(57)【要約】  本発明は、Ｂリンパ球の活性化誘導シチジンデアミナーゼを利用することによってＢリンパ球をエンジニアリングするための方法を提供する。これにより、Ｃａｓヌクレアーゼなどのエンジニアードされたヌクレアーゼの使用を回避することができる。エンジニアードされたＢ細胞は、カスタマイズされた抗体の産生やＢ細胞療法に有用である。したがって、本発明はまた、エンジニアードされたＢ細胞及びエンジニアードされたＢ細胞によって産生されるカスタマイズされた抗体も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＢリンパ球のゲノムを編集するための方法であって、
（ｉ）前記Ｂリンパ球の内在性活性化誘導シチジンデアミナーゼを活性化する工程、及び
（ｉｉ）目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を前記Ｂリンパ球に導入する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様ヌクレアーゼ、又はメガヌクレアーゼなどの、外来性ヌクレアーゼ及び／又はエンジニアードヌクレアーゼを伴わない請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ分子が、線状又は線状化ＤＮＡ分子である請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ分子が、一本鎖ＤＮＡ分子（ｓｓＤＮＡ）又は二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ分子が、ｄｓＤＮＡ分子である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡ分子が、平滑末端又はオーバーハングを有する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記目的の（ポリ）ペプチドをコードする前記ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列が、コドン最適化されている請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ分子が、前記目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流及び／又は下流にイントロン配列を含む請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記イントロン配列が、スプライス認識部位を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記イントロン配列が、Ｉｇ遺伝子座イントロン配列を含む請求項８から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記イントロン配列が、Ｊセグメント下流イントロンのイントロン配列及び／又はＣＨ上流イントロンのイントロン配列を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ分子が、スプライシングエンハンサーを含む請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
Ｎ末端からＣ末端方向に、可変ドメイン、前記目的の（ポリ）ペプチド、及び定常ドメインを含む改変免疫グロブリン鎖を発現するように前記Ｂリンパ球のゲノムが編集される請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
内在性可変ドメインが前記目的の（ポリ）ペプチドによって置き換えられている改変免疫グロブリン鎖を発現するように前記Ｂリンパ球のゲノムが編集される請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ分子が、前記目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流及び／又は下流の切断部位をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記切断部位が、Ｔ２Ａ切断部位である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記目的の（ポリ）ペプチドが、病原体結合ドメイン、ＶＨドメイン、又はＶＨ−ＶＬドメインを含む又はからなる請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記目的の（ポリ）ペプチドが、ＣＤ４、ジペプチジルペプチダーゼ４、ＣＤ９、又はアンギオテンシン変換酵素２、又はそれらの断片若しくは配列変異体を含む又はからなる請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記単離されたＢリンパ球が、初代Ｂリンパ球である請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、エンジニアードされたＢリンパ球を得ることを含み、前記Ｂリンパ球のゲノムが、前記目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の、前記Ｂリンパ球のゲノムへの組み込みを確認する工程（ｉｉｉ）を更に含む請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記単離されたＢリンパ球が、１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ベータメルカプトエタノール、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％カナマイシン、及び１％トランスフェリンを含むＲＰＭＩ又はＩＭＤＭ中で培養される請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記単離されたＢリンパ球が、１×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌ、好ましくは２×１０５細胞／ｍｌで培養される請求項１から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｂリンパ球が、活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化因子を含む培養培地中で培養される請求項１から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
活性化誘導シチジンデアミナーゼの前記活性化因子が、サイトカイン、抗Ｂ細胞受容体抗体又はその断片、ＴＬＲアゴニスト、ＣｐＧ−Ｂアゴニスト、イミダゾキノリン化合物、又は前記活性化因子のいずれかの組合せからなる群から選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記サイトカインが、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ４、ＩＬ２、ＩＬ２１、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＧＦ−β１、４−１ＢＢＬ、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ｃ−Ｋｉｔ、ＦＬＴ−３、ＩＦＮα、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記サイトカインが、０．０１〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度で投与される請求項２４から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｂリンパ球が、ＩＬ４及び／又はＣＤ４０Ｌを含む培地中で培養される請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化が、ＣＤ４０Ｌ発現細胞株との共培養及びＩＬ−４の添加によって行われる請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
（最終培養培地中の）ＩＬ−４の濃度が、０．００５〜０．０３ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜０．０２５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１５〜０．０２ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．１６ｎｇ／ｍｌである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣＤ４０Ｌ発現細胞株が、Ｋ５６２Ｌである請求項２９から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ分子を前記Ｂリンパ球に導入することが、前記活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化後最大１０日間、好ましくは前記活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化後最大７日間、より好ましくは前記活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化後最大５日間、更により好ましくは前記活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化後最大２日間、最も好ましくは前記活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化後約１日間で行われる請求項１から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｂリンパ球をレトロウイルスで形質導入させることを含まない請求項１から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記ＤＮＡ分子が、ヌクレオフェクションによって導入される請求項１から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記ＤＮＡ分子を前記Ｂリンパ球に導入した後、前記Ｂリンパ球が再活性化される請求項１から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
例えば請求項２５から３１に定義されるＢ細胞刺激剤が、前記ＤＮＡ分子を前記Ｂリンパ球に導入した後、前記Ｂリンパ球に適用される請求項１から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｂリンパ球が、前記ＤＮＡ分子を前記Ｂリンパ球に導入する前に、代替末端結合をブロックすることができるＤＮＡ阻害剤で処理される請求項１から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む前記ＤＮＡ分子が、前記ＤＮＡ分子を前記Ｂリンパ球に導入する前に、Ｋｕ７０／Ｋｕ８０などのＫｕタンパク質と共にインキュベートされる請求項１から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記ＤＮＡ分子が、ＳＶ４０核局在化シグナルなどの核局在化シグナルを含む請求項１から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記ＤＮＡ分子が、ＧＦＰ又はＲＦＰをコードするヌクレオチド配列を含まない請求項１から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記ＤＮＡ分子が、プロモーターを含む請求項１から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記ＤＮＡ分子が、転写ユニットを含む請求項１から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｂリンパ球の前記活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化後約２４時間で、前記Ｂリンパ球がＭｉｒｉｎなどのヌクレアーゼ阻害剤で処理される請求項１から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記Ｂリンパ球が、ヒトのＢリンパ球である請求項１から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
請求項１から４４のいずれかに記載の方法によって得られることを特徴とするエンジニアードされたＢリンパ球。
【請求項４６】
目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種インサートをスイッチ領域に含む編集された免疫グロブリン遺伝子座を含むことを特徴とするエンジニアードされたＢリンパ球。
【請求項４７】
前記Ｂリンパ球が、ヒトである請求項４５から４６のいずれかに記載のＢリンパ球。
【請求項４８】
前記Ｂリンパ球の免疫グロブリン遺伝子座の前記スイッチ領域が、切断部位、特にＴ２Ａ切断部位を含む請求項４５から４７のいずれかに記載のＢリンパ球。
【請求項４９】
前記Ｂリンパ球の免疫グロブリン遺伝子座の前記スイッチ領域が、病原体結合ドメイン、ＶＨドメイン、又はＶＨ−ＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含む請求項４５から４８のいずれかに記載のＢリンパ球。
【請求項５０】
前記Ｂリンパ球の免疫グロブリン遺伝子座の前記スイッチ領域が、ＣＤ４、ジペプチジルペプチダーゼ４、ＣＤ９、又はアンギオテンシン変換酵素２、又はその断片若しくは配列変異体をコードするヌクレオチド配列を含む請求項４５から４９のいずれかに記載のＢリンパ球。
【請求項５１】
前記Ｂリンパ球が、蛍光レポータータンパク質を発現しない請求項４５から５０のいずれかに記載のＢリンパ球。
【請求項５２】
医学における使用のための請求項４５から５１のいずれかに記載のＢリンパ球。
【請求項５３】
前記Ｂリンパ球が、請求項１から４４のいずれかにしたがってエンジニアードされている請求項５２に記載の使用のためのＢリンパ球。
【請求項５４】
前記エンジニアードされたＢリンパ球が、患者に投与される請求項５２から５３のいずれかに記載の使用のためのＢリンパ球。
【請求項５５】
前記エンジニアードされたＢリンパ球を投与される患者が、エンジニアリング前に前記Ｂリンパ球を単離したのと同一の患者である請求項５４に記載の使用のためのＢリンパ球。
【請求項５６】
Ｂ細胞療法のための方法であって、
（ａ）患者からＢリンパ球を単離する工程、
（ｂ）請求項１から４４のいずれかに記載されるＢリンパ球をエンジニアリングする工程、及び
（ｃ）エンジニアードされた前記Ｂリンパ球を前記患者に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項５７】
請求項４５から５１のいずれかに記載のＢリンパ球の細胞株。
【請求項５８】
目的の（異種の）（ポリ）ペプチドを含む抗体又はその断片を生成するための方法であって、
（１）請求項４５から５１及び５７のいずれかに記載のエンジニアードされたＢリンパ球又はＢ細胞株を提供する工程であって、前記Ｂリンパ球が、前記目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種インサートをスイッチ領域に含む編集された免疫グロブリン遺伝子座を含む工程、
（２）前記エンジニアードされたＢリンパ球又はＢ細胞株を培養する工程、及び
（３）前記目的の（異種の）（ポリ）ペプチドを含む抗体又はその断片をＢ細胞培養物から単離する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項５９】
前記エンジニアードされたＢリンパ球が、請求項１から４４のいずれかに記載の方法によって得られる請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
−前記抗体又は抗体断片の機能を決定するための機能的アッセイを行うこと、
−結合アッセイを行って、前記抗体又は抗体断片の結合特異性及び／又は前記抗体又は抗体断片によって認識される結合パートナー／エピトープの結合特異性を決定すること、及び／又は
−中和アッセイを行って、前記抗体又は抗体断片の、毒素又は病原体を中和する能力を決定することを含む前記抗体又は抗体断片を特徴付けることを更に含む請求項５８から５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
請求項５８から６０のいずれかに記載の方法によって得られることを特徴とする抗体。
【請求項６２】
請求項４５から５１のいずれかに記載のＢリンパ球又は請求項６１に記載の抗体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項６３】
薬学的に許容される担体を更に含む請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
医学における使用のための請求項６２から６３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６５】
請求項６１に記載の抗体、請求項４５から５１のいずれかに記載のエンジニアードされたＢ細胞、又は請求項６２から６３のいずれかに記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含むことを特徴とする免疫療法のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に抗体の産生のための、エンジニアードされた（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）Ｂリンパ球の分野に関する。特に、本発明は、エンジニアードされたＢ細胞がカスタマイズされた抗体を産生できるようにする、Ｂ細胞における免疫グロブリン遺伝子の編集に関する。したがって、本発明は、エンジニアードされたＢ細胞を産生するための方法、及び本発明の方法にしたがってエンジニアードされたＢ細胞を提供する。そのようなエンジニアードされたＢ細胞、及びＢ細胞によって産生されたカスタマイズされた抗体は、エンジニアードされた抗体によって標的とされる疾患の予防及び治療、並びに診断アプローチ、例えば、（単離された）サンプル中の抗原の検出用などの様々な医療用途において有用である。
【０００２】
治療用モノクローナル抗体の使用は、免疫障害、癌、及び感染症などの様々な疾患を特異的に標的とする画期的なアプローチとなっている。現在、６５種のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が臨床使用のためにＦＤＡによって承認されており、３５０種を超えるｍＡｂが臨床試験中であり、このことは、この治療アプローチと組換え抗体エンジニアリングの効力を実証している。
【０００３】
多くの疾患を治療するための強力なツールとしての治療用抗体の可能性は、特に、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎがｍＡｂの産生手法を開発した１９７５年以来、注目されている（非特許文献１）。最初のｍＡｂはマウスで産生されたが、患者に投与すると、それらのマウス抗体は外来分子として認識され深刻な問題に直面した。これは、人間の免疫系による排除と、軽度の発疹から腎不全に至るまでのアレルギー反応をもたらした。更に、これらのマウス抗体は、ヒト免疫系の構成要素と適切に相互作用することができず、それらの生物学的有効性は厳しく制限された（非特許文献２参照）。
【０００４】
これらの問題を回避するために、マウス抗体をより「ヒト」のものに近いものにするための戦略が開発された。１つのアプローチは、マウスの可変ドメインをヒトの定常ドメインと融合させたキメラ抗体の開発であり、約７０％がヒトで、完全にヒトのＦｃ部分を有する抗体が得られた（非特許文献３）。ｍＡｂのマウス部分を更に減少させるために、「ヒト化」抗体が開発された。この抗体では、完全ヒト抗体の超可変ループを、「相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト化」によって、目的とするマウス抗体の超可変ループで置き換えた。ヒト化抗体は、８５〜９０％のヒト配列を含み、キメラ抗体よりも免疫原性が更に低くなっている。承認されたｍＡｂの大部分は、キメラ又はヒト化抗体である（非特許文献２参照）。しかし、ヒト化は技術的要求が厳しく、抗体活性の喪失（即ち、機能喪失）に至ることがある。
【０００５】
治療用抗体を開発するための別のアプローチは、ファージディスプレイなどのインビトロディスプレイ技術に関連する（非特許文献４）。それにより、ヒト抗体又は抗体断片は、スクリーニングのためにファージ、細菌、又は酵母などの単純な生物の表面に提示される。しかし、そのようなライブラリシステムは完全長の抗体を含まず、抗体はヒト細胞によってではなく細菌又は酵母によって発現される。このような発現系は、ヒトの翻訳後修飾を反映することはできない。具体的には、インビトロで産生された抗体は、多くの場合、天然のヒト抗体のグリコシル化パターンに類似していない。しかし、これらのパターンは、エフェクター機能と免疫系の下流の活性化に影響を与えるので、抗体の有効性にとって重要である。
【０００６】
更に、トランスジェニック「ヒト化」マウスを使用して、ヒト遺伝子から抗体を産生することができる（非特許文献５）。しかし、この技術は抗原によるマウスの免疫化に依存しているので、マウスの免疫系によって認識され得る抗原に対する抗体の産生に限定される。
【０００７】
したがって、治療用抗体を産生するための「ゴールドスタンダード」は、単離ヒトＢリンパ球の使用であり、ヒト抗体産生の「自然な」方法を利用する（非特許文献６及び非特許文献７）。したがって、Ｂ細胞は、通常、天然のＢ細胞ゲノムに基づいて、天然のヒト抗体及びヒト抗体ライブラリを得るために使用された（非特許文献８）。ごく最近、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）などのゲノム編集ツールの開発に伴って、ヒトＢ細胞も免疫グロブリン遺伝子編集の標的となり、単離ヒトＢ細胞によって、カスタマイズ組換え抗体の産生が可能となった。
【０００８】
例えば、Ｃｈｅｏｎｇらは、Ｃａｓ９とガイドＲＮＡをレトロウイルス又はレンチウイルスと共にＢ細胞に送達し、免疫グロブリンクラススイッチ組換えを誘導することによって、免疫グロブリン遺伝子を編集するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の応用を報告した（非特許文献９）。
【０００９】
更に、特許文献１はまた、ヒトＢ細胞をエンジニアリングするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の使用について記載している。更に、特許文献１はまた、Ｂ細胞を遺伝子改変するためのジンクフィンガーヌクレアーゼ及びＴＡＬＥＮＳなどの他のエンジニアードヌクレアーゼの使用を示唆している。
【００１０】
通常、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、及びＴＡＬＥＮなどのエンジニアードヌクレアーゼを使用するゲノム編集アプローチが、近年、有望な治療可能性を有するバイオテクノロジーの強力なツールとして登場した。しかし、一方で、エンジニアードヌクレアーゼの作用メカニズムとそれらの送達要件が理由で、臨床応用におけるエンジニアードヌクレアーゼによるゲノム編集の使用には、大きな安全性の懸念が生じている。
【００１１】
主要な懸念は、望ましくないオフターゲット切断及び変異に関連する。エンジニアードヌクレアーゼによる特異的な標的化にもかかわらず、エンジニアードヌクレアーゼの意図しない相互作用及びその結果としての非標的部位の切断が報告された（非特許文献１０及び非特許文献１１）。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでは、ｓｇＲＮＡは、部分的な相同性を有するミスマッチ配列に結合できる。
【００１２】
更に、外来性遺伝子編集ツールの腫瘍形成能は、別の重要な安全性の問題を表し、特に、オフターゲット変異（例えば、癌原遺伝子近傍での）が癌の発症をもたらし得る。換言すれば、オフターゲット変異の生成は、機能異常と癌の発症のリスクを有する。
【００１３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、及びＴＡＬＥＮはいずれも外来性であり、人体にとって外来性であるので、別の重要な安全性の懸念は、エンジニアードヌクレアーゼの免疫原性に関連している。したがって、エンジニアードヌクレアーゼは、免疫応答を誘発し得る（非特許文献１２）。更に、エンジニアードヌクレアーゼの送達に使用されるウイルスベクターも免疫原性であり得、同一のウイルスベクターの反復使用を制限する抗体産生及びＴ細胞免疫応答をもたらし得る（非特許文献１３）。更に、ウイルスベクターは、染色体中への組込み及び生殖細胞系への伝達のリスクを有する。
【００１４】
したがって、より安全なＢ細胞ゲノム編集ツールの開発の必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１６１４４６号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｋｏｅｈｌｅｒ  Ｇ，  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ：  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ．  １９７５  Ａｕｇ  ７；  ２５６（５５１７）：４９５−７
【非特許文献２】Ｃｈａｍｅｓ  Ｐ，  Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ  Ｍ，  Ｗｅｉｓｓ  Ｅ，  Ｂａｔｙ  Ｄ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ，  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｈｏｐｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ．  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．  ２００９；１５７（２）：２２０−２３３．  ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４７６−５３８１．２００９．００１９０．ｘ．
【非特許文献３】Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ＭＳ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＧＴ，  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＥＢ，  Ｊｏｕｈａｌ  ＳＳ，  Ｆｌａｎａｇａｎ  ＪＧ，  Ｒａｂｂｉｔｔｓ  ＴＨ：  Ａ  ｈａｐｔｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍａｅｒｉｃ  ＩｇＥ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ．  １９８５  Ｍａｒ  ２１−２７；  ３１４（６００８）：２６８−７０
【非特許文献４】ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  Ｊ，  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ＡＤ，  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ，  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ  ＤＪ：  Ｐｈａｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  １９９０  Ｄｅｃ  ６；  ３４８（６３０１）：５５２−４）
【非特許文献５】Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．  Ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．  Ｉｎ：  Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ  Ｙ，  Ｎｉｓｓｉｍ  Ａ，  ｅｄｉｔｏｒｓ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １８１．  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；  ２００８．  ｐｐ．  ６９−９７．  Ｅｄｓ．
【非特許文献６】Ｔｒａｇｇｉａｉ  Ｅ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓ，  Ｓｕｂｂａｒａｏ  Ｋ，  Ｋｏｌｅｓｎｉｋｏｖａ  Ｌ，  Ｕｅｍａｔｓｕ  Ｙ，  Ｇｉｓｍｏｎｄｏ  ＭＲ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＢＲ，  Ｒａｐｐｕｏｌｉ  Ｒ，  Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  Ａ．  Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｍａｋｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ：  ｐｏｔｅｎｔ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＲＳ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ２００４  Ａｕｇ；１０（８）：８７１−５．  Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｊｕｌ  １１
【非特許文献７】Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  Ａ，  Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ  Ｎ，  Ｔｒａｇｇｉａｉ  Ｅ，  Ｒｕｐｒｅｃｈｔ  ＣＲ，  Ｃｏｒｔｉ  Ｄ，  Ｓａｌｌｕｓｔｏ  Ｆ．  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｍａｋｉｎｇ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００６  Ｊｕｎ；２１１：３０３−９
【非特許文献８】Ｄｕｖａｌｌ  ＭＲ，  Ｆｉｏｒｉｎｉ  ＲＮ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｏｂｔａｉｎｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１４  Ｍａｒ；１１（１）：４１−７
【非特許文献９】Ｃｈｅｏｎｇ  ＴＣ，  Ｃｏｍｐａｇｎｏ  Ｍ，  Ｃｈｉａｒｌｅ  Ｒ．  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１６  Ｍａｒ  ９；  ７：１０９３４．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１０９３４
【非特許文献１０】Ｚｈａｎｇ  ＸＨ，  Ｔｅｅ  ＬＹ，  Ｗａｎｇ  ＸＧ，  Ｈｕａｎｇ  ＱＳ，  Ｙａｎｇ  ＳＨ．  Ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  ２０１５  Ｎｏｖ  １７；４：ｅ２６４．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１５．３７
【非特許文献１１】Ｓｈｉｍ  Ｇ，  Ｋｉｍ  Ｄ，  Ｐａｒｋ  ＧＴ，  Ｊｉｎ  Ｈ，  Ｓｕｈ  ＳＫ，  Ｏｈ  ＹＫ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ：  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ．  ２０１７  Ｊｕｎ；３８（６）：７３８−７５３．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ａｐｓ．２０１７．２
【非特許文献１２】Ｄａｉ  ＷＪ，  Ｚｈｕ  ＬＹ，  Ｙａｎ  ＺＹ，  Ｘｕ  Ｙ，  Ｗａｎｇ  ＱＬ，  Ｌｕ  ＸＪ．  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ｐｒｏｍｉｓｅ  ａｎｄ  Ｈｕｒｄｌｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  ２０１６；５：ｅ３４９．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１６．５８
【非特許文献１３】Ｚａｉｓｓ  ＡＫ，  Ｍｕｒｕｖｅ  ＤＡ．  Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００５  Ｊｕｎ；５（３）：３２３−３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
前記に鑑みて、本発明の目的は、Ｂ細胞をエンジニアリングするための新規な方法を提供することにあり、この方法は、前記した従来技術の欠点を克服する。特に、本発明の目的は、Ｂ細胞をエンジニアリングするためのより安全な方法を提供することにある。例えば、本発明の目的は、望ましくないオフターゲット変異のリスクを低下させる、Ｂ細胞をエンジニアリングするための方法を提供することにある。これらの目的は、以下に示す及び添付の特許請求の範囲に記載の主題によって達成される。
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、及び試薬に、これらは変わる可能性があるので、限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。特段の断りがない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。
【００１９】
以下に、本発明の要素について説明する。これら要素は、具体的な実施形態と共に列挙されるが、これらを任意の方式で任意の数組み合わせて更なる実施形態を生み出すことができることを理解すべきである。様々に記載される実施例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載される実施形態に限定することを意図するものではない。この記載は、明示的に記載された実施形態を任意の数の開示された及び／又は好ましい要素と組み合わせる実施形態をサポート及び包含すると理解すべきである。更に、特に指定しない限り、本願における全ての記載された要素の任意の入れ換え及び組合せが本願の記載によって開示されるとみなすべきである。
【００２０】
本明細書及びその後に続く特許請求の範囲全体を通して、特に必要としない限り、用語「含む」並びに「含み」及び「含んでいる」等の変形は、指定されている部材、整数、又は工程を含むが、任意の他の指定されていない部材、整数、又は工程を除外するものではないことを意味すると理解される。用語「からなる」は、任意の他の指定されていない部材、整数、又は工程が除外される、用語「含む」の具体的な実施形態である。本発明において、用語「含む」は、用語「からなる」を包含する。したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなっていてもよく、追加の何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【００２１】
用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」、並びに本発明の説明（特に、特許請求の範囲）において使用される同様の参照は、本明細書に指定されているか又は文脈上明示的に否定されていない限り、単数及び複数の両方を網羅すると解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、範囲内の各別個の値を個別に参照する簡易的な方法として機能することを意図する。本明細書において特に指定しない限り、各個別の値は、本明細書に個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。明細書中のいずれの言語も、本発明の実施に必須の任意の請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【００２２】
用語「実質的に」は、「完全に」を除外するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含んでいなくてもよい。必要な場合、用語「実質的に」は、本発明の定義から省略されることもある。
【００２３】
数値ｘに関連する用語「約」は、ｘ±１０％を意味する。
【００２４】
本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」は、それぞれ、好ましくは通常のペプチド結合、又は修飾されたペプチド結合（例えば、等価（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）ペプチドの場合など）によって互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸を含む融合タンパク質を含むペプチド、オリゴペプチド、又はタンパク質を意味する。用語「（ポリ）ペプチド」は、ペプチド及び／又はポリペプチドを意味する。特に、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」は、非ペプチド構造要素を含むペプチドアナログとして定義される「ペプチド模倣物」も含まれ、このペプチドは、天然の親ペプチドの生物学的作用を模倣する又は拮抗することができる。ペプチド模倣物は、酵素的に切断可能なペプチド結合などの古典的なペプチド特性を欠く。ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、遺伝暗号で定義される２０種のアミノ酸のいずれかで構成され得る。更に、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、これらのアミノ酸に加えて、遺伝暗号によって定義される２０個のアミノ酸以外のアミノ酸も含んでもよく、又は遺伝暗号によって定義される２０個のアミノ酸以外のアミノ酸から構成されてもよい。特に、本発明の文脈におけるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、翻訳後成熟プロセスなどの天然プロセス又は化学プロセスによって修飾されたアミノ酸から等しく構成することができ、これは当業者によく知られている。そのような修飾は、文献に十分に記載されている。これらの修飾は、ポリペプチドの任意に箇所、即ち、ペプチド骨格、アミノ酸鎖、又はカルボキシ又はアミノ末端においても現れる可能性がある。特に、ペプチド又はポリペプチドは、ユビキチン化に続いて分岐するか、分岐の有無にかかわらず環状であり得る。このタイプの修飾は、当業者によく知られた天然又は合成の翻訳後プロセスの結果であり得る。本発明の文脈における用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」には、特に、修飾されたペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質も含まれる。例えば、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合固定、脂質又は脂質誘導体の共有結合固定、ホスファチジルイノシトールの共有結合固定、共有結合又は非共有結合の架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、ペグ化を含むグリコシル化、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセス、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化、硫酸化、アルギニル化などのアミノ酸付加、又はユビキチン化が含まれる。このような修飾は、文献に十分に記載されている（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  （１９９３）  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｔ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ；  Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （１９８３）  Ｂ．  Ｃ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ；  Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ��１９９０）  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８２：  ６２６−６４６  ａｎｄ  Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ，  Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  ６６３：  ４８−６２）。したがって、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」には、好ましくは、例えば、リポペプチド、リポタンパク質、糖ペプチド、糖タンパク質などが含まれる。
【００２５】
しかしながら、好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、「古典的な」ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質であり、「古典的な」ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、通常、遺伝コードによって定義される２０種のアミノ酸から選択され、通常のペプチド結合によって互いに結合されるアミノ酸で構成される。
【００２６】
本明細書で使用される（抗体又は抗体断片の）「重鎖」という用語は、別のポリペプチド（「軽鎖」）と会合されるポリペプチドを意味する。特に、重鎖及び軽鎖は、ジスルフィド結合を介して会合する。重鎖は、１つ、２つ、３つ、又は４つの抗体重定常ドメインを含むことができる。好ましい実施形態では、それは、３つの抗体重定常ドメイン、即ち、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３、並びにＣＨ１とＣＨ２の間のヒンジ領域を含む。前記重鎖定常ドメインは、マウス、キメラ、合成、ヒト化、又はヒト、及びモノクローナル又はポリクローナルである抗体に由来することができる。重鎖は、１つ以上の可変ドメイン、好ましくは抗体重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）を含むことができる。
【００２７】
本明細書で使用される（抗体又は抗体断片の）「軽鎖」という用語は、別のポリペプチド（「重鎖」）と会合されるポリペプチドを意味する。特に、重鎖及び軽鎖は、ジスルフィド結合を介して会合する。軽鎖は、抗体軽鎖定常領域ＣＬを含むことができる。前記軽鎖定常ドメインは、マウス、キメラ、合成、ヒト化、又はヒト、及びモノクローナル又はポリクローナルである抗体に由来することができる。第２のポリペプチド鎖は、１つ以上の可変ドメイン、好ましくは抗体軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）を含むことができる。
【００２８】
一般に、「抗体」は、抗原に特異的に結合するタンパク質である。通常、抗体は、その対応する抗原との特異的結合を可能とするユニークな構造を有するが、一般に、抗体は類似した構造を有し、特に免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られる。本明細書で使用される「抗体」という用語は、本発明に係る特徴的な性質が維持される限り、限定するものではないが、抗体全体、抗体断片、特に抗原結合断片、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、及び遺伝子操作された抗体（変異体又は突然変異抗体）を含む各種形態の抗体を含む。特許請求の範囲を含む明細書は、一部の箇所で、抗体の抗原結合断片、抗体断片、変異体、及び／又は誘導体に明示的に言及する場合があるが、用語「抗体」は、抗体の全てのカテゴリー、即ち、抗体の抗原結合断片、抗体断片、変異体、及び誘導体を含む。
【００２９】
本明細書で使用される「抗原結合断片」、「断片」、及び「抗体断片」という用語は、相互変換可能に用いられ、抗体の任意の断片を意味する。特に、用語「抗原結合断片」、「断片」、及び「抗体断片」は、（ｉ）抗体の抗原結合活性及び／又は（ｉｉ）本明細書に記載される抗体の（追加の）機能的ドメインによって提供される追加機能性、例えば、（独立した）結合部位によって提供される結合活性を保持する抗体の任意の断片を意味する。本発明に係る抗体断片では、本発明に係る特徴的な性質が保持される。一般に、抗体断片の例としては、限定するものではないが、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２が挙げられる。抗体の断片は、ペプシン又はパパインなどの酵素による消化を含む方法によって、及び／又は化学還元によるジスルフィド結合の切断によって抗体から得ることができる。或いは、抗体の断片は、重鎖又は軽鎖の配列の一部のクローニング及び発現によって得ることができる。更に、本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗体及びその抗体断片の両方を含む。
【００３０】
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが意図される。ヒト抗体は、現在の技術水準でよく知られている（ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，  Ｍ．  Ａ．，  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，  Ｊ．  Ｇ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ５  （２００１）  ３６８−３７４）。また、ヒト抗体は、免疫感作時に内在性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリー又は一揃いを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）で産生することができる。そのような生殖細胞系突然変異マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原接種時にヒト抗体の産生をもたらす（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０  （１９９３）  ２５５１−２５５５；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２  （１９９３）  ２５５−２５８；  Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７  （１９９３）  ３３４０参照）。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーでも作製できる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，  Ｈ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｇ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７  （１９９２）  ３８１−３８８；  Ｍａｒｋｓ，  Ｊ．  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２  （１９９１）  ５８１−５９７）。Ｃｏｌｅら及びＢｏｅｒｎｅｒらの技術は、また、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  ｐ．  ７７  （１９８５）；及びＢｏｅｒｎｅｒ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７  （１９９１）  ８６−９５）。しかし、最も好ましくは、本明細書に記載される本発明に係る方法によって調製されるヒトモノクローナル抗体であり、これは、Ｔｒａｇｇｉａｉ  Ｅ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓ，  Ｓｕｂｂａｒａｏ  Ｋ，  Ｋｏｌｅｓｎｉｋｏｖａ  Ｌ，  Ｕｅｍａｔｓｕ  Ｙ，  Ｇｉｓｍｏｎｄｏ  ＭＲ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＢＲ，  Ｒａｐｐｕｏｌｉ  Ｒ，  Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  Ａ．  （２００４）：  Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｍａｋｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ：  ｐｏｔｅｎｔ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＲＳ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  １０（８）：８７１−５に記載される改善されたＥＢＶ−Ｂ細胞不死化と組み合わせることができる。本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、本明細書に記載の本発明に係る性質を生成するように修飾された抗体も含む。
【００３１】
本発明に係る抗体は、精製された形態で提供され得る。したがって、本発明に係る抗体又は抗体断片は、精製された抗体又は抗体断片であることができる。典型的には、抗体は、他のポリペプチドを実質的に含まない組成物（例えば、組成物の９０％（重量）未満、通常６０％未満、より通常５０％未満が他のポリペプチドで構成される場合）に存在する。
【００３２】
本明細書で使用される「可変ドメイン」（「可変領域」とも呼ばれる；軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））という用語は、古典的な天然抗体におけるＮ末端ドメイン、典型的には古典的な天然抗体における最大の可変性を提供するドメインであり、且つ抗原への抗体の結合に直接関与する抗体又は抗体断片のドメインを意味する。通常、可変ヒト軽鎖及び重鎖のドメインは同一の一般的構造を有し、各ドメインは、その配列が広く保存されているフレームワーク（ＦＲ）領域（特に、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域）及び３つの「超可変領域」又は相補性決定領域、ＣＤＲ（特に、３つの「超可変領域」／ＣＤＲ）を含む。フレームワーク領域は、通常、βシート構造を採用し、ＣＤＲは、βシート構造をつなぐループを形成することができる。各鎖のＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によってその３次元構造に保持され、他の鎖のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。
【００３３】
本明細書で使用される「超可変領域」という用語は、抗原結合を司る抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  ｅｄ．，  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１）の標準的な定義にしたがって決定することができる。通常、特にネイティブな単一特異性ＩｇＧ抗体では、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）が可変ドメインに非連続的に配置される。換言すれば、重鎖及び／又は軽鎖上のＣＤＲは、例えば、フレームワーク領域によって分離されることができ、フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲより「可変」ではない可変ドメイン内の領域である。例えば、抗体において、可変ドメイン（又はそれぞれの各可変ドメイン）は、好ましくは、３つのＣＤＲにより分離された４つのフレームワーク領域を含み得る。特に、抗体の可変ドメイン（軽鎖又は重鎖可変ドメインＶＨ又はＶＬ）は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。各鎖のＣＤＲは、そのようなフレームワークアミノ酸によって分離される。通常、重鎖の３つのＣＤＲと、連結された軽鎖の３つのＣＤＲとが共に、抗原結合部位（パラトープ）を形成する。換言すれば、特にネイティブな単一特異性ＩｇＧ抗体では、抗原結合部位が、通常、２つの可変ドメインで構成されるので、各抗原結合部位に６つのＣＤＲが存在する（重鎖：ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；軽鎖：ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）。単一抗体、特に単一のネイティブな単一特異性ＩｇＧ抗体は、通常、２つの（同一の）抗原結合部位を有するので、１２個のＣＤＲ（即ち、２×６個のＣＤＲ）を含む。
【００３４】
その「多重特異性」、即ち異なる抗原結合部位のため、多重特異性抗体の重鎖及び／又は軽鎖、又はその抗原結合断片は、（それぞれ）３超のＣＤＲ、特に３超の異なるＣＤＲを含み得る。例えば、多重特異性抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含むことができ、前記少なくとも２つの異なる可変ドメインは、それぞれ、異なる単一特異性抗体、例えばＩｇＧ型の抗体に由来する。そのような単一特異性抗体は通常、抗原結合部位を形成する重鎖に３つのＣＤＲ及び軽鎖に３つのＣＤＲを含むので、多重特異性抗体は、特に、第１の抗体の重鎖の３つのＣＤＲ及び第１の抗体の軽鎖の３つのＣＤＲ、第２の抗体の重鎖の３つのＣＤＲ及び第２の抗体の軽鎖の３つのＣＤＲ、任意に、第３の抗体の重鎖の３つのＣＤＲ及び第３の抗体の軽鎖の３つのＣＤＲなどを含むことができる。したがって、多重特異性抗体の重鎖及び／又は軽鎖に含まれるＣＤＲの数は、好ましくは３の倍数、例えば３、６、９、１２などである。それにより、多重特異性抗体の重鎖及び軽鎖の両方に含まれるＣＤＲの合計が６の倍数、例えば６、１２、１８などであることが好ましい。「抗原結合部位」は通常、ＣＤＲ、即ちＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３により特徴付けられるので、多重特異性抗体においては、ＣＤＲは、その順序（例えば、同一の単一特異性抗体に由来するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３及び／又はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）が、抗原結合部位を保持するように、即ち、抗原の特定部位に特異的に結合する能力を保持するように維持される。これは、例えば、一続きのアミノ酸における第１の単一特異性抗体に由来するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の順序が、好ましくは第２の単一特異性抗体に由来するＣＤＲによって中断されないことを意味する。重要なことには、多重特異性抗体が少なくとも２つの異なる単一特異性抗体に由来する抗原結合部位を含む場合、これらの単一特異性抗体のＣＤＲ又は可変ドメインは、ＣＤＲ（又は可変領域）が由来する各単一特異性抗体の「抗原受容体」が保持される、即ち、抗原の特定部位に特異的に結合する能力が保持されるように、多重特異性抗体に配置される。
【００３５】
本発明の文脈において、可変ドメインは、天然の抗体の任意の可変ドメイン（特に、ＶＨ及び／又はＶＬ）であり得るか、又は可変ドメインは、改変／エンジニアードされた可変ドメインであり得る。改変／エンジニアードされた可変ドメインは、当技術分野で知られている。通常、可変ドメインは、１つ以上の機能を削除又は追加するように、例えば、体細胞突然変異を「生殖系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）」（体細胞突然変異を「除去」）する又はヒト化することによって改変／エンジニアードされる。
【００３６】
本明細書で使用される「定常ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能を示す抗体のドメインを意味する。典型的に、重鎖は、免疫グロブリンのクラスに応じて、３つ又は４つの定常ドメイン、即ち、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及び任意にＣＨ４を（ＮＣ末端方向に）含む。したがって、重鎖の定常領域は通常、（ＮからＣ末端方向に）ＣＨ１−ヒンジ（重鎖の第１の定常ドメインと第２の定常ドメインとの間にアミノ酸を含む柔軟なポリペプチド）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）によって形成される。軽鎖は通常、ＣＬと呼ばれる単一定常ドメインを１つだけ含み、これは通常、軽鎖の定常領域も形成する。本発明の文脈において、定常ドメインは、天然の抗体の任意の定常ドメイン（特に、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及び／又はＣＨ４）であり得る、又は定常ドメインは、改変／エンジニアードされた定常ドメインであり得る。改変／エンジニアードされた定常領域は、当技術分野で知られている。通常、定常ドメインは、例えばＦｃ領域の機能性の文脈において、１つ以上の関数を削除又は追加するように改変／エンジニアードされる。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのクラスに分けられ、これらのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラスに更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域はそれぞれ、α、ε、γ、及びμと呼ばれる。本発明に係る抗体は、好ましくはＩｇＭ型又はＩｇＧ型のものである。ＩｇＧとは異なり、ＩｇＭは、ヒンジ領域を含まないが、追加の定常ドメインと、カルボキシ末端に１８個のアミノ酸のテール部とを含み、このテール部は、システインを含み分子の多量体化に関与する。
【００３７】
一般に、抗体は任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、即ち、α、γ、又はμ重鎖）のものであり得るが、好ましくはＩｇＭ又はＩｇＧである。ＩｇＧアイソタイプ内で、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラスであることができ、ＩｇＧ１が好ましい。抗体は、κ又はλ軽鎖を有することができる。
【００３８】
本明細書で使用される「組換え抗体」という用語は、天然には存在しない全ての抗体、例えば、本発明の方法にしたがってエンジニアードされたＢ細胞によって産生される抗体を含むことが意図される。
【００３９】
本明細書で使用するとき、抗体又は抗体断片の文脈における「多重特異性」という用語は、抗体又は抗体断片が、例えば異なる抗原上又は同一抗原上の少なくとも２つの異なるエピトープに結合する能力を意味する。したがって、「二重特異性」、「三重特異性」、「四特異性」などの用語は、抗体が結合できる異なるエピトープの数を意味する。例えば、従来の単一特異性ＩｇＧ型抗体は、２つの同一の抗原結合部位（パラトープ）を有し、したがって、同一のエピトープにのみ結合できる（異なるエピトープには結合できない）。対照的に、多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるタイプのパラトープ／結合部位を有し、したがって、少なくとも２つの異なるエピトープに結合できる。本明細書で使用する「パラトープ」とは、抗体の抗原結合部位を意味する。更に、単一の「特異性」とは、単一の抗体における１、２、３、又はそれ以上の同一のパラトープを意味し得る（１つの単一の抗体分子におけるパラトープ／結合部位の実際の数は、「価（ｖａｌｅｎｃｙ）」と呼ばれる）。例えば、単一のネイティブなＩｇＧ抗体は、２つの同一のパラトープを有するの、単一特異性で二価である。したがって、多重特異性抗体は、少なくとも２つの（異なる）パラトープ／結合部位を含む。したがって、「多重特異性抗体」という用語は、１超のパラトープと２つ以上の異なるエピトープに結合する能力を有する抗体を意味する。「多重特異性抗体」という用語は、特に上に定義された二重特異性抗体を含むが、典型的にはタンパク質、例えば、特に３つ以上の異なるエピトープに結合する抗体、足場、即ち、３つ以上のパラトープ／結合部位を有する抗体も含む。
【００４０】
特に、多重特異性抗体又は抗体断片は、２つ以上のパラトープ／結合部位を含むことができ、抗体の全てのパラトープ／結合部位が少なくとも２つの異なるタイプのパラトープ／結合部位に属し、したがって、抗体が少なくとも２つの特異性を有するように、いくつかのパラトープ／結合部位が同一であることができる。例えば、多重特異性抗体又は抗体断片は、４つのパラトープ／結合部位を含むことができ、各２つのパラトープ／結合部位が同一であり（即ち、同一の特異性を有し）、したがって、抗体又はその断片は二重特異性で四価（２つの特異性のそれぞれに対して２つの同一のパラトープ／結合部位）である。したがって、「１つの特異性」は、特に同一の特異性を示す１つ以上のパラトープ／結合部位（通常、そのような１つ以上のパラトープ／結合部位が同一であることを意味する）を意味し、したがって、「２つの特異性」は、２つだけの特異性に言及している限り、２、３、４、５、６、又はそれ以上のパラトープ／結合部位によって実現され得る。或いは、多重特異性抗体は、（少なくとも２つの）特異性ごとに１つの単一のパラトープ／結合部位を含むことができ、即ち、多重特異性抗体は、合計で少なくとも２つのパラトープ／結合部位を含む。例えば、二重特異性抗体は、２つの特異性のそれぞれに対して１つの単一のパラトープ／結合部位を含む、即ち、抗体は合計２つのパラトープ／結合部位を含む。また、抗体は、２つの特異性のそれぞれについて２つの（同一の）パラトープ／結合部位を含む、即ち、抗体は合計４つのパラトープ／結合部位を含むことも好ましい。好ましくは、抗体は、２つの特異性のそれぞれについて３つの（同一の）パラトープ／結合部位を含む、即ち、抗体は合計６つのパラトープ／結合部位を含む。
【００４１】
本明細書で使用される「抗原」という用語は、適応免疫応答の受容体の標的、特に抗体、Ｔ細胞受容体、及び／又はＢ細胞受容体の標的として機能する任意の構造物質を意味する。「抗原決定基」としても知られる「エピトープ」は、免疫系、特に抗体、Ｔ細胞受容体、及び／又はＢ細胞受容体によって認識される抗原の一部（又は断片）である。したがって、１つの抗原は少なくとも１つのエピトープを有する、即ち、単一の抗原は１つ以上のエピトープを有する。抗原は、（ｉ）ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、（ｉｉ）多糖、（ｉｉｉ）脂質、（ｉｖ）リポタンパク質又はリポペプチド、（ｖ）糖脂質、（ｖｉ）核酸、又は（ｖｉｉ）低分子薬又は毒素であり得る。したがって、抗原は、ペプチド、タンパク質、多糖類、脂質、リポタンパク質及び糖脂質を含むそれらの組合せ、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイＤＮＡ、プラスミド）、又は低分子薬（例えば、シクロスポリンＡ、パクリタキセル、ドキソルビシン、メトトレキサート、５−アミノレブリン酸）、又はそれらの任意の組合せであり得る。好ましくは、抗原は、（ｉ）ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、（ｉｉ）多糖、（ｉｉｉ）脂質、（ｉｖ）リポタンパク質又はリポペプチド、及び（ｖ）糖脂質から選択され、より好ましくは、抗原は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である。
【００４２】
本明細書で使用される「抗原結合部位」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、相補的である領域を含む抗体の一部を意味する。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分のみに結合することがあり、その部分を「エピトープ」と呼ぶ。典型的には、２つの可変ドメイン、特に重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖可変ドメインＶＬが会合して、抗原結合部位を形成する。特に、抗原結合部位は、重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲと軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲとが一緒になって、即ち前記したように６つのＣＤＲによって形成される。
【００４３】
「特異的に結合する」という用語及び同様の記載は、非特異的な付着（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｔｉｃｋｉｎｇ）は含まない。
【００４４】
本明細書で使用される用語「リンカー」（「スペーサー」とも呼ばれる）は、抗体又は抗体断片などの、ポリペプチド又はタンパク質の異なるドメインを接続するように適合されたペプチドを意味する。リンカーは当技術分野で知られており、Ｒｅｄｄｙ  Ｃｈｉｃｈｉｌｉ  ＶＰ，  Ｋｕｍａｒ  Ｖ，  Ｓｉｖａｒａｍａｎ  Ｊ．  Ｌｉｎｋｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：  Ａ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．  ２０１３；２２（２）：１５３−１６７）に詳細に記載される。通常、リンカーは、機能性に影響を与えないように設計される。特に、リンカーは、標的に特異的に結合しない。リンカーは任意のアミノ酸を含むことができ、アミノ酸は、グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）が好ましいことがある。好ましくは、リンカーは、アミノ酸グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）から構成される（「ＧＳリンカー」）。１つのポリペプチド又はタンパク質中に２つ以上のリンカーが存在する場合、リンカーは、互いに等しくても異なっていてもよい。更に、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸の長さを有する。
【００４５】
本明細書で使用される「核酸又は核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖（ｓｓ）でも二本鎖（ｄｓ）でもよい。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養」という用語は相互変換可能にに使用され、その記載はいずれも子孫を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という用語は、一次対象細胞、及び継代（ｔｒａｎｓｆｅｒｓ）の数に関わらず、それに由来する培養物を含む。また、故意又は偶発的な変異のために、全ての子孫のＤＮＡ含量が正確に同一ではないことがあることも理解される。最初に形質転換された細胞でスクリーニングされたものと同一の機能又は生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。異なる記載が意図される場合には、文脈から明確となろう。
【００４７】
本明細書で使用するとき、「配列変異体」（「変異体」とも称する）は、レファレンス配列における任意の変化を指し、レファレンス配列は、「配列の表及び配列番号」（配列表）に列挙されている配列、即ち、配列番号１〜配列番号１１５のいずれかである。したがって、用語「配列変異体」は、ヌクレオチド配列変異体及びアミノ酸配列変異体を含む。注目すべきことに、本明細書で言及される配列変異体は、特に機能的配列変異体、即ち、例えば、レファレンス配列の生物学的機能を維持する配列変異体である。例えば、目的の（ポリ）ペプチドの機能性（例えば、結合機能性を有する）、イントロン配列（例えば、スプライス部位機能性及び／又はスプライシングエンハンサー機能性を有する）を維持することができる。したがって、好ましい配列変異体は、レファレンス配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する（機能的）配列変異体である。本明細書に使用される表現「少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列変異体」という表現は、％配列同一性が高いほど、より好ましい配列変異体であることを意味する。換言すれば、表現「少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列変異体」は、特に、配列改変体がそれぞれのレファレンス配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、特に好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、特に好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有することを意味する。
【００４８】
配列同一性は、通常、レファレンス配列（即ち、本願に列挙される配列）の完全長に対して計算される。本明細書において言及するとき、同一性パーセントは、例えば、ＮＣＢＩ（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって指定されたデフォルトパラメータ［Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリクス；ギャップオープンペナルティ＝１１、及びギャップエクステンションペナルティ＝１］を用いるＢＬＡＳＴを使用して決定することができる。
【００４９】
本明細書で使用するとき、「ヌクレオチド配列変異体」は、レファレンス配列におけるヌクレオチドのうちの１つ以上が欠失若しくは置換されているか、又は１つ以上のヌクレオチドがレファレンスヌクレオチド配列の配列に挿入されている、変化した配列を有する。ヌクレオチドは、標準的な一文字表記（Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ）によって本明細書に言及される。遺伝子コードの縮重に起因して、「ヌクレオチド配列変異体」は、それぞれのレファレンスアミノ酸配列に変化をもたらす、即ち、「アミノ酸配列変異体」を生じさせる場合もあり、そうではない場合もある。好ましい配列変異体は、アミノ酸配列変異体を生じさせない（サイレント突然変異）ヌクレオチド配列変異体である。しかし、他の非サイレント突然変異も範囲内であり、具体的には、レファレンス配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を生じさせる、突然変異ヌクレオチド配列も範囲内である。
【００５０】
「アミノ酸配列変異体」は、レファレンスアミノ酸におけるアミノ酸のうちの１つ以上が欠失、置換、又は１つ以上のアミノ酸がレファレンスアミノ酸配列の配列に挿入されている、変化した配列を有する。変化の結果、アミノ酸配列変異体は、レファレンス配列と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、最も好ましくは少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する。少なくとも９０％同一の変異体配列は、レファレンス配列の１００アミノ酸当たり１０以下の変化、即ち、欠失、挿入、又は置換の任意の組合せを有する。
【００５１】
非保存的アミノ酸置換を有することが可能であるが、置換は、置換されたアミノ酸が、レファレンス配列における対応するアミノ酸と類似の構造的又は化学的性質を有する保存的アミノ酸置換であることが好ましい。一例として、保存的アミノ酸置換は、ある脂肪族又は疎水性のアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、及びイソロイシン）の別の脂肪族又は疎水性のアミノ酸による置換；あるヒドロキシル含有アミノ酸（例えば、セリン及びトレオニン）の別のヒドロキシル含有アミノ酸による置換；ある酸性残基（例えば、グルタミン酸又はアスパラギン酸）の別の酸性残基による置換；あるアミド含有残基（例えば、アスパラギン及びグルタミン）の別のアミド含有残基による置換；ある芳香族残基（例えば、フェニルアラニン及びチロシン）の別の芳香族残基による置換；ある塩基性残基（例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジン）の別の塩基性残基による置換；並びにある小アミノ酸（例えば、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、及びグリシン）の別の小アミノ酸による置換を含む。
【００５２】
アミノ酸配列の挿入は、１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドに及ぶ長さの範囲のアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、アミノ酸配列のＮ又はＣ末端のレポーター分子又は酵素への融合が挙げられる。
【００５３】
重要なことに、配列変異体における変化は、本件におけるそれぞれのレファレンス配列の機能、例えば、その抗原に結合するための抗体又は抗体断片の配列の機能性、及び／又は機能的ドメインによって提供される追加の機能性、例えば、（独立した）結合部位の標的に結合するための機能性を消失させるものではない。かかる機能を消失させることなしにそれぞれどのヌクレオチド及びアミノ酸残基を置換、挿入、又は欠失させることができるかを決定するための指針は、当技術分野において周知のコンピュータプログラムを使用することによって見出される。
【００５４】
本明細書で使用するとき、指定の核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に「由来する」核酸配列又はアミノ酸配列は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の起源を指す。好ましくは、特定の配列に由来する核酸配列又はアミノ酸配列は、これらが由来する配列又はその一部と本質的に同一のアミノ酸配列を有し、「本質的に同一」とは、上に定義した配列変異体を含む。好ましくは、特定のペプチド又はタンパク質に由来する核酸配列又はアミノ酸配列は、特定のペプチド又はタンパク質における対応するドメインに由来する。それに関して、「対応する」とは、特に、同一の機能に言及する。例えば、「細胞外ドメイン」は、（別のタンパク質の）別の「細胞外ドメイン」に対応する、又は「膜貫通ドメイン」は、（別のタンパク質の）別の「膜貫通ドメイン」に対応する。したがって、ペプチド、タンパク質、及び核酸の「対応する」部分は、当業者によって容易に同定可能である。同様に、他の配列に「由来する」配列は、通常、前記配列中にその起源を有することが当業者によって容易に同定可能である。
【００５５】
好ましくは、別の核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に由来する核酸配列又はアミノ酸配列は、（それが由来する）出発核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質と同一であり得る。しかし、別の核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に由来する核酸配列又はアミノ酸配列は、（それが由来する）出発核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に対して１つ以上の突然変異を有していてもよく、具体的には、別の核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に由来する核酸配列又はアミノ酸配列は、（それが由来する）出発核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の上記機能性配列変異体であってよい。例えば、ペプチド／タンパク質において、１つ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換してもよく、１つ以上のアミノ酸残基が挿入又は欠失してもよい。
【００５６】
本明細書で使用するとき、用語「突然変異」は、レファレンス配列、例えば、対応するゲノム配列と比較した、核酸配列及び／又はアミノ酸配列の変化に関する。（例えばゲノム配列と比較した）突然変異は、（自然界に存在する）体細胞突然変異、自然突然変異、例えば、酵素、化学物質、若しくは放射線によって誘導される誘導突然変異、又は部位特異的突然変異誘発（核酸配列及び／又はアミノ酸配列を特異的且つ故意に変化させるための分子生物学的方法）によって得られる突然変異であってよい。したがって、用語「突然変異」又は「突然変異する」とは、例えば、核酸配列及び／又はアミノ酸配列において突然変異を物理的に作製することも含むと理解されるものとする。突然変異は、１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失、及び挿入に加えて、幾つか（２つ以上）の連続するヌクレオチド又はアミノ酸の逆位も含む。アミノ酸配列に突然変異を生じさせるために、好ましくは、（組み換え）突然変異型ポリペプチドを発現させるために、前記アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列に突然変異を導入してよい。突然変異は、例えば、あるアミノ酸をコードしている核酸分子のコドンを、例えば部位特異的突然変異誘発によって、変化させて異なるアミノ酸をコードしているコドンを生じさせることにより、又は核酸分子の１つ以上のヌクレオチドを突然変異させる必要無しに、ポリペプチドをコードしている核酸分子のヌクレオチド配列を理解し、ポリペプチドの変異体をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子の合成を設計することによって、配列変異体を合成することにより行ってよい。
【００５７】
本明細書で使用される「上流」及び「下流」という用語はいずれも、ＤＮＡ又はＲＮＡにおける相対的な位置を意味する。ＤＮＡ又はＲＮＡの各鎖は、５’末端と３’末端（デオキシリボース又はリボース環の炭素位置に基づいて名付けられる）を有する。慣例により、上流と下流は、ＲＮＡ転写が起こる５’から３’の方向に関している。上流は、ＲＮＡ分子の５’末端に向かい、下流は３’末端に向かう。二本鎖ＤＮＡでは、上流は、着目するエキソンのコード鎖の５’末端に向かい、下流は、３’末端に向かう。ＤＮＡの逆平行性により、このことは、テンプレート鎖の３’末端が遺伝子の上流にあり、５’末端が下流にあることを意味する。
【００５８】
本発明の文脈において使用される用語「疾患」は、ヒト若しくは動物の身体又は正常な機能が典型的には損なわれているその部分のうちの１つの異常／病的な状態を全て反映し、典型的には、識別可能な徴候及び症状によって顕在化し、且つヒト又は通常、動物の寿命及び／又は生活の質を低減するという点で、用語「疾病」及び（健康状態のような）「状態」と略同義であることを意図し、互換的に使用される。
【００５９】
本明細書の本文中には幾つかの文献が引用されている。本明細書中に引用した各文献（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の明細書、指示書などを含む）は、上記又は下記のいずれかにかかわらず、参照によりその全体を本明細書に援用する。本明細書中のいかなるものも、本発明が、先行する発明によってそのような開示よりも先行する資格がないと認めるものとして解釈されるものではない。
【００６０】
本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、及び試薬に、これらは変わる可能性があるので、限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためにのみ用いられるのであって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。特段の断りがない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。
【００６１】
Ｂリンパ球のゲノムを編集するための方法
第１の態様において、本発明は、単離されたＢリンパ球のゲノムを編集するための方法であって、
（ｉ）Ｂリンパ球の内在性活性化誘導シチジンデアミナーゼを活性化する工程、及び
（ｉｉ）目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を前記Ｂリンパ球に導入する工程を含む方法を提供する。
【００６２】
「ゲノムの編集」は、目的の（天然に存在する）遺伝子又は遺伝子座を挿入、欠失、又は改変すること、特に、改変された特異性及び／又は機能を有するＢ細胞を生成することを意味する。したがって、本発明の方法によって、エンジニアードされたＢリンパ球を得ることができ、Ｂリンパ球のゲノムは、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、本発明にしたがって編集される目的の遺伝子座は、免疫グロブリン遺伝子座、即ち、免疫グロブリン（抗体）ポリペプチド鎖をコードする遺伝子座である。好ましくは、本発明の方法は、組換え（カスタマイズされた）抗体を産生（及び分泌）するようにエンジニアードされたＢ細胞（免疫グロブリン遺伝子座が編集された）を提供する。したがって、本発明は、好ましくは、本明細書に記載の工程を含む、単離されたＢ細胞のゲノム中の免疫グロブリン遺伝子座を編集するための方法を提供する。
【００６３】
用語「Ｂリンパ球」と「Ｂ細胞」は、相互変換可能に用いられる。一般に、「Ｂリンパ球」は、リンパ球サブタイプの白血球の一種である。Ｂリンパ球の主な機能は、抗体を分泌することである。したがって、Ｂリンパ球は、適応免疫系の体液性成分に属する。更に、Ｂリンパ球は抗原を提示し、サイトカインを分泌することができる。他の２つのクラスのリンパ球、Ｔ細胞とナチュラルキラー細胞とは異なり、Ｂリンパ球は、細胞膜上にＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現する。ＢＣＲは、Ｂ細胞が特定の抗原に結合することを可能にし、それに対して抗体応答が開始される。
【００６４】
一般に、Ｂリンパ球は、任意の種のものであってよい。いくつかの実施形態では、Ｂリンパ球は、哺乳動物のＢリンパ球である。好ましくは、Ｂリンパ球は、ヒトのＢリンパ球である。したがって、いくつかの実施形態では、Ｂリンパ球は、ニワトリのＢリンパ球又はマウスのＢリンパ球ではない。特に、Ｂリンパ球のＩｇＬ遺伝子座を欠失していないことが好ましい。
【００６５】
一般に、用語「単離された」Ｂリンパ球は、人体又は動物の体の一部ではないＢリンパ球を意味する。特に、単離されたＢリンパ球は、初代Ｂリンパ球又はＢ細胞株（のＢリンパ球）であり得る。
【００６６】
細胞株は、特に腫瘍又は人工的な不死化、例えば、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）による不死化によって、典型的には継代される（即ち、無限に増殖し得る）。Ｂ細胞株は、例えば、Ｒａｍｏｓ（ＡＴＣＣ（登録商標）−ＣＲＬ−１５９６）又はＳＫＷ  ６．４（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−１２５）として市販されている。特に、Ｂ細胞株のＢリンパ球は、その内在性活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を活性化することができる能力を有する。或いは、Ｂ細胞株のＢリンパ球は、ＲＡＭＯＳ  Ｂ細胞株（例えば、Ｒａｍｏｓ  ＲＡ１（ＡＴＣＣ（登録商標）−ＣＲＬ−１５９６））などのその内在性活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）の恒常的活性を有し得る。
【００６７】
最も好ましくは、単離されたＢリンパ球は、初代Ｂリンパ球である。「初代」Ｂリンパ球は、生体組織から分離され、インビトロ培養用に樹立されている。継代（腫瘍又は人工的に不死化された）細胞株とは異なり、「初代」細胞は「新たに」単離されたものであり、即ち、インビトロでの細胞分裂は殆ど経験していない。通常、初代細胞の寿命は有限であり、即ち、細胞株のように「不死化」されていない。特に、初代細胞は、何ら改変をされていない（起源の組織から細胞を抽出するために必要な酵素的及び／又は物理的解離は除く）。
【００６８】
初代Ｂ細胞は、血液から、又は骨髄、胸腺、脾臓、及び／又はリンパ節などのリンパ組織から単離することができる。通常、Ｂ細胞は、対象の（単離された）サンプルから単離される。サンプルは、例えば、血液又は骨髄、胸腺、脾臓、及び／又はリンパ節などのリンパ組織である。例えば、Ｂ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、又は脾臓から単離される。
【００６９】
初代Ｂリンパ球を単離するための方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｂ細胞は、フローサイトメトリー、磁気細胞単離、及び細胞分離（ＭＡＣＳ）、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ、又は抗体パニングによって単離することができる。単離されたＢリンパ球に十分な純度、生存率、及び収量を提供するために、１以上の単離技術を利用することができる。好ましくは、初代Ｂ細胞は、ＭＡＣＳ又はＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐによって単離される。例えば、Ｂ細胞は、磁気細胞選別によって、特に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離することができる。この目的のために、例えば、抗ＣＤ１９マイクロビーズを使用することができ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃなどから入手可能である。
【００７０】
好ましくは、単離された（初代）Ｂリンパ球の純度は、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、又はそれ以上である。更に、単離された（初代）Ｂ細胞は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の生存率であることが好ましい。任意に、単離後、初代Ｂリンパ球を培地中で増殖させてもよい。
【００７１】
好ましい実施形態では、初代Ｂリンパ球は、患者（の単離されたサンプル）から単離される。エンジニアリング後、Ｂ細胞を、（Ｂ細胞又はその前駆細胞を単離した）同一患者に投与することができる。このようなＢ細胞は、「自家」Ｂ細胞と呼ばれることがある。このようにして、患者はインビボで（「自分自身で」）カスタマイズされた抗体を産生することができる。或いは、エンジニアードされたＢ細胞を使用して、例えば、カスタマイズされた抗体のインビトロ生産用の（不死化された）Ｂ細胞株を樹立することができる。
【００７２】
単離されたＢリンパ球のゲノム編集の第１の工程において、Ｂリンパ球の内在性活性化誘導シチジンデアミナーゼが活性化される。Ｂリンパ球の活性化誘導シチジンデアミナーゼを活性化する様々な方法が当技術分野で知られており、本明細書中において以下により詳細に記載される。これにより、特に免疫グロブリン遺伝子座のスイッチ領域において、ゲノムＤＮＡ中に二本鎖切断（ＤＳＢ）が誘導される。一般に、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（「ＡＩＤ」又は「ＡＩＣＤＡ」としても知られる）は、シトシン塩基の脱アミノ化によってＤＮＡに変異を生じさせ、それによってシトシンをウラシルに変える酵素である。ＡＩＤは、体細胞超変異（ＳＨＭ）、クラススイッチ組換え（ＣＳＲ）、及び遺伝子変換（ＧＣ）を媒介するので、二次抗体の多様化の「マスターレギュレータ」として認識されている。特に、ＡＩＤは、ＣＳＲの免疫グロブリン遺伝子座のスイッチ領域（「Ｓ領域」とも呼ばれる）のＤＮＡ切断を媒介する。スイッチ領域は、特にＣＨ遺伝子部分の上流に位置する免疫グロブリン遺伝子座の反復ＤＮＡ配列の領域である。
【００７３】
ＣＳＲは、各ＣＨ遺伝子部分の上流に位置する２つのスイッチ領域間で生じ、介在するＤＮＡ（「スイッチサークル」）を切除し、可変領域を下流のＣＨ遺伝子部分と並置する。ＡＩＤは、シトシンの脱アミノ化を引き起こし、ｄＵを生成する。次いで、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）と脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ１）の複合作用によって除去され、一本鎖ＤＮＡ切断（ＳＳＢ）を生じさせる。ＳＳＢが反対側のＤＮＡ鎖に近接している場合、二本鎖切断（ＤＳＢ）が形成される。ＤＳＢは、「エンドプロセシング」によるミスマッチ修復（ＭＭＲ）経路の作用によっても形成される。２つのスイッチ領域でＤＳＢが形成された後、ＤＮＡの残りの「末端」が結合し、古典的な非相同末端結合（Ｃ−ＮＨＥＪ）又は代替末端結合（Ａ−ＥＪ）経路を介して組換えが生じる。
【００７４】
用語「内在性」は、活性化誘導シチジンデアミナーゼがＢリンパ球内に由来することを意味する。特に、活性化誘導シチジンデアミナーゼは、活性化誘導シチジンデアミナーゼをコードする内在性遺伝子に基づいて発現される（即ち、Ｂ細胞に導入された構築物によってではない）。したがって、活性化誘導シチジンデアミナーゼはＢリンパ球によって発現される。したがって、（外来性）ヌクレアーゼ（又はそのようなヌクレアーゼをコード又は発現する核酸、ベクター、又はウイルス）をＢ細胞に導入する必要がない。むしろ、ゲノムＤＮＡの切断は、本発明にしたがってのみ活性化されるＢ細胞自身の機構によって行われる。特に、本発明の方法は、典型的には、ヌクレアーゼ（又はヌクレアーゼをコードする核酸又はヌクレアーゼをコードする及び／又は発現させるための他の外来性手段）をＢ細胞に導入することを含まない。
【００７５】
Ｂリンパ球の活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化後、本発明に係る方法の更なる工程（工程（ｉｉ））において、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子がＢ細胞に導入される。したがって、本発明に係る方法の工程（ｉｉ）は、典型的には、工程（ｉ）の後に行われる。特に、Ｂ細胞の内在性活性化誘導シチジンデアミナーゼは、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子がＢ細胞に導入される前に活性化される。
【００７６】
したがって、Ｂリンパ球は、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子でトランスフェクトされる。一般に、用語「トランスフェクション」は、細胞、好ましくは真核細胞への、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子などの核酸分子の導入を意味する。本発明の文脈において、用語「トランスフェクション」は、ＤＮＡ分子をＢリンパ球に導入するための、当業者に知られた任意の方法を含む。そのような方法は、例えば、ウイルス性及び非ウイルス性のトランスフェクション法を含む。遺伝子導入に使用できるウイルスとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が挙げられる。しかし、いくつかの実施形態では、Ｂリンパ球は、レトロウイルスで形質導入されない。更に、ナノ粒子もトランスフェクションに使用できる。更なる非ウイルス性トランスフェクション法としては、多くの化学的及び物理的方法が挙げられる。化学的トランスフェクション法としては、カチオン性脂質及び／又はリポソームなどに基づくリポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、又はＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのカチオン性ポリマーに基づくトランスフェクションが挙げられる。物理的トランスフェクション法としては、エレクトロポレーション、弾道遺伝子導入（ＤＮＡでコーティングした粒子を細胞に導入する）、マイクロインジェクション（マイクロキャピラリーを介した細胞へのＤＮＡ導入）、及びヌクレオフェクションが挙げられる。好ましくは、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子のＢリンパ球への導入は、非ウイルス性である。最も好ましくは、ＤＮＡは、ヌクレオフェクションによって導入される。
【００７７】
目的の（ポリ）ペプチドは、カスタマイズされた抗体（の一部）として発現されることが想定される任意の（ポリ）ペプチドであり得る。目的の好ましい（ポリ）ペプチドは、本明細書中において以下により詳細に記載される。
【００７８】
本発明に係る単離されたＢリンパ球のゲノムを編集するための方法は、図１に概略的に示される。如何なる理論にも拘束されるものではないが、本発明者らは、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子のＢ細胞ゲノム中、特にＢリンパ球の免疫グロブリン遺伝子座のスイッチ領域への組込みは、相同組換え（ＨＲ）、非相同末端結合（ｃ−ＮＨＥＪ）、又は代替末端結合（Ａ−ＥＪ）経路などの天然のメカニズムによって生じると考えている。換言すれば、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子をＢリンパ球に導入（トランスフェクション）した後、Ｂリンパ球の内在性修復メカニズムが、相同組換え（ＨＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、及び／又は代替末端結合（Ａ−ＥＪ）などの天然のプロセスによって、生じた切断を修復することにより、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子をＢリンパ球のゲノムに組み込む。ｃ−ＮＨＥＪ及びＡ−ＥＪ経路では、ＤＮＡ切断は、Ｍｒｅ１１／Ｒａｄ５０／Ｎｂｓ１（ＭＲＮ）及び毛細血管拡張性運動失調症（ＡＴＭ）複合体によって検出される。ｃ−ＮＨＥＪでは、Ｋｕタンパク質Ｋｕ７０及びＫｕ８０ヘテロダイマーとＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡＰＫ）が、非相同ＤＮＡ末端を共に保持する足場を形成し、ＤＮＡ末端を修飾し、ＤＮＡリガーゼＩＶを動員してＤＮＡ末端を再結合させる。対照的に、Ａ−ＥＪは、Ｋｕ及びＤＮＡリガーゼＩＶとは独立して生じ、ＤＮＡリガーゼＩ又はＩＩＩを介したＤＮＡ末端プロセシング及びライゲーションに必要な追加因子の足場としてＰＡＲＰ及び／又はＣｔＩＰを利用することがある。
【００７９】
まとめると、外来性の（エンジニアードされた）ヌクレアーゼの投与に依存する従来のＢ細胞エンジニアリング法と比較して、本発明に係るＢリンパ球のゲノム編集法は、望ましくないオフターゲット変異のリスクを低下させる。特に、本発明に係る方法は、Ｂリンパ球のゲノム編集は、ｉ）単離及びＢ細胞刺激の１日間後でも行うことができ、ｉｉ）Ｃａｓ９などのエンジニアードヌクレアーゼを添加せずに行われる。
【００８０】
特に、本発明に係る方法は、外来性ヌクレアーゼを伴わない。換言すれば、本発明に係る方法では、特に、外来性ヌクレアーゼの存在は必要とされない。したがって、本発明の文脈において、外来性ヌクレアーゼそれ自体も、外来性ヌクレアーゼをコードする核酸も、Ｂリンパ球に導入されないことが好ましい。一般に、ヌクレアーゼは、核酸のモノマー間のホスホジエステル結合を切断することができる酵素である。外来性ヌクレアーゼは、Ｂリンパ球内で発生しないヌクレアーゼ、特にＢ細胞によって発現されないヌクレアーゼである。より好ましくは、本発明に係る方法は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様ヌクレアーゼ、又はメガヌクレアーゼを伴わない／利用しない。
【００８１】
したがって、本発明に係る方法は、人工的にエンジニアードされたヌクレアーゼを含まないことが好ましい。そのようなエンジニアードされたヌクレアーゼはしばしば「分子はさみ」と呼ばれ、エンジニアードされたメガヌクレアーゼ（例えば、エンジニアードされたメガヌクレアーゼ再度エンジニアードされたホーミングエンドヌクレアーゼ）、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及びＲＮＡガイドヌクレアーゼなどが挙げられ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）ヌクレアーゼが挙げられる、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、Ｃｍｒヌクレアーゼ、Ｃｓｆヌクレアーゼ、Ｃｓｍヌクレアーゼ、Ｃｓｎヌクレアーゼ、Ｃｓｙヌクレアーゼ、Ｃ２ｃｌヌクレアーゼ、Ｃ２ｃ３ヌクレアーゼ、又はＣ２ｃ３ヌクレアーゼが挙げられる。より好ましくは、本発明に係る方法は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様ヌクレアーゼ、又はメガヌクレアーゼなどのエンジニアードされたヌクレアーゼを伴わない／利用しない。
【００８２】
メガヌクレアーゼは、１２〜４０塩基対の大きな認識部位によって特徴付けられるエンドヌクレアーゼである。エンジニアードされたメガヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼに由来することが多い。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工的制限酵素であり、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、複合体ゲノム内のユニークな配列を標的とすることを可能にする特異的な所望のＤＮＡ配列を標的とするように設計することができる。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって作られる制限酵素であり、ＤＮＡの特定の配列を切断するようにエンジニアードすることができる。ＣＲＩＳＰＲは、原核生物を攻撃するウイルス由来のＤＮＡの断片を含む細菌と古細菌のＤＮＡ配列のファミリーであり、原核生物がその後の攻撃中に同様のウイルスからＤＮＡを検出して破壊するために使用される。ＣＲＩＳＰＲ配列にスペーサー配列を含むＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが外来性ＤＮＡを認識して切断するのに役立つ。遺伝子編集の場合、通常、Ｃａｓヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、Ｃｍｒヌクレアーゼ、Ｃｓｆヌクレアーゼ、Ｃｓｍヌクレアーゼ、Ｃｓｎヌクレアーゼ、Ｃｓｙヌクレアーゼ、Ｃ２ｃｌヌクレアーゼ、Ｃ２ｃ３ヌクレアーゼ、又はＣ２ｃ３ヌクレアーゼなどのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと共に細胞に導入され、細胞のゲノムを所望の位置で切断する。
【００８３】
更に、本発明の方法は、好ましくは、ガイド核酸（ガイドＲＮＡ又はガイドＤＮＡ）のＢリンパ球への導入を伴わない。ガイドＲＮＡを使用する前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに加えて、ガイド核酸を使用する他のゲノム編集方法も当技術分野で知られており、例えば、５’リン酸化短鎖一本鎖核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を、標的を切断するためのガイドとして用いるアルゴノート（Ａｇｏ）ヌクレアーゼに基づく方法が挙げられる。しかし、本発明に係る方法は、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を利用し、これは、スイッチ領域を自然に標的とし、したがって、ガイド核酸を必要とせず、特に、ガイド核酸が関与しない。
【００８４】
任意に、本発明に係る方法は、以下の工程を更に含むことができる。
（ｉｉｉ）目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列のＢリンパ球のゲノムへの組込みを確認する工程。
【００８５】
特に、この工程（ｉｉｉ）は、前記工程（ｉ）及び（ｉｉ）の後に行われる。工程（ｉｉｉ）は、例えば、配列決定（Ｂリンパ球由来の、ゲノムＤＮＡなどの核酸）によって、及び／又はエンジニアードされたＢリンパ球によって産生されるＢ細胞受容体又は抗体が目的の（ポリ）ペプチドを含むかどうかをチェックすることによって行うことができる。例えば、目的の（ポリ）ペプチドが特異的結合部位である場合、エンジニアードされたＢリンパ球によって産生された抗体の特異的結合パートナーへの結合を評価することができる。目的の（ポリ）ペプチドの抗体への組み込みが成功したかどうかは、例えば、組み込まれた目的の（ポリ）ペプチドが表面分子の一部、即ち、Ｂ細胞によって内因的に発現されたものではない場合、蛍光標識抗体による細胞表面染色及びフローサイトメトリー分析によって評価することもできる。更に、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列のＢリンパ球のゲノムへの組み込みは、ＰＣＲ増幅及び／又はｓｗｉｔｃｈ−μ、及び任意に、全てのアルファ及びガンマアイソタイプの対応する領域を含む免疫グロブリンスイッチ領域の（その後の）配列決定によって検証することができる。
【００８６】
目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子
工程（ｉｉ）でＢリンパ球に導入されたＤＮＡ分子は、任意の形態、例えば、環状（プラスミドなど）又は線状のＤＮＡ分子であることができる。例えば、環状ＤＮＡ分子（プラスミド）が工程（ｉｉ）で導入される場合、それは、プラスミドがゲノムへの組み込みのために切断され得るように、内在性ＤＮａｓｅのための少なくとも１つの制限部位を含み得る。好ましくは、本発明に係る方法の工程（ｉｉ）においてＢリンパ球に導入されるＤＮＡ分子は、線状の又は線状化されたＤＮＡ分子である。例えば、ＤＮＡ分子は、Ｂリンパ球に導入される（線状化ＤＮＡ分子）前に切断される（目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むように）プラスミドとして（又はプラスミドの成分として）調製することができる。
【００８７】
更に、工程（ｉｉ）でＢリンパ球に導入されるＤＮＡ分子は、一本鎖ＤＮＡ分子（ｓｓＤＮＡ）又は二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）であることができる。実施例１に示されるように、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡの両方を、本発明に係る方法に使用することができる。好ましくは、ＤＮＡ分子はｄｓＤＮＡ分子である。
【００８８】
更に、工程（ｉｉ）でＢリンパ球に導入された二本鎖ＤＮＡ分子は、平滑末端、５’及び／又は３’オーバーハング、又は解れた末端（ｆｒａｙｅｄ  ｅｎｄ）を有することがある。「平滑末端」は、二本鎖ＤＮＡ分子の最も単純な末端であり、ＤＮＡ分子の両方の鎖が相補的な塩基の塩基対（それぞれアデニン：チミジン（Ａ：Ｔ）及びシトシン：グアニン（Ｃ：Ｇ））で終結している。換言すれば、平滑末端では、第１の鎖の各ヌクレオチドが他方の鎖の相補的ヌクレオチドと対になっている（塩基対を形成している）。一方、「オーバーハング」は、ｄｓＤＮＡ分子の末端にある対を形成していないヌクレオチドの一続きである。これらの対を形成していないヌクレオチドは、いずれの鎖にも存在し、３’又は５’のオーバーハングを形成する。少なくとも２つの対を形成していないヌクレオチドのオーバーハングは、「粘着末端」又は「付着末端」とも呼ばれる。したがって、粘着又は付着末端は、対にを形成していないヌクレオチドを含む突出した一本鎖（オーバーハングと呼ばれる）を有するが、平滑末端は突出した鎖を有さない。最後に、「解れた末端」とは、（非相補的な「塩基対」において）かなりの割合の非相補的配列を有する末端近くのｄｓＤＮＡ分子の領域を意味する。ただし、誤って一致したヌクレオチドは結合しない傾向があるので、ロープの解れ部のような鎖に類似して見える。
【００８９】
好ましくは、ＤＮＡ分子は、粘着末端又は平滑末端を有する。最も好ましくは、ＤＮＡ分子は平滑末端を有する。
【００９０】
また、目的の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は少なくともＤＮＡ分子のヌクレオチド配列がコドン最適化されることが好ましい。特に、ヒト起源ではない目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、好ましくはコドン最適化される。一般に、コドン最適化は、ヒト細胞における組換えタンパク質の翻訳と発現を改善することができる。コドン最適化のための様々な方法が当技術分野で知られている。例えば、宿主のコドン適応指数（ＣＡＩ）又は個々のコドン使用（ＩＣＵ）の観点から、コーディング配列のコドン使用頻度を定量化及び最適化するために開発されたＪＣａｔ（Ｇｒｏｔｅ  Ａ，  Ｈｉｌｌｅｒ  Ｋ，  Ｓｃｈｅｅｒ  Ｍ，  Ｍｕｅｎｃｈ  Ｒ，  Ｎｏｅｒｔｅｍａｎｎ  Ｂ，  Ｈｅｍｐｅｌ  ＤＣ，  Ｊａｈｎ  Ｄ．  ＪＣａｔ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ａｄａｐｔ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｏｆ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｈｏｓｔ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００５  Ｊｕｌ  １；３３（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５２６−３１）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｗｕ  Ｇ，  Ｂａｓｈｉｒ−Ｂｅｌｌｏ  Ｎ，  Ｆｒｅｅｌａｎｄ  ＳＪ．  Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ：  ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｗｅｂ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｔｏ  ｅｘｐｌｏｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．  ２００６  Ｊｕｎ；４７（２）：４４１−５）、及びＯＰＴＩＭＩＺＥＲ（Ｐｕｉｇｂｏ  Ｐ，  Ｇｕｚｍａｎ  Ｅ，  Ｒｏｍｅｕ  Ａ，  Ｇａｒｃｉａ−Ｖａｌｌｖｅ  Ｓ．  ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ：  ａ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００７  Ｊｕｌ；３５（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ１２６−３１）などの計算ツールを用いることができる。更に、コドンコンテキスト（ＣＣ）としても知られるコドンペアリングの最適化を、例えば、異種遺伝子発現を改善するために使用することができる（例えば、以下に記載されている：Ｃｈｕｎｇ  ＢＫ，  Ｙｕｓｕｆｉ  ＦＮ，  Ｍａｒｉａｔｉ，  Ｙａｎｇ  Ｙ，  Ｌｅｅ  ＤＹ．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ｉｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１３  Ｓｅｐ  １０；１６７（３）：３２６−３３；  Ｈａｔｆｉｅｌｄ  ＧＷ，  Ｒｏｔｈ  ＤＡ．  Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｓｃａｌｅｕｐ  ｙｉｅｌｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  （ＣＯＤＡ）  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．  ２００７；１３：２７−４２；  ａｎｄ／ｏｒ  Ｍｏｕｒａ  ＧＲ，  Ｐｉｎｈｅｉｒｏ  Ｍ，  Ｆｒｅｉｔａｓ  Ａ，  Ｏｌｉｖｅｉｒａ  ＪＬ，  Ｆｒｏｍｍｌｅｔ  ＪＣ，  Ｃａｒｒｅｔｏ  Ｌ，  Ｓｏａｒｅｓ  ＡＲ，  Ｂｅｚｅｒｒａ  ＡＲ，  Ｓａｎｔｏｓ  ＭＡ．  Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｄｏｎ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｒｕｌｅｓ  ｕｎｖｅｉｌ  ｎｏｎ−ｎｅｕｔｒａｌｉｔｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１１；６（１０）：ｅ２６８１７）。更に、隠れ終止コドン（ＨＳＣ）の存在はオフフレームの読み取りも防ぐので、隠れ終止コドン（ＨＳＣ）の数を最大にして遺伝子発現を増大させることができる。コドン最適化のための特に好ましいツールとしてはＣＯＯＬ  （ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｃｏｏｌ．ｓｙｎｃｔｉ．ｏｒｇ／；  Ｊｕ  Ｘｉｎ  Ｃｈｉｎ，  Ｂｅｖａｎ  Ｋａｉ−Ｓｈｅｎｇ  Ｃｈｕｎｇ，  Ｄｏｎｇ−Ｙｕｐ  Ｌｅｅ；  Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ＯｎＬｉｎｅ  （ＣＯＯＬ）：  ａ  ｗｅｂ−ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉ−ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ３０，  Ｉｓｓｕｅ  １５，  １  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１４，  Ｐａｇｅｓ  ２２１０−２２１２）；  “ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅＴＭ−Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ”（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ；米国特許出願公開第ＵＳ  ２０１１／００８１７０８Ａ１明細書に記載）及び“Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌ”（ＩＤＴ（登録商標）Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；  ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｅｕ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ）が挙げられる。
【００９１】
或いは、目的の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は少なくともＤＮＡ分子のヌクレオチド配列がコドン最適化されないことも好ましい。特に、目的の（ポリ）ペプチドがヒト（ポリ）ペプチドである又はヒト（ポリ）ペプチドに由来する場合、ＤＮＡ分子又は前記ヌクレオチド配列はコドン最適化されないことが好ましい。
【００９２】
好ましくは、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子は、（目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列に加えて）、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流及び／又は下流のイントロン配列を更に含む。より好ましくは、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子は、（目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列に加えて）（ｉ）目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流のイントロン配列、及び（ｉｉ）目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流のイントロン配列を更に含む。特に、用語「イントロン配列」は、非コードヌクレオチド配列を意味する。
【００９３】
好ましくは、イントロン配列は、少なくとも５ヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ：塩基対；ｂｐ）、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ：塩基対；ｂｐ）、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ：塩基対；ｂｐ）、更により好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ：塩基対；ｂｐ）、及び最も好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ：塩基対；ｂｐ）の長さを有する。イントロニック配列は、また、少なくとも５０ヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ：塩基対；ｂｐ）、好ましくは少なくとも７５又は１００ヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ：塩基対；ｂｐ）、より好ましくは少なくとも１５０又は２００ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも３００又は４００ヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ：塩基対；ｂｐ）、更により好ましくは少なくとも５００ヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ：塩基対；ｂｐ）、最も好ましくは少なくとも６００ヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ：塩基対；ｂｐ）の長さを有することが好ましい。
【００９４】
イントロン配列は、また、３０００ヌクレオチド以下、好ましくは２５００ヌクレオチド以下（ｄｓＤＮＡ：塩基対；ｂｐ）、より好ましくは２０００ヌクレオチド以下（ｄｓＤＮＡ：塩基対；ｂｐ）、更により好ましくは（特にＤＮＡ分子が２つのイントロン配列を含む場合）１５００ヌクレオチド以下（ｄｓＤＮＡ：塩基対；ｂｐ）、更により好ましくは（特にＤＮＡ分子が２つのイントロン配列を含む場合）１２５０ヌクレオチド以下、（ｄｓＤＮＡ：塩基対；ｂｐ）、最も好ましくは（特にＤＮＡ分子が２つのイントロン配列を含む場合）１０００ヌクレオチド以下（ｄｓＤＮＡ：塩基対；ｂｐ）の長さを有ることが好ましい。
【００９５】
好ましくは、イントロン配列は、スプライス認識部位を含む。「スプライス認識部位」（「スプライス部位」とも呼ばれる）はヌクレオチド配列であり、これはスプライセオソームによって特異的に認識され、スプライシングされる。したがって、スプライス（認識）部位は、イントロンとエキソンの間の「境界」にあるイントロンヌクレオチド配列である。
【００９６】
より好ましくは、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子は、
（ｉ）目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流にある（単一の）スプライス認識部位を含むイントロン配列（例えば、５’スプライス部位）；及び
（ｉｉ）目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流にある（単一の）スプライス認識部位を含むイントロン配列（例えば、３’スプライス部位）を含む。
【００９７】
最も好ましくは、スプライス認識部位は、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の直接隣接して（直接上流又は下流）位置する。
【００９８】
本明細書で使用される用語「５’スプライス部位」は、イントロンの下流端に位置し、したがって、エキソンのすぐ上流（エキソンの５’端）に位置するスプライス部位を意味する。例えば、「５’スプライス部位」は、通常、その３’末端にヌクレオチド「ＡＧ」（この順序で）を含む。換言すれば、「５’スプライス部位」は、最後の２ヌクレオチドとしてヌクレオチド「ＡＧ」で終結することがある（その後、エキソン／コード配列が開始する）。
【００９９】
本明細書で使用される用語「３’スプライス部位」は、イントロンの上流端に位置し、したがって、エキソンのすぐ下流（エキソンの３’端）に位置するスプライス部位を意味する。例えば、「３’スプライス部位」は、通常、その５’末端にヌクレオチド「ＧＴ」（この順序で）を含む。換言すれば、「３’スプライス部位」は、最初の２つのヌクレオチドとしてのヌクレオチド「ＧＴ」で開始することがある（エキソン／コード配列の終結直後に（直接））。
【０１００】
スプライス部位は、例えば、以下を含む様々なバイオインフォマティクスツールによってインシリコで予測することができる。
−Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｙ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ；  ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｓｐｌｉｃｅ．ｈｔｍｌ；  Ｒｅｅｓｅ  ＭＧ，  Ｅｅｃｋｍａｎ，  ＦＨ，  Ｋｕｌｐ，  Ｄ，  Ｈａｕｓｓｌｅｒ，  Ｄ，  １９９７．  “Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓｐｌｉｃｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｉｅ”．  Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｌ  ４（３），  ３１１−２３）；
−Ｈｕｍａｎ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  Ｆｉｎｄｅｒ  （ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｍｄ．ｂｅ／ＨＳＦ／；  ＦＯ  Ｄｅｓｍｅｔ，  Ｈａｍｒｏｕｎ  Ｄ，  Ｌａｌａｎｄｅ  Ｍ，  Ｃｏｌｌｏｄ−Ｂｅｒｏｕｄ  Ｇ，  Ｃｌａｕｓｔｒｅｓ  Ｍ，  Ｂｅｒｏｕｄ  Ｃ．  Ｈｕｍａｎ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  Ｆｉｎｄｅｒ：  ａｎ  ｏｎｌｉｎｅ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００９，  Ａｐｒｉｌ）；
−ＧｅｎｅＳｐｌｉｃｅｒ  （ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｃｃｂ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎｅｓｐｌｉｃｅｒ／；  Ｍ．  Ｐｅｒｔｅａ  ，  Ｘ．  Ｌｉｎ  ，  Ｓ．  Ｌ．  Ｓａｌｚｂｅｒｇ  ．  ＧｅｎｅＳｐｌｉｃｅｒ  ：  ａ  ｎｅｗ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｔｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ．  ２００１  Ｍａｒ  １；２９（５）：１１８５−９０）；
−ＮｅｔＧｅｎｅ２  Ｓｅｒｖｅｒ  （ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／；  Ｓ．Ｍ．  Ｈｅｂｓｇａａｒｄ，  Ｐ．Ｇ．  Ｋｏｒｎｉｎｇ，  Ｎ．  Ｔｏｌｓｔｒｕｐ，  Ｊ．  Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ，  Ｐ．  Ｒｏｕｚｅ，  Ｓ．  Ｂｒｕｎａｋ：  Ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｔｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｌｏｃａｌ  ａｎｄ  ｇｌｏｂａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９６，  Ｖｏｌ．  ２４，  Ｎｏ．  １７，  ３４３９−３４５２．  Ｂｒｕｎａｋ，  Ｓ．，  Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｋｎｕｄｓｅｎ，  Ｓ．：  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ｍＲＮＡ  Ｄｏｎｏｒ  ａｎｄ  Ａｃｃｅｐｔｏｒ  Ｓｉｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９１，  ２２０，  ４９−６５）；
−ＳｐｌｉｃｅＰｏｒｔ：  Ａｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｓｐｌｉｃｅ  Ｓｉｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌ  （ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｓｐｌｉｃｅｐｏｒｔ．ｃｂｃｂ．ｕｍｄ．ｅｄｕ／；  Ｄｏｇａｎ  ＲＩ，  Ｇｅｔｏｏｒ  Ｌ，  Ｗｉｌｂｕｒ  ＷＪ，  Ｍｏｕｎｔ  ＳＭ．  ＳｐｌｉｃｅＰｏｒｔ−Ａｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｅ−ｓｉｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２００７；３５（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ２８５−Ｗ２９１．  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｍ４０７）；及び
−ＭａｘＥｎｔＳｃａｎ  （ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｂｕｒｇｅｌａｂ／ｍａｘｅｎｔ／Ｘｍａｘｅｎｔｓｃａｎ＿ｓｃｏｒｅｓｅｑ．ｈｔｍｌ；  Ｙｅｏ  Ｇ，  Ｂｕｒｇｅ  ＣＢ．  Ｍａｘｉｍｕｍ  ｅｎｔｒｏｐｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｍｏｔｉｆｓ  ｗｉｔｈ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｓ．  Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．  ２００４；１１（２−３）：３７７−９４。
【０１０１】
好ましくは、３’スプライス部位は、配列番号１に係るヌクレオチド配列又はその配列変異体を含む。
ＡＧＧＴＡＡＧＴ
［配列番号１］
【０１０２】
５’スプライス部位がポリピリミジントラクト（１０Ｕ又はＣ、これに続いて任意の塩基及びＣ）及び末端ＡＧを含むことも好ましい。
【０１０３】
特に好ましい実施形態では、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子は、
（ｉ）目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流に（目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端に）、（単一の）スプライス認識部位、特に５’スプライス部位を含むイントロン配列、特に（天然）のイントロンの３’末端；及び
（ｉｉ）目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流に（目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に）、（単一の）スプライス認識部位、特に３’スプライス部位を含むイントロン配列、特にイントロンの５’末端を更に含む。
【０１０４】
最も好ましくは、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子は、（以下の順で）：
１．第１のスプライス認識部位を含む第１のイントロン配列（例えば、５’スプライス部位を含む（天然の）イントロンの３’末端）；
２．目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び
３．第２のスプライス認識部位を含む第２のイントロン配列（例えば、３’スプライス部位を含む（天然の）イントロンの５’末端）を含む。
【０１０５】
このようなＤＮＡ分子の概略例（例えば、Ｂリンパ球のゲノムの１４番染色体のスイッチ領域に組み込まれる）を図１１に示す。特に、図１１の上部は一般的な概念を示す（図１１の中央と下部は、以下に記載する更なる特徴を含む例を示す）。
【０１０６】
イントロン配列の特に好ましい例は、配列番号１１２〜１１５のいずれかに係るヌクレオチド配列又は本明細書で定義されるその配列変異体を含む又はからなる。例えば、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の（直接）上流（目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端）に位置するイントロン配列は、好ましくは、配列番号１１２若しくは配列番号１１４、又は本明細書で定義されるそれらの配列変異体に係るヌクレオチド配列を含む又はからなる。例えば、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の（直接）下流（目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端）に位置するイントロン配列は、好ましくは、配列番号１１３若しくは配列番号１１５、又は本明細書で定義されるそれらの配列変異体に係るヌクレオチド配列を含む又はからなる。
【０１０７】
好ましくは、イントロン配列は、Ｉｇ遺伝子座イントロン配列を含む。用語「Ｉｇ遺伝子座イントロン配列」は、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座のイントロン配列（特に、Ｉｇ遺伝子座に天然に存在するイントロン５’末端及び／又は３’末端などの、Ｉｇ遺伝子座に天然に存在するイントロン配列）を意味する。したがって、イントロン配列は、Ｉｇ遺伝子座の（天然に存在する）イントロンの断片又はＩｇ遺伝子座の完全なイントロンであることが好ましい。
【０１０８】
最も好ましくは、イントロン配列は、Ｊセグメント下流イントロンのイントロン配列及び／又はＣＨ上流イントロン、例えば、ＣＨ１上流イントロンのイントロン配列を含む。用語「Ｊセグメント下流イントロン」は、Ｊセグメントをコードするエキソンのすぐ下流のイントロンを意味する。用語「ＣＨ上流イントロン」は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）をコードするエキソンのすぐ上流のイントロンを意味する。したがって、Ｊセグメント下流イントロンのイントロン配列及び／又はＣＨ上流イントロンのイントロン配列は、前記したように、完全なＪセグメント下流イントロン／完全なＣＨ上流イントロン又はその断片であり得る。好ましくは、ＣＨ上流イントロンは、分岐点配列（「分岐配列」又は「分岐部位」としても知られる）を含む。特に好ましくは、ＤＮＡ分子は、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流にあるＣＨ上流イントロン（例えば、ＣＨ１上流イントロン）のイントロン配列（即ち、ＣＨ上流イントロンのイントロン配列が、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の（すぐ）「前」／上流に位置する）及び／又は目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流のＪセグメント下流イントロンのイントロン配列（即ち、イントロンＪセグメント下流イントロンの配列は、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の（すぐ）「前」／下流に位置する）を含む。
【０１０９】
最も好ましくは、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子は、（以下の順で）：
１．その３’末端に第１のスプライス認識部位（例えば、５’スライス部位）を含むＣＨ上流イントロンのイントロン配列（例えば、ＣＨ上流イントロンの３’末端断片）であって、好ましくは分岐点配列及び／又はイントロンスプライシングエンハンサーを更に含むＣＨ上流イントロンのイントロン配列；
２．目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列；
３．その５’末端に第２のスプライス認識部位（例えば、３’スライス部位）を含むＪセグメント下流イントロンのイントロン配列（例えば、Ｊセグメント下流イントロンの５’末端断片）であって、好ましくはイントロンスプライシングエンハンサーを更に含むＪセグメント下流イントロンのイントロン配列。
【０１１０】
そのような好ましい実施形態は、図１１（中央）に概略的に示されている。
【０１１１】
したがって、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流のイントロン配列は、分岐点配列（「分岐配列」又は「分岐部位」としても知られている）を含むことが好ましい。「分岐部位」は、５’スプライス部位から約１８〜５０ヌクレオチドの保存された距離に位置するＹＮＣＴＧＡＣ（ここで、ＹはＣ又はＴであり得、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、及びＴから選択される任意のヌクレオチドであり得る；配列番号２）などの保存度が低い配列エレメントである。したがって、分岐部位は、イントロン配列に含まれる５’スプライス部位の上流約１８〜５０ヌクレオチド（好ましくは２０〜４０ヌクレオチド）のイントロン配列に位置することが好ましい。
【０１１２】
イントロン配列はまた、スプライシングを増強する又は沈黙させる（抑制する）シス作用性配列であるスプライシング調節エレメント（ＳＲＥ）を含んでもよい。したがって、「スプライシングエンハンサー」と「スプライシングサイレンサー」は、区別され得る。ＳＲＥは、トランス作用性スプライシング因子を動員して、スプライス部位の認識又はスプライセオソームの集合を活性化又は抑制する。
【０１１３】
好ましくは、イントロン配列は、（イントロン）スプライシングエンハンサーを含む。また、イントロン配列が、（イントロン）スプライシングサイレンサーを含まないことも好ましい。一般に、イントロン配列（例えば、イントロン（の断片）内）に存在するスプライシングエンハンサー／サイレンサーは、「イントロン性」スプライシングエンハンサー／サイレンサーと呼ばれ、（例えば、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列における）エキソン／コード配列は、「エキソン性」スプライシングエンハンサー／サイレンサーと呼ばれる。ＤＮＡ分子中に、天然又は設計されたスプライシングエンハンサーが存在する及び／又はスプライシングサイレンサーが存在しないことが好ましく、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列のスプライシング及び組み込みを改善することができる。
【０１１４】
ＤＮＡ分子は、また、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流及び／又は下流にイントロン性スプライシングエンハンサーを含むイントロン配列を含むことが好ましい。好ましいイントロン性スプライシングエンハンサーは、Ｗａｎｇ  Ｙ，  Ｍａ  Ｍ，  Ｘｉａｏ  Ｘ，  Ｗａｎｇ  Ｚ．  Ｉｎｔｒｏｎｉｃ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ，  Ｃｏｇｎａｔｅ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｅｘｔ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｕｌｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  ２０１２；１９（１０）：１０４４−１０５２．  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．２３７７．に記載されている。
【０１１５】
最も好ましくは、イントロン性スプライシングエンハンサーは、配列番号３〜２６のいずれかに係るヌクレオチド配列又はその配列変異体を有する。
ＧＴＡＧＴＧＡＧＧＧ（配列番号３）
ＧＴＴＧＧＴＧＧＴＴ（配列番号４）
ＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴ（配列番号５）
ＧＴＡＴＴＧＧＧＴＣ（配列番号６）
ＡＧＴＧＴＧＡＧＧＧ（配列番号７）
ＧＧＧＴＡＡＴＧＧＧ（配列番号８）
ＴＣＡＴＴＧＧＧＧＴ（配列番号９）
ＧＧＴＧＧＧＧＧＴＣ（配列番号１０）
ＧＧＴＴＴＴＧＴＴＧ（配列番号１１）
ＴＡＴＡＣＴＣＣＣＧ（配列番号１２）
ＧＴＡＴＴＣＧＡＴＣ（配列番号１３）
ＧＧＧＧＧＴＡＧＧ（配列番号１４）
ＧＴＡＧＴＴＣＣＣＴ（配列番号１５）
ＧＴＴＡＡＴＡＧＴＡ（配列番号１６）
ＴＧＣＴＧＧＴＴＡＧ（配列番号１７）
ＡＴＡＧＧＴＡＡＣＧ（配列番号１８）
ＴＣＴＧＡＡＴＴＧＣ（配列番号１９）
ＴＣＴＧＧＧＴＴＴＧ（配列番号２０）
ＣＡＴＴＣＴＣＴＴＴ（配列番号２１）
ＧＴＡＴＴＧＧＴＧＴ（配列番号２２）
ＧＧＡＧＧＧＴＴＴ（配列番号２３）
ＴＴＴＡＧＡＴＴＴＧ（配列番号２４）
ＡＴＡＡＧＴＡＣＴＧ（配列番号２５）
ＴＡＧＴＣＴＡＴＴＡ（配列番号２６）
【０１１６】
最も好ましくは、イントロン配列は、配列番号２７〜５３のいずれか係るヌクレオチド配列又はその配列変異体を有する。配列番号２７〜４５は、ＣＨ上流イントロン（のイントロン配列／断片）の好ましい例を示し、配列番号４６〜５１は、Ｊセグメント下流イントロン（のイントロン配列／断片）の好ましい例を示す。
５’ＩｇＭ−ＣＨ１
ＣＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴＴＴＧＴＣＣＴＧＣＧＧＧＴＣＣＴＣＡＧ
［配列番号２７］
５’ＩｇＭ−ＣＨ２
ＣＧＡＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＧＣＡＣＣＧＧＧＣＴＧＡＣＡＣＧＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＴＧＣＡＧ
［配列番号２８］
５’ＩｇＭ−ＣＨ３
ＴＣＣＧＣＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＴＴＧＡＣＴＣＣＡＧ
［配列番号２９］
５’ＩｇＭ−ＣＨ４
ＣＣＡＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＣＡＣＴＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＴＴＣＡＣＡＧ
［配列番号３０］
５’ＩｇＧ１−ＣＨ１
ＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＴＣＣＣＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＣＡＣＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧ
［配列番号３１］
５’ＩｇＧ１−ヒンジ
ＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＴＴＣＣＡＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧ
［配列番号３２］
５’ＩｇＧ１−ＣＨ２
ＡＧＧＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＧＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧ
［配列番号３３］
５’ＩｇＧ１−ＣＨ３
ＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧＴＡＣＣＡＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＡＣＡＧ
［配列番号３４］
５’ＩｇＧ３−ＣＨ１
ＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＴＣＣＣＡＣＡＣＣＧＣＡＧＴＣＡＣＡＴＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧ
［配列番号３５］
５’ＩｇＧ３−ヒンジ
ＡＧＡＴＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧ
［配列番号３６］
５’ＩｇＧ３−ヒンジ２
ＡＣＧＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＧＡＴＣＣＣＣＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧ
［配列番号３７］
５’ＩｇＧ３−ヒンジ３
ＡＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＧＡＴＣＣＣＣＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧ
［配列番号３８］
５’ＩｇＧ３−ヒンジ４
ＡＣＧＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＧＡＴＣＣＣＣＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧ
［配列番号３９］
５’ＩｇＧ３−ＣＨ２
ＡＣＧＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＧＡＴＣＣＣＣＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧ
［配列番号４０］
５’ＩｇＧ３−ＣＨ３
ＧＡＣＣＣＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＡＣＡＧ
［配列番号４１］
５’ＩｇＧ４−ＣＨ１
ＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＴＣＣＣＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＣＡＣＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧ
［配列番号４２］
５’ＩｇＧ４−ヒンジ
ＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧ
［配列番号４３］
５’ＩｇＧ４−ＣＨ２
ＡＧＧＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＧＧＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧ
［配列番号４４］
５’ＩｇＧ４−ＣＨ３
ＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＡＣＡＧ
［配列番号４５］
【０１１７】
前記した例は、ＩｇＭ及びさまざまなＩｇＧサブクラスのそれぞれのＩｇ遺伝子座（例えば、ＩｇＭ−ＣＨ１など）に天然に存在するイントロンの断片（３’末端）を示す。また、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、及びＩｇＥなどの他の免疫グロブリンアイソタイプの対応する（天然に存在する）イントロン配列を使用することも好ましい。
３’Ｊ１
ＧＴＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＧＧＧＡＴＡＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＣＡＡ
［配列番号４６］
３’Ｊ２
ＧＴＧＡＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＣＡ
［配列番号４７］
３’Ｊ３
ＧＴＡＡＧＡＴＧＧＣＴＴＴＣＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＣＣ
［配列番号４８］
３’Ｊ４
ＧＴＧＡＧＴＣＣＴＣＡＣＡＡＣＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＴＴＴＡＡＣＴＣＴＧＡＡＧＧＧＴＴＴＴＧＣＴＧＣＡＴ
［配列番号４９］
３’Ｊ５
ＧＴＧＡＧＴＣＣＴＣＡＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＣＴＴＡＧＧＧＡＧＡＣＴＣＡＧＣＴＴＧＣＣ
［配列番号５０］
３’Ｊ６
ＧＴＡＡＧＡＡＴＧＧＣＣＡＣＴＣＴＡＧＧＧＣＣＴＴＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴ
［配列番号５１］
【０１１８】
更に好ましい例としては、下記が挙げられる。
５’ＬＡＩＲ１
ＣＡＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＣＴＡＣＡＧＴＧＧＡＣＧＣＴＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＴＣＣＴＡＧ
［配列番号５２］
３’ＬＡＩＲ１
ＧＴＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＧＣＴＣＧＡＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧ
［配列番号５３］
【０１１９】
一般に、ＤＮＡ分子がスプライシングエンハンサーを含むことが好ましい。スプライシングエンハンサーは、イントロン性（即ち、ＤＮＡ分子のイントロン配列に位置する）又はエキソン性（即ち、ＤＮＡ分子のコード配列、例えば、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列に位置する）であることができる。目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、一般に、イントロン配列よりも（目的の（ポリ）ペプチドをコードするその機能性のために）遥かに事前に決定されているので、イントロン性スプライシングエンハンサーが通常好ましい。換言すれば、スプライシングエンハンサーは、ＤＮＡ分子に含まれるイントロン配列に位置することが通常好ましい。より好ましくは、ＤＮＡ分子は、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流のイントロン配列及び目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流のイントロン配列を含み、各イントロン配列はスプライシングエンハンサーを含む。そのような好ましい実施形態を図１１（下部）に概略的に示す。
【０１２０】
しかし、ＤＮＡ分子は、例えば、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列に、エキソン性スプライシングエンハンサーを含むことも好ましい。例えば、目的の（ポリ）ペプチドは、それを「天然に」コードするヌクレオチド配列がエキソン性スプライシングエンハンサーを含むように選択され得る。更に、遺伝暗号の縮重を使用して、エキソンスプライシングエンハンサーを導入することができる。即ち、（コードされたアミノ酸を変更しない）サイレント突然変異を使用して、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列にエキソン性スプライシングエンハンサーを導入することができる。
【０１２１】
好ましくは、ＤＮＡ分子は、エキソン性スプライシングサイレンサーを含まない。
【０１２２】
エキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）は、エキソン内の個別の配列であり、構成的スプライシングと調節的スプライシングの両方を促進する。エキソン性スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）配列は、セリン及びアルギニンリッチ（ＳＲ）タンパク質によって結合され、スプライシング因子の動員を向上させる。好ましくは、エキソン性スプライシングエンハンサーは、６つの塩基からなる配列モチーフである。
【０１２３】
エキソン性スプライシングエンハンサーは、当技術分野で知られている（Ｌｉｕ  Ｈ−Ｘ，  Ｚｈａｎｇ  Ｍ，  Ｋｒａｉｎｅｒ  ＡＲ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｏｎｉｃ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｍｏｔｉｆｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ＳＲ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  １９９８；１２（１３）：１９９８−２０１２；  Ｂｌｅｎｃｏｗｅ  ＢＪ．  Ｅｘｏｎｉｃ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ，  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．  ２０００  Ｍａｒ；２５（３）：１０６−１０）。スプライシングエンハンサーは、さまざまなバイオインフォマティクスツールによってインシリコで予測でき、例えば、ＲＥＳＣＵＥ−ＥＳＥ  Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ（ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｂｕｒｇｅｌａｂ／ｒｅｓｃｕｅ−ｅｓｅ／；  Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ  ＷＧ，  Ｙｅｈ  ＲＦ，  Ｓｈａｒｐ  ＰＡ，  Ｂｕｒｇｅ  ＣＢ．  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｎｉｃ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００２  Ａｕｇ  ９；２９７（５５８３）：１００７−１３）  ａｎｄ／ｏｒ  ｂｙ  ＥＳＥｆｉｎｄｅｒ  （ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｔｏｏｌｓ／ＥＳＥ３／ｅｓｅｆｉｎｄｅｒ．ｃｇｉ？ｐｒｏｃｅｓｓ＝ｈｏｍｅ；  Ｓｍｉｔｈ，  Ｐ．  Ｊ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｃ．，  Ｗａｎｇ，  Ｊ．  Ｃｈｅｗ，  Ｓ．  Ｌ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｍ．  Ｑ．  ａｎｄ  Ｋｒａｉｎｅｒ，  Ａ．  Ｒ．  ２００６．  Ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＦ２／ＡＳＦ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｏｎｉｃ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １５（１６）：  ２４９０−２５０８；  Ｃａｒｔｅｇｎｉ  Ｌ．，  Ｗａｎｇ  Ｊ．，  Ｚｈｕ  Ｚ．，  Ｚｈａｎｇ  Ｍ．  Ｑ．，  Ｋｒａｉｎｅｒ  Ａ．  Ｒ．；  ２００３．  ＥＳＥｆｉｎｄｅｒ：  ａ  ｗｅｂ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｅｘｏｎｉｃ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００３，  ３１（１３）：  ３５６８−３５７１）などによって予測できる。
【０１２４】
最も好ましくは、スプライシングエンハンサー（イントロン性又はエキソン性）は、単離されたヒトＢ細胞、特に初代ヒトＢ細胞において効率を示すように選択される。したがって、スプライシングエンハンサーは、好ましくは、単離されたヒトＢ細胞、特に初代ヒトＢ細胞に由来する（例えば、本明細書に記載の適切なバイオインフォマティクスツールをスプライシングエンハンサーの予測に用いＢ細胞配列を分析することによって）。
【０１２５】
好ましくは、本発明に係る方法において、Ｂリンパ球のゲノムは、Ｎ末端からＣ末端方向に、可変ドメイン、（本発明に係る方法の工程（ｉｉ）で導入されるＤＮＡ分子によってコードされる）目的の（ポリ）ペプチド、及び定常ドメインを含む修飾免疫グロブリン鎖を発現するように編集される。換言すれば、Ｂリンパ球のゲノムは、好ましくは、免疫グロブリン鎖の可変ドメインと定常ドメインとの間に配置された目的の（ポリ）ペプチドを含む修飾免疫グロブリン鎖を発現するように編集される。したがって、Ｂリンパ球のゲノムは、抗体のエルボー領域に目的の（ポリ）ペプチドを含む修飾抗体を発現するように編集されることが好ましい。更に、Ｂリンパ球のゲノムは、抗体のエルボー領域に目的の（ポリ）ペプチドを含む修飾Ｂ細胞受容体を発現するように編集されることが好ましい。
【０１２６】
エルボー領域は、抗体の重鎖と軽鎖の可変ドメインと定常ドメインとの間の接合部である。通常、可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）のＣ末端は、最もＮ末端側の定常ドメイン（通常、ＣＨ１又はＣＬ）のＮ末端に直接結合し、可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）のＣ末端と、最もＮ末端側の定常ドメイン（通常、ＣＨ１又はＣＬ）のＮ末端との間の接合部は、「エルボー」又は「エルボー領域」と呼ばれる。エルボー領域は、定常ドメインに対する可変ドメインの屈曲と回転を可能にする。したがって、ヒンジ領域と共に、エルボー領域は、抗原結合のための抗体に柔軟性を提供する。エルボー領域は、エルボー領域によって提供される可動域に基づいて「分子球関節（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｌｌ−ａｎｄ−ｓｏｃｋｅｔ  ｊｏｉｎｔ）」とも呼ばれる（Ｌｅｓｋ  ＡＭ，  Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ．  Ｅｌｂｏｗ  ｍｏｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｌｌ−ａｎｄ−ｓｏｃｋｅｔ  ｊｏｉｎｔ．  Ｎａｔｕｒｅ．  １９８８  Ｓｅｐ  ８；３３５（６１８６）：１８８−９０）。
【０１２７】
Ｂリンパ球のゲノムでは、スイッチ領域は、抗体の可変ドメインと（最もＮ末端側の）定常ドメインの間に位置する。前記したように、ＡＩＤの作用により、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子は、Ｂ細胞ゲノムのスイッチ領域に組み込まれる。したがって、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子は、抗体の可変ドメインと定常ドメインとの間に組み込まれる。特に、本明細書に記載される本発明にしたがって編集されたＢ細胞ゲノムによって発現される免疫グロブリン鎖が、Ｎ末端からＣ末端方向に、可変ドメイン、（本発明に係る方法の工程（ｉｉ）で導入されるＤＮＡ分子によってコードされる）目的の（ポリ）ペプチド、及び定常ドメインを含むように、イントロン配列がスプライシング中に除去される。したがって、発現された免疫グロブリン鎖において、目的の（ポリ）ペプチドは、抗体のエルボー領域、即ち、可変ドメインと最もＮ末端側の定常ドメインとの間に位置する。
【０１２８】
エルボー領域に目的の（ポリ）ペプチドを含む抗体の好ましい例及び対応するゲノム配列を図２Ａに示す。図２Ａの上部は、エルボー領域に目的の（ポリ）ペプチドとして単一の受容体ドメインを有する（古典的なＩｇＧタイプの）抗体を示す。図２Ａの中央部分は、エルボー領域に目的の（ポリ）ペプチドとして２つの受容体ドメインを有する（古典的なＩｇＧタイプの）抗体を示す。図２Ａの下部は、エルボー領域に目的の（ポリ）ペプチドとしてＶＨドメインとＶＬドメインを有する（古典的なＩｇＧタイプの）抗体を示す。
【０１２９】
一般に、本明細書に記載される本発明に係る方法で得ることができる「Ｉｎ−Ｅｌｂｏｗ−Ｉｎｓｅｒｔｓ」（ＩＥＩ）を有する抗体は、参照により本明細書に援用する国際公開第２０１９／０２５３９１Ａ１号及び国際公開第２０１９／０２４９７９Ａ１号（ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６９３５７）に詳細に記載されている。特に、Ｂリンパ球のゲノムは、本発明に係る方法で編集されて、抗体、又は重鎖を含むその抗原結合断片を発現することができ、前記重鎖は、ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）可変ドメイン、特に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）目的の（ポリ）ペプチド、及び
（ｉｉｉ）１以上の定常ドメイン、特に重鎖定常ドメイン（ＣＨ）、好ましくは少なくともＣＨ１定常ドメインを含むドメインを含む。
【０１３０】
好ましくは、重鎖の目的の（ポリ）ペプチド（ｉｉ）は、好ましくは、軽鎖の断片を含まない。
【０１３１】
目的の（ポリ）ペプチドを含むようにエルボー領域でエンジニアードされた抗体は、例えば、（１）それらの可変ドメインによって標的とされる抗原、及び（２）抗体のエルボー領域に導入された結合部位によって標的とされる追加の標的に同時に結合することができ、これは、国際公開第２０１９／０２５３９１Ａ１号及び国際公開第２０１９／０２４９７９Ａ１号（ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６９３５７）に詳細に記載されている。
【０１３２】
特に、様々な「Ｉｎ−Ｅｌｂｏｗ−Ｉｎｓｅｒｔｓ」（ＩＥＩ）抗体を、本明細書に記載される本発明に係る方法で得ることができる。「Ｉｎ−Ｅｌｂｏｗ−Ｉｎｓｅｒｔｓ」（ＩＥＩ）抗体は、国際公開第２０１９／０２５３９１Ａ１号及び国際公開第２０１９／０２４９７９Ａ１号（ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６９３５７）に詳細に記載されている。本発明に係る方法で得られる好ましい「Ｉｎ−Ｅｌｂｏｗ−Ｉｎｓｅｒｔｓ」（ＩＥＩ）抗体は、国際公開第２０１９／０２５３９１Ａ１号及び国際公開第２０１９／０２４９７９Ａ１号（ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６９３５７）に記載されている「Ｉｎ−Ｅｌｂｏｗ−Ｉｎｓｅｒｔｓ」（ＩＥＩ）抗体の好ましい実施形態に対応する。
【０１３３】
しかし、本発明に係る方法では、他の組換え抗体も得ることができる。また、Ｂリンパ球のゲノムが、修飾された免疫グロブリン鎖を発現するように編集され、内在性可変ドメインが目的の（ポリ）ペプチドによって置き換えられることが好ましい。したがって、Ｂリンパ球のゲノムを編集して、改変されたＢ細胞受容体を発現させることも好ましく、内在性可変ドメインは、目的の（ポリ）ペプチドによって置き換えられる。したがって、Ｂリンパ球のゲノムは、内在性可変ドメインに「代えて」目的の（ポリ）ペプチドを含む修飾抗体を発現するように編集されることが好ましい。
【０１３４】
内在性可変領域に代えて目的の（ポリ）ペプチドを含む免疫グロブリン鎖を含む抗体の好ましい例及び対応するゲノム配列を図２Ｂに示す。図２Ｂの上部は、（古典的なｉｇＧタイプの）抗体を示し、内在性可変領域（ＶＨ）を別の（異種）可変領域（ＶＨ）に置き換えた。次の構築物では、内在性可変領域（ＶＨ）を、受容体ドメイン及び別の（異種）可変領域（ＶＨ）に置き換えた。次の構築物では、内在性可変領域（ＶＨ）を３つの（異種）可変領域（ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ）に置き換えた。図２Ｂの最下部では、内在性可変領域（ＶＨ）を２つの（異種）可変領域及び（異種）定常領域（ＶＬ−ＣＬ−ＶＨ）に置き換えらた。用語「異種」は、内在性配列とは異なる配列、即ち、元々このゲノム位置に存在していた配列を意味する。
【０１３５】
また、Ｂリンパ球のゲノムが、修飾された免疫グロブリン鎖を発現するように編集され、内在性定常ドメインが目的の（ポリ）ペプチドによって置き換えられていることも好ましい。したがって、Ｂリンパ球のゲノムが、修飾されたＢ細胞受容体を発現するように編集され、内在性定常ドメインが目的の（ポリ）ペプチドによって置き換えられることも好ましい。したがって、Ｂリンパ球のゲノムは、内在性定常ドメインに「代えて」目的の（ポリ）ペプチドを含む修飾抗体を発現するように編集されることが好ましい。したがって、そのような修飾免疫グロブリン鎖は、（内在性）可変ドメイン、目的の（ポリ）ペプチドを含むが、（内在性）定常ドメインは含まない。
【０１３６】
目的の（ポリ）ペプチドが内在性可変ドメインと置き換わる修飾は、内在性ＶＤＪエキソンと目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に、Ｔ２Ａ切断部位などの切断部位をコードするヌクレオチド配列を導入することによって達成することができる。目的の（ポリ）ペプチドが内在性定常ドメインと置き換わる修飾は、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列と定常領域をコードするヌクレオチド配列との間に、Ｔ２Ａ切断部位などの切断部位をコードするヌクレオチド配列との間に導入することによって達成することができる。
【０１３７】
したがって、ＤＮＡ分子は、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流及び／又は下流の切断部位をコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましい。好ましくは、切断部位はＴ２Ａ切断部位である。
【０１３８】
本明細書で使用される用語「切断部位」は、酵素的切断（例えば、プロテアーゼによる切断）及び「自己切断」、例えば、リボソームスキッピングによるものも含む。酵素的切断の部位は当技術分野で知られている。好ましい例としては、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）３Ｃプロテアーゼ用の３Ｃ（「ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ」）切断タグ（配列：ＬＥＶＬＦＱＧＰ；配列番号５４）；エンテロキナーゼのＥＫＴ（エンテロキナーゼ）切断タグ（配列：ＤＤＤＤＫ；配列番号５５）；Ｘａ因子のＦＸａ（Ｘａ因子）切断タグ（配列：ＩＥＧＲ；配列番号５６）；タバコエッチウイルスプロテアーゼのＴＥＶ（タバコエッチウイルス）切断タグ（配列：ＥＮＬＹＦＱＧ；配列番号５７）；及びトロンビン用トロンビン切断タグ（配列：ＬＶＰＲＧＳ；配列番号５８）が挙げられる。一般に、プロテアーゼ又はペプチダーゼによる切断部位は、翻訳後、修飾された免疫グロブリン遺伝子から翻訳されたタンパク質を切断することを可能にする。そのようなタンパク質切断によって、例えば、ペプチダーゼ又はプロテイナーゼによって、翻訳された遺伝子産物（一本鎖）に含まれる共有結合した免疫グロブリン成分が断片に処理され、それにより、前記した修飾された抗体又は抗体断片が達成される。
【０１３９】
更に、切断部位は、例えば、様々なバイオインフォマティクスツールによってインシリコで予測することができ、例えば、以下が挙げられる。
−ＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒ  （ＵＲＬ：  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅ＿ｃｕｔｔｅｒ／；  Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ  Ｅ．，  Ｈｏｏｇｌａｎｄ  Ｃ．，  Ｇａｔｔｉｋｅｒ  Ａ．，  Ｄｕｖａｕｄ  Ｓ．，  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｍ．Ｒ．，  Ａｐｐｅｌ  Ｒ．Ｄ．，  Ｂａｉｒｏｃｈ  Ａ．；
−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  Ｓｅｒｖｅｒ；（Ｉｎ）  Ｊｏｈｎ  Ｍ．  Ｗａｌｋｅｒ  （ｅｄ）：  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  （２００５））；
−ＰＲＯＳＰＥＲ  （ＵＲＬ：  ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｓｐｅｒ．ｅｒｃ．ｍｏｎａｓｈ．ｅｄｕ．ａｕ／ｗｅｂｓｅｒｖｅｒ．ｈｔｍｌ；  Ｓｏｎｇ  Ｊ，  Ｔａｎ  Ｈ，  Ｐｅｒｒｙ  ＡＪ，  Ａｋｕｔｓｕ  Ｔ，  Ｗｅｂｂ  ＧＩ，  Ｗｈｉｓｓｔｏｃｋ  ＪＣ  ａｎｄ  Ｐｉｋｅ  ＲＮ．  ＰＲＯＳＰＥＲ：  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｆｅａｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅｓ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，  ２０１２，  ７（１１）：  ｅ５０３００）；
−ＭＥＲＯＰＳ  （ＵＲＬ：  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｍｅｒｏｐｓ／；  Ｒａｗｌｉｎｇｓ，  Ｎ．Ｄ．，  Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ａ．Ｊ．，  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｐ．Ｄ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｘ．，  Ｂａｔｅｍａｎ，  Ａ．  ＆  Ｆｉｎｎ，  Ｒ．Ｄ．  （２０１８）  Ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ，  ｔｈｅｉｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ２０１７  ａｎｄ  ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＡＮＴＨＥＲ  ｄａｔａｂａｓｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４６，  Ｄ６２４−Ｄ６３２）；
−ＴｏｐＦＩＮＤ  （ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｐｓｅｒｖｅ．ｃｌｉｐ．ｕｂｃ．ｃａ／ｔｏｐｆｉｎｄ；  Ｎｉｋｏｌａｕｓ  Ｆｏｒｔｅｌｎｙ，  Ｓｈａｒｏｎ  Ｙａｎｇ，  Ｐａｕｌ  Ｐａｖｌｉｄｉｓ，  Ｐｈｉｌｉｐｐ  Ｆ．  Ｌａｎｇｅ＊，  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｍ．  Ｏｖｅｒａｌｌ＊，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４３  （Ｄ１），  Ｄ２９０−Ｄ２９７  （２０１４））；及び
−ＣｕｔＤＢ  （ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｃｕｔｄｂ．ｂｕｒｎｈａｍ．ｏｒｇ／；  Ｉｇａｒａｓｈｉ  Ｙ，  Ｅｒｏｓｈｋｉｎ  Ａ，  Ｇｒａｍａｔｉｋｏｖａ  Ｓ，  Ｇｒａｍａｔｉｋｏｆｆ  Ｋ，  Ｚｈａｎｇ  Ｙ，  Ｓｍｉｔｈ  ＪＷ，  Ｏｓｔｅｒｍａｎ  ＡＬ，  Ｇｏｄｚｉｋ  Ａ．  ＣｕｔＤＢ：  ａ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｖｅｎｔ  ｄａｔａｂａｓｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００７  Ｊａｎ；３５（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ５４６−９）。
【０１４０】
好ましくは、切断部位は、リボソームスキッピング部位などの「自己切断」部位（「自己プロセシング」部位とも呼ばれる）である。本明細書で使用される用語「自己切断」（「自己プロセシング」）は、例えば、リボソームスキッピングによる、プロテアーゼによらない「切断」に関する。好ましくは、自己プロセシング部位をコードするヌクレオチド配列は、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏをコードするヌクレオチド配列であり、Ｘは任意のアミノ酸であり得る（ＤＸ１ＥＸ２ＮＰＧＰ、ここで、Ｘ１はＶａｌ又はＩｌｅであり、Ｘ２は任意の（天然の）アミノ酸であり得る；配列番号５９）。リボソームスキッピングは、ｍＲＮＡ翻訳の過程で別々のエンティティの提供をもたらす。根底にあるメカニズムは、ｍＲＮＡ翻訳中の２種のアミノ酸、即ち、Ｇ（Ｇｌｙ）とＰ（Ｐｒｏ）間の共有結合の非形成に基づいている。したがって、ｍＲＮＡ翻訳は、Ｇｌｙ／Ｐｒｏ間の共有結合の非形成によって中断されず、ｍＲＮＡに対するリボソーム活性を停止させることなく進行する。特に、配列パターンＡｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ≠Ｐｒｏがペプチド配列中に生じる場合、リボソームはこれらのアミノ酸間にペプチド結合を形成しない。共有結合の非形成は、前記したアミノ酸の一続きのＣ末端Ｇｌｙ−Ｐｒｏ位置の間で生じる。好ましい自己プロセシング部位は、Ｔ２Ａ（配列：ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号６０）；Ｆ２Ａ（配列：ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号６１）；又はＰ２Ａ配列：ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号６２）；又は本明細書に記載されるそれらの配列変異体特に、配列番号６３（ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）又は配列番号６４（ＲＫＲＲＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）に係る配列変異体などの２Ａ部位である。
【０１４１】
最も好ましくは、ＤＮＡ分子は、Ｔ２Ａ部位（例えば、配列番号６０）をコードするヌクレオチド配列又は本明細書に記載されるその配列変異体を含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子は、染色体の全長ＤＮＡ鎖を含まない。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子はプロモーターを含む。より具体的には、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子は、転写ユニットを含むことができる。用語「転写ユニット」は、その転写に必要な配列と共に、単一のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの配列を意味する。典型的には、転写ユニットは、プロモーター、ＲＮＡコード配列、及びターミネーターを含む。プロモーター及びターミネーターの例としては、当技術分野でよく知られている。例えば、プロモーター及びターミネーターは、コードされた（ポリ）ペプチドに関して天然に存在する遺伝子と同一であることができる。いくつかの実施形態では、プロモーター（及び／又はターミネーター）は、異種である（コード化された（ポリ）ペプチドに関して；即ち、コードされた（ポリ）ペプチドの遺伝子には天然には存在しない）。特に、ＲＮＡコード配列（及びＤＮＡ分子内の対応するＤＮＡ配列）は、典型的には、例えば本明細書に記載されるように、目的の（ポリ）ペプチドをコードする。
【０１４４】
目的の（ポリ）ペプチド
目的の（ポリ）ペプチドは、異種である（即ち、天然にはＢリンパ球によって発現されない）及び／又は異種である（即ち、天然にはＢリンパ球によって発現されない；修飾抗体など）ポリペプチド（又はタンパク質）に含まれ得る。
【０１４５】
前記したように、目的の（ポリ）ペプチドは、特に、カスタマイズされた抗体又は抗体断片（の一部）として発現されることが想定される任意の（ポリ）ペプチドであることができる。特に、目的の（ポリ）ペプチドは、１つ（単一）又はそれ以上の機能的ドメインを含む又はからなる。一般に、用語「機能的ドメイン」は、例えば、抗体又は抗体断片の機能的ユニットを意味する。通常、機能的ドメインはタンパク質、例えば、抗体又は抗体断片に（追加の）機能性をもたらす。したがって、（追加の）機能的ドメインは、通常、（追加の）機能を提供するために必要な全てのアミノ酸／配列を含む。
【０１４６】
好ましくは、（目的の（ポリ）ペプチドに含まれる）機能的ドメインは、最大１０００アミノ酸、より好ましくは最大７５０アミノ酸、更により好ましくは最大５００アミノ酸、更により好ましくは最大４００アミノ酸、特に好ましくは最大３００アミノ酸、最も好ましくは最大２７５又は２５０アミノ酸の長さを有する。更に、機能的ドメインは、５〜１０００アミノ酸、より好ましくは１０〜７５０アミノ酸、更により好ましくは２０〜５００アミノ酸、更により好ましくは５０〜４００アミノ酸、特に好ましくは７０〜３００アミノ酸、最も好ましくは７５〜２７５又は１００〜２５０アミノ酸の長さを有することが好ましい。
【０１４７】
（目的の（ポリ）ペプチドに含まれる）機能的ドメインは、また、最大１５０ｋＤａ、より好ましくは最大１００ｋＤａ、更により好ましくは最大８０ｋＤａ、更により好ましくは最大７０ｋＤａ、特に好ましくは最大５０ｋＤａ、最も好ましくは最大３０又は２５ｋＤａのサイズを有することが好ましい。更に、機能的ドメインは、０．５ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、より好ましくは１ｋＤａ〜１００ｋＤａ、更により好ましくは２．５ｋＤａ〜８０ｋＤａ、更により好ましくは５ｋＤａ〜７０ｋＤａ、特に好ましくは７．５ｋＤａ〜５０ｋＤａ、最も好ましくは１０ｋＤａ〜３０又は２５ｋＤａのサイズを有することが好ましい。
【０１４８】
目的の（ポリ）ペプチドは、単量体ドメイン又は多量体ドメインを含むことができる。単量体ドメインは、任意の更なる（追加の）ドメインの関与なしにその機能性を媒介するドメインである。多量体ドメイン、例えば、二量体を形成する２つのドメイン又は三量体を形成する３つのドメインは、特に多量体として、例えば、二量体又は三量体として、それらの機能性を共に媒介する。多量体ドメインの場合、目的の（ポリ）ペプチドは、多量体を形成するのに十分な柔軟性を提供するために本明細書に記載のリンカーを含むことができ、特にリンカーは、１以上の多量体ドメインに（直接）隣接して配置することができ、例えば、２つの多量体ドメイン間又は全ての多量体ドメインの両側に配置することができる。好ましくは、目的の（ポリ）ペプチドは、１以上の単量体ドメインを含む又はからなる。
【０１４９】
一般に、目的の（ポリ）ペプチドは、単一のタンパク質ドメイン又は１超のタンパク質ドメインを含む又はからなることができる。「１超のタンパク質ドメイン」は、前記したような多量体ドメイン及び／又は前記したような１以上の単量体ドメインであることができる。例えば、目的の（ポリ）ペプチドは、同一又は異なるの機能を媒介し得る及び／又は任意にリンカーによって接続され得る２つ又は３つの単量体ドメインを含む又はからなることができる。例えば、目的の（ポリ）ペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の（異なる）タンパク質ドメインを含むことができる。
【０１５０】
好ましくは、目的の（ポリ）ペプチド（より好ましくは、目的の完全な（ポリ）ペプチド）に含まれる機能的ドメインは、ヒトタンパク質、ペプチド、若しくはポリペプチド、又はそれらの断片（特に、ドメイン）若しくは誘導体である。
【０１５１】
目的の（ポリ）ペプチドはまた、リンカー、例えば、ＧＳリンカーを含むことができる。
【０１５２】
（目的の（ポリ）ペプチドに含まれる）好ましい機能的ドメインは、Ｉｇ様ドメイン、例えば、以下に例示するようなタンパク質又は（ポリ）ペプチドのＩｇ様ドメインを含む又はからなる。免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の基本構造は、ジスルフィド結合で結合された２つの軽鎖と２つの重鎖の四量体である。軽鎖には、カッパとラムダの２種類があり、それぞれ定常ドメイン（ＣＬ）と可変ドメイン（ＶＬ）で構成される。重鎖には、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューの５種類があり、いずれも可変ドメイン（ＶＨ）及び３種（アルファ、デルタ、及びガンマ）又は４種（イプシロン及びミュー）の定常ドメイン（ＣＨ１〜ＣＨ４）からなる。Ｉｇ分子は高度にモジュール化されたタンパク質であり、可変ドメインと定常ドメインは、明確な保存された配列パターンを有する。Ｉｇ及びＩｇ様分子におけるドメインは、Ｖセット（可変）、Ｃ１セット（定常１）、Ｃ２セット（定常２）、及びＩセット（中間）の４種に分類される。構造研究により、これらのドメインが、ベータシートにおけるストランドの数とその配列パターンが異なるタイプと、共通のコアのグリークキーベータサンドイッチ構造を共有することが示された。配列と構造の両方に関連する免疫グロブリン様ドメインは、いくつかの多様なタンパク質ファミリーに見られる。Ｉｇ様ドメインは、細胞間認識、細胞表面受容体、筋肉構造、免疫系など、様々な機能に関与する。
【０１５３】
Ｉｇ様ドメインの好ましい例としては、以下のタンパク質又は（ポリ）ペプチドのいずれかのＩｇ様ドメインが挙げられる：Ａ１ＢＧ（アルファ−１−β糖タンパク質）、ＡＣＡＭ、ＡＤＡＭＴＳＬ１（ＡＤＡＭＴＳ様１）、ＡＤＡＭＴＳＬ３（ＡＤＡＭＴＳ様３）、ＡＧＥＲ（終末糖化産物特異的受容体）、ＡＬＣＡＭ（活性化白血球細胞接着分子）、ＡＬＰＫ３（アルファキナーゼ３）、ＡＭＩＧＯ１（Ｉｇ様ドメイン１を有する接着分子）、ＡＭＩＧＯ２（Ｉｇ様ドメイン２を有する接着分子）、ＡＭＩＧＯ３（Ｉｇ様ドメイン３を有する接着分子）、ＡＸＬ（ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ）、ＢＣＡＭ（基底細胞接着分子（ルーテル式血液型））、ＢＯＣ（ＢＯＣ細胞接着関連、癌遺伝子調節）、ＢＳＧ（バシジン（Ｏｋ血液型）））、ＢＴＬＡ（Ｂ及びＴリンパ球関連）、Ｃ１０ｏｒｆ７２、Ｃ２０ｏｒｆ１０２、ＣＡＤＭ１（細胞接着分子１）、ＣＡＤＭ３（細胞接着分子３）、ＣＡＤＭ４（細胞接着分子４）、ＣＣＤＣ１４１（コイルドコイルドメイン含有１４１）、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ８０、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ９６、ＣＤ１０１、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２４４、ＣＤ２７６、ＣＤＯＮ（細胞接着関連、癌遺伝子調節）、ＣＥＡＣＡＭ１（癌胎児性抗原関連細胞接着分子１）、ＣＥＡＣＡＭ５（癌胎児性抗原関連細胞接着分子５）、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原関連細胞接着分子６）、ＣＥＡＣＡＭ７（癌胎児性抗原関連細胞接着分子７）、ＣＥＡＣＡＭ８（癌胎児性抗原関連細胞接着分子８）、ＣＥＡＣＡＭ１６（癌胎児性抗原関連細胞接着分子１６）、ＣＥＡＣＡＭ１８（癌胎児性抗原関連細胞接着分子１８）、ＣＥＡＣＡＭ２０（癌胎児性抗原関連細胞接着分子２０）、ＣＥＡＣＡＭ２１（癌胎児性抗原関連細胞接着分子２１）、ＣＨＬ１（細胞接着分子Ｌ１様）、ＣＩＬＰ（軟骨中間層タンパク質）、ＣＩＬＰ２（軟骨中間層タンパク質２）、ＣＬＭＰ（ＣＸＡＤＲ様膜タンパク質）、ＣＮＴＦＲ（繊毛神経栄養因子受容体）、ＣＮＴＮ１（コンタクチン１）、ＣＮＴＮ２（コンタクチン２）、ＣＮＴＮ３（コンタクチン３、ＣＮＴＮ４（コンタクチン４）、ＣＮＴＮ５（コンタクチン５）、ＣＮＴＮ６（コンタクチン６）、ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、ＣＸＡＤＲ（ＣＸＡＤＲ、Ｉｇ様細胞接着分子）、ＤＳＣＡＭ（ＤＳ細胞接着分子）、ＤＳＣＡＭＬ１（ＤＳ細胞接着分子様１）、ＥＭＢ（エンビジン）、ＥＳＡＭ（内皮細胞接着分子）、Ｆ１１Ｒ（Ｆ１１受容体）、ＦＡＩＭ３、ＦＣＭＲ（ＩｇＭ受容体のＦｃ断片）、ＨＭＣＮ１（ヘミセンチン１）、ＨＭＣＮ２（ヘミセンチン２）、ＦＣＡＲ（ＩｇＡ受容体のＦｃ断片）、ＦＣＥＲ１Ａ（ＩｇＥ受容体ＩａのＦｃ断片）、ＦＣＧＲ１Ａ（ＩｇＧ受容体ＩａのＦｃ断片）、ＦＣＧＲ１Ｂ（ＩｇＧ受容体ＩｂのＦｃ断片）、ＦＣＧＲ１ＣＰ（ＩｇＧ受容体ＩｃのＦｃ断片、偽遺伝子）、ＦＣＧＲ２Ａ（ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃ断片）、ＦＣＧＲ２Ｂ（ＩｇＧ受容体ＩＩｂのＦｃ断片）、ＦＣＧＲ２Ｃ（ＩｇＧ受容体ＩＩｃのＦｃ断片）、ＦＣＧＲ３Ａ（ＩｇＧ受容体ＩＩＩａのＦｃ断片）、ＦＣＧＲ３Ｂ（ＩｇＧ受容体ＩＩＩｂのＦｃ断片���、ＦＣＲＨ１、ＦＣＲＨ３、ＦＣＲＨ４、ＦＣＲＬ１（Ｆｃ受容体様１）、ＦＣＲＬ２（Ｆｃ受容体様２）、ＦＣＲＬ３（Ｆｃ受容体様３）、ＦＣＲＬ４（Ｆｃ受容体様４）、ＦＣＲＬ５（Ｆｃ受容体様５）、ＦＣＲＬ６（Ｆｃ受容体様６）、ＦＣＲＬＡ（Ｆｃ受容体様Ａ）、ＦＣＲＬＢ（Ｆｃ受容体様Ｂ）、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲＬ１、ＦＬＴ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）、ＦＬＴ３（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３）、ＦＬＴ４（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ４）、ＦＳＴＬ４（フォリスタチン様４）、ＦＳＴＬ５（フォリスタチン様５）、ＧＰ６（糖タンパク質ＶＩ血小板）、ＧＰＡ３３（糖タンパク質Ａ３３、ＧＰＲ１１６、ＧＰＲ１２５、ＡＤＧＲＦ５（接着Ｇタンパク質結合受容体Ｆ５）、ＡＤＧＲＡ２（接着Ｇタンパク質結合受容体Ａ２）、ｈＥＭＭＰＲＩＮ、ＨＥＰＡＣＡＭ（肝細胞及びグリア細胞接着分子）、ＨＥＰＡＣＡＭ２（ＨＥＰＡＣＡＭファミリーメンバー２）、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＱＢ、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＮＴ、ＨＳＰＧ２（ヘパラン硫酸プロテオグリカン２）、ＨＹＳＴ２４７７、ＩＣＡＭ１（細胞間接着分子１）、ＩＣＡＭ２（細胞間接着分子２）、ＩＣＡＭ３（細胞間接着分子３）、ＩＣＡＭ４（細胞間接着分子４（Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒ血液型））、ＩＣＡＭ５（細胞間接着分子５）、ＤＣＣ（ＤＣＣネトリン１受容体）、ＮＥＯ１（ネオゲニン１）、ＩＧＨＡ１、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＥ、ＩＧＤＣＣ４（免疫グロブリンスーパーファミリーＤＣＣサブクラスメンバー４）、ＩＧＬＯＮ５（ＩｇＬＯＮファミリーメンバー５）、ＩＧＳＦ１（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー１）、ＩＧＳＦ２（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２）、ＩＧＳＦ３（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３）、ＩＧＳＦ５（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー５）、ＩＧＳＦ９（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー９）、ＩＧＳＦ９Ｂ（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー９Ｂ）、ＩＧＳＦ１０（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー１０）、ＩＧＳＦ１１（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー１１）、ＩＧＳＦ２１（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２１）、ＩＧＳＦ２３（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２３）、ＩＬ１Ｒ１（インターロイキン１受容体１型）、ＩＬ１Ｒ２（インターロイキン１受容体２型）、ＩＬ１ＲＡＰ（インターロイキン１受容体アクセサリータンパク質）、ＩＬ１ＲＡＰＬ１（インターロイキン１受容体アクセサリータンパク質様１）、ＩＬ１ＲＡＰＬ２（インターロイキン１受容体アクセサリータンパク質様２）、ＩＬ１ＲＬ１（インターロイキン１受容体様１）、ＩＬ１ＲＬ２（インターロイキン１受容体様２）、ＩＬ６Ｒ（インターロイキン６受容体）、ＩＬ１１ＲＡ（インターロイキン１１受容体サブユニットアルファ）、ＩＬ１２Ｂ（インターロイキン１２Ｂ）、ＩＬ１８ＢＰ（インターロイキン１８結合タンパク質）、ＩＬ１８Ｒ１（インターロイキン１８受容体１）、ＩＬ１８ＲＡＰ（インターロイキン１８受容体アクセサリータンパク質）、ＩＳＬＲ２（ロイシンリッチリ���ート２を含む免疫グロブリンスーパーファミリー）、ＪＡＭ２（接合部接着分子２）、ＪＡＭ３（接合部接着分子３）、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）、ＫＩＲ−１２３ＦＭ、ＫＩＲ２ＤＬ１（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと長い細胞質テール１）、ＫＩＲ２ＤＬ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと長い細胞質テール２）、ＫＩＲ２ＤＬ３（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと長い細胞質テール３）、ＫＩＲ２ＤＬ４（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと長い細胞質テール４）、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと長い細胞質テール５Ａ）、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと長い細胞質テール５Ｂ）、ＫＩＲ２ＤＬＸ、ＫＩＲ２ＤＳ１（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと短い細胞質テール１）、ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと短い細胞質テール２）、ＫＩＲ２ＤＳ３（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと短い細胞質テール３）、ＫＩＲ２ＤＳ４（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと短い細胞質テール４）、ＫＩＲ２ＤＳ５（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと短い細胞質テール５）、ｋｉｒ３ｄ、ＫＩＲ３ＤＬ１（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメインと長い細胞質テール１）、ＫＩＲ３ＤＬ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメインと長い細胞質テール２）、ＫＩＲ３ＤＬ３（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメインと長い細胞質テール３）、ＫＩＲ３ＤＰ１（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメイン偽遺伝子１、ＫＩＲ３ＤＳ１（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメインと短い細胞質テール１）、ＫＩＲ３ＤＸ１（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメインＸ１）、ＫＩＲＲＥＬ１（ｋｉｒｒｅ様ネフリンファミリー接着分子１）、ＫＩＲＲＥＬ２（ｋｉｒｒｅ様ネフリンファミリー接着分子２）、ＫＩＲＲＥＬ３（ｋｉｒｒｅ様ネフリンファミリー接着分子３）、ＫＩＴ（ＫＩＴ癌原遺伝子受容体チロシンキナーゼ）、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＧ３（リンパ球活性化３）、ＬＡＩＲ１（白血球関連免疫グロブリン様受容体１）、ＬＡＩＲ２（白血球関連免疫グロブリン様受容体２）、ＬＥＰＲ（レプチン受容体）、ＬＩＬＲＡ１（白血球免疫グロブリン様受容体Ａ１）、ＬＩＬＲＡ２（白血球免疫グロブリン様受容体Ａ２）、ＬＩＲＬＡ３（白血球免疫グロブリン様受容体Ａ３、ＬＩＲＬＡ４（白血球免疫グロブリン様受容体Ａ４）、ＬＩＬＲＡ５（白血球免疫グロブリン様受容体Ａ５）、ＬＩＬＲＡ６（白血球免疫グロブリン様受容体Ａ６）、ＬＩＬＲＢ１（白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ１）、ＬＩＬＲＢ２（白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ２）、ＩＬＲＲＢ３（白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ３）、ＬＩＬＲＢ４（白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ４）、ＬＩＲＬＢ５（白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ５）、ＬＩＬＲＰ２、ＬＲＩＧ１、ＬＲＩＧ２、ＬＲ���Ｇ３、ＬＲＩＴ１、ＬＲＲＣ４、ＬＳＡＭＰ、ＬＳＲ（脂肪分解刺激リポタンパク質受容体）、ＬＹ９（リンパ球抗原９）、ＭＡＤＣＡＭ１（粘膜血管アドレッシン細胞接着分子１）、ＭＡＧ（ミエリン関連糖タンパク質）、ＭＡＬＴ１（ＭＡＬＴ１パラカスパーゼ）、ＭＣＡＭ（ミエローマ細胞接着分子）、ＭＤＧＡ１（グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー１を含むＭＡＭドメイン）、ＭＤＧＡ２（グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー２を含むＭＡＭドメイン）、ＭＥＲＴＫ（ＭＥＲ癌原遺伝子、チロシンキナーゼ）、ＭＦＡＰ３、ＭＩＲ、ＭＩＬＲ１（マスト細胞免疫グロブリン様受容体１）、ＭＭＰ２３Ａ（マトリクスメタロペプチダーゼ２３Ａ（偽遺伝子））、ＭＭＰ２３Ｂ（マトリクスメタロペプチダーゼ２３Ｂ）、ＭＵＳＫ（筋肉関連受容体チロシンキナーゼ）、ＭＸＲＡ５（マトリクスリモデリング関連５）、ＭＹＢＰＣ３、ＭＹＯＭ１（ミオメシン１）、ＭＹＯＭ２（ミオメシン２）、ＭＹＯＭ３（ミオメシン３）、ＮＣＡ、ＮＣＡＭ１、ＮＣＡＭ２、ＮＣＲ１（自然細胞傷害性トリガー受容体１）、ＮＥＧＲ１、ＮＥＯ１、ＮＦＡＳＣ、ＮＯＰＥ、ＮＰＨＳ１（ＮＰＨＳ１、ネフリン）、ＮＰＴＮ（ニューロプラスチン）、ＮＲＣＡＭ（神経細胞接着分子）、ＮＴＲＫ１（神経栄養性受容体チロシンキナーゼ１）、ＮＲＧ１、ＮＴ、ＮＴＲＫ３、ＯＢＳＣＮ、ＯＢＳＬ１（オブスキュリン様１）、ＯＰＣＭＬ、ＯＳＣＡＲ（破骨細胞関連、免疫グロブリン様受容体）、ＰＡＰＬＮ、ＰＤＣＤ１ＬＧ２（プログラム細胞死１リガンド２）、ＰＤＧＦＲＡ（血小板由来成長因子受容体アルファ）、ＰＤＧＦＲＢ（血小板由来成長因子受容体ベータ）、ＰＤＧＦＲＬ（血小板由来成長因子受容体様）、ＰＥＣＡＭ１（血小板及び内皮細胞接着分子１）、ＰＲＯＤＨ２、ＰＳＧ１（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質１）、ＰＳＧ２（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質２）、ＰＳＧ３（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質３）、ＰＳＧ４（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質４）、ＰＳＧ５（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質５）、ＰＳＧ６（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質６）、ＰＳＧ７（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質７（遺伝子／偽遺伝子））、ＰＳＧ８（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質８）、ＰＳＧ９（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質９）、ＰＳＧ１０（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質１０）、ＰＳＧ１１（妊娠特異的ベー
タ１糖タンパク質１１）、ＰＳＧ１１ｓ’（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質１１ｓ’）、ＰＴＧＦＲＮ（プロスタグランジンＦ２受容体阻害剤）、ＰＴＫ７（タンパク質チロシンキナーゼ７（不活性））、ＰＴＰＲＤ（タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体タイプＤ）、ＰＴＰＲＫ（タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体タイプＫ）、ＰＴＰＲＭ（タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体タイプＭ）、ＰＴＰＲＳタンパク質チロシンホスファターゼ、受容体タイプＳ）、ＰＴＰＲＴ（タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体タイプＴ）、ＰＴＰシグマ、ＰＵＮＣ、ＰＶＲ（ポリオウイルス受容体）、ＰＶＲＬ１、ＰＶＲＬ２、ＰＶＲＬ４、ＮＥＣＴＩＮ１（ネクチン細胞接着分子１）、ＮＥＣＴＩＮ２（ネクチン細胞接着分子２）、ＮＥＣＴＩＮ３（ネクチン細胞接着分子３）、ＲＡＧＥ、ＲＯＢＯ３（ラウンドアバウト誘導受容体３）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウム電圧ゲートチャネルベータサブユニット１）、ＳＤＫ１（サイドキック細胞接着分子１）、ＳＤＫ２（サイドキック細胞接着分子２）、ＳＥＭＡ３Ａ（セマフォリン３Ａ）、ＳＥＭＡ３Ｂ（セマフォリン３Ｂ）、ＳＥＭＡ３Ｅ（セマフォリン３Ｅ）、ＳＥＭＡ３Ｆ（セマフォリン３Ｆ）、ＳＥＭＡ３Ｇ（セマフォリン３Ｇ）、ＳＥＭＡ４Ｃ（セマフォリン４Ｃ）、ＳＥＭＡ４Ｄ（セマフォリン４Ｄ）、ＳＥＭＡ４Ｇ（セマフォリン４Ｇ）、ＳＥＭＡ７Ａ  ８セマフォリン７Ａ（ジョンミルトンハーゲン血液型））、ＳＩＧＩＲＲ（単一ＩｇとＴＩＲドメイン含有）、ＳＩＧＬＥＣ１（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１）、ＳＩＧＬＥＣ５（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン５）、ＳＩＧＬＥＣ６（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン６）、ＳＩＧＬＥＣ７（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン７）、ＳＩＧＬＥＣ８（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン８）、ＳＩＧＬＥＣ９（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン９）、ＳＩＧＬＥＣ１０（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１０）、ＳＩＧＬＥＣ１１（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１１）、ＳＩＧＬＥＣ１２（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１２）（遺伝子／偽遺伝子））、ＳＩＧＬＥＣ１４（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１４）、ＳＩＧＬＥＣ１５（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１５）、ＳＬＡＭＦ１（シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーメンバー１）、ＳＬＡＭＦ６（ＳＬＡＭファミリーメンバー６）、ＳＬＡＭＦ８（ＳＬＡＭファミリーメンバー８）、ＳＩＲＰＧ；ＴＡＲＭ１（Ｔ細胞相互作用骨髄細胞活性化受容体１）、ＴＥＫ（ＴＥＫ受容体チロシンキナーゼ）、ＴＨＹ１  Ｔｈｙ−１細胞表面抗原）、ＴＩＥ１（免疫グロブリン様及びＥＧＦ様ドメイン１を有するチロシンキナーゼ）、ＴＭＥＭ８１（膜貫通タンパク質８１）、ＴＭＩＧＤ１（膜貫通及び免疫グロブリンドメイン含有１）、ＴＭＩＧＤ２（膜貫通及び免疫グロブリンドメイン含有２）、ＴＴＮ（チチン）、ＴＹＲＯ３（ＴＹＲＯ３タンパク質チロシンキナーゼ）、ＵＮＣ５Ｄ、ＶＣＡＭ１（血管細胞接着分子１）、ＶＳＩＧ１（Ｖセット及び免疫グロブリンドメイン含有１）、ＶＳＩＧ２（Ｖセット及び免疫グロブリンドメイン含有２）、ＶＳＩＧ４（Ｖセット及び免疫グロブリンドメイン含有４）、ＶＳＩＧ１０（Ｖセット及び免疫グロブリンドメ��ン含有１０）、ＶＳＩＧ１０Ｌ（Ｖセット及び免疫グロブリンドメイン含有１０様）、ＶＳＴＭ１（Ｖセット及び膜貫通ドメイン含有１）、ＶＴＣＮ１（Ｖセットドメイン含有Ｔ細胞活性化阻害剤１）、ＺＰＢＰ（透明帯結合タンパク質）、又はＺＰＢＰ２（透明帯結合タンパク質２）。
【０１５４】
より好ましくは、Ｉｇ様ドメインは、以下のタンパク質：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ８０、ＣＤ８６のいずれか、特にＣＤ４のＩｇ様ドメインである。
【０１５５】
更に、目的の（ポリ）ペプチドは、また、１以上の可変ドメイン（例えば、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ））及び／又は１以上の定常ドメイン（例えば、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）又は１以上（２つ又は３つ）の重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３））などの１以上の抗体ドメインを含む又はからなることが好ましい。例えば、目的の（ポリ）ペプチドは、（異種）ＶＨドメインを含む又はからなる。別の例では、目的の（ポリ）ペプチドは、（異種）ＶＨ及び（異種）ＶＬドメインを含む又はからなる。別の例では、目的の（ポリ）ペプチドは、２つの（異種）ＶＨ及び（異種）ＶＬドメイン（例えば、ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ）を含む又はからなる。別の例では、目的の（ポリ）ペプチドは、（異種）ＶＨドメイン、（異種）ＣＬドメイン、及び（異種）ＶＬドメイン（例えば、ＶＬ−ＣＬ−ＶＨ）を含む又はからなる。抗体ドメインは、また、受容体ドメイン（例えば、受容体ドメイン及びＶＨドメイン）などの本明細書に記載の別の機能的ドメインと組み合わせ得ることも好ましい。
【０１５６】
Ｉｇ様ドメインの更に好ましい例について、本明細書中、以下に記載する。
【０１５７】
（目的の（ポリ）ペプチドに含まれる）別の好ましい機能的ドメインは、（既知の）タンパク質の細胞外及び／又は細胞内ドメインを含む又はからなる。更に、機能的ドメインは、好ましくは、（既知の）可溶性球状タンパク質のドメインを含む又はからなり得る。より好ましくは、機能的ドメインは、（既知の）タンパク質の細胞外ドメイン又は（既知の）可溶性球状タンパク質のドメインを含む又はからなる。
【０１５８】
好ましくは、（目的の（ポリ）ペプチドに含まれる）機能的ドメインは、キャリアドメイン、レポータードメイン、タグ、局在化ドメイン、（独立した）結合部位、酵素又は酵素ドメイン、受容体又はその機能的断片、又はリガンド又はその機能的断片を含む又はからなる。
【０１５９】
好ましくは、（目的の（ポリ）ペプチドに含まれる）機能的ドメインは、酵素又はその酵素ドメインを含む又はからなる。「酵素」は、ポリペプチド又はタンパク質の触媒であり、即ち、酵素は典型的には化学反応を加速させる。酵素が作用し得る分子は基質と呼ばれ、酵素は基質を生成物として知られる異なる分子に変換する。細胞内のほぼ全ての代謝プロセスは、生命を維持するのに十分に早い速度で行われるために酵素を必要とする。好ましい酵素としては、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、溶解酵素、イソメラーゼ、及びリガーゼが挙げられる。二量体を形成する酵素の場合、目的の（ポリ）ペプチドは、リンカーによって接続された２つの同一のドメインを含むことができる。例えば、酵素は、特定部位、例えば腫瘍でプロドラッグを活性化させるのに有用であることができる。好ましい酵素の例及びそのような酵素を含む抗体の使用は、Ａｎｄｒａｄｙ  Ｃ，  Ｓｈａｒｍａ  ＳＫ，  Ｃｈｅｓｔｅｒ  ＫＡ；  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｅｎｚｙｍｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ；  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  ２０１１  Ｆｅｂ；３（２）：１９３−２１１  ａｎｄ  ｉｎ  Ｂｏａｄｏ  ＲＪ１，  Ｚｈａｎｇ  Ｙ，  Ｚｈａｎｇ  Ｙ，  Ｘｉａ  ＣＦ，  Ｗａｎｇ  Ｙ，  Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ＷＭ；  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ；  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００８  Ｆｅｂ  １；９９（２）：４７５−８４に記載される。
【０１６０】
好ましい酵素は、デヒドロゲナーゼ、ルシフェラーゼ、ＤＭＳＯレダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、アミノプロパノールオキシドレダクターゼ、ジアセチルレダクターゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、プロパンジオール−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋）、Ｄ−キシルロースレダクターゼ、Ｌ−キシルロースレダクターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、グルコースオキシダーゼ、Ｌ−グロノラクトンオキシダーゼ、チアミンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、ビリベルジンレダクターゼ、モノアミンオキシダーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、サルコシンオキシダーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、尿酸オキシダーゼ、亜硫酸レダクターゼ、亜硫酸レダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ、チオレドキシンレダクターゼ、亜硫酸酸化酵素、シトクロムｃオキシダーゼ、コエンザイムＱシトクロムｃレダクターゼ、カテコールオキシダーゼ、ラッカーゼ、シトクロムｃペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、レニラルシフェリン−２−モノオキシゲナーゼ、ウミホタルルシフェリン−２−モノオキシゲナーゼ、ホタルルシフェラーゼ、ホタルイカルシフェリン−２−モノオキシゲナーゼ、発光エビルシフェリン−２−モノオキシゲナーゼ、アロマターゼ、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ、一酸化窒素ジオキシゲナーゼ、一酸化窒素シンターゼ、アロマターゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、チロシナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、セルロプラスミン、ニトロゲナーゼ、デヨージナーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ＡＴＣａｓｅ、オルニチントランスカルバモイラーゼ、アミノレブリン酸シンターゼ、コリンアセチルトランスフェラーゼ、第ＸＩＩＩ因子、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、チアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、酪酸キナーゼ、ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、酸ヒドロラーゼ、ホスホリパーゼＡ、ホスホリパーゼＣ、アセチルコリンエステラーゼ、コリンエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１、ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、フルクトースビスホスファターゼ、ＣＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼタイプ５、ホスホリパーゼＤ、制限酵素タイプ１、制限酵素タイプ２、制限酵素タイプ３、制限酵素タイプ４、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、リボヌクレアーゼ、アミラーゼ、スクラーゼ、キチナーゼ、リゾチーム、マルターゼ、ラクターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、アデノシルメチオニンヒドロラーゼ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ、アルケニルグリセロホスホコリンヒドロラーゼ、アルケニルグリセロホスホエタノールアミンヒドロラーゼ、コレステロール−５，６−オキシドヒドロラーゼ、ヘポキシリン−エポキシドヒドロラーゼ、イソコリスマターゼ、ロイコトリエン−Ａ４ヒドロラーゼ、リモネン−１，２−エポキシドヒドロラーゼ、ミクロソームエポキシドヒドロラーゼ、トランスエポキシコハク酸ヒドロラーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、アンギオテンシン変換酵素、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン、トリプシン、トロンビン、第Ｘ因子、プラスミン、アクロシン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、プロリルオリゴペプチダーゼ、第ＸＩ因子、エラスターゼ、第ＸＩＩ因子、プロテイナーゼＫ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プロテインＣ、セパラーゼ、ペプシン、レンネット、レニン、トリプシノーゲン、プラスメプシン、マトリクスメタロプロテイナーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、ウレアーゼ、ベータラクタマーゼ、アルギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ、ニトリラーゼ、ヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＲｅｃＱヘリカーゼ、ＡＴＰアーゼ、ＮａＫＡＴＰアーゼ、ＡＴＰシンターゼ、キヌレニナーゼ、ハロ酢酸デハロゲナーゼ、リアーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、ウリジン一リン酸シンテターゼ、芳香族−Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ、ルビスコ、炭酸脱水酵素、トリプトファンシンターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、シスタチオニンガンマリアーゼ、シスタチオニンベータリアーゼ、ロイコトリエンＣ４シンターゼ、ジクロロメタンデヒロゲナーゼ、ハロヒドリンデハロゲナーゼ、アデニル酸シクラーゼ、グアニル酸シクラーゼ、アミノ酸ラセマーゼ：フェニルラニンラセマーゼ、セリンラセマーゼ、マンデル酸ラセマーゼ、ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、ＦＫＢＰ：ＦＫＢＰ１Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＦＫＢＰ２、ＦＫＢＰ３、ＦＫＢＰ５、ＦＫＢＰ６、ＦＫＢＰ８、ＦＫＢＰ９、ＦＫＢＰ１０、ＦＫＢＰ５２、ＦＫＢＰＬ、シクロフィリン、パルブリン、プロリルイソメラーゼ、２−クロロ−４−カルボキシメチレンブト−２−エン−１，４−オリドイソメラーゼ、ベータカロテンイソメラーゼ、ファルネソール２−イソメラーゼ、フリルフラミドイソメラーゼ、リノール酸イソメラーゼ、マレイン酸イソメラーゼ、マレイルアセト酢酸イソメラーゼ、マレイルピルビン酸イソメラーゼ、パルブリン、フォトイソメラーゼ、プロリコペンイソメラーゼ、プロリルイソメラーゼ、レチナールイソメラーゼ、レチノールイソメラーゼ、ゼータカロテンイソメラーゼ、エノイルＣｏＡイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ムコン酸シクロイソメラーゼ、３−カルボキシ−シス，シス−ムコン酸シクロイソメラーゼ、テトラヒドロキシプテリ���ンシクロイソメラーゼ、イノシトール−３−リン酸シンターゼ、カルボキシ−シス，シス−ムコン酸シクラーゼ、カルコンイソメラーゼ、クロロムコン酸シクロイソメラーゼ、（＋）−ボルニル二リン酸シンターゼ、シクロユーカレノールシクロイソメラーゼ、アルファピネンオキシドデシクラーゼ、ジクロロムコン酸シクロイソメラーゼ、コパリル二リン酸シンターゼ、Ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼ、Ｓｙｎ−コパリル二リン酸シンターゼ、テルペンテジエニル二リン酸シンターゼ、ハリマジエニル二リン酸シンターゼ（Ｈａｌｉｍａｄｉｅｎｙｌ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、（Ｓ）−ベータ−マクロカルペンシンターゼ、リコペンイプシロン−シクラーゼ、リコペンベータ−シクラーゼ、プロソラナピロン−ＩＩＩシクロイソメラーゼ、Ｄ−リボースピラナーゼ、ステロイドデルタイソメラーゼ、トポイソメラーゼ、６−カルボキシテトラヒドロプテリンシンターゼ、ＦＡＲＳＢ、グルタミンシンテターゼ、ＣＴＰシンターゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、及びＤＮＡリガーゼからなる群から選択される。
【０１６１】
より好ましい酵素は、カルボキシペプチダーゼ、β−ラクタマーゼ、シトシンデアミナーゼ、β−グルクロニダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、グランザイムＢ、カスパーゼ、及びＲＮａｓｅ、例えばＨＰＲ（ヒト膵臓ＲＮａｓｅ、バルナーゼ、ウシ精液ＲＮａｓｅ、オンコナーゼ、ＲａｐＬＲ１、アンギオゲニン、ダイサー、ＤＩＳ３様エキソヌクレアーゼ２、ホスホジエステラーゼＥＬＡＣ  ２、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ｔ２、及びｔＲＮＡスプライシングリボヌクレアーゼからなる群から選択することができる。
【０１６２】
酵素の機能的断片は、機能を媒介する能力を有する酵素の任意の断片であることができる。通常、このような断片は「ドメイン」と呼ばれる。したがって、酵素の機能的断片は、酵素の任意のドメインであることができる。好ましい例としては、前記の（例示された）酵素の機能的断片（例えば、ドメイン）が挙げられる。好ましくは、機能的ドメインに含まれる酵素の機能的断片が酵素の触媒ドメインである。酵素の触媒ドメインは、その基質と相互作用して酵素反応を引き起こす酵素の領域である。例えば、機能的ドメインは、以下の酵素のいずれかの触媒ドメインであることができる：カルボキシペプチダーゼ、β−ラクタマーゼ、シトシンデアミナーゼ、β−グルクロニダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、グランザイムＢ、カスパーゼ、及びＨＰＲ（ヒト膵臓ＲＮａｓｅ、バルナーゼ、ウシ精液ＲＮａｓｅ、オンコナーゼ、ＲａｐＬＲ１、アンギオゲニン、ダイサー、ＤＩＳ３様エキソヌクレアーゼ２、ホスホジエステラーゼＥＬＡＣ  ２、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ｔ２、及びｔＲＮＡスプライシングリボヌクレアーゼ。
【０１６３】
好ましくは、（目的の（ポリ）ペプチドに含まれる）機能的ドメインは、キャリアドメインを含む又はからなる。本明細書で使用するとき、「キャリアドメイン」は、抗体の別分子へのコンジュゲーションを提供するアミノ酸配列を意味する。好ましい例において、キャリアドメインは、抗体又はその抗原結合断片の、例えば薬剤、造影剤、又はナノ粒子へのコンジュゲーションを提供する。一般に、本発明の文脈において有用であり得るコンジュゲートの好ましい例は、Ｗｕ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｓｅｎｔｅｒ，  Ｐ．  Ｄ．  （２００５）  Ａｒｍｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３，  １１３７−１１４６に記載される。
【０１６４】
例えば、抗体にコンジュゲートすることができる薬剤としては、Ｔｈｏｍａｓ  Ａ，  Ｔｅｉｃｈｅｒ  ＢＡ，  Ｈａｓｓａｎ  Ｒ；  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ；  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１６  Ｊｕｎ；１７（６）：ｅ２５４−６２．  ｄｏｉ：  １０．１０１６／Ｓ１４７０−２０４５（１６）３００３０−４に記載されるものなどの抗癌剤が挙げられる。例えば、抗体にコンジュゲートすることができる造影剤は、Ｓｔｅｖｅ  Ｋｎｕｔｓｏｎ，  Ｅｒｕｍ  Ｒａｊａ，  Ｒｙａｎ  Ｂｏｍｇａｒｄｅｎ，  Ｍａｒｉｅ  Ｎｌｅｎｄ，  Ａｏｓｈｕａｎｇ  Ｃｈｅｎ，  Ｒａｍａｓｗａｍｙ  Ｋａｌｙａｎａｓｕｎｄａｒａｍ，  ａｎｄ  Ｓｕｒｂｈｉ  Ｄｅｓａｉ；  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ；  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１６；  １１（６）：  ｅ０１５７７６２に記載される。そのような薬剤は、好ましくは細胞毒性剤である。本発明の抗体又は抗原結合断片にコンジュゲートすることができる薬剤の好ましい例としては、ドキソルビシン、トランケートされたシュードモナス外毒素Ａ、マイタンシノイドＤＭ１が挙げられる。
【０１６５】
本発明の抗体又は抗原結合断片にコンジュゲートすることができる造影剤の例としては、Ｓｃｈｕｂｅｒｔ  Ｍ，  Ｂｅｒｇｍａｎｎ  Ｒ，  Ｆｏｅｒｓｔｅｒ  Ｃ，  Ｓｉｈｖｅｒ  Ｗ，  Ｖｏｎｈｏｆｆ  Ｓ，  Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ  Ｓ，  Ｂｅｔｈｇｅ  Ｌ，  Ｗａｌｔｈｅｒ  Ｍ，  Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ  Ｊ，  Ｐｉｅｔｚｓｃｈ  Ｊ，  Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ  Ｊ，  Ｐｉｅｔｚｓｃｈ  ＨＪ；  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｌ−Ｃｏｎｆｉｇｕｒｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ；  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  ２０１７  Ａｐｒ  １９；２８（４）：１１７６−１１８８  ａｎｄ  ｉｎ  Ｂｈｕｓａｒｉ  Ｐ，  Ｖａｔｓａ  Ｒ，  Ｓｉｎｇｈ  Ｇ，  Ｐａｒｍａｒ  Ｍ，  Ｂａｌ  Ａ，  Ｄｈａｗａｎ  ＤＫ，  Ｍｉｔｔａｌ  ＢＲ，  Ｓｈｕｋｌａ  Ｊ；  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌｕ−１７７−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｆｏｒ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ＨＥＲ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ；  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０１７  Ｆｅｂ  １５；１４０（４）：９３８−９４７に記載されるものなどの放射性同位体が挙げられる。放射性同位体の好ましい例としては、９０Ｙ、１３１Ｉ、及び１７７Ｌｕが挙げられる。
【０１６６】
本発明の抗体又は抗原結合断片にコンジュゲートすることができる造影剤の更なる例としては、蛍光色素、量子ドット、及び酸化鉄が挙げられる。蛍光色素の例としては、レポータードメインとして以下に記載されるものが挙げられる。酸化鉄ナノ粒子の例は、Ｈｅｎｇｙｉ  Ｘｕ，  Ｚｏｒａｉｄａ  Ｐ．  Ａｇｕｉｌａｒ，  Ｌｉｌｙ  Ｙａｎｇ，  Ｍｉｎ  Ｋｕａｎｇ，  Ｈｏｎｇｗｅｉ  Ｄｕａｎ，  Ｙｏｎｇｈｕａ  Ｘｉｏｎｇ，  Ｈｕａ  Ｗｅｉ，  ａｎｄ  Ａｎｄｒｅｗ  Ｗａｎｇ：  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｉｒｏｎ  Ｏｘｉｄｅ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｆｒｅｓｈ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１１  Ｄｅｃ；  ３２（３６）：  ９７５８−９７６５に記載される。
【０１６７】
抗体コンジュゲート（即ち、他の分子にコンジュゲートされた抗体）は、当技術分野で知られている。特に、抗体にコンジュゲートされた分子は、切断可能又は非切断可能なリンカーによって抗体に連結することができる（例えば、Ｔｈｏｍａｓ  Ｈ．  Ｐｉｌｌｏｗ．  Ｎｏｖｅｌ  ｌｉｎｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｔ  Ｖｏｌ．  ６，  Ｎｏ．  １，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ３ｒｄ，  ２０１７，  ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４１５５／ｐｐａ−２０１６−００３２；  ｏｒ  ｉｎ：  Ｂｅｃｋ  Ａ，  Ｇｏｅｔｓｃｈ  Ｌ，  Ｄｕｍｏｎｔｅｔ  Ｃ，  Ｃｏｒｖａｉａ  Ｎ．  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１７  Ｍａｙ；１６（５）：３１５−３３７に記載）。分子を抗体又は抗原結合断片に連結するために使用することができるそのようなリンカーの例は、例えば、ＥＰ２９２７２２７、及びＴｈｏｍａｓ  Ｈ．  Ｐｉｌｌｏｗ．  Ｎｏｖｅｌ  ｌｉｎｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｔ  Ｖｏｌ．  ６，  Ｎｏ．  １，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ３ｒｄ，  ２０１７，  ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４１５５／ｐｐａ−２０１６−００３２に記載される。しかし、先行技術では、リンカーは、抗体のＩｇドメイン（即ち、抗体の可変及び／又は定常ドメイン）に直接結合し、これは抗体のＩｇドメインの機能を妨害する可能性がある。それを考慮して、機能的ドメインは、リンカーの抗体への付着に使用することができる。好ましいリンカーは、追加のシステイン又はリジンを含むようにエンジニアードされているという点で、「古典的な」リンカーとは異なる。好ましくは、キャリアドメインは、例えば、Ｌｉｎｋ  ＡＪ，  Ｍｏｃｋ  ＭＬ，  Ｔｉｒｒｅｌｌ  ＤＡ．  Ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００３  Ｄｅｃ；１４（６）：６０３−９に記載されているように、部位特異的コンジュゲーションに有用な１つ以上の非標準アミノ酸（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）を含む。更に、キャリアドメインは、Ｄｅｎｎｌｅｒ  Ｐ．，  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｅ．，  Ｓｃｈｉｂｌｉ  Ｒ．  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：  Ｆｒｏｍ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｒｅａｇｅｎｔｓ．  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  ２０１５；４：１９７−２２４のセクション６に記載されるように、後にコンジュゲーションに使用され得る特定のアミノ酸を修飾する特定の酵素（例えば、ホルミルグリシン生成酵素、ソルターゼ、及び／又はトランスグルタミナーゼ）によって認識されるように設計することができる。
【０１６８】
更なる好ましいキャリアドメインは、例えば、Ｐｉｃｈｉｃｈｅｒｏ  ＭＥ：  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ，  Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２０１３  Ｄｅｃ；９（１２）：２５０５−２３に記載されるような、ジフテリア毒素、破傷風トキソイド（Ｔ）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、ジフテリアトキソイド（Ｄ）、及びインフルエンザタンパク質Ｄ（ＨｉＤ）の遺伝子組換え交差反応物質（ＣＲＭ）などの、コンジュゲーション用ドメインである。
【０１６９】
好ましくは、（目的の（ポリ）ペプチドに含まれる）機能的ドメインは、レポータードメインを含む又はからなる。レポータードメインは通常、レポーター遺伝子によってコードされる。レポータードメインは、（例えば、細胞、生物内において）その存在が容易に観察できるドメインである。レポータードメインは、例えば、ＧＦＰ／ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質／強化緑色蛍光タンパク質）、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（ｔｄＴｏｍａｔｏ又はＤｓＲｅｄなどの赤色蛍光タンパク質）、及びＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ルシフェラーゼなどの蛍光タンパク質、並びにベータガラクトシダーゼ及びペルオキシダーゼなどの酵素を含む。レポータードメインは、インビボ及びエクスビボアプローチに有用であり得る。例えば、蛍光タンパク質は、特定の波長の光で励起されると細胞に蛍光を発せさせ、ルシフェラーゼは、細胞に発光反応を触媒させ、ベータ−ガラクトシダーゼなどの酵素は、基質を着色産物に変換する。特定のレポーター及び望まれる特性データに応じて、レポーターを測定又は定量するいくつかの異なる方法がある。一般に、顕微鏡検査は、特に単一細胞レベルでのレポーター活性に関する空間的及び時間的情報の取得に有用である。フローサイトメーターは、大規模な細胞集団に亘るレポーター活性の分布を測定するのに最適である。プレートリーダーは、一般に、多くの異なるサンプルの経時的な集団平均測定に最適である。所定の基質と反応することができるベータガラクトシダーゼ及びペルオキシダーゼなどの酵素は、例えば腫瘍診断における、ヒトサンプルのエクスビボ染色に有用であり得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、目的の（ポリ）ペプチドは、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）又はＲＦＰ（ｔｄＴｏｍａｔｏ又はＤｓＲｅｄなどの赤色蛍光タンパク質）を含まない。より一般的には、いくつかの実施形態では、目的の（ポリ）ペプチドは、蛍光（レポーター）タンパク質を含まない。したがって、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子は、ＧＦＰ又はＲＦＰ（又は、より一般的には、蛍光（レポーター）タンパク質）をコードするヌクレオチド配列を含まない。
【０１７０】
好ましくは、レポータードメインは、ＧＦＰ／ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はペルオキシダーゼをコードするアミノ酸配列を含む又はからなる。更に、以下に記載する蛍光タグは、レポータードメインとしても有用である。
【０１７１】
好ましくは、（目的の（ポリ）ペプチドに含まれる）機能的ドメインは、局在化ドメインを含む又はからなる。一般に、局在化ドメインは、例えば生物又は細胞のレベルで、タンパク質を特定の標的に向ける。局在化ドメインは、本発明に係る抗体又は抗原結合断片を、細胞の特定の物理的位置、例えば核、膜、ペリプラズム、細胞外への分泌、身体の特定の部分又は他の箇所に向けることができる。
【０１７２】
例えば、本発明に係る抗体又は抗原結合断片を細胞内に向けるために、機能的ドメインは、細胞透過性ペプチドを含む又はからなることができる。「細胞透過性ペプチド」（「ＣＰＰ」、「タンパク質形質導入ドメイン」／「ＰＴＤ」とも呼ばれる）という用語は、一般に、原形質膜を介して異なるタイプのカーゴ分子を輸送し、さまざまな分子カーゴ（ナノサイズの粒子から小さな化学分子及びＤＮＡの大きな断片まで）の細胞取り込みを促進することができる短いペプチドを示すために使用される。細胞透過性ペプチドは、通常、リジン又はアルギニンなどの正に帯電したアミノ酸を高い相対存在量で有する、又は極性／帯電アミノ酸と非極性の疎水性アミノ酸の交互パターンを含む配列を有するアミノ酸組成を有する。これら２つのタイプの構造は、それぞれポリカチオン性又は両親媒性と呼ばれる。通常、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、細胞膜を通過して大部分の細胞種に侵入する能力を有する８〜５０残基のペプチドである。或いは、それらは、天然タンパク質に存在するものとしてその起源を反映するタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）とも呼ばれる。ＦｒａｎｋｅｌとＰａｂｏは、ＧｒｅｅｎとＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎと同時に、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−ＴＡＴ）に由来するトランス活性化転写活性化因子の細胞への形質導入能について記述した（Ｆｒａｎｋｅｌ，  Ａ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｃ．Ｏ．  Ｐａｂｏ，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ．  Ｃｅｌｌ，  １９８８．  ５５（６）：  ｐ．  １１８９−９３）。１９９１年に、キイロショウジョウバエに由来するアンテナペディアホメオドメイン（ＤＮＡ結合ドメイン）の神経細胞への形質導入が記述された（Ｊｏｌｉｏｔ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｎｅｕｒａｌ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  １９９１．  ８８（５）：  ｐ．  １８６４−８）。１９９４年に、ペネトラチンと呼ばれる最初の１６マーペプチドＣＰＰが、アンテナペディアのホメオドメインの３番目のヘリックスから特徴付けられ（Ｄｅｒｏｓｓｉ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｈｅｌｉｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９４．  ２６９（１４）：  ｐ．  １０４４４−５０）、その後、１９９８年に、タンパク質形質導入に必要なＴＡＴの最小ドメインが同定された（Ｖｉｖｅｓ，  Ｅ．，  Ｐ．  Ｂｒｏｄｉｎ，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｌｅｂｌｅｕ，  Ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ＨＩＶ−１  Ｔａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｕｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９７．  ２７２（２５）：  ｐ．  １６０１０−７）。過去２０年に亘って、ウイルスタンパク質（例えば��ＶＰ２２）（Ｅｌｌｉｏｔｔ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｐ．  Ｏ’Ｈａｒｅ，  Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  ａ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｃｅｌｌ，  １９９７．  ８８（２）：  ｐ．  ２２３−３３）を含む各種起源、又は毒液、例えばメリチン（Ｄｅｍｐｓｅｙ，  Ｃ．Ｅ．，  Ｔｈｅ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｅｌｉｔｔｉｎ  ｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，  １９９０．  １０３１（２）：  ｐ．  １４３−６１）、マストパラン（ｍａｓｔｏｐｏｒａｎ）（Ｋｏｎｎｏ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｅｕｍｅｎｉｎｅ  ｍａｓｔｏｐａｒａｎ−ＡＦ  （ＥＭＰ−ＡＦ）、孤立スズメバチ（オオフタオビドロバチ）の毒液中の新たなマスト細胞脱顆粒ペプチド（Ｔｏｘｉｃｏｎ，  ２０００．  ３８（１１）：  ｐ．  １５０５−１５）、マウロカルシン（Ｅｓｔｅｖｅ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｔｏｘｉｎ  ｍａｕｒｏｃａｌｃｉｎｅ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｎ  ｃｒｏｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２００５．  ２８０（１３）：  ｐ．  １２８３３−９）、クロタミン（Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ，  Ｆ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｏｔａｍｉｎｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２００７．  ２８２（２９）：  ｐ．  ２１３４９−６０）又はブフォリン（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｕｆｏｒｉｎ  ２．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００４．  ４３（４９）：  ｐ．  １５６１０−６）に由来する数十のペプチドが報告された。ポリアルギニン（Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、及びＲ１２）（Ｆｕｔａｋｉ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ａｎ  ａｂｕｎｄａｎｔ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｓ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２００１．  ２７６（８）：  ｐ．  ５８３６−４０）又はトランスポータン（Ｐｏｏｇａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ，  １９９８．  １２（１）：  ｐ．  ６７−７７）を含む合成ＣＰＰも設計された。前記したＣＰＰはいずれも、本発明に係る抗体又は抗原結合断片における細胞透過性ペプチドとして使用することができる。本発明に係る抗体又は抗原結合断片中の細胞透過性ペプチドとして使用することができる各種ＣＰＰが、レビュー：Ｍｉｌｌｅｔｔｉ，  Ｆ．，  Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  ｃｌａｓｓｅｓ，  ｏｒｉｇｉｎ，  ａｎｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １７  （１５−１６）：  ８５０−６０，  ２０１２にも開示されている。
【０１７３】
本発明に係る抗体又は抗原結合断片において使用することができる局在化ドメインの他の例は、例えば、Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＧＫ，  Ｃａｒａｍ−Ｓａｌａｓ  Ｎ，  Ｈａｑｑａｎｉ  ＡＳ，  Ｂｒｕｎｅｔｔｅ  Ｅ，  Ｅｌｄｒｅｄｇｅ  Ｊ，  Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  Ｂ，    Ａｎｔｏｇｎｅｔｔｉ  Ｇ，  Ｂａｕｍａｎｎ  Ｅ，  Ｄｉｎｇ  Ｗ，  Ｇａｒｂｅｒ  Ｅ，  Ｊｉａｎｇ  Ｓ，  Ｄｅｌａｎｅｙ  Ｃ，  Ｂｏｉｌｅａｕ  Ｅ，  Ｓｉｓｋ  ＷＰ，  Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ  ＤＢ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ−ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２０１４  Ｎｏｖ；２８（１１）：４７６４−７８に記載される血液脳関門を通過するためのドメインである。
【０１７４】
局在化ドメインの更なる例は、核局在化ドメインである。核局在化ドメインは、タンパク質、特に本発明に係る抗体又は抗原結合断片を、細胞核に向ける。核局在化ドメインは、抗体又は抗原結合断片が転写因子の活性を遮断し、遺伝子発現を調節するのに有用であり得る。核局在化ドメインの好ましい例は、Ｋａｌｄｅｒｏｎ  Ｄ，  Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＢＬ，  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＷＤ，  Ｓｍｉｔｈ  ＡＥ  （１９８４）  “Ａ  ｓｈｏｒｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｂｌｅ  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｔｉｏｎ”  Ｃｅｌｌ  ３９  （３  Ｐｔ  ２）：  ４９９−５０９  ａｎｄ  ｉｎ  Ｌｕｓｋ  ＣＰ，  Ｂｌｏｂｅｌ  Ｇ，  Ｋｉｎｇ  ＭＣ  （Ｍａｙ  ２００７）  “Ｈｉｇｈｗａｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｎｅｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ：  ｒｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｏａｄ”    Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８  （５）：  ４１４−２０に記載される。
【０１７５】
好ましくは、（目的の（ポリ）ペプチドに含まれる）機能的ドメインは、タグを含む又はからなる。より好ましくは、タグは、親和性タグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグ、又は蛍光タグである。
【０１７６】
タグは、組換えタンパク質にグラフトされたペプチド配列である。タグの例としては、アフィニティータグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグ、蛍光タグ、タンパク質タグが挙げられる。親和性タグを使用して、親和性技法を用いて粗生物源からタンパク質を精製することができる。親和性タグの例としては、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。更なる例は、金属マトリックスに結合するポリ（Ｈｉｓ）タグである。特に大腸菌などのシャペロン欠乏種で発現する組換えタンパク質の場合には、タンパク質の適切なフォールディングを助け、沈殿を防ぐために、可溶化タグを使用することができる。可溶化タグの例としては、チオレドキシン（ＴＲＸ）及びポリ（ＮＡＮＰ）が挙げられる。クロマトグラフィータグを使用してタンパク質のクロマトグラフィー特性を変更し、特定の分離技法で異なる分解能を提供できる。クロマトグラフィータグは、多くの場合、ＦＬＡＧタグなどのポリアニオン性アミノ酸からなる。エピトープタグは、高親和性抗体を多くの異なる種で確実に産生できるので、選択される短いペプチド配列である。これらは通常、ウイルス遺伝子に由来し、高い免疫反応性を示す。エピトープタグとしては、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、及びＮＥタグが挙げられる。これらのタグは、ウエスタンブロット、免疫蛍光、免疫沈降実験に特に有用であるが、抗体精製にも使用できる。蛍光タグを使用して、タンパク質を視覚的に読み取ることができる。ＧＦＰとその変異体は、最も一般的に使用される蛍光タグである。ＧＦＰは、フォールディングレポーターとして使用できる（フォールディングされている場合は蛍光、そうでない場合は無色）。タンパク質タグは、特定の酵素修飾（例えば、ビオチンリガーゼによるビオチン化）又は化学修飾（例えば、蛍光イメージングのためのＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２との反応）を可能にする。例えば、タンパク質を複数の他のコンポーネントに結合させるために、タグを組み合わせることができる。タグは、化学物質又はタンパク質分解若しくはインテインスプライシングなどの酵素的手段によって除去可能であり得る。
【０１７７】
タグの好ましい例としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：：ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ（ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号６５）；ＡｖｉＴａｇ、酵素ＢｉｒＡによるビオチン化を可能にするペプチドであり、ストレプトアビジンによってタンパク質を単離できる（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ；配列番号６６）；カルモジュリンタグ、タンパク質カルモジュリンが結合したペプチド（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ；配列番号６７）；ポリグルタミン酸タグ、Ｍｏｎｏ−Ｑなどのアニオン交換樹脂に効率的に結合するペプチド（ＥＥＥＥＥＥ；配列番号６８）；Ｅタグ、抗体によって認識されるペプチド（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ；配列番号６９）；ＦＬＡＧタグ、抗体によって認識されるペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号７０）；ＨＡタグ、抗体によって認識されるヘマトグルチニン由来のペプチド（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号７１）；Ｈｉｓタグ、ニッケル又はコバルトキレートが結合した５〜１０個のヒスチジン（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号７２）；Ｍｙｃタグ、抗体によって認識されるｃ−ｍｙｃ由来のペプチド（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号７３）；ＮＥタグ、モノクローナルＩｇＧ１抗体によって認識される１８アミノ酸合成ペプチド（ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥＥＳＹＤＤＮＥＳ；配列番号７４）、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、免疫沈降、及び組換えタンパク質のアフィニティ精製を含む幅広い用途に有用である；Ｓタグ、リボヌクレアーゼＡ由来のペプチド（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ；配列番号７５）；ＳＢＰタグ、ストレプトアビジンに結合するペプチド（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ；配列番号７６）；Ｓｏｆｔａｇ  １、哺乳類発現用（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ；配列番号７７）；Ｓｏｆｔａｇ  ３、原核生物発現用（ＴＱＤＰＳＲＶＧ；配列番号７８）；Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ、ストレプトアビジン又はストレプトアクチンと呼ばれる修飾ストレプトアビジンに結合するペプチド（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号７９）；ＴＣタグ、ＦｌＡｓＨ及びＲｅＡｓＨ二ヒ素化合物によって認識されるテトラシステインタグ（ＣＣＰＧＣＣ；配列番号８０）；Ｖ５タグ、抗体によって認識されるペプチド（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ；配列番号８１）；ＶＳＶタグ、抗体によって認識されるペプチド（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ；配列番号８２）；Ｘｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ；配列番号８３）；イソペプタグ、ピリン−Ｃタンパク質に共有結合するペプチド（ＴＤＫＤＭＴＩＴＦＴＮＫＫＤＡＥ；配列番号８４）；ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質に共有結合するペプチド（ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ；配列番号８５）；ＳｎｏｏｐＴａｇ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質に共有結合するペプチド（ＫＬＧＤＩＥＦＩＫＶＮＫ；配列番号８６）；Ｔｙ１タグ（ＥＶＨＴＮＱＤＰＬＤ；配列番号８７）；ＢＣＣＰ（ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質）、ストレプトアビジンによる認識を可能にするＢｉｒＡによってビオチン化されるタンパク質ドメイン；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、固定化グルタチオンに結合するタンパク質；緑色蛍光タンパク質タグ、自然に蛍光を発し、ナノボディが結合できるタンパク質；ＨａｌｏＴａｇ、反応性ハロアルカン基質に共有結合する変異細菌ハロアルカンデハロゲナーゼであり、広範囲の基質への結合が可能；マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、アミロースアガロースに結合するタンパク質；Ｎｕｓ（Ｎ−利用物質）タグ；チオレドキシン（Ｔｒｘ）タグ；肝蛭８ｋＤａ抗原（Ｆｈ８）タグ；小ユビキチン修飾（ＳＵＭＯ）タグ；溶解度向上ペプチド配列（ＳＥＴ）タグ；プロテインＧのＩｇＧドメインＢ１（ＧＢ１）タグ；プロテインＡ（ＺＺ）のＩｇＧリピートドメインＺＺタグ；溶解度向上ユビキタスタグ（ＳＮＵＴ）タグ；１７キロダルトンタンパク質（Ｓｋｐ）タグ；ファージＴ７プロテインキナーゼ（Ｔ７ＰＫ）タグ；大腸菌分泌プロテインＡ（ＥｓｐＡ）タグ；単量体バクテリオファージＴ７  ０．３タンパク質（Ｏｒｃタンパク質）／Ｍｏｃｒタグ；大腸菌トリプシン阻害剤（Ｅｃｏｔｉｎ）タグ；カルシウム結合タンパク質（ＣａＢＰ）タグ；ストレス応答性ヒ酸レダクターゼ（ＡｒｓＣ）タグ；翻訳開始因子ＩＦ２のＮ末端断片（ＩＦ２ドメインＩ）タグ；発現度タグ（翻訳開始因子ＩＦ２のＮ末端断片）；ストレス応答性タンパク質ＲｐｏＡ、ＳｌｙＤ、Ｔｓｆ、ＲｐｏＳ、ＰｏｔＤ、Ｃｒｒタグ；大腸菌酸性タンパク質ｍｓｙＢ、ｙｊｇＤ、ｒｐｏＤタグ（例えば、Ｃｏｓｔａ  Ｓ，  Ａｌｍｅｉｄａ  Ａ，  Ｃａｓｔｒｏ  Ａ，  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ  Ｌ．  Ｆｕｓｉｏｎ  ｔａｇｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ，  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  Ｆｈ８  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ２０１４；５：６３，  ｉｎ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ｔａｂｌｅ  １  ｉｎ  Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４参照）。
【０１７８】
したがって、タグは、配列番号６５〜８７のいずれかに係るアミノ酸配列又はその配列変異体を含む又はからなることが好ましい。最も好ましくは、タグは、特に配列番号６５又は７９に係るＳｔｒｅｐタグである。
【０１７９】
好ましくは、（目的の（ポリ）ペプチドに含まれる）機能的ドメインは、受容体又はその機能的断片（「受容体ドメイン」とも呼ばれる）を含む又はからなる。「受容体」は、特定の（シグナル）分子、そのリガンドに結合し、例えば細胞内において、応答を開始することができるポリペプチド又はタンパク質である。天然には、受容体は、特に細胞膜上又は細胞膜内（細胞表面受容体）又は細胞内（細胞内受容体）に位置する。好ましい受容体は、イオンチャネル結合（イオンチャネル型）受容体、Ｇタンパク質結合（代謝型）ホルモン受容体、酵素結合ホルモン受容体、細胞質受容体、及び核受容体を含む。二量体を形成する受容体の場合、目的の（ポリ）ペプチドの機能的ドメインは、リンカーによって接続された２つの同一のドメインを含むことができる。
【０１８０】
好ましい受容体は、Ｉｇ様ドメインを含む受容体である。特に、受容体は、Ｉｇ様ドメインを含む阻害剤受容体又はＩｇ様ドメインを含む活性化受容体であり得る。Ｉｇ様ドメインを含む阻害性受容体の好ましい例としては、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１又はＰＤ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ−３；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）としても知られる）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、細胞表面糖タンパク質ＣＤ２００受容体１（ＣＤ２００Ｒ１）、２Ｂ４（ＣＤ２４４；ＳＬＡＭＦ４）、Ｔｒｅｍ（ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体）様転写物２（ＴＬＴ２）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー４（ＬＩＬＲＢ４）、及びキラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメイン及び長い細胞質テール２（ＫＩＲ２ＤＬ２）が挙げられる。Ｉｇ様ドメインを含む活性化受容体の好ましい例としては、誘導性Ｔ細胞ＣＯＳ刺激因子（ＩＣＯＳ）及びＣＤ２８が挙げられる。特に好ましくは、受容体は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１又はＰＤ１）又はシグナリングリンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）である。
【０１８１】
更なる好ましい受容体は、例えばＨｅａｎｅｙ  ＭＬ，  Ｇｏｌｄｅ  ＤＷ．  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．  １９９８  Ａｕｇ；６４（２）：１３５−４６に開示される可溶性受容体である。その例としては、ＴＮＦＲ（腫瘍壊死因子受容体）、ｐ５５、ｐ７５、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、神経成長因子受容体、ＣＤ２７、ＣＤ３０、成長ホルモン受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）、トロンボポエチン受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＩＬ−１ＲＩ（インターロイキン１受容体Ｉ）、ＩＬ−１ＲＩＩ（インターロイキン１受容体ＩＩ）、ＩＬ−２Ｒα（インターロイキン２受容体α、Ｔａｃ、ＣＤ２５）、ＩＬ−４Ｒ（インターロイキン４受容体）、ＩＬ−５Ｒα（インターロイキン５受容体α）、ＩＬ−７Ｒ（インターロイキン７受容体）、ＩＬ−６Ｒα（インターロイキン６受容体α）、ｇｐ１３０、ＣＮＴＦＲ（繊毛神経栄養因子受容体）、ＬＩＦＲ（白血病阻止因子受容体）、レプチン受容体、ＩＬ−１１Ｒ（インターロイキン１１受容体）、ＩＬ−１２  ｐ４０（インターロイキン１２受容体ｐ４０）、幹細胞因子受容体（ｃ−ｋｉｔ）、インターフェロン受容体、リポ多糖受容体（ＣＤ１４）、補体受容体Ｉ型（ＣＤ３５）、ヒアルロン酸受容体（ＣＤ４４）、ＣＤ５８、ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ２３）、ＩｇＧ受容体（ＦｃγＲＩＩ）、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＣＡＭ−３（ＣＤ５０）、トランスフォーミング成長因子β受容体ＩＩＩ、表皮成長因子受容体（ｃ−ｅｒｂ  Ｂ）、血管内皮成長因子受容体、血小板由来成長因子受容体、線維芽細胞成長因子、コロニー刺激因子−１受容体（ＭＣＦＲ、ｃ−ｆｍｓ）、ＡＲＫ（アドレナリン受容体キナーゼ）、Ｔｉｅ（アンジオポエチン受容体）、インスリン受容体、インスリン様成長因子−ＩＩ受容体、及びマンノース６−リン酸受容体が挙げられる。
【０１８２】
より好ましくは、可溶性受容体は、可溶性サイトカイン受容体であり、例えば、クラスＩサイトカイン受容体スーパーファミリー受容体、クラスＩＩサイトカイン受容体スーパーファミリー受容体、ＩＬ−１／ＴＬＲファミリー受容体、ＴＧＦ−β受容体ファミリー受容体、ＴＮＦＲスーパーファミリー受容体、又はＩＬ−１７Ｒなどである。クラスＩサイトカイン受容体スーパーファミリーの好ましい受容体は、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−５Ｒα、ＩＬ−６Ｒα、ＩＬ−７Ｒα、ＩＬ−９Ｒα、ＥｐｏＲ、Ｇ−ＣＳＦＲ、ＧＭ−ＣＳＦＲα、ｇｐ１３０、及びＬＩＦＲαを含む。クラスＩＩサイトカイン受容体スーパーファミリーの好ましい受容体は、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２αなどのＩ型ＩＦＮＲを含む。ＩＬ−１／ＴＬＲファミリーの好ましい受容体は、ＩＬ−１ＲＩＩ及びＩＬ−１ＲａｃＰを含む。ＴＧＦ−β受容体ファミリーの好ましい受容体は、ＴβＲ−１及びアクチビン受容体様キナーゼ７を含む。ＴＮＦＲスーパーファミリーの好ましい受容体は、ＴＮＦＲＳＦ６／Ｆａｓ／ＣＤ９５及びＴＮＦＲＳＦ９／４−１ＢＢ／ＣＤ１３７を含む。したがって、サイトカイン受容体の好ましい例としては、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−５Ｒα、ＩＬ−６Ｒα、ＩＬ−７Ｒα、ＩＬ−９Ｒα、ＥｐｏＲ、Ｇ−ＣＳＦＲ、ＧＭ−ＣＳＦＲα、ｇｐ１３０、ＬＩＦＲα、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２α、ＩＬ−１ＲＩＩ、ＩＬ−１ＲａｃＰ、ＴβＲ−Ｉ、アクチビン受容体様キナーゼ７、ＴＮＦＲＳＦ６／Ｆａｓ／ＣＤ９５、ＴＮＦＲＳＦ９／４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、及びＩＬ−１７Ｒが挙げられる。そのような受容体又はその機能的断片を含む機能的ドメインを含む抗体又は抗体断片は、抗体がその標的に到達する間に炎症応答を調節することができる。例えば、主にさまざまな刺激に応答するタンパク質分解切断によって生成される可溶性ＩＩ型ＩＬ−１受容体（ｓＩＬ−１ＲＩＩ）は、ＩＬ−１βを優先的に結合することにより、過剰なＩＬ−１生物活性を減らすことができる。例えば、可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰは、外部ドメインの切断ではなく、選択的スプライシングによって生成される。例えば、可溶性ＩＬ−６受容体は、膜ＩＬ−６Ｒと同様の親和性でＩＬ−６に結合し、それによりＩＬ−６の半減期を延長する。
【０１８３】
受容体の機能的断片は、機能を媒介する能力を有する受容体の任意の断片であり得る。通常、このような断片は「ドメイン」と呼ばれる。したがって、受容体の機能的断片は、受容体の任意のドメインであり得る。好ましい例としては、前記の（例示した）受容体の機能的断片（例えば、ドメイン）が挙げられる。好ましくは、機能的ドメインに含まれる受容体の機能的断片は、受容体の細胞外ドメインである。例えば、機能的ドメインは、以下の受容体のいずれかの細胞外ドメインであり得る：ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−５Ｒα、ＩＬ−６Ｒα、ＩＬ−７Ｒα、ＩＬ−９Ｒα、ＥｐｏＲ、Ｇ−ＣＳＦＲ、ＧＭ−ＣＳＦＲα、ｇｐ１３０、ＬＩＦＲα、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２α、ＩＬ−１ＲＩＩ、ＩＬ−１ＲａｃＰ、ＴβＲ−Ｉ、アクチビン受容体様キナーゼ７、ＴＮＦＲＳＦ６／Ｆａｓ／ＣＤ９５、ＴＮＦＲＳＦ９／４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＩＬ−１７Ｒ、ｐ５５、ｐ７５、神経成長因子受容体、ＣＤ２７、ＣＤ３０、成長ホルモン受容体、トロンボポエチン受容体、ＩＬ−１ＲＩ（インターロイキン１受容体Ｉ）、ＩＬ−２Ｒα（インターロイキン２受容体α、Ｔａｃ、ＣＤ２５）、ＣＮＴＦＲ（繊毛神経栄養因子受容体）、レプチン受容体、ＩＬ−１１Ｒ（インターロイキン１１受容体）、ＩＬ−１２  ｐ４０（インターロイキン１２受容体ｐ４０）、幹細胞因子受容体（ｃ−ｋｉｔ）、インターフェロン受容体、リポ多糖受容体（ＣＤ１４）、補体受容体Ｉ型（ＣＤ３５）、ヒアルロン酸受容体（ＣＤ４４）、ＣＤ５８、ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ２３）、ＩｇＧ受容体（ＦｃγＲＩＩ）、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＣＡＭ−３（ＣＤ５０）、トランスフォーミング成長因子β受容体ＩＩＩ、上皮成長因子受容体（ｃ−ｅｒｂ  Ｂ）、血管内皮成長因子受容体、血小板由来成長因子受容体、線維芽細胞成長因子、コロニー刺激因子−１受容体（ＭＣＦＲ、ｃ−ｆｍｓ）、ＡＲＫ（アドレナリン受容体キナーゼ）、Ｔｉｅ（アンジオポエチン受容体）、インスリン受容体、インスリン様成長因子−ＩＩ受容体、及びマンノース６−リン酸受容体。
【０１８４】
好ましくは、機能的ドメインに含まれる受容体の機能的断片は、Ｉｇ様ドメインである。例えば、機能的ドメインは、以下の受容体のいずれかのＩｇ様ドメインであり得る：ＰＤ１、ＳＬＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２００Ｒ１、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＴＬＴ２、ＬＩＬＲＢ４、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＩＣＯＳ、又はＣＤ２８。好ましくは、機能的ドメインは、膜貫通ドメインを含まない。最も好ましくは、受容体は、ＰＤ１、ＳＬＡＭ、又はＬＡＩＲ１（の断片）、例えば、配列番号８８〜９０のいずれかに記載のアミノ酸配列又はその配列変異体を含む又はからなる。
【０１８５】
更に、国際公開第２０１６／２０７４０２Ａ１号に記載されるように、機能的ドメインは、変異白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）断片を含む又はからなることが特に好ましい。配列番号８８に示される変異ＬＡＩＲ１断片、又は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは９０％、特に好ましくは９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその配列変異体が最も好ましい。
改変ＬＡＩＲ１断片：
ＥＤＬＰＲＰＳＩＳＡＥＰＧＴＶＩＰＬＧＳＨＶＴＦＶＣＲＧＰＶＧＶＱＴＦＲＬＥＲＥＲＮＹＬＹＳＤＴＥＤＶＳＱＴＳＰＳＥＳＥＡＲＦＲＩＤＳＶＮＡＧＮＡＧＬＦＲＣＩＹＹＫＳＲＫＷＳＥＱＳＤＹＬＥＬＶＶＫ
［配列番号８８］
【０１８６】
特に好ましくは、（目的の（ポリ）ペプチドに含まれる）機能的ドメインは、配列番号８９又は配列番号９０に示されるアミノ酸配列などのＰＤ１又はＳＬＡＭのＩｇ様断片、又は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその配列変異体を含む又はからなる。
ＰＤ−１断片：
ＤＳＰＤＲＰＷＮＰＰＴＦＳＰＡＬＬＶＶＴＥＧＤＮＡＴＦＴＣＳＦＳＮＴＳＥＳＦＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲＶＴＱＬＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬＲＶＴ
［配列番号８９］
ＳＬＡＭ断片：
ＥＱＶＳＴＰＥＩＫＶＬＮＫＴＱＥＮＧＴＣＴＬＩＬＧＣＴＶＥＫＧＤＨＶＡＹＳＷＳＥＫＡＧＴＨＰＬＮＰＡＮＳＳＨＬＬＳＬＴＬＧＰＱＨＡＤＮＩＹＩＣＴＶＳＮＰＩＳＮＮＳＱＴＦＳＰＷＰＧＣＲＴＤＰＳ
［配列番号９０］
【０１８７】
好ましくは、（目的の（ポリ）ペプチドに含まれる）機能的ドメインは、リガンド又はその機能的断片を含む又はからなる。「リガンド」とは、タンパク質又は他の分子の特定部位に特異的に結合する分子である。本発明の文脈においては、リガンドは、目的の（ポリ）ペプチドに含まれるため、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である。リガンドの結合は、特にイオン結合、水素結合、ファンデルワールス力などの分子間力によって生じる。リガンドの好ましい例としては、前記した受容体のいずれか、特に受容体ＰＤ１、ＳＬＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２００Ｒ１、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＴＬＴ２、ＬＩＲＢ４、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＩＣＯＳ、又はＣＤ２８、例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ４（Ｂ７ホモログ）、ガレクチン−９、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）、ＯＸ−２膜糖タンパク質、ＣＤ４８、Ｂ７−Ｈ３（Ｂ７ホモログ）、ＭＨＣＩ、及びＩＣＯＳ−Ｌなどのいずれかのサイトカイン及びリガンドである。
【０１８８】
好ましくは、リガンドは、サイトカイン又はその機能的断片である。サイトカインは通常、細胞シグナル伝達に重要な小さなタンパク質（〜約５〜２０ｋＤａ）である。それらは細胞によって放出され、他の細胞の挙動に影響を及ぼし、放出する細胞自体の挙動に影響を及ぼす場合もある。サイトカインは、サイトカインのＳＩＳファミリー、サイトカインのＳＩＧファミリー、サイトカインのＳＣＹファミリー、血小板因子４スーパーファミリー及びインタークリンＣＣケモカインリガンド（ＣＣＬ）−１〜−２８（特に、ＣＣＬ１２）、ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１（リンホタクチン−α）及びＸＣＬ２（リンホタクチン−β）、フラクタルカイン（又はＣＸ３ＣＬ１）などのケモカイン；Ｉ型ＩＦＮ、ＩＩ型ＩＦＮ、ＩＩＩ型ＩＦＮ、特にＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−ω、ＩＬ１０Ｒ２（ＣＲＦ２−４とも呼ばれる）及びＩＦＮＬＲ１（ＣＲＦ２−１２とも呼ばれる）などのインターフェロン；ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、及びＩＬ−３６などのインターロイキン；ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンガンマなどのリンホカイン；ＣＤ４０ＬＧ（ＴＮＦＳＦ５）などの腫瘍壊死因子；ＣＤ７０（ＴＮＦＳＦ７）；ＥＤＡ；ＦＡＳＬＧ（ＴＮＦＳＦ６）；ＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１）；ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３）；ＴＮＦ、ＴＮＦα、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ）；ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ１５３）；ＴＮＦＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦ１１（ＲＡＮＫＬ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ）；ＴＮＦＳＦ１３；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４；ＴＮＦＳＦ１５；及びＴＮＦＳＦ１８；並びにＣＳＦ１（「マクロファージコロニー刺激因子」とも呼ばれる）、ＣＳＦ２（「顆粒球マクロファージコロニー刺激因子」とも呼ばれる；ＧＭ−ＣＳＦ及びサルグラモスチム）；ＣＳＦ３（「顆粒球コロニー刺激因子」としても知られる）；Ｇ−ＣＳＦ及びフィルグラスチム）、並びにプロメガポエチンなどの合成ＣＳＦなどのコロニー刺激因子から選択することができる。したがって、サイトカインの好ましい例としては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、ＩＬ−３６、ＣＣＬ−１、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４、ＣＣＬ−５、ＣＣＬ−６、ＣＣＬ−７、ＣＣＬ−８、ＣＣＬ−９、ＣＣＬ−１０、ＣＣＬ−１１、ＣＣＬ−１２、ＣＣＬ−１３、ＣＣＬ−１４、ＣＣＬ−１５、ＣＣＬ−１６、ＣＣＬ−１７、ＣＣＬ−１８、ＣＣＬ−１９、ＣＣＬ−２０、ＣＣＬ−２１、ＣＣＬ−２２、ＣＣＬ−２３、ＣＣＬ−２４、ＣＣＬ−２５、ＣＣＬ−２６、ＣＣＬ−２７、ＣＣＬ−２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、フラクタルカイン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−ω、ＩＬ１０Ｒ２、ＩＦＮＬＲ１、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ７０、ＥＤＡ、ＦＡＳＬＧ（ＴＮＦＳＦ６）、ＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１）、ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３）、ＴＮＦα、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ）、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８、ＣＳＦ１、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、及びＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）が挙げられる。サイトカインのより好ましい例としては、ＩＬ−２、ＩＬ６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＮＦが挙げられる。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、マスト細胞などの免疫細胞、内皮細胞、線維芽細胞、及び各種間質細胞などの広範囲に亘る細胞によって産生され、所定のサイトカインが１種超の細胞によって産生され得る。そのようなサイトカイン又はその機能的断片を含む機能的ドメインを含む抗体又は抗体断片は、選択されたサイトカインに応じて、炎症誘発性免疫刺激応答又は抗炎症性免疫抑制又は細胞傷害性応答を誘発し得る。
【０１８９】
他の好ましいリガンドは、例えば、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質であるホルモンを含む。ホルモンは、循環系によって輸送され、遠く離れた臓器を標的とし、特に生理学と挙動を調節するシグナル伝達分子である。ホルモンは通常、多細胞生物の腺によって産生される。特に好ましいホルモンは（ヒト）成長ホルモンである。ホルモンの更なる例としては、ＴＲＨ、バソプレシン、インスリン、プロラクチン、ＡＣＴＨ、オキシトシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、グルカゴン、ソマトスタチン、コレシストキニン、ガストリン、レプチン、アンギオテンシンＩＩ、塩基性線維芽細胞成長因子２、及び副甲状腺ホルモン関連タンパク質が挙げられる。
【０１９０】
リガンドの機能的断片は、機能を媒介する能力を有するリガンドの任意の断片であり得る。通常、このような断片は「ドメイン」と呼ばれる。したがって、リガンドの機能的断片は、リガンドの任意のドメインであり得る。好ましい例としては、前記の（例示した）リガンドの機能的断片（例えば、ドメイン）が挙げられる。好ましくは、機能的ドメインに含まれるリガンドの機能的断片は、Ｉｇ様ドメインである。
【０１９１】
好ましくは、（目的の（ポリ）ペプチドに含まれる）機能的ドメインは、（独立した）結合部位を含む又はからなる。したがって、目的の（ポリ）ペプチドは、（独立した）結合部位を含む又はからなることが好ましい。
【０１９２】
一般に、「（独立した）結合部位」は、特に、化学結合、例えば非共有結合を形成することによって、特定の標的（例えば、分子及び／又はイオン）が結合できるポリペプチド鎖の領域である。非共有結合は、電子の密接な共有を伴わない比較的弱い化学結合である。複数の非共有結合は、しばしば高分子の立体構造を安定化し、分子間の高度に特異的な相互作用を媒介する。したがって、結合部位は、結合機能を提供する機能的ドメインである。特に、結合部位は、ＧＳリンカーなどのリンカーではない。リンカーは、通常、結合機能を提供しない。結合部位は、ＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）を任意に含んでもよいが、ＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）からならないことが好ましい。換言すれば、結合部位がＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）を含む場合でも、２つのペプチドを互いに（純粋に）結合することとは異なる機能を媒介する追加のアミノ酸配列を含むことが好ましい。したがって、結合部位は、ＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）とは異なることが好ましい。
【０１９３】
好ましくは、（独立した）結合部位は、受容体及びその機能的断片、リガンド及びその機能的断片、ＣＤ分子及びその機能的断片、単鎖抗体及びその抗原結合断片、抗原及びその機能的断片、並びにタグからなる群から選択される。
【０１９４】
より好ましくは、（独立した）結合部位は、受容体又はその機能的断片を含む又はからなる。受容体は通常、（特定の）リガンドに結合できる。したがって、受容体は、（独立した）結合部位とも呼ばれる。様々な受容体が前述されており、その好ましい実施形態及び例が同様に適用される。
【０１９５】
結合部位の文脈において、受容体の機能的断片は、そのリガンドに結合する受容体の能力を保持する受容体の断片である。結合部位は受容体又はその機能的断片を含み得るので、それは、用語「機能的」が結合部位の文脈において言及する受容体の結合機能である。受容体の他の断片／ドメインは、（独立した）結合部位に含まれないことが好ましい場合がある。例えば、受容体は、受容体の結合機能に通常関与しない、したがって好ましくは（独立した）結合部位に含まれない１つ以上の膜貫通ドメインを含むことができる。したがって、（独立した）結合部位に含まれる受容体の断片は、（特に、受容体の更なるドメインなしに）単に受容体の結合部位であることが最も好ましい。
【０１９６】
また、（独立した）結合部位がリガンド又はその機能的断片を含む又はからなることもより好ましい。リガンドは通常、（特定の）受容体に結合することができる。したがって、リガンドは、（独立した）結合部位と呼ばれることもある。様々なリガンドが前述されており、その好ましい実施形態及び例が同様に適用される。
【０１９７】
結合部位の文脈において、リガンドの機能的断片は、リガンドの結合能を保持するリガンドの断片である。結合部位はリガンド又はその機能的断片を含み得るので、それは、用語「機能的」が結合部位の文脈において言及するリガンドの結合機能である。リガンドの他の断片／ドメインは、（独立した）結合部位に含まれないことが好ましい場合がある。したがって、（独立した）結合部位に含まれるリガンドの断片は、（特に、リガンドの更なるドメインなしに）単にリガンドの結合部位であることが最も好ましい。
【０１９８】
好ましくは、（独立した）結合部位は、ＣＤ（表面抗原分類）分子又はその機能的断片である。ＣＤ（表面抗原分類）分子は細胞表面マーカーである。ＣＤ分子はしばしば受容体又はリガンドとして作用する又は細胞接着に関与する。ＣＤ命名法は、１９８２年に開始したＨＬＤＡ（ヒト白血球分化抗原）ワークショップを通して開発され、維持されている。本発明の文脈において結合部位として機能し得るＣＤ分子の例としては、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｈｕｍａｎ−ｃｄ−ｃｈａｒｔ．ｈｔｍ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ’ｓ  “Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｃｄ＿ｍａｒｋｅｒ＿ｈａｎｄｂｏｏｋ．ｐｄｆで取得可能）又はｗｗｗ．ｈｃｄｍ．ｏｒｇ．などの当業者に知られた様々なソースから取得できる。したがって、（独立した）結合部位は、ＣＤマーカー又はその機能的断片、例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ’ｓ  “Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｃｄ＿ｍａｒｋｅｒ＿ｈａｎｄｂｏｏｋ．ｐｄｆで取得可能）又は適切な結合部位を選択できるように、典型的には、結合パートナーも示す他の「ＣＤマーカーチャート」のソースに記載される（ヒト）ＣＤマーカーであることができる。
【０１９９】
ＣＤ分子の機能的断片は、ＣＤ分子の結合能を保持するＣＤ分子の断片である。本発明の文脈において、結合部位は、ＣＤ分子又はその機能的断片を含むことができ、それは、用語「機能的」が言及するＣＤ分子の結合機能である。ＣＤ分子の他の断片／ドメインは、（独立した）結合部位に含まれないことが好ましい場合がある。したがって、（独立した）結合部位に含まれるＣＤ分子の断片は、（特に、ＣＤ分子の更なるドメインなしに）単にＣＤ分子の結合部位であることが最も好ましい。好ましくは、（独立した）結合部位に含まれるＣＤ分子の機能的断片は、Ｉｇ様ドメインである。
【０２００】
好ましくは、（独立した）結合部位は、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ又はＶＨＨ）又はその抗原結合断片である。また、（独立した）結合部位は、抗原又はエピトープなどのその機能的断片であることが好ましい。
【０２０１】
好ましくは、（独立した）結合部位は、単鎖抗体又はその抗原結合断片である。単鎖抗体は、単一のポリペプチド鎖からなる組換え抗体である。単鎖抗体の好ましい例としては、単ドメイン抗体、単鎖可変断片に基づく単鎖抗体（ｓｃＦｖ’ｓ）、及び単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）などの定常ドメインを有しない単鎖抗体、並びに単鎖Ｆａｂ断片（ｓｃＦａｂ；Ｈｕｓｔ  Ｍ，  Ｊｏｓｔｏｃｋ  Ｔ，  Ｍｅｎｚｅｌ  Ｃ，  Ｖｏｅｄｉｓｃｈ  Ｂ，  Ｍｏｈｒ  Ａ，  Ｂｒｅｎｎｅｉｓ  Ｍ，  Ｋｉｒｓｃｈ  ＭＩ，  Ｍｅｉｅｒ  Ｄ，  Ｄｕｅｂｅｌ  Ｓ．  Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆａｂ  （ｓｃＦａｂ）  ｆｒａｇｍｅｎｔ．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００７  Ｍａｒ  ８；７：１４）などの定常ドメインを有する単鎖抗体が挙げられる。
【０２０２】
単鎖可変断片に基づく単鎖抗体（ｓｃＦｖ’ｓ）の好ましい例としては、ｓｃＦｖ（１つの単一ＶＨ及び１つの単一ＶＬドメイン）及びタンデムｓｃＦｖ’ｓ、例えば、タンデム−ジ−ｓｃＦｖ（ＢｉＴＥ）、タンデム−トリ−ｓｃＦｖ、及びタンデム−テトラ−ｓｃＦｖが挙げられる。
【０２０３】
単一ドメイン抗体（「ナノボディ」とも呼ばれる）は、１つの単一（単量体）可変ドメインのみを含む／からなる抗体断片である。抗体全体と同様に、単一ドメイン抗体は、特定の抗原に選択的に結合できる。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物に存在する重鎖抗体からエンジニアードされ、これらは、「ＶＨＨ」又は「ＶＨＨ断片」と呼ばれる。軟骨魚類も重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新規抗原受容体」）を有し、これから「ＶＮＡＲ」又は「ＶＮＡＲ断片」と呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。別のアプローチは、ヒト又はマウスからの一般的な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の二量体可変ドメインを単量体に分割することである。したがって、単一ドメイン抗体は、重鎖又は軽鎖可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）に由来し得る。単一ドメイン抗体の好ましい例としては、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、ＩｇＧ由来ＶＨ、及びＩｇＧ由来ＶＬを挙げられる。
【０２０４】
最も好ましくは、機能的ドメインは、ＶＨＨ又はｓｃＦｖである。ＶＨＨの最も好ましい例は、Ｔ３−ＶＨＨ又はＦ４−ＶＨＨである。例えば、単一ドメイン抗体は、好ましくは、配列番号９１又は９３に示されるアミノ酸配列、又は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは９０％、特に好ましくは９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその配列変異体を含む又はからなる。ｓｃＦｖの最も好ましい例は、ＴＴ３９．７−ｓｃＦｖ又はＭＰＥ８−ｓｃＦｖである。例えば、単一ドメイン抗体は、好ましくは、配列番号９２又は９４に示されるアミノ酸配列、又は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは９０％、特に好ましくは９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその配列変異体を含む又はからなる。
Ｔ３−ＶＨＨ：
ＭＡＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＴＬＳＣＡＡＳＧＳＴＳＲＳＹＡＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＨＶＧＱＴＡＥＦＡＱＧＲＦＴＩＳＲＤＦＡＫＮＴＶＳＬＱＭＮＤＬＫＳＤＤＴＡＩＹＹＣＶＡＳＮＲＧＷＳＰＳＲＶＳＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
［配列番号９１］
ＴＴ３９．７−ｓｃＦｖ：
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＲＶＧＶＧＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＳＬＩＹＷＤＤＥＫＨＹＳＰＳＬＫＮＲＶＴＩＳＫＤＳＳＫＮＱＶＶＬＴＬＴＤＭＤＰＶＤＴＧＴＹＹＣＡＨＲＧＶＤＴＳＧＷＧＦＤＹＷＧＱＧＡＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＳＧＡＧＳＤＶＧＧＨＮＦＶＳＷＹＱＱＹＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＤＶＫＮＲＰＳＧＶＳＹＲＦＳＧＳＫＳＧＹＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＴＹＦＣＳＳＹＳＳＳＳＴＬＩＩＦＧＧＧＴＲＬＴＶＬ
［配列番号９２］
Ｆ４−ＶＨＨ：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＤＹＹＹＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＡＶＳＣＩＳＧＳＳＧＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＩＲＳＳＳＷＧＧＣＶＨＹＧＭＤＹＷＧＫＧＴＱＶＴＶＳＳ
［配列番号９３］
ＭＰＥ８−ｓｃＦｖ：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＡＳＳＳＹＳＤＹＡＤＳＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＳＬＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＦＣＡＲＡＲＡＴＧＹＳＳＩＴＰＹＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＳＶＶＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＳＣＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＡＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＲＮＬＳＧＶＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬ
［配列番号９４］
【０２０５】
好ましくは、（独立した）結合部位は、抗原又はその機能的断片、特にエピトープである。抗原は、分子、又は抗体が結合できる分子の一部である。抗原又はその機能的断片はポリペプチド鎖に含まれるので、本発明の文脈においては、結合部位が抗原又はその機能的断片である場合、前記抗原又はその機能的断片はペプチド又はポリペプチドであることが理解される。抗原は、典型的には、１つ以上のエピトープを含む。エピトープは、抗体によって結合される（抗体によって「認識される」）抗原の一部である。抗原の好ましい例としては、限定されるものではないが、血清タンパク質、例えば、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ９、及びＩＬ１３、生理活性ペプチド、細胞表面分子、例えば、受容体、輸送体、イオンチャネル、ウイルス及び細菌タンパク質、ＲＡＧＥ（終末糖化産物受容体）、ＧＰＶＩ、及びコラーゲンが挙げられる。
【０２０６】
抗原の機能的断片は、抗原の結合能を保持する抗原の断片である。したがって、抗原の断片は、好ましくはエピトープである、又は１つ以上のエピトープを含む。抗原の他の断片／ドメインは、（独立した）結合部位に含まれないことが好ましい場合がある。したがって、（独立した）結合部位に含まれる抗原の断片は、エピトープである又は（特に、抗原の更なるドメインなしに）１超のエピトープを含むことが最も好ましい。
【０２０７】
また、（独立した）結合部位は、結合部位を含むタグであることも好ましい。大部分のタグは結合できる（例えば、親和性タグ）。したがって、別の分子に結合する能力を有するこれらのタグは、（独立した）結合部位と呼ばれることもある。結合部位を含むタグを含む様々なタグが前述されており、その好ましい実施形態及び例が同様に適用される。
【０２０８】
最も好ましくは、機能的ドメインは、Ｉｇ様ドメイン、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、又はＳｔｒｅｐタグである。特に、機能的ドメインは、好ましくは、配列番号６５、７９、及び８８〜９４のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその配列変異体を含む又はからなる。
【０２０９】
特に好ましい実施形態では、目的の（ポリ）ペプチドは、前記したように、ＶＨドメイン又はＶＨ−ＶＬドメインを含む又はからなる。目的の（ポリ）ペプチドは、また、病原体結合ドメイン、即ち、病原体に特異的に結合することができる結合部位を含む又はからなるドメインを含む又はからなることも好ましい。一般に、用語「病原体」は、病気を引き起こす可能性のあるもの、特に微生物又は微生物自体に由来する感染性因子を意味する。病原体は、細菌性病原体、ウイルス性病原体、真菌性病原体、プリオン性病原体、原生動物病原体、（別の）（ヒト）寄生虫の病原体、例えば、蠕虫類、又は藻類の病原体から選択され得る。
【０２１０】
ＣＤ４、ジペプチジルペプチダーゼ４、ＣＤ９、若しくはアンギオテンシン変換酵素２、又はそれらの断片若しくは配列変異体を含む又はからなる目的の（ポリ）ペプチドが特に好ましい。例えば、分化クラスター（ＣＤ）４は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に結合する。例えば、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ−４）とＣＤ９は、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）の標的になる。例えば、アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）に結合する。
【０２１１】
目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の特に好ましい例は、配列番号１１１に記載のヌクレオチド配列、又は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９２％、更により好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９６％、更により好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するその（機能的）配列変異体を含む又はからなる。
【０２１２】
したがって、本発明にしたがって単離されたＢ細胞に導入されるＤＮＡ分子の特に好ましい例としては、配列番号９９又は１１０に記載のヌクレオチド配列を含む又はからなるＤＮＡ分子、又は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９２％、更により好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９６％、更により好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するその（機能的）配列変異体が挙げられる。
【０２１３】
Ｂリンパ球培養とＡＩＤの活性化
前記したように、本発明は、Ｂリンパ球のゲノムを編集するための方法を提供する。特に、Ｂリンパ球のゲノムは、前記したように、Ｂリンパ球がその内在性（即ち、天然に再結合された）Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現しないように編集することができる。例えば、Ｂリンパ球のゲノムは、内在性Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）をカスタマイズされた（モノクローナル）抗体の配列で置き換えるように編集することができる。
【０２１４】
Ｂリンパ球のゲノムを編集するために、単離された（好ましくは初代）Ｂリンパ球が、特に培養で提供される。単離された（好ましくは初代の）Ｂ細胞を培養するための方法は、当技術分野で知られている。
【０２１５】
一般に、培養条件は通常、「完全培養培地」を含む。本明細書で通常使用される用語「培養培地」は、細胞の増殖を支援するように設計された液体又はゲルを意味する。「完全培養培地」は、少なくとも１つの追加の成分が追加された基本培地、好ましくは基本合成培地を意味する。完全培養培地の非限定的な例としては、国際公開第０３／０７６６０１号、国際公開第０５／００７８４０号、ＥＰ７８７１８０、ＵＳ６，１１４，１６８、ＵＳ５，３４０，７４０、ＵＳ６，６５６，４７９、ＵＳ５，８３０，５１０、及びＰａｉｎら（１９９６，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：２３３９−２３４８）に記載されている。
【０２１６】
本明細書で使用される用語「基本培地」は、それ自体で、少なくとも細胞の生存、好ましくは細胞の増殖を可能にする培地を意味する。特に、基本培地は、古典的な培地処方を有する。基本培地の非限定的な例としては、ＢＭＥ（イーグル基本培地）、ＭＥＭ（最小イーグル培地）、培地１９９、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）、ノックアウトＤＭＥＭ、ＧＭＥＭ（グラスゴー変法イーグル培地）、ＤＭＥＭ−ＨａｍＦ１２、Ｈａｍ−Ｆ１２及びＨａｍ−Ｆ１０、イスコフ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、マッコイ５Ａ培地、及びＲＰＭＩ１６４０が挙げられる。特に、基本培地は、１以上の無機塩（例えば、ＣａＣｌ２、ＫＣＩ、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、ＮａＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４など）、１以上のアミノ酸、１以上ビタミン（例えば、チアミン、リボフラビン、葉酸、Ｄ−Ｃａパントテネートなど）及び／又は１以上の他の成分、例えば、グルコース、ベータ−メルカプト−エタノール、及びピルビン酸ナトリウムなどを含む。好ましくは、基本培地は合成培地である。最も好ましくは、基本培地は、ＩＭＤＭ及び／又はＲＰＭＩである。
【０２１７】
好ましくは、本発明の培養培地は、動物血清、特に胎児動物血清を更に含む。好ましい動物血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）である。特に好ましいＦＢＳは、ＨｙＣｌｏｎｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；例えば、ＨｙＣｌｏｎｅ  ４０ｍｍフィルター、ＳＨ３００７０．０３）である。しかし、他の動物種からの血清を含む動物血清もまた使用することができる。培養培地中の動物血清の最終濃度は、好ましくは約０．０１〜１０％、好ましくは０．０５〜５％、より好ましくは０．１〜２．５％、更により好ましくは０．５〜１．５％、最も好ましくは約１％である。
【０２１８】
本発明の培養培地は、好ましくは、特に細菌汚染を防止するために、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシン及び／又はカナマイシンなどの抗生物質を更に含むことができる。ペニシリン／ストレプトマイシンの組合せが好ましい。更に、カナマイシンも好ましい。例えば、最終培養培地は、ペニシリン／ストレプトマイシン及び／又はカナマイシンを含むことができる。好ましくは、培養培地中の抗生物質の濃度は、１〜１０００Ｕ／ｍｌ、より好ましくは１０〜５００Ｕ／ｍｌ、更により好ましくは５０〜２５０Ｕ／ｍｌ、特に好ましくは約１００Ｕ／ｍｌである。例えば、ペニシリン／ストレプトマイシンの組合せは、最終培養培地で以下の抗生物質濃度で使用できる：１〜１０００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１〜１０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、より好ましくは１０〜５００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１０〜５００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、更により好ましくは５０〜２５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０〜２５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、特に好ましくは約１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び約１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン。最終培養培地中のペニシリン／ストレプトマイシンの濃度は、また、０．０１〜１０％、好ましくは０．０５〜５％、より好ましくは０．１〜２．５％、更により好ましくは０．５〜１．５％、最も好ましくは約１％であることが好ましい。最終培養培地中のカナマイシンの濃度は、また、０．０１〜１０％、好ましくは０．０５〜５％、より好ましくは０．１〜２．５％、更により好ましくは０．５〜１．５％、最も好ましくは約１％であることが好ましい。
【０２１９】
更に、本発明の培養培地は、好ましくは、更なる添加剤、例えば、グルタミン誘導体、好ましくはＧｌｕｔａＭａｘ、ＮＥＡＡ、生物学的緩衝液、好ましくはＨＥＰＥＳ、ピルビン酸（例えば、ピルビン酸ナトリウム）、β−メルカプトエタノール、及び／又はトランスフェリンを含むことができる。一般に、前記した添加剤及び更なる添加剤は、製造元指定の濃度で使用することができる。
【０２２０】
グルタミン誘導体は、例えば、Ｌ−グルタミン又はＧｌｕｔａＭａｘであることができ、ＧｌｕｔａＭａｘが好ましい。ＧｌｕｔａＭａｘはＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドであり、例えば、０．８５％ＮａＣｌ（１００倍ストック溶液）中の２００ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドとして入手可能である。グルタミン誘導体は、好ましくは、０．１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．５〜５０ｍＭ、更により好ましくは１〜１０ｍＭ、特に好ましくは約２ｍＭの濃度で最終培養培地に用いられる。最終培養培地中のＧｌｕｔａＭａｘの濃度は、また、０．０１〜１０％、好ましくは０．０５〜５％、より好ましくは０．１〜２．５％、更により好ましくは０．５〜１．５％、最も好ましくは約１％であることが好ましい。
【０２２１】
ＮＥＡＡ、即ち、非必須アミノ酸溶液は、Ｅａｒｌｅ’ｓ  Ｓａｌｔｓ  Ｂａｓｅ、非必須アミノ酸、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、及びｐＨ指示薬としてフェノールレッドを含み、Ｌ−グルタミンを含まない市販の滅菌ろ過及び細胞培養試験済み液体製剤である。最終培養培地中のＮＥＡＡの濃度は、通常、製造元によって異なり、例えば、１００倍ストック溶液の場合は１：１００である。最終培養培地中のＮＥＡＡの濃度は、また、０．０１〜１０％、好ましくは０．０５〜５％、より好ましくは０．１〜２．５％、更により好ましくは０．５〜１．５％、最も好ましくは約１％であることが好ましい。
【０２２２】
ピルビン酸は解糖系の中間有機酸代謝物であり、細胞に容易に出入りできるＥｍｂｄｅｎ  Ｍｙｅｒｈｏｆｆ経路の最初のものである。したがって、それを細胞培養培地に添加することは、同化プロセスのためのエネルギー源と炭素骨格の両方を提供する。好ましいピルビン酸はピルビン酸ナトリウムであり、これはまた、蛍光によって誘発される光毒性を低減するのに役立ち得る。ピルビン酸、好ましくはピルビン酸ナトリウムは、好ましくは、０．０５〜５０ｍＭ、より好ましくは０．１〜１０ｍＭ、更により好ましくは０．５〜５ｍＭ、特に好ましくは約１ｍＭの濃度で培地中に用いられる。また、最終培養培地中のピルビン酸、好ましくはピルビン酸ナトリウムの濃度は、０．０１〜１０％、好ましくは０．０５〜５％、より好ましくは０．１〜２．５％、更により好ましくは０．５〜１．５％、最も好ましくは約１％である。
【０２２３】
ベータメルカプトエタノール（２−メルカプトエタノール、β−ＭＥ又は２−ＭＥとも呼ばれる）は、フリーラジカルスカベンジャーとして機能すると想定されている。ベータメルカプトエタノールは、好ましくは、０．００５〜５．０ｍＭ、より好ましくは０．０１〜１．０ｍＭ、更により好ましくは０．０５〜０．５ｍＭ、特に好ましくは約０．１ｍＭの濃度で最終培養培地に用いられる。最終培養培地中のベータメルカプトエタノールの濃度は、また、０．０１〜１０％、好ましくは０．０５〜５％、より好ましくは０．１〜２．５％、更により好ましくは０．５〜１．５％、最も好ましくは約１％であることが好ましい。
【０２２４】
更に、最終培養培地中のトランスフェリンの濃度は、また、０．０１〜１０％、好ましくは０．０５〜５％、より好ましくは０．１〜２．５％、更により好ましくは０．５〜１．５％、最も好ましくは約１％であることが好ましい。
【０２２５】
したがって、本発明に係る特に好ましい培養培地は、
−基本培地、好ましくはＲＰＭＩ又はＩＭＤＭ、
−好ましくは動物血清、より好ましくはＦＢＳ、
−好ましくは抗生物質、より好ましくはペニシリン／ストレプトマイシン及び／又はカナマイシン、
−好ましくは、例えばグルタミン誘導体（好ましくはＧｌｕｔａＭａｘ）、ＮＥＡＡ、ピルビン酸（例えばピルビン酸ナトリウム）、β−メルカプトエタノール、及び／又はトランスフェリンなどの更なる添加剤を含む。
【０２２６】
最も好ましくは、Ｂリンパ球は、１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ベータメルカプトエタノール、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％カナマイシン、及び１％トランスフェリンを含むＲＰＭＩ又はＩＭＤＭ中で培養される。
【０２２７】
別の例では、Ｂリンパ球は、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）、１％ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、及び１％Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ（例えば、ＲＰＭＩ−１６４０）で培養することができる。
【０２２８】
好ましくは、Ｂリンパ球は、約又は０．５×１０５〜１０×１０６細胞／ｍｌ、好ましくは１×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌ、より好ましくは１×１０５から５×１０５細胞／ｍｌ、更により好ましくは１．５×１０５〜２．５×１０５細胞／ｍｌ、最も好ましくは約２×１０５細胞／ｍｌの密度で培養される。
【０２２９】
本発明に係る方法の工程（ｉ）で、Ｂ細胞の内在性ＡＩＤが活性化される。好ましくは、Ｂリンパ球の活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化は、例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化因子を含む培養培地中でＢ細胞を培養することによって達成することができる。好ましくは、活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化因子は、サイトカイン、抗Ｂ細胞受容体抗体又はその断片、ＴＬＲアゴニスト、ＣｐＧ−Ｂアゴニスト、イミダゾキノリン化合物、又は前記活性化因子の任意の組合せからなる群から選択される。換言すれば、Ｂリンパ球は、サイトカイン、抗Ｂ細胞受容体抗体又はその断片、ＴＬＲアゴニスト、ＣｐＧ−Ｂアゴニスト、及び／又はイミダゾキノリン化合物を含む培養培地で培養されることが好ましい。
【０２３０】
Ｂ細胞の内在性ＡＩＤの活性化のために、Ｂリンパ球は、好ましくは、活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化因子（例えば、サイトカイン、抗Ｂ細胞受容体抗体又はその断片、ＴＬＲアゴニスト、ＣｐＧ−Ｂアゴニスト、及び／又はイミダゾキノリン化合物など）を含む細胞培養培地で、約３時間〜１０日間、好ましくは約６時間から７日間、より好ましくは約１２時間から５日間、更により好ましくは約１８時間から３日間、更により好ましくは約２１時間から２日間培養される。最も好ましくは、Ｂ細胞は、活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化因子（サイトカイン、抗Ｂ細胞受容体抗体又はその断片、ＴＬＲアゴニスト、ＣｐＧ−Ｂアゴニスト、及び／又はイミダゾキノリン化合物）を含む細胞培養培地で約２４時間培養される。
【０２３１】
したがって、Ｂリンパ球は、活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化因子（例えば、サイトカイン、抗Ｂ細胞受容体抗体又はその断片、ＴＬＲアゴニスト、ＣｐＧ−Ｂアゴニスト、及び／又はイミダゾキノリン化合物など）を含む細胞培養培地で、ＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の約３時間〜１０日間、好ましくはＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の約６時間〜７日間、より好ましくはＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の約１２時間〜５日間、更により好ましくはＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の約１８時間〜３日間、更により好ましくはＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の約２１時間〜２日間、最も好ましくはＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の約２４時間培養されることが好ましい。
【０２３２】
更に、Ｂリンパ球は、活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化因子（例えば、サイトカイン、抗Ｂ細胞受容体抗体又はその断片、ＴＬＲアゴニスト、ＣｐＧ−Ｂアゴニスト、及び／又はイミダゾキノリン化合物など）を含む細胞培養培地で、ＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の少なくとも３時間、好ましくはＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の少なくとも６時間、より好ましくはＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の少なくとも１２時間、更により好ましくはＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の少なくとも１８時間、最も好ましくはＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の少なくとも２１時間、例えば、ＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の約２４時間培養されることが好ましい。
【０２３３】
また、Ｂリンパ球は、活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化因子（例えば、サイトカイン、抗Ｂ細胞受容体抗体又はその断片、ＴＬＲアゴニスト、ＣｐＧ−Ｂアゴニスト、及び／又はイミダゾキノリン化合物など）を含む細胞培養培地で、ＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の１０日間以内、好ましくはＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の７日間以内、より好ましくはＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の５日間以内、更により好ましくはＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の３日間以内、更により好ましくはＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の２日間以内、最も好ましくはＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の３６時間以内、例えば、ＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ））前の約２４時間以内培養されることが好ましい。
【０２３４】
換言すれば、本発明に係る方法において、Ｂリンパ球へのＤＮＡ分子の導入は、活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化後最大１０日間、好ましくは活性化誘導シチジンデアミナーゼを活性化後最大７日間、より好ましくは活性化誘導シチジンデアミナーゼを活性化後最大５日間、更により好ましくは活性化誘導シチジンデアミナーゼを活性化後最大２日間、最も好ましくは活性化誘導シチジンデアミナーゼを活性化後約１日間行うことが好ましい。
【０２３５】
前記したように、活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化因子は、好ましくは、サイトカイン、抗Ｂ細胞受容体抗体又はその断片、ＴＬＲアゴニスト、ＣｐＧ−Ｂアゴニスト、及び／又はイミダゾキノリン化合物である。
【０２３６】
好ましいＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストは、Ｒ８４８又はＣＬ２６４などのＴＬＲ７又はＴＬＲ９のアゴニストである。抗Ｂ細胞受容体抗体又はその断片の好ましい例としては、ヒト免疫グロブリンに特異的な抗Ｂ細胞受容体Ｆ（ａｂ’）２−断片が挙げられる。ＣｐＧ−Ｂアゴニストの好ましい例は、ＯＤＮ２００６である。イミダゾキノリン化合物の好ましい例は、Ｃｌｏ９７である。
【０２３７】
サイトカインの例としては、ＩＬ１様、ＩＬ１ａ、ＩＬ１β、ＩＬ１ＲＡ、ＩＬ１８、ＣＤ１３２、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＣＤ１３１、ＩＬ３、ＩＬ５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ６−ｌｉｋｅ、ＩＬ６、ＩＬ１１、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ１２、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ１０−ｌｉｋｅ、ＩＬ１０、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＣＤ１５４、ＬＴβ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、４−１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ−１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦβΙ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ｃ−Ｋｉｔ、ＦＬＴ−３、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、ＦＵ−３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ａＣＤ４０、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。好ましくは、サイトカインは、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ４、ＩＬ２、ＩＬ２１、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＧＦ−β１、４−１ＢＢＬ、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ｃ−Ｋｉｔ、ＦＬＴ−３、ＩＦＮα、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。最も好ましくは、Ｂリンパ球は、ＩＬ４及び／又はＣＤ４０Ｌを含む培地で培養される。
【０２３８】
例えば、Ｂ細胞は、ＤＮＡ分子の導入（工程（ｉｉ）；トランスフェクション）前に、ＣＤ４０Ｌ発現細胞株（例えば、Ｋ５６２Ｌ又は３Ｔ３細胞など）と共培養することがでいる。Ｂ細胞は、トランスフェクション前、少なくとも１２、２４、３６、４８、又は７２時間共培養することができる。
【０２３９】
好ましくは、（培養培地中の）サイトカインの濃度は、０．００１〜２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．００１〜１ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは０．００５〜０．５ｎｇ／ｍｌ、更により好ましくは０．０１〜０．１ｎｇ／ｍｌ、更により好ましくは０．０１５〜０．０２ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．１６ｎｇ／ｍｌである。
【０２４０】
更に、Ｂリンパ球は、サイトカインを、少なくとも０．００１ｎｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも０．００１ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも０．００５ｎｇ／ｍｌ、更により好ましくは少なくとも０．０１ｎｇ／ｍｌ、更により好ましくは少なくとも０．０１５ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．１６ｎｇ／ｍｌ含む細胞培養培地で培養されることが好ましい。
【０２４１】
また、Ｂリンパ球は、２０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ以下、更により好ましくは０．０２ｎｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは約０．１６ｎｇ／ｍｌの濃度のサイトカインを含む細胞培養培地で培養されることが好ましい。
【０２４２】
好ましい実施形態では、活性化誘導シチジンデアミナーゼを活性化することは、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＩＬ４（の存在下でのＢリンパ球の培養）によって行われる。換言すれば、Ｂリンパ球は、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＩＬ４を含む細胞培養培地で培養されることが好ましい。より好ましくは、活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化は、（前記した）ＣＤ４０Ｌ発現細胞株との共培養及び（前記した培地への）ＩＬ−４の添加によって行われる。最も好ましくは、ＣＤ４０Ｌ発現細胞株はＫ５６２Ｌである。
【０２４３】
一般に、培養培地中のＩＬ４の濃度は、サイトカインについて一般に前記した通りであることができる。特に、（最終培養培地中の）ＩＬ４の濃度は、好ましくは０．００５〜０．０３ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１〜０．０２５ｎｇ／ｍｌ、更により好ましくは０．０１５〜０．０２ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．１６ｎｇ／ｍｌである。
【０２４４】
好ましくは、Ｂリンパ球は、ＤＮＡ分子をＢリンパ球に導入した後（トランスフェクション後）に再活性化される。トランスフェクション後の細胞の再活性化により、生存率が改善する。再活性化のために、前記Ｂ細胞刺激剤、即ち、サイトカイン、抗Ｂ細胞受容体抗体又はその断片、ＴＬＲアゴニスト、ＣｐＧ−Ｂアゴニスト、及び／又は前記イミダゾキノリン化合物を使用することができる。換言すれば、例えば、上で定義したＢ細胞刺激剤（サイトカイン、抗Ｂ細胞受容体抗体又はその断片、ＴＬＲアゴニスト、ＣｐＧ−Ｂアゴニスト、及び／又はイミダゾキノリン化合物）が、ＤＮＡ分子をＢリンパ球に導入した後にＢリンパ球に適用されることが好ましい。
【０２４５】
一般に、Ｂリンパ球は、ＤＮＡ分子をＢリンパ球に導入した後（トランスフェクション後）に１回又は繰り返し再活性化することができる。例えば、Ｂリンパ球は、約１、２、３、４、５日間、又はそれ以上の間、再活性化することができる。好ましくは、Ｂ細胞は、トランスフェクション後２４時間以内、例えば、トランスフェクション後約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４時間で（トランスフェクション後初めて）再活性化される。より好ましくは、Ｂ細胞は、トランスフェクション後１８時間以内に再活性化され、更により好ましくは、Ｂ細胞は、トランスフェクション後１２時間以内に再活性化され、最も好ましくは、Ｂ細胞は、トランスフェクション後６時間以内、例えば、トランスフェクション後３〜５時間、例えばトランスフェクション後約４時間で再活性化される。そのような再活性化は、最も好ましくは、ＩＬ４で行われる。更に、再活性化（例えば、ＩＬ４を用いた再活性化）は、好ましくは１〜５日間ごとに、好ましくは２〜４日間ごとに、最も好ましくは３日間ごとに繰り返される。
【０２４６】
追加的に又は代替的に、Ｂリンパ球は、特に好ましくは、Ｋ５６２Ｌ細胞などのＣＤ４０Ｌ発現細胞によって、例えば１回又は繰り返し、最も好ましくはトランスフェクション後２〜１０日間で１回、好ましくはトランスフェクション後４〜９日間、より好ましくはトランスフェクション後６〜８日間、例えば、トランスフェクション後約７日間で再活性化される。
【０２４７】
特に好ましい実施形態では、Ｂ細胞は、トランスフェクション後４時間、ＩＬ４で３日連続して、Ｋ５６２Ｌ細胞で７日目に再活性化される。
【０２４８】
好ましくは、Ｂリンパ球は、ＤＮＡ分子をＢリンパ球に導入する前に、代替末端結合をブロックすることができるＤＮＡ阻害剤で処理される。そのようなＤＮＡ阻害剤の好ましい例はＯｌａｐａｒｉｂである。このような前処理は、代替末端結合（ａ−ＥＪ）経路をブロックすることによって、ｃ−ＮＨＥＪ経路の使用を強制し、エンジニアリング効率を更に高める。
【０２４９】
目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子は、また、ＤＮＡ分子をＢリンパ球に導入する前に、Ｋｕ７０／Ｋｕ８０などのＫｕタンパク質と共にインキュベートされることが好ましい。したがって、好ましい実施形態では、ＤＮＡ分子／Ｋｕタンパク質複合体（インキュベーション中に形成される）がＢリンパ球に導入される。それにより、ＤＮＡ分子の成功した組み込みの数を更に増やすことができる。
【０２５０】
ＤＮＡ分子は、また、ＳＶ４０核局在化シグナルなどの核局在化シグナル、例えば、配列番号９５に係るＳＶタンデムリピート又はその配列変異体を含むことが好ましい。
ＳＶタンデムリピート：
ＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴＧＡＧＡＴＧＣＡＴＧＣＴＴＴＧＣＡＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴＧＡＧＡＴＧＣＡＴＧＣＴＴＴＧＣＡＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣ
［配列番号９５］
【０２５１】
それにより、Ｂリンパ球の核内のＤＮＡ分子の高濃度が達成され得、これはまた、Ｂリンパ球のゲノムへのＤＮＡ分子の組み込みを更に増加させる。
【０２５２】
更に、特にＢリンパ球の活性化誘導シチジンデアミナーゼの活性化の少なくとも約２４時間後に、Ｂリンパ球をヌクレアーゼ阻害剤で処理することも好ましい。ヌクレアーゼ阻害剤の好ましい例は、Ｍｉｒｉｎである。これにより、Ｂ細胞のエンドヌクレアーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼによる、Ｂ細胞に導入されたＤＮＡ分子の分解を回避することができる。
【０２５３】
トランスフェクション
前記したように、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を導入するための方法（即ち、トランスフェクション法）は、例えば、ウイルス性及び非ウイルス性のトランスフェクション法を含む。遺伝子導入に使用できるウイルスとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が挙げられる。しかし、いくつかの実施形態では、Ｂリンパ球は、レトロウイルスで形質導入されない。更に、ナノ粒子もトランスフェクションに使用することができる。更なる非ウイルストランスフェクション法としては、多くの化学的及び物理的方法が挙げられる。化学的トランスフェクション法としては、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づくリポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、又はＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのカチオン性ポリマーに基づくトランスフェクションが挙げられる。物理的トランスフェクション法としては、エレクトロポレーション、弾道遺伝子導入（ＤＮＡでコーティングした粒子を細胞に導入する）、マイクロインジェクション（マイクロキャピラリーを介した細胞へのＤＮＡ導入）、及びヌクレオフェクションが挙げられる。好ましくは、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子のＢリンパ球への導入は、非ウイルス性である。
【０２５４】
最も好ましくは、ＤＮＡ分子は、ヌクレオフェクションによってＢリンパ球に導入される。ヌクレオフェクションは、特定の電圧を印加することにより、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸を細胞に移入することができるエレクトロポレーションに基づくトランスフェクション法である。エレクトロポレーションの物理的方法に基づいて、ヌクレオフェクションは、ヌクレオフェクションデバイス（「Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ」）を、好ましくは細胞型特異的試薬と共に用いて生成させた電気的パラメータの組合せを使用する。ＤＮＡ分子（基質）は細胞核と細胞質に直接移入される。したがって、ヌクレオフェクションにはヌクレオフェクションデバイスを使用することが好ましい。一般に、任意のヌクレオフェクションデバイス、例えば、Ｎｅｏｎ（登録商標）、ＭａｘＣｙｔｅ、又はＡｍａｘａ（登録商標）を使用することができる。好ましくは、Ａｍａｘａ（登録商標）又はＮｅｏｎ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒが使用される。
【０２５５】
一般に、ヌクレオフェクションデバイスの製造元によって提供される任意のヌクレオフェクションプログラムを使用することができる。好ましくは、２１００〜２５００Ｖが、１０〜２０ｍｓ（ｍｓｅｃ）の１又は２パルスで使用される。より好ましくは、２１００〜２４００Ｖを、１０〜２０ｍｓ（ｍｓｅｃ）の１又は２パルスで使用することができる。例えば、２１５０Ｖ及び１０ｍｓの単一パルスを使用できる。例えば、２１５０Ｖ及び１５ｍｓの単一パルスを使用できる。例えば、２１５０Ｖ及び２０ｍｓの単一パルスを使用できる。例えば、２１５０Ｖ及び１０ｍｓの２パルスを使用できる。例えば、２４００Ｖ及び１０ｍｓの単一パルスを使用できる。例えば、２４００Ｖ及び１５ｍｓの単一パルスを使用できる。例えば、２４００Ｖ及び２０ｍｓの単一パルスを使用できる。例えば、２５００Ｖ及び１０ｍｓの単一パルスを使用できる。例えば、２５００Ｖ及び１５ｍｓの単一パルスを使用できる。最も好ましくは、２１５０Ｖ及び１０ｍｓの（正確に）２パルスが、特にＮｅｏｎ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒで使用される。
【０２５６】
好ましくは、Ｂ細胞用のヌクレオフェクターキット（例えば、ヒトＢ細胞用のロンザのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット）が、特にＡｍａｘａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒと、例えば製造元の指示にしたがって組み合わせて使用される。最も好ましくは、Ａｍａｘａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒは、Ｕ１５プログラムと共に製造元の指示に記載されているように、ロンザのヒトＢ細胞用Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットと組み合わせて使用され、Ａｍａｘａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのヌクレオフェクション当たり細胞数は（変更されて）２００万及び／又はＤＮＡ量は（変更されて）約２．５μｇである。
【０２５７】
好ましくは、ＤＮＡは、約０．５μｇ〜１０μｇのＤＮＡ量（トランスフェクション、特にヌクレオフェクション当たりの量）でトランスフェクトされ、例えば、ＤＮＡ濃度は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０μｇであることができる。より好ましくは、ＤＮＡ濃度は、（トランスフェクション、特にヌクレオフェクション当たり）の量で、約１μｇ〜５μｇのＤＮＡ、更により好ましくは１．５μｇ〜３．５μｇのＤＮＡ、更により好ましくは１．０〜３．０μｇのＤＮＡであり、最も好ましくはトランスフェクション当たりのＤＮＡ量は、約２．５μｇのＤＮＡである。
【０２５８】
好ましくは、ゲノム編集されたＢ細胞は、ゲノム編集プロセスの直後又は短い培養期間の後に使用される。臨床使用のために、ゲノム編集されたＢ細胞は使用前に照射されることがある。照射は、サイトカインの発現を誘導し、免疫エフェクター細胞の活性を促進する。
【０２５９】
エンジニアードされたＢリンパ球とその使用
更なる態様において、本発明はまた、本明細書に記載される本発明に係る方法によって得られるエンジニアードされたＢリンパ球を提供する。換言すれば、本発明はまた、本明細書に記載される本発明に係る方法によって作製されたエンジニアードされたＢリンパ球を提供する。
【０２６０】
したがって、上で概説した本発明に係るＢリンパ球のゲノムを編集するための方法の詳細な説明及び好ましい実施形態は、そのような方法によって得られるエンジニアードされたＢリンパ球にも同様に適用されることが理解される。例えば、前記した編集されたＢ細胞の詳細な説明、特に、目的の好ましい（ポリ）ペプチドは、本発明の方法によって得られるＢ細胞に同様に適用される。
【０２６１】
一般に、本発明の方法によって得られたＢ細胞は、Ｂ細胞ゲノムのスイッチ領域における異種インサートにより容易に認識することができる。
【０２６２】
したがって、本発明はまた、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種インサートをスイッチ領域に含む編集された免疫グロブリン遺伝子座を含むエンジニアードされたＢリンパ球を提供する。用語「異種」は、内在性配列、即ち、元々このゲノム位置にあった配列とは異なる配列を意味する。一般に、前記した目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子は、本質的に異種インサートに対応する。したがって、前記した目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子の詳細な説明及び好ましい実施形態は、異種インサートにも同様に適用される。特に、目的の（ポリ）ペプチドは前記したものと同一である。
【０２６３】
一般に、異種インサートは、免疫グロブリン遺伝子座のスイッチ領域に挿入される。これにより、免疫グロブリン遺伝子座が編集される。一般に、エンジニアードされたＢリンパ球についても、上で概説した本発明に係るＢリンパ球のゲノムを編集するための方法の詳細な説明及び好ましい実施形態が同様に適用される。
【０２６４】
一般に、本発明のエンジニアードされたＢリンパ球は、任意の種のものであることができる。いくつかの実施形態では、エンジニアードされたＢリンパ球は、哺乳動物のＢリンパ球である。好ましくは、本発明に係るエンジニアードされたＢリンパ球はヒトである。したがって、いくつかの実施形態では、エンジニアードされたＢリンパ球は、ニワトリ又はマウスのＢリンパ球ではない。特に、Ｂリンパ球のＩｇＬ遺伝子座は欠失されていないことが好ましい。
【０２６５】
特に、本発明に係るエンジニアードされたＢ細胞において、Ｂ細胞のゲノムは、好ましくは、Ｎ末端からＣ末端方向に、可変ドメイン、（工程（ｉｉ）で導入されたＤＮＡ分子によってコードされる）目的の（ポリ）ペプチド、及び定常ドメインを含む修飾免疫グロブリン鎖を発現するように編集される。換言すれば、Ｂリンパ球のゲノムは、好ましくは、免疫グロブリン鎖の可変ドメインと定常ドメインとの間に配置された目的の（ポリ）ペプチドを含む修飾免疫グロブリン鎖を発現するように編集される。したがって、Ｂリンパ球のゲノムは、抗体のエルボー領域に目的の（ポリ）ペプチドを含む修飾抗体を発現するように編集されることが好ましい。更に、Ｂリンパ球のゲノムは、抗体のエルボー領域に目的の（ポリ）ペプチドを含む修飾Ｂ細胞受容体を発現するように編集されることが好ましい。この文脈において、本発明に係る方法の文脈において、上で概説された詳細な説明が同様に適用される。
【０２６６】
また、Ｂリンパ球のゲノムが、修飾された免疫グロブリン鎖を発現するように編集され、内在性可変ドメインが目的の（ポリ）ペプチドによって置き換えられることが好ましい。したがって、Ｂリンパ球のゲノムを編集して、改変されたＢ細胞受容体を発現させることも好ましく、内在性可変ドメインは、目的の（ポリ）ペプチドによって置き換えられる。したがって、Ｂリンパ球のゲノムは、内在性可変ドメインに「代えて」目的の（ポリ）ペプチドを含む修飾抗体を発現するように編集されることが好ましい。ここでも、本発明に係る方法の文脈において、上で概説した詳細な説明が同様に適用される。
【０２６７】
また、Ｂリンパ球のゲノムが、修飾された免疫グロブリン鎖を発現するように編集され、内在性定常ドメインが目的の（ポリ）ペプチドによって置き換えられていることも好ましい。したがって、Ｂリンパ球のゲノムが、修飾されたＢ細胞受容体を発現するように編集され、内在性定常ドメインが目的の（ポリ）ペプチドによって置き換えられることも好ましい。したがって、Ｂリンパ球のゲノムは、内在性定常ドメインに「代えて」目的の（ポリ）ペプチドを含む修飾抗体を発現するように編集されることが好ましい。したがって、そのような修飾免疫グロブリン鎖は、（内在性）可変ドメイン、目的の（ポリ）ペプチドを含むが、（内在性）定常ドメインは含まない。ここでも、本発明に係る方法の文脈において、上で概説した詳細な説明が同様に適用される。
【０２６８】
好ましくは、本発明に係るエンジニアードされたＢリンパ球の免疫グロブリン遺伝子座のスイッチ領域は、切断部位、より好ましくは、Ｔ２Ａ切断部位などの自己プロセシング部位を含む。ここでも、本発明に係る方法の文脈において、切断部位について上で概説した詳細な説明が同様に適用される。
【０２６９】
好ましくは、本発明に係るエンジニアードされたＢリンパ球の免疫グロブリン遺伝子座のスイッチ領域は、病原体結合ドメイン、ＶＨドメイン、又はＶＨ−ＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。また、本発明に係るエンジニアードされたＢリンパ球の免疫グロブリン遺伝子座のスイッチ領域が、ＣＤ４、ジペプチジルペプチダーゼ４、ＣＤ９、又はアンギオテンシン変換酵素２、又はそれらの断片若しくは配列変異体をコードするヌクレオチド配列を含むことも好ましい。ここでも、本発明に係る方法の文脈において、上で概説した詳細な説明が同様に適用される。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、エンジニアードされたＢリンパ球は、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）又はＲＦＰ（ｔｄＴｏｍａｔｏ又はＤｓＲｅｄなどの赤色蛍光タンパク質）を発現しない。より一般的には、いくつかの実施形態では、エンジニアードされたＢリンパ球は、（蛍光）レポータータンパク質を発現しない。一般に、エンジニアードされたＢ細胞は、Ｂ細胞受容体の発現、特異性、及び／又は機能性を調節することが望まれる任意の用途に使用することができる。好ましくは、エンジニアードされたＢリンパ球は、医学、即ち、医学用途、例えば、免疫療法において使用される。この目的のために、Ｂリンパ球は、好ましくは、本明細書に記載されるようにエンジニアードされる（即ち、ゲノム編集される）。
【０２７１】
一般に、本発明に係るエンジニアードされたＢリンパ球が標的とする疾患としては、（モノクローナル）抗体で治療することができる任意の疾患が挙げられる。このような疾患としては、癌、感染症、自己免疫疾患、移植片拒絶、骨粗鬆症、黄斑変性症、多発性硬化症、及び心血管疾患が挙げられる。癌及び／又は感染症の治療及び／又は予防が好ましい。
【０２７２】
好ましくは、本発明に係るエンジニアードされたＢ細胞は、癌又は腫瘍疾患の予防、治療、及び／又は改善（のための薬剤の調製）のために使用することができる。一般に、用語「癌」は、固形腫瘍、特に肉腫、癌腫、及びリンパ腫などの悪性固形腫瘍、並びに白血病などの血液癌を含む。癌としては、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、及び芽細胞腫が挙げられる。
【０２７３】
好ましくは、本発明に係るエンジニアードされたＢ細胞は、感染症の予防、治療、及び／又は改善（のための薬剤の調製）のために使用することができる。感染症としては、ウイルス性、レトロウイルス性、細菌性、及び原虫性の各感染症が挙げられる。
【０２７４】
更に、本発明に係るエンジニアードされたＢ細胞は、自己免疫障害の予防、治療、及び／又は改善（のための薬剤の調製）のために使用することができる。通常、自己免疫疾患は、体内に常在する物質及び組織に対する体の異常な免疫応答（自己免疫）から生じる。これは、特定の臓器に限定される場合もあれば、様々な場所の特定の組織に関係する場合もある。自己免疫障害は、過敏症の対応するタイプ：タイプＩ（即ち、自家血清によって誘発される蕁麻疹）、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、又はタイプＩＶによって分類することがでいる。
【０２７５】
医療用途では、エンジニアードされたＢリンパ球を患者に投与されることが好ましい。患者に投与されるＢリンパ球は、自家Ｂリンパ球（即ち、Ｂ細胞は、Ｂ細胞又はその前駆細胞をエンジニアリング前に単離したのと同一の患者に投与される）又は同種Ｂリンパ球（別の（ヒト）起源のもの、即ち、Ｂ細胞は、エンジニアリング後に投与される患者に由来するものではない）であることができる。最も好ましくは、Ｂ細胞は自家Ｂリンパ球であり、即ち、エンジニアードされたＢリンパ球が投与される患者は、エンジニアリング前にＢリンパ球（又はその前駆細胞）が単離されたのと同一の患者である。
【０２７６】
したがって、本発明はまた、
（ａ）対象から（エンジニアードされていない）Ｂリンパ球を単離する工程、
（ｂ）本明細書に記載される本発明に係るＢリンパ球をエンジニアリングする工程、及び
（ｃ）エンジニアードされたＢリンパ球を（同一の）対象に投与する工程を含むＢ細胞療法のための方法を提供する。
【０２７７】
エンジニアードされたＢリンパ球（自家又は同種異系）を対象／患者に投与する場合、対象／患者に投与する前に、癌の（発症）に関与することが知られている変異（即ち、そのような変異がＢ細胞中で生じるかどうか）に関して、Ｂリンパ球を試験（例えば、インビトロ試験）することが好ましい。そのような癌を引き起こす変異の例としては、染色体転座が挙げられる。これにより、癌（の発症）に関与することが知られている変異を有することが特定されたエンジニアードＢリンパ球を排除することができ、即ち、癌（の発症）に関与することが知られている変異を有することが特定されたエンジニアードＢリンパ球は、患者に投与されない。これにより、癌を引き起こす変異を伴うＢ細胞を投与するリスクが大幅に低減される。
【０２７８】
Ｂ細胞における癌を引き起こす変異を試験するための方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｂ細胞の表面上での免疫グロブリンの喪失は、癌を引き起こす変異の指標である。したがって、エンジニアードされたＢ細胞は、Ｂ細胞を患者に投与する前に、保存されたＢＣＲ表面発現で選択することができる。したがって、患者にＢ細胞を投与する前に、Ｂ細胞がその表面に免疫グロブリン／Ｂ細胞受容体を発現していることを確認することが好ましい。
【０２７９】
代替的に又は追加的に、エンジニアードされたＢ細胞はまた、患者／対象に投与する前に、特定の癌遺伝子の存在についてチェックすることができる。そのような癌遺伝子の例としては、ＢＣＬ６、ＢＣＬ２（ＭＣＬ１）、ＢＣＬ１１、及びＭＡＬＴ１が挙げられる。したがって、患者にＢ細胞を投与する前に、Ｂ細胞が、癌遺伝子、例えば、ＢＣＬ６、ＢＣＬ２（ＭＣＬ１）、ＢＣＬ１１、及び／又はＭＡＬＴ１の制御不全発現（例えば、過剰発現）を示さないことを確認することが好ましい。
【０２８０】
更なる態様において、本発明はまた、本明細書に記載されるエンジニアードされたＢリンパ球の細胞株を提供する。特に、用語「細胞株」、不死化させた細胞株を意味する。不死化細胞株は、不死化されているのでインビトロで長期間増殖可能な多細胞生物由来の細胞集団である。Ｂ細胞を不死化させるための方法は当技術分野で知られている。好ましくは、ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）不死化が使用される。例えば、ＥＢＶによるＢ細胞不死化のための改良方法が、Ｔｒａｇｇｉａｉ  Ｅ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓ，  Ｓｕｂｂａｒａｏ  Ｋ，  Ｋｏｌｅｓｎｉｋｏｖａ  Ｌ，  Ｕｅｍａｔｓｕ  Ｙ，  Ｇｉｓｍｏｎｄｏ  ＭＲ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＢＲ，  Ｒａｐｐｕｏｌｉ  Ｒ，  Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  Ａ．  （２００４）：  Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｍａｋｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ：  ｐｏｔｅｎｔ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＲＳ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  １０（８）：８７１−５．に記載されている。
【０２８１】
そのような不死化Ｂ細胞株は、ヒト抗体の産生に特に有用である。したがって、本発明はまた、目的の（異種の）（ポリ）ペプチドを含む抗体又はその断片を生成するための方法を提供し、この方法は、
（１）本明細書に記載の本発明に係るエンジニアードされたＢリンパ球又はＢ細胞株を提供する工程であって、前記Ｂリンパ球が、目的の（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種インサートをスイッチ領域に含む編集された免疫グロブリン遺伝子座を含む工程、
（２）前記エンジニアードされたＢリンパ球又はＢ細胞株を培養する工程、及び
（３）前記目的の（異種の）（ポリ）ペプチドを含む抗体又はその断片をＢ細胞培養物から単離する工程を含む。
【０２８２】
抗体はＢ細胞によって分泌されるので、抗体の分離は容易である。好ましくは、単離された抗体を精製する。このことは、抗体が通常、他のポリペプチドを実質的に含まない組成物で存在することを意味し、例えば、組成物の９０％（重量）未満、通常６０％未満、更には５０％未満が他のポリペプチドで構成される。
【０２８３】
更に、本発明に係る抗体又はその断片を生成するための方法は、好ましくは、抗体又は抗体断片を特徴付けることを更に含み、特徴付けは、
−抗体又は抗体断片の機能を決定するための機能的アッセイを行うこと、
−結合アッセイを行って、前記抗体又は抗体断片の結合特異性及び／又は前記抗体又は抗体断片によって認識される結合パートナー／エピトープの結合特異性を決定すること、及び／又は
−中和アッセイを行って、前記抗体又は抗体断片の、毒素又は病原体を中和する能力を決定することを含む。
【０２８４】
機能的アッセイ、結合アッセイ、及び中和アッセイは、当技術分野で知られている。当業者であれば、抗体の機能性に応じて適切なアッセイを選択しよう。例えば、抗体が結合部位を含む場合（例えば、挿入された目的の（ポリ）ペプチドが結合部位を含む場合）、当業者は、前記結合部位の結合パートナーを用いて結合アッセイを行うことができる。
【０２８５】
更なる態様において、本発明はまた、本明細書に記載される本発明に係る抗体を生成するための方法によって得られる抗体を提供する。換言すれば、本発明はまた、本明細書に記載の本発明に係る抗体を生成するための方法によって作製された抗体を提供する。そのような抗体は、前記した目的の（ポリ）ペプチドを含む。目的の（ポリ）ペプチドは、前記した通り、抗体のエルボー領域に位置し得る。或いは、目的の（ポリ）ペプチドはまた、本明細書に記載の通り、抗体の（例えば、重鎖の）可変領域又は定常領域に置き換わることができる。
【０２８６】
更なる態様において、本発明はまた、本発明に係るエンジニアードされたＢリンパ球又は本発明に係る抗体を含む組成物を提供する。好ましくは、組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を更に含む。したがって、組成物は、好ましくは医薬組成物である。
【０２８７】
担体又は賦形剤は投与を容易にすることができるが、好ましくは、それ自体が、組成物を摂取する個体にとって有害な抗体の産生を誘導してはならない。また、毒性であってもならない。好適な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性ウイルス粒子等の、大きく、ゆっくりと代謝される巨大分子であってよい。一般的に、本発明に係る医薬組成物中の薬学的に許容し得る担体は、活性成分であっても不活性成分であってもよい。
【０２８８】
薬学的に許容し得る塩、例えば、鉱酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、及び硫酸塩）又は有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩）を用いてもよい。
【０２８９】
医薬組成物中の薬学的に許容し得る担体は、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノール等の液体を更に含有していてもよい。更に、湿潤剤若しくは乳化剤等の補助物質、又はｐＨ緩衝物質がかかる組成物中に存在していてもよい。かかる担体によって、対象に服用させるために、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、及び懸濁剤として製剤化することができるようになる。
【０２９０】
本発明の医薬組成物は、様々な形態で調製することができる。例えば、前記組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射液として調製してよい。注射する前に液体ビヒクルの溶液又は懸濁液にするのに好適な固体形態を調製してもよい（例えば、保存剤を含有する滅菌水で再構成するための、Ｓｙｎａｇｉｓ（商標）及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）と同様の凍結乾燥組成物）。前記組成物は、例えば軟膏剤、クリーム剤、又は粉剤として調製してもよい。前記組成物は、例えば錠剤若しくはカプセル剤として、噴霧剤として、又はシロップ剤として（任意で、風味付けされる）経口投与用に調製してもよい。前記組成物は、例えば微粉末又はスプレーを用いる吸入器として調製してもよい。前記組成物は、例えば点眼剤として調製してもよい。前記組成物は、例えば対象に投与する直前に、複合組成物が再構成できるように設計されたキット形態であってもよい。例えば、凍結乾燥した抗体を、滅菌水又は滅菌バッファと共にキット形態で提供してよい。
【０２９１】
組成物中の活性成分は、本発明に係るエンジニアードＢ細胞又は抗体であることが好ましい。組成物は、分解から抗体を保護する又はＢ細胞の生存率を保証する薬剤を含んでもよい。
【０２９２】
薬学的に許容し得る担体についての詳細な検討は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２から入手可能である。
【０２９３】
本発明の医薬組成物は、一般的に、５．５〜８．５のｐＨを有し、幾つかの実施形態では、これは、６〜８であり、他の実施形態では、約７である。ｐＨは、バッファを使用することによって維持することができる。前記組成物は、無菌及び／又はパイロジェンフリーであってよい。前記組成物は、ヒトに対して等張であってよい。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、密封容器で提供される。
【０２９４】
前記組成物は、油性又は水性のビヒクルの懸濁液、溶液、又はエマルションの形態をとってもよく、特に、懸濁化剤、保存剤、安定剤、及び／又は分散剤等の調合剤を含有していてもよい。或いは、抗体分子は、適切な無菌液体を用いて使用前に再構成するために乾燥形態であってもよい。
【０２９５】
前記組成物は、水又は生理食塩水などのビヒクルを含んでもよい。ビヒクルは、典型的には、薬学的活性化合物等の化合物、特に、本発明に係る抗体を保存、輸送、及び投与するのに好適な物質であると理解される。例えば、ビヒクルは、薬学的活性化合物、特に、本発明に係る抗体を保存、輸送、及び／又は投与するのに好適な生理学的に許容し得る液体であってよい。
【０２９６】
前記組成物は、パイロジェンフリーであり且つ好適なｐＨ、等張性、及び安定性を有する非経口的に許容し得る水溶液であることができる。当業者は、例えば、生食注射、リンゲル液、乳酸加リンゲル液等の等張ビヒクルを用いて好適な溶液をうまく調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／又は他の添加剤が含まれていてもよい。本発明に係る組成物を、例えばプレフィルドシリンジで提供してよい。
【０２９７】
上に定義された組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、又は液剤が挙げられるがこれらに限定されない剤形であってもよい。錠剤の場合、一般的に使用される担体としては、ラクトース及びコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤も典型的に添加される。カプセル形態の場合、有用な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁剤が必要な場合、活性成分を乳化剤及び懸濁化剤と合わせてもよい。必要に応じて、特定の甘味剤、着香剤、又は着色剤を添加してもよい。
【０２９８】
前記組成物に含有される担体の更なる例としては、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス及び水が挙げられるが、これらに限定されない。或いは、本発明の医薬組成物は、好適なローション又はクリームに製剤化することもできる。本発明において、好適な担体としては、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９９】
一実施形態では、本発明の組成物は、本発明の抗体を含むことができ、抗体は、組成物中の総タンパク質の少なくとも５０重量％（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）を構成することができる。そのような組成物において、抗体は、精製された形態であることが好ましい。
【０３００】
医薬組成物は、特に複数回投与フォーマットにパッケージ化されている場合、抗微生物剤を含んでいてよい。前記医薬組成物は、洗浄剤、例えばＴｗｅｅｎ８０等のＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含んでいてよい。洗浄剤は、一般的に、低濃度、例えば、０．０１％未満で存在する。また、組成物は、等張にするためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含んでいてもよい。例えば、１０±２ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ濃度が典型的である。
【０３０１】
更に、医薬組成物は、特に、凍結乾燥される場合又は凍結乾燥物質から再構成された物質を含む場合、例えば、約１５ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ（例えば、２５ｍｇ／ｍＬ）の糖アルコール（例えば、マンニトール）又は二糖（例えば、スクロース又はトレハロース）を含んでいてよい。凍結乾燥用組成物のｐＨは、凍結乾燥前に５〜８、又は５．５〜７、又は約６．１に調整してよい。
【０３０２】
本発明の組成物はまた、１つ以上の免疫調節剤を含むことができる。一実施形態では、免疫調節剤の１つ以上はアジュバントを含む。
【０３０３】
本発明に係るエンジニアードされたＢ細胞又は抗体を含む組成物は、好ましくは、医学における使用、即ち医薬として使用するためのものである。この文脈において、エンジニアードされたＢ細胞の医学的使用について前記した詳細な説明が同様に、例えば、治療対象疾患に関して適用される。
【０３０４】
したがって、本発明はまた、本発明に係る抗体、本発明に係るエンジニアードされたＢ細胞、又は本発明に係る組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む免疫療法のための方法を提供する。
【０３０５】
以下、添付図面の簡単な説明をする。図面は、本発明をより詳細に説明することが意図されている。しかし、それらは本発明の主題を何ら限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０３０６】
【図１】図１は、所望の特異性（目的の（ポリ）ペプチド）を含む抗体を生成する余剰なエキソンエレメント（目的の（ポリ）ペプチド）の統合による、１４番染色体上の抗体スイッチ領域のＡＩＤ媒介Ｂ細胞エンジニアリングの概要を示す図である。
【図２】図２は、本発明にしたがってエンジニアードされたＢ細胞から得られる抗体鎖をコードするエンジニアード遺伝子の概略例及びそれぞれの抗体の概略を示す図である。（Ａ）抗体のエルボー領域（可変領域と定常領域の間）に追加のインサートを含む例。（Ｂ）Ｔ２Ａプロテアーゼ切断部位を含む例、例えば、抗体の元の可変領域を置き換える例。Ｖ、Ｄ、Ｊ−元のＶ、Ｄ、Ｊ遺伝子。Ｃｏｎｓｔａｎ−元の定常ドメイン。Ｔ２Ａ−導入されたＴ２Ａ切断部位。ＶＨ−導入された重鎖可変領域。ＶＬ−導入された軽鎖可変領域。受容体ドメイン−導入された受容体ドメイン。
【図３】図３は、ゲノムＬＡＩＲ１挿入を検出するための実施例（ｅｘｐ）（実施例１；ｅｘｐ１）、ＬＡＩＲ１−Ａｂ発現初代Ｂ細胞産生、及びソーティング（実施例２；ｅｘｐ２）又はハイスループットスクリーニング（実施例３；ｅｘｐ３）による選択の概要を示す図である。日数は、刺激ヌクレオフェクションが行われてから何日間後かを示し、「ヌクレオフェクション」の列の記載は、ヌクレオフェクションに使用される核酸の特徴を示し、「スクリーニング」の列の記載は、どのタイプのスクリーニングが行われたかを示す。
【図４】図４は、実施例１に関し、（Ａ）スイッチ領域ＰＣＲの設計、及び（Ｂ）二本鎖（ｄｓＤＮＡ）ＬＡＩＲ１基質のヌクレオフェクション後のＭｉｎＩＯＮシークエンシング技術による長いスイッチμ領域ＰＣＲアンプリコンでのコドン最適化ＬＡＩＲ１（部分的組み込みを含む）の検出結果を示す図である。
【図５】図５は、実施例２に関し、（Ａ）ネガティブコントロール（ＭＭＥ１７）及びポジティブコントロール（ＭＭＪ５）コントロールＢ細胞株と比較した、ＦＡＣＳソーティングによってヌクレオフェクション後に選択された、ＬＡＩＲ１含有抗体を発現する、本発明にしたがって生成されたＢ細胞株のＬＡＩＲ１及びＩｇＭ表面共染色、及び（Ｂ）ＬＡＩＲ１野生型及びＬＡＩＲ１  ＣＨ１／Ｊ６イントロン最適化基質でヌクレオフェクトされたＢ細胞株によって分泌された人工ＬＡＩＲ１含有抗体のビーズプルダウン及びＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図６】図６は、実施例２に関し、（Ａ）培養上清のＬＡＩＲ１及びＩｇＭ特異的ウエスタンブロット、（Ｂ）組換えＬＡＩＲ１含有抗体を発現するエンジニアードされたＢ細胞株から単離されたゲノムＤＮＡのスイッチμフォワード及びＬＡＩＲ１リバースプライマーを使用したＰＣＲ増幅、及び（Ｃ）スイッチ領域と、スイッチ領域を灰色で強調表示した５’ＬＡＩＲ１インサートカバー領域と、太字のスプライスアクセプター部位と黒色のＬＡＩＲ１エキソンを有するライトグレーのＬＡＩＲ１イントロンとのＰＣＲ産物配列アラインメントを示す図である。
【図７】図７は、実施例３に関し、（Ａ）６００００細胞と３５０００細胞のそれぞれのハイスループットスクリーニングによって検出された組換えＬＡＩＲ１含有抗体を発現するエンジニアードされたＢ細胞株の頻度を示し、細胞は、ＬＡＩＲ１野生型基質又はＣＨ１／Ｊ６イントロン最適化バージョンのいずれかでヌクレオフェクトされており、ＩＩ）のスクリーニング条件は、培養上清中の抗体濃度を高めるために培養時間を延ばしつつ、細胞播種数を減らすことによって最適化されている、及び（Ｂ）抗ＬＡＩＲ１対コントロールビーズによって捕捉されたＩｇＭのＭＦＩ比を測定する２枚の３８４ウェル培養プレートのビーズスクリーニングの例であり、白丸はポジティブコントロールを示し、矩形は人工ＬＡＩＲ１含有抗体を分泌する培養物を示す図である。
【図８】図８は、実施例４に関し、（Ａ）ＰＢＭＣの照射後のＤＮＡ二本鎖切断を示すＨ２ＡＸ染色（ＦＡＣＳプロット）及び（Ｂ）ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ４刺激及びＡＩＤ誘導後の初代Ｂ細胞を示す図である（ＭＦＩ＝平均蛍光強度）。
【図９】図９は、実施例４に関し、（Ａ）ｐＭＡＸ−ＧＦＰコントロールプラスミドのＮＥＯＮヌクレオフェクションの２日間後の生存及びＧＦＰ発現初代Ｂ細胞の％を示し、（Ｂ）ＦＡＣＳプロットが、更なるスクリーニング実験に使用したモックヌクレオフェクタントのゲーティング戦略と条件ｄ）（２１５０Ｖ、１０ｍｓ、２パルス）を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例５の原理と結果を示し、（Ａ）インビトロスイッチ挿入は、ｃ−ＮＨＥＪに依存する、（Ｂ）ナイーブソートＢ細胞をＣＤ４０Ｌ及びＩＬ４で刺激し、ｃ−ＮＨＥＪ（ＳＣＲ７）、ａ−ＮＨＥＪ（Ｏｌａｐａｒｉｂ）、又は逆転写酵素（ｄｄＩ／ＡＺＴ）の阻害剤の存在下で９日間培養し、天然のスイッチインサートは、ＭｉｎＩＯＮシークエンシング技術によって、５０，０００個インビトロＩｇＧ＋スイッチＢ細胞で検出した図である。
【図１１】図１１は、スプライス部位認識のためのイントロン最適化の概略図を示す図である。
【実施例】
【０３０７】
実施例
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書に記載するものと類似又は等価な方法及び材料を本発明の実施又は試験で用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に記載する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照文献は、その全体が参照によって援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。更に、材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。
【０３０８】
実施例１：本発明にしたがってエンジニアードされた、組換え抗体を発現するＢ細胞の生成。
実施例１〜３の根本的目的は、単離されたヒトＢ細胞の免疫グロブリンスイッチ領域が遺伝子改変の標的となり、その後、組換え抗体の産生をもたらすことを実証することとした。一例として、いくつかの実験が成功裏に行われ、ＬＡＩＲ１ドメインが挿入された抗体を産生するエンジニアードされたヒト初代Ｂ細胞が生成された（実施例１〜３）。
【０３０９】
方法：
Ｂ細胞の単離、シミュレーション、及びヌクレオフェクション  初代ヒトＢ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃの抗ＣＤ１９マイクロビーズを用いた磁気セルソーティングによって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。１０００００／ｍｌのＢ細胞を１２ウェルに播種した。ＣＤ４０Ｌを発現し、照射されたＫ５６２Ｌ細胞を、Ｂ細胞に１：２の比で添加した。ヒト組換えＩＬ４を１６ｎｇ／ｍｌで添加した。翌日、細胞を８ｎｇ／ｍｌのＩＬ４で再刺激した。ヌクレオフェクションは、細胞播種後１日間目、ＩＬ４再刺激後４時間で行う、又は更に培養し、３日間ごとに８ｎｇ／ｍｌのＩＬ４で再刺激し、指定の時点でヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションでは、Ｂ細胞を回収し、ＮＥＯＮ（登録商標）デバイスを製造元の指示にしたがって２１５０Ｖ、１０ｍｓ、２パルスで使用して、２×１０６Ｂ細胞に１μｇのＤＮＡをヌクレオフェクトした。
【０３１０】
ＤＮＡヌクレオフェクション生成物  コドン最適化されたＬＡＩＲ１を、自社のコドン最適化ツールを使用したＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）からの遺伝子合成によって配列させた。ｓｓＤＮＡの生成には、「ロング一本鎖ＤＮＡ（ＬｓＯＤＮ）調製キット」（フナコシ）を使用した。コドン最適化されたＬＡＩＲ１をｐＬＳＯＤＮ−１ベクターにクローニングした。ベクターの制限酵素消化を行って、コドン最適化されたＬＡＩＲ１のｓｓＤＮＡ又は平滑末端／粘着末端ｄｓＤＮＡを生成した。
【０３１１】
配列解析  市販のキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ヌクレオフェクションの７日後にヌクレオフェクトされたＢ細胞からｇＤＮＡを単離した。ｇＤＮＡのスイッチ領域ＰＣＲは、ＬｏｎｇＡｍｐ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を５０μｌの反応量で９５℃にて３分間インキュベートした後、９５℃で４０秒間、６０℃で３０秒間、６５℃で３分間を３０サイクル行い、６５℃で１０分間の最終伸長を行った。上流スイッチ−μフォワードプライマーＳ−μ−ＦＷ（ｃａｃｃｃｔｔｇａａａｇｔａｇｃｃｃａｔｇｃｃｔｔｃｃ；配列番号９６）をＳ−γ−ＲＥＶ（ｃｃｔｇｃｃｔｃｃｃａｇｔｇｔｃｃｔｇｃａｔｔａｃｔｔｃｔｇ；配列番号９７）と組み合わせた。代わりに、ヌクレオフェクトされたＢ細胞ｇＤＮＡのスイッチ−μ領域は、Ｓ−μ−ＦＷプライマーをＳ−μ−ＲＥＶ（ｇｇａａｃｇｃａｇｔｇｔａｇａｃｔｃａｇｃｔｇａｇｇ；配列番号９８）と組み合わせて増幅させた。ＰＣＲ反応は、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を、５０μｌ量中、１Ｍベタインと３％ＤＭＳＯと共に用いて、９８℃で４分間、続いて９８℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、及び７２℃で４分間を３０サイクル行い、７２℃で３０分間の最終伸長を行った。スイッチ領域ＰＣＲの設計の概要を図４Ａに示す。オリゴクローナルＢ細胞培養物からサイズ選択され精製されたスイッチアンプリコンを、ＭｉｎＩＯＮ／Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＯＮＴ）でシークエンシングした。バーコードは、推奨されるＢＣ配列をＳ−μ及びＳ−γプライマーに追加し、ＰＣＲ増幅することによって導入した。シークエンスライブラリは、Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ２ＤシークエンスキットＳＱＫ−ＬＳＫ２０７を使用して準備し、続いてＮａｎｏｐｏｒｅフローセルＦＬＯ−ＭＩＮ１０６にロードし、ＭｉｎＩＯＮＭｋ１Ｂシークエンサーで最大２０時間シークエンシングした。
【０３１２】
最初の実験で使用したＤＮＡ基質は、コドン最適化されたＬＡＩＲ１エキソンと以下のヌクレオチド配列を有する野生型隣接イントロン配列とを有するｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡバージョンを含んだ。
2021525517.tif 000002
［配列番号９９］
（目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列には、下線が施されている。５’及び３’スプライス認識部位は、太字及び斜体で示す。）
【０３１３】
結果
一般に、ｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡの両方の基質によるヌクレオフェクションにより、Ｂ細胞ゲノムへの核酸基質の組み込みが成功した。一例として、図４Ｂは、ｄｓＤＮＡで得られた結果を示す。
【０３１４】
実施例２：本発明にしたがってエンジニアードされた、組換え抗体を発現するＢ細胞株の更なる検証。
ＬＡＩＲ１を含む抗体の生産的な挿入と発現の証拠を提供するために、初代Ｂ細胞をｄｓＤＮＡ  ＬＡＩＲ１野生型基質でヌクレオフェクトし、ＬＡＩＲ１とＩｇＭの共染色についてセルソーティングでスクリーニングした。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）不死化後に、天然のＬＡＩＲ１受容体はダウンレギュレートされることから、この実験条件では、天然の受容体をエンジニアードされたＢ細胞受容体と区別するためにＥＢＶ株を生成した。
【０３１５】
ヌクレオフェクション用のＬＡＩＲ１野生型（ｗｔ）産物を調製するために、以下のプライマー（ＬＡＩＲ１＿ＩＮ＿ＦＷ  ｃｃａｃｃｔｃｃａａａｃｇｇｃａｇｇｃａｔｃｃ（配列番号１００）；ＬＡＩＲ１＿ＩＮＴＲ＿ＲＥＶ  ｃｃａａａｇｇｃｃｇｃａｔｇａｃｃａｔｃａｃｇｃ（配列番号１０１））を使用してヒトゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）からヒト野生型ＬＡＩＲ１をＰＣＲ増幅した。ヒト免疫グロブリン遺伝子座に由来するＬＡＩＲ１エキソン及びイントロンを含むキメラＤＮＡ産物は、まず、プライマーＩｇＭ−ＣＨ１−ＩＮ−ｆｗ  ｃｃｔｃａｇｃｔｇａｇｔｃｔａｃａｃｔｇｃｇｔｔｃｃ（配列番号１０２）、ＩｇＭ−ＣＨ１−ＩＮ−ｒｅｖ  ｃｔｇａｇｇａｃｃｃｇｃａｇｇａｃａａａａｇａｇａａａｇｇｇ（配列番号１０３）、Ｊ６−ＩＮ−ｆｗ  ｇｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａｇｇｔａａｇａａｔｇｇｃｃ（配列番号１０４）、Ｊ６＿ＩＮ−ＲＥＶ  ｇｃｃｔｔｔｔｃａｇｔｔｔｃｇｇｔｃａｇｃｃｔｃｇｃ（配列番号１０５）を用いて単一産物を増幅することにより生成し、次いで、それらを、ＬＡＩＲ１−ＣＨ１−ＦＷ  ｇｃｇｇｇｔｃｃｔｃａｇａａｇａｔｃｔｇｃｃｃａｇａｃｃｃ（配列番号１０６）及びＬＡＩＲ１−Ｊ６−ＲＥＶ  ｇｇｃｃａｔｔｃｔｔａｃｃｔｔｔｃａｃｃａｇｃａｇｃｔｃｃａｇｇ（配列番号１０７）を用いて、オーバーラッププライマーでＰＣＲによりＬＡＩＲ１ｗｔアンプリコンと融合させることによって生成した。最適化されたバージョンは、プライマーＬＡＩＲ１−ＣＨ１−ｏｐｔ−ＦＷ  ｇｃｇｇｇｔｃｃｔｃａｇｇｇｇａａｇａｔｃｔｇｃｃｃａｇａｃｃｃ（配列番号１０８）及びＬＡＩＲ１−Ｊ６−ＲＥＶ  ｇｇｃｃａｔｔｃｔｔａｃｃｔｇａｇｇａｇａｃｇｇｃｔｔｔｃａｃｃａｇｃａｇｃｔｃｃａｇｇ（配列番号１０９）を使用して生成した。増幅中にポリメラーゼによって導入される変異を最小限にするために、標準的ＰＣＲ増幅プログラムを適用して、高いプルーフリーディング活性を備えたＱ５（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用した。
【０３１６】
前記したように、Ｂ細胞を単離し、刺激し、ヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションの１日間後、前述しように３７℃で回動させつつ４時間のウイルスインキュベーションを行うことにより、Ｂ細胞をエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）で不死化させた。（Ｔｒａｇｇｉａｉ  Ｅ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓ，  Ｓｕｂｂａｒａｏ  Ｋ，  Ｋｏｌｅｓｎｉｋｏｖａ  Ｌ，  Ｕｅｍａｔｓｕ  Ｙ，  Ｇｉｓｍｏｎｄｏ  ＭＲ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＢＲ，  Ｒａｐｐｕｏｌｉ  Ｒ，  Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  Ａ．  Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｍａｋｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ：  ｐｏｔｅｎｔ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＲＳ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ２００４  Ａｕｇ；１０（８）：８７１−５．  Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｊｕｌ  １１）。Ｂ細胞を洗浄し、ＣｐＧ−ＤＮＡ（２．５μｇ／ｍｌ）の存在下で２４ウェル培養液に１×１０６／ｍｌにてバルクでプレーティングした。Ｂ細胞自身のＬＡＩＲ１野生型受容体の不死化とダウンレギュレーションの１週間後、Ｂ細胞を、まず、モノクローナル抗ＬＡＩＲ１  ＰＥコンジュゲート（クローンＤＸ２６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５５０８１１）及び抗−ＩｇＭ  ＡＰＣコンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９−６０６−１２９）で標識し、その後、ＦＡＣＳソーティングを行って、ＬＡＩＲ１とＩｇＭの共発現について選択した。ＬＡＩＲ１とＩｇＭを共発現した細胞を９６Ｕウェルにプレーティングし、２週間増殖させた後、ＦＡＣＳソーティングで繰り返し選択した。細胞株から単離されたｇＤＮＡのゲノム解析及びスイッチμ領域のＰＣＲ増幅を前記したように行い、続いてサンガーシークエンシングを行った。
【０３１７】
ＥＢＶ不死化Ｂ細胞によるＬＡＩＲ１含有抗体の分泌を確認するために、培養上清をウエスタンブロット分析によって分析した。上清を水で希釈し、４×サンプルローディングバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１０×還元剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に７０℃で１０分間インキュベートした。サンプルを、４〜１２％のアクリルアミド勾配（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するプレキャストゲルにロードした。タンパク質をｉＢｌｏｔ２装置（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＰＶＤＦメンブランに転写した後、ＴＢＳ中３％ＢＳＡで室温にて１時間ブロッキングした。メンブランを、ＴＢＳ／１％ＢＳＡで希釈した一次抗体と二次抗体の各種組合せと共に室温で１時間インキュベートし、２回の連続したＴＢＳインキュベーションを行って、インキュベーションの間にはメンブランを洗浄した。ＩｇＭアイソタイプは、１０μｇ／ｍｌの非標識ヤギ抗ヒトＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０２０−０１）及び８ｎｇ／ｍｌロバ抗ヤギＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、７０５−０３６−１４７）で染色した。ＬＡＩＲ１含有抗体は、２μｇ／ｍｌのポリクローナルヤギ抗ヒトＬＡＩＲ１抗体（Ｒ＆Ｄ）を二次ロバ抗ヤギＨＲＰと組み合わせて検出した。メンブランは、Ｌａｓ４０００ｉｍａｇｅｒ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）にてＥＣＬ基質で発色させた。
【０３１８】
図５は、ＦＡＣＳ分析の結果を示す。図５Ａは、表面にＬＡＩＲ１−ＩｇＭを発現するＢ細胞が成功裏に生成されたことを示す。ＬＡＩＲ１ドメインの分泌抗体への組み込みは、前記したようにビーズキャプチャーアッセイ（図５Ｂ）及びウエスタンブロット分析（図６Ａ）によって確認した。更に、ＬＡＩＲ１野生型エキソンが、免疫グロブリン遺伝子座イントロン領域、即ち、Ｊセグメント下流イントロンと、以下の配列を有するＣＨ１上流イントロン（ＬＡＩＲ１  ＣＨ１／Ｊ６と命名する）とによって隣接される基質を使用して、組み込みも成功した。
2021525517.tif 000003
［配列番号１１０］
（目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列には、下線が施されている。５’及び３’スプライス認識部位は、太字及び斜体で示す。）
【０３１９】
ＬＡＩＲ１野生型配列のスイッチ領域へのゲノム挿入は、特異的ＰＣＲ反応と配列解析によって確認した（図６Ｂ、Ｃ）。
【０３２０】
実施例３：本発明にしたがってエンジニアードされた、組換え抗体を発現するＢ細胞株の更なる検証。
ＬＡＩＲ１含有抗体を産生する成功裏にヌクレオフェクトされた細胞の頻度を評価するために、３８４ウェル形式にウェルの培養液当たり１０〜３０個の細胞をＬＡＩＲ１捕捉ビーズアッセイでスクリーニングした。
【０３２１】
Ｂ細胞の単離、刺激、ヌクレオフェクション、及びＥＢＶ不死化を、前記したように行った。ウイルスのインキュベーション後、フィーダー細胞として２５０００個の照射された自家ＰＢＭＣ及びＣｐＧ−ＤＮＡ（２．５μｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｂ細胞を１０又は３０細胞／ウェルでプレーティングした。２週間の培養後、細胞の上清を２つの決定因子ビーズベースのイムノアッセイによってＬＡＩＲ１含有抗体の分泌について分析した。したがって、抗ヤギＩｇＧマイクロビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）は、ヤギ抗ヒトＬＡＩＲ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ２６６４）又はコントロール抗体ヤギ抗ヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ−２５９−ＮＡ）で室温で２０分間コーティングした。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＬＡＩＲ１抗体コーティング溶液に４０倍で添加して、ＬＡＩＲ１コーティングとコントロールビーズを区別した。ビーズを洗浄し、混合し、不死化Ｂ細胞の上清と室温で３０分間インキュベートした。ビーズを捕捉し、ＬＡＩＲ１含有抗体を２．５μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲートロバ抗ヒトＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、７０９−６０６−０７３）を使用して検出した。
【０３２２】
結果を図７に示す。結果は、約１２０００個の初代Ｂ細胞における１つの生産的挿入の頻度を示す（図７Ａ、Ｂ）。
【０３２３】
実施例４：ヌクレオフェクションの時点と条件の最適化。
この実施例では、ヌクレオフェクションの最適な時点と条件を検証した。
【０３２４】
Ｂ細胞を、抗ＣＤ１９ビーズを用いた磁気セルソーティングによってＰＢＭＣから単離し、前記したように、ＣＤ４０Ｌを発現するＫ５６２Ｌ細胞及びＩＬ４で刺激した。ＤＮＡ二本鎖切断の誘導を評価するために、指定の時点で細胞を回収し、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、９０％メタノールで透過処理（ｐｅｒｍａｂｉｌｉｚｅｄ）し、−２０℃で保存した。分析の当日、細胞を０．２５μｇ／ｍｌのウサギ抗γ−Ｈ２ＡＸ（ヒストンＨ３、クローンＤ１Ｈ２、＃１２１６７Ｓ、細胞シグナリング）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。抗体染色の特異性のためのコントロールとして、照射又は未処理のＰＢＭＣＳによる染色を行った。
【０３２５】
培養開始後１〜１０日間でＢ細胞をヌクレオフェクトした。結果を図８に示す。図８ＢのＨ２ＡＸヒストンマーカーの染色で示されるように、ＤＮＡ二本鎖切断の最大値は、２〜３日間目で達成される。
【０３２６】
次に、Ｂ細胞をＮｅｏｎ（登録商標）トランスフェクションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２１５０Ｖ  １０ｍｓ  １パルス、２１５０Ｖ  １５ｍｓ  １パルス、２１５０Ｖ  ２０ｍｓ  １パルス、２１５０Ｖ  １０ｍｓ  ２パルス、２４００Ｖ  １０ｍｓ  １パルス、２４００Ｖ  １５ｍｓ  １パルス、２１５０Ｖ  ２０ｍｓ  １パルス、２５００Ｖ  １０ｍｓ  １パルス、及び２５００Ｖ  １５ｍｓ  １パルスの各種条件下でヌクレオフェクトした。結果を図９に示す。いずれの条件下でも、成功裏にヌクレオフェクションが行われた。最も良い結果は、２１５０Ｖ、１０ｍｓ、２パルスで得られた。
【０３２７】
実施例５：スイッチ領域でのインサート獲得に対するｃ−ＮＨＥＪとａ−ＥＪの影響。
エンジニアリング効率を高めるために、インビトロシステムを用いて、天然インサートの獲得に対するｃ−ＮＨＥＪ及びａ−ＥＪの影響を研究した。
【０３２８】
この目的のために、抗ＣＤ１９ビーズを使用した磁気ビーズによってＢ細胞を単離し、続いてＦＡＣＳソーティングとナイーブＢ細胞（ＩｇＭ＋  ＩｇＤ＋  ＣＤ２７−  ＩｇＧ−  ＩｇＡ−）の選択を行った。細胞を、５００００Ｂ細胞／ｍｌの濃度で４８ウェルプレートにプレーティングし、２５０００照射Ｋ５６２Ｌ／ｍｌ及び８ｎｇ／ｍｌのＩＬ４で刺激した。コントロールとして、ＤＮＡ修復阻害剤Ｏｌａｐａｒｉｐ（４ｎＭ）、ＳＣＲ７（１００ｎＭ）、又はＤＭＳＯ（１：１００）を培地に添加した。３日間目及び６日間目に、ＩＬ４及び阻害剤を添加した新鮮な培地と交換した。１０日間目に細胞を回収し、蛍光標識した抗ＣＤ１９及び抗ＩｇＧ抗体で染色した。スイッチされたＩｇＧ  Ｂ細胞をフローサイトメトリーでソートし、市販のキットを使用してｇＤＮＡを単離した。前記したように、５００００個のソートされた細胞のゲノムＤＮＡをγスイッチ領域ＰＣＲ増幅及びＭＩＮＩＯＮシークエンシングに使用した。インサート頻度は、バイオインフォマティクスパイプラインで分析した（Ｐｉｅｐｅｒ  Ｋ，  Ｔａｎ  Ｊ，  Ｐｉｃｃｏｌｉ  Ｌ，  Ｆｏｇｌｉｅｒｉｎｉ  Ｍ，  Ｂａｒｂｉｅｒｉ  Ｓ，  Ｃｈｅｎ  Ｙ，  Ｓｉｌａｃｃｉ−Ｆｒｅｇｎｉ  Ｃ，  Ｗｏｌｆ  Ｔ，  Ｊａｒｒｏｓｓａｙ  Ｄ，  Ａｎｄｅｒｌｅ  Ｍ，  Ａｂｄｉ  Ａ，  Ｎｄｕｎｇｕ  ＦＭ，  Ｄｏｕｍｂｏ  ＯＫ，  Ｔｒａｏｒｅ  Ｂ，  Ｔｒａｎ  ＴＭ，  Ｊｏｎｇｏ  Ｓ，  Ｚｅｎｋｌｕｓｅｎ  Ｉ，  Ｃｒｏｍｐｔｏｎ  ＰＤ，  Ｄａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｃ，  Ｂｕｌｌ  ＰＣ，  Ｓａｌｌｕｓｔｏ  Ｆ，  Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  Ａ：  Ｐｕｂｌｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｍａｌａｒｉａ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｗｏ  ＬＡＩＲ１  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１７．  Ａｕｇ  ３１  ；  ５４８（７６６９）：５９７−６０１）。
【０３２９】
一般原理を図１０Ａに示し、結果を図１０Ｂに示す。結果からＳＣＲ７の存在下でのインサート頻度が減少する一方で、Ｏｌａｐａｒｉｂの培養培地への添加時には上昇するので、天然のスイッチインサートがｃ−ＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復経路に依存することが示された（図１０Ａ、Ｂ）。したがって、阻害剤Ｏｌａｐａｒｉｂの存在下でのＢ細胞エンジニアリングは、エンジニアリング効率を高めることが可能である。同様に、ｃ−ＮＨＥＪを介した修復の最初のイベントであるＤＮＡ結合タンパク質Ｋｕ７０／８０とのＤＮＡ基質のプレインキュベーション、及びＤＮＡ−Ｋｕ７０／８０タンパク質複合体のヌクレオフェクションにより、成功した組み込み数を増やすことができる（図１０Ａ）。
【０３３０】
配列及び配列番号の表（配列表）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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