(57)【要約】  本発明は、とりわけ、それらを必要とする対象で、５−ヒドロキシトリプトファンの徐放性剤形（５−ＨＴＰ  ＳＲ）を使用して、便秘などの胃腸（ＧＩ）状態を治療または軽減するための方法を提供する。５−ＨＴＰ  ＳＲを含むキットも提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に、有効量の５−ヒドロキシトリプトファンの徐放性剤形（５−ＨＴＰ  ＳＲ）を投与することを含む、胃腸（ＧＩ）状態の影響を、それらを必要とする対象で治療または軽減する方法。
【請求項２】
前記ＧＩ状態が便秘である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象が、ヒト、獣医学的動物、および農業用動物からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象がヒトである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記胃腸（ＧＩ）状態が、突発性便秘、便秘が主要素をなす過敏性腸症候群（ＩＢＳ−Ｃ）、オピオイド誘発便秘、パーキンソンにおける便秘および自閉症における便秘から選択される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記胃腸（ＧＩ）状態が、突発性便秘または便秘が主要素をなす過敏性腸症候群（ＩＢＳ−Ｃ）である、請求項１から４に記載の方法。
【請求項７】
前記胃腸（ＧＩ）状態が、薬物治療（例えば、オピオイド治療）により誘発された便秘である、請求項１から４に記載の方法。
【請求項８】
前記対象がＧＩの５−ＨＴ欠損を有する、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象が、トリプトファンヒドロキシラーゼ２（ＴＰＨ２）をコードする遺伝子に突然変異を有する、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記突然変異が遺伝子におけるＲ４４１Ｈまたは等価の突然変異である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記投与ステップが経口投与により実施される、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記５−ヒドロキシトリプトファンの徐放性剤形（５−ＨＴＰ  ＳＲ）が、１日に体重１ｋｇ当たり約０．１ｇの速度で投与される、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記５−ヒドロキシトリプトファンの徐放性剤形（５−ＨＴＰ  ＳＲ）が、１日に体重１ｋｇ当たり約０．０１から約０．１ｇ、または１日に体重１ｋｇ当たり約０．００１から約０．０１ｇ、または１日に体重１ｋｇ当たり約０．０００１から約０．００１ｇ、または１日に体重１ｋｇ当たり約０．００００１から約０．０００１ｇの速度で投与される、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記５−ヒドロキシトリプトファンの徐放性剤形（５−ＨＴＰ  ＳＲ）が、５、１０または２５ｍｇから１００、２５０または５００ｍｇの投薬量で経口的に投与されるか、または０．５から１グラムの投薬量で経口的に投与される、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
対象に、有効量の５−ヒドロキシトリプトファンの徐放性剤形（５−ＨＴＰ  ＳＲ）を投与することを含む、それらを必要とする対象において、内臓の疼痛を治療する方法。
【請求項１６】
有効量の５−ヒドロキシトリプトファンの徐放性剤形（５−ＨＴＰ  ＳＲ）を、第２の活性化合物、および任意選択的にそれを使用するための使用説明書と一緒に含む、対象における胃腸（ＧＩ）状態の影響を治療または軽減するためのキット。
【請求項１７】
前記第２の活性化合物が分泌を促す化合物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の活性化合物が浸透性緩下剤である、請求項１８に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の活性化合物が刺激薬緩下剤である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記５−ＨＴＰ  ＳＲが、末梢デカルボキシラーゼ阻害剤を任意選択的に含む（例えば、全身的に薬学的に活性な血液レベルを惹起しない低投与量で（例えば、１日に５〜５０ｍｇ、または１〜１０ｍｇ、２〜２０ｍｇの範囲内、または１日に２０〜５０ｍｇの範囲））胃保持型剤形である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法またはキット。
【請求項２１】
５−ＨＴＰが、胃以外の、前記上部および下部ＧＩに送達されるか、または５−ＨＴＰが腸に送達される、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法またはキット。
【請求項２２】
５−ＨＴＰが選択的に結腸に送達される、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法またはキット。
【請求項２３】
医薬が５−ヒドロキシトリプトファンの徐放性剤形（５−ＨＴＰ  ＳＲ）を含む、それらを必要とする対象において、胃腸（ＧＩ）状態の影響を治療または軽減することに使用するための５−ＨＴＰ。
【請求項２４】
医薬が５−ヒドロキシトリプトファンの徐放性剤形（５−ＨＴＰ  ＳＲ）を含む、それらを必要とする対象で、胃腸（ＧＩ）状態の影響を治療または軽減するための医薬の調製における５−ＨＴＰの使用。
【請求項２５】
医薬が結腸選択的な５−ヒドロキシトリプトファンの徐放剤形（５−ＨＴＰ  ＳＲ）を含む、請求項２３の使用のための５−ＨＴＰまたは請求項２４の５−ＨＴＰの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［政府支援の言明］
本発明は、ＤＫ０９３７８６、ＮＳ１５５４７による政府支援、およびナショナルインスティテュートオブヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ））により授与されたＮＩＡＴ３５ＡＧ０４４３０３、および国防省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｆｅｎｓｅ（ＤＯＤ））により授与されたＦＰＲ１６０３６５を使用して実施された。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、特に、５−ヒドロキシトリプトファンの徐放性剤形（５−ＨＴＰ  ＳＲ）を使用して胃腸（ＧＩ）の状態を治療するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
セロトニン（別名５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）は、睡眠および気分に役割があることが古くから知られている神経伝達物質であり、中枢神経系（ＣＮＳ）および腸内神経系（ＥＮＳ）の発達、ＧＩ運動性、および腸内マイクロバイオーム変調のためにも決定的に重要である。セロトニンは、食事のトリプトファンから直接の前駆体５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）を通して合成される（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。トリプトファンの５−ＨＴＰへの変換は、５−ＨＴ合成を受け持つ律速酵素であるトリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）により媒介される。
【０００４】
【化１】
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【０００５】
腸には２種の異なる５−ＨＴ貯留物が存在しており、各々が、それ自体のＴＰＨの律速アイソフォームを有する。大きいＴＰＨ１依存性の５−ＨＴプールは、粘膜の腸のクロム親和性の（ＥＣ）細胞中に存在し、一方、小さい方のＴＰＨ２依存性プールは、ＥＮＳのセロトニン作動性のニューロン中に存在する。腸内ニューロンの５−ＨＴは、発達中および成人期に、神経伝達物質としておよび神経原性の増殖因子としても機能する。腸内ＴＰＨ１およびＴＰＨ２から誘導される５−ＨＴは、両方共ＧＩの運動性を調節する（Ｋｅｎｄｉｇ  ａｎｄ  Ｇｒｉｄｅｒ，２０１５）。ＴＰＨ２から誘導される５−ＨＴは、さらに陰窩上皮細胞の増殖の調節により腸上皮の増殖に影響することが示されている（Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。注目に値することとして、ＴＰＨ２はＣＮＳから誘導される５−ＨＴ産生のために特に必要とされる（Ｗａｌｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。それ故、消化管における５−ＨＴＰの薬理学的作用は、ＥＮＳニューロンにおけるならびに非神経細胞、特に腸のクロム親和性細胞における増大した５−ＨＴ産生に由来する可能性がある。
【０００６】
他方、外因性５−ＨＴＰ（５−ＨＴの直接の前駆体）の投与は（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００６）、ＴＰＨ１およびＴＰＨ２の両方を迂回して、酵素アミノ酸デカルボキシラーゼにより触媒される反応で、５−ＨＴに直接変換されるであろう。５−ＨＴＰの５−ＨＴへの変換は５−ＨＴ合成における律速因子ではないので、内因性５−ＨＴＰ（トリプトファンから合成された）の循環する全身的レベルは、ベースライン状態下では低く、例えば０〜５０ｎｇ／ｍｌ血漿である（Ｃｏｍａｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１０）。外因性５−ＨＴＰの投与後に全身的な薬理学的効果を生ずるためには、典型的には、１００ｎｇ／ｍｌを超える５−ＨＴＰ血漿レベルが必要とされる（Ｇｉｊｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００２；Ｖｅｅｎｉｎｇａ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｅｎｂｅｒｇ，１９９２）。
【０００７】
従前の報告は、遅延放出（ＳＲ）送達は、５−ＨＴＰの治療能力を増強することを教示しており（米国特許第８９６９４００号明細書；米国特許第９４６８６２７号明細書；米国特許第７６７０６１９号明細書）、すなわち、これはＣＭａｘに関連する有害事象を低下させることにより、５−ＨＴＰの全身的曝露における断続的な治療量以下の底値を回避することにより、および投薬を治療環境において実際的な頻度に減少させることによる。５−ＨＴＰ  ＳＲのこの使用は、全身的循環中に吸収させるために外因性５−ＨＴＰを送達して、このように腸から吸収された外因性５−ＨＴＰから中枢神経系（ＣＮＳ）により合成された５−ＨＴによる薬理学的作用により働く治療方法に関する。Ｍｉｈａｙｌｏｖの米国特許第７６７０６１９号明細書は、二重層錠剤で構成される５−ＨＴＰ剤形を記載している。一層は、急速に放出される５−ＨＴＰを含有する。他の層は、７時間以上にわたって継続して放出されるトリプトファンまたは５−ＨＴＰを含有する。Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌの米国特許第９４６８６２７号明細書は、５−ＨＴＰをＧＩ管全体にわたって送達できる種々の５−ＨＴＰ  ＳＲ送達手法を記載している。米国特許第９４６８６２７号明細書は、５−ＨＴＰ薬物送達中の間、大部分が胃中に保持される剤形、すなわち、全身的循環中に吸収させるために５−ＨＴＰを腸上部に選択的に送達する「胃保持型」５−ＨＴＰ  ＳＲ剤形も記載している。
【０００８】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙによれば、便秘は「不満足な排便と定義された症状に基づく障害であり、低頻度の排便、困難な便通、または両方により特徴付けられる」。人口の１０％を超える人々が便秘障害に苦しみ、刺激反応性の腸症候群−便秘が優勢で、慢性突発性便秘が最も一般的な診断である（Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）。便秘障害の病原性は、（ｉ）低下した腸、特に結腸の運動性、および（ｉｉ）腸、特に結腸中への低下した正味の流体分泌を含むことが目立つ（Ｇｅｒｓｈｏｎ，２０１３ａ；Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａ，２０１７）。大部分の場合、主要な原因は知られていない、すなわち便秘は突発性である。
【０００９】
便秘のための薬剤（緩下剤）は、５つのカテゴリーに入る：（ｉ）バルク剤（例えばオオバコ、メチルセルロース、カルシウムポリカルボフィル、小麦デキストリン）；（ｉｉ）非吸収物質（例えばＰＥＧ３３５０、ラクツロース、マグネシウム塩）；（ｉｉｉ）刺激剤（例えばビサコジル、センナ）；（ｉｖ）分泌を促す薬剤（例えばリナクロチド、ルビプロストン）；および（ｖ）運動性支持薬剤（例えば、プルカロプリド、テガセロド、シサプリド）。このような作用剤の目的は、腸の運動性を増大させるか、および／または流体の腸管腔への正味の分泌を増大させ、これによって便の水分含有率を増大させること、および／または排便を容易にすることである。便秘の主要な病理学的部位は結腸であり、糞便は不適切な排泄に基づいてそこに蓄積する（Ｗａｌｄ，２０１６）。したがって、結腸の運動性および正味の結腸の流体分泌の強化は、有益であり得る。
【００１０】
言及したように、５−ＨＴは、ＧＩ機能の主要な制御因子である。特に５−ＨＴは、ＧＩの運動性ならびに流体分泌を促す（Ｂｏｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｌｅｉｇｈ，１９９７；Ｇｅｒｓｈｏｎ，２０１３ａ）。ＧＩにおける５−ＨＴの運動性の支持および分泌効果を支持媒介する５−ＨＴ受容体は、主として５−ＨＴ４受容体および５−ＨＴ３受容体であるが、５−ＨＴ２Ａ受容体、５−ＨＴ２Ｂ受容体、および５−ＨＴ７受容体も役割を演じ得る（Ｓａｎｇｅｒ，２００８）。５−ＨＴ４受容体および５−ＨＴ３受容体の両方のアゴニストは、ヒトにおけるＧＩ運動性を刺激する（ＤｅＭａｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００８；Ｓｐｉｌｌｅｒ，２０１１）。５−ＨＴ４受容体のアゴニスト（例えば、シサプリド、テガセロド、プルカロプリド）は、便秘障害の治療に関して規制上の承認を得ている。５−ＨＴ４受容体の選択的アゴニストは、運動性作用支持により便秘を軽減する。しかし、目的を外れた毒性および／または不十分な効能は、便秘障害の治療において、５−ＨＴ４受容体アゴニストにとって弱点である（ＤｅＭａｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。５−ＨＴ３受容体の選択的アゴニストは、抗便秘活性も有するが、５−ＨＴ３受容体アゴニストの全身的投与は、有意の吐き気を伴う（Ｍａｗｅ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ，２０１３）。複数の５−ＨＴ受容体（５−ＨＴ４および５−ＨＴ３受容体、およびおそらく５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｂ、および５−ＨＴ７受容体も）の刺激を同時に可能にする薬物治療は、より顕著な抗便秘作用を提供すると予測されるであろう。
【００１１】
５−ＨＴＰは、ヒトで、実験的療法剤として、主として抗鬱剤として研究されたことがある（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。しかし、当局に承認された５−ＨＴＰ処方薬剤は現在のところ入手可能でなく、その理由は、おそらく自然のままの５−ＨＴＰが、急速な薬物動態のために、ヒトにおける療法剤としてあまり適しないことである（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ａ）。ヒトにおける５−ＨＴＰ投与と関連する最も一般的な末梢作用の１つは、促進された排便と増大した糞便の水含有率である（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。同様に、齧歯類においても、外因性５−ＨＴＰ投与は、低用量、＜１０ｍｇ／ｋｇにおいてさえ、ＧＩ運動性および流体分泌の強い誘発因子であることが知られている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００７ａ）。齧歯類においては、機構は、５−ＨＴ３および５−ＨＴ４受容体両方の刺激を包含するように思われる（Ｂａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９６；Ｐａｓｃｕａｌ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。興味あることに、これらのＧＩ効果は、いかなる明白な行動の異常を生じさせない低い５−ＨＴＰ用量においても生ずる（Ｏｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ，１９７３）。
【００１２】
便秘のための可能性のある救済策として、５−ＨＴＰについて公表の言及がある（例えば、インターネットの健康ウェブサイトで）。しかし、便秘または他のＧＩ障害を治療するために５−ＨＴＰが使用され得ることを直接示唆する審査された動物またはヒトのデータの公表もなく、適当な投与量、投薬形態、または他の治療パラメータについての言及もない。同様に、便秘または他のＧＩ障害を効果的に治療するための医薬の５−ＨＴＰ投薬形態をどのように作製するかの例やデザインもない。
【発明の概要】
【００１３】
それらを必要とする対象において、対象に有効量の５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰＳＲ）の徐放性剤形を投与することを含む、胃腸（ＧＩ）状態の影響を治療または軽減する方法が、本発明で提供される。幾つかの実施形態にて、対象は、ヒト、獣医学的動物、または農業用動物などの哺乳類である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００１４】
幾つかの実施形態にて、胃腸（ＧＩ）状態は便秘である。幾つかの実施形態にて、ＧＩ状態は、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、突発性便秘、便秘が主要素をなす過敏性腸症候群（ＩＢＳ−Ｃ）、短消化管症候群（short gut syndrome）、手術後消化管修復、機能性内臓の疼痛、内臓の過敏性、腸内神経系（ＥＮＳ）形成不全、欠陥のある晩発発達ニューロン（deficient late−developing neuron）、異常な腸内上皮の増殖および増殖から選択される。
【００１５】
幾つかの実施形態にて、ＧＩ状態は、突発性便秘、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、便秘、便秘が主要素をなす過敏性腸症候群（ＩＢＳ−Ｃ）、オピオイド誘発便秘、パーキンソン病における便秘および自閉症における便秘から選択されるものである。
【００１６】
幾つかの実施形態にて、ＧＩ状態は、薬物治療により誘発される便秘である（例えば、オピオイド誘発便秘）。
【００１７】
幾つかの実施形態にて、対象は、５−ＨＴのＧＩ欠損に基づいて便秘に苦しむ。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴ欠損は、トリプトファンヒドロキシラーゼ２（ＴＰＨ２）をコードする遺伝子における突然変異に由来する。幾つかの実施形態にて、突然変異は、ＴＰＨ２遺伝子におけるＲ４４１Ｈまたは等価の突然変異である。
【００１８】
幾つかの実施形態にて、投与ステップは、経口投与により実施される。
【００１９】
幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰは、１日に体重１ｋｇ当たり約０．１ｇの速度で投与される。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰ  ＳＲは、１日に体重１ｋｇ当たり約０．０１から０．１ｇの速度で投与される。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰ  ＳＲは、１日に体重１ｋｇ当たり約０．００１から０．０１ｇの速度で投与される。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰ  ＳＲは、１日に体重１ｋｇ当たり約０．０００１から０．００１ｇの速度で投与される。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰ  ＳＲは、１日に体重１ｋｇ当たり約０．００００１から０．０００１ｇの速度で投与される。
【００２０】
幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰは、５、１０または２５ｍｇから１００、２５０または５００ｍｇの投薬で経口的に投与されるか、または０．５から１グラムの投薬で経口的に投与される。
【００２１】
対象に有効量の５−ＨＴＰ  ＳＲを投与することを含む、それらを必要とする対象における内臓の疼痛を治療する方法も提供される。
【００２２】
それを使用するための使用説明書と一緒に梱包された、有効量の５−ＨＴＰ  ＳＲを含む、対象におけるＧＩ状態の影響を治療または軽減するためのキットがさらに提供される。幾つかの実施形態にて、キットは、分泌を促す薬物をさらに含む。幾つかの実施形態にて、キットは、５−ＨＴに伴う吐き気を予防する薬物をさらに含む。幾つかの実施形態にて、キットは、ＳＳＲＩ、または別の抗鬱剤をさらに含む。幾つかの実施形態にて、キットは、刺激薬をさらに含む。幾つかの実施形態にて、キットは、浸透性剤をさらに含む。幾つかの実施形態にて、キットは、バルク緩下剤をさらに含む。
【００２３】
前述の幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰ  ＳＲは、胃保持型剤形である。前述した幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰ  ＳＲは、末梢デカルボキシラーゼ阻害剤をさらに含む胃保持型剤形である。前述の幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰ  ＳＲは、末梢デカルボキシラーゼ阻害剤を、全身的に活性カルビドパ血液レベルを惹起しない低投与量でさらに含む胃保持型剤形である。
【００２４】
前述した幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰは、上部および下部ＧＩに送達される。前述の幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰは腸全体にわたって送達される。
【００２５】
前述した幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰは結腸に特異的に／選択的に送達される。
【００２６】
５−ＨＴＰは、胃腸（ＧＩ）状態の影響を、それらを必要とする対象において、治療または軽減することに使用するために、さらに提供され、医薬は、本明細書にて教示された５−ヒドロキシトリプトファンの徐放性剤形（５−ＨＴＰ  ＳＲ）を含む。
【００２７】
胃腸（ＧＩ）状態の影響を、それらを必要とする対象において治療または軽減するための医薬の調製における５−ＨＴＰの使用も提供され、該医薬は、本明細書にて教示された５−ヒドロキシトリプトファンの徐放性剤形（５−ＨＴＰ  ＳＲ）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】晩期に産生した腸内ニューロンの合計数は、Ｒ４３９Ｈマウスで減少している。（ｎ＝３〜４／群）。ＡＮＮＡ−１の免疫細胞化学的検出が合計ニューロンのマーカーとして使用され、ＧＡＢＡが腸内ＧＡＢＡ作動性のニューロンのためのマーカーとして使用され、ＴＨが腸内ドパミン作動性ニューロンのためのマーカーとして使用された。（Ａ）回腸の腸管筋の網状組織における合計ニューロン（ＡＮＮＡ−１＋）およびＧＡＢＡ作動性のニューロン（ＧＡＢＡ＋）。（Ｂ）回腸の腸管筋の網状組織中における合計ニューロンの比率としてのＧＡＢＡ作動性のニューロン。（Ｃ）回腸の粘膜下組織の網状組織中における合計ニューロンおよびドパミン作動性ニューロン（ＴＨ＋）。（Ｄ）回腸の粘膜下組織の網状組織中における合計ニューロンの比率としてのドパミン作動性ニューロン。（Ｅ）結腸の腸管筋の網状組織中における合計ニューロンおよびＧＡＢＡ作動性のニューロン。（Ｆ）結腸の腸管筋の網状組織中における合計ニューロンの比率としてのＧＡＢＡ作動性のニューロン。（Ｇ）結腸の粘膜下組織の網状組織中における合計ニューロンおよびドパミン作動性ニューロン。（Ｈ）結腸の粘膜下組織の網状組織中における比率としてのドパミン作動性ニューロン。（Ｉ−Ｎ）ＷＴ（Ｉ−Ｋ）およびＲ４３９Ｈ（Ｌ−Ｎ）マウスの回腸からの腸管筋の網状組織。（ＩおよびＬ）合計ニューロン（ＡＮＮＡ−１免疫反応性）。（ＪおよびＭ）ＧＡＢＡ作動性のニューロン。（ＫおよびＮ）合計ニューロンとＧＡＢＡ作動性のニューロンとの間の一致した免疫反応性。（Ｏ−Ｔ）ＷＴ（Ｏ−Ｑ）およびＲ４３９Ｈ（Ｒ−Ｔ）マウスの結腸からの粘膜下組織の網状組織。（ＯおよびＲ）合計ニューロン（ＡＮＮＡ−１免疫反応性）。（ＰおよびＳ）ドパミン作動性ニューロン。（ＱおよびＴ）合計ニューロンとドパミン作動性ニューロンの間の一致した免疫反応性。スチューデントの独立ｔ検定を、群を比較するために使用した。データは平均±ＳＥＭを表す。スケールバー：２５μｍ。
【図２】腸の運動性は、Ｒ４３９ＨではＷＴマウスよりも遅い。（ｎ＝１２〜１４／群；１〜３回の試行）。（Ａ）ＧＩ通過の合計は、インビボでカルミンレッドの経口投与後に測定した。（Ｂ）結腸の運動性は、直腸中に２ｃｍ挿入されたガラスビーズを排出するために要した時間を測定することにより評価した。（Ｃ）胃内容排出および（Ｄ）上部小腸通過を、ローダミンデキストランの経口投与後に蛍光分光法により測定した。（ＥおよびＦ）ＷＴ（Ｅ）およびＲ４３９Ｈ（Ｆ）マウスの結腸の単離された組織標本中でＣＭＭＣ（矢印）を示す空間と時間上のマップ（ｎ＝８〜１０／群）。縦座標は、時間を表し、横軸は口から肛門までの距離を表す。収縮を示す消化管の幅（ｍｍ）に疑似カラー化した。（Ｇ）ビデオ撮像から空間と時間上のマップを構成後、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）２０１３ｂで、ＣＭＭＣ頻度および（Ｈ）ＣＭＭＣ速度を測定した。群を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。データは、平均±ＳＥＭを表す。
【図３】即時型放出５−ＨＴＰ（５−ＨＴＰ  ＩＲ）は、インビボの運動性およびインビトロにおける蠕動の収縮を変調させる。（ｎ＝６〜１０／群）。（Ａ）合計ＧＩ通過を、対照マウスおよび腹腔内５−ＨＴＰ  ＩＲの３０および１００ｍｇ／ｋｇに曝露されたマウスで、カルミンレッドの経口投与後に測定した。（Ｂ）結腸の運動性を、対照マウスおよび腹腔内５−ＨＴＰ  ＩＲの３０および１００ｍｇ／ｋｇに曝露されたマウスにおいて、直腸中２ｃｍに挿入されたガラスビーズを排出するために要した時間を測定することにより評価した。１μＭの５−ＨＴＰ  ＩＲの単回の管腔外投与量を受ける前および受けた後の単離された結腸の連続測定における（Ｃ）ＣＭＭＣ頻度および（Ｄ）ＣＭＭＣ速度（ｎ＝３／群）。１μＭの５−ＨＴＰ  ＩＲの管腔内投与量を受ける前および受けた後の単離された結腸の連続的測定における（Ｅ）ＣＭＭＣ頻度および（Ｆ）ＣＭＭＣ速度（ｎ＝４／群）。（Ｇ−Ｊ）管腔内の５−ＨＴＰ  ＩＲの投与前のＷＴ（Ｇ）およびＲ４３９Ｈ（Ｉ）マウス、および管腔内の５−ＨＴＰ  ＩＲの投与後のＷＴ（Ｈ）およびＲ４３９Ｈ（Ｊ）マウスにおける結腸の単離された組織標本におけるＣＭＭＣ（白色矢印）を示す空間と時間上のマップ。スチューデントの独立ｔ検定および一元配置ＡＮＯＶＡを、群の比較で、単一および複数の手段を比較するためにそれぞれ使用した。データは、平均±ＳＥＭを表す。Ｃｔｒｌ、対照。
【図４】成熟期中における徐放性５−ＨＴＰの投与は、マウスをＲ４３９Ｈ突然変異と関連するＥＮＳ異常から救済する。（ｎ＝３〜４／群）。ＡＮＮＡ−１の免疫細胞化学的検出を、合計ニューロンのマーカーとして使用した。ＧＡＢＡを腸内ＧＡＢＡ作動性のニューロンについてのマーカーとして使用した。ＴＨを腸内ドパミン作動性ニューロンについてのマーカーとして使用した。回腸の腸管筋の網状組織中における（Ａ）合計ニューロン（ＡＮＮＡ−１＋）および（Ｂ）ＧＡＢＡ作動性のニューロン（ＧＡＢＡ＋）。（Ｃ）合計ニューロンの比率としてのＧＡＢＡ作動性のニューロン。回腸の粘膜下組織の網状組織中における（Ｄ）合計ニューロンおよび（Ｅ）ドパミン作動性ニューロン（ＴＨ＋）。（Ｆ）合計ニューロンの比率としてのドパミン作動性ニューロン。（Ｇ−Ｒ）（Ｇ−Ｉ）ＷＴ、（Ｊ−Ｌ）５−ＨＴＰ  ＳＲで治療されたＷＴ、（Ｍ−Ｏ）Ｒ４３９Ｈ、および（Ｐ−Ｒ）５−ＨＴＰ  ＳＲで治療されたＲ４３９Ｈの回腸からの腸管筋の網状組織。（Ｇ、Ｊ、Ｍ、Ｐ）合計ニューロン（ＡＮＮＡ−１免疫反応性）。（Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ）ＧＡＢＡ作動性のニューロン。（Ｉ、Ｌ、Ｏ、Ｒ）合計ニューロンとＧＡＢＡ作動性のニューロンとの間の一致した免疫反応性。一元配置ＡＮＯＶＡおよびフィッシャーのＬＳＤ検定を、群を比較するために使用した。データは平均±ＳＥＭを表す。スケールバー：２５μｍ。Ｖｅｈ、ビヒクル。
【図５】成熟期中における徐放性５−ＨＴＰの投与は、Ｒ４３９Ｈの突然変異と関連する運動性における異常を逆行させる。（ｎ＝１０〜１４／群、１〜３回の試行）。（Ａ）合計ＧＩ通過は、インビボでカルミンレッドの経口投与後に測定した。（Ｂ）結腸の運動性は、直腸中２ｃｍに挿入されたガラスビーズを排出するために要した時間を測定することにより評価した。（Ｃ）胃内容排出および（Ｄ）小腸（上部）通過は、ローダミンデキストランの経口投与後に蛍光分光法により測定した。（Ｅ）ＣＭＭＣ頻度および（Ｆ）ＣＭＭＣ速度は、ビデオ撮像から空間と時間上のマップを構成した後、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）２０１３ｂで測定した（ｎ＝５〜９／群）。（Ｇ−Ｊ）対照の食物を摂取したＷＴ（Ｇ）およびＲ４３９Ｈ（Ｈ）マウス、ならびに５−ＨＴＰ  ＳＲを受けたＷＴ（Ｈ）およびＲ４３９Ｈ（Ｊ）マウスの結腸の単離された組織標本中におけるＣＭＭＣ（矢印）を示す空間と時間上のマップ。縦座標は時間を表し、横軸は口から肛門までの距離を表す。収縮を示す消化管の幅（ｍｍ）を疑似カラー化した。一元配置ＡＮＯＶＡおよびフィッシャーのＬＳＤ検定を、群を比較するために使用した。データは平均±ＳＥＭを表す。Ｖｅｈ、ビヒクル。
【図６】Ｒ４３９Ｈの突然変異は、腸上皮のホメオスタシスの異常なパラメータをもたらすが、それは５−ＨＴＰ  ＳＲの投与により軽減される。（ｎ＝４〜６／群）（Ａ）絨毛の高さは、絨毛の基底から先端までの距離として測定した（３０／マウス）。（Ｂ）陰窩の周長は各陰窩の縁を各絨毛の基底までたどることにより測定した（３０／マウス）。（Ｃ−Ｆ）ＷＴ（Ｃ）、５−ＨＴＰを用いたＷＴ（Ｄ）、５−ＨＴＰを用いたＲ４３９Ｈ（Ｅ）およびＲ４３９Ｈ（Ｆ）マウスにおける個々の絨毛および隣接する陰窩を示すヘマトキシリンおよびエオシンで染色された回腸の切片。（Ｇ）回腸における個々の絨毛の面積の比率としての腸のクロム親和性細胞（ＥＣ；５−ＨＴ＋）のカウント。（Ｈ）回腸における個々の絨毛面積の比率としての腸内分泌細胞（ＥＥ；クロモグラニン−Ａ＋）のカウント。（Ｉ−Ｌ）ＷＴ（Ｉ）、５−ＨＴＰを用いたＷＴ（Ｊ）、５−ＨＴＰを用いたＲ４３９Ｈ（Ｋ）およびＲ４３９Ｈ（Ｌ）マウスにおけるビスベンズイミド（ＤＮＡ；青）および５−ＨＴ（ＥＣ細胞；赤）で染色された回腸の切片。（Ｍ）ＧＡＰＤＨの比率としての回腸におけるＴＰＨ２  ｍＲＮＡの転写物（ｎ＝１４〜２１／群）。（Ｎ）ＧＡＰＤＨの比率としての回腸におけるＳＥＲＴ  ｍＲＮＡの転写物（ｎ＝１４〜２１／群）。一元配置ＡＮＯＶＡおよびフィッシャーのＬＳＤ検定を、群を比較するために使用した。データは平均±ＳＥＭを表す。スケールバー：２５μｍ。Ｖｅｈ、ビヒクル。
【図７】マイクロバイオームのキャラクタリゼーションは、Ｒ４３９ＨマウスとＷＴマウスとの間の非常に重要な相違を明らかにして、それは５−ＨＴＰ  ＳＲ治療で解決した。（Ａ）家族レベルの分析は、ＷＴマウスと比較してＲ４３９Ｈマウスにおける数家族における減少を確認した。特徴：Ａ、アナエロプラズマ科（Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）；Ｂ１、バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）；Ｂ２ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）；Ｃ１、クロストリジウム科＿１（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ  １）；Ｃ２、コリオバクテリア科（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）；Ｄ１、デフェリバクター科（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）；Ｄ２、デスルフォビブリオ科（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）；Ｅ１、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）；Ｅ２、エリュシペロトリクス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）；Ｅ３、ユーバクテリウム科（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）；Ｈ、ヘリコバクテリウム科（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）；Ｌ１、乳酸桿菌科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）；Ｌ２、乳酸桿菌科；Ｍ、マイコプラズマ科（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）；Ｐ１、パスツレラ科（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）；Ｐ２、ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）；Ｐ３、ポルフィロモナス科（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）；Ｐ４、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）；Ｒ１、リケネラ科（Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ）；Ｒ２、ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）；Ｓ、サテレラ科（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）；ＵＡ、未分類アロファプロテオバクテリア綱（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；ＵＢ１、未分類細菌；ＵＢ２、未分類バクテロイデス目（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ）；ＵＢ３、未分類バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）；ＵＢ４、未分類ベータプロテオバクテリア綱（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；ＵＣ１、未分類カンジダタスサッカリバクテリア（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＳａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ）；ＵＣ２、未分類クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）；ＵＣ３、未分類クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）；ＵＤ、未分類デルタプロテオバクテリア綱（Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；ＵＦ、未分類フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）；ＵＰ、未分類プロテオバクテリア門；Ｖ、ヴェルコミクロビア科（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ）。（Ｂ）５−ＨＴＰ  ＳＲ治療後のＲ４３９ＨマウスにおけるＷＴに正常化された数種のＯＴＵ、ポルフィロモナス科、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、およびアッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）における増加、アナエロプラズマ属（Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ）およびクロストリジウム目における減少を含む。（Ｃ）ポルフィロモナス科が、マウスでより遅い結腸の運動性と共に増加した。（Ｄ）増加したアッカーマンシア属は、より遅い合計ＧＩ通過時間と関連した。
【図８】マウスにおけるモルヒネ誘発便秘および５−ＨＴＰによる逆行。モルヒネ１０ｍｇ／ｋｇは、遅らせた結腸の運動性により決定されたように便秘を誘発した。５−ＨＴＰ３０ｍｇ／ｋｇは、モルヒネ誘発便秘を逆行させて、それ自体で結腸の運動性を増強した。＊、ｐ＜０．０５、群の比較を示した。
【図９】結腸の運動性。プルカロプリド対５−ＨＴＰの効果。５−ＨＴＰは、より低い用量でプルカロプリドよりも強い＊、ｐ＜０．０５、対照との比較。＃、ｐ＜０．０５、プルカロプリド対５−ＨＴＰ。
【図１０】ヒト志願者における５−ＨＴＰの経口、結腸内、および静脈内（ＩＶ）投与について時間に対する５−ＨＴＰの血漿濃度のプロットである。経口、結腸内、およびＩ．Ｖ．について、５−ＨＴＰ投与のサブ実験に先立つ平均ベースラインの５−ＨＴＰ血漿レベルは、それぞれ６．７、４．０、および２．８ｎｇ／ｍｌであった。経口５−ＨＴＰ２００ｍｇは、Ｆ＝２０％のバイオアベイラビリティーを有し、および３７０ｎｇ／ｍｌの最高の平均５−ＨＴＰ血漿（ＣＭａｘ）レベルを生じた。結腸内５−ＨＴＰ２００ｍｇは、Ｆ＝４％のバイオアベイラビリティーを有し、４７ｎｇ／ｍｌの最高の平均５−ＨＴＰ血漿（ＣＭａｘ）レベルを生じた。
【図１１】（Ａ）結腸に選択的な５−ＨＴＰ  ＳＲの固体剤形の例の実施形態形の概念図。この実施形態では、投薬形態は、コーティングおよび遅延放出コアの２層からなる。コーティングは、遅延放出コアを腸中の水性相、すなわち糜粥および糞便から隔離することにより、５−ＨＴＰの腸上部への送達がないかまたは最少であることを確実にする。遅延放出コアは、５−ＨＴＰを長期にわたって送達し、それにより持続する薬理学的作用をもたらし、一方で、局所組織のＣＭａｘ５−ＨＴＰ値を低下させることにより有害事象を低減する。コーティング：コーティングは、ｐＨ依存性であってもよく、終端の回腸で起こるようにｐＨ≒７でのみ溶解する。また、時間依存性であってもよく、例えば胃から結腸への典型的な通過時間、３〜５時間かけてゆっくり溶解し；結腸の微生物叢による消化に依存でき；または手法の組合せを利用できる。遅延放出コア：遅延放出コアは、利用可能なマトリックス、浸透性、軟質ゲル、浸食、その他の技術を使用して実現できる。（Ｂ）（Ａ）に示した例の実施形態の薬物送達機能の模式図。コーティングは、胃、空腸、および近位の回腸に本質的にそのままで存在し、実質的に５−ＨＴＰ送達を防止する。終端の回腸、回盲部の接合、盲腸、または結腸においてのみコーティングは、崩壊して、結腸全体にわたる５−ＨＴＰ送達を開始するであろう。（Ｃ）結腸における結腸選択的５−ＨＴＰ  ＳＲの抗便秘薬理学的効果の模式図。便秘した状態で、乾燥した硬い糞便が結腸中に蓄積して、疼痛、膨満、および一般的不快を生じさせる。５−ＨＴＰ送達は、腸のクロム親和性のおよび可能性として他の上皮および非上皮細胞（例えば、ニューロン）により取り込まれて、５−ＨＴに変換される。５−ＨＴが放出されて、平滑筋アクチンおよび流体分泌中に含まれる細胞に局在する５−ＨＴ３、５−ＨＴ４および他の５−ＨＴ受容体に作用して、結腸の運動性および結腸の管腔中への新しい流体分泌の両方を強化する。流体分泌は硬い便を軟化させて、そのことが増強された結腸の運動性により便の排泄を容易にする。したがって、増強された結腸の運動性および流体分泌は、便秘を相乗的に解決する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の開示の原理の理解を助長する目的のために、ここで好ましい実施形態を参照して、それを記載するために特定の言語が使用されるであろう。それにも拘わらず、開示の範囲の限定はこれによって意図されるものではなく、本明細書にて例示した開示の変更およびさらなる変形は、開示が関係する当業者に通常想到するであろうように考慮されていることは理解されるであろう。
【００３０】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では１つまたは１を超える（すなわち少なくとも１つの）冠詞の文法的目的を指して使用される。例として、「要素」は、少なくとも１つの要素を意味して、１を超える要素を含むことができる。
【００３１】
「約」は、与えられた値が、所望の結果に影響することなく、端点の「僅かに上」または「僅かに下」であってもよいことを提供することにより、数の範囲の端点に柔軟性を提供するために使用される。
【００３２】
本明細書にて、「を含む（including）」、「を含む（comprising）」、または「を有する（having）」、およびそれらの変形は、その後挙げられる要素およびそれらの等価物ならびに追加の要素を包含することが意味される。ある要素「を含む（including）」、「を含む（comprising）」、または「を有する（having）」として挙げられた実施形態は、これらのある要素「から本質的になる」および「からなる」とも考えられる。
【００３３】
本明細書における値の範囲の記述は、特に断りのない限り、範囲内に入る各別々の値を個々に指す簡略な方法として役立つことが単に意図されており、恰もそれが本明細書にて個々に挙げられたかのように、各別々の値が本明細書中に組み込まれる。例えば、濃度範囲が１％から５０％と記述されていれば、２％から４０％、１０％から３０％、または１％から３％、その他などの値が、この明細書中で明示的に数え上げられることが意図される。これらは、特に意図されることの一例に過ぎず、数を挙げられた最低の値および最高の値の間のおよびそれらを含む数値および全ての可能な組合せが、本開示で明示的に言明されたと考えられるべきである。
【００３４】
本明細書にて、「治療（treatment）」、「療法（therapy）」および／または「療法投与計画（therapy regimen）」は、患者により顕わされるかまたは患者がかかり得る疾患、障害または生理学的状態に対する応答において行われる臨床的介入を指す。治療の目的は、症状の軽減もしくは予防、疾患、障害、もしくは状態の進行もしくは悪化の遅延もしくは停止ならびに／または疾患、障害もしくは状態の寛解を含む。
【００３５】
用語「有効量」または「治療有効量」は、有益なまたは望ましい生物学的および／または臨床的結果をもたらすために十分な量を指す。
【００３６】
本明細書にて、用語「対象」および「患者」は、本明細書で互換的に使用され、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指す。本開示の用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等を含む。
【００３７】
特に断りのない限り、本明細書にて使用する全ての技術的用語は、本開示が属する当業者により共通的に理解される同じ意味を有する。
【００３８】
ＧＩ障害を効果的に治療するために５−ＨＴＰをいかに使用するかの方法、剤形、または他の詳細について、これまで当技術分野において記載されたことがない。便秘のための既存の５−ＨＴ−刺激薬剤、すなわち５−ＨＴ４受容体アゴニスト（例えばＭｏｔｅｇｒｉｔｙ（登録商標）（プルカロプリド））と対照的に、５−ＨＴＰは、ＧＩ運動性に関与する複数の５−ＨＴ受容体を活性化できる。さらに、５−ＨＴＰは、腸管腔中への流体分泌の強力な誘発因子でもある。それ自体、腸中への増大した流体分泌は、抗便秘効果を発揮するために十分確立されている（例えばＦＤＡにより承認された分泌を促す薬剤Ｌｉｎｚｅｓｓ（登録商標）（リナクロチド）およびＡｍｉｔｉｚａ（登録商標）（ｌｕｂｉｐｒｏｓｔｏｎｅ））。それ故、５−ＨＴＰを主成分とする抗便秘薬剤は、５−ＨＴ４受容体アゴニストよりも強く運動性を刺激しながら、同時に流体分泌を増大させることにより、これらの既存の薬剤より有効であると予測される。
【００３９】
本発明において、ＴＰＨ２をコードする遺伝子におけるある突然変異（例えば、ヒトにおけるＲ４４１Ｈ）を有する対象におけるＴＰＨ２に媒介される５−ＨＴ産生の異常は、ＥＮＳにおける５−ＨＴ欠損から生ずるＧＩ機能における異常の原因となり得ることも示される。これらの異常は、５−ＨＴＰ  ＳＲを用いる機構に導かれる介入により治療され得ることがさらに示される。５−ＨＴＰは、運動性および分泌を強化する一般的活性剤として作用でき、このことは、５−ＨＴにおける異常その他に関係する多くの主要な原因から生ずる便秘を解消すると予測されることがさらに示される。
【００４０】
このように、本発明の一実施形態は、対象における胃腸（ＧＩ）状態の影響を治療または軽減する方法である。この方法は、対象に５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ  ＳＲ）の有効量の徐放性剤形を投与することを含む。
【００４１】
幾つかの実施形態にて、対象は、ヒト、獣医学的動物、および農業用動物からなる群から選択され得る哺乳類である。好ましくは、対象はヒトである。
【００４２】
本明細書にて、「胃腸疾患」、「胃腸状態」または「ＧＩ状態」は、胃腸管が関与する疾患または状態を指す。胃腸状態の例には、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、突発性便秘、便秘が主要素をなす過敏性腸症候群（ＩＢＳ−Ｃ）、短消化管症候群、手術後腸修復、機能性内臓の疼痛、内臓の過敏性、腸内神経系（ＥＮＳ）形成不全、欠陥のある晩発発達ニューロン、異常腸内上皮成長および増殖が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、ＧＩ状態は、便秘が主要素をなす過敏性腸症候群（ＩＢＳ−Ｃ）である。幾つかの実施形態にて、ＧＩ状態は、オピオイド誘発便秘などの薬物誘発性のものである。
【００４３】
幾つかの実施形態にて、ＧＩ状態は、パーキンソン病と関係する便秘である。幾つかの実施形態にて、ＧＩ状態は、精神病と関係する便秘である。幾つかの実施形態にて精神病は鬱病である。幾つかの実施形態にて精神病は自閉症である。
【００４４】
５−ＨＴＰ  ＳＲが治療できる他のＧＩ障害は、減少した腸表面積または正常に機能しない腸内粘膜の増殖により引き起こされるものを含む。そのようなＧＩ障害の例には、短腸症候群、および手術後消化管修復が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
幾つかの実施形態にて、対象はＧＩに５−ＨＴ欠損を有する。幾つかの実施形態にて、対象は、トリプトファンヒドロキシラーゼ２（ＴＰＨ２）をコードする遺伝子における突然変異を有する。ある実施形態では、突然変異は、ヒトではＲ４４１Ｈであり、または他の非ヒト対象者における他の等価の突然変異である。
【００４６】
幾つかの実施形態にて、対象は、ＧＩにおける正常な５−ＨＴ機能を有し、５−ＨＴＰ  ＳＲ治療およびその結果の５−ＨＴ機能の強化が、５−ＨＴと関係しない異常な主要な病原性を相殺する。
【００４７】
本明細書にて、５−ＨＴＰの「徐放性」または「遅延放出」剤形（５−ＨＴＰ「ＳＲ」）とは、５−ＨＴＰを遅い速度で放出する能力を有し、その結果、即時型放出剤形と比較して血漿Ｔ１／２が遅延／延長され、および／もしくはＴＭａｘが減少するか、または即時型放出剤形と比較して血漿ＴＭａｘが遅延するおよび／もしくはＣＭａｘが減少し、一方、治療に有効な５−ＨＴＰ露出の持続時間が長期化される（すなわち、Ｔ１／２が延長される）剤形を指す。好ましい結果は、より優れた臨床的有効性、より優れた安全、および患者のためのより高度の便利さである。用語「５−ＨＴＰ徐放性」、「遅延速度における５−ＨＴＰ」、および「遅延放出における５−ＨＴＰ」および「５−ＨＴＰ遅延放出／５−ＨＴＰ  ＳＲ」は、互換的に使用され、５−ＨＴＰを、すなわち錠剤、溶液、または粉体などの即時型放出形態として直接投与される場合よりも遅い速度で対象に放出する能力を指す。
【００４８】
遅延放出（ＳＲ）剤形５−ＨＴＰは、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの最新版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；２０１１  Ｅｄｉｔｉｏｎ）およびＭｏｄｉｆｉｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｂｏｏｋ  １８４；２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）におけるような当技術分野において知られている剤形化方法によって調製できる。ＳＲ剤形の例には、親油性マトリックス、親水性マトリックス、親油性および親水性混合マトリックス、浸透性、浸食、拡散、軟質ゲル、微粒子、ミクロ錠剤、およびカプセル系が含まれるが、これらに限定されない。結合剤、滑沢剤、潤滑剤、充填剤、抗酸化剤、崩壊剤、着色剤などの適当な賦形剤、およびコーティングを適宜含めることができる。
【００４９】
５−ＨＴＰの結腸選択的送達を達成するために、投薬形態は、前記コーティングが溶解して活性な５−ＨＴＰコアが曝露される前に送達が起こることを防止または阻害するコーティングを含むことができる。活性５−ＨＴＰコアは、均一であるかまたは２層以上を含むかまたは５−ＨＴＰ送達特性が異なる部分区画を含むことができる。露出されると、ＧＩ中の水との接触が５−ＨＴＰの薬物送達の開始の引き金を引く。結腸選択性を付与するコーティングの例には、Ａｍｉｄｏｎ（Ａｍｉｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１５，Ｃｏｌｏｎ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ：ｄｅｓｉｇｎ  ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ  １６（４）：７３１−７４１）に総説されたようなｐＨ依存性コーティング、時間依存性コーティング、および微生物叢依存性コーティングが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの場合に、任意選択的に異なる原理、例えばｐＨおよび時間依存性の両方のコーティングの組合せを使用できる。
【００５０】
ｐＨ依存性コーティングは、メタクリレート、メタクリル酸の誘導体、例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓ−１００；Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓ１２，５；Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＦＳ３０Ｄ；およびＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＦＳ１００などを含むことができる。あるいは、ある種の多糖類を使用できる。これらのｐＨ感受性ポリマーは、通常、終端の回腸でのみ出会うｐＨ＞／＝７で溶解する。したがって、５−ＨＴＰ含有コアは、終端の回腸、盲腸、または結腸でのみ曝露され、該化合物は主としてまたは結腸にのみ送達される。
【００５１】
時間依存性コーティングは、予め特定された速度で、例えば４〜６時間で浸食され、５−ＨＴＰコアを曝露する。腸上部通過時間は通常３〜４時間であるから、送達は、通常結腸で始まるであろう。予測可能な速度で浸食されて、時間依存性送達を可能にするポリマーの例は、ワックス、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびＥｕｄｒａｇｉｔ  ＲＳ１００を含むものの、これらに限定されない。
【００５２】
微生物叢依存性コーティングは、結腸の微生物叢により分泌される酵素により分解されるが、上部ＧＩ系、例えば膵臓により分泌される酵素によっては分解されない材料、通常ポリマー、通常多糖を含む。そのようなポリマーの例はエチルセルロースおよびガラス状アミロースを含むものの、これらに限定されない。
【００５３】
幾つかの実施形態にて送達プロファイルは、実質的に一次、またはゼロ次である。幾つかの実施形態にて送達プロファイルは双曲線状であるか、または１次である。幾つかの実施形態にて、送達開始は、ＧＩ中の水に対する曝露で遅れを示す。５−ＨＴＰ送達の持続時間は、典型的には、約４時間から約２４時間、幾つかの実施形態にて約１２時間、他の実施形態では約４時間から約６時間、幾つかの実施形態にて約６時間から約１２時間であろう。幾つかの実施形態では、約１時間から約４時間などの短い送達プロファイルが望まれるであろう。送達プロファイルは、米国薬局方により特定されるような標準的な方法に従って溶解試験により確立できる。
【００５４】
幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰ  ＳＲは、経口投与により１日に体重１ｋｇ当たり約０．１ｇの速度で対象に投与される。この投与量は、マウスにおいて１日に体重１ｋｇ当たり約１ｇが、ＥＮＳの５−ＨＴ欠陥マウスにおける便秘表現型を解消するであろうという、本明細書に記載の所見に基づくものである。一般的に、マウスとヒトとの間の種間の比例縮小係数は１／１０の範囲内であり、ヒトは、同じ全身的曝露および薬理学的効果を生ずる１ｋｇ当たり１０分の１の薬物の投与量を必要とするであろうということが予測されることが意味される。
【００５５】
幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰ  ＳＲは、１日に体重１ｋｇ当たり約０．０１から０．１ｇの速度で投与される。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰ  ＳＲは、１日に体重１ｋｇ当たり約０．００１から０．０１ｇの速度で投与される。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰ  ＳＲは、１日に体重１ｋｇ当たり約０．０００１から０．００１ｇの速度で投与される。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰ  ＳＲは、１日に体重１ｋｇ当たり約０．００００１から０．０００１ｇの速度で投与される。
【００５６】
幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰの投与される投与量は、経口投薬形態によって５、１０または２５ｍｇから１００、２００、３００または５００ｍｇであってもよい。幾つかの実施形態にて、投与量は１００ｍｇから２５０ｍｇであってもよい。幾つかの実施形態にて、投与量は１０ｍｇから１００ｍｇであってもよい。幾つかの実施形態にて投与量は２５０ｍｇから５００ｍｇであってもよい。幾つかの実施形態にて、投与量は、より高く、例えば、５００ｍｇから１０００ｍｇなどであってもよい。
【００５７】
本発明のさらなる実施形態は、対象における内臓の疼痛を治療する方法である。この方法は、対象に、有効量の５−ＨＴＰ  ＳＲ剤形を投与することを含む。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰ  ＳＲは、刺激反応性腸症候群の診断のために使用される、内臓の疼痛として顕性の内臓の過敏性を治療できる。低い５−ＨＴレベルが、便秘が主要素をなすＩＢＳを有する一部の患者で見出されている（ＩＢＳ−Ｃ）（Ｇｅｒｓｈｏｎ，２０１３ｂ）。５−ＨＴアゴニストが、腸の運動性を増大させて疼痛を低減させることができた方法の１つは、５−ＨＴ４受容体の活性化による。腸中で、５−ＨＴの５−ＨＴ４への結合は、胃腸の運動性の増大を生ずる（Ｓｅｎｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）。脳中で、５−ＨＴ４受容体の活性化は、内臓の過敏性を減少させることが示されている（Ｆａｒｚａｅｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）。５−ＨＴＰ  ＳＲ薬物は、設計に依存して、脳および腸中で利用可能な５−ＨＴを増大させることにより、それによってＧＩ運動性および分泌を増大させることができるだけでなく、内臓の疼痛を軽快させることもできる。
【００５８】
本発明の別の実施形態は、対象における胃腸（ＧＩ）状態の影響または内臓の疼痛を治療または軽減するためのキットである。このキットは、５−ヒドロキシトリプトファンの有効量の徐放性剤形（５−ＨＴＰ  ＳＲ）、ＧＩの状態を治療するための第２の活性剤を、任意選択的にその使用のための使用説明書と一緒に梱包されて含む。
【００５９】
５−ＨＴＰが、５−ＨＴ欠損それ自体は存在しない状態下で、胃の運動性および結腸の運動性を合わせて強く刺激することも、本発明で提供された所見で示される。それ故、腸の運動性を刺激してそれにより、主要な原因とかかわりなく、便秘を解消および治療するであろう５−ＨＴＰの投薬形態が提供される。
【００６０】
変形機構を使用して便秘およびＧＩ障害を治療するために使用され得る、ＧＩ管のある部分を標的として送達される数通りの５−ＨＴＰ  ＳＲ投薬形態を記載して、その限定にならない例を下でさらに提供する。
【００６１】
＜例  ＳＲ剤形１：５−ＨＴＰ胃保持型剤形＞
５−ＨＴＰ胃保持型投薬形態は、胃中に残留して、腸上部による吸収のために５−ＨＴＰを送達するであろう。ここから５−ＨＴＰは、血流により腸内神経系ニューロンおよび空腸、回腸、結腸、および直腸の腸のクロム親和性細胞のニューロン（ニューロンのみ）に運ばれる。これらの細胞は、５−ＨＴＰを５−ＨＴに変換して、それは、細胞外に放出されると、ＧＩの運動性および分泌を強化して、それにより便秘を軽減するであろう。同時に、投与された５−ＨＴＰのかなりの比率、すなわち大部分は、ＧＩ管腔（大部分空腸中の）から、腸のクロム親和性細胞中に、および多分他のタイプの細胞中に直接入り、そこから５−ＨＴＰは５−ＨＴに変換されて、腸上部におけるＧＩの運動性および分泌を強化するように局所的に作用するであろう。したがって、５−ＨＴＰは、血流を通してＧＩ管全体に沿ってニューロン、腸のクロム親和性細胞、および他の細胞に送達されて、同時に管腔から主に腸のクロム親和性細胞およびＧＩ上皮の他の細胞により直接吸収されるであろう。５−ＨＴＰは、ＧＩ管全体に沿って５−ＨＴに変換されるであろう。
【００６２】
膨潤、ブイ、粒子状、磁性、および粘膜付着性系を含むが、これらに限定されない所望の胃保持型送達を生ずるために適当な種々の薬物送達系が存在する。例えば、Ｌｏｐｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１６を参照されたい。
【００６３】
このタイプの剤形は、胃を含むＧＩ管全体に沿って、ＥＮＳおよび腸のクロム親和性細胞で５−ＨＴ機能の広い刺激を提供できる。したがって、この剤形は、ＧＩ管全体にわたる欠陥のある運動性および分泌が存在する状態ならびに病原性を治療することに特に有益であり得る。さらに、ＣＮＳにおいて５−ＨＴシグナル伝達を増強することによっても、中枢鎮痛性の経路が起用され得る。
【００６４】
このタイプの剤形は、鬱病および不安などの気分障害が伴う便秘に特別の関係を有し得る。さらに、この剤形は、軽症の胃アトニーを含むが、これに限定されない損傷された胃機能が関与するＧＩ障害について特別の関係を有し得る。その上、このタイプの剤形は、パーキンソン病を含むが、これに限定されないレボドパ／カルビドパで治療される共存症の障害を有する患者に有利であり得る。
【００６５】
＜例  ＳＲ剤形２：５−ＨＴＰ＋末梢デカルボキシラーゼ胃保持型剤形＞
この胃保持型投薬形態は、胃中に残留して、腸上部による吸収のために５−ＨＴＰ＋末梢デカルボキシラーゼ阻害剤（ＰＤＩ）を送達するであろう。ＰＤＩは、５−ＨＴＰと共に存在する場合、５−ＨＴＰの５−ＨＴへの変換を阻害するかまたは減少させるであろう。ＰＤＩの例は、カルビドパおよびベンセラジドを含むが、これらに限定されない。腸上部から、５−ＨＴＰは、血流により、腸内神経系ニューロンおよび空腸、回腸、結腸、および直腸の腸のクロム親和性細胞のニューロン（ニューロンのみ）に運ばれるであろう。幾つかの実施形態にて、ＰＤＩの投与量は、５−ＨＴへの変換に対して５−ＨＴＰを保護するために、腸上部に局所的にのみ作用するように低く、全身的に薬学的に活性なＰＤＩレベルを生じさせない、すなわち治療中平均で４０ｎｇ／ｍｌ未満のＰＤＩ血漿レベルである。そのような低いＰＤＩ用量は、典型的には、１日に５〜５０ｍｇの範囲内であろう。したがって、５−ＨＴＰは血流を通してＧＩ管全体に沿って、ニューロン、腸のクロム親和性細胞、および他の細胞に送達されるであろう。５−ＨＴＰは、主に上部ＧＩの下方の部分（すなわち、回腸）、結腸、および直腸で５−ＨＴに変換されるであろう。
【００６６】
上で注意したように、膨潤、ブイ、粒子状、磁性、および粘膜付着性系を含むが、これらに限定されない所望の胃保持型送達を生ずるために適当な種々の薬物送達系が存在する。例えば、Ｌｏｐｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１６を参照されたい。
【００６７】
このタイプの剤形は、ＥＮＳおよび主に回腸、結腸、および直腸中の腸のクロム親和性細胞に５−ＨＴ機能の広い刺激を与えることができる。したがって、この剤形は、欠陥のある運動性および分泌が存在する状態および回腸、結腸、および直腸における病原性の治療に特に有益であり得る。さらに、ＣＮＳ中枢における５−ＨＴシグナル伝達を増強することによっても、痛みを与える刺激の経路が束縛され得る。その上、ＰＤＩの封入は５−ＨＴＰのバイオアベイなどのバイオラビリティーを増強し得て、それはより小さい固体投薬形態サイズを可能にして、より高い可能な５−ＨＴＰ血漿レベルおよびより強い薬理学的効果を助長する。
【００６８】
このタイプの剤形は、鬱病および不安などの気分障害に伴う便秘について特別の関係を有し得る。さらに、このタイプの剤形は、一部の患者で起こることが知られている現象であるが、５−ＨＴＰに対する胃または腸上部の感受性を有する対象者に特別の関係を有し得る（ｖａｎ  Ｈｉｅｌｅ，１９８０，ＰＭＩＤ：６９６７１９４）。
【００６９】
＜例  ＳＲ剤形３：５−ＨＴＰの腸送達＞
腸送達の投薬形態は、ＧＩ管の３つの主要なセグメント−空腸、回腸、結腸に沿って５−ＨＴＰを送達する。この事例では、投薬形態は、胃中に保持されず、自由に腸中に移る。投薬形態は、大蠕動により腸を移動して、その間に５−ＨＴＰを送達する。５−ＨＴＰは、管腔から、腸のクロム親和性細胞および他の細胞により取り込まれて、大部分は５−ＨＴに変換され、それは、細胞外に放出されたときに、ＧＩの運動性および分泌を強化するであろう。血流を通してＥＮＳニューロンに送達される５−ＨＴＰは少ないであろう。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰの送達速度は、胃から結腸まで本質的に定常的である。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰの送達は腸に限定され−胃における５−ＨＴの刺激は嘔吐を引き起こすことがあるので回避され（ｖａｎ  Ｈｉｅｌｅ，１９８０）−それはｐＨ感受性腸内コーティングを使用して達成され得る。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰの送達速度は、胃から結腸まで本質的に定常的である。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰ送達は、腸に限定される。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰの送達速度は、腸に限定され、腸全体にわたって本質的に定常的である。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰの送達速度は、投薬形態が結腸に達したら、より高くなる。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰのおよそ２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、空腸および回腸を合わせたよりも結腸に送達される。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰは、全身的な血漿中の５−ＨＴＰレベルが１００ｎｇ／ｍｌ未満であるように送達され、それにより５−ＨＴＰの有意の全身的および／またはＣＮＳ薬理学的作用は回避されるであろう。
【００７０】
マトリックス、粒子状、浸透性、浸食、ゲル、二重層、生分解性、ｐＨ感受性、および時間依存性の放出系を含むが、これらに限定されない所望の管腔内送達プロファイルを生ずるために適当と思われる種々の薬物送達系が存在する。例えば、Ｐａｒｋ、２０１４を参照されたい。
【００７１】
このタイプの剤形は、全身的末梢またはＣＮＳに対する効果がないように、またはより少なくして、ＧＩ中における５−ＨＴ機能の選択的増強を提供できる。このことは、全身的末梢およびＣＮＳ曝露に関係する５−ＨＴＰの有害な効果が最小化されるので、同時の５−ＨＴ作動性薬物治療との（例えば、ＳＳＲＩ、他の抗鬱剤、トリプタンとの）望ましくない相互作用の可能性が低下するであろうことから、有利であろう。さらに、与えられた錠剤の５−ＨＴＰ投与量強度について、５−ＨＴＰ、およびそれ故５−ＨＴの局所濃度は、空腸以降のＧＩセグメントでより高いと思われ、それは強い薬理学的効果を生じ得る。
【００７２】
このようなタイプの剤形は、ＩＢＳ−Ｃ、オピオイド便秘、自閉症における便秘、医学的療法により惹起される便秘を含むが、これらに限定されない複数の主要な原因から生ずる便秘に特別の関係を有することもある。さらに、このタイプの剤形は、５−ＨＴＰが精神医学の、神経の、および鎮痛性治療を含むが、これらに限定されない他の薬物治療と相互作用し得る可能性がある場合に、便秘治療のために特別の関係を有し得る。その上、このタイプの剤形は、空腸または回腸に影響する手術後消化管修復、短腸症候群、小腸運動不全、小腸擬閉塞などのＧＩ障害について特別の関係を有し得る。
【００７３】
＜例  ＳＲ剤形４：５−ＨＴＰの結腸の送達＞
結腸の送達投薬形態は、５−ＨＴＰ（５−ＨＴＰ投与量の実質的に全てのまたは大部分）を結腸にのみ送達する。この事例では、投薬形態は、胃および上部ＧＩを通して移動して、結腸に達したときに、または終端の回腸または盲腸の直前でのみ５−ＨＴＰ送達を開始する。５−ＨＴＰは、管腔から、腸のクロム親和性細胞および他の細胞により取り込まれて、大部分の５−ＨＴＰは５−ＨＴに変換され、それは、細胞外に放出されたときに、ＧＩの運動性および分泌を強化するであろう。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰの送達速度は本質的に定常的である。幾つかの実施形態にて、全身的血漿５−ＨＴＰレベルは、１００ｎｇ／ｍｌ未満であり、それにより５−ＨＴＰの有意の全身的またはＣＮＳの薬理学的作用が回避されるであろう。
【００７４】
５−ＨＴＰ投与量は、全身的５−ＨＴＰ送達と比較して低くでき、幾つかの実施形態にて１日に１ｇ以下、他の実施形態では、１日に０．５ｇ未満、さらに他の実施形態では、１日に０．２５ｇ未満である。幾つかの実施形態にて、５−ＨＴＰの投与される投与量は、１日に５、１０または２５ｍｇから１００、２００、３００または５００ｍｇであってもよい。幾つかの実施形態にて、投与量は、１日に１００ｍｇから２５０ｍｇであってもよい。幾つかの実施形態にて、投与量は１日に１０ｍｇから１００ｍｇであってもよい。幾つかの実施形態にて、投与量は、１日に２５０ｍｇから５００ｍｇであることもある。幾つかの実施形態にて、投与量は、１日に５００ｍｇから１０００ｍｇなど、より高くてもよい。
【００７５】
上でも注意したように、時間依存性放出、ＰＨ感受性、微粒子、プロドラッグ、浸透性、および生分解性系を含むが、これらに限定されない所望の特異的な結腸管腔内送達プロファイルを生ずるために適当な種々の薬物送達系が存在する。例えば、Ａｍｉｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１５；Ｄａｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１７；Ｄｈａｎｅｓｈｗａｒ，２０１４（ＰＭＩＤ：２８２７７８２４；ＰＭＩＤ：２４７０７１３９；ＰＭＩＤ：１７７２５５２４）を参照されたい。
【００７６】
本明細書にて、「結腸選択的」または「結腸特異的」は、互換的に使用されて、投薬形態が結腸に達するまで薬物送達がないか、または実質的に省略されるかのいずれかの薬物送達手法を意味する。結腸選択的薬物は、大てい結腸に局在する炎症性および感染性疾患のために使用される。結腸選択的薬物送達のために最も一般的に使用される手法は、（ｉ）ｐＨ依存性のコーティングポリマー、（ｉｉ）時間依存性手法、および（ｉｉｉ）結腸の微生物叢により分解される多糖、および（ｉｖ）組み合わされた手法（例えばｐＨ応答性＋時間遅延性）が関与する手法に一般的に分けることができる。表１は、結腸選択的剤形手法を使用するＦＤＡに承認された／後期の臨床的段階の経口固体剤形薬剤の非網羅的例を提供する。
【００７７】
【表１】
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結腸選択性は、結腸または終端の回腸でのみ溶解するコーティングを有する固体剤形のｐＨ依存性コーティングにより最も一般的に確保される。これらのコーティングの使用は、腸上部で約ｐＨ＝６から終端の回腸で約ｐＨ＝７．４にｐＨが徐々に上昇するという事実の利点を利用する（Ｆａｌｌｉｎｇｂｏｒｇ，１９９９）。市販のＥｕｄｒａｇｉｔＳ−１００などのメタクリレートを主成分とするポリマーは、ｐＨ＞７で確実に溶解する。錠剤、カプセル、または他の固体剤形をＥｕｄｒａｇｉｔＳ−１００でコーティングすると、投薬形態は、腸中で水性相（糜粥、水、糞便）から遮蔽される。終端の回腸に到達すると、そこでｐＨは通常７を超えて上昇し、ＥｕｄｒａｇｉｔＳ−１００コーティングは崩壊する。このことは、活性化合物を搭載した投薬形態のコアを水性相に曝露して、それが薬物送達を開始させる。
【００７８】
５−ＨＴＰの結腸特異的送達の好ましい一実施形態では、ブデソニドの結腸選択的送達のために米国特許第７４１０６５１号明細書に記載された時間依存性／親水性系と、リファマイシンの結腸選択的送達のために米国特許第８２６３１２０号明細書に記載されたｐＨ依存性／親水性系との組合せを使用する。
【００７９】
結腸特異的剤形は、全身的末梢またはＣＮＳに影響しないかまたは最小限しか影響しないで、結腸における５−ＨＴ機能の選択的増強を提供できる。これは、全身的末梢およびＣＮＳへの曝露に関係する５−ＨＴＰの有害な影響が最小化されて、同時に使用する５−ＨＴ作動性薬物治療との（例えば、ＳＳＲＩ、他の抗鬱剤、トリプタンとの）望ましくない可能性のある相互作用が最小化されるので、有利であろう。さらに、有害事象、例えば、上部ＧＩにおける５−ＨＴ受容体の刺激に関係する吐き気および嘔吐が低下するかまたは最小化されて、安全が改善され得る。その上、与えられた錠剤５−ＨＴＰの投与量強度について、５−ＨＴＰ、およびそれ故５−ＨＴの局所濃度は、結腸でより高く、それはより強い薬理学的効果を生ずることができる。
【００８０】
結腸特異的剤形は、主要な病原性部位が結腸であり、およびＩＢＳ−Ｃ、オピオイド便秘、自閉症における便秘、他の医学的療法により惹起された便秘を含むが、これらに限定されない複数の主要な原因から生じた便秘と特別の関係を有し得るＧＩ障害のために特注される。さらに、このタイプの剤形は、５−ＨＴＰが精神医学の、神経の、および鎮痛性治療を含むが、これらに限定されない他の薬物治療と可能性として相互作用し得る便秘治療について、特別の関係を有し得る。その上、このタイプの剤形は、主として結腸に影響するＧＩ障害、例えば、主要な便秘および突発性便秘などについて特別の関係を有し得る。
【００８１】
本発明を以下の例でさらに説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００８２】
本明細書で示すデータは、以下のことを含む：（ｉ）動物で、５−ＨＴＰは、インビボ（図３Ｂ、図８、および図９）およびエックスビボ（図３Ｃ−Ｊ）で結腸の運動性を強化する。（ｉｉ）動物で、５−ＨＴＰは、特異的５−ＨＴ４受容体アゴニストのプルカロプリド（米国で抗便秘薬Ｍｏｔｅｇｒｉｔｙ（登録商標）として上市されている）と比較して、より高い効力（すなわちより高い最高の効果）およびより高い力価（すなわちより低い用量で活性）で結腸の運動性を強化する（図８）。（ｉｉｉ）遅延放出として投与された５−ＨＴＰは、便秘の自然を模倣する動物モデルにおける便秘だけでなく、便秘で不定期に影響を与えるＧＩの病理学的変化も逆行させる（図１、図３、図４、図５、図６、および図７）。したがって、５−ＨＴＰ  ＳＲは、便秘の原因および症状の両方を治療できる。（ｉｖ）５−ＨＴＰは、オピオイド誘発便秘を逆行させることができる（図８）。（ｖ）ヒトで、５−ＨＴＰは、結腸の腸壁を越える吸収が最少である（図１０）。以前の齧歯類のデータでは、５−ＨＴＰが結腸から実質的に吸収されることが見出されたので、この所見は予想外であった。
【００８３】
［実施例１］：便秘モデルにおける５−ＨＴＰの概念実証研究のマウス試験
（導入）
鬱病および便秘は、国家の人口のそれぞれ８％および２７％に影響する一般的な衰弱させる可能性のある状態である（Ｂｒｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１８；Ｓａｎｃｈｅｚ  ａｎｄ  Ｂｅｒｃｉｋ，２０１１）。該２種の障害は、独立に生じ得るが、鬱病は、しばしば便秘との共存症である。慢性便秘を有する人々における大部分の鬱病の有病率は、３３％と高いことが報告されている（Ｄｉｐｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ，２０１６；Ｈｏｓｓｅｉｎｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。さらに、便秘は、鬱病の個人における主たる共存症である（Ｈｏｓｓｅｉｎｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。
【００８４】
自閉症スペクトル障害、パーキンソン病、およびアルツハイマー病を含む、脳に影響する疾患は、しばしば胃腸（ＧＩ）の乱れと関連する（Ｒａｏ  ａｎｄ  Ｇｅｒｓｈｏｎ，２０１６）。一般的な病理生理学的機構で、これらの状態におけるＧＩおよびＣＮＳ共存症の頻度を説明できる。これは驚くことではなく、その理由は、腸内神経系（ＥＮＳ）の構造がＣＮＳの構造と類似し、該２つの系が多くの同じ神経伝達物質機構を利用するからである（Ｆｕｒｎｅｓｓ，２００８；Ｇｅｒｓｈｏｎ，２０１３ｂ）。その上、ＥＮＳとＣＮＳとが互いに情報交換を行い、担当する神経が疾患伝播のための双方向の導管であり得る。末梢神経系の最大および大部分の複合体単位であるＥＮＳは、ＣＮＳ入力の非存在下でＧＩ行動の調和を保ちつつ独特に調整できるようにするマイクロ回路を含有するが、それにも拘わらず、通常生ずるＣＮＳ−ＥＮＳの相互の情報交換は、該２つの神経系が互いの機能に影響することを可能にする。ＥＮＳ−ＣＮＳ情報交換に関与できるだけでなく、腸内マイクロバイオームが両方に影響することを可能にすることにも関与できる最も重要な分子は、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン；５−ＨＴ）である。
【００８５】
５−ＨＴは、ＣＮＳおよびＥＮＳの両方で神経伝達物質として作用する（Ｇｅｒｓｈｏｎ，２０１３ｂ）。しかし、腸内では、５−ＨＴは、粘膜上皮の腸のクロム親和性（ＥＣ）細胞においても見出される（Ｅｒｓｐａｍｅｒ，１９５３，１９６６）。２種の異なる遺伝子生成物、トリプトファンヒドロキシラーゼ１（ＴＰＨ１）およびトリプトファンヒドロキシラーゼ２（ＴＰＨ２）は、トリプトファンの５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）への変換を触媒し、５−ＨＴＰは芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼにより５−ＨＴに急速に変換される（Ｍａｔｔｈｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｄｅｒ，２０１８）。２種の異なる５−ＨＴの貯留槽は腸中に存在して、大きいＴＰＨ１依存性５−ＨＴは、粘膜の腸のクロム親和性の（ＥＣ）細胞中に溜まり、はるかに小さい方のＴＰＨ２依存性５−ＨＴは、ＥＮＳのセロトニン作動性のニューロン中に溜まる（Ｇｅｒｓｈｏｎ  ａｎｄ  Ｔａｃｋ，２００７）。
【００８６】
腸内５−ＨＴは、パラクリンの、内分泌の、および神経分泌のシグナル伝達に役割を有する多官能性分子である（Ｇｅｒｓｈｏｎ，２０１３ｂ）。ＥＣ細胞からの５−ＨＴの放出は、蠕動および分泌を促す反射運動を刺激して、吐き気および不快などの感覚の情報のＣＮＳへの伝達においても重要である（Ｂｌａｃｋｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｇｒｕｎｄｙ，１９９３；Ｇｒｅｇｏｒｙ  ａｎｄ  Ｅｔｔｉｎｇｅｒ，１９９８；Ｇｒｕｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９４；Ｈａｇｂｏｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｈｉｌｌｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）。対照的に、発達中および成人期においてさえ、ＥＮＳに誘導される５−ＨＴは、ＥＮＳの神経発生を刺激して、晩発発達ニューロン性の細胞亜集団（例えば、ドーパミンおよびＧＡＢＡを発現するニューロン）の増殖を支持する明確な効果を有する（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１１ｂ；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，２００９；Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｃ）。ニューロンの５−ＨＴは、腸粘膜の増殖も促進して、陰窩上皮の細胞増殖を刺激する（Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１２；Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ）。腸内粘膜のおよびニューロンの５−ＨＴは両方共ＧＩの運動性の調節に寄与するが、ニューロンの５−ＨＴは、重要なＧＩ通過において、より顕著な役割を演ずる（Ｈｅｒｅｄｉａ  ｅｔ  ａｌ，２０１３；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１１ａ；Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｒｓｈｏｎ，２０１６ａ；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｇｅｒｓｈｏｎ，２０１５）。５−ＨＴの機能は、腸の局所活性および脳へのシグナル伝達の両方において、気分およびＧＩ運動性に同時に影響し得る脳と消化管との間の双方向の情報交換に関与する可能性を強調している（Ｃｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，２０１５；Ｇａｓｐａｒ  ｅｔ  ａｌ，２００３；Ｋｅｎｄｉｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）。注目に値することとして、ＴＰＨ２は、ＣＮＳに誘導される５−ＨＴ産生のために特に必要とされる（Ｍａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１８；Ｗａｌｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。ＴＰＨ２は、ＥＮＳおよびＣＮＳの両方におけるニューロンの５−ＨＴ生合成のために必須であるので、それは、ＣＮＳおよびＥＮＳの発達および機能を同時に調節する方法に関与するように思われる。
【００８７】
選択的なセロトニン再取込み阻害剤（ＳＳＲＩ）は、鬱病を有する個人のために最初に選ぶべき治療として処方される。ＳＳＲＩはセロトニン再取込み輸送体（ＳＥＲＴ）による再取込みを遮断することにより５−ＨＴの脳細胞外レベルを上昇させて、ＣＮＳにおける利用可能な５−ＨＴの増大をもたらす（Ｓｔａｈｌ，１９９８）。ＣＮＳにおける過剰の５−ＨＴは、順送りで、海馬などの鬱病に関係する領域における神経発生を促進し、このことがその抗鬱効果のための作用の可能性のある機構として仮説が立てられている（Ｗｉｌｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。しかし、ＳＳＲＩ治療は、少数の第３の鬱病の患者においてしか寛解を誘発しない（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ；Ｔｒｉｖｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。さらに、慢性ＳＳＲＩ治療の抗コリン作動性副作用は、便秘を悪化されることもある（Ｍａｒｋｅｎ  ａｎｄ  Ｍｕｎｒｏ，２０００）。したがって、鬱病を有する患者は、限定された治療の選択肢および顕著なＧＩ機能不全にしばしば直面する。
【００８８】
ＴＰＨ２の複数のコード変形が、鬱病を有する個人で過発現している（Ｆａｓｃｈｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１２；Ｋａｒａｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ，２０１７；Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ，２００９；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ａｕｗｅｒａ  ｅｔ  ａｌ，２０１４；Ｗｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１８；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００５；Ｚｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。１つのそのような突然変異、高度に保存されたＡｒｇ４４１がＨｉｓで置き換えられた（Ｇ１４６３Ａ；Ｒ４４１Ｈ）ＴＰＨ２における一ヌクレオチド多型が、鬱病を有しない個人におけるよりもＳＳＲＩ耐性の単極性鬱病を有する患者において１０倍蔓延していることが示された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。Ｒ４４１Ｈ突然変異を宿す一部の個人も、不安と変わらない症状を示す（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。興味あることに、この突然変異を発現する個人も、ＳＳＲＩを用いる治療で悪化した鬱状態を示した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。ＳＥＲＴ拮抗作用がこれらの個人において５−ＨＴ産生を阻害しているかどうかを決定するために、Ｒ４４１Ｈ、Ｒ４３９Ｈに対する類似の突然変異を、トランスジェニックマウスのモデル中にノックインして検査した。Ｒ４３９Ｈマウスは、ＣＮＳ  ５−ＨＴレベルならびに不安および鬱のような行動において６０〜８０％の減少を示した（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１２ａ；Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１２ｂ；Ｓａｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１３ａ；Ｓａｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１３ｂ；Ｓｉｅｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１３；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。したがって、Ｒ４３９Ｈマウスの表現型は、これらの動物におけるＴＰＨ２の大きく減少した活性が正常なＣＮＳの発達および機能のために必要とされる５−ＨＴシグナル伝達に干渉することを示唆する。さらに、ＳＳＲＩ、フルオキセチンを用いるＲ４３９Ｈマウスの治療は、それらの鬱の行動を悪化させてさらなるＣＮＳ  ５−ＨＴレベルの低下を生じさせた。ＴＰＨ２、５−ＨＴおよびＳＥＲＴは、腸にも存在するので、Ｒ４３９Ｈ突然変異は、ＣＮＳだけでなく、ＥＮＳの発達および機能における異常も引き起こすことが可能である。
【００８９】
脳と腸との間の関係は、腸内微生物叢（Ｂｕｒｏｋａｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１５；Ｄｉｎａｎ  ａｎｄ  Ｃｒｙａｎ，２０１７；Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ；Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）、ＥＮＳおよびＣＮＳ発達に影響する腸内の＞１０００億の微生物（Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１５；Ｏｂａｔａ  ａｎｄ  Ｐａｃｈｎｉｓ，２０１６；Ｓａｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｚｍａｎｉａｎ，２０１５）、ＧＩ運動性（Ｑｕｉｇｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｐｉｌｌｅｒ，２０１６；Ｒｅｉｇｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ，２０１５；Ｔｉｇｃｈｅｌａａｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）および気分（Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ａ；Ｙａｒａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）によっても変調され得る。特定の腸細菌と鬱病および／または便秘との間の関連が記載されている（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１５；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１７）（Ｓｔｒａｔｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１７；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１７；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１４；Ｚｏｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１８）。さらに、双方向の関係が、特定の腸内微生物叢、それらの代謝物および５−ＨＴの間に存在し得る（Ｗｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，２００９）（Ｒｅｉｇｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）（Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）（Ｏｌｅｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９８；Ｔｓａｖｋｅｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。それ故、特定の腸内微生物叢は便秘と鬱病のつながりにも役割を演じ得る。
【００９０】
ＴＰＨ２の低い有効性の原因となる遺伝子変形体が、５−ＨＴ機能不全および、最終的に、便秘および鬱病を生じさせるならば、治療のための妥当な手法は、ＴＰＨ２を迂回しながら、消化管におけるＥＮＳおよび非ＥＮＳで５−ＨＴを増大させることであり得る。したがって、本発明者らは、鬱病およびＧＩ異常の両方を効果的におよび同時に首尾よく治療できる新規な治療的手法を明らかにすることを探求した。本発明者らは、５−ＨＴの治療的に関係する前駆体の５−ヒドロキシトリプトファンを考慮した（５−ＨＴＰ）（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ）。急性の補助薬５−ＨＴＰがヒトおよび動物モデルにおいてＳＳＲＩ治療の効果を強化して、ＳＳＲＩ耐性の鬱病におけるＳＳＲＩ治療の効力を改善すること、およびＳＳＲＩ治療中のＴＰＨ２  Ｒ４４１Ｈ保有者に生ずる５−ＨＴ欠損の増悪を予防することが報告されている（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ａ；Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ；Ｎａｒｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，１９８３；Ｓｉｅｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。しかし、急性の補助薬５−ＨＴＰの急速な吸収および排出プロファイルは、有効な治療のために必要な持続する５−ＨＴレベルを維持するその能力を低下させる。
【００９１】
薬物療法設計における最近の進歩は、５−ＨＴＰの徐放性剤形（５−ＨＴＰ  ＳＲ）の製造を可能にした。即時型放出５−ＨＴＰと対照的に、５−ＨＴＰ  ＳＲは、ＳＳＲＩ耐性鬱病の動物モデルでＣＮＳ  ５−ＨＴの治療的に適切なレベルを維持する（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ａ；Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ）。
【００９２】
本発明者らは、試験仮説：（１）鬱病に伴うＴＰＨ２に媒介される５−ＨＴ産生における変化も：（ａ）腸内ニューロンの発達、（ｂ）ＥＮＳに媒介されるＧＩ機能および（ｃ）鬱病および／または便秘を有する個人で示される異常に伴う腸内微生物叢における異常の原因でもある、および（２）これらの異常は、機構に誘導された介入により５−ＨＴＰ  ＳＲを用いて治療できるという仮説を試験した。
【００９３】
本発明者らは、ＳＳＲＩ耐性不安および鬱のような行動を宿すＲ４３９Ｈ動物も、腸内ニューロンの発達、ＧＩ運動性および腸内粘膜の増殖を含むＥＮＳが変調した機能の調節における有意の異常ならびに鬱病および／または便秘を有する個人で見られるこれらとよく似た腸内マイクロバイオームにおける異常を示すことを見出した。驚いたことに、本発明者らは、これらの異常が５−ＨＴＰ  ＳＲで効果的に治療され得ることも見出した。本発明者らの所見は、ＣＮＳの形質発現だけでなく、成人腸の神経構造および長期ＥＮＳに誘導される機能も個体発生中にＴＰＨ２に媒介される５−ＨＴ活性に鋭敏に感受性であること、さらにこれらの異常は、成熟期において５−ＨＴＰ徐放性の新型を用いて逆行させることができることを明らかにする。
【００９４】
（結果）：
腸内ニューロンの数は、発達中のＴＰＨ２活性と関係する。ＴＰＨ２は、ＥＮＳ中で５−ＨＴを合成して、５−ＨＴは、腸内ニューロンの発達を促進する；それ故、本発明者らは、５−ＨＴ産生を減少させるＴＰＨ２  Ｒ４３９Ｈの突然変異は、腸内神経の発生を妨げるという仮説を試験した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１１ａ；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。セロトニン作動性の制御下であることが以前に示された腸内ニューロンおよび後期に発生するニューロンの細胞亜集団の合計数が、１０〜１２週齢でマウスの消化管壁から切除された薄片標本のホールマウントで、免疫細胞化学的に確認され、定量された。セロトニン作動性のニューロンは初期に誕生して、５−ＨＴはチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（ドパミン作動性ニューロン）およびγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１１ａ；Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ）を発現する晩期に産生されるニューロンの発達を増強するので、これらの表現型が研究のために選ばれた。ニューロンの数は、組織の引き伸ばしに比較的耐性であるパラメータである神経節面積の関数として定量した（Ｋａｒａｏｓｍａｎｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）。Ｒ４３９Ｈマウスは、ＷＴ同腹子と比較した。ＧＡＢＡを発現するニューロンは、それらが局在する腸管筋の網状組織で定量したが、それに対して、ＴＨを発現するニューロンは、最も多く見出される粘膜下組織の網状組織で定量した。
【００９５】
合計腸内ニューロンは、ＷＴ同腹子におけるよりもＲ４３９Ｈマウスにおいて有意に少なかった（図１）。この差は、腸管筋の網状組織（図１Ａ：ＷＴの６８．７％±１０．３％、Ｐ＜０．０５、ｎ＝４、ＩとＬとも比較されたい）および回腸の粘膜下組織の網状組織（図１Ｃ：ＷＴの６６．３％±５．０％、Ｐ＜０．０５、ｎ＝３）、および腸管筋の網状組織（図１Ｅ：ＷＴの６１．６％±７．５％、Ｐ＜０．０５、ｎ＝４）および結腸の粘膜下組織の網状組織（図１Ｇ：ＷＴの６０．５％±６．１％、Ｐ＜０．０５、ｎ＝４、ＯとＲとも比較もされたい）の両方で観察された。晩期に産生したニューロンの表現型は合計ニューロンよりも発達中におけるＴＰＨ２活性のレベルに対して感受性が強かったので、したがって選択的に影響されると思われる。Ｒ４３９Ｈマウスでは、腸管筋のＧＡＢＡを発現するニューロンは、絶対数におけるだけでなく（図１Ａ：回腸、ＷＴの１７．２％±６．３％、Ｐ＜０．０００５、ｎ＝４；図１Ｅ：結腸、ＷＴの４９．９％±４．８％、Ｐ＜０．０００５、ｎ＝４）合計ニューロンに対する比率としても（図１Ｂ：回腸、ＷＴにおける８．７％±２．５％に対してＲ４３９Ｈでは２．２％±０．４％、Ｐ＜０．０５、ｎ＝４；図１Ｆ：結腸、ＷＴにおける７．１％±０．１％に対してＲ４３９Ｈでは５．７％±０．５％、Ｐ＜０．０５、ｎ＝４、ＪとＭとも比較されたい）回腸および結腸の両方で不足していた。粘膜下組織のＴＨを発現するニューロンも、回腸（図１Ｃ：ＷＴの７２．６％±２．６％、Ｐ＜０．０５、ｎ＝４）および結腸（図１Ｇ：ＷＴの３５．５％±８．２％、Ｐ＜０．０５、ｎ＝４）において絶対数に不足があったが、しかし、合計ニューロンに対する比率としてのＴＨを発現するニューロンのパーセンテージは、回腸（図１Ｄ：ＷＴにおける２７．３％±１．０％に対してＲ４３９Ｈでは２７．４％±２．４％、Ｐ＝０．９７、ｎ＝４、ＰおよびＳも参照されたい）および結腸（図１Ｈ：ＷＴにおける１０．６％±２．６％に対してＲ４３９Ｈでは５．９％±１．５％、Ｐ＝０．１７、ｎ＝４）で影響されなかった。したがって、Ｒ４３９Ｈ突然変異の発現は、その発達は５−ＨＴに促進される晩期に産生するニューロンの発達／生存の選択的な機能障害を伴う形成不全のＥＮＳをもたらす。
【００９６】
ＴＰＨ２  Ｒ４３９Ｈの突然変異は、遅いＧＩ通過および蠕動の反射運動の機能障害をもたらす。Ｒ４３９Ｈ突然変異と関連する長く続くＥＮＳ形成不全がＧＩ運動性に反映されるかどうかを決定するために実験を行った。１０〜１２週齢のマウスで、ＧＩ通過時間、推進する結腸直腸の運動性、胃内容排出、および腸上部通過の合計をインビボで測定した。さらに、Ｒ４３９Ｈマウスにおける腸通過の変化が、ＥＮＳの固有の欠陥に基づくかどうかを決定するために、結腸の移動する運動筋肉複合体（migrating motor complex）（ＣＭＭＣ；蠕動の反射運動）をインビトロで調べた。消化管の外因性の神経支配は、単離された組織標本、およびＥＮＳに媒介されるＣＭＭＣの固有の回路において切断される（Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）。
【００９７】
合計ＧＩ通過時間（図２Ａ：ＷＴの１２４．１％±６．２％、Ｐ＜０．０１、ｎ＝３７〜３９）、推進する結腸直腸の運動性（図２Ｂ：ＷＴの１２５．９％±９．１％、Ｐ＜０．０１、ｎ＝３２〜４３）、および腸上部通過（図２Ｄ：幾何学的中心として、ＷＴにおける４．３±０．２に対するＲ４３９Ｈにおける３．６±０．２、Ｐ＜０．０５、ｎ＝１３）は、Ｒ４３９ＨマウスではＷＴ同腹子におけるよりも全て有意に遅かった。対照的に、胃内容排出の速度（図２Ｃ：胃内容排出の％として、ＷＴにおける８３．８％±２．３％に対するＲ４３９Ｈにおける７６．８％±２．２％、Ｐ＝０．０６、ｎ＝１３）は、Ｒ４３９ＨおよびＷＴ動物で有意に異ならなかった。
【００９８】
インビトロで運動性を測定するために、結腸の単離された組織標本で管腔内圧力を上げてＣＭＭＣを開始し、組織標本をビデオで撮像して、収縮活性パターンの空間と時間上のマップを構成した（図２Ｅ、２Ｆ）。これらのマップの分析により、ＣＭＭＣ頻度（図２Ｇ：ＷＴにおける０．７１±０．０８ＣＭＭＣ／分に対してＲ４３９Ｈでは０．４９±０．０６ＣＭＭＣ／分、Ｐ＜０．０５、ｎ＝９）および速度（図２Ｈ：ＷＴにおける１．６±０．２ｍｍ／秒に対してＲ４３９Ｈでは１．０±０．１ｍｍ／秒、Ｐ＜０．０１、ｎ＝９）が、Ｒ４３９ＨではＷＴマウスにおけるよりも有意に遅く、一方、伝導長は変化しないことが明らかになった（データ掲載せず）。これらの観察は、Ｒ４３９ＨマウスのＥＮＳ形成不全が蠕動の反射運動の発生および伝導を損なうことを示唆する。
【００９９】
即時型放出（ＩＲ）５−ＨＴＰは、インビボにおける運動性およびインビトロにおける蠕動の収縮を増大させる。Ｒ４３９Ｈの突然変異は、ニューロンの５−ＨＴ産生を減少させる。したがって、神経伝達のために利用可能な５−ＨＴを増大させると、ＥＮＳ発達およびＧＩ機能における欠損を改良できる。５−ＨＴＰは、治療に関係する５−ＨＴ前駆体であり、腸の運動性を増大させることが以前に示されている（Ｂｏｇｄａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，１９５８；Ｂｕｅｎｏ  ａｎｄ  Ｆｉｏｒａｍｏｎｔｉ，１９８２；Ｇｏｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９４；Ｓｃｈｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｅｈｒｌｅｉｎ，１９８６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００７ａ）。５−ＨＴＰがインビボで運動性を増大させることができるかどうか、およびこのことがＥＮＳ刺激によりおこるかどうかを決定するために、本発明者らは、即時型放出５−ＨＴＰ（５−ＨＴＰ  ＩＲ）が増大インビボでＴＧＩＴおよび結腸の運動性ならびに頻度および／またはＣＭＭＣの速度を増大させることができるかどうかを、それぞれ検査した。これらの検討を実行するために、３０および１００ｍｇ／ｋｇ用量の５−ＨＴＰ  ＩＲをＷＴマウスの腹腔内に投与した。５−ＨＴＰ  ＩＲは、インビボにおいてＧＩ通過合計時間を投与量依存性様式で有意に減少させた（図３Ａ：対照における２３８．７±２９．６分に対して３０ｍｇ／ｋｇで７４．９±１９．５分、それに対して１００ｍｇ／ｋｇで２５．４±２．７分、ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１、ｎ＝８〜１０）。さらに、５−ＨＴＰ  ＩＲのどの投与量も結腸のビーズ排出の時間を有意に減少させた（図３Ｂ：対照における２８．５±５．９分に対して３０ｍｇ／ｋｇで７．２±１．６分、それに対して１００ｍｇ／ｋｇでは５．２±１．６分、ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０１、ｎ＝６〜１０）。
【０１００】
５−ＨＴＰ  ＩＲのインビトロにおけるＥＮＳの固有の行動を反映する蠕動の収縮（ＣＭＭＣ）における効果を決定するために、結腸の単離された組織標本を使用して管腔内および管腔外両方に５−ＨＴＰ  ＩＲを投与前および後に、収縮性活性パターンの空間と時間上のマップを発生させた（図３Ｇ−Ｊ）。投与量応答曲線を最初に作成して５−ＨＴＰの投与量を決定した。それによりＧＩ運動性はＲ４３９Ｈマウスでは両方共減少し、ＷＴマウスでは運動性は有意に変化しなかった。本発明者らは、管腔外で５−ＨＴＰ  ＩＲの１μＭ投与量に曝露されたＲ４３９Ｈマウスの結腸で、ＣＭＭＣ頻度（図３Ｃ：ベースラインにおける０．２７±０．０４ＣＭＭＣ／分に対して５−ＨＴＰでは０．７８±０．１８ＣＭＭＣ／分、Ｐ＜０．０５、ｎ＝３）およびＣＭＭＣ速度（図３Ｄ：ベースラインにおける１．０±０．２ｍｍ／秒に対して５−ＨＴＰでは３．２±０．２、Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）は両方共有意に増大したが、一方、ＷＴマウスでは両方のパラメータは変わらないでそのままであることを見出した（図３Ｃ：ベースラインにおける０．７１±０．０６ＣＭＭＣ／分に対して５−ＨＴＰでは０．６０±０．２０ＣＭＭＣ／分、Ｐ＝０．６２、ｎ＝３；図３Ｄ：ベースラインにおける１．８±０．１ｍｍ／秒に対して５−ＨＴＰでは１．４±０．５ｍｍ／秒、Ｐ＝０．４２、ｎ＝３）。同様に、管腔内で５−ＨＴＰ  ＩＲの１μＭ投与量に曝露されたＲ４３９Ｈマウス結腸では、ＣＭＭＣ頻度（図３Ｅ：ベースラインにおける０．４５±０．０９ＣＭＭＣ／分に対して５−ＨＴＰでは１．０２±０．１０、Ｐ＜０．０１、ｎ＝４）およびＣＭＭＣ速度（図３Ｆ：ベースラインにおける１．５±０．２ｍｍ／秒に対して５−ＨＴＰでは２．７±０．２ｍｍ／秒、Ｐ＜０．０１、ｎ＝４）においてその後の増大があった。ＷＴマウスで、両方のパラメータが再び不変であった（図３Ｅ：ベースラインにおける０．９５±０．１４ＣＭＭＣ／分に対して５−ＨＴＰでは０．９０±０．０６ＣＭＭＣ／分、Ｐ＝０．７５、ｎ＝４；図４Ｆ：ベースラインにおける２．６±０．１ｍｍ／秒に対して５−ＨＴＰでは２．３±０．２ｍｍ／秒、Ｐ＝０．２３、ｎ＝４）。これらの観察は、５−ＨＴＰが、合計ＧＩ通過および結腸の運動性を、蠕動の収縮速度および頻度を増大させることにより加速して、その結果、増大したＥＮＳ活性化を反映する機構を通して作用することを示唆する。
【０１０１】
成熟期における徐放性５−ＨＴＰ（５−ＨＴＰ  ＳＲ）の投与は、マウスをＲ４３９Ｈ突然変異と関連するＥＮＳ異常から救済する。５−ＨＴは、５−ＨＴ４受容体の刺激により少なくとも一部で腸内神経発生を増大させる（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。ＴＰＨ２の活性不全が５−ＨＴの有効性を低下させることにより腸内神経発生を妨げるなら、ＴＰＨ２のための基質ではなく、ＳＥＲＴにより速やかに不活性化することもない外部から供給される５−ＨＴの供給源で、この欠陥を解消しなければならない。５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）は、５−ＨＴのレベルを上昇させ得る５−ＨＴ前駆体である（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ａ）。しかし、ＳＥＲＴによる５−ＨＴＰの急速な吸収および放出は、補助薬５−ＨＴＰの治療的に関係するレベルを維持する能力に干渉する。５−ＨＴＰ  ＳＲは、ＣＮＳ中の５−ＨＴＰ濃度、ならびに鬱病の治療効力を、マウスモデルで有意に増強する。それ故、本発明者らは、５−ＨＴＰ  ＳＲの経口投与がＧＩの神経構造における異常も矯正して、その結果として、Ｒ４３９ＨマウスにおけるＥＮＳに媒介される欠損を改善するであろうという考えを試験した。５−ＨＴＰ  ＳＲを、粉末状形態で、マウスの食物中に組み込んだ。マウスは、以前記載されたように、およそ１ｇ／ｋｇ／日（１グラムの食物中に６．７ｍｇの５−ＨＴＰ）（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ）を６−７週齢で開始して４週間受けた。
【０１０２】
Ｒ４３９Ｈマウスでは、４週間の５−ＨＴＰ  ＳＲが、腸管筋の網状組織（図４Ａ：ＷＴの％として、Ｒ４３９Ｈにおける６８．７％±１０．３％に対してＲ４３９Ｈで５−ＨＴＰを用いて１２５．７％±９．９％、Ｐ＜０．０１、ｎ＝４、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．００５）および回腸の粘膜下組織の網状組織（図４Ｄ：ＷＴの％として、Ｒ４３９Ｈにおける６６．３％±５．０％に対してＲ４３９Ｈで５−ＨＴＰを用いて１０４．３％±９．３％、Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０５）の両方で合計ニューロンに生じた形成不全（ＡＮＮＡ−１−免疫反応性）を改良した。５−ＨＴＰ  ＳＲ治療も、Ｒ４３９Ｈが関連する欠損を、腸管筋のＧＡＢＡを発現するニューロン（図４Ｂ：ＷＴの％として、Ｒ４３９Ｈにおける４６．５％±１２．９％に対してＲ４３９Ｈで５−ＨＴＰを用いて１２７．６％±１７．５％、Ｐ＜０．０１、ｎ＝４、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０１）およびドパミン作動性ニューロンの絶対数で逆行させた（ＴＨ−免疫反応性；図４Ｅ：ＷＴの％として、Ｒ４３９Ｈにおける７２．６％±２．６％に対してＲ４３９Ｈで５−ＨＴＰを用いて１１１．６％±７．０％、Ｐ＜０．００５、ｎ＝４、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０５）。さらに、Ｒ４３９Ｈマウスにおける５−ＨＴＰ  ＳＲ治療は、腸管筋の網状組織中のＧＡＢＡを発現するニューロンの比率を増大させた（図４Ｃ：Ｒ４３９Ｈにおける２．２％±０．４％に対してＲ４３９でＨ５−ＨＴＰを用いて５．２％±１．０％、Ｐ＜０．０５、ｎ＝４、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０５）が、一方、腸管筋の網状組織中のドパミン作動性ニューロンの比率は影響されなかった（図４Ｆ：Ｒ４３９Ｈにおける２７．４％±２．４％に対してＲ４３９Ｈで５−ＨＴＰを用いて２７．３％±２．３％、Ｐ＝０．９９、ｎ＝３、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．６５）。ＷＴ同腹子における５−ＨＴＰ  ＳＲ治療は、腸管筋中のニューロン（図４Ａ：ＷＴの％として、ＷＴにおける１０１．１％±３．９％に対してＷＴで５−ＨＴＰを用いて９４．６％±８．８％、Ｐ＝０．５３、ｎ＝４）または粘膜下組織の網状組織中の合計ニューロン（図４Ｄ：ＷＴの％として、ＷＴにおける１００．０％±５．９に対してＷＴで５−ＨＴＰを用いて１０２．２％±８．１％、Ｐ＝０．８４、ｎ＝３）、腸管筋の網状組織中のＧＡＢＡ作動性のニューロン（図４Ｂ：ＷＴの％として、ＷＴにおける１００．０％±１０．８％に対してＷＴで５−ＨＴＰを用いて８６．７％±１３．３％、Ｐ＝０．４７、ｎ＝４）、粘膜下組織の網状組織中のドパミン作動性ニューロン（図４Ｅ：ＷＴの％として、ＷＴにおける１００．０％±７．８％に対してＷＴで５−ＨＴＰを用いて９４．７％±９．２％、Ｐ＝０．６８、ｎ＝４）の合計ニューロンの数に影響せず、合計ニューロンに対する比として、ＧＡＢＡ作動性のニューロン（図４Ｃ：ＷＴにける８．７％±２．６％に対してＷＴで５−ＨＴＰを用いて５．６％±０．４％、Ｐ＝０．２７、ｎ＝４）またはドパミン作動性ニューロン（図４Ｆ：ＷＴにおける２７．３％±１．０％に対してＷＴで５−ＨＴＰを用いて２４．５％±１．６％、Ｐ＝０．２０、ｎ＝３）の比率にも影響しなかった。
【０１０３】
５−ＨＴＰ  ＳＲ投与に伴った腸管筋のおよび粘膜下組織の網状組織中のニューロンの数の正常化を、Ｒ４３９Ｈ−関連する合計ＧＩ通過時間の遅延からの救済（図５Ａ：ＷＴの％として、Ｒ４３９Ｈにおける１２４．１％±６．２％に対してＲ４３９Ｈで５−ＨＴＰを用いて１０１．５％±５．１％、Ｐ＜０．０１、ｎ＝２７〜３７、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．００１）および結腸の運動性（図５Ｂ：ＷＴの％として、Ｒ４３９Ｈにおける１２５．９％±９．１％に対してＲ４３９Ｈで５−ＨＴＰを用いて９８．９％±９．０％、Ｐ＜０．０５、ｎ＝２５〜３２、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０５）と組ませた。対照的に、５−ＨＴＰ  ＳＲは、胃内容排出（図５Ｃ：胃内容排出％として、Ｒ４３９Ｈにおける７８．８％±１．７％に対してＲ４３９Ｈで５−ＨＴＰを用いて７９．９％±３．６％、Ｐ＝０．５７、ｎ＝１３、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．０８）または腸上部通過（図５Ｄ：幾何学的中心として、Ｒ４３９Ｈにおける３．８±０．２に対してＲ４３９Ｈで５−ＨＴＰを用いて４．４±０．４、Ｐ＜０．０５、ｎ＝１３、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．２１）に影響しなかった。ＷＴ同腹子における５−ＨＴＰ  ＳＲ治療は、合計ＧＩ通過（図５Ａ：ＷＴの％として、ＷＴにおける１００．０％±５．８％に対してＷＴで５−ＨＴＰを用いて９３．１％±４．０％、Ｐ＝０．３６、ｎ＝３０〜３９）、結腸の運動性（図５Ｂ：ＷＴの％として、ＷＴにおける９６．２％±４．６％に対してＷＴで５−ＨＴＰを用いて１０１．６％±９．１％、Ｐ＝０．５６、ｎ＝２７〜４３）、胃内容排出（図５Ｃ：胃内容排出の％として、ＷＴにおける８４．３％±１．３％に対してＷＴで５−ＨＴＰを用いて７７．４％±３．７％、Ｐ＝０．０６、ｎ＝１０）、または腸上部通過（図５Ｄ：幾何学的中心として、ＷＴにおける４．３±０．１に対してＷＴで５−ＨＴＰを用いて４．３±０．５、Ｐ＝０．５７、ｎ＝１１）に有意には影響しなかった。
【０１０４】
インビボにおける運動性の５−ＨＴＰ  ＳＲに媒介される救済も、インビトロで測定されたＣＭＭＣの正常化で明らかである。５−ＨＴＰ  ＳＲ治療は、ＣＭＭＣ頻度におけるＲ４３９Ｈ−関連する減少（図５Ｅ：Ｒ４３９Ｈにおける０．４８±０．０４ＣＭＭＣ／分に対してＲ４３９Ｈで５−ＨＴＰを用いて０．６４±０．０７ＣＭＭＣ／分、Ｐ＜０．０５、ｎ＝７、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０５）および増殖の速度（図５Ｆ：Ｒ４３９Ｈにおける１．０±０．１ｍｍ／秒に対してＲ４３９Ｈで５−ＨＴＰを用いて１．５±０．３ｍｍ／秒、Ｐ＜０．０５、ｎ＝７、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０１）を正常化した。空間と時間上のマップを図５Ｇ−Ｊに示した。５−ＨＴＰ  ＳＲを用いるＷＴ同腹子の治療は、ＣＭＭＣ頻度も（図５Ｅ：ＷＴにおける０．６８±０．０５ＣＭＭＣ／分に対してＷＴで５−ＨＴＰを用いて０．７３±０．０６ＣＭＭＣ／分、Ｐ＝０．７８、ｎ＝５）またはＣＭＭＣ速度も（図５Ｆ：ＷＴにおける１．６±０．１ｍｍ／秒に対してＷＴで５−ＨＴＰを用いて１．８±０．１ｍｍ／秒、Ｐ＝０．３３、ｎ＝５）有意には変化させなかった。これらのインビトロにおける観察は、５−ＨＴＰ  ＳＲにより誘発されたＧＩ運動性の正常化がＥＮＳ機能の正常化に基づくものであることを示唆する。
【０１０５】
Ｒ４３９Ｈ突然変異は、減少した絨毛高さおよび陰窩周長をもたらし、それは５−ＨＴＰ  ＳＲの投与により軽快する。５−ＨＴシグナル伝達のＴＰＨ２調節は、上皮の均衡にとって重要である。ＥＮＳ、特に５−ＨＴは、粘膜の維持に関連付けられ（Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）、腸管筋のセロトニン作動性のニューロンは一過性増幅細胞（ｔｒａｎｓｉｔ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）の増殖を調節する粘膜下組織のコリン作動性ニューロンを神経支配する。結果として、細胞増殖指数、陰窩深さおよび絨毛高さは、ＷＴマウスにおけるよりもＳＥＲＴＫＯにおいて全て大きく、ＴＰＨ２ＫＯマウスにおいては不足している（Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。粘膜よりもむしろニューロンの５−ＨＴがこれらの効果を媒介することが示されている（Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。それ故、本発明者らは、Ｒ４３９Ｈマウスにおける絨毛高さおよび陰窩周長を構造的に同時に５−ＨＴＰ  ＳＲを用いて長期治療後に比較した（図６）。腸上部における絨毛高さおよび陰窩周長は、ＷＴと比較してＲ４３９Ｈマウスで有意に減少した（図６Ａ：ＷＴの８６．２％±１．２％、Ｐ＜０．０００１、ｎ＝４〜５、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１；図６Ｂ：ＷＴの８９．２％±１．６％、Ｐ＜０．０００１、ｎ＝４〜５、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）。５−ＨＴＰ  ＳＲを用いて治療するとＲ４３９ＨおよびＷＴマウスの両方で絨毛高さが増大した（図６Ａ：ＷＴで５−ＨＴＰを用いてＷＴの１０５．５％±０．９％、Ｐ＜０．０１、ｎ＝４−５；Ｒ４３９Ｈで５−ＨＴＰを用いてＷＴの９３．７％±１．０％、Ｒ４３９Ｈに対してＰ＜０．０００１、ｎ＝４〜５）。さらに、Ｒ４３９Ｈマウスにおいて、５−ＨＴＰを用いる治療は腸上部陰窩の周長を増大させたが（図６Ｂ：Ｒ４３９Ｈで５−ＨＴＰを用いてＷＴの９５．７％±１．２％、Ｒ４３９Ｈに対してＰ＜０．０１、ｎ＝４〜５）、一方、５−ＨＴＰを用いて治療されたＷＴマウスでは陰窩周長に差はなかった（図６Ｂ：ＷＴの１００．１％±１．３％に対してＷＴで５−ＨＴＰを用いて、Ｐ＝０．９７、ｎ＝４〜５）。これらのデータは、絨毛および陰窩の測定もＴＰＨ２ＫＯマウスで有意に減少したことを示す以前の報告と一致する（Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。代表的絨毛および陰窩を図６Ｃ−Ｆに示す。
【０１０６】
細胞系統に対するＲ４３９Ｈ突然変異の影響もある。興味あることに、ＥＣ細胞の相対密度および腸内分泌細胞（ＥＥ）の細胞クラス全体の相対密度は、ＷＴマウスにおけるよりもＲ４３９Ｈにおいて有意に少なかった（図６Ｇ：ＷＴにおける６９．８±７．４細胞／ｍｍ２に対してＲ４３９Ｈでは４９．４±５．１細胞／ｍｍ２、Ｐ＜０．０５、ｎ＝４〜５、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０５；図６Ｈ：ＷＴにおける１０４．１±９．４細胞／ｍｍ２に対してＲ４３９Ｈでは７７．１±９．１細胞／ｍｍ２、Ｐ＜０．０５、ｎ＝４〜５、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０５）。ＥＣ細胞の相対密度は、Ｒ４３９Ｈマウスで５−ＨＴＰ  ＳＲの長期投与後に有意に増大したが（図６Ｇ：Ｒ４３９Ｈで５−ＨＴＰを用いて６９．７±８．１細胞／ｍｍ２に対してＲ４３９Ｈでは４９．４±５．１細胞／ｍｍ２、Ｐ＜０．０５、ｎ＝４〜５）、一方、薬物を受けたＷＴマウスで変化はなかった（図６Ｇ：ＷＴで５−ＨＴＰを用いて５７．６±５．９細胞／ｍｍ２に対してＷＴでは６９．８±７．４細胞／ｍｍ２、Ｐ＝０．２０、ｎ＝４〜５）。しかし、５−ＨＴＰ  ＳＲを用いる治療は、ＷＴにおいても（図６Ｈ：ＷＴで５−ＨＴＰを用いて１０１．６±７．９細胞／ｍｍ２、Ｐ＝０．８４、ＷＴに対して、ｎ＝４〜５）またはＲ４３９Ｈマウスにおいても（Ｒ４３９Ｈで５−ＨＴＰを用いて７９．９±７．６細胞／ｍｍ２、Ｐ＝０．８２、Ｒ４３９Ｈに対して、ｎ＝４〜５）いずれもＥＥ細胞の相対密度に対して効果を有しなかった。腸上部における腸のクロム親和性細胞の５−ＨＴで標識された代表的染色を、図６Ｉ−Ｌに示す。これらの所見は、５−ＨＴＰ  ＳＲ投与後にＥＣおよびＥＥ細胞数において見られる変化が５−ＨＴＰ  ＳＲを受けたＷＴマウスで見出されなかったので、細胞系統が、利用可能な５−ＨＴにおける増大に応答することを停止する５−ＨＴのレベルがあり得るという考えと矛盾しない。
【０１０７】
５−ＨＴＰ  ＳＲの長期投与の前および後に、Ｔｐｈ２およびＳＥＲＴの転写は、Ｒ４３９Ｈマウスで変化した。Ｒ４３９Ｈマウスの活性不全のＴＰＨ２が、Ｔｐｈ２、ＳＥＲＴおよびＤＡＴの転写を変化させたかどうかを決定するために実験を実施した。Ｒ４３９Ｈマウスの腸において、ＴＰＨ２をコードする転写物は、ＷＴ動物のこれらのものと構造的に有意に異ならなかった（図６Ｍ：ＷＴの１５０％±２２％、Ｐ＝０．０９、ｎ＝１８〜２１、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００５）。対照的に、５−ＨＴＰ  ＳＲを４週間受けたＲ４３９ＨマウスおよびＷＴマウスの腸上部では、ＴＰＨ２をコードする転写物が、５−ＨＴＰ  ＳＲを受けたＷＴマウスで有意に減少した（図６Ｍ：ＷＴの４４％±９％、Ｐ＜０．０５、ｎ＝１４〜２１）が、５−ＨＴＰ  ＳＲを受けたＲ４３９Ｈマウスでは変化しなかった（図６Ｍ：ＷＴの２０１％±３８％、Ｐ＝０．２４に対してＲ４３９Ｈ、ｎ＝１５〜１８）。さらに、５−ＨＴＰ  ＳＲを受けたＲ４３９Ｈマウスは、ＷＴ対照マウスまたは５−ＨＴＰ  ＳＲを受けたＷＴマウスのいずれよりも、有意に大きいレベルのＴＰＨ２転写物を有した（図６Ｍ：ＷＴの２０１％±３８％、Ｐ＜０．０５、ＷＴに対して、Ｐ＜０．０００６、ＷＴに対して５−ＨＴＰを用いて、ｎ＝１４〜２１）。
【０１０８】
ＴＰＨ２と対照的に、ＳＥＲＴ転写物数は、ＷＴマウスと構造的に比較して、Ｒ４３９Ｈマウスにおいて有意に低かった（図６Ｎ：ＷＴの４５％±５％、Ｐ＜０．０００５、ｎ＝１７〜２３、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）。興味あることに、ＳＥＲＴ転写のレベルは、Ｒ４３９Ｈマウスで５−ＨＴＰ  ＳＲの長期投与後に変化しなかったが（図６Ｎ：Ｒ４３９ＨにおけるＷＴの４５％±５％に対してＲ４３９Ｈで５−ＨＴＰを用いてＷＴの６７％±１０％、Ｐ＝０．０７、ｎ＝１７〜１８）、一方、同様な期間、薬物を受けたＷＴマウスでは、レベルが有意に増大した（図６Ｎ：ＷＴで５−ＨＴＰを用いてＷＴの１５２％±１３％、Ｐ＜０．０１、ＷＴに対して、ｎ＝１９〜２３）。これらの所見は、ＳＥＲＴがＲ４３９Ｈマウスでは５−ＨＴの減少したレベルに対する応答で減少して、５−ＨＴＰ  ＳＲを受けたＷＴマウスでは増大したことが示されたので、ＳＥＲＴは、利用可能な５−ＨＴレベルに対する応答で調節されるという考えと矛盾しない。ＤＡＴは、任意の群で有意に異なることが見出されなかった（示していない）ことは、それがＲ４３９Ｈマウスに存在する減少したレベルのＳＥＲＴ転写を補償するために増大することはないことを示す。
【０１０９】
Ｒ４３９Ｈマウスの腸内マイクロバイオームにおける異常は、便秘および／または鬱病を有する個人で見られるこれらの異常を模倣する。ＧＩマイクロバイオームは、気分およびＧＩ運動性における変化と関連付けられてきており、したがって、鬱病と便秘との間の重要なリンクであり得る。それ故、本発明者らは、５−ＨＴＰ  ＳＲ治療を受けた、および受けなかったＲ４３９ＨおよびＷＴマウスからの糞便の詳細な配列決定を実施した。マイクロバイオームの評価の後、どのような特定の微生物叢が運動性または神経構造のパラメータにおける変化と関連するかを決定するために、統合的分析を実施した。全ての群の間の細菌の多様性に関して、有意性の差は観察されなかった（示していない）。全てのマウス中の腸内マイクロバイオームは、主として、バクテロイデス門、フィルミクテス門、およびプロテオバクテリア門で構成されていた。科レベルの分析（図７Ａ）は、５ＨＴＰ  ＳＲの投与後に回収されたＷＴと比較して、Ｒ４３９Ｈマウスにおける数通りの科において減少を示した。アナエロプラズマ科（ｐ＝０．０００３９）は、Ｒ４３９Ｈマウスでは増大し、５−ＨＴＰ  ＳＲを受けた後、ＷＴマウスと一致するレベルに減少した（補足。図１）。さらに、ＷＴと比較してＲ４３９Ｈで最初は減少したが、５−ＨＴＰ  ＳＲ投与後にＷＴレベルに増大した科は：乳酸桿菌科（ｐ＝０．０３１）、ポルフィロモナス科（ｐ＝０．０４）、サテレラ科（ｐ＝０．００４５）、およびヴェルコミクロビア科（ｐ＝０．００１６）を含む（図７Ｂ、補足  図１）。関係するこれらの差に寄与するＯＴＵには、数タイプのポルフィロモナス科（ＯＴＵ＿２［ｐ＝０．０００３９］、ＯＴＵ＿１３［ｐ＝０．００２８］、ＯＴＵ＿１８［ｐ＝０．００１２］、およびＯＴＵ＿９３［ｐ＝０．００１２］）、ラクノスピラ科（ＯＴＵ＿１５［ｐ＝０．００１３］およびＯＴＵ＿１８８［ｐ＝０．００１１］）、アナエロプラズマ科（ＯＴＵ＿９９（ｐ＝０．０００１２）、およびヴェルコミクロビア科（ＯＴＵ＿３１（ｐ＝０．００３２）（図７Ａ、Ｂ、補図１）が含まれた。注目されるが、最も顕著な所見は、全ての他の群と構造的に比較して、Ｒ４３９Ｈマウスにおけるヴェルコミクロビア門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）の著しく減少した存在量であった（ｐ＝０．００１７）。アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）と同定されるＯＴＵ＿３１は、ヴェルコミクロビア門、特にヴェルコミクロビア科の存在量で観察される差に、単独で且つ重大に寄与する（図７Ａ、Ｂ）。
【０１１０】
特定の微生物叢、ＥＮＳ神経構造およびＥＮＳ機能の間の関連を評価するために、綜合的分析を実施した。科レベルの分析により、結腸の運動が遅いマウスにおけるポルフィロモナス科（ｐ＝０．００７）およびサテレラ科（ｐ＝０．０３８）の増大が明らかになった（図７Ｃ）。遅れるＧＩ通過時間の合計は、ヴェルコミクロビア科、特にアッカーマンシア種（Ａｋｋｅｒｍａｎｉｓａ  ｓｐ．）の増大に向かう傾向と関連した（ｐ＝０．０５８）（図７Ｄ）。腸内ニューロン数における正常性は、ポルフィロモナス科（ｐ＝０．０９３）、ステレラ科（ｐ＝０．１１）、およびヴェルコミクロビア科（ｐ＝０．１０）を含む数通りの科で増大に向かう傾向と一致して観察されたが、これらのいずれも有意性に達しなかった（示していない）。
【０１１１】
（方法：）
動物。ＴＰＨ２  Ｒ４３９Ｈマウスは、前に記載されたように（Ｂｅａｕｌｉｅｕ  ｅｔ  ａｌ，２００８）１２９Ｓ６／ＳｖＥｖバックグラウンドで生まれた。マウスは、Ｍａｒｃ  Ｃａｒｏｎの実験室（デューク大学医学部：Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から得られて、コロンビア大学医学センター（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）で飼育された。実験は、確認されたホモ接合ＷＴおよびＲ４３９Ｈ同腹子で実施した。以前、脳および行動の検討のためにＲ４３９ＨおよびＷＴマウスで行われたように（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ）、徐放性（ＳＲ）５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ  ＳＲ）（≒１ｇ／ｋｇ／日；１グラムの食物中に６．７ｍｇ５−ＨＴＰ）を、動物に約６〜１０週間、５−ＨＴＰ  ＳＲを受けない対照マウスと同じ食物で投与した。動物実験は、ＩＡＣＵＣ  ｏｆ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒによって承認された。
【０１１２】
免疫細胞化学。組織試料を収集して、０．１Ｍリン酸緩衝ホルムアルデヒド（４％；ｐＨ７．４；パラホルムアルデヒドから）１．５時間固定して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。腸管筋のおよび粘膜下組織の網状組織を、消化管壁の薄片からなる組織標本のホールマウントで検査した。使用された方法は、本発明者らの実験室で前に記載した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１１ａ；Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ）。正常ウマ血清（１０％、室温で３０分間）を、組織標本をブロックするために使用して、次にそれを、全て以前の刊行物で利用した（Ｂｏｎｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）一次抗体に曝露した（ＡＮＮＡ、ＴＨ、ＧＡＢＡ；４℃；４８〜７２時間）。ニューロンのマーカーＡＮＮＡ−１、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、およびγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の免疫反応性を、局在化して、ドパミン作動性およびＧＡＢＡ作動性の腸内ニューロンの合計の存在量を定量化した（Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ）。結合した一次抗体を、コントラストをつける蛍光団で標識された適当な種特異的二次抗体を用いて可視化した（Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ  ３５０、４８８、または５９４；１：２００に希釈）。組織標本を洗浄して（ＰＢＳ）、アルカリ性グリセリン（６６％；ｐＨ８）にマウントし、冷却されたＣＣＤカメラで像を得て、コンピューターを利用して分析した（Ｖｏｌｏｃｉｔｙ  ６．０ソフトウェア、Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。標識された細胞の数を数えるために、コンピューター制御された運動筋肉駆動のステージを使用して精査し、１０ｍｍ面積の全体に及ぶ×２０対物レンズで像を集めた。集められた像をコンピューター処理して（Ｖｏｌｏｃｉｔｙ  ６．０  ソフトウェア）、各タイプの免疫反応性細胞の数を推定した（神経節面積の１平方ミリメートル当たりの細胞）。
【０１１３】
結腸の推進力。マウスをイソフラン（Ｂａｘｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で麻酔して、ガラスビーズ（直径３ｍｍ）を、火で平滑にしたガラス棒で肛門を通して結腸中に肛門の縁から２ｃｍの距離に押し込んだ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。マウスがビーズを排出するために要した時間を決定して、インビボにおける結腸直腸の推進力を推定するために使用した。
【０１１４】
合計胃腸通過時間。合計ＧＩ通過時間を研究するために、吸収され得ない０．５％メチルセルロースに懸濁されたカルミンレッド（３００μｌ、６％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、胃管栄養により投与した。合計ＧＩ通過時間は、胃管栄養と便中のカルミンレッドの出現との間の間隔と考えた（Ｋｉｍｂａｌｌら、２００５）。
【０１１５】
胃内容排出および腸上部通過。動物を寝藁のないケージ中で終夜絶食させた。水を実験の３時間前に引き去った。ローダミンＢデキストランを含有する溶液（１００μｌ；２％メチルセルロース中に１０ｍｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、各マウスに、胃管栄養により２１−ゲージの丸い先端の給餌注射針を通して投与した。動物を、胃管栄養の１５分後に殺害して、胃、腸上部、盲腸、および結腸を０．９％ＮａＣｌ中に収集した。腸上部を等長の１０セグメントに分割して、結腸（全部回収されたローダミンＢ蛍光を得るために使用した）を半分に分割した。次に、各組織片を４ｍｌの０．９％ＮａＣｌを含有する１４ｍｌチューブ中に移して、均質化して遠心分離し（２０００×ｇ）、透明な上清を得た。ローダミンの蛍光を上清の１ｍｌアリコートで測定した（ＶｅｒｓａＦｌｕｏｒ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。胃を空にして出したローダミンＢデキストランの比率を、［（全部回収された蛍光−胃中に残る蛍光）／（全部回収された蛍光）］×１００として計算した。腸上部通過を、腸上部におけるローダミンＢデキストランの幾何学的中心の位置により推定した。腸上部の各セグメント（１−１０）について、幾何学的中心（ａ）を、以下のように計算した：ａ＝（各セグメント中の蛍光×セグメントの数）／（腸上部で回収された合計蛍光）（Ｌｉら、２０１１ａ）。全体の幾何学的中心はΣである（各セグメントのａ）。全体の幾何学的中心値は、１（最低の運動性）と１０（最高の運動性）との間に分布する。
【０１１６】
インビトロにおける結腸の移動する運動筋肉複合体（ＣＭＭＣ）のパターン測定。全結腸（５〜６ｃｍ）を取り出してマウントし、自発的筋肉運動のパターンが空間と時間上のマップの構造としてビデオ撮像されることを可能にする（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ，２００８；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。単離された結腸をクレブス’溶液中で内蔵糞便のペレットが排出されるまでインキュベートした。空の結腸に両端でカニューレ処置して、水平な浴槽（ｏｒｇａｎ  ｂａｔｈ）にマウントし、管腔および漿膜区画の両方に酸素化されたクレブス溶液を３５℃で注いだ。経口カニューレに接続された貯蔵器の高さを調節して管腔内圧力を＋２ｃｍＨＯに維持した。肛門のカニューレには最大２ｃｍの背圧を提供した。収縮活性を消化管より７〜８ｃｍ高く位置したＬｏｇｉｔｅｃｈ  Ｑｕｉｃｋｃａｍプロカメラで撮像した。組織標本を３０分間平衡させて１５分で４回ビデオで捉えた。結腸の近傍−遠方長に沿った各点における直径の空間と時間上のマップを作図してＣＭＭＣの頻度ならびにそれらの伝播の速度および長さを定量化するために使用した（Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ；Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）。ＣＭＭＣは、組織標本の長さの少なくとも５０％に伝播する腸の直径の収縮と定義した。ＩＲ  ５−ＨＴＰを利用する検討のために、投与量応答曲線を作成して、それにより、単離された結腸を、管腔内および管腔外の両方で１から１０μＭの範囲の５−ＨＴＰの濃度に曝露した。
【０１１７】
転写物の定量。ＲＮＡを抽出し、それをｃＤＮＡに逆転写して、転写物の存在量をリアルタイムＰＣＲで定量化するために使用される方法は、以前記載された（Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。簡単に述べると、ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）で組織から抽出して、デオキシリボヌクレアーゼＩ（１Ｕ／ｍＬ）で処理した。β−アクチンのためのプライマーを利用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＤＮＡ汚染の非存在を確認した。逆転写酵素（高容量ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を使用して１μｇの試料を相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換した。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＴＰＨ２、ＳＥＲＴ、およびＤＡＴをコードするメッセンジャーＲＮＡを定量した。各々の発現をグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現に正規化した。プライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。リアルタイム反応は、ｃＤＮＡ（５．０μｌ）、サイトカイン／ケモカイン／標準のためのプライマー（２５０ｎｍｏｌ）、ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（１２．５ｍｌ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、およびヌクレアーゼを含まない水（６．２５ｍｌ）を使用した。ＧｅｎｅＡｍｐ７５００配列検出系（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｃＤＮＡレベルを定量化した。２連で２分間５０℃でインキュベートして、１０分間９５℃で変性させ、６０℃で２０秒間のアニーリング、６０℃で１分間延長、および９５℃で１５秒間変性の４０サイクルにかけた。ＴａｑＭａｎ７５００ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）をデータ分析のために使用した。
【０１１８】
粘膜維持のパラメータ。結腸および腸上部のセグメントを、上で記載したように終夜室温で固定した。固定された組織をパラフィンに包埋して、１０μｍで切片にして、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。コンピューターを利用した撮像で（Ｖｏｌｏｃｉｔｙ  ６．０ソフトウェアおよびＩｍａｇｅＪ２．０ソフトウェア）絨毛高さおよび陰窩周長を測定した（Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。絨毛（＞３０／マウス）は、中央乳糜管が完全に可視化されたときに測定した。絨毛面積は、ＩｍａｇｅＪのポリゴントレースツールを使用して手動で定量した。陰窩（＞３０／マウス）は、陰窩−絨毛接合が陰窩の両側で可視化できたときに分析した（Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ）。陰窩の周長は、ＩｍａｇｅＪの自由形線トレーシングツールを使用して、２本の絨毛間の各陰窩の縁に沿う長さから測定した。
【０１１９】
上皮の染色。腸のクロム親和性細胞を、５−ＨＴ（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ、１：１０００）で免疫染色した後定量した（Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ）。腸内の分泌細胞を、クロモグラニンＡで染色した後定量した（Ａｂｃａｍ；１：１０００）（Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ）。コンピューターを利用する撮像を使用してＥＣ（５−ＨＴ＋）細胞およびＥＥ（クロモグラニンＡ＋）細胞の存在を定量化した。結合した一次抗体を、コントラストをつける蛍光団（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒＴＭ３５０、４８８、または５９４；１：２００に希釈）で標識された適当な種特異的二次抗体で可視化した。
【０１２０】
マイクロバイオームのキャラクタリゼーションのための便収集。新鮮便の５〜７個のペレットを、綿を先端に付けたアプリケーターを用いた簡単な直腸刺激の後収集した。ペレットを直ちに−８０℃で凍結して処理を行うまで保存した。
【０１２１】
マイクロバイオームのキャラクタリゼーション。凍結した便検体を氷上で解凍し、０．０１〜０．０２ｇをＭＯ  ＢＩＯ  ＰｏｗｅｒＢｅａｄチューブ（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）に加えて、穏やかな均質化のために１５分間ボルテックス処理した。引き続き材料を、標準ＭＯ  ＢＩＯ  ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ抽出キットプロトコル（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により処理した。生じた核酸の内容の量および質をＮａｎｏｄｒｏｐ−１０００およびＱｕｂｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、デラウェア州）によって確認した。１６ＳリボソームＲＮＡの遺伝子のＶ４領域の増幅および配列決定を、ＮＥＸＴｆｌｅｘ  １６Ｓ  Ｖ４  Ａｍｐｌｉｃｏｎ−Ｓｅｑキット２．０（Ｂｉｏｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｕｓｔｉｎ、テキサス州）を使用して２０ｎｇの投入量のＤＮＡで実施して、配列をＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットホーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、カリフォルニア州）上に発生させた。配列データを、前に記載されたように（Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）、ＬｏｔｕＳパイプラインを通して処理した。簡単に説明すると、リードを分離して、ペア化された終端を綴じた。クオリティフィルタリングを実施した後、ＵＰＡＲＳＥアルゴリズムの修正版（Ｅｄｇａｒ，２０１３）を使用して操作的分類単位（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｕｎｉｔ）（ＯＴＵ）クラスタリングを行った。試料当たり２８，４７６配列の中央値（標準偏差±９３８８）が、その後の分析に含まれた。分類の帰属を、分類子（ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）としてＲＤＰおよび選択されたデータベースとしてＳＩＬＶＡを用いて実施した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００７ｂ）。可能性として種レベルに分類された生物体は、有意性のある個々のＯＴＵに基づいた。界レベルで細菌として分類に成功しなかったＯＴＵを除去した後、さらに分析した。
【０１２２】
統計分析。マイクロバイオーム分析の例外について全て検討するために、スチューデントの対応のないまたは対応のあるｔ検定およびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの補正のある一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、それぞれ、単独および複数の手段を比較した。０．０５未満のＰ値を有意と考えた。マイクロバイオームを検討するために、ＣａｌｙｐｓｏをＯＴＵの可視化および統計分析のために使用して、累積の合計の尺度化およびｌｏｇ２変換を実施した後さらに分析した（Ｐａｕｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１３；Ｚａｋｒｚｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１７）。主成分分析を使用して群間の全体的な差を可視化した。群（Ｒ４３９Ｈ、ＷＴ、Ｒ４３９Ｈ＋５−ＨＴＰ  ＳＲ、ＷＴ＋５−ＨＴＰ  ＳＲ）の間の比較を、ＯＴＵレベルを含む種々の分類レベルで行った。有意のＯＴＵの代表的配列についての分類の帰属を手動のデータベースの調査および整合により確認した。それに加えて、綜合的分析を実施してニューロンのカウントおよびＧＩ運動性のパラメータに関して評価した。複数の群の比較のために、変動の分析を実施し、２群間の比較のためにＷｅｌｃｈのｔ−検定を実施した。Ｐ値とピアソンの相関を、ＯＴＵおよび代謝物について、ＲＳｔｕｄｉｏ（ＲＳｔｕｄｉｏ、Ｂｏｓｔｏｎ、マサチューセッツ州）を使用して計算した。過誤発見率を制御するためにＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ方法を用いて複数の試験についてＰ値を修正した。
【０１２３】
（考察）
ＴＰＨ２  Ｒ４４１Ｈは、単極性の、重症鬱病を有する個人で過発現しているＳＮＰである（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。ＴＰＨ２  Ｒ４３９Ｈマウスは、鬱病の特徴と広くアラインメントする行動を示し（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００５）、鬱病に対する５−ＨＴシグナル伝達異常の寄与の可能性を分析するためのモデルとしてのＲ４３９Ｈマウスの使用を支持する。腸の問題は、鬱病を有する個人について最も共通的な愁訴の中に含まれる（Ｈｏｓｓｅｉｎｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。同様に、機能性便秘を有する患者の３分の１までが鬱病を患う（Ｄｉｐｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）。ＴＰＨ２は、それにＲ４４１Ｈ突然変異がある場合には、５−ＨＴの産生にとっての有効性は６０〜８０％少ないので、しかもＴＰＨ２は、ＣＮＳに影響するだけでなく、ＥＮＳ発達にも影響するので、本発明者らは、ＴＰＨ２の低効率はＣＮＳ発達および機能における異常の原因になるだけでなく、ＴＰＨ２  Ｒ４３９ＨマウスにおけるＥＮＳ構造および機能においても異常の原因になるであろうと仮定した。本発明者らの仮定を調べるために、本発明者らは個体発生中および生涯を通じてＴＰＨ２が機能不全であるＲ４３９Ｈマウスを包括的に分析して、それらをそれらのＷＴ同腹子と比較した。
【０１２４】
Ｒ４３９Ｈマウスでは、ＥＮＳが極端に形成不全であった。ニューロンの数が上部の腸および大腸の両方の網状組織で減少して、個体発生中（ＴＨまたはＧＡＢＡを発現する）にセロトニン作動性のニューロンの後に発生したニューロンは、ＥＮＳのニューロンよりも一般的に不完全であった。これらの観察は、Ｒ４３９Ｈマウスにおける５−ＨＴの減少した産生に基づく欠陥のある５−ＨＴシグナルの伝達が腸内の神経発生に干渉するという考えと矛盾しない。晩期に産生するニューロン（特にＧＡＢＡ）のＴＰＨ２活性に対する感受性は、早期に産生するセロトニン作動性のニューロンが腸内の神経発生を調節して、したがって、ＥＮＳを形作ることを助けるという考えと矛盾しない。これらの観察により、５−ＨＴはＥＮＳ増殖因子であること、およびセロトニン作動性のシグナル伝達は正常な神経発生のために必須であることが確認される（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１１ａ；Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ）。データも、ＥＮＳおよびＣＮＳに共通の欠陥が鬱病における共存症のＧＩ乱れの原因であり得るという仮説と矛盾しない。
【０１２５】
Ｒ４３９ＨマウスにおけるＧＩ運動性は、インビボ（遅延するＧＩ通過時間の合計、腸上部通過および結腸の通過）およびインビトロ（ＣＭＭＣの伝導の減少した速度、頻度、および長さ）の両方で損なわれた。ＥＮＳ依存性である（Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）ＣＭＭＣは、Ｒ４３９Ｈ腸の単離された組織標本で欠陥があるので、筋肉運動の異常性は、したがって、ＥＮＳの固有の性質である。これを考慮することは重要であり、その理由は、ＴＰＨ２におけるこのグローバルな欠陥は、ＣＮＳにおよびＥＮＳにも同様に影響するからである。したがって、Ｒ４３９ＨマウスのＥＮＳ形成不全は、直接、機能に影響を有し、したがって、治療的介入のための目的であり得る。
【０１２６】
ＴＰＨ２は、陰窩上皮の細胞の増殖および粘膜の維持の調節に非常に重要な役割を演ずることが、以前に示されている（Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。腸管筋のセロトニン作動性のニューロンは、粘膜にムスカリン様入力を提供する粘膜下組織のコリン作動性ニューロンを神経支配して、それは、順送りで上皮の増殖ならびに絨毛および陰窩の増殖を刺激する（Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。したがって、ＴＰＨ２の低効率は粘膜下組織のシナプスにおける５−ＨＴの作用を低下させ、それは絨毛高さおよび陰窩周長を間接的に減少させる。これらの差に伴うことは、幹細胞系統における異常である。Ｒ４３９Ｈマウスは、ＥＥ細胞およびＥＣ細胞の数において減少を示した。これらのデータは、発達中における減少したＴＰＨ２活性に基づくＥＮＳ形成不全は、生涯を通じて粘膜の維持を損なうことを示唆する。
【０１２７】
Ｒ４３９Ｈの突然変異は、５−ＨＴ産生の減少を生じさせるので、神経伝達のために利用可能な５−ＨＴを増大させれば、ＥＮＳ発達および機能における欠損を改良できる。しかし、ＳＳＲＩ投与でＳＥＲＴ拮抗作用によって５−ＨＴレベルを上げると、Ｒ４３９Ｈマウスにおける鬱の行動が悪化し、およびＣＮＳ  ５−ＨＴレベルがさらに減少した。ＳＳＲＩ耐性鬱病の動物モデルで、５−ＨＴＰ  ＳＲは、ＣＮＳの５−ＨＴ治療に関係するレベルを維持することが見出された（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ａ；Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ）。したがって、本発明者らは、５−ＨＴＰ  ＳＲは、ＴＰＨ２の低効率と関連するＥＮＳ異常も治療する有効な治療剤として利用され得るという仮説を試験した。本発明者らは、即時型放出と違って、急速に５−ＨＴに変換されず、したがって、不活性化が早すぎることがない、５−ＨＴＰの新規な徐放性剤形を利用した（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ａ；Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ）。さらに、５−ＨＴＰ  ＳＲはＳＥＲＴと拮抗しないので、それは、Ｒ４３９ＨマウスにおけるＥＮＳに関連する欠陥を悪化させるはずがない。５−ＨＴＰ  ＳＲは、事実、Ｒ４３９Ｈ異常を克服して、ＥＮＳ形成不全、晩期に発達するニューロンの欠損、インビボにおけるＧＩの遅い通過、インビトロで生じたＣＭＭＣにおける欠損ならびに腸内上皮の増殖における異常を逆行させた。
【０１２８】
マイクロバイオームは、気分、ＧＩ運動性および脳−消化管軸情報交換との関連が増大してきた。したがって、本発明者らは、糞便の微生物叢を評価して、鬱病および／または便秘を有する患者ならびに５−ＨＴＰ  ＳＲを用いる治療の後で正常化したこれらの群で示されるこれらを模倣する微生物集団を同定した。本発明者らは、主要な鬱障害および／または便秘を有する個人で変化が見出された３通りの特定の微生物科を同定した（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１５；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１７）（Ｓｔｒａｔｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１７；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１７；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１４；Ｚｏｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１８）。これらの細菌は、ヴェルコミクロビア門、フィルミクテス門、およびバクテロイデス門由来、および特にウェルコミクロビア科、ラクノスピラ科、およびポルフィロモナス科由来であった。これらの科は、Ｒ４３９ＨとＷＴマウスの間で有意に異なり、さらに、５−ＨＴＰ  ＳＲ治療の後、Ｒ４３９ＨマウスにおけるレベルはＷＴのレベルに正常化された。ヴェルコミクロビア科、アッカーマンシア属に関しては、事実において、５−ＨＴＰ  ＳＲを用いなかったＲ４３９Ｈマウスには全く存在しなかった。興味あることに、アッカーマンシア属は結腸の通過時間と正に相関して（Ｖａｎｄｅｐｕｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）、その結果、低レベルのアッカーマンシア・ムシニフィラは、便秘ならびにＩＢＳ−Ｃと関連して、便秘治療で増大することが示された（Ｇｏｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）。
【０１２９】
クロストリジウム目、特にラクノスピラ科を含むこの目は、ＩＢＳ−Ｃと相関することが最近示された（Ｇａｒｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１８；Ｔａｐ  ｅｔ  ａｌ，２０１７）。さらに、ラクノスピラ科は、亜慢性のおよび緩和な社会的敗北のストレスに曝露された動物で増大したことが示され、Ｒ４４１Ｈの突然変異を有するヒトで見られる不安、別の形質において、この科に何らかの役割がある可能性があることを示す（Ａｏｋｉ−Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）。ポルフィロモナス科は、微生物叢が枯渇したラットにおける鬱の表現型と関連していた（Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ａ）。これらの関連は細菌により産生された代謝物の結果または５−ＨＴホメオスタシスに対するそれらの影響であり得る。例えば、クロストリジウム属は、ＳＥＲＴレベルならびに５−ＨＴ合成に影響する可溶代謝物の産生を変化させることにより５−ＨＴシグナル伝達を変調でき（Ｒｅｉｇｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ，２０１５；Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）、便秘した固体から糞便の微生物叢移植を受けたマウスは腸蠕動における低下を示して、それはクロストリジウム綱のレベルの変化、ＳＥＲＴ発現の増大および結腸の組織中における５−ＨＴ含有率の減少を伴った（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１７）。
【０１３０】
マウスへの５−ＨＴＰ  ＳＲの全身投与は、薬物の作用は腸内神経発生の直接刺激に由来するという絶対的結論を排除するが；これはありそうに思われ、５−ＨＴの腸内神経発生に対する寄与と矛盾しない。それでも、成熟マウスにおけるＲ４３９Ｈが関連するＥＮＳニューロンの形成不全およびその結果を修正する５−ＨＴＰ  ＳＲの目覚ましい能力は、ＴＰＨ２は、５−ＨＴに助長される神経発生において重要な役割を演ずるという考えを支持し、およびＲ４３９Ｈマウスに見られる欠損は、事実において、これらのマウスが発現する低効率のＴＰＨ２により産生される、減少したレベルの内因性ＥＮＳに誘導された５−ＨＴに基づくという全体的仮説も支持する。
【０１３１】
鬱病および便秘は、一般的で、コストが高く、高罹患率が関連する病態である（Ｂｒｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１８；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。その上、２つの状態の共起が多く、罹患した人々の生活の質を、単独のどちらの状態よりも大きく低下させる（Ｄｉｐｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ，２０１６；Ｈｏｓｓｅｉｎｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。さらに、鬱病の薬理学的治療は、しばしばＧＩ機能不全の悪化の原因となり得る（Ｍａｒｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。これらの問題にも拘らず、２つの状態をつなぐ可能性のある因子について、またはどのように２つの状態を同時に有効な様式で治療するかについて比較的少ししか理解されていない。
【０１３２】
このモデルは、便秘および鬱病を有するヒトに存在する行動、消化管および腸内微生物の表現型の表面および構造の妥当性を有する本発明者らの知識にとって最も重要なものであり、および本発明者らがこれらの異常の各々にシグナル伝達する５−ＨＴの寄与を評価すること、さらに、５−ＨＴＰ（ＳＲ）の剤形を便秘および鬱病の同時治療で試験することを可能にした。したがって、このデータは、５−ＨＴ、および特に５−ＨＴ感受性神経の発生経路における欠陥が、脳および腸の両方に影響する病態における行動および腸内異常の底流となり得るという考えを支持する文献（Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ｂ）の拡大する主要部に重要な洞察を付け加える。将来のヒトの研究は、この特定の突然変異がヒトで共存する鬱病および便秘の原因となることを確認することが求められる。しかし、ＴＰＨ２における遺伝子変形は、鬱病の個人を評価するヒトの検討において一貫して注目されてきており、僅かな研究が行われているが、可能性としてＩＢＳにおいても同様に認識され始めており、この可能性をより見込みのあるものにする（Ｆａｓｃｈｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１２；Ｊｕｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｋａｒａｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ，２０１７；Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ，２００９；ＶａｎｄｅｒＡｕｗｅｒａ  ｅｔ  ａｌ，２０１４；Ｗｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１８；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００５；Ｚｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。
【０１３３】
刺激的にも、本発明者らの成人モデルで５−ＨＴＰ  ＳＲが、脳、行動、ＥＮＳおよび一部の微生物異常を正常化した。５−ＨＴＰ  ＳＲが、ヒトにおける鬱病および便秘の同時治療のための新規な助けになる治療的手法にもなり得るかどうかは、さらに研究を必要とする。
【０１３４】
（参考文献）
【０１３５】
［実施例２］：ヒトの５−ＨＴＰの胃腸領域の吸収の研究
複数の以前の臨床的検討は、５−ＨＴＰは腸上部により容易に吸収されて、十分な程度に薬学的に活性な全身的５−ＨＴＰレベルを生じさせることを報告している（Ｌｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ，２００６；Ｍｅｌｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８４；Ｓａｒｇｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）。結腸による５−ＨＴＰの吸収について臨床的研究の報告は公開されていない。しかし、１つの齧歯類の研究が、５−ＨＴＰが結腸および腸上部により均等に十分に吸収されたことを報告した（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６ａ）。
【０１３６】
ヒトの胃腸の５−ＨＴＰの吸収を以下の研究で試験した。
【０１３７】
（方法）
ヒトにおける無制限のおよび局所の腸の５−ＨＴＰのバイオアベイラビリティーの決定。
【０１３８】
５−ＨＴＰの投薬：
５−ＨＴＰの遊離の基剤形態を使用した（５−ＨＴＰは＞１０ｍｇ／ｍＬの水溶解度を有する）。
結腸内：５−ＨＴＰの遊離の基剤の生理食塩水溶液２００ｍｇ。
静脈内：５−ＨＴＰの遊離の基剤の生理食塩水溶液５０ｍｇ。
経口／上部ＧＩ：１００ｍｇ５−ＨＴＰの遊離基剤の５−ＨＴＰゼラチン錠剤２錠（２００ｍｇの合計投与量）。
【０１３９】
対象者：健常な男性および女性志願者、１９から２８のボディーマス指数（ＢＭＩ）を有する１８から６５歳が研究のために適格であった。対象者は、５−ＨＴＰ投与の２時間前に医学研究ユニット（ＩＭＵ）に入院して血液サンプリングの後で安全アセスメントのためにＩＭＵに２４時間とどまった。
【０１４０】
研究の順序：全ての対象者（ｎ＝１２）は、３回の時機に５−ＨＴＰｍｇを受けた。（１）結腸内視鏡で結腸内に２００ｍｇの５−ＨＴＰ溶液。（２）静脈内５０ｍｇ（ＩＶ）。（３）上部ＧＩ（経口）に５−ＨＴＰ２００ｍｇ。各訪問間に少なくとも６日空けた。
【０１４１】
血漿試料分析：血漿試料を、５−ＨＴＰ投与後２４時間にわたって収集した。血漿試料は、分析まで−８０℃で貯蔵した。５−ＨＴＰおよび代謝物５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）を質量分析計検を備えた液体クロマトグラフィーにより定量した。
【０１４２】
データ分析：ＰＫデータを区画されない（ＮＣＡ）および区画された（混合効果）数学的モデル化手法を使用して分析し、各対象について各５−ＨＴＰ投与について５−ＨＴＰ血漿曲線の曲線下面積（area 5-HTP plasma under the curve）（ＡＵＣ）を計算した。このデータを、５−ＨＴＰの絶対バイオアベイラビリティー（Ｆ）および相対上部ＧＩ管―結腸バイオアベイラビリティー（ＲＢＡ）のデータを、下に提供した式に従って計算するために使用した。
【０１４３】
（結果）
上記の種々の投与経路による５−ＨＴＰのヒトバイオアベイラビリティーを、ヒト対象者に、５−ＨＴＰをこれらの種々の経路を通して投与することにより確立して、その結果生じた５−ＨＴＰ血漿レベルを種々の時点で定量した。全てのヒト対象者は、３通りの投与経路の各々により別々の日に５−ＨＴＰを受けた。５−ＨＴＰ定量のための血漿試料は、選択された時点で２４時間収集された。結果を図１０に示す。
【０１４４】
図１０から、各投与経路について曲線下面積（ＡＵＣ）が得られ、次に、それを使用して経口および結腸経路の投与の絶対バイオアベイラビリティー（Ｆ）を計算した。例えば、経口経路（ｐｏ）により投与された薬物についてＦを計算するための式は、下で与えられる（Ｄは投与量である）：
【数１】
2021530494.tif 000005
【０１４５】
同様な式を、結腸の投薬後の絶対バイオアベイラビリティーを決定するために使用した。経口投薬についてのＡＵＣは、１５０５（ｈ＊ｎｇ／ｍｌ）であり、結腸の投薬について、それは３１２（ｈ＊ｎｇ／ｍｌ）であり、および静脈内投薬についてそれは２０４２（ｈ＊ｎｇ／ｍｌ）であり、それらの値は、経口および結腸のバイオアベイラビリティーを提供するために、下で示すように使用した。
【０１４６】
【数２】
2021530494.tif 000006
【０１４７】
上の計算に基づいて、経口経路を通す絶対５−ＨＴＰバイオアベイラビリティーはＦ＝２０％（上部ＧＩ管）であったが、結腸への投薬からの５−ＨＴＰの絶対バイオアベイラビリティーはＦ＝４％であった。経口：結腸の相対バイオアベイラビリティー（ＲＢＡ）は以下のように計算した。
【数３】
2021530494.tif 000007
【０１４８】
したがって、
【数４】
2021530494.tif 000008
【０１４９】
上で計算されたように、上部ＧＩ管：結腸の相対バイオアベイラビリティーは２０％であった（結腸の絶対バイオアベイラビリティーの４％に対応する）。
【０１５０】
（考察）
これらのデータは、結腸への５−ＨＴＰ送達で、全身的循環中への吸収は最少であり、全身的５−ＨＴＰの最大でも最小の増大しか生じさせず、それ故、非ＧＩ末梢器官中および脳中における５−ＨＴ合成の増大は最小になるであろうことを示す。実際、最高の５−ＨＴＰ血漿レベルは、５−ＨＴＰ２００ｍｇを結腸に投与した後に観察され、それでも約４０〜５０ｎｇ／ｍｌで、治療されていないヒトにおけるベースラインで観察される範囲内であった（Ｃｏｍａｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１０）。これは、５−ＨＴＰが腸上部に送達されるときと対照的であり、腸上部では５−ＨＴＰは５時間で吸収されて、結腸中へと比較して効力はより高く、それは全身的５−ＨＴＰの実質的な増大をもたらし、それは順送りで、非ＧＩ末梢器官および脳における５−ＨＴ合成を増大させることが当技術分野で周知である。
【０１５１】
それ故、結腸への５−ＨＴＰの選択送達は、５−ＨＴＰに誘発される５−ＨＴ合成による全身的副作用、例えば吐き気、嘔吐、胃痛、鎮静、およびめまいの確率を排除または最小化し得る。さらに、結腸への５−ＨＴＰの選択送達は、５−ＨＴＰが他のセロトニン作動性の薬物療法、例えば抗鬱およびトリプタンと相互作用する確率を排除または最小化し得る。その上、結腸への５−ＨＴＰ送達は、５−ＨＴＰを便秘の病原の主要な部位に集中するであろう。
【０１５２】
本開示に記載の実施形態は、種々の方法で組合せることができる。一実施形態について記載された任意の態様または特徴は、本開示で言及された任意の他の実施形態に組み込まれ得る。本発明に係る原理の種々の新規特徴が、示され、記載され、およびそれらの特定の実施形態に適用されることが指摘されるが、本開示の精神から逸脱することなく、種々の省略および置換および変化が当業者により行われ得ることは理解されるべきである。当業者は、本発明の原理は記載された実施形態以外で実行され得るが、実施形態は例示の目的で提示されたもので限定するものではないことを認識するであろう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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