(57)【要約】  有効量の、配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離Ｃｈｐペプチド、又はそれと約８０％の配列同一性を有し、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、若しくはそれを死滅させる修飾Ｃｈｐペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が本明細書に開示される。さらに、単離Ｃｈｐペプチド、並びにＣｈｐペプチドをコードする核酸分子を含むベクター及びベクターを含む宿主細胞が本明細書に開示される。また、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる方法、及び被験体において細菌感染を治療する方法が本明細書に開示される。【選択図】図１Ａ
2021519311.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬組成物であって、
有効量の（ｉ）配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離Ｃｈｐペプチド若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６の少なくとも１つのアミノ酸配列と８０％の配列同一性を有し、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、若しくはそれを死滅させる修飾Ｃｈｐペプチドと、
薬学的に許容可能な担体と、
を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記Ｃｈｐペプチドが、配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６のいずれか１つのアミノ酸配列又はその活性フラグメントに対して少なくとも１つの非天然修飾を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記非天然修飾が、置換修飾、Ｎ末端アセチル化修飾及びＣ末端アミド化修飾からなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３及び配列番号６６からなる群から選択される、又はその活性フラグメントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８及び配列番号５４からなる群から選択される、又はその活性フラグメントである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
溶液、懸濁液、エマルション、吸入用粉末、エアロゾル又はスプレーである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
グラム陰性細菌の治療に適した１つ以上の抗生物質を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
（ｉ）配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣｈｐペプチド若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６の少なくとも１つのアミノ酸配列と８０％の配列同一性を有し、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、若しくはその菌数を減少させるか、若しくはそれを死滅させる修飾Ｃｈｐペプチドをコードする核酸分子を含む、ベクター。
【請求項９】
（ｉ）配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣｈｐペプチド若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６の少なくとも１つのアミノ酸配列と８０％の配列同一性を有し、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる修飾Ｃｈｐペプチドをコードする核酸分子を含み、該核酸が異種プロモーターに操作可能に連結される、組換え発現ベクター。
【請求項１０】
前記アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３及び配列番号６６からなる群から選択される、又はその活性フラグメントである、請求項９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８及び配列番号５４からなる群から選択される、又はその活性フラグメントである、請求項９又は１０に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１２】
前記核酸分子がｃＤＮＡ配列である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか一項に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
【請求項１４】
配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列若しくはその活性フラグメントを含むＣｈｐペプチドをコードする単離精製された核酸又はそれに相補的な配列を含む核酸。
【請求項１５】
前記Ｃｈｐペプチドが、配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６のいずれか１つのアミノ酸配列又はその活性フラグメントに対して少なくとも１つの非天然修飾を含む、請求項１４に記載の単離精製された核酸。
【請求項１６】
前記修飾が、置換修飾、Ｎ末端アセチル化修飾及びＣ末端アミド化修飾からなる群から選択される、請求項１４又は１５に記載の単離精製された核酸。
【請求項１７】
配列番号２７〜配列番号３０、配列番号３２〜配列番号５３及び配列番号６８〜配列番号７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離精製されたＤＮＡ。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの非天然修飾を含む、請求項１７に記載の単離精製されたＤＮＡ。
【請求項１９】
前記非天然修飾が、突然変異、又はＮ末端アセチル化修飾若しくはＣ末端アミド化修飾をコードする核酸配列である、請求項１７又は１８に記載の単離精製されたＤＮＡ。
【請求項２０】
少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる方法であって、
前記細菌と、有効量の（ｉ）配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列、若しくはその活性フラグメントを含むＣｈｐペプチド、又は（ｉｉ）配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６の少なくとも１つのアミノ酸配列と８０％の配列同一性を有する修飾Ｃｈｐペプチドを含む組成物とを接触させることを含み、
前記Ｃｈｐペプチド又は修飾Ｃｈｐペプチドが前記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖の阻害、その菌数の減少、又はその死滅に十分な期間にわたって溶菌活性を有する、方法。
【請求項２１】
前記アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３及び配列番号６６からなる群から選択される、又はその活性フラグメントである、請求項２０に記載の少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる方法。
【請求項２２】
前記アミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８及び配列番号５４からなる群から選択される、又はその活性フラグメントである、請求項２０又は２１に記載の少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの種のグラム陰性細菌によって引き起こされる細菌感染を予防又は治療する方法であって、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２４】
前記グラム陰性細菌が、アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、エンテロバクター・クロアカエ、サルモネラ属、淋菌及びシゲラ属からなる群から選択される、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌がシュードモナス・エルギノーサである、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細菌感染が局所又は全身の細菌感染である、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記グラム陰性細菌感染の治療に適した抗生物質を前記被験体に投与することを更に含む、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗生物質が、アジスロマイシン、アズトレオナム、ホスホマイシン、セフタジジム、セフェピム、セフォペラゾン、セフトビプロール、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、アミノグリコシド、イミペネム、メロペネム、ドリペネム、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ピペラシリン、チカルシリン、ペニシリン、リファンピシン、ポリミキシンＢ及びコリスチンの１つ以上から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗生物質が、アミカシン、アジスロマイシン、アズトレオナム、シプロフロキサシン、コリスチン、ホスホマイシン、ゲンタマイシン、イミペネム、ピペラシリン、リファンピシン及びトブラマイシンの１つ以上から選択される、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求物１〜７に記載の医薬組成物を投与することが、前記抗生物質を単独で投与するよりも、前記グラム陰性細菌の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる上でより効果的である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの種のグラム陰性細菌によって引き起こされる細菌感染を予防又は治療する方法であって、
細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に、第１の量の請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物と、第２の量のグラム陰性細菌感染の治療に適した抗生物質との組み合わせを同時投与することを含み、
前記第１及び第２の量が共に、前記細菌感染の予防又は治療に効果的である、方法。
【請求項３２】
前記抗生物質が、アジスロマイシン、アズトレオナム、ホスホマイシン、セフタジジム、セフェピム、セフォペラゾン、セフトビプロール、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、アミノグリコシド、イミペネム、メロペネム、ドリペネム、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ピペラシリン、チカルシリン、ペニシリン、リファンピシン、ポリミキシンＢ及びコリスチンの１つ以上から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗生物質が、アミカシン、アジスロマイシン、アズトレオナム、シプロフロキサシン、コリスチン、ホスホマイシン、ゲンタマイシン、イミペネム、ピペラシリン、リファンピシン及びトブラマイシンの１つ以上から選択される、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１つの種のグラム陰性細菌によって引き起こされる細菌感染の治療に適した抗生物質の有効性を高める方法であって、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物と組み合わせて前記抗生物質を同時投与することを含み、
前記組み合わせの投与が、前記抗生物質又は前記医薬組成物のいずれかを個別に投与するよりも、前記グラム陰性細菌の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる上でより効果的である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１８年３月２９日付で出願された米国仮特許出願第６２／６５０，２３５号の利益を主張し、その出願日に依拠し、その開示全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０００２】
［配列表］
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。２０１９年３月２８日付けで作製された上記ＡＳＣＩＩコピーの名前は０３４１＿０００２−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、２８０９７バイトのサイズである。
【０００３】
本開示は、抗微生物剤の分野に関し、より具体的にはグラム陰性細菌に感染するファージ由来抗微生物性アムリンペプチドと、グラム陰性細菌の死滅並びに細菌感染及び汚染への対処におけるこれらのペプチドの使用とに関する。
【背景技術】
【０００４】
グラム陰性細菌、特にシュードモナス（Pseudomonas）属の成員及び新興多剤耐性病原体であるアシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）は、深刻な、生命に関わる恐れのある侵襲的感染の重要な原因である。シュードモナス感染は、熱傷創、慢性創傷、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、脆弱な患者に対して多くの脅威を及ぼす移植生体材料上、並びに院内環境表面（hospital surface）及び給水設備内での表面増殖といった大きな問題となる。
【０００５】
シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）は、患者において定着した後、治療が特に困難な場合がある。そのゲノムは、β−ラクタム抗生物質及びアミノグリコシド抗生物質への耐性を与える多剤排出ポンプ及び酵素を含む多くの耐性遺伝子をコードし、新規の抗微生物治療剤がないことから、このグラム陰性病原体に対する療法は、特に困難なものとなっている。この難点は、細菌を宿主防御及び化学療法から保護することによって感染を引き起こす細菌の能力を高める可能性があるバイオフィルム中で増殖するシュードモナス・エルギノーサの能力によって複雑になる。
【０００６】
医療現場では、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）の薬物耐性株の発生率が増加している。地域病院における医療関連の血流感染（ＢＳＩ：BloodStream Infection）の観察研究では、シュードモナス・エルギノーサが上位４つの多剤耐性（ＭＤＲ：Multiple Drug Resistant）病原体の１つであり、全院内死亡率は１８％であった。さらに、ＭＤＲシュードモナス・エルギノーサの大流行がよく記載されている。不良な転帰が、コリスチン等の最終手段の薬物による治療を必要とすることが多いシュードモナス・エルギノーサのＭＤＲ株と関連付けられている。
【０００７】
世界保健機関（ＷＨＯ）及び疾病管理センター（ＣＤＣ）によって重大な脅威として特定された他の薬物耐性細菌としては、次のグラム陰性細菌：アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ、腸内細菌科（大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）及びエンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）を含む）、サルモネラ属（Salmonella）種、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）及びシゲラ属（Shigella）種が挙げられる（非特許文献１）。
【０００８】
新規の機構を持つ新たな抗微生物剤の必要性に応えるため、研究者らが様々な薬物及び生物学的製剤を調査している。かかるクラスの抗微生物剤の１つに、溶解素が含まれる。溶解素は細胞壁ペプチドグリカンヒドロラーゼであり、「分子バサミ」として作用して細胞形状の維持及び内部浸透圧への抵抗に関与するペプチドグリカン網を分解する。ペプチドグリカンの分解は浸透圧溶解をもたらす。しかしながら、グラム陽性細菌に存在せず、下にあるペプチドグリカンへのアクセスを制限するグラム陰性細菌の外膜（ＯＭ）の存在のため、或る特定の溶解素は、少なくとも部分的にグラム陰性細菌に対しては有効ではなかった。修飾溶解素（「ａｒｔｉｌｙｓｉｎ」）も開発されている。ポリカチオン性、両親媒性及び疎水性の特性を有する特定のα−ヘリックスドメインに融合した溶解素を含有するこれらの作用物質は、ＯＭを介して移行することができる。しかしながら、或る特定のａｒｔｉｌｙｓｉｎは、ｉｎ  ｖｉｖｏで低い活性を示す。これは、ヒト血清の構成成分、具体的には生理学的塩及び２価カチオンによって引き起こされる場合がある。これらの構成成分はリポ多糖結合部位について競合し、溶解素のαヘリックス転移ドメインを妨害し、それによって血液中での活性を制限して、侵襲的感染を治療するための或る特定の溶解素及びａｒｔｉｌｙｓｉｎの有効性を制限する可能性がある。複数の異なる外膜を透過及び不安定化する抗微生物ペプチドについて、血液中での同様の活性の欠如が報告されている。
【０００９】
溶解素及びａｒｔｉｌｙｓｉｎに加えて、「アムリン」を含む他のファージにコードされている宿主溶解システムが同定された（非特許文献２）。アムリンという用語は、ｓｓＤＮＡファージ及びｓｓＲＮＡファージ（それぞれミクロウイルス科及びレビウイルス科）の両方に由来する、限定された非壁溶解の（nonmuralytic）（「壁破壊」ではない、すなわち、細胞壁のペプチドグリカン加水分解に基づくものではない）溶解活性のセットを説明する。例えば、ファージφＸ１７４（ミクロウイルス科ミクロウイルス属）のタンパク質Ｅアムリンは、ムレイン前駆物質であるリピドＩの形成を触媒する必須膜埋め込み型酵素である細菌トランスロカーゼＭｒａＹを阻害することにより溶解を引き起こす９１アミノ酸の膜タンパク質である（非特許文献３）。さらに、ファージＱβ（レビウイルス科アロレビウイルス属）のＡ２カプシドタンパク質は、ＭｕｒＡ活性に干渉し、ペプチドグリカン生合成のプロセスを調節不全にすることにより溶解を引き起こす４２０アミノ酸の構造タンパク質（及びアムリン）である（非特許文献４）。他の非限定的な例としては、ＭｕｒＪの特異的阻害物質であるファージＭのＬｙｓＭアムリン、大腸菌（E. coli）のリピドＩＩフリッパーゼ、及びファージＭＳ２（レビウイルス科レビウイルス属）のタンパク質Ｌアムリン（７５アミノ酸の内在性膜タンパク質であり、宿主シャペロンＤｎａＪの活性を必要とする方法で溶解を引き起こす）（非特許文献５）が挙げられる。Ｌ様アムリンの推定ドメイン構造が割り当てられており、１０個〜１７個の疎水性残基の伸長が直前に付されている内部ロイシルセリンジペプチドを含む。これらのアムリンは、内在性膜タンパク質であり、精製されておらず、溶解素のようには使用されていない。さらに、それらの標的は細胞質にある。それらは、溶菌剤として試験されていない。幾つかのアムリンは、例えばＰＣＴ出願公開である特許文献１に詳しく記載されているが、せいぜい治療薬の開発の基礎となるにすぎず、抗菌治療薬に開発されているものではない。
【００１０】
最近の出版物では、溶解素／ａｒｔｉｌｙｓｉｎ及び他の宿主溶解システム（例えば、アムリン）が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて様々なレベルの有効性でグラム陰性細菌に対して使用することができると記載されているが、侵襲的感染の治療のためにＭＤＲシュードモナス・エルギノーサ及び他のグラム陰性細菌を標的とする追加の抗菌化合物、特に、溶解性が高く、血清の存在下でｉｎ  ｖｉｖｏにおいて活性なままであり、及び／又は溶血活性を有しない抗菌化合物に対する必要性が残されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００１／００９３８２号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Tillotson G. 2018. A crucial list of pathogens. Lancet Infect Dis 18:234-236
【非特許文献２】Chamakura KR et al., 2017. Mutational analysis of the MS2 lysis protein L. Microbiology 163:961-969
【非特許文献３】Zheng Y et al., 2009. Purification and functional characterization of phiX174 lysis protein E. Biochemistry 48:4999-5006
【非特許文献４】Gorzelnik KV et al., 2016. Proc Natl Acad Sci U S A 113:11519-11524
【非特許文献５】Chamakura KR et al., 2017. J Bacteriol 199
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
この出願は、例えば、ミクロウイルス科のゲノム配列に由来し、既知の溶解素／ａｒｔｉｌｙｓｉｎ及びアムリンを含む、他のかかる作用物質とは異なる新規クラスのファージ溶菌剤を開示する。本明細書に開示されるファージ溶菌剤はクラミジアファージ（Ｃｈｐ：Chlamydia phage）ペプチドと称され、「アムリンペプチド」（アムリンとの配列類似性を意味しない機能的定義）とも称される。同定されている４０種のＣｈｐペプチドが本明細書に開示され、特定の溶菌性タンパク質のファミリーを構成する。本明細書に開示されるＣｈｐペプチドの幾つかは、互いに顕著な配列類似性を示すが、配列データベース内の他の既知のペプチドとは異なる。Ｃｈｐペプチドに特有な配列にもかかわらず、それらはいずれも脊椎動物の自然免疫系の幾つかの以前に記載される抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）と同様のαヘリックス構造をとると予測されている（E.F. Haney et al, 2017, In Hansen PR (ed), Antimicrobial Peptides: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1548）が、かかるＡＭＰとの配列類似性は有していない。Ｃｈｐクラスに関する抗菌機能と一致して、幾つかの異なる精製Ｃｈｐペプチドに関して、グラム陰性病原体に対する強力な広域スペクトルの殺菌活性が本明細書に開示される。外部に適用されたタンパク質によって容易にアクセスすることができない場合がある細胞壁の生合成装置に細胞質標的を有するミクロウイルス科の先に記載されるアムリンとは異なり、本明細書に開示されるＣｈｐペプチドを、「ない状態から」（すなわち、細胞壁の外側に対して作用することにより）殺菌活性を発揮するために精製された形態で使用することができる。本明細書で同定されるＣｈｐペプチドは、グラム陰性病原体に対する広域スペクトル活性、及び血清の存在下で持続する能力を有する新規クラスの抗微生物剤となる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一態様では、本開示は、薬学的に許容可能な担体と、有効量の（ｉ）配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離Ｃｈｐペプチド若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６の少なくとも１つと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有し、任意にヒト血清の存在下で、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害する、その菌数を減少させる、及び／又はそれを死滅させる修飾Ｃｈｐペプチドとを含む、医薬組成物に関する。或る特定の実施の形態では、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、シュードモナス・エルギノーサを含む。
【００１５】
本明細書に開示される別の実施の形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体と、有効量のＣｈｐ１、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ３、Ｃｈｐ４、Ｃｈｐ６、Ｃｈｐ７、Ｃｈｐ８、Ｃｈｐ９、Ｃｈｐ１０、Ｃｈｐ１１、Ｃｈｐ１２、ＣＰＡＲ３９、Ｇｋｈ１、Ｇｋｈ２、Ｕｎｐ１、Ｅｃｐ１、Ｔｍａ１、Ｅｃｐ２、Ｏｓｐ１、Ｕｎｐ２、Ｕｎｐ３、Ｇｋｈ３、Ｕｎｐ５、Ｕｎｐ６、Ｓｐｉ１、Ｓｐｉ２、Ｅｃｐ３、Ｅｃｐ４、Ｌｖｐ１、Ｌｖｐ２、ＡＬＣＥＳ１、ＡＶＱ２０６、ＡＶＱ２４４、ＣＤＬ９０７、ＡＧＴ９１５、ＨＨ３９３０、Ｆｅｎ７８７５及びＳＢＲ７７のペプチドからなる群から選択される単離Ｃｈｐペプチド、又はその活性フラグメントとを含む。
【００１６】
幾つかの実施の形態では、Ｃｈｐペプチドは、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ４、Ｃｈｐ６、Ｅｃｐ１又はＥｃｐ２である。
【００１７】
本開示の様々な実施の形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体と、有効量の（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離Ｃｈｐペプチド、又はその活性フラグメントとを含む。
【００１８】
或る特定の実施の形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体と、有効量の（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８及び配列番号５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントとを含む。
【００１９】
或る特定の実施の形態では、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも１つの非天然修飾を含み、或る特定の実施の形態では、非天然修飾は、アミノ酸の置換等の置換修飾、Ｎ末端アセチル化修飾及びＣ末端アミド化修飾からなる群から選択される。或る特定の実施の形態では、修飾Ｃｈｐペプチドは、配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含み、該修飾Ｃｈｐペプチドは、任意にヒト血清の存在下で、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害する、その菌数を減少させる、及び／又はそれを死滅させる。或る特定の実施の形態では、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、シュードモナス・エルギノーサを含む。或る特定の実施の形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。或る特定の実施の形態では、配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む修飾Ｃｈｐペプチドは、少なくとも１つのαヘリックスドメインを有するカチオン性ペプチドである。
【００２０】
医薬組成物は、幾つかの実施の形態では、溶液、懸濁液、エマルション、吸入用粉末、エアロゾル又はスプレーであり得る。幾つかの実施の形態では、本医薬組成物はまた、グラム陰性細菌の治療に適した１つ以上の抗生物質を含んでもよい。任意に、ペプチドＣｈｐ１は、医薬組成物がＣｈｐ１を含まないように排除される。
【００２１】
或る特定の実施の形態では、（ｉ）配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣｈｐペプチド若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６の少なくとも１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、任意にヒト血清の存在下で、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害する、その菌数を減少させる、及び／又はそれを死滅させる修飾Ｃｈｐペプチドをコードする核酸を含むベクターが本明細書に開示される。或る特定の実施の形態では、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、シュードモナス・エルギノーサを含む。
【００２２】
また、（ｉ）配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６の少なくとも１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、任意にヒト血清の存在下で、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害する、その菌数を減少させる、及び／又はそれを死滅させる修飾Ｃｈｐペプチドをコードする核酸を含む組換え発現ベクターが本明細書に開示される。或る特定の実施の形態では、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、シュードモナス・エルギノーサを含む。或る特定の実施の形態では、核酸は、異種プロモーターに操作可能に連結される。或る特定の実施の形態では、核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントをコードし、或る特定の実施の形態では、核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８及び配列番号５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントをコードする。
【００２３】
本明細書に開示される更なる実施の形態は、前述のベクターを含む単離宿主細胞を含む。幾つかの実施の形態では、核酸配列はｃＤＮＡ配列である。
【００２４】
更に別の態様では、本開示は、配列番号１〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド、又はその活性フラグメントをコードする単離精製された核酸に関する。或る特定の実施の形態では、核酸は、配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド、又はその活性フラグメントをコードする。代替的な実施の形態では、単離精製されたＤＮＡは、配列番号２７〜配列番号５３及び配列番号６８〜配列番号８０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、或る特定の実施の形態では、単離精製されたＤＮＡは、配列番号２７〜配列番号３０、配列番号３２〜配列番号５３及び配列番号６８〜配列番号７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。任意に、核酸はｃＤＮＡである。或る特定の実施の形態では、ヌクレオチド配列は、突然変異（例えば、置換、挿入又は欠失）等の少なくとも１つの非天然修飾、又はＮ末端修飾若しくはＣ末端修飾をコードする核酸配列を含む。
【００２５】
他の態様では、本開示は様々な方法／使用に関する。かかる使用の１つは、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害する、その菌数を減少させる、及び／又はそれを死滅させる方法であって、該細菌と、有効量の（ｉ）配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）それらと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、上記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害する、その菌数を減少させる、及び／又はそれを死滅させる修飾Ｃｈｐペプチドを含む組成物とを接触させることを含む、方法である。或る特定の実施の形態では、Ｃｈｐペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその活性フラグメントを含み、或る特定の実施の形態では、Ｃｈｐペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８及び配列番号５４からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその活性フラグメントを含む。
【００２６】
また、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害する、その菌数を減少させる、及び／又はそれを死滅させる方法であって、細菌と、有効量のＣｈｐ１、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ３、Ｃｈｐ４、Ｃｈｐ６、Ｃｈｐ７、Ｃｈｐ８、Ｃｈｐ９、Ｃｈｐ１０、Ｃｈｐ１１、Ｃｈｐ１２、ＣＰＡＲ３９、Ｇｋｈ１、Ｇｋｈ２、Ｕｎｐ１、Ｅｃｐ１、Ｔｍａ１、Ｅｃｐ２、Ｏｓｐ１、Ｕｎｐ２、Ｕｎｐ３、Ｇｋｈ３、Ｕｎｐ５、Ｕｎｐ６、Ｓｐｉ１、Ｓｐｉ２、Ｅｃｐ３、Ｅｃｐ４、Ｌｖｐ１、Ｌｖｐ２、ＡＬＣＥＳ１、ＡＶＱ２０６、ＡＶＱ２４４、ＣＤＬ９０７、ＡＧＴ９１５、ＨＨ３９３０、Ｆｅｎ７８７５及びＳＢＲ７７からなる群から選択されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントを含む組成物とを接触させることを含み、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントが、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害する、その菌数を減少させる、及び／又はそれを死滅させる特性を有する、方法が本明細書に開示される。
【００２７】
或る特定の実施の形態では、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、シュードモナス・エルギノーサであり、或る特定の実施の形態では、上記方法は、シュードモナス・エルギノーサに加えて少なくとも１つの他の種のグラム陰性細菌を死滅させることを更に含む。
【００２８】
また、グラム陰性細菌によって引き起こされる細菌感染を治療する方法であって、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に本明細書に開示される医薬組成物を投与することを含む、方法が本明細書に開示される。
【００２９】
前述の方法／使用のいずれかにおいて、グラム陰性細菌は、アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、エンテロバクター・クロアカエ、サルモネラ属種、淋菌及びシゲラ属種からなる群から選択される少なくとも１つのグラム陰性細菌であり得る。或る特定の実施の形態では、グラム陰性細菌はシュードモナス・エルギノーサである。
【００３０】
また、治療又は予防を必要とする被験体に本明細書に開示される医薬組成物を投与することを含む、グラム陰性細菌によって引き起こされる局所又は全身の病原性細菌感染を治療又は予防する方法が本明細書に開示される。
【００３１】
さらに、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に、第１の量の本明細書に開示される医薬組成物と、第２の量のグラム陰性細菌感染の治療に適した抗生物質との組み合わせを同時投与することを含み、第１及び第２の量が共に、グラム陰性細菌感染の予防又は治療に効果的である、細菌感染を予防又は治療する方法が本明細書に開示される。
【００３２】
幾つかの実施の形態では、グラム陰性細菌感染の治療に適した抗生物質は、セフタジジム、セフェピム、セフォペラゾン、セフトビプロール、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、アミノグリコシド、イミペネム、メロペネム、ドリペネム、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ピペラシリン、チカルシリン、ペニシリン、リファンピシン、ポリミキシンＢ及びコリスチンの１つ以上から選択される。或る特定の実施の形態では、抗生物質は、アミカシン、アジスロマイシン、アズトレオナム、シプロフロキサシン、コリスチン、ホスホマイシン、ゲンタマイシン、イミペネム、ピペラシリン、リファンピシン及びトブラマイシンの１つ以上から選択される。
【００３３】
更に別の実施の形態では、グラム陰性細菌感染の治療に適した抗生物質の有効性を高める方法であって、本明細書に開示される医薬組成物と組み合わせて該抗生物質を同時投与することを含み、該組み合わせの投与が、上記抗生物質又はその医薬組成物のいずれかを個別に投与するよりも、グラム陰性細菌の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる上でより効果的である、方法が開示される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】クラミジアファージペプチド（Ｃｈｐ）ファミリーの成員であるＣｈｐ１、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ４、Ｃｈｐ５、Ｃｈｐ６、Ｃｈｐ７、Ｅｃｐ１、Ｅｃｐ２及びＯｓｐ１の構造についてＩ−Ｔａｓｓｅｒによって推定される３次元モデルを示す図である。比較のため、ヒト自然免疫エフェクターペプチドＬＬ−３７を含める。αヘリックス構造は明らかであり、一般に最上部末端はＮ末端である。
【図１Ｂ】ＪＰＲＥＤ４を用いたＣｈｐ２（配列番号２）のコンセンサス二次構造予測を示す図である。αヘリックスは、太い縞模様のバーで示される。
【図１Ｃ】ＪＰＲＥＤ４を用いたＣｈｐ４（配列番号４）のコンセンサス二次構造予測を示す図である。αヘリックスは、太い縞模様のバーで示される。
【図２Ａ】ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントから生成された或る特定のＣｈｐファミリーの成員の有根（ＵＰＧＭＡクラスタリング法）系統樹を示す図である。
【図２Ｂ】ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントから生成された或る特定のＣｈｐファミリーの成員の無根（隣接結合クラスタリング法）系統樹を示す図である。
【図３】１００％ヒト血清中でＣｈｐ２（１０μｇ／ｍＬ）又はバッファー対照（「未処理」）で１５分間処理されたシュードモナス・エルギノーサ株１２９２の顕微鏡分析（倍率２０００倍）を示す一連の顕微鏡写真である。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（ThermoFisher）を用いてサンプルを染色し、微分干渉観察（ＤＩＣ：Differential Interference Contrast）及び蛍光顕微鏡の両方で調べた。顕微鏡写真は、未処理の列に死んだ細菌がないこと、及び処理された列の生細菌の減少を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
定義
本明細書で使用される場合、以下の用語及びその同語源語は、文脈上そうでないことが明示されない限り、下記の意味を有するものとする。
【００３６】
「担体」は、活性化合物と共に投与される溶媒、添加剤、賦形剤、分散媒、可溶化剤、コーティング剤、保存料、等張剤及び吸収遅延剤（absorption delaying agent）、界面活性剤、噴射剤、希釈剤、ビヒクル等を指す。かかる担体は、滅菌液、例えば水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、及び石油、動物、植物又は合成起源のものを含む油、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等であり得る。
【００３７】
「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的に適合するあらゆる溶媒、添加剤、賦形剤、分散媒、可溶化剤、コーティング剤、保存料、等張剤及び吸収遅延剤、界面活性剤、噴射剤、希釈剤、ビヒクル等を指す。担体（複数の場合もある）は、薬剤中で通常使用される量で治療対象の被験体に有害でないという意味で「許容可能」でなくてはならない。薬学的に許容可能な担体は、組成物をその意図される目的に不適なものにすることなく組成物の他の成分に適合する。さらに、薬学的に許容可能な担体は、過度の有害な副作用（毒性、刺激及びアレルギー応答等）なしに本明細書に提示される被験体への使用に適している。副作用は、それらのリスクが組成物によってもたらされる利益を上回る場合に「過度」である。薬学的に許容可能な担体又は賦形剤の非限定的な例としては、任意の標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、水、並びに油／水エマルション及びマイクロエマルション等のエマルションが挙げられる。好適な医薬担体は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin, 18th Editionに記載されている。薬学的に許容可能な担体は、自然に存在しない担体であってもよい。
【００３８】
「殺菌」又は「殺菌活性」は、細菌の初期菌数において１８時間〜２４時間にわたって少なくとも３ｌｏｇ１０（９９．９％）以上の減少の程度まで細菌の死滅を引き起こすか、又は細菌を死滅させることが可能であるという特性を指す。
【００３９】
「静菌」又は「静菌活性」は、細菌細胞の増殖を阻害し、それにより細菌の初期菌数において１８時間〜２４時間にわたって２ｌｏｇ１０（９９％）以上かつ最大３ｌｏｇ弱の減少を引き起こすことを含む、細菌増殖を阻害する特性を指す。
【００４０】
「抗菌剤」は、静菌剤及び殺菌剤の両方を指す。
【００４１】
「抗生物質」は、細菌に致死性又は増殖の低減等の負の影響を与える特性を有する化合物を指す。抗生物質は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌又はその両方に負の影響を与えることができる。例としては、抗生物質は、細胞壁ペプチドグリカンの生合成、細胞膜の完全性、又は細菌におけるＤＮＡ若しくはタンパク質の合成に影響を及ぼし得る。グラム陰性細菌に対して活性な抗生物質の非限定的な例としては、セフトリアキソン−セフォタキシム、セフタジジム、セフェピム、セフォペラゾン及びセフトビプロール等のセファロスポリン；シプロフロキサシン及びレボフロキサシン等のフルオロキノロン；ゲンタマイシン、トブラマイシン及びアミカシン等のアミノグリコシド；ピペラシリン、チカルシリン、イミペネム、メロペネム、ドリペネム、βラクタマーゼ阻害剤と併用する又は併用しない広域スペクトルペニシリン、リファンピシン、ポリミキシンＢ及びコリスチンが挙げられる。
【００４２】
「薬物耐性」は、概して薬物の抗菌活性に耐性を示す細菌を指す。或る特定の方法で使用される場合、薬物耐性は、特に抗生物質耐性を指し得る。場合によっては、一般に特定の抗生物質の影響を受けやすい細菌は、抗生物質に対する耐性を発現し、それにより薬物耐性微生物又は株となる可能性がある。「多剤耐性」（「ＭＤＲ」）病原体は、各々が単剤療法として使用される少なくとも２つのクラスの抗微生物薬に対する耐性を発現した病原体である。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）の或る特定の株は、メチシリン及び／又はバンコマイシンを含む幾つかの抗生物質に耐性を示すことが見出されている（Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department of Health and Services, Centers for Disease Control and Prevention）。当業者は、薬物又は抗生物質に対する細菌の感受性又は耐性を決定する日常的な実験技術を用いて、細菌が薬物耐性であるかを容易に決定することができる。
【００４３】
「有効量」は、適切な頻度又は投与計画で適用又は投与した場合に、細菌増殖若しくは細菌負荷を予防、低減、阻害若しくは解消するか、又は治療される障害（例えば、グラム陰性細菌病原体の増殖又は感染）の発症、重症度、期間若しくは進行を予防、低減若しくは改善するか、治療される障害の進展を予防するか、治療される障害の退行を引き起こすか、又は抗生物質若しくは静菌療法等の別の療法の予防効果若しくは治療効果（複数の場合もある）を高める若しくは改善するのに十分な量を指す。
【００４４】
「同時投与する」は、順次的な２種類の作用物質、例えばＣｈｐペプチド及び抗生物質又は任意の他の抗菌剤の投与、並びに実質的に同時の、例えば単一の混合物／組成物中での、又は別個に与えられるが、それでも実質的に同時に、例えば同日又は２４時間中に異なる時点で被験体に投与される用量でのこれらの作用物質の投与を指す。Ｃｈｐペプチドと１つ以上の付加的な抗菌剤とのこのような同時投与は、最大数日、数週間又は数ヶ月続く継続的な治療として行うことができる。さらに、用途に応じて、同時投与は、継続的又は同延的（coextensive）である必要はない。例えば、用途が局所抗菌剤として、例えば細菌性潰瘍又は感染した糖尿病性潰瘍を治療することであった場合、Ｃｈｐペプチドを初めのみ、追加の抗生物質の２４時間以内に投与することができ、その後、追加の抗生物質の使用をＣｈｐペプチドの更なる投与なしに継続してもよい。
【００４５】
「被験体」は、哺乳動物、植物、下等動物、単細胞生物又は細胞培養物を指す。例えば、「被験体」という用語は、細菌感染、例えばグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌感染の影響を受けやすい又はそれを患う生物、例えば原核生物及び真核生物を含むことを意図する。被験体の例としては、哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット及びトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。或る特定の実施形態では、被験体はヒト、例えばかかる感染が全身性であるか、局所性であるか、又は別の形で特定の器官若しくは組織に集中若しくは限局しているかに関わらず、グラム陰性細菌による感染を患う、それを患うリスクがある又はその影響を受けやすいヒトである。
【００４６】
「ポリペプチド」は、本明細書で「ペプチド」という用語と区別なく使用され、アミノ酸残基からなり、概して少なくとも約３０個のアミノ酸残基を有するポリマーを指す。この用語は、単離形態のポリペプチドだけでなく、その活性フラグメント及び誘導体も含む。「ポリペプチド」という用語は、本明細書に記載のＣｈｐペプチドを含み、例えば溶解機能を維持する融合タンパク質又は融合ポリペプチドも包含する。文脈に応じて、ポリペプチドは、自然発生ポリペプチド、又は組換え、改変若しくは合成的に作製されたポリペプチドであり得る。特定のＣｈｐペプチドは、例えば酵素的若しくは化学的切断によって天然タンパク質から得るか若しくは取り出しても、又は従来のペプチド合成法（例えば、固相合成）若しくは分子生物学的手法（例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に開示されるもの）を用いて調製しても、又は戦略的に切断若しくはセグメント化して、例えば、同じ若しくは少なくとも１つの一般的な標的細菌に対する溶菌活性を維持する活性フラグメントを得てもよい。
【００４７】
「融合ポリペプチド」は、通例、異なる特性又は機能性を有する２つ以上のドメイン又はセグメントを有する融合発現産物を生じる、２つ以上の核酸セグメントの融合から得られる発現産物を指す。より特定の意味では、「融合ポリペプチド」という用語は、直接、又はアミノ酸若しくはペプチドリンカーを介して共有結合的に連結した２つ以上の異種ポリペプチド又はペプチドを含むポリペプチド又はペプチドも指す場合がある。融合ポリペプチドを形成するポリペプチドは通例、Ｃ末端からＮ末端に連結されるが、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端又はＮ末端からＣ末端に連結されてもよい。「融合ポリペプチド」という用語は、「融合タンパク質」という用語と区別なく使用される場合もある。或る特定の構造「を含むポリペプチド」というオープンエンドの表現は、融合ポリペプチド等の列挙される構造よりも大きい分子を含む。
【００４８】
「異種」は、天然では隣接しないヌクレオチド、ペプチド又はポリペプチドの配列を指す。例えば、本開示の文脈で、「異種」という用語は、融合ペプチド又はポリペプチドが通常は天然に見られない２つ以上のペプチド及び／又はポリペプチドの組合せ又は融合、例えば増強した溶菌活性を有し得る、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメント、並びにカチオン性及び／又はポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、ｓｕｓｈｉペプチド（Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65(7-8):1202-19 (2008)）、ディフェンシンペプチド（Ganz, T. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003)）、疎水性ペプチド及び／又は抗微生物ペプチドを記載するために使用することができる。２つ以上のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントがこの定義に含まれる。これらは、溶菌活性を有する融合ポリペプチドの作製に使用することができる。
【００４９】
「活性フラグメント」は、フラグメントが得られた単離ポリペプチドの１つ以上の機能又は生物活性、例えば、１つ以上のグラム陰性細菌に対する殺菌活性を保持するポリペプチドの部分を指す。
【００５０】
「両親媒性ペプチド」は、親水性官能基及び疎水性官能基の両方を有するペプチドを指す。或る特定の実施形態では、二次構造により疎水性及び親水性アミノ酸残基が両親媒性ペプチドの反対側（例えば、ペプチドが水等の溶媒中にある場合、内側対外側）に置かれる。これらのペプチドは、或る特定の実施形態では、α−ヘリックス二次構造等のヘリックス二次構造を取ることができる。
【００５１】
「カチオン性ペプチド」は、正に帯電したアミノ酸残基を高い割合で有するペプチドを指す。或る特定の実施形態では、カチオン性ペプチドは、８．０以上のｐＫａ値を有する。本開示の文脈での「カチオン性ペプチド」という用語は、主に正に帯電したアミノ酸残基、例えばリシン（Ｌｙｓ）及び／又はアルギニン（Ａｒｇ）残基で構成される、合成的に作製されたペプチドであるポリカチオン性ペプチドも包含する。正に帯電していないアミノ酸残基は、中性に帯電したアミノ酸残基、負に帯電したアミノ酸残基、及び／又は疎水性アミノ酸残基であり得る。
【００５２】
「疎水性基」は、水分子に対する親和性が低いか又は親和性を有しないが、油分子に対してより高い親和性を有するアミノ酸側鎖等の化学基を指す。疎水性物質は、水又は水相への溶解性が低いか又は溶解性を有しない傾向があり、通例非極性であるが、油相への溶解性がより高い傾向がある。疎水性アミノ酸の例としては、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）が挙げられる。
【００５３】
「高める（Augmenting）」は、そうでない場合よりも高い抗微生物活性等の作用物質の活性の程度を指す。「高める」は、相加的効果及び相乗（超相加的（superadditive））効果を包含する。
【００５４】
「相乗的」又は「超相加的」は、独立して働く２つの作用物質の効果の総和を超える、組合せでの２つの物質によってもたらされる有益な効果を指す。或る特定の実施形態では、相乗又は超相加的効果は、独立して働く２つの作用物質の効果の総和を有意に、すなわち統計的に有意に超える。一方又は両方の活性成分を閾値下レベル、すなわち活性物質が個別に用いられる場合に効果を生じないか、又は非常に限られた効果しか生じないレベルで用いることができる。効果は、本明細書に記載されるチェッカーボードアッセイ等のアッセイによって測定することができる。
【００５５】
「治療」は、ヒト等の被験体が、直接的又は間接的に、障害を治癒するか、病原体を根絶するか、又は被験体の状態を改善する目的で医療を受ける任意のプロセス、行為、適用、療法等を指す。治療は、発生率の低減、症状の軽減、再発の解消、再発の予防、発生の予防、発生リスクの低減、症状の改善、予後の改善、又はそれらの組合せも指す。「治療」は、被験体における細菌の菌数、増殖速度又は病原性を低減することで、被験体における細菌感染、又は器官、組織若しくは環境の細菌汚染を制御又は低減することを更に包含し得る。このため、発生率を低減する「治療」は、例えば、被験体であるか又は環境であるかを問わず、特定のミリュー（milieu）での少なくとも１つのグラム陰性細菌の増殖を阻害するのに効果的となり得る。一方、既に確立された感染の「治療」は、感染又は汚染の原因となるグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させること（根絶することを含む）を指す。
【００５６】
「予防する」は、細菌感染等の障害の発生、再発、拡大、発症又は確立の予防を指す。本開示が感染の完全な予防又は感染の確立の予防に限定されることは意図されない。幾つかの実施形態では、発症を遅らせるか、又は続いて発症した（contracted）疾患の重症度若しくは疾患の発症の可能性を低減することが予防例を構成する。
【００５７】
「発症した疾患」は、発熱、敗血症又は菌血症の検出等の臨床症状又は不顕性（subclinical）症状が現れた疾患、並びにかかる病理と関連する症状が未だ現れていない場合の細菌病原体の増殖（例えば、培養物中での）によって検出され得る疾患を指す。
【００５８】
ペプチド又はポリペプチド又はその活性フラグメントとの関連での「誘導体」という用語は、溶菌活性に実質的に悪影響を与えない又は溶菌活性を損なわない、アミノ酸以外の１つ以上の化学的部分を含有するように修飾されたポリペプチドを包含することを意図する。化学的部分は、例えばアミノ末端のアミノ酸残基、カルボキシ末端のアミノ酸残基又は内部アミノ酸残基を介してペプチドに共有結合的に連結することができる。かかる修飾は、天然であっても又は非天然であってもよい。或る特定の実施形態では、非天然修飾は、反応性部分への保護基若しくはキャップ基（capping group）の付加、抗体及び／又は蛍光標識等の検出可能な標識の付加、グリコシル化の付加若しくは修飾、又はＰＥＧ（ペグ化）等の嵩高基（bulking group）の付加、並びに当業者に既知の他の変化を含み得る。或る特定の実施形態では、非天然修飾は、Ｎ末端アセチル化及びＣ末端アミド化等のキャップ修飾であり得る。Ｃｈｐペプチドに付加することができる、例示的な保護基としては、ｔ−Ｂｏｃ及びＦｍｏｃが挙げられるが、これらに限定されない。限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及びｍＣｈｅｒｒｙ等の一般に使用される蛍光標識タンパク質は、細胞タンパク質の正常機能に干渉することなく、Ｃｈｐペプチドに共有結合的若しくは非共有結合的に結合するか、又はＣｈｐペプチドに融合させることができる小型のタンパク質である。或る特定の実施形態では、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドをＣｈｐポリヌクレオチド配列の上流又は下流に挿入することができる。これにより、細胞機能又はそれが結合したＣｈｐペプチドの機能を妨げない融合タンパク質（例えば、Ｃｈｐペプチド：：ＧＦＰ）が生じる。タンパク質へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のコンジュゲーションが、多くの医薬タンパク質の循環半減期を延長する方法として使用されている。このため、Ｃｈｐペプチド誘導体との関連で、「誘導体」という用語は、１つ以上のＰＥＧ分子の共有結合によって化学修飾されたＣｈｐペプチドを包含する。ペグ化Ｃｈｐペプチドは、生物活性及び治療活性を保持した上で非ペグ化Ｃｈｐペプチドと比較して延長された循環半減期を示すことが予想される。
【００５９】
「パーセントアミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を達成するように配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、任意の保存的置換を配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチド配列、例えば特定のＣｈｐペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当業者の能力の範囲内の様々な方法で、例えばＢＬＡＳＴ等の公開されているソフトウェア、又は例えばDNASTARにより市販されているソフトウェアを用いて達成することができる。２つ以上のポリペプチド配列は、０％〜１００％の間のいずれか、又はその間の任意の整数値で同一であり得る。本開示の文脈で、２つのポリペプチドは、アミノ酸残基の少なくとも８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２．５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％）が同一である場合に「実質的に同一」である。本明細書に記載される「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」という用語は、Ｃｈｐペプチドにも当てはまる。このため、「実質的に同一」という用語は、本明細書に記載される単離Ｃｈｐポリペプチド及びペプチドの突然変異型、切断型、融合型、又は別の形で配列が修飾された変異体、及びその活性フラグメント、並びに参照（野生型又は他の無傷）ポリペプチドと比較して相当の配列同一性（例えば、１つ以上の上記の方法によって測定される、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性）を有するポリペプチドを包含する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２．５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％）が同一であるか、又は保存的置換を示す場合に「実質的に相同」である。本開示のポリペプチドの配列は、ポリペプチド、例えば本明細書に記載のＣｈｐペプチドのアミノ酸の１つ以上、例えば最大１０％、最大１５％、又は最大２０％が同様の又は保存的アミノ酸置換で置換され、得られるペプチド、例えば本明細書に開示のＣｈｐペプチドが、参照ポリペプチドの少なくとも１つの活性（例えば、抗菌効果）及び／又は細菌特異性を有する場合に実質的に相同である。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。
【００６２】
「吸入用組成物」は、日常呼吸又は補助呼吸（例えば、気管気管支内（intratracheobronchial）投与、経肺投与及び／又は経鼻投与による）時の、又はそれと同時の気道への直接送達のために配合されている本開示の医薬組成物を指し、霧化、噴霧化、乾燥粉末及び／又はエアロゾル化配合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
「バイオフィルム」は、表面に付着し、細菌及び／又は宿主に由来する成分で構成され得る水和したポリマーマトリックス中に凝集した細菌を指す。バイオフィルムは、生物表面又は非生物表面上で細胞が互いに接着した微生物の凝集物である。これらの接着細胞は、限定されるものではないが、細胞外高分子物質（ＥＰＳ）で構成されるマトリックス中に埋め込まれることが多い。バイオフィルムのＥＰＳは、スライム（スライムと記載されたもの全てがバイオフィルムという訳ではない）又はプラークとも称され、一般に細胞外ＤＮＡ、タンパク質及び多糖で構成されるポリマー集塊である。
【００６４】
或る特定の細菌に対する使用に適した抗生物質との関連での「適した、好適な（Suitable）」は、耐性が後に発現する場合であっても、これらの細菌に対して効果的であることが見出された抗生物質を指す。
【００６５】
「外膜（Outer Membrane）」すなわち「ＯＭ」はグラム陰性細菌の特性を指す。外膜は、リン脂質の内葉と、大部分がリポ多糖（ＬＰＳ）からなる両親媒性の外葉とを有する脂質二重層で構成される。ＬＰＳは、リピドＡと呼ばれるヘキサアシル化グルコサミンベースのリン脂質、多糖コア、及びＯ抗原と呼ばれる伸長した外部多糖鎖の３つの要部を有する。ＯＭは、ｉ）特にカチオンが存在し、リン酸基を中和する場合のＬＰＳ分子の互いに対する強い結合、ｉｉ）殆どが飽和したアシル鎖の密な充填、及びｉｉｉ）リピドＡ部分の疎水性スタッキングを含む３つの主な相互作用によって安定化している非流動性の連続体を示す。生じる構造は、疎水性分子及び親水性分子の両方にとって障壁となる。ＯＭの下では、ペプチドグリカンが加水分解に非常に影響を受けやすい薄層を形成する。厚さ３０ナノメートル（ｎｍ）〜１００ｎｍであり、最大４０層からなるグラム陰性細菌のペプチドグリカンとは異なり、グラム陰性細菌のペプチドグリカンは、厚さが僅か２ｎｍ〜３ｎｍであり、１層〜３層のみからなる。
【００６６】
ミクロウイルス科ファージ
ミクロウイルス科ファージの成員は、幾つかの理由で抗感染症薬の潜在源として特に関心がもたれる可能性がある。本明細書に開示されているように、クラミジアミクロウイルス（Chlamydiamicrovirus）属（ミクロウイルス科、ゴクショウイルス（Gokushovirinae）亜科）のものを含むこれらのファージの大きなサブセットは保存されたアムリン配列を有しておらず、代わりにこれまで性質が知られていない溶菌系の基礎を形成するように見える小さな性質不明のカチオン性ペプチドをコードすることがわかっている。さらに、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、シュードモナス科（Pseudomonadaceae）及びクラミジア科の成員を含むミクロウイルス科のバクテリオファージは、医学的に関連する生物に感染する（Doore SM et al, 2016. Virology 491:45-55.）。これらのバクテリオファージもまたアムリンを欠き、代わりに、本明細書で開示されるように、以前に同定されていないか、それらに起因する機能を有していない、独自の特徴を持たない抗微生物様ペプチド（アムリンペプチドと呼ばれる）をコードする。推定抗微生物様ペプチドが以前に記載される抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）と同様の方式で作用するのであれば、アムリン及びそれらの細胞質標的では不可能な方法で「ない状態からの溶菌」を可能とすることが予測されると推論された。
【００６７】
ＧｅｎＢａｎｋの全てのコメント付きミクロウイルスゲノム配列（アムリンを欠くファージに焦点を当てている）のバイオインフォマティクス分析に基づいて、４０個の新規なシンテニックな（syntenic）オープンリーディングフレームを同定した。それらは、様々な脊椎動物の自然免疫系に由来するＡＭＰ（但し、ＡＭＰに似ていないアミノ酸配列を有する）と同様の推定α−ヘリックス構造を有する小さなカチオン性ペプチドをコードする。総称して「Ｃｈｐペプチド」又は「アムリンペプチド」と称されるこれらのペプチドは、主にクラミジアミクロウイルス属に見られ、ゴクショウイルス亜科の他の関連する成員で見られる頻度はより少ない。例えば、下記表１及び表２を参照されたい。様々なミクロウイルス科ファージに由来するＣｈｐペプチドは、互いに３０％〜１００％の同一性を示し、タンパク質配列データベース内の他のペプチドとの相同性を有しないか又は殆ど有しない場合がある。例えば、下記表３を参照されたい。ＣｈｐペプチドがＡＭＰ様活性を持つという予測に基づき、種々のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）アッセイにおける分析のため、３９種類の異なるファミリーの成員（Ｃｈｐ２及びＣｈｐ３は同一のアミノ酸配列である）を合成した。ヒト血清の存在下での最小阻止濃度（ＭＩＣ）の値０．２５μｇ／ｍＬ〜４μｇ／ｍＬに基づいて、幾つかのＣｈｐペプチドは、試験した最大１７種類の既知の一群のＡＭＰ（自然免疫エフェクター及びその誘導体を含む）と比較して優れた血清活性を示した。さらに、シュードモナス・エルギノーサ、大腸菌、エンテロバクター・クロアカエ、クラブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニ及びチフス菌を含む世界保健機関（ＷＨＯ）及び疾病管理センター（ＣＤＣ）の優先リストにある幾つかを含む、様々なグラム陰性病原体に対する活性が実証された。
【００６８】
少なくとも２つの強力なＣｈｐペプチド、Ｃｈｐ２及びＣｈｐ４について、グラム陰性感染の臨床治療に使用される抗生物質を含む、シュードモナス・エルギノーサに対する最大１１種類の様々な抗生物質とｉｎ  ｖｉｔｒｏで相乗作用する能力が実証されている。さらに、Ｃｈｐ２及びＣｈｐ４はいずれも、ＭＢＥＣアッセイフォーマットにおいて強力な抗バイオフィルム活性（ＭＢＥＣ＝０．２５μｇ／ｍＬ）を有すること、及び時間−殺菌（time-kill）アッセイフォーマットでは１μｇ／ｍＬ以下の濃度まで殺菌活性を有することが示された。下記実施例５を参照されたい。
【００６９】
全体として、これらの知見は、宿主細胞溶解のプロセスにおけるＣｈｐファミリーの成員の役割（バクテリオファージの生活環との関係で）及び標的であるグラム陰性病原体に対する広域スペクトルの抗微生物剤としての精製Ｃｈｐペプチド又はその誘導体の使用のいずれとも矛盾しない。侵襲的感染の治療として先に記載されるＡＭＰを使用することの1つの大きな欠点は、赤血球に対する毒性及び広汎な膜分解活性（すなわち溶血）に関する（Oddo A. et al., 2017. Hemolytic Activity of Antimicrobial Peptides. Methods Mol Biol 1548:427-435）。一般的に、これはヒト赤血球の溶解を検出するための標準化されたアッセイを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験され得る。本明細書に開示されるＣｈｐペプチドの多くは、ヒト赤血球に対して溶血活性を示さないが、これとは対照的に、文献に記載されている幾つかのＡＭＰ（及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）は溶血活性を有する。或る特定の実施形態では、本明細書に開示されるＣｈｐペプチドは、ＡＭＰと比較して、ヒトの赤血球に対して最低限の溶血活性を示すにすぎないか、又は全く溶血活性を示さない。文献に記載されているＡＭＰのもう一つの欠点は、ヒト血液マトリックス及び生理学的塩濃度の存在下での活性喪失に関し（Mohanram H. et al., 2016. Salt-resistant short antimicrobial peptides. Biopolymers 106:345-356)、実際に、既知のＡＭＰのこの効果は下記表６で観察され得る。本明細書で提供されるデータは、或る特定のＣｈｐペプチドがヒトの血清又は血漿のいずれかの存在下で活性であること、及び／又は生理学的塩濃度を含むミューラー・ヒントン・ブロス及びカザミノ酸培地等の増殖培地において活性であることを実証している。理論によって制限されるものではないが、Ｃｈｐペプチド及びＡＭＰペプチドの活性で観察される違いは（文献において）、Ｃｈｐペプチドがファージ由来であり、ＡＭＰが脊椎動物免疫系の自然免疫エフェクターに大きく基づくという、供給源が異なる２種類の作用物質に起因する可能性があると考えられている。Ｃｈｐペプチドの活性が高いこと、血液マトリックス中のＣｈｐペプチドの活性、及び／又は溶血活性の欠如は、Ｃｈｐペプチドを侵襲性疾患の治療に適したものとしている。例えば、或る特定の実施形態では、Ｃｈｐペプチドはナノモル量で活性となり得る。
【００７０】
要約すると、病原体特異的標的化溶解素治療薬は、既知のＭＤＲ病原体によって引き起こされる重篤な単独菌感染症に対する個別化療法（tailored therapy）としての役割を果たす能力を有するが、複数菌耐性グラム陰性感染症（polymicrobial resistant Gram-negative infection）によって引き起こされる重篤で生命を脅かす感染（例えば或る特定の腹腔内感染、並びに重篤な熱傷、外科的及び他の創傷感染）に対処するための作用物質に対する今も満たされていない医学的必要性がある。本明細書に開示されるＣｈｐペプチドは、共通してＭＤＲと関連する全ての主なＥＳＫＡＰＥ病原体（エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ及びエンテロバクター属（Enterobacter））に対して強い活性を示し、多くのグラム陰性細菌に対して活性となることが期待されているため、この必要性を満たすのに役立つ。本明細書に開示されるＣｈｐペプチドは、高ナノモル濃度で、活性な溶解素と同程度に活性となり得る。本明細書に開示されるＣｈｐペプチドはまた、非常に強力で急速な溶菌効果、バイオフィルムを除去する能力、従来の抗生物質との相乗作用、及び互いとの相乗作用（２つ以上のＣｈｐペプチド間の相乗作用等）を担う可能性がある。
【００７１】
本開示のＣｈｐペプチドは、抗微生物ペプチドの付加によって修飾される必要はないが、或る特定の実施形態では、本明細書に開示されるＣｈｐペプチドは融合タンパク質に組み込まれていてもよい。例えば、融合タンパク質は、本明細書に開示されるＣｈｐペプチドと、グラム陰性細菌に対して活性な溶解素等の溶解素とを含んでもよい。或る特定の実施形態では、Ｃｈｐペプチドは、リンカー配列の有無にかかわらず溶解素のＮ末端又はＣ末端に付加され得る。２つ以上の溶菌セグメントを含む融合ポリペプチドは、親溶解素及び／又は親Ｃｈｐペプチドの溶菌活性に積極的に寄与し得ることが企図される。
【００７２】
ポリペプチド
本明細書で実証及び説明されるように、野生型Ｃｈｐペプチド、修飾Ｃｈｐペプチド及びその誘導体又は活性フラグメントを含む本項に記載されるＣｈｐペプチドを、本明細書に記載される医薬組成物及び方法において使用することができる。
【００７３】
幾つかの実施形態では、Ｃｈｐペプチドは、Ｃｈｐ１（配列番号１）、Ｃｈｐ２（配列番号２）、ＣＰＡＲ３９（配列番号３）、Ｃｈｐ３（配列番号５４）、Ｃｈｐ４（配列番号４）、Ｃｈｐ６（配列番号６）、Ｃｈｐ７（配列番号７）、Ｃｈｐ８（配列番号８）、Ｃｈｐ９（配列番号９）、Ｃｈｐ１０（配列番号１０）、Ｃｈｐ１１（配列番号１１）、Ｃｈｐ１２（配列番号１２）、Ｇｋｈ１（配列番号１３）、Ｇｋｈ２（配列番号１４）、Ｕｎｐ１（配列番号１５）、Ｅｃｐ１（配列番号１６）、Ｔｍａ１（配列番号１７）、Ｅｃｐ２（配列番号１８）、Ｏｓｐ１（配列番号１９）、Ｕｎｐ２（配列番号２０）、Ｕｎｐ３（配列番号２１）、Ｇｋｈ３（配列番号２２）、Ｕｎｐ５（配列番号２３）、Ｕｎｐ６（配列番号２４）、Ｓｐｉ１（配列番号２５）、Ｓｐｉ２（配列番号２６）、Ｅｃｐ３（配列番号５５）、Ｅｃｐ４（配列番号５６）、Ｌｖｐ１（配列番号５７）、Ｌｖｐ２（配列番号５８）、ＡＬＣＥＳ１（配列番号５９）、ＡＶＱ２０６（配列番号６０）、ＡＶＱ２４４（配列番号６１）、ＣＤＬ９０７（配列番号６２）、ＡＧＴ９１５（配列番号６３）、ＨＨ３９３０（配列番号６４）、Ｆｅｎ７８７５（配列番号６５）、ＳＢＲ７７（配列番号６６）及びＢｄｐ１（配列番号６７）、又は溶菌活性を有するその活性フラグメントの少なくとも１つから選択される。
【００７４】
Ｃｈｐペプチドは、修飾Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントであってもよい。或る特定の実施形態では、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６の少なくとも１つに対して、少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入若しくは欠失等の少なくとも１つの修飾を含む。或る特定の実施形態では、修飾Ｃｈｐペプチドは、配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６からなる群から選択される少なくとも１つのＣｈｐペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９２．５％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列又はその活性フラグメントを含み、該修飾Ｃｈｐペプチドは、任意にヒト血清の存在下で、シュードモナス・エルギノーサ等の少なくとも１つの種のグラム陰性細菌及び任意に少なくとも１つの追加の種の本明細書に記載されるグラム陰性細菌の増殖を阻害する、その菌数を減少させる、及び／又はそれを死滅させる。
【００７５】
幾つかの実施形態では、Ｃｈｐペプチドは、（ｉ）Ｃｈｐ１（配列番号１）、Ｃｈｐ２（配列番号２）、ＣＰＡＲ３９（配列番号３）、Ｃｈｐ３（配列番号５４）、Ｃｈｐ４（配列番号４）、Ｃｈｐ６（配列番号６）、Ｃｈｐ７（配列番号７）、Ｃｈｐ８（配列番号８）、Ｃｈｐ１０（配列番号１０）、Ｃｈｐ１１（配列番号１１）、Ｅｃｐ１（配列番号１６）、Ｅｃｐ２（配列番号１８）、Ｅｃｐ３（配列番号５５）、Ｅｃｐ４（配列番５６）、Ｏｓｐ１（配列番号１９）、Ｕｎｐ２（配列番号２０）、Ｇｋｈ３（配列番号２２）、Ｕｎｐ５（配列番２３）、Ｕｎｐ６（配列番号２４）、Ｓｐｉ１（配列番号２５）、Ｌｖｐ１（配列番号５７）、ＡＬＣＥＳ１（配列番号５９）、ＡＶＱ２０６（配列番号６０）、ＣＤＬ９０７（配列番号６２）、ＡＧＴ９１５（配列番号６３）及びＳＢＲ７７（配列番号６６）の少なくとも１つ若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１〜配列番号２５、配列番号５４〜配列番号５７、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３及び配列番号６６の少なくとも１つと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、任意にヒト血清の存在下で、シュードモナス・エルギノーサ及び少なくとも１つの追加の種のグラム陰性細菌の増殖を阻害する、その菌数を減少させる、及び／又はそれを死滅させる修飾Ｃｈｐペプチドから選択される。
【００７６】
幾つかの実施形態では、Ｃｈｐペプチドは、（ｉ）Ｃｈｐ２（配列番号２）、Ｃｈｐ３（配列番号５４）、Ｃｈｐ４（配列番号４）、Ｃｈｐ６（配列番号６）、Ｅｃｐ１（配列番号１６）及びＥｃｐ２（配列番号１８）の少なくとも１つ若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１６及び配列番号１８の少なくとも１つと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、任意にヒト血清の存在下で、シュードモナス・エルギノーサ等の少なくとも１つの種のグラム陰性細菌及び少なくとも１つの追加の種のグラム陰性細菌の増殖を阻害する、その菌数を減少させる、及び／又はそれを死滅させる修飾Ｃｈｐペプチドから選択される。
【００７７】
或る特定の実施形態では、Ｃｈｐペプチドは、（ｉ）配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群からから選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣｈｐペプチド、若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号２、配列番号４及び配列番号６の少なくとも１つと少なくとも９２．５％の配列同一性を有し、任意にヒト血清の存在下で、シュードモナス・エルギノーサ等の少なくとも１つの種のグラム陰性細菌及び少なくとも１つの追加の種のグラム陰性細菌の増殖を阻害する、その菌数を減少させる、及び／又はそれを死滅させる修飾Ｃｈｐペプチドから選択される。
【００７８】
幾つかの実施形態では、本開示のＣｈｐペプチドは、１つの化学修飾された参照Ｃｈｐペプチドの誘導体である。化学修飾は、限定されるものではないが、化学部分を追加すること、新たな結合を作ること、及び化学部分を除去することを含む。化学修飾は、アミノ酸側鎖、及びアミノ末端又はカルボキシル末端を含むＣｈｐペプチドのどこにでも起こり得る。例えば、或る特定の実施形態では、Ｃｈｐペプチドは、Ｎ末端アセチル化修飾を含む。或る特定の実施形態では、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、Ｃ末端アミド化修飾を含む。かかる修飾は、Ｃｈｐペプチド中の２以上の部位に存在し得る。
【００７９】
さらに、Ｃｈｐポリペプチド又はその活性フラグメントの１つ以上の側鎖基又は末端基は、当業者に既知の保護基によって保護され得る。
【００８０】
幾つかの実施形態では、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、持続時間延長（duration enhancing）部分にコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、持続時間延長部分はポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）は、持続時間が延長された治療用ポリペプチドを得るために使用されている（Zalipsky, S., Bioconjugate Chemistry, 6:150-165 (1995)、Mehvar, R., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3:125-136 (2000)、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす）。ＰＥＧ骨格（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）ｎ（ここで、ｎは繰り返しモノマーの数である）は、柔軟で両親媒性である。Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメント等の別の化学成分に付着すると、ＰＥＧポリマー鎖は、免疫応答及び他のクリアランス機構からかかるポリペプチドを保護することができる。その結果、ペグ化は、薬物動態を最適化し、バイオアベイラビリティを高め、免疫原性及び投薬の量及び／又は頻度を減少させることによって、有効性及び安全性の向上につなげることができる。
【００８１】
ポリヌクレオチド
Ｃｈｐペプチド及びその活性フラグメント
一態様では、本開示は、Ｃｈｐペプチド又は溶菌活性を有するその活性フラグメントをコードする核酸分子を含む単離ポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用される場合、「溶菌活性」は、ヒト血清の存在下又は不在下で、例えばグラム陰性細菌（例えば、シュードモナス・エルギノーサ）の外膜を透過することによるＣｈｐペプチドの細菌を死滅させる能力、細菌の菌数を減少させる能力又は細菌の増殖を阻害する能力を包含する。溶菌活性はまた、ヒト血清の存在下及び／又は不在下で、バイオフィルムを除去若しくは減少させる能力及び／又は抗生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を低下させる能力を包含する。
【００８２】
或る特定の実施の形態では、核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣｈｐペプチド、又はその活性フラグメントをコードする。
【００８３】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣｈｐペプチド、又はその活性フラグメントをコードする。
【００８４】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣｈｐペプチド、又はその活性フラグメントをコードし、或る特定の実施の形態では、核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８及び配列番号５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣｈｐペプチド、又はその活性フラグメントをコードする。
【００８５】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド及びその活性フラグメントは、グラム陰性細菌の外膜を透過することができる。理論によって制限されるものではないが、外膜の透過後、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、細菌細胞壁の主な構造成分であるペプチドグリカンを分解し、細胞溶解をもたらすことができる。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、グラム陰性細菌のアニオン性外膜への結合を促進して、隣接するペプチドグリカンへの移行を引き起こす、正に帯電した（及び両親媒性の）Ｎ末端及び／又はＣ末端のα−ヘリックスドメインを含む。
【００８６】
Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントのグラム陰性細菌の外膜を透過する能力は、国際公開第２０１７／０４９２３３号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されるような当該技術分野で既知の任意の方法によって評定され得る。例えば、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントを、グラム陰性細菌及び疎水性化合物と共にインキュベートしてもよい。殆どのグラム陰性細菌は、外膜が存在することから、疎水性化合物に耐性が強く、そのため１−Ｎ−フェニルナフチルアミン（ＮＰＮ）、クリスタルバイオレット又は８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）等の疎水性作用物質を取り込ませない。ＮＰＮは、例えば、疎水性条件下では強く、水性条件下では弱く蛍光を発する。したがって、ＮＰＮ蛍光は、外膜透過性の尺度（measurement）として使用することができる。
【００８７】
より詳しくは、外壁を透過するＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントの能力は、例えば、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントの存在下で、活性を試験するグラム陰性細菌、例えば、シュードモナス・エルギノーサ株ＰＡ０１と共に、例えばＮＰＮをインキュベートすることで評定され得る。Ｃｈｐペプチドが存在しない場合（陰性対照）に放出される蛍光と比較して蛍光の誘導が高いことは、外膜透過を示す。加えて、蛍光誘導を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等の確立された透過剤、又はシュードモナス・エルギノーサの治療に最終手段として用いられる抗生物質、すなわち、ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）等の抗生物質の蛍光誘導と比較することで、外膜透過のレベルを評定することができる。
【００８８】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、ヒト血清の存在下及び／又は不在下で溶菌活性を示す。ヒト血清中でＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントの活性を評定するのに適した方法は、当該技術分野において既知であり、実施例に記載されている。簡潔に述べると、ＭＩＣ値（すなわち、対照と比較して細菌増殖を少なくとも８０％抑制するのに十分なペプチドの最小濃度）をＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントについて決定することができ、例えば、ヒト血清中で不活性な化合物、例えば、Ｔ４ファージリゾチーム又はａｒｔｉｌｙｓｉｎ  ＧＮ１２６と比較することができる。Ｔ４ファージリゾチームは、例えばSigma-Aldrich, Incから市販されている。ＧＮ１２６は、文献に記載されているＡｒｔ−１７５に相当し、ＡＭＰ  ＳＭＡＰ−２９をＧＮ溶解素ＫＺ１４４に融合させることによって得られる。Briers et al. 2014, Antimicrob, Agents Chemother. 58:3774-3784を参照されたい。本文献はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【００８９】
より詳しくは、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントのＭＩＣ値は、例えば、ミューラー・ヒントン・ブロス、ヒト血清を添加したミューラー・ヒントン・ブロス、生理学的塩濃度を備えた本明細書に記載されるＣＡＡ、及びヒト血清を添加したＣＡＡにおいて、例えばシュードモナス・エルギノーサの実験室株ＰＡ０１に対して決定され得る。殆どの臨床分離株とは異なり、ＰＡ０１はヒト血液マトリックスの抗菌活性に感受性がないことから、ＰＡ０１の使用により血清濃度が上昇した状態での試験が可能になる。
【００９０】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、バイオフィルムを低減することができる。Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントの最小バイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ：Minimal Biofilm Eradicating Concentration）を評定する方法は、修正を加えた微量液体希釈ＭＩＣ法の変法を用いて決定することができる（Ceri et al. 1999. J. Clin Microbial. 37:1771-1776（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）、及びSchuch et al., 2017, Antimicrob. Agents Chemother. 61, pages 1-18（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。この方法では、例えばＡＴＣＣ１７６４７等のシュードモナス・エルギノーサ株の新しいコロニーを培地、例えば、ＴＳＢｇ（０．２％グルコースを添加したトリプシンソイブロス）中に例えば１：１００に希釈したリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に懸濁し、例えば、０．１５ｍｌのアリコートとしてこれをＣａｌｇａｒｙ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｄｅｖｉｃｅ（９６個のポリカーボネートペグを持つ蓋付きの９６ウェルプレート；lnnovotechInc.）に加え、例えば３７℃で２４時間インキュベートする。次いで、バイオフィルムを洗浄し、例えば、ＴＳＢｇ中の溶解素の２倍希釈系列を用いて、例えば、３７℃で２４時間処理する。処理後、ウェルを洗浄し、例えば３７℃で風乾し、例えば０．０５％クリスタルバイオレットで１０分間染色した。染色後、バイオフィルムを、例えば３３％酢酸中で脱色し、例えば、抽出されたクリスタルバイオレットのＯＤ６００を決定する。各サンプルのＭＢＥＣは、クリスタルバイオレットの定量により評定されるバイオフィルムのバイオマスの少なくとも９５％を除去するのに必要な最小Ｃｈｐペプチド濃度である。
【００９１】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、ヒト血清の存在下及び／又は不在下での抗生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を低下させる。ＭＩＣを評定するための任意の既知の方法が使用され得る。幾つかの実施形態では、チェッカーボードアッセイを、抗生物質濃度に対するＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントの影響を決定するために使用する。チェッカーボードアッセイは、微量液体希釈によるＭＩＣ決定のためのＣＬＳＩ法の修正に基づく（Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）、及びCeri et al. 1999. J. Clin. Microbiol. 37:1771-1776（同様にその全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。
【００９２】
チェッカーボードは、最初に、例えば、各ウェルが横軸に沿って２倍に希釈された同じ量の抗生物質を有する９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートの列を準備することによって構築される。別のプレートに、各ウェルが、例えば、縦軸に沿って２倍に希釈された同じ量のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントを有する比較用の行を準備する。そして、各列が一定量の抗生物質と、Ｃｈｐペプチドの倍加希釈物とを有し、各行が一定量のＣｈｐペプチドと、抗生物質の倍加希釈物とを有するように、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメント及び抗生物質の希釈物を組み合わせる。各ウェルは、このようにＣｈｐペプチドと抗生物質との独自の組み合わせを持つ。細菌を、例えば、ヒト血清の有無にかかわらず、ＣＡＡ中１×１０５ＧＦＵ／ｍｌの濃度で薬物の組み合わせに加える。次いで、単独の及び組み合わせた各薬物のＭＩＣを、例えば周囲空気中、３７℃で１６時間後に記録する。部分阻止濃度の合計（ΣＦＩＣ：Summation Fractional Inhibitory Concentration）を各薬物について計算し、最小ΣＦＩＣ値（ΣＦＩＣｍｉｎ）を用いてＣｈｐペプチド／抗生物質の組み合わせの効果を決定する。
【００９３】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、赤血球に対して低い毒性を示す。当該技術分野で既知の任意の方法論は、本Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントの溶血活性の可能性を評定するために使用され得る。
【００９４】
幾つかの実施形態では、本開示の単離ポリヌクレオチドは、修飾Ｃｈｐペプチド、例えば、参照Ｃｈｐペプチドと比較して１つ以上の挿入、欠失及び／又はアミノ酸置換を含むＣｈｐペプチドをコードする核酸分子を含む。かかる参照Ｃｈｐペプチドとしては、配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６のいずれか１つが挙げられる。或る特定の実施形態では、修飾Ｃｈｐペプチドは、配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号２６及び配列番号５４〜配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する参照Ｃｈｐペプチドに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００９５】
本開示の修飾Ｃｈｐペプチドは、典型的には、α−ヘリックスドメインを保持するように設計されており、その有無は、Ｊｐｒｅｄ４（compio.dundee.ac.uk/jpred）及びＨｅｌｉｃａｌ  Ｗｈｅｅｌ（hael.net/helical.htm）等の様々なソフトウェアプログラムを用いて容易に決定することができる。
【００９６】
幾つかの実施形態では、α−ヘリックスドメインは、分子の大部分に及ぶ。例えば、図１のＣｈｐ１及びＣｈｐ４を参照されたい。幾つかの実施形態では、α−ヘリックスドメインは中断され（例えば、図１のＣｈｐ２を参照されたい）、幾つかの実施形態では、α−ヘリクスドメインは切断される（例えば、図１のＣｈｐ６及びＯｓｐ１を参照されたい）。本開示のＣｈｐペプチドのα−ヘリックスドメインは、約３個〜３２個のアミノ酸、より典型的には約１０個〜２５個のアミノ酸残基で大きさが変化する。
【００９７】
本開示の修飾Ｃｈｐペプチドは、典型的には、参照Ｃｈｐペプチドの１つ以上の機能的活性又は生物学的活性を保持する。幾つかの実施形態では、修飾はＣｈｐペプチドの抗菌活性を改善する。典型的には、修飾Ｃｈｐペプチドは、参照Ｃｈｐペプチドと比較してｉｎ  ｖｉｔｒｏでの（例えばバッファー及び／又は培地における）抗菌活性を改善した。他の実施形態では、修飾Ｃｈｐペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの（例えば、動物感染モデルにおける）抗菌活性を改善した。幾つかの実施形態では、修飾は、ヒト血清の不在下及び／又は存在下でのＣｈｐペプチドの抗菌活性を改善する。
【００９８】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又はその変異体若しくは活性フラグメントは、ヒト血清の不在下若しくは存在下、又はヒト血清の有無に関わらず、シュードモナス・エルギノーサ及び任意に少なくとも１つの他の種のグラム陰性細菌の増殖を阻害することができるか、又はその菌数を減少させることができるか、又はそれを死滅させることができる。
【００９９】
幾つかの実施形態では、本開示の核酸分子は、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又は修飾Ｃｈｐペプチドの活性フラグメントをコードする。「活性フラグメント」という用語は、完全長のＣｈｐペプチドの一部を指し、これは、参照ペプチドの１つ以上の生物学的活性を保持する。そのため、本明細書で使用される場合、Ｃｈｐペプチド又は修飾Ｃｈｐペプチドの活性フラグメントは、ヒト血清の不在下若しくは存在下、又はヒト血清の有無にかかわらず、シュードモナス・エルギノーサ及び任意に本明細書に記載される少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。典型的には、活性フラグメントは、α−ヘリックスドメインを保持する。或る特定の実施形態では、活性フラグメントは、α−ヘリックスドメインを保持するカチオン性ペプチドである。
【０１００】
ベクター及び宿主細胞
別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド若しくはその活性フラグメントのいずれかをコードする核酸分子を含む単離ポリヌクレオチド又は本単離ポリヌクレオチドの相補配列を含むベクターに関する。幾つかの実施形態では、ベクターはプラスミド又はコスミドである。他の実施形態では、ベクターはウイルスベクターであり、この場合、追加のＤＮＡセグメントをウイルスベクターにライゲートすることができる。幾つかの実施形態では、ベクターは、ベクターが導入された宿主細胞において自律的に複製することができる。幾つかの実施形態では、ベクターは宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに統合され、それによって宿主ゲノムと共に複製され得る。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、特定のベクターは、本明細書において「組み換え発現ベクター」又は「発現ベクター」と称され、ベクターが操作可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。ポリヌクレオチド配列は、別のヌクレオチド配列と機能的な関係に置かれる場合、「操作可能に連結」される。例えば、プロモーター又は調節ＤＮＡ配列は、２つの配列が操作可能に連結している場合、又はプロモーター若しくは調節ＤＮＡ配列がコーディングＤＮＡ配列若しくは構造ＤＮＡ配列の発現レベルに影響を与えるように位置する場合、ＲＮＡ及び／又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列に「操作可能に連結して」いると言われる。操作可能に連結されたＤＮＡ配列は、典型的には連続的であるが、必ずしもそうであるわけではない。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、本開示は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣｈｐペプチド、又はその活性フラグメントをコードする核酸分子を含むベクターに関する。
【０１０３】
或る特定の実施の形態では、ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣｈｐペプチド、又はその活性フラグメントをコードする核酸分子を含む。
【０１０４】
或る特定の実施形態では、ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣｈｐペプチド、又はその活性フラグメントをコードする核酸分子を含み、或る特定の実施の形態では、ベクターは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８及び配列番号５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣｈｐペプチド、又はその活性フラグメントをコードする核酸分子を含む。
【０１０５】
一般的には、宿主においてポリペプチドを維持、増殖又は発現するのに適した任意の系又はベクターは、本明細書に開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントの発現に使用され得る。適切なＤＮＡ／ポリヌクレオチド配列は、例えばSambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)に記載されるもの等、様々な既知の日常的な手法のいずれかによって発現系へと挿入され得る。さらに、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントにタグ、例えば、ｃ−ｍｙｃ、ビオチン、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ等を付加して、簡便な分離方法を提供することもできる。かかる発現系用のキットは市販されている。
【０１０６】
広範な宿主／発現ベクターの組合せを、本明細書に開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列の発現に用いることができる。多数の好適なベクターが当業者に既知であり、市販されている。適切なベクターの例は例えば、Sambrook et al, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)に提示されている。かかるベクターとしては、特に染色体ベクター、エピソームベクター及びウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体要素、バキュロウイルス、ＳＶ４０等のパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルス等のウイルスに由来するベクター、並びにそれらの組合せに由来するベクター、例えばプラスミドとコスミド及びファージミド等のバクテリオファージ遺伝要素とに由来するベクターが挙げられる。
【０１０７】
さらに、上記ベクターは、本開示のＣｈｐペプチド又はその活性化フラグメントの構成的又は誘導性発現をもたらすことができる。好適なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体、並びに既知の細菌プラスミド、例えば大腸菌プラスミドｃｏｌＥｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体、ＲＰ４、ｐＢＡＤ２４及びｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ等のプラスミド；ファージＤＮＡ、例えばファージＡの多数の誘導体、例えばＮＭ９８９、並びに他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３及び繊維状一本鎖ファージＤＮＡ；２Ｄプラスミド等の酵母プラスミド又はその誘導体；昆虫又は哺乳動物細胞に有用なベクター等の真核細胞に有用なベクター；ファージＤＮＡ又は他の発現制御配列を用いるように修飾されたプラスミド等のプラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。上述のベクターの多くがNew England Biolabs Inc.、Addgene、Takara Bio Inc.、ThermoFisher Scientific Inc.等の供給業者から市販されている。
【０１０８】
さらに、ベクターは、様々な調節要素（プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する様々なシスエレメントを含む）を含んでいてもよく、ベクターは、宿主細胞に応じて構築される。広範な発現制御配列（それに操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を制御する配列）のいずれかを、本開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を発現するために、これらのベクターに用いることができる。有用な制御配列としては、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマ又はアデノウイルスの初期又は後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、ファージＡの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄ外被タンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）のプロモーター、酵母接合因子のプロモーター、細菌における発現のための大腸菌プロモーター、並びに原核若しくは真核細胞、又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られる他のプロモーター配列、並びにそれらの様々な組合せが挙げられるが、これらに限定されない。通例、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列は、異種プロモーター又は調節要素に操作可能に連結される。
【０１０９】
別の態様では、本開示は、本開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む、本明細書に開示されるいずれかのベクターを含む宿主細胞に関する。広範な宿主細胞が本ポリペプチドの発現に有用である。本ポリペプチドの発現に適した宿主細胞の非限定的な例としては、大腸菌株、シュードモナス株、バシラス（Bacillus）株、ストレプトミセス（Streptomyces）株、酵母等の真菌、並びにＣＨＯ細胞、Ｒｌ．ｌ細胞、Ｂ−Ｗ細胞及びＬ−Ｍ細胞等の動物細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣｌ、ＢＳＣ４０及びＢＭＴ１０）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、並びに組織培養ではヒト細胞及び植物細胞等の既知の真核生物及び原核生物の宿主が挙げられる。発現宿主は、任意の既知の発現宿主細胞であってもよいが、典型的な実施形態では、発現宿主は大腸菌の株の１つである。これらの大腸菌株としては、限定されるものではないが、Ｔｏｐ１０（ThermoFisher Scientific, Inc.）、ＤＨ５ａ（Thermo Fisher Scientific, Inc.）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Agilent Technologies, Inc.）、ＳＣＳ１１０（Agilent Technologies, Inc.）、ＪＭ１０９（Promega, Inc.）、ＬＭＧ１９４（ATCC）及びＢＬ２１（Thermo Fisher Scientific, Inc.）等の市販の大腸菌株が挙げられる。
【０１１０】
大腸菌を宿主系として使用することの利点は幾つかあり、最適な環境条件下で、その倍加時間が約２０分間である急速な増殖動態（Sezonov et al., J. Bacterial. 189 8746-8749 (2007)）、容易に達成される高密度の培養物、外来性ＤＮＡによる容易かつ急速な形質転換等が挙げられる。プラスミド選択及び株選択を含む、大腸菌におけるタンパク質発現に関する詳細は、Rosano, G. and Ceccarelli, E., Front Microbial., 5: 172 (2014)に詳細に論考されている。
【０１１１】
本Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントの効率的な発現は、最適発現シグナル（転写及び翻訳の両方のレベルで）、正確なタンパク質フォールディング及び細胞増殖特性等の様々な要因によって決まる。ベクターを構築する方法及び構築した組換えベクターを宿主細胞に形質導入する方法に関して、当該技術分野で既知の従来の方法を利用することができる。全てのベクター、発現制御配列及び宿主が本開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を発現するよう同様に良好に機能するわけではないことが理解されるが、当業者は、本開示の範囲から逸脱することなく所望の発現を達成するために過度な実験なしに適当なベクター、発現制御配列及び宿主を選択することが可能である。
【０１１２】
本開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む既知の方法によって組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。高速液体クロマトグラフィーをＣｈｐペプチド精製に用いることもできる。
【０１１３】
代替的には、本開示のＣｈｐペプチド又は活性フラグメントの作製に用いられるベクター系は、無細胞発現系であってもよい。様々な無細胞発現系が市販されており、限定されるものではないが、Promega、LifeTechnologies、Clonetech等から入手可能なものが挙げられる。
【０１１４】
上記のように、タンパク質の産生及び精製に関しては、様々な選択肢がある。タンパク質の産生及び精製において検討される好適な方法及び戦略の例は、国際公開第２０１７／０４９２３３号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に提供され、さらにStructural Genomics Consortium et al., Nat. Methods., 5(2):135-146 (2008)に提示される。
【０１１５】
医薬組成物
本開示の組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル剤、液体を含有するカプセル剤、粉末、持続放出製剤、坐剤、タンポン用途エマルション、エアロゾル、スプレー、懸濁液、ロゼンジ、トローチ、キャンディー、注射剤、チューインガム、軟膏、スメア（smears）、時間放出パッチ、液体を吸収したワイプ、及びそれらの組合せの形態をとることができる。
【０１１６】
本開示の組成物又はその薬学的に許容可能な形態の投与は局所的であってもよく、すなわち、該医薬組成物は、その作用が望まれる場所に直接（例えば創傷に直接）適用されてもよく、又は全身的であってもよい。同様に、全身投与は、経腸又は経口（すなわち、組成物は消化管を介して与えられ得る）であってもよく、非経口（すなわち、組成物は注射又は吸入等の消化管以外の経路によって与えられ得る）であってもよい。そのため、本開示のＣｈｐペプチド及びそれらを含む組成物は、経口的に、非経口的に、吸入により、局所的に、経腸的に、経鼻的に、バッカルで、留置されたリザーバーにより、又は任意の他の既知の方法により被験体に投与され得る。本開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントを、持続放出剤形を用いて投与することもできる。
【０１１７】
経口投与の場合、本開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントを、固体又は液体の調製物、例えば錠剤、カプセル剤、粉末、溶液、懸濁液及び分散液に配合することができる。組成物を、例えば、ラクトース、スクロース、コーンスターチ、ゼラチン、ジャガイモデンプン、アルギン酸及び／又はステアリン酸マグネシウム等の賦形剤と配合することができる。
【０１１８】
錠剤及び丸剤等の固体組成物を調製するため、本開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントを薬学的賦形剤と混合して固体プレ製剤組成物を形成してもよい。望ましい場合、標準的な手法によって錠剤を糖コーティング又は腸溶性コーティングしてもよい。錠剤又は丸剤を、長期作用の利点を与える剤形を提供するためにコーティングしてもよく、又は他の形で配合させてもよい。例えば、錠剤又は丸剤は、内部製剤（inner dosage）及び外部製剤（outer dosage）の成分を含むことができ、後者は前者を覆うエンベロープの形態である。２つの成分を腸溶層によって分離することができ、胃内での崩壊に抵抗するようにはたらき、内側の成分が十二指腸をそのまま通過するか、又は放出が遅延することを可能にする。かかる腸溶層又はコーティング剤には様々な材料を使用することができ、かかる材料としては、多くのポリマー酸、並びにシェラック、セチルアルコール及び酢酸セルロース等の材料とのポリマー酸の混合物が挙げられる。
【０１１９】
本開示の局所組成物は、皮膚科学的に又は耳（otically）に許容可能な担体等の薬学的又は生理学的に許容可能な担体を更に含んでもよい。かかる担体は、皮膚科学的に許容可能な担体の場合、皮膚、爪、粘膜、組織及び／又は毛髪に適合性であり得て、これらの要件を満たす従来使用される任意の皮膚科担体を含むことができる。耳に許容可能な担体の場合、担体は、耳の全ての部分に適合性であり得る。かかる担体は、当業者によって容易に選択され得る。本開示の組成物の局所投与用の担体としては、限定されるものではないが、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン及び／又はポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水が挙げられる。皮膚軟膏を配合する際には、本開示の活性成分を、例えば油性炭化水素基剤、無水吸収基剤、油中水型吸収基剤、水中油型水分除去（water-removable）基剤及び／又は水溶性基剤に配合することができる。耳用組成物を配合する際には、本開示の活性成分を、例えばデキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、多糖ゲル、Ｇｅｌｒｉｔｅ（商標）等のゲランガム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース系ポリマー、及びアクリル酸のポリマー又はコポリマー等のカルボキシ含有ポリマー等の担体、並びに他の高分子粘滑剤を含む、水性高分子懸濁液に配合することができる。本開示による局所組成物は、局所適用に適した任意の形態であり得て、水性、水性アルコール性若しくは油性の溶液、ローション若しくはセラム分散液、水性、無水若しくは油性のゲル、水相に脂肪相を（Ｏ／Ｗ又は水中油型）若しくはその逆に（Ｗ／Ｏ又は油中水型）分散させることで得られるエマルション、マイクロエマルション或いはマイクロカプセル、マイクロ粒子又はイオン性及び／又は非イオン性タイプの脂質ベシクル分散物、クリーム、ローション、ゲル、フォーム（加圧キャニスター、適切なアプリケーター、乳化剤及び不活性噴射剤を用い得る）、エッセンス、乳液、懸濁液及びパッチを含む。本開示の局所組成物はまた、親水性又は親油性のゲル化剤、親水性又は親油性の活性剤、保存剤、酸化防止剤、溶媒、香料、増量剤、日焼け止め剤、消臭剤（odor-absorbers）及び色素等のアジュバントを含んでもよい。更なる態様では、本明細書に開示の局所組成物は、被験体の皮膚又は他の組織に付着可能であるか、別の形で付くことが可能な、本明細書に開示される治療有効量の１つ以上のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントを送達することができる経皮パッチ、包帯剤、パッド、ラップ、マトリックス及び包帯等の用具と併用して投与され得る。
【０１２０】
一実施形態では、本開示の局所組成物は、局所熱傷を治療するために使用される１つ以上の成分を追加的に含む。かかる成分としては、限定されるものではないが、プロピレングリコールヒドロゲル；グリコール、セルロース誘導体及び水溶性アルミニウム塩の組合せ；消毒薬；抗生物質；並びに副腎皮質ステロイドを挙げることができる。保湿剤（固体又は液体のワックスエステル等）、吸収促進剤（親水性粘土又はデンプン等）、増粘剤及び皮膚保護剤も添加することができる。局所製剤は、マウスウォッシュ等のリンスの形態であってもよい。例えば、国際公開第２００４／００４６５０号を参照されたい。
【０１２１】
本開示の組成物を、適切な量のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントと、担体とを含む治療剤の注射により投与することもできる。例えば、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントを、グラム陰性細菌による感染（シュードモナス・エルギノーサによって引き起こされるもの等）を治療するため、筋肉内、髄腔内、皮膚下（subdermally）、皮下（subcutaneously）又は静脈内に投与することができる。担体は、蒸留水、生理食塩水、アルブミン、血清又はそれらの任意の組み合わせで構成され得る。さらに、非経口注射剤の医薬組成物は、ｐＨ緩衝液、アジュバント（例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤）、リポソーム製剤、ナノ粒子、分散液、懸濁液又はエマルション、及び使用の直前に滅菌注射液又は分散液に再構成するための滅菌粉末の１つ以上に加えて、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントの薬学的に許容可能な水性又は非水性の溶液を含むことができる。
【０１２２】
非経口注射が選択される投与様式である場合、等張性製剤が用いられ得る。一般的には、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを挙げることができる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水等の等張溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンを挙げることができる。血管収縮剤を製剤に添加することができる。この種の用途に応じた医薬調製物は、滅菌されパイロジェンフリーで提供され得る。
【０１２３】
希釈剤は、エタノール、プロピレングリコール、油、又は薬学的に許容可能な乳化剤若しくは界面活性剤等の１つ以上の他の賦形剤を更に含んでもよい。
【０１２４】
別の実施形態では、本開示の組成物は吸入可能な組成物である。本開示の吸入可能な組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含むことができる。一実施形態では、本開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、乾燥した吸入可能な粉末として配合され得る。具体的な実施形態では、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントを含む吸入用溶液は、エアロゾル送達用の噴射剤を用いて更に配合され得る。或る特定の実施形態では、溶液は、噴霧化されてもよい。
【０１２５】
医薬品と噴射剤との間の表面張力及び界面張力を低下させるため、界面活性剤を本開示の吸入用医薬組成物に添加することができる。医薬品と噴射剤と賦形剤とが懸濁液を形成する場合、界面活性剤は使用されてもよく、又は使用されなくてもよい。医薬品と噴射剤と賦形剤とが溶液を形成する場合、界面活性剤は、例えば、特定の医薬品及び賦形剤の溶解度に応じて、使用されてもよく、又は使用されなくてもよい。界面活性剤は、医薬品と非反応性であり、医薬品と賦形剤と噴射剤との間の表面張力を低くし、及び／又はバルブ潤滑剤として作用する、任意の適切な非毒性の化合物であり得る。
【０１２６】
好適な界面活性剤の例としては、限定されないが、オレイン酸；ソルビタントリオレエート；塩化セチルピリジニウム；大豆レシチン；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート；ポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテル；ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル；ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンエチレンジアミンブロックコポリマー；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート；ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー；ひまし油エトキシレート及びそれらの組合せが挙げられる。
【０１２７】
適切な噴射剤の例としては、限定されるものではないが、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン及び二酸化炭素が挙げられる。
【０１２８】
吸入用組成物に使用される好適な賦形剤の例としては、限定されないが、ラクトース、デンプン、中鎖脂肪酸のプロピレングリコールジエステル；中鎖、短鎖若しくは長鎖、又はそれらの任意の組合せの脂肪酸のトリグリセリドエステル；パーフルオロジメチルシクロブタン；パーフルオロシクロブタン；ポリエチレングリコール；メタノール；ラウログリコール；ジエチレングリコールモノエチルエーテル；中鎖脂肪酸のポリグリコール化グリセリド；アルコール；ユーカリ油；短鎖脂肪酸；及びそれらの組合せが挙げられる。
【０１２９】
幾つかの実施形態では、本開示の組成物は、鼻腔適用を含む。鼻腔適用としては、鼻腔用スプレー、鼻腔用ドロップ、鼻腔用軟膏、鼻腔用洗浄液、鼻腔用注射剤、鼻腔用パッキング、気管支スプレー及び吸入剤等の直接用途に対する適用、並びに咽喉ロゼンジ剤及び洗口液若しくは含嗽剤等の間接的用途に対する適用、又は鼻孔若しくは顔に塗布される軟膏の使用によるもの、またこれらの及び同様の適用方法の任意の組み合わせが挙げられる。
【０１３０】
別の実施形態では、本開示の医薬組成物は、１つ以上の抗微生物剤及び／又は１つ以上の従来の抗生物質を含む相補的な作用物質を含む。感染の治療を促進するため又は抗菌作用を高めるため、本開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントを含有する治療剤は、ペプチドの殺菌活性を強化することもできる少なくとも１つの相補的な作用物質を更に含んでもよい。相補的な作用物質としては、グラム陰性細菌の治療に用いられる１種以上の抗生物質であり得る。一実施形態では、相補的な作用物質は、シュードモナス・エルギノーサによって引き起こされる感染症の治療に使用される抗生物質又は抗微生物剤である。
【０１３１】
本開示の医薬組成物は、単位剤形で与えられ得て、当該技術分野で既知の任意の方法によって調製され得る。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、例えば治療される宿主、感染性細菌へのレシピエントの曝露期間、被験体の大きさ及び体重、並びに特定の投与様式によって異なる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、例えば治療効果を生み出す各化合物のその量であり得る。或る特定の実施形態では、１００％のうち、有効成分の総量は約１％〜約９９％、例えば約５％〜約７０％、又は約１０％〜約３０％の範囲であり得る。
【０１３２】
投与量及び投与
適用される投与量は、治療されている感染の活動性、治療される被験体の年齢、健康及び総合的な健康状態、特定のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントの活性、存在する場合には、本開示によるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントと組み合わせる抗生物質の性質及び活性、並びにかかる組合せの併用効果等の多くの要因に依存し得る。或る特定の実施形態において、投与されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントの有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（又は１ｍｃｇ／ｍｌ〜５０ｍｃｇ／ｍｌ）の範囲内に収まり得る。或る特定の実施形態では、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、毎日１回〜４回を１日〜１４日間に及ぶ期間にわたって投与され得る。抗生物質も使用される場合は、任意の相乗作用を考慮して標準的な投与計画又は低量で投与され得る。しかしながら、（Ｃｈｐペプチド若しくはその活性フラグメント、又はそれに伴って投与される任意の抗生物質に関わらず）かかる投与量及び投与計画はいずれも、最適化の対象となる。最適な投与量は、当業者が備えている技能の範囲内であるが、本開示を考慮に入れて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのパイロット有効性実験を行うことにより決定され得る。
【０１３３】
本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、急速な殺菌性を提供することができ、ＭＩＣ量以下で使用される場合には静菌効果を提供することができることが企図される。本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、様々な抗生物質耐性細菌に対して活性であり、耐性の発現と関連しないことが更に企図される。本開示に基づいて、臨床現場では、本Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、単独で又は抗生物質（耐性が生じた抗生物質を含む）と共に、薬物耐性細菌及び多剤耐性細菌から生じる感染を治療するための強力な代替（又は添加剤）であり得る。グラム陰性細菌に対する既存の耐性機構は、本Ｃｈｐポリペプチド又はその活性フラグメントの溶菌活性に対する感受性に影響を与えないと考えられる。
【０１３４】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントに対する時間曝露は、１ｍｌ当たりの活性ペプチド単位の所望の濃度に影響を及ぼす場合がある。「長時間」又は「緩徐（slow）」放出担体に分類される担体（例えば、或る特定の鼻スプレー又はロゼンジ等）は、１ｍｌ当たりのペプチド単位の濃度は低いが、より長時間にわたって提供し得るのに対し、「短時間」又は「即時」放出担体（例えば、含嗽剤等）は、１ｍｌ当たりのペプチド単位（ｍｃｇ）の濃度は高いが、より短時間で提供し得る。より高い単位／ｍｌ投与量又はより低い単位／ｍｌ投与量が所望され得る状況もある。
【０１３５】
本開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントでは、治療有効用量は、細胞培養アッセイ又は動物モデル（通常はマウス、ウサギ、イヌ、又はブタ）のいずれかで最初に推定され得る。望ましい濃度範囲及び投与経路を達成するために動物モデルを使用することもできる。次いで、得られた情報を、ヒトにおける有効用量、並びに投与経路を決定するために使用することができる。十分なレベルの有効成分を提供するか、又は所望の効果を維持するように、投与量及び投与を更に調整することができる。考慮され得る追加の要因としては、疾患状態の重症度；患者の年齢、体重及び性別；食餌；望ましい治療期間；投与方法；投与の時間及び頻度；薬物の組合せ；反応感受性；治療法に対する忍容性／応答；並びに治療医の判断が挙げられる。
【０１３６】
治療計画は、毎日（例えば、毎日１回、２回、３回等）、隔日（１日おきに１回、２回、３回等）、半週毎、毎週、２週間に１回、１カ月に１回等の投与を必要とし得る。一実施形態では、治療を、持続点滴として与えることができる。単位用量を複数回で投与することができる。また、臨床症状を監視することによって指示されるというように、間隔が不規則であってもよい。代替的には、単位用量を持続放出製剤として投与することができ、その場合、より低頻度の投与が用いられ得る。投与量及び頻度は、患者によって異なる可能性がある。限局性の（localized）投与、例えば、鼻腔内、吸入、直腸等、又は全身投与、例えば経口、直腸（例えば、浣腸による）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、経尿道等に対してかかるガイドラインを調整することが当業者に理解される。
【０１３７】
方法
本開示のＣｈｐペプチド及びその活性フラグメントを、被験体において、例えば、シュードモナス・エルギノーサ等のグラム陰性細菌による細菌感染を治療するためｉｎ  ｖｉｖｏで、並びに例えば、医療用具の表面等の細菌汚染のレベルを低下させるためｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することができる。
【０１３８】
例えば、幾つかの実施形態では、本Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、グラム陰性細菌によって形成される細菌バイオフィルムの予防、制御、破壊及び処理に使用され得る。バイオフィルム形成は、微生物細胞が互いに接着し、表面上の細胞外高分子物質（ＥＰＳ）のマトリックス中に埋め込まれる場合に生じる。生体高分子（例えば、多糖、核酸及びタンパク質）及び栄養素が豊富な、かかる保護環境での微生物の増殖は、微生物クロストークを増強し、病原性を増大させる。バイオフィルムは、生物表面及び非生物表面、例えばＣＦ肺の粘液栓、汚染カテーテル、コンタクトレンズ等を含む任意の支持環境で発生し得る（Sharma et al. Biologicals, 42(1):1-7 (2014)（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす））。そのため、一実施形態では、本開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、細菌が細菌性バイオフィルムによって保護される場合に、グラム陰性細菌による細菌感染の予防、制御、破壊及び処理に使用することができる。
【０１３９】
一態様では、本開示は、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む、本明細書に記載される１つ以上の付加的なグラム陰性細菌によって引き起こされる細菌感染を治療する方法に関する。
【０１４０】
「感染」及び「細菌感染」という用語は、気道感染（ＲＴＩ）、例えば嚢胞性線維症（ＣＦ）を有する患者における気道感染、下気道感染、例えば慢性気管支炎の急性増悪（ＡＣＥＢ）、急性副鼻腔炎、市中肺炎（ＣＡＰ）、院内肺炎（ＨＡＰ）及び院内気道感染；淋菌性子宮頸管炎及び淋菌性尿道炎等の性感染症；尿路感染；急性中耳炎；新生児敗血症及びカテーテル関連敗血症を含む敗血症；並びに骨髄炎を含むことが意図される。薬物耐性細菌及び多剤耐性細菌によって引き起こされる感染も企図される。
【０１４１】
シュードモナス・エルギノーサ等のグラム陰性細菌によって引き起こされる感染の非限定的な例としては、Ａ）院内感染：１．気道感染、特に嚢胞性線維症患者及び人工呼吸器を装着している患者における気道感染、２．菌血症及び敗血症、３．創傷感染、特に火傷被害者の創傷感染、４．尿路感染、５．侵襲的器具上での術後感染、６．汚染された薬液の静脈内投与による心内膜炎、７．後天性免疫不全症候群、癌化学療法、ステロイド療法、血液悪性疾患、臓器移植、腎代替療法、及び重度の好中球減少症を伴う他の病態の患者における感染、Ｂ）市中感染：１．市中気道感染、２．髄膜炎、３．汚染水に起因する毛包炎及び外耳道感染、４．高齢者及び糖尿病患者における悪性外耳炎、５．小児における踵骨の骨髄炎、６．一般に汚染されたコンタクトレンズと関連した眼感染、７．手が頻繁に水に曝される人々における爪感染等の皮膚感染、８．消化管感染、並びに９．筋骨格系感染を挙げることができる。
【０１４２】
本方法のグラム陰性細菌の１つ以上の種は、本明細書に記載されるグラム陰性細菌の任意の種を含み得る。典型的には、付加的な種のグラム陰性細菌は、アシネトバクター・バウマンニ、アシネトバクター・ヘモリティクス（Acinetobacter haemolyticus）、アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、バクテロイデス（Bacteroides）属種（バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Bacteroides thetaioatamicron）、バクテロイデス・ディスタソニス（Bacteroides distasonis）、バクテロイデス・オバトゥス（Bacteroides ovatus）、バクテロイデス・ヴルガトゥス（Bacteroides vulgatus）、バルトネラ・クインタナ（Bartonella Quintana）、百日咳菌（Bordetella pertussis）等）、ブルセラ（Brucella）属種（ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）等）、バークホルデリア（Burkholderia）属種（バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、バークホルデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei）及びバークホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）等）、フソバクテリウム（Fusobacterium）、プレボテラ・コーポリス（Prevotella corporis）、プレボテラ・インテルメディア（Prevotella intermedia）、プレボテラ・エンドドンタリス（Prevotella endodontalis）、ポルフィロモナス・アサッカロリティカ（Porphyromonas asaccharolytica）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、カンピロバクター・フィタス（Campylobacter fetus）、カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）、クラミジア（Chlamydia）属種（肺炎クラミジア（Chlamydia pneumoniae）及びクラミジア・トラコマティス（Chlamydia trachomatis）等）、シトロバクター・フロウンディ（Citrobacter freundii）、シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）、コクシエラ・バーネッティ（Coxiella burnetii）、エドワジエラ（Edwarsiella）属種（エドワジエラ・タルダ（Edwarsiella tarda）等）、エイケネラ・コロデンス（Eikenella corrodens）、エンテロバクター属種（エンテロバクター・クロアカエ、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）及びエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）等）、大腸菌、野兎病菌（Francisella tularensis）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ヘモフィルス・ドゥクレイ（Haemophilus ducreyi）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、キンゲラ・キンゲ（Kingella kingae）、クレブシエラ（Klebsiella）属種（クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、クレブシエラ・リノスクレロマティス（Klebsiella rhinoscleromatis）及びクレブシエラ・オザエナエ（Klebsiella ozaenae）等）、レジオネラ・ペヌモフィラ（Legionella penumophila）、モラクセラ（Moraxella）属種（モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）等）、モルガネラ（Morganella）属種（モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）等）、淋菌、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、シュードモナス・エルギノーサ、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、プレシオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、プロテウス・ペンネリ（Proteus penneri）、プロテウス・ミクソファシエンス（Proteus myxofaciens）、プロビデ���シア（Providencia）属種（プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stuartii）、プロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettgeri）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）等）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、チフス菌（Salmonella typhi）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、パラチフス菌（Salmonella paratyphi）、セラチア（Serratia）属種（セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）等）、シゲラ属種（シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）、シゲラ・ボイディ（Shigella boydii）、シゲラ・ソネイ（Shigella sonnei）及び志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）等）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）、ビブリオ・バルニフィカス（Vibrio vulnificus）、ビブリオ・アルギノリチカス（Vibrio alginolyticus）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、ペスト菌（Yersinia pestis）、仮性結核菌（Yersinia pseudotuberculosis）、肺炎クラミジア、クラミジア・トラコマティス、リケッチア・プロワツェキイ（Ricketsia prowazekii）、コクシエラ・バーネッティ、エーリキア・シャフェンシス（Ehrlichia chafeensis）及び／又はバルトネラ・ヘンセラ（Bartonella hensenae）の１つ以上から選択される。
【０１４３】
より典型的には、グラム陰性細菌の少なくとも１つの他の種は、アシネトバクター・バウマンニ、百日咳菌、バークホルデリア・セパシア、バークホルデリア・シュードマレイ、バークホルデリア・マレイ、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・コリ、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロバクター・アエロゲネス、大腸菌、野兎病菌、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ドゥクレイ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ペヌモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、モルガネラ・モルガニ、淋菌、髄膜炎菌、パスツレラ・ムルトシダ、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、チフス菌、セラチア・マルセセンス、シゲラ・フレックスネリ、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ソネイ、志賀赤痢菌、ステノトロホモナス・マルトフィリア、コレラ菌、及び／又は肺炎クラミジアの１つ以上から選択される。
【０１４４】
より典型的には、グラム陰性細菌の少なくとも１つの他の種は、ネズミチフス菌、チフス菌、シゲラ属種、大腸菌、アシネトバクター・バウマンニ、クレブシエラ・ニューモニエ、淋菌、髄膜炎菌、セラチア属種、プロテウス・ミラビリス、モルガネラ・モルガニ、プロビデンシア属種、エドワジエラ属種、エルシニア属種、インフルエンザ菌、バルトネラ・クインタナ、ブルセラ属種、百日咳菌、バークホルデリア属種、モラクセラ属種、野兎病菌、レジオネラ・ニューモフィラ、コクシエラ・バーネッティ、バクテロイデス属種、エンテロバクター属種及び／又はクラミジア属種の１つ以上から選択される。
【０１４５】
更に典型的には、少なくとも１つの他の種のグラム陰性細菌は、クレブシエラ属種、エンテロバクター属種、大腸菌、シトロバクター・フロウンディ、ネズミチフス菌、ペスト菌及び野兎病菌の１つ以上から選択される。
【０１４６】
幾つかの実施形態では、グラム陰性細菌による感染は、局所細菌感染、例えば皮膚創傷等の局在化した感染をもたらす。他の実施形態では、細菌感染は全身病原性細菌感染である。一般的なグラム陰性病原体及び関連感染を本開示の表Ａに収載する。これらは、本Ｃｈｐペプチド及びその活性フラグメントで治療、緩和又は予防され得る細菌感染の例となることを意味し、限定を意図するものではない。
【０１４７】
2021519311.tif 000003
【０１４８】
幾つかの実施形態では、本開示のＣｈｐペプチド及びその活性フラグメントは、グラム陰性細菌に起因する感染を獲得するリスクがある被験体を治療するために使用される。グラム陰性細菌感染を獲得するリスクがある被験体としては、例えば、嚢胞性線維症患者、好中球減少症患者、壊死性腸炎患者、熱傷の犠牲者、創傷感染を有する患者が挙げられ、より一般的には、病院にいる患者、特に外科の患者及びカテーテル、例えば中心静脈カテーテル、ヒックマンデバイス（Hickman device）等の留置型医療用具、又は電気生理学的心臓装置、例えばペースメーカー及び留置型除細動器を使用して治療されている患者が挙げられる。グラム陰性細菌に感染するリスクがある他の患者群としては、限定されるものではないが、関節全置換（例えば膝又は股関節の全置換）等の留置型プロテーゼを有する患者が挙げられる。
【０１４９】
別の態様では、本開示は、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に、有効量の本明細書に記載されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントを含有する第１の有効量の組成物と、グラム陰性細菌感染の治療に適した第２の有効量の抗生物質との組合せを同時投与することを含む、細菌感染を予防又は治療する方法に関する。
【０１５０】
本開示のＣｈｐペプチド及びその活性フラグメントは、個別に又は当業者の技能の範囲内の様々な組合せで標準療法の抗生物質又は最終手段の抗生物質と同時投与することができる。シュードモナス・エルギノーサに対して用いられる伝統的な抗生物質を表Ｂに記載する。クレブシエラ属種、エンテロバクター属種、大腸菌、シトロバクター・フロウンディ、サルモネラ菌、ペスト菌及び野兎病菌等の他のグラム陰性細菌に対する抗生物質は、シュードモナス・エルギノーサについて表Ｂに記載されているものと同様である。
【０１５１】
2021519311.tif 000004
【０１５２】
より具体的な実施形態では、抗生物質は、セフタジジム、セフェピム、セフォペラゾン、セフトビプロール、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、アミノグリコシド、イミペネム、メロペネム、ドリペネム、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ピペラシリン、チカルシリン、ペニシリン、リファンピシン、ポリミキシンＢ及びコリスチンの１つ以上から選択される。
【０１５３】
本開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントを抗生物質と組み合わせることで有効な抗菌投与計画を提供する。幾つかの実施形態では、本開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントと、１つ以上の抗生物質との同時投与により、Ｃｈｐペプチド若しくはその活性フラグメントのいずれか若しくは抗生物質、又はそれらの両方の用量及び量を減少して、及び／又は殺菌活性及び静菌活性を高め、抗生物質耐性のリスクを低減させ、有害な神経学的若しくは腎臓の副作用のリスク（コリスチン又はポリミキシンＢの使用に関連するもの等）を低減させて、治療頻度を減らし及び／又は治療期間を短くして行うことができる。以前の研究は、総累積コリスチン用量が腎臓損傷に関連していることを示し、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントとの併用療法を用いる投与量の減少又は治療期間の短縮が腎毒性の発生を低下させる可能性があることを示唆している（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Spapen et al. Ann Intensive Care. 1:14 (2011)）。本明細書で使用される場合、「用量の減少」という用語は、同じ有効成分を用いる単剤療法と比較した、組合せにおける１つの有効成分の用量を指す。幾つかの実施形態では、組み合わせたＣｈｐペプチド若しくはその活性フラグメント又は抗生物質の用量は、それぞれの単剤療法と比較して最適以下、更には閾値以下となる場合がある。
【０１５４】
幾つかの実施形態では、本開示は、被験体に本明細書に開示のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントを対象の抗生物質と共に投与することによって、グラム陰性細菌に対する１つ以上の抗生物質の抗生物質活性を単独で使用される該抗生物質の活性と比較して高める方法を提供する。組合せは細菌に対して有効であり、抗生物質に対する耐性を克服すること及び／又は抗生物質をより低用量で用いることを可能とし、ポリミキシンＢの腎毒性及び神経毒性作用等の望ましくない副作用を減少させる。
【０１５５】
本開示の抗生物質と任意に組み合わせたＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントを、限定されるものではないが、例えば、ＥＤＴＡ、ＴＲＩＳ、乳酸、ラクトフェリン、ポリミキシン、クエン酸（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Vaara M. Microbial Rev. 56(3):395-441 (1992)）等の金属キレート剤を含む、グラム陰性細菌の追加の外膜透過化剤と更に組み合わせることができる。
【０１５６】
更に別の態様では、本開示は、グラム陰性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害する、又はその菌数を減少させる、又はそれを死滅させる方法に関し、該方法は、細菌を、有効量の本明細書に記載されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントを含有する組成物と接触させることを含み、ここで、該Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、グラム陰性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。
【０１５７】
幾つかの実施形態では、グラム陰性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させることは、細菌と本明細書に記載されるＣｈｐペプチド又は活性フラグメントとを接触させることを含み、細菌は、例えば病院及び他の健康関連又は公共の建物における医療器具、床、階段、壁及び調理台の表面、並びに手術室、緊急治療室、病室、診療所及び浴室等における機器の表面上に存在する。
【０１５８】
本明細書に記載のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントを用いて保護することができる医療器具の例としては、管類及び他の表面医療器具、例えば尿道カテーテル、粘液吸引カテーテル、吸引カテーテル、臍帯カニューレ（umbilical cannulae）、コンタクトレンズ、子宮内器具、膣内及び腸内器具、気管内チューブ、気管支鏡、歯科補綴物及び歯列矯正器具、外科用器械、歯科用器械、管類、歯科用送水管、布、紙、指示薬ストリップ（例えば、紙の指示薬ストリップ又はプラスチックの指示薬ストリップ）、接着剤（例えば、ヒドロゲル接着剤、ホットメルト接着剤又は溶剤系接着剤）、包帯、組織包帯剤（tissue dressings）又は治療器具、及び密封パッチ（occlusive patches）、並びに医療分野で使用される任意の他の表面器具が挙げられるが、これらに限定されない。器具には、電極、外部人工装具、固定テープ、圧迫包帯、及び様々なタイプのモニターが含まれ得る。医療器具には、挿入又は移植部位近くの皮膚等の挿入又は移植部位に設置することができ、グラム陰性細菌によるコロニー形成の影響を受けやすい少なくとも１つの表面を含み得る任意の器具も含まれ得る。
【実施例】
【０１５９】
材料及び方法
細菌株及び増殖条件
本明細書に開示される研究の大半は、ニューヨークの特殊外科病院（Hospital for Special Surgery）でヒト血液から得られたカルバペナム耐性シュードモナス・エルギノーサ臨床分離株ＣＦＳ−１２９２（病理学及び臨床検査医学の教授であるLars Westblade博士により提供された）を用いて行われたが、市販の抗生物質耐性分離株を使用することもできる。他の全ての分離株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）、デレルコレクション（d'Herelle collection）（「ＨＥＲ」）、ＢＥＩリソース（BEI Resources）（「ＨＭ」）又はニューヨークの特殊外科病院（「ＨＳＳ」）のいずれかから得られた。分離株を、溶原培地（ＬＢ；Sigma-Aldrich）、カザミノ酸（ＣＡＡ）培地（５ｇ／Ｌカザミノ酸、Ameresco/VWR；５．２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、Sigma-Aldrich；１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、Sigma-Aldrich）、１００ｍＭ  ＮａＣｌを添加したＣＡＡ、又は２．５％ヒト血清（ＡＢ型、男性、プールしたもの；Sigma-Aldrich）を添加したＣＡＡのいずれかで培養し、試験した。特に示されていない限り、全ての抗生物質及びタンパク質試薬（例えば、Ｔ４リゾチーム）をSigma-Aldrichから入手した。
【０１６０】
バイオインフォマティクス研究
全てのタンパク質を、全てのミクロウイルス科及びレビウイルス科のゲノムに関する注釈付きＧｅｎＢａｎｋデータベースエントリにおいて同定した。各Ｃｈｐ群のペプチドのアクセッション番号を下記表１及び表２に示す。Ｂｌａｓｔｐ解析をuniprot.org/blast/で利用可能なＵｎｉＰｒｏｔサーバーを使用して行った。タンパク質二次構造予測を、www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/indexで利用可能なＪＰＲＥＤ４、及びwww.zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/で利用可能なＩ−Ｔａｓｓｅｒを用いて行った。系統発生解析を、www.genome.jp/tools-bin/clustalwで利用可能なＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アラインメントツール（Multiple Sequence Alignment tool）を用いて行った。予測される分子量及び等電点を、web.expasy.org/compute_pi/で利用可能なＥｘＰＡＳｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｏｒｔａｌを用いて決定した。
【０１６１】
最小阻止濃度（ＭＩＣ）の決定
米国臨床検査標準協議会（ＣＬＳＩ：Clinical and Laboratory Standards Institute）によって規定される標準微量液体希釈参照法（2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.）の修正を用いてＭＩＣ値を決定した。修正は、場合によっては、ミューラー・ヒントン・ブロスのＣＡＡ培地（ＮａＣｌを含む又は含まない）又は２．５％ヒト血清を添加したＣＡＡのいずれかによる置換えに基づくものであった。本明細書で使用される場合、ＭＩＣは、対照と比較して細菌増殖の少なくとも８０％を抑制するのに十分なペプチドの最小濃度である。
【０１６２】
最小バイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ）の決定
修正された微量液体希釈ＭＩＣ法の変法（Ceri H et al., 1999. J Clin Microbiol 37:1771-1776、及びSchuch R et al., 2017. Antimicrob Agents Chemother 61）を用いてＭＢＥＣ値を決定した。シュードモナス・エルギノーサ株ＡＴＣＣ１７６４７の新鮮なコロニーをＰＢＳ（０．５マクファーランド単位）に懸濁し、０．２％グルコースを含むＬＢに１：１００で希釈し、９６ウェルＣａｌｇａｒｙ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｄｅｖｉｃｅ（Innovotech）の各ウェルに０．１５ｍｌのアリコートとして加えて、ポリカーボネートペグ上でのバイオフィルム形成のため３７℃で２４時間インキュベートした。バイオフィルムを洗浄し、ＴＳＢｇ中の各ペプチドの２倍希釈系列を用いて３７℃で１６時間処理した。処理後、ウェルを洗浄し、３７℃で風乾し、０．０５％クリスタルバイオレットで１０分間染色し、３３％酢酸で脱色した。抽出されたクリスタルバイオレットのＯＤ６００を決定した。各サンプルのＭＢＥＣ値を、クリスタルバイオレットの定量（未処理対照との比較）によって評定されるバイオフィルムバイオマスの９５％超を除去するのに必要な最小薬物濃度として決定した。Ｔ４ファージリゾチームを陰性対照として使用し、これは抗バイオフィルム活性を提供しない。
【０１６３】
チェッカーボードアッセイ
チェッカーボードアッセイは、微量液体希釈（CLSI 2015; and Moody J. 2010. Synergy testing: broth microdilution checkerboard and broth macrodilution methods, p 5.12.11-15.12.23. In Garcia LS (ed), Clinical Microbiology Procedures Handbook, vol 2）によるＭＩＣ決定のためのＣＬＳＩ法の修正に基づく。チェッカーボードを、初めに、横軸に沿って各ウェルが同量の２倍希釈した抗生物質を含む９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートの列を作成することによって構築した。別のプレートに、縦軸に沿って各ウェルが同量の２倍に希釈したペプチドを含む比較用の行を作成した。次いで、各列が一定量の抗生物質及びグラム陰性溶解素の倍加希釈物を含み、各行が一定量のグラム陰性溶解素及び抗生物質の倍加希釈物を含むように、ペプチド及び抗生物質の希釈物を組み合わせた。これにより、各ウェルはペプチド及び抗生物質の独自の組み合わせを含んでいた。細菌を、２．５％ヒト血清を含むＣＡＡ中１×１０５ＣＦＵ／ｍＬの濃度で各ウェルに加えた。次いで、単独の及び組み合わせた各作用物質のＭＩＣを、周囲空気中にて３７℃で１６時間の後に記録した。部分阻止濃度指数（ＦＩＣＩ）の合計を各薬物について算出し、最小のＦＩＣＩを用いて相乗作用を決定した。ＦＩＣＩを次のように計算した。ＦＩＣＩ＝ＦＩＣ  Ａ＋ＦＩＣ  Ｂ（ここで、ＦＩＣ  Ａは組み合わせでの各抗生物質のＭＩＣ／単独での各抗生物質のＭＩＣであり、ＦＩＣ  Ｂは組み合わせでの各グラム陰性溶解素のＭＩＣ／単独での各グラム陰性溶解素のＭＩＣである）。組み合わせは、ＦＩＣＩが０．５以下である場合に相乗的、ＦＩＣＩが０．５超〜１未満である場合に強く相加的、ＦＩＣＩが１〜２未満である場合に相加的、及びＦＩＣＩが２以上である場合に拮抗的とみなされる。アミカシン、アジスロマイシン、アズトレオナム、シプロフロキサシン、コリスチン、ホスホマイシン、ゲンタマイシン、イミペネム、ピペラシリン、リファンピシン及びトブラマイシンを含む１１種類の異なる様々な抗生物質に対するＣｈｐ２又はＣｈｐ４のいずれかの組み合わせを含むＣＡＡ／Ｈｕｓにおいてシュードモナス・エルギノーサ株ＣＦＳ−１２９２を用いる、チェッカーボードアッセイを行った。大半の組み合わせで０．５以下のＦＩＣＩ値が観察され、Ｃｈｐ２及びＣｈｐ４が幅広い抗生物質と相乗作用する能力を示している（下記の表８を参照されたい）。これらの知見は、Ｃｈｐペプチドが抗生物質の存在下で強力な抗菌活性を提供する可能性があることを示唆している。
【０１６４】
グラム陰性溶解素の溶血活性のアッセイ
ヒト赤血球の溶解によって放出されるヘモグロビンの量として、溶血活性を測定した（Lv Y et al, 2014. PLoS One 9:e86364）。簡潔に述べると、ヘパリンの入ったポリカーボネートチューブ内のプールした健常ドナー（BioreclamationIVT）から得られた３ｍｌの新鮮ヒト血液細胞（ｈＲＢＣ）を１０００×ｇにて４℃で５分間遠心分離した。得られた赤血球をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（ｐＨ７．２）で３回洗浄し、３０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。５０μｌ容量の赤血球溶液を、２倍希釈範囲（１２８μｇ／ｍＬ〜０．２５μｇ／ｍＬ）の５０μｌの各グラム陰性溶解素（ＰＢＳ中）と共に３７℃で１時間の間インキュベートした。無傷赤血球を１０００×ｇにて４℃で５分間の遠心分離によってペレット化し、上清を新たな９６ウェルプレートに移した。ヘモグロビンの放出を、５７０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）における吸光度を測定することによってモニタリングした。最小溶血濃度を、目に見える溶解を示す最も低いペプチド濃度として決定した（これは、未処理の対照サンプルの５％以上のＯＤ値をもたらす最小濃度に相当する）。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、又はＲＲ１２、ＲＲ１２極性及びＲＲ１２疎水性（Mohanram H. et al, 2016. Biopolymers 106:345-356）を含む既知の溶血活性を有する、並びにＲＩ１８（Lyu Y. et al., 2016. Sci Rep 6:27258）及びＲＲ２２を含む溶血活性の低い又は溶血活性のない一連の各抗微生物ペプチドのいずれかを用いて上記のように処理したＰＢＳ中のｈＲＢＣを含む追加の対照を使用した。
【０１６５】
グラム陰性溶解素活性の時間−死滅アッセイ
シュードモナス・エルギノーサ株ＣＦＳ−１２９２の一晩培養物を、２．５％ヒト血清を含む新鮮なＣＡＡ培地（ＣＡＡ／ＨｕＳ）に１：００で希釈し、攪拌しながら３７℃で２．５時間増殖させた。次いで、対数期細菌をＣＡＡ／ＨｕＳに１：１００で希釈し、１μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬのいずれかの最終濃度でペプチドを添加した。ペプチドを添加しない対照培養物（すなわち、バッファー対照）を含めた。培養物を、通気しながら３７℃でインキュベートし、１時間、３時間及び２４時間の時点で、サンプルをＣＡＡ寒天プレート上での定量的プレーティングのため取り出した。
【０１６６】
顕微鏡観察
ＬＢ中で２．５時間増殖させたシュードモナス・エルギノーサ株ＣＦＳ−１２９２のアリコートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ又は１００％ヒト血清のいずれかに再懸濁して、最終濃度１０μｇ／ｍＬのペプチドＣｈｐ２を用いて又はそれを用いずに室温にて１５分間処理した。サンプルのサブセットを製造業者のプロトコルに従いＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（ThermoFisher）を使用して染色し、微分干渉観察（ＤＩＣ）顕微鏡及び蛍光顕微鏡により調べた。
【０１６７】
実施例１：Ｃｈｐペプチドの同定
グラム陰性細菌であるクラミジアに特異的に感染してこれを死滅させる、説明が十分になされていない或る特定のバクテリオファージ（クラミジアミクロウイルス科）の知識を持ち、これらの生物の公開されているゲノムを研究して、当初は新規な溶解素を同定することに注目していたが、溶解素様配列も先に記載されたアムリンに類似するいかなる配列も観察されなかった。クラミジアは、それらの構造において他の細菌と同じように豊富にはペプチドグリカン（溶解素の既知の標的）を利用しておらず、むしろクラミジアは、一般的に分裂時にのみペプチドグリカンを使用する。したがって、クラミジアファージの標的が何であるかという疑問が生じた。クラミジアファージが標的に侵入する機構は以前に知られていたものとは異なる可能性があること、またそれらの標的は異なり、グラム陰性細菌の外膜の主な構成要素であって外膜の溶解素による透過にとって障害であるリポ多糖（ＬＰＳ）に焦点を当てている可能性があることが仮定された。
【０１６８】
クラミジアミクロウイルスの公開されているゲノムをシンテニック遺伝子座（すなわち、遺伝的に関連するファージ群のゲノム内の同じ位置にある類似する遺伝子）を同定することを視野に入れて検討したところ、同様の機能が示唆された。小さくカチオン性の高いペプチドは、以前に同定された抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）と非常によく似た分子電荷プロファイルを有することが同定された。クラミジアファージ配列は、ＡＭＰ、溶解素、又は既知のアムリンタンパク質（例えば、タンパク質Ａ２、タンパク質Ｅ及びその他）に対してタンパク質配列の類似性はなかったが、全体的な正電荷が顕著な特徴であった。上記のようなバイオインフォマティクスの手法（ＪＰＲＥＤ及びｉＴＡＳＳＡＲ）を用いることで、多くのＡＭＰの顕著な特徴であるαヘリックスの存在を明らかにする構造予測が行われた。αヘリックス、全体的な電荷、クラミジア間の保存、及び関連するグラム陰性細菌ファージゲノムはいずれも、これらのタンパク質がこれまで特徴がわかっていないファージ溶菌性ポリペプチドのファミリーとなる可能性があり、それらがこれまで説明されていないファージの溶菌機構を定義する可能性があることを示唆した。これらのタンパク質はサイズが小さく、（それらの電荷プロファイルに基づいて）可溶性であると予測されたという事実もまた、一旦合成されると、単に感受性の細菌培養物にそれらを加えるだけで容易に試験を受けられるようになる可能性が高いことを意味した。
【０１６９】
前述のとおり、シンテニック遺伝子座内の１２個の保存配列をＧｅｎＢａｎｋデータベースのミクロウイルスゲノムから、具体的にはクラミジアミクロウイルスのゲノム（及び後述する幾つかの他のウイルス）から抽出した。１２個の保存配列は、仮定上の、特徴が不明な又は非構造的なタンパク質としてのみ注釈が付され、α−ヘリックス構造をとると予測される小さな（推定）カチオン性タンパク質をコードしていた。これらの１２個の配列を表１に示す。表１にあるペプチドの１つであるＣｈｐ５は、正に帯電しているアルギニン及びリシンを、負に帯電したアミノ酸残基で置き換えることによってＣｈｐ４とは異なる分子電荷を有するように合成された。Ｃｈｐ５は非活性であると予測された。これらのペプチドは他の溶菌性又は抗微生物性のタンパク質と配列類似性を示さないが、抗菌剤であるＡＭＰの大きなファミリーのサブセットに類似するα−ヘリックス構造をとると予測されている（例えば、図１を参照されたい）。Ｃｈｐペプチドは、それらが由来するファージに対して宿主溶菌機能を果たすと仮定した。
【０１７０】
前述の検討に基づいて、グラム陰性細菌に感染する他のファージ（同じミクロウイルス科のクラミジアミクロウイルスに関連する）のゲノムの更なる研究、並びに同じシンテニー（synteny）及び電荷プロファイルを提示する他の特徴が不明な供給源は、表２に収載される１４種類の追加のペプチドをもたらした。３９種類のペプチド（Ｃｈｐ５を除く）の全てが共に、新規のファージの溶菌剤の関連ファミリーを形成する。それらのペプチドはいずれもミクロウイルス科の供給源に由来する。
【０１７１】
したがって、Ｃｈｐファミリーの全ての成員（各ペプチドの或る特定の特徴を含む）の完全な一覧を表１及び表２に提供する。この群には、ペプチドＣｈｐ１〜Ｃｈｐ４及びＣｈｐ６〜Ｃｈｐ１２、並びにＣＰＡＲ３９が含まれ（これらは１１種類の異なるクラミジアミクロウイルスに由来し、表１に記載される）、ペプチドＣｈｐ２及びＣｈｐ３は２つの異なるファージに由来する２つの同一のペプチドである。上述したように、Ｃｈｐ５は、アルギニン及びリシンを含む全ての正に帯電したアミノ酸を、グルタミン及びグルタミン酸を含む負に帯電したアミノ酸で置き換えることによって生成されるＣｈｐ４の修飾誘導体である。Ｃｈｐファミリーの追加の２７種類の成員は、クラミジアミクロウイルスタンパク質との相同性によって同定され、表２（「追加のＣｈｐファミリーの成員」）に記載されている。２７種類の追加のＣｈｐファミリーの成員は、クラミジアミクロウイルス源に由来するものではなく、推定ミクロウイルスファージ源に由来する。
【０１７２】
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【０１７３】
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【０１７４】
幾つかのＣｈｐファミリーの成員のタンパク質配列相同性に関する追加情報を表３に提供する。Ｃｈｐ１、Ｂｄｐ１、Ｌｖｐ１及びＬｖｐ２のみが、ＧｅｎＢａｎｋの注釈で予測される活性が示されているＣｈｐファミリーの成員である。Ｃｈｐ１（ＧｅｎＢａｎｋ配列ＮＰ＿０４４３１９．１）はＤＮＡ結合タンパク質として注釈が付けられているが、これを支持するデータは提供されておらず、注釈は宿主溶菌における推定的な役割と矛盾している。全体として、Ｃｈｐタンパク質は互いに３９％〜１００％同一であり、タンパク質配列データベース内の他のペプチドと相同ではない。Ｃｈｐファミリーの或る特定の成員を示す有根及び無根の系統樹を図２Ａ及び図２Ｂにそれぞれ示す。
【０１７５】
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【０１７６】
実施例２：Ｃｈｐペプチドの合成
全てのＣｈｐペプチドを、米国ニュージャージー州のGenScriptにより、個別支払いで（Ｎ末端アセチル化（Ａｃ）及びＣ末端アミド化（ＮＨ２））をキャッピングして合成した。GenScriptは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び質量分析（ＭＳ）により各ペプチドの純度を評定した。GenScriptはまた、全てのペプチドについて溶解性試験を行い、Ｖａｒｉｏ  ＭＩＣＲＯ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて正味ペプチド含有量（ＮＰＣ％）を決定した。Ｃｈｐ５、Ｌｖｐ１及びＬｖｐ２を除き、全てのペプチドは水溶性であり、これらを５ｍｇ／ｍＬ又は１０ｍｇ／ｍＬのいずれかの濃度で懸濁した。Ｃｈｐ５及びＬｖｐ１を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに懸濁し、Ｌｖｐ２を２ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに懸濁した。対照ペプチドＲＩ１８、ＲＰ−１、ＷＬＢＵ２、ＢＡＣ３、ＧＮ−２ａｍｐ、ＧＮ−３ａｍｐ、ＧＮ−４ａｍｐ、ＧＮ−６ａｍｐ及びＢａｃ８ｃも上記のようにGenScriptで合成された。全ての追加ペプチドは、GenScript又はAnaspecのいずれかから購入した市販品であった。
【０１７７】
実施例３：Ｃｈｐペプチドの活性−グラム陰性細菌に対する最小阻止濃度（ＭＩＣ）
３９種類のＣｈｐペプチド（Ｃｈｐ２と同一のペプチド配列を有するＣｈｐ３を除く）を合成し、抗菌感受性検査（ＡＳＴ：Antimicrobial Susceptibility Testing）形式で調べた。まず、２．５％のヒト血清を添加したＣＡＡ培地におけるカルバペナム耐性シュードモナス・エルギノーサ臨床分離株ＣＦＳ−１２９２に対するＭＩＣ値を決定した（表４）。Ｃｈｐ１、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ４、Ｃｈｐ６、ＣＰＡＲ３９（ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む）、Ｃｈｐ７、Ｃｈｐ８、Ｃｈｐ１０、Ｃｈｐ１１、Ｅｃｐ１、Ｅｃｐ２、Ｏｓｐ１、Ｓｐｉ１、Ｇｋｈ３、Ｕｎｐ２、Ｕｎｐ５、Ｕｎｐ６、Ｅｃｐ３、Ｅｃｐ４、Ｌｖｐ１、ＡＬＣＥＳ１、ＡＶＱ２０６、ＣＤＬ９０７、ＡＧＴ９１５及びＳＢＲ７７を含む幾つかのペプチドは、０．２５μｇ／ｍＬ〜４μｇ／ｍＬの範囲の優れたＭＩＣ値を示した。ペプチドＣｈｐ５、ＣＰＡＲ３９（ＤＴＴなし）、Ｇｋｈ１、Ｕｎｐ１、Ｓｐｉ２及びＢｄｐ１は活性が不十分であり、３２μｇ／ｍＬ以上のＭＩＣ値を示した。ＣＰＡＲ３９は、内部システイン残基を含み、活性に０．５ｍＭ  ＤＴＴの存在を必要とすることから、この群の中では特有である。Ｃｈｐ５は、全ての正に帯電した残基が負電荷に変更されたＣｈｐ４の誘導体として設計された。カチオン性ＡＭＰの研究に基づいて、抗細菌活性にカチオン性残基が必要であり、アニオン性残基によるカチオン性残基の除去は活性を除去すると予測される。したがって、Ｃｈｐ５（ＭＩＣ＞６４μｇ／ｍＬ）は、Ｃｈｐ４（ＭＩＣ＝０．５μｇ／ｍＬ）の不活性変異体である。ＣＰＡＲ３９（ＤＴＴなし）及びＣｈｐ５をいずれも陰性対照として使用する。
【０１７８】
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【０１７９】
或る特定の主要なＥＳＫＡＰＥ病原体を含む、シュードモナス・エルギノーサ、大腸菌、エンテロバクター・クロアカエ、クレブシエラ・ニューモニエ及びアシネトバクター・バウマンニを含む様々なグラム陰性生物に対して、ペプチドＣｈｐ１、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ４、ＣＰＡＲ３９（ＤＴＴなし）、Ｃｈｐ６、Ｅｃｐ１及びＥｃｐ２を用いて、追加のＭＩＣ試験を行った（表５）。ヒト血清の存在に対する標的生物の差次感受性のため、２．５％のヒト血清を添加しなかったＣＡＡ（生理学的塩濃度を備える）で試験を行った。１μｇ／ｍＬ〜４μｇ／ｍＬの優れたＭＩＣ値は、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ４、Ｃｈｐ６、Ｅｃｐ１及びＥｃｐ２について試験した全ての株に対して観察され、生理学的塩濃度の状況における本Ｃｈｐペプチドの広域スペクトル活性を示した。Ｃｈｐ２及びＥｃｐ１をサルモネラ菌に対して追加的に試験し、２μｇ／ｍＬのＭＩＣを有することを実証した。
【０１８０】
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【０１８１】
また、５０％のヒト血漿又はヒト血清のいずれかを添加したミューラー・ヒントン・ブロス中のシュードモナス・エルギノーサの実験室株ＰＡＯ１に対して、Ｃｈｐ２及びＣｈｐ４の両方のＭＩＣ値を決定し、文献による様々なＡＭＰ（自然免疫エフェクター及びその誘導体を含む）のＭＩＣ値と比較した（表６）。ここでは、ＰＡＯ１は、殆どの臨床分離株とは異なり、ヒト血液マトリックスの抗菌活性に感受性がないことから、ＰＡＯ１（実験室分離株）を使用することにより血清濃度及び血漿濃度が上昇した状態での試験が可能になる。表６では、Ｃｈｐ２及びＣｈｐ４のＭＩＣ値は２μｇ／ｍＬであり、それと比較してＲＩ１８及びプロテグリンのみが同様に活性であり（ＭＩＣ＝１μｇ／ｍＬ〜４μｇ／ｍＬ）、試験した１８種類の追加のペプチドは非活性であるか、活性が不十分であった。
【０１８２】
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【０１８３】
実施例４：Ｃｈｐペプチドの活性−グラム陰性細菌のバイオフィルムの根絶
抗バイオフィルム活性を評価するため、ＭＢＥＣ（最小バイオフィルム根絶濃度）値を、２％グルコースを添加したトリプシンソイブロス培地中でシュードモナス・エルギノーサ株ＡＴＣＣ１７６４７により形成された成熟したバイオフィルムに対してＣｈｐ２及びＣｈｐ４のペプチドについて決定した。Ｃｈｐ２及びＣｈｐ４のいずれについても０．２５μｇ／ｍＬのＭＢＥＣ値が観察され（表７）、これは成熟したバイオフィルムを根絶する強力な能力と一致する。比較すると、活性が高いＡＭＰ（１５）であるＲＩ１８の活性は４μｇ／ｍＬと実質的に低いことが観察され、また活性が不十分な溶解素であるＴ４リゾチームの活性は６４μｇ／ｍＬ超であることが観察された。
【０１８４】
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【０１８５】
実施例５：Ｃｈｐペプチドと抗生物質との組み合わせ
Ｃｈｐ２又はＣｈｐ４のいずれかと１１種類の様々な抗生物質との相乗作用を評価するため、Ｃｈｐ２と１１種類の抗生物質及びＣｈｐ４と１１種類の抗生物質との各組み合わせを、２．５％ヒト血清を添加したＣＡＡ培地においてシュードモナス・エルギノーサ株ＣＦＳ−１２９２を使用する標準的なチェッカーボードアッセイ形式で試験した。チェッカーボードアッセイでは、部分阻止濃度指数（ＦＩＣＩ）値を計算する。０．５以下のＦＩＣＩ値は相乗作用と一致し、０．５超〜１の値は強い相加活性と一致し、１〜２の値は相加活性と一致し、２超の値は拮抗的とみなされる。表８に示すように、Ｃｈｐ２及びＣｈｐ４の両方について、値は、Ｃｈｐペプチドと抗生物質との間の相乗的（すなわち、０．５以下）又は強く相加的（すなわち、０．５超〜１）な相互作用のいずれかと一致していた。
【０１８６】
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【０１８７】
実施例６：Ｃｈｐペプチドの溶血活性の評定
侵襲的感染の治療に使用することができる抗微生物ペプチドは、赤血球に対して低毒性を示さなければならない（Oddo A. et al, 2017. Methods Mol Biol 1548:427-435）。溶血活性の可能性を調べるため、ヒト赤血球に対する最小溶血濃度（ＭＨＣ）の決定に基づいて、赤血球を溶解するＡＭＰの能力を測定する一般的な方法論（上記の材料及び方法に記載される）を用いた。試験した３７種類のＣｈｐペプチドのうち３３種類について、ＭＨＣ値が１２８μｇ／ｍＬ超であり、溶血の証拠は認められなかった（表９）。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００対照は、２％の開始濃度で試験し、ＭＨＣは０．００７％で観察された。比較すると、ＲＩ１８、Ｒ１２、ＲＲ１２ｐ及びＲＲ１２ｈを含む既知の溶血活性を有する４種類のＡＭＰでは、４μｇ／ｍＬ〜１２８μｇ／ｍＬの範囲のＭＨＣ値が観察された。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、一般的に、溶血アッセイで陽性対照として使用される膜溶解性洗浄剤（membranolytic detergent）であり、２％〜０．００７％の濃度の範囲にわたって溶血性であった。これらの知見は、ＣｈｐペプチドがＡＭＰについて共通して観察されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性（すなわち、溶血活性）を有していないことを示唆している。この特性は、表１及び表２の残りのＣｈｐペプチドが、パーセント配列同一性、３Ｄ構造類似性及び電荷プロファイルに基づくだけでなく、本ペプチドが、溶菌剤としてグラム陰性細胞のエンベロープに対して非常に高特異的となる可能性が高いという期待に基づいている。
【０１８８】
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【０１８９】
実施例７：グラム陰性細菌に対する溶菌活性の持続期間
シュードモナス・エルギノーサ株ＣＦＳ−１２９２に対するＣｈｐ２及びＣｈｐ４の活性を、材料及び方法に記載されているように２．５％ヒト血清を含むＣＡＡを用いた時間−死滅形式で調べた。濃度１μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬのＣｈｐ２又はＣｈｐ４のいずれかによる処理後１時間、３時間及び２４時間での細菌生存率の評定は、全ての場合において強力な殺菌活性と一致する数ｌｏｇ倍（multi-log fold）の減少をもたらした(表１０）。表１０は、２．５％ヒト血清を添加したＣＡＡにおける処理後のシュードモナス・エルギノーサ株ＣＦＳ−１２９２に時間−死滅形式を用いて決定された、（未処理対照と比較した）コロニー形成単位の対数減少を示す。
【０１９０】
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【０１９１】
さらに、実施例２で上述したとおりに調製したペプチドのインキュベーション後のＭＩＣの倍変化を検出するため、安定性の評定を行った。安定性を、１００％ヒト血清中で３７℃でのインキュベーションの１０分後、１時間及び２時間後に評定した。結果を下記表１１に示す。
【０１９２】
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【０１９３】
表１１に示すように、Ｃｈｐ１、Ｃｈｐ２、ＣＰＡＲ３９、Ｃｈｐ４、Ｃｈｐ５、Ｃｈｐ６、Ｃｈｐ７、Ｃｈｐ８、Ｃｈｐ９、Ｃｈｐ１０、Ｃｈｐ１１、Ｃｈｐ１２、Ｇｋｈ１、Ｇｋｈ２、Ｇｋｈ３、Ｅｃｐ１、Ｅｃｐ２、Ｅｃｐ３、Ｅｃｐ４、Ｏｓｐ１、Ｕｎｐ１、Ｕｎｐ２、Ｕｎｐ３、Ｕｎｐ５、Ｕｎｐ６、Ｓｐｉ１、Ｓｐｉ２、Ｂｄｐ１、Ｌｖｐ１、Ｌｖｐ２、ＡＬＣＥＳ１、ＡＶＱ２０６、ＡＶＱ２４４、ＣＤＬ９０７、ＡＧＴ９１５、ＨＨ３９３０、Ｆｅｎ７８７５及びＳＢＲ７７はいずれも１０分後、１時間後及び２時間後に十分に安定であった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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