(57)【要約】  本発明は、２つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、少なくとも１つの追加の結合ドメインと、を含む多価抗体に関連し、該ベース抗体部分は、リンカーによって少なくとも１つの追加の結合ドメインに接続され、該ベース抗体部分の各結合ドメイン及び該少なくとも１つの追加の結合ドメインのそれぞれは、全て共通可変領域を有し、該リンカーは、ヒンジ配列又はヒンジ配列に由来する配列を含む。本発明はまた、２つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、少なくとも１つの追加の結合ドメインと、を含む多価抗体に関連し、少なくとも１つの追加の結合ドメインは、ＣＨ１領域を含み、該リンカーによってベース抗体部分に接続されて、ベース抗体部分の可変領域及びＣＨ１領域が連結され、該多価抗体は、少なくとも３つの異なるエピトープに結合する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、
少なくとも１つの追加の結合ドメインと、を含む、多価抗体であって、
前記ベース抗体部分が、リンカーによって前記少なくとも１つの追加の結合ドメインに接続され、
前記ベース抗体部分の各結合ドメイン及び前記少なくとも１つの追加の結合ドメインのそれぞれが全て、共通可変領域を有し、
前記リンカーが、ヒンジ配列、又はヒンジ配列に由来する配列を含む、多価抗体。
【請求項２】
少なくとも１つの追加の結合ドメインが、Ｆｖドメイン、Ｆａｂドメイン、又は修飾Ｆａｂドメインを含む、請求項１に記載の多価抗体。
【請求項３】
少なくとも１つの追加の結合ドメインが、ＣＨ１領域を含み、前記リンカーによって前記ベース抗体部分に接続されて、前記ベース抗体部分の可変領域及び前記ＣＨ１領域を連結する、請求項１に記載の多価抗体。
【請求項４】
前記共通可変領域が、ＶＬ−ＣＬを含む共通軽鎖の形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項５】
前記共通軽鎖が、配列番号２９の配列を含む、請求項４に記載の多価抗体。
【請求項６】
前記共通可変領域が、ＶＨ−ＣＨ１を含む共通重鎖の形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項７】
前記ベース抗体部分の各結合ドメインが、異なるエピトープに結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項８】
少なくとも３つの異なるエピトープに結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項９】
２つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、
少なくとも１つの追加の結合ドメインと、を含む、多価抗体であって、
少なくとも１つの追加の結合ドメインが、ＣＨ１領域を含み、前記リンカーによって前記ベース抗体部分に接続されて、前記ベース抗体部分の可変領域及び前記ＣＨ１領域を連結し、
前記多価抗体が、少なくとも３つの異なるエピトープに結合する、多価抗体。
【請求項１０】
前記ベース抗体部分の各結合ドメイン及び前記少なくとも１つの追加の結合ドメインのそれぞれが全て、共通可変領域を有する、請求項９に記載の多価抗体。
【請求項１１】
少なくとも１つの追加の結合ドメインが、Ｆｖドメイン、Ｆａｂドメイン、又は修飾Ｆａｂドメインを含む、請求項９又は１０に記載の多価抗体。
【請求項１２】
前記共通可変領域が、ＶＬ−ＣＬを含む共通軽鎖の形態である、請求項１０又は１１に記載の多価抗体。
【請求項１３】
前記共通軽鎖が、配列番号２９の配列を含む、請求項１２に記載の多価抗体。
【請求項１４】
前記共通可変領域が、ＶＨ−ＣＨ１を含む共通重鎖の形態である、請求項１０又は１１に記載の多価抗体。
【請求項１５】
前記ベース抗体部分の各結合ドメインが、異なるエピトープに結合する、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項１６】
前記リンカーが、配列番号１〜２４のいずれか１つに記載の配列、又は配列番号１〜２４のいずれか１つと少なくとも約８５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項１７】
前記ベース抗体部分が全長免疫グロブリンである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項１８】
前記ベース抗体部分の前記結合ドメインがＦａｂドメインである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項１９】
前記抗体の前記ベース部分が、第２のＣＨ３ドメインと二量体化する第１のＣＨ３ドメインを含み、前記第１のＣＨ３ドメインは、３５１位及び３６６位又はそれに対応する位置にアミノ酸残基リジンを含み、前記第２のＣＨ３ドメインは、３５１位又はそれに対応する位置にアスパラギン酸のアミノ酸残基、及び３６８位又はそれに対応する位置にグルタミン酸のアミノ酸残基を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項２０】
前記抗体の前記結合ドメインの前記共通可変領域が、その生殖細胞系において再構成可変鎖核酸配列を含むトランスジェニックげっ歯類によってコードされる核酸から得られるか、それに由来するか、又はそれに基づく核酸によってコードされる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項２１】
前記ベース抗体部分の各Ｆａｂドメインが、リンカーを介して追加の結合ドメインに接続される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項２２】
前記ベース抗体部分の結合ドメインのＮ末端が、リンカーを介して１つの追加の結合ドメインのＣ末端に接続される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項２３】
前記ベース抗体部分の前記第１の結合ドメインのＮ末端が、リンカーを介して第１の追加の結合ドメインのＣ末端に接続され、前記ベース抗体部分の前記第２の結合ドメインのＮ末端が、リンカーを介して第２の追加の結合ドメインのＣ末端に接合される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項２４】
前記ベース抗体部分の前記第１の結合ドメインのＮ末端が、リンカーを介して第１の追加の結合ドメインのＣ末端に接続され、第２の追加の結合ドメインのＣ末端が、リンカーを介して前記第１の追加の結合ドメインのＮ末端に接続される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項２５】
少なくとも４つの異なるエピトープに結合することができる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項２６】
少なくとも２つの異なる抗原に結合することができる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項２７】
少なくとも１つの追加の結合ドメインが、Ｆａｂドメインであり、前記追加のＦａｂドメインが、前記ベース抗体部分の前記ＣＨ１と比較して異なるサブクラスのＣＨ１を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項２８】
前記リンカーが、短い、長い、荷電している、剛性である、又は柔軟性である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項２９】
前記リンカーのアミノ酸配列が、天然に生じる配列を含むか、又は天然に生じる配列に由来する配列を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項３０】
前記リンカーが、中央ヒンジ領域配列を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項３１】
前記リンカーが、上部及び下部ヒンジ配列を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項３２】
前記リンカーが、らせん形成配列を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項３３】
前記リンカーが、配列番号１〜２４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項３４】
少なくとも１つの追加の結合ドメインが、ＣＨ１ドメインを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項３５】
前記結合ドメインのうちの少なくとも１つが、免疫エフェクター細胞上の抗原に特異的に結合する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項３６】
前記免疫エフェクター細胞がＴ細胞である、請求項３５に記載の多価抗体。
【請求項３７】
前記Ｔ細胞上の前記抗原がＣＤ３である、請求項３６に記載の多価抗体。
【請求項３８】
前記結合ドメインのうちの少なくとも１つが、異常細胞上の抗原に特異的に結合する、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項３９】
少なくとも２つの結合ドメインが、異常細胞上の抗原に特異的に結合する、請求項３８に記載の多価抗体。
【請求項４０】
前記少なくとも２つの結合ドメインが、異常細胞上の少なくとも２つの異なる抗原に特異的に結合する、請求項３９に記載の多価抗体。
【請求項４１】
前記少なくとも２つの結合ドメインが、少なくともＥＧＦＲ及びＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、請求項４０に記載の多価抗体。
【請求項４２】
第１の結合ドメインがＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、第２の結合ドメインがＣＤ３に特異的に結合し、第３の結合ドメインがＥＧＦＲに特異的に結合する、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項４３】
前記異常細胞が腫瘍細胞である、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項４４】
前記ベース抗体が、結合ドメイン１及び２を含み、前記追加の結合ドメイン３が結合ドメイン１に連結され、任意の追加の結合ドメイン４が結合ドメイン２に連結される、請求項３５〜４３のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項４５】
結合ドメイン１がＣＤ３結合ドメインであり、結合ドメイン２及び３が異なる標的細胞抗原に結合する、請求項４４に記載の多価抗体。
【請求項４６】
結合ドメイン２がＣＤ３結合ドメインであり、結合ドメイン１及び３が異なる標的細胞抗原に結合する、請求項４４に記載の多価抗体。
【請求項４７】
結合ドメイン３がＣＤ３結合ドメインであり、結合ドメイン１及び２が異なる標的細胞抗原に結合する、請求項４４に記載の多価抗体。
【請求項４８】
更なる異なる標的細胞抗原に結合する結合ドメイン４を含む、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項４９】
前記標的細胞抗原結合ドメインの第１が、ＰＤ−Ｌ１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１３７、ＣＬＥＣ１２Ａ、フィブリノーゲン、又はサイログロブリンに結合する、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項５０】
前記第１及び第２の標的細胞結合ドメインが、異なる抗原に結合する、請求項４４〜４９のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項５１】
前記標的細胞抗原結合ドメインの第１及び第２が、ＰＤ−Ｌ１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１３７、ＣＬＥＣ１２Ａ、フィブリノーゲン、及びサイログロブリンから選択される抗原に結合する、請求項５０に記載の多価抗体。
【請求項５２】
前記ＣＤ３結合ドメインが、ＭＦ８０５７、又はＭＦ８０５８、又はＭＦ８０７８、又はＭＦ８３９７、又はＭＦ８５０８、又はＭＦ９２４９、又はＭＦ９２６７の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項５３】
前記ＣＤ３結合ドメインが、前記ＣＤＲ以外の１つ以上の位置に０〜１０、好ましくは０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ８０５７、ＭＦ８０５８、ＭＦ８０７８、ＭＦ８３９７、ＭＦ８５０８、ＭＦ９２４９、又はＭＦ９２６７のＶＨのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項４４〜５２のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項５４】
標的細胞抗原結合ドメインが、ＰＤ−Ｌ１結合ドメインである、請求項４４〜５３のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項５５】
前記ＰＤ−Ｌ１結合ドメインが、ＭＦ５３７７、又はＭＦ５４４４、又はＭＦ５３８０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項５４に記載の多価抗体。
【請求項５６】
前記ＰＤ−Ｌ１結合ドメインが、前記ＣＤＲ以外の１つ以上の位置に０〜１０、好ましくは０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５３７７、ＭＦ５４４４、又はＭＦ５３８０のＶＨのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項５４又は請求項５５に記載の多価抗体。
【請求項５７】
標的細胞抗原結合ドメインが、ＥＧＦＲ結合ドメインである、請求項４４〜５６のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項５８】
前記ＥＧＦＲ結合ドメインが、ＭＦ８２３３、又はＭＦ９８９１、又はＭＦ９８８６、又はＭＦ９８７３、又はＭＦ９９８８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項５７に記載の多価抗体。
【請求項５９】
前記ＥＧＦＲ結合ドメインが、前記ＣＤＲ以外の１つ以上の位置に０〜１０、好ましくは０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ８２３３、ＭＦ９８９１、ＭＦ９８８６、ＭＦ９８７３、又はＭＦ９９８８のＶＨのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項５７又は請求項５８に記載の多価抗体。
【請求項６０】
標的細胞抗原結合ドメインが、ＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメインである、請求項４４〜５９のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項６１】
前記ＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメインが、ＭＦ４３２７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項６０に記載の多価抗体。
【請求項６２】
前記ＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメインが、前記ＣＤＲ以外の１つ以上の位置に０〜１０、好ましくは０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ４３２７のＶＨのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項６０又は請求項６１に記載の多価抗体。
【請求項６３】
ＣＤ３結合ドメイン、ＥＧＦＲ結合ドメイン、及びＰＤ−Ｌ１結合ドメインを含む、請求項５２〜６２のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項６４】
多価抗体の調製方法であって、前記方法が、
請求項１〜６３のいずれか一項に記載の多価抗体に組み立てることができるポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む細胞を準備することと、
前記宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現及びそれらの組み立てを多価抗体に提供する条件下で培養することと、を含む、方法。
【請求項６５】
多価抗体の調製方法であって、前記方法が、
（ｉ）２つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、（ｉｉ）少なくとも１つの追加の結合ドメインと、（ｉｉｉ）ヒンジ配列又はヒンジ配列に由来する配列を含む少なくとも１つのリンカーとに、組み立てることができるポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む細胞を準備することと、
前記ベース抗体部分、前記少なくとも１つの追加の結合ドメイン、及び前記少なくとも１つのリンカーの発現、並びに多価抗体へのそれらの組み立てを提供する条件下で前記宿主細胞を培養することと、を含み、
組み立ての際に、前記ベース抗体部分が、リンカーによって前記少なくとも１つの追加の結合ドメインに接続され、前記ベース抗体部分の各結合ドメイン及び前記少なくとも１つの追加の結合ドメインのそれぞれが全て、共通可変領域を有する、方法。
【請求項６６】
多価抗体の調製方法であって、前記方法が、
（ｉ）２つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、（ｉｉ）少なくとも１つの追加の結合ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのリンカーとに、組み立てることができるポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む細胞を準備することと、
前記ベース抗体部分、前記少なくとも１つの追加の結合ドメイン、及び前記少なくとも１つのリンカーの発現、並びに多価抗体へのそれらの組み立てを提供する条件下で前記宿主細胞を培養することと、を含み、
組み立ての際に、前記ベース抗体部分が、リンカーによって前記少なくとも１つの追加の結合ドメインに接続され、前記ベース抗体部分の各結合ドメイン及び前記少なくとも１つの追加の結合ドメインのそれぞれが全て、共通可変領域を有し、前記多価抗体が、少なくとも３つの異なるエピトープに結合する、方法。
【請求項６７】
多価抗体の調製方法であって、前記方法が、
（ｉ）２つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、（ｉｉ）少なくとも１つの追加の結合ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのリンカーとに、組み立てることができるポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む細胞を準備することと、
前記ベース抗体部分、前記少なくとも１つの追加の結合ドメイン、及び前記少なくとも１つのリンカーの発現、並びに多価抗体へのそれらの組み立てを提供する条件下で前記宿主細胞を培養することと、を含み、
組み立ての際に、前記ベース抗体部分が、リンカーによって前記少なくとも１つの追加の結合ドメインに接続され、前記ベース抗体部分の各結合ドメイン及び前記少なくとも１つの追加の結合ドメインのそれぞれが全て、共通可変領域を有し、各結合ドメインが、抗原刺激に応答して体細胞組換えを受けた核酸から得られる、又はそれに基づいて、又はそれに由来した再構成可変領域を含み、前記共通可変領域を有するＦａｂドメインを形成する、方法。
【請求項６８】
少なくとも１つの追加の結合ドメインが、Ｆｖドメイン、Ｆａｂドメイン、又は修飾Ｆａｂドメインを含む、請求項６４〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
少なくとも１つの追加の結合ドメインが、ＣＨ１領域を含む、請求項６４〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記共通可変領域が、ＶＬ−ＣＬを含む共通軽鎖の形態である、請求項６４〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記共通軽鎖が、配列番号２９の配列を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記共通可変領域が、ＶＨ−ＣＨ１を含む共通重鎖の形態である、請求項６４〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ベース抗体部分の各結合ドメインが、異なるエピトープに結合する、請求項６４〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
請求項１〜６３のいずれか一項に記載の多価抗体に組み立てることができるポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む細胞。
【請求項７５】
（ｉ）２つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、（ｉｉ）少なくとも１つの追加の結合ドメインと、（ｉｉｉ）ヒンジ配列又はヒンジ配列に由来する配列を含む少なくとも１つのリンカーとに、組み立てることができるポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む細胞であって、
組み立ての際に、前記ベース抗体部分が、リンカーによって前記少なくとも１つの追加の結合ドメインに接続され、前記ベース抗体部分の各結合ドメイン及び前記少なくとも１つの追加の結合ドメインのそれぞれが全て、共通可変領域を有する、細胞。
【請求項７６】
（ｉ）２つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、（ｉｉ）少なくとも１つの追加の結合ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのリンカーとに、組み立てることができるポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む細胞であって、
組み立ての際に、前記ベース抗体部分が、リンカーによって前記少なくとも１つの追加の結合ドメインに接続され、前記ベース抗体部分の各結合ドメイン及び前記少なくとも１つの追加の結合ドメインのそれぞれが全て、共通可変領域を有し、前記多価抗体が、少なくとも３つの異なるエピトープに結合する、細胞。
【請求項７７】
（ｉ）２つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、（ｉｉ）少なくとも１つの追加の結合ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのリンカーとに、組み立てることができるポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む細胞であって、
組み立ての際に、前記ベース抗体部分が、リンカーによって前記少なくとも１つの追加の結合ドメインに接続され、前記ベース抗体部分の各結合ドメイン及び前記少なくとも１つの追加の結合ドメインのそれぞれが全て、共通可変領域を有し、各共通可変領域が、その同族領域と共進化している、細胞。
【請求項７８】
配列番号３〜５、７〜１１若しくは１３〜２４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は配列番号３〜５、７〜１１若しくは１３〜２４のいずれか１つに対して少なくとも約８５％の配列同一性を有するポリペプチド。
【請求項７９】
請求項７８に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項８０】
請求項７９に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項８１】
請求項１〜６３のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項８２】
治療によるヒト又は動物の身体の処置に使用するための、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の多価抗体。
【請求項８３】
医学的適応症に罹患しているヒト又は動物を処置するための方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項１〜６３のいずれか一項に記載の抗体を前記ヒト又は動物に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３つ以上の結合ドメインを有する多価抗体、及びかかる多価抗体の作製方法に関する。本発明は、多価抗体の構成ポリペプチド、及び多価抗体の１つ以上の結合ドメインを接続するために使用することができるリンカーに更に関する。本発明は、かかる多価抗体、リンカーをコードする核酸、及びかかる核酸を含むベクター、並びに多価抗体を産生する宿主細胞に更に関する。本発明はまた、癌細胞又は腫瘍細胞抗原上に存在する標的抗原及び免疫エフェクター細胞に関与する標的を含む、３つの抗原又は標的に同時に結合することができる多価抗体にも関する。また、本発明は、多価抗体を含む医薬組成物、及び治療によってヒト又は動物の処置に使用するための多価抗体に関する。また、本発明は、抗体を使用したヒト又は動物を処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２つの抗原又は２つのエピトープに結合することができる二重特異性抗体などの多価抗体は、当該技術分野において既知である。かかる多価結合タンパク質は、細胞融合、化学的コンジュゲーション、又は組み換えＤＮＡ技術を含む様々な技術を使用して生成することができる。
【０００３】
抗体は、典型的には、２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖を含む４つのタンパク質で構成される多量体であり、重鎖は可変ドメイン（ＶＨ）、及び３つの定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）で構成され、軽鎖は可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ）から構成される。典型的には、軽鎖は、多くの非共有相互作用の影響を通じて、更にはジスルフィド結合を介して重鎖と対合する。２つの重鎖は、ＣＨ１をＣＨ２に接続するヒンジ領域で、及び／又は２つのＣＨ３ドメイン間の界面でのアミノ酸相互作用を介して、対合する。ＶＨとＶＬとの対合は、抗原結合ドメインを形成し、典型的には、可変性は、相補性決定領域又はＣＤＲである、ＶＨ及びＶＬドメイン内の３つの表面ループ形成領域において見出される。
【０００４】
２つの異なる抗原、又は同じ抗原内の２つの異なるエピトープに結合し得る、二重特異性抗体などの２つの異なる結合ドメインを有する抗体など、特定の多価抗体フォーマットが当技術分野において既知である。かかるフォーマットでは、多価抗体が、１つの抗原を発現する正常な細胞を標的化したり、又はより低い発現レベルで１つの抗原を発現するかかる正常な細胞を標的化することなく、腫瘍細胞などの２つの抗原又はエピトープを発現する細胞又は標的を選択的に標的とすることを可能にする調整された結合の使用を可能にし得る。同様に、二重特異性抗体などの多価抗体上に２つの異なる結合ドメインを有することにより、異なる抗原の結合が可能となり、それにより、この多価抗体を使用して、単一細胞又は２つの相互作用細胞上の阻害分子及び刺激分子の両方を標的とすることができ、その結果、多価抗体の効力が高まる。多価抗体はまた、腫瘍にリダイレクトされ得る、例えば免疫調節細胞などの細胞をリダイレクトするために使用され得る。
【０００５】
単一の抗体における３つ以上の結合ドメインを組み込むことで、標的及び有効性のより多岐にわたる有益な組み合わせを可能にし得る。例えば、３つ以上の結合ドメインを有する多価抗体は、同じ抗原及びエピトープを標的とし得、標的に対する抗体のより低い比で、所与の標的に対する特異性及び／又は標的の飽和を可能にする。多価抗体は、標的細胞への高いアビディティ結合を可能にするために、２つ以上の同一の抗原結合ドメインを含有してもよい。これは、腫瘍細胞上で過剰発現されるガングリオシドなどの抗原を特異的に標的化するために使用することができる。これらの腫瘍関連抗原は、通常の細胞上に存在するが、腫瘍細胞上では非常に高密度で存在する。いくつかの低親和性結合領域を含有する多価抗体は、正常細胞と反応しないか、又はより低い比で反応すると同時に、追加の受容体を活性化若しくは遮断しながら、腫瘍細胞への特異的標的化を可能にし得る。最終的に、３つ以上の結合領域が、かかる用途において有用である。
【０００６】
特定の多価抗体が当該技術分野において記載されてきたが、当該技術分野では、多価抗体の効率的な産生を可能にし、多くの抗原に対するその結合ドメインを容易に作製及び効率的かつ安定的に多価抗体へと変換でき、そして多岐にわたる抗原及びエピトープに結合することができる、新たなフォーマット及び新たなリンカーが必要とされている。３つ以上の結合ドメインを含有する抗体の操作は、従来、時間がかかり、非効率的で、費用がかかってきた。実際に、様々な抗原を標的化するために生成することができる高品質で低免疫原性の多価抗体の効率的な産生には、多くの障害が存在する。
【０００７】
例えば、３つ又は４つの結合ドメインを含有する既存の多価フォーマットは、第１に、分子中の全ての結合ドメインへのアクセスを制限する傾向があり、第２に、開発可能性にとって問題となり得る、配列ドメインを含有するＧｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）リピートなどの合成リンカーに依存する。
【０００８】
既存の多価抗体フォーマットはまた、ジスルフィド結合及びアミノ酸相互作用によって会合される、又は単鎖可変領域断片（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ)（ｓｃＦｖ）の場合、短いリンカーによって接合され得る、異なる重鎖及び軽鎖に依存する。しかし、３つ以上の結合特異性の多重特異的フォーマットで使用される複数の可変ドメインのそれぞれにおいて、異なる可変鎖（重鎖及び／又は軽鎖）を使用する必要があるので、重鎖及び軽鎖の誤対合を防止するために、かかる分子の広範な操作を必要とする。このことは、常に、これらの分子の複雑性、安定性、免疫原性、及び産生レベルに影響を及ぼす。
【０００９】
多価抗体フォーマットは、各結合ドメインに同じ軽鎖を使用することに依存し得、この場合、該軽鎖と対合する１つ以上の同族可変領域は、該同族鎖が、抗原曝露、及びＢ細胞の発達中に発生する共進化のプロセスに応答して共通軽鎖と形成されて対合するのではなく、化学修飾によって強制的に対合する。
【００１０】
多価抗体フォーマットはまた、１つの抗原に結合する既存の単特異性抗体からの軽鎖に依存し得、これは、その後、ライブラリにおいて使用されて、該軽鎖を対合することが可能な重鎖を同定し、同時に異なるエピトープ又は抗原にも結合する。
【００１１】
かかる擬似共通軽鎖（ｐｓｅｕｄｏ−ｃｏｍｍｏｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ）は、本発明での使用には好ましくない。本発明の好ましい共通軽鎖は、多様な同族鎖と対合することが可能であり、体細胞組換え、好ましくは抗原曝露に応答した体細胞超変異を受けたＤＮＡによってコードされる、再構成された同族鎖と対合する共通鎖から得られるか、それに由来するか、又はそれに基づくものである。
【００１２】
疑似軽鎖アプローチは、利用可能な同族鎖の範囲を制限する。抗原曝露に応答して一緒に形成されなかった重鎖及び軽鎖の対合を強制することにより、特異性及び親和性の喪失につながり、有用性が制限される。更に、ＶＨ及びＶＬのシャッフルを可能にし、親和性及び特異性を維持することは、任意の所与の抗体にとって、通常、稀少である。
【００１３】
抗原に結合する能力を維持しながら、重鎖及び軽鎖が免疫応答において共進化していない、重鎖及び軽鎖の対合を強制することは簡単ではなく、このアプローチの柔軟性を制限する可能性がある。
【００１４】
同様に、１つの抗体の軽鎖を再利用して、その軽鎖に結合可能な重鎖を同定し、更に対象となる異なる抗体にも結合することは、利用可能な重鎖の範囲を制限し、適切な追加の重鎖を同定できなくなる可能性が高くなり、より多くの抗原又はエピトープが結合しようとする。すなわち、重鎖と対合する軽鎖を使用して、所与の抗原に結合するＦａｂを形成して、該軽鎖と対合し、第２の抗原に結合することができる、後続の重鎖を同定してもよい。しかし、その軽鎖を３回目に使用して、第３の抗原又はエピトープに結合しながら該軽鎖と対合することができる第３の重鎖を同定することはますます稀少になり、更に稀少なことには、異なるエピトープ又は抗原にも結合しながら該軽鎖と対になることができる、より多くの重鎖が同定されることが求められる。
【００１５】
本明細書に記載される本発明の好ましい実施形態は、抗原に応答して、多様な重鎖と対合する共通鎖を用い、単特異性抗体の既存の軽鎖の再利用又は化学修飾による軽鎖の同族鎖への強制対合を必要としない。
【００１６】
２つのドメインを直接融合することにより生物活性が損なわれる可能性があるため、多価抗体の構築が成功するかどうかは、異なるドメイン間のタンパク質リンカーの適切な選択に依存する。リンカー又は複数のリンカーの生物物理的特性、例えば、電荷、剛性、又は柔軟性、並びに結合ドメイン間の距離及び結合領域間の空間的コンフォメーションは、エピトープのアクセス及びその標的に結合する多価タンパク質の能力に影響を及ぼし得る。したがって、モジュール式で、異なる分子及び／又は異なる細胞上に位置し得る異なる組み合わせのエピトープへの同時結合を可能にする多価抗体の構築を可能とする、異なる特徴を有する様々なリンカーを用いることができる多価フォーマットが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第出願公開２０１０／０２０３０５６（Ａ１）号
【特許文献２】国際公開第２０１１／０６６３８９号
【特許文献３】国際公開第２０１３／０７９１７４号
【特許文献４】国際公開第２０１３／１８１６３４号
【特許文献５】国際公開第２０１６／１４９２０１号
【特許文献６】国際公開第２０１７／０３４９１６号
【特許文献７】国際公開第２０１３／１７３２２３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、安定性、低免疫原性、及び開発可能性の容易さを維持しながら、標的の組み合わせに応じてモジュール式で用いることができる剛性、柔軟性、長さの異なる特徴を含む一連のリンカーの設計が当該技術分野において必要とされている。
したがって、３つ以上の結合ドメインを含む広範な抗体の迅速かつ堅牢な生成に広く適用可能である抗体の産生のために、３つ以上の結合ドメイン及びリンカーを有する多価抗体のための新しく有用なフォーマットが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、多重特異性抗体であり得る３つ以上の結合ドメインを含む多価抗体の新規なモジュール式フォーマットに基づく。これらのフォーマットでは、少なくとも１つの結合ドメインは、ベース抗体部分に接続され、該ベース抗体部分は２つの結合ドメインを含む。追加の結合ドメインは、可変領域、Ｆｖドメイン、Ｆａｂドメイン、又は修飾Ｆａｂドメイン、又はそれらのいずれかの機能的断片を含んでもよい。ベース抗体部分は、例えば、全長抗体又はその断片であってもよいが、いずれの場合にも、２つの結合ドメインを含む。
【００２０】
１つ以上の追加の結合ドメインは、リンカー（複数可）を介してベース抗体部分に接続され、ベース抗体部分のものに加えて１つ以上の結合部分を提供する。
【００２１】
リンカーは、１つ以上の追加の結合ドメインをベース抗体部分に接続するために使用される。リンカーは、ペプチド領域、例えば、１つ以上のヒンジ領域及び／又はヒンジ領域に由来する１つ以上の領域を含む。リンカーと、該リンカーが接続している定常領域（例えば、ＣＨ１）との組み合わせは、多価抗体の特性の判定に重要であり得、抗体の正確な機能及び／又はベース抗体への１つ以上の追加の結合ドメインの配向を可能にする。したがって、リンカー配列が所与のサブタイプのヒンジに基づく場合、該リンカーが結合している追加の結合ドメインの定常領域は、同じサブタイプのものであることが好ましい場合がある。
【００２２】
１つ以上の追加の結合ドメイン（複数可）は、可変領域、Ｆｖドメイン、Ｆａｂドメイン、又は修飾Ｆａｂドメインを含み得る。
【００２３】
Ｆａｂドメインは、特に、安定であり、容易に製造することができる多価分子の製造に有用である予測可能な挙動を有するタンパク質ドメインを含むため、有益な追加の結合ドメインを構成する。
【００２４】
本発明の多価抗体の効率的な産生及び開発可能性を促進するため、該多価抗体は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）であり得る共通可変領域を含み得るが、典型的には共通軽鎖（ｃＬＣ）可変領域である。
【００２５】
共通可変領域は、典型的には、体細胞組換え、好ましくは親和性成熟を受けた核酸によってコードされる同族可変領域と対合しているか、又は体細胞組換え、好ましくは親和性成熟のプロセスを受けた核酸によりコードされる再構成可変領域に基づくか、若しくはそれに由来するか、及び／又は、ファージディスプレイ、ヒト化免疫系を有するトランスジェニック動物を含む動物の免疫化、及び当技術分野で周知の他の技術などの既知の抗体生成技術に基づくか、又はそれに由来する。
【００２６】
本発明の多価抗体の各結合ドメインにおいて本質的に同一である共通可変領域の使用は、かかる抗体の開発及び製造を促進する。
【００２７】
したがって、本発明の多価抗体において使用するための共通可変領域の選択は、様々な同族重領域又は軽領域と共に広く使用することができるものである必要がある。
【００２８】
同一の、又は実質的に同一の共通可変領域、例えばｃＬＣ可変領域により、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術で使用されるような広範な操作、又は重鎖及び軽鎖の誤対合を防ぐためのリンカー（ｓｃＦｖドメインで使用されるようなもの）を必要とすることなく、３つ以上の全ての結合領域に、完全な、又は実質的に完全なＦａｂドメインの使用が可能となる。また、本質的に生殖細胞系にコードされ、非免疫原性の共通可変領域が既知であるため（国際公開第２００９／１５７７７１号を参照されたい）、３つ以上のＦａｂドメインのそれぞれにおいて該共通可変領域を使用することにより、免疫原性の低減をもたらすことができる。
【００２９】
多価抗体を産生するための本明細書に記載のフォーマットの追加の利点により、多様な同族可変領域と対合することができる共通可変領域（例えば、多様な重鎖可変領域と対合する共通軽鎖可変領域）（国際公開第２００９／１５７７７１を参照されたい）をゲノム内に有するトランスジェニック動物、好ましくはトランスジェニックげっ歯類を使用することが可能となり、これにより、異なる抗原への曝露から形成された同族可変領域をコードするＤＮＡを、共通可変領域をコードするＤＮＡとともに宿主細胞に導入することが可能となる（多価抗体の生成のためにそれぞれ発現させることができる）。
【００３０】
例えば、その生殖細胞系に、共通可変領域をコードするＤＮＡと、再構成されて同族可変領域を形成することができ、体細胞組換えを受けることができる再構成されていない免疫グロブリン遺伝子座をコードするＤＮＡと、を含むトランスジェニックマウスは、１つ以上の抗原に曝露されることができ、その結果、次いで、３つ以上の抗原への曝露に基づいて産生された再構成可変領域を使用して、本発明の多価抗体を生成することができる。共通可変領域をコードする核酸配列、及び３つ以上の再構成可変領域を宿主細胞に形質転換して、本発明の多価抗体を発現させることができる。
【００３１】
したがって、多価抗体を産生するための本明細書に記載されるフォーマットは、全てが共通可変領域、好ましくは共通軽鎖可変領域を含み得る３つ以上の結合ドメインを利用する。
【００３２】
本発明のフォーマットは、ベース抗体部分のものに加えて、１つ以上の結合ドメインを含む。かかる追加の結合ドメインは、好ましくはＣＨ１ドメイン及び可変ドメインを含む、Ｆｖドメイン、Ｆａｂドメイン、又は修飾Ｆａｂドメインであってもよく、リンカーを介してベース抗体部分に接続される。修飾Ｆａｂドメインでは、ＣＨ１ドメインは、ＣＬと対合していない。好適なＣＨ１ドメインは、１つ以上の疎水性領域を除去するように操作されたものであってもよく、又はラクダ科動物若しくはサメ由来のものであってもよい。あるいは、追加の結合ドメインは、リンカーを介してベース抗体部分に接続される、ＣＬドメイン及び可変ドメインを含んでもよい。ＣＬドメインは、Ｃカッパ又はＣラムダドメインのいずれかであり得る。
【００３３】
典型的には、追加の結合ドメイン（複数可）は、ベース抗体部分の結合ドメインの、共通可変部分若しくは再構成可変領域のいずれか又は両方のＮ末端領域におけるベース抗体部分の一方又は両方の結合ドメインに接続される。
【００３４】
あるいは、追加の結合ドメインは、ベース抗体部分の結合ドメインの共通鎖及び再構成可変ドメインの両方を、追加の結合ドメインのＣＨ１及びＣＬ領域に接続するリンカーを介して、ベース抗体部分に接続されてもよい。追加の結合ドメインが定常領域を欠いている場合、本明細書に開示される新規リンカーは、ベース抗体部分の結合ドメインの共通鎖及び再構成可変ドメインの両方を、追加の結合ドメインの共通鎖及び／又は再構成可変領域に接続してもよい。
【００３５】
あるいは、追加の結合ドメインは、単一のリンカーペプチドによってベース抗体部分に接続される、ＶＨ領域及びＶＬ領域、すなわちＦｖドメインであってもよい。典型的には、この種類の追加の結合ドメイン（複数可）は、ベース抗体部分の結合ドメインの共通可変部分又は再構成可変領域のいずれかのＮ末端領域における、ベース抗体部分の一方又は両方の結合ドメインに結合される。
【００３６】
このフォーマットは、異なる長さ、構造、及び剛性度を含む、本明細書に開示される本発明のリンカーと共に使用される場合、驚くほど柔軟である。したがって、本発明は、３つ以上の結合ドメインを多価抗体に組み合わせるように開発を容易にさせる、開示された多価抗体フォーマットにおいて使用するための異なる特性を有するリンカーのレパートリーを提供する。
【００３７】
本明細書に開示されるリンカーにより、本発明は、適切なリンカーの選択と、対応する結合ドメイン（例えば、Ｆａｂドメイン）のセットの選択とを一緒にしたモジュール式アプローチを提供し、これにより、これらの結合ドメインが多価抗体において様々な効能のために一緒に機能することを可能にする。
【００３８】
本発明の多価抗体は、治療、特に、いわゆる「エンゲージャー」抗体として使用することができ、それにより、抗体は、免疫エフェクター細胞と腫瘍細胞との間にリンクを形成することができる。
【００３９】
したがって、本発明によれば、
２つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、
少なくとも１つの追加の結合ドメインと、を含む多価抗体を提供し、
該ベース抗体部分は、リンカーによって少なくとも１つの追加の結合ドメインに接続され、
該ベース抗体部分の各結合ドメイン及び該少なくとも１つの追加の結合ドメインのそれぞれは全て、共通可変領域を有し、
該リンカーは、ヒンジ配列、又はヒンジ配列に由来する配列を含む。
【００４０】
本発明はまた、
２つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、
少なくとも１つの追加の結合ドメインと、を含む多価抗体を提供し、
少なくとも１つの追加の結合ドメインは、ＣＨ１領域を含み、該リンカーによって該ベース抗体部分に接続されて、該ベース抗体部分の可変領域及び該ＣＨ１領域を連結し、
該多価抗体は、少なくとも３つの異なるエピトープに結合する。
【００４１】
好ましくは、ベース抗体部分の各結合ドメイン及び少なくとも１つの追加の結合ドメインのそれぞれは全て、共通可変領域を有してもよい。
【００４２】
様々な１つ以上の追加の結合ドメイン
好ましい実施形態は多価抗体であり、１つ以上の結合ドメインが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦｖドメインである。
【００４３】
更なる好ましい実施形態は多価抗体であり、１つ以上の結合ドメインが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂドメインであり、該Ｆａｂドメインの重鎖可変領域がＣＨ１領域（ＶＨ−ＣＨ１）を含み、該Ｆａｂの軽鎖可変領域がＣＬ領域（ＶＬ−ＣＬ）を含む。該Ｆａｂドメインは、Ｖカッパ−Ｃカッパ、Ｖラムダ−Ｃラムダ、Ｖラムダ−Ｃカッパ、又はＶカッパ−ＣラムダのいずれかであるＶＬ−ＣＬを含有し得る。
【００４４】
別の実施形態は多価抗体であり、１つ以上の追加の結合ドメインが、ＶＨ−ＣＨ１及びＶＬからなる修飾Ｆａｂドメインである。あるいは、一実施形態は多価抗体であり、１つ以上の追加の結合ドメインが、ＶＬ−ＣＬ及びＶＨからなる修飾Ｆａｂドメインである。かかる修飾Ｆａｂドメインでは、その同族領域と対合するものではない定常領域ＣＨ１若しくはＣＬが存在する、及び／又はその同族領域と対合するものではない可変領域ＶＨ若しくはＶＬが存在する。
【００４５】
共通鎖
好ましい実施形態は多価抗体であり、１つ以上の追加の結合ドメインは、抗原への曝露後に体細胞再構成を受けた再構成可変領域と対合する共通の再構成可変領域を含むＦａｂドメインを含むか、又は体細胞再構成の結果である配列から得られるか、それに由来するか、又はそれに基づく核酸によってコードされる。あるいは、再構成可変領域は、合成ファージディスプレイライブラリの使用を含む当該技術分野において既知の分子生物学技術を使用して、多様性がレパートリーに導入される合成レパートリーから得られるか、それに由来するか、又はそれに基づくものであり得る。好ましくは、Ｆａｂドメインは、対応する再構成重鎖可変領域と対合する共通軽鎖可変領域を含む。好ましくは、共通軽鎖可変領域は、ＣＬ領域に接続され、再構成重鎖可変領域は、ＣＨ１領域に接続される。好ましくは、共通軽鎖は、ＣＬ及びＣＨ１領域の結合を介して重鎖可変領域と対合する。あるいは、共通鎖が重鎖であり、再構成可変領域が軽鎖であり、該鎖は、それぞれＣＨ１及びＣＬドメインを含んでもよく、ＣＬ及びＣＨ１領域の結合を介して対合してもよい。
【００４６】
好ましい実施形態は多価抗体であり、３つ以上の結合ドメインがそれぞれ同じ共通鎖を含むが、３つ以上の結合ドメインは、異なる再構成可変同族鎖を含み、より好ましくは、同一の共通鎖が共通軽鎖である。
【００４７】
好ましい実施形態は多価抗体であり、３つ以上の結合ドメインが、抗原に曝露され、共通軽鎖と対合する再構成重鎖可変領域を含む抗体を産生する、共通軽鎖と再構成されていない重鎖可変領域を含むトランスジェニック動物の核酸配列から得られるか、それに由来するか、又はそれに基づいた核酸によってコードされる再構成可変領域を含む。あるいは、多価抗体の一実施形態では、３つ以上の結合ドメインは、抗原に曝露され、共通重鎖と対合する再構成軽鎖可変領域を含む抗体を産生する、共通重鎖と再構成されていない軽鎖可変領域を含むトランスジェニック動物の核酸配列から得られるか、それに由来するか、又はそれに基づいた核酸によってコードされる再構成可変領域を含む。
【００４８】
リンカー組成物
好ましい実施形態は該多価抗体であり、該リンカーが天然に存在する配列であるか、又は天然に存在する配列に基づくものである。より具体的には、該リンカーは、ヒンジ配列であるか、又はヒンジ配列に基づく配列を含む。より具体的には、該リンカーは、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＩｇＧ２ヒンジ領域、ＩｇＧ３ヒンジ領域、又はＩｇＧ４ヒンジ領域に基づくヒンジ領域を含み得る。
【００４９】
あるいは、該リンカーは、以下：
ＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号１）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号２）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）
ＥＲＫＳＳＶＥＳＰＰＳＰ（配列番号４）
ＥＲＫＣＳＶＥＳＰＰＳＰ（配列番号５）
ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号６）
ＥＳＫＹＧＰＰＳＰＳＳＰ（配列番号７）
ＥＲＫＳＳＶＥＡＰＰＶＡＧ（配列番号８）
ＥＲＫＣＳＶＥＡＰＰＶＡＧ（配列番号９）
ＥＳＫＹＧＰＰＡＰＥＦＬＧＧ（配列番号１０）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ（配列番号１１）
ＥＰＫＳＣＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰＰＶＡＧ（配列番号１３）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号１４）
ＥＲＫＳＳＶＥＳＰＰＳＰＡＰＰＶＡＧ（配列番号１５）
ＥＲＫＣＳＶＥＳＰＰＳＰＡＰＰＶＡＧ（配列番号１６）
ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＡＰＥＦＬＧＧ（配列番号１７）
ＥＳＫＹＧＰＰＳＰＳＳＰＡＰＥＦＬＧＧ（配列番号１８）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号１９）
ＥＲＫＳＳＶＥＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＰＶＡＧ（配列番号２０）
ＥＲＫＣＳＶＥＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＰＶＡＧ（配列番号２１）
ＥＳＫＹＧＰＰＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＥＦＬＧＧ（配列番号２２）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号２３）
ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＥＦＬＧＧ（配列番号２４）
又はこれらのいずれか１つに対して少なくとも約８５％の配列同一性を有する配列のうちの１つ以上を含むペプチド領域を含む。
【００５０】
好ましくは、本発明の多価抗体は、配列番号１〜２４のいずれか１つのアミノ酸配列、又は配列番号１〜２４のいずれかに対して少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むことにより、ベース抗体部分を１つ以上の結合ドメインに接続するリンカーを含む。
【００５１】
表１は、かかるリンカーがどのようにＣＨ１領域に接続され得るかを示す。
【００５２】
本発明の好ましい多価抗体は、剛性であるリンカーを含む。より好ましくは、該多価抗体は、らせん形成配列を含むリンカーを含む。
【００５３】
本発明の好ましい多価抗体は、（ＥＡＡＫ）２モチーフを含むペプチド配列を含むリンカーを含む。
【００５４】
本発明の好ましい多価抗体は、柔軟であるリンカーを含む。
【００５５】
本発明の好ましい多価抗体は、該多価抗体が接続している定常領域のサブタイプのヒンジ領域に対応する、３つ以上のアミノ酸残基を含むリンカーを含む。
【００５６】
本発明の好ましい多価抗体は、該多価抗体が接続している定常領域のサブタイプのヒンジ領域に対応する、配列番号１〜２４の配列を含むリンカーを含む。
【００５７】
リンカー位置／配向
好ましい実施形態は多価抗体であり、ベース抗体部分が、リンカーによって１つ以上の追加の結合ドメインに接続され、該リンカーが、該ベース抗体部分の可変領域のＮ末端を、１つ以上の追加の結合ドメインのＣ末端に接合する。好ましくは、ベース抗体部分は、Ｆａｂドメインを含み、１つ以上の追加の結合ドメインは、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインを含むＦａｂドメインを含み、リンカーは、ベース抗体部分のＦａｂの可変領域のＮ末端を１つ以上の追加の結合ドメインのＦａｂドメインのＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインのＣ末端のいずれか若しくは両方に接続する。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態は、ベース抗体部分の各結合ドメインに、及び１つ以上の追加の結合ドメインのそれぞれに共通鎖と、ベース抗体部分の再構成可変領域のＮ末端を１つ以上の追加の結合ドメインの再構成可変領域のＣ末端に接続するリンカーと、を含む多価抗体である。より好ましくは、１つ以上の追加の結合ドメインは、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインを含むＦａｂドメインを含み、リンカーは、ベース抗体部分のＦａｂドメインの可変領域のＮ末端を、１つ以上の追加の結合ドメインのＦａｂドメインのＣＨ１ドメイン又はＣＬドメインに接続する。
【００５９】
追加の結合ドメインを含む領域の対合
抗体の組み立ては、ＶＨとＶＬ間、及びＣＨ１とＣＬ間の界面において相互作用する残基に基づいた、軽鎖及び重鎖の会合、すなわちＶＨとＶＬ及びＣＨ１とＣＬの会合（対合）によって生じる。典型的には、対合は、軽鎖が、サブタイプに応じて、ＣＬ内の軽鎖のシステイン残基と、ＣＨ１又はヒンジにおける重鎖のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって重鎖に共有結合することにより更に安定化する。
【００６０】
したがって、本発明の多価抗体では、追加の１つ以上の結合ドメイン（複数可）がリンカー（複数可）を介してベース抗体部分に接続され、１つ以上の結合ドメイン（複数可）は、Ｆｖドメイン、Ｆａｂドメイン、又は修飾Ｆａｂドメインを含み、結合ドメイン（通常は、重鎖領域及び軽鎖領域）を含む対応する免疫グロブリン鎖は、安定した会合で一緒に対合する。
【００６１】
追加の結合ドメインを含有する本発明の多価抗体の場合、結合ドメインは、Ｆｖ又はＦａｂドメインであり、システイン残基が存在してもよく、又は重鎖及び軽鎖ドメイン内に操作されてもよく、それによりジスルフィド結合が形成されて追加の結合ドメインの重鎖と軽鎖との間の対合を安定化させる。本発明の多価抗体が、ＩｇＧ１サブクラスを含む追加の結合ドメインを含む場合、（Ｇ４Ｓ）ｎなどの人工リンカーの上流（ｎ末端側）に接続される、重鎖のＩｇＧ１（ＥＰＫＳＣ）の上部ヒンジを使用して、追加の結合ドメインの軽鎖と共有結合するシステインが提供され得る。追加の結合ドメインにおいて使用される他のサブクラスに関して、当業者であれば、追加の結合ドメインの軽鎖ドメイン及び重鎖ドメインの対合を安定化させ、使用される該軽鎖と重鎖との間にジスルフィド架橋を形成するために用いられるリンカー内のシステイン残基を操作する能力について認識するであろう。
【００６２】
野生型ＩｇＧ１ヒンジ領域は、配列：ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号４２）を有する。下線を付したＣ残基は、ＩｇＧ１重鎖におけるＣｙｓ２２０であり、軽鎖のＣｙｓ２１４と対合する。本発明の多価抗体が、かかるヒンジに基づくリンカーを含む場合、好ましくは、Ｃｙｓ２２０以外の任意のＣｙｓ残基は、ジスルフィド結合を形成することができないアミノ酸残基、例えばＳｅｒで置換される。
【００６３】
野生型ＩｇＧ２ヒンジ領域は、配列：ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧ（配列番号４６）を有する。下線を付したＣ残基は、軽鎖のＣｙｓ２１４と対合するＩｇＧ２−Ｂ重鎖においてＣｙｓ２１９である。ＩｇＧ２−Ａにおいては、重鎖のＣｙｓ１２７はＣｙｓ２１４と対合する。本発明の多価抗体が、かかるヒンジに基づくリンカーを含む場合、好ましくは、Ｃｙｓ２１５以外の任意のＣｙｓ残基は、ジスルフィド結合を形成することができないアミノ酸残基、例えばＳｅｒで置換される。
【００６４】
野生型ＩｇＧ３ヒンジ領域は、配列：ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＦＬＧＧ（配列番号５０）を有する。ＩｇＧ３においては、重鎖のＣｙｓ１３１は軽鎖のＣｙｓ２１４と対合する。
【００６５】
ＩｇＧ４ヒンジ領域は、配列：ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧ（配列番号５４）を有する。ＩｇＧ４においては、重鎖のＣｙｓ１３１は軽鎖のＣｙｓ２１４と対合する。本発明の多価抗体が、かかるヒンジに基づくリンカーを含む場合、好ましくはヒンジのＣＰＳＰＣ領域内のＣｙｓ残基のうちの１つ又は両方が、ジスルフィド結合を形成することができないアミノ酸残基、例えばＳｅｒで置換される。
【００６６】
本明細書に記載されるように、３つの異なるエピトープに同時に結合することができるＩｇＧ構造に基づいて、三価構築物を含む多価構築物を生成するために、リンカーは、異なるサブクラスのＩｇＧヒンジに基づいて使用され、ベース抗体部分の結合ドメインを、重鎖定常領域を含む追加の結合ドメインに接続する。追加の結合ドメインの軽鎖のシステインと重鎖のシステインの間の共有結合の安定化を確実にするために、本発明は、ヒンジ領域を含むか、又は特定のサブタイプのヒンジ領域に基づくリンカーを、同じサブタイプに由来する追加の結合ドメインのＣＨ１と一致させる。
【００６７】
多価抗体が、対合する領域（例えば、ＶＨ−ＣＨ１とＶＬ−ＣＬの対合、又はＶＨとＶＬの対合）からなる追加の結合ドメインを含む場合、領域間の界面を安定化させることは、本発明において様々な方法で達成され得る。１つ以上の追加の結合ドメインが、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域からなるＦａｂドメインである場合、ＣＨ１は、可変重鎖領域に接続され得る。ＣＨ１は、共有結合、典型的には、可変軽鎖領域に接続されたジスルフィド架橋でＣＬと対合することができる。加えて、Ｆａｂドメインの重鎖及び軽鎖は、非共有相互作用を介して対合している。あるいは、１つ以上の追加の結合ドメインをベース抗体部分に結合するリンカーを更に使用して、いずれかの鎖とのペプチド結合、及び対応する鎖との共有結合を形成することにより、可変重鎖領域を追加の結合ドメインの可変軽鎖領域に対合することができる。これは、リンカーのＮ末端の、又はその付近にシステインを、並びに１つ以上の追加の結合ドメインの可変重鎖及び／又は可変軽鎖領域のＣ末端の、又はその付近にシステインを設計することによって達成することができ、これにより、リンカーと、１つ以上の追加の結合ドメインの可変重鎖及び／又は可変軽鎖領域との間に共有結合が形成される。Ｆａｂドメインなどの１つ以上の追加の結合ドメインを含むドメインを対合する他の手段は、当業者に既知であり、以下に更に詳細に記載される。
【００６８】
好ましい実施形態は多価抗体であり、ベース抗体部分及び１つ以上の追加の結合ドメインを含む。１つ以上の追加の結合ドメインが、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含むＦｖドメインである場合、本発明のリンカーは、該Ｆｖの重鎖可変領域と軽鎖可変領域と対合しながら、ベース抗体部分をＦｖに接続する。
【００６９】
あるいは、結合ドメインは、ＣＨ１領域を含む可変重領域と、ＣＬ領域を含む可変軽領域とを含むＦａｂドメインである。本発明のリンカーは、ＦａｂドメインのＣＨ１及びＣＬ領域を対合しながら、ベース抗体部分をＣＨ１領域又はＣＬ領域又はその両方でＦａｂドメインに接続する。
【００７０】
ベース抗体部分の対合
ベース抗体部分の重鎖定常領域（例えば、ＣＨ２及びＣＨ３）を対合する、及びそれらのヘテロ二量体化を引き起こす、異なる技術が当該技術分野において既知である。例えば、抗体重鎖のヘテロ二量体化を引き起こすためのＤＥＫＫ変異の使用（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１５７９５４及びＤｅ  Ｎａｒｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１７）２９２（３５）１４７０６−１４７１７）により、効率的なヘテロ二量体形成、安定なＦｃ領域、及び製造の容易さが更に可能となる。このアプローチにより、分子のＦｃ領域を機能させ、Ｆｃ受容体、補体、及びＦｃＲｎなどの免疫受容体と関与することができる。したがって、本発明の特定の多価抗体の実施形態は、当業者に既知であるＤＥＫＫ修飾、又は他のＦｃ修飾を用いて、ベース抗体部分の重鎖を優先的にヘテロ二量体化する。
【００７１】
更に、多価抗体の特定の実施形態では、例えば、Ｔ細胞を関与、刺激、及び／又は共刺激するために多価抗体を使用して、免疫系のエフェクター機能に関与しないことが望ましい場合があり（例えば、抗体依存性細胞傷害、抗体媒介性食作用、及び／又は細胞依存性細胞傷害を制限するため）、その場合には、エフェクター機能を排除又は軽減するために、Ｆｃ領域に追加の修飾を用いる場合がある。したがって、本発明の特定の多価抗体の実施形態は、エフェクター機能（複数可）を排除又は軽減する、ベース抗体部分の重鎖定常領域に対する修飾を含有する。
【００７２】
本発明の更なる好ましい実施形態は、ＣＨ２又はＣＨ３領域を欠く２つの重鎖からなるベース抗体部分を含む多価抗体であり、該重鎖は、ヒンジ領域において一緒に結合される。
【００７３】
本発明はまた、多価抗体の調製方法を提供し、この方法は、本発明の多価抗体に組み立てることができるポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む細胞を提供することを含む。細胞は、ベース抗体部分、少なくとも１つの追加の結合ドメイン、及び少なくとも１つのリンカーの発現、及び本発明の多価抗体へのそれらの組み立てを提供するための条件下で、培養され得る。
【００７４】
本発明はまた、本発明の多価抗体の構成タンパク質をコードする核酸及びそれらが産生する多価抗体も提供する。
【００７５】
本発明はまた、本発明の核酸配列を含むベクターも提供する。
【００７６】
本発明はまた、核酸を発現し、該多価抗体を産生する宿主細胞も提供する。
【００７７】
本発明はまた、同族鎖に多様性を有する共通鎖抗体を産生する、その生殖細胞系に共通鎖を含むトランスジェニック動物の使用によるものを含む、該多価抗体を生成する方法を提供し、該多価抗体は、抗原に曝露されたトランスジェニック動物によって発現される共通鎖抗体の１つ以上の同族鎖から得られるか、それに由来するか、又はそれに基づく核酸によってコードされる再構成可変領域を有する１つ以上の結合ドメインを含む。
【００７８】
本発明はまた、多様なヒト重鎖可変領域と対合することができる共通ヒト軽鎖可変領域を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供し、該共通軽鎖可変領域及びヒト重鎖可変領域をコードする核酸は、非ヒトトランスジェニック動物の内因性可変領域遺伝子座に存在する（それぞれ軽鎖及び重鎖、又はその逆）、及び／又は該トランスジェニック動物の生殖細胞系の他の場所に安定して組み込まれ（例えば、Ｒｏｓａ遺伝子座）、該トランスジェニック動物を抗原と接触させることにより、共通軽鎖可変領域と対合する一連の再構成ヒト重鎖可変領域が生成され、該再構成ヒト重鎖可変領域をコードする核酸は、本発明の多価抗体を産生することができる宿主細胞に形質転換され、該多価抗体は、抗原に曝されたトランスジェニック動物によって産生された１つ以上の再構成ヒト重鎖可変領域から得られるか、それに由来するか、又はそれに基づいた核酸によってコードされた該再構成ヒト重鎖可変領域を含む１つ以上の結合ドメインを含む。
【００７９】
本発明はまた、本発明の抗体と、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００８０】
本発明はまた、治療によってヒト又は動物の身体の処置に使用するための本発明の抗体も提供する。
本発明はまた、医学的適応症に罹患しているヒト又は動物を処置するための方法も提供し、該方法は、ヒト又は動物に治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む。
【００８１】
参照しやすいように、図１５〜図２８では、三重特異性分子を説明する場合に、次のフォーマット：ＭＦＡ×ＭＦＢ：ＭＦＣ又は抗原Ａｘ抗原Ｂ：抗原Ｃが使用されており、その結果、×が続くＭＦＡ又は抗原Ａは「短腕」を構成し、その際×は二量体化を示し、続いてＭＦＢ又は抗原Ｂが、長腕の内部の位置を説明し、続いて「：」がリンカーを示し、続いてＭＦＣ又は抗原Ｃが、長腕の遠位ドメインにあるＭＦＣ又は抗原Ｃを示す。用語「モック」は、多価分子の文脈において使用される場合、それが試験される所与のアッセイ中に存在しない抗原に結合することができる、かかる分子の結合ドメインを指す。典型的には、本明細書で使用されるモック結合ドメインは、破傷風毒素（ＴＴ）、フィブリノーゲン（Ｆｉｂｒｉ）、又はサイログロブリン（Ｔｈｙｒｏ）に結合する。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１ａ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｂ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｃ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｄ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｅ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｆ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｇ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｈ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｉ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｊ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｋ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｌ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｍ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｎ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｏ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｐ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｑ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｒ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｓ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｔ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図１ｕ】異なる結合ドメイン構造、リンカー、及びベース抗体部分を含む、本発明の多価抗体のフォーマットについて示す。
【図２ａ】ベクターＭＶ１６２６内の構築物をクローニングするために使用されるＶＨ１−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ２インサートの概略図を示す。図示されていないが、ベクターはまた、ＶＨ２に接続されたＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ１領域をコードし得ることが理解される。
【図２ｂ】ＶＨ１が破傷風トキソイド抗原に結合し、ＶＨ２がフィブリノーゲン抗原に結合し、ＶＨ３がサイログロブリン抗原に結合する、三重特異性抗体を示す。
【図３】ＭＶ１６２６ベクターの概略図を示す。
【図４】ＭＧ１０２５Ｃ３７７発現ベクターの概略図を示す。
【図５】ＭＶ１６２６にクローニングするために使用されるインサートの配列のアラインメントを示す。アラインメントは、明確にする目的で、ＣＨ１−リンカーのみを網羅することに留意されたい。
【図６】ＭＶ１０５７ベクターの概略図を示す。
【図７】ＭＶ１２６０ベクターの概略図を示す。
【図８】非還元（上）及び還元（下）条件におけるＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図９】２４の多価構築物のスクリーニングデータを示す。
【図１０】１８の多価構築物のスクリーニングデータを示す。
【図１１Ａ】共通軽鎖アミノ酸配列である。
【図１１Ｂ】共通軽鎖可変ドメインのＤＮＡ配列及び翻訳したものである（ＩＧＫＶ１−３９／ｊｋ１）。
【図１１Ｃ】共通軽鎖定常領域のＤＮＡ配列及び翻訳したものである。
【図１１Ｄ】ＩＧＫＶ１−３９／ｊｋ５共通軽鎖可変ドメインの翻訳したものである。
【図１１Ｅ】Ｖ領域ＩＧＫＶ１−３９Ａである。
【図１１Ｆ】共通軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３である。
【図１２】４つの異なる条件下で分析された、１８個の多価ＩｇＧ構築物及び４個の対照抗体の安定性分析である。
【図１３】８つのリンカーのバイオインフォマティクスモデリングである。
【図１４】長腕内部免疫細胞結合ドメイン及び短腕腫瘍細胞抗原結合ドメイン（１４ａ）又は長腕遠位腫瘍細胞抗原結合ドメイン及び短腕腫瘍細胞抗原結合ドメイン（１４ｂ）を有する、２つのエンゲージャー三重特異性フォーマットである。
【図１５ａ】短腕上のＥＧＦＲ（図１５ａにおいてＥＧＦＲｘＣＤ３：ＴＴ）のフォーマットの読み取り値として、ＣＤ２５及びＣＤ６９の発現を伴うフローサイトメトリーによるＢｘＰＣ３細胞におけるＴ細胞活性化（ＥＧＦＲ発現の中央値）である。二重特異性抗体（ＥＧＦＲｘＣＤ３）は、陽性対照として使用される。
【図１５ｂ】長腕上のＥＧＦＲ（図１５ｂにおいてＴｈｙｒｏｘＣＤ３：ＥＧＦＲ）のフォーマットの読み取り値として、ＣＤ２５及びＣＤ６９の発現を伴うフローサイトメトリーによるＢｘＰＣ３細胞におけるＴ細胞活性化（ＥＧＦＲ発現の中央値）である。二重特異性抗体（ＥＧＦＲｘＣＤ３）は、陽性対照として使用される。
【図１６ａ】ＨＣＴ１１６細胞におけるＴ細胞の細胞傷害（ＥＧＦＲ発現の中央値）を、ＥＧＦＲｘＣＤ３：ＴＴ（図１６ａ）についてＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏによって評価されたＡＴＰレベルを測定することによって求めた。Ｅｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダー上の発光によって測定された上のグラフのＡＴＰレベルは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて分析された相対発光量（ＲＬＵ）値を示し、下のグラフは、次の式：殺傷率＝（１００−（試料のＲＬＵ／ＩｇＧなしＲＬＵ）ｘ１００）に基づく殺傷率と相関している。
【図１６ｂ】ＴｈｙｒｏｘＣＤ３：ＥＧＦＲ（図１６ｂ）の両方についてＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏによって評価されたＡＴＰレベルを測定することによって求めた。Ｅｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダー上の発光によって測定された上のグラフのＡＴＰレベルは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて分析された相対発光量（ＲＬＵ）値を示し、下のグラフは、次の式：殺傷率＝（１００−（試料のＲＬＵ／ＩｇＧなしＲＬＵ）ｘ１００）に基づく殺傷率と相関している。
【図１７ａ】ＨＣＴ１１６細胞におけるＴ細胞の細胞傷害に対するリンカーの効果である（図１７ａ）。
【図１７ｂ】様々なリンカーにおける標的細胞溶解対サイトカイン放出の比較を、ＩＬ−２（図１７ｂ）について実証した。
【図１７ｃ】様々なリンカーにおける標的細胞溶解対サイトカイン放出の比較を、ＩＦＮ−ｇ（図１７ｃ）について実証した。
【図１７ｄ】様々なリンカーにおける標的細胞溶解対サイトカイン放出の比較を、ＴＮＦ−Ａ（図１７ｄ）について実証した。
【図１８】ＣＤ３結合ドメインが短腕上に位置するＣＤ３ｘＰＤ−Ｌ１：ＥＧＦＲ三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子の構成である。
【図１９】ＣＤ３結合ドメインが長腕の内部領域に位置するＥＧＦＲｘＣＤ３：ＰＤ−Ｌ１三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子の構成である。
【図２０】ＣＤ３結合ドメイン及び２つの腫瘍細胞抗原結合ドメインを組み合わせた三重特異性分子を、１つの腫瘍細胞抗原結合ドメイン、モックドメイン、及びＣＤ３結合ドメインを有する三重特異性対照、及び上記の陽性対照と比較して、Ｔ細胞の細胞傷害活性データがＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して提供された。
【図２１】ＣＤ３結合ドメイン及び２つの腫瘍細胞抗原結合ドメインを組み合わせた三重特異性分子と、１つの腫瘍細胞抗原結合ドメイン、モックドメイン、及びＣＤ３結合ドメインを有する三重特異性対照と比較した、Ｔ細胞の細胞傷害活性データがＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して提供され、該三重特異性分子は、ＥＧＦＲ及びＰＤ−Ｌ１を標的とするための親和性の範囲を含む腫瘍細胞抗原結合ドメインを含む。
【図２２】ＣＤ３結合ドメイン及び２つの腫瘍細胞抗原結合ドメインを組み合わせた三重特異性分子と、１つの腫瘍細胞抗原結合ドメイン、モックドメイン、及びＣＤ３結合ドメインを有する三重特異性対照と比較した、Ｔ細胞の細胞傷害活性データがＨＣＴ１１６細胞に対して提供され、該三重特異性分子は、ＥＧＦＲ及びＰＤ−Ｌ１を標的とするための親和性の範囲を含む腫瘍細胞抗原結合ドメインを含む。
【図２３ａ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＦＡＣＳデータは、ＰＤ−Ｌ１親和性の範囲とＥＧＦＲ親和性の範囲の曲線下面積（ＡＵＣ）として示され、腫瘍抗原結合ドメインの親和性の増加と相関する二重抗原結合を示す。
【図２３ｂ】Ｔ細胞の細胞傷害性活性データは、ＢｘＰＣ３細胞に対して提供され、ＣＤ３ｘＰＤ−Ｌ１：ＥＧＦＲのフォーマットを有する特定の三重特異性分子を示す。単一抗原及びＣＤ３に結合する分子（ＣＤ３ｘＥＧＦＲ：モック又はＣＤ３ｘモック：ＰＤ−Ｌ１のいずれか）への細胞傷害に対する相加作用により、同時の二重抗原結合及び免疫細胞関与が生じた。特定の重鎖配列は示されていない。
【図２４】ＣＤ３結合ドメインが長腕の遠位領域に位置するＥＧＦＲｘフィブリノーゲン：ＣＤ３三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子の構成である。
【図２５】Ｔ細胞活性化データはＨＴ２９細胞に対して提供され、図１５で使用されている陽性対照ＥＧＦＲｘＣＤ３二重特異性抗体と比較して、異なるＣＤ３結合ドメインを使用した様々なＥＧＦＲｘフィブリノーゲン：ＣＤ３三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子によるＴ細胞活性化を示す。
【図２６】同じＥＧＦＲ結合ドメイン（ＭＦ９８９１）を有するＥＧＦＲｘＣＤ３：ＥＧＦＲ二重特異性三価分子の構成である。
【図２７】ＨＣＴ１１６細胞のＴ細胞活性化活性を、同じＥＧＦＲ結合ドメイン（ＭＦ９８９１）と様々なリンカーを有する異なるスーパークラスターの異なるＣＤ３結合ドメインを有する一連の二重特異性三価ＥＧＦＲｘＣＤ３：ＥＧＦＲ分子について測定した。
【図２８】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＴ細胞活性化活性を、同じＥＧＦＲ結合ドメイン（ＭＦ９８９１）と様々なリンカーを有する様々なスーパークラスターの異なるＣＤ３結合ドメインを有する一連の二重特異性三価ＥＧＦＲｘＣＤ３：ＥＧＦＲ分子について測定した。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
「抗体」は、抗原上のエピトープに結合する１つ以上のドメインを含有するタンパク質の免疫グロブリンクラスに属するタンパク質分子を意味し、かかるドメインは、抗体の可変領域に由来するか又は配列相同性を共有する。抗体結合は、特異性及び親和性を含む異なる性質を有する。特異性は、どの抗原又はそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されているかを判定する。親和性は、特定の抗原又はエピトープへの結合の強度についての尺度である。本明細書では、抗体の「特異性」は、特定の抗原に対するその選択性を指し、「親和性」は、抗体の抗原結合部位とそれが結合するエピトープとの間の相互作用の強度を指すことに注意しておくとよい。
【００８４】
したがって、本明細書で使用する場合、「結合特異性」は、抗原決定基と反応する個々の抗体結合部位の能力を指す。典型的には、本発明の抗体の結合部位は、Ｆａｂドメインに位置し、重鎖及び／又は軽鎖の超可変領域から構築される。
【００８５】
「親和性」は、単一抗原結合部位とその抗原との間の相互作用の強度である。抗原に対する本発明の抗体の単一抗原結合部位は、解離定数（ＫＤ）で表すことができる。典型的には、治療用途のための抗体は、最大１×１０１０Ｍ又は更により高い親和性を有し得る。
【００８６】
「抗原」は、宿主生物において（抗体を産生するために）免疫応答を誘導することができる、及び／又は抗体によって標的化されることができる分子である。分子レベルにおいて、抗原は、抗体の抗原結合部位によって結合される能力を特徴とする。また、抗原の混合物は「抗原」とみなすことができ、すなわち、当業者であれば、時には腫瘍細胞の溶解物、又はウイルス粒子が「抗原」として示されてもよく、その一方で、かかる腫瘍細胞溶解物又はウイルス粒子の調製は、多くの抗原決定基が存在することを認識するであろう。抗原は、少なくとも１つ、多くの場合、より多くのエピトープを含む。
【００８７】
「エピトープ」又は「抗原決定基」は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原上の部位である。エピトープは、タンパク質の３次フォールディング（それぞれ、いわゆる直鎖及び立体構造エピトープ）によって並置された連続アミノ酸又は非連続アミノ酸から形成することができる。連続的な直鎖アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒に曝露されて保持される一方で、３次フォールディングにより形成されるエピトープは、構造が、典型的には、変性溶媒による処理で失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間的コンフォメーションにおいて３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸を含んでもよい。
【００８８】
用語「重鎖」又は「免疫グロブリン重鎖」は、任意の生物の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含み、特に明記されない限り、重鎖可変ドメインを含む。重鎖可変ドメインという用語は、特に明記されない限り、３つの重鎖ＣＤＲ及び４つのＦＲ領域を含む。重鎖の断片としては、ＣＤＲ、ＣＤＲ及びＦＲ、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。典型的な重鎖は、可変ドメイン（Ｎ末端からＣ末端へ）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能的断片は、抗原を特異的に認識することができ、少なくとも１つのＣＤＲを含む断片を含む。
【００８９】
用語「軽鎖」は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、又はＶＬ（又はその機能的断片）、及び免疫グロブリン定常ドメイン、又は任意の生物からのＣＬ（又はその機能的断片）配列を含む。特に明記されない限り、用語「軽鎖」は、ヒトのカッパ、ラムダ、及びこれらの組み合わせから選択される軽鎖を含み得る。軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは、典型的には、特に明記されない限り、３つの軽鎖ＣＤＲ及び４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。概して、全長軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含むＶＬドメイン、及び軽鎖定常ドメインを含む。本発明で使用することができる軽鎖としては、例えば、重鎖によって選択的に結合したエピトープに選択的に結合しないものが挙げられる。
【００９０】
多価抗体の発明での使用に適した軽鎖には、既存の抗体ライブラリー（ウェットライブラリー又はｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で最も一般的に使用される軽鎖をスクリーニングすることにより同定できるものなどの共通軽鎖が含まれ、該軽鎖は、重鎖のエピトープ結合ドメインの親和性及び／又は選択性を実質的に阻害しないが、一連の重鎖と対合するのにも適している。例えば、好適な軽鎖は、そのゲノムに組み込まれた共通軽鎖を含むトランスジェニックげっ歯類などのトランスジェニック動物由来のものを含み、これは、抗原への曝露時に重鎖に多様性を有する共通軽鎖抗体の大きなパネルを生成するために使用することができる。
【００９１】
本発明による用語「共通軽鎖」は、同一であり得る、又はいくつかのアミノ酸配列の違いを有し得る軽鎖を指し、本発明の抗体の結合特異性は影響を受けない、すなわち、その違いは機能的結合領域の形成に実質的に影響を与えない。
【００９２】
例えば、本明細書において使用される共通鎖の定義の範囲内で、同一ではないが機能的に同等である可変鎖を調製又は発見することが可能である（例えば、保存的アミノ酸変化、同族鎖と対合する場合に結合特異性に寄与しないか、又は部分的にのみ寄与する領域におけるアミノ酸の変化などを導入及び試験することにより）。したがって、かかる変異体は、異なる同族鎖を結合し、機能的抗原結合ドメインを形成することも可能である。したがって、本明細書において使用する場合、用語「共通軽鎖」は、重鎖との対合後に得られる抗体の結合特異性を保持しながら、同一であり得る又はいくつかのアミノ酸配列の差異を有し得る軽鎖を指す。特定の共通軽鎖とかかる機能的に同等である変異体との組み合わせは、用語「共通軽鎖」に包含される。
【００９３】
「Ｆｖドメイン」は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む結合ドメインを意味する。
【００９４】
「Ｆａｂドメイン」は、可変領域を含む結合ドメイン、典型的には、対合する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む結合ドメインを意味する。Ｆａｂドメインは、定常軽ドメイン（ＣＬ）及びＶＬドメインと対合するＣＨ１及びＶＨドメインを含む、定常領域ドメインを含み得る。かかる対合は、例えば、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおいてジスルフィド架橋を介した共有結合として行ってもよい。
【００９５】
「修飾Ｆａｂドメイン」は、ＣＨ１及びＶＨドメインを含む結合ドメインを意味し、ＶＨはＶＬドメインと対合し、ＣＬドメインは存在しない。あるいは、修飾Ｆａｂドメインは、ＣＬドメイン及びＶＬドメインを含む結合ドメインであり、ＶＬはＶＨドメインと対合しており、ＣＨ１ドメインは存在しない。ＣＨ１又はＣＬ領域が対合していない形態で存在し得るように、疎水性の領域の長さを除去又は低減することが必要であり得る。一本鎖抗体を自然に発現する動物の種、例えば、ラマ若しくはラクダなどのラクダ科動物、又はサメのＣＨ１領域を使用してもよい。修飾Ｆａｂドメインの他の例としては、その同族領域及び／又は可変領域ＶＨ又はＶＬと対合していない定常領域ＣＨ１又はＣＬが存在し、これはその同族領域と対合するものではない。
【００９６】
本明細書において使用する場合、用語「免疫エフェクター細胞」又は「エフェクター細胞」は、標的細胞の生存力に影響を及ぼすように活性化され得る、哺乳類免疫系内の細胞の自然なレパートリー内の細胞を指す。免疫エフェクター細胞は、リンパ系細胞、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔ細胞を含むＴ細胞、又はＢ細胞を含むが、骨髄系細胞もまた、免疫エフェクター細胞、例えば、単球又はマクロファージ、樹状細胞、及び好中球顆粒球と見なすことができる。したがって、該エフェクター細胞は、好ましくは、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、又は好中球顆粒球である。
【００９７】
本明細書における核酸又はアミノ酸配列について言及する場合、「パーセント（％）同一性」は、最適な比較目的のために配列をアラインメントした後、選択された配列中の残基と同一である候補配列中の残基の割合として定義される。２つの配列間のアラインメントを最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにギャップが導入され得る。かかるアラインメントは、比較される配列の全長にわたって実施することができる。あるいは、アラインメントは、より短い長さ、例えば約２０、約５０、約１００以上の核酸／ベース又はアミノ酸にわたって実施されてもよい。配列同一性は、報告されたアラインメント領域にわたる２つの配列間における同一一致の割合である。
【００９８】
配列の比較、及び２つの配列間の配列同一性の割合の測定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。当業者であれば、２つの配列をアラインメントさせ、２つの配列間の同一性を測定するために、いくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実を認識するであろう（Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｉｎ  Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ，（ｅｄ．），Ｔｉｍｅ  ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ  ｅｄｉｔｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ｐｐ．１−４４  Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｅｙ）。２つのアミノ酸配列又は核酸配列間のパーセント配列同一性は、２つの配列のアラインメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して求めることができる。（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥに実装される。本発明の目的のために、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用して、アミノ酸及び核酸配列のパーセント同一性を求める（２．８．０バージョン又はそれ以上，ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．ＬｏｎｇｄｅｎＪ．ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）ｐｐ２７６−２７７，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列については、ＥＢＬＯＳＵＭ６２が置換マトリックスに使用される。ＤＮＡ配列の場合、ＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用されるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ及び０．５のギャップ伸長ペナルティである。
【００９９】
上述のようなＮＥＥＤＬＥプログラムによるアラインメント後、クエリ配列と本発明の配列間の配列同一性の割合は、以下のように計算される：アラインメントのギャップの総数を差し引いた後、両方の配列の同一のアミノ酸又は同一のヌクレオチドを示すアラインメントの対応する位置の数を、アラインメントの全長で除算する。
【０１００】
本明細書において、用語「接続された」は、一次アミノ酸配列においてペプチド結合によって互いに接合されるドメインを指す。例えば、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含むベース抗体部分の重鎖は、追加の結合ドメインＶＨ−ＣＨ１（又は追加の結合ドメインに対する追加の結合ドメイン）の重鎖に、リンカーを介して接続され得（ＣＨ１で追加の結合ドメインの重鎖をベース抗体部分のＶＨ領域に接続する）、これは一緒に１つのポリペプチド鎖を構成する。同様に、ＣＨ１ドメインは可変重領域に接続されてもよく、ＣＬドメインは可変軽領域に接続されてもよい。
【０１０１】
「対合」とは、本発明の多価抗体を構成するポリペプチド間において、これらが多量体化することができるような相互作用を指す。例えば、追加の結合ドメインは、軽鎖領域（ＶＬ−ＣＬ）と対合した重鎖領域（ＶＨ−ＣＨ１）を含んでもよく、ＣＨ１及びＣＬは対合して該結合ドメインを形成する。本明細書に記載されるように、抗体ドメイン（例えば、重鎖及び軽鎖）の対合は、非共有相互作用により、またジスルフィド結合を介して生じ、本明細書に開示される技術及び当該技術分野において既知の方法によって操作することができる。
【０１０２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という単語、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、包括的に解釈されるべきである。すなわち、これらの単語は、文脈によって許される場合、具体的に列挙されていない他の要素又は整数の可能な包含を伝えることを意図している。
【０１０３】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、２つ以上の（すなわち、１つ又は少なくとも１つ）文法的対象の物品を指すために使用される。一例として、「要素」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味し得る。
【０１０４】
本発明は、
２つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、
少なくとも１つの追加の結合ドメインと、を含む多価抗体を提供し、
該ベース抗体部分は、リンカーによって少なくとも１つの追加の結合ドメインに接続され、
該ベース抗体部分の各結合ドメイン及び該少なくとも１つの追加の結合ドメインのそれぞれは全て、共通可変領域を有し、
該リンカーは、ヒンジ配列、又はヒンジ配列に由来する配列を含む。
【０１０５】
本発明はまた、
２つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、
少なくとも１つの追加の結合ドメインと、を含む多価抗体を提供し、
少なくとも１つの追加の結合ドメインは、ＣＨ１領域を含み、該リンカーによって該ベース抗体部分に接続されて、該ベース抗体部分の可変領域及び該ＣＨ１領域を連結し、
該多価抗体は、少なくとも３つの異なるエピトープに結合する。
【０１０６】
かかる多価抗体では、ベース抗体部分の各結合ドメイン及び少なくとも１つの追加の結合ドメインのそれぞれは全て、共通可変領域を有してもよい。
【０１０７】
したがって、本発明は、典型的には、少なくとも３つの結合ドメインを介して標的又は複数の標的に結合することが可能な多価抗体を提供する（すなわち、抗体は多価抗体である）。多価抗体は、任意に多重特異性抗体であり得る。すなわち、本発明の抗体は、２つ以上の異なるエピトープ又は２つ以上の異なる抗原、例えば、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の異なるエピトープ又は抗原に結合することができる。
【０１０８】
多価抗体の異なるフォーマット
本発明の他の特徴及び態様は、例として本発明の実施形態による特徴を示した添付の図面と合わせて詳細な説明から明らかになることに留意されたい。図面は例示的なものであり、特許請求の範囲及び完全な範囲の詳細な開示によって定義される本発明の範囲を限定することを意図したり、限定したりするものではなく、本明細書に記載された発明を説明し、可能にする。本発明の多価抗体は、ベース抗体部分及び追加の結合ドメイン、好ましくはＶＬ−ＣＬ領域と対合するＶＨ−ＣＨ１領域を含むＦａｂドメインを含み得る。該多価抗体は、３つのＶＨ領域、及び３つのＶＬ領域を含む。ＶＨ又はＶＬのいずれかは、同族鎖の再構成可変領域と対合する共通可変領域（ＶＨｃ又はＶＬｃ）であり得る。例えば、３つのＶＬ領域は、共通鎖（ＶＬｃ）であってもよく、各ＶＨ領域（ＶＨ１〜ＶＨ３）は、再構成可変領域を含んでもよく、該ＶＨ１、ＶＨ２、及びＶＨ３領域は、同じエピトープ又は３つの異なるエピトープに結合してもよい。多価抗体は、共通軽鎖（ＶＬｃ）及び３つの重鎖可変領域（ＶＨ１〜ＶＨ３）を含み、ＶＬｃ−ＣＬと対合したＶＨ３−ＣＨ１からなる追加のＦａｂドメインは、ベース抗体部分のＶＨ１又はＶＨ２領域と追加のＦａｂドメインのＣＨ１との間に配置されたリンカーを介して、ベース抗体に接続されてもよい。例えば、図１ａを参照のこと。
【０１０９】
あるいは、追加のＦａｂドメインは、ベース抗体の共通軽鎖領域（ＶＬｃ）と追加のＦａｂドメインのＣＬ領域との間に配置されたリンカーを介して、ベース抗体に接続されてもよい。例えば、図１ｂを参照のこと。本発明の別の態様では、３つのＶＨ領域は、共通鎖（ＶＨｃ）であってもよく、各ＶＬ領域は、再構成可変領域を含んでもよく、該３つのＶＬ領域は、同じ又は異なるエピトープ（ＶＬ１〜ＶＬ３）に結合してもよい。多価抗体は、共通重鎖（ＶＨｃ）及び３つの軽鎖可変領域（ＶＬ１〜ＶＬ３）を含み、追加のＦａｂドメインは、ベース抗体部分のＶＬ１又はＶＬ２領域と追加のＦａｂドメインのＣＬとの間に配置されたリンカーを介して、ベース抗体に接続されてもよい。例えば、図１ｃを参照のこと。あるいは、追加のＦａｂドメインは、ベース抗体の共通重鎖領域（ＶＨｃ）と追加のＦａｂドメインのＣＨ１領域との間に配置されたリンカーを介して、ベース抗体に接続されてもよい。例えば、図１ｄを参照のこと。
【０１１０】
あるいは、追加のＦａｂドメインは、共通鎖が重鎖であるか軽鎖であるかにかかわらず、ベース抗体の重可変領域及び軽可変領域の両方と、追加のＦａｂドメインのＣＨ１及びＣＬ領域の間に配置されたリンカーを介して、ベース抗体に接続されてもよい。例えば、図１ｅを参照のこと。
【０１１１】
本発明の多価抗体は、ベース抗体部分及び２つ以上の追加の結合ドメイン、例えば２つのＦａｂドメインを含み得る。該多価抗体のＶＨ又はＶＬ領域のいずれかは、同一又は異なる抗原又はエピトープに結合する再構成可変領域を含む同族鎖（例えば、ＶＨｃ及びＶＬ１〜ＶＬ４、又はＶＨ１〜ＶＨ４及びＶＬｃ）を有する共通可変領域（例えば、ＶＨｃ又はＶＬｃ）であり得る。追加のＦａｂドメインは、ベース抗体部分の共通鎖（ＶＨｃ又はＶＬｃ）と追加のＦａｂドメインの共通可変領域のそれぞれの定常領域との間、又はベース抗体の再構成可変ドメイン（ＶＨ１及びＶＨ２、又はＶＬ１及びＶＬ２）と追加のＦａｂドメインの再構成可変ドメインのそれぞれの定常領域との間に位置するリンカーを介してベース抗体部分に接続されてもよい。例えば、図１ｆは、ベース抗体及び２つの追加のＦａｂドメインを含む本発明の多価抗体を示し、抗体は、共通軽鎖（ＶＬｃ）及び４つの重鎖可変領域（ＶＨ１〜ＶＨ４）を含み、リンカーは、ベース抗体の再構成重鎖可変領域（ＶＨ２及びＶＨ３）及び追加のＦａｂドメインのＣＨ１領域において、ベース抗体を追加のＦａｂドメインに接続する。あるいは、図１ｇは、本発明の多価抗体を示し、該ベース抗体は、第１の追加のＦａｂドメインのＣＨ１領域に対する第１の再構成重鎖領域（ＶＨ２）で２つの追加のＦａｂドメインに接続され、第２の追加のＦａｂドメインのＣＬ領域にベース抗体の共通軽鎖可変領域（ＶＬｃ）が接続される。あるいは、図１ｈは、本発明の多価抗体を示し、該ベース抗体は、ベース抗体の両方の共通軽鎖領域（ＶＬｃ）を２つの追加のＦａｂドメインのＣＬ領域に接続するリンカーを介して、２つの追加のＦａｂドメインに接続される。あるいは、図１ｊは、本発明の多価抗体を示し、該ベース抗体は、ベース抗体の再構成重鎖可変領域（ＶＨ３）及び共通軽鎖領域（ＶＬｃ）の両方を、それぞれＣＨ１及びＣＬで第１の追加のＦａｂドメインに接続しているリンカーを介して、第１の追加のＦａｂドメインに接続され、第２の追加のＦａｂドメインは、リンカーを介して、第２の追加のＦａｂドメインのＣＨ１領域でベース抗体の第２の再構成重鎖可変領域（ＶＨ２）に接続される。あるいは、（図１ｉ）第２の追加のＦａｂドメインは、ベース抗体の共通軽鎖可変領域（ＶＬｃ）に対するリンカーを介して、第２の追加のＦａｂドメインのＣＬ領域に接続される。あるいは、（図１ｋ）第２の追加のＦａｂドメインは、第２の追加のＦａｂドメインのＣＨ１及びＣＬ領域のそれぞれにおいて、第２の再構成重鎖可変領域（ＶＨ２）及びベース抗体部分の共通軽鎖（ＶＬｃ）の両方にリンカーを介して接続される。本明細書に記載され、図１ｆ〜１ｋに示されるフォーマットはまた、共通鎖が重鎖（ＶＨｃ）であり、多価抗体が、最大４つの異なる結合特異性を含む４つの再構成軽鎖可変領域（ＶＬ１〜ＶＬ４）を含む場合にも適用される。
【０１１２】
更に、２つ以上の追加の結合ドメインは、第１のＦａｂドメインがリンカーを介して第２のＦａｂドメインに接続され、これは次にベース抗体部分に接続されるように、リンカーを介してベース抗体部分の１つの結合ドメインのみに接続され得る。すなわち、第１のリンカーは、ベース抗体部分と追加のＦａｂドメインのうちの１つとの間に配置され、第２のリンカーは、２つの追加のＦａｂドメインの間に配置される。２つのリンカーは、同一でも異なっていてもよい。
【０１１３】
本発明の別の態様では、多価抗体を構成する個々のタンパク質は、同じタンパク質内で重鎖及び軽鎖を混合することができる。例えば、多価抗体は、Ｎ末端からＣ末端へＶＬｃ−ＣＬ−ＶＨ２−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順にベース抗体に連結された追加のＦａｂドメインを含む第１のタンパク質からなり得、それにより、リンカーは、追加のＦａｂドメインのＶＬｃ−ＣＬ領域を、ＶＨ２−ＣＬにおいてベース抗体部分に接続する。ＶＨ１−ＣＨ１を含む第２のタンパク質は、該第１のタンパク質のＶＬｃ−ＣＬと対合する。第３のタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へＶＨ３−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順に含み、その結果、第３及び第１のタンパク質は、それぞれのＣＨ１領域の下で対合する。第４のタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へＶＬｃ−ＣＬの順に含み、第１のタンパク質のＶＨ２−ＣＨ１及び第３のタンパク質のＶＨ３−ＣＨ１と対合する。例えば、図１ｌを参照のこと。
【０１１４】
図１ｌに記載及び図示されたフォーマットは、共通軽鎖、及び最大３つの異なる結合特異性を含む少なくとも３つの再構成重鎖可変領域（ＶＨ１〜ＶＨ３）の使用を示しているが、このフォーマットは、共通鎖が重鎖（ＶＨｃ）である場合に適用され、多価抗体は、最大３つの異なる結合特異性を含む３つ以上の再構成軽鎖可変領域（ＶＬ１〜ＶＬ３）を含むことが理解される必要がある。
【０１１５】
本発明の別の態様は、４つのタンパク質を含む多価抗体であり、共通鎖は共通軽鎖である。多価抗体は、Ｎ末端からＣ末端の順に４つのタンパク質で構成されており、リンカーがＣＨ１をＶＬｃに接続するＶＨ１−ＣＨ１−ＶＬｃ−ＣＬの第１のタンパク質と、ＶＨ１−ＣＨ１と対合して追加のＦａｂドメインを形成するＶＬｃ−ＣＬの第２のタンパク質と、第３のタンパク質のＣＨ１が第２のタンパク質のＣＬと対合する、ＶＨ２−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第３のタンパク質と、第３及び第４のタンパク質がＣＨ１領域の下で対合し、第２のタンパク質（ＶＬｃ−ＣＬ）が第４のタンパク質のＣＨ１領域で第４のタンパク質と対合するＶＨ３−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第４のタンパク質と、を含む。例えば、図１ｍを参照のこと。
【０１１６】
本発明の多価抗体は、ベース抗体部分及び追加のＦａｂドメインを含んでもよく、多価抗体のＶＨ又はＶＬ領域のいずれかは、共通可変領域であってもよく、追加のＦａｂドメインは、ベース抗体のＶＨ（図１ｎ）又はＶＬ（図１ｏ）のいずれかに配置されたリンカーを介してベース抗体部分に接続されてもよく、該リンカーは、ベース抗体をＦａｂドメインに同時に接続し、更にＦａｂドメインの同族鎖と対合する。かかる例では、該Ｆａｂドメインは、任意にＣＨ１−ＣＬドメインを欠いていてもよく、リンカーを使用してＦａｂドメインの可変ドメインを対合してもよい。
【０１１７】
本発明の多価抗体は、ベース抗体部分と、対合されたＶＨ及びＶＬを含む追加の結合ドメインとを含み得る。ＶＨ及びＶＬを含む該追加の結合ドメインは、ＶＨとＶＬとの間に形成されたシステイン架橋を介して対合してもよく、それにより、ＣＨ１又はＣＬ領域の存在を必要としない場合がある。例えば、図１ｐを参照のこと。なお、システイン架橋が図１ｐに示されているが、当業者は、追加のシステイン架橋が、典型的には、ＣＨ１／ＣＬ界面（図示せず）に存在することを理解する。
【０１１８】
本発明の多価抗体は、ベース抗体部分及び追加の修飾Ｆａｂドメインを含み得る。修飾Ｆａｂドメインは、修飾ＣＨ１を含んでもよく、これにより、ＣＬと対合する必要性がない。例えば、ＣＨ１は、ラクダ科ＣＨ１であってもよく、又はラクダ科ＣＨ１に基づいてもよく、又は当該技術分野において既知の技術を介して疎水性残基を欠くように修飾されてもよい。各ＶＨ又はＶＬは、共通又は再構成可変領域であってもよい。追加の修飾Ｆａｂドメインは、ベース抗体部分のＶＨ２と修飾ＦａｂドメインのＣＨ１との間に配置されたリンカーを介して、ベース抗体部分に接続されてもよい。修飾ＦａｂドメインのＶＨ及びＶＬは、システイン架橋、又はあるいは非共有相互作用を介して対合されてもよい。例えば、図１ｑを参照のこと。あるいは、追加の修飾Ｆａｂドメインは、ベース抗体部分のＶＬと修飾ＦａｂドメインのＣＨ１との間に配置されたリンカーを介してベース抗体部分に接続されてもよい。修飾ＦａｂドメインのＶＨ及びＶＬは、システイン架橋を介して対合されてもよい。例えば、図１ｒを参照のこと。
【０１１９】
本発明の多価抗体は、ベース抗体部分及び追加の修飾Ｆａｂドメインを含んでもよく、該修飾Ｆａｂドメインは、修飾ＣＬを含んでもよく、これにより、ＣＨ１と対合する必要性がない。例えば、ＣＬは、疎水性領域を除去するように操作され得る。修飾Ｆａｂドメインの各ＶＨ又はＶＬは、共通又は再構成可変領域であってもよい。追加の修飾Ｆａｂドメインは、ベース抗体部分のＶＬと修飾ＦａｂドメインのＣＬとの間に配置されたリンカーを介して、ベース抗体部分に接続されてもよい。修飾ＦａｂドメインのＶＨ及びＶＬは、システイン架橋を介して対合されてもよい。例えば、図１ｓを参照のこと。
【０１２０】
本発明の多価抗体は、ベース抗体部分及び追加の修飾Ｆａｂドメインを含んでもよく、該修飾Ｆａｂドメインは、修飾ＣＬを含んでもよく、これにより、ＣＨ１と対合する必要性がない。例えば、ＣＬは、疎水性領域を除去するように操作され得る。修飾Ｆａｂドメインの各ＶＨ又はＶＬは、共通又は再構成可変領域であってもよい。追加の修飾Ｆａｂドメインは、ベース抗体部分のＶＨ２と修飾ＦａｂドメインのＣＬとの間に配置されたリンカーを介して、ベース抗体部分に接続されてもよい。修飾ＦａｂドメインのＶＨ及びＶＬは、システイン架橋を介して対合されてもよい。例えば、図１ｔを参照のこと。
【０１２１】
本発明のベース抗体部分
図１ａ〜１ｕは、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む対合する重鎖定常領域を含む多価抗体のベース抗体部分を示すが、これらの領域は単に例示目的のために示され、本発明はこれらの実施形態に限定されないことに留意されたい。本明細書では、開示される抗体における使用に好適なベース抗体部分及び追加の結合ドメインの異なるフォーマットが記載される。
【０１２２】
本発明の多価抗体のベース抗体部分は、全長免疫グロブリン、例えば、全長ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ部分であり得るが、好ましくはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＧ１であってもよい。
【０１２３】
本発明の任意の抗体において、追加の結合ドメイン、好ましくはＦａｂドメインのうちの少なくとも１つは、抗体のベース抗体部分のＣＨ１ドメイン（複数可）のものとは異なる免疫グロブリンサブクラスのＣＨ１ドメインを含んでもよく、及び／又は異なるクラスの軽鎖を有してもよい。例えば、抗体のベース部分が全長ＩｇＧ１である場合、追加の結合ドメインのうちの少なくとも１つは、サブクラスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４のＣＨ１ドメインを含む、及び／又は抗体のベース部分がカッパ軽鎖を含む場合、追加の結合ドメインのうちの少なくとも１つはラムダ軽鎖を含んでもよい。
【０１２４】
ベース抗体の重鎖は、当業者に既知の技術、例えば、ベース抗体のＣＨ３領域におけるＤＥＫＫ修飾の操作を通じて優先的に対合するように設計されてもよい。重鎖のヘテロ二量体化を推進するためのＣＨ３領域における遺伝子操作について示す、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１５７９５４号及びＤｅ  Ｎａｒｄｉｓ  Ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１７）２９２（３５）１４７０６−１４７１７を参照のこと。本発明において使用され得るヘテロ二量体化を推進するための代替的なアプローチとしては、ノブインホールフォーマット（国際公開第１９９８／０５０４３１号）、及び電荷操作の使用（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ，ＪＢＣ  ２０１０，ｖｏｌ  ２８５，ｐｐ  １９６３７−１９６４６）を含む。
【０１２５】
Ｆｃ領域は、補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）、及び抗体依存性細胞貪食作用（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ、ＡＤＣＰ）などの抗体のエフェクター機能を媒介する。多価抗体に応じて、エフェクター機能を低減又は増大させることが望ましい場合がある。本発明のいくつかの実施形態のように、免疫応答が活性化、増強、又は刺激されるべき場合、エフェクター機能の低減が望まれ得る。エフェクター機能を低減した抗体を使用して、とりわけ免疫細胞の細胞表面分子を標的化することができる。抗体が有害な細胞を標的化している場合にエフェクター機能の増加が望ましい場合があり、それにより免疫エフェクター細胞又は補体カスケードがかかる標的を排除又は溶解する能力を高めることができる。
【０１２６】
重鎖Ｆｃ領域のエフェクター機能は、当業者に既知の修飾によって軽減又は排除され得る。同様に、重鎖Ｆｃ領域のエフェクター機能は、当業者に既知の修飾によって増強され得る。例えば、ＡＤＣＣは、ＣＨ２ドメインの遺伝子修飾によって増強され得る。例えば、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９（６）６８５−９１を参照のこと。
【０１２７】
本発明の多価抗体は、一実施形態では、アフコシル化され得る。本発明の多価抗体は、好ましくは、正常なＣＨＯ細胞において産生された同じ抗体と比較した場合に、Ｆｃ領域におけるＮ−結合型炭水化物構造のフコシル化の量の減少を含む。
【０１２８】
本発明の多価抗体の一態様はまた、ＣＨ２又はＣＨ３領域を欠いているベース抗体を含み、ベース抗体部分の該重鎖は、ＣＨ１領域の下のシステイン共有結合架橋によって接合されてもよい。
【０１２９】
本発明のベース抗体部分の変形形態を含む本発明の態様を図１ｕに示す。
【０１３０】
本明細書では、本発明の抗体のベース部分を１つ以上の結合ドメインと接続するために使用することができるリンカーのレパートリーについて説明する。可変領域、Ｆｖドメイン、Ｆａｂドメイン、又は修飾Ｆａｂドメインなどの１つ以上の結合ドメインは、本発明の抗体のベース抗体部分に接続され得る。
【０１３１】
本発明の抗体は、ベース抗体部分を含み、リンカー又は複数のリンカーを介して、１つ以上の結合ドメインに結合する。
【０１３２】
全長ＩｇＧベース抗体部分を含む多価抗体は、かかる構造が、典型的には、好ましい半減期、予測可能な生物物理的挙動、及びより低い免疫原性などの有益な特性を有するため好ましい。本発明の抗体は、典型的には治療用途に好適であり、したがって、ヒト治療薬の使用のためのヒト配列から構成される。あるいは、該抗体は、当業者に周知の技術を使用して、治療薬が使用されている種の配列を有するか、又はその所与の種内のコンセンサス配列に基づいている。
【０１３３】
本発明の抗体のベース抗体部分が全長ＩｇＧである場合、全長ＩｇＧは、所望の特性を提供する突然変異を含み得る。かかる変異は、いずれかの領域の相当部分の欠失ではない。しかしながら、得られるＩｇＧ部分の結合特性を本質的に変えることなく、１つ又はいくつかのアミノ酸残基が挿入、欠失、又は置換されている全長ＩｇＧ部分は、用語「全長ＩｇＧ」に含まれる。例えば、かかるＩｇＧ部分は、好ましくは非ＣＤＲ領域において、１〜１０アミノ酸残基の１つ以上の挿入、欠失、又は置換を有することができ、該挿入、欠失又は置換されたアミノ酸は、ＩｇＧの結合特異性にとっては必須ではない。
【０１３４】
ＩｇＧ１は、ヒトにおけるその長い循環半減期に基づいて優勢であり得る。また、ヒトにおける免疫原性を軽減するために、本発明による抗体のベース抗体部分はヒト抗体であることが好ましい。
【０１３５】
本発明の抗体のベース部分は、本質的に完全な抗体を含むと定義される全長免疫グロブリンであってもよい。かかる本質的に完全な抗体は、インタクトな抗体の全ての機能を必ずしも有さなくてもよい。
【０１３６】
本明細書に記載される抗体の全長ベース部分は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む。各鎖は、定常（Ｃ）領域及び可変（Ｖ）領域を含有し、これは重鎖ではＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ、軽鎖ではＣＬ、ＶＬと表示されるドメインに分解することができる。抗体は、定常ドメインを介して、典型的にはＦｃ部分を介して、免疫系の分子及び細胞と相互作用することができる。
【０１３７】
二重特異性又は多重特異性抗体を含む本発明の抗体の定常領域は、好ましくはヒト定常領域である。この定常領域は、１つ以上の、好ましくは１０個以下の、好ましくは５個以下の、天然に存在するヒト抗体の定常領域とは異なるアミノ酸を含有することができる。本明細書で産生される様々な抗体の可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインライブラリに由来する。したがって、これらの可変ドメインはヒトである。独自のＣＤＲ領域は、ヒトに由来してもよく、合成であってもよく、又は別の生物に由来してもよい。本発明の抗体又は二重特異性抗体は、好ましくはヒト又はヒト化抗体である。好適な重鎖定常領域を、非限定的に表２１に例示される。
【０１３８】
本発明の抗体は、典型的には、多重特異性抗体の半減期及び安定性を維持するインタクトなＦｃ領域を有する。Ｆｃはまた、Ｆｃ受容体、補体、及びＦｃＲｎなどの免疫エフェクター分子との相互作用を可能にし得る。当業者には理解されるように、Ｆｃ受容体との相互作用を防止若しくは軽減するか、又はＦｃ受容体との相互作用を強化するために、Ｆｃ領域を設計するために、技術が利用可能である。
【０１３９】
ベース抗体部分及び１つ以上の追加の結合ドメイン、例えば、Ｆａｂドメインは、１つ以上のリンカーを介して接続される。少なくとも１つの追加のＦａｂドメインは、所与のアイソタイプ又はサブクラスのもの、例えば、ＩｇＧ１、２ａ、２ｄ、３、又は４であり得、少なくとも１つの追加のＦａｂは、全長ＩｇＧ部分のＦａｂドメインのサブクラスとは異なるサブクラスのものであり得るか、又は異なるクラス（カッパ又はラムダ）の軽鎖を保有し得る。
【０１４０】
多価抗体フォーマットで使用するためのリンカー
本発明の抗体は、１つ以上の追加の結合ドメインをベース抗体部分に接続する１つ以上のリンカーを含む。リンカーは、リンカーが接続される結合ドメインと共に、多価抗体の機能性を少なくとも部分的に判定する。
【０１４１】
本発明の抗体において、リンカーのペプチド領域は、ヒンジ配列を含んでもよく、又はヒンジ配列に基づく配列を含んでもよい。したがって、好適なペプチド領域のアミノ酸配列は、天然に生じる配列を含んでもよく、又は天然に生じる配列に基づく配列を含んでもよい。かかる配列の使用は、本発明の多価抗体の開発可能性に役立ち得、低免疫原性を確保するのに役立ち得る。
【０１４２】
ヒンジ領域は、ＩｇＧ及びＩｇＡ免疫グロブリンクラスの重鎖の中央部分（すなわち、ＦａｂをＦｃに接続する部分）における柔軟性アミノ酸伸張であり、これらの２つの重鎖をジスルフィド結合により対合する。システイン及びプロリンアミノ酸が豊富であり、任意の他の免疫グロブリン領域とほとんど類似しない。
【０１４３】
したがって、本発明の多価抗体において使用するための、１つ以上の追加の結合ドメインをベース抗体部分に接続するのに好適なリンカーは、ＩｇＧ又はＩｇＡヒンジ配列由来であり得る。リンカー領域は、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＩｇＧ２ヒンジ領域、ＩｇＧ３ヒンジ領域、又はＩｇＧ４ヒンジ領域に基づくことができる。
【０１４４】
典型的には、使用されるヒンジ領域の種類は、リンカーが接続される追加のＦａｂドメインの定常領域、例えばＣＨ１の種類と一致する。すなわち、リンカーが、ＩｇＧ１ヒンジ領域の配列又は複数の配列に基づく場合、該リンカーが接続している追加のＦａｂドメインのＣＨ１は、ＩｇＧ１由来のＣＨ１である。
【０１４５】
抗体のリンカーは、上部、中央、若しくは下部ヒンジ領域、又はかかる領域のサブセットに基づいてもよい。
【０１４６】
ＩｇＧ１ヒンジ領域は、配列：ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号４２）を有する。
【０１４７】
上部ヒンジ領域は、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号４３）として定義される。
【０１４８】
中央ヒンジ領域は、ＣＰＰＣＰ（配列番号４４）として定義される。
【０１４９】
下部ヒンジ領域は、ＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号４５）として定義される。
【０１５０】
したがって、本発明の抗体では、リンカーは、これらの配列のうちの１つ以上、及び／又はこれらの配列のうちの１つ以上に基づく配列を含んでもよい。
【０１５１】
ＩｇＧ２ヒンジ領域は、配列：ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧ（配列番号４６）を有する。
【０１５２】
上部ヒンジ領域は、ＥＲＫＣＣＶＥ（配列番号４７）として定義される。
【０１５３】
中央ヒンジ領域は、ＣＰＰＣＰ（配列番号４８）として定義される。
【０１５４】
下部ヒンジ領域は、ＡＰＰＶＡＧ（配列番号４９）として定義される。
【０１５５】
したがって、本発明の抗体では、リンカーは、これらの配列のうちの１つ以上、及び／又はこれらの配列のうちの１つ以上に基づく配列を含んでもよい。
【０１５６】
ＩｇＧ３ヒンジ領域は、配列：ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＦＬＧＧ（配列番号５０）を有する。
【０１５７】
上部ヒンジ領域は、ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号５１）として定義される。
【０１５８】
中央ヒンジ領域は、ＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ（配列番号５２）として定義される。
【０１５９】
下部ヒンジ領域は、ＡＰＥＦＬＧＧ（配列番号５３）として定義される。
【０１６０】
ＩｇＧ４ヒンジ領域は、配列：ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧ（配列番号５４）を有する。
【０１６１】
上部ヒンジ領域は、ＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号５５）として定義される。
【０１６２】
中央ヒンジ領域は、ＣＰＳＣＰ（配列番号５６）として定義される。
【０１６３】
下部ヒンジ領域は、ＡＰＥＦＬＧＧ（配列番号５７）として定義される。
【０１６４】
コンセンサス配列ＣＸＸＣを有する中間領域は、野生型ＩｇＧと関連して両方のＩｇＧ重鎖を接続し、剛性である。これらのジスルフィド架橋は、現在の用途には必須ではなく、したがって、リンカーは中央ヒンジ配列を含み、好ましくはＣＸＸＣコンセンサス中の他方又は両方のＣｙｓ残基は、例えば、Ｓｅｒ残基で置換される。したがって、好ましい実施形態では、ＣｘｘＣはＳｘｘＳであってもよい。
【０１６５】
本発明の多価抗体において使用するのに好適なリンカーは、中間ヒンジ配列、例えば中間ヒンジ配列を含むが、下部及び／又は上部ヒンジ配列を含まない配列に基づくものであり得る。本発明の多価抗体において使用するのに好適なリンカーは、上部ヒンジ配列、例えば上部ヒンジ配列を含むが、下部及び／又は中央ヒンジ配列を含まない配列に基づくものであり得る。本発明の多価抗体において使用するのに好適なリンカーは、中間ヒンジ配列、例えば下部及び上部ヒンジ配列の組み合わせを含む配列を含まないものであり得る。
【０１６６】
したがって、本発明は、配列番号３〜５、７〜１１、又は１３〜２４のうちの１つのアミノ酸配列を含むリンカーを提供する。
【０１６７】
したがって、本発明の抗体では、リンカーは、これらの配列のうちの１つ以上、及び／又はこれらの配列のうちの１つ以上に基づく配列を含んでもよい。ペプチド領域は、本質的に中間領域配列からなるか、若しくはかかる配列に基づいていてもよく、又は本質的に上部及び下部領域配列からなるか、若しくはかかる配列に基づいていてもよい。
【０１６８】
本発明の抗体における使用に好適なリンカーは、本明細書に記載の任意のリンカー配列のアミノ酸配列を含む配列を参照して定義することができ、その中には０〜５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加（又はこれらの組み合わせ）が作製される。いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に記載のリンカー配列に関して、０〜４、好ましくは０〜３、好ましくは０〜２、好ましくは０〜１、好ましくは０のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加（又はこれらの組み合わせ）を含むアミノ酸配列を含む。
【０１６９】
好適なリンカーは、約７〜約２９アミノ酸長、例えば約１０〜約２０アミノ酸長であってよい。しかしながら、好適なリンカーは、短いリンカー、例えば約７〜約１０のアミノ酸長であってもよく、又は長いリンカー、例えば約２０〜約２９アミノ酸長であってもよい。
【０１７０】
リンカーは、Ｉｇヒンジ領域を含んでもよく、又はリンカーと同じサブクラスのＣＨ１領域に接続されたＩｇＧヒンジ領域に基づく配列を含んでもよく、共通軽鎖の共有結合のためのシステインを含んでもよい。
【０１７１】
本発明の抗体における使用に好適なリンカーは、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＩｇＧ２ヒンジ領域、ＩｇＧ３ヒンジ領域、又はＩｇＧ４ヒンジ領域に基づくことができる。
【０１７２】
（Ｇ４Ｓ）ｎ配列が使用される場合、好ましくは、それは、ＩｇＧ以外のアイソタイプ又はＩｇＧ１以外のサブクラス由来のヒンジ配列と組み合わせて使用され、ＣＨ１領域を含む。
【０１７３】
本発明の抗体では、リンカーは剛性であっても柔軟性であってもよく、荷電配列を含んでもよく、直線状であっても屈曲していてもよい。
【０１７４】
本発明の目的のための剛性配列は、約１．０１５以下のＫａｒｐｌｕｓ及びＳｃｈｕｌｚ柔軟性予測を有する配列である。部分的に柔軟性の配列は、約１．０１５〜約１．０４のＫａｒｐｌｕｓ及びＳｃｈｕｌｚ柔軟性予測を有するものである。本発明の目的のための柔軟性配列は、少なくとも約１．０１５のＫａｒｐｌｕｓ及びＳｃｈｕｌｚ柔軟性予測を有する配列である（Ｋａｒｐｌｕｓ  ＰＡ，Ｓｃｈｕｌｚ  ＧＥ．タンパク質中の鎖の柔軟性予測−ペプチド抗原の選択のためのツール．Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  １９８５；７２：２１２−３；（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｂｃｅｌｌ／）。柔軟性予測は、配列に沿った７つの残基の連続したウィンドウにわたって計算され（１残基刻み）、ウィンドウ毎に予測される「柔軟性」指数が得られる。リンカー配列全体にわたる全体的な柔軟性は、配列全体にわたって平均として与えられる。
【０１７５】
ＩｇＧヒンジ領域内のＣｙｓ残基の除去又は置換は、Ｃｙｓ残基をセリン（Ｓｅｒ）と置換することを含む、そのヒンジに基づくリンカーをより柔軟にすることができる。あるいは、リンカーは、らせん形成配列の存在を考慮して剛性リンカーであってもよい。したがって、中間ヒンジ領域、例えば、保存されたＣＰＰＣＰモチーフは、らせん形成配列、例えば（ＥＡＡＡＫ）２によって置き換えられてもよく、これは、リンカー中に短い剛性のらせんをもたらす。したがって、本発明の抗体では、リンカーは、例えばアミノ酸配列（ＥＡＡＡＫ）２を含むらせん形成配列を含んでもよい。かかる配列の使用は、剛性を加えるのに役立ち得る。
【０１７６】
本発明のリンカーは、好ましくは、配列番号３〜５、７〜１１、若しくは１３〜２４のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列、又はこれらのいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性、好ましくは、これらのいずれか１つに対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、より好ましくは、これらのいずれか１つに対して少なくとも約９７％の配列同一性、より好ましくは、これらのいずれか１つに対して少なくとも約９８％の配列同一性、より好ましくは、これらのいずれか１つに対して少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１７７】
例えば、本発明の多価抗体での使用に好適なリンカーは、０〜５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加（又はこれらの組み合わせ）が作製される配列番号１〜２４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む配列を参照して定義され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号３〜５、７〜１１、又は１３〜２４に記載の配列に関して、０〜４、好ましくは０〜３、好ましくは０〜２、好ましくは０〜１、好ましくは０のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加（又はこれらの組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含む。
【０１７８】
本発明の多価抗体での使用に好適なリンカーは、配列番号１〜２４のいずれか１つのアミノ酸配列、又はこれらのいずれか１つに対して少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、これらのいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性、例えば、これらのいずれか１つに対して少なくとも約９５％の配列同一性、例えば、これらのいずれか１つに対して約９８％の配列同一性、例えば、これらのいずれか１つに対して少なくとも約９９％の配列同一性を含む配列を参照して定義することができる。
【０１７９】
表１は、リンカー配列がＣＨ１及びＶＨ２領域にどのように接続され得るかを示す。
【表１】
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【０１８０】
追加の結合ドメインの対合する領域へのリンカーの使用
本明細書で使用されるリンカーは、ベース抗体部分を少なくとも１つの追加の結合ドメインに接続し得る。加えて、少なくとも１つの追加の結合ドメインがＦａｂドメインであるか、又は重鎖可変領域と軽鎖可変領域との対合から構成される場合、リンカーは、共有結合を介して、典型的にはジスルフィド架橋を介して、重鎖及び軽鎖を対合し得る。ジスルフィド架橋は、リンカー内のシステイン残基と追加の結合ドメイン（複数可）の可変領域との間に形成され得る。リンカーによって引き起こされるかかる対合は、共通軽鎖と対応する再構成重鎖可変領域とを含むＦａｂドメイン、又は共通重鎖と対応する再構成軽鎖可変領域とを含むＦａｂドメイン、を含む追加の結合ドメインに適用することができる。
【０１８１】
多価性及び多重特異性
本発明の多価タンパク質のベース抗体の２つの結合ドメインが異なる抗原に結合する場合、該第１及び第２の抗原は、１つの細胞又は異なる細胞型に位置する２つの異なる分子又は部分であり得る。内因性免疫細胞を動員及び活性化することによって細胞傷害を媒介する２つの結合ドメインを含む抗体は、新たなクラスの抗体治療薬である。これは、標的細胞（すなわち、腫瘍細胞）及びエフェクター細胞（すなわち、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージ）の抗原結合特異性を１分子中で組み合わせることによって達成することができる（例えば、国際公開第２０１４／０５１４３３号を参照のこと）。本発明の抗体は、少なくとも３つの結合ドメインを含む。ベース抗体部分は、典型的には、２つの異なる結合ドメインを含む（ただし、２つの結合ドメインは同じ配列を有してもよく、同じエピトープに結合してもよい）。３つ以上の結合ドメインを含む多価抗体は、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の腫瘍関連抗原を標的にして、正常細胞に対する有害細胞の特異的標的化を可能にし得る。例えば、多価抗体の１つの結合ドメイン又は２つの結合ドメインは、異常な（腫瘍）細胞上の抗原に結合してもよく、一方で、多価抗体の第２又は第３の結合ドメインは、１つ以上の腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の方向付けられた殺傷を引き起こし得る免疫エフェクター細胞上の抗原に結合し得る。あるいは、多価抗体の２つの結合ドメインは、腫瘍細胞で発現される同一の抗原又は異なる抗原上の２つの異なるエピトープに特異的に結合し得、一方で、これらの腕の親和性は、１つの抗原のみを発現する細胞への結合を軽減するために、又は多価抗体の１つの結合ドメインのみが関与する場合に弱められる。又は、本発明の多価抗体の３つの結合ドメインは、３つの異なる抗原又は同一の抗原に結合し得るが、免疫エフェクター細胞の異なるエピトープで結合してもよい。
【０１８２】
同様に、３つ以上の結合ドメインを含む多価抗体は、リガンド又は酵素などの機能的標的に結合し得、生物学的応答を誘発するか、又は標的の機能を遮断し、阻害性又はアゴニスト性の細胞活性をもたらす。本発明の多価抗体の少なくとも１つの結合ドメインは、リンカーを介してベース抗体部分の結合ドメインに接続される。ベース抗体部分の結合ドメインがＦａｂドメインである場合、これは、例えば、ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１の形態をとることができ、リンカーは、ベース抗体部分の重鎖を少なくとも１つの追加の結合ドメイン、好ましくはＦａｂドメインに接続する。
【０１８３】
あるいは、これは、例えば、ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＬの形態をとることができ、リンカーは、ベース抗体部分の軽鎖を少なくとも１つの追加の結合ドメイン、好ましくはＦａｂドメインに接続する。
【０１８４】
Ｆａｂドメインなどの追加の結合ドメインは、それぞれ別個のリンカーを介して、ベース抗体部分の結合ドメインのそれぞれに接続されてもよい。追加の結合ドメインをベース抗体部分又は追加の結合ドメインに接続する２つ以上のリンカーは、同じであっても異なっていてもよい。更に、リンカーは、結合ドメインの同族鎖の対合を可能にし得る。
【０１８５】
本発明の抗体が２つ以上のリンカーを含む場合、それらのリンカーは同じであっても異なっていてもよく、又はこれらの組み合わせであってもよい。後者の状況の一例は、多重特異性抗体が３つのリンカーを含み、これらのうちの２つは同じであり、第３のリンカーは異なる（他の２つから）。
【０１８６】
更に、リンカーを介してベース抗体部分の結合ドメインに接続された結合ドメインは、それ自体が、本明細書に記載されるリンカーを介して接続された結合ドメインに結合されてもよく、該ベース抗体部分は、リンカーを介して追加の結合ドメインに接続し、その結合ドメインをリンカーを介して第２の追加の結合ドメインに接続することなどにより、モジュール式に伸長し得る。
【０１８７】
このようにして、本発明の抗体は、３つ以上のエピトープに結合することができる。したがって、本発明の多重特異性抗体は、３つ以上のエピトープに特異的に結合することができる。
【０１８８】
本発明の抗体は、２つ、３つ、又はそれ以上の抗原に結合することができる。したがって、本発明の多重特異性抗体は、２つ、３つ、又はそれ以上の抗原に特異的に結合することができる。
【０１８９】
本発明の抗体は、１つの抗原上の異なるエピトープに結合することができる２つ以上のＦａｂドメインなどの２つ以上の結合ドメインを含んでもよい。
【０１９０】
したがって、本発明の抗体は、異なる２つ以上のＦａｂドメインなどの少なくとも３つの結合ドメインを含む。
【０１９１】
本発明の別の態様は、少なくとも３つのＦａｂドメインを含む多価抗体を含み、したがって、典型的には互いに全て異なる３つのエピトープに結合することができる。
【０１９２】
本発明の抗体は多価であってもよい。本発明の抗体は多重特異性であってもよい。多価は、抗体が少なくとも３つの結合ドメインを有し、したがって少なくとも３つの抗原結合部位を有することを示す。多重特異性は、抗体が少なくとも２つの異なるエピトープ、例えば、同じ抗原上の２つの異なる抗原又は２つのエピトープに結合することができることを示す。三重特異性は、抗体が３つの異なるエピトープに結合することができることを示す。四重特異性は、抗体が４つの異なるエピトープなどに結合することができることを示す。
【０１９３】
本発明の抗体は、同じ分子上に位置する標的エピトープに結合し得る。これは、１つのエピトープのみが標的化されている状況と比較して、該標的分子の（生物学的）機能のより効率的な拮抗作用を可能にし得る。例えば、本発明の抗体は、抗原細胞上、例えば、成長因子受容体、又は腫瘍細胞が増殖するのに重要な可溶性分子に存在する２つ又は３つ以上のエピトープに同時に結合し得、それによって、制御されていない増殖をもたらすいくつかの独立したシグナル伝達経路を効果的に遮断する。
【０１９４】
本発明の少なくとも２つの抗体の任意の組み合わせは、成長因子受容体又は可溶性分子などの標的分子上に存在する２、３、４以上のエピトープに同時に結合してもよい。
【０１９５】
標的部分は、可溶性分子であってもよく、又は膜結合部分であってもよく、又は結合時に内在化する細胞表面上に存在する部分であってもよい。
【０１９６】
標的エピトープは、異なる部分、例えば２つ（すなわち、第１の部分上の２つ以上の標的エピトープ及び第２の部分上の１つ以上の標的エピトープ）又は３つの異なる部分上（すなわち、３つの部分のそれぞれの少なくとも１つの標的エピトープ）に位置し得る。この場合、異なる標的部分のそれぞれは、可溶性部分若しくは膜結合部分、又は結合時に内在化する細胞表面上に存在する部分のいずれかであってもよい。一実施形態では、異なる標的部分は可溶性部分である。あるいは、少なくとも１つの標的部分は可溶性部分であり、一方で少なくとも１つの標的部分は膜結合部分である。更に別の代替例では、全ての標的部分は膜結合部分である。一実施形態では、異なる標的部分は同じ細胞上で発現されるが、他の実施形態では、異なる標的部分は異なる細胞上で発現される。
【０１９７】
非限定的な例として、本発明の任意の抗体、又は本発明の抗体と追加抗体との任意の組み合わせは、複数の膜結合受容体を同時に遮断し、腫瘍細胞のサイトカイン又は成長因子などの複数の可溶性分子を中和するか、又は異なるウイルス血清型若しくはウイルス株を中和するのに好適であり得る。
【０１９８】
本発明の抗体では、少なくとも１つの標的エピトープが腫瘍細胞上に位置してもよい。あるいは、又はそれに加えて、少なくとも標的エピトープは、エフェクター細胞の表面上に位置してもよい。これは、例えば、腫瘍細胞殺傷のためのＴ細胞又はＮＫ細胞の動員に好適である。例えば、本発明の抗体は、免疫エフェクター細胞上に位置する標的分子に特異的に結合することによって、免疫エフェクター細胞、好ましくはヒト免疫エフェクター細胞を動員することができる。更なる実施形態では、該免疫エフェクター細胞は、本発明の抗体の標的分子への結合時に活性化される。エフェクター機構の動員は、例えば、Ｔ細胞受容体又はＦｃガンマ受容体などの細胞傷害性トリガー分子に結合することができ、それにより下流の免疫エフェクター経路又は免疫エフェクター細胞を活性化する、本発明による方法によって産生されたＩｇ様分子を投与することによる免疫調節された細胞傷害のリダイレクトを包含し得る。
【０１９９】
免疫細胞エンゲージャー
本発明の抗体などの多価多量体は、免疫エフェクター細胞エンゲージャー抗体であってもよい。すなわち、本発明の多価抗体は、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞上の抗原に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含むものであってもよく、また癌又は腫瘍細胞などの異常細胞上の抗原に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含むものであってもよい。
【０２００】
三重特異性抗体などの本発明の多価多量体は、３つの結合ドメインを有するものであってもよく、腫瘍細胞、及び２つの免疫エフェクター細胞を含む、３つの細胞を、エンゲージャー複合体にまとめたものであってもよい。
【０２０１】
三重特異性抗体などの本発明の多価多量体は、更に、２つの細胞を標的化する３つの結合ドメイン及び可溶性分子を有するものであり得る。
【０２０２】
本明細書に記載される実施形態では、Ｆｃは野生型Ｆｃであってもよく、当業者に既知の手段に基づいて、ＡＤＣＣ若しくはＣｑ１の結合のために強化されてもよく、又は当業者に既知の手段に基づいて、かかる活性のために排除されてもよい。
【０２０３】
多価抗体を関与するかかる免疫細胞の構成要素は、様々な構成で互いに対して配置することができる。例示的な構成を図１ａ〜１ｕに示す。特定の実施形態では、本発明は、免疫細胞関与多価抗体に関し、第３の結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、ベース抗体の第１又は第２の結合ドメインのＮ末端に連結される。
【０２０４】
一実施形態では、免疫細胞関与多価抗体は、３つの結合ドメイン、すなわち、ベース抗体部分及び１つの追加の結合ドメインを含み、それにより、該多価抗体は、三重特異性である。
【０２０５】
ベース抗体部分の結合ドメインのうちの１つは、免疫エフェクター細胞上の抗原に結合してもよい。あるいは、追加の結合ドメインは、免疫エフェクター細胞の抗原に結合してもよい。すなわち、免疫エフェクター細胞上の抗原に対する結合ドメインは、位置１、２又は３であってもよく、これらの位置は、図１ａに示されるＶＨ１、ＶＨ２、及びＶＨ３に対応する。あるいは、共通重鎖が使用される場合、免疫エフェクター細胞上の抗原に対する結合ドメインは、例えば、図１ｃに示されるように、ＶＬ１、ＶＬ２、及びＶＬ３に対応する位置１、２又は３であってもよい。
【０２０６】
本発明の免疫エフェクター細胞エンゲージャー抗体において、結合ドメインのうちの少なくとも１つは、異常細胞上の抗原に特異的に結合し得る。典型的には、少なくとも２つの結合ドメインは異常細胞上の抗原に結合し、典型的には少なくとも２つの結合ドメインは、異常細胞上の抗原上の少なくとも２つの異なる抗原又はエピトープに結合する。本発明の免疫エフェクター細胞エンゲージャー抗体において、２つ以上の結合ドメインは、抗原及びエピトープを含む同じ標的と、免疫エフェクター細胞を関与する別の結合ドメインとを結合してもよい。
【０２０７】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の多価抗体は、免疫エフェクター細胞上の抗原に特異的に結合し、また腫瘍細胞などの異常細胞上の２つの異なる抗原に特異的に結合する。
【０２０８】
本発明の一実施形態では、Ｔ細胞関与多価抗体は、標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、及びヒトＴ細胞の表面抗原に同時に結合することができる。一実施形態では、Ｔ細胞関与多価抗体は、標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、及びヒトＣＤ３に同時に結合することができる。一実施形態では、Ｔ細胞関与多価抗体は、標的細胞抗原及びＣＤ３に同時結合することによってＴ細胞及び標的細胞を架橋することができる。別の実施形態では、同時結合は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解をもたらす。一実施形態では、同時結合は、Ｔ細胞の活性化をもたらす。他の実施形態では、同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害性活性、及び活性化マーカーの発現の群から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答をもたらす。一実施形態では、標的細胞抗原に同時結合することなく、Ｔ細胞関与ポリペプチドのＣＤ３への結合は、Ｔ細胞活性をもたらさず、例えば、残りの結合ドメインは腫瘍細胞抗原に結合しない。
【０２０９】
一実施形態では、Ｔ細胞関与多価抗体は、Ｔ細胞の細胞傷害性活性を標的細胞にリダイレクトすることができる。一実施形態では、リダイレクトは、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原提示及び／又はＴ細胞の特異性とは無関係である。一実施形態では、Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０２１０】
本発明のＴ細胞関与多価抗体は、ヒトＴ細胞の表面抗原に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ３（本明細書では「ＣＤ３抗原結合ドメイン」とも呼ばれる）に結合する。
【０２１１】
用語「ＣＤ３」（分化群３）は、ＣＤ３γ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０９６９３）、ＣＤ３δ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０４２３４）、ＣＤ３ε鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６）、及びＣＤ３ζ鎖ホモ二量体（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ２０９６３）から構成されるタンパク質複合体を指す。ＣＤ３イプシロンは、様々な別名の下で既知であり、そのうちのいくつかは、「ＣＤ３ｅ分子，イプシロン（ＣＤ３−ＴＣＲ複合体）」、「ＣＤ３ｅ抗原，イプシロンポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）」；Ｔ細胞表面抗原Ｔ３／Ｌｅｕ−４イプシロン鎖；Ｔ３Ｅ；Ｔ細胞抗原受容体複合体，Ｔ３のイプシロンサブユニット；ＣＤ３ｅ抗原；ＣＤ３−イプシロン３；ＩＭＤ１８；ＴＣＲＥである。ＣＤ３Ｅ遺伝子についてのＩｄは、ＨＧＮＣ：１６７４；Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：９１６；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１９８８５１；ＯＭＩＭ：１８６８３０、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０７７６６である。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びζ鎖と会合して、ＴＣＲ複合体を形成し、分裂促進シグナル伝達によって、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成することができる。ＣＤ３は、Ｔ細胞及びＮＫ  Ｔ細胞上で発現される。本明細書において、ＣＤ３について言及される場合、特に明記されない限り、ヒトＣＤ３を指す。
【０２１２】
特定の実施形態では、Ｔ細胞関与ポリペプチドは、ＣＤ３に対する特異的結合が可能な２つ以下の結合ドメインを含む。一実施形態では、Ｔ細胞関与ポリペプチドは、ＣＤ３に対する一価の結合を提供する。一実施形態では、Ｔ細胞関与ポリペプチドは、ＣＤ３結合結合ドメインのスーパークラスターの１つのメンバーを含む。「スーパークラスター」が本明細書において使用され、特定の抗原に対する結合特異性を失うことなく、例えば、本発明のＶＨ若しくはＶＬ及び／又はＣＤＲを含む重鎖可変領域に関して、許容されるアミノ酸変化を有する可変領域を指す。より具体的には、「スーパークラスター」は、同じＶＨ  Ｖ遺伝子の使用を共有し、ＨＣＤＲ３において少なくとも７０％の配列同一性を有し、同じＨＣＤＲ３長を有するクローン群である。スーパークラスター内のクローンは、潜在的にエピトープ上の異なる親和性及び／又は異なる位置の同じ抗原に結合することが予想される。
【０２１３】
ＣＤ３結合ドメインは、親和性、エピトープ、及び他の特性の範囲であり得る。ＣＤ３の細胞外部分に結合することができる特定の可変ドメインは、ＭＦ８０５７、ＭＦ８０５８、ＭＦ８０７８のＶＨのアミノ酸配列及びこのスーパークラスターの可変領域、ＭＦ８３９７及びこのスーパークラスターの可変領域、ＭＦ８５０８及びこのスーパークラスターの可変領域、並びにＭＦ９２４９及びＭＦ９２６７並びにこのスーパークラスターの可変領域、を含む可変ドメインである。
【０２１４】
ＣＤ３抗原結合ドメインは、ＭＦ８０５７、ＭＦ８０５８、ＭＦ８０７８のＶＨ及びこのスーパークラスターの可変領域、ＭＦ８３９７及びこのスーパークラスターの可変領域、ＭＦ８５０８及びこのスーパークラスターの可変領域、並びにＭＦ９２４９及びＭＦ９２６７並びにこのスーパークラスターの可変領域からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号９７、配列番号１０６、配列番号１１５、配列番号１２４、配列番号１３３、配列番号１４２、配列番号９８、配列番号１０７、配列番号１１６、配列番号１２５、配列番号１３４配列番号１４３配列番号１５２配列番号９９、配列番号１０８、配列番号１１７、配列番号１２６、配列番号１３５、配列番号１４４及び／又は配列番号１５３）と、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６からなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲと、を含む。
【０２１５】
一実施形態では、ＣＤ３抗原結合ドメインは、配列番号９７、配列番号１０６、配列番号１１５、配列番号１２４、配列番号１３３、又は配列番号１４２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９８、配列番号１０７、配列番号１１６、配列番号１２５、配列番号１３４、配列番号１４３、又は配列番号１５２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号９９、配列番号１０８、配列番号１１７、配列番号１２６、配列番号１３５、配列番号１４４、又は配列番号１５３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２５４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５６の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２１６】
一実施形態では、ＣＤ３抗原結合ドメインは、配列番号１００、配列番号１０９、配列番号１１８、配列番号１２７、配列番号１３５、配列番号１４５、及び配列番号１５４の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号３７及び配列番号４０の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列と、を含む。
【０２１７】
一実施形態では、ＣＤ３抗原結合ドメインは、配列番号１００、配列番号１０９、配列番号１１８、配列番号１２７、配列番号１３５、配列番号１４５、又は配列番号１５４の重鎖可変領域と、配列番号３７又は配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０２１８】
多価抗体における結合ドメインの位置は、定義することができる。ベース抗体の結合ドメイン又は可変ドメインが結合ドメイン１及び２と呼ばれる場合、追加の１つ以上の結合ドメインは、結合ドメイン３、４などと呼ばれ得る。結合ドメインは、ＢＤとも呼ばれる。ＢＤ３は、ＢＤ１又はＢＤ２に連結されてもよい。ＢＤ３がＢＤ１又は２のうちの１つに連結される場合、ＢＤ４は、存在する場合、ＢＤ１及び２の他方に連結される。
【０２１９】
本発明のＴ細胞関与多価抗体は、標的細胞抗原（本明細書では「標的細胞抗原結合ドメイン」又は「第２」若しくは「第３」抗原結合ドメインとも呼ばれる）に結合することができる、少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｔ細胞関与多価抗体は、標的細胞抗原に結合することができる２つの抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、これらの抗原結合ドメインのそれぞれは、同じ抗原決定基に特異的に結合する。別の実施形態では、標的細胞抗原結合ドメインは同一である。一実施形態では、Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドは、標的細胞抗原に結合可能な２つ以下の標的細胞抗原結合ドメインを含む。
【０２２０】
一実施形態では、多価抗体は、ＣＤ３結合ドメインであるＢＤ１と、第１の標的細胞抗原（以後ＴＡ１と呼ぶ）に結合する結合ドメインであるＢＤ２と、第２の標的細胞抗原（以後ＴＡ２と呼ぶ）に結合する結合ドメインであるＢＤ３と、を含む。この実施形態では、ＢＤ３は、ＢＤ１又はＢＤ２に連結され得る。一実施形態では、ＢＤ３に結合するＴＡ２は、ＢＤ１に結合するＣＤ３に連結される。別の実施形態では、ＢＤ３に結合するＴＡ２は、ＢＤ２に結合するＴＡ１に連結される。
【０２２１】
一実施形態では、多価抗体は、ＢＤ１に結合するＴＡ１、ＢＤ２に結合するＴＡ２、及びＢＤ３に結合するＣＤ３を含む。この実施形態では、ＢＤ３は、ＢＤ１又はＢＤ２に連結され得る。一実施形態では、ＢＤ３に結合するＣＤ３は、ＢＤ１に結合するＴＡ１に連結される。別の実施形態では、ＢＤ３に結合するＣＤ３は、ＢＤ２に結合するＴＡ２に連結される。
【０２２２】
一実施形態では、本発明は、ベース抗体が結合ドメイン１及び２（ＢＤ１及び２）を含み、追加の結合ドメイン３（ＢＤ３）が結合ドメイン１（ＢＤ１）に連結され、任意選択の追加の結合ドメイン４（ＢＤ４）が結合ドメイン２（ＢＤ２）に連結される、多価抗体を提供する。一実施形態では、結合ドメイン１はＣＤ３結合ドメインであり、結合ドメイン２及び３は異なる標的細胞抗原に結合する。別の実施形態では、結合ドメイン２はＣＤ３結合ドメインであり、結合ドメイン１及び３は異なる標的細胞抗原に結合する。更なる実施形態では、結合ドメイン３はＣＤ３結合ドメインであり、結合ドメイン１及び２は異なる標的細胞抗原に結合する。
【０２２３】
好ましい実施形態では、多価の抗体は、更なる異なる標的細胞抗原に結合する結合ドメイン４を含む。
【０２２４】
本発明は、本明細書に記載の多価抗体を更に提供し、ベース抗体は結合ドメイン１及び２を含み、追加の結合ドメイン３は結合ドメイン１に連結され、任意選択の追加の結合ドメイン４は結合ドメイン２に連結される。一実施形態では、結合ドメイン１はＣＤ３結合ドメインであり、結合ドメイン２及び３は異なる標的細胞抗原に結合する。別の実施形態では、結合ドメイン２はＣＤ３結合ドメインであり、結合ドメイン１及び３は異なる標的細胞抗原に結合する。更なる実施形態では、結合ドメイン３はＣＤ３結合ドメインであり、結合ドメイン１及び２は異なる標的細胞抗原に結合する。
【０２２５】
結合ドメイン４を含む場合、ドメインは、更に更なる異なる標的細胞抗原に結合することが好ましい。
【０２２６】
一実施形態では、該標的細胞抗原結合ドメインの第１は、ＰＤ−Ｌ１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１３７、ＣＬＥＣ１２Ａ、フィブリノーゲン、又はサイログロブリンに結合する。一実施形態では、標的細胞抗原結合ドメインの第１及び第２は、ＰＤ−Ｌ１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１３７、ＣＬＥＣ１２Ａ、フィブリノーゲン、及びサイログロブリンから選択される抗原に結合する。第１及び第２の標的細胞結合ドメインは、好ましくは異なる抗原に結合する。
【０２２７】
ＣＤ３結合ドメインは、好ましくは、ＭＦ８０５７又はＭＦ８０５８又はＭＦ８０７８又はＭＦ８３９７又はＭＦ８５０８又はＭＦ９２４９又はＭＦ９２６７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。ＣＤ３結合ドメインは、好ましくはＣＤＲ以外の１つ以上の位置に０〜１０、好ましくは０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ８０５７、ＭＦ８０５８、ＭＦ８０７８、ＭＦ８３９７、ＭＦ８５０８、ＭＦ９２４９、又はＭＦ９２６７のＶＨのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【０２２８】
標的細胞抗原結合ドメインは、ＰＤ−Ｌ１結合ドメインであり得る。存在する場合、ＰＤ−Ｌ１結合ドメインは、好ましくは、ＭＦ５３７７、又はＭＦ５４４４、又はＭＦ５３８０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。ＰＤ−Ｌ１結合ドメインは、好ましくは、ＣＤＲ以外の１つ以上の位置に０〜１０、好ましくは０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５３７７、ＭＦ５４４４、又はＭＦ５３８０のＶＨのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【０２２９】
標的細胞抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲ結合ドメインであり得る。存在する場合、ＥＧＦＲ結合ドメインは、好ましくは、ＭＦ８２３３、又はＭＦ９８９１、又はＭＦ９８８６、又はＭＦ９８７３、又はＭＦ９９８８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。ＥＧＦＲ結合ドメインは、好ましくは、ＣＤＲ以外の１つ以上の位置に０〜１０、好ましくは０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ８２３３、ＭＦ９８９１、ＭＦ９８８６、ＭＦ９８７３、又はＭＦ９９８８のＶＨのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【０２３０】
標的細胞抗原結合ドメインは、ＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメインであり得る。存在する場合、ＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメインは、好ましくは、ＭＦ４３２７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。ＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメインは、好ましくは、ＣＤＲ以外の１つ以上の位置に０〜１０、好ましくは０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ４３２７のＶＨのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【０２３１】
一実施形態では、多価抗体は、ＣＤ３結合ドメイン、ＥＧＦＲ結合ドメイン、及びＰＤ−Ｌ１結合ドメインを含む。
【０２３２】
示される重鎖可変領域を有する結合ドメインは、軽鎖可変領域を含む。軽鎖可変領域は、好ましくは、アミノ酸配列ＣＤＲ１−ＱＳＩＳＳＹ、ＣＤＲ２−ＡＡＳ、ＣＤＲ３−ＱＱＳＹＳＴＰ、すなわちＩＧＫＶ１−３９（ＩＭＧＴによる）のＣＤＲを含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域を含む。アミノ酸の変異、挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせは、好ましくは軽鎖可変領域のＣＤＲ３領域にはなく、好ましくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１又はＣＤＲ２領域にはない。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、示される配列に対する欠失、付加又は挿入を含まない。この実施形態では、軽鎖可変領域は、示されるアミノ酸配列に対して０〜５個のアミノ酸置換を有することができる。アミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。本発明の抗体の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、本明細書の他の箇所に記載されるように、それぞれ、アミノ酸配列ＣＤＲ１−ＱＳＩＳＳＹ、ＣＤＲ２−ＡＡＳ、ＣＤＲ３−ＱＱＳＹＳＴＰ、すなわち、ＩＧＫＶ１−３９（ＩＭＧＴによる）のＣＤＲを含む。示される重鎖可変領域を有する結合ドメインの軽鎖は、好ましくは全て同じ軽鎖を含む。好ましくは、本明細書の他の箇所に定義される共通軽鎖である。
【０２３３】
アミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせは、好ましくは重鎖可変領域のＣＤＲ３領域にはなく、好ましくは重鎖可変領域のＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域にはない。好ましい実施形態では、重鎖可変領域は、示される配列に対する欠失、付加、又は挿入を含まない。一実施形態では、重鎖可変領域は、示されるアミノ酸配列に対して０〜１０個、好ましくは０〜５個のアミノ酸置換を有することができる。好ましい実施形態では、重鎖可変領域は、ＣＤＲ以外の位置に、示されるアミノ酸配列に対して０〜９、０〜８、０〜７、０〜６、０〜５、０〜４、好ましくは０〜３、好ましくは０〜２、好ましくは０〜１、及び好ましくは０のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを含む。挿入、付加、欠失、又は置換の組み合わせは、アラインメントされた配列が１０超の位置で異ならない（好ましくは５未満）場合、特許請求される組み合わせである。アラインメントされた配列のうちの一方にあるギャップは、他の配列でスキップされたのと同じアミノ酸の数に値する。アミノ酸置換は、もしあれば、好ましくは保存的アミノ酸置換である。
【０２３４】
一実施形態では、標的細胞抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。一実施形態では、標的細胞抗原結合ドメインは、特異的抗原決定基に結合するＦａｂ分子であり、Ｔ細胞関与多価抗体を標的部位、例えば、抗原決定基を有する特定のタイプの腫瘍細胞に向けることができる。
【０２３５】
特定の実施形態では、標的細胞抗原結合は、プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ−Ｌ１）、好ましくはヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号２５７）と特異的に結合する。
【０２３６】
ＰＤ−Ｌ１は、妊娠、組織同種移植、自己免疫疾患、及び肝炎などの他の疾患状態などの特定の事象中に免疫応答を抑制する役割を果たす、１型膜貫通タンパク質である。ＰＤＬ１のＰＤ−１又はＢ７．１（ＣＤ８０）への結合は、抑制性シグナルを伝達し、これは、Ｔ細胞を発現するＰＤ−１の増殖を低減する。ＰＤ−１は、アポトーシスを介した外来抗原特異的Ｔ細胞の蓄積を制御することができると考えられている。ＰＤ−Ｌ１は、様々な癌細胞によって発現され、その発現は、癌細胞に対して免疫応答を弱めることに少なくとも部分的に関与すると考えられている。ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ７ファミリーのタンパク質のメンバーであり、様々な他の名称で知られており、例えば、ＣＤ２７４分子、ＣＤ２７４抗原、Ｂ７ホモログ１、ＰＤＣＤ１リガンド１、ＰＤＣＤ１ＬＧ１、ＰＤＣＤ１Ｌ１、Ｂ７Ｈ１、ＰＤＬ１、プログラム細胞死１リガンド１、プログラム細胞死リガンド１、Ｂ７−Ｈ１、及びＢ７−Ｈであり、ＣＤ２７４についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１７６３５、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：２９１２６；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１２０２１７；ＯＭＩＭ：６０５４０２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＮＺＱ７である。
【０２３７】
ＰＤ−Ｌ１結合ドメインは、親和性、エピトープ、及び他の特性の範囲であり得る。ＰＤ−Ｌ１の細胞外部分に結合することができる特定の可変ドメインは、ＭＦ５３７７、ＭＦ５４４４、又はＭＦ５３８０のＶＨのアミノ酸配列を含む可変ドメインである。
【０２３８】
ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインは、配列番号１６０、配列番号１６９、配列番号１７８、配列番号１６１、配列番号１７０、配列番号１７９配列番号１６２、配列番号１７１、及び配列番号１８０のＶＨからなる群から選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲと、配列番号２５４、配列番号２５５、及び配列番号２５６の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【０２３９】
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインは、配列番号１６０、配列番号１６９、又は配列番号１７８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６１、配列番号１７０、又は配列番号１７９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６２、配列番号１７１、又は配列番号１８０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２５４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５６の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２４０】
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインは、配列番号１６３、配列番号１７２及び配列番号１８１の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号３７及び配列番号４０の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列と、を含む。
【０２４１】
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインは、配列番号１６３、配列番号１７２又は配列番号１８１の重鎖可変領域と、配列番号３７又は配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【０２４２】
特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインは、アミノ酸配列を含むＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を含み、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６（米国特許第出願公開２０１０／０２０３０５６（Ａ１）号を参照のこと）、ＭＥＤＩ−４７３６（国際公開第２０１１／０６６３８９号を参照のこと）、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ（国際公開第２０１３／０７９１７４号を参照のこと）、ＳＴＩ−１０１４（国際公開第２０１３／１８１６３４号を参照のこと）、ＣＸ−０７２（国際公開第２０１６／１４９２０１号を参照のこと）、ＫＮ０３５（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｃｏｖ．７：３（Ｍａｒｃｈ  ２０１７）を参照のこと）、ＬＹ３３０００５４（例えば、国際公開第２０１７／０３４９１６号を参照のこと）、及びＣＫ−３０１（Ｇｏｒｅｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．、ＡＡＣＲ：Ａｂｓｔｒａｃｔ  ４６０６（Ａｐｒ  ２０１６）を参照のこと）、及び１２Ａ４又はＭＤＸ−１１０５（例えば、国際公開第２０１３／１７３２２３号を参照のこと）について開示されている。
【０２４３】
特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインは、ＰＤ−Ｌ１抗体ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６（ＵＳ２０１０／０２０３０５６  Ａ１を参照のこと）、ＭＥＤＩ−４７３６（国際公開第２０１１／０６６３８９号を参照のこと）、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ（国際公開第２０１３／０７９１７４号を参照のこと）、ＳＴＩ−１０１４（国際公開第２０１３／１８１６３４号を参照のこと）、ＣＸ−０７２（国際公開第２０１６／１４９２０１号を参照のこと）、ＫＮ０３５（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｃｏｖ．７：３（Ｍａｒｃｈ  ２０１７）を参照のこと）、ＬＹ３３０００５４（例えば、国際公開第２０１７／０３４９１６号を参照のこと）、及びＣＫ−３０１（Ｇｏｒｅｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．、ＡＡＣＲ：Ａｂｓｔｒａｃｔ  ４６０６（Ａｐｒ  ２０１６）を参照のこと）、及び１２Ａ４又はＭＤＸ−１１０５（例えば、国際公開第２０１３／１７３２２３号を参照のこと）、の重鎖及び軽鎖可変領域と同じエピトープに結合する。
【０２４４】
特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインは、ＰＤ−Ｌ１抗体ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６（ＵＳ２０１０／０２０３０５６  Ａ１を参照のこと）、ＭＥＤＩ−４７３６（国際公開第２０１１／０６６３８９号を参照のこと）、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ（国際公開第２０１３／０７９１７４号を参照のこと）、ＳＴＩ−１０１４（国際公開第２０１３／１８１６３４号を参照のこと）、ＣＸ−０７２（国際公開第２０１６／１４９２０１号を参照のこと）、ＫＮ０３５（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｃｏｖ．７：３（Ｍａｒｃｈ  ２０１７）を参照のこと）、ＬＹ３３０００５４（例えば、国際公開第２０１７／０３４９１６号を参照のこと）、及びＣＫ−３０１（Ｇｏｒｅｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．、ＡＡＣＲ：Ａｂｓｔｒａｃｔ  ４６０６（Ａｐｒ  ２０１６）を参照のこと）、及び１２Ａ４又はＭＤＸ−１１０５（例えば、国際公開第２０１３／１７３２２３号を参照のこと）、の重鎖及び軽鎖可変領域を有するＰＤ−Ｌ１への結合について競合する。
【０２４５】
特定の実施形態では、標的細胞抗原結合は、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（配列番号２５８）と特異的に結合する。「ＥｒｂＢ１」又は「ＥＧＦＲ」は、Ｈｅｒ−又はｃＥｒｂＢ−１、−２、−３及び−４と命名された４つの受容体チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ、ＲＴＫ）のファミリーのメンバーである。ＥＧＦＲは、４つのサブドメインから構成される細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を有し、これらのドメインのうちの２つは、リガンド結合に関与し、そのうちの１つは、ホモ二量体化及びヘテロ二量体化に関与する。この項で使用される参照番号は、「本明細書で引用された参照文献」との表題が付けられた列挙の番号付けを指す。ＥＧＦＲは、多様な細胞内応答を得るために、様々なリガンドからの細胞外シグナルを統合する。ＥＧＦＲにより活性化される主要シグナル伝達経路は、Ｒａｓマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ、ＭＡＰＫ）有糸分裂シグナル伝達カスケードから構成される。この経路の活性化は、Ｇｒｂ２のチロシンリン酸化ＥＧＦＲへの動員によって開始される。これは、Ｇｒｂ２結合Ｒａｓグアニンヌクレオチド交換因子Ｓｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ（ＳＯＳ）を介してＲａｓの活性化をもたらす。加えて、ＰＩ３−キナーゼ−Ａｋｔシグナル伝達経路はまた、ＥＧＦＲによって活性化されるが、この活性化は、Ｈｅｒ３の共発現が存在する場合にははるかに強力である。ＥＧＦＲは、いくつかのヒト上皮悪性腫瘍、特に乳房、膀胱、非小細胞肺癌肺、結腸、卵巣、頭頸部、及び脳の癌に関与している。この遺伝子における活性化突然変異、並びに受容体及びそのリガンドの過剰発現が見出されており、自己分泌活性化ループが生じる。したがって、このＲＴＫは、癌療法の標的として広く使用されている。細胞外リガンド結合ドメインに指向されたＲＴＫ及びモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍＡｂ）を標的とする小分子阻害剤の両方が開発されてきたが、これは、今までのところは、ほとんどが患者の選択群に関してだが、いくつかの臨床的成功を示している。ヒトＥＧＦＲタンパク質及びそれをコードする遺伝子についてのデータベース登録番号は、（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００５２２８．３）である。この登録番号は、主に、ＥＧＦＲタンパク質を標的として同定する更なる方法を提供するために与えられ、抗体によって結合されたＥＧＦＲタンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかの癌などで生じるものなどのコード遺伝子における変異のために変化し得る。本明細書において、ＥＧＦＲに言及される場合、特に明記しない限り、ヒトＥＧＦＲを指す。ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、ＥＧＦＲ及びいくつかのＥＧＦＲ陽性腫瘍で発現されたものなどの様々な変異体に結合する。
【０２４６】
ＥＧＦＲ結合ドメインは、親和性、エピトープ、及び他の特性の範囲であり得る。ＥＧＦＲの細胞外部分に結合することができる特定の可変ドメインは、ＭＦ８２３３、ＭＦ９８９１、ＭＦ９８８６、ＭＦ９８７３、ＭＦ９９８８のＶＨのアミノ酸配列を含む可変ドメインである。
【０２４７】
ＥＧＦＲ抗原結合ドメインは、配列番号１８７、配列番号１９６、配列番号２０５、配列番号２１４、配列番号２２３、配列番号１８８、配列番号１９７、配列番号２０６、配列番号２１５、配列番号２２４配列番号１８９、配列番号１９８、配列番号２０７、配列番号２１６、及び配列番号２２５からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲと、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【０２４８】
一実施形態では、ＥＧＦＲ抗原結合ドメインは、配列番号１８７、配列番号１９６、配列番号２０５、配列番号２１４、又は配列番号２２３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８８、配列番号１９７、配列番号２０６、配列番号２１５、又は配列番号２２４の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１８９、配列番号１９８、配列番号２０７、配列番号２１６、又は配列番号２２５の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２５４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５６の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２４９】
一実施形態において、ＥＧＦＲ抗原結合ドメインは、配列番号１９０、配列番号１９９、配列番号２０８、配列番号２１７、及び配列番号２２６の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号３７及び配列番号４０の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列と、を含む。
【０２５０】
一実施形態では、ＥＧＦＲ抗原結合ドメインは、配列番号１９０、配列番号１９９、配列番号２０８、配列番号２１７、又は配列番号２２６の重鎖可変領域と、配列番号３７又は配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【０２５１】
特定の実施形態では、ＥＧＦＲ抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲ抗体、セツキシマブ（Ｃ２２５，Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標），Ｌｉｌｌｙ）又はパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ，Ａｍｇｅｎ）の重鎖及び軽鎖可変領域を含む。
【０２５２】
特定の実施形態では、ＥＧＦＲ抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲ抗体、セツキシマブ（Ｃ２２５，Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標），Ｌｉｌｌｙ）又はパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ，Ａｍｇｅｎ）の重鎖及び軽鎖可変領域と同じエピトープに結合する。
【０２５３】
特定の実施形態では、ＥＧＦＲ抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲ抗体、セツキシマブ（Ｃ２２５，Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標），Ｌｉｌｌｙ）又はパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ，Ａｍｇｅｎ）の重鎖及び軽鎖可変領域を有するＥＧＦＲへの結合について競合する。
【０２５４】
共通可変領域
本発明の多価抗体は、好ましくは、３つ以上の結合ドメインのそれぞれにおいて共通鎖を使用する。記載されるように、本発明の多価抗体のベース抗体部分は、好ましくは、１つの抗原に結合する第１の重鎖可変領域／軽鎖可変領域（ＶＨ／ＶＬ）の組み合わせを有し、第２の抗原に結合する第２のＶＨ／ＶＬの組み合わせを有する。ベース抗体部分に接続された、それぞれの追加の結合ドメインは、抗原上の更なるエピトープに結合する追加のＶＨ／ＶＬの組み合わせを含んでもよい。
【０２５５】
本発明のベース抗体部分は、好ましくは、２つの重鎖（一方又は両方が１つ以上の追加のＣＨ１及びＶＨドメインを含む）と、各ＣＨ１及びＶＨドメインと対合する軽鎖と、を含む。好ましくは、２つの重鎖は適合性ヘテロ二量体化ドメインを有し、好ましくは、軽鎖は共通軽鎖である。あるいは、本発明の多価抗体のベース抗体部分は、２つの軽鎖（一方又は両方が１つ以上の追加のＣＬ及びＶＬドメインを含む）、並びに各ＣＬ及びＶＬドメインと対合する重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、共通重鎖可変領域を含む。
【０２５６】
本発明の実施形態が、共通軽鎖を含む多価抗体を含み、該軽鎖は、２つ以上の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む宿主細胞内で発現され、該軽鎖は、利用可能な重鎖（又はＣＨ１−ＶＨ１領域）と対合することができ、それにより少なくとも３つの機能的抗原結合ドメインを形成する。
【０２５７】
機能的抗原結合ドメインは、抗原上のエピトープに特異的に結合することができる。好ましくは、本発明の多価抗体において使用される共通軽鎖は、本発明による方法により産生された全ての重鎖（又はＣＨ１−ＶＨ１領域）と対合することができ、それにより機能的抗原結合ドメインを形成し、その結果、マッチしない重鎖及び軽鎖の誤対合が回避されるか、又は多価抗体よりも著しく低い比率で産生される。
【０２５８】
本発明の多価抗体が、一連の重鎖可変領域と結合して機能的抗原結合ドメインを有する抗体を形成することができる共通軽鎖（可変領域）を有することが本発明の好ましい態様である。（国際公開第２００４／００９６１８号、国際公開第２００９／１５７７７１号）。
【０２５９】
本発明の多価抗体において使用するための共通軽鎖（可変領域）は、好ましくはヒト軽鎖（可変領域）である。共通軽鎖（可変領域）は、好ましくは生殖細胞系列配列を有する。好ましい生殖細胞系列配列は、ヒトレパートリーで頻繁に使用され、良好な熱力学的安定性、収率、及び溶解度を有する軽鎖可変領域である。好ましい生殖細胞系列軽鎖は、Ｏ１２である。共通軽鎖は、好ましくは、再構成生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１（図１１Ａ；配列番号３５）である。共通軽鎖可変領域は、好ましくは、再構成生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１の可変領域（図１１Ａ；配列番号３５）である。共通軽鎖は、好ましくは、０〜５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する、図１１Ｂ、又は８Ｄに示されるような（それぞれ配列番号３７又は４０）軽鎖可変領域を含む。共通軽鎖は、好ましくは、軽鎖定常領域、好ましくはカッパ軽鎖定常領域を更に含む。共通軽鎖をコードする核酸は、共通軽鎖タンパク質を発現するために使用される細胞系に対してコドン最適化され得る。コード核酸は、生殖細胞系列核酸配列から逸脱し得る。
【０２６０】
本発明の多価抗体で使用するための共通軽鎖（可変領域）は、ラムダ軽鎖であり得、これもまた本発明の文脈内で提供されるが、カッパ軽鎖が好ましい。本発明の共通軽鎖は、カッパ又はラムダ軽鎖の定常領域を含み得る。このことは、好ましくは、カッパ軽鎖の定常領域であり、好ましくは、該共通軽鎖は生殖細胞系列軽鎖であり、好ましくは、ＩｇＶＫＩ−３９遺伝子断片を含む再構成生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖、例えば、再構成生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶＫｌ−３９＊０１／ＩＧＪＫＩ＊０１（図１１）である。再構成生殖細胞系ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１、ＩＧＫＶ１−３９／ＩＧＫＪ１、ｈｕＶκ１−３９軽鎖、又は短縮してｈｕＶκ１−３９、又は単に１−３９という用語は、本出願全体にわたって互換的に使用される。当業者は、「共通」とは、アミノ酸配列が同一ではない軽鎖の機能的等価物を指すことも認識するであろう。該軽鎖の多くの変異体が存在し、機能的結合領域の形成に実質的に影響を与えない変異（欠失、置換、付加）が存在する。
【０２６１】
ＩｇＶκ１−３９は、免疫グロブリン可変カッパ１−３９遺伝子についての短縮形である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変１−３９、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１−３９、Ｏ１２ａ、又はＯ１２としても知られる。この遺伝因子についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：５７４０、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：２８９３０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２４２３７１である。ＩｇＶκ１−３９の好ましいアミノ酸配列を図１１に示す。これはＶ領域の配列を列挙している。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと組み合わせることができる。図１１は、Ｊ領域と組み合わせたＩｇＶκ１−３９についての２つの好ましい配列を記載している。結合された配列は、ＩＧＫＶ１−３９／ｊｋ１及びＩＧＫＶ１−３９／ｊｋ５として示され、代替名は、ＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１又はＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ５＊０１である（ｉｍｇｔ．ｏｒｇでのＩＭＧＴデータベースの世界的なウェブによる命名法）。
【０２６２】
共通軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖定常領域に結合することが好ましい。好ましい実施形態では、本発明の多価抗体において使用される軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１又はＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ５＊０１を含む。好ましい実施形態では、多価抗体中の共通軽鎖はＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１である。
【０２６３】
共通軽鎖を産生する細胞は、例えば、再構成生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１及びラムダ定常領域に融合された前述の軽鎖の可変領域を含む軽鎖を産生することができる。本明細書では生殖系列配列を参照する場合、可変領域は生殖系列配列であることが好ましい。
【０２６４】
本発明の多価抗体において使用するための好ましい共通軽鎖は、配列番号２９に記載された配列を含むものである。
【０２６５】
本発明の多価抗体において使用するための共通鎖は、重鎖であってもよく、こてもまた本発明の文脈においても提供される。共通重鎖は、二重特異性抗体を作製するために当該技術分野において使用されており、本明細書では３つ以上の結合ドメインを含む多価抗体を作製する際に使用することができ、該結合ドメインのうちの２つ以上は、当該技術分野において既知の共通重鎖を含む。例えば、重鎖可変ドメインが全てのライブラリメンバーに関して同じであり、したがって、多様性が軽鎖可変ドメインに基づく抗体ライブラリの使用である。かかるライブラリは、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５６１９号、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５７７８０号に記載されており、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。共通重鎖を有する結合ドメインを生成するためのこれらの及び他の技術は、当業者によって作られ得、本発明では、本明細書に開示される新規なフォーマットを有する多価抗体を産生するために使用することができる。
【０２６６】
多価抗体の産生
本発明の多価抗体は、図１ａ〜図１ｕ含む上記のような多価抗体を含む多量体を形成する３つ以上のタンパク質を一緒にコードする１つ以上の遺伝子構築物と個々の細胞を共トランスフェクションすることによって産生され得る。例えば、宿主細胞は、３つ以上の重鎖可変領域及び共通軽鎖可変領域をコードする核酸と共トランスフェクションされて、多価抗体を産生することができる。あるいは、本発明の多価抗体は、３つ以上の軽鎖可変領域及び共通重鎖を一緒にコードする１つ以上の遺伝子構築物を用いた個々の細胞の共トランスフェクションによって産生され得る。
【０２６７】
ヘテロ二量体である産生抗体を有利にするために、いくつかの方法が公開されている。本発明において、細胞は、それぞれのホモ二量体の産生よりもヘテロ二量体の産生を優先することが好ましい。このことは、典型的には、ホモ二量化よりもヘテロ二量化（つまり、１つの重鎖が第２の重鎖と結合する二量化）を優先するように、重鎖の定常領域を修飾することによって達成される。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、適合性ヘテロ二量体化ドメインを有する２つの異なる免疫グロブリン重鎖を含む。
【０２６８】
この適合性ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくは、適合性免疫グロブリン重鎖ＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインである。野生型ＣＨ３ドメインが使用される場合、２つの異なる重鎖（Ａ及びＢ）と共通軽鎖との共発現は、３つの異なる抗体種、ＡＡ、ＡＢ及びＢＢをもたらすであろう。ＡＡ及びＢＢは、２つのホモ二量体抗体の表記であり、ＡＢはヘテロ二量体抗体の表記である。所望のヘテロ二量体産物（ＡＢ）の割合を増加させるために、ＣＨ３操作を使用することができ、又は言い換えれば、以下に定義されるように、適合性ヘテロ二量体化ドメインを有する重鎖を使用することができる。当該技術分野では、重鎖のこのようなヘテロ二量体化が達成され得る様々な方法が記載されている。
【０２６９】
本明細書で使用するとき、用語「適合性ヘテロ二量体化ドメイン」は、操作ドメインＡ’が操作ドメインＢ’を有するヘテロ二量体を優先的に形成し、逆もまた同様であり、Ａ’−Ａ’とＢ’−Ｂ’との間のホモ二量体化が減少するように操作を受けたタンパク質ドメインを指す。
【０２７０】
米国特許出願公開第１３／８６６，７４７号（現在、米国特許第９，２４８，１８１号として発行）、米国特許出願公開第１４／０８１，８４８号（現在、米国特許第９，３５８，２８６号として発行）、国際公開第２０１３／１５７９５３号、及び国際公開第２０１３／１５７９５４号において、適合性ヘテロ二量体化ドメインを使用して多価抗体を産生するための方法及び手段が開示されている。本発明では、これらの手段及び方法を好適に採用することができる。具体的には、本発明の抗体は、好ましくは、本質的に二重特異性全長ＩｇＧ分子のみを産生するための変異を含む。好ましい変異は、第１のＣＨ３ドメイン又はそれに対応する位置におけるアミノ酸置換Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵナンバリング）（「ＫＫ−変異体」重鎖）、並びに第２のドメイン又はそれに対応する位置におけるアミノ酸置換Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅ（「ＤＥ−変異体」重鎖）である（又はその逆）。ＤＥ−変異体及びＫＫ−変異体が優先的に対をなして、ヘテロ二量体（いわゆる「ＤＥＫＫ」二重特異性分子）を形成することが、本発明者らの米国特許第９，２４８，１８１号及び同第９，３５８，２８６号の特許、並びに国際公開第２０１３／１５７９５４号で以前に実証されている。ＤＥ−変異体重鎖のホモ二量体化（ＤＥＤＥホモ二量体）又はＫＫ−変異体重鎖のホモ二量体化（ＫＫＫＫホモ二量体）は、同一の重鎖間のＣＨ３−ＣＨ３界面における荷電残基間の反発力のために、ほとんど発生しない。
【０２７１】
多価抗体を形成するために多量体化するタンパク質を発現することができる本発明の好ましい宿主細胞では、宿主細胞は、３つのタンパク質をコードする核酸で形質転換される。Ｎ末端からＣ末端の順に、コードされたタンパク質は、ＶＨ１−ＣＨ１−ＶＨ２−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のタンパク質を含み、リンカーは、ＶＨ２及びＣＨ１を第１のタンパク質上に接続し、第２のコードされたタンパク質は、ＶＬｃ−ＣＬを含み、第３のコードされたタンパク質は、ＶＨ３−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第１及び第３のコードされたタンパク質のＣＨ１は、第２のコードされたタンパク質のＣＬと対合し、第１及び第３のタンパク質のコードされたＣＨ３領域は、それぞれ、第１のＣＨ３タンパク質若しくはそれに対応する位置においてアミノ酸Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵ番号付け）をコードする、又は第３のタンパク質若しくはそれに対応する位置においてアミノ酸Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅをコードする、又はその逆もまた同様である。あるいは、該第１及び第３のタンパク質は、これらのタンパク質のそれぞれのＣＨ３ドメインの効率的な対合を引き起こす他の適合性ヘテロ二量体化ドメインを含む。
【０２７２】
該３つのタンパク質をコードする該核酸は、本発明の多価抗体を生成するために、１つ以上のベクター上に存在し得る。同様に、宿主細胞は、図１ａ〜１ｕのものを含む、上記の多価抗体のそれぞれについて、３つを超えるタンパク質をコードして生成することができる。
【０２７３】
該３つのタンパク質をコードしている該核酸は、宿主細胞のゲノムに、好ましくは、高発現、及び遺伝子サイレンシングの非存在又は減少のために既知の染色体領域で、安定的に組み込まれてもよい。
【０２７４】
したがって、本発明によれば、多価抗体の調製方法が提供され、該方法は、
本発明による多価抗体に組み立てることができるポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む細胞を準備することと、
該宿主細胞を、ポリペプチドの発現及びそれらの組み立てを多価抗体に提供する条件下で培養することと、を含む。
【０２７５】
本発明の宿主細胞は、全発現免疫グロブリンに基づいて、本発明の多価抗体の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の純度で産生することができる。
【０２７６】
本発明の宿主細胞は、多価抗体を産生することができ、産生される多価抗体の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％は、全ての結合部位に対して同族の共通鎖と対合した可変再構成領域を含む。
【０２７７】
本発明の宿主細胞は、多価抗体を産生することができ、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の発現した共通鎖は多価抗体と対合しており、遊離した会合していないタンパク質ではない。
【０２７８】
抗体産生に好適な細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、又はＰＥＲ−Ｃ６細胞である。特に好ましい実施形態では、該細胞は、ＣＨＯ細胞である。本明細書に開示される抗体の産生のための細胞は、宿主細胞とも呼ばれる。
【０２７９】
様々な機関及び企業は、例えば、臨床使用のために、抗体の大規模生産のための細胞株を開発してきた。かかる細胞株の非限定的な例は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞である。これらの細胞の少なくとも一部はまた、タンパク質の産生などの他の目的にも使用される。タンパク質及び抗体の工業規模生産のために開発された細胞株は、本明細書では産業細胞株と更に称される。好ましい実施形態では、本発明は、本発明の抗体を産生する工業用細胞株を提供する。
【０２８０】
一実施形態では、本発明は、本発明による抗体及び／又は本発明による核酸を含む細胞（宿主細胞）を提供する。該細胞は、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。本発明の目的のために、好適な細胞、好適な宿主細胞は、本発明による抗体及び／又は本発明による核酸を含み、好ましくは産生することができる任意の細胞である。
【０２８１】
本発明は、本発明による抗体を含む細胞を更に提供する。好ましくは、該細胞（典型的にはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、単離、又は組換え細胞）は、該抗体を産生する。好ましい実施形態では、該細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、又はＰＥＲ−Ｃ６細胞である。特に好ましい実施形態では、該細胞は、ＣＨＯ細胞である。本発明による細胞を含む細胞培養が更に提供される。様々な機関及び企業は、例えば、臨床使用のために、抗体の大規模生産のための細胞株を開発してきた。かかる細胞株の非限定的な例は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞である。これらの細胞はまた、タンパク質の産生などの他の目的にも使用される。タンパク質及び抗体の工業規模生産のために開発された細胞株は、本明細書では産業細胞株と更に称される。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、本発明の多価抗体の産生のための抗体の大規模生産のために開発された細胞株の使用を提供する。本発明は更に、請求項に記載の多価抗体に対して単独で又は一緒にコードされるもう１つの核酸分子を含む多価抗体を産生するための細胞を提供する。
【０２８２】
本発明はまた、同じ細胞によって２つ以上の抗体を産生するための方法を提供し、該抗体のうちの少なくとも１つは、本明細書に記載される多価抗体である。この実施形態は、前述のＤＥ／ＫＫヘテロ二量体化システムによって例示される。しかしながら、本発明は、重鎖のヘテロ二量体化を可能にするための特定の方法に限定されない。前述のように、ＤＥ−変異体及びＫＫ−変異体は、優先的に対合して、ヘテロ二量体（いわゆる「ＤＥＫＫ」二価／多価分子）を形成する。ＤＥ−変異体重鎖のホモ二量体化（ＤＥＤＥホモ二量体）又はＫＫ−変異体重鎖のホモ二量体化（ＫＫＫＫホモ二量体）は、同一の重鎖間のＣＨ３−ＣＨ３界面における荷電残基間の反発力のために、ほとんど発生しない。ＤＥ−又はＫＫ−変異体重鎖のいずれかを有する更なる重鎖を導入することにより、更なるＤＥＫＫ二価／多価分子の産生が可能になる。新たに導入されたＤＥ−重鎖（ＤＥ２）は、既存のＫＫ重鎖と会合することができる。したがって、細胞は、２つの二重／多価抗体、ＤＥ１ＫＫ及びＤＥ２ＫＫ二価抗体を産生する。新たなＫＫ重鎖（ＫＫ２）が新たなＤＥ重鎖の代わりに導入される場合、ＤＥＫＫ１とＤＥＫＫ２との組み合わせを有する二価抗体が産生される。異なる抗体が細胞によって産生され得るレベルは、典型的には、互いに対するＤＥ１／２及びＫＫ１／２鎖の相対的発現を調節することによって最適に調節される。軽鎖は、典型的には、単一の重鎖のレベルを低減するのに十分に産生され、１つの鎖が産生されるレベルは、典型的には、相補鎖と効果的な対合を可能にするのに十分である。ＤＥ１／２において、ＫＫ例であるＤＥ１及びＤＥ２重鎖は、好ましくはＫＫ重鎖のレベルと一緒に一致するレベルで産生される。それぞれの抗体のレベルは、ＤＥ１及びＤＥ２が、互いに連動して産生されるレベルを調節することによって調節することができる。ＫＫ１／２  ＤＥ変異体の場合、状況は当然ながら同様であるが、ＫＫ１及びＫＫ２鎖の場合は互いに関連している。重鎖のそれぞれに会合する結合ドメイン又は可変ドメインの数に応じて、この方法は、様々な異なる二価／多価抗体の産生を可能にする。ここで、いくつかの非限定的な例を説明する。この例では、重鎖ＤＥ１は、抗原Ｖに結合する結合ドメイン又は可変ドメインの全ての結合ドメインに共通軽鎖とともにある１つの重鎖可変領域を有し、重鎖ＤＥ２は、抗原Ｗ及びＸに結合する２つの結合ドメイン又は可変ドメインを形成する、共通軽鎖とともにある２つの重鎖可変領域を有する。重鎖ＫＫは、抗原Ｙに結合する結合ドメイン又は可変ドメインを形成する、共通軽鎖とともにある１つの重鎖可変領域を有する。細胞内においてこれらの重鎖及び軽鎖を産生すると、抗体ＤＥ１ＫＫ及び抗体ＤＥ２ＫＫが産生され、抗体ＤＥ１ＫＫは、抗原Ｖ及びＹに結合する二価抗体である。抗体ＤＥ２ＫＫは、抗原Ｗ、Ｘ、Ｙに結合する多価抗体である。上記の例において、ＤＥ１が共通軽鎖とともに２つの結合ドメイン又は可変ドメインを形成する２つの重鎖可変領域も有する場合、本発明の２つの多価抗体が産生される。ＫＫ重鎖はまた、追加の重鎖可変領域を提供することができ、それにより、同じ又は異なる抗原結合特異性の更なる結合ドメインを追���することもできる。上記のＤＥ／ＫＫなどの２つ以上の異なるヘテロ二量体化ドメインの組み合わせ、及びノブインホールドメインは、オリゴクローン抗体産生において更なる多様性を付加することができる。例えば、２つの重鎖を、一方がノブと共に、他方が相補的なホールと共に付加することにより、ノブ重鎖及びホール重鎖を含む独立した二価／多価抗体の産生を可能にする。各重鎖と会合する重鎖可変領域の数に応じて、そして同一であるか又は異なっているかに応じて、更なる単特異性抗体、又は更なる二価若しくは多価抗体が産生される。
【０２８３】
本発明によると、２つ以上の抗体を含む組成物が提供され、そのうちの少なくとも１つは、本発明の多価抗体であってもよい。本発明のかかる組成物は、本発明の２つ以上の多価抗体を含み得る。かかる組成物は、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の抗体を含んでもよく、そのうちの少なくとも１つは、本発明の多価抗体であってもよい。かかる組成物は、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の抗体を含んでもよく、これらの抗体の全ては、本発明の多価抗体であってもよい。
【０２８４】
かかる組成物では、組成物中に存在する１つ以上の抗体は、共通の１つの重鎖を有し得る。
【０２８５】
本発明の宿主細胞は、２つ以上の抗体を発現し得るか、又は発現することができる場合があり、そのうちの少なくとも１つは、本発明の多価抗体であってもよい。本発明の宿主細胞は、本発明の２つ以上の多価抗体を発現し得るか、又は発現することができる場合がある。かかる宿主細胞は、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の抗体を発現し得るか、又は発現することができる場合があり、そのうちの少なくとも１つは、本発明の多価抗体であってもよい。かかる宿主細胞は、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の抗体を発現し得るか、又は発現することができる場合があり、これらの全ては、本発明の多価抗体であってもよい。
【０２８６】
したがって、本発明によれば、２つ以上の抗体を含む組成物の調製方法が提供され、この方法は、
２つ以上の抗体に組み立てることができるポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む細胞を提供することであって、そのうちの少なくとも１つは、本発明による多価抗体である、ことと、
該宿主細胞を、ポリペプチドの発現を提供する条件下で、それらの組み立てを２つ以上の抗体に提供する条件下で培養することであって、そのうちの少なくとも１つは、本発明による多価抗体である、ことと、を含む。
【０２８７】
本発明はまた、同じ細胞によって２つ以上の該抗体を産生するための方法を提供し、この抗体のうちの少なくとも１つは、本明細書に記載される多価抗体である。
【０２８８】
本発明は、少なくとも１つが請求項に記載の多価抗体である、２つ以上の抗体を含む組成物の産生方法であって、該方法は、
共通軽鎖とともにある重鎖可変領域を有する第１の重鎖をコードし、第１の抗原に結合する結合ドメイン又は可変ドメインを形成する核酸と、
該共通軽鎖とともにある重鎖可変領域を有する第２の重鎖をコードし、第２の抗原に結合する可変ドメイン、及び該共通軽鎖とともにある重鎖可変領域を形成し、第３の抗原に結合する可変ドメインを形成する核酸と、
該共通軽鎖とともにある重鎖可変領域を有する第３の重鎖をコードし、第４の抗原に結合する可変ドメインを形成する核酸と、
該共通軽鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、を有する細胞を提供することを含み、
該核酸のうちの２つ以上は、物理的に連結されていても、されていなくてもよく、該核酸のそれぞれは、該細胞内のコードされた重鎖及び軽鎖の発現を可能にする発現制御配列を更に含み、該方法は、該細胞を培養して該重鎖及び軽鎖の発現を可能にすることと、任意に該２つ以上の抗体を収集することと、を更に含む。一実施形態では、該第１及び第２の重鎖は、適合性ヘテロ二量体化ドメイン、好ましくはＤＥ／ＫＫヘテロ二量体化ドメインを有する。好ましい実施形態では、該第３の重鎖は、適合性ヘテロ二量体化ドメインの一部のうちの１つを含み、その結果、２つの抗体が産生される。一実施形態では、本方法は、該核酸を有する細胞の収集を提供することと、収集したものから、重鎖及び軽鎖それぞれの発現の所望の比を有する細胞を選択することと、を更に含む。好ましい実施形態では、該２つ以上の抗体は、２つ以上の多重特異性抗体である。好ましい実施形態では、細胞は、本質的に２つ以上の抗体の等モル量を産生する。いくつかの実施形態では、細胞は、該２つ以上の抗体のうちの他方のものよりも一方の抗体をより多く産生する。
【０２８９】
非ヒト動物
多価結合タンパク質の合成及び発現は、一部は２つ以上の異なる重鎖と結合して発現できる適切な軽鎖の特定に関連する問題が原因で、一部は分離の問題が原因で問題がある。更に、当該技術分野では、多様な抗体の価数、安定性を有する柔軟性、及び低免疫原性を可能にする一連のリンカーを欠いている。
【０２９０】
本明細書に記載の方法及び組成物は、好適な方法から得られる、それに由来する、又はそれに基づいて、結合ドメインを有する好適な多価結合タンパク質を作製することを可能にする。好適な方法としては、ファージディスプレイ法（ファージディスプレイシステムにおいて生成された生殖細胞系列配列の修飾を含む）、及び当該技術分野において既知の他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を挙げることができる。特に有用な方法は、遺伝子組換え非ヒト動物に、体細胞組換えの自然なプロセス、及び親和性成熟により、共通軽鎖と会合して発現することができる適切な重鎖可変ドメインを作製させることである。
【０２９１】
一実施形態では、本発明の多価抗体において使用される可変ドメインは、生殖細胞系内に再構成されていない重鎖可変遺伝子座を含み、単一の再構成ヒト軽鎖可変ドメイン、例えば、げっ歯類などの共通軽鎖哺乳動物を発現する非ヒトトランスジェニック動物の重鎖及び軽鎖可変領域から得られるか、それに由来するか、又はそれに基づく。かかる非ヒトトランスジェニック動物は、抗原への曝露時に、共通軽鎖と対合した多様な重鎖可変領域を発現し、次いで、それを使用して、多価抗体の産生のために宿主細胞に効率的に形質転換することができる、該トランスジェニック動物から得られるか、それに由来するか、又はそれに基づく重鎖可変領域をコードする核酸配列を開発することができる。
【０２９２】
特に、１つ以下、又は２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来するヒト軽鎖可変ドメインを発現するように操作された免疫化された共通軽鎖動物の適切なＢ細胞のヒト可変領域配列は、本発明の多価抗体の潜在的ＶＨドメインの供給源として使用され得る。動物のＢ細胞は、様々な実施形態において多価抗体が結合する抗原である１つ又は複数の目的の抗原で免疫化される。該動物のＢ細胞は、様々な実施形態において多価抗体が結合する抗原である１つ以上の目的の抗原で免疫化される。該動物の細胞、組織、又は血清、脾臓又はリンパ材料をスクリーニングして、対象となる抗原に関する所望の特性、例えば、高親和性、低親和性、遮断能、活性化、内在化、又は他の特性などを示す重鎖可変ドメイン（又はそれらを発現するＢ細胞）を得る。該トランスジェニック動物における抗原刺激に応答して生成される重鎖可変ドメインのほぼ全てが、１つ未満、又は２つ未満のＶＬ遺伝子セグメントに由来するヒト免疫グロブリン軽鎖の発現と共に作られるため、重鎖可変領域は、トランスジェニック動物において発現される共通軽鎖ドメインを発現及び会合することができる。
【０２９３】
一態様では、本明細書に記載のエピトープ結合タンパク質が提供され、ヒトＶＬ及びＶＨ配列は、目的のエピトープを含む抗原で免疫されている、本明細書に記載されるトランスジェニックマウス、及び／又は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１５７７７１号に開示されているトランスジェニック動物のＢ細胞から得られる核酸に基づいて核酸によりコードされる。
【０２９４】
核酸配列、ポリペプチド、ベクター、及び細胞
本発明は、本発明の多価抗体の組み立てにおいて使用され得るポリペプチド又はリンカーをコードする核酸配列、かかる核酸配列を含むベクター、本発明の多価抗体を産生できる細胞、及びかかる細胞を使用してかかる多価抗体を調製する方法を、更に提供する。
【０２９５】
本発明による多価抗体は、典型的には、本発明の抗体を形成するように一緒に組み立てるポリペプチドをコードする核酸配列を発現する細胞によって産生される。
【０２９６】
したがって、本発明は、配列番号１〜３若しくは５〜２４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むリンカー、又はそれらのいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性、それらのいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性、例えばそれらのいずれかと少なくとも約９０％の配列同一性、例えばそれらのいずれかと少なくとも約９５％の配列同一性、例えばそれらのいずれかと少なくとも約９８％の配列同一性、例えばそれらのいずれかと少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
【０２９７】
本発明は、ＶＨ１−ＣＨ１−ヒンジベースリンカー−ＶＨ２−ＣＨ１を含むポリペプチドを更に提供する。
【０２９８】
特定の実施形態では、ＶＨ１及びＶＨ２は、同じエピトープに結合する。特定の実施形態では、ＶＨ１及びＶＨ２は、同じ抗原に結合するが、異なるエピトープに結合する。特定の実施形態では、ＶＨ１及びＶＨ２は、別個のエピトープ及び抗原に結合する。
【０２９９】
また、本発明によって提供されるのは、かかるリンカー又はポリペプチドをコードする核酸配列、及びかかる核酸配列を含むベクターである。
【０３００】
記載のポリペプチドを作製するために採用される核酸配列は、任意の好適な発現ベクター内に配置されてもよく、適切な状況では、単一の宿主細胞内の２つ以上のベクター内に配置されてもよい。
【０３０１】
一般に、可変ドメインをコードする核酸配列は、適切なリンカー及び／又は定常領域でクローニングされ、配列は、発現に好適な細胞株において好適な発現構築物内のプロモーターと作動可能に連結して配置される。
【０３０２】
したがって、本発明は、抗体の調製方法も提供し、該方法は、
本発明の多価抗体に組み立てることが可能なポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む細胞を準備することと、
該宿主細胞を、ポリペプチドの発現及びそれらの組み立てを多価抗体に提供する条件下で培養することと、を含む。
【０３０３】
多価抗体の発現
組み換え宿主細胞における抗体の発現は、当該技術分野において記載されている。本発明の抗体の軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子は、染色体外コピーとして存在してもよく、及び／又は宿主細胞の染色体に安定的に組み込まれてもよい。後者が好ましいが、その場合には遺伝子サイレンシングを欠くことが知られている遺伝子座を標的とし得る。
【０３０４】
本発明の抗体として組み立てるポリペプチドをコードしている核酸配列の発現を得るために、かかる発現を駆動することができる配列は、ポリペプチドをコードしている核酸配列に機能的に連結され得ることが、当業者には周知である。機能的な連結は、ポリペプチド又はその前駆体をコードする核酸配列が、これらの配列がポリペプチド又はその前駆体の発現を駆動できるように、発現を駆動することができる配列に連結されていることを説明することを意味する。有用な発現ベクターは、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡベクターシリーズなど、当該技術分野において利用可能である。対象となるポリペプチドをコードする配列が、コードされたポリペプチドの転写及び翻訳を調節する配列を参照して適切に挿入される場合、得られる発現カセットは、発現と呼ばれる対象となるポリペプチドを産生するのに有用である。発現を駆動する配列としては、プロモーター、エンハンサーなど、及びこれらの組み合わせが挙げられ得る。これらは、宿主細胞において機能することができ、それにより、それらに機能的に連結された核酸配列の発現を駆動することができる必要がある。プロモーターは、構成的であるか又は調節されていてもよく、ウイルス、原核生物、若しくは真核生物源、又は人工的に設計された物を含む様々な供給源から得ることができる。
【０３０５】
本発明の核酸配列の発現は、天然プロモーター若しくはその誘導体由来、又は完全に異種プロモーター由来であってもよい。真核細胞において発現するためのいくつかの周知の多用されるプロモーターは、ウイルス由来のプロモーター、例えば、アデノウイルス、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーター、Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０（ＳＶ４０）由来のプロモーターを含む。好適なプロモーターはまた、例えばメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、伸長因子ｌａ（ＥＦ−ｌａ）プロモーター、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどの真核細胞に由来し得る。宿主細胞における本発明の核酸配列の発現を駆動することができる任意のプロモーター又はエンハンサー／プロモーターは、本発明において好適である。一実施形態では、発現を駆動することが可能な配列は、ＣＭＶプロモーターの領域、好ましくはＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー／プロモーターのヌクレオチド−７３５〜＋９５を含む領域を含む。当業者であれば、本発明において使用される発現配列が、インスレーター、マトリックス付着領域、ＳＴＡＲエレメントなどの発現を安定化又は増強することができるエレメントと好適に組み合わせられ得ることを認識するであろう。これは、発現の安定性及び／又はレベルを向上させることができる。
【０３０６】
組み換え核酸配列を発現させるのに好適な任意の細胞を使用して、本発明の抗体を生成することができる。好ましくは、該細胞は懸濁増殖に適合される。
【０３０７】
本発明の多価抗体は、典型的には、本発明の好適な細胞を培養し、該培養物から該抗体を採取することによって、宿主細胞において発現させることができる。好ましくは、該細胞は、無血清培地中で培養される。本発明の抗体は、細胞から回収され得るか、又は好ましくは、当業者に一般的に知られている方法によって細胞培養培地から回収され得る。
【０３０８】
更に、本発明による抗体を製造するための方法によって得ることができる抗体が提供される。抗体は、好ましくは、培養培地から精製される。
【０３０９】
回収後、当該技術分野において既知の方法を使用して、培養物から抗体を精製することができる。かかる方法としては、沈殿、遠心分離、ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、陽イオン及び／又は陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用、クロマトグラフィーなどを挙げることができる。本発明の多価抗体を分離する手段としてリンカー配列をベースとする親和性クロマトグラフィーを使用することができる。
【０３１０】
医薬組成物及び使用方法
また、本発明によって提供されるのは、本発明の抗体と、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む医薬組成物である。
【０３１１】
したがって、本発明は、治療によってヒト又は動物の身体の処置に使用するための、本明細書に記載される多重特異性抗体を提供する。
【０３１２】
本発明によって更に提供されるのは、医学的状態に罹患しているヒト又は動物を処置するための方法であって、該方法は、本明細書に記載されるように、治療有効量の抗体をヒト又は動物に投与することを含む。
【０３１３】
患者に投与されるべき本発明による抗体の量は、典型的には、治療用ウィンドウ内にあり、これは、治療効果を得るために十分な量が使用されるが、その量は、許容不可能な程度の副作用をもたらす閾値を超えないことを意味する。所望の治療効果を得るために必要とされる抗体の量が少なくなるほど、治療用ウィンドウは典型的にはより大きくなるであろう。したがって、低薬用量で十分な治療効果を発揮する本発明による抗体が好ましい。
【０３１４】
先行技術として与えられる特許文献又は他の事項への本明細書での言及は、その文書若しくは事項が既知であったこと、又はそれを含む情報が、特許請求の範囲のいずれかの優先日における共通のな一般知識の一部であったことを認めるものとして解釈されるべきではない。
【０３１５】
本明細書に記載される各参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３１６】
明確さ及び簡潔な説明のために、特徴は本明細書では同じ又は別個の実施形態の一部として記載されているが、本発明の範囲は、記載される特徴の全て又は一部の組み合わせを有する実施形態を含んでもよいことが理解されよう。
【０３１７】
以下の実施例は、本発明を例示する。参照しやすいように、実施例８〜１５について、三重特異性分子を説明する場合に、次のフォーマット：ＭＦＡ×ＭＦＢ：ＭＦＣ又は抗原Ａｘ抗原Ｂ：抗原Ｃが使用されており、その結果、×が続くＭＦＡ又は抗原Ａは「短腕」を構成し、その際×は二量体化を示し、続いてＭＦＢ又は抗原Ｂが、長腕の内部の位置を説明し、続いて「：」がリンカーを示し、続いてＭＦＣ又は抗原Ｃが、長腕の遠位ドメインにあるＭＦＣ又は抗原Ｃを示す。
【実施例】
【０３１８】
実施例１：多重特異性抗体を発現することができるベクターの生成のための可変ドメイン及びリンカーのクローニング
２４のリンカー構築物を、ＩｇＧ重鎖ヘテロ二量体（国際公開第２０１３／１５７９５４号及び国際公開第２０１３／１５７９５３号）の生成のために、ＣＨ３領域においてＫＫ残基（Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｋ）を含有するＭＶ１６２６ベクター（図３参照）に表２に詳細を示すサイズに従って、プールにクローニングした。構築物を、制限酵素ＳｆｉＩ及びＸｈｏＩを使用してベクターＭＶ１６２６にクローニングした。全ての構築物は、ＭＦ１３３７のＶＨ遺伝子、ＣＨ１ドメイン、翻訳物が表２に列挙されているリンカー配列、及びＭＦ１１２２のＶＨ遺伝子を連続して含有する。一例として、構築物ＭＦ１３３７ｘＩｇＧ４  ＵＨｘＭＦ１１２２のＤＮＡ配列を以下の表３に提供する。概略的に構築物を図２ａに示す。構築物は、構築物の名前に示されるＩｇＧアイソタイプのＣＨ１及びリンカー配列の両方に基づく。リンカー配列と組み合わせた全ての２４のＣＨ１領域の翻訳物が、図５に提供される。全ての３つのＶＨ遺伝子及び共通軽鎖遺伝子の翻訳物は、以下の表４に提供される。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【０３１９】
ＳｆｉＩ制限酵素を使用して、インサート及びベクターを５０℃で２時間消化した後、ＸｈｏＩ酵素を用いて３７℃で２時間消化した。消化したＤＮＡを０．８％アガロースゲルにロードし、１００ボルトで２時間実行した。続いて、１／５比（ｗ／ｗベクター／インサート）中のＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で一晩ライゲーションする前に、Ｑｉａｇｅｎ  ＱｌＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して、消化したベクター及びインサートをゲルから単離した。５０μＬのＤＨ５α−Ｔ１ＲコンピテントＥ．ｃｏｌｉを、５μＬのライゲーションミックスの存在下で、氷上で３０分間、続いて４２℃で２分間及び氷上で２分間のヒートショック操作で形質転換した。形質転換バクテリアをアンピシリンを添加したＬＢ寒天にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。単一のコロニーを採取し、１００μＬの滅菌脱イオン水と混合し、プライマーＤＯ＿２１３０及びＤＯ＿１０５６を使用してコロニーＰＣＲに使用して、インサートの存在を確認し、続いてプライマーＤＯ＿２１３０を使用してクローン確認のためにＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーターｖ１．１サイクルシークエンシングキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）によってシークエンスＰＣＲを行った。
【０３２０】
確認されたクローンの単一コロニーを使用して、４ｍＬのＬＢ−Ａｍｐを播種した。３７℃で一晩培養物を、製造元マニュアルに従ってＱＩＡＧＥＮプラスミドミニキットを使用して、２４ウェル形式ミニプレップで調製した。カラムから溶出した後、０．７体積の室温イソプロパノールを添加することにより、精製ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡペレットを、１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、無菌条件下で空気乾燥し、−２０℃で保管する前に無菌Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液中に再懸濁させた。ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーターｖ１．１サイクルシークエンシングキットを使用して、インサートにはプライマーＤＯ＿１４８８、ＤＯ＿１０５６、及びＤＯ＿２１３０、とＣＨ２／ＣＨ３領域にはプライマーＤＯ＿０１８２及びＤＯ＿００９１を使用して、最終構築物をジデオキシシークエンシングした。
【０３２１】
全てのプライマー配列を表５に示す。
【０３２２】
シークエンシングは、全ての構築物が正常に調製されたことを示した。
【表５】
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【０３２３】
実施例２：トランスフェクション及びＩｇＧ精製
実施例１で生成した発現ベクターを、多重特異性抗体のベース抗体部分の第２重鎖を発現するベクターＭＧ１０２５Ｃ３７７（図４）と組み合わせ、ＣＨ３領域にＬ３５１Ｄ−Ｌ３６８Ｅ変異（国際公開第２０１３／１５７９５４号及び国際公開第２０１３／１５７９５３号）及び抗体ＭＦ１０２５のサイログロブリンＦａｂ遺伝子（国際公開第２０１３／１５７９５３号の実施例２を参照のこと）を有する。共通軽鎖とともにある２つの重鎖の発現は、図２ｂに示されるように、三重特異性抗体の産生をもたらす。
【０３２４】
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を、２４ウェルプレート形式において設計された抗体の発現に使用した。トランスフェクションの２日前に、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞ストックを２９３−Ｆ培地に１：１の比率で分割し、軌道振とう速度１５５ｒｐｍで３７℃、８％ＣＯ２で一晩インキュベートした。トランスフェクションの前日に細胞を５ｘ１０５細胞／ｍＬの密度に希釈した。４ｍｌの懸濁細胞を２４のディープウェルプレートに播種し、通気性のあるシールで覆い、３７℃、８％ＣＯ２で、２８５ｒｐｍの軌道振とう速度でインキュベートした。トランスフェクション日に、４．８ｍｌの２９３−Ｆ培地を２４０μｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）リニア（ＭＷ  ２５，０００）と混合した。産生される各ＩｇＧについて、表６に詳述されるように、２００μＬの２９３Ｆ培養培地−ＰＥＩ混合物を８μＬのＤＮＡ（ＩｇＧヘテロ二量体の場合、各重鎖をコードしている４μＬのＤＮＡ）に添加した。混合物を、細胞に穏やかに添加する前に、室温で２０分間インキュベートした。トランスフェクションの翌日、５００μＬの２９３Ｆ培地で希釈したペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ）を各ウェルに添加した。プレートを、トランスフェクションの７日後に回収するまで、２８５ｒｐｍの軌道振とう速度で３７℃及び８％ＣＯ２でインキュベートした。ＩｇＧを含有する５００ｇの上清において５分間プレートを遠心分離し、１０〜１２μｍのメルトブローポリプロピレンフィルタープレートを用いてろ過し、精製前に−２０℃で保管した。
【０３２５】
様々な対照抗体も発現させた、すなわち、
Ｆａｂ  ＭＦ１３３７を使用する二価抗破傷風トキソイド抗体（ベクターＭＧ１３３７Ｃ０５７を使用）
Ｆａｂ  ＭＦ１０２５を使用する二価抗サイログロブリン抗体（ベクターＭＧ１０２５Ｃ０５９を使用）
Ｆａｂ  ＭＦ１１２２ｖを使用する二価抗フィブリノーゲン抗体（ベクターＭＧ１１２２Ｃ０５７を使用）
【０３２６】
ＭＧ１３３７Ｃ０５７は、ベクターＭＶ１０５７からＭＦ１３３７のＶＨ領域を発現する構築物を示す。ＭＧ１０２５Ｃ０５９は、ベクターＭＶ１０５９からＭＦ１０２５のＶＨ領域を発現する構築物を示す。ＭＧ１１２２Ｃ０５７は、ベクターＭＶ１０５７からＭＦ１１２２のＶＨ領域を発現する構築物を示す。ＭＶ１０５７（図６）及びＭＶ１０５９は、単特異性二価ヒトＩｇＧ１分子を発現するベクターである。ＭＶ１０５７及びＭＶ１０５９は、本質的に同一のベクターであり、同一のＩｇＧ１分子の発現をもたらす。
【０３２７】
Ｆａｂ  ＭＦ１３３７及びＦａｂ  ＭＦ１０２５を組み合わせた（ＭＧ１０２５Ｃ３７７×ＭＧ１３３７Ｃ２６０を使用して）二重特異性抗サイログロブリン×抗破傷風トキソイド抗体
【０３２８】
Ｆａｂ  ＭＦ１１２２及びＦａｂ  ＭＦ１０２５を組み合わせた（ＭＧ１０２５Ｃ３７７×ＭＧ１１２２Ｃ２６０を使用して）二重特異性抗サイログロブリン×抗フィブリノーゲン抗体
【０３２９】
ＭＧ１０２５Ｃ３７７（図４）は、Ｌ３５１Ｄ，Ｌ３６８Ｅ（ＤＥ）変異を含有するヒトＩｇＧ１重鎖の文脈において、抗体ＭＦ１０２５の重鎖可変ドメインを発現する。ＭＧ１３３７Ｃ２６０（図７）は、Ｌ３５１Ｋ，Ｔ３６６Ｋ（ＫＫ）変異を含有するヒトＩｇＧ１重鎖の文脈において、抗体ＭＦ１３３７の重鎖可変ドメインを発現する。ＭＧ１１２２Ｃ２６０は、Ｌ３５１Ｋ，Ｔ３６６Ｋ（ＫＫ）変異を含有するヒトＩｇＧ１重鎖の文脈において、抗体ＭＦ１１２２の重鎖可変ドメインを発現する。
【表６】
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【０３３０】
採取後、抗体を以下のように２４ウェルフォーマットで精製した：上清を５０μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｚｍａ（ｐＨ８）及び１００μＬのＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂビーズ（５０％ｖ／ｖ，Ｇ．Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合し、６００ｒｐｍの軌道振とうで２５℃で２時間インキュベートした。ビーズを真空ろ過し、３ｍＬのＰＢＳ  ｐＨ７．４で２回洗浄した。２００μＬのクエン酸緩衝液０．１Ｍ，ｐＨ３を添加し、続いて３００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｚｍａ  ｐＨ８で中和することによって、抗体の溶出を行った。精製ＩｇＧ画分を直ちにＰＢＳ  ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＩｇＧ試料を、３０ｋＤａの９６ウェルフィルタープレートに移し、ポリエーテルスルホン膜を、ウェル当たり１０μＬの体積が残るまで１５００ｇ、４℃で遠心分離した。各ウェルに２００μＬのＰＢＳを添加し、試料を５００ｒｐｍで３分間混合した後、ＩｇＧを４℃で保存するために回収した。ＩｇＧ濃度は、Ｏｃｔｅｔ及びＰｒｏｔｅｉｎＡバイオセンサ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）によって測定した。ヒトＩｇＧを、１９２μｇ／ｍｌから開始して３μｇ／ｍｌまで７つの２倍希釈液において標準として使用した。ＩｇＧ試料の濃度を、重複して測定した。
【０３３１】
還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、対照を含む全ての３０個の産生されたＩｇＧについて行った。これらの結果を図８に示す。ＮＲ条件下では、三重特異性の多価抗体では約２００ｋＤａ、対照のモノクローナルＩｇＧ及びＢｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）では約１５０ｋＤａの予想される産物サイズが観察された。Ｒ条件では、三価抗体では約２５ｋＤａ（ＬＣ）、約５０ｋＤａ（ＨＣ／１ＶＨ）、及び約７５ｋＤａ（ＨＣ／２ＶＨ）の産物サイズが観察された。対照ＩｇＧの約２５ｋＤａ（ＬＣ）及び約５０ｋＤａ（ＨＣ）のバンドサイズは予想通りであった。結果はまた、三重特異性構築物について約１５０ｋＤａのバンドを示した。これらは、より長いＫＫ含有重鎖よりも短いＤＥ重鎖を含むＤＥの、より高い発現レベルの結果である可能性があるＤＥ重鎖の会合から生じるホモ二量体である。
【０３３２】
実施例３：ＥＬＩＳＡにおいて測定されたＶＨ１、ＶＨ２、及びＶＨ３位置におけるＦａｂドメインの結合活性
各構築物中の３つのＦａｂドメインの結合活性を、破傷風トキソイド、フィブリノーゲン、及びサイログロブリン抗原、及びｈｕＥＧＦＲ−Ｆｃ抗原を陰性対照として使用して、ＥＬＩＳＡによって確認した（コーティング条件、供給元、及びカタログ番号については表７を参照されたい）。
【０３３３】
各多重特異性ＩｇＧ試料を、最初にＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌに希釈し、フィブリノーゲン、破傷風トキソイド、及びサイログロブリンの滴定で、１０〜０．０８μｇ／ｍｌの４つの５倍希釈液において、分析した。全ての３０の試料を１０μｇ／ｍＬでｈｕＥＧＦＲ−Ｆｃで分析した。ＰＢＳ中の適切な量の抗原を調製した。５０μｌの希釈した抗原溶液を、ＥＬＩＳＡプレートウェル当たり添加し、４℃でコーティングした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で２回洗浄した。ウェルを、３００μｌ／ウェルブロック緩衝液（ＰＢＳ／２％ＢＳＡ）で室温で１時間ブロッキングした。インキュベーション中、適切なＩｇＧ希釈液をブロック緩衝液で作製した。プレートを、シンク上で反転させ、続いて組織上で叩くことによって空にした。５０μｌの希釈ＩｇＧ試料及び対照を、ブロックプレートのウェルに添加し、シールで覆い、室温で６０分間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した。ブロック緩衝液中の希釈した検出抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カタログ番号５５５７８８）１／２０００を５０μＬ／ウェルで添加した。プレートをシールで覆い、室温で６０分間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＴＭＢ基質溶液（ＢＤ、ＯｐｔＥＩＡ（商標）カタログ番号５１−２６０６ＫＣ）を、試薬Ａ及びＢを１：１比で混合し、５０μｌ／ウェルを添加することによって作成し、（最大）１０分間展開させた。５０μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加して、染色反応を停止させた。
【０３３４】
プレートを、「ＢｉｏＴｅｋ  Ｅｌｘ８０８  ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用してＡ４５０で読み取った。各構築物の各抗原ＥＬＩＳＡについて計算したＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７及び曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して結合曲線をプロットし、表８に列挙した。１２％及び８％のサイログロブリン（ＶＨ１，ＤＥ腕上，図１を参照のこと）及び破傷風トキソイド（ＶＨ３，ＫＫ腕の先端上，図１を参照のこと）への結合については、ＡＵＣの小さな変動が見られる。フィブリノーゲン−腕（これはＶＨ２である，図１）については、より大きな変動が見られる。これは、ＶＨ２位置におけるＦａｂドメインのアクセシビリティ又は親和性が、ＶＨ２位置のＦａｂをＶＨ３位置のＦａｂに接続するリンカーに依存することを示す。全てのリンカーは、機能性であるＶＨ２を提供する。
【表７】
2021519610.tif 000008
【表８】
2021519610.tif 000009
【０３３５】
実施例４：結合活性の安定性
三価抗体構築物中の３つのＦａｂドメインの結合活性の安定性を、４つの加速ストレス条件に従って分析した。試料をＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌに希釈し、４℃で１ヶ月間インキュベートした。試料をＤ１０Ｆ培地中、１０μｇ／ｍｌに希釈し、４０℃で７日間インキュベートした。試料をＤ１０Ｆ培地中、１０μｇ／ｍｌに希釈し、５０℃で２日間インキュベートした。試料をＰＢＳで希釈し、５回の凍結解凍サイクル（５ＸＦＴ）に供した。
【０３３６】
これらの加速ストレス条件に続いて、３つのＦａｂドメインによって認識された抗原に対する結合活性を、前述のＥＬＩＳＡで分析した。曲線下面積を計算し、表にした。
【０３３７】
４０℃で加えられたストレスは、ＶＨ２位置におけるＦａｂの結合に著しく影響を与えただけであり、試験された異なる構築物においてはフィブリノーゲンに異なる程度に結合する。５０℃及び５ｘＦＴでの４℃でのストレスは、試験した異なる構築物において、３つ全てのＦａｂドメインの異なる程度での結合に影響を及ぼす。
【０３３８】
結合活性を、各抗原及びストレス条件についてランク付けし、各ストレス条件下における１６の最も最適な構築物を各Ｆａｂ位置について特定した。構築物が１６の最適な構築物の中にある回数を合計し、加速ストレス条件下での３つのＦａｂの結合活性の保存に基づいて全ての構築物をランク付けするために使用した。
【０３３９】
結果は、図９に記載され、加速ストレス条件下で異なる構築物の様々な安定性が存在することを示す。２１の産生された三価抗体構築物における３つのＦａｂドメインの結合活性の安定性を、４つの加速ストレス条件に従って分析した。ＥＬＩＳＡデータ（ＡＵＣ）を表にする。結合活性をランク付けし、各ストレス条件下における１６の最適な構築物を各Ｆａｂ位置について特定した。構築物が１６の最適な構築物の中にある回数を合計し、加速ストレス条件下での３つのＦａｂの結合活性の保存に基づいて全ての構築物をランク付けするために使用した。
【０３４０】
全ての抗体は安定であり、一部は他の抗体よりも安定である。
【０３４１】
実施例５：大規模トランスフェクション及びＩｇＧ精製
以下のように、１８個の構築物を、更なる分析のために大規模生産用に選択した：ＩｇＧ１  ＭＨ、ＩｇＧ１  Ｈ、ＩｇＧ１  Ｒ、ＩｇＧ１  Ｇ４Ｓ，ＩｇＧ１  ＵＨ、ＩｇＧ３  Ｒ、ＩｇＧ３  ＵＨ、＊＊ＩｇＧ２Ａ  Ｒ、ＩｇＧ２Ａ  ＭＨ、ＩｇＧ３  ＵＬＨ、ＩｇＧ２Ｂ  Ｒ、ＩｇＧ４  ＭＨ、ＩｇＧ４  ＵＬ、ＩｇＧ２Ａ  Ｈ、ＩｇＧ２Ｂ  Ｈ、＊ＩｇＧ１  ＵＬ、＊ＩｇＧ４  Ｈ、＊ＩｇＧ４  Ｒ。対照として、以下の生成物が含まれた：二重特異性抗サイログロブリン×抗破傷風トキソイド（実施例２において前述のＭＧ１０２５Ｃ３７７×ＭＧ１３３７Ｃ２６０を使用）及び二重特異性抗サイログロブリン×抗フィブリノーゲン（前述のＭＧ１０２５Ｃ３７７×ＭＧ１１２２Ｃ２６０を使用して）。
【０３４２】
これらの構築物のＤＮＡを、前述のように調製した。表６に列挙した構築物の共トランスフェクションによって、前述したように多重特異的ＩｇＧをトランスフェクションした。選択した構築物を、より大規模に産生した。トランスフェクションの２日前に、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞ストックを２９３−Ｆ培養液に５００ｍｌ培養フラスコあたり１００ｍｌの最終容量で１：１の比率で分割し、軌道振とう速度１５５ｒｐｍで３７℃及び８％  ＣＯ２でインキュベートした。トランスフェクションの１日前、細胞を２９３−Ｆ培養培地で希釈することによって調製された５．０ｘ１０５細胞／ｍｌの密度を有する細胞懸濁液で細胞を計数した。次いで、細胞をＴ５００フラスコ当たり１００ｍｌの細胞懸濁液で播種し、１５５ｒｐｍの軌道振とう速度で３７℃及び８％ＣＯ２でインキュベートした。翌日、細胞をトランスフェクトした。２９３−Ｆ培地、ＰＥＩ、及びＤＮＡの混合物は、７．５ｍｌの２９３−Ｆ培地、１μｇ／μｌで１８７．５μｌのＰＥＩストック、０．５μｇ／μｌで１５０μｌのＤＮＡを混合して調製した。これを室温で２０分間インキュベートし、次いで細胞に添加し、次いで、３７℃及び８％ＣＯ２で、１５５ｒｐｍの軌道振とう速度で７日間インキュベートした。
【０３４３】
抗体タンパク質を含有する上清を１０００ｇで１０分間遠心分離して細胞を除去した。上清を０．４５μｍフィルターを用いてろ過した。ＩｇＧを、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ）及びタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを使用して上清からＩｇＧを精製した後、脱塩した。製造業者の指示に従って、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ５ｍｌカラム及びＨｉＴｒａｐ  ５ｍｌ  脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ）を使用した。ＩｇＧ濃度をＯＤ２８０吸光度によって求めた。全ての構築物についてＰＢＳ中で０．８〜４．９ｍｇのＩｇＧを得た。生成したタンパク質を、実施例２において前述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元及び非還元）で分析した。データは、実施例２に見られるデータを確認し、ここでは提供しない。
【０３４４】
ＨＰ−ＳＥＣを実施して、多重特異性抗体のベース抗体部分を構成する２つの重鎖間の発現比を確かめた。三価構築物中の２つの重鎖のサイズ差により、ハーフボディ及びホモ二量体は、高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）において同定及び定量化することができる。ＴＳＫガードカラムＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号０８５４３）及びＴＳＫ−ｇｅｌカラムＧ３０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号０８５４１）を装備したＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣシステムを使用して、ＨＰ−ＳＥＣを実施した。各分析のために、ＰＢＳ中の２０μｇのタンパク質試料をカラムに注入し、これを２００ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌをランニング緩衝液として使用して、４℃で１ｍＬ／分の流速で流した。クロマトグラムを、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  ６．８０ソフトウェアを使用して、ＵＶ２８０結果に基づいて保持時間及び相対ピーク面積について分析した。三価のＩｇＧ／ＤＥＤＥホモ二量体の量の比を計算し、以下の表９に示す。平均を超える三価／ＤＥＤＥ比を有する構築物は、イタリック体で提示される。
【表９】
2021519610.tif 000010
【０３４５】
大規模精製ＩｇＧ（２つの対照を含む）の安定性を、前述の異なるストレス条件の後、ＰＢＳ中で５回凍結解凍サイクル後、Ｄ１０Ｆ培地中で４０℃で１週間インキュベート後、Ｄ１０Ｆ培地中で５０℃で１週間インキュベート後、ＰＢＳ中で５０℃で１週間インキュベート後に評価した。ストレスを受けた試料の性能を、４℃で１週間のインキュベーション後、同じ試料の性能と比較した（対照）。その目的のために、１００ｍｌの生成物からの精製ＩｇＧをＰＢＳ中で０．２ｍｇ／ｍＬで希釈し、２つのバッチに分割した：１つはＰＢＳ中で０．２ｍｇ／ｍｌでの安定性試験（４℃、３ｘＦＴ、及び５０℃）のために、１つは上記のように４℃、４０℃、及び５０℃でのストレス試験のためにＤ１０Ｆ中で０．１ｍｇ／ｍｌに希釈した。試料ＩｇＧ１  Ｈについては、０．１９４ｍｇ／ｍＬの濃度を使用した。
【０３４６】
これらの加速ストレス条件に続いて、３つのＦａｂ断片によって認識された抗原に対する結合活性を、前述のＥＬＩＳＡで分析した。曲線下面積を計算し、表にした（図１０を参照）。４℃で保存した対照試料の活性と比較した、ストレス後の残存結合活性のパーセンテージを、各結合活性について計算した。各ストレス条件における各標的に対する各結合活性について、試料をこれらのパーセンテージに基づいてランク付けした。平均を超えるパーセンテージは表示し、平均を超えることを示した各試料の回数が合計され、図１０の表の最後の列に記載される。これは、ストレス後の３つのＦａｂ腕の結合活性によって測定される構築物の安定性が多様に存在することを示す。
【０３４７】
実施例６：１８の多価ＩｇＧ構築物の安定性分析
安定性分析は、図１０において同定された１８の多価構築物上で、実施例５に前述したように、安定性分析を行った。加えて、参照により組み込まれる国際公開第２０１８／０５６８２１（Ａ１）号に前述されているＭＦ６７４４（配列番号９１）、ＭＦ１３３７（配列番号２８及び配列番号２８８）、及びＭＦ１１２２（配列番号２６及び配列番号２８６）を含む重鎖結合ドメインを有する４つの対照抗体を使用し、これらはｃＬＣに結合され、すなわち、
Ｆａｂ  ＭＦ６７４４／ｃＬＣを使用した単特異性抗ＣＤ１３７抗体、
Ｆａｂ  ＭＦ１１２２／ｃＬＣを使用した単特異性抗フィブリノーゲン抗体、
Ｆａｂ  ＭＦ１３３７／ｃＬＣを使用した単特異性抗破傷風トキソイド抗体、並びに
ＤＥＫＫ二重特異性対照としてＦａｂ  ＭＦ１１２２／ｃＬＣ及びＦａｂ  ＭＦ１３３７／ｃＬＣを含む二重特異性抗フィブリノーゲン×抗破傷風トキソイド抗体である。
【０３４８】
安定性分析のために試験した試料のリストを以下の表１０に提供する。
【表１０】
2021519610.tif 000011
【０３４９】
１８の多価構築物及び４つの対照抗体の安定性を、４つの異なる条件に従って分析した。したがって、２２の試料（１８三価＋４対照）をＰＢＳ中で０．２  ｍｇ／ｍｌに希釈し、
４℃（Ｔ０）で１ヶ月間（参照として見た）、
５０℃で７日間、
−８０℃での５Ｘ凍結解凍（ＦＴ）サイクル、又は
室温で４００ｒｐｍで４時間振とう。
【０３５０】
これら４つの条件のそれぞれの後、安定性を、７つの異なる方法を用いて分析した、すなわち、
ＵＶ−Ｖｉｓ吸収分光法：凝集体によるバックグラウンド緩衝吸収及び光散乱の減算後、吸光度を３５０ｎｍで試験して、Ｅｃｋｈａｒｄｔ，１９９４：Ｍｕｌｉｎａｃｃｉ，２０１１ｂ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓ，２０１３に説明されるように、試料の凝集状態に関する情報を提供する。
９０°光散乱分光法：溶液中、光の散乱強度は、タンパク質濃度、屈折率、粒径及び形状、並びに入射光の波長などの異なる要因によって影響され得る。この方法は、Ｃａｐｐｅｌｌｅ，２００５；Ｄｅｍｅｕｌｅ，２００７ａ及びｂ；Ｍｕｌｉｎａｃｃｉ，２０１１ａ及び２０１３；Ｌｕｃａ，２０１０；Ｐａｔｏｉｓ，２０１１及び２０１２；Ｐｅｔｅｒｓ  ２０１３において報告されているタンパク質凝集を研究するために使用される。
【０３５１】
Ｔ０と比較した変化率（％）として表されるトリプトファン固有の蛍光発光：環境の疎水性と剛性の変化は、トリプトファンの蛍光発光によって測定することができる（Ｃａｐｅｌｌｅ，２００５；Ｄｅｍｅｕｌｅ，２００７ａ及びｂ及び２００９；Ｍｕｌｉｎａｃｃｉ，２０１１ａ及びｂ；Ｌｕｃａ，２０１０；Ｐａｔｏｉｓ，２０１１；Ｐｅｔｅｒｓ，２０１３）。
【０３５２】
１，８−ＡＮＳ蛍光発光は、Ｔ０と比較した変化率（％）として表される：帯電していない小さな疎水性蛍光プローブとして、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（１，８−ＡＮＳ）は、タンパク質、タンパク質凝集体、界面活性剤ミセル、浸出物、膜及び細胞成分の静電ポケットに結合すると水中で蛍光になり、したがって膜表面及びタンパク質の研究に使用することができる（Ｄｅｍｅｕｌｅ，２００９；Ｍｕｌｉｎａｃｃｉ，２０１１ａ及びｂ；Ｌｕｃａ  ２０１０）。
【０３５３】
Ｔ０と比較した変化率（％）として表されるナイルレッド蛍光発光：帯電していない小さな疎水性蛍光プローブとして、ナイルレッドは環境の極性に影響され、タンパク質分解、タンパク質凝集、脂質構造、タンパク質アンフォールディングを分析するために使用することができる（Ｓａｃｋｅｔｔ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆｆ，１９８７）。
【０３５４】
粒子の数／１μｌを測定するナイルレッド蛍光顕微鏡法：Ｌｅｉｃａ  ＤＭｉ８顕微鏡を使用して蛍光顕微鏡法用にタンパク質凝集体を可視化するために、試料を染色するのにナイルレッドが使用される（Ｄｅｍｅｕｌｅ，２００７ａ及びｂ，並びに２００９；Ｍｕｌｉｎａｃｃｉ，２０１１ｂ及び２０１３；Ｐａｔｏｉｓ  ２０１１）。
【０３５５】
動的光散乱、Ｔ０と比較したモノマーの変化率（％）（強度計算）として表される：動的光散乱は、ＮａｎｏＦｌｅｘ装置を使用して測定される。光ファイバーを通過するレーザーは散乱し、粒子のサイズ分布プロファイルを判定するために散乱光強度を測定する検出器に向かって粒子から散乱及び反射される。
【０３５６】
これらの方法の読み取り値は、タンパク質の安定性の尺度であるタンパク質の凝集、断片化、及びアンフォールディングに関する。結果は、４００ｒｐｍでの４時間の振とうが、抗体の安定性に最も影響を及ぼしたことを示した。対照単特異性ＰＧ１３３７／ＭＦ１３３７抗体は、ストレス条件によって最も影響を受けた。したがって、全ての１８の多価構築物及び二重特異性対照はＰＧ１３３７／ＭＦ１３３７Ｆａｂを含有しているため、全ての結果は、閾値として設定されたＰＧ１３３７で正規化された。
【０３５７】
分子の安定性は、４つの異なる条件の間に全ての７つの方法のスコアを組み合わせることによって計算した。結果は図１２に見ることができ、構築物が様々な安定性の範囲を有することを明らかとし、様々な三重特異性分子が対照二重特異性ＩｇＧに対して優れた安定性を示した。
【０３５８】
実施例７：バイオインフォマティクスリンカーの特性評価
以下の表１１に記載され、図１３に示される８つのリンカーを更に特性評価した。Ｋａｒｐｌｕｓ及びＳｃｈｕｌｚの柔軟性予測方法（配列内の各アミノ酸の柔軟性指数の平均を計算する）を使用して、これらの配列のそれぞれについて柔軟性予測を得た。柔軟性指数は、Ｋａｒｐｌｕｓ  ＰＡ，Ｓｃｈｕｌｚ  ＧＥに記載されるタンパク質構造中の各アミノ酸の平均特性に由来する。タンパク質中の鎖の柔軟性予測−ペプチド抗原の選択のためのツールＮａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  １９８５；７２：２１２−３；（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｂｃｅｌｌ／）。表１１では、ＫＳスコアが１．０１５以下である場合には剛性（Ｒ）として、ＫＳスコアが約１．０１５〜１．０４である場合には部分的に柔軟としてリンカーを示す。本発明の目的のための柔軟性配列は、１．０４を超えるＫａｒｐｌｕｓ及びＳｃｈｕｌｚ柔軟性予測を有する配列である。
【表１１】
2021519610.tif 000012
【０３５９】
Ｒｏｓｅｔｔａ局所構造予測を使用して、これらのリンカーの第２のバイオインフォマティクス予測を得た。本明細書ではＲｏｓｅｔｔａ断片のピッカーを使用して、Ｇｒｏｎｔ  Ｄ，Ｋｕｌｐ  ＤＷ，Ｖｅｒｎｏｎ  ＲＭ，Ｓｔｒａｕｓｓ  ＣＥＭ，Ｂａｋｅｒ  Ｄ（２０１１）Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｐｉｃｋｉｎｇ  ｉｎ  Ｒｏｓｅｔｔａ：Ｄｅｓｉｇｎ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（８）：ｅ２３２９４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒａｌ．ｐｏｎｅ．００２３２９４に記載されているような局所構造予測を提供した。予測ツールをこのように使用する場合は、最小４０残基が好ましく、したがって、リンカーの末端にグリシン残基を導入して、中央にリンカー配列を有する各４０残基長の配列を作製した。これらのリンカーは、ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ内の構造内の近くの局所配列のマッチを見つけるＲｏｓｅｔｔａ断片パイプラインを通じてシークエンシングを実行し、局所構造を予測するためにこれらの配列間のマッチを使用して、２次構造が特性評価された。次いで、中心の断片を、図１３の上記８つの配列のそれぞれについて可視化した。
【０３６０】
結果の要約を以下の表１２に示す：Ｆ＝柔軟性Ｍ＝中間、Ｒ＝剛性、Ｃ＝コイル＝柔軟性、Ｈ＝らせん＝剛性、Ｅ＝ストランド＝中間であり、これは、予測される二次構造に基づくＫａｒｐｌｕｓ及びＳｃｈｕｌｔｚスコアとの一般的な一致を示す。
【表１２】
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【０３６１】
実施例８：抗ＣＤ３、ＰＤ−Ｌ１、及びＥＧＦＲ結合ドメインの生成
免疫化に使用されるマウス。
ＣＤ３、ＥＧＦＲ、及びＰＤ−Ｌ１に結合するヒト抗体の生成のために、ヒト共通軽鎖及びヒト重鎖（ＨＣ）ミニ遺伝子座（ヒトＶ遺伝子セグメント、全てのヒトＤ及び全てのヒトＪの選択を含む）（参照により本明細書に組み込まれるＷ０２００９／１５７７７１を参照）のトランスジェニックマウスを、以下に見られるタンパク質をコードするＤＮＡ又は組換えＤＮＡのいずれかで免疫することができる。これらのマウスは、「ＭｅＭｏ（登録商標）」マウスと称される。特定の重鎖可変領域、又は本明細書に開示される配列を有する三価多量体については、これらは、当業者に既知の任意の手段によって産生することができる。
【０３６２】
タンパク質免疫化
「ＭｅＭｏ（登録商標）」マウスを、組換えタンパク質及びＧｅｒｂｕアジュバントＭＭ（Ｇｅｒｂｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ｃ＃３００１）を皮下注射することにより免疫化した。組み換えｈｕＰＤＬ１−Ｈｉｓ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ；カタログ番号１００８４−Ｈ０８Ｈ）タンパク質を免疫化に使用した。マウスを、４０μｌのアジュバントと混合したＰＢＳ中４０μｇの組換えタンパク質で、１００μｌの総容量で免疫化させた。続いて、１４及び２８日目に、マウスを、２０μｌのアジュバントと混合したＰＢＳ中２０μｇの組換えタンパク質で、５０μｌの総容量で追加免疫化させた。３５日目にマウス血清を採取し、血清力価を求めた。低血清力価を有するマウスは、ブースター免疫化及び血清分析の更なるサイクルを受けた。各サイクルは、５０μｌのＰＢＳ中２０μｇの組換えタンパク質を使用する週２回の免疫化、続いて１週間後の力価分析のための血清採取からなった。ヒト及びマカクザル標的に対して高い血清力価を示すマウスは、５０μｌのＰＢＳ中の２０μｇの組換えタンパク質を３日間連続して毎日注射することからなる最終的な追加免疫化を受けた。最終注射から１日後に、マウスリンパ系組織を採取した。
【０３６３】
ＤＮＡ免疫化
ＭｅＭｏ（登録商標）のマウスを、マイクロピグメンテーション装置を用いて、ＤＮＡタトゥーによって免疫化させた。ＤＮＡタトゥー免疫化を、標的抗原をコードする２０μｇのプラスミドＤＮＡを用いて行った。マウスを、ヒト標的ＰＤ−Ｌ１をコードするＤＮＡで免疫化した。ＰＤ−Ｌ１の免疫化については、０．５ｍｇの抗ＣＤ２５抗体ＰＣ６１．５をマウスに注射して寛容破綻することによる免疫化の開始の４日前にＴｒｅｇ細胞を枯渇させた。マウスを、０、３、６、１４、１７、２８及び３１日目に免疫化させた。３５日目にマウス血清を採取し、血清力価を求めた。ヒト及び／又はマカクザル標的に対する血清反応性が低いマウスには、ヒト、ラット、又はマカクザルＤＮＡ抗原でブースター免疫化の更なるサイクルを受けさせて、血清分析を行った。各サイクルは、週２回のＤＮＡ免疫化、続いて１週間後の力価分析のための血清採取からなった。ヒト及びマカクザル標的を発現する細胞に対する血清反応性を示すマウスは、最終的な追加免疫化を受けた後、３日後にリンパ系組織を採取した。
【０３６４】
リンパ組織の回収
脾臓及び流入領域リンパ節を、正常に免疫化された全てのマウスから除去した。脾臓リンパ節及び鼠径リンパ節の両方から単一細胞懸濁液を生成し、続いてこれらの組織をＴｒｉｚｏｌ  ＬＳ試薬中に溶解し、使用するまで−８０℃で保存した。正常に免疫化されたマウスからのＶＨ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲクローニングにより「免疫」ファージ抗体レパートリーを生成し、鼠径リンパ節を「免疫」ファージ抗体レパートリーの構築に使用した。この目的のために、ＴＲＩＺＯＬ  ＬＳ溶解リンパ組織からＲＮＡを抽出し、ＩｇＧ−ＣＨ１特異的プライマーを用いてＲＴ反応で１μｇの全ＲＮＡを使用した。次いで、得られたｃＤＮＡを使用して、基本的にＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９１  Ｄｅｃ  ５；２２２（３）：５８１−９７）に記載されているように、自社開発ＶＨ特異的プライマーを使用して、ＶＨコードｃＤＮＡのポリクローナルプールを増幅した。得られたＰＣＲ産物は、軽鎖がすべての抗体で同じであり、ベクターによってコードされていたことを除いて、ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｊｕｎ  ２５；２７４（２６）：１８２１８−３０）に記載されているように、ファージ上のＦａｂ断片の表示のためにファージミドベクターにクローニングされた。ライゲーション後、ファージミドを使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細菌を形質転換し、形質転換細菌をアンピシリン及びグルコースを含有するＬＢ−寒天１０５プレート上に播種した。全てのファージライブラリは、１０６個超の形質転換体を含有し、８０％超のインサート頻度を有した。一晩増殖後に細菌を採集し、確立されたプロトコル（ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｊｕｎ  ２５；２７４（２６）：１８２１８−３０）に従ってファージを調製するために使用した。
【０３６５】
標的化抗体
ＥＧＦＲ及びＰＤ−Ｌ１  ｃＬＣ抗体を、以前に記載された方法を使用して、標的免疫化に成功したＭｅＭｏ（登録商標）マウスから生成されたファージ抗体レパートリーから得た。更に、合成ヒト抗ＥＧＦＲ抗体を含む、ＥＧＦＲ抗体のための抗体可変ドメインＶＨ鎖を生成する方法もまた、参照により本明細書に組み込まれる係属中の出願：ＷＯ２０１５／１３０１７３（Ａ１）、ＷＯ２０１５／１３０１７２（Ａ１）に記載されている。
【０３６６】
ＣＤＲ３を有するＭｅｍｏ（登録商標）マウスの免疫化
ＣＤ３に結合するヒト抗体の生成のために、ヒト共通軽鎖及びヒト重鎖（ＨＣ）ミニ遺伝子座（ヒトＶ遺伝子セグメント、全てのヒトＤ及び全てのヒトＪの選択を含む）（参照により本明細書に組み込まれるＷ０２００９／１５７７７１を参照）のトランスジェニックマウスを、ＴＣＲ／ＣＤ３含有リポ粒子（Ｉｎｔｅｒｇｒａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ））で免疫化した。これらのマウスは、「ＭｅＭｏ（登録商標）」マウスと称される。特定の重鎖可変領域、又は本明細書に開示される配列を有する三価多量体については、これらは、当業者に既知の任意の手段によって産生することができる。
【０３６７】
ＭｅＭｏ（登録商標）マウスは、リポ粒子を含有するＨｅｋ２９３Ｔ由来のヒト５Ｄ５Ｍ  ＴＣＲ／ＣＤ３で免疫化し、続いて抗ＴＣＲ／ＣＤＲ３免疫応答の生成及び抗ＴＣＲ／ＣＤ３抗体パネル生成のためにヒトＴ細胞で免疫化した。
【０３６８】
リポ粒子は、構造的にインタクトな膜タンパク質を細胞表面から直接濃縮し、これらの複雑なタンパク質を、抗体の免疫化及びスクリーニングのための可溶性の高濃度タンパク質として操作できるようにする。
【０３６９】
本研究において免疫化に使用されるリポ粒子は、５Ｄ５Ｍ  ＴＣＲαβの組み合わせを含む。アミノ酸配列（配列番号２８９及び配列番号２９０）
【０３７０】
５Ｄ５Ｍ  ＴＣＲαβの組み合わせのＨｅｋ２９３Ｔ由来ＴＣＲ／ＣＤ３リポ粒子を合成、クローニングし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｉｎｔｅｒｇｒａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）への一過性トランスフェクションにより、このＴＣＲ／ＣＤ３の組み合わせを含むリポ粒子を生成するために使用した。
【０３７１】
５Ｄ５Ｍ  ＴＣＲα（配列番号２８９）
ＭＷＧＶＦＬＬＹＶＳＭＫＭＧＧＴＴＧＱＮＩＤＱＰＴＥＭＴＡＴＥＧＡＩＶＱＩＮＣＴＹＱＴＳＧＦＮＧＬＦＷＹＱＱＨＡＧＥＡＰＴＦＬＳＹＮＶＬＤＧＬＥＥＫＧＲＦＳＳＦＬＳＲＳＫＧＹＳＹＬＬＬＫＥＬＱＭＫＤＳＡＳＹＬＣＡＶＭＤＳＮＹＱＬＩＷＧＡＧＴＫＬＩＩＫＰＤＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ
【０３７２】
５Ｄ５Ｍ  ＴＣＲβ（配列番号２９０）
ＭＲＩＲＬＬＣＣＶＡＦＳＬＬＷＡＧＰＶＩＡＧＩＴＱＡＰＴＳＱＩＬＡＡＧＲＲＭＴＬＲＣＴＱＤＭＲＨＮＡＭＹＷＹＲＱＤＬＧＬＧＬＲＬＩＨＹＳＮＴＡＧＴＴＧＫＧＥＶＰＤＧＹＳＶＳＲＡＮＴＤＤＦＰＬＴＬＡＳＡＶＰＳＱＴＳＶＹＦＣＡＳＳＥＡＧＧＮＴＧＥＬＦＦＧＥＧＳＲＬＴＶＬＥＤＬＮＫＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＶＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＦ
【０３７３】
ＭｅＭｏ（登録商標）マウスを、ＴＣＲ／ＣＤ３リポ粒子及び初代ヒトＴ細胞を使用して免疫化に使用した。
【０３７４】
免疫化スケジュールは、３５、５６、７７、及び９８日目の時点を含み、抗原特異的ＩｇＧ血清力価は、抗マウスＩｇＧ検出を使用して、ＱＴＧ由来の３ＳＤＸ  ＴＣＲ／ＣＤ３陽性及び陰性リポ粒子を使用したＥＬＩＳＡによって、そして陽性対照としてＣＤ３ｃ５Ｅ−Ｆｃ融合タンパク質を使用したＥＬＩＳＡによって求めた。３５日目に採取された血清において反応性が観察され、どのマウスが関連する抗ＴＣＲ／ＣＤ３応答を発現したかが判定される。
【０３７５】
全ての免疫化マウスについて、抗体発見のためのリンパ系材料を回収し、以下のように保存した：
力価は、ヒトＴＣＲ／ＣＤ３において１／３００であるか（リポ粒子を使用するＥＬＩＳＡにおいて）、又は、
力価は、ヒトＴＣＲ／ＣＤ３において１／３００未満及び１／１００超であり、最後のブースター免疫化の間に増加しなかった。
【０３７６】
リポ粒子を使用した初回免疫（Ｐｒｉｍｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ）
ＴＣＲ／ＣＤ３についてＭｅＭｏ（登録商標）マウスにおける体液性免疫応答をプライミングするために、ヒト５Ｄ５Ｍ  ＴＣＲαβの組み合わせを含むリポ粒子を免疫化のために使用した。リポ粒子を、第１及び第２の注射用のＧｅｒｂｕアジュバントと共に使用した。
【０３７７】
ポリクローナルＴ細胞を用いたブースター免疫化
マウスを、細胞懸濁液の皮下注射によって免疫した。第１のブースター免疫化（２８日目）は、ＰＢＳ中の細胞とアジュバントとの混合物を含み、後続の注射全ては、ＰＢＳ中の細胞からのみ構成される。３５日目に、ヒトＴＣＲ／ＣＤ３に対する１／３００の血清ｌｇＧ力価（リポ粒子を使用したＥＬＩＳＡにより測定）を発現したマウスは、４２、４３、及び４４日目に細胞を追加注射された。これらの基準を満たすことができなかったマウスは、細胞とブースター免疫される（４２日目及び４９日目）。全ての後続の免疫化は、ＰＢＳ中の細胞の皮下注射として与えられる。最終免疫化後、マウスを屠殺し、血清及び脾臓及び左鼠径リンパ節を収集する。
【０３７８】
ＥＬＩＳＡ中の免疫化されたマウスからの血清のスクリーニング
暫定血清ＩｇＧ力価を、ＴＣＲ／ＣＤ３含有リポ粒子と「ヌル」リポ粒子を使用したＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。抗マウスｌｇＧ染色を使用して、血清ｌｇＧ力価を測定し、この染色は最も敏感であることが示された。
【０３７９】
ＣＤ３結合可変ドメインは、配列番号９２〜１５４に示されるように、そのＣＤＲ領域のＣＤ３  ＭＦの重鎖可変領域のアミノ酸配列を使用して作製された。
【０３８０】
ファージミドベクターからＩｇＧ発現ベクターへのＶＨコードｃＤＮＡの再クローニング
全ての標的特異的クローンのＶＨコード化ｃＤＮＡを配列決定した。次いで、配列同一性及びクラスター解析に基づく固有のクローンの選択を、Ｓｆｉ１−ＢｓｔＥＩＩ又はＳｆｉＩ／ＸｈｏＩ消化及びＩｇＧ発現プラスミドへの消化されたｃＤＮＡのプールのライゲーションを用いて、異なるＩｇＧ発現ベクターに再クローニングし、標準化された分子生物学的技術に従って行った。
【０３８１】
培養上清からの抗体の精製
抗体を含有する培地を回収し、遠心分離して細胞残屑を除去する。続いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａセファロースビーズを培地に添加する。培地及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ａセファロースビーズを抗体とインキュベートして結合を可能にする。
【０３８２】
インキュベーション後、ビーズを培地から単離し、真空フィルターによって洗浄する。溶出緩衝液とのインキュベーションによって、抗体をビーズから溶出させる。
【０３８３】
任意に、精製ＩｇＧの緩衝液を交換／脱塩する。
【０３８４】
緩衝液交換
精製された抗体を脱塩するために、フィルタープレート又はフィルターカラムを使用して抗体画分を遠心分離する。プレート又はカラムを遠心分離して、抗体画分の体積を減少させる。続いて、ＰＢＳ又は必要な緩衝液を画分に添加して、緩衝液を低塩緩衝液と置き換える。任意に、抗体の保存緩衝液を更に脱塩するために、この遠心分離ステップに続いて緩衝液を追加することを繰り返す。
【０３８５】
実施例９：短腕又は長腕上に腫瘍細胞抗原を有する三重特異性抗体の生成。
三重特異性抗体を、三重特異性抗体の効率的なヘテロ二量体化及び形成のために、ＣＨ３操作技術を用いて、異なるＶＨドメインを有するＩｇＧをコードする２つのプラスミドの一過性共トランスフェクションによって生成した。共通軽鎖もまた、同じプラスミド又は別のプラスミド上のいずれかで同じ細胞に共トランスフェクションされる。本発明の同時係属出願（例えば、国際公開第２０１３／１５７９５４号及び国際公開第２０１３／１５７９５３号、参照により本明細書に組み込まれる）では、単一の細胞から多重特異性抗体を産生するための方法及び手段を開示しており、これにより、単特異性抗体の形成よりも多重特異性抗体の形成を有利にする手段が提供される。これらの方法はまた、三重特異性抗体を含む多価多量体の生成のために、本発明において好適に使用することができる。
【０３８６】
具体的には、三重特異性全長ＩｇＧ分子を優勢に生成するのに好ましい変異は、第１のＣＨ３ドメイン中の３５１及び３６６位でのヒト野生型配列に関連したアミノ酸置換、例えばＬ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵ番号付けに従っての番号付け）（「ＫＫ−変異体」重鎖）、及び第２のＣＨ３ドメイン中の３５１及び３６８位でのアミノ酸置換、例えばＬ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅ（「ＤＥ−変異体」重鎖）、又はその逆である。これは、負に帯電したＤＥ−変異体重鎖及び正に帯電したＫＫ−変異体重鎖が優先的に対合し、ヘテロ二量体を形成する（いわゆる「ＤＥＫＫ」分子）ことが、本発明の同時係属出願により以前に実証されている。ＤＥ−変異体重鎖のホモ二量体化（ＤＥ−ＤＥホモ二量体）又はＫＫ−変異体重鎖のホモ二量体化（ＫＫ−ＫＫホモ二量体）は、同一の重鎖間のＣＨ３−ＣＨ３界面における荷電残基間の強い反発力のために、ほとんど発生しない。
【０３８７】
本発明によれば、免疫細胞関与結合ドメイン又は腫瘍抗原結合ドメインは、長腕又は短腕の遠位又は内部位置を含む、多価分子上の任意の位置に配置でき、ヘテロ二量体化技術を利用して、単一特異性、二価ホモ二量体、又は四重特異性ホモ二量体よりも三重特異性分子を有利に生成することができる。
【０３８８】
まず、腫瘍細胞抗原結合ドメインが、長腕又は短腕の遠位領域又は内部領域のいずれかに配置され得ることが実証された。
【０３８９】
本明細書に記載の三重特異性及び／又は三価抗体のそれぞれについて、３．０ｘ１０６細胞／ｍｌの密度になるまでシェーカープレートのＴ１２５フラスコで培養した、懸濁増殖適応２９３細胞を介して発現が達成される。細胞は、２４深型ウェルプレートの各ウェルに０．３〜０．５ｘ１０６生細胞／ｍｌの密度で播種した。細胞を、異なる抗体をコード化する２つのプラスミドの混合物で一過性にトランスフェクトし、独自のベクター系にクローニングした。トランスフェクションから７日後に、細胞上清を採取し、０．２２μＭのフィルターを通してろ過した。無菌上清を、三重特異性抗体の精製まで４℃で保存した。
【０３９０】
長腕の内側の位置に免疫関与結合ドメインを有し、短腕に腫瘍細胞抗原を有する三重特異性分子の例については、ＣＤ３結合ドメイン（ＭＦ８０７８）、本発明のリンカー、及び破傷風トキソイド（ＴＴ）結合ドメイン（ＭＦ１３３７）のＶＨ遺伝子をコードするＤＮＡが、正に帯電したＣＨ３ドメイン（ＫＫ）をコードするベクターにクローニングされ、その場合、ＥＧＦＲ結合ドメイン（ＭＦ８２３３）のＶＨ遺伝子をコードするＤＮＡは、ＥＧＦＲｘＣＤ３：ＴＴの三重特異性分子をコードする負に帯電したＣＨ３ドメイン（ＤＥ）をコードするベクターにクローニングされる。３つの結合ドメインの重鎖可変領域は表１３に記載され、これらの三重特異性分子の活性は図１５ａ及び１６ａに記載された。これらの三重特異性分子の場合、各重鎖可変領域は、共通軽鎖と対合する（配列番号２９）。
【表１３】
2021519610.tif 000014
【０３９１】
長腕の内側の位置に免疫関与結合ドメインを有し、遠位に腫瘍細胞抗原を有する三重特異性抗体の例については、ＣＤ３結合ドメイン（ＭＦ８０７８）のＶＨ遺伝子をコードするＤＮＡ、本発明のリンカー、及びＥＧＦＲ結合ドメイン（ＭＦ８２３３）のＶＨ遺伝子をコードするＤＮＡが、正に荷電したＣＨ３ドメイン（ＫＫ）をコードするベクターにクローニングされ、その場合、サイログロブリン結合ドメイン（「Ｔｈｙｒｏ」）（ＭＦ１０２５）のＶＨ遺伝子をコードするＤＮＡは、ＴｈｙｒｏｘＣＤ３：ＥＧＦＲの三重特異性分子をコードする負に荷電したＣＨ３ドメイン（ＤＥ）をコードするベクターにクローニングされる。図１４ｂ．３つの結合ドメインの重鎖可変領域は表１４に記載され、これらの三重特異性分子の活性は図１５ｂ及び１６ｂに記載された。これらの三重特異性分子の場合、各重鎖可変領域は、共通軽鎖と対合する（配列番号２９）。
【表１４】
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【０３９２】
実施例１０：腫瘍細胞抗原結合ドメインをＴ細胞関与三価分子の短腕又は長腕に配置する効果。
細胞株
ＢｘＰＣ３は、ヒト膵臓癌細胞株である。
ＨＣＴ−１１６は、ヒト結腸がん細胞株である。
【０３９３】
上記の一連の三重特異性ＩｇＧは、短腕に抗ＥＧＦＲ結合ドメイン（図１４ａ及び表１３）と長腕に抗ＥＧＦＲ結合ドメイン（図１４ｂ及び表１４）を含有する三種特異性に１１の異なるリンカーを組み込んだものと、一連の対照抗体を２４ウェルの産生で生成した。これらの分子は、Ｔ細胞活性化を引き起こす能力について細胞傷害アッセイにおいて評価されている。
【０３９４】
Ｆｉｃｏｌｌ及びＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞分離キットを標準的な手法に従って使用し、健康なドナーの全血から静止Ｔ細胞を分離し、フローサイトメトリー分析を使用して抗ＣＤ３抗体で９５％超のＴ細胞純度を確認し、その後凍結保存した。細胞傷害アッセイでは、凍結保存されたＴ細胞を解凍し、解凍時に生存率が９０％を超える場合は、標準のトリパンブルー染色で測定して使用した。細胞傷害アッセイは、短く言えば、解凍した静止Ｔ細胞及びＢｘＰＣ３（図１５）又はＨＣＴ１１６（図１６及び１７）標的細胞を、５：１のＥ：Ｔ比で４８時間、共培養した。三価抗体については、４μｇ／ｍｌの濃度で開始する６段階３倍希釈系列を使用した。ＥＧＦＲｘＣＤ３二重特異性抗体を陽性対照として使用した；モックｘモック：モック、モックｘＣＤ３：モック、及びＥＧＦＲｘモック：モック三価抗体を特異性対照に使用した。Ｔ細胞活性化を、フローサイトメトリーを使用して定量化した；ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞をＣＤ４及びＣＤ８発現に基づいてゲーティングし、続いて、Ｔ細胞上でＣＤ２５及びＣＤ６９発現を測定することによって、それらの活性化状態について分析した。標的細胞溶解は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって評価されたＡＴＰレベルを測定することによって、生存細胞の割合を測定することによって求めた。Ｅｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダーでの発光によって測定されたＡＴＰレベルは、相対発光量（ＲＬＵ）値をもたらし、これをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて分析した。
【０３９５】
各試料の標的細胞溶解度を以下のように計算した：
％殺傷率＝（１００−（ＲＬＵ試料／ＲＬＵ  ＩｇＧなし）×１００）。
【０３９６】
Ｔ細胞活性化に関するこれらのデータ（図１５を参照）及び細胞傷害（図１６）は、三重特異性抗体が機能性であることを示す。図１５及び１６に示すように、モックｘＣＤ３：ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｘＣＤ３：モック三重特異性分子は、ＥＧＦＲ標的特異的Ｔ細胞活性化及び細胞傷害を誘導することが可能であることが実証される。抗ＥＧＦＲ  Ｆａｂが長腕内の遠位に配置される場合、モックｘＣＤ３：ＥＧＦＲ三重特異性は、Ｔ細胞活性化（図１５）及び細胞傷害（図１６）の両方において、二重特異性ＥＧＦＲｘＣＤ３、並びに短腕上にＥＧＦＲ結合ドメインを有し、長腕にＣＤ３及びモックＴＴ（ＭＦ１３３７）結合ドメインを有する（図１４ａを参照のこと）三重特異性の両方に対する活性の増強を示した。
【０３９７】
更に、長腕上のＥＧＦＲ及びＣＤ３を有する三重特異性抗体の活性に基づいて、リンカーは、図１７ｂ〜ｄに示すように、比較的高いサイトカイン産生と関連するもの（ＩｇＧ１  ＵＨ（配列番号２）、ＩｇＧ１  ＭＨ（配列番号１１）、ＩｇＧ２Ａ  ＭＨ（配列番号４）、及びＩｇＧ１  Ｇ４Ｓ（配列番号１２））、並びに比較的低いサイトカイン産生と関連するもの（ＩｇＧ１  ＵＬ（配列番号１４）、ＩｇＧ２Ａ  Ｈ（配列番号１５）、ＩｇＧ２Ｂ  Ｒ（配列番号２１）、ＩｇＧ２Ａ  Ｒ（配列番号２０）、ＩｇＧ１  Ｈ（配列番号１９）、ＩｇＧ１Ｒ（配列番号２３））に結合することができる。リンカーの使用方法の変更と細胞傷害への影響はそれほど顕著ではなかった（図１７ａ）。
【０３９８】
実施例１１：短腕又は長腕上の結合ドメインと関与する免疫細胞を有する三重特異性抗体の生成。
本発明によれば、免疫細胞関与結合ドメインは、長腕又は短腕の遠位又は内部位置を含む多価分子上の任意の位置に配置することができ、ヘテロ二量体化技術は、三価分子を好適に生成するために利用することができる。図１８（短腕上のＣＤ３結合ドメイン）、図１９（内側長腕上のＣＤ３結合ドメイン）、及び図２５（遠位長腕上のＣＤ３結合ドメイン）を参照のこと。
【０３９９】
例えば、免疫関与ドメインは短腕に配置され、ＣＤ３結合ドメイン（ＭＦ８０７８）のＶＨ遺伝子をコードするＤＮＡは、正に荷電したＣＨ３ドメイン（ＫＫ）をコードするベクターにクローニングされ、ＥＧＦＲ結合ドメイン（ＭＦ９９８８（配列番号２１８）又はＭＦ９８９１（配列番号１９１））、リンカーＩｇＧ２Ａ  ＭＨ、及びＰＤ−Ｌ１結合ドメイン（ＭＦ５３８０（配列番号１７３）又はＭＦ５４４４（配列番号１６４））のＶＨ遺伝子をコードするＤＮＡは、負に荷電したＣＨ３ドメイン（ＤＥ）をコードするベクターにクローニングされる。図１８（ＣＤ３ｘＰＤ−Ｌ１：ＥＧＦＲ）。
【表１５】
2021519610.tif 000016
【０４００】
あるいは、免疫関与ドメインが長腕の内側の位置に配置されており、その場合、ＣＤ３結合ドメインのＶＨ遺伝子（ＭＦ８０７８）、リンカーＩｇＧ２Ａ  ＭＨ（配列番号４）、及びＰＤ−Ｌ１結合ドメインのＶＨ遺伝子（ＭＦ５４４４（配列番号１６４））をコードするＤＮＡが、ＭＦ５３８０（配列番号１７３）、ＭＦ５３７７（配列番号１５５））は、正に荷電したＣＨ３ドメイン（ＫＫ）をコードするベクターにクローニングされ、ＥＧＦＲ結合ドメイン（ＭＦ９８８６（配列番号２００）、ＭＦ９９８８（配列番号２１８）、ＭＦ９８９１（配列番号１９１）、又はＭＦ９８７３（配列番号２０９））のＶＨ遺伝子をコードするＤＮＡは、負に荷電したＣＨ３ドメイン（ＤＥ）をコードするベクターにクローニングされる。図１９（ＥＧＦＲｘＣＤ３：ＰＤ−Ｌ１）。
【表１６】
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【０４０１】
あるいは、免疫関与ドメインが長腕の遠位位置に配置され、この場合、ＣＤ３結合ドメイン（ＭＦ８０７８（配列番号１１０）、ＭＦ８５０８（配列番号１２８）又はＭＦ８０５７（配列番号９２））、リンカーＩｇＧ  １Ｈ（配列番号１９）のＶＨ遺伝子、及びフィブリノーゲン結合ドメイン（「Ｆｉｂｒｉ」）（ＭＦ１０２５）のＶＨ遺伝子をコードするＤＮＡは、正に荷電したＣＨ３ドメイン（ＫＫ）をコードするベクターにクローニングされ、この場合、ＥＧＦＲ結合ドメイン（ＭＦ８２３３）のＶＨ遺伝子をコードするＤＮＡは、負に荷電したＣＨ３ドメイン（ＤＥ）をコードするベクターにクローニングされる。図２４（ＥＧＦＲｘＦｉｂｒｉ：ＣＤ３）．
【表１７】
2021519610.tif 000018
【０４０２】
上記の三重特異性分子のそれぞれについて、図１８、１９、及び２４に記載されているように、各重鎖可変領域は、共通軽鎖と対合する。配列番号２９。
【０４０３】
以下に更に記載されるように、各ＣＤ３結合ドメインの配置は、１つ以上の細胞外に曝露された腫瘍細胞抗原を発現する細胞に対するＴ細胞の細胞傷害又は活性化を生成するのに有効であることが実証された。
【０４０４】
実施例１２：ＥＧＦＲｘＣＤ３：ＰＤ−Ｌ１の三重特異性フォーマットのためのＣＤ３を介した効果的な二重腫瘍抗原結合及びＴ細胞関与。
細胞株：
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−２６）は乳癌細胞であり、転移部位から誘導される。
【０４０５】
図１９のフォーマットに従って三重特異性抗体を産生し、かかる分子の能力を分析して腫瘍抗原標的化及び細胞傷害を介するＴ細胞関与を同時に達成した。これらの抗体は、上記技術によって生成された。
【０４０６】
低〜高の様々な親和性を有する４つの抗ＥＧＦＲ  Ｆａｂ（ＭＦ９８８６、ＭＦ９９８８、ＭＦ９８９１、ＭＦ９８７３）を短腕に使用し、長腕に低〜高の様々な遠位の親和性を更に含有する異なる抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆａｂ（ＭＦ５４４４、ＭＦ５３８０、及びＭＦ５３７７）と組み合わせた。抗ＣＤ３  Ｆａｂ及びリンカーは、ＭＦ８０７８及びリンカーＩｇＧ２  ＡＭＨ（配列番号４）を使用して一定に維持した。
【０４０７】
ＥＧＦＲ及びＰＤ−Ｌ１親和性のランク付けは、それぞれ表１８及び１９の結合データに基づいた；ランク付けは、下記の参照抗ＥＧＦＲ及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対する結合に基づくものであった。
【表１８】
2021519610.tif 000019
【０４０８】
ＥＧＦＲ重鎖の親和性のランク付けは、重鎖ＭＦ８２３３を有する単特異性二価抗体の陽性対照と比較して、上記のＥＧＦＲ発現細胞に結合するこれらの単特異性二価抗体の相対的能力に基づく。
【表１９】
2021519610.tif 000020
【０４０９】
ＰＤ−Ｌ１重鎖腕の相対親和性ランク付けは、ＥＬＩＳＡ中のヒトＰＤ−Ｌ１に結合する能力に基づく。この目的のために、ＥＬＩＳＡプレートを、１０μｇ／ｍｌで開始して、８段階、３倍滴定希釈範囲でｈｕＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）でコーティングした。続いて、各ＰＤ−Ｌ１  Ｆａｂの結合を、ＰＤ−Ｌ１ｘＴＴ  ＩｇＧ  ５μｇ／ｍｌとして評価した。結合のためのＥＣ５０を判定し、抗ＰＤ−Ｌ１  ＲＧ７４４６  ＭＰＤＬ３２８０Ａについて判定された結合ＥＣ５０に正規化した。各ＥＬＩＳＡプレート上に存在する米国特許出願公開第２０１０／０２０３０５６号を参照のこと。
【０４１０】
これらの三重特異性ＥＧＦＲｘＣＤ３：ＰＤ−Ｌ１分子を、次いで、腫瘍細胞抗原について異なる抗原密度を有する２つの細胞株（ＨＣＴ１１６及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対して本明細書に前述した方法に基づいて細胞傷害を誘導する能力について試験した。これらの細胞株の発現プロファイルは、対照抗体（ＥＧＦＲの場合はセツキシマブ、ＰＤ−Ｌ１の場合はＭＰＤＬ３２８０Ａ）の使用によってＦＡＣＳ染色を使用して判定され、平均蛍光強度（ＭＦＩ）がバックグラウンド信号より３倍高かった場合、目的の抗原の発現が陽性であると見なされた。ＰＤ−Ｌ１については３回、ＥＧＦＲについては４回繰り返し、結果を以下に示すようにＭＦＩとして報告した。
【表２０】
2021519610.tif 000021
【０４１１】
これらの細胞株に対する三重特異性分子の細胞傷害を調査するこの研究は、ＥＧＦＲｘＣＤ３：ＰＤ−Ｌ１三重特異性分子の３つ全ての結合ドメインが２つの腫瘍細胞抗原とＣＤ３を同時に結合でき、それにより三重特異性分子の両方の腫瘍抗原結合ドメインがＴ細胞の関与時に細胞傷害に寄与することを示す。図２０及び２１（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して）及び図２２（ＨＣＴ１１６細胞に対して）。これらの三重特異性分子は、一般に、二重特異性ＥＧＦＲｘＣＤ３ｘモック及びモックｘＣＤ３ｘＰＤ−Ｌ１対照よりも高い機能活性を示し、三重特異性分子９８７３ｘ８０７８：５３７７は、最大の溶解率を示す（図２１）。本明細書で試験した三重特異性は、ＨＣＴ１１６細胞と比較して比較的高い標的抗原レベルを有するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対してより強力である（図２１及び図２２）。
【０４１２】
実施例１３：ＣＤ３ｘＰＤ−Ｌ１：ＥＧＦＲの三重特異性フォーマットのためのＣＤ３を介した効果的な二重腫瘍抗原結合及びＴ細胞関与
図１８のフォーマットに従って三重特異性抗体を産生し、免疫関与ドメインが短腕に存在する場合に、同時の腫瘍抗原標的化が更に示される。これらの抗体は、上記技術によって生成された。このフォーマットでは、ＰＤ−Ｌ１親和性の増加に伴い、ＣＤ３ｘＰＤ−Ｌ１：ＥＧＦＲ分子で観察されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＦＡＣにより測定される標的細胞結合の継続的な増強があったように、二重抗原標的相関結合が実証された。図２３ａ．ＣＤ３ｘＰＤ−Ｌ１：ＥＧＦＲのフォーマットを有する特定のこれらの三重特異性分子の場合、同時の二重抗原結合及び免疫細胞関与は、単一の抗原及びＣＤ３に結合する分子（重鎖配列図示せず）におけるＢｘＰＣ３細胞の細胞傷害に相加効果があることが示され、これらの分子が３つすべての結合腕に同時に関与する能力が確認された。図２３ｂ．これらのデータに対する細胞傷害アッセイのプロトコルについては、上述した。
【０４１３】
実施例１４：ＥＧＦＲｘフィブリノーゲン：ＣＤ３の三重特異性フォーマットの場合、遠位長腕でのＣＤ３を介した効果的なＴ細胞活性化。
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ＲＥ−ｌｕｃ２細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ−ＲＥ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する操作Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株である。
【０４１４】
ＨＴ２９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８）は、ヒト結腸癌細胞である。
【０４１５】
ＥＧＦＲ（ＭＦ８２３３）ｘフィブリノーゲン（ＭＦ１１２２）：ＣＤ３（ＭＦ８０７８）の三価分子を使用して、ＣＤ３結合ドメインを長腕の遠位領域に配置するための研究を実施した。図２４．標的細胞ＨＴ２９に対してＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ＲＥ−ｌｕｃ２細胞でＴ細胞活性化アッセイを実行して、このフォーマットの機能的なＴ細胞活性化能力を確立する。簡単に言えば、レポーターアッセイ：濃度範囲の三価抗体と対照抗体の存在下で、ＪｕｒｋａｔエフェクターＴ細胞を標的細胞と共インキュベートした。５時間のインキュベーション後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、レポーター細胞のルシフェラーゼ活性をＴ細胞活性化の読み取り値として測定した。発光活性はＥｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダーで測定され、相対発光量（ＲＬＵ）値を得、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して分析した。
【０４１６】
図２５に示すように、ＥＧＦＲｘＦｉｂｒｉ：ＣＤ３三重特異性分子によるＴ細胞の活性化は、図１５ａでＴ細胞の活性化を引き起こすことが以前に示されているＥＧＦＲｘＣＤ３抗体である陽性対照以上のレベルで示された。
【０４１７】
実施例１５：一連のＣＤ３結合ドメイン及びリンカーに対するＣＤ３を介した効果的な腫瘍抗原結合及びＴ細胞の関与
ＥＧＦＲｘＣＤ３：ＥＧＦＲ二重特異性三価分子のパネルが生成され（図２６）、様々な異なるＣＤ３、免疫細胞関与結合ドメイン、及び８つの異なるリンカーに対する腫瘍標的化及びＴ細胞関与の有効性が示された。各三価分子は、短腕及び遠位の長腕の位置に同じ抗ＥＧＦＲ結合ドメイン（ＭＦ９８９１）を２つ含有し、長腕の内部の位置にＣＤ３結合ドメインを有した。この研究では、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ＲＥ−ｌｕｃ２細胞及び標的細胞ＨＣＴ１１６（中間ＥＧＦＲ発現）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１のレポーター細胞株を使用して、前述の方法によりＴ細胞活性化を測定した。陰性対照の場合、異なるスーパークラスターのＣＤ３結合ドメインを使用した三価分子がモックｘＣＤ３ｘモック又は二重特異性（ＥＧＦＲ（ＭＦ８２３３）ｘＴＴ（ＭＦ１３３７））（４，０００ｎｇ／ｍｌ）を産生した。読み取り値は、５時間のインキュベーション後のレポーター活性に依存した。
【０４１８】
様々なスーパークラスターから試験した各ＣＤ３は、ＨＣＴ１１６細胞を使用してレポーター活性を示し、スーパークラスター７のＣＤ３結合ドメインは、リンカー腕に基づく活性のスペクトルを示しながら、最低の相対レポーター活性を示した。対照的に、スーパークラスター１からの２つのＣＤ３結合ドメイン（ＭＦ８０５８及びＭＦ８０７８）及びスーパークラスター４からのＣＤ３結合ドメイン（ＭＦ８５０８）は、リンカー腕に関係なく比較的一貫した活性を示した。最後に、スーパークラスター１の１つのＣＤ３結合ドメイン（ＭＦ８０５７）は、比較的低いレポーター活性を示し、異なるリンカーに関連するいくつかの差異をもたらした。図２７を参照のこと。これらのデータの総説は、ＩｇＧ１  ＭＨリンカーを含有する三価が一貫してスーパークラスターにわたって最も強力であるように一貫して現れることを示す。
【０４１９】
同様に、様々なスーパークラスターから試験した各ＣＤ３結合ドメインは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を使用してレポーター活性を示し、スーパークラスター７のＣＤ３結合ドメインは、使用されたリンカーに基づく活性のスペクトルの比較的低いレポーター活性を示した。対照的に、スーパークラスター１からの３つのＣＤ３結合ドメイン（ＭＦ８０５７、ＭＦ８０５８、及びＭＦ８０７８）とスーパークラスター４からのＣＤ３結合ドメインは、使用したリンカーに関係なく、比較的類似した活性を示した。図２８を参照のこと。
【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
2021519610.tif 000030
【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
2021519610.tif 000033
【図１ｆ】
2021519610.tif 000034
【図１ｇ】
2021519610.tif 000035
【図１ｈ】
2021519610.tif 000036
【図１ｉ】
2021519610.tif 000037
【図１ｊ】
2021519610.tif 000038
【図１ｋ】
2021519610.tif 000039
【図１ｌ】
2021519610.tif 000040
【図１ｍ】
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【図１ｎ】
2021519610.tif 000042
【図１ｏ】
2021519610.tif 000043
【図１ｐ】
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【図１ｑ】
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【図１ｒ】
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【図１ｓ】
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【図１ｔ】
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【図１ｕ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2021519610.tif 000061
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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