(57)【要約】  本発明は、ＴＧＦβ／Ｓｍａｄ３／ＥＰＢ４１Ｌ５分子メカニズムに関する癌細胞における影響を究明し、ここで、ＥＰＢ４１Ｌ５の高い発現が癌患者の全般的な生存率に関連することを明らかにしたところ、ＥＰＢ４１Ｌ５が癌の潜在的な予後指標であることを確認した。したがって、本発明は、ＥＰＢ４１Ｌ５を抗原として認識するようにするＥＰＢ４１Ｌ５のエピトープを特定し、これに特異的に結合する抗体またはその断片に関し、本発明における抗体は、ＥＰＢ４１Ｌ５に関連する癌に対する治療剤として有用に活用できる。【選択図】【図１Ａ】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるＥＰＢ４１Ｌ５（Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂａｎｄ４．１  Ｌｉｋｅ５）タンパク質の６１９〜６２４番目アミノ酸残基の中から選択される１〜６ｍｅｒのエピトープ。
【請求項２】
前記エピトープは、ＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質のアミノ酸位置６１９〜６２４番目アミノ酸配列からなるものである、請求項１に記載のエピトープ。
【請求項３】
配列番号１で表されるＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質を抗原として認識してこれに特異的に結合する単クローン抗体またはその断片。
【請求項４】
前記単クローン抗体またはその断片は、配列番号１で表されるＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の６１９〜６２４番目アミノ酸残基の中から選択される１〜６ｍｅｒのエピトープに結合するものである、請求項３に記載の単クローン抗体またはその断片。
【請求項５】
前記単クローン抗体またはその断片は、
配列番号６で表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号７で表される重鎖ＣＤＲ２；および配列番号８で表される重鎖ＣＤＲ３；を含む重鎖可変領域；および
配列番号９で表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１０で表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１１で表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む軽鎖可変領域；を含むものである、請求項３に記載の単クローン抗体またはその断片。
【請求項６】
前記単クローン抗体またはその断片は、ＥＰＢ４１Ｌ５とＴＧＦ−β１との間の相互作用を遮断するものである、請求項３に記載の単クローン抗体またはその断片。
【請求項７】
前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）、両特異性分子、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ドメイン抗体、二重特異的抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗体模倣体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）またはその断片である、請求項３に記載の単クローン抗体またはその断片。
【請求項８】
請求項３に記載の単クローン抗体またはその断片をコーディングする核酸分子。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号１で表されるＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の６１９〜６２４番目アミノ酸残基の中から選択される１〜６ｍｅｒのエピトープ；これをコーディングする核酸分子；またはこれを含むベクターを有効成分として含む癌の予防または治療用ワクチン組成物。
【請求項１２】
前記癌は、癌幹細胞である、請求項１１に記載の癌の予防または治療用ワクチン組成物。
【請求項１３】
請求項３に記載の単クローン抗体またはその断片；これをコーディングする核酸分子；前記核酸分子を含むベクター；またはＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現を抑制する抑制剤で構成された群より選択される少なくともいずれか１つを有効成分として含む癌の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項１４】
前記ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現を抑制する抑制剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＰＮＡ）およびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくともいずれか１つである、請求項１３に記載の癌の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項１５】
前記ｓｉＲＮＡは、配列番号４の塩基配列で表されるｓｉＲＮＡ、または配列番号５の塩基配列で表されるｓｉＲＮＡである、請求項１４に記載の癌の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項１６】
前記癌は、癌幹細胞である、請求項１３に記載の癌の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項１７】
請求項３に記載の単クローン抗体またはその断片；これをコーディングする核酸分子；前記核酸分子を含むベクター；またはＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現を抑制する抑制剤で構成された群より選択される少なくともいずれか１つを有効成分として含む癌の転移抑制用薬剤学的組成物。
【請求項１８】
前記癌は、癌幹細胞である、請求項１６に記載の癌の転移抑制用薬剤学的組成物。
【請求項１９】
（ａ）被検者から体外に分離されたサンプルを取得するステップ；
（ｂ）請求項３に記載の単クローン抗体またはその断片を前記サンプルに処理するステップ；および
（ｃ）前記被検者のサンプル中に含まれたＥＰＢ４１Ｌ５の発現量が、正常群サンプル中に含まれたＥＰＢ４１Ｌ５の発現量より高いか否かを確認するステップ；を含むＥＰＢ４１Ｌ５の過発現による疾患の診断のための情報を提供する方法。
【請求項２０】
前記ＥＰＢ４１Ｌ５の過発現による疾患は、癌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌は、癌幹細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＥＰＢ４１Ｌ５の過発現による疾患は、転移癌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
請求項３に記載の単クローン抗体またはその断片を処理するステップを含む、サンプル中に含まれたＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質を定量する方法。
【請求項２４】
請求項３に記載の単クローン抗体またはその断片を含むＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の定量キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＰＢ４１Ｌ５（Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂａｎｄ４．１  Ｌｉｋｅ５）タンパク質のエピトープおよびこれに特異的に結合する単クローン抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌（Ｃａｎｃｅｒ）とは、組織をなす細胞が異常に無制限増殖して腫瘍が形成されるようにし、それによって臓器が正常な機能を果たせないようにして個体の生命を脅かしかねない非常に致命的な疾患である。２０１７年、韓国人の死亡原因１位が悪性新生物（癌）であり、全体死亡者の２７．６％が癌によって死亡した。
【０００３】
癌疾患のうち、胃癌は最も主要な死亡原因の一つである。特に、転移性胃癌は全世界的に５年生存率が３０％未満の悪性疾患であると知られている。このような転移性胃癌の治療のために新たなバイオマーカーに関連する研究が進められてきているが、その具体的な発病機序については明確に知られていないのが現状である。
【０００４】
現在まで開発された標的治療剤は、ＨＥＲ２標的治療剤、ＶＥＧＦＲ２標的治療剤などがあり、特にＨＥＲ２の場合、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ社で乳癌、卵巣癌または胃癌の良くない予後に関連があることを明らかにして、ＨＥＲ２／ｎｅｕの細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）に結合するヒト化された単クローン抗体（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎまたはＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）を開発した。また、ハーセプチン／トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ／Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）は現在全世界的に販売されるブロックバスター薬で、２０１１年上半期だけで米国で９億５千万ドルの販売高を上げたが、乳癌を除いたＨＥＲ２／ｎｅｕを相当量過発現する他の癌については臨床効果を示していないだけでなく、ハーセプチン／トラスツズマブを長期投与した患者は耐性を有するという欠点があると知られている。
【０００５】
したがって、癌の成長と転移に関連がある生体分子を究明し、これを標的にして癌の成長と転移を制御できる新たな癌標的治療の生物指標の発掘に対する必要性が台頭しているのが現状である。
【０００６】
上記の背景技術として説明された事項は本発明の背景に対する理解のためのものに過ぎず、この技術分野における通常の知識を有する者にすでに知られた従来技術に該当することを認めるものと受け止められてはならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の一目的は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の６１９〜６２４番目アミノ酸残基の中から選択される１〜６ｍｅｒのエピトープを提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、配列番号１で表されるＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質を抗原として認識してこれに特異的に結合する単クローン抗体またはその断片を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、前記単クローン抗体またはその断片をコーディングする核酸分子；およびこれを含むベクターを提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、配列番号１で表されるＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の６１９〜６２４番目アミノ酸残基の中から選択される１〜６ｍｅｒのエピトープ；これをコーディングする核酸分子；またはこれを含むベクターを有効成分として含む癌の予防または治療用ワクチン組成物を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記単クローン抗体またはその断片；これをコーディングする核酸分子；または前記核酸分子を含むベクターを有効成分として含む癌の予防、改善または治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、ＥＰＢ４１Ｌ５の過発現による疾患の診断のための情報を提供する方法を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的および利点は下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲および図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、正常対照群に比べてＥＰＢ４１Ｌ５（Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂａｎｄ４．１  Ｌｉｋｅ５）タンパク質の過発現が癌の成長と転移に関連することを確認し、これを標的にして癌の成長および転移を制御できる新規癌標的治療生物指標を発掘すべく鋭意努力した結果、ＴＧＦβ−ＥＰＢ４１Ｌ５の信号伝達機序により癌の成長および転移を抑制するＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質のエピトープを確認することにより、本発明を完成するに至った。
【００１５】
本発明の一態様によれば、本発明は、配列番号１で表されるＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の６１９〜６２４番目アミノ酸残基の中から選択される１〜６ｍｅｒのエピトープを提供する。
【００１６】
本発明において、前記ＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質は、配列番号１で表され、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿０２０９０９から配列情報を確認することができる。
【００１７】
本発明において、前記ＥＰＢ４１Ｌ５（Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂａｎｄ４．１  ｌｉｋｅ５）タンパク質は、Ｎ−末端にＦＲＥＭドメインとＣ−末端に非相同性配列を有するＥｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂａｎｄ４．１のスーパーファミリー（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）のＮＢＬ４下位グループに属する。
【００１８】
本明細書において、用語「エピトープ」とは、抗体またはその断片が特異的に結合できる抗原の局所化された（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）部位を意味する。エピトープは、概してアミノ酸または糖側鎖のような分子の表面基からなり、一般的に特異的な３次元構造特性および特異的電荷特性を有する。立体形態的および非−立体形態的エピトープは、変性溶媒の存在下で立体形態的エピトープに対する結合は損失するが、非−立体形態的エピトープに対しては損失しないという点で区別される。エピトープは、結合に直接関連するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性成分とも称される）、および結合に直接関連しないその他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸残基が特異的抗原結合ペプチドのフットプリント（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）内に存在する）を含むことができる。
【００１９】
本発明において、前記エピトープは、ＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の６１９、６２０、６２１、６２２、６２３および６２４位置のアミノ酸残基の中から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸を含むことができる。
【００２０】
本発明において、前記エピトープは、ＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の６１９〜６２４番目アミノ酸配列からなるものであってもよく、好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００２１】
本発明において、前記位置のアミノ酸を含むエピトープは、その構造を維持するために、ワクチンや組成物に用いられる時、担体と結合した形態で利用可能である。本発明による担体は、生体適合し、本発明で目的とする効果を収められるものであれば特にこれに限定されないが、好ましくは、ペプチド、血清アルブミン、免疫グロブリン、ヘモシアニンおよび多糖体などから選択される。
【００２２】
本発明の他の態様によれば、本発明は、配列番号１で表されるＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質を抗原として認識してこれに特異的に結合する単クローン抗体またはその断片を提供する。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体またはその断片は、ＥＰＢ４１Ｌ５の６１９〜６２４番目アミノ酸残基の中から選択される１〜６ｍｅｒのエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合することができる。
【００２４】
上皮−間葉転移（ＥＭＴ）は胃癌転移の主要原因の一つで、多くの研究グループでＴＧＦβの信号伝達機序が上皮−間葉転移を調節すると知られている。ＴＧＦβリガンドがセリン／スレオニンキナーゼであるＴＧＦβ受容体ＩＩによってＴＧＦβ受容体Ｉに結合すれば、ＴＧＦβ受容体二量体の活性化によってＳｍａｄ２／３がリン酸化によって活性化されると、ｃｏ−ＳｍａｄであるＳｍａ４と結合して核内に移動して、上皮−間葉転移過程に関連する遺伝子ＰＡＩ−１、ＺＥＢ１、Ｓｌｕｇを調節する。ＴＧＦ−β１の発現が胃癌患者の粘液、血清、組織で高く現れ、高いＴＧＦ−β１の発現が胃癌患者の低い生存率に関連するという一部の研究報告がある。
【００２５】
本発明において、ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙとＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析によりＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子およびこれによってコーディングされるタンパク質の発現レベルが高い時、癌患者の生存率が低いことを確認し、ＫＡＴＯＩＩＩ、ＭＫＮ２８、ＳＮＵ１、ＳＮＵ７１９の４つの胃癌細胞株においてＥＰＢ４１Ｌ５  ｍＲＮＡとタンパク質の発現はＴＧＦ−β１によって増加したことを確認し、ＴＧＦ−β１によって増加したＥＰＢ４１Ｌ５の発現はＳｍａｄ−依存性ＴＧＦβの信号機序によって調節されていることを確認した。ＴＧＦβの信号機序によって増加したＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質は、細胞付着物質であるｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎと相互作用して癌の転移に影響を及ぼしうる。よって、本発明による前記単クローン抗体またはその断片は、ＥＰＢ４１Ｌ５／ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの複合体が形成される時に結合するアミノ酸配列をエピトープとして特異的に結合するため、ＥＰＢ４１Ｌ５／ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの複合体の形成を効果的に抑制することにより、癌の発生、転移、成長などを非常に効果的に抑制することができる。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記単クローン抗体またはその断片は、配列番号１で表されるＥＰＢ４１Ｌ５に特異的に結合し、ＥＰＢ４１Ｌ５とｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎとの間の相互作用を遮断するもので、配列番号１で表されるＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質を抗原として用いて製造されたものであれば特にこれに限定されないが、最も好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を抗原として用いたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００２７】
本明細書において、用語「エピトープ」とは、抗体またはその断片が特異的に結合できる抗原の局所化された（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）部位を意味する。例えば、抗原であるポリペプチド中の連続したアミノ酸がエピトープになり得、ポリペプチドにおいて３次構造上の折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）によって非連続の２またはそれ以上の部位が共にエピトープになり得る。エピトープは、抗原独特の３次元構造において、連続または非連続のアミノ酸を最小２個以上、最小３個以上、最小４個以上、最小５個以上、最小６個以上、最小７個以上、最小８個以上、最小９個以上、最小１０個以上、最小１１個以上、最小１２個以上、最小１３個以上、最小１４個以上または最小１５個以上含むことができる。本発明の抗体またはその断片は、ＥＰＢ４１Ｌ５を抗原として認識してこれに特異的に結合するが、ＥＰＢ４１Ｌ５は、前記６１９〜６２４番目アミノ酸残基の中から選択される１〜６ｍｅｒをエピトープとして特異的に結合することができ、前記エピトープは、１またはそれ以上のアミノ酸を含むことができる。
【００２８】
所与の抗体が結合するエピトープを決定する方法（例えば、エピトープマッピング）は、抗体に対する反応性テストによる免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）および免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）試験などの多様な方法がある。エピトープの３次元空間構造を決定する方法は、ｘ−線結晶学（ｘ−ｒａｙ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）、２次元核磁気共鳴法（２−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）およびＨＤＸ−ＭＳなどの多様な方法を利用して行うことができる（Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６））。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体またはその断片が結合できるエピトープは、ＮＭＲ分光学、Ｘ−ｒａｙ回折結晶学、ＥＬＩＳＡ分析、ＨＤＸ−ＭＳ（ｈｙｄｒｏｇｅｎ／ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、アレイベースのオリゴ−ペプチドスキャニング（ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ）、および／または突然変異誘発マッピング（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｍａｐｐｉｎｇ）により決定できる（Ｇｉｅｇｅ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ５０（Ｐｔ４）：３３９−３５０；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ａ（１９９０）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ１８９：１−２３；Ｃｈａｙｅｎ  ＮＥ（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ５：１２６９−１２７４；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ａ（１９７６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２５１：６３００−６３０３）。
【００３０】
本明細書において、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子のいずれかの類型の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＹ）であってもよいし、いずれか下位類型の抗体（例えば、ヒトにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４；およびマウスにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３）であってもよい。免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）は、多様なアロタイプ（ａｌｌｏｔｙｐｅ）が存在してもよいし、本明細書において、用語「抗体」は、一般的に知られたアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）およびアロタイプ（ａｌｌｏｔｙｐｅ）を含む。また、本明細書において、用語「抗体」は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であるか、そのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）類型であってもよい（例えば、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のハイブリッド）。
【００３１】
本明細書において、用語「単クローン抗体」または「ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ」は、特定のエピトープに対する単一結合特異性（ｓｉｎｇｌｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）および親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を示す抗体を意味する。
【００３２】
本発明の単クローン抗体は、例えば、文献［Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２５６，４９５（１９７５）］で初めて説明されたハイブリドーマ方法によって生産されるか、組換えＤＮＡ方法によって生産される。単クローン抗体はまた、例えば、文献［Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２，６２４−６２８（１９９１）］および［Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７（１９９１）］に記載された技術を利用してファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。単クローン抗体は、任意の好適な供給源から入手できるが、本発明における単クローン抗体は、ＥＰＢ４１Ｌ５抗原を発現する細胞、またはＥＰＢ４１Ｌ５抗原をコーディングする核酸形態の関心のある抗原で免疫化させたマウスから得た細胞から製造したハイブリドーマから入手できる。単クローン抗体はさらに、免疫化されたヒトまたは非−ヒト哺乳動物、例えば、ラット、イヌ、霊長類などの抗体−発現細胞に由来するハイブリドーマから入手できる。
【００３３】
本明細書において、前記単クローン抗体は、その断片を含む意味で使われ、前記断片は、好ましくは、抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を意味する。前記断片は、当業界で知られた多様な方法を利用して製造することができる。例えば、パパイン（Ｆａｂ断片の生産）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２）のような酵素を用いて免疫グロブリン分子のタンパク質分解性切断（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ）により、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片を製造することができる。
【００３４】
本明細書において、用語「断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦＶ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、またはモノマーのＶＨまたはＶＬドメインを含むｓｄＡｂであってもよいし、前記断片については当業界でよく知られている。
【００３５】
本発明において、前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）、両特異性分子、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ドメイン抗体、二重特異的抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗体模倣体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、またはその断片であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００３６】
本発明において、前記「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域およびヒト抗体の不変領域を組換えた抗体であって、マウス抗体に比べて免疫反応が大きく改善された抗体である。
【００３７】
また、本発明において、前記「ヒト化抗体」は、ヒトではない種に由来する抗体のタンパク質配列を、ヒトから自然的に生産された抗体変異体と類似するように変形させた抗体を意味する。その例として、前記ヒト化抗体は、マウス由来のＣＤＲをヒト抗体由来のＦＲと組換えてヒト化可変領域を製造し、これを好ましいヒト抗体の不変領域と組換えてヒト化抗体を製造することができる。
【００３８】
本発明の単クローン抗体またはその断片は、ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子またはこれによってコーディングされるタンパク質によって媒介される癌の成長と転移に関連する生理学的効果を抑制する。具体的には、癌においてＴＧＦ−β１の増加が確認され、ＴＧＦ−β１によってＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の発現レベルが増加するが、ＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の発現レベルはＳｍａｄ依存性ＴＧＦβの信号機序によって調節される。すなわち、ＴＧＦ−β１によって増加したＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の発現レベルは、上皮−間葉転移過程により癌の移動性と浸潤に影響を与えるもので、上述した抗原結合タンパク質を含む単クローン抗体またはその断片を処理して、ＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質によって媒介される細胞信号伝達などを非常に効果的に抑制することができる。
【００３９】
本発明において、「成長を抑制する」とは、本発明の単クローン抗体またはその断片と接触しない同一細胞の成長と比較して、単クローン抗体またはその断片と接触した時、細胞成長の任意測定可能な減少（例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の細胞培養液の成長抑制を含む）を含むように意図され、前記細胞成長の減少は多様なメカニズムによって発生可能である。
【００４０】
前記単クローン抗体またはその断片は、１つ以上のＣＤＲ（例えば、１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲ）を含む。前記単クローン抗体またはその断片は、ＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質を抗原としてこれに結合させるもので、本願で説明される１つ以上の相補性決定区域（ＣＤＲ）を含むポリペプチドである。前記抗原結合タンパク質において、ＣＤＲは好適な抗原結合特性が達成されるようにＣＤＲを配向させる。本願で提供される抗原結合タンパク質は、ＥＰＢ４１Ｌ５とｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの相互作用を阻害または遮断、あるいは減少または調整することができる。すなわち、これによって対象内に存在するＥＰＢ４１Ｌ５／ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの複合体の形成を阻害することにより、ＴＧＦ−β１によって媒介される癌の転移、成長を抑制することができる。
【００４１】
本発明において、前記単クローン抗体またはその断片は、
配列番号６で表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号７で表される重鎖ＣＤＲ２；および配列番号８で表される重鎖ＣＤＲ３；を含む重鎖可変領域；および配列番号９で表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１０で表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１１で表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む軽鎖可変領域；を含むものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００４２】
本発明において、前記単クローン抗体またはその断片は、
配列番号１２で表される重鎖可変領域；および配列番号１３で表される軽鎖可変領域；を含むものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００４３】
ＶＨドメイン、または１つまたはそれ以上のＣＤＲは、重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）を形成するために不変ドメインに連結される。また、ＶＬドメイン、または１つまたはそれ以上のＣＤＲは、軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）を形成するために不変ドメインに連結される。全長（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）重鎖および全長軽鎖が結合して全長抗体を構成する。
【００４４】
本発明において、前記単クローン抗体またはその断片は、先に説明したように、配列番号１で表されるＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の６１９〜６２４番目アミノ酸残基の中から選択される１〜６ｍｅｒのエピトープに結合するもので、配列番号１で表されるＥＰＢ４１Ｌ５に特異的に結合することにより、ＥＰＢ４１Ｌ５とｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎとの間の相互作用を遮断する効果を示す。
【００４５】
本発明において、前記単クローン抗体またはその断片は、治療用途に使用できる。具体的には、前記ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子またはこれによってコーディングされるタンパク質の１つ以上の生物学的活性を抑制または阻害、あるいは調整することができ、ＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質に特異的に結合して、前記ＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質と結合可能なタンパク質、例えば、ＴＧＦ−β１との競争的結合により実質的にＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質によって誘導される細胞信号伝達などを抑制することにより、治療用途に非常に適宜使用できる。
【００４６】
免疫グロブリン鎖の可変区域は、一般的に３個の超可変区域（よりしばしば「相補性決定区域」、すなわちＣＤＲと呼ばれる）によって連結された比較的保存されたフレームワーク区域（ＦＲ）を含む同一の全体構造を示す。上述したそれぞれの重鎖／軽鎖対の２個の鎖からのＣＤＲは、大体フレームワーク区域によって整列されて、標的タンパク質（例えば、ＰＣＳＫ９）上の特異的エピトープと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ−末端からＣ−末端に、天然発生軽鎖および重鎖可変区域はいずれも一般的に次の順序のかかる要素と一致する：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。それぞれのこれらドメイン内の位置を占めるアミノ酸に数字を割り当てるためのナンバリングシステムが考案された。前記ナンバリングシステムは文献（［Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７  ａｎｄ  １９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）］、または［Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７］；［Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８−８８３］）に定義されている。
【００４７】
多様な重鎖および軽鎖可変区域が本願により提供され、先に説明したように、それぞれのこれら可変区域は、前記重鎖および軽鎖不変区域に付着してそれぞれ完全な抗体の重鎖および軽鎖を形成することができる。また、それぞれの形成された重鎖および軽鎖配列は組み合わされて完全な抗体構造を形成することができる。
【００４８】
本発明で提供する前記単クローン抗体またはその断片は、ＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質に特異的に結合できる限り、前記アミノ酸配列の変異体を含むことができる。例えば、抗体の結合親和度および／またはその他の生物学的特性を改善させるために抗体のアミノ酸配列に変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体をなすアミノ酸配列残基の欠失、挿入および／または置換を含む。
【００４９】
このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいて行われる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形状および種類に対する分析によって、アルギニン、リシンとヒスチジンはいずれも正電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシンとセリンは類似の大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは類似の形状を有することが分かる。したがって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；およびフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは生物学的に機能均等物といえる。
【００５０】
変異の導入にあたり、アミノ酸の疎水性インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考えられる。それぞれのアミノ酸は、疎水性と電荷によって疎水性インデックスが付与されている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスタイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。タンパク質の相互的な生物学的機能（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を付与するにあたり、疎水性アミノ酸インデックスは非常に重要である。類似の疎水性インデックスを有するアミノ酸に置換してこそ類似の生物学的活性を保有できるというのは、公知の事実である。疎水性インデックスを参照して変異を導入させる場合、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、さらにより好ましくは±０．５以内の疎水性インデックスの差を示すアミノ酸間で置換をする。
【００５１】
一方、類似の親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）を有するアミノ酸間の置換が均等な生物学的活性を有するタンパク質をもたらすこともよく知られている。米国特許第４，５５４，１０１号に開示されているように、次の親水性値がそれぞれのアミノ酸残基に付与されている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。親水性値を参照して変異を導入させる場合、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、さらにより好ましくは±０．５以内の親水性値の差を示すアミノ酸間で置換を行うことができる。
【００５２】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質におけるアミノ酸交換は、当該分野で公知である（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９））。最も通常起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ｇｌｎ／Ｇｌｕ間の交換である。
【００５３】
上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すれば、本発明の結合分子は、配列リストに記載の配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むと解釈される。
【００５４】
本発明において、用語「実質的な同一性」とは、本発明の配列と任意の他の配列を最大限対応するように並べ、当業界で通常利用されるアルゴリズムを用いて並べられた配列を分析した場合に、最小６１％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、さらにより好ましくは８０％の相同性、最も好ましくは９０％の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は、当業界で公知である。アラインメントについての多様な方法およびアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４８：４４３（１９７０）；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ７３：２３７−４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１−３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．８：１５５−６５（１９９２）ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１（１９９４）に開示されている。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））は、ＮＢＣＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などでアクセス可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ  ａｎｄ  ｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して利用可能である。ＢＬＳＡＴは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でアクセス可能である。このプログラムを用いた配列相同性の比較方法は、オンライン（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）により確認することができる。
【００５５】
本発明において、前記結合分子、好ましくは、前記抗体は、抗体を生産する通常の方法によって生成されてもよいが、親和度成熟（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）によって生成できる。
【００５６】
本発明において、前記「親和度成熟（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」は、活性化されたＢ細胞が免疫反応過程で抗原に対する親和度の増加した抗体を生産する過程を意味する。本発明の目的上、前記親和度成熟は、自然で起こる過程と同様に、突然変異と選択の原理に基づいて親和度成熟によって生成された抗体または抗体断片を生成することができる。
【００５７】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記単クローン抗体またはその断片をコーディングする核酸分子；前記核酸分子を含むベクター；または前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００５８】
本発明の前記核酸分子は、単離されたものであるか、組換えられたものであってもよいし、単鎖および二重鎖形態のＤＮＡおよびＲＮＡだけでなく、対応する相補性配列が含まれる。「単離された核酸」は、天然生成源から単離された核酸の場合、核酸が単離された個体のゲノムに存在する周辺の遺伝配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的にまたは化学的に合成された核酸、例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、またはオリゴヌクレオチドの場合、このような手順から生成された核酸が単離された核酸分子と理解される。単離された核酸分子は、別の断片の形態またはより大きい核酸構築物の成分としての核酸分子を示す。核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置される時、「作動可能に連結」される。例えば、前配列または分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）のＤＮＡは、ポリペプチドが分泌される前の形態である前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは、ポリペプチド配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作動可能に連結され、またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置される時、コーディング配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結された」は、連結されるＤＮＡ配列が隣接して位置することを意味し、分泌リーダーの場合、隣接して同一のリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは隣接して位置する必要はない。連結は便利な制限酵素部位においてライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプダーまたはリンカーを通常の方法により用いる。
【００５９】
本明細書において、用語「ベクター」は、核酸配列を複製できる細胞への導入のために核酸配列を挿入できる伝達体を意味する。核酸配列は、外生（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）または異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であってもよい。
【００６０】
本明細書において、用語「発現ベクター」は、転写される遺伝子産物の少なくとも一部分をコーディングする核酸配列を含むベクターを意味する。一部の場合は、その後、ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。発現ベクターには多様な調節配列を含むことができる。転写および翻訳を調節する調節配列と共に、ベクターおよび発現ベクターには他の機能も提供する核酸配列も含まれる。
【００６１】
本発明において、前記発現ベクターの具体例としては、商業的に広く使用されるｐＣＤＮＡベクター、Ｆ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴｏＬ、Ｔｉベクター；コスミド；ラムダ、ラムダ状（ｌａｍｂｄｏｉｄ）、Ｍ１３、Ｍｕ、ｐ１  Ｐ２２、Ｑμ、Ｔ−ｅｖｅｎ、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ７などのファージ；植物ウイルスからなる群より選択できるが、これに限定されるものではなく、当業者に発現ベクターとして知られたすべての発現ベクターは本発明に使用可能であり、発現ベクターを選択する時には目的とする宿主細胞の性質による。宿主細胞へのベクターの導入時、リン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ−デキストラン調節トランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクションまたは電気穿孔法によって行われるが、これに限定されるものではなく、当業者は使用する発現ベクターおよび宿主細胞に適した導入方法を選択して用いることができる。好ましくは、ベクターは、１つ以上の選別マーカーを含むが、これに限定されず、選別マーカーを含まないベクターを用いて生産物の生産の有無によって選別可能である。選別マーカーの選択は、目的とする宿主細胞によって選別され、これはすでに当業者に知られた方法を利用するので、本発明はこれに限定されない。
【００６２】
本発明において、前記核酸分子を精製を容易にするためにタグ配列を発現ベクター上に挿入して融合させることができる。前記タグとしては、ヘキサ−ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、ｍｙｃタグまたはｆｌａｇタグを含むが、これに限定されるものではなく、当業者に知られた精製を容易にするタグはすべて本発明で利用可能である。
【００６３】
本明細書において、用語「宿主細胞」は、真核生物および原核生物を含み、前記ベクターを複製できるか、ベクターによってコーディングされる遺伝子を発現できる任意の形質転換可能な生物を意味する。宿主細胞は、前記ベクターによって形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）または形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）されてもよいし、これは外生の核酸分子が宿主細胞内に伝達または導入される過程を意味する。
【００６４】
本発明の宿主細胞は、好ましくは、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６５】
本発明の他の態様によれば、本発明は、配列番号１で表されるＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の６１９〜６２４番目アミノ酸残基の中から選択される１〜６ｍｅｒのエピトープ；これをコーディングする核酸分子；またはこれを含むベクターを有効成分として含む癌の予防または治療用ワクチン組成物を提供する。
【００６６】
本発明の前記ワクチン組成物において、ＥＰＢ４１Ｌ５、エピトープ、核酸分子、ベクターに関連する内容は上述したものと同じで、本明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。
【００６７】
前記ワクチンは、生ワクチン、弱毒化ワクチンまたは死ワクチンであってもよいし、ワクチンを飼料または飼料添加剤としても使用可能である。
【００６８】
本発明のワクチン組成物は、能動免疫によりＥＰＢ４１Ｌ５に対して免疫反応だけでなく全身免疫反応を誘導可能で、癌を予防または治療することができ、能動免疫は、病原体が侵入した時、生体自らが自分の体の中に抗体が生成されるようにして免疫されることを意味する。
【００６９】
また、本発明は、前記ワクチン組成物を個体に投与して癌の予防または治療に利用可能である。
【００７０】
本発明の前記癌は、ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子およびそのタンパク質の発現レベルを測定した場合、ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子またはタンパク質の発現レベルが過発現したものであってもよい。
【００７１】
本明細書で使われた用語「過発現」は、好適な発現分析法によりＥＰＢ４１Ｌ５の発現レベルを測定した場合において、比較対象細胞（例えば、当該器官の正常細胞）と比較して、ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子またはこれによってコーディングされるタンパク質の発現レベルが１．１〜２倍以上増加していることを意味する。本発明の癌の種類は限定されず、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）および急性リンパ球白血病（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性非リンパ球白血病（ａｃｕｔｅ  ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）、慢性リンパ球白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性骨髄白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）および多発骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ）などのようなリンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ）、膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、横紋筋肉腫（Ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）、網膜芽細胞腫（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）、ウィルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ  Ｔｕｍｏｒ）、骨腫瘍（ｂｏｎｅ  ｔｕｍｏｒｓ）および軟部組織肉腫（ｓｏｆｔ−ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｒｃｏｍａｓ）などのような小児固形腫瘍（ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ）、肺癌（ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）、尿路癌（ｕｒｉｎａｒｙ  ｃａｎｃｅｒｓ）、子宮癌（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｃａｎｃｅｒｓ）、口腔癌（ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）およびその他の皮膚癌（ｓｋｉｎ  ｃａｎｃｅｒｓ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ）、肝臓癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ）、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）および睾丸癌（ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ）などのような成人の通常の固形腫瘍（ｃｏｍｍｏｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ）を含む多数の癌を治療するように投与可能である。
【００７２】
本発明の前記癌は、癌幹細胞であってもよい。
【００７３】
本発明の前記「癌幹細胞」とは、幹細胞特有の能力である自己再生や分化能力を有する包括的な意味の癌細胞を意味する。腫瘍内に存在すると知られており、正常幹細胞の遺伝的な情報の異常な転移によって発生すると考えられている。癌幹細胞はそれらが生存するための微細環境、ニッシェ（ｎｉｃｈｅ）の存在によって維持、増殖され、周辺に存在する正常細胞、免疫関連細胞または分化された癌細胞がこれら特性の維持と増殖に影響を及ぼすと知られている。前記癌幹細胞は、正常な腫瘍の生長条件（前記「正常な腫瘍の生長条件」とは、細胞の成長に必要な営養分（ブドウ糖）が十分で腫瘍微細環境の生長条件が豊富で細胞ストレスがない状態を指す。）で一般的な癌細胞と異なって遅い速度で増殖するか、休止期（ｄｏｒｍａｎｔ  ｓｔａｔｅ）状態を維持して抗癌剤に対する抵抗性を有することができ、例えば、転写調節因子の発現が正常な腫瘍細胞とは異なって統制されて、主要代謝調節物質の機能が一般の癌細胞と比較して異なる。このような異なる代謝調節能力とこれに機序的に連携された細胞信号伝達系の調節により栄養欠乏状態で細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に対する抵抗性を獲得し、浸潤および／または転移能がある細胞を包括的に指し示す。しかし、一般的な癌細胞に分化可能な細胞であればこれに限定されない。
【００７４】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記単クローン抗体またはその断片；これをコーディングする核酸分子；前記核酸分子を含むベクター；またはＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現を抑制する抑制剤を含む組成物を提供する。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は、癌の予防または治療；または癌の転移抑制用薬剤学的組成物として使用できる。
【００７６】
本発明の前記組成物において、抗体またはその断片、核酸分子、癌、癌幹細胞などに関連する内容は前記エピトープ、単クローン抗体またはその断片などに記載のものと同じで、明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。
【００７７】
本発明の薬剤学的組成物は、（ａ）前記抗体またはその断片；これをコーディングする核酸分子；前記核酸分子を含むベクター；またはＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現を抑制する抑制剤；および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含むことができる。
【００７８】
本発明の前記薬剤学的組成物の最も大きな特徴は、ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子またはこれによってコーディングされるタンパク質を標的にして、前記ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現レベルまたは前記ＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の発現または活性を抑制して、癌を治療するか、または転移を抑制させるということである。
【００７９】
本発明の前記抑制剤は、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択された１種以上であってもよいが、好ましくは、前記遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）である。前記抑制剤は、ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現を抑制するもので、前記ｓｉＲＮＡは、配列番号４の塩基配列で表されるｓｉＲＮＡ、または配列番号５の塩基配列で表されるｓｉＲＮＡであってもよい。
【００８０】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記薬剤学的組成物を投与する段階を含む癌の予防または治療方法を提供する。
【００８１】
本発明の前記癌の予防または治療方法において、薬剤学的組成物に関連する内容は前記薬剤学的組成物に記載のものと同じで、明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。
【００８２】
本発明の前記「予防」は、本発明の前記組成物を用いて癌に起因する症状を遮断するか、その症状を抑制または遅延させられるすべての行為であれば制限なく含まれる。
【００８３】
本発明の前記「治療」は、本発明の前記組成物を用いて癌に起因する症状を好転させるか、有利にするすべての行為であれば制限なく含まれる。本発明のワクチン組成物と薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分のほか、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加的に含んでもよい。好適な薬剤学的に許容される担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【００８４】
本発明のワクチン組成物と薬剤学的組成物は、経口または非経口投与可能であり、好ましくは、非経口投与であり、例えば、静脈内注入、局所注入および腹腔注入などで投与することができる。
【００８５】
本発明のワクチン組成物と薬剤学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様であり、通常熟練した医師は所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定および処方することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、本発明のワクチン組成物と薬剤学的組成物の１日投与量は、０．０００１−１００ｍｇ／ｋｇである。
【００８６】
本発明のワクチン組成物と薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することにより、単位用量形態に製造されるか、または多用量容器内に入れて製造される。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤形態であってもよいし、分散剤または安定化剤を追加的に含んでもよい。
【００８７】
本発明のワクチン組成物と薬剤学的組成物は、単独の療法で利用できるが、他の通常の化学療法または放射療法と共に利用されてもよいし、このような並行療法を実施する場合にはより効果的な癌治療が可能である。本発明の組成物と共に利用可能な化学療法剤は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ビスルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、トランスプラチナム（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）およびメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）などを含む。本発明の組成物と共に利用可能な放射療法は、Ｘ−線照射およびγ−線照射などである。
【００８８】
本発明のさらに他の態様によれば、ＥＰＢ４１Ｌ５の過発現による疾患の診断のための情報を提供する方法を提供する。
【００８９】
本発明において、前記方法は、（ａ）被検者から体外に分離されたサンプルを取得するステップ；（ｂ）前記単クローン抗体またはその断片を前記サンプルに処理するステップ；および（ｃ）前記被検者のサンプル中に含まれたＥＰＢ４１Ｌ５の発現量が、正常群サンプル中に含まれたＥＰＢ４１Ｌ５の発現量より高いか否かを確認するステップ；を含む。
【００９０】
本発明の前記情報を提供する方法において、ＥＰＢ４１Ｌ５の過発現による疾患、癌、癌幹細胞、単クローン抗体などに関する内容は上述したものと同じで、明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。
【００９１】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、単クローン抗体またはその断片を処理するステップを含む、サンプル中に含まれたＥＰＢ４１Ｌ５の定量方法を提供する。
【００９２】
本発明の単クローン抗体またはその断片は、ＥＰＢ４１Ｌ５に特異的に結合するため、これを用いると、サンプル中に含まれたＥＰＢ４１Ｌ５の量を正確に測定可能である。
【００９３】
本発明の前記定量方法において、ＥＰＢ４１Ｌ５の過発現による疾患、癌、癌幹細胞、単クローン抗体などに関する内容は上述したものと同じで、明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。
【００９４】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記単クローン抗体またはその断片を含むＥＰＢ４１Ｌ５定量キットを提供する。
【００９５】
本発明の定量キットは、抗原抗体結合反応により前記抗体に対する抗原を分析することによりＥＰＢ４１Ｌ５の量を定量することができ、前記抗原−抗体結合反応は、通常のＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｎｏａｓｓａｙ）、サンドイッチ測定法（Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ａｓｓａｙ）、ポリアクリルアミドゲル状のウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ）、免疫ブロット分析（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）および免疫組織化学染色方法（Ｉｍｍｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）からなる群より選択されることが好ましいが、これに限定されない。
【００９６】
本発明の前記抗原−抗体結合反応のための固定体としては、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、ポリビニル（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）樹脂またはポリスチレン（Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂で合成されたウェルプレート（Ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）およびガラスからなるスライドガラス（Ｓｌｉｄｅ  ｇｌａｓｓ）からなる群より選択されるものが使用できるが、これに限定されるものではない。
【００９７】
前記二次抗体は、発色反応をする通常の発色剤で標識されるものが好ましく、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリ性リン酸分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（Ｃｏｌｏｉｄ  ｇｏｌｄ）、ＦＩＴＣ（Ｐｏｌｙ  Ｌ−リシン−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＲＩＴＣ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｂ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）などの蛍光物質（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）および色素（Ｄｙｅ）からなる群より選択されるいずれか１つの標識体が使用できる。発色を誘導する基質は、発色反応をする標識体に応じて使用するものが好ましく、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ［２，２’−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）］およびＯＰＤ（ｏｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなる群より選択されるいずれか１つを用いるものが好ましいが、これに限定されるものではない。
【発明の効果】
【００９８】
本発明の特徴および利点を要約すれば、次の通りである：
（１）本発明は、ＥＰＢ４１Ｌ５を抗原として認識してこれに特異的に結合する単クローン抗体またはその断片を提供する。
（２）本発明は、ＥＰＢ４１Ｌ５のエピトープに特異的に結合する抗体の発掘に活用することができ、この方法により発掘した抗体は、ＥＰＢ４１Ｌ５の信号伝達過程を抑制する機能を示し、この機能を利用してＥＰＢ４１Ｌ５が関与する癌、特に胃癌に対するワクチンまたは治療剤として有用に活用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、胃癌患者標本からマイクロアレイ分析を行った結果で、ＥＰＢ４１Ｌ５の発現レベルが高ければ、胃癌患者の予後が良くないことを確認した。図１Ａは、リンパ節転移がない胃癌患者からオリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析を行った結果である。胃癌患者は遺伝子の発現様相（ＥＰＢ４１Ｌ５の発現の中間値基準）によって２つのグループに分類した。図１Ｂは、胃癌患者の２つのグループに対する１０年間の生存率を分析した結果グラフである。図１Ｃは、胃癌患者の２つのグループに対するＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒプロッター分析を実施した結果である。
【図２】図２は、ＥＰＢ４１Ｌ５および間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）遺伝子の発現がＴＧＦβの信号とどのような関連性を有するかを分析するために行った多様な実験データで、図２Ａは、多様な胃癌細胞をウェスタンブロットで分析した結果である。  図２Ｂは、２４時間ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）を処理した胃癌細胞、および処理しなかった胃癌細胞に対してリアルタイムｑＰＣＲを行うことにより、ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現レベルを分析した結果グラフである。この時、ｃｏｎｔｒｏｌは、ＴＧＦ−β１を処理しなかった胃癌細胞におけるＥＰＢ４１Ｌ５  ｍＲＮＡの発現を示したものであり、ＴＧＦ−β１は、ＴＧＦ−β１を処理した胃癌細胞におけるＥＰＢ４１Ｌ５  ｍＲＮＡの発現を示したものである。  図２Ｃは、２４時間ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）を処理した胃癌細胞、および処理しなかった胃癌細胞に対してウェスタンブロットを行って、ＥＭＴ関連遺伝子（ＥＰＢ４１Ｌ５、ｐ−Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２、ｐ−Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ３、ＰＡＩ−１、β−ａｃｔｉｎ）の発現程度を分析した結果である。  図２Ｄは、２４時間ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）を処理したＮＣＩ−Ｎ８７細胞とＫＡＴＯＩＩＩ細胞、および処理しなかったＮＣＩ−Ｎ８７細胞とＫＡＴＯＩＩＩ細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）から内因性ＥＰＢ４１Ｌ５およびＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現レベルを分析した結果である。この時、緑色はＥＰＢ４１Ｌ５、赤色はＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、青色はＨｏｃｈｅｓｔ３３２５８を示し、スケールバーは２０μｍを意味する。  図２Ｅは、ＴＧＦ−β１処理するか、処理しなかったＫＡＴＯＩＩＩおよびＳＮＵ７１９細胞から細胞形態を撮影した写真である。図２Ｅを通して、ＴＧＦ−β１の存在の有無による細胞形態が観察された。白い矢印は間葉細胞に形質転換された細胞を示すもので、露出したＫＡＴＯＩＩＩおよびＳＮＵ７１９細胞。スケールバーは２０μＭを表す。
【図３】図３は、Ｓｍａｄに依存的なＴＧＦβの信号伝達がＥＰＢ４１Ｌ５の発現を調節できることを確認した実験結果で、図３Ａは、Ｓｍａｄ４の発現が欠乏したＭＫＮ４５細胞およびＮＣＩ−Ｎ８７細胞にＴＧＦ−β１を処理するか、処理しなかった後にウェスタンブロットで分析した結果である。  図３Ｂは、免疫蛍光染色分析によりＴＧＦ−β１で処理するか、処理しなかったＮＣＩ−Ｎ８７細胞から内因性ＥＰＢ４１Ｌ５およびＥ−カドヘリンの発現レベルを分析した結果である。この時、緑色はＥＰＢ４１Ｌ５、赤色はＥ−カドヘリンであり、スケールバーは２０μｍを意味する。  図３Ｃは、ＴＧＦ−β１またはｓｉＳＭＡＤ４＃１または＃２で処理するか、処理しなかったＫＡＴＯＩＩＩ細胞からＳｍａｄ４、ＥＰＢ４１Ｌ５、Ｓｌｕｇ、ＰＡＩ−１のｍＲＮＡ  ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎを分析して示したグラフである。実験結果は平均±ｓ．ｅ．ｍで表記し、スケールバーは２０μＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。  図３Ｄは、ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）またはｓｉＳｍａｄ４＃１、＃２を処理したＫＡＴＯＩＩＩ細胞、および処理しなかったＫＡＴＯＩＩＩ細胞に対してウェスタンブロットを行って、ＥＭＴ関連遺伝子（ＥＰＢ４１Ｌ５、ｐ−Ｓｍａｄ４、αＰＡＩ−１、αＳｌｕｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎ）の発現程度を分析した結果である。
【図４】図４は、何ら処理しなかったＫＡＴＯＩＩＩ細胞、ＴＧＦ−β１のみ処理したＫＡＴＯＩＩＩ細胞、ＴＧＦ−β１を処理した後、ＴＧＦβ抑制剤（ＬＹ２１５７２９９）を処理したＫＡＴＯＩＩＩ細胞を用意し、これを内因性ＥＰＢ４１Ｌ５およびＥ−カドヘリンの発現を分析するために免疫蛍光染色で分析した結果である。緑色はＥＰＢ４１Ｌ５、赤色はＥ−カドヘリン、青色はＨｏｃｈｅｓｔ３３２５８であり、スケールバーは２０μｍである。
【図５】図５Ａは、ＴＧＦ−β１の処理によるＥＰＢ４１Ｌ５によって胃癌細胞の移動性が調節されることを確認したもので、ＴＧＦ−β１の添加の有無によるＮＣ  ｓｉＲＮＡ形質感染したＫＡＴＯＩＩＩ細胞、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃１、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃２で形質感染したＫＡＴＯＩＩＩ細胞におけるリアルタイムｑＰＣＲの結果である。  図５Ｂは、ＴＧＦ−β１の添加の有無によるＮＣ  ｓｉＲＮＡ形質感染したＫＡＴＯＩＩＩ細胞、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃１、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃２で形質感染したＫＡＴＯＩＩＩ細胞におけるウェスタンブロット分析の結果である。  図５Ｃは、ＴＧＦ−β１の添加の有無によるＮＣ  ｓｉＲＮＡ形質感染したＫＡＴＯＩＩＩ細胞、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃１、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃２で形質感染したＫＡＴＯＩＩＩ細胞とＳＮＵ７１９細胞の形態学的変化を示した結果で、白い矢印は中間葉細胞に変形された細胞を示し、スケールバーは２０μＭである。  図５Ｄは、ＴＧＦ−β１の添加の有無によるＮＣ  ｓｉＲＮＡ形質感染したＫＡＴＯＩＩＩ細胞、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃１、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃２で形質感染したＫＡＴＯＩＩＩ細胞に対する試験管内の移動および浸潤分析結果のイメージである。スケールバーは２０μＭである。  図５Ｅは、ＴＧＦ−β１の添加の有無によるＮＣ（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）ｓｉＲＮＡ形質感染したＫＡＴＯＩＩＩ細胞、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃１またはＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃２で形質感染したＫＡＴＯＩＩＩ細胞に対する試験管内の移動および浸潤分析の結果である。実験結果は平均±ｓ．ｅ．ｍで表記し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６】図６は、抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体の特異性に関するもので、図６Ａは、ＭＫＮ２８細胞をＦｌａｇ−ＥＰＢ４１Ｌ５構造物で形質感染させた後、これをウェスタンブロットで分析した結果であり、図６Ｂは、ＭＫＮ２８細胞をＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ（＃１または＃２）で形質感染させた後、これをウェスタンブロットで分析した結果である。  図６Ｃは、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡで形質感染したＭＫＮ２８細胞（ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ）を免疫蛍光染色で分析した結果である。この時、緑色はＥＰＢ４１Ｌ５を示す。  図６Ｄは、ＥＰＢ４１Ｌ５のドメイン構造を示した概略図である。  図６Ｅは、ＥＰＢ４１Ｌ５のＦＬ（全長）、ＥＰＢ４１Ｌ５のＦＥＲＭおよびＥＰＢ４１Ｌ５のＣ−末端で形質感染した２９３Ｔ細胞に対するウェスタン分析の結果である。  図６Ｆは、ＥＰＢ４１Ｌ５のＣ−末端において５個のアミノ酸残基が連続して欠失したプラスミド（１−６３３、１−６２８、１−６２３、１−６１８、１−６１３）で形質感染した２９３Ｔ細胞の全体溶解物をウェスタンブロットで分析した結果である。  図６Ｇは、ＥＰＢ４１Ｌ５のＦＬ（全長）とＥＰＢ４１Ｌ５の△６１９−６２４のプラスミドで形質感染した２９３Ｔ細胞の全体溶解物をウェスタンブロットで分析した結果である。  図６Ｈは、ＥＰＢ４１Ｌ５のＦＬ（全長）、ＥＰＢ４１Ｌ５のＦＥＲＭ、ＥＰＢ４１Ｌ５のＣ−ｔｅｒｍおよびＥＰＢ４１Ｌ５の△６１９−６２４の中から選択されるいずれか１つとＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡが共−形質感染したＭＫＮ２８細胞をそれぞれ製造し、これらに対して免疫蛍光染色で分析した結果である。この時、免疫蛍光染色は、抗−ＥＰＢ４１Ｌ５  ｍＡｂおよび抗−Ｆｌａｇ抗体を用いて分析した。緑色はＥＰＢ４１Ｌ５、赤色はＦｌａｇ  ｔａｇ、青色はＨｏｃｈｅｓｔであり、スケールバーは２０μＭである。
【図７】図７は、ＴＧＦ−β１によって増加した胃癌細胞の浸潤と転移を抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体によって抑制されていることを確認したもので、ＴＧＦ−β１を処理の有無によるＫＡＴＯＩＩＩ細胞に抗−ＥＰＢ４１Ｌ５  ｍＡｂを濃度別に処理した時、その細胞の移動に対するイメージ（Ａ）と分析結果グラフ（Ｂ）である。実験データは平均±ｓ．ｅ．ｍで表記し、スケールバーは２０μｍである。＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８】図８は、本発明による単クローン抗体と他のエピトープを認知する抗体との間のＴＧＦ−β１によって増加した胃癌細胞の浸潤と転移を抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体によって抑制される程度を比較した結果を示したものである。
【図９】図９は、ＥＰＢ４１Ｌ５と胃癌細胞の肺転移との関連性を確認するためのもので、図９Ａは、ＥＰＢ４１Ｌ５過発現したＫＡＴＯＩＩＩ細胞と対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）に対する試験管内の移動と浸潤分析を行った結果である。この時、１％ＦＢＳを化学誘引物質として使用した。  図９Ｂは、ＥＰＢ４１Ｌ５過発現したＫＡＴＯＩＩＩ細胞と対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）に対する試験管内の移動と浸潤分析を行った結果を定量化したもので、各群から１５個の細胞をランダムに選択してＦｕｓｉｏｎ  Ｃａｐｔ高級ソフトウェアによりセル計数したものである。実験データは平均±ｓ．ｅ．ｍで表記した。  図９Ｃは、ＥＰＢ４１Ｌ５過発現ＫＡＴＯＩＩＩ細胞（ＧＦＰ標識）（ＥＰＢ４１Ｌ５（ＧＦＰ））をヌードマウスの尾静脈を通して注入し（各グループあたり１０匹）、これに対する肺転移の推移をＩＶＩＳ光学映像システムで分析したものである。図９Ｄは、図９Ｃの映像から測定した強度を定量したもので、ＲＯＩツールを用いた。実験データは平均放射効率±ｓ．ｅ．ｍで表記した。＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１０】図１０Ａは、ＥＰＢ４１Ｌ５過発現したＫＡＴＯＩＩＩ細胞をヌードマウスの尾静脈を通して注入し、２日間隔で２週間抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体を５ｍｇ／ｋｇずつ注入した（ＥＰＢ４１Ｌ５＋ｍＡｂ）群を製造するためのダイヤグラムである。  図１０Ｂは、対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）とＥＰＢ４１Ｌ５過発現したＫＡＴＯＩＩＩ細胞をヌードマウスの尾静脈を通して注入した（ＥＰＢ４１Ｌ５）群、ＥＰＢ４１Ｌ５過発現したＫＡＴＯ２細胞をヌードマウスの尾静脈を通して注入し、２日間隔で２週間抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体を５ｍｇ／ｋｇずつ注入した（ＥＰＢ４１Ｌ５＋ｍＡｂ）群に対するＩＶＩＳ光学映像システムで分析した結果である。  図１０Ｃは、図９Ｂの映像からＲＯＩツールにより強度を定量化して示したグラフである。実験データは平均放射効率±ｓ．ｅ．ｍで表記した。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１１】図１１は、ＥＰＢ４１Ｌ５抗体を用いて胃癌、肺癌、乳癌細胞においてＥＢＰ４１Ｌ５タンパク質の発現と抗体機能をウェスタンブロットで分析した結果である。
【図１２】図１２は、胃癌、肺癌、乳癌細胞株にそれぞれ濃度別にＥＢＰ４１Ｌ５抗体を処理して細胞生存率を分析した結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
本発明の一実施形態によれば、配列番号１で表されるＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の６１９〜６２４番目アミノ酸残基を含むエピトープ；およびこれを含む癌の予防または治療用ワクチン組成物を提供する。
【０１０１】
本発明の他の実施形態によれば、配列番号６で表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号７で表される重鎖ＣＤＲ２；および配列番号８で表される重鎖ＣＤＲ３；を含む重鎖可変領域；および配列番号９で表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１０で表される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１１で表される軽鎖ＣＤＲ３；を含む軽鎖可変領域；を含むものである、単クローン抗体またはその断片を提供する。
【０１０２】
本発明のさらに他の実施形態によれば、前記単クローン抗体またはその断片を有効成分として含む癌の予防または治療用組成物を提供する。
【実施例】
【０１０３】
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【０１０４】
実験方法
１．患者標本
ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙと生存率分析のために、胃癌患者標本は臨床試験センターセブランス病院（ＩＲＢ  Ｎｏ：４−２０１６−００１３）から提供されて進行させた。
【０１０５】
２．細胞培養および試薬
ヒト胃癌細胞株であるＡＧＳ、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＫＡＴＯ２、ＳＫ−ＧＴ−４、ＭＫＮ１、ＭＫＮ２８、ＭＫＮ４５、ＳＮＵ１、ＳＮＵ５、ＳＮＵ１６、ＳＮＵ２１６、ＳＮＵ４８４、ＳＮＵ６３８、ＳＮＵ６６８およびＳＮＵ７１９は延世大学のチョン・ジェホ教授研究室（ソウル、韓国）から提供されて使用した。
【０１０６】
すべての胃癌細胞は、５％ＣＯ２、３７℃で１０％ＦＢＳと１％抗生剤／抗菌剤溶液（コーニング、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）が添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。２９３ＦＴ細胞はＤＭＥＭで培養した。ＴＧＦ−β１はＰｒｏｓｐｅｃ（Ｅａｓｔ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ、ＵＳＡ）から購入して使用し、ＬＹ２１５７２９９はＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）から購入して使用した。
【０１０７】
３．プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）
全体長さ、ＦＥＲＭドメイン、Ｃ−末端、△６１９−６２４および順次に除去されたＣ末端の５個のアミノ酸をコーディングするＥＰＢ４１Ｌ５関連のＤＮＡ構造物をＰＣＲによって生成し、ｐＳＧ５−ＫＦ２Ｍ１フラッグ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を複製した。すべてのプラスミド構造物はＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【０１０８】
４．ｓｉＲＮＡ形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
製造会社の手続きによってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて細胞にｓｉＲＮＡを形質感染させた。使用されたｓｉＲＮＡはＧｅｎｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で合成されたもので、ＥＰＢ４１Ｌ５−１（ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃１；ｓｉＥＰＢ４１Ｌ５＃１）（５’−ＧＣ  ＡＡＵＵＧＧＣＡＧＣＵＵＡＵＡＡＵＵＵ−３’）、ＥＰＢ４１Ｌ５−２（ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃２；ｓｉＥＰＢ４１Ｌ５＃２）（５’−ＵＵＣＡＧＡＵＵＣ  ＧＵＧＣＣＵＡＵＵＣＡＧＵＵ−３’）、Ｓｍａｄ４−１（５’−ＧＣＵＡＣＵＵＡＣＣＡＵＣＡＵ  ＡＡＣＡＵＵ−３’）およびＳｍａｄ４−２（５’−ＧＵＵＣＣＡＵＵＧＣＵＵＡＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵ−３’）である。
【０１０９】
５．単クローン抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）＿抗−ＥＰＢ４１Ｌ５  ｍＡｂ
単クローン抗体は、ヒトＥＰＢ４１Ｌ５抗原の３８６〜６３７番目アミノ酸残基（配列番号３）をマウスに免疫処理して製造され、これはＡＴｇｅｎ（城南（ソンナム）、大韓民国）に依頼して獲得した。
【０１１０】
１）マウスの免疫化およびハイブリドーマ細胞の作製
単クローン抗体は、ヒトＥＰＢ４１Ｌ５抗原の３８６〜６３７番目アミノ酸残基（配列番号３）を用いて製造された。効率的な抗体の製造のために配列番号３を抗体作製ターゲットペプチドとして選択した。
【０１１１】
前記抗体作製ターゲットペプチド（配列番号３）をマウスに注射した後、抗原に対する抗体を生産する細胞を生成し、マウスの脾臓から得た抗体生産細胞（Ｂ細胞、Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を骨髄腫細胞（Ｍｙｅｌｏｍａ）と融合してハイブリドーマ細胞を獲得した。ハイブリドーマ細胞だけが生存できるＨＡＴ培地で培養した後、抗体の活性をＥＬＩＳＡ実験により確認した。
【０１１２】
２）選別および確保
前記ハイブリドーマ細胞のうちＥＰＢ４１Ｌ５を特異的に認識する単クローンハイブリドーマ細胞を選定した後、マウスの腹腔内に前記選定された単クローンハイブリドーマ細胞を注入した後、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）から獲得した。腹水から回収した本発明の単クローン抗体は、タンパク質Ａとタンパク質Ｇカラムなどの使用によって精製した。
【０１１３】
以後、前記抗体は、ＥＰＢ４１Ｌ５構造物とｓｉＲＮＡを用いてウェスタンブロットと免疫蛍光法でＥＰＢ４１Ｌ５を特異的に認識する単クローン抗体（ＥＰＢ４１Ｌ５  ｍＡｂ）を選別および確認した。
【０１１４】
６．ＥＰＢ４１Ｌ５の過発現細胞株（ＥＰＢ４１Ｌ５  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）の生成
ＥＰＢ４１Ｌ５  ＤＮＡをｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ｐｕｒｏベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）にクローニングした。レンチウイルス粒子を生成するために、パッケージングプラスミドｐＲＳＶ−ＲｅｖおよびｐＭＤ２．Ｇを２９３ＦＴ細胞においてｐＣＤＨ−ＥＰＢ４１Ｌ５またはｐＬＥＣＥ３−ＧＦＰと共に形質感染させた。４８時間培養した後、上澄液を収集し、０．４５μＭの気孔フィルタで濾過した。ＫＡＴＯ２細胞をレンチウイルスに感染させた後、１μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で選別した。選別された安定化ＥＰＢ４１Ｌ５の過発現細胞株をＡｒｉａＩＩ流動細胞計測器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）でＧＦＰに分類した。
【０１１５】
７．ウェスタンブロット分析
細胞を溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｃ−Ｃｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１．５％ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  Ｎａ２ＶＯ４、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）およびプロテアーゼ抑制剤カクテル、ｐＨ７．５）に溶解させた。溶解物を簡単にボルテックスし、４℃、１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上澄液を取って新しいチューブに移した。タンパク質の濃度はタンパク質分析試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で６６０ｎｍで測定した。同じ濃度のタンパク質試料を用意し、各試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ニトロセルロース伝達膜（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と５％（ｗ／ｖ）無脂肪ＤｉｆｃｏＴＭ脱脂乳（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で膜をブロッキングし、一次抗体で標識（ｐｒｏｂｅ）した。抗体としては、ＥＰＢ４１Ｌ５（ＡＴｇｅｎ、韓国、城南（ソンナム））、Ｆｌａｇ−ｔａｇ、β−ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、α−ｔｕｂｕｌｉｎ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）、ＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、ｐ−Ｓｍａｄ２、ｐ−Ｓｍａｄ３、スラグ、ＺＥＢ１（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびＰＡＩ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、ＵＳＡ）を使用し、これらの信号は製造会社のプロトコルに従って基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通して確認した。
【０１１６】
８．ＲＮＡ分離およびリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ、Ｏｔｓｕ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、製造会社のプロトコルに従ってＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ、Ｏｔｓｕ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）とｏｌｉｇｏ（ｄＴ）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて定量的ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ）を行った。下記のプライマーを用いてこれらの転写を確認した：α−チューブリン（α−ｔｕｂｕｌｉｎ）（５’−ＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＣＡＣＣ−３’）および（５’−ＧＴＴＡＧＴＧＴＡＧＧＴＴＧＧＧＣＧＣＴ−３’）、ＥＰＢ４１Ｌ５（５’−ＧＡＡＡ  ＧＡＡＧＧＣＣＣＡＧＣＡＡＡＣＧ−３’）および（５’−ＡＧＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴ−３’）、ＰＡＩ−１（５’−ＣＣＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＡＧＧＣＴＧＴＴ−３’）および（５’−ＧＣＣＧＴＴＧＡＡ  ＧＴＡＧＡＧＧＧＣＡＴ−３’）、Ｓｌｕｇ（５’−ＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＡＧ−３’）および（５’−ＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴＡＴＧＴＴＴＧＧＣ−３’）、ＺＥＢ１（５’−ＴＡＴＧＡＡＴＧＣＣＣＡ  ＡＡＣＴＧＣＡＡ−３’）および（５’−ＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＧ−３’）、Ｓｍａｄ４（５’−ＴＧＣＡＴＧＡＣＴＴＴＧＡＧＧＧＡＣＡＧ−３’）および（５’−ＧＴＧＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡＡＴＧＴＴ−３’）。ｃＤＮＡの量はα−チューブリンに標準化した。すべての実験は３回繰り返し行い、相対的発現レベルおよび標準偏差は比較方法で計算して示した。
【０１１７】
９．免疫蛍光分析（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
細胞をチャンバスライド（ＳＰＬ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ、抱川（ポチョン）市、韓国）で培養し、室温で３０分間４％パラホルムアルデヒドで固定させた。ＰＢＳで洗浄した後、固定された細胞を３％ＢＳＡと共に１時間恒温培養して非特異的抗体をブロックさせた。Ａｎｔｉ−ＥＰＢ４１Ｌ５、Ａｎｔｉ−Ｅ−カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）および抗−Ｆｌａｇ−ｔａｇを４℃で一晩培養した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４９−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔまたはマウス二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。核（Ｎｕｃｌｅｉ）はＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色し、前記試料はＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で映像化した。
【０１１８】
１０．試験管内の移動および浸潤分析（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
細胞の移動は８．０μｍサイズの気孔を有するポリカーボネート膜挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）を用いてトランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）で測定した。浸潤分析のためには、トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）の挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）をＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングした。１×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌを上部（ｕｐｐｅｒ）チャンバに入れて、下部（ｌｏｗｅｒ）チャンバを化学誘引物質（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）であるＴＧＦ−β１、ＬＹ２１５７２９９（ＴＧＦβ抑制剤）または抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体（ｍＡｂ）を含むか、含まない６００μｌの無血清培地で満たした。２４時間培養した後、移動しなかったり侵入した細胞（ｉｎｖａｄｉｎｇ  ｃｅｌｌ）を綿棒で用心深く上部チャンバから除去した。移動または浸潤した細胞（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｃｅｌｌ）を０．２％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む２０％メタノール溶液で染色し、Ｘ２００倍率の顕微鏡を用いて計数した。移動および浸潤分析は３回繰り返し行った。
【０１１９】
１１．生体内転移検定（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ａｓｓａｙ）
５週齢の無胸腺症（ａｔｈｙｍｉｃ）ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスはＯｒｉｅｎｔ（Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）から購入して使用した。対照群ベクターまたはｐＣＤＨ−ＥＰＢ４１Ｌ５およびｐＬＥＣＥ３−ＧＦＰ過発現したＫＡＴＯ２細胞（２×１０７細胞を含む２００μｌのＰＢＳ溶液）を外側尾静脈に注射した。抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体は５ｍｇ／ｋｇずつ毎日２週間投与された。蛍光イメージを撮影し、分析するために、ＩＶＩＳイメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いた。
【０１２０】
１２．統計分析
胃癌患者標本から得たデータから全体生存率を分析するためにＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用した。使用されたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＩＤは２２０９７７＿ｘ＿ａｔであり、ｌｏｇ−ｒａｎｋテストはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を用いた。統計分析は、独立した実験（両面）の２つのグループを比較するためにＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて行われ、データは平均±標準偏差（ＳＤ）で示した。Ｐ＜０．０５は統計的に有意と見なされた。
【０１２１】
実施例
＜実施例１＞．胃癌患者標本におけるＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現レベルの分析
ＧＣで重要な標的分子を確認するために、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析を実施した。これはリンパ節（ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）転移がない７８人の胃癌患者を対象にして行った。前記患者はＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現の中間値を基準として第１、第２グループに分類した。ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現レベルの中間値を基準として左側に位置する第１グループ、ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現レベルの中間値を基準として右側に位置する第２グループがある。
【０１２２】
ＡＰＥＧ１、ＳＭＰＸ、ＧＰＲ１７７およびＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子が高い第１グループは、前記遺伝子の発現が高くない第２グループより再発率や死亡率がより高いことを確認した（図１Ａ）。ＡＰＥＧ１、ＳＭＰＸ、ＧＰＲ１７７およびＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の中でも抗体−ベースの癌治療の対象になるＥＰＢ４１Ｌ５を標的タンパク質として選択した。ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現レベルの中間値を基準とした２つのグループにおける向こう１０年間の生存率を分析した結果（図１Ｂ）、ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現が高い患者が、低いレベルの患者に比べて生存率がより低いことが分かる。
【０１２３】
また、癌患者２つのグループに対するＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒプロッター分析を実施したもので、８７６人の胃癌患者を対象に行った結果、ＧＥＯ、ＥＧＡ、ＴＣＧＡのようなデータベースを用いるＫａｐｌａｎ  ＭｅｉｅｒプロッターでＥＰＢ４１Ｌ５の発現が高い胃癌患者は生存率も低いことを確認した（ＨＲ１．７３、Ｐ２．８Ｅ−１０）（図１Ｃ）。このような臨床的結果を通して、ＥＰＢ４１Ｌ５の発現レベルが胃癌患者の不良予後に関連することが分かる。言い換えれば、ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現レベルが高い胃癌患者は生存率が低かった。
【０１２４】
＜実施例２＞．胃癌細胞におけるＴＧＦ−β１とＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の発現様相の分析
本発明において、どの胃癌細胞がＴＧＦβの信号に反応するかを調べようとした。様々な胃癌細胞株を対象にウェスタンブロット分析を実施して、ＴＧＦβシグナリングに関連性があるタンパク質のレベルを分析した（図２Ａ）。その結果、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＭＫＮ４５、ＳＮＵ２１６およびＳＮＵ４８４細胞では、Ｓｍａｄ３またはＳｍａｄ４が検出されなかったことを確認した。
【０１２５】
以後、ＴＧＦ−β１を胃癌細胞に処理してＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現がＴＧＦβの信号によって調節されるか否かを調べようとし、その結果、ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現レベルはＴＧＦ−β１処理によってＫＡＴＯＩＩＩ、ＭＫＮ２８、ＳＮＵ１およびＳＮＵ７１９細胞で有意に増加したが、Ｓｍａｄ３／Ｓｍａｄ４欠陥のＧＣ細胞ではＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子の発現レベルが有意に増加しなかった（図２Ｂ）。また、ＴＧＦ−β１処理によってＰＡＩ−１、Ｓｌｕｇおよびリン酸化されたＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ３のような間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）遺伝子の発現が有意に増加した（図２Ｃ）。
【０１２６】
免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）染色分析の結果（図２Ｄ）によれば、膜内外（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）に存在する上皮マーカーＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現が減少し、ＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の発現レベルがＫＡＴＯＩＩＩの細胞膜においてＴＧＦ−β１によって増加することを確認した。また、胃癌細胞であるＫＡＴＯＩＩＩとＳＮＵ７１９細胞はＴＧＦ−β１処理によって間葉性（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）に変化した（図２Ｅ、図２Ｆ）。
【０１２７】
前記結果を通して、ＴＧＦβの信号が癌、例えば、胃癌細胞においてＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子およびこれによってコーディングされるタンパク質の発現レベルと上皮間葉転移（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を調節することが分かる。
【０１２８】
＜実施例３＞．Ｓｍａｄ依存性ＴＧＦβの信号伝達によるＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の発現レベルの調節
ＴＧＦ−β１によって誘導されたＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の発現レベルの増加がＳｍａｄ依存性であるか否かを確認するために、Ｓｍａｄ４が欠乏したＭＫＮ４５（Ｓｍａｄ４ノック−ダウンされたＭＫＮ４５）およびＮＣＩ−Ｎ８７細胞（胃癌）においてウェスタンブロットと免疫蛍光染色を行った。ＴＧＦ−β１を処理した各細胞でこれらの遺伝子とＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質のレベルが変化しないことを確認した（図３Ａ、３Ｂ）。また、ＴＧＦ−β１で処理する場合、各細胞においてＥＰＢ４１Ｌ５、ＰＡＩ−１およびＳｌｕｇが上方調節され、ｓｉＲＮＡを用いてＳｍａｄ４がノック−ダウンされた（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎｅｄ）ＭＫＮ２８細胞では、ＥＰＢ４１Ｌ５、ＰＡＩ−１およびＳｌｕｇの発現が抑制されたことを確認した（図３Ｃ、図３Ｄ）。
【０１２９】
このような結果をまとめると、ＴＧＦβの信号伝達経路がＳｍａｄに依存的であり、これは胃癌細胞においてＥＰＢ４１Ｌ５の発現調節に関与していることを意味するのである。
【０１３０】
＜実施例４＞．ＴＧＦ−β１のＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質との関連性の分析
本発明は、強力なＴＧＦβ受容体Ｉ抑制剤であるＬＹ２１５７２９９（Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ）を処理した時、ＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の発現レベルの変化を分析しようとした。
【０１３１】
図４は、何ら処理しなかったＫＡＴＯＩＩＩ細胞、ＴＧＦ−β１のみ処理したＫＡＴＯＩＩＩ細胞、ＴＧＦ−β１を処理した後、ＴＧＦβ抑制剤（ＬＹ２１５７２９９）を処理したＫＡＴＯＩＩＩ細胞を用意し、これを内因性ＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質およびＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）の発現を分析するために免疫蛍光染色で分析した結果である。緑色はＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質、赤色はＥ−カドヘリン、青色はＨｏｃｈｅｓｔ３３２５８であり、スケールバーは２０μｍである。
【０１３２】
図４に示すように、ＴＧＦ−β１のみをＫＡＴＯＩＩＩ細胞に処理したことと、ＴＧＦ−β１とＬＹ２１５７２９９を順次に処理したＫＡＴＯＩＩＩ細胞を免疫蛍光染色した結果、ＴＧＦ−β１によってＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の発現レベルが増加するが、ＬＹ２１５７２９９によっては抑制されていることを確認した。
【０１３３】
＜実施例５＞．胃癌細胞の移動性に対するＥＰＢ４１Ｌ５の影響の分析
ＥＰＢ４１Ｌ５がＴＧＦβの信号に反応して胃癌細胞の移動に影響を与えるか否かを確認しようとした。このために、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞またはＳＮＵ７１９細胞にＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡを形質感染させた。具体的には、ＥＰＢ４１Ｌ５欠乏のために、２つの類型のｓｉＲＮＡ（ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃１（配列番号４：５’−ＧＣ  ＡＡＵＵＧＧＣＡＧＣＵＵＡＵＡＡＵＵＵ−３’）、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃２（配列番号５：５’−ＵＵＣＡＧＡＵＵＣ  ＧＵＧＣＣＵＡＵＵＣＡＧＵＵ−３’）を使用した。ＮＣ  ｓｉＲＮＡ形質感染したＫＡＴＯＩＩＩ細胞と比較して、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃１、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃２で形質感染したＫＡＴＯＩＩＩ細胞においてＥＰＢ４１Ｌ５およびＰＡＩ−１の遺伝子とタンパク質のレベルが有意に減少したことを確認した（図５Ａ、図５Ｂ）。しかし、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃１、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃２で形質感染したＫＡＴＯＩＩＩ細胞においてリン酸化されたＳｍａｄ３（αｐ−Ｓｍａｄ３）とＳｍａｄ３（αＳｍａｄ３）には変化が観察されなかった（図５Ｂ）。
【０１３４】
また、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ形質感染したＫＡＴＯＩＩＩ細胞、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃１、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡ＃２で形質感染したＫＡＴＯＩＩＩ細胞にＴＧＦ−β１を処理した時、間葉転移の有無と胃癌細胞の移動性を分析した結果、ＥＰＢ４１Ｌ５が欠乏する場合、間葉転移と胃癌細胞の移動性に対するＴＧＦ−β１の影響を遮断していることを確認した（図５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ）。すなわち、ＥＰＢ４１Ｌ５は、ＴＧＦβによって誘導される細胞の転移と胃癌細胞の移動に必須の要素であることが分かる。
【０１３５】
＜実施例６＞．抗−ＥＰＢ４１Ｌ５  ｍＡｂ（単クローン抗体）はＣ−末端の６１９−６２４ＡＡ配列を認識する
本発明は、転移において細胞付着分子が重要な役割を果たすため、これに基づいて単クローン抗体とペプチドを用いるならば新たな治療剤の開発が可能になると考え、ＥＰＢ４１Ｌ５に対する単クローン抗体（ｍＡｂ）を開発しようとした。
【０１３６】
開発された抗体の特異性を立証するために、Ｆｌａｇ−ＥＰＢ４１Ｌ５またはＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡで形質感染した胃癌細胞をウェスタンブロットと免疫蛍光分析で分析した。その結果、Ｆｌａｇ−ＥＰＢ４１Ｌ５で形質感染した胃癌細胞で過発現したＥＰＢ４１Ｌ５が検出され（図６Ａ）、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡで形質感染した胃癌細胞（ＮＣ、ｓｉＲＮＡ＃１またはｓｉＲＮＡ＃２）でＥＰＢ４１Ｌ５が沈黙していることを確認した（図６Ｂ）。また、ＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡで形質感染した胃癌細胞を免疫蛍光染色法で分析した結果、ＥＰＢ４１Ｌ５が胃癌細胞において抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体によって明確に検出されたことが分かる（図６Ｃ）。本発明における抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体は、ウェスタンブロット分析により分析した結果、ＥＰＢ４１Ｌ５のＮ末端のＦＥＲＭドメインではないＥＰＢ４１Ｌ５のＣ−末端を認識していることを確認した（図６Ｄ、６Ｅ）。
【０１３７】
また、ＥＰＢ４１Ｌ５のＣ−末端において５アミノ酸を順次に除去した抗体を確認した結果、抗体がＥＰＢ４１Ｌ５のＣ−末端のアミノ酸６１９−６２４を認識することを確認した（図６Ｆ、６Ｇ）。透過できない免疫蛍光染色の特性を考慮して、内因性ＥＰＢ４１Ｌ５の発現を抑制するために、ＥＰＢ４１Ｌ５のＦＬ（全長）、ＥＰＢ４１Ｌ５のＦＥＲＭ、ＥＰＢ４１Ｌ５のＣ−ｔｅｒｍおよびＥＰＢ４１Ｌ５の△６１９−６２４の中から選択されるいずれか１つのプラスミドとＥＰＢ４１Ｌ５  ｓｉＲＮＡを共−形質感染させた。よって、外因性ＥＰＢ４１Ｌ５の発現を抗−Ｆｌａｇ抗体を用いて分析した。ＥＰＢ４１Ｌ５の発現は、ＦＬおよびＣ−末端構造体で形質感染したＦＫ細胞と△６１９−６２４で形質感染しなかったＭＫＮ２８細胞から確認された（図６Ｈ）。これらの結果をまとめると、抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体がＥＰＢ４１Ｌ５の６１９−６２４アミノ酸領域を特異的に認識していることが分かる。
【０１３８】
＜実施例７＞．抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体の可変領域の配列の分析
前記＜実施例６＞．で作製された単クローン抗体の可変領域の配列をＡＴｇｅｎ（韓国）に依頼して分析した。その結果、本発明による単クローン抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列は、下記の通りである。
重鎖可変領域
（配列番号１２）ＱＶＱＬＫＥＳＧＴＶＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＳＤＴＳＹＮＱＫＦＫＤＫＡＫＬＴＡＶＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＤＥＡＳＡＶＹＹＣＴＲＧＧＫＬＰＦＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
軽鎖可変領域
（配列番号１３）ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＭＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【０１３９】
さらに、本発明による単クローン抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ１〜３と軽鎖可変領域ＣＤＲ１〜３の配列は、下記の通りである。
重鎖可変領域ＣＤＲ１：Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ（配列番号６）
重鎖可変領域ＣＤＲ２：Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ（配列番号７）
重鎖可変領域ＣＤＲ３：Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ（配列番号８）
軽鎖可変領域ＣＤＲ１：Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ（配列番号９）
軽鎖可変領域ＣＤＲ２：Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ（配列番号１０）
軽鎖可変領域ＣＤＲ３：Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ（配列番号１１）
【０１４０】
＜実施例８＞．抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体の治療効果
抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体の特異性を検証しようとした。本実験において、ＴＧＦ−β１処理をするか、しないでＧＣ細胞の移動に対する抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体の効果を評価した結果、ＴＧＦ−β１はＫＡＴＯＩＩＩ細胞の移動を効率的に増加させたことを確認した。さらに、抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体はＫＡＴＯＩＩＩ細胞においてＴＧＦ−β１によって増加した細胞の移動を阻害することを確認した（図７Ａ、Ｂ）。
【０１４１】
＜実施例９＞．抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体の転移抑制効果の比較
前記＜実施例８＞．と同様の方法で単クローン抗体が認知するエピトープの配列の差による抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体による細胞の移動阻害の程度を比較した。図８に示すように、本発明による単クローン抗体（ＡｔＧｅｎ）の場合には、ＴＧＦ−β１によって増加した細胞の移動を著しく阻害（１００％）するのに対し、ＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の６３８〜７０８番目アミノ酸配列を認知する抗体（Ｎｏｖｕｓ抗体）の場合には、ＴＧＦ−β１によって増加した細胞の移動をほとんど阻害できないことを確認した。よって、ＥＰＢ４１Ｌ５のＣ−末端部位の６１９〜６２４番目アミノ酸配列を認知する抗体は、他のアミノ酸配列で構成されたエピトープに特異的に結合する抗体と比較して、ＴＧＦ−β１によって増加した細胞の移動性を非常に効果的に阻害できることが分かる。
【０１４２】
＜実施例１０＞．ＥＰＢ４１Ｌ５と胃癌細胞転移との関連性の分析
上記の実験を通して、ＴＧＦ−β１によって増加したＥＰＢ４１Ｌ５の発現が生体内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で胃癌細胞の移動と浸潤に関与していることを確認した。よって、本発明では、試験管内の移動および浸潤分析法により胃癌細胞の移動におけるＥＰＢ４１Ｌ５の効果を分析しようとした。
【０１４３】
具体的には、ＥＰＢ４１Ｌ５を過発現させたＫＡＴＯＩＩＩ細胞と、その対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）として何ら処理されていないＫＡＴＯＩＩＩ細胞を用意した。
【０１４４】
ＥＰＢ４１Ｌ５を過発現させたＫＡＴＯＩＩＩ細胞から、試験管内の移動および浸潤分析を行った結果、ＥＰＢ４１Ｌ５を過発現させたＫＡＴＯＩＩＩ細胞は、実質的に細胞の移動と浸潤が向上したことを確認した（図９Ａ、９Ｂ）。生体内でＥＰＢ４１Ｌ５の発現による胃癌細胞の影響を観察するために、ＥＰＢ４１Ｌ５過発現したＫＡＴＯＩＩＩ細胞をヌードマウスの尾静脈を通して注射した。その結果、対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ（ＧＦＰ））に比べて胃癌細胞の肺転移がＥＰＢ４１Ｌ５（ＧＦＰ）群で有意に増加したことを確認した（図９Ｃ、９Ｄ）。まとめると、ＥＰＢ４１Ｌ５が胃癌細胞の生体内転移を促進することが分かる。
【０１４５】
＜実施例１１＞．抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体の胃癌細胞転移抑制能の確認
抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体の生体内効能を確認しようとした。このために、対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）とＥＰＢ４１Ｌ５過発現したＫＡＴＯＩＩＩ細胞をヌードマウスの尾静脈を通して注入した（ＥＰＢ４１Ｌ５）群、ＥＰＢ４１Ｌ５過発現したＫＡＴＯＩＩＩ細胞をヌードマウスの尾静脈を通して注入し、２日間隔で２週間抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体を５ｍｇ／ｋｇずつ注入した（ＥＰＢ４１Ｌ５＋ｍＡｂ）群を用意した（図１０Ａ）。
【０１４６】
ＥＰＢ４１Ｌ５の過発現細胞を注入したヌードマウスでは癌の肺転移が増加したが、抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体を注入した群では胃癌細胞の肺転移が対照群より減少したことを確認することができる（図１０Ｂ、１０Ｃ）。これを通して、本発明による抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体が効果的に進行性胃癌に対して治療または予防効果を示していることが分かる。
【０１４７】
＜実施例１２＞．抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体のＥＢＰ４１Ｌ５タンパク質特異的認識機能の確認
抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体のＥＢＰ４１Ｌ５に対する特異性を確認しようとした。このために、胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）細胞株としてＫＡＴＯＩＩＩ細胞とＭＫＮ２８細胞を用意した。肺癌（Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）細胞株としてはＡ５４９細胞とＨ２２６細胞を用意し、乳癌（Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）細胞株としてはＭＣＦ７細胞とＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用意した。前記細胞は、延世大学チョン・ジェホ教授研究室および韓国細胞株銀行から提供されて使用した。各細胞は、５％ＣＯ２、３７℃で１０％ＦＢＳと１％抗生剤／抗菌剤溶液（コーニング、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）が添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。
【０１４８】
抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体を用いて、各細胞群でＥＢＰ４１Ｌ５タンパク質の発現をウェスタンブロットを用いて確認した（図１１）。その結果、抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体によって胃癌細胞株だけでなく、肺癌細胞株と乳癌細胞株においてもＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の発現を確認した（図１１）。これを通して、本発明による抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体が胃癌だけでなく、肺癌と乳癌においても効果的に治療または予防のために使用できることを示している。
【０１４９】
＜実施例１１＞．抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体の細胞特異的毒性の確認
多様な細胞に対する本発明の抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体の細胞生存率を確認しようとした。このために、胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）細胞株としてＫＡＴＯＩＩＩ細胞とＭＫＮ２８細胞を用意した。肺癌（Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）細胞株としてはＡ５４９細胞とＨ２２６細胞を用意し、乳癌（Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）細胞株としてはＭＣＦ７細胞とＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用意した。前記細胞は、延世大学チョン・ジェホ教授研究室および韓国細胞株銀行から提供されて使用した。
【０１５０】
各細胞は、５％ＣＯ２、３７℃で１０％ＦＢＳと１％抗生剤／抗菌剤溶液（コーニング、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）が添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。
【０１５１】
各細胞群に抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体を０、２、４、６μｇずつ注入し、２４時間経過後、各細胞群の細胞生存率（ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ、％）を確認するために、３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｒｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ方法により確認した（図１２）。その結果、抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体を注入した場合、濃度別に細胞生存率が減少することを確認したことから、本発明の抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体が効果的に進行性癌あるいは胃癌に対して治療または予防効果を示していることが分かる（図１２）。
【０１５２】
＜結論＞
細胞付着タンパク質は癌転移において重要な役割を果たしている。したがって、細胞付着タンパク質に対する抗体を用いることにより、癌転移に対する治療剤の開発の可能性が議論されているのが現状である。本発明者は、転移に関連する新たな接着分子または複合体をベースとする新たな治療法を開発すべく努力を重ねたところ、本発明を完成するに至った。ＥＭＴ（上皮間葉移行；Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｏ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）は、細胞−細胞接合および細胞極性の喪失と中間葉型表現型を可能にするアクチン細胞骨格の再構成を有している。ＥＰＢ４１Ｌ５は、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎを不安定化させるｐ１２０カテニンおよびｐａｘｉｌｌｉｎと相互作用すると報告されているが、ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅも細胞極性を否定的に調節するＣｒｕｍｂｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ成分であるＭＰＰ５と結合することが知られている。他の接合タンパク質であるβ−ｃａｔｅｎｉｎは、腎臓上皮細胞の側膜のＥＰＢ４１Ｌ５と共存し、その結合は確認されなかった。ＦＡＫはＮ末端のＦＥＲＭドメインを有しており、Ｃ末端のＥＰＢ４１Ｌ５のさらに他の結合パートナーであるＡＳＡＰ１／ＡＭＡＰ１およびｐａｘｉｌｌｉｎと結合する。
【０１５３】
本発明において、ＥＰＢ４１Ｌ５が胃癌患者の不良予後をもたらすということを明らかにし、これに関連して、ＥＰＢ４１Ｌ５は、癌細胞で高い発現率を示すことを確認した。一方、ＴＧＦβは胃癌転移を促進することが知られているので、この発現がリンパ節転移と癌の予後に相関関係があるはずと予測し、ＴＧＦβとＥＰＢ４１Ｌ５との関連性を分析した結果、ＥＰＢ４１Ｌ５遺伝子プロモーターにおいて多数のＳｍａｄ結合モチーフを確認した。
【０１５４】
よって、ＥＰＢ４１Ｌ５のノックダウンで、ＴＧＦ−β１−誘導された中間葉転移とＧＣ細胞の移動性の増加を排除することを確認することにより、ＥＰＢ４１Ｌ５がＴＧＦβの信号伝達機序における主要因子であることを確認した。このような結果をまとめると、胃癌細胞では、ＴＧＦβ／Ｓｍａｄ３／ＥＰＢ４１Ｌ５経路を通した上皮間葉転移過程で癌細胞の移動と浸潤を制御できることが分かる。
【０１５５】
本発明において、ＥＰＢ４１Ｌ５が細胞表面に位置し、ＧＣ細胞の試験管内および生体内転移を促進していることを確認したところ、これを特異的とする抗体は、治療をベースとする単クローン抗体として使用可能になると考えて、ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体を開発した。ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体は、ＴＧＦ−β１による胃癌細胞の移動および浸潤を効果的に遮断し、ＥＰＢ４１Ｌ５が過発現した細胞で発生する増加した肺転移は、抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体によって有意に抑制されたことを確認した。
【０１５６】
また、本発明の抗−ＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体は、胃癌、肺癌、乳癌の各細胞群（特に、胃癌細胞株）でＥＰＢ４１Ｌ５タンパク質の発現を有意に抑制し、癌細胞の生存率を減少させることを確認した。
【０１５７】
したがって、本発明のＥＰＢ４１Ｌ５単クローン抗体は、癌、特に胃癌を予防または治療、あるいは転移を抑制するのに非常に効果的な方法であることが分かる。
【０１５８】
以上、本発明の特定の部分を詳細に述べたが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい実施形態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付した請求項とその等価物によって定義されるというべきである。
【産業上の利用可能性】
【０１５９】
本発明の特徴および利点を要約すれば、次の通りである：
（１）本発明は、ＥＰＢ４１Ｌ５を抗原として認識してこれに特異的に結合する単クローン抗体またはその断片を提供する。
（２）本発明は、ＥＰＢ４１Ｌ５のエピトープに特異的に結合する抗体の発掘に活用することができ、この方法により発掘した抗体は、ＥＰＢ４１Ｌ５の信号伝達過程を抑制する機能を示し、この機能を利用してＥＰＢ４１Ｌ５が関与する癌、特に胃癌に対するワクチンまたは治療剤として有用に活用できる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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