(57)【要約】  ポリヌクレオチドのサンプル中の標的ポリヌクレオチドを選択的に修飾するための方法であって、当該方法は、ポリヌクレオチドのサンプルを、標的ポリヌクレオチドの配列に結合するガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させることであって、それによりポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、標的ポリヌクレオチドを切断して、オーバーハングを含む切断末端を生成する、ことと、アダプターを、標的ポリヌクレオチド中の切断末端に結合することと、を含む。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドのサンプル中の標的ポリヌクレオチドを選択的に適合させるための方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記ポリヌクレオチドの末端を保護することと、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドを、前記標的ポリヌクレオチドの配列に結合するガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させ、それにより前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、前記標的ポリヌクレオチドを切断して、前記ガイドポリヌクレオチドが結合する配列によって判定された部位において２つの対向する切断末端を生成する、ことと、
（ｃ）アダプターを、前記標的ポリヌクレオチドの前記２つの対向する切断末端のうちの一方または両方に結合させることと、を含み、
前記アダプターが、前記標的ポリヌクレオチドの切断末端のうちの一方または両方に結合するが、前記サンプル中の前記ポリヌクレオチドの保護末端には結合しない、方法。
【請求項２】
前記サンプル中の前記ポリヌクレオチドの末端が、前記ポリヌクレオチドの５’末端を脱リン酸化することによって保護される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドの５’末端が、前記ポリヌクレオチドのサンプルにデホスホリラーゼを添加することによって脱リン酸化される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプル中の前記ポリヌクレオチドの末端が、前記ポリヌクレオチドの３’末端を伸長して、一本鎖オーバーハングを生成することによって保護される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドの３’末端が、前記ポリヌクレオチドのサンプルに末端トランスフェラーゼおよびｄＮＴＰを添加することによって伸長される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３、Ｃｓｎ２、Ｃｓｆ１、Ｃｍｒ５、Ｃｓｍ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｅ１、またはＣ２ｃ２である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的ポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖を切断する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖を切断して、平滑末端を生成する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖を切断して、一本鎖オーバーハングを生成する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、前記サンプルをポリメラーゼまたは末端トランスフェラーゼおよびｄＮＴＰと接触させて、オーバーハングを充填し、平滑末端または単一ヌクレオチドオーバーハングを生成することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アダプターが、単一のＴまたはポリＴ尾部を含み、前記方法が、ステップ（ｃ）の前に前記サンプルをポリメラーゼおよびｄＡＴＰと接触させて、単一のＡ尾部を前記標的ポリヌクレオチドの切断末端のうちの少なくとも１つに添加することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリメラーゼが、約６０℃を超える温度で活性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アダプターが、前記標的ポリヌクレオチドに共有結合している、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記アダプターが、連結またはトポ異性化によって標的ポリヌクレオチドに共有結合している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、前記２つの対向する切断末端のうちの一方に結合したままであり、前記アダプターが、前記２つの対向する切断末端のうちの他方に結合している、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、前記標的ポリヌクレオチドに結合したままではないか、または前記標的ポリヌクレオチドから除去される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記アダプターが、中間アダプターであり、前記方法が、前記中間アダプターにさらなるアダプターを結合することを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記さらなるアダプターが、シークエンシングアダプターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドを、関心対象の領域内の前記標的ポリヌクレオチドに結合する１つ以上のガイドポリヌクレオチドと接触させる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチドを、関心対象の領域外の前記標的ポリヌクレオチドに結合する１つ以上のガイドポリヌクレオチドと接触させる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドを、前記標的ポリヌクレオチドの異なる配列に結合する２つ以上のガイドポリヌクレオチドと接触させ、それにより前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、２つ以上の部位において前記標的ポリヌクレオチドを切断し、各部位において２つの対向する切断末端を生成する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記２つ以上の部位のうちの少なくとも１つが、前記標的ポリヌクレオチドの関心対象の領域の各側に位置し、前記２つ以上の部位のいずれも、関心対象の領域内に位置しない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
関心対象の領域の各側に位置する部位において前記標的ポリヌクレオチドを切断した後、前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、関心対象の領域を含まない前記ポリヌクレオチドの切断末端に結合したままであるように、前記ガイドポリヌクレオチドが配向されている、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記２つ以上の部位が、前記標的ポリヌクレオチドの関心対象の領域のいずれかの側において少なくとも２つの部位を含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記同じポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、前記２つ以上の部位のすべてにおいて切断するために使用される、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
異なるポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、前記２つ以上の部位において切断するために使用される、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法が、前記適合されたポリヌクレオチドの関心対象の領域に隣接する前記アダプター内の配列にハイブリダイズする一対のＰＣＲプライマーを使用して、標的ポリヌクレオチドの関心対象の領域を増幅することをさらに含む、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
２つ以上の異なる標的ポリヌクレオチドの配列に結合する２つ以上のガイドポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチドのそれぞれにおいて関心対象の少なくとも１つの領域内のまたはそれに隣接するアダプターを結合するために、前記方法において使用される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記２つ以上のガイドポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドの関心対象の２つ以上の領域内のまたはそれに隣接するアダプターを結合するために、前記方法において使用される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記適合されたポリヌクレオチドにおいて前記アダプターにさらなるアダプターを結合することをさらに含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記さらなるアダプターが、シークエンシングアダプターである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記シークエンシングアダプターが、一本鎖リーダー配列、ポリヌクレオチド結合タンパク質、および／または膜もしくは細孔アンカーを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が、前記標的ポリヌクレオチドを特徴付けることをさらに含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
標的ポリヌクレオチドを検出するおよび／または特徴付ける方法であって、
（ｉ）請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法によって得られたサンプルをナノ細孔と接触させることと、
（ｉｉ）前記ナノ細孔にわたって電位差を印加することと、
（ｉｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドと前記ナノ細孔との相互作用から生じる効果の存在または不在についてモニタリングして、前記標的ポリヌクレオチドの存在または不在を判定し、それにより前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドを検出すること、および／または前記標的ポリヌクレオチドと前記ナノ細孔との相互作用をモニタリングして、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を判定することと、を含む、方法。
【請求項３８】
前記標的ポリヌクレオチドが、配列決定によって特徴付けられる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ポリヌクレオチドのサンプル中の標的ポリヌクレオチドを選択的に修飾するためのキットであって、デホスホリラーゼと、単一のＮまたはポリＮ尾部を含むアダプターであって、Ｎが、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧである、アダプターと、任意にポリメラーゼ、リガーゼ、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、およびガイドポリヌクレオチドのうちの１つ以上と、を含む、キット。
【請求項４０】
ポリヌクレオチドのサンプル中の標的ポリヌクレオチドを選択的に適合させるための方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記ポリヌクレオチドを、前記標的ポリヌクレオチドの配列に結合する２つのガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させることであって、前記２つのガイドポリヌクレオチドが結合する配列が、前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を２つの部位に導き、それにより前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、前記２つの部位のうちの少なくとも１つにおいて前記標的ポリヌクレオチドを切断して、２つの対向する切断末端を生成する、ことと、
（ｂ）アダプターを、前記標的ポリヌクレオチドの前記２つの対向する切断末端のうちの一方または両方に結合することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドのサンプル中の標的ポリヌクレオチドを選択的に適合させる方法に関する。本発明はまた、修飾されたポリヌクレオチドを特徴付ける方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幅広い用途にわたる迅速かつ安価なポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列決定および同定技術が現在必要とされている。既存の技術は、主に、多量のポリヌクレオチドを生成するために増幅技法に依存し、信号検出のために多量の専門蛍光薬剤を必要とするため、時間がかかり、高価である。
【０００３】
膜貫通孔（ナノ細孔）は、ポリマーおよび様々な小分子用の直接的な電気バイオセンサーとして大きな将来性を有する。特に、最近は、潜在的なＤＮＡ配列決定技術としてナノ細孔が注目されている。
【０００４】
ナノ細孔にわたって電位が印加されると、ヌクレオチドなどの分析物が特定の時間バレル中に一時的に滞留する場合、電流の流れに変化がある。ヌクレオチドのナノ細孔検出は、既知のシグネチャーおよび持続時間の電流変化をもたらす。鎖配列決定方法では、単一のポリヌクレオチド鎖は細孔を通過させ、ヌクレオチドの同一性が誘導される。鎖配列決定は、細孔を通るポリヌクレオチドの移動を制御するために分子ブレーキの使用を含み得る。
【０００５】
ポリヌクレオチド配列決定および同定技術を含む、核酸ライブラリーの調製を必要とする多くの商業的状況がある。これは、しばしばトランスポザーゼを使用して達成される。ライブラリーを調製するために使用されるトランスポザーゼに応じて、例えば、シークエンシングにおける、ライブラリーを使用することができる前にインビトロで転位事象を修復する必要があり得る。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、ポリヌクレオチドのサンプル中の標的ポリヌクレオチドを選択的に適合させる方法を考案した。この方法では、ポリヌクレオチドの末端を保護して、サンプル中のポリヌクレオチドの末端へのアダプターの非特異的付加を防止する。この方法は、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を利用して、標的ポリペプチド内で切断し、切断末端のうちの少なくとも１つに１つ以上のアダプターを付加する。次いで、標的ポリヌクレオチドを、サンプル中の他のポリヌクレオチドから標的ポリヌクレオチドを物理的に分離する必要なしに、鎖配列決定などによって特徴付けることができる。例えば、ナノ細孔配列決定法では、標的ポリヌクレオチドから得られたシグナルは、それらの末端で適合されたポリヌクレオチドから生じるバックグラウンドシグナルが非常に低いため、効果的に増強される。
【０００７】
サンプル中のポリヌクレオチドの末端は、ポリヌクレオチドの末端を化学的に変えるだけで保護することができる。例えば、ポリヌクレオチドの５’末端は、通常リン酸化されている。ポリヌクレオチドの末端が脱リン酸化され、標的ポリヌクレオチドがポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を使用して切断される場合、アダプターは、切断末端に結合（連結）され得るが、脱リン酸化された末端では結合（連結）され得ない。これにより、アダプターを標的ポリヌクレオチドの切断末端に選択的に共有結合させることができる。末端の脱リン酸化は、ポリヌクレオチドのサンプルにデホスホリラーゼを添加することによって、簡単かつ容易に達成することができる。サンプルをさらに処理する前に、デホスホリラーゼをサンプルから除去する必要はない。デホスホリラーゼは、切断酵素を添加する前に、単に熱で不活性化することができる。
【０００８】
ポリヌクレオチドの末端を化学的に改変する方法の別の例は、少なくとも１つのヌクレオチドを含む３’尾部を付加するために末端トランスフェラーゼを使用して、ポリヌクレオチドの３’末端を伸長することである。これにより、３’オーバーハングを有するアダプターへの連結が防止される。これにより、アダプターを標的ポリヌクレオチドの切断末端に共有結合させることができる。したがって、サンプル中のポリヌクレオチドの末端を保護するために複雑なステップは必要とされず、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質によって切断されないアダプターがサンプル中のポリヌクレオチドに添加されない。標的ポリヌクレオチドへのアダプターの選択的付加により、サンプル中の他のポリヌクレオチドから標的ポリヌクレオチドを物理的に分離する必要なしに、標的ポリペプチドの検出および／または特徴付けが可能になり、いかなる検出／特徴付け方法のバックグラウンドシグナルも、両端が保護されない方法と比較して低下しない。標的ポリヌクレオチドへのアダプターの選択的付加を使用して、サンプル中の他のポリヌクレオチドから標的ポリヌクレオチドを物理的に分離することもできる。例えば、アダプターをタグとして使用して、例えば、アダプターを使用してビオチンを標的ポリヌクレオチドに結合させ、標的ポリヌクレオチドをビーズに結合させることによって、標的ポリヌクレオチドを分離することができる。
【０００９】
この方法には、サンプルの調製が最小限で済むという利点がある。方法のステップは、方法のステップ間のクリーンアップステップを必要とせずに実行することができ、いくつかの実施形態において、方法は、単一のポットで実行することができる。非標的ポリヌクレオチドから分離することなく、サンプルを直接分析して、標的ポリヌクレオチドを特徴付けることができる。配列決定の文脈では、この方法により、長い読み込みを得ることを可能にする。特徴付けの文脈では、この方法により、長いポリヌクレオチドを修飾のためにスクリーニングして、例えば、メチル化されたまたはそうでなければ修飾された塩基の検出、ポリヌクレオチドの構造変化の同定、例えば、転位事象の検出、多型の検出、または拡張反復のモニタリングを可能にする。標的ポリヌクレオチドの切断部位は、複数の断片として長いポリヌクレオチドのカバレッジを達成するように設計することもできる。
【００１０】
したがって、以下が提供される。
−ポリヌクレオチドのサンプル中の標的ポリヌクレオチドを選択的に適合させるための方法であって、サンプル中のポリヌクレオチドの末端を保護することと、ポリヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドの配列に結合するガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させることであって、それによりポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が標的ポリヌクレオチドを切断して、ガイドポリヌクレオチドが結合する配列によって判定された部位において２つの対向する切断末端を生成する、接触させることと、アダプターを、標的ポリヌクレオチドの２つの対向する切断末端のうちの一方または両方に結合させることと、を含み、アダプターは、標的ポリヌクレオチドの切断末端のうちの一方または両方に結合するが、サンプル中のポリヌクレオチドの保護末端には結合しない、方法、
−標的ポリヌクレオチドを検出するおよび／または特徴付けする方法であって、上記の方法によって得られたサンプルをナノ細孔と接触させることと、ナノ細孔にわたって電位差を印加することと、標的ポリヌクレオチドとナノ細孔との相互作用から生じる効果の存在または不在についてモニタリングして、標的ポリヌクレオチドの存在または不在を判定し、それによりサンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出すること、および／または標的ポリヌクレオチドとナノ細孔との相互作用をモニタリングして、標的ポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を判定することと、を含む、方法。
−ポリヌクレオチドのサンプル中の標的ポリヌクレオチドを選択的に修飾するためのキットであって、デホスホリラーゼと、単一のＮまたはポリＮ尾部を含むアダプターであって、Ｎが、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧである、アダプターと、任意にポリメラーゼ、リガーゼ、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、およびガイドポリヌクレオチドのうちの１つ以上と、を含む、キット、ならびに
−ポリヌクレオチドのサンプル中の標的ポリヌクレオチドを選択的に適合させるための方法であって、サンプル中のポリヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドの配列に結合する２つのガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させることであって、２つのガイドポリヌクレオチドが結合する配列が、密接に位置していても位置していなくてもよい２つの異なる部位にポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を導き、それによりポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、２つの部位のうちの少なくとも１つにおいて標的ポリヌクレオチドを切断して、２つの対向する切断末端を生成する、接触させることと、アダプターを、標的ポリヌクレオチドの２つの対向する切断末端のうちの一方または両方を結合させることと、を含む、方法。
【００１１】
図は、説明を目的としており、限定することを意図するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ｔｒａｃｒＲＮＡ  ＢおよびｃｒＲＮＡ  Ｃが結合したＣａｓ９酵素Ａをどのように使用して、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）Ｅを含む標的ｄｓＤＮＡ分子Ｄを切断することができるかを図式的に示す。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、２つをヘアピンＦで連結することによって、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子として組み込まれ得る。Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼセンターＧを使用して分子を切断し、２つのｄｓＤＮＡ断片ＨおよびＪを生成し、そのうちの一方（Ｈ）はＣａｓ９によって保護され、もう一方（Ｊ）は遊離の５’リン酸Ｋおよび３’ヒドロキシル基Ｌを持っている。
【図２】ｃｒＲＮＡ  Ｂが結合したＣｐｆ１酵素Ａをどのように使用して、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）Ｄを含む標的ｄｓＤＮＡ分子Ｃを切断することができるかを図式的に示す。Ｃｐｆ１は、２つの部位Ｅで単一のヌクレアーゼセンターを使用して分子を切断し、２つのｄｓＤＮＡ断片ＦおよびＧを生成し、そのうちの一方（Ｆ）はＣｐｆ１によって保護され、もう一方（Ｇ）は遊離５’リン酸Ｈ、３’ヒドロキシル基Ｊ、および５’オーバーハングＫを持っている。
【図３】ＤＮＡプロセシング酵素による様々なＤＮＡ産物の処理：３’−ｄＡ尾部断片Ｂを得るためにポリメラーゼ（例えば、ＴａｑまたはＫｌｅｎｏｗエキソポリメラーゼ）およびｄＡＴＰで処理した平滑末端ｄｓＤＮＡ断片Ａ；３’−ｄＡ尾部断片Ｄを得るためにポリメラーゼ（例えば、ＴａｑまたはＫｌｅｎｏｗエキソポリメラーゼ）ならびにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの混合物で処理した５’オーバーハング断片Ｃ；３’−ｄＡ尾部の５’−脱リン酸化断片Ｆを得るためにポリメラーゼ（例えば、ＴａｑまたはＫｌｅｎｏｗエキソポリメラーゼ）およびｄＡＴＰで処理した５’−脱リン酸化断片Ｅ；ならびに断片の末端構造に全体的な変化はないポリメラーゼ（例えば、ＴａｑまたはＫｌｅｎｏｗエキソポリメラーゼ）およびｄＮＴＰで処理した３’−オーバーハング断片（例えば、末端トランスフェラーゼによって生成される）Ｇ、を図式的に示す。
【図４】脱リン酸化によって末端を保護し、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の切断（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの切断）によってリン酸塩を明らかにし、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質（例えばＣａｓ９）を除去し、末端をｄＡテーリングし、アダプターを連結し、シークエンシングデバイスに導入することによって、標的ＤＮＡ分子が配列決定され得る１つの可能なワークフローを示す。標的（Ａ）および非標的（Ｂ）の高分子量ＤＮＡの混合物を、デホスホリラーゼ酵素（子ウシ腸ホスファターゼなど）によって処理して、ブロックされた末端Ｃを有するライブラリー分子を得る。ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体（例えばＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ）Ｄを結合すると、標的分子を２つの断片ＥおよびＦに切断する二本鎖切断が導入される。除タンパク質によって結合複合体（例えばＲＮＰ）を除去すると、シークエンシングアダプターのｄＡテーリングおよび連結により、２つのアダプターが連結された標的断片ＧおよびＨを得、ナノ細孔に導入されるとき、膜Ｊおよび孔Ｋを含むシークエンシングフローセルは両方とも、配列決定され得る。標的分子および非標的分子の両方が、フローセルに導入されるが、標的分子のみが膜につながれ、配列決定される。
【図５】脱リン酸化によって末端を保護し、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の切断（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの切断）によってリン酸塩を明らかにし、末端をｄＡテーリングし、アダプターを連結し、シークエンシングデバイスに導入することによって、標的ＤＮＡ分子が配列決定され得る１つの可能なワークフローを示す。標的（Ａ）および非標的（Ｂ）の高分子量ＤＮＡの混合物を、デホスホリラーゼ酵素（子ウシ腸ホスファターゼなど）によって処理して、ブロックされた末端Ｃを有するライブラリー分子を得る。ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体（例えばＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ）Ｄを結合すると、標的分子を２つの断片ＥおよびＦに切断する二本鎖切断が導入される。シークエンシングアダプターのｄＡテーリングおよび連結により、１つのアダプターが連結された標的断片Ｇを得、ナノ細孔に導入されるとき、膜Ｈおよび孔Ｊを含むシークエンシングフローセルは、配列決定され得る。標的分子および非標的分子の両方が、フローセルに導入されるが、標的分子のみが膜につながれ、配列決定される。
【図６】脱リン酸化によって末端を保護し、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の切断（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの切断）によってリン酸塩を明らかにし、末端をｄＡテーリングし、アダプターを連結し、シークエンシングデバイスに導入することによって、標的ＤＮＡ分子が配列決定され得る１つの可能なワークフローを示す。標的（Ａ）および非標的（Ｂ）の高分子量ＤＮＡの混合物を、デホスホリラーゼ酵素（子ウシ腸ホスファターゼなど）によって処理して、ブロックされた末端Ｃを有するライブラリー分子を得る。ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体（例えばＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ）Ｄを結合すると、標的分子を２つの断片ＥおよびＦに切断する二本鎖切断が導入される。ここで、複合体（ＲＮＰ）は、自然発生的に解離する。シークエンシングアダプターのｄＡテーリングおよび連結により、２つのアダプターが連結された標的断片ＧおよびＨを得、ナノ細孔に導入されるとき、膜Ｊおよび孔Ｋを含むシークエンシングフローセルは両方とも、配列決定され得る。標的分子および非標的分子の両方が、フローセルに導入されるが、標的分子のみが膜につながれ、配列決定される。
【図７】脱リン酸化によって末端を保護し、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の切断（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの切断）によってリン酸塩を明らかにし、相補的アダプターを連結し、シークエンシングデバイスに導入することによって、標的ＤＮＡ分子が配列決定され得る１つの可能なワークフローを示す。標的（Ａ）および非標的（Ｂ）の高分子量ＤＮＡの混合物を、デホスホリラーゼ酵素（子ウシ腸ホスファターゼなど）によって処理して、ブロックされた末端Ｃを有するライブラリー分子を得る。ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体（例えばＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ）Ｄを結合すると、標的分子を２つの断片ＥおよびＦに切断する二本鎖切断が導入される。ここで、複合体（ＲＮＰ）は、自然発生的に解離する。相補的シークエンシングアダプター（Ｇ）の連結により、１つのアダプターが連結された標的断片Ｈを得、ナノ細孔に導入されるとき、膜Ｊおよび孔Ｋを含むシークエンシングフローセルは両方とも、配列決定され得る。標的分子および非標的分子の両方が、フローセルに導入されるが、標的分子のみが膜につながれ、配列決定される。
【図８】脱リン酸化によって末端を保護し、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の切断（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの切断）によってリン酸塩を明らかにし、相補的な中間バーコードのピースを連結し、シークエンシングデバイスに導入することによって、標的ＤＮＡ分子が配列決定され得る１つの可能なワークフローを示す。標的（Ａ）および非標的（Ｂ）の高分子量ＤＮＡの混合物を、デホスホリラーゼ酵素（子ウシ腸ホスファターゼなど）によって処理して、ブロックされた末端Ｃを有するライブラリー分子を得る。ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体（例えばＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ）Ｄを結合すると、標的分子を２つの断片ＥおよびＦに切断する二本鎖切断が導入される。ここで、ＲＮＰは、自然発生的に解離する。相補的中間バーコード（Ｇ）の連結およびアダプター（Ｈ）の配列決定により、１つのアダプターが連結された標的断片Ｉを得、ナノ細孔に導入されるとき、膜Ｊおよび孔Ｋを含むシークエンシングフローセルは両方とも、配列決定され得る。標的分子および非標的分子の両方が、フローセルに導入されるが、標的分子のみが膜につながれ、配列決定される。
【図９】脱リン酸化によって末端を保護し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の切断によってリン酸塩を明らかにし、ｄＡテーリングをし、シークエンシングアダプターを連結し、シークエンシングデバイスに導入することによって、標的ＤＮＡ分子が配列決定され得るワークフローの一例を示す。チューブＡでは、高分子量ゲノムＤＮＡは、３７℃で１０分間、脱ホスホリラーゼ酵素（子ウシ腸のホスファターゼなど）によって脱リン酸化され、酵素は、８０℃で５分間熱不活性化される。同時にチューブＢでは、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡにアニールされ、ＲＮＰは、この混合物をＣａｓ９で、室温で１０分間インキュベートすることによって形成される。その後、ＴａｑポリメラーゼおよびｄＡＴＰに加えて、チューブＢの内容物を、チューブＡに添加する。混合物を、３７℃で１５〜６０分間インキュベートして、脱リン酸化された標的ＤＮＡの切断およびｄＡ−テーリングを可能にする。関心対象の断片は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、シークエンシングアダプターに連結され、シークエンシングライブラリーを形成する。ライブラリーのＳＰＲＩ精製後、サンプルを、シークエンシングデバイスに導入する。
【図１０】脱リン酸化によって末端を保護し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１の切断によってリン酸塩を明らかにし、ｄＡテーリングをし、シークエンシングアダプターを連結し、シークエンシングデバイスに導入することによって、標的ＤＮＡ分子が配列決定され得るワークフローの一例を示す。チューブＡでは、高分子量ゲノムＤＮＡは、３７℃で１０分間、脱ホスホリラーゼ酵素（子ウシ腸のホスファターゼなど）によって脱リン酸化され、酵素は、８０℃で５分間熱不活性化される。同時にチューブＢでは、ｃｒＲＮＡは、熱変性であり、ＲＮＰは、この混合物をＣａｓ９で、室温で１０分間インキュベートすることによって形成される。続いて、チューブＢの内容物をチューブＡに添加し、３７℃で１５〜６０分間インキュベートして、脱リン酸化された標的ＤＮＡの切断を可能にする。関心対象の断片は、バーコードおよびシークエンシングアダプターに連結され、シークエンシングライブラリーを形成する。ライブラリーのＳＰＲＩ精製後、サンプルを、シークエンシングデバイスに導入する。
【図１１】冗長プローブが関心対象の領域（Ｄ）の隣接領域に相補的である、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の切断（例えばＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓのＲＮＰ）（Ｃ）によって誘導された非標的ＤＮＡ（Ａ）の切断パターンではなく、標的ＤＮＡ（Ｂ）の切断パターンを図式的に示す。ＲＮＰ１および２は、ＲＯＩの上流のセンス鎖（＋）に結合しており、ＲＮＰ３および４は、アンチセンス鎖（−）を認識する。ＲＮＰによる切断後に、５つの断片が生成される。生成された断片のうち３つだけが、５’リン酸（Ｅ、Ｆ、Ｇ）を含み、シークエンシングデバイスによって読み取ることができる。断片Ｇは、連結可能な両端を含む唯一の断片である。図３に示すように、ｄＡテーリングが実行される。
【図１２】図１１に示すように、生成された標的ＤＮＡ断片へのシークエンシングアダプターの連結を示す。ｄＡテーリング後に、シークエンシングアダプターの連結により、３つのアダプターが連結された標的断片Ａ、Ｂ、Ｃが生成される。断片Ａは、センス方向に配列決定することができ、断片Ｂは、アンチセンス方向から読み取ることができる。断片Ｃの両端は、ＲＮＰによって切断され、両端の２つのシークエンシングアダプターの連結が可能になり、センスおよびアンチセンスの両方向でのシークエンシングが可能になった。シークエンシング読み取りの長さおよび方向は、概略図Ｄに要約されている。ゲノム座標に沿った読み取り数またはカバレッジの深さのプロットは、断片Ｃのシークエンシングの双方向性により、ＲＮＰ２とＲＮＰ３の間のカバレッジの古典的な増加を示す。
【図１３】シークエンシングのために図１１に示すように生成された標的ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を示す。ｄＡテーリング後に、ＰＣＲアダプターのアニーリングにより、３つのアダプターが連結された標的断片Ａ、Ｂ、およびＣが生成される。断片Ｃの両端は、ＲＮＰによって切断され、各末端で２つのＰＣＲアダプターの連結が可能になり、ＰＣＲ増幅が可能になる。ＰＣＲ後に、関心対象の増幅された領域を、シークエンシングアダプターに連結して、センス方向およびアンチセンス方向の両方で配列決定を可能にする。この場合、ゲノム座標に沿ったカバレッジの深さのプロットは、ＲＮＰ２と３の切断部位間のカバレッジのみを示す。
【図１４】ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質切断（例えばＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓのＲＮＰ）（Ａ）により誘発された関心対象の領域（ＲＯＩ）における単一のｄｓＤＮＡ切断のシークエンシングパターンを調査する。ＲＮＰが切断の両側を解放した場合、２つの断片（ＢおよびＣ）は、ｄＡテーリングおよびシークエンシングアダプター連結にアクセス可能である。断片Ｂは、アンチセンス方向（−）で読み取られ、断片Ｃは、センス方向（＋）で読み取られ、その結果、両方向で切断位置からカバレッジの深さ（Ｄ）の減少をもたらす。
【図１５】Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２、株ＭＧ１６５５のｒｒｓ遺伝子に対して行われた生成されたｃｒＲＮＡプローブを用いて、全Ｅ．ｃｏｌｉゲノムサンプルからの全１  ６Ｓ（ｒｒｓ）遺伝子の富化を示すカバレッジプロットの一例を示す。パネルは、順（正の数）方向および逆（負の数）方向読み取りについてのカバレッジ対位置のプロットを示す。７つの標的ピーク、ｉ〜ｖｉｉは、同定され、バックグラウンドに対して大きな比率を占める。
【図１６−１】実施例１で使用した３つのアプローチ（１）、（２）、および（３）の違いを強調する。（１）、（２）、および（３）のそれぞれの左側および中央のパネルは、３つのアプローチを使用して得られたカバレッジを示し、（１）、（２）、および（３）のそれぞれの右側のパネルは、シークエンシング読み取りおよびＥ．ｃｏｌｉ参照のアラインメントをもたらすパイルアップを示す。
【図１６−２】図１６−１の続きである。
【図１７−１】実施例２に記載のライブラリーＡのＣａｓ９濃縮を示す。パネルは、Ｃａｓ９切断後のエキソＫｌｅｎｏｗによるｄＡテーリング後に、ヒトＮＡ１２８７８参照へのシークエンシング読み取りのアラインメントから生じた結果のパイルアップを示す。
【図１７−２】図１７−１の続きである。
【図１８】Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２、株ＭＧ１６５５のｒｒｓ遺伝子に対して行われたｃｒＲＮＡプローブを用いて、全Ｅ．ｃｏｌｉゲノムサンプルからの全１６Ｓ（ｒｒｓ）遺伝子の富化を示すカバレッジプロットの一例を示す。Ａ、左は、順（正の数）方向および逆（負の数）方向読み取りについてのカバレッジ対位置のプロットを示す。７つの標的ピーク、ｉ〜ｖｉｉは、同定され、バックグラウンドＢに対して大きな比率を占める。Ａ、下は、順方向および逆方向読み取りの凝集を示す。Ｃは、各ビンにマッピングされた塩基の数に対して正規化された、参照に首尾よくマッピングしたすべての読み取りの読み取り長さのヒストグラムを示す。
【図１９−１】Ｃｐｆ１濃縮のための異なるアプローチの使用を比較する。Ａは、５’ｎｔのオーバーハング切断部位配列に対する特定のバーコードが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｒｓ  １６Ｓ遺伝子を配列決定するために使用された実験を示す。Ｂは、一般的なバーコードが複数の５’ｎｔオーバーハング配列に結合することができる同等の実験を示す。ＣおよびＤは、酵素（Ｋｌｅｎｏｗ（エキソ−）またはＴａｑ）をそれぞれ使用して、５’ｎｔオーバーハングを埋め、ｄＡテーリングする同等の実験を比較する。
【図１９−２】図１９−１の続きである。
【図２０−１】ヒトゲノムＤＮＡサンプルによるＣｐｆ１濃縮のための特定のバーコードアプローチを使用して得られたヒトＮＡ１２８７８参照へのシークエンシング読み取りのアラインメントから生じた結果のパイルアップを示す。
【図２０−２】図２０−１の続きである。
【図２１−１】ヒトゲノムＤＮＡサンプルでＣｐｆ１を濃縮するためのＫｌｅｎｏｗ（エキソ−）アプローチを用いたｄＡ−テーリングを使用して得られたシークエンシング読み取りおよびヒトＮＡ１２８７８参照のアラインメントから生じるパイルアップを示す。
【図２１−２】図２１−１の続きである。
【図２２】脱リン酸化によって末端を保護し、２つの部位においてポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の切断（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの切断）によってリン酸塩を明らかにし、任意に末端をｄＡテーリングし、アダプターを連結し、シークエンシングデバイスに導入することによって、標的ＤＮＡ分子が配列決定され得る１つの可能なワークフローを示す。標的（Ａ）および非標的（Ｂ）の高分子量ＤＮＡの混合物を、デホスホリラーゼ酵素（子ウシ腸ホスファターゼなど）によって処理して、ブロックされた末端Ｃを有するライブラリー分子を得る。ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体（例えばＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ）Ｄを結合すると、標的分子を３つの断片ＥおよびＦに切断する二本鎖切断が導入される。ここで、複合体（ＲＮＰ）は、２つの外側断片Ｆに結合したままである。一本鎖の外側領域を含む中間アダプターピースＧが、内側の断片Ｅに連結されている。断片Ｅは、中間アダプターピースＧの一本鎖の外側領域に特異的なプライマーＨを使用して増幅される。シークエンシングアダプターの連結により、アダプターが連結された標的断片Ｋを得、ナノ細孔に導入されるとき、膜Ｍおよび孔Ｌを含むシークエンシングフローセルは、配列決定され得る。標的分子および非標的分子の両方が、フローセルに導入されるが、標的分子のみが膜につながれ、配列決定される。
【図２３−１】実施例５に記載されるように、ライブラリーＡ（１）およびＢ（２）に対するヒトＮＡ１２８７８参照（ＨＴＴ遺伝子）へのシークエンシング読み取りのアラインメントから生じるパイルアップ、ならびにライブラリーＢ（３）の遺伝子ごとのバーコードあたりの読み取り数を示す。
【図２３−２】図２３−１の続きである。
【図２４】実施例６の増幅なし（１）、リン酸化（２）または脱リン酸化（３）ＰＣＲアダプターアプローチによる増幅後のＥ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０参照へのシークエンシング読み取りのアラインメントから生じるパイルアップを示す。
【図２５−１】実施例７に記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ参照へのシークエンシング読み取りのアラインメントから生じるパイルアップを示す。（１）は、シークエンシングアダプターが、標的が切断され、ｄＡテーリングされたサンプルに連結された反応からのパイルアップを示す。（２）は、シークエンシングアダプターの連結前に、標的が切断され、ＲＮＡｓｅＨによって消化され、次いでＴａｑポリメラーゼによってｄＡテーリングされた反応からのパイルアップを示す。（３）は、標的が切断されたＤＮＡが、Ｃａｓ９変性後にＲＮＡｓｅＨでインキュベートされ、次いでシークエンシングアダプターの連結前に、ｄＡテーリングされた反応からのパイルアップを示す。
【図２５−２】図２５−１の続きである。
【図２６−１】実施例８に記載されているように、Ｅ．ｃｏｌｉ参照へのシークエンシング読み取りのアラインメントから生じるパイルアップを示す。（１）は、シークエンシングアダプターが、標的が切断され、ｄＡテーリングされたサンプルに連結された反応からのパイルアップを示す。（２）は、標的が切断されたＤＮＡが、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでインキュベートされ、次いでシークエンシングアダプターの連結前に、ｄＡテーリングされた反応からのパイルアップを示す。（３）は、標的が切断されたものが、Ｃａｓ９変性後にＲＮＡｓｅＨでインキュベートされ、シークエンシングアダプターの連結前に、ｄＡテーリングされた反応からのパイルアップを示す。
【図２６−２】図２６−１の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
開示される方法および産物の異なる適用が、当該技術分野における特定の必要性に合わせられ得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、方法および産物の特定の実施形態を説明する目的のためだけのものであり、限定を意図するものではないことも理解されたい。また、一実施形態に関連するものとして定義された特徴は、別の実施形態に関連する特徴と組み合わせることができる。
【００１４】
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド」への言及は、２つ以上のポリヌクレオチドを含み、「アンカー」への言及は、２つ以上のアンカーを含み、「ヘリカーゼ」への言及は、２つ以上のヘリカーゼを含み、「膜貫通孔」への言及は、２つ以上の細孔などを含む。
【００１５】
上記または下記の本明細書に引用されるすべての出版物、特許、および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１６】
本発明者らは、ポリヌクレオチドのサンプル中の標的ポリヌクレオチドを選択的に修飾するための方法を考案した。この方法は、ポリヌクレオチドのサンプル中の標的ポリヌクレオチドの選択的修飾をもたらす。これは、アダプターが標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドにのみ付加されることを意味する。次いで、標的ポリヌクレオチド（複数可）を、サンプル中の他の（非標的）ポリヌクレオチドから分離する必要なしに、分析または特徴付けることができる。
【００１７】
本発明者らによって考案された方法は、ポリヌクレオチドのサンプル中の標的ポリヌクレオチドまたは複数の標的ポリヌクレオチドの選択的適合をもたらし、この方法は、サンプル中のポリヌクレオチドの末端を保護することと、ポリヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドの配列に結合するガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させることであって、それによりポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が標的ポリヌクレオチドを切断して、ガイドポリヌクレオチドが結合する配列によって判定された部位において２つの対向する切断末端を生成する、接触させることと、アダプターを、標的ポリヌクレオチドの２つの対向する切断末端のうちの一方または両方に結合することと、を含み、アダプターは、標的ポリヌクレオチドの切断末端のうちの一方または両方に結合するが、サンプル中のポリヌクレオチドの保護末端には結合しない。
【００１８】
この方法は、適合されたポリヌクレオチドのライブラリーを生成するために使用することができ、複数のガイドポリヌクレオチドを使用して、１つ以上の標的ポリヌクレオチドを切断する、および／または同じ標的ポリヌクレオチド内の複数の部位内で切断するように、１つ以上のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を導く。
【００１９】
末端を保護する
この方法は、サンプル中のポリヌクレオチドの末端を保護するステップを含む。サンプル中のポリヌクレオチドの末端は、アダプターがポリヌクレオチドの末端に結合するのを防ぐために保護される。理想的には、サンプル内のすべてのポリヌクレオチドの末端が、保護される。しかしながら、実際には、サンプル中のポリヌクレオチドの一部のみが、両端を保護することができる。例えば、サンプル中のポリヌクレオチドの約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、または約９５％以上は、保護された末端を有し得る。
【００２０】
サンプル中のポリヌクレオチドの末端は、ポリヌクレオチドの末端を化学的に改変することによって保護することができる。末端は、酵素的に保護されていることが好ましい。これは、末端が、酵素を、任意に１つ以上の遊離ｄＮＴＰなどの基質を有する、サンプルに添加することによって保護されることを意味する。酵素は、例えば、デホスホリラーゼまたは末端トランスフェラーゼであり得る。
【００２１】
例えば、ポリヌクレオチドの５’末端は、通常リン酸化されている。ポリヌクレオチドの末端が脱リン酸化され、標的ポリヌクレオチドがポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を使用して切断される場合、アダプターは、切断末端に結合（連結）され得るが、脱リン酸化された末端では結合（連結）され得ない。これにより、例えば、単一のＴオーバーハングまたはポリＴオーバーハングを含むアダプターを標的ポリヌクレオチドの切断末端に選択的にハイブリダイズするか、または共有結合させることができる。末端の脱リン酸化は、ポリヌクレオチドのサンプルにデホスホリラーゼを添加することによって、簡単かつ容易に達成することができる。サンプルをさらに処理する前に、デホスホリラーゼをサンプルから除去する必要はない。デホスホリラーゼは、切断酵素を添加する前に、単に熱で不活性化することができる。
【００２２】
したがって、この方法では、サンプル中のポリヌクレオチドの末端は、ポリヌクレオチドの５’末端を脱リン酸化することによって保護することができる。この方法は、ポリヌクレオチドのサンプルにデホスホリラーゼを添加することを含み得る。デホスホリラーゼをサンプルに添加して、適切な時間インキュベートすることができる。当業者は、好適な期間を容易に決定することができるであろう。例えば、サンプルがデホスホリラーゼとインキュベートされる期間は、約５〜約３０分、例えば約１０〜約１５分、好ましくは約１０分であり得る。インキュベーション温度は、典型的には、使用されるデホスホリラーゼの最適温度によって決定されるが、例えば、約２０℃〜約４０℃の範囲、例えば、約３０℃、または好ましくは約３７℃であり得る。
【００２３】
ポリヌクレオチドの末端を化学的に改変する方法の別の例は、少なくとも１つのヌクレオチドを含む３’尾部を付加するために末端トランスフェラーゼを使用して、ポリヌクレオチドの３’末端を伸長することである。これにより、３’オーバーハングを有するアダプターへの連結が防止される。これにより、アダプターが標的ポリヌクレオチドの切断末端に共有結合させることができる。デホスホリラーゼおよび末端トランスフェラーゼの両方を使用して、ポリヌクレオチドの末端を保護することができる。
【００２４】
ポリヌクレオチドの末端を保護する方法は、好ましくは、サンプル中の二本鎖ポリヌクレオチドの反対の鎖の５’および３’末端を結合することを含まず、例えば、この方法は、二本鎖ポリヌクレオチドの反対の鎖の隣接する５’末端と３’末端の間にヘアピンループを結合することを含まない。しかしながら、例えば、二本鎖ポリヌクレオチドの各鎖の５’末端を同じ鎖の３’末端に結合することによって、ポリヌクレオチドの環状化によって末端を保護することができる。
【００２５】
サンプル中のポリヌクレオチドの末端は、ブロッキング化学を使用して保護することができる。例えば、ビオチンは、鎖のうちの一方または両方のポリヌクレオチドの末端に結合され、次いでストレプトアビジンに結合され得る。代替的に、各ポリヌクレオチドのうちの一端または両端を、ビオチン−ストレプトアビジンなどの好適な付着手段または他の親和性分子を使用して、ビーズの表面などの固体表面に結合させることができる。
【００２６】
サンプル
サンプルは、ポリヌクレオチドを含む任意の好適なサンプルであり得る。
【００２７】
サンプルは、生体サンプルであってもよい。本発明は、任意の有機体または微生物から得られたかまたは抽出されたサンプル上で、インビトロで実施され得る。有機体または微生物は、典型的には、古細菌、原核生物、または真核生物であり、典型的には、植物界、動物界、真菌界、モネラ界、および原生生物界の５つの界のうちの１つに属する。本発明は、任意のウイルスから得られたかまたは抽出されたサンプル上で、インビトロで実施され得る。
【００２８】
サンプルは、好ましくは、流体サンプルである。サンプルは、通常は、体液を含む。体液は、ヒトまたは動物から取得してもよい。ヒトまたは動物は、疾患を有する、疾患を有する疑いがある、または疾患の危険性があるものであってもよい。サンプルは、尿、リンパ液、唾液、粘液、精液、または羊水であってもよいが、好ましくは、全血、血漿、または血清である。典型的には、サンプルは、ヒト由来のものであるが、代わりに、別の哺乳動物由来のもの、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタなどの商業的に飼育されている動物由来のもの、あるいはネコまたはイヌなどのペットであってもよい。
【００２９】
代替的に、植物由来のサンプルは、通常は、穀物、豆類、果物、または野菜などの市販の作物、例えば、小麦、大麦、オート麦、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、大豆、米、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、豆、レンズ豆、サトウキビ、ココア、綿、茶、またはコーヒーから取得する。
【００３０】
サンプルは、非生体サンプルであってもよい。非生体サンプルは、好ましくは、液状サンプルである。非生物学的サンプルの例としては、外科用流体、水、例えば飲料水、海水、または河川水、および臨床検査用の試薬が挙げられる。
【００３１】
サンプルは、方法を実施する前に、例えば、遠心分離によって、または不必要な分子もしくは細胞、例えば赤血球を濾過して取り除く膜を通過させることによって処理され得る。この方法は、採取された直後にサンプルに対して実行されてもよい。サンプルは、通常、方法の前に、好ましくは−７０℃未満で保存することもできる。
【００３２】
サンプルは、ゲノムＤＮＡを含み得る。好ましくは、ゲノムＤＮＡは断片化されていない。ゲノムＤＮＡは、任意の生物からのものであり得る。ゲノムＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡであり得る。
【００３３】
標的ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であり得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの１本の鎖にハイブリダイズされたＲＮＡの１本の鎖を含み得る。ポリヌクレオチドは、１つ以上の合成スペーサーを含み得る。当該技術分野で既知の合成ポリヌクレオチドには、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーが含まれる。
【００３４】
ポリヌクレオチドは、好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、最も好ましくはＤＮＡである。標的ポリヌクレオチドは、好ましくは、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が結合する二本鎖領域を含む。標的ポリヌクレオチドは二本鎖であってもよい。標的ポリペプチドは、一本鎖であり得、小さい一本鎖ポリヌクレオチドは、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の標的部位にハイブリダイズされ得る。標的ポリペプチドは、一本鎖領域ならびに他の構造、例えばヘアピンループ、三重螺旋、および／または四重螺旋を有する領域を含み得る。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、同じ鎖上にＤＮＡとＲＮＡとを含み得る。好ましくは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドはＲＮＡ鎖にハイブリダイズした一本のＤＮＡ鎖を含む。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡである。ゲノムＤＮＡは、典型的には二本鎖である。
【００３５】
標的ポリヌクレオチドは、任意の長さであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、長さが少なくとも５００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対であり得る。標的ポリヌクレオチドは、１０００個以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対、５０００個以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さ、または１０００００個以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さであり得る。
【００３６】
標的ポリヌクレオチドは、疾患および／または微生物に関連するポリヌクレオチドであり得る。
【００３７】
この方法は、複数の標的ポリヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの群であり得る。例えば、群は、特定の表現型に関連付けられ得る。群は、特定の種類の細胞に関連付けられ得る。例えば、群は、細菌細胞を示し得る。群は、ウイルス、真菌、細菌、マイコバクテリウム、または寄生生物を示し得る。
【００３８】
標的ポリヌクレオチドは、特定の疾患または状態に関連するバイオマーカーである、２つ以上のポリヌクレオチドの群であり得る。バイオマーカーは、疾患または状態を診断または予後診断するために使用することができる。バイオマーカーの好適なパネルは、例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ７：１８２４−１８３７、Ｊａｃｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ８：２６８７−２６９９、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５６：１７７−１８５に記載されるように、当該技術分野で既知である。疾患または状態は、例えば、癌、冠状動脈性心疾患および心血管疾患を含む心疾患、または結核もしくは敗血症などの感染性疾患であり得る。疾患または状態は、ハンチントン病、脆弱性Ｘ、脊髄および球部の筋萎縮症または筋緊張性ジストロフィーなどの拡張反復に関連する疾患であり得る。
【００３９】
標的ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。２つ以上の標的ポリヌクレオチドの群は、２つ以上のｍｉＲＮＡの群であり得る。本発明での使用に適したｍｉＲＮＡは、当該技術分野で周知である。例えば、好適なｍｉＲＮＡは、公的に利用可能なデータベースに保存される。
【００４０】
標的ポリヌクレオチドの配列は、既知であっても未知であってもよい。標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、ガイドポリヌクレオチドがエフェクタータンパク質を標的ポリヌクレオチドに標的化することができるように既知であることが好ましい。
【００４１】
ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質
ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、ガイドポリヌクレオチドに結合し、ガイドポリヌクレオチドが結合するポリヌクレオチドを切断する任意のタンパク質であり得る。ガイドポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ、ガイドＤＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むガイドであり得る。ガイドポリヌクレオチドは、好ましくは、ガイドＲＮＡである。したがって、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、好ましくは、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質である。
【００４２】
ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、ガイドＲＮＡに結合する任意のタンパク質であり得る。ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、典型的には、標的ポリヌクレオチドに結合するガイドＲＮＡの領域ではないガイドＲＮＡの領域に結合する。例えば、ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む場合、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、典型的には、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合し、ｃｒＲＮＡは、典型的には、標的ポリヌクレオチドに結合する。ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、好ましくは、標的ポリヌクレオチドにも結合する。ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、典型的には、標的ポリヌクレオチドの二本鎖領域に結合する。ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質の結合によって切断される標的ポリヌクレオチドの部位は、典型的には、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする配列の近くに位置する。
【００４３】
ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、ガイドＲＮＡが結合する配列の上流または下流を切断し得る。例えば、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、ガイドＲＮＡが結合する配列の隣に位置するＤＮＡ中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に結合し得る。ＰＡＭは、典型的には、５’−ＮＧＧ−３’（式中、Ｎは任意の塩基である）、５’−ＮＧＡ−３’、５’−ＹＧ−３’（式中、Ｙはピリミジンである）、５’ＴＴＮ−３’、または５’−ＹＴＮ−３’などの、２〜６塩基対配列である。異なるＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、異なるＰＡＭに結合する。ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、特に、標的がＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである場合、ＰＡＭを含まない標的ポリヌクレオチドに結合し得る。
【００４４】
ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、典型的には、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼなどのヌクレアーゼである。ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、典型的には、Ｃａｓタンパク質である。ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ、Ｃｓｎ２、Ｃｐｆ１、Ｃｓｆ１、Ｃｍｒ５、Ｃｓｍ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｅ１、またはＣ２ｃ２であり得る。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、またはＣａｓ１３であり得る。好ましくは、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａである。Ｃａｓ、Ｃｓｎ２、Ｃｐｆ１、Ｃｓｆ１、Ｃｍｒ５、Ｃｓｍ２、Ｃｓｙ１、またはＣｓｅ１は、好ましくは、標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡ領域を含む場合に使用される。Ｃ２ｃ２は、好ましくは、標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡ領域を含む場合に使用される。ＲｅｃＡファミリーからのタンパク質などのＤＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、ＤＮＡを標的化するために使用され得る。使用され得るＲｅｃＡファミリーからのタンパク質の例は、ＲｅｃＡ、ＲａｄＡ、およびＲａｄ５１である。
【００４５】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性は、部分的に無効化され得る。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの１つ以上の触媒ヌクレアーゼ部位は、酵素が標的ポリヌクレオチドの少なくとも１つの鎖を切断する能力を保持しているという条件で不活性化され得る。例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが２つの触媒ヌクレアーゼ部位を含む場合、触媒部位のうちの一方は、不活性化され得る。典型的には、触媒部位のうちの一方は、それが特異的に結合するポリヌクレオチドのうちの一方の鎖を切断し、他方の触媒部位は、ポリヌクレオチドの反対の鎖を切断するであろう。したがって、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチドの二本鎖領域の両方の鎖または一方の鎖を切断し得る。
【００４６】
二本鎖標的ポリヌクレオチドのうちの一方の鎖のみを切断することができるポリヌクレオチド誘導型エンドヌクレアーゼは、ニッカーゼと称され得る。ニッカーゼは、典型的には、標的ポリヌクレオチドに一本鎖切断を生じさせる。２つのニッカーゼを使用して、第１のニッカーゼが標的ポリヌクレオチドのうちの一方の鎖を切断し、第２のニッカーゼが標的ポリヌクレオチドの他方の鎖を切断する、オーバーハングを有する切断末端を生成し得る。例えば、ニッカーゼは、同じエンドヌクレアーゼの部分的に不活性化されたバージョンであってもよく、一方のニッカーゼでは、第１の触媒部位が不活性化され、他方のニッカーゼでは、第２の触媒部位が不活性化されている。この例示的な実施形態において、第１のニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインが不活性化されているＣａｓ９エンドヌクレアーゼであってよく、第２のニッカーゼは、ＨＮＨドメインが不活性化されているＣａｓ９エンドヌクレアーゼであってよい。第１および第２のニッカーゼは、異なるガイドポリヌクレオチドによって誘導され得、それによりニッカーゼは、所望の長さのオーバーハングを有する切断末端が形成されるように、二本鎖標的ポリヌクレオチドの異なる場所で切断する。
【００４７】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの触媒部位は、変異によって不活性化され得る。変異は、置換、挿入、または欠失変異であり得る。例えば、１つ以上、例えば２、３、４、５、または６つのアミノ酸が、置換または触媒部位に挿入または触媒部位から欠失され得る。変異は、好ましくは置換または挿入であり、より好ましくは触媒部位における単一のアミノ酸の置換である。当業者であれば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの触媒部位およびそれらを不活性化する変異を容易に同定することができるであろう。例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼがＣａｓ９である場合、一方の触媒部位はＤ１０での変異によって、他方はＨ６４０での変異によって不活性化され得る。
【００４８】
エフェクタータンパク質がニッカーゼである場合、この方法は、５’から３’へのまたは３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素をサンプルに添加して、ユニバーサル配列を含む一本鎖部分（典型的には３’）を含むアダプターなどのアダプターがハイブリダイズすることができる一続きの一本鎖ポリヌクレオチドを曝露するために、標的ポリヌクレオチドのニックの入った鎖のニックの片側に隣接するヌクレオチドを除去することをさらに含み得る。ポリメラーゼを使用して、アダプターの標的ポリヌクレオチドへの連結などの共有結合の前に、アダプター（典型的には、３’）の末端と標的ポリヌクレオチドの二本鎖領域（典型的には、５’）の末端と）の間の任意のギャップを閉じることができる。
【００４９】
ガイドポリヌクレオチド
ガイドポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質に結合することもできる配列を含む。ガイドポリヌクレオチドは、それが標的ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質に結合することを可能にする任意の構造を有し得る。
【００５０】
ガイドポリヌクレオチドは、典型的には、標的ポリヌクレオチド中の約２０ヌクレオチドの配列にハイブリダイズする。ガイドＲＮＡが結合する配列は、約１０〜約４０、例えば約１５〜約３０、好ましくは約１８〜約２５ヌクレオチド、例えば、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドであり得る。ガイドポリヌクレオチドは、典型的には、標的ポリヌクレオチドの二本鎖領域の一本鎖の一部に相補的である。
【００５１】
ガイドＲＮＡは、ＰＡＭに対して５’または３’である標的ポリヌクレオチド中の領域に相補的であり得る。これは、標的ポリヌクレオチドがＤＮＡを含む場合、特にＲＮＡエフェクタータンパク質がＣａｓ９またはＣｐｆ１である場合に好ましい。ガイドＲＮＡは、グアニンに隣接する標的ポリヌクレオチド中の領域に相補的であり得る。これは、標的ポリヌクレオチドがＲＮＡを含む場合、特にＲＮＡエフェクタータンパク質がＣ２ｃ２である場合に好ましい。
【００５２】
ガイドＲＮＡは、それが標的ポリヌクレオチドおよびＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質に結合することを可能にする任意の構造を有し得る。ガイドＲＮＡは、標的ポリヌクレオチドの配列に結合するｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、典型的には、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質に結合する。ガイドＲＮＡの典型的な構造は、当該技術分野で既知である。例えば、ｃｒＲＮＡは、典型的には、一本鎖ＲＮＡであり、ｔｒａｃｒＲＮＡは、典型的には、一本鎖がｃｒＲＮＡの３’末端に結合している二本鎖領域およびｃｒＲＮＡに結合していない鎖の３’末端にヘアピンループを形成する部分を有する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、単一片ｓｇＲＮＡとしてインビトロで転写され得る。
【００５３】
ガイドＲＮＡは、追加のＲＮＡ塩基もしくはＤＮＡ塩基または他の核酸塩基などの他の成分を含み得る。ガイドＲＮＡ中のＲＮＡおよびＤＮＡ塩基は、天然塩基または修飾塩基であり得る。ガイドＲＮＡの代わりにガイドＤＮＡが使用され、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質の代わりにＤＮＡ誘導型エフェクタータンパク質が使用され得る。標的ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、ガイドＤＮＡおよびＤＮＡ誘導型エフェクタータンパク質の使用が好ましくあり得る。
【００５４】
カスタマイズされたガイドポリヌクレオチドは、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から市販されている。
【００５５】
この方法は、ポリヌクレオチドのサンプルを複数のガイドポリヌクレオチドと接触させることを含み得る。例えば、１〜１００、例えば２〜５０、例えば４、６、８、１０、２０、または３０のガイドポリヌクレオチドを使用することができる。複数のガイドポリヌクレオチドは、同じ標的ポリヌクレオチドの異なる部位において、例えば、標的ポリヌクレオチドの関心対象の領域の末端（隣接する）で、あるいは標的ポリヌクレオチドのすべてまたは長い長さのカバレッジがアダプターを結合させることができる標的ポリヌクレオチドの断片を生成することによって得ることができるように、配列を結合し得る。断片は、異なる断片または重複する断片であり得る。複数のガイドポリヌクレオチドは、異なる標的ポリヌクレオチドの配列に結合し得る。
【００５６】
一実施形態において、この方法は、一方のガイドポリヌクレオチドがニッカーゼに二本鎖標的ポリヌクレオチドの一方の鎖を切断するように導き、他方のガイドポリヌクレオチドがニッカーゼを導いて二本鎖ポリヌクレオチドの他方の鎖を切断するように設計された２つのガイドポリヌクレオチドを利用し得る。このようにして、オーバーハングを有する対向する切断末端がそれぞれ、形成され得る。この方法は、そのようなガイドポリヌクレオチドの２つ以上の対を利用して、標的ポリヌクレオチドにおいて２つ以上のオーバーハングを有する切断末端を生成し得る。
【００５７】
一実施形態において、切断部位は、標的ポリヌクレオチドにおける関心対象の領域の末端２０ヌクレオチドのうちの１つ以上を含み得、および／または標的ポリヌクレオチドにおける関心対象の領域の末端の０〜５０ヌクレオチド、例えば、１〜４０、５〜３０、または１０〜２０ヌクレオチド内であり得る。
【００５８】
一実施形態において、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、標的ポリヌクレオチドの１つの部位において切断する。
【００５９】
別の実施形態において、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、標的ポリヌクレオチドの２つ以上の部位において切断する。この実施形態において、２つの部位は、好ましくは、標的ポリヌクレオチドの末端にあるか、または標的ポリヌクレオチドにおける関心対象の領域の末端にある。したがって、方法は、ポリヌクレオチドのサンプルを２つ以上のガイドポリヌクレオチドと接触させることを含み得、第１のガイドポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの一方の末端近くの配列に結合し、第２のガイドポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドのうちの他方の末端近くの配列に結合するか、または、第１のガイドポリヌクレオチドは、関心対象の領域のうちの一方の末端近くの配列に結合し、第２のガイドポリヌクレオチドは、関心対象の領域のうちの他方の末端近くの配列に結合する。代替的に、この方法は、ポリヌクレオチドのサンプルを２対以上のガイドポリヌクレオチドと接触させることを含み得、第１の対は、標的ポリヌクレオチドの一方の末端または関心対象の領域で切断するように、一対のニッカーゼを導き、第２の対は、標的ポリヌクレオチドのうちの他方の末端または関心対象の領域で切断するように一対のニッカーゼを導く。
【００６０】
一実施形態において、標的ポリヌクレオチド内の３つ以上の部位、例えば４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の部位が、切断される。この方法は、例えば、３つのガイドポリヌクレオチドまたは３対のガイドポリヌクレオチドを使用することを含み得、１つは、標的ポリヌクレオチドまたは関心対象の領域内の配列に結合し、他の２つは、標的ポリヌクレオチドの末端、または関心対象の領域の配列に結合する。
【００６１】
ガイドポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の作用がより長いポリヌクレオチドから関心対象の領域を切り出すように、またはそれが標的ポリヌクレオチド全体を切り出すように設計され得る。例えば、この方法は、２つのガイドポリヌクレオチド、または２対のガイドポリヌクレオチドを利用することができ、１つのガイドポリヌクレオチドまたは１対のガイドポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドのうちの一方の末端の部位に結合し、他のガイドポリヌクレオチドまたは対のガイドポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドのうちの他方の末端の部位に結合する。
【００６２】
ガイドポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質に結合され得る、すなわち、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）と称され得る複合体を形成し得る。ＲＮＰを形成するための条件は、当該技術分野で周知である。例えば、等モルのｃｒＲＮＡプールを、約９５℃で約５分間ｔｒａｃｒＲＮＡにアニーリングして、ガイドポリヌクレオチドを形成し、次いでポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を添加して、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質をガイドポリヌクレオチドに結合させるために、少なくとも約１０分間インキュベートする前に室温に冷却することができる。ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を含む複合体を、サンプルに添加することができる。この方法は、２つ以上の異なるガイドポリヌクレオチドを使用する場合、それぞれが、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と複合体化され得る。したがって、この方法は、２つ以上、例えば３、４、５、７、８、９、１０またはそれ以上のそのような複合体をサンプルに添加することを含み得る。
【００６３】
この方法は、２つ以上の異なる標的ポリヌクレオチドの配列に結合する２つ以上のガイドポリヌクレオチドを使用する場合、ガイドポリヌクレオチドを使用して、各標的ポリヌクレオチド内の関心対象のうちの少なくとも１つの領域内または隣接するアダプターを結合させることができる。
【００６４】
切断末端
この方法では、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、標的ポリヌクレオチドを切断して、２つの対向する切断末端を生成する。ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質およびガイドポリヌクレオチドは、典型的には、ポリヌクレオチドの脱リン酸化サンプルを用いて、約２０℃〜約４０℃、例えば約３０℃、好ましくは約３７℃の温度で約１５分間〜約１時間以上、例えば、約３０分間インキュベートされる。例えば、サンプルの量、エフェクタータンパク質濃度、インキュベーション温度、およびインキュベーション時間を含む反応条件は、必要に応じて調整することができる。
【００６５】
ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、典型的には、二本鎖領域の標的ポリヌクレオチドを切断して、２つの対向する切断末端を生成する。対向する切断末端は、例えば、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質がニッカーゼである場合、二本鎖ポリヌクレオチドのちょうど一方の鎖にあり得る。対向する切断末端は、二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖にあり得る。対向する切断末端は、平滑末端であり得る、すなわち、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖を同じ地点で切断し得る。したがって、一実施形態において、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖を切断して、平滑末端を生成する。別の実施形態において、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖を切断して、一本鎖オーバーハングを生成する。対向する切断末端はそれぞれ、一本鎖オーバーハングを有してもよく、各末端の一本鎖オーバーハングは、５’オーバーハングであるか、または各末端の一本鎖オーバーハングは、３’オーバーハングである。一本鎖オーバーハングは、好ましくは、３’オーバーハングである。
【００６６】
一実施形態において、切断末端は、それぞれ、一本鎖オーバーハングを含む。一本鎖オーバーハングは、例えばＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）などの単一のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質によって形成され得る。別の実施形態において、一本鎖オーバーハングを含む切断末端は、２つのポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の作用によって生成され、各タンパク質は、標的ポリヌクレオチドの異なる鎖を切断する。この方法では、アダプターを、エフェクタータンパク質（複数可）によって生成された切断末端のうちの一方または両方に結合する。オーバーハングは、任意の好適な長さのものであり得る。典型的には、オーバーハングは、４〜３０、例えば、５〜２５、６〜２０、７〜１５、８〜１２、または９〜１０ヌクレオチドを含む。
【００６７】
オーバーハングの配列は、既知であっても未知であってもよい。ガイドポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドにおける特定の既知の配列に導かれ得る。ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が標的を切断する部位は、既知であるので、オーバーハングの配列は、予め決定される。したがって、アダプターは、例えば、アダプターの結合を望む切断末端のオーバーハングと反対側の鎖に一本鎖オーバーハングなどの一本鎖領域を有するように設計することができ、アダプターの一本鎖領域の配列は、切断末端のオーバーハングの配列に相補的である。標的ポリヌクレオチドの切断末端のオーバーハングは、アダプターのオーバーハングなどの一本鎖領域にハイブリダイズすることができる。
【００６８】
一実施形態において、アダプターのオーバーハングの配列は、切断末端の配列とまさに相補的である。２つのオーバーハング配列の間に１つ以上の塩基対のミスマッチがあり得る可能性がある。例えば、２つまたは３つの塩基対のミスマッチなど、１〜４つの塩基対のミスマッチがあり得る。しかしながら、典型的には、２つのオーバーハング配列の間に少なくとも４、例えば、５〜２０、６〜１５、または８〜１０のマッチした塩基がある。
【００６９】
一実施形態において、アダプターは、５’リン酸を欠いている場合がある。これにより、アダプター自体の連結を防ぐのに役立ち得る。
【００７０】
一実施形態において、アダプターの一本鎖オーバーハングの配列は、ユニバーサル配列である。アダプターのユニバーサル配列は、約３〜約１５ヌクレオチドの長さ、例えば、約４、５、６、または７〜約１２、１０、または８ヌクレオチドの長さであり得る。ユニバーサル配列は、二本鎖ポリヌクレオチドを切断することによって形成されるオーバーハングの任意のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるユニバーサルヌクレオチドを含む。
【００７１】
ユニバーサルヌクレオチドは、テンプレートポリヌクレオチドのすべてのヌクレオチドにある程度ハイブリダイズするヌクレオチドである。ユニバーサルヌクレオチドは、好ましくは、ヌクレオシドアデノシン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）を含むヌクレオチドにある程度ハイブリダイズするものである。ユニバーサルヌクレオチドは、他のヌクレオチドよりもいくつかのヌクレオチドにより強くハイブリダイズし得る。例えば、ヌクレオシド、２’−デオキシイノシンを含むユニバーサルヌクレオチド（Ｉ）は、Ｉ−Ｃ＞Ｉ−Ａ＞Ｉ−Ｇの優先的な対合順序がおよそ＝Ｉ−Ｔであることを示すであろう。アダプターで使用されるユニバーサルヌクレオチドが二本鎖ポリヌクレオチドのすべてのヌクレオチドにハイブリダイズすることのみが必要である。例えば、二本鎖ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、アダプターのユニバーサルヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴにのみ結合する必要がある。
【００７２】
ユニバーサルヌクレオチドは、ヒポキサンチン、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドール、３−ニトロピロール、ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンゾイミダゾール、５−ニトロインダゾール、４−アミノベンゾイミダゾール、またはフェニル（Ｃ６芳香族環の、核酸塩基のうちの１つを含み得る。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、２’−デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、７−デアザ−イノシン、２−アザ−デオキシイノシン、２−アザ−イノシン、４−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロインドールリボヌクレオシド、５−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインドールリボヌクレオシド、６−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、６−ニトロインドールリボヌクレオシド、３−ニトロピロール２’−デオキシリボヌクレオシド、３−ニトロピロールリボヌクレオシド、ヒポキサンチンの非環状糖類似体、ニトロイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、ニトロイミダゾールリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾールリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾールリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、フェニルＣ−リボヌクレオシド、またはフェニルＣ−２’−デオキシリボシルヌクレオシドのヌクレオシドのうちの１つを含む。
【００７３】
５’オーバーハングで切断末端にアダプターの結合を望む場合、相補的またはユニバーサル一本鎖領域は、一本鎖アダプターの５’末端にあるか、または二本鎖アダプター上の一本鎖５’オーバーハングである。例えば、アダプターが、ユニバーサルオーバーハングまたは切断末端のオーバーハングに相補的な一本鎖オーバーハングを有する場合、切断末端のオーバーハングが上部の鎖上に５’オーバーハングである場合、アダプターのオーバーハングが、下部の鎖上に５’オーバーハングであるか、または逆も同様である。代替的に、３’オーバーハングを有する切断末端へのアダプターの結合を望む場合、ユニバーサルまたは相補的一本鎖領域は、一本鎖アダプターの３’末端にあるか、または二本鎖アダプターの３’オーバーハングである。例えば、切断末端のオーバーハングが、下部の鎖上の３’オーバーハングである場合、アダプターのオーバーハングは、上部の鎖上の３’オーバーハングであるか、または逆も同様である。
【００７４】
アダプターのオーバーハングの長さは、典型的には、切断末端のオーバーハングの長さと同じである。オーバーハングのうちの１つが他のオーバーハングよりも短くなり得ることが可能である。典型的には、オーバーハングは、４〜３０、例えば、５〜２５、６〜２０、７〜１５、８〜１２、または９〜１０ヌクレオチドの領域にわたってハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーション後、一続きの一本鎖ヌクレオチドが存在する場合、例えば、ポリメラーゼを使用してギャップを埋めることができる。好ましくは、２つの相補的オーバーハングの長さは同一であるか、または標的配列におけるオーバーハングおよびユニバーサルオーバーハングの長さは同一である。
【００７５】
ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質（複数可）の作用が一本鎖オーバーハングをもたらす実施形態において、この方法は、サンプルをポリメラーゼおよびｄＮＴＰと接触させて、オーバーハングを充填し、平滑末端を生成することを含み得る。
【００７６】
アダプターがｄＴ尾部を含む場合、この方法は、サンプルをポリメラーゼおよびｄＡＴＰと接触させて、ｄＡ尾部を標的ポリヌクレオチドの切断末端のうちの少なくとも１つに付加することをさらに含み得る。ｄＡ尾部は、平滑末端または一本鎖オーバーハングに付加され得る。代替例として、アダプターがｄＡ尾部を含む場合、この方法は、サンプルをポリメラーゼおよびｄＴＴＰと接触させて、ｄＴ尾部を標的ポリヌクレオチドの切断末端のうちの少なくとも１つに付加することをさらに含み得る。同様に、ｄＡおよびｄＴの代わりにｄＧおよびｄＣが、使用され得る。
【００７７】
アダプターの結合のための遊離切断末端
ポリヌクレオチドを切断した後、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、切断部位の片側に結合したままであり得るか、または標的ポリヌクレオチドから放出され得る。ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、切断部位の片側に結合したままである場合、エフェクタータンパク質が結合したままである切断部位の側の切断末端へのアダプターの結合を防止され得る。この場合、エフェクタータンパク質が結合されていない切断部位の面の切断末端へのアダプターの付加に対してバイアスが存在する。したがって、この方法の一実施形態において、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、２つの対向する切断末端のうちの一方に結合したままであり、アダプターは、２つの対向する切断末端のうちの他方に結合している。
【００７８】
ガイドポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを切断し、関心対象の領域に切断部位の反対側に留まるように、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を導くように設計され得る。ガイドポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質がポリヌクレオチドを切断し、関心対象の領域の切断部位上流の反対側に留まり、ポリヌクレオチドを切断し、関心対象の領域の切断部位下流の反対側に留まるように設計され得る。典型的には、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、切断部位のＰＡＭ遠位側に結合したままであり、切断部位のＰＡＭ近位側を、ｄＡテーリング酵素および／またはアダプター結合にアクセス可能なままにする。
【００７９】
ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、各標的部位において１００％の割合で切断しない。本発明者らは、標的ポリヌクレオチドが切断および適合される可能性を高める方法を考案した。この方法は、例えば、アダプターが関心対象の領域の両側に付加されることを確実にするために使用され得る。この方法では、ガイドポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を、標的ポリヌクレオチドの同じ領域内の２つ以上、例えば、３、４、５、６またはそれ以上の部位に導くように設計され、典型的には、例えば、標的ポリヌクレオチドを切断した後、エフェクタータンパク質が、関心対象の領域に切断部位の反対側に結合したままであるように、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は同じ配向にある。これは、エフェクタータンパク質が標的ポリヌクレオチドを切断部位のうちの一方または両方で切断した場合に、アダプターを必要に応じて結合することができることを意味する。同じ領域内の２つの切断部位は、互いに約１０ｋｂ、５ｋｂ、１ｋｂ、５００ヌクレオチド、または１００ヌクレオチド内、例えば、約９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド内に配置され得る。定義された関心対象の領域の両側に切断部位がある場合、２つ以上、例えば、３、４、５、６、またはそれ以上の切断部位が関心対象の領域のいずれかの側にあり得る。標的ポリヌクレオチドの同じ領域内の切断部位は、同じポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が導かれる部位、または例えばＣａｓ９およびＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）などの異なるポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が導かれる部位であり得る。
【００８０】
したがって、ポリヌクレオチドのサンプル中の標的ポリヌクレオチドを選択的に適合させるための方法であって、サンプル中のポリヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドの配列に結合する２つのガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させることであって、２つのガイドポリヌクレオチドが結合する配列が、２つの密接に位置している部位にポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を導き、それによりポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、２つの部位のうちの少なくとも１つで標的ポリヌクレオチドを切断して、２つの対向する切断末端を生成する、接触させることと、アダプターを、標的ポリヌクレオチドの２つの対向する切断末端のうちの一方または両方を結合させることと、を含む、方法が提供される。
【００８１】
関心対象の領域は、配列決定されるなどの特徴付けられる標的ポリヌクレオチドの領域である。関心対象の領域は、その末端で標的化された切断部位によって定義され得る。関心対象の領域は、一端が標的切断部位の位置によって定義され、関心対象の領域が、一方向または両方向に標的切断部位から離れて伸長するという意味で「開口末端」であり得る。切断部位から離れた特定の方向の関心対象の領域の特徴付けは、ガイドポリヌクレオチドを設計することによってバイアスをかけることができ、それによりエフェクタータンパク質は、優先的に、例えば関心対象の領域を特徴付けることを望む側面に対して切断部位の反対側に結合したままである。
【００８２】
標的ポリヌクレオチドは、例えばＳＮＰなどの多型を含み得る。一実施形態において、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、ＳＮＰなどの多型の部位を標的とするように設計することができ、多型の存在下（または非存在下）でのみ標的ポリヌクレオチドに結合し、切断することができる。代替的に、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、例えば、関心対象の領域が、多型を含んでも含まなくてもよい領域であるように、多型を含む領域を特徴付けることができるように、標的ポリヌクレオチドを切断するように設計することができる。
【００８３】
ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が切断して、標的ポリヌクレオチド中に平滑末端を残す場合、アダプター連結を促進するために、末端を修飾してもよい。例えば、アダプターが、単一のまたはポリＴ尾部などのｄＴ尾部を有する場合、切断末端は、例えば単一のｄＴまたはポリＴ尾部を付加するために、ｄＡテーリングされ得る。平滑末端にｄＡ尾部を付加するための方法は、当該技術分野で既知である。任意の好適な方法を使用することができる。一実施形態において、ｄＡ尾部は、ポリメラーゼを使用して添加される。ポリメラーゼは、例えば、耐熱性または熱安定性ポリメラーゼであってよい。耐熱性ポリメラーゼまたは熱安定性ポリメラーゼは、典型的には、約５０℃、約６０℃、約７０℃、約７５℃、または約８０℃を超える温度で安定したままである。典型的には、耐熱性ポリメラーゼまたは熱安定性ポリメラーゼは、約５０℃、約６０℃、約７０℃、約７５℃、または約８０℃を超える温度でポリメラーゼ活性を有する。例えば、耐熱性ポリメラーゼまたは熱安定性ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼであってよい。Ｔａｑポリメラーゼが使用される場合、ｄＡ尾部は、例えば、約７２℃の温度で付加され得る。
【００８４】
ｄＡが切断部位をテーリングする前に、エフェクタータンパク質は、不活性化され得る。典型的には、不活性化は、サンプルを、例えば、少なくとも約５０℃、約６０℃、約７０℃、約７５℃、または約８０℃に加熱することによって達成され得る。サンプルを加熱して、エフェクタータンパク質を、約２分〜約２０分、例えば、約５分〜約１５分または約１０分不活性化することができる。耐熱性ポリメラーゼまたは熱安定性ポリメラーゼが、ｄＡテーリングに使用される場合、エフェクタータンパク質の熱による不活性化の前に添加され得る。例えば、熱安定性ポリメラーゼは、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と同時にサンプルに添加され得る。この実施形態において、エフェクタータンパク質の不活化ステップ中に、ｄＡ尾部を切断部位に付加することができる。エフェクタータンパク質を不活性化するために使用される温度で活性ではないポリメラーゼ、例えば、中温性ポリメラーゼがｄＡテーリングに使用される場合、熱不活化後、サンプルは、典型的には、ｄＡテーリングに使用されるポリメラーゼが最適に活性である温度、例えば、サンプルにポリメラーゼを添加する前に、約３７℃または室温まで冷却される。代替的に、中温性ポリメラーゼは、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と同時に活性になるように、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と同時にサンプルに添加され得る。しかしながら、この実施形態において、ｄＡテーリングにアクセス可能な末端の数は、エフェクタータンパク質の熱不活性化の後にｄＡテーリングが行われる場合よりも少なくてもよい。好適な中温性ポリメラーゼの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ変異体である３’−５’エキソ−ＫｌｅｎｏｗなどのＫｌｅｎｏｗ断片である。
【００８５】
この方法の一実施形態において、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、標的ポリヌクレオチドから除去される。この方法の別の実施形態において、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、標的ポリヌクレオチドに結合したままではない。
【００８６】
エフェクタータンパク質の熱不活化は、標的ポリヌクレオチドからのエフェクタータンパク質の解離を助け、したがって、ｄＡテーリングおよび／またはアダプターの結合のためにアクセス可能な切断末端の数を増加させ、特に、切断部位で形成された２つの対向する末端の両方へのアダプターの結合を促進することができる。エフェクタータンパク質は、典型的には、このステップで変性される。
【００８７】
一実施形態において、サンプルは、タンパク質除去されて、切断後に標的ポリヌクレオチドに結合したままである任意のエフェクタータンパク質を除去することができる。例えば、プロテイナーゼは、サンプルをエフェクタータンパク質で十分な時間インキュベートした後、エフェクタータンパク質の熱不活性化の前または後のいずれかに、サンプルに添加することができる。典型的には、除タンパク質ステップは、ポリメラーゼを添加して、ｄＡテーリングステップを実施する前に実施される。除タンパク質ステップの目的は、エフェクタータンパク質の作用によって形成された対向する切断末端の両方にアダプターを結合することができるように、結合したエフェクタータンパク質を放出させることである。
【００８８】
場合によっては、エフェクタータンパク質は、例えばエフェクタータンパク質がＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９の類似体である場合、切断後に標的ポリヌクレオチドから放出されてもよい。この場合、切断部位において２つの対向する末端の両方にアダプターを結合するために、除タンパク質は必要とされない。エフェクタータンパク質の熱不活化も、必要とされ得ない。
【００８９】
この方法は、サンプル中のポリヌクレオチドを、１つ以上の標的ポリヌクレオチドに結合する１つ以上のガイドポリヌクレオチドと接触させることを含み得る。１つ以上のガイドポリヌクレオチドは、関心対象の領域内または関心対象の領域外の標的ポリヌクレオチドに結合し得る。したがって、この方法は、２つ以上、例えば、３、４、５、７、８、９、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１０，０００、または１００，０００もしくはそれ以上のガイドポリヌクレオチドをポリヌクレオチドのサンプルに添加することを含み得る。ガイドポリヌクレオチドは、１つ、２つまたはそれ以上、例えば、３、４、５、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００、１０，０００、または１００，０００もしくはそれ以上の標的ポリヌクレオチドなどを標的とし得る。
【００９０】
ポリヌクレオチドのサンプルが、標的ポリヌクレオチドの異なる配列に結合する２つ以上のガイドポリヌクレオチドと接触させられると、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、２つ以上の部位において標的ポリヌクレオチドを切断し、各部位において２つの対向する切断末端を生成し得る。一実施形態において、２つ以上の部位のうちの少なくとも１つは、標的ポリヌクレオチドの関心対象の領域の第１の側に位置し、２つ以上の部位のうちの少なくとも１つは、標的ポリヌクレオチドの関心対象の領域の第２の側に位置し、２つ以上の部位のうちのいずれも、関心対象の領域内に位置しない。
【００９１】
関心対象の領域の各側に位置する部位において標的ポリヌクレオチドを切断した後、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、関心対象の領域を含まないポリヌクレオチドの切断末端に結合したままであるように、ガイドポリヌクレオチドは、配向され得る。このようにして、アダプターは、標的ポリヌクレオチドから脱落するポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質に依存することなく、またはポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を能動的に除去するステップを含むことなく、関心対象の領域を含むポリヌクレオチドの両端に添加することができる。
【００９２】
一実施形態において、ガイドポリヌクレオチドによって標的化される２つ以上の部位は、標的ポリヌクレオチドの関心対象の領域のいずれかの側において少なくとも２つの部位を含む。一実施形態において、同じポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、２つ以上の部位のすべてにおいて切断するために使用される。別の実施形態において、異なるポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、２つ以上の部位において切断するために使用される。例えば、関心対象の領域のうちのいずれかの側にガイドポリヌクレオチドによって標的化される少なくとも２つの部位がある場合、関心対象の領域の第１の側にある部位のうちの１つは、第１のガイドポリヌクレオチドおよび第１のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質によって標的化され得、別の部位は、第２のガイドポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質によって標的化され得る。
【００９３】
切断部位の片側に結合したままのエフェクタータンパク質から生じる読み取りバイアスは、読み取りの方向性を改善するため、または必要に応じて双方向読み取りの数を増やすために、増加または減少させてもよい。いくつかの実施形態において、バイアスは、エフェクタータンパク質を熱不活性化（変性）することによって、および／またはサンプルを脱タンパク質化することによって低減されてもよい。
【００９４】
いくつかの実施形態において、バイアスは、切断されたポリヌクレオチド、典型的にはＤＮＡをＲＮＡａｓｅＨで処理することによって低減されてもよい。ＲＮＡａｓｅＨは、ＲＮＡ／ＤＮＡ基質のＲＮＡを切断する。ＲＮＡａｓｅＨ処理は、エフェクタータンパク質の脱タンパク質化または熱不活化の前または後に、好ましくはその後に実行され得るか、またはタンパク質化もしくは熱不活化ステップの非存在下で実行され得る。ＲＮＡａｓｅは、典型的には、ｄＡテーリングおよびアダプター連結の前にサンプルに添加される。
【００９５】
いくつかの実施形態において、バイアスは、切断されたポリヌクレオチドを３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理することによって増加してもよい。そのような酵素の一例は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼドメインを含むポリメラーゼである。ポリメラーゼは、典型的には、ｄＮＴＰの不在下で添加され、それにより、それはポリメラーゼ活性を有しない。そのような酵素の別の例は、３’−５’エキソヌクレアーゼである。好ましくは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有しない。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する好適な酵素の例には、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＴ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ７  ＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、エフェクタータンパク質の脱タンパク質化または熱不活化の前または後に、好ましくはその後に添加され得るか、または脱タンパク質化もしくは熱不活化ステップが、方法に不在であり得る。ポリメラーゼは、典型的には、ｄＡテーリングおよびアダプター連結の前にサンプルに添加される。
【００９６】
アダプターの結合
アダプターは、１つ以上の切断末端、または例えば、ｄＡテーリングされた切断末端などの１つ以上の修飾された切断末端にハイブリダイズされ得る。
【００９７】
アダプターが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズして、アダプターの末端（例えば、３’末端）と、アダプターもハイブリダイズされている標的ポリヌクレオチド鎖にハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド鎖の末端（例えば、５’末端）との間にギャップがある場合、ギャップを埋めることができる。これにより、アダプターの末端（例えば３’末端）および標的ポリヌクレオチドの末端（例えば５’末端）を互いに共有結合させることができる。
【００９８】
二本鎖構築物における一本鎖ギャップを修復するための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、ギャップは、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼなどのポリメラーゼおよびリガーゼを使用して修復することができる。代替的に、ギャップは、ギャップおよびリガーゼを架橋するのに十分な長さのランダムオリゴヌクレオチドを使用して修復することができる。
【００９９】
例えば、５’から３’の方向に作用するポリメラーゼを使用して、アダプターを一本鎖領域にハイブリダイズした後、アダプターの末端を伸長して、アダプターの３’末端と、隣接する二本鎖ＤＮＡの５’末端との間のギャップを閉じることができる。５’から３’の方向に作用する好適なポリメラーゼには、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
【０１００】
この方法は、アダプターを二本鎖ポリヌクレオチドに共有結合していることをさらに含み得る。典型的には、アダプターの３’末端ヌクレオチドは、一本鎖領域に隣接する５’末端ヌクレオチドに共有結合している。共有結合は、任意の好適な手段によって、例えば、連結またはクリック化学によって達成され得る。
【０１０１】
したがって、この方法は、共有結合すること、例えば、アダプターを二本鎖ポリヌクレオチドに連結することをさらに含み得る。例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼをサンプルに添加して、アダプターを二本鎖ポリヌクレオチドに連結し得る。アダプターは、ＡＴＰの不在下で、またはＡＴＰの代わりにガンマ−Ｓ−ＡＴＰ（ＡＴＰγＳ）を使用して、二本鎖ポリヌクレオチドに連結され得る。使用することができるリガーゼの例には、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡリガーゼ、９°Ｎ  ＤＮＡリガーゼが含まれる。アダプターは、トポイソメラーゼを使用して結合することができる。トポイソメラーゼは、例えば、部分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および５．９９．１．３のうちのいずれかのメンバーであり得る。
【０１０２】
アダプター
アダプターは、典型的には、３’部分または領域、および５’部分または領域を含み得る。アダプターの３’部分は、二本鎖ポリヌクレオチドにおける一本鎖ポリヌクレオチドの露出したストレッチにハイブリダイズする一本鎖ポリヌクレオチドの３’ストレッチを含む。
【０１０３】
アダプター中の一本鎖ポリヌクレオチドの３’ストレッチは、約１、２、または３〜約１５ヌクレオチドの長さ、例えば約４、５、６、または７〜約１２、１０、または８ヌクレオチドの長さであり得る。
【０１０４】
一実施形態において、アダプター中の一本鎖ポリヌクレオチドの３’ストレッチは、二本鎖ポリヌクレオチド中の一本鎖ポリヌクレオチドの露出したストレッチ中の任意のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるユニバーサルヌクレオチドを含む。
【０１０５】
一実施形態において、アダプター中の一本鎖ポリヌクレオチドの３’ストレッチは、標的切断部位において一本鎖オーバーハングで露出されるポリヌクレオチド配列に対して相補的な、少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％または９５％である配列を含む。例えば、アダプター中の一本鎖ポリヌクレオチドの３’ストレッチは、二本鎖ポリヌクレオチド中の一本鎖ポリヌクレオチドの露出したストレッチ中のポリヌクレオチド配列に対して正確に相補的である配列を含み得る。
【０１０６】
一実施形態において、アダプター中の一本鎖ポリヌクレオチドの３’ストレッチは、アダプターの３’部分の３’末端のヌクレオチドが、一本鎖オーバーハングの５’末端のヌクレオチドにハイブリダイズするように、二本鎖ポリヌクレオチド中の一本鎖ポリヌクレオチドの露出したストレッチにハイブリダイズする。
【０１０７】
アダプター内の一本鎖ポリヌクレオチドの３’ストレッチは、標的ポリヌクレオチド内の一本鎖オーバーハングと同じ長さであり得るか、またはアダプター中の一本鎖ポリヌクレオチドの３’ストレッチは、標的ポリヌクレオチド中のオーバーハングの長さよりも短くあり得る。
【０１０８】
アダプターの５’部分は、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。５’部分は、二本鎖でも一本鎖でもよい。典型的には、５’部分は、一本鎖であるか、または一本鎖領域を含む。アダプターの５’部分の一本鎖領域は、例えば、シークエンシング、または他のアダプター、またはプライマーなどのアダプターをさらなるポリペプチドに結合するために使用され得る。
【０１０９】
５’部分は、約３〜約４５ヌクレオチド、例えば、約６、８、１０、または１５〜約３０、２５、または２０ヌクレオチドの長さを有し得る。５部分のすべてであり得る５’部分の一本鎖領域は、典型的には、少なくとも約３、６、８、１０、または１５ヌクレオチドの長さである。
【０１１０】
アダプターは、典型的には、約１５〜約４０または約２０〜約３０ヌクレオチドなどの約１０〜約５０または約６０ヌクレオチドの長さを有する。
【０１１１】
一実施形態において、アダプターは、一本鎖ポリヌクレオチドであるか、またはそれを含む。一本鎖ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドが切断部位においてポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質によって切断されたときに、例えば、５’オーバーハングの標的ポリヌクレオチドの標的切断部位において露出されている配列に、ハイブリダイズする、例えば相補的であるように設計された３’部分を有し得る。アダプターは、一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリー中に存在し得る。ライブラリーは、１つ以上の標的ポリヌクレオチドにおける複数の異なる切断部位にハイブリダイズするように設計された一本鎖ポリヌクレオチドを含み得る。この実施形態において、一本鎖ポリヌクレオチドは、バーコードと称され得る。ライブラリー内の各一本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖がハイブリダイズして、５’または中央二本鎖部分を含むアダプターを生成し得る共通の配列を有し得る。ライブラリー内の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、５’オーバーハングの標的ポリヌクレオチドの標的化された切断部位において露出されている配列に正確に相補的である配列を有する場合、標的ポリヌクレオチドが切断部位においてポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質によって切断されたときに、一本鎖ポリヌクレオチドは、特定のバーコードであるとみなされ得る。ライブラリー内の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、５’オーバーハングの標的ポリヌクレオチドの標的化された切断部位において露出されている配列に部分的にのみ相補的である配列を有する場合、標的ポリヌクレオチドが切断部位においてポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質によって切断されたときに、一本鎖ポリヌクレオチドは、一般的なバーコードであるとみなされ得る。
【０１１２】
一実施形態において、アダプターは、二本鎖ポリヌクレオチドを含み、二本鎖は、中央領域でハイブリダイズし、二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖は、第１の一本鎖オーバーハングを含む３’部分を含む。第１の一本鎖オーバーハングは、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が標的ポリヌクレオチドを切断するときに生成されるオーバーハングの配列に相補的である第１の配列を含み得るか、または第１の一本鎖オーバーハングは、例えば、ｄＡ尾部にハイブリダイズし得るｄＴ尾部を含み得る。
【０１１３】
アダプターは、第１の一本鎖オーバーハングに対して中央領域の反対側に配列を有する第２の一本鎖オーバーハングを含み得、第２の配列は、第１の配列とは異なる。第２の一本鎖オーバーハングは、第１の一本鎖オーバーハングと同じ鎖にあってもよく、または第１の一本鎖オーバーハングと反対の鎖にあってもよい。第２の一本鎖オーバーハングは、１、２、３、または４〜３０、例えば、５〜２５、６〜２０、７〜１５、８〜１２、または９〜１０ヌクレオチドの長さを有し得る。第２の一本鎖オーバーハングは、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングであり得る。一実施形態において、本方法は、さらなるアダプターを第２の一本鎖オーバーハング配列にハイブリダイズさせることによって、標的ポリヌクレオチドの切断末端に結合したアダプターにさらなるアダプターを結合することをさらに含む。
【０１１４】
アダプターは、典型的には、ポリヌクレオチドであり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ（塩基性ＤＮＡなど）、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、および／またはＰＥＧを含み得る。アダプターは、好ましくは、一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む。
【０１１５】
アダプターは、アダプターの５’部分をさらなるアダプターに結合するための化学基（例えば、クリック化学）および／またはアダプターの３’部分を二本鎖ポリヌクレオチドに結合するための化学基（例えば、クリック化学）をさらに含み得る。
【０１１６】
アダプターは、３’部分および／または５’部分に反応基をさらに含み得る。３’部分の反応基は、アダプターを二本鎖ポリヌクレオチドに共有結合させるために使用され得、および／または５’部分の反応基は、アダプターをさらなるアダプターに共有結合させるために使用され得る。
【０１１７】
反応基は、クリック化学を使用して、断片をオーバーハングに連結するために使用され得る。クリック化学は、２００１年にＫｏｌｂらによって最初に導入された用語であり、小規模利用および大規模利用の両方において確実に作用する、強力であり、選択的なモジュラービルディングブロックを記載している（Ｋｏｌｂ  ＨＣ，Ｆｉｎｎ，ＭＧ，Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ  ＫＢ，Ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｄｉｖｅｒｓｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｆｅｗ  ｇｏｏｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０（２００１）２００４−２０２１）。彼らは、以下のとおりにクリック化学の厳しい基準のセットを定義している：「反応は、モジュラーであって、範囲が広く、非常に高い収率が得られ、非クロマトグラフィー法で除去することができる無害な副産物だけを生成し、立体特異的でなければならない（しかし、必ずしもエナンチオ選択的である必要はない）。要求されるプロセス特徴には、単純な反応条件（理想的には、プロセスは酸素および水に対して無反応性でなければならない）、容易に入手可能な出発物質および試薬、溶媒の不使用、または良溶媒（水など）であり、または容易に除去される溶媒の使用、および簡単な生成物分離が含まれる。必要であれば、精製は、結晶化または蒸留などの非クロマトグラフィー法によるものでなければならず、生成物は、生理学的条件下で安定でなければならない」。
【０１１８】
クリック化学の好適な例には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
（ａ）アジドが、例えばシクロオクタン環に、歪みを受けているアルキンと反応する、１，３双極性環化付加反応の銅不含バリアント、
（ｂ）一方のリンカー上の酸素求核試薬と、他方のエポキシドまたはアジリジン反応性部分との反応、および
（ｃ）アルキン部分をアリールホスフィンで置換して、アジドとの特異的反応をもたらして、アミド結合を付与することができる、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結。
【０１１９】
本発明では、任意の反応基を使用してもよい。反応基は、クリック化学に適したものであり得る。反応基は、ＷＯ２０１０／０８６６０２、特にその出願の表４に開示されているもののうちのいずれであってもよい。
【０１２０】
一実施形態において、切断部位に結合されたアダプターは、シークエンシングアダプターであり得る。アダプターは、標的ポリヌクレオチドの切断末端に連結され得る。アダプターは、ＡＴＰの不在下で、またはＡＴＰの代わりにガンマ−Ｓ−ＡＴＰ（ＡＴＰγＳ）を使用して、標的ポリヌクレオチドに連結され得る。アダプターが、核酸処理酵素が結合しているシークエンシングアダプターであるＡＴＰの不在下でポリヌクレオチドに連結されることが好ましい。
【０１２１】
この方法が、同じ標的ポリヌクレオチドまたは異なる標的ポリヌクレオチドにあり得る２つ以上の部位において切断することを含み、一本鎖オーバーハングを生成する場合、切断末端で生成されたオーバーハングは、異なるヌクレオチド配列を有し得る。この実施形態において、方法は、サンプルを複数のアダプターと接触させることを含むことができ、異なるアダプターは、典型的にはオーバーハング配列である異なる一本鎖ポリヌクレオチド配列を含む。異なるアダプターの異なる配列は、異なる標的ポリヌクレオチドまたは同じ標的ポリヌクレオチドの異なる部位においてポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の作用によって生成される異なるオーバーハング配列にハイブリダイズするように設計される。
【０１２２】
複数のアダプターを利用する方法において、各アダプターは、異なる第１の配列を含み、アダプターのすべては、同じ第２の配列を含み得る。この実施形態において、第２の配列を使用して、アダプターが同じ方法で結合されている標的ポリヌクレオチドのすべてをさらに処理することができる。例えば、第１のアダプター上の５’オーバーハング中の第２の配列にハイブリダイズすることができる一本鎖ポリヌクレオチドを含むさらなるアダプターは、サンプル中の標的ポリヌクレオチドのすべてに結合され得る。さらなるアダプターは、典型的には、第１の第２の配列に相補的である配列を有する一本鎖オーバーハングを含む。第１のアダプターの第２の配列は、さらなるアダプターのオーバーハングの相補配列にハイブリダイズすることができる。
【０１２３】
第１のアダプターが一本鎖ポリヌクレオチドアダプターである場合、さらなるアダプターは、第１のアダプターが切断末端に結合するときにオーバーハングを形成する一本鎖アダプターのすべてまたは一部にハイブリダイズし得る。
【０１２４】
好ましくは、第１のアダプターの第２の配列は、さらなるアダプターのオーバーハング配列に正確に相補的である。２つのオーバーハング配列間に１つ以上の塩基対のミスマッチがあり得る可能性がある。例えば、２つまたは３つの塩基対のミスマッチなど、１〜４つの塩基対のミスマッチがあり得る。しかしながら、典型的には、２つのオーバーハング配列の間に少なくとも４、例えば、５〜２０、６〜１５、または８〜１０のマッチした塩基がある。
【０１２５】
さらなるアダプターの５’オーバーハングへの結合を望む場合、相補的な一本鎖領域は、好ましくは、二本鎖のさらなるアダプター上の５’オーバーハングである。例えば、切断末端に結合されるときに露出したアダプターのオーバーハングが、上部の鎖上の５’オーバーハングである場合、さらなるアダプターのオーバーハングは、下部の鎖上の５’オーバーハングであるか、または逆も同様である。代替的に、さらなるアダプターの３’オーバーハングへの結合を望む場合、相補的な一本鎖領域は、典型的には、二本鎖アダプター上の３’オーバーハングである。例えば、切断末端に結合されるときに露出したアダプターのオーバーハングが、下部の鎖上の３’オーバーハングである場合、アダプターのオーバーハングは、上部の鎖上の３’オーバーハングであるか、または逆も同様である。
【０１２６】
さらなるアダプターのオーバーハングの長さは、典型的には、第１のアダプターが切断末端に結合されるときに露出された第１のアダプターのオーバーハングの長さと同じである。オーバーハングのうちの１つが他のオーバーハングよりも短くなり得ることが可能である。典型的には、オーバーハングは、４〜３０、例えば、５〜２５、６〜２０、７〜１５、８〜１２、または９〜１０ヌクレオチドの領域にわたってハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーション後、一続きの一本鎖ヌクレオチドが存在する場合、例えば、ポリメラーゼを使用してギャップを埋めることができる。好ましくは、２つの相補的なオーバーハングの長さは、同一である。
【０１２７】
ユニバーサルオーバーハングに結合されているさらなるアダプターは、例えば、シークエンシングアダプターであり得る。シークエンシングアダプターは、膜貫通孔を利用する配列決定方法のために設計され得る。
【０１２８】
標的ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド内の単一の切断部位内から配列決定され得る。全標的ポリヌクレオチドは、配列決定され得る。代替的に、標的ポリヌクレオチド内の関心対象の領域のみが、配列決定され得る。
【０１２９】
アダプターまたはさらなるアダプターは、膜貫通孔を使用して標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのアダプターであり得る。膜貫通孔を使用して標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのアダプターは、好ましくは、リーダー配列、ポリヌクレオチド結合タンパク質、および／または膜もしくは細孔アンカーを含む。
【０１３０】
第１のアダプターおよび／またはさらなるアダプターは、核酸処理酵素が結合する一本鎖ポリヌクレオチドを含み得る。
【０１３１】
アダプターまたはさらなるアダプターは、ビーズに結合するためのタグを含み得る。
【０１３２】
アダプターは、好ましくは、合成または人工のものである。アダプターは、好ましくは、ポリマーを含む。ポリマーは、好ましくは、ポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドアダプターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ（塩基性ＤＮＡなど）、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡおよび／またはＰＥＧを含み得る。アダプターは、より好ましくは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【０１３３】
第１のアダプターまたはさらなるアダプターは、シークエンシングアダプターであり得る。シークエンシングアダプターは、Ｙアダプターであり得る。Ｙアダプターは、典型的には、ポリヌクレオチドアダプターである。Ｙアダプターは、典型的には、二本鎖であり、（ａ）２つの鎖が一緒にハイブリダイズする領域と、（ｂ）２つの鎖が相補的でない末端領域と、を含む。鎖の非相補的な部分がオーバーハングを形成する。Ｙアダプター中の非相補領域の存在は、二本鎖部分とは異なり２本の鎖が典型的には互いにハイブリダイズしないため、アダプターにＹ形状を与える。二本鎖部分は、好ましくは、５〜約５０、例えば、６〜約３０、７〜約２０、８〜１５、または９〜約１２ヌクレオチド塩基対の長さを有する。オーバーハング領域は、好ましくは、５〜約５０、例えば、６〜約３０、７〜約２０、８〜１５、または９〜約１２ヌクレオチドの長さを有する。
【０１３４】
非相補鎖Ｙアダプターのうちの１つは、典型的には、リーダー配列を含み、これは膜貫通孔と接触させられると、孔に通すことができる。リーダー配列は、通常は、ポリマーを含む。ポリマーは、好ましくは、負に荷電されている。ポリマーは、好ましくは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチド、（無塩基ＤＮＡなどの）修飾ポリヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリペプチドである。リーダーは、好ましくは、ポリヌクレオチドを含み、より好ましくは、一本鎖ポリヌクレオチドを含む。一本鎖リーダー配列は、最も好ましくは、ポリｄＴ切片などのＤＮＡの一本鎖を含む。リーダー配列は、好ましくは、１つ以上のスペーサーを含む。
【０１３５】
リーダー配列は、任意の長さであり得るが、典型的には、１０〜１５０ヌクレオチドの長さ、例えば、２０〜１２０、３０〜１００、４０〜８０、または５０〜７０ヌクレオチドの長さである。
【０１３６】
核酸処理酵素は、好ましくは、リーダー配列を含むオーバーハングであるオーバーハングおよび／または二本鎖領域に結合され得る。酵素は、好ましくは、典型的にはスペーサーによって、またはスペーサーで停止される。ＷＯ２０１４／１３５８３８に開示されている酵素およびスペーサーの任意の構成を使用することができる。好ましいスペーサーは、２〜２０、例えば、４、６、８、または１２のｉＳｐＣ３基、ｉＳｐ１８基またはｉＳｐ９基、より好ましくは、４、１２、または２０のｉＳｐＣ３基、６のｉＳｐＣ９基または２もしくは６のｉＳｐＣ１８基を含む。非相補鎖Ｙアダプターのうちの１つは、典型的には、リーダー配列を含み、これは膜貫通孔と接触させられると、孔に通すことができる。
【０１３７】
一実施形態において、Ｙアダプターは、膜アンカーまたは細孔アンカーを含む。アンカーは、酵素が結合していないオーバーハングに相補的であり、したがってそれとハイブリダイズするポリヌクレオチドに結合することができる。アンカーが結合するポリヌクレオチドは、好ましくは、５〜約５０、例えば６〜約３０、７〜約２０、８〜１５、または９〜約１２ヌクレオチドの長さである。
【０１３８】
Ｙアダプターは、典型的には、ハイブリダイズした領域の反対側の端に、アダプターにそのＹ形状を与えるオーバーハングに対するさらなる一本鎖オーバーハングを含む。第１のアダプターがＹアダプターである場合、Ｙアダプターは、標的ポリヌクレオチドの切断末端のオーバーハングに相補的であり、２つの鎖が相補的ではない末端領域へのＹアダプターの反対側の端にある、一本鎖領域を含む。さらなるアダプターがＹアダプターである場合、Ｙアダプターは、標的ポリヌクレオチドの切断末端に結合された第１のアダプターの末端のオーバーハングに相補的であり、２つの鎖が相補的ではない末端領域へのＹアダプターの反対側の端にある、一本鎖領オーバーハングを含む。
【０１３９】
一実施形態において、アダプターが標的ポリヌクレオチドの各末端の切断部位に結合している場合、アダプターのうちの１つは、ヘアピンループアダプターであり得るか、または２つの末端のうちの１つでアダプターに付加されたさらなるアダプターは、ヘアピンループアダプターであり得る。ヘアピンループアダプターは、単一のポリヌクレオチド鎖を含むアダプターであり、ポリヌクレオチド鎖の末端は、互いにハイブリダイズすることができるか、または互いにハイブリダイズし、ポリヌクレオチドの中央部分はループを形成する。好適なヘアピンループアダプターは、当該技術分野で既知の方法を使用して設計することができる。ループは、任意の長さであり得る。ループは、好ましくは、約２〜４００、５〜３００、１０〜２００、２０〜１００ヌクレオチド、または３０〜５０ヌクレオチドの長さである。ポリヌクレオチド鎖の２つのハイブリダイズしたセクションによって形成されるアダプターの二本鎖セクションは、ステムと呼ばれる。ヘアピンループのステムは、好ましくは４〜２００、例えば、５〜１５０、１０〜１００、２０〜９０、３０〜８０、４０〜７０、または５０〜６０ヌクレオチド対の長さである。核酸処理酵素がヘアピンアダプターに結合しているか、または結合する場合、それは、典型的には、ステムではなくヘアピンのループに結合する。
【０１４０】
一実施形態において、Ｙアダプターを標的ポリヌクレオチドの一端に、ヘアピンループアダプターを他端に付加することができる。
【０１４１】
一実施形態において、Ｙアダプターおよび／またはヘアピンアダプターなどのシークエンシングアダプターは、膜アンカーまたは細孔アンカーをさらに含む。好適なアンカーは、例えば、ＷＯ２０１２／１６４２７０およびＷＯ２０１５／１５０７８６に記載されているように、当該技術分野で既知である。好ましくは、アンカーは、膜アンカーである。好ましくは、膜アンカーは、コレステロールまたは脂肪アシル鎖を含む。例えば、ヘキサデカン酸などの６〜３０個の炭素原子の長さを有する任意の脂肪アシル鎖を使用することができる。
【０１４２】
一実施形態において、アダプターまたはさらなるアダプターは、バーコード配列を含む。ポリヌクレオチドバーコードは、当該技術分野で周知である（Ｋｏｚａｒｅｗａ，ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７３３：２７９−２９８）。
【０１４３】
一実施形態において、アダプターまたはさらなるアダプターは、ＰＣＲプライマーまたは等温増幅用のプライマーなどの増幅プライマーに相補的な配列を含み得る。この方法は、適合したポリヌクレオチドの関心対象の領域に隣接するアダプター内の配列にハイブリダイズする一対のＰＣＲ配列を使用して、標的ポリヌクレオチドの関心対象の領域を増幅することをさらに含み得る。この方法は、標的ポリヌクレオチドに結合したアダプター内の配列にハイブリダイズする１つ以上のプライマーを使用して、標的ポリヌクレオチドの関心対象の領域を増幅することをさらに含み得る。
【０１４４】
一実施形態において、切断された標的ポリヌクレオチドは、アダプター結合の前に増幅され得る。この実施形態において、ＰＣＲアダプターなどの増幅アダプターは、切断されたポリヌクレオチドのｄＡ尾部末端に付加される。次いで、ＰＣＲなどの増幅反応は、シークエンシングアダプターを付加する前に実行される。
【０１４５】
ＰＣＲアダプターなどの増幅アダプターは、リン酸化または脱リン酸化され得る。いくつかの実施形態において、増幅アダプターの脱リン酸化が好ましい。増幅は、例えば、少なくとも約５％まで、少なくとも約１０％以上まで、標的読み取りの数を増加させる。
【０１４６】
一実施形態において、エフェクタータンパク質（複数可）は、増幅アダプター（例えば、ＰＣＲアダプター）は、標的ポリヌクレオチドの両方の末端に連結されるように、標的ポリヌクレオチドの一方の末端の切断部位を標的とし、次いで、標的ＤＮＡに連結された増幅アダプター（例えば、ＰＣＲアダプター）のオーバーハングに結合するプライマー（例えば、ＰＣＲ）を使用して増幅される。オーバーハングは、典型的には、プライマーに相補的な５’オーバーハングである。
【０１４７】
したがって、一実施形態において、増幅プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）は、典型的には、二本鎖部分および一本鎖部分を含む。一本鎖部分は、典型的には、５’オーバーハングである。一本鎖部分は、例えば、約１０〜約１００、例えば約３０〜約８０、または約４０〜約６０、例えば約５０ヌクレオチドの長さを有し得る。一本鎖領域のすべてまたは一部は、ＰＣＲプライマーなどの増幅用プライマーに相補的である。二本鎖部分は、平滑末端を有し得る。平滑末端は、平滑末端切断部位に連結され得る。代替的に、二本鎖領域は、増幅アダプターの中央にあってもよく、増幅アダプターは、第２の一本鎖領域を含んでもよく、第２の一本鎖領域は、３’オーバーハングである。３’オーバーハングは、上記のアダプターの一本鎖ポリヌクレオチドの３’ストレッチと同じ特徴を有し得る一本鎖ポリヌクレオチドの３’ストレッチである。
【０１４８】
一実施形態において、第１のアダプターまたはさらなるアダプターは、例えば、ビオチン化された第１のアダプターもしくはビオチン化されたさらなるアダプター、または別の親和性分子に結合している第１のアダプターもしくはさらなるアダプター、あるいは捕捉鎖に結合することができるポリヌクレオチド配列を使用することによって、標的ポリヌクレオチドの捕捉を可能にし得る。シグナルは、標的ポリヌクレオチドの容易な検出および／または同定を可能にするために、第１のアダプターまたはさらなるアダプターに結合され得る。シグナルは、例えば、分子ビーコンまたはフルオロフォアであり得る。一実施形態において、第１のアダプターは、消光剤を含み得、さらなるアダプターは、フルオロフォアを含み得、または逆も同様である。
【０１４９】
一実施形態において、アダプターは、バーコード配列を含み得る。バーコード配列は、当該技術分野で既知である。バーコードは、特定の既知の方法で細孔を通る電流に影響を与える異なるシグナルを生成するポリヌクレオチドの特定の配列である。この方法は、複数のサンプルを分析するための多重法であってもよく、それぞれが異なるバーコードを有する複数のアダプターが利用される。例えば、一実施形態において、複数、例えば２〜約１００以上、例えば、約５、約１０、約２０、または約５０のサンプルが分析され、各サンプルは、本明細書に開示された方法により処理され、固有のバーコードを含むアダプターが、試験される各サンプルに使用される。サンプルを使用する方法の産物は、バーコードアダプターの連結後にプールされ得る。
【０１５０】
バーコードは、中間アダプター、例えば、増幅アダプターおよび／またはシークエンシングアダプターに含まれ得る。バーコードがシークエンシングアダプターにある実施形態において、異なるサンプルに対して実施される方法の産物は、シークエンシングアダプターの結合の前または後にプールされ得る。
【０１５１】
シークエンシングアダプターの付加
一実施形態において、方法は、シークエンシングアダプターを、切断部位に結合されているアダプターの５’部分に結合することをさらに含む。したがって、アダプターは、第１のアダプターまたは中間アダプターとしての役割を果たし得る。
【０１５２】
シークエンシングアダプターは、第１のアダプターの５’部分における一本鎖ポリヌクレオチドのストレッチにハイブリダイズする一本鎖部分を含み得る。シークエンシングアダプターは、一本鎖リーダー配列、ポリヌクレオチド結合タンパク質、および／または膜もしくは細孔アンカーを含み得る。シークエンシングアダプターは、上記のアダプターの特性のうちのいずれかを有し得る。
【０１５３】
ハイブリダイゼーション後、シークエンシングアダプターは、リガーゼを使用して、またはクリック化学によってアダプターに共有結合し得る。リガーゼは、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡリガーゼ、および９°Ｎ  ＤＮＡリガーゼであってよい。アダプターは、トポイソメラーゼを使用して結合することができる。トポイソメラーゼは、例えば、部分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および５．９９．１．３のうちのいずれかのメンバーであり得る。シークエンシングアダプターは、ＡＴＰの不在下で、またはＡＴＰの代わりにガンマ−Ｓ−ＡＴＰ（ＡＴＰγＳ）を使用して、ポリヌクレオチドに連結され得る。核酸処理酵素がシークエンシングアダプターに結合しているＡＴＰの不在下で、アダプターをポリヌクレオチドに連結することが好ましい。
【０１５４】
シークエンシングアダプターは、アダプターが標的ポリヌクレオチドに結合した後に、アダプターに結合させることができる。したがって、この方法は、第１のアダプターを標的ポリヌクレオチドの切断部位に結合させるステップと、シークエンシングアダプターを第１のアダプターに結合させるステップと、を含み得る。したがって、シークエンシングアダプターをサンプルに添加する前に、第１の（中間）アダプターは、サンプルに添加することができる。
【０１５５】
シークエンシングアダプターは、第１のアダプターが標的ポリヌクレオチドに結合する前に、第１のアダプターに結合させることができる。また、この方法は、単一のステップにおいて、第１のアダプターを標的ポリヌクレオチドに結合させることと、シークエンシングアダプターを第１のアダプターに結合させることと、を含み得る。したがって、シークエンシングアダプターおよび第１の（中間）アダプターは、同時にサンプルに添加することができる。
【０１５６】
シークエンシングアダプターは、一実施形態において、増幅アダプターが結合している標的ポリヌクレオチドの増幅後に、標的ポリヌクレオチドに添加され得る。
【０１５７】
核酸処理酵素
アダプターの核酸処理酵素は、ポリヌクレオチドに結合し、ポリヌクレオチドを処理することができる任意のタンパク質であってよい。ポリヌクレオチドの処理において、核酸処理酵素はポリヌクレオチドに沿って移動する。酵素の移動の方向は一貫している。一貫した動きとは、酵素がポリヌクレオチドの５’末端から３’末端に、またはその逆に移動することを意味する。酵素は、ポリヌクレオチドを処理するときにポリヌクレオチドを修飾することができる。ポリヌクレオチドの修飾が起こることは必須ではない。したがって、核酸処理酵素は、ポリヌクレオチドに沿って移動するその能力を保持する修飾された酵素であり得る。
【０１５８】
核酸処理酵素は、例えば、トランスロカーゼ、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、またはエキソヌクレアーゼであってよい。
【０１５９】
核酸処理酵素は、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡなどの一本鎖ポリヌクレオチドに沿って移動してもよく、または二本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドなどの二本鎖ポリヌクレオチドに沿って移動してもよい。例えば、一本鎖または二本鎖ＤＮＡのいずれかに作用するヘリカーゼまたはトランスロカーゼを使用することができる。好適なヘリカーゼの例には、Ｄｄａ、Ｈｅｌ３０８、ＮＳ３、およびＴｒａＩが含まれる。これらのヘリカーゼは、典型的には、一本鎖ＤＮＡに作用する。二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に沿って移動することができるヘリカーゼの例には、ＦｔｆＫ、およびＲｅｃＢＣＤなどの六量体酵素複合体が含まれる。
【０１６０】
ヘリカーゼは、ＷＯ２０１３／０５７４９５、ＷＯ２０１３／０９８５６２、ＷＯ２０１３／０９８５６１、ＷＯ２０１４／０１３２６０、ＷＯ２０１４／０１３２５９、ＷＯ２０１４／０１３２６２、およびＷＯ／２０１５／０５５９８１に開示されているヘリカーゼ、修飾ヘリカーゼ、またはヘリカーゼ構築物のいずれであってもよい。Ｄｄａヘリカーゼは、好ましくは、ＷＯ／２０１５／０５５９８１、およびＷＯ２０１６／０５５７７７に開示されている修飾のうちのいずれかを含む。
【０１６１】
核酸処理酵素は、ポリメラーゼであってもよい。ポリメラーゼは通常、ポリヌクレオチドに沿って移動するときに相補的なポリヌクレオチド鎖を合成する。そうでなければ、ポリメラーゼはトランスロカーゼと同様の方法で使用されてもよい。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドに沿って移動する能力を保持するが、相補鎖を合成しない修飾されたポリメラーゼであってもよい。ポリメラーゼは、例えば、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）、ＳＤポリメラーゼ（Ｂｉｏｒｏｎ（登録商標）から市販されている）、またはそれらのバリアントであり得る。酵素は、好ましくは、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼまたはそのバリアントである。トポイソメラーゼは、好ましくは、部分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および５．９９．１．３のいずれかのメンバーである。
【０１６２】
核酸処理酵素は、エキソヌクレアーゼであってもよい。エキソヌクレアーゼは通常、ポリヌクレオチドに沿って移動するときに、ポリヌクレオチドを消化する。エキソヌクレアーゼは、典型的には、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖を切断して、個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドのより短い鎖、例えば、ジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを形成する。エキソヌクレアーゼが使用される場合、最終的に選択されるポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドの未消化の鎖、または一方の鎖が部分的に消化され、他方の鎖が無傷であるポリヌクレオチドである。
【０１６３】
核酸処理酵素は、好ましくは、長いポリヌクレオチド鎖を処理することができるものである。典型的には、核酸処理酵素は、５００ヌクレオチド塩基対〜２億５０００万ヌクレオチド塩基対まで、例えば、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００または１００，０００ヌクレオチド塩基対〜２億、１億、１千万、１００万ヌクレオチド塩基対までのポリヌクレオチド鎖に沿って移動することができる。
【０１６４】
酵素は、修飾されていても、修飾されていなくてもよい。酵素は修飾されて、閉鎖複合体を形成し得る。閉鎖複合体は、酵素がポリヌクレオチドの末端に到達する場合を除き酵素がポリヌクレオチドから脱落しないように酵素がポリヌクレオチドの周りで閉鎖されるようにポリヌクレオチド結合部位が修飾されている酵素である。好適な閉鎖複合体酵素および閉鎖複合体を生成するために酵素を修飾する方法の例は、例えば、ＷＯ２０１４／０１３２６０およびＷＯ２０１５／０５５９８１に開示されている。
【０１６５】
特徴付け方法
ポリヌクレオチドを特徴付ける方法が提供される。上記の方法は、標的ポリヌクレオチドを特徴付けることをさらに含み得る。
【０１６６】
標的ポリヌクレオチドを検出および／または特徴付ける方法は、典型的には、
（ａ）本明細書に記載の方法により得られた修飾ポリヌクレオチドサンプルを、膜貫通孔を含む膜と接触させることと、
（ｂ）膜にわたって電位差を印加することと、
（ｃ）複合体と膜貫通孔との相互作用から生じる効果の存在または不在についてモニタリングして、複合体の存在または不在を判定し、それによりサンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出すること、および／または複合体と膜貫通孔との相互作用をモニタリングして、標的ポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を判定することと、を含む。
【０１６７】
この方法は、各ポリヌクレオチドの２つ、３つ、４つ、または５つ以上の特徴を測定することを含み得る。１つ以上の特徴は、好ましくは、（ｉ）ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される。｛ｉ｝、｛ｉｉ｝、｛ｉｉｉ｝、｛ｉｖ｝、｛ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ｝、｛ｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉ，ｖ｝、｛ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、または｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝などの（ｉ）〜（ｖ）の任意の組み合わせが本発明に従って測定され得る。
【０１６８】
標的ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列決定によって特徴付けられる。
【０１６９】
（ｉ）について、ポリヌクレオチドの長さは、例えば、ポリヌクレオチドと細孔との間の相互作用の数またはポリヌクレオチドと細孔との間の相互作用の持続時間を判定することによって測定され得る。
【０１７０】
（ｉｉ）について、ポリヌクレオチドの同一性は、いくつかの方法で測定され得る。ポリヌクレオチドの同一性は、ポリヌクレオチドの配列の測定と併せて、またはポリヌクレオチドの配列の測定を伴わずに測定され得る。前者は簡単であり、ポリヌクレオチドが配列決定され、それにより同定される。後者は、いくつかの方法で行うことができる。例えば、ポリヌクレオチド中の特定のモチーフの存在が測定され得る（ポリヌクレオチドの残りの配列を測定することなく）。代替的には、本方法における特定の電気的および／または光学的シグナルの測定は、特定の供給源から得られるものとしてポリヌクレオチドを同定することができる。
【０１７１】
（ｉｉｉ）について、ポリヌクレオチドの配列は、前述のように決定することができる。好適な配列決定方法、特に電気的測定を使用するものは、Ｓｔｏｄｄａｒｔ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１２；１０６（１９）：７７０２−７、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２０１０；１３２（５０）：１７９６１−７２、および国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されている。
【０１７２】
（ｉｖ）について、二次構造は、様々な方法で測定され得る。例えば、方法が電気的測定を伴う場合、二次構造は、滞留時間の変化または細孔を通過する電流の変化を使用して測定され得る。これは、一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドの領域を識別することを可能にする。
【０１７３】
（ｖ）について、任意の修飾の存在または不在が測定され得る。この方法は、好ましくは、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つ以上のタンパク質によって、または１つ以上の標識、タグ、もしくはスペーサーによってポリヌクレオチドが修飾されているか否かを決定することを含む。特異的修飾は、細孔との特異的相互作用をもたらすことになり、これは下記の方法を使用して測定することができる。例えば、メチルシオチン（ｍｅｔｈｙｌｃｙｏｔｓｉｎｅ）は、各ヌクレオチドとのその相互作用中に細孔を通過する電流に基づき、シトシンと区別され得る。
【０１７４】
この方法は、細孔が膜中に存在する膜／細孔システムを調査するのに適した任意の装置を用いて実施してもよい。この方法は、膜貫通孔センシングに適した任意の装置を用いて実施してもよい。例えば、装置は、水溶液を含むチャンバと、チャンバを２つの区画に分ける障壁とを備える。障壁は、典型的には、細孔を含有する膜が形成される孔を有する。代替的には、障壁は、細孔が存在する膜を形成する。膜貫通孔は、当該技術分野で既知である。ポリヌクレオチドの配列および他の特性を決定するために電流シグナルを分析する方法と同様に、好適な膜およびデバイスもまた知られている。この方法は、ＷＯ２００８／１０２１２０に記載されている装置を用いて実施してもよい。様々な異なる種類の測定を行ってもよい。これは、電気的測定および光学的測定を含むが、これらに限定されない。蛍光の測定を含む好適な光学的方法は、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１  １６５２−１６５３によって開示されている。考えられる電気的測定としては、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定（Ｉｖａｎｏｖ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１１  Ｊａｎ  １２；１１（１）：２７９−８５）、およびＦＥＴ測定（国際出願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）が挙げられる。光学的測定は、電気的測定と組み合わされ得る（Ｓｏｎｉ  ＧＶ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍ．２０１０  Ｊａｎ；８１（１）：０１４３０１）。測定は、膜貫通電流測定、例えば、細孔を通過するイオン電流の測定であり得る。
【０１７５】
特徴付け方法は、典型的には、ポリヌクレオチドが膜貫通孔に対して移動する際に膜貫通孔を通過する電流を測定することを含む。
【０１７６】
ビーズは、例えばＷＯ２０１６／０５９３７５に開示されているように、細孔への標的ポリヌクレオチドの送達を促進するために使用されてもよい。
【０１７７】
キット
ポリヌクレオチドのサンプル中の標的ポリヌクレオチドを選択的に修飾するためのキットも提供される。一実施形態において、ポリヌクレオチドのサンプル中の標的ポリヌクレオチドを選択的に修飾するためのキットは、デホスホリラーゼと、アダプターと、任意にポリメラーゼ、リガーゼ、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、およびガイドポリヌクレオチドのうちの１つ以上と、を含む。キットは、１つ以上のガイドポリヌクレオチドおよび／または１つ以上のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質をさらに含み得る。キット中のアダプターは、単一のＮまたはポリＮ尾部などのｄＮ尾部を含むことができ、式中、Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧである。
【０１７８】
一実施形態において、キットは、本明細書に記載されるように、１つ以上のガイドポリヌクレオチドおよび／または１つ以上の第１のアダプターと一緒に１つ以上の第１のアダプターを含み得る。キットは、本明細書に定義されるように、１つ以上のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質および／または１つ以上のさらなるアダプターをさらに含み得る。
【０１７９】
一実施形態において、キットは、標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するガイドポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチドを切断して、オーバーハングを含む切断末端を生成することができるポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と、中央二本鎖領域を含む第１のアダプターと、を含み得、一方の末端の第１の一本鎖領域は、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が標的ポリヌクレオチドを切断するときに生成されるオーバーハングの配列に相補的である第１の配列を有する。
【０１８０】
第１のアダプターは、本明細書で定義されているアダプターのうちのいずれであってもよい。第１のアダプターは、任意に、第１の一本鎖オーバーハングへのアダプターの他方の末端に第２の一本鎖オーバーハングをさらに含んでもよく、第２の一本鎖オーバーハングは、第１の配列とは異なる第２の配列を有し、このキットは、第１のアダプターの第２の配列に相補的である配列を有する一本鎖領域を含むさらなるアダプターを含み得る。
【０１８１】
中央二本鎖領域と、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が標的ポリヌクレオチドを切断するときに生成されるオーバーハングの配列に相補的である第１の配列を有する一方の末端に第１の一本鎖領域と、第２の配列が、第１の配列とは異なる、ポリヌクレオチドおよび第２の配列を有する他方の末端に第２の一本鎖領域と、を含む、第１のアダプターと、第１のアダプターにおける第２の配列に相補的である配列を有する一本鎖領域を含むさらなるアダプターと、を含むキットも提供される。
【０１８２】
第１のアダプターは、本明細書で定義されているアダプターのうちのいずれであってもよい。さらなるアダプターは、本明細書で定義されているさらなるアダプターうちのいずれであってもよい。
【０１８３】
上記の上のキットの実施形態のいずれにおいても、キットは、本明細書に記載されているように、１つ以上、例えば、２〜５０、３〜４０、５〜３０、または１０〜２０の第１のアダプターと、本明細書で定義されているように、１つ以上のさらなるアダプター、例えば、２〜５０、３〜４０、５〜３０、または１０〜２０のさらなるアダプターを含み得る。
【０１８４】
好ましくは、キットは、第１のアダプターのパネルを含み、各アダプターは、第１のオーバーハング領域内に異なる配列および第２のオーバーハング領域内に同じ配列を有する。パネルの第１のアダプターが、第２のオーバーハング領域内に同じ配列を有する場合、キットは、好ましくは、１種類のさらなるアダプターを含む。
【０１８５】
システム
一態様では、ポリヌクレオチドのサンプル中の標的ポリヌクレオチドを選択的に適合させるためのシステムが、提供され、このシステムは、
（ａ）ポリヌクレオチドの末端を保護するための手段と、
（ｂ）標的ポリヌクレオチドの配列に結合するガイドポリヌクレオチドと、
（ｃ）ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と、
（ｄ）ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質によって生成（ｃｒｅａｔｅ）された切断ポリヌクレオチド末端と互換性があるアダプターと、を含む。
【０１８６】
一実施形態において、ポリヌクレオチドの末端を保護するための手段は、デホスホリラーゼである。デホスホリラーゼは、ポリヌクレオチドの５’末端を脱リン酸化することによって、サンプル中のポリヌクレオチドの末端を保護する。
【０１８７】
サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出するためのシステムも提供され、このシステムは、ナノ細孔、例えば、膜中に存在するナノ細孔をさらに含む。いくつかの実施形態において、このシステムは、シークエンシングデバイスまたは装置と互換性があるフローセルを含む。
【０１８８】
このシステムでは、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、いくつかの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質、例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３、Ｃｓｎ２、Ｃｓｆ１、Ｃｍｒ５、Ｃｓｍ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｅ１、Ｃ２ｃ２、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、またはＣａｓＹである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖を切断する。他の実施形態において、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖を切断して、平滑末端を生成する。さらに他の実施形態において、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖を切断して、一本鎖オーバーハングを生成する。
【０１８９】
このシステムでは、いくつかの実施形態において、アダプターは、単一のＮまたはポリＮ尾部を含み、式中、Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧである。一実施形態において、アダプターは、単一のＴまたはポリＴ尾部を含む。一実施形態において、アダプターは、中間アダプターであり、システムは、中間アダプターに相補的な部分を含むシークエンシングアダプターをさらに含む。シークエンシングアダプターは、例えば、一本鎖リーダー配列、ポリヌクレオチド結合タンパク質、および／または膜もしくは細孔アンカーであり得る。
【０１９０】
一実施形態において、システムは、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、２つ以上の部位において標的ポリヌクレオチドを切断して、各部位において２つの対向する切断末端を生成するように、標的ポリヌクレオチドの異なる配列に結合する２つ以上のガイドポリヌクレオチドを含む。
【０１９１】
一実施形態において、システムは、アダプター内の配列に相補的な一対のＰＣＲプライマーをさらに含む。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、システムは、ポリメラーゼおよび／またはリガーゼをさらに含む。
【０１９３】
下記の非限定的な実施例は、本発明を説明する。
【０１９４】
実施例１
この実施例は、単一の縮退合成ｃｒＲＮＡプローブをどのように使用して、ナノ細孔シークエンシング用の細菌ゲノムの重複領域を濃縮するかを示す。この濃縮は、標的ＤＮＡと非標的ＤＮＡの物理的な分離によってではなく、標的領域の脱リン酸化およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介した切断によってアダプター連結に対するＤＮＡ末端の保護および脱保護によって、それぞれ発生する。ここでは、酵素ステップ（脱リン酸化、Ｃａｓ９によって媒介した切断、ｄＡテーリング、およびアダプター連結）が、連続して実行される、シンプルなワンポットアプローチについて説明する。
【０１９５】
材料および方法
高分子量ゲノムＤＮＡ（「ｇＤＮＡ」）は、製造業者の指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ  ｔｉｐ−５００を使用して大腸菌（ＳＣＳ１１０株）から抽出することによって精製した。５μｇのｇＤＮＡは、子ウシ腸デホスホリラーゼによる処理を介して脱リン酸化された。２．５μＬのＱｕｉｃｋ  ＣＩＰ（「ＮＥＢ  Ｑｕｉｃｋ  ＣＩＰキット」、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０５０８から）を、合計５０μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｂ７２０４）の５μｇのｇＤＮＡに３７℃で１０分間添加し、続いてデホスホリラーゼを８０℃で２分間熱不活化した。このステップにより、「末端保護されたｇＤＮＡ」を得た。
【０１９６】
野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）は、以下のとおりに調製した。オリゴヌクレオチドＡＲ３６３（５’ＤＮＡ伸長を有する合成ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここでは使用されない）およびＡＲ４００（合成ｃｒＲＮＡ）は、初めに、１μＬのＡＲ３６３（１００μＭ）、１μＬのＡＲ４００（１００μＭ）、および８μＬのヌクレアーゼフリー二重緩衝液（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号１１−０１−０３−０１）で９５℃で５分間インキュベートし、室温に冷却することによってアニーリングして、１０μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体を形成した。次いで、ＲＮＰは、９μＬのｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体（最終濃度６００ｎＭ）を、合計１５０μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中の２００ｎＭのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０３８６Ｍ）で、室温で２０分間インキュベートすることによって形成された。このステップにより、１５０μＬの「Ｃａｓ９  ＲＮＰ」を得た。
【０１９７】
３つの異なる反応が、以下のとおりに、３つの単一のチューブで実施された。
（１）ｄＡテーリングを、Ｔａｑポリメラーゼを使用して実施し、Ｃａｓ９  ＲＮＰおよびＴａｑポリメラーゼを、反応混合物に同時に添加したが、ｄＡテーリング反応は、温度を３７℃（Ｃａｓ９標的の切断が最適に近い温度）から７２℃（Ｃａｓ９を熱不活性化するが、ＴａｑポリメラーゼはｄＡテーリングに最適な温度）に上昇させることによって開始する、標的切断反応。
５００ｎｇの末端保護されたｇＤＮＡは、５μＬ（５００ｎｇ）の脱リン酸化ライブラリー（上記の末端保護されたｇＤＮＡ）、２５μＬのＣａｓ９  ＲＮＰ（上記）、２００μＭのｄＡＴＰ（１．６μＬの１０ｍＭストック）、５，０００単位（１μＬ）のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０２７３）、４．５μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液、４０．５μＬのヌクレアーゼフリー水の合計７７．６μＬでのインキュベーションによって、切断され、ｄＡテーリングされた。この混合物を、Ｃａｓ９を使用して、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで７２℃で５分間インキュベートして、標的部位を切断し、ＰＣＲサーモサイクラーを使用して、Ｃａｓ９およびｄＡ尾部の両方を、アクセス可能なすべての３’末端を変性させ、５００ｎｇの「ＴａｑポリメラーゼによってｄＡテーリングされ、標的が切断されたＤＮＡ」を得た。このステップは、上記の脱リン酸化ステップと同じチューブで行われ、次の連結ステップに持ち越された。
【０１９８】
（２）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ変異体であるＫｌｅｎｏｗ断片を使用して、Ｃａｓ９によって媒介した標的切断と同時にｄＡテーリングを行った、標的切断反応。
５００ｎｇの末端保護されたｇＤＮＡは、５μＬ（５００ｎｇ）の脱リン酸化ライブラリー（上記の末端保護されたｇＤＮＡ）、２５μＬのＣａｓ９  ＲＮＰ（上記）、２００μＭのｄＡＴＰ（１．６μＬの１０ｍＭストック）、４．５μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液、４．５μＬ（２２，５００単位）のＫｌｅｎｏｗ断片（５’−３’エキソ−；ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２１２）、および４０．５μＬのヌクレアーゼフリー水を、合計７９．５μＬのインキュベーションによって切断された。この混合物を、３７℃で３０分間インキュベートして、Ｃａｓ９およびｄＡ尾部のすべてのアクセス可能な３’末端を使用して、標的部位を切断した。その後、Ｃａｓ９およびＫｌｅｎｏｗ断片を、７５℃で２０分間熱変性した。このステップにより、５００ｎｇの「Ｋｌｅｎｏｗ断片によって同時にｄＡテーリングされ、標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０１９９】
（３）Ｃａｓ９  ＲＮＰおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ変異体であるＫｌｅｎｏｗ断片を使用して、切断およびｄＡテーリングを連続して行った、標的切断反応。
５００ｎｇの末端保護されたｇＤＮＡは、５μＬ（５００ｎｇ）の脱リン酸化ライブラリー（上記の末端保護されたｇＤＮＡ）、２５μＬのＣａｓ９  ＲＮＰ（上記）、２００μＭのｄＡＴＰ（１．６μＬの１０ｍＭストック）、４０．５μＬのヌクレアーゼフリー水、および４．５μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液のインキュベーション（３７℃で３０分間）によって切断された。次いで、Ｃａｓ９を、７５℃で２０分間インキュベートし、室温まで冷却することによって熱不活化した。同じチューブに、４．５μＬ（２２，５００単位）のＫｌｅｎｏｗ断片（５’−３’エキソ−；ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２１２）を、合計７９．５μＬ添加した。この混合物を、３７℃で３０分間インキュベートして、アクセス可能なＤＮＡ末端をｄＡテーリングした。続いて、Ｋｌｅｎｏｗ断片を、７５℃で２０分間熱変性した。このステップにより、５００ｎｇの「Ｋｌｅｎｏｗ断片によって連続的にｄＡテーリングされ、標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０２００】
標的の切断およびｄＡテーリングのステップに続いて、シークエンシングアダプターを、各サンプルに連結した。標的が切断され、ｄＡテーリングされたｇＤＮＡを、４０μＬの４倍連結緩衝液（ＯＮＬＳ１３１１７）、２．３５μＬのＡＭＸ  １Ｄ（Ｖｉｖａｓｐｉｎ−５００濃縮器；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓを使用して１．７μＭに濃縮したＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０８から）、１０μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ  Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｓｅキット、ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ２２００から２００万単位／ｍＬ）、および２６．７μＬのヌクレアーゼフリー水の合計容量約１６０μＬを使用したインキュベーションによって同じチューブ内でアダプター連結を行った。この混合物を、室温で１０分間インキュベートして、アダプターが連結したｇＤＮＡを得た。次いで、混合物をＳＰＲＩ精製に供して、連結されていないアダプターおよび他の汚染物質を除去した。０．４容量（約６４μＬ）のＳＰＲＩビーズ（ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を、アダプター連結したＤＮＡに添加し、逆さにして穏やかに混合し、室温で１０分間インキュベートして、アダプター連結ＤＮＡをビーズに結合した。磁気セパレーターを使用して、ビーズをペレット化し、上清を除去し、２５０μＬのＡＢＢ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０８から）で２回洗浄し、各洗浄でビーズを完全に再懸濁し、洗浄後にビーズを再ペレット化した。２回目の洗浄の後、ビーズをもう一度ペレット化し、余分な洗浄緩衝液を除去し、１６μＬのＴｒｉｓ溶出緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、室温でｐＨ７．５）にビーズペレットを室温で１０分間再懸濁することによって、ＤＮＡをビーズから溶出した。ビーズをもう一度ペレット化し、精製されたｇＤＮＡを含む溶出液（上清）を、標的部位に適合させて保持した。２３．３μＬのＲＢＦおよび１１．７μＬのＬＬＢ（どちらもＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＬＳＫ−１０８から）を、１５μＬの溶出液に加えて、「ＭｉｎＩＯＮシークエンシングミックス」を得た。
【０２０１】
標的ＤＮＡのシークエンシングを行うために、入口ポートを介して、８００μＬのフローセル調製ミックス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０８からの４８０μＬのＲＢＦ、５２０μＬのヌクレアーゼフリー水、０．５μＬの１００μＭのコレステロールアダプターテザーＳＫ４３を使用して調製）を導入することによって、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＦＬＯ−ＭＩＮ１０６フローセルを調製した。その後、ＳｐｏｔＯＮポートを開き、さらに２００μＬのフローセル調製ミックスを注入口から灌流した。５０μＬのＭｉｎＩＯＮシークエンシングミックスを、ＳｐｏｔＯＮポートを介してフローセルに添加し、ポートを閉じた。Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｉｎＫＮＯＷ（バージョン１．１０．６）を使用して、６時間のシークエンシングデータを収集し、その後、オフラインでベースコール（Ａｌｂａｃｏｒｅを使用して）して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０参照ゲノムに位置合わせした。
【０２０２】
結果
図１５および下の表１は、Ｔａｑポリメラーゼ条件（条件（１））からの順方向と逆方向の読み取り間のバイアスを調べる。縮重ｃｒＲＮＡプローブによって標的化されたｒｒｓ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０参照で両方の方向に見られる。７つのｒｒｓ遺伝子のうち６つは、読み取り方向に明らかなバイアスを示し、これは参照ゲノム内の遺伝子の方向と相関した。他の２つの条件（条件（２）および（３）、図１５）でも非常に類似したバイアスが観察された。
【０２０３】
図１６は、Ｅ．ｃｏｌｉ参照へのシークエンシング読み取りのアラインメントから生じるパイルアップを示す。上記の実験で使用したｃｒＲＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０株のｒｒｓ遺伝子の７つのコピーすべてに共通のプロトスペーサー配列を標的化する。予想どおりに、７つのｒｒｓ遺伝子（その位置は下の表１に示される）のそれぞれで観察された標的領域の濃縮により、Ｃａｓ９が主に正しい位置で切断し、切断部位が（様々な範囲まで）解放され、ｄＡテーリングされ、アダプターが切断部位に効率的に連結されたことを示す。
【０２０４】
図１６はまた、使用されるアプローチ間の違いも強調する。Ｔａｑポリメラーゼを使用して、切断されたサンプルが７２℃でｄＡテーリングされたときに（条件（１））、最高のオンターゲットスループット（８６９８）を得た。逆に、切断されたサンプルが、３７℃（条件（２））でのＣａｓ９切断と同時にｄＡテーリングされたときに、最小のオンターゲット読み取り数（１０９５）を得た。サンプルが、Ｃａｓ９の熱不活化（条件（３））後にｄＡテーリングされたときに、読み取りの中間数（５１９１）を得た。オンターゲット読み取りの割合は、切断されたサンプルがＴａｑポリメラーゼを使用して７２℃でｄＡテーリングされたときに（条件（１））、８４．１％であり、切断されたサンプルが３７℃でＣａｓ９切断と同時にｄＡテーリングされたときに（条件（２））、７５．９％であり、サンプルがＣａｓ９の熱不活性化後にテーリングされたときに（条件（３））、８６．３％であった。
【表１】
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【０２０５】
結合ヌクレアーゼ欠損Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ｄＣａｓ９が約６０℃以上で５分間酵素をインキュベートすると、標的ＤＮＡから解離することを（ＷＯ２０１８／０６０７４０に記載されるように）すでに確証している。ここで、野生型Ｃａｓ９の熱不活化は、７２℃で５分（Ｔａｑ条件、条件（１）の場合）、または７５℃で２０分（Ｋｌｅｎｏｗエキソ条件、条件（２）の場合）のいずれかであった。条件（１）および（２）のオンターゲットの割合の類似性は、７２℃で５分がｄＡテーリング酵素にアクセス可能なＣａｓ９で生成された二本鎖切断の少なくともＰＡＭ近位側を示すのに十分であることを示す。
【０２０６】
まとめると、データは、（ｉ）Ｃａｓ９によって媒介した切断後のＣａｓ９の熱不活性化がｄＡテーリングポリメラーゼへの切断部位のアクセスを増加させることが必要とされる、（ｉｉ）熱変性すると、切断の短い（ＰＡＭ−近位）側がＣａｓ９によって優先的に解放されるが、ＰＡＭ−遠位側は変性されたＣａｓ９によって結合されたままであり、ｄＡテーリング酵素へのアクセスが大幅に少なくなる、（ｉｉｉ）７２℃で５分間のインキュベーションが、ｄＡテーリング酵素にアクセス可能なＣａｓ９で生成された末端を示すのに十分であることを示唆している。
【０２０７】
実施例２
この実施例は、複数の合成ｃｒＲＮＡプローブを使用して、ヒトゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）サンプルから複数の関心対象の領域（ＲＯＩ）を切り出し、配列決定することができることを示す。ここでは、一連の冗長プローブを使用して、１０のヒト遺伝子標的を切り出し、Ｃａｓ９を使用して、増幅せずに高いカバレッジの深さ（対立遺伝子あたり１００倍超）まで配列決定された。増幅の欠如は、疾患に関連したヌクレオチド拡張反復など、特定の興味深い構造的特徴を保持する。さらに、ｇＤＮＡライブラリーの脱リン酸化は、読み取られるバックグラウンドＤＮＡ鎖の数を減らし、オンターゲットＤＮＡ読み取りのスループットが向上するために必要であることをここで示す。
【０２０８】
材料および方法
高分子量ゲノムＤＮＡ（「ｇＤＮＡ」）は、製造業者の指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ  ｔｉｐ−５００を使用して培養されたヒト細胞（細胞株ＧＭ１２８７８；Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から抽出することによって精製した。合計２５μｇのｇＤＮＡを、子ウシ腸デホスホリラーゼによる処理を介して大量に脱リン酸化した。１２．５μＬのＱｕｉｃｋ  ＣＩＰ（「ＮＥＢ  Ｑｕｉｃｋ  ＣＩＰキット」、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０５０８からの）を、２５μｇのｇＤＮＡに合計２５０μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｂ７２０４）３７℃で１０分間添加し、続いてデホスホリラーゼを８０℃で２分間熱不活化した。このステップにより、「末端保護されたｇＤＮＡ」を得た。
【０２０９】
別に、対照ライブラリーを、５μｇの非脱リン酸化ＧＭ１２８７８を合計５０μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液に添加して調製した。このステップにより、「脱リン酸化されていないｇＤＮＡ」を得た。
【０２１０】
野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）は、以下のとおりに調製した。４１のカスタムＡｌｔ−Ｒ  Ｃａｓ９  ｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって合成された）の等モル混合物を、１μＬの各ｃｒＲＮＡ（１００μＭのＴＥ緩衝液、ｐＨ７．５で再懸濁された）をエッペンドルフＤＮＡ  Ｌｏ−Ｂｉｎｄチューブで混合することによって調製した。オリゴヌクレオチドＡＲ３６３（５’ＤＮＡ伸長を有する合成ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここでは使用されない）および合成ｃｒＲＮＡの４１プローブプールを、１μＬのＡＲ３６３（１００μＭ）、１μＬのｃｒＲＮＡミックス（１００μＭ）および８μＬのヌクレアーゼフリー二本鎖緩衝液（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号１１−０１−０３−０１）を９５℃で５分間インキュベートし、室温まで冷却することによってアニーリングして、１０μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体を形成した。次いで、ＲＮＰは、７．５μＬのｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体（最終濃度６００ｎＭ）を、合計１２５μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中の３００ｎＭのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０３８６Ｍ）で、室温で２０分間インキュベートすることによって形成された。このステップにより、１２５μＬの「Ｃａｓ９  ＲＮＰ」を得た。
【０２１１】
５０μＬ（５μｇ）の末端保護されたｇＤＮＡは、２５μＬのＣａｓ９  ＲＮＰの添加によって切断された。反応物を、３７℃で６０分間インキュベートした後、７５℃で２０分間熱不活性化し、その後、室温まで徐冷した。同じチューブに、１．６μＬの１０ｍＭ  ｄＡＴＰおよび４．５μＬのＫｌｅｎｏｗエキソ−（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２１２）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、７５℃で２０分間熱不活性化することによって、ｇＤＮＡをｄＡテーリングした。この手順は、実施例１に記載されるように条件（３）を複製する。この手順により、ライブラリーＡ（７５μＬ）を得た。
【０２１２】
脱リン酸化の要件の対照として、５０μＬ（５μｇ）の非脱リン酸化ｇＤＮＡを切断し、末端保護されたｇＤＮＡとまったく同じようにｄＡテーリングした。この手順により、ライブラリーＢ（７５μＬ）を得た。
【０２１３】
標的領域内での読み取りのためのＣａｓ９を生成した末端の要件の対照として、２５μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液を、５０μＬ（５μｇ）の末端保護されたｇＤＮＡに添加した。混合物を、３７℃で６０分間インキュベートした後、７５℃で２０分間熱不活性化し、その後、室温まで徐冷した。同じチューブに、１．６μＬの１０ｍＭのｄＡＴＰおよび４．５μＬのＫｌｅｎｏｗエキソ−（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２１２）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、７５℃で２０分間熱不活性化することによって、ｇＤＮＡをｄＡテーリングした。この手順は、実施例１に記載されるように条件（３）を複製する。この手順により、ライブラリーＣ（７５μＬ）を得た。
【０２１４】
ライブラリーＡ、ライブラリーＢ、またはライブラリーＣを別々に、４０μＬの４倍連結緩衝液（ＯＮＬＳ１３１１７）、２．３５μＬのＡＭＸ  １Ｄ（Ｖｉｖａｓｐｉｎ−５００濃縮器；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓを使用して１．７μＭに濃縮したＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０８から）、１０μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ  Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｓｅキット、ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ２２００から２００万単位／ｍＬ）、および２６．７μＬのヌクレアーゼフリー水の合計容量約１５４μＬを使用したインキュベーションによって、ライブラリーＡ、Ｂ、およびＣへのアダプター連結を行った。この混合物を、室温で１０分間インキュベートして、アダプターが連結したｇＤＮＡを得た。次いで、混合物をＳＰＲＩ精製に供して、連結されていないアダプターおよび他の汚染物質を除去した。０．４容量（約６２μＬ）のＳＰＲＩビーズ（ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を、アダプター連結したＤＮＡに添加し、逆さにして穏やかに混合し、室温で１０分間インキュベートして、アダプター連結ＤＮＡをビーズに結合した。磁気セパレーターを使用して、ビーズをペレット化し、上清を除去し、２５０μＬのＡＢＢ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０８から）で２回洗浄し、各洗浄でビーズを完全に再懸濁し、洗浄後にビーズを再ペレット化した。２回目の洗浄の後、ビーズをもう一度ペレット化し、余分な洗浄緩衝液を除去し、１６μＬのＴｒｉｓ溶出緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、室温でｐＨ７．５）にビーズペレットを室温で１０分間再懸濁することによって、ＤＮＡをビーズから溶出した。ビーズをもう一度ペレット化し、精製されたｇＤＮＡを含む溶出液（上清）を、標的部位に適合させて保持した。２３．３μＬのＲＢＦおよび１１．７μＬのＬＬＢ（どちらもＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＬＳＫ−１０８から）を、１５μＬの溶出液に添加して、ライブラリーＡ、Ｂ、およびＣに関連する「ＭｉｎＩＯＮシークエンシングミックス」をそれぞれ得た。
【０２１５】
標的ＤＮＡのシークエンシングを行うために、入口ポートを介して、８００μＬのフローセル調製ミックス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０８からの４８０μＬのＲＢＦ、５２０μＬのヌクレアーゼフリー水、０．５μＬの１００μＭのコレステロールアダプターテザーＳＫ４３を使用して調製）を導入することによって３つのＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＦＬＯ−ＭＩＮ１０６フローセルを調製した。その後、ＳｐｏｔＯＮポートを開き、さらに２００μＬのフローセル調製ミックスを注入口から灌流した。５０μＬのＭｉｎＩＯＮシークエンシングミックスＡ、Ｂ、またはＣを、ＳｐｏｔＯＮポートを介して各フローセルに添加し、これらのポートを閉じた。Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｉｎＫＮＯＷ（バージョン１．１０．６）を使用して、４８時間のシークエンシングデータを収集し、シークエンシング実行中にオンラインでＭｉｎＫＮＯＷを使用してベースコールして、ｂｗａを使用してオフラインでＮＡ１２８７８ヒト参照ゲノムに位置合わせした。
【０２１６】
結果
図１７は、ライブラリーＡにおけるヒトＮＡ１２８７８参照へのシークエンシング読み取りのアラインメントから生じるパイルアップを示す上記の実験で使用したｃｒＲＮＡは、１０個のヒト遺伝子のプロトスペーサー配列を標的化する。予想どおりに、標的領域の濃縮が観察され、Ｃａｓ９が主に正しい位置で切断し、切断部位が（様々な範囲まで）解放され、ｄＡテーリングされ、アダプターが切断部位に効率的に連結されたことを示す。すべての読み取りの約１０％が、１０個の標的領域のうちの１つにマッピングされた。各標的に対する読み取りの項目別リストを、下の表２に示す。
【表２】
2021523704.tif 000004
【０２１７】
下の表３は、サンプルがＣａｓ９の切断を開始する前に脱リン酸化されなかった場合、同じ１０個の遺伝子標的パネルの約３分の１の読み取り数が得られたが、それ以外はライブラリーＡ（ライブラリーＢ）と同じであったことを示す。ライブラリーＡの１０分の１と比較して、３００分の１の読み取りのみが標的領域のうちの１つにマッピングされた（約０．３３％）。したがって、非標的ＤＮＡの脱リン酸化により、非標的読み取りの数が大幅に減少した。
【表３】
2021523704.tif 000005
【０２１８】
下の表４は、ライブラリーが脱リン酸化されたときに、ＦＭＲ１遺伝子に対応する単一の読み取りのみが得られ、Ｃａｓ９（ライブラリーＣ）で切断されなかったことを示す。したがって、Ｃａｓ９による切断は、ライブラリーが脱リン酸化されているときにオフターゲットの読み取りを得るために絶対に必要である。
【表４】
2021523704.tif 000006
【０２１９】
オリゴヌクレオチド
ｔｒａｃｒＲＮＡ
【表５】
2021523704.tif 000007
ｃｒＲＮＡ
全体で使用されているｃｒＲＮＡは、ＩＤＴからカスタム購入されたもの（「Ａｌｔ−Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｃｒＲＮＡ」）であった
【表６−１】
2021523704.tif 000008
【表６−２】
2021523704.tif 000009
ｗｔ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＤＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥ
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ＯＮＬＳ１３１１７
４倍連結緩衝液組成：２０２ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８  −４℃）、２．５ＭのＮａＣｌ、３０％ＰＥＧ−８０００（ｗ／ｖ）、４０ｍＭのＡＴＰ
【０２２０】
実施例３
この実施例は、どのようにして合成ｃｒＲＮＡプローブを使用して、ナノ細孔シークエンシング用の細菌ゲノムの複製領域の関心対象の領域（ＲＯＩ）を切り出し、配列決定することができるかを示す。ここでは、酵素ステップ（脱リン酸化、Ｃｐｆ１によって媒介した切断、バーコーディング、またはｄＡテーリングおよびアダプター連結）が、連続して実行される、シンプルなワンポットアプローチについて説明する。
【０２２１】
材料および方法
高分子量ゲノムＤＮＡ（「ｇＤＮＡ」）は、製造業者の指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ  ｔｉｐ−５００を使用して大腸菌（ＳＣＳ１１０株）から抽出することによって精製した。２μｇのｇＤＮＡは、子ウシ腸デホスホリラーゼによる処理を介して脱リン酸化された。６μＬのＱｕｉｃｋ  ＣＩＰ（「ＮＥＢ  Ｑｕｉｃｋ  ＣＩＰキット」、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０５０８からの）を、２μｇのｇＤＮＡに合計１２０μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｂ７２０４）３７℃で１０分間添加し、続いてデホスホリラーゼを８０℃で２分間熱不活化した。このステップにより、「末端保護されたｇＤＮＡ」を得た。
【０２２２】
オリゴヌクレオチドＡＲ６３０〜ＡＲ６４３（「ガイドＲＮＡ」として知られている）を、一緒にプールし、ヌクレアーゼフリー水を用いて１０μＭに希釈した。複合体形成の前に、ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｂ７２００４）で５００ｎＭの「ガイドＲＮＡ」を、９５℃で４分間インキュベートした後、２１℃に冷却した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体は、５００ｎＭのＬ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｃｐｆ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｍ０６５３）を反応物に２１℃で２０分間添加することによって形成され、５００ｎＭのＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体を生成した。最終濃度１２５ｎＭのＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体を添加して末端保護されたｇＤＮＡを切断し、３７℃で１５分間インキュベートして、「プローブ−標的複合体」として知られている複合体を得た。
【０２２３】
４つの異なる反応が、以下のとおりに、４つの単一チューブで実施された。
Ａ．プローブ−標的複合体を、各切断部位の５’ｎｔオーバーハング配列と一致する特定のバーコードのライブラリーを介してシークエンシングアダプターに連結した。
オリゴヌクレオチドＡＲ５９８、ＡＲ６５６、およびＡＲ６５７は、それぞれ、各々４０μＭで、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ中、９５℃〜２５℃、毎分１℃で、ＮＢ０１にアニールした。ハイブリダイズしたＤＮＡは、一緒にプールされ、「特定のバーコード」として知られていた。ヘリカーゼを有する約３３ｎＭのＢＡＭ  １Ｄ（ＯＮＴ  ＳＱＫ−ＬＳＫ３０８）を、５０μＬのブラントＴ／Ａリガーゼマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｍ０３６７）を使用して１μＭに希釈した０．２μＬの特定のバーコードでプローブ標的複合体に２１℃で２０分間連結した。このステップにより、５００ｎｇの「特定のバーコードを有する標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０２２４】
Ｂ．プローブ−標的複合体を、各切断部位の部分的に一致する５’ｎｔオーバーハング配列を使用した一般的なバーコードのライブラリーを介してシークエンシングアダプターに連結した。
オリゴヌクレオチドＣＰＢＣ３４およびＣＰＢＣ３７は、それぞれ、各々４０μＭで、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ中、９５℃〜２５℃、毎分１℃で、ＮＢ０１にアニールした。ハイブリダイズしたＤＮＡは、一緒にプールされ、「一般的なバーコード」として知られていた。ヘリカーゼを有する約３３ｎＭのＢＡＭ  １Ｄ（ＯＮＴ  ＳＱＫ−ＬＳＫ３０８）を、５０μＬのブラントＴ／Ａリガーゼマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｍ０３６７）の合計１２０μＬを使用して１μＭに希釈した０．２μＬの一般的なバーコードを有するプローブ−標的複合体に２１℃で２０分間連結した。このステップにより、５００ｎｇの「一般的なバーコードを有する標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０２２５】
Ｃ．プローブ−標的複合体は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｋｌｅｎｏｗ断片のエキソヌクレアーゼ変異体を使用してｄＡテーリングした。
５，０００単位（１μＬ）のＫｌｅｎｏｗ断片（３’→５’エキソ−）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｍ０２１２）を、２０μＭのｄＮＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｎ０４４６Ｓ）および１００μＭのｄＡＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｎ０４４６Ｓ）を含むプローブ−標的複合体に添加し、３７℃で１５分間、６５℃で５分間インキュベートした。ヘリカーゼを有する約２５ｎＭのＡＭＸ  １Ｄ（Ｖｉｖａｓｐｉｎ−５００濃縮器；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓを使用して１．７μＭに濃縮されたＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０８から）を、５０μＬのブラントＴ／Ａリガーゼマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｍ０３６７）を使用してプローブ−標的複合体に２１℃で１０分間連結した。このステップにより、５００ｎｇの「Ｋｌｅｎｏｗ断片によってｄＡテーリングされた標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０２２６】
Ｄ．Ｔａｑポリメラーゼを使用して、プローブ−標的複合体をｄＡテーリングした。
５，０００単位（１μＬ）のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｍ０２７３）を、２０μＭのｄＮＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｎ０４４６Ｓ）および１００μＭのｄＡＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｎ０４４６Ｓ）を有するプローブ−標的複合体に添加し、６５℃で５分間インキュベートした。ヘリカーゼを有する約２５ｎＭのＡＭＸ  １Ｄ（Ｖｉｖａｓｐｉｎ−５００濃縮器；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓを使用して１．７μＭに濃縮されたＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０８から）を、５０μＬのブラントＴ／Ａリガーゼマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｍ０３６７）を使用してプローブ−標的複合体に２１℃で１０分間連結した。このステップにより、５００ｎｇの「ＴａｑポリメラーゼによってｄＡテーリングされた標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０２２７】
各混合物を、以下のとおりに、ＳＰＲＩ磁性ビーズを用いた精製ステップに供した：０．４体積当量のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩ磁性ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を混合物に添加し、２１℃で１０分間インキュベートした。磁気ビーズを、磁性分離機を用いてペレット化し、上清を吸引し、ＤＬＢで希釈した２５０μＬのＡＢＢ（ＯＮＴ  ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８）を添加して、ビーズを再懸濁した。ビーズをもう一度直ちにペレット化し、上清を吸引し、その後チューブを、ラックから１６μＬのトリス溶出緩衝液（１０ｍＭのトリス−Ｃｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、室温でｐＨ７．５）室温で１０分間取り出した。ビーズを、磁性分離機を用いてペレット化し、溶出液を保持した。これにより、「ＭｉｎＩＯＮシークエンシングミックスＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ」として知られている、各端にアダプターを有するニ本鎖ＤＮＡをもたらした。
【０２２８】
標的ＤＮＡのシークエンシングを行うために、入口ポートを介して、８００μＬのフローセル調製ミックス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０８からの４８０μＬのＲＢＦ、５２０μＬのヌクレアーゼフリー水、０．５μＬの１００μＭのコレステロールアダプターテザーＳＫ４３を使用して調製）を導入することによって、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＦＬＯ−ＭＩＮ１０６フローセルを調製した。その後、ＳｐｏｔＯＮポートを開き、さらに２００μＬのフローセル調製ミックスを注入口から灌流した。５０μＬのＭｉｎＩＯＮシークエンシングミックスＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤを、ＳｐｏｔＯＮポートを介してフローセルに添加し、これらのポートを閉じた。Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｉｎＫＮＯＷ（バージョン１．１０．６）を使用して、６時間のシークエンシングデータを収集し、その後、オフラインでベースコール（Ａｌｂａｃｏｒｅを使用して）して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０参照ゲノムに位置合わせした。
【０２２９】
結果
図１８は、Ｅ．ｃｏｌｉ参照へのシークエンシング読み取りのアラインメントから生じるパイルアップを示す。予想どおりに、７つのｒｒｓ遺伝子のそれぞれで標的領域の濃縮が観察され（その位置は表５に示されている）、Ｃｐｆ１が主に正しい位置で切断されたことを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０株でｒｒｓ遺伝子の各コピーを切り出すために使用されるｃｒＲＮＡの位置を、表５に示し、これは、プルダウンで使用される単一プローブの７つの予想される結合位置を示す。
【０２３０】
図１９は、上記のＣｐｆ１切断後に４つの異なるアプローチ（Ａ〜Ｄ）から生じるパイルアップを比較する。表６は、各アプローチ（Ａ〜Ｄ）の読み取り数およびオンターゲット読み取りの割合を示す。切断されたサンプルが特定のバーコードを使用してバーコード化されたときに（条件Ａ）、最高のオンターゲットスループット（９０％）を得た。オンターゲットの読み取りの最大数（１１８２０８）は、ＴａｑポリメラーゼでｄＡテーリングを使用して達成された。
【表７】
2021523704.tif 000010
【表８】
2021523704.tif 000011
【０２３１】
実施例４
この実施例は、複数の合成ｃｒＲＮＡプローブを使用して、ヒトゲノムＤＮＡサンプルから複数の関心対象の領域（ＲＯＩ）を切り出し、配列決定することができることを示す。ここでは、一連の冗長プローブを使用して、１０のヒト遺伝子標的を切り出し、Ｃｐｆ１を使用して、増幅せずに高いカバレッジの深さ（対立遺伝子あたり１００倍超）まで配列決定された。増幅の欠如は、疾患に関連したヌクレオチド拡張反復など、特定の興味深い構造的特徴を保持する。
【０２３２】
材料および方法
高分子量ゲノムＤＮＡ（「ｇＤＮＡ」）は、製造業者の指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ  ｔｉｐ−５００を使用して培養されたヒト細胞（細胞株ＧＭ１２８７８；Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から抽出することによって精製した。合計１０μｇのｇＤＮＡを、子ウシ腸デホスホリラーゼによる処理を介して大量に脱リン酸化した。３μＬのＱｕｉｃｋ  ＣＩＰ（「ＮＥＢ  Ｑｕｉｃｋ  ＣＩＰキット」、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｍ０５０８からの）を、１０μｇのｇＤＮＡに合計６０μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｂ７２０４）に３７℃で１０分間添加し、続いてデホスホリラーゼを８０℃で２分間熱不活化した。このステップにより、「末端保護されたｇＤＮＡ」を得た。
【０２３３】
３９のカスタムＡｌｔ−Ｒ  Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって合成された）の等モル混合物を、１μＬの各ｃｒＲＮＡ（１００μＭのＴＥ緩衝液、ｐＨ７．５で再懸濁された）をエッペンドルフＤＮＡ  Ｌｏ−Ｂｉｎｄチューブで混合することによって調製した。次いで、混合物を、ヌクレアーゼフリー水を用いて１０μＭに希釈し、「ガイドＲＮＡ」として知られていた。複合体形成の前に、ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｂ７２００４）で５００ｎＭの「ガイドＲＮＡ」を、９５℃で４分間インキュベートした後、２１℃に冷却した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体は、５００ｎＭのＬ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｃｐｆ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｍ０６５３）を反応物に２１℃で２０分間添加することによって形成され、５００ｎＭのＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体を生成した。１２５ｎＭのＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体を末端保護されたｇＤＮＡに添加し、３７℃で１５分間インキュベートして、「プローブ−標的複合体」として知られている複合体を得た。
【０２３４】
２つの異なる反応が、以下のとおりに、２つの単一のチューブで実施された。
Ａ．プローブ−標的複合体を、特定の５’ｎｔオーバーハング切断配列を使用して、特定のバーコードを介してシークエンシングアダプターに連結した。
オリゴヌクレオチドＡＲ５９８、ＡＲ６５６、およびＡＲ６５７は、それぞれ、各々４０μＭで、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ中、９５℃〜２５℃、毎分１℃で、ＮＢ０１にアニールした。ハイブリダイズしたＤＮＡは、一緒にプールされ、「特定のバーコード」として知られていた。ヘリカーゼを有する約３３ｎＭのＢＡＭ  １Ｄ（ＯＮＴ  ＳＱＫ−ＬＳＫ３０８）を、５０μＬのブラントＴ／Ａリガーゼマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｍ０３６７）を使用して１μＭに希釈した０．２μＬの特定のバーコードでプローブ−標的複合体に２１℃で２０分間連結した。このステップにより、５００ｎｇの「特定のバーコードを有する標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０２３５】
Ｂ．プローブ−標的複合体は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｋｌｅｎｏｗ断片のエキソヌクレアーゼ変異体を使用してｄＡテーリングした。
５，０００単位（１μＬ）のＫｌｅｎｏｗ断片（３’→５’エキソ−）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｍ０２１２）を、２０μＭのｄＮＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｎ０４４６Ｓ）および１００μＭのｄＡＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｎ０４４６Ｓ）を含むプローブ−標的複合体に添加し、３７℃で１５分間、６５℃で５分間インキュベートした。ヘリカーゼを有する約２５ｎＭのＡＭＸ  １Ｄ（Ｖｉｖａｓｐｉｎ−５００濃縮器；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓを使用して１．７μＭに濃縮されたＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０８から）を、５０μＬのブラントＴ／Ａリガーゼマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｍ０３６７）を使用してプローブ−標的複合体に２１℃で１０分間連結した。このステップにより、５００ｎｇの「Ｋｌｅｎｏｗ断片によってｄＡテーリングされた標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０２３６】
次いで、混合物をＳＰＲＩ精製に供して、連結されていないアダプターおよび他の汚染物質を除去した。０．４容量のＳＰＲＩビーズ（ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を、アダプター連結したＤＮＡに添加し、逆さにして穏やかに混合し、室温で１０分間インキュベートして、アダプター連結ＤＮＡをビーズに結合した。磁気セパレーターを使用して、ビーズをペレット化し、上清を除去し、２５０μＬのＡＢＢ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０８から）で２回洗浄し、各洗浄でビーズを完全に再懸濁し、洗浄後にビーズを再ペレット化した。２回目の洗浄の後、ビーズをもう一度ペレット化し、余分な洗浄緩衝液を除去し、１６μＬのＴｒｉｓ溶出緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、室温でｐＨ７．５）にビーズペレットを室温で１０分間再懸濁することによって、ＤＮＡをビーズから溶出した。ビーズをもう一度ペレット化し、精製されたｇＤＮＡを含む溶出液（上清）を、標的部位に適合させて保持した。２３．３μＬのＲＢＦおよび１１．７μＬのＬＬＢ（どちらもＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＬＳＫ−１０８から）を、１５μＬの溶出液に添加して、「ＭｉｎＩＯＮシークエンシングＡとＢの混合」を得た。
【０２３７】
標的ＤＮＡのシークエンシングを行うために、入口ポートを介して、８００μＬのフローセル調製ミックス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０８からの４８０μＬのＲＢＦ、５２０μＬのヌクレアーゼフリー水、０．５μＬの１００μＭのコレステロールアダプターテザーＳＫ４３を使用して調製）を導入することによって４つのＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＦＬＯ−ＭＩＮ１０６フローセルを調製した。その後、ＳｐｏｔＯＮポートを開き、さらに２００μＬのフローセル調製ミックスを注入口から灌流した。５０μＬのＭｉｎＩＯＮシークエンシングミックスＡまたはＢを、ＳｐｏｔＯＮポートを介して各フローセルに添加し、これらのポートを閉じた。Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｉｎＫＮＯＷ（バージョン１．１０．６）を使用して、４８時間のシークエンシングデータを収集し、シークエンシング実行中にオンラインでＭｉｎＫＮＯＷを使用してベースコールして、ｂｗａを使用してオフラインでＮＡ１２８７８ヒト参照ゲノムに位置合わせした。
【０２３８】
結果
図２０は、特定のバーコードアプローチに従ってヒトＮＡ１２８７８参照へのシークエンシング読み取りのアラインメントから生じるパイルアップを示す。上記の実験で使用したｃｒＲＮＡは、１０個のヒト遺伝子のプロトスペーサー配列を標的化する。予想どおりに、標的領域の濃縮が観察され、Ｃｐｆ１が主に正しい位置で切断し、切断部位が（様々な範囲まで）解放され、バーコード化され、アダプターが切断部位に効率的に連結されたことを示す。すべての読み取りの約５％が、１０個の標的領域のうちの１つにマッピングされた。各標的に対する読み取りの項目別リストを、表７に示す。
【０２３９】
図２１は、Ｋｌｅｎｏｗ（エキソ−）アプローチによるｄＡテーリング後に、ヒトＮＡ１２８７８参照へのシークエンシング読み取りのアラインメントから生じるパイルアップを示す。上記の実験で使用したｃｒＲＮＡは、１０個のヒト遺伝子のプロトスペーサー配列を標的化する。予想どおりに、標的領域の濃縮が観察され、Ｃｐｆ１が主に正しい位置で切断し、切断部位が（様々な範囲まで）解放され、ｄＡテーリングされ、アダプターが切断部位に効率的に連結されたことを示す。すべての読み取りの約０．２％が、１０個の標的領域のうちの１つにマッピングされた。各標的に対する読み取りの項目別リストを、表８に示す。
【表９】
2021523704.tif 000012
【表１０】
2021523704.tif 000013
【０２４０】
オリゴヌクレオチド
ｃｒＲＮＡ
全体で使用されているｃｒＲＮＡは、ＩＤＴからカスタム購入されたもの（「Ａｌｔ−Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡ」）であった
【表１１−１】
2021523704.tif 000014
【表１１−２】
2021523704.tif 000015
【０２４１】
バーコード
全体で使用されるバーコードは、ＩＤＴ（「カスタムＤＮＡオリゴ」）から購入した
【表１２−１】
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【表１２−２】
2021523704.tif 000017
【０２４２】
アダプター配列
全体で使用されるバーコードは、ＩＤＴ（「カスタムＤＮＡオリゴ」）から購入した
【表１３】
2021523704.tif 000018
【０２４３】
実施例５
この実施例は、複数の合成ｃｒＲＮＡプローブを使用して、異なるヒトゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）サンプルから複数の関心対象の領域（ＲＯＩ）を切り出し、配列決定することができることを示す。ここでは、一連のプローブおよびバーコードを使用して、１０のヒト遺伝子標的を５つの異なる反応から切り出し、Ｃａｓ９を使用して、増幅せずに高いカバレッジの深さ（対立遺伝子あたり１００倍超）まで配列決定された。
【０２４４】
材料および方法
高分子量ゲノムＤＮＡ（「ｇＤＮＡ」）は、製造業者の指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ  ｔｉｐ−５００を使用して培養されたヒト細胞（細胞株ＧＭ１２８７８；Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から抽出することによって精製した。合計２５μｇのｇＤＮＡを、子ウシ腸デホスホリラーゼによる処理を介して大量に脱リン酸化した。１５μＬの１０倍ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液および１５μＬのＱｕｉｃｋ  ＣＩＰ（「ＮＥＢ  Ｑｕｉｃｋ  ＣＩＰキット」、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０５０８からの）を、２５μｇのｇＤＮＡに合計１５０μＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｂ７２０４）３７℃で１０分間添加し、続いてデホスホリラーゼを８０℃で２分間熱不活化した。このステップにより、「末端保護されたｇＤＮＡ」を得た。
【０２４５】
野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）は、以下のとおりに調製した。４１のカスタムＡｌｔ−Ｒ  Ｃａｓ９  ｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって合成された）の等モル混合物を、１μＬの各ｃｒＲＮＡ（１００μＭのＴＥ緩衝液、ｐＨ７．５で再懸濁された）をエッペンドルフＤＮＡ  Ｌｏ−Ｂｉｎｄチューブで混合することによって調製した。Ａｌｔ−Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｔｒａｃｒＲＮＡ  （Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）および合成ｃｒＲＮＡの４１プローブプールを、１μＬのｔｒａｃｒＲＮＡ（１００μＭ）、１μＬのｃｒＲＮＡミックス（１００μＭ）および８μＬのヌクレアーゼフリー二本鎖緩衝液（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号１１−０１−０３−０１）を９５℃で５分間インキュベートし、室温まで冷却することによってアニーリングして、１０μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体を形成した。次いで、ＲＮＰは、４．８μＬのｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体（最終濃度８００ｎＭ）を、合計６０μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中の４００ｎＭのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０３８６Ｍ）で、室温で２０分間インキュベートすることによって形成された。このステップにより、６０μＬの「Ｃａｓ９  ＲＮＰ」を得た。
【０２４６】
２つの別々のライブラリーＡおよびＢは、以下のとおりに生成された。
Ａ．１５μＬの末端保護されたｇＤＮＡ（２．５μｇ）は、１０μＬのＣａｓ９  ＲＮＰミックスを３０μＬの総量で末端保護されたｇＤＮＡに添加することによって、Ｃａｓ９  ＲＮＰによって切断された。５単位（１μＬ）のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｍ０２７３）および２００μＭのｄＡＴＰも、同じチューブ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｎ０４４６Ｓ）に添加した。反応物を３７℃で１５分間インキュベートし、次いで７２℃で５分間インキュベートした。同じチューブ中で、ライブラリーに、５μＬのＡＭＸシークエンシングアダプター（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０９から）を、１０μＬのＴ４リガーゼ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅから）および２０μＬのＬＮＢ緩衝液（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０９から）を使用して、総量８０μＬで、２１℃で１０分間連結した。このステップにより、２．５μｇの「ＴａｑポリメラーゼによってｄＡテーリングされた標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０２４７】
Ｂ．３０μＬの末端保護されたｇＤＮＡ（合計２５μｇ；チューブあたり５μｇ）の５つの別々のチューブを、末端保護されたｇＤＮＡの各チューブに１０μＬのＣａｓ９  ＲＮＰミックスを添加することによって、Ｃａｓ９  ＲＮＰによって切断した。５単位（１μＬ）のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｍ０２７３）を、２００μＭのｄＡＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｎ０４４６Ｓ）と同じチューブに添加し、３７℃で１５分間インキュベートし、次いで７２℃で５分間インキュベートした。約２５ｎＭの天然バーコードＮＢ０１〜ＮＢ０５（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＥＸＰ−ＮＢＤ−１０４から）を、２０μＬのブラントＴ／Ａリガーゼマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｍ０３６７）を使用して、５つの異なるプローブ−標的複合体  に２１℃で１０分間連結した。各混合物を、以下のとおりに、ＳＰＲＩ磁性ビーズを使用して精製に供した：０．７体積当量のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩ磁性ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を混合物に添加し、２１℃で１０分間インキュベートした。磁気ビーズを、磁性分離機を用いてペレット化し、上清を吸引し、２５０μＬのエタノールおよびヌクレアーゼフリー水溶液の７０％ミックスを使用して、ビーズを洗浄した。ビーズをもう一度直ちにペレット化し、上清を吸引し、その後チューブを、ラックから１４μＬのヌクレアーゼフリー水を室温で１０分間取り出した。ビーズを、磁性分離機を用いてペレット化し、溶出液を保持した。１３μＬの各溶出液を同じチューブにプールし、６５μＬの最終容量をもたらした。プローブ−標的複合体に、５μＬのＡＭＩＩバーコードシークエンシングアダプター（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＮＢＤ−１０４から）を、１０μＬのＴ４リガーゼ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅから）および２０μＬのＬＮＢ緩衝液（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０９から）を使用して、総量８０μＬで、２１℃で１０分間連結した。このステップにより、１２．５μｇの「天然バーコードを有する標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０２４８】
各混合物を、以下のとおりに、ＳＰＲＩ磁気ビーズを用いた精製ステップに供した：１体積当量のＩＤＴＥ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．３体積当量のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を混合物に添加し、２１℃で１０分間インキュベートした。磁気ビーズを、磁性分離機を用いてペレット化し、上清を吸引し、２５０μＬのＬＦＢ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＳＱＫ−ＬＳＫ１０９から）を添加して、ビーズを再懸濁した。ビーズをもう一度直ちにペレット化し、上清を吸引し、その後チューブを、ラックから１６μＬのＥＢ緩衝液（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ−ＬＳＫ１０９）を室温で１０分間取り出した。ビーズを、磁性分離機を用いてペレット化し、溶出液を保持した。１３μＬのＬＢおよび２５μＬのＳＱＢ（どちらもＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＬＳＫ−１０９から）を、１２μＬの溶出液に添加して、「ＭｉｎＩＯＮシークエンシングＡとＢの混合」を得た。
【０２４９】
標的ＤＮＡのシークエンシングを行うために、入口ポートを介して、８００μＬのフローセル調製ミックス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０９から１１７０μＬのＦＬＢ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０９から３０μＬのＦＬＴを使用して調製）を導入することによって、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＦＬＯ−ＭＩＮ１０６フローセルを調製した。その後、ＳｐｏｔＯＮポートを開き、さらに２００μＬのフローセル調製ミックスを注入口から灌流した。５０μＬのＭｉｎＩＯＮシークエンシングミックスＡ、Ｂを、ＳｐｏｔＯＮポートを介してフローセルに添加し、これらのポートを閉じた。Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｉｎＫＮＯＷ（バージョン１．１５）を使用して、１６時間のシークエンシングデータを収集し、シークエンシング実行中にオンラインでＭｉｎＫＮＯＷを使用してベースコールして、ｍｉｎｉｍａｐ２を使用してオフラインでＮＡ１２８７８ヒト参照ゲノムに位置合わせした。ライブラリーＢは、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＧｕｐｐｙベースコーラーを使用して逆多重化された。
【０２５０】
結果
図２３は、ライブラリーＡおよびＢに対するヒトＮＡ１２８７８参照（ＨＴＴ遺伝子）へのシークエンシング読み取りのアラインメントから生じるパイルアップ、ならびにライブラリーＢの遺伝子ごとのバーコードあたりの読み取り数を示す。上記の実験で使用したｃｒＲＮＡは、１０個のヒト遺伝子のプロトスペーサー配列を標的化する。予想どおりに、標的領域の濃縮が観察され、Ｃａｓ９が主に正しい位置で切断し、切断部位が（様々な範囲まで）解放され、ｄＡテーリングされ、バーコード化され、アダプターが切断部位に効率的に連結されたことを示す。すべての読み取りの約１０％が、１０個の標的領域のうちの１つにマッピングされた。各標的に対する読み取りの項目別リストを、表９に示す。
【表１４】
2021523704.tif 000019
【０２５１】
表１０は、５つの異なるサンプルがバーコード化され、一緒にプールされたときに、同じ１０の遺伝子の標的パネルに対してほぼ同じ数の読み取りが得られたことを示す（ライブラリーＢ）。ライブラリーＡの１０分の１と比較して、１５０分の１の読み取りのみが、標的領域のうちの１つにマッピングされた（約０．６％）。サンプルがプールされたため、より多くのバックグラウンド読み取りが、配列決定され、オンターゲットの読み取りの割合の低下が観察された。
【表１５】
2021523704.tif 000020
【０２５２】
表１１は、ライブラリーＢの標的（ＨＴＴ遺伝子）のうちの１つで使用されるバーコードごとの読み取りの分布を示す。バーコードごとの読み取り量は、使用されるすべてのバーコード全体でほぼ一定である。未分類の読み取りが低く、バーコード化および逆多重化が効率的であることを示す。
【表１６】
2021523704.tif 000021
【０２５３】
実施例６
この実施例は、どのようにして合成ｃｒＲＮＡプローブを使用して、ナノ細孔シークエンシング用の低入力細菌ゲノムの複製領域の関心対象の領域（ＲＯＩ）を切り出し、配列決定することができるかを示す。ここでは、酵素ステップ（脱リン酸化、切断、バーコーディング、増幅、アダプター連結）が、連続して実行される、シンプルなワンポットからツーポツトアプローチについて説明する。
【０２５４】
材料および方法
高分子量ゲノムＤＮＡ（「ｇＤＮＡ」）は、製造業者の指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ  ｔｉｐ−５００を使用して大腸菌（ＳＣＳ１１０株）から抽出することによって精製した。２μｇのｇＤＮＡは、子ウシ腸デホスホリラーゼによる処理を介して脱リン酸化された。３μＬのＱｕｉｃｋ  ＣＩＰ（「ＮＥＢ  Ｑｕｉｃｋ  ＣＩＰキット」、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０５０８からの）を、合計３０μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｂ７２０４）の２μｇのｇＤＮＡに３７℃で１０分間添加し、続いてデホスホリラーゼを８０℃で２分間熱不活化した。このステップにより、「末端保護されたｇＤＮＡ」を得た。
【０２５５】
４０μＭのＣａｓＡｍｐトップ鎖および４０μＭのＣａｓＡｍｐボトム鎖を、２５μＬのヌクレアーゼフリー二本鎖緩衝液（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）で、反応物を９５℃で５分間インキュベートし、その後、室温に冷却することによってアニールした。３９μＬのヌクレアーゼフリー二本鎖緩衝液に１μＬのアニーリングしたＣａｓＡｍｐ鎖を添加することによって、反応物を１μＭに希釈した。これにより、４０μＬの「脱リン酸化ＰＣＲアダプター」を生成した。
【０２５６】
野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）は、以下のとおりに調製した。オリゴヌクレオチドＣＰＤ１およびＣＰＤ８（「ガイドＲＮＡ」として知られている）は、最初に等モル比で一緒にプールされた。次いで、Ａｌｔ−Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｔｒａｃｒＲＮＡ  （Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）およびガイドｃｒＲＮＡを、１μＬのｔｒａｃｒＲＮＡ（１００μＭ）、１μＬのガイドＲＮＡ（１００μＭ）および８μＬのヌクレアーゼフリー二本鎖緩衝液（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号１１−０１−０３−０１）を９５℃で５分間インキュベートし、室温まで冷却することによってアニーリングして、１０μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体を形成した。次いで、ＲＮＰは、２．４μＬのｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体（最終濃度８００ｎＭ）を、合計３０μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中の４００ｎＭのＨｉＦｉ  Ｃａｓ９  Ｖ３（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で、室温で２０分間インキュベートすることによって形成された。このステップにより、３０μＬの「Ｃａｓ９  ＲＮＰ」を得た。３００ｎｇ（合計２μｇからの）の末端保護されたｇＤＮＡは、４．５μＬ（３００ｎｇ）の脱リン酸化ライブラリー（上記の末端保護されたｇＤＮＡ）、３０μＬのＣａｓ９  ＲＮＰ（上記）、２００μＭのｄＡＴＰ（１．６μＬの１０ｍＭストック）、１５単位（３μＬ）のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０２７３）の合計１２６μＬでのインキュベーションによって切断され、ｄＡテーリングされた。この混合物を、Ｃａｓ９を使用して、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで７２℃で５分間インキュベートして、標的部位を切断し、ＰＣＲサーモサイクラーを使用して、Ｃａｓ９およびｄＡ尾部の両方を、アクセス可能なすべての３’末端を変性させ、３００ｎｇの「ＴａｑポリメラーゼによってｄＡテーリングされ、標的が切断されたＤＮＡ」を得た。このステップは、上記の脱リン酸化ステップと同じチューブで行われ、次の連結ステップに持ち越された。
【０２５７】
３つの異なる反応が、以下のとおりに、３つの単一のチューブで実施された。
（１）増幅ステップを通して行われなかった反応。
ＴａｑポリメラーゼによってｄＡテーリングされた、１００ｎｇの標的が切断されたＤＮＡを次のステップに持ち越した。
【０２５８】
（２）ＰＣＲアダプターを、標的が切断されたｄＡテーリングされたサンプルに連結し、増幅ステップを行った反応。
約２５ｎＭのＰＣＡアダプター（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＥＸＰ−ＰＣＡ００１から）を、１０μＬのＴ４リガーゼ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅから）および２５μＬのＬＮＢ緩衝液（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０９から）を使用して、Ｔａｑポリメラーゼ複合体によってｄＡテーリングされた、１００ｎｇの標的が切断されたＤＮＡに２１℃で１０分間連結した。
【０２５９】
（３）脱リン酸化されたＰＣＲアダプターを、標的が切断されたｄＡテーリングされたサンプルに連結し、増幅ステップを行った反応。
約２５ｎＭの「脱リン酸化されたＰＣＲアダプター」を、１０μＬのＴ４リガーゼ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅから）および２５μＬのＬＮＢ緩衝液（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０９から）を使用して、Ｔａｑポリメラーゼ複合体によってｄＡテーリングされた、１００ｎｇの標的が切断されたＤＮＡに２１℃で１０分間連結した。
【０２６０】
次いで、混合物（２）および（３）をＳＰＲＩ精製に供して、連結されていないアダプターおよび他の汚染物質を除去した。０．５容量（約５０μＬ）のＳＰＲＩビーズ（ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を、混合物に添加し、逆さにして穏やかに混合し、室温で１０分間インキュベートして、ＤＮＡをビーズに結合した。磁気分離機を使用して、ビーズをペレット化し、上清を除去し、２５０μＬのＬＦＢ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０９から）で２回洗浄し、各洗浄でビーズを完全に再懸濁し、洗浄後にビーズを再ペレット化した。２回目の洗浄の後、ビーズをもう一度ペレット化し、余分な洗浄緩衝液を除去し、２５μＬのヌクレアーゼフリー水にビーズペレットを室温で１０分間再懸濁することによって、ＤＮＡをビーズから溶出した。このステップにより、それぞれ、１００μｇの「ＰＣＡ適合した標的が切断されたＤＮＡ」および１００μｇの「脱リン酸化したＰＣＡ適合した標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０２６１】
２４μＬのこれらのライブラリーは、５０μＬのＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｔａｑ  ２Ｘマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０２８７）に２００ｎＭのＰＣＲプライマーを添加して持ち越した。ＰＣＲサーモサイクラーを使用して、以下のとおりに増幅を行った：７２℃で３０秒、９５℃で３０秒の３サイクル、５６℃で３０秒、７２℃で５秒、続いて９５℃で３０秒の１５サイクル、および７２℃で５分間。増幅は、７２℃で５分間終了し、４℃で保持した。
【０２６２】
標的の切断、ｄＡテーリング、ＰＣＲアダプターの連結、および増幅ステップ（ライブラリー（２）および（３）の場合）に続いて、シークエンシングアダプターを、各ライブラリーに連結した。５０ｎＭのＡＭＸ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ−ＬＳＫ１０９から）、１０μＬのＴ４リガーゼ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅから）、および２０μＬのＬＮＢ緩衝液（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０９から）を使用して、アダプター連結を、２１℃で１０分間行った。
【０２６３】
各混合物を、以下のとおりに、ＳＰＲＩ磁気ビーズを用いた精製ステップに供した：１体積当量のＩＤＴＥ  ｐＨ８（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．３体積当量のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を混合物に添加し、２１℃で１０分間インキュベートした。磁気ビーズを、磁性分離機を用いてペレット化し、上清を吸引し、２５０μＬのＬＦＢ（ＯＮＴ  ＳＱＫ−ＬＳＫ１０９）を添加して、ビーズを再懸濁した。ビーズをもう一度直ちにペレット化し、上清を吸引し、その後チューブを、ラックから１６μＬのＥＢ緩衝液（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ−ＬＳＫ１０９）を室温で１０分間取り出した。ビーズを、磁性分離機を用いてペレット化し、溶出液を保持した。これにより、「ＭｉｎＩＯＮシークエンシングミックス（１）、（２）、および（３）」として知られている、各端にアダプターを有するニ本鎖ＤＮＡをもたらした。
【０２６４】
標的ＤＮＡのシークエンシングを行うために、入口ポートを介して、８００μＬのフローセル調製ミックス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０９から１１７０μＬのＦＬＢ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０９から３０μＬのＦＬＴを使用して調製）を導入することによって、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＦＬＯ−ＭＩＮ１０６フローセルを調製した。その後、ＳｐｏｔＯＮポートを開き、さらに２００μＬのフローセル調製ミックスを注入口から灌流した。５０μＬのＭｉｎＩＯＮシークエンシングミックス（１）、（２）、および（３）を、ＳｐｏｔＯＮポートを介してフローセルに添加し、これらのポートを閉じた。Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｉｎＫＮＯＷ（バージョン１．１５）を使用して１６時間のシークエンシングデータを収集し、シークエンシング実行中にオンラインでＭｉｎＫＮＯＷを使用してベースコールして、オフラインでＥ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０参照ゲノムに位置合わせした。
【０２６５】
結果
図２４は、増幅なし、リン酸化または脱リン酸化されたＰＣＲアダプターアプローチによる増幅後のＥ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０参照へのシークエンシング読み取りのアラインメントから生じるパイルアップを示す。上記の実験で使用したｃｒＲＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムの４ｋｂ領域を標的化する。予想どおりに、すべての条件下で標的領域の濃縮が観察され、正しい位置で切断およびｄＡテーリングを生じたことを示す。脱リン酸化されたＰＣＲアダプターが、切断され、ｄＡテーリングされたサンプルに連結されるときに、オンターゲットの読み取りの最大数が観察され、アダプターの連結および増幅が予想どおりに生じたことを示す。増幅ステップにより、非常に高い特異性（ほぼ９５％）で読み取り数が１０倍以上増加した。
【０２６６】
表１２は、ライブラリー（（１）〜（３））のそれぞれの読み取り数およびオンターゲット読み取りの割合を示す。脱リン酸化されたＰＣＲアダプターを使用して、切断されたサンプルが増幅されたとき、最高のオンターゲットスループット（９４．８７％）が得られ、Ｃａｓ９切断、ｄＡテーリング、および増幅が低入力ゲノムから可能であることを示す。
【表１７】
2021523704.tif 000022
【０２６７】
オリゴヌクレオチド
【表１８】
2021523704.tif 000023
【表１９】
2021523704.tif 000024
【表２０】
2021523704.tif 000025
【０２６８】
実施例７
この実施例は、どのようにして合成ｃｒＲＮＡプローブを使用して、ナノ細孔シークエンシング用の細菌ゲノムの複製領域の関心対象の領域（ＲＯＩ）を切り出し、配列決定することができるか、ならびにどのようにして読み取り方向のバイアスをＲＮＡｓｅを使用して変調することができるかを示す。ここでは、酵素ステップ（脱リン酸化、切断、消化、およびアダプター連結）が、連続して実行される、シンプルなワンポットアプローチについて説明する。
【０２６９】
材料および方法
高分子量ゲノムＤＮＡ（「ｇＤＮＡ」）は、製造業者の指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ  ｔｉｐ−５００を使用して大腸菌（ＳＣＳ１１０株）から抽出することによって精製した。１．５μｇのｇＤＮＡは、子ウシ腸デホスホリラーゼによる処理を介して脱リン酸化された。７．５μＬのＱｕｉｃｋ  ＣＩＰ（「ＮＥＢ  Ｑｕｉｃｋ  ＣＩＰキット」、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０５０８からの）を、合計１５０μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｂ７２０４）の１．５μｇのｇＤＮＡに３７℃で１０分間添加し、続いてデホスホリラーゼを８０℃で２分間熱不活化した。このステップにより、「末端保護されたｇＤＮＡ」を得た。
【０２７０】
野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）は、以下のとおりに調製した。Ａｌｔ−Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｔｒａｃｒＲＮＡ  （Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）およびＡＲ４００（合成ｃｒＲＮＡ）を、最初に、１μＬのｔｒａｃｒＲＮＡ（１００μＭ）、１μＬのＡＲ４００（１００μＭ）、および８μＬのヌクレアーゼフリー二本鎖緩衝液（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号１１−０１−０３−０１）を９５℃で５分間インキュベートし、室温まで冷却することによってアニーリングして、１０μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体を形成した。次いで、ＲＮＰは、４．５μＬのｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体（最終濃度６００ｎＭ）を、合計７５μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中の３００ｎＭのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０３８６Ｍ）で、室温で２０分間インキュベートすることによって形成された。このステップにより、７５μＬの「Ｃａｓ９  ＲＮＰ」を得た。
【０２７１】
３つの異なる反応が、以下のとおりに、３つの単一のチューブで実施された。
（１）シークエンシングアダプターが、標的が切断され、ｄＡテーリングされたサンプルに連結された反応。
５００ｎｇの末端保護されたｇＤＮＡは、５０μＬ（１００ｎｇ）の脱リン酸化ライブラリー（上記の末端保護されたｇＤＮＡ）、２５μＬのＣａｓ９  ＲＮＰ（上記）、２００μＭのｄＡＴＰ（１．７μＬの１０ｍＭストック）、５単位（１μＬ）のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０２７３）の合計８５μＬでのインキュベーションによって切断され、ｄＡテーリングされた。この混合物を、Ｃａｓ９を使用して、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで７２℃で５分間インキュベートして、標的部位を切断し、ＰＣＲサーモサイクラーを使用して、Ｃａｓ９およびｄＡ尾部の両方を、アクセス可能なすべての３’末端を変性させ、５００ｎｇの「ＴａｑポリメラーゼによってｄＡテーリングされ、標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０２７２】
（２）標的が切断されたＤＮＡが、ＲＮＡｓｅＨによって消化され、次いでＴａｑポリメラーゼによってｄＡテーリングされた反応。次いで、シークエンシングアダプターを、このサンプルに連結した。
５００ｎｇの末端保護されたｇＤＮＡは、５０μＬ（１００ｎｇ）の脱リン酸化ライブラリー（上記の末端保護されたｇＤＮＡ）のインキュベーションによって切断され、ｄＡテーリングされ、２５μＬのＣａｓ９  ＲＮＰ（上記）を、３７℃で２５分間インキュベーションして、Ｃａｓ９を使用して標的部位を切断した。５単位（１μＬ）のＲＮＡｓｅＨ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０２９７）を、ＮＥＢｕｆｆｅｒ（商標）３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号＃Ｂ７００３）に合計８５μＬ添加した。ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を消化するために、反応物を３７℃で２０分間インキュベートし、Ｃａｓ９およびＲＮＡｓｅＨの両方を変性させるために、６５℃で２０分間インキュベートした。２００μＭのｄＡＴＰ（１．７μＬの１０ｍＭストック）、５単位（１μＬ）のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０２７３）を、同じチューブに合計８５μＬ添加した。この混合物を、ＰＣＲサーモサイクラーを使用して、アクセス可能なすべての３’末端をｄＡテーリングさせるために、７２℃で５分間インキュベートして、５００ｎｇの「ＲＮＡｓｅＨによって消化され、ｄＡテーリングされた、標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０２７３】
（３）標的が切断されたＤＮＡが、Ｃａｓ９変性後にＲＮＡｓｅＨでインキュベートされ、次いでｄＡテーリングされた反応。次いで、シークエンシングアダプターを、このサンプルに連結した。
５００ｎｇの末端保護されたｇＤＮＡは、５０μＬ（１００ｎｇ）の脱リン酸化ライブラリー（上記の末端保護されたｇＤＮＡ）のインキュベーションによって切断され、ｄＡテーリングされ、２５μＬのＣａｓ９  ＲＮＰ（上記）を、Ｃａｓ９を使用して標的部位を切断するために、３７℃で２５分間インキュベーションし、Ｃａｓ９を変性するために６５℃で５分間インキュベーションした。５単位（１μＬ）のＲＮＡｓｅＨ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０２９７）を、合計８５μＬのＮＥＢｕｆｆｅｒ（商標）３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号＃Ｂ７００３）の反応物に添加した。ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を消化するために、反応物を３７℃で２０分間インキュベートし、ＲＮＡｓｅＨを変性させるために、６５℃で２０分間インキュベートした。２００μＭのｄＡＴＰ（１．７μＬの１０ｍＭストック）、５単位（１μＬ）のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０２７３）を、同じチューブに合計８５μＬ添加した。この混合物を、ＰＣＲサーモサイクラーを使用して、アクセス可能なすべての３’末端をｄＡテーリングさせるために、７２℃で５分間インキュベートして、５００ｎｇの「ＲＮＡｓｅＨによって消化され、ｄＡテーリングされた、標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０２７４】
次いで、１６５μＬの連結緩衝液（ＯＮＬＳ１３１１７）中で２５ｎＭのＡＭＸ  １Ｄ（Ｖｉｖａｓｐｉｎ−５００濃縮器；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓを使用して１．７μＭに濃縮されたＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０８から）、１０μＬのＴ４リガーゼ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ内製）を添加することによって、シークエンシングアダプターを各ライブラリーに連結した。２１℃で１０分間インキュベーションした後、各混合物を、以下のとおりに、ＳＰＲＩ磁気ビーズを用いた精製ステップに供した：１体積当量のＩＤＴＥ  ｐＨ８（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．４体積当量のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を混合物に添加し、２１℃で１０分間インキュベートした。磁気分離機を使用して、ビーズをペレット化し、上清を除去し、ＤＬＢで希釈した２５０μＬのＡＢＢ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０８から）で２回洗浄し、各洗浄でビーズを完全に再懸濁し、洗浄後にビーズを再ペレット化した。２回目の洗浄の後、ビーズをもう一度ペレット化し、余分な洗浄緩衝液を除去し、１５μＬのＥＬＢ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８から）にビーズペレットを室温で１０分間再懸濁することによって、ＤＮＡをビーズから溶出した。２５μＬのＳＱＢおよび１０μＬのＬＢ（どちらもＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＬＳＫ−１０９から）を、１５μＬの溶出液に添加して、「ＭｉｎＩＯＮシークエンシングミックス」を得た。
【０２７５】
標的ＤＮＡのシークエンシングを行うために、入口ポートを介して、８００μＬのフローセル調製ミックス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０９から１１７０μＬのＦＬＢ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０９から３０μＬのＦＬＴを使用して調製）を導入することによって、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＦＬＯ−ＭＩＮ１０６フローセルを調製した。その後、ＳｐｏｔＯＮポートを開き、さらに２００μＬのフローセル調製ミックスを注入口から灌流した。５０μＬのＭｉｎＩＯＮシークエンシングミックス（１）、（２）、および（３）を、ＳｐｏｔＯＮポートを介してフローセルに添加し、これらのポートを閉じた。Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｉｎＫＮＯＷ（バージョン１．１０．６）を使用して、６時間のシークエンシングデータを収集し、その後、オフラインでベースコール（Ａｌｂａｃｏｒｅを使用して）して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０参照ゲノムに位置合わせした。
【０２７６】
結果
図２５は、Ｅ．ｃｏｌｉ参照へのシークエンシング読み取りのアラインメントから生じるパイルアップを示す。上記の実験で使用したｃｒＲＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０株のｒｒｓ遺伝子の７つのコピーすべてに共通のプロトスペーサー配列を標的化する。予想どおりに、７つのｒｒｓ遺伝子のそれぞれ（それらの位置を、表１３〜１５に示す）で標的領域の濃縮が観察され、Ｃａｓ９が主に正しい位置で切断し、切断部位が（様々な範囲まで）解放され、ｄＡテーリングされ、アダプターが切断部位に効率的に連結されたことを示す。この図は、より多くの双方向読み取りが、Ｃａｓ９切断および変性後にＲＮＡｓｅＨの添加に伴って観察されることも強調している。
【０２７７】
表１３は、Ｔａｑポリメラーゼ条件（条件（１））からの順方向と逆方向の読み取り間のバイアスを調べる。縮重ｃｒＲＮＡプローブによって標的化されたｒｒｓ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０参照で両方の方向に見られる。７つのｒｒｓ遺伝子のうち６つは、読み取り方向に明らかなバイアスを示し、これは参照ゲノム内の遺伝子の方向と相関した。同様のバイアスが、他の条件（ライブラリー（２）、表１４、図２５）で観察された。
【０２７８】
しかしながら、ライブラリー（３）における読み取りバイアスを調べる表１５は、Ｃａｓ９切断および変性後のＲＮＡｓｅＨの添加により、ライブラリー（１）および（２）と比較して読み取りバイアスの一部が軽減されたことを示す。例えば、ｒｒｓＨ遺伝子に対応するピークｉの読み取りバイアスは、ライブラリー（１）の３４％と比較して、ＲＮＡｓｅＨの添加に伴って約４２％に低下した。
【表２１】
2021523704.tif 000026
【表２２】
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【表２３】
2021523704.tif 000028
【０２７９】
実施例８
この実施例は、どのようにして合成ｃｒＲＮＡプローブを使用して、ナノ細孔シークエンシング用の細菌ゲノムの複製領域の関心対象の領域（ＲＯＩ）を切り出し、配列決定することができるか、ならびにどのようにして開裂に由来する読み取りのシークエンシング方向は、Ｔ４ポリメラーゼを使用して一方向にバイアスをかけることができるかを示す。ここでは、酵素ステップ（脱リン酸化、切断、消化、およびアダプター連結）が、連続して実行される、シンプルなワンポットアプローチについて説明する。
【０２８０】
材料および方法
高分子量ゲノムＤＮＡ（「ｇＤＮＡ」）は、製造業者の指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ  ｔｉｐ−５００を使用して大腸菌（ＳＣＳ１１０株）から抽出することによって精製した。１．５μｇのｇＤＮＡは、子ウシ腸デホスホリラーゼによる処理を介して脱リン酸化された。７．５μＬのＱｕｉｃｋ  ＣＩＰ（「ＮＥＢ  Ｑｕｉｃｋ  ＣＩＰキット」、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０５０８からの）を、合計１５０μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｂ７２０４）の１．５μｇのｇＤＮＡに３７℃で１０分間添加し、続いてデホスホリラーゼを８０℃で２分間熱不活化した。このステップにより、「末端保護されたｇＤＮＡ」を得た。
【０２８１】
野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）は、以下のとおりに調製した。Ａｌｔ−Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｔｒａｃｒＲＮＡ  （Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）およびＡＲ４００（合成ｃｒＲＮＡ）を、最初に、１μＬのｔｒａｃｒＲＮＡ（１００μＭ）、１μＬのＡＲ４００（１００μＭ）、および８μＬのヌクレアーゼフリー二本鎖緩衝液（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号１１−０１−０３−０１）を９５℃で５分間インキュベートし、室温まで冷却することによってアニーリングして、１０μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体を形成した。次いで、ＲＮＰは、４．５μＬのｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体（最終濃度６００ｎＭ）を、合計７５μＬのＮＥＢ  ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中の３００ｎＭのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０３８６Ｍ）で、室温で２０分間インキュベートすることによって形成された。このステップにより、７５μＬの「Ｃａｓ９  ＲＮＰ」を得た。
【０２８２】
３つの異なる反応が、以下のとおりに、３つの単一のチューブで実施された。
（１）シークエンシングアダプターが、標的が切断され、ｄＡテーリングされたサンプルに連結された反応。
５００ｎｇの末端保護されたｇＤＮＡは、５０μＬ（５００ｎｇ）の脱リン酸化ライブラリー（上記の末端保護されたｇＤＮＡ）、２５μＬのＣａｓ９  ＲＮＰ（上記）、２００μＭのｄＡＴＰ（１．７μＬの１０ｍＭストック）、５単位（１μＬ）のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０２７３）の合計８５μＬでのインキュベーションによって切断され、ｄＡテーリングされた。この混合物を、Ｃａｓ９を使用して、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで７２℃で５分間インキュベートして、標的部位を切断し、ＰＣＲサーモサイクラーを使用して、Ｃａｓ９およびｄＡ尾部の両方を、アクセス可能なすべての３’末端を変性させ、５００ｎｇの「ＴａｑポリメラーゼによってｄＡテーリングされ、標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０２８３】
（２）標的が切断されたＤＮＡが、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでインキュベートされ、次いでｄＡテーリングされた反応。次いで、シークエンシングアダプターを、このサンプルに連結した。
５００ｎｇの末端保護されたｇＤＮＡは、５０μＬ（１００ｎｇ）の脱リン酸化ライブラリー（上記の末端保護されたｇＤＮＡ）のインキュベーションによって切断され、ｄＡテーリングされ、２５μＬのＣａｓ９  ＲＮＰ（上記）を、３７℃で２５分間インキュベーションして、Ｃａｓ９を使用して標的部位を切断した。３単位（１μＬ）のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０２０３）を、合計８５μＬ添加した。ｄＮＴＰが存在しない場合、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼは、３’から５’末端のエキソヌクレアーゼとして機能し、ここでは、任意の潜在的な３’末端のオーバーハングを除去するために使用される。反応物を、２１℃で５分間インキュベートした。２００μＭのｄＡＴＰ（１．７μＬの１０ｍＭストック）、５単位（１μＬ）のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０２７３）を、同じチューブに合計８０μＬ添加した。この混合物を、ＰＣＲサーモサイクラーを使用して、アクセス可能なすべての３’末端をｄＡテーリングさせるために、７２℃で５分間インキュベートして、５００ｎｇの「Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼによって消化され、ｄＡテーリングされた、標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０２８４】
（３）標的が切断された反応を、Ｃａｓ９変性後に、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでインキュベートされ、ｄＡテーリングされた反応。次いで、シークエンシングアダプターを、このサンプルに連結した。
５００ｎｇの末端保護されたｇＤＮＡは、５０μＬ（１００ｎｇ）の脱リン酸化ライブラリー（上記の末端保護されたｇＤＮＡ）のインキュベーションによって切断され、ｄＡテーリングされ、２５μＬのＣａｓ９  ＲＮＰ（上記）を、Ｃａｓ９を使用して標的部位を切断するために、３７℃で２５分間インキュベーションし、Ｃａｓ９を変性するために６５℃で５分間インキュベーションした。３単位（１μＬ）のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０２０３）を、反応物に合計８０μＬ添加した。ｄＮＴＰが存在しない場合、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼは、３’から５’末端のエキソヌクレアーゼとして機能し、ここでは、任意の潜在的な３’末端のオーバーハングを除去するために使用される。反応物を、２１℃で５分間インキュベートした。２００μＭのｄＡＴＰ（１．７μＬの１０ｍＭストック）、５単位（１μＬ）のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｍ０２７３）を、同じチューブに合計８０μＬ添加した。この混合物を、ＰＣＲサーモサイクラーを使用して、アクセス可能なすべての３’末端をｄＡテーリングさせるために、７２℃で５分間インキュベートして、５００ｎｇの「変性され、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼによって消化され、ｄＡテーリングされた、標的が切断されたＤＮＡ」を得た。
【０２８５】
次いで、１６５μＬの連結緩衝液（ＯＮＬＳ１３１１７）中で２５ｎＭのＡＭＸ  １Ｄ（Ｖｉｖａｓｐｉｎ−５００濃縮器；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓを使用して１．７μＭに濃縮されたＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０８から）、１０μＬのＴ４リガーゼ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ内製）を添加することによって、シークエンシングアダプターを各ライブラリーに連結した。２１℃で１０分間インキュベーションした後、各混合物を、以下のとおりに、ＳＰＲＩ磁気ビーズを用いた精製ステップに供した：１体積当量のＩＤＴＥ  ｐＨ８（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．４体積当量のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を混合物に添加し、２１℃で１０分間インキュベートした。磁気分離機を使用して、ビーズをペレット化し、上清を除去し、ＤＬＢで希釈した２５０μＬのＡＢＢ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０８から）で２回洗浄し、各洗浄でビーズを完全に再懸濁し、洗浄後にビーズを再ペレット化した。２回目の洗浄の後、ビーズをもう一度ペレット化し、余分な洗浄緩衝液を除去し、１５μＬのＥＬＢ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８から）にビーズペレットを室温で１０分間再懸濁することによって、ＤＮＡをビーズから溶出した。２５μＬのＳＱＢおよび１０μＬのＬＢ（どちらもＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＬＳＫ−１０９から）を、１５μＬの溶出液に添加して、「ＭｉｎＩＯＮシークエンシングミックス」を得た。
【０２８６】
標的ＤＮＡのシークエンシングを行うために、入口ポートを介して、８００μＬのフローセル調製ミックス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０９から１１７０μＬのＦＬＢ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＬＳＫ−１０９から３０μＬのＦＬＴを使用して調製）を導入することによって、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＦＬＯ−ＭＩＮ１０６フローセルを調製した。その後、ＳｐｏｔＯＮポートを開き、さらに２００μＬのフローセル調製ミックスを注入口から灌流した。５０μＬのＭｉｎＩＯＮシークエンシングミックス（１）、（２）、および（３）を、ＳｐｏｔＯＮポートを介してフローセルに添加し、これらのポートを閉じた。Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｉｎＫＮＯＷ（バージョン１．１０．６）を使用して、６時間のシークエンシングデータを収集し、その後、オフラインでベースコール（Ａｌｂａｃｏｒｅを使用して）して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０参照ゲノムに位置合わせした。
【０２８７】
結果
図２６は、Ｅ．ｃｏｌｉ参照へのシークエンシング読み取りのアラインメントから生じるパイルアップを示す。上記の実験で使用したｃｒＲＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０株のｒｒｓ遺伝子の７つのコピーすべてに共通のプロトスペーサー配列を標的化する。予想どおりに、７つのｒｒｓ遺伝子のそれぞれ（それらの位置を、表１７〜１９に示す）で標的領域の濃縮が観察され、Ｃａｓ９が主に正しい位置で切断し、切断部位が（様々な範囲まで）解放され、ｄＡテーリングされ、アダプターが切断部位に効率的に連結されたことを示す。この図は、より少ない双方向の読み取りが、Ｃａｓ９切断後のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼの添加に伴って観察されたことも強調している。
【０２８８】
表１７〜１９は、Ｔａｑポリメラーゼ条件（ライブラリー（１））からの順方向と逆方向の読み取り間のバイアスを調べる。縮重ｃｒＲＮＡプローブによって標的化されたｒｒｓ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０参照で両方の方向に見られる。７つのｒｒｓ遺伝子のうち６つは、読み取り方向に明らかなバイアスを示し、これは参照ゲノム内の遺伝子の方向と相関した。
【０２８９】
しかしながら、ライブラリー（２）および（３）における読み取りバイアスを調べる表１８および１９は、Ｃａｓ９変性の有無にかかわらずＣａｓ９切断後のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼの添加が、ライブラリー（１）と比較して、読み取りバイアスが軽減されたことを示す。例えば、ｒｒｓＨ遺伝子に対応するピークｉの（＋）方向への読み取りバイアスは、ライブラリー（１）の６５％と比較して、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼの添加に伴って約９６％であった。これは、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼの添加が、Ｃａｓ９切断部位のＰＡＭ遠位側へのシークエンシングアダプター連結の効率が低下することを示す。
【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【国際調査報告】
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