(57)【要約】本開示は、男性の生殖能力状態、およびそれと、回帰モデルを使用して計算されるような、妊娠を引き起こす確率との関連性を決定する方法を提供する。方法は、精子受精能獲得を誘発した後のＧＭ１局在パターンを決定すること、様々なパターンのパーセンテージ、特に［（ＡＡ＋ＡＰＭ）／ＧＭ１局在パターンの合計数］の比を特定すること、および誘発された受精能獲得に応答する特定のＧＭＩ局在パターンのパーセンテージが変化しているか決定することを含む。誘発された受精能獲得に応答する特定のパターンの局在パターンのパーセンテージに生じた変化に基づき、単独でまたはその他の精子特性と組み合わせて、男性の生殖能力状態が特定され得る。
2021523355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．  男性に由来する精子試料の一部分を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露し、これにより受精能を獲得した精子試料を形成するステップと、
ｂ．  前記受精能を獲得した精子試料を、固定剤を用いて固定し、これにより固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を形成するステップと、
ｃ．  前記固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子であって、検出可能な標識を有する標識分子で処理し、これにより標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を形成するステップと、
ｄ．  前記標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターン、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを含む複数のＧＭ１標識された局在パターンを特定するステップと、
ｅ．  前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンおよび前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンを、受精能獲得状態に割り当てるステップと、
ｆ．  前記縞状細胞ＧＭ１局在パターンおよびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを、非受精能獲得状態に割り当てるステップと、
ｇ．  １つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器を、前記精子試料から得られたデータに適用することにより、前記男性の生殖能力状態を特徴付けるステップであって、前記精子試料から得られた前記データが、（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比（例えば、受精能獲得状態を呈する精子の、割り当てられた精子の合計数に対する比）を含むステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記精子試料から得られた前記データが、（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記精子試料から得られた前記データが、
ｉ．  前記精子試料の体積、
ｉｉ．  前記精子試料中の精子の濃度、
ｉｉｉ．  前記精子試料中の精子の運動性、ならびに
ｉｖ．  （ａ）（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、（ｂ）前記精子試料の体積、（ｃ）前記精子試料中の精子の濃度、および（ｄ）前記精子試料中の精子の運動性のうちの任意の２つの、演算による組合せ
からなる群より選択される１つまたは複数のデータ項目を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記精子試料から得られた前記データが、
ａ．  （ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、
ｂ．  前記精子試料の体積、ならびに
ｃ．  （ａ）（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、および（ｂ）前記精子試料の体積、の積
からなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの１つの分類器が、非線形回帰モデルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの１つの分類器が、ロジスティック回帰モデル（例えば、
【数１０】
2021523355.tif 000020
の形態のモデルであって、式中、
ａ．  ｆ（Ｘ）が、生殖能力の尺度であり、
ｂ．  ｉが、正の整数であり、
ｃ．  αが、前記事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、および
ｄ．  β０，β１，．．．，βｉが、前記事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、および
ｅ．  ｛Ｘ１，．．．，Ｘｉ｝内の各Ｘｊが、前記精子試料から得られた前記データ内のデータ項目である
モデル）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記受精能獲得条件が、前記精子試料の前記一部分を、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出のメディエーターのうちの１つまたは複数に曝露することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ステロール流出のメディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎児臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ステロール流出のメディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記固定剤が、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはその組合せを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＧＭ１局在パターンに対する前記標識分子が、蛍光的に標識されたコレラ毒素ｂサブユニットを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記特定するステップが、前記曝露するステップの２〜２４時間後に実施される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記曝露するステップの前に、前記精子試料の前記一部分の粘度を減少させるために、非金属材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、かつ精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、前記精子試料の前記一部分を処理するステップを更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ．  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露されており、固定剤内で固定されており、およびＧＭ１局在パターンに対する標識分子で染色されている、男性に由来する精子試料の一部分について、その第１の部分を得るステップであって、前記標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと、
ｂ．  前記標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターン、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを含む複数のＧＭ１標識された局在パターンを特定するステップと、
ｃ．  前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンおよび前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンを、受精能獲得状態に割り当てるステップと、
ｄ．  前記縞状細胞ＧＭ１局在パターンおよびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを、非受精能獲得状態に割り当てるステップと、
ｅ．  １つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器を、前記精子試料から得られたデータに適用することにより、前記男性の生殖能力状態を特徴付けるステップであって、前記精子試料から得られた前記データが、（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せの間の比（例えば、受精能獲得状態を呈する精子の、割り当てられた精子の合計数に対する比）を含むステップと、
を含む、方法。
【請求項１５】
前記精子試料から得られた前記データが、（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記精子試料から得られた前記データが、
ａ．  前記精子試料の体積、
ｂ．  前記精子試料中の精子の濃度、
ｃ．  前記精子試料中の精子の運動性、ならびに
ｄ．  （ａ）（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、（ｂ）前記精子試料の体積、（ｃ）前記精子試料中の精子の濃度、および（ｄ）前記精子試料中の精子の運動性のうちの任意の２つの、演算による組合せ
からなる群より選択される１つまたは複数のデータ項目を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記精子試料から得られた前記データが、
ａ．  （ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、
ｂ．  前記精子試料の体積、ならびに
ｃ．  （ａ）（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、および（ｂ）前記精子試料の体積、の積
からなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの１つの分類器が、非線形回帰モデルである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの１つの分類器が、ロジスティック回帰モデル（例えば、
【数１１】
2021523355.tif 000021
の形態のモデルであって、式中、
ａ．  ｆ（Ｘ）が、生殖能力の尺度であり、
ｂ．  ｉが、正の整数であり、
ｃ．  αが、前記事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、および
ｄ．  β０，β１，．．．，βｉが、前記事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、および
ｅ．  ｛Ｘ１，．．．，Ｘｉ｝内の各Ｘｊが、前記精子試料から得られた前記データ内のデータ項目である
モデル）である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記受精能獲得条件が、前記精子試料の前記一部分を、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出のメディエーターのうちの１つまたは複数に曝露することを含む、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ステロール流出のメディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎児臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ステロール流出のメディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記固定剤が、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはその組合せを含む、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＧＭ１局在パターンに対する前記標識分子が、蛍光的に標識されたコレラ毒素ｂサブユニットを含む、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記特定するステップが、前記曝露するステップの２〜２４時間後に実施される、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記得るステップの前に、前記精子試料の前記一部分の粘度を減少させるために、非金属材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、かつ精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、前記精子試料の前記一部分を処理するステップを更に含む、請求項１４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ａ．  精子試料を得るステップであって、前記精子試料の少なくとも一部分が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子を得るために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露されており、固定剤に曝露されており、およびＧＭ１について染色されており、これにより標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を形成する、ステップと、
ｂ．  前記標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを、１つまたは複数のＧＭ１標識された局在パターンに基づき決定するステップであって、前記ＧＭ１標識された局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターン、先体後方原形質膜（Post-Acrosomal PlasmaMembrane）（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと、
ｃ．  １つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器を、前記精子試料から得られたデータに適用することにより、男性の生殖能力状態を特徴付けるステップであって、前記データが、（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比（例えば、受精能獲得状態を呈する精子の、割り当てられた精子の合計数に対する比）を含む、ステップと
を含む、方法。
【請求項２８】
前記精子試料から得られた前記データが、（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比からなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記精子試料から得られた前記データが、
ａ．  前記精子試料の体積、
ｂ．  前記精子試料中の精子の濃度、
ｃ．  前記精子試料中の精子の運動性、ならびに
ｄ．  （ａ）（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、（ｂ）前記精子試料の体積、（ｃ）前記精子試料中の精子の濃度、および（ｄ）前記精子試料中の精子の運動性のうちの任意の２つの、演算による組合せ
からなる群より選択される１つまたは複数のデータ項目を更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記精子試料から得られた前記データが、
ａ．  （ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、
ｂ．  前記精子試料の体積、ならびに
ｃ．  （ａ）（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、および（ｂ）前記精子試料の体積、の積、
からなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの１つの分類器が、非線形回帰モデルである、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの１つの分類器が、ロジスティック回帰モデル（例えば、
【数１２】
2021523355.tif 000022
の形態のモデルであって、式中、
ｖ．  ｆ（Ｘ）が、生殖能力の尺度であり、
ｖｉ．  ｉが、正の整数であり、
ｖｉｉ．  αが、前記事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、および
ｖｉｉｉ．  β０，β１，．．．，βｉが、前記事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、および
ｉｘ．  ｛Ｘ１，．．．，Ｘｉ｝内の各Ｘｊが、前記精子試料から得られた前記データ内のデータ項目である
モデル）である、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記得るステップの前に、前記精子試料の前記一部分の粘度を減少させるために、非金属材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、かつ精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、前記精子試料の前記一部分を処理するステップを更に含む、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ａ．  １つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器を、男性に由来する精子試料から得られたデータに適用することにより、前記男性の生殖能力状態を特徴付けるステップであって、前記データが、前記精子試料の、処理された一部分において、（ｉ）先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターンと先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比を含む、ステップを含む方法であって、
ｂ．  （ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比が、
ａ．  前記男性に由来する前記精子試料の一部分を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露し、これにより受精能を獲得した精子試料を形成すること、
ｂ．  固定剤を用いて前記受精能を獲得した精子試料を固定し、これにより固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を形成すること、
ｃ．  前記固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子であって、検出可能な標識を有する標識分子で処理し、これにより標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を形成すること、
ｄ．  前記標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、ＡＡ  ＧＭ１局在パターン、ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを含む複数のＧＭ１標識された局在パターンを特定すること、
ｅ．  前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンおよび前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンを、受精能獲得状態に割り当てること、
ｆ．  前記縞状細胞ＧＭ１局在パターンおよびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを、非受精能獲得状態に割り当てること、ならびに
ｇ．  （ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せを、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せと比較すること
により決定される、方法。
【請求項３５】
前記精子試料から得られた前記データが、（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比からなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記精子試料から得られた前記データが、
ａ．  前記精子試料の体積、
ｂ．  前記精子試料中の精子の濃度、
ｃ．  前記精子試料中の精子の運動性、ならびに
ｄ．  （ａ）（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、（ｂ）前記精子試料の体積、（ｃ）前記精子試料中の精子の濃度、および（ｄ）前記精子試料中の精子の運動性のうちの任意の２つの、演算による組合せ
からなる群より選択される１つまたは複数のデータ項目を更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記精子試料から得られた前記データが、
ａ．  （ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、
ｂ．  前記精子試料の体積、ならびに
ｃ．  （ａ）（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、および（ｂ）前記精子試料の体積、の積
からなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの１つの分類器が、非線形回帰モデルである、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの１つの分類器が、ロジスティック回帰分析モデル（例えば、
【数１３】
2021523355.tif 000023
の形態のモデルであって、式中、
ａ．  ｆ（Ｘ）が、生殖能力の尺度であり、
ｂ．  ｉが、正の整数であり、
ｃ．  αが、前記事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、および
ｄ．  β０，β１，．．．，βｉが、前記事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、および
ｅ．  ｛Ｘ１，．．．，Ｘｉ｝内の各Ｘｊが、前記精子試料から得られた前記データ内のデータ項目である
モデル）である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記受精能獲得条件が、前記精子試料の前記一部分を、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出のメディエーターのうちの１つまたは複数に曝露することを含んだ、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ステロール流出のメディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎児臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ステロール流出のメディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記固定剤が、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはその組合せを含む、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ＧＭ１局在パターンに対する前記標識分子が、蛍光的に標識されたコレラ毒素ｂサブユニットを含む、請求項３４〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記特定するステップが、前記曝露するステップの２〜２４時間後に実施された、請求項３４〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記曝露するステップの前に、前記精子試料の前記一部分の粘度を減少させるために、前記精子試料の前記一部分が、非金属材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、かつ精子膜に損傷を与えない試薬を使用して処理された、請求項３４〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
男性の生殖能力状態を特徴付ける生殖能力分類器を訓練するためのシステムであって、
ａ．  少なくとも１つのプロセッサー、および前記少なくとも１つのプロセッサーによりアドレス可能なメモリーを含み、前記メモリーが前記少なくとも１つのプロセッサーにより実行される少なくとも１つのプログラムを記憶し、前記少なくとも１つのプログラムが、
ｉ．  生殖補助（例えば、子宮内人工授精（ＩＵＩ））における試みについての既知の転帰と関連付けられた複数の男性に由来する精子試料に由来するデータを含む訓練セットであって、各個別の精液試料に由来する前記データが、前記個別の精液試料中の精子の、（ｘ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｙ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比（例えば、受精能獲得状態を呈する精子の、割り当てられた精子の合計数に対する比）を含む、訓練セットを得るための命令、および
ｉｉ．  前記生殖補助の試みの転帰と、各個別の精液試料中の精子の、（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の対応する比との間の少なくとも１つの対応に基づき、１つまたは複数の生殖能力分類器を訓練するための命令
を含む、システム。
【請求項４８】
前記複数の男性に由来する各個別の精子試料について、精子の、（ｉ）前記先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターンと前記先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンとの組合せとの間の比が、
ａ．  前記複数の男性内の個別の男性に由来する前記精子試料の一部分を、受精能獲得条件にｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝露し、これにより受精能を獲得した精子試料を形成するステップ、
ｂ．  固定剤を用いて前記受精能を獲得した精子試料を固定し、これにより固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を形成するステップ、
ｃ．  前記固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子であって、検出可能な標識を有する標識分子で処理し、これにより標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を形成するステップ、
ｄ．  前記標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、ＡＡ  ＧＭ１局在パターン、ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを含む複数のＧＭ１標識された局在パターンを特定するステップ、
ｅ．  前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンおよび前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンを、受精能獲得状態に割り当てるステップ、
ｆ．  前記縞状細胞ＧＭ１局在パターンおよびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを、非受精能獲得状態に割り当てるステップ、ならびに
ｇ．  精子の、（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せを、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せと比較するステップ、
を含む方法により決定された、請求項４７に記載のシステム。
【請求項４９】
前記受精能獲得条件が、前記精子試料の前記一部分を、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出のメディエーターのうちの１つまたは複数に曝露することを含む、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５０】
前記ステロール流出のメディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎児臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームを含む、請求項４９に記載のシステム。
【請求項５１】
前記ステロール流出のメディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンを含む、請求項４９に記載のシステム。
【請求項５２】
前記固定剤が、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはその組合せを含む、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５３】
ＧＭ１局在パターンに対する前記標識分子が、蛍光的に標識されたコレラ毒素ｂサブユニットを含む、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５４】
前記特定するステップが、前記曝露するステップの２〜２４時間後に実施される、請求項４８〜５３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５５】
各個別の精液試料について、精子の、（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比を決定するのに使用される前記方法が、得るステップの前に、前記精子試料の粘度を減少させるために、非金属材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、かつ精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、前記精子試料の前記一部分を処理するステップを更に含んだ、請求項４８〜５４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５６】
前記１つまたは複数の生殖能力分類器を訓練するのに使用されるデータが、前記複数の男性に由来する各個別の精液試料に由来する、（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）前記ＧＭ１標識された局在パターンのすべての組合せとの間の比からなる、請求項４７〜５５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５７】
前記生殖能力分類器を訓練するのに使用されるデータが、前記複数の男性に由来する各個別の精液試料に由来する、
ａ．  前記精子試料の体積、
ｂ．  前記精子試料中の精子の濃度、
ｃ．  前記精子試料中の精子の運動性、ならびに
ｄ．  （ａ）（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、（ｂ）前記精子試料の体積、（ｃ）前記精子試料中の精子の濃度、および（ｄ）前記精子試料中の精子の運動性のうちの任意の２つの、演算による組合せ
からなる群より選択される１つまたは複数のデータ項目を更に含む、請求項４７〜５５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５８】
前記生殖能力分類器を訓練するのに使用されるデータが、前記複数の男性に由来する各個別の精子試料に由来する、
ａ．  （ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の個別の比
ｂ．  前記精子試料の体積、ならびに
ｃ．  （ａ）（ｉ）前記ＡＡ  ＧＭ１局在パターンと前記ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての前記ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、および（ｂ）前記精子試料の体積、の積
からなる、請求項５７に記載のシステム。
【請求項５９】
前記１つまたは複数の生殖能力分類器のうちの１つの分類器が、非線形回帰モデルである、請求項４７〜５８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６０】
前記１つまたは複数の生殖能力分類器のうちの１つの分類器が、ロジスティック回帰分析モデル（例えば、
【数１４】
2021523355.tif 000024
の形態のモデルであって、式中、
ａ．  ｆ（Ｘ）が、生殖能力の尺度であり、
ｂ．  ｉが、正の整数であり、
ｃ．  αが、事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、および
ｄ．  β０，β１，．．．，βｉが、事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、および
ｅ．  ｛Ｘ１，．．．，Ｘｉ｝内の各Ｘｊが、前記精子試料から得られた前記データ内のデータ項目である
モデル）である、請求項４７〜５８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６１】
ａ．  請求項６に記載の方法を使用して妊娠のパーセント可能性を決定するステップ、および
ｂ．  ステップａにおいて特定された数値に基づき、適切な生殖アプローチを決定するステップ
を含む、生殖アプローチを特定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、男性の生殖能力の分野、より具体的には、精子受精能獲得が誘発された後の、ＧＭ１ガングリオシド分布パターンに基づき、男性の生殖能力状態を決定することと一般的に関連する。
【背景技術】
【０００２】
米国では、１０％のカップルが不妊症と関連する予約診療を受診しており、不妊症の４０％は男性において生じたものである。世界的には、これは７３００万組を超える不妊カップルに相当する。代表的な男性の生殖健康診断では、精子数、外観、および運動性が評価される。残念ながら、不妊男性の半数は、これらの記述的基準について正常なパラメーターに適合する精子を有し、また自然妊娠および生殖補助、例えば子宮内人工授精（ＩＵＩ）等の技術の両方において失敗を繰り返した後、「特発性不妊症」を有するとして特定されるにすぎない。サイクルが失敗する毎に、身体的、精神的、および経済的に大きな負担をカップルに負わせ、また米国の健康管理システムにとって、毎年５０億ドルを超えるコストとなるので、精子機能の実用的なテストに対してきわめて大きな必要性が存在する。精子機能に関するデータがあれば、臨床医は、その患者に、最良の妊娠機会を患者にもたらす生殖補助技術を指示することができる。
【０００３】
女性器に進入した際、精子は卵子を速やかに受精させることができるわけではない。むしろ、精子は「受精能獲得」として知られている機能的成熟プロセスを経なければならない。このプロセスは、精子の細胞膜において特異的な変化を有することにより特異的な刺激に応答するその能力、すなわち受精能を獲得するための刺激への曝露に応答して、ガングリオシドＧＭ１の分布パターンに変化が生ずる能力に立脚する。
【０００４】
様々なＧＭ１局在パターンが特定され、また受精能獲得または非受精能獲得に関連付けられている。特に、先体頂部（Ａｐｉｃａｌ  Ａｃｒｏｓｏｍｅ）（ＡＡ）ＧＭ１局在パターンおよび先体原形質膜（Ａｃｒｏｓｏｍａｌ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターンが、ウシおよびヒトの精子において受精能獲得に関連付けられている。精子の受精能獲得は、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）精子機能テストまたはＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）男性生殖能力アッセイ（「Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）テスト」または「Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）」）により生成されるＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）値として定量的に表現可能であり、それは（［先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターンの数＋先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターンの数］／ＧＭ１標識された局在パターンの合計数）として定義されるが、その場合、各局在パターンの数が測定され、次に最終的にパーセンテージスコアに変換される。ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンおよびＡＡ  ＧＭ１局在パターンに加えて、その他の標識された局在パターンとして、縞状細胞（Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ）ＧＭ１局在パターン、中間（ＩＮＴＥＲ）ＧＭ１局在パターン、先体後方原形質膜（ｐｏｓｔ  ａｃｒｏｓｏｍａｌ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ＰＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）ＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）ＧＭ１局在パターン、および拡散性（ＤＩＦＦ）ＧＭ１局在パターンが含まれた（Travis et al., "Impacts of common semen handling methods onSperm function," The Journal of Urology, 195 (4), e909 (2016)）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｒａｖｉｓら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ（２０１６）１９５（４）ｅ９０９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一実施形態では、男性の生殖能力状態を決定するための方法およびキットが本明細書において開示される。一実施形態では、本開示は、少なくとも１つの受精能獲得刺激に応答して、特定のＧＭ１局在パターンの数に生じた変化に基づき、男性の生殖能力状態を特定するための方法について記載する。
本明細書に開示される実施形態は、男性の生殖能力状態を決定するための方法である。一実施形態では、方法は下記のステップを含む：受精能獲得刺激に曝露された精子細胞の試料は、蛍光標識で処理される。そのような精子細胞の１つまたは複数の蛍光画像が得られるが、該画像は１つまたは複数のＧＭ１局在パターンを呈する。先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターンおよび先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターンを発現する精子細胞は、受精能獲得状態にそれぞれ割り当てられ、そしてすべてのその他の蛍光標識されたＧＭ１局在パターンは、非受精能獲得状態に割り当てられる。受精能を獲得していないＧＭ１局在パターンとして、ＩＮＴＥＲ、ＰＡＰＭ（先体後方原形質膜）、ＡＡ／ＰＡ（先体頂部／先体後方）、ＥＳ（赤道セグメント）ＤＩＦＦ（拡散性）、および縞状細胞が挙げられる。［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージが計算される。一実施形態では、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージと関連する生殖能力閾値が決定されるが、その場合、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージは、下記に対応する既知の生殖能力がある集団の分布統計学に基づく：参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力があることを示し；参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たず、かつ参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力が低いことを示し；参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、不妊であることを示す。一実施形態では、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージは、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較される。生殖能力閾値が比較に基づき特定される。
【０００７】
別の実施形態では、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージと関連する生殖能力閾値が決定されるが、その場合、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージは、下記に対応する既知の生殖能力がある集団の分布統計学に基づく：参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、正常な男性生殖能力を示し；参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、異常な男性生殖能力を示す。標識され、固定され、受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージが、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較される。生殖能力閾値が比較に基づき特定される。
【０００８】
本明細書に開示される別の実施形態は、男性の生殖能力状態を決定するための方法である。一実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料を得るために、男性に由来する精子試料の第１の部分を非受精能獲得条件に曝露するステップ；ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を得るために、精子試料の第２の部分を受精能獲得条件に曝露するステップ；ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を固定剤で、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、または２４時間の期間にわたって固定するステップ；固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料、および固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子で処理するステップであって、標識分子が検出可能な標識を有する、ステップ；標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料、および標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記ＧＭ１標識された局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターン、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンであるステップ；標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料についての標識されたＧＭ１局在パターンを、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての標識されたＧＭ１局在パターンと比較するステップ；比較に基づき、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターンと先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターンを、受精能獲得状態に割り当てるステップ、および縞状細胞ＧＭ１局在パターンとすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを非受精能獲得状態に割り当てるステップ；ならびに標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料、および標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、特定され、ＧＭ１標識された局在パターンに基づき、男性の生殖能力状態を特徴付けるステップを含む。一実施形態では、特徴付けるステップは、下記のステップを含む：標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージと関連する生殖能力閾値を決定するステップ；ただし、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージは、下記に対応する既知の生殖能力がある集団の分布統計学に基づく：参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力があることを示し；参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たず、かつ参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力が低いことを示し；参照平均パーセンテージを��標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、不妊を示す。標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージは、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較される。生殖能力閾値が比較に基づき特定される。
【０００９】
別の実施形態では、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージと関連する生殖能力閾値が決定されるが、ただし、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージは、下記に対応する既知の生殖能力がある集団の分布統計学に基づく：参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、正常な男性生殖能力を示し；参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、異常な男性生殖能力を示す。標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージは、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較される。生殖能力閾値が比較に基づき特定される。
【００１０】
一実施形態では、曝露するステップの前に、精液粘度を減少させるために、精液試料は、非金属材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、かつ精液粘度を減少させるために使用される様々な試薬から選択される、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して処理される。いくつかのそのような実施形態では、膜損傷性試薬は、（ｉ）プロテアーゼ；（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）粘液溶解剤；（ｉｖ）リパーゼ；（ｖ）エステラーゼ、および（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼを潜在的に含みうる。一部の実施形態では、特定するステップは、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定になるまで繰り返される。そのような一実施形態では、特定するステップが実施された後、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が標識された細胞の合計数の５％未満、３％未満となるまで；または標識された細胞の合計数の１％〜５％、２〜５％の範囲に収まるまで決定する。別のそのような実施形態では、特定するステップが実施された後、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が標識された細胞の合計数の２５％、２０％、１５％、もしくは１０％未満となるまで；または標識された細胞の合計数の２％〜２５％、２％〜２０％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％の範囲に収まるまで決定される。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージ、または１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍ、または１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【００１１】
別のそのような実施形態では、特徴付けるステップは下記のステップをさらに含む：事前に決定された数の、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料について、各ＧＭ１標識された局在パターンの数を決定するステップ；事前に決定された数の、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、各ＧＭ１標識された局在パターンの数を決定するステップ；標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料について、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンの数の和の、ＧＭ１標識された局在パターンの合計数の和に対する比を計算するステップ；および標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンの数の和の、ＧＭ１標識された局在パターンの合計数の和に対する比を計算するステップ。
【００１２】
本明細書に開示される一実施形態では、方法は下記のステップをさらに含む：標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子の比を、生殖能力状態が既知である、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子の比と比較するステップ；および標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子の比を、生殖能力状態が既知である、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子の比と比較するステップ。
【００１３】
本明細書に開示されるさらに別の実施形態は、男性の生殖能力状態を決定するための方法である。一実施形態では、方法は下記のステップを含む：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件に曝露され、固定剤中で少なくとも１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、または２４時間固定され、およびＧＭ１局在パターンに対する標識分子で処理された、男性に由来する精子試料の第１の部分を得るステップであって、標識分子が検出可能な標識を有する、ステップ；ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、固定剤中で固定され、およびＧＭ１局在パターンに対する標識分子で処理された精子試料の第２の部分を得るステップ；標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料、および標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターン、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンである２つ以上のＧＭ１標識された局在パターンを特定するステップ；標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料についての標識されたＧＭ１局在パターンを、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての標識されたＧＭ１局在パターンと比較するステップ；比較に基づき、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターンと先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターンを、受精能獲得状態に割り当てるステップ、および縞状細胞ＧＭ１局在パターンとすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを非受精能獲得状態に割り当てるステップ；ならびに標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料、および標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、特定され、ＧＭ１標識された局在パターンに基づき、男性の生殖能力状態を特徴付けるステップ。そのような一実施形態では、特徴付けるステップは下記のステップを含む：標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージと関連する生殖能力閾値を決定するステップであって、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージが、下記に対応する既知の生殖能力がある集団の分布統計学に基づく：参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力があることを示し、参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たず、かつ参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力が低いことを示し、参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、不妊を示す、ステップ；標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージを、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較するステップ、ならびに比較に基づき生殖能力閾値を特定するステップ。
【００１４】
別の実施形態では、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージと関連する生殖能力閾値が決定されるが、その場合、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージは、下記に対応する既知の生殖能力がある集団の分布統計学に基づく：参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、正常な男性生殖能力を示し；参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、異常な生殖能力を示す。標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージが、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較される。生殖能力閾値が比較に基づき特定される。
【００１５】
一部の実施形態では、特定するステップは、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定になるまで繰り返される。そのような一実施形態では、特定するステップが実施された後、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が標識された細胞の合計数の５％未満、３％未満となるまで；または標識された細胞の合計数の１％〜５％、２〜５％の範囲に収まるまで決定する。別のそのような実施形態では、特定するステップが実施された後、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が標識された細胞の合計数の２５％、２０％、１５％、もしくは１０％未満となるまで；または標識された細胞の合計数の２％〜２５％、２％〜２０％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％の範囲に収まるまで決定する。
【００１６】
そのような方法の一実施形態では、方法は下記のステップをさらに含む：事前に決定された数の、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料、および標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、各ＧＭ１標識された局在パターンの数を決定するステップ、ならびに標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料、および標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料それぞれについて、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンの数の和の、ＧＭ１局在パターンの合計数の和に対する比を計算するステップ。
【００１７】
別の実施形態では、特徴付けるステップは、生殖能力状態が既知である男性について、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料の比を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子のＧＭ１局在パターンの比と比較するステップ；および生殖能力状態が既知である男性について、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料の比を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子のＧＭ１局在パターンの比と比較するステップをさらに含む。
【００１８】
本明細書に開示されるさらにいっそう別の実施形態は、男性の生殖能力状態を決定するための方法である。一実施形態では、方法は下記のステップを含む：男性に由来する精子試料を、受精能獲得条件にｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝露するステップ；受精能を獲得した精子試料を、固定剤で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、または２４時間固定するステップ；ＧＭ１局在パターンに対する標識分子で固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を処理するステップであって、標識分子が検出可能な標識を有する、ステップ；標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターン、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンである２つ以上のＧＭ１標識された局在パターンを特定するステップ；先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターンと先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターンを、受精能獲得状態に割り当てるステップ、および縞状細胞ＧＭ１局在パターンとすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを非受精能獲得状態に割り当てるステップ；ならびに男性の生殖能力状態を特徴付けるステップ。一実施形態では、特徴付けるステップは下記のステップを含む：標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージと関連する生殖能力閾値を決定するステップ；その場合、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージは、下記に対応する既知の生殖能力がある集団の分布統計学に基づく：参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力があることを示し、参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たず、かつ参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力が低いことを示し、参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、不妊を示す；標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージを、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較するステップ、ならびに比較に基づき生殖能力閾値を特定するステップ。
【００１９】
別の実施形態では、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージと関連する生殖能力閾値が決定されるが、その場合、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージは、下記に対応する既知の生殖能力がある集団の分布統計学に基づく：参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、正常な男性生殖能力を示し；参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、異常な男性生殖能力を示す。標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージが、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較される。生殖能力閾値が比較に基づき特定される。
【００２０】
一実施形態では、曝露するステップの前に、精液粘度を減少させるために、精液試料は、非金属材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、かつ精液粘度を減少させるために使用される様々な試薬から選択される、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して処理される。一部の実施形態では、膜損傷性試薬は、（ｉ）プロテアーゼ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）粘液溶解剤、（ｉｖ）リパーゼ、（ｖ）エステラーゼ、および（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼからなる群より潜在的に選択されうる。一部の実施形態では、特定するステップは、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定になるまで繰り返される。そのような一実施形態では、特定するステップが実施された後、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が標識された細胞の合計数の５％未満、３％未満となるまで；または標識された細胞の合計数の１％〜５％、２〜５％の範囲に収まるまで決定する。別のそのような実施形態では、特定するステップが実施された後、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が標識された細胞の合計数の２５％、２０％、１５％、もしくは１０％未満となるまで；または標識された細胞の合計数の２％〜２５％、２％〜２０％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％の範囲に収まるまで決定する。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージ、または１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍ、または１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【００２１】
そのような方法の一実施形態では、方法は、ＧＭ１局在パターンの比を、生殖能力状態が既知である男性に関するＧＭ１局在パターンの比と比較するステップをさらに含む。そのような一実施形態では、比較するステップは下記のステップを含む：事前に決定された数の、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、各ＧＭ１標識された局在パターンの数を決定するステップ、およびＡＡ  ＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンの数の和の、ＧＭ１標識された局在パターンの合計数の和に対する比を計算するステップ。
【００２２】
本明細書に開示される別の実施形態は、男性の生殖能力状態を決定するための方法である。一実施形態では、方法は下記のステップを含む：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、固定剤中で、少なくとも１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、または２４時間固定され、およびＧＭ１局在パターンに対する標識分子で染色された、男性に由来する精子試料の第１の部分を得るステップであって、標識分子が検出可能な標識を有する、ステップ；標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターン、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンである２つ以上のＧＭ１標識された局在パターンを特定するステップ；先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターンと先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターンを、受精能獲得状態に割り当てるステップ、および縞状細胞ＧＭ１局在パターンとすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを非受精能獲得状態に割り当てるステップ；ならびに男性の生殖能力状態を特徴付けるステップ。一部の実施形態では、特徴付けるステップは、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージと関連する生殖能力閾値を決定するステップであって、その場合、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージは、下記に対応する既知の生殖能力がある集団の分布統計学に基づく：参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力があることを示し、参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たず、かつ参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力が低いことを示し、参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、不妊を示す、ステップ；標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージを、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較するステップ、ならびに比較に基づき生殖能力閾値を特定するステップを含む。
【００２３】
別の実施形態では、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージと関連する生殖能力閾値が決定され、その場合、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージは、下記に対応する既知の生殖能力がある集団の分布統計学に基づく：参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、正常な男性生殖能力を示す；参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、異常な男性生殖能力を示す。標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージが、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較される。生殖能力閾値が比較に基づき特定される。
【００２４】
一部の実施形態では、特定するステップは、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定となるまで繰り返される。そのような一実施形態では、特定するステップが実施された後、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が標識された細胞の合計数の５％未満、３％未満となる、または標識された細胞の合計数の１％〜５％、２〜５％の範囲に収まるまで決定する。別のそのような実施形態では、特定するステップが実施された後、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が標識された細胞の合計数の２５％、２０％、１５％、もしくは１０％未満となるまで、または標識された細胞の合計数の２％〜２５％、２％〜２０％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％の範囲に収まるまで決定する。
【００２５】
そのような方法の一実施形態では、方法は、ＧＭ１局在パターンの比を、生殖能力状態が既知である男性に関するＧＭ１局在パターンの比と比較するステップをさらに含む。そのような一実施形態では、比較するステップは、事前に決定された数の、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、各ＧＭ１標識された局在パターンの数を決定するステップ、およびＡＡ  ＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンの数の和の、ＧＭ１標識された局在パターンの合計数の和に対する比を計算するステップを含む。
【００２６】
本明細書に開示される別の実施形態は、男性の生殖能力状態を決定するための方法である。一実施形態では、方法は下記のステップを含む：精子試料を得るステップであって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子を得るために、精子試料の少なくとも一部分がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露されており、固定剤に少なくとも１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、または２４時間曝露されており、およびＧＭ１について染色されているステップ；精子試料の１つまたは複数の精液パラメーターに関する数値を得るステップ；１つまたは複数のＧＭ１標識された局在パターンに基づき、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを決定するステップであって、前記ＧＭ１標識された局在パターンが先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターン、先体後方原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンであるステップ；ならびに決定されたＣａｐ  Ｓｃｏｒｅおよび１つまたは複数の得られた精液パラメーターに基づき、男性の男性生殖能力指数(malefertility index)（ＭＦＩ）値を計算するステップ。一実施形態では、精子試料の１つまたは複数の精液パラメーターは、元の精子試料の体積、精子の濃度、精子の運動性、および精子の形態からなる群より選択される。一部の実施形態では、特定するステップは、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定となるまで繰り返される。
【００２７】
そのような一実施形態では、特定するステップが実施された後、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が標識された細胞の合計数の５％未満、３％未満となるまで、または標識された細胞の合計数の１％〜５％、２〜５％の範囲に収まるまで決定する。別のそのような実施形態では、特定するステップが実施された後、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が標識された細胞の合計数の２５％、２０％、１５％、もしくは１０％未満となるまで、または標識された細胞の合計数の２％〜２５％、２％〜２０％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％の範囲に収まるまで決定する。
【００２８】
本明細書に記載される本方法の様々な実施形態では、ＧＭ１標識された局在パターンのうちの２つ以上は、ＡＡ  ＧＭ１局在パターン、ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、中間（ＩＮＴＥＲ）ＧＭ１局在パターン、先体後方原形質膜（ＰＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）ＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）ＧＭ１局在パターン、および拡散性（ＤＩＦＦ）ＧＭ１局在パターンを含む。
【００２９】
一実施形態では、精子試料の第１の部分を非受精能獲得条件に曝露するステップ、および精子試料の第２の部分を受精能獲得条件に曝露するステップが同時に行われる。
【００３０】
一実施形態では、受精能を獲得した精子の１つまたは複数のＧＭ１局在パターン、および受精能を獲得していない精子の１つまたは複数のＧＭ１局在パターンを説明する図であって、受精能を獲得した精子の前記ＧＭ１局在パターンおよび受精能を獲得していない精子の前記ＧＭ１局在パターンが既知の生殖能力状態を反映する図；精子膜の剪断を防止するのに十分な直径サイズのオリフィスを有する広いオリフィスのピペット；下記のうちの１つまたは複数：受精能獲得培地、非受精能獲得培地、固定剤組成物、ＧＭ１局在パターンを決定するための標識試薬（ただし、固定剤組成物は精子膜に損傷を与えず、受精能獲得培地および非受精能獲得培地は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで精子細胞に適用されたとき、図に反映されるような、受精能を獲得した精子を示すＧＭ１局在パターン、および受精能を獲得していない精子を示すパターンを生成する）を含む、男性の生殖能力状態を特定するためのキットが本明細書に開示される。一実施形態では、キットは、精子膜への損傷を回避するために、精子を取り扱うための指示を備える。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージ、または１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍ、または１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【００３１】
本明細書に記載されるある特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件は、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出のメディエーターのうちの１つまたは複数への曝露を含む。一部の実施形態では、ステロール流出のメディエーターは、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎児臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームである。一実施形態では、ステロール流出のメディエーターは、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。
【００３２】
一実施形態では、非受精能獲得条件は、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出のメディエーターのうちの１つまたは複数への曝露の欠如を含む。
【００３３】
本明細書に記載されるある特定の実施形態では、固定剤はアルデヒド固定剤である。一実施形態では、固定剤として、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはその組合せが挙げられる。ある特定の実施形態では、ＧＭ１に対する親和性分子は蛍光標識されたコレラ毒素ｂサブユニットである。
【００３４】
本明細書に記載されるある特定の実施形態では、方法は、１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器を、精子試料から得られたデータに適用することにより、男性の生殖能力状態を特徴付けるステップを含むが、その場合、該精子試料から得られたデータは、（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比（例えば、受精能獲得状態を呈する精子の、割り当てられた精子の合計数に対する比）を含むことが記載される。
【００３５】
本明細書に記載される本発明のある特定の実施形態では、１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの分類器は、ロジスティック回帰モデル（例えば、
【数１】
2021523355.tif 000003
の形態のモデルであって、式中、
ｆ（Ｘ）が、生殖能力の尺度であり、
ｉが、正の整数であり、
αが、該事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、および
β０，β１，．．．，βｉが、該事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、および
｛Ｘ１，．．．，Ｘｉ｝内の各Ｘｊが、該精子試料から得られたデータ内のデータ項目である、
モデル）である。
【００３６】
ある特定の実施形態では、男性の生殖能力状態を特徴付けるための生殖能力分類器を訓練するためのシステムが記載される。一実施形態では、システムは、少なくとも１つのプロセッサーおよび該少なくとも１つのプロセッサーによりアドレス可能なメモリーを含み、該メモリーは、該少なくとも１つのプロセッサーにより実行するための少なくとも１つのプログラムを記憶し、該少なくとも１つのプログラムは、
Ａ）生殖補助（例えば、子宮内人工授精（ＩＵＩ））における試みについての既知の転帰と関連付けられた複数の男性に由来する精子試料から得られたデータを含む訓練セットであって、各個別の精液試料に由来するデータが、該個別の精液試料中の精子の、（ｉ）該ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての該ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比（例えば、受精能獲得状態を呈する精子の、割り当てられた精子の合計数に対する比）を含む、訓練セットを得るための命令、および
Ｂ）該生殖補助の試みの転帰と、各個別の精液試料中の精子の、（ｉ）該ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべての該ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の対応する比との間の少なくとも１つの対応に基づき、１つまたは複数の生殖能力分類器を訓練するための命令を含む。
【００３７】
ある特定の実施形態では、生殖アプローチを特定するための方法が記載される。一実施形態では、方法は、本発明にしたがうＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを決定するステップ、本発明に記載されるようなロジスティック回帰モデルを使用して、子宮腔内授精を３回試みたうちに自然受胎し、３ヶ月以内に妊娠する可能性を決定するステップ、および前記数値に基づき、生殖アプローチが妊娠を達成したか決定するステップを含む。
【００３８】
男性の生殖能力状態を決定するための方法およびキットの実施形態に関する前述の概要および後述する詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、より良く理解されるであろう。しかし、本発明は、示されている正確な構成および手段に限定されないことを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、非受精能獲得条件または受精能獲得条件下での、正常ヒト精子および不妊男性に由来する精子におけるＧＭ１のＩＮＴＥＲ、ＡＰＭ、ＡＡ、ＰＡＰＭ、ＡＡ／ＰＡ、ＥＳおよびＤＩＦＦ局在パターンを示す。
【００４０】
【図２】図２Ａは、非受精能獲得条件下での正常ヒト精子におけるＧＭ１のＩＮＴＥＲ、ＡＰＭ、ＡＡ、ＰＡＰＭ、ＡＡ／ＰＡ、ＥＳおよびＤＩＦＦ局在パターンの相対分布を示す。
【００４１】
図２Ｂは、受精能獲得条件下での正常ヒト精子におけるＧＭ１のＩＮＴＥＲ、ＡＰＭ、ＡＡ、ＰＡＰＭ、ＡＡ／ＰＡ、ＥＳおよびＤＩＦＦ局在パターンの相対分布を示す。
【００４２】
図２Ｃは、受精能獲得条件下での、不妊男性に由来するヒト精子におけるＧＭ１のＩＮＴＥＲ、ＡＰＭ、ＡＡ、ＰＡＰＭ、ＡＡ／ＰＡ、ＥＳおよびＤＩＦＦ局在パターンの相対分布を示す。
【００４３】
【図３】図３は、受精能獲得条件および非受精能獲得条件下での、正常男性群に関するヒト精子および不妊男性群に関するヒト精子におけるインキュベーション時間の関数としての、組み合わせたＡＰＭおよびＡＡ局在パターンの相対数、ならびに各男性群に関する臨床転帰を示す。
【００４４】
【図４】図４は、受精能獲得を促進する刺激と共にインキュベートされた、既知の生殖能力があるドナーに由来する精子におけるＡＡおよびＡＰＭ局在パターンのパーセンテージを示す。
【００４５】
【図５】図５は、生殖能力が低い（sub-fertile）／不妊であると疑われるドナーに由来する精子におけるＡＡおよびＡＰＭ局在パターンのパーセンテージの、生殖能力がある男性の統計的閾値との比較を示す。
【００４６】
【図６】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃおよび６Ｄは、受精能獲得条件下での、不妊男性に由来する精子におけるＧＭ１の縞状細胞ＧＭ１局在パターンを示す。
【００４７】
【図７】図７は、実施例７に記載されている複数クリニック生殖補助転帰訓練セットに基づく、男性の生殖能力のロジスティック回帰モデルを説明する。
【００４８】
【図８−１】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）と、３回以内の子宮内人工授精の試みで妊娠を生じる確率（ＰＧＰ）との間の強い関係性を実証するための、ロジスティック回帰の使用を示す。図８Ａは、実施例７のデータを示す、ＰＧＰ＝１／［１＋ｅｘｐ［−［−２．８６３＋０．０７７６＊Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ］］］；ｎ＝１２４；ｐ＜０．０１。モデルのフィットを検査するため、合計ｎ＝２５２のために追加的な１２８個のデータ点が追加された。図８Ｂは、実施例８のデータを示す、ＰＧＰ＝１／［１＋ｅｘｐ［−［−２．２６３＋０．０５９３＊Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ］］］；ｐ＜０．００１。いずれのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）についても、ごく僅かな平均変化が観察され（平均２．６％）、モデルのフィットが改善された。図８Ｃおよび８Ｄは、ＰＧＰ、対、３回以内の子宮内人工授精の試みで観察された妊娠の結果を説明する。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
添付図面を参照しながら、本発明の様々な実施形態が、以下により完全に記載されている。本発明のすべてではないが、その一部の実施形態を示す。実際、本発明の様々な実施形態は、多くの異なる形態で具体化されうるが、明示的に記載されている実施形態に対する限定として解釈すべきでない。明確化を目的として、端折りながら本発明の明確な理解にとって重要な要素に焦点を当てるために、本発明の図および説明の少なくともいくつかは単純化されているが、当業者が理解するその他の要素も、本発明の一部分を占めうるものと理解される。しかしながら、そのような要素は当技術分野において周知されているので、またそれらは本発明のより良い理解を必ずしも促進しないので、そのような要素の説明は本明細書に提示されない。
【００５０】
本明細書において特定された参考資料のいずれもみな、参照によりその全体が組み込まれている。
【００５１】
本明細書において特に記載する場合を除き、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、１つの要素に限定されず、むしろ「少なくとも１つの」という意味として読み取られるべきである。
【００５２】
「約」は、参照された数値の±１０％の範囲を意味するものと理解される。しかしながら、数値と関連して「約」が使用されても、参照された数値そのものの可能性を除外しない。例えば、「約１時間」は、「５４分」、「１時間」および「６６分」を十分に支持するものと理解される。
【００５３】
本開示は、特定のＧＭ１局在パターンは男性の生殖能力状態に関する情報を提供しうる、という観察に基づく。ＧＭ１局在パターンの決定は、米国特許第７，１６０，６７６号、同第７，６７０，７６３号、および同第８，３６７，３１３号に記載されており、その開示は本明細書において参照により組み込まれている。本開示は、男性の生殖能力状態を決定するための方法およびキットを提供する。ある特定の実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得刺激に曝露された際に、特定のＧＭ１局在パターンのパーセンテージにおける変化に基づく。他の実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得刺激に曝露された際の縞状細胞ＧＭ１局在パターンのパーセンテージにおける変化に特に基づく。
【００５４】
一実施形態では、男性の生殖能力状態を決定するための方法が、本明細書に開示される。一実施形態では、方法は、個体から得られた精子試料をｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件に付すこと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露された際の特定のＧＭ１局在パターンのパーセンテージにおける変化を決定すること、および変化のレベルに基づき、生殖能力状態を特定することを含む。
【００５５】
用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した」精子とは、受精能獲得プロセスを促進する条件下でインキュベートされた精子を指す。一実施形態では、受精能獲得条件として、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール受容体、例えば血清アルブミン、またはシクロデキストリンのうちの１つまたは複数が培地中に存在することが挙げられる。一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件として、培地中での重炭酸およびカルシウムイオンの存在、およびステロール受容体の存在が挙げられる。一実施形態では、ステロール受容体は、ステロール流出のメディエーターである。受精能を獲得した精子は、先体エキソサイトーシスを起こす能力を取得しており、また過剰に活性化したパターンの運動性を取得している。用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない」精子とは、受精能獲得のための上記刺激のうちの１つまたは複数と共にインキュベートされていない精子を指す。一実施形態では、非受精能獲得条件として、受精能獲得条件が存在しないことが挙げられる。別の実施形態では、非受精能獲得条件として、受精能獲得に必要とされる刺激のうちの１つまたは複数が存在しないことが挙げられる。受精能を獲得していない精子は、生理学的リガンド、例えば透明帯、透明帯に由来する可溶化されたタンパク質、またはプロゲステロン等により誘発された先体エキソサイトーシスを起こさない。さらに、非受精能獲得条件下でインキュベートされた精子も、過剰に活性化した運動性を示さない。
【００５６】
一実施形態では、受精能獲得は、外部刺激、例えば重炭酸、およびカルシウムイオン等、ならびにステロール流出のメディエーター、例えば２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、リポソーム等への曝露により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘発されうる。ある特定の実施形態では、精子が、これらの刺激のうちの１つまたは複数にｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝露されるとき、ＧＭ１局在パターンにおける特定可能な変化が観察される。
【００５７】
一実施形態では、収集後、精液試料は、液化、洗浄、および／または富化のうちの１つまたは複数を含む、いくつかの方法で一般的に処理される。一部の実施形態では、液化は、試料が、室温または３７℃（またはその間の任意の温度）で、様々な期間（１０〜６０分の範囲であるが、一般的には１５〜２０分）において液化するのを可能にすることと関係する。液化は、精漿がゲルからより流体／液体のコンシステンシーに変換するプロセスである。精漿は、何らかの操作をしなくても一般的に液化するが、しかし特に粘稠試料の場合、またはプロセスを速めたい、もしくは一貫した液化プロトコールを作成し、そのプロトコールによりすべての試料が取り扱われるようにしたい要望が存在する場合には、個体は液化を実現するために試料を操作しうる。ある特定の実施形態では、精液試料は、精液粘度を減少させるために、非金属材料からなる広いオリフィスのピペットを使用することにより操作される。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージ、または１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍ、または１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。ある特定の実施形態では、精子膜に損傷を与えない様々な試薬を添加することにより、液化を実現することもできる。避けるべき試薬として、精子膜に損傷を与える試薬が挙げられる。精子は、遠心分離および再懸濁により洗浄可能であり、またそれを精液分析に付すことができ、ならびに／あるいは下記を含む１つまたは複数の選択プロセスに付すことができる：試料最上部における積層化および密度勾配による遠心分離；試料最上部における積層化および密度勾配による遠心分離、それに続く精子富化画分の収集、その後の再懸濁および洗浄；試料最上部における積層化および密度勾配による遠心分離、それに続く精子富化画分の収集、およびその最上部へのより低密度の培地（運動精子がその中に泳動する）の重層；または試料最上部へのより低密度の培地の重層、および運動精子がその中に泳動するのを可能にすること。
【００５８】
最初の処理の後に、精子を数えることができ、次に所望の最終濃度を実現するために、所定数の精子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ非受精能獲得培地またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精能獲得培地を含有する容器（チューブ等）中に配置可能である。一実施形態では、代表的な最終精子濃度は、１，０００，０００／ｍｌである（最終濃度範囲は、２５０，０００／ｍｌ〜２５０，０００，０００／ｍｌで変化しうる）。
【００５９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ非受精能獲得性および受精能獲得性ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で精子をインキュベートするためのベース培地は、生理学的緩衝溶液、例えば、ヒト卵管液（ＨＴＦ）；修飾されたヒト卵管液（ｍＨＴＦ）；Ｗｈｉｔｔｅｎ培地；修飾されたＷｈｉｔｔｅｎ培地；ＫＳＯＭ；リン酸緩衝食塩水；ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水；トリス緩衝食塩水；ＨａｍのＦ−１０；Ｔｙｒｏｄｅ培地；修飾されたＴｙｒｏｄｅ培地；ＴＥＳ−トリス（ＴＥＳＴ）卵黄緩衝液；またはＢｉｇｇｅｒｓ、Ｗｈｉｔｔｅｎ、およびＷｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ（ＢＷＷ）培地等でありうるが、ただしこれらに限定されない。ベース培地は、生存能力を促進するために、または受精能獲得を誘発するのに十分役立つ濃度において、タンパク質、およびそれに添加されるその他の因子の１つもしくは複数の定義された、または複合した供給源（胎児臍帯血清限外濾過液、プラスマネート、卵黄、スキムミルク、アルブミン、リポタンパク質、または脂肪酸結合タンパク質を含む）を有しうる。受精能獲得のための代表的な刺激として、下記のうちの１つまたは複数が挙げられる：重炭酸塩（５〜５０ｍＭの範囲、一般的に２０〜２５ｍＭ）、カルシウム（０．１〜１０ｍＭの範囲、一般的に１〜２ｍＭ）、および／またはシクロデキストリン（０．１〜２０ｍＭの範囲、一般的に１〜３ｍＭ）。シクロデキストリンは、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよび／またはメチル−β−シクロデキストリンを含み得る。インキュベーション温度は、一般的に３７℃（３０℃〜３８℃の範囲）であり、またインキュベーション時間は、一般的に１〜４時間（３０分〜１８時間の範囲）であるが、ただしベースライン試料がインキュベーション期間の開始時（「時間ゼロ」）に取得可能である。
【００６０】
一実施形態では、ＧＭ１のパターンを生成するために、精子が標準的なベース培地（例えば、リン酸緩衝食塩水、修飾されたＷｈｉｔｔｅｎ培地、またはその他の類似した培地）で洗浄され、そしてＧＭ１に対する標識分子（検出可能な標識をその上に有する）と共にインキュベートされる。ＧＭ１は、エピトープとして機能することができる細胞外糖残基を有するので、細胞を固定し、透過性にすることなく可視化可能である。しかしながら、細胞を固定すれば、パターン形成に寄与しつつ、検体の保存がより良好になり、可視化はより容易になり（泳動精子におけるパターン識別と比較して）、またより長時間の可視化が可能となる。精子（ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ）の組織学的試験において公知の様々な固定剤は、当業者の理解の範囲内にある。好適な固定剤として、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ブアン固定液、およびカコジル酸ナトリウム、塩化カルシウム、ピクリン酸、タンニン酸等を含む固定剤が挙げられる。一実施形態では、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはその組合せが使用される。
【００６１】
固定条件は、約０．００４％（重量／体積）のパラホルムアルデヒド〜約４％（重量／体積）のパラホルムアルデヒドの範囲でありうるが、ただし約０．０１％〜約１％（重量／体積）のパラホルムアルデヒドが一般的に使用される。一実施形態では、約０．００５％（重量／体積）のパラホルムアルデヒド〜約１％（重量／体積）のパラホルムアルデヒドが使用可能である。一実施形態では、リン酸緩衝食塩水中の約４％のパラホルムアルデヒド（重量／体積）、約０．１％のグルタルアルデヒド（重量／体積）、および約５ｍＭのＣａＣｌ２が使用可能である。
【００６２】
精子試料が固定剤中で固定される期間は変化しうる。一実施形態では、精子試料は、固定剤中で約５時間またはそれより短い期間固定される。一実施形態では、精子試料は、固定剤中で約５時間より長い期間固定される。別の実施形態では、精子試料は、固定剤中で、約０．５時間、約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約３．５時間、約４時間、約４．５時間、約５時間、約５．５時間、約６時間、約６．５時間、約７時間、約７．５時間、約８時間、約８．５時間、約９時間、約９．５時間、約１０時間、約１０．５時間、約１１時間、約１１．５時間、約１２時間、約１２．５時間、約１３時間、約１３．５時間、約１４時間、約１４．５時間、約１５時間、約１５．５時間、約１６時間、約１６．５時間、約１７時間、約１７．５時間、約１８時間、約１８．５時間、約１９時間、約１９．５時間、約２０時間、約２０．５時間、約２１時間、約２１．５時間、約２２時間、約２２．５時間、約２３時間、約２３．５時間、約２４時間、約２４．５時間、約２５時間、約２５．５時間、約２６時間、約２６．５時間、約２７時間、約２７．５時間、約２８時間、約２８．５時間、約２９時間、約２９．５時間、約３０、または上記時間から決定可能な任意の範囲（例えば、約２６時間〜約２８時間、または約３時間〜約５時間）固定される。
【００６３】
生存精子または固定済みの精子におけるＧＭ１の局在パターンは、標識結合技術を使用することにより得ることが可能である。ＧＭ１ガングリオシドに対して特異的親和性を有する分子が使用可能である。標識分子は、検出可能な標識（フルオロフォア等）と直接連結可能であり、または検出可能な標識をその上に有する第２の標識分子により検出されうる。例えば、コレラ毒素のｂサブユニットは、ＧＭ１に特異的に結合することが公知である。したがって、標識された（例えば、蛍光標識された）コレラ毒素ｂサブユニットが、ＧＭ１の分布パターンを得るのに使用可能である。一実施形態では、フルオロフォアと連結したコレラ毒素のｂサブユニットの最終濃度は、約１０μｇ／ｍｌ〜約１５μｇ／ｍｌである。別の実施形態では、フルオロフォアと連結したコレラ毒素のｂサブユニットの最終濃度は、約０．１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌである。あるいは、ＧＭ１に対する標識抗体が使用可能である。さらに別の代替法では、コレラ毒素ｂサブユニットに対する標識抗体が、ＧＭ１染色パターンを視覚化するのに使用可能である。そしてさらに別の代替法では、ＧＭ１に直接結合する一次抗体、またはコレラ毒素のｂサブユニットに結合する一次抗体と結合する、標識された二次抗体が使用されうる。用語「ＧＭ１染色」もしくは「ＧＭ１の染色」、または「標識」、または関連する用語は、本明細書で使用される場合、ＧＭ１に対する標識された親和性分子の結合に起因して、細胞上でまたは細胞内で認められる染色を意味する。例えば、蛍光タグがついた／蛍光標識されたコレラ毒素ｂサブユニットが、ＧＭ１の限局化（localization）で使用されるとき、シグナルまたは染色はコレラ毒素ｂサブユニットに由来するが、しかしＧＭ１の場所を示す。用語「シグナル」および「染色」および「標識」は交換可能に使用される。検出可能な標識は、検出可能なシグナルを生成する能力を有するようなものである。そのような標識として、放射性核種、酵素、蛍光剤、または発色団が挙げられる。精子内のＧＭ１分布の標識（または染色）および可視化は、標準的な技術により実施される。コレラ毒素のｂサブユニット以外の標識分子も使用可能である。これには、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体が含まれる。ＧＭ１ガングリオシドに対する特異的抗体は、ルーチンの免疫化プロトコールにより生成可能である、または商業的に購入可能である（例えば、Ｍａｔｒｅｙａ，Ｉｎｃ．、Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）。抗体はＧＭ１に対して生じうる、またはＧＭ１分子の関連するエピトープのペプチド模倣体を使用することにより生成可能である。ペプチド模倣体の同定および生成は当業者にとって周知である。さらに、コレラ毒素へのｂサブユニットの結合は小分子により模倣されうる。所定の試薬に類似した結合特性を有する小分子の特定は当業者にとって周知である。
【００６４】
ヒト精子の場合、精子がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に置かれたとき、８つの異なる局在パターン（下記実施例１の詳細を参照）が認められた。これらのパターンは、ＩＮＴＥＲ、ＡＰＭ、ＡＡ、ＰＡＰＭ、ＡＡ／ＰＡ、ＥＳ、ＤＩＦＦ、および縞状細胞と命名されている。ＩＮＴＥＲ、ＡＰＭ、ＡＡ、ＰＡＰＭ、ＡＡ／ＰＡ、ＥＳ、およびＤＩＦＦパターンを図１に示し、また縞状細胞パターンを図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、および図６Ｄに示し、そのそれぞれを以下でさらに記載する：
・ＩＮＴＥＲ：大多数の蛍光は、赤道セグメントを取り巻くバンド内にあり、先体を覆う原形質膜に若干のシグナルが認められる。シグナルの勾配が通常存在し、大半が赤道セグメントに位置し、そして先端部に向かって徐々に少なくなる。赤道セグメント全体にわたるバンドにおいて、シグナル強度の増加が精子頭部の縁に多くの場合認められる。
・ＡＰＭ（先体原形質膜）：ＩＮＴＥＲと比較して、赤道シグナルと頂部先端部に向かって移動するシグナルとの間で、このパターンでは、その相違はそれほど大きくない。すなわち、先体を覆う原形質膜内のシグナルはより均等に分布している。ＡＰＭシグナルが、先端部に向かって頂部側に移動する明るい赤道ＩＮＴＥＲバンドから認められる、またはＡＡを伴う連続体であるので、先端部に向かってさらに開始することができ、またより小さい領域に見出される。
・ＡＡ（先体頂部）：このパターンでは、蛍光は、頂部先端部に向かって徐々に濃縮され、輝度が増加し、そしてシグナルを有するエリアでは減少する。
・ＰＡＰＭ（先体後方原形質膜）：シグナルは先体後方原形質膜に限定される。
・ＡＡ／ＰＡ（先体頂部／先体後方）：シグナルは、先体を覆う原形質膜および先体後方原形質膜の両方において認められる。シグナルは、赤道セグメントからは失われる。
・ＥＳ（赤道セグメント）：明るいシグナルが赤道セグメントのみに認められる。赤道領域全体にわたり精子頭部の肥厚を伴う場合がある。
・ＤＩＦＦ（拡散性）：拡散性のシグナルが精子頭部全体にわたり認められる。
・縞状細胞：シグナルが、先体後方領域の最上部および先体を覆う原形質膜、ならびに赤道セグメントの底部において認められる（すなわち、先体後方／赤道帯）。シグナルは、赤道セグメント周辺で失われている。
【００６５】
用語「ＧＭ１局在パターン」は、「パターン」または「局在パターン」と交換可能に使用される。
【００６６】
図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、および図６Ｄは、受精能獲得条件に置かれた不妊男性に由来する精子内のＧＭ１について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンを示す。特に、図６Ａは、シグナルが先体後方／赤道帯および先体を覆う原形質膜において均等に分布している縞状細胞ＧＭ１局在パターンを示す。図６Ｂは、先体を覆う原形質膜におけるシグナルが、先体後方／赤道帯におけるシグナルよりも明るい縞状細胞ＧＭ１局在パターンを示す。図６Ｃおよび図６Ｄは、先体を覆う原形質膜におけるシグナルよりも明るい、先体後方／赤道帯におけるシグナルを示す。
【００６７】
ＩＮＴＥＲ、ＡＡ、ＡＰＭパターン、およびこれらのパターンの組合せは、正常な精子膜構造、したがって生殖能力を有する生存精子と正に相関するが、ＰＡＰＭ、ＡＡ／ＰＡ、ＥＳ、ＤＩＦＦ、および縞状細胞パターンは、生存能力、正常な膜構造、および生殖能力と正に相関しないことが観察された。非受精能獲得条件下でインキュベートした場合、正常な膜構造を有する生存精子の大部分はＩＮＴＥＲパターンを示すが、同パターンは、標識の大部分が赤道セグメント近傍に位置し、残りは先体を覆う原形質膜まで延在することにより特徴付けられる。さらに、受精能獲得のための刺激に曝露すると、ＡＰＭおよびＡＡパターンの数の増加が認められる。ＡＰＭパターンは、先体を覆う原形質膜においてより均一なシグナルを示す一方、ＡＡパターンは、先体頂部である精子頭部の吻側部分においてシグナルの強度増加、および赤道セグメントに向かって尾部側に移動するシグナルの低下を示す。不妊の個体において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件下でインキュベートした精子は、正常な個体において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件下でインキュベートした精子のＧＭ１局在パターンと類似したＧＭ１局在パターンを有する。
【００６８】
一実施形態では、男性の生殖能力状態を決定するための方法が本明細書に開示される。一実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料を得るために、男性に由来する精子試料の第１の部分を非受精能獲得条件に曝露するステップ；ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を得るために、精子試料の第２の部分を受精能獲得条件に曝露するステップ；ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、固定剤で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、または２４時間の期間にわたって固定するステップ；固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子で処理するステップであって、標識分子が検出可能な標識を有する、ステップ；標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記ＧＭ１標識された局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターン、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンであるステップ；標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料についての標識されたＧＭ１局在パターンを、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての標識されたＧＭ１局在パターンと比較するステップ；比較に基づき、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターンと先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターンを受精能獲得状態に割り当て、および縞状細胞ＧＭ１局在パターンとすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを非受精能獲得状態に割り当てるステップ；ならびに、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料、および標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、特定され、ＧＭ１標識された局在パターンに基づき、男性の生殖能力状態を特徴付けるステップを含む。一実施形態では、特徴付けるステップは、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージと関連する生殖能力閾値を決定するステップであって、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージが、下記に対応する既知の生殖能力がある集団の分布統計学に基づく：参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力があることを示し、参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たず、かつ参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力が低いことを示し、参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージに満たないこ��が、不妊を示す、ステップ；標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージを、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較するステップ；および比較に基づき生殖能力閾値を特定するステップを含む。
【００６９】
別の実施形態では、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージと関連する生殖能力閾値が決定され、その場合、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージは、下記に対応する既知の生殖能力がある集団の分布統計学に基づく：参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、正常な男性生殖能力を示し、参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、異常な男性生殖能力を示す。標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージが、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較される。生殖能力閾値が比較に基づき特定される。
【００７０】
一実施形態では、曝露するステップの前に、精液試料は、精液粘度を減少させるために、非金属材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、かつ精液粘度を減少させるために使用される様々な試薬から選択される、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して処理される。一部の実施形態では、膜損傷試薬は、（ｉ）プロテアーゼ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）粘液溶解剤、（ｉｖ）リパーゼ、（ｖ）エステラーゼ、および（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼからなる群より選択される。一部の実施形態では、特定するステップは、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定となるまで繰り返される。そのような一実施形態では、特定するステップが実施された後、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が標識された細胞の合計数の５％未満、３％未満となるまで、または標識された細胞の合計数の１％〜５％、２〜５％の範囲に収まるまで決定する。別のそのような実施形態では、特定するステップが実施された後、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が標識された細胞の合計数の２５％、２０％、１５％、もしくは１０％未満となるまで、または標識された細胞の合計数の２％〜２５％、２％〜２０％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％の範囲に収まるまで決定する。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージ、または１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍ、または１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【００７１】
そのような一実施形態では、特徴付けるステップは下記のステップを含みうる：事前に決定された数の、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料について、各ＧＭ１標識された局在パターンの数を決定するステップ；事前に決定された数の、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、各ＧＭ１標識された局在パターンの数を決定するステップ；標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料について、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンの数の和の、ＧＭ１標識された局在パターンの合計数の和に対する比を計算するステップ；ならびに標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンの数の和の、ＧＭ１標識された局在パターンの合計数の和に対する比を計算するステップ。
【００７２】
そのような一実施形態では、方法は下記のステップをさらに含みうる：標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子の比を、既知の生殖能力状態を有する、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子の比と比較するステップ；および標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子の比を、既知の生殖能力状態を有する標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子の比と比較するステップ。
【００７３】
一実施形態では、男性の生殖能力状態を決定するための方法が、本明細書に開示されている。一実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非受精能獲得条件に曝露され、固定剤中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間または２４時間固定され、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子で処理された、男性に由来する精子試料の第１の部分を得るステップであって、標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露され、固定剤中で固定され、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子で処理された、精子試料の第２の部分を得るステップと、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターン、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンである２つ以上のＧＭ１標識された局在パターンを特定するステップと、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料についての標識されたＧＭ１局在パターンを、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての標識されたＧＭ１局在パターンと比較するステップと、比較に基づき、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターンおよび先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターンを受精能獲得状態に割り当て、縞状細胞ＧＭ１局在パターンおよびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを非受精能獲得状態に割り当てるステップと、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての特定されたＧＭ１標識された局在パターンに基づき、男性の生殖能力状態を特徴付けるステップとを含む。一実施形態では、特徴付けるステップは、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージに関連する生殖能力閾値を決定するステップであって、既知の生殖能力がある集団の分布統計に基づく［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージが、参照平均パーセンテージを下回る標準偏差であるパーセンテージを超えることが、生殖能力があることを示す；参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たず、かつ参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力が低いことを示す；参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、不妊を示すことに対応する、ステップと、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージを、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較するステップと、比較に基づき生殖能力閾値を特定するステップとを含む。
【００７４】
別の実施形態では、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージに関連する生殖能力閾値が決定され、既知の生殖能力がある集団の分布統計に基づく［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージは、参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、正常な男性の生殖能力を示す；参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、異常な男性の生殖能力を示すことに対応する。標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージは、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較される。生殖能力閾値は、比較に基づき特定される。
【００７５】
一部の実施形態では、特定するステップは、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定になるまで反復される。斯かる一実施形態では、特定するステップが行われた後に、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が、標識された細胞の合計数の５％未満、３％未満；または標識された細胞の合計数の１％〜５％、２〜５％の範囲になるまで決定する。別の斯かる実施形態では、特定するステップが行われた後に、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が、標識された細胞の合計数の２５％、２０％、１５％もしくは１０％未満；または標識された細胞の合計数の２％〜２５％；２％〜２０％；２〜１５％；２〜１０％；２〜５％の範囲になるまで決定する。
【００７６】
斯かる方法の一実施形態では、方法は、所定の数の標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、各ＧＭ１標識された局在パターンの数を決定するステップと、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料のそれぞれについて、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンの数およびＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンの数の和の、ＧＭ１局在パターンの合計数の和に対する比を計算するステップとをさらに含む。
【００７７】
斯かる一実施形態では、特徴付けるステップは、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料の比を、既知の生殖能力状態を有する男性についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子のＧＭ１局在パターンの比と比較するステップと、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料の比を、既知の生殖能力状態を有する男性についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子のＧＭ１局在パターンの比と比較するステップとをさらに含むことができる。
【００７８】
一実施形態では、男性の生殖能力状態を決定するための方法が、本明細書に開示されている。一実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、男性に由来する精子試料を受精能獲得条件に曝露するステップと、受精能を獲得した精子試料を、固定剤を用いて少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間または２４時間固定するステップと、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子で処理するステップであって、標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターン、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンである２つ以上のＧＭ１標識された局在パターンを特定するステップと、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターンおよび先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターンを、受精能獲得状態に割り当て、縞状細胞ＧＭ１局在パターンおよびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを、非受精能獲得状態に割り当てるステップと、男性の生殖能力状態を特徴付けるステップとを含む。一実施形態では、特徴付けるステップは、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージに関連する生殖能力閾値を決定するステップであって、既知の生殖能力がある集団の分布統計に基づく［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージが、参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力があることを示す；参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たず、かつ参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力が低いことを示す；参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、不妊を示すことに対応する、ステップと、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージを、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較するステップと、比較に基づき生殖能力閾値を特定するステップとを含む。
【００７９】
別の実施形態では、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージに関連する生殖能力閾値が決定され、既知の生殖能力がある集団の分布統計に基づく［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージは、参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、正常な男性の生殖能力を示す；参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、異常な男性の生殖能力を示すことに対応する。標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージは、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較される。生殖能力閾値は、比較に基づき特定される。
【００８０】
一実施形態では、曝露するステップの前に、精液試料は、非金属性材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、精液粘度を減少させるために使用される様々な試薬から選択される精子膜に損傷を与えない試薬を使用して処理して、精液粘度を減少させる。一部の実施形態では、膜損傷試薬は、（ｉ）プロテアーゼ；（ｉｉ）ヌクレアーゼ；（ｉｉｉ）粘液溶解剤；（ｉｖ）リパーゼ；（ｖ）エステラーゼおよび（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼからなる群より選択される。一部の実施形態では、特定するステップは、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定になるまで反復される。斯かる一実施形態では、特定するステップが行われた後に、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が、標識された細胞の合計数の５％未満、３％未満；または標識された細胞の合計数の１％〜５％、２〜５％の範囲になるまで決定する。別の斯かる実施形態では、特定するステップが行われた後に、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が、標識された細胞の合計数の２５％、２０％、１５％もしくは１０％未満；または標識された細胞の合計数の２％〜２５％；２％〜２０％；２〜１５％；２〜１０％；２〜５％の範囲になるまで決定する。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージまたは１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍまたは１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【００８１】
斯かる方法の一実施形態では、方法は、ＧＭ１局在パターンの比を、既知の生殖能力状態を有する男性についてのＧＭ１局在パターンの比と比較するステップをさらに含むことができる。一実施形態では、既知の生殖能力状態は、生殖能力がある男性に対応する。別の実施形態では、既知の生殖能力状態は、不妊男性に対応する。斯かる一実施形態では、比較するステップは、所定の数の標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、各ＧＭ１標識された局在パターンの数を決定するステップと、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンの数およびＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンの数の和の、ＧＭ１標識された局在パターンの合計数の和に対する比を計算するステップとを含む。
【００８２】
一実施形態では、男性の生殖能力状態を決定するための方法が、本明細書に開示されている。一実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露されており、固定剤中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間または２４時間固定されており、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子で染色されている、男性に由来する精子試料の第１の部分を得るステップであって、標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターン、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンである２つ以上のＧＭ１標識された局在パターンを特定するステップと、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターンおよび先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターンを受精能獲得状態に割り当て、縞状細胞ＧＭ１局在パターンおよびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを非受精能獲得状態に割り当てるステップと、男性の生殖能力状態を特徴付けるステップとを含む。一実施形態では、特徴付けるステップは、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージに関連する生殖能力閾値を決定するステップであって、既知の生殖能力がある集団の分布統計に基づく［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージが、参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力があることを示す；参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たないこと、かつ参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、生殖能力が低いことを示す；参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、不妊を示すことに対応する、ステップと、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージを、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較するステップと、比較に基づき生殖能力閾値を特定するステップとを含む。
【００８３】
別の実施形態では、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージに関連する生殖能力閾値が決定され、既知の生殖能力がある集団の分布統計に基づく［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージは、参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、正常な男性の生殖能力を示す；参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、異常な男性の生殖能力を示すことに対応する。標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージは、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較される。生殖能力閾値は、比較に基づき特定される。
【００８４】
一部の実施形態では、特定するステップは、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定になるまで反復される。斯かる一実施形態では、特定するステップが行われた後に、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が、標識された細胞の合計数の５％未満、３％未満；または標識された細胞の合計数の１％〜５％、２〜５％の範囲になるまで決定する。別の斯かる実施形態では、特定するステップが行われた後に、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子について、縞状細胞ＧＭ１局在パターンの数を、該数が、標識された細胞の合計数の２５％、２０％、１５％または１０％未満；または標識された細胞の合計数の２％〜２５％；２％〜２０％；２〜１５％；２〜１０％；２％〜５％の範囲になるまで決定する。
【００８５】
斯かる方法の一実施形態では、方法は、ＧＭ１局在パターンの比を、既知の生殖能力状態を有する男性についてのＧＭ１局在パターンの比と比較するステップをさらに含むことができる。一実施形態では、既知の生殖能力状態は、生殖能力がある男性に対応する。別の実施形態では、既知の生殖能力状態は、不妊男性に対応する。斯かる一実施形態では、比較するステップは、所定の数の標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、各ＧＭ１標識された局在パターンの数を決定するステップと、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンの数およびＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンの数の和の、ＧＭ１標識された局在パターンの合計数の和に対する比を計算するステップとを含む。
【００８６】
一実施形態では、男性の生殖能力状態を決定するための方法が、本明細書に開示されている。一実施形態では、方法は、精子試料を得るステップであって、精子試料の少なくとも一部分が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子を得るためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露されており、固定剤に少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間または２４時間曝露されており、ＧＭ１について染色されている、ステップと、精子試料の１つまたは複数の精液パラメーターの値を得るステップと、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを、１つまたは複数のＧＭ１標識された局在パターンに基づき決定するステップであって、前記ＧＭ１標識された局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターン、先体後方原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと、決定されたＣＡＰ  ｓｃｏｒｅおよび１つまたは複数の得られた精液パラメーターに基づき、男性の男性生殖能力指数（ＭＦＩ）値を計算するステップとを含む。一実施形態では、精子試料の１つまたは複数の精液パラメーターは、元の精子試料の体積、精子の濃度、精子の運動性、および精子の形態からなる群より選択される。
【００８７】
本明細書に開示されている１つの実施形態は、男性の生殖能力状態を決定するための方法である。一実施形態では、方法は、次のステップを含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞の試料が、蛍光標識で処理される。１つまたは複数の受精能を獲得した蛍光画像が得られ、画像は、蛍光標識されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞に関連する１つまたは複数のＧＭ１局在パターンを呈する。先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターンおよび先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターンはそれぞれ、受精能獲得状態に割り当てられ、縞状細胞ＧＭ１局在パターンおよびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンは、非受精能獲得状態に割り当てられ、それぞれ、ｃａｐ−蛍光画像において示される。ＧＭ１局在パターンの数が測定され、パターンは、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージを決定するための受精能を獲得した蛍光画像において示される、蛍光標識されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞についてのＡＡ  ＧＭ１局在パターン、ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを含む。［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージに関連する生殖能力閾値が決定され、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージは、参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることは、生殖能力があることを示す；参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たず、かつ参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージを超えることは、生殖能力が低いことを示す；参照平均パーセンテージを２標準偏差下回るパーセンテージに満たないことは、不妊を示すことに対応する。［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージは、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較される。生殖能力閾値は、比較に基づき特定される。
【００８８】
別の実施形態では、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージに関連する生殖能力閾値が決定され、既知の生殖能力がある集団の分布統計に基づく［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージは、参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージを超えることが、正常な男性の生殖能力を示す；参照平均パーセンテージを１標準偏差下回るパーセンテージに満たないことが、異常な生殖能力を示すことに対応する。標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料についての［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］のパーセンテージは、［（ＡＡ  ＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン）／総ＧＭ１局在パターン］の参照パーセンテージと比較される。生殖能力閾値は、比較に基づき特定される。
【００８９】
斯かる一実施形態では、特定するステップはまた、次のうちの１つまたは複数に基づく：患者人口動態、女性パートナーの生殖状態、精子濃度、総運動性、直進運動性（progressive motility）、精液体積、精液ｐＨ、精液粘度および／または精子形態、ならびにそれらの組合せ。
【００９０】
本明細書に記載されている方法の様々な実施形態では、精子細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、受精能獲得条件で、少なくとも１時間；少なくとも２時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間の受精能獲得期間にわたり、０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜２４時間；１２時間〜２４時間；または１８時間〜２４時間の間の範囲の受精能獲得期間にわたり処理される。
【００９１】
本明細書に記載されている方法の様々な実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞は、固定剤で、少なくとも０．５時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間；少なくとも３０時間；少なくとも３６時間；または少なくとも４８時間の固定期間にわたり、０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜１８時間；６〜１８時間；６〜２４時間；１２時間〜２４時間；１８時間〜２４時間；１８〜３０時間；１８〜３６時間；２４〜３０時間；２４〜２６時間；１８〜４８時間；２４〜４８時間；または３６〜４８時間の間の範囲の固定期間にわたり処理される。
【００９２】
本明細書に記載されている方法の様々な実施形態では、ＧＭ１標識された局在パターンのうちの２種以上は、ＡＡ  ＧＭ１局在パターン、ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、中間（intermediate）（ＩＮＴＥＲ）ＧＭ１局在パターン、先体後方原形質膜（ＰＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）ＧＭ１局在パターン、赤道（equatorial）セグメント（ＥＳ）ＧＭ１局在パターン、および拡散（ＤＩＦＦ）ＧＭ１局在パターンを含む。
【００９３】
一実施形態では、精子試料の第１の部分を非受精能獲得条件に曝露するステップと、精子試料の第２の部分を受精能獲得条件に曝露するステップは、同時に行われる。
【００９４】
男性個体は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。非ヒト動物の場合、生殖能力状態と相関したパターンの特定は、本明細書に提供される教示に基づき実行することができる。非ヒト動物は、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、シカ、ウサギ、ニワトリ、シチメンチョウ、様々な種の魚類、および様々な動物学的な種を含む。
【００９５】
一実施形態では、本開示の方法は、男性を不妊の可能性があると指定するための方法であって、受精能獲得および非受精能獲得条件下でインキュベートされ、必要に応じて固定された、個体由来および正常対照に由来する精子におけるＧＭ１局在パターン（例えば、縞状細胞、ＡＡ、ＡＰＭおよびすべてのその他のＧＭ１局在パターンのうちの１つまたは複数）を得るステップと、ＧＭ１局在パターンを比較するステップとを含む方法を提供する。正常対照において、ある特定の局在パターンを呈する精子のパーセンテージの統計的に有意な変化が観察され得る。被験個体に由来する精子において同じ変化が観察されない場合には、個体は、異常な生殖能力状態を有すると指定される。一実施形態では、正常および異常な生殖能力状態の情報的な価値があるパターンは、局在パターンの縞状細胞、ＩＮＴＥＲ、ＡＡおよび／またはＡＰＭである。よって、正常な生殖能力状態を有することが既知の個体に由来する試料（対照として使用することができる）において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件への曝露の際に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非受精能獲得条件に曝露された精子と比較して、ＡＡおよび／またはＡＰＭ局在パターンを示す精子がより高いパーセンテージで、縞状細胞および／またはＩＮＴＥＲ局在パターンを示す精子がより低いパーセンテージで存在する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件への曝露の際に、精子がｉｎ  ｖｉｔｒｏで非受精能獲得条件に曝露された場合と比較して、これらの局在パターンのうちの１つまたは複数のパーセンテージに差も有意差も観察されない場合には、個体は、生殖能力の問題を有すると指定される。上述の実施形態の変形形態では、対照は、不妊であるまたは生殖能力が低いことが既知の個体に由来する場合がある。本実施形態では、縞状細胞、ＩＮＴＥＲ、ＡＡおよび／またはＡＰＭ局在パターンにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精能獲得の際の被験個体に由来するＧＭ１パターンの変化が、対照と同じである場合には、個体は、生殖能力が低いまたは不妊であるとみなすことができる。
【００９６】
上述の実施形態のさらに別の変形形態では、被験個体に由来する試料は、対照と比較せずに評価することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件への曝露の際に、縞状細胞、ＩＮＴＥＲ、ＡＡおよび／またはＡＰＭパターンの数に変化も有意な変化も観察されない場合には、個体は、異常とみなすことができ、さらなる検査に指定することができる一方、縞状細胞および／またはＩＮＴＥＲが減少する、ＡＡが増加する、および／またはＡＰＭが増加するような変化が観察される場合には、個体は、正常な生殖能力を有すると指定することができる。
【００９７】
一実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露された精子におけるＡＡおよびＡＰＭパターンの数を特定するための、ＧＭ１局在パターンの解析を含む。数は、総計と比べたＧＭ１分布パターンのうちの１つまたは複数のパーセンテージとして表現することができる。一実施形態では、生殖能力は、所定の生殖能力閾値、例えば、不妊および生殖能力が低いと分類された個体の間の閾値（すなわち、カットオフ）レベル、または生殖能力が低いと分類された個体および生殖能力があると分類された個体の間の閾値レベルに対する、ＡＡおよび／またはＡＰＭ局在パターンの数の比較に基づき予測される。
【００９８】
他の実施形態では、生殖能力閾値は、生殖能力が既知の男性集団に由来する精子において見出されるパターンの統計解析によって決定することができる。ある実施形態では、男性が、自然受胎または３もしくはそれよりも少ないサイクルの子宮内人工授精のいずれかを使用して、３年以内に妊娠したパートナーを有するまたは子供の父親になった場合、男性は、生殖能力があると考慮されるまたは正常な男性の生殖能力を有する。ある実施形態では、男性が、避妊を使用せずに６〜１２ヶ月以内の妊娠の達成に失敗し、妊娠を達成するために３を超えるサイクルの子宮内人工授精を要求した場合、男性は、生殖能力が低いと考慮される。ある実施形態では、男性が、避妊を使用せずに１年以内の妊娠の達成に失敗し、反復したサイクルの子宮内人工授精を使用して妊娠の達成に失敗した場合、男性は、不妊と考慮される。ある実施形態では、異常な男性の生殖能力は、生殖能力が低いおよび不妊の男性を含む。
【００９９】
図４に示す通り、生殖能力があることが既知の２４名の男性から７３種の精液試料を得た。その精子を、受精能獲得のための刺激、この場合は、４ｍＭ  ２−ヒドロキシ−プロピル−βシクロデキストリンと共にインキュベートし、０．０１％パラホルムアルデヒド（最終濃度）を用いて固定した。受精能を獲得したことを示すパターン（例えば、ＡＡ＋ＡＰＭ）を有する細胞のパーセンテージを評価した。ＡＡおよびＡＰＭパターンを有する精子の平均パーセンテージは、４１％であり、平均から２標準偏差は、２７％および５５％として計算した。
【０１００】
その生殖能力状態の医学的評価を求める１４名の男性に由来する１４種の試料におけるＧＭ１局在パターンを解析した。ＡＡ＋ＡＰＭ局在パターンを有する精子の相対的パーセンテージを、既知の生殖能力がある男性の集団から特定された統計的閾値に対して比較した（図５）。ベースライン（非刺激的、非受精能獲得条件）下でインキュベートした試料において観察される差はなかった。しかし、１４名の男性のうちの５名が、４ｍＭ  ２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンと共にインキュベートした場合に、ＡＡ＋ＡＰＭパターンを有する低パーセンテージの精子を示した試料を生じた。これら５種の試料はすべて、平均から２標準偏差下回っていた。受胎に困難があるカップルのおよそ３０〜５０％が、男性側要因の成分を有することが考えられる。これらのデータは、予想される範囲内に収まる。
【０１０１】
一実施形態では、本開示は、男性の生殖能力状態の決定のためのキットを提供する。キットは、次のうちの１つまたは複数を含む：精子膜の剪断を防止するのに十分な直径サイズのオリフィスを有するピペット、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精能獲得のための刺激として作用し得る薬剤、受精能獲得培地、非受精能獲得培地、固定剤、ＧＭ１局在パターンを決定するための標識試薬、受精能を獲得した精子の１つまたは複数のＧＭ１局在パターンおよび受精能を獲得していない精子の１つまたは複数のＧＭ１局在パターンを説明する図表。斯かる、受精能を獲得した精子のＧＭ１局在パターンおよび受精能を獲得していない精子のＧＭ１局在パターンは、既知の生殖能力状態を反映する。斯かるキット実施形態では、固定剤組成物は、精子膜に損傷を与えるべきではない。斯かる実施形態では、精子膜に損傷を与え得る試薬は、精液粘度を減少させるために使用される様々な試薬から選択される。一部の実施形態では、膜損傷試薬は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、粘液溶解剤、リパーゼ、エステラーゼおよびグリコシドヒドロラーゼのうちの１つまたは複数を含む。別のキット実施形態では、受精能獲得培地および非受精能獲得培地は、精子細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで適用されると、図表に反映される通り、受精能を獲得した精子を示すＧＭ１局在パターンおよび受精能を獲得していない精子を示すパターンを生じる。
【０１０２】
一実施形態では、キットは、受精能獲得を刺激するための４％シクロデキストリンを有する薬剤を含む。
【０１０３】
一実施形態では、受精能獲得培地は、３ｍＭ最終濃度を得るように２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンが添加された、改変されたヒト卵管液（tubal fluid）を含み；非受精能獲得培地は、改変されたヒト卵管液を含み；固定剤は、１％パラホルムアルデヒドであり；ＧＭ１パターンを決定するための試薬は、コレラ毒素のｂサブユニット（１５μｇ／ｍｌ最終濃度）である。他の実施形態では、パラホルムアルデヒドの最終濃度は、０．０１％である。
【０１０４】
例示的なキットは、ＨＥＰＥＳで緩衝されたゲンタマイシンを有する改変されたＨＴＦ培地を含む（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、参照９０１２６）。重炭酸塩緩衝培地が使用されたかＨＥＰＥＳ緩衝培地が使用されたかにかかわらず、ＧＭ１局在パターン、生存度または精子回収、および受精能獲得に差は観察されなかった。したがって、重炭酸塩緩衝培地を使用することもできる。ＨＥＰＥＳ緩衝液の使用は、ＣＯ２インキュベーターのみと適合性である場合とは対照的に、エアインキュベーターまたはウォーターバスを使用して、クリニックでアッセイが行われることを可能にする。同様に、市販のもの（ＨＴＦ−ＳＳＳＴＭ、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃまたはプラスマネート）であれ、粉末アルブミンであれ、補足的タンパク質の添加は、回収または生存度を変更せず、受精能獲得状態を有利に増強する。
【０１０５】
例示的なキットは、細胞単離培地（たとえば、Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｓ−Ｐｌｕｓ細胞単離培地、９０％、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ製、参照：１５２３２  ＥＳＰ−１００−９０％）をさらに含むことができる。例示的な試薬、消耗品および手順は、ヒト精子におけるＧＭ１の有利な標識を生じることが実証された。
【０１０６】
例示的なキットは、広いオリフィスのピペットチップ（２００μｌラージオリフィスチップ、ＵＳＡ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０１１−８４００）をさらに含むことができる。例示的なキットは、広いオリフィスのトランスファーピペット（多目的トランスファーピペット、標準バルブ参照番号：２０２−２０Ｓ。ＶＷＲカタログ番号１４６７０−１４７）をさらに含むことができる。一実施形態では、ピペットは、非金属性である。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージまたは１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍまたは１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【０１０７】
例示的なキットは、１．５ｍｌチューブ（処理キャップ（Treatment cap）、ノンキャップ（noncap）、ＣＤ）（ＵＳＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  １４１５９７００）をさらに含むことができ、そのうちの１つは、受精能獲得を刺激するための粉末形態のシクロデキストリンを含有し、もう１つは、培地単独の非受精能獲得条件のために空である。一部の実施形態では、シクロデキストリンが、別々のチューブに見出されることが可能であり、そこに培地が添加して、それ自体が受精能獲得チューブに添加されることになるストック溶液を作製する。
【０１０８】
精漿から精子を単離する場合、ヒト男性学研究室にとって、密度勾配を使用して精子を収集することが一般的である。例示的なキットは、密度勾配から精漿を除去し、次いで未使用のトランスファーピペットを使用して、ペレットになった精子を収集するための、密度勾配材料および／または指示をさらに含むことができる。
【０１０９】
例示的なキットは、固定剤（０．１％ＰＦＡ等）をさらに含むことができ、必要に応じて、輸送、貯蔵または規制目的に有用な、情報書式（患者要求書式等）、標識および容器／バッグ／パウチ等を含む。例えば、キットは、ホイルパウチ、患者試料を郵送するための吸収剤を有するバイオハザードバッグ、吸収剤を有する再封可能なバッグ、および発泡体のチューブ設置ホルダーを含有することができる。
【０１１０】
例示的なキットは、本明細書に開示されている方法のいずれかについて記載する指示をさらに含むことができる。
【０１１１】
別の態様では、男性個体の生殖能力を測定するための方法が提供される。ＧＭ１局在アッセイは、精子が受精能を獲得することができるか否か、したがって、卵に受精する能力を有するようになるか否かを示すことができる。上述の通り、アッセイは、精子頭部におけるＧＭ１局在の特異的パターンを有する形態学的に正常な精子のパーセンテージとしてスコア化され得る。ＡＰＭおよびＡＡパターンは、精子が受精能獲得のための刺激に応答するにつれて増加する。カットオフを使用して、射精液の相対的生殖能力を区別し、精液試料を男性の生殖能力に基づく群へと分けることができる（例えば、生殖能力がある男性を生殖能力が低い男性と不妊男性から区別する）。しかし、精子数、運動性および形態もまた、男性の生殖能力に影響し得るため、本開示は、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅおよび１つまたは複数の関連する精液パラメーター（例えば、数、運動性および形態等）を包含する、男性の生殖能力の指数（「男性生殖能力指数」または「ＭＦＩ」）を作成するための方法を提供する。Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（ＧＭ１スコアとも称される）は、１つまたは複数のＧＭ１パターンの数である。例えば、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅは、縞状細胞、ＩＮＴＥＲ、ＡＡおよびＡＰＭのうちの１つまたは複数の数であり得る。特異的精液パラメーターを強調する、異なる指数を生成することができる。例えば、本開示に従った指数は：
・  Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ×％直進運動性あり×絶対数；
・  Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ×％形態学的に正常な精子×絶対数；
・  Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ×％総運動性×絶対数×％形態学的に正常な精子；ならびに
・  他の変形形態、またはＣａｐ−Ｓｃｏｒｅおよびこれらのパラメーターの組合せ、またはＶＳＬ（直線速度）；ＳＴＲ（直線性）；ＬＩＮ（直進性（linearity））；ＶＣＬ（曲線速度）；ＶＡＰ（平均パス速度（velocity average path））；％運動性；運動性の持続時間；ＬＨＡ（側方頭部振幅（lateralhead amplitude））；ＷＯＢ（ゆらぎ）；ＰＲＯＧ（前進）；およびＢＣＦ（頭部振動数（Beat cross number））等のＣＡＳＡ（コンピューター支援精子解析）を使用して得られるパラメーターを含む他の特異的パラメーターを含む。例えば、WorldHealth Organization, "WHO Laboratory Manual for the Examination andProcessing of Human Sperm," (Fifth Ed. 2010)を参照されたい。
【０１１２】
男性生殖能力指数は、男性個体の生殖能力状態を測定するための方法として具体化することができる。精子試料が得られ、精子試料は、測定されている個体に由来し、上述の通り、精子試料の少なくとも一部分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露されており、固定剤に曝露されており、ＧＭ１に対して染色されている。例えば、個体に由来する元の試料の体積、ならびに／または試料の精子の濃度、運動性および／もしくは形態等、精子試料について１つまたは複数の精液パラメーターの値が得られる。ＭＦＩは、１つまたは複数のＧＭ１パターン（例えば、ＣＡＰ−Ｓｃｏｒｅ（商標））の数、および１つまたは複数の得られた精液パラメーター値から決定される。本明細書で使用される例では、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）は、受精能獲得条件下での３時間目の１つまたは複数のＧＭ１パターンのパーセンテージであるが、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅの他の変種は、本開示の観点から明らかとなるであろう（例えば、他の時間間隔での数、受精能を獲得していない状態から受精能を獲得した状態におけるＧＭ１パターンの数の変化等）。
【０１１３】
一実施形態では、男性生殖能力指数スコアは、次の方程式に従って、男性の試料について計算することができる：男性生殖能力指数／生殖能力群＝ａ＋ｂ１＊ｘ１＋ｂ２＊ｘ２＋．．．＋ｂｍ＊ｘｍ（式中、ａは定数であり、ｂ１〜ｂｍは回帰係数であり、ｘ１〜ｘｍは、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ、運動性、形態、体積および濃度等の男性の生殖能力変数である）。判別関数解析を使用して、いずれの生殖能力変数が、２つまたはそれよりも多い天然に存在する群の間を識別するか決定することができる。例えば、個体が、生殖能力がある群、生殖能力が低い群または不妊群になるか決定するため、データは、精子機能および精液の質について記載する多数の生殖能力変数について収集され得る。次いで、判別解析を使用して、いずれの変数（複数可）が、生殖能力群の最良の予測因子であるか、また、各生殖能力変数を相対的にどの程度加重するべきか決定することができる。
【０１１４】
男性生殖能力指数は、ＧＭ１局在アッセイを解読する研究室によって生成することができる。研究室は、１つまたは複数の施設（例えば、生殖能力クリニック、精子バンク等）から、精子試料および精子試料に対応する精液解析を得ることができる。精液解析情報は、ＧＭ１局在アッセイキットに添えられたカードに含まれる、研究室に電子的に送られる、および／または他の仕方で提供され得る。別の例示的な実施形態では、研究室は、精子試料のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを得、精子試料についての精液解析情報も得る。一実施形態では、研究室は、得られたＣａｐ−Ｓｃｏｒｅおよび得られた精液解析データに基づき男性生殖能力指数を計算する。
【０１１５】
男性の生殖能力状態を特定するための例示的な方法は、個体に由来する精子試料を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非受精能獲得条件およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露するステップを含む。精子が固定され、固定された精子における選択されたＧＭ１パターンのパーセンテージが決定される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非受精能獲得条件およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露された精子における異なるＧＭ１パターンのパーセンテージが比較される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非受精能獲得条件に曝露された精子に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露された精子における１つまたは複数の選択されたＧＭ１パターンのパーセンテージにおける変化は、個体の生殖能力状態を示す。選択されたＧＭ１パターンは、縞状細胞、ＩＮＴＥＲ、ＡＡおよび／またはＡＰＭであり得る。一実施形態では、個体の生殖能力状態は、受精能を獲得した精子について、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンの数およびＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンの数の和の、ＧＭ１標識された局在パターンの合計数の和に対する比を計算することにより決定される。
【０１１６】
男性の生殖能力状態を特定するための例示的な方法は、個体に由来する精子試料をｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露するステップを含む。精子が固定され、固定された精子における選択されたＧＭ１パターンのパーセンテージが決定される。異なるＧＭ１パターンのパーセンテージが、対照に由来するパーセンテージと比較され、対照精子試料は、同じｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件および同じ固定剤に曝露されている。対照における変化と比べた、１つまたは複数の選択されたＧＭ１パターンのパーセンテージにおける変化は、対照の生殖能力状態とは異なる個体の生殖能力状態を示す。ＧＭ１パターンは、縞状細胞、ＩＮＴＥＲ、ＡＡおよび／またはＡＰＭであり得る。一実施形態では、個体の生殖能力状態は、受精能を獲得した精子について、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンの数およびＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンの数の和の、ＧＭ１標識された局在パターンの合計数の和に対する比を計算することにより決定される。一実施形態では、曝露するステップの前に、精液試料は、非金属性材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、精液粘度を減少させるために使用される様々な試薬から選択される精子膜に損傷を与えない試薬を使用して処理して、精液粘度を減少させる。一部の実施形態では、膜損傷試薬は、（ｉ）プロテアーゼ；（ｉｉ）ヌクレアーゼ；（ｉｉｉ）粘液溶解剤；（ｉｖ）リパーゼ；（ｖ）エステラーゼおよび（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼからなる群より選択される。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージまたは１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍまたは１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【０１１７】
例示的な方法では、対照は、正常な生殖能力状態を有することが既知の個体、または異常な生殖能力状態を有することが既知の個体に由来する精子試料であり得る。対照は、複数の個体を含むデータセット、例えば、少なくとも５０名の個体を含むデータセットから得られる値であり得る。
【０１１８】
男性の生殖能力状態を、不妊である、生殖能力が低いまたは生殖能力があると特定するための例示的な方法は、個体に由来する精子試料をｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露するステップを含む。試料におけるＧＭ１パターンが決定される。１つまたは複数のＧＭ１パターンのパーセンテージが、生殖能力閾値と比較され、生殖能力閾値に満たないパーセンテージは、生殖能力の問題を示す。例えば、生殖能力閾値に満たないパーセンテージは、不妊のまたは生殖能力が低い生殖能力状態を示すことができる。ＧＭ１パターンは、縞状細胞、ＩＮＴＥＲ、ＡＡおよび／またはＡＰＭであり得る。一実施形態では、個体の生殖能力状態は、受精能を獲得した精子について、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンの数およびＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンの数の和の、ＧＭ１標識された局在パターンの合計数の和に対する比を計算することにより決定される。一実施形態では、曝露するステップの前に、精液試料は、非金属性材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、精液粘度を減少させるために使用される様々な試薬から選択される精子膜に損傷を与えない試薬を使用して処理して、精液粘度を減少させる。一部の実施形態では、膜損傷試薬は、（ｉ）プロテアーゼ；（ｉｉ）ヌクレアーゼ；（ｉｉｉ）粘液溶解剤；（ｉｖ）リパーゼ；（ｖ）エステラーゼおよび（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼからなる群より選択される。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージまたは１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍまたは１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【０１１９】
例示的な方法におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件は、ｉ）重炭酸イオンおよびカルシウムイオン、ならびにｉｉ）２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎児臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質またはリポソーム等のステロール流出のメディエーターへの曝露を含むことができる。例示的な方法では、受精能獲得条件または非受精能獲得条件への対照の曝露は、被験試料と並行して行うことができる。
【０１２０】
男性の生殖能力状態を、不妊である、生殖能力が低いまたは生殖能力があると特定するための例示的な方法は、個体に由来する精子試料を、受精能獲得条件に曝露するステップを含む。試料における各ＧＭ１パターンのパーセンテージが決定される。１つまたは複数のＧＭ１パターンのパーセンテージは、不妊閾値と比較され、不妊閾値に満たないパーセンテージは、生殖能力の問題を示す。例示的な方法における受精能獲得条件は、ｉ）重炭酸イオンおよびカルシウムイオン、ならびにｉｉ）２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎児臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質またはリポソーム等のステロール流出のメディエーターへの曝露を含むことができる。１つまたは複数のＧＭ１局在パターンは、縞状細胞、ＩＮＴＥＲ、ＡＡおよび／またはＡＰＭであり得る。一実施形態では、個体の生殖能力状態は、受精能を獲得した精子について、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンの数およびＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンの数の和の、ＧＭ１標識された局在パターンの合計数の和に対する比を計算することにより決定される。一実施形態では、曝露するステップの前に、精液試料は、非金属性材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、精液粘度を減少させるために使用される様々な試薬から選択される精子膜に損傷を与えない試薬を使用して処理して、精液粘度を減少させる。一部の実施形態では、膜損傷試薬は、（ｉ）プロテアーゼ；（ｉｉ）ヌクレアーゼ；（ｉｉｉ）粘液溶解剤；（ｉｖ）リパーゼ；（ｖ）エステラーゼおよび（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼからなる群より選択される。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージまたは１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、広いオリフィスのピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍまたは１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【０１２１】
例示的な方法における生殖能力閾値は、集団の生殖能力が実質的な増加を止めるＡＡ＋ＡＰＭパターンパーセンテージであり得る。例えば、生殖能力閾値は、集団の５０％よりも多くに生殖能力があるＡＡ＋ＡＰＭのレベル；集団の６０〜８５％よりも多くに生殖能力があるＡＡ＋ＡＰＭのレベル；または３５〜４０（総ＧＭ１パターンの相対的パーセンテージ）の両端を含む範囲のＡＡ＋ＡＰＭのレベルであり得る。生殖能力閾値は、３８、３８．５、３９または３９．５％  ＡＡ＋ＡＰＭ（総ＧＭ１パターンと比べて）であり得る。
【０１２２】
例示的な方法は、１つまたは複数のＧＭ１パターンのパーセンテージを不妊閾値と比較するステップをさらに含むことができ、不妊閾値に満たないパーセンテージは、不妊を示す。例えば、不妊閾値は、集団の生殖能力が実質的に増加し始めるＡＡ＋ＡＰＭパターンパーセンテージ；集団の５０％未満に生殖能力があるＡＡ＋ＡＰＭのレベル；集団の６０〜８５％よりも多くに生殖能力があるＡＡ＋ＡＰＭのレベル；または１４〜１８（総ＧＭ１パターンの相対的パーセンテージ）の両端を含む範囲のＡＡ＋ＡＰＭのレベルであり得る。不妊閾値は、１４、１４．５、１５または１５．５％ＡＡ＋ＡＰＭ（総ＧＭ１パターンと比べて）であり得る。
【０１２３】
男性の生殖能力状態を特定するための例示的な方法は、精子試料を得るステップを含み、精子試料は、個体に由来し、精子試料は、非受精能獲得条件または受精能獲得条件に曝露され、固定され、ＧＭ１について染色されている。精子における選択されたＧＭ１パターンの数が決定される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非受精能獲得条件およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露された精子における異なるＧＭ１パターンのパーセンテージが比較される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非受精能獲得条件に曝露された精子に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露された精子における１つまたは複数の選択されたＧＭ１パターンのパーセンテージにおける変化は、個体の生殖能力状態を示す。ＧＭ１パターンは、ＡＡ、ＡＰＭ、ＩＮＴＥＲ、縞状細胞、およびそれらの組合せからなる群より選択することができる。一実施形態では、個体の生殖能力状態は、受精能を獲得した精子について、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンの数およびＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンの数の和の、ＧＭ１標識された局在パターンの合計数の和に対する比を計算することにより決定される。
【０１２４】
男性個体の生殖能力状態を特定するための例示的な方法は、精子試料を得るステップを含み、精子試料は、個体に由来し、精子試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露されており、固定されており、ＧＭ１の存在について染色されている。精子における選択されたＧＭ１パターンの数が決定される。１つまたは複数の異なるＧＭ１パターンのパーセンテージは、対照に由来するパターンのパーセンテージまたは所定の判断基準と比較される。対照精子試料は、同じｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件および同じ固定剤に曝露されている。対照における変化と比べた、１つまたは複数の選択されたＧＭ１パターンのパーセンテージにおける変化は、対照の生殖能力状態とは異なる個体の生殖能力状態を示す。
【０１２５】
男性個体の生殖能力状態を特定するための例示的な方法は、精子試料を得るステップを含み、精子試料は、個体に由来し、精子試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露されており、固定されており、ＧＭ１パターンについて染色されている。試料におけるＧＭ１局在パターンが決定される。１つまたは複数のＧＭ１パターンのパーセンテージは、不妊閾値と比較され、不妊閾値に満たないパーセンテージは、生殖能力の問題を示す。
【０１２６】
男性個体の生殖能力状態を測定するための例示的な方法は、精子試料を得るステップを含み、精子試料は、個体に由来し、精子試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露されており、固定剤に曝露されており、ＧＭ１について染色されている。元の試料の体積、ならびに元の試料における精子の濃度、運動性および形態のうちの１つまたは複数について値が得られる。精子試料のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅは、試料における１つまたは複数のＧＭ１局在パターンのパーセンテージとして決定される。個体の男性生殖能力指数（ＭＦＩ）値は、決定されたＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ、ならびに１つまたは複数の得られた体積、濃度、運動性および形態に基づき計算される。例えば、ＭＦＩ値は、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）、体積、濃度、運動性値および形態値を掛けることにより計算することができる。運動性は、運動性がある精子のパーセンテージであり得る。形態は、形態学的に正常な精子のパーセンテージであり得る。
【０１２７】
男性個体の生殖能力状態を測定するための例示的な方法は、試料における１つまたは複数のＧＭ１局在パターンのパーセンテージとして、個体の精子試料のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）を得るステップを含む。元の試料の体積、ならびに元の試料における精子の濃度、運動性および形態のうちの１つまたは複数について値が得られる。個体の男性生殖能力指数（ＭＦＩ）値は、決定されたＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ、ならびに１つまたは複数の得られた体積、濃度、運動性および形態に基づき計算される。
【０１２８】
回帰およびコンピューター学習モデル化
一部の態様では、本開示は、当業者にとって公知の広範囲の分類方法のうちの１つまたは複数を使用して、男性の生殖能力状態を特徴付けるための（例えば、自然条件下で、または子宮内人工授精（ＩＵＩ）等の生殖補助方法下で、例えば、男性の精子の使用が妊娠を生じる確率（ＰＧＰ）を予測する）、方法、システムおよびコンピューター可読媒体（例えば、非一過性コンピューター可読媒体）を提供する。一部の態様では、本開示はまた、男性の生殖能力状態を特徴付けるための生殖能力分類器を訓練するための（例えば、自然条件下で、または子宮内人工授精（ＩＵＩ）等の生殖補助方法下で、妊娠を生じる確率を予測することは、例えば、妊娠をもたらすであろう）、方法、システムおよびコンピューター可読媒体（例えば、非一過性コンピューター可読媒体）を提供する。
【０１２９】
分類方法
一部の実施形態では、モデル２１４は、機械学習技法または方法を使用して訓練される。機械学習方法は、コンピューターシステムが、特異的な適用分野（例えば、ドメイン）に属する事実データのセット（例えば、生殖補助方法を使用して妊娠を試みたカップルの男性の精液試料に由来する特色の訓練セット）から、自動（例えば、ソフトウェアプログラムによる）学習を行うことを可能にする。斯かる訓練セットを仮定すると、機械学習方法は、データそれ自体からパターンおよび関係性を抽出することができる。機械学習方法およびその適用に関する広範な考察は、それぞれこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Mitchell, 1997, Machine Learning, McGraw-Hillおよび米国特許第８，８４３，４８２号に見出すことができる。周知の機械学習方法は、決定木、相関ルール、ニューラルネットワークおよびベイジアン方法を含む。
【０１３０】
学習されたパターンおよび関係性は、機械学習方法によって、使用される機械学習技法に応じて異なる形態を取り得る形式的定量的モデルにおいてコードされる。モデルの形態の例は、論理ルール、数学的方程式および数学的グラフを含む。機械学習方法の目標は、データの表現としてのモデル、例えば、男性の生殖能力を表すためのモデルを得るための、データ内のパターンおよびデータ間の関係性のより良い理解および定量化である。
【０１３１】
一部の実施形態では、モデルは、訓練セットにわたる単一の特色（例えば、ＩＵＩ等の生殖補助方法を使用して、妊娠が達成されたか否か）に対して訓練される。一部の実施形態では、この単一の第２の特色は、カテゴリー的である（例えば、妊娠したまたは妊娠しなかった）。一部の実施形態では、この単一の第２の特色は、数値的である（例えば、妊娠の前に行われた生殖補助のラウンド数）。一部の実施形態では、モデルは、訓練セットにわたる単一の特色の組合せに対して訓練される。一部の実施形態では、訓練セットにおける第２の特色の値は、モデルの訓練に使用されない。一部の実施形態では、カーネル変換技法および／または主成分解析技法は、後述する一部の詳細な実施形態に関して開示される通り、第１の特色のセット（例えば、パラメーター｛β０、β１、．．．、βｉ｝）を特定するために使用される。そのようなものとして、一部の実施形態では、第１の特色のセット｛β０、β１、．．．、βｉ｝が、主成分の形態にあり、これが、本明細書に記載されている男性の生殖能力モデルのいずれかの訓練に使用される主成分であることが認められるであろう。他の実施形態では、主成分の形態でない第１の特色のセット｛β０、β１、．．．、βｉ｝それ自体の測定値は、本明細書に記載されているモデルのいずれかの訓練に使用される。
【０１３２】
一部の実施形態では、男性の生殖能力モデルは、教師あり回帰モデルであり、訓練されたモデルは、単一の第２の特色（例えば、妊娠を達成する前に生殖補助のラウンドが何回必要とされるかに関する予測）の実際の値の予測をもたらす。斯かるアプローチは、標的第２の特色（例えば、妊娠までの時間）が連続した数として測定される、有用な実例である。
【０１３３】
一部の実施形態では、男性の生殖能力モデルは、教師あり分類モデルであり、訓練されたモデルは、単一の第２の特色（例えば、生殖補助技法を使用してカップルが妊娠する機会に関する予測）の分類の予測をもたらす。斯かるアプローチは、標的第２の特色（例えば、妊娠）が別個の標識として測定される、有用な実例である。
【０１３４】
一部の実施形態では、モデル２１４は、教師なしクラスタリングモデルまたは最近隣探索モデルである。斯かる教師なしアプローチにおいて、モデルは、参照実体の間の全体的対応を定量化する。
【０１３５】
一部の実施形態では、モデルのアンサンブル（２つまたはそれよりも多く）が使用される。一部の実施形態では、ＡｄａＢｏｏｓｔ等のブースト技法を、多くの他の種類の学習アルゴリズムと併せて使用して、それらの性能を改善する。このアプローチにおいて、本明細書に開示されているモデルのいずれかまたはその等価物の出力は、ブーストされた分類器の最終出力を表す加重和へと組み合わされる。これにより参照により本明細書に組み込まれる、Freund, 1997, "A decision-theoretic generalization of on-linelearning and an application to boosting," Journal of Computer and SystemSciences 55, p. 119を参照されたい。
【０１３６】
一部の実施形態では、訓練された男性の生殖能力モデルは、非線形回帰モデルである。非線形回帰アプローチにおいて、｛Ｘ１、…、Ｘｉ｝における各Ｘｊは、非線形関数ｆ（ｘ，β）によって得られる平均による、ランダム変数としてモデル化される。これにより参照により本明細書に組み込まれる、Seber and Wild, 1989, Nonlinear Regression, New York: John Wiley andSons, ISBN 0471617601を参照されたい。
【０１３７】
一実施形態では、訓練された男性の生殖能力モデルは、ロジスティック回帰モデル、例えば、
【数２】
2021523355.tif 000004
（式中、ｆ（Ｘ）は、生殖能力の尺度であり、ｉは、正の整数であり、αは、事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、β０，β１，．．．，βｉは、事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、｛Ｘ１，．．．，Ｘｉ｝内の各Ｘｊは、精子試料から得られたデータ（例えば、（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、精子試料の体積、精子試料中の精子の濃度、精子試料中の精子の運動性、それらの相互作用項、そのデータ項目の変換、そのデータ項目の基底展開、および２つまたはそれよりも多いそのデータの線形成分として表現される主成分のうちの１つまたは複数を含む）内のデータ項目である）の形態のモデルである。それぞれこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Hastieet al., 2001, The Elements of Statistical Learning, pp. 42-49；およびJolliffe,1982, "A note on the Use of Principal Components in Regression,"Journal of the Royal Statistical Society, Series C. 31 (3), pp. 300-303を参照されたい。
【０１３８】
第１のデータ項目の変換の例は、対数、平方根、平方または一般に、データ項目の値の累乗を含むがこれらに限定されない。データ項目の基底展開の例は、これにより参照により本明細書に組み込まれる、Hastie et al., 2001, The Elements of Statistical Learning, Chapter 5に記述されている通り、多項式、区分的多項式または平滑化スプラインとしてのデータ項目の表現を含むがこれらに限定されない。２つまたはそれよりも多いデータ項目の間の相互作用の例は、Ｘ１・Ｘ２である。
【０１３９】
一部の実施形態では、訓練された男性の生殖能力分類モデルは、
【数３】
2021523355.tif 000005
（式中、ｔは、正の整数であり、ｆ（Ｘ）は、男性の生殖能力の尺度であり、β０，β１，…，βｔは、モデルの訓練によって決定されたパラメーターであり、｛Ｘ１，…，Ｘｔ｝内の各Ｘｊは、精子試料から得られたデータ（例えば、（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、精子試料の体積、精子試料中の精子の濃度、精子試料中の精子の運動性、それらの相互作用項、そのデータ項目の変換、そのデータ項目の基底展開、および２つまたはそれよりも多いそのデータの線形成分として表現される主成分のうちの１つまたは複数を含む）内のデータ項目である）の形態の線形回帰モデルである。それぞれこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Hastieet al., 2001, The Elements of Statistical Learning, pp. 42-49；およびJolliffe,1982, "A note on the Use of Principal Components in Regression,"Journal of the Royal Statistical Society, Series C. 31 (3), pp. 300-303を参照されたい。
【０１４０】
一部の実施形態では、訓練された男性の生殖能力分類モデルは、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）である。斯かる実施形態では、ＳＶＭは、訓練セットにわたる精子試料データ｛Ｘ１，．．．，Ｘｉ｝の測定値、および訓練セットにわたる転帰（例えば、妊娠および／または妊娠までの時間）の測定値を使用して、それぞれの実体を分類するように訓練される。ＳＶＭは、それぞれ全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Cristianini and Shawe-Taylor, 2000, "An Introduction to SupportVector Machines," Cambridge University Press, Cambridge；Boser et al.,1992, "A training algorithm for optimal margin classifiers," inProceedings of the 5th Annual ACM Workshop on Computational Learning Theory,ACM Press, Pittsburgh, Pa., pp. 142-152；Vapnik, 1998, Statistical LearningTheory, Wiley, New York；Mount, 2001, Bioinformatics: sequence and genomeanalysis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Duda,Pattern Classification, Second Edition, 2001, John Wiley & Sons, Inc., pp.259, 262-265；およびHastie, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer,New York；およびFurey et al., 2000, Bioinformatics 16, 906-914に記載されている。分類に使用される場合、ＳＶＭは、標識されたデータから最大限に離れた超平面により、バイナリー標識されたデータ訓練セットの所与のセットに分ける（例えば、標的転帰は、標的転帰を保有すること（例えば、妊娠）または標的転帰を保有しないこと（例えば、妊娠に失敗）のいずれかのバイナリー標識を与えられる）。線形分離が不可能な場合、ＳＶＭは、特色空間への非線形マッピングを自動で実現する「カーネル」の技法と組み合わせて機能することができる。特色空間におけるＳＶＭによって見出される超平面は、入力空間における非線形決定境界に対応する。
【０１４１】
一部の実施形態では、訓練された男性の生殖能力分類モデルは、主成分解析（ＰＣＡ）モデルである。標識（例えば、妊娠または非妊娠）を識別する決定ルールを構築するために、ＰＣＡを使用して、訓練セットの精子試料特徴データを解析することができる。ＰＣＡは、訓練セットの精子試料特徴データを、訓練セットの特色を要約する変数（主成分）の新しいセットに変換することにより、訓練セット２０６の次元数を低減させる。例えば、これにより参照により本明細書に組み込まれる、Jolliffe, 1986, Principal Component Analysis, Springer, New Yorkを参照されたい。ＰＣＡは、これにより参照により本明細書に組み込まれる、Draghici,2003, Data Analysis Tools for DNA Microarrays, Chapman & Hall/CRCにも記載されている。
【０１４２】
主成分（ＰＣ）は、無相関であり、第ｋのＰＣが、ＰＣの間でｋ番目に大きい分散を有するように順序付けされる。第ｋのＰＣは、最初のｋ−１  ＰＣに対して直交性となるように、データ点の投射の変動を最大化する方向として解釈され得る。最初のいくつかのＰＣは、訓練セットにおける変動の大部分を捕捉する。対照的に、最後のいくつかのＰＣは、多くの場合、訓練セットにおける残留「ノイズ」のみを捕捉すると仮定される。そのようなものとして、ＰＣＡを使用して、本開示に従ったモデルを作成することもできる。斯かるアプローチにおいて、表中の各行が構築され、訓練セットの特定の参照実体に由来する精子試料特徴データのための測定値を表し、ベクトルと考慮され得る。そのようなものとして、訓練セットにおけるデータは、ベクトルの行列として考えることができ、各ベクトルは、それぞれの参照実体を表し、訓練セットにおけるそれぞれの男性に由来する精子試料特徴データのための測定値を含む。一部の実施形態では、この行列は、モノマーの定性的バイナリー記述のフリー−ウィルソン方法において表され（Kubinyi, 1990, 3D QSAR in drug design theory methods andapplications, Pergamon Press, Oxford, pp 589-638）、行列における全分散情報が考慮されるまで、第１の主成分（ＰＣ）が、可能な最大量の分散情報を捕捉し、第２の主成分（ＰＣ）が、２番目に大きい量の全分散情報を捕捉するように等々、ＰＣＡを使用して最大限に圧縮された空間において分布される。次いで、ベクトルのそれぞれ（各ベクトルが、訓練セットの参照実体を表す場合）がプロットされる。
【０１４３】
特色選択方法
一部の実施形態では、本明細書に記載されている通りに使用および／または訓練される生殖能力分類方法は、特色選択方法、例えば、最小角回帰（least angle regression）または段階的回帰を使用して選択される精子試料の特色に基づく。特色選択方法は、訓練セットにわたり存在する多数の変数（例えば、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ、精子数（例えば、濃度）、精子運動性、精子形態、ＶＳＬ（直線速度）、ＳＴＲ（直線性）、ＬＩＮ（直進性）、ＶＣＬ（曲線速度）、ＶＡＰ（平均パス速度）、％運動性、運動性の持続時間、ＬＨＡ（側方頭部振幅）、ＷＯＢ（ゆらぎ）、ＰＲＯＧ（前進）およびＢＣＦ（頭部振動数）等の他の精子運動測定基準、ならびに年齢、体重等の男性被験体に由来する他の生体測定基準データ、等）の中から、いずれの特色が、所与の転帰に重要な因果効果を有するか（例えば、いずれの精子特徴が、低い男性の生殖能力および／または高い男性の生殖能力に因果関係があるか）特定する際に特に有利である。特色選択技法は、例えば、それぞれこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Saeys et al., 2007, "A Review of Feature Selection Techniquesin Bioinformatics," Bioinformatics 23, 2507-2517およびTibshirani, 1996,"Regression and Shrinkage and Selection via the Lasso," J. R.Statist. Soc. B, pp. 267-288に記載されている。
【０１４４】
一部の実施形態では、特色選択方法は、予測精度を改善するための、訓練セットにわたる正則化を含む（例えば、Ｌａｓｓｏ、最小角回帰またはエラスティックネット（Elastic net）である）。Ｌａｓｓｏは、これにより参照により本明細書に組み込まれる、Hastie et al., 2001,The Elements of Statistical Learning, pp. 64-65に記載されている。最小角回帰は、これにより参照により本明細書に組み込まれる、Efronet al., 2004, "Least Angle Regression," The Annals of Statistics, pp.407-499に記載されている。リッジ回帰を包含するエラスティックネットは、これにより参照により本明細書に組み込まれる、Hastie, 2005,"Regularization and Variable Selection via the Elastic Net," Journalof the Royal Statistical Society, Series B: pp. 301-320に記載されている。
【０１４５】
一部の実施形態では、特色選択方法は、訓練セットへの決定木の適用を含む。決定木は、一般に、これにより参照により本明細書に組み込まれる、Duda, 2001, Pattern Classification, John Wiley & Sons, Inc., NewYork, pp. 395-396によって記載されている。木に基づく方法は、特色空間を長方形のセットに区分化し、次いで、それぞれのセットにおいてモデル（定数等）をフィットさせる。一部の実施形態では、決定木は、ランダムフォレスト回帰である。使用することができる特異的なアルゴリズムの１つは、分類および回帰木（ＣＡＲＴ）である。他の特異的な決定木アルゴリズムは、ＩＤ３、Ｃ４．５、ＭＡＲＴおよびランダムフォレストを含むがこれらに限定されない。ＣＡＲＴ、ＩＤ３およびＣ４．５は、これにより参照により本明細書に組み込まれる、Duda,2001, Pattern Classification, John Wiley & Sons, Inc., New York. pp.396-408 and pp. 411-412に記載されている。ＣＡＲＴ、ＭＡＲＴおよびＣ４．５は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Hastieet al., 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer-Verlag, New York,Chapter 9に記載されている。ランダムフォレストは、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Breiman, 1999,"Random Forests--Random Features," Technical Report 567, StatisticsDepartment, U.C. Berkeley, September 1999に記載されている。
【０１４６】
本開示のシステムおよび方法において使用することができる別の特色選択方法は、多変量適応回帰スプライン（ＭＡＲＳ）である。ＭＡＲＳは、回帰のための適応手順であり、本開示が取り組む高次元問題に良く適している。ＭＡＲＳは、回帰設定におけるＣＡＲＴの性能を改善するための、段階的線形回帰の一般化またはＣＡＲＴ方法の改変として考慮することができる。ＭＡＲＳは、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Hastie et al., 2001, The Elements of Statistical Learning,Springer-Verlag, New York, pp. 283-295に記載されている。
【０１４７】
一部の実施形態では、特色選択方法は、訓練セットへのガウス過程回帰の適用を含む。ガウス過程回帰は、これにより参照により本明細書に組み込まれる、Ebden, August 2008, arXiv:1505.029652v2 (29 Aug 2015),"Gaussian Processes for Dimensionality Reduction: A QuickIntroduction,"に開示されている。
【０１４８】
例示的な分類方法、システムおよびコンピューター可読媒体
そこで、本開示の様々な実施形態で使用される異なる分類モデルおよび特色選択モデルの概要を概説してきたが、具体的なモデルおよびモデル訓練についてさらなる詳細を提示する。
【０１４９】
一態様では、本開示は、男性の生殖能力状態を特徴付けるための方法であって、男性に由来する精子試料の一部分を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露し、これにより受精能を獲得した精子試料を形成するステップと、受精能を獲得した精子試料を、固定剤を用いて固定し、これにより固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を形成するステップと、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子であって、検出可能な標識を有する標識分子で処理し、これにより標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を形成するステップと、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターン、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを含む複数のＧＭ１標識された局在パターンを特定するステップと、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンおよびＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンを、受精能獲得状態に割り当てるステップと、縞状細胞ＧＭ１局在パターンおよびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを、非受精能獲得状態に割り当てるステップと、１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器を、精子試料から得られたデータに適用することにより、男性の生殖能力状態を特徴付けるステップであって、精子試料から得られたデータが、（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比（例えば、受精能獲得状態を呈する精子の、割り当てられた精子の合計数に対する比）を含む、ステップとを含む方法を提供する。
【０１５０】
一部の実施形態では、精子試料から得られたデータは、（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比からなる。一部の実施形態では、精子試料から得られたデータは、（Ａ）精子試料の体積、（Ｂ）精子試料中の精子の濃度、（Ｃ）精子試料中の精子の運動性、ならびに（Ｄ）（ａ）（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、（ｂ）精子試料の体積、（ｃ）精子試料中の精子の濃度、および（ｄ）精子試料中の精子の運動性のうちの任意の２つの、演算による組合せ（例えば、相互作用項）からなる群より選択される１つまたは複数のデータ項目をさらに含む。一部の実施形態では、演算による組合せは、任意の２つのデータ尺度の和、差、積または比である。一部の実施形態では、精子試料から得られたデータは、（Ａ）（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、（Ｂ）精子試料の体積、ならびに（Ｃ）（ａ）（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比および（ｂ）精子試料の体積、の積からなる。
【０１５１】
一部の実施形態では、１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの１つの分類器は、非線形回帰モデルである。一部の実施形態では、１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの１つの分類器は、ロジスティック回帰モデル、例えば、
【数４】
2021523355.tif 000006
（式中、ｆ（Ｘ）は、生殖能力の尺度であり、ｉは、正の整数であり、αは、事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、β０，β１，．．．，βｉは、事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、｛Ｘ１，．．．，Ｘｉ｝内の各Ｘｊは、精子試料から得られたデータ（例えば、（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、精子試料の体積、精子試料中の精子の濃度、精子試料中の精子の運動性、およびそれらの相互作用項のうちの１つまたは複数を含む）内のデータ項目である）
の形態のモデルである。
【０１５２】
一部の実施形態では、受精能獲得条件は、精子試料の一部分の、重炭酸イオン、カルシウムイオンおよびステロール流出のメディエーターのうちの１つまたは複数への曝露を含む。一部の実施形態では、ステロール流出のメディエーターは、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎児臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質またはリポソームを含む。一部の実施形態では、ステロール流出のメディエーターは、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンを含む。
【０１５３】
一部の実施形態では、固定剤は、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組合せを含む。
【０１５４】
一部の実施形態では、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子は、蛍光的に標識されたコレラ毒素ｂサブユニットを含む。
【０１５５】
一部の実施形態では、特定するステップは、曝露するステップの２〜２４時間後に実施される。
【０１５６】
一部の実施形態では、方法は、曝露するステップの前に、精子試料の一部分の粘度を減少させるために、非金属性材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、かつ精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精子試料の一部分を処理するステップをさらに含む。
【０１５７】
一態様では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露されており、固定剤中で固定されており、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子で染色されている、男性に由来する精子試料の一部分の第１の部分を得るステップであって、標識分子が、検出可能な標識を有する、ステップと、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターン、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを含む複数のＧＭ１標識された局在パターンを特定するステップと、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンおよびＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンを、受精能獲得状態に割り当てるステップと、縞状細胞ＧＭ１局在パターンおよびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを、非受精能獲得状態に割り当てるステップと、１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器を、精子試料から得られたデータに適用することにより、男性の生殖能力状態を特徴付けるステップであって、精子試料から得られたデータが、（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）ＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比（例えば、受精能獲得状態を呈する精子の、割り当てられた精子の合計数に対する比）を含む、ステップとを含む方法を提供する。
【０１５８】
一部の実施形態では、精子試料から得られたデータは、（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比からなる。一部の実施形態では、精子試料から得られたデータは、（Ａ）精子試料の体積、（Ｂ）精子試料中の精子の濃度、（Ｃ）精子試料中の精子の運動性、ならびに（Ｄ）（ａ）（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、（ｂ）精子試料の体積、（ｃ）精子試料中の精子の濃度、および（ｄ）精子試料中の精子の運動性のうちの任意の２つの、演算による組合せからなる群より選択される１つまたは複数のデータ項目をさらに含む。一部の実施形態では、演算による組合せは、任意の２つのデータ尺度の和、差、積または比である。一部の実施形態では、精子試料から得られたデータは、（Ａ）（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、（Ｂ）精子試料の体積、ならびに（Ｃ）（ａ）（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比および（ｂ）精子試料の体積、の積からなる。
【０１５９】
一部の実施形態では、１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの１つの分類器は、非線形回帰モデルである。一部の実施形態では、１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの１つの分類器は、ロジスティック回帰モデル、例えば、
【数５】
2021523355.tif 000007
（式中、ｆ（Ｘ）は、生殖能力の尺度であり、ｉは、正の整数であり、αは、事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、β０，β１，．．．，βｉは、事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、｛Ｘ１，．．．，Ｘｉ｝内の各Ｘｊは、精子試料から得られたデータ（例えば、（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、精子試料の体積、精子試料中の精子の濃度、精子試料中の精子の運動性、およびそれらの相互作用項のうちの１つまたは複数を含む）内のデータ項目である）
の形態のモデルである。
【０１６０】
一部の実施形態では、受精能獲得条件は、精子試料の一部分の、重炭酸イオン、カルシウムイオンおよびステロール流出のメディエーターのうちの１つまたは複数への曝露を含む。一部の実施形態では、ステロール流出のメディエーターは、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎児臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質またはリポソームを含む。一部の実施形態では、ステロール流出のメディエーターは、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンを含む。
【０１６１】
一部の実施形態では、固定剤は、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組合せを含む。
【０１６２】
一部の実施形態では、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子は、蛍光的に標識されたコレラ毒素ｂサブユニットを含む。
【０１６３】
一部の実施形態では、特定するステップは、曝露するステップの２〜２４時間後に実施される。
【０１６４】
一部の実施形態では、方法は、得るステップの前に、精子試料の一部分の粘度を減少させるために、非金属性材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、かつ精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精子試料の一部分を処理するステップをさらに含む。
【０１６５】
一態様では、本開示は、精子試料を得るステップであって、精子試料の少なくとも一部分が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露されており、固定剤に曝露されており、ＧＭ１について染色されている、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子を得て、これにより標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を形成するステップと、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを、１つまたは複数のＧＭ１標識された局在パターンに基づき決定するステップであって、前記ＧＭ１標識された局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターン、先体後方原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと、１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器を、精子試料から得られたデータに適用することにより、男性の生殖能力状態を特徴付けるステップであって、データが、（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比（例えば、受精能獲得状態を呈する精子の、割り当てられた精子の合計数に対する比）を含む、ステップとを含む方法を提供する。
【０１６６】
一部の実施形態では、精子試料から得られたデータは、（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比からなる。一部の実施形態では、精子試料から得られたデータは、（Ａ）精子試料の体積、（Ｂ）精子試料中の精子の濃度、（Ｃ）精子試料中の精子の運動性、ならびに（Ｄ）（ａ）（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、（ｂ）精子試料の体積、（ｃ）精子試料中の精子の濃度、および（ｄ）精子試料中の精子の運動性のうちの任意の２つの、演算による組合せからなる群より選択される１つまたは複数のデータ項目をさらに含む。一部の実施形態では、演算による組合せは、任意の２つのデータ尺度の和、差、積または比である。一部の実施形態では、精子試料から得られたデータは、（Ａ）（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、（Ｂ）精子試料の体積、ならびに（Ｃ）（ａ）（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比および（ｂ）精子試料の体積、の積からなる。
【０１６７】
一部の実施形態では、１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの１つの分類器は、非線形回帰モデルである。一部の実施形態では、１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの１つの分類器は、ロジスティック回帰モデル、例えば、
【数６】
2021523355.tif 000008
（式中、ｆ（Ｘ）は、生殖能力の尺度であり、ｉは、正の整数であり、αは、事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、β０，β１，．．．，βｉは、事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、｛Ｘ１，．．．，Ｘｉ｝内の各Ｘｊは、精子試料から得られたデータ（例えば、（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、精子試料の体積、精子試料中の精子の濃度、精子試料中の精子の運動性、およびそれらの相互作用項のうちの１つまたは複数を含む）内のデータ項目である）
の形態のモデルである。
【０１６８】
一部の実施形態では、方法は、得るステップの前に、精子試料の一部分の粘度を減少させるために、非金属性材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、かつ精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精子試料の一部分を処理するステップをさらに含む。
【０１６９】
一態様では、本開示は、１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器を、男性に由来する精子試料から得られるデータに適用することにより、男性の生殖能力状態を特徴付けるステップであって、データが、精子試料の処理された部分における、（ｉ）先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターンと先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比を含み、（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比が：男性に由来する精子試料の一部分をｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能獲得条件に曝露し、これにより受精能を獲得した精子試料を形成すること、受精能を獲得した精子試料を、固定剤を用いて固定し、これにより固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を形成すること、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子で処理し、標識分子が、検出可能な標識を有し、これにより標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を形成すること、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、ＡＡ  ＧＭ１局在パターン、ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを含む複数のＧＭ１標識された局在パターンを特定すること、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンおよびＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンを受精能獲得状態に割り当てること、縞状細胞ＧＭ１局在パターンおよびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを非受精能獲得状態に割り当てること、ならびに（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せを、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せと比較することにより決定される、ステップを含む方法を提供する。
【０１７０】
一部の実施形態では、精子試料から得られたデータは、（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比からなる。一部の実施形態では、精子試料から得られたデータは、（Ａ）精子試料の体積、（Ｂ）精子試料中の精子の濃度、（Ｃ）精子試料中の精子の運動性、ならびに（Ｄ）（ａ）（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、（ｂ）精子試料の体積、（ｃ）精子試料中の精子の濃度、および（ｄ）精子試料中の精子の運動性のうちの任意の２つの、演算による組合せからなる群より選択される１つまたは複数のデータ項目をさらに含む。一部の実施形態では、精子試料から得られたデータは、（Ａ）（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、（Ｂ）精子試料の体積、ならびに（Ｃ）（ａ）（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比および（ｂ）精子試料の体積、の積からなる。
【０１７１】
一部の実施形態では、１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの１つの分類器は、非線形回帰モデルである。一部の実施形態では、１つまたは複数の事前訓練された生殖能力分類器のうちの１つの分類器は、ロジスティック回帰モデル（例えば、
【数７】
2021523355.tif 000009
（式中、ｆ（Ｘ）は、生殖能力の尺度であり、ｉは、正の整数であり、αは、事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、β０，β１，．．．，βｉは、事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、｛Ｘ１，．．．，Ｘｉ｝内の各Ｘｊは、精子試料から得られたデータ（例えば、（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、精子試料の体積、精子試料中の精子の濃度、精子試料中の精子の運動性、およびそれらの相互作用項のうちの１つまたは複数を含む）内のデータ項目である）の形態のモデルである。
【０１７２】
一部の実施形態では、受精能獲得条件は、精子試料の一部分の、重炭酸イオン、カルシウムイオンおよびステロール流出のメディエーターのうちの１つまたは複数への曝露を含んだ。一部の実施形態では、ステロール流出のメディエーターは、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎児臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質またはリポソームを含む。一部の実施形態では、ステロール流出のメディエーターは、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンを含む。
【０１７３】
一部の実施形態では、固定剤は、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組合せを含む。
【０１７４】
一部の実施形態では、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子は、蛍光的に標識されたコレラ毒素ｂサブユニットを含む。
【０１７５】
一部の実施形態では、特定するステップは、曝露するステップの２〜２４時間後に実施された。
【０１７６】
一部の実施形態では、曝露するステップの前に、精子試料の一部分の粘度を減少させるために、精子試料の一部分は、非金属性材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、かつ精子膜に損傷を与えない試薬を使用して処理された。
【０１７７】
一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのプロセッサーと、少なくとも１つのプロセッサーによってアドレス可能なメモリーとを含む、男性の生殖能力状態を特徴付けるために生殖能力分類器を訓練するためのシステムであって、メモリーが、少なくとも１つのプロセッサーにより実行される少なくとも１つのプログラムを記憶し、少なくとも１つのプログラムが、Ａ）生殖補助（例えば、子宮内人工授精（ＩＵＩ））における試みについての既知の転帰と関連付けられた複数の男性に由来する精子試料から得られたデータを含む訓練セットであって、各個別の精液試料に由来するデータが、個別の精液試料中の精子の（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比（例えば、受精能獲得状態を呈する精子の、割り当てられた精子の合計数に対する比）を含む、訓練セットを得るための命令、およびＢ）生殖補助の試みの転帰と、各個別の精液試料中の精子の（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の対応する比との間の少なくとも１つの対応に基づき、１つまたは複数の生殖能力分類器を訓練するための命令を含む、システムを提供する。
【０１７８】
一部の実施形態では、複数の男性に由来する各個別の精子試料について、精子の（ｉ）先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在パターンと先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比は、複数の男性における個別の男性に由来する精子試料の一部分を、受精能獲得条件にｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝露し、これにより受精能を獲得した精子試料を形成するステップと、受精能を獲得した精子試料を、固定剤を用いて固定し、これにより固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を形成するステップと、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子であって、検出可能な標識を有する標識分子で処理し、これにより標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を形成するステップと、標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料について、ＡＡ  ＧＭ１局在パターン、ＡＰＭ  ＧＭ１局在パターン、縞状細胞ＧＭ１局在パターン、およびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを含む複数のＧＭ１標識された局在パターンを特定するステップと、ＡＡ  ＧＭ１局在パターンおよびＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンを、受精能獲得状態に割り当てるステップと、縞状細胞ＧＭ１局在パターンおよびすべてのその他の標識されたＧＭ１局在パターンを、非受精能獲得状態に割り当てるステップと、精子の（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せを、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せと比較するステップとを含む方法によって決定された。
【０１７９】
一部の実施形態では、受精能獲得条件は、精子試料の一部分の、重炭酸イオン、カルシウムイオンおよびステロール流出のメディエーターのうちの１つまたは複数への曝露を含む。一部の実施形態では、ステロール流出のメディエーターは、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎児臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質またはリポソームを含む。一部の実施形態では、ステロール流出のメディエーターは、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンを含む。
【０１８０】
一部の実施形態では、固定剤は、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組合せを含む。
【０１８１】
一部の実施形態では、ＧＭ１局在パターンに対する標識分子は、蛍光的に標識されたコレラ毒素ｂサブユニットを含む。
【０１８２】
一部の実施形態では、特定するステップは、曝露するステップの２〜２４時間後に実施される。
【０１８３】
一部の実施形態では、各個別の精液試料について、精子の（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比を決定するのに使用される方法は、得るステップの前に、精子試料の粘度を減少させるために、非金属性材料からなる広いオリフィスのピペットを使用し、かつ精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精子試料の一部分を処理するステップをさらに含んだ。
【０１８４】
一部の実施形態では、１つまたは複数の生殖能力分類器を訓練するのに使用されるデータは、複数の男性に由来する各個別の精液試料に由来する（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）ＧＭ１標識された局在パターンのすべての組合せとの間の比からなる。一部の実施形態では、生殖能力分類器を訓練するのに使用されるデータは、複数の男性に由来する各個別の精液試料に由来する、（Ａ）精子試料の体積、（Ｂ）精子試料中の精子の濃度、（Ｃ）精子試料中の精子の運動性、ならびに（Ｄ）（ａ）（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、（ｂ）精子試料の体積、（ｃ）精子試料中の精子の濃度、および（ｄ）精子試料中の精子の運動性のうちの任意の２つの、演算による組合せからなる群より選択される１つまたは複数のデータ項目をさらに含む。一部の実施形態では、生殖能力分類器を訓練するのに使用されるデータは、複数の男性に由来する各個別の精子試料に由来する：（Ａ）（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の個別の比、（Ｂ）精子試料の体積、ならびに（Ｃ）（ａ）（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比および（ｂ）精子試料の体積、の積からなる。
【０１８５】
一部の実施形態では、１つまたは複数の生殖能力分類器のうちの１つの分類器は、非線形回帰モデルである。一部の実施形態では、１つまたは複数の生殖能力分類器のうちの１つの分類器は、ロジスティック回帰モデル、例えば、
【数８】
2021523355.tif 000010
（式中、ｆ（Ｘ）は、生殖能力の尺度であり、ｉは、正の整数であり、αは、事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、β０，β１，．．．，βｉは、事前訓練された分類器の訓練中に決定されたパラメーターであり、｛Ｘ１，．．．，Ｘｉ｝内の各Ｘｊは、精子試料から得られたデータ（例えば、（ｉ）ＡＡ  ＧＭ１局在パターンとＡＰＭ  ＧＭ１局在パターンとの組合せと、（ｉｉ）すべてのＧＭ１標識された局在パターンの組合せとの間の比、精子試料の体積、精子試料中の精子の濃度、精子試料中の精子の運動性、およびそれらの相互作用項のうちの１つまたは複数を含む）内のデータ項目である）の形態のモデルである。
【０１８６】
本発明のある実施形態では、正常で生殖能力がある男性についての平均Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）は、約３０〜約４０またはそれよりも多い。ある実施形態では、平均Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）は、約３２〜約３８である。ある実施形態では、平均Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）は、約３４〜約３６である。ある実施形態では、平均Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）は、約３５．３である。
【０１８７】
本発明のある実施形態では、平均の妊娠の可能性パーセント（または妊娠確率）は、約３５％〜約５０％である。ある実施形態では、平均妊娠確率は、約３７％〜約４８％である。本発明のある実施形態では、平均妊娠確率は、約３９％〜約４６％である。ある実施形態では、平均妊娠確率は、約４１％〜約４４％である。本発明のある実施形態では、平均妊娠確率は、約４３％である。
【０１８８】
ある実施形態では、本開示は、妊娠を達成しようと試みるカップルのための生殖アプローチを特定するための方法を提供する。ある実施形態では、方法は、上に示す通りに個体についてのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを得るステップと、上に記述されているロジスティック回帰解析によりＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを実行して、自然受胎により受胎しようと試みてから最初の３ヶ月間以内に、または子宮内人工授精（ＩＵＩ）の３ラウンド以内に、男性からの妊娠の可能性パーセントの見込みを得るステップとを含む。この値は、医師および患者に、最も効果的かつ効率的な生殖療法の過程を伝え、最終的に、患者、医者および保険会社の時間、金銭および労力を節約するであろう。例えば、ロジスティック回帰解析によりＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを実行した後に、高いＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを有する男性（男性１）は、自然受胎により受胎しようと試みた最初の３ヶ月間以内に、またはＩＵＩの３ラウンド以内に、低いＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを有する男性（男性２）よりも高いパーセントの妊娠達成可能性を有するであろう。したがって、医師は、男性１のパートナーに生殖能力刺激薬を与え、男性１とそのパートナーに、自然な受胎を試みるよう指示することを選ぶことができる一方、男性２に対し、医師は、例えば、体外受精または精子ドナー等、より厳密な形態の生殖療法を推奨することができる。
【０１８９】
米国特許出願公開第２０１７−０１８４６０５号、同第２０１７−０２３４８５７号および同第２０１７−０２４８５８４号の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９０】
制限的と解釈されるべきではない次の例示的な実施例により、本発明はさらに記載される。
【実施例】
【０１９１】
（実施例１）
本実施例は、ヒト精子により得られるＧＭ１局在パターンの実証を提供する。男性ドナーから射精された精子を収集し、２０分間３７℃で液化させ、次いで、体積、初期計数、運動性および形態評価を行った。１ｍｌの精液試料を、１５ｍｌコニカルチューブ内の１ｍｌの密度勾配（９０％Ｅｎｈａｎｃｅ−Ｓ；Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）の上に重層した。チューブを３００×ｇで１０分間遠心分離した。下の１ｍｌ画分を新しい１５ｍｌチューブに移し、次いで、４ｍｌのｍＨＴＦに再懸濁した。これを６００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、精子のペレットを０．５ｍｌのｍＨＴＦに再懸濁した。次いで、洗浄した精子を、濃度および運動性について評価した。次いで、各チューブの最終体積が３００μｌになり、精子の最終濃度が１，０００，０００／ｍｌになるように、等しい体積の精子を２本のチューブに添加した。第１のチューブは、ｍＨＴＦ（非受精能獲得条件）を含有し、第２のチューブは、ｍＨＴＦプラス最終濃度３ｍＭの２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン（受精能獲得条件）を含有した。精子は、変動する長さの時間でインキュベートしたが、３時間を典型的に使用した。これらのインキュベーションは、３７℃で行った。
【０１９２】
インキュベーション期間の終わりに、各チューブの内容物を穏やかに混合し、各チューブから１８μｌを取り出し、別々の微量遠心分離チューブに移した。２μｌの１％（重量／体積）パラホルムアルデヒドを添加して、０．１％の最終濃度を達成した。別の実施形態では、０．１％（重量／体積）パラホルムアルデヒドを添加して、０．０１％の最終濃度を達成した。これらのチューブを穏やかに混合し、室温で１５分間インキュベートし、この時点で、０．３μｌの１ｍｇ／ｍｌコレラ毒素ｂサブユニットを添加した。２本のチューブの内容物を再び穏やかに混合し、さらに５分間室温でインキュベートした。各チューブから、５μｌを取り出し、蛍光顕微鏡による評価のためにスライドガラス上に置いた。対比染色、焦点面の高速（speeding）決定および蛍光シグナルの寿命増加をもたらすために、３μｌのＤＡＰＩ／退色防止剤（Antifade）を添加する場合もあった。
【０１９３】
図２に示す通り、正常ヒト精子におけるＧＭ１の局在パターンは、受精能獲得条件に対する応答を反映する。完全応答は、正常な生殖能力を有する男性のみで見られた；子宮内人工授精（ＩＵＩ）または体外受精（ＩＶＦ）における以前の試みに失敗した未解明の不妊の男性において、応答性パターンは大部分が低減したまたは存在しなかった。図１は、ヒト精子におけるＧＭ１パターンを示す。しかし、診断アッセイの目的のため、ＰＡＰＭ、ＡＡ／ＰＡ、ＥＳおよびＤＩＦＦ等、異常を反映するパターンは、解析をし易くするために群分けすることができる。図２Ａ〜２Ｃは、非受精能獲得条件（ＮＣ；図２Ａ）または受精能獲得条件（ＣＡＰ；図２Ｂ）下でインキュベートした正常精液における異なるパターンの相対分布を示す。ＩＮＴＥＲパターンの低減が、ＣＡＰへの曝露後の正常精液に見られる（図２Ｃ）一方、ＡＡパターンおよびＡＰＭパターンの大幅な増加も見られる。これらの正常データとの比較において、未解明の不妊であることが既知の男性の群に由来する精子も、ＧＭ１アッセイに供した。これらの精子において、受精能獲得条件下でＡＡパターンまたはＡＰＭパターンの増加はほぼなかった。
【０１９４】
（実施例２）
本実施例では、３４名の患者の臨床歴を調べて、妊娠の今までに達成した臨床エビデンス歴と比べたそのＧＭ１アッセイスコアの綿密な解析を行った。患者カップルが、３またはそれよりも少ないサイクル以内に受精／臨床妊娠（生化学的エビデンスまたは超音波検査で心拍がない嚢に限定される場合であっても）のいくつかのエビデンスを達成した場合、男性患者は、「生殖能力がある」と定義した。
【０１９５】
これらの３４名の患者のデータの解析は、３時間の時点で受精能を獲得した試料のスコアに対し４０％（ＡＰＭ＋ＡＡ）のカットオフを適用した場合には、「合格した」（３９．５％またはそれを超えるスコアを有する）７／８名が、「生殖能力がある」と指定されていたことが見出された（８７．５％）ことを明らかにした。「不合格の」（３９．４またはそれ未満のスコアを有する）２６名のうちの、３／２６名のみが、臨床妊娠のエビデンスを有していた（１１．５％）（下の表１を参照）。
【０１９６】
カットオフを低減させた場合、より多くの臨床的に生殖能力が低い人が、合格スコアを得て、アッセイに合格し３サイクル以内に生殖能力がある者のパーセンテージが下落することが予測されるであろう。興味深いことに、結果は、生殖能力（≦３サイクル判断基準によって定義される）に関して平滑な勾配または連続した曲線ではなかった。すなわち、４０において定義されるアッセイに合格しなかったか、または３５において定義されるアッセイに合格しなかったかは、生殖能力の見込みのいかなる顕著な変化とも相関せず、これは常に低かった（１１．５〜１４．３％の間）。逆に、３５対４０におけるアッセイに合格することは、生殖能力の見込みにおける非常に大きい差に対応した（それぞれ５３．８〜８７．５％の範囲である）。この点を強調して繰り返すと、組み合わせたＡＰＭ＋ＡＡパーセンテージの５％の変化は、生殖成功歴（history of fertility）の３０％を超える変化に対応した。
【０１９７】
これらの結果は、男性の生殖能力が、男性の生殖能力（臨床妊娠を達成する見込み）のそれ相応に小さいが連続した変化と同一視するスコアの小さい変化よりもむしろ、男性の生殖能力アッセイのスコアの範囲が「生殖能力がある」、「生殖能力が低い」または「不妊」のカテゴリー化に対応する、「ステップ関数」に似ていることを示す。これらのデータは、およそ３８．５〜４０のスコアが、「生殖能力が低い」または「生殖能力がある」の指定の間のカットオフとなるであろうことを強く示す。データのさらなる検査は、＜１４．５％のカットオフを「不妊」の可能性の指定として使用することができることを示す。
【表６−１】
2021523355.tif 000011
【表６−２】
2021523355.tif 000012
【０１９８】
平均精液パラメーターの観点からすべて同様であるこれらの男性のデータを要約すると、次の範囲が示唆される（絶対的スコアに基づく）：不妊：＜１４．５、生殖能力が低い：１４．５〜３８．４、生殖能力がある：≧３８．５。
【０１９９】
あるいは、受精能獲得条件下のインキュベーション時間にわたり、または非受精能獲得条件下で観察される相対数に対し、ＡＰＭおよび／またはＡＡパターンの相対数の変化を比較することにより、試料の生殖能力を評価することができる。例えば、受精能獲得条件における３時間のインキュベーション後のＡＰＭ＋ＡＡ相対数を、インキュベーション開始時のそれらのパターンの相対数と比較することができる。さらに別の実施形態では、ＡＰＭおよび／またはＡＡ頻度の変化を、逐次的な時点（１、２および３時間等）から得られる結果と比較することができる。実際には、相対的頻度をＹ軸に、時点をＸ軸にプロットし、非受精能獲得および受精能獲得条件下におけるＩＮＴＥＲ、ＡＰＭおよび／またはＡＡ試料のうちの１つまたは複数の増加する数の変化の傾きまたは比率を評価することができる。６３名の患者の群において解析に対するこのアプローチが行われた場合、１、２および３時間のインキュベーションにわたる、それぞれ非受精能獲得培地における１７％〜２２％〜２８％および受精能獲得培地における２６％〜３１％〜３８％のベースラインＧＭ１パターンにより、正常参照群にマッチするスコアを有する３１名の男性を特定した（図３を参照）。非受精能獲得培地における１５％〜２０％〜２４％および受精能獲得培地における２０％〜２５％〜２９％の参照値を下回る３２名の男性を特定した。数、運動性およびパーセント正常形態の精液解析パラメーター（厳格なＷＨＯ判断基準を使用）は、２群の間で同程度であった。正常範囲ＧＭ１パターンを有する集団は、４５．２％の子宮内人工授精（ＩＵＩ）妊娠率を有し（１４／３１）、そのうちの８名（２５．８％）は、少なくとも１つの胎児の心拍を得た。この群における３組の追加的なカップルは、自然に妊娠した。参照を下回るＧＭ１パターンを有する男性について、ＩＵＩ臨床妊娠率は、僅かに６．３％（２／３２；Ｐ＝０．０３）であった。このコホートにおいて、１３名がＩＣＳＩを受け、６名が妊娠した（４６．２％）。
【０２００】
（実施例３）
精子細胞は、固定剤中で２４時間インキュベートした以外は、実施例１に記載されている通りに処理した。次いで、標識された精子細胞を蛍光顕微鏡により評価した。図６Ａ、６Ｂ、６Ｃおよび６Ｄに説明される通り、新しいＧＭ１局在パターンである縞状細胞を特定した。縞状細胞において、図６Ａに説明される通り、赤道セグメントの底部／先体後方領域の頂部におよび先体を覆う原形質膜にＧＭ１シグナルが存在する。シグナルは、先体後方／赤道領域および先体を覆う原形質膜に均等に分布する。シグナルを欠く赤道セグメントにおける帯も存在する。図６Ｂに説明される通り、先体を覆う原形質膜におけるシグナルは、先体後方／赤道帯におけるシグナルよりも明るい。図６Ｃおよび図６Ｄに説明される通り、先体後方／赤道帯に見出されるシグナルが、先体を覆う原形質膜におけるシグナルよりも明るい。
【０２０１】
単一ドナーに由来する精子細胞を洗浄し、受精能獲得（刺激（Stim））および非受精能獲得（非刺激（Non-Stim））条件下の両方でインキュベートし、次いで、０日目（固定液（fix）中におよそ５時間維持）および１日目（固定液中におよそ２７．５時間維持）の両方でスコア化した。刺激処理について、０日目から１日目にかけて縞状細胞のパーセンテージに変化は殆どなかった。対照的に、非刺激処理について、０日目から１日目にかけて縞状細胞のパーセントは、３から２２％に増加した。この変化と併せて、ＩＮＴＥＲには７６から５１％へのその後の減少があった。これらのデータは、０日目にｉｎｔｅｒパターンを有する細胞からの１日目に発生する縞状細胞パターンと一致する。
表1
【表１】
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【０２０２】
（実施例４）
単一ドナーに由来する細胞を洗浄し、受精能獲得（刺激）および非受精能獲得（非刺激）条件下の両方でインキュベートし、次いで、０日目（固定液中におよそ４時間維持）および１日目（固定液中におよそ２５時間維持）の両方でスコア化した。０日目に縞状細胞は殆ど観察されなかったため、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅを決定するために縞状細胞の数を含めてまたは含めず、０日目に同様のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅが得られた。しかし、１日目に縞状細胞の出現により、縞状細胞がどのように解釈されたかに応じて、異なるＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）値を得ることができた。例えば、縞状細胞が、受精能を獲得していないとして処理された場合、刺激および非刺激処理の両方で同様のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）が得られた。しかし、縞状細胞が、受精能を獲得したとして処理され、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）計算から分離または除去された場合、非刺激処理で、刺激処理よりも大きいＣａｐ−Ｓｃｏｒｅが得られた。これらの精子細胞は基本条件下でインキュベートされ、よって、受精能獲得に関連するＧＭ１パターンを示していなかったため、非刺激処理でより大きいＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）値を有することには意味がない。これらの観察は、縞状細胞が、非受精能獲得状態を表し、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）を計算する際に、そのようなものとして処理されるべきであることのさらなる補完的エビデンスをもたらす。
表2
【表２】
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【０２０３】
（実施例５）
１８名の特有のドナーに由来する４０種の異なる精液試料を洗浄し、精子を受精能獲得（刺激）および非受精能獲得（非刺激）条件下の両方でインキュベートし、次いで、０日目および１日目の両方でスコア化した。縞状細胞が、受精能を獲得していないとして処理される場合、０日目および１日目に得られる刺激Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）値の間に顕著な相関が観察される（ｒ＝０．３２；ｎ＝４０；ｐ＜０．０５）。対照的に、縞状細胞が、受精能を獲得したとして処理され、ＧＭ１局在パターンに基づき受精能を獲得したもしくは受精能を獲得していないビンのいずれかへと分けられる、またはＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）から単純に除去される場合、０日目および１日目の間に相関は観察されない。これらの観察は、縞状細胞局在パターンが、精子が一晩維持されると発達し、０日目に、これらの精子が、ｉｎｔｅｒ／受精能を獲得していないパターンを示すという考えを支持する。受精能を獲得していない細胞としての縞状細胞の処理は、経時的にＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）を安定化し、不妊である細胞を反映するこのパターンと一致する。その上、これらのデータは、受精能を獲得していない細胞としての縞状細胞の解釈が、集団に適用可能であることを実証する。そうであるにもかかわらず、１日目の縞状細胞の出現は、ドナー依存性である。これは、これらの縞状細胞の観察から、これらのドナー、およびドナーの精子の受精能力に関する追加的な情報を提供し得る可能性が生じる。
【０２０４】
（実施例６）
単一生殖能力クリニックにおいて、子宮内人工授精（ＩＵＩ）を使用して、そのパートナーと妊娠するように試みた５６名の男性被験体から収集された精子試料（すなわち、精液試料）に由来するデータを、様々な生殖能力パターン認識分類器のための訓練セットとして使用した。各データ入力は、ＩＵＩを使用してカップルが妊娠したか否か、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）、精子試料の体積、精子試料中の精子の濃度、および精子試料中の精子の運動性を含んだ。
【０２０５】
第１の試みにおいて、ロジスティック回帰を使用して、男性の生殖能力を特徴付けするための分類器を構築した。ロジスティック回帰は、カテゴリーの確率が、所与の変数のセットにおける線形モデルの変換によって決定されると仮定することによりカテゴリー的データをモデル化する技法である。妊娠した／妊娠しなかった二分法等のバイナリーデータのため、変数において線形であると仮定されるものは、成功確率のロジットである：
【数９】
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（式中、ｘは、変数のあるベクトルであり、Ａは、それぞれが各変数に対する係数のセットである）。４つの変数は、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ、運動性、濃度および体積であった。線形判別解析（ＬＤＡ）のため、これらの変数を中心に置き縮尺調整したが、モデルは、元の値を使用した。
４つの変数のすべての組合せを使用したモデル（１５種のモデル）および相互作用モデルは、段階的変数選択により選択した。２つの最良のモデルは、一方は、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ単独に基づき、他方は、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅおよび体積を使用した。Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ単独により、妊娠転帰を予測した（ｐ＝０．０５；妊娠を生じる確率（ＰＧＰ）範囲：６．９７〜５８．７％）。
【０２０６】
モデルがデータをどの程度十分に説明するかに関する１つの尺度である逸脱は、より複雑なモデル（例えば、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅおよび体積を使用する）が、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ単独に基づくモデルよりも僅かに優れたモデルであることを示唆する。しかし、より複雑なモデルは、単純により柔軟であるため、より低い逸脱を有する傾向がある。
【０２０７】
より複雑なモデルが、実際により情報的な価値があるか、またはより柔軟であるため、より情報的な価値があると単に思われるか評価するために、ＡＩＣは、モデル複雑性を考慮に入れる。ＡＩＣは、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ単独を使用したモデルが、複雑なモデル（例えば、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ、体積および両者の積である相互作用項を使用する）よりも僅かに優れていることを示唆する。
【０２０８】
逸脱およびＡＩＣ尺度は、ある１つのモデルを他のモデルよりも明らかに好むわけではない。しかし、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ単独に基づくモデルを使用することは、少なくとも３つの理由から有利である。第１に、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ単独に基づくモデルは、より単純であり、より単純なモデルは、より頑強になる傾向がある。第２に、体積は、医学的見地から問題になる。中等度の値について、増加した体積は、増加した生殖能力と関連するが、大きい値は、減少した生殖能力に関連する。第３に、ロジスティックモデルの出力は、下でさらに記述される通り、成功の確率として直接的に解釈可能である。
【０２０９】
変数（相互作用項を除外）の全１５通りの組合せに関する統計的尺度を、下の表３に示す。上述の通り、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ単独を使用したモデルは、より低い逸脱を伴うより複雑なモデルを含む、あらゆる他のモデルよりも低いＡＩＣを伴った。
表3.単一IUIクリニックに由来する男性の生殖能力のロジスティック回帰モデルのためのフィットの統計的尺度
【表３−１】
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【表３−２】
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上述のＬＤＡモデルが使用して、妊娠した（Ｐ）および妊娠しなかった（ＮＰ）の２つの経験的累積分布関数（ＥＣＤＦ）をコンピューター処理し、最大の差の点を見出すことにより設定された閾値により、高い、中程度の、および低い妊娠確率のセットへの男性の生殖能力の単純細分化をもたらした。ＬＤＡモデルを上回るロジスティック回帰モデルの重要な利点は、ロジスティックモデルが、トリアージカテゴリーをもたらすのではなく、個体の受胎確率を推定することである。ロジスティックモデルを使用して、同様にトリアージカテゴリーを作成することができるが、これは、上述よりも情報的な価値がある。ＬＤＡにより、判別の個々の値の単刀直入な解釈は存在しない。
トリアージ閾値は、統計的手順の結果であり、異なる試料が存在していた場合、それらの閾値によって定義される区間は、集団の異なるパーセンテージを有するであろう。それらのパーセンテージの不確実性は、元の集団から置き換えによりサンプリングして、新しい集団の効果をシミュレートするブートストラップを使用することにより計算された。本発明者らは、閾値のパーセンテージが、約９％の標準偏差を有することを発見した。すなわち、本発明者らは、３９％として与えられるパーセンテージが、２１％〜５７％の間であるとだけ、自信を持って言うことができる。これは、ＬＤＡ解析またはロジスティック回帰のいずれかから計算されるトリアージパーセンテージに当てはまる。
上に参照される個々の確率も、確率的シミュレーションによって評価することができる不確実性を有し、それらの可変性は同じ桁のものである。本データにより、いずれの解析から得られる数量（figure）も、小数第１位を越えて正確さが保証されない。
機械学習に基づく他のモデルも考慮されたが、上に概要を述べるロジスティック回帰アプローチほど成功しなかった。例えば、上述の単一施設試験において測定される４つの変数（例えば、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）、精子試料の体積、精子試料中の精子の濃度、および精子試料中の精子の運動性）に基づきニューラルネットワークを構築する試みは、収束に失敗した。同様に、教師なし方法は、ｋ−平均をコールし、クラスタリングは、１つのクラスターにおけるデータの中心的大部分をコールし、端の周囲のごく小さいクラスターを打ち切った。
【０２１０】
２つの他の統計的方法、ランダムフォレストおよび最近傍分類が、実行に成功した。しかし、これらの方法は、ロジスティック回帰モデルと比較して、不十分に機能した。単一クリニックデータにおいて訓練されたランダムフォレストモデルは、妊娠していない症例の５８．８％を正確に分類したが、妊娠した症例の２２．７％のみを正確に分類した。最近傍分類は、妊娠していない症例の５９％を正確に特定したが、妊娠した症例の３５．３％のみを正確に分類した。２つの技法は、主に、データの全体を一度に「見る」ことができないローカルな技法であるため、劣った予測を生成する。２つの方法は、相当に異なっているが、非常に同様の結果を生じた：大部分の症例について、推量よりもごく僅かに優れているだけであった。より大きいデータセットは、ロジスティック回帰または線形判別解析の精度を少なくともより良く決定するであろう；これらの技法の場合、より多くの試料における訓練により、これらがより優れた成績を収めることを予想する理由はない。
【０２１１】
上述のモデルを使用して、訓練セットから除外された自然妊娠の１７症例を予測することができるかについても考慮した。ＬＤＡモデルを使用して、１７症例のうちの７症例のみが、当該解析によって定義される「高い」カテゴリーにスコア化された一方、４症例が、「中程度の」とスコア化され、６症例が、「低い」とスコア化された。ロジスティック回帰モデルにより、妊娠の予測中央値は、僅かに３４％であり、３症例のみが、５０％を上回る予測を有し、最も高い予測は５６％であった。自然妊娠データが、ＩＵＩ妊娠データ「に似てい」ないことが明らかである。
【０２１２】
（実施例７）
単一ロジスティック回帰モデルが、複数の生殖能力クリニックで得たデータをフィットさせることができるか決定するために、５つの異なるクリニックにわたり、子宮内人工授精（ＩＵＩ）を使用した１２４名の男性被験体に由来する精子試料（すなわち、精液試料）からデータを収集した。各データ入力は、ＩＵＩを使用してカップルが妊娠したか否か、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）、精子試料の体積、精子試料中の精子の濃度、および精子試料中の精子の運動性を含んだ。
段階的変数選択により選択された４つの変数のすべての組合せ（１５種のモデル）および相互作用モデルについて、実施例５の通りにロジスティック回帰モデルを計算した。変数（相互作用項を除外）の全１５通りの組合せに関する統計的尺度を、下の表４に示す。
表4. 5つのIUIクリニックに由来する男性の生殖能力のロジスティック回帰モデルのためのフィットの統計的尺度
【表４】
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【０２１３】
単一クリニックデータについて報告される通り、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ単独を使用したロジスティック回帰モデル（図７に表す）は、あらゆる他のモデルよりも低いＡＩＣを伴った。Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ単独は、妊娠転帰を予測した（ｐ＜０．００１、ＰＧＰ範囲６．９７〜８０．７％）。複数拠点に由来するデータの取込みは、モデルの質の尺度の非常に僅かな降下をもたらし、おそらく、異なる施設の間で使用された方法における何らかの不均一性を示す。しかし、その結果得られるモデルは、それらのいずれかを説明するのに適切であり、５つのクリニックのいずれかに由来する単一クリニックデータのみに基づき計算されたモデルと比較して、低減した不確実性を有する。実施例６に記載されているブートストラップ演習（bootstrapping exercise）を複数クリニックデータのために反復して、その結果得られる確率予測の不確実性を決定した。不確実性が、約９％の以前の標準偏差（単一クリニック試験における）から４％（複数クリニック試験のため）まで降下したことが見出された。予測される通り、追加的なデータは、予測推定値の誤差を低減させる。
【０２１４】
（実施例８）
精子の受精能力に関する情報を提供する機能検査を欠き、濃度、運動性、形態および体積等の精子および精液のより記述的な特徴のみに着目するため、精液解析は、男性側要因生殖能力の多くの症例の診断に失敗する。Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）は、低いおよび正常な生殖能力「カットオフ」点を使用して、男性の生殖能力と強い相関を有することが以前に示されている。しかし、男性の生殖能力は連続的なものであり、本発明者らは、ロジスティック回帰を使用して、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）が、妊娠を生じる確率にどのように関係するか示すことを意図した。そこで、予測された妊娠を生じる確率および実際のＩＵＩ転帰の間の関係性を検査した。
【０２１５】
６つのクリニックから、２９２名の男性被験体のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）および転帰を得た。２９２名の被験体のうちの、１２８名が処置を完了した（すなわち、３サイクル以内に子宮内人工授精（ＩＵＩ）により妊娠した、または妊娠を生じることなく３回の試みを完了した）。ＰＧＰモデルは、２つの仕方で検査した。検査１：新しい転帰を実施例７の先の１２４個の転帰に加え、モデルを再実行して、変化を決定した。検査２：１２８個の転帰をおよそ等しいサイズの順位序列付けされた群へと分け、本明細書に記載されている線形回帰アプローチを使用して、各群内の妊娠を生じることに成功した個体の割合を、当該群内の平均予測ＰＧＰと比較した。
【０２１６】
検査１結果。１２８個の新しいデータ点が、実施例７に由来する以前の１２４個のデータ点に加えられ、新しいロジスティック回帰モデルが生成された場合に、ごく僅かな平均変化が観察された。変化の大部分は、データ点が最も少ない、曲線の末端から生じた。１２４個のデータ点についての回帰方程式は、ｐ＜０．０１のｐ値による、ＰＧＰ＝１／［１＋ｅｘｐ［−［−２．８６＋０．０８＊Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）］］］であり、２５２個のデータ点（１２４＋１２８）に由来する回帰方程式は、Ｐ＜０．００１のｐ値による、ＰＧＰ＝１／［１＋ｅｘｐ［−［−２．２６＋０．０６＊Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）］］］であった。図８Ａおよび８Ｂは、それぞれｎ＝１２４群およびｎ＝２５２群についての、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）およびＰＧＰの間の関係性を説明する。両方の群について、本明細書に開示されているロジスティック回帰モデルを使用して、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）およびＰＧＰの間の強い関連が観察され、図８Ｂに示す通り、より多くのデータ点を用いて、モデルのフィットが改善した。
【０２１７】
検査２結果。１２８個の転帰を５つの群へと分け、各群についてＰＧＰを計算した；転帰をまた、６つの群へと分け、各群についてＰＧＰを計算した。予測されるＰＧＰを、観察された妊娠と比較した場合に、異なる群について有意な線形関係性が見られた。ｎ＝５群について、ｙ＝０．８１ｘ＋０．１０；Ｒ２＝０．８４；ｐ＝０．０３であり、ｎ＝６群について、ｙ＝０．６９ｘ＋０．１４；Ｒ２＝０．８６；ｐ＜０．０１であった。傾きは、１と有意に異ならず、切片は、０と有意に異ならなかった（ｔ検定における、ｐ＞０．０５）。図８Ｃおよび８Ｄは、それぞれｎ＝５およびｎ＝６群について、観察された妊娠の回帰を示す。両方の群について、関係性は、群内の平均ＰＧＰが、当該群について、観察された妊娠を生じる割合と効果的に等しかったことを示す。
これらの結果は、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）、精子機能／受精能力、および妊娠を生じる能力の間の強い関連の実証をさらに支持する。
【０２１８】
（実施例９）
精子受精能獲得の欠損は、自身の生殖能力に関する疑問のために生殖能力検査を受けている男性に高度に蔓延しており、これは、それらの検査が、男性が正常精子である（すなわち、世界保健機関（ＷＨＯ）判断基準に従って、体積、濃度および運動性の精液解析が正常である）と決定した場合であっても当てはまる。本実施例では、精液解析測定基準、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）および３サイクル以内に妊娠を生じる確率（ＰＧＰ）を解析した。これは、相関試験であった  −  １６１０名の男性のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）、ＰＧＰおよび精液解析測定基準を、７６名の男性の既知の生殖能力がある集団（妊娠したパートナーがいるまたは最近父親になったとして特定）の結果と比較した。
【０２１９】
潜在的生殖能力問題に懸念がある男性患者から精液を収集した。試料は、９つの異なるクリニックから、約２．５年間の期間にわたって収集した。試料における精液体積、濃度および精子運動性を評価した。試料の一部分を固定し、そのプロトコールに従ってＡｎｄｒｏｖｉａ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓに送り、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）およびＰＧＰについて解析した。
【０２２０】
自身の生殖能力に疑問を抱く男性におけるＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）およびその関連するＰＧＰの分布を評価するために、ＰＧＰを、≦１９％、２０〜２９％、３０〜３９％、４０〜４９％、５０〜５９％および≧６０％のビンへと分割し、７６名の生殖能力が既知の男性の集団の結果に対し、１６１０名の男性についてＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）およびＰＧＰの分布を比較した。生殖能力が既知の男性において分布に基づき予想されるよりも大幅に多い、自身の生殖能力に疑問を抱く男性が、≦１９％、２０〜２９％および３０〜３９％のＰＧＰビンに見出された（ｐ＜０．００１）。自身の生殖能力に疑問を抱き精液解析を行った男性の５９パーセント（５９％；９４８／１６１０）が、体積、濃度および運動性に関して正常精子であると見出された。そのうちの、６５％（６１６／９４８）が、より低い生殖能力状態を示す３１未満のまたはこれに等しいＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）、およびより低いＰＧＰ（３９％未満）を有した。生殖能力がある男性の分布から予想されるよりも少ない、自身の生殖能力に疑問を抱く男性が、３２またはそれを超えるＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）を有した。これらの結果は、正常精子精液測定基準を有する男性の高い蔓延が、生殖能力検査を求める男性集団における受精能獲得および／または受精能力を低減させたことを明らかにした。さらに、精子機能の欠損は、任意の単一または複数の精子解析測定基準の合格に関係なく等しく蔓延していた；患者の異なる群の間でＰＧＰに差はなかった：全患者、単一の正常精液解析測定基準（ＷＨＯに従う）を有する患者、２つ以上の正常精液解析測定基準（ＷＨＯに従う）を有する患者、または総計１千万個を超える運動性細胞を有する患者（ｐ＝０．９９０）。生殖能力がある群と比較して、自身の生殖能力に疑問を抱く正常精子男性の６５％（６１６／９４８）が、３１またはそれ未満のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）を有し、３９％またはそれ未満の妊娠確率を有した一方、既知の生殖能力がある群の２５％のみ（１９／７６）が、この範囲内のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）を有した。逆に、生殖能力検査を求める正常精子の男性の３５％のみ（３２２／９４８）が、３２またはそれを超えるＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）を有し、４０％またはそれよりも多い妊娠確率を有した一方、既知の生殖能力がある群の７５％が、この範囲内のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）を有した。これらのデータは、伝統的な精液解析が、潜在的な男性の生殖能力問題の特定において十分ではなく、よって、特発性不妊と診断されている男性の高いパーセンテージに寄与するという結論を支持する。これらのデータは、精子受精能獲得の検査（すなわち、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ解析）が、特発性不妊と診断された男性のパーセンテージを低減させ得、精子受精能獲得を改善し、よって、ＰＧＰを改善するであろう潜在的介入を特定し得ることを支持する。
表5:実施例9研究の結果
【表５】
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【０２２１】
１つまたは複数の特定の実施形態に関して本開示を記載してきたが、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、本開示の他の実施形態を為すことができ、斯かる他の実施形態が、本開示の範囲内にあると意図されることが理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【国際調査報告】
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