(57)【要約】  本発明は、龍膽草及び接骨木抽出物を含む骨粗しょう症の予防または治療用組成物に関し、本発明の目的は、骨形成を高め、骨吸収を抑制することができる骨粗しょう症の予防または治療用組成物を提供することにある。なお、天然物である龍膽草及び接骨木抽出物を含んで生体親和性を高め、副作用がないため、安定的に骨粗しょう症の予防または治療効果を奏する骨粗しょう症の予防または治療用組成物を提供することにある。
2021525222.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
龍膽草及び接骨木抽出物を含む骨粗しょう症の予防または治療用組成物。
【請求項２】
前記龍膽草抽出物及び前記接骨木抽出物の混合重量比は、１：０．１〜１０である、請求項１に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物。
【請求項３】
前記龍膽草及び接骨木の抽出物を全体組成物の総重量に対して０．００１〜１００重量％で含む、請求項１に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物。
【請求項４】
前記龍膽草及び接骨木抽出物は、熱水抽出により抽出されたものである、請求項１に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物。
【請求項５】
前記組成物は、骨形成に関連する遺伝子の発現を向上させるものである、請求項１に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物。
【請求項６】
前記骨形成に関連する遺伝子は、ＡＬＰ、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、ＢＭＰ、ＴＧＦ−β及びｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎからなる群より選択された１種以上の遺伝子である、請求項５に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物。
【請求項７】
前記組成物は、骨吸収に関連する遺伝子の発現を抑制させるものである、請求項１に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物。
【請求項８】
前記骨形成に関連する遺伝子は、ＮＦ−ｋＢ、ｃ−ＦＯＳ、ＮＦＡＴＣ−１、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ及びＭＭＰ−９からなる群より選択された１種以上の遺伝子である、請求項７に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物。
【請求項９】
１）龍膽草及び接骨木を溶媒に入れ、加熱して抽出物を得る段階；及び
２）前記１）段階から得た抽出物を減圧下で濃縮する段階；
を含む請求項１に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物の製造方法。
【請求項１０】
前記１）段階の加熱温度は、８０〜１００℃である、請求項９に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物の製造方法。
【請求項１１】
前記２）段階は、３０〜７０℃で行う段階である、請求項９に記載の骨粗しょう症の予防または治療用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１９年４月２９日付け韓国特許出願第１０−２０１９−００４９９４６号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含む。
【０００２】
本発明は、龍膽草及び接骨木抽出物を含む骨粗しょう症の予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
現在、高齢社会に入り、骨代謝疾患が大きな問題として台頭しており、骨代謝疾患のうち骨粗しょう症が最も大きな比重を占めている。一方、骨粗しょう症とは、カルシウム代謝の不均衡により骨格の組成が変化し、骨の質量（ｂｏｎｅ ｍａｓｓ）が減少して橈骨及び大腿部、脊椎の骨折を容易にもたらす病気で、特に、閉経後の女性に発生頻度が最も高く示され、ｅｓｔｒｏｇｅｎの分泌が主要原因と報告されている。
【０００４】
骨は成長が終わった後も再形成（ｂｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）が持続的に起こり、この過程を通じて造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）による骨形成と破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）による骨吸収との恒常性が維持され、通常の条件下での骨組織は骨形成と骨吸収が均衡をなしている。
【０００５】
造骨前駆細胞が様々な因子（ＢＭＰ、ＡＬＰ、ＴＧＦ−β）によって分化されて造骨細胞に変化し、完全に分化した造骨細胞は非タンパク質及びタンパク質成分によって骨基質（ｂｏｎｅ ｍａｔｒｉｘ）内で骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）の形態で存在する。一方、造骨細胞はＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ−ｋＢ ｌｉｇａｎｄ）と、これの誘導受容体（ｄｅｃｏｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるＯＰＧ（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）を生成する。
【０００６】
骨吸収において非常に重要な過程は破骨細胞への分化であり、分化を媒介する主なリガンドはＲＡＮＫＬで、ＲＡＮＫＬが破骨前駆細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｐｒｏｐｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）の表面にある受容体であるＲＡＮＫに結合すると、破骨前駆細胞が破骨細胞に成熟化（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）されて骨吸収（ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）が起こる。また、破骨細胞分化に重要な役割をする遺伝子はＮＦ−ｋＢ、ｃ−ＦＯＳのような物質である。
【０００７】
しかしながら、ＯＰＧ（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）がＲＡＮＫＬと結合するとＲＡＮＫＬとＲＡＮＫとの結合が遮断されて破骨細胞の形成が抑制され、必要以上の骨吸収が起こらなくなる。古い骨の吸収または破壊は血液細胞（造血幹細胞）から生じる破骨細胞によって行われ、これは骨に穴を開けて少量のカルシウムが血流に放出され、身体機能を維持するために使用される。一方、骨細胞で生成した造骨細胞は、膠原質（コラーゲン）で穴を満たし、カルシウムとリンの沈着物（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）を覆って硬くかつ新しい骨を作って骨格を再建する。
【０００８】
骨が破壊され始めて再度新しい骨に再形成されるまでは、約１００日程度かかる。幼児では、１年以内に骨のカルシウムが１００％変わるが、成人では毎年、骨格の約１０〜３０％がこのような過程を通じて再形成され、破骨速度と造骨速度が同一であれば以前のような骨密度を維持することができる。このように重要な骨に均衡が破れる場合、多くの病気を引き起こすことができ、特に骨粗しょう症が代表的な疾患である。
【０００９】
現在まで知られている骨粗しょう症の治療方法は、ｅｓｔｒｏｇｅｎ療法、ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ療法、カルシウム補充剤、ビタミンＤ誘導体療法などが存在するが、最も多く利用される方法としては、ｅｓｔｒｏｇｅｎ療法とｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ療法が報告されているが、様々な副作用と投与時期を調節しにくい欠点があると報告されている。そのため、最近では副作用がなく、安価の天然物を開発して骨粗しょう症を治療しようとする研究が行われている。
【００１０】
これにより、天然物を利用した従来技術として大韓民国公開特許公報第１０−２０１７−００５４１１５号には、大豆の発芽胚芽抽出物を含む骨粗しょう症の予防または治療用医薬組成物が公知となっており、大韓民国登録特許公報第１０−１７８３１１号には、五味子、トチュウ及びクコの複合抽出物を有効成分として含有する骨代謝疾患の予防または治療用組成物が公知となっている。
【００１１】
しかしながら、前述した従来の技術では、天然物を利用して造骨細胞の増殖能及び分化能または造骨細胞に関連する因子発現を高めることができることを示しているが、破骨細胞による骨吸収の効果は記載していないので、骨形成及び骨吸収の恒常性を維持することができる新しい天然物質の骨粗しょう症治療剤の開発が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】大韓民国公開特許公報第１０−２０１７−００５４１１５号
【特許文献２】大韓民国登録特許公報第１０−１７８３１１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
前述した問題を解消するためのものであり、本発明の目的は、骨形成を高め、骨吸収を抑制することができる骨粗しょう症の予防または治療用組成物を提供することにある。
【００１４】
なお、天然物である龍膽草及び接骨木抽出物を含んで生体親和性を高め、副作用がないため、安定的に骨粗しょう症の予防または治療効果を奏する骨粗しょう症の予防または治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の実施例に係る龍膽草及び接骨木抽出物を含む骨粗しょう症の予防または治療用組成物を提供する。
【００１６】
前記龍膽草抽出物と前記接骨木抽出物の混合重量比は、１：０．１〜１０であってもよい。
【００１７】
前記龍膽草及び接骨木の抽出物を全体組成物の総重量に対して０．００１〜１００重量％で含むことができる。
【００１８】
前記龍膽草及び接骨木抽出物は熱水抽出により抽出されたものであってもよい。
【００１９】
前記組成物は、骨形成に関連する遺伝子の発現を向上させることができる。
【００２０】
前記骨形成に関連する遺伝子は、ＡＬＰ、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、ＢＭＰ、ＴＧＦ−β及びｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎからなる群より選択された１種以上の遺伝子であってもよい。
【００２１】
前記組成物は、骨吸収に関連する遺伝子の発現を抑制させることができる。
【００２２】
前記骨形成に関連する遺伝子は、ＮＦ−ｋＢ、ｃ−ＦＯＳ、ＮＦＡＴＣ−１、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ及びＭＭＰ−９からなる群より選択された１種以上の遺伝子であってもよい。
【００２３】
本発明は、他の一実施例に係る骨粗しょう症の予防または治療用組成物の製造方法を提供する。
【００２４】
前記組成物の製造方法は、
１）龍膽草及び接骨木を溶媒に入れ、加熱して抽出物を得る段階；
２）前記１）段階から得た抽出物を減圧下で濃縮する段階を含むことができる。
【００２５】
前記１）段階の加熱温度は、８０〜１００℃であってもよい。
【００２６】
前記２）段階は、３０〜７０℃で行う段階であってもよい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係る骨粗しょう症の予防または治療用組成物は、骨形成を高め、骨吸収を抑制する効果を提供することができる。
【００２８】
なお、本発明に係る骨粗しょう症の予防または治療用組成物は、天然物である龍膽草及び接骨木抽出物を主成分として含むことにより、生体親和性が高く、副作用がないため、安定的に骨粗しょう症の予防または治療効果を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の一実施例に係る抽出物の濃度によるＡＬＰ活性を測定した結果で、図１ａは参考例１、図１ｂは参考例２、図１ｃは実施例１、図１ｄは実施例２、図１ｅは実施例３に該当する結果である。
【図２】本発明の一実施例に係る抽出物の濃度によるｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＴＲＡＰ）酵素の活性を測定した結果で、図２ａは参考例１、図２ｂは参考例２、図２ｃは実施例１、図２ｄは実施例２、図２ｅは実施例３に該当する結果である。
【図３】本発明の一実施例に係る抽出物の濃度によるＡＬＰ遺伝子発現量を測定した結果で、図３ａは参考例１、図３ｂは参考例２、図３ｃは実施例１、図３ｄは実施例２、図３ｅは実施例３に該当する結果である。
【図４】本発明の一実施例に係る抽出物の濃度によるＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ遺伝子発現量を測定した結果で、図４ａは参考例１、図４ｂは参考例２、図４ｃは実施例１、図４ｄは実施例２、図４ｅは実施例３に該当する結果である。
【図５】本発明の一実施例に係る抽出物の濃度によるＮＦＡＴＣ−１遺伝子発現量を測定した結果で、図５ａは参考例１、図５ｂは参考例２、図５ｃは実施例１、図５ｄは実施例２、図５ｅは実施例３に該当する結果である。
【図６】本発明の一実施例に係る抽出物の濃度によるＣａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ遺伝子発現量を測定した結果で、図６ａは参考例１、図６ｂは参考例２、図６ｃは実施例１、図６ｄは実施例２、図６ｅは実施例３に該当する結果である。
【図７】本発明の一実施例に係る抽出物の濃度によるＭＭＰ−９遺伝子発現量を測定した結果で、図７ａは参考例１、図７ｂは参考例２、図７ｃは実施例１、図７ｄは実施例２、図７ｅは実施例３に該当する結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明において、添付の図面は従来技術との差別性及び明瞭性、そして技術把握の便宜のために誇張された表現で示されていることもある。また、後述する用語は、本発明における機能を考慮して定義された用語で、使用者、運用者の意図または慣例によって異なることがあるので、このような用語の定義は本明細書全般にわたった技術的内容に基づいて下さなければならない。一方、実施例は本発明の請求の範囲に提示された構成要素の例示的事項に過ぎず、本発明の権利範囲を限定するものではなく、権利範囲は本発明の明細書全般にわたった技術的思想に基づいて解釈されなければならない。
【００３１】
本発明の一実施例に係る骨粗しょう症の予防または治療用組成物は、龍膽草及び接骨木抽出物を有効成分として含有する。
【００３２】
本発明において用いられる龍膽草は、Ｇｅｎｔｉａｎ ｓｃａｂｒａ Ｂｕｎｇｅ ｖａｒ． ｂｕｅｒｇｅｒｉ（Ｍｉｑｕｅｌ）Ｍａｘｉｍで、韓国、日本、中国東北部、シベリア東部に主に分布しており、双子葉植物合板火軍リンドウ目リンドウ科の多年草で山地の草原で育つ。また、知られている効能及び効果は肝臓、胆の火が旺盛なことを下げる効能があり、清熱燥湿、瀉肝胆火、苦味健胃薬、利胆剤として利用され、消化作用、肝機能亢進及び抗炎症に効果がある。
【００３３】
本発明者らは、龍膽草の新しい効果として骨形成を促進及び骨吸収抑制効果を確認し、龍膽草が骨代謝疾患のうち骨粗しょう症を予防または治療に有用に用いることができることを確認した。
【００３４】
一般的に、龍膽草は健胃、瘡腫、疥癬、肝蛭、盜汗、驚風、蛔蟲、心臓病、湿疹、胃炎、胃酸過多症、胃酸過少症、胃カタル、胃疾患に効能があると知られているが、骨代謝疾患に関連して骨粗しょう症の予防または治療に効果があるということは、本発明者らによって最初に確認された。
【００３５】
本発明の一実施例において、前記龍膽草は龍膽草の葉、芽、茎または根であってもよいが、これに制限されない。好ましくは根である。
【００３６】
本発明において用いられる接骨木は、Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉで、ニワトコ属に属する落葉低木で活血止痛の効能があるため、風湿性関節炎、腰痛、骨折傷、外傷出血に有効であり、産後のお血削除及び打撲傷に主に用いられる。
【００３７】
本発明者らは接骨木が骨形成を促進させ、骨吸収を抑制することができることを確認し、これにより、骨代謝疾患のうち骨粗しょう症を予防または治療に有用に用いることができることを確認した。
【００３８】
本発明における用語「予防」とは、組成物の投与により骨粗しょう症を抑制するか、または発病を遅延させるすべての行為を意味する。
【００３９】
本発明において、用語「治療」とは、組成物の投与により骨粗しょう症による症状が好転するか、または有利に変更するすべての行為を意味する。
【００４０】
本発明の一実施例において、前記抽出物は溶媒抽出法、超音波抽出法、超臨界抽出法、発酵法及び炮製法による抽出法から選択されたいずれか一つ以上の方法で得ることができるが、これに制限されるものではない。前記溶媒抽出法は水、Ｃ１〜Ｃ４の低級アルコールまたはこれらの混合溶媒を用いたことを特徴とする。
【００４１】
本発明において抽出方法としては、前記溶媒抽出法が好ましく用いられ、より好ましくは熱水を利用した溶媒抽出法が用いられるが、これに制限されない。
【００４２】
このとき、前記熱水を利用した溶媒抽出法は、天然物に含有された有効成分を安全に抽出することができるだけでなく、化合物を用いずに抽出することにより、最終産物または組成物からもたらすことができる副作用を減らし、生体親和性を高めることができる。
【００４３】
前記龍膽草抽出物と前記接骨木抽出物との混合重量比は、１：０．１〜１０であってもよく、好ましくは１：０．４〜２．５であるが、これに制限されない。ここで、前記混合重量比が１：０．１〜１０である場合、骨形成への向上効果及び骨吸収への抑制効果が互いに均衡をなすことができる。
【００４４】
前記龍膽草及び接骨木抽出物は全体組成物の総重量に対して０．００１〜１００重量％で含むことができ、好ましくは０．００１〜５０重量％であり、より好ましくは０．００１〜２０重量％であるが、これに制限されない。前記抽出物が全体組成物に対して０．００１重量％未満である場合、濃度が低すぎて骨形成の誘導及び骨吸収の抑制効果が微々たる。
【００４５】
前記龍膽草抽出物は、全体組成物に対して０．００１〜９９．９９９重量％含まれることができ、好ましくは０．００１〜８０重量％であり、より好ましくは３０〜７０重量％であるが、これに制限されない。
【００４６】
前記接骨木抽出物は、０．００１〜９９．９９９重量％含まれることができ、好ましくは０．００１〜８０重量％であり、より好ましくは３０〜７０重量％であるが、これに制限されない。
【００４７】
前記組成物は、骨形成に関連する遺伝子の発現を向上させることができ、ここで、前記遺伝子の発現は、造骨前駆細胞が造骨細胞に分化する過程または造骨細胞が骨細胞の形態に変化する過程でともに起こることを意味し、このとき、遺伝子はＡＬＰ、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、ＢＭＰ、ＴＧＦ−β及びｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎからなる群より選択された１種以上の遺伝子であってもよく、好ましくは、ＡＬＰ及びＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎで造骨前駆細胞が造骨細胞に分化する過程において最も重要な因子であるが、これに制限されない。
【００４８】
前記ＡＬＰは骨組織に存在し、骨の成長が活発に起こるとき、その活性が増加すると知られている遺伝子である。
【００４９】
前記Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎは、骨材の形成時に造骨細胞により合成され、骨のｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ ｍａｔｒｉｘに結合されるタンパク質を意味する。
【００５０】
また、前記組成物は、骨吸収に関連する遺伝子の発現を抑制させることができ、このとき、前記遺伝子の発現は、破骨細胞への分化過程でともに起こることを意味する。ここで、前記遺伝子はＮＦ−ｋＢ、ｃ−ＦＯＳ、ＮＦＡＴＣ−１、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ及びＭＭＰ−９からなる群より選択された１種以上の遺伝子であってもよく、好ましくはＮＦＡＴＣ−１、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ及びＭＭＰ−９からなる群より選択された１種以上の遺伝子であるが、これに制限されない。
【００５１】
このとき、ＮＦＡＴＣ−１は、破骨細胞の分化過程で発現が増加することになる遺伝子であり、一方、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ及びＭＭＰ−９は、破骨細胞の分化過程が続く場合、発現量が増加される遺伝子である。
【００５２】
本発明の組成物は、医薬組成物として利用されることができ、薬学的に許容される担体、賦形剤及び希釈剤からなる群より選択された１種以上の添加剤をさらに含むことができる。このように、本発明の医薬組成物に追加に含まれる添加剤の種類と量は関連技術分野において通常知られているところに従う。
【００５３】
本発明の組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。薬学的に許容可能な担体を含む上記組成物は、経口または非経口の様々な剤形であってもよい。製剤化する場合には、通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の他にステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も使用できる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤には、滅菌した水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを用いることができる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂（ｌａｕｒｉｎｕｍ）、グリセロゼラチンなどを用いることができる。
【００５４】
本発明の組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などの経口投与剤；及び滅菌した注射溶液として水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、及び乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などの非経口投与剤などの形態で適用形態に合わせて製剤化して用いることができる。
【００５５】
前記組成物の投与経路は、目的組織に到達することができる限り、いかなる一般的な経路を通じて投与することができる。本発明の組成物は目的とするところに従い、腹腔内投与、静脈投与、動脈投与、筋肉内投与、骨内投与、子宮内投与、硬膜投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、脾内投与、肺内投与、直腸内投与、脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）に注射することができるが、これに制限されない。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置により投与することができる。
【００５６】
本発明の組成物は、薬剤学的に有効な量で投与することができる。
【００５７】
本発明における用語「薬剤学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは個体の種類及び重症度、年齢、性別、感染したウイルスの種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、同時に用いられる薬物を含む要素及びその他の医学分野においてよく知られている要素により決定することができる。
【００５８】
例えば、本発明の組成物は、龍膽草及び接骨木の混合使用量を基準に１日基準０．０１ｇ〜２０ｇの量で投与することができる。具体的に抽出物である場合、前記含有量の範囲の龍膽草及び接骨木を用いて製造された抽出物を１日投与量として考慮することができる。
【００５９】
本発明の組成物は、個別治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療法とは順次にまたは同時に投与することができる。そして、単一または多重投与することができる。前記要素をすべて考慮して副作用なく最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定することができる。
【００６０】
本発明の組成物は、骨粗しょう症の予防または治療のために単独で、または手術、ホルモン治療、薬物治療及び生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して用いることができる。
【００６１】
本発明はまた他の一実施例で、前記龍膽草及び接骨木抽出物を有効成分として含む、骨粗しょう症の予防または改善用食品組成物を提供する。
【００６２】
このとき、前記龍膽草及び接骨木抽出物は前述した通りである。
【００６３】
前記龍膽草及び接骨木抽出物を常食できながらも、骨粗しょう症の改善を図ることができる食品の形態で製造して摂取することができる。このとき、前記食品に含まれる前記龍膽草及び接骨木抽出物の含有量は、特に制限されないが、一例として、食品組成物の総重量に対して０．００１〜１００重量％で含むことができる。食品が飲料である場合には、一例として、１００ｍｌを基準に０．０１〜６０ｇ、他の例として０．１〜６０ｇの割合で含むことができる。
【００６４】
また、前記組成物は食品組成物に通常用いられ、嗅覚、味覚、視覚などを向上させることができる追加成分を含むことができる。たとえば、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ナイアシン（ｎｉａｃｉｎ）、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、フォレート（ｆｏｌａｔｅ）、パントテン酸（ｐａｎｔｈｏｔｅｎｉｃ ａｃｉｄ）などを含むことができる。また、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、クロム（Ｃｒ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、銅（Ｃｕ）などのミネラルを含むことができる。また、リジン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含むことができる。また、防腐剤（ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（漂白粉と高度漂白粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜硝酸ナトリウム、亜酢酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（ＭＳＧグルタミン酸ナトリウムなど）、甘味料（ズルチン、シクラメート、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラクトン類など）、膨張剤（ミョウバン、Ｄ−酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、皮膜剤、ガム基礎剤、泡抑制剤、溶剤、改良剤などの食品添加物（ｆｏｏｄ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）を添加することができる。前記添加物は、食品の種類に応じて選別され、適切な量で用いられる。
【００６５】
一方、前記龍膽草及び接骨木抽出物を用いて骨粗しょう症改善用の機能性食品を製造することができる。
【００６６】
具体的な例として、前記食品組成物を用いて骨粗しょう症を改善させることができる加工食品を製造することができ、例えば、菓子、飲料、酒類、発酵食品、缶詰、牛乳加工食品、食肉加工食品または麺加工食品の形態である健康機能性食品として製造することができる。このとき、菓子はビスケット、パイ、ケーキ、パン、キャンディ、ゼリー、ガム、シリアル（穀物フレークなどの食事代用品類を含む）などを含む。飲料は飲用水、炭酸飲料、機能性イオン飲料、ジュース（例えば、リンゴ、ナシ、ブドウ、アロエ、柑橘、桃、ニンジン、トマトジュースなど）、甘酒などを含む。酒類は清酒、ウイスキー、焼酎、ビール、洋酒、果実酒などを含む。発酵食品は醤油、味噌、コチュジャンなどを含む。缶詰は水産物缶詰（例えば、マグロ、サバ、サンマ、サザエ缶詰など）、畜産物缶詰（牛肉、豚肉、鶏肉、七面鳥缶詰など）、農産物缶詰（トウモロコシ、桃、パインアップル缶詰など）を含む。乳加工食品はチーズ、バター、ヨーグルトなどを含む。食肉加工食品はとんカツ、ビーフカツ、チキンカツ、ソーセージ、酢豚、ナゲット類、ノビアニなどを含む。麺加工食品は乾麺、そうめん、ラーメン、うどん麺、冷麺、密封包装生麺などを含む。この他にも、前記組成物はレトルト食品、スープ類などに用いられることができる。
【００６７】
本発明の用語「健康機能性食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ）」とは、特定保健用食品（ｆｏｏｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉａｌ ｈｅａｌｔｈ ｕｓｅ、ＦｏＳＨＵ）と同一の用語で、栄養供給の他にも、生体調節機能を効率的に示すように加工された医学、医療効果の高い食品を意味し、前記食品は骨粗しょう症の改善に有用な効果を得るために、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状、環などの多様な形態で製造することができる。
【００６８】
本発明の他の一実施例によれば、前記骨粗しょう症の予防または治療用組成物の製造方法を提供することができる。
【００６９】
前記組成物の製造方法は、
１）龍膽草及び接骨木を溶媒に入れ、加熱して抽出物を得る段階；及び
２）前記１）段階から得た抽出物を減圧下で濃縮する段階を含む。
【００７０】
前記１）段階は、龍膽草及び接骨木の有効成分を抽出するための段階で、溶媒抽出法で加熱して効果的に龍膽草及び接骨木の有効成分を抽出する段階である。一例として、龍膽草及び接骨木をそれぞれ水に入れて加熱する段階であってもよい。
【００７１】
前記１）段階の加熱温度は、８０〜１００℃であってもよい。前記加熱温度を８０〜１００℃で行う場合、有効成分を迅速に抽出しながら、実行途中に有効成分が揮発したり、気化したりすることを防ぐことができる。
【００７２】
前記２）段階は、前記１）の段階から得たそれぞれの龍膽草、接骨木抽出物を減圧して濃縮する段階である。
【００７３】
このとき、前記２）段階は、３０〜７０℃で行うことができ、この温度範囲で濃縮する場合、濃縮時間を短縮することができる。
【００７４】
前記骨粗しょう症の予防または治療用組成物の製造方法は、前記２）段階の後に、
３）前記２）段階から得た濃縮された抽出物を凍結乾燥する段階；及び
４）前記３）段階から得た粉末状の龍膽草及び接骨木抽出物を混合する段階をさらに含むことができる。
【００７５】
前記３）段階は、前記２）段階から濃縮された抽出物を凍結乾燥させる段階で、当該段階を介して龍膽草及び接骨木抽出物を粉末状に得ることができる。
【００７６】
次に、前記４）段階は、龍膽草及び接骨木抽出物を混合した混合物を得る段階で、当該技術分野の技術者が容易に変更することができる。
【００７７】
以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。しかし、本発明の実施形態は多様な異なる形態に変形することができ、本発明の範囲が以下説明する実施形態に限定されるものではない。また、本発明の実施形態は当該技術分野において平均的な知識を有する者に本発明をさらに完全に説明するために提供するものである。
【００７８】
製造例１．龍膽草及び接骨木抽出物の製造
龍膽草抽出物と接骨木抽出物を製造するために、それぞれの１００ｇの原水に蒸留水２Ｌを入れ、９０℃で５時間熱水抽出した。濾過された抽出液を５０℃で減圧濃縮して凍結乾燥により粉末状の試料を得た。龍膽草抽出物と接骨木抽出物の収率は、それぞれ１５．４％、９．２７％であった。
【実施例】
【００７９】
下記表１に羅列したように、実施例を準備し、表１に記載された龍膽草抽出物と接骨木抽出物は、前記製造例１により製造した。
【００８０】
【表１】
2021525222.tif 000003
【００８１】
実験例１．細胞毒性の評価
本実験例では、本発明の接骨木及び龍膽草抽出物を処理したとき、細胞毒性に及ぼす影響を確認するために実験を行った。
【００８２】
１×１０４個のＭＣ３Ｔ３−Ｌ１細胞を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに分注し、培養液は１０％ＦＢＳを含有したＤＭＥＭを用いた。１２時間培養した後、各抽出物（実施例１〜５）を１００−１０００μｇ／ｍｌで処理し、２４時間培養した。その後、ＷＳＴ ｒｅａｇｅｎｔ２０μｌを添加して光によるＷＳＴ還元を最小限にするためにホイルで光を遮断し、３時間反応させた。ｉＭＡＲＫＴＭ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｈｅａｄｑｕａｒｔｅｒｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて５６０ｎｍの波長でｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙを測定した。
【００８３】
各抽出物の細胞毒性をＥＤ５０（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙが５０％となる濃度）で求めた結果を表２に示した。この結果、本発明の龍膽草及び接骨木抽出物は６００μｇ／ｍｌ以上の高濃度でも安全であると示された。
【００８４】
【表２】
2021525222.tif 000004
【００８５】
実験例２．Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｉｔｉｖｉｔｙ（ＡＬＰ ａｃｉｔｉｖｉｔｙ）の測定
本実験例では、本発明の龍膽草及び接骨木抽出物を濃度別に処理したとき、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｉｔｉｖｉｔｙに及ぼす影響を確認するために、実験を行った。一方、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（塩基性リン酸分解酵素；ＡＬＰ）は、ほとんどの組織に存在し、骨組織に存在するＡＬＰは骨成長が活発に起こるときにその活性が増加すると知られている。
【００８６】
５×１０３個のＭＣ３Ｔ３−Ｌ１細胞を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに分注し、５０μｇ／ｍｌのａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄと１０ｍＭのβ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅを添加して造骨細胞への分化を誘導した。参考例１、２及び実施例１〜３をそれぞれ５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌの濃度別に処理した後、３７℃、５％のＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒで４８時間培養後、ＰＢＳで２回洗浄し、０．２％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を入れた後、３７℃ ｉｎｃｕｂａｔｏｒで３０分間ｌｙｓｉｓさせた。２,５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄液を取ってタンパク質を定量し、残りの上澄液は、０．１Ｎ ｇｌｙｃｉｎｅと１００ｍＭ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐ−ＮＰＰ）を添加した後、３７℃で３０分間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ後、０．１Ｎ ＮａＯＨを入れて反応を停止させた後、４０５ｎｍで吸光度を測定し、ＡＬＰ酵素によりｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌに転換された量を算出した。この結果を図１に示した。前記図１のＮＣは、対照群として何も処理しない実験群である。
【００８７】
図１に示すように、各抽出物により濃度が増加するほどＡＬＰ活性が増加することを確認し、参考例１（図１ａ）または２（図１ｂ）に比べて、実施例１〜３（図１ｃ〜図１ｅ）がさらに優れたＡＬＰ活性が示されることを確認した。すなわち、龍膽草または接骨木抽出物を単独で処理したときよりも龍膽草及び接骨木抽出物を処理する場合、ＡＬＰ活性が著しく高いことを確認した。これにより、本発明の龍膽草及び接骨木抽出物は、骨成長の誘導効果に優れることを確認した。
【００８８】
実験例３．ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＴＲＡＰ）の測定
本実験例では、本発明の龍膽草及び接骨木抽出物を濃度別に処理時、破骨細胞の分化程度に及ぼす影響を確認するために実験を行った。具体的に、破骨細胞が骨吸収作用をするときに増加するＴＲＡＰ酵素の活性を測定し、破骨細胞の分化程度にどのように影響を及ぼすかを確認した。
【００８９】
一方、ＴＲＡＰ酵素の活性は、破骨細胞が骨吸収作用をするときに増加することで、単核の破骨前駆細胞を形成した後、細胞が融合される多核の性骨破骨細胞を形成するようになり、骨表面に付着する。また、ＴＲＡＰはＮｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＡＴＰ存在下で活性を示すもので、破骨細胞のみに唯一存在する骨分解酵素である。
【００９０】
まず、１×１０５個のＲＡＷ ２６４．７破骨前駆細胞を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに分注し、３０ｎｇ／ｍｌ濃度のＲＡＮＫＬを各ウェルに入れた後、参考例１、２及び実施例１〜３をそれぞれ５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ 、２００μｇ／ｍｌの濃度別に処理した造骨細胞の条件培養液を処理して３日間培養した。基質溶液としてｃｉｔｒａｔｅ−ａｃｅｔｏｎｅ及びｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ混合溶液で固定した細胞を１．３６ｍｇ／ｍＬの４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、１０ｍＭのｔａｒｔｒａｔｅを含む５０ｍＭのｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒを製造し、固定した細胞に基質溶液を分注し、３７℃、５％のＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒで３０分間反応させた後、酵素反応液を０．１Ｎ ＮａＯＨで反応を停止させ、４０５ｎｍの波長でｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙを３回測定し、その平均値と標準偏差を求め、この結果を図２に示した。前記図２のＮＣは、対照群として何も処理しない実験群である。
【００９１】
図２に示すように、何も処理しない実験群に比べて、各抽出物により濃度が増加するほどＴＲＡＰ酵素活性が減少することを確認し、参考例１（図２ａ）または２（図２ｂ）に比べて、実施例１〜３（図２ｃ〜図２ｅ）が顕著にＴＲＡＰ酵素活性が低くなることを確認した。すなわち、龍膽草または接骨木抽出物を単独で処理したときよりも龍膽草及び接骨木抽出物を処理する場合、ＴＲＡＰ酵素活性がより顕著に低くなることを確認し、これにより、本発明の龍膽草及び接骨木抽出物は骨吸収を阻害することができることを確認した。
【００９２】
実験例４．前骨芽細胞で造骨細胞分化関連因子発現の測定
龍膽草及び接骨木抽出物を処理したとき、前骨芽細胞で造骨細胞分化関連因子について発現するかどうかを調べるために、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。まず、１×１０５個のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに分注し、参考例１、２及び実施例１〜３をそれぞれ５０、１００、２００μg／ｍＬの濃度別に処理した後、４８時間培養した後、細胞を収集してＲＮｅａｓｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）で製造社のｐｒｏｔｏｃｏｌによりＲＮＡ抽出を行った。ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｈｅａｄｑｕａｒｔｅｒｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡ合成した。遺伝子の発現を測定するために、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（ｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いた実時間定量ＰＣＲを行い、機器はＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ ）を用いた。測定するために用いた遺伝子の塩基配列は表３に示した。Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ反応は、総２０μｌ内にｃＤＮＡ ２μｌと２Ｘ ＳＹＢＲ ｍｉｘ１０μｌ、ｆｏｒｗａｒｄ、ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒはそれぞれ１００ｐｍｏｌ／μｌを１μｌずつ添加し、残りはＨ２Ｏで満たされた。ＲＣＲ増幅段階は次の通りであり、増幅ｃｙｃｌｅは４０ｃｙｃｌｅを行った。Ｈｏｔ ｓｔａｒｔのために９５℃で８分、増幅段階のｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎを９５℃で１５秒、ａｎｎｅａｌｉｎｇを５５℃で３０秒、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎを７２℃で３０秒間繰り返し、各ｃｙｃｌｅのｅｘｔｅｎｓｉｏｎ後の値が記録された。すべてのｃｙｃｌｅが完了した後、ｐｒｉｍｅｒの特異性を確認するために、ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ分析を行った。結果の分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから提供されるＯｎｅ ｓｔｅｐ ｓｙｓｔｅｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．１で分析した。ＡＬＰ遺伝子発現量を測定した結果は図３に、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ遺伝子発現量を測定した結果は図４に示した。前記図３及び図４のＮＣは、対照群として造骨細胞の分化誘導実験も行わず、何も処理しない実験群である。
【００９３】
【表３】
2021525222.tif 000005
【００９４】
図３に示すように、各抽出物により濃度が増加するほどＡＬＰ遺伝子の発現が高くなることを確認し、参考例１（図３ａ）または２（図３ｂ）に比べて、実施例１〜３（図３ｃ〜図３ｅ）がさらに多くＡＬＰ遺伝子発現が示されることを確認した。すなわち、龍膽草または接骨木抽出物を単独で処理したときよりも龍膽草及び接骨木抽出物を処理する場合、ＡＬＰ遺伝子発現誘導効果に優れることを確認した。これにより、本発明の龍膽草及び接骨木抽出物は、骨成長の誘導効果に優れることを確認した。
【００９５】
図４に示すように、各抽出物により濃度が増加するほどＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ（ＯＣ）の発現が高くなることを確認し、参考例１（図４ａ）または２（図４ｂ）に比べて、実施例１〜３（図４ｃ〜図４ｅ）がさらに多くＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ発現が示されることを確認した。すなわち、龍膽草または接骨木抽出物を単独で処理したときよりも龍膽草及び接骨木抽出物を処理する場合、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ発現誘導効果に優れることを確認した。一方、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ（ＯＣ）は、骨材形成時に造骨細胞により合成され、骨のｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ ｍａｔｒｉｘに結合されるタンパク質であるので、本発明の龍膽草及び接骨木抽出物は、骨再形成を誘導することができることを確認した。
【００９６】
実験例５．前破骨細胞で破骨細胞分化関連因子発現の測定
龍膽草及び接骨木抽出物を処理したとき、前破骨細胞で破骨細胞分化関連因子の発現を調べるために、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。５×１０５個のＲＡＷ２４６．７細胞を１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに分注し、１０ｎｇ／ｍＬのＲＮＡＫＬと１０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦを添加して破骨細胞への分化を誘導した後、参考例１、２及び実施例１〜３をそれぞれ５０、１００、２００μg／ｍＬの濃度別に処理し、４８時間が経過した後、細胞を収集し、ＲＮｅａｓｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）で製造社のｐｒｏｔｏｃｏｌによりＲＮＡ抽出を行った。ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｈｅａｄｑｕａｒｔｅｒｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡを合成した。遺伝子の発現を測定するために、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（ｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いた実時間定量ＰＣＲを行い、機器はＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ ）を用いた。測定しようとする遺伝子の塩基配列は前記表３に示した。Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ反応は、総２０μｌ内にｃＤＮＡ２μｌと２Ｘ ＳＹＢＲ ｍｉｘ １０μｌ、ｆｏｒｗａｒｄ、ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒはそれぞれ１００ｐｍｏｌ／μｌを１μｌずつ添加し、残りはＨ２Ｏで満たされた。ＲＣＲ増幅段階は次の通りであり、増幅ｃｙｃｌｅは４０ ｃｙｃｌｅを行った。Ｈｏｔ ｓｔａｒｔのために９５℃で８分、増幅段階のｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎを９５℃で１５秒、ａｎｎｅａｌｉｎｇを５５℃で３０秒、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎを７２℃で３０秒間繰り返し、各ｃｙｃｌｅのｅｘｔｅｎｓｉｏｎ後に値が記録された。すべてのｃｙｃｌｅが完了した後、ｐｒｉｍｅｒの特異性を確認するために、ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ分析を行った。結果の分析は、Ａｐｐｌｉｄｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから提供されるＯｎｅ ｓｔｅｐ ｓｙｓｔｅｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．１で分析した。
【００９７】
破骨細胞分化は、造骨細胞と活性化されたＴリンパ球から分泌される破骨細胞誘導因子であるｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｏｔｒ−ｋＢ ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）と破骨前駆細胞で発現するその受容体ＲＡＮＫの結合により開始される。ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫの結合が進行すると、ｃ−ｆｏｓとＮＦＡＴＣ−１の発現が増加することになり、その結果により、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ及びＭＭＰ９の発現が増加することになり、これにより、破骨細胞の分化が持続される。これにより、実験例５では、ＮＦＡＴＣ−１遺伝子発現量を測定してこの結果を図５に、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ遺伝子発現量を測定してこの結果を図６に、ＭＭＰ−９遺伝子発現量を測定してこの結果を図７に示した。前記図５〜図７のＮＣは、対照群として破骨細胞の分化誘導実験も行わず、何も処理しない実験群であり、Ｃは、比較群として破骨細胞の分化誘導実験は行ったが、何も処理しない実験群である。
【００９８】
図５に示すように、各抽出物により濃度が増加するほどＮＦＡＴＣ−１遺伝子の発現が減少することを確認し、参考例１（図５ａ）または２（図５ｂ）に比べて、実施例１〜３（図５ｃ〜図５ｅ）が、ＮＦＡＴＣ−１遺伝子発現量が顕著に低いことを確認した。すなわち、龍膽草または接骨木抽出物を単独で処理したときよりも龍膽草及び接骨木抽出物を処理する場合、ＮＦＡＴＣ−１遺伝子発現の抑制効果に優れることを確認した。特に、実施例１〜３を２００μｇ／ｍｌで処理した結果は、破骨細胞分化誘導後、何も処理しない実験群に比べてＮＦＡＴＣ−１遺伝子発現がそれぞれ５４．９６％、６５．１０％、７６．５６％有意に減少したことを確認した。
【００９９】
図６に示すように、各抽出物により濃度が増加するほどＣａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ遺伝子の発現が減少することを確認し、参考例１（図６ａ）または２（図６ｂ）に比べて実施例１〜３（図６ｃ〜図６ｅ）が、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ遺伝子発現量が顕著に低いことを確認した。すなわち、龍膽草または接骨木抽出物を単独で処理したときよりも龍膽草及び接骨木抽出物を処理する場合、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ遺伝子発現の抑制効果に優れることを確認した。特に、実施例１〜３を２００μｇ／ｍｌで処理した結果は、破骨細胞分化誘導後、何も処理しない実験群に比べてＣａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ遺伝子発現がそれぞれ４６．９８％、５９．４９％、７４．９８％有意に減少したことを確認した。
【０１００】
図７に示すように、各抽出物により濃度が増加するほどＭＭＰ−９遺伝子の発現が減少することを確認し、参考例１（図７ａ）または２（図７ｂ）に比べて実施例１〜３（図７ｃ〜図７ｅ）が、ＭＭＰ−９遺伝子発現量が顕著に低いことを確認した。すなわち、龍膽草または接骨木抽出物を単独で処理したときよりも龍膽草及び接骨木抽出物を処理する場合、ＭＭＰ−９遺伝子発現の抑制効果に優れることを確認した。特に、実施例１〜３を２００μｇ／ｍｌで処理した結果は、破骨細胞分化誘導後、何も処理しない実験群に比べてＭＭＰ−９遺伝子発現がそれぞれ５２．５１％、５８．１７％、７２．１２％有意に減少したことを確認した。
【０１０１】
前述のように、本発明は図面に示された実施例を参考にして説明したが、これは例示的に過ぎず、当該技術が属する分野における通常の知識に基づいて、多様な変形及び均等な他の実施例が可能であるという点を理解しなければならない。したがって、本発明の真正な技術的保護範囲は、以下に記述する請求の範囲により、前述した発明の具体的な内容に基づいて定められなければならない。
【図１】
2021525222.tif 000006
【図２】
2021525222.tif 000007
【図３】
2021525222.tif 000008
【図４】
2021525222.tif 000009
【図５】
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【図６】
2021525222.tif 000011
【図７】
2021525222.tif 000012
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月2日(2020.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
【表３】
2021525222.tif 000013
【国際調査報告】
2021525222.tif 000014
2021525222.tif 000015
2021525222.tif 000016
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