(57)【要約】  第一の側面において、本発明は、新規組換え人工的ポリペプチドであって、該ポリペプチドを含有する細胞において細胞質シグナル伝達を可能にする前記ポリペプチドに関する。特に、本発明は、人工的リガンドおよび人工的リガンドに結合する受容体より選択される第一の結合パートナーを含むドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに細胞質シグナル伝達ドメイン、それによって結合パートナーを含むドメインおよび細胞質シグナル伝達ドメインが生物において天然に存在しないドメインの組み合わせである、を含有する組換えポリペプチド、ならびに結合対の特異的形成のための第二の結合パートナーを含有する、シグナルを伝達するための系に関する。さらなる側面において、本発明記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子、ならびにベクター、前記ベクターを含有する細胞、細胞株または宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、被験体の癌または自己免疫疾患を治療するか、または免疫調節を可能にするとともに、本発明記載の組換えポリペプチド中に存在する第一の結合パートナーに特異的な第二の結合パートナーを適用した際、細胞の状態を変化させるために使用するための、本発明記載の組換えポリペプチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内にシグナルを伝達するための系であって、
ｉ．）少なくとも以下のドメイン：
結合対の人工的リガンドおよび該人工的リガンドに結合する受容体より選択される第一の結合パートナーであって、前記結合対が受容体およびリガンドの第一および第二の結合パートナーで構成され、それによってリガンドが人工的分子である、前記の第一の結合パートナーを含有する第一のドメイン；
随意に、スペーサードメイン；
膜貫通ドメイン、ならびに
細胞質シグナル伝達ドメイン、ここで、該第一のドメインおよび該細胞質シグナル伝達ドメインが、細胞またはそれに由来する細胞を含有する生物において、天然には存在しないドメインの組み合わせである、
をＮ末端から始まりＣ末端まで含有する、組換えポリペプチドの少なくとも１つのタイプ、ならびに
ｉｉ．）ｉ．）の組換えポリペプチド中に存在する第一の結合パートナーに応じて、人工的リガンドおよび人工的リガンドに結合する受容体より選択される、前記結合対の第二の結合パートナー
を含む、前記系。
【請求項２】
前記組換えポリペプチドが、第一の結合パートナーが一本鎖抗体単位、受容体分子、内因性ペプチドまたはその断片、および人工的ペプチドからなる群より選択される組換えポリペプチドである、請求項１記載の系。
【請求項３】
前記組換えポリペプチドが、第一の結合パートナー、例えば一本鎖抗体単位を含有する第一のドメインのＮ末端に位置するリーダー配列をさらに含む、請求項１または２記載の系。
【請求項４】
前記組換えポリペプチドの細胞質シグナル伝達ドメインが、サイトカイン受容体に由来する細胞質シグナル伝達ドメインであり、特に、一般的に刺激性受容体、例えばｇｐ１３０、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−１２Ｒβ１、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＦＮαＲ、ＩＦＮγＲ、ＴＮＦ１Ｒ、ＴＮＦ２Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＬ−２２Ｒ、サイレンシング（消耗性）受容体、例えばＰＤ−１、ＩＬ−１０Ｒ、ＴＩＭ３、ＩＬ−２７Ｒまたは殺傷性受容体、例えばＦａｓＲ、ＴＲＡＩＬＲからなる群より選択される細胞質シグナル伝達ドメインである、先行する請求項のいずれか一項記載の系。
【請求項５】
前記組換えポリペプチドの膜貫通ドメインが、前記細胞の膜に渡る膜貫通ドメインであり、特に膜貫通ドメインが、細胞質シグナル伝達ドメインが由来するサイトカイン受容体に由来する、先行する請求項のいずれか一項記載の系。
【請求項６】
前記組換えポリペプチドが、第一の結合パートナーを含有する第一のドメインが、人工的リガンドである第二の結合パートナーに特異的に結合するナノボディを含有する第一のドメインである、組換えポリペプチドである、先行する請求項のいずれか一項記載の系。
【請求項７】
２つの異なる第一のドメインまたは２つの異なる細胞質ドメインの少なくとも１つ、および第一の組換えポリペプチドの第一の結合パートナーに結合する結合セグメントを含む人工的リガンド、および第二の組換えポリペプチドの第一の結合パートナーに結合する第二の結合セグメントを含有する、請求項１〜６のいずれか一項に定義するような少なくとも２つの異なる組換えポリペプチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項記載の系。
【請求項８】
第二の結合パートナーとしての人工的リガンドが結合して結合対を形成した際、細胞内にシグナルを伝達するため、組換えポリペプチドが、ホモ二量体またはホモ三量体の形で存在する、請求項１〜７のいずれか一項記載の系。
【請求項９】
人工的リガンドが、少なくとも、第一の組換えポリペプチド中に存在する第一の結合パートナーに特異的に結合する結合セグメントで構成され、そして人工的リガンドのさらなる結合セグメントが第二の組換えポリペプチドの第一の結合パートナーに特異的に結合した際に、細胞内にシグナルを伝達するため、少なくとも２つの異なる組換えポリペプチドが、ヘテロ二量体またはヘテロ三量体を形成する、請求項１〜７のいずれか一項記載の系。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に定義するような、組換えポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１記載の核酸配列を含むベクター、特にウイルスベクターまたはプラスミド。
【請求項１３】
請求項１２記載のベクターまたは請求項１１記載の核酸分子を含有するか、あるいは請求項１０記載の組換えポリペプチドを発現する、細胞、細胞株または宿主細胞。
【請求項１４】
末梢血細胞である、請求項１３記載の細胞、細胞株または宿主細胞。
【請求項１５】
ＣＤ８＋またはＣＤ４＋  Ｔ細胞である、請求項１４記載の細胞、細胞株または宿主細胞。
【請求項１６】
キメラ抗原受容体をさらに発現する、遺伝子操作されたＴ細胞である、請求項１５記載の細胞、細胞株または宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１２記載の第二のベクターまたは請求項１１記載の第二の核酸分子をさらに含有する請求項１０または１１のいずれか一項記載の細胞、細胞株または宿主細胞であって、このベクターまたは核酸分子が、第一の結合ドメインまたは細胞質シグナル伝達ドメインの少なくとも１つあるいは両方と異なる、請求項１０記載のポリペプチドをコードする、前記細胞、細胞株または宿主細胞。
【請求項１８】
第二のベクターの細胞質シグナル伝達ドメインが、異なるシグナル伝達経路を通じてシグナル伝達を誘導する、請求項１３〜１７のいずれか一項記載の細胞、細胞株または宿主細胞。
【請求項１９】
被験体の癌または自己免疫疾患の治療、または免疫調節に使用するための、請求項１〜９のいずれか一項記載の系または請求項１０記載の組換えポリペプチド、請求項１１記載の核酸分子、請求項１２記載のベクター、あるいは請求項１３〜１８のいずれか一項記載の細胞、細胞株または宿主細胞。
【請求項２０】
前記ポリペプチド、ベクター、核酸分子、あるいは宿主細胞、または細胞株中に存在する第一の結合パートナーに特異的な第二の結合パートナーを適用した際に、細胞の状態を変化させる、すなわち細胞の状態を調節するために使用するための、特に請求項１９記載の使用のための、請求項１〜９のいずれか一項記載の系、請求項１０記載の組換えポリペプチド、請求項１１記載の核酸分子、請求項１２記載のベクター、あるいは請求項１３〜１８のいずれか一項記載の細胞、細胞株または宿主細胞。
【請求項２１】
免疫調節のため、細胞、特にリンパ球、例えばＴ細胞の産生において使用するための、請求項１２記載のベクター、請求項１３〜１８のいずれか一項記載の細胞、細胞株または宿主細胞、請求項１１記載の核酸分子および／または請求項１０記載のペプチドを含有する、キットまたは系。
【請求項２２】
請求項１３〜１８のいずれか一項記載の細胞、細胞株または宿主細胞、ならびに前記細胞、細胞株または宿主細胞によって発現される組換えポリペプチド中に存在する第一の結合パートナーに応じて、人工的リガンドおよび人工的リガンドに結合する受容体より選択される、前記結合対の第二の結合パートナーを含有する、キットまたは系。
【請求項２３】
請求項１２記載のベクター、および組換えポリペプチド中に存在する第一の結合パートナーに応じて、人工的リガンドおよび人工的リガンドに結合する受容体より選択される、前記結合対の第二の結合パートナーのための、請求項１１記載の核酸分子を含有する、キットまたは系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
第一の側面において、本発明は、新規組換え人工的ポリペプチドであって、該ポリペプチドを含有する細胞において細胞質シグナル伝達を可能にする前記ポリペプチドに関する。特に、本発明は、人工的リガンドおよび人工的リガンドに結合する受容体より選択される第一の結合パートナーを含むドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに細胞質シグナル伝達ドメイン、それによって結合パートナーを含むドメインおよび細胞質シグナル伝達ドメインが生物において天然に存在しないドメインの組み合わせである、を含有する組換えポリペプチド、ならびに結合対の特異的形成のための第二の結合パートナーを含有する、シグナルを伝達するための系に関する。さらなる側面において、本発明記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子、ならびにベクター、前記ベクターを含有する細胞、細胞株または宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、被験体の癌または自己免疫疾患を治療するか、または免疫調節を可能にするとともに、本発明記載の組換えポリペプチド中に存在する第一の結合パートナーに特異的な第二の結合パートナーを適用した際、細胞の状態を変化させるために使用するための、本発明記載の組換えポリペプチドの使用に関する。
【発明の概要】
【０００２】
養子細胞療法および養子細胞トランスファーは、悪性腫瘍の治療において有意な有効性を示してきており、そして癌、自己免疫疾患を含む多様な疾患を持つ患者において治癒性である可能性もあり、それとともに被験体における免疫調節を可能にする可能性もある。例えば、癌はドイツにおいて二番目に一般的な死因であり、そして癌の療法ならびに自己免疫疾患の療法または一般に免疫調節は、集中的な研究の目的となっている。
【０００３】
癌の治療には、手術、放射線照射または切除に加えて、養子細胞療法を含む多様な方法が存在する。治療しようとする被験体の免疫系の利用および免疫系の操作は、癌の治療を可能にするとともに、自己免疫疾患等の治癒を可能にする。
【０００４】
養子細胞療法において、通常、患者由来のＴ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで操作して、特定の受容体を発現させるかまたは特定のＴ細胞を活性化させる。適応Ｔ細胞療法において有用な操作Ｔ細胞の例は、組換えＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現している操作Ｔ細胞である。前記キメラ抗原受容体は、典型的には、抗体由来の細胞外抗原結合ドメインおよびＴ細胞受容体エンドドメイン由来の細胞内Ｔ細胞活性化ドメインで構成される。生理学的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とは対照的に、ＣＡＲは、細胞外部分を通じた抗原結合と、細胞内シグナル伝達部分によって提供されるＴ細胞活性化機構を組み合わせた、単一ポリペプチド鎖で構成される。
【０００５】
癌および他の疾患を治療するための他のアプローチは、Ｔ細胞を刺激するか、またはＴ細胞上の特定の受容体をブロッキングすることを可能にし、こうして、前記Ｔ細胞を活性化するかまたは不活性化するか、あるいは前記Ｔ細胞およびあらかじめ決定されたターゲットに対する免疫反応の有効性を増加させる、薬剤の使用である。例えばＰＤ１ならびにＰＤＬ１（ＰＤ１のリガンド）に対する薬剤は、腫瘍の治療において成功裡に用いられている。しかし、これまで、免疫療法の主な副作用の１つは、例えば抗ＣＤ２８薬剤である薬剤に関して記載されるような重大な副作用が伴う、非特異的な過剰な免疫活性化および典型的にはいわゆるサイトカインストームによって誘導される過剰な免疫反応である。ＣＡＲ分子は前記の問題を克服しうると考えられた。ＣＡＲ修飾Ｔ細胞中に存在する抗体由来ドメインは、抗原の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）提示とは独立に、そのターゲット、通常は細胞表面抗原を認識することを可能にし、そして腫瘍細胞変異によって損なわれて、腫瘍免疫エスケープの一般的に観察される機構に相当する抗原プロセシングの低下または不全を伴うことがない。近年、このＣＡＲ  Ｔ細胞腫瘍免疫療法に基づく第一の方法が、小児急性リンパ球性白血病に関して、ならびに巨細胞Ｂ細胞リンパ腫に関して、ＦＤＡによって認可された。
【０００６】
しかし、ＣＡＲに基づく療法はなお、抗ＣＤ１９  ＣＡＲに関して記載されるように、特異性、およびサイトカインストームを含む望ましくない免疫活性に関する問題を有する。したがって、細胞に基づく療法におけるさらなる発展が必要である。特に、重大な副作用を減少させながら、操作細胞、特に操作腫瘍反応性Ｔ細胞の増殖増進を可能にするさらなるツールを提供することが望ましい。
【０００７】
当該技術分野におけるさらなるアプローチは、修飾サイトカイン受容体または修飾サイトカイン誘導性シグナル伝達の使用である。サイトカイン誘導性シグナル伝達は、免疫関連プロセスを調節する多くの他の機能の中でも、とりわけ、天然生物学的スイッチによって実行される。原則として、サイトカイン受容体は、サイトカインの非存在下ではオフ状態であり、そしてサイトカインの存在下ではオン状態である。オン状態は、サイトカインおよびサイトカイン受容体の枯渇の負のフィードバック機構によって中断されうる。例えば、オン状態にロックされている、ロイシンジッパーまたはＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉおよびＩＬ−６シグナル伝達因子ｇｐ１３０の融合に基づく、リガンド独立性合成受容体が報告されてきている。しかし、これらの合成または人工的受容体は、スイッチ操作可能ではない。Ｓｕｔｈａｕｓ，  Ｊ．ら，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ，  ２０１０，  ２１，  ２７９７−２８０１。興味深いことに、炎症性肝細胞腺腫におけるＩＬ−６／ＩＬ−１１シグナル伝達の顕著な活性化は、リガンド独立性恒常的活性ｇｐ１３０受容体を導く、ｇｐ１３０受容体鎖における機能獲得突然変異によって直接引き起こされた。さらに、サイトカイン、エリスロポエチンでの刺激によりｇｐ１３０誘導性シグナル伝達を生じる、スイッチ操作可能合成サイトカイン受容体が記載されてきている。Ｇｅｒｈａｒｔｚ，  Ｃ．ら，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９６，  ２７１，  １２９９１−１２９９８。
【０００８】
この系の主な欠点は、エリスロポエチンが天然ＥＰＯ受容体と交差反応性を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方で、その適用が限定されることであった。また、天然リガンド、例えばエリスロポエチンを用いて、より高次のマルチ受容体複合体に集合させることは不可能であり、こうしたリガンドは、受容体ホモ二量体化しか誘導しない。これは、非修飾天然存在リガンド、例えばサイトカインの使用に関連する一般的な問題に相当する。シグナル伝達の直接細胞内活性化および細胞死の誘導は、細胞浸透性合成リガンド、例えばＦＫ５０６および結合タンパク質、例えばＦＫＢＰ１２を用いて達成され、これらはホモ二量体化およびホモオリゴマー化を生じた。しかし、問題は、オリゴマー化の度合いが調節不能であることであった。共刺激受容体、ｎｏｔｃｈに基づく受容体および抗原特異的阻害性受容体を含む、操作ＣＡＲ  Ｔ細胞反応を最適化するための、合成膜貫通受容体の多様な形式が設計されてきている。例えば、Ｆｅｄｅｒｏｖ，  Ｖ．Ｄ．ら，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｌ  Ｍｅｄ，  ２０１３，  ５，  ２１５ｒａ１７２，  ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００６５９７。しかし、スイッチ操作可能でバックグラウンドに関連しない系、特に、ヘテロ／ホモ二量体、三量体または多量体構成を含めて、受容体複合体の集合方式に関して完全に制御可能であるフリー合成サイトカイン受容体系は、入手不能である。
【０００９】
ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙを特異的に認識する、最近開発されたナノボディは、内因性リガンドに結合できず（例えば、Ｆｒｉｄｙ  Ｐ．Ｃ．ら，  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２０１４，  １２，  １２５３−１２６０を参照されたい）、そしてしたがって、こうしたナノボディは、合成サイトカイン受容体の結合パートナーとして不適格である。ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄａｅ）重鎖抗体のＮ末端領域は、その同族（ｃｏｇｎａｔｅ）抗原に結合する、ＶＨＨまたはナノボディと称される特化した可変ドメインを含有する。ナノボディは、重鎖抗体の可変領域から生じる約１１０アミノ酸残基の単一ドメイン抗体である。
【００１０】
上記を考慮して、腫瘍免疫療法における新規アプローチ、ならびに自己免疫疾患を含む他の免疫に基づく疾患の治療、ならびに特に、例えばそれぞれの療法のさらなる発展を妨害する、適応療法におけるＣＡＲ発現Ｔ細胞において記載される副作用を克服するため、被験体における免疫調節の必要性がある。すなわち、悪性癌細胞および健康な細胞の間を区別しないＣＡＲを発現する操作Ｔ細胞を用いたＣＡＲに基づく適応療法において、このＣＡＲアプローチに関してもまた、サイトカインストームが記載されている。さらに、養子細胞療法における活性細胞、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞を調節する系およびアプローチが必要である。
【００１１】
本発明は、減少した毒性、高い特異性、減少した副作用を有するとともに、単純な活性化および非活性化によってスイッチ操作可能である、新規に開発された組換えポリペプチド、ならびに細胞内にシグナルを伝達するための系におけるその使用に関する。
【００１２】
第一の側面において、本発明は
細胞内にシグナルを伝達するための系であって、
ｉ．）少なくとも以下のドメイン：
人工的リガンドおよび該人工的リガンドに結合する受容体より選択される結合対の第一の結合パートナーであって、前記結合対が受容体およびリガンドの第一および第二の結合パートナーで構成され、それによってリガンドが人工的分子である、前記の第一の結合パートナーを含有する第一のドメイン；
随意に、スペーサードメイン；
膜貫通ドメイン、ならびに
細胞質シグナル伝達ドメイン、ここで該第一のドメインおよび該細胞質シグナル伝達ドメインが、細胞またはそれに由来する細胞を含有する生物において、天然には存在しないドメインの組み合わせである、
をＮ末端から始まりＣ末端まで含有する、組換えポリペプチドの少なくとも１つのタイプ、ならびに
ｉｉ．）ｉ．）の組換えポリペプチド中に存在する第一の結合パートナーに応じて、人工的リガンドおよび人工的リガンドに結合する受容体より選択される、前記結合対の第二の結合パートナー
を含む、前記系を提供する。
【００１３】
すなわち、第一の側面において、本発明は、少なくとも以下のドメイン：
人工的リガンドおよび人工的リガンドに結合する受容体より選択される、第一の結合パートナーを含有する第一のドメイン；
随意に、スペーサードメイン、
膜貫通ドメイン、ならびに
細胞質シグナル伝達ドメイン、ここで、該第一のドメインおよび該細胞質シグナル伝達ドメインが、生物において、天然には存在しないドメインの組み合わせである、
をＮ末端から始まりＣ末端まで含有する、組換えポリペプチドを提供する。
【００１４】
好ましい態様において、本発明記載の組換えポリペプチドは、ナノボディを含有する第一のドメイン、ならびに同じサイトカイン受容体由来の膜貫通ドメインおよび細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【００１５】
さらなる側面において、本発明は、本発明記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子に関する。さらに、本発明記載の核酸配列を含むベクター、特にウイルスベクターまたはプラスミドの形のベクターを開示する。
【００１６】
さらに、本発明記載のベクターまたは本発明記載の核酸分子を含有し、そして最終的に本発明記載の組換えポリペプチドを発現する細胞、細胞株または宿主細胞を記載する。
【００１７】
さらに、本発明は、被験体の癌または自己免疫疾患の治療に使用するための、または免疫調節に使用するための、本発明記載の組換えポリペプチド、核酸分子、ベクター、細胞、細胞株または宿主細胞に関する。さらに、上記は、活性化および非活性化、細胞におけるアポトーシスまたは細胞死の誘導、ならびに老化の誘導等を含めて、細胞の状態を変化させるために有用である。さらに、壊死、例えばネクロトーシスが誘導されてもよい。さらに、細胞の阻害および細胞の消耗も可能であってもよい。
【００１８】
さらに、本発明記載の細胞、細胞株または宿主細胞、ならびに細胞、細胞株または宿主細胞によって発現される組換えポリペプチド中に存在する第一の結合パートナーに応じて、人工的リガンドおよび人工的リガンドに結合する受容体より選択される、結合対の第二の結合パートナーを含有する、キットまたは系を提供する。さらに、本発明記載の核酸分子、本発明記載のベクターまたはベクター、ならびに核酸分子またはベクターによってコードされる組換えポリペプチド中に存在する第一の結合パートナーに応じて、人工的リガンドおよび人工的リガンドに結合する受容体より選択される、結合対の第二の結合パートナーを含有する、キットまたは系を提供する。
【００１９】
最後に、本発明は、特に、免疫調節のため、細胞、例えばＴ細胞の産生において使用するための、本発明記載のベクター、細胞、細胞株または宿主細胞、核酸分子および／またはペプチドを含有する、キットまたは系に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】ＩＬ−２３のための合成サイトカイン受容体（ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２Ａ））は、形質導入Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞において、ＩＬ−２３誘導性シグナル伝達および細胞増殖をシミュレーションする。ａ．ＩＬ−２３シグナル伝達をシミュレーションするＳｙＣｙＲの模式的例示。ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質は、合成サイトカインリガンドとして働いた。ＧＶＨＨ−ＩＬ−１２Ｒβ１は、ＩＬ−１２Ｒβ１の細胞外部分の１５ａａ、膜貫通および細胞内ドメインに融合したＧＦＰ−ナノボディ（ＧＶＨＨ）からなる。ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒは、ＩＬ−２３Ｒの細胞外部分の１７ａａ、膜貫通および細胞内ドメインに融合したｍＣｈｅｒｒｙ−ナノボディ（ＣＶＨＨ）からなる。ＩＬ−２３Ｒ内の天然ＳＴＡＴ３結合部位を、囲んだＳＴＡＴ３によって強調した。ｂ．ＨＩＬ−６およびＧＦＰ：ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質での異なるＢａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞株の細胞増殖。等しい数の細胞を、示す合成リガンドの存在下（６．２５ｎｇ／ｍｌ）で、３日間培養した。ｍＣｈｅｒｒｙでの刺激をＧＦＰ（０．２５％）と同じ体積で行った。ＨＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）での刺激を対照として用いた。比色ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ細胞生存度アッセイを用いて増殖を測定した。３つのうち１つの代表的な実験を示す。ｃ．すべてのＳｙＣｙＲの発現カセットは、ＩＬ−１１Ｒ由来のシグナルペプチドに続き、ＦｌａｇまたはｍｙｃタグおよびＣＶＨＨまたはＧＶＨＨ、サイトカイン受容体の細胞外部分の１３〜１７ａａ、膜貫通および細胞内ドメインからなる。ｄ．ＧＶＨＨ−ＣＶＨＨ融合タンパク質の発現カセットは、ＰｅｌＢシグナルペプチドに続き、Ｆｌａｇタグ、ＧＶＨＨ、ＣＶＨＨおよびＨｉｓタグからなる。
【図１−２】ＩＬ−２３のための合成サイトカイン受容体（ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２Ａ））は、形質導入Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞において、ＩＬ−２３誘導性シグナル伝達および細胞増殖をシミュレーションする。ａ．ＩＬ−２３シグナル伝達をシミュレーションするＳｙＣｙＲの模式的例示。ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質は、合成サイトカインリガンドとして働いた。ＧＶＨＨ−ＩＬ−１２Ｒβ１は、ＩＬ−１２Ｒβ１の細胞外部分の１５ａａ、膜貫通および細胞内ドメインに融合したＧＦＰ−ナノボディ（ＧＶＨＨ）からなる。ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒは、ＩＬ−２３Ｒの細胞外部分の１７ａａ、膜貫通および細胞内ドメインに融合したｍＣｈｅｒｒｙ−ナノボディ（ＣＶＨＨ）からなる。ＩＬ−２３Ｒ内の天然ＳＴＡＴ３結合部位を、囲んだＳＴＡＴ３によって強調した。ｂ．ＨＩＬ−６およびＧＦＰ：ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質での異なるＢａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞株の細胞増殖。等しい数の細胞を、示す合成リガンドの存在下（６．２５ｎｇ／ｍｌ）で、３日間培養した。ｍＣｈｅｒｒｙでの刺激をＧＦＰ（０．２５％）と同じ体積で行った。ＨＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）での刺激を対照として用いた。比色ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ細胞生存度アッセイを用いて増殖を測定した。３つのうち１つの代表的な実験を示す。ｃ．すべてのＳｙＣｙＲの発現カセットは、ＩＬ−１１Ｒ由来のシグナルペプチドに続き、ＦｌａｇまたはｍｙｃタグおよびＣＶＨＨまたはＧＶＨＨ、サイトカイン受容体の細胞外部分の１３〜１７ａａ、膜貫通および細胞内ドメインからなる。ｄ．ＧＶＨＨ−ＣＶＨＨ融合タンパク質の発現カセットは、ＰｅｌＢシグナルペプチドに続き、Ｆｌａｇタグ、ＧＶＨＨ、ＣＶＨＨおよびＨｉｓタグからなる。
【図２】ＩＬ−６の合成サイトカイン受容体（ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−６））は、形質導入Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞およびマウスにおいて、ＩＬ−６／ＩＬ−１１誘導性シグナル伝達および細胞増殖をシミュレーションする。ａ．ＩＬ−６シグナル伝達をシミュレーションするＳｙＣｙＲの模式的例示。ＧＦＰ−ＧＦＰ融合タンパク質は、合成サイトカインリガンドとして働いた。ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０は、ヒトｇｐ１３０の細胞外部分の１３ａａに続く膜貫通および細胞内ドメインに融合したＧＦＰ−ナノボディからなる。ｇｐ１３０内の天然ＳＴＡＴ３結合部位を、囲んだＳＴＡＴ３によって強調した。ｂ．すべてのＳｙＣｙＲの発現カセットは、ＩＬ−１１Ｒ由来のシグナルペプチドに続いて、ＦｌａｇまたはｍｙｃタグおよびＣＶＨＨまたはＧＶＨＨ、サイトカイン受容体の細胞外部分の１３〜１７ａａ、膜貫通および細胞内ドメインからなる。ｃ．Ｆに示す免疫ブロッティングによって決定されるような、ｐＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ３肝臓発現の相対密度の比；ｎ＝３動物／群；＊ｐ＜０．０５、一方向ＡＮＯＶＡ。（Ｈ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、１．２８μｇ  ｐｃＤＮＡ３．１−３ｘＧＦＰおよび／または２．３μｇ  ｐｃＤＮＡ３．１−ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０プラスミドＤＮＡの水力学的トランスフェクション２４時間後の肝臓急性期反応Ｓａａ１  ｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ。ハウスキーパーｍＲＮＡ  ＧａｐｄｈおよびΔΔＣＴ法を用いて、データを標準化し、そして計算した；ｎ＝６動物／群；＊ｐ＜０．０５、一方向ＡＮＯＶＡ。
【図３】ホモ二量体ＩＬ−２３Ｒ（ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３Ｒ））の合成サイトカイン受容体は、形質導入Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞において、シグナル形質導入および細胞増殖を誘導した。ａ．ホモ二量体ＩＬ−２３Ｒシグナル伝達をシミュレーションするＳｙＣｙＲの模式的例示。ＧＦＰ−ＧＦＰ融合タンパク質は、合成サイトカインリガンドとして働いた。ＧＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒは、ＩＬ−２３Ｒの細胞外部分の１７ａａ、膜貫通および細胞内ドメインに融合したＧＦＰ−ナノボディからなる。ＩＬ−２３Ｒ内の天然ＳＴＡＴ３結合部位を、囲んだＳＴＡＴ３によって強調した。ｂ．すべてのＳｙＣｙＲの発現カセットは、ＩＬ−１１Ｒ由来のシグナルペプチドに続く、ＦｌａｇまたはｍｙｃタグおよびＣＶＨＨまたはＧＶＨＨ、サイトカイン受容体の細胞外部分の１３〜１７ａａ、膜貫通および細胞内ドメインからなる。ｃ．ＨＩＬ−６およびＧＦＰ：ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質でのＢａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３Ｒ）細胞の細胞増殖。等しい数の細胞を、示す合成リガンドの存在下（６．２５ｎｇ／ｍｌ）で、３日間培養した。ｍＣｈｅｒｒｙでの刺激をＧＦＰ（０．２５％）と同じ体積で行った。ＨＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）での刺激を対照として用いた。比色ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ細胞生存度アッセイを用いて増殖を測定した。３つのうち１つの代表的な実験を示す。
【図４−１】形質導入Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞において、ＩＬ−２３Ｒの操作ヘテロ三量体ＳｙＣｙＲは、ＳＴＡＴ３トランスリン酸化が可能である。ａ．ＳＴＡＴ３トランスリン酸化をシミュレーションするＩＬ−２３Ｒ−ＳｙＣｙＲの模式的例示。２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質は、合成サイトカインリガンドとして働いた。ＧＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＳＴＡＴは、ＳＴＡＴ結合モチーフを欠くＩＬ−２３Ｒの細胞外部分の１６ａａ、膜貫通および細胞内ドメインに融合したＧＦＰ−ナノボディからなる。ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＪＡＫ変異体は、ＪＡＫ活性化部位を欠くＩＬ−２３Ｒ（ΔＪＡＫ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ）の細胞外部分の１６ａａ、膜貫通および細胞内ドメインに融合したｍＣｈｅｒｒｙ−ナノボディからなる。ｂ．すべてのトランス活性化ＳｙＣｙＲの発現カセットは、ＩＬ−１１Ｒ由来のシグナルペプチドに続くＦｌａｇまたはｍｙｃタグおよびＣＶＨＨまたはＧＶＨＨ、サイトカイン受容体の細胞外部分の１６〜１７ａａ、膜貫通および細胞内ドメインからなる。ｃ．Ｂａ／Ｆ３−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＳＴＡＴ細胞におけるＪＡＫ活性化の分析。細胞を３回洗浄し、飢餓状態にし、そして１００ｎｇ／ｍｌの示す合成リガンドで２０分間刺激した。細胞溶解物を調製し、そして等量の総タンパク質（５０μｇ／レーン）をＳＤＳゲル上に装填した後、ホスホＪＡＫ２およびＪＡＫ２に対する特異的抗体を用いて、イムノブロッティングした。ウェスタンブロットデータは、３つのうち１つの代表的な実験を示す；ｄ．Ｂａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３Ｒ）、Ｂａ／Ｆ３−Ｇｖｈｈ−ＩＬ−２３デルタＳＴＡＴ細胞およびその変異体の、３ｘＧＦＰまたは２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質での細胞増殖。等しい数の細胞を、示すリガンド（０．１〜１６００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で３日間培養した。比色ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ細胞生存度アッセイを用いて増殖を測定した。４つのうち１つの代表的な実験を示す。
【図４−２】形質導入Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞において、ＩＬ−２３Ｒの操作ヘテロ三量体ＳｙＣｙＲは、ＳＴＡＴ３トランスリン酸化が可能である。ａ．ＳＴＡＴ３トランスリン酸化をシミュレーションするＩＬ−２３Ｒ−ＳｙＣｙＲの模式的例示。２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質は、合成サイトカインリガンドとして働いた。ＧＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＳＴＡＴは、ＳＴＡＴ結合モチーフを欠くＩＬ−２３Ｒの細胞外部分の１６ａａ、膜貫通および細胞内ドメインに融合したＧＦＰ−ナノボディからなる。ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＪＡＫ変異体は、ＪＡＫ活性化部位を欠くＩＬ−２３Ｒ（ΔＪＡＫ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ）の細胞外部分の１６ａａ、膜貫通および細胞内ドメインに融合したｍＣｈｅｒｒｙ−ナノボディからなる。ｂ．すべてのトランス活性化ＳｙＣｙＲの発現カセットは、ＩＬ−１１Ｒ由来のシグナルペプチドに続くＦｌａｇまたはｍｙｃタグおよびＣＶＨＨまたはＧＶＨＨ、サイトカイン受容体の細胞外部分の１６〜１７ａａ、膜貫通および細胞内ドメインからなる。ｃ．Ｂａ／Ｆ３−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＳＴＡＴ細胞におけるＪＡＫ活性化の分析。細胞を３回洗浄し、飢餓状態にし、そして１００ｎｇ／ｍｌの示す合成リガンドで２０分間刺激した。細胞溶解物を調製し、そして等量の総タンパク質（５０μｇ／レーン）をＳＤＳゲル上に装填した後、ホスホＪＡＫ２およびＪＡＫ２に対する特異的抗体を用いて、イムノブロッティングした。ウェスタンブロットデータは、３つのうち１つの代表的な実験を示す；ｄ．Ｂａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３Ｒ）、Ｂａ／Ｆ３−Ｇｖｈｈ−ＩＬ−２３デルタＳＴＡＴ細胞およびその変異体の、３ｘＧＦＰまたは２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質での細胞増殖。等しい数の細胞を、示すリガンド（０．１〜１６００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で３日間培養した。比色ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ細胞生存度アッセイを用いて増殖を測定した。４つのうち１つの代表的な実験を示す。
【図４−３】形質導入Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞において、ＩＬ−２３Ｒの操作ヘテロ三量体ＳｙＣｙＲは、ＳＴＡＴ３トランスリン酸化が可能である。ａ．ＳＴＡＴ３トランスリン酸化をシミュレーションするＩＬ−２３Ｒ−ＳｙＣｙＲの模式的例示。２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質は、合成サイトカインリガンドとして働いた。ＧＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＳＴＡＴは、ＳＴＡＴ結合モチーフを欠くＩＬ−２３Ｒの細胞外部分の１６ａａ、膜貫通および細胞内ドメインに融合したＧＦＰ−ナノボディからなる。ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＪＡＫ変異体は、ＪＡＫ活性化部位を欠くＩＬ−２３Ｒ（ΔＪＡＫ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ）の細胞外部分の１６ａａ、膜貫通および細胞内ドメインに融合したｍＣｈｅｒｒｙ−ナノボディからなる。ｂ．すべてのトランス活性化ＳｙＣｙＲの発現カセットは、ＩＬ−１１Ｒ由来のシグナルペプチドに続くＦｌａｇまたはｍｙｃタグおよびＣＶＨＨまたはＧＶＨＨ、サイトカイン受容体の細胞外部分の１６〜１７ａａ、膜貫通および細胞内ドメインからなる。ｃ．Ｂａ／Ｆ３−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＳＴＡＴ細胞におけるＪＡＫ活性化の分析。細胞を３回洗浄し、飢餓状態にし、そして１００ｎｇ／ｍｌの示す合成リガンドで２０分間刺激した。細胞溶解物を調製し、そして等量の総タンパク質（５０μｇ／レーン）をＳＤＳゲル上に装填した後、ホスホＪＡＫ２およびＪＡＫ２に対する特異的抗体を用いて、イムノブロッティングした。ウェスタンブロットデータは、３つのうち１つの代表的な実験を示す；ｄ．Ｂａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３Ｒ）、Ｂａ／Ｆ３−Ｇｖｈｈ−ＩＬ−２３デルタＳＴＡＴ細胞およびその変異体の、３ｘＧＦＰまたは２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質での細胞増殖。等しい数の細胞を、示すリガンド（０．１〜１６００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で３日間培養した。比色ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ細胞生存度アッセイを用いて増殖を測定した。４つのうち１つの代表的な実験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、受容体を含有する細胞において、受容体活性化および不活性化を通じてシグナル伝達を誘導することが可能な新規組換えポリペプチドであって、生物中に天然には存在しない前記ポリペプチドの提供を目的とする。
【００２２】
特に、新規組換えポリペプチドは、それによってシグナル伝達がリガンドによって誘発され、そして前記リガンドが人工的リガンドである、細胞内にシグナルを伝達するための適切な手段である。
【００２３】
本発明の態様において、ナノボディを細胞外ドメインとして、すなわちいわゆる合成サイトカイン受容体（ＳｙＣｙＲ）の部分である人工的リガンドの結合パートナーとして用いて、ホモおよびヘテロ二量体ならびにヘテロ三量体受容体複合体の形成および活性化を導いた。本発明記載の組換えポリペプチドは、ターゲット細胞におけるシグナル伝達を可能にするスイッチ操作可能な受容体系に相当する。
【００２４】
すなわち、第一の側面において、
細胞内にシグナルを伝達するための系であって、
ｉ．）少なくとも以下のドメイン：
結合対の人工的リガンドおよび該人工的リガンドに結合する受容体より選択される第一の結合パートナーであって、前記結合対が受容体およびリガンドの第一および第二の結合パートナーで構成され、それによってリガンドが人工的分子である、前記結合パートナーを含有する第一のドメイン；
随意に、スペーサードメイン；
膜貫通ドメイン、ならびに
細胞質シグナル伝達ドメイン、ここで、該第一のドメインおよび該細胞質シグナル伝達ドメインが、細胞またはそれに由来する細胞を含有する生物において、天然には存在しないドメインの組み合わせである、
をＮ末端から始まりＣ末端まで含有する、組換えポリペプチドの少なくとも１つのタイプ、ならびに
ｉｉ．）ｉ．）の組換えポリペプチド中に存在する第一の結合パートナーに応じて、人工的リガンドおよび人工的リガンドに結合する受容体より選択される、前記結合対の第二の結合パートナー
を含む、前記系である。例えば、少なくとも以下のドメイン：
人工的リガンドおよび人工的リガンドに結合する受容体より選択される、第一の結合パートナーを含有する第一のドメイン；
随意に、スペーサードメイン、
膜貫通ドメイン、ならびに
細胞質シグナル伝達ドメイン、ここで、該第一のドメインおよび該細胞質シグナル伝達ドメインが、生物において、天然には存在しないドメインの組み合わせである、
をＮ末端から始まりＣ末端まで含有する、組換えポリペプチドを提供する。
【００２５】
本明細書において同義的に用いられる用語「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」または「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、ならびに用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」には、本明細書において、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」および「からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」の態様が含まれる。
【００２６】
別に示さない限り、用語「遺伝子操作された」は、遺伝子操作によって操作されている細胞を指す。すなわち、細胞は、前記細胞中に天然に存在しないか、または前記細胞のゲノム中に導入された特定の位で、前記細胞中に天然には存在しない、異種配列を含有する。典型的には、異種配列は、ベクター系またはリポソームを含めて細胞内に核酸分子を導入するための他の手段によって導入される。異種核酸分子は、前記細胞のゲノム内に組み込まれてもよいし、または染色体外に、例えばプラスミドの形で存在してもよい。該用語にはまた、本発明記載の遺伝子操作された、すなわち組換えの単離ポリペプチドを、細胞内に導入する態様も含まれる。
【００２７】
用語「結合対」は、本明細書において、結合部分または結合パートナーとも称される少なくとも２つの結合分子、すなわち、結合対の第一の部分、第一の結合パートナー、および結合対の第二の部分、第二の結合パートナーの複合体を指す。結合部分および結合パートナーは、本明細書において、交換可能に用いられる。
【００２８】
結合パートナー、第一の結合パートナーまたは第二の結合パートナーは、他方の結合パートナーと相互作用して、結合対または結合複合体を特異的に形成するセクターまたは領域である、結合セグメントを含む。
【００２９】
本発明にしたがって、本発明記載の組換えペプチド中に存在する第一の結合パートナーは、第二の結合パートナーに特異的に結合し、こうして結合対を形成する。結合対は、本発明記載の組換えポリペプチド中に存在する細胞質シグナル伝達ドメインを通じて、シグナル伝達を誘導する。
【００３０】
組換えポリペプチドは人工的ポリペプチドであり、これは、本発明記載の組換えポリペプチド中に存在する異なるドメインの特異的組み合わせが、ターゲット生物またはターゲット宿主中に天然には存在しないことを意味する。すなわち、当業者は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内（細胞質）ドメインを含有するサイトカイン受容体分子のような受容体分子をよく知っている。人工的ポリペプチドに相当する本発明記載の組換えポリペプチドは、遺伝子操作を伴わずには天然で生物から単離できない、第一の受容体、例えば抗原結合ドメインまたはサイトカイン受容体の細胞外ドメイン、および例えばサイトカイン受容体に由来する細胞質シグナル伝達ドメインの第二の細胞質ドメインを含有する、組換えポリペプチドである。
【００３１】
用語「人工的リガンド」は、宿主において、例えばヒトにおいて、天然には存在しないリガンドを指す。すなわち、人工的リガンドは、例えば細胞または組織表面には結合しない分子であり、未結合または遊離細胞外分子である。特に、人工的リガンドは、宿主生物、例えばヒトによって発現されない単離合成または遺伝子操作化合物である。人工的リガンドは、結合パートナーに特異的に結合する結合セグメントを含み、したがって本明細書に記載するような特異的結合対を形成する。
【００３２】
用語「受容体」は、さらなる結合パートナーに特異的に結合して、特異的に結合対を形成する結合パートナーを指す。前記受容体は、アミノ酸配列によって形成される任意の種類の受容体分子であってもよい。
【００３３】
本明細書において、用語「ナノボディ」は、単一単量体可変抗体ドメインからなる単一ドメイン抗体を指す。典型的には、ナノボディは、サイズ１２〜１５キロダルトンである。用語「ＶＨＨ抗体」または「ＶＨＨ」は、「単一ドメイン抗体」または「ナノボディ」と同義的に用いられる。
【００３４】
用語「ポリペプチド」は、本明細書において、典型的には最大５００アミノ酸のサイズを有し、例えば最大４００、例えば最大３００のサイズを有する、アミノ酸で構成されるペプチドを指す。例えば、ポリペプチドのサイズは、５０〜５００アミノ酸の間、例えば１００〜４００アミノ酸である。
【００３５】
用語「に由来する」は、言及する特定の受容体または分子から得られるかまたはそれに起因するドメイン、特に細胞質シグナル伝達ドメインを指す。すなわち、用語「に由来する」は、ドメインまたは部分が、同定される分子の一部であることを同定する。例えば、サイトカイン受容体に由来する細胞質シグナル伝達ドメインは、サイトカイン受容体の細胞の細胞質中に存在するペプチド配列を指す。当業者は、当該技術分野に記載されるようなそれぞれのペプチド部分をよく知っている。
【００３６】
用語「その断片」は、同じ望ましい機能を有する、例えば結合パートナーに対して同じ特異的結合能を有し、特異的結合対を形成して、本発明記載の組換えポリペプチド中に存在する細胞質シグナル伝達ドメインを通じてシグナル伝達を可能にする、言及するペプチドの部分を指す。
【００３７】
リガンド、すなわち「人工的リガンド」は、本発明記載の組換えポリペプチドが発現される、典型的には細胞外の環境には、生理学的に存在しないリガンドを指す。
【００３８】
１つの態様において、本発明記載の組換えポリペプチド中に存在する第一の結合パートナーは、一本鎖抗体単位、受容体分子、内因性ペプチドまたはその断片、および人工的ペプチドからなる群より選択される。すなわち、第一の結合パートナーは、抗原エピトープに特異的に結合するナノボディまたは他のタイプの一本鎖抗体であってもよい。あるいは、２つの相互作用ポリペプチド、例えば結合パートナーは、既知のリガンドを有する受容体分子、例えばサイトカイン受容体分子である。
【００３９】
さらに、第一の結合パートナーは人工的ペプチドであってもよい。当業者は、特異的ペプチドまたは非ペプチド結合パートナーと結合対を形成することが知られる適切な人工的ペプチドを知っている。人工的ペプチドの典型的な例は、結合パートナー、ビオチンを伴うアビジンまたはストレプトアビジンである。
【００４０】
１つの態様において、人工的リガンドは、同一であってもまたは異なってもよい、少なくとも２つの結合セグメントを含んでもよい。実施例に示すように、人工的リガンドは、１つまたは２つのＧＦＰ結合セグメント（エピトープ）ならびに１つまたはそれより多いｍＣｈｅｒｒｙ結合セグメント（エピトープ）で構成されてもよい。当業者は適切な組み合わせをよく知っている。例えば、組換えポリペプチドのホモまたはヘテロ二量体化あるいはホモまたはヘテロ三量体化を可能にするため、人工的リガンドを、実施例に概略するように、適宜設計する。
【００４１】
さらなる態様において、本発明記載の組換えポリペプチドは、第一の結合パートナー、例えば一本鎖抗体単位を含有する第一のドメインのＮ末端に位置するリーダー配列をさらに含む。当業者は、例えば前記細胞の膜中に割り当てるため、細胞小器官に組換えポリペプチドを向けることを可能にする適切なリーダー配列をよく知っている。
【００４２】
一般的に、組換えポリペプチドは、記載するような第一のドメインを含有する細胞外に存在するエクトドメイン、および随意にスペーサードメインからなる。エクトドメインは、前記スペーサードメインの存在によって膜貫通ドメインから離れていてもよい。前記の随意のスペーサードメインは、第一のドメインを膜貫通ドメインに連結し、そして膜貫通ドメインと組み合わせられた前記スペーサードメインは、第一のドメインが異なる方向に配向して結合対形成を容易にすることを可能にするために十分に柔軟であることが好ましい。
【００４３】
本発明記載の組換えポリペプチド中に存在する膜貫通ドメインは、典型的には、膜に渡る疎水性アルファらせんである。最終的に、細胞質シグナル伝達ドメインを含むエンドドメインは、本発明記載の組換えポリペプチドの細胞質部分中のシグナル伝達ドメインに相当する。
【００４４】
エンドドメインは、シグナル伝達ドメインを含有し、そしてまた、本明細書において交換可能に用いられる細胞内ドメインとも称される。１つの態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、サイトカイン受容体に由来し、特に、一般的に刺激性受容体、例えばｇｐ１３０、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−１２Ｒβ１、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＦＮαＲ、ＩＦＮγＲ、ＴＮＦ１Ｒ、ＴＮＦ２Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＬ−２２Ｒ、サイレンシング（消耗性）受容体、例えばＰＤ−１、ＩＬ−１０Ｒ、ＴＩＭ３、ＩＬ−２７Ｒまたは殺傷性受容体、例えばＦａｓＲ、ＴＲＡＩＬＲからなる群より選択される。さらに、ドメインは共刺激ドメインを含有してもよい。１つの態様において、シグナル伝達ドメインは、例えば養子細胞療法において使用するため、Ｔ細胞において発現される組換えポリペプチドを用いた際、Ｔ細胞における細胞殺傷活性の活性化またはＴ細胞によるインターフェロンガンマの分泌にそれぞれ関与する。
【００４５】
１つの態様において、膜貫通ドメインおよび細胞質シグナル伝達ドメインは同じ分子に由来し、例えばサイトカイン受容体に由来する。
【００４６】
別の態様において、膜貫通ドメインは、１つの分子から得られてもよく、一方、細胞質シグナル伝達ドメインは別の分子から得られてもよい。例えば、本発明記載の組換えポリペプチドの一部ではないＣＡＲ分子の場合と同様に、膜貫通ドメインおよび細胞内膜近位部分はＣＤ２８に由来する一方、細胞内部分はＣＤ３ζに由来する。１つの態様において、ＣＤ２８配列は、ＬＣＫ結合モチーフを欠く、当該技術分野に記載されるような突然変異配列である。
【００４７】
本発明記載の組換えポリペプチド中に存在する第一の結合パートナーに特異的に結合する第二の結合パートナーは、典型的には、人工的な第二の結合パートナーである。例えば、第二の結合パートナーは、本発明記載の組換えポリペプチド中に受容体が存在する場合、人工的なリガンドである。用語「人工的な第二の結合パートナー」は、天然存在ではなく、そして環境、すなわち本発明記載の組換えポリペプチドを発現する細胞の細胞外環境には生理学的に存在しない分子を指す。
【００４８】
さらなる態様において、本発明記載の系は、２つの異なる第一のドメインまたは２つの異なる細胞質ドメインの少なくとも１つを含有する本明細書に定義するような少なくとも２つの異なる組換えポリペプチド、および第一の組換えポリペプチドの第一の結合パートナーに結合する結合セグメントを含む人工的リガンド、および第二の組換えポリペプチドの第一の結合パートナーに結合する第二の結合セグメントを含む、系である。さらに、第二の結合パートナーとしての人工的リガンドが結合して結合対を形成した際、細胞内にシグナルを伝達するため、組換えポリペプチドが、ホモ二量体またはホモ三量体の形で存在する、系を提供する。さらに、人工的リガンドが、少なくとも、第一の組換えポリペプチド中に存在する第一の結合パートナーに特異的に結合する結合セグメントで構成され、そして人工的リガンドのさらなる結合セグメントが第二の組換えポリペプチドの第一の結合パートナーに特異的に結合した際に、細胞内にシグナルを伝達するため、少なくとも２つの異なる組換えポリペプチドが、ヘテロ二量体またはヘテロ三量体を形成する、系を提供する。
【００４９】
さらに、本発明は、本発明記載の組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。さらに、記載するようなポリペプチドをコードする本発明記載の核酸配列を含むベクターを提供する。当業者は、適切なベクター系およびベクター、特に真核細胞、特にＴ細胞のトランスフェクションおよび形質導入を可能にするベクターをよく知っている。１つの態様において、ベクターおよびプラスミドは、本発明記載の２つの異なる組換えポリペプチドを含有し、したがって、遺伝子操作された細胞において、２つの異なる受容体分子の発現を可能にする。２つの異なる組換えポリペプチドを発現することによって、適切な人工的リガンドを用いて、受容体をヘテロ二量体化することが可能である。例えば、以下の実施例に示すように、合成サイトカイン受容体のヘテロ二量体化が可能であり、したがって、前記遺伝子操作細胞におけるシグナル伝達カスケードを誘導し、そしてさらにスイッチ操作可能なシグナル伝達を可能にする。
【００５０】
細胞中で発現された際、組換えポリペプチドは、シグナル伝達を可能にする、本明細書に記載するような異なるタイプの組換えペプチド、例えば異なるタイプのＳｙＣｙＲに相当してもよい。例えば、刺激性ＳｙＣｙＲを発現させて、それぞれの細胞の活性化または増殖を可能にしてもよい。さらに、阻害性ＳｙＣｙＲを発現させて、細胞の増殖を阻害するかまたは細胞を不活性化してもよい。さらに、ＳｙＣｙＲには、細胞死またはアポトーシスまたは老化誘導性シグナル伝達ドメインが含まれる。したがって、細胞を能動的に制御して、そして特異的な第二の結合パートナー、典型的には前記ＳｙＣｙＲに結合する人工的リガンドの存在または非存在に応じて、細胞を１つの状態から別の状態に、例えば活性化から不活性化状態およびその逆に、ならびに老化状態から増殖状態およびその逆にスイッチングすることが可能である。
【００５１】
刺激性ＳｙＣｙＲの例には、ｇｐ１３０、ＴＮＦＲ、ＩＬ−７のサイトカインシグナル伝達ドメインが含まれ、阻害性ＳｙＣｙＲの例には、ＩＬ−２７Ｒ、ＰＤ１およびＴＩＭ３Ｒ由来の細胞質シグナル伝達ドメインが含まれる一方、細胞死誘導性ＳｙＣｙＲには、ＦＡＳＲおよびＴＲＡＩＬ由来細胞質シグナル伝達ドメインが含まれる。
【００５２】
【表１】
2021519601.tif 000002
表１：本発明を生じる人工的リガンド、すなわち実施例に記載するような共有結合ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙリガンドによるＳｙＣｙＲの活性化の例を示す。それぞれのＳｙＣｙＲは、それぞれ、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙに対するナノボディを含有する。
【００５３】
死ＳｙＣｙＲ態様は、養子細胞療法の場合、例えばＣＡＲ分子と組み合わせた際に有用でありうる。ＣＡＲ細胞の過剰な反応が生じた際（サイトカインストーム）、ＣＡＲ細胞中に存在する死ＳｙＣｙＲポリペプチドに対する人工的リガンドを投与すると、活性を調節し、そして最終的にＣＡＲ  Ｔ細胞を適宜殺すことが可能になる。あるいは、本明細書に記載するような適切なポリペプチドを用いてサイレンシングまたは阻害を達成することも可能である。
【００５４】
例えば、本発明記載のプラスミドまたはベクターは、ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）に基づく系である。あるいは、２Ａ系を適用してもよい（Ｆａｎｇ，  Ｊ．ら  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３，  ５８４−５９０，  ２００５）。
【００５５】
当業者は、ターゲット細胞において、本発明記載の単一組換えポリペプチドのトランスフェクションおよび発現を可能にするか、または１つのターゲット細胞において、本発明記載の２つの異なる組換えポリペプチドのトランスフェクションおよび発現を適宜可能にする適切な系をよく知っている。
【００５６】
さらに、本発明は、本発明記載のベクターまたは本発明記載の核酸分子または本発明記載の核酸分子を含有するか、あるいは本発明記載の組換えポリペプチドを発現する細胞、細胞株または宿主細胞を提供する。好ましくは、前記細胞、細胞株または宿主細胞は、Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞である。本発明記載の細胞、細胞株または宿主細胞は、１つの態様において、修飾末梢血細胞、例えばＣＤ８＋またはＣＤ４＋  Ｔ細胞のような言及するＴ細胞を含むリンパ球である。１つの態様において、細胞、細胞株または宿主細胞は、一般的に、ＣＡＲ受容体をさらに発現する遺伝子操作Ｔ細胞に相当する。本発明記載の組換えポリペプチドを用いると、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を制御することが可能になり、したがって、養子細胞療法において、これらの遺伝子操作ＣＡＲ発現Ｔ細胞の適用が改善される。
【００５７】
１つの側面において、本発明記載の細胞、細胞株または宿主細胞は、本明細書に定義するような第二のベクターまたは本発明記載の第二の核酸分子を含有し、ここでこの第二のベクターまたは核酸分子は、第一の結合ドメインまたは細胞質シグナル伝達ドメインの少なくとも１つあるいは両方で異なる、本発明記載のポリペプチドをコードする。
【００５８】
１つの態様において、本発明記載のこの細胞、細胞株または宿主細胞は、本発明記載の２つの異なる組換えポリペプチドを含むベクターまたはプラスミドを含有するか、あるいは２つの異なる組換えポリペプチドをコードする２つのベクターまたはプラスミドを含有し、ここで、第二のベクターの細胞質シグナル伝達ドメインは、異なるシグナル伝達経路を通じたシグナル伝達を誘導する。
【００５９】
さらに、本発明は、本発明記載の組換えポリペプチドを発現するＴ細胞の産生において使用するための、本発明記載のベクター、本発明記載の細胞、細胞株または宿主細胞、本発明記載の核酸分子、ならびに／あるいは本発明記載のペプチドを含有する、キットまたは系を提供する。特に、前記細胞はリンパ球、例えばＴ細胞であり、そして前記細胞は、被験体において、免疫反応の調節を可能にする。
【００６０】
さらに、本発明は、被験体の癌または自己免疫疾患の治療、または免疫調節において使用するための、本発明記載の組換えポリペプチド、本発明記載の核酸分子、本発明記載のベクター、あるいは本発明記載の細胞、細胞株または宿主細胞を提供する。例えば、本発明は、白血病、黒色腫、リンパ腫、結腸癌、甲状腺癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、乳癌、頸部癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、喉頭癌、咽頭癌、肝細胞癌、前立腺癌、精巣癌、子宮頸癌；肉腫、子宮内膜癌、神経膠芽腫、胆管癌、膀胱癌、中皮腫、胸腺癌、組織非形成性甲状腺癌、基底細胞腫、結腸直腸癌、ＮＳＣ肺癌、ＳＣ肺癌、メルケル細胞癌を含む、多様なタイプの癌の治療のための養子細胞療法を可能にする。
【００６１】
さらに、本発明は、本発明記載の組換えポリペプチド、本発明記載の核酸分子、本発明記載のベクター、あるいは本発明記載の細胞、細胞株または宿主細胞であって、前記ポリペプチド中に存在するか、または前記ベクター中もしくは本発明記載の核酸によってコードされる、第一の結合パートナーに特異的な第二の結合パートナーを適用するか、あるいは宿主細胞、細胞または細胞株において発現させた際に、被験体において、細胞の状態を変化させるために使用するための前記ポリペプチド、核酸分子、ベクター、あるいは細胞、細胞株または宿主細胞を提供する。特に、状態は、被験体の癌または自己免疫疾患を治療する際に、または被験体の免疫調節のために使用するための状態のタイプである。特に、人工的な第二の結合パートナーを投与すると、スイッチ操作可能な方式で、細胞の状態を変化させることが可能になる。これは、シグナル伝達のオン／オフが可能であり、したがって例えば活性化および非活性化の間の、ならびに老化および増殖の間の、そしてさらに活性化および細胞死のアポトーシスの間のスイッチ操作を可能にすることを意味する。
【００６２】
本発明記載の組換えポリペプチド、核酸分子、ベクター、細胞、細胞株または宿主細胞は、一般に、被験体の癌または自己免疫疾患を治療する際、または被験体の免疫調節において使用するために、特に有用である。すなわち、本発明記載の組換えポリペプチド、核酸分子、ベクター、細胞、細胞株または宿主細胞は、細胞の状態を変化させるために有用である。細胞の状態の変化には、前記細胞の活性化または非活性化、細胞の任意の種類の変化、例えば細胞におけるアポトーシスまたは細胞死、ならびに老化の誘導が含まれる。さらに、壊死、例えばネクロトーシスを誘導してもよい。さらに、細胞の消耗、例えばＴ細胞の消耗を含む細胞の阻害を誘導してもよい。一般的に、本発明記載の組換えポリペプチド、核酸分子またはベクターで、ウイルス療法が可能である。ウイルス療法には、抗癌腫瘍溶解性ウイルス、遺伝子治療のためのウイルスベクターおよびウイルス免疫療法を含む療法剤としてのウイルスの使用が含まれる。より一般的には、ウイルス療法には、医学的状態を治療するためのウイルスの形のベクターの使用が含まれる。
【００６３】
別の態様において、本発明記載のポリペプチド、核酸分子、ベクター、細胞または細胞株または宿主細胞は、診断目的のためのキット中の生化学的アッセイの一部であってもよく、そしてこうしたアッセイで用いられてもよい。
【００６４】
さらに、本発明は、本発明記載の細胞、細胞株または宿主細胞、ならびに前記細胞、細胞株または宿主細胞によって発現される組換えポリペプチド中に存在する第一の結合パートナーに応じて、人工的リガンドおよび人工的リガンドに結合する受容体より選択される前記の結合対の第二の結合パートナーを含有する、キットまたは系を提供する。さらに、キットまたは系であって、本発明記載の核酸分子または本発明記載のベクター、ならびに該キットまたは系に存在する前記核酸分子または前記ベクターによってコードされる組換えポリペプチド中に存在する第一の結合パートナーに応じて、人工的リガンドおよび人工的リガンドに結合する受容体より選択される前記結合対の第二の結合パートナーを含有する、前記キットまたは系を提供する。
【００６５】
本発明はさらに、実施例によって記載される。前記例は、本発明を限定することなく、本発明をさらに例示する。
【実施例】
【００６６】
方法
細胞および試薬。ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＣＣ−１１０）細胞をＬｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ドイツ・ブラウンシュバイク）より得た。Ｕ４Ｃ細胞は、Ｈｅｉｋｅ  Ｈｅｒｍａｎｎｓ（ヴュルツブルク大学、ドイツ）より恵贈された。ヒトｇｐ１３０を形質導入されたネズミＢａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞は、Ｉｍｍｕｎｅｘ（米国ワシントン州シアトル）より提供された。パッケージング細胞株Ｐｈｏｅｎｉｘ−ＥｃｏをＵｒｓｕｌａ  Ｋｌｉｎｇｍｕｅｌｌｅｒ（ＤＫＦＺ、ドイツ・ハイデルベルグ）より得た（Ｋｅｔｔｅｌｅｒ，  Ｒ．ら，  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ９，  ４７７−４８７，  ２００２）。ネズミＩＬ−１２Ｒβ１およびネズミＩＬ−２３Ｒを含むＢａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞は、以前記載されてきている（Ｆｌｏｓｓ，  Ｄ．Ｍ．ら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８，  １９３８６−１９４００，  ２０１３）。すべての細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、６０ｍｇ／ｌペニシリンおよび１０ｍｇ／ｌストレプトマイシン（Ｇｅｎａｘｘｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ウルム）を補充したＤＭＥＭ高グルコース培地（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ・ダルムシュタット）中、水飽和大気中で、５％ＣＯ２とともに、３７℃で増殖させた。Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞を、ＩＬ−６および可溶性ＩＬ−６Ｒの融合タンパク質であり、ＩＬ−６トランスシグナル伝達を模倣する、ハイパー−ＩＬ−６（ＨＩＬ−６）の存在下で維持した。組換えタンパク質（１０ｎｇ／ｍｌ）またはハイパーＩＬ−６を分泌する安定ＣＨＯ−Ｋ１クローン由来の順化細胞培地０．２％（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＥＬＩＳＡによって決定した際、およそ５μｇ／ｍｌのストック溶液）のいずれかを用いて、増殖培地に補充した。ネズミＩＬ−２３ＲおよびネズミＩＬ−１２Ｒβ１を発現するＢａ／Ｆ３−ＩＬ−１２Ｒβ１−ＩＬ−２３Ｒ細胞を、ＥＬＩＳＡによって決定した際、およそ５μｇ／ｍｌの濃度でネズミ・ハイパーＩＬ−２３（ＨＩＬ−２３）を分泌している安定ＣＨＯ−Ｋ１クローン由来の順化細胞培地０．２％（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。ホスホ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）（Ｄ３Ａ７）（カタログ番号９１４５）、ＳＴＡＴ３（１２４Ｈ６）（カタログ番号９１３９）、ホスホ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）（Ｔｈｒ−２０２／Ｔｙｒ−２０４）（Ｄ１３．１４．４Ｅ）（カタログ番号４３７０）、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）（カタログ番号９１０２）、ホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）（Ｄ９Ｅ）（カタログ番号４０６０）、ＡＫＴ（カタログ番号９２７２Ｓ）、ホスホ−ＪＡＫ１（Ｔｙｒ１０２２／１０２３）（カタログ番号３３３１）、ＪＡＫ１（６Ｇ４）（カタログ番号３３４４Ｓ）、ホスホ−ＪＡＫ２（Ｔｙｒ１００７／１００８）（カタログ番号３７７１）、ＪＡＫ２（Ｄ２Ｅ１２）（カタログ番号３２３０）、ホスホ−ＴＹＫ２（Ｔｙｒ１０５４／１０５５）（カタログ番号９３２１）、ＴＹＫ２（カタログ番号９３１２）���ＧＦＰ（４Ｂ１０）（カタログ番号２９５５）、およびｍｙｃ（７１Ｄ１０），（カタログ番号２２７８）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ドイツ・フランクフルト）より得た。ｍＣｈｅｒｒｙ（カタログ番号３１４５１）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国マサチューセッツ州ウォルサム）より得た。Ｆｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（カタログ番号Ｆ７４２５）およびγ−チューブリン（カタログ番号Ｔ５３２６）ｍＡｂを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ドイツ・ミュンヘン）より得た。ヒトＣＩＳ３／ＳＯＣＳ３（Ｃ２０４）ｍＡｂ（カタログ番号ＪＰ１８３９１）を、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃｏ，  Ｌｔｄ．（日本・藤岡）より得た。β−アクチン（Ｃ４）ｍＡｂ（カタログ番号ｓｃ−４７７７８）を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国ダラス）から得た。ペルオキシダーゼ・コンジュゲート化二次ｍＡｂ（カタログ番号３１４６２、カタログ番号３１４５１）をＰｉｅｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）より得た。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート化Ｆａｂヤギ抗ウサギＩｇＧ（カタログ番号Ａ１１０７０）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国マサチューセッツ州ウォルサム）より得た。
【００６７】
合成サイトカイン受容体（ＳｙＣｙＲ）および合成リガンドの構築。
【００６８】
ｐｃＤＮＡ３．１−ＧＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ発現ベクターを、ヒトＩＬ−１１Ｒシグナルペプチド（Ｑ１４６２６、ＡＳ  １−２４）に続いて、ｍｙｃタグの配列、ＧＦＰ−ナノボディ（ＧＶＨＨ）（Ｒｏｔｈｂａｕｅｒ，  Ｕ．ら  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ７，  ２８２−２８９，  ２００８）、ならびに受容体の細胞外ドメインの１７ａａ、膜貫通ドメインおよび細胞質部分に相当するアミノ酸Ａ３５８〜Ｋ６４４を含むネズミＩＬ−２３Ｒ（Ｑ８Ｋ４Ｂ４、Ｕｎｉｐｒｏｔ）の融合によって生成した。ＧＶＨＨ−ＩＬ−１２Ｒβ１をコードするｃＤＮＡを、ｐ４０９−ＩＬ−１２Ｒβ１からＰＣＲによって増幅した（Ｆｏｓｓらを参照されたい）ネズミＩＬ−１２Ｒβ１をコードするｃＤＮＡ（Ｑ６０８３７、Ｕｎｉｐｒｏｔ、受容体の細胞外ドメインの１５ａａ、膜貫通ドメインおよび細胞質部分に相当するａａ  Ａ５５１〜Ａ７３８）を、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＧＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ内に挿入することによって生成し、ここでＩＬ−２３Ｒのコード配列は除去された。ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ発現ベクターを、ヒトＩＬ−１１Ｒシグナルペプチドのコード配列（Ｑ１４６２６、ＡＳ  １−２４）に続いて、Ｆｌａｇ−タグ、ｍＣｈｅｒｒｙ−ナノボディ（ＣＶＨＨ）（Ｆｅｄｏｒｏｖ，  Ｖ．Ｄ．ら  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ５，  ２１５ｒａ１７２，  ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００６５９７、２０１３）およびアミノ酸Ａ３５８〜Ｋ６４４を含むネズミＩＬ−２３Ｒ（Ｑ８Ｋ４Ｂ４）（受容体の細胞外ドメインの１７ａａ、膜貫通ドメインおよび細胞質部分）のコード配列の融合によって生成した。ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３ＲおよびＧＶＨＨ−ＩＬ−１２Ｒβ１のコード配列を１つのオープンリーディングフレーム中で合わせるため、両方のＳｙＣｙＲをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、そして自己プロセシング２ＡペプチドをコードするｐＭＫ−ＦＵＳＩＯ内にクローニングした（Ｆａｎｇ，  Ｊ．ら  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３，  ５８４−５９０，  ２００５）。ＩＬ−２３Ｒ−ΔＳＴＡＴ（Δ５０３）をコードするｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＳＴＡＴ（Δ５０３）からＰＣＲによって増幅し（Ｆｏｓｓ上記を参照されたい）、そしてｐｃＤＮＡ３．１−ＧＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒに挿入し、ここでＩＬ−２３Ｒの配列は除去された。したがって、ΔＪＡＫ−Ａ（ＩＬ−２３Ｒ−Δ４０３−４１７）、ΔＪＡＫ−Ｂ（ＩＬ−２３Ｒ−Δ４５５−４７９）およびΔＪＡＫ−Ｃ（ＩＬ−２３Ｒ−Δ４０３−４７９）をコードするｃＤＮＡを、受容体の細胞外ドメインの１６ａａ、膜貫通ドメインおよび短縮細胞質部分を含有する、ｐ４０９−ＩＬ−２３Ｒ−Δ４０３−４１７、−ＩＬ−２３Ｒ−Δ４５５−４７９および−ＩＬ−２３Ｒ−Δ４０３−４７９（Ｆｌｏｓｓ，  Ｄ．ら  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２７，  ２３０１−２３１６、ｄｏｉ：１０．１０９１／ｍｂｃ．Ｅ１４−１２−１６４５  ２０１６）からＰＣＲによって増幅し、そしてｐｃＤＮＡ３．１−ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒに挿入し、ここでＩＬ−２３Ｒの配列は除去された。ｐ４０９−ｇｐ１３０（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサムによって化学的に合成）を、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩによって消化し、そして同じ酵素によって消化された、ｐｃＤＮＡ３．１−ＧＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ内に連結して、ヒト受容体の細胞外ドメインの１６ａａ、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含有する、ｐｃＤＮＡ３．１−ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０を生成した。ｇｐ１３０−ΔＳＴＡＴをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し（ａａ１〜７５８）、そして前述の同じベクターに連結した。３ｘＧＦＰの発現カセットをｐｍＥＧＦＰ−１３（Ａｄｄｇｅｎｅ、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）より得て、そしてＩＬ−１１ＲシグナルペプチドおよびＮ末端Ｆｌａｇ−タグを含有するｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター内に挿入した。ｐｃＤＮＡ３．１−２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙを生成するため、ｐｃＤＮＡ３．１−３ｘＧＦＰからＧＦＰを１つ除去して、そしてｐｃＤＮＡ３．１−ｍＣｈｅｒｒｙ由来のｍＣｈｅｒｒｙと置換した。単一ＧＦＰを生成するため、ＧＦＰをコードするｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１−２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙからＰＣＲによって増幅して、そしてｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター内に挿入した。ｐｃＤＮＡ３．１−ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙを生成するため、ｍＣｈｅｒｒｙをコードするｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１−ＧＦＰ内に挿入した。Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞のレトロウイルス形質導入のため、異なる耐性遺伝子を含む２つのレトロウイルスプラスミド、ピューロマイシン耐性をコードするｐＭＯＷＳ−ピューロおよびハイグロマイシンＢ耐性をコードするｐＭＯＷＳ−ハイグロを用いている。ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−２Ａ−ＧＶＨＨ−ＩＬ−１２Ｒβ１（ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２Ａ））、ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ、ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＪＡＫ−Ａ（Δ４０３−４１７）、ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＪＡＫ−Ｂ（Δ４５５−４７９）、ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＪＡＫ−Ｃ（Δ４０３−４７９）、およびＧＶＨＨ−ｇｐ１３０をコードする発現カセットをｐＭＯＷＳ−ピューロ内に挿入する一方、ＧＶＨＨ−ＩＬ−１２Ｒβ１、ＧＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＳＴＡＴ（Δ５０３）およびＧＶＨＨ−ｇｐ１３０−ΔＳＴＡＴをコードするものを、ｐＭＯＷＳ−ハイグロ内に挿入した。生成したすべての発現プラスミドを、配列決定によって検証した。
【００６９】
細胞のトランスフェクション、形質導入および選択。示したプラスミドでのＵ４ＣおよびＣＨＯ−Ｋ１細胞のトランスフェクションを、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて行った。Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞を、多様な合成受容体変異体をコードするｐＭＯＷＳ発現プラスミドでレトロウイルス形質導入した（Ｆｌｏｓｓらを参照されたい）。形質導入細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ  ＨＩＬ−６を補充した上述のような標準的ＤＭＥＭ培地中で増殖させた。形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞の選択を、ピューロマイシン（１．５μｇ／ｍｌ）またはハイグロマイシンＢ（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、ドイツ・カールスルーエ）または両方で、少なくとも２週間行った。その後、ＨＩＬ−６を洗い流し、そして生成されたＢａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞株を、ＧＦＰ：ｍＣｈｅｒｒｙ依存性増殖に関して選択し、そして受容体細胞表面発現に関して分析した。ＧＦＰ：ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を分泌している安定トランスフェクションＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１．１２５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８硫酸（Ｇｅｎａｘｘｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ・ウルム）で選択した。高発現細胞クローンをウェスタンブロッティングによって同定した。
【００７０】
大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）からのＧＶＨＨ−ＣＶＨＨの発現および精製。二重特異性抗体ＧＶＨＨ−ＣＶＨＨをコードするｃＤＮＡを生成し、そしてｐｅｔ２３ａ内にサブクローニングした。生じた二重特異性抗体配列には、周辺質発現のためのＮ末端ＰｅｌＢリーダー配列および精製のための３’ヘキサヒスチジン配列が隣接した。大腸菌株ＢＬ２１−Ｒｏｓｅｔｔａにおいてタンパク質を発現した。アンピシリン１：１０００（１００μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール１：１０００（３４μｇ／ｍｌ）を含有する２リットルのＬＢ−培地中、光学密度が０．６〜０．９に到達するまで、３７℃で細菌をインキュベーションした。次いで、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加した。ＩＰＴＧ誘導４時間後、遠心分離（５０００ｘｇ、３０分間、４℃）によって細菌を採取した。ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ・マンハイム）を添加し、そして０．４５μｍボトルトップフィルターを通じて上清をろ過した。ＩＭＡＣクロマトグラフィを通じてタンパク質を精製し、そして５００ｍＭイミダゾールで溶出させた。
【００７１】
細胞生存度アッセイ。サイトカインを取り除くため、Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞株を無菌ＰＢＳで３回洗浄した。５ｘ１０３細胞を、１０％ＦＣＳ、６０ｍｇ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中に懸濁し、そして示すようにサイトカイン／蛍光タンパク質を含みまたは含まず、最終体積１００μｌ中で３日間培養した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ細胞生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ドイツ・カールスルーエ）を用いて、ウェルあたり２０μｌの試薬を添加した直後（０時点）、そして標準細胞培養条件下での最大２時間のインキュベーション後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  ＰＲＯプレート読み取り装置（Ｔｅｃａｎ、ドイツ・クライルスハイム）を用い、蛍光（励起５６０ｎｍ、発光５９０ｎｍ）を記録することによって、生存細胞数を概算した。すべての値を実験あたり３つ組で測定した。０時点の値を減じることによって、蛍光値を標準化した。
【００７２】
刺激アッセイ。ＳＴＡＴ３、ＥＲＫ１／２およびＡＫＴ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２ならびにＴＹＫ２活性化の分析のため、多様なＳｙＣｙＲ変異体を発現するＢａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞株を無菌ＰＢＳで３回洗浄し、そして血清不含ＤＭＥＭ中で少なくとも２時間インキュベーションした。細胞を、示すようにＧＦＰ：ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質で刺激し、採取し、液体窒素中で凍結し、そして溶解した。細胞溶解物のタンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）によって決定した。ＳＴＡＴ３、ＥＲＫ１／２、ＡＫＴ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２およびＴＹＫ２活性化の分析のため、ＳＯＣＳ３およびβ−アクチン発現を、総細胞溶解物由来の２５〜７５μｇタンパク質を用い、そしてホスホ−ＳＴＡＴ３、ホスホ−ＥＲＫ１／２、ホスホ−ＡＫＴ、ホスホ−ＪＡＫ１、ホスホ−ＪＡＫ２、ホスホ−ＴＹＫ２、ＳＯＣＳ３およびβ−アクチンｍＡｂを用いて検出するイムノブロッティングによって行った。
【００７３】
ウェスタンブロッティング。細胞溶解物由来の定義した量のタンパク質を、レーンごとに装填し、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＰＶＤＦ膜（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、ドイツ・カールスルーエ）にトランスファーした。膜を、ＴＢＳ−Ｔ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、ドイツ・カールスルーエ）ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、ドイツ・ダルムシュタット）、１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ・ミュンヘン））中の５％脱脂粉乳（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、ドイツ・カールスルーエ）中でブロッキングし、そしてＴＢＳ−Ｔ中の５％脱脂粉乳（ＳＴＡＴ３、β−アクチン、ＧＦＰ  ｍＡｂ）またはＴＢＳ−Ｔ中の５％ＢＳＡ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、ドイツ・カールスルーエ）（ホスホ−ＳＴＡＴ３、ホスホ−ＥＲＫ１／２、ＥＲＫ１／２、ホスホ−ＡＫＴ、ＡＫＴ、ｍｙｃおよびＦｌａｇ、ＳＯＣＳ３、ホスホ−ＪＡＫ１、ＪＡＫ１、ホスホ−ＪＡＫ２、ＪＡＫ２、ホスホ−ＴＹＫ２、ＴＹＫ２およびβ−アクチンｍＡｂ）中で、示す一次抗体で、４℃で一晩探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。洗浄後、膜を、ＴＢＳ−Ｔ中の５％脱脂粉乳中で希釈した二次ペルオキシダーゼ・コンジュゲート化抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）と室温で１時間インキュベーションした。ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＴＭウェスタン化学発光ＨＲＰ基質（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ダルムシュタット）およびＣｈｅｍｏＣａｍ  Ｉｍａｇｅｒ（ＩＮＴＡＳ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ゲッチンゲン）をシグナル検出に用いた。別の一次抗体で再探査するため、６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、ドイツ・カールスルーエ）ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、ドイツ・カールスルーエ）および０．１％  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ・ミュンヘン）中、６０℃で３０分間膜をストリッピングし、そして再びブロッキングした。
【００７４】
サイトカイン受容体の細胞表面検出。合成サイトカイン受容体の細胞表面発現を検出するため、安定形質導入Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で洗浄し、そして５ｘ１０５細胞／１：１００希釈の抗ｍｙｃまたは１．２μｇの抗Ｆｌａｇ  ｍＡｂを補充した１００μｌ  ＦＡＣＳ緩衝液で、氷上で１時間インキュベーションした。ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した後、１：１００希釈のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート化Ｆａｂヤギ抗ウサギＩｇＧを含有する１００μｌ  ＦＡＣＳ緩衝液中、細胞を氷上で１時間インキュベーションした。最後に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、５００μｌ  ＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁し、そしてフローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州サンノゼ）によって分析した。ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ４  Ｆｌｏｗソフトウェア（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国カリフォルニア州ロサンゼルス）を用いてデータを評価した。
【００７５】
マイクロアレイ分析。Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、６０ｍｇ／ｌペニシリンおよび１０ｍｇ／ｌストレプトマイシン（Ｇｅｎａｘｘｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ウルム）を補充したＤＭＥＭ高グルコース培地中、水飽和大気中で、５％ＣＯ２とともに、３７℃で増殖させた。ハイパーＩＬ−６を分泌する安定ＣＨＯ−Ｋ１クローン由来の順化細胞培地１０ｎｇ／ｍｌ（ＥＬＩＳＡによって決定した際、およそ５μｇ／ｍｌのストック溶液）を用いて、増殖培地に補充した。Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞を、異なる受容体複合体（ＩＬ−１２Ｒβ１−ＩＬ−２３Ｒ、ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−２Ａ−ＧＶＨＨ−ＩＬ−１２Ｒβ１（ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２Ａ））またはＧＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ（ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３Ｒ）））で安定形質導入し、独立に選択し、そして数週間培養した。続いて、Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞株を無菌ＰＢＳで４回洗浄し、そして血清不含ＤＭＥＭ中で３時間インキュベーションした。等しい数の細胞（２ｘ１０６）を１００ｎｇ／ｍＬのＨＩＬ−２３、ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙまたは３ｘＧＦＰで、独立に、３７℃で１時間刺激した。非トランスフェクションＣＨＯ−Ｋ１細胞由来の細胞培養上清での刺激を対照として用いた。４つの独立の生物学的複製物の総ＲＮＡ抽出を、製造者の指示にしたがって、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ・ヒルデン）で作製した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いてＲＮＡ品質を評価し、そして高品質ＲＮＡ（ＲＩＮ＞８）のみをマイクロアレイ分析に用いた。このため、Ａｍｂｉｏｎ  ＷＴ発現キットおよびＷＴ末端標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて総ＲＮＡ（１５０ｎｇ）をプロセシングして、そして約２８，０００プローブセットを含有するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅ  ＳＴ  １．０アレイ上でハイブリダイズさせた。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現プロトコルにしたがって、染色およびスキャニングを行った。発現コンソール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ドイツ・フライブルグ）を品質管理に用い、そしてアノテーションつき標準化ＲＭＡ遺伝子レベルデータ（スケッチ分位点（ｓｋｅｔｃｈ−ｑｕａｎｔｉｌｅ）標準化を含む標準設定）を得た。ＣＡＲＭＡウェブ中に実装された統計プログラミング環境Ｒ（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ）を利用することによって、統計分析を行った（１．５倍、ｐ値≦０．０１）。データを対で分析し、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙで刺激したＢａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２３Ａ）細胞対１００ｎｇ／ｍｌ  ＨＩＬ−２３で刺激したＢａ／Ｆ３−ＩＬ−１２Ｒβ１−ＩＬ−２３Ｒ細胞、および１００ｎｇ／ｍｌ  ３ｘＧＦＰで刺激したＢａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３Ｒ）対１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙで刺激したＢａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２Ａ）を分析した。
【００７６】
示差量（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｂｕｎｄａｎｔ）の転写物（１．５倍、ｐ値≦０．０１）のＧＯ  ｔｅｒｍおよびパスウェイ濃縮分析（濃縮のｐ＜０．０１）を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ・ヒルデン）で行った。遺伝子発現生データは、ＧＥＯで入手可能である（寄託番号ＧＳＥ１０１５６９）。
【００７７】
動物。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｎｖｉｅｒラボ）をデュッセルドルフ大学の動物施設より得た。マウスに標準的実験室食餌を与え、そしてオートクレーブした水道水を自由に与えた。マウスを、管理された温度（２０〜２４℃）、湿度（４５〜６５％）、および明暗周期（１２時間明期、１２時間暗期）の空調室に維持した。マウスを１週間慣れさせた後、実験に参入させた。すべての方法を、動物ケアに関する国の指針にしたがって行い、そしてこれらは動物実験のための地域研究委員会（ＬＡＮＵＶ、Ｓｔａｔｅ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｎａｔｕｒｅ，  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｕｍｅｒ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ、認可番号（Ａｚ．  ８４−０２．０４．２０１６．Ａ０２５））によって認可された。
【００７８】
水力学に基づくｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子送達。以前記載されるように、ＰＢＳ中で調製したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０（２．３μｇ／マウス）および／またはｐｃＤＮＡ３．１−３ｘＧＦＰ（１．２８μｇ／マウス）の尾静脈注射を通じて、８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスをトランスフェクションした。
【００７９】
肝臓溶解物の調製。肝臓由来の組織タンパク質抽出物を、溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、ドイツ・カールスルーエ）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、ドイツ・ダルムシュタット）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ・ミュンヘン）、２ｍＭ  ＮａＦ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ・ミュンヘン）、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ・ミュンヘン）、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０  ＢｉｏＣｈｅｍｉｃａ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、ドイツ・ダルムシュタット）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ・ミュンヘン）およびｃＯｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ・マンハイム）を用いて、氷上で調製し、そしてウェスタンブロッティングによって分析した。等量のタンパク質（５０μｇ／レーン）を装填した。
【００８０】
統計分析。データを平均±ＳＥＭとして提示する。多数比較のため、一方向ＡＮＯＶＡ、その後、ボンフェローニ事後検定を用いた（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンディエゴ）。統計的有意性をｐ＜０．０５のレベルにセットした。
【００８１】
結果
合成サイトカイン受容体（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）（ＳｙＣｙＲ）は、ＩＬ−２３およびＩＬ−６／ＩＬ−１１シグナル伝達をシミュレーションする。
【００８２】
天然生物学的スイッチは、受容体活性化および不活性化を通じて、サイトカイン誘導性シグナル伝達を制御する。ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙに対する高特異性ナノボディをツールとして選択して、高感度およびバックグラウンド不含サイトカイン様シグナル伝達を仲介した。天然には、ＩＬ−２３は、ＩＬ−２３ＲおよびＩＬ−１２Ｒβ１からなるその受容体複合体を通じてシグナル伝達する。ＩＬ−２３シグナル伝達を模倣するため、本発明者らは、２つの合成サイトカイン受容体（ＳｙＣｙＲ）を生成し、該受容体において、ＩＬ−２３ＲおよびＩＬ−１２Ｒβ１のリガンド結合部位を含む細胞外部分を、それぞれ、ｍＣｈｅｒｒｙ（ＣＶＨＨ）およびＧＦＰ（ＧＶＨＨ）を特異的に認識するナノボディによって置換した（図１ａ、図１ｃ）。ＳｙＣｙＲをＢａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞中で発現させ、該細胞は、ハイパー−ＩＬ−６（ＨＩＬ−６）と称されるＩＬ−６および可溶性ＩＬ−６Ｒの融合タンパク質によるＳＴＡＴ３活性化後に増殖する（図１ｂ）。ＳｙＣｙＲの合成リガンドとして、本発明者らは、ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質および多様な組み合わせを生成した（図１ａ、図１）。ＳＴＡＴ３活性化はＩＬ−２３シグナル伝達の特徴であるため、本発明者らは、ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３ＲおよびＧＶＨＨ−ＩＬ−１２Ｒβ１を発現しているＢａ／Ｆ３−ｇｐ１３０（１つのオープンリーディングフレーム中で組み合わせられた両方のｃＤＮＡを含む２Ａ技術を用いて生成されたＢａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２Ａ）、および２つの別個のｃＤＮＡで生成されたＢａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３））のＳＴＡＴ３依存性増殖が、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙタンパク質、ならびにこれらの融合体で誘導可能であるかどうかを試験した。興味深いことに、Ｂａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２Ａ）細胞の増殖は、ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙおよび２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質によって特異的に誘導されたが、単一のＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙタンパク質によっては誘導されなかった（図１ｂ）。ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３ＲまたはＧＶＨＨ−ＩＬ−１２Ｒβ１のみを発現するＢａ／Ｆ３細胞は増殖できず、合成サイトカインリガンドとしてのＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙの高い選択性が立証された。それぞれ、ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙおよびハイパー−ＩＬ−２３（ＨＩＬ−２３）でのＢａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２Ａ）およびＢａ／Ｆ３−ＩＬ−１２Ｒβ１−ＩＬ−２３Ｒ細胞の用量依存性増殖の比較分析によって、天然サイトカインおよび合成サイトカインが、匹敵する強度を示し、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＨＩＬ−２３（５６ｋＤａ）およびＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ（５７ｋＤａ）濃度で最大半量増殖が達成されるとことが明らかになった。Ｂａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２Ａ）細胞のＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ誘導性細胞増殖は、可溶性ＧＶＨＨ−ＣＶＨＨ融合タンパク質（図１ｅ）によって特異的に阻害された。細胞内シグナル伝達の分析によって、ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ、２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質が、Ｂａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２Ａ）細胞において、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ３、ＥＲＫ１／２およびＡＫＴリン酸化を誘導する��、単一ｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＦＰおよび３ｘＧＦＰタンパク質がこれらのリン酸化を誘導しないことが示された。ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２Ａ）はまた、Ｕ４Ｃ細胞においても、特異的ＳＴＡＴ３活性化を生じた。Ｂａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２Ａ）およびＢａ／Ｆ３−ＩＬ−１２Ｒβ１−ＩＬ−２３Ｒ細胞のＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙまたはＨＩＬ−２３のいずれかでの後のｐＳＴＡＴ３およびＳＯＣＳ３誘導の動力学は、匹敵した。ＩＬ−２３Ｒ複合体は、ＳＯＣＳ３によってターゲティングされないため、活性化は、ＳＴＡＴ３リン酸化維持を生じた。次に、本発明者らは、ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙで刺激されたＢａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２Ａ）細胞およびＨＩＬ−２３で刺激されたＢａ／Ｆ３−ＩＬ−１２Ｒβ１−ＩＬ−２３Ｒ細胞の遺伝子アレイ分析によるｍＲＮＡ発現を分析した。ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙおよびＨＩＬ−２３は、係数１．５またはそれより多くで、それぞれ１０７および１９３遺伝子を上方または下方制御した。これらの中には、ＰＩＭ１、ＳＯＣＳ３およびＯＳＭを含む典型的なＳＴＡＴ３ターゲット遺伝子がある。経路分析によって、ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙおよびＨＩＬ−２３によって制御される遺伝子は、同じ経路に属することが明らかになった。本発明者らのデータによって、天然サイトカインに比較した際、合成リガンドによって誘導されるトランスクリプトーム間に高い度合いの重複があることが明らかになった。
【００８３】
ＳｙＣｙＲがホモ二量体リガンドによって活性化可能であるかどうかを調べるため、本発明者らは、この系をＩＬ−６／ＩＬ−１１受容体複合体に適応させた。ｇｐ１３０のＳｙＣｙＲを生成し、この中で、サイトカイン受容体の細胞外部分をＧＶＨＨによって置換した（ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０）（図２ａ、図１ｃ）。Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞（Ｂａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−６））中のＧＶＨＨ−ｇｐ１３０の発現をフローサイトメトリーによって検証した。予期されるように、Ｂａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−６）細胞中のＪＡＫ、ＴＹＫ、ＳＴＡＴ３、ＥＲＫ１／２リン酸化は、２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙおよび３ｘＧＦＰによって特異的に誘導された。Ｂａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−６）およびＢａ／Ｆ３−ｇｐ１３０の、それぞれ、３ｘＧＦＰおよびＨＩＬ−６での用量依存性増殖の比較によって、天然および合成サイトカインが類似の活性を示し、それぞれ、１〜１０ｎｇ／ｍｌ  ３ｘＧＦＰ（８６ｋＤａ）またはＨＩＬ−６（６０ｋＤａ）で、最大半量増殖を持つことが示された。Ｂａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−６）細胞の３ｘＧＦＰ刺激は、ＳＴＡＴ３リン酸化の時間依存性の迅速な活性化および１２０分後のわずかな不活性化を生じ、これにはＳＯＣＳ３の上方制御が伴った。全体として、３ｘＧＦＰ誘導性シグナル伝達は、ＨＩＬ−６誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化およびＳＯＣＳ３発現と区別不能であった。次に、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝組織中でＳｙＣｙＲ（ＩＬ−６）を発現させた。ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０および３ｘＧＦＰを単独でまたは組み合わせてコードするＤＮＡを注射した２４時間後、本発明者らは、ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０を３ｘＧＦＰと同時発現した際に、ＳＴＡＴ３リン酸化を観察した（図２ｂ）。興味深いことに、ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０発現は、ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０および３ｘＧＦＰの両方を発現するマウスに比較した際、ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０をコードするｃＤＮＡのみを注射したマウスにおいてはるかにより高いことが見出された。該データは、ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０および３ｘＧＦＰの同時発現が、ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０の活性化依存性分解を生じることを示唆した。さらに、ウェスタンブロッティングによる血清試料中の３ｘＧＦＰの検出は、３ｘＧＦＰをコードするｃＤＮＡのみを注射したマウスにおいて、３ｘＧＦＰの強い集積を示す一方、ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０および３ｘＧＦＰをコードするｃＤＮＡを注射したマウスにおいては、３ｘＧＦＰはほとんど検出不能であった。これらの知見は、ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０の結合および活性化後、ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０だけでなく、３ｘＧＦＰタンパク質もまた、肝細胞において、効率的に内在化され、そして分解されることを示唆する。これと一致して、急性期反応遺伝子Ｓａａ１の発現は、ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０および３ｘＧＦＰをコードするｃＤＮＡｗの注射後に増加し、これはＧＶＨＨ−ｇｐ１３０または３ｘＧＦＰのみをコードするｃＤＮＡの注射とは非常に対照的であった。全体として、本発明者らのデータは、試験したＳｙＣｙＲが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−６およびＩＬ−２３シグナル伝達の表現型をコピーすることを示した。
【００８４】
合成ＩＬ−２３Ｒサイトカイン受容体ホモ二量体は生物学的に活性である。
【００８５】
多量体ＧＦＰは、ホモ二量体ＧＶＨＨ−ｇｐ１３０を通じてＩＬ−６シグナル伝達を誘導可能であったため、本発明者らは、ＩＬ−２３Ｒもまたホモ二量体として生物学的に活性であるかどうか疑問を持った。したがって、本発明者らは、ＩＬ−２３Ｒの膜貫通および細胞内ドメインに融合した、細胞外ＧＶＨＨからなるＳｙＣｙＲ（ＧＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ；（ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３Ｒ）））を生成した（図３ａおよび図１ｃ）。興味深いことに、３ｘＧＦＰおよび２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質は、Ｂａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３Ｒ）細胞の増殖を誘導する（図３ｂ）一方、単一ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙまたはヘテロ二量体ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質は誘導しなかった（図３ｂ）。最大半量増殖は、約１０〜２０ｎｇ／ｍｌ  ３ｘＧＦＰ（８６ｋＤａ）で達成され、これはＨＩＬ−２３（５６ｋＤａ；５〜１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激したＢａ／Ｆ３−ＩＬ−１２Ｒβ１−ＩＬ−２３Ｒ細胞に比較してわずかにより低いのみであった。したがって、わずかに減少した活性は、分子のモル濃度の相違を通じては説明できない。予期されるように、３ｘＧＦＰおよび２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質は、Ｂａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３Ｒ）細胞において、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ３、ｐＥＲＫ１／２およびＡＫＴリン酸化を誘導したが、単一ＧＦＰはこうしたリン酸化を誘導しなかった。また、ＨＩＬ−２３および３ｘＧＦＰのｐＳＴＡＴ３活性化およびＳＯＣＳ３発現の動力学もまた匹敵し、ＩＬ−２３Ｒホモ二量体もまた、ＳＯＣＳ３によって負に制御されないことが示唆された。驚くべきことに、３ｘＧＦＰでのＢａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３Ｒ）の刺激後、少なくとも１．５倍上方制御または下方制御されたのはわずか３５遺伝子であった。しかし、３５の転写物のうち３４はまた、ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ群（Ｂａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２Ａ））でも見出された。３５の制御される遺伝子の中には、ＰＩＭ、ＳＯＣＳ３、およびＯＳＭを含む典型的なＩＬ−２３ターゲット遺伝子がある。ＩＬ−１２Ｒβ１−ＩＬ−２３Ｒヘテロ二量体刺激に比較した際、ホモ二量体ＩＬ−２３Ｒシグナル伝達によって減少した数の遺伝子が誘発されるが、同様のシグナル伝達経路が影響を受けた。結論として、ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３Ｒ）のホモ型活性化もまた、シグナル伝達経路および動力学に関して、ＩＬ−２３シグナル伝達の表現型をコピーするが、ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２Ａ）に比較した際、全体に減少した遺伝子発現誘導を生じた。
【００８６】
操作されたヘテロ三量体ＳｙＣｙＲは、ＳＴＡＴ３トランスリン酸化が可能である。
【００８７】
トランスリン酸化中、キナーゼ活性受容体は、キナーゼ陰性突然変異体受容体をトランスリン酸化することが可能である。２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙは、ＳｙＣｙＲの機能性ヘテロおよびホモ二量体化を誘導可能であるため、本発明者らは、２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙが合成三量体受容体複合体を通じて、ＳＴＡＴ３のトランスリン酸化を誘導可能であるかどうか疑問を持った。したがって、標準的ＳＴＡＴ結合モチーフを欠くが、ＪＡＫ、ＥＲＫおよびＡＫＴ活性を保持する（ＩＬ−２３Ｒ−ΔＳＴＡＴ）Ｃ末端一部切除ＩＬ−２３Ｒ（Δ５０３）を選択し、そしてＧＶＨＨと融合させた（図４ａおよび４ｂ）。Ｊａｎｕｓキナーゼは、アミノ酸４０３〜４７９の間に位置するＩＬ−２３Ｒ内のペプチドモチーフと相互作用し、そして完全または部分的欠失は、ＪＡＫ活性不全を生じる。したがって、本発明者らは、ｍＣｈｅｒｒｙ−ナノボディに融合した、ＪＡＫ活性不全を伴うＩＬ−２３Ｒ細胞内ドメインの３つの欠失変異体、ΔＪＡＫ−Ａ（Δ４０３−４１７）、ΔＪＡＫ−Ｂ（Δ４５５−４７９）およびΔＪＡＫ−Ｃ（Δ４０３−４７９）を生成した（図４ａおよび図４ｂ）。Ｂａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞中のこれらのＳｙＣｙＲの細胞表面発現を、フローサイトメトリーによって検証した。予期されるように、２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙでのＢａ／Ｆ３−ｇｐ１３０細胞におけるＧＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＳＴＡＴの刺激は、ＪＡＫおよびＥＲＫリン酸化を生じたが、ＳＴＡＴ３活性化は不全であった（図４ｃ）。その結果、Ｂａ／Ｆ３−ＧＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＳＴＡＴ細胞の３ｘＧＦＰ誘導性増殖は、Ｂａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３Ｒ）細胞に比較した際、劇的に減少した（図４ｄ）。興味深いことに、２つのＧＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＳＴＡＴ受容体および１つのＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＪＡＫ受容体からなる２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ誘導性三量体複合体の集合のみが、増加したＳＴＡＴ３トランスリン酸化および細胞増殖を生じた（図４ｅ）。ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙによるＧＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＳＴＡＴとすべてのＣＶＨＨ−ΔＪＡＫ受容体の二量体化は、ＳＴＡＴ活性化を誘導せず、ＧＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＳＴＡＴにおける２つの生物学的活性ＪＡＫがＳＴＡＴ３トランスリン酸化に必要であることが立証された。注目すべきことに、２ｘｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質での刺激および二量体ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＪＡＫの形成は、ＳＴＡＴ３リン酸化を生じない一方、ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒのホモ二量体は生物学的に活性であり、ＣＶＨＨ−ＩＬ−２３Ｒ−ΔＪＡＫ変異体が二量体として生物学的に活性でないことが立証された。
【００８８】
考察
本明細書において、本発明者らは、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）サイトカイン受容体に融合したＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙに対して向けられるナノボディに基づく合成サイトカイン受容体系の発展を記載する。ナノボディは、分子生物学に広く用いられ、高いアフィニティおよび抗原特異性を示す、多用途ツールである。本発明者らは、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙに対するナノボディを選択し、これは、これらの蛍光タンパク質が哺乳動物細胞に対して非毒性であり、内因性受容体に対する非特異的結合を引き起こさず、そしてしたがって副作用／バックグラウンドを持たないとみなされるためである。受容体系として、本発明者らは、ＩＬ−２３およびＩＬ−６受容体シグナル伝達複合体によって例示される、ヘテロ二量体およびホモ二量体サイトカイン受容体組成物を用いた。ＩＬ−２３は、ＩＬ−１２Ｒβ１およびＩＬ−２３Ｒからなるヘテロ二量体受容体複合体を通じてシグナル伝達する一方、ＩＬ−６は非シグナル伝達性ＩＬ−６Ｒおよびｇｐ１３０のシグナル伝達性ホモ二量体を通じてシグナル伝達する。どちらの受容体複合体も、ＳＴＡＴ、ＥＲＫおよびＡＫＴ経路を活性化する受容体会合Ｊａｎｕｓキナーゼを通じてシグナルを誘導する。ＪＡＫは恒常性であるが、クラスＩおよびＩＩサイトカイン受容体と非共有的に会合し、これらはサイトカイン結合に際して、２つのＪＡＫを一緒にして活性シグナル伝達複合体を生成する。ＪＡＫは、サイトカイン受容体の細胞内ドメイン中に存在する受容体ペプチドモチーフと相互作用する。受容体活性化中、ＪＡＫは相互リン酸化によって「オン」状態にスイッチングされ、そして続いてＳＴＡＴ３などの受容体チロシンおよびシグナル伝達分子をリン酸化する。
【００８９】
ＩＬ−２３シグナル伝達を模倣する合成受容体複合体は、ヘテロ二量体合成ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙリガンドによって活性化されるが、単一ＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙあるいは多量体ＧＦＰ融合タンパク質によっては活性化されず、一方、ＩＬ−６シグナル伝達をシミュレーションする合成受容体複合体は、ホモ二量体合成ＧＦＰリガンドによって特異的に活性化された。重要なことに、ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙおよび３ｘＧＦＰ融合タンパク質は、合成サイトカイン受容体を欠く細胞において、細胞反応を活性化しなかった。
【００９０】
最近の報告によって、細胞内ドメインのみがシグナル伝達強度を決定するわけではなく、細胞外受容体複合体集合の様式もこうした強度を決定することが示された。特に、ＥＰＯにおける点突然変異は、ＥＰＯ受容体二量体化を変化させることが示され、この結果、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３リン酸化が減少するが、ＳＴＡＴ５活性化は影響を受けなかった。これは、別の結合ドメイン、例えばナノボディによってサイトカイン受容体の細胞外部分を置換すると、シグナル伝達強度および動力学に影響を及ぼす可能性があり、これが最終的に、キメラ受容体の細胞内反応の改変を導くことを暗示する。本発明者らの合成サイトカイン受容体に対するこうした影響を排除するため、典型的なシグナル伝達経路（ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＥＲＫ、ＡＫＴ）の一般的な分析とは別に、本発明者らは、ＩＬ−２３およびＩＬ−６の時間依存性活性化プロファイルが、合成リガンドのものと同一であることを検証した。これらの知見は、それぞれ、ＨＩＬ−２３およびＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙによって活性化されるＢａ／Ｆ３−ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−１２Ｒβ１およびＢａ／Ｆ３−ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３／２Ａ）細胞のトランスクリプトーム比較によって裏付けられ、ここで、両サイトカインに制御されるほぼすべての遺伝子は同一であった。ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ刺激に比較した際、ＨＩＬ−２３刺激後にはより制御された遺伝子が検出されるものの、この相違は、異なる受容体複合体を形質導入されており、そして独立に選択され、そして数週間培養されている細胞株を用いた際に、予期される変動内であった。重要なことに、天然および合成ＩＬ−２３受容体複合体の経路分析によって、天然におよび合成で誘導されたシグナル伝達は、基本的に同一であることが強調された。これは、シグナル伝達経路および発現プロファイルの詳細な分析を含む、キメラ複合体を用いた最初の研究である。重要なことに、合成受容体はｉｎ  ｖｉｖｏで活性であるようであり、これは本発明者らが、水力学的注射後、マウス肝臓において、３ｘＧＦＰによるＧＶＨＨ−ｇｐ１３０の活性化を立証したためである。
【００９１】
これまで、Ｊａｎｕｓキナーゼの活性化とは別の、受容体複合体におけるＩＬ−１２Ｒβ１のシグナル伝達上の役割は割り当てられてきていない。これと一致して、本発明者らの合成受容体を用いて、本発明者らはＩＬ−２３Ｒホモ二量体受容体複合体を誘導した。シグナル伝達経路の一般的な活性化は、ＩＬ−２３シグナル伝達と類似であるようであるが、遺伝子アレイ分析によって、ヘテロ二量体シグナル伝達に比較した際、制御される遺伝子の数は減少することが明らかになった。この現象は、天然ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−１２Ｒβ１複合体に比較した際、ＳｙＣｙＲ（ＩＬ−２３Ｒ）シグナル伝達後に観察される、増殖のわずかな減少によって引き起こされる可能性もある。さらに、合成リガンドのアフィニティの減少または生化学的特徴は、ＳｙＣｙＲシグナル伝達に影響を及ぼす可能性もある。この影響はまた、天然および合成ＩＬ−２３受容体活性化が、制御される遺伝子の絶対数に関して異なるという観察にも寄与する可能性もある。
【００９２】
合成リガンドはモジュールの性質を持ち、ＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙあたり１つの受容体結合部位で、受容体化学量論の正確な組成が可能になり、これは明らかに、すべてではなくとも多くの他のサイトカイン受容体に関して興味深いことである。さらに、この系は、所望のシグナル伝達可能性および能力を持つ新規受容体組み合わせの組み合わせ集合を可能にするであろう。リクルートされる合成受容体の数は、１つのＧＦＰ：ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質中に連結されるリガンドの最大数によって、または別のＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ多量体化戦略によってのみ限定される。
【００９３】
ＩＬ−６およびＩＬ−２３シグナル伝達のため、本発明者らは、ホモおよびヘテロ二量体ＧＦＰ：ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質を用いたが、本発明者らはまた、ホモおよびヘテロ三量体ＧＦＰ：ｍＣｈｅｒｒｙ変異体を生成することも可能であった。これらの合成リガンドを用いて、本発明者らは、生物学的に活性である三量体受容体複合体がまた、会合するキナーゼを伴うサイトカイン受容体ファミリーの中で、機能的に集合可能であるかどうかを分析した。チロシン受容体および会合するキナーゼを伴う受容体は、典型的には、並置される二量体として活性であり、そして続いて、少なくとも２つの受容体キナーゼを活性化する。これは、これらの受容体系が天然には第三の受容体を必要としないことを暗示する。ＩＬ−６およびＩＬ−２３シミュレーションのための三量体受容体複合体を生成するため、本発明者らは、合成ＧＶＨＨ−ＩＬ−２３およびＧＶＨＨ−ｇｐ１３０受容体においてＳＴＡＴ３結合モチーフを欠失させ、そしてＣＶＨＨに融合したＳＴＡＴ結合モチーフを含有するＪＡＫ不全受容体とこれらの受容体を組み合わせた。本発明者らは、これらの三量体受容体の組み合わせにおいて、ＳＴＡＴ３活性化が、トランスリン酸化によって仲介されることを示した。２つのＪＡＫ有効性だがＳＴＡＴ不全である受容体および１つのＳＴＡＴ結合モチーフの受容体のＧＦＰ−ＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ（２ｘＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ）での三量体受容体複合体形成は、ＳＴＡＴ３トランスリン酸化を生じた。しかし、１つのＪＡＫ有効性受容体と１つのＳＴＡＴ結合モチーフ受容体のＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合による集合は、トランスリン酸化を導かず、１つのＪａｎｕｓキナーゼでは受容体活性化には不十分であることが確認された。注目すべきことに、トランスリン酸化は、これまでのところ、ＰＤＧＦおよびＥＧＦファミリーのチロシンキナーゼ受容体に関してしか記載されておらず、この場合、キナーゼ活性受容体は、受容体二量体化後、第二のキナーゼ不活性突然変異体受容体をトランスリン酸化することが可能であった。これらの場合、キナーゼ陰性突然変異体受容体は、他の受容体の機能性キナーゼを活性化することが可能であった。ここで、本発明者らは、会合するＪａｎｕｓキナーゼを伴うサイトカイン受容体の最初の受容体鎖トランスリン酸化に関して記載する。
【００９４】
要約すると、合成サイトカイン受容体系は、定義される数および組成の受容体鎖のリクルートによって、サイトカインシグナル伝達のテーラーメードの活性化および分析を可能にする。受容体集合は、リガンド融合タンパク質におけるＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ単位の数および配列によって決定される。この系は、以前、キメラ受容体系で記載されてきている適切なバックグラウンド活性化を伴わずに、シグナル伝達をシミュレーションする。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの蛍光タンパク質の毒性がないことによって、トランスジェニックマウスにおける合成リガンド適用による細胞タイプ特異的受容体活性化を研究するための、広範囲での潜在的な適用が可能になる。重要なことに、本発明者らの系は、容易にオン／オフスイッチ操作可能であり、これはシグナル活性化が、合成ＧＦＰ：ｍＣｈｅｒｒｙリガンドに対して向けられる可溶性ナノボディ融合タンパク質の適用によって迅速に阻害されることが可能であるためであり、そしてこのことは、免疫療法中の非生理学的ターゲットを伴う新規療法措置への道を開くであろう。
【００９５】
態様
１．  少なくとも以下のドメイン：
人工的リガンドおよび人工的リガンドに結合する受容体より選択される、第一の結合パートナーを含有する第一のドメイン；
随意に、スペーサードメイン、
膜貫通ドメイン、および
細胞質シグナル伝達ドメイン、ここで、該第一のドメインおよび該細胞質シグナル伝達ドメインが、生物において、天然には存在しないドメインの組み合わせである、
をＮ末端から始まりＣ末端まで含有する、組換えポリペプチド。
【００９６】
２．  第一の結合パートナーが、一本鎖抗体単位、受容体分子、内因性ペプチドまたはその断片、および人工的ペプチドからなる群より選択される、態様１記載の組換えポリペプチド。
【００９７】
３．  第一の結合パートナー、例えば一本鎖抗体単位を含有する第一のドメインのＮ末端に位置するリーダー配列をさらに含む、態様１または態様２記載の組換えポリペプチド。
【００９８】
４．  細胞質シグナル伝達ドメインが、サイトカイン受容体に由来し、特に、一般的に刺激性受容体、例えばｇｐ１３０、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−１２Ｒβ１、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＦＮαＲ、ＩＦＮγＲ、ＴＮＦ１Ｒ、ＴＮＦ２Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＬ−２２Ｒ、サイレンシング（消耗性）受容体、例えばＰＤ−１、ＩＬ−１０Ｒ、ＴＩＭ３、ＩＬ−２７Ｒまたは殺傷性受容体、例えばＦａｓＲ、ＴＲＡＩＬＲからなる群より選択される細胞質シグナル伝達ドメインに由来するか、あるいはＢ細胞受容体またはＴ細胞受容体、特に、ＣＤ２８、ＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖からなる群より選択される細胞質シグナル伝達ドメインに由来する、先行する態様いずれか１つに記載の組換えポリペプチド。
【００９９】
５．  膜貫通ドメインが、細胞質シグナル伝達ドメインが由来するサイトカイン受容体に由来する膜貫通ドメインである、先行する態様のいずれか１つに記載の組換えポリペプチド。
【０１００】
６．  第一の結合パートナーを含有する第一のドメインが、ナノボディを含有する第一のドメインである、先行する態様のいずれか１つに記載の組換えポリペプチド。
【０１０１】
７．  態様１〜６のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【０１０２】
８．  態様７記載の核酸配列を含むベクター、特にウイルスベクターまたはプラスミド。
【０１０３】
９．  態様８記載のベクターまたは態様７記載の核酸分子を含有する、細胞、細胞株または宿主細胞。
【０１０４】
１０．  修飾末梢血細胞である、特にＴ細胞、例えばＣＤ８＋またはＣＤ４＋  Ｔ細胞のようなＴ細胞を含むリンパ球である、例えばキメラ抗原受容体をさらに発現する遺伝子操作Ｔ細胞である、態様９記載の細胞、細胞株または宿主細胞。
【０１０５】
１１．  態様８記載の第二のベクターまたは態様７記載の第二の核酸分子をさらに含有する態様９または１０のいずれか１つに記載の細胞、細胞株または宿主細胞であって、このベクターまたは核酸分子が、第一の結合ドメインまたは細胞質シグナル伝達ドメインの少なくとも１つあるいは両方と異なる、態様１〜６のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードする、前記細胞、細胞株または宿主細胞。
【０１０６】
１２．  第二のベクターの細胞質シグナル伝達ドメインが、異なるシグナル伝達経路を通じてシグナル伝達を誘導する、態様１１記載の細胞、細胞株または宿主細胞。
【０１０７】
１３．  被験体の癌または自己免疫疾患の治療または免疫調節に使用するための、態様１〜６のいずれか１つに記載の組換えポリペプチド、態様７記載の核酸分子、態様８記載のベクター、あるいは態様９〜１２のいずれか１つに記載の細胞、細胞株または宿主細胞。
【０１０８】
１４．  特に態様１３記載の使用のための、前記ポリペプチド、ベクター、核酸分子、あるいは宿主細胞、細胞または細胞株に存在する第一の結合パートナーに特異的な第二の結合パートナーを適用した際に、細胞の状態を変化させるために使用するための、態様１〜６のいずれか１つに記載の組換えポリペプチド、態様７記載の核酸分子、態様８記載のベクター、あるいは態様９〜１２のいずれか１つに記載の細胞、細胞株または宿主細胞。
【０１０９】
１５．  免疫調節のため、細胞、特にリンパ球、例えばＴ細胞の産生において使用するための、態様８記載のベクター、態様９〜１２のいずれか１つに記載の細胞、細胞株または宿主細胞、態様７記載の核酸分子および／または態様１〜６のいずれか１つに記載のペプチドを含有する、キットまたは系。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【国際調査報告】
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