(57)【要約】本開示は、オーリスタチンＥ誘導体のアルブミン結合プロドラッグおよびその使用を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、静脈内投与に好適である。いくつかの実施形態では、組成物は、患者に静脈内投与されるとき、血液循環において内因性アルブミンにインサイチュで選択的かつ急速に共有結合する。他の実施形態では、組成物は、患者に静脈内投与されるとき、血液循環において内因性アルブミンのシステイン−３４のチオール基にインサイチュで選択的かつ急速に共有結合する。
2021505541.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩもしくはＩＩの構造を有する化合物、
【化４５】
2021505541.tif 000047
またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、もしくは異性体であって、
式中、
Ｒ’は、Ｈまたは−ＣＨ３であり、
Ｍは、Ｈまたは薬学的に許容される対イオンであり、
Ｙは、不在であるか、または任意に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−から選択され、
Ｒ１は、不在であるか、または任意に置換されたＣ１−Ｃ１８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ１８アルキルにおける任意に最大６個の炭素原子は、各々独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で置換され、
Ｘは、Ｈであるか、またはハロゲン（例えば、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、もしくは−Ｉ）、−ＮＯ２、−ＮＲ２Ｒ３、−ＯＲ２、−ＮＨＣＯＲ２、および−ＯＣＯＲ２から選択され、式中、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルから選択され、
ＴＢＧは、任意に置換されたマレイミド基、任意に置換されたハロアセトアミド基、任意に置換されたハロアセテート基、任意に置換されたピリジルチオ基、任意に置換されたイソチオシアネート基、任意に置換されたビニルカルボニル基、任意に置換されたアジリジン基、任意に置換されたジスルフィド基、および任意に置換されたアセチレン基から選択される、チオール結合基である、化合物。
【請求項２】
Ｒ’が、−ＣＨ３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＴＢＧが、任意に置換されたマレイミド基から選択される、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
ＴＢＧが、下記式のマレイミド基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【化４６】
2021505541.tif 000048
【請求項５】
Ｙが、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｍが、Ｈ＋またはＮａ＋である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１が、任意に置換されたＣ１−Ｃ５アルキルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１が、Ｃ１−Ｃ５アルキルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
式ＩＩＩの構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【化４７】
2021505541.tif 000049
【請求項１０】
式ＩＶの構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【化４８】
2021505541.tif 000050
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
前記薬学的に許容される担体が、可溶化剤、カプセル化剤、および溶解保護剤のうちの１つ以上から選択される、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記薬学的に許容される担体が、ジメチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、およびトリメチル−β−シクロデキストリンのうちの１つ以上を含む、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記薬学的組成物が、静脈内投与に好適である、請求項１１〜１３のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、患者に静脈内投与されるとき、血液循環において内因性アルブミンにインサイチュで選択的かつ急速に共有結合する、請求項１４３に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、患者に静脈内投与されるとき、血液循環において内因性アルブミンのシステイン−３４のチオール基にインサイチュで選択的かつ急速に共有結合する、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
癌、ウイルス疾患、自己免疫疾患、急性または慢性炎症疾患、ならびに細菌、真菌、および他の微生物によって引き起こされる疾患から選択される疾患に罹患している患者を治療するための方法であって、それを必要とする前記患者に、治療有効量の、請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物または請求項１１〜１６のいずれかに記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
前記疾患が、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、および黒色腫から選択される癌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与が、静脈内投与である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
化合物の細胞毒性を低減する方法であって、請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物または請求項１１〜１６のいずれかに記載の薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与することを含み、前記投与が、等用量の未修飾活性剤と比較されるとき、細胞毒性の低減をもたらす、方法。
【請求項２１】
腫瘍における化合物の代謝産物の濃度を増加させる方法であって、請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物または請求項１１〜１６のいずれかに記載の薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与することを含み、前記増加が、等用量の未修飾活性剤と比較される、方法。
【請求項２２】
医薬品としての使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
癌、ウイルス疾患、自己免疫疾患、急性または慢性炎症疾患、および細菌、真菌、または他の微生物によって引き起こされる疾患からなる群から選択される疾患または状態の治療における使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
癌、ウイルス疾患、自己免疫疾患、急性または慢性炎症疾患、および細菌、真菌、または他の微生物によって引き起こされる疾患から選択される疾患または状態の治療のための医薬品の調製における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物または請求項１１〜１６に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／５９２，７２１号の優先権を主張し、その開示は、その全体が本明細書に参照によって組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
低分子量抗癌薬はしばしば、それらの臨床有効性を限定する狭い治療濃度域を有する。これらの低分子量化合物は、拡散によって体組織に浸透する高い傾向を示し、均一な生体内分布をもたらす。したがって、少量のみの薬物が作用部位に到達し、健康な体組織にわたる分布によって、当該薬物は、問題のある副作用を生じさせる。
【０００３】
これらの不利点は、高度に細胞毒性であり、非常に狭い治療濃度域を有する薬物にとって特に重要である。オーリスタチンは、チューブリン結合ペプチド系薬物であり、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、オーリスタチンＰＥ、オーリスタチンＥ、またはオーリスタチンＦなどの代表例は、高度細胞毒性効果を示す。臨床フェーズ１および２試験において、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、およびオーリスタチンＰＥは、許容されない全身毒性および抗腫瘍活性不足をもたらし、よって中止された（Ｅ．Ａ．Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ，２３：２５７−２６１（２００５）；Ｍ．ｖｏｎ  Ｍｅｈｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓａｒｃｏｍａ，８：１０７−１１１（２００４）；Ｒ．Ｓ．Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２６：３３６−３３７（２００３））。
【０００４】
腫瘍学における薬物送達は、高度細胞毒性薬剤の狭い治療指数を増加させる潜在性を有するアプローチである。ほとんどの薬物送達システムにおいて、細胞毒性薬物は、結合した薬物が細胞標的部位で放出されることを可能にする所定の限界点を組み込むスペーサーを通して担体に結合している（Ｆ．Ｋｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ，３：２０−５３（２００８））。
【０００５】
アルブミンまたはその薬物コンジュゲートは、最大１９日の全身循環における著しく長い半減期を示す。特に魅力的なアプローチは、投与後に高分子担体として機能する循環血清アルブミンに共有結合する高度細胞毒性薬剤のプロドラッグを開発することである。１．）インタクトなリンパ液排出システムと組み合わされた悪性、感染または炎症組織の血管壁を通した高分子の上昇した浸透性、ならびに２．）腫瘍内皮上および腫瘍間質内のアルブミン結合タンパク質の発現のために、アルブミン薬物コンジュゲートは、治療有効物質を、高度細胞毒性薬剤が放出される標的部位（すなわち、腫瘍）に輸送する（ＵＳ７，３８７，７７１；Ｆ．Ｋｒａｔｚ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，１３２：１７１−１８３（２００８）；Ｆ．Ｋｒａｔｚ，Ｕ．Ｂｅｙｅｒ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，５：２８１−２９９（１９９８））。
【０００６】
しかしながら、高度細胞毒性薬剤での薬物送達システムを設計するとき、細胞毒性薬物の制御放出を可能にしながら薬物担体の標的化特性を保存することと、血液循環または全身におけるその早期放出を回避することとの間で重要なバランスがとられるべきである。酸感受性薬物送達システムは、血流において十分な安定性を有するべきだが、ｐＨ依存的に腫瘍部位での薬物の効果的な放出を可能にする（Ｆ．Ｋｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ，３：２０−５３（２００８））。
【０００７】
水不溶性および非常に狭い治療濃度域のために投与することができない、低分子量ペプチド系オーリスタチンのクラスなどの、ピコモル範囲の腫瘍細胞に対するＩＣ５０値を有する高度細胞毒性薬物について、そのような高度に強力な薬物のより有効な制御された送達および放出を達成するために効率的な薬物送達および放出システムの必要性がある。したがって、本開示は、悪性疾患の治療において使用することができるオーリスタチンＥ誘導体のアルブミン結合プロドラッグのより効率的なおよび／またはより忍容性の薬学的組成物を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，３８７，７７１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｅ．Ａ．Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ，２３：２５７−２６１（２００５）
【非特許文献２】Ｍ．ｖｏｎ  Ｍｅｈｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓａｒｃｏｍａ，８：１０７−１１１（２００４）
【非特許文献３】Ｒ．Ｓ．Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２６：３３６−３３７（２００３）
【非特許文献４】Ｆ．Ｋｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ，３：２０−５３（２００８）
【非特許文献５】Ｆ．Ｋｒａｔｚ，Ｕ．Ｂｅｙｅｒ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，５：２８１−２９９（１９９８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、式ＩもしくはＩＩの構造を有する化合物、
【化１】
2021505541.tif 000003
【化２】
2021505541.tif 000004
またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、もしくは異性体を提供し、
式中、
Ｒ’は、Ｈまたは−ＣＨ３であり、
Ｍは、Ｈまたは薬学的に許容される対イオンであり、
Ｙは、不在であるか、または任意に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−から選択され、
Ｒ１は、不在であるか、または任意に置換されたＣ１−Ｃ１８アルキルであり、当該Ｃ１−Ｃ１８アルキルにおける任意に最大６個の炭素原子は、各々独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で置換され、
Ｘは、Ｈであるか、またはハロゲン（例えば、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、もしくは−Ｉ）、−ＮＯ２、−ＮＲ２Ｒ３、−ＯＲ２、−ＮＨＣＯＲ２、および−ＯＣＯＲ２から選択され、式中、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルから選択され、
ＴＢＧは、任意に置換されたマレイミド基、任意に置換されたハロアセトアミド基、任意に置換されたハロアセテート基、任意に置換されたピリジルチオ基、任意に置換されたイソチオシアネート基、任意に置換されたビニルカルボニル基、任意に置換されたアジリジン基、任意に置換されたジスルフィド基、および任意に置換されたアセチレン基から選択されるチオール結合基である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、−ＣＨ３である。他の実施形態では、Ｒ’は、Ｈである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＴＢＧは、任意に置換されたマレイミド基から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＴＢＧは、下記式のマレイミド基である。
【化３】
2021505541.tif 000005
【００１４】
いくつかの実施形態では、Ｙは、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、Ｍは、Ｈ＋またはＮａ＋である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ５アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ５アルキルである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本開示は、式ＩＩＩの構造を有する化合物を提供する。
【化４】
2021505541.tif 000006
【００１８】
他の実施形態では、本開示は、式ＩＶの構造を有する化合物を提供する。
【化５】
2021505541.tif 000007
【００１９】
本開示はまた、本明細書に開示される化合物と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、可溶化剤、カプセル化剤、および溶解保護剤のうちの１つ以上から選択される。他の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ジメチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、およびトリメチル−β−シクロデキストリンのうちの１つ以上を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、静脈内投与に好適である。いくつかの実施形態では、組成物は、患者に静脈内投与されるとき、血液循環において内因性アルブミンにインサイチュで選択的かつ急速に共有結合する。他の実施形態では、組成物は、患者に静脈内投与されるとき、血液循環において内因性アルブミンのシステイン−３４のチオール基にインサイチュで選択的かつ急速に共有結合する。
【００２１】
本開示はまた、癌、ウイルス疾患、自己免疫疾患、急性または慢性炎症疾患、ならびに細菌、真菌、および他の微生物によって引き起こされる疾患から選択される疾患に罹患している患者を治療するための方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の本明細書に記載される化合物または薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患は、癌であり、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、および黒色腫から選択される。いくつかの実施形態では、投与は、静脈内投与である。
【００２２】
本開示はまた、化合物の細胞毒性を低減する方法であって、本明細書に開示される化合物または薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与することを含み、投与が、等用量の未修飾活性剤と比較されるとき、細胞毒性の低減をもたらす、方法を提供する。
【００２３】
本開示は、腫瘍における化合物の代謝産物の濃度を増加させる方法であって、本明細書に開示される化合物または薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与することを含み、増加が等用量の未修飾活性剤と比較される、方法をさらに提供する。
【００２４】
本開示は、医薬品としての使用のための、本明細書に開示される化合物を提供する。
【００２５】
本開示はまた、癌、ウイルス疾患、自己免疫疾患、急性または慢性炎症疾患、および細菌、真菌、または他の微生物によって引き起こされる疾患からなる群から選択される疾患または状態の治療における使用のための、本明細書に開示される化合物を提供する。
【００２６】
本開示は、癌、ウイルス疾患、自己免疫疾患、急性または慢性炎症疾患、および細菌、真菌、または他の微生物によって引き起こされる疾患からなる群から選択される疾患または状態の治療のための医薬品の調製における、本明細書に開示される化合物または組成物の使用をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】再構成緩衝剤（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ７．６５、５％スクロース（重量／体積）、および２％２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（２−ＨＰβＣＤ、（重量／体積））におけるＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７（パネル（ａ））およびＡＥ−ケト−ＥＭＣＨ（パネル（ｂ））の安定性を比較する。
【図１Ｂ】再構成緩衝剤（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ７．６５、５％スクロース（重量／体積）、および２％２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（２−ＨＰβＣＤ、（重量／体積））におけるＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７（パネル（ａ））およびＡＥ−ケト−ＥＭＣＨ（パネル（ｂ））の安定性を比較する。
【図２Ａ】再構成緩衝剤（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ７．６５、５％スクロース（重量／体積）、および４％２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（２−ＨＰβＣＤ、（重量／体積））におけるＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７（パネル（ａ））およびＡＥ−エステル−ＥＭＣＨ（パネル（ｂ））の安定性を比較する。
【図２Ｂ】再構成緩衝剤（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ７．６５、５％スクロース（重量／体積）、および４％２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（２−ＨＰβＣＤ、（重量／体積））におけるＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７（パネル（ａ））およびＡＥ−エステル−ＥＭＣＨ（パネル（ｂ））の安定性を比較する。
【図３】ヒト血漿におけるアルブミンへのＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７のコンジュゲーションを示す。
【図４】ヒト血漿におけるアルブミンへのＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７のコンジュゲーションを示す。
【図５】ヒト血漿におけるアルブミンへのＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の結合キネティクスを示す。
【図６】マウス血漿におけるアルブミンへのＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の結合キネティクスを示す。
【図７】ラット血漿におけるアルブミンへのＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の結合キネティクスを示す。
【図８】ヒト血漿におけるアルブミンへのＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の結合キネティクスを示す。
【図９】薬物について定量限界（ＬＯＱ）が達成されるまでのマウス血漿におけるアルブミンへのＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の結合キネティクスを示す。
【図１０】薬物についてＬＯＱが達成されるまでのラット血漿におけるアルブミンへのＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の結合キネティクスを示す。
【図１１Ａ】ヒトアルブミン結合ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７からのＡＥ−ケト（ｐＨ７．４（パネル（ａ）およびｐＨ４．１（パネル（ｂ））のｐＨ依存性放出を示す。
【図１１Ｂ】ヒトアルブミン結合ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７からのＡＥ−ケト（ｐＨ７．４（パネル（ａ）およびｐＨ４．１（パネル（ｂ））のｐＨ依存性放出を示す。
【図１２Ａ】ヒトアルブミン結合ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７からのＡＥ−エステル（ｐＨ７．４（パネル（ａ）およびｐＨ４．１（パネル（ｂ））のｐＨ依存性放出を示す。
【図１２Ｂ】ヒトアルブミン結合ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７からのＡＥ−エステル（ｐＨ７．４（パネル（ａ）およびｐＨ４．１（パネル（ｂ））のｐＨ依存性放出を示す。
【図１３】悪性黒色腫癌モデルＡ３７５、開始時腫瘍体積平均中央値約１３４ｍｍ３における対照群との比較において、オーリスタチンＥおよびＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の抗腫瘍効果を示す。
【図１４】悪性黒色腫癌モデルＡ３７５、開始時腫瘍体積平均中央値約３３２ｍｍ３における対照群との比較において、オーリスタチンＥおよびＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の抗腫瘍効果を示す。
【図１５】ＮＳＣＬＣ異種移植モデルＬＸＦＡ７３７、開始時腫瘍体積平均中央値約１３２ｍｍ３における対照群との比較において、オーリスタチンＥおよびＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の抗腫瘍効果を示す。
【図１６】ＮＳＣＬＣ異種移植モデルＬＸＦＡ７３７、開始時腫瘍体積平均中央値約３３０ｍｍ３における対照群との比較において、オーリスタチンＥおよびＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の抗腫瘍効果を示す。
【図１７】ヒト卵巣癌モデルＡ２７８０、開始時腫瘍体積平均中央値約１４８ｍｍ３における対照群との比較において、オーリスタチンＥおよびＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の抗腫瘍効果を示す。
【図１８】ヒト卵巣癌モデルＡ２７８０、開始時腫瘍体積平均中央値約３５１ｍｍ３における対照群との比較において、オーリスタチンＥおよびＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の抗腫瘍効果を示す。
【図１９】腎細胞癌モデルＲＸＦ６３１、開始時腫瘍体積約１４０ｍｍ３における対照群との比較において、オーリスタチンＥおよびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の抗腫瘍効果を示す。
【図２０】悪性黒色腫癌モデルＡ３７５、開始時腫瘍体積平均中央値約３３２ｍｍ３における対照群との比較において、オーリスタチンＥおよびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の抗腫瘍効果を示す。
【図２１】ＮＳＣＬＣ異種移植モデルＬＸＦＡ７３７、開始時腫瘍体積平均中央値約１３２ｍｍ３における対照群との比較において、オーリスタチンＥおよびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の抗腫瘍効果を示す。
【図２２】ヒト卵巣癌モデルＡ２７８０、開始時腫瘍体積約３５１ｍｍ３における対照群との比較において、オーリスタチンＥおよびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の抗腫瘍効果を示す。
【図２３】ヒト卵巣癌モデルＡ２７８０、開始時腫瘍体積約１４８ｍｍ３における対照群との比較において、ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の抗腫瘍効果を示す。
【図２４】ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７およびＡＥ−ケト−ＥＭＣＨの安定性の比較として凍結乾燥されたオーリスタチン製剤の加速された分解を示す。
【図２５】ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７およびＡＥ−エステル−ＥＭＣＨの安定性の比較として凍結乾燥されたオーリスタチン製剤の加速された分解を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書において別段に定義されない限り、本出願で使用される科学および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。一般に、本明細書に記載される、化学、分子生物学、細胞および癌生物学、免疫学、微生物学、薬理学、ならびにタンパク質化学の技法に関する用語体系は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。
【００２９】
本出願において参照される全ての刊行物、特許、および公開特許出願は、本明細書に参照によって特に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書は、その特定の定義を含み、優先されるであろう。別段に特定されない限り、本明細書に開示される各実施形態は、単独でまたは本明細書に開示される任意の１つ以上の他の実施形態と組み合わせて使用され得ることが理解されるものである。
【００３０】
定義
本明細書を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数（もしくは成分）または整数（もしくは成分）の群の包含を示すが、任意の他の整数（もしくは成分）または整数（もしくは成分）の群の除外を示さないことが理解されるであろう。
【００３１】
本出願を通して、化合物または組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として記載される場合、そのような化合物または組成物はまた、列挙された成分から本質的になるか、またはこれらからなり得ることが企図される。同様に、方法またはプロセスが、特定のプロセスステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として記載される場合、前記プロセスは、列挙されたプロセスステップから本質的になるか、またはこれらからなり得る。さらに、ステップの順序または特定のアクションを行うための順序は、本明細書に記載される化合物、組成物、および方法が実施可能なままである限り、重要でないことが理解されるべきである。また、２つ以上のステップまたはアクションを同時に行うことができる。
【００３２】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈で別段に明示しない限り、複数形も含む。
【００３３】
「含む」という用語は、「含むがこれらに限定されない」を意味するために使用される。「含む」および「含むがこれらに限定されない」は、交換可能に使用される。
【００３４】
本明細書で使用される「または」という用語は、文脈で別段に明示しない限り、「および／または」を意味すると理解されるべきである。
【００３５】
「薬物」、「薬剤」、「治療剤」、「治療活性剤」、「細胞毒性薬剤もしくは薬物」、「高度細胞毒性薬剤もしくは薬物」、または「治療有効物質」という用語は、問題の生物おいて自力でまたはその変換後のいずれかで薬理効果をもたらし、よってこれらの変換からの誘導体も含む、任意の化合物を意味するために使用される。本開示による組成物の薬物の薬理効果は、単一の効果のみ、例えば、細胞静止および／もしくは細胞毒性効果、または広域薬理スペクトルの作用、例えば、同時に免疫抑制および抗炎症効果であり得る。
【００３６】
「患者」、「対象」、または「個体」という用語は、交換可能に使用され、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを指す。これらの用語は、ヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ウシ、ブタ）、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコ）、および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む。特定の実施形態では、患者または対象は、ヒト患者または対象、例えば、治療を必要とする状態を有するヒト患者である。
【００３７】
「薬学的組成物」という用語は、例えば、１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、または溶媒と組み合わされた、ヒトおよび哺乳動物を含む、対象動物における薬学的使用に好適な組成物を指す。そのような組成物はまた、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、保護剤、および当該技術分野で周知の他の材料を含有し得る。特定の実施形態では、薬学的組成物は、活性成分（複数可）と、賦形剤、担体、または希釈剤を構成する不活性成分（複数可）とを含む組成物、および直接または間接的に、成分のうちの任意の２つ以上の組み合わせ、錯体形成、もしくは凝集から、または成分のうちの１つ以上の解離から、または成分のうちの１つ以上の他のタイプの反応もしくは相互作用から、もたらされる任意の生成物を包含する。したがって、本開示の薬学的組成物は、本開示の化合物と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤（複数可）、担体（複数可）、および／または希釈剤（複数可）とを混合することによって作製される任意の組成物を包含する。
【００３８】
「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書に開示される治療有効物質と共に、患者に投与され得、薬剤の薬理活性を破壊しない非毒性担体を指す。「賦形剤」という用語は、薬学的に活性な成分ではない製剤または組成物における添加剤を指す。特定の実施形態では、「薬学的に許容される」物質は、投与スケジュールによる剤形で使用される量で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または他の有害反応なしに、動物またはヒトの細胞、組織、または臓器との接触における使用に好適であり、合理的なベネフィット／リスク比に相応する。特定の実施形態では、薬学的組成物の成分である「薬学的に許容される」物質は、加えて、組成物の他の成分（複数可）と適合性である。特定の実施形態では、「薬学的に許容される賦形剤」、「薬学的に許容される担体」、および「薬学的に許容される希釈剤」という用語は、限定なく、薬学的に許容される不活性成分、材料、組成物、およびビヒクル、例えば、液体充填剤、固体充填剤、希釈剤、賦形剤、担体、溶媒、およびカプセル化材料を包含する。担体、希釈剤、および賦形剤はまた、全ての薬学的に許容される分散媒体、コーティング、緩衝剤、等張剤、安定化剤、吸収遅延剤、抗微生物剤、抗細菌剤、抗真菌剤、補助剤などを含む。任意の従来の賦形剤、担体、または希釈剤が活性成分と非適合性である限りを除いて、本開示は、薬学的組成物における従来の賦形剤、担体、および希釈剤の使用を包含する。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，２００５）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（２００５）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ａｓｈ  ａｎｄ  Ａｓｈ，Ｅｄｓ．，Ｇｏｗｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（２００７）；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，２００４）を参照されたい。
【００３９】
「薬学的に有効な量」、「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」、または「治療有効用量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）」という用語は、患者において疾患を治療するために有効な、例えば、疾患（例えば、癌）に罹患している患者の一般的な健康における有益なおよび／または所望の変化、治療、治癒、生理反応または状態の阻害または改善などを引き起こす量を指す。完全な治療効果は、１回の用量の投与によって必ずしも発生せず、一連の用量の投与後にのみ発生し得る。よって、治療有効量は、１回以上の投与で投与され得る。対象に必要な正確な有効量は、例えば、対象のサイズ、健康および年齢、疾患の性質および程度、投与に選択される治療剤または治療剤の組み合わせ、ならびに投与方法に依存するであろう。当業者であれば、通常の実験によって所与の状況についての有効量を容易に決定することができる。当業者であれば、癌を治療することが、これらに限定されないが、癌細胞を殺滅すること、新たな癌細胞の成長を防止すること、腫瘍退縮（腫瘍サイズの減少）を引き起こすこと、転移の減少を引き起こすこと、患者の生活機能を改善すること、患者の幸福を改善すること、疼痛を減少させること、食欲を改善すること、患者の体重を改善すること、およびこれらに任意の組み合わせを含むことを認識するであろう。「薬学的に有効な量」、「治療有効量」、または「治療有効用量」という用語はまた、患者の臨床症状を改善するために必要な量を指す。本明細書に記載される治療的方法または癌を治療する方法は、癌を「治癒する」と解釈されるか、またはそうでなければこれに限定されるものではない。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「治療する」または「治療」という用語は、対象の状態を改善または安定化する方法で状態の症状、臨床徴候、および基礎病理を逆転、低減、または停止することを含む。本明細書で使用され、当該技術分野で十分に理解されるように、「治療」とは、臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能か検出不能かにかかわらず、これらに限定されないが、状態、例えば、癌と関連した１つ以上の症状または状態の、軽減、改善、または進行の減速、疾患の程度の低下、疾患の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、ならびに寛解（部分または完全）を含むことができる。「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを意味することができる。例示的な有益な臨床結果は、本明細書に記載される。
【００４１】
物質、化合物、または薬剤を対象に「投与すること」または「その投与」は、当業者に知られている様々な方法のうちの１つを用いて行うことができる。例えば、化合物または薬剤は、静脈内、動脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、眼内、舌下、経口（服用による）、鼻腔内（吸入による）、髄腔内、脳内、および経皮（例えば、皮膚管を通した、吸収による）投与することができる。化合物または薬剤は、再充填可能なまたは生分解可能なポリマーデバイスまたは他のデバイス、例えば、パッチおよびポンプ、または薬剤によって適切に導入することができ、これは、化合物または薬剤の持続性、緩効性、または制御放出を提供する。投与することはまた、例えば、１回、複数回、および／または１つ以上の長期間にわたって行うことができる。いくつかの態様では、投与は、自己投与を含む、直接投与、および薬物を処方する行為を含む、間接投与の両方を含む。例えば、本明細書で使用されるとき、患者に薬物を自己投与するように、もしくは薬物を別の者に投与してもらうように指示する、および／または患者に薬物の処方を提供する医師は、薬物を患者に投与している。方法が、２つ以上の薬剤または治療モダリティを含む治療レジメンの一部であるとき、本開示は、薬剤が、同じまたは異なる時間で、および同じまたは異なる投与経路で投与され得ることを企図する。物質、化合物、または薬剤を対象に投与する適切な方法はまた、例えば、対象の年齢、投与時に対象が活動的または非活動的であるか、投与時に対象に認知障害があるか、障害の程度、ならびに化合物または薬剤の化学および生物学的特性（例えば、可溶性、消化性、生物学的利用能、安定性、および毒性）に依存するであろう。
【００４２】
「置換された」という用語は、化学的化合物の骨格の１つ以上の炭素上の水素を置換する置換基を有する部分を指す。「置換」または「〜で置換された」とは、そのような置換が、置換された原子および置換基の許容される原子価に従い、置換が、例えば、転位、環化、脱離などによるような変換を自発的に受けない、安定な化合物をもたらすという暗示的な条件を含むことが理解されるであろう。本明細書で使用されるとき、「置換された」という用語は、有機化合物の全ての許容される置換基を含むことが企図される。広範な態様では、許容される置換基は、有機化合物の非環式および環式、分岐および非分岐、炭素環式および複素環式、芳香族および非芳香族置換基を含む。許容される置換基は、１つ以上であり、適切な有機化合物について同じまたは異なり得る。本開示の目的のために、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基、および／またはヘテロ原子の原子価を満たす本明細書に記載される有機化合物の任意の許容される置換基であり得る。置換基は、本明細書に記載される任意の置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシルなど）、チオカルボニル（チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメートなど）、アルコキシル、アルキルチオ、アシルオキシ、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族（例えば、Ｃ６−Ｃ１２アリール）もしくは複素芳香族（例えば、ヘテロアリール）部分を含むことができる。
【００４３】
「任意の」または「任意に」とは、その後に記載される状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味するので、本出願は、状況が起こる場合および起こらない場合を含む。例えば、「任意に置換された」という句は、所与の原子上に非水素置換基が存在してもしなくてもよいことを意味し、よって、本出願は、非水素置換基が存在する構造および非水素置換基が存在しない構造を含む。
【００４４】
特に「非置換」として記載されない限り、本明細書における化学部分への参照は、置換バリアントを含むことが理解される。例えば、「アルキル」基または部分への参照は、置換および非置換バリアントの両方を暗示的に含む。化学部分上の置換基の例としては、これらに限定されないが、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート）、アルコキシル、アルキルチオ、アシルオキシ、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、またはアリールもしくはヘテロアリール部分が挙げられる。
【００４５】
「アリール」とは、環に、示された数の炭素原子、例えば、６〜１２個または６〜１０個の炭素原子を有する芳香族炭素環を示す。アリール基は、単環式または多環式（例えば、二環式、三環式）であり得る。いくつかの例では、多環式アリール基の両方の環は、芳香族（例えば、ナフチル）である。他の例では、多環式アリール基は、芳香族環に縮合した非芳香族環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル）を含み得るが、ただし、多環式アリール基は、芳香族環における原子を介して親構造に結合している。よって、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−５−イル基（部分が芳香族炭素原子を介して親構造に結合している）は、アリール基とみなされるが、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イル（部分が非芳香族炭素原子を介して親構造に結合している）は、アリール基とみなされない。同様に、１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−８−イル基（部分が芳香族炭素原子を介して親構造に結合している）は、アリール基とみなされるが、１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−１−イル基（部分が非芳香族窒素原子を介して親構造に結合している）は、アリール基とみなされない。しかしながら、「アリール」という用語は、結合点にかかわらず、本明細書で定義される「ヘテロアリール」を包含しないか、またはこれとは重複しない（例えば、キノリン−５−イルおよびキノリン−２−イルの両方は、ヘテロアリール基である）。
【００４６】
「ヘテロアリール」とは、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個以上のヘテロ原子（例えば、１、２、３、または４個のヘテロ原子）からなり、残りの環原子が炭素である、示された数の環原子を含有する芳香族環（例えば、５〜１２、または５〜１０員ヘテロアリール）を示す。５員ヘテロアリールは、５個の環原子を有するヘテロアリールである。６員ヘテロアリールは、６個の環原子を有するヘテロアリールである。ヘテロアリール基は、隣接するＳおよびＯ原子を含有しない。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基におけるＳおよびＯ原子の総数は、２以下である。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基におけるＳおよびＯ原子の総数は、１以下である。別段に示されない限り、ヘテロアリール基は、原子価が許容するように、炭素または窒素原子によって親構造に結合され得る。例えば、「ピリジル」は、２−ピリジル、３−ピリジル、および４−ピリジル基を含み、「ピロリル」は、１−ピロリル、２−ピロリル、および３−ピロリル基を含む。窒素がヘテロアリール環に存在するとき、それは、隣接する原子および基の性質が許容する場合、酸化状態（すなわち、Ｎ＋−Ｏ−）で存在する。加えて、硫黄がヘテロアリール環に存在するとき、それは、隣接する原子および基の性質が許容する場合、酸化状態（すなわち、Ｓ＋−Ｏ−またはＳＯ２）で存在する。ヘテロアリール基は、単環式または多環式（例えば、二環式、三環式）であり得る。
【００４７】
いくつかの例では、ヘテロアリール基は、単環式である。例としては、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール（例えば、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、１，３，４−トリアゾール）、テトラゾール、フラン、イソオキサゾール、オキサゾール、オキサジアゾール（例えば、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール）、チオフェン、イソチアゾール、チアゾール、チアジアゾール（例えば、１，２，３−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール）、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン（例えば、１，２，４−トリアジン、１，３，５−トリアジン）、およびテトラジンが挙げられる。
【００４８】
「アシル」という用語は、当該技術分野で認識されており、一般式ヒドロカルビル−Ｃ（Ｏ）−によって表される基、例えば、アルキル−Ｃ（Ｏ）−を指す。
【００４９】
「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基、および分岐鎖アルキル基を含む、飽和脂肪族基のラジカルを指す。いくつかの実施形態では、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格に３０個以下の炭素原子（例えば、直鎖はＣ１−Ｃ３０、分岐鎖はＣ４−Ｃ３０）を有し、他の実施形態では、２０個以下の炭素原子を有する。特定の実施形態では、アルキル基は、低級アルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、およびｎ−ペンチルである。また、明細書、実施例、および特許請求の範囲を通して使用される「アルキル」という用語は、「非置換アルキル」および「置換アルキル」の両方を含むことが意図され、その後者は、炭化水素骨格の１つ以上の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルキル部分を指す。特定の実施形態では、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格に３０個以下の炭素原子（例えば、直鎖はＣ１−Ｃ３０、分岐鎖はＣ３−Ｃ３０）を有する。いくつかの実施形態では、鎖は、その骨格に１０個以下の炭素（Ｃ１−Ｃ１０）原子を有する。他の実施形態では、鎖は、その骨格に６個以下の炭素（Ｃ１−Ｃ６）原子を有する。
【００５０】
「ヒドラゾン部分」または「ヒドラゾン」という用語は、Ｅおよび／またはＺヒドラゾン、例えば、
【化６】
2021505541.tif 000008
または
【化７】
2021505541.tif 000009
を指す。
ヒドラゾン部分の立体化学は、ＥまたはＺであり得る。本明細書で使用されるヒドラゾンという用語は、ＥおよびＺ異性体の両方を含む。本明細書に開示されるヒドラゾン部分は一般的には、一方の配置で描写されるが、本開示は、Ｅおよび／またはＺの両方を含むことができることが理解される。
【００５１】
本明細書における様々な場所で、本開示の化合物の置換基は、群または範囲において開示されている。本開示は、そのような群および範囲のメンバーの各々および全ての個別の部分組み合わせを含むことが特に意図される。例えば、「Ｃ１−Ｃ６アルキル」という用語は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチルなどを個別に開示することが特に意図される。
【００５２】
「薬学的に許容される塩」とは、これらに限定されないが、金属塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）、酸付加塩（例えば、鉱酸、カルボン酸など）、および塩基付加塩（例えば、アンモニア、有機アミンなど）を含む、薬学的使用に好適な化合物の塩である。塩基としてその遊離形態で発生する化合物の酸付加塩形態は、当該遊離塩基形態を、無機酸、例えば、塩酸もしくは臭化水素酸などのハロゲン化水素鎖、硫酸、硝酸、リン酸など、または有機酸、例えば、酢酸、ヒドロキシ酢酸、プロパン酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、環状酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、パモ酸などのような、適切な酸で処理することによって得ることができる（例えば、ＷＯ０１／０６２７２６を参照されたい。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６：１−１９（１９７７）によって列挙されるいくつかの薬学的に許容される塩）。酸性プロトンを含有する化合物は、適切な有機および無機塩基での処理によって、それらの治療活性、非毒性塩基付加塩形態、例えば、金属またはアミン塩に変換され得る。適切な塩基塩形態は、例えば、アンモニウム塩、アルカリおよび土類アルカリ金属塩またはイオン、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩など、有機塩基を有する塩、例えば、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ヒドラバミン塩、ならびにアミノ酸を有する塩、例えば、アルギニン、リジンなどを含む。逆に、当該塩形態は、適切な塩基または酸での処理によって遊離形態に変換することができる。化合物およびそれらの塩は、本開示の範囲内に含まれる、溶媒和物の形態であり得る。そのような溶媒和物は、例えば、水和物、アルコラートなどを含む（例えば、ＷＯ０１／０６２７２６を参照されたい）。
【００５３】
本開示は、薬学的に許容される担体または賦形剤と共に本開示の１つ以上の化合物を含む薬学的組成物をさらに提供する。本開示の化合物または薬学的組成物は、インビトロまたはインビボで使用され得る。
【００５４】
本明細書で使用される「異性体」という用語は、これらに限定されないが、互変異性体、シスおよびトランス異性体（Ｅ（ｅｎｔｇｅｇｅｎ）、Ｚ（ｚｕｓａｍｍｅｎ））、Ｒ−およびＳ−エナンチオマー（当該ＲおよびＳ表記は、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７６），４５，１１−３０に記載される規則に従って使用される）、ジアステレオマー、（Ｄ）異性体、（Ｌ）異性体、立体異性体、そのラセミ混合物、ならびにその他の混合物を含む。全てのそのような異性体、およびその混合物は、本開示に含まれることが意図される。互変異性体は、本明細書に記載される式において明示的には示されていないが、本開示の範囲内に含まれることが意図される。
【００５５】
本開示の化合物
本開示の実施形態は、式Ｉもしくは式ＩＩによって表される構造を有する化合物、
【化８】
2021505541.tif 000010
またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、もしくは異性体を提供し、式中、
Ｒ’は、Ｈまたは−ＣＨ３であり、
Ｍは、Ｈおよび薬学的に許容される対イオン、例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＮＲ４＋、またはＮＨＲ３＋から選択され、式中、Ｒは、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルから選択され、
Ｙは、不在であるか、または任意に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−から選択され、
Ｒ１は、不在であるか、または任意に置換されたＣ１−Ｃ１８アルキルであり、当該Ｃ１−Ｃ１８アルキルにおける任意に最大６個の炭素原子は、各々独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で置換され、
Ｘは、Ｈであるか、またはハロゲン（例えば、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、もしくは−Ｉ）、−ＮＯ２、−ＮＲ２Ｒ３、−ＯＲ２、−ＮＨＣＯＲ２、および−ＯＣＯＲ２から選択され、式中、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルから選択され、
ＴＢＧは、任意に置換されたマレイミド基、任意に置換されたハロアセトアミド基、任意に置換されたハロアセテート基、任意に置換されたピリジルチオ基、任意に置換されたイソチオシアネート基、任意に置換されたビニルカルボニル基、任意に置換されたアジリジン基、任意に置換されたジスルフィド基、および任意に置換されたアセチレン基から選択されるチオール結合基である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、式ＩまたはＩＩの構造の化合物は、任意に薬学的に許容される担体を含有する薬学的組成物として製剤化され、薬学的組成物は、生物に投与され、血液循環において内因性アルブミンのシステイン−３４のチオール基にインサイチュで選択的かつ急速に共有結合する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、−ＣＨ３である。他の実施形態では、Ｒ’は、Ｈである。
【００５８】
いくつかの実施形態では、チオール結合基、ＴＢＧは、マレイミド基である。
【化９】
2021505541.tif 000011
【００５９】
いくつかの実施形態では、高度細胞毒性ペプチド系薬物は、ヒドラジド部分を含有するマレイミド水溶化リンカーでの酸感受性ヒドラゾン結合の形成を可能にするカルボニル基を含有するような方法で誘導体化されるオーリスタチンＥである。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で開示される化合物と、任意に薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を提供し、薬学的組成物は、静脈内投与され、血液循環において内因性アルブミンのシステイン−３４のチオール基にインサイチュで選択的かつ急速に共有結合する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるアルブミン結合化合物において、高度細胞毒性薬物は、オーリスタチンＥのペンタペプチド誘導体を含有するカルボニルであり、アルブミン結合部分は、投与後アルブミンのシステイン−３４に急速かつ選択的に結合する、チオール結合基（ＴＢＧ）、例えば、マレイミド基であり、酸感受性結合は、一般式ＩおよびＩＩの誘導体化ベンゾイルヒドラゾン結合、
【化１０】
2021505541.tif 000012
またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、もしくは異性体であり、式中、
Ｒ’は、Ｈまたは−ＣＨ３であり、
Ｍは、Ｈおよび薬学的に許容される対イオン、例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＮＲ４＋、またはＮＨＲ３から選択され、式中、Ｒは、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルから選択され、
Ｙは、不在であるか、または任意に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−から選択され、
Ｒ１は、不在であるか、または任意に置換されたＣ１−Ｃ１８アルキルであり、当該Ｃ１−Ｃ１８アルキルにおける任意に最大６個の炭素原子は、各々独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で置換され、
Ｘは、Ｈであるか、またはハロゲン（例えば、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、もしくは−Ｉ）、−ＮＯ２、−ＮＲ２Ｒ３、−ＯＲ２、−ＮＨＣＯＲ２、および−ＯＣＯＲ２から選択され、式中、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルから選択され、
ＴＢＧは、任意に置換されたマレイミド基、任意に置換されたハロアセトアミド基、任意に置換されたハロアセテート基、任意に置換されたピリジルチオ基、任意に置換されたイソチオシアネート基、任意に置換されたビニルカルボニル基、任意に置換されたアジリジン基、任意に置換されたジスルフィド基、および任意に置換されたアセチレン基から選択されるチオール結合基である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ＴＢＧは、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはハロゲンで置換される。いくつかの実施形態では、ＴＢＧは、メチル、−Ｃｌ、または−Ｂｒで置換される。
【００６３】
ジスルフィド基は、交換性基としてチオニトロ安息香酸（例えば、５’−チオ−２−ニトロ安息香酸）によって活性化され得る。マレイミドまたはピリジルジチオ基は、適切な場合、アルキル基によって、または上記水溶性基によって置換することができる。一般に、チオール結合基は、タンパク質結合特性を有し、すなわち、それは、生理環境において、タンパク質の表面上の特定のアミノ酸に共有結合する（「共有タンパク質結合基」）。いくつかの実施形態では、マレイミド基、ハロアセトアミド基、ハロアセテート基、ピリジルジチオ基、ジスルフィド基、ビニルカルボニル基、アジリジン基、および／またはアセチレン基は、システインのチオール（−ＳＨ）基と反応する。いくつかの実施形態では、タンパク質結合基は、
【化１１】
2021505541.tif 000013
アルブミンのシステイン−３４に結合するマレイミド基である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、薬物送達システムは、酸感受性で、開裂可能なヒドラゾン部分を含有する。ヒドラゾン部分の開裂および薬物放出の半減期は、カルボニル誘導体の構造によって変動する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、４．０〜６．５のｐＨ範囲におけるアルブミン結合薬物放出の放出の半減期は、約１．５時間から約８０時間まで変動する。
【００６６】
理論によって縛られることなく、ヒドラゾン結合へオルト位に結合したスルホン酸（−ＳＯ３Ｈ）またはスルホネート基（−ＳＯ３−）などの１つの電子吸引基を含むフェニル環は、ヒドラゾン部分を安定化し、酸性条件における薬物の緩効性および持効性放出をもたらす。
【００６７】
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、−ＣＨ３である。他の実施形態では、Ｒ’は、Ｈである。
【００６８】
いくつかの実施形態では、Ｙおよび／またはＲ１は、存在する。いくつかの実施形態では、Ｙは、不在である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、不在である。いくつかの実施形態では、ＹおよびＲ１の両方は、不在である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、Ｙは、メチル、エチル、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−から選択される。
【００７０】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ１８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ１８アルキルであり、当該Ｃ１−Ｃ１８アルキルにおける１個の炭素原子は、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で置換される。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ１８アルキルであり、当該Ｃ１−Ｃ１８アルキルにおける２個の炭素原子は、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で置換される。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ１８アルキルであり、当該Ｃ１−Ｃ１８アルキルにおける３個の炭素原子は、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で置換される。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ１８アルキルであり、当該Ｃ１−Ｃ１８アルキルにおける４個の炭素原子は、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で置換される。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ１８アルキルであり、当該Ｃ１−Ｃ１８アルキルにおける５個の炭素原子は、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で置換される。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ１８アルキルであり、当該Ｃ１−Ｃ１８アルキルにおける６個の炭素原子は、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で置換される。
【００７１】
ＵＳ６８８４８６９−Ｂ２（出願番号：１０／００１，１９１、２００１年１１月０１日出願）は、抗体薬物コンジュゲートについて記載し、式Ａおよび式Ｂの化学構造のペンタペプチド誘導体は、以下に描写される。
【化１２】
2021505541.tif 000014
【００７２】
これらは、チオール含有抗体にコンジュゲートされた。両方の化合物は、上記に描写される式Ａおよび式Ｂの２つの化合物に最小限の水溶性を与える脂肪族６−マレイミドカプロイルヒドラゾン部分を含有する。実際に、両方の前者の化合物と抗体とのコンジュゲーションは、有機溶媒、すなわち、アセトニトリル：ＤＭＳＯの９：１混合物の補助のみでの化合物の溶解によって達成された。血流において循環するアルブミンのシステイン−３４へのインサイチュ結合に適用可能な薬学的組成物の製剤における、単独での有機溶媒の使用、すなわち、本明細書に記載される薬物送達アプローチは、可能ではない。したがって、いくつかの実施形態では、本組成物は、有機溶媒を含まない。
【００７３】
よって、静脈内投与のための薬学的組成物の製剤のためにアルブミン結合プロドラッグに十分な水溶性を与えるスルホン酸部分を含む芳香族マレイミドリンカーが発明された。１つのそのようなリンカーは、Ｓｕｌｆ０７と略され、以下に描写される化学構造を有する、５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−２−（ヒドラジンカルボニル）−ベンゼンスルホン酸である。
【化１３】
2021505541.tif 000015
【００７４】
リンカーＳｕｌｆ０７、５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−２−（ヒドラジンカルボニル）−ベンゼンスルホン酸を、下記合成スキームにおいて描写される経路Ａおよび／または経路Ｂに従って調製した。
【化１４】
2021505541.tif 000016
スキーム１、経路Ａ
【化１５】
2021505541.tif 000017
スキーム２、経路Ｂ
【００７５】
経路ＡおよびＢに従って達成された、新規リンカーＳｕｌｆ０７、５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−２−（ヒドラジンカルボニル）ベンゼンスルホン酸の新たな合成手順および特徴分析は、実施例１に記載される。
【００７６】
リンカーＳｕｌｆ０７は、それぞれ、式ＩＩＩ（ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７と略される）および式ＩＶ（ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７と略される）の化合物を得るために、
【化１６】
2021505541.tif 000018
ＡＥ−ケト
または
【化１７】
2021505541.tif 000019
ＡＥ−エステルと反応させた。
【化１８】
2021505541.tif 000020
式ＩＩＩ（ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７）
【化１９】
2021505541.tif 000021
式ＩＶ（ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７）
【００７７】
ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７（式ＩＩＩ）およびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７（式ＩＶ）の合成および特徴分析は、実施例２および３に記載される。
【００７８】
ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７およびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の構造の分析は、両方の分子の２つの部分（−ＳＯ３Ｈおよび−Ｎ（ＣＨ３）２基）が酸−塩基対として存在し、よってスキーム３およびスキーム４において描写される双性イオンを形成することを明らかにする。
【化２０】
2021505541.tif 000022
スキーム３
【化２１】
2021505541.tif 000023
スキーム４
【００７９】
リンカーＳｕｌｆ０７において統合されるスルホン酸部分ならびに２つのオーリスタチンプロドラッグＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７およびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の双性イオン特性は、薬学的組成物を製剤化するために十分な水溶性を提供し、より重要なことにはマレイミド部分の高い安定性を提供し、これは式Ａ（ＡＥ−ケト−ＥＭＣＨ）および式Ｂ（ＡＥ−エステル−ＥＭＣＨ）に対して有意に改善している。
【化２２】
2021505541.tif 000024
【化２３】
2021505541.tif 000025
ＵＳ６８８４８６９−Ｂ２（出願番号：１０／００１，１９１、２００１年１１月０１日出願）に開示される。
【００８０】
内因性アルブミンのシステイン−３４へのインサイチュ結合について、７．４〜７．６のｐＨ範囲の生理的条件下でのマレイミド基の安定性は、静脈内投与および血流における循環アルブミンへの効率的な結合の基準である。
【００８１】
図１および図２に示されるように、ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７およびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の両方についての加水分解に対するマレイミド部分の安定性は、ＵＳ６８８４８６９−Ｂ２に記載される２つの化合物、すなわち、ＡＥ−ケト−ＥＭＣＨ（式Ａの化合物）およびＡＥ−エステル−ＥＭＣＨ（式Ｂの化合物）と比較してかなり改善している。再構成緩衝剤（４％ＨＰβＣＤおよび５％スクロースを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．６５）における室温で４時間のインキュベーション後、ＡＥ−ケト−ＥＭＣＨの５．４％マレイミド加水分解と比較して、ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の２．２％マレイミドが加水分解され、同様にＡＥ−エステル−ＥＭＣＨの１１．０％と比較してＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の２．５％マレイミドが加水分解された。加えて、Ｓｕｌｆ０７誘導体の活性薬学的成分（ＡＰＩ）製剤は、加速分解条件（例えば、最大２６４時間５５℃）下で優れた安定性を示した（図２４および図２５）が、ＥＭＣＨ誘導体のマレイミド部分は、急速に加水分解された。最小限のマレイミド加水分解は、定量的な内因性アルブミン結合を確保するために、よって循環におけるいずれの早期遊離薬物放出も制限し、臨床効率を最大化するために、製品開発および製造に必須である。
【００８２】
ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７およびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の水溶液のさらなる利点は、それらが６．８〜７．５の範囲の生理的ｐＨ値を有することである。
【００８３】
また、双性イオンＡＰＩの可溶性および安定性は、Ｔｗｅｅｎ  ８０、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどの薬学的な承認された担体との組み合わせで使用されるとき増加し、これは薬学的組成物の製剤を促進し得る。
【００８４】
ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７およびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の薬学的製剤は、血漿における非常に急速なアルブミン結合を達成した（ヒト、マウス、およびラット（図５〜１０））。両方の治療剤についてのアルブミンへの結合の特異性も、ヒト血漿において示された（図３〜４）。
【００８５】
薬学的組成物
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される化合物を含む薬学的組成物を提供する。
【００８６】
患者に投与される組成物における化合物の総量は、その患者に好適なものである。当業者であれば、異なる個体が、異なる総量の治療有効物質を必要とし得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、化合物の量は、薬学的に有効な量である。当業者であれば、例えば、患者の年齢、体重、および健康状態などの因子に基づいて、患者を治療するために必要な組成物における化合物の量を決定することができるであろう。化合物の濃度は、静脈内投与溶液におけるその可溶性および投与することができる流体の体積に依存する。例えば、化合物の濃度は、注射可能な組成物における約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、化合物の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
【００８７】
本開示の薬学的組成物およびキットはまた、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、保護剤、および当該技術分野で周知の他の材料を含有し得る。「薬学的に許容される」という用語は、活性成分（複数可）の生物学的活性の有効性に干渉しない非毒性材料を意味する。担体の特徴は、投与経路に依存するであろう。
【００８８】
組成物は、様々な従来の方法で投与され得る。使用することができる例示的な投与経路は、経口、非経口、静脈内、動脈内、皮膚、皮下、筋肉内、局所、頭蓋内、眼窩内、眼内、硝子体内、心室内、嚢内、髄腔内、槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、中枢神経系（ＣＮＳ）投与、または坐剤による投与を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、非経口投与に好適である。これらの組成物は、例えば、腹腔内、静脈内、または髄腔内投与され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内注射される。いくつかの実施形態では、再構成製剤は、例えば、アルコール、ＤＭＳＯ、および／またはポリエチレングリコールならびに水および／または塩緩衝剤を含む再構成液体において凍結乾燥化合物組成物を再構成することによって調製することができる。そのような再構成は、再構成液体を添加し、例えば、混合物をスワールまたはボルテックスすることによって混合することを含み得る。再構成製剤は次いで、例えば、乳酸リンゲル溶液、５％グルコース溶液、等張性食塩水、または好適な塩緩衝剤を製剤と混合して注射可能な組成物を作製することによって、注射に好適にすることができる。当業者であれば、治療有効物質製剤または組成物を投与する方法が、治療される患者の年齢、体重、および健康状態、ならびに治療される疾患または状態などの因子に依存するであろうことを理解するであろう。当業者であれば、よって、個別的に患者に最適な投与方法を選択することができるであろう。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される化合物および組成物は、癌、ウイルス疾患、自己免疫疾患、急性または慢性炎症疾患、および細菌、真菌、または他の微生物によって引き起こされる疾患の治療おける使用のためのものである。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される化合物は、癌、ウイルス疾患、自己免疫疾患、急性または慢性炎症疾患、および細菌、真菌、または他の微生物によって引き起こされる疾患から選択される疾患を治療するための医薬品の製造において使用され得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、癌は、血液癌または固形腫瘍癌である。いくつかの実施形態では、癌は、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、および黒色腫から選択される。
【００９２】
いくつかの実施形態では、癌は、腺癌、ブドウ膜黒色腫、急性白血病、聴神経腫、膨大部癌腫、肛門癌腫、星状細胞腫、基礎細胞腫、膵臓癌、結合組織腫瘍、膀胱癌、気管支癌腫、非小細胞気管支癌腫、乳癌、バーキットリンパ腫、子宮体癌腫、ＣＵＰ症候群、結腸癌、小腸の癌、卵巣癌、子宮内膜癌腫、胆嚢癌、胆嚢癌腫、子宮癌、子宮頸癌、頸部、鼻および耳腫瘍、血液学的新生物、有毛細胞白血病、尿道癌、皮膚癌、神経膠腫、精巣癌、カポジ肉腫、咽頭癌、骨癌、結腸直腸癌腫、頭頸部腫瘍、結腸癌腫、頭蓋咽頭腫、肝臓癌、白血病、肺癌、非小細胞肺癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、胃癌、結腸癌、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、腎臓癌、腎細胞癌腫、乏突起神経膠腫、食道癌腫、溶骨性癌腫および骨形成性癌腫、骨肉腫、卵巣癌腫、膵臓癌腫、陰茎癌、前立腺癌、舌癌、卵巣癌腫、またはリンパ腫癌である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される化合物と、薬学的に許容される賦形剤、担体、および／または希釈剤とを含む、キットを提供する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の賦形剤が組成物に含まれ得る。当業者であれば、任意の１つの賦形剤の選択が、任意の他の賦形剤の選択に影響し得ることを理解するであろう。例えば、賦形剤の組み合わせは、望ましくない効果を生み出すので、賦形剤の選択は、１つ以上の追加の賦形剤の使用を除外し得る。当業者であれば、どの賦形剤を、もしあれば、組成物に含むべきか経験的に決定することができるであろう。賦形剤は、これらに限定されないが、共溶媒、可溶化剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、増量剤、界面活性剤、カプセル化剤、張性調節剤、安定化剤、保護剤、および粘度調整剤を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物に薬学的に許容される担体を含むことが有益であり得る。
【００９５】
いくつかの実施形態では、可溶化剤が組成物に含まれ得る。可溶化剤は、化合物または賦形剤を含む、組成物の成分のいずれかの可溶性を増加させるために有用であり得る。本明細書に記載される可溶化剤は、完全なリストを構成することは意図されないが、単に組成物において使用され得る例示的な可溶化剤として提供される。特定の実施形態では、可溶化剤は、これらに限定されないが、エチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、メチルパラベン、プロピルパラベン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、シクロデキストリン、例えば、ジメチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、およびトリメチル−β−シクロデキストリン、ならびにその組み合わせ、ならびにその任意の薬学的に許容される塩および／または組み合わせを含む。
【００９６】
組成物のｐＨは、製剤または組成物に所望の特性を提供する任意のｐＨであり得る。所望の特性は、例えば、化合物安定性、他のｐＨ値の組成物と比較して増加した化合物保持、改善した濾過効率を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物のｐＨ値は、約３．０〜約９．０、例えば、約５．０〜約７．０であり得る。特定の実施形態では、組成物のｐＨ値は、５．５±０．１、５．６±０．１、５．７±０．１、５．８±０．１、５．９±０．１、６．０±０．１、６．１±０．１、６．２±０．１、６．３±０．１、６．４±０．１、６．５±０．１、６．６±０．１、６．７±０．１、６．８±０．１、６．９±０．１、７．０±０．１、７．１±０．１、および７．２±０．１であり得る。
【００９７】
いくつかの実施形態では、組成物に１つ以上の緩衝剤を含むことによってｐＨを緩衝することが有益であり得る。特定の実施形態では、緩衝剤は、例えば、約５．５、約６．０、または約６．５のｐＫａを有し得る。当業者であれば、適切な緩衝剤が、そのｐＫａおよび他の特性に基づいて組成物に含めるために選択され得ることを理解するであろう。緩衝剤は、当該技術分野において周知である。したがって、本明細書に記載される緩衝剤は、完全なリストを構成することは意図されないが、単に本開示の製剤または組成物において使用され得る例示的な緩衝剤として提供される。特定の実施形態では、緩衝剤は、これらに限定されないが、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびカリウムの組み合わせ、Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、重炭酸ナトリウム、リン酸アルギニン、塩酸アルギニン、塩酸ヒスチジン、カコジル酸塩、コハク酸塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、マレイン酸塩、ビス−トリス、リン酸塩、炭酸塩、ならびに任意の薬学的に許容される塩および／またはそれらの組み合わせを含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ｐＨ調節剤が組成物に含まれ得る。組成物のｐＨを調整することは、例えば、化合物の安定性もしくは可溶性に対して有益な効果を有し得るか、または非経口投与に好適な組成物の作製において有用であり得る。ｐＨ調節剤は、当該技術分野で周知である。したがって、本明細書に記載されるｐＨ調節剤は、完全なリストを構成することは意図されないが、単に組成物において使用され得る例示的なｐＨ調節剤として提供される。ｐＨ調節剤は、酸および塩基を含み得る。いくつかの実施形態では、ｐＨ調節剤は、これらに限定されないが、酢酸、塩酸、リン酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせを含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、増量剤が組成物に含まれ得る。増量剤は、組成物に追加された体積を提供し、組成物の可視化を補助するために、特に凍結乾燥ペレットがそうでなければ見えにくい場合、凍結乾燥組成物において一般的に使用される。増量剤はまた、薬学的組成物の活性成分（複数可）の噴出防止および／または組成物の凍結保護の補助に役立ち得る。増量剤は、当該技術分野において周知である。したがって、本明細書に記載される増量剤は、完全なリストを構成することは意図されないが、単に組成物において使用され得る例示的な増量剤として提供される。
【０１００】
例示的な増量剤は、炭水化物、単糖、二糖、多糖、糖アルコール、アミノ酸、および糖酸、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。炭水化物増量剤は、これらに限定されないが、モノ−、ジ−、またはポリ−炭水化物、デンプン、アルドース、ケトース、アミノ糖、グリセルアルデヒド、アラビノース、リキソース、ペントース、リボース、キシロース、ガラクトース、グルコース、ヘキソース、イドース、マンノース、タロース、ヘプトース、グルコース、フルクトース、メチルα−Ｄ−グルコピラノシド、マルトース、ラクトン、ソルボース、エリトロース、トレオース、アラビノース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、タガトース、グルコサミン、ガラクトサミン、アラビナン、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン、イヌリン、レバン、フコイダン、カラギーナン、ガラクトカロロース、ペクチン、アミロース、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、プスツラン、キチン、アガロース、ケラチン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、キサンチンガム、スクロース、トレハロース、デキストラン、およびラクトースを含む。糖アルコール増量剤は、これらに限定されないが、アルジトール、イノシトール、ソルビトール、およびマンニトールを含む。糖酸増量剤は、これらに限定されないが、アルドン酸、ウロン酸、アルダル酸、グルコン酸、イソアスコルビン酸、アスコルビン酸、グルカル酸、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、ノイラミン酸、ペクチン酸、およびアルギン酸を含む。アミノ酸増量剤は、これらに限定されないが、グリシン、ヒスチジン、およびプロリンを含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、界面活性剤が組成物に含まれ得る。界面活性剤は、一般的には、液体組成物の表面張力を低減する。これは、改善した濾過しやすさなどの有益な特性を提供し得る。界面活性剤は、乳化剤および／または可溶化剤として作用し得る。界面活性剤は、当該技術分野において周知である。したがって、本明細書に記載される界面活性剤は、完全なリストを構成することは意図されないが、単に本開示の製剤または組成物において使用され得る例示的な界面活性剤として提供される。含まれ得る界面活性剤は、これらに限定されないが、ソルビタンエステル、例えば、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０）、リポ多糖、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００およびＰＥＧ３０００）、ポロキサマー（すなわち、プルロニック（登録商標））、エチレンオキシドおよびポリエチレンオキシド（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、サポニン、リン脂質（例えば、レシチン）、およびそれらの組み合わせを含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、カプセル化剤が組成物に含まれ得る。カプセル化剤は、分子を隔離し、それらの安定化または可溶化を助けることができる。カプセル化剤は、当該技術分野において周知である。したがって、本明細書に記載されるカプセル化剤は、完全なリストを構成することは意図されないが、単に組成物において使用され得る例示的なカプセル化剤として提供される。組成物に含まれ得るカプセル化剤は、これらに限定されないが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、およびそれらの組み合わせ（例えば、α−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリン、およびそれらの組み合わせを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、張性調節剤が組成物に含まれ得る。液体組成物の張性は、例えば、非経口投与によって、組成物を患者に投与するとき、重要な考慮点である。張性調節剤は、よって、投与に好適な組成物の作製を助けるために使用され得る。張性調節剤は、当該技術分野において周知である。したがって、本明細書に記載される張性調節剤は、完全なリストを構成することは意図されないが、単に組成物において使用され得る例示的な張性調節剤として提供される。張性調節剤は、イオン性または非イオン性であり得、これらに限定されないが、無機塩、アミノ酸、炭水化物、糖、糖アルコール、および炭水化物を含む。例示的な無機塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、および硫酸カリウムを含み得る。例示的なアミノ酸は、グリシンである。例示的な糖は、グリセロール、プロピレングリコール、グルコース、スクロース、ラクトース、デキストロース、およびマンニトールなどの糖アルコールを含み得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、安定化剤が組成物に含まれ得る。安定化剤は、組成物における化合物の安定性を増加させるのに役立つ。これは、例えば、化合物の分解を低減または凝集を防止することによって起こり得る。理論によって縛られることを望むことなく、安定性を向上させるためのメカニズムは、溶媒からの化合物の隔離、または治療有効物質の遊離ラジカル酸化を阻害することを含み得る。安定化剤は、当該技術分野において周知である。したがって、本明細書に記載される安定化剤は、完全なリストを構成することは意図されないが、単に組成物において使用され得る例示的な安定化剤として提供される。安定化剤は、これらに限定されないが、乳化剤および界面活性剤を含み得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、保護剤が組成物に含まれ得る。保護剤は、薬学的に活性な成分（例えば、治療有効物質または化合物）を望ましくない条件（例えば、凍結もしくは凍結乾燥、または酸化によって引き起こされる不安定性）から保護する薬剤である。保護剤は、例えば、凍結保護剤、溶解保護剤、および抗酸化剤を含むことができる。凍結保護剤は、組成物がその凝固点未満の温度に曝露されるとき活性薬学的成分（例えば、アントラサイクリン化合物）の効力の喪失を防止するのに有用である。例えば、凍結保護剤は、再構成凍結乾燥製剤に含まれ得、製剤は、静脈内投与のために希釈前に凍結され得る。凍結保護剤は、当該技術分野において周知である。したがって、本明細書に記載される凍結保護剤は、完全なリストを構成することは意図されないが、単に組成物において使用され得る例示的な凍結保護剤として提供される。凍結保護剤は、これらに限定されないが、溶媒、界面活性剤、カプセル化剤、安定化剤、粘度調整剤、およびそれらの組み合わせを含む。凍結保護剤は、例えば、二糖（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース、およびトレハロース）、ポリオール（例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、およびズルシトール）、グリコール（例えば、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコール）を含み得る。
【０１０６】
溶解保護剤は、凍結乾燥に供された組成物の成分を安定化するのに有用である。例えば、治療有効物質は、再構成の前に溶解保護剤で凍結乾燥され得る。溶解保護剤は、当該技術分野において周知である。したがって、本明細書に記載される溶解保護剤は、完全なリストを構成することは意図されないが、単に組成物において使用され得る例示的な溶解保護剤として提供される。溶解保護剤は、これらに限定されないが、溶媒、界面活性剤、カプセル化剤、安定化剤、粘度調整剤、およびそれらの組み合わせを含む。例示的な溶解保護剤は、例えば、糖およびポリオールであり得る。トレハロース、スクロース、デキストラン、およびヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンは、溶解保護剤の非限定的な例である。
【０１０７】
抗酸化剤は、組成物の成分の酸化を防止するのに有用である。酸化は、薬物製品の凝集または薬物製品の純度もしくはその効力への他の有害効果をもたらし得る。抗酸化剤は、当該技術分野において周知である。したがって、本明細書に記載される抗酸化剤は、完全なリストを構成することは意図されないが、単に組成物において使用され得る例示的な抗酸化剤として提供される。抗酸化剤は、例えば、アスコルビン酸ナトリウム、クエン酸塩、チオール、メタ重亜硫酸塩、およびそれらの組み合わせであり得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、粘度調整剤が組成物に含まれ得る。粘度調整剤は、液体組成物の粘度を変化させる。これは、粘度が液体組成物の濾過しやすさにおいて重要な役割を果たすので、有益であり得る。組成物は、凍結乾燥および再構成前、または再構成後に濾過され得る。粘度調整剤は、当該技術分野において周知である。したがって、本明細書に記載される粘度調整剤は、完全なリストを構成することは意図されないが、単に組成物において使用され得る例示的な粘度調整剤として提供される。粘度調整剤は、溶媒、可溶化剤、界面活性剤、およびカプセル化剤を含む。組成物に含まれ得る例示的な粘度調整剤は、これらに限定されないが、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンおよびＮ−アセチル−システインを含む。
【０１０９】
ヒト腫瘍異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍活性
アルブミン結合プロドラッグＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７およびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７は、腫瘍細胞株において例外的な抗腫瘍活性を示し、遊離薬物ＡＥ−ケトおよびＡＥ−エステルのＩＣ５０は、ピコモル範囲（それぞれ、２５９および３３９ｐＭ、親化合物ＡＥの１３０ｐＭのＩＣ５０に相当、実施例４参照）であり、ヌードマウスにおけるいくつかのヒト腫瘍異種移植モデルにおいて、評価された全てのヒト腫瘍異種移植において部分および完全寛解を誘発した（図１３〜２３の例を参照されたい）。これは、約１３０〜１７０ｍｍ３の範囲の出発体積を有する小腫瘍およびまた最大約３８０ｍｍ３の出発体積を有する大腫瘍を含んだ。さらに、ほとんどの症例では、アルブミン結合プロドラッグＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７およびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７での療法は、長期寛解および相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の減少を誘発した。親化合物オーリスタチンＥ（ＡＥ）は、試験されたモデルにおいて主に不活性であるか、または限界腫瘍阻害のみを示した。腫瘍担持マウスモデルにおける実験手順および結果は、実施例５および図１３〜２３に詳細に記載される。
【０１１０】
治療方法
本明細書に記載される化合物および組成物は、様々な臨床応用に有用である。
【０１１１】
本明細書に記載される化合物および組成物は、腫瘍成長の延長または長期阻害を誘発することができる。特定の実施形態では、腫瘍成長の延長または長期阻害は、体重のいかなる減少もなく、骨髄毒性も全くないか、ほんのわずかである。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本開示は、悪性疾患を治療するための方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の本明細書に記載される化合物を含有する薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態は、癌、ウイルス疾患、自己免疫疾患、急性または慢性炎症疾患、ならびに細菌、真菌、および他の微生物によって引き起こされる疾患から選択される疾患に罹患している患者を治療するための方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の本開示による化合物を投与することを含む、方法を含む。
【０１１３】
本開示は、患者における状態または疾患を治療する方法であって、当該状態または疾患が、癌、ウイルス疾患、自己免疫疾患、急性または慢性炎症疾患、ならびに細菌、真菌、および他の微生物によって引き起こされる疾患から選択され、患者に、本明細書に記載される化合物または薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、癌は、血液癌または固形腫瘍癌である。いくつかの実施形態では、癌は、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、または黒色腫から選択される。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、癌は、腺癌、ブドウ膜黒色腫、急性白血病、聴神経腫、膨大部癌腫、肛門癌腫、星状細胞腫、基礎細胞腫、膵臓癌、結合組織腫瘍、膀胱癌、気管支癌腫、非小細胞気管支癌腫、乳癌、バーキットリンパ腫、子宮体癌腫、ＣＵＰ症候群、結腸癌、小腸の癌、卵巣癌、子宮内膜癌腫、胆嚢癌、胆嚢癌腫、子宮癌、子宮頸癌、頸部、鼻および耳腫瘍、血液学的新生物、有毛細胞白血病、尿道癌、皮膚癌、神経膠腫、精巣癌、カポジ肉腫、咽頭癌、骨癌、結腸直腸癌腫、頭頸部腫瘍、結腸癌腫、頭蓋咽頭腫、肝臓癌、白血病、肺癌、非小細胞肺癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、胃癌、結腸癌、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、腎臓癌、腎細胞癌腫、乏突起神経膠腫、食道癌腫、溶骨性癌腫および骨形成性癌腫、骨肉腫、卵巣癌腫、膵臓癌腫、陰茎癌、前立腺癌、舌癌、卵巣癌腫、またはリンパ腫癌である。
【０１１６】
いくつかの実施形態は、本開示による化合物を投与することを含む、腫瘍における化合物の代謝産物の濃度を増加させる方法を含む。
【０１１７】
変形および変更
本明細書に記載されるものの変形、変更、および他の実施は、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者に思いつくであろう。したがって、本開示は、先行する記載または以下の例に限定されない。
【０１１８】
例示
本開示の態様はここで一般的に記載され、これらは、単に本開示の特定の特徴および実施形態の例示の目的のために含まれ、限定することが意図されない、以下の例の参照によってより容易に理解されるであろう。
【０１１９】
等価物
当業者であれば、本明細書に記載される化合物、組成物、およびそれらの使用方法の多数の等価物を認識するか、または日常的にすぎない実験を用いて確認することができるであろう。そのような等価物は、本開示の範囲内であるとみなされる。
【実施例】
【０１２０】
化合物の調製および分析のための材料および方法
全ての反応は、別段に記載されない限り、窒素不活性雰囲気下で行った。市販の試薬は、別段に記載されない限り、さらなる精製なしで使用した。無水溶媒は、無水形態（ジクロロメタン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフランなど）で購入し、全ての他の使用される溶媒は、試薬グレードまたはＨＰＬＣもしくはＬＣＭＳグレードであった。
【０１２１】
ガラス製品および撹拌棒は一般に、オーブンにおいて１１０℃で少なくとも１２時間乾燥させ、次いで、適用可能な場合、使用前に窒素雰囲気下で冷却した。全ての他の反応は、ゴム隔膜で封止された丸底フラスコにおいて行った。液体試薬を移すために、プラスチックシリンジまたはガラスピペットを使用した。反応物は、テフロン（登録商標）コーティングされた磁気撹拌棒を用いて磁気的に撹拌した。有機溶液は、減圧下、回転蒸発装置ＫＮＦ  ＲＣ  ６００およびＨｅｉｄｏｌｐｈ  Ｈｅｉ−ＶＡＰを用いて濃縮した。
【０１２２】
フラッシュカラムクロマトグラフィーは、予め充填されたＢｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰ  ＵｌｔｒａおよびＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  Ｃ１８フラッシュシリカゲルカートリッジで、Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｉｓｏｌｅｒａ（商標）ＯｎｅおよびＢｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｉｓｏｌｅｒａ（商標）ＳＬ（大規模）フラッシュ精製システムを用いて行った。
【０１２３】
溶液のｐＨ値は、室温で、ＳｅｎＴｉｘ（登録商標）ｍｉｃ−Ｄ電極を備えたｐＨメーターＷＴＷ  Ｉｎｏｌａｂ  ７３１０を用いて測定した。
【０１２４】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、ＳＰＤ−Ｍ２０Ａフォトダイオードアレイ検出器を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｎｅｘｅｒａ  ＸＲ  ＨＰＬＣシステムを用いて行い、別段に記載されない限り、２２０ｎｍで監視された。
【０１２５】
低分解能質量スペクトル（ＬＲＭＳ）は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｍａｚｏｎ  ＳＬまたはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＬＣＱアドバンテージ分光計（エレクトロスプレーイオン化、ＥＳＩ）で質量分析と組み合わされた液体クロマトグラフィー（ＬＣＭＳ）を用いて収集した。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化および飛行時間質量分析計（ＥＳＩ−ＴＯＦ）を用いるＢｒｕｋｅｒからのｍｉｃｒＯＴＯＦ装置で記録した。元素分析は、Ｃ、Ｈ、およびＳについてＩＲ検出器を備え、Ｎについて熱伝導度検出器（ＴＣＤ）を備えた、Ｌｅｃｏ  ＴｒｕＳｐｅｃ（登録商標）ＣＨＮＳ  Ｍａｃｒｏで行った。
【０１２６】
凍結乾燥は、Ｍａｒｔｉｎ  Ｃｈｒｉｓｔ  ＡｌｐｈａまたはＥｐｓｉｌｏｎ  ２−４  ＬＳＣｐｌｕｓ凍結乾燥機を用いて行った。
【０１２７】
遠心分離は、Ｒｏｔｏｒ  Ａ−４−８１、２３０Ｖ／５０−６０Ｈｚを備え、冷蔵された、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機５８１０Ｒを用いて行った。
【０１２８】
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有量は、イオンクロマトグラフィーを用いて測定し、含水量は、Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ（ＫＦ）電量分析を用いて測定した。
【０１２９】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、周囲温度で、４００ＭＨｚ分光計で記録した。Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ４００  Ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄ（１Ｈにおいて４００ＭＨｚ、１３Ｃにおいて１００ＭＨｚ）。プロトン化学シフトの全ての値は、百万分率（δ）で報告され、ＤＭＳＯ−ｄ６（δ２．５０）における重水素化プロトンが参照される。炭素化学シフトの全ての値は、百万分率（δ）で報告され、ＤＭＳＯ−ｄ６（δ３９．５２）における炭素共鳴が参照される。ＮＭＲデータは、以下のように表される：化学シフト、多重特異性（ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｐ＝五重項、ｍ＝多重項、ｂｒ＝ブロード、ｄｄ＝二重項の二重項、ｔｄ＝二重項の三重項）、結合定数＝Ｊ（Ｈｚ＝ヘルツ）、および統合。
【０１３０】
ＨＰＬＣ方法
方法１：リンカー中間体および最終生成物Ｓｕｌｆ０７純度のためのＨＰＬＣ方法。カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｐｏｌａｒ  Ｃ１８（１５０×４．６ｍｍ、２．６μｍ、１００Å）、勾配：移動相Ａ：９５：５酢酸アンモニウム１０ｍＭ  ｐＨ７．０：アセトニトリル、移動相Ｂ：９５：５、アセトニトリル：酢酸アンモニウム１０ｍＭ  ｐＨ７．０．Ｂ相の溶出勾配：０〜２．５分：０％、２．５〜１８分：０〜４５％、１８〜２０分：４５〜７５％、２０〜２４分：７５％、２４〜２６分：７５％〜０％、２６〜３０分：０％、３０分：方法終了、流量＝１．０ｍＬ／分。
【０１３１】
方法２：実施例２および実施例３のためのＨＰＬＣ方法。カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｐｏｌａｒ  Ｃ１８（１５０×４．６ｍｍ、２．６μｍ、１００Å）、勾配：移動相Ａ：９５：５酢酸アンモニウム１０ｍＭ  ｐＨ７．０：アセトニトリル、移動相Ｂ：９５：５、アセトニトリル：酢酸アンモニウム１０ｍＭ  ｐＨ７．０．Ｂ相の溶出勾配：０〜０．５分：３０％、０．５〜９分：３０〜９５％、９〜１１分：９５％、１１〜１２．５分：９５〜３０％、１２．５〜１５分：３０％、１５分：方法終了、流量＝１．０ｍＬ／分。
【０１３２】
方法３：リンカー中間体および最終生成物Ｓｕｌｆ０７のためのＬＣＭＳ方法。カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｐｏｌａｒ  Ｃ１８（１５０×２．１ｍｍ、２．６μｍ、１００Å）、勾配：移動相Ａ：９５：５酢酸アンモニウム１０ｍＭ  ｐＨ７．０：アセトニトリル、移動相Ｂ：９５：５、アセトニトリル：酢酸アンモニウム１０ｍＭ  ｐＨ７．０．Ｂ相の溶出勾配：０〜２．５分：０％、２．５〜１８分：０〜４５％、１８〜２０分：４５〜７５％、２０〜２４分：７５％、２４〜２６分：７５％〜０％、２６〜３０分：０％、３０分：方法終了。流量＝０．４ｍＬ／分。
【０１３３】
方法４：実施例２および実施例３のためのＬＣＭＳ方法。カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｏｍｅｇａ  Ｐｏｌａｒ  Ｃ１８（５０×２．１ｍｍ、１．６μｍ、１００Å）、勾配：移動相Ａ：９９．９：０．１水：ギ酸、移動相Ｂ：９９．９：０．１アセトニトリル：ギ酸。Ｂ相の溶出勾配：０〜０．５分：２０％、０．５〜３．５分：２０〜１００％、３．５〜５．０分：１００％、５．０〜５．５分：１００〜２０％、５．５〜７．０分：２０％、７分：方法終了。流量＝０．４ｍＬ／分。
【０１３４】
方法５：血漿結合実験のためのＬＣＭＳ方法。カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｐｏｌａｒ  Ｃ１８（５０×２．１ｍｍ、２．６μｍ、１００Å）、勾配：移動相Ａ：９５：５酢酸アンモニウム１０ｍＭ  ｐＨ７．０：アセトニトリル、移動相Ｂ：９５：５、アセトニトリル：酢酸アンモニウム１０ｍＭ  ｐＨ７．０．Ｂ相の溶出勾配：０〜１．０分：０％、１．０〜７．０分：０〜７５％、７．０〜７．５分：７５〜９０％、７．５〜８．５分：９０〜０％、８．５〜１０．０分：０％、１０分：方法終了、流量＝０．４ｍＬ／分。
【０１３５】
方法６：血漿結合のための疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法。カラム：ＭａｂＰａｃ  ＨＩＣ−２０（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ、１００Å）、勾配：移動相Ａ：１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４ｐＨ８．０、移動相Ｂ：２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４ｐＨ８．０および２０％イソプロパノール。Ｂ相の溶出勾配：０〜２．０分：０％、２．０〜１０．０分：０〜５０％、１０．０〜１３．０分：５０〜６０％、１３．０〜１７．０分：６０〜１００％、１７．０〜２０．０分：１００％、２０．０〜２５．０分：１００〜０％、２５．０〜３０．０分：０％、３０分：方法終了、流量＝１ｍＬ／分。
【０１３６】
方法７：アルブミン薬物コンジュゲートのｐＨ安定性プロファイルのためのＨＰＬＣ方法。カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ａｅｒｉｓ  ＷＰ  Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ、３．６μｍ、ワイドポア）、勾配：移動相Ａ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝剤ｐＨ８．０、移動相Ｂ：９０％アセトニトリルＵＨＰＬＣおよび１０％水。Ｂ相の溶出勾配：０〜０．５分：２５％、０．５〜２．５分：２５〜３５％、２．５〜１６．０分：３５〜８５％、１６．０〜１７．０分：８５〜９５％、１７．０〜２０．０分：９５％、２０．０〜２５．０分：９５〜２５％、２５．０〜３０．０分：２５％、３０分：方法終了、流量＝１．０ｍＬ／分。
【０１３７】
方法８：ＡＰＩの製剤の加速分解のためのＨＰＬＣ方法。カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｐｏｌａｒ  Ｃ１８（１５０×４．６ｍｍ、２．６μｍ、１００Å）、勾配：移動相Ａ：９５：５酢酸アンモニウム１０ｍＭ  ｐＨ７．０：アセトニトリル、移動相Ｂ：９５：５、アセトニトリル：酢酸アンモニウム１０ｍＭ  ｐＨ７．０．Ｂ相の溶出勾配：０〜２．５分：２０％、０．５〜９分：２０〜７５％、９〜１１分：７５％、１１〜１２．５分：７５〜２０％、１２．５〜１５分：２０％、１５分：方法終了、流量＝１．０ｍＬ／分。
【０１３８】
方法９：経路Ｃによって調製されたリンカー中間体および最終生成物Ｓｕｌｆ０７純度のためのＨＰＬＣ方法。カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｐｏｌａｒ  Ｃ１８（１５０×４．６ｍｍ、２．６μｍ、１００Å）、勾配：移動相Ａ：Ｈ２Ｏ中の０．１％トリフルオロ酢酸、移動相Ｂ：アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸。Ｂ相の溶出勾配：０〜５．５分：１％、５．５〜２０分：１〜４０％、２０〜２２分：４０〜６５％、２２〜２４分：６５％、２４〜２７分：６５％〜１％、２７〜３０分：１％、３０分：方法終了、流量＝１．０ｍＬ／分。
【０１３９】
方法１０：経路Ｃによって得られたリンカーＳｕｌｆ０７から調製されたＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の純度のためのＨＰＬＣ方法。Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｐｏｌａｒ  Ｃ１８カラム（２．６μｍ、１００Å、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）、勾配：移動相Ａ：９５：５酢酸アンモニウム５ｍＭ  ｐＨ７．０：メタノール、移動相Ｂ：９５：５メタノール：酢酸アンモニウム５ｍＭ  ｐＨ７．０。Ｂ相の溶出勾配：０〜２．５分：６０％、２．５〜１８分：６０〜８０％、１８〜２２分：８０〜９５％、２２〜２６分：９５％、２６〜３０分：方法終了。流量＝１．０ｍＬ／分。カラムオーブン：３７℃。
【０１４０】
実施例１
Ｓｕｌｆ０７、５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−２−（ヒドラジン−カルボニル）−ベンゼンスルホン酸）を、経路Ａに従って、以下に記載され、スキーム１に示されるように調製した。
【化２４】
2021505541.tif 000026
スキーム１、経路Ａ
４−ニトロ−２−スルホ安息香酸の合成（Ａ）
【化２５】
2021505541.tif 000027
【０１４１】
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水（４５０ｍＬ）中の過マンガン酸カリウム（７２ｇ、４６０ｍｍｏｌ、４．５当量、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の撹拌溶液に、１０秒以内に、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水（１００ｍＬ）中の４−ニトロ−２−スルホン酸水和物（２６ｇ、１０２ｍｍｏｌ、１．０当量、Ａｂｃｒ）の溶液を添加した。得られた紫色の混合物を、１１５℃で５時間撹拌し、これは、この時間後に褐色に変わった。ＨＰＬＣ（方法１、２２０ｎｍ）は、反応が５時間後に完了したことを確認した。反応混合物を、室温まで冷却した。反応中に形成された褐色の固体を、Ｃｅｌｉｔｅパッドでの吸引濾過を通して除去し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水（３００ｍＬ）で洗浄し、褐色／黄色の濾過溶液を４０℃の減圧下で約１２５ｍＬに濃縮し、白色の懸濁液が形成される（約ｐＨ１）まで５ＭのＨＣｌ溶液でゆっくりと酸性化した。白色の懸濁液を次いで、透明な溶液が得られるまで１００℃で加熱し、これを、白色の固体が形成されるまで、氷浴に１０分間放置した。白色の固体を、フリットフィルター（ポアサイズ４）を用いる吸引濾過によって得た。白色の固体を次いで、高真空下で１０時間乾燥させ、Ａを得た。収率：１８ｇ、７２％。ＨＰＬＣ（方法１、２２０ｎｍ）による純度＞９５％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ７Ｈ４ＮＯ７Ｓ［Ｍ−Ｈ］−の計算：２４５．９８。実測：２４５．８３。
４−アミノ−２−スルホ安息香酸の合成（Ｂ）
【化２６】
2021505541.tif 000028
【０１４２】
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水（７５ｍＬ）中の４−ニトロ−２−スルホ安息香酸Ａ（１３ｇ、５１ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌懸濁液を、完全溶解まで還流（１２０℃）で加熱した。その温度で、酢酸（７．２ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、続いて鉄粉（９．５ｇ、１８０ｍｍｏｌ、３．５当量、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を少量ずつ（約１ｇ／１．０分）１０分かけて添加し、発熱反応を回避した。反応混合物を次いで、還流下で１時間撹拌しておいた。この時間中、形成された褐色の固体およびＨＰＬＣ分析（方法１、２２０ｎｍ）は、反応が完了したことを確認した。褐色の固体を、（熱いうちに）直接Ｃｅｌｉｔｅパッド上での吸引濾過によって除去し、熱水（３×５０ｍＬ）でさらに洗浄した。濾液を次いで、Ｗｈａｔｍａｎフィルターペーパー（１１μｍ）を通して濾過した。得られた濾液を、減圧下、５０℃で、約１００ｍＬの体積まで濃縮した。濃縮ＨＣｌを、ｐＨ１が達成されるまで滴下（約１ｍＬ／２．０分）し、白色／黄色の固体が沈殿した。懸濁液を、４℃で１時間放置した。固体を、フリットフィルター（ポアサイズ４）を用いる吸引濾過によって収集し、高真空下で１０時間乾燥させ、Ｂを白色の固体として得た。収率：９ｇ、８１％。ＨＰＬＣ（方法１、２２０ｎｍ）による純度＞９５％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ７Ｈ４ＮＯ５Ｓ［Ｍ−Ｈ］−の計算：２１６．００。実測：２１６．１６。
６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイルクロリドまたはＥＭＣ−Ｃｌの合成（Ｃ）
【化２７】
2021505541.tif 000029
【０１４３】
室温で窒素雰囲気下の乾燥ジクロロメタン（１５０ｍＬ）中の６−マレイミドカプロン酸（ＥＭＣ）の撹拌溶液（３３ｇ、１５６ｍｍｏｌ、１．０当量、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）に、３０分以内（約１ｍＬ／２分）に、滴下漏斗を用いて塩化オキサリル（１５ｍＬ、１７１ｍｍｏｌ、１．１当量、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。注意：添加プロセス中に気体発生が観察された。反応物を、室温で５時間撹拌した。反応溶液の色は、反応時間中に濃黄色に変化し、ＨＰＬＣ分析（方法１、２２０ｎｍ）は、反応が５時間後に完了したことを確認した。溶媒を、減圧下４０℃で除去して、油を得、それを高真空下で乾燥させ、凝固化合物を得た。得られた淡褐色の固体を、スパチュラで粉砕し、高真空下でさらに２０時間乾燥させて、Ｃを黄色の微結晶固体として得た。化合物を、さらなる精製なしで次の反応に使用した。収率：３４ｇ、９５％。ＨＰＬＣ（方法１、２２０ｎｍ）による純度メチルエステルとして＞９５％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ１１Ｈ１６ＮＯ４（メチルエステルとして）［Ｍ＋Ｈ］＋の計算：２２６．１０。実測：２２５．９７。
４−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−２−スルホ安息香酸の合成（Ｄ）
【化２８】
2021505541.tif 000030
【０１４４】
Ｂ（１８．５ｇ、８５ｍｍｏｌ、１．０当量）を、窒素雰囲気下で無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３００ｍＬ）に溶解した。溶液を、氷浴で冷却し、１０分間撹拌しておき、４℃に達した。次いで、４−メチルモルホリン（１８．６９ｍＬ、１７０ｍｍｏｌ、２．０当量、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、滴下漏斗を用いて１時間以内に冷却した溶液に滴下（約１ｍＬ／３．５分）した。添加が完了したとき混合物は濃褐色となり、この濃褐色混合物に、１時間以内に滴下漏斗を用いて、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）中のＣ（２９．２８ｇ、１２７ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液を滴下（約０．５ｇ／分）した。反応混合物を、一晩室温まで徐々に温め、次いで室温で１０時間撹拌させた。ＨＰＬＣ（方法１、２２０ｎｍ）によって示されるように反応の完全変換後、反応溶液を、８×５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに分注し、２０分間１０℃および４．０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を除去し、固体を各チューブあたり１０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに再懸濁させ、２０分間１０℃および４．０００ｒｐｍで再度遠心分離した。全ての上清を組み合わせ、減圧下、５０℃で３時間濃縮して、淡橙色の固体（収率：３４ｇ、ＨＰＬＣ（方法１、２２０ｎｍ）による純度６６％）を得た。この固体をメタノール（２５０ｍＬ）に再懸濁させ、８×５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、２０分間１０℃および４．０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を除去し、固体を各チューブあたり５ｍＬのメタノールに再懸濁させ、２０分間１０℃および４．０００ｒｐｍで再度遠心分離した。全ての固体を組み合わせ、高真空下で２４時間乾燥させて、Ｄを結晶黄色固体として得た。収率：２４ｇ、３７％。ＨＰＬＣ（方法１、２２０ｎｍ）による純度９７％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ１７Ｈ１７Ｎ２Ｏ８Ｓ［Ｍ−Ｈ］−の計算：４０９．０８。実測：４０９．１３。
２−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジン−１−カルボニル）−５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）ベンゼンスルホン酸またはＢＯＣ保護リンカーの合成（Ｅ）
【化２９】
2021505541.tif 000031
【０１４５】
窒素雰囲気下の無水Ｎ−Ｎ−ジメチルホルムアミド（３５０ｍＬ）中のＤ（１７ｇ、４１．４ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド−塩酸塩（ＥＤＣ−ＨＣｌ）（８．７２ｇ、４５．５ｍｍｏｌ、１．１当量、Ｒｏｔｈ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（６．１５ｇ、４５．５ｍｍｏｌ、１．１当量、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。反応混合物を、３０分室温で撹拌しておき、次いでｔｅｒｔ−ブチルカルバゼート（７．１２ｇ、５３．９ｍｍｏｌ、１．３当量、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、溶液は、透明な黄色から赤っぽい色に変化した。反応混合物を、室温で一晩撹拌した。この時間後、反応の完全変換がＨＰＬＣ（方法１、２２０ｎｍ）によって確認された。溶媒を、減圧下４０℃で、次いで高真空下、室温で１時間除去して、紫褐色の油を得、これを２つの予め充填されたＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  ３４０ｇカートリッジでのフラッシュ精製システムで精製した。精製を、６０カラム体積における１００％ジクロロメタンから９０％／１０％ジクロロメタン／メタノールまでの、線形勾配システムを用いて行った。所望の生成物を含有するチューブを組み合わせ、減圧下４０℃で１時間、および高真空下でさらに６時間乾燥させて、Ｅを発泡性の黄色の固体として得た。収率：９ｇ、１７．１ｍｍｏｌ、４２％。ＨＰＬＣ（方法１、２２０ｎｍ）＞９５％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ２２Ｈ２７Ｎ４Ｏ９Ｓ［Ｍ−Ｈ］−の計算：５２３．１６。実測：５２３．１５。
リンカーＳｕｌｆ０７、５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−２−（ヒドラジンカルボニル）ベンゼンスルホン酸の合成
【化３０】
2021505541.tif 000032
【０１４６】
４〜５℃に冷却された、無水ジクロロメタン（３０ｍＬ）中のＥ（１０．２ｇ、１９．４ｍｍｏｌ、１．０当量）の黄色の溶液に、トリフルオロ酢酸（１５ｍＬ、Ｒｏｔｈ）を、３０分以内に、滴下（約１ｍＬ／２．０分）した。添加後、冷浴を除去し、反応混合物を室温で３時間撹拌しておいた。この時間後、反応の完了がＨＰＬＣ（方法１、２２０ｎｍ）によって確認された。反応混合物を、各々約３５ｍＬの冷たいジエチルエーテルを含有する、６つのＦａｌｃｏｎチューブに滴下した。白色の沈殿物が直ちに形成された。チューブを４℃で３時間放置した。２０分間１０℃および４０００ｒｐｍでのＦａｌｃｏｎチューブの遠心分離後、上清を除去し、固体を各チューブあたり５ｍＬのジエチルエーテルに再懸濁させ、再度遠心分離（４０００ｒｐｍ、２０分、１０℃）した。上清を再度除去し、固体を収集し、高真空下で２０時間乾燥させて、リンカーＳｕｌｆ０７を白色の微結晶固体として得た。収率：１０ｇ、２３．６ｍｍｏｌ、９６％。ＨＰＬＣ（方法１、２２０ｎｍ）＞９５％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ１７Ｈ２１Ｎ４Ｏ７Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算：４２５．１１。実測：４２５．０７。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ１７Ｈ１９Ｎ４Ｏ７Ｓ［Ｍ−Ｈ］−の計算：４２３．１１。実測：４２３．１２。ＨＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ１７Ｈ２１Ｎ４Ｏ７Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算：４２５．１１２５。実測：４２５．１１２５。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ１７Ｈ１９Ｎ４Ｏ７Ｓ［Ｍ−Ｈ］−の計算：４２３．０９７８。実測：４２３．０９８０。
【０１４７】
５−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−２−（ヒドラジン−カルボニル）ベンゼンスルホン酸、Ｓｕｌｆ０７の構造を、１Ｈ  ＮＭＲによって確認した：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．９４（ｓ、１Ｈ、Ｃ１−ＮＨ）、１０．２７（ｓ、１Ｈ、Ｃ８−ＮＨ）、８．０１（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ４−ＣＨ）、７．９３（ｄｄ、Ｊ＝８．５、２．２Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ６−ＣＨ）、７．６８（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ７−ＣＨ）、７．００（ｓ、２Ｈ、Ｃ１５−ＣＨ、Ｃ１６−ＣＨ）、３．４０（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ、Ｃ１３−ＣＨ２）、２．３２（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ、Ｃ９−ＣＨ２）、１．６０（ｐ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ、Ｃ１０−ＣＨ２）、１．５２（ｐ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ、Ｃ１２−ＣＨ２）、１．２６（ｑ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、２Ｈ、Ｃ１１−ＣＨ２）、１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７２．２０（Ｃ８）、１７１．５４（Ｃ１４，Ｃ１７）、１６７．５９（Ｃ１）、１４５．７３（Ｃ５）、１４２．０９（Ｃ３）、１３４．９０（Ｃ１５，Ｃ１６）、１３２．０９（Ｃ７）、１２３．７９（Ｃ２）、１１９．４４（Ｃ６）、１１７．４７（Ｃ４）、３７．４２（Ｃ１３）、３６．６５（Ｃ９）、２８．２２（Ｃ１２）、２６．２１（Ｃ１１）、２４．９０（Ｃ１０）。元素分析Ｃ１７Ｈ２１Ｎ４Ｏ７Ｓの計算、Ｃ、４５．７１、Ｈ、４．２６、Ｎ、１１．８５、Ｓ、６．７８。実測：Ｃ、４６．２９１７、Ｈ、４．４８３６、Ｎ、１２．８８７９、Ｓ、６．７８８６。ＴＦＡ含有量＜２％（重量／重量）。
【０１４８】
Ｓｕｌｆ０７、５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−２−（ヒドラジン−カルボニル）ベンゼンスルホン酸を、経路Ｂに従って、以下に記載され、スキーム２に示されるように調製した。
【化３１】
2021505541.tif 000033
スキーム２、経路Ｂ
５−アミノ−２−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジン−１−カルボニル）ベンゼンスルホン酸の合成（Ｆ）
【化３２】
2021505541.tif 000034
【０１４９】
無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１０００ｍＬ）中の４−アミノ−２−スルホ安息香酸Ｂ（５０．００ｇ、２３０．２０ｍｍｏｌ、１．００当量）の懸濁液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、４０．２０ｍＬ、２９．７５ｇ、２３０．２０ｍｍｏｌ、１．００当量）を５分かけて添加した。ＥＤＣ−ＨＣｌ（４８．５４ｍｇ、２５３．２１ｍｍｏｌ、１．１０当量）を次いで添加し、混合物を２３℃で３０分間撹拌した。ｔｅｒｔ−ブチルカルバゼート（３３．４６ｇ、２５３．１８ｍｍｏｌ、１．１０当量）を次いで添加し、混合物を７０℃まで加熱し、２時間撹拌した。ＥＤＣ−ＨＣｌ（２４．３１ｇ、１２６．６８ｍｍｏｌ、０．５５当量）およびｔｅｒｔ−ブチルカルバゼート（１６．７６ｍｇ、１２６．６８ｍｍｏｌ、０．５５当量）の第２の部分を添加し、反応混合物を７０℃で１４時間さらに撹拌した。反応物を、２３℃まで冷却し、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）５４５（１００ｇ）を通して濾過した。Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）５４５を７００ｍＬのメタノールでさらに洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、７つの予め充填されたＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  ３４０ｇカートリッジを用いるフラッシュ精製システムによって精製した。精製を、１００％ジクロロメタンから７０％ジクロロメタン／３０％メタノールまでの、線形勾配システムを用いて行って、表題化合物Ｆを白色の固体として得た。収率：３２．５０ｇ、９８．０９ｍｍｏｌ、４２．６％、ＨＰＬＣ（方法１、２２０ｎｍ）＞９７％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ１２Ｈ１６Ｎ３Ｏ６Ｓ［Ｍ−Ｈ］−の計算：３３０．０８。実測：３３０．１７。
Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピルプロパン−２−アミニウム２−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ−カルボニル）ヒドラジン−１−カルボニル）−５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−）ヘキサンアミド）ベンゼンスルホン酸塩の合成（Ｅ）
【化３３】
2021505541.tif 000035
【０１５０】
無水ジメチルアセトアミド（１１０ｍＬ）および無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、２７５ｍＬ）の混合物中のＦ（２６．９７ｇ、８１．４０ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、無水テトラヒドロフラン（１６５ｍＬ）中の６−マレイミドカプロン酸塩化物Ｃ（２６．６０ｇ、１１５．８２ｍｍｏｌ、１．４２当量）の溶液を、一度に室温で添加した。透明な反応溶液を、室温で１０分間撹拌した。反応混合物を次いで、各々ジイソプロピルエーテル（１１００ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（１０．１５ｍＬ）を含有する、２つの２Ｌコニカルフラスコに撹拌しながら添加した。油が沈殿したら、上清を注意深く捨て、油をジイソプロピルエーテル（２×１００ｍＬ）で洗浄し、メタノールに溶解し、組み合わせ、溶媒を高真空下で除去した。得られた油を、６つの予め充填されたＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  ３４０ｇカートリッジを用いるフラッシュ精製システムによって精製した。精製を、１００％ジクロロメタンから８０％ジクロロメタン／２０％メタノールまでの、線形勾配システムを用いて行って、表題化合物Ｅを白色の固体として得た。収率：２４．００ｇ、３６．７１ｍｍｏｌ、４５．１％、ＨＰＬＣ（方法１、２２０ｎｍ）＞９５％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ２２Ｈ２７Ｎ４Ｏ９Ｓ［Ｍ−Ｈ］−の計算：５２３．１５。実測：５２３．３０。
５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−２−（ヒドラジン−カルボニル）ベンゼンスルホン酸（Ｓｕｌｆ０７）の合成
【化３４】
2021505541.tif 000036
【０１５１】
ジクロロメタン（１５０ｍＬ）中のＥ（２１．００ｇ、３２．１２ｍｍｏｌ、１．００当量）の冷たい溶液（４℃）に、トリフルオロ酢酸（２５．００ｍＬ、３７．２５ｇ、３２６．７０ｍｍｏｌ、１０．１７当量）を１時間かけて添加した。反応物を次いで、徐々に（３０分かけて）室温まで温め、１時間撹拌した。反応混合物を、分液漏斗を介して１時間かけて、０℃のジイソプロピルエーテル（１．４Ｌ）を含有する２Ｌコニカルフラスコに滴下した。得られた白色の固体を、４Å多孔性フリット漏斗を通して濾過し、ジクロロメタン（２×１０００ｍＬ）およびジイソプロピルエーテル（２×１０００ｍＬ）で連続して洗浄した。固体を、フリット漏斗で一晩室温で乾燥させておいた。さらなる乾燥を、高真空、２５℃で２時間行った。最終生成物Ｓｕｌｆ０７を、白色の固体として得た。収率：１３．５８ｇ、３２．００ｍｍｏｌ、９９．６％、ＨＰＬＣ（方法１、２２０ｎｍ）＞９６％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ１７Ｈ１９Ｎ４Ｏ７Ｓ［Ｍ−Ｈ］−の計算：４２３．１０。実測：４２３．２１。
【０１５２】
Ｓｕｌｆ０７、５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−２−（ヒドラジン−カルボニル）ベンゼンスルホン酸を、経路Ｃに従って、以下に記載され、スキーム２に示されるように調製した。
【化３５】
2021505541.tif 000037
スキーム２、経路Ｃ
５−アミノ−２−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジン−１−カルボニル）ベンゼンスルホン酸の合成（Ｆ）
【化３６】
2021505541.tif 000038
【０１５３】
無水アセトニトリル（６００ｍＬ）中のＢ（３０．００ｇ、１３８．１２ｍｍｏｌ、１．００当量）の懸濁液に、トリエチルアミン（４１．９３ｇ、５７．７６ｍＬ、４１４．３７ｍｍｏｌ、３．００当量）を添加し、混合物を１０分間撹拌した。その後、ｔｅｒｔ−ブチルカルバゼート（２７．３８ｇ、２０７．１９ｍｍｏｌ、１．５０当量）を添加し、混合物を−３５℃まで冷却した。この温度で、プロピルホスホン酸無水物溶液、Ｔ３Ｐ、（１１４．２７ｇ、１０６．７９ｍＬ、１７９．５６ｍｍｏｌ、酢酸エチル中の５０％ｓｏｌ．、１．３当量）を１時間かけて滴下した。反応物を、−３５℃で２時間撹拌した。混合物を、室温まで温め、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）５４５（１００ｇ）を通して濾過した。Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を、アセトニトリル（５００ｍＬ）でさらに洗浄した。両方の濾液を組み合わせ、２５０ｍＬに濃縮した。溶液を６つの部分に等しく分割し、溶媒を減圧下で除去した。各部分を、１％Ｅｔ３Ｎを含有するジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｓｏｌｅｒａ（商標）Ｏｎｅ  Ｆｌａｓｈ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで、予め充填されたＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  ３４０ｇカラムでの、７のカラム体積にかけてＤＣＭ（１％ＮＥｔ３含有）中の２％から１２％までのメタノール（１％ＮＥｔ３含有）の段階的な勾配を用いる、ＮＰフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。次いで、全ての部分からの精製画分を組み合わせ、溶媒を減圧下で除去し、固体を高真空下で乾燥させて、表題化合物Ｆをオフホワイト色の固体として得た。収率：５３．２５ｇ、１０８．０ｍｍｏｌ、７８．２％（ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＮＭＲは１．６当量トリエチルアミンの存在を示した）。ＨＰＬＣ（方法９、２２０ｎｍ）＞９９％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ１２Ｈ１６Ｎ３Ｏ６Ｓ［Ｍ−Ｈ］−の計算：３３０．０８。実測：３３０．０８。
Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピルプロパン−２−アミニウム２−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ−カルボニル）ヒドラジン−１−カルボニル）−５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−）ヘキサンアミド）ベンゼンスルホン酸塩の合成（Ｅ）
【化３７】
2021505541.tif 000039
【０１５４】
Ｆ（４５．００ｇ、９１．２４ｍｍｏｌ、１．００当量）および６−マレイミドカプロン酸（１９．２７ｇ、９１．２４ｍｍｏｌ、１．００当量）の混合物に、アセトニトリル（４５０ｍＬ）、トリエチルアミン（１３．８５ｇ、１９．０８ｍＬ、１３６．８６ｍｍｏｌ）およびＴ３Ｐ（４３．５５ｇ、４０．７０ｍＬ、１３６．８６ｍｍｏｌ、酢酸エチル中の５０％ｓｏｌ．）を一度に室温で添加した。溶液を、室温で２４時間撹拌した。溶媒を、減圧下で除去した。粗生成物を次いで、ジクロロメタン中の２％メタノールから１５％メタノールまでの線形勾配を形成する７つの予め充填されたＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  ３４０ｇカートリッジを用いるフラッシュ精製システムによって精製して、表題化合物Ｅをオフホワイト色の固体として得た。収率：３０．５５ｇ、５３．５％（ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＮＭＲは１．１当量のトリエチルアミンの存在を示した）。ＨＰＬＣ（方法９、２２０ｎｍ）＞９９％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ２２Ｈ２７Ｎ４Ｏ９Ｓ［Ｍ−Ｈ］−の計算：５２３．１５。実測：５２３．２６。
５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−２−（ヒドラジン−カルボニル）ベンゼンスルホン酸（Ｓｕｌｆ０７）の合成
【化３８】
2021505541.tif 000040
【０１５５】
ジクロロメタン（５０ｍＬ）中のＥ（１０．００ｇ、１５．９８ｍｍｏｌ、１．００当量）の冷たい懸濁液（４℃）に、トリフルオロ酢酸（１８．２２ｇ、１２．３１ｍＬ、１５９．８１ｍｍｏｌ、１０．１７当量）を１５分かけて添加した。混合物を４℃で１５分間さらに撹拌し、次いで室温まで徐々に温め、１５０分間撹拌した。反応混合物を、分液漏斗を介して、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ＭＴＢＥ、（４００ｍＬ）、およびジクロロメタン（２００ｍＬ）の撹拌溶液に滴下した。得られた白色の固体を、４Ａ多孔性フリット漏斗を通して濾過し、ジクロロメタン（２×１５０ｍＬ）およびＭＴＢＥ（１×５０ｍＬ）、ＭｅＯＨ（１×５０ｍＬ）、ならびに再度ＭＴＢＥ（２ｘ１５０ｍＬ）で連続して洗浄した。固体を、フリット漏斗で一晩室温で１０分間乾燥させておいた。さらなる乾燥を、高真空、２５℃で１８時間行った。最終生成物Ｓｕｌｆ０７を、黄色の固体として得た。収率：５．７８６ｇ、１３．６３ｍｍｏｌ、９８．７％、ＨＰＬＣ（方法９、２２０ｎｍ）＞９６％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ１７Ｈ１９Ｎ４Ｏ７Ｓ［Ｍ−Ｈ］−の計算：４２３．１０。実測：４２２．９５。
【０１５６】
実施例２
化合物ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７、２−（２−（（Ｒ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−１−フェニルプロピリデン）ヒドラジン−１−カルボニル）−５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）ベンゼンスルホン酸を、以下に記載され、スキーム５に示されるように合成した。
【化３９】
2021505541.tif 000041
スキーム５
（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｒ）−１−オキソ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）アミノ）−Ｎ，Ｎ，３−トリメチル−１−オキソブタン−２−アミニウム２，２，２−トリフルオロ酢酸塩（ＡＥ−ケトＴＦＡ塩）の合成
【化４０】
2021505541.tif 000042
【０１５７】
経路Ａ：特許ＵＳ６８８４８６９−Ｂ２の改善した手順による合成
クロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）（３８２ｍｇ、１．７７２ｍｍｏｌ、１．５当量、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、無水ジクロロメタン（３０ｍＬ）中のオーリスタチンＥ  ＴＦＡ塩（１０００ｍｇ、１．１８３ｍｍｏｌ、Ｌｅｖｅｎａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）の溶液に窒素雰囲気下で添加した。反応混合物を、室温で１７時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ（方法４、ポジティブモード）は、出発材料の完全変換を示した。反応混合物を、２５ｍＬのジクロロメタンで希釈し、ブライン（３×２０ｍＬ）で洗浄した。水相を、１回ジクロロメタン（２０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機相を、減圧下４０℃で蒸発させた。残留物を７．５ｍＬのアセトニトリルに溶解し、１６のカラム体積にわたる水（＋０．１％ＴＦＡ）中の２％から４０％までのアセトニトリル（＋０．１％ＴＦＡ）の段階的勾配を用いて、予め充填されたＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  Ｃ１８  ３０ｇカートリッジでのＲＰフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋の生成物画分をプールし、アセトニトリルを減圧下４０℃で除去し、残留溶媒を凍結乾燥して、白色の固体を得た。収率：５３０ｍｇ、５３％。ＲＰ−ＨＰＬＣ（方法２、２２０ｎｍ）：＞９５％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ４０Ｈ６８Ｎ５Ｏ７［Ｍ＋Ｈ］＋の計算：７３０．５１。実測：７３０．３４。
【０１５８】
経路Ｂ：ポリマー結合酸化剤を用いる合成
ＩＢＸ−ポリスチレン（１．１３ｇ、４．５ｅｑ、１．３４ｍｍｏｌ、装填１．１８ｍｍｏｌ／ｇ、Ｍｅｒｃｋ  Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を、無水ジクロロメタン（７．５ｍＬ）に懸濁させ、１５分間室温で穏やかに撹拌した。無水ジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解したＡＥ  ＴＦＡ塩（２５０ｍｇ、２９５．５１μｍｏｌ、Ｓａｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を添加し、混合物を穏やかに室温で撹拌した。２１時間後、出発材料の生成物への完全変換がＨＰＬＣ（方法２、２２０ｎｍ）によって観察された。樹脂を、折り畳んだフィルターペーパー（グレード３ｈｗ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）での濾過によって除去し、ジクロロメタンで洗浄し、組み合わされた濾液を減圧下４０℃で乾燥状態まで蒸発させた。油性残留物をジエチルエーテルで滴定し、オフホワイト色の沈殿物を形成し、これを高真空下で乾燥させ、発泡性のオフホワイト色の固体を得た。収率：１７１ｍｇ、６９％、ＨＰＬＣ（方法２、２２０ｎｍ）＞９９％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ４０Ｈ６８Ｎ５Ｏ７［Ｍ＋Ｈ］＋の計算：７３０．５１。実測：７３０．６９、Ｃ４０Ｈ６６Ｎ５Ｏ７［Ｍ−Ｈ］−の計算：７２８．５０。実測：７２８．７９。
２−（２−（（Ｒ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−１−フェニルプロピリデン）ヒドラジン−１−カルボニル）−５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）ベンゼンスルホン酸（ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７）の合成
【化４１】
2021505541.tif 000043
【０１５９】
合成１：窒素下で、ＡＥ−ケトＴＦＡ塩（２００ｍｇ、２３６．９６μｍｏｌ）を、無水エタノール（６ｍＬ）に溶解し、続いて分子篩（０．３ｎｍビーズ、３Å）を添加した。無水ジメチルスルホキシド（１．５ｍＬ）に溶解したＳｕｌｆ０７（２０１ｍｇ、４７３．９２μｍｏｌ、２当量）を添加した。黄色の溶液を、室温で撹拌した。ＨＰＬＣ／ＬＣ−ＭＳ分析（方法２および４、２２０ｎｍ）のための試料を、２４および４４時間後に採取した。変換（４４時間後８５％）後、混合物を、０．２μｍ  ＰＶＤＦシリンジフィルターを通して濾過し、エタノールのほとんどを減圧下で除去した。３ｍＬの２００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．２を、溶液のｐＨが約６になるまで滴下した。溶液（約５ｍＬ）を、１６のカラム体積にわたる水中の２％から５０％までのアセトニトリルの段階的勾配を用いて、予め充填されたＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  Ｃ１８  ３０ｇカートリッジでのＲＰフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物画分をＨＰＬＣ（方法２、２２０ｎｍ）によって分析し、純粋な画分を組み合わせ、アセトニトリルを減圧下で除去し、残留溶液を凍結乾燥させて、オフホワイト色の飛散性固体を得た。収率：１１３ｍｇ、４２％、融点：＞１０５℃。ＨＰＬＣ（方法２、２２０ｎｍ）＞９５％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ５７Ｈ８６Ｎ９Ｏ１３［Ｍ＋Ｈ］＋の計算：１１３６．６１。実測：１１３６．７６、Ｃ５７Ｈ８４Ｎ９Ｏ１３［Ｍ−Ｈ］−の計算：１１３４．５９。実測：１１３５．０９。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．２１（２ｘｓ、１Ｈ）、１０．０９（２ｘｓ、１Ｈ）、８．６６（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．２０（２ｘｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．８４−７．６９（ｍ、２Ｈ）、７．５０−７．４１（ｍ、１Ｈ）、７．３５−７．２１（ｍ、５Ｈ）、６．９８（ｓ、２Ｈ）、４．９６−４．８４（ｍ、１Ｈ）、４．７７−４．６０（ｍ、１Ｈ）、４．５６（ｔｄ、Ｊ＝８．６、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．０３−３．９２（ｍ、１Ｈ）、３．６１−３．５２（ｍ、１Ｈ）、３．５１−３．４１（ｍ、２Ｈ）、３．３８（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．３５−３．３２（ｍ、１Ｈ）、３．２０（ｍ、７Ｈ）、３．０２（２ｘｓ、３Ｈ）、２．６１（２ｘｓ、６Ｈ）、２．４７−２．３７（ｍ、１Ｈ）、２．２６（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．２２−２．０４（ｍ、３Ｈ）、２．０４−１．９１（ｍ、１Ｈ）、１．８８−１．６３（ｍ、３Ｈ）、１．６２−１．４３（ｍ、７Ｈ）、１．３７−１．２７（ｍ、４Ｈ）、１．２７−１．１９（ｍ、２Ｈ）、１．０６（ｄ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、０．９８（ｄ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、０．９６−０．８８（ｍ、８Ｈ）、０．８７−０．８１（ｍ、５Ｈ）、０．８０−０．７３（ｍ、５Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７２．６７、１７２．３８、１７２．２６、１７１．４７、１７１．４５、１７１．１３、１７１．１０、１６８．７６、１６８．５２、１６６．６４、１６６．２３、１６４．８２、１６４．６１、１５６．６３、１５５．７５、１４４．７６、１４４．６８、１４０．２７、１４０．１４、１３４．４６、１３３．００、１３１．８９、１３��．７９、１２８．７８、１２８．５６、１２８．４０、１２８．３１、１２７．６６、１２７．６１、１２７．１０、１２０．２５、１１８．６６、１１８．５６、１１６．４７、１１６．３４、８５．４５、８１．３８、７７．６９、７６．７４、７１．９１、６０．９４、６０．２０、５８．５７、５８．１６、５７．０５、５５．０７、５４．４８、５４．３９、４９．２５、４８．８６、４７．１８、４６．２４、４３．５８、４３．１２、４１．５０、４１．４４、３７．１５、３６．９６、３６．１５、３５．０１、３１．８３、３１．５７、３０．０４、２９．９４、２７．７７、２６．６８、２６．６４、２５．７６、２５．３９、２５．２７、２４．５２、２４．５０、２４．２９、２３．１７、１９．３０、１９．２８、１８．８５、１８．６２、１８．５７、１８．４８、１８．２０、１７．１７、１６．９２、１５．５８、１５．５１、１５．２３、１４．９６、１０．４３、１０．２５。注記：いくつかの１Ｈ−ＮＭＲシグナルは、溶液における配座異性体の存在のために２つの異なるシグナルに分けられる。この理由で、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけるピークの数は、ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７について予想される炭素の数よりも高い。
【０１６０】
合成２：窒素下の２５ｍＬ丸底フラスコにおいて、ＡＥ−ケト（１５０ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ、１．０当量）および経路Ｃから得られたＳｕｌｆ０７（９３ｍｇ、０．２１３ｍｍｏｌ、１．２当量）を、無水ＥｔＯＨ（２２５μＬ）および無水ＤＭＳＯ（２２５μＬ）の混合物に溶解した。完全溶解は、室温での５分の超音波処理後に達成された。活性化分子篩を添加し、得られた黄色の懸濁液を室温で撹拌し、進行をＨＰＬＣ分析によって確認した。２２時間後、反応混合物を２ｍＬエッペンドルフチューブに移し、反応バイアルを２回６００μＬのＤＭＳＯ−ＥｔＯＨ（１：１）で洗浄し、組み合わされた部分を遠心分離した。固体を上清から分離した。生成物を、４５μＬのＭＴＢＥの上清への添加によって沈殿させた。白色の懸濁液を遠心分離し、得られた上清を廃棄した。標的化合物の精製を、２％〜５０％水／アセトニトリルの勾配を形成するＡＱ  Ｃ１８球形２０−３５ｕｍ  １００Ａ  ４０ｇｒカートリッジを備えたＩｓｏｌｅｒａ  Ｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｔａｇｅ  ＡＢ、Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で行った。凍結乾燥後、表題化合物を、オフホワイト色の固体として得た。収率８０ｍｇ、４０％。ＨＰＬＣ（方法１０、２２０ｎｍ）＞９７％。以前の報告に従ったＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳ分析。
【０１６１】
実施例３
化合物ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７、２−（２−（１−（４−（（（１Ｓ，２Ｒ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｒ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−１−フェニルプロポキシ）カルボニル）フェニル）エチリデン）ヒドラジン−１−カルボニル）−５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）ベンゼンスルホン酸を、以下に記載され、スキーム６に示されるように合成した。
【化４２】
2021505541.tif 000044
スキーム６
（１Ｓ，２Ｒ）−２−（（３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−１−フェニルプロピル４−アセチル安息香酸塩（ＡＥ−エステル）の合成
【化４３】
2021505541.tif 000045
特許ＵＳ６８８４８６９−Ｂ２の改善した手順による合成
【０１６２】
分子篩（０．３ｎｍビーズ、３Å）の存在下での無水ジクロロメタン（１８ｍＬ）中のオーリスタチンＥ  ＴＦＡ塩（１．０ｇ、１．１８ｍｍｏｌ、１．０当量、Ｌｅｖｅｎａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）および４−アセチル安息香酸（１９８ｍｇ、１．４２ｍｍｏｌ、１．２当量、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）の溶液に、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、２４４ｍｇ、２．３６ｍｍｏｌ、２．０当量、Ｃａｒｂｏｌｕｔｉｏｎ）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、１８６μＬ、１．４２ｍｍｏｌ、１．２当量、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。混合物を、室温で５時間撹拌した。反応の進行をＨＰＬＣ（方法２、２２０ｎｍ）によって監視し、８１％の所望の生成物への変換を示した。ＤＩＣ（１５５μＬ、１．１８ｍｍｏｌ、１．０当量、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）をさらに添加し、混合物を室温で１８時間撹拌しておき、この後ＨＰＬＣは、所望の生成物への９８％反応変換を示した。異なるバッチの化合物の合成中、新たに開けたボトルからの新鮮なＤＩＣが使用されるとき、第２の添加の必要性がないことが留意された。分子篩および微細に形成された沈殿物、ＤＩＣ副生成物を、折り畳んだフィルターペーパー（グレード３ｈｗ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通して濾過し、得られた透明な黄色の溶液を１回ＨＣｌ（０．１Ｍ、１５ｍＬ）で洗浄した。水層を１回ジクロロメタン（１５ｍＬ）で逆抽出し、有機層を次いで組み合わせ、１回ブライン（１５ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶液を減圧下で４０℃で濃縮して、黄色の油を得、これを次いで最小限の量のジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解した。過剰なジエチルエーテル（５０ｍＬ）を添加して、白色の固体を生成した。混合物を、２〜４℃で３０分間放置し、次いで固体を遠心分離によって分離した。沈殿手順を３回繰り返し、白色の粉末を減圧下で乾燥させた。収率：７０６ｍｇ、６８％収率。ＨＰＬＣ（方法２、２２０ｎｍ）による純度９８％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ４９Ｈ７５ＦＮ５Ｏ９［Ｍ＋Ｈ］＋の計算：８７９．２０。実測：８７８．７０。
２−（２−（１−（４−（（（１Ｓ，２Ｒ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｒ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−１−フェニルプロポキシ）カルボニル）フェニル）エチリデン）ヒドラジン−１−カルボニル）−５−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）ベンゼンスルホン酸（ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７）の合成
【化４４】
2021505541.tif 000046
【０１６３】
無水ジメチルスルホキシド（２ｍＬ）中のＳｕｌｆ０７（１６４ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液を、分子篩（０．３ｎｍビーズ、３Å）の存在下で無水エタノール（８ｍＬ）中のＡＥ−エステル（２４３ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に添加した。パラトルエンスルホン酸（１０．５ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、０．２当量）を添加して反応を触媒し、反応物を次いで室温で撹拌した。パラトルエンスルホン酸の代わりにＴＦＡを使用することもできた。反応をＨＰＬＣ（方法２、２２０ｎｍ）によって監視し、１５時間後に完全変換を示した。分子篩および形成された微細な沈殿物を、折り畳んだフィルターペーパー（グレード３ｈｗ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通した濾過によって反応溶液から除去した。溶液を過剰な量のメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（６０ｍＬ）で沈殿させ、混合物を２〜４℃で３０分間放置した。沈殿物を次いで、遠心分離によって分離して、黄色の粘着性の固体を達成した。黄色の粘着性の固体をメタノール／ジクロロメタン３／７（１０ｍＬ）に溶解し、溶液を、予め充填されたＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  ２５ｇカートリッジで、フラッシュ精製システムに注射した。精製を、１７のカラム体積における１００％ジクロロメタンから６０％ジクロロメタン／４０％メタノールまでの、段階的勾配を用いて、順相で行った。生成物を含有するチューブを組み合わせ、高真空下で乾燥させた。収率：１６２ｍｇ、４５％収率。ＲＰ−ＨＰＬＣ（方法２、２２０ｎｍ）による純度９６％。ＬＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ６６Ｈ９３Ｎ９Ｏ１５Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算：１２８５．５８。実測：１２８４．２０。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．２４（ｄ、Ｊ＝５．３Ｈｚ、１Ｈ）、１０．２１（ｓ、１Ｈ）、９．２０（２ｘｂｒ．ｓ、１Ｈ）、８．３２−７．９０（ｍ、８Ｈ）、７．７４−７．７１（ｄｄ、Ｊ＝８．５、２．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．４１−７．２７（ｍ、５Ｈ）、７．００（ｓ、２Ｈ）、６．１３−６．０２（２ｘｄ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．８０−４．５１（ｍ、２Ｈ）、４．４１−４．２３（ｍ、１Ｈ）、４．０９−３．５５（ｍ、３Ｈ）、３．５４−３．３７（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、３Ｈ）、３．２７−３．１７（ｍ、８Ｈ）、３．００（ｓ、２Ｈ）、２．８８−２．６３（ｍ、５Ｈ）、２．３７−２．３０（ｍ、６Ｈ）、２．２２−１．８０（ｍ、４Ｈ）、１．７５−１．４８（ｍ、７Ｈ）、１．４２−１．２２（ｍ、６Ｈ）、１．１８−１．１１（ｍ、３Ｈ）、１．１０−１．０４（ｍ、３Ｈ）、１．００−０．７４（ｍ、２０Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ１７２．９３、１７２．６５、１７１．４４、１７０．９４、１６８．６１、１６８．４９、１６４．５９、１６４．５２、１６４．２４、１６４．１６、１４９．２０、１４４．８３、１４３．０５、１４２．９６、１４０．７１、１３７．９７、１３７．７８、１３４．３０、１３２．２５、１２９．４３、１２９．３８、１２９．３１、１２９．２１、１２８．３９、１２８．３１、１２６．４９、１２６．４４、１２６．３５、１２５．７２、１１８．７７、１１６．７７、８５．２０、８１．２６、７７．６５、７７．０４、７６．８４、６０．８２、６０．１２、５８．５９、５８．０３、５７．０１、４８．３５、４７．７６、４７．１５、４６．０３、４３．６０、４２．９９、３６．８９、３６．１１、３１．６４、２９．８９、２９．７３、２７．７０、２６．５６、２５．７０、２５．３３、２５．０４、２４．４２、２４．０４、２３．０３、１９．１６、１８．６３、１８．４４、１８．３７、１５．５０、１５．４７、１５．２９、１５．１４、１３．８８、１３．８４、１０．１９、１０．０４。注記：いくつかの１Ｈ−ＮＭＲシグナルは、溶液における配座異性体の存在のために２つの異なるシグナルに分けられる。この理由で、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけるピークの数は、ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７について予想される炭素の数よりも高い。
ｐＨ７．４およびｐＨ４．１でのＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７およびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７のヒト血清アルブミンコンジュゲートのｐＨ依存性放出（図１１および図１２）
【０１６４】
アルブミン結合オーリスタチン−Ｓｕｌｆ０７誘導体を、無水ＤＭＳＯ中の２ｍＭストック溶液として調製した。
【０１６５】
ｐＨ７．４での放出：１０００μＭの還元ヒト血清アルブミン（８８１μＭ遊離システイン−３４）および７２７．６μＬのＰＢＳ緩衝剤（４ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４および１５０ｍＭのＮａＣｌ）の４４２．４μＬを、封止したＨＰＬＣバイアルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。３０分のインキュベーション後、１３０μＬの適切なＤＭＳＯ薬物ストック溶液を、プレインキュベートしたバイアルに添加して、オーリスタチン薬物の２００μＭ溶液およびアルブミン（遊離システイン−３４）の３００μＭ溶液を生成した。混合物を１０分間３７℃で反応させ、次いでＨＰＬＣ（方法７、２０μＬ注射）によって分析した。注射を、１時間後、および次いで２４時間まで毎時間繰り返した。
【０１６６】
ｐＨ４．１での放出：１０００μＭの還元ヒト血清アルブミン（８８１μＭ遊離システイン−３４）および５３９．４μＬの水の４０８．５μＬを、封止したＨＰＬＣバイアルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。別個のバイアルにおいて、１９０μＬの酢酸ナトリウム緩衝剤５０ｍＭ  ｐＨ３．０および２４．７μＬの１Ｍ  ＨＣｌを、３７℃で３０分間インキュベートした。３０分のインキュベーション後、１２０μＬの適切なＤＭＳＯ薬物ストック溶液を、プレインキュベートしたバイアルに添加して、アルブミン薬物コンジュゲートを生成した。１０分のインキュベーション後、１３２μＬの酢酸ナトリウム緩衝剤溶液を添加して、オーリスタチン薬物誘導体の２００μＭ溶液およびアルブミン（遊離システイン−３４）の３００μＭ溶液を生成した。得られた溶液を、ＨＰＬＣ（方法７）によって直接分析した。バイアルからの注射を、１時間後、および次いで２４時間まで毎時間繰り返した。
【０１６７】
放出された遊離薬物のパーセンテージを、ＨＰＬＣによって、遊離薬物、すなわち、ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７のＡＥ−ケトおよびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７のＡＥ−エステルの較正曲線（２００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、および１２．５μＭ）で決定した。ＨＰＬＣ分析前に、薬物ストック溶液を、溶媒としてＤＭＳＯを用いて調製し、リン酸緩衝剤（４ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４および１５０ｍＭのＮａＣｌ）で１０倍に希釈した。薬物放出計算は、ＡＵＣ：２５４ｎｍのＡＥ−ケトおよび３１０ｎｍのＡＥ−エステル（局所ＵＶ最大値）に基づいた。放出されたＡＥ−エステルのパーセントは、ｐＨを７．４から４．１まで変化させた後放出されたＡＥ−ケトのパーセントよりも高かった（図１１および１２を比較されたい）。
【０１６８】
再構成安定性ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７およびＡＥ−ケト−ＥＭＣＨ（図１）
アルブミン結合ＡＥ−ケト薬物誘導体を、５％スクロース（重量／体積）および２％２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（２−ＨＰβＣＤ）を含有した５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ７．６において再構成した。両方の薬物を１２７７μＭ（４．５ｍｇ／ｋｇのマウス異種移植用量に等しい）の濃度で再構成し、両方の薬物の溶解をＨＰＬＣ（方法２、２５４ｎｍ）によって確認した。再構成された薬物の安定性を、マレイミド加水分解およびＡＰＩの喪失についてＨＰＬＣによって室温で１５分毎に２４０分の期間をかけて監視した。ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７は、ＡＥ−ケト−ＥＭＣＨよりも安定であった（図１参照）。
【０１６９】
再構成安定性ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７およびＡＥ−エステル−ＥＭＣＨ（図２）
アルブミン結合ＡＥ−エステル誘導体を、５％スクロース（重量／体積）および４％２−ＨＰβＣＤを含有した５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ７．６において再構成した。両方の薬物を６５５μＭ（２．４ｍｇ／ｋｇのマウス異種移植用量に等しい）の濃度で再構成し、両方の薬物の溶解をＨＰＬＣ（方法２、３１０ｎｍ）によって確認した。再構成された薬物の安定性を、マレイミド加水分解およびＡＰＩの喪失についてＨＰＬＣによって室温で１５分毎に２４０分の期間をかけて監視した。ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７は、ＡＥ−エステル−ＥＭＣＨよりも安定であった（図２参照）。
【０１７０】
ヒト血漿、ラット血漿、およびＣＤ１マウス血漿におけるオーリスタチン−Ｓｕｌｆ０７誘導体の結合キネティクス（図５〜１０）。
ＣＤ１マウス血漿およびＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット血漿を、−８０℃保存から除去し、室温に到達させた。解凍された血漿を、１３．６ｋＲＰＭで６０秒間スピンダウンし、フィルターニードル（５μｍ）およびその後０．４５μｍＣＡメンブレンを通して濾過した。
【０１７１】
全血を健康なヒトボランティア（ＥＤＴＡ収集チューブ）から取得し、血漿を３分間３０００ＲＰＭでスピンダウンすることによって赤血球から分離した。血漿を次いで、血液供与の２時間以内に直接使用した。３６０μＬの適切な血漿を各結合実験に使用した。
【０１７２】
全ての結合実験を３通り行った。血漿を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｃを用いて３７℃でインキュベートした。３０分のインキュベーション後、４０μＬの適切なアルブミン結合オーリスタチン−Ｓｕｌｆ０７誘導体をその再構成溶液に溶解し、血漿に添加した。試料（４０μＬ）を、１５秒、２分、４分、８分、および１５分後に取得した（５試料）。
【０１７３】
試料を、１６０μＬのアセトニトリル（内部標準として４μｇ／ｍＬの’ＭＭＡＥを含有する）に直ちに添加し、１分間ボルテックスした。
【０１７４】
溶液を、Ｉｍｐａｃｔ血漿沈殿プレート（６０秒間振盪）にピペット化し、９６ウェルプレートに真空によって濾過した。残った薬物を、ＭＲＭ  ＭＳ２ネガティブモード（多重反応モニタリング）を用いるＬＣＭＳ定量化（方法５、３０μＬ注射）によって決定した。親イオン：オーリスタチンＦ（質量−７４４．８）、ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７（質量−１１３５．１）、およびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７（質量−１２８３．２）。結合のパーセンテージを、ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７およびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７のＡＵＣと、各化合物のＬＣＭＳによって生成された較正曲線とを比較することによって決定した。
【０１７５】
手順：ヒト血清アルブミンのシステイン−３４へのオーリスタチン−Ｓｕｌｆ０７誘導体の結合特異性（図３〜４）。
アルブミン結合オーリスタチン−Ｓｕｌｆ０７誘導体を、２−ＨＰβＣＤを含有した５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ７．６および５％スクロースにおいて再構成した。それぞれ、２％ＨＰβＣＤ濃度を使用してＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７、４％でＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７を再構成した。両方の薬物を、１ｍｇ／ｍＬ（ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７  ７８０μＭ、ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７  ８８０μＭ）の濃度で再構成した。
【０１７６】
ヒト血漿を−８０℃保存から除去し、室温に到達させた。解凍された血漿を、１３．６ｋＲＰＭで６０秒間スピンダウンし、フィルターニードル（５μｍ）およびその後０．４５μｍＣＡメンブレンを通して濾過した。１８０μＬの適切な血漿を各結合実験に使用した。血漿を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｃを用いて３７℃でインキュベートした。３０分のインキュベーション後、２０μＬの適切なアルブミン結合オーリスタチン−Ｓｕｌｆ０７誘導体を添加した。アルブミン結合薬物を、血漿において５分間３７℃で反応させた。５分後、溶液をＨＰＬＣ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、方法６、２５０ｎｍ）によって直接分析して、アルブミンへの部位特異的コンジュゲーションおよびアルブミン薬物コンジュゲートの形成を確認した。
【０１７７】
凍結乾燥オーリスタチン製剤の加速分解：ＥＭＣＨおよびＳｕｌｆ０７安定性（図２４〜２５）
ＡＰＩを、２−ＨＰβＣＤ、１０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ６．２、５０％ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（体積／体積）を含有した凍結乾燥緩衝剤に溶解した。ＡＥ−ケト誘導体について、２％（重量／体積）２−ＨＰβＣＤを使用して、ＡＥ−ケトＡＰＩを１．２７ｍＭ濃度で溶解し、ＡＥ−エステル誘導体について、４％（重量／体積）２−ＨＰβＣＤを使用して、ＡＰＩを１．０５ｍＭ濃度で溶解した。溶解したＡＰＩを、Ａｃｒｏｄｉｓｃ  Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ  ＩＩシリンジフィルター（０．２μｍ）を用いて滅菌濾過した。滅菌溶液を、凍結乾燥バイアルにピペット操作し、これを次いで、ゴム栓を用いて部分的に封止した。バイアルをその後、凍結乾燥のために凍結乾燥機に入れた。バイアルを−４０℃で２時間凍結乾燥機で凍結し、２時間後、本乾燥を開始した。本乾燥を、２６時間、パラメータ：貯蔵温度−２０℃、真空０．００４８ｍｂａｒで行った。本乾燥後、最終乾燥を開始した。最終乾燥を、１６時間、パラメータ：貯蔵温度２０℃、真空０．００４７ｍｂａｒで行った。最終乾燥の完了後、バイアルを真空下で封止した。
【０１７８】
封止バイアルを、プレート挿入物（Ｓｍａｒｔｂｌｏｃｋ）および蓋を備えたＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｃを用いて５５℃でインキュベートした。選択される時点（ｔ：０、４６、９４、１６６、および２６４時間）で、試料を除去し、無水ＤＭＳＯに溶解した。ＡＰＩの安定性を、ＨＰＬＣ（方法８、ＡＥ−ケト誘導体は２５４ｎｍ、ＡＥ−エステル誘導体は３１０ｎｍ）によって決定した。各時点でのマレイミド加水分解のパーセンテージを、０時点での各ＡＰＩのＡＵＣへの比較によって決定した。ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７およびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７は、それぞれＥＭＣＨ誘導体ＡＥ−ケト−ＥＭＣＨおよびＡＥ−エステル−ＥＭＣＨよりも安定であった（図２４および図２５参照）。
【０１７９】
実施例４
腫瘍細胞株のパネルに対するオーリスタチンＥ、ＡＥ−ケト、およびＡＥ−エステルの評価のための一般的な手順
ＩＣ５０決定
試料は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｇｅｒｍａｎｙ  ＧｍｂＨに、薬学的グレードＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中の凍結ストック溶液として提供された。実験の各日に、ストック溶液の凍結されたアリコートを解凍した。その後の段階希釈は、中間体希釈プレートを用いて、完全なＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地で実現した。中間体希釈プレートから取得された１０μＬを次いで、１４０μＬ／ウェルの細胞培養プレートに移した。細胞を、１０の濃度の試験化合物で０．００３ｎＭから１００ｎＭまで９６時間の期間のハーフログステップにおいて３通りに処理した。
【０１８０】
化合物を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いることによって６つの選択されたヒト癌細胞株のパネルにおいて試験した。ＩＣ値は、試験された全ての細胞株にわたるＩＣ５０値の幾何平均として試験化合物について得られた、絶対ＩＣ５０値として報告される。
【０１８１】
使用された細胞株は、ＬＸＦＬ  １６７４Ｌ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｇｅｒｍａｎｙ  ＧｍｂＨの患者由来異種移植から構築される）、ＳＷ−６２０（ＮＣＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡによって親切に提供される）、ＣＡＬ−２７（ＤＳＭＺ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから購入される）、ＲＫＯ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、およびＳＫ−ＯＶ−３（ＡＴＣＣ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡから）であった。全ての細胞株の信頼性は、ＤＳＭＺでＳＴＲ（ショートタンデムリピート）分析、ＰＣＲベースのＤＮＡ−フィンガープリント方法によって証明された。細胞株を、週に１回または２回通常通りに継代し、最大２０回の継代にわたって培養に維持した。細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２を有する加湿雰囲気において、１０％（体積／体積）ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および０．１ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が補足されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌ−グルタミンを有する、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で成長させた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを、製造業者の指示に従って使用した。簡潔に、細胞を、対数期培養物から採取し、カウントし、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに、細胞株の成長速度に応じて４，０００〜１０，０００細胞／ウェルの細胞密度で播種した。細胞が対数成長を再開することを可能にする２４時間の回復期後、１０μＬの培養培地（６つの対照ウェル／プレート）または試験化合物を有する培養培地を添加した。化合物を、１０の濃度で３通りに最大１００ｎＭのハーフログ増分で適用し、細胞を９６時間継続して処理した。４日の細胞処理後、２０μＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を添加した。４時間までのインキュベーション期間後、蛍光（ＦＵ）を、Ｅｎｓｐｉｒｅ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（励起λ＝５３１ｎｍ、放出λ＝６１５ｎｍ）を用いることによって測定した。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ生体分析ソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で決定した。
【０１８２】
Ｓ字状濃度−効果曲線での濃度依存性活性が、試験された６つの腫瘍細胞株において観察された。幾何平均ＩＣ５０値は、ＡＥ−ケトについて２５９±０．１１ｐＭ、ＡＥ−エステルについて３９９±０．１９ｐＭであった。極めて強力な薬物ＭＭＡＥ（１７１±０．１０ｐＭ）およびＡＥ（１３０±０．０５ｐＭ）と比較して、ＡＥ−ケトおよびＡＥ−エステル誘導体は、ピコモル範囲の同様の細胞毒性を有する。
【０１８３】
実施例５
患者由来の腫瘍異種移植モデルにおけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体の評価の一般的な手順。
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｇｅｒｍａｎｙ  ＧｍｂＨからの雌免疫欠損ＮＭＲＩヌードマウスの左脇腹に、ヒト由来腫瘍での片側腫瘍インプラントを、イソフルラン麻酔下で、腫瘍が触診可能になり、所望の体積に到達するまで皮下投与した。
【０１８４】
動物をケージに保持し、ケージ内の温度を２５±１℃、４５〜６５％の相対湿度、および１時間あたり６０倍の空気変化率で維持した。マウスを、１４時間の明／１０時間の暗の人工光サイクル下に保持した。動物は、Ｅｎｖｉｇｏ  ＲＭＳ  ＳＡＲＬからのＴｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  １９％Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒｕｄｅｄ  Ｄｉｅｔ（Ｔ．２０１９Ｓ．１２）が給餌され、週に２回交換された滅菌濾過および酸性化（ｐＨ２．５）水道水へのアクセスを有した。飼料および水は、自由に提供した。療法の前に、動物は、群腫瘍体積の同程度の中央値および平均値を考慮してランダム化した（１群あたり７〜８匹）。動物は、営業日は１日２回、土曜日および日曜日は１日１回、日常的に監視した。０日目に開始して、動物は、１週間に２回計量した。個別の動物の相対体重（ＲＢＷ）は、Ｘ日目の個別の絶対体重（ＢＷｘ）を、ランダム化の日の個別の体重によって割り、１００％をかけることによって計算した。腫瘍体積は、ランダム化の日（０日目）および次いで週に２回のキャリパーでの２次元測定によって決定した。腫瘍体積は、以下の式：
腫瘍体積［ｍｍ３］＝ｌ［ｍｍ］×ｗ２［ｍｍ２］×０．５に従って計算され、式中、「ｌ」は、腫瘍の長さであり、「ｗ」は、腫瘍の幅である。Ｘ日目の個別の腫瘍の相対体積（ＲＴＶｘ）は、Ｘ日目のそれぞれの腫瘍（Ｔｘ）の絶対個別腫瘍体積［ｍｍ３］を、ランダム化の日の同じ腫瘍の絶対個別腫瘍体積によって割り、１００％をかけることによって計算した。スケジュールは、動物福祉政策が許容する程度に適用した。個別のマウスの屠殺は、腫瘍体積＞２０００ｍｍ３（片側）で行った。抗腫瘍有効性の統計的有意性の評価のために、ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、続いてペアワイズ比較のためのＤｕｎｎの方法を行い、これによって試験および対照群の個別のＲＴＶを、試験群において最小Ｔ／Ｃ値が達成された日に比較し、Ｔ／Ｃ［％］＝（ＲＴＶｘ治療群中央値／ＲＴＶｘ対照群中央値）ｘ１００であった。統計的分析は、相対群における初期ランダム化動物の少なくとも５０％が依然として生存した場合のみ行った。試験群間の比較を、同じ日数で行った。慣例により、ｐ値≦０．０５は、腫瘍阻害の有意性を示す。統計的計算は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ生体分析ソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）を用いて行った。
【０１８５】
用量設定研究および細胞株由来腫瘍異種移植モデルにおけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体の評価の一般的な手順。
Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅからの雌免疫欠損ＮＭＲＩヌードマウスに、腫瘍が触診可能であり、（異種移植研究について）所望の体積に達するまで、皮下接種させる緩衝剤／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）における５ｘ１０６−１０７培養癌細胞を投与した。
【０１８６】
動物をケージ（Ｍａｃｒｏｌｏｎ  Ｔｙｐｅ−ＩＩワイヤーメッシュ）に保持し、温度を２２±１℃、５０±１０％の相対湿度、および１時間あたり６０倍の空気変化率で維持した。マウスを、１２時間の明／１２時間の暗の人工光サイクル下に保持した。動物は、オートクレーブされたＳｓｎｉｆｆ  ＮＭ（Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が給餌され、週に２回交換された滅菌濾過および酸性化（ｐＨ４．０）水道水へのアクセスを有した。飼料および水は、自由に提供した。療法の前に、動物は、群腫瘍体積の同程度の中央値および平均値を考慮して、ランダム化した（用量設定研究において１群あたり３〜４匹および異種移植研究において１群あたり７〜８匹）。動物の健康は、実験の開始時および実験中に１日２回調査した。使用される識別：耳標およびケージラベル。０日目に開始して、動物は、週に２回または３回計量され、１群あたりの平均体重は、体重変化（ＢＷＣ）を計算するために初期値パーセントに関した。腫瘍直径は、ランダム化の日（０日目）および次いで週に２回または３回のキャリパーでの２次元測定によって決定した。腫瘍体積は、以下の式：
腫瘍体積［ｍｍ３］＝ｌ［ｍｍ］×ｗ２［ｍｍ２］×０．５に従って計算され、式中、「ｌ」は、腫瘍の長さであり、「ｗ」は、腫瘍の幅である。Ｘ日目の個別の腫瘍の相対体積（ＲＴＶｘ）は、Ｘ日目のそれぞれの腫瘍（Ｔｘ）の絶対個別腫瘍体積［ｍｍ３］を、ランダム化の日の同じ腫瘍の絶対個別腫瘍体積によって割り、１００％をかけることによって計算した。スケジュールは、動物福祉政策が許容する程度に適用した。個別のマウスの屠殺は、腫瘍体積＞１５００ｍｍ３（片側）で、または潰瘍が観察されたとき行った。統計的比較は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定で行った。
【０１８７】
オーリスタチンＥならびにアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７およびＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の用量設定研究
ストック溶液を次のように調製した。
１）１群あたり３匹のマウス、ランダム化の日に２６ｇの平均体重：０．３、０．６、または１．２ｍｇ／ｋｇの用量のオーリスタチンＥ  ＴＦＡ塩（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に１回、０、６、１３、２０日目に≡０．３５〜１．４１ｍｇ／ｋｇ≡７．１〜２８．３μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：８．５ｍｇを５０ｍＬバイアルに計量し、３０．０ｍＬの２５／７５ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、最終的な所望の最終用量に応じて０．２〜０．８ｍＬを２ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、０．８ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２０％プロピレングリコール−ｐＨ７．０で再構成した。
２）１群あたり３匹のマウス、ランダム化の日に２６ｇの平均体重：１．２および２．４ｍｇ／ｋｇのＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回≡１．９４〜３．８７ｍｇ／ｋｇ≡３８．７および７７．４μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：１１．０ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、１４．２ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、最終的な所望の最終用量に応じて０．４〜０．８ｍＬを２ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、０．８ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２０％プロピレングリコール−ｐＨ７．０で再構成した。
３）１群あたり３匹のマウス、ランダム化の日に２６ｇの平均体重：１．２、１．６、または２．０ｍｇ／ｋｇのＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回１日≡２．１８〜３．６４ｍｇ／ｋｇ≡４３．７〜７２．８μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：１９．２ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、２６．３ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、最終的な所望の最終用量に応じて０．４８〜０．８ｍＬを２ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、０．８ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％Ｔｗｅｅｎ  ８０−ｐＨ７．６で再構成した。
４）１群あたり４匹のマウス、ランダム化の日に２３ｇの平均体重：２．０、２．２、および２．４ｍｇ／ｋｇのＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回１日に≡３．６４〜４．３７ｍｇ／ｋｇ≡７２．８〜８７．３μｇ／２０ｇマウスで投与し、４．０、４．４、および４．８ｍｇ／ｋｇのＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に１回０、７、１４、２１日目に≡７．２８〜８．７３ｍｇ／ｋｇ≡１４５．６〜１７４．７μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：５６．０ｍｇを５０ｍＬバイアルに計量し、３２．０ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、最終的な所望の最終用量に応じて０．３３〜０．８ｍＬを２ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、０．８ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２％Ｔｗｅｅｎ  ８０−ｐＨ７．６で再構成した。
【０１８８】
１．２および０．６ｍｇ／ｋｇ用量のオーリスタチンＥは、それぞれ第１および第２の注射後に、高い毒性を示し、動物が生存しなかった。０．３ｍｇ／ｋｇ用量は十分に忍容された。その後の研究において、ＡＥは、４週間にわたって週に２回注射された０．３ｍｇ／ｋｇ（合計８回の注射）で忍容されたことが見出され、この用量は、したがって、最大耐量（ＭＴＤ）として異種移植研究に使用された。
【０１８９】
週に２回のスケジュールで８回注射されたＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７について試験された全ての用量は、十分に忍容された。その後の異種移植研究では、この薬物の用量は、同じ投与レジメンで６．５ｍｇ／ｋｇまで増加させ、この最も高い用量で、１匹のマウスにおいて体重減少および第２のマウスにおいて悪い全身状態を引き起こし、治療は、計画された８回ではなく、５回の注射後に停止しなければならなかった。そのような用量は、したがって、ＭＴＤを超えるとみなされ、４．５ｍｇ／ｋｇが安全な用量として選択された。
ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７は、４週間にわたって週に２回投与された最大２．０ｍｇ／ｋｇで初期試験され、毒性の明らかな兆候を有さなかった。皮膚刺激がその後異種移植研究において観察されたので、第２の用量設定研究は、４週間かけて週に２回投与された２．０、２．２、および２．４ｍｇ／ｋｇで繰り返され、週に１回のみ注射された４．０、４．４、および４．８ｍｇ／ｋｇの対応する二倍用量と比較した。体重変化は観察されなかったが、皮膚刺激は、全ての群において９〜１４日後に出現した。より早期およびより頻繁な皮膚刺激は、より高用量について観察された。刺激が治療終了後に治癒し始めたように、副作用は可逆的であると考えられた。週に１回４．０ｍｇ／ｋｇで治療された群は、最も低い副作用を示したが、他の群の間で有意な差が観察されなかった。
【０１９０】
腫瘍異種移植モデルにおけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体の評価基準
各薬物の有効性は、腫瘍体積低減（０日目と比較した選択される日の腫瘍体積の％）に基づいて決定した：初期腫瘍体積と比較して、完全寛解＜１０％、部分寛解＞１０〜５０％、小寛解＞５０〜７５％、安定性疾患＞７５〜１２５％、進行性疾患＞１２５％。
【０１９１】
ヒト悪性黒色腫癌モデルＡ３７５−小腫瘍におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の評価（図１３）
ヒト悪性黒色腫癌モデルＡ３７５におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の評価を、細胞株由来異種移植モデルについての一般的な手順に記載されるように行った。
【０１９２】
ストック溶液を次のように調製した。
１）７匹のマウス、ランダム化の日に２９ｇの平均体重、１３５ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：０．３ｍｇ／ｋｇのオーリスタチンＥ  ＴＦＡ塩（ＡＥ当量）を、３週間にわたって週に２回、０、６、９、１３、１６、１９日目に≡０．３５ｍｇ／ｋｇ≡７．１μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：２ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、２８．３ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．２ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２０％プロピレングリコール−ｐＨ７．０で再構成した。
２）７匹のマウス、ランダム化の日に２８ｇの平均体重、１３７ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：３．０ｍｇ／ｋｇのＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、３週間にわたって週に２回、０、６、９、１３、１６、１９日目に≡５．３２ｍｇ／ｋｇ≡１０６．３μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：１９．２ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、１９．０ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．２ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２０％プロピレングリコール−ｐＨ７．０で再構成した。
【０１９３】
黒色腫異種移植モデルＡ３７５における腫瘍成長進行は、両方とも６回、週に２回注射された、オーリスタチンＥの０．３ｍｇ／ｋｇ用量に対する、３．０ｍｇ／ｋｇの化合物ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の統計的に有意な優れた抗腫瘍有効性を示した（２７日目から３７日目までｐ＜０．０１）。オーリスタチンＥで治療されたマウスは、２１日目まで安定性疾患状態を達成し、その後腫瘍は再度成長し始めた。対照的に、ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７治療群におけるマウスは、長期腫瘍退縮を達成し、１９日目から３７日目の研究終了まで完全寛解（１ｍｍ３最終腫瘍体積）を示した。
【０１９４】
ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７で治療された群におけるマウスは、対照と比較して体重増加のわずかな低減のみを有したが、検出可能な副作用は観察されなかった。
【０１９５】
ヒト悪性黒色腫癌モデルＡ３７５−大腫瘍におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の評価（図１４）。
ヒト悪性黒色腫癌モデルＡ３７５におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の評価を、細胞株由来異種移植モデルについての一般的な手順に記載されるように行った。
【０１９６】
ストック溶液を次のように調製した。
１）７匹のマウス、ランダム化の日に２８ｇの平均体重、３１０ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：０．３ｍｇ／ｋｇのオーリスタチンＥ  ＴＦＡ塩（ＡＥ当量）を、３週間にわたって週に２回、１、６、９、１３、１６日目に≡０．３５ｍｇ／ｋｇ≡７．１μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：２ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、２８．３ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．２ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２０％プロピレングリコール−ｐＨ７．０で再構成した。
２）７匹のマウス、ランダム化の日に２７ｇの平均体重、３３１ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：６．５ｍｇ／ｋｇのＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、３週間にわたって週に２回、１、６、９、１３、１６日目に≡１１．５２ｍｇ／ｋｇ≡２３０．４μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：２８．０ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、１２．２ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．２ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２％Ｔｗｅｅｎ  ８０−ｐＨ７．６で再構成した。
【０１９７】
化合物ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の抗腫瘍有効性も、より大きな悪性黒色腫Ａ３７５腫瘍（約３２０ｍｍ３）を有するマウスにおいて試験されて、薬物有効性が小さな腫瘍に限定されないことを証明した。６．５ｍｇ／ｋｇのＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７で治療されたマウスは、同様に５回、週に２回注射された、０．３ｍｇ／ｋｇ用量のオーリスタチンＥで治療された群と比較して、抗腫瘍効果の統計的に有意な改善を示した（９日目から３３日目までｐ＜０．０１）。オーリスタチンＥは、１４日目まで初期安定性疾患を示した後、着実に成長したが、ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７治療群におけるマウスは、１９日目から３７日目の研究終了まで完全寛解を記録し、２８日目（最終治療後１２日目）に１ｍｍ３および研究終了時に約１４ｍｍ３の腫瘍体積の最小値に達し、相対的に大きな開始時腫瘍体積中央値にかかわらず、長期効果をもたらした。
【０１９８】
ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７は、一時的な体重減少を引き起こし（２１日目に１３％が到達され）、２匹のマウスは、悪い全身状態のために犠死させなければならなかった。
【０１９９】
ヒト非小細胞肺癌モデルＬＸＦＡ７３７−小腫瘍におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の評価（図１５）
ヒト非小細胞肺癌モデルＬＸＦＡ７３７におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の評価を、患者由来異種移植モデルについての一般的な手順に記載されるように行った。
【０２００】
ストック溶液を次のように調製した。
１）７匹のマウス、ランダム化の日に２７ｇの平均体重、１３７ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：０．３ｍｇ／ｋｇのオーリスタチンＥ  ＴＦＡ塩（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回、０、４、７、１１、１４、１８、２１、２５日目に≡０．３５ｍｇ／ｋｇ≡７．１μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：２ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、２８．３ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．２ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２０％プロピレングリコール−ｐＨ７．０で再構成した。
２）７匹のマウス、ランダム化の日に２６ｇの平均体重、１２８ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：４．５ｍｇ／ｋｇのＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回、０、４、７、１１、１４、１８、２１、２５日目に≡７．９８ｍｇ／ｋｇ≡１５９．５μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：３８ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、２３．８ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．２ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２％２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン２−ＨＰβＣＤ−ｐＨ７．６で再構成した。
３）７匹のマウス、ランダム化の日に２７ｇの平均体重、１３０ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：４．５ｍｇ／ｋｇのＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回、０、４、７、１１、１４、１８、２１、２５日目に≡７．９８ｍｇ／ｋｇ≡１５９．５μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：３８ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、２３．８ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ６に溶解し、１．２ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２％Ｔｗｅｅｎ  ８０−ｐＨ７．６で再構成した。
【０２０１】
ＮＳＣＬＣ異種移植モデルＬＸＦＥ７３７における腫瘍成長進行は、８回、週に２回投与された０．３ｍｇ／ｋｇのオーリスタチンＥに対する（Ｔｗｅｅｎ  ８０および２−ＨＰβＣＤの両方の緩衝剤中の）４．５ｍｇ／ｋｇの化合物ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の優れた抗腫瘍有効性を、統計的有意性と共に示した（５６および６３日目にｐ＜０．０１）。オーリスタチンＥ治療群における腫瘍は、（２１日目から４２日目まで）一時的にのみ安定性疾患状態を保ち、療法の終了後に有意に成長した。対照的に、ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７で治療されたマウスは、療法終了の３日後、２８日目に完全腫瘍寛解に達し、（使用される緩衝剤から独立して）７４日目の研究終了まで腫瘍体積を測定不能レべルに下げ、長期抗腫瘍効果をもたらした。
【０２０２】
対照に対する体重変化は、ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７で治療された群における毒性の部分的な増加を示した。３２日目に、２−ＨＰβＣＤの症例において毒性の他の兆候なく、体重減少の最大値（−７％）が記録されたが、２匹のマウスは、薬物がＴｗｅｅｎ  ８０で投与されたとき、悪い全身状態のために犠死させなければならなかった。
【０２０３】
ヒト非小細胞肺癌モデルＬＸＦＡ７３７−大腫瘍におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の評価（図１６）
ヒト非小細胞肺癌モデルＬＸＦＡ７３７におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の評価を、患者由来異種移植モデルについての一般的な手順に記載されるように行った。
【０２０４】
ストック溶液を次のように調製した。
１）８匹のマウス、ランダム化の日に２６ｇの平均体重、３２４ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：０．３ｍｇ／ｋｇのオーリスタチンＥ  ＴＦＡ塩（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回、１、５、８、１２、１５、１９、２２、２６日目に≡０．３５ｍｇ／ｋｇ≡７．１μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：３ｍｇを１００ｍＬバイアルに計量し、４３．３ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、２．４ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、２．４ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２０％プロピレングリコール−ｐＨ７．０で再構成した。
２）８匹のマウス、ランダム化の日に２８ｇの平均体重、３４２ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：４．５ｍｇ／ｋｇのＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回、１、５、８、１２、１５、１９、２２、２６日目に≡６．９９ｍｇ／ｋｇ≡１３９．７μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：５１ｍｇを１００ｍＬバイアルに計量し、３６．５ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤、３％２−ＨＰβＣＤ−ｐＨ６．２に溶解し、２．４ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、２．４ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．６で再構成した。
【０２０５】
ＮＳＣＬＣ異種移植モデルＬＸＦＥ７３７における腫瘍成長進行は、両方とも８回、週に２回投与された、０．３ｍｇ／ｋｇのオーリスタチンＥに対する４．５ｍｇ／ｋｇの化合物ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の優れた抗腫瘍有効性を、統計的有意性と共に示した（２８日目にｐ＜０．０１）。オーリスタチンＥ治療群における腫瘍は、いかなる活性も示さなかったが、ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７で治療されたマウスは、１５日目から５９日目の研究終了まで部分腫瘍寛解を達成し、長期抗腫瘍効果をもたらした。
【０２０６】
副作用は記録されなかった。
【０２０７】
ヒト卵巣癌腫モデルＡ２７８０−小腫瘍におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の評価（図１７）
ヒト卵巣癌腫モデルＡ２７８０におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の評価を、細胞株由来異種移植モデルについての一般的な手順に記載されるように行った。
【０２０８】
ストック溶液を次のように調製した。
１）７匹のマウス、ランダム化の日に２７ｇの平均体重、１４７ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：０．３ｍｇ／ｋｇのオーリスタチンＥ  ＴＦＡ塩（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回、１、４、８、１１、１５、１８、２２、２５日目に≡０．３５ｍｇ／ｋｇ≡７．１μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：２ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、２８．３ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．２ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２０％プロピレングリコール−ｐＨ７．０で再構成した。
２）７匹のマウス、ランダム化の日に２７ｇの平均体重、１５３ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：３．０ｍｇ／ｋｇのＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回、１、４、８、１１、１５、１８、２２、２５日目に≡５．３２ｍｇ／ｋｇ≡１０６．３μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：５１．０ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、２８．８ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、０．７２ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２％Ｔｗｅｅｎ  ８０−ｐＨ７．６で再構成した。
３）７匹のマウス、ランダム化の日に２５ｇの平均体重、１４１ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：５．０ｍｇ／ｋｇのＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回、１、４、８、１１、１５、１８、２２、２５日目に≡８．８６ｍｇ／ｋｇ≡１７７．２μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：５１．０ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、２８．８ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．２ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２％Ｔｗｅｅｎ  ８０−ｐＨ７．６で再構成した。
【０２０９】
卵巣癌腫モデルＡ２７８０における腫瘍成長進行は、８回、週に２回注射された、０．３ｍｇ／ｋｇ用量で投与されたオーリスタチンＥに対する、３．０および５．０ｍｇ／ｋｇの化合物ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の統計的に有意な優れた抗腫瘍有効性を示した（７日目から２９日目までｐ＜０．０１）。オーリスタチンＥで治療されたマウスは、いかなる抗腫瘍効果も達成せず、腫瘍は、対照群で治療されたものと同等に成長した。ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７での療法は、しかしながら、９日目から６０日目の研究終了まで部分寛解、低用量について２３日目から３５日目までおよび高用量について２５日目から５１日目まで一時的な完全寛解を誘発し、用量から独立して、長期腫瘍退縮をもたらした。
【０２１０】
ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７治療群は、第１の治療後に約２％の一時的な体重減少を引き起こした。高用量群からの１匹のマウスは、３５日目に死亡が確認され、低用量群からの１匹は、４２日目に悪い全身状態のために犠死させなければならなかった。
【０２１１】
ヒト卵巣癌腫モデルＡ２７８０−大腫瘍におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の評価（図１８）
ヒト卵巣癌腫モデルＡ２７８０におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の評価を、細胞株由来異種移植モデルについての一般的な手順に記載されるように行った。
【０２１２】
ストック溶液を次のように調製した。
１）８匹のマウス、ランダム化の日に２８ｇの平均体重、３４１ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：０．３ｍｇ／ｋｇのオーリスタチンＥ  ＴＦＡ塩（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回、１、４、８、１１、１５、１８、２２、２５日目に≡０．３５ｍｇ／ｋｇ≡７．１μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：３．７ｍｇを１００ｍＬバイアルに計量し、５２．３ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．５ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．５ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２０％プロピレングリコール−ｐＨ７．０で再構成した。
２）８匹のマウス、ランダム化の日に２８ｇの平均体重、３７８ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：４．５ｍｇ／ｋｇのＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回、１、４、８、１１、１５、１８、２２、２５日目に≡６．９９ｍｇ／ｋｇ≡１３９．７μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：４０．０ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、２８．６ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．５ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．５ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２％２−ＨＰβＣＤ−ｐＨ７．６で再構成した。
【０２１３】
化合物ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７の抗腫瘍有効性はまた、ヒト卵巣癌腫モデルＡ２７８０のより大きな腫瘍（約３６０ｍｍ３）を有するマウスに対して試験された。薬物は、両方とも８回、週に２回注射された、０．３ｍｇ／ｋｇで投与されたオーリスタチンＥに対する、４．５ｍｇ／ｋｇで投与された統計的に有意な優れた抗腫瘍効果を示した（２２日目から４０日目までｐ＜０．００１）。オーリスタチンＥで治療されたマウスは、いかなる抗腫瘍効果も達成せず、対照的に、ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７で治療されたマウスは、２６日目から１０３日目の研究終了まで完全寛解を示し、より小さな腫瘍で既に観察されているように、長期腫瘍退縮を達成した。
【０２１４】
ＡＥ−ケト−Ｓｕｌｆ０７治療マウスは、対照と比較してわずかに低減した体重増加のみを有した。
【０２１５】
ヒト腎細胞癌モデルＲＸＦ６３１−小腫瘍におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の初期評価（図１９）
ヒト腎細胞癌モデルＲＸＦ６３１におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の初期評価を、患者由来異種移植モデルについての一般的な手順に記載されるように行った。
【０２１６】
このインビボ実験のために、ストック溶液を次のように調製した。
１）７匹のマウス、ランダム化の日に２５ｇの平均体重、１３８ｍｍ３の平均腫瘍体積：０．３ｍｇ／ｋｇのオーリスタチンＥ  ＴＦＡ塩（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回、１、５、８、１２、１５、１９、２２、２６日目に≡０．３５ｍｇ／ｋｇ≡７．１μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：２ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、２８．３ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．２ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２０％プロピレングリコール−ｐＨ７．０で再構成した。
２）７匹のマウス、ランダム化の日に２６ｇの平均体重、１４１ｍｍ３の平均腫瘍体積：２．２〜３．０ｍｇ／ｋｇのＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回、１、５、８、１２、１５、１９、２６日目に≡４．００ｍｇ／ｋｇ≡８０．１μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：１５．７ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、１９．６ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．２ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２％ｔｗｅｅｎ  ８０−ｐＨ７．６で再構成した。
【０２１７】
腎細胞癌モデルＲＸＦ６３１における腫瘍成長進行は、それぞれ８回および７回、週に２回注射された、０．３ｍｇ／ｋｇで投与されたオーリスタチンＥに対する、２．２ｍｇ／ｋｇ（用量は１５日目および１９日目の注射で一時的に３．０ｍｇ／ｋｇに増加した）で投与された化合物ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の統計的に有意な優れた抗腫瘍有効性を示した（ｐ＜０．０５）。オーリスタチンＥは、約４０日目まで安定性疾患状態を達成した後、研究終了まで着実に成長した。対照的に、ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７療法は、２４日目から５３日目まで完全寛解をもたらし、１ｍｍ３の腫瘍体積の最小値および長期効果を達成した。
【０２１８】
ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７は、一時的な体重減少を引き起こし、９％の最小値が３１日目に到達された。１７日目から開始した噛みつきおよび引っ掻きによる創傷も観察された。２匹のマウスが死亡し、１匹は悪い全身状態のために犠死させなければならなかった（２０、４３、および６６日目）。
【０２１９】
ヒト悪性黒色腫癌モデルＡ３７５−大腫瘍におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の評価（図２０）
ヒト悪性黒色腫癌モデルＡ３７５におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の評価を、細胞株由来異種移植モデルについての一般的な手順に記載されるように行った。
【０２２０】
ＲＸＦ６３１異種移植モデルにおける投与経験に基づいて、ストック溶液を次のように調製した。
１）７匹のマウス、ランダム化の日に２８ｇの平均体重、３１０ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：０．３ｍｇ／ｋｇのオーリスタチンＥ  ＴＦＡ塩（ＡＥ当量）を、３週間にわたって週に２回、１、６、９、１３、１６日目に≡０．３５ｍｇ／ｋｇ≡７．１μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：２ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、２８．３ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．２ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２０％プロピレングリコール−ｐＨ７．０で再構成した。
２）７匹のマウス、ランダム化の日に２９ｇの平均体重、３７１ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：２．４ｍｇ／ｋｇのＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、３週間にわたって週に２回、１、６、９、１３、１６日目に≡４．３７ｍｇ／ｋｇ≡８７．３μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：１２．６ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、１４．４ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．２ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２％Ｔｗｅｅｎ  ８０−ｐＨ７．６で再構成した。
３）７匹のマウス、ランダム化の日に３１ｇの平均体重、３５５ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：２．４ｍｇ／ｋｇのＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、３週間にわたって週に２回、１、６、９、１３、１６日目に≡４．３７ｍｇ／ｋｇ≡８７．３μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：１２．６ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、１４．４ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．２ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、４％２−ＨＰβＣＤ−ｐＨ７．６で再構成した。
【０２２１】
黒色腫異種移植モデルＡ３７５における腫瘍成長進行は、５回、週に２回注射された、０．３ｍｇ／ｋｇで投与されたオーリスタチンＥと比較して、（再構成緩衝剤、２％Ｔｗｅｅｎ  ８０または４％２−ＨＰβＣＤから独立して）２．４ｍｇ／ｋｇで投与された化合物ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の統計的に有意な抗腫瘍改善を示す（９〜３３日目にｐ＜０．０１）。オーリスタチンＥでの治療は、１４日目まで初期安定性疾患を示し、その後腫瘍は着実に成長した。ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７で治療されたマウスは、しかしながら、１６日目から３７日目の研究終了までほぼ完全寛解を達成し、実験の開始時の大きな腫瘍体積中央値にかかわらず、それぞれ２％Ｔｗｅｅｎ  ８０および４％２−ＨＰβＣＤで再構成されたＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７について２３日目に４ｍｍ３および２６日目に１ｍｍ３の最小値に到達した。
【０２２２】
対照と比較して有意な体重変化は記録されなかったが、９日目から開始した噛みつきおよび引っ掻きによる創傷が観察された。Ｂｅｐａｎｔｈｅｎ治療は、負傷したマウスの健康を改善した。ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７  ２％Ｔｗｅｅｎ  ８０治療群における１匹のみのマウスを、悪い全身状態のために犠死させなければならなかった。
【０２２３】
ヒト非小細胞肺癌モデルＬＸＦＡ７３７−小腫瘍におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の評価（図２１）
ヒト非小細胞肺癌モデルＬＸＦＡ７３７におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の評価を、患者由来異種移植モデルについての一般的な手順に記載されるように行った。
【０２２４】
ストック溶液を次のように調製した。
１）７匹のマウス、ランダム化の日に２７ｇの平均体重、１３７ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：０．３ｍｇ／ｋｇのオーリスタチンＥ  ＴＦＡ塩（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回、０、４、７、１１、１４、１８、２１、２５日目に≡０．３５ｍｇ／ｋｇ≡７．１μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：２ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、２８．３ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．２ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２０％プロピレングリコール−ｐＨ７．０で再構成した。
２）７匹のマウス、ランダム化の日に２７ｇの平均体重、１２６ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：２．４ｍｇ／ｋｇのＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回、０、４、７、１１、１４、１８、２１、２５日目に≡４．３７ｍｇ／ｋｇ≡８７．３μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：３１ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、２８．５ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、０．９６ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．２ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、４％２−ＨＰβＣＤ−ｐＨ７．６で再構成した。
【０２２５】
ＮＳＣＬＣ異種移植モデルＬＸＦＥ７３７における腫瘍成長進行は、両方とも８回週に２回投与された、０．３ｍｇ／ｋｇのオーリスタチンＥに対する２．４ｍｇ／ｋｇの化合物ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の優れた抗腫瘍有効性を、統計的有意性と共に示した（５６および６３日目にｐ＜０．０５）。オーリスタチンＥ治療群における腫瘍は、２１日目から４２日目まで一時的にのみ安定性疾患状態を保ち、療法の終了後に有意に成長した。対照的に、ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７で治療されたマウスは、２１日目に完全腫瘍寛解に達し、７４日目の研究終了まで腫瘍体積を測定不能レべルに下げ、長期抗腫瘍効果をもたらした。
【０２２６】
研究の経過中、５匹のマウスを、体重減少および皮膚病変の組み合わせのために安楽死させなければならなかった。
【０２２７】
ヒト卵巣癌腫モデルＡ２７８０−大腫瘍におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の評価（図２２）
ヒト卵巣癌腫モデルＡ２７８０におけるオーリスタチンＥおよびアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の評価を、細胞株由来異種移植モデルについての一般的な手順に記載されるように行った。
【０２２８】
ストック溶液を次のように調製した。
１）８匹のマウス、ランダム化の日に２８ｇの平均体重、３４１ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：０．３ｍｇ／ｋｇのオーリスタチンＥ  ＴＦＡ塩（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に２回、１、４、８、１１、１５、１８、２２、２５日目に≡０．３５ｍｇ／ｋｇ≡７．１μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：３．７ｍｇを１００ｍＬバイアルに計量し、５２．３ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．５ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．５ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２０％プロピレングリコール−ｐＨ７．０で再構成した。
２）８匹のマウス、ランダム化の日に２７ｇの平均体重、４０３ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：１．９ｍｇ／ｋｇのＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に１回、１、４、８、１１、１５、１８、２２、２５日目に≡３．４６ｍｇ／ｋｇ≡６９．２μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：３６．５ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、２６．４ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、０．７５ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．５ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、２％２−ＨＰβＣＤ−ｐＨ７．６で再構成した。
【０２２９】
１．９ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７は、卵巣癌腫モデルＡ２７８０において、同様に８回週に２回注射された、０．３ｍｇ／ｋｇで投与されたオーリスタチンＥと比較して、優れた抗腫瘍有効性を示す（３７日目から４０日目までｐ＜０．００１）。オーリスタチンＥで治療されたマウスは、いずれの抗腫瘍効果も達成しなかった。ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７で治療されたマウスは、しかしながら、１９日目から５１日目までに部分寛解、および５４日目から１０３日目の研究の終了までに完全寛解を示し、長期腫瘍退縮をもたらした。
【０２３０】
ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７治療マウスは、対照と比較して体重減少の兆候を有さなかったが、４匹の動物は、腫瘍壊死のために研究から除外されなければならなかった。
【０２３１】
ヒト卵巣癌腫モデルＡ２７８０−小腫瘍におけるアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体化合物ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の評価（図２３）
ヒト卵巣癌腫モデルＡ２７８０におけるアルブミン結合オーリスタチンＥ誘導体ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７の評価を、細胞株由来異種移植モデルについての一般的な手順に記載されるように行った。
【０２３２】
ストック溶液を次のように調製した。
１）８匹のマウス、ランダム化の日に２７ｇの平均体重、１７４ｍｍ３の平均腫瘍体積中央値：３．８ｍｇ／ｋｇのＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７（ＡＥ当量）を、４週間にわたって週に１回、１、８、１５、２２日目に≡６．６７ｍｇ／ｋｇ≡１３３．４μｇ／２０ｇマウスで投与した。試料調製：２５．６ｍｇを３０ｍＬバイアルに計量し、１９．２ｍＬの５０／５０ｔｅｒｔ−ブタノール／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、５％スクロース−ｐＨ７．０に溶解し、１．５ｍＬを４ｍＬバイアルにアリコートした。バイアルを１時間−４０℃で凍結し、−２０℃で約３６時間かけて凍結乾燥し、次いで栓をした。注射の日に、凍結乾燥試料を、１．５ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、６％２−ＨＰβＣＤ−ｐＨ７．６で再構成した。
【０２３３】
ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７はまた、同じ卵巣癌腫モデルＡ２７８０において、より小さな腫瘍、およびマウスの皮膚に対する薬物の副作用を減少させる異なる投与スキームで試験された。ＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７は、３．８ｍｇ／ｋｇで４回、週に１回投与され、対照と比較して統計的に有意な改善した抗腫瘍効果を再度示した（７日目から１４日目までｐ＜０．０１）。新たな投与レジメンにおいてＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７で治療されたマウスは、１２日目から３５日目までに部分寛解、３９日目から７０日目の研究の終了までに完全寛解を達成した。３匹のＡＥ−エステル−Ｓｕｌｆ０７治療マウスは、体重減少を示し、５９日目に犠死させなければならなかった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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