(57)【要約】  本発明は、アブラムシに高致死性のRNAi標的遺伝子およびその使用に関する。具体的に、本発明は、6つのRNA干渉技術に基づいた昆虫の幼虫および/または成虫期の死亡につながる遺伝子断片を公開したが、dsRNAを含有する組成物を植物に散布してアブラムシに摂食させるか、直接アブラムシの表面に散布することにより、アブラムシを致死させることができる。本発明方法は、便利で、快速で、正確で、効率的である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖で、かつそのフォワード鎖またはリバース鎖に式Iで表される構造が含まれることを特徴とするdsRNA構築物。
Seqフォワード-X-Seqリバース       式I
（式中において、
Seqフォワードは、昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子または断片のヌクレオチド配列である。
Seqリバースは、Seqフォワードに基本的に相補的なヌクレオチド配列である。
Xは、SeqフォワードとSeqリバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeqフォワードおよびSeqリバースに相補的なものではない。
ここで、前記の昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子は、DS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、DS45遺伝子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。）
【請求項２】
式IIで表されるdsRNA。
【化１】
2021523726.tif 000019
（式中において、
Seq'フォワードは、昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子または断片のヌクレオチド配列に相応するRNA配列または配列断片である。
Seq’リバースはSeq’フォワードに基本的に相補的な配列である。
X’はないか、あるいはSeq’フォワードとSeq’リバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeq’フォワードおよびSeq’リバースに相補的なものではない。
ここで、前記の昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子は、DS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、DS45遺伝子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。）
|| は、Seq’フォワードとSeq’リバースの間に形成された水素結合を表す。）
【請求項３】
前記昆虫は植食性昆虫で、好ましくは同翅亜目（Homoptera）の昆虫で、最も好ましくはワタアブラムシ属（Aphis）であることを特徴とする請求項1に記載のdsRNA構築物。
【請求項４】
請求項1に記載のdsRNA構築物を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項５】
請求項4に記載の発現ベクターを含むか、あるいは染色体に請求項1に記載のdsRNA構築物に相応するDNA配列が組み込まれていることを特徴とする宿主細胞。
【請求項６】
請求項1に記載のdsRNA構築物および/または請求項2に記載のdsRNAと、昆虫の摂食で許容される担体とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項1に記載のdsRNA構築物、または請求項2に記載のdsRNA、または請求項5に記載の宿主細胞、または請求項6に記載の組成物の使用であって、以下の群から選ばれることを特徴とする使用：
(1) アブラムシの防除効果の向上、および/または
(2) 虫数減少率の向上、および/または
(3) 幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子の発現量の降下、および/または
(4) 虫数基盤の降下、および/または
(5) 植物被害率の減少、および/または
(6) 作物の被害程度の降下、農作物の品質の向上。
【請求項８】
昆虫を滅殺する方法であって、幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子の発現を干渉する干渉分子、あるいは前記干渉分子を含む担体、細胞、植物組織または昆虫防除試薬で昆虫に投与または散布する工程を含み、
好ましくは、前記の昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子は、DS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、DS45遺伝子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項2に記載のdsRNAを製造する方法であって、
（i） dsRNAを発現する構築物であって、二本鎖で、かつそのプラス鎖またはマイナス鎖に式Iで表される構造が含まれる構築物を製造する工程、
Seqフォワード-X-Seqリバース    式I
（式中において、
Seqフォワードは、昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子または断片のヌクレオチド配列である。
Seqリバースは、Seqフォワードに基本的に相補的なヌクレオチド配列である。
Xは、SeqフォワードとSeqリバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeqフォワードおよびSeqリバースに相補的なものではない。
ここで、前記の昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子は、DS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、DS45遺伝子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。）
（ii） 工程（i）に記載の構築物を宿主細胞に導入することによって、宿主細胞において式IIで表されるdsRNAを発現させる工程、
【化２】
2021523726.tif 000020
（式中において、
Seq’フォワードはSeqフォワード配列に相応するRNA配列または配列断片である。
Seq’リバースはSeq’フォワードに基本的に相補的な配列である。
X’はないか、あるいはSeq’フォワードとSeq’リバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeq’フォワードおよびSeq’リバースに相補的なものではない。
|| は、Seq’フォワードとSeq’リバースの間に形成された水素結合を表す。）
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
昆虫防除試薬を製造する方法であって、請求項1に記載のdsRNA構築物、または請求項2に記載のdsRNA、または請求項5に記載の宿主細胞、または請求項6に記載の組成物を植物の表面に散布することにより、昆虫防除試薬を製造する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
植物の昆虫に対する耐性を向上させる方法であって、
植物において組み換えDNA構築物を発現させ、ここで、前記組み換えDNA構築物はRNAをコードするDNAを含み、前記RNAは前記標的遺伝子の少なくとも21またはそれ以上の連続したヌクレオチドと基本的に同様の配列またはそれと基本的に相補的な配列を有し、ここで、前記標的遺伝子は昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子で、DS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、DS45遺伝子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
遺伝子組み換え植物細胞を製造する方法であって、
（i）組み換えDNA構築物を植物細胞に導入または形質移入することによって前記植物細胞に前記構築物を含有させることで、前記遺伝子組み換え植物細胞を製造し、ここで、前記組み換えDNA構築物はRNAをコードするDNAを含み、前記RNAは前記標的遺伝子の少なくとも21またはそれ以上の連続したヌクレオチドと基本的に同様の配列またはそれと基本的に相補的な配列を有し、ここで、前記標的遺伝子は昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子で、DS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、DS45遺伝子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
遺伝子組み換え植物を製造する方法であって、
請求項12に記載の方法によって製造された前記遺伝子組み換え植物細胞を植物体に再生させることで、前記遺伝子組み換え植物を得る工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術および農業応用の分野に属する。具体的に、本発明は、アブラムシに高致死性のRNAi標的遺伝子およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アブラムシは主要な世界的害虫で、半翅目（Hemiptera）、アブラムシ上科（Aphidoidea）に属し、現在、約4700種類超が知られており、体型が小さく、繁殖速度が速く、主要な農業および園芸の害虫で、アブラムシに対する防除は、現在まだ主に化学薬剤であるが、繁殖速度が速く、見つかりにくいため、防除効果が劣り、大量に農薬を使用してその繁殖を抑制する必要があり、不可避にアブラムシの薬剤耐性につながっている。
【０００３】
RNAiは、遺伝子機能を研究するためのツールとして大量に利用され、特に遺伝子操作ツールが不十分な動植物において幅広く利用されている。しかしながら、現在、昆虫において、dsRNAが摂取によって昆虫の体内に入った後、細胞内に入らないとRNAi機構を活性化させることができない。昆虫の腸壁細胞は大半のdsRNAのほかの組織への進入を阻止することができ、RNAiの効率に影響する要因の一つで、現在、dsRNAの経口送達方法の応用に対する最大の障碍でもある。
【０００４】
昆虫の種類によってdsRNAに対する摂取機構が異なることで、dsRNAへの応答および標的遺伝子のサイレンシング効率が異なるため、異なる種類の昆虫に対する致死作用の差が大きい。
そのため、本分野では、アブラムシに高致死性のRNAi標的遺伝子の開発が切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、アブラムシに高致死性のRNAi標的遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第一の側面では、二本鎖で、かつそのフォワード鎖またはリバース鎖に式Iで表される構造が含まれるdsRNA構築物を提供する。
Seqフォワード-X-Seqリバース       式I
（式中において、
Seqフォワードは、昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子または断片のヌクレオチド配列である。
Seqリバースは、Seqフォワードに基本的に相補的なヌクレオチド配列である。
Xは、SeqフォワードとSeqリバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeqフォワードおよびSeqリバースに相補的なものではない。
ここで、前記の昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子は、DS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、DS45遺伝子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。）
【０００７】
もう一つの好適な例において、前記dsRNAの長さは少なくとも21 ntである。
もう一つの好適な例において、DS7遺伝子の場合、前記dsRNAの長さは21 nt〜1350 nt、好ましくは506 nt〜1093 ntである。
もう一つの好適な例において、DS9遺伝子の場合、前記dsRNAの長さは21 nt〜909 nt、好ましくは54 nt〜631 ntである。
もう一つの好適な例において、DS15遺伝子の場合、前記dsRNAの長さは21 nt〜2148 nt、好ましくは516 nt〜1029 ntである。
もう一つの好適な例において、DS25遺伝子の場合、前記dsRNAの長さは21 nt〜1233 nt、好ましくは58 nt〜674 ntである。
【０００８】
もう一つの好適な例において、DS27遺伝子の場合、前記dsRNAの長さは21 nt〜1152 nt、好ましくは219 nt〜748 ntである。
もう一つの好適な例において、DS45遺伝子の場合、前記dsRNAの長さは21 nt〜909 nt、好ましくは42 nt〜637 ntである。
もう一つの好適な例において、前記dsRNAとの相同性は少なくとも80％で、好ましくは85％〜100％である。
もう一つの好適な例において、Seqフォワード、Seqリバースの長さは少なくとも50 bpである。
【０００９】
もう一つの好適な例において、前記dsRNA構築物は式IIで表されるdsRNAになれる。
【化１】
2021523726.tif 000002
（式中において、
Seq’フォワードはSeqフォワード配列に相応するRNA配列または配列断片である。
Seq’リバースはSeq’フォワードに基本的に相補的な配列である。
X’はないか、あるいはSeq’フォワードとSeq’リバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeq’フォワードおよびSeq’リバースに相補的なものではない。
|| は、Seq’フォワードとSeq’リバースの間に形成された水素結合を表す。）
【００１０】
もう一つの好適な例において、前記dsRNAはループのないdsRNAである。
もう一つの好適な例において、前記dsRNAは配列番号9-10で示される配列から増幅して得られる。
もう一つの好適な例において、前記dsRNAは配列番号11-12で示される配列から増幅して得られる。
もう一つの好適な例において、前記dsRNAは配列番号13-14で示される配列から増幅して得られる。
もう一つの好適な例において、前記dsRNAは配列番号15-16で示される配列から増幅して得られる。
もう一つの好適な例において、前記dsRNAは配列番号17-18で示される配列から増幅して得られる。
もう一つの好適な例において、前記dsRNAは配列番号19-20で示される配列から増幅して得られる。
【００１１】
本発明の第二の側面では、式IIで表されるdsRNAを提供する。
【化２】
2021523726.tif 000003
（式中において、
Seq'フォワードは、昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子または断片のヌクレオチド配列に相応するRNA配列または配列断片である。
Seq’リバースはSeq’フォワードに基本的に相補的な配列である。
X’はないか、あるいはSeq’フォワードとSeq’リバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeq’フォワードおよびSeq’リバースに相補的なものではない。
ここで、前記の昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子は、DS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、DS45遺伝子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
|| は、Seq’フォワードとSeq’リバースの間に形成された水素結合を表す。）
【００１２】
もう一つの好適な例において、Seqフォワード、Seqリバースの長さは少なくとも50 bpである。
もう一つの好適な例において、前記のスペーサー配列X'の長さは0〜300 bpである。
もう一つの好適な例において、前記の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子はワタアブラムシ属（Aphis）由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記DS7遺伝子の配列は配列番号1または24で示される。
もう一つの好適な例において、前記DS9遺伝子の配列は配列番号2または25で示される。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記DS15遺伝子の配列は配列番号3または26で示される。
もう一つの好適な例において、前記DS25遺伝子の配列は配列番号4または27で示される。
もう一つの好適な例において、前記DS27遺伝子の配列は配列番号5または28で示される。
もう一つの好適な例において、前記DS45遺伝子の配列は配列番号6または29で示される。
もう一つの好適な例において、前記昆虫は植食性昆虫で、好ましくは同翅亜目（Homoptera）の昆虫で、最も好ましくはワタアブラムシ属（Aphis）である。
もう一つの好適な例において、前記昆虫は、モモアカアブラムシ、ダイズアブラムシ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００１４】
本発明の第三の側面では、本発明の第一の側面に記載のdsRNA構築物を含有する発現ベクターを提供する。
本発明の第四の側面では、本発明の第三の側面に記載の発現ベクターを含むか、あるいは染色体に本発明の第一の側面に記載のdsRNA構築物のDNA配列が組み込まれた宿主細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は植物細胞で、好ましくは緑葉植物細胞である。
もう一つの好適な例において、前記植物はアブラナ科の植物（たとえば野菜や大豆）を含む。
【００１５】
本発明の第五の側面では、本発明の第一の側面に記載のdsRNA構築物および/または本発明の第二の側面に記載のdsRNAと、昆虫の摂食で許容される担体とを含む組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の昆虫の摂食で許容される担体は水を含む。
もう一つの好適な例において、前記の組成物はワタアブラムシ属（Aphis）の幼虫および/または成虫期の死亡を誘導するか引き起こすための組成物である。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前記のdsRNAは以下の配列を有する：
dsRNA1：配列番号1または24で示される配列を有する；
dsRNA2：配列番号2または25で示される配列を有する；
dsRNA3：配列番号3または26で示される配列を有する；
dsRNA4：配列番号4または27で示される配列を有する；
dsRNA5：配列番号5または28で示される配列を有する；
dsRNA6：配列番号6または29で示される配列を有する。
【００１７】
もう一つの好適な例において、DS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、および/またはDS45遺伝子は昆虫由来のもので、好ましくは同翅亜目（Homoptera）の昆虫由来のもので、最も好ましくはワタアブラムシ属（Aphis）由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物では、dsRNA1の含有量は1〜500 ng/μL、好ましくは5〜300 ng/μL、より好ましくは50〜150 ng/μLである。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物では、dsRNA2の含有量は1〜500 ng/μL、好ましくは5〜300 ng/μL、より好ましくは50〜150 ng/μLである。
【００１８】
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物では、dsRNA3の含有量は1〜500 ng/μL、好ましくは5〜300 ng/μL、より好ましくは50〜150 ng/μLである。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物では、dsRNA4の含有量は1〜500 ng/μL、好ましくは5〜300 ng/μL、より好ましくは50〜150 ng/μLである。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物では、dsRNA5の含有量は1〜500 ng/μL、好ましくは5〜300 ng/μL、より好ましくは50〜150 ng/μLである。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物では、dsRNA6の含有量は1〜500 ng/μL、好ましくは5〜300 ng/μL、より好ましくは50〜150 ng/μLである。
【００１９】
本発明の第六の側面では、本発明の第一の側面に記載のdsRNA構築物、または本発明の第二の側面に記載のdsRNA、または本発明の第四の側面に記載の宿主細胞、または本発明の第五の側面に記載の組成物の使用であって、以下の群から選ばれる使用を提供する：
(1) アブラムシの防除効果の向上、および/または
(2) 虫数減少率の向上、および/または
(3) 幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子の発現量の降下、および/または
(4) 虫数基盤の降下、および/または
(5) 植物被害率の減少、および/または
(6) 作物の被害程度の降下、農作物の品質の向上。
【００２０】
本発明の第七の側面では、昆虫を滅殺する方法であって、幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子の発現を干渉する干渉分子、あるいは前記干渉分子を含む担体、細胞、植物組織または昆虫防除試薬で昆虫に投与または散布する工程を含み、
好ましくは、前記の昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子は、DS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、DS45遺伝子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる方法を提供する。
【００２１】
もう一つの好適な例において、前記昆虫の滅殺は、以下のことを含む：
(1) アブラムシの防除効果の向上、および/または
(2) 虫数減少率の向上、および/または
(3) 幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子の発現量の降下、および/または
(4) 虫数基盤の降下、および/または
(5) 植物被害率の減少、および/または
(6) 作物の被害程度の降下、農作物の品質の向上。
【００２２】
もう一つの好適な例において、前記の干渉分子は、昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子またはその断片またはその転写物を抑制またはサイレンシングの標的とするdsRNA、アンチセンス核酸、低分子干渉分子、マイクロRNAから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子はワタアブラムシ属（Aphis）由来のものである。
【００２３】
もう一つの好適な例において、前記昆虫は植食性昆虫で、好ましくは半翅目（Hemiptera）からの昆虫で、最も好ましくはワタアブラムシ属（Aphis）からの昆虫である。
もう一つの好適な例において、前記方法は、本発明の第一の側面に記載のdsRNA構築物、または本発明の第二の側面に記載のdsRNA、または本発明の第四の側面に記載の宿主細胞、または本発明の第五の側面に記載の組成物を昆虫に投与または散布する工程を含む。
【００２４】
本発明の第八の側面では、本発明の第二の側面に記載のdsRNAを製造する方法であって、
（i） dsRNAを発現する構築物であって、二本鎖で、かつそのプラス鎖またはマイナス鎖に式Iで表される構造が含まれる構築物を製造する工程、
Seqフォワード-X-Seqリバース    式I
（式中において、
Seqフォワードは、昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子または断片のヌクレオチド配列である。
Seqリバースは、Seqフォワードに基本的に相補的なヌクレオチド配列である。
Xは、SeqフォワードとSeqリバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeqフォワードおよびSeqリバースに相補的なものではない。
ここで、前記の昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子は、DS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、DS45遺伝子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。）
【００２５】
（ii） 工程（i）に記載の構築物を宿主細胞に導入することによって、宿主細胞において式IIで表されるdsRNAを発現させる工程、
【化３】
2021523726.tif 000004
（式中において、
Seq’フォワードはSeqフォワード配列に相応するRNA配列または配列断片である。
Seq’リバースはSeq’フォワードに基本的に相補的な配列である。
X’はないか、あるいはSeq’フォワードとSeq’リバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeq’フォワードおよびSeq’リバースに相補的なものではない。
|| は、Seq’フォワードとSeq’リバースの間に形成された水素結合を表す。）
を含む方法を提供する。
【００２６】
本発明の第九の側面では、昆虫防除試薬を製造する方法であって、本発明の第一の側面に記載のdsRNA構築物、または本発明の第二の側面に記載のdsRNA、または本発明の第四の側面に記載の宿主細胞、または本発明の第五の側面に記載の組成物を植物の表面に散布することにより、昆虫防除試薬を製造する工程を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記植物は、ダイズ、ダイコン、モモ、タバコ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００２７】
本発明の第十の側面では、植物の昆虫に対する耐性を向上させる方法であって、
植物において組み換えDNA構築物を発現させ、ここで、前記組み換えDNA構築物はRNAをコードするDNAを含み、前記RNAは前記標的遺伝子の少なくとも21またはそれ以上の連続したヌクレオチドと基本的に同様の配列またはそれと基本的に相補的な配列を有し、ここで、前記標的遺伝子は昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子で、DS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、DS45遺伝子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを含む方法を提供する。
【００２８】
もう一つの好適な例において、前記標的遺伝子は以下の群から選ばれる：
（i） 配列が配列番号1-6、24-29のいずれかで示されるポリヌクレオチド；
（ii） ヌクレオチド配列の配列番号1-6、24-29のいずれかで示される配列との相同性が≧80％、好ましくは85％〜90％、より好ましくは95％、96％、97％、98％、99％または100％のポリヌクレオチド；
（iii） 配列番号1-6、24-29のいずれかで示されるヌクレオチドの5’末端および/または3’末端において1〜60個（好ましくは1〜30、より好ましくは1〜10個）のヌクレオチドが削除または付加されたポリヌクレオチド；
（iv） （i）〜（iii）のいずれかに記載のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド。
【００２９】
もう一つの好適な例において、前記標的遺伝子は配列番号1-6、24-29のいずれかで示される。
もう一つの好適な例において、前記dsRNAとの相同性は少なくとも80％で、好ましくは85％〜100％で、より好ましくは95〜100％である。
もう一つの好適な例において、DS7遺伝子の場合、前記RNAは前記標的遺伝子の21 nt〜1350 nt、好ましくは506 nt〜1093 ntの連続したヌクレオチドと基本的に同様の配列またはそれと基本的に相補的な配列を有する。
もう一つの好適な例において、DS9遺伝子の場合、前記RNAは前記標的遺伝子の21 nt〜909 nt、好ましくは54 nt〜631 ntの連続したヌクレオチドと基本的に同様の配列またはそれと基本的に相補的な配列を有する。
【００３０】
もう一つの好適な例において、DS15遺伝子の場合、前記RNAは前記標的遺伝子の21 nt〜2148 nt、好ましくは516 nt〜1029 ntの連続したヌクレオチドと基本的に同様の配列またはそれと基本的に相補的な配列を有する。
もう一つの好適な例において、DS25遺伝子の場合、前記RNAは前記標的遺伝子の21 nt〜1233 nt、好ましくは58 nt〜674 ntの連続したヌクレオチドと基本的に同様の配列またはそれと基本的に相補的な配列を有する。
もう一つの好適な例において、DS27遺伝子の場合、前記RNAは前記標的遺伝子の21 nt〜1152 nt、好ましくは219 nt〜748 ntの連続したヌクレオチドと基本的に同様の配列またはそれと基本的に相補的な配列を有する。
もう一つの好適な例において、DS45遺伝子の場合、前記RNAは前記標的遺伝子の21 nt〜909 nt、好ましくは42 nt〜637 ntの連続したヌクレオチドと基本的に同様の配列またはそれと基本的に相補的な配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記RNAは少なくとも1本のRNA鎖を含むdsRNAである。
【００３１】
もう一つの好適な例において、前記RNA鎖は配列番号1-6、24-29から選ばれるいずれかで示される配列と少なくとも90％、好ましくは95〜100％の相同性を有する配列を含む。
もう一つの好適な例において、前記組み換えDNA構築物はプロモーター、好ましくは異種プロモーターを含む。
もう一つの好適な例において、前記プロモーターは、構成的プロモーター、空間特異的プロモーター、時間特異的プロモーター、発育特異的プロモーター、誘導型プロモーター、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記プロモーターは植物において機能を有するプロモーターである。
もう一つの好適な例において、前記プロモーターは、pol IIプロモーター、pol IIIプロモーター、pol IVプロモーター、pol Vプロモーター、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００３２】
もう一つの好適な例において、前記組み換えDNA構築物は、さらに、エンハンサー、低分子RNA認識部位、アプタマーまたはリボザイム、ターミネーター、コード配列を発現させるための余分な別の発現カセット（たとえば、導入遺伝子、たとえば殺虫タンパク質または選択可能なマーカーを発現させるもの）、非コード配列（たとえば、別の抑制エレメントを発現させるもの）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる1つまたは複数のほかのエレメントを含む。
もう一つの好適な例において、前記植物において、さらに、パタチン、フィトヘマグルチニン、植物ステロイド、バチルス・シューリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫タンパク質、ゼノラブダス属（Xenorhabdus）殺虫タンパク質、フォトラブダス属（Photorhabdus）殺虫タンパク質、バチルス菌後期殺虫タンパク質、バチルス・スファエリクス（Bacillus sphaericus）殺虫タンパク質からなる群から選ばれる1つまたは複数の殺虫剤タンパク質が発現される。
【００３３】
もう一つの好適な例において、前記植物は被子植物および裸子植物を含む。
もう一つの好適な例において、前記裸子植物は、ソテツ科(Cycadaceae)、マキ科(Podocarpaceae)、ナンヨウスギ科(Araucariaceae)、マツ科(Pinaceae)、スギ科（Taxodiaceae）、ヒノキ科（Cupressaceae）、イヌガヤ科（Cephalotaxaceae）、イチイ科（Taxaceae）、マオウ科（Ephedraceae）、グネツム科（Gnetaceae）、単型科（monotypic family）、ウェルウィッチア科（Welwitschiaceae）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００３４】
もう一つの好適な例において、前記植物は単子葉植物および双子葉植物を含む。
もう一つの好適な例において、前記植物は草本植物および木本植物を含む。
もう一つの好適な例において、前記草本植物は、ナス科植物、イネ科植物、マメ科植物、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記木本植物は、マタタビ科、バラ科、クワ科、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記植物は、アブラナ科植物、イネ科植物、マメ科植物、ナス科、マタタビ科、アオイ科、ボタン科、バラ科、ユリ科、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の植物は、シロイヌナズナ、イネ、ハクサイ、ダイズ、トマト、トウモロコシ、タバコ、コムギ、モロコシ、ダイコン、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００３５】
本発明の第十一の側面では、遺伝子組み換え植物細胞を製造する方法であって、
（i）組み換えDNA構築物を植物細胞に導入または形質移入することによって前記植物細胞に前記構築物を含有させることで、前記遺伝子組み換え植物細胞を製造し、ここで、前記組み換えDNA構築物はRNAをコードするDNAを含み、前記RNAは前記標的遺伝子の少なくとも21またはそれ以上の連続したヌクレオチドと基本的に同様の配列またはそれと基本的に相補的な配列を有し、ここで、前記標的遺伝子は昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子で、DS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、DS45遺伝子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを含む方法を提供する。
【００３６】
もう一つの好適な例において、前記標的遺伝子は以下の群から選ばれる：
（i） 配列が配列番号1-6、24-29のいずれかで示されるポリヌクレオチド；
（ii） ヌクレオチド配列の配列番号1-6、24-29のいずれかで示される配列との相同性が≧80％、好ましくは85％〜90％、より好ましくは95％、96％、97％、98％、99％または100％のポリヌクレオチド；
（iii） 配列番号1-6、24-29のいずれかで示されるヌクレオチドの5’末端および/または3’末端において1〜60個（好ましくは1〜30、より好ましくは1〜10個）のヌクレオチドが削除または付加されたポリヌクレオチド；
（iv） （i）〜（iii）のいずれかに記載のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド。
【００３７】
もう一つの好適な例において、前記dsRNAとの相同性は少なくとも80％で、好ましくは85％〜100％で、より好ましくは95〜100％である。
もう一つの好適な例において、DS7遺伝子の場合、前記RNAは前記標的遺伝子の21 nt〜1350 nt、好ましくは506 nt〜1093 ntの連続したヌクレオチドと基本的に同様の配列またはそれと基本的に相補的な配列を有する。
もう一つの好適な例において、DS9遺伝子の場合、前記RNAは前記標的遺伝子の21 nt〜909 nt、好ましくは54 nt〜631 ntの連続したヌクレオチドと基本的に同様の配列またはそれと基本的に相補的な配列を有する。
もう一つの好適な例において、DS15遺伝子の場合、前記RNAは前記標的遺伝子の21 nt〜2148 nt、好ましくは516 nt〜1029 ntの連続したヌクレオチドと基本的に同様の配列またはそれと基本的に相補的な配列を有する。
【００３８】
もう一つの好適な例において、DS25遺伝子の場合、前記RNAは前記標的遺伝子の21 nt〜1233 nt、好ましくは58 nt〜674 ntの連続したヌクレオチドと基本的に同様の配列またはそれと基本的に相補的な配列を有する。
もう一つの好適な例において、DS27遺伝子の場合、前記RNAは前記標的遺伝子の21 nt〜1152 nt、好ましくは219 nt〜748 ntの連続したヌクレオチドと基本的に同様の配列またはそれと基本的に相補的な配列を有する。
もう一つの好適な例において、DS45遺伝子の場合、前記RNAは前記標的遺伝子の21 nt〜909 nt、好ましくは42 nt〜637 ntの連続したヌクレオチドと基本的に同様の配列またはそれと基本的に相補的な配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記の形質移入にアグロバクテリウム菌による形質転換法またはパーティクル・ガン法が使用される。
【００３９】
本発明の第十二の側面では、遺伝子組み換え植物細胞を製造する方法であって、
本発明の第十一の側面に記載の方法によって製造された前記遺伝子組み換え植物細胞を植物体に再生させることで、前記遺伝子組み換え植物を得る工程を含む方法を提供する。
本発明の第十三の側面では、遺伝子組み換え植物細胞であって、本発明の第十一の側面に記載の方法によって製造される植物細胞を提供する。
本発明の第十四の側面では、遺伝子組み換え植物であって、本発明の第十二の側面に記載の方法によって製造される植物を提供する。
【００４０】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組み合わせ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図1は、標的遺伝子のアブラムシに対する防除効果を示す。
【図２】図2は、標的遺伝子の相対発現レベルの検出結果を示す。
【図３】図3は、モモアカアブラムシの3つの標的遺伝子のフィールドにおける防除効果を示す。
【図４】図4は、モモアカアブラムシのフィールドにおける防除効果および虫数減少率の統計分析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
具体的な実施形態
本発明者は幅広く深く研究し、アブラムシの幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子の断片をスクリーニングしたところ、意外に、配列番号1または24で示されるDS7遺伝子、配列番号2または25で示されるDS9遺伝子、配列番号3または26で示されるDS15遺伝子、配列番号4または27で示されるDS25遺伝子、配列番号5または28で示されるDS27遺伝子、配列番号6または29で示されるDS45遺伝子に対し、干渉RNA(dsRNA)を合成すると、前記dsRNAは（たとえばワタアブラムシ属（Aphis））による摂食または植食性昆虫の表面への直接の散布により、標的遺伝子を干渉し、標的遺伝子の発現を抑制し、最終的にアブラムシを滅殺することが見出された。また、本発明は、昆虫に対する耐性を向上させる植物を構築することができ、かつ本発明の方法によって、アブラムシを効率的に滅殺することができ、アブラムシの防除効果が≧80％で、虫数減少率が≧70％である。これに基づき、本発明者が本発明を完成した。
【００４３】
用語
本明細書で用いられるように、前記「農作物」とは農業において栽培される様々な植物である。食糧作物、経済作物（油料作物、野菜作物、花、草、木）、工業原料作物、飼料作物、薬材作物などを含み、そして大量に生長するか、大面積で収穫することができ、利益または食糧になる植物（たとえば穀物、野菜、綿、亜麻など）である。
【００４４】
そのうち、食糧作物は、主な作物として、イネ、トウモロコシ、マメ類、イモ類、ハダカムギ、ソラマメ、コムギで、油料作物は、主に、油料種子、カブ、カラシナ、ラッカセイ、ゴマ、タイマ、ヒマワリなどで、野菜作物は、主に、ダイコン、ハクサイ、セロリ、ニラ、ニンニク、ネギ、ニンジン、ヘチマ、キャベツ、キクイモ、ナタマメ、コエンドロ、ステムレタス、ユウスゲ、トウガラシ、キュウリ、トマト、パクチーなどで、果実類は、ナシ、アオウメ、リンゴ、モモ、アンズ、クルミ、スモモ、サクランボ、イチゴ、ワリンゴ、ナツメなどの品種で、野生果実類は、シュウシリ、山アンズ、野生モモ、サネブトナツメ、ユスラウメ、サジーなどで、飼料作物は、たとえば、トウモロコシ、緑肥、ゲンゲなどで、薬用作物は、オタネニンジン、トウキ、スイカズラ、ミント、チョウセンヨモギなどである。
【００４５】
RNA干渉（RNAi）
本明細書で用いられるように、用語「RNA干渉（RNA interference、RNAi）」とは、一部の小さい二本鎖RNAは効率的に、特異的に体内における特定の遺伝子の発現を遮断し、mRNAの分解を促進し、細胞が特定の遺伝子が欠失した表現型を示すように誘導するが、RNA関与またはRNAインターフェレンスとも呼ばれる。RNA干渉は高度に特異的なmRNAレベルにおける遺伝子サイレンシング機構である。
本明細書で用いられるように、用語「低分子干渉RNA（small interfering RNA、siRNA）」とは短鎖断片の二本鎖RNA分子で、相同相補配列のmRNAを標的として特定のmRNAを分解させることができるが、この過程はRNA干渉経路（RNA interference pathway）である。
【００４６】
本発明において、前記RNA干渉の基本の原理は、植物を媒介とし、昆虫にその遺伝子（たとえばDS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、DS45遺伝子）の発現を干渉できる低分子干渉RNA（siRNA）を摂食させることにより、昆虫の生長を抑制する。
具体的に、前記の原理は、アブラムシの植食性摂食またはアブラムシへの干渉物質の散布により、RNAiを虫体に入らせ、標的遺伝子のRNAを干渉し、標的遺伝子の発現を抑制することで、昆虫の正常の生長・発育を干渉し、アブラムシの死亡につながる。
【００４７】
一つの好適な形態として、1つのイントロンの配列を利用し、両末端に相補的な遺伝子配列を連結し、細胞に導入すると、「ネック-ループ」構造が生じ、そして「ネック」状の部分が昆虫の体内において約21-25 nt程度の小さいRNAに加工され、このような小さいRNAは特に有効に標的遺伝子の発現を抑制することができる。
もう一つの好適な形態として、表1におけるT7付きプライマーをそれぞれ利用して増幅し、転写の相補作用で二本鎖RNAが形成し、このような二本鎖RNAはそのまま標的遺伝子の発現の抑制に使用することができる。
【００４８】
昆虫遺伝子
本明細書で用いられるように、用語「昆虫遺伝子」とは、昆虫の幼虫および/または成虫期の調節に関連する遺伝子で、本発明の一つの好適な例において、前記の昆虫遺伝子はDS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、および/またはDS45遺伝子で、前記遺伝子の低発現または不発現によって昆虫の生長、発育、代謝、繁殖などの過程に異常が生じ、さらに昆虫の死亡につながる。
【００４９】
本発明の好適な形態として、本発明の好適な昆虫遺伝子の断片の長さは少なくとも21 bpで、たとえば30 bp、50 bp、60 bp、80 bp、100 bp、200 bp、500 bp、1000 bpまたは遺伝子の全長でもよい。前記遺伝子は、本発明に使用される場合、全長の遺伝子または遺伝子断片でもよく、好ましくは、DS7遺伝子に対する断片は配列番号24で示され、DS9遺伝子に対する断片は配列番号25で示され、DS15遺伝子に対する断片は配列番号26で示され、DS25遺伝子に対する断片は配列番号27で示され、DS27遺伝子に対する断片は配列番号28で示され、DS45遺伝子に対する断片は配列番号29で示され、これらの断片はこれらの遺伝子との類似度がそれぞれ85％〜100％で、いずれも同様の殺虫効果が生じる。
【００５０】
また、本発明は、配列が配列番号23で示されるDS50遺伝子に対するdsRNAを提供する。DS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、および/またはDS45遺伝子と比べ、DS50遺伝子の防除効果が劣り、最高でも約23％である。
本発明は、昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子に対する干渉RNAを提供するが、昆虫は経口でRNAiが散布された植物または発現されたdsRNA構築物またはdsRNAを投与することにより、前記の干渉RNAiを摂取するか、あるいは干渉RNAiを直接昆虫の表面に散布することができる。
【００５１】
本発明で示されたdsRNA構築物は式Iで表され、dsRNAは式IIで表され、使用されるスペーサー配列Xの長さが特に限定されず、フォワード配列およびリバース配列と構築物になって体内に導入された後、式IIで表されるdsRNAになれるものであればよい。本発明の好適な形態として、本発明に記載のスペーサー配列の長さは80〜300 bp、好ましくは100〜250 bpである。
本発明の一つの好適な例において、前記の昆虫遺伝子dsRNAを発現する構築物を宿主細胞に導入し、前記宿主細胞は植物の細胞、組織または器官でもよく、前記構築物は植物体内で昆虫遺伝子dsRNAを発現することができ、dsRNAはsiRNAに加工される。一般的に、siRNAの長さは約21〜25 nt程度である。
【００５２】
通常、前記の構築物は発現ベクターにある。前記の発現ベクターは、通常、さらにプロモーター、複製起点および/またはマーカー遺伝子などを含む。当業者に熟知の方法は、本発明に必要な発現ベクターの構築に使用することができる。これらの方法は、体外組み換えDNA技術、DNA合成技術、体内組み換え技術などを含む。前記の発現ベクターは、好ましくは1つまたは2つ以上の選択性マーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞を選択するための形質、たとえばカナマイシン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、アンピシリン耐性を提供する。
上記の適切な遺伝子配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターは、適切な宿主細胞を形質転換させることができる。本発明の方法において、前記の宿主は任意の前記発現ベクターを担持し、かつ前記発現ベクターを植物細胞に送達することができる宿主でもよい。好ましくは、前記の宿主はアグロバクテリウム菌である。
【００５３】
本発明の実例で挙げられた昆虫はアブラムシである。しかし、本発明では、本発明に適用される昆虫が特に制限されず、前記昆虫は任意の植物を食する植食性昆虫、たとえば半翅目（Hemiptera）の昆虫でもよい。
本発明では、本発明に適用される植物が特に制限されず、好ましくはアブラムシが食する植物、たとえばダイズ、ダイコン、モモ、タバコなどである。
【００５４】
DS7遺伝子
本明細書で用いられるように、用語「DS7遺伝子」、「チューブリンα鎖様（tubulin alpha chain-like）」、「チューブリンα鎖」は入れ替えて使用することができ、いずれも幅広く分布する1種類の球状タンパク質で、細胞内における微小管の基本の構造単位で、細胞の運動および分裂のいずれにおいても重要な作用を発揮し、幼虫期で発現される。
【００５５】
本発明において、当該タンパク質のC末端の一部のグルタミン酸残基がポリグルタミル化され、γ-カルボキシ基におけるポリグルタミン酸鎖が形成している。ポリグルタミル化はスパスチン（SPAST）の微小管の切断において重要な作用を果たす。SPASTが優先的にオリゴグルタミン酸の尾部で修飾された微小管を認識して作用する：SPASTの切断活性が各チューブリンのグルタミン酸塩の数の1から8の増加につれて増加するが、当該グルタミル化の閾値よりも低下する。
【００５６】
C末端の一部のグルタミン酸残基はモノグリコシル化されたものであるが、ポリグリセロール化されたものではない。モノグリシン化は主に軸糸に入ったチューブリン（繊毛および鞭毛）に限られる。ポリバレリル化およびモノグリシン化はいずれも隣接する残基における同様のタンパク質に共存してもよく、かつグリシン化レベルを低下させると、ポリバレリル化が増加し、そして相互作用する。
本発明の一つの実施形態において、RNAi技術に基づき、DS7遺伝子を標的とし、DS7遺伝子に対する干渉RNA断片をスクリーニングし、好ましくは、前記DS7遺伝子断片の配列は配列番号1または24で示される。
【００５７】
ATGCGTGAATGTATCTCTGTACACGTTGGCCAAGCTGGTGTTCAAATCGGTAATGCCTGCTGGGAATTGTACTGTTTGGAACATGGAATTGCTCCAGATGGTCAAATGCCATCTGACAAGACCATTGGAGGTGGAGACGACAGCTTCAACACCTTCTTCAGCGAAACTGGCTCAGGCAAACATGTGCCAAGAGCTGTGTTCGTTGATCTCGAACCAACTGTTGTTGATGAGGTAAGAACTGGAACATACCGCCAGTTGTTCCACCCTGAACAATTGATCACTGGTAAGGAAGATGCCGCCAACAACTACGCACGTGGACACTACACTATCGGAAAAGAGATTGTTGATGTTGTTTTGGACCGAATCAGGAAATTGGCTGATCAGTGCACTGGTCTTCAAGGTTTCCTGATCTTCCACTCTTTCGGAGGTGGTACTGGATCTGGTTTCACATCTTTGTTGATGGAAAGACTCAGCGTTGACTACGGAAAGAAGAGTAAATTAGAATTCGCCATCTACCCAGCCCCTCAAGTATCCACAGCTGTAGTTGAGCCATACAACTCCATCTTGACCACACATACAACTCTTGAACACAGTGACTGTGCATTCATGGTCGATAATGAAGCCATCTATGACATCTGCCGTCGTAATCTCGATATTGAACGTCCAACTTACACTAACTTGAATCGTCTTATTGGCCAGATTGTTTCTTCAATCACAGCTTCTCTCCGTTTCGATGGTGCCCTCAATGTTGACTTGACTGAATTCCAGACCAATTTGGTCCCATACCCCCGTATTCATTTCCCATTGGTCACCTATGCACCAGTCATCTCCGCTGAAAAGGCTTACCATGAACAATTGTCCGTATCAGAAATCACTAACGCTTGTTTTGAACCAGCCAACCAAATGGTGAAATGTGATCCACGTCATGGCAAATACATGGCTTGTTGCATGTTGTACCGTGGTGATGTTGTACCCAAAGACGTCAACGCTGCCATTGCTTCCATCAAGACCAAGAGAACAATTCAGTTTGTTGACTGGTGTCCAACTGGTTTCAAAGTTGGTATCAACTACCAACCCCCAACCGTGGTACCCGGTGGTGACTTGGCTAAGGTACAACGTGCCGTCTGCATGTTGTCCAACACTACAGCTATTGCTGAAGCTTGGGCTAGGTTGGACCACAAGTTCGACTTGATGTACGCCAAACGTGCTTTCGTCCATTGGTATGTTGGAGAAGGTATGGAAGAAGGAGAATTCTCTGAAGCTCGTGAGGATTTGGCTGCTCTAGAGAAAGATTACGAAGAGGTTGGCATGGACTCCGTCGAAGGCGAAGGCGAAGGTGGTGAAGAATAC （配列番号1）
【００５８】
TAATACGACTCACTATAGGGAGATCGCCATCTACCCAGCCCCTCAAGTATCCACAGCTGTAGTTGAGCCATACAACTCCATCTTGACCACACATACAACTCTTGAACACAGTGACTGTGCATTCATGGTCGATAATGAAGCCATCTATGACATCTGCCGTCGTAATCTCGATATTGAACGTCCAACTTACACTAACTTGAATCGTCTTATTGGCCAGATTGTTTCTTCAATCACAGCTTCTCTCCGTTTCGATGGTGCCCTCAATGTTGACTTGACTGAATTCCAGACCAATTTGGTCCCATACCCCCGTATTCATTTCCCATTGGTCACCTATGCACCAGTCATCTCCGCTGAAAAGGCTTACCATGAACAATTGTCCGTATCAGAAATCACTAACGCTTGTTTTGAACCAGCCAACCAAATGGTGAAATGTGATCCACGTCATGGCAAATACATGGCTTGTTGCATGTTGTACCGTGGTGATGTTGTACCCAAAGACGTCAACGCTGCCATTGCTTCCATCAAGACCAAGAGAACAATTCAGTTTGTTGACTGGTGTCCAACTGGTTTCAAAGTTGGTATCAACTACCAACCCCCAACCGTGGTACCCG AGAGGGATATCACTCAGCATAAT（配列番号24）
【００５９】
DS9遺伝子
本明細書で用いられるように、用語「DS9遺伝子」、「ADP/ATPトランスロカーゼ3様（ADP/ATP translocase 3-like）」、「ADP/ATP輸送体（AAC）」は入れ替えて使用することができ、リン酸化して合成されたATPを細胞質に輸送し、細胞の主なエネルギー源として、熱力学反応に動力を供給し、幼虫期で発現される。
本発明において、当該タンパク質は輸送体で、細胞内におけるアデノシン二リン酸（ADP）およびミトコンドリアにおけるアデノシン三リン酸（ATP）にミトコンドリア内膜を通過させる。遊離ADPは細胞質からミトコンドリア基質に輸送され、酸化・リン酸化によって生成したATPはミトコンドリア基質から細胞質に輸送されることで、細胞に主なエネルギーを提供する。
本発明の一つの実施形態において、RNAi技術に基づき、DS9遺伝子を標的とし、DS9遺伝子に対するRNA断片をスクリーニングし、好ましくは、前記DS9遺伝子断片の配列は配列番号2または25で示される。
【００６０】
ATGGCCGAAACCAAAGCGCCGAAGGACCCGTATGGTTTCTTGAAGGACTTCATGGCCGGTGGTATCTCCGCTGCCGTGTCGAAGACCGCCGTGGCTCCGATCGAGCGCGTCAAGCTTATCCTGCAAGTGCAGGCCGCTTCCACGCAGATCGCCGCCGACCAACAGTACAAAGGAATTATGGACTGTTTGGTGAGAATCCCAAAAGAACAAGGATTTGCCAGTTTCTGGAGAGGTAACTTTGCCAATGTCATCAGGTACTTCCCAACACAAGCATTGAACTTTGCTTTCAAGGATGTCTACAAACAGGTGTTTATGGACGGTGTGGATAAAAAGACTCAATTCTGGCGGTATTTTGCTGGTAACTTGGCATCTGGTGGTGCTGCTGGAGCAACATCTTTGTGCTTTGTATACCCCCTCGATTACGCACGTACACGATTAGGAGCTGATGTCGGTAAAGGACCAGCTGAAAGGCAGTTCAAAGGTCTTGGTGATTGTTTAGCCAAAACCGTCAAGTCTGATGGTCCCATTGGTTTGTACCGTGGTTTCATTGTATCAGTACAGGGTATCATCATCTACCGTGCTGCATACTTTGGATTTTTCGACACAGCTAAGGGAATGTTGCCAGACCCCAAGAATACTCCATTCTTAGTTTCATGGGGTATCGCCCAATTTGTAACAACATTCGCTGGTATTATGTCCTATCCATTTGACACAGTCAGACGTCGTATGATGATGCAATCTGGCCGTGCTGCTGACCAACGCATGTACAAGAGCACATTGGACTGCTGGGGTAAACTTTACAAGAATGAAGGTACATCTGCTTTCTTCAAGGGTGCATTCTCCAACGTACTCAGAGGTACTGGTGGTGCCTTGGTGTTGGTCTTCTACGACGAACTCAAAAACCTCATG (配列番号2)
【００６１】
TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCCGGTGGTATCTCCGCTGCCGTGTCGAAGACCGCCGTGGCTCCGATCGAGCGCGTCAAGCTTATCCTGCAAGTGCAGGCCGCTTCCACGCAGATCGCCGCCGACCAACAGTACAAAGGAATTATGGACTGTTTGGTGAGAATCCCAAAAGAACAAGGATTTGCCAGTTTCTGGAGAGGTAACTTTGCCAATGTCATCAGGTACTTCCCAACACAAGCATTGAACTTTGCTTTCAAGGATGTCTACAAACAGGTGTTTATGGACGGTGTGGATAAAAAGACTCAATTCTGGCGGTATTTTGCTGGTAACTTGGCATCTGGTGGTGCTGCTGGAGCAACATCTTTGTGCTTTGTATACCCCCTCGATTACGCACGTACACGATTAGGAGCTGATGTCGGTAAAGGACCAGCTGAAAGGCAGTTCAAAGGTCTTGGTGATTGTTTAGCCAAAACCGTCAAGTCTGATGGTCCCATTGGTTTGTACCGTGGTTTCATTGTATCAGTACAGGGTATCATCATCTACCGTGCTGCATACTTTGGATTTTTCGACACAGCTAAGGGAATGTTGCCAGACCCCA AGAGGGATATCACTCAGCATAAT （配列番号25）
【００６２】
DS15遺伝子
本明細書で用いられるように、用語「DS15遺伝子」、「熱ショックタンパク質83様（heat shock protein 83-like）」、「熱ショックタンパク質83」は入れ替えて使用することができ、細胞内における分子シャペロンタンパク質で、タンパク質の相互作用において重要な作用を有し、たとえば適切なフォルディングや適切なタンパク質の立体配座の構築に協力する。幼虫期で発現される。
【００６３】
本発明において、熱ショックタンパク質（HSP）は細胞がストレス条件に露出すると応答して生じるタンパク質のファミリーである。まず、熱ショックに関連するが、現在、ほかのストレス、たとえば、寒さに露出すること、そして傷の癒合または組織再構築も知られている。当該ファミリーの多くのメンバーは新しいタンパク質を安定化させることによって正しいフォルディングを維持するか、細胞のストレスによって損傷したタンパク質のフォルディングに協力して分子シャペロンの機能を果たす。増加は転写の調節である。熱ショックタンパク質の顕著な上方調節は熱ショック反応の重要な部分で、主に熱ショック因子（HSF）によって誘導される。
本発明の一つの実施形態において、RNAi技術に基づき、DS15遺伝子を標的とし、DS15遺伝子に対するRNA断片をスクリーニングし、好ましくは、前記DS15遺伝子断片の配列は配列番号3または26で示される。
【００６４】
ATGCCTGAAGACGTTACCATGACTGCATCTGATGATGTTGAGACCTTCGCTTTCCAAGCTGAGATCGCTCAGCTTATGTCCCTCATCATCAACACCTTCTACTCGAACAAAGAAATCTTTTTGCGAGAATTGGTATCCAATTCTTCTGATGCATTGGACAAAATTCGTTATGAGTCATTGACTGATCCATCCAAATTGGAATCTGGCAAAGATTTACACATTAAAATCATCCCCAATGCGGAAGAAAAAACTCTGACCATTATTGACACTGGTATCGGTATGACCAAAGCTGATCTAGTCAACAACTTGGGAACCATTGCTAAATCTGGTACTAAGGCTTTCATGGAAGCTTTACAAGCTGGAGCTGATATTTCCATGATTGGTCAATTTGGTGTGGGTTTCTATTCCGCCTATCTGGTAGCTGACAAAGTCACTGTTGTTTCCAAACACAACGACGATGAACAATATTTGTGGGAATCTGCTGCCGGAGGTTCATTCACCATCCGTACTGATCCTGGTGAACCATTGGGCCGTGGTACCAAAATTGTCCTTCAAATCAAAGAAGATCAAGCTGAGTTCCTCCAACAAGAAAAAATTACCAGCATCATCAAGAAGCACTCTCAATTCATTGGCTACCCAATCAAATTAATCGTTGAGAATGAACGTACCAAAGAAGTCAGCGATGATGAAGCTGAAGAAGAAAAGAAAGATGAAGTTGAAGGTGAAACTGAAGAAGACAAAAAACCCAAAATTGAGGATGTTGGTGAGGATGAAGACGAAGACAAAAAAGATGAAGACAAAGACAAAAAGAAGAAGAAGACTATTAAAGAAAAGTACTTGGATGAAGAGGTCTTGAACAAGACAAAACCAATCTGGACACGCAACCCTGATGATATCAGCCAAGATGAATATGGTGAATTCTACAAATCCTTAACCAATGACTGGGAAGATCATTTAGCCGTCAAACATTTCTCTGTGGAAGGACAACTTGAATTCAGAGCATTGTTATTCATTCCCAAGCGTGCGCCTTATGACATGTTTGAGAACAAGAAGAAGAAGAACAACATTAAATTATATGTCCGTCGTGTCTTCATCATGGACAACTGCGAAGACCTCATGCCAGAATACTTGAACTTCATCAAGGGTGTTGTTGACAGTGAGGATTTGCCGTTGAACATCTCCCGTGAAATGCTCCAACAAAACAAGATCTTGAAAGTTATCAGGAAGAATTTGGTTAAGAAATGTTTGGAATTGTTCGAGGAATTGGCTGAAGACAAGGACAACTACAAGAAATTGTACGAACAGTTCAGCAAGAACTTGAAACTTGGAATCCACGAAGATAGCCAAAACAGAAAGAAACTCTCAGACTTGTTGAGATTCCACTCCTCAGCCAGTGGTGACGAATCATGCTCCCTTAAGGAGTATGTTGCACGTATGAAGCCAAATCAAACCCACATTTACTACATCACAGGTGAAAGCCGTGAACAAGTATCCAACTCTTCATTCGTTGAACGTGTCAAGAAACGTGGTTTTGAAGTTATTTACATGACTGAACCCATTGATGAATACGTTGTCCAACAAATGAAAGAATATGACGGCAAGAACTTGGTATCTGTCACTAAAGAAGGTTTGGACTTGCCTGAAACCGATGAAGAAAAGAAGAAGCGCGAGGATGATCAATCCAGATTTGAAAAATTGTGCAAAGTTGTTAAGGACATTTTGGACAAGAAAGTTGAGAAGGTTGTCATCAGTAACAGACTTGTTGAGTCTCCCTGTTGCATTGTCACATCTCAGTATGGTTGGACTGCCAACATGGAACGTATCATGAAGGCACAAGCACTCAGAGATTCATCTACCATGGGTTATATGTCTGCCAAAAAACACTTGGAAATCAACCCTGACCACCCGATCATTGAAACACTCAGACAAAAGGCTGAAGCTGATTGCAACGACAAGGCTGTCAGAGACTTGGTCATGCTTTTGTTCGAGACAAGTTTGTTGTCATCTGGTTTTGGACTTGAAGACCCACAAGTTCACGCTTCTAGAATCCACAGAATGATCAAATTGGGTTTGGGCATTGATGAAGATTTGCCAGTAGTTGAAGAAAAATCTGCTGAAGTTGAAGCCTCCGAGCCTGTTGTTGAAGCTGATGCTGAAGATTCTTCTCGCATGGAAGAAGTTGAT （配列番号3）
【００６５】
TAATACGACTCACTATAGGGAGATGGTGAACCATTGGGCCGTGGTACCAAAATTGTCCTTCAAATCAAAGAAGATCAAGCTGAGTTCCTCCAACAAGAAAAAATTACCAGCATCATCAAGAAGCACTCTCAATTCATTGGCTACCCAATCAAATTAATCGTTGAGAATGAACGTACCAAAGAAGTCAGCGATGATGAAGCTGAAGAAGAAAAGAAAGATGAAGTTGAAGGTGAAACTGAAGAAGACAAAAAACCCAAAATTGAGGATGTTGGTGAGGATGAAGACGAAGACAAAAAAGATGAAGACAAAGACAAAAAGAAGAAGAAGACTATTAAAGAAAAGTACTTGGATGAAGAGGTCTTGAACAAGACAAAACCAATCTGGACACGCAACCCTGATGATATCAGCCAAGATGAATATGGTGAATTCTACAAATCCTTAACCAATGACTGGGAAGATCATTTAGCCGTCAAACATTTCTCTGTGGAAGGACAACTTGAATTCAGAGCATTGTTATTCATTCCCAAGCGTGCGCCT AGAGGGATATCACTCAGCATAAT （配列番号26）
【００６６】
DS25遺伝子
本明細書で用いられるように、用語「DS25遺伝子」、「真核生物開始因子4A様（eukaryotic initiation factor 4A-like）」、「真核生物開始因子複合体4A型」は入れ替えて使用することができ、二本鎖RNAを解離させるヘリカーゼで、リボソームのサブユニットの結合に必要な機能タンパク質でもあり、幼虫期で発現される。
本発明において、真核生物開始因子複合体はGTPおよび開始剤Met-tRNAと三元複合体を形成し、当該過程はグアニル酸の交換およびリン酸化によって調節され、そして遺伝子発現ネックの主な調節エレメントである。翻訳が進んで伸長段階に入る前、多くの開始因子はリボソームおよびmRNAの協同作用を促進し、そしてmRNAの5'UTRに二次構造が十分に欠けているように維持しないといけない。4組目の真核生物開始因子はこのような結合を促進し、翻訳の正常の調節および癌細胞の転換と進展において意味が有る。
本発明の一つの実施形態において、RNAi技術に基づき、DS25遺伝子を標的とし、DS25遺伝子に対するRNA断片をスクリーニングし、好ましくは、前記DS25遺伝子断片の配列は配列番号4または27で示される。
【００６７】
ATGAATGCTAATGAGACGAAAAATGGACCTCCTAGTGAAACCAATGACTACTCGGGACCACCTGGCATGGACGTCGGTGGAACTATTGAGTCTGACTGGAAAGAAGTGGTGGATAACTTTGATGAGATGAATTTAAAAGAAGAATTGTTGCGTGGTATTTATGGATATGGTTTTGAAAAGCCATCAGCTATTCAACAACGTGCTATTTTGCCGTGCATCAAGGGACATGATGTCATTGCTCAGGCCCAATCTGGTACTGGCAAGACAGCTACTTTTTCCATTTCTATTCTCCAACAAATTGATACAAGTTTGAATGAGTGCCAAGCACTTATTTTGGCACCAACACGTGAATTGGCTCAACAGATTCAAAAGGTGGTCATTGCTTTGGGTGATTTCATGAAAGCTGATTGTCATGCTTGCATTGGCGGTACAAACGTTCGTGATGACATGCGTAAGCTGGATACTGGATCCCATGTAGTTGTTGGAACTCCTGGCCGTGTTTATGACATGATTGCTAGAAAATCCCTAAGAACTCAATTTATCAAGATATTTGTGTTGGACGAAGCTGATGAAATGTTGTCTCGAGGTTTCAAAGATCAAATTAAAGAGGTGTTCAAGTTCCTCGAAGAAGATATTCAGGTCATTCTGTTGTCTGCTACAATGCCCGAGGACGTTTTGGATGTGAGCACTCATTTCATGCGTAATCCAGTACGCATTCTTGTTCAAAAGGAAGAACTGACATTGGAAGGTATCAAACAGTTTTACATCAATGTTACCAAAGAAGAATGGAAGTTTGACACTCTATGTGATTTGTACGACACTCTTAGTATCACCCAGGCTGTGATCTTCTGTAACACACGTCGTAAGGTAGAGTGGTTGACTGAAAATATGCGTTTGAAAACATTTACTGTATCAGCTATGCATGGAGAAATGGACCAACGTCAACGTGAGCTAATTATGCGTCAATTCCGTTCTGGCTCTAGTCGTGTTCTAATTACCACTGATTTGTTGGCTCGAGGCATTGATGTACAACAAGTTTCTCTGGTCATCAATTACGATTTGCCGTCCAATCGTGAAAACTATATTCACAGGATTGGACGTTCTGGCCGTTTCGGTCGTAAAGGAGTCGCCATTAATTTTATCACCGAAGACGACAAAAGAGCTATGAAGGATATTGAATCATTTTACAACACTCACGTGCTCGAGATGCCACAGAATGTGGCCGATTTGCTG （配列番号4）
【００６８】
TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCTGGCATGGACGTCGGTGGAACTATTGAGTCTGACTGGAAAGAAGTGGTGGATAACTTTGATGAGATGAATTTAAAAGAAGAATTGTTGCGTGGTATTTATGGATATGGTTTTGAAAAGCCATCAGCTATTCAACAACGTGCTATTTTGCCGTGCATCAAGGGACATGATGTCATTGCTCAGGCCCAATCTGGTACTGGCAAGACAGCTACTTTTTCCATTTCTATTCTCCAACAAATTGATACAAGTTTGAATGAGTGCCAAGCACTTATTTTGGCACCAACACGTGAATTGGCTCAACAGATTCAAAAGGTGGTCATTGCTTTGGGTGATTTCATGAAAGCTGATTGTCATGCTTGCATTGGCGGTACAAACGTTCGTGATGACATGCGTAAGCTGGATACTGGATCCCATGTAGTTGTTGGAACTCCTGGCCGTGTTTATGACATGATTGCTAGAAAATCCCTAAGAACTCAATTTATCAAGATATTTGTGTTGGACGAAGCTGATGAAATGTTGTCTCGAGGTTTCAAAGATCAAATTAAAGAGGTGTTCAAGTTCCTCGAAGAAGATATTCAGGTCATTCTGTTGTCTGCTACAATGCCCGAGGACGT AGAGGGATATCACTCAGCATAAT (配列番号27)
【００６９】
DS27遺伝子
本明細書で用いられるように、用語「DS27遺伝子」、「トロポニンT様アイソフォーム3（troponin T-like isoform 3）」、「トロポニン3型」は入れ替えて使用することができ、Caチャネルを介し、昆虫横紋筋の収縮調節機能を調節する。幼虫、成虫期で発現される。
本発明において、トロポニンはタンパク質のトロポミオシンに付着し、そして筋肉組織におけるアクチン線維の間の窪みに位置する。弛緩した筋肉では、トロポミオシンはミオシンのクロスブリッジの付着部位を遮断することで、収縮が止められる。活動電位で筋肉細胞を刺激して収縮させる場合、カルシウムチャネルは漿膜において開放してカルシウムを筋漿に放出する。ここで、一部のカルシウムがトロポニンに付着し、その形状を変化させ、アクチン線維におけるミオシン（活性部位）の結合部位が露出する。ミオシンとアクチンの結合によってクロスブリッジが生じ、そして筋肉の収縮が開始する。
【００７０】
トロポニンは活性化される。トロポニンC（赤）はCa2+に結合し、活性化状態を安定化させ、ここで、トロポニンI（黄）はアクチンと結合しなくなる。トロポニンT（青）は複合体をトロポミオシンに固定される。
トロポニンは骨格筋および心筋に存在するが、トロポニンの特定の形態は異なる種類の筋肉で異なる。違いは主にトロポニンのTnCサブユニットが、骨格筋では4つのカルシウムイオンの結合部位があるが、心筋では3つのみであることである。トロポニンに結合するカルシウムの実際の含有量の観点から、専門家および由来によってことなる。
本発明の一つの実施形態において、RNAi技術に基づき、DS27遺伝子を標的とし、DS27遺伝子に対するRNA断片をスクリーニングし、好ましくは、前記DS27遺伝子断片の配列は配列番号5または28で示される。
【００７１】
ATGTCCGACGAAGAAGAAGTGTACACTGATTCCGAAGAAGAAACGCAACCGGAGCCTGAAAAAAGCAAAGATGGAGATGGAGATCCCGAATTCGTTAAGAGGCAAGAATTAAAATCTTCAGCCTTAGACGAACAGCTTAAAGAGTACATCCAAGAATGGCGCAAACAGCGGTCAAAGGAAGAAGACGACTTAAAGAAGTTGAAGGAAAAACAGGCCAAGCGCAAGGTTATGCGAGCGGAAGAAGAGAAGAGAATGGCCGAGAGAAAGAAGCAAGAAGAAGAACGCAGACAGAGAGAAGTCGAGGAAAAGAAACAAAAGGACATCGAAGAAAAACGTAAACGTCTAGAAGAGGCCGAGAAAAAACGGCAAGCTATGATGGCTGCTCTTAAGGAACAAACCAATAAATCTAAAGGACCAAATTTCACCATCAGCAAAAAAGAAGGTGCGTTGAGTATGACTTCTGCCCAACTTGAACGCAATAAAACCAGAGAACAGATCGAAGAAGAAAAGAAAATATCGTTGAGCTTCAGAATCAAACCTTTGAATATTGAAGGATTCTCTGTGCAAAAACTCCAATTCAAAGCTACCGAACTCTGGGACCAGATCATCAAGTTGGAAACAGAAAAATACGATTTGGAGGAAAGGCAAAAGAGACAAGATTACGACTTGAAAGAGTTGAAAGAACGTCAGAAGCAACAACTCCGCCACAAGGCTCTGAAGAAAGGTCTCGACCCCGAAGCCCTAACCGGCAAATACCCACCCAAGATCCAAGTCGCTTCCAAGTACGAGAGGCGAGTTGACACGAGGTCTTATGATGACAAAAAGAAGCTGTTCGAAGGAGGTTATATGGAAACCACTAAAGAATCAATGGAAAAACAATGGACAGAAAAAAGTGACCAATTCGGTGGCCGCGCTAAAGGACGATTACCGAAATGGTTCGGCGAACGTCCGGGCAAGAAGAAGGATGACCCAGACACACCCGAAGAGGAAGAGCTCAAGAAAAACGAGGAAGACGAAGAACCGTTTGGCCTCGACGACGAAGAAGCTGAAGAAGAAGTTGAAGAGGAAGAAGAGGAGGAAGAAGAAGAGGAAGAGGAGGAGGAAGAGGAAGAAGAGGAAGAAGAAGAAGAGGAAGAGGAAGAAGAAGAAGAA （配列番号5）
【００７２】
TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGCAAGGTTATGCGAGCGGAAGAAGAGAAGAGAATGGCCGAGAGAAAGAAGCAAGAAGAAGAACGCAGACAGAGAGAAGTCGAGGAAAAGAAACAAAAGGACATCGAAGAAAAACGTAAACGTCTAGAAGAGGCCGAGAAAAAACGGCAAGCTATGATGGCTGCTCTTAAGGAACAAACCAATAAATCTAAAGGACCAAATTTCACCATCAGCAAAAAAGAAGGTGCGTTGAGTATGACTTCTGCCCAACTTGAACGCAATAAAACCAGAGAACAGATCGAAGAAGAAAAGAAAATATCGTTGAGCTTCAGAATCAAACCTTTGAATATTGAAGGATTCTCTGTGCAAAAACTCCAATTCAAAGCTACCGAACTCTGGGACCAGATCATCAAGTTGGAAACAGAAAAATACGATTTGGAGGAAAGGCAAAAGAGACAAGATTACGACTTGAAAGAGTTGAAAGAACGTCAGAAGCAACAACTCCGCCACAAGGCTCTGAAGAAAGGTCTCGACCCCGAAGCCCTAACCGAGAGGGATATCACTCAGCATAAT （配列番号28）
【００７３】
DS45遺伝子
本明細書で用いられるように、用語「DS45遺伝子」、「Yボックスタンパク質Ct-p40様（Y-box protein Ct-p40-like）」、「Yボックス結合タンパク質Ct-p40様」は入れ替えて使用することができ、細胞の分化、細胞骨格の形成に影響し、欠失すると細胞内外のシグナル伝達経路が抑制され、DNA損傷の修復および転写に関与し、幼虫期で発現される。
本発明の一つの実施形態において、RNAi技術に基づき、DS45遺伝子を標的とし、DS45遺伝子に対するRNA断片をスクリーニングし、好ましくは、前記DS45遺伝子断片の配列は配列番号6または29で示される。
【００７４】
ATGGCGGAACAAGTCGGCGAGAGGAGGACGGAACGGCCGCCGCAGAAGCCCGTGGCCCAAAAGCCGGTCATATCTGTGAAAGTCACCGGCGTTGTTAAATGGTTCAACGTCAAAAGCGGTTATGGTTTTATTAATCGTAATGATACAAAAGAAGATATATTTGTACATCAGTCTGCTATTATCAAGAACAACCCTAAGAAAATTGTACGCAGTGTCGGTGATGGAGAAACTGTAGAATTTGACGTTGTTGAGGGCGAAAAAGGTCACGAAGCAGCAAATGTTACTGGTCCAGATGGAGAAGCTGTTAAAGGATCACCTTATGCAGCTGAAAGAAGAAGAAATAACTATCGTCAGTGGTTTTATGGACGCCGTCCTAATACCCGTCCAAGAAATGGTGGTCAACCTCCAAGAGATGGTAGTCCAAGTGGTGACAAGGAAGAAACTGAAAATGAAGTAGGAGAACAACCAAGACGTTACCGCCAGCCACGTCAACAGAATTGGTATAATAGCTATCGTGGAAATCGAAGAGGTCCACCACCAAATAGAGGAGAAGGTGGTGATTACAATGGTGGAGATAATTATGGATATGATAGTTCACCTCCTGGTAGAGGCAGAGGTCGTGGGATGGGTGCGCCTAGACGTTTCTTTAGACGTGGCAGTGGATTTAGAGGGAGCCGTGGAACAGGTGGTCCACCCAGAAGACCATATCAAGATGAAAATCAGGACAATGAATATAATCAAAGTGATGAAAATGGAGCAAATAGACCTCGTCCTCGCTATCGCCGCCGCAATAATCGTTCTAGAGCGAGAAGTGATGGTCCTCCAAGAGCCAATAGCCAAAGTGACAATGAATCTAAACAAAAAAACTTTGGAGGAGAAGCATTGGAACTGGATGAAAGTAGTCATGCT （配列番号6）
【００７５】
TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAGAAGCCCGTGGCCCAAAAGCCGGTCATATCTGTGAAAGTCACCGGCGTTGTTAAATGGTTCAACGTCAAAAGCGGTTATGGTTTTATTAATCGTAATGATACAAAAGAAGATATATTTGTACATCAGTCTGCTATTATCAAGAACAACCCTAAGAAAATTGTACGCAGTGTCGGTGATGGAGAAACTGTAGAATTTGACGTTGTTGAGGGCGAAAAAGGTCACGAAGCAGCAAATGTTACTGGTCCAGATGGAGAAGCTGTTAAAGGATCACCTTATGCAGCTGAAAGAAGAAGAAATAACTATCGTCAGTGGTTTTATGGACGCCGTCCTAATACCCGTCCAAGAAATGGTGGTCAACCTCCAAGAGATGGTAGTCCAAGTGGTGACAAGGAAGAAACTGAAAATGAAGTAGGAGAACAACCAAGACGTTACCGCCAGCCACGTCAACAGAATTGGTATAATAGCTATCGTGGAAATCGAAGAGGTCCACCACCAAATAGAGGAGAAGGTGGTGATTACAATGGTGGAGATAATTATGGATATGATAGTTCACCTCCTGGTAGAGGCAGAGGTCGTGGGATGGGTGCGCCTAAGAGGGATATCACTCAGCATAAT  (配列番号29)
【００７６】
dsRNA構築物およびその使用
本発明は、二本鎖で、かつそのプラス鎖またはマイナス鎖に式Iで表される構造が含まれるdsRNA構築物を提供する。
Seqフォワード-X-Seqリバース       式I
（式中において、
Seqフォワードは、昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子または断片のヌクレオチド配列である。
Seqリバースは、Seqフォワードに基本的に相補的なヌクレオチド配列である。
Xは、SeqフォワードとSeqリバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeqフォワードおよびSeqリバースに相補的なものではない。
ここで、前記の昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子は、DS7遺伝子、DS9遺伝子、DS15遺伝子、DS25遺伝子、DS27遺伝子、DS45遺伝子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。）
【００７７】
本発明の一つの好適な例において、Seqフォワード、Seqリバースの長さは少なくとも50 bpである。
本発明の一つの好適な例において、前記dsRNA構築物は昆虫（たとえばアブラムシ）に摂食された後、式IIで表されるdsRNAになる。
【化４】
2021523726.tif 000005
（式中において、
Seq’フォワードはSeqフォワード配列に相応するRNA配列または配列断片である。
Seq’リバースはSeq’フォワードに基本的に相補的な配列である。
X’はないか、あるいはSeq’フォワードとSeq’リバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeq’フォワードおよびSeq’リバースに相補的なものではない。
|| は、Seq’フォワードとSeq’リバースの間に形成された水素結合を表す。）
【００７８】
また、本発明は、前記dsRNA構築物の使用であって、(1) アブラムシの防除効果の向上、および/または(2) 虫数減少率の向上、および/または(3) 幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子の発現量の降下、および/または(4) 虫数基盤の降下、および/または(5) 植物被害率の減少、および/または(6) 作物の被害程度の降下、農作物の品質の向上における使用を提供する。
【００７９】
dsRNAおよびその使用
また、本発明は、式IIで表されるdsRNAを提供する。
【化５】
2021523726.tif 000006
（式中において、
Seq’フォワードはSeqフォワード配列に相応するRNA配列または配列断片である。
Seq’リバースはSeq’フォワードに基本的に相補的な配列である。
X’はないか、あるいはSeq’フォワードとSeq’リバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeq’フォワードおよびSeq’リバースに相補的なものではない。
|| は、Seq’フォワードとSeq’リバースの間に形成された水素結合を表す。）
【００８０】
もう一つの好適な例において、前記スペーサー配列Xの長さは0〜300 bp、好ましくは100 bpである。
前記の昆虫の幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子はアブラムシ由来のもので、DS7遺伝子の配列は配列番号1で示され、DS9遺伝子は配列番号2で示され、DS15遺伝子は配列番号3で示され、DS25遺伝子は配列番号4で示され、DS27遺伝子は配列番号5で示され、DS45遺伝子は配列番号6で示される。
【００８１】
もう一つの好適な例において、前記昆虫は植食性昆虫で、好ましくは半翅目（Hemiptera）からの昆虫で、最も好ましくはワタアブラムシ属（Aphis）からの昆虫である。
また、本発明は、前記dsRNAの使用であって、(1) アブラムシの防除効果の向上、および/または(2) 虫数減少率の向上、および/または(3) 幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子の発現量の降下、および/または(4) 虫数基盤の降下、および/または(5) 植物被害率の減少における使用を提供する。
【００８２】
組成物及びその使用
また、本発明は組成物を提供するが、本発明者は効率的にアブラムシを滅殺するという難題に対し、RNAi技術に基づいて標的遺伝子に対するRNAi断片を開発し、そして昆虫への投与または昆虫への直接の散布により、アブラムシの防除効果および虫数減少率を向上させ、RNAiに遺伝子発現を抑制する効果を果たさせ、最終的に効率的にアブラムシを滅殺するという目的を実現させる。本発明の方法は効率的で、便利で、快速で、正確で、かつ無公害である。
前記組成物は、dsRNA構築物および/またはdsRNAと、昆虫の摂食で許容される有効量の担体とを含む。もう一つの好適な例において、前記の組成物はアブラムシの幼虫および/または成虫期の死亡を誘導するか引き起こすための組成物である。
【００８３】
もう一つの好適な例において、前記のdsRNAは以下の配列を有する：
dsRNA1：配列番号1または24で示される配列を有する；
dsRNA2：配列番号2または25で示される配列を有する。
dsRNA3：配列番号3または26で示される配列を有する；
dsRNA4：配列番号4または27で示される配列を有する。
dsRNA5：配列番号5または28で示される配列を有する；
dsRNA6：配列番号6または29で示される配列を有する。
【００８４】
また、本発明は、前記組成物の使用であって、
(1) アブラムシの防除効果の向上、および/または(2) 虫数減少率の向上、および/または(3) 幼虫および/または成虫期の調節の関連遺伝子の発現量の降下、および/または(4) 虫数基盤の降下、および/または(5) 植物被害率の減少、および/または(6) 作物の被害程度の降下、農作物の品質の向上からなる群から選ばれる使用を提供する。
本発明の一つの好適な例において、組成物は水溶液で、pHが通常約5〜8で、好ましくは、pHが約6〜8である。
【００８５】
本明細書で用いられるように、用語「有効量」または「有効投与量」とは、前記昆虫の投与に機能や活性があり、かつ前記昆虫に許容される量である。好適に、dsRNA1の含有量は約1-500ng/μl、好ましくは、5-300ng/μl、より好ましくは、50-150 ng/μlで、dsRNA2の含有量は約1-500ng/μl、好ましくは、5-300ng/μl、より好ましくは、50-150 ng/μlで、dsRNA3の含有量は約1-500ng/μl、好ましくは、5-300ng/μl、より好ましくは、50-150 ng/μlで、dsRNA4の含有量は約1-500ng/μl、好ましくは、5-300ng/μl、より好ましくは、50-150 ng/μlで、dsRNA5の含有量は約1-500ng/μl、好ましくは、5-300ng/μl、より好ましくは、50-150 ng/μlで、dsRNA6の含有量は約1-500ng/μl、好ましくは、5-300ng/μl、より好ましくは、50-150 ng/μlである。好適な有効量の選択は、当業者がいろいろな要素によって決めることができる（たとえば投与試験または散布実験による）。
【００８６】
本明細書で用いられるように、「昆虫の摂食で許容される」成分は、前記昆虫に適用する場合、過度の不良な副反応（例えば毒性、刺激とアレルギー反応）がない、すなわち、合理的なベネフィット/リスク比を持つ物質である。
本明細書で用いられるように、用語「担体」は様々な賦形剤および希釈剤を含む。このような担体は、水、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合せを含むが、これらに限定されない。
本発明の組成物は、直接散布、投与してもよく、あるいは注射剤としてもよく、たとえば水、生理食塩水またはブドウ糖およびほかの助剤を含有する水溶液で通常の方法によって製造することができる。前記の組成物は、無菌または無RNA酵素の条件で製造することが好ましい。
【００８７】
本発明の主な利点は以下の通りである。
1) 本発明の特定の標的遺伝子に対して設計されたdsRNAは効率的にアブラムシを滅殺し、アブラムシの防除効果（≧80％）および虫数減少率（≧70％）を向上させることができる。
2) 得られるdsRNAはそのままアブラムシの滅殺に使用可能で、便利である。
3) 生産コストが低く、安定性が良く、大規模生産に適する。
4) 環境にやさしく、エコで無公害で、ヒトや家畜に安全である。
【００８８】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特別に説明しない限り、実施例で使用された材料または試薬はいずれも市販品である。
【００８９】
共通の方法および材料
1．アブラムシの飼育および生物テスト
モモアカアブラムシ（Myzus persicae）は室内の温室またはグリーンハウスで栽培されるダイコン苗において培養・繁殖およびテストが行われ、ダイズアブラムシ（Aphid glycine）は室内の温室またはグリーンハウスで栽培されるダイス苗において培養・繁殖およびテストが行われた。培養室は、温度が25±1℃で、相対湿度が40〜60％で、光照射周期が12 h：12hであった。
テスト前、一定の数のアブラムシを標的の植物に接種して計数し、所定の濃度のdsRNAを散布した後、それぞれ1日、3日および5日でまた計数し、各遺伝子のテストはいずれも10回繰り返した。計数の結果から、標的遺伝子の防除効果を確認した。
【００９０】
2．防除効果の統計方法
本研究では、2つの統計方法によって標的dsRNAのアブラムシに対する作用効果を評価した。
1つ目の方法は、防除効果で、計算方法は以下の通りである。
防除効果（％）＝（1-CK0×PT1/CK1×PT0）×100
ここで、PT0：処理領域における投与前の虫数、PT1：処理領域の投与後の虫数、CK0：対照領域における投与前の虫数、CK1：対照領域の投与後の虫数。
2つ目の方法は、虫数減少率で、計算方法は以下の通りである。
虫数減少率（％）＝[(投与前の虫数-投与後の虫数)/投与前の虫数]×100
【００９１】
3．RNAの抽出および品質の検出
全RNAの抽出はTRIzolR Reagent（Invitrogen）を使用し、そして説明書に従って操作した。1） 1 mL TRIzolに十分に研磨されたアワノメイガのサンプルを50-100 mg入れ、均一に混合し、室温で5 min静置した。2）200 μLのクロロホルムを入れ、振とうして均一に混合し、室温で3 min静置した。3）12000 rpm（4℃）で15 min遠心し、上層の水相をもう1つの新しい遠心管に移し、500 μLの冷却しておいたイソプロパノールを入れ、振とうして均一に混合し、室温で10 min静置した。4）12000 rpm（4℃）で15 min遠心し、注意して上清を吸い取った。5）500 μLの冷却しておいた75％エタノールで洗浄し、ボルテックスで軽く10 sec混合した。6）12000 rpm（4℃）で2 min遠心し、注意して上清を吸い取った後、室温で5 min乾燥、適量のDEPC滅菌水を入れて溶解させ、全RNAのサンプルを得た。分光光度計によって吸光度を検出し、1％アガロースゲル電気泳動によって全RNAの質量を検出し、-80℃で使用に備えて保存した。
【００９２】
4．dsRNAの合成
キットMEGAscriptR RNAi Kit（Ambion）によってdsRNAの合成を行い、そして説明書に従って実験操作を行った。後続のdsRNAの合成がしやすいように、増幅鋳型のプライマー5’末端にT7プロモーター配列を付加した。pPigbac A3 EGFPを合成対照群のdsEGFPの鋳型とし、後続の試験において、dsEGFPを陰性対照として試験群の処理に入れた。dsRNAの合成のプライマーは付録S3を参照する。合成の過程において、鋳型DNAおよび一本鎖RNAはそれぞれDNaseおよびRNaseで除去した。
【００９３】
5．遺伝子発現量の検出（q-RT-PCR）
TRIzol（登録商標） reagent（Invitrogen）で全RNAの抽出を行い、手順は厳格に操作マニュアルに従って行われた。1 μgの全RNAを取り、キットReverTra Ace（登録商標） qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO）でcDNAの一本目の鎖の合成を行った。RT-qPCR反応に使用されるキットはSYBR（登録商標） Premix Ex Taq（商標） II (Takara)で、プライマーは付録S3を参照する。各遺伝子のサンプルに3回繰り返して検出し、その発現レベルの解析は18S rRNAの発現量で正規化処理を行った。データ分析は2−ΔΔCT法(Livak & Schmittgen, 2001)を参照する。平均値および標準偏差を計算して相応する数値を得た。個体差をなくすため、各実験群のサンプルは2匹の処理後の生存幼虫からのサンプルプールで、各実験群では3回生物学的に繰り返した。
【００９４】
実施例1  標的遺伝子配列よびdsRNAの合成
有効なRNA干渉技術に基づいたアブラムシの標的遺伝子をスクリーニングするため、モモアカアブラムシ（Myzus persicae）およびダイズアブラムシ（Aphid glycine）に対してそれぞれトランスクリプトームのシークエンシングを行った（2種類のアブラムシのサンプリングおよびシークエンシングの分方法は同様である）。異なる発育時期のアブラムシからそれぞれ全RNAを抽出した後、等量のRNAを取って均一に混合し、アブラムシの全発育期の全RNAにし、深セン華大遺伝子科技服務有限公司に送り、Illumina Hiseq2000プラットフォームでトランスクリプトームのシークエンシングを行った。シークエンシングの結果からリンカーを除去した後、denoveプログラムで組み立て、さらにUnigeneに対して機能アノテーションを行った。本研究は、これらの機能アノテーションのあるUnigeneから目的遺伝子の断片を選んで増幅し、そしてdsRNAを合成した。大量にスクリーニングすることにより、本発明の6つの標的遺伝子、外因性対照遺伝子GFPおよびダイズアブラムシ由来の内因性比較遺伝子DS50を増幅して合成するプライマーは表1に示す。6つの遺伝子断片のDNA配列は表2を参照し、ここで、ds7、ds9、ds15はアブラムシ、特にモモアカアブラムシに対するもので、ds25、ds27、ds45はアブラムシ、特にダイズアブラムシに対するものである。
【００９５】
【表１】
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【００９６】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【００９７】
実施例2  標的遺伝子dsRNAのアブラムシに対する防除効果
所定の数のモモアカアブラムシまたはダイズアブラムシをそれぞれダイコン苗またはダイズ苗に接種し、まず、それぞれ各株の植物に接種されたアブラムシの数を記録し、合成されたdsRNAを2％のツイン-80に溶解させ、6つの標的遺伝子のdsRNAの濃度は表3に示す。その後、1mlのdsRNAをそれぞれアブラムシが接種された植物株に散布し、そして次の日に計数してdsRNA処理後の1日目の統計結果とし、それから1日おきに1回統計し、計3回統計し、それぞれ処理後1日目、3日目および5日の結果として記録した。2％のツイン-80およびdsGFPを対照とした。統計結果から、2％ツイン-80のみの対照と比べ、3つのモモアカアブラムシの標的遺伝子および3つのダイズアブラムシは2種類のアブラムシに対する防除効果がいずれも80％超であった（図1，A，B）。
【００９８】
【表３】
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【００９９】
実施例3  標的遺伝子のアブラムシに対する虫数減少率の統計
アブラムシは産雌単為生殖の卵胎生の昆虫で、生まれてから1齢の新生アブラムシである。1齢の新生アブラムシから産卵できるまでの周期は約5-7日で（環境温度に影響される）、1株の植物におけるアブラムシに明らかな世代交代現象が見られ、つまり、異なる世代および様々な大きさ（異なる齢期）の虫が共存するため、テスト植物株に虫を接種する場合様々な齢期のアブラムシがあり（たとえば2th-4th、さらに成虫の可能性もある）、よって各テスト処理後、アブラムシはすぐに繁殖し、次の世代が生まれ、テストされる植物株におけるアブラムシの数は薬物の散布前かつ計数後でも、増え続ける。これらはアブラムシ類殺虫剤の防除効果の判断には大きな干渉であるため、より厳格か比較的に正確なアブラムシの防除効果の計算方法、つまり、虫数減少率ができた（計算公式は共通の方法および材料の部分を参照する）。
【０１００】
本発明の統計結果から、3つのモモアカアブラムシの標的遺伝子のdsRNAを散布した後、モモアカアブラムシ群集の処理後1日、3日および5日の虫数減少率を表4に示したが、散布後5日目の虫数減少率はいずれも70％以上に達したことがわかる。
3つのダイズアブラムシの標的遺伝子のdsRNAを散布した後、ダイズアブラムシ群集の処理後1日、3日および5日の虫数減少率を表5に示したが、散布後5日目の虫数減少率は、ds45の67.61％以外、ほかの2つの標的遺伝子ではいずれも70％以上であった。
【０１０１】
【表４】
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【０１０２】
【表５】
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【０１０３】
実施例4  モモアカアブラムシ標的とイミダクロプリドの防除効果の比較
実験方法：
1．12-15dのダイコン苗に100匹接種し、1d安定化した後、次の日にdsRNA散布処理を行った。
2．散布用のdsRNAの濃度は300ng/μlであった。合成されたdsRNAを水に溶解させ、各株に300μl散布した。
3．イミダクロプリドの濃度は10000倍液（独国バイエルのアドマイヤー70％イミダクロプリド3g、水分散顆粒剤）で、各株に300μl散布した。
4．試験方法：噴霧処理で、各処理に4回繰り返した。
結果は表6、表7および図3、図4に示す。
【０１０４】
【表６】
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【０１０５】
【表７】
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【０１０６】
結果から、モモアカアブラムシの3つの遺伝子について、3日目から、いずれも顕著な致死効果が示され、5日目に、虫数減少率がいずれも70％以上で、イミダクロプリドと比べ、虫数減少率の差が顕著ではなかったが、対照のdsGFPと比べ、虫数減少率に有意差があったことがわかる（表6）。同時に、防除効果の統計分析から、この3つの標的遺伝子は防除効果がいずれも90％以上に達し、そして3日目に既に良い防除効果が示されたことがわかる（表7）。そのため、本結果から、この3つの標的遺伝子は、モモアカアブラムシに対する致死効果が強く、モモアカアブラムシを防除する標的遺伝子として害虫の防除を行うことができることがわかる。
【０１０７】
実施例5  標的遺伝子の発現の検出
これらの標的遺伝子のdsRNAの散布によるアブラムシ群集に対する制御作用が標的遺伝子の発現の抑制によるものであることを証明するため、それぞれ6つの標的遺伝子のdsRNAで処理して1日、3日および5日のアブラムシを収集し、定量PCR（q-RT-PCR）によって標的遺伝子が抑制されたかどうか検出した。3つのモモアカアブラムシの標的遺伝子の検出結果は図2Aに示すように、ds9遺伝子で処理して1日後、標的遺伝子が上方調節するように誘導された以外、すべての遺伝子は処理から3日および5日で顕著に上方調節したことから、アブラムシの死亡は遺伝子の発現量に密接に関連することが示された。
3つのダイズアブラムシの標的遺伝子の検出結果は図2Bに示すように、ds25遺伝子で処理して1日後、標的遺伝子の発現が対照と有意差がなかった以外、すべての遺伝子は処理から3日および5日で顕著に上方調節したことから、アブラムシの死亡は遺伝子の発現量に密接に関連することが示された。
【０１０８】
実施例6
組成物の調製
本実施例では、効率的にアブラムシを滅殺するための組成物であって、当該組成物は水溶液で、以下の成分を含む組成物を提供した：
1．配列が配列番号1または24で示されるDS7遺伝子断片に対するdsRNA
濃度は100ng/μlである；
2．配列が配列番号2または25で示されるDS9遺伝子断片に対するdsRNA
濃度は100ng/μlである。
3．配列が配列番号3または26で示されるDS15遺伝子断片に対するdsRNA
濃度は100ng/μlである。
4．配列が配列番号4または27で示されるDS25遺伝子断片に対するdsRNA
濃度は100ng/μlである。
5．配列が配列番号5または28で示されるDS27遺伝子断片に対するdsRNA
濃度は100ng/μlである。
6．配列が配列番号6または29で示されるDS45遺伝子断片に対するdsRNA
濃度は100ng/μlである。
【０１０９】
比較例1
方法は実施例1および2と同様で、違いは、標的遺伝子はDS50で、使用されたプライマーは以下のものであることにある：
プライマーF：
TAATACGACTCACTATAGGGAGACGTGTCTGAGGCGGTTGCCA（配列番号30）
プライマーR：
TAATACGACTCACTATAGGGAGATGATCTTGGCCCGGAGAGCCGG （配列番号31）
増幅産物の長さは578 bpである。
【０１１０】
DS50遺伝子は脂肪酸合成酵素遺伝子（fatty acid synthase-like）で、配列が配列番号23で示され、FASN遺伝子をコードする。脂肪酸合成酵素は脂肪酸の合成を触媒する多酵素タンパク質である。単一の酵素ではなく、2つの同様の272kDaの多機能ポリペプチドからなる酵素系で、ここで、基質が一つの機能領域から次の領域に送達され、その主な機能はNADPHの存在下でアセチルCoAおよびマロニルCoAによるパルミチン酸エステルの合成を触媒することである。
結果から、本発明の方法によってDS50遺伝子に対して設計されたdsRNAはアブラムシに対する防除効果が劣り、最高でも約23％であったことがわかる。
前記DS50遺伝子断片の配列は配列番号23で示される。
【０１１１】
TTGGAATTGATTCAACATCTAGCTCAAAGAGGAGCCCGCAAATTTGTTTTAGTGTCGAAATTGAACAACAAACCTCAGTCAGGTTACAAGACGTTGACCTTAAGACGGTTGAAGAACAAGAACGTTACCGTAGTCCTATCGTTTGCTGACCCATCAACAGTGAGAGGCGCTGAAGACGTACTGAGAGAAGCTGTAGCCCTCGGAACAGTCTGTGGTATTTACCACATAACCACCGCTCCGGAAACCAAACACTTGCAATCCCTGAGCGAAAAGGATTTCGCAGAGACGAAAAAAGTCGTGTCTGAGGCGGTTGCCAATTTGGACACACTGAGCAGGAGATTGATTCCTCAACTTGAATCGTTTGTTGTCCTTGCTCCGGCCGTCGCATCAAGAGGAGCTAAAGCCAAGTCCAACTACGTTTTCGCAAACGCAGATGTTATCAGAGTCGCTGAAGTCCGTAAAGTTTCGGGCTATCCAACAGTAGTCATAGAATACGGCGCAATCGAAGGTATTTCGAATGCGTTCAACAGTCCAAACTTCAAACCAGCGTCGATCGTTTCAGCGTTGAATGTTCTGGATGAAATTACCAAACAACCACAAAACCCAACAGTCGTGTCCTTCTCAAAATTCAACGGTCCAATTTATGAAGAAACGGATGCCGCCACTCCATTGTTGAAGACAATTGCCAAGATTTTCGGTTACAAGACACTGTCCCAAATTGAACAGACCTTTAATCTCGCTCAACTCGGCCTGGACACGTTCCTCGCACCACGCGTTCAAGAAGCCATCAGACAACAAGCCAACGCAGTCATCGAGGTAGAAGAACTAAGAACACTGACGTTCCCGGCTCTCCGGGCCAAGATCATCGAATTACTCGCC (配列番号23)
【０１１２】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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