(57)【要約】  本発明は、ナノ粒子および医療用途の分野に関する。具体的には、がん治療に使用するためのポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子内にカプセル化されている、活性成分としてのカバジタキセル（ＣＢＺ）に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん治療に使用するための、カバジタキセル（ＣＢＺ）またはその薬学的に許容される塩が負荷されているＰＥＧ化ポリ（アルキルシアノアクリレート）（ＰＡＣＡ）ナノ粒子（ＮＰ）を含む薬物送達システムであって、前記ＣＢＺが、前記ＮＰの１〜５０重量％、優先的には前記ＮＰの５〜２０重量％を構成し、前記薬物送達システムが、ＮＰ安定化マイクロバブル（ＭＢ）を含まないことを条件とする、薬物送達システム。
【請求項２】
前記ＰＡＣＡ  ＮＰが、ミニエマルションアニオン重合プロセスに従って生成される、請求項１に記載の薬物送達システム。
【請求項３】
前記ＮＰが、さらに標的化部分によって表面修飾されている、請求項１または２のいずれかに記載の薬物送達システム。
【請求項４】
前記ＰＡＣＡ  ＮＰが、１〜８００ｎｍ、または１０〜５００ｎｍ、または７０〜１５０ｎｍから選択される範囲などの８００ｎｍ未満である、請求項１〜３のいずれかに記載の薬物送達システム。
【請求項５】
前記薬物送達システムが、非経口投与される、請求項１〜４のいずれかに記載の薬物送達システム。
【請求項６】
前記薬物送達システムが、血中に投与される、請求項１〜５のいずれかに記載の薬物送達システム。
【請求項７】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の薬物送達システム。
【請求項８】
前記がんが、血管相の腫瘍である、請求項１〜７のいずれかに記載の薬物送達システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ粒子および医療用途の分野に関する。具体的には、がん治療に使用するためのポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子内にカプセル化されている活性成分に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品におけるナノテクノロジーの使用は、多くの心躍る可能性を提供し、多くの医療用途における潜在性が予見される。具体的には、ナノ医薬品は複雑な疾患の治療に大きな改善をもたらすと予想されている。ナノ粒子の使用が特定の価値を実証し始めている２つの領域は、薬物送達および分子イメージングである。
【０００３】
ポリ（アルキルシアノアクリレート）（ＰＡＣＡ）は、最初に外科用接着剤として開発および承認された。ＰＡＣＡナノ粒子（ＮＰ）は、生分解性であり、高い薬物負荷容量を可能にする薬物担体としての有望な能力を後に実証した。
【０００４】
ＷＯ２０１４／１９１５０２Ａ１は、ＰＡＣＡホモポリマーまたはコポリマーのステルスＮＰを調製するための、水中油型ミニエマルションのアニオン重合を含むワンステップ重合プロセスを開示している。開示されているように、ミニエマルションを特定の部類のポリアルキレングリコール誘導体と組み合わせて利用することによって、ポリアルキレングリコールに標的化部分を共有結合させることが可能であり、それによって、標的化基の導入およびステルスコロナの形成を同時に可能にする。ミニエマルションは、活性薬剤を含有することができることが記載されており、療法剤のリストが開示されている。しかしながら、いずれの例も、これらの薬剤のうちのいずれのカプセル化も含まず、インビトロまたはインビボデータのいずれも開示されていない。
【０００５】
新しい標的治療オプションおよび免疫療法が開発されているが、依然として化学療法が進行がん患者の主な療法オプションである。しかしながら、ある特定のがんタイプには療法効果が十分ではなく、治療による重篤な副作用も生じる。薬物負荷ＮＰのうちのいくつかの製品が市場に出ており、多くの新しい製品候補が臨床試験中である。がんの薬物送達におけるナノ粒子の使用の課題および機会を含むこれらの態様は、Ｓｈｉら（２０１７）およびＴｏｒｃｈｉｌｉｎ（２０１４）を含む多数の概説および解説で考察されている。向上した透過性および保持（ＥＰＲ）（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  ｅｔ  Ｍａｅｄａ，１９８６）の恩恵によって効能が改善されることに加えて、ＮＰカプセル化薬物送達は、毒性の低減を実証し得る。Ｐａｒａｈｂａｋａｒら（２０１３）に記載されているように、市場の薬物負荷ＮＰの主な利点は、遊離薬物よりも副作用が少なく、ある程度同様の療法効能を有することである。
【０００６】
Ｓｎｉｐｓｔａｄら（２０１７）では、マイクロバブル（ＭＢ）および超音波と組み合わせたＰＥＧ化ＰＥＢＣＡ  ＮＰの医学用途が開示されている。記載の薬物送達システムは、高分子ナノ粒子（ＮＰＭＢ）によって安定化されたマイクロバブルからなり、これは、超音波が媒介する薬物送達を可能にする。ＮＰは、ミニエマルション重合によって合成される。トリプルネガティブヒト乳腺がん腫細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における、カバジタキセル（ＣＢＺ）を含有するＮＰおよびこれらのＮＰのインビトロ毒性が開示されている。Ｓｎｉｐｓｔａｄら（２０１７）に開示されている薬物送達システムのインビボデータは、局所的な固形腫瘍に対するＮＰ安定化ＭＢによって達成される療法効果、および集束超音波を適用することによって改善された効果がどのように達成されるかを記載している。
【０００７】
乳がんは、女性に最も一般的な非皮膚悪性腫瘍であり、がん死亡率では肺がん腫に次いで２番目である。乳がんにはいくつかのタイプがあり、過去１０年間で、遺伝子発現プロファイルに基づいて乳がんの分子分類を実施することが可能になっている。ヒト乳房腫瘍の分析によって、独特な遺伝子シグネチャおよび臨床転帰を有する、著しく強力な分子サブタイプが明らかになっている（Ｔｏｆｔ  ａｎｄ  Ｃｒｙｎｓ，Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２０１１  Ｆｅｂ；２５（２）：１９９−２１１）。基底様乳がん（ＢＬＢＣ）は、成人の乳腺の基底層または外層の上皮細胞によって発現される遺伝子の強力なクラスターによって定義される、特に攻撃的な分子サブタイプである。これらの腫瘍は若い女性に蔓延しており、多くの場合、急速に再発するため、ＢＬＢＣは主要な臨床的課題である。加えて、ほとんどの（すべてではない）基底様腫瘍は、ステロイドホルモン受容体（エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体）、ならびにヒト上皮成長因子受容体２の発現が欠如しており、これらの主なトリプルネガティブ乳がんに対する標的療法オプションを制限する。Ｅｎｇｅｂｒａａｔｅｎら（２０１３）に記載されているように、基底様腫瘍には、標的療法は利用可能ではなく、したがって、患者は、改善された化学療法計画から利益を受けるであろう。
【０００８】
乳がんに対応するものは、男性では前立腺がんである。これは、男性の間で最も一般的ながんであり、男性の生殖器系の腺である前立腺に発生する。ほとんどの前立腺がんはゆっくりと成長するが、しかしながら一部は比較的急速に成長する。がん細胞は、前立腺から体の他の領域、具体的には骨およびリンパ節に広がる場合がある。前立腺がんは、多くの場合、早期に発見されれば、うまく治療することができる。
【０００９】
タキサンは、ヒトのがんにおいて効能が証明されている重要な化学療法剤である。タキサンとしては、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、およびそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。元来、パクリタキセルは、太平洋イチイの木に由来していた。ドセタキセルは、パクリタキセルの半合成類似体である。Ｖｒｉｇｎａｕｄら（２０１３）によって特徴評価されたＣＢＺは、比較的新規の半合成タキサン誘導体である。ＣＢＺは、微小管の安定化による強力な細胞増殖抑制効果を有するが、その毒性に起因してその使用は制限されている。ＣＢＺは、いくつかのタイプのがんに対する効能を調査するいくつかの臨床試験に含まれている。ＣＢＺは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって、ドセタキセル化学療法後の第２選択薬物として難治性前立腺がんの治療用に承認されている。タキサンは、水への可溶性が低いため、医薬品としての配合が困難である。
【００１０】
したがって、療法剤を特定の場所に効果的に送達することが可能な新しい薬物送達システムを開発することが望ましく、したがってこれが本発明の目的である。具体的には、より少ない有害な副作用に加えて、効能を実証する薬物送達システムが望ましいであろう。
【００１１】
新しい薬物送達システムが疎水性および／または難溶性の療法剤を送達することが可能であれば、さらに望ましい。
最終的には、薬物送達システムが標的療法が利用可能ではない腫瘍の治療に好適であれば、望ましい。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の第１の態様では、がん治療に使用するための、カバジタキセル（ＣＢＺ）またはその薬学的に許容される塩が負荷されているＰＥＧ化ポリ（アルキルシアノアクリレート）（ＰＡＣＡ）ナノ粒子（ＮＰ）を含む、薬物送達システムであって、薬物送達システムが、ＮＰ安定化マイクロバブル（ＭＢ）を含まないことを条件とする、薬物送達システムが本明細書で提供される。
【００１３】
この態様の一実施形態では、薬物送達システムは、ＭＢを安定化するＮＰ、またはガス充填ＭＢを安定化するために使用されるＮＰを含まない。別の実施形態では、薬物送達システムは、ＭＢに会合しているＮＰを含まない。なお別の実施形態では、薬物送達システムは、ガス充填ＭＢを含まない。さらなる実施形態では、薬物送達システムは、ＭＢを含まない。
【００１４】
さらなる実施形態では、ＰＡＣＡ  ＮＰは、ミニエマルションアニオン重合プロセスに従って生成される。
別の実施形態では、ＮＰは、標的化部分によってさらに表面修飾されている。
【００１５】
第１の態様の異なる実施形態によれば、ＰＡＣＡ  ＮＰは、１〜８００ｎｍ、または１０〜５００ｎｍ、または７０〜１５０ｎｍから選択される範囲などの８００ｎｍ未満である。
【００１６】
なお他の実施形態では、ＣＢＺは、ＮＰの１〜９０重量％、優先的にはＮＰの５〜５０重量％、より優先的には５〜２０重量％、または最も優先的にはＮＰの５〜１５重量％を構成する。特定の実施形態では、ＣＢＺは、ＮＰの６〜１３重量％、より具体的にはＮＰの約６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３重量％を構成する。
【００１７】
第１の態様の他の実施形態では、薬物送達システムは、非経口投与され、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。
第１の態様のなお別の実施形態では、がんは、血管相の腫瘍である。
【００１８】
さらなる実施形態では、腫瘍は、前立腺がん、乳がん、神経膠腫、肺がん、副腎皮質がん腫、精巣がん、尿路移行上皮細胞がん腫、および卵巣がんからなる群から選択されるタイプのがんに属する。なお別の実施形態では、薬物送達システムは、リンパ節を介した転移を防止するためのがんの予防的治療に使用するためのものである。
【００１９】
なおさらなる実施形態では、薬物送達システムは、カプセル化薬物の療法効果を向上するための、免疫調節剤および／またはビヒクルとして使用するためのものである。
本発明の第２の態様では、第１の態様による薬物送達システムを、それを必要とする患者に投与することを含む、がんを治療するための方法も提供される。
【００２０】
第３の態様では、本発明の第１の態様による薬物送達システムを含む組成物または溶液が提供される。組成物または溶液は、薬学的に許容される賦形剤および希釈剤を含む薬学的配合物であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＭＡＳ９８．１２効能研究に使用したバッチのサイズ分布。ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ（表１の２１５ｎｍの平均ｚサイズを有するバッチ）のサイズ分布を濃い青色で示し、ＰＥＢＣＡ（薬物を含まず、表１の１５６ｎｍの平均ｚを有するバッチ）のサイズ分布を薄い青色で示す。Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０溶液に可溶化した非カプセル化ＣＢＺのサイズ分布を赤色で示す。ｙ軸上の強度（％）は、全散乱の強度パーセントを意味する。
【図２】患者由来のＭＡＳ９８．１２異種移植（ＰＤＸ）乳房腫瘍モデルを担持するマウスで研究された治療効能および毒性。治療後の腫瘍成長阻害（Ａ）および体重変化（Ｂ）。ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺおよびＣＢＺは、赤い矢印で示されている３３および３６日目に、ＣＢＺ２ｘ１５ｍｇ／体重ｋｇで注射した。空のＰＥＢＣＡ  ＮＰ（ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺと同じ用量）および生理食塩水を陰性対照として使用した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝８〜９腫瘍／５〜６マウス）。腫瘍サイズは、無作為化時に測定したサイズと相対的である。移植後５７日目の触診不可能な腫瘍は、完全寛解として示される。曲線下面積のウェルチｔ検定の統計的ｐ値を示す（ｐ＝０．０２）。
【図３】ＭＡＳ９８．１２腫瘍担持マウスで測定した、蛍光色素ＮＲ６６８を含有するＰＥＢＣＡ粒子の生体内分布。全身画像は、ＮＰの静脈内投与の１、４、２４、９６時間後にＩＶＩＳを用いて入手し、右側のカラースケールは、ラジアン効率×１０9を示す（Ａ）。単離された臓器のエクスビボ蛍光画像は、注射２４時間後に得た（Ｂ）。注射２４時間後に収集された組織の対象のピクセルデータ領域ごとの、相対放射効率としての蛍光強度の定量化（Ｃ）。２匹の動物について得られた平均値、エラーバーは推定ＳＤ値を示す。ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ：ＣＢＺおよびＮＲ６６８を含有するＰＥＢＣＡ、ＰＥＢＣＡ：ＮＲ６６８を含有するがＣＢＺは含有しないＰＥＢＣＡ。ＬＮ：リンパ節。
【図４】ＣＢＺ１５ｍｇ／ｋｇを投与後、質量分析法を用いて測定した血漿および臓器のＣＢＺ濃度。時間と相関して測定した血漿濃度（Ａ）。２４時間後（Ｂ）および９６時間後（Ｃ）に測定した、腫瘍および臓器のＣＢＺ濃度。ＬＮ：リンパ節。示されているデータは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）である。ｙ軸上ではすべて対数スケールが使用されていることに留意されたい。
【図５】治療されたＭＡＳ９８．１２腫瘍におけるマクロファージ浸潤。マクロファージ浸潤は、生理食塩水（対照）、ＰＥＢＣＡ  ＮＰ（薬物を含まず）、非カプセル化ＣＢＺ、およびＰＥＢＣＡ−ＣＢＺの注射９６時間後のＭＡＳ９８．１２腫瘍で測定した。（Ａ）：ＣＤ６８に対する抗体を使用して、浸潤したマクロファージの総集団を定量化した。（Ｂ）：ｉＮＯＳに対する抗体を使用して、抗腫瘍原性（炎症誘発性）マクロファージの集団を定量化した。（Ｃ）：ＣＤ２０６に対する抗体を用いて、腫瘍原性誘発性（抗炎症性）マクロファージの集団を定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして示されている（対照試料ではｎ＝３は、ＰＥＢＣＡではｎ＝４、ＣＢＺおよびＰＥＢＣＡ−ＣＢＺではｎ＝５）。アスタリスクは、独立２群のパラメトリックｔ検定によって得られた統計的有意性を示し、ｐ＜０．０００５を＊＊＊で印をつけ、ｐ＜０．０００１を＊＊＊＊で印をつけている。
【図６】ＭＡＳ９８．１２  ＰＤＸモデルでの治療効能。各バーは、図２に示されている個々のＭＡＳ９８．１２腫瘍の平均曲線下面積（ＡＵＣ）を表す。示されているデータは、平均±ＳＥＭである（各群でｎ＝９または１０の腫瘍）。統計的ｐ値は、示された群を比較する、ウェルチの不等分散ｔ検定を使用して計算されている。
【図７】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を担持するマウスにおける治療効能。ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ、非カプセル化ＣＢＺ、薬物を含まないＰＥＢＣＡ  ＮＰ、および生理食塩水の２回の注射後、腫瘍成長阻害を測定した。赤い矢印は、注射の日を示す。ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺおよびＣＢＺは、ＣＢＺ２ｘ１５ｍｇ／ｋｇで注射し、薬物を含有しないＰＥＢＣＡ粒子を２ｘ１７５ｍｇ注射し（ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ群のＮＰの量と同様）、体重１０ｇあたり２ｘ０．１ｍｌの生理食塩水を対照として注射した。
【図８】ＮＲ６６８を含有するＰＥＢＣＡ粒子注射後に得られた単離臓器のエクスビボ蛍光画像。粒子の注射１、４、および９６時間後に撮影した臓器の画像を示す（注射２４時間後に撮影された画像を図３に示す）。ＬＮ：リンパ節。
【図９】治療されたＭＡＳ９８．１２腫瘍におけるマクロファージ浸潤の免疫組織化学的染色。マクロファージ浸潤は、生理食塩水（対照）、ＰＥＢＣＡ  ＮＰ（薬物を含まず）、非カプセル化ＣＢＺ、およびＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ（左欄から右欄へ）の、注射９６時間後の腫瘍で測定した。（Ａ）抗ＣＤ６８、（Ｂ）抗ｉＮＯＳ、および（Ｃ）抗ＣＤ２０６を用いた免疫組織化学的染色。スケールバー：１００μｍ。
【図１０】３つの乳がん細胞株の細胞生存率および細胞増殖として測定した、インビトロ毒性。１００ｎＭのＣＢＺを含むＰＥＢＣＡ−ＣＢＺは、４．５μｇ／ｍｌのＰＥＢＣＡ材料を含有し、等量の空のＰＥＢＣＡ  ＮＰを比較のために与えた。左欄：ＭＴＴアッセイを用いて、インキュベーション７２時間後に測定した細胞生存率。右欄：インキュベーション２４時間後の［3Ｈ］チミジン取り込みとして測定した、細胞増殖。次の細胞株を使用した：（Ａ）：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、（Ｂ）：ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、および（Ｃ）：ＭＣＦ−７。平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として示されているデータ。
【図１１】Ｊｅｖｔａｎａ（登録商標）として配合されたＣＢＺ、ＰＥＢＣＡ  ＮＰ中のＣＢＺ、および対照を用いた、前立腺がん腫瘍モデル（ＰＣ３）の治療効果。３つの群の平均腫瘍サイズのプロット。矢印は治療日を示し、エラーバーは標準偏差を示し、＊＊＊はｐ＞０．００１、ｔ検定を示す。定義  「ナノ粒子（ＮＰ）」という用語は、本明細書では、８００ｎｍ未満の直線寸法を有する粒子またはカプセルを説明するために使用される。
【００２２】
「ＰＥＧ化」という用語は、本明細書では、ナノ粒子への、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖の共有結合および非共有結合の両方、または融合のプロセスを説明するために使用され、これは以後ＰＥＧ化（ペグ化）と記載される。当業者に既知であろうように、ＮＰ表面へのＰＥＧの会合は、ＮＰの周りに水のコロナを作り出すことによって、宿主の免疫系からＮＰを「隠す」ことができる。これによって、ＮＰに対する免疫原性および抗原性を低減することができ、腎クリアランスの低減によってその循環時間を延長することができる。表面上のＰＥＧの密度に応じて、ＰＥＧは、ブラシまたはキノコ構造に分類される。ＰＥＧ化は、共有結合または非共有結合のいずれかによって、ＮＰの合成中または合成後のいずれかで実施され、ＰＥＧ化の特性の変動を生じることができる。
【００２３】
「標的化部分」という用語は、本明細書では、ＮＰの表面に結合することができ、特定の細胞または生物学的表面への選択的結合を生じることができる、任意の分子を説明するために使用される。
【００２４】
「受動的標的化」という用語は、本明細書では、血管の漏れおよびリンパ排液の障害に起因して発生する炎症のある悪性組織における、ナノ粒子の蓄積および／または保持を説明するために使用される。受動的標的化は、ＮＰの表面上の部分を標的化することに依存しない。
【００２５】
「能動的標的化」という用語は、本明細書では、標的化部分と細胞表面または生物学的表面との間の特異的相互作用に起因する、特定の細胞または生物学的表面上へのナノ粒子の蓄積および／または保持を説明するために使用される。
【００２６】
「向上した透過性および保持（ＥＰＲ）」効果という用語は、本明細書では、ある特定のサイズの分子（典型的にはリポソーム、ナノ粒子、および巨大分子薬物）が、正常組織におけるよりもはるかに多く腫瘍組織に蓄積される傾向がある現象を説明するために使用される。本明細書に記載のＮＰは、典型的には、約１０〜５００、好ましくは約７０〜１５０ｎｍなどの約１〜８００ｎｍのサイズのものである。したがって、ＥＰＲ効果は、本明細書に記載のＮＰが、選択的に血管外に浸出し、腫瘍に蓄積することを可能にするであろう。
【００２７】
「非経口投与」および「非経口投与される」という用語は、当技術分野で認識されている用語であり、注射などの経腸および局所投与以外の投与モードを含み、限定されないが、静脈内、筋肉内、胸膜内、血管内、心膜内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内の注射および注入が挙げられる。
【００２８】
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、疾患の重症度および治療の必要性に照らして、本明細書に記載の治療を達成するために、系または組成物が、過度に有害な副作用がなく、ヒト患者を含む対象に投与するために好適であることを示す。
【００２９】
「療法」、「治療する」、「治療すること」、および「治療」という用語は、疾患のリスクがある、または疾患を患っている患者に利益を提供するあらゆる行為を指すために同義的に使用され、少なくとも１つの症状の軽減、阻害、抑制、または排除を通じた状態の改善、疾患進行の遅延、疾患発症の可能性の予防、遅延、または阻害などを含む。
【００３０】
「ナノ粒子が会合しているマイクロバブル」または「マイクロバブルが会合しているナノ粒子」という用語は、本明細書では、ナノ粒子がマイクロバブル界面とどのように相互作用することができるかを説明するために使用される。これに関連して使用される「会合する」という用語は、共有結合、非共有結合、水素結合、イオン結合、または他の任意の表面−表面相互作用などの任意のタイプの化学結合による会合を含む。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、がん治療に使用するための、カバジタキセル（ＣＢＺ）が負荷されているＰＥＧ化ポリ（アルキルシアノアクリレート）（ＰＡＣＡ）ナノ粒子（ＮＰ）を含む、薬物送達システムについて説明し、薬物送達システムが、マイクロバブル（ＭＢ）を含まないことを条件とする。
【００３２】
細胞毒性薬物ＣＢＺが負荷されているＰＡＣＡ  ＮＰの効果は、いくつかのインビトロおよびインビボ研究で実証されている。本明細書に開示されているように、研究は、３つの乳がん細胞株、免疫不全マウスの乳房脂肪体で成長した患者由来の１つの基底様異種移植モデル、および１つの前立腺がん腫瘍モデルにおける効果の実証を含む。ＮＰカプセル化ＣＢＺは、非カプセル化薬物と同様の濃度で同様の、またはそれよりさらに良好な効能を有することが実証されている。患者由来の基底様異種移植で実証されるように、結果は、８つの腫瘍のうちの６つが完全寛解を示している。血液および選択された組織試料を使用して実施したＣＢＺの質量分析法を用いて、非カプセル化ＣＢＺに対する、ＮＰカプセル化ＣＢＺで得られる異なる薬物濃度を調査した。結果は、ナノ粒子カプセル化薬物が、血中での長い循環時間、腫瘍組織内での高い含有量を有することを示している。質量分析法を使用して２４時間後に得られる組織の生体内分布は、蛍光物質ＮＲ６６８で標識されたナノ粒子のＩＶＩＳ（登録商標）分光インビボイメージングを使用して得られる生体内分布データと、良好に相関する。これは、これらのデータもナノ粒子の分布を表すものであることを明確に示している。さらに、免疫組織化学を使用して、ＮＰカプセル化ＣＢＺ注射後および非カプセル化ＣＢＺ注射後の、腫瘍組織へのマクロファージの浸潤を推定した。ＮＰで治療された腫瘍では、腫瘍原性誘発性マクロファージに対して、抗腫瘍原性マクロファージの含有量が高いことも実証された。理論に縛られることなく、これは、ＮＰカプセル化薬物で得られる改善された効果にさらに寄与し得る。要約すると、ＰＡＣＡ  ＮＰ内へのＣＢＺのカプセル化は、臨床的に利用可能な薬物の配合物に代わる、有望な代替物である。
【００３３】
当業者によって理解されるであろうように、本明細書に開示の発明は、Ｓｎｉｐｓｔａｄら（２０１７）に記載されているような薬物送達システムとは異なる。本明細書に記載されているように、本発明の薬物送達システムは、Ｓｎｉｐｓｔａｄら（２０１７）に記載されているようなＮＰ安定化ＭＢを含まない。異なる実施形態では、本発明による薬物送達システムは、ＭＢを安定化するＮＰも、ガス充填ＭＢを安定化するために使用されるＮＰも含まない。したがって、本発明の薬物送達システムは、Ｓｎｉｐｓｔａｄら（２０１７）に記載の超音波が媒介する送達システムとは対照的に、超音波に依存せずに治療効果を達成する。
【００３４】
したがって、本明細書で提供される本発明の一実施形態は、がん治療に使用するための、ＣＢＺまたはその薬学的に許容される塩が負荷されているＰＥＧ化ＰＡＣＡ  ＮＰを含む、薬物送達システムであって、薬物送達システムが、超音波または集束超音波などの音場によって媒介されないことを条件とする、薬物送達システムである。
【００３５】
本発明のさらなる実施形態では、薬物送達システムは、ＭＢに会合しているＮＰを含まない。ガス充填ＭＢを含まない薬物送達システムも開示される。なお別の実施形態では、薬物送達システムは、ＭＢを含まない。
【００３６】
Ｓｕｌｈｅｉｍら（２０１６）によって実証されたように、ＰＡＣＡ  ＮＰの分解速度は、シアノアクリレートモノマーのアルキル鎖の選択によって制御することができる。使用されるモノマー、すなわちｎ−ブチル−、２−エチル−ブチル−、またはオクチルシアノアクリレート（それぞれＢＣＡ、ＥＢＣＡ、およびＯＣＡ）に細胞毒性が依存することも、細胞株のパネルを使用して実証されており、Ｓｕｌｈｅｉｍら（２０１７）を参照されたい。
【００３７】
本発明の異なる実施形態では、シアノアクリレートモノマーのアルキル鎖は、線状または分岐状Ｃ４〜Ｃ１０アルキル鎖である。好ましい実施形態では、使用されるモノマーは、ｎ−ブチル−（ＢＣＡ）、２−エチルブチル（ＥＢＣＡ）、ポリイソヘキシル（ＩＨＣＡ）、およびオクチルシアノアクリレート（ＯＣＡ）からなる群から選択される。したがって、異なる実施形態では、薬物送達システムは、ＰＢＣＡ、ＰＥＢＣＡ、ＰＩＨＣＡ、およびＰＯＣＡからなる群から選択されるＮＰを含む。
【００３８】
本明細書に記載されているように、ＮＰは、ＰＥＧ化されている、すなわち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーでコーティングされている。
薬物送達におけるＰＥＧ化の理論的根拠は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射などの非経口投与後の循環時間の増加を得ることである。これは良好に実証されており、当業者に既知である。Ａｓｌｕｎｄら（２０１７）は、ＰＡＣＡナノ粒子に対する異なるタイプのＰＥＧを含む分子の定量的および定性的効果を研究した。例えば、表面上のより長いＰＥＧは、血液循環時間およびコラーゲンゲル中のＰＡＣＡ  ＮＰの拡散を増加させるであろうことを実証している。
【００３９】
したがって、ＰＥＧのタイプを変動させることによって、異なる表面修飾を有するＮＰを達成することができる。これは、本明細書に記載のＮＰのゼータ電位、タンパク質吸着、拡散、細胞間相互作用、および血液循環半減期に影響を与えるであろう。
【００４０】
本発明の異なる実施形態では、ＮＰは、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ、Ｂｒｉｊ、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるＰＥＧを含む分子でＰＥＧ化される。
【００４１】
一実施形態によれば、ＮＰは、ＰｌｕｒｏｎｉｃおよびＫｏｌｌｉｐｈｏｒから選択されるＰＥＧを含む分子でＰＥＧ化される。
別の実施形態によれば、ＮＰは、ＢｒｉｊおよびＫｏｌｌｉｐｈｏｒから選択されるＰＥＧを含む分子でＰＥＧ化される。
【００４２】
本発明の一実施形態では、ＰＡＣＡ  ＮＰは、標的化部分を含む場合または含まない場合の両方のミニエマルションアニオン重合プロセス、具体的には、ＷＯ２０１４／１９１５０２に記載のワンステッププロセスによって生成される。
【００４３】
標的化部分でさらに表面修飾されているＮＰを使用することによって、たとえば、標的化部分に共有結合しているポリアルキレングリコールを用いるミニエマルションアニオン重合技術によって調製されたＮＰを使用することによって、腫瘍または病変組織などの特定の位置で、能動的標的化および保持の向上を潜在的に可能にすることができる。また、これは、特定のリガンド−受容体相互作用に依存する、がん細胞への取り込みを促進することができる。
【００４４】
標的化部分は、標的位置にＮＰの特異的結合を引き起こす、任意の好適な部分であり得る。
好ましくは、標的化部分は、１００〜２０００００Ｄａ、より好ましくは２００〜５００００Ｄａ、さらにより好ましくは３００〜１５０００Ｄａの範囲の分子量を有する。
【００４５】
単一の標的化部分または異なる標的化部分の混合物が使用され得ることが理解されるべきである。
標的化部分の例は、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体断片、糖類、炭水化物、グリカン、サイトカイン、ケモカイン、ヌクレオチド、レクチン、脂質、受容体、ステロイド、神経伝達物質、細胞表面マーカー、がん抗原、糖タンパク質抗原、アプタマー、またはそれらの混合物からなる群から選択される。特に好ましい標的化部分としては、線状および環状ペプチドが挙げられる。一実施形態では、標的化部分は、アミノ酸および脂質からなる群に属さない
ナノ粒子は、漏れやすい血管系を有する腫瘍の周りの領域に蓄積するので、ナノ粒子が全身的に血中に投与されるときのナノ粒子のサイズが、ナノ粒子の標的化効果に影響を与えることが以前から知られている。これは、腫瘍組織における「強化された透過性および保持」（ＥＰＲ）効果として知られている。ＥＰＲ効果は一種の標的化であり、一般的に「受動的標的化」と称される。
【００４６】
従来、腫瘍標的化アプローチは、「受動的標的化」と「能動的標的化」とに分類される。
ＥＰＲ効果は、受動的標的化の形態として当業者には既知であろう。ＮＰの表面上への標的化部分の導入は、一種の能動的標的化として当業者には既知であろう。
【００４７】
血管新生は、新しい毛細血管が形成されることによる生物学的プロセスである。それは、胚発生、排卵、および創傷修復などの多くの生理学的状態、ならびに関節炎、糖尿病性網膜症、および腫瘍などの病理学的状態に不可欠である。
【００４８】
腫瘍は、酸素および栄養素の拡散制限に起因して代謝要求が制限される前に、およそ１〜２ｍｍ3のサイズに成長し得る。このサイズを超えて成長するためには、腫瘍は血管新生表現型に切り替わり、周囲の血管から新生血管系の形成を開始する。したがって、腫瘍は血管新生能力を備えており、それらの成長、侵襲、および転移は血管新生に依存する。一部の例外を除いて、ほとんどの場合、新生物細胞集団は、血管新生能力を獲得し、その成長を維持するのに十分な血管網を生成した後にのみ、臨床的に観察可能な腫瘍を形成するであろう。さらに、新しい血管は、新生物細胞集団が循環系に進入し、離れた部位に転移するための入り口を提供する。腫瘍の血管新生は、腫瘍細胞によって作り出された血管新生分子によって本質的に媒介される。
【００４９】
理論に縛られることなく、ＥＰＲ効果の現象は、腫瘍細胞が増殖するために血管の生成を刺激する腫瘍の能力によって引き起こされる。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および当業者に既知の他の成長因子は、がんの血管新生に関与している。腫瘍細胞は、１５０〜２００μｍほど小さく凝集し、それらへの栄養素および酸素供給のために新生血管系によって行われる血液供給に依存し始める。しかしながら、これらの新しく形成された腫瘍血管は、通常、形態および構造が異常である。それらは、穿孔を有する不完全に並んだ欠陥のある内皮細胞、平滑筋層の欠如、またはより広い内腔を有する神経支配、およびアンジオテンシンＩＩの機能的受容体の損傷を有する。さらに、腫瘍組織は通常、効果的なリンパ排液が欠如している。これらのすべての要因は、異常な分子および異常な流体輸送ダイナミクスをもたらし、特に、本明細書に開示のＮＰには好適である。
【００５０】
したがって、血管系の透過性亢進およびリンパ排液の欠如に起因して、ＥＰＲ効果は、腫瘍におけるＮＰの受動的蓄積を生じるであろう。これは、ＮＰが血管に拘束されている正常組織で見られるものとは対照的である。これによって、本明細書に記載のＮＰは、腫瘍標的化には魅力的なものになる。腫瘍に達するＮＰの割合を増加するために、ＮＰの全身循環時間を増加させる。循環時間を延長することによって、血管内の開口部を通じてＮＰが拡散する可能性が増加するので、腫瘍内に蓄積することが可能なＮＰの数が向上するであろう。
【００５１】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、薬物送達システムは、限定されないが、結腸、肺、乳房、子宮頸部、膀胱、前立腺、および膵臓の腫瘍を含む、腫瘍などのがん治療用である。
【００５２】
さらに、本発明によるＮＰは、リンパ節に部分的に蓄積することが実証されている。これは、リンパ節の転移性がん細胞の治療に利用することができる。したがって、本発明の一実施形態では、薬物送達システムは、リンパ節の転移性がん細胞を治療するためのものである。なお別の実施形態では、薬物送達システムは、リンパ節を通じた転移を防止することによる、がんの予防的治療のためのものである。さらなる実施形態では、薬物送達システムは、腫瘍の治療および転移の予防的治療のためのものである。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、腫瘍は、透過性を亢進可能である、および／またはリンパ排液が欠如した血管系を有する。
腫瘍成長は、無血管性、およびその後の血管相からなる。本発明の一実施形態では、腫瘍は血管相にある。
【００５４】
実施例で使用したＮＰは、細胞毒性薬物のカバジタキセル（ＣＢＺ）を含有している。ＣＢＺは、微小管の分解を阻害する半合成のタキサン誘導体である。ＣＢＺは、水への可溶性が非常に低く、遊離した非カプセル化薬物の投与を複雑にする。
【００５５】
しかしながら、実施例で実証されるように、アルキルシアノアクリレートモノマーへのＣＢＺの優れた融和性および可溶性に起因して、高濃度のこの薬物は、アルキルシアノアクリレートモノマー溶液に溶解することができ、したがってＰＡＣＡ内にカプセル化される。
【００５６】
本発明の異なる実施形態によれば、ＮＰ内のＣＢＺ負荷容量は、ＮＰの１〜９０重量％、優先的にはＮＰの５〜５０重量％であり得る。特に好ましい実施形態では、ＣＢＺの負荷容量は、ＮＰの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５重量％などのＮＰの５〜１５重量％である。
【００５７】
したがって、本発明による薬物送達システムは、高い負荷容量を有し、本発明の治療効果に影響を与えることが示されている。
ＣＢＺは水に不溶性であるため、従来の配合物は、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０溶液に可溶化させたＣＢＺである。本明細書で使用する場合、非カプセル化または遊離ＣＢＺは、従来の配合物を指す。
【００５８】
ＣＢＺは、いくつかのタイプの前立腺がん、副腎皮質がん腫、精巣がん、尿路移行上皮細胞がん腫、および卵巣がんを含む、異なるタイプのがんへの影響を研究する、いくつかの臨床試験に含まれている。本発明者らは、神経膠腫および肺がんにおけるＣＢＺの療法効果も実証した。
【００５９】
臨床研究では、ＣＢＺの効能は、深刻な副作用および中毒死を伴うことが実証されている。臨床試験で観察された毒性速度は、ＣＢＺの使用および管理に障害をもたらすと想定されているが、一方で、この薬物の高い活性が実証されている。副作用のリスク、ならびに投与計画に由来する高いコストおよび不快感、ならびにＣＢＺ治療のために以前提案された投与計画を順守する患者の欠如により、臨床試験から臨床診療への移行時には、ＣＢＺはあまり使用されないであろうと推測されている。したがって、例えば前立腺がん治療において、例えば３週間ごとから毎週に投与計画を制限して、関連する毒性を増加させることなく、用量強度および活性を増加させることが可能なより良好な療法範囲とともに、血液耐性を改善することが提案されている。
【００６０】
したがって、本発明者らによって記載される薬物送達システムは、薬物負荷ＮＰが遊離薬物よりも悪影響が少ないという利点によって、ＣＢＺを非常に妥当なものにする。ＣＢＺをＮＰ内にカプセル化することによって、薬物のより徐放性のプロファイルが提供され、毒性の一部が改良され、より高用量の投与を可能にすることができる。悪影響を低減することによって、薬物の用量を増加させることが可能になる。したがって、薬物をＮＰ内にカプセル化することによって、治療効果がさらに改善されるであろう。したがって、本発明者らは、本明細書に記載の薬物送達システムをがん治療に使用すると、治療効果を向上する、および／または副作用を低減するであろうという考えを提案する。
【００６１】
異なる実施形態では、本発明は、がん治療に使用するための、ＣＢＺまたはその薬学的に許容される塩が負荷されているＰＥＧ化ＰＡＣＡ  ＮＰを含む、薬物送達システムであって、腫瘍が、前立腺がん、乳がん、神経膠腫、肺がん、副腎皮質がん腫、精巣がん、尿路移行上皮細胞がん腫、および卵巣がんからなる群から選択されるタイプのがんに属する、薬物送達システムを提供する。
【００６２】
本発明の特定の一実施形態では、腫瘍は、前立腺がん腫、ホルモン不応性前立腺がん、前立腺新生物、または骨転移性前立腺がんなどのタイプの前立腺がんに属する。
本発明の別の特定の実施形態では、腫瘍は、管腔様および基底様乳がんを含むタイプの乳がんに属する。
【００６３】
乳がんは、遺伝子発現パターンに基づいて主要なサブグループに分類することができる。最も攻撃的なサブタイプに属する腫瘍は、一般的に、アントラサイクリンおよびタキサン系の化学療法計画で治療される。実施例では、ＰＥＢＣＡ  ＮＰ内にカプセル化されているＣＢＺの成長阻害効果は、インビトロおよびインビボの乳がんモデル、ならびにインビボの前立腺がん腫瘍モデルで実証されている。２つの主なタイプの乳がん、管腔様および基底様サブグループを表す３つの乳がん細胞株を使用した。また、免疫不全マウスの乳房脂肪体に細胞株のうちの１つを注射し、成長させる。加えて、攻撃的な基底様乳がんを高く表すことが以前実証された、１人の患者に由来する異種移植（ＰＤＸ）が実施例に含まれる。
【００６４】
本明細書で提示される１つの発見は、基底様ＰＤＸモデルで実証された、非カプセル化ＣＢＺと比較して改善されたＰＥＢＣＡ−ＣＢＺの療法効果が驚くべきことに実証されたことである。これが、ＮＰ内への薬物のカプセル化後、腫瘍に送達されるＣＢＺの増加に起因し得ることが、質量分析法を用いた分析によって示された。また、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺで治療した腫瘍は、非カプセル化ＣＢＺで治療した腫瘍よりも腫瘍原性誘発性マクロファージの含有量が低いことが、免疫組織化学的染色によって明らかになった。理論に縛られることなく、これは、効能の改善に寄与し得る。ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺと非カプセル化ＣＢＺとの効能の違いを解明するために、実施例は、親油性および近赤外蛍光物質ＮＲ６６８が負荷されている粒子のインビボ生体内分布を実証している。ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺおよび非カプセル化ＣＢＺの両方を注射後の組織におけるＣＢＺの生体内分布、および血漿中のＣＢＺの動態を説明するために、定量的質量分析法を使用した。
【００６５】
前立腺がん腫を用いる実施例は、ＰＥＢＣＡ  ＮＰ内にカプセル化されているＣＢＺが、臨床的に承認された配合物と同様の成長阻害を有したことを実証している。正常組織と比較してがん細胞における薬物負荷ＮＰの保持が向上した本発明の薬物送達システムは、悪影響がより少なく、より多い用量の投与を可能にする。
【００６６】
転移性腫瘍の治療のための、リンパ節への薬物送達が議論されてきた。局所リンパ節は多くのがんタイプにおいて主な転移部位であるため、リンパ組織へのＰＥＢＣＡ−ＣＢＺの蓄積は、療法および予防的治療の両方にさらに寄与し得る。
【００６７】
要約すると、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ  ＮＰは、前立腺がんおよび乳がん治療に有望な結果を実証し、本明細書に開示の腫瘍治療に使用するための薬物送達システムの療法効果を裏付ける。
【００６８】
さらに、ＰＡＣＡ  ＮＰが抗腫瘍原性マクロファージの腫瘍内の存在を向上すると思われるという観察は、本発明の薬物送達システムがより普遍的な価値を有し得、免疫調節剤としておよび／またはカプセル化薬物の療法効果を向上することが可能なビヒクルとして使用することができることを裏付けることができる。
【００６９】
本発明の実施形態によれば、薬物送達システムは、非経口などの全身投与される組成物中で提供される。
本発明の最後の態様では、本発明の第１の態様による薬物送達システムを、それを必要とする患者に投与することを含む、がんを治療する方法を含む。
【実施例】
【００７０】
実施例１
材料および方法
ナノ粒子の合成および特性評価。ＰＥＧ化ＰＥＢＣＡ  ＮＰを、ミニエマルション重合によって合成した。０．２％（ｗ／ｗ）のブチル化ヒドロキシトルエン（Ｆｌｕｋａ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））および２％（ｗ／ｗ）のＭｉｇｌｙｏｌ８１２（Ｃｒｅｍｅｒ（ＵＳＡ））を含有する２．５ｇの２−エチルブチルシアノアクリレート（モノマー（Ｃｕａｎｔｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ（Ｓｐａｉｎ））からなる油相を調製した。光学イメージング用の蛍光粒子は、油相に０．２％（ｗ／ｗ）のＮＲ６６８（改変Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ）、カスタム合成を添加することによって調製した。油相にＣＢＺ（１０％（ｗ／ｗ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｐａｒｔｎｅｒ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｃｈｉｎａ）、製品番号ＢＣＰ０２４０４）を添加することによって、治療のための細胞増殖抑制薬物を含有する粒子を調製した。
【００７１】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ））を含有する０．１ＭのＨＣｌ（２０ｍｌ）、およびＫｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＨＳ１５（６ｍＭ、Ｓｉｇｍａ（Ｇｅｒｍａｎｙ））からなる水相を油相に添加し、すぐに氷上で３分間超音波処理した（６ｘ３０秒間隔、６０％振幅、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０（ＵＳＡ））。溶液を室温で一晩回転させた後（１５ｒｐｍ、ＳＢ３回転器（Ｓｔｕａｒｔ，ＵＫ））、１ＭのＮａＯＨを使用してｐＨを５に調節した。回転させながら室温で５時間重合を続けた。１ｍＭのＨＣｌを用いて分散液を透析して（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析膜ＭＷＣＯ  １００，０００Ｄａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ（ＵＳＡ））、未反応のＰＥＧを除去した。ＮＰのサイズ、多分散指数（ＰＤＩ）、およびゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＵＫ））を使用する、動的光散乱およびレーザードップラーマイクロ電気泳動によって測定した。カプセル化薬物の量を計算するために、粒子をアセトンに溶解（１：１０）することによって薬物を粒子から抽出し、質量分析法に接続した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって以下のように定量化した。
【００７２】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＣＢＺの定量化。純粋な化学物質またはＮＰの一部としてのＣＢＺを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４９０トリプル四重極質量分析計に接続したＡｇｉｌｅｎｔ  １２９０ＨＰＬＣシステムを使用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量化した。Ａｓｃｅｎｔｉｓ  ＥｘｐｒｅｓｓＣ８（７５ｘ２．１ｍｍ、２．７μｍの粒子サイズ）を、同じ材料（Ｓｉｇｍａ）の５ｘ２．１ｍｍガードカラムとともに、ＨＰＬＣカラムを４０℃で使用した。溶離液Ａは水中２５ｍＭのギ酸であり、溶離液Ｂは１００％メタノールであり、流量は０．５ｍｌ／分であった。移動相勾配は、５５％のＢで１．５分間、次いで５５％から８０％のＢで１分間、続いて１分間のウォッシュアウト時間であり、その後カラムの再平衡化による無勾配化した。注入量は、５．００μｌであった。ＭＳ検出は、ポジティブＥＳＩモード（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｊｅｔｓｔｒｅａｍ）で、トランジションｍ／ｚ８５８．３→５７７．２を使用してマルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）モードで定量化した。親イオンは、Ｎａ付加物として選択し、これによって、最高の感度を得た。同様に、六重水素化内部標準物質は、８６４．４→５８３．２トランジションで検出した。どちらの分析物も、３８０Ｖフラグメンターおよび２０Ｖの衝突エネルギーで分析した。
【００７３】
正確な定量化には、参照標準物質を使用した。非標識ＣＢＺ標準物質は、＞９８％の純度で合成（上記参照）に使用したものと同じであった。六重水素化ＣＢＺ内部標準物質は、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した（（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）カタログ番号Ｃ０４６５０２、９９．６％同位体純度）。標準物質をアセトンに溶解させ、少なくとも５つの濃度ポイントにまたがる一連の標識のない標準物質を構築するために使用した。
【００７４】
定量限界（ＬＯＱ）は、標準曲線の最低濃度ポイント（０．１ｎｇ／ｍｌ）の６回の反復定量化から、具体的には平均と６つの標準偏差として計算し、これは０．１９ｎｇ／ｍｌのＬＯＱの量であった（シグナル／ノイズ比＞２０）。同じ標準試料セットに基づく正確性は、８．８％、精度は１８．０％であった。
【００７５】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析前の組織試料の処理。組織試料のＣＢＺ含有量を定量化することができるように処理するために、組織の酵素消化、続いて上記のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法を使用するＣＢＺの抽出および定量化のプロトコルを構築した。酵素緩衝液は、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、パパイン（Ｍｅｒｃｋ、Ｆ２７５６４４）０．１２５ｍｇ／ｍｌ、トリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ７４０９）２．５ｍｇ／ｍｌ、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ７９２６）０．８ｍｇ／ｍｌ、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ３５０６）０．６９ｍｇ／ｍｌ、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ−８７８７）１％（ｖ／ｖ）の最終濃度を有する、１％（ｖ／ｖ）のペニシリン−ストレプトマイシン原液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ０７８１）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）、４１９６５０３９）からなる。ＣＢＺの生体内分布を測定するために、凍結臓器（肝臓、脾臓、リンパ節、腎臓、腫瘍）を解凍し、新しく調製した酵素緩衝液を組織５０ｍｇあたり１ｍｌで添加し、臓器全体を消化させた。組織が完全に溶解するまで、試料を１日１回ボルテックスしながら３７℃で７２時間加熱した。組織の消化物、ならびに動物の血漿試料をアセトンで１０倍に希釈し、その後遠心分離し、これは、タンパク質および他の巨大分子の両方を沈殿させる二重の効果を有し、したがって試料がクリーンアップされ、すべてのＣＢＺが確実に可溶化される。可能なマトリックス効果を補正するために、アセトンに溶解させた内部標準物質（六重水素化ＣＢＺ）を、アセトン希釈中に１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。
【００７６】
細胞株。この研究では、３つの乳がん細胞株を使用した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（トリプルネガティブ、クローディン低）をＲＰＭＩ１６４０中で培養し、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（トリプルネガティブ、基底）およびＭＣＦ−７（管腔Ａ）細胞株をＤＭＥＭ中で培養した。すべての培地は、１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎児血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）および１００単位／ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ）ｍｌで強化した。すべての細胞株はＡＴＣＣから入手し、マイコプラズマについて定期的に試験した。２４または９６ウェルプレートで成長している細胞を、Ｔｗｅｅｎ−８０（Ｆｌｕｋａ）に溶解させたＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ、ＣＢＺ（非カプセル化ＣＢＺ）、およびＣＢＺを含まないＰＥＢＣＡの連続希釈液とともに、３７℃で２４、４８、または７２時間、５％のＣＯ2雰囲気下でインキュベートした。一般的に使用されるＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）細胞生存率アッセイによって、［3Ｈ］チミジン取り込みに基づいて細胞増殖を測定することによって、［3Ｈ］ロイシン取り込みによるタンパク質合成を測定することによって、およびＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）を使用してＡＴＰレベルを測定することによってのいずれかで、毒性を評価した。
【００７７】
ＭＴＴ細胞生存率アッセイ。細胞を異なるＮＰ／物質とともに２４、４８、および７２時間インキュベートした。次いで細胞培地を吸引し、最終濃度２５０μｇのＭＴＴ／ｍｌを含有する１００μｌの培地と交換した。ホルマザン粒子を形成するために、３７℃で３時間インキュベーションを続け、これを１％（ｖ／ｖ）ＮＨ4Ｃｌを含むＤＭＳＯに溶解させた。プレートリーダ（Ｂｉｏｓｙｓ  Ｌｔｄ（Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ））で、吸光度を５７０ｎｍで読み取り、６５０ｎｍでの吸光度からバックグラウンドを差し引いた。
【００７８】
［3Ｈ］チミジン取り込みによって測定した細胞増殖。ＤＮＡへの［3Ｈ］チミジン取り込みを使用して、細胞増殖を推定した。細胞を異なるＮＰ／物質とともに２４時間インキュベートした。次いで細胞培地を吸引し、［3Ｈ］チミジン（３μｇ／ｍｌ、７５μＣｉ／ｍｌ）を含有する無血清細胞培地と置き換えた。３７℃で３０分間インキュベーションを続けた。培地を除去し、５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加した。５分後、細胞をＴＣＡで２回洗浄し、０．１ＭのＫＯＨ  ２００μｌで可溶化した後、３ｍｌのシンチレーション液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（ＵＳＡ））と混合した。シンチレーション計測器（Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  ２１００ＴＲ、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ））で１分間、放射能を計測した。
【００７９】
［3Ｈ］ロイシン取り込みによって測定したタンパク質合成。ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺおよびＣＢＺがタンパク質合成に及ぼす影響を決定するために、細胞をこれらの物質とともに２４時間インキュベートした。次いで細胞培地を吸引し、ロイシンを含まないＨＥＰＥＳ培地（２８ｍＭのＨＥＰＥＳ、（ＭＥＭ中の４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸））で細胞を１回洗浄し、さらに［3Ｈ］ロイシン（２μＣｉ／ｍｌ）を含有する、ロイシンを含まないＨＥＰＥＳ培地で３７℃で３０分間インキュベートした。培地を除去し、５％（ｗ／ｖ）ＴＣＡを添加して、タンパク質を沈殿させた。５分後、細胞を５％（ｗ／ｖ）ＴＣＡで再度洗浄し、０．１ＭのＫＯＨ  ２００μｌで可溶化した後、３ｍｌのシンチレーション液と混合し、上記のように放射能を計測した。
【００８０】
ＡＴＰを測定することによって推定される細胞生存率。供給者によって記載されているように、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ，ＵＳＡ）アッセイを使用することによるＡＴＰレベルを測定して、細胞の生存率を試験した。細胞をＰＥＢＣＡ−ＣＢＺまたはＣＢＺとともに７２時間インキュベートし、その後体積の半分を除去し、等量のＡＴＰ試薬と交換し穏やかに混合した。１０分間インキュベートした後、細胞溶解物を遮光した９６ウェルプレートに移し、プレートリーダ（Ｂｉｏｓｙｓ  Ｌｔｄ（Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ））で発光を測定した。
【００８１】
ヌードマウスにおける治療効能評価。すべての動物実験は、ノルウェー動物研究機関（Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）（許可番号１５−１３６０４１）に従って承認および実施され、欧州実験動物科学連合（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＦＥＬＡＳＡ）の規制に従って行った。マウスは病原菌のない条件下で、一定温度（２１．５±０．５℃）および一定湿度（５５±５％）、１５回／時間の空気交換および１２時間の明／暗サイクルで飼育した。マウスには、４ｍｇ／ｌの濃度の１７−β−エストラジオールが補充された蒸留水を自由に利用させた。この研究に使用したすべてのマウスは、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｏｓｌｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｎｏｒｗａｙ））の地元で飼育されていたメスの無胸腺ヌードｆｏｘｎ１nuマウス（５〜６週齢、体重１８〜２０ｇ）であった。
【００８２】
本来の位置で成長している基底様異種移植モデルＭＡＳ９８．１２をインハウスで確立し、Ｌｉｎｄｈｏｌｍら（２０１２）に以前記載されているように使用した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を使用するときには、１５０万個の細胞を乳房脂肪体に注射し、成長している腫瘍を連続移植に使用した。ＭＡＳ９８．１２モデルについては、１〜２ｍｍ3の健康な腫瘍組織片をメス無胸腺マウスの乳房脂肪体の両横に移植した。腫瘍がおよそ５ｍｍの直径に達した後、マウスを無作為に異なる治療群に割り当てた（各群の平均体積は４９〜５７ｍｍ3であった）。
【００８３】
ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ  ＮＰは、１５ｍｇ／ｋｇのＣＢＺおよび１７５ｍｇ／ｋｇのＮＰの用量で、ｉ．ｖ．尾静脈注射として２回（無作為化後１日目および４日目に）与えた。同等量の空のＰＥＢＣＡ  ＮＰを対照として与えた。非カプセル化ＣＢＺは、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０（４０ｍｇ／ｍｌ）中に原液として調製し、１３％（ｖ／ｖ）のエタノールでさらに希釈して、１０ｍｇ／ｍｌのＣＢＺの希釈標準溶液にした。注射溶液は、０．９％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌの希釈標準溶液に希釈することによって、投与直前に調製した。同量のエタノール（１．２〜１．４％（ｖ／ｖ））をビヒクル対照として使用し、注射量は２００〜２９０μｌの範囲であった。治療の初日から、腫瘍の直径および体重を週２回測定した。マウスの健康状態を毎日監視し、瀕死状態になった場合、または腫瘍が１５００ｍｍ3に達した場合は、頸椎脱臼によってと殺した。腫瘍をキャリパによって測定し、腫瘍体積を式０．５ｘ長さｘ幅2に従って計算し、治療開始時の平均腫瘍体積に関連付けた。
【００８４】
インビボイメージング。ＩＶＩＳ（登録商標）分光インビボイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、ＭＡ９８．１２を担持するマウスの生体内分布を研究するために、親油性および蛍光色素ＮＲ６６８で標識したＰＥＢＣＡ  ＮＰを使用した。マウスには、効能研究と同じ用量のＰＥＢＣＡ−ＣＢＺまたは薬物を含まないＰＥＢＣＡを静脈内注射した。ＣＢＺを含有するバッチは、ＣＢＺを含有しないバッチよりもやや大きい粒子を有する。（表Ｓ１）。５３５／６４０ｎｍの励起／発光波長ペアは、最高のシグナル対ノイズ比を与えることが見出され、したがってＮＰのイメージングに使用した。注射１、４、２４、および９６時間後に全身画像を入手し、次いで頸椎脱臼によって動物を犠牲にし、臓器を採取した。臓器は、上と同じ環境を使用して、ＩＶＩＳスキャナを用いてエクスビボで撮像した。臓器における相対シグナル強度は、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、それぞれの臓器の周りに描かれた対象の領域の１ピクセルあたりの放射効率（発光［光子／秒／ｃｍ2／ｓｔｒ］／励起光［μＷ／ｃｍ2］×１０9）として計算した。インビボイメージングに使用されるＰＥＢＣＡ  ＮＰの蛍光測定は、ＣＢＺを含まない粒子が、ＣＢＺを含有するＰＥＢＣＡ  ＮＰのものの１．１７倍の蛍光強度を有したことを示し、図３Ｃに示されているデータは、この違いに対して補正する。
【００８５】
血中の生体内分布と薬物動態。ＭＡＳ９８．１２腫瘍を担持するマウス（ｎ＝３）の尾静脈への、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺおよび非カプセル化ＣＢＺ（１５ｍｇ／ｋｇ）の単回ｉｖ注射後に、血液および組織の試料を得た。空の粒子（ＰＥＢＣＡ）および生理食塩水を陰性対照として使用した。血液試料は、尾静脈穿刺（注射およそ２分後、ならびにその後注射１、４、および２４時間後）によって、または終末心臓穿刺（注射９６時間後）によってのいずれかで、ＥＤＴＡを含有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ））に取得し、氷上で保管した。０〜２４時間の試料は、同じ動物（ｎ＝３）から連続的に収集し、９６時間後の試料は、別個のマウス（ｎ＝３）から得た。血液を４℃で１５分間、および３４００ｘｇ遠心分離し、上清血漿を収集し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで−８０℃で保存した。２４または９６時間後に動物をと殺し、組織試料（腫瘍、肝臓、脾臓、リンパ節、および腎臓）を採取した。臓器を生理食塩水で穏やかに洗浄し、次いで液体窒素で急速冷凍し、上記のようにさらに処理およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析するまで−８０℃で保存した。統計分析は、ｔ検定を使用して実施した。
【００８６】
免疫組織化学。ＭＡＳ９８．１２効能研究で注射したのと同じ物質を単回注射した９６時間後に、ＭＡＳ９８．１２を担持するマウスから腫瘍を収集した。腫瘍を４％（ｖ／ｖ）ホルマリン中で保存し、次いでパラフィン処理し、スライスして、連続スライド（厚さ３μｍ）を調製した。脱パラフィン剤Ｎｅｏ−ｃｌｅａｒおよび封入剤Ｎｅｏ−ｍｏｕｎｔは、ＶＷＲ（Ｒａｄｎｏｒ（ＰＡ，ＵＳＡ））から得た。１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で脱パラフィン化したスライドを、１００℃の水浴に２０分間置くことによって、熱処理してエピトープの再露出を実施した。Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６）中３％（ｖ／ｖ）の過酸化水素でスライドをインキュベートすることによって、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断した。切片を洗浄し、ＴＢＳ中３％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて非特異的結合の遮断を３０分間実施した。次いで切片を一次抗体とともに６０分間インキュベートした。３つの異なる抗体、すなわち抗ＣＤ６８（１ｍｇ／ｍｌ、ａｂ１２５２１２、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ））、抗ＣＤ２０６（０．１μｇ／ｍｌ、ａｂ６４６９３、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ））、および抗ｉＮＯＳ（０．５μｇ／ｍｌ、ａｂ１５３２３、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ））を使用して、マクロファージの異なる集団を検出した。ＣＤ６８はマクロファージ集団全体に一般的に使用されるマーカーであり、ｉＮＯＳ（誘発性一酸化窒素シンターゼ）はＭ１マクロファージ（抗腫瘍原性および炎症誘発性マクロファージ）のマーカーであり、ＣＤ２０６はＭ２マクロファージ（腫瘍原性誘発性および抗炎症性マクロファージ）のマーカーである。ステップ間でスライドを洗浄するために、ＴＢＳを使用した。一次抗体の検出は、製造元（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））のプロトコルに従って、ＭＡＣＨ３ウサギＨＲＰポリマー検出キットを使用して実施した。シグナルは、Ｂｅｔａｚｏｉｄ  ＤａＢ色素原キット（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）とともに提供される色素原溶液を用いるインキュベーションによって構築した。対比染色には、ヘマトキシリンおよび３７ｍＭの水酸化アンモニウム含有溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ））を使用した。
【００８７】
染色した組織切片を、４０ｘ対物レンズを使用してスキャンした（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ＨＴ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ））。ＣＤ６８、ｉＮＯＳ、およびＣＤ２０６の程度は、ＩｍｍｕｎｏＰａｔｈソフトウェア（Ｒｏｏｍ４  Ｌｔｄ．（Ｃｒｏｗｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ））を使用して自動的にスコアリングした。非特異的または偽陽性染色を避けるために、壊死領域ならびに血管を除いた腫瘍領域に、手動でマークを付けた。次いで、注釈が付けられた領域は、効率的な処理のために、対象の画像ごとにより小さなフレームに分割した。注釈が付けられた代表的な領域は、コンピュータ画像分析によってさらに分析した。異なる腫瘍から無作為に選択された画像に画像分析プロトコルを設定して、ヘマトキシリン染色された青色の陰性染色と茶色の陽性染色とを区別するようにソフトウェアを設定した。分析結果は、注釈が付けられた領域全体の、ポジティブピクセル部分およびネガティブピクセル部分の数を提供する。
【００８８】
統計分析。効能研究の有意性を計算するために、各腫瘍の曲線下面積を計算し、ウェルチの不等分散を使用して群の平均値を比較した。異なる治療群間の腫瘍退縮の頻度に有意差があるかどうかを決定するために、フィッシャーの正確確率検定を使用した。特に明記しない限り、ウェルチ補正を用いず独立２群の両側スチューデントｔ検定を使用した。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｗｉｎｄｏｗｓバージョン７．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳ））またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌのいずれかを使用して実施した。
【００８９】
結果
ＰＥＢＣＡ粒子の特徴評価。使用したバッチの粒子サイズ、多分散性指数（ＰＤＩ）、およびゼータ電位は、それぞれ１４８〜２２７ｎｍ（ｚ平均）、０．０４〜０．１９、および−（０．６〜２．４）ｍＶの範囲であった。最終粒子の薬物含有量は、６．０〜８．６％（ｗ／ｗ）であり、ＮＰ原液中にＣＢＺ２．０〜３．４ｍｇ／ｍｌを得た（表Ｓ１）。薬物ＣＢＺまたは蛍光標識ＮＲ６６８を添加すると、ＰＥＢＣＡ  ＮＰのサイズが増加した（表Ｓ１）。ＭＡＳ９８．１２腫瘍モデルにおける効能研究に使用した２つのバッチのサイズ分布曲線、およびＣＢＺ（溶液中でクラスターを形成）のものを図１に示す。
【００９０】
ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺは、ＭＡＳ９８．１２マウスモデルで、遊離ＣＢＺよりも腫瘍成長をより効率的に阻害する。ＰＤＸモードでＣＢＺが組み込まれたＰＥＢＣＡ  ＮＰの効能を試験するために、ＭＡＳ９８．１２腫瘍をヌードマウスの乳房脂肪体に移植し、薬物負荷粒子（ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ）、空の粒子（ＰＥＢＣＡ）、非カプセル化（遊離）ＣＢＺ、および対照として生理食塩水で治療した（図２Ａ）。注射された用量は、ＣＢＺ２ｘ１５ｍｇ／体重ｋｇであり、これは２ｘ１７５ｍｇ／ｋｇの粒子用量に相当する（図２Ａ）。腫瘍成長は、空のＰＥＢＣＡ  ＮＰによって影響を受けなかった。ＣＢＺ治療は、腫瘍成長を著しく阻害し、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ治療の効果は、腫瘍サイズの低減を引き起こしたことによって、より明白であった（図２Ａ）。ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ治療群では、８つの腫瘍のうち６つが完全寛解したが、ＣＢＺ治療腫瘍では９つのうちの２つのみであり、陰性対照群では１つもなかった（フィッシャーの正確確率検定（片側）：ｐ＝０．０４、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺとＣＢＺとの比較）。
【００９１】
４つの群間の腫瘍成長の違いをさらに評価するために、個々の腫瘍の曲線下面積（ＡＵＣ）を各々計算し、各治療群の平均値を比較した。ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺの効能は、非カプセル化ＣＢＺを用いる治療よりも有意に良好である（ｐ＝０．０２、図Ｓ１）。治療開始時の重量と相対的な体重として測定した、異なる治療の毒性を図２Ｂに示す。ＣＢＺを用いる２つの治療（非カプセル化またはＰＥＢＣＡ−ＣＢＺとしてカプセル化）は、およそ１５％の体重減少を引き起こしたが、最後の注射から１週間後に毒性が後退した。この許容される体重減少および回復時間は、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺとＣＢＺとで同等であった。空のＰＥＢＣＡ  ＮＰの投与は、体重から推定されるように、いかなる毒性作用も引き起こさなかった。
【００９２】
ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺおよび非カプセル化ＣＢＺの効能も、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍担持マウスで研究した。このモデルでは、２つのＣＢＺ配合物間の有意差は検出されなかったが、腫瘍成長の遅延が観察された（図Ｓ２）。ＣＢＺ（遊離およびカプセル化薬物）は、ＭＡＳ９８．１２と比較すると、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍では効果が低かった。薬物の遊離配合物の毒性に起因して、非カプセル化薬物の用量を増加させることによって効能を改善することは不可能であった。
【００９３】
ＰＥＢＣＡ粒子のインビボ生体内分布。ＭＡＳ９８．１２を担持するマウスにおけるＰＥＢＣＡ  ＮＰの生体内分布は、蛍光色素ＮＲ６６８を含有する粒子注射後、最大９６時間の蛍光イメージングによって研究した。１、４、２４、および９６時間後にＩＶＩＳ（登録商標）分光スキャナを使用してマウスを撮像し（図３Ａ）、次いで臓器を採取しエクスビボで視覚化することができるように犠牲にした。注射２４時間後に採取したすべての臓器の画像を図３Ｂに示し、臓器ごとの対象領域のピクセルサイズと相対的な平均放射効率を図３Ｃにプロットする。１、４、および９６時間で得られた臓器の画像を、図Ｓ３に示す。遊離ＮＲ６６８色素を注射しても、使用した波長では検出可能な蛍光は得られず（データは示さず）、したがって、検出されたシグナルが、ＰＥＢＣＡに結合したＮＲ６６８からのものであることを示している。図３および図Ｓ３に示されている画像は、示されているすべての組織への急速な取り込みを実証しており、注射２４時間後、肝臓、脾臓、およびリンパ節で最も強いシグナルが観察されたが、腫瘍、腎臓、心臓、肺でも蛍光は容易に検出可能であった（図３Ｃ）。
【００９４】
カプセル化および非カプセル化ＣＢＺの薬物動態および生体内分布。ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺおよび非カプセル化ＣＢＺ（１５ｍｇ／ｋｇ）を、ＭＡＳ９８．１２腫瘍を担持するマウスの尾静脈に静脈内注射した。注射のおよそ２分後、ならびに注射１、４、２４、および９６時間後に血液試料を採取し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法を使用してＣＢＺについて血漿試料を分析した。ほとんどすべての時点でのＣＢＺ濃度は、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺを受けたマウスでは、遊離ＣＢＺを受けたマウスと比較して少なくとも１０倍高かった（図４Ａ）。ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺおよびＣＢＺの両方の血漿濃度／時間曲線は、初期の分布段階、続いて最終消失相を示す。データポイントの数が少ないことにより、非線形回帰を通じた分布または消失半減期を決定することができなかった。最初の２つのデータポイント（最大１時間）に基づく補間は、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺおよびＣＢＺでそれぞれおよそ５０分および３０分の範囲での分布半減期を示す。同様に、最後の２つの時点（２４時間および９６時間）の平均値に基づいて消失半減期を計算すると、両方の化合物では約６０時間のこの相の半減期を示す。ＣＢＺと比較したＰＥＢＣＡ−ＣＢＺの投与後に観察されるより高い血漿濃度は、ＣＢＺと比較して、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺの低い分布体積および低い総クリアランスを示唆している。これは、ＮＰ配合物が血管コンパートメントから脱出する可能性、および主に細網内皮系を通じたＮＰの消失が低いことと一致している。
【００９５】
ＣＢＺ濃度は、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺおよびＣＢＺ（１５ｍｇ／ｋｇ）の単回注射後に、腫瘍、肝臓、脾臓、リンパ節、および腎臓で測定した。注射２４および９６時間後に採取した試料で得られた結果を、それぞれ図４ＢおよびＣに示す。組織１ｍｇあたりの薬物の最高量は、脾臓で得られた。しかしながら、図４のデータは、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺの肝臓／脾臓比が、注射２４時間後に２．１倍、注射９６時間後に４．４倍であることを示し、マウス15の肝臓の質量が脾臓のもののおよそ１３倍であると想定すると、肝臓が、これらのＮＰのほとんどを取り込んでいることを実証している。ＣＢＺ  ｎｇ／組織ｍｇとして測定した腫瘍試料中のＣＢＺの量は、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ注射後の肝臓のものの２０％（２４時間）および１．４％（９６時間）であった。
【００９６】
ＣＢＺの濃度は、非カプセル化薬物（ＣＢＺ）と比較して、粒子結合物（ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ）の注射２４時間後に分析されたすべての組織において有意に高く（ｔ検定、ｐ値＜０．０１）、最高量のＰＥＢＣＡ−ＣＢＺを含有する肝臓および脾臓で最大の違いが観察された。非カプセル化ＣＢＺ注射後、最高濃度のＣＢＺが腫瘍で見出されたが、このレベルは、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ群で得られたレベルの約１／３にすぎない。注射９６時間後に得た試料では、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺの注射後に分析されたすべての組織でＣＢＺを（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法のＬＯＱを上回って）検出することができたが、遊離ＣＢＺの注射後には腫瘍組織のみで検出された（図４Ｃ）。この時点で、遊離ＣＢＺ注射後の腫瘍におけるＣＢＺの濃度は、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ注射後に得られた濃度のおよそ５０％であったが、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ試料の高い分散に起因して、この差は統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．１８）。ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺの注射２４時間および９６時間後に得た組織試料のＣＢＺ濃度を比較すると、腫瘍、脾臓、および腎臓で減少し、肝臓およびリンパ節では２４〜９６時間に増加している。ＭＡＳ９８．１２腫瘍組織での減少のみが有意差である（ｐ＝０．０２）。また、非カプセル化ＣＢＺを注射後のＣＢＺ濃度は、２４時間と比較して９６時間後の腫瘍では有意に低かった（ｐ＜０．００１）。ＣＢＺを含有しないＰＥＢＣＡ  ＮＰ注射後、血漿および組織試料もＣＢＺについて分析し、これらすべての試料（ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ注射後に分析された試料と同様）は、分析方法のＬＯＱを下回った。
【００９７】
治療されたＭＡＳ９８．１２腫瘍におけるマクロファージ浸潤。治療中のＭＡＳ９８．１２腫瘍へのマクロファージの浸潤は、免疫組織化学によって推定した。浸潤マクロファージの総集団の程度は、ＣＤ６８に対する抗体およびスキャンしたスライドの自動定量化を使用して定量化した。遊離ＣＢＺまたは生理食塩水を受けたマウスと比較して、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺまたは薬物を含まないＰＥＢＣＡを注射したマウスでは、腫瘍浸潤マクロファージのレベルの増加が観察されたが、差は統計的有意性に達さなかった（図５Ａ）。また、炎症誘発性Ｍ１マクロファージ（ｉＮＯＳ）のマーカーは、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺまたはＰＥＢＣＡを受けたマウスの腫瘍へのマクロファージ浸潤の増加を実証した（図５Ｂ）。しかしながら、ＣＤ２０６陽性細胞として測定した抗炎症Ｍ２マクロファージサブセットは、生理食塩水対照と比較して、ＰＥＢＣＡを受けた腫瘍でのみ、浸潤の増加を実証した（図５Ｃ）。さらに、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺを受けたマウスの腫瘍は、ＰＥＢＣＡを単独で受けた腫瘍よりも、有意に低いレベルのこの腫瘍原性誘発性マクロファージ集団を示した（ｐ＜０．００１、図５Ｃ）。
【００９８】
インビトロ細胞研究。２つの異なる試験システムを使用して、３つの細胞株、すなわちＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＳＦ−７における、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ、非カプセル化ＣＢＺ、および薬物を含まないＰＥＢＣＡの細胞毒性を試験した、すなわち、２４時間後の［3Ｈ］チミジンの取り込みによる細胞増殖、およびＭＴＴアッセイを使用して７２時間後の細胞生存率を測定した。ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺおよびＣＢＺは、すべての細胞株で、薬物を含まないＰＥＢＣＡよりも有意に（１３０〜３５０倍の範囲）毒性が高かったが、いずれかの細胞株におけるこれらの試験システムのうちのいずれでも、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺおよびＣＢＺの毒性効果に差はなかった（図１０）。インキュベーション７２時間後にＭＴＴアッセイを使用すると、試験したすべての細胞株の細胞のごく一部（１０〜２０％）は、非常に高いＣＢＺ濃度でも生存したことが明らかであった。他の２つの試験システムも使用して、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺおよび非カプセル化ＣＢＺの毒性を、３つすべての細胞株で試験した。タンパク質合成（［3Ｈ］ロイシン取り込み）への影響を、インキュベーション２４時間後に測定し、ＡＴＰレベル（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標））を７２時間後に測定した。これらの試験システムで得られた結果（データは示さず）は、図Ｓ５に示したものと非常に似ていた。インキュベーション２４および４８時間後にもＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対してＭＴＴアッセイを実施し、得られたデータは、インキュベーション７２時間後に示されたもの（図１０）と同様であったが、これらのより短いインキュベーション時間の後は毒性効果が小さかった（データは示さず）。
【００９９】
考察
本研究の主な発見は、ＣＢＺを含有するＰＥＢＣＡ  ＮＰを用いて基底様ＰＤＸマウスモデルで観察された、著しく良好な療法効果であり、ＣＢＺ１５ｍｇ／ｋｇを２回注射した後、８つの腫瘍のうち６つで完全寛解が得られた（図２Ａ）。非カプセル化ＣＢＺに対するＰＥＢＣＡ−ＣＢＺの有利な効果について、いくつか可能性のある説明を想定することができ、得られたデータは少なくとも次の要因：ＮＰ−ＣＢＺのより長い血中循環、および腫瘍における薬物のより高い濃度（図４）、ならびに治療された腫瘍における抗ｉＮＯＳ標識マクロファージ対抗ＣＤ２０６標識マクロファージのより高い比（１６〜１７）（図５）を指している。
【０１００】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法を使用して、血漿およびいくつかの組織のＣＢＺの量を定量化した。血漿データは、ＣＢＺがＮＰに組み込まれるとより長い時間循環していることを明確に示しており、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺを受けたマウスのほぼすべての時点でのＣＢＺ濃度は、遊離ＣＢＺを受けたマウスと比較して、少なくとも１０倍高かった（図４Ａ）。そのようなデータを評価すると、ＮＰに組み込まれたＣＢＺは、ＮＰから放出される前に療法効果を有さないことを銘記することが重要である。したがって、ＭＡＳ９８．１２モデルに例示されるように、良好な療法効果を得るには、ＮＰの生分解が必要である。
【０１０１】
ＮＲ６６８で標識されたＰＥＢＣＡ  ＮＰを用いて得られたインビボ蛍光イメージングデータは、ＣＢＺが存在することが分かった組織と同じ組織に蛍光が蓄積されていることを実証している。予想通り、これらのデータは、ほとんどのＮＰが肝臓に達することを示している。注射２４時間後に測定した１ピクセルあたりの蛍光の肝臓／脾臓比は、ＣＢＺを含まないＮＰでは２．９、ＣＢＺを含むＮＰでは２．４であると推定されたが、肝臓対脾臓の総ＣＢＺ含有量の比は、ＭＳ分析に基づいて２．１と計算した。（１ピクセルあたりの測定に基づく）蛍光イメージングからの定量的データの解釈には注意が必要であるが、２つの異なる方法を用いて得たこれらの生体内分布データは、同様の結果を示した。遊離ＮＲ６６８の注射が測定可能なインビボシグナルを与えなかったという、本明細書での観察、（Ｓｎｉｐｓｔａｄら（２０１７）で実証されているように）ＮＲ６６８が同様の組成物を含むＮＰから漏れなかったという事実、および非カプセル化ＣＢＺの血液からの急速な消失は、ＣＢＺおよびＮＲ６６８のほとんどが、注射２４時間後にＮＰ内に封じ込められていることを示している。したがって、これらの低分子物質の生体内分布は、現時点でのＰＥＢＣＡ  ＮＰの分布をよく表していると思われる。Ｓｎｉｐｓｔａｄら（２０１７）に開示の研究では、ＮＰはやや似ているが、別のＰＥＧ化および蛍光マーカーを使用して、注射６時間後に５．３の肝臓／脾臓比が報告された。この研究では、注射２４時間後に腫瘍で得られた平均蛍光シグナルは、ＣＢＺを含有しないＮＰでは肝臓のシグナルの１２％、およびＣＢＺを含有するＮＰでは３％であった。ＩＶＩＳデータ（図３Ａ、Ｂ）は、ＣＢＺを含有するＮＰよりも、薬物を含まないＰＥＢＣＡ  ＮＰ注射後の蛍光が高いことを示している。おそらく、薬物を含むＮＰのサイズがやや大きい（表Ｓ１）ことが、この違いの原因である。
【０１０２】
マクロファージは、乳腺腫瘍で最も豊富な免疫細胞である。腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）は元来、抗腫瘍活性を発揮すると考えられていたが、臨床的および実験的証拠の増加によって、ＴＡＭも腫瘍の進行を促進し、抗がん薬物の応答に影響を与え得ることが示されている。従来、活性化された炎症誘発性（Ｍ１タイプ）マクロファージが抗腫瘍原性特性を呈することが知られている一方で、代わって腫瘍誘発性マクロファージは、活性化され抗炎症（Ｍ２タイプ）と称される。可塑性は、マクロファージ集団の特徴であり、それらの表現型の動的な変化によって、異なるサブタイプが定義される。Ｍ１およびＭ２のマーカーは、主な表現型または機能を認識するために一般的に使用されるが、この組のマーカーは、集団全体のより包括的な特徴評価に推奨される。本実施例では、Ｍ１表現型およびマンノース受容体（ＣＤ２０６）を検出するために広く受け入れられている、一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）を使用して、Ｍ２タイプを定義している。
【０１０３】
ＴＡＭは、環境（ｃｏｎｔｅｘｔ）、例えば、微小環境における要因または外部から添加された抗がん薬物による影響を受ける。興味深いことに、ドセタキセルの効果は、乳がんモデルにおけるＭ２マクロファージの枯渇およびＭ１マクロファージの拡大に部分的に依存することが示されている。対照的に、効率的な成長遅延にもかかわらず、別のタキサンである遊離ＣＢＺを用いる治療では、マクロファージ集団における応答は観察されなかった。しかしながら、ＰＥＢＣＡカプセル化ＣＢＺを用いる治療によって、抗腫瘍効能が有意に改善され、腫瘍の７５％で完全寛解を生じた。免疫組織化学的定量化に使用される腫瘍の数は少ないが、データは、この良好な効果を説明し得る２つの可能性のあるメカニズムを示唆している。第１に、ＰＥＢＣＡ  ＮＰ（薬物の有無にかかわらず）を用いる治療では、腫瘍の炎症が上昇する傾向が観察された。これは、腫瘍への抗腫瘍原性Ｍ１マクロファージのホーミングにおけるＰＥＢＣＡ  ＮＰの役割を暗に意味し得、したがって、ＣＢＺの効果をさらに裏付けることができる。第２に、薬物を含まないＮＰを用いる治療と比較して、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ治療は、腫瘍におけるＣＤ２０６発現を有意に低減することも示し、これは腫瘍原性誘発性マクロファージの枯渇を示し得る。
【０１０４】
Ｍ２マクロファージは、マクロピノサイトーシスによる活発なエンドサイトーシス的取り込みを示すが、この取り込みは、Ｍ１マクロファージでは実質的に不活性であることが最近発表された。さらに、別の研究では、Ｍ２マクロファージが、エンドサイトーシスを使用してコラーゲンを分解し、固形腫瘍の腫瘍成長を促進することが示された。理論に縛られることなく、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺを用いる治療後に観察されたＭ２マクロファージの減少および腫瘍成長への強い影響は、マクロピノサイトーシスによるＰＥＢＣＡ−ＣＢＺの取り込み、およびその後のこれらのＭ２マクロファージの死に関連している。したがって、Ｍ１およびＭ２マクロファージの固有の特性、ならびにＭ２マクロファージに対する薬物含有粒子の選択的毒性効果は、治療の効能を増加させ得る。ＴＡＭをＭ１に分極させる（Ｍ１／Ｍ２マクロファージの比率を増加させる）ことによって、マウスのがんモデルに有望な療法効果が示されることが、以前発表されている。
【０１０５】
また、ＭＡＳ９８．１２  ＰＤＸモデルと同じ効能を示さない、同所に成長するＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍でも、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺおよび非カプセル化ＣＢＺの効果を調べた。空のＰＥＢＣＡと比較した、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍におけるＰＥＢＣＡ−ＣＢＺの療法効果がデータで実証されてはいるが、その効果は、非カプセル化ＣＢＺで見られるものとは異なる。
【０１０６】
これらのＮＰの結果はＥＰＲ効果に基づくので、腫瘍血管系は、腫瘍内でのＮＰ蓄積に重要な要因である。基底様ＭＡＳ９８．１２腫瘍は、管腔様ＭＡＳ９８．０６腫瘍よりも高い血管分布を有することが以前示されている。また、血管新生は、マウスのＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍で目視されているが、ＭＡＳ９８．１２とＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍との血管分布の違いはあまりよく特徴評価されていない。しかしながら、以前発表された２つの研究では、血液体積は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１接種５週間後の腫瘍体積の２．４％、およびＭＡＳ９８．１２移植５週間後５．９％を占め、後者のモデルでより効率的な血管分布を示唆している。したがって、血管分布の程度は、効能に影響を与え得る。
【０１０７】
組織試料内の蛍光インビボイメージングデータおよびＣＢＺ定量化の両方で、リンパ節におけるＰＥＢＣＡ  ＮＰの蓄積が明らかに実証されている（図３Ｂ、Ｃ、および図４Ｂ）。リンパ節における薬物または造影剤の蓄積が最近見直され、最良の蓄積のためには非常に小さいＮＰを注射することの利点が示唆されている。この研究では、本研究に使用したものと同様の粒子、すなわちＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７で修飾され、ビンクリスチンが負荷されているポリ（ブチルシアノアクリレート）のリンパ節への蓄積が報告されている。これらのＮＰは、ビンクリスチンを急速に放出することが示されているので、非カプセル化薬物注射後にもビンクリスチンがリンパ節に蓄積され、これらのＮＰが実際にリンパ節に蓄積した程度を評価することは困難である。転移性腫瘍の治療のための、リンパ節への薬物送達が議論されてきた。局所リンパ節は、局所乳がん転移の最初の部位であり、攻撃的なトリプルネガティブ基底様乳がんの主な転移部位でもあるため、リンパ組織へのＰＥＢＣＡ−ＣＢＺの蓄積が、そのような治療にさらに寄与し得る。
【０１０８】
要約すると、ＰＥＢＣＡ−ＣＢＺ  ＮＰは、乳がん治療に有望な結果を実証し、本明細書に開示の固形腫瘍治療に使用するための薬物送達システムの療法効果を裏付ける。
さらに、ＰＡＣＡ  ＮＰが抗腫瘍原性マクロファージの腫瘍内の存在を向上すると思われるという観察は、本発明の薬物送達システムがより普遍的な価値を有し得、免疫調節剤としておよび／またはカプセル化薬物の療法効果を向上することが可能なビヒクルとして使用することができることを裏付けることができる。
【０１０９】
【表１】
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【０１１０】
実施例２
Ｊｅｖｔａｎａ（登録商標）として配合されている、またはＰＥＢＣＡ  ＮＰ内にカプセル化されているＣＢＺを用いる前立腺がん腫瘍モデルの治療
方法：
乳がん治療研究で説明されているように、Ｊｅｖｔａｎａを配合した。簡単に言えば、ＣＢＺをＴｗｅｅｎ８０中に４０ｍｇ／ｍｌで溶解させ、次いで１３％のＥｔＯＨで１：４に希釈した。乳がん治療研究で説明されているように、ＣＢＺが負荷されているＰＥＢＣＡ  ＮＰを調製し、特徴評価した。簡単に言えば、ＣＢＺを１０ｗ／ｖ％でモノマー相に添加し、ペグ化ＰＥＢＣＡ  ＮＰをワンステップミニエマルション重合で作製した。ＤＬＳを用いてサイズ、サイズ分布、およびゼータ電位について、ＮＰを特徴評価した。
【０１１１】
１０％のＦＢＳおよび１％のペンシリン／ストレプトアビジンを含むＤＭＥＭ中で、ヒトＰＣ３前立腺腺がん腫細胞を成長させた。５０μｌの細胞培地中３００万個の細胞を、マウスの後脚に皮下注射した。腫瘍体積が２００ｍｍ3に達したときに治療を開始し、毎週１回の治療を３週間続けた。１；対照−治療なし、２；１０ｍｇ／ｋｇＣＢＺ−ＰＥＢＣＡ、３；１０ｍｇ／ｋｇのＪｅｖｔａｎａ、を受ける３つの群に、動物を無作為に分けた。尾静脈のカテーテルを通して、薬物を投与した。キャリパを用いて腫瘍を週２回測定し、腫瘍が１０００ｍｍ3に達したときに動物を安楽死させた。
結果：
動的光散乱でＮＰを特徴評価し、１８０ｎｍの直径、０．１８のＰＤＩ、−１．７ｍＶのゼータ電位を有した。ＣＢＺカプセル化を質量分析法で測定し、８．５ｗ／ｗ％のＮＰ質量であることが分かった。
【０１１２】
臨床的に承認された配合物として、またはＰＥＢＣＡ  ＮＰ内のいずれかで配合されると、ＣＢＺは、同様の成長阻害を有することが分かった（図１）。両方の治療は、最初の治療１４日後に、未治療の対照とは有意に異なった（ｐ＜０．００１、ｔ検定）。
【０１１３】
図１１では、３つの群の平均腫瘍サイズがプロットされている。矢印は治療日を示し、エラーバーは標準偏差を示し、＊＊＊はｐ＞０．００１、ｔ検定を示す。図から分かるように、ＰＥＢＣＡ  ＮＰ内に配合されたＣＢＺの細胞増殖抑制効果は、前立腺がんモデルＰＣ３における薬物の臨床配合物の効果と同様であった。
参照文献：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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