(57)【要約】  強力なヒト及びマウスＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）１／ＴＬＲ２アゴニストとして同定され、最適化されたジプロボッシムは、ヒトＴＨＰ−１細胞において１１０ｐＭ、及び初代マウス腹腔マクロファージにおいて１．３ｎＭのＥＣ50を示した。マウスでは、ジプロボッシムをアジュバントとするオボアルブミン免疫が抗原特異的ヒト及びＣＴＬ応答を促進し、かつ抗ＰＤ−Ｌ１治療と組み合わせることで腫瘍増殖を抑制して、長期抗腫瘍記憶を生成し、マウスメラノーマＢ１６−ＯＶＡを生着させたマウスを治癒、又は生存期間を延長する相乗効果を示した。腫瘍浸潤性白血球のＣＤ８Ｔ細胞は免疫と抗ＰＤ−Ｌ１治療の組み合わせの抗腫瘍効果に必要であるが、ジプロボッシムはミョウバンと比べて腫瘍浸潤性白血球の出現頻度を大幅に誘導した。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において疾患細胞の増殖を抑制する方法であって、前記疾患細胞が、前記疾患にかかっていない同種の細胞上に存在しない、又は前記疾患細胞と比べて有意に少ない数で無疾患細胞上に存在するマーカー分子を発現する方法において、以下の工程：
ａ）前記罹患哺乳動物に（ｉ）アジュバントに十分な量のジプロボッシム化合物、（ｉｉ）Ｔ細胞刺激量の免疫チェックポイント阻害剤、及び（ｉｉｉ）免疫量の前記マーカー分子又はその部分を投与する工程；
ｂ）前記免疫された哺乳動物が、前記免疫に対して免疫応答を開始するのに十分な時間にわたって、維持される工程
を含み、
前記ジプロボッシム化合物の構造が、構造式Ｖ、
【化１】
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に相当し、
前記上式において、
−Ａは、−Ｈ（ヒドリド）又は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ4であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4は、同一又は異なり、かつ２−（４−フルオロフェニル）エチル基、トランス−２−フェニルシクロプロピル基、トランス−２−（４−フルオロフェニル）−シクロプロピル基、又はＣ2−Ｃ18ヒドロカルビル基であり、
ただし、
１）Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4（Ｒ1-4）のうち少なくとも２つ、若しくはＲ1、Ｒ2、及びＲ3（Ｒ1-3）のうち少なくとも２つが、トランス−２−フェニルシクロプロピル基、トランス−２−（４−フルオロフェニル）−シクロプロピル基、若しくはこれらの混合物であり、又はＲ1-4のそれぞれが２（４−フルオロフェニル）エチル基であり、
２）式中のピロリジニルジカルボキサミド基の少なくとも１つが（Ｓ，Ｓ）配置を有し、かつＲ1-4のそれぞれが２−（４−フルオロフェニル）エチル基以外のとき、Ｃ2−Ｃ18ヒドロカルビル基以外の式中のＲ置換基のそれぞれが、トランス−２−フェニルシクロプロピル基、トランス−２−（４−フルオロフェニル）−シクロプロピル基、又はこれらの混合物であり、
３）−Ａが−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ4のとき、Ｒ1-4のうち２つ以下がＣ2−Ｃ18ヒドロカルビル基であり、そして
４）Ａがヒドリドのとき、Ｒ1-3のうち１つがＣ2−Ｃ18ヒドロカルビル基となり得、かつ式中のＲ3を含むピロリジニルカルボキサミド基が、Ｒ若しくはＳ配置のいずれか、又は両方の配置の混合を有し得、
−Ｚは、ハロゲン  −Ｈ、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＯＣＨ3、−ＮＯ2、
−ＯＣＨ2ＣＯ2Ｈ、−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、
−ＮＨＣＯＣＨ2Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨＯＨ）ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨＣＯ2Ｈ（ＣＨ2ＣＯ2Ｈ）、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ［（ＣＨ2）4ＮＨ2］ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）ＣＯ｛ＮＨＣＨ［（ＣＨ2）4ＮＨ2］ＣＯ｝mＮＨＣＨ−［（ＣＨ2）4ＮＨ2］ＣＯ2Ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ番号：３−８）、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯ｛ＮＨＣＨ［（ＣＨ2）4ＮＨ2］ＣＯ｝pＮＨＣＨ［（ＣＨ2）4ＮＨ］ＣＯ2Ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ番号：９−１３）、及び
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯ｛ＮＨＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）ＣＯ｝qＮＨＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）ＣＯ2Ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ番号：１４−１８）のうち１以上であり；
Ｗは、窒素（Ｎ）又はＣＨであり；
「ｎ」は、平均値が１〜約８の数であり；
「ｍ」は、値が１〜約６の数であり；
「ｐ」は、値が１〜約６の数であり；並びに
「ｑ」は、値が１〜約６の数である、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ジプロボッシム化合物、免疫チェックポイント阻害剤、及びマーカー分子が、免疫医薬組成物に溶解又は分散させて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ジプロボッシム化合物、免疫チェックポイント阻害剤、及びマーカー分子又はこれらの部分が、別個の免疫医薬組成物に溶解又は分散させて投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ジプロボッシム化合物及びマーカー分子又はその部分が、同一の免疫医薬組成物に溶解又は分散させて投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ジプロボッシム化合物、免疫チェックポイント阻害剤、及びマーカー分子又はその部分が、同一の免疫医薬組成物から溶解又は分散させて一緒に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫組成物が水性媒体である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫チェックポイント阻害剤がパラトープ含有分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
式Ｖに記載のピロリジニルジカルボキサミド基の各置換基が、（Ｓ，Ｓ）配置を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｗが、ＣＨであり、前記ジプロボッシム化合物が、以下の構造式Ｉａ、
【化２】
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を有し、かつＲ1-4及びＺ部分が、上述の通りである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
−Ｚが、−Ｈである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ1-4のそれぞれが、（１Ｓ，２Ｒ）配置を有するトランス−２−フェニルシクロプロピル基又はトランス−２−（４−フルオロフェニル）シクロプロピル基である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患細胞が、がん性であるか、又は病原体に感染している、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患細胞が、がん性固形腫瘍細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記マーカー分子が、ＣＤ９６、ＣＤ２０、ＤＬＬ４、ＣＤ５５、ＴＩＭ−３、ＣＸＣＲ１、ＣＤ５４、ＣＤ１１４、ＬＧＲ５、ＣＤ１０５、ＣＤ５６、ＣＤ１３、ＣＤ２７１、ＣＤ３４、ＣＸＣＲ４、ＣＤ２６、ＣＤ１１７、ＣＤ１０、ＣＤ１４６、Ｎｏｔｃｈ２、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＰＯＤＸＬ−２、Ｃｒｉｐｔｏ−１、ＣＤ３２６、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＳＳＥＡ１、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ４、ＳＳＥＡ３、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０、及びＣＤ４４のうち１以上である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記がん性固形腫瘍細胞が、骨肉腫細胞、カポジ肉腫細胞、メラノーマ細胞、前立腺がん細胞、グリア芽細胞、小細胞肺癌細胞、乳がん細胞、肝がん細胞、結腸がん細胞、卵巣がん細胞、腎がん細胞、胃がん細胞、神経芽腫細胞、膵がん細胞、及びホジキンリンパ腫細胞のうち１以上からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患細胞が、病原体に感染している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記感染性病原体が、ウイルス、細菌、真菌及び単細胞性寄生虫のうち１以上である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記マーカー分子が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｂｅｒｇｅｉｉ、又はＰ．ｙｏｅｌｌｉのスポロゾイト周囲タンパク質；インフルエンザウイルスのＭ２ｅタンパク質、血球凝集素タンパク質又はノイラミニダーゼタンパク質のうち１以上である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ジプロボッシム化合物が、下記式Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＩ、
【化３】
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及び
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のうち１以上からなる群から選択される構造式を有する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国国立衛生研究所より付与されたＡＩ１２５５８１による政府支援を受けて行われた。政府は本発明について一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
アジュバントは、樹状細胞（ＤＣ）やマクロファージなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化することにより、病原体又はがんを殺傷する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の本来の機能を最大限に引き出す可能性を有している。ＴＬＲアゴニストを含む多くのアジュバントが、抗原を提示し、サイトカインを産生し、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞に共刺激シグナルをもたらすＡＰＣ（１、２）を含むＡＰＣ上の自然免疫受容体に関与している。ＣＤ８Ｔ細胞はこれらのシグナルに応答して増殖し、標的抗原を発現する感染細胞又は腫瘍細胞を殺傷する能力があるＣＴＬに分化する。更に、そのようなシグナルがＣＤ４Ｔ細胞を活性化し、これらの増殖及びＴｈ１又はＴｈ２ヘルパーＴ細胞への分化を誘導する（３）。
アジュバント技術の向上における極めて重要な目的の１つが、がん免疫療法の領域であり、適応免疫系を利用して、がん関連抗原又はネオアンチゲンの発現に基づいてがん細胞を殺傷する（４、５）。がん免疫療法の有効性は、腫瘍細胞の殺傷と長期的な抗腫瘍記憶応答（５）をもたらす腫瘍特異的ＣＴＬの産生と活性化（５、６）及びｉｎ  ｖｉｖｏ活性の維持によって決まる。従って、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、及び抗ＣＴＬＡ−４などの免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬの活性化を阻害する経路を遮断する作用により、メラノーマなどのがんの治療において目覚ましい臨床成功を収めている（７、８）。
しかしながら、チェックポイント遮断の影響を受けやすいことが知られているこれらの腫瘍においても、おそらく腫瘍反応性ＣＴＬの数若しくは活性化が十分でないか、又は腫瘍に浸潤できないために、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体治療で報告されている奏効率は約２０％にすぎない（５、９）。こうした欠陥は、がん環境が引き起こす免疫抑制作用によって悪化することもある。
更に、Ｔ細胞ヘルプがないことが、様々な病原体及びがん関連細胞表面抗原に対する多くの合成ワクチンの効力不足に少なくとも部分的に関与していると考えられている。ＥＮＲＥＦ  ２１
【０００３】
ＴＬＲリガンドは、適応免疫応答（１０、１１）においてアジュバントとして機能し、アダプタータンパク質（ＭｙＤ８８、ＴＲＩＦ、ＴＲＡＭ、ＭＡＬ）、キナーゼ、及びユビキチンリガーゼを介してシグナルを伝達し、ＮＦ−κＢ及びＩＲＦを活性化させることが長らく知られている（１２−１４）。こうした転写因子は、何千もの遺伝子の発現を誘導し、自然免疫応答を引き起こす（１５）。ＴＬＲ３アゴニスト、ポリＩ：Ｃ（９）、ＴＬＲ９アゴニスト、ＣｐＧ（１６）、及びＳＴＩＮＧアゴニスト、ｃＧＡＭＰ（６）などいくつかのヌクレオチドベースのアジュバントは、がん治療のための前臨床モデルにおいて免疫チェックポイント阻害剤の有効性を向上させることが報告されている。
こうしたアプローチは、チェックポイント阻害剤がその上で作用できる腫瘍特異的ＣＴＬの数を増やすことを目指している。しかしながら、これらは主に天然ＴＬＲリガンドに依存する。こうしたリガンドは合成するのが難しく、また場合によっては、おそらく生体内で広範に広がり、骨髄系細胞を無差別に活性化してサイトカインストームを引き起こすことから、極めて有毒である（１７）。優れた薬理学的特性を有するアゴニストの開発が試みられ、構造及び分子の機序が明らかにされており、そこから重要なアジュバント設計原理を学ぶことができる。
合成化合物のライブラリーをスクリーニングし、どの微生物ＴＬＲアゴニストとも構造的に類似していない、強力なヒト及びマウス活性ＴＬＲ１／２アゴニスト、ジプロボッシム(Diprovocim)が特定された。以下に説明するように、ジプロボッシムは、マウスにおいて強力なアジュバント活性を実例的に引き出し、Ｂ１６−ＯＶＡメラノーマモデルでがん抗原及び免疫チェックポイント遮断と組み合わせると、見事に腫瘍増殖を抑制し、生存期間を延長する。
【発明の概要】
【０００４】
アジュバントは時には未知の機序によって適応免疫応答を増強し、またがん抗原に対する体液性応答と細胞応答の両方を増強するのに使用できる。本明細書に記載する発明は、合成化学アジュバントジプロボッシムの相乗的な免疫学的効果を説明する。ジプロボッシムはマウス及びヒトにおいて自然免疫受容体ＴＬＲ２／ＴＬＲ１を標的とし、疾患細胞マーカーの免疫原分子及びチェックポイント阻害剤と併用すると、個々の成分又はこれらの成分のうち任意の２つを使用する場合と比べて、疾患細胞の増殖抑制において相乗効果をもたらす。
【０００５】
従って本発明は、哺乳動物において疾患細胞の増殖を抑制する方法を企図する。これらの疾患細胞は、前記疾患にかかっていない同種の細胞に不在である、又は前記疾患細胞と比べて大幅に少ない数で無疾患細胞に存在するマーカー分子を発現する。企図する方法は、必要とする罹患哺乳動物を免疫する以下の工程を含む：ａ）罹患哺乳動物に（ｉ）アジュバントに十分な量のジプロボッシム化合物、（ｉｉ）Ｔ細胞刺激量の免疫チェックポイント阻害剤、及び（ｉｉｉ）免疫量の疾患マーカー分子を投与する工程。免疫哺乳動物は、ｂ）哺乳動物が免疫に対して免疫応答を開始し、疾患細胞の増殖を抑制するのに十分な時間にわたって維持される。
企図するジプロボッシム化合物の構造は構造式Ｖに相当し、
【化１】
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上式で、
−Ａは、−Ｈ（ヒドリド）又は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ4であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4は、同一又は異なり、かつ２−（４−フルオロフェニル）エチル基、トランス−２−フェニルシクロプロピル基、トランス−２−（４−フルオロフェニル）−シクロプロピル基、又はＣ2−Ｃ18ヒドロカルビル基であり、
ただし、
１）Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4（Ｒ1-4）のうち少なくとも２つ、若しくはＲ1、Ｒ2、及びＲ3（Ｒ1-3）のうち少なくとも２つが、トランス−２−フェニルシクロプロピル基、トランス−２−（４−フルオロフェニル）−シクロプロピル基、若しくはこれらの混合物であり、又はＲ1-4のそれぞれが２（４−フルオロフェニル）エチル基であり、
２）式中のピロリジニルジカルボキサミド（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌｄｉｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）基の少なくとも１つが（Ｓ，Ｓ）配置を有し、かつＲ1-4のそれぞれが２−（４−フルオロフェニル）エチル基以外のとき、Ｃ2−Ｃ18ヒドロカルビル基以外のＲ置換基のそれぞれが、トランス−２−フェニルシクロプロピル基、トランス−２−（４−フルオロフェニル）−シクロプロピル基、又はこれらの混合物であり、
３）−Ａが−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ4のとき、Ｒ1-4のうち２つ以下がＣ2−Ｃ18ヒドロカルビル基であり、並びに
４）Ａがヒドリドのとき、Ｒ1-3のうち１つがＣ2−Ｃ18ヒドロカルビル基である可能性があり、かつＲ3を含むピロリジニルカルボキサミド（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）基がＲ若しくはＳ配置のいずれか、又は両方の配置の混合を有する可能性があり、
−Ｚは、ハロゲン  −Ｈ、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＯＣＨ3、−ＮＯ2、
−ＯＣＨ2ＣＯ2Ｈ、−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、
−ＮＨＣＯＣＨ2Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨＯＨ）ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨＣＯ2Ｈ（ＣＨ2ＣＯ2Ｈ）、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ［（ＣＨ2）4ＮＨ2］ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）ＣＯ｛ＮＨＣＨ［（ＣＨ2）4ＮＨ2］ＣＯ｝mＮＨＣＨ−［（ＣＨ2）4ＮＨ2］ＣＯ2Ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ番号：３−８）、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯ｛ＮＨＣＨ［（ＣＨ2）4ＮＨ2］ＣＯ｝pＮＨＣＨ［（ＣＨ2）4ＮＨ］ＣＯ2Ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ番号：９−１３）、及び
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯ｛ＮＨＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）ＣＯ｝qＮＨＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）ＣＯ2Ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ番号：１４−１８）のうち１つ以上であり；
Ｗは窒素（Ｎ）又はＣＨであり；
「ｎ」は、平均値が１〜約８の数であり；
「ｍ」は、値が１〜約６の数であり；
「ｐ」は、値が１〜約６の数であり；並びに
「ｑ」は、値が１〜約６の数である。
【０００６】
ジプロボッシム−１（国際公開第２０１８／００５８１２号；化合物３）は、マウスにおいて強力なアジュバント活性を示し、特に細胞性免疫応答を誘導した。
【化２】
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遺伝子組み換え腫瘍特異的抗原であるオボアルブミン（ＯＶＡ）に対する免疫は、ジプロボッシム−１をアジュバントとすることにより、抗ＰＤ−Ｌ１による免疫チェックポイント遮断の存在下でＢ１６メラノーマの増殖を抑制し、かつ生存期間を延長した。オボアルブミンとジプロボッシムを、又はオボアルブミンと抗ＰＤ−Ｌ１阻害剤を組み合わせた免疫では、いくらか有効性が示されたものの、ジプロボッシム、免疫原、及びチェックポイント阻害剤の３つの成分を用いた免疫には、マウスの１００％が応答した。このデータは、ジプロボッシム−１が、このチェックポイント阻害剤に応答できる腫瘍特異的ＣＴＬの数及び活性化を増大させることにより、抗ＰＤ−Ｌ１治療が成功する可能性を高めることを示唆している。
国際公開第２０１８／００５８１２号及びＭｏｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ（２０１８）で開示されているように、ジプロボッシムファミリーのいくつかのメンバーは、調製及びその活性のアッセイが行われ、ジプロボッシム−１からジプロボッシム−６などの番号が付与されている。同様の活性プロファイルを有し、使用したアッセイで活性値が同程度乃至若干小さかったジプロボッシムファミリーの他のいくつかの化合物も、調製とアッセイが行われている。
ジプロボッシム−１は、本明細書においてファミリー全体の例示的なメンバーとして用いられており、以下、ジプロボッシムという語がハイフン付きの数字なしに用いられる場合は、ジプロボッシムファミリーのメンバーを使用することを意味すると理解する必要がある。従って、「ジプロボッシム」という語は、「ジプロボッシムファミリー」又は「ａ  ジプロボッシム」のように「ファミリー」又は「ａ」という語とつなげて用いられる場合、式Ｖに定めるジプロボッシムファミリーのメンバーを意味するのに用いられる。「好ましい」という語と共に用いられる「ジプロボッシム」は式Ｉの化合物を指し、「より好ましい」又は「より好ましくは」という句は、式Ｉａのジプロボッシムファミリー化合物を指す。「最も好ましい」ジプロボッシムは、以下に言及するＡ〜Ｉが付された化合物のうちの１つである。
【０００７】
化合物のジプロボッシムファミリーの好ましいメンバーは、構造が構造式Ｉに対応する化合物であり、
【化３】
2021533134.tif 000005
このとき、−Ａは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ4である。式中のＲ1-4、Ｗ、及びＺ部分は上述の通りである。
化合物のジプロボッシムファミリーの更により好ましいメンバーは、構造が構造式Ｉａに対応する化合物である。
【化４】
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Ｒ1-4が事前に定義されており、かつ−Ｚがヒドリド（−Ｈ）である式Ｉａの現在最も好ましい化合物の構造式は、式Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＩの化合物として以下に示す。
抗原疾患関連マーカー分子を発現するホスト哺乳動物細胞と接触させるのに、アジュバントに十分な量のジプロボッシムを利用する。
ペプチド配列などの抗原疾患関連マーカー化合物を発現するホスト哺乳動物細胞は、チェックポイント阻害剤、好ましくは抗体又はパラトープ含有抗体部分の免疫応答刺激量とも接触させる。
以下の図面は、本開示の一部を形成する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｅはそれぞれ、独立した３つの試料の平均値をプロットしている。Ｐ値は一元配置ＡＮＯＶＡで算出し、異なる投与量に対する応答を比較した。全試験でＰ＜０．０００１。図１Ａ〜図１Ｅの結果は、独立した２試験を代表している。図１Ａは、ジプロボッシムがマウス及びヒト細胞によるサイトカイン分泌を誘導することを示すグラフ。ジプロボッシム−１で４時間処置した後のヒトＴＨＰ−１細胞上清中のＴＮＦ量を示す。
【図１Ｂ】ジプロボッシムがマウス及びヒト細胞によるサイトカイン分泌を誘導することを示すグラフ。ジプロボッシム−１で２４時間処置した後のヒトＰＢＭＣ上清中のＴＮＦ量を示す。
【図１Ｃ】ジプロボッシムがマウス及びヒト細胞によるサイトカイン分泌を誘導することを示すグラフ。ジプロボッシム−１で４時間処置した後のマウス腹腔マクロファージ上清中のＴＮＦ量を示す。
【図１Ｄ】ジプロボッシムがマウス及びヒト細胞によるサイトカイン分泌を誘導することを示すグラフ。ジプロボッシム−１で４時間処置した後のマウスＢＭＤＣ上清中のＴＮＦ量を示す。
【図１Ｅ】ジプロボッシムがマウス及びヒト細胞によるサイトカイン分泌を誘導することを示すグラフ。ジプロボッシムで４時間処置した後のマウスＢＭＤＣ上清中のＩＬ−６量を示す。
【図２Ａ】ジプロボッシムがマウス及びヒトＴＬＲ１／ＴＬＲ２を活性化することを示すグラフ。ジプロボッシム（５００ｎＭ）で４時間処置した後の各遺伝子型のマウス腹腔マクロファージ上清中のＴＮＦ量を示す（ｎ＝３匹／遺伝子型）。サイトカイン値は、刺激したＣ５７ＢＬ／６Ｊ細胞の値に正規化した。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定により算出したＰ値は、刺激したＣ５７ＢＬ／６Ｊ細胞と刺激した変異遺伝子型の細胞の応答間の有意差を示している。星４個は統計的有意差があるものを示す。
【図２Ｂ】ジプロボッシムがマウス及びヒトＴＬＲ１／ＴＬＲ２を活性化することを示すグラフ。対照抗体、抗ＴＬＲ１（２０μｇ／ｍＬ）、又は抗ＴＬＲ２（２０μｇ／ｍＬ）で１時間前処置した後、溶媒又はジプロボッシム（２５０ｐＭ）で更に４時間処置したヒトＴＨＰ−１細胞上清中のＴＮＦ量を示す。Ｐ値はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定により算出した。図２Ａ及び図２Ｂは独立した３つの試料の平均値をプロットしている。
【図２Ｃ】ジプロボッシムがマウス及びヒトＴＬＲ１／ＴＬＲ２を活性化することを示すグラフ。示した時間にわたってジプロボッシム（５ｎＭ）で処置したヒトＴＨＰ−１細胞の溶解物の分析結果を示す免疫ブロットである。
【図２Ｄ】ジプロボッシムがマウス及びヒトＴＬＲ１／ＴＬＲ２を活性化することを示すグラフ。示した時間にわたってジプロボッシム（５００ｎＭ）で処置したマウス腹腔マクロファージの溶解物の分析結果を示す免疫ブロットである。結果はすべて、独立した２試験を代表している。
【図３Ａ】ジプロボッシムが抗原特異的抗体及びＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。図３Ａ〜図３Ｃは、溶媒、ジプロボッシム（１０ｍｇ／ｋｇ）、又はミョウバン（２ｍｇ／ｋｇ）と混合したＯＶＡ１００μｇを筋肉内投与して免疫したＷＴ又はＴｌｒ２-/-Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４匹／群）の結果を示す。１４日後に、ＯＶＡ特異的ＩｇＧの血清力価をＥＬＩＳＡで測定した。
【図３Ｂ】ジプロボッシムが抗原特異的抗体及びＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。１４日後に、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１の血清力価をＥＬＩＳＡで測定した。
【図３Ｃ】ジプロボッシムが抗原特異的抗体及びＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。１４日後に、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ｂの血清力価をＥＬＩＳＡで測定した。
【図３Ｄ】ジプロボッシムが抗原特異的抗体及びＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ及び模式図。溶媒又はジプロボッシムと混合したＯＶＡを筋肉内投与して免疫した２４時間後にマウスから回収したＤＣと２４時間共培養した後のＯＴ−Ｉ  ＣＤ８Ｔ細胞におけるＣＤ６９発現を調べた実験設定の模式図（左）、及びフローサイトメトリーによる検出結果（中央）、及び定量化（右）を示す（４匹／群）。
【図３Ｅ】ジプロボッシムが抗原特異的抗体及びＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。図３Ｅ及び図３Ｆは、溶媒又はジプロボッシム（１０ｍｇ／ｋｇ）と混合したＯＶＡ１００μｇを筋肉内投与して免疫したマウスと免疫していないマウスの結果を示す（４匹／群）。免疫の７日後、ＯＶＡペプチド（アミノ酸２５７〜２６３）でパルスした（標的細胞）、又はパルスしていない（対照細胞）ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ標識マウス脾細胞をマウスに静脈内投与した。２日後、血液を採取し、生き残った色素標識細胞を測定した。野生型マウスで残った標的細胞（右側ピーク）及び対照細胞（左側ピーク）を計数した典型的なフローサイトメトリープロットを示す。
【図３Ｆ】ジプロボッシムが抗原特異的抗体及びＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。ＷＴ、Ｔｌｒ１-/-、又はＴｌｒ２-/-マウスで殺傷された標的細胞の割合の定量比較を示す。
【図３Ｇ】ジプロボッシムが抗原特異的抗体及びＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。Ｐ値はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定により算出した。結果はすべて、独立した２試験を代表している。
【図４Ａ】ジプロボッシムをアジュバントとする腫瘍ワクチン接種及びチェックポイント遮断を用いた腫瘍前又は腫瘍後治療によるＢ１６−ＯＶＡ腫瘍増殖の抑制を示す、腫瘍前及び腫瘍後治療プロトコルの模式図。０日目にＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝８匹／治療）に２×１０5個のＢ１６−ＯＶＡメラノーマ細胞を皮下投与した。腫瘍前治療では、同日の腫瘍接種前に、溶媒又はジプロボッシム（１０ｍｇ／ｋｇ）又はミョウバン（２ｍｇ／ｋｇ）と混合したＯＶＡ（１００μｇ）をマウスに筋肉内投与して免疫した。７日後にマウスにブースター免疫を行い、また腫瘍接種後３、６、及び９日目に腹腔内投与により抗ＰＤ−Ｌ１（２００μｇ）を投与した。腫瘍後治療では、腫瘍接種後３日目に最初の免疫を、その７日後にブースター免疫を行った。腫瘍接種後３、６、９、１２、及び１５日目に腹腔内投与により抗ＰＤ−Ｌ１（２００μｇ）を投与した。
【図４Ｂ】ジプロボッシムをアジュバントとする腫瘍ワクチン接種及びチェックポイント遮断を用いた腫瘍前又は腫瘍後治療によるＢ１６−ＯＶＡ腫瘍増殖の抑制を示すグラフ。腫瘍前治療の腫瘍体積の結果を示す。
【図４Ｃ】ジプロボッシムをアジュバントとする腫瘍ワクチン接種及びチェックポイント遮断を用いた腫瘍前又は腫瘍後治療によるＢ１６−ＯＶＡ腫瘍増殖の抑制を示すグラフ。腫瘍前治療のマウスの生存率（生存数／マウス総数）の結果を示す。
【図４Ｄ】ジプロボッシムをアジュバントとする腫瘍ワクチン接種及びチェックポイント遮断を用いた腫瘍前又は腫瘍後治療によるＢ１６−ＯＶＡ腫瘍増殖の抑制を示すグラフ。腫瘍前治療の腫瘍体積の結果を示す。
【図４Ｅ】ジプロボッシムをアジュバントとする腫瘍ワクチン接種及びチェックポイント遮断を用いた腫瘍前又は腫瘍後治療によるＢ１６−ＯＶＡ腫瘍増殖の抑制を示すグラフ。腫瘍前治療のマウスの生存率（生存数／マウス総数）の結果を示す。
【図４Ｆ】ジプロボッシムをアジュバントとする腫瘍ワクチン接種及びチェックポイント遮断を用いた腫瘍前又は腫瘍後治療によるＢ１６−ＯＶＡ腫瘍増殖の抑制を示すグラフ。腫瘍前治療において、未治療マウス（ｎ＝８）又は（図４Ｃ）から３５日目の無腫瘍生存マウス（ｎ＝８）にＢ１６−ＯＶＡ及びＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞をそれぞれ２×１０5個を皮下投与し、腫瘍体積を観察した試験の結果を示す。
【図４Ｇ】ジプロボッシムをアジュバントとする腫瘍ワクチン接種及びチェックポイント遮断を用いた腫瘍前又は腫瘍後治療によるＢ１６−ＯＶＡ腫瘍増殖の抑制を示すグラフ。図４Ｇ〜図４Ｊは腫瘍前治療（図４Ｇ及び図４Ｈ）と腫瘍後治療（図４Ｉ及び図４Ｊ）の比較を表しており、図４Ｇは腫瘍体積を示す。腫瘍体積分析のＰ値は、グラフに示す最終時点に適用され、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定により算出した。結果はすべて、独立した２試験を代表している。
【図４Ｈ】ジプロボッシムをアジュバントとする腫瘍ワクチン接種及びチェックポイント遮断を用いた腫瘍前又は腫瘍後治療によるＢ１６−ＯＶＡ腫瘍増殖の抑制を示すグラフ。マウスの生存率（生存数／マウス総数）を示す。生存率のＰ値は、カプラン・マイヤー法で算出した。
【図４Ｉ】ジプロボッシムをアジュバントとする腫瘍ワクチン接種及びチェックポイント遮断を用いた腫瘍前又は腫瘍後治療によるＢ１６−ＯＶＡ腫瘍増殖の抑制を示すグラフ。腫瘍体積を示す。
【図４Ｊ】ジプロボッシムをアジュバントとする腫瘍ワクチン接種及びチェックポイント遮断を用いた腫瘍前又は腫瘍後治療によるＢ１６−ＯＶＡ腫瘍増殖の抑制を示すグラフ。マウスの生存率（生存数／マウス総数）を示す。
【図５Ａ】ジプロボッシムが腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及び抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強することを示す、図５Ａ〜図５Ｊの治療プロトコルの模式図。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝６匹／治療）に、０日目に２×１０5個のＢ１６−ＯＶＡメラノーマ細胞を皮下投与し、３日後に溶媒又はジプロボッシム（１０ｍｇ／ｋｇ）又はミョウバン（２ｍｇ／ｋｇ）と混合したＯＶＡ（１００μｇ）を筋肉内投与して免疫した。腫瘍接種後１０日目にブースター免疫を行い、また腫瘍接種後３、６、９、及び１２日目に腹腔内投与により抗ＰＤ−Ｌ１（２００μｇ）を投与した。１４日目に腫瘍を採取し、ＴＩＬを分析した。全腫瘍細胞のうちそれぞれの細胞型の出現頻度を示す。
【図５Ｂ】ジプロボッシムがＴＩＬ及び抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。全腫瘍細胞のうちＴＩＬ（ＣＤ４５+）の出現頻度を示す。
【図５Ｃ】ジプロボッシムがＴＩＬ及び抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。全腫瘍細胞のうちＣＤ４Ｔ細胞（ＣＤ４+ＣＤ３+ＣＤ４５+）の出現頻度を示す。
【図５Ｄ】ジプロボッシムがＴＩＬ及び抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。全腫瘍細胞のうち活性化ＣＤ４Ｔ細胞（ＣＤ４４highＣＤ４+ＣＤ３+ＣＤ４５+）の出現頻度を示す。
【図５Ｅ】ジプロボッシムがＴＩＬ及び抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。全腫瘍細胞のうちＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ８+ＣＤ３+ＣＤ４５+）の出現頻度を示す。
【図５Ｆ】ジプロボッシムがＴＩＬ及び抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。全腫瘍細胞のうち活性化ＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ４４highＣＤ８+ＣＤ３+ＣＤ４５+）を示す。
【図５Ｇ】ジプロボッシムがＴＩＬ及び抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。全腫瘍細胞のうちＯＶＡ(257-264)−Ｈ２Ｋｂテトラマーに特異的なＴ細胞受容体を有するＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の出現頻度を示す。
【図５Ｈ】ジプロボッシムがＴＩＬ及び抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。全腫瘍細胞のうちＮＫ細胞（ＮＫ１．１+ＣＤ３-ＣＤ４５+）の出現頻度を示す。
【図５Ｉ】ジプロボッシムがＴＩＬ及び抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。全腫瘍細胞のうちＤＣ（ＣＤ１１ｃ+ＣＤ３-ＣＤ４５+）の出現頻度を示す。
【図５Ｊ】ジプロボッシムがＴＩＬ及び抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。全腫瘍細胞のうちマクロファージ（Ｆ４／８０+ＣＤ１１ｂ+ＣＤ４５+）の出現頻度を示す。
【図５Ｋ】ジプロボッシムがＴＩＬ及び抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強することを示す、図５Ｌ及び図５Ｍの治療プロトコルの模式図。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝８匹／治療）に、０日目に２×１０5個のＢ１６−ＯＶＡメラノーマ細胞を皮下投与し、３日後に溶媒又はジプロボッシム（１０ｍｇ／ｋｇ）と混合したＯＶＡ（１００μｇ）を筋肉内投与して免疫した。腫瘍接種後１０日目にブースター免疫を行い、また腫瘍接種後３、６、９、１２、及び１５日目に腹腔内投与により抗ＰＤ−Ｌ１（２００μｇ）を投与した。０、３、６、９、１２、及び１５日目に、抗ＣＤ４（３００μｇ）、抗ＣＤ８（３００μｇ）、抗ＮＫ１．１（３００μｇ）、又はこれら３つの抗体の混合物をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに腹腔内投与した。
【図５Ｌ】ジプロボッシムがＴＩＬ及び抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。腫瘍体積を示す。腫瘍体積分析のＰ値は、グラフに示す最終時点に適用され、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定により算出した。
【図５Ｍ】ジプロボッシムがＴＩＬ及び抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強することを示すグラフ。マウスの生存率（生存数／マウス総数）を示す。生存率のＰ値は、カプラン・マイヤー法で算出した。結果はすべて、独立した２試験を代表している。
【図６】ジプロボッシムをアジュバントとした免疫とチェックポイント阻害を組み合わせた抗腫瘍効果を媒介する重要な細胞事象の図式モデル。
【図７】ジプロボッシムがマウス腹腔マクロファージによるＩＦＮ−β分泌を刺激しないことを示すグラフ。ジプロボッシム又はＬＰＳで４時間処置した後のマウス腹腔マクロファージ上清中のＩＦＮ−βをアッセイした。独立した３つの試料の平均値をプロットしている。Ｐ値はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定により算出した。未刺激細胞（０ｎＭ）及びジプロボッシムで刺激した細胞の応答間に有意差は認められなかった。結果は独立した２試験を代表している。
【図８Ａ】抗ＰＤ−Ｌ１抗体がマウスでＢ１６腫瘍の増殖を抑制しないことを示すグラフで、時間に対する腫瘍体積を示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝８）に、０日目に２×１０5個のＢ１６−ＯＶＡメラノーマ細胞を皮下投与した。腫瘍接種後３、６、及び９日目に抗ＰＤ−Ｌ１（２００μｇ）又はマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体を腹腔内投与により投与した。両方のプロットにおける対照値は、２つの値が異なる場合、抗ＰＤ−Ｌ１値の上に示されている。腫瘍体積分析のＰ値は、最終時点に適用され、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定により算出した。治療間に有意差は認められなかった。
【図８Ｂ】抗ＰＤ−Ｌ１抗体がマウスでＢ１６腫瘍の増殖を抑制しないことを示すグラフで、時間に対するマウスの生存率（生存数／マウス総数）を示す。生存率のＰ値は、カプラン・マイヤー法で算出した。治療間に有意差は認められなかった。結果は独立した２試験を代表している。
【図９Ａ】ヒト細胞でのＴＮＦ産生の活性化においてジプロボッシムがＰａｍ3ＣＳＫ4よりも強力であることを示すグラフ。ジプロボッシム又はＰａｍ3ＣＳＫ4で４時間処置した後のヒトＴＨＰ−１細胞上清でアッセイしたＴＮＦ量を示す。ジプロボッシムのデータ点は全体的にＰａｍ3ＣＳＫ4のデータ点の左側に示されている。独立した３つの試料の平均値をプロットしている。結果は独立した２試験を代表している。
【図９Ｂ】ヒト細胞でのＴＮＦ産生の活性化においてジプロボッシムがＰａｍ3ＣＳＫ4よりも強力であることを示すグラフ。ジプロボッシム又はＰａｍ3ＣＳＫ4で２４時間処置した後のヒトＰＢＭＣ上清でアッセイしたＴＮＦ量を示す。ジプロボッシムのデータ点は、２線が分岐した後Ｐａｍ3ＣＳＫ4のデータ点の上方に示されている。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義
抗体：リガンド基に免疫学的に結合するポリペプチド。本明細書で使用する抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片である。当技術分野でＦａｂ、Ｆａｂ’；Ｆ（ａｂ’）2、及びＦVとして知られるこのような部分も含まれる。通常、抗体は、サイズが約６〜約３４オングストローム（Ａ）の範囲であるリガンドと、約１０4〜約１０10Ｍ-1の範囲にある結合定数、及び１０13Ｍ-1に達する結合定数で結合する。抗体は、ステロイド及びプロスタグランジンなどの小分子、核酸、タンパク質、及び多糖類などのバイオポリマー、並びにポリプロピレンなどの合成ポリマーを含む様々なリガンドと結合できる。
「抗体結合部位」又は「パラトープ」は、「抗原」又は「エピトープ」と特異的に結合する（免疫反応する）重鎖及び軽鎖可変及び超可変領域からなる抗体分子の構造部分である。
用語「抗体」は、汚染に起因する有害作用を伴わない、治療を必要とする罹患哺乳動物への（薬学的に許容される）投与に好適なモノクローナル抗体を特に包含するものとされる。そのようなモノクローナル抗体は、本明細書で説明する、免疫する動物種、例えばヒトから得ることができる。或いは、ある動物で抗体を誘導し、免疫する哺乳動物の抗体タンパク質配列を生成するよう抗体産生細胞を修飾することができる。哺乳動物の他の種でも免疫が企図されるが、ヒトはとりわけ好ましい免疫レシピエントである。そのため、例えば元々マウスで誘導された企図するモノクローナル抗体は、いわゆる「ヒト化」抗体、又は「キメラ」抗体であると、ヒトレシピエントにとってより有用である可能性がある。これらの用語は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｏｎｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  Ｎａｍｅｓ（ＩＮＮ）ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ（ａ  ｒｅｖｉｅｗ），世界保健機関（２０１６），§２．７に記載されているように本明細書で使用する。
【００１０】
「抗原」という語は、歴史的に、抗体又は受容体が結合する実体を指すのに、また抗体の産生を誘導する実体を指すのにも用いられてきた。最近の使用では、抗原の意味が、抗体又は受容体が結合する実体に限定されているのに対し、抗体産生を誘導する、又は受容体に結合する実体には「免疫原」という語が用いられる。本明細書で説明する実体が免疫原実体と抗原実体の両方である場合、免疫原又は抗原のいずれかとしての言及は、通常、意図する有用性に従ってなされる。
種々の文法型の「免疫反応」という用語は、本明細書では、抗原決定基含有分子（抗原）と、抗体分子全体又はそのパラトープ含有部分のような抗体結合部位を含む分子との特異的結合を指すのに使用する。
「抗原決定基」は、抗体結合部位又はＴ細胞受容体が免疫学的に結合する抗原の構造部分である。この用語は「エピトープ」と同じ意味でも使用される。抗体は抗原（モノクローナル）の単一のエピトープ又は複数のエピトープ（ポリクローナル）に結合できる。タンパク性材料において、線形エピトープの長さは、通常、約５〜約７個のアミノ酸残基とされる。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つ又は１より大きい（即ち、少なくとも１つ）を指すのに使用する。例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つ又は１つより大きい数のｅｌｅｍｅｎｔを意味する。
【００１１】
「ヒドロカルビル」という語は、本明細書では、炭素及び水素のみを含む直鎖及び分岐鎖の脂肪族基、及び脂環式基、又はラジカルを含む非芳香族基の簡略化した用語として使用される。従って、アルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基が企図されるのに対し、厳密にはヒドロカルビル基でもあるフェニル基及びナフチル基などの芳香族炭化水素は、本明細書では、以下に説明するように、アリール基又はラジカルと呼ばれる。
特定の脂肪族ヒドロカルビル置換基が意図される場合、その基として、即ち、メチル、エチル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘキシル、ヘキセニル、２−エチルヘキシル、ドデシル（Ｃ12）、オクタデシル（Ｃ18）が挙げられる。特に好ましいヒドロカルビル基はアルキル基である。そのため、一般化しながらも、より好ましい置換基は、本明細書に列挙する置換基のいずれかにおいて、記述語「ヒドロカルビル」を「アルキル」で置き換えることによって述べることができる。
長鎖の（例えば、Ｃ18）ヒドロカルビル基が企図されるものの、本明細書では、例示的に短い（Ｃ1−Ｃ4）基の例を用いる。そのような例示的なアルキルラジカルに、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、及びシクロプロピルなどがある。好適なアルケニルラジカルの例に、エテニル（ビニル）、２−プロペニル、３−プロペニル、１，４−ブタジエニル、１−ブテニル、２−ブテニル、及び３−ブテニルなどがある。アルキニルラジカルの例に、エチニル、２−プロピニル、１−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、及び１−メチル−２−プロピニルなどがある。
Ｃ1アルケニル基などの存在し得ない置換基が「ヒドロカルビル」という語に包含されることは意図されないが、２個以上の炭素原子を有するそのような置換基は意図されることを、当業者は理解しよう。
「ヒドロカルビル」という語を用いる場合は、通常の化学接尾辞の命名法に従うが、それにより名称が１つ以上の置換基と類似する可能性があるため、末尾の「ｙｌ（イル）」を削除して適切な接尾辞を追加するという通常の方法に必ずしも従うわけではない。従って、ヒドロカルビルエーテルは、通常の化学命名法に従えば、より適切かもしれない「ヒドロカルボキシ」基ではなく、「ヒドロカルビルオキシ」基と呼ばれる。例示的なヒドロカルビルオキシ基には、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、アリルオキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉｓｏ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、及びｔｅｒｔ−ブトキシ基などがある。
【００１２】
リガンド：特定の受容体分子に、通常は静電力及び／又は水素結合によって特異的に結合する構造領域を有する分子。例示的なリガンドは上皮増殖因子分子である。
【００１３】
「マーカー分子」（抗原又は免疫原）は細胞表面で発現させることができるが、それは必須ではなく、むしろ疾患細胞内のどこででも発現させることができる。哺乳動物の実質的にすべての天然細胞タンパク質が、細胞によって短いペプチドにプロセシングされ、細胞外でクラスＩ  ＭＨＣ分子と結合するのがその理由である。そのような天然タンパク質は、通常、有機体が未成熟なうちにそのようにプロセシングされ、これらの天然タンパク質部分によって誘導され得るＴ細胞や他の免疫細胞は、成熟前に有機体によって排除され、「自己タンパク質」耐性がもたらされる。その結果、特定の免疫疾患の場合を除いて、細胞が突然変異によって生じるがんなどの疾患に起因する外来ペプチド又はネオ抗原ペプチドのみが「外来」として認識され、ＭＨＣ結合ペプチドに対する免疫応答を誘導する。  更に、突然変異に関して、突然変異はフレームシフト突然変異となり、アミノ酸の非自然配列が生じることがある。マーカー分子は「腫瘍抗原」、つまり、例えば胚発生時に他の細胞によって発現される可能性があるものの、正常細胞よりも腫瘍によって特徴的に発現されることがはるかに多いタンパク質である可能性もある。或いは、マーカー分子は、がん遺伝子産物、例えば、腫瘍細胞内の組み換え事象によって生成された異常な融合タンパク質である可能性がある。マーカー分子は、ウイルスや細菌などの感染因子の産物である場合もある。
【００１４】
ペプチド／ポリペプチド：１個の残基のα−アミノ基と、隣接する残基のα−カルボキシル基とのペプチド結合によって、隣接する残基が結び付いている、少なくとも２個のアミノ酸残基を含むオリゴマー又はポリマー。ポリペプチドの一次構造は、ポリマーの１つの末端に第一級アミン基を、もう１つの末端にカルボン酸基を有する。ペプチド又はポリペプチドは、本明細書及び通常当技術分野において、左から右に、かつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に描写される。また、水溶液中のポリペプチドは、通常、溶液のｐＨに応じて、１つ以上の双性イオン形態で存在する。「ペプチド」及び「ポリペプチド」という語は、本明細書では同じ意味で使用する。
【００１５】
タンパク質：単一のポリペプチド、又は約１００個を超えるアミノ酸残基を含む架橋ポリペプチドの集まり。タンパク質は、同じポリペプチド鎖内で、又は隣接するポリペプチド間で、化学的架橋、例えばジスルフィド架橋を有することがある。グリコシル化されたタンパク質は、グリコタンパク質と呼ばれることがある。タンパク質は、ペプチド結合、アミノ酸残基配列、ジスルフィド架橋などによって互いに結合した１つ以上の別々のポリペプチド／タンパク質サブユニットを含むとき、融合タンパク質、融合ポリペプチド、キメラ融合などのように称されることが多い。
【００１６】
受容体：別の分子（リガンド）に（又は、別の分子と）特異的に結合する構造領域を有する生物学的に活性なタンパク質性分子。例示的な受容体分子は、抗体結合部位、又は、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ、及びＨＥＲ２などとも称される内皮成長ホルモン受容体などの細胞内又は細胞間シグナル伝達に関わる膜貫通細胞タンパク分子である。
【００１７】
用語「残基」は、アミノ酸残基という句と同じ意味で用いられる。本明細書で特定されるアミノ酸残基はすべて、天然又はＬ配置に存在する。アミノ酸残基の略語は、標準ポリペプチド命名法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５７−５９（１９６９）］に従って、以下の対応表に示す通りとなる。
【表１】
2021533134.tif 000007
【００１８】
本発明は、複数の利益と利点を有する。
本発明の際立った利益は、組み合わせ免疫が、疾患細胞増殖を抑制する相乗作用の結果をもたらすことである。
本発明の利点は、組み合わせ免疫が、無ウイルス及び無菌ワクチンに往々にして欠如していたＴ細胞ヘルプをもたらすことである。
本発明が提供する別の利点は、当業者が、１９８０年代初頭以降結局は成功していないものの、現在はうまく使用できる疾患関連免疫原の処方を見いだし、研究し、公表していることである。
本発明のまたさらなる利益及び利点は、当業者には以下の開示により明らかとなろう。
【００１９】
本発明は、哺乳動物において疾患細胞の増殖を抑制する方法を企図する。これらの疾患細胞は、前記疾患にかかっていない同種の細胞に不在である、又は前記疾患細胞と比べて大幅に少ない数で無疾患細胞に存在する１つ以上のマーカー分子を発現する。当業者は、無疾患細胞に存在する量より大幅に多い量で疾患細胞に存在するマーカー分子、及びこれらの差を判定する方法を検討する多数の論文及び報告を公表している。例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＢ  Ｒｅｐ  ５０（６）：２８５−２９８（２０１７）及び同文献の引用を参照のこと。更に、吸光度スキャン又は放射能検出手段などの手段を用いて行われる定量的ウエスタンブロットなどの技術は当技術分野で周知である。「同種の」細胞とは、疾患細胞と同じ器官及び組織から得られる無疾患細胞である。
【００２０】
企図する方法は、必要とする罹患哺乳動物を免疫する以下の工程を含む：ａ）罹患哺乳動物に（ｉ）アジュバントに十分な量のジプロボッシム化合物、（ｉｉ）Ｔ細胞刺激量の免疫チェックポイント阻害剤、及び（ｉｉｉ）免疫量のマーカー分子を投与する工程。免疫哺乳動物は、ｂ）哺乳動物が免疫に対して免疫応答を開始し、疾患細胞の増殖を抑制するのに十分な時間にわたって維持される。
企図するジプロボッシム化合物の構造は構造式Ｖに相当し、
【化５】
2021533134.tif 000008
上式で、
−Ａは−Ｈ（ヒドリド）又は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ4であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4は同一又は異なり、かつ２−（４−フルオロフェニル）エチル、トランス−２−フェニルシクロプロピル基、トランス−２−（４−フルオロフェニル）−シクロプロピル基、又はＣ2−Ｃ18ヒドロカルビル基であり、ただし：
１）Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4（Ｒ1-4）のうち少なくとも２つ、若しくはＲ1、Ｒ2、及びＲ3（Ｒ1-3）のうち少なくとも２つが、トランス−２−フェニルシクロプロピル基、トランス−２−（４−フルオロフェニル）−シクロプロピル基、若しくはこれらの混合物であり、又はＲ1-4のそれぞれが２（４−フルオロフェニル）エチル基であり、
２）式中のピロリジニルジカルボキサミド基の少なくとも１つが（Ｓ，Ｓ）配置を有し、かつＲ1-4のそれぞれが２−（４−フルオロフェニル）エチル基以外のとき、Ｃ2−Ｃ18ヒドロカルビル基以外の式中のＲ置換基のそれぞれが、トランス−２−フェニルシクロプロピル基、トランス−２−（４−フルオロフェニル）−シクロプロピル基、又はこれらの混合物であり、
３）−Ａが−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ4のとき、Ｒ1-4のうち２つ以下がＣ2−Ｃ18ヒドロカルビル基であり、並びに
４）Ａがヒドリドのとき、Ｒ1-3のうち１つがＣ2−Ｃ18ヒドロカルビル基である可能性があり、かつ式中のＲ3を含むピロリジニルカルボキサミド基がＲ若しくはＳ配置のいずれか、又は両方の配置の混合を有する可能性があり、
−Ｚは、ハロゲン  −Ｈ、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＯＣＨ3、−ＮＯ2、
−ＯＣＨ2ＣＯ2Ｈ、−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、
−ＮＨＣＯＣＨ2Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨＯＨ）ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨＣＯ2Ｈ（ＣＨ2ＣＯ2Ｈ）、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ［（ＣＨ2）4ＮＨ2］ＣＯ2Ｈ、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）ＣＯ｛ＮＨＣＨ［（ＣＨ2）4ＮＨ2］ＣＯ｝mＮＨＣＨ−［（ＣＨ2）4ＮＨ2］ＣＯ2Ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ番号：３−８）、
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯ｛ＮＨＣＨ［（ＣＨ2）4ＮＨ2］ＣＯ｝pＮＨＣＨ［（ＣＨ2）4ＮＨ］ＣＯ2Ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ番号：９−１３）、及び
−ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯ｛ＮＨＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）ＣＯ｝qＮＨＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）ＣＯ2Ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ番号：１４−１８）のうち１つ以上であり；
Ｗは窒素（Ｎ）又はＣＨであり；
「ｎ」は平均値が１〜約８の数であり；
「ｍ」は値が１〜約６の数であり；
「ｐ」は値が１〜約６の数であり；並びに
「ｑ」は値が１〜約６の数である。
【００２１】
式Ｖの化合物のジプロボッシムファミリーの好ましいメンバーは、構造が構造式Ｉに対応する以下の化合物であり、
【化６】
2021533134.tif 000009
このとき、−Ａ＝−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ4で、式中のＲ1-4、Ｗ、及びＺ部分は上述の通りである。
【００２２】
式Ｉのより好ましい化合物の１つでは、置換基対Ｒ1及びＲ3（Ｒ1若しくはＲ3のいずれか）又は対Ｒ1及びＲ2（Ｒ1若しくはＲ2のいずれか）の少なくとも１つのメンバーが、トランス−２−フェニルシクロプロピル基又はトランス−２−（４−フルオロフェニル）シクロプロピル基である。また好ましくは、置換基対Ｒ1及びＲ3又は対Ｒ1及びＲ2の少なくとも１つのメンバーが、トランス−２−フェニルシクロプロピル基又はトランス−２−（４−フルオロ−フェニル）シクロプロピル基の（１Ｓ，２Ｒ）配置を有する。
より好ましくは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4のうち少なくとも３つの置換基が、トランス−２−フェニルシクロプロピル基又はトランス−２−（４−フルオロフェニル）シクロプロピル基の（１Ｓ，２Ｒ）配置を有する。また更に好ましくは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4のそれぞれが、トランス−２−フェニルシクロプロピル基又はトランス−２−（４−フルオロフェニル）シクロプロピル基の（１Ｓ，２Ｒ）配置を有する。
別の好ましい態様では、式中のピロリジニルジカルボキサミド基はそれぞれ（Ｓ，Ｓ）配置を有し、かつ式中のＲ1-4置換基はそれぞれトランス−２−フェニルシクロプロピル基、トランス−２−（４−フルオロ−フェニル）シクロプロピル基、又はこれらの混合物であり、かつシクロプロピル部分との結合が（１Ｓ，２Ｒ）配置を有する。
【００２３】
別の態様では、式Ｉの化合物のＲ1-4のうち最大２個、又はその下位区分の式の１つは、Ｃ2−Ｃ18ヒドロカルビル基である可能性がある。好ましくは、ヒドロカルビル基はアルキル基であり、４〜約１６個の長さの炭素原子、より好ましくは、約６〜約１０の長さの炭素原子を有する。直鎖状のヒドロカルビル基も好ましいが、最大２個のメチル基及びエチル基の置換基又は両方が、炭素環及び１つ又は２つの二重結合又は三重結合のように存在することがある。特定のＣ2−Ｃ18ヒドロカルビル基については、先にヒドロカルビルという語の使用についての説明で述べている。
式Ｉからわかるように、各分子は、少なくとも１つ、また好ましくは２つの３，４−ピロリジニルジカルボキシル（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌｄｉｃａｒｂｏｘｙｌ）基を含有する。カルボキシル基はアミン末端Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4置換基に結合し、４個（又は３個）のアミド結合を形成している。従って、２個のピロリジニルジカルボキシル基は、２個のピロリジニルジカルボキサミド基と呼ぶこともできる。
ピロリジニルジカルボキシル基のカルボキシル基に結合した置換基はｃｉｓ又はトランス配座に存在する可能性がある。つまり、２個の置換基が共に、式中の環の面の上方若しくは下方に突出する（ｃｉｓ）か、又は置換基の１個が面の上方に、もう１個が下方に突出する（トランス）ことができる。２個の同一の置換基を持つｃｉｓ−二置換ピロリジニルジカルボキシル基は対称配置を有し、エナンチオマー形態を取らない。これらと同じ２個の同一の置換基を持つトランス−二置換ピロリジニルジカルボキシル基は非対称（キラル）配置を有し、エナンチオマー形態を取る。２つのキラル配置は（Ｓ，Ｓ）及び（Ｒ，Ｒ）と称し、以下に示す通りである。
【化７】
2021533134.tif 000010
３，４−ピロリジニルジカルボキシル基の少なくとも１つ、より好ましくは両方が（Ｓ，Ｓ）配置を有すると好ましい。
【００２４】
一方、式Ｖの−Ａはヒドリドであり、かつＲ1-3のうち１つはＣ2−Ｃ18ヒドロカルビル基、より好ましくはＣ10−Ｃ16ヒドロカルビル基である。好ましい化合物は、構造が式Ｖａに相当し、
【化８】
2021533134.tif 000011
このとき、式中のＲ1-3、Ｗ、及びＺ部分は上述の通りである。式中の−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ3基は、Ｒ配置、Ｓ配置のいずれかにおいて、又は両方の配置の混合として存在してよい。Ｓ配置を有する化合物は活性がわずかに高いため、より好ましい。
式Ｖａの化合物において、Ｒ3基の炭素原子数は、好ましくは２〜１８個、より好ましくは１０〜１６個である。このヒドロカルビル基も、より好ましくはアルキル基、つまり直鎖状の置換基であるが、メチル及びエチル分岐は、鎖中の二重結合及び／又は三重結合と同じように許容することができる。環状ヒドロカルビル置換基の化合物及び炭素環含有置換基も使用できる。
【００２５】
ＷがＣＨであっても好ましい。以下に示す構造式Ｉａには、上述の好ましい態様のいくつかが組み込まれている。
【化９】
2021533134.tif 000012
−Ｚがヒドリド（−Ｈ）である式Ｉａの現在最も好ましい化合物の構造式は、式Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＩの化合物として以下に示す。参照のため、国際公開第２０１８００５８１２号のジプロボッシムの番号を記載する。
【化１０】
2021533134.tif 000013
2021533134.tif 000014
2021533134.tif 000015
2021533134.tif 000016
2021533134.tif 000017
2021533134.tif 000018
2021533134.tif 000019
2021533134.tif 000020
及び
2021533134.tif 000021
式Ｆの化合物では、式中の両方のアミド基における「ｇ」は、ヒトＴＨＰ−１細胞及びマウスマクロファージの両方に対して最大活性を示すために、好ましくは同じ数（長さ）の５〜９個のメチレン基であり、ｇ＝５のとき、両方の細胞型に対して最も活性な化合物が得られる。式Ｇの化合物では、式中のアミド基における「ｈ」は１〜１７、好ましくは７〜１７、及びより好ましくは９〜１５である。式Ｉの化合物では、式中のアミド基における「ｊ」は１〜１７、好ましくは３〜１１、及びより好ましくは５〜９である。
【００２６】
企図する免疫チェックポイント阻害剤は、通常、無傷の抗体、又は抗体のパラトープ含有部分である。このような意図する抗体、又は抗体のパラトープ含有部分は、好ましくはモノクローナルヒト化抗体、キメラ抗体、又はヒト抗体である。米国食品医薬品局の承認を受けた例示的なチェックポイント阻害剤には、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（抗ＰＤ−１）、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）（抗ＣＴＬＡ−４）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）（抗ＰＤ−Ｌ１）、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）（抗ＰＤ−１）、及びＩｍｆｉｎｚｉ（登録商標）（抗ＰＤ−Ｌ１）などがある。ＣＴＬＡ−４自体は、タンパク質Ｂ７−１及びＢ７−２と結合し、Ｔ細胞活性を抑制する。抗Ｂ７−１及び抗Ｂ７−２パラトープ含有分子を用いて、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１＋Ｂ７−２の相互作用を遮断することもでき、これにより、結合対のＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１のいずれに対する抗体とも同程度にチェックポイント阻害活性が得られる。
【００２７】
マーカー分子について以下に詳細に説明する。これらの材料は、通常、タンパク質性であり、全タンパク質、又はタンパク質の免疫原部分である可能性がある。
哺乳動物において疾患細胞の増殖を抑制する方法で使用する場合、アジュバントに十分な量のジプロボッシム化合物、Ｔ細胞刺激量の免疫チェックポイント阻害剤、及び免疫量の抗原（免疫原）疾患関連マーカー分子を投与して、ホスト哺乳動物細胞と接触させる。これら３つの成分は一緒に投与できるが、チェックポイント阻害剤は、通常一緒に投与できるジプロボッシム及び抗原（免疫原）とは別に投与することが好ましい。好ましくは、チェックポイント阻害剤は静脈内に（ＩＶ）投与し、一方、ジプロボッシム及び抗原は、これらを一緒に含有する免疫医薬組成物を筋肉内（ＩＭ）又は皮下（ＳＣ）に投与する。
こうした投与は、数分、数時間、数日、又は数週間の期間内に行うことができる。多くのチェックポイント阻害剤は、通常、約２〜約４週間程度の生体内終末相半減期を有する抗体又はパラトープ含有抗体部分である［Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（抗ＰＤ−１）の製品ラベル１２．３項、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）（抗ＣＴＬＡ−４）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）（抗ＰＤ−Ｌ１）、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）（抗ＰＤ−１）、及びＩｍｆｉｎｚｉ（登録商標）（抗ＰＤ−Ｌ１）を参照］。従って、チェックポイント阻害剤は、ジプロボッシム及び免疫原の投与前、同時、又は数日後に投与できる。
各成分は治療過程で複数回投与できる。複数回投与の使用については本明細書で説明する。
【００２８】
ジプロボッシム化合物はアジュバントに十分な量を投与する。本明細書の別の場所で説明する試験において、本明細書で例示的に使用するジプロボッシム−１（Ａ）は頑強なｉｎ  ｖｉｖｏアジュバント又はＴＬＲ１／ＴＬＲ２アゴニストとして作用し、免疫医薬組成物中で免疫原と一緒に筋肉内経路で投与すると、マウスの体内で約０．２５〜約５ｍｇ／ｋｇ（筋肉内）で強力なＴＬＲ２依存性アジュバント活性を誘発した。より体重の重い哺乳動物におけるアジュバントに十分な量は、当技術分野で周知の技術によって容易に決定できる。更に、ジプロボッシム−１は、アジュバントとして使用した場合のＬＰＳ投与の特徴である明らかな毒性を示さなかった。
チェックポイント阻害剤は、通常、製品ラベルに記載されている量で利用する。例示的な用量及び投与法に、記載された量で使用する例示的な疾患細胞としてメラノーマが用いられた以下がある：Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）−メラノーマ：２ｍｇ／ｋｇを３週間毎；Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）−メラノーマのアジュバント：１０ｍｇ／ｋｇの９０分間静脈内投与を３週間毎に４回の後、１０ｍｇ／ｋｇを１２週間毎に最長３年間、又は疾患再発まで、又は容認できない毒性が認められるまで；Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）−１２００ｍｇの６０分間静脈内投与を３週間毎；及びＯｐｄｉｖｏ（登録商標）−切除不能又は転移性のメラノーマ：２４０ｍｇを隔週。
免疫量の抗原（免疫原）疾患関連マーカー分子は、使用するマーカーの免疫原性によって異なる。Ｂ細胞及びＴ細胞に対して免疫原性であるペプチドの選択は当技術分野で周知であり、本明細書では踏み込まない。そのような有用なペプチドの多くは当技術分野で報告されているが、恐らくＴ細胞ヘルプがないために、所望のワクチンとしてうまく製剤化されなかった。３成分の免疫医薬組成物によってこの欠点が克服されると考えられる。
【００２９】
長さが約５〜約２０個の残基を有するペプチドなどの小さな疾患関連マーカー分子の多くは、それ自体の免疫原性が低く、キャリア分子に化学結合させたハプテンとして利用するのが最善であることが多い。例示的なキャリアタンパク質性分子に、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎コア抗原（カプシド；ＨＢｃＡｇ）、オボアルブミン、ウシ血清アルブミン、ウシγグロブリン、及びヒトγグロブリンなどがあり、他の多くの分子が文献で用いられているように、ハプテンキャリアとして用いられている。
【００３０】
企図する疾患関連マーカー分子は、疾患細胞内及び／又は疾患細胞上に存在する。疾患細胞は、通常、がん性細胞又は病原体感染細胞である。
正常な組織細胞上に滅多に発現しないがん幹細胞（ＣＳＣ）マーカーを含む、固形腫瘍細胞内及び／又は固形腫瘍細胞上に存在する免疫原として有用な疾患関連マーカー分子又はこれらの部分を以下に挙げる［Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＢ  Ｒｅｐ５０（６）：２８５−２９８（２０１７）］。正常な（罹患していない）細胞にはほとんど存在せず、疾患細胞に存在する例示的なＣＳＣマーカーに、ＣＤ９６、ＣＤ２０、ＤＬＬ４、ＣＤ５５、ＴＩＭ−３、ＣＸＣＲ１、ＣＤ５４、ＣＤ１１４、ＬＧＲ５、ＣＤ１０５、ＣＤ５６、ＣＤ１３、ＣＤ２７１、ＣＤ３４、ＣＸＣＲ４、ＣＤ２６、ＣＤ１１７、ＣＤ１０、ＣＤ１４６、Ｎｏｔｃｈ２、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＰＯＤＸＬ−２、Ｃｒｉｐｔｏ−１、ＣＤ３２６、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＳＳＥＡ１、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ４、ＳＳＥＡ３、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０、及びＣＤ４４などがある。
例示的な疾患関連マーカー分子は、通常、固形腫瘍細胞内及び／又は固形腫瘍細胞上に存在する。例示的な固形腫瘍に、骨肉腫細胞、カポジ肉腫細胞、メラノーマ細胞、前立腺がん細胞、グリア芽細胞、小細胞肺癌細胞、乳がん細胞、肝がん細胞、大腸がん細胞、卵巣がん細胞、腎がん細胞、胃がん細胞、神経芽腫細胞、膵がん細胞、及びホジキンリンパ腫細胞などがある。
【００３１】
企図する疾患関連マーカー分子又はこれらの部分は、病原体感染細胞内及び／又は病原体感染細胞上に存在することもできる。例示的な感染性病原体に、１つ以上のウイルス、細菌、真菌、及び単細胞性寄生虫などがある。
例示的なウイルスに、インフルエンザ、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、例えば水痘帯状疱疹（水痘）、単純ヘルペス１及び２型（ＨＳＶ１、ＨＳＶ２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）などがある。例示的な細菌性病原体に、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓなどがある。例示的な単細胞性寄生虫は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｂｅｒｇｅｉｉ、又はＰ．ｙｏｅｌｌｉ．のマラリアスポロゾイトである。
例示的なタンパク質免疫原に次の疾患関連マーカー分子ペプチドがあり、出典の引用と合わせて以下に記載する。
【表２】
2021533134.tif 000022
米国特許第８，０１７，１２７号明細書
インフルエンザＡ  Ｍ２タンパク質Ｂ細胞エピトープ
米国特許第８，０１７，１２７号明細書に記載されているように、Ｍ２タンパク質は、インフルエンザＡ株によって感染した細胞で発現させる。Ｍ２タンパク質のＮ末端残基１−２４は、感染した細胞の膜を通して伸びる。タンパク質の細胞外部分はＭ２ｅと呼ばれる。そのため、そのタンパク質のインフルエンザＡ細胞外Ｍ２ｅ部分を免疫原性マーカーとして用いることで、すべてのインフルエンザ株から保護することができる。従って、毎年インフルエンザワクチンの選択を変更する必要がなくなる。
【表３】
2021533134.tif 000023
2021533134.tif 000024
米国特許第４，５９９，２３１号明細書
Ｂ型肝炎表面抗原
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）はＢ細胞及びＴ細胞両方のポリペプチドエピトープをもたらす。米国特許第４，５９９，２３１号明細書に開示される各種エピトープの数を、ａｙｗドナー（Ｐ４９）及びａｄｗドナー（Ｐ７２及びＰ７３）のＤＮＡに基づいて当該特許に記載されているように、そのペプチドの名称と、Ｎ末端からの配列位置（丸括弧内）と合わせて以下の表に示す。
【表４】
2021533134.tif 000025
米国特許第５，１８０，８０６号明細書
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）マーカーペプチド
パピローマウイルスは、皮膚又は粘膜上皮の異形成、良性及び悪性の過剰増殖を誘発する。５０種（株）を超えるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）が確認されている。ヒトでは、様々な種類のパピローマウイルスが異なる病気を引き起こすことが知られている。例えば、ＨＰＶ１及び２型は一般的なイボを、６及び１１型はコンジローマ及び性器扁平イボを引き起こす。これに対し、大多数の子宮頸がんで感染が認められるＨＰＶ１６、１８、及び３３型は、通常のコンジローマを引き起こさず、頸部内皮にびまん性に残存し、最小限の病理学的変化しか示さない。子宮頸がんに関連するＨＰＶ型は、最初の感染から数年間は頸部内皮組織に潜伏状態で維持され、その後進行して子宮頸がんを引き起こすことがあると考えられている。
米国特許第５，１８０，８０６号明細書は、抗体産生を誘導するいくつかのペプチド配列を開示している。米国特許第５，１８０，８０６号明細書に開示されているＨＰＶ１６型関連配列の例示的なペプチドマーカーを以下に例示する。当該特許は、１８及び３３型のペプチド配列に加え、ＨＰＶ６、１１、１８、及び３３型のＥ２  ＯＲＦによってコードされる配列も開示している。
【表５】
2021533134.tif 000026
【００３２】
企図する免疫組成物は、典型的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイなどの医薬用途を意図していない組成物中に存在可能なものと比べて、薬学的に（又は生理学的に）許容される希釈剤又はキャリアと総称される薬学的に許容される塩、緩衝液などの賦形剤も含有する。これらの組成物について、以下で更に詳細に説明する。
本明細書で有用なジプロボッシム化合物は、それ自体による、又は薬学的に許容される塩としての使用に供することができる。企図する化合物に有用である例示的な塩に以下があるがこれらに限定されない：硫酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、ジグルコン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニル−プロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、メシル酸塩、及びウンデカン酸塩。カルボキシレート基の塩に、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、アンモニウム、及び多くの置換アンモニウム塩などがある。
医薬化合物と共に薬学的に許容される塩を形成する、一般に用いられる薬学的に許容される酸及び塩基の一覧については、Ｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９７７  ６８（１）：１−１９を参照のこと。
場合によっては、塩は、本発明の化合物の単離、精製、又は分解の補助として使用することもできる。そのような使用において、使用される酸又は塩基、及び調製される塩は、薬学的に許容可能である必要はない。
【００３３】
企図する免疫医薬組成物は、免疫原性マーカーと併せて生理学的（薬学的）に許容されるキャリアに溶解又は分散させた式Ｖの化合物又はこれらの薬学的に許容される塩のアジュバント有効量を含有する。このような組成物は、細胞培養においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞に投与してこれらの細胞に接触させる、又は必要とする生きたホスト哺乳動物などにｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に接触させることができる。本明細書に記載するデータからわかるように、フェムトモルからナノモル量で存在する、企図するジプロボッシム化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ試験でアジュバント効果をもたらす。
ワクチンアジュバントとして用いる場合、式Ｖの化合物は、好ましくは、選択された免疫原性マーカーと一緒に投与する。成分はいずれも、好ましくは、前述の通り、単一の免疫医薬組成物中に一緒に存在する。しかしながら、この２つの材料は、別々に投与される免疫医薬組成物中に存在することができ、この別個の組成物は、最大約１〜約２時間の間隔で投与できる。２つの別個の組成物を投与する場合、できるだけ短い時間間隔で投与することが好ましい。
別の実施形態では、使用するジプロボッシム化合物の一部又は全部を免疫マーカー化合物に化学結合させることができる。この化学結合は、カルボキシル基を含むＺ置換基を免疫原性ペプチドマーカー化合物のアミノ基に結合させられるように、式Ｖに示すＺ置換基を用いて形成することができる。別法として、免疫原性マーカー化合物を、キャリア分子に結合させたハプテンとして用いる場合、ジプロボッシム化合物を同じキャリア分子に化学結合させることもできる。
【００３４】
企図する免疫医薬組成物は、通常、必要とする対象に、毎日又は毎週などのように１ヵ月以内に複数回ｉｎ  ｖｉｖｏで投与し、かつ数ヵ月間から数年間にわたって投与できる。更に一般的には、企図する組成物は、治療過程にわたって複数回投与される。
企図する免疫医薬組成物は、好ましくは非経口投与に適している。従って免疫医薬組成物は、好ましくは投与時に液体形態であり、最も好ましくは、液体は水性液であるが、他の液体も以下に説明するように企図され、現在最も好ましい組成物は注射剤である。
従って、注射剤、例えば、注射可能な無菌の水性又は油性溶液又は懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、既知の方法に従って処方できる。無菌注射剤は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液のように、非経口的に許容される非毒性の希釈剤又は溶剤中の注射可能な無菌の溶液又は懸濁液である可能性もある。使用できる許容可能な溶媒及び溶剤に、水、リンゲル液、等張食塩水、リン酸緩衝生理食塩水がある。
【００３５】
他の液体医薬組成物に、例えば、非経口投与に好適な溶液がある。式Ｖの化合物の無菌水溶液、又は水、エタノール、若しくはプロピレングリコールを含む溶剤中の式Ｖの化合物の無菌溶液が、非経口投与に好適な液体組成物の例である。いくつかの態様では、式Ｖの企図する化合物は、使用前に注射用塩化ナトリウムなどの適切な液体媒質に溶解できる乾燥粉末として提供される。
更に、慣例的に、溶剤又は懸濁化剤として無菌固定油が用いられる。このために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の無刺激固定油を用いることができる。更に、オレイン酸などの脂肪酸を注射用組成物の調製に使用する。ジメチルアセトアミド、非イオン性及びイオン性洗剤を含む界面活性剤、ポリエチレングリコールを使用できる。前述した溶剤と湿潤剤の混合物も有用である。無菌溶液は、活性成分を所望の溶剤系に溶解させ、次いで、得られた溶液をメンブレンフィルターで濾過して滅菌するか、又は無菌条件下で、事前に滅菌した溶剤に無菌化合物を溶解させて調製できる。
【００３６】
治療を必要とする疾患細胞を有し、かつ少なくとも式Ｖの化合物及び免疫原性マーカー化合物を含有する医薬組成物が投与される哺乳動物（対象）は、霊長類、例えばヒト、チンパンジー若しくはゴリラなどの類人猿、カニクイザル若しくはマカクなどのサル、ラット、マウス、若しくはウサギなどの実験動物、イヌ、ネコ、ウマなどのペット動物、又は雌ウシ若しくは去勢ウシ、ヒツジ、子ヒツジ、ブタ、ヤギ、若しくはラマなどの食用動物などであり得る。
好ましくは、医薬組成物は単位用量形態である。そのような形態において、組成物は、適切な量のジプロボッシム及び免疫原を含有する単位用量に分割される。単位用量形態は、包装された製剤である可能性があり、包装は、例えば、バイアル又はアンプル中に個別の量の製剤を含む。
【００３７】
結果
ジプロボッシムはヒト及びマウスの両方の細胞でサイトカイン産生を誘導する
約１００，０００個のメンバーを含む化学ライブラリーから、ＰＭＡ分化ヒトＴＨＰ−１骨髄系細胞でＴＮＦ生合成を活性化できる左右対称性を有する化合物のクラスを特定した。クラスの最初のメンバーは、細胞表面受容体の二量化を促進するよう設計された非開示の化合物のサブライブラリーから得た（１８）。
以下のジプロボッシム−１は、広範な構造活性相関（ＳＡＲ）試験後にこのクラスから開発された。
【化１１】
2021533134.tif 000027
ジプロボッシム−１は、ＴＨＰ−１細胞（ＥＣ50  １１０ｐＭ）及びヒトＰＢＭＣ（ＥＣ50  ８７５ｐＭ）（図１Ａ及び図１Ｂ）による、並びにマウス腹腔マクロファージ（ＥＣ50  １．３ｎＭ）及び骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）（ＥＣ50  ６．７ｎＭ）（図１Ｃ及び図１Ｄ）による用量依存的なＴＮＦ産生を誘導した。ＴＮＦに加え、ジプロボッシム−１はマウスＢＭＤＣによるＩＬ−６産生も誘導した（図１Ｅ）。ただし、マウス腹腔マクロファージによるタイプＩ  ＩＦＮ産生は刺激しなかった（図７）。試験した、他の番号が付与されたジプロボッシム、及び構造式Ｉに示したジプロボッシムもこれらの活性を共有している。
【００３８】
ジプロボッシムはＴＬＲ１／ＴＬＲ２を標的とし、下流ＭＡＰＫ及びＮＦ−κＢシグナル伝達経路を活性化する
ジプロボッシムの分子標的を確認するために、様々なＴＬＲシグナル伝達成分が欠乏した野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腹腔マクロファージに対する効果を分析した。ジプロボッシムによるＴＮＦの誘導は、ＴＬＲ１又はＴＬＲ２欠乏マクロファージでは全く認められなかったが、ＴＬＲ−６欠乏マクロファージではそうではなかった（図２Ａ）。ジプロボッシム活性は、ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ、及びＩＲＡＫ４欠乏細胞のマクロファージにおいても著しく低下した（図２Ａ）。これらのデータから、ジプロボッシムがマウスＴＬＲ１／ＴＬＲ２ヘテロ二量体を標的とすることが示唆された。
ＴＬＲ１又はＴＬＲ２抗体はＴＨＰ−１細胞に対するジプロボッシムの効果を有意に低下させた。これは、ヒトＴＬＲ１／ＴＬＲ２もジプロボッシム分子の標的となることを示している（図２Ｂ）。ジプロボッシムは、ＴＨＰ−１細胞及びマウス腹腔マクロファージにおけるＩＫＫα、ＩＫＫβ、ｐ３８、ＪＮＫ、及びＥＲＫのリン酸化、並びにＩκＢαの分解を誘導した。これは、ジプロボッシムが、ＭＡＰＫ及び標準的なＮＦ−κＢシグナル伝達を含む通常のＴＬＲ１／ＴＬＲ２シグナル伝達を活性化することを示している（図２Ｃ及び図２Ｄ）。
【００３９】
ジプロボッシムはｉｎ  ｖｉｖｏでアジュバント活性を示す
オボアルブミン（ＯＶＡ）とミョウバン又はジプロボッシムのいずれかを組み合わせて用いた野生型マウスの筋肉内免疫により、同レベルの血清ＯＶＡ特異的ＩｇＧが誘導された。これは、ＯＶＡ＋溶媒を用いた免疫により誘導したレベルと比べて高度に向上した（図３Ａ〜図３Ｃ）。ＯＶＡ＋ミョウバンを用いた免疫が主にＴｈ２関連ＩｇサブクラスＩｇＧ１を誘導したのに対し、ＯＶＡ＋ジプロボッシムはＩｇＧ１とＴｈ１関連ＩｇＧ２ｂの両方を誘導した（図３Ｂ及び図３Ｃ）。
ＯＶＡ＋ジプロボッシムでマウスを免疫した２４時間後に流入領域リンパ節及び脾臓から精製した樹状細胞（ＤＣ）は、ＯＴ−Ｉ細胞におけるＣＤ６９の上方制御から明らかなように、これらと共培養したＯＴ−Ｉ  ＣＤ８Ｔ細胞を活性化した（図３Ｄ）。これに対し、ＯＶＡ＋溶媒で免疫したマウスのＤＣは、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８Ｔ細胞においてＣＤ６９の発現を誘導しなかった（図３Ｄ）。この結果は、ジプロボッシムが、ＤＣによる抗原クロスプレゼンテーション及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ８Ｔ細胞のクロスプライミングを活性化することを示している。
ジプロボッシムがクロスプライミングを刺激することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤ８＋Ｔ細胞による殺傷能力が向上するかを更に調べるために、ＣＴＬ殺傷アッセイを実施した。蛍光マーカー標識及びＯＶＡペプチド（残基、２５７−２６３）パルス標的細胞を、ＯＶＡ＋ジプロボッシムで免疫したマウスに静脈内投与し、２日後にフローサイトメトリーで生きた標的細胞の数を計測した。ＯＶＡ＋ジプロボッシムで免疫したマウスでは標的細胞の約７０％が排除されたのに対し、ＯＶＡ＋溶媒で免疫したマウスでは約１０％であった（図３Ｅ）。これらのデータは、ジプロボッシムが、抗原特異的抗体産生及びＣＴＬ殺傷においてアジュバント活性を示すことを証明するものであり、これはＴＬＲ１及び／又はＴＬＲ２欠乏マウスでは抑制された（図３Ａ〜Ｃ、Ｆ、及びＧ）。
【００４０】
チェックポイント遮断と、ジプロボッシムをアジュバントとした抗がんワクチンを組み合わせることによるＢ１６腫瘍増殖の完全抑制
Ｂ１６メラノーマ発現ＯＶＡ（Ｂ１６−ＯＶＡ）に対する野生型マウスの予防免疫におけるジプロボッシムのアジュバント活性を調べた（図４Ａ）。Ｂ１６−ＯＶＡ細胞の接種前、ただし同日に、マウスにジプロボッシム含有又は非含有ＯＶＡを、腫瘍細胞の注射部位より遠位に筋肉内注射した。腫瘍増殖速度及び生存期間は、溶媒単独、ジプロボッシム単独、又はＯＶＡ単独で免疫したマウスで同程度であった（図４Ｂ及び図４Ｃ）。ＯＶＡ単独に対し、ジプロボッシム＋ＯＶＡを用いた免疫は、控えめながら有意に腫瘍増殖速度を遅延させたが、生存期間は延長せず；ＯＶＡ免疫と抗ＰＤ−Ｌ１治療の組み合わせで同様の効果が認められた（図４Ｂ及び図４Ｃ）。
それ自体に効果はないものの（図８Ａ及び図８Ｂ）、抗ＰＤ−Ｌ１治療をジプロボッシム＋ＯＶＡ免疫に追加すると、８週間の観察期間にわたって腫瘍増殖の完全抑制及び１００％生存が達成されたことが目を引く（図４Ｂ及び図４Ｃ）。ジプロボッシムのみを抗ＰＤ−Ｌ１治療と組み合わせても腫瘍増殖又はマウス生存に効果がなかったことから、この劇的な抗腫瘍効果はＯＶＡ免疫によるものであった（図４Ｄ及び図４Ｅ）；この結果は、Ｂ１６メラノーマの免疫原性の低さと一致している（１９−２１）。
【００４１】
生存しているマウスが、がん抗原に対して検出される特異的かつ長期の記憶を備えているかを確認するために、図４Ｃの５週間生存例にＢ１６−ＯＶＡ細胞及びＯＶＡ非含有Ｂ１６細胞（Ｂ１６）で再試験を行った。それ以上の治療を行わない場合、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍の増殖は全く認められなかったのに対し、Ｂ１６腫瘍は急速に増殖した（図４Ｆ）。未治療のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスでは、Ｂ１６及びＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞のいずれも同程度の速度で増殖した（図４Ｆ）。
まとめると、マウスでジプロボッシムをがんワクチンのアジュバントとして使用すると、抗原特異的抗腫瘍免疫が促進され、Ｔ細胞チェックポイント遮断を組み合わせることでこの免疫が大幅に強化されることが、これらのデータから示される。アジュバントとしてジプロボッシムを用いた免疫は、ホストの腫瘍増殖の再発を防ぐ抗原特異的記憶応答をもたらす。
すでにＢ１６−ＯＶＡ腫瘍が定着したマウスの治療免疫におけるジプロボッシムの抗腫瘍効果を調べた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、腫瘍接種日又は腫瘍接種後３日目にジプロボッシム含有又は非含有ＯＶＡで免疫を行い、７日後にブースター免疫を実施した（図４Ａ）。一部のマウスでジプロボッシムの代わりにミョウバンを使用し、これら２種のアジュバントを直接比較できるようにした。すべての条件で、腫瘍接種後３日目に抗ＰＤ−Ｌ１治療を開始し、その後３日毎に１２日間治療をくり返した。
【００４２】
腫瘍接種日にＯＶＡ単独で免疫したマウスは、平均２４日間生存し、腫瘍接種３８日後までに１００％のマウス（８／８）が死亡した。予想通り、腫瘍接種日のジプロボッシム＋ＯＶＡ投与により腫瘍増殖が完全に抑制され、５４日の観察期間にわたって１００％のマウス（８／８）が生存した（図４Ｇ及び図４Ｈ）。同じ試験でジプロボッシムの代わりにミョウバンを使用すると、腫瘍増殖は部分的に抑制され、平均生存期間が３７日間となり、２５％のマウス（２／８）が５４日間生存した（図４Ｇ及び図４Ｈ）。  腫瘍接種３日後まで免疫を遅らせても、ジプロボッシム＋ＯＶＡはなおも腫瘍増殖を有意に抑制し、ＯＶＡ単独と比べて平均生存期間を延長させた（４１日間対２２日間）（図４Ｉ及び図４Ｊ）。これに対し、ミョウバン＋ＯＶＡは腫瘍増殖を抑制したものの、平均生存期間はわずかしか延長されず（３０日間）、ミョウバン＋ＯＶＡの生存曲線とＯＶＡ単独の生存曲線に有意差はなかった（Ｐ＝０．０８２）（図４Ｉ及び図４Ｊ）。腫瘍治療前後において、腫瘍増殖、生存率、及び生存期間に対するジプロボッシムの効果はミョウバンより優れていた。
【００４３】
ジプロボッシムは抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強する
抗ＰＤ−Ｌ１治療と、ジプロボッシムをアジュバントとした免疫を組み合わせて腫瘍を排除する細胞機構を調べた。ジプロボッシム＋ＯＶＡ又はミョウバン＋ＯＶＡで免疫したマウスの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、腫瘍接種３日後に分析した（図５Ａ）。接種１４日後に腫瘍を採取し、単細胞懸濁液を抗体染色したのち、フローサイトメトリーで分析して、総白血球、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＤＣ、並びにマクロファージを測定した。白血球も、ＯＶＡペプチド（残基２５７−２６４）に結合したＨ−２ＫbＭＨＣクラスＩテトラマーに対する抗体、並びにＣＤ８に対する抗体で染色し、腫瘍特異的ＣＤ８Ｔ細胞を同定した。
ジプロボッシムを含有するＯＶＡ免疫は、溶媒＋ＯＶＡと比べて腫瘍における白血球の出現頻度を有意に増加させた（図５Ｂ）。これらのＴＩＬを更に分析すると、ジプロボッシムが、活性ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ４４high）並びにＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を含むＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の出現頻度に加え、ＮＫ細胞の出現頻度を増加させることが明らかとなった（図５Ｃ〜図５Ｈ）。
ミョウバン＋ＯＶＡ免疫はＴＩＬを増加させる傾向を示し（図５Ｂ）、合計及びＣＤ４４highＣＤ８Ｔ細胞で統計学的有意に達した（図５Ｅ及び図５Ｆ）。しかしながら、増加の程度はジプロボッシム＋ＯＶＡによる誘導と比べて低下した。ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞は、腫瘍接種後１４日目時点でミョウバン＋ＯＶＡ免疫では増加しておらず（図５Ｇ）、溶媒＋ＯＶＡと比べて、合計及びＣＤ４４highＣＤ４Ｔ細胞（図５Ｃ及び図５Ｄ）でもＮＫ細胞（図５Ｈ）でも増加を示さなかった。
腫瘍内ＤＣ及びマクロファージの出現頻度は、溶媒＋ＯＶＡ、ジプロボッシム＋ＯＶＡ、及びミョウバン＋ＯＶＡで免疫したマウスで同程度であった（図５Ｉ及び図５Ｊ）。全体として、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞、活性ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞、ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞、並びにＮＫ細胞の腫瘍内出現頻度は、免疫したマウスでジプロボッシム  及びミョウバンの抗腫瘍効果と相関しているが、ＤＣ又はマクロファージではそうでないことがこれらのデータから示される。
【００４４】
ジプロボッシム＋ＯＶＡと抗ＰＤ−Ｌ１の組み合わせの抗腫瘍効果に必要な免疫細胞集団を確認するために、細胞型特異的抗体を用いて、マウスのＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又は３つすべての細胞集団を枯渇させた。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍接種日（０日目）、及びその後３日毎に１５日間にわたって枯渇抗体を腹腔内に投与した（図５Ｋ）。マウスのＣＤ８Ｔ細胞又は３つすべての細胞型（ＣＤ４  Ｔ、ＣＤ８  Ｔ、ＮＫ細胞）を枯渇させると、腫瘍増殖とマウス生存の両方に対するジプロボッシム＋ＯＶＡの効果が失われた（図５Ｌ及び図５Ｍ）。これに対し、ＣＤ４Ｔ細胞又はＮＫ細胞の枯渇は、Ｄｉｐｒｏｒｏｃｉｍ＋ＯＶＡの抗腫瘍活性にほとんど影響を及ぼさなかった（図５Ｌ及び図５Ｍ）。
興味深いことに、ジプロボッシム＋ＯＶＡと抗ＰＤ−Ｌ１の組み合わせで治療したマウスの腫瘍増殖において、ＣＤ８Ｔ細胞枯渇とＣＤ４＋ＣＤ８＋ＮＫ細胞枯渇の影響にわずかな統計学的有意差が認められ、３つすべての細胞型を枯渇させたマウスで、腫瘍の増殖が大きかった。しかしながら、この差は生存率又は生存期間のいずれの差にも繋がらなかった。この結果は、ＣＤ４Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はその両方のいずれも、ジプロボッシム＋ＯＶＡと抗ＰＤ−Ｌ１の組み合わせの抗腫瘍効果の媒介において重要な役割を果たしていないことを示している。これらのデータは、マウスにおけるジプロボッシム＋ＯＶＡ免疫及びチェックポイント阻害の治療による腫瘍根絶にＣＤ８Ｔ細胞が必要であることを示している。
【００４５】
考察
腫瘍ネオ抗原を標的とするがんワクチンは、チェックポイント阻害剤に応答できる腫瘍特異的ＣＴＬの数及び活性化を増大させることによって、がん治療のための免疫チェックポイント阻害の成功率を高められると考えられている。しかしながら、免疫に対するＴ細胞応答の種類と程度はワクチンアジュバントに大きく依存し、現在、ヒトで使用が承認されているアジュバントはごくわずかにすぎない。
本明細書では、ヒト及びマウスＴＬＲ１／ＴＬＲ２ヘテロ二量体に関与し、これを活性化する新規の強力なアジュバント、ジプロボッシムの作用について説明している。ジプロボッシムは、ＴＬＲ１／ＴＬＲ２を活性化することが報告されている他の化学合成リガンドとも天然リガンドとも構造的に類似していない（２２−２６）。ジプロボッシムは、ヒトＴＬＲ１／ＴＬＲ２の活性化において、周知のリガンドであるＰａｍ3ＣＳＫ4よりも強力かつ有効である（図９Ａ及び図９Ｂ）。
【００４６】
マウスでは、ジプロボッシムは、共投与された抗原に対する強力なＴＬＲ１及びＴＬＲ２依存的な体液性及びＣＴＬ応答を誘導する。ジプロボッシムをアジュバントとする免疫は、チェックポイント阻害と組み合わせると、急性致死性腫瘍の抗原特異的根絶を引き起こし、更に腫瘍の再増殖を防ぐことができる記憶応答を誘導する。チェックポイント阻害単独では致死的転帰を防ぐのに不十分であるにもかかわらず腫瘍の治癒が認められ（図８Ａ及び図８Ｂ）、この併用免疫療法という前提を裏付けている。
データは、ジプロボッシムをアジュバントとする免疫とチェックポイント阻害の組み合わせの抗腫瘍効果を媒介する以下の主要な機構的事象を裏付けている（図５）。ジプロボッシムはＡＰＣ上でＴＬＲ１／ＴＬＲ２に結合し、これらを活性化して炎症性サイトカインを分泌させ、投与した腫瘍特異的抗原を取り込ませて、ＭＨＣ  Ｉ及びＭＨＣ  ＩＩを介して処理及び提示する。ＡＰＣによる抗原提示、共刺激分子発現、及びサイトカイン分泌は、抗原特異的ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の増殖と活性化を誘導し、これが、腫瘍細胞に対する細胞溶解活性を高める。ＮＫ細胞も炎症性サイトカインによって活性化され、腫瘍部位に浸潤する。抗ＰＤ−Ｌ１を追加することで、腫瘍微小環境で活性である主要免疫抑制機構が抑制され、ＴＣＲ／ＣＤ２８ライゲーションに応答したＴ細胞活性化と増殖が抑制されなくなり（２７−２９）、更にＣＤ８Ｔ細胞が媒介する腫瘍細胞溶解が促進される。
【００４７】
試験対象のがんの細胞型又は種類に依存し得るＴＬＲ２シグナル伝達の腫瘍形成促進と抗腫瘍の両方の効果については、数多く報告されている。例えば、ＴＬＲ２シグナル伝達は、ＩＬ−１０などの免疫抑制性サイトカインの誘導、及びミエロイド由来免疫抑制細胞と腫瘍関連マクロファージの活性化によって腫瘍増殖を後押しする（３０−３２）。一方、ＴＬＲ２シグナル伝達は、ＤＣ活性化とクロスプレゼンテーションを刺激し（３３）、Ｔｒｅｇ機能を下方制御する（３４−３６）ことにより腫瘍退縮も促進する。
ジプロボッシムでは、ＯＶＡ免疫と免疫チェックポイント阻害を組み合わせた場合、全身的なＴＬＲ２活性化の結果として、全体的に、腫瘍浸潤抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞が媒介した腫瘍細胞溶解及び腫瘍増殖抑制が認められた。
アジュバントの治療指数は、ＡＰＣに対する抗原の共同ターゲティングの有効性、及びそのＡＰＣの活性化に依存する。ジプロボッシムとＴＬＲ２の相互作用の様式はＸ線結晶学で研究されており、受容体のこのサブユニットとの接触については別の場所で報告する。ジプロボッシム−ＴＬＲ１／２複合体の構造は、免疫原性ペプチドを取り込むようジプロボッシムを修飾できる可能性を示しており、すべての活性ジプロボッシム分子に確実に抗原を添加することによって治療指数を最適化できる可能性がある。ジプロボッシムは容易に合成でき、また腫瘍関連抗原及びネオ抗原を取り込むよう速やかに適合させることができる。こうした特徴ゆえに、ジプロボッシムは臨床開発の魅力的な候補となる。
【００４８】
材料と方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｔｌｒ２-/-、Ｍｙｄ８８-/-、及びＯＴ−ＩマウスをＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから、Ｌｙ９６-/-（ＭＤ−２-/-）マウスをＲＩＫＥＮ  ＢＲＣから購入した。Ｔｌｒ４lps3/lps3、Ｔｌｒ６int/int、Ｔｌｒ７rsq1/rsq1、Ｔｉｒａｐtor/tor、Ｔｉｃａｍ１Lps2/Lps2、Ｔｉｃａｍ１Lps2/Lps2／Ｉｒａｋ４otiose/otioseマウスは、ＥＮＵ突然変異誘発により純粋なＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドで作製した。これについてはｈｔｔｐ：／／ｍｕｔａｇｅｎｅｔｉｘ．ｕｔｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ．ｅｄｕ．に記載されている。
Ｔｌｒ１-/-マウスはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子ターゲティングによって作製した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスは、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）６．５Ｕを注射し、その４８時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）６．５Ｕを注射して過剰排卵させた。次いで、過剰排卵させたマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスと一晩交配させた。翌日、卵管から受精卵を採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写Ｃａｓ９ｍＲＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）、及びガイドＲＮＡとわずかに塩基対合するＴｌｒ１（５０ｎｇ／μＬ；５’−ＣＡＡＡＣＣＧＡＴＣＧＴＡＧＴＧＣＴＧＡ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ番号：ＸＸ）を胚の細胞質又は前核に注入した。注入した胚は、Ｍ１６培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３７℃、５％ＣＯ2で培養した。変異体マウスを作製するために、２細胞期の胚をＨｓｄ：ＩＣＲ（ＣＤ−１）偽妊娠雌マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の卵管膨大部に移植した（１０−２０の胚／卵管）。
マウスを用いた実験手順はすべて、テキサス大学サウスウェスタンメディカルセンターの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認を受け、施設で承認された動物ケア及び使用のプロトコルとガイドラインに従って実施した。マウスはすべて、施設で承認されたプロトコルに従って、テキサス大学サウスウェスタンメディカルセンターで飼育された。
【００４９】
腹腔マクロファージ、ＢＭＤＣ、ヒトＰＢＭＣの単離、及び細胞培養
ＢＢＬチオグリコール酸培地（Ｂｒｅｗｅｒ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ）（４質量／体積％；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）２ｍＬを腹腔内に注入した４日後に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）５ｍＬを用いた腹腔洗浄によりチオグリコール酸誘導性マクロファージを回収した。腹腔マクロファージはＤＭＥＭ細胞培養培地［１０体積／体積％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、１体積／体積％ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）］で、３７℃、９５％空気／５％ＣＯ2で培養した。
マウスＢＭＤＣでは、骨髄細胞をペトリ皿の１０ｎｇ／ｍＬマウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）含有ＤＭＥＭ細胞培養培地１０ｍＬで培養した。培養３日目にこれを新鮮なＧＭ−ＣＳＦ培地に移した。軽く付着した細胞を新しいペトリ皿に移し、更に４日間培養した。ヒトＰＢＭＣはＳｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ）細胞はＲＰＭＩ細胞培養培地［１０体積／体積％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、１％ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）］でＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）１００ｎＭで２４時間処置して分化させた。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、新鮮なＲＰＭＩ細胞培養培地で２４時間培養してから試験に使用した。
【００５０】
サイトカイン産生の測定
細胞は９６ウェルプレートに１×１０5個／ウェルで播種し、ジプロボッシム（ＤＭＳＯに溶解し、全実験でＤＭＳＯ最終濃度（≦０．２％）を一定に保った）を用いて４時間刺激した。上清中のマウスＴＮＦ、ＩＬ−６、若しくはＩＦＮ−β、又はヒトＴＮＦを、使用説明書に従ってＥＬＩＳＡキットで測定した（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ及びＰＢＬ  Ａｓｓａｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）。抗ＴＬＲ１、抗ＴＬＲ２、又はアイソタイプ対照抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）２０μｇ／ｍＬで１時間、前処置した。別段の指示のない限り、マウス細胞は野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのものであった。
ウエスタンブロット法
マウス腹腔マクロファージ又はヒトＴＨＰ−１細胞（１×１０6個／ウェル）は、１２ウェルプレートでジプロボッシム（マウス細胞では５００ｎＭ、ヒト細胞では５ｎＭ）を用いて、示された時間にわたって刺激し、試料緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中で直接溶解した。細胞溶解物はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。膜は次の抗体でプローブした：ホスホＩＫＫα（Ｓｅｒ１７６）／ＩＫＫβ（Ｓｅｒ１７７）、ＩκＢα、ホスホｐ３８（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）、ホスホＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）、ホスホＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びβ−Ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ）。
【００５１】
抗体応答の免疫と測定
最低純度≧９８％（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、エンドトキシン濃度＜１ＥＵ／ｍｇのＥｎｄｏＦｉｔオボアルブミン（ＯＶＡ）をＩｎｖｉｖｏｇｅｎから購入した。マウス（４匹／群）は、溶媒（ＤＭＳＯ：Ｔｗｅｅｎ８０：生理食塩水＝１：１：８）、ジプロボッシム１０ｍｇ／ｋｇ又はミョウバン２ｍｇ／ｋｇ（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバント２％、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合したＯＶＡ１００μｇを筋肉内投与して免疫した。１４日後、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ２ｂ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）の血清力価をＥＬＩＳＡで測定した。
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＴＬ殺傷アッセイ
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスにＯＶＡ１００μｇ＋ジプロボッシム１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４匹／群）を筋肉内投与した。１週間後、未処置のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを殺傷し、脾細胞を採取した。脾細胞の半分は未パルスのまま残し、半分はＯＶＡ２５７−２６３ペプチドを用いて完全培地［１０体積／体積％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ、１％ペニシリン及びストレプトマイシン］で２時間、３７℃でパルスした。未パルス及びペプチドパルス細胞は、無血清培地で２０分間、それぞれ０．５μＭ（「ｌｏｗ」）又は５μＭ（「ｈｉｇｈ」）のＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。同数（２×１０6個）のＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔhigh（ＯＶＡでパルス）及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔlow（未パルス）細胞を混合し、免疫マウスに静脈内投与した。４８時間後、処置したマウスの血液を採取し、フローサイトメトリー分析を実施した。生き残ったＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔhigh及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔlow細胞の数を測定し、殺傷されたＯＶＡペプチドパルス標的細胞の割合の計算に用いた。特異的殺傷は以下のように定義した。
割合＝ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔlow細胞／
ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔhigh細胞
標的細胞溶解の割合＝［１−未免疫率／免疫率］×１００
【００５２】
腫瘍接種、免疫化、及び腫瘍測定
Ｂ１６−ＯＶＡ細胞（チキンオボアルブミンを安定して発現するＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞）を１０体積／体積％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで増殖させた。ＰＢＳ１００μＬ中の合計２×１０5個のＢ１６−ＯＶＡ細胞を、８〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスの右脇腹に皮下投与し、腫瘍を定着させた（ｎ＝８匹／群）。前処置として、ジプロボッシム−１  １０ｍｇ／ｋｇ又はミョウバン２ｍｇ／ｋｇ含有又は非含有ＯＶＡ（１００μｇ）を腫瘍接種と同じ日（０日目）にマウスの筋肉内に投与した。最初の免疫の７日後、マウスにブースター投与を行った。３、６、及び９日目に、一部の群に生理食塩水１００μＬ中のチェックポイント阻害剤２００μｇ（抗ｍＰＤ−Ｌ１、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を腹腔内投与した。
前処置として、ジプロボッシム−１  １０ｍｇ／ｋｇ又はミョウバン２ｍｇ／ｋｇ含有ＯＶＡ（１００μｇ）を腫瘍接種後３日目のマウスに筋肉内投与した。最初の免疫の７日後、マウスにブースター投与を行った。また、腫瘍接種後３、６、９、１２、及び１５日目に生理食塩水１００μＬ中の抗ｍＰＤ−Ｌ１  ２００μｇを腹腔内投与した。
ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、及び／若しくはＮＫ細胞を枯渇させるために、生理食塩水２００μＬ中の、抗ｍＣＤ４（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）３００μｇ、抗ｍＣＤ８（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）３００μｇ、抗ｍＮＫ１．１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）３００μｇ、又は３つの抗体すべてを、腫瘍接種後０、３、６、９、１２、及び１５日目に、マウスに腹腔内投与した。ジプロボッシム１０ｍｇ／ｋｇを含有したＯＶＡ（１００μｇ）又は溶媒を腫瘍接種後３日目に筋肉内投与した。最初の免疫の７日後、マウスにブースター投与を行った。また、腫瘍接種後３、６、９、１２、及び１５日目に生理食塩水１００μＬ中の抗ｍＰＤ−Ｌ１  ２００μｇを腹腔内投与した。
腫瘍はデジタルキャリパー（Ｆｉｓｈｅｒ）で測定し、腫瘍サイズは以下の式を用いて計算した：体積＝０．５×長さ×幅2。マウスは腫瘍の長さ又は幅が２ｃｍに達した場合、屠殺した。
【００５３】
腫瘍浸潤リンパ球の分離と染色
ＰＢＳ１００μＬ中の合計２×１０5個のＢ１６−ＯＶＡ細胞をマウスの脇腹に皮下投与し、腫瘍を定着させた（ｎ＝６匹／治療）。ジプロボッシム−１  １０ｍｇ／ｋｇ又はミョウバン２ｍｇ／ｋｇ含有ＯＶＡ（１００μｇ）を腫瘍接種後３日目のマウスに筋肉内投与した。最初の免疫の７日後、マウスにブースター投与を行った。また、腫瘍接種後３、６、９、及び１２日目に抗ｍＰＤ−Ｌ１  ２００μｇを腹腔内投与した。
腫瘍接種後１４日目に、腫瘍を採取し、細分化した後、４０μｍストレーナーで濾過し、単細胞懸濁液を得た。赤血球細胞をＲＢＣ溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）で溶解した。ペレット状にした後、抗マウスＣＤ４５．２−ＰＥ又はＣＤ４５．２−ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗マウスＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗マウスＣＤ４−ＢＶ７８６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗マウスＣＤ８−ＢＶ５１０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗マウスＣＤ４４−ＰＥ−ＣＦ５９４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ共役Ｈ−２Ｋｂ／ＯＶＡ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ；ＳＥＱ  ＩＤ番号：ＸＸ）テトラマー（ベイラー医科大学）、抗マウスＦ４／８０−ＰＥ（Ｔｏｎｂｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗マウスＣＤ１１ｂ−ＢＶ６０５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１１ｃ−ＢＶ７１１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＮＫ１．１−ＢＶ６５０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの抗体の混合物で細胞を４５分間染色した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。染色した細胞をＬＳＲＩＩ装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてフローサイトメトリーデータを分析した。
【００５４】
ＣＤ８Ｔ細胞のクロスプライミングの測定
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスに溶媒又はジプロボッシム１０ｍｇ／ｋｇと混合したＯＶＡ１００μｇを筋肉内投与した（ｎ＝４匹／治療）。２４時間後、流入領域リンパ節及び脾臓のＤＣをＭｏｕｓｅ  Ｐａｎ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で精製した。ＯＴ−ＩトランスジェニックマウスのＣＤ８Ｔ細胞をＭｏｕｓｅ  ＣＤ８＋Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で精製した。３×１０5個のＤＣを、１０体積／体積％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地及び１体積／体積％ペニシリン及びストレプトマイシンで３ｘ１０5個のＯＴ−Ｉ  ＣＤ８Ｔ細胞と２４時間共培養した。続いて細胞を回収し、抗マウスＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗マウスＣＤ８−ＢＶ５１０、及び抗マウスＣＤ６９−ＰＥ−ＣＦ５９４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で４５分間染色した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。染色した細胞をＬＳＲＩＩ装置で分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてフローサイトメトリーデータを分析した。
統計解析
データはすべてのグラフでエラーバー付きで平均±ＳＥＭを示す。実験群間の統計学的有意差は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７及び提示した統計的検定を用いて判定していた。独立した２つの実験群間の差を比較するために、独立Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定を用いて、両側Ｐ値が報告される。Ｐ値は＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１で示される。Ｐ≦０．０５は統計学的に有意とみなされた。
【００５５】
方法
ジプロボッシム−１の合成
【化１２】
2021533134.tif 000028
ジプロボッシム分子及び中間体の合成については、２０１８年１月４日に公開された国際公開第２０１８／００５８１２号に示され、かつ詳細に説明されている。また、例示的な合成を以下に示す。
（３Ｓ，４Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−エチル  ４−（（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキソオキサゾリジン−３−カルボニル）ピロリジン−１，３−ジカルボキシレート（２）。（３Ｓ，４Ｓ）−エチル−１−ベンジル−４−（（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキソオキサゾリジン−３−カルボニル）ピロリジン−３−カルボキシレート（Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，４８９，３５４号明細書に従って、単一立体異性体として調製）（１、３．４３ｇ、７．８６ミリモル）及びＢｏｃ2Ｏ（１．８０ｇ、８．２５ミリモル、１．０５当量）を室温でエタノール（ＥｔＯＨ、５０ｍＬ）に溶解した。Ｐｄ（ＯＨ）2／Ｃ（５００ｍｇ）を添加し、窒素（Ｎ2）を用いて反応混合液を１５分間噴霧した。
水素（Ｈ2）充填バルーンと真空源を備えた３方向フラッシングアダプターを装着した。溶剤が沸騰し始めるまで反応混合液上の空間を真空引きした後、Ｈ2を充填した。この真空引き／充填工程を１０〜１５回くり返して液上空間のＨ2を最大にした。反応混合液は１８時間攪拌した後、６ｃｍのセライトプラグを通して濾過し、ＥｔＯＨのアリコート（３×１５ｍＬ）で徹底的に洗浄して濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で２．９３ｇ（８４％）の２を透明粘性油として得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．４０−７．１９（ｍ，５Ｈ）、４．６９（ｄｄ，Ｊ＝９．０，４．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．５２（ｑ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．２９−４．１４（ｍ，４Ｈ）、３．９５−３．７５（ｍ，２Ｈ）、３．６０（ｍ，２Ｈ）、３．５２−３．２７（ｍ，２Ｈ）、２．８６−２．７１（ｍ，１Ｈ）、１．４６（ｓ，９Ｈ）、１．２８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ23Ｈ31Ｎ2Ｏ7［Ｍ＋Ｈ］+４４７．２１２６，ｆｏｕｎｄ：４４７．２１２６。
（３Ｓ，４Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３，４−ジカルボン酸（３）（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍ．８，８８３−８８７（１９９７）の手順を改変）。（３Ｓ，４Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−エチル−４−（（Ｓ）−４−ベンジル−２−オキソオキサゾリジン−３−カルボニル）−ピロリジン−１，３−ジカルボキシレート（（３Ｓ，４Ｓ）−２、２．０６ｇ、４．６３ミリモル）を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、２０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。過酸化水素（２．１０ｍＬ、約１８．５ミリモル、４．０当量、３０％質量／体積）を、攪拌した反応溶液に滴加した。３〜５分後、ＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ（５００ｍｇ、１１．９ミリモル）を添加した。２時間後、追加のＬｉＯＨ（４７０ｍｇ、１１．２ミリモル）をＨ2Ｏ（１０ｍＬ）及びＴＨＦ（１５ｍＬ）と併せて添加した。
【００５６】
水性ＴＨＦ反応混合液を３時間攪拌し、室温に温めた。飽和水性Ｎａ2ＳＯ3（１０ｍＬ）を添加し、Ｎ2流下でＴＨＦを除去した。得られた混合液をＨ2Ｏ（２００ｍＬ）に注ぎ入れ、塩化メチレン（ＣＨ2Ｃｌ2、２×１００ｍＬ）で抽出し、オキサゾリジノンを除去した。
水相は水性１Ｎ  ＨＣｌを加えてｐＨ２（約７５ｍＬ）の酸性にした。水相はエチル酢酸塩（ＥｔＯＡｃ、３×１２５ｍＬ）で抽出し、有機抽出液をＮａ2ＳＯ4で乾燥させた後、濾過して濃縮し、１．１３ｇ（９４％）の（Ｓ，Ｓ）−３を白色固体として得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ３．５９−３．４８（ｍ，２Ｈ）、３．４１−３．３１（ｍ，２Ｈ）、３．３０−３．１８（ｍ，２Ｈ）、１．３９（ｓ，９Ｈ）。
（３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル−３，４−Ｂｉｓ（（（１Ｓ，２Ｒ）−２−フェニルシクロプロピル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボキシレート（５）。（３Ｓ，４Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３，４−ジカルボキシレート（（Ｓ，Ｓ）−３、７７５ｍｇ、２．９９ミリモル）、（１Ｓ，２Ｒ）−トランス−２−フェニルシクロプロピルアミン（（１Ｓ，２Ｒ）−４、８１６ｍｇ、６．１３ミリモル、２．０５当量、Ｄ−Ｌ  Ｃｈｉｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから市販されている）、及び１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ、８９５ｍｇ、６．５８ミリモル、２．２０当量）をＮ2雰囲気下で無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、（１５ｍＬ）に溶解した。２，６−ルチジン（１．７５ｍＬ、１４．９ミリモル、５．００当量）をゆっくり添加した。試薬を溶解しながら（約１５分間）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ、１．４３ｇ、７．４７ミリモル、２．５０当量）を一部に添加し、反応混合液を１８時間攪拌した後、水性１Ｎ  ＨＣｌ（１５０ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に注ぎ入れた。
【００５７】
水相はＥｔＯＡｃ（２×７５ｍＬ）で抽出し、組み合わせた有機相を水性１Ｎ  ＨＣｌ（７５ｍＬ）、飽和水性ＮａＨＣＯ3（７５ｍＬ）、及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）で順次洗浄した。有機相はＮａ2ＳＯ4で乾燥させた後、濾過して濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で１．０２ｇ（７０％）の５を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ７．３３−７．２４（ｍ，５Ｈ）、７．２３−７．０９（ｍ，５Ｈ）、６．６１（ｓ，１Ｈ）、６．４３（ｓ，１Ｈ）、３．８５（ｔ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．６８（ｍ，１Ｈ）、３．６０（ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ）、３．４２（ｔ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．２７（ｑ，Ｊ＝１０．０，９．３Ｈｚ，１Ｈ）、３．１２（ｔ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ）、２．８８（ｍ，２Ｈ）、２．０５（ｄｄｔ，Ｊ＝９．８，６．４，３．４Ｈｚ，２Ｈ）、１．４６（ｓ，９Ｈ）、１．２４（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ）、１．１３（ｄｔ，Ｊ＝１０．１，５．３Ｈｚ，２Ｈ）。  ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ29Ｈ36Ｎ3Ｏ4［Ｍ＋Ｈ］+４９０．２７００，ｆｏｕｎｄ：４９０．２７０５。
（３Ｓ，４Ｓ）−Ｎ3，Ｎ4−ビス（（１Ｓ，２Ｒ）−２−フェニル−シクロプロピル）ピロリジン−３，４−ジカルボキサミド塩酸塩（６）。（３Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル−３，４−ビス（（（１Ｓ，２Ｒ）−２−フェニルシクロプロピル）カルバモイル）−ピロリジン−１−カルボキシレート（５、９９８ｍｇ、２．０４ミリモル）を室温で無水ＴＨＦ（２ｍＬ）に懸濁させた。４Ｎ  ＨＣｌ（８ｍＬ、ジオキサン中の４．０Ｍ溶液）を、激しく攪拌した反応溶液に滴加した。室温で３時間攪拌した後（攪拌中に反応混合液からいくらか生成物が沈殿していた）、Ｎ2流により１６時間にわたって溶剤を除去した。残留固形分を無水ＴＨＦに懸濁させ、真空中で（３×５ｍＬ）再濃縮してジオキサン及び過剰なＨＣｌを完全に除去した。無水Ｅｔ2Ｏ（３×５ｍＬ）を用いてこの工程をくり返し、８７０ｍｇ（９９％）の６を非晶質の白色固体として得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ９．３５（ｓ，２Ｈ）、８．７６（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．２６（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，４Ｈ）、７．２０−７．０６（ｍ，６Ｈ）、３．７６−３．６２（ｍ，１Ｈ）、３．５５−３．４２（ｍ，１Ｈ）、３．２６（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．２１−３．１１（ｍ，２Ｈ）、２．９０−２．７８（ｍ，２Ｈ）、１．９９（ｄｄｄ，Ｊ＝９．６，６．３，３．４Ｈｚ，２Ｈ）、１．２６−１．１３（ｍ，４Ｈ）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ24Ｈ28Ｎ3Ｏ2［Ｍ＋Ｈ］+３９０．２１７６，ｆｏｕｎｄ：３９０．２１７８。
【００５８】
ジプロボッシム−１：（３Ｓ，３’Ｓ，４Ｓ，４’Ｓ）−１，１’−テレフタロイルビス（Ｎ3，Ｎ4−ビス（（１Ｓ，２Ｒ）−２−フェニルシクロ−プロピル）ピロリジン−３，４−ジカルボキサミド）。（３Ｓ，４Ｓ）−Ｎ3，Ｎ4−ビス（（１Ｓ，２Ｒ）−２−フェニルシクロプロピル）−ピロリジン−３，４−ジカルボキサミド塩酸塩（６、５００ｍｇ、１．１７ミリモル、２．２０当量）及びテレフタル酸（ベンゼン−１，４−ジカルボン酸、８９ｍｇ、０．５３ミリモル、１．００当量）を室温で無水ＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解させた。ｉ−Ｐｒ2ＮＥｔ（０．２８０ｍＬ、１．６０ミリモル、３．００当量）を、更に５分後にブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＰｙＢｒＯＰ、４９７ｍｇ、１．０７ミリモル、２．００当量）を添加し、混合液を２３℃で１８時間攪拌した。１８時間後、反応混合液をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈し、水性０．５Ｎ  ＨＣｌ（２×１５０ｍＬ）で洗浄した。水相はＥｔＯＡｃ（１×５０ｍＬ）で抽出した。
組み合わせた有機相を飽和水性ＮａＨＣＯ3（１００ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（７５ｍＬ）で洗浄した。有機相はＮａ2ＳＯ4で乾燥させた後、上清を移して濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、５〜８％ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）でジプロボッシム−１を得た。ジプロボッシム−１は低温（０℃）の１：１  Ｅｔ2Ｏ／ＥｔＯＡｃ（３×５ｍＬ）を用いて摩砕し、液体相の上清を移して更に精製して、４２１ｍｇ（８６％）の純粋なジプロボッシムを得ることができた。［α］26D＋５７（ｃ０．３３、ＥｔＯＨ）。ＩＲ（ｎｅａｔ）ｖmax  ３２５９、１６３３、１５３９、１４２６、１３８６、１０７３、６９５ｃｍ-1。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）δ８．４２（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，２Ｈ）、８．２９（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．５６（ｓ，４Ｈ）、７．２７−７．２１（ｍ，８Ｈ）、７．１９−７．０９（ｍ，８Ｈ）、７．０９−７．０３（ｍ，４Ｈ）、３．８０（ｄｄ，Ｊ＝１２．０，８．６Ｈｚ，２Ｈ）、３．７１−３．５８（ｍ，２Ｈ）、３．５１（ｄｄｄ，Ｊ＝１５．６，１１．２，８．２Ｈｚ，４Ｈ）、３．１９（ｑ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．１０（ｑ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ）、２．９０−２．８０（ｍ，２Ｈ）、２．８０−２．７３（ｍ，２Ｈ）、１．９７（ｄｄｄ，Ｊ＝９．６，６．４，３．４Ｈｚ，２Ｈ）、１．８６（ｄｄｄ，Ｊ＝９．５，６．３，３．４Ｈｚ，２Ｈ）、１．２１−１．１３（ｍ，４Ｈ）、１．１３−１．０５（ｍ，４Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１７１．６５、１７０．９３、１６７．４６、１４１．２８、１４１．１９、１３７．７１、１２８．１７、１２８．１４、１２７．０９、１２５．８３、１２５．７９、１２５．６０、５１．４８、４８．７４、４６．９５、４５．８３、４５．０７、３２．５４、３２．４５、２５．８７、２３．９０、２３．８１、１５．３３、１５．２４。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ56Ｈ57Ｎ6Ｏ6［Ｍ＋Ｈ］+９０９．４３３４，ｆｏｕｎｄ：９０９．４３３４。
〔引用文献〕
【００５９】
2021533134.tif 000029
2021533134.tif 000030
2021533134.tif 000031
2021533134.tif 000032
2021533134.tif 000033
【００６０】
本明細書に引用した特許、特許出願、及び論文はそれぞれ参照により援用される。
前述の説明及び実施例は、例示を意図したものであり、限定として解釈されるべきではない。本発明の精神及び範囲内で更に他の変形が可能であり、当業者には容易に想起されるであろう。
【図１Ａ】
2021533134.tif 000045
【図１Ｂ】
2021533134.tif 000046
【図１Ｃ】
2021533134.tif 000047
【図１Ｄ】
2021533134.tif 000048
【図１Ｅ】
2021533134.tif 000049
【図２Ａ】
2021533134.tif 000050
【図２Ｂ】
2021533134.tif 000051
【図２Ｃ】
2021533134.tif 000052
【図２Ｄ】
2021533134.tif 000053
【図３Ａ】
2021533134.tif 000054
【図３Ｂ】
2021533134.tif 000055
【図３Ｃ】
2021533134.tif 000056
【図３Ｄ】
2021533134.tif 000057
【図３Ｅ】
2021533134.tif 000058
【図３Ｆ】
2021533134.tif 000059
【図３Ｇ】
2021533134.tif 000060
【図４Ａ】
2021533134.tif 000061
【図４Ｂ】
2021533134.tif 000062
【図４Ｃ】
2021533134.tif 000063
【図４Ｄ】
2021533134.tif 000064
【図４Ｅ】
2021533134.tif 000065
【図４Ｆ】
2021533134.tif 000066
【図４Ｇ】
2021533134.tif 000067
【図４Ｈ】
2021533134.tif 000068
【図４Ｉ】
2021533134.tif 000069
【図４Ｊ】
2021533134.tif 000070
【図５Ａ】
2021533134.tif 000071
【図５Ｂ】
2021533134.tif 000072
【図５Ｃ】
2021533134.tif 000073
【図５Ｄ】
2021533134.tif 000074
【図５Ｅ】
2021533134.tif 000075
【図５Ｆ】
2021533134.tif 000076
【図５Ｇ】
2021533134.tif 000077
【図５Ｈ】
2021533134.tif 000078
【図５Ｉ】
2021533134.tif 000079
【図５Ｊ】
2021533134.tif 000080
【図５Ｋ】
2021533134.tif 000081
【図５Ｌ】
2021533134.tif 000082
【図５Ｍ】
2021533134.tif 000083
【図６】
2021533134.tif 000084
【図７】
2021533134.tif 000085
【図８Ａ】
2021533134.tif 000086
【図８Ｂ】
2021533134.tif 000087
【図９Ａ】
2021533134.tif 000088
【図９Ｂ】
2021533134.tif 000089
【国際調査報告】
2021533134.tif 000090
2021533134.tif 000091
2021533134.tif 000092
2021533134.tif 000093