(57)【要約】  本発明は、ヒトＣＤ１６のエピトープに結合できる分子（例えば抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、ＴａｎｄＡｂ等）（「ＣＤ１６結合分子」）を対象とする。本発明は更に、ヒトＣＤ１６のエピトープと、疾患抗原（「ＤＡ」）の１つ以上のエピトープとに結合できるＣＤ１６結合分子（例えば「ＣＤ１６×ＤＡ結合分子」）を対象とする。本発明は特に、抗体である、又はそのエピトープ結合ドメインを含む、又はダイアボディ（ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを含む）、二重特異性抗体、ＴａｎｄＡｂ、他の多重特異性結合分子（例えば３価ＴＲＩＤＥＮＴ（商標）分子）等である、上述のようなＣＤ１６×ＤＡ結合分子を対象とする。本発明は特に、ＣＤ１６に結合できることに加えて、癌抗原又は病原体関連抗原である疾患抗原に結合できる、ＣＤ１６×ＤＡ結合分子に関する。本発明は特に、癌及び病原体関連疾患の治療における、上述のようなＣＤ１６及びＣＤ１６×ＤＡ結合分子の使用に関する。本発明はまた、１つ以上の上記分子を含む医薬組成物も対象とする。【選択図】図１４Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１６のエピトープに結合できるＣＤ１６結合ドメインと、疾患抗原のエピトープに結合できる疾患抗原結合ドメインとを含む、ＣＤ１６×疾患抗原（ＣＤ１６×ＤＡ）結合分子であって、
前記ＣＤ１６結合ドメインは：
（Ｉ）（Ａ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号６８又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号６９又は配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲL２ドメイン；及び
（Ｆ）配列番号７１又は配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲL３ドメイン；
（ＩＩ）（Ａ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲL２ドメイン；及び
（Ｆ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲL３ドメイン；
（ＩＩＩ）配列番号７２、配列番号８３、配列番号８４、又は配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；
（ＩＶ）配列番号７３、配列番号８５、又は配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（Ｖ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（ＶＩ）配列番号８３又は配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（ＶＩＩ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（ＶＩＩＩ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；並びに
（ＩＸ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
のうちの１つ以上を含む、ＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項２】
前記分子は、二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、二重特異性ＴａｎｄＡｂ、二重特異性３価分子、又は二重特異性ＣＡＲである、請求項１に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項３】
前記分子は、２つ以上の疾患抗原及び／又は２つ以上のＣＤ１６のエピトープに結合できる、請求項１又は２に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項４】
前記ＣＤ１６結合ドメインは：
（Ａ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号６８、又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号６９、又は配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲL２ドメイン；及び
（Ｆ）配列番号７１、又は配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲL３ドメイン
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項５】
前記ＣＤ１６結合ドメインは：
（Ａ）配列番号７２、若しくは配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；
（Ｂ）配列番号７３、若しくは配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（Ｃ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（Ｄ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（Ｅ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は
（Ｆ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項６】
前記ＣＤ１６結合ドメインは：
（Ａ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲL２ドメイン；及び
（Ｆ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲL３ドメイン
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項７】
前記ＣＤ１６結合ドメインは：
（Ａ）配列番号８３、若しくは配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；
（Ｂ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は
（Ｃ）配列番号８３若しくは配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項８】
前記疾患抗原は癌抗原であり、前記疾患は癌である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項９】
前記癌は、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膠芽腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、小リンパ性リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、精巣癌、及び子宮癌からなる群から選択される、請求項６に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項１０】
前記癌抗原は、癌抗原：１９．９、４．２、Ａ３３、ＡＤＡＭ‐９、ＡＨ６、ＡＬＣＡＭ、Ｂ１、Ｂ７‐Ｈ３、ＢＡＧＥ、β‐カテニン、血液型ＡＬｅb／Ｌｅy、バーキットリンパ腫抗原‐３８．１３、Ｃ１４、ＣＡ１２５、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４０／ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１０３、ＣＤ１２３、ＣＤ３１７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＯ１７‐１Ａ、ＣＯ‐４３、ＣＯ‐５１４、ＣＴＡ‐１、ＣＴＬＡ‐４、サイトケラチン８、Ｄ１．１、Ｄ1５６‐２２、ＤＲ５、Ｅ1シリーズ、ＥＧＦＲ、エフリン受容体、ＥｐｈＡ２、Ｅｒｂ、ＧＡＧＥ、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２ガングリオシド、ＧＩＣＡ１９‐９、ｇｐ１００、Ｇｐ３７、ｇｐ７５、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＦＧ、ヒトパピローマウイルス‐Ｅ６／ヒトパピローマウイルス‐Ｅ７、ＨＭＷ‐ＭＡＡ、Ｉ抗原、ＩＬ１３Ｒα２、インテグリンβ６、ＪＡＭ‐３、ＫＩＤ３、ＫＩＤ３１、ＫＳ  １／４汎癌腫抗原、Ｌ６、Ｌ２０、ＬＥＡ、ＬＵＣＡ‐２、Ｍ１：２２：２５：８、Ｍ１８、Ｍ３９、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ、メソテリン、ＭＵＣ‐１、ＭＵＭ‐１、Ｍｙｌ、Ｎ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ネオ糖タンパク質、ＮＳ‐１０、ＯＦＡ‐１、ＯＦＡ‐２、オンコスタチンＭ、ｐ１５、ｐ９７、ＰＥＭ、ＰＥＭＡ、ＰＩＰＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、前立腺酸性リン酸塩、Ｒ24、ＲＯＲ１、スフィンゴ脂質、ＳＳＥＡ‐１、ＳＳＥＡ‐３、ＳＳＥＡ‐４、ｓＴｎ、Ｔ細胞受容体由来ペプチド、Ｔ5Ａ7、ＴＡＧ‐７２、ＴＬ５、ＴＮＦ‐受容体、ＴＮＦ‐γ受容体、ＴＲＡ‐１‐８５、トランスフェリン受容体、５Ｔ４、ＴＳＴＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＰ８、ＶＥＰ９、ＶＩＭ‐Ｄ５、及びＹハプテン、Ｌｅyからなる群から選択される、請求項８又は９に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項１１】
前記疾患抗原は、５Ｔ４、Ｂ７‐Ｈ３、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＲＦ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＩＬ１３Ｒα２又はＶＥＧＦである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項１２】
前記疾患抗原は病原体関連抗原である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項１３】
前記病原体関連抗原は、病原体関連抗原：単純ヘルペスウイルス感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、単純ヘルペスウイルスｇＤ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐１、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ａ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ｂ、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ４１等、ヒトパピローマウイルスＥ６、ヒトパピローマウイルスＥ７、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ６４、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ４６、及びヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ２１からなる群から選択される、請求項１２に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項１４】
前記疾患抗原はＨＩＶ  ｅｎｖ抗原である、請求項１２又は１３に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項１５】
前記分子は：
（Ａ）２つ、３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、ダイアボディ；
（Ｂ）３つ、４つ、若しくは５つのポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、３価結合性分子；又は
（Ｃ）二重特異性抗体
である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項１６】
前記分子はＦｃ領域を含む、請求項１５に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項１７】
前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプのものである、請求項１６に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項１８】
前記Ｆｃ領域は、変異型Ｆｃ領域であって：
（Ａ）ＦｃγＲに対する前記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する１つ以上のアミノ酸修飾；及び／又は
（Ｂ）前記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を向上させる１つ以上のアミノ酸修飾
を含む、変異型Ｆｃ領域である、請求項１６又は１７に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項１９】
（Ａ）ＦｃγＲに対する前記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する前記修飾が、Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの置換を含み；且つ
（Ｂ）前記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を向上させる前記修飾が、Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；又はＫ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋの置換を含み、
前記番号付与はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である、請求項１８に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子。
【請求項２０】
（Ａ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号６８、又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号６９、又は配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲL２ドメイン；及び
（Ｆ）配列番号７１、又は配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲL３ドメイン
を含む、ＣＤ１６結合分子。
【請求項２１】
前記分子は：
（Ａ）配列番号７２、若しくは配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；
（Ｂ）配列番号７３、若しくは配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（Ｃ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（Ｄ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（Ｅ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は
（Ｆ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、請求項２０に記載のＣＤ１６結合分子。
【請求項２２】
（Ａ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲL２ドメイン；及び
（Ｆ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲL３ドメイン
を含む、ＣＤ１６結合分子。
【請求項２３】
前記分子は：
（Ａ）配列番号８３、若しくは配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；
（Ｂ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は
（Ｃ）配列番号８３若しくは配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、請求項２２に記載のＣＤ１６結合分子。
【請求項２４】
前記分子は：抗体、多重特異性抗体、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、（Ｆｖ）断片、単鎖（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ダイアボディ、３価結合分子、及びＣＡＲ‐Ｔ分子からなる群から選択される、請求項２０〜２３に記載のＣＤ１６結合分子。
【請求項２５】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＣＤ１６×疾患抗原結合分子と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物。
【請求項２６】
請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のＣＤ１６結合分子と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物。
【請求項２７】
前記疾患抗原の発現を特徴とする疾患の治療における、請求項２５に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２８】
前記疾患抗原の発現を特徴とする疾患の治療のための方法であって、前記方法は、治療的有効量の請求項２５に記載の医薬組成物を、前記医薬組成物の投与を必要とする被験者に投与するステップを含む、方法。
【請求項２９】
前記ＣＤ１６×疾患抗原結合分子は、２つ以上の疾患抗原及び／又はＣＤ１６の２つ以上のエピトープに結合できる、請求項２７に記載の使用又は請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記疾患抗原は癌抗原であり、前記疾患は癌である、請求項２７に記載の使用又は請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記癌は、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膠芽腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、小リンパ性リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、精巣癌、及び子宮癌からなる群から選択される、請求項３０に記載の使用又は方法。
【請求項３２】
前記癌抗原は、癌抗原：１９．９、４．２、Ａ３３、ＡＤＡＭ‐９、ＡＨ６、ＡＬＣＡＭ、Ｂ１、Ｂ７‐Ｈ３、ＢＡＧＥ、β‐カテニン、血液型ＡＬｅb／Ｌｅy、バーキットリンパ腫抗原‐３８．１３、Ｃ１４、ＣＡ１２５、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４０／ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１０３、ＣＤ１２３、ＣＤ３１７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＯ１７‐１Ａ、ＣＯ‐４３、ＣＯ‐５１４、ＣＴＡ‐１、ＣＴＬＡ‐４、サイトケラチン８、Ｄ１．１、Ｄ1５６‐２２、ＤＲ５、Ｅ1シリーズ、ＥＧＦＲ、エフリン受容体、ＥｐｈＡ２、Ｅｒｂ、ＧＡＧＥ、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２ガングリオシド、ＧＩＣＡ１９‐９、ｇｐ１００、Ｇｐ３７、ｇｐ７５、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＦＧ、ヒトパピローマウイルス‐Ｅ６／ヒトパピローマウイルス‐Ｅ７、ＨＭＷ‐ＭＡＡ、Ｉ抗原、ＩＬ１３Ｒα２、インテグリンβ６、ＪＡＭ‐３、ＫＩＤ３、ＫＩＤ３１、ＫＳ  １／４汎癌腫抗原、Ｌ６、Ｌ２０、ＬＥＡ、ＬＵＣＡ‐２、Ｍ１：２２：２５：８、Ｍ１８、Ｍ３９、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ、メソテリン、ＭＵＣ‐１、ＭＵＭ‐１、Ｍｙｌ、Ｎ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ネオ糖タンパク質、ＮＳ‐１０、ＯＦＡ‐１、ＯＦＡ‐２、オンコスタチンＭ、ｐ１５、ｐ９７、ＰＥＭ、ＰＥＭＡ、ＰＩＰＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、前立腺酸性リン酸塩、Ｒ24、ＲＯＲ１、スフィンゴ脂質、ＳＳＥＡ‐１、ＳＳＥＡ‐３、ＳＳＥＡ‐４、ｓＴｎ、Ｔ細胞受容体由来ペプチド、Ｔ5Ａ7、ＴＡＧ‐７２、ＴＬ５、ＴＮＦ‐受容体、ＴＮＦ‐γ受容体、ＴＲＡ‐１‐８５、トランスフェリン受容体、５Ｔ４、ＴＳＴＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＰ８、ＶＥＰ９、ＶＩＭ‐Ｄ５、及びＹハプテン、Ｌｅyからなる群から選択される、請求項３０に記載の使用又は方法。
【請求項３３】
前記疾患抗原は、５Ｔ４、Ｂ７‐Ｈ３、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＲＦ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＩＬ１３Ｒα２又はＶＥＧＦである、請求項３２に記載の使用又は方法。
【請求項３４】
前記疾患抗原は病原体関連抗原である、請求項２７に記載の使用又は請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記病原体関連抗原は、病原体関連抗原：単純ヘルペスウイルス感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、単純ヘルペスウイルスｇＤ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐１、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ａ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ｂ、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ４１等、ヒトパピローマウイルスＥ６、ヒトパピローマウイルスＥ７、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ６４、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ４６、及びヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ２１からなる群から選択される、請求項３４に記載の使用又は方法。
【請求項３６】
前記疾患抗原はＨＩＶ  ｅｎｖ抗原である、請求項３５に記載の使用又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許出願第６２／５９７，８００号（２０１７年１２月１２日出願；係属中）に対する優先権を主張するものであり、上記出願は参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００２】
［配列表の参照］
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ以上の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：１３０１＿０１５３ＰＣＴ＿配列＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０１８年１２月４日作成、サイズ：２７６，３８４バイト）において開示されており、上記ファイルは、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００３】
本発明は、ヒトＣＤ１６のエピトープに結合できる分子（例えば抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、抗体、ＴａｎｄＡｂ等）（「ＣＤ１６結合分子」）を対象とする。本発明は更に、ヒトＣＤ１６のエピトープと、疾患抗原（「ＤＡ」）の１つ以上のエピトープとに結合できるＣＤ１６結合分子（例えば「ＣＤ１６×ＤＡ結合分子」）を対象とする。本発明は特に、抗体である、又はそのエピトープ結合ドメインを含む、又はダイアボディ（ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを含む）、二重特異性抗体、ＴａｎｄＡｂ、他の多重特異性結合分子（例えば３価ＴＲＩＤＥＮＴ（商標）分子）等である、上述のようなＣＤ１６×ＤＡ結合分子を対象とする。本発明は特に、ＣＤ１６に結合できることに加えて、癌抗原又は病原体関連抗原である疾患抗原に結合できる、ＣＤ１６×ＤＡ結合分子に関する。本発明は特に、癌及び病原体関連疾患の治療における、上述のようなＣＤ１６及びＣＤ１６×ＤＡ結合分子の使用に関する。本発明はまた、１つ以上の上記分子を含む医薬組成物も対象とする。
【背景技術】
【０００４】
哺乳類免疫系は、例えば創傷、感染及び新生物を含む多様な状態に対する防御として機能する。ヒト及び他の哺乳類が病原体、外来物質及び癌抗原に対する免疫応答を発現する効率は、２つの特徴：抗原認識に対する免疫応答の優れた特異性、及び同一の抗原による再活性化に対するより迅速かつより活発な応答を可能とする免疫記憶に基づくものである（非特許文献１〜３）。
【０００５】
健康な個体では、免疫系は静止状態であり、多様な阻害性受容体及びリガンドによって阻害される。癌抗原、微生物病原体又はアレルゲンを認識すると、活性化受容体及び受容体リガンドのアレイは、免疫系の活性化を誘発するようトリガされる。このような活性化は、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び抗原特異性細胞傷害性Ｔ細胞の活性化につながり、様々なサイトカインの放出を促進し、これらのサイトカインは全て、被験者の健康に対する知覚された脅威に対抗するよう作用する（非特許文献４〜６）。免疫系は、相殺阻害性免疫シグナルが活性化免疫シグナルよりも大きい場合に、その正常な静止状態に戻ることができる。
【０００６】
よって、癌の疾患状態（及び実際には感染性疾患の疾患状態）は、被験者の免疫系の十分な活性化の失敗を反映したものであると考えることができる。このような失敗は、活性化免疫シグナルの不十分な提示を反映したものであってよく、又は被験者における阻害性免疫シグナルを軽減する能力が不十分であることを反映したものであってよい。いくつかの例では、研究者により、癌細胞が免疫系を組み込むことによって、上記免疫系に検出されるのを避けることができることが判明した（非特許文献３）。
【０００７】
受容体のうち、Ｆｃ受容体：ＣＤ１６、ＣＤ３２、及びＣＤ６４が、免疫系の活性化に関与する。これらのＦｃ受容体は、複数のタイプの免疫系細胞（例えばＢリンパ球、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及び肥満細胞）の表面上に見られる。このような受容体は、（これによってＦｃドメインと結紮できる）「細胞外」部分、（細胞膜を通って延在する）「膜透過」部分、及び（細胞の内側に位置する）「細胞質」部分を有する。複数のタイプのＦｃγＲ：ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）、ＣＤ１６Ｂ（ＦｃγＲＩＩＩＢ）、ＣＤ３２Ａ（ＦｃγＲＩＩＡ）、ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）及びＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）が同定されている。このような結合により、活性化又は阻害シグナルが免疫系に伝達される。これらの受容体はＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合することにより、免疫系への活性化又は阻害シグナルの伝達をトリガする。
【０００８】
ＣＤ１６は、活性化性Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）の一般名である。これらの受容体は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合することにより、サイトカインの放出をトリガする。このような抗体が、細胞（例えば癌細胞、病原体感染細胞等）上に発現された疾患抗原に結合すると、このような放出によって標的化された細胞の殺滅が仲介される。
【０００９】
ＣＤ１６Ａは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び凝集しているがモノマーではないヒトＩｇＧに結合する組織マクロファージによって発現される（非特許文献７〜１３）。
【００１０】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によるＣＤ１６Ａの発現は、本発明に特に関連する。というのは、上記細胞は、そのＣＤ１６分子が抗体のＦｃドメインに結合するとサイトカインを放出するためである。よって、天然抗体が標的細胞の疾患抗原に結合すると、そのＦｃドメインをナチュラルキラー細胞のＣＤ１６分子によって認識でき、そしてナチュラルキラー細胞は標的細胞の殺滅を仲介する。このような殺滅は抗体依存性であるため、抗体依存性細胞仲介型細胞傷害性（ａｎｔｉｂｏｄｙ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）と呼ばれる。従ってＡＤＣＣは、事前の抗体応答に依存し、ＦｃγＲ発現性エフェクタ細胞（典型的にはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、及び好酸球）の存在及び関与を必要とする。ＣＤ１６Ａは、ＮＫ細胞のＣＤξタンパク質との相互作用によってＡＤＣＣをシグナリングし、またマクロファージＦｃγＲ鎖との相互作用によってマクロファージ仲介型殺滅をシグナリングする。
【００１１】
ＣＤ１６Ａは２つの主要な多型、Ｆ１５８及びＶ１５８を有し、これらは、残基１５８（ＣＤ１６Ａの細胞外ドメインの残基１６０（図７）として示され、全長タンパク質の残基１７６に対応する）に、フェニルアラニン又はバリンを有する点で異なっている（非特許文献１４〜１８）。白色人種の５０％は、フェニルアラニン多型についてホモ接合型（Ｆ１５８／Ｆ１５８）であるのに対し、白色人種の３９％は、この多型についてヘテロ接合型（Ｆ１５８／Ｖ１５８）であり、また白色人種の１１％は、バリン多型についてホモ接合型（Ｖ１５８／Ｖ１５８）である。
【００１２】
ＣＤ１６Ｂは好中球上で発現され、グリコホスファチジルイノシトールに固定される（「ＧＰＩ固定型」）（非特許文献１９、２０、７、１３）。これはデコイ受容体であると考えられるが、シグナルを伝達することもでき（非特許文献２１）、また細胞活性化後にＡＤＡＭ１７によって下方制御／切断される（非特許文献２２、３）。
【００１３】
ＣＤ１６Ｂは２つの主要な多型、ＮＡ１及びＮＡ２を有し、これらはＩｇＧ１及びＩｇＧ３サブクラスに対する異なる結合親和性を呈する（非特許文献２４、１７）。白色人種の１３％及びインド人の１６％は、ＮＡ１多型についてホモ接合型（ＮＡ１／ＮＡ１）であるのに対し、白色人種の５５％及びインド人の２８％は、この多型についてヘテロ接合型（ＮＡ１／ＮＡ２）であり、白色人種の３２％及びインド人の５５％は、ＮＡ２多型についてホモ接合型（ＮＡ２／ＮＡ２）である。ヒトＣＤ１６Ａ及びＣＤ１６Ｂアロタイプの配置を図７に示す。
【００１４】
ＣＤ３２Ａ（ＦｃγＲＩＩＡ）（非特許文献２５、１７、７）及びＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）（非特許文献２６〜２９）は、マクロファージ、好中球、好酸球及び樹状細胞上で（ＣＤ３２Ａに関しては、血小板及びランゲルハンス細胞上でも）発現される活性化性Ｆｃ受容体である。対照的に、ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）は、Ｂリンパ球（マクロファージ、好中球及び好酸球）上の阻害性Ｆｃ受容体である（非特許文献３０〜３２、７）。
【００１５】
様々なＦｃγＲの、正反対の機能を仲介する能力は、それらの構造的な差異、特にＦｃγＲが免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ‐ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ：「ＩＴＡＭ」）を有するか、免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ‐ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ：「ＩＴＩＭ」）を有するかを反映する。これらの構造に対する異なる細胞質酵素の補充は、ＦｃγＲ仲介細胞応答の結果を決定づける。ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡを含み、Ｆｃドメイン（例えば免疫複合体中に存在する凝集Ｆｃドメイン）に結合した場合に免疫系を活性化する。ＦｃγＲＩＩＢは、現在知られている唯一の天然ＩＴＩＭ含有ＦｃγＲであり；凝集Ｆｃドメインに結合した場合に、免疫系を弱めるか、又は阻害する働きをする。
【００１６】
ある特定の疾患抗原のエピトープを対象とする天然ＩｇＧ抗体は、ＣＤ１６分子と相互作用して被験者の免疫応答を活性化できるＦｃドメインを有するが、多くの疾患及び多くの被験者について、このような免疫応答の活性化は、疾患の有効な療法を提供するために十分なものではない。よって、哺乳類の免疫応答に関与する分子の同定における過去の進歩にもかかわらず、癌及び感染症の治療のための改良された療法に対する需要が存在し続けている。本発明のＣＤ１６結合分子、特にＣＤ１６結合ドメインと、標的細胞上に発現される疾患抗原に対して特異的な結合ドメインとを含む、本発明のＣＤ１６×ＤＡ結合分子は、ＣＤ１６発現細胞を、疾患抗原を発現する細胞の１つ以上の部位に共局在させることができる。このような共局在化により、疾患抗原のエピトープを対象とする抗体のＦｃ部分がＣＤ１６発現性エフェクタ細胞に結合し、このようなＦｃ‐ＣＤ１６間の相互作用によって免疫系の活性化及び標的細胞に対するサイトカインの放出をトリガする可能性を高めることによって、標的細胞のＡＤＣＣ仲介型殺滅を強化する。よって本発明は、疾患抗原に対する被験者の免疫応答の活性化の改善、及び他の目標を対象とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Portoles, P. et al. (2009) “The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination,” Current Pharmaceutical Design 15:3290-3300
【非特許文献２】Guy, C.S. et al. (2009) “Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex,” Immunol Rev. 232(1):7-21
【非特許文献３】Topalian, S.L. et al. (2015) “Immune Checkpoint Blockade: A Common Denominator Approach to Cancer Therapy,” Cancer Cell 27:450-461
【非特許文献４】Dong, C. et al. (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,” Immunolog. Res. 28(1):39-48
【非特許文献５】Viglietta, V. et al. (2007) “Modulating Co-Stimulation,” Neurotherapeutics 4:666-675
【非特許文献６】Korman, A.J. et al. (2007) “Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy,” Adv. Immunol. 90:297-339
【非特許文献７】Selvaraj, P. et al. (2004) “Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors,” Immunol Res. 29(1-3):219-230
【非特許文献８】Peltz, G.A. et al. (1989) “Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86(3):1013-1017
【非特許文献９】Bachanova, V. et al. (2014) “NK Cells In Therapy Of Cancer,” Crit. Rev. Oncog. 19(1-2):133-141
【非特許文献１０】Miller, J.S. (2013) “Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic,” Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247-253
【非特許文献１１】Youinou, P. et al. (2002) “Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases,” Autoimmun Rev. 1(1-2):13-19
【非特許文献１２】Peipp, M. et al. (2002) “Bispecific Antibodies Targeting Cancer Cells,” Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-511
【非特許文献１３】Unkeless, J.C. et al. (1995) “Function Of Human Fc Gamma RIIA And Fc Gamma RIIIB,” Semin. Immunol. 7(1):37-44
【非特許文献１４】Wu, J. et al. (1997) “A Novel Polymorphism of FcγRIIIa (CD16) Alters Receptor Function and Predisposes to Autoimmune Disease,” J. Clin.Invest. 100(5):1059-1070
【非特許文献１５】Ravetch, J. V. et al. (1989) “Alternative Membrane Forms Of FcγRIII(CD16) On Human Natural Killer Cells And Neutrophils,” J. Exper. Med. 170:481-497
【非特許文献１６】Koene, H.R. et al. (1997) “FcγRIIIa-158V/F Polymorphism Influences the Binding of IgG by Natural Killer Cell FcγRIIIa, Independently of the FcγRIIIa-48L/R/H Phenotype,” Blood,  90(3):1109-1114
【非特許文献１７】van Sorge, N.M. (2003) “FcgammaR Polymorphisms: Implications For Function, Disease Susceptibility And Immunotherapy,” Tissue Antigens 61(3):189-202
【非特許文献１８】Fijen, C.A. (2000) “The Role Of Fcgamma Receptor Polymorphisms And C3 In The Immune Defence Against Neisseria Meningitidis In Complement-Deficient Individuals,” Clin. Exp. Immunol. 120(2):338-345
【非特許文献１９】Meknache, N. et al. (2009) “Human Basophils Express The Glycosylphosphatidylinositol-Anchored Low-Affinity IgG Receptor FcgammaRIIIB (CD16B),” J. Immunol. 182(4):2542-2550
【非特許文献２０】Fernandes, M.J. et al. (2006) “CD16b Associates With High-Density, Detergent-Resistant Membranes In Human Neutrophils,” Biochem. J. 393(Pt 1):351-359
【非特許文献２１】Fernandes, M.J. (2005) “Signaling Through CD16b In Human Neutrophils Involves The Tec Family Of Tyrosine Kinases,” J. Leukoc. Biol. 78(2):524-532
【非特許文献２２】Wang, Y. et al. (2013) “ADAM17 Cleaves CD16b (FcγRIIIb) In Human Neutrophils,” Biochim. Biophys. Acta 1833(3):680-685
【非特許文献２３】Guo, S. et al. (2012) “Role of ADAM10 and ADAM17 in CD16b Shedding Mediated By Different Stimulators,” Chin. Med. Sci. J. 27(2):73-79
【非特許文献２４】Bournazos, S. et al. (2010) “Fcγ Receptor IIIb (CD16b) Polymorphisms Are Associated With Susceptibility To Idiopathic Pulmonary Fibrosis,” Lung 188(6):475-481
【非特許文献２５】Brandsma, A.M. (2015) “Fc Receptor Inside-Out Signaling And Possible Impact On Antibody Therapy,” Immunol Rev. 268(1):74-87
【非特許文献２６】Lu, S. et al. (2015) “Structural Mechanism Of High Affinity FcγRI recognition Of Immunoglobulin G,” Immunol. Rev. 268(1):192-200
【非特許文献２７】Swisher, J.F. et al. (2015) “The Many Faces Of FcγRI: Implications For Therapeutic Antibody Function,” Immunol. Rev. 268(1):160-174
【非特許文献２８】Thepen, T. et al. (2009) “Fcgamma Receptor 1 (CD64), A Target Beyond Cancer,” Curr. Pharm. Des. 15(23):2712-2718
【非特許文献２９】Rouard, H. et al. (1997) “Fc Receptors As Targets For Immunotherapy,” Int. Rev. Immunol. 16(1-2):147-185
【非特許文献３０】Stopforth, R.J. et al. (2016) “Regulation of Monoclonal Antibody Immunotherapy by FcγRIIB,” J. Clin. Immunol. [2016 Feb 27 Epub], pp. 1-7
【非特許文献３１】Bruhns, P. et al. (2009) “Specificity And Affinity Of Human Fcgamma Receptors And Their Polymorphic Variants For Human IgG Subclasses,” Blood. 113(16):3716-3725
【非特許文献３２】White, A.L. et al. (2014) “FcγRIIB As A Key Determinant Of Agonistic Antibody Efficacy,” Curr. Top. Microbiol. Immunol. 382:355-372
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、ヒトＣＤ１６のエピトープに結合できる分子（例えば抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、抗体、ＴａｎｄＡｂ等）（「ＣＤ１６結合分子」）を対象とする。本発明は更に、ヒトＣＤ１６のエピトープと、疾患抗原（「ＤＡ」）の１つ以上のエピトープとに結合できるＣＤ１６結合分子（例えば「ＣＤ１６×ＤＡ結合分子」）を対象とする。本発明は特に、抗体である、又はそのエピトープ結合ドメインを含む、又はダイアボディ（ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを含む）、二重特異性抗体、ＴａｎｄＡｂ、他の多重特異性結合分子（例えば３価ＴＲＩＤＥＮＴ（商標）分子）等である、上述のようなＣＤ１６×ＤＡ結合分子を対象とする。本発明は特に、ＣＤ１６に結合できることに加えて、癌抗原又は病原体関連抗原である疾患抗原に結合できる、ＣＤ１６×ＤＡ結合分子に関する。本発明は特に、癌及び病原体関連疾患の治療における、上述のようなＣＤ１６及びＣＤ１６×ＤＡ結合分子の使用に関する。本発明はまた、１つ以上の上記分子を含む医薬組成物も対象とする。
【００１９】
詳細には、本発明は、ＣＤ１６のエピトープに結合できるＣＤ１６結合ドメインと、疾患抗原のエピトープに結合できる疾患抗原結合ドメインとを含む、ＣＤ１６×疾患抗原（ＣＤ１６×ＤＡ）結合分子を提供し、ここで上記ＣＤ１６結合ドメインは：
（Ｉ）（Ａ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号６８又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号６９又は配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲL２ドメイン；及び
（Ｆ）配列番号７１又は配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲL３ドメイン；
（ＩＩ）（Ａ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲL２ドメイン；及び
（Ｆ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲL３ドメイン；
（ＩＩＩ）配列番号７２、配列番号８３、配列番号８４、又は配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；
（ＩＶ）配列番号７３、配列番号８５、又は配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（Ｖ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（ＶＩ）配列番号８３又は配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（ＶＩＩ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（ＶＩＩＩ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；並びに
（ＩＸ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
のうちの１つ以上を含む。
【００２０】
本発明は更に、上記分子が二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、二重特異性ＴａｎｄＡｂ、二重特異性３価分子、又は二重特異性ＣＡＲである、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００２１】
本発明は更に、上記分子が２つ以上の疾患抗原及び／又は２つ以上のＣＤ１６のエピトープに結合できる、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００２２】
本発明は更に、上記ＣＤ１６結合ドメインが：
（Ａ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号６８、又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号６９、又は配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲL２ドメイン；及び
（Ｆ）配列番号７１、又は配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲL３ドメイン
を含む、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００２３】
本発明は更に、上記ＣＤ１６結合ドメインが：
（Ａ）配列番号７２、若しくは配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；
（Ｂ）配列番号７３、若しくは配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（Ｃ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（Ｄ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（Ｅ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は
（Ｆ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００２４】
本発明は更に、上記ＣＤ１６結合ドメインが：
（Ａ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲL２ドメイン；及び
（Ｆ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲL３ドメイン
を含む、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００２５】
本発明は更に、上記ＣＤ１６結合ドメインが：
（Ａ）配列番号８３、若しくは配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；
（Ｂ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は
（Ｃ）配列番号８３若しくは配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００２６】
本発明は更に、上記疾患抗原が癌抗原であり、上記疾患が癌である、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００２７】
本発明は更に、上記癌が、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膠芽腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、小リンパ性リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、精巣癌、及び子宮癌からなる群から選択される、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００２８】
本発明は更に、上記癌抗原が、癌抗原：１９．９、４．２、Ａ３３、ＡＤＡＭ‐９、ＡＨ６、ＡＬＣＡＭ、Ｂ１、Ｂ７‐Ｈ３、ＢＡＧＥ、β‐カテニン、血液型ＡＬｅb／Ｌｅy、バーキットリンパ腫抗原‐３８．１３、Ｃ１４、ＣＡ１２５、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４０／ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１０３、ＣＤ１２３、ＣＤ３１７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＯ１７‐１Ａ、ＣＯ‐４３、ＣＯ‐５１４、ＣＴＡ‐１、ＣＴＬＡ‐４、サイトケラチン８、Ｄ１．１、Ｄ1５６‐２２、ＤＲ５、Ｅ1シリーズ、ＥＧＦＲ、エフリン受容体、ＥｐｈＡ２、Ｅｒｂ、ＧＡＧＥ、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２ガングリオシド、ＧＩＣＡ１９‐９、ｇｐ１００、Ｇｐ３７、ｇｐ７５、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＦＧ、ヒトパピローマウイルス‐Ｅ６／ヒトパピローマウイルス‐Ｅ７、ＨＭＷ‐ＭＡＡ、Ｉ抗原、ＩＬ１３Ｒα２、インテグリンβ６、ＪＡＭ‐３、ＫＩＤ３、ＫＩＤ３１、ＫＳ  １／４汎癌腫抗原、Ｌ６、Ｌ２０、ＬＥＡ、ＬＵＣＡ‐２、Ｍ１：２２：２５：８、Ｍ１８、Ｍ３９、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ、メソテリン、ＭＵＣ‐１、ＭＵＭ‐１、Ｍｙｌ、Ｎ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ネオ糖タンパク質、ＮＳ‐１０、ＯＦＡ‐１、ＯＦＡ‐２、オンコスタチンＭ、ｐ１５、ｐ９７、ＰＥＭ、ＰＥＭＡ、ＰＩＰＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、前立腺酸性リン酸塩、Ｒ24、ＲＯＲ１、スフィンゴ脂質、ＳＳＥＡ‐１、ＳＳＥＡ‐３、ＳＳＥＡ‐４、ｓＴｎ、Ｔ細胞受容体由来ペプチド、Ｔ5Ａ7、ＴＡＧ‐７２、ＴＬ５、ＴＮＦ‐受容体、ＴＮＦ‐γ受容体、ＴＲＡ‐１‐８５、トランスフェリン受容体、５Ｔ４、ＴＳＴＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＰ８、ＶＥＰ９、ＶＩＭ‐Ｄ５、及びＹハプテン、Ｌｅyからなる群から選択される、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００２９】
本発明は更に、上記疾患抗原が、５Ｔ４、Ｂ７‐Ｈ３、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＲＦ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＩＬ１３Ｒα２又はＶＥＧＦである、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００３０】
本発明は更に、上記疾患抗原が病原体関連抗原である、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００３１】
本発明は更に、上記病原体関連抗原が、病原体関連抗原：単純ヘルペスウイルス感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、単純ヘルペスウイルスｇＤ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐１、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ａ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ｂ、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ４１等、ヒトパピローマウイルスＥ６、ヒトパピローマウイルスＥ７、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ６４、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ４６、及びヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ２１からなる群から選択される、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００３２】
本発明は更に、上記疾患抗原がＨＩＶ  ｅｎｖ抗原である、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００３３】
本発明は更に、上記分子が：
（Ａ）２つ、３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、ダイアボディ；
（Ｂ）３つ、４つ、若しくは５つのポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、３価結合性分子；又は
（Ｃ）二重特異性抗体
である、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００３４】
本発明は更に、上記分子がＦｃ領域を含む、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００３５】
本発明は更に、上記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプのものである、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００３６】
本発明は更に、上記Ｆｃ領域が、変異型Ｆｃ領域であって：
（Ａ）ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する１つ以上のアミノ酸修飾；及び／又は
（Ｂ）上記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を向上させる１つ以上のアミノ酸修飾
を含む、変異型Ｆｃ領域である、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００３７】
本発明は更に：
（Ａ）ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する上記修飾が、Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの置換を含み；
（Ｂ）上記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を向上させる上記修飾が、Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；又はＫ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋの置換を含み、
上記番号付与はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子の実施形態に関する。
【００３８】
本発明は更に：
（Ａ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号６８、又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号６９、又は配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲL２ドメイン；及び
（Ｆ）配列番号７１、又は配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲL３ドメイン
を含む、ＣＤ１６結合分子に関する。
【００３９】
本発明は更に、上記分子が：
（Ａ）配列番号７２、若しくは配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；
（Ｂ）配列番号７３、若しくは配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（Ｃ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（Ｄ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
（Ｅ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は
（Ｆ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、上述のＣＤ１６結合分子の実施形態に関する。
【００４０】
本発明は更に、上記分子が：
（Ａ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲL２ドメイン；及び
（Ｆ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲL３ドメイン
を含む、上述のＣＤ１６結合分子の実施形態に関する。
【００４１】
本発明は更に、上記分子が：
（Ａ）配列番号８３、若しくは配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；
（Ｂ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は
（Ｃ）配列番号８３若しくは配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、上述のＣＤ１６結合分子の実施形態に関する。
【００４２】
本発明は更に、上記分子が：抗体、多重特異性抗体、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、（Ｆｖ）断片、単鎖（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ダイアボディ、３価結合分子、及びＣＡＲ‐Ｔ分子からなる群から選択される、上述のＣＤ１６結合分子の実施形態に関する。
【００４３】
本発明は更に、上述のＣＤ１６×疾患抗原結合分子又はＣＤ１６結合分子のうちのいずれと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物に関する。
【００４４】
本発明は更に、疾患抗原の発現を特徴とする疾患の治療における、上述の医薬組成物の使用に関する。
【００４５】
本発明は更に、疾患抗原の発現を特徴とする疾患の治療のための方法に関し、上記方法は、治療的有効量の上述の医薬組成物を、それを必要とする被験者に投与するステップを含む。
【００４６】
本発明は更に、上記ＣＤ１６×疾患抗原結合分子が、２つ以上の疾患抗原及び／又はＣＤ１６の２つ以上のエピトープに結合できる、上述の使用又は方法の実施形態に関する。
【００４７】
本発明は更に、上記疾患抗原が癌抗原であり、上記疾患が癌である、上述の使用又は方法に関する。
【００４８】
本発明は更に、上記癌が、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膠芽腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、小リンパ性リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、精巣癌、及び子宮癌からなる群から選択される、上述の使用又は方法に関する。
【００４９】
本発明は更に、上記癌抗原が、癌抗原：１９．９、４．２、Ａ３３、ＡＤＡＭ‐９、ＡＨ６、ＡＬＣＡＭ、Ｂ１、Ｂ７‐Ｈ３、ＢＡＧＥ、β‐カテニン、血液型ＡＬｅb／Ｌｅy、バーキットリンパ腫抗原‐３８．１３、Ｃ１４、ＣＡ１２５、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４０／ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１０３、ＣＤ１２３、ＣＤ３１７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＯ１７‐１Ａ、ＣＯ‐４３、ＣＯ‐５１４、ＣＴＡ‐１、ＣＴＬＡ‐４、サイトケラチン８、Ｄ１．１、Ｄ1５６‐２２、ＤＲ５、Ｅ1シリーズ、ＥＧＦＲ、エフリン受容体、ＥｐｈＡ２、Ｅｒｂ、ＧＡＧＥ、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２ガングリオシド、ＧＩＣＡ１９‐９、ｇｐ１００、Ｇｐ３７、ｇｐ７５、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＦＧ、ヒトパピローマウイルス‐Ｅ６／ヒトパピローマウイルス‐Ｅ７、ＨＭＷ‐ＭＡＡ、Ｉ抗原、ＩＬ１３Ｒα２、インテグリンβ６、ＪＡＭ‐３、ＫＩＤ３、ＫＩＤ３１、ＫＳ  １／４汎癌腫抗原、Ｌ６、Ｌ２０、ＬＥＡ、ＬＵＣＡ‐２、Ｍ１：２２：２５：８、Ｍ１８、Ｍ３９、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ、メソテリン、ＭＵＣ‐１、ＭＵＭ‐１、Ｍｙｌ、Ｎ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ネオ糖タンパク質、ＮＳ‐１０、ＯＦＡ‐１、ＯＦＡ‐２、オンコスタチンＭ、ｐ１５、ｐ９７、ＰＥＭ、ＰＥＭＡ、ＰＩＰＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、前立腺酸性リン酸塩、Ｒ24、ＲＯＲ１、スフィンゴ脂質、ＳＳＥＡ‐１、ＳＳＥＡ‐３、ＳＳＥＡ‐４、ｓＴｎ、Ｔ細胞受容体由来ペプチド、Ｔ5Ａ7、ＴＡＧ‐７２、ＴＬ５、ＴＮＦ‐受容体、ＴＮＦ‐γ受容体、ＴＲＡ‐１‐８５、トランスフェリン受容体、５Ｔ４、ＴＳＴＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＰ８、ＶＥＰ９、ＶＩＭ‐Ｄ５、及びＹハプテン、Ｌｅyからなる群から選択される、上述の使用又は方法に関する。
【００５０】
本発明は更に、上記疾患抗原が、５Ｔ４、Ｂ７‐Ｈ３、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＲＦ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＩＬ１３Ｒα２又はＶＥＧＦである、上述の使用又は方法に関する。
【００５１】
本発明は更に、上記疾患抗原が病原体関連抗原である、上述の使用又は方法に関する。
【００５２】
本発明は更に、上記病原体関連抗原が、病原体関連抗原：単純ヘルペスウイルス感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、単純ヘルペスウイルスｇＤ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐１、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ａ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ｂ、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ４１等、ヒトパピローマウイルスＥ６、ヒトパピローマウイルスＥ７、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ６４、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ４６、及びヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ２１からなる群から選択される、上述の使用又は方法に関する。
【００５３】
本発明は更に、上記疾患抗原がＨＩＶ  ｅｎｖ抗原である、上述の使用又は方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１Ａ−１Ｂ】図１Ａ〜１Ｂは、それぞれＥコイル又はＫコイルヘテロ二量体促進ドメイン（選択できるヘテロ二量体促進ドメインは以下で提示する）を有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合ダイアボディの概略図を提供する。システイン残基は、リンカー中（図１Ａ）及び／又はヘテロ二量体促進ドメイン中（図１Ｂ）に存在してよい。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。この図、及び結合分子ドメインの概略図を提供する全ての図における、波状の線（ＷＷＷ）は、１つ以上の任意のヘテロ二量体促進ドメインを表し、これは存在することが好ましい。
【図２】図２は、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、それぞれＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図３Ａ−３Ｅ】図３Ａ〜３Ｅは、２ペアのポリペプチド鎖（即ち合計４つのポリペプチド鎖）からなる４つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合した４価ダイアボディの概略図である。各ペアのうちの１つのポリペプチド鎖は、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。上記２ペアのポリペプチド鎖は、同一であってよい。（図３Ａ〜３Ｂに示すように）２ペアのポリペプチド鎖が同一であり、かつＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、二重特異性であり、結合する各エピトープに対して２価である。ＶＬ及びＶＨドメインが同一のエピトープを認識する（例えば同一のＶＬドメインＣＤＲ及び同一のＶＨドメインＣＤＲを両方の鎖に対して使用する）実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、単一特異性であり、単一のエピトープに対して４価である。あるいは、上記２ペアのポリペプチドは異なっていてよい。（図３Ｃにおいて様々な陰影及びパターンで示すように）ポリペプチドの各ペアのＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、四重特異性であり、結合する各エピトープに対して１価である。図３Ａは、システイン残基を含むペプチドヘテロ二量体促進ドメインを含有するＦｃ領域含有ダイアボディを示す。図３ＢはＦｃ領域含有ダイアボディを示し、これは、システイン残基及び（任意のシステイン残基を有する）リンカーを含む、Ｅコイル及びＫコイルヘテロ二量体促進ドメインを含有する。図３Ｃは、抗体ＣＨ１及びＣＬドメインを含有するＦｃ領域含有ダイアボディを示す。図３Ｄ〜３Ｅは、図３Ｂに示した結合ドメインの選択によって、ＣＤ１６のエピトープに対して特異的な２つの結合部位及びＤＡのエピトープに対して特異的な２つの結合部位を有するＣＤ１６×ＤＡ結合分子をどのようにもたらすことができるかの非限定的な例を示す。図３Ｄ〜３Ｅは、異なる配向を有するＣＤ１６×ＤＡ結合分子を得るために、ドメインをどのように選択できるかを示す（即ち、図３Ｄは、上記結合分子のＶＬ１ドメインとしてＶＬ  ＣＤ１６ドメインを、上記結合分子のＶＨ１ドメインとしてＶＨ  ＣＤ１６ドメインを、上記結合分子のＶＬ２ドメインとしてＶＬ  ＤＡドメインを、及び上記結合分子のＶＨ２ドメインとしてＶＨ  ＤＡドメインを採用する。対照的に、図３Ｅは、上記結合分子のＶＬ１ドメインとしてＶＬ  ＤＡドメインを、上記結合分子のＶＨ１ドメインとしてＶＨ  ＤＡドメインを、上記結合分子のＶＬ２ドメインとしてＶＬ  ＣＤ１６ドメインを、及び上記結合分子のＶＨ２ドメインとしてＶＨ  ＣＤ１６ドメインを採用する）。以下で提示されるように、ポリペプチド鎖の集合によって形成されるＶＬ／ＶＨ結合部位は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又は四重特異性の４価結合を可能とするために、同一であっても異なっていてもよい。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは、３つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体促進ドメインを更に含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図５Ａ−５Ｄ】図５Ａ〜５Ｄは、５つのポリペプチド鎖からなる４つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合型結合分子の概略図である。図５Ａは、このようなＣＤ１６×ＤＡ結合分子の一般構造を示す。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を含むＦｃ領域を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体促進ドメインを更に含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。図５Ｂは、代替的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の構造を示し、ここでは、例示的なＤＡであるＨＥＲ２／ｎｅｕに対して特異的な２つの非ダイアボディ型結合ドメインと、ＣＤ１６に対して特異的な２つのダイアボディ型結合ドメインとを有する、結果的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子を得るために、図５Ａに示されている可変ドメインが選択されている。図５Ｃは、代替的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の構造を示し、ここでは、ＣＤ１６に対して特異的な２つの非ダイアボディ型結合ドメインと、ＨＥＲ２／ｎｅｕに対して特異的な２つのダイアボディ型結合ドメインとを有する、結果的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子を得るために、図５Ａに示されている可変ドメインが選択されている。図５Ｄは、代替的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の構造を示し、ここでは、ＣＤ１６のエピトープに対して特異的な２つの非ダイアボディ型結合ドメインと、ＨＥＲ２／ｎｅｕのエピトープに対して特異的な１つのダイアボディ型結合ドメインと、ＣＤ１６のエピトープに対して特異的な第２のダイアボディ型結合ドメインとを有する、結果的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子を得るために、図５Ａに示されている可変ドメインが選択されている。このようなＣＤ１６エピトープは、同一であっても異なっていてもよい。理解されるように、図５Ａに示されている結合ドメインを適切に選択することによって、ＣＤ１６のエピトープに結合するために、これらの結合ドメインのうちのいずれの３つを選択して、ＣＤ１６のエピトープに結合させることができる。また同様に、これらの結合ドメインのうちのいずれの３つを選択して、ＨＥＲ２／ｎｅｕのエピトープに結合させることができる。以下で提示するように、ポリペプチド鎖の集合によって形成されるＶＬ／ＶＨ結合部位は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又は四重特異性の４価結合を可能とするために、同一であっても異なっていてもよい。
【図６Ａ−６Ｆ】図６Ａ〜６Ｈは、３つのエピトープ結合部位を有する、代表的なＦｃ領域含有３価結合分子の概略図である。図６Ａは、ダイアボディ型結合ドメインがＦｃ領域に対するＮ末端又はＣ末端となる異なるドメイン配向を有する、２つのダイアボディ型結合ドメイン及びＦａｂ型結合ドメインを含む３価結合分子のドメインの概略図を示す。図６Ｂ〜６Ｃは、ＣＤ１６×ＤＡ結合分子の例示的かつ非限定的な例の構造を示し、ここでは、ＣＤ１６に対して特異的な非ダイアボディ型結合ドメインと、例示的なＤＡであるＨＥＲ２／ｎｅｕに対して特異的なダイアボディ型結合ドメインと、ＣＤ１６に対して特異的な第２のダイアボディ型結合ドメインとを有する、結果的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子を得るために、図６Ａに示されている可変ドメインが選択されている。図６Ｄは、ダイアボディ型結合ドメインがＦｃ領域に対するＮ末端又はＣ末端となる異なるドメイン配向を有する、２つのダイアボディ型結合ドメイン及びＦａｂ型結合ドメインを含む３価結合分子のドメインを概略図で示す。図６Ａ〜６Ｄの分子は４つの鎖を含む。図６Ｅ及び６Ｆはそれぞれ、Ｆｃ領域のＮ末端にある２つのダイアボディ型結合ドメインと、軽鎖及び重鎖がポリペプチドスペーサを介して連結されたＦａｂ型結合ドメイン、又はｓｃＦｖ型結合ドメインとを含む、３価結合分子のドメインの概略図を示す。図６Ｇ及び６Ｈの３価結合分子はそれぞれ、Ｆｃ領域のＣ末端にある２つのダイアボディ型結合ドメインと、軽鎖及び重鎖がポリペプチドスペーサを介して連結されたＦａｂ型結合ドメイン、又はｓｃＦｖ型結合ドメインとを含む、３価結合分子のドメインの概略図を示す。図６Ｅ〜６Ｈの３価結合分子は、３つの鎖を含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図７】図７は、ヒトＣＤ１６Ａの１５８Ｆアロタイプ（配列番号１４６）、ヒトＣＤ１６Ａの１５８Ｖアロタイプ（配列番号１４７）、ヒトＣＤ１６ＢのＮＡ１アロタイプ（配列番号１４８）、ヒトＣＤ１６ＢのＮＡ２アロタイプ（配列番号１４９）、及びカニクイザルのＣＤ１６（配列番号１５０）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の配置を示す。ヒトＣＤ１６Ａの１５８Ｆアロタイプの配列に対する差異を、下線付き太字で示す。提示されているヒトＣＤ１６Ａ分子の一部分において、１５８Ｆ／１５８Ｖ多型は１６０位に見られる。
【図８】図８は、ＬＮＫ１６、ＤＪ１３０ｃ及びＣＤ１６‐Ｍ１のＣＤ１６結合ドメインの、ＣＤ１６に結合する能力に対する、ヒトＩｇＧの濃度の上昇の影響を示す。
【図９Ａ−９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、ＣＤ１６結合分子：ＤＡＲＴ‐Ｆ及びＤＡＲＴ‐Ｇの、ドナー被験者の全血中のＮＫ細胞（図９Ａ；ＣＤ１６Ａ：ｎａ）、好中球（図９Ｂ；ＣＤ１６Ｂ：ｎａ）、及びＴ細胞（図９Ｃ）に結合する能力を、（ＣＤ３結合ドメインを介したＴ細胞との結合に関する陽性対照としての）ＨＩＶ×ＣＤ３ダイアボディ、（全ての結合に関する陽性対照としての）ＨＩＶ×ＲＳＶダイアボディ、及びｈ３Ｇ８×ＲＳＶダイアボディコンパレータ分子と比較して示す。
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｂは、ＣＤ１６結合分子：ＤＡＲＴ‐Ｆ及びＤＡＲＴ‐Ｇの、ゲーティングされたリンパ球集団（図１０Ａ）及びゲーティングされた顆粒球集団（図１０Ｂ）のＣＤ１６Ａ発現細胞に結合する能力を、（全ての結合に関する陰性対照としての）ＨＩＶ×ＲＳＶダイアボディ、及びｈ３Ｇ８×ＲＳＶダイアボディコンパレータ分子と比較して示す。
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｂは、ＣＤ１６‐Ｍ１及びｈ３Ｇ８のＣＤ１６結合ドメインの、グリコシル化アロタイプＮＡ１（図１１Ａ）及びＮＡ２（図１１Ｂ）を区別する能力を示す。
【図１２】図１２は、（ＤＡＲＴ‐Ｃ中に存在する）抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＣＤ１６結合ドメインの、全血中のＮＫ細胞に優先的に結合する能力を示す。
【図１３】図１３は、ヒトＣＤ１６（配列番号１８３）、カニクイザルＣＤ１６（配列番号１８４）、及びマウスＣＤ１６（配列番号１８５）のアミノ酸配列の配置を示す。ヒトＣＤ１６の配列に対する配列の差異は、下線付き太字で示されている。
【図１４Ａ−１４Ｅ】図１４Ａ〜１４Ｅは、ＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子：（ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｃ、（ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｄ、（ｈ３Ｇ８  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐１、陰性対照ＨＥＲ２／ｎｅｕ×ＲＳＶダイアボディ、又は陽性対照ｈ３Ｇ８×ＲＳＶダイアボディの存在下での、異なるレベルのＨＥＲ２／ｎｅｕ及びエフェクタ細胞（ヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝３０：１）又は精製済みヒトＮＫ細胞（Ｅ：Ｔ＝２：１））を発現する標的癌細胞の２４時間インキュベーションの結果としてのパーセンテージ細胞傷害性を示す。図１４Ａ：Ｎ８７  ＨＥＲ２／ｎｅｕ標的細胞（ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現：＋＋＋）／ＮＫ細胞；ＣＤ１６Ａアロタイプ１５８Ｆ／１５８Ｆ；図１４Ｂ：ＭＣＦ７  ＨＥＲ２／ｎｅｕ標的細胞（ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現：＋／‐）／ＮＫ細胞；ＣＤ１６Ａアロタイプ１５８Ｆ／１５８Ｆ；図１４Ｃ：ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１  ＨＥＲ２／ｎｅｕ標的細胞（ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現：＋／‐）／ＰＢＭＣ；ＣＤ１６Ａアロタイプ未評価；図１４Ｄ：Ｎ８７  ＨＥＲ２／ｎｅｕ標的細胞（ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現：＋＋＋）／ＰＢＭＣ；ＣＤ１６Ａアロタイプ１５８Ｆ／１５８Ｖ；図１４Ｅ：Ｈｓ７００Ｔ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ標的細胞（ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現：＋／‐）／ＰＢＭＣ；ＣＤ１６Ａアロタイプ１５８Ｆ／１５８Ｖ。
【図１５Ａ−１５Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｃは、ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ  ＣＤ１６結合分子：（ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｆ、（ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｇ、又は（ｈ３Ｇ８  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐２の存在下での、サブタイプＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質及びエフェクタ細胞（ヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝３０：１）又は精製済みヒトＮＫ細胞（Ｅ：Ｔ＝３：１）を発現するＨＥＫ／Ｄ３７１標的細胞の２４時間インキュベーションの結果としてのパーセンテージ細胞傷害性を示す。図１５Ａ：２９３ＨＥＫ  Ｄ３７１標的細胞／ＰＢＭＣ；ＣＤ１６Ａアロタイプ１５８Ｆ／１５８Ｖ；図１５Ｂ：２９３ＨＥＫ  Ｄ３７１標的細胞／ＰＢＭＣ；ＣＤ１６Ａアロタイプ１５８Ｆ／１５８Ｆ；図１５Ｃ：２９３ＨＥＫ  Ｄ３７１標的細胞／ＮＫ細胞；ＣＤ１６Ａアロタイプ１５８Ｆ／１５８Ｖ。
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｂは、（ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｘ、（ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｙ、（ｈ３Ｇ８  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐０、又はＤＡＲＴ‐３（ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＣＤ１６結合ドメインを有するＣＤ１６×ＲＳＶダイアボディ）を用いたインキュベーション後の、エフェクタ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ＣＤ１６Ａ  １５８Ｆ（図１６Ａ）又は１５８Ｖ／ＮＦＡＴ‐Ｌｕｃ細胞（図１６Ｂ））の存在下での、ＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質を発現する標的ＨＥＫ／Ｄ３７１細胞のパーセンテージ細胞傷害性を示す。
【図１７Ａ−１７Ｃ】図１７Ａ〜１７Ｃは、（ＤＡＲＴ‐Ｉ中に存在する）ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａ、（ＤＡＲＴ‐Ｊ中に存在する）ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ、（ＤＡＲＴ‐Ｋ中に存在する）ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢの最適化済みＣＤ１６結合ドメインの、ＰＢＭＣ試料中に存在するヒトＮＫ細胞（図１７Ａ）、カニクイザルＮＫ細胞（図１７Ｂ）、及びアカゲザルＮＫ細胞（図１７Ｃ）に結合する能力を、ｈＣＤ１６‐Ｍ１（ＤＡＲＴ‐Ｃ及びＤＡＲＴ‐３中に存在する）ｈＣＤ１６‐Ｍ１の親ＣＤ１６結合ドメイン並びに（ＤＡＲＴ‐１中に存在する）ｈ３Ｇ８のＣＤ１６結合ドメインと比較して示す。（ＣＤ１６結合ドメインを含まない）ＨＥＲ２／ｎｅｕ×ＲＳＶダイアボディが陰性対照として含まれている。
【図１８Ａ−１８Ｄ】図１８Ａ〜１８Ｄは、（ＤＡＲＴ‐Ｉ中に存在する）ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａ、（ＤＡＲＴ‐Ｊ中に存在する）ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ、及び（ＤＡＲＴ‐Ｋ中に存在する）ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａの最適化済みＣＤ１６結合ドメインの、ヒトエフェクタ細胞及びカニクイザルエフェクタ細胞の両方によるＨＥＲ２／ｎｅｕ発現性標的細胞の標的転換細胞殺滅を仲介する能力を示す。プロットされているのは、ＬＤＨ標的転換細胞殺滅アッセイ（パーセント細胞傷害性としてプロット、図１８Ａ及び１８Ｃ）又はＬＵＭ標的転換細胞殺滅アッセイ（相対発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ：ＲＬＵ）を単位として発光（ＬＵＭ）をプロット、図１８Ｂ及び１８Ｄ）において測定された、ＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子：（ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｃ、（ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａ  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｉ、（ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｊ、（ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢ結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｋ、（ｈ３Ｇ８  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐１、又は陰性対照ＨＥＲ２／ｎｅｕ×ＲＳＶダイアボディの存在下でのＪＩＭＴ‐１‐Ｌｕｃ標的癌細胞及びエフェクタ細胞（ヒトＰＢＭＣ（図１８Ａ〜１８Ｂ）又はカニクイザルＰＢＭＣ（図１８Ｃ〜１８Ｄ））（Ｅ：Ｔ＝３０：１）の２４時間インキュベーションの結果としての細胞傷害性である。
【図１９Ａ−１９Ｄ】図１９Ａ〜１９Ｄは、（ＤＡＲＴ‐Ｍ中に存在する）ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ、及び（ＤＡＲＴ‐Ｎ中に存在する）ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢの最適化済みＣＤ１６結合ドメインの、ヒトエフェクタ細胞によるＣＤ１９発現性標的細胞の標的転換細胞殺滅を仲介する能力を示す。ＬＤＨ標的転換細胞殺滅アッセイ（パーセント細胞傷害性としてプロット、図１９Ａ及び１９Ｂ）又はＬＵＭ標的転換細胞殺滅アッセイ（ＲＬＵを単位としてＬＵＭをプロット、図１９Ｃ及び１９Ｄ）において測定された、ＣＤ１６×ＣＤ１９結合分子：（ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｌ、（ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ結合ドメイン）を有するＤＡＲＴ‐Ｍ、（ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢ結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｎ、ズボルツキシズマブ（ｄｕｖｏｒｔｕｘｉｚｕｍａｂ：陽性対照ＣＤ３×ＣＤ１９ダイアボディ）、又は陰性対照ＣＤ１６×ＲＳＶダイアボディである（ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐５、（ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐６、（ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢ結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐７の存在下での、Ｒａｊｉ‐Ｌｕｃ標的癌細胞及びヒトＰＢＭＣエフェクタ細胞（Ｅ：Ｔ＝３０：１）の２４時間（図１９Ａ及び１９Ｃ）並びに４８時間（図１９Ｂ及び１９Ｄ）のインキュベーション後の細胞傷害性。
【図２０Ａ−２０Ｄ】図２０Ａ〜２０Ｄは、（ＤＡＲＴ‐Ｍ中に存在する）ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ、及び（ＤＡＲＴ‐Ｎ中に存在する）ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢの最適化済みＣＤ１６結合ドメインの、ヒトＰＢＭＣ試料及びカニクイザルＰＢＭＣ試料両方における試験管内で自己Ｂ細胞欠乏を仲介する能力を示す。フローサイトメトリーで測定された、ＣＤ１６×ＣＤ１９結合分子：（ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｌ、（ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｍ、（ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢ結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｎ、又は陰性対照ＣＤ１６×ＲＳＶダイアボディである（ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐５、（ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐６の存在下での、ヒト（図２０Ａ〜２０Ｂ）又はカニクイザル（図２０Ｃ‐２０Ｄ）ＰＢＭＣの７２時間（図２０Ａ及び２０Ｃ）、９６時間（図２０Ｂ）、並びに１４４時間（図２０Ｄ）インキュベーション後のＢ細胞数（ＣＤ３‐／ＣＤ２０+細胞）。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明は、ヒトＣＤ１６のエピトープに結合できる分子（例えば抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、抗体、ＴａｎｄＡｂ等）（「ＣＤ１６結合分子」）を対象とする。本発明は更に、ヒトＣＤ１６のエピトープと、疾患抗原（「ＤＡ」）の１つ以上のエピトープとに結合できるＣＤ１６結合分子（例えば「ＣＤ１６×ＤＡ結合分子」）を対象とする。本発明は特に、抗体である、又はそのエピトープ結合ドメインを含む、又はダイアボディ（ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを含む）、二重特異性抗体、ＴａｎｄＡｂ、他の多重特異性結合分子（例えば３価ＴＲＩＤＥＮＴ（商標）分子）等である、上述のようなＣＤ１６×ＤＡ結合分子を対象とする。本発明は特に、ＣＤ１６に結合できることに加えて、癌抗原又は病原体関連抗原である疾患抗原に結合できる、ＣＤ１６×ＤＡ結合分子に関する。本発明は特に、癌及び病原体関連疾患の治療における、上述のようなＣＤ１６及びＣＤ１６×ＤＡ結合分子の使用に関する。本発明はまた、１つ以上の上記分子を含む医薬組成物も対象とする。
【００５６】
Ｉ．抗体及び他の結合分子
Ａ．抗体
本発明のＣＤ１６×ＤＡ結合分子は、抗体であってよく、又は抗体から誘導可能なもの（例えば抗体ポリペプチドの断片化、切断等によって、若しくは抗体分子のアミノ酸配列の、若しくはこのようなポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド（若しくはその配列）の使用等によって）であってよい。
【００５７】
抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の分子の特定のドメイン又は部分又は立体配座（「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」に特異的に結合できる、免疫グロブリン分子である。エピトープ含有分子は、免疫原性活性を有してよく、従ってエピトープ含有分子は動物の体内で抗体産生応答を誘発する。このような分子は「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」と呼ばれる。本明細書において使用される場合、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ及びａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、及び以上のうちのいずれかのエピトープ結合ドメインを包含する。このような免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1及びＩｇＡ2）又はサブクラスのものとすることができる。抗体は、ポリペプチド又はタンパク質又は非タンパク質分子に免疫特異的に結合できる。
【００５８】
用語「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は均質な抗体の集団を指し、上記モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関わる（自然に発生する又は自然に発生しない）アミノ酸から構成される。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープ（又は抗原部位）に対して指向性を有する。用語「モノクローナル抗体」は、完全なモノクローナル抗体及び全長モノクローナル抗体だけでなく、これらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ等）、単鎖（ｓｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、並びに必要な特異性及び抗原への結合能力を有する抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。抗原の源又は抗原を作製する方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子導入動物等による）に関して、限定は意図されていない。この用語は、免疫グロブリン全体、及び「抗体」の定義において上述した断片等を含む。モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。採用してよい１つの方法は、Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495-497の方法又はその修正例である。典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラット又はウサギにおいて発現する。上記抗体は、動物を、所望のエピトープを含有する免疫原性量の細胞、細胞抽出物又はタンパク製剤で免疫化することによって産生される。免疫原は、一次細胞、培養された細胞株、癌細胞、タンパク質、ペプチド、核酸又は組織とすることができるが、これらに限定されない。免疫化に使用してよい細胞は、これらを免疫原として使用するよりもある期間（例えば少なくとも２４時間）だけ前に、培養してよい。細胞は単独で、又はＲｉｂｉ等の非変性アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用してよい（Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,” ILAR J. 37(3):119-125を参照）。一般に細胞は、免疫原として使用される際、完全な状態、及び好ましくは生存できる状態に維持しなければならない。完全な細胞は、破裂した細胞よりも、免疫性を与えられた動物が抗原をより良好に検出できるようにすることができる。変性又は強いアジュバント、例えばフロイントアジュバントの使用は、細胞を破裂させる場合があり、従って推奨されない。免疫原は、２週間に１回若しくは１週間に１回等、周期的な間隔で複数回投与してよく、又は動物中（例えば組織組み換え中）に生存能力を維持できるように投与してよい。あるいは、所望の病原性エピトープに対する免疫特異性を有する既存のモノクローナル抗体及び他の同等の抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え配列及び産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、以下で詳述するように、本発明の単一特異性又は多重特異性（例えば二重特異性、三重特異性及び四重特異性）分子、並びに親和性最適化済み、キメラ抗体、ヒト化抗体及び／又はイヌ化抗体を生成することによって、抗体の親和性又は他の特徴を改善するための、遺伝子操作のために使用してよい。
【００５９】
本発明の抗体及び結合分子は、その結合ドメインを介して、「免疫特異的な（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」様式でエピトープに結合する。本明細書中で使用される場合、分子は、別の分子のあるエピトープに、別のエピトープに対してよりも頻繁に、迅速に、長期間、及び／又は高い親和性で結合又は集合する場合に、該エピトープに「免疫特異的に（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」結合すると表現される。例えば、ウイルスエピトープに免疫特異的に結合する抗体は、該抗体が他のウイルスエピトープ又は非ウイルスエピトープに結合するよりも、高い親和性で、高い結合活性で、より迅速に、及び／又はより長期間結合する抗体である。この定義を読むと、例えば第１の標的に免疫特異的に結合する抗体（又は部分若しくはエピトープ）は、第２の標的に特異的又は優先的に結合するものであっても、そうでなくてもよいことも理解される。従って「免疫特異的結合（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、必ずしも排他的な結合を要求しない（ただしこれを含み得る）。一般には、結合に関する言及は「免疫特異的な」結合を意味するが、必ずしもそうではない。天然抗体は１つのエピトープ種にしか結合できない（即ちこれらは「単一特異性（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」である）が、天然抗体は、該種の複数の複製に免疫特異的に結合できる（即ち「２価性（ｂｉｖａｌｅｎｃｙ）」又は「多価性（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｙ）」を示す）。２つの分子は、これらの結合が、それぞれのリガンドに受容体が結合する際の特異性を示す場合に、「生理特異的に（ｐｈｙｓｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」様式で互いに結合できると表現される。
【００６０】
この数十年、抗体の治療能力に対する関心が再燃しており、抗体は、バイオテクノロジー由来薬物の主要な分類の１つとなっている（Chan, C.E. et al. (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7):663-666）。２００を超える抗体ベースの薬物について、その使用が承認されているか、又は開発中である。
【００６１】
１．抗体の一般的な構造的属性
自然発生した免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）の基本的な構造単位は、２つの長い「重鎖」と複合体化した２つの短い「軽鎖」からなる四量体であり、通常約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として表される。各鎖は、「可変ドメイン」を含むアミノ末端（「Ｎ末端」）部分と、少なくとも１つの「定常ドメイン」を含むカルボキシ末端（「Ｃ末端」）部分とからなる。ＩｇＧ軽鎖は、単一の「軽鎖可変ドメイン」（「ＶＬ」）と、単一の「軽鎖定常ドメイン」（「ＣＬ」）とからなる。よって、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造は、ｎ‐ＶＬ‐ＣＬ‐ｃである（ここでｎ及びｃはそれぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。ＩｇＧ重鎖は、単一の「重鎖可変ドメイン」（「ＶＨ」）、３つの「重鎖定常ドメイン」（「ＣＨ１」、「ＣＨ２」及び「ＣＨ３」）、並びにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置する「ヒンジ」領域（「Ｈ」）からなる。よって、ＩｇＧ重鎖の構造は、ｎ‐ＶＨ‐ＣＨ１‐Ｈ‐ＣＨ２‐ＣＨ３‐ｃである（ここでｎ及びｃはそれぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。無傷の修飾されていない抗体（例えばＩｇＧ抗体）の、抗原のエピトープに結合する能力は、可変ドメインの存在及びその配列に左右される。特段の記載がない限り、本明細書に記載のタンパク質分子のドメインの順序は、「Ｎ末端からＣ末端への（Ｎ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｏ  Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ）」方向である。
【００６２】
（ａ）定常ドメイン
（ｉ）軽鎖定常ドメイン
好ましいＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ  ＣＬκドメインである。例示的なヒトＣＬκドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１）：
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG 
NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK 
SFNRGEC
である。
【００６３】
あるいは、例示的なＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ  ＣＬλドメインである。例示的なヒトＣＬλドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２）：
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA 
GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP 
TECS
である。
【００６４】
（ｉｉ）重鎖ＣＨ１ドメイン
抗体の２つの重鎖のＣＨ１ドメインは、抗体の軽鎖の「ＣＬ」定常領域と複合体化し、介在ヒンジドメインを介して重鎖ＣＨ２ドメインに付着する。
【００６５】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号３）：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
である。
【００６６】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号４）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
である。
【００６７】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ３  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ３  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号５）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRV
である。
【００６８】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号６）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
である。
【００６９】
（ｂ）重鎖ヒンジ領域
１つの例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ１ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号７）：EPKSCDKTHTCPPCPである。
【００７０】
別の例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ２ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ２ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号８）：ERKCCVECPPCPである。
【００７１】
別の例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ３ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ３ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９）：
ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK 
SCDTPPPCPR CP
である。
【００７２】
別の例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ４ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０）：ESKYGPPCPSCPである。本明細書中で記載されるように、ＩｇＧ４ヒンジドメインは、Ｓ２２８Ｐ置換等の安定化突然変異を含んでよい。例示的なＳ２２８Ｐ‐安定化ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１１）：ESKYGPPCPPCPである。
【００７３】
（ｃ）重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン
２つの重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、相互作用してＩｇＧ抗体の「Ｆｃドメイン（Ｆｃ  Ｄｏｍａｉｎ）」を形成し、これは、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）を含むがこれに受容されない細胞Ｆｃ受容体によって認識されるドメインである。本明細書中で使用される場合、用語「Ｆｃ領域」は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域の一部分（Ｆｃ領域全体を包含する一部分を含む）を、本明細書では「Ｆｃドメイン」と呼ぶ。Ｆｃ領域は、そのアミノ酸配列が、他のＩｇＧアイソタイプに対してよりも、あるＩｇＧアイソタイプに対して最も相同性が高い場合に、この特定のＩｇＧアイソタイプ、クラス又はサブクラスのものであると表現される。抗体は、診断学におけるその公知の使用法に加えて、治療剤として有用であることが示されている。
【００７４】
例示的なヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１２）：
231     240          250          260          270          280
APELLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVKFNWYVD
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQYNSTY   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKALPA
340          350          360          370          380
PIEKTISKAK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE
390          400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPVLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NVFSCSVMHE
440       447
ALHNHYTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００７５】
例示的なヒトＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１３）：
231     240          250          260          270          280
APPVA-GPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVQFNWYVD 
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQFNSTF   RVVSVLTVVH   QDWLNGKEYK   CKVSNKGLPA 
340          350          360          370          380
PIEKTISKTK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDISVE
390          400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPMLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NVFSCSVMHE 
440       447
ALHNHYTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００７６】
例示的なヒトＩｇＧ３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１４）：
231     240          250          260          270          280
APELLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVQFKWYVD 
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQYNSTF   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKALPA
340          350          360          370          380
PIEKTISKTK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE
390          400          410          420          430
WESSGQPENN   YNTTPPMLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NIFSCSVMHE
440       447
ALHNRFTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００７７】
例示的なヒトＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１５）：
231    240          250          260          270          280
APEFLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSQED   PEVQFNWYVD 
290          300         310           320          330
GVEVHNAKTK   PREEQFNSTY   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKGLPS 
340          350          360          370          380
SIEKTISKAK   GQPREPQVYT   LPPSQEEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE 
390          400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPVLDS   DGSFFLYSRL   TVDKSRWQEG   NVFSCSVMHE 
440       447
ALHNHYTQKS   LSLSLGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００７８】
本明細書全体を通して、ＩｇＧ重鎖の定常領域の残基の番号付与は、Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service、NH1、MD (1991)（「Ｋａｂａｔ」、これは参照により明示的に本明細書に援用される）によるＥＵインデックスの番号付与である。用語「Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックス（EU index as in Kabat）」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の定常ドメインの番号付与を指す。免疫グロブリンの成熟した重鎖及び軽鎖の可変ドメインからのアミノ酸は、鎖内でのアミノ酸の位置によって指定される。Ｋａｂａｔは、抗体に関する多数のアミノ酸配列を記載し、各サブグループに関するアミノ酸コンセンサス配列を同定し、残基番号を各アミノ酸に割り当てており、またＣＤＲは、Ｋａｂａｔによって定義されるように同定される（Chothia, C. & Lesk, A. M.(1987) “Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,” J. Mol. Biol. 196:901-917）によって定義されるＣＤＲH１は、残基５個分前から始まることが理解されるだろう）。Ｋａｂａｔの番号付与スキームは、その大要に含まれていない抗体に対して、保存されたアミノ酸を参照して上記抗体をＫａｂａｔのコンセンサス配列のうちの１つと整列させることにより、拡張可能である。残基番号を割り当てるこの方法は、当該技術分野において標準的なものとなっており、キメラ変異型又はヒト化変異型を含む異なる抗体の同一の位置のアミノ酸が容易に同定される。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０位のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の５０位のアミノ酸と同一位置を占める。
【００７９】
多型は、抗体定常領域内の多数の異なる位置（例えばＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによる番号付与で２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位及び３５８位を含むがこれらに限定されないＦｃ位置）において観察されており、従ってここで提示される配列と従来技術の配列との間にはわずかな差異が存在し得る。ヒト免疫グロブリンの多型形態は、十分に特性決定されている。現在、１８個のＧｍアロタイプが公知である：Ｇ１ｍ（１，２，３，１７）又はＧ１ｍ（ａ，ｘ，ｆ，ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５，６，１０，１１，１３，１４，１５，１６，２１，２４，２６，２７，２８）又はＧ３ｍ（ｂ１，ｃ３，ｂ３，ｂ０，ｂ３，ｂ４，ｓ，ｔ，ｇ１，ｃ５，ｕ，ｖ，ｇ５）（Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211）。特に、本発明の抗体が、いずれの免疫グロブリン遺伝子のいずれのアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプを組み込むことができ、本明細書中で提示される配列のアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプに限定されないと考えられる。更に、発現系によっては、ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基（上記太字）は、翻訳後に除去できる。従ってＣＨ３ドメインのＣ末端残基は、本発明のＣＤ１６×ＤＡ結合分子の任意のアミノ酸残基である。本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端残基が欠けたＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。また本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端リシン残基を含む構造である。
【００８０】
（ｄ）可変ドメイン
ＩｇＧ分子の可変ドメインは、エピトープと接触することになる抗体のアミノ酸残基を含有する３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、及びフレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる介在性非ＣＤＲセグメントからなり、上記フレームワークセグメントは、一般にＣＤＲループの構造を維持してＣＤＲの位置を決定することにより、このような接触を可能とする（ただし特定のフレームワーク残基もエピトープに接触し得る）。従って、ＶＬ及びＶＨドメインは、構造ｎ‐ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４‐ｃを有する。ＣＤＲのアミノ酸配列は、ある抗体がある特定のエピトープに結合できるかどうかを決定する。抗体軽鎖と抗体重鎖との相互作用、特に、それぞれ別個のポリペプチド上に存在するこれらのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、抗体のエピトープ結合部位を形成する。
【００８１】
抗体の軽鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインと呼ばれる。同様に、抗体の重鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインと呼ばれる。よって、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、ＣＤＲL３ドメイン、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、及びＣＤＲH３ドメインという用語は、あるタンパク質に組み込まれた場合に、当該タンパク質が、軽鎖及び重鎖若しくはダイアボディ若しくは単鎖結合分子（例えばｓｃＦｖ、ＢｉＴｅ等）を有する抗体であるか、又は別のタイプのタンパク質であるかにかかわらず、当該タンパク質を、特定のエピトープに結合できるようにする、ポリペプチドを対象としている。
【００８２】
用語「エピトープ結合ドメイン（Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ）」は、結合分子の、あるエピトープに免疫特異的に結合できる能力に寄与する、該結合分子の断片又は部分（あるいはこのような断面又は部分のアミノ酸配列を有するポリペプチド）を指す。エピトープ結合ドメインは、抗体のＶＬ若しくはＶＨドメイン、若しくは抗体のＣＤＲドメインのうちの１、２、３、４若しくは５個を含有してよく、又は抗体のＣＤＲドメインのうちの６個全てを含有してよく、このようなエピトープに免疫特異的に結合できるものの、このような抗体のエピトープとは異なるエピトープに対する免疫特異性、親和性又は選択性を呈してもよい。エピトープ結合ドメインは、ＣＤＲの一部のみ、即ちＣＤＲ残基の、結合に必要なサブセットのみを含有してよく、これはＳＤＲと呼ばれる（Kim, J.H. et al. (2012) “Humanization By CDR Grafting And Specificity-Determining Residue Grafting,” Methods Mol. Biol. 907:237-245; Kim, K.S. et al. (2010) “Construction Of A Humanized Antibody To Hepatitis B Surface Antigen By Specificity-Determining Residues (SDR)-Grafting And De-Immunization,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 396(2):231-237; Kashmiri, S.V. et al. (2005) “SDR Grafting - A New Approach To Antibody Humanization,” Methods 36(1):25-34; Gonzales, N.R. et al. (2004) “SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity,” Mol. Immunol. 41:863-872）。しかしながら好ましくは、エピトープ結合ドメインは、このような抗体のＣＤＲドメインのうちの６個全てを含有することになる。あるエピトープ結合ドメインは、単一のポリペプチド鎖（例えばｓｃＦｖ）であってよく、又はそれぞれがアミノ末端及びカルボキシ末端を有する、ジスルフィド結合によって互いに共有結合できる２つ以上のポリペプチド鎖（例えばダイアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ2断片等）を含んでよい。
【００８３】
２．抗体のヒト化
本発明はまた特に、ある抗体のＶＬ又はＶＨドメイン、好ましくはある抗体のＶＬ及びＶＨドメインの両方を含む結合分子を包含する。好ましくは、このような抗体はヒト化抗体である。モノクローナル抗体は典型的には、マウス又はウサギ等の非ヒト種の体内で調製される。このような抗体の変異型及び／又は定常ドメインは、免疫原として認識され得るため、これらに対する免疫応答が引き起こされる。しかしながら、このような分子は、１つ以上のアミノ酸置換を導入して、上記抗体をヒトによって生成される抗体により近い抗体とすることにより「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅ）」でき、これによって上記抗体の免疫原性を低減又は排除できる。用語「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体は、キメラ分子であって、一般に組み換え技術を用いて調製され、非ヒト種からの免疫グロブリンのエピトープ結合部位と、残りの、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく分子の免疫グロブリン構造とを有する、キメラ分子を指す。このような抗体の可変ドメインのポリヌクレオチド配列は、上記誘導体を生成するため及び上記抗体の親和性又は他の特徴を改善するための遺伝子操作のために使用できる。様々な抗体に対するこのアプローチの適用は、LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224; Sato, K. et al. (1993) “Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6-Dependent Tumor Cell Growth,” Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; 及びCo, M.S. et al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149-1154によって報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、オリジナルの抗体に対して配列が異なる改変された１つ以上のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ及び／又は６つ）を有する。
【００８４】
抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体のエピトープ結合ドメインの塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体又はイヌ化抗体を設計するステップ、即ちヒト化又はイヌ化プロセス中に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化又はイヌ化法／技術；並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，８０７，７１５号；米国特許第５，８６６，６９２号；及び米国特許第６，３３１，４１５号を参照。
【００８５】
非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合ドメインを含む多数のヒト化抗体分子が記述されており、これらは、げっ歯類又は修飾げっ歯類可変ドメインと、ヒト定常ドメインに融合した、これらに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを有するキメラ抗体を含む（例えばWinter et al. (1991) “Man-made Antibodies,”Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989); Shaw et al. (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,” J. Immunol. 138:4534-4538;及びBrown et al. (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,” Cancer Res. 47:3577-3583を参照）。他の参照文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合する前にヒト支持性フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフと重合される、げっ歯類ＣＤＲについて説明している（例えば、Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536;及びJones et al. (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse,” Nature 321:522-525を参照）。別の参照文献は、組み換えによってベニアリングされたげっ歯類フレームワーク領域によって支持されたげっ歯類ＣＤＲについて説明している。例えば欧州公開特許第５１９，５９６号を参照。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントのこれらの部分の治療的応用の期間及び効果を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小化するよう設計される。抗体をヒト化するために利用してよい他の方法は、Daugherty et al. (1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476並びに米国特許第６，１８０，３７７号；米国特許第６，０５４，２９７号；米国特許第５，９９７，８６７号；及び米国特許第５，８６６，６９２号によって開示されている。本発明は特に、「ヒト化」抗体のＶＬ及び／又はＶＨドメインを含む（抗体及びダイアボディを含む）結合分子を包含する。
【００８６】
このような成功にもかかわらず、治療用途に最適化された、安定した官能性ヘテロ二量体非単一特異性ダイアボディの生産は、ポリペプチド鎖で採用するドメインを注意深く考察し配置することによって、更に改善できる。よって本発明は、ＣＤ１６及び疾患抗原に同時に結合できる、安定した治療に有用なヘテロ二量体ダイアボディ及びヘテロ二量体Ｆｃダイアボディを、共有結合によって形成するよう特に設計された、特定のポリペプチドの提供を対象とする。
【００８７】
Ｂ．二重特異性抗体
上述のように、天然抗体は１つのエピトープ種にしか結合できないが、上記種の複数の複製に結合できる。抗体の、抗原のエピトープに結合する能力は、該抗体のＶＬ及びＶＨドメインの存在及びそのアミノ酸配列に依存する。抗体の軽鎖と重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、ＩｇＧ等の天然抗体の２つのエピトープ結合ドメインのうちの１つを形成する。天然抗体は１つのエピトープ種にしか結合できない（即ちこれらは単一特異である）が、天然抗体は、該種の複数の複製に結合できる（即ち２価性又は多価性を示す）。
【００８８】
抗体の官能性は、２つの別個の異なる抗原（若しくは同一の抗原の異なるエピトープ）に同時に結合できる多重特異性抗体系分子を生成することによって、並びに／又は同一のエピトープ及び／若しくは抗原に関して更に高い価数（即ち３つ以上の結合ドメイン）を有する抗体系分子を生成することによって、増強できる。
【００８９】
天然抗体より高い能力を有する分子を提供するために、広範な組み換え二重特異性抗体フォーマットが開発されてきた（例えば国際公開第２００８／００３１１６号、国際公開第２００９／１３２８７６号、国際公開第２００８／００３１０３号、国際公開第２００７／１４６９６８号、国際公開第２００９／０１８３８６号、国際公開第２０１２／００９５４４号、国際公開第２０１３／０７０５６５号を参照）。このようなアプローチの大半は、更なる結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）へ若しくは上記抗体コア内に融合させるため、又は複数の抗原結合部分（例えば２つのＦａｂ断片若しくはｓｃＦｖ）を互いに融合させるために、リンカーペプチドを使用する。代替的なフォーマットは、結合タンパク質（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン又は代替となるポリペプチド等の二量体化ドメインに融合させるために、リンカーペプチドを使用する（国際公開第２００５／０７０９６６号、国際公開第２００６／１０７７８６Ａ号、国際公開第２００６／１０７６１７Ａ号、国際公開第２００７／０４６８９３号）。典型的には、このようなアプローチは妥協及びトレードオフを伴う。例えば国際公開第２０１３／１７４８７３号、国際公開第２０１１／１３３８８６号、及び国際公開第２０１０／１３６１７２号は、リンカーの使用によって、治療的設定に問題が生じる場合があることを開示しており、２つ以上の抗原に結合できるように、ＣＬ及びＣＨ１ドメインがそれぞれの自然位置から切り替わり、かつＶＬ及びＶＨドメインが多様化されている、三重特異性抗体を教示している（国際公開第２００８／０２７２３６号；国際公開第２０１０／１０８１２７号）。従って、これらの文書に開示されている分子は、結合特異性を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。国際公開第２０１３／１６３４２７号及び国際公開第２０１３／１１９９０３号は、ＣＨ２ドメインを修飾して、結合ドメインを含む融合タンパク付加物を含有させるステップを開示している。この文書は、ＣＨ２が、エフェクタ機能の仲介において最低限の役割しか果たさないらしいことを記載している。国際公開第２０１０／０２８７９７号、国際公開第２０１００２８７９６号、及び国際公開第２０１０／０２８７９５号は、Ｆｃ領域が追加のＶＬ及びＶＨドメインで置換されて、３価結合分子を形成している、組み換え抗体を開示している。国際公開第２００３／０２５０１８号及び国際公開第２００３０１２０６９号は、個々の鎖がｓｃＦｖドメインを含有する組み換えダイアボディを開示している。国際公開第２０１３／００６５４４号は、単一のポリペプチド鎖として合成された後、タンパク質分解に供されることによってヘテロ二量体構造が得られる、多価ｆａｂ分子を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、エフェクタ機能を仲介する能力の全て又はある程度を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。国際公開第２０１４／０２２５４０号、国際公開第２０１３／００３６５２号、国際公開第２０１２／１６２５８３号、国際公開第２０１２／１５６４３０号、国際公開第２０１１／０８６０９１号、国際公開第２００８／０２４１８８号、国際公開第２００７／０２４７１５号、国際公開第２００７／０７５２７０号、国際公開第１９９８／００２４６３号、国際公開第１９９２／０２２５８３号、及び国際公開第１９９１／００３４９３号は、追加の結合ドメイン又は官能基を抗体又は抗体部分に付加するステップ（例えば抗体の軽鎖にダイアボディを付加するステップ、又は抗体の軽鎖及び重鎖に追加のＶＬ及びＶＨドメインを付加するステップ、又は異種融合タンパク質を互いに対して付加するステップ若しくは複数のＦａｂドメインを互いに対して連鎖させるステップ）を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、ナイーブ抗体構造を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。
【００９０】
Ｃ．キメラ抗原受容体
本発明の結合分子は、ＣＤ１６及び疾患抗原に結合できる単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）であってよい。上述のように、ｓｃＦｖは、短い連結ペプチドを介して軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を連結することによって作製される。第１世代ＣＡＲは典型的には、内因性ＴＣＲからのシグナルの主要な伝達物質であるＣＤ３ζ‐鎖からの細胞内ドメインを有していた。第２世代ＣＡＲは、Ｔ細胞に更なるシグナルを供給するために、様々な共刺激タンパク質受容体（例えばＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ等）からＣＡＲの細胞質側末端への、更なる細胞内シグナリングドメインを有していた。第３世代ＣＡＲは、効力を更に増強するために、ＣＤ３ｚ‐ＣＤ２８‐４１ＢＢ又はＣＤ３ｚ‐ＣＤ２８‐ＯＸ４０といった複数のシグナリングドメインを併せ持っている（Tettamanti, S. et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,” Blood 123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,” Blood 122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62）。
【００９１】
本発明のＣＡＲの細胞内ドメインは好ましくは：４１ＢＢ‐ＣＤ３ζ、ｂ２ｃ‐ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ２８‐４‐１ＢＢ‐ＣＤ３ζ、ＣＤ２８‐ＣＤ３ζ、ＣＤ２８‐ＦｃεＲＩγ、ＣＤ２８ｍｕｔ‐ＣＤ３ζ、ＣＤ２８‐ＯＸ４０‐ＣＤ３ζ、ＣＤ２８‐ＯＸ４０‐ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４‐ＣＤ３ζ、ＣＤ４‐ＦｃεＲＩγ、ＣＤ８‐ＣＤ３ζ、ＦｃεＲＩγ、ＦｃεＲＩγＣＡＩＸ、へレグリン‐ＣＤ３ζ、ＩＬ‐１３‐ＣＤ３ζ、又はＬｙ４９Ｈ‐ＣＤ３ζのうちのいずれの細胞内ドメインから選択される（Tettamanti, S. et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,” Blood 123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,” Blood  122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62）。
【００９２】
ＩＩ．二重特異性ダイアボディ
本技術分野は更に、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点でこのような天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる可能性に注目している（例えばHolliger et al. (1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; 米国公開特許第２００４／００５８４００号（Hollinger et al.）；米国公開特許第２００４／０２２０３８８号（Mertens et al.）；Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94；Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；国際公開第０２／０２７８１号（Mertens et al.）；Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27；Wu, A. et al. (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588；Baeuerle, P.A. et al. (2009) “Bispecific T cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944を参照）。
【００９３】
ダイアボディの設計は、軽鎖及び／又は重鎖可変ドメインが短い連鎖ペプチドを用いて連結されている、単鎖可変ドメイン断片（ｓｃＦｖ）の構造に基づく。Bird et al. (1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426)は、一方の可変ドメインのカルボキシ末端と他方の可変ドメインのアミノ末端との間の約３．５ｎｍを埋める連結ペプチドの例を記載している。他の配列のリンカーも設計及び使用されている（Bird et al. (1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426）。リンカーは、薬剤の付着又は剛性支持体の付着といった追加の機能のために修飾できる。単鎖変異体は、組み換えによって又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生に関しては、自動化されたシンセサイザを使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生に関しては、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫若しくは哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞である好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の従来の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離できる。
【００９４】
非単一特異性「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」の提供は、異なるエピトープを発現する細胞を共連結（ｃｏ‐ｌｉｇａｔｅ）して共存させることができる能力という、抗体を上回る有意な利点を提供する。従って二重特異性ダイアボディは、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。二重特異性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び操作の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原の結合活性の上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その２価性、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（Fitzgerald et al. (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221）。
【００９５】
二重特異性ダイアボディを産生する能力により、異なる細胞上に存在する受容体の共連結（例えば細胞傷害性Ｔ細胞と、疾患抗原を発現する癌細胞又は病原体感染細胞等の標的細胞との架橋）によって、２つの細胞を共連結するために、上記ダイアボディを（「トランス」として）使用できるようになる（Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al. (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658; Sloan et al.  (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,” PLoS Pathog 11(11): e1005233. doi:10.1371/journal.ppat.1005233）。あるいは又は更に、二重特異性（又は多重特異性）ダイアボディを（「シス」として）用いて、同一の細胞の表面上に存在する受容体等の分子を共連結できる。異なる細胞及び／又は受容体の共連結は、エフェクタ機能及び／又は免疫細胞シグナリングを変調するために有用である。エピトープ結合ドメインを含む多重特異性分子（例えば二重特異性ダイアボディ）は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、抗原提示細胞又は他の単核細胞上で発現される、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ｄ等といったいずれの免疫細胞の表面決定因子、又はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ４０及びＣＤ７４といったＢ細胞の表面決定因子を対象としてよい（Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Cheson, B.D. et al. (2008) “Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma,” N. Engl. J. Med. 359(6):613-626; Castillo, J. et al. (2008) “Newer Monoclonal Antibodies For Hematological Malignancies,” Exp. Hematol. 36(7):755-768）。特に、免疫エフェクタ細胞上に存在する細胞表面受容体を対象とするエピトープ結合ドメインは、標的転換細胞殺滅を仲介できる多重特異性結合分子の生成に有用である。
【００９６】
多くの研究において、エフェクタ細胞決定因子、例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合するダイアボディは、エフェクタ細胞を活性化させることも分かった（Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) “Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909-2916；国際公開第２００６／１１３６６５号；国際公開第２００８／１５７３７９号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１２／１６２０６８号）。通常、エフェクタ細胞の活性化は、Ｆｃドメイン-ＦｃγＲ相互作用によるエフェクタ細胞への抗原結合抗体の結合によってトリガされる。従ってこれに関して、ダイアボディ分子は、Ｆｃドメインを含むかどうかとは無関係に、（例えば当該技術分野において公知の、又は本明細書に例示されているいずれのエフェクタ機能アッセイ（例えばＡＤＣＣアッセイ）においてアッセイされるように）Ｉｇ様官能性を示し得る。腫瘍とエフェクタ細胞とを架橋させることによって、ダイアボディは腫瘍細胞近傍にエフェクタ細胞を移動させるだけではなく、効果的な腫瘍殺滅をもたらす（例えばCao et al. (2003) "Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics, "Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197を参照）。
【００９７】
しかしながら、上述の二重特異性ダイアボディの利点は顕著なコストにつながる。このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチド（即ち２つのポリペプチド種）を提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合を防止できる（即ちこれらのホモ二量体化を防止できる）ような方法で達成しなければならない（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）。従って本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合的連結を教示している（例えばOlafsen et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672を参照）。
【００９８】
しかしながら、本技術分野は、非共有結合的に連結したポリペプチドで構成される二重特異性ダイアボディが不安定であり、非官能性単一ポリペプチド鎖モノマーへと容易に分解することを認識している（例えばLu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672を参照）。
【００９９】
この課題をものともせず、本技術分野は、ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディと呼ばれる、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した。例えばSloan, D.D. et al. (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,” PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.1005233; Al Hussaini, M. et al. (2015) “Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART(R)) Platform,” Blood pii: blood-2014-05-575704; Chichili, G.R. et al. (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion,” J. Molec. Biol. 399(3):436-449; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIB (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551；米国特許第８，０４４，１８０号；米国特許第８，１３３，９８２号；米国特許第８，１８７，５９３号；米国特許第８，１９３，３１８号；米国特許第８，５３０，６２７号；米国特許第８，６６９，３４９号；米国特許第８，７７８，３３９号；米国特許第８，７８４，８０８号；米国特許第８，７９５，６６７号；米国特許第８，８０２，０９１号；米国特許第８，８０２，０９３号；米国特許第８，９４６，３８７号；米国特許第８，９６８，７３０号；及び米国特許第８，９９３，７３０号；米国公開特許第２００９／００６０９１０号；米国公開特許第２０１０／０１７４０５３号；米国公開特許第２０１１／００８１３４７号；米国公開特許第２０１１／００９７３２３号；米国公開特許第２０１１／０１１７０８９号；米国公開特許第２０１２／０００９１８６号；米国公開特許第２０１２／００３４２２１号；米国公開特許第２０１２／０１４１４７６号；米国公開特許第２０１２／０２９４７９６号；米国公開特許第２０１３／０１４９２３６号；米国公開特許第２０１３／０２９５１２１号；米国公開特許第２０１４／００１７２３７号；及び米国公開特許第２０１４／００９９３１８号；欧州特許第１８６８６５０号；欧州特許第２１５８２２１号；欧州特許第２２４７３０４号；欧州特許第２２５２６３１号；欧州特許第２２８２７７０号；欧州特許第２３２８９３４号；欧州特許第２３７６１０９号；欧州特許第２５４２２５６号；欧州特許第２６０１２１６号；欧州特許第２７１４０７９号；欧州特許第２７１４７３３号；欧州特許第２７８６７６２号；欧州特許第２８３９８４２号；欧州特許第２８４００９１号；並びに国際公開第２００６／１１３６６５号；国際公開第２００８／１５７３７９号；国際公開第２０１０／０２７７９７号；国際公開第２０１０／０３３２７９号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；国際公開第２０１１／１０９４００号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１２／１６２０６７号；国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１４／１５９９４０号；��際公開第２０１５／０２１０８９号；国際公開第２０１５／０２６８９２号；及び国際公開第２０１５／０２６８９４号を参照。このようなダイアボディは、２つ以上の共有結合的に複合体化したポリペプチドを含み、１つ以上のシステイン残基を、採用したポリペプチド種（これらはジスルフィド結合を形成でき、これによってこのようなポリペプチド鎖の１つ以上のペアを互いに共有結合させることができる）それぞれの中へと組み込むステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、関与するポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、ダイアボディの結合特性に干渉することなく、得られるダイアボディを安定化させる。
【０１００】
最も単純なＤＡＲＴ（登録商標）は、２つのポリペプチド鎖を含み、これらはそれぞれ３つのドメインを含む（図１Ａ〜１Ｂ）。第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含むドメイン；（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む、第２のドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記第２のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を促進する役割、及びダイアボディの第２のポリペプチド鎖に対する第１のポリペプチド鎖の共有結合を促進する役割を果たす、第３のドメイン（「ヘテロ二量体促進ドメイン（Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ‐Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ）を含む。第２のポリペプチド鎖は：相補的な第１のドメイン（ＶＬ２ドメイン）；相補的な第２のドメイン（ＶＨ１ドメイン）；並びに第１のポリペプチド鎖の第３のドメインと複合体化して、第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進する、第３のドメイン（「ヘテロ二量体促進ドメイン」）を含有する。このような分子は、安定かつ強力であり、２つ以上の抗原を同時に結合する能力を有する。一実施形態では、第１及び第２のポリペプチド鎖の第３のドメインはそれぞれ、システイン（「「Ｃマーク（Ｃを丸で囲んだマーク）」）残基を含有し、このシステイン残基は、ジスルフィド結合を介してポリペプチドを一体に結合させる役割を果たす。上記ポリペプチド鎖のうちの一方又は両方の第３のドメインは更に、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの配列を有してよく、これにより、ダイアボディポリペプチドの複合体化によって、細胞（Ｂリンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及び肥満細胞等）のＦｃ受容体に結合できるＦｃドメインが形成される）。このような分子の多数の変形例が記載されており（例えば米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号；米国公開特許第２００７‐０００４９０９号；米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；国際公開第２００６／１１３６６５号を参照）、また本明細書中で提供される。このような分子の多数の変異型が記載されており（例えば、米国公開特許第２０１５／０１７５６９７号；米国公開特許第２０１４／０２５５４０７号；米国公開特許第２０１４／００９９３１８号；米国公開特許第２０１３／０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０／０１７４０５３号；米国公開特許第２００９／００６０９１０号；米国公開特許第２００７‐０００４９０９号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；欧州公開特許第１８６８６５０号；及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号;国際公開第２００６／１１３６６５号参照）、また本明細書中で提供される。
【０１０１】
二重特異性又は４価分子が望ましいもののＦｃは必要ない場合の用途のために、代替的な構成が当該技術分野において公知であり、これは、「ＢｉＴＥ（登録商標）抗体」とも呼ばれる、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ分子（例えば国際公開第１９９３／１１１６１号；及び国際公開第２００４／１０６３８１号参照）並びに「ＴａｎｄＡｂ（登録商標）」とも呼ばれる４価タンデム抗体（例えば米国公開特許第２０１１‐０２０６６７２号；欧州公開特許第２３７１８６６号；国際公開第１９９９／０５７１５０号；国際公開第２００３／０２５０１８号；及び国際公開第２０１３／０１３７００号参照）を含むが、これに限定されない。ＢｉＴＥは、タンデム結合されたｓｃＦｖを含む単一のポリペプチド鎖から形成され、またＴａｎｄＡｂは、ＶＨ１、ＶＬ２、ＶＨ２、及びＶＬ２ドメインをそれぞれ有する２つの同一の鎖のホモ二量体化によって形成される。
【０１０２】
本発明は、疾患抗原を発現する標的細胞（例えば癌細胞又は病原体感染細胞、病原体等）を対象とする免疫応答を増強できる二重特異性結合分子を提供する。このような二重特異性結合分子は、「第１のエピトープ」及び「第２のエピトープ」に結合でき、これらのエピトープのうちの一方はＣＤ１６のエピトープであり、これらのエピトープのうちのもう一方は疾患抗原（「ＤＡ」）のエピトープである。ある特定のエピトープが第１のエピトープ又は第２のエピトープのいずれとして指定されるかは無関係であり、このような表記法は、本発明の結合分子のポリペプチド鎖のドメインの存在及び配向のみに関連する。よって、本発明の二重特異性分子は、ＣＤ１６のエピトープに結合できる「ＶＬCD16」／「ＶＨCD16」ドメイン、及び疾患抗原のエピトープに結合できる「ＶＬDA」／「ＶＨDA」ドメインを含む。本発明は特に、本明細書中で提供される方法のうちのいずれかを用いて生成される、二重特異性ダイアボディ、ＢｉＴＥ、抗体及びＴａｎｄＡｂを包含する。
【０１０３】
Ａ．Ｆｃドメインを含まないダイアボディ
一実施形態では、本発明のＣＤ１６結合分子は二重特異性ダイアボディであり、第１及び第２のエピトープ両方に結合できるドメインを含むものの、Ｆｃドメインを含まず、従ってＦｃ‐ＦｃγＲ相互作用によるＦｃγＲ分子への結合が不可能である。しかしながら、このような分子は、そのＣＤ１６結合ドメインのＳＤＲ又はＣＤＲを介してＣＤ１６に結合できる。よって、Ｆｃドメインの不在は、このような分子が、阻害性受容体ＣＤ３２Ｂ等の非ＣＤ１６  ＦｃγＲに結合するのを防止する役割を果たす。
【０１０４】
二重特異性ダイアボディのこのような実施形態の第１のポリペプチド鎖は、好ましくは、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；第１又は第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬCD16又はＶＬDA）；第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）；（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬCD16を含有する場合は）疾患抗原のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン、又は（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬDAを含有する場合は）ＣＤ１６のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；任意にシステイン残基を含有する第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１Ａ〜１Ｂ）。
【０１０５】
二重特異性ダイアボディのこの実施形態の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；第１又は第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬCD16又はＶＬDA；及び上記ＶＬドメインは上記ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖に含まれないよう選択される）；介在スペーサペプチド（リンカー１）；第１又は第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（即ちＶＨCD16又はＶＨDA；及び上記ＶＨドメインは上記ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖に含まれないよう選択される）；任意にシステイン残基を含有する第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１Ａ〜１Ｂ）。ある特定のエピトープに対して特異的な、採用されるＶＬ及びＶＨドメインは、好ましくは同一のモノクローナル抗体から得られる、又は同一のモノクローナル抗体に由来する。しかしながらこれらのドメインは、これらのドメインが集合して、上記エピトープに免疫特異的に結合できる官能性結合ドメインを形成する場合、異なるモノクローナル抗体に由来してもよい。このような異なる抗体は、本明細書では「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」抗体と呼ばれる。
【０１０６】
第１のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第２のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、上記エピトープのうちの１つ（例えば第１のエピトープ）に対して特異的な第１の官能性エピトープ結合ドメインを形成する。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、他方のエピトープ（即ち第２のエピトープ）に対して特異的な第２の官能性エピトープ結合ドメインを形成する。よって、第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインの選択は、ダイアボディのこれら２つのポリペプチド鎖が合わせて、第１のエピトープ及び第２のエピトープの両方に結合できるＶＬ及びＶＨドメインを含む（即ちこれらが合わせて、ＶＬCD16／ＶＨCD16及びＶＬDA／ＶＨDAを含む）ように、「調整（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）」される。
【０１０７】
最も好ましくは、介在スペーサペプチド（即ち上述のＶＬドメインとＶＨドメインとを隔てる「リンカー１」）の長さは、上記ポリペプチド鎖の上記ＶＬ及びＶＨドメインが互いに対して結合する（例えば０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個の介在リンカーアミノ酸残基からなる）のを実質的に又は完全に防止するよう選択される。従って第１のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号１６）：GGGSGGGGを有する。
【０１０８】
上記第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）の長さ及び組成は、上述のような二量体化を促進する１つ以上のポリペプチドドメイン（即ち「ヘテロ二量体促進ドメイン」）の選択に基づいて選択される。典型的には、上記第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）は、３〜２０個のアミノ酸残基を含む。特に、採用した１つ以上のヘテロ二量体促進ドメインがシステイン残基を含まない場合、システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）が利用される。システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）は、１つ、２つ、３つ又は４つ以上のシステインを含有する。好ましいシステイン含有スペーサペプチド（リンカー２）は、配列GGCGGG（配列番号１７）を有する。あるいは、リンカー２はシステインを含まず（例えば、GGG、GGGS（配列番号１８）、LGGGSG（配列番号１９）、GGGSGGGSGGG（配列番号２０）、ASTKG（配列番号２１）、LEPKSS（配列番号２２）、APSSS（配列番号２３）等）、以下で説明されるシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインが使用される。任意に、システイン含有リンカー２及びシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインの両方が使用される。
【０１０９】
ヘテロ二量体促進ドメインは、一方のポリペプチド鎖上にGVEPKSC（配列番号２４）又はVEPKSC（配列番号２５）又はAEPKSC（配列番号２６）、及び他方のポリペプチド鎖上にGFNRGEC（配列番号２７）又はFNRGEC（配列番号２８）を含んでよい（米国特許第２００７／０００４９０９号）。
【０１１０】
ある好ましい実施形態では、ヘテロ二量体促進ドメインは、対向する電荷のタンデム反復コイルドメイン、例えば、グルタミン酸残基がｐＨ７において負の電荷を形成する「Ｅコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン（配列番号２９：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK）、又はリシン残基がｐＨ７において正の電荷形成する「Ｋコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン（配列番号３０：KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE）を含む。このような荷電ドメインの存在により、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の関連付けが促進され、従ってヘテロ二量体形成が促進される。上述のＥコイル及びＫコイルの配列の、１つ以上のシステイン残基を含むような修飾を含む、ヘテロ二量体促進ドメインを利用してよい。このようなシステイン残基の存在により、一方のポリペプチド鎖に存在するコイルが、他方のポリペプチド鎖に存在する相補的なコイルと共有結合し、これにより上記ポリペプチド鎖を互いに共有結合させて、ダイアボディの安定性を向上できる。特に好ましい例は、アミノ酸配列EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK（配列番号３１）を有する修飾されたＥコイルと、アミノ酸配列KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE（配列番号３２）を有する修飾されたＫコイルとを含む、ヘテロ二量体促進ドメインである。
【０１１１】
国際公開第２０１２／０１８６８７号に開示されているように、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するために、ダイアボディを、ダイアボディの末端のうちの１つ又は複数に血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含有するように修飾してよい。最も好ましくは、このような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、ダイアボディのポリペプチド鎖のＣ末端に配置されることになる。アルブミンは、血漿中に最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて１９日の半減期を有する。アルブミンは複数の小さな分子結合ドメインを有し、これによりアルブミンは他のタンパク質に非共有結合して血清半減期を延長できる。連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定した３重螺旋束を形成する４６個のアミノ酸残基からなり、広範なアルブミン結合特異性を有する（Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120）。従って、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するための、血清結合タンパク質の特に好ましいポリペプチド部分は、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、及びより好ましくは、連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）（配列番号３３）：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALPである。
【０１１２】
国際公開第２０１２／１６２０６８号（参照により本出願に援用される）に開示されているように、配列番号３３の「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）」変異型は、ＭＨＣクラスＩＩ結合を減衰させる又は排除する能力を有する。組み合わさった突然変異の結果に基づいて、以下の置換の組み合わせが、このような脱免疫化ＡＢＤを形成するための好ましい置換であると考えられる：６６Ｄ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７９Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｅ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｅ。修飾Ｌ６４Ａ、Ｉ６５Ａ及びＤ７９Ａ、又は修飾Ｎ６６Ｓ、Ｔ７０Ｓ及びＤ７９Ａを有する変異型ＡＢＤ。アミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID66NAKS70 A71EGVKALIDE ILAALP（配列番号３４）
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA64A65NNAKT VEGVKALIA79E ILAALP（配列番号３５）
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS66NAKS70 VEGVKALIA79E ILAALP（配列番号３６）
を有する、変異型脱免疫化ＡＢＤが特に好ましい。というのは、このような脱免疫化ＡＢＤは、ＭＨＣクラスＩＩ結合の減衰を提供しながら、略野生型の結合を呈するためである。従って、ＡＢＤを有するこのようなダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖は、好ましくはこのようなポリペプチド鎖のＥコイル（又はＫコイル）ドメインに対してＣ末端に位置決めされることによって、上記Ｅコイル（又はＫコイル）ドメインとＡＢＤ（これは好ましくは脱免疫化ＡＢＤである）との間に介在する、第３のリンカー（リンカー３）を含有する。このようなリンカー３の好ましい配列は、配列番号１８：GGGSである。
【０１１３】
Ｂ．Ｆｃドメインを含むダイアボディ
本発明の一実施形態は、Ｆｃドメインを含み、またＣＤ１６のエピトープと疾患抗原のエピトープとに同時に結合できる、多重特異性ダイアボディ（例えば二重特異性、三重特異性、四重特異性等）に関する。このような分子のＦｃドメインは、いずれのアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のものであってよい。上記分子は更に、ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジドメインを含んでよい。ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジドメインが存在する場合、これらはいずれのアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のものであってよく、好ましくは所望のＦｃドメインと同一のアイソタイプのものである。
【０１１４】
上記ダイアボディポリペプチド鎖のうちの一方又は両方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを追加して、上記ダイアボディ鎖の複合体化によってＦｃドメインが形成されるようにすると、上記ダイアボディの生物学的半減期が増大し、及び／又は価数が変化する。このようなダイアボディは、ポリペプチド鎖を互いに共有結合させて、第１のエピトープ及び第２のエピトープに同時に結合できる共有結合ダイアボディを形成できる配列を有する、２つ以上のポリペプチド鎖を含む。上記ダイアボディポリペプチドの両方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むと、２鎖二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディの形成が可能となる（図２）。
【０１１５】
あるいは、上記ダイアボディポリペプチドのうちの一方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むと、より複雑な４鎖二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディの形成が可能となる（図３Ａ〜３Ｃ）。図３Ｃは、定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン及び定常重鎖ＣＨ１ドメインを有する代表的な４鎖ダイアボディを示すが、このようなドメインの断片及び他のポリペプチドを代わりに採用してもよい（例えば図３Ａ及び３Ｂ、米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号及び米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号、及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号を参照）。従って例えば、ＣＨ１ドメインの代わりに、ヒトＩｇＧのヒンジドメイン由来のアミノ酸配列GVEPKSC（配列番号２４）、VEPKSC（配列番号２５）又はAEPKSC（配列番号２６）を有するペプチドを採用してよく、またＣＬドメインの代わりに、ヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸、GFNRGEC（配列番号２７）又はFNRGEC（配列番号２８）を採用してよい。４鎖ダイアボディを含有する代表的なペプチドを図３Ａに示す。あるいは、又は更に、対向する電荷のタンデムコイルドメイン、例えば「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号２９：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK又は配列番号３０：EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK）；及び「Ｋコイル」ドメイン（配列番号３１：KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE又は配列番号３２：KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE）を含むペプチドを採用してよい。４鎖ダイアボディを含有する代表的なコイルドメインを図３Ｂに示す。
【０１１６】
本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディ分子は、更なる介在スペーサペプチド（リンカー）を含んでよく、このようなリンカーは一般に、ヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル若しくはＫコイル）とＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとの間、及び／又はＣＨ２‐ＣＨ３ドメインと可変ドメイン（即ちＶＨ若しくはＶＬ）との間に組み込まれる。典型的には、この追加のリンカーは３〜２０個のアミノ酸残基を含み、任意にＩｇＧヒンジドメインの全体又は一部分（好ましくは、１個、２個、３個、若しくは４個以上のシステイン残基を有するＩｇＧヒンジドメインのシステイン含有部分）を含有してよい。本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディ分子において採用できるリンカーとしては：GGGS（配列番号１８）、LGGGSG（配列番号１９）、GGGSGGGSGGG（配列番号２０）、ASTKG（配列番号２１）、LEPKSS（配列番号２２）、APSSS（配列番号２３）、APSSSPME（配列番号３７）、VEPKSADKTHTCPPCP（配列番号３８）、LEPKSADKTHTCPPCP（配列番号３９）、DKTHTCPPCP（配列番号４０）、ｓｃＦｖリンカー：GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号４１）；「長い（ｌｏｎｇ）」リンカー：GGGGSGGGSGGG（配列番号４２）、GGC、及びGGGが挙げられる。クローニングを容易にするために、GGG又はGGCの代わりにLEPKSS（配列番号２２）を使用してよい。更に、アミノ酸ＧＧＧ又はLEPKSS（配列番号２２）の直後にDKTHTCPPCP（配列番号４０）を続けることによって、代替リンカー：GGGDKTHTCPPCP（配列番号４３）；及びLEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号４４）を形成してよい。本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有分子は、リンカーに加えて又はリンカーに代えて、ＩｇＧヒンジドメインを組み込んでよい。例示的なヒンジドメインとしては：ＩｇＧ１からのEPKSCDKTHTCPPCP（配列番号５）；ＩｇＧ２からのERKCCVECPPCP（配列番号６）；ＩｇＧ３からのELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKS CDTPPPCPRCP（配列番号７）；ＩｇＧ４からのESKYGPPCPSCP（配列番号８）；及び鎖交換を低減するための安定化Ｓ２２８Ｐ置換を含むＩｇＧ４ヒンジ変異型からのESKYGPPCPPCP（配列番号９）が挙げられる（Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従って番号付与）。
【０１１７】
図３Ａ〜３Ｃに提示されているように、本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディは４つの異なる鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖は、４つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。第２及び第４のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、第１／第３のポリペプチド鎖と第２／第４のポリペプチド鎖との二量体化を促進する。第３及び第４のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメイン、並びに第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は四重特異性の４価結合が可能となる。表記法「ＶＬ３」及び「ＶＨ３」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第３の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。同様に、表記法「ＶＬ４」及び「ＶＨ４」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第４の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。本発明の代表的な４鎖二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表１に提示する。
【０１１８】
【表１】
2021505637.tif 000003
【０１１９】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、合計４つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合ドメインを有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである（図３Ａ〜３Ｃ）。本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、２つの第１のエピトープ結合ドメイン及び２つの第２のエピトープ結合ドメインを含む。
【０１２０】
更なる実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１のポリペプチドは、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。このようなダイアボディの第２のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。このようなダイアボディの第３のポリペプチドは、ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含む。従ってこのようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に連結して、上記第１又は第２のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１エピトープ結合ドメイン、及び上記エピトープ農地のもう一方に結合できるＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合ドメインを形成する。上記第１及び第２のポリペプチドは、それぞれの第３のドメインのシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃドメインを形成する。このような二重特異性ダイアボディは、強度が増強されている。図４Ａ及び４Ｂは、このようなダイアボディの構造を示す。このようなＦｃドメイン含有ダイアボディは、２つの配向（表２）のうちのいずれを有してよい。
【０１２１】
【表２】
2021505637.tif 000004
【０１２２】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、合計３つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、２価（即ち２つのエピトープ結合ドメインを有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである（図４Ａ〜４Ｂ）。本発明の二重特異性、２価Ｆｃ含有ダイアボディは、第１又は第２のエピトープに対して免疫特異的な１つのエピトープ結合ドメイン、及び上記エピトープのうちのもう一方に対して特異的に結合できるＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合ドメインを含む。
【０１２３】
更なる実施形態では、上記Ｆｃドメイン含有ダイアボディは、合計５つのポリペプチド鎖を含んでよい。ある特定の実施形態では、上記５つのポリペプチド鎖のうちの２つは、同一のアミノ酸配列を有する。このようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記第１のポリペプチド鎖は、ＶＨ１及び重鎖定常領域を含有する抗体の重鎖であってよい。このようなダイアボディの第２及び第５のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。このようなダイアボディの上記第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、上記第１／第３のポリペプチド鎖のＶＨ１に対して相補的なＶＬ１を含有する抗体の軽鎖であってよい。上記第１、第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって構成できる。このようなダイアボディの第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメイン；（ｉｖ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｖ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｖｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、上記第３の鎖と上記第４の鎖との二量体化を促進する。このようなダイアボディの第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第３のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。
【０１２４】
従って、このようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖と上記第３及び第５のポリペプチド鎖とは、互いに連結して、第１のエピトープに結合できる２つのＶＬ１／ＶＨ１エピトープ結合ドメインを形成する。このようなダイアボディの上記第３及び第４のポリペプチド鎖は、互いに連結して、第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合ドメイン、及び第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合ドメインを形成する。上記第１及び第３のポリペプチドは、それぞれの定常領域のシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、Ｆｃドメインを形成する。このような多重特異性ダイアボディは、強度が増強されている。図５は、このようなダイアボディの構造を示す。ＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は三重特異性である結合が可能となることが理解されるだろう。
【０１２５】
上記ポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、所望のエピトープに特異的なＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成するよう選択される。上記ポリペプチド鎖の連結によって形成されるＶＬ／ＶＨ結合ドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性、三重特異性又は四重特異性である４価結合が可能となる。特に上記ＶＬ及びＶＨドメインは、多価ダイアボディが、第１のエピトープに関する２つの結合ドメイン及び第２のエピトープに関する２つの結合ドメイン、又は第１のエピトープに関する３つの結合ドメイン及び第２のエピトープに関する１つの結合ドメイン、又は（図５に示すように）第１のエピトープに関する２つの結合ドメイン、第２のエピトープに関する１つの結合ドメイン、及び第３のエピトープに関する１つの結合ドメインを含むように選択してよい。本発明の代表的な５鎖Ｆｃドメイン含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表３に示す。
【０１２６】
【表３】
2021505637.tif 000005
【０１２７】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、第１のエピトープに免疫特異的な２つのエピトープ結合ドメイン、及び第２のエピトープに特異的な２つのエピトープ結合ドメインを有する、合計５つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合ドメインを有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである。別の実施形態では、本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、第１のエピトープに免疫特異的な３つのエピトープ結合ドメイン、及び第２のエピトープに特異的な１つのエピトープ結合ドメインを含む。上述のように、ＶＬ及びＶＨドメインは、三重特異性結合が可能となるように選択してよい。従って本発明は、三重特異性４価Ｆｃ含有ダイアボディも包含する。本発明の三重特異性４価Ｆｃ含有ダイアボディは、第１のエピトープに対して免疫特異的な２つのエピトープ結合ドメイン、第２の分子に対して免疫特異的な１つのエピトープ結合ドメイン、及び第３のエピトープに対して免疫特異的な１つのエピトープ結合ドメインを含む。
【０１２８】
従来の免疫機能では、抗体‐抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性細胞傷害性、肥満細胞脱顆粒及び食作用等のエフェクタ機能から、リンパ球増殖及び抗体分泌を制御するもの等の免疫調節性シグナルにまで及ぶ、広範な応答をもたらす。これらの相互作用は全て、抗体又は免疫複合体のＦｃドメインの、造血細胞上の特殊化された細胞表面受容体への結合によって開始される。上述のように、抗体及び免疫複合体によってトリガされる細胞応答の多様性は、３つのＦｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の構造不均質性によって得られる。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は活性化（即ち免疫系増強）受容体であり；ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は阻害性（即ち免疫系減衰）受容体である。更に、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用は、エンドソームから細胞表面へのＩｇＧ分子の再循環及び血中への放出を仲介する。例示的な野生型ＩｇＧ１（配列番号１２）、ＩｇＧ２（配列番号１３）、ＩｇＧ３（配列番号１４）及びＩｇＧ４（配列番号１５）のアミノ酸配列は、既に提示されている。
【０１２９】
Ｆｃドメインの修飾は、表現型の変化、例えば血清半減期の変化、安定性の変化、細胞酵素に対する感受性の変化、又はエフェクタ機能の変化につながり得る。従って、本発明のＦｃドメイン含有結合分子をエフェクタ機能に関して修飾して、例えば癌の治療におけるこのような分子の有効性を増強することが望ましい場合がある。例えば、作用機序が、標的抗原を担持する細胞の殺滅ではなく遮断又は拮抗作用を伴う抗体の場合といった、特定の場合においては、Ｆｃドメイン仲介型エフェクタ機能の低減又は削減が望ましい。エフェクタ機能の上昇は、ＦｃγＲが低いレベルで発現する腫瘍及び外来細胞、例えばＦｃγＲＩＩＢのレベルが低い腫瘍特異性Ｂ細胞（例えば非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬ及びバーキットリンパ腫）といった、望ましくない細胞を対象とする場合に一般に望ましい。エフェクタ機能活性が与えられた又は変更された本発明のこのような分子は、エフェクタ機能活性の効率の増強が望ましい疾患、障害又は感染の治療及び／又は予防のために有用である。
【０１３０】
従って特定の実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有分子のＦｃドメインは、操作された可変Ｆｃ領域であってよい。本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有分子のＦｃドメインは、１つ以上のＦｃ受容体（例えば１つ以上のＦｃγＲ）に結合できる能力を有してよいが、より好ましくは、上記変異型Ｆｃドメインは、（野生型Ｆｃドメインが呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）若しくはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が変化しており、例えばある活性化受容体への結合が増強されており、及び／又は１つ以上の阻害性受容体に結合する能力が低下しているか若しくは上記能力を有しない。従って、本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有分子のＦｃドメインは、完全ＦｃドメインのＣＨ２ドメインのうちのある程度若しくは全体及び／若しくはＣＨ３ドメインのうちのある程度若しくは全体を含んでよく、又は（例えば完全ＦｃドメインのＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインに対する１つ以上の挿入及び／若しくは１つ以上の欠失を含んでよい）変異型ＣＨ２及び／若しくは変異型ＣＨ３配列を含んでよい。このようなＦｃドメインは、非Ｆｃポリペプチド部分を含んでよく、又は自然に発生しない完全Ｆｃドメインの部分を含んでよく、又はＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインの自然に発生しない配向を含んでよい（例えば２つのＣＨ２ドメイン若しくは２つのＣＨ３ドメイン、若しくはＮ末端からＣ末端への方向において、ＣＨ３ドメインと、これが連結したＣＨ２ドメイン、等）。
【０１３１】
変化したエフェクタ機能として表されるＦｃドメイン修飾は当該技術分野において公知であり、活性化型受容体に対する結合を増大させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ））、及び阻害型受容体に対する結合を低下させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ））が含まれる（例えばStavenhagen, J.B. et al. (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res. 57(18):8882-8890を参照）。表４は、活性化受容体への結合を増大させる、及び／又は阻害性受容体への結合を低下させる例示的な修飾の、単一、二重、三重、四重及び五重置換のリスト（（ＥＵインデックスに従った）番号付与及び置換は、上で提示した配列番号１２のアミノ酸配列に対するものである）を示す。
【０１３２】
【表４】
2021505637.tif 000006
【０１３３】
ＣＤ３２Ｂへの結合が低下した、及び／又はＣＤ１６Ａへの結合が増大した、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインの例示的な変異型は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ又はＰ３９６Ｌ置換を含有し、ここでの番号付与は、Kabat中のEUインデックスの番号付与である。これらのアミノ酸置換は、いずれの組み合わせで、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン内に存在してよい。一実施形態では、上記変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、上記変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ置換を含有する。
【０１３４】
特定の実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子のＦｃドメインに関して、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（配列番号１２）が呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下している（又はこれらに略結合しない）ことが好ましい。ある具体的実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、抗体依存性細胞仲介型細胞傷害性（ＡＤＣＣ）エフェクタ機能が低下したＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む。ある好ましい実施形態では、このような結合分子のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、以下の置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｑ、及びＮ２９７Ｇのうちのいずれの１つ、２つ、３つ又は４つを含み、ここでの番号付与は、Kabat中のEUインデックスの番号付与である。別の実施形態では、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、Ｎ２９７Ｑ置換、Ｎ２９７Ｇ置換、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換又はＤ２６５Ａ置換を含有するが、それはこれらの突然変異がＦｃＲ結合を消失させるためである。あるいは、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（配列番号１２）が呈する結合及びエフェクタ機能に対して）ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に対する結合が元来低い（又は略結合しない）、及び／又はエフェクタ機能が元来低い、天然のＦｃドメインのＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを利用する。ある具体的実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、ＩｇＧ２  Ｆｃドメイン（配列番号１３）、ＩｇＧ３  Ｆｃドメイン（配列番号１４）、又はＩｇＧ４  Ｆｃドメイン（配列番号１５）を含む。ＩｇＧ４  Ｆｃドメインを利用する場合、本発明は、上述のヒンジ領域Ｓ２２８Ｐ置換（例えば配列番号１１参照）等の安定化突然変異の導入も包含する。Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ａ置換はエフェクタ機能を消失させるため、エフェクタ機能が望まれる状況下では、これらの置換は採用しないことが好ましい。
【０１３５】
エフェクタ機能が低下したか又は消失した、本発明のＦｃドメイン含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１配列は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの置換を含む（配列番号４５）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１３６】
本発明のＦｃ領域含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する、第２の好ましいＩｇＧ１配列は、Ｓ４４２Ｃ置換（下線を付して示す）を含み、これにより、２つのＣＨ３ドメインがジスルフィド結合を介して互いに共有結合でき、即ち薬剤部分のコンジュゲートが可能となる。このような分子のアミノ酸配列は、（配列番号４６）：
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LCLSPGX
であり、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１３７】
本発明のＦｃ領域含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する、第３の好ましいＩｇＧ１配列は、エフェクタ機能を低減又は消失させるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換（下線を付して示す）と、２つのＣＨ３ドメインがジスルフィド結合を介して互いに共有結合できるようにする、即ち薬剤部分のコンジュゲートを可能とする、Ｓ４４２Ｃ置換（下線を付して示す）とを含む。このような分子のアミノ酸配列は、（配列番号４７）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LCLSPGX
であり、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１３８】
Ｆｃドメインを含むタンパク質の血清半減期は、ＦｃＲｎに関するＦｃドメインの結合親和性を増大させることによって増大させることができる。本明細書において使用される場合、用語「半減期（ｈａｌｆ‐ｌｉｆｅ）」は、投与後の分子の平均生存時間の尺度となる、分子の薬物動態特性を意味する。半減期は、血清中で（即ち循環半減期）又は他の組織中で測定した場合に、分子の既知の量の５０パーセント（５０％）が被験者の身体（例えばヒト患者若しくは他の哺乳類）又はその特定の体腔から排除されるために必要な時間として表すことができる。一般に、半減期の増大は、投与される分子の循環における平均滞留時間（ＭＲＴ）の増大につながる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、従って（野生型Ｆｃドメインを含む場合に対して）増大した半減期を有する、変異型Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、２３８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６からなる群から選択される１つ以上の位置に半減期延長アミノ酸置換を含む、変異型ＩｇＧ  Ｆｃドメインを含み、ここでの番号付与は、Ｋａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である。Ｆｃドメイン含有分子の半減期を増大させることができる多数の突然変異が当該技術分野において公知であり、例えばＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ及びこれらの組み合わせが挙げられる。例えば：米国特許第６，２７７，３７５号；米国特許第７，０８３，７８４号；米国特許第７，２１７，７９７号；米国特許第８，０８８，３７６号；米国公開特許第２００２／０１４７３１１号；米国公開特許第２００７／０１４８１６４号；並びに国際公開第９８／２３２８９号；国際公開第２００９／０５８４９２号；及び国際公開第２０１０／０３３２７９号（これらは参照によりその全体が本出願に援用される）に記載されている突然変異を参照。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、半減期が増強された本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、Ｆｃドメイン残基２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２８８、３０７、３０８、３０９、３１１、３７８、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６のうちの２つ以上における置換、特にＴ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｔ３０７Ｑ、Ｖ３０８Ｐ、Ａ３７８Ｖ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｈ４３５Ｋ及びＹ４３６Ｉから選択される２つ以上の置換を含む変異型Ｆｃドメインを有し、ここでの番号付与は、Ｋａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である。ある具体的実施形態では、上記分子は：
（Ａ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｂ）Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；
（Ｃ）Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｄ）Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ；
（Ｅ）Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａ；
（Ｆ）Ａ３７８Ｖ及びＮ４３４Ａ；
（Ｇ）Ｎ４３４Ａ及びＹ４３６Ｉ；
（Ｈ）Ｖ３０８Ｐ及びＮ４３４Ａ；又は
（Ｉ）Ｋ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ
の置換を含む変異型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を有してよい。
【０１４１】
ある好ましい実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有ＣＤ１６×ＤＡ結合分子は、置換：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅのうちのいずれの１つ、２つ又は３つを含む変異型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を有する。本発明は更に：
（Ａ）エフェクタ機能及び／又はＦｃγＲを変化させる、１つ以上の突然変異；並びに
（Ｂ）血清半減期を延長させる、１つ以上の突然変異
を含む変異型Ｆｃ領域を有する、ＣＤ１６×ＤＡ結合分子を包含する。
【０１４２】
半減期の増大を提供する（及びカニクイザルＦｃＲｎ及びヒトＦｃＲｎの両方への結合が１０倍増大した本発明のＦｃドメイン含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関するＩｇＧ１配列（Dall’Acqua, W.F. et al. (2006) “Properties of Human IgG1s Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn),” J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524）は、置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含む（配列番号４８）：
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１４３】
置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａによって提供されるエフェクタ機能の低下又は消失と、置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅによって提供される血清半減期の増大とが組み合わさった、本発明のＦｃドメイン含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する別のＩｇＧ１配列は、配列番号４９：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
によって提供され、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１４４】
本発明のＦｃ領域含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する更なる好ましいＩｇＧ１配列は、エフェクタ機能を低下又は消失させるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換（下線を付して示されている）と、血清半減期を延長するためのＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ置換（下線を付して示されている）と、２つのＣＨ３ドメインを、ジスルフィド結合を介して互いに共有結合させることができる、即ち薬剤部分のコンジュゲートを可能にするＳ４４２Ｃ置換（下線を付して示されている）とを含む。このような分子のアミノ酸配列は、（配列番号５０）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LCLSPGX
であり、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１４５】
アミノ酸配列が異なる複数のＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖を有することが望まれる（例えばＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖が同一ではないことが望まれる）特定の抗体、ダイアボディ及び３価結合分子に関して、同一の鎖（例えば２つの第１のポリペプチド鎖、又は２つの第３のポリペプチド鎖）のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン間でのホモ二量体化の発生を低減又は防止することが望ましい。このようなポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは配列において同一である必要はなく、有利には２つのポリペプチド鎖間のヘテロ二量体複合体形成を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（ｋｎｏｂ）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（ｈｏｌｅ）」と対合させて、ヘテロ二量体化を促進できる。このような一連の突然変異は、Ｆｃドメインを形成するＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドのいずれのペアに施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。
【０１４６】
好ましいノブは、ＩｇＧ  Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、ＩｇＧ  Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。ホール担持ポリペプチド鎖ホモ二量体を、二重特異性ヘテロ二量体Ｆｃドメイン含有分子から精製するのを補助するために、好ましくは、ポリペプチド鎖のホール担持ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合ドメインを、位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）におけるアミノ酸置換によって変異させる。このようにして、ホール担持ポリペプチド鎖ホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方で二重特異性ヘテロ二量体は、タンパク質Ａ結合ドメインを介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。代替実施形態では、ホール担持ポリペプチド鎖は、４３４位及び４３５位にアミノ酸置換を組み込んでよい（Ｎ４３４Ａ／Ｎ４３５Ｋ）。
【０１４７】
本発明のＦｃドメイン含有分子のあるＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１アミノ酸配列は、「ノブ担持」配列（配列番号５１）を有する：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０１４８】
Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換及び「ノブ担持」配列を有する、本発明のＦｃドメイン含有分子のあるＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する別のＩｇＧ１アミノ酸配列は、配列番号５２：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
であり、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０１４９】
２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃドメイン含有分子の他方のＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖（又は３つ、４つ、若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃドメイン含有分子の第３のポリペプチド鎖）のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１アミノ酸配列は、「ホール担持」配列を有する（配列番号５３）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNRYTQKS LSLSPGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０１５０】
Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換及び「ホール担持」配列を有する、本発明のＦｃドメイン含有分子の他方のＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する別のＩｇＧ１アミノ酸配列は、配列番号５４：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNRYTQKS LSLSPGX
であり、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０１５１】
後に記載されるように、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、アラニンによる２３４位の置換及びアラニンによる２３５位の置換を含み、従って、（野生型Ｆｃドメイン（配列番号１２）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下した（又は結合を実質的に示さない）Ｆｃドメインを形成する。本発明はまた、野生型アラニン残基、Ｆｃドメインのエフェクタ機能及び／又はＦγＲ結合活性を修正する代替的な及び／又は更なる置換を含む、このようなＣＨ２‐ＣＨ３ドメインも包含する。本発明はまた、１つ以上の半減期延長アミノ酸置換を更に含む、このようなＣＨ２‐ＣＨ３ドメインも包含する。特に本発明は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを更に含む、このようなホール担持及びノブ担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを包含する。
【０１５２】
本発明のＦｃドメイン含有分子の上記１つのＦｃドメイン含有ポリペプチドのＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関するＩｇＧ４アミノ酸配列は、Ｙ２５２／Ｔ２５４／Ｅ２５６を有することにより、（ＩｇＧ１  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに比べて）血清半減期が増大する（配列番号５５）：
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSLGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１５３】
このようなＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３アミノ酸配列の「ノブ担持」変異型は、配列番号５６：
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSLGX
のアミノ酸配列を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１５４】
このようなＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３アミノ酸配列の「ホール担持」変異型は、配列番号５７：
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 
ALHNRYTQKS LSLSLGX
のアミノ酸配列を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１５５】
第１のポリペプチド鎖が、配列番号５１又は配列番号５２のもの等の「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３配列を有することが好ましい。しかしながら、理解されるように、第１のポリペプチド鎖中に「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号５３又は配列番号５４）を採用でき、この場合「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号５１又は配列番号５２）は、２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃドメイン含有分子の第２のポリペプチド鎖中（又は３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃドメイン含有分子の第３のポリペプチド鎖中）に採用される。
【０１５６】
他の実施形態では、本発明は、国際公開第２００７／１１０２０５号；国際公開第２０１１／１４３５４５号；国際公開第２０１２／０５８７６８号；国際公開第２０１３／０６８６７号（これらは全て、参照によりその全体が本出願に援用される）において開示されているもの等の当該技術分野で公知の突然変異を用いて、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化を指向するよう操作されたＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含む、Ｆｃドメイン含有結合分子を包含する。
【０１５７】
ＩＩＩ．Ｆｃドメインを含有する３価結合分子
本発明の更なる実施形態は、第１のエピトープ、第２のエピトープ及び第３のエピトープ（ここで上記エピトープのうちの少なくとも１つは、別のエピトープと同一ではない）に同時に結合できるＦｃドメインを含む、三重特異性３価結合性分子に関する。このような三重特異性３価結合性分子は３つのエピトープ結合ドメインを含み、そのうちの２つは、結合ドメインＡ及び結合ドメインＢを提供するダイアボディ型結合ドメインであり、１つは、結合ドメインＣを提供するＦａｂ型結合ドメイン（又はｓｃＦｖ型結合ドメイン）である（例えば図６Ａ〜６Ｈ、並びに国際公開第２０１５／１８４２０７号及び国際公開第２０１５／１８４２０３号を参照）。このような３価結合分子は従って、第１のエピトープに結合できる「ＶＬ１」／「ＶＨ１」ドメイン、並びに第２のエピトープに結合できる「ＶＬ２」／「ＶＨ２」ドメイン、並びに上記３価結合分子の「第３の」エピトープに結合できる「ＶＬ３」及び「ＶＨ３」ドメインを含む。「ダイアボディ型結合ドメイン」は、上述のように、ダイアボディ中に存在するエピトープ結合ドメインのタイプである。「Ｆａｂ型結合ドメイン」及び「ｓｃＦｖ型結合ドメイン」はそれぞれ、イムノグロブリン軽鎖のＶＬドメインと、相補的なイムノグロブリン重鎖のＶＨドメインとの相互作用によって形成される、エピトープ結合ドメインである。Ｆａｂ型結合ドメインは、Ｆａｂ型結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖が単一のエピトープ結合ドメインしか含まないが、ダイアボディ型結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖は少なくとも２つのエピトープ結合部位を含むという点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。同様に、ｓｃＦｖ型結合ドメインも、これらが単一のエピトープ結合ドメインしか含まないという点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。よって本明細書において使用される場合、Ｆａｂ型及びｓｃＦｖ型結合ドメインは、ダイアボディ型結合ドメインとは別個である。
【０１５８】
典型的には、本発明の３価結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖を含む（図６Ａ〜６Ｂ参照）が、上記分子は、例えばこれらのポリペプチド鎖を（例えばペプチド結合によって）互いに融合させることによって、又はこれらのポリペプチドを「分割（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）」して追加のポリペプチド鎖を形成することによって、又はより少数若しくは追加のポリペプチド鎖をジスルフィド結合によって連結することによって、より少数又はより多数のポリペプチド鎖を含むことができる。図６Ｅ〜６Ｆは、３つのポリペプチド鎖を有する分子を概略的に示すことによって、本発明のこの態様を図示している。図６Ａ〜６Ｈに提示されているように、本発明の３価結合分子は、上記ダイアボディ型結合ドメインがＦｃドメインに対するＮ末端（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｅ、及び６Ｆ）又はＣ末端（図６Ｄ、６Ｇ及び６Ｈ）となる交互の配向を有してよい。３価結合分子の生成に有用なＣＨ２及びＣＨ３ドメインは上述されており、ノブ担持及びホール担持ドメインを含む。
【０１５９】
特定の実施形態では、本発明のこのような３価結合分子の第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記ＶＬ１及びＶＬ２ドメインは、表４（図６Ａ及び６Ｂも参照）に提示されるように、上記ＣＨ２‐ＣＨ３含有ドメインに対してＮ末端又はＣ末端に位置する。このような実施形態の第２のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有する。このような実施形態の第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記第３のポリペプチド鎖は、ＶＨ３及び重鎖定常領域を含有する抗体、又は上記ドメインを含有するポリペプチドの、重鎖であってよい。このような実施形態の第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。上記第４のポリペプチド鎖は、上記第３のポリペプチド鎖のＶＨ３に対して相補的なＶＬ３を含有する抗体、又は上記ドメインを含有するポリペプチドの、軽鎖であってよい。上記第３又は第４のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって、合成によって、又は他の手段によって構成できる。
【０１６０】
上記第１及び第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインは、介在スペーサペプチドによって、このようなポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインから隔てられ、上記介在スペーサリンカーは、これらのＶＬ１／ＶＨ２（又はこれらのＶＬ２／ＶＨ１）ドメインを一体に連結して、第１又は第２のエピトープに結合できるエピトープ結合ドメインを形成することを可能にするには短すぎる長さを有する。この目的のために好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号１６）：GGGSGGGGを有する。上記３価結合分子の他のドメインは、任意にシステイン残基を含む、１つ以上の介在スペーサペプチド（リンカー）によって隔てられていてよい。特に上述のように、このようなリンカーは典型的には可変ドメイン（即ちＶＨ又はＶＬ）とペプチドヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル又はＫコイル）との間、及び上記ペプチドヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル又はＫコイル）とＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとの間に組み込まれる。３価結合分子の生成に有用な例示的なリンカーは上で提示されており、またＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０８１号；及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０７６号にも提示されている。従ってこのような３価結合分子の第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に連結して、第１のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１結合ドメイン、及び第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２結合ドメインを形成する。このような３価結合分子の第３及び第４のポリペプチド鎖は、一体に連結して、第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合ドメインを形成する。
【０１６１】
上述のように、本発明の３価結合分子は、３つのポリペプチドを含んでよい。３つのポリペプチド鎖を含む３価結合分子は、（例えば介在スペーサペプチド（リンカー４）を用いて）第４のポリペプチドＮ末端のドメインを第３のポリペプチドのＶＨ３含有ドメインに連結することによって得ることができる。あるいは、以下の３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する本発明の３価結合分子の第３のポリペプチド鎖が利用され、ここでＶＬ３及びＶＨ３は、これらのドメインが連結してエピトープ結合ドメインを形成できるようにするために十分な長さ（少なくとも９以上のアミノ酸残基）を有する介在スペーサペプチドによって、互いから隔てられる。この目的に関して好ましい１つの介在スペーサペプチドは、配列：GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号４１）を有する。
【０１６２】
このような３価結合性分子のＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは異なっていてよく、それによって単一特異性、二重特異性又は三重特異性の結合が可能となることが理解されるだろう。特に、ＶＬ及びＶＨドメインは、３価結合分子が第１のエピトープに対する２つの結合ドメイン及び第２のエピトープに対する１つの結合ドメイン、又は第１のエピトープに対する１つの結合ドメイン及び第２のエピトープに対する２つの結合ドメイン、又は第１のエピトープに対する１つの結合ドメイン、第２のエピトープに対する１つの結合ドメイン、及び第３のエピトープに対する１つの結合ドメイン、を含むように選択される。
【０１６３】
本発明の代表的な３価結合性分子のポリペプチド鎖の一般構造を、図６Ａ〜６Ｈ及び表５で提供する。
【０１６４】
【表５】
2021505637.tif 000007
【０１６５】
上述のように、このような３価結合分子は、３つ、４つ、５つ又は６つ以上のポリペプチド鎖を含んでよい。
【０１６６】
ＩＶ．本発明の実施形態
上述のように、本発明は、ＣＤ１６のエピトープに結合できる結合ドメイン（即ち「ＣＤ１６結合ドメイン」）と、疾患抗原のエピトープに結合できる結合ドメイン（即ち「疾患抗原結合ドメイン」）とを含む、ＣＤ１６×ＤＡ結合分子（例えば抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、抗体、ＴａｎｄＡｂ等）を対象とする。よって本発明は、ＣＤ１６に結合する抗体のＶＨ及び／又はＶＬドメインのうちの１つ以上、又は更に好ましくは、このようなドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２、及びＣＤＲH３、並びにＣＤＲL１、ＣＤＲL２、及びＣＤＲL３部分を含む、結合分子を包含する。本発明のある好ましい実施形態では、このような結合分子は更に、このような分子を１つ、２つ、３つ、又は４つ以上の疾患抗原のエピトープに結合させるために十分な結合ドメインを含有する。本発明はまた、１つ以上のこのような分子を含む医薬組成物を対象とする。
【０１６７】
ＣＤ１６及び疾患抗原に免疫特異的に結合するために十分な結合ドメインを有することにより、本発明の分子は、ＣＤ１６発現性細胞（及び特にナチュラルキラー細胞）を、疾患抗原を発現する細胞の１つ以上の部位に共局在させることによって、標的細胞のＡＤＣＣ仲介型殺滅の可能性を増大させる能力を有する。上述のように、このような分子は二重特異性であってよく、又は３つ以上のエピトープに結合できるものであってもよい。
【０１６８】
一実施形態では、本発明のこのようなＣＤ１６結合分子は単一特異性であり、従ってＣＤ１６の単一のエピトープのみ、及び疾患抗原の単一のエピトープのみに結合する能力を有する。
【０１６９】
あるいは、このような分子は多重特異性であってよく、即ち合計で１つ、２つ、３つ、又は４つのエピトープに結合でき、これらは、ＣＤ１６の１つ、２つ、又は３つのエピトープ（２つ又は３つのＣＤ１６エピトープは、同一であっても異なっていてもよい）、及び１つ以上の疾患抗原の３つ、２つ、又は１つのエピトープに結合するよう、いずれの方法で割り当てることができる。
【０１７０】
よって、このような分子が単一の疾患抗原のみに免疫特異的に結合できる場合、上記分子は：１つだけのＣＤ１６エピトープ、及び疾患抗原の１つ、２つ、又は３つのエピトープ（２つの疾患抗原エピトープは同一であっても異なっていてもよく、３つのエピトープは同一であっても、異なっていても、又は２つの同一のエピトープ及び１つの異なるエピトープであってもよい）に免疫特異的に結合できるものであってよく；あるいは、２つだけのＣＤ１６エピトープ（２つのエピトープは同一であっても異なっていてもよい）、及び疾患抗原の１つ又は２つのエピトープ（２つのエピトープは同一であっても異なっていてもよい）に免疫特異的に結合できるものであってよく；あるいは、３つのＣＤ１６エピトープ（３つのエピトープは同一であっても、異なっていても、又は２つの同一のエピトープ及び１つの異なるエピトープであってもよい）、及び疾患抗原の１つのエピトープに免疫特異的に結合できるものであってよい。
【０１７１】
同様に、このような分子が２つの異なる疾患抗原（例えば第１の疾患抗原及び第２の疾患抗原）に免疫特異的に結合できる場合、上記分子は：１つだけのＣＤ１６エピトープ、及び第１の疾患抗原の１つ又は２つのエピトープ（２つの第１の疾患抗原エピトープは同一であっても異なっていてもよい）、及び第２の疾患抗原の２つ又は１つのエピトープ（２つの第２の疾患抗原エピトープは同一であっても異なっていてもよい）に免疫特異的に結合できるものであってよく；あるいは、２つだけのＣＤ１６エピトープ（２つのエピトープは同一であっても異なっていてもよい）、及び第１の疾患抗原の１つのエピトープ、及び第２の疾患抗原の１つのエピトープに免疫特異的に結合できるものであってよい。
【０１７２】
同様に、このような分子は、３つの異なる疾患抗原（例えば第１の疾患抗原、第２の疾患抗原、及び第３の疾患抗原）、並びに１つだけのＣＤ１６エピトープに免疫特異的に結合できるものであってよい。
【０１７３】
よって、例えばこのような分子は：
（１）ＣＤ１６の単一のエピトープ、及び標的細胞の表面上に配列された疾患抗原の単一のエピトープ；
（２）ＣＤ１６の単一のエピトープ、及び標的細胞の表面上に配列された疾患抗原の２つのエピトープ；
（３）ＣＤ１６の単一のエピトープ、及び標的細胞の表面上に配列された疾患抗原の３つのエピトープ；
（４）ＣＤ１６の単一のエピトープ、標的細胞の表面上に配列された第１の疾患抗原の１つのエピトープ、及び標的細胞の表面上に配列された第２の疾患抗原の１つのエピトープ；
（５）ＣＤ１６の単一のエピトープ、標的細胞の表面上に配列された第１の疾患抗原の２つのエピトープ、及び標的細胞の表面上に配列された第２の疾患抗原の１つのエピトープ；
（６）ＣＤ１６の２つのエピトープ、及び標的細胞の表面上に配列された疾患抗原の単一のエピトープ；
（７）ＣＤ１６の２つのエピトープ、及び標的細胞の表面上に配列された疾患抗原の２つのエピトープ；
（８）ＣＤ１６の２つのエピトープ、及び標的細胞の表面上に配列された第１の疾患抗原の１つのエピトープ、及び標的細胞の表面上に配列された第２の疾患抗原の１つのエピトープ；
（９）ＣＤ１６の３つのエピトープ、及び標的細胞の表面上に配列された疾患抗原の１つのエピトープ；
に結合してよく、結合がＣＤ１６又は疾患抗原の２つ以上のエピトープに対するものである全ての場合において、このようなエピトープは同一であっても異なっていてもよく、又は１つのこのようなエピトープと同一であり、かつ別のこのようなエピトープとは異なっていてよい。
【０１７４】
表６は、本発明の例示的な分子の結合特異性の可能な組み合わせを示す。
【０１７５】
【表６】
2021505637.tif 000008
【０１７６】
更に複雑な分子を形成することにより、１つ以上の疾患抗原に結合でき、かつ５つ以上のエピトープ結合ドメインを有する、ＣＤ１６結合分子を得ることができる。よって、本発明の分子が結合し得るエピトープ又は追加のエピトープの性質については、このような追加の結合能力によって、ＣＤ１６のエピトープに結合できる分子又はその結合ドメインの、ＣＤ１６への結合が妨げられず、また疾患抗原のエピトープに結合できる分子又はその結合ドメインの、疾患抗原への結合が妨げられないことを除いて、一切の制約が課されない。よって、本発明のＣＤ１６結合分子は、代替的なエピトープ結合ドメイン又は追加のエピトープ結合ドメインを有してよい。一例として、本発明は、ＣＤ１６のエピトープに免疫特異的に結合できる第１のエピトープ結合ドメインと、このような標的細胞の表面上に配列された疾患抗原のエピトープに免疫特異的に結合できる第２のエピトープ結合ドメインと、ナチュラルキラー細胞の非ＣＤ１６細胞表面分子といった異なる細胞表面分子に免疫特異的に結合できる第３のエピトープ結合ドメインとを含む、結合分子を考える。
【０１７７】
Ｖ．例示的な結合分子
本発明は、ＣＤ１６結合ドメインを有することにより、ヒトＣＤ１６に結合できる分子（例えば抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、抗体、ＴａｎｄＡｂ等）を対象とする。本発明は特に、ＣＤ１６×ＤＡ結合分子である、このようなＣＤ１６結合分子を対象とする。以下に列挙するのは、本発明の結合分子及び併用療法の製造に使用できる例示的な抗体である。
【０１７８】
Ａ．例示的な抗ヒトＣＤ１６抗体
１．ＣＤ１６‐Ｍ１及びＣＤ１６‐Ｍ２、並びにこれらのヒト化誘導体ｈＣＤ１６‐Ｍ１及びｈＣＤ１６‐Ｍ２
本発明は、マウス抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体：ＣＤ１６‐Ｍ１及びＣＤ１６‐Ｍ２、並びにこれらのヒト化誘導体：ｈＣＤ１６‐Ｍ１及びｈＣＤ１６‐Ｍ２を提供し、これらは、ＣＤ１６  １５８Ｆアロタイプ及びＣＤ１６  １５８Ｖアロタイプの両方に良好に結合し、かつＣＤ１６‐ＩｇＧ間の結合をブロックしない部位でＣＤ１６に結合する、新規かつ高親和性の抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体である。上記抗体は、１５８Ｆ／１５８Ｖ  ＣＤ１６Ａ多型に関係なく患者の集団に容易に採用できるため、本発明の目的のために特に好ましい。
【０１７９】
（ａ）抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ＣＤ１６‐Ｍ１
マウス抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVKLVESGGT LVKPGGSLKL SCAASGFTFN NYGMSWVRQT PEKRLEWVAT 
ISGGGSYTFY PDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMSSLRSED TALYYCIRQS
ARAPEPYWGQ GTLVTVSS
【０１８０】
マウス抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号６５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVG THVAWYQQKS GQSPKSLLYS
ASYRYSGVPD RFSGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFCQQ YKSYPLTFGA 
GTKLELK
【０１８１】
抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ＣＤ１６‐Ｍ１のＣＤＲを表７に示す。
【０１８２】
【表７】
2021505637.tif 000009
【０１８３】
ｈＣＤ１６‐Ｍ１は、マウス抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ＣＤ１６‐Ｍ１のヒト化誘導体である。ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS NYGMSWVRQA PGKGLEWVAT 
ISGGGSYTFY PDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRTED TALYYCVRQS 
ARAPEPYWGQ GTLVTVSS
【０１８４】
ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQQ YKSYPLTFGQ 
GTKLEIK 
【０１８５】
ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａは、ヒト化抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１の最適化済み誘導体である。ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａは、ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬドメイン（配列番号７３）と、ＣＤＲH３に突然変異を含む最適化済みＶＨドメインとを含む。ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａの最適化済みＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５８）を以下に示す（突然変異したＣＤＲH３残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS NYGMSWVRQA PGKGLEWVAT 
ISGGGSYTFY PDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRTED TALYYCVRQS 
ANSPVPYWGQ GTLVTVSS
【０１８６】
ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂは、ヒト化抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１の最適化済み誘導体である。ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂは、ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨドメイン（配列番号７２）と、ＣＤＲL３に突然変異を含む最適化済みＶＬドメインとを含む。ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂの最適化済みＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５９）を以下に示す（突然変異したＣＤＲL３残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS 
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQD YTNYPLTFGQ 
GTKLEIK 
【０１８７】
ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢは、ヒト化抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１の最適化済み誘導体である。ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢは、ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａの最適化済みＶＨドメイン（配列番号５８）と、ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂの最適化済みＶＬドメイン（配列番号５９）とを含む。
【０１８８】
ヒト化抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１、及び最適化済み抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａ、ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ、ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢのＣＤＲを、表８に示す。
【０１８９】
【表８】
2021505637.tif 000010
【０１９０】
認識されるように、ｈＣＤ１６‐Ｍ１、ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａ、ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ、及びｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢ（RASQNVGTHVA；配列番号７４）のＣＤＲL１は、ＣＤ１６‐Ｍ１（KASQNVGTHVA；配列番号６９）のＣＤＲL１と、その第１の残基において異なっている。いずれのＣＤＲL１も互換的に使用でき、本発明は、以下のＣＤＲHのうちの１つ、２つ、若しくは３つ、及び／又はこのようなＣＤＲLのうちの１つ、２つ、若しくは３つのアミノ酸配列を有するＣＤ１６エピトープ結合ドメインを含む、ヒト化及び最適化済みＣＤ１６結合分子を包含する。
【０１９１】
（ｂ）抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ＣＤ１６‐Ｍ２
マウス抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ＣＤ１６‐Ｍ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７５）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SSAMHWVKKN PGQGLEWIGY 
INHYNDGIKY NERFKGKATL TSDKSSSTAY MELSSLTSED SAVYYCATGY
RYASWFASWG QGTLVTVSS
【０１９２】
マウス抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ＣＤ１６‐Ｍ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSCRASQNIG TSIHWYQQRT DGSPRLLIKS
VSESISGIPS RFSGSGSGTD FTLTINGVES GDISDYYCQQ SNSWPLTFGA 
GTKLELK
【０１９３】
抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ＣＤ１６‐Ｍ２のＣＤＲを表９に示す。
【０１９４】
【表９】
2021505637.tif 000011
【０１９５】
ｈＣＤ１６‐Ｍ２は、マウス抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ＣＤ１６‐Ｍ２のヒト化誘導体である。ヒト化は、２つの好適なＶＨドメイン（ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＶＨ１及びｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＶＨ２）をもたらした。これらはいずれも、得られるヒト化ＶＬドメイン（ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＶＬ１）と共に使用してよい。
【０１９６】
ＶＨドメインｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＶＨ１のアミノ酸配列（配列番号８３）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SSAMHWVRQA PGQGLEWMGY 
INHYNDGIKY NERFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCATGY 
RYASWFASWG QGTLVTVSS
【０１９７】
ＶＨドメインｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＶＨ２のアミノ酸配列（配列番号８４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
2021505637.tif 000012
【０１９８】
認識されるように、ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＶＨ１のアミノ酸配列（配列番号８３）は、ＣＤＲH３の直前の残基にＴ９８Ｒ置換（上では四角で囲んで示されている）有するという点で、ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＶＨ２のアミノ酸配列（配列番号８４）とは異なる。
【０１９９】
ＶＬドメインのアミノ酸配列ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＶＬ１（配列番号８５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
EIVLTQSPAT LSVSPGERAT LSCRASQNIG TSIHWYQQKP DQSPKLLIKS
VSESISGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDFATYYCQQ SNSWPLTFGQ 
GTKLEIK
【０２００】
ヒト化抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ２のＣＤＲを表１０に示す。
【０２０１】
【表１０】
2021505637.tif 000013
【０２０２】
Ｂ．細胞表面エフェクタ細胞に結合する例示的な抗体
本発明のＣＤ１６×ＤＡ結合分子、特に本発明の三重特異性ＣＤ１６×ＤＡ結合分子は、エフェクタ細胞の非ＣＤ１６細胞表面分子に対する結合部位を含んでよい。本明細書中で使用される場合、用語「エフェクタ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ）」は、標的細胞（例えば外来細胞、感染細胞又は癌細胞）の殺滅を直接的又は間接的に仲介する細胞を指す。エフェクタ細胞の例としては、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、形質細胞（抗体分泌Ｂ細胞）、マクロファージ及び顆粒球が挙げられる。このような細胞の好ましい細胞表面分子としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ及びＮＫＧ２Ｄ受容体が挙げられる。従って、上記分子のエピトープに、又は他のエフェクタ細胞表面分子に免疫特異的に結合できる分子を、本発明の原理に従って使用してよい。標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子の構築にＶＨ及びＶＬドメインを使用してよい例示的な抗体を、以下に提供する。
【０２０３】
１．例示的な抗ＮＫＧ２Ｄ抗体
ナチュラルキラーエフェクタ細胞の好ましい非ＣＤ１６細胞表面分子は、ＮＫＧ２Ｄ受容体である。ＮＫＧ２Ｄ受容体は、全てのヒト（及び他の哺乳類）のナチュラルキラー細胞上（Bauer, S. et al. (1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA,” Science 285(5428):727-729; Jamieson, A.M. et al. (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1):19-29）並びに全てのＣＤ８+Ｔ細胞上（Groh, V. et al. (2001) “Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells,” Nat. Immunol. 2(3):255-260; Jamieson, A.M. et al. (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1):19-29）で発現する。このような結合リガンド、特に正常細胞上で発現されない結合リガンドとしては、組織適合性６０（Ｈ６０）分子、レチノイン酸初期誘導性遺伝子‐１（ＲＡＥ‐１）の産物、及びマウスＵＬ１６結合タンパク質様転写物１（ＭＵＬＴ１）が挙げられる（Raulet D.H. (2003) “Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands,” Nature Rev. Immunol. 3:781-790; Coudert, J.D. et al. (2005) “Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells,” Blood 106:1711-1717）。ＮＫＧ２Ｄ受容体に特異的に結合する分子としては、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体「ＫＹＫ‐１．０」及び「ＫＹＫ‐２．０」が挙げられる（Kwong, KY et al. (2008) “Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity,” J. Mol. Biol. 384:1143-1156）。
【０２０４】
ＫＹＫ‐１．０のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF 
IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTKY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR 
FGYYLDYWGQ GTLVTVSS
【０２０５】
ＫＹＫ‐１．０のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号８７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QPVLTQPSSV SVAPGETARI PCGGDDIETK SVHWYQQKPG QAPVLVIYDD 
DDRPSGIPER FFGSNSGNTA TLSISRVEAG DEADYYCQVW DDNNDEWVFG 
GGTQLTVL
【０２０６】
ＫＹＫ‐２．０のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF 
IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR 
GLGDGTYFDY WGQGTTVTVS S
【０２０７】
ＫＹＫ‐２．０のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号８９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QSALTQPASV SGSPGQSITI SCSGSSSNIG NNAVNWYQQL PGKAPKLLIY 
YDDLLPSGVS DRFSGSKSGT SAFLAISGLQ SEDEADYYCA AWDDSLNGPV 
FGGGTKLTVL
【０２０８】
ナチュラルキラー細胞の細胞表面に結合する他の例示的な抗体としては、抗体：Ａ１、ＡＣ２、ＥＰＲ３６７８（２）、ＥＰＲ２０４６１、ＥＰＲ２０６２７及びＩＭＧ１７Ｂ５Ｆ１１（ＣＤ３９に結合）；ＴＢ０１、ＨＮＫ‐１／Ｌｅｕ‐７及びＮＫ１（ＣＤ５７に結合）；ＦＮ５０（ＣＤ６９に結合）；５Ｂ５、Ｂ‐Ｌ２、ＴＳ８２ｂ及びＣ３３（ＣＤ８２に結合）；３Ｂ３、Ｂ１９９．２及びＥＰ７１６９（ＣＤ１６１に結合）；１７Ｄ９（ＣＬＥＣ１Ｂに結合）；２Ｆ９（ＫＩＲ２ＤＬ１に結合）；ＥＰＲ８８２５（ＫＩＲ２ＤＬ２に結合）；ｍＡｂ３３（ＫＩＲ２ＤＬ４に結合）；１１Ｅ３、１７Ｂ４、ＥＰＲ４３９２（２）、ＥＰＲ２０２６１及びＥＰＲ２０６２７（リンパ球活性化遺伝子３に結合）；Ａ１０、Ｃ７、ＣＸ５、１Ｄ１１及びＭＭ０４８９‐１０Ｒ２７（ＮＫＧ２Ｄに結合）；ＢＭＫ１３（ＰＲＧ２に結合）；ＥＰＲ９９１６（ＳＬＡＭＦ６に結合）；等が挙げられる。このような非ＣＤ１６細胞表面分子それぞれに結合可能な抗体は、Ａｂｃａｍ  ｐｌｃ及び他の供給元から市販されており、本発明の目的に容易に適合させることができる。
【０２０９】
２．例示的な抗ＣＤ２抗体
一実施形態では、標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる本発明の分子は、エフェクタ細胞に、上記エフェクタ細胞の表面上に存在するＣＤ２のエピトープに免疫特異的に結合することによって結合する。ＣＤ２に特異的に結合する分子としては、抗ＣＤ２抗体「ＣＤ２  ｍＡｂ  Ｌｏ‐ＣＤ２ａ」が挙げられる。
【０２１０】
ＣＤ２  ｍＡｂ  Ｌｏ‐ＣＤ２ａのＶＨドメインのアミノ酸配列（ＡＴＣＣ受託番号：１１４２３；配列番号９０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）:
EVQLQQSGPE LQRPGASVKL SCKASGYIFT EYYMYWVKQR PKQGLELVGR
IDPEDGSIDY VEKFKKKATL TADTSSNTAY MQLSSLTSED TATYFCARGK
FNYRFAYWGQ GTLVTVSS
【０２１１】
ＣＤ２  ｍＡｂ  Ｌｏ‐ＣＤ２ａのＶＬドメインのアミノ酸配列（ＡＴＣＣ受託番号：１１４２３；配列番号９１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DVVLTQTPPT LLATIGQSVS ISCRSSQSLL HSSGNTYLNW LLQRTGQSPQ 
PLIYLVSKLESGVPNRFSGS GSGTDFTLKI SGVEAEDLGV YYCMQFTHYP
YTFGAGTKLE LK
【０２１２】
３．例示的な抗ＣＤ８抗体
一実施形態では、標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる本発明の分子は、エフェクタ細胞に、上記エフェクタ細胞の表面上に存在するＣＤ８のエピトープに免疫特異的に結合することによって結合する。ＣＤ８に特異的に結合する分子としては、抗ＣＤ８抗体「ＯＫＴ８」及び「ＴＲＸ２」が挙げられる。
【０２１３】
ＯＫＴ８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLLESGPE LLKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQS HGKSLEWIGY
IYPYTGGTGY NQKFKNKATL TVDSSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARNF 
RYTYWYFDVW GQGTTVTVSS
【０２１４】
ＯＫＴ８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVMTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD SYDNSLMHWY QQKPGQPPKV 
LIYLASNLES GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YCQQNNEDPY
TFGGGTKLEI KR
【０２１５】
ＴＲＸ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL
IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH
YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS S
【０２１６】
ＴＲＸ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN
TDILHTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG 
TKVEIK
【０２１７】
ＶＩ．例示的な疾患抗原
本発明の疾患抗原は、癌細胞に特徴的な細胞表面抗原（「癌抗原」）、及び病原体細胞又は病原体に感染した細胞に特徴的な細胞表面抗原（「病原体関連抗原」）を含む。
【０２１８】
Ａ．癌細胞の表面上に配列された例示的な癌抗原
本明細書中で使用される場合、用語「癌抗原（ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）は、癌細胞の表面上に特徴的に発現し、従って抗体系分子又は免疫変調分子によって治療され得る、抗原を指す。癌抗原の例としては、限定するものではないが：結腸癌、胃癌ムチンにおいて確認される１９．９；４．２；Ａ３３（結腸直腸癌抗原；Almqvist, Y. (2006), “In vitro and in vivo Characterization of 177Lu-huA33: A Radioimmunoconjugate Against Colorectal Cancer,” Nucl Med Biol. 33(8):991-998）；ＡＤＡＭ‐９（米国公開特許第２００６／０１７２３５０号；国際公開第０６／０８４０７５号）；胃癌において確認されるＡＨ６；ＡＬＣＡＭ（国際公開第０３／０９３４４３号）；ＡＰＯ‐１（悪性ヒトリンパ球抗原）(Trauth, B.C. et al.(1989) “Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis,” Science 245:301-304);Ｂｌ（Egloff, A.M. et al. (2006), “Cyclin B1 And Other Cyclins As Tumor Antigens In Immunosurveillance And Immunotherapy Of Cancer,” Cancer Res. 66(l):6-9）；Ｂ７‐Ｈ３（Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,” Genome Biol. 6:223.1-223.7）.  Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production,” Nature Immunol. 2:269-274; Sun, M. et al. (2002) “Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes,” J. Immunol. 168:6294-6297）；ＢＡＧＥ（Bodey, B. (2002) “Cancer-Testis Antigens: Promising Targets For Antigen Directed Antineoplastic Immunotherapy,” Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-584）；ベータ‐カテニン（Prange W. et al. (2003) “Beta-Catenin Accumulation In The Progression Of Human Hepatocarcinogenesis Correlates With Loss Of E-Cadherin And Accumulation Of P53, But Not With Expression Of Conventional WNT-1 Target Genes,” J. Pathol. 201(2):250-259）；結腸腺癌において確認される血液型ＡＬｅb／ＡＬｅy；結腸腺癌において確認されるバーキットリンパ腫抗原‐３８．１３；Ｃ１４；ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）（Bast, R.C. Jr. et al. (2005) “New Tumor Markers: CA125 And Beyond,” Int J Gynecol Cancer 15(Suppl 3):274-281; Yu et al.(1991) “Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants,” Cancer Res.51(2):468-475）；カルボキシペプチダーゼＭ（米国公開特許第２００６／０１６６２９１号）；ＣＤ５（Calin, G.A. et al. (2006) “Genomics Of Chronic Lymphocytic Leukemia MicroRNAs As New Players With Clinical Significance,” Semin Oncol. 33(2): 167-173）；ＣＤ１９（Ghetie et al. (1994) “Anti-CD19 Inhibits The Growth Of Human B-Cell Tumor Lines In Vitro And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest,” Blood 83:1329-1336; Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48）；ＣＤ２０（Reff et al. (1994) “Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20,” Blood83:435-445; Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5): 1125-36）；ＣＤ２２（Kreitman, R.J. (2006) “Immunotoxins For Targeted Cancer Therapy,” AAPS J. 18;8(3):E532-51）；ＣＤ２３（Rosati, S. et al. (2005) “Chronic Lymphocytic Leukaemia: A Review Of The Immuno-Architecture,”  Curr Top Microbiol Immunol. 294:91-107）；ＣＤ２５（Troussard, X. et al. (1998) “Hairy Cell Leukemia. What Is New Forty Years After The First Description?” Hematol Cell Ther. 40(4): 139-148）；ＣＤ２７（Bataille, R. (2006) “The Phenotype Of Normal, Reactive And Malignant Plasma Cells. Identification Of "Many And Multiple Myelomas" And Of New Targets For Myeloma Therapy,” Haematologica 91(9): 1234-1240）；ＣＤ２８（Bataille, R. (2006) “The Phenotype Of Normal, Reactive And Malignant Plasma Cells. Identification Of "Many And Multiple Myelomas" And Of New Targets For Myeloma Therapy,�� Haematologica 91(9): 1234-1240）；ＣＤ３３（Sgouros et al. (1993) “Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody M195 (Anti-CD33) In Acute Myelogenous Leukemia,” J. Nucl. Med. 34:422-430）；ＣＤ３６（Ge, Y. (2005) “CD36: A Multiligand Molecule,”Lab Hematol. ll(l):31-7）；ＣＤ４０／ＣＤ１５４（Messmer  D. et al. 2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60）；ＣＤ４５（Jurcic, J.G. (2005) “Immunotherapy For Acute Myeloid Leukemia,” Curr Oncol Rep. 7(5):339-346）；ＣＤ５６（Bataille, R. (2006) “The Phenotype Of Normal, Reactive And Malignant Plasma Cells. Identification Of "Many And Multiple Myelomas" And Of New Targets For Myeloma Therapy,” Haematologica 91(9): 1234-40）；ＣＤ４６（米国特許第７，１４８，０３８号；国際公開第０３／０３２８１４号）；ＣＤ５２（Eketorp, S.S. et al. (2014) “Alemtuzumab (Anti-CD52 Monoclonal Antibody) As Single-Agent Therapy In Patients With Relapsed/Refractory Chronic Lymphocytic Leukaemia (CLL)-A Single Region Experience On Consecutive Patients,” Ann Hematol. 93(10):1725-1733; Suresh, T. et al. (2014) “New Antibody Approaches To Lymphoma Therapy,” J. Hematol. Oncol. 7:58; Hoelzer, D. (2013) “Targeted Therapy With Monoclonal Antibodies In Acute Lymphoblastic Leukemia,” Curr. Opin. Oncol. 25(6):701-706）;ＣＤ５６（Bataille, R. (2006) “The Phenotype Of Normal, Reactive And Malignant Plasma Cells. Identification Of “Many And Multiple Myelomas” And Of New Targets For Myeloma Therapy,” Haematologica 91(9):1234-1240）;ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ（Troussard, X. et al. (1998) “Hairy Cell Leukemia. What Is New Forty Years After The First Description?” Hematol. Cell. Ther. 40(4): 139-148；Chu, P.G. et al. (2001) “CD79: A Review,” Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 9(2):97-106）；
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【０２１９】
【表１１】
2021505637.tif 000014
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【０２２０】
癌細胞の表面上に配列された癌抗原に結合して上記癌細胞の標的転換殺滅を仲介できる本発明の結合分子を構成するために、ＶＨ及びＶＬドメインを使用できる、例示的な抗体は、表１１に列挙されており、癌細胞の表面上に配列された癌抗原に結合して上記癌細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子を構成するために使用できる更なる抗体を以下に提供する。
【０２２１】
１．例示的な抗Ｂ７‐Ｈ３抗体
Ｂ７‐Ｈ３は、多種多様な固形腫瘍に過剰発現する癌抗原であり、免疫調節に関与する分子のＢ７ファミリーのメンバーである（米国特許第８，８０２，０９１号；米国特許第２０１４／０３２８７５０号；米国特許第２０１３／０１４９２３６号；Loo, D. et al. (2012) “Development Of An Fc-Enhanced Anti-B7-H3 Monoclonal Antibody With Potent Antitumor Activity,” Clin. Cancer Res. 18(14):3834-3845を参照）。特に、ヒト悪性癌細胞（例えば神経芽細胞腫並びに胃癌、卵巣癌及び非小細胞肺癌の癌細胞）が、Ｂ７‐Ｈ３タンパク質の発現の顕著な増大を示すこと、並びにこの発現の増大が、疾患の重篤度の上昇に関連することが、複数の独立した研究によって示されており（Zang, X. et al. (2007) “The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition,” Clin. Cancer Res. 13:5271-5279）、これは、Ｂ７‐Ｈ３が免疫回避経路として腫瘍に利用されることを示唆している（Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278）。
【０２２２】
Ｂ７‐Ｈ３はまた、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を共刺激することが分かっている。Ｂ７‐Ｈ３はまた、ＩＦＮ‐γ産生及びＣＤ８＋溶解活性も刺激する（Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production,” Nature Immunol. 2:269-274；Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126）。しかしながらこのタンパク質は、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞に関する核内因子）、ＮＦ‐κＢ（核内因子κＢ）及びＡＰ‐１（活性化タンパク質１）因子を通してＴ細胞活性化を阻害するようにも作用する可能性がある（Yi. K.H. et al. (2009) “Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4,” Immunol. Rev. 229:145-151）、Ｂ７‐Ｈ３はまた、Ｔｈ１、Ｔｈ２又はＴｈ１７をインビボで阻害すると考えられる（Prasad, D.V. et al. (2004) “Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of T Cells,” J. Immunol. 173:2500-2506; Fukushima, A. et al. (2007) “B7-H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice,” Immunol. Lett. 113:52-57; Yi. K.H. et al. (2009) “Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4,” Immunol. Rev. 229:145-151）。
【０２２３】
好ましいＢ７‐Ｈ３結合分子は、ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３モノクローナル抗体「Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｂ」、「Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｃ」、「Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｄ」のＶＬ及び／又はＶＨドメインを有し；より好ましくは、このような抗Ｂ７‐Ｈ３モノクローナル抗体のＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを有する。
【０２２４】
ヒト化すると、抗体Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｂから２つの変異型ＶＨドメイン：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｂ  ＶＨ１及びＢ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｂ  ＶＨ２と、２つの変異型ＶＬドメイン：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｂ  ＶＬ１及びＢ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｂ  ＶＬ２とが得られ、これらをＶＨ／ＶＬドメインのいずれの組み合わせで使用して、官能性Ｂ７‐Ｈ３結合ドメインを得ることができる。
【０２２５】
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｂ  ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT
IYPGDGDTRY TQKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG
IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS 
【０２２６】
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｂ  ＶＨ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT
IYPGGGDTRY TQKFQGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG
IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS
【０２２７】
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｂ  ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG 
GTKLEIK
【０２２８】
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｂ  ＶＬ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYY 
TSRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG 
GTKLEIK
【０２２９】
ヒト化Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐ＣのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１００）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMSWVRQA PGKGLEWVAT
INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARHD
GGAMDYWGQG TTVTVSS
【０２３０】
ヒト化Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐ＣのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESIY SYLAWYQQKP GKAPKLLVYN
TKTLPEGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYGTPPWTFG 
QGTRLEIK
【０２３１】
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐ＤのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY 
ISSGSGTIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARHG
YRYEGFDYWG QGTTVTVSS
【０２３２】
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐ＤのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYFCQQ YNNYPFTFGQ 
GTKLEIK
【０２３３】
特に好ましいのは、「エノブリツズマブ」（ＭＧＡ２７１としても公知；ＣＡＳ登録番号：１３５３４８５‐３８‐７）を含むがこれに限定されないヒト化ＶＨ及び／又はＶＬドメインを有するＢ７‐Ｈ３結合分子である。エノブリツズマブは、ＨＥＲ２／ｎｅｕに結合してＡＤＣＣ活性の増強を仲介するＦｃ最適化モノクローナル抗体である。エノブリツズマブの完全重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、当該技術分野において公知である（例えばWHO Drug Information、2017、Recommended INN: List 77、31(1):49を参照）。
【０２３４】
エノブリツズマブのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY
ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGRGR
ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS
【０２３５】
エノブリツズマブのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ 
GTKLEIK
【０２３６】
上で同定した好ましい抗Ｂ７‐Ｈ３結合分子に加えて、本発明は、以下の抗Ｂ７‐Ｈ３結合分子：ＬＵＣＡ１；ＢＬＡ８；ＰＡ２０；又はＳＫＮ２（米国特許第７，５２７，９６９号；米国特許第８，７７９，０９８号及び国際公開第２００４／００１３８１号を参照）；Ｍ３０；ｃＭ３０；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ１；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ２；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ３；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ４；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ５；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ６；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ７；Ｍ３０‐Ｈ４‐Ｌ１；Ｍ３０‐Ｈ４‐Ｌ２；Ｍ３０‐Ｈ４‐Ｌ３；及びＭ３０‐Ｈ４‐Ｌ４（米国特許出願公開第２０１３／００７８２３４号及び国際公開第２０１２／１４７７１３号を参照）；並びに８Ｈ９（米国特許第７，６６６，４２４号；米国特許第７，７３７，２５８号；米国特許第７，７４０，８４５号；米国特許第８，１４８，１５４号；米国特許第８，４１４，８９２号；米国特許第８，５０１，４７１号；米国特許第９，０６２，１１０号；米国特許出願公開第２０１０／０１４３２４５号、及び国際公開第２００８／１１６２１９号を参照）のうちのいずれの使用も考える。
【０２３７】
本発明は具体的には、Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｂ、Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｂ  ＶＨ１、Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｂ  ＶＨ２、Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｂ  ＶＬ１、Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｂ  ＶＬ２、Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｃ、Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｄ、又はエノブリツズマブ、又は本明細書中で提供される他のＢ７‐Ｈ３抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全て、並びに／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全てを含み、より好ましくは、上述のような抗Ｂ７‐Ｈ３モノクローナル抗体のＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全て、及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全てを有する、ＣＤ１６×Ｂ７‐Ｈ３結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０２３８】
２．例示的な抗ＣＥＡＣＡＭ５及び抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体
癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）及び６（ＣＥＡＣＡＭ６）は、甲状腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮体癌、乳癌、造血癌、白血病及び卵巣癌（国際公開第２０１１／０３４６６０号）、並びに特に、結腸直腸癌、胃腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）、乳癌、甲状腺癌、胃癌、卵巣癌及び子宮癌腫（Zheng, C. et al. (2011) “A Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity,” PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11）を含む様々なタイプの癌に関連していることが分かっている。
【０２３９】
ＣＥＡＣＡＭ５は、胃腸癌、結腸直腸癌及び膵臓癌の９０％、非小細胞肺癌細胞の７０％並びに乳癌の５０％において過剰発現することが分かっている（Thompson, J.A. et al. (1991) “Carcinoembryonic Antigen Gene Family: Molecular Biology And Clinical Perspectives,” J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366）。過剰発現した癌胎児性抗原関連細胞接着分子６（ＣＥＡＣＡＭ６）は、甲状腺髄様癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮体癌、乳癌、造血癌、白血病及び卵巣癌を含む多様なヒト癌の侵襲及び転位において重要な役割を果たす（国際公開第２０１１／０３４６６０号；Deng, X. et al. (2014) “Expression Profiling Of CEACAM6 Associated With The Tumorigenesis And Progression In Gastric Adenocarcinoma,” Genet. Mol. Res. 13(3):7686-7697; Cameron, S. et al. (2012) “Focal Overexpression Of CEACAM6 Contributes To Enhanced Tumourigenesis In Head And Neck Cancer Via Suppression Of Apoptosis,” Mol. Cancer 11:74, pp. 1-11; Chapin, C. et al. (2012) “Distribution And Surfactant Association Of Carcinoembryonic Cell Adhesion Molecule 6 In Human Lung,” Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 302(2):L216-L25; Riley, C.J. et al. (2009) “Design And Activity Of A Murine And Humanized Anti-CEACAM6 Single-Chain Variable Fragment In The Treatment Of Pancreatic Cancer,” Cancer Res. 69(5):1933-1940; Lewis-Wambi, J.S. et al. (2008) “Overexpression Of CEACAM6 Promotes Migration And Invasion Of Oestrogen-Deprived Breast Cancer Cells,” Eur. J. Cancer 44(12):1770-1779; Blumenthal, R.D. et al. (2007) “Expression Patterns Of CEACAM5 And CEACAM6 In Primary And Metastatic Cancers,” BMC Cancer. 7:2, pp. 1-15）。ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６に免疫特異的に結合する抗体は市販されている（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Novus Biologicals LLC; Abnova Corporation）。
【０２４０】
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体１６Ｃ３（欧州特許第２５８５４７６号）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQSGPE VVRPGVSVKI SCKGSGYTFT DYAMHWVKQS HAKSLEWIGL 
ISTYSGDTKY NQNFKGKATM TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARGD 
YSGSRYWFAY WGQGTLVTVS S
【０２４１】
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体１６Ｃ３（欧州特許第２５８５４７６号）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCGASENIY GALNWYQRKP GKSPKLLIWG 
ASNLADGMPS RFSGSGSGRQ YTLTISSLQP EDVATYYCQN VLSSPYTFGG 
GTKLEIK
【０２４２】
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体ｈＭＮ１５（国際公開第２０１１／０３４６６０号）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCSSSGFALT DYYMSWVRQA PGKGLEWLGF 
IANKANGHTT DYSPSVKGRF TISRDNSKNT LFLQMDSLRP EDTGVYFCAR 
DMGIRWNFDV WGQGTPVTVS S
【０２４３】
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体ｈＭＮ１５（国際公開第２０１１／０３４６６０号）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTCSASSRVS YIHWYQQKPG KAPKRWIYGT
STLASGVPAR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYYCQQW SYNPPTFGQG 
TKVEIKR
【０２４４】
本発明は具体的には、抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６モノクローナル抗体１６Ｃ３又はｈＭＮ１５の、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１６×ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０２４５】
３．例示的な抗ＥＧＲＦ抗体
上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＥＧＦＲ）は、特定の転移性大腸癌、転移性非小細胞癌及び頭頸部癌の癌抗原である。ヒトＥＧＲＦに結合する例示的な抗体は、「セツキシマブ」及び「パニツムマブ」である。セツキシマブは、組み換えヒト‐マウスキメラ上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ＩｇＧ１モノクローナル抗体である（Govindan R. (2004) “Cetuximab In Advanced Non-Small Cell Lung Cancer,” Clin. Cancer Res. 10(12 Pt 2):4241s-4244s; Bou-Assaly, W. et al. (2010) “Cetuximab (Erbitux),” Am. J. Neuroradiol. 31(4):626-627）。パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ）は、完全ヒト化上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ＩｇＧ２モノクローナル抗体である（Foon, K.A. et al. (2004) “Preclinical And Clinical Evaluations Of ABX-EGF, A Fully Human Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibody,” Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 58(3):984-990; Yazdi, M.H. et al. (2015) “A Comprehensive Review of Clinical Trials on EGFR Inhibitors Such as Cetuximab and Panitumumab as Monotherapy and in Combination for Treatment of Metastatic Colorectal Cancer,” Avicenna J. Med. Biotechnol. 7(4):134-144）。
【０２４６】
キメラ抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVSGFSLT NYGVHWVRQS PGKGLEWLGV
IWSGGNTDYN TPFTSRLSIN KDNSKSQVFF KMNSLQSNDT AIYYCARALT 
YYDYEFAYWG QGTLVTVSA
【０２４７】
キメラ抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１１１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DILLTQSPVI LSVSPGERVS FSCRASQSIG TNIHWYQQRT NGSPRLLIKY 
ASESISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYCQQ NNNWPTTFGA 
GTKLELKR
【０２４８】
パニツムマブのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS SGDYYWTWIR QSPGKGLEWI 
GHIYYSGNTN YNPSLKSRLT ISIDTSKTQF SLKLSSVTAA DTAIYYCVRD 
RVTGAFDIWG QGTMVTVSS
【０２４９】
パニツムマブのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１１３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYD
ASNLETGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQH FDHLPLAFGG 
GTKVEIKR
【０２５０】
本発明は具体的には、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体セツキシマブ又はパニツムマブの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１６×ＥＧＦＲ結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０２５１】
４．例示的な抗ＥｐｈＡ２抗体
受容体チロシンキナーゼ、エフリンタイプＡ受容体２（ＥｐｈＡ２）は通常、成体の上皮組織の細胞間接触部位に発現するが、最近の研究により、ＥｐｈＡ２が様々なタイプの上皮癌においても、転移性病変において観察される最も高いレベルのＥｐｈＡ２発現で過剰発現することが分かった。高発現レベルのＥｐｈＡ２は、前立腺癌、乳癌、非小細胞肺癌及び黒色腫を含む、広範な癌及び多数の癌細胞株において確認されている（Xu, J. et al. (2014) “High EphA2 Protein Expression In Renal Cell Carcinoma Is Associated With A Poor Disease Outcome,” Oncol. Lett. Aug 2014; 8(2): 687-692; Miao, B. et al. (2014) “EphA2 is a Mediator of Vemurafenib Resistance and a Novel Therapeutic Target in Melanoma,” Cancer Discov. pii: CD-14-0295）。ＥｐｈＡ２は単なる癌のマーカーとは思われないが、多数のヒト癌において持続的に過剰発現し、機能的に変化するようである（Chen, P. et al. (2014) “EphA2 Enhances The Proliferation And Invasion Ability Of LnCap Prostate Cancer Cells,” Oncol. Lett. 8(1):41-46）。ヒトＥｐｈＡ２に結合する例示的な抗体は、「ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ  １」、「ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ  ２」及び「ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ  ３」である。
【０２５２】
ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVHWVRQP PGKGLEWLGM
IWGGGSTDYN SALKSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCARKHG
NYYTMDYWGQ GTSVTVSS
【０２５３】
ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１１５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY 
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG 
TKLEIK
【０２５４】
ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW
INTYIGEPTY ADDFKGRFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAREL
GPYYFDYWGQ GTTLTVSS
【０２５５】
ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１１７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK 
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP 
TFGSGTKLEI K
【０２５６】
ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ  ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMYWVRQT PEKRLEWVAT
ISDGGSFTSY PDSVKGRFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTRDE
SDRPFPYWGQ GTLVTVSS
【０２５７】
ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ  ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１１９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW
ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG 
GTKLEIK
【０２５８】
本発明は具体的には、抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ  １、ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ  ２及びＥｐｈＡ２  ｍＡｂ  ３の、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１６×ＥｐｈＡ２結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０２５９】
５．例示的な抗ｇｐＡ３３抗体
４３ｋＤ膜貫通糖タンパク質Ａ３３（ｇｐＡ３３）は、全ての結腸直腸癌の＞９５％において発現する（Heath, J.K. et al. (1997) “The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) “Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686; Wong, N.A. et al. (2006) “EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia,” J. Clin. Pathol. 59(3):260-263）。ヒトｇｐＡ３３に結合する例示的な抗体は、「ｇｐＡ３３  ｍＡｂ  １」である。
【０２６０】
ｇｐＡ３３  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR
IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY
GNNVYFDVWG QGTTVTVSS
【０２６１】
ｇｐＡ３３  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１２１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT
SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG 
TKLEIK
【０２６２】
本発明は具体的には、抗ｇｐＡ３３モノクローナル抗体ｇｐＡ３３  ｍＡｂ  １、又は国際公開第２０１５／０２６８９４号において提供された抗ｇｐＡ３３モノクローナル抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１６×ｇｐＡ３３結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０２６３】
６．例示的な抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体
ＨＥＲ２／ｎｅｕは、化学的に処置されたラットの神経芽細胞腫からの形質転換遺伝子の産生として元来同定された、１８５ｋＤａ受容体である。ＨＥＲ２／ｎｅｕは、複数のヒト癌腫及び哺乳類の発生において機能するため、広く研究されてきた（Hynes et al. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1198:165-184; Dougall et al. (1994) Oncogene 9:2109-2123; Lee et al. (1995) Nature 378:394-398）。ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕに結合する例示的な抗体としては、「マルゲツキシマブ」、「トラスツズマブ」及び「ペルツズマブ」が挙げられる。マルゲツキシマブ（ＭＧＡＨ２２としても公知；ＣＡＳ登録番号：１３５０６２４‐７５‐７）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕに結合してＡＤＣＣ活性の増強を仲介する、Ｆｃ最適化モノクローナル抗体である。トラスツズマブ（ｒｈｕＭＡＢ４Ｄ５としても公知、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）として市販；ＣＡＳ登録番号：１８０２８８‐６９‐１；米国特許第５，８２１，３３７号を参照）は、ＩｇＧ１／κ定常領域を有する、抗体４Ｄ５のヒト化バージョンである。ペルツズマブ（ｒｈｕＭＡＢ２Ｃ４としても公知、Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）として市販；ＣＡＳ登録番号：３８０６１０‐２７‐５；例えば国際公開第２００１／０００２４５号を参照）は、ＩｇＧ１／κ定常領域を有する、抗体２Ｃ４のヒト化バージョンである。
【０２６４】
本発明は、抗Ｈｅｒ２／Ｎｅｕモノクローナル抗体マルゲツキシマブ、トラスツズマブ又はペルツズマブの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０２６５】
マルゲツキシマブのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIHWVKQR PEQGLEWIGR
IYPTNGYTRY DPKFQDKATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSRWG
GDGFYAMDYW GQGASVTVSS
【０２６６】
マルゲツキシマブ のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１２３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS
ASFRYTGVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG 
GTKVEIK
【０２６７】
マルゲツキシマブの完全重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、当該技術分野において公知である（例えばWHO Drug Information、2014, Recommended INN: List 71, 28(1):93-94を参照）。
【０２６８】
トラスツズマブのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR
IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWG
GDGFYAMDYW GQGTLVTVSS
【０２６９】
トラスツズマブのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１２５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ
GTKVEIK
【０２７０】
ペルツズマブのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT DYTMDWVRQA PGKGLEWVAD
VNPNSGGSIY NQRFKGRFTL SVDRSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARNL
GPSFYFDYWG QGTLVTVSS
【０２７１】
ペルツズマブのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１２７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVS IGVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YYIYPYTFGQ 
GTKVEIK
【０２７２】
上で同定された好ましい抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子に加えて、本発明は、以下の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子：１．４４．１；１．１４０；１．４３；１．１４．１；１．１００．１；１．９６；１．１８．１；１．２０；１．３９；１．２４；及び１．７１．３（米国特許第８，３５０，０１１号；米国特許第８，８５８，９４２号；及び国際公開第２００８／０１９２９０号）；Ｆ５及びＣ１（米国特許第７，８９２，５５４号；米国特許第８，１７３，４２４号；米国特許第８，９７４，７９２号；及び国際公開第９９／５５３６７号）；並びに米国特許出願公開第２０１３０１７１１４号並びに国際公開第２０１１／１４７９８６号及び国際公開第２０１２／１４３５２４号の抗ＨＥＲ‐２結合分子のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１６×ＨＥＲ２／Ｎｅｕ結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０２７３】
本発明は具体的には：マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、若しくはペルツズマブ、又は本明細書で提供されている他の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、並びに／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む；更に好ましくは、このような抗ＨＥＲ２／ｎｅｕモノクローナル抗体のＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、並びに／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを有する、ＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０２７４】
７．例示的な抗ＶＥＧＦ抗体
ＶＥＧＦ‐Ａは、多様な疾患、特に転移性大腸癌等の特定の転移性癌、並びに特定の肺癌、腎臓癌、卵巣癌及び脳の多形性膠芽腫において血管新生を刺激する、化学シグナルである。ヒトＶＥＧＦ‐Ａに結合する例示的な抗体は、「ベバシズマブ」（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））である。ベバシズマブは、組み換えヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である（Midgley, R. et al. (2005) “Bevacizumab - Current Status And Future Directions,” Ann. Oncol. 16(7):999-1004; Hall, R.D. et al. (2015) “Angiogenesis Inhibition As A Therapeutic Strategy In Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC),” Transl. Lung Cancer Res. 4(5):515-523; Narita, Y. (2015) “Bevacizumab For Glioblastoma,” Ther. Clin. Risk Manag. 11:1759-1765）。
【０２７５】
ベバシズマブのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW 
INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP 
HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS
【０２７６】
ベバシズマブのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１２９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF 
TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ 
GTKVEIKR
【０２７７】
本発明は具体的には、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体ベバシズマブの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１６×ＶＥＧＦ結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０２７８】
８．例示的な抗５Ｔ４抗体
癌胎児性タンパク質５Ｔ４は、腎臓癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌を含む多くの癌腫の細胞膜上、及び急性リンパ芽球性白血病において発現する、腫瘍関連タンパク質である（Boghaert, E.R. et al. (2008) “The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin,” Int. J. Oncol. 32(1):221-234; Eisen, T. et al. (2014) “Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin,” Curr. Oncol. Rep. 16:370, pp. 1-6を参照）。ヒト５Ｔ４に結合する例示的な抗体としては、「５Ｔ４  ｍＡｂ  １」及び「５Ｔ４  ｍＡｂ  ２」が挙げられる。
【０２７９】
５Ｔ４  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１３０）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SFWMHWVRQA PGQGLEWMGR
IDPNRGGTEY NEKAKSRVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAGGN
PYYPMDYWGQ GTTVTVSS
【０２８０】
５Ｔ４  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３１）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR
ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ 
GTKLEIK
【０２８１】
５Ｔ４  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１３２）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYWITWVKQR PGQGLEWIGD 
IYPGSGRANY NEKFKSKATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCARYG
PLFTTVVDPN SYAMDYWGQG TSVTVSS
【０２８２】
５Ｔ４  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３３）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSIV YSNGNTYLEW YLQKPGQSPK 
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP 
FTFGSGTKLE IK
【０２８３】
本発明は具体的には、抗５Ｔ４モノクローナル抗体５Ｔ４  ｍＡｂ  １若しくは５Ｔ４  ｍＡｂ  ２の、又は国際公開第２０１３／０４１６８７号若しくは国際公開第２０１５／１８４２０３号で提供されている抗５Ｔ４抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１６×５Ｔ４結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０２８４】
更に本出願は具体的には、５Ｔ４、ＣＤ１６及びＣＤ８に結合できるＣＤ１６×５Ｔ４三重特異性結合分子、並びに特に、抗５Ｔ４モノクローナル抗体５Ｔ４  ｍＡｂ  １若しくは５Ｔ４  ｍＡｂ  ２の、又は本明細書中で提供されている抗５Ｔ４モノクローナル抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、並びに／あるいは、国際公開第２０１５／１８４２０３号で提供されている抗ＣＤ８モノクローナル抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記三重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０２８５】
９．例示的な抗ＩＬ１３Ｒα２抗体
インターロイキン‐１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）は、グリア芽腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、膵臓癌、多発性黒色腫、骨肉腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌及び肺癌を含む多様な癌において過剰発現する（国際公開第２００８／１４６９１１号；Brown, C.E. et al. (2013) “Glioma IL13Rα2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis,” PLoS One. 18;8(10):e77769; Barderas, R. et al. (2012) “High Expression Of IL-13 Receptor Α2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis,” Cancer Res. 72(11):2780-2790; Kasaian, M.T. et al. (2011) “IL-13 Antibodies Influence IL-13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL-13Rα2,” J. Immunol. 187(1):561-569; Bozinov, O. et al. (2010) “Decreasing Expression Of The Interleukin-13 Receptor IL-13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas,” Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 50(8):617-621; Fujisawa, T. et al. (2009) “A Novel Role Of Interleukin-13 Receptor Alpha2 In Pancreatic Cancer Invasion And Metastasis,” Cancer Res. 69(22):8678-8685)。ＩＬ１３Ｒα２に免疫特異的に結合する抗体は市販されており、当該技術分野において既に説明されている(Abnova Corporation, Biorbyt, LifeSpan BioSciences, United States Biologicals;国際公開第２００８／１４６９１１号も参照)。ヒトＩＬ１３Ｒα２に結合する例示的な抗体としては、「ｈｕ０８」が挙げられる（例えば国際公開第２０１４／０７２８８８号を参照）。
【０２８６】
ｈｕ０８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１３４）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RNGMSWVRQA PGKGLEWVAT
VSSGGSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQG
TTALATRFFD VWGQGTLVTV SS
【０２８７】
ｈｕ０８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３５）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVG TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRSTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYSAPWTFGG
GTKVEIK
【０２８８】
本発明は具体的には、抗ＩＬ１３Ｒα２モノクローナル抗体ｈｕ０８の、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１６×ＩＬ１３Ｒα２結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０２８９】
１０．例示的な抗ＣＤ１２３抗体
ＣＤ１２３（インターロイキン３受容体α、ＩＬ‐３Ｒａ）は４０ｋＤａ分子であり、インターロイキン３受容体複合体の一部である（Stomski, F.C. et al. (1996) “Human Interleukin-3 (IL-3) Induces Disulfide-Linked IL-3 Receptor Alpha- And Beta-Chain Heterodimerization, Which Is Required For Receptor Activation But Not High-Affinity Binding,” Mol. Cell. Biol. 16(6):3035-3046）。インターロイキン３（ＩＬ‐３）は、多能性幹細胞の、赤血球細胞、骨髄細胞及びリンパ球系前駆細胞への早期分化を促進する。ＣＤ１２３は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を含む幅広い血液悪性腫瘍中の悪性細胞上で過剰発現していることが報告されている（Munoz, L. et al. (2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86(12):1261-1269）。ＣＤ１２３の過剰発現は、ＡＭＬの不良な予後に関連する（Tettamanti, M.S. et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401）。
【０２９０】
ヒトＣＤ１２３に結合し、本発明で採用できる例示的抗体は、「ＣＤ１２３  ｍＡｂ  １」である（例えば国際公開第２０１５／０２６８９２号を参照）。
【０２９１】
ＣＤ１２３  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１３６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVQSGAE LKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMKWVRQA PGQGLEWIGD
IIPSNGATFY NQKFKGRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSH
LLRASWFAYW GQGTLVTVSS
【０２９２】
ＣＤ１２３  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP 
KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY
PYTFGQGTKL EIK
【０２９３】
本発明は具体的には、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体ＣＤ１２３  ｍＡｂ  １、又は米国特許第２０１７／０８１４２４号及び国際公開第２０１６／０３６９３７号で開示されている抗ＣＤ１２３抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１６×ＣＤ１２３結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０２９４】
１１．例示的な抗ＣＤ１９抗体
ＣＤ１９（Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｍ２８１７０）は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）複合体の構成要素であり、Ｂ細胞活性化及び体液性免疫に関する閾値を変調するＢ細胞シグナリングの正の調節因子である。ＣＤ１９は、Ｂ細胞系統中に最も偏在的に発現される抗原の１つであり、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含むＢ細胞悪性腫瘍の＞９５％において発現される。特に、ＣＤ１９発現は、抗ＣＤ２０療法に対する耐性を示すようになったＢ細胞リンパ腫において維持される（Davis et al. (1999) “Therapy of B-cell Lymphoma With Anti-CD20 Antibodies Can Result In The Loss Of CD20 Antigen Expression.” Clin Cancer Res, 5:611-615, 1999）。ＣＤ１９はまた、自己免疫疾患を治療するための標的としても示唆されている（Tedder (2009) “CD19: A Promising B Cell Target For Rheumatoid Arthritis,” Nat. Rev. Rheumatol. 5:572-577）。
【０２９５】
ヒトＣＤ１９に結合し、本発明において採用してよい例示的な抗体は、国際公開第２０１６／０４８９３８号で開示されている抗ＣＤ１９抗体（本明細書では「ＣＤ１９  ｍＡｂ  １」と呼ばれる）である。
【０２９６】
ＣＤ１９  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２３）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMGVGWIR QPPGKALEWL 
AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV FLTMTNMDPV DTATYYCARM
ELWSYYFDYW GQGTTVTVSS
【０２９７】
ＣＤ１９  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITCRASQSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDA
SNRASGVPSR FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG 
TKLEIK
【０２９８】
本発明は具体的には、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＣＤ１９  ｍＡｂ  １、又は米国特許第７，１１２，３２４号で開示されている抗ＣＤ１９抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１６×ＣＤ１９結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０２９９】
Ｂ．例示的な病原体関連抗原
本明細書中で使用される場合、用語「病原体関連抗原（Ｐａｔｈｏｇｅｎ‐Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ）」は、病原体感染細胞の表面上に特徴的に発現し、従って抗体系分子又は免疫調節分子を用いて処置できる、抗原を指す。病原体関連抗原の例としては、限定するものではないが：単純ヘルペスウイルス（例えば感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、ｇＤ等）；水痘帯状疱疹ウイルス；カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス；エプスタイン‐バーウイルス（例えばＬＭＰ‐１、ＬＭＰ‐２Ａ、ＬＭＰ‐２Ｂ等）；サイトメガロウイルス（例えばＵＬ１１等）；ヒト免疫不全ウイルス（例えばｅｎｖタンパク質ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１等）；ヒトパピローマウイルス（例えばＥ６、Ｅ７等）；ヒトＴ細胞白血病ウイルス（例えばｅｎｖタンパク質ｇｐ６４、ｇｐ４６、ｇｐ２１等）；Ａ型肝炎ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）；桿菌；シトロバクター；コレラ；ジフテリア；エンテロバクター；淋菌；ヘリコバクター・ピロリ；クレブシエラ；レジオネラ；髄膜炎菌；マイコバクテリア；シュードモナス；肺炎球菌；リケッチア細菌；サルモネラ；セラチア；ブドウ球菌；連鎖球菌；破傷風；アスペルギルス（フミガーツス、クロコウジカビ等）；ブラストミセス・デルマチチジス；カンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリス等）；クリプトコッカス・ネオフォルマンス；ムコラエ属（ケカビ、ユミケカビ、クモノスカビ）；スポロスリックス・シェンキー；パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス；コクシジオイデス・イムチス；ヒストプラスマ・カプスラツム；レプトスピラ症；ボレリア・ブルグドルフェリ；蠕虫性寄生虫（鉤虫、条虫、吸虫、扁虫（例えば住血吸虫））；ランブル鞭毛虫；トリキネラ属；二核アメーバ；トリパノソーマ・ブルセイ；トリパノソーマ・クルージ；及びドノバン・リーシュマニア）に感染した細胞の表面上に発現される抗原が挙げられる。このような抗体は、多数のソースから市販されており、又は（モノクローナル抗体の産生のために含まれている）マウス若しくは他の動物を上記抗原で免疫化することによって得ることができる。
【０３００】
病原体感染細胞の表面上に配列された病原体関連抗原に結合できる分子を構築するためにＶＨ及びＶＬドメインを使用してよい例示的な抗体を以下で提供する。更なる抗体が当該技術分野において公知である。
【０３０１】
１．例示的な抗ＨＩＶ抗体
ＨＩＶのｅｎｖタンパク質は、例示的な病原体関連抗原であり、ＨＩＶのｅｎｖタンパク質に結合する抗体は、病原体関連抗原に結合できる例示的な抗体である。
【０３０２】
ＨＩＶ‐１感染の最初のステップは、細胞表面ＣＤ４が三量体ＨＩＶ‐１エンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖ）、膜貫通型糖タンパク質（ｇｐ４１）及び表面糖タンパク質（ｇｐ１２０）のヘテロ二量体に結合することによって発生する。ｇｐ１２０及びｇｐ４１糖タンパク質は初め、単一のｇｐ１６０ポリペプチドとして合成され、これはその後切断されて、非共有結合ｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体が生成される。ｅｎｖの外部ドメインは、全ｇｐ１２０成分と約２０ｋＤａのｇｐ４１とからなる、質量約１４０ｋＤａのヘテロ二量体である（Harris, A. et al. (2011) “Trimeric HIV-1 Glycoprotein Gp140 Immunogens And Native HIV-1 Envelope Glycoproteins Display The Same Closed And Open Quaternary Molecular Architectures,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 108(28):11440-11445）。ｅｎｖタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は市販されており、当該技術分野において既に説明されている（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦＱ３１５０３；  Buchacher, A. et al. (1994) “Generation Of Human Monoclonal Antibodies Against HIV-1 Proteins; Electrofusion And Epstein-Barr Virus Transformation For Peripheral Blood Lymphocyte Immortalization,” AIDS Res. Hum. Retroviruses 10(4):359-369; Shen, R. (2010) “GP41-Specific Antibody Blocks Cell-Free HIV Type 1 Transcytosis Through Human Rectal Mucosa And Model Colonic Epithelium,” J. Immunol. 184(7):3648-3655；国際公開第２０１２／１６２０６８号；及び国際公開第２０１６／０５４１０１号を参照）。ＨＩＶ  ｅｎｖに結合する例示的な抗体としては、「７Ｂ２」（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦＱ３１５０３）及び「Ａ３２」（国際公開第２０１４／１５９９４０号）が挙げられる。
【０３０３】
抗体７Ｂ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＸ１８８４３８及びＪＸ１８８４３９）は、この分子の免疫優性ヘリックス‐ループ‐ヘリックス領域の５９８〜６０４において、ＨＩＶ  ｇｐ４１に結合する、抗ＨＩＶ  ｅｎｖ  ヒトＩｇＧ１抗体である（Sadraeian, M. et al. (2017) “Selective Cytotoxicity Of A Novel Immunotoxin Based On Pulchellin A Chain For Cells Expressing HIV Envelope,” Sci. Rep. 7(1):7579 doi: 10.1038/s41598-017-08037-3）。上記抗体は、エプスタイン・バー（ＥＢ）ウイルスＢ細胞の形質転換及びヘテロハイブリドーマの産生を用いて、ＨＩＶ‐１慢性感染被験者から単離された（Pincus, S.H. et al. (2003) “In Vivo Efficacy Of Anti-Glycoprotein 41, But Not Anti-Glycoprotein 120, Immunotoxins In A Mouse Model Of HIV Infection,” J. Immunol. 170(4):2236-2241）。抗体７Ｂ２は、ウイルス粒子及び感染細胞の両方を認識できることが分かっている（Santra, S. et al. (2015) “Human Non-neutralizing HIV-1 Envelope Monoclonal Antibodies Limit the Number of Founder Viruses during SHIV Mucosal Infection in Rhesus Macaques,” PLoS Pathog. 11(8):e1005042. doi: 10.1371/journal.ppat.1005042; Tay, M.Z. et al. (2016) “Antibody-Mediated Internalization of Infectious HIV-1 Virions Differs among Antibody Isotypes and Subclasses,” PLoS Pathog. 12(8):e1005817. doi: 10.1371/journal.ppat.1005817）。
【０３０４】
７Ｂ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１４０）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
QVQLVQSGGG VFKPGGSLRL SCEASGFTFT EYYMTWVRQA PGKGLEWLAY 
ISKNGEYSKY SPSSNGRFTI SRDNAKNSVF LQLDRLSADD TAVYYCARAD
GLTYFSELLQ YIFDLWGQGA RVTVSS
【０３０５】
７Ｂ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１４１）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP 
KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH
PPTFGHGTRV EIK
【０３０６】
モノクローナル抗体Ａ３２は、ＨＩＶ‐１  Ｅｎｖ  ｇｐ１２０のＣ１領域中の立体配座エピトープを認識し（Wyatt et al. (1995) “Involvement Of The V1/V2 Variable Loop Structure In The Exposure Of Human Immunodeficiency Virus Type 1 gp120 Epitopes Induced By Receptor Binding,” J. Virol. 69:5723-5733）、強力なＡＤＣＣ活性を仲介して、ＨＩＶ‐１感染個体において検出可能なＡＤＣＣ仲介型Ａｂ活性の大部分をブロックできる（Ferrari, G. et al. (2011) “An HIV-1 gp120 Envelope Human Monoclonal Antibody That Recognizes a C1 Conformational Epitope Mediates Potent Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC) Activity and Defines a Common ADCC Epitope in Human HIV-1 Serum,” J. Virol. 85(14):7029-7036）。
【０３０７】
フレームワーク領域１及び／又は４に若干の変化を有する抗体Ａ３２の複数のＶＨドメインが、当該技術分野において報告されている（例えばタンパク質データベース受託番号ＰＤＢ：４ＹＢＬ＿Ｈ、米国公開特許第２０１５／０２３９９６１号、及び国際公開第２００６／０４４４１０号を参照）。これらの変異型抗体Ａ３２  ＶＨドメインのいずれを、本発明に従って使用してよい。Ａ３２の例示的なＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１４２）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL SCTVSGGSSS SGAHYWSWIR QYPGKGLEWI 
GYIHYSGNTY YNPSLKSRIT ISQHTSENQF SLKLNSVTVA DTAVYYCARG
TRLRTLRNAF DIWGQGTLVT VSS
【０３０８】
Ａ３２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１４３）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII 
SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV
FGGGTKLTVL
【０３０９】
Ａ３２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１４３）を、Ａ３２の例示的なＶＨドメイン（配列番号１４２）と共に、又は変異型抗体Ａ３２  ＶＨドメイン（例えばタンパク質データベース受託番号ＰＤＢ：４ＹＢＬ＿Ｈ、米国公開特許第2015/0239961号、及び国際公開第2006/044410号を参照）のいずれと共に使用して、抗ＨＩＶ‐１  Ｅｎｖ  ｇｐ１２０エピトープ結合部位を形成できる。
【０３１０】
本発明は具体的には、抗ＨＩＶモノクローナル抗体７Ｂ２若しくはＡ３２、又は国際公開第２０１６１９６９７５号、国際公開第２０１６／１４９７１０号、国際公開第２０１６／１４９６９８号、国際公開第２０１６／１４９６９５号、国際公開第２０１５／０４８６１０号、国際公開第２０１２／０３０９０４号、国際公開第２０１３／１６３４２７号、国際公開第２０１３／１９２５８９号、国際公開第２０１４／０６３０５９号、国際公開第２０１７０／１１４１３号、国際公開第２０１６／０５４１０１号、国際公開第２０１４／１５９９４０号、若しくは国際公開第２０１７／０１１４１４号で開示されている抗ＨＩＶ抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全て、並びに／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１６×ＨＩＶ結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０３１１】
更に本発明は具体的には、ＨＩＶ、ＣＤ１６及びＣＤ８に結合できるＣＤ１６×ＨＩＶ結合分子、並びに特に、抗ＨＩＶモノクローナル抗体７Ｂ２若しくはＡ３２、又は国際公開第２０１５／１８４２０３号、国際公開第２０１６／０５４１０１号、国際公開第２０１７／０１１４１３号、国際公開第２０１７／０１１４１４号で開示されている抗ＨＩＶ抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記三重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０３１２】
２．例示的な抗ＲＳＶ抗体
更なる例示的な病原体関連抗原は、ＲＳＶ糖タンパク質Ｆである。例示的な抗ＲＳＶ糖タンパク質Ｆ抗体は、パリビズマブ（例えばタンパク質データバンク（ＰＤＢ）ＩＤ  Ｎｏ．２ＨＷＺを参照）である。別の抗ＲＳＶ糖タンパク質Ｆ抗体としては、モタビズマブ（例えばＰＤＢ  ＩＤ  Ｎｏ．３ＩＸＴを参照）、及びパリビズマブのＣＤＲL１からシステイン残基を除去するよう加工されたパリビズマブの変異型（本明細書中では「ｖパリビズマブ」とも呼ばれる）が挙げられる。パリビズマブの変異型のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１４４）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMSVGWIR QPPGKALEWL 
ADIWWDDKKD YNPSLKSRLT ISKDTSKNQV VLKVTNMDPA DTATYYCARS
MITNWYFDVW GAGTTVTVSS
【０３１３】
パリビズマブの変異型のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１４５）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCRASQSVG YMHWYQQKPG KAPKLLIYDT
SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPD DFATYYCFQG SGYPFTFGGG 
TKLEIK
【０３１４】
本発明は具体的には、抗ＲＳＶモノクローナル抗体パリビズマブ又はｖパリビズマブの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全て、並びに／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１６×ＲＳＶ結合分子を含み、またこれらを包含する。
【０３１５】
ＶＩＩ．本発明の例示的な結合分子
本発明の原理は、異なる複数のマウス又はヒト化抗ＣＤ１６結合ドメインが組み込まれ、また疾患抗原に対して免疫特異的な結合ドメインを有する、一連の例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子によって例示される。このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の共有ダイアボディ構造及び配列を、表１２にまとめ、以下で詳細に説明する。認識されるように、類似のダイアボディ及び他の二重特異性分子は、（これらの例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子中に使用されているＶＬ及びＶＨドメインの代わりに所望の抗体のＶＬ及びＶＨドメインを使用することによって）同様に構築できる。
【０３１６】
【表１２】
2021505637.tif 000020
2021505637.tif 000021
2021505637.tif 000022
【０３１７】
Ａ．ＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子、ＤＡＲＴ‐Ａ
「ＤＡＲＴ‐Ａ」と呼称されるＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子が、第１の例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ａは、ＣＤ１６及びＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原に結合できるＦｃドメイン含有二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐Ａは３つのポリペプチド鎖からなり、また抗ヒトＣＤ１６抗体ＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、トラスツズマブのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。上記３つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原のエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。
【０３１８】
ＤＡＲＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖は、配列番号１５１：
2021505637.tif 000023
のアミノ酸配列を有する。
【０３１９】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第１のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１５１）は、トラスツズマブのＶＬドメイン（配列番号１２５）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３３は、抗ヒトＣＤ１６抗体ＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨドメイン（配列番号６４）に対応する。残基２３４〜２３８は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２３９〜２６６は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２６７〜２７９は、リンカー（配列番号４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２８０〜４９６は、「ノブ担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５１）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０３２０】
ＤＡＲＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１５２：
2021505637.tif 000024
のアミノ酸配列を有する。
【０３２１】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第２のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１５２）は、抗ヒトＣＤ１６抗体ＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬドメイン（配列番号６５）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３５は、トラスツズマブのＶＨドメイン（配列番号１２４）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２３６〜２４０は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４１〜２６８は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０３２２】
ＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖は、配列番号１５３：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED 
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK 
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG 
NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
のアミノ酸配列を有する。
【０３２３】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第３のポリペプチド鎖の残基１〜１０（配列番号１５３）は、リンカー（配列番号４０）に対応する。第３のポリペプチド鎖の残基１１〜２２７は、「ホール担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５３）に対応し、Ｈ４３５Ｒ置換（下線を付して示されている）を含有し、その最後の残基はリシンである。上述のように、Ｈ４３５Ｒ置換は、上記分子の、タンパク質Ａに結合する能力を排除する。
【０３２４】
認識されるように、ＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖は、いずれのエピトープ結合部位を含有せず、よって様々なＣＤ１６×ＤＡ結合分子中で使用できる。従ってＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖は、「共通のダイアボディポリペプチド鎖（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｄｉａｂｏｄｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈａｉｎ）」と呼ばれる。
【０３２５】
Ｂ．ＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子、「ＤＡＲＴ‐Ｂ」
「ＤＡＲＴ‐Ｂ」と呼称されるＣＤ１６×Ｈｅｒ２／ｎｅｕ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｂは、ＣＤ１６及びＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原に結合できるＦｃドメイン含有二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐Ｂは３つのポリペプチド鎖からなり、また抗ヒトＣＤ１６抗体ＣＤ１６‐Ｍ２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、トラスツズマブのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。上記３つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原のエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。
【０３２６】
ＤＡＲＴ‐Ｂの第１のポリペプチド鎖は、配列番号１５４：
2021505637.tif 000025
のアミノ酸配列を有する。
【０３２７】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第１のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１５４）は、トラスツズマブのＶＬドメイン（配列番号１２５）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３４は、抗ヒトＣＤ１６抗体ＣＤ１６‐Ｍ２のＶＨドメイン（配列番号７５）に対応する。残基２３５〜２３９は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２４０〜２６７は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２６８〜２８０は、リンカー（配列番号４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２８１〜４９７は、「ノブ担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５１）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０３２８】
ＤＡＲＴ‐Ｂの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１５５：
2021505637.tif 000026
のアミノ酸配列を有する。
【０３２９】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第２のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１５５）は、抗ヒトＣＤ１６抗体ＣＤ１６‐Ｍ２のＶＬドメイン（配列番号７６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３５は、トラスツズマブのＶＨドメイン（配列番号１２４）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２３６〜２４０は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４１〜２６８は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０３３０】
ＤＡＲＴ‐Ｂの第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。
【０３３１】
Ｃ．ＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子、「ＤＡＲＴ‐Ｃ」
「ＤＡＲＴ‐Ｃ」と呼称されるＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｃは、ＣＤ１６及びＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原に結合できるＦｃドメイン含有二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐Ｃは３つのポリペプチド鎖からなり、またヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、トラスツズマブのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。上記３つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原のエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。
【０３３２】
ＤＡＲＴ‐Ｃの第１のポリペプチド鎖は、配列番号１５６：
2021505637.tif 000027
のアミノ酸配列を有する。
【０３３３】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第１のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１５６）は、トラスツズマブのＶＬドメイン（配列番号１２５）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３３は、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨドメイン（配列番号７２）に対応する。残基２３４〜２３８は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２３９〜２６６は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２６７〜２７９は、リンカー（配列番号４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２８０〜４９６は、「ノブ担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５１）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０３３４】
ＤＡＲＴ‐Ｃの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１５７：
2021505637.tif 000028
のアミノ酸配列を有する。
【０３３５】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第２のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１５７）は、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬドメイン（配列番号７３）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３５は、トラスツズマブのＶＨドメイン（配列番号１２４）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２３６〜２４０は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４１〜２６８は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０３３６】
ＤＡＲＴ‐Ｃの第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。
【０３３７】
Ｄ．ＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子、「ＤＡＲＴ‐Ｄ」
「ＤＡＲＴ‐Ｄ」と呼称されるＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｄは、ＣＤ１６及びＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原に結合できるＦｃドメイン含有二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐Ｄは３つのポリペプチド鎖からなり、またヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、トラスツズマブのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。上記３つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原のエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。
【０３３８】
ＤＡＲＴ‐Ｄの第１のポリペプチド鎖は、配列番号１５８：
2021505637.tif 000029
のアミノ酸配列を有する。
【０３３９】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第１のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１５８）は、トラスツズマブのＶＬドメイン（配列番号１２５）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３４は、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ２のＶＨ１ドメイン（配列番号８３）に対応する。残基２３５〜２３９は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２４０〜２６７は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２６８〜２８０は、リンカー（配列番号４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２８１〜４９７は、「ノブ担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５１）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０３４０】
ＤＡＲＴ‐Ｄの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１５９：
2021505637.tif 000030
のアミノ酸配列を有する。
【０３４１】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第２のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１５９）は、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ２のＶＬ１ドメイン（配列番号８５）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３５は、トラスツズマブのＶＨドメイン（配列番号１２４）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２３６〜２４０は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４１〜２６８は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０３４２】
ＤＡＲＴ‐Ｄの第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。
【０３４３】
Ｅ．ＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子、「ＤＡＲＴ‐Ｅ」
「ＤＡＲＴ‐Ｅ」と呼称されるＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｅは、ＣＤ１６及びＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原に結合できる二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐Ｂは３つのポリペプチド鎖からなり、またヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、トラスツズマブのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。上記３つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原のエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。
【０３４４】
ＤＡＲＴ‐Ｅの第１のポリペプチド鎖は、配列番号１６０：
2021505637.tif 000031
のアミノ酸配列を有する。
【０３４５】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第１のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１６０）は、トラスツズマブのＶＬドメイン（配列番号１２５）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３４は、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ２のＶＨ２ドメイン（配列番号８４）に対応する。残基２３５〜２３９は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２４０〜２６７は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２６８〜２８０は、リンカー（配列番号４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２８１〜４９７は、「ノブ担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５１）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０３４６】
ＤＡＲＴ‐Ｅの第２のポリペプチド鎖は、ＤＡＲＴ‐Ｄの第２のポリペプチド鎖（配列番号１５９）と同一の配列である。
【０３４７】
ＤＡＲＴ‐Ｅの第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。
【０３４８】
Ｆ．ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子、「ＤＡＲＴ‐Ｆ」
「ＤＡＲＴ‐Ｆ」と呼称されるＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｆは、ＣＤ１６及びＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質に結合できる二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐Ｆは３つのポリペプチド鎖からなり、またヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、抗体Ａ３２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。上記３つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。
【０３４９】
ＤＡＲＴ‐Ｆの第１のポリペプチド鎖は、配列番号１６１：
2021505637.tif 000032
のアミノ酸配列を有する。
【０３５０】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第１のポリペプチド鎖の残基１〜１１０（配列番号１６１）は、抗体Ａ３２のＶＬドメイン（配列番号１４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１１〜１１８（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１９〜２３６は、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨドメイン（配列番号７２）に対応する。残基２３７〜２４１は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２４２〜２６９は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２７０〜２８２は、リンカー（配列番号４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２８３〜４９９は、「ノブ担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５１）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０３５１】
ＤＡＲＴ‐Ｆの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１６２：
2021505637.tif 000033
のアミノ酸配列を有する。
【０３５２】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第２のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１６２）は、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬドメイン（配列番号７３）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３８は、抗体Ａ３２のＶＨドメイン（配列番号１４２）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２３９〜２４３は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４４〜２７１は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０３５３】
ＤＡＲＴ‐Ｆの第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。
【０３５４】
Ｇ．ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子、「ＤＡＲＴ‐Ｇ」
「ＤＡＲＴ‐Ｇ」と呼称されるＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｇは、ＣＤ１６及びＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質に結合できる二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐Ｇは３つのポリペプチド鎖からなり、またヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、抗体Ａ３２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。上記３つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。
【０３５５】
ＤＡＲＴ‐Ｇの第１のポリペプチド鎖は、配列番号１６３：
2021505637.tif 000034
のアミノ酸配列を有する。
【０３５６】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第１のポリペプチド鎖の残基１〜１１０（配列番号１６３）は、抗体Ａ３２のＶＬドメイン（配列番号１４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１１〜１１８（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１９〜２３７は、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ２のＶＨドメイン（配列番号８３）に対応する。残基２３８〜２４２は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２４３〜２７０は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２７１〜２８３は、リンカー（配列番号４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２８４〜５００は、「ノブ担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５１）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０３５７】
ＤＡＲＴ‐Ｇの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１６４：
2021505637.tif 000035
のアミノ酸配列を有する。
【０３５８】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第２のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１６４）は、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ２のＶＬドメイン（配列番号８５）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３８は、抗体Ａ３２のＶＨドメイン（配列番号１４２）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２３９〜２４３は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４４〜２７１は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０３５９】
ＤＡＲＴ‐Ｇの第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。
【０３６０】
Ｈ．ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子「ＤＡＲＴ‐Ｈ」
「ＤＡＲＴ‐Ｈ」と呼称されるＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｈは、ＣＤ１６及びＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質に結合できる二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐Ｈは３つのポリペプチド鎖からなり、またヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、抗体７Ｂ２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。上記３つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。
【０３６１】
ＤＡＲＴ‐Ｈの第１のポリペプチド鎖は、配列番号１６５：
2021505637.tif 000036
のアミノ酸配列を有する。
【０３６２】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第１のポリペプチド鎖の残基１〜１１３（配列番号１６５）は、抗体７Ｂ２のＶＬドメイン（配列番号１４１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１４〜１２１（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１２２〜２３９は、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨドメイン（配列番号７２）に対応する。残基２４０〜２４４は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２４５〜２７２は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２７３〜２８５は、リンカー（配列番号４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２８６〜５０２は、「ノブ担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５１）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０３６３】
ＤＡＲＴ‐Ｈの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１６６：
2021505637.tif 000037
のアミノ酸配列を有する。
【０３６４】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第２のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１６６）は、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬドメイン（配列番号７３）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１６〜２４１は、抗体７Ｂ２のＶＨドメイン（配列番号１４０）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４２〜２４６は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４７〜２７４は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０３６５】
ＤＡＲＴ‐Ｈの第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。
【０３６６】
Ｉ．ＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子「ＤＡＲＴ‐Ｉ」
「ＤＡＲＴ‐Ｉ」と呼称されるＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｉは、上述のＤＡＲＴ‐Ｃと類似しているが、（突然変異ＣＤＲH３を含む）ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡのＶＨドメインを含有する。上述のように、ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡのＶＬドメインは、ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬドメインと同一のアミノ酸配列を有する。
【０３６７】
ＤＡＲＴ‐Ｉの第１のポリペプチド鎖は、配列番号１８６：
2021505637.tif 000038
のアミノ酸配列を有する。
【０３６８】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第１のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１８６）は、トラスツズマブのＶＬドメイン（配列番号１２５）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３３は、最適化済み抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡのＶＨドメイン（配列番号５８）に対応する。残基２３４〜２３８は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２３９〜２６６は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２６７〜２７９は、リンカー（配列番号４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２８０〜４９６は、「ノブ担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５１）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０３６９】
ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡのＶＬドメインはｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬドメインと同一であるため、ＤＡＲＴ‐Ｉの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＤＡＲＴ‐Ｃの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（即ち配列番号１５７）と同一となる。同様に、ＤＡＲＴ‐Ｉの第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。
【０３７０】
Ｊ．ＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子「ＤＡＲＴ‐Ｊ」
「ＤＡＲＴ‐Ｊ」と呼称されるＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｊは、上述のＤＡＲＴ‐Ｃと類似しているが、（突然変異ＣＤＲL３を含む）ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＢのＶＬドメインを含有する。上述のように、ｈＣＤ１６‐Ｍ１BのＶＨドメインは、ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨドメインと同一のアミノ酸配列を有する。
【０３７１】
ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＢのＶＨドメインはｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨドメインと同一であるため、ＤＡＲＴ‐Ｊの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＤＡＲＴ‐Ｃの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（即ち配列番号１５６）と同一となる。
【０３７２】
ＤＡＲＴ‐Ｊの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１８７：
2021505637.tif 000039
のアミノ酸配列を有する。
【０３７３】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第２のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１５７）は、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＢのＶＬドメイン（配列番号５９）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３５は、トラスツズマブのＶＨドメイン（配列番号１２４）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２３６〜２４０は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４１〜２６８は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０３７４】
ＤＡＲＴ‐Ｊの第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。
【０３７５】
Ｋ．ＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子「ＤＡＲＴ‐Ｋ」
「ＤＡＲＴ‐Ｋ」と呼称されるＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｋは、上述のＤＡＲＴ‐Ｊと類似しているが、（突然変異ＣＤＲH３を含む）ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡのＶＨドメインも含有する。よってＤＡＲＴ‐Ｋは、（突然変異ＣＤＲL３及び突然変異ＣＤＲH３を含む）ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢのＶＬ及びＶＨドメインを含有する。
【０３７６】
ＤＡＲＴ‐ＫはｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡのＶＨドメインを含有するため、ＤＡＲＴ‐Ｋの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＤＡＲＴ‐Ｉの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（即ち配列番号１８６）と同一である。
【０３７７】
ＤＡＲＴ‐ＫはｈＣＤ１６‐Ｍ１ＢのＶＬドメインを含有するため、ＤＡＲＴ‐Ｋの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＤＡＲＴ‐Ｊの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（即ち配列番号１８７）と同一である。
【０３７８】
ＤＡＲＴ‐Ｋの第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。
【０３７９】
Ｌ．ＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子「ＤＡＲＴ‐Ｌ」
「ＤＡＲＴ‐Ｌ」と呼称されるＣＤ１６×ＣＤ１９結合分子が、別の例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｌは、ＣＤ１６及びＣＤ１９Ｂ細胞腫瘍抗原に結合できるＦｃドメイン含有二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐Ｌは３つのポリペプチド鎖からなり、また抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、ＣＤ１９  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１９癌抗原のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。上記３つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＣＤ１９癌抗原のエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。
【０３８０】
ＤＡＲＴ‐Ｌの第１のポリペプチド鎖は、配列番号１８８：
2021505637.tif 000040
のアミノ酸配列を有する。
【０３８１】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第１のポリペプチド鎖の残基１〜１０６（配列番号１８８）は、ＣＤ１９  ｍＡｂ  １のＶＬドメイン（配列番号１３９）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１０７〜１１４（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１５〜２３２は、抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨドメイン（配列番号７２）に対応する。残基２３３〜２３８は、リンカー（配列番号１７、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２３９〜２６６は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２６７〜２７９は、リンカー（配列番号４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２８０〜４９６は、「ノブ担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５１）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０３８２】
ＤＡＲＴ‐Ｌの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１８９：
2021505637.tif 000041
のアミノ酸配列を有する。
【０３８３】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第２のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１８９）は、抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬドメイン（配列番号７３）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３５は、ＣＤ１９  ｍＡｂ  １のＶＨドメイン（配列番号１３８）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２３６〜２４１は、リンカー（配列番号１７、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４２〜２６９は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０３８４】
ＤＡＲＴ‐Ｌの第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。
【０３８５】
Ｍ．ＣＤ１６×ＣＤ１９結合分子「ＤＡＲＴ‐Ｍ」
「ＤＡＲＴ‐Ｍ」と呼称されるＣＤ１６×ＣＤ１９結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｍは、上述のＤＡＲＴ‐Ｌと類似しているが、（突然変異ＣＤＲL３を含む）ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＢのＶＬドメインを含有する。上述のように、ｈＣＤ１６‐Ｍ１BのＶＨドメインは、ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨドメインと同一のアミノ酸配列を有する。
【０３８６】
ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＢのＶＨドメインはｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨドメインと同一であるため、ＤＡＲＴ‐Ｍの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＤＡＲＴ‐Ｌの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（即ち配列番号１８８）と同一となる。
【０３８７】
ＤＡＲＴ‐Ｍの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１９０：
2021505637.tif 000042
のアミノ酸配列を有する。
【０３８８】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第２のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１９０）は、抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＢのＶＬドメイン（配列番号５９）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３５は、ＣＤ１９  ｍＡｂ  １のＶＨドメイン（配列番号１３８）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２３６〜２４１は、リンカー（配列番号１７、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４２〜２６９は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０３８９】
ＤＡＲＴ‐Ｍの第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。
【０３９０】
Ｎ．ＣＤ１６×ＣＤ１９結合分子「ＤＡＲＴ‐Ｎ」
「ＤＡＲＴ‐Ｎ」と呼称されるＣＤ１６×ＣＤ１９結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｎは、上述のＤＡＲＴ‐Ｍと類似しているが、（突然変異ＣＤＲH３を含む）ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡのＶＨドメインも含有する。よってＤＡＲＴ‐Ｎは、（突然変異ＣＤＲL３及び突然変異ＣＤＲH３を含む）ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢのＶＬ及びＶＨドメインを含有する。
【０３９１】
ＤＡＲＴ‐Ｎの第１のポリペプチド鎖は、配列番号１９１：
2021505637.tif 000043
のアミノ酸配列を有する。
【０３９２】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第１のポリペプチド鎖の残基１〜１０６（配列番号１９１）は、ＣＤ１９  ｍＡｂ  １のＶＬドメイン（配列番号１３９）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１０７〜１１４（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１５〜２３２は、抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡのＶＨドメイン（配列番号５８）に対応する。残基２３３〜２３８は、リンカー（配列番号１７、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２３９〜２６６は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２６７〜２７９は、リンカー（配列番号４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２８０〜４９６は、「ノブ担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５１）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０３９３】
ＤＡＲＴ‐ＮはｈＣＤ１６‐Ｍ１ＢのＶＬドメインを含有するため、ＤＡＲＴ‐Ｎの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＤＡＲＴ‐Ｍの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（即ち配列番号１９０）と同一である。
【０３９４】
ＤＡＲＴ‐Ｎの第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。
【０３９５】
Ｏ．ＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子「ＤＡＲＴ‐Ｏ」
「ＤＡＲＴ‐Ｏ」と呼称されるＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐１は、ＣＤ１６及びＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原に結合できる二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐１は、ＤＡＲＴ‐Ａ中に存在する抗ヒトＣＤ１６抗体ＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨ及びＶＬドメイン（それぞれ配列番号６４及び配列番号６５）の代わりに、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈ３Ｇ８のＶＬ及びＶＨドメイン（例えば米国公開特許第２００４／００１０１２４号；国際公開第２０１７／１４２９２８号；Li, W. et al. (2016) “Identification Of High-Affinity Anti-CD16A Allotype-Independent Human Antibody Domains,” Exp. Mol. Pathol. 101(2):281-289を参照）を有する点を除いて、ＤＡＲＴ‐Ａと基本的に同一である。
ヒト化抗ヒトＣＤ１６  ｍＡｂ  ｈ３Ｇ８のＶＨドメイン（配列番号６２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMGVGWIR QPPGKALEWL 
AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCAQI 
NPAWFAYWGQ GTLVTVSS
ヒト化抗ヒトＣＤ１６  ｍＡｂ  ｈ３Ｇ８のＶＬドメイン（配列番号６３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL 
LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY 
TFGQGTKLEI K
ｈ３Ｇ８のＶＨ及びＶＬドメインは、本出願ではコンパレータＣＤ１６結合部位として使用される。ＤＡＲＴ‐１は３つのポリペプチド鎖からなり、これらは、抗ヒトＣＤ１６抗体ＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）２つの結合ドメインと、トラスツズマブのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。上記３つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＨＥＲ２／ｎｅｕ癌抗原のエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。
【０３９６】
ＤＡＲＴ‐１の第１のポリペプチド鎖は、配列番号１６７：
2021505637.tif 000044
のアミノ酸配列を有する。
【０３９７】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第１のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１６７）は、トラスツズマブのＶＬドメイン（配列番号１２５）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３３は、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈ３Ｇ８のＶＨドメイン（配列番号６２）に対応する。残基２３４〜２３８は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２３９〜２６６は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２６７〜２７９は、リンカー（配列番号４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２８０〜４９６は、「ノブ担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５１）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０３９８】
ＤＡＲＴ‐１の第２のポリペプチド鎖は、配列番号１６８：
2021505637.tif 000045
のアミノ酸配列を有する。
【０３９９】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第２のポリペプチド鎖の残基１〜１１１（配列番号１６８）は、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈ３Ｇ８のＶＬドメイン（配列番号６３）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１２〜１１９（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１２０〜２３９は、トラスツズマブのＶＨドメイン（配列番号１２４）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４０〜２４４は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４５〜２７２は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０４００】
ＤＡＲＴ‐１の第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。
【０４０１】
Ｐ．ＣＤ１６×ＲＳＶ結合分子「ＤＡＲＴ‐２」
「ＤＡＲＴ‐２」と呼称されるＣＤ１６×ＲＳＶ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐２は、ＣＤ１６及びＲＳＶ糖タンパク質Ｆに結合できる二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐２は、ＤＡＲＴ‐１ダイアボディ中に存在するトラスツズマブのＶＨ及びＶＬドメイン（それぞれ配列番号１２４及び配列番号１２５）の代わりに、抗ＲＳＶ糖タンパク質Ｆ抗体ｖパリビズマブのＶＨ及びＶＬドメイン（それぞれ配列番号１４４及び配列番号１４５）を有する点を除いて、ＤＡＲＴ‐１と基本的に同一である。よってＤＡＲＴ‐２は３つのポリペプチド鎖からなり、またヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈ３Ｇ８のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、ｖパリビズマブのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＲＳＶ糖タンパク質Ｆのエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。上記３つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＲＳＶ糖タンパク質Ｆのエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。上述のように、ｈ３Ｇ８のＶＨ及びＶＬドメインは、本出願ではコンパレータＣＤ１６結合部位として使用される。
【０４０２】
Ｑ．ＣＤ１６×ＲＳＶ結合分子「ＤＡＲＴ‐３」
「ＤＡＲＴ‐３」と呼称されるＣＤ１６×ＲＳＶ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＣＤ１６×ＲＳＶ  ＤＡＲＴ‐３は、ＣＤ１６及びＲＳＶ糖タンパク質Ｆに結合できる二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐３は３つのポリペプチド鎖からなり、またヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、ｖパリビズマブのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＲＳＶ糖タンパク質Ｆのエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。上記３つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＲＳＶ糖タンパク質Ｆのエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。
【０４０３】
ＤＡＲＴ‐３の第１のポリペプチド鎖は、配列番号１６９：
2021505637.tif 000046
のアミノ酸配列を有する。
【０４０４】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第１のポリペプチド鎖の残基１〜１０６（配列番号１６９）は、ｖパリビズマブのＶＬドメイン（配列番号１４５）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１０７〜１１４（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１５〜２３２は、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨドメイン（配列番号７２）に対応する。残基２３３〜２３７は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２３８〜２６５は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２６６〜２７８は、リンカー（配列番号４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２７９〜４９５は、「ノブ担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５１）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０４０５】
ＤＡＲＴ‐３の第２のポリペプチド鎖は、配列番号１７０：
2021505637.tif 000047
のアミノ酸配列を有する。
【０４０６】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第２のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１７０）は、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬドメイン（配列番号７３）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３５は、ｖパリビズマブのＶＨドメイン（配列番号１４４）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２３６〜２４０は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４１〜２６８は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０４０７】
ＤＡＲＴ‐３の第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。
【０４０８】
Ｒ．ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子「ＤＡＲＴ‐４」
「ＤＡＲＴ‐４」と呼称されるＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐４は、ＣＤ１６及びＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質に結合できる二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐４は、ＤＡＲＴ‐１中に存在するトラスツズマブのＶＨ及びＶＬドメイン（それぞれ配列番号１２４及び配列番号１２５）の代わりに、抗ＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質抗体７Ｂ２のＶＨ及びＶＬドメイン（それぞれ配列番号１４０及び配列番号１４１）を有する点を除いて、ＤＡＲＴ‐１と基本的に同一である。よってＤＡＲＴ‐４は３つのポリペプチド鎖からなり、またヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈ３Ｇ８のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、７Ｂ２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。上記３つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。上述のように、ｈ３Ｇ８のＶＨ及びＶｌドメインは、本出願ではコンパレータＣＤ１６結合部位として使用される。
【０４０９】
Ｓ．ＣＤ１６×ＲＳＶ結合分子「ＤＡＲＴ‐５」
「ＤＡＲＴ‐５」と呼称されるＣＤ１６×ＲＳＶ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐５は、ＣＤ１６及びＲＳＶ糖タンパク質Ｆに結合できる二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐５は、ＤＡＲＴ‐Ｌ中に存在するＣＤ１９  ｍＡｂ  １のＶＨ及びＶＬドメイン（それぞれ配列番号１３８及び配列番号１３９）の代わりに、抗ＲＳＶ糖タンパク質Ｆ抗体ｖパリビズマブのＶＨ及びＶＬドメイン（それぞれ配列番号１４４及び配列番号１４５）を有する点を除いて、ＤＡＲＴ‐Ｌと基本的に同一である。よってＤＡＲＴ‐５は３つのポリペプチド鎖からなり、またヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、ｖパリビズマブのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＲＳＶ糖タンパク質Ｆのエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。上記３つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＲＳＶ糖タンパク質Ｆのエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。
【０４１０】
Ｔ．ＣＤ１６×ＲＳＶ結合分子「ＤＡＲＴ‐６」
「ＤＡＲＴ‐６」と呼称されるＣＤ１６×ＲＳＶ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐６は、ＣＤ１６及びＲＳＶ糖タンパク質Ｆに結合できる二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐６は、ＤＡＲＴ‐Ｍ中に存在するＣＤ１９  ｍＡｂ  １のＶＨ及びＶＬドメイン（それぞれ配列番号１３８及び配列番号１３９）の代わりに、抗ＲＳＶ糖タンパク質Ｆ抗体ｖパリビズマブのＶＨ及びＶＬドメイン（それぞれ配列番号１４４及び配列番号１４５）を有する点を除いて、ＤＡＲＴ‐Ｍと基本的に同一である。よってＤＡＲＴ‐６は３つのポリペプチド鎖からなり、また最適化済み抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＢのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、ｖパリビズマブのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＲＳＶ糖タンパク質Ｆのエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。上記３つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＲＳＶ糖タンパク質Ｆのエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。
【０４１１】
Ｕ．ＣＤ１６×ＲＳＶ結合分子「ＤＡＲＴ‐７」
「ＤＡＲＴ‐７」と呼称されるＣＤ１６×ＲＳＶ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐７は、ＣＤ１６及びＲＳＶ糖タンパク質Ｆに結合できる二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐７は、ＤＡＲＴ‐Ｎ中に存在するＣＤ１９  ｍＡｂ  １のＶＨ及びＶＬドメイン（それぞれ配列番号１３８及び配列番号１３９）の代わりに、抗ＲＳＶ糖タンパク質Ｆ抗体ｖパリビズマブのＶＨ及びＶＬドメイン（それぞれ配列番号１４４及び配列番号１４５）を有する点を除いて、ＤＡＲＴ‐Ｎと基本的に同一である。よってＤＡＲＴ‐７は３つのポリペプチド鎖からなり、また最適化済み抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、ｖパリビズマブのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＲＳＶ糖タンパク質Ｆのエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。第３のポリペプチド鎖は、共通のダイアボディポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）を有する。上記３つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＲＳＶ糖タンパク質Ｆのエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。
【０４１２】
Ｖ．ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子「ＤＡＲＴ‐Ｘ」
「ＤＡＲＴ‐Ｘ」と呼称されるＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｘは、ＣＤ１６及びＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質に結合できる二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐Ｘは２つのポリペプチド鎖からなり、また抗ヒトＣＤ１６抗体ＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、７Ｂ２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。上記２つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図１Ａ〜１Ｂを参照）。
【０４１３】
ＤＡＲＴ‐Ｘの第１のポリペプチド鎖は、配列番号１７１：
2021505637.tif 000048
のアミノ酸配列を有する。
【０４１４】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第１のポリペプチド鎖の残基１〜１１３（配列番号１７１）は、７Ｂ２のＶＬドメイン（配列番号１４１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１４〜１２１（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１２２〜２３９は、抗ヒトＣＤ１６抗体ＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨドメイン（配列番号６４）に対応する。残基２４０〜２４４は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２４５〜２７２は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。
【０４１５】
ＤＡＲＴ‐Ｘの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１７２：
2021505637.tif 000049
のアミノ酸配列を有する。
【０４１６】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第２のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１７２）は、抗ヒトＣＤ１６抗体ＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬドメイン（配列番号６５）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１６〜２４１は、７Ｂ２のＶＨドメイン（配列番号１４０）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４２〜２４６は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４７〜２７４は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０４１７】
Ｗ．ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子「ＤＡＲＴ‐Ｙ」
「ＤＡＲＴ‐Ｙ」と呼称されるＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｙは、ＣＤ１６及びＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質に結合できる二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐Ｙは２つのポリペプチド鎖からなり、また抗ヒトＣＤ１６抗体ＣＤ１６‐Ｍ２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、７Ｂ２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。上記２つのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープ及びＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図１Ｂを参照）。
【０４１８】
ＤＡＲＴ‐Ｙの第１のポリペプチド鎖は、配列番号１７３：
2021505637.tif 000050
のアミノ酸配列を有する。
【０４１９】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第１のポリペプチド鎖の残基１〜１１３（配列番号１７３）は、７Ｂ２のＶＬドメイン（配列番号１４１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１４〜１２１（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１２２〜２４０は、抗ヒトＣＤ１６抗体ＣＤ１６‐Ｍ２のＶＨドメイン（配列番号７５）に対応する。残基２４１〜２４５は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２４６〜２７３は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。
【０４２０】
ＤＡＲＴ‐Ｙの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１７４：
2021505637.tif 000051
のアミノ酸配列を有する。
【０４２１】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第２のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１７４）は、抗ヒトＣＤ１６抗体ＣＤ１６‐Ｍ２のＶＬドメイン（配列番号７６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１６〜２４１は、７Ｂ２のＶＨドメイン（配列番号１４０）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４２〜２４６は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４７〜２７４は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０４２２】
Ｘ．ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子「ＤＡＲＴ‐０」
「ＤＡＲＴ‐０」と呼称されるＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐０は、ＣＤ１６及びＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質に結合できる二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐０は、ＤＡＲＴ‐Ｘ中に存在する抗ヒトＣＤ１６抗体ＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨ及びＶＬドメイン（それぞれ配列番号６４及び配列番号６５）の代わりに、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈ３Ｇ８のＶＨ及びＶＬドメイン（それぞれ配列番号６２及び配列番号６３）を有する点を除いて、ＤＡＲＴ‐Ｘと基本的に同一である。よってＤＡＲＴ‐０は２つのポリペプチド鎖からなり、これらは、ヒト化抗ヒトＣＤ１６抗体ｈ３Ｇ８のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、７Ｂ２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。これらのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的な１つの結合ドメインと、ＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに対して免疫特異的な１つの結合部位とを有する、２つのポリペプチド鎖からなる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図１Ａ〜１Ｂを参照）。上述のように、ｈ３Ｇ８のＶＨ及びＶＬドメインは、本出願ではコンパレータＣＤ１６結合部位として使用される。
【０４２３】
Ｙ．ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子「ＤＡＲＴ‐Ｚ」
「ＤＡＲＴ‐Ｚ」と呼称されるＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子が、更なる例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｚは、ＣＤ１６及びＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質に結合できる二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐Ｚは、抗ＨＩＶ  ｅｎｖ抗体７Ｂ２のＶＨ及びＶＬドメインではなく抗ＨＩＶ  ｅｎｖ抗体Ａ３２のＶＨ及びＶＬドメイン（それぞれ配列番号１４２及び１４３）を有する点、並びにＤＡＲＴ‐Ｘ中に存在する抗ヒトＣＤ１６抗体ＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨ及びＶＬドメイン（それぞれ配列番号６４及び配列番号６５）の代わりに、抗ヒトＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖ  ４‐ＬＳ２１（米国公開特許第２０１５／０２１８２７５号）のＶＨ及びＶＨドメインを有する点を除いて、ＤＡＲＴ‐Ｘと基本的に同一である。
抗ヒトＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖ  ４‐ＬＳ２１のＶＨドメイン（配列番号１７５）：
EEVQLVQSGA EVKKPGESLK VSCKASGYTF TSYYMHWVRQ APGQGLEWMG 
IINPSGGSTS YAQKFQGRVT MTRDTSTSTV YMELSSLRSE DTAVYYCARG 
SAYYYDFADY WGQGTLVTVS S
抗ヒトＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖ  ４‐ＬＳ２１のＶＬドメイン（配列番号１７６）：
QPVLTQPSSV SVAPGQTATI SCGGHNIGSK NVHWYQQRPG QSPVLVIYQD 
NKRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQVW DNYSVLFGGG 
TKLTVL
よって、ＤＡＲＴ‐Ｚは２つのポリペプチド鎖からなり、これらは、抗ヒトＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖ  ４‐ＬＳ２１のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、Ａ３２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。これらのポリペプチド鎖は、結合して、ＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的な１つの結合ドメインと、ＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに対して免疫特異的な１つの結合部位とを有する、２つのポリペプチド鎖からなる共有結合ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成する（例えば図１Ａ〜１Ｂを参照）。４‐ＬＳ２１のＶＨ及びＶＬドメインは、本出願ではコンパレータＣＤ１６結合部位として使用される。
【０４２４】
Ｚ．ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ×ＨＩＶ  ｅｎｖ３価分子
本発明のＣＤ１６×ＤＡ結合分子は、Ｆｃドメイン含有二重特異性又は三重特異性ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ×ＨＩＶ  ｅｎｖ３価分子によって更に例示され、これは、ＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに結合できる２つの結合ドメインと、ＣＤ１６のエピトープに結合できる１つの結合ドメインとを含む。ＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のこのようなエピトープは、（ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ×ＨＩＶ  ｅｎｖ３価分子「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ」においてと同様に）同一であってよく、又はこれらは（ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ×ＨＩＶ  ｅｎｖ３価分子「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ」においてと同様に）異なっていてもよい。例示的な３価ＴＲＩＤＥＮＴ（商標）分子の構造及び配列を表１３にまとめ、以下で詳細に説明する。
【０４２５】
【表１３】
2021505637.tif 000052
【０４２６】
１．ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ×ＨＩＶ  ｅｎｖ３価分子「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ」
「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ」と呼称されるＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ×ＨＩＶ  ｅｎｖ３価分子は、４つのポリペプチド鎖からなり、抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、それぞれＡ３２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従って抗体Ａ３２が認識するＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに対して免疫特異的である）２つの結合ドメインとを有する。４つのポリペプチド鎖は結合して、抗体Ａ３２が認識するＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質エピトープの１つ又は２つの複製と、ＣＤ１６のエピトープとに免疫特異的に結合できる、共有結合ＴＲＩＤＥＮＴ（商標）分子を形成する（図６Ａを参照）。
【０４２７】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖は、配列番号１７７：
2021505637.tif 000053
のアミノ酸配列を有する。
【０４２８】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第１のポリペプチド鎖の残基１〜１１０（配列番号１７７）は、抗体Ａ３２のＶＬドメイン（配列番号１４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１１〜１１８（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１９〜２３６は、抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨドメイン（配列番号７２）に対応する。残基２３７〜２４１は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２４２〜２６９は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２７０〜２８２は、リンカー（配列番号４３）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２８３〜４９９は、「ノブ担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５１）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０４２９】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１７８：
2021505637.tif 000054
のアミノ酸配列を有する。
【０４３０】
このような例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子の第２のポリペプチド鎖の残基１〜１０７（配列番号１７８）は、抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬドメイン（配列番号７３）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１０８〜１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１６〜２３８は、抗体Ａ３２のＶＨドメイン（配列番号１４２）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２３９〜２４３は、リンカー（配列番号４３）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４４〜２７１は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０４３１】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖は、配列番号１７９：
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL SCTVSGGSSS SGAHYWSWIR QYPGKGLEWI 
GYIHYSGNTY YNPSLKSRIT ISQHTSENQF SLKLNSVTVA DTAVYYCARG 
TRLRTLRNAF DIWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC 
LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG 
TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP 
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE 
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR 
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LSCAVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT 
PPVLDSDGSF FLVSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN RYTQKSLSLS
PGK
のアミノ酸配列を有する。
【０４３２】
第３のポリペプチド鎖の残基１〜１２３（配列番号１７９）は、抗体Ａ３２のＶＨドメイン（配列番号１４２）に対応する。第３のポリペプチド鎖の残基１２４〜２２１は、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号３）に対応する。第３のポリペプチド鎖の残基２２２〜２３６は、ＩｇＧヒンジドメイン（配列番号７、下線部）に対応する。第３のポリペプチド鎖の残基２３７〜４５３は、「ホール担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５３）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０４３３】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第４のポリペプチド鎖は、配列番号１８０：
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII 
SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV 
FGGGTKLTVL RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ 
WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT 
HQGLSSPVTK SFNRGEC
のアミノ酸配列を有する。
【０４３４】
第４のポリペプチド鎖の残基１〜１１０（配列番号１８０）は、抗体Ａ３２のＶＬドメイン（配列番号１４３）に対応する。第４のポリペプチド鎖の残基１１１〜２１７は、ヒトＣＬκドメイン（配列番号１）に対応する。
【０４３５】
２．ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ×ＨＩＶ  ｅｎｖ３価分子「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ」
「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ」と呼称される例示的なＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ×ＨＩＶ  ｅｎｖ３価分子もまた、４つのポリペプチド鎖からなる。これは、抗ヒトＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、Ａ３２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従って抗体Ａ３２が認識するＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、７Ｂ２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従って抗体７Ｂ２が認識するＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープに対して免疫特異的である）更なる１つの結合ドメインとを有する。４つのポリペプチド鎖は結合して、抗体Ａ３２が認識するＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープ及び／又は抗体７Ｂ２が認識するＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のエピトープと、ＣＤ１６のエピトープとに免疫特異的に結合できる、共有結合ＴＲＩＤＥＮＴ（商標）分子を形成する（図６Ａを参照）。
【０４３６】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂの第１のポリペプチド鎖は、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖（配列番号１７７）と同一である。
【０４３７】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂの第２のポリペプチド鎖は、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖（配列番号１７８）と同一である。
【０４３８】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂの第３のポリペプチド鎖は、配列番号１８１：
QVQLVQSGGG VFKPGGSLRL SCEASGFTFT EYYMTWVRQA PGKGLEWLAY 
ISKNGEYSKY SPSSNGRFTI SRDNAKNSVF LQLDRLSADD TAVYYCARAD 
GLTYFSELLQ YIFDLWGQGA RVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKSTSGGTAA 
LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS LSSVVTVPSS 
SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKRVEPKSCD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF 
LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP 
REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG 
QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLSCAVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY 
KTTPPVLDSD GSFFLVSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNRYTQKSL 
SLSPGK
のアミノ酸配列を有する。
【０４３９】
第３のポリペプチド鎖の残基１〜１２６（配列番号１８１）は、抗体７Ｂ２のＶＨドメイン（配列番号１４０）に対応する。第３のポリペプチド鎖の残基１２７〜２２４は、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号３）に対応する。第３のポリペプチド鎖の残基２２５〜２３９は、ＩｇＧヒンジドメイン（配列番号７、下線部）に対応する。第３のポリペプチド鎖の残基２４０〜４５６は、「ホール担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５３）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０４４０】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂの第４のポリペプチド鎖は、配列番号１８２：
DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP 
KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH 
PPTFGHGTRV EIKRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA 
KVQWKVDNAL QSGNSQESVT EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC 
EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
のアミノ酸配列を有する。
【０４４１】
第４のポリペプチド鎖の残基１〜１１３（配列番号１８２）は、抗体７Ｂ２のＶＬドメイン（配列番号１４１）に対応する。第４のポリペプチド鎖の残基１１４〜２２０は、ヒトＣＬκドメイン（配列番号１）に対応する。
【０４４２】
ＶＩＩＩ．産生方法
最も好ましくは、本発明の分子は、当該技術分野において公知であるように、上記ポリペプチドをエンコードする核酸分子の組み換え発現によって産生される。
【０４４３】
本発明のポリペプチドは、固相ペプチド合成を用いて便利に調製できる（Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis,” Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15): 5131-5135; Ganesan, A. (2006) “Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10）。
【０４４４】
当該技術分野において公知の方法を用いて、抗体を組み換えによって作製し、発現させてよい。抗体は、まず宿主動物から作製された抗体を単離し、遺伝子配列を取得し、上記遺伝子配列を使用して宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）内で抗体を組み換え発現させることによって作製できる。採用できる別の方法は、植物（例えばタバコ）又はトランスジェニックミルク中で抗体配列を発現させることである。植物又はミルク中で抗体を組み換え発現させるための好適な方法は、開示されている（例えばPeeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock et a/.(1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231 : 147-157を参照）。例えばヒト化、単鎖等の抗体の誘導体を作製するための好適な方法は、当該技術分野において公知であり、また上述されている。別の代替案では、抗体はファージディスプレイ技術によって、組み換えによって作製できる（例えば米国特許第５，５６５，３３２号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，７３３，７４３号；米国特許第６，２６５，１５０号；及びWinter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455を参照）。
【０４４５】
関心対象のポリヌクレオチドを含有するベクター（例えば本発明の結合分子のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド）は：電気穿孔；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ‐デキストラン又は他の物質を使用したトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；及び感染（例えばベクターがワクシニアウイルス等の感染性因子である場合）を含む多数の適切な手段のうちのいずれによって、宿主細胞に導入できる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は、宿主細胞の特徴に左右される場合が多い。
【０４４６】
ポリペプチド、又はタンパク質を発現する目的で、異種ＤＮＡを過剰発現できるいずれの宿主細胞を使用できる。好適な哺乳類宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ及びＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４７】
本発明は、本発明の結合分子のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当該技術分野において公知の手順で産生できる。上記ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解若しくは他の分解によって、上述のような組み換え法（即ち単一若しくは融合ポリペプチド）によって、又は化学的合成によって産生できる。上記抗体のポリペプチド、特にアミノ酸最高約５０個分の比較的短いポリペプチドは、化学的合成によって便利に作製される。化学的合成方法は当該技術分野において公知であり、市販されている。
【０４４８】
本発明は、本開示の結合分子（上記分子の特性に有意な影響を及ぼさない、機能的に同等のポリペプチド、及び活性が増強した又は低下した変異型を含む）を含んでよい。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野において慣用的に実践されており、本明細書で詳細に説明する必要はない。修飾されたポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性を大幅に又は劣化するように変化させない１つ以上の欠失若しくは追加、又は化学的類似体の使用が挙げられる。互いを保存的に置換できるアミノ酸残基としては：グリシン／アラニン；セリン／トレオニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；リジン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシンが挙げられるが、これらに限定されない。これらのポリペプチドとしては、グリコシル化及び非グリコシル化ポリペプチド、並びに例えば異なる複数の糖によるグリコシル化、アセチル化及びリン酸化といった、その他の変換後修飾を有するポリペプチドも挙げられる。好ましくは、アミノ酸置換は保存的であり、即ち置換されたアミノ酸は、オリジナルのアミノ酸と同様の化学的特性を有する。このような保存的置換は当該技術分野において公知であり、その例は上述されている。アミノ酸修飾は、１つ以上のアミノ酸を変化させるか又は修飾することから、可変ドメイン等の領域の完全な再設計にまで及んでよい。可変ドメインの変化は、結合親和性及び／又は特異性を変化させる。他の修飾方法としては、酵素的手段、酸化的置換及びキレート化を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の連結技術の使用が挙げられる。修飾は例えば、イムノアッセイのための標識の付与、例えばラジオイムノアッセイのための放射性部分の付与等のために使用できる。修飾されたポリペプチドは、当該技術分野において確立された手順を用いて作製され、また当該技術分野において公知の標準的なアッセイを用いてスクリーニングできる。
【０４４９】
一実施形態では、軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖の両方を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、異種免疫グロブリン定常領域を含有する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、公的に寄託されたハイブリドーマから産生された抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含有する。本発明の目的のために、抗体融合タンパク質は、該タンパク質をＣＤ１６及び疾患抗原の両方に免疫特異的に結合できるようにし、かつ天然分子においては上記抗体融合タンパク質が結合しない別のアミノ酸配列、例えば異種配列又は別の領域（例えば脱免疫化アルブミン結合ドメイン、タンパク質Ａ認識配列、ペプチドタグ等）由来の同種配列を含有する、ポリペプチドドメインを含有する。
【０４５０】
本発明は特に、診断又は治療用部分にコンジュゲートする上記結合分子（例えば抗体、ダイアボディ、３価結合分子等）を包含する。診断を目的として、本発明の結合分子を、検出可能な物質と連結させてよい。このような結合分子は、臨床試験手順の一部としての疾患の発症又は進行の監視及び／又は予後判定、例えば特定の療法の有効性の決定に有用である。検出可能な物質の例としては、様々な酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ等）、補欠分子族（例：アビジン／ビオチン）、蛍光物質（例えばアンベリフェロン、フルオレセイン又はフィコエリスリン）、発光材料（例えばルミノール）、生物発光材料（例えばルシフェラーゼ又はエクオリン）、放射性材料（例えば炭素１４、マンガン５４、ストロンチウム８５又は亜鉛６５）、陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。上記検出可能な物質は、直接的に、又は当該技術分野において公知の技法を用いて、介在物（例えばリンカー）を介して間接的に、結合分子と連結又はコンジュゲートさせてよい。
【０４５１】
治療を目的として、本発明の結合分子を、細胞毒素等の治療成分（例えば細胞増殖抑制剤若しくは細胞破壊剤）、治療剤又はαエミッタ等の放射性金属イオンとコンジュゲートさせてよい。細胞毒素又は細胞傷害剤としては、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素Ａ〜Ｆ、リシンアブリン、サポリン、及びこれらの作用剤の細胞傷害性断片といった、細胞に有害ないずれの作用剤が挙げられる。治療剤としては、障害を予防的又は治療的に処置するための治療効果を有するいずれの作用剤が挙げられる。このような治療剤は、化学治療剤、タンパク質又はポリペプチド治療剤であってよく、所望の生物活性を有する、及び／又は所与の生物応答を修正する治療剤を含んでよい。治療剤の例としては、アルキル化剤、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、ホルモン療法剤、及び細胞増殖性疾患の治療に有用な抗体が挙げられる。治療用部分は、直接的に、又は当該技術分野において公知の技法を用いて、介在物（例えばリンカー）を介して間接的に、結合分子と連結又はコンジュゲートさせてよい。
【０４５２】
ＩＸ．本発明の結合分子の使用
上述のように、ＣＤ１６及び疾患抗原に結合できる分子は、細胞表面上にこのような疾患抗原を発現する標的細胞（即ち癌細胞又は病原体感染細胞）の標的転換殺滅を仲介できる。このような分子は、治療目的のために、例えば癌又は感染症を有する被験者において使用できる。よって本発明の結合分子は、上記標的細胞の表面上での疾患抗原、特に癌抗原若しくは病原体関連抗原の発現に関連する、又は上記発現を特徴とする、いずれの疾患又は状態を治療する能力を有する。よって、限定するものではないが、本発明の結合分子は、癌、特に癌抗原の発現を特徴とする癌の治療に採用できる。本発明の結合分子は、感染症、特に病原体関連抗原の発現を特徴とする感染症の治療に採用できる。
【０４５３】
特に本発明は：ＣＤ１６に結合できる分子が、ＣＤ１６に結合できる抗体のエピトープ結合ドメインを含み、かつ（標的転換細胞殺滅（例えば標的転換Ｔ細胞又は標的転換ＮＫ細胞殺滅）を仲介することによって）標的細胞の標的転換殺滅を仲介するために、標的細胞の表面上の疾患抗原（特に癌抗原又は病原体関連抗原）に結合できるエピトープ結合ドメインを含む、上記方法を包含する。
【０４５４】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６及び疾患抗原に結合できる分子は、二重特異性抗体又は（ｓｃＦｖを含む）その結合部位、ＢｉＴｅ、ＴａｎｄＡｂ、及びＣＡＲである。
【０４５５】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６及び疾患抗原に結合できる分子は、二重特異性ダイアボディである。
【０４５６】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６及び疾患抗原に結合できる分子は、３価結合分子である。
【０４５７】
本明細書中で使用される場合、用語「療法を提供する（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ  ａ  ｔｈｅｒａｐｙ）」、及び「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は：疾患に由来する症状の低減；感染症の症状（例えばウイルス量、発熱、疼痛、敗血症等）の軽減；腫瘍（癌の文脈では、例えば乳癌、胃癌若しくは前立腺癌の腫瘍）のサイズの縮小；癌細胞成長の遅延；転移の発生、成長若しくは進行の遅延；疾患に由来する症状の低減；レシピエント被験者のＱＯＬの向上；被験者の疾患の治療のために提供される他の薬物の用量の低減；標的化及び／若しくは内在化等による、別の薬物の効果の増強；疾患の進行の遅延：並びに／又はレシピエント被験者の生存期間の延長といったいずれの臨床的結果を含むがこれに限定されない、有益な又は所望の結果のいずれの兆候に関連する、組成物のいずれの投与を指す。
【０４５８】
治療の被験者としては、動物、最も好ましくは非霊長類（例えばウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類種が挙げられる。ある好ましい実施形態では、被験者はヒトである。
【０４５９】
本発明の様々な実施形態によって治療できる例示的な障害としては、限定するものではないが、増殖性障害、細胞増殖性障害、及び癌（特に標的転換細胞殺滅を仲介できる分子によって結合できる癌抗原を発現する癌）、病原体関連疾患（特に標的転換細胞殺滅を仲介できる分子によって結合される病原体関連抗原の発現に関連する慢性ウイルス感染症）が挙げられる。様々な実施形態では、本発明は、被験者の疾患又は障害の治療、予防又は管理のための方法及び組成物を包含し、これは、治療的有効量の本発明の結合分子を被験者に投与するステップを含む。このような分子は、原発性腫瘍の成長の予防、阻害、低減又は退縮、及び腫瘍の転移の予防、阻害、低減のため、並びに病原体量の低減又は病原体感染細胞の排除のために特に有用である。特定の作用機序による束縛を意図したものではないが、上記分子は、標的細胞に対するエフェクタ機能を仲介してよく、標的細胞、架橋細胞表面抗原及び／又は標的細胞上の受容体に対する免疫系の活性化を促進してよく、またアポトーシス又は負の成長調節シグナリングを増強してよく、又はこれらの組み合わせを実現してよく、これにより、標的細胞の除去及び／又はその個数の低減をもたらす。
【０４６０】
本発明の分子によって、及び本発明の方法によって治療できる癌としては、限定するものではないが：褐色細胞腫、又は副腎皮質癌を含むがこれらに限定されない、副腎癌；エイズ関連癌；歯槽軟部肉腫；星状細胞腫；基底細胞癌；移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、又は癌肉腫を含むがこれらに限定されない、膀胱癌；限定するものではないが、骨肉腫（ｂｏｎｅ  ｓａｒｃｏｍａ、ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟部組織肉腫、管肉腫（血管肉腫）、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫又は滑膜肉腫等の、骨及び結合組織肉腫；神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起神経膠腫、非グリア腫瘍（ｎｏｎｇｌｉａｌ  ｔｕｍｏｒ）、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、又は原発性脳リンパ腫を含む、脳癌；脳及び脊髄癌；腺癌、小葉（小細胞）癌、管内癌、髄様乳癌、粘液性乳癌、管状乳癌、乳頭状乳癌、パジェット病、又は炎症性乳癌を含むがこれらに限定されない、乳癌；頸動脈球腫瘍；扁平上皮癌、又は腺癌を含むがこれらに限定されない、子宮頸癌；乳頭状、結節状、又はびまん性胆管癌を含むがこれらに限定されない、胆管癌；軟骨肉腫；脊索腫；腎明細胞癌；明細胞癌；結腸癌；結腸直腸癌；皮膚良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫及び毛様体黒色等の眼内黒色腫並びに腫網膜芽細胞腫を含むがこれらに限定されない、眼癌；扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣状癌、及び燕麦細胞（小細胞）癌を含むがこれらに限定されない、食道癌；ユーイング腫；骨外性粘液性軟骨肉腫；線維形成不全骨；骨の線維性異形成；腺癌を含むがこれらに限定されない、胆嚢癌又は胆管癌；胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；重鎖病；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；急性白血病を含むがこれに限定されない白血病；急性リンパ性白血病；限定するものではないが、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性若しくは赤白血病性白血病、又は骨髄異形成症候群等の、急性骨髄性白血病；限定するものではないが、慢性骨髄性（顆粒球）白血病、慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病等の、慢性白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫性腫瘍；肝細胞癌又は肝芽腫を含むがこれらに限定されない、肝臓癌；限定するものではないがホジキン病等の、リンパ腫；非ホジキン病；非小細胞肺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌又は小細胞肺癌を含むがこれらに限定されない、肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；良性単クローン性免疫グロブリン血症；意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症；多発性内分泌腫瘍；限定するものではないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫及び髄外性形質細胞腫等の、多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽腫；神経内分泌腫瘍；扁平上皮癌を含むがこれに限定されない、口腔癌；卵巣上皮癌、ボーダーライン腫瘍、胚細胞腫瘍及び間質腫瘍を含むがこれらに限定されない、卵巣癌；インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、脂肪腫、ソマトスタチン分泌腫瘍、又は癌様体若しくは膵島細胞腫瘍を含むがこれらに限定されない、膵臓癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；陰茎癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；扁平上皮癌又は水疱性癌を含むがこれらに限定されない、咽頭癌；クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、末端肥大症、又は糖尿病性小児腫瘍を含むがこれらに限定されない、下垂体癌；腺癌、平滑筋肉腫又は横紋筋肉腫を含むがこれらに限定されない、前立腺癌；真性赤血球増加症；後部ブドウ膜黒色腫；まれな血液障害；腺癌、過腎腫、線維肉腫、腎転移癌又は移行上皮癌（腎盂及び／若しくは尿管）を含むがこれらに限定されない、腎臓癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；腺癌、粘表皮癌又は腺様嚢胞癌を含むがこれらに限定されない、唾液腺癌；肉腫；基底細胞癌、扁平上皮癌及び黒色腫、表在性増殖性黒色腫、結節性黒色腫、水晶体悪性黒色腫又は末端黒子型黒色腫を含むがこれらに限定されない、皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；腺癌、真菌性（ポリープ状）、潰瘍性、表在性、びまん性又は悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、及び癌肉腫を含むがこれらに限定されない、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）；滑膜肉腫；胚性腫瘍、セミノーマ、未分化、古典的（典型的）、精細胞性、非セミノーマ、胚性癌、奇形腫癌、又は絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）を含むがこれらに限定されない、精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；限定するものではないが、甲状腺乳頭若しくは濾胞癌、転移性甲状腺癌、甲状腺髄様癌又は未分化甲状腺癌等の、甲状腺癌；子宮内膜癌又は子宮肉腫を含むがこれらに限定されない、子宮癌；扁平上皮癌、腺癌又は黒色腫を含むがこれらに限定されない、膣癌；扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫又はパジェット病を含むがこれらに限定されない、外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；あるいはウィルムス腫瘍が挙げられる。更に、癌としては、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、及び乳頭状腺癌が挙げられる（これらの障害の概観に関しては、Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia and Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc.を参照）。
【０４６１】
特に、本発明の結合分子は、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膠芽腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、小リンパ性リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、精巣癌、及び子宮癌の治療に使用できる。
【０４６２】
本発明のＣＤ１６結合分子で治療できる病原体関連疾患としては、慢性ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫感染が挙げられる。本発明のＣＤ１６結合分子で治療できる慢性感染としては：エプスタイン・バーウイルス；Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；ヘルペスウイルス（例えばＨＳＶ‐１、ＨＳＶ‐２、ＨＨＶ‐６、ＣＭＶ）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）；桿菌；シトロバクター；コレラ；ジフテリア；エンテロバクター；淋菌；ヘリコバクター・ピロリ；クレブシエラ；レジオネラ；髄膜炎菌；マイコバクテリア；シュードモナス；肺炎球菌；リケッチア細菌；サルモネラ；セラチア；ブドウ球菌；連鎖球菌；破傷風；アスペルギルス（アスペルギルス・フミガーツス、クロコウジカビ等）；ブラストミセス・デルマチチジス；カンジダ（カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・トロピカリス等）；クリプトコッカス・ネオフォルマンス；ムコラエ属（ケカビ、ユミケカビ、クモノスカビ）；スポロスリックス・シェンキー；パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス；コクシジオイデス・イムチス；ヒストプラスマ・カプスラツム；レプトスピラ症；ボレリア・ブルグドルフェリ；蠕虫性寄生虫（鉤虫、条虫、吸虫、扁虫（例えば住血吸虫））；ランブル鞭毛虫；トリキネラ属；二核アメーバ；トリパノソーマ・ブルセイ；トリパノソーマ・クルージ；及びドノバン・リーシュマニアが挙げられる。
【０４６３】
Ｘ．医薬組成物
本発明は、ＣＤ１６に結合でき、かつ疾患抗原に結合できる分子含む、組成物を包含する。本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験者又は患者への投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、予防的又は治療的有効量のＣＤ１６に結合でき、かつ疾患抗原に結合できることにより、標的細胞（例えば癌細胞、病原体感染細胞等）の標的転換殺滅を仲介できる分子、又はこれらの分子の組み合わせと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明の結合分子のうちの１つ又は複数と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。ある好ましい態様では、上記組成物は略精製済みである（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を略含まない）。
【０４６４】
このような組成物の様々な処方を、投与に用いてよい。１つ以上の薬理学的有効成分に加えて、本発明の組成物は、好適な、薬学的に許容可能なキャリアを含有してよく、上記キャリアは、当該技術分野において公知の賦形剤及び助剤を含み、また薬理学的に有効な物質の投与を促進する、又は上記活性化合物の、作用部位への送達のために薬学的に使用できる調製物への加工を促進する、比較的不活性の物質である。例えば賦形剤は、形状若しくは粘度を与えることができ、又は希釈剤として作用できる。好適な賦形剤としては、安定化剤、湿潤及び乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル化剤、緩衝液、並びに皮膚浸透促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６５】
ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。
【０４６６】
本発明はまた、単独の又は上述のような薬学的に許容可能なキャリアと組み合わされた本発明の結合分子で充填された１つ以上のコンテナを含む、医薬パック又はキットも提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ以上の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ以上のコンテナを含む、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ以上のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。
【０４６７】
本発明は、上述の方法において使用できるキットを提供する。キットは、本発明の結合分子のいずれを含むことができる。このキットは更に、癌の治療に有用な１つ以上の他の予防剤及び／又は治療剤を、１つ以上のコンテナ内に含むことができる
【０４６８】
ＸＩ．投与方法
本発明の組成物は、有効量の本発明のＣＤ１６×ＤＡ医薬組成物を、被験者に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する１つ以上の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。ある好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験者は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、げっ歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験者はヒトである。
【０４６９】
本発明のＣＤ１６×ＤＡ結合分子又は医薬組成物を投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明の結合分子は、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。
【０４７０】
本発明はまた、本発明の結合分子の調製物を、この分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、上記分子は、気密性コンテナ内の乾燥滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験者への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明の結合分子は、気密性コンテナ内の乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給される。
【０４７１】
凍結乾燥された本発明の結合分子の調製物は、その元々のコンテナ内において２℃〜８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、このような分子は、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。好ましくは、このような結合分子は、液体形態で提供される場合、気密性コンテナ内に供給される。
【０４７２】
障害に関連する１つ以上の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明の上記調製物の量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。
【０４７３】
本明細書において使用される場合、医薬組成物の「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は：疾患によってもたらされる症状の低減；感染の症状（例えばウイルス負荷、発熱、疼痛、敗血症等）若しくは癌の症状（例えば癌細胞の増殖、腫瘍の存在、腫瘍転移等）を減弱させる疾患に起因する症状の減弱；これによる、疾患に罹患したヒトのＱＯＬの上昇；疾患を治療するために必要な他の投薬量の低減；標的化及び／若しくは内在化等による別の投薬の効果の増強；疾患の進行の遅延；並びに／又は個体の生存期間の延長を含むがこれらに限定されない、有益な又は所望の結果を得るために十分な量である。単独で投与される個々の有効成分に対して適用される場合、この用語は、上記成分のみを指す。組み合わせに対して適用される場合、この用語は、治療効果をもたらす複数の有効成分の合計量を指し、上記有効成分が組み合わせた状態で投与されるか、順次投与されるか、又は同時に投与されるかにかかわらない。
【０４７４】
有効量は、１回又は複数回の投与で投与できる。本発明の目的のために、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、直接的又は間接的な：癌細胞の殺滅及び／若しくは増殖の低減；並びに／又は癌の原発部位からの転移の進展の排除、低減及び／若しくは遅延；又は感染病原体の増殖（又はその影響）の低減；並びに病原体仲介型疾患の進展の低減及び／又は遅延に十分な量である。いくつかの実施形態では、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、別の薬剤、化合物又は医薬組成物と組み合わせて達成してもしなくてもよい。従って「有効量」は、１つ以上の化学療法剤を投与する文脈で考えることができ、また単一の作用剤が、１つ以上の他の作用剤と組み合わせて所望の結果を達成できる又は所望の結果を達成する場合に、有効量で与えられているものと考えることができる。個別の必要量は異なるが、各成分の有効量の最適な範囲の決定は当業者の能力の範囲内である。
【０４７５】
本発明に包含される結合分子に関して、患者に投与される投薬量は好ましくは、レシピエント被験者の体重（ｋｇ）に基づいて決定される。本発明に包含される結合分子に関して、患者に投与される投薬量は典型的には、被験者の体重に対して約０．０１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ以上である。
【０４７６】
本発明の結合分子の投与の用量及び頻度は、例えば脂質化等の改質によって分子の取り込み及び組織貫通を増強することによって低減又は変更できる。
【０４７７】
患者に投与される本発明の結合分子の投薬量は、単一作用剤による治療としての使用のために計算してよい。あるいは、上記分子は他の治療用組成物と併用され、患者に投与される投薬量は、上記分子を単一作用剤による治療として使用する場合よりも小さくなる。
【０４７８】
本発明の医薬組成物は、治療が必要な領域に局所的に投与してよく、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的点滴によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料性であり、ＳＩＡＬＡＳＴＩＣ（登録商標）膜等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。
【０４７９】
本発明の組成物は、小嚢、特にリポソーム中で送達できる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365(1989); Lopez-Berestein,同上、pp.317-327参照）。
【０４８０】
治療的又は予防的有効量の本発明の結合分子を用いた被験者の治療は、単回治療を含むことができ、又は好ましくは一連の複数回の治療を含むことができる。ある好ましい例では、被験者は、本発明の医薬組成物を用いて、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、更に好ましくは約４、５又は６週間にわたって処置される。本発明の医薬組成物は、１日１回投与でき、この投与は１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回等のスケジュールで行われる。あるいは本発明の医薬組成物は、１日２回投与でき、この投与は１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回等のスケジュールで行われる。あるいは、本発明の医薬組成物は、１日３回投与でき、この投与は１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回等のスケジュールで行われる。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間に亘って増減させてよいことも理解されるだろう。
【実施例】
【０４８１】
これまで本発明を概説してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することによって更に容易に理解されるだろう。これらの実施例は例示として提供されており、特段の記載がない限り、本発明を限定することを意図したものではない。
【０４８２】
実施例１
ＣＤ１６結合分子の特性決定
上述のように、異なるマウス、ヒト化、又は最適化済み抗ＣＤ１６結合ドメインが組み込まれ、また：（１）ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍抗原（トラスツズマブ由来の結合ドメイン）；（２）ＨＩＶ抗原に対して免疫特異的な結合ドメイン（Ａ３２若しくは７Ｂ２由来の結合ドメイン）；（３）ＣＤ１９Ｂ細胞抗原（ＣＤ１９  ｍＡｂ  １由来の結合ドメイン）；又は（４）ＲＳＶ抗原に対して免疫特異的な結合ドメイン（パリビズマブ由来の結合ドメイン）に対して免疫特異的な結合ドメインを有する、一連のＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディＣＤ１６×ＤＡ結合分子を生成した（表１４）。
【０４８３】
【表１４】
2021505637.tif 000055
【０４８４】
マウス抗体ＣＤ１６‐Ｍ１、マウス抗体ＣＤ１６‐Ｍ２、ヒト化抗体３Ｇ８、並びに入手が容易な２つの市販の抗体：ＬＮＫ１６及びＤＪ１３０ｃ（Ａｂｃａｍ等）を含む２鎖ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ｘ、ＤＡＲＴ‐Ｙ及びＤＡＲＴ‐０）を用いて、競合研究を実施した。ＰｒｏｔｅＯｎ分析を実施して、チップ上に不動化したＣＤ１６分子に対する試験物品の結合を評価した。ＣＤ１６分子を、まず５ｎＭの捕捉されたＣＤ１６‐Ｆｃ（ヒトＩｇＧ２）融合タンパク質を用いてインキュベートし、次に１０ｎＭの第１の試験物品（試験物品１）を用いてインキュベートし、次に１０ｎＭの第２の試験物品（試験物品２）を用いてインキュベートした。抗ヒトＦｃＦ（ａｂ’）2断片を用いて結合を検出した。
【０４８５】
この研究により、ＣＤ１６‐Ｍ１、ＣＤ１６‐Ｍ２、ＬＮＫ１６及び３Ｇ８結合ドメインが、それぞれＣＤ１６の異なるエピトープに結合することが明らかになった。ＣＤ１６‐Ｍ２は、ＣＤ１６への結合に関して抗体ＤＪ１３０ｃと競合することが発見された。ＤＪ１３０ｃは、ＣＤ１６のＦｃ結合部位と重ならない部位においてＣＤ１６に結合することが報告されている（Tamm, A. et al. (1996) “The Binding Epitopes Of Human CD16 (Fc Gamma RIII) Monoclonal Antibodies. Implications For Ligand Binding,” J. Immunol. 157(4):1576-1581; Tamm, A. et al. (1996) “The Igg Binding Site Of Human FcgammaRIIIB Receptor Involves CC' And FG Loops Of The Membrane-Proximal Domain,” J. Biol. Chem. 271(7):3659-3666）。
【０４８６】
ＣＤ１６‐Ｍ１、ＤＪ１３０ｃ及びＬＮＫ１６の、ＩｇＧの存在下でＣＤ１６Ａに結合する能力を評価した。ＩｇＧの存在は、ＮＫ１６による結合を阻害すること、ＣＤ１６とＣＤ１６‐Ｍ１との間の結合は、ＩｇＧの存在によって阻害されないことが分かった。３Ｇ８エピトープは、ＣＤ１６のＦｃ結合部位と重なることが報告されている（Tamm、A. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271(7):3659-3666）。
【０４８７】
ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）の濃度が上昇すると、ＣＤ１６に対する抗体ＬＮＫ１６の結合が低下するため、ＬＮＫ１６によって認識されるエピトープがＣＤ１６のＦｃ結合部位と重なることが示され、またこれとは対照的に、ＤＪ１３０ｃ又はＣＤ１６‐Ｍ１のＣＤ１６結合ドメインによる結合は略影響を受けないため、これらの分子によって認識されるＣＤ１６エピトープがＣＤ１６のＦｃ結合部位と重ならないことが示された（図８）。
【０４８８】
上述のように、ＣＤ１６Ａは、１５８Ｆ多型及び１５８Ｖ多型を反映した２つの主要なアロタイプを有する。表１５に示すように、ＣＤ１６‐Ｍ１及びＣＤ１６‐Ｍ２のＣＤ１６結合ドメインは、これら両方のＣＤ１６アロタイプに、同様に高い親和性で結合することが分かった。この高い親和性は、ｈ３Ｇ８よりもおよそ３〜２５倍良好であり、ｈ３Ｇ８は、ＣＤ１６  １５８Ｆアロタイプに対して、ＣＤ１６  １５８Ｖアロタイプに比べて１０倍低い親和性を有する。ｈ３Ｇ８の結合ドメインは、速いオフレートを示すことが分かった。分析はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）フォーマットを用いて実施され、このフォーマットでは、ダイアボディ分子はヤギ（Ｆａｂ’）2抗ヒトＦｃ表面上で捕捉され、（Ａｖｉｔａｇで標識された）ヒトＣＤ１６ＡＶ／Ｆ分子は、捕捉されたダイアボディ上を通過した（正規化、１：１結合フィット）。
【０４８９】
【表１５】
2021505637.tif 000056
【０４９０】
ＰｒｏｔｅＯｎ分析を実施して、構築されたダイアボディのＣＤ１６結合ドメインの、チップ上に不動化されたＣＤ１６‐Ｈｉｓタグ付き分子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する結合を評価した。ＣＤ１６分子を抗ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体によって不動化し、続いてダイアボディと共にインキュベートした。ＣＤ１６結合に関する研究の結果を、表１６にまとめる（ＤＡＲＴ‐ＺのＣＤ１６結合ドメインは、ＣＤ１６Ａに対して特異的であるｓｃＦｖ４‐ＬＳ２１に由来する）。
【０４９１】
【表１６】
2021505637.tif 000057
【０４９２】
この結果は、ＣＤ１６‐Ｍ１又はＣＤ１６‐Ｍ２  ＣＤ１６結合ドメインを含むダイアボディが、ＣＤ１６Ａの両方の対立遺伝子に対する比較的高い親和性、及びコンパレータ分子より高い親和性を示したことを示す。ｈＣＤ１６‐Ｍ２（ＶＨ１）ＣＤ１６結合ドメインを含むダイアボディは、ｈＣＤ１６‐Ｍ２（ＶＨ２）ＣＤ１６結合ドメインを含むダイアボディよりもわずかに良好な結合を示した（ＤＡＲＴ‐ＤとＤＡＲＴ‐Ｅとを比較）。
【０４９３】
実施例２
ＤＡＲＴ‐Ｆ及びＤＡＲＴ‐Ｇ  ＣＤ１６結合分子の、ＮＫ細胞、好中球、及びＴ細胞に対する結合
本発明のＣＤ１６×ＤＡ結合分子の、ＣＤ１６に結合する能力を実証するために、ドナー被験者の全血を、ＣＤ１６結合ダイアボディ：ＤＡＲＴ‐Ｆ及びＤＡＲＴ‐Ｇ、（ＣＤ結合ドメインを介したＴ細胞結合に関する陽性対照としての）ＨＩＶ×ＣＤ３ダイアボディ、（全ての結合に関する陰性対照としての）ＨＩＶ×ＲＳＶダイアボディ、並びにｈ３Ｇ８×ＲＳＶダイアボディコンパレータ分子の存在下でインキュベートした。インキュベート後、細胞を：抗ＣＤ５６‐アロフィコシアニン（ＣＤ５６  ＡＰＣ、ＮＫ細胞マーカー）、抗ＣＤ６６ｂ‐フルオレセインイソシアネート（ＣＤ６６ｂ  ＦＩＴＣ、好中球細胞マーカー）及び抗ＣＤ３‐ペリジニンクロロフィルタンパク質‐Ｃｙ５．５（ＣＤ３  ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５、Ｔ細胞マーカー）、並びに抗ヒトＦｃ‐フィコエリスリン（αｈＦｃ  ＰＥ）で標識して、ダイアボディの結合及び細胞表面を検出した。標識された細胞を、ＮＫ細胞に対してゲーティングしたフローサイトメトリーで分析した。第１の被験者に関する調査の同時染色の結果を図９Ａ〜９Ｃに示し、この結果は、ＤＡＲＴ‐Ｆ（ｈＣＤ１６‐Ｍ１）がＤＡＲＴ‐Ｇ（ｈＣＤ１６‐Ｍ２）に比べて、ＮＫ細胞の表面上のＣＤ１６Ａに対する高い親和性を有していたことを示し、ＤＡＲＴ‐Ｆ及びＤＡＲＴ‐Ｇはいずれも、ｈ３Ｇ８×ＲＳＶダイアボディコンパレータ分子よりも高い親和性を有する（図９Ａ）。対照的に、ｈ３Ｇ８×ＲＳＶダイアボディコンパレータ分子は好中球のＣＤ１６Ｂに結合できたものの、ＤＡＲＴ‐Ｇの結合能力はより低く、またＤＡＲＴ‐Ｆは結合能力を略有していなかった（図９Ｂ）。図９Ｃに示すように、ＣＤ１６結合分子はＴ細胞に結合できなかった。
【０４９４】
第２のドナー被験者の全血を用いて、同様の結合を観察した。リンパ球結合（ＣＤ１６Ａ  Ｆ／Ｖ）及び好中球結合（ＣＤ１６Ｂ、アロタイプ未判定）を、ＤＡＲＴ‐Ｆ（ｈＣＤ１６‐Ｍ１）、ＤＡＲＴ‐Ｇ（ｈＣＤ１６‐Ｍ１）、及びｈ３Ｇ８×ＲＳＶダイアボディコンパレータを用いて、基本的に上述のようにして評価した。この調査の結果を図１０Ａ〜１０Ｂに示す。図１０Ａに示すように、ＤＡＲＴ‐Ｆ（ｈＣＤ１６‐Ｍ１）及びＤＡＲＴ‐Ｇ（ｈＣＤ１６‐Ｍ１）はいずれも、ゲーティングされたリンパ球集団のＣＤ１６Ａ発現細胞への結合を示し、ＤＡＲＴ‐Ｆがより高い結合を示したが、ｈ３Ｇ８×ＲＳＶダイアボディコンパレータ分子ははるかに弱い結合を示した。図１０Ｂに示すように、結合を示したＤＡＲＴ‐Ｇ及びｈ３Ｇ８×ＲＳＶダイアボディコンパレータ分子とは対照的に、ＤＡＲＴ‐Ｆは、ゲーティングされた顆粒球集団のＣＤ１６Ｂ発現細胞には結合しなかった。
【０４９５】
実施例３
抗ＣＤ１６結合分子ＣＤ１６‐Ｍ１及びＣＤ１６‐Ｍ２のＣＤ１６Ｂアロタイプ特異性
本発明のＣＤ１６×ＤＡ結合分子の、ＣＤ１６Ｂのグリコシル化アロタイプＮＡ１及びＮＡ２を区別する能力を実証するために、ＤＡＲＴ‐Ｆ（ｈＣＤ１６‐Ｍ１）及びｈ３Ｇ８×ＲＳＶダイアボディコンパレータを、全血の存在下でインキュベートし、基本的に上述のように分析した。その結果は、ＣＤ６６ｂ＋細胞（即ち好中球及び好酸球）に対してゲーティングされた全血のダイアボディ染色を示す。図１１Ａ〜１１Ｂはこのような分析の結果を示し、ｈ３Ｇ８×ＲＳＶダイアボディコンパレータが、ＮＡ１に対する強い結合、及びＮＡ２に対する中程度の結合を示したことを示している。対照的に、ＤＡＲＴ‐Ｆは、ＮＡ２に対する強い結合、及びＮＡ１に対する弱い結合を示した。
【０４９６】
実施例４
ＣＤ１６結合分子ＣＤ１６‐Ｍ１及びＣＤ１６‐Ｍ２のＣＤ１６Ｂアロタイプ特異性
本発明のＣＤ１６×ＤＡ結合分子の、白血球に結合する能力を更に評価するために、ＣＤ１６‐Ｍ１のＣＤ１６結合ドメインの、全血由来のＮＫ細胞及び顆粒球に結合する能力を評価した。ＤＡＲＴ‐Ｃは、全血白血球細胞の存在下でインキュベートし、基本的に上述のように分析した。その結果は、ＮＫ細胞（白血球の０．６％）に対して、又は顆粒球（白血球の４９％）に対してゲーティングされた全血のダイアボディ染色を示す。図１２はこのような分析の結果を示し、ＣＤ１６‐Ｍ１がＮＫ細胞に優先的に結合することを示している。
【０４９７】
実施例５
ヒトＣＤ１６、カニクイザルＣＤ１６、及びマウスＣＤ１６に対するＣＤ１６結合分子の結合
ヒトＣＤ１６、カニクイザルＣＤ１６、及びマウスＣＤ１６のアミノ酸配列は、様々な程度の相同性を共有する（図１３；それぞれ配列番号：１８３、１８４、及び１８５）ため、抗体ＣＤ１６‐Ｍ１、ＣＤ１６‐Ｍ２及び３Ｇ８のＣＤ１６結合ドメインを有するＣＤ１６×ＤＡ結合分子の、ヒトＣＤ１６、カニクイザルＣＤ１６、及びマウスＣＤ１６に結合する能力を調査した。この分析は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）フォーマットを用いて実施され、このフォーマットでは、ダイアボディ分子はＨｅｒ２‐Ｈｉｓタグ付き表面上に捕捉され、ＣＤ１６分子（ＩｇＧ２‐Ｆｃ融合タンパク質、２５及び１００ｎＭ）は、捕捉されたダイアボディ上を通過した（正規化、２価結合フィット推定値）。この調査の結果を表１７にまとめる。
【０４９８】
【表１７】
2021505637.tif 000058
【０４９９】
ｈ３Ｇ８のＣＤ１６結合ドメインは、ヒトＣＤ１６ａへの結合に比べて若干低い親和性で、カニクイザルのＣＤ１６ａに結合できることが分かった。ＤＡＲＴ‐Ｃ（ｈＣＤ１６‐Ｍ１）及びＤＡＲＴ‐Ｄ（ｈＣＤ１６‐Ｍ２）のＣＤ１６結合ドメインは、カニクイザルＣＤ１６に対して低い親和性を有することが分かった。試験したＣＤ１６結合分子はいずれも、マウスＣＤ１６に結合できないことが分かった。これはマウスＣＤ１６の、ヒトＣＤ１６との相同性の低さに応じたものである。
【０５００】
実施例６
ＨＥＲ２／Ｎｅｕ‐陽性細胞のＣＤ１６結合分子仲介型細胞傷害性の評価
本発明のＣＤ１６×ＤＡ結合分子の、細胞殺滅を仲介する能力を実証するために、ＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子：
（ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｃ；
（ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｄ；
（ｈ３Ｇ８  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐１；又は
ＨＥＲ２／Ｎｅｕ×ＲＳＶダイアボディ（陰性対照）
を、エフェクタ細胞（ヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝３０：１）又は精製済みヒトＮＫ細胞（Ｅ：Ｔ＝２：１））の存在下で、異なるレベルのＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する標的癌細胞と共に、２４時間にわたって別個にインキュベートした。基本的に以下のようにして、損傷した細胞による、培地中への乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することにより、パーセンテージ細胞傷害性（即ち標的転換細胞殺滅）を決定した。この調査の結果を図１４Ａ〜１４Ｅに示す。図１４Ａは、精製ＮＫ細胞によってＮ８７  ＨＥＲ２／ｎｅｕ標的細胞（（ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現：＋＋＋）に対して示された細胞傷害性を示し；このようなＮＫ細胞のＣＤ１６Ａアロタイプは１５８Ｆ／１５８Ｆであった。図１４Ｂは、精製ＮＫ細胞によってＭＣＦ７  ＨＥＲ２／ｎｅｕ標的細胞（ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現：＋／‐）に対して示された細胞傷害性を示し；このようなＮＫ細胞のＣＤ１６Ａアロタイプは１５８Ｆ／１５８Ｆであった。図１４Ｃは、ＰＢＭＣによってＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１  ＨＥＲ２／ｎｅｕ標的細胞（ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現：＋／‐）に対して示された細胞傷害性を示し；このようなＰＢＭＣ調製物のＮＫ細胞のＣＤ１６Ａアロタイプは評価されなかった。図１４Ｄは、ＰＢＭＣによってＮ８７  ＨＥＲ２／ｎｅｕ標的細胞（ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現：＋＋＋）に対して示された細胞傷害性を示し；このようなＰＢＭＣ調製物のＮＫ細胞のＣＤ１６Ａアロタイプは１５８Ｆ／１５８Ｖであった。図１４Ｅは、ＰＢＭＣによってＨｓ７００Ｔ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ標的細胞（ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現：＋／‐）に対して示された細胞傷害性を示し；このようなＰＢＭＣ調製物のＮＫ細胞のＣＤ１６Ａアロタイプは１５８Ｆ／１５８Ｖであった。これらの結果は、ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＣＤ１６結合ドメインを含むＣＤ１６×ＤＡ結合分子が、ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＣＤ１６結合ドメインを含むＣＤ１６×ＤＡ結合分子に比べて、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現性癌細胞に対する高い細胞傷害性を示したこと、及びこのようなＣＤ１６結合ドメインを含む分子が、ｈ３Ｇ８  ＣＤ１６結合ドメインを含むＣＤ１６×ＤＡ結合分子に比べて、高い細胞傷害性を示したことを示す。
【０５０１】
実施例７
ＨＩＶ感染細胞のＣＤ１６結合分子仲介型細胞傷害性の評価
本発明のＣＤ１６×ＤＡ結合分子の、細胞殺滅を仲介する能力を更に実証するために、ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子：
（ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｆ；
（ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｇ；又は
ＤＡＲＴ‐２（ここでは陰性対照として使用されるｈ３Ｇ８×ＲＳＶ  ダイアボディ）
を、エフェクタ細胞（ヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝３０：１）又は精製済みヒトＮＫ細胞（Ｅ：Ｔ＝３：１））の存在下で、ＨＩＶ  Ｅｎｖを発現する標的２９３ＨＥＫ  Ｄ３７１と共に、２４時間にわたって別個にインキュベートした。基本的に以下のようにして、ＬＤＨ標的転換細胞殺滅アッセイを用いて、損傷した細胞による、培地中への乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することにより、パーセンテージ細胞傷害性（即ち標的転換細胞殺滅）を決定した。この調査の結果を図１５Ａ〜１５Ｃに示す。図１５Ａは、第１のドナーのＰＢＭＣによって２９３ＨＥＫ  Ｄ３７１標的細胞に対して示された細胞傷害性を示し、このようなＰＢＭＣ調製物のＮＫ細胞のＣＤ１６Ａアロタイプは１５８Ｆ／１５８Ｖであった。図１５Ｂは、第２のドナーのＰＢＭＣによって２９３ＨＥＫ  Ｄ３７１標的細胞に対して示された細胞傷害性を示し、このようなＰＢＭＣ調製物のＮＫ細胞のＣＤ１６Ａアロタイプは１５８Ｆ／１５８Ｆであった。図１５Ｃは、精製ＮＫ細胞によって２９３ＨＥＫ  Ｄ３７１標的細胞ＭＣに対して示された細胞傷害性を示し、ＮＫ細胞のＣＤ１６Ａアロタイプは１５８Ｆ／１５８Ｖであった。これらの結果は、ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＣＤ１６結合ドメインを含むＣＤ１６×ＤＡ結合分子が、ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＣＤ１６結合ドメインを含むＣＤ１６×ＤＡ結合分子に比べて、ＨＩＶ  ｅｎｖ発現性細胞に対する高い細胞傷害性を示したことを示す。
【０５０２】
上で示したように、ＤＡＲＴ‐Ｆ及びＤＡＲＴ‐Ｇはいずれも、３つのポリペプチド鎖からなるＦｃドメイン含有ダイアボディである。Ｆｃドメインを含まない本発明のＣＤ１６×ＤＡ結合分子の、細胞殺滅を仲介する能力を実証するために、ＣＤ１６×ＨＩＶ  ｅｎｖ結合分子：
（ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｘ；
（ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｙ；
（ｈ３Ｇ８  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐０；又は
ＤＡＲＴ‐３（ここでは陰性対照として使用される、ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＣＤ１６結合ドメインを有するＣＤ１６×ＲＳＶダイアボディ）
を、エフェクタ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ＣＤ１６Ａ  １５８Ｆ（図１６Ａ）又は１５８Ｖ／ＮＦＡＴ‐Ｌｕｃ細胞（図１６Ｂ））の存在下で、ＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質を発現する標的ＨＥＫ／Ｄ３７１細胞と共に、別個にインキュベートした。基本的に以下のようにして、ＬＤＨ標的転換細胞殺滅アッセイを用いて、損傷した細胞による、培地中への乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することにより、パーセンテージ細胞傷害性（即ち標的転換細胞殺滅）を決定した。この調査の結果を図１６Ａ〜１６Ｂに示す。
【０５０３】
図１６Ａ〜１６Ｂは、（ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｘが、（ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＣＤ１６結合ドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｙよりも高いパーセンテージ細胞傷害性を示したことを示す。（ｈ３Ｇ８  ＣＤ１６結合ドメイン）を有するＤＡＲＴ‐０は、ＤＡＲＴ‐Ｙよりも高いレベルの細胞傷害性を仲介することが分かったが、この効果は、１５８Ｖアロタイプを有するエフェクタ細胞に依存していた（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。対照的に、ＤＡＲＴ‐Ｘ又はＤＡＲＴ‐Ｙが仲介する細胞傷害性は、ＣＤ１６Ａのアロタイプに依存していなかった（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。
【０５０４】
実施例８
非ヒト霊長類ＣＤ１６への結合の最適化
上述のように、ｈＣＤ１６‐Ｍ１は、カニクイザルＣＤ１６（ｃｙｎｏＣＤ１６）に対する低い親和性を有することが分かった。ランダムな突然変異誘発を用いて、ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＣＤＲL３（Ｋａｂａｔ位置９０〜９５）及びＣＤＲH３（Ｋａｂａｔ位置９６〜１００）ドメイン内に置換を導入した。突然変異体をスクリーニングして、非ヒト霊長類ＣＤ１６（例えばｃｙｎｏＣＤ１６）への結合が強化されたクローンと、ヒトＣＤ１６の両方の対立遺伝子への結合親和性を保持したクローンとを同定した。突然変異ＣＤＲH３を有する、「ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａ」と呼称される変異型、及び突然変異ＣＤＲL３を有する、「ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ」と呼称される変異型を、更なる分析のために選択した。更に、ＣＤＲH３突然変異とＣＤＲL３突然変異とを組み合わせた第３の変異型を生成し、「ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢ」と命名した。ＣＤＲ並びにＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列は、既に提供されている（例えば表８を参照）。最適化済み抗ＣＤ１６結合ドメイン：ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａ、ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ、又はｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢが組み込まれ、かつ抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合ドメインを有する、例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子を生成し、それぞれＤＡＲＴ‐Ｉ、ＤＡＲＴ‐Ｊ、及びＤＡＲＴ‐Ｋと命名した（概要については表１２を、詳細な説明及び全アミノ酸配列については上記を参照）。
【０５０５】
最適化済みｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａ、ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ、及びｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢを有する例示的なＣＤ１６×ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子の、ヒト（図１７Ａ）、カニクイザル（図１７Ｂ）、及びアカゲザル（図１７Ｃ）ＮＫ細胞の表面上で発現されるＣＤ１６に結合する能力を、フローサイトメトリーによって検査した。簡潔に述べると、ＰＢＭＣを単離し、ＣＤ１６結合ダイアボディ：（親ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＶＨ及びＶＬドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｃ；（それぞれ最適化済みｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａ、ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ、及びｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢ  ＶＨ／ＶＬドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｉ、ＤＡＲＴ‐Ｊ、ＤＡＲＴ‐Ｋ；（ＣＤ１６結合に関する陰性対照としての）ＨＥＲ２／ｎｅｕ×ＲＳＶダイアボディ；ＤＡＲＴ‐３（親ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＶＨ及びＶＬドメインを有するＣＤ１６×ＲＳＶダイアボディ対照）；又はＤＡＲＴ‐１（ｈ３Ｇ８×ＨＥＲ２／ｎｅｕダイアボディ）コンパレータ分子の存在下でインキュベートした。インキュベート後、細胞を：抗ＣＤ５６‐アロフィコシアニン（ＣＤ５６  ＡＰＣ、ＮＫ細胞マーカー）、及び抗ＣＤ３‐ペリジニンクロロフィルタンパク質‐Ｃｙ５．５（ＣＤ３  ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５、Ｔ細胞マーカー）、並びに抗ヒトＦｃ‐フィコエリスリン（αｈＦｃ  ＰＥ）で標識して、ダイアボディの結合及び細胞表面を検出した。標識された細胞を、ＮＫ細胞に対してゲーティングしたフローサイトメトリーで分析した。
【０５０６】
この調査の同時染色の結果を図１７Ａ〜１７Ｃに示し、この結果は、最適化済み変異型を含むＣＤ１６×ＤＡ結合分子、特にｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢ（ＤＡＲＴ‐Ｋ）が、非ヒト霊長類ＣＤ１６（図１７Ｂ〜１７Ｃ）に関して改善された親和性を示した（図１７Ｂ〜１７Ｃ）が、ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ（ＤＡＲＴ‐Ｊ）及びｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢ（ＤＡＲＴ‐Ｋ）を含む分子は、このアッセイにおいてヒトＣＤ１６への結合が若干低下した（図１７Ａ）ことを示す。陰性対照では結合は観察されなかった。
【０５０７】
最適化済みｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａ、ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ、及びｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢ結合ドメインを有するＣＤ１６×ＤＡ結合分子の、複数のドナーからのヒトＰＢＭＣ（ｈｕＰＢＭＣ）又はカニクイザルＰＢＭＣ（ｃｙｎｏＰＢＭＣ）によるＪＩＭＴ‐１‐Ｌｕｃ標的細胞の標的転換細胞殺滅を仲介する能力を、２つの異なる標的転換細胞殺滅アッセイを用いて評価した。これらの研究からの代表的なデータを図１８Ａ〜１８Ｄに提示し、表１８にまとめた。いずれのアッセイにおいても、（親ｈＣＤ１６‐Ｍ１  ＶＨ及びＶＬドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｃ；（それぞれ最適化済みｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａ、ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ、及びｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢ  ＶＨ／ＶＬドメインを有する）ＤＡＲＴ‐Ｉ、ＤＡＲＴ‐Ｊ、若しくはＤＡＲＴ‐Ｋ；陰性対照（ＨＥＲ２／ｎｅｕ×ＲＳＶダイアボディ若しくはＣＤ１６×ＲＳＶダイアボディ、ＤＡＲＴ‐３）；又はＤＡＲＴ‐１（ｈ３Ｇ８×ＨＥＲ２／ｎｅｕダイアボディ）コンパレータ分子を、ｈｕＰＢＭＣ（図１８Ａ〜１８Ｂ）又はｃｙｎｏＰＢＭＣ（図１８Ｃ〜１８Ｄ）、及びＪＩＭＴ‐１‐Ｌｕｃ標的腫瘍細胞をＥ：Ｔ比３０：１で用いてインキュベートし、パーセンテージ細胞傷害性（即ち細胞殺滅）を決定した。一方のアッセイでは、基本的に以下のようにして、ＬＤＨ標的転換細胞殺滅アッセイを用いて、損傷した細胞による、培地中への乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することにより、細胞殺滅を決定した（図１８Ａ及び１８Ｃ）。別のアッセイでは、基本的に以下に記載のようにして、ＬＵＭ標的転換細胞殺滅アッセイを用いて、標的細胞の細胞ルシフェラーゼ活性を測定する、ルミネッセンス（ＬＵＭ）アッセイにより、細胞傷害性を決定した（図１８Ｂ及び１８Ｄ）。２４時間及び４８時間のインキュベート後のＬＤＨアッセイに関するＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）を、表１８に提示する。
【０５０８】
【表１８】
2021505637.tif 000059
【０５０９】
これらのデータは、ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＣＤ１６結合ドメインを含むＣＤ１６×ＤＡ結合分子（ＤＡＲＴ‐Ｃ）が、明らかに低い親和性でｃｙｎｏＣＤ１６に結合するものの、標的転換細胞殺滅を仲介できることを示している。更に、最適化済みＣＤ１６結合ドメインｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａを含むＣＤ１６×ＤＡ結合分子（ＤＡＲＴ‐Ｉ）、ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂを含むＣＤ１６×ＤＡ結合分子（ＤＡＲＴ‐Ｊ）、又はｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢを含むＣＤ１６×ＤＡ結合分子（ＤＡＲＴ‐Ｋ）は、ｈｕＰＢＭＣではｈＣＤ１６‐Ｍ１を含む同じ分子（ＤＡＲＴ‐Ｃ）に比べてわずかな細胞傷害性の低下しか示さないにもかかわらず、ＣｙｎｏＰＢＭＣでは改善された細胞傷害性を示した。
【０５１０】
実施例９
ＣＤ１６×ＣＤ１９結合分子
更なる研究では、抗ＣＤ１９結合ドメインを有し、またｈＣＤ１６‐Ｍ１の抗ＣＤ１６結合ドメイン、又はｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂ若しくはｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢの最適化済み抗ＣＤ１６結合ドメインが組み込まれた例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子を生成し、それぞれＤＡＲＴ‐Ｌ、ＤＡＲＴ‐Ｍ、及びＤＡＲＴ‐Ｎと命名した（概要については表１２を、詳細な説明及び全アミノ酸配列については上記を参照）。３つの更なる分子を生成し、（ｈＣＤ１６‐Ｍ１を含む）ＤＡＲＴ‐５、（ｈＣＤ１６‐Ｍ１Ａを含む）ＤＡＲＴ‐６、及び（ｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢ）を含むＤＡＲＴ‐７と命名した。これらにおいては、ＣＤ１９結合ドメインが抗ＲＳＶ結合ドメインで置換されており（概要については表１２を、詳細な説明については上記を参照）、これらの例示的なＣＤ１６×ＲＳＶ結合分子は、以下ではＣＤ１９結合に関する陰性対照として使用される。
【０５１１】
ＤＡＲＴ‐Ｌ、ＤＡＲＴ‐Ｍ、及びＤＡＲＴ‐Ｎ；対照分子：ＤＡＲＴ‐５、ＤＡＲＴ‐６、及びＤＡＲＴ‐７；又はＣＤ３×ＣＤ１９ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディであるズボルツキシズマブ（ＭＧＤ０１１としても知られる；WHO Drug Information, 2016, Proposed INN: List 116, 30(4):627-629中に見られるアミノ酸配列）の、ヒトＰＢＭＣ（ｈｕＰＢＭＣ）エフェクタ細胞（Ｅ：Ｔ＝３０：１）によるＲａｊｉ‐Ｌｕｃ標的細胞の標的転換細胞殺滅を仲介する能力を、基本的に以下に記載されるように、ＬＤＨ及びＬＵＭ細胞殺滅アッセイで評価した。これらの研究からの代表的なデータを、図１９Ａ〜１９Ｄに提示する。ＬＤＨアッセイの結果は、２４時間（図１９Ａ）及び４８時間（図１９Ｂ）のインキュベート後、ＣＤ１６×ＤＡ結合分子がＭＧＤ０１１と同様の細胞傷害性を示し、ここで最適化済みＣＤ１６結合ドメインｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂを含むＣＤ１６×ＤＡ結合分子（ＤＡＲＴ‐Ｍ）、又はｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢを含むＣＤ１６×ＤＡ結合分子（ＤＡＲＴ‐Ｎ）は、ｈＣＤ１６‐Ｍ１を含む同じ分子（ＤＡＲＴ‐Ｌ）と比べて、ｈｕＰＢＭＣによる同様の細胞傷害性を示したことを示す。ＬＵＭアッセイにおいて、２４時間後（図１９Ｃ）及び４８時間後（図１９Ｄ）に同様の結果が観察された。ＣＤ１９結合ドメインを含まない対照分子（ＤＡＲＴ‐５、ＤＡＲＴ‐６、及びＤＡＲＴ‐７）に関しては、これらの研究において最小の細胞傷害性が観察された。
【０５１２】
（Ｂ細胞抗原ＣＤ１９に対する結合部位を有する）例示的なＣＤ１６×ＤＡ結合分子ＤＡＲＴ‐Ｌ、ＤＡＲＴ‐Ｍ、ＤＡＲＴ‐Ｎ、並びに陰性対照：（ＣＤ１６に対する結合部位及びＲＳＶに対する結合部位を有する）ＤＡＲＴ‐５及びＤＡＲＴ‐６を、試験管内で自己Ｂ細胞欠乏を仲介する能力に関して評価した。簡潔に述べると、ヒト又はカニクイザルから単離したＰＢＭＣを、補足培地中で、濃度を上昇させたＤＡＲＴ‐Ｌ、ＤＡＲＴ‐Ｍ、ＤＡＲＴ‐Ｎ、並びにＣＤ１９結合ドメインを含まない対照分子ＤＡＲＴ‐５及びＤＡＲＴ‐６の存在下でインキュベートした。ｈｕＰＢＭＣに関してはインキュベート後７２時間及び９６時間において（それぞれ図２０Ａ〜２０Ｂ）、ｃｙｎｏＰＢＭＣに関してはインキュベート後７２時間及び１４４時間において（それぞれ図２０Ｃ〜２０Ｄ）、Ｂ細胞レベルを、（陰性選択のためのＣＤ３、及びＢ細胞マーカーとしてのＣＤ２０；ＣＤ３／ＣＤ２０+を用いた）フローサイトメトリーによって分析した。これらの研究からの代表的なデータを図２０Ａ〜２０Ｄに示し、これらのデータは、全てのＣＤ１６×ＤＡ結合分子が、ｈｕＰＢＭＣ（図２０Ａ〜２０Ｂ）及びｃｙｎｏＰＢＭＣ（図２０Ｃ〜２０Ｄ）の両方から自己Ｂ細胞を欠乏させることができたことを示す。最適化済みＣＤ１６結合ドメインｈＣＤ１６‐Ｍ１Ｂを含むＣＤ１６×ＤＡ結合分子（ＤＡＲＴ‐Ｍ）、又はｈＣＤ１６‐Ｍ１ＡＢを含むＣＤ１６×ＤＡ結合分子（ＤＡＲＴ‐Ｎ）は、ｈＣＤ１６‐Ｍ１を含む同じ分子（ＤＡＲＴ‐Ｌ）に比べて、ｈｕＰＢＭＣ及びｃｙｎｏＰＢＭＣのいずれを用いても、Ｂ細胞の比較的大幅な減少を仲介した。しかしながら、ｃｙｎｏＰＢＭＣからＢ細胞を欠乏させるには、比較的高い濃度が必要であった。この傾向は、複数のＰＢＭＣドナーに関して観察された。ＣＤ１９結合ドメインを含まない対照分子（ＤＡＲＴ‐５及びＤＡＲＴ‐６）に関しては、最小のＢ細胞欠乏が観察された。
【０５１３】
実施例１０
例示的な標的転換細胞殺滅アッセイ
ＬＤＨ標的転換細胞殺滅アッセイ：これらのアッセイは、基本的に以下に記載されるようにＬＤＨ放出を定量的に測定するＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）等を用いて実施してよい。標的細胞（例えば標的腫瘍細胞）を、密度４×１０5細胞／ｍＬ（又は所望のＥ：Ｔ比を達成するために適切な密度）でアッセイ培地（例えばフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）中に再懸濁し、アッセイ開始時の生存率は好ましくは９０％より高く、また、エフェクタ細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比１０：１又は３０：１（又は他の所望のＥ：Ｔ比）を達成するために適切な密度（例えば４×１０5細胞／ｍＬ）でアッセイ培地中に懸濁された、単離された精製エフェクタ細胞（例えばヒト又は非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）ドナーから精製したＰＢＭＣ又はＮＫ細胞）を使用する。標的細胞懸濁液のアリコート（例えば５０μＬ、〜２０，０００細胞）、エフェクタ細胞懸濁液のアリコート（例えば１０：１のＥ：Ｔ比のために１００μＬ、〜２００，０００細胞）、及び（例えば５倍又は１０倍に）連続希釈した試験物品のアリコート（例えば５０μＬ）を、マイクロタイタープレートの２つの同一のウェルに添加し、２４〜９６時間、又は必要に応じて更に長い時間にわたってインキュベートする（３７℃、５％ＣＯ２）。インキュベートの終了時、溶解液のアリコート（例えば３０μＬ）を添加し、プレートを〜１０分間にわたってインキュベートして、標的細胞を完全に溶解させる。続いてプレートを遠心分離して細胞の破片をペレット化し、（例えば２１２×ｇで５分間）、上清のアリコート（例えば４０μＬ）を、アッセイプレートの各ウェルから平底ＥＬＩＳＡプレートに移し、ＬＤＨ基質溶液のアリコート（例えば４０μＬ）を各ウェルに添加する。プレートを暗所で室温において１０〜２０分間インキュベートし、停止液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ＃Ｇ１８３Ａ）のアリコート（例えば４０μＬ）を添加する。光学密度を、Ｖｉｃｔｏｒ２マルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＃１４２０‐０１４）等で、１時間以内にわたって４９０ｎｍで測定する。光学密度（ＯＤ）データから、以下の式：
2021505637.tif 000060
を用いて特定の細胞溶解を計算する。ここで「ＡＩＣＣ」は抗体非依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ‐ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）であり、「ＭＲ」は最大放出（ｍａｘｉｍａｌ  ｒｅｌｅａｓｅ）であり、「ＳＲ」は自発的放出（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅ）である。シグモイド用量‐応答関数に対する細胞傷害値の曲線当てはめによって、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６  ｓｏｆｔｗａｒｅ等を用いて用量‐応答曲線を生成する。
【０５１４】
発光（ＬＵＭ）標的転換細胞殺滅アッセイ：これらのアッセイは、Ｓｔｅａｄｙ‐Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）又は類似の基質を用いて実施でき、基本的に以下に記載されるように、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポータ遺伝子を発現するように操作された生存標的細胞（例えばＪＩＭＴ‐１‐Ｌｕｃ、Ｒａｊｉ‐Ｌｕｃ細胞）における細胞ルシフェラーゼ活性を定量的に測定できる。これらのアッセイに関する準備及び設定は、上述のＬＤＨアッセイと基本的に同一である。インキュベート後、培養培地のアリコート（例えば１００μＬ）を各ウェルから除去し、続いてＳｔｅａｄｙ‐Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）等のアリコート（例えば１００μＬ）を各ウェルに添加し、その後、標的細胞を完全に溶解するために、ピペッティングによって数回上下させる。プレートを暗所で室温において１０分間インキュベートし、ＶｉｃｔｏｒＸ４マルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＃１４２０‐０１４）等を用いて、読み取り値として相対発光量（ＲＬＵ）で発光強度を測定する。ＲＬＵは、標的細胞の相対生存率の指標である。シグモイド用量‐応答関数に対するＲＬＵ値の曲線当てはめによって、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６  ｓｏｆｔｗａｒｅ等を用いて用量‐応答曲線を生成する。
【０５１５】
本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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