(57)【要約】本明細書では、サイトカイン放出症候群及び／またはＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチーを緩和するための、ＣＡＲ−Ｔ細胞などのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞から分泌されたサイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子編集または内在性抑制を行うための方法を開示する。これらの方法は、ＣＡＲをサイトカイン遺伝子の遺伝子座に挿入して、そのサイトカイン遺伝子の発現を阻害することを含む。本明細書で更に開示するのは、サイトカイン遺伝子の遺伝子座に挿入されたＣＡＲを有する（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞、ならびに、サイトカイン放出症候群及び／またはＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチーの発症率の低い免疫治療薬を用いて疾患を治療するための方法である。【選択図】図１
2021525530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカイン放出症候群に関与するサイトカインもしくはケモカインまたは転写因子を欠損した、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞。
【請求項２】
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の欠損は、前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子をコードする遺伝子の欠失または抑制によりもたらされる、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記欠失または抑制は、前記ＣＡＲを、前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子の遺伝子座に挿入することによりもたらされる、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
前記ＣＡＲは、選択マーカーもまた含む構築物の一部である、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記選択マーカーは、緑色蛍光（ＧＦＰ）遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、ｔＣＤ３４遺伝子、またはｔＥＧＦＲ遺伝子を含む、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の欠損は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）編集、またはＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）編集による、前記サイトカインまたはケモカインの遺伝子の欠失または抑制によりもたらされる、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
欠失または抑制は、ＣＲＩＳＰＲを使用することによりもたらされる、請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
欠失または抑制は、Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲを使用することによりもたらされる、請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
前記Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡまたはタンパク質として前記細胞内に送達される、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡとして前記細胞内に送達される、請求項８に記載の細胞。
【請求項１１】
前記Ｃａｓ９は、タンパク質として前記細胞内に送達される、請求項８に記載の細胞。
【請求項１２】
欠失または抑制される前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、前記Ｃａｓ９と同時に送達される、請求項６から請求項１１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１３】
前記送達はエレクトロポレーションによる、請求項９から請求項１２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の欠損は、１種または複数種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクションによる、前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子転写物の抑制によりもたらされる、請求項１に記載の細胞。
【請求項１５】
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の欠損は、１種または複数種の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の形質導入による、前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子転写物の抑制によりもたらされる、請求項１に記載の細胞。
【請求項１６】
少なくとも１種のＣＡＲを発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞であって、
前記少なくとも１種のＣＡＲは、サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の、遺伝子または転写因子遺伝子の遺伝子座に挿入される、
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）編集、及びＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）編集、から選択される方法により欠失または抑制される、
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子は、小胞体（ＥＲ）内の前記サイトカインまたはケモカインに結合して分泌を防止する、前記ＥＲに結合するテザーを有するｓｃＦｖの発現により抑制される、
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子転写物は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクションにより抑制される、あるいは、
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子転写物は、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の形質導入により抑制される、
前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞。
【請求項１７】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）、ＣＡＲ保有ｉＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ−ＣＡＲ）及びＣＡＲ保有ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＮＫ−ＣＡＲ）、またはＣＡＲ保有マクロファージ、から選択される、請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１８】
ＣＡＲ−Ｔである、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
デュアルＣＡＲ−ＴまたはタンデムＣＡＲ−Ｔである、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
ｉＮＫＴ−ＣＡＲである、請求項１７に記載の細胞。
【請求項２１】
デュアルｉＮＫＴ−ＣＡＲまたはタンデムｉＮＫＴ−ＣＡＲである、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
ＣＡＲマクロファージである、請求項１７に記載の細胞。
【請求項２３】
デュアルＣＡＲマクロファージまたはタンデムＣＡＲマクロファージである、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子は、サイトカイン放出症候群の発症に寄与する、請求項１から請求項２３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２５】
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子は、表１０に記載のサイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の中から選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項２６】
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子は、骨髄細胞を活性化または局在化するＴ細胞により産生される、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子は、骨髄細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞を活性化するＴ細胞表面受容体遺伝子である、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２８】
欠失または抑制される前記遺伝子は、ＣＡＲ−Ｔ細胞シグナル伝達に組み込まれたＴ細胞表面受容体である、請求項２に記載の細胞。
【請求項２９】
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子は、Ｔ細胞／ＣＡＲ−Ｔ細胞の分化を駆動する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３０】
前記サイトカインまたはケモカインは、Ｔ細胞／ＣＡＲ−Ｔ細胞の分化を駆動する転写因子である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３１】
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子は、ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）、ＭＣＰ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｉｌ−４、及びＩＦＮγから選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項３２】
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子は、ＧＭ−ＣＳＦである、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
ＧＭ−ＣＳＦ欠損ＣＡＲ−Ｔ細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
ＧＭ−ＣＳＦ欠損ｉＮＫＴ−ＣＡＲ細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３５】
使用する前記免疫エフェクター細胞は、健康なドナーから採取される、請求項１に記載の細胞。
【請求項３６】
前記ドナーはヒトである、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
前記キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３８】
悪性細胞上に発現した前記１種または複数種の抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ−３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、から選択される、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
前記キメラ抗原受容体は、悪性Ｔ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、請求項１から請求項３８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４０】
前記抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＣＲＡ、及びＴＣＲβ、から選択される、請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
前記キメラ抗原受容体は、悪性Ｂ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、請求項１から請求項３８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４２】
前記抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３８、及びＣＤ４５、から選択される、請求項４１に記載の細胞。
【請求項４３】
前記抗原は、ＣＤ１９及びＣＤ２０から選択される、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４４】
前記キメラ抗原受容体は、悪性中皮細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、請求項１から請求項３８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４５】
前記抗原はメソテリンである、請求項４４に記載の細胞。
【請求項４６】
前記キメラ抗原受容体は、悪性形質細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、請求項１から請求項３８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４７】
前記抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、及びＣＤ１９、から選択される、請求項４６に記載の細胞。
【請求項４８】
前記キメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方を効果的に共標的とする、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩに対するリガンドである、前記ＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分を発現する、請求項３７に記載の細胞。
【請求項４９】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は自殺遺伝子を更に含む、請求項１から請求項４８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５０】
内在性Ｔ細胞受容体介在性シグナル伝達は、前記細胞内においてごくわずかである、請求項１から請求項４９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５１】
アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しない、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５２】
同胞殺しを誘導しない、請求項１から請求項５１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５３】
請求項１から請求項５２のいずれか１項に記載の細胞を投与することを含む、サイトカイン放出症候群及び／またはＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチーの発症率が低い患者におけるがんを治療するための方法。
【請求項５４】
前記がんは血液悪性腫瘍である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記血液悪性腫瘍はＴ細胞悪性腫瘍である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｔ細胞悪性腫瘍はＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記Ｔ細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記血液悪性腫瘍は多発性骨髄腫である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記血液悪性腫瘍はＡＭＬである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
前記がんは固形腫瘍である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
前記がんは、子宮頸癌、膵臓癌、卵巣癌、中皮腫、及び肺癌である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）免疫治療薬、ＣＡＲ保有ｉＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ−ＣＡＲ）免疫治療薬、ＣＡＲ保有ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＮＫ−ＣＡＲ）免疫治療薬、またはＣＡＲ保有マクロファージ（ＣＡＲマクロファージ）免疫治療薬、を投与されている患者におけるサイトカイン放出症候群またはＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチーを予防または抑制するための方法であって、請求項１から請求項５２のいずれか１項に記載の細胞を前記免疫治療薬として投与することを含む、前記方法。
【請求項６３】
前記患者はがんの治療を受けている、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記がんは血液悪性腫瘍である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記血液悪性腫瘍はＴ細胞悪性腫瘍である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記Ｔ細胞悪性腫瘍はＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記Ｔ細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記血液悪性腫瘍は多発性骨髄腫である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記血液悪性腫瘍はＡＭＬである、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記がんは固形腫瘍である、請求項６２に記載の方法。
【請求項７１】
前記がんは、子宮頸癌、膵臓癌、卵巣癌、中皮腫、及び肺癌である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）、ＣＡＲ保有ｉＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ−ＣＡＲ）、ＣＡＲ保有ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＮＫ−ＣＡＲ）、またはＣＡＲ保有マクロファージ（ＣＡＲマクロファージ）を用いて、サイトカイン遺伝子もしくはケモカイン遺伝子または転写因子遺伝子の発現を阻害するための方法であって、前記サイトカイン遺伝子もしくはケモカイン遺伝子または転写因子遺伝子の遺伝子座にＣＡＲを挿入することを含む、前記方法。
【請求項７３】
前記サイトカイン遺伝子もしくはケモカイン遺伝子または転写因子遺伝子の前記発現を阻害することは、ＣＡＲ−Ｔ細胞介在性殺傷を抑制しない、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子を欠失または抑制することを含む、ＣＲＳまたはＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチー（ＣＡＮ）を引き起こさない、または、前記ＣＲＳまたはＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチー（ＣＡＮ）に寄与しない、ＣＡＲ−Ｔ（免疫エフェクター）細胞、を作製するための方法。
【請求項７５】
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子を欠失または抑制することは、ＣＡＲ−Ｔ細胞介在性殺傷を抑制しない、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記欠失または抑制は、前記ＣＡＲを、前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子の遺伝子座に挿入することによりもたらされる、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＣＡＲは、選択マーカーもまた含む構築物の一部である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記選択マーカーは、緑色蛍光（ＧＦＰ）遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、ｔＣＤ３４遺伝子、またはｔＥＧＦＲ遺伝子を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項７９】
選択マーカーを有するＣＡＲを前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子に挿入することにより、ＴＣＲ陰性細胞の単一工程精製が可能となる、請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
選択マーカーを有するＣＡＲを前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子に挿入することにより、ＣＡＲ＋サイトカイン陰性細胞の単一工程精製が可能となる、請求項７４に記載の方法。
【請求項８１】
前記欠失または抑制は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）編集、またはＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）編集を使用することによりもたらされる、請求項７４に記載の方法。
【請求項８２】
前記欠失または抑制は、ＣＲＩＳＰＲを使用することによりもたらされる、請求項７４に記載の方法。
【請求項８３】
前記欠失または抑制は、Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲを使用することによりもたらされる、請求項７４に記載の方法。
【請求項８４】
前記Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡまたはタンパク質として前記細胞内に送達される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡとして前記細胞内に送達される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記Ｃａｓ９は、タンパク質として前記細胞内に送達される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
欠失または抑制される前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、前記Ｃａｓ９と同時に送達される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８８】
前記送達はエレクトロポレーションによる、請求項７４に記載の方法。
【請求項８９】
前記欠失または抑制は、１種または複数種の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の形質導入による、前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子転写物の抑制によりもたらされる、請求項７４に記載の方法。
【請求項９０】
前記欠失または抑制は、タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）をコードする構築物を形質導入することによりもたらされる、請求項７４に記載の方法。
【請求項９１】
前記構築物は、前記サイトカイン、ケモカイン、またはＴＦの遺伝子に特異的な、抗体由来単鎖可変フラグメントをコードする、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記サイトカイン、ケモカイン、または転写因子の遺伝子の欠失は、ＣＡＲ−Ｔ介在性殺傷を抑制しない、請求項５３から請求項９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
挿入される前記ＣＡＲは、ドナー鋳型を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項９４】
ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＤＮＡを含む、請求項９３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年６月１日に出願された米国仮出願第６２／６７９，５９７号の利益を主張するものであり、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、血液悪性腫瘍を治療するための有望な治療法として登場した。Ｂ細胞悪性腫瘍に対する注目すべき臨床効果にもかかわらず、ＣＡＲ−Ｔ療法の成功は、患者の５０％超に認められる重度の生命を脅かす毒性によって、限定的なものとなっている。これらの毒性により、臨床試験の早期終了につながる数名の死亡という結果となった。主にサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ、「サイトカインストーム」とも呼ばれる）として顕在化する毒性は、ＩＮＦγ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、ＩＬ−１０、及びＩＬ−６を含むサイトカインの極端な上昇を特徴としている。これらサイトカインの上昇は、発熱、低血圧症、臓器機能障害、呼吸不全、及び凝血異常を含む多くの臨床症状の原因となる。ＣＲＳは致命的となり得る。加えて、ＣＲＳの初期症状が軽減した後であっても、神経毒性が現れることが多い。ＣＲＳ及び関連神経毒性の病因に対する理解は不十分であり、メカニズムの更なる理解は、ＣＡＲ−Ｔ療法の順調な移行において有用となり得る。その一方で、発現に利用可能なサイトカイン遺伝子のレベルを抑制することによってＣＲＳの病因を阻害することは、症状を緩和するための１つの方法である。
【０００３】
本明細書では、サイトカイン放出症候群及び／またはＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチーを緩和するための、ＣＡＲ−Ｔ細胞などのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞から分泌されたサイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子欠失及び内在性抑制を行うための方法を開示する。これらの遺伝子欠失法としては、サイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子の遺伝子座にＣＡＲを挿入すること、サイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子の発現を阻害すること、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、またはＣＲＩＳＰＲを用いた遺伝子編集、小胞体（ＥＲ）内のサイトカインに結合して分泌を防止する、ＥＲに結合するテザーを有するｓｃＦｖの発現、及び、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクション、を挙げることができるがこれらに限定されない。本明細書ではまた、これら記載するサイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子の欠失法を用いて修飾されたＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞、ならびに、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）及び／またはＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチー（ＣＡＮ）の発症率の低い免疫治療薬を用いて疾患を治療するための方法、を開示する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、サイトカインの翻訳を阻害することにより、サイトカインを欠失させるまたはサイトカインのレベルを低下させて、それにより、サイトカイン放出症候群及び／またはＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞関連ニューロパチー（ＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチー）を予防または抑制するための、サイトカイン用の遺伝子にＣＡＲを挿入するコンセプトを示す。
【０００５】
図２は、本明細書で開示するＣＡＲ−Ｔ細胞を用いて血液悪性腫瘍を治療するための方法の時間表を示す。当業者は、示した期間にある程度の自由度が可能であることを理解するであろう。
【０００６】
図３は、ＣＤ３４をＧＭ−ＣＳＦ遺伝子座に挿入するためのＡＡＶドナー構築物を示す。
【０００７】
図４は、ＧＦＰをＣＤ３ε遺伝子座に挿入するために用いるＷＣ４０プラスミドベクターを示す。
【０００８】
図５は、ＧＦＰをＣＤ３ε遺伝子座に挿入するためのＡＡＶドナー構築物を示す。
【０００９】
図６は、ＣＡＲ１９−ＧＭ−ＣＳＦ  ＰＥＢＬ−ｔｒＣＤ３４構築物を示す。
【００１０】
図７は、ＧＭ−ＣＳＦノックアウト、野生型、及び対照の、Ｔ細胞、ｉＤＣ細胞、Ｔ細胞＋ｉＤＣ、Ｔ細胞＋ビーズ、及びｉＤＣ＋ビーズ＋Ｔ細胞における、２４時間時点のＩＬ−６発現を示す。
【００１１】
図８は、ＣＡＲ１９  ＧＭ−ＣＳＦノックアウト、ＣＡＲ１９、及び対照の、ＣＡＲ１９、ｉＤＣのみ、活性化ＭＱのみ、ＭＣのみ、ＲＡＭＯＳのみ、ＣＡＲ１９＋ｉＤＣ、ＣＡＲ１９＋活性化ＭＱ、ＣＡＲ１９＋ＭＱ、ＣＡＲ１９＋ＲＡＭＯＳ、ｉＤＣ＋ＲＡＭＯＳ＋ＣＡＲ−Ｔ、活性化ＭＱ＋ＲＡＭＯＳ＋ＣＡＲ−Ｔ、及びＭＱ＋ＲＡＭＯＳ＋ＣＡＲ−Ｔにおける、２４時間時点のＩＬ−６発現を示す。
【００１２】
図９は、ＧＭ−ＣＳＦノックアウト、野生型、及び対照の、Ｔ細胞、ｉＤＣ細胞、Ｔ細胞＋ｉＤＣ、Ｔ細胞＋ビーズ、及びｉＤＣ＋ビーズ＋Ｔ細胞における、４８時間時点のＩＬ−６発現を示す。
【００１３】
図１０は、ＣＡＲ１９  ＧＭ−ＣＳＦノックアウト、ＣＡＲ１９、及び対照の、ＣＡＲ１９、ｉＤＣのみ、活性化ＭＱのみ、ＭＣのみ、ＲＡＭＯＳのみ、ＣＡＲ１９＋ｉＤＣ、ＣＡＲ１９＋活性化ＭＱ、ＣＡＲ１９＋ＭＱ、ＣＡＲ１９＋ＲＡＭＯＳ、ｉＤＣ＋ＲＡＭＯＳ＋ＣＡＲ−Ｔ、活性化ＭＱ＋ＲＡＭＯＳ＋ＣＡＲ−Ｔ、及びＭＱ＋ＲＡＭＯＳ＋ＣＡＲ−Ｔにおける、４８時間時点のＩＬ−６発現を示す。
【００１４】
図１１は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の特定のマーカーを検出するための、ＥＬＩＳＡプレートのセットアップを示す。
【００１５】
図１２ａおよび図１２ｂは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の特定のマーカーを検出するためのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。ＥＬＩＳＡプレートの上半分を示す。行Ａ〜Ｈのそれぞれにおける上から下にかけて、サブ行は、［４５０］試験、［５４０］参照、経路長、４５０、５４０、補正［４５０］、及び補正［５４０］を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
それゆえ、本明細書では、実施形態１として、サイトカイン放出症候群に関与するサイトカインもしくはケモカインまたは転写因子を欠損した、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞を開示する。
【００１７】
以下の開示は、サイトカイン欠損細胞の詳細な実施形態、選択肢、及び使用、ならびに、例えば、疾患を治療するための、免疫療法及び養子細胞移入におけるこのような細胞の使用である。それゆえ、本明細書では、以下の更なる実施形態を提供する。
【００１８】
実施形態２−前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の欠損は、前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子をコードする遺伝子の欠失または抑制によりもたらされる、実施形態１に記載の細胞。
【００１９】
実施形態３−前記欠失または抑制は、前記ＣＡＲを、前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子の遺伝子座に挿入することによりもたらされる、実施形態１または実施形態２のいずれか１つに記載の細胞。
【００２０】
実施形態４−前記ＣＡＲは、選択マーカーもまた含む構築物の一部である、実施形態１から実施形態３のいずれか１つに記載の細胞。
【００２１】
実施形態５−前記選択マーカーは、緑色蛍光（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光（ＹＦＰ）遺伝子、トランケートＣＤ３４（ｔＣＤ３４）遺伝子、またはトランケートＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）遺伝子を含む、実施形態１から実施形態４のいずれか１つに記載の細胞。
【００２２】
実施形態６−前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の欠損は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）編集、またはＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）編集による、前記サイトカインまたはケモカインの遺伝子の欠失または抑制によりもたらされる、実施形態１から実施形態５のいずれか１つに記載の細胞。
【００２３】
実施形態７−欠失または抑制は、ＣＲＩＳＰＲを使用することによりもたらされる、実施形態１から実施形態６のいずれか１つに記載の細胞。
【００２４】
実施形態８−欠失または抑制は、Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲを使用することによりもたらされる、実施形態１から実施形態７のいずれか１つに記載の細胞。
【００２５】
実施形態９−前記Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡまたはタンパク質として前記細胞内に送達される、実施形態１から実施形態８のいずれか１つに記載の細胞。
【００２６】
実施形態１０−前記Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡとして前記細胞内に送達される、実施形態１から実施形態９のいずれか１つに記載の細胞。
【００２７】
実施形態１１−前記Ｃａｓ９は、タンパク質として前記細胞内に送達される、実施形態１から実施形態１０のいずれか１つに記載の細胞。
【００２８】
実施形態１２−欠失または抑制される前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、前記Ｃａｓ９と同時に送達される、実施形態１から実施形態１１のいずれか１つに記載の細胞。
【００２９】
実施形態１３−前記送達はエレクトロポレーションによる、実施形態１から実施形態１２のいずれか１つに記載の細胞。
【００３０】
実施形態１４−前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の欠損は、１種または複数種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクションによる、前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子転写物の抑制によりもたらされる、実施形態１から実施形態１３のいずれか１つに記載の細胞。
【００３１】
実施形態１５−前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の欠損は、１種または複数種の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の形質導入による、前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子転写物の抑制によりもたらされる、実施形態１から実施形態１４のいずれか１つに記載の細胞。
【００３２】
実施形態１６−少なくとも１種のＣＡＲを発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞であって、
前記少なくとも１種のＣＡＲは、サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の、遺伝子または転写因子遺伝子の遺伝子座に挿入される、
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）編集、及びＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）編集、から選択される方法により欠失または抑制される、
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子は、小胞体（ＥＲ）内の前記サイトカインまたはケモカインに結合して分泌を防止する、前記ＥＲに結合するテザーを有するｓｃＦｖの発現により抑制される、
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子転写物は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクションにより抑制される、あるいは、
前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子転写物は、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の形質導入により抑制される、
前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞。
【００３３】
実施形態１７−キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）、ＣＡＲ保有ｉＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ−ＣＡＲ）及びＣＡＲ保有ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＮＫ−ＣＡＲ）、またはＣＡＲ保有マクロファージ、から選択される、実施形態１から実施形態１６のいずれか１つに記載の細胞。
【００３４】
実施形態１８−ＣＡＲ−Ｔである、実施形態１から実施形態１７のいずれか１つに記載の細胞。
【００３５】
実施形態１９−デュアルＣＡＲ−ＴまたはタンデムＣＡＲ−Ｔである、実施形態１から実施形態１８のいずれか１つに記載の細胞。
【００３６】
実施形態２０−ｉＮＫＴ−ＣＡＲである、実施形態１から実施形態１７のいずれか１つに記載の細胞。
【００３７】
実施形態２１−デュアルｉＮＫＴ−ＣＡＲまたはタンデムｉＮＫＴ−ＣＡＲである、実施形態１から実施形態２０のいずれか１つに記載の細胞。
【００３８】
実施形態２２−ＣＡＲマクロファージである、実施形態１から実施形態１７のいずれか１つに記載の細胞。
【００３９】
実施形態２３−デュアルＣＡＲマクロファージまたはタンデムＣＡＲマクロファージである、実施形態１から実施形態２２のいずれか１つに記載の細胞。
【００４０】
実施形態２４−前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子は、サイトカイン放出症候群の発症に寄与する、実施形態１から実施形態２３のいずれか１つに記載の細胞。
【００４１】
実施形態２５−前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子は、表１０に記載のサイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の中から選択される、実施形態１から実施形態２４のいずれか１つに記載の細胞。
【００４２】
実施形態２６−前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子は、骨髄細胞を活性化または局在化するＴ細胞により産生される、実施形態１から実施形態２５のいずれか１つに記載の細胞。
【００４３】
実施形態２７−前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子は、骨髄細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞を活性化するＴ細胞表面受容体遺伝子である、実施形態１から実施形態２６のいずれか１つに記載の細胞。
【００４４】
実施形態２８−欠失または抑制される前記遺伝子は、ＣＡＲ−Ｔ細胞シグナル伝達に組み込まれたＴ細胞表面受容体である、実施形態１から実施形態２７のいずれか１つに記載の細胞。
【００４５】
実施形態２９−前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子は、Ｔ細胞／ＣＡＲ−Ｔ細胞の分化を駆動する、実施形態１から実施形態２８のいずれか１つに記載の細胞。
【００４６】
実施形態３０−前記サイトカインまたはケモカインは、Ｔ細胞／ＣＡＲ−Ｔ細胞の分化を駆動する転写因子である、実施形態１から実施形態２９のいずれか１つに記載の細胞。
【００４７】
実施形態３１−前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子は、ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）、ＭＣＰ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｉｌ−４、及びＩＦＮγから選択される、実施形態１から実施形態３０のいずれか１つに記載の細胞。
【００４８】
実施形態３２−前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子はＧＭ−ＣＳＦである、実施形態１から実施形態３１のいずれか１つに記載の細胞。
【００４９】
実施形態３３−ＧＭ−ＣＳＦ欠損ＣＡＲ−Ｔ細胞である、実施形態１から実施形態３２のいずれか１つに記載の細胞。
【００５０】
実施形態３４−ＧＭ−ＣＳＦ欠損ｉＮＫＴ−ＣＡＲ細胞である、実施形態１から実施形態３３のいずれか１つに記載の細胞。
【００５１】
実施形態３５−使用する前記免疫エフェクター細胞は、健康なドナーから採取される、実施形態１から実施形態３４のいずれか１つに記載の細胞。
【００５２】
実施形態３６−前記ドナーはヒトである、実施形態１から実施形態３５のいずれか１つに記載の細胞。
【００５３】
実施形態３７−前記キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態１から実施形態３６のいずれか１つに記載の細胞。
【００５４】
実施形態３８−悪性細胞上に発現した前記１種または複数種の抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ−３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、から選択される、実施形態１から実施形態３７のいずれか１つに記載の細胞。
【００５５】
実施形態３９−前記キメラ抗原受容体は、悪性Ｔ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態１から実施形態３８のいずれか１つに記載の細胞。
【００５６】
実施形態４０−前記抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＣＲＡ、及びＴＣＲβ、から選択される、実施形態１から実施形態３９のいずれか１つに記載の細胞。
【００５７】
実施形態４１−前記キメラ抗原受容体は、悪性Ｂ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態１から実施形態３８のいずれか１つに記載の細胞。
【００５８】
実施形態４２−前記抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３８、及びＣＤ４５、から選択される、実施形態１から実施形態４１のいずれか１つに記載の細胞。
【００５９】
実施形態４３−前記抗原は、ＣＤ１９及びＣＤ２０から選択される、実施形態１から実施形態４２のいずれか１つに記載の細胞。
【００６０】
実施形態４４−前記キメラ抗原受容体は、悪性中皮細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態１から実施形態３８のいずれか１つに記載の細胞。
【００６１】
実施形態４５−前記抗原はメソテリンである、実施形態１から実施形態４４のいずれか１つに記載の細胞。
【００６２】
実施形態４６−前記キメラ抗原受容体は、悪性形質細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態１から実施形態３８のいずれか１つに記載の細胞。
【００６３】
実施形態４７−前記抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、及びＣＤ１９、から選択される、実施形態１から実施形態４６のいずれか１つに記載の細胞。
【００６４】
実施形態４８−前記キメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方を効果的に共標的とする、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩに対するリガンドである、前記ＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分を発現する、実施形態１から実施形態４７のいずれか１つに記載の細胞。
【００６５】
実施形態４９−前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は自殺遺伝子を更に含む、実施形態１から実施形態４８のいずれか１つに記載の細胞。
【００６６】
実施形態５０−内在性Ｔ細胞受容体介在性シグナル伝達は、前記細胞内においてごくわずかである、実施形態１から実施形態４９のいずれか１つに記載の細胞。
【００６７】
実施形態５１−アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しない、実施形態１から実施形態５０のいずれか１つに記載の細胞。
【００６８】
実施形態５２−同胞殺しを誘導しない、実施形態１から実施形態５１のいずれか１つに記載の細胞。
【００６９】
実施形態５３−実施形態１から実施形態５２のいずれか１つに記載の細胞を投与することを含む、サイトカイン放出症候群及び／またはＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチーの発症率が低い患者におけるがんを治療するための方法。
【００７０】
実施形態５４−前記がんは血液悪性腫瘍である、実施形態５３に記載の方法。
【００７１】
実施形態５５−前記血液悪性腫瘍はＴ細胞悪性腫瘍である、実施形態５３から実施形態５４のいずれか１つに記載の方法。
【００７２】
実施形態５６−前記Ｔ細胞悪性腫瘍はＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）である、実施形態５３から実施形態５５のいずれか１つに記載の方法。
【００７３】
実施形態５７−前記Ｔ細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫である、実施形態５３から実施形態５６のいずれか１つに記載の方法。
【００７４】
実施形態５８−前記血液悪性腫瘍は多発性骨髄腫である、実施形態５３から実施形態５７のいずれか１つに記載の方法。
【００７５】
実施形態５９−前記血液悪性腫瘍はＡＭＬである、実施形態５３から実施形態５８のいずれか１つに記載の方法。
【００７６】
実施形態６０−前記がんは固形腫瘍である、実施形態５３から実施形態５９のいずれか１つに記載の方法。
【００７７】
実施形態６１−前記がんは、子宮頸癌、膵臓癌、卵巣癌、中皮腫、及び肺癌である、実施形態５３から実施形態６０のいずれか１つに記載の方法。
【００７８】
実施形態６２−キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）免疫治療薬、ＣＡＲ保有ｉＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ−ＣＡＲ）免疫治療薬、ＣＡＲ保有ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＮＫ−ＣＡＲ）免疫治療薬、またはＣＡＲ保有マクロファージ（ＣＡＲマクロファージ）免疫治療薬、を投与されている患者におけるサイトカイン放出症候群またはＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチーを予防または抑制するための方法であって、実施形態５３から実施形態６１のいずれか１つに記載の細胞を前記免疫治療薬として投与することを含む、前記方法。
【００７９】
実施形態６３−前記患者はがんの治療を受けている、実施形態５３から実施形態６２のいずれか１つに記載の方法。
【００８０】
実施形態６４−前記がんは血液悪性腫瘍である、実施形態５３から実施形態６３のいずれか１つに記載の方法。
【００８１】
実施形態６５−前記血液悪性腫瘍はＴ細胞悪性腫瘍である、実施形態５３から実施形態６４のいずれか１つに記載の方法。
【００８２】
実施形態６６−前記Ｔ細胞悪性腫瘍はＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）である、実施形態５３から実施形態６５のいずれか１つに記載の方法。
【００８３】
実施形態６７−前記Ｔ細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫である、実施形態５３から実施形態６６のいずれか１つに記載の方法。
【００８４】
実施形態６８−前記血液悪性腫瘍は多発性骨髄腫である、実施形態５３から実施形態６７のいずれか１つに記載の方法。
【００８５】
実施形態６９−前記血液悪性腫瘍はＡＭＬである、実施形態５３から実施形態６８のいずれか１つに記載の方法。
【００８６】
実施形態７０−前記がんは固形腫瘍である、実施形態５３から実施形態６９のいずれか１つに記載の方法。
【００８７】
実施形態７１−前記がんは、子宮頸癌、膵臓癌、卵巣癌、中皮腫、及び肺癌である、実施形態５３から実施形態７０のいずれか１つに記載の方法。
【００８８】
実施形態７２−キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）、ＣＡＲ保有ｉＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ−ＣＡＲ）、ＣＡＲ保有ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＮＫ−ＣＡＲ）、またはＣＡＲ保有マクロファージ（ＣＡＲマクロファージ）を用いて、サイトカイン遺伝子もしくはケモカイン遺伝子または転写因子遺伝子の発現を阻害するための方法であって、前記サイトカイン遺伝子もしくはケモカイン遺伝子または転写因子遺伝子の遺伝子座にＣＡＲを挿入することを含む、前記方法。
【００８９】
実施形態７３−前記サイトカイン遺伝子もしくはケモカイン遺伝子または転写因子遺伝子の前記発現を阻害することは、ＣＡＲ−Ｔ細胞介在性殺傷を抑制しない、実施形態５３から実施形態７２のいずれか１つに記載の方法。
【００９０】
実施形態７４−サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子を欠失または抑制することを含む、ＣＲＳまたはＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチー（ＣＡＮ）を引き起こさない、または、前記ＣＲＳまたはＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチー（ＣＡＮ）に寄与しない、ＣＡＲ−Ｔ（免疫エフェクター）細胞、を作製するための方法。
【００９１】
実施形態７５−前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子を欠失または抑制することは、ＣＡＲ−Ｔ細胞介在性殺傷を抑制しない、実施形態５３から実施形態７４のいずれか１つに記載の方法。
【００９２】
実施形態７６−前記欠失または抑制は、前記ＣＡＲを、前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子の遺伝子座に挿入することによりもたらされる、実施形態５３から実施形態７５のいずれか１つに記載の方法。
【００９３】
実施形態７７−前記ＣＡＲは、選択マーカーもまた含む構築物の一部である、実施形態５３から実施形態７６のいずれか１つに記載の方法。
【００９４】
実施形態７８−前記選択マーカーは、緑色蛍光（ＧＦＰ）遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、ｔＣＤ３４遺伝子、またはｔＥＧＦＲ遺伝子を含む、実施形態５３から実施形態７７のいずれか１つに記載の方法。
【００９５】
実施形態７９−選択マーカーを有するＣＡＲを前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子に挿入することにより、ＴＣＲ陰性細胞の単一工程精製が可能となる、実施形態５３から実施形態７８のいずれか１つに記載の方法。
【００９６】
実施形態８０−選択マーカーを有するＣＡＲを前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子に挿入することにより、ＣＡＲ＋サイトカイン陰性細胞の単一工程精製が可能となる、実施形態５３から実施形態７９のいずれか１つに記載の方法。
【００９７】
実施形態８１−前記欠失または抑制は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）編集、またはＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）編集を使用することによりもたらされる、実施形態５３から実施形態８０のいずれか１つに記載の方法。
【００９８】
実施形態８２−前記欠失または抑制は、ＣＲＩＳＰＲを使用することによりもたらされる、実施形態５３から実施形態８１のいずれか１つに記載の方法。
【００９９】
実施形態８３−前記欠失または抑制は、Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲを使用することによりもたらされる、実施形態５３から実施形態８２のいずれか１つに記載の方法。
【０１００】
実施形態８４−前記Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡまたはタンパク質として前記細胞内に送達される、実施形態５３から実施形態８３のいずれか１つに記載の方法。
【０１０１】
実施形態８５−前記Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡとして前記細胞内に送達される、実施形態５３から実施形態８４のいずれか１つに記載の方法。
【０１０２】
実施形態８６−前記Ｃａｓ９は、タンパク質として前記細胞内に送達される、実施形態５３から実施形態８５のいずれか１つに記載の方法。
【０１０３】
実施形態８７−欠失または抑制される前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、前記Ｃａｓ９と同時に送達される、実施形態５３から実施形態８６のいずれか１つに記載の方法。
【０１０４】
実施形態８８−前記送達はエレクトロポレーションによる、実施形態５３から実施形態８７のいずれか１つに記載の方法。
【０１０５】
実施形態８９−前記欠失または抑制は、１種または複数種の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の形質導入による、前記サイトカインもしくはケモカインまたは転写因子の遺伝子転写物の抑制によりもたらされる、実施形態５３から実施形態８８のいずれか１つに記載の方法。
【０１０６】
実施形態９０−前記欠失または抑制は、タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）をコードする構築物を形質導入することによりもたらされる、実施形態５３から実施形態８９のいずれか１つに記載の方法。
【０１０７】
実施形態９１−前記構築物は、前記サイトカイン、ケモカイン、またはＴＦの遺伝子に特異的な、抗体由来単鎖可変フラグメントをコードする、実施形態５３から実施形態９０のいずれか１つに記載の方法。
【０１０８】
実施形態９２−前記サイトカイン、ケモカイン、または転写因子の遺伝子の欠失は、ＣＡＲ−Ｔ介在性殺傷を抑制しない、実施形態５３から実施形態９１のいずれか１つに記載の方法。
【０１０９】
実施形態９３−挿入される前記ＣＡＲは、ドナー鋳型を含む、実施形態５３から実施形態９２のいずれか１つに記載の方法。
【０１１０】
実施形態９４−ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＤＮＡを含む、実施形態５３から実施形態９３のいずれか１つに記載の方法。
【０１１１】
本明細書で開示するのは、サイトカインを欠損したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞である。
【０１１２】
特定の実施形態では、サイトカインの欠損は、サイトカイン遺伝子もしくはケモカイン遺伝子または転写因子遺伝子の除去によりもたらされる。
【０１１３】
特定の実施形態では、除去は、ＣＡＲを、サイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子の遺伝子座に挿入することによりもたらされる。
【０１１４】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、選択マーカーもまた含む構築物の一部である。
【０１１５】
特定の実施形態では、サイトカインの欠損は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）編集、またはＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）編集による、サイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子の欠失または抑制によりもたらされる。
【０１１６】
特定の実施形態では、サイトカインの欠損は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクションによる、サイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子転写物の抑制によりもたらされる。
【０１１７】
本明細書で更に開示するのは、少なくとも１種のＣＡＲを発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞であり、
・少なくとも１種のＣＡＲは、サイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子の遺伝子座に挿入される、
・サイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）編集、及びＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）編集、から選択される方法により欠失もしくは抑制される、
・サイトカインは、小胞体（ＥＲ）内のサイトカインに結合して分泌を防止する、ＥＲに結合するテザーを有するｓｃＦｖの発現により抑制される、または、
・サイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子転写物は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクションにより抑制される。
【０１１８】
特定の実施形態では、細胞は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）、ＣＡＲ保有ｉＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ−ＣＡＲ）、及びＣＡＲ保有ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＮＫ−ＣＡＲ）、から選択される。
【０１１９】
特定の実施形態では、細胞はＣＡＲ−Ｔである。
【０１２０】
特定の実施形態では、細胞はデュアルＣＡＲ−ＴまたはタンデムＣＡＲ−Ｔである。
【０１２１】
特定の実施形態では、細胞はｉＮＫＴ−ＣＡＲである。
【０１２２】
特定の実施形態では、細胞はデュアルｉＮＫＴ−ＣＡＲまたはタンデムｉＮＫＴ−ＣＡＲである。
【０１２３】
特定の実施形態では、サイトカインは、サイトカイン放出症候群の発症に寄与する。
【０１２４】
特定の実施形態では、サイトカインは、ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）、ＭＣＰ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、及びＩＦＮγ、から選択される。
【０１２５】
特定の実施形態では、サイトカインはＧＭ−ＣＳＦである。
【０１２６】
特定の実施形態では、細胞はＧＭ−ＣＳＦ欠損ＣＡＲ−Ｔ細胞である。
【０１２７】
特定の実施形態では、細胞はＧＭ−ＣＳＦ欠損ｉＮＫＴ−ＣＡＲ細胞である。
【０１２８】
特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、悪性Ｔ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する。
【０１２９】
特定の実施形態では、抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＣＲＡ、及びＴＣＲβ、から選択される。
【０１３０】
特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、悪性Ｂ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する。
【０１３１】
特定の実施形態では、抗原は、ＣＤ１９及びＣＤ２０から選択される。
【０１３２】
特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、悪性中皮細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する。
【０１３３】
特定の実施形態では、抗原はメソテリンである。
【０１３４】
特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、悪性形質細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する。
【０１３５】
特定の実施形態では、抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、及びＣＤ１９、から選択される。
【０１３６】
特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方を効果的に共標的とする、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩに対するリガンドである、ＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分を発現する。
【０１３７】
特定の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は自殺遺伝子を更に含む。
【０１３８】
特定の実施形態では、内在性Ｔ細胞受容体介在性シグナル伝達は、細胞内においてごくわずかである。
【０１３９】
特定の実施形態では、細胞は、アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しない。
【０１４０】
特定の実施形態では、細胞は同胞殺しを誘導しない。
【０１４１】
本明細書で更に開示するのは、本明細書で開示するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞を投与することを含む、サイトカイン放出症候群及び／またはＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチーの発症率が低い患者におけるがんを治療するための方法、である。
【０１４２】
特定の実施形態では、がんは血液悪性腫瘍である。
【０１４３】
特定の実施形態では、血液悪性腫瘍はＴ細胞悪性腫瘍である。
【０１４４】
特定の実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍はＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）である。
【０１４５】
特定の実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫である。
【０１４６】
特定の実施形態では、血液悪性腫瘍は多発性骨髄腫である。
【０１４７】
特定の実施形態では、がんは固形腫瘍である。
【０１４８】
特定の実施形態では、がんは、子宮頸癌、膵臓癌、卵巣癌、中皮腫、及び肺癌である。
【０１４９】
本明細書で更に開示するのは、本明細書で開示するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞を免疫治療薬として投与することを含む、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）免疫治療薬、ＣＡＲ保有ｉＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ−ＣＡＲ）免疫治療薬、またはＣＡＲ保有ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＮＫ−ＣＡＲ）免疫治療薬、を投与されている患者におけるサイトカイン放出症候群、ＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチーを予防または抑制するための方法、である。
【０１５０】
本明細書で更に開示するのは、サイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子の遺伝子座にＣＡＲを挿入することを含む、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）、ＣＡＲ保有ｉＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ−ＣＡＲ）、またはＣＡＲ保有ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＮＫ−ＣＡＲ）を用いて、サイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子の発現を阻害するための方法、である。
【０１５１】
ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、１）細胞外リガンド結合ドメイン、すなわち、抗原認識ドメイン、２）膜貫通ドメイン、及び３）シグナル伝達ドメイン、を含む、組換え融合タンパク質である。
【０１５２】
臨床グレードのＣＡＲ−Ｔ細胞集団のＣＡＲ設計、送達及び発現、ならびに製造を行うための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０１２，１８（１０）：２７８０−９０を参照されたい。ＣＡＲをコードする遺伝子改変キメラ抗原受容体ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド、抗原認識ドメイン、少なくとも１種の共刺激ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、を含む。
【０１５３】
キメラ抗原受容体の抗原特異的細胞外ドメインは、抗原（一般的には、悪性腫瘍の表面に発現した抗原）を認識してそれに特異的に結合する。「抗原特異的細胞外ドメイン」（すなわち、「抗原結合ドメイン」）は抗原に特異的に結合するが、その際、例えば、約０．１ｐＭ〜約１０μＭ、好ましくは約０．１ｐＭ〜約１μＭ、より好ましくは約０．１ｐＭ〜約１００ｎＭの親和性定数または相互作用（ＫＤ）の親和性で抗原に結合する。相互作用の親和性を測定するための方法は、当該技術分野において周知である。本開示のＣＡＲに用いるのに好適な抗原特異的細胞外ドメインは、任意の抗原結合ポリペプチドであってもよく、多種多様なそれらは、当技術分野において周知である。一部の例においては、抗原結合ドメインは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。その他の抗体ベース認識ドメイン、ｃＡｂ  ＶＨＨ（ラクダ科抗体可変ドメイン）及びそれらのヒト化型、ＩｇＮＡＲ  ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）及びそれらのヒト化型、ｓｄＡｂ  ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）、ならびに、「ラクダ化」抗体可変ドメイン、が使用に好適である。一部の例においては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベース認識ドメイン、例えば、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、ＶαＶβを含む一本鎖２ドメインＴＣＲ）などもまた、使用に好適である。
【０１５４】
本開示のキメラ抗原受容体はまた、抗原特異的細胞外ドメインに抗原が結合すると、ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞に細胞内シグナルをもたらす、「細胞内ドメイン」を含む。本開示のキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体を発現するＴ細胞における少なくとも１種のエフェクター機能の活性化に影響を及ぼす。用語「エフェクター機能」とは、ｉＮＫＴ細胞などの分化細胞における特殊機能のことを意味する。例えば、ｉＮＫＴ細胞のエフェクター機能は、ＮＫのトランス活性化、Ｔ細胞の活性化及び分化、Ｂ細胞の活性化、樹状細胞の活性化及びクロスプレゼンテーション活性、ならびにマクロファージの活性化、であってもよい。それゆえ、用語「細胞内ドメイン」とは、抗原が細胞外ドメインに結合すると、エフェクター機能シグナルを伝達してｉＮＫＴ細胞に特殊機能を実行させる、ＣＡＲの部分のことを意味する。好適な細胞内ドメインの非限定例としては、Ｔ細胞受容体のζ鎖またはそのホモログ（例えば、η、δ、γ、またはε）のいずれか、ＭＢ１鎖、８２９、Ｆｅ  Ｒｉｌｌ、Ｆｅ  Ｒｌ、及びＣＤ３ζとＣＤ２８などのシグナル伝達分子の組み合わせ、ＣＤ２７、４−１  ＢＢ、ＤＡＰ−１０、ＯＸ４０及びこれらの組み合わせ、ならびにその他の類似した分子及びフラグメント、が挙げられる。活性化タンパク質ファミリーのその他のメンバーの細胞内シグナル伝達部位、例えば、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃεＲＩなどを使用してもよい。通常は、完全な細胞内ドメインを採用するが、多くのケースでは、完全な細胞内ポリペプチドの使用は必須ではない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケート部分が有用となり得る範囲において、エフェクター機能シグナルをなおも伝達する限りにおいて、このようなトランケート部分をインタクト鎖の代わりに使用してもよい。それゆえ、用語「細胞内ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内ドメインの任意のトランケート部分を含むことを意味する。
【０１５５】
通常、抗原特異的細胞外ドメインは、「膜貫通ドメイン」により、キメラ抗原受容体の細胞内ドメインに連結している。膜貫通ドメインは細胞膜を貫通し、ＣＡＲをＴ細胞表面に固定し、細胞外ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結させることにより、Ｔ細胞表面上におけるＣＡＲの発現に影響を及ぼす。キメラ抗原受容体はまた、１種もしくは複数種の共刺激ドメイン及び／または１種もしくは複数種のスペーサーを更に含んでいてもよい。「共刺激ドメイン」は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるサイトカインの産生、増殖、細胞傷害性、及び／または持続性を向上させる共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインから誘導される。「ペプチドヒンジ」は抗原特異的細胞外ドメインを膜貫通ドメインに連結させる。膜貫通ドメインは共刺激ドメインに融合し、任意選択的に、共刺激ドメインは第２の共刺激ドメインに融合し、共刺激ドメインは、ＣＤ３ζに限定されないシグナル伝達ドメインに融合する。例えば、抗原特異的細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、及び複数のｓｃＦｖ（タンデムＣＡＲの場合）間にスペーサードメインを設けて、抗原結合ドメイン（複数可）の柔軟性に影響を及ぼすことにより、ＣＡＲ機能に影響を及ぼしてもよい。好適な膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及びスペーサーは、当該技術分野において周知である。
【０１５６】
レトロウイルスを用いて遺伝子改変ＣＡＲをＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞内に導入してもよく、それにより、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を標的細胞ゲノム内に効率的かつ安定的に組み込むことが可能となる。当該技術分野において周知のその他の方法としては、レンチウイルス形質導入、トランスポゾンベースのシステム、直接的なＲＮＡトランスフェクション、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（すなわちＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（すなわちＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（すなわちＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（すなわちＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（すなわちＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６などの好適なＣａｓタンパク質を用いたＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型のシステム）、が挙げられるがこれらに限定されない。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）もまた使用してもよい。例えば、Ｓｈｅａｒｅｒ  ＲＦ  ａｎｄ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ＤＮ，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ：  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ，”Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２０１５  Ｊａｎ；２０（１）：１−１０を参照されたい。
【０１５７】
ＰＩ３Ｋシグナル伝達の操作を使用して、構成的なＣＡＲの自己シグナル伝達による変異ＣＡＲ−Ｔ細胞の分化を防止してもよく、長命メモリーＴ細胞の発現を促進させてもよい。ＣＡＲ−Ｔの製造中及びｅｘ  ｖｉｖｏ増殖中にＰＩ３Ｋを薬理学的に阻害することにより、優先的なエフェクターＴ細胞の発現を阻害して、ＣＡＲ−Ｔのエフェクター／メモリー比率を、空のベクターを形質導入したＴ細胞に認められる比率にまで回復させることができ、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の持続性及び治療活性を向上させることができる。ｐ１１０δ  ＰＩ３Ｋを阻害することにより腫瘍特異的治療用ＣＤ８Ｔ細胞の有効性及び記憶を向上させることができる一方で、ｐ１１０α  ＰＩ３Ｋを阻害することによりサイトカイン産生及び抗腫瘍効果を向上させることができる。
【０１５８】
Ｔ細胞の表面上にＣＡＲが存在することにより、リガンドがない場合であってもＴ細胞の活性化及び分化に変化が生じ得ることから、このＰＩ３Ｋの阻害が提案されている。ｓｃＦｖフレームワークとシグナル伝達ドメインの両方に関連する、ＣＡＲによる構成的な自己シグナル伝達により、分化の変異及び生存率の低下を含む、異所性のＴ細胞挙動がもたらされ得る。この異所性のＴ細胞挙動は、患者におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性がそれらＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ寿命と直接関係している場合に重要である。ＣＤ２８共刺激ドメインが存在すると、持続的なＣＡＲの自己シグナル伝達が引き起こすＣＡＲ−Ｔ細胞の消耗が増加し、４−１ＢＢ共刺激ドメインの効果はより少ない。更に、ＣＤ３−ｚｅｔａは、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ及び解糖経路の構成的活性化を有意に向上させ、セントラル／ステムメモリー細胞よりも短命エフェクター細胞の形成を促進させる。例えば、Ｚｈａｎｇ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＩ３Ｋ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ＣＡＲ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１８  Ｎｏｖ  ９；９（８８）：３５８０７−３５８０８を参照されたい。
【０１５９】
ＣＡＲ抗原。本明細書で開示するｉＮＫＴ細胞を用いてゲノム編集される好適な抗原、及び本明細書で開示するｉＮＫＴ−ＣＡＲにおけるＣＡＲが認識する好適な抗原としては、血液悪性腫瘍に特異的な抗原が挙げられる。これら好適な抗原としては、Ｔ細胞特異的抗原、及び／またはＴ細胞に特異的ではない抗原を挙げることができる。抗原は、ｉＮＫＴ−ＣＡＲ細胞のキメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原であってもよく、ｉＮＫＴ−ＣＡＲ細胞が欠損している抗原は、悪性Ｔ細胞上に発現した抗原、好ましくは、非悪性Ｔ細胞と比較して悪性Ｔ細胞上に過剰発現した抗原（すなわち、Ｔ細胞悪性腫瘍に由来するＴ細胞）である。このような抗原の例としては、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＲＡＣ、及びＴＣＲβ、が挙げられる。
【０１６０】
Ｔ細胞悪性腫瘍は、Ｔ細胞前駆細胞、成熟Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞、に由来する悪性腫瘍を含む。Ｔ細胞悪性腫瘍の例としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）性白血病、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型陽性（ＨＴＬＶ−１＋）成人Ｔ細胞性白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、ならびに、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、ＡＬＫ陽性未分化大細胞リンパ腫、及びＡＬＫ陰性未分化大細胞リンパ腫を含むがこれらに限定されない、様々な末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、が挙げられる。
【０１６１】
好適なＣＡＲ抗原としてはまた、多発性骨髄腫細胞、すなわち、悪性形質細胞の表面上に認められる抗原、例えば、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、及びＣＤ１９などを挙げることができる。代替的に、多発性骨髄腫を治療するための、ＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方を効果的に共標的とする、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩに対するリガンドである、ＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分を発現するように、ＣＡＲを設計してもよい。
【０１６２】
本明細書で開示するｉＮＫＴ細胞を用いてゲノム編集される好適な抗原、及び本明細書で開示するｉＮＫＴ−ＣＡＲにおけるＣＡＲが認識する好適な抗原の別の例については、以下の表１〜１０に記載する。これらの抗原としては、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＲＡＣ、ＴＣＲβ、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、及びＣＤ３８、が挙げられる。
【０１６３】
同胞殺し抵抗性。本開示が包含するＣＡＲ−Ｔ、ｉＮＫＴ、ＮＫ、及びその他のＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する１種または複数種の抗原を任意選択的に欠損しており、その結果、同胞殺し抵抗性である。一部の実施形態では、細胞の１種または複数種の抗原は、キメラ抗原受容体が１種または複数種の修飾抗原にもはや特異的に結合しないように、修飾されている。例えば、キメラ抗原受容体が認識する１種もしくは複数種の抗原のエピトープは、１つもしくは複数のアミノ酸変異（例えば、置換または欠失）によって修飾されていてもよく、または、エピトープは、抗原から欠失されていてもよい。その他の実施形態では、１種または複数種の抗原の発現は、細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ以上低下する。タンパク質の発現を低下させるための方法は当技術分野において周知であり、タンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結するプロモーターを修飾または置換することが挙げられるがこれらに限定されない。更にその他の実施形態では、細胞は、例えば、１種または複数種の抗原をコードする遺伝子を欠失または破壊することにより、１種または複数種の抗原が発現しないように修飾される。上記の実施形態のそれぞれでは、ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する１種または好ましくは全ての抗原を欠損していてもよい。１種または複数種の抗原を欠損させる細胞を遺伝的に修飾するための方法は、当該技術分野において十分周知されており、非限定的な例については上に記載している。例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を用いて、１種または複数種の抗原を欠損させる細胞を修飾してもよい。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）もまた使用してもよい。例えば、Ｓｈｅａｒｅｒ  ＲＦ  ａｎｄ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ＤＮ，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ：  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ，”Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２０１５  Ｊａｎ；２０（１）：１−１０を参照されたい。
【０１６４】
同種異系の回避。本開示が包含するＣＡＲ−Ｔ、ｉＮＫＴ、ＮＫ、及びその他のＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）−ＣＤ３複合体の一部を欠失させた結果として、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達を更に欠損していてもよい。様々な実施形態では、本明細書で開示するＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を用いて、内在性ＴＣＲシグナル伝達を除去または抑制することが望ましい場合がある。例えば、同種異系Ｔ細胞を用いてＣＡＲ−Ｔ細胞を作製する場合に、ＣＡＲ−Ｔ細胞における内在性ＴＣＲシグナル伝達を抑制または除去することにより、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防または抑制してもよい。内在性ＴＣＲシグナル伝達を除去または抑制するための方法は当該技術分野において周知であり、ＴＣＲ−ＣＤ３受容体複合体の一部、例えば、ＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）、ＴＣＲ受容体β鎖（ＴＲＢＣ）、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及び／またはＣＤ３ζ、を欠失させること、が挙げられるがこれらに限定されない。ＴＣＲ受容体複合体の一部を欠失させることにより、ＴＣＲ介在性シグナル伝達を阻害することができ、それにより、生命を脅かすＧｖＨＤを誘導することなく、ＣＡＲ−Ｔ細胞の供給源として同種異系Ｔ細胞を安全に使用することを可能としてもよい。
【０１６５】
自殺遺伝子。代替的にまたは加えて、本開示が包含するＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞は、１種または複数種の自殺遺伝子を更に含んでいてもよい。本明細書で使用する場合、「自殺遺伝子」とは、活性化した場合に細胞の死をもたらす、当該技術分野において周知の標準的な方法を用いて細胞に導入された核酸配列のことを意味する。自殺遺伝子により、必要に応じ、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞の効果的な追跡及び除去を促進してもよい。自殺遺伝子を活性化させることにより促進された殺傷は、当該技術分野において周知の方法を用いて生じさせてもよい。当該技術分野において周知の好適な自殺遺伝子療法システムとしては、様々な単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）／ガンシクロビル（ＧＣＶ）自殺遺伝子療法システム、または誘導性カスパーゼ９タンパク質、が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な実施形態では、自殺遺伝子は、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ自殺遺伝子である。
【０１６６】
本明細書に記載のＣＡＲ内に含まれ得る構成要素については、以下の表１及び表２に記載する。
【表１】
2021525530.tif 000003
2021525530.tif 000004
【表２】
2021525530.tif 000005
2021525530.tif 000006
【０１６７】
モノＣＡＲ−Ｔ細胞
特定の実施形態では、本開示は、抗原または細胞表面タンパク質に特異的に結合する単一のＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、その抗原または細胞表面タンパク質を任意選択的に欠損している（例えば、ＣＤ７ＣＡＲＴΔＣＤ７細胞）。非限定的な例では、抗原または細胞表面タンパク質の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾された抗原もしくは細胞表面タンパク質にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現する抗原もしくは細胞表面タンパク質を修飾すること（例えば、キメラ抗原受容体が認識する１種もしくは複数種の抗原のエピトープは、１つもしくは複数のアミノ酸変異（例えば、置換または欠失）によって修飾されていてもよく、または、エピトープは、抗原から欠失されていてもよい）、（ｂ）抗原もしくは細胞表面タンパク質の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）抗原もしくは細胞表面タンパク質が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、抗原または細胞表面タンパク質をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。上記の実施形態のそれぞれでは、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する１種または好ましくは全ての抗原または細胞表面タンパク質を欠損していてもよい。１種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を欠損させるＴ細胞を遺伝的に修飾するための方法は、当該技術分野において十分周知されており、非限定的な例については本明細書に記載している。以下に記載する実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いて、１種または複数種の抗原を欠損させるＴ細胞を修飾する。これら実施形態のうちのいずれかは、本明細書で開示する方法を用いて実施してもよい。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。
【０１６８】
例えば、商業的に合成された抗ＣＤ７一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、ＣＤ２８及び／または４−１ＢＢ内部シグナル伝達ドメインを有する第３世代のＣＡＲ骨格にクローニングすることにより、ＣＤ７特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞用のＣＡＲを作製してもよい。Ｐ２Ａペプチドの後に細胞外ｈＣＤ３４ドメインを加えて、ウイルス形質導入及び抗ｈＣＤ３４磁性ビーズを用いた精製の後における、ＣＡＲによる両方の検出を可能としてもよい。その他の悪性Ｔ細胞抗原に特異的なＣＡＲを作製するために、同様の方法を続けてもよい。
【０１６９】
本開示が包含するＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）−ＣＤ３複合体の一部を欠失させた結果として、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達を更に欠損していてもよい。様々な実施形態では、本明細書で開示するＣＡＲ−Ｔ細胞を用いて、内在性ＴＣＲシグナル伝達を除去または抑制することが望ましい場合がある。例えば、同種異系Ｔ細胞を用いてＣＡＲ−Ｔ細胞を作製する場合に、ＣＡＲ−Ｔ細胞における内在性ＴＣＲシグナル伝達を抑制または除去することにより、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防または抑制してもよい。内在性ＴＣＲシグナル伝達を除去または抑制するための方法は当該技術分野において周知であり、ＴＣＲ−ＣＤ３受容体複合体の一部、例えば、ＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）、ＴＣＲ受容体β鎖（ＴＣＲβ）もしくはそのサブタイプ、ＴＣＲδ、ＴＣＲγ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及び／またはＣＤ３δ、を欠失させること、が挙げられるがこれらに限定されない。ＴＣＲ受容体複合体の一部を欠失させることにより、ＴＣＲ介在性シグナル伝達を阻害することができ、それにより、生命を脅かすＧｖＨＤを誘導することなく、ＣＡＲ−Ｔ細胞の供給源として同種異系Ｔ細胞を安全に使用することを可能としてもよい。
【０１７０】
加えて、本開示が包含するＣＡＲ−Ｔ細胞は、本明細書に記載の１種または複数種の自殺遺伝子を更に含んでいてもよい。
【０１７１】
類似の方法を用いて、その他のモノＣＡＲ−Ｔ細胞を構築してもよく、それらについては以下の表３に記載する。
【表３】
2021525530.tif 000007
2021525530.tif 000008
2021525530.tif 000009
【０１７２】
細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、またはガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞に由来する、ゲノム編集されたＣＡＲ−Ｔ細胞の表面上に発現させることのできるＣＡＲアミノ酸配列の実施形態について開示する。
【表４】
2021525530.tif 000010
2021525530.tif 000011
2021525530.tif 000012
2021525530.tif 000013
2021525530.tif 000014
【０１７３】
タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞
タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞（ｔＣＡＲ−Ｔ）は、２つの異なる細胞表面分子（例えば、抗原／タンパク質）と相互作用可能な２つの異なる細胞外リガンド結合（抗原／タンパク質認識）ドメインを含む単一キメラ抗原ポリペプチドを有するＴ細胞であり、細胞外リガンド結合ドメインは、１つまたは複数のフレキシブルリンカーによって互いに連結し、１種または複数種の共刺激ドメインを共有しており、第１または第２の細胞外リガンド結合ドメインの結合により、１種または複数種の共刺激ドメイン（複数可）、及びシグナル伝達ドメインにわたり、シグナルが伝達される。
【０１７４】
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、１種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ７＊ＣＤ２−ｔＣＡＲΔＣＤ７ΔＣＤ２細胞用のＣＤ７及びＣＤ２、または、ＣＤ３＊ＣＤ２−ｔＣＡＲΔＣＤ３ΔＣＤ２細胞用のＣＤ２）を欠損している。非限定的な例では、抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾された抗原（複数可）もしくは細胞表面タンパク質（複数可）にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現する抗原もしくは細胞表面タンパク質を修飾すること（例えば、キメラ抗原受容体が認識する１種もしくは複数種の抗原のエピトープは、１つもしくは複数のアミノ酸変異（例えば、置換または欠失）によって修飾されていてもよく、または、エピトープは、抗原から欠失されていてもよい）、（ｂ）抗原（複数可）もしくは細胞表面タンパク質（複数可）の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）抗原（複数可）もしくは細胞表面タンパク質（複数可）が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、抗原または細胞表面タンパク質をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。上記の実施形態のそれぞれでは、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する１種または好ましくは全ての抗原または細胞表面タンパク質を欠損していてもよい。１種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を欠損させるＴ細胞を遺伝的に修飾するための方法は、当該技術分野において十分周知されており、非限定的な例については本明細書に記載している。以下に記載する実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いて、１種または複数種の抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）を欠損させるＴ細胞を修飾する。これら実施形態のうちのいずれかは、本明細書で開示する方法を用いて実施してもよい。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。
【０１７５】
ペプチドリンカーによって分離された、商業的に合成された抗ＣＤ２一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）及び抗ＣＤ３一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、例えば、ＣＤ２８及び／または４−１ＢＢ内部シグナル伝達ドメインを有する第２または第３世代のＣＡＲ骨格を含有するレンチウイルスベクターにクローニングすることにより、ゲノム編集タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞用のｔＣＡＲ、すなわち、ＣＤ２＊ＣＤ３−ｔＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３εを作製してもよい。Ｐ２Ａペプチドの後に細胞外ｈＣＤ３４ドメインを加えて、ウイルス形質導入及び抗ｈＣＤ３４磁性ビーズを用いた精製の後における、ＣＡＲによる両方の検出を可能としてもよい。その他の悪性Ｔ細胞抗原に特異的なｔＣＡＲを作製するために、同様の方法を続けてもよい。
【０１７６】
タンデムＣＡＲは、異なるリンカー構造を有していてもよく、すなわち、直鎖状またはヘアピンであってもよく、ヘアピンリンカーは、（Ｃｙｓ＝Ｃｙｓ）二本鎖結合（ＤＳＢ）を任意選択的に含んでいてもよい。
【０１７７】
直鎖状タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞は、第１のシグナルペプチド、第１の細胞外リガンド結合ドメイン、第２の細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、１種または複数種の共刺激ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを含み、第１の細胞外リガンド結合抗原認識ドメイン及び第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、異なる細胞表面分子、すなわち、がん細胞、例えば、悪性Ｔ細胞、悪性Ｂ細胞、または悪性形質細胞上の抗原に対する親和性を有し、直鎖状タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞は、直鎖状タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞における細胞表面分子の発現低下をもたらす、１つまたは複数の遺伝子修飾、欠失、または破壊を有する。
【０１７８】
別の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８αに由来するシグナルペプチドである。
【０１７９】
第３の実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）により連結されたＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、２、３、４、５、または６回繰り返されている。一部の実施形態では、第１の抗原認識ドメインは、１）ＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１、または２）ＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１から選択することができる。
【０１８０】
一部の実施形態では、第２の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）により連結されたＶＨ２及びＶＬ２と呼ばれる重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、２、３、４、５、または６回繰り返されている。一部の実施形態では、第１の抗原認識ドメインは、１）ＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２、または２）ＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２から選択することができる。
【０１８１】
更なる実施形態では、第１の抗原認識ドメイン及び第２の抗原認識ドメインは、５アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）の短いリンカーペプチドにより連結されている。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、２、３、４、５、または６回繰り返されている。
【０１８２】
タンデムＣＡＲ構築物
一実施形態では、第１の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）により連結されたＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含み、細胞表面分子、すなわち、悪性細胞上に発現した抗原を標的とする、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
【０１８３】
特定の実施形態では、ＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントは、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ−３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、から選択される、悪性Ｔ細胞上に発現した抗原を標的とする。
【０１８４】
特定の実施形態では、第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）により連結されたＶＨ２及びＶＬ２と呼ばれる重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含み、細胞表面分子、すなわち、悪性細胞上に発現した抗原を標的とする、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
【０１８５】
特定の実施形態では、ＶＨ２及びＶＬ２と呼ばれる重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントは、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ−３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、から選択される、悪性Ｔ細胞上に発現した抗原を標的とし、ＣＡＲ分子の第１の細胞外リガンド結合ドメインの可変重（ＶＨ１）鎖配列及び可変軽（ＶＬ１）鎖配列とは異なる。
【０１８６】
タンデムＣＡＲの別の例については、以下の表５に記載する。
【表５】
2021525530.tif 000015
2021525530.tif 000016
2021525530.tif 000017
2021525530.tif 000018
【０１８７】
一部の実施形態では、例えば、ＣＤ２  ｓｃＦｖ及びＣＤ３  ｓｃＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインを組み込んだ構築物を含むがこれらに限定されない、ヘアピンタンデムＣＡＲ構築物（表６）を本明細書において提供してもよい。
【表６】
2021525530.tif 000019
【０１８８】
デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞
特定の実施形態では、本開示は、同一エフェクター細胞内に発現した異なる抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）に対する親和性を有する、２つの異なるキメラ抗原受容体ポリペプチドを有する遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、それぞれのＣＡＲ機能は独立している。ＣＡＲは、異なる抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）に特異的に結合する単一または複数のポリヌクレオチド配列から発現してもよく、Ｔ細胞は、ＣＡＲが結合する抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）を欠損している（例えば、ＣＤ７＊ＣＤ２−ｄＣＡＲΔＣＤ７ΔＣＤ２細胞）。非限定的な例では、抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾された抗原（複数可）もしくは細胞表面タンパク質（複数可）にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現する抗原もしくは細胞表面タンパク質を修飾すること（例えば、キメラ抗原受容体が認識する１種もしくは複数種の抗原のエピトープは、１つもしくは複数のアミノ酸変異（例えば、置換または欠失）によって修飾されていてもよく、または、エピトープは、抗原から欠失されていてもよい）、（ｂ）抗原（複数可）もしくは細胞表面タンパク質（複数可）の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）抗原（複数可）もしくは細胞表面タンパク質（複数可）が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、抗原または細胞表面タンパク質をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。上記の実施形態のそれぞれでは、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する１種または好ましくは全ての抗原または細胞表面タンパク質を欠損していてもよい。１種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を欠損させるＴ細胞を遺伝的に修飾するための方法は、当該技術分野において十分周知されており、非限定的な例については本明細書に記載している。以下に記載する実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いて、１種または複数種の抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）を欠損させるＴ細胞を修飾する。これら実施形態のうちのいずれかは、本明細書で開示する方法を用いて実施してもよい。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。
【０１８９】
商業的に合成された抗ＣＤ２一本鎖可変フラグメントを、例えば、ＣＤ２８及び／または４−１ＢＢ内部シグナル伝達ドメインを有する第２または第３世代のＣＡＲ骨格を含有するレンチウイルスベクターにクローニングしてから、商業的に合成された抗ＣＤ３ε一本鎖可変フラグメントを、ＣＤ２８及び／または４−１ＢＢ内部シグナル伝達ドメインを有する別の第２または第３世代のＣＡＲ骨格を含有する同一レンチウイルスベクターにクローニングして、２種のＣＡＲ構築物が同一ベクターから発現するプラスミドを生じさせることにより、ゲノム編集デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞用のｄＣＡＲ、すなわち、ＣＤ２＊ＣＤ３ε−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３εを作製してもよい。Ｐ２Ａペプチドの後に細胞外ｈＣＤ３４ドメインを加えて、ウイルス形質導入及び抗ｈＣＤ３４磁性ビーズを用いた精製の後における、ＣＡＲによる両方の検出を可能としてもよい。その他の悪性Ｔ細胞抗原に特異的なｔＣＡＲを作製するために、同様の方法を続けてもよい。
【０１９０】
類似の方法を用いて、その他のデュアルＣＡＲを構築してもよく、それらについては以下の表５〜７に記載する。
【０１９１】
一実施形態では、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞は、（ｉ）第１のシグナルペプチド、第１の抗原認識ドメイン、第１のヒンジ領域、第１の膜貫通ドメイン、第１の共刺激ドメイン、及び第１のシグナル伝達ドメイン、を含む、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、ならびに、（ｉｉ）第２のシグナル伝達ペプチド、第２の抗原認識ドメイン、第２のヒンジ領域、第２の膜貫通ドメイン、第２の共刺激ドメイン、及び第２のシグナル伝達ドメイン、を含む、第２のキメラ抗原受容体ポリペプチド、を含み、第１の抗原認識ドメイン及び第２の抗原認識ドメインは、異なる標的抗原に対する親和性を有し、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞は、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞における標的抗原の発現低下をもたらす、１つまたは複数の遺伝子破壊を有する。
【０１９２】
第２の実施形態では、第１のシグナルペプチドはＣＤ８ａシグナル配列である。
【０１９３】
第３の実施形態では、第１の抗原認識ドメインは、５アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）の短いリンカーペプチドにより連結された、第１の抗原認識ドメイン用の、ＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域の融合タンパク質である。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、３または４回繰り返されている。一部の実施形態では、第１の抗原認識ドメインは、ＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１、またはＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１から選択することができる。
【０１９４】
一部の実施形態では、第１のヒンジ領域はＣＤ８ａを含む。
【０１９５】
一部の実施形態では、第１の膜貫通ドメインはＣＤ８またはＣＤ２８である。
【０１９６】
一部の実施形態では、第１の共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、またはいずれかの順番の両方の組み合わせ、すなわち、４−１ＢＢ−ＣＤ２８、もしくはＣＤ２８−４−１ＢＢを含む。
【０１９７】
一部の実施形態では、第１のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、またはＣＤ３ζバイペプチド、すなわち、ＣＤ３ζ−ＣＤ３ζである。
【０１９８】
一部の実施形態では、第２のシグナルペプチドは、配列番号：１のＣＤ８ａシグナル配列である。
【０１９９】
一部の実施形態では、第２の抗原認識ドメインは、５アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）の短いリンカーペプチドにより連結された、第２の抗原認識ドメイン用の、ＶＨ２及びＶＬ２と呼ばれる免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域の融合タンパク質である。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、３または４回繰り返されている。一部の実施形態では、第２の抗原認識ドメインは、ＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２、またはＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２から選択することができる。
【０２００】
一部の実施形態では、第２のヒンジ領域はＣＤ８ａを含む。
【０２０１】
一部の実施形態では、第２の膜貫通ドメインはＣＤ８またはＣＤ２８である。
【０２０２】
一部の実施形態では、第２の共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、またはいずれかの順番の両方の組み合わせ、すなわち、４−１ＢＢ−ＣＤ２８、もしくはＣＤ２８−４−１ＢＢを含む。
【０２０３】
一部の実施形態では、第２のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、またはＣＤ３ζバイペプチド、すなわち、ＣＤ３ζ−ＣＤ３ζである。
【０２０４】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１の第１の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２の第２の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。
【０２０５】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１の第１の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２の第２の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。
【０２０６】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２の第１の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１の第２の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。
【０２０７】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２の第１の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１の第２の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。
【０２０８】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１の第１の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２の第２の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。
【０２０９】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１の第１の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２の第２の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。
【０２１０】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２の第１の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１の第２の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。
【０２１１】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２の第１の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１の第２の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。
【０２１２】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、少なくとも１つの高効率開裂部位を含み、その高効率開裂部位は、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａから選択される。
【０２１３】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは自殺遺伝子を含む。
【０２１４】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは変異サイトカイン受容体を含む。
【０２１５】
一部の実施形態では、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ３７１（ＣＬＬ−１、ＣＬＥＣ１２Ａ）、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、ＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８、及びＣＤ１９、ＡＰＲＩＬ、ならびにＴＡＣＩ、から選択される２種の抗原を標的とする。
【０２１６】
デュアルＣＡＲの別の例については、以下の表７に記載する。
【０２１７】
【表７】
2021525530.tif 000020
2021525530.tif 000021
2021525530.tif 000022
2021525530.tif 000023
【０２１８】
サイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子の欠失または抑制
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、免疫治療薬（またはその他の免疫学的刺激物）に応答した免疫細胞からの、大規模で急速なサイトカインの放出によって引き起こされる。それゆえ、放出されるサイトカインのレベルを低下させることにより、ＣＲＳの発症及び／または維持を予防または低下させることができる。これは、本明細書で開示するように、１つまたは複数のサイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子を修飾、破壊、または欠失することにより達成することができる。これを達成するための１つの方法は、遺伝子の配列情報を変化または欠失させることにより遺伝子発現をなくす、遺伝子の除去（遺伝子サイレンシング）である。これは、当該技術分野において周知の遺伝子操作ツール、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＣＲＩＳＰＲなどを用いることにより、また低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクションによっても、達成することができる。
【０２１９】
別の技術は、小胞体（ＥＲ）内のサイトカインに結合して分泌を防止する、ＥＲに結合するテザーを有するｓｃＦｖの発現である。タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）という名称の特定の構築物は、標的とするタンパク質の細胞膜への輸送を防止する。ＰＥＢＬ構築物は、免疫細胞をｅｘ  ｖｉｖｏ細胞処理するために、その他の遺伝子改変システムと容易に組み合わせることができる。短ヘアピンＲＮＡまたは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ／ヘアピンベクター）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により標的遺伝子の発現（すなわち、抗原の）をサイレンシングするのに使用可能な、急なヘアピンの折り返しを有する人工ＲＮＡ分子である。細胞におけるｓｈＲＮＡの発現は通常、プラスミドの送達、または、ウイルスベクターもしくは細菌ベクターにより達成される。
【０２２０】
例えば、サイトカインの遺伝子配列にＣＡＲを標的形質導入することにより、本明細書で開示する免疫エフェクター細胞から欠失させることができるサイトカインまたはケモカインとしては、以下、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＣＤ１５４、ＬＴ−β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、４−１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ−１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＳＰ、Ａ２Ｍ、ＡＣＫＲ１、ＡＣＫＲ２、ＡＣＫＲ３、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＣＶＲＬ１、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＧＥＲ、ＡＧＲＮ、ＡＩＭＰ１、ＡＲＥＧ、ＢＭＰ１、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ａ、ＢＭＰ８Ｂ、ＢＭＰＲ２、Ｃ１０ｏｒｆ９９、Ｃ１ＱＴＮＦ４、Ｃ５、ＣＣＬ２８、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＤ１０９、ＣＤ３６、ＣＤ４、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ７４、ＣＥＲ１、ＣＨＲＤ、ＣＫＬＦ、ＣＬＣＦ１、ＣＭＴＭ１、ＣＭＴＭ２、ＣＭＴＭ３、ＣＭＴＭ４、ＣＭＴＭ５、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ７、ＣＭＴＭ８、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＲ、ＣＯＰＳ５、ＣＲＬＦ１、ＣＳＦ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＴＦ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＥＢＩ３、ＥＤＮ１、ＥＬＡＮＥ、ＥＮＧ、ＦＡＭ３Ｂ、ＦＡＭ３Ｃ、ＦＡＭ３Ｄ、ＦＡＳ、ＦＡＳＬＧ、ＦＧＦ２、ＦＬＴ３ＬＧ、ＦＺＤ４、ＧＢＰ１、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ９、ＧＰＩ、ＧＲＥＭ１、ＧＲＥＭ２、ＧＲＮ、ＨＡＸ１、ＨＦＥ２、ＨＭＧＢ１、ＨＹＡＬ２、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＥ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＬ１、ＩＦＮＬ３、ＩＦＮＷ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｄ、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ−１９、ＩＬ��Ｆ１０、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２２ＲＡ２、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３１、ＩＬ３１ＲＡ、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３４、ＩＬ３６Ａ、ＩＬ３６Ｂ、ＩＬ３６Ｇ、ＩＬ３６ＲＮ、ＩＬ３７、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＨＢＢ、ＩＮＨＢＣ、ＩＮＨＢＥ、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ３、ＫＩＴ、ＫＩＴＬＧ、ＫＬＨＬ２０、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＬＩＦＲ、ＬＴＡ、ＬＴＢ、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＬＴＢＰ４、ＭＩＦ、ＭＩＮＯＳ１−、ＭＳＴＮ、ＮＡＭＰＴ、ＮＢＬ１、ＮＤＰ、ＮＬＲＰ７、ＮＯＤＡＬ、ＮＯＧ、ＮＲＧ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＯＳＭＲ、ＰＡＲＫ７、ＰＤＰＮ、ＰＦ４、ＰＦ４Ｖ１、ＰＧＬＹＲＰ１、ＰＬＰ２、ＰＰＢＰ、ＰＸＤＮ、ＳＣＧ２、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＳＥＣＴＭ１、ＳＬＵＲＰ１、ＳＯＳＴＤＣ１、ＳＰ１００、ＳＰＰ１、ＴＣＡＰ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨＢＳ１、ＴＨＮＳＬ２、ＴＨＰＯ、ＴＩＭＰ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ１１、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＳＦ１２−、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ４、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ９、ＴＲＩＭ１６、ＴＳＬＰ、ＴＷＳＧ１、ＴＸＬＮＡ、ＶＡＳＮ、ＶＥＧＦＡ、ＶＳＴＭ１、ＷＦＩＫＫＮ１、ＷＦＩＫＫＮ２、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ７Ａ、及びＺＦＰ３６、が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２２１】
一部の実施形態では、サイトカインは、ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）、ＭＣＰ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｉｌ−４、及びＩＦＮγ、から選択される。
【０２２２】
特定の実施形態では、本明細書で開示する免疫エフェクター細胞から欠失させることができる転写因子としては、ＡＨＲ、ＢＣＬ６、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＭＡＦ、ＲＯＲＣ、ＳＰＩ１、及びＴＢＸ２１、が挙げられる。
【０２２３】
これらの遺伝子の配列は当該技術分野において周知かつ入手可能であり、例えば、表１０に記載の配列を挙げることができる。
【０２２４】
標的遺伝子の優先順位の選択
ＣＲＳを緩和するためにＣＡＲ−Ｔ細胞を用いて欠失または抑制（例えば、除去、ノックアウト、ＫＯ）するためのサイトカイン／ケモカイン遺伝子の個々の目的とする標的は、生物学的機能を基準としたグループに分類されている。ＣＲＳの発症は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化及びそれに続くサイトカインの放出に左右されるが、それにより、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法のレシピエントにおける免疫機構の調節不全が誘導される。レシピエントにおける骨髄の活性化がＣＲＳの発症に必須であることを、いくつかの研究が示している。
【０２２５】
ＣＡＲ−Ｔを用いてＫＯする第１グループの候補遺伝子は、正常な免疫応答において骨髄細胞と結合した際に骨髄細胞を活性化させる表面受容体（例えば、ＣＤ４０Ｌ）である。第２グループは、骨髄細胞を活性化するＣＡＲ−Ｔ細胞から放出されるサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）である。これらの分類の両方における目的は、レシピエントの骨髄細胞を活性化しＣＲＳを誘導することになるＣＡＲ−Ｔ細胞のシグナル伝達を防止することである。
【０２２６】
第３分類の標的は、ＣＡＲ−Ｔ受容体に組み込まれた、Ｔ細胞活性を上昇させる（場合により、腫瘍標的の不在下で）内在性Ｔ細胞受容体（例えば、内在性ＣＤ２８）である。目的は、非腫瘍相互作用、例えば、活性化Ｔ細胞上のＣＤ２８と結合し、その結果、Ｔ細胞サイトカイン産生及びそれに続く骨髄の活性化を増強し得る、活性化した骨髄細胞などによるＣＡＲ−Ｔの活性化を低下させることである。
【０２２７】
第４及び第５分類の遺伝子ＫＯ標的は、ＣＡＲ−Ｔ細胞分化及びそれに続く機能特性化を駆動する転写因子及びサイトカインである。正常な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、一般的に、ＣＤ８発現により識別される）に表現型が類似したＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞介在性エフェクター機能により腫瘍の殺傷を命じることができる。ＣＴＬは、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４を発現している）によって支援及び維持されている。重要なことに、Ｔヘルパー細胞の亜型は、ＣＴＬを支援（すなわち、Ｔｈ１細胞）または抑制（すなわち、Ｔｈ２細胞）し得る。その他のＴ細胞、例えば、Ｔｒｅｇなどはまた、ＣＴＬの発現及び機能を抑制し得る。目的は、非細胞傷害性Ｔ細胞集団へのＣＡＲ−Ｔの分化をもたらし得る、ＣＡＲ−Ｔ集団におけるサイトカインまたは転写因子を標的とすることである。加えて、Ｔｈ２細胞はサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４など）を産生するが、それらサイトカインは、ＣＲＳを示唆するマーカーである。腫瘍細胞の殺傷に最適となるはずのないＣＡＲ−Ｔの表現型が、ＣＡＲ−Ｔ受容体により活性化されて、宿主におけるＣＲＳを駆動するシグナルを生成し、腫瘍の殺傷に要する時間が長くなることによって、最適化「殺傷」生成物と比較してより多いＣＡＲ−Ｔ細胞用量が必要となるということが考えられる。それゆえ、転写因子（例えば、ＧＡＴＡ３など）またはサイトカイン（例えば、ＩＬ−４など）をノックアウトまたは除去（または抑制）することにより、Ｔｈ２バイアスが防止（または抑制）されＣＲＳが抑制される。
【０２２８】
骨髄を活性化させるサイトカインと最適化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の分化の両方に関する別の目的は、ＣＡＲ−Ｔの神経毒性を緩和する潜在能力についてである。ＣＲＳを有するＣＡＲ−Ｔレシピエントの小集団において神経毒性が生じている。神経毒性を発症するほどにまで進行したＣＲＳ患者において、ＩＬ−５レベル及びフェリチンレベルが高くなっていることを、研究が示している（Ｓａｎｔｏｍａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１９）。これら２つのバイオマーカーは、肥満細胞の活性化がＣＮＳ合併症に関与し得るということを示している。ＩＬ−５は、Ｔｈ２細胞、好酸球及び肥満細胞が産生する主要なサイトカインである。肥満細胞症、及び肥満細胞の調節異常を伴ういくつかの疾患において、過剰レベルのフェリチンが認められている。加えて、多くの肥満細胞疾患は神経の調節異常を伴う。一部の患者におけるＩＬ−５、フェリチン、及び神経毒性のレベルの上昇を考慮すると、ＩＬ−５などのサイトカインを用いて肥満細胞の活性化を抑制すること、または、ＩＬ−５依存性の肥満細胞活性化を駆動するＴｈ２細胞の発現を防止することもまた、ＣＲＳレシピエントに認められる神経合併症を緩和することになり得る。ＣＮＳ合併症に関しては、ＣＮＳにおける高いＴ細胞負荷量がこれまでに示されていることから、ＣＸ３ＣＲ１及びＯＸ４０についても注目されている。ＣＸ３ＣＲ１は、主として、Ｔ細胞及び場合によりＣＡＲ−Ｔ細胞をＣＮＳへと誘導する、Ｔ細胞ケモカイン受容体である。ＯＸ４０は、好酸球及び肥満細胞上のＯＸ４０Ｌと細胞間相互作用することにより活性化を促進する、Ｔ細胞受容体である。
【０２２９】
それゆえ、特定の実施形態では、サイトカインは、ＣＣＬ２（ＭＣＰ１）、ＭＣＰ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｉｌ−４、及びＩＦＮγから選択される。
【０２３０】
適応症、及びＣＡＲ−Ｔ療法における標準治療
一部の実施形態では、本明細書で開示する及び／または本明細書で開示する方法を用いて作製されるゲノム編集免疫エフェクター細胞は、１種または複数種のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、医薬品として、すなわち、疾患の治療用に使用され得る。多くの実施形態では、細胞はＣＡＲ−Ｔ細胞である。
【０２３１】
本明細書で開示する及び／または本明細書で開示する方法を用いて作製される細胞は、がん、自己免疫疾患、感染症、及びその他の症状を治療するために、または、がん、自己免疫疾患、感染症、及びその他の症状を治療するための医薬品を製造するために、免疫療法及び養子細胞移入に使用され得る。
【０２３２】
がんは、血液悪性腫瘍または固形腫瘍であってもよい。血液悪性腫瘍としては、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、及びそれらの亜型、が挙げられる。リンパ腫は、様々な方法、多くの場合、悪性細胞の基本的なタイプに基づいて分類することができ、ホジキンリンパ腫（リードスタンバーグ細胞のがんであることが多いが、時としてＢ細胞から発生することもあり、全てのその他のリンパ腫は非ホジキンリンパ腫である）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他のリンパ腫、が挙げられる。
【０２３３】
Ｂ細胞リンパ腫としては、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他のＢ細胞リンパ腫、が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３４】
Ｔ細胞リンパ腫としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、Ｔ細胞慢性リンパ性白血病（Ｔ−ＣＬＬ）、セザリー症候群、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他のＴ細胞リンパ腫、が挙げられる。
【０２３５】
白血病としては、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）（または骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ））白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性（または骨髄性）白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性（またはリンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、毛様細胞性白血病（時として、リンパ腫に分類される）、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他の白血病、が挙げられる。
【０２３６】
形質細胞性悪性腫瘍としては、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞腫、及び多発性骨髄腫、が挙げられる。
【０２３７】
一部の実施形態では、患者におけるがんを治療するために、とりわけ、固形腫瘍、例えば、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫など、または、がん、例えば、脳、頭頸部、乳房、肺（例えば、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）、生殖系（例えば、卵巣）、上部消化管、膵臓、肝臓、腎臓（ｒｅｎａｌ）系（例えば、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ））、膀胱、前立腺、及び結腸直腸の腫瘍など、を治療するために、医薬品を使用してもよい。
【０２３８】
別の実施形態では、患者におけるがんを治療するために、とりわけ、多発性骨髄腫及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）から選択される血液悪性腫瘍、ならびに、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、及びＴ細胞慢性リンパ性白血病（Ｔ−ＣＬＬ）から選択されるＴ細胞悪性腫瘍、を治療するために、医薬品を使用してもよい。
【０２３９】
一部の実施形態では、自己免疫疾患、例えば、狼瘡、自己免疫（関節）リウマチ、多発性硬化症、移植拒絶反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、皮膚炎などの治療に、細胞を使用してもよい。一部の実施形態では、細胞は、抗体フラグメントの代わりに抗原またはそのフラグメントを提示するキメラ自己抗体受容体Ｔ細胞、すなわちＣＡＡＲ−Ｔであり、このタイプの養子細胞移入では、自己免疫疾患を引き起こすＢ細胞は、遺伝子改変Ｔ細胞を攻撃しようとし、遺伝子改変Ｔ細胞を殺傷することで反応する。
【０２４０】
一部の実施形態では、ＨＩＶ及び結核などの感染症の治療に、細胞を使用してもよい。
【０２４１】
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、強力なｉｎ  ｖｉｖｏＴ細胞増殖を受けてもよく、長時間にわたり持続し得る。
【０２４２】
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた患者の治療は、緩和、治癒的または予防的となり得る。その治療は、自家免疫療法治療の一部、または同種異系免疫療法治療の一部のいずれかであってもよい。自家とは、患者の治療に用いる細胞、細胞株、または細胞集団が、上記患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合ドナーに由来するということを意味する。同種異系とは、患者の治療に用いる細胞または細胞集団が、その患者ではなくドナーに由来するということを意味する。
【０２４３】
本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞を用いたがんの治療は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、放射線療法、レーザー光線療法、及び放射線療法、から選択される１種または複数種の治療法と組み合わされてもよい。
【０２４４】
本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、埋め込み、または移植、により実施される。本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞組成物、すなわち、モノＣＡＲ、デュアルＣＡＲ、タンデムＣＡＲは、皮下、皮膚内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内もしくはリンパ管内注射、または腹腔内で、患者に投与され得る。一実施形態では、本開示の細胞組成物は、静脈注射で投与されることが好ましい。
【０２４５】
ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団の投与は、体重１ｋｇあたり１０４〜１０９の細胞、好ましくは、１０５〜１０６の細胞／ｋｇ（体重）（これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む）、の投与で構成され得る。ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、１回または複数回の投与で投与されてもよい。別の実施形態では、有効量のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、単回投与で投与される。別の実施形態では、有効量の細胞は、ある期間にわたり２回以上の投与で投与される。投与のタイミングは健康管理提供者の良識の範囲内であり、患者の臨床症状によって決まる。ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、任意の供給源、例えば、血液銀行またはドナーなどから得てもよい。患者の要望は様々ではあるが、個々の疾患または症状のための、任意のＣＡＲ−Ｔ細胞集団（複数可）の有効量の至適範囲の算出は当業者の知るところである。有効量とは、治療効果または予防効果をもたらす量のことを意味する。投与量は、患者レシピエントの年齢、健康及び体重、併用治療の種類（ある場合、治療の頻度）、ならびに、望まれる効果の性質によって決まる。
【０２４６】
別の実施形態では、有効量の、ＣＡＲ−Ｔ細胞もしくはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団、またはそれらＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物は、非経口で投与される。投与は、静脈内投与であってもよい。ＣＡＲ−Ｔ細胞もしくはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団、またはそれらＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物の投与は、腫瘍内への注射によって直接実施されてもよい。
【０２４７】
本開示の一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖及び持続性を向上させる、サイトカイン、もしくはＣＡＲ−Ｔ内のサイトカインの発現を用いた治療、ならびに、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１５を用いることを含むがこれらに限定されない治療、を含むがこれらに限定されない多くの関連治療モダリティと共に、例えば、その前に、それと同時に、またはその後に、患者に投与される。
【０２４８】
第２の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、ＴＧＦ−β、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、アデノシン、ＶＥＧＦ、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ２（ＩＤＯ２）、トリプトファン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）、乳酸、低酸素症、アルギナーゼ、及びプロスタグランジンＥ２の阻害剤、を含むがこれらに限定されない、免疫抑制経路を阻害する薬剤と組み合わせて使用してもよい。
【０２４９】
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、抗ＣＴＬＡ４（イピリムマブ）、抗ＰＤ１（ペンブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ）、抗ＰＤＬ１（アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ）、抗ＰＤＬ２、抗ＢＴＬＡ、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ３、抗ＶＩＳＴＡ、抗ＴＩＧＩＴ、及び抗ＫＩＲ、を含むがこれらに限定されないＴ細胞チェックポイント阻害薬、と組み合わせて使用してもよい。
【０２５０】
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ−４０、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、及びＨＶＥＭを刺激する抗体を含むがこれらに限定されないＴ細胞アゴニストと組み合わせて使用してもよい。
【０２５１】
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びポックスウイルス、を含むがこれらに限定されない治療用腫瘍崩壊ウイルス、と組み合わせて使用してもよい。
【０２５２】
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ９アゴニスト、を含むがこれらに限定されない、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストなどの免疫活性化治療薬、と組み合わせて使用してもよい。
【０２５３】
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）などのインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストと組み合わせて使用してもよい。
【０２５４】
免疫エフェクター細胞無形成症、とりわけ、Ｔ細胞無形成症はまた、養子細胞移入療法後の懸念事である。治療する悪性腫瘍がＴ細胞悪性腫瘍でありＣＡＲ−Ｔ細胞がＴ細胞抗原を標的とする場合、抗原を発現する正常なＴ細胞及びその前駆細胞が枯渇し、免疫機構が損なわれる。それゆえ、これらの副作用を管理するための方法は、治療の案内係である。このような方法としては、後ほど、ＣＡＲ−Ｔ細胞が枯渇または不活性化した後に、増殖させて患者に再注入するために、自家または同種異系（任意選択的に、拒絶反応を引き起こさないまたは拒絶されないように遺伝子改変された）のいずれかの、非悪性のＴ細胞または前駆細胞を選択及び保持することが挙げられる。代替的に、ＴＣＲ保有細胞の亜型、例えば、正常及び悪性のＴＲＢＣ１＋（しかし、ＴＲＢＣ２＋細胞ではない）、あるいは、ＴＲＢＣ２＋（しかし、ＴＲＢＣ１＋細胞ではない）などを認識して殺傷するＣＡＲ−Ｔ細胞を使用して、十分な正常Ｔ細胞を保持して正常な免疫機構の機能を維持しつつ、Ｔ細胞悪性腫瘍を根絶してもよい。
【０２５５】
定義
本明細書で使用する場合、以下の用語は、示された意味を有する。本明細書の全体にわたり、その他の定義が現れる場合もある。
【０２５６】
数値の範囲を開示する場合、また表記「ｎ１…〜ｎ２」または「ｎ１…〜ｎ２の間」を使用する場合、ｎ１及びｎ２は数字であり、そのため、特に明記しない限り、この表記は、数字自体及びそれらの間の範囲を含むことを意図している。この範囲は、数字間における整数または連続であってもよく、末端の数値を含む。例えば、「２〜６個の炭素」の範囲は、炭素が整数単位で存在することから、２、３、４、５、及び６個の炭素を含むことを意図している。対照的に、例えば、「１〜３μＭ（マイクロモル）」の範囲は、１μＭ、３μＭ、及び、数字間における任意数の有効数字（例えば、１．２５５μＭ、２．１μＭ、２．９９９９μＭなど）の全てを含むことを意図している。
【０２５７】
用語「約」は、本明細書で使用する場合、その用語が修飾する数値を、このような数値が誤差の範囲内で変動することを表すように、限定することを意図している。誤差の範囲が特にない場合、例えば、データのグラフまたは表に記載された平均値に対する標準偏差が列挙されている場合などにおいて、用語「約」は、列挙された数値を包含し得る範囲、及び、同様に、有効数字を考慮して、その数値にまで切り上げるまたは切り下げることにより含まれ得る範囲を意味するものと理解すべきである。
【０２５８】
細胞に関する用語「活性化」（及びその別の活用型）は通常、「刺激すること」と同義であると理解すべきであり、本明細書で使用する場合、細胞集団の増殖をもたらす細胞の処理のことを意味する。Ｔ細胞において、活性化は、ＣＤ２及びＣＤ２８（及び同様に、ＣＤ２の場合もある）アゴニスト、一般的には、任意選択的に、磁性ビーズ上にコーティングしたまたはコロイド状のポリマーマトリックスにコンジュゲートした、抗体、に曝露することによって達成されることが多い。
【０２５９】
用語「抗原」は、本明細書で使用する場合、Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体が認識する（すなわち、Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体の標的である）細胞表面タンパク質である。古典的な意味において、抗原は、抗体が認識する物質、典型的にはタンパク質であるが、ＣＡＲが、１種または複数種の抗原（複数可）を認識する軽（ＶＬ）鎖及び重（ＶＨ）鎖などの抗体由来ドメインを含む限りにおいて、定義は重複するものである。
【０２６０】
用語「がん」とは、体内における悪性腫瘍、または細胞の異常増殖のことを意味する。多くの異なるがんが、特定の細胞表面タンパク質または分子によって特性決定または同定され得る。それゆえ、一般的な用語において、本開示によるがんは、本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞を用いて治療可能なあらゆる悪性腫瘍のことを意味し得、免疫エフェクター細胞は、がん細胞上の細胞表面タンパク質を認識してそれに結合する。本明細書で使用する場合、がんとは、血液悪性腫瘍、例えば、多発性骨髄腫、Ｔ細胞悪性腫瘍、またはＢ細胞悪性腫瘍などのことを意味し得る。Ｔ細胞悪性腫瘍としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）または非ホジキンリンパ腫を挙げることができるがこれらに限定されない。がんはまた、子宮頸癌、膵臓癌、卵巣癌、中皮腫、及び肺癌、を含むがこれらに限定されない固形腫瘍のことを意味し得る。
【０２６１】
「細胞表面タンパク質」は、本明細書で使用する場合、細胞の表面上で少なくとも部分的に、細胞が発現するタンパク質（またはタンパク質複合体）である。細胞表面タンパク質の例としては、ＴＣＲ（及びそのサブユニット）及びＣＤ７が挙げられる。
【０２６２】
用語「組み合わせ治療」とは、本開示に記載の治療症状または障害を治療するための、２種またはそれ以上の治療薬の投与のことを意味する。このような投与は、固定比率の活性成分を有する単一のカプセル剤、または、それぞれの活性成分用の複数の別々のカプセル剤などによる、これらの治療薬のほぼ同時の共投与を包含する。加えて、このような投与はまた、それぞれの種類の治療薬の連続的な使用を包含する。いずれの場合も、治療レジメンは、本明細書に記載の症状または障害の治療において、薬剤組み合わせの有益な効果をもたらす。
【０２６３】
用語「組成物」とは、本明細書で使用する場合、１種または複数種の治療的に許容される担体と組み合わせた、免疫療法用の細胞集団のことを意味する。
【０２６４】
用語「疾患」は、本明細書で使用する場合、全てが、正常な機能を損なっているヒトもしくは動物の体またはその部位の１つにおける、異常な状態を反映し、典型的には、徴候及び症状が際立つことにより顕在化し、またヒトまたは動物の寿命または生活の質を低下させるという点で、一般的に、用語「障害」、「症候群」及び「症状」（医学的症状と同様）と同義であり、それらと同じ意味で用いられることを意図している。
【０２６５】
用語「ドナー鋳型」とは、相同組換え修復（ＨＤＲ）ＤＮＡ修復経路により二本鎖切断を修復するための鋳型として細胞が使用する基準ゲノム物質のことを意味する。ドナー鋳型は、ゲノム内へと挿入される、二本鎖切断部位の側面を狙う２本のホモロジーアームを有するＤＮＡの断片（発現させる遺伝子、すなわち、ＣＡＲまたはマーカーの遺伝子を含有している）を含有している。一部の実施形態では、ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス、一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＤＮＡ、であってもよい。
【０２６６】
用語「同胞殺し」とは、本明細書で使用する場合、標的とされる細胞が、両方の細胞上のキメラ抗原受容体が特異的に認識する抗原を発現していることから、ＣＡＲ−Ｔ細胞（またはその他のＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞）が、そのＣＡＲ−Ｔ細胞の標的と同一のキメラ抗原受容体を含む別のＣＡＲ−Ｔ細胞の標的となる際、または別のＣＡＲ−Ｔ細胞によって殺傷される際に生じるプロセスのことを意味する。キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損したキメラ抗原受容体を含むＣＡＲ−Ｔは、「同胞殺し抵抗性」である。
【０２６７】
用語「ゲノム編集」または「遺伝子編集」とは、本明細書で使用する場合、遺伝子、またはゲノムの一部が、非機能的となるように付加、欠失、または修飾（例えば、破壊）されているということを意味する。それゆえ、特定の実施形態では、「ゲノム編集Ｔ細胞」は、少なくとも１種の抗原を認識するＣＡＲなどの遺伝子を付加された、及び／または、ＣＡＲが認識する抗原（複数可）の遺伝子（複数可）などの遺伝子を欠失された、及び／または、ＴＣＲもしくはそのサブユニットの遺伝子が破壊された、Ｔ細胞である。
【０２６８】
「健康なドナー」は、本明細書で使用する場合、悪性腫瘍（とりわけ、血液悪性腫瘍、例えば、Ｔ細胞悪性腫瘍）を有していない健康なドナーである。
【０２６９】
本明細書で使用する場合、「未成熟樹状細胞」すなわち「ｉＤＣ」とは、未成熟な樹状細胞のことを意味する。
【０２７０】
用語「治療的に許容される」とは、過度の毒性、炎症、及びアレルギー反応を伴わず、妥当な利益／リスク比に見合い、及び／または、その使用目的において有効である、患者の組織との接触に用いるのに適切な物質のことを意味する。
【０２７１】
用語「治療的に有効」は、疾患もしくは障害の治療に使用する、または、臨床エンドポイントの効果に使用する、活性成分の量を適格とすることを意図している。
【０２７２】
用語「患者」は一般的に、用語「対象」と同義であり、ヒトを含む全ての哺乳動物を含む。
【０２７３】
「悪性Ｂ細胞」は、Ｂ細胞悪性腫瘍に由来するＢ細胞である。Ｂ細胞悪性腫瘍としては、（ＤＬＢＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、及びＢ細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２７４】
用語「に曝露する」は、本明細書で使用する場合、目的の組成物（例えば、抗体など）を別の目的の組成物（例えば、細胞など）と密着させる状況において、「と培養する」と同義であることを意図しており、短い期間の接触は、用語「と培養する」の代わりに用語「に曝露する」を使用することを意図している。
【０２７５】
「悪性Ｔ細胞」は、Ｔ細胞悪性腫瘍に由来するＴ細胞である。用語「Ｔ細胞悪性腫瘍」とは、Ｔ細胞前駆細胞、成熟Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞に由来する、広く、極めて不均一なグループの悪性腫瘍のことを意味する。Ｔ細胞悪性腫瘍の非限定例としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型陽性（ＨＴＬＶ−１＋）成人Ｔ細胞性白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病（ＨＴＬＶ−１関連）、アグレッシブＮＫ細胞性白血病、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、ＡＬＫ陽性未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、ＡＬＫ陰性血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、乳房インプラント関連未分化大細胞リンパ腫、ＮＫ細胞の慢性リンパ増殖性障害、節外性鼻型ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、腸疾患型Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ＧＩ管の無痛性Ｔ細胞リンパ増殖性障害、単形性上皮向性腸管Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ＴＦＨ表現型を伴う節性末梢Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、ＮＯＳ、原発性皮膚α／βＴ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋アグレッシブ表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚先端型ＣＤ８＋Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ４＋小型／中型Ｔ細胞リンパ増殖性障害［原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫（Ｃ−ＡＬＣＬ）、リンパ球様丘疹症］、セザリー症候群、皮下脂肪組織炎様Ｔ細胞リンパ腫、小児期の全身性ＥＢＶ＋Ｔ細胞リンパ腫、及びＴ細胞大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）、が挙げられる。
【０２７６】
「悪性形質細胞」は、形質細胞性悪性腫瘍に由来する形質細胞である。用語「形質細胞性悪性腫瘍」とは、異常な形質細胞が過剰産生された悪性腫瘍のことを意味する。形質細胞性悪性腫瘍の非限定例としては、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞腫、及び多発性骨髄腫、が挙げられる。
【０２７７】
本明細書で使用する場合、「自殺遺伝子」とは、活性化した場合にＣＡＲ−Ｔ細胞の死をもたらす、当該技術分野において周知の標準的な方法を用いてＣＡＲ−Ｔ細胞に導入された核酸配列のことを意味する。必要に応じ、自殺遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の追跡及び除去、すなわち、殺傷を促進し得る。自殺遺伝子を活性化することによりＣＡＲ−Ｔ細胞の殺傷を促進することは、当該技術分野において周知の標準的な方法を用いて実施することができる。当該技術分野において周知の自殺遺伝子システムとしては、いくつかの単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）／ガンシクロビル（ＧＣＶ）自殺遺伝子療法システム、及び誘導性カスパーゼ９タンパク質、が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、自殺遺伝子はキメラＣＤ３４／チミジンキナーゼである。
【０２７８】
本明細書で使用する場合、「免疫エフェクター細胞」は、免疫応答を調節することができる白血球である。免疫エフェクター細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ｉＮＫＴ細胞（インバリアントＴ細胞受容体αナチュラルキラーＴ細胞）、及びマクロファージ、が挙げられる。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）保有免疫エフェクター細胞は、当然、Ｔ細胞を含むが、Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝子改変された細胞もまた含む。免疫エフェクター細胞は、健康なドナー、末梢血単核球、臍帯血、及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、を含むがこれらに限定されない任意の適切な供給源から取得または誘導／産生してもよい。
【０２７９】
本明細書で使用する場合、「ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞」は、少なくとも１種のＣＡＲを形質導入された免疫エフェクター細胞である。「ＣＡＲ−Ｔ細胞」は、少なくとも１種のＣＡＲを形質導入されたＴ細胞であり、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、モノ、デュアル、またはタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞であってもよい。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、自家（対象自身の細胞から遺伝子改変されたことを意味する）であってもよく、または、同種異系（細胞が健康なドナーを供給源としていることを意味する）であってもよく、多くの場合、宿主対移植片反応、または移植片対宿主反応を引き起こさないように遺伝子改変されている。
【０２８０】
「キメラ抗原受容体」すなわち「ＣＡＲ」とは、本明細書で使用する場合、及び当該技術分野において一般的に使用する場合、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞外リガンド結合ドメインが標的細胞上に存在する構成要素に結合すると、細胞に特殊機能を実行させるシグナル伝達ドメイン、を有する、組換え融合タンパク質のことを意味する。例えば、ＣＡＲは、特定の抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を産生するための、Ｔ細胞受容体を活性化させる細胞内ドメインを有し、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する、抗体に基づいた特異性を有していてもよい。第１世代のＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン（一般的には、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγ）を含む。第２世代のＣＡＲは、細胞内共刺激ドメイン（一般的には、４−１ＢＢまたはＣＤ２８）を含ませることにより、第１世代のＣＡＲ構築物を土台に構築されている。これらの共刺激ドメインは、第１世代のＣＡＲと比較して、ＣＡＲ−Ｔ細胞の傷害性及び増殖を向上させるのに役立つ。第３世代のＣＡＲは、主として、ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖及び持続性を向上させるための、複数の共刺激ドメインを含む。キメラ抗原受容体は、ＭＨＣ非依存性抗原に結合するその能力と、その細胞内ドメインを介して活性化シグナルを変換するその能力の両方により、その他の抗原結合因子とは区別される。
【０２８１】
用語「ＣＡＲ−ｉＮＫＴ細胞」（すなわち、ｉＮＫＴ−ＣＡＲ）とは、キメラ抗原受容体を発現するｉＮＫＴ細胞のことを意味する。デュアルｉＮＫＴ−ＣＡＲ細胞（すなわち、ｉＮＫＴ−ｄＣＡＲ）は、同一エフェクター細胞内に発現した異なる標的抗原に対する親和性を有する、２つの異なるキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現するｉＮＫＴ−ＣＡＲ細胞であり、それぞれのＣＡＲ機能は独立している。ＣＡＲは、単一または複数のポリヌクレオチド配列から発現してもよい。タンデムｉＮＫＴ−ＣＡＲ細胞（すなわち、ｉＮＫＴ−ｔＣＡＲ）は、異なる標的に対する親和性を有する、２つの異なる抗原認識ドメインを含有する単一キメラ抗原ポリペプチドを有するｉＮＫＴ−ＣＡＲ細胞であり、抗原認識ドメインは、ペプチドリンカーによって連結し、共通の共刺激ドメイン（複数可）を共有しており、いずれかの抗原認識ドメインの結合により、共通の共刺激ドメイン（複数可）、及びシグナル伝達ドメインにわたり、シグナルが伝達される。
【０２８２】
用語「キメラ抗原受容体Ｔ細胞」（すなわち、ＣＡＲ−Ｔ）とは、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞のことを意味する。
【０２８３】
用語「デュアルＣＡＲ」（ｄＣＡＲ−Ｔ）とは、同一エフェクター細胞内に発現した異なる標的抗原に対する親和性を有する、２つの異なるキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞のことを意味し、それぞれのＣＡＲ機能は独立している。ＣＡＲは、単一または複数のポリヌクレオチド配列から発現してもよい。
【０２８４】
用語「タンデムＣＡＲ−Ｔ」（ｔＣＡＲ−Ｔ）とは、異なる標的に対する親和性を有する、２つの異なる抗原認識ドメインを含有する単一キメラ抗原ポリペプチドのことを意味し、抗原認識ドメインは、ペプチドリンカーによって連結し、共通の共刺激ドメイン（複数可）を共有しており、いずれかの抗原認識ドメインの結合により、共通の共刺激ドメイン（複数可）、及びシグナル伝達ドメインにわたり、シグナルが伝達される。
【０２８５】
本明細書で使用する場合、「キメラ抗原受容体ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞」（すなわち、ＮＫ−ＣＡＲ）は、ＣＡＲ−Ｔ及びｉＮＫＴ−ＣＡＲの定義と類似した意味を有し得る。
【０２８６】
本明細書で使用する場合、「キメラ抗原受容体マクロファージ」（すなわち、ＣＡＲマクロファージ）は、ＣＡＲ−Ｔ、ｉＮＫＴ−ＣＡＲ、及びＮＫ−ＣＡＲの定義と類似した意味を有し得る。
【０２８７】
本明細書で使用する場合、用語「サイトカイン放出症候群」とは、いくつかの種類の免疫治療薬、例えば、モノクローナル抗体及びＣＡＲ−Ｔまたはその他のＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞などを用いた治療後に生じ得る症状のことを意味する。サイトカイン放出症候群は、免疫治療薬の影響を受けた免疫細胞から血流への、大規模で急速なサイトカインの放出によって引き起こされる。ＣＲＳの症状としては、発熱、疲労、食欲不振、筋肉痛及び関節痛、悪心、嘔吐、下痢、発疹、呼吸促迫、頻拍、低血圧、発作、頭痛、混乱、譫妄、幻覚、振戦、ならびに運動感覚の低下、が挙げられる。ＣＲＳは、軽度から致死性の範囲に沿って顕在化し得、以下の重症度、
・グレード１：軽度の反応、注入中断の指示なし、介入の指示なし
・グレード２：治療または注入の中断の指示はあるが、対症治療（例えば、抗ヒスタミン薬、ＮＳＡＩＤ、麻酔薬、ＩＶ輸液）に対する迅速な応答があり、＜＝２４時間の予防薬剤の指示あり
・グレード３：持続性（例えば、対症薬物療法に速やかに応答しない、及び／または、短期間の注入中断）、初期の改善後における症状の再発、臨床的続発症（例えば、腎機能障害、肺浸潤）による入院指示あり
・グレード４：生命を脅かす結果、昇圧または換気補助の指示あり
・グレード５：死亡
によりランク付けすることができる。
例えば、“Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ（ＣＴＣＡＥ）Ｖｅｒｓｉｏｎ  ｖ４．０３，”Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｊｕｎｅ  １４，２０１０；Ｌｅｅ  ＤＷ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，”Ｂｌｏｏｄ  ２０１４  １２４（２）：１８８−９５を参照されたい。
【０２８８】
本明細書で使用する場合、用語「ＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチー」とは、患者へのＣＡＲ−Ｔ治療薬の投与後、多くの場合、介入を行うサイトカイン放出症候群が発症して軽減した後に生じるニューロパチーのことを意味する。この用語は、ＣＡＲ−Ｔ療法が比較的新しいことを主な理由として、比較的新しいものであり、例えば、Ｖａｓｔｈｉｅ  Ｐ  ａｎｄ  Ｂｒｅｉｔｂａｒｔ  ＷＳ，“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ，”Ｐａｌｌｉａｔ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｃａｒｅ．２０１７  Ａｕｇ；１５（４）：４９９−５０３を参照されたい。それゆえ、ＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチーは、類似したニューロパチーが、例えば、ｉＮＫＴ−ＣＡＲまたはＮＫ−ＣＡＲを用いた治療に起因して生じる可能性があることから、この時点において、用語「ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞関連ニューロパチー」と等しいものと理解すべきである。
【０２８９】
本明細書で使用する場合、「サイトカイン」は、免疫機構における特定の細胞が調節可能に合成及び分泌し、場合によっては、局所的に高濃度となり、別の細胞上の受容体に結合することにより、それら別の細胞へとシグナルを伝達して、それら別の細胞に影響を及ぼす、小さな（約５〜２０ｋＤａ）、可溶性のシグナル伝達タンパク質の部類のうちの１つである。「ケモカイン」は、走化性サイトカイン、すなわち、近傍の応答性細胞の走化性を誘導することができるサイトカインの亜種である。
【０２９０】
本明細書で使用する場合、サイトカインまたはタンパク質を「欠損」したとは、サイトカインまたはタンパク質がその正常な作用を誘導する上で、十分な量のサイトカインまたはタンパク質を欠いているということを意味する。ＧＭ−ＣＳＦを「欠損」した細胞、例えば、（「ＧＭ−ＣＳＦ欠損」細胞）は、ＧＭ−ＣＳＦを完全に欠いていてもよいが、また、存在するＧＭ−ＣＳＦが、サイトカイン放出症候群の発症または維持に対していかなる有効な形でも寄与し得ないほどに、ごくわずかな量のＧＭ−ＣＳＦを発現し得る。
【０２９１】
用語「欠失」とは、本明細書で使用する場合、遺伝子に対する編集効果またはそのタンパク質産物における効果に関し、タンパク質産物の発現が抑制または防止されるように、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変または一部喪失させることを意味する。用語「抑制」とは、同一の文脈において、タンパク質産物の発現を低下させることを意味し、用語「除去」とは、同一の文脈において、タンパク質産物の発現をノックアウト（ＫＯ）または防止することを意味する。欠失は、抑制及び除去を包含する。
【０２９２】
本明細書で使用する場合、「分泌可能なタンパク質」は、別の細胞に影響を及ぼす、細胞が分泌するタンパク質である。例えば、分泌可能なタンパク質としては、サイトカイン、ケモカイン、及び転写因子、が挙げられる。
【０２９３】
本明細書で使用する場合、「選択マーカー」とは、異なる細胞型間、例えば、ＣＡＲが成功裏に挿入された細胞（すなわち、遺伝子編集または修飾された細胞）などを識別することを可能とするマーカーのことを意味する。選択マーカーは当該技術分野において周知であり、その使用のための原料及び方法は容易に入手可能である。一部の実施形態では、本開示による適切な選択マーカーは、緑色蛍光（ＧＦＰ）遺伝子または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子を含むがこれらに限定されない蛍光タンパク質遺伝子であってもよい。一部の実施形態では、選択マーカーは、ＣＤ３４遺伝子のスプライスバリアント、例えば、トランケートＣＤ３４（ｔＣＤ３４）遺伝子またはトランケートＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）遺伝子などであってもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載の選択マーカー、例えば、ＧＦＰまたは当該技術分野において周知かつ入手可能なその他の選択マーカーなどを、本明細書に記載の遺伝子（すなわち、ＣＡＲを有さない）に単独で挿入してもよく、または、選択マーカー及びＣＡＲを含む構築物の構成要素として挿入してもよい。
【０２９４】
本明細書で使用する場合、「短ヘアピンＲＮＡ」または「低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）」は、細胞内におけるｓｉＲＮＡへのプロセシングの結果として遺伝子発現をノックダウンすることにより、標的遺伝子の発現をサイレンシングするのに使用可能で、多くの場合、約８０塩基対長であり、急なヘアピンの折り返しを有する人工ＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡをゲノムＤＮＡに組み込んで、安定で長続きする発現をもたらしてもよい。
【０２９５】
本明細書で使用する場合、「形質導入」は、ウイルス、またはプラスミドなどのウイルスベクターにより、例えば、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いて、外来ＤＮＡを細胞に導入するプロセスであり、多くの場合、長続きするまたは永続的な遺伝子のサイレンシングをもたらす。形質導入は、エレクトロポレーションを含む当該技術分野において周知の方法を用いて実施することができる。
【０２９６】
トランスフェクションは、精製した核酸、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を真核細胞に故意に導入するプロセスであり、ｍＲＮＡ転写物へのＲＮＡ干渉により、遺伝子の一過性サイレンシングをもたらす。形質導入は、ウイルス、またはプラスミドなどのウイルスベクターにより、例えば、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いて、外来ＤＮＡを細胞に導入するプロセスであり、多くの場合、長続きするまたは永続的な遺伝子のサイレンシングをもたらす。トランスフェクションと形質導入の両方は、エレクトロポレーションを含む当該技術分野において周知の方法を用いて実施することができる。
【実施例】
【０２９７】
以下の実施例により本発明を更に説明する。
【０２９８】
実施例１−ＣＡＲの挿入により遺伝子翻訳を阻害するための方法
図１は、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲを使用してサイトカイン遺伝子の遺伝子座を標的としてから、相同組換え修復を用いてＣＡＳ構築物を挿入することによる、サイトカイン遺伝子の欠失を示す。任意選択的に、ＣＡＳ構築物は、マーカー、例えば、本明細書に記載の選択マーカーなどを含有し得る。このコンセプトに関する１つの課題は、サイトカイン／ケモカインをなおも発現している細胞から、編集された細胞を選択して分離することが困難な点である。この課題を克服するための１つの方法は、マーカーを含有するＣＡＲ構築物を、欠失された遺伝子に挿入することである。ＣＡＲ１９をＴＲＡＣ遺伝子に挿入することにより、ＴＲＡＣ陰性、ＣＡＲ陽性の細胞の選択が可能となることが、これまでに示されている。これにより、ＣＡＲの発現と欠失したサイトカインの両方を示す細胞の分離が可能となり得る。別の代替法は、ゲノムを改変することなくサイトカイン用のＲＮＡのコードを低下させ得るｓｈＲＮＡを、ＣＡＲ構築物から発現させることであり得る。ＣＡＲ構築物上のマーカー（例えば、トランケートＣＤ３４マーカーなど）を使用して、サイトカインを下方制御してＣＡＲを発現する（すなわち、ＣＡＲ＋  ＝  サイトカイン陰性）細胞を選択してもよい。
【０２９９】
図２に示すように、ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ）は、標的サイトカイン遺伝子を欠失させてＣＡＲを形質導入する遺伝子編集の前の２日間にわたり活性化され得る。
【０３００】
実施例２−ゲノム編集ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を作製するための一般的な方法
ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を作製するための方法に関する更なる詳細は当該技術分野において周知であり、例えば、ＷＯ２０１８０２７０３６Ａ１に開示されている。
【０３０１】
以下の一般的な工程を採用してＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を得てもよい。当業者は理解するように、おそらく異なる効率をもたらすであろうが、ある特定の工程を、以下に記載する順で連続的に実施してもよく、または、順不同に実施してもよい。
【０３０２】
工程１．例えば、細胞特異的タンパク質に結合する、標識抗体をコーティングした磁性ビーズ（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから入手可能）を使用した、磁気選択を用いて、細胞を回収、単離、及び精製する。Ｔ細胞用には、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用してもよい。その他の精製技術は当該技術分野において周知であり、それらを使用してもよい。
【０３０３】
工程３．その後、細胞を活性化させる。免疫エフェクター細胞を活性化させるための方法はいくつかある。例えば、ビーズを取り除く前の２日間にわたり抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して、Ｔ細胞を活性化させてもよい。代替的に、抗体を使用してもよい。
【０３０４】
工程４．ＣＡＲの標的である抗原を細胞表面から欠失させてもよく、または、その抗原の発現を抑制してそれに続く同胞殺しを防止してもよい。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ、及び標的（複数可）に対するｇＲＮＡをエレクトロポレーションすることにより、標的の欠失を実施してもよい。しかしながら、その他の技術を使用して標的の発現を抑制してもよい。これらの技術としては、その他のゲノム編集技術、例えば、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、ＲＮＡ干渉、及び、抗原の内部結合を生じさせて細胞表面発現を防止することなどが挙げられる。標的の欠失は、全ての状況において必須ということでなくてもよい。使用可能なｇＲＮＡの例としては、表８〜１０に示すｇＲＮＡに加えて、当該技術分野において周知のその他のｇＲＮＡが挙げられる。
【表８】
2021525530.tif 000024
【０３０５】
工程５．次に、１種または複数種の抗原標的またはタンパク質標的を標的とする（すなわち、認識する）ＣＡＲ、例えば、ＣＡＲ構築物を含有するレンチウイルスを、細胞に形質導入してもよい。形質導入／トランスフェクションの任意のその他の好適な方法を用いてもよく、例えば、転移因子を含有する、ＤＮＡを組み込んだウイルスもしくは非ウイルスベクター、または、一過性発現の、非ＤＮＡを組み込んだポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡなど、を使用したトランスフェクションを用いてもよく、あるいは、相同または非相同組換えを使用した、ヌクレアーゼ活性部位へのＣＡＲポリヌクレオチドの挿入を用いてもよい。
【０３０６】
工程６．次に、ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を培養してその集団を増殖させる。
【０３０７】
実施例３−ゲノム編集タンデムＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を作製するための方法
上記実施例における手順の変化形態では、２種の抗原を認識するｔＣＡＲ細胞を作製してもよい。工程４では、細胞表面から２種の抗原を欠失させる、または、上記のとおり抑制してもよいが、２種の標的それぞれ用のｇＲＮＡ、及びＣａｓ９  ｍＲＮＡをエレクトロポレーションする。次に、工程５では、２種の標的を認識するＣＡＲを細胞に形質導入する。
【０３０８】
実施例４−ゲノム編集デュアルＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を作製するための方法
上記実施例における手順の変化形態では、２種の抗原を認識するｄＣＡＲ細胞を作製してもよい。この変化形態では、それぞれが異なる抗原を認識する２種の独立したＣＡＲを含有していてもよい。
【０３０９】
実施例５−サイトカインまたはケモカインの発現を抑制したゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製及び試験するための方法
以下の工程を採用して、特定のサイトカインまたはケモカインの発現及び／または分泌を抑制したゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞を得てもよい。本実施例では、ＧＭ−ＣＳＦの発現を欠損した、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ−Ｔの作製について説明する。当業者は理解するように、おそらく異なる効率をもたらすであろうが、ある特定の工程を、以下に記載する順で連続的に実施してもよく、または、順不同に実施してもよい。
【０３１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＲＳ実験を実施する場合、ＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウスに腫瘍（ルシフェラーゼを含有する３ｅ６  Ｒａｊｉ）を注入する。この腫瘍の注入は、ＣＡＲ−Ｔをマウスに注入する３週間前に完了させる必要がある。
【０３１１】
Ｔ細胞の活性化（０日目）。
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ヒトＰａｎＴ単離キットを使用して、ロイコフェレーシスチャンバーからＴ細胞を精製し、その後、培地に再懸濁させる。細胞をカウントして、３：１のビーズ：細胞比率を得るのに必要なヒトＴ細胞活性化ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの数を求める。Ｔ細胞培地でビーズを２回洗浄してから、１．２５６細胞／ｍＬとなるように、ｈＸｃｙｔｅ培地中に細胞を希釈する。ヒトＴ細胞活性化ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを加える。６ウェルプレートのそれぞれのウェルに、ウェルあたり、１．２５６細胞／ｍＬ溶液４ｍＬをアリコートする。細胞を３７℃で培養する。
【０３１２】
ＣＲＩＳＰＲ（２日目）。
Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ、及び標的（複数可）に対するｇＲＮＡをエレクトロポレーションすることにより、標的の欠失を実施してもよい。しかしながら、その他の技術を使用して標的の発現を抑制してもよい。これらの技術としては、その他のゲノム編集技術、例えば、ＴＡＬＥＮ、ＲＮＡ干渉、及び、抗原の内部結合を生じさせて細胞表面発現を防止することなどが挙げられる。使用可能なｇＲＮＡの例としては、表８〜１０に示すｇＲＮＡに加えて、当該技術分野において周知のその他のｇＲＮＡが挙げられる。
2021525530.tif 000025
【表９】
2021525530.tif 000026
【表１０】
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＊は、骨髄細胞を活性化または局在化するＴ細胞により産生されたサイトカイン／ケモカインを表す。
＊＊は、骨髄細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞を活性化するＴ細胞表面受容体遺伝子を表す。
＊＊＊は、ＣＡＲ−Ｔ細胞シグナル伝達に組み込まれることにより内在性受容体が重複することになる、Ｔ細胞表面受容体を表す。
＾は、Ｔ細胞／ＣＡＲ−Ｔ細胞の分化を駆動するサイトカインを表す。
太字の行は、Ｔ細胞／ＣＡＲ−Ｔ細胞の分化を駆動する転写因子を表す。
【０３１３】
実施例６−手順−ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ４Ｄを使用したヌクレオフェクション
反応あたり４×１０６の細胞を使用する。ＥＯ−１１５−１００μｌのトランスフェクション容量をプログラムし、全ての助剤をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐ３に加える。適切な数のウェルに望ましい容量の推奨培地（６ウェルプレートに２ｍｌ）を充填してから、加湿インキュベータ内、３７℃／５％ＣＯ２で、プレートを予備培養／平衡化することにより、細胞培養プレートを調製する。ビーズを磁気で取り除き（完全な除去を確保するために２回）、その後、細胞をカウントし、細胞密度を測定する。必要な数の細胞を、室温、９０×ｇで１０分間、遠心分離にかけ、上清を完全に除去する。次に、細胞をＰＢＳ（１ｍｌ）中に再懸濁してから微量遠心チューブに移し、必要な数の細胞を、室温、９０×ｇで１０分間、遠心分離にかける。上清を完全に除去してから、完全に室温の４Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐ３中に細胞ペレットを慎重に再懸濁する（１００μｌあたり４×１０６）。２０μｇのｇＲＮＡ（ｇＧＭ−ＣＳＦ）を、それぞれのチューブの１５μｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡに加える。次に、１００μｌの細胞を、それぞれのチューブのＣａｓ９／ｇＲＮＡに加え、軽く混合してから、全てをＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）に移す。キュベットを軽く叩いて気泡を除去する。プログラム（ヒトＴ細胞刺激ＥＯ−１１５）を使用してエレクトロポレーションを実施する。処理の完了後、専用のツールを使用して、保持器の容器からＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）を慎重に取り外す。予め温めた培地に細胞を再懸濁する。次に、目的ウェルから培地を除去し、キュベットに加え、２〜３回上下に優しくピペッティングする。次に、これをウェルに移す。同一ウェルの培地を用いてこの手順を繰り返し、３７℃で培養する。
【０３１４】
ＣＡＲの形質導入（２日目）。
次に、１種または複数種の標的を標的とする（すなわち、認識する）１種または複数種のＣＡＲ、例えば、ＣＡＲ構築物を含有するレンチウイルスを、ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞に形質導入してもよい。形質導入の任意のその他の好適な方法を用いてもよい。
【０３１５】
レンチウイルスをＴ細胞に形質導入するための手順：それぞれのｍｌの培地用に１μｌのポリブレンを加える（８ｍｇ／ｍｌストック）。次に、必要量のウイルスを加えて、必要とされるＭ．Ｏ．Ｉ．を得る。細胞及びウイルスを混合し、３７℃のインキュベータに戻す。
【０３１６】
形質導入効率の評価（１０日目）。
次に、それぞれの試料から５×１０５の細胞を取り出してフローサイトメトリーで解析することにより、形質導入効率について、細胞の試料を評価してもよい。試料をＲＢで洗浄してから、３μｌの抗ＣＤ３４  ＰＥ抗体を加える（構築物がヒトトランケートＣＤ３４を含有していることから、ＣＡＲを検出するために）。その後、５μｌのＣＤ３  ＡＰＣを加え、細胞を洗浄してから、フローサイトメトリーを実施する。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ３ε陽性、ＣＤ３４陽性のはずである。
【０３１７】
遺伝子の欠失の評価。
遺伝子の欠失を評価するために、それぞれの試料から５×１０５の細胞を回収し、それらのＤＮＡを抽出する。ＴＩＤＥ解析またはディープシークエンシングを使用し、標的遺伝子座のターゲットシークエンシングを用いて、遺伝子編集効率を評価する。
【０３１８】
全身腫瘍組織量及びサイトカインレベルの評価。
Ｔ細胞を回収する（１１日目）。生物発光イメージングを用いて、マウスにおける全身腫瘍組織量のイメージングを行ってもよい。マウスあたり３×１０７のＣＡＲ−ＴをＩ．Ｐ．注射する。
【０３１９】
例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスサイトカインプロファイリングアッセイを使用して、血清サイトカインレベル（１２日目）を測定して、ＣＲＳ関連サイトカインの上昇を確認する。標的細胞（Ｒａｊｉ）に対する４時間のクロム放出アッセイを実施して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を評価してもよい（１１日目）。
【０３２０】
実施例７−ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞の別の例
上記の方法を使用して、サイトカインを欠損した、いくつかのタイプのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞を作製してもよい。以下の表１１〜１３に例を示す。
【表１１】
2021525530.tif 000064
2021525530.tif 000065
2021525530.tif 000066
2021525530.tif 000067
【表１２】
2021525530.tif 000068
2021525530.tif 000069
2021525530.tif 000070
2021525530.tif 000071
【表１３】
2021525530.tif 000072
2021525530.tif 000073
2021525530.tif 000074
2021525530.tif 000075
【０３２１】
実施例８−バイオアッセイ
以下のアッセイまたはその変形形態を使用して、本明細書で開示するサイトカイン欠損キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞の有効性を評価してもよい。
【０３２２】
Ｔ−ＡＬＬ。Ｔ−ＡＬＬの異種モデルを用いた細胞の有効性試験：１×１０５のＣｌｉｃｋ  Ｂｅｅｔｌｅ  Ｒｅｄルシフェラーゼ（ＣＢＲ）標識ＣＣＲＦ−ＣＥＭ  Ｔ−ＡＬＬ（ＦＡＣＳにより９９％  ＣＤ７＋）細胞をＮＳＧレシピエントにＩ．Ｖ．注射してから、２×１０６〜１×１０７のＣＡＲ７保有免疫エフェクター細胞または非標的ＣＡＲ１９保有免疫エフェクター細胞対照細胞を＋４日目にＩ．Ｖ．注入する。ＣＡＲＴ１９保有免疫エフェクター細胞を投与されたマウスまたは腫瘍のみを注入されたマウスとは対照的に、ＣＡＲ７保有免疫エフェクター細胞を投与されたマウスは、生物発光イメージングを用いて測定する際に、有意に長期間にわたる生存及び全身腫瘍組織量の低下を示す。
【０３２３】
多発性骨髄腫。多発性骨髄腫の異種モデルを用いたｉＮＫＴ−ＣＡＲ−ＣＳ１の有効性試験：５×１０５のＣｌｉｃｋ  Ｂｅｅｔｌｅ  Ｒｅｄルシフェラーゼ（ＣＢＲ）標識ＭＭ．１Ｓ（ＦＡＣＳにより９９％  ＣＳ１＋）細胞をＮＳＧレシピエントにＩ．Ｖ．注射してから、２×１０６〜１×１０７のｉＮＫＴ−ＣＡＲ−ＣＳ１または非標的ｉＮＫＴ−ＣＡＲ１９対照細胞を＋４日目、または＋１４日目もしくは＋２８日目にＩ．Ｖ．注入する。ｉＮＫＴ−ＣＡＲ１９を投与されたマウスまたは腫瘍のみを注入されたマウスとは対照的に、ｉＮＫＴ−ＣＡＲ−ＣＳ１を投与されたマウスは、生物発光イメージングを用いて測定する際に、有意に長期間にわたる生存及び全身腫瘍組織量の低下を示す。
【０３２４】
サイトカイン放出症候群及び神経毒性のｉｎ  ｖｉｖｏモデル。
ＣＲＳのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルについては、Ｇｉａｖｒｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，“ＣＡＲ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ａｂａｔｅｄ  ｂｙ  ＩＬ−１  ｂｌｏｃｋａｄｅ，”Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１８  Ｍａｙ  ２８に開示されている。例えば、モデル系でＣＲＳを誘導するためには、腫瘍細胞を免疫欠損マウスに腹腔内注入してから腫瘍へと発達させる。次に、がん性細胞を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞をマウスに投与してから、ＣＲＳの発症が生じるのを数日間モニターし、その後、マウスを屠殺し、細胞及び組織を解析用に取得する。マウスはまた、ＣＲＳの治療を行ってから、治療の成功または失敗をモニターしてもよい（すなわち、サイトカインに対する抗体を投与して、ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与による結果を生じさせる）。
【０３２５】
このようなモデルにおけるＣＲＳをモニターするのに適切な解析法としては、ＣＡＲ−Ｔ細胞投与後のマウスの体重変化、マウスの生存率、炎症性因子、すなわち、マウスＳＡＡ３（ヒトＣ反応性タンパク質に相当）の血清レベル、ＣＡＲ−Ｔ細胞投与前後のサイトカインレベル、炎症性サイトカインの起源種（すなわち、ヒトサイトカイン対マウスサイトカイン）、及び／または、特定のサイトカインに対する抗体を投与された、ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療したマウスの生存率、をモニターすることを挙げることができる。
【０３２６】
ＣＲＳ症状または合併症により最終的に死亡するマウスを、重度のＣＲＳを示すマウスに分類してもよく、一方で、生存しているが１０％超の体重減少を経験するマウスを、重度ではないＣＲＳを示すマウスに分類してもよい。このモデルを使用することにより、単球及びマクロファージが、ＣＲＳにおけるＩＬ−６の主な供給源であることが判明した。
【０３２７】
ＣＲＳとＣＡＲ−Ｔ関連ニューロパチーの両方を評価するのに有用な別のモデルについては、Ｎｏｒｅｌｌｉ，“Ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＩＬ−１  ａｎｄ  ＩＬ−６  ａｒｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｄｕｅ  ｔｏ  ＣＡＲ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１８  Ｍａｙ  ２８に開示されている。このモデルでは、ヒト幹細胞、例えば、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）などを、ヒト化ＮＳＧマウスに注射するが、これらのマウスは、ヒト幹細胞因子、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ−３を発現して、注射されたヒト幹細胞による造血を補助して向上させる免疫低下トランスジェニックマウスである。続けて投与するＣＡＲ−Ｔ細胞の標的として機能する腫瘍細胞をマウスに投与してから、ＣＲＳ症状をモニターする。ＣＡＲ−Ｔ細胞の注射後、これらのマウスは、高熱、ならびに、ＣＲＳに関連する特定のサイトカイン、例えば、ＩＬ−１及び／またはＩＬ−６などのレベル上昇、を含む、ＣＲＳの典型的な症状を示す。これらのマウスのＣＲＳの対照については、例えば、抗体を使用してサイトカイン用の受容体を阻害すること、サイトカインを発現する細胞型を枯渇させること、または、サイトカインのアンタゴニストを投与すること、により、実施してもよい。上記のとおり、単球が、ＣＲＳ前のサイトカインであるＩＬ−６の主な供給源であり、単球を枯渇させるとＣＲＳが解消されて、マウスがＣＲＳにより死亡するのを防ぐことが確認された。
【０３２８】
その他のＣＲＳ動物モデルは、当該技術分野において周知であり、適切とみなしてそれらを使用してもよい。
【０３２９】
サイトカイン放出症候群を制御目的で誘導及び試験するための方法
１つのモデルでは、本明細書に記載するとおり、マウスまたはその他の動物モデルにＩＬ−７を直接注射して、ＣＲＳを制御目的で誘導または引き起こしてもよい。更に別の例では、組換えまたは遺伝子組換えＩＬ−７を細胞内で発現させて、ＩＬ−７のシグナル伝達上昇をもたらしてもよい。
【０３３０】
なおも更なる例では、構成的にシグナル伝達を行っているサイトカイン受容体、例えば、ＩＬ−７受容体などを、免疫エフェクター細胞に導入して、その結果、免疫エフェクター細胞自体がＩＬ−７のシグナル伝達をトリガーするが、細胞外ＩＬ−７には反応せず、周囲のリンパ球によるＩＬ−７のシグナル伝達開始を回避するようにしてもよい。加えて、構成的にシグナル伝達を行っているＩＬ−７受容体を、特定の疾患部または腫瘍抗原を認識するＣＡＲと共発現させることにより、Ｔ細胞増殖、生存率、及び抗腫瘍活性の上昇をもたらす。構成的に発現しているＩＬ−７受容体は、ＩＬ−７Ｒαと共に、ＩＬ−７リガンド、または、天然ＩＬ−７受容体の構成要素である共通γｃ鎖を必要とすることなく、ＩＬ−７のシグナル伝達を伝えることができる。この伝達は、ＩＬ−７Ｒα鎖の膜貫通ドメインにシステイン及び／またはプロリンを導入することによって達成することができ、その結果、ＩＬ−７Ｒαのホモ二量体化、及びそれに続くＪＡＫ１／ＪＡＫ１のリン酸化がもたらされ、次に、下流におけるＩＬ−７のシグナル伝達が活性化される。
【０３３１】
選択マーカーを遺伝子編集遺伝子座に挿入することによりＣＲＳの誘導を欠損させたゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製及び試験するための方法の一例を以下に記載する。
【０３３２】
実施例９−Ｔ細胞受容体遺伝子へのＣＡＲの挿入
ＣＡＲまたは任意の目的のタンパク質をＴ細胞受容体用の遺伝子に挿入してもよい。ＭａｃＬｅｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（“Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＣＤ１９  ＣＡＲ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ＴＣＲ  Ａｌｐｈａ  Ｃｈａｉｎ  Ｌｏｃｕｓ  Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｇｅｎｅ−Ｅｄｉｔｅｄ  ＣＡＲ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ，”Ｍｏｌｅｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２５（４）：Ｐ９４９−９６１，２０１７）は、遺伝子改変ホーミングエンドヌクレアーゼ及びＡＡＶドナー鋳型を使用して、天然ＴＣＲの遺伝子座を標的としてＣＡＲ導入遺伝子を直接挿入することによる、同種異系ＣＡＲＴ細胞の生成について報告している。この方法で作製された抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞は、内在性の細胞表面ＴＣＲを発現せず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで強力なエフェクター機能を示し、ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるＣＤ１９＋腫瘍の排除を媒介する。得られた遺伝子編集ＣＡＲＴ細胞は、前臨床モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍活性を示し、ＣＤ１９＋血液悪性腫瘍を有する非血縁患者における養子細胞療法としての安全かつ有効な使用の可能性をこれらの細胞が有していることを示唆している。
【０３３３】
実施例１０−ＣＲＳを抑制するための抗サイトカイン／ケモカイン抗体
がんを治療するために免疫エフェクター細胞を患者または対象に導入すると、免疫エフェクター細胞によるサイトカイン及び／またはケモカインの産生及び分泌に起因して、ＣＲＳがもたらされる場合が多い。ＣＲＳを防止するための１つの方法は、血中サイトカイン／ケモカインの量が低下するように、特定のＣＲＳ誘導サイトカインまたはケモカインを認識する抗体を患者または対象に投与することである。例えば、Ｓａｃｈｄｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２９４（１４）：５４３０−５４３７，２０１９）が報告しているように、抗ＧＭＣＳＦ抗体を投与するとＧＭＣＳＦ分泌が低下し、その結果として、ＣＲＳが効果的に抑制される。それゆえ、特定のサイトカイン及び／またはケモカインを認識する抗体を投与することにより、患者または対象におけるＣＲＳの発症を予防または低下させることができる。
【０３３４】
実施例１１−ＧＭＣＳＦ遺伝子へのＣＡＲの挿入
ＣＲＳを予防するための１つの例示的な方法は、ＣＲＳの誘導または持続に関与するサイトカインまたはケモカイン用の遺伝子にＣＡＲを挿入することである。ＣＡＲ−Ｔ細胞またはその他の免疫エフェクター細胞におけるサイトカインまたはケモカインの遺伝子を破壊または除去すると、その特定のサイトカインまたはケモカインにより、ＣＲＳの誘導が予防される。ＣＲＳの誘導または持続に関与するその他の遺伝子もまた、本明細書に記載のこの方法または類似の方法で破壊してもよいが、このような遺伝子の１つの例はＧＭＣＳＦである。ＧＭＣＳＦ遺伝子の破壊については、少なくとも、Ｓａｃｈｄｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２９４（１４）：５４３０−５４３７，２０１９）に記載されており、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子へと挿入されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製及び試験するための説明については以下に記載する。要約すると、ＣＡＲ−Ｔ細胞における選択したサイトカインまたはケモカインの遺伝子を標的とするように、ＴＡＬＥＮまたはその他の遺伝子編集酵素を設計または遺伝子改変して、当該技術分野において周知の方法を用いて、その遺伝子の発現をモニターしてもよい。サイトカインまたはケモカインの遺伝子の発現及び分泌におけるＣＡＲ−Ｔ細胞による有意な低下が報告されており、ＣＲＳの発症が抑制され得ることを示唆している。加えて、トランスウェルアッセイ及び連続殺傷アッセイを用いて評価すると、この手法により、ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖能力と抗腫瘍活性の両方が同時に維持されることが判明した。
【０３３５】
ＧＭ−ＣＳＦなどの遺伝子を欠失させるための遺伝子編集の使用に加えて、ＣＲＳを誘導するまたはＣＲＳに寄与するサイトカインまたはケモカインに対する抗体もまた使用してもよい。例えば、ＣＡＲ−Ｔ療法を受けている患者または対象に、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質を認識する抗体を投与してもよい。この手法は、当該技術分野、とりわけ、ＩＬ−６Ｒアンタゴニストであるトシリズマブを使用したＩＬ−６のシグナル伝達によって生じるＣＲＳの抑制において周知であるが、サイトカインもしくはケモカインを認識するその他の抗体もしくはアンタゴニスト、または、サイトカインもしくはケモカインの受容体のアンタゴニストを、臨床医が適切とみなして使用してもよい。適切な抗体が血中のサイトカインまたはケモカインに結合し、アンタゴニストが、サイトカインまたはケモカイン用の天然の受容体に結合することにより、対象における下流のＣＲＳ促進活性が予防される。一部の例では、これら手法の両方、すなわち、サイトカインまたはケモカイン用の遺伝子にＣＡＲを挿入してその遺伝子を不活性化すること、及び、同一のサイトカインまたはケモカインに対する抗体を対象に投与すること、を対象に採用してもよい。この手法が、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の活性にマイナスの影響を与えずに、有効であることが示されている（Ｓｔｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“ＧＭ−ＣＳＦ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＣＡＲ−Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ，”Ｂｌｏｏｄ  １３３：６９７−７０９，２０１９）。
【０３３６】
実施例１２−選択マーカーを遺伝子編集遺伝子座に挿入することによりＣＲＳの誘導を欠損させたゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製及び試験するための方法
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＲＳ実験を実施する場合、ＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウスに腫瘍（ルシフェラーゼを含有する３ｅ６  Ｒａｊｉ）を注入する。この腫瘍の注入は、ＣＡＲ−Ｔをマウスに注入する３週間前に完了させる必要がある。
【０３３７】
以下の工程を採用して、本明細書で開示する選択マーカーを有する遺伝子編集遺伝子座からＣＡＲが発現している、ゲノム編集され、ＣＲＳ抵抗性の、ＣＡＲ−Ｔ細胞を得てもよい。内部タンパク質または分泌タンパク質をコードする遺伝子の欠失に基づいて編集細胞を選択及び精製することは不可能であることから、この遺伝子改変体を濃縮するには選択マーカーが必要となる。本実施例では、ＧＭ−ＣＳＦの欠失がＣＲＳのリスクを緩和し、ＣＤ３εの欠失がＴＣＲのシグナル伝達及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防する、ＣＤ１９ＣＡＲＴΔＧＭＣＳＦΔＣＤ３ε細胞の作製について説明する。当業者は理解するように、おそらく異なる効率をもたらすであろうが、ある特定の工程を、以下に記載する順で連続的に実施してもよく、または、順不同に実施してもよい。
【０３３８】
工程１：Ｔ細胞の活性化（０日目）
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ヒトＰａｎＴ単離キットを使用して、ロイコフェレーシスチャンバーからＴ細胞を精製する。培地に再懸濁させる。細胞をカウントする。３：１のビーズ：細胞比率を得るのに必要なヒトＴ細胞活性化ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの数を求める。Ｔ細胞培地でビーズを２回洗浄する。１．２５６細胞／ｍＬとなるように、ｈＸｃｙｔｅ培地中に細胞を希釈する。ヒトＴ細胞活性化ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを加える。６ウェルプレートに、ウェルあたり、１．２５６細胞／ｍＬ溶液４ｍＬをアリコートする。細胞を３７℃で培養する。
【０３３９】
工程２：ＣＲＩＳＰＲ（２日目）。
標的遺伝子を遺伝的に欠失させて、遺伝子編集遺伝子座にＣＡＲを挿入する。切断を修復して所望の配列を編集遺伝子座に挿入するためのドナー鋳型を使用した、相同組換え修復を用いて、ＤＮＡの二本鎖切断を修復してもよい。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ、及び標的（複数可）に対するｇＲＮＡをエレクトロポレーションすることにより、標的の欠失を実施してもよい。ドナー鋳型は、二本鎖切断周りのＤＮＡとの相同性を含有し、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡと共にエレクトロポレーションされる、ＤＮＡプラスミド、または、二本鎖直鎖状ＤＮＡ、もしくは一本鎖直鎖状ＤＮＡであってもよい。本実施例では、ホモロジーアームは、ｇＲＮＡ  ＧＭ−ＣＳＦにより導入された二本鎖切断の両側に位置合わせされる。加えて、ＡＡＶなどのウイルスベクターをドナー鋳型の供給源として使用してもよい。しかしながら、その他の技術を使用してＤＮＡ二本鎖切断を導入してもよい。これらの技術としては、ＴＡＬＥＮ及びメガヌクレアーゼなどのその他のゲノム編集技術が挙げられる。
【０３４０】
ＧＭ−ＣＳＦ及びＣＤ３ε用のｇＲＮＡの配列は、以下、
ｈＧＭＣＳＦ  ｇＲＮＡ：５’＿２′ＯＭｅ（Ｕ（ｐｓ）Ａ（ｐｓ）Ｃ（ｐｓ））ＵＣＡＧＧＵＵＣＡＧＧＡＧＡＣＧＣＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ２′ＯＭｅ（Ｕ（ｐｓ）Ｕ（ｐｓ）Ｕ（ｐｓ）Ｕ＿３’（配列番号：５０）
ＣＤ３ε  ｇＲＮＡ：５’＿２′ＯＭｅ（Ａ（ｐｓ）Ｇ（ｐｓ）Ｇ（ｐｓ））ＧＣＡＵＧＵＣＡＡＵＡＵＵＡＣＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ２′ＯＭｅ（Ｕ（ｐｓ）Ｕ（ｐｓ）Ｕ（ｐｓ）  Ｕ  ３’（配列番号：４７）
のとおりである。
2021525530.tif 000076
【０３４１】
ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ４Ｄを使用したヌクレオフェクション：
上記（実施例６）のとおりに、それぞれのチューブの１５μｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡに対して２０μｇのそれぞれのｇＲＮＡ（ｇＧＭ−ＣＳＦ及びｇＣＤ３ε）を使用して、ヌクレオフェクション手順を実施する。
【０３４２】
工程３：ＨＤＲ修復構築物を含有するＡＡＶベクターをＴ細胞に形質導入して、ＣＡＲ及び選択マーカーをＧＭ−ＣＳＦ遺伝子座に導入する。
ベクター構成要素用の本明細書に記載の配列を配列表に記載するが、これら配列としては、配列番号：３０４８〜３０６４が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、１×１０４〜１×１０６のＭＯＩでのエレクトロポレーションの２〜４時間後に、ＩＴＲ右ホモロジーアーム（配列番号：５１）、ＥＦ１ａプロモーター（配列番号：５２）、ＣＡＲ１９  ｐ２ａ  ｔｒＣＤ３４（配列番号：５３）、左ホモロジーアーム（配列番号：５４）、ＩＴＲ（配列番号：５５）、を含有する組換えＡＡＶ６ドナーベクター（図３）を細胞培養液に加える。
【０３４３】
工程４：ＣＲＩＳＰＲ活性及びＴｄ効率の評価（１０日目）
それぞれの試料から５×１０５の細胞を取り出してフローサイトメトリーで解析する。試料をＲＢで洗浄する。３μｌの抗ＣＤ３４  ＰＥ抗体を加える（これにより、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子座に挿入したＴｒＣＤ３４タグを検出する）。５μｌのＣＤ３  ＡＰＣ及び２μｌの抗ＦＡＢ  ＢＶ４２１を加える（ＣＡＲの形質導入を検出する）。洗浄する。フローサイトメトリーを実施する。細胞は、ＣＤ３ε陰性、ＣＤ３４陽性、かつＦＡＢ＋のはずである。Ｔ細胞を回収する（１１日目）。
【０３４４】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の精製。ＴＣＲａ／ｂ陰性選択を用いてＴＣＲ陰性細胞を精製し、ＴＣＲ陽性細胞を除去してもよい。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ａｕｔｏｍａｃｓ上のＣＤ３４陽性選択を用いてＧＭ−ＣＳＦ欠失細胞を濃縮してもよい。これにより、ＧＭ−ＳＣＦ細胞が濃縮され、ＴＣＲ＋細胞が除去される。
【０３４５】
工程５：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＡＲ−Ｔ活性の評価
マウスあたり３×１０７のＣＡＲ−ＴをＩ．Ｐ．注射する。血清サイトカインレベルを評価する。（１２日目、１３日目、１４日目）Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスサイトカインプロファイリングアッセイを使用して、血清サイトカインレベルを測定して、ＣＲＳ関連サイトカインの上昇を確認する。標的細胞（Ｒａｊｉ）に対する４時間のクロム放出アッセイを実施して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を評価する（１１日目）。
【０３４６】
実施例１３−ＣＤ３ｅプロモーターの制御下、ジャーカットのＣＤ３ｅ遺伝子座に挿入したＥＧＦＰの、ＧＦＰ発現の確認
以下で詳しく述べる方法を用いて、ジャーカット細胞株のＣＤ３ｅ遺伝子座へのＧＦＰの直接挿入を実施してもよい。
【０３４７】
数日前：プラスミドをＰＳＴ１で消化する（図４）。消化により２つのフラグメント（３．５ｋｂ及び２．６ｋｂ）を生成する。ゲル抽出キット及びエタノール沈殿を使用して精製を行う。５００ｎｇ／μｌとなるように再懸濁する。これにより、以下の表のドナー鋳型「ＤＮＡ」を作製する。
【０３４８】
ＡＡＶを作製して力価を測定する。ＡＡＶの配列を図５に示し、配列番号：＿＿−＿＿で記載する。これにより、以下の表のドナー鋳型「ＡＡＶ」を作製する。
【０３４９】
ドナー鋳型「プラスミド」を以下の表に示す。
【０３５０】
０日目：
ジャーカットを回収してカウントする。＠１００ｇで１０分間、細胞を遠心沈殿する。１．５ｍ微量遠心チューブに細胞を移して、ＰＢＳで洗浄する。＠１００×ｇで１０分間、細胞を遠心沈殿する。予め温めた緩衝液ＳＥに再懸濁する。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９を入れたチューブに１００μｌを加える。ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅに移して、４Ｄ上のジャーカットプログラムを使用して電気をかける。６ウェルプレートの予め温めた培地（それぞれの培地は２ｍｌ）に移す。インキュベータに戻して４日間増殖させる。
【表１４】
2021525530.tif 000077
【０３５１】
４日目：ＧＦＰ及びＣＤ３  ＡＰＣ用の細胞をＦＡＣＳにかける。ＣＤ３の低下により編集効率を評価し、ＧＦＰ蛍光によりＡＡＶ−ＧＦＰドナーの挿入を評価する。
【０３５２】
実施例１４−ＣＡＲをＣＤ３ｅ遺伝子座に挿入することによりゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製及び試験するための方法
以下の工程を採用して、本明細書で開示する遺伝子編集遺伝子座（ＣＡＲ−Ｔ）からＣＡＲが発現している、ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞を得てもよい。本実施例では、ＣＤ７ＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＣＤ３ε細胞の作製について説明する。当業者は理解するように、おそらく異なる効率をもたらすであろうが、ある特定の工程を、以下に記載する順で連続的に実施してもよく、または、順不同に実施してもよい。
【０３５３】
工程１：Ｔ細胞の活性化（０日目）
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ヒトＰａｎＴ単離キットを使用して、ロイコフェレーシスチャンバーからＴ細胞を精製する。培地に再懸濁させる。細胞をカウントする。３：１のビーズ：細胞比率を得るのに必要なヒトＴ細胞活性化ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの数を求める。Ｔ細胞培地でビーズを２回洗浄する。１．２５６細胞／ｍＬとなるように、ｈＸｃｙｔｅ培地中に細胞を希釈する。ヒトＴ細胞活性化ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを加える。６ウェルプレートに、ウェルあたり、１．２５６細胞／ｍＬ溶液４ｍＬをアリコートする。細胞を３７℃で培養する。
【０３５４】
工程２：ＣＲＩＳＰＲ（２日目）。
標的遺伝子を遺伝的に欠失させて、遺伝子編集遺伝子座にＣＡＲを挿入する。切断を修復して所望の配列を編集遺伝子座に挿入するためのドナー鋳型を使用した、相同組換え修復を用いて、ＤＮＡの二本鎖切断を修復してもよい。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ、及び標的（複数可）に対するｇＲＮＡをエレクトロポレーションすることにより、標的の欠失を実施してもよい。ドナー鋳型は、二本鎖切断周りのＤＮＡとの相同性を含有し、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡと共にエレクトロポレーションされる、ＤＮＡプラスミド、または、二本鎖直鎖状ＤＮＡ、もしくは一本鎖直鎖状ＤＮＡであってもよい。加えて、ＡＡＶなどのウイルスベクターをドナー鋳型の供給源として使用してもよい。しかしながら、その他の技術を使用してＤＮＡ二本鎖切断を導入してもよい。これらの技術としては、ＴＡＬＥＮ及びメガヌクレアーゼなどのその他のゲノム編集技術が挙げられる。
2021525530.tif 000078
【０３５５】
ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ４Ｄを使用したヌクレオフェクション：
上記（実施例６）のとおりに、それぞれのチューブの１５μｇのＣａｓ９に対して２０μｇのそれぞれのｇＲＮＡ（ｇＣＤ７及びｇＣＤ３ε）を使用して、ヌクレオフェクション手順を実施する。
【０３５６】
工程３：ＨＤＲ修復構築物を含有するＡＡＶベクターのＴ細胞への形質導入。
１×１０４〜１×１０６のＭＯＩでのエレクトロポレーションの２〜４時間後に、組換えＡＡＶ６（またはその他の血清型のＡＡＶ）ドナーベクターを細胞培養液に加える。
【０３５７】
工程４：ＣＲＩＳＰＲ活性及びＴｄ効率の評価（１０日目）
それぞれの試料から５×１０５の細胞を取り出してフローサイトメトリーで解析する。試料をＲＢで洗浄する。３μｌの抗ＣＤ３４  ＰＥ抗体を加える（構築物がヒトトランケートＣＤ３４を含有していることから、これにより、ＣＡＲを検出する）。５μｌのＣＤ３  ＡＰＣ及び２μｌのＣＤ７  ＢＶ４２１を加える。洗浄する。フローサイトメトリーを実施する。細胞は、ＣＤ３ε陰性、ＣＤ７陰性、かつＣＤ３４陽性のはずである。Ｔ細胞を回収する（１１日目）。
【０３５８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の精製。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ａｕｔｏｍａｃｓ上のＣＤ３４＋細胞の陽性選択を用いて、ＣＤ３４＋（ＣＡＲ＋）かつＴＣＲ陰性の細胞を単一工程で精製してもよい。これにより、ＣＡＲ＋細胞が濃縮され、ＴＣＲ＋細胞が除去される（ＣＡＲの挿入がＴＣＲのシグナル伝達を阻害するため）。
【０３５９】
工程５：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＡＲ−Ｔ活性の評価
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング実験を実施する場合、ＮＳＧマウスに腫瘍（ルシフェラーゼを含有する、５×１０５のＭＯＬＴ３またはＨＨ）を注入する（７日目）。
【０３６０】
生物発光イメージングを用いて、マウスにおける全身腫瘍組織量のイメージングを行う。マウスあたり２×１０６のＣＤ３４＋ＣＡＲ−Ｔを尾静脈Ｉ．Ｖ．注射する、または、標的細胞（ＭＯＬＴ３またはＨＨ）に対する４時間のクロム放出アッセイを実施する（１１日目）。当業者は、明記した期間にある程度の自由度が可能であることを理解するであろう。
【０３６１】
実施例１５−ｓｈＲＮＡを用いたサイトカイン／ケモカインの遺伝子のサイレンシング
ｓｉＲＮＡに類似した短ヘアピンＲＮＡを使用して、免疫エフェクター細胞におけるサイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子の発現をノックダウンまたは除去してもよい。
【０３６２】
Ｃｈｅｒｋａｓｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（“Ｈｕｍａｎ  ＣＡＲ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌ−ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ＰＤ−１  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｒｅｓｉｓｔ  ｔｕｍｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  ２０１６；１２６：３１３０−３１４４）は、ＣＤ２８メソテリン特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞における免疫チェックポイントＰＤ−１の発現をノックダウンするためのｓｈＲＮＡの使用について報告しており、抗原刺激時の高い増殖能、高い細胞傷害性、及び高いサイトカイン分泌が示されている。加えて、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞リンパ腫に使用するために、ＰＤ−１  ｓｈＲＮＡレンチウイルスカセットを有するＣＤ１９特異的ＣＡＲの試験が行われている。有用なｓｈＲＮＡ及びその配列の一覧を表１５及び１６に記載する。
【表１５】
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【表１６】
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【０３６３】
実施例１６−タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）−ＣＡＲ１９−ＧＭ−ＣＳＦ  ＰＥＢＬを用いて特定のサイトカイン発現を欠損した細胞を作製及び試験するための方法
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＲＳ実験を実施する場合、ＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウスに腫瘍（ルシフェラーゼを含有する３ｅ６  Ｒａｊｉ）を注入する。この腫瘍の注入は、ＣＡＲ−Ｔをマウスに注入する３週間前に完了させる必要がある。
【０３６４】
以下の工程を採用してＣＲＳ抵抗性を得てもよい。サイトカインが分泌タンパク質であることから、この遺伝子改変体を濃縮するには選択マーカーが必要となる。本実施例では、ＧＭ−ＣＳＦ分泌の阻害がＣＲＳのリスクを緩和する、細胞ＣＡＲ１９−ＧＭ−ＣＳＦ  ＰＥＢＬの作製について説明する。当業者は理解するように、おそらく異なる効率をもたらすであろうが、ある特定の工程を、以下に記載する順で連続的に実施してもよく、または、順不同に実施してもよい。
【０３６５】
工程１：Ｔ細胞の活性化（０日目）
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ヒトＰａｎＴ単離キットを使用して、ロイコフェレーシスチャンバーからＴ細胞を精製する。培地に再懸濁させる。細胞をカウントする。３：１のビーズ：細胞比率を得るのに必要なヒトＴ細胞活性化ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの数を求める。Ｔ細胞培地でビーズを２回洗浄する。１．２５６細胞／ｍＬとなるように、ｈＸｃｙｔｅ培地中に細胞を希釈する。ヒトＴ細胞活性化ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを加える。６ウェルプレートに、ウェルあたり、１．２５６細胞／ｍｌ溶液４ｍｌをアリコートする。３７℃で培養する。
【０３６６】
工程２：ＰＥＢＬ  ＣＡＲのＴ細胞への形質導入（１日目）
１種または複数種の抗原標的またはタンパク質標的を標的とする（すなわち、認識する）ＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ構築物を含有するレンチウイルスを、抗ＧＭ−ＣＳＦ  ＰＥＢＬと組み合わせて、Ｔ細胞に形質導入する。ＣＤ３４発現がＣＡＲ発現とＰＥＢＬ発現の両方を表すことを可能とするポリシストロン性ベクターからの発現が好ましい。しかしながら、ＣＡＲとＰＥＢＬの両方を個別に発現する同一ウイルスベクターを用いて、または、ＣＡＲ及びＰＥＢＬをそれぞれ含有する別々のベクターを用いた独立した形質導入により、発現を達成してもよい。形質導入を行うための任意のその他の好適な方法、例えば、ＡＡＶ、レトロウイルスなどを使用してもよく、または、相同組換え修復及び構築物を含有するドナーベクターを用いて、ゲノムの標的位置にＣＡＲ  ＰＥＢＬ複合体を直接挿入することにより、形質導入を行ってもよい。
【０３６７】
工程３：Ｔｄ効率の評価（１０日目）
それぞれの試料から５×１０５の細胞を取り出してフローサイトメトリーで解析する。試料をＲＢで洗浄する。３μＬの抗ＣＤ３４  ＰＥ抗体を加える。５μＬのＣＤ３  ＡＰＣ及び２μＬの抗ＦＡＢ  ＢＶ４２１を加える（ＣＡＲの形質導入を検出する）。洗浄する。フローサイトメトリーを実施する。細胞は、ポリシストロン性ベクターからのＣＡＲ及びＰＥＢＬの発現を示すＣＤ３４陽性であるはずである。Ｔ細胞を回収する（１１日目）。
【０３６８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の精製。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ａｕｔｏｍａｃｓ上のＣＤ３４陽性選択を用いて、ＣＡＲ＋（ＣＤ３４＋）細胞及びＧＣ−ＣＳＦ欠損（ＰＥＢＬ＋）細胞を濃縮してもよい。これにより、ＧＣ−ＣＳＦ抑制細胞が濃縮され、ＣＡＲ＋細胞が濃縮される。
【０３６９】
工程４：ＣＡＲ−Ｔ活性の評価
マウスあたり３×１０７のＣＡＲ−Ｔ細胞をＩ．Ｐ．注射する。血清サイトカインレベルを評価する。（１２日目、１３日目、１４日目）。Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスプロファイリングアッセイを使用して、血清サイトカインレベルを測定して、ＣＲＳ関連サイトカインの上昇を確認する。標的細胞（Ｒａｊｉ）に対する４時間のクロム放出アッセイを実施して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を評価する（１１日目）。
【０３７０】
ＧＭ−ＣＳＦを標的とするＰＥＢＬ構築物を図６ならびに表１７及び１８に記載する。
【表１７】
2021525530.tif 000175
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【表１８】
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【０３７１】
実施例１７−ＣＡＲＴ１９におけるＧＭ−ＣＳＦの欠失後にＣＲＳを誘導する効果を試験するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＲＳアッセイ
細胞株：ＣＤ１９陽性Ｂ−ＡＬＬ細胞株ＲＡＭＯＳを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでＣＲＳを評価した。アッセイの前に、レンチウイルス形質導入を用いて、ＲＡＭＯＳ細胞にＧＦＰを安定的にトランスフェクションし、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ中で培養した。
【０３７２】
正常ドナーの単球及びＴ細胞の単離：正常で健康なヒトドナーから初代ヒトＴ細胞及び単球を単離した。ＣＤ４＋ＣＤ８＋選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＰＢＭＣからＴ細胞を単離し、製造業者の手順に従い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃの標準的な単球単離用ビーズを用いて単球を分離した。
【０３７３】
Ｔ細胞培養及びＣＡＲ−Ｔ遺伝子編集：続けて、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５を補足したＸｃｙｔｅ培地中に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ビーズ対細胞の比率３：１）の存在下、１×１０６細胞／ｍＬの濃度でＴ細胞を再懸濁した。初回刺激の２４時間後、ポリブレン（終濃度６μｇ／ｍｌ）の存在下、ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターをＴ細胞にトランスフェクションした。２日目に刺激用ビーズを取り出した。４×１０６のＴ細胞でＣＡＲＴ１９細胞を懸濁し、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ４ＤのプログラムＥＯ−１１５を用いて、１５μｇのｓｐＣａｓ９  ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ  ＣＡ．）及び２０μｇのＧＭ−ＣＳＦ  ｇＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を含む１００μｌの緩衝液Ｐ３中で、Ｔ細胞にエレクトロポレーションを行った。ＧＭ−ＣＳＦ  ｇＲＮＡを含ませず、対照ＣＡＲ１９Ｔ細胞にエレクトロポレーションを行った。その後、６日目に、フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ３４（ＣＡＲ−Ｔのバイシストロン性マーカー）及び細胞内ＧＭ−ＣＳＦ発現についてＴ細胞を評価してから、共培養アッセイを行った。
【０３７４】
単球系細胞の作製：ｉＤＣを生成するために、０．１ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＭ非必須アミノ酸、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び１０％ウシ胎児血清（ｃＲ１０）を補足した６ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０中で、単球（１×１０６）を培養した。その後、０．２μｇ／ｍＬのヒトＩＬ−４（Ｐｅｐｔｏｔｅｃ）及び０．２μｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｔｏｔｅｃ）をｃＲ１０に補足した。
【０３７５】
マクロファージ及び活性化マクロファージを生成するために、ウシ胎児血清の代わりに１０％ヒトＡ／Ｂ血清（ｈＲ１０）をｃＲ１０に補足した。活性化マクロファージ用に、３０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳをｈＲ１０培地に補足した。４日目に、サイトカイン及びＬＰＳを補充した。単離後６日目に、２ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを用いて、マクロファージ、活性化マクロファージ、及びｉＤＣ（未成熟樹状細胞）を回収した。２４時間後、２ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡで細胞を回収してから、ＣＤ４５、ＣＤ８０、及びＣＤ８６で染色し、未成熟ＤＣ及び成熟ＤＣの分化を確認した。
【０３７６】
共培養アッセイ：以下の比率、１２．５ＫのＵＣＡＲＴ−１９（ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯを伴うまたは伴わずに）、標的の、５０ＫのＲａｍｏｓ細胞（ＣＤ１９＋）及び単球由来細胞、１ＫのｉＤＣまたは５Ｋのマクロファージもしくは５Ｋの活性化マクロファージで、９６ウェルあたり２００ｕｌで、ＣＡＲ−Ｔ細胞を混合した。
【０３７７】
続いて、共培養液を３７℃で培養し、２４時間及び４８時間時点で、１００ｕｌのアッセイ上清をサイトカイン解析用に回収した。
【０３７８】
サイトカインレベルの測定
ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡプレート（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、培養上清からのサイトカイン濃度測定を実施した。３００ｇ、４℃で１０分間、上清を遠心分離にかけ、それに続き、アッセイ標準希釈剤を用いて１：１０に希釈してから、上清を解析した。標準的な製品手順を用いて測定を実施した。
【０３７９】
ＧＭ−ＣＳＦ欠損ＣＡＲＴ１９は、異なる単球系にわたる有意に低いＩＬ−６発現を誘導した。図８及び図１０。
【０３８０】
実施例１８−Ｔ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦの欠失後にＣＲＳを誘導する効果を試験するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＲＳアッセイ
正常ドナーの単球及びＴ細胞の単離：正常で健康なヒトドナーから初代ヒトＴ細胞及び単球を単離した。ＣＤ４＋ＣＤ８＋選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＰＢＭＣからＴ細胞を単離し、製造業者の手順に従い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃの標準的な単球単離用ビーズを用いて単球を分離した。
【０３８１】
Ｔ細胞培養及び遺伝子編集：続けて、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５を補足したＸｃｙｔｅ培地中に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ビーズ対細胞の比率３：１）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ＃１１１．３２Ｄ）の存在下、１０６細胞／ｍＬの濃度でＴ細胞を再懸濁した。初回刺激の２４時間後。２日目に刺激用ビーズを取り出した。ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ４ＤのプログラムＥＯ−１１５を用いて、１５μｇのｓｐＣａｓ９  ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ  ＣＡ．）及び２０μｇのＴＲＡＣ  ｇＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を含む１００μｌの緩衝液Ｐ３中で、４×１０６のＴ細胞にエレクトロポレーションを行った。ＧＭ−ＣＳＦ  ｇＲＮＡを含ませず、対照ＣＡＲ１９Ｔ細胞にエレクトロポレーションを行った。その後、６日目に、フローサイトメトリーを用いて、ＧＭ−ＣＳＦ発現についてＴ細胞を評価してから、共培養アッセイを行った。
【０３８２】
単球系細胞の作製：ｉＤＣを生成するために、０．１ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＭ非必須アミノ酸、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び１０％ウシ胎児血清（ｃＲ１０）を補足した６ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０中で、単球（１×１０６）を培養した。その後、０．２μｇ／ｍＬのヒトＩＬ−４（Ｐｅｐｔｏｔｅｃ）及び０．２μｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｔｏｔｅｃ）をｃＲ１０に補足した。４日目に、サイトカイン及びＬＰＳを補充した。単離後６日目に、２ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを用いて、ｉＤＣ（未成熟樹状細胞）を回収した。
【０３８３】
共培養アッセイ：以下の比率、１２．５ＫのＴ細胞（ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯを伴うまたは伴わずに）、５０Ｋの抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、及び１ＫのｉＤＣで、９６ウェルあたり２００ｕｌで、Ｔ細胞を混合した。続いて、共培養液を３７℃で培養し、２４時間及び４８時間時点で、１００ｕｌのアッセイ上清をサイトカイン解析用に回収した。
【０３８４】
サイトカインレベルの測定：ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡプレート（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、培養上清からのサイトカイン濃度測定を実施した。３００×ｇ、４℃で１０分間、上清を遠心分離にかけ、それに続き、アッセイ標準希釈剤を用いて１：１０に希釈してから、上清を解析した。標準的な製品手順を用いて測定を実施した。
【０３８５】
ＧＭ−ＣＳＦを欠失させると、ＩＬ−６産生が、非編集Ｔ細胞と比較して、２４時間時点で＞３倍（図７及び図８）、４８時間時点で＞４倍（図９及び図１０）低下した。
【０３８６】
ＧＭ−ＣＳＦ欠損Ｔ細胞は、異なる単球系にわたる有意に低いＩＬ−６発現を誘導した。
【０３８７】
実施例１９−選択マーカーを遺伝子編集遺伝子座に挿入することによりＣＲＳの誘導を欠損させたゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製及び試験するための方法
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＲＳ実験を実施する場合、ＮＳＧマウスに原発性Ｂ−ＡＬＬ（２×１０６）を注入する。この腫瘍の注入は、ＣＡＲ−Ｔをマウスに注入する３週間前に完了させる必要がある。
【０３８８】
以下の工程を採用して、ゲノム編集され、ＣＲＳ抵抗性の、ＣＡＲ−Ｔ細胞を得てもよい。本実施例では、ＧＭ−ＣＳＦの欠失がＣＲＳのリスクを緩和し、ＣＤ３ｅの欠失がＴＣＲのシグナル伝達及びＧｖＨＤを予防し、変異ＩＬ−７Ｒが、このモデルのＣＲＳを誘導させるのに十分、ＣＡＲ−Ｔの増殖を向上させる、ＣＤ１９ＣＡＲＴΔＧＭＣＳＦΔＣＤ３ε変異ＩＬ−７Ｒ  Ｔ細胞の作製について説明する。変異体をコードする配列、構成的に活性なＩＬ−７Ｒ配列については、表１９に記載されている、または、当該技術分野において見出すことができる。当業者は理解するように、おそらく異なる効率をもたらすであろうが、ある特定の工程を、以下に記載する順で連続的に実施してもよく、または、順不同に実施してもよい。
【０３８９】
工程１：Ｔ細胞の活性化（０日目）
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ヒトＰａｎＴ単離キットを使用して、ロイコフェレーシスチャンバーからＴ細胞を精製する。培地に再懸濁させる。細胞をカウントする。３：１のビーズ：細胞比率を得るのに必要なヒトＴ細胞活性化ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの数を求める。Ｔ細胞培地でビーズを２回洗浄する。１．２５６細胞／ｍＬとなるように、ｈＸｃｙｔｅ培地中に細胞を希釈する。ヒトＴ細胞活性化ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを加える。６ウェルプレートに、ウェルあたり、１．２５６細胞／ｍＬ溶液４ｍＬをアリコートする。細胞を３７℃で培養する。
【０３９０】
工程２：Ｔ細胞の形質導入（１日目）
次に、１種または複数種の標的を標的とする（すなわち、認識する）１種または複数種のＣＡＲ、例えば、ＣＡＲ構築物を含有するレンチウイルスを、ＣＡＲ−Ｔ細胞に形質導入してもよい。形質導入の任意のその他の好適な方法を用いてもよい。
【０３９１】
工程３：ＣＲＩＳＰＲ（２日目）。
ＣＲＳ抵抗性ＣＡＲ−Ｔ細胞では、サイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子または転写因子を欠失させて、サイトカインの分泌を誘導する因子の骨髄細胞からの分泌を防止してもよい。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ、及び標的（複数可）に対するｇＲＮＡをエレクトロポレーションすることにより、欠失を実施してもよい。しかしながら、その他の技術を使用して標的の発現を抑制してもよい。これらの技術としては、その他のゲノム編集技術、例えば、ＴＡＬＥＮ、ＲＮＡ干渉、及び、抗原の内部結合を生じさせて細胞表面発現を防止することなどが挙げられる。使用可能なｇＲＮＡの例としては、表８〜１０に示すｇＲＮＡ、及び、当該技術分野において周知のその他のｇＲＮＡが挙げられる。
2021525530.tif 000193
【０３９２】
例えば、細胞特異的タンパク質に結合する、標識抗体をコーティングした磁性ビーズ（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから入手可能）を使用した、磁気選択を用いて、細胞を回収、単離、及び精製する。Ｔ細胞用には、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用してもよい。その他の精製技術は当該技術分野において周知であり、それらを使用してもよい。
【表１９】
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【０３９３】
手順−ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ４Ｄを使用したヌクレオフェクション
上記（実施例６）のとおりに、それぞれのチューブの１５μｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡに対して２０μｇのそれぞれのｇＲＮＡ（ｇＧＭ−ＣＳＦ及びｇＣＤ３ε）を使用して、ヌクレオフェクション手順を実施する。
【０３９４】
工程４：ＣＲＩＳＰＲ活性及びＴｄ効率の評価（１０日目）
それぞれの試料から５×１０５の細胞を取り出してフローサイトメトリーで解析する。試料をＲＢで洗浄する。５μｌのＣＤ３  ＡＰＣ及び２μｌの抗ＦＡＢ  ＢＶ４２１を加える（ＣＡＲの形質導入を検出する）。洗浄する。フローサイトメトリーを実施する。細胞は、ＣＤ３ε陰性、ＣＤ３４陽性、かつＦＡＢ＋のはずである。Ｔ細胞を回収する（１１日目）。
【０３９５】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の精製。ＴＣＲａ／ｂ陰性選択を用いてＴＣＲ陰性細胞を精製し、ＴＣＲ陽性細胞を除去してもよい。
【０３９６】
工程５：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＡＲ−Ｔ活性の評価
マウスあたり５×１０６のＣＡＲ−ＴをＩ．Ｖ．注射する。血清サイトカインレベルを評価する（＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋１０、＋１５日目）。Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスサイトカインプロファイリングアッセイを使用して、血清サイトカインレベルを測定して、ＣＲＳ関連サイトカインの上昇を確認する。標的細胞（Ｒａｊｉ）に対する４時間のクロム放出アッセイを実施して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を評価する（１１日目）。ｈＣＤ４５、ＣＤ１９＋細胞を検出するための血液のフローサイトメトリーを用いて、腫瘍の排除効果をモニターする。
【０３９７】
Ｔ細胞ＣＲＩＳＰＲ用の改変ｇＲＮＡ手順、及びＵＣＡＲＴ１９のＣＡＲ−Ｔ形質導入について、以下に記載する。
【０３９８】
０日目−Ｔ細胞の活性化：
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ヒトＰａｎＴ単離キットを使用して、ロイコフェレーシスチャンバーからＴ細胞を精製する。培地に再懸濁させる。細胞をカウントする。３：１のビーズ：細胞比率を得るのに必要なヒトＴ細胞活性化ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの数を求める。Ｔ細胞培地でビーズを２回洗浄する。１．２５６細胞／ｍＬとなるように、ｈＸｃｙｔｅ培地中に細胞を希釈する。ヒトＴ細胞活性化ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを加える。
【０３９９】
次に、１種または複数種の標的を標的とする（すなわち、認識する）１種または複数種のＣＡＲ、例えば、ＣＡＲ構築物を含有するレンチウイルスを、Ｔ細胞に形質導入してもよい。形質導入の任意のその他の好適な方法を用いてもよい。
【０４００】
２日目：反応あたり４×１０６の細胞を使用する。ＥＯ−１１５−１００μｌのトランスフェクション容量をプログラムし、全ての助剤をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐ３に加える。適切な数のウェルに望ましい容量の推奨培地（６ウェルプレートに２ｍｌ）を充填してから、加湿インキュベータ内、３７℃／５％ＣＯ２で、プレートを予備培養／平衡化することにより、細胞培養プレートを調製する。ビーズを磁気で取り除き（完全な除去を確保するために２回）、その後、細胞をカウントし、細胞密度を測定する。必要な数の細胞を、室温、９０×ｇで１０分間、遠心分離にかけ、上清を完全に除去する。次に、細胞をＰＢＳ（１ｍｌ）中に再懸濁してから微量遠心チューブに移し、必要な数の細胞を、室温、９０×ｇで１０分間、遠心分離にかける。上清を完全に除去してから、完全に室温の４Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐ３中に細胞ペレットを慎重に再懸濁する（１００μｌあたり４×１０６）。２０μｇのｇＲＮＡ（ｇＧＭ−ＣＳＦ及びｇＴＲＡＣ）を、それぞれのチューブの１５μｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡに加える。次に、１００μｌの細胞を、それぞれのチューブのＣａｓ９／ｇＲＮＡに加え、軽く混合してから、全てをＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）に移す。キュベットを軽く叩いて気泡を除去する。プログラム（ヒトＴ細胞刺激ＥＯ−１１５）を使用してエレクトロポレーションを実施する。処理の完了後、専用のツールを使用して、保持器の容器からＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）を慎重に取り外す。予め温めた培地に細胞を再懸濁する。次に、目的ウェルから培地を除去し、キュベットに加え、２〜３回上下に優しくピペッティングする。次に、これをウェルに移す。同一ウェルの培地を用いてこの手順を繰り返し、３７℃で培養する。
【０４０１】
５日目：ＣＲＩＳＰＲ活性及びＴｄ効率を評価する。次に、それぞれの試料から５×１０５の細胞を取り出してフローサイトメトリーで解析することにより、形質導入効率について、細胞の試料を評価してもよい。試料を固定して透過処理を行ってから、ＣＤ３、ＣＤ３４、及び細胞内ＧＭ−ＣＳＦについて、ＦＡＣＳを用いて解析する。
【０４０２】
遺伝子の欠失の評価。
ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＲＡＣの遺伝子の欠失を評価するために、それぞれの試料から５×１０５の細胞を回収し、それらのＤＮＡを抽出する。ＴＩＤＥ解析またはディープシークエンシングを使用し、標的遺伝子座のターゲットシークエンシングを用いて、遺伝子編集効率を評価する。
【０４０３】
１１日目
マウスの採血を行い全身腫瘍組織量を測定する。
【０４０４】
ＣＤ３を枯渇させたＴ細胞をマウスに注射する。
【０４０５】
５×１０６のＣＡＲ＋Ｔ細胞／マウスをマウスに注射する。
【０４０６】
マウス群を以下の表２０に記載する。
【表２０】
2021525530.tif 000217
【０４０７】
その後、０、１、２、３、５、７、１４、及び２１日目に、ＦＡＣＳ及び血漿測定用にマウスの採血を行い、体重を量り、体温を測定する。
【０４０８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の特定のマーカーを検出するためのパネルは以下のとおりである。
2021525530.tif 000218
【０４０９】
サイトカイン解析及びＣＲＳの評価について、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスサイトカイン解析を用いて評価を行う。
【０４１０】
本明細書に記載のベクターを調製するための配列としては、以下、
配列番号：３０４８−ＣＤ３４をＧＭ−ＣＳＦ遺伝子座に挿入するためのベクターの左ＩＴＲ
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ
配列番号：３０４９−ＣＤ３４をＧＭ−ＣＳＦ遺伝子座に挿入するためのベクターの左ホモロジーアーム
ｃｃｔｇａｇａｔｇｇａｔｇｃａｇｃｃａｃａｇｃｃｃｔｇｇａｇｃｃａｇｃｃｔｇａａｇｃｔｃｃｔｇｇｔｇｔｃｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｔａｃａｔａｔａｇｇａｇｔｇｔａｇｔｃｃｇａａｃｃｔｃａｇａｇｇｇｇｃａａａｃｃｔｇｃｔｃｔｇｃａｇａｇｇｇａａｔｃａａｇｇｔｔｃａｃａｔａａｃｃａｇａｇａｇｇｇｇａｇｔｃａｃｔｃａｇｇａａｇｇｔｇｇｃｔｃｃａｇａｇｃｃａａｇａｇｔｃａｇａｃｔｃｔｇｇｇｔｃｃｃｇａｃｔｔｇａｃｃｃａｇｃｃａｃａｃｃｃｃｃｔｃｔｇａａｇｃｔｔｇｃｔｇａｇａｇｔｇｇｃｔｇｃａｇｔｃｔｃｇｃｔｇｃｔｇｇａｔｇｔｇｃａｃａｔｇｇｔｇｇｔｃａｔｔｃｃｃｔｃｔｇｃｔｃａｃａｇｇｇｇｃａｇｇｇｇｔｃｃｃｃｃｃｔｔａｃｔｇｇａｃｔｇａｇｇｔｔｇｃｃｃｃｃｔｇｃｔｃｃａｇｇｔｃｃｔｇｇｇｔｇｇｇａｇｃｃｃａｔｇｔｇａａｃｔｇｔｃａｇｔｇｇｇｇｃａｇｇｔｃｔｇｔｇａｇａｇｃｔｃｃｃｃｔｃａｃａｃｔｃａａｇｔｃｔｃｔｃａｃａｇｔｇｇｃｃａｇａｇａａｇａｇｇａａｇｇｃｔｇｇａｇｔｃａｇａａｔｇａｇｇｃａｃｃａｇｇｇｃｇｇｇｃａｔａｇｃｃｔｇｃｃｃａａａｇｇｃｃｃｃｔｇｇｇａｔｔａｃａｇｇｃａｇｇａｔｇｇｇｇａｇｃｃｃｔａｔｃｔａａｇｔｇｔｃｔｃｃｃａｃｇｃｃｃｃａｃｃｃｃａｇｃｃａｔｔｃｃａｇｇｃｃａｇｇａａｇｔｃｃａａａｃｔｇｔｇｃｃｃｃｔｃａｇａｇｇｇａｇｇｇｇｇｃａｇｃｃｔｃａｇｇｃｃｃａｔｔｃａｇａｃｔｇｃｃｃａｇｇｇａｇｇｇｃｔｇｇａｇａｇｃｃｃｔｃａｇｇａａｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｔｇｇｇｃｔｇｔｃｇｇｔｔｃｔｔｇｇａａａｇｇｔｔｃａｔｔａａｔｇａａａａｃｃｃｃｃａａｇｃｃｔｇａｃｃａｃｃｔａｇｇｇａａａａｇｇｃｔｃａｃｃｇｔｔｃｃｃａｔｇｔｇｔｇｇｃｔｇａｔａａｇｇｇｃｃａｇｇａｇａｔｔｃｃａｃａｇｔｔｃａｇｇｔａｇｔｔｃｃｃｃｃｇｃｃｔｃｃｃｔｇｇｃａｔｔｔｔｇｔｇｇｔｃａｃｃａｔｔａａｔｃａｔｔｔｃｃｔｃｔｇｔｇｔａｔｔｔａａｇａｇｃｔｃｔｔｔｔｇｃｃａｇｔｇａｇｃｃｃａＧＴＡＣＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＴＡＡＡＧＴＴＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＣＣＧＣＴＣＧＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＣ
配列番号：３０５０−ＣＤ３４をＧＭ−ＣＳＦ遺伝子座に挿入するためのベクターのＥＦＳプロモーター
ＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＴＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧ
配列番号：３０５１−ＣＤ３４をＧＭ−ＣＳＦ遺伝子座に挿入するためのベクターのｔｒＣＤ３４
ａｔｇｃｃｇｃｇｇｇｇｃｔｇｇａｃｃｇｃｇｃｔｔｔｇｃｔｔｇｃｔｇａｇｔｔｔｇｃｔｇｃｃｔｔｃｔｇｇｇｔｔｃａｔｇａｇｔｃｔｔｇａｃａａｃａａｃｇｇｔａｃｔｇｃｔａｃｃｃｃａｇａｇｔｔａｃｃｔａｃｃｃａｇｇｇａａｃａｔｔｔｔｃａａａｔｇｔｔｔｃｔａｃａａａｔｇｔａｔｃｃｔａｃｃａａｇａａａｃｔａｃａａｃａｃｃｔａｇｔａｃｃｃｔｔｇｇａａｇｔａｃｃａｇｃｃｔｇｃａｃｃｃｔｇｔｇｔｃｔｃａａｃａｔｇｇｃａａｔｇａｇｇｃｃａｃａａｃａａａｃａｔｃａｃａｇａａａｃｇａｃａｇｔｃａａａｔｔｃａｃａｔｃｔａｃｃｔｃｔｇｔｇａｔａａｃｃｔｃａｇｔｔｔａｔｇｇａａａｃａｃａａａｃｔｃｔｔｃｔｇｔｃｃａｇｔｃａｃａｇａｃｃｔｃｔｇｔａａｔｃａｇｃａｃａｇｔｇｔｔｃａｃｃａｃｃｃｃａｇｃｃａａｃｇｔｔｔｃａａｃｔｃｃａｇａｇａｃａａｃｃｔｔｇａａｇｃｃｔａｇｃｃｔｇｔｃａｃｃｔｇｇａａａｔｇｔｔｔｃａｇａｃｃｔｔｔｃａａｃｃａｃｔａｇｃａｃｔａｇｃｃｔｔｇｃａａｃａｔｃｔｃｃｃａｃｔａａａｃｃｃｔａｔａｃａｔｃａｔｃｔｔｃｔｃｃｔａｔｃｃｔａａｇｔｇａｃａｔｃａａｇｇｃａｇａａａｔｃａａａｔｇｔｔｃａｇｇｃａｔｃａｇａｇａａｇｔｇａａａｔｔｇａｃｔｃａｇｇｇｃａｔｃｔｇｃｃｔｇｇａｇｃａａａａｔａａｇａｃｃｔｃｃａｇｃｔｇｔｇｃｇｇａｇｔｔｔａａｇａａｇｇａｃａｇｇｇｇａｇａｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｃｇａｇｔｇｃｔｇｔｇｔｇｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｇｃｔｇａｔｇｃｔｇａｔｇｃｔｇｇｇｇｃｃｃａｇｇｔａｔｇｃｔｃｃｃｔｇｃｔｃｃｔｔｇｃｃｃａｇｔｃｔｇａｇｇｔｇａｇｇｃｃｔｃａｇｔｇｔｃｔａｃｔｇｃｔｇｇｔｃｔｔｇｇｃｃａａｃａｇａａｃａｇａａａｔｔｔｃｃａｇｃａａａｃｔｃｃａａｃｔｔａｔｇａａａａａｇｃａｃｃａａｔｃｔｇａｃｃｔｇａａａａａｇｃｔｇｇｇｇａｔｃｃｔａｇａｔｔｔｃａｃｔｇａｇｃａａｇａｔｇｔｔｇｃａａｇｃｃａｃｃａｇａｇｃｔａｔｔｃｃｃａａａａｇａｃｃｃｔｇａｔｔｇｃａｃｔｇｇｔｃａｃｃｔｃｇｇｇａｇｃｃｃｔｇｃｔｇｇｃｔｇｔｃｔｔｇｇｇｃａｔｃａｃｔｇｇｃｔａｔｔｔｃｃｔｇａｔｇａａｔｃｇｃｃｇｃａｇｃｔｇｇａｇｃｃｃｃａｔｔｔａａ
配列番号：３０５２−ＣＤ３４をＧＭ−ＣＳＦ遺伝子座に挿入するためのベクターのｈＧＭＢ  Ｐｏｌｙ  Ａ
ＡＣＧＧＧＴＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＴＧＣＣＡＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＴＴＧＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＴＡＡＧＴＴＧＣＡＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＴＧＡＣＴＡＧＧＴＧＴＣＣＴＴＣＴＡＴＡＡＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＧＴＧＧＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＡＧＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣＴＧＴＡＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＧＴＣＴＡＴＴＧＧＧＡＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＡＡＴＣＴＴＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＴＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＧＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＡＴＴＣＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＡＧＡＧＡＣＧＧＧＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＡＴＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＡＡＴＣＴＣＡＧＧＴＧＡＴＣＴＡＣＣＣＡＣＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＴＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＴＧＣＴＣＣＣＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧＴＡＧＧＴＡＡＣＣＡＣＧＴＧＣＧＧＡＣＣＧＡ
配列番号：３０５３−ＣＤ３４をＧＭ−ＣＳＦ遺伝子座に挿入するためのベクターのＲＨＡ
ＣＧＴＣＴＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＴＡＧＡＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＴＧｇｔａａｇｔｇａｇａｇａａｔｇｔｇｇｇｃｃｔｇｔｇｃｃｔａｇｇｃｃａｃｃｃａｇｃｔｇｇｃｃｃｃｔｇａｃｔｇｇｃｃａｃｇｃｃｔｇｔｃａｇｃｔｔｇａｔａａｃａｔｇａｃａｔｔｔｔｃｃｔｔｔｔｃｔａｃａｇＡＡＴＧＡＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＡＴＧＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＧｇｔａａｇａｔｇｃｔｔｃｔｃｔｃｔｇａｃａｔａｇｃｔｔｔｃｃａｇａａｇｃｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｇａｃｔｃｃａｔｔｔｔａｇａｔｇｇｃａｃｃａｃａｃａｇｇｇｔｔｇｔｃｃａｃｔｔｔｃｔｃｔｃｃａｇｔｃａｇｃｔｇｇｃｔｇｃａｇｇａｇｇａｇｇｇｇｇｔａｇｃａａｃｔｇｇｇｔｇｃｔｃａａｇａｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃｃｇｔｇｃｃｃｃｔａｔｇｇｃａｇｔｃａｃａｔｇａｇｃｔｃｃｔｔｔａｔｃａｇｃｔｇａｇｃｇｇｃｃａｔｇｇｇｃａｇａｃｃｔａｇｃａｔｔｃａａｔｇｇｃｃａｇｇａｇｔｃａｃｃａｇｇｇｇａｃａｇｇｔｇｇｔａａａｇｔｇｇｇｇｇｔｃａｃｔｔｃａｔｇａｇａｃａｇｇａｇｃｔｇｔｇｇｇｔｔｔｇｇｇｇｃｇｃｔｃａｃｔｇｔｇｃｃｃｃｇａｇａｃｃａａｇｔｃｃｔｇｔｔｇａｇａｃａｇｔｇｃｔｇａｃｔａｃａｇａｇａｇｇｃａｃａｇａｇｇｇｇｔｔｔｃａｇｇａａｃａａｃｃｃｔｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｃａｇｇｔｃｃａｇｇｔｇａｇｇｃｃｃｃａｃｃｃｃｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇａａｔｇａｔｇｇｇｇｔｇａｇａｇｔｃａｃｃｔｃｃｔｔｃｃｃｔａａｇｇｃｔｇｇｇｃｔｃｃｔｃｔｃｃａｇｇｔｇｃｃｇｃｔｇａｇｇｇｔｇｇｃｃｔｇｇｇｃｇｇｇｇｃａｇｔｇａｇａａｇｇｇｃａｇｇｔｔｃｇｔｇｃｃｔｇｃｃａｔｇｇａｃａｇｇｇｃａｇｇｇｔｃｔａｔｇａｃｔｇｇａｃｃｃａｇｃｃｔｇｔｇｃｃｃｃｔｃｃｃａａｇｃｃｃｔａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｃｔｇｇｇｇｇｃａｇｃａｇｃａａａａａｇｇａｇｔｇｇｔｇｇａｇａｇｔｔｃｔｔｇｔａｃｃａｃｔｇｔｇｇｇｃａｃｔｔｇｇｃｃａｃｔｇｃｔｃａｃｃｇａｃｇａａｃｇａｃａｔｔｔｔｃｃａｃａｇＧＡＧＣＣＧＡＣＣＴＧＣＣＴＡＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＴＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＡＣＣＣＣＧｇｔｇａｇｔｇｃ
配列番号：５１−ＣＤ３４をＧＭ−ＣＳＦ遺伝子座に挿入するためのベクターの右ＩＴＲ
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧ
配列番号：３０５４−ＣＤ３４をＧＭ−ＣＳＦ遺伝子座に挿入するためのベクターの完全配列
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配列番号：３０４８−ＧＦＰをＣＤ３ε遺伝子座に挿入するためのドナー構築物の左ＩＴＲ
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配列番号：３０５５−ＧＦＰをＣＤ３ε遺伝子座に挿入するためのドナー構築物のクローニングレムナント
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配列番号：３０５６−ＧＦＰをＣＤ３ε遺伝子座に挿入するためのドナー構築物のＣＤ３  Ｌホモロジーアーム
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配列番号：３０５７−ＧＦＰをＣＤ３ε遺伝子座に挿入するためのドナー構築物のＣＡＲ７
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配列番号：３０５８−ＣＤ３ε遺伝子座に挿入するためのドナー構築物のＧＦＰ
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配列番号：３０５９−ＧＦＰをＣＤ３ε遺伝子座に挿入するためのドナー構築物のｈＧＭＢ  Ｐｏｌｙ  Ａ
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配列番号：３０６０−ＧＦＰをＣＤ３ε遺伝子座に挿入するためのドナー構築物のＣＤ３ｅ  Ｒホモロジーアーム
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配列番号：３０６１−ＧＦＰをＣＤ３ε遺伝子座に挿入するためのドナー構築物のクローニングレムナント
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配列番号：３０６２−ＧＦＰをＣＤ３ε遺伝子座に挿入するためのドナー構築物の右ＩＴＲ
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配列番号：３０６３−ＧＦＰをＣＤ３ε遺伝子座に挿入するためのドナー構築物のクローニングレムナント
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配列番号：３０６４−ＧＦＰをＣＤ３ｅ遺伝子座に挿入するためのベクターの完全配列
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が挙げられるがこれらに限定されない。
【０４１１】
本出願に列挙する全ての参照文献、米国または外国の特許または出願は、その全体が本明細書に記載されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。任意の矛盾が生じた場合には、本明細書で実際に開示する物質が優先される。
【０４１２】
上記の記載内容から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に見極めることができ、また、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく本発明の様々な変更及び修正を行い、様々な用法及び条件に適合させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【国際調査報告】
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