(57)【要約】本開示は、ポリヌクレオチド配列での免疫原性モチーフに正確な配列の改変により、長いポリヌクレオチド配列での免疫原性を抑制する方法に関する。さらに、本開示は、低度の自然免疫原性、改善した安定性、または、タンパク質の高発現をもたらす、改善した機能性を備えた、正確に配列を改変したポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドでは、免疫原性配列モチーフを除去しており、そして、残余の配列を保存している。全体的なヌクレオチドの変更と比較して、この標的を改変する手法は、天然または最適化したポリヌクレオチド配列の攪乱が少ないなどの独自の利点があり、それ故に、自然免疫受容体を秘匿する一方で、高い発現性を維持している。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変したポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドの配列は、ポリペプチドをコードし、かつ、そのポリペプチドをコードする配列内に複数のＴＬＲ７モチーフまたはＴＬＲ８モチーフを含むリファレンスオリゴヌクレオチドの配列に対応しているが、前記改変したポリヌクレオチドは、複数の前記モチーフのそれぞれを欠いているにもかかわらず、前記ポリペプチドをなおもコードする、前記改変したポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記モチーフのそれぞれを、ＫＮＵＮＤＫモチーフ、ＵＣＷモチーフ、ＵＮＵモチーフ、ＵＷＮモチーフ、ＵＳＵモチーフ、ＫＷＵＮＤＫモチーフ、ＫＮＵＷＤＫモチーフ、ＵＮＵＮＤＫモチーフ、ＫＮＵＮＵＫモチーフ、及び、それらの組み合わせからなる群から選択する、請求項１に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項３】
ＤＮＡである、または、ＤＮＡを含む、請求項１または請求項２に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項４】
ＲＮＡである、または、ＲＮＡを含む、請求項１または請求項２に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載の改変したポリヌクレオチドを、細胞に対して投与することを含む方法。
【請求項６】
前記改変したポリヌクレオチドが、ＲＮＡである、または、ＲＮＡを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡが、請求項１に記載の改変したポリヌクレオチドでもあるＤＮＡから発現した、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
改変したＤＮＡからｍＲＮＡを発現させて、治療用ｍＲＮＡを製造する方法であって、前記ＤＮＡの配列は、ポリペプチドをコードし、かつ、そのポリペプチドをコードする配列内に複数のＴＬＲ７モチーフまたはＴＬＲ８モチーフを含むリファレンスＤＮＡの配列に対応しているが、前記改変したＤＮＡは、複数の前記モチーフのそれぞれを欠いているにもかかわらず、前記ポリペプチドをなおもコードする、前記方法。
【請求項９】
少なくとも５４個のヌクレオチドを含む改変したポリヌクレオチドであって、前記改変したポリヌクレオチドは、出発ポリヌクレオチドに基づいて正確に配列を改変して、前記出発ポリヌクレオチドでの少なくとも１つの免疫原性配列モチーフを除去している、前記改変したポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが、天然ポリヌクレオチドである、請求項９に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが、合成ポリヌクレオチドである、請求項９に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記出発ポリヌクレオチドが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項１３】
少なくとも１つの免疫原性配列モチーフを、コード領域、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、または、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）から選択するｍＲＮＡの少なくとも１つの領域から除去する、請求項１０に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ｍＲＮＡが、哺乳動物タンパク質、病原性抗原、がん抗原及び新抗原、キメラタンパク質、変異タンパク質、及び、合成タンパク質からなる群から選択するポリペプチドをコードする、請求項１２に記載の改変したポリペプチド。
【請求項１５】
前記改変したｍＲＮＡがコードしたタンパク質が、出発ｍＲＮＡ配列がコードしたタンパク質のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記改変したポリヌクレオチドが、Ｃｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ９のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、アプタマーＲＮＡ、合成ＲＮＡである、請求項９に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記免疫原性配列モチーフが、ヒトＴＬＲ７に結合することができる１つ以上の配列を含む、請求項９に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項１８】
少なくとも１つの前記免疫原性配列モチーフが、ヒトＴＬＲ８に結合することができる１つ以上の配列を含む、請求項９に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記免疫原性モチーフが、ＫＮＵＮＤＫであり、式中、Ｋは、グアノシン一リン酸、または、ウリジン一リン酸を示しており、Ｎは、あらゆるヌクレオチドを示しており、Ｕは、ウリジン一リン酸を示しており、Ｄは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、または、ウリジン一リン酸を示している、請求項１８に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記免疫原性モチーフが、ＵＣＷ、ＵＷＮ、ＵＳＵ、ＵＮＵ、ＫＷＵＮＤＫ、ＫＮＵＷＤＫ、ＵＮＵＮＤＫ、及び、ＫＮＵＮＵＫからなる群から選択するモチーフであり、式中、Ｗは、アデノシン一リン酸、または、ウリジン一リン酸を示しており、Ｓは、グアノシン一リン酸、または、シチジン一リン酸を示している、請求項９に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記出発ポリヌクレオチド配列で認められる免疫原性モチーフ配列の少なくとも１％、少なくとも５０％、または、少なくとも９０％を除去する、請求項９に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記免疫原性モチーフの除去を介した正確な配列の改変を、前記ポリヌクレオチドのコドン最適化と組み合わせて使用する、請求項９に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記正確な配列の改変を、低ＧＵ含有量、低Ｕ含有量、及び、増大したＧＣ含有量に基づいたｍＲＮＡ配列の改変からなる群から選択する、大雑把に配列を改変する方法の少なくとも１つと組み合わせて使用する、請求項９に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記正確な配列の改変が、プソイドウリジン（Ψ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（Ｎ１ｍΨ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、または、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）からなる群から選択する少なくとも１つの非カノニカルヌクレオチドを使用して、ポリヌクレオチドの少なくとも一部の化学修飾と組み合わせて使用する、請求項９に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記改変したポリヌクレオチドが、キャップ類似体を使用して、酵素的キャッピング、または、共転写キャッピングを介して付加した５’キャップ構造をさらに含む、請求項９に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記改変したポリヌクレオチドが、ポリＡ尾部をさらに含む、請求項９に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記改変したポリヌクレオチドを、精製する、請求項９に記載の改変したポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項１に記載の改変したポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項２９】
請求項９に記載の改変したポリヌクレオチドを含む獣医用組成物、または、研究用組成物。
【請求項３０】
請求項９に記載の改変したポリヌクレオチドを含む送達ビヒクルであって、前記送達ビヒクルを、イオン化可能である、または、カチオン性の脂質ナノ粒子、リポソーム、リポプレックス、及び、ポリマー担体からなる群から選択する、前記送達ビヒクル。
【請求項３１】
正確に配列を改変する方法であって、
ａ）少なくとも５４個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供すること、
ｂ）前記ポリヌクレオチド配列での少なくとも１つの免疫原性モチーフを同定すること、
ｃ）前記同定した少なくとも１つの免疫原性モチーフ配列を除去すること、とを含む前記方法。
【請求項３２】
前記ポリヌクレオチドが、天然ポリヌクレオチドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドが、合成ポリヌクレオチドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチドが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記修飾が、前記ｍＲＮＡがコードするアミノ酸配列を変えない、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記ステップ（ｂ）で同定した少なくとも１つの免疫原性モチーフが、複数の免疫原性モチーフを含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ステップｃ）が、同定した複数の免疫原性モチーフを除去することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ステップ（ｃ）が、前記同定した免疫原性モチーフの少なくとも１０％を除去することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ステップ（ｃ）が、前記同定した免疫原性モチーフの少なくとも５０％を除去することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記ステップ（ｃ）が、前記同定した免疫原性モチーフのすべてを除去することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリヌクレオチドを、Ｃｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ９のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、アプタマーＲＮＡ、及び、合成ＲＮＡからなる群から選択する、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
ｄ）前記ポリヌクレオチド配列をコドン最適化することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
ｄ）プソイドウリジン（Ψ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（Ｎ１ｍΨ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、または、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）からなる群から選択する少なくとも１つの非カノニカルヌクレオチドを使用して、前記ポリヌクレオチドの一部を化学修飾することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】
前記前記改変したポリヌクレオチドに対して、キャップ類似体を使用して、酵素的キャッピング、または、共転写キャッピングを介して５’キャップ構造を付加する、ことをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリヌクレオチドに対して、ポリＡ尾部を付加することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリヌクレオチドを、精製することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
参照による配列表の援用
２０１８年８月９日に作成し、そして、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出をした、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ  Ｋｅｒｎａｌ．ｔｘｔの名称の６ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表を、参照により、本明細書で援用する。
【背景技術】
【０００２】
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分野は、現代医学では複数の用途がある。治療目的でｍＲＮＡを使用する上で非常に重要なことは、その自然免疫原性を抑制することにあり、さもなければ、サイトカイン分泌からＲＮＡ分解や翻訳の停滞に至る一連の望ましくない影響を招きかねない。幾つかの自然免疫受容体は、ヒトで同定されており、これらは、一般的にはインビトロ転写（ＩＶＴ）反応を介して製造される外因性ｍＲＮＡを認識するものであり、一本鎖ｍＲＮＡと、キャップ付きｍＲＮＡの両方、ならびに、二本鎖ｍＲＮＡ、及び／または、無キャップｍＲＮＡなどの副産物の出現を招く（Ｓａｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，  １３：７５９−８０）。自然免疫系の受容体として、無キャップＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、及び、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）のセンサーがある（Ｓｃｈｌｅｅ  ＆  Ｈａｒｔｍａｎｎ，  ２０１６，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １６：５６６−５８０）。これらの受容体の中で、ＲＩＧ−Ｉは、５’三リン酸（５’ＰＰＰ）、または、キャップ０構造を有する平滑末端ｄｓＲＮＡに結合する（Ｓｃｈｕｂｅｒｔｈ−Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ４３：４１−５２）が、ＩＦＩＴ１は、５’三リン酸（５’ＰＰＰ）またはキャップ０構造を有するｓｓＲＮＡに結合する（Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｎａｔｕｒｅ．  ４９４：６０−６４；Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７，  ＰＮＡＳ，  １１４：Ｅ２１０６−Ｅ２１１５）。これらの無キャップＲＮＡセンサーは、キャップＩ構造を得るための効率的なキャッピング、及び／または、ＩＶＴ  ｍＲＮＡのホスファターゼ処理によって回避することができる（Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ７：６１８−３０；Ｒａｍａｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４４：７５１１−７５２６）。ｄｓＲＮＡを感知する受容体として、ＴＬＲ３、ＭＤＡ５、ＰＫＲ、及び、ＯＡＳ１があり（Ｓｃｈｌｅｅ  ＆  Ｈａｒｔｍａｎｎ，  ２０１６，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １６：５６６−５８０）、これらは、ｍＲＮＡを精製して、ＩＶＴ反応の二本鎖ＲＮＡ産物を除去することで回避できる（Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３９：ｅ１４２；Ｐｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４，  米国特許商標庁  特許出願番号第ＵＳ  ２０１４／０３２８８２５  Ａ１号）。
【０００３】
ｓｓＲＮＡ（一本鎖ＯＲＮ、及び、ｓｉＲＮＡ二本鎖の個々の鎖）に結合する自然免疫受容体として、ＴＬＲ７とＴＬＲ８があり、これらは相同性が大きい（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２８１：３７４２７−３７４３４；Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  １０．１１８６／１４７１−２１６４−８−１２４；Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，  １８：１６８４−１６９１）。ｓｉＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡは、エンドソーム内で、二本鎖ＲＮＡの２本の鎖を一本鎖ＲＮＡに分離した後に、ＴＬＲ７とＴＬＲ８が認識することもできる（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １０：４０）。これらの受容体を刺激すると、細胞内のＮＦ−κＢと、ＩＲＦ−３シグナル伝達経路が活性化され、そして、ＩＦＮ−アルファ（ＴＬＲ７）、及び、ＴＮＦ−アルファ、及び、ＩＬ−１２ｐ４０（ＴＬＲ８）が分泌される（Ｇｏｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７４：１２５９−１２６８；Ｆｏｒｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １８０：３７２９−３７３８）。これらのタンパク質の結晶構造が、最近になって解明されており（Ｔａｎｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２２：１０９−１１５；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ４５：７３７−７４８）、そして、それらのリガンド結合部位が同定されている（Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，  １８：１６８４−１６９１；Ｏｈｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．  １６：２７３−２８２）。これらの研究によって、２つの別個のリガンド結合ドメインが明らかになった。一方は、単一のヌクレオシド（ＴＬＲ７に関するグアノシンと、ＴＬＲ８に関するウリジン）に結合し、他方は、短いオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）に結合する。これらの受容体を二量体化して活性化するには、両方のドメインでのリガンド結合が必要である。構造生物学の研究は、Ｕ−及びＧＵ−に富んだＯＲＮ配列が、ＴＬＲ７／８の活性化因子であることを一貫して示しているＴＬＲ７／８リガンドに関する従前の研究と一致している（Ｊｕｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２３，４５７−４６２；Ｈｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  （８０）３０３：１５２６−１５２９；Ｈｏｒｎｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，  １０．１０３８／ｎｍ１１９１）。幾つかのグループが、ＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８に対して大きな刺激活性を示す特異的なｓｓＲＮＡ配列を同定した（Ｄｉｅｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０．１００２／ｅｊｉ．２００６３６６１７；Ｆｏｒｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １８０：３７２９−３７３８；Ｊｕｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．  ２１：２０１−２１４，  Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａ���．，  ２０１２，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８７：３９７８９−３９７９９）。Ｊｕｒｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）は、これらのｓｓＲＮＡの様々な誘導体について試験を行い、そして、ＴＬＲ７／８結合に関するｓｓＲＮＡ配列モチーフを同定した。彼らは、（ＩＦＮ−ａ分泌に基づいて）ヒトＴＬＲ７のＵＣＷモチーフ（Ｗは、ＵまたはＡである）と、（ＩＬ１２ｐ４０分泌に基づいて）ヒトＴＬＲ８刺激のＫＮＵＮＤＫモチーフ（Ｎは、あらゆるヌクレオチド、Ｋは、ＧまたはＵ、及び、Ｄは、Ｃ以外のあらゆるヌクレオチドである）に注目した。
【０００４】
精製及びキャップをしたＩＶＴ  ｍＲＮＡは、ＲＩＧ−Ｉ、ＩＦＩＴ、ＰＫＲ、ＭＤＡ５、ＯＡＳ、及び、ＴＬＲ３を回避できるが、ヒト細胞では、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８によって認識される。この認識は、プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、メトキシ−ウリジン、及び、２−チオウリジンなどの非カノニカルヌクレオチドのｍＲＮＡへの組み込み（Ｋａｒｉｋｏ，  ２００５，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ２３：１６５−７５；Ｋａｒｉｋｏ，  ２００８，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  １６：１８３３−４０；Ｋｏｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２９：１５４−１５７；Ａｎｄｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  ２１７：３３７−３４４）、あるいは、ｍＲＮＡの全体的なヌクレオチド含有量の変更を介して、ｍＲＮＡ配列の未精製／大雑把な改変のいずれかを行って、回避をすることができる。後者の手法は、ＧＣ含量の増量を介して行うことができ（Ｔｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２３：１４５６−６４；Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｓｓ，  ２０１５）、または、ｍＲＮＡのＡを増量して、もしくは、ＵまたはＧＵの含有量を減量して行うことができる（Ｋａｒｉｋｏ  ＆  Ｓａｈｉｎ，  ２０１７，  ＷＩＰＯ特許出願第ＷＯ  ２０１７／０３６８８９  Ａ１号）。コード領域の場合、この配列の改変は、主にｍＲＮＡに関するコドンの３番目のヌクレオチドを変えて実施する。遺伝暗号の冗長性のため、配列を改変しても、コードしたタンパク質のアミノ酸配列は変わらない。この方法は、導入遺伝子のタンパク質発現収量を改善するために、分子生物学及び合成生物学で一般的に使用されている技術であるコドン最適化に類似している（Ｑｕａｘ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ５９：１４９−１６１）。しかしながら、ＩＶＴ  ｍＲＮＡ配列改変の事例での主な目標は、ＩＶＴ  ｍＲＮＡを秘匿する、あるいは、体内のＲＮＡセンサーから見えないようにする、ことである。
プソイドウリジンなどの化学修飾は、特に、トランスフェクションを繰り返すと、自然免疫原性を抑制するが、完全に除去するまでには至らない（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２５（１２）：２６３５−２６４７）。加えて、その他のＲＮＡセンサーではなく、一部の刺激を所望する場合には、ｍＲＮＡの治療用途が考えられる。例えば、ＴＬＲ７結合活性だけを有するｍＲＮＡは、ＩＦＮ−アルファ分泌が、抗腫瘍免疫を誘導または増強できる一部の免疫腫瘍学用途において望ましい場合がある。化学修飾では、一部のセンサーを回避したり、その他のセンサーを刺激したりすることはできない。
ヒトゲノムでのコード領域のＧＣ含量は、５２％であり（Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３１８（５８４８）：２４５−５０）、そのヌクレオチドの１％未満が、非カノニカルである（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１５，  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，  １１（８）：５９２−７）。ｍＲＮＡの化学的性質または配列を、（ＩＶＴ  ｍＲＮＡの自然免疫原性を抑制するために）天然（細胞）のヒトｍＲＮＡからさらに離れていくような修飾をすると、意図しない結果を招くリスクが高くなる。全体的なヌクレオチド含有量を変える手法を介した化学修飾と配列の改変の両方は、攪乱を招き、かつ、合併症を招く未精製／大雑把な方法であり；同合併症として、（５−メチル−シチジン、６−メチルアデノシン、及び、２−チオ−ウリジン修飾の場合は）翻訳の抑制（Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，  １６（１１）：１８３３−４０）、または、潜在的なペプチド形成（Ｍａｕｒｏ  ＆  Ｃｈａｐｐｅｌｌ，  ２０１４，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ２０１４  Ｎｏｖ；２０（１１）：６０４−１３；Ｍａｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８，  ＢｉｏＤｒｕｇｓ，  ３２：６９−８１）がある。さらに、ヒトｍＲＮＡ「エピトランスクリプトーム」内では、ｍ６Ａやプソイドウリジンなどの化学修飾ヌクレオシドは、均一に分布していない（Ｃａｒｌｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｎａｔｕｒｅ．  ５１５：１４３−６；Ｄｏｍｉｎｉｓｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｎａｔｕｒｅ．  ５３０：４４１−４４６）。例えば、哺乳動物の終止コドンに位置するウリジンは、プソイドウリジン化モチーフを含んでおらず（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１４，  Ｃｅｌｌ．  １５９：１４８−１６２）、また、ＩＶＴ  ｍＲＮＡへのプソイドウリジンの取り込みが、終止コドンの読み通しを招くことを示した（Ｋａｒｉｊｏｌｉｃｈ    ＆  Ｙｕ，  ２０１１，  Ｎａｔｕｒｅ．  ４７４：３９５−３９８；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１３，  Ｎａｔｕｒｅ．  ５００：１０７−１１０）。さらに、修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡ転写酵素（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）と、翻訳機構の忠実度を抑制することができ、また、タンパク質の翻訳後修飾を変えることもできる。また、修飾ヌクレオチドは、ヒトのＲＮａｓｅに対する耐性をｍＲＮＡに付与することができ、また、血清でのＲＮＡ蓄積は、凝固亢進状態をもたらすことができる。これらの生物学的リスクに加えて、非カノニカルヌクレオチドの使用は、製造コストの増大も招く（Ｈａｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ  Ｒｅｖ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．  ９：ｅ１３６７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１４／０３２８８２５号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１７／０３６８８９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓａｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，  １３：７５９−８０
【非特許文献２】Ｓｃｈｌｅｅ  ＆  Ｈａｒｔｍａｎｎ，  ２０１６，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １６：５６６−５８０
【非特許文献３】Ｓｃｈｕｂｅｒｔｈ−Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ４３：４１−５２
【非特許文献４】Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｎａｔｕｒｅ．  ４９４：６０−６４
【非特許文献５】Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７，  ＰＮＡＳ，  １１４：Ｅ２１０６−Ｅ２１１５
【非特許文献６】Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ７：６１８−３０
【非特許文献７】Ｒａｍａｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４４：７５１１−７５２６
【非特許文献８】Ｓｃｈｌｅｅ  ＆  Ｈａｒｔｍａｎｎ，  ２０１６，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １６：５６６−５８０
【非特許文献９】Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３９：ｅ１４２
【非特許文献１０】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２８１：３７４２７−３７４３４
【非特許文献１１】Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  １０．１１８６／１４７１−２１６４−８−１２４
【非特許文献１２】Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，  １８：１６８４−１６９１
【非特許文献１３】Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １０：４０
【非特許文献１４】Ｇｏｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７４：１２５９−１２６８
【非特許文献１５】Ｆｏｒｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １８０：３７２９−３７３８
【非特許文献１６】Ｔａｎｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２２：１０９−１１５
【非特許文献１７】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ４５：７３７−７４８
【非特許文献１８】Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，  １８：１６８４−１６９１
【非特許文献１９】Ｏｈｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．  １６：２７３−２８２
【非特許文献２０】Ｊｕｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２３，４５７−４６２
【非特許文献２１】Ｈｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  （８０）３０３：１５２６−１５２９
【非特許文献２２】Ｈｏｒｎｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，  １０．１０３８／ｎｍ１１９１
【非特許文献２３】Ｄｉｅｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０．１００２／ｅｊｉ．２００６３６６１７
【非特許文献２４】Ｆｏｒｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １８０：３７２９−３７３８
【非特許文献２５】Ｊｕｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．  ２１：２０１−２１４
【非特許文献２６】Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８７：３９７８９−３９７９９
【非特許文献２７】Ｋａｒｉｋｏ，  ２００５，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ２３：１６５−７５
【非特許文献２８】Ｋａｒｉｋｏ，  ２００８，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  １６：１８３３−４０
【非特許文献２９】Ｋｏｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２９：１５４−１５７
【非特許文献３０】Ａｎｄｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  ２１７：３３７−３４４
【非特許文献３１】Ｔｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２３：１４５６−６４
【非特許文献３２】Ｑｕａｘ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ５９：１４９−１６１
【非特許文献３３】Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２５（１２）：２６３５−２６４７
【非特許文献３４】Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３１８（５８４８）：２４５−５０
【非特許文献３５】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１５，  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，  １１（８）：５９２−７
【非特許文献３６】Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，  １６（１１）：１８３３−４０
【非特許文献３７】Ｍａｕｒｏ  ＆  Ｃｈａｐｐｅｌｌ，  ２０１４，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ２０１４  Ｎｏｖ；２０（１１）：６０４−１３
【非特許文献３８】Ｍａｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８，  ＢｉｏＤｒｕｇｓ，  ３２：６９−８１
【非特許文献３９】Ｃａｒｌｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｎａｔｕｒｅ．  ５１５：１４３−６
【非特許文献４０】Ｄｏｍｉｎｉｓｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｎａｔｕｒｅ．  ５３０：４４１−４４６
【非特許文献４１】Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１４，  Ｃｅｌｌ．  １５９：１４８−１６２
【非特許文献４２】Ｋａｒｉｊｏｌｉｃｈ    ＆  Ｙｕ，  ２０１１，  Ｎａｔｕｒｅ．  ４７４：３９５−３９８
【非特許文献４３】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１３，  Ｎａｔｕｒｅ．  ５００：１０７−１１０
【非特許文献４４】Ｈａｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ  Ｒｅｖ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．  ９：ｅ１３６７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ヒトＴＬＲ８に対する結合に関与する免疫原性配列モチーフを除去するように配列を改変したポリヌクレオチド（例えば、メッセンジャーＲＮＡ）を提供する。
【０００８】
ある実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の配列を正確に改変する方法を提供しており、免疫原性モチーフだけを除去する一方で、残余の配列は無傷のままである。
【０００９】
ある実施形態では、本発明は、ヒトＴＬＲ８を介して自然免疫原性を有意に抑制するポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）から、免疫原性ＲＮＡ配列モチーフであるＫＮＵＮＤＫを除去する方法を提供する。
【００１０】
ある実施形態では、本発明は、ＧＦＰをコードするメッセンジャーＲＮＡを提供しており、ｍＲＮＡのコード領域内のＫＮＵＮＤＫ配列モチーフに一致する１つ以上の免疫原性配列を、この配列に関するＤＮＡテンプレートのコドン改変を介して除去しており、そして、ヒトＴＬＲ８とタンパク質の高発現を介して、ＨＥＫ細胞にトランスフェクションして、免疫原性を抑制させる。
【００１１】
本発明のある態様は、ヒト胎児腎臓細胞株（ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ８  ＳＥＡＰ）を、ＫＮＵＮＤＫ配列モチーフを除去したｍＲＮＡと繰り返し接触させて、ｍＲＮＡの自然免疫原性を抑制しながら、高レベルのタンパク質発現を可能ならしめる、ことを含む方法である。
【００１２】
本発明のある態様は、ヒト初代単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）を、ＫＮＵＮＤＫモチーフを除去したｍＲＮＡと接触させて、ｍＲＮＡの自然ＴＬＲ８免疫原性を抑制しながら、高レベルのタンパク質発現を可能ならしめる、ことを含む方法である。
【００１３】
本発明の別の態様は、ｍＲＮＡを秘匿するように正確に改変する新規の方法であって、ヒトＴＬＲ７、及び、ヒトＲＩＧ−Ｉなどのその他のＲＮＡセンサーの活性化を許容しながら、ｍＲＮＡによるヒトＴＬＲ８の活性化を妨げる。
【００１４】
本明細書に開示する正確にｍＲＮＡを改変する方法は、モチーフ除去を介して、免疫原性配列を除去しながら、ｍＲＮＡ内の非免疫原性配列の使用を控える。この低侵襲手法は、ｍＲＮＡが、免疫原性を抑制しながら、高レベルの翻訳活性を保持することを可能にする。大雑把な配列改変手法（高ＧＣ、低ＧＵ、または、低ＵをベースとしたｍＲＮＡ改変など）とは異なり、この手法は、効率的な翻訳を妨げないので、高レベルのタンパク質発現を維持または達成するために、配列を改変したｍＲＮＡの数多くのバージョンを試験する必要がない。この手法は、非カノニカルヌクレオチドを使用しないので、翻訳効率の低下、翻訳後修飾、または、終止コドンの読み通しなどの問題は発生し得ない。最後に、正確な改変を行うので、ｍＲＮＡ治療薬の製造コストも抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】配列を改変したｅＧＦＰ  ｍＲＮＡデザイン。ネイティブ（「野生型」）ｍＲＮＡ配列を、コード領域内で変えて、ＴＬＲ８モチーフ（「低モチーフ」）を除去して、全体的なＧ及びＵ含有量（「粗製」）を減らす、または、両方ともに、モチーフを除去して、Ｇ及びＵ（「低モチーフ＋粗製」）を減らす。
【図１Ｂ】ヌクレオチドとモチーフの変化の概要。それぞれのｍＲＮＡデザイン手法に関して、存在するＴＬＲ８モチーフの最終的な数と、変えたヌクレオチドの総数を表に示す。正確な（低モチーフ）手法は、変えたヌクレオチドの個数を最小限に抑えながら、ＴＬＲ８結合部位を効率的に除去する。（ＵＴＲ：非翻訳領域）。
【図２】ＴＬＲ８を過剰発現するヒト細胞に対して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを介してトランスフェクションして改変したｅＧＦＰ  ｍＲＮＡの自然免疫原性。野生型（ＷＴ）、及び、配列を改変したｍＲＮＡを、ＨＰＬＣを介して精製し、そして、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して、ＴＬＲ８を過剰発現しており、かつ、レポータープラスミドを保有するＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションを行い、その結果、ＴＬＲ８刺激をすると、（ＮＦ−ＫＢ及びＡＰ−１結合部位に融合したＩＦＮ−Ｂプロモーターを介して）分泌した胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を分泌する。分泌したＳＥＡＰ活性を、ｍＲＮＡトランスフェクションの４８時間後に測定した。低モチーフ、粗製（低ＧＵ）、及び、低モチーフ＋粗製ｍＲＮＡは、野生型（ＷＴ）ｍＲＮＡと比較して、ＴＬＲ８刺激の有意な抑制を示した（３つの比較すべてに関して、ｐ＜０．０５）。トランスフェクションを定量的に行い、そして、データを、平均＋／−標準偏差（ＳＤ）として表す。
【図３】ＴＬＲ８野生型（ＷＴ）を過剰発現するヒト細胞において、Ｔｒａｎｓ−ＩＴを介してトランスフェクションして改変したｅＧＦＰ  ｍＲＮＡの自然免疫原性。野生型（ＷＴ）、及び、配列を改変したｍＲＮＡを、ＨＰＬＣを介して精製し、そして、ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡ試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）を介して、ＨＥＫ２９３−ｎｕｌｌ細胞（ＴＬＲ８発現無し）、それに、ＴＬＲ８を過剰発現するＨＥＫ２９３−ＴＬＲ８細胞へトランスフェクションした。両方の細胞株は、ＴＬＲ８刺激の際に、（ＮＦ−ＫＢ及びＡＰ−１結合部位に融合したＩＦＮ−Ｂプロモーターを介して）アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の分泌を招くレポータープラスミドを保有している。分泌したＡＰ活性を、ｍＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に測定し、そして、実験前のＳＥＡＰレベルで定量した細胞数で正規化した。化学的に修飾した（「ｃｈｅｍ．ｍｏｄ．」）ｍＲＮＡコントロールは、１００％の疑似−Ｕと、１００％の５ｍＣを含んでいた。（ＨＥＫ−Ｎｕｌｌ細胞のＡＰ活性を測定して、基本的なＴＬＲ３発現を介して駆動するバックグラウンド免疫シグナルを決定した）。化学的に修飾したｍＲＮＡと同様に、低モチーフｍＲＮＡは、野生型（ＷＴ）及び低ＧＵ（「粗製」）ｍＲＮＡよりも有意に穏やかなＴＬＲ８刺激を示した。トランスフェクションを定量的に行い、そして、データを、平均＋／−ＳＤとして表す。
【図４】［図４Ａ］ＴＬＲ８を過剰発現するヒト細胞に対して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を介してトランスフェクションして改変したｅＧＦＰ  ｍＲＮＡで駆動するタンパク質発現。野生型（ＷＴ）、及び、配列を改変したｍＲＮＡを、ＨＰＬＣを介して精製を行い、そして、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を介して、ＴＬＲ８を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞へとトランスフェクションした。ｅＧＦＰ発現細胞の画像を、トランスフェクションの２日後に、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを介して得た。［図４Ｂ］図４Ａに示したＴＬＲ８を過剰発現しているヒト細胞でのｅＧＦＰ発現の定量。正確に改変したｍＲＮＡ（「低モチーフ」）は、Ｌｏｗ−ＧＵ（「粗製」）と、化学修飾（「Ｃｈｅｍ．ｍｏｄ．」）ｍＲＮＡよりも有意に大きなタンパク質発現を示した。トランスフェクションを定量的に行い、そして、データを、平均＋／−ＳＤとして表す。
【図５】Ａ〜Ｄ。ヒト単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）にトランスフェクションして改変したｅＧＦＰ  ｍＲＮＡで駆動するタンパク質発現。野生型（ＷＴ）、及び、配列を改変したｍＲＮＡを、ＨＰＬＣを介して精製し、そして、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を介して、ＭＤＤＣへとトランスフェクションした。ｅＧＦＰ発現は、４日目に定量した。ＭＤＤＣでトランスフェクションを１回行った後に、低モチーフｍＲＮＡ（Ｃ）は、粗製ｍＲＮＡ（Ｂ）よりも有意に大きなタンパク質発現と、ＷＴ  ｍＲＮＡ（Ａ）と同様の発現をもたらした。（Ｄ）３度の実験の結果。データを、平均＋／−ＳＤとして表す。
【図６】Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を介してＴＬＲ８を過剰発現するヒト細胞に繰り返しトランスフェクションして改変したｅＧＦＰ  ｍＲＮＡで駆動するタンパク質発現。野生型（ＷＴ）、及び、配列を改変したｍＲＮＡを、スピンカラム（「ＷＴ−未精製」及び「低モチーフ−未精製」）を介して回収した、あるいは、ＨＰＬＣ（「ＷＴ−ＨＰＬＣ」及び「低モチーフ−ＨＰＬＣ」）を介して精製した。次に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を介して、２、３、及び、４日目に、ＴＬＲ８を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞へと連続的にトランスフェクションした（０日目に播種した）。ｅＧＦＰ発現を、４、７、及び、１１日目に定量した。繰り返しトランスフェクションの設定では、低モチーフの精製ｍＲＮＡは、ＷＴ精製ｍＲＮＡよりも有意に大きなタンパク質発現を示した。トランスフェクションを定量的に行い、そして、データを、平均＋／−ＳＤとして表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
本明細書で使用する用語「約」とは、所与の値から約±１０％以内の変動を指す。
【００１７】
用語「クローニング部位」とは、一般的には、発現ベクターに存在するヌクレオチド配列であって、ＤＮＡフラグメント（複数可）の発現ベクターへのクローニングにおいて有用な１つ以上の制限酵素認識配列を含むヌクレオチド配列のことを指す。ヌクレオチド配列が、複数の制限酵素認識配列を含む場合、そのヌクレオチド配列を、「マルチクローニング部位」または「ポリリンカー」とも称する。
【００１８】
用語「発現ベクター」とは、所望の分子の発現に影響を与える配列、例えば、プロモーター、コード領域、及び、転写終結配列などの核酸のことを指す。発現ベクターを、統合型ベクター（すなわち、宿主ゲノムに統合することができるベクター）、または、統合はしないまでも、自己複製するベクターとすることができ、この事例では、ベクターは、「複製起点」を含んでおり、これにより、宿主細胞内にベクターが入り込むと、ベクター全体が複製される。
【００１９】
用語「遺伝子発現」とは、核酸配列が、首尾良く転写され、そして、大抵の事例では、タンパク質またはペプチドを生成する翻訳のプロセスのことを指す。明確にするために、「遺伝子発現」の測定と言及する場合、この測定は、転写の核酸産物、例えば、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ、または、翻訳のアミノ酸産物、例えば、ポリペプチドまたはペプチドの測定になり得る、ことを意味するものと理解すべきである。ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、及び、ペプチドの量またはレベルを測定する方法は、当該技術分野で周知である。
【００２０】
句「免疫原性モチーフ」とは、本明細書では、細胞内に位置するＴＬＲ７またはＴＬＲ８などの自然免疫受容体に対するＲＮＡの結合に関与しており、かつ、細胞内細胞シグナル伝達経路を活性化して、その結果、遺伝子発現、及び／または、細胞からのサイトカインの放出を変化させるあらゆるＲＮＡ配列のことを指す目的で使用している。
【００２１】
用語「プラスミド」は、細菌での天然プラスミドと、人工的に構築した環状ＤＮＡフラグメントの両方を含む。
【００２２】
本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」とは、１３個のヌクレオチドより長いあらゆるＲＮＡまたはＤＮＡ配列のことを指す。用語ポリヌクレオチドとして、天然または合成（化学的に修飾した）リン酸骨格、糖類、及び、リボース糖を有する天然または合成起源の核酸がある。
【００２３】
本明細書で使用する用語「メッセンジャーＲＮＡ」及び「ｍＲＮＡ」とは、細胞内または無細胞タンパク質翻訳系において、ポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができるあらゆるＲＮＡ配列のことを指す。
【００２４】
本明細書で使用する用語「インビトロ転写」とは、プラスミドまたはＰＣＲ産物をベースとすることができるＤＮＡテンプレートからｍＲＮＡを製造するための酵素反応のことを指す。前者の事例では、制限酵素で線形化したプラスミドＤＮＡと、制限部位との間のＩＶＴテンプレート領域を精製して、より高品質のＤＮＡテンプレートを得る。後者の事例では、末端領域または隣接領域に相補的なプライマーを、プラスミド由来のテンプレートＤＮＡを増幅して精製するように改変する。これらのＰＣＲプライマーの１つが、ポリＴ配列を含んでいる場合、転写している間に、ポリＡ尾部をｍＲＮＡ配列に組み込むこともできる。インビトロ転写（ＩＶＴ）反応では、通常、Ｔ７、Ｔ３、または、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ酵素と、カノニカルヌクレオチド基質、または、化学的に修飾したヌクレオチド基質を使用する。
【００２５】
本明細書で使用する用語「コード領域」とは、一般的に、５’と３’の非翻訳領域の間に位置しており、かつ、リボソームによってタンパク質を活発に翻訳するメッセンジャーＲＮＡの一部のことを指す。
【００２６】
本明細書で使用する用語「５’ＵＴＲ」とは、ｍＲＮＡの５’末端に位置しており、かつ、一般的には、リボソームに対する結合、及び、ｍＲＮＡコード領域の発現の増強に関与するメッセンジャーＲＮＡの一部のことを指す。
【００２７】
本明細書で使用する用語「３’ＵＴＲ」とは、ｍＲＮＡの３’末端に位置しており、かつ、一般的には、ｍＲＮＡの発現、及び、半減期の長期化に関与するメッセンジャーＲＮＡの一部のことを指す。
【００２８】
本明細書で使用する用語「配列の改変」とは、特定の理由でポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に加えられた、あらゆる変化のことを指す。このような変化は、免疫原性の低下、発現の増強、及び／または、半減期の長期化をもたらすことができる。それらは、ＲＮＡ配列全体、または、ＲＮＡ配列の特定のセクション内で作り出すことができる。メッセンジャーＲＮＡの場合、配列の改変は、コード配列、５’ＵＴＲ、及び／または、３’ＵＴＲ領域の変化に関与し得る。
【００２９】
本明細書で使用する用語「正確な配列の改変」とは、残余のオリゴヌクレオチド配列の不必要な変化を回避しながら、免疫原性モチーフを除去して、オリゴヌクレオチドの免疫原性を抑制するために、オリゴヌクレオチド配列に対して加える変化のことを指す。一部の実施形態では、「正確な配列の改変」は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つの免疫原性モチーフ、または、ポリヌクレオチド内のすべての免疫原性モチーフを除去することと関係している。一部の実施形態では、「正確な配列の改変」は、ポリヌクレオチド配列に認められる免疫原性モチーフの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、または、１００％の除去を含む。
【００３０】
句「免疫原性モチーフの除去」とは、免疫原性モチーフの単一ヌクレオチド、または、免疫原性モチーフの複数のヌクレオチド（例えば、所与の免疫原性モチーフの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または、すべて）を変化させて、ヌクレオチドモチーフがもはや存在しなくする（すなわち、免疫原性モチーフを「破壊する」）ような、免疫原性モチーフの修飾のことを指す。本明細書で使用する用語「変化」とは、１つ以上のヌクレオチドに対する修飾を含み、同修飾として、ヌクレオチド置換、欠失、挿入、及び、化学修飾があるが、これらに限定されない。例えば、「ＫＮＵＮＤＫ」免疫原性モチーフは、表１に示したように、１９２個のヌクレオチド配列を含み得る。「ＫＮＵＮＤＫ」モチーフに適合しない（すなわち、表１に記載した１９２個の配列以外の）配列をもたらす１つ以上のヌクレオチドの突然変異、変化、または、置換は、このモチーフを、「破壊」または「除去」する。例えば、出発ポリヌクレオチドの免疫原性モチーフが「ＧＡＵＡＡＧ」であり、そして、それが「ＧＡＡＡＡＧ」に変異している場合、ＫＮＵＮＤＫモチーフを「除去した」ものとする。
【００３１】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡである。特定の実施形態では、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。ｍＲＮＡのコード領域内で、正確な配列の改変は、遺伝暗号の冗長性を利用して、それぞれの標的コドンを、ネイティブコドンと同じアミノ酸をコードする代替コドンに置き換え、それにより、コードしたタンパク質の最終配列を保存する。換言すれば、少なくとも１つの免疫原性モチーフが、ｍＲＮＡのアミノ酸をコードする部分（すなわち、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」）にある場合、それらの変化（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、または、すべてのヌクレオチドの変化）は、ｍＲＮＡがコードするアミノ酸配列を変えずに行える。
【００３２】
本明細書で使用する用語「コドン最適化」とは、ポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルを高める目的で実行する配列の改変のことを指す。ポリペプチド及びタンパク質の量またはレベルを測定する方法は、当該技術分野で周知である。
【００３３】
本明細書で使用する用語「低ＧＵ  ｍＲＮＡ」とは、配列を改変したｍＲＮＡであって、同じｍＲＮＡの野生型バージョンのものと比較して、グアニン（Ｇ）とウラシル（Ｕ）含有量が減っているｍＲＮＡのことを指す。
【００３４】
本明細書で使用する用語「低Ｕ  ｍＲＮＡ」とは、配列を改変したｍＲＮＡであって、同じｍＲＮＡの野生型バージョンのものと比較して、Ｕ含有量が減っているｍＲＮＡのことを指す。
【００３５】
本明細書で使用する用語「高ＧＣ  ｍＲＮＡ」とは、配列を改変したｍＲＮＡであって、同じｍＲＮＡの野生型バージョンのものと比較して、Ｇ及びＣ含有量が増えているｍＲＮＡのことを指す。
【００３６】
本明細書で使用する用語「酵素的キャッピング」とは、酵素によって、キャップ０、キャップＩ、キャップＩＩなどの７−メチルグアノシンをベースとしたキャップ構造を付加することを指しており、同酵素として、一般的には、ｍＲＮＡの５’末端での最初のヌクレオチドを２−Ｏ−メチル化してキャップＩ構造を作り出す２−Ｏ−メチルトランスフェラーゼと組み合わせた、５’−５’ホスホジエステル結合を有する７−メチルグアノシンキャップ（キャップ０）を付加するＶａｃｃｉｎｉａキャッピングシステムがあり、これらは、ｍＲＮＡの翻訳を首尾良く行うために、転写反応の後に添加する。酵素キャッピングの方法は、当該技術分野で周知である。
【００３７】
本明細書で使用する用語「共転写キャッピング」とは、７−メチルグアノシンキャップ、または、キャップ類似体、例えば、ＡＲＣＡまたはＣｌｅａｎＣａｐの付加のことを指しており、これらのキャップ類似体を、ｍＲＮＡ転写反応に取り込んで、ｍＲＮＡの翻訳を首尾良く行う。共転写キャッピングの方法は、当該技術分野で周知である。
【００３８】
本明細書で使用する用語「化学修飾」とは、ｍＲＮＡの窒素塩基に対して行われる化学的変化のことを指す。このような変化は、一般的には、ｍＲＮＡ転写反応でのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの基質として、非カノニカル（化学的に修飾した）ヌクレオチド類似体を取り込んで実行されている。これらの化学修飾として、プソイドウリジン（Ψ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（Ｎ１ｍΨ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、または、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）があるが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書で使用する用語「部分的化学修飾」とは、ｍＲＮＡ内の特定のヌクレオチド、一般的には、ウリジンまたはシチジンのすべての化学修飾ではなく、一部の化学修飾のことを指す。例えば、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）を、１〜３のモル速度で、ＩＶＴ基質として一部を取り込むことで、約２５％の割合で使用でき、この場合、３つのカノニカルウリジンごとに、１つの２−チオウリジンが、ｍＲＮＡに取り込まれる。
【００４０】
本明細書で使用する用語「カプセル化」とは、固体、層状または小胞様、脂質またはポリマーをベースとしたナノ粒子内へのｍＲＮＡの封じ込めのことを指す。
【００４１】
本明細書で使用する用語「送達ビヒクル」とは、ｍＲＮＡのカプセル化のために使用することができ、かつ、標的細胞または組織へのｍＲＮＡペイロードの効果的な安定化、輸送、及び、送達を可能ならしめる、あらゆる天然材料または合成材料のことを指す。
【００４２】
句「研究用組成物」とは、科学的知識を増やす目的で実験室において使用する、あらゆる研究材料のことを指しており、臨床的または獣医学的使用を意図していない。句「獣医用組成物」とは、動物の健康と生育状態を改善するために、動物に対して使用するあらゆる材料のことを指す。
【００４３】
概説
本開示は、ポリヌクレオチド配列での免疫原性モチーフを除去する正確な配列の改変によって、ポリヌクレオチド配列での免疫原性を抑制する方法に関する。本開示は、そのようなポリヌクレオチドでの１つ以上、または、すべての免疫原性配列モチーフを除去した、改変したポリヌクレオチドの組成物にも関する。
【００４４】
既存のｍＲＮＡ修飾と、当該改変方法での制約を考慮して、自然免疫センサーに関連する配列だけを変更する、新規のｍＲＮＡを改変する手法が、なおも待望されている。
【００４５】
ｍＲＮＡの自然免疫原性の抑制を可能ならしめる、現在のところ利用可能なｍＲＮＡの化学修飾と配列改変の手法は、大雑把であり、また、すべての配列を均一に変化させてしまい、または、修飾する。
【００４６】
ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、特定のＵ含有配列または配列モチーフに基づいて、ｍＲＮＡを含むｓｓＲＮＡ種を検出する。これらの免疫原性モチーフを標的として除去することで、より正確に配列を改変する手法を実現することができる。遺伝暗号の冗長性（ほぼすべてのコドンの３番目の位置に、新生ポリペプチド鎖の同じアミノ酸残基をコードする代替ヌクレオチドがある）が故に、ｍＲＮＡ配列を変化させて、配列モチーフを特異的に除去する一方で、コードしたタンパク質配列を同じままで残存させる。
【００４７】
高ＧＣ  ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ配列を人為的に変更して、全体のＧ及びＣ含有量を増やす）、または、低ＧＵ  ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ配列を人為的に変更して、全体のＧ及びＵ含有量を減らす）などの大雑把な改変手法と比較して、この正確な手法（低モチーフ手法）は、低侵襲性であり、すなわち、ＴＬＲ７／８結合に関与していないあらゆる配列を変化させない。結果として、この新規の手法は、当該ｍＲＮＡの構造的及び機能的特徴のほとんどを維持する。多くの利点がある中で、この手法は、堅調な翻訳効率を可能にする。本発明は、正確なｍＲＮＡ改変が、実行可能かつ有利であることを初めて示したのである。
【００４８】
したがって、ある実施形態では、研究目的、ならびに、ワクチン接種または治療用遺伝子置換などの獣医学的及び臨床的用途において、本明細書に記載したモチーフを、タンパク質を発現するために使用するその他のメッセンジャーＲＮＡから除去し得る。このｍＲＮＡは、様々なオリゴペプチド、ポリペプチド、または、タンパク質の１つ以上をコードすることができ、同産物として、遺伝子編集酵素（例えば、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、及び、ＴＡＬＥＮ）、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）リプログラミング因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及び、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｇｌｉｓ１）、分化転換因子、代謝酵素（例えば、界面活性剤タンパク質Ｂ、ウリジン５’−ジホスホ−グルクロノシルトランスフェラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ）、細胞膜タンパク質（例えば、ＣＦＴＲ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬＲ４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、Ｂ細胞受容体サブユニット、Ｔ細胞受容体サブユニット、キメラ抗原受容体）、ホルモン及びサイトカイン（ＥＰＯ、ＶＥＧＦ、ＩＬ１２、ＩＬ３６ガンマ）、アポトーシス促進性、壊死性及び壊死タンパク質、ウイルス抗原（例えば、ＨＩＶ  ｇｐ１２０及びｇｐ４１抗原、インフルエンザＨＡ及びＮＡ抗原）、細菌抗原、及び、毒素、がん抗原、及び、新抗原、予防抗体または治療抗体、及び、抗体フラグメントがあるが、これらに限定されない。
【００４９】
別の実施形態では、配列を改変するｍＲＮＡは、複数のタンパク質、すなわち、（融合タンパク質を産生する）キメラ構築物、あるいは、ＩＲＥＳ領域または自己開裂ペプチドをコードする配列が点在している別個のコード領域がコードする別個のポリペプチドのいずれかをコードすることができる。
【００５０】
一部の実施形態では、本発明は、ＫＮＵＮＤＫを、ヒトＴＬＲ８及びマウスＴＬＲ７モチーフとして利用しており、そして、ＫＮＵＮＤＫモチーフに一致する配列を除去しており、式中、Ｎは、あらゆるヌクレオチドであり、Ｋは、グアノシン（Ｇ）またはウリジン（Ｕ）のいずれかであり、Ｄは、シチジン（Ｃ）以外のあらゆるヌクレオチドである。ＫＮＵＮＤＫモチーフを含む６マーの配列を、表１に示す。
【００５１】
その他の実施形態では、モチーフ除去を介した正確な配列の改変は、その他のＴＬＲ７及びＴＬＲ８配列モチーフに基づくことができ、同モチーフとして、ＵＣＷ、ＵＮＵ、ＵＷＮ、ＵＳＵ、ＫＷＵＮＤＫ、ＫＮＵＷＤＫ、ＵＮＵＮＤＫ、ＫＮＵＮＵＫ（Ｆｏｒｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８；Ｊｕｒｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２）、及び、これらの組み合わせがあるが、これらに限定されず、式中、Ｗは、アデノシン（Ａ）またはＵであり、そして、Ｓは、ＧまたはＣである。
【００５２】
【表１−１】
2021533826.tif 000003
【表１−２】
2021533826.tif 000004
【００５３】
別の実施形態では、このモチーフ除去手法を、５４個超のヌクレオチドのその他の長いポリヌクレオチドに対して実施して、そのようなポリヌクレオチドの自然免疫原性を抑制することができる。一部の実施形態では、長いポリヌクレオチドは、少なくとも５４個、少なくとも５５個、少なくとも５６個、少なくとも５７個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、少なくとも１００個、少なくとも１１０個、少なくとも１２０個、少なくとも１３０個、少なくとも１４０個、または、少なくとも１５０個のヌクレオチドを含む。これらの長いポリヌクレオチドとして、Ｃｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ９のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、及び、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）があるが、これらに限定されない。
【００５４】
一部の実施形態では、改変していない出発ポリヌクレオチドは、複数の免疫原性モチーフを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドでの複数の免疫原性モチーフは、単一のタイプのモチーフである（例えば、ポリヌクレオチドでのすべての免疫原性モチーフは、ＵＣＷ、ＵＷＮ、ＵＳＵ、ＵＮＵ、ＫＷＵＮＤＫ、ＫＮＵＷＤＫ、ＵＮＵＮＤＫ、ＫＮＵＮＤＫ、及び、ＫＮＵＮＵＫからなる群から選択するモチーフであり、式中、Ｗは、アデノシン一リン酸、または、ウリジン一リン酸を示しており、そして、Ｓは、グアノシン一リン酸、または、シチジン一リン酸を示す）。一部の実施形態では、ポリペプチドでの複数の免疫原性モチーフは、異なるタイプを含む（例えば、ＵＣＷ、ＵＷＮ、ＵＳＵ、ＵＮＵ、ＫＷＵＮＤＫ、ＫＮＵＷＤＫ、ＵＮＵＮＤＫ、ＫＮＵＮＤＫ、及び、ＫＮＵＮＵＫからなる群から選択するポリヌクレオチド配列では、少なくとも２つの異なるモチーフタイプがあり、式中、Ｗは、アデノシン一リン酸、または、ウリジン一リン酸を示しており、そして、Ｓは、グアノシン一リン酸、または、シチジン一リン酸を示す）。
【００５５】
一部の実施形態では、正確に配列を改変したポリヌクレオチドは、改変していないポリヌクレオチド（免疫原性モチーフを標的とした除去）と比較して、または、その他の従来の方法で変化させたポリヌクレオチドと比較して、改善した機能性を示す。一部の実施形態では、句「改善した機能性」とは、自然免疫系受容体由来の免疫原性の顕著な低さと、同自然免疫系受容体を秘匿することを指しており、同自然免疫系受容体として、ＴＬＲ７やＴＬＲ８があるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドがタンパク質をコードする実施形態では、句「改善した機能性」とは、改善した翻訳効率のことを指しており、コードしたタンパク質の改善した生産性と、生産量の増大をもたらす。一部の実施形態では、句「改善した機能性」とは、改変したポリヌクレオチドの改善した安定性のことを指す。特定の実施形態では、正確に配列を改変したポリヌクレオチドでの改善した安定性は、エンドヌクレアーゼ、及び／または、エキソヌクレアーゼに対する改善した、または、増強した耐性に起因する。
【００５６】
別の実施形態では、当該モチーフ除去手法は、プソイドウリジン（Ψ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（Ｎ１ｍΨ）、メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、または、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）など、これらに限定されない１つ以上の一般的に使用されているｍＲＮＡ化学修飾と組み合わせて使用し得るものであり、当該修飾は、ｍＲＮＡでのカノニカルヌクレオチドの０．１〜１％、１〜１０％または１０〜２５％または２５〜５０％または５０〜１００％を置換する。
【００５７】
別の実施形態では、当該モチーフ除去手法は、１つ以上のその他の自然界で認められるＲＮＡ化学修飾と組み合わせて使用し得るものであり、同修飾として、１，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン、１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン、１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン、１−メチルアデノシン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、１−メチルプソイドウリジン、２，８−ジメチルアデノシン、２−メチルチオメチレンチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン、２−ゲラニルチオウリジン、２−リシジン、２−メチルアデノシン、２−メチルチオ環状Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン  ２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−セレノウリジン、２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン、２−チオシチジン  ２−チオウリジン、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチルイノシン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、５−オキシ酢酸メチルエステル、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩）、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩）、３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）−５，６−ジヒドロウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン、３−メチルシチジン、３−メチルプソイドウリジン、３−メチルウリジン、４−ジメチルウイオシン、４−チオウリジン、５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン、５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジンメチルエステル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオウリジン、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン、５−アミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−アミノメチル−２−セレノウリジン、５−アミノメチル−２−チオウリジン、５−アミノメチルウリジン、５−カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５−カルバモイルメチル−２−チオウリジン、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−カルバモイルメチルウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−セレノウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチルリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５−カルボキシメチルウリジン、５−シアノメチルウリジン、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン、５��ホルミルシチジン、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルジヒドロウリジン、５−メチルウリジン、５−タウリノメチル−２−チオウリジン、５−タウリノメチルウリジン、７−アミノカルボキシプロピル−デメチルウイオシン、７−アミノカルボキシプロピルウイオシン、７−アミノカルボキシプロピルウイオシンメチルエステル、７−アミノメチル−７−デアザグアノシン、７−シアノ−７−デアザグアノシン、７−メチルグアノシン、８−メチルアデノシン、Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン、Ｎ２，７，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン、Ｎ２，７−ジメチルグアノシン、Ｎ２、Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン、Ｎ２、Ｎ２，７−トリメチルグアノシン、Ｎ２、Ｎ２−ジメチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン、Ｎ４、Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチルシチジン、Ｎ４、Ｎ４−ジメチルシチジン、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチルシチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン、Ｎ６、Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン、Ｎ６、Ｎ６−ジメチルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−アセチルアデノシン、Ｎ６−ホルミルアデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシメチルアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｑｂａｓｅ、アグマチジン、アルカエオシン、環状Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、ジヒドロウリジンエポキシキューオシン、ガラクトシル−キューオシン、グルタミル−キューオシン、ヒドロキシ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、ヒドロキシウイブトシン、イノシン、イソウイオシン、マンノシル−キューオシン、メチル化過小修飾ヒドロキシウイブトシン、メチルウイオシン、ペルオキシウイブトシン、プソイドウリジン、キューオシン、過小修飾ヒドロキシウイブトシン、ウリジン５−オキシ酢酸、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル、ウイイブトシン、及び、ウイオシンがあるが、これらに限定されるものではなく、当該修飾は、ｍＲＮＡでのカノニカルヌクレオチドの０．１〜１％、１〜１０％または１０〜２５％または２５〜５０％または５０〜１００％を置換する。
【００５８】
メッセンジャーＲＮＡの免疫原性と翻訳活性は、キャッピング、ポリアデニル化、及び、不純物（ＩＶＴ反応に由来するｄｓＲＮＡ汚染物質）の影響も受ける。本発明では、ｍＲＮＡは、Ｖａｃｃｉｎｉａキャッピングシステム（７ｍＧを備えた５’終端には、キャップ０構造があり、そして、２−Ｏ−メチル化  Ｎ１−ヌクレオチドは、ｍＲＮＡの５’末端に、キャップＩ構造を作り出す）を使用して、酵素的にキャップした。別の実施形態では、配列を改変したｍＲＮＡは、合成キャップ類似体、または、天然キャップ類似体、例えば、次のものに限定されるものではないが、３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ＡＲＣＡ）、または、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ／Ｇ）ｐＧ（ＣｌｅａｎＣａｐ）などを使用して、共転写的にキャップし得る。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’末端（５’ｐｐｐ）での脱リン酸化の有無に関係なく、無キャップで使用することができる。
【００５９】
本発明の一部の実施形態では、ｍＲＮＡを、テンプレートをベースとした手法を使用して、ポリアデニル化する。この手法では、テンプレートＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ上の固定長ポリＡ尾部をコードする末端ポリＡ／Ｔ配列を含んでいる。代替の実施形態では、配列を改変したｍＲＮＡを、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して、酵素的にポリアデニル化し得る。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリアデニル化していない状態で使用し得る。
【００６０】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、逆相ＨＰＬＣと、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーで精製する。別の実施形態では、ｍＲＮＡを、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、または、ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩまたはダイサー処理を用いたｄｓＲＮＡの酵素消化を介して精製する。別の実施形態では、酵素消化と、１つ以上のクロマトグラフィー法との組み合わせを使用し得る。
【００６１】
本発明では、配列を改変する別の方法を用いずに、ｍＲＮＡのモチーフ除去を使用した。しかしながら、この正確にｍＲＮＡを改変する手法を、その他の配列を改変する手法と組み合わせることが可能である。一部の実施形態では、モチーフ除去のための配列の改変を、コドン最適化のための組み合わせ配列の改変において使用する。一部の実施形態では、コドン最適化は、コドン使用（コドンバイアス）、コドン隣接コンテキスト、ｍＲＮＡ二次構造、ｍＲＮＡ三次構造、または、これらのパラメーターの組み合わせに基づく。ｍＲＮＡのタンパク質発現収量は、コドン最適化を介して、大幅に改善できる。この配列を改変する手法は、ＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８配列モチーフの除去と一緒に使用することができる。
【００６２】
別の実施形態では、正確に配列を改変する手法（モチーフ除去）は、高ＧＣ  ｍＲＮＡなどの大雑把な配列を改変する手法と組み合わせることができ、その組み合わせでは、配列の改変を、ｍＲＮＡに対して実施して、低ＧＵである当該ｍＲＮＡのＧＣ含有量を最大化する、その組み合わせでは、配列の改変を、ｍＲＮＡのＧ及びＵ含有量、または、低Ｕ  ｍＲＮＡを最小化するために実施する、その組み合わせでは、配列の改変を、ｍＲＮＡのＵ含有量を最小化するために実行する。これらの大雑把な手法は、一般的には、免疫原性の完全な排除には至らないので、正確な改変と組み合わせて、残余のモチーフを除去して、さらなる改善を図ることができる。本発明では、配列の改変を、ｍＲＮＡのコード領域内で実施した。別の実施形態では、５’及び３’非翻訳領域を改変して、免疫原性モチーフを除去することもできる。別の実施形態では、５’及び３’非翻訳領域を（天然または合成ＵＴＲ配列のライブラリーから）選択して、これらの領域でのモチーフの数を解消または最小化することができる。
【００６３】
本発明の一部の実施形態では、配列を改変したｍＲＮＡは、線状ｍＲＮＡであった。その他の実施形態では、配列を改変したｍＲＮＡは、化学的、酵素的、リボザイム媒介、または、自己循環を介して作り出した環状ｍＲＮＡとすることができる。
【００６４】
一部の実施形態では、本発明は、カチオン性脂質をベースとした送達剤を使用する。その他の実施形態では、ｍＲＮＡは、その他の送達剤で送達し得るものであり、同送達剤として、ポリラクチド、ポリラクチド−ポリグリコリドコポリマー、ポリアクリレート、ポリアルキシアノアクリレート、ポリカプロラクトン、デキストラン、ゼラチン、アルギン酸塩、プロタミン、コラーゲン、アルブミン、キトサン、シクロデキストリン、ＰＥＧ化プロタミン、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、ＰＥＧ化ＰＬＬ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、脂質ナノ粒子、リポソーム、ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然及び合成の双方に由来するエキソソーム、天然、合成、及び、半合成のラメラ体、ナノ粒子、リン酸カルシウム−ケイ酸塩ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、ナノ結晶粒子、半導体ナノ粒子、乾燥粉末、ナノデンドリマー、デンプンをベースとした送達系、ミセル、エマルジョン、ゾル−ゲル、ニオソーム、プラスミド、ウイルス、ウイルス様粒子、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、及び、ペプチドがあるが、これらに限定されない。その他の実施形態では、これらの送達剤は、小分子リガンド、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー、オリゴペプチド、または、抗体などのタンパク質、抗体フラグメント、及び、トランスフェリンなどのリガンドに対するコンジュケーションを介して、界面を機能化する。
【００６５】
本発明において、ｍＲＮＡは、インビトロで、細胞に送達した。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、エクスビボまたはインビボで、細胞、組織、または、生物に送達することができる。インビボ投与のための送達経路は、経口または非経口（静脈内、筋肉内、皮内、または、皮下）である。
【００６６】
一部の実施形態では、単一のタンパク質をコードするｍＲＮＡは、単独で送達する。別の実施形態では、異なるタンパク質をコードする複数のｍＲＮＡは、カクテル製剤として送達する。この製剤内の個々のｍＲＮＡを、裸のｍＲＮＡとし、または、脂質ナノ粒子またはポリマー担体内にカプセル封入して、ｍＲＮＡの合理的な取り込みと翻訳を可能ならしめ得る、または、裸のｍＲＮＡとカプセル化したｍＲＮＡとの組み合わせとし得る。一部の実施形態では、カクテルｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ配列、及び／または、送達剤成分、大きさ、電荷、電荷比、界面化学を変化させることで、特定の用途における活性をさらに最適化する。特定の実施形態では、カクテル製剤での幾つかのｍＲＮＡは、ＴＬＲ７／８結合を最小化するような改変を施されており、一方で、自然免疫系の選択的または部分的な刺激を可能にするために、改変せずにおく、または、部分的な改変に止める。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例は、本明細書の一部を構成しており、本開示の特定の態様をさらに実証するためのものであって、限定を意図するものではない。
【００６８】
実施例１．材料及び方法
テンプレートＤＮＡの生成（ＩＤＴ）
本開示で使用するすべてのＤＮＡテンプレートは、Ｔ７プロモーター、５’ＵＴＲ（非翻訳領域）配列、コード領域、及び、３’ＵＴＲ配列を含んでいた。コード領域は、野生型ｅＧＦＰテンプレートＤＮＡ配列に変化を加えて改変しており、そこでは、野生型コドンと同じアミノ酸残基をコードする代替コドンを使用して、Ｇ及びＵ含有量の減少、あるいは、オープンリーディングフレーム内の免疫原性配列モチーフの除去のいずれかを行った。デザインした配列を、商用ベンダー（ＩＤＴ）で合成を行い、次いで、ＴＡクローニングを介して、ｐＭｉｎｉ−Ｔベクター（ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ，ＮＥＢ）にクローニングし、そして、Ｓａｎｇｅｒシークエンシングを介して配列を検証した。メッセンジャーＲＮＡを、フォワード（ＴＴＧＧＡＣＣＣＴＣＧＴＡＣＡＧＡＡＧＣＴ）（配列番号５）プライマーと、リバース（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＧＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣＡＡＧＣＣ）（配列番号６）プライマーとを備えたＱ５  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、ＰＣＲ増幅によって、ベクターから得た。リバースプライマーは、１２０個のヌクレオチド長のポリＡ尾部のテンプレート配列を含んでいた。ＰＣＲ反応産物を、アガロースゲルに泳動させ、そして、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌと、ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）で精製した。
【００６９】
ｍＲＮＡのインビトロ転写（ＩＶＴ）
未修飾のｍＲＮＡを、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用して、製造業者のプロトコルに従って、ＤＮＡテンプレートから転写した。ＩＶＴ反応を、３７℃で、２時間行った（修飾ｍＲＮＡ）。反応産物を、ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で、３７℃で、１０分間、処理し、そして、ｍＲＮＡを、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で分離した。Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＮＥＢ）と、ｍＲＮＡ  Ｃａｐ  ２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、転写後に、キャッピングを実行した。Ａｎｔａｒｃｔｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ酵素（ＮＥＢ）を使用してホスファターゼ処理を行い、続いて、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔで分離した。プソイドウリジンと５−メチルシチジン（Ｌ−６１０１）で修飾したｅＧＦＰ  ｍＲＮＡを、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。
【００７０】
ｍＲＮＡ精製：
キャッピングと、脱リン酸化をしたｍＲＮＡを、Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３に従って、ＨＰＬＣ精製した。簡単に説明すると、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ（移動相Ａ）と、２５％アセトニトリル緩衝剤を含むＴＥＡＡ（移動相Ｂ）を使用する逆相ＰＤＶＢ  ＨＰＬＣカラム（ＲＮＡＳｅｐカラム、簡潔な分離）を備えたＶａｒｉａｎ  Ｐｒｏｓｔａｒ  ＨＰＬＣ機器に、メッセンジャーＲＮＡを導入した。主なｍＲＮＡ画分を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、そして、ＲＮＡｓｅ不含の水で希釈した。ＲＮＡを、酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ５．５；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、イソプロパノール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、及び、グリコーゲン（Ｒｏｃｈｅ）で、一晩、沈殿させて回収した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で測定した。
【００７１】
細胞：
ＨＥＫ２９３  ＴＬＲ８と、その親株（ＨＥＫ２９３  Ｎｕｌｌ）を、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから得た。細胞を、ＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）と、１０％ＦＢＳ（Ｓｅｒａｄｉｇｍ）で継代した。実験時の細胞継代数は、１５未満であった。ヒト初代単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）は、Ａｓｔａｒｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｄｏｎｏｒ  ＃３４５）から得た。ＭＤＤＣの維持には、１００ｕｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦと、ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＡＩＭ  Ｖ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用した。
【００７２】
ｍＲＮＡトランスフェクション：
トランスフェクションの４８時間前に、２０，０００〜４０，０００個のＨＥＫ２９３細胞を、ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）でプレコートした９６ウェルプレートに播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）をベースとしたトランスフェクションの場合、トランスフェクションを行う日に、培地を、５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ無血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）と交換した。それぞれのウェルに関して、４００ｎｇのｍＲＮＡを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭと混合して、最終容量を２５μｌとし、そして、０．４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を、２４．６μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合した。溶液を、室温で、５分間、プレインキュベートした。次いで、それらを合わせて、室温で、２０分間インキュベートした。５０μｌのｍＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体を、それぞれのウェルに加えて、細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの４時間後に、培地を、ＤＭＥＭ及び１０％  ＦＢＳと交換した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いた繰り返し（連続）トランスフェクションでは、播種した細胞数を、１２，０００個／ウェルにまで減らした。細胞を、０日目に播種し、そして、２、３、及び、４日目にトランスフェクションした。
【００７３】
ＴｒａｎｓＩＴ  ｍＲＮＡ（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）をベースとしたＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションでは、細胞を、ポリ−Ｌ−リジンで前処理した９６ウェルプレートに、２５，０００個の細胞／ウェルで播種した。７２時間後に、４００ｎｇ  ｍＲＮＡ、０．２２μｌ  ＴｒａｎｓＩＴ  ｍＲＮＡ試薬、０．１４μｌ  ＴｒａｎｓＩＴ  ｂｏｏｓｔ試薬、及び、ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ無血清培地を、１７．５μｌ／ウェルの最終体積に至るまで使用した。トランスフェクションの２４時間後に、培地を、増殖培地と交換した。ＭＤＤＣトランスフェクションについては、凍結細胞を、解凍、洗浄し、そして、９６ウェルプレートに、５０，０００個／ウェルの細胞を置いた。０．１１μｌ  ＴｒａｎｓＩＴ  ｍＲＮＡと、０．０７μｌ  ｂｏｏｓｔ試薬を使用して、細胞を、２４時間後に、トランスフェクションした。トランスフェクションの４時間後に、培地を交換した。
【００７４】
ＳＥＡＰ及びｅＧＦＰの定量
ｅＧＦＰを定量するために、プレートを、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ２１０５  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒで読み取りをした。自然免疫原性の測定では、トランスフェクションの２２〜２４時間後に、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ａｓｓａｙ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）で、ＳＥＡＰ活性を測定した。ホスファターゼアッセイのインキュベーションを、３７℃で、２時間、実施した。
【００７５】
実施例２
一部の実施形態では、配列の改変を、ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡをコードするテンプレートＤＮＡのＯＲＦ（コード領域）について行った。Ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ（５’ＵＴＲ）、及び、ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓアルファ−グロビン（３’ＵＴＲ）由来の隣接ＵＴＲ配列と、ポリＡ尾部［１２０個のＡ］を有する、未改変またはネイティブ（野生型）のｅＧＦＰ  ｍＲＮＡ。
【００７６】
（配列番号１）は、ＴＬＲ８結合に関与する１１個の免疫原性モチーフを有しており、これらの内の７つは、ｍＲＮＡのコード領域に認められており、そして、その他の４つは、５’−及び３’ＵＴＲ領域内に局在していた（図１Ａ）。大雑把な改変手法は、結果として、コード領域内の７つの免疫原性モチーフの内の５つを除去しており、しかも、合計で７８個の配列の変化を有する低ＧＵ  ｍＲＮＡ（配列番号２）をもたらしていた。対照的に、正確に配列を改変する手法では、コード領域内の７つの免疫原性モチーフのすべてを除去しており、しかも、配列の変化が非常に少ない（合計７つ）低モチーフｍＲＮＡ（配列番号３）をもたらしていた（図１Ｂ）。
【００７７】
実施例３
一部の実施形態では、配列を改変したｍＲＮＡを、ＴＬＲ８を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００でトランスフェクションした（図２）。２７，０００個の細胞／ウェルを、ポリ−Ｌ−リジンで前処理した９６ウェルプレートに播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して、４８時間後に、それぞれのウェルで、４００ｎｇ／ウェルのｍＲＮＡをトランスフェクションした。４時間後に、培地を交換した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞培養上清でのＳＥＡＰ活性を定量して、自然免疫原性を決定した（図２）。ＴＬＲ８刺激の抑制が、低ＧＵ  ｍＲＮＡ（粗製）と、低モチーフｍＲＮＡの両方で認められた。大雑把な手法と、正確な手法（粗製＋低モチーフｍＲＮＡ）を組み合わせて使用しても、ＴＬＲ８の活性がさらに抑制を受けることはなかった。
【００７８】
実施例４
一部の実施形態では、配列を改変したｍＲＮＡを、ＴＬＲ８を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞、または、ＴＬＲ８を過剰発現しない親ＨＥＫ２９３  Ｎｕｌｌ細胞に、ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡ試薬を使用して、トランスフェクションした（図３）。３５，０００個の細胞／ウェルを、ポリ−Ｌ−リジンで前処理した９６ウェルプレートに播種した。４８時間後に、細胞に、４００ｎｇ／ウェルのｍＲＮＡをトランスフェクションした。４時間後に、培地を交換した。自然免疫原性を、トランスフェクションの前と２４時間後に、細胞培養上清でのＳＥＡＰ活性を定量して決定した。トランスフェクション前のＳＥＡＰ読取値を使用して、免疫シグナルを、播種した細胞量に対して正規化させた。ＴｒａｎｓＩＴをベースとした送達系では、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００をベースとしたトランスフェクションと同様に、正確な改変を行うことで、ＴＬＲ８刺激の抑制が認められた。化学的に修飾したｍＲＮＡも、同様に抑制を受けたＴＬＲ８刺激を示した。大雑把な手法でもＴＬＲ８活性の抑制が認められたが、低ＧＵ  ｍＲＮＡのＳＥＡＰシグナルは、低モチーフｍＲＮＡと、化学修飾ｍＲＮＡとでのＳＥＡＰシグナルと比較して大きかった。
【００７９】
実施例５
一部の実施形態では、配列を改変したｍＲＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して、ＴＬＲ８を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした（図４）。２７，０００個の細胞／ウェルを、ポリ−Ｌ−リジンで前処理した９６ウェルプレートに播種した。それぞれのウェルを、４８時間後に、４００ｎｇ／ウェルのｍＲＮＡでトランスフェクションした。４時間後に、培地を交換した。トランスフェクションの６日後に、ｅＧＦＰのタンパク質発現レベルを、プレートを画像化して決定し（図４Ａ）、そして、それぞれのウェルでのｅＧＦＰシグナルを定量した（図４Ｂ）。ｅＧＦＰ発現に基づいて、大雑把な手法と化学的修飾が、ｍＲＮＡ翻訳の抑制を招いたが、正確な配列の改変（低モチーフｍＲＮＡ）では、保存された翻訳が認められた。
【００８０】
実施例６
一部の実施形態では、配列を改変したｍＲＮＡを、ＴｒａｎｓＩＴ  ｍＲＮＡ試薬を使用して、ＭＤＤＣにトランスフェクションした（図５）。５０，０００個の細胞／ウェルを、９６ウェルプレートに播種した。それぞれのウェルを、２４時間後に、４００ｎｇ／ウェルのｍＲＮＡでトランスフェクションした。４時間後に、培地を交換した。トランスフェクションの４日後に、ｅＧＦＰのタンパク質発現レベルを、プレートを画像化して決定し（図５Ａ）、そして、それぞれのウェルのｅＧＦＰシグナルを定量した（図５Ｂ）。ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅでトランスフェクションしたｍＲＮＡと同様に、ＴｒａｎｓＩＴでトランスフェクションしたｍＲＮＡは、低ＧＵ  ｍＲＮＡと比較して、低モチーフｍＲＮＡの翻訳活性の改善を示した。
【００８１】
実施例７
別の仕様では、配列を改変したｍＲＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬を使用して、ＴＬＲ８を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に繰り返しトランスフェクションした（図６）。１２，０００個の細胞／ウェルを、０日目に、ポリ−Ｌ−リジンで前処理した９６ウェルプレートに播種した。それぞれのウェルを、２、３、及び、４日目に、４００ｎｇ／ウェルのｍＲＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクションの４時間後に、培地を交換した。４、７、及び、１１日目に、ｅＧＦＰのタンパク質発現レベルを、それぞれのウェルのｅＧＦＰシグナルを定量して決定した（図５Ｂ）。トランスフェクションの繰り返し設定では、低モチーフｍＲＮＡは、低ＧＵ  ｍＲＮＡと、野生型（非改変）ｍＲＮＡの両方よりも高水準の翻訳を示した。
【００８２】
配列表
配列番号１
野生型ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡのインビトロ転写のための合成テンプレートＤＮＡ配列。Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位、Ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ  ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）コード配列のネイティブ（野生型）バージョン、ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  アルファ−グロブリン３’ＵＴＲ、及び、ポリＡ尾部［１２０個のＡ］を含む合成ＤＮＡ配列
【化１】
2021533826.tif 000005
【００８３】
配列番号２
大雑把に改変した（低ＧＵ）ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡのインビトロ転写のための合成テンプレートＤＮＡ配列、コード配列：Ｇ及びＵを減らしたＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ｅＧＦＰコード配列。
【化２】
2021533826.tif 000006
【００８４】
配列番号３
低モチーフｅＧＦＰ  ｍＲＮＡのインビトロ転写のための合成テンプレートＤＮＡ配列。コード配列：ＫＮＵＮＤＫモチーフを除去したＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ｅＧＦＰコード配列。
【化３】
2021533826.tif 000007
【００８５】
配列番号４
粗製（低ＧＵ）及び低モチーフｅＧＦＰ  ｍＲＮＡのインビトロ転写のための合成テンプレートＤＮＡ配列。コード配列：ＫＮＵＮＤＫモチーフを除去しており、そして、ＧＵは、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ｅＧＦＰを抑制した。
【化４】
2021533826.tif 000008
【００８６】
配列番号５
ＤＮＡ−人工配列−オリゴヌクレオチド
【化５】
2021533826.tif 000009
【００８７】
配列番号６
ＤＮＡ−人工配列−オリゴヌクレオチド
【化６】
2021533826.tif 000010
【図１Ａ】
2021533826.tif 000011
【図１Ｂ】
2021533826.tif 000012
【図２】
2021533826.tif 000013
【図３】
2021533826.tif 000014
【図４】
2021533826.tif 000015
【図５】
2021533826.tif 000016
【図６】
2021533826.tif 000017
【配列表】
2021533826000001.app
【国際調査報告】
2021533826.tif 000018
2021533826.tif 000019
2021533826.tif 000020