異体の脂質生産性の増加は完全に抑制された。アンモニウムが存在する場合、ＴＲＰ−６０２９ノックアウト株ＧＥ−１５３６０の脂質生成は、変異ＴＰＲ−６０２９遺伝子を含まない親株のものと本質的に同一であった。
【０１８７】
実施例４．
半連続培養におけるノックアウト変異体の増殖および脂質生合成
半連続生産性アッセイで、ノックアウト株ＧＥ−１５３６０もアッセイした。連続生産性アッセイでは、２２５ｃｍ２のフラスコ内のＰＭ０７４（硝酸塩のみ）培地に、初期に５５０ｍｌ（接種された最終体積）の培養物が０．１５の初期ＯＤ７３０を有するようにＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ種培養物を接種した。典型的な希釈物には、半連続アッセイでのアンモニウム開始濃度が１．５ｍＭ未満になるように、ＰＭ０７４培地を使用して５５０ｍｌにした、（５ｍＭのアンモニウムを含有する）ＰＭ１２４培地中におよそ１５０ｍｌの開始培養物を使用した。ＰＭ０７４培地を用いて日毎に希釈することによって、アッセイの進行に伴い、アンモニウム濃度がさらに低下した。株ごとに３つの培養を開始した。フラスコは攪拌棒を含み、培養物を通して発生するＣＯ２に富む空気（１％ＣＯ２、流量１００ｍｌ／分）を送達するためのシリンジフィルターで接続するチューブを有するストッパーを有した。４５０ｒｐｍに設定した攪拌プレート上にフラスコを設置した。フラスコは、明／暗サイクル、および「正午」まで増加し次いで明所期間の終わりに向けて減少する光プロファイルでプログラムされたＬＥＤ光バンクに対して、幅（最も狭い寸法）で揃えた。光源から後方に延びるフラスコの「深さ」寸法は１３．７ｃｍであった。フラスコの配置を考慮すると、光源の表面からフラスコ内の細胞の最も遠い距離はおよそ１５．５ｃｍであった。明所プロファイルは、南カリフォルニアの春の日を模倣して設計した（明所１６時間：暗所８時間、およそ２０００ｕＥの光ピーク）。培養物体積の３０％（１５０ｍｌ）を取り出し、希釈した新しいＰＭ０７４培地で置き換えること（６６ｍｌのｄｉＨ２Ｏから１ＬのＰＭ０７４培地）によって、培養物を明所期間の中央（ピーク）で日毎に希釈して、培養物に発生する、蒸発に起因する塩分増加を調節した。ＦＡＭＥおよびＴＯＣ分析用の試料は、希釈のために取り出した培養物から採取した。典型的には、連続アッセイは７〜１４日間実行し、各試料の３つの培養物の平均を得た。表１〜３は、半連続アッセイで実行したノックアウトおよび野生型培養物のＦＡＭＥおよびＴＯＣ分析の結果を示している。括弧内の各値の標準偏差を用いて、３つの培養物の平均を提供する。
【０１８８】
硝酸塩のみの培養培地で実施した半連続アッセイでは、ＧＥ−１５３６０ノックアウト変異体は、野生型株と比較して高いＦＡＭＥ生産性を実証し、日毎の生産性は野生型細胞のＦＡＭＥ生産性よりも約７．４％〜約１１５．６％の範囲で多かった（表１）。これはまた、図５のグラフに見ることができ、グラフでは、ＴＲＰ−６０２９変異体（ＧＥ−１５３６０）が野生型株ＷＴ−３７３０よりも一貫してより高いｆａｍｅを日毎に生成している。（アッセイでの他の２つの株は、ＴＲＰ−６０２９変異体とは関係がない。）しかしながら、ＧＥ−１５３６０ノックアウト変異体によるバイオマス（ＴＯＣ）蓄積は、野生型細胞よりも驚くほど高かった（表２）。変異体はアッセイの過程にわたり約０．３〜約０．７のＦＡＭＥ／ＴＯＣ比率を有した一方で、同一培養条件下でアッセイした野生型のＦＡＭＥ／ＴＯＣ比率は約０．２５〜０．３の間で変動したことを示した、アッセイの過程にわたるＧＥ−１５３６０ノックアウト変異体のＦＡＭＥ／ＴＯＣ比率（表３）から、脂質への炭素分配の増加は明らかであった。
【０１８９】
（表１）硝酸塩のみの培地で日毎に希釈した半連続培養における、野生型およびＧＥ−１５３６０ノックアウト細胞によるＦＡＭＥの日毎の生成（μｇ／ｍｌ）
2021505158.tif 000003
【０１９０】
（表２）硝酸塩のみの培地で日毎に希釈した半連続培養における、野生型およびＧＥ−１５３６０ノックアウト細胞によるＴＯＣの日毎の生成（μｇ／ｍｌ）
2021505158.tif 000004
【０１９１】
（表３）硝酸塩のみの培地で日毎に希釈した半連続培養における、野生型およびＧＥ−１５３６０ノックアウト細胞によるＦＡＭＥ／ＴＯＣ比率
2021505158.tif 000005
【０１９２】
本発明は、上の実施例を参照して説明されてきたが、修正および変更が本発明の趣旨および範囲内に包含されることが理解されるであろう。したがって、本発明は、次の特許請求の範囲によってのみ制限される。
【図１】
2021505158.tif 000006
【図２】
2021505158.tif 000007
【図３】
2021505158.tif 000008
【図４】
2021505158.tif 000009
【図５】
2021505158.tif 000010
【配列表】
2021505158000001.app
【国際調査報告】
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