(57)【要約】  本発明は、２つ以上のペプチドループがスキャフォールドへの結合点の間に張られるように芳香族分子スキャフォールドに共有結合的に結合したポリペプチドに関する。特に、本発明は、Ｅｐｈ受容体チロシンキナーゼＡ２（ＥｐｈＡ２）の高親和性バインダーであるペプチドを記載する。本発明はまた、１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされている、前記ペプチドを含む薬物コンジュゲート、前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートを含む医薬組成物ならびに疾患組織（例えば、腫瘍）におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害の予防、抑制または治療における前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートの使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのループ配列により分離された少なくとも３つのシステイン残基を含むポリペプチド、および少なくとも２つのポリペプチドループが芳香族分子スキャフォールド上に形成されるように前記ポリペプチドの前記システイン残基と共有結合を形成する前記分子スキャフォールドを含む、ＥｐｈＡ２に特異的なペプチドリガンド。
【請求項２】
前記ループ配列が、４、５、６または７つのアミノ酸酸を含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
【請求項３】
前記ループ配列が、その両方が５つのアミノ酸からなる２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基（例えば、表３、４および９４に列記されるもの）を含む、請求項１または請求項２に記載のペプチドリガンド。
【請求項４】
前記ループ配列が、その両方が６つのアミノ酸からなる２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基（例えば、表３〜１０に列記されるもの）を含む、請求項１または請求項２に記載のペプチドリガンド。
【請求項５】
前記ループ配列が、その一方が６つのアミノ酸からなり、かつ、他方が５つのアミノ酸からなる２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基（例えば、表４に列記されるもの）を含む、請求項１または請求項２に記載のペプチドリガンド。
【請求項６】
前記ループ配列が、その一方が６つのアミノ酸からなり、かつ、他方が４つのアミノ酸からなる２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基（例えば、表４に列記されるもの）を含む、請求項１または請求項２に記載のペプチドリガンド。
【請求項７】
前記ループ配列が、その一方が６つのアミノ酸からなり、かつ、他方が７つのアミノ酸からなる２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基（例えば、表８に列記されるもの）を含む、請求項１または請求項２に記載のペプチドリガンド。
【請求項８】
前記ペプチドリガンドが、
Ｃｉ−Ｘ１−Ｃｉｉ−Ｘ２−Ｃｉｉｉ
（式中、Ｘ１およびＸ２が、表３〜１０において列記されるシステイン残基の間のアミノ酸残基を表し、かつ、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉが、それぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表す）から選択されるアミノ酸配列または薬学的に許容されるその塩を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項９】
前記ペプチドリガンドが、１つまたは複数の表３〜１０において列記されるペプチドリガンドのうちの１つまたは複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１０】
前記分子スキャフォールドが、（１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン）（ＴＢＭＢ）から選択され、かつ、前記ペプチドリガンドが、表３〜１０において列記されるペプチドリガンドのいずれか１つから選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１１】
化合物１〜２８６、２８９、２９２〜２９３および２９６〜２９７のいずれか１つまたは薬学的に許容されるその塩から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１２】
前記薬学的に許容される塩が、遊離酸またはナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム塩から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１３】
前記ＥｐｈＡ２がヒトＥｐｈＡ２である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１４】
１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲート。
【請求項１５】
前記細胞傷害剤がＤＭ１から選択される、請求項１４に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１６】
ＢＤＣ−１〜ＢＤＣ−４などの、ＢＤＣ−１〜ＢＤＣ−５のいずれか１つから選択される、請求項１４または請求項１５に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１７】
１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とともに、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチドリガンドまたは請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項１８】
疾患組織におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害の予防、抑制または治療において使用するための、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１９】
がんの予防、抑制または治療において使用するための、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２０】
肺がんの予防、抑制または治療において使用するための、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２１】
非小細胞肺癌の予防、抑制または治療において使用するための、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２つ以上のペプチドループがスキャフォールドへの結合点の間に張られるように芳香族分子スキャフォールドに共有結合的に結合したポリペプチドに関する。特に、本発明は、Ｅｐｈ受容体チロシンキナーゼＡ２（ＥｐｈＡ２）の高親和性バインダーであるペプチドを記載する。本発明はまた、１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされている、前記ペプチドを含む薬物コンジュゲート、前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートを含む医薬組成物ならびに疾患組織（例えば、腫瘍）におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害の予防、抑制または治療における前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートの使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
環状ペプチドは、高い親和性および標的特異性でタンパク質標的に結合することができ、それゆえ、治療剤の開発のための魅力的な分子クラスである。実際、例えば、抗菌性ペプチドであるバンコマイシン、免疫抑制薬であるシクロスポリン、または抗がん薬物であるオクトレオチドのようないくつかの環状ペプチドは、診療所において既に成功裡に使用されている（Ｄｒｉｇｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７  （７），  ６０８−２４）。良好な結合特性は、ペプチドと標的との間に形成される比較的大きい相互作用表面の他に、環状構造の低減したコンホメーション柔軟性の結果としてもたらされる。典型的には、例えば、環状ペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニストＣＶＸ１５（４００Å２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３０，  １０６６−７１）、インテグリンαＶｂ３に結合するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを有する環状ペプチド（３５５Å２）（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６  （５５５６５），  １５１−５）またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合する環状ペプチド阻害剤ｕｐａｉｎ−１（６０３Å２；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７），  Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １６０  （１），  １−１０）のように、大環状分子は数百平方オングストロームの表面に結合する。
【０００３】
環状の構成に起因して、ペプチド大環状分子は直鎖状ペプチドより柔軟性が低く、標的への結合時にエントロピーのより小さい損失に繋がり、結果としてより高い結合親和性をもたらす。低減した柔軟性はまた、標的特異的なコンホメーションのロッキングに繋がり、直鎖状ペプチドと比較して結合特異性を増加させる。この効果は、その環が開いた時に他のＭＭＰに対するその選択性を喪失するマトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ−８）の強力かつ選択的な阻害剤により例示されている（Ｃｈｅｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８），  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４１  （１１），  １７４９−５１）。大環状化を通じて達成される好都合な結合特性は、例えば、バンコマイシン、ナイシンおよびアクチノマイシンにおけるように１つより多くのペプチド環を有する多環ペプチドにおいてよりいっそう顕著になる。
【０００４】
異なる研究チームはこれまでに、システイン残基を有するポリペプチドを合成分子構造にテザー連結してきた（Ｋｅｍｐ  ａｎｄ  ＭｃＮａｍａｒａ  （１９８５），  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）。Ｍｅｌｏｅｎおよび共同研究者らは、タンパク質表面の構造的模倣のための合成スキャフォールド上への複数のペプチドループの迅速かつ定量的な環化のためにトリス（ブロモメチル）ベンゼンおよび関連分子を使用した（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）。例えばトリス（ブロモメチル）ベンゼンとしての分子スキャフォールドにシステイン含有ポリペプチドを連結することにより候補薬物化合物が生成される前記化合物の生成方法は、ＷＯ２００４／０７７０６２およびＷＯ２００６／０７８１６１において開示されている。
【０００５】
目的の標的に対する二環ペプチドの大きいライブラリーを生成およびスクリーニングするためのファージディスプレイに基づいたコンビナトリアルアプローチが開発されている（Ｈｅｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ５  （７），  ５０２−７およびＷＯ２００９／０９８４５０）。簡潔に述べれば、３つのシステイン残基および６つのランダムなアミノ酸（Ｃｙｓ−（Ｘａａ）６−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）６−Ｃｙｓ）の２つの領域を含有する直鎖状ペプチドのコンビナトリアルライブラリーがファージ上に提示され、システイン側鎖を小分子（トリス−（ブロモメチル）ベンゼン）に共有結合的に連結することにより環化される。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、少なくとも２つのループ配列により分離された少なくとも３つのシステイン残基を含むポリペプチド、および少なくとも２つのポリペプチドループが芳香族分子スキャフォールド上に形成されるように前記ポリペプチドの前記システイン残基と共有結合を形成する前記分子スキャフォールドを含む、ＥｐｈＡ２に特異的なペプチドリガンドが提供される。
【０００７】
本発明のさらなる態様によれば、１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされている本明細書において定義されるようなペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲートが提供される。
【０００８】
本発明のさらなる態様によれば、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて本明細書において定義されるようなペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。
【０００９】
本発明のさらなる態様によれば、疾患組織（例えば、腫瘍）におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害の予防、抑制または治療において使用するための本明細書において定義されるようなペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートが提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
一実施形態では、前記ループ配列は、４、５、６または７つのアミノ酸酸を含む。
【００１１】
さらなる実施形態では、前記ループ配列は、その両方が５つのアミノ酸からなる２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含む（例えば、表３、４および表９に列記されるもの）。
【００１２】
さらなる実施形態では、前記ループ配列は、その両方が６つのアミノ酸からなる２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含む（例えば、表３〜１０に列記されるもの）。
【００１３】
さらなる実施形態では、前記ループ配列は、その一方が６つのアミノ酸からなりかつ他方が５つのアミノ酸からなる２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含む（例えば、表４に列記されるもの）。
【００１４】
さらなる実施形態では、前記ループ配列は、その一方が６つのアミノ酸からなりかつ他方が４つのアミノ酸からなる２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含む（例えば、表４に列記されるもの）。
【００１５】
さらなる実施形態では、前記ループ配列は、その一方が６つのアミノ酸からなりかつ他方が７つのアミノ酸からなる２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含む（例えば、表８に列記されるもの）。
【００１６】
一実施形態では、ペプチドリガンドは、
Ｃｉ−Ｘ１−Ｃｉｉ−Ｘ２−Ｃｉｉｉ
（Ｘ１およびＸ２は、表３〜１０において列記されるシステイン残基の間のアミノ酸残基を表し、かつ、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表す）から選択されるアミノ酸配列または薬学的に許容されるその塩を含む。
【００１７】
さらなる実施形態では、ペプチドリガンドは、１つまたは複数の表３〜１０において列記されるペプチドリガンドのうちの１つまたは複数から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
一実施形態では、分子スキャフォールドは（１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン）（ＴＢＭＢ）から選択され、かつ、ペプチドリガンドは、表３〜１０に列記されるペプチドリガンドのいずれか１つから選択される。
【００１９】
一実施形態では、ペプチドリガンドは、化合物１〜３０８のいずれか１つまたは薬学的に許容されるその塩から選択される。
【００２０】
さらなる実施形態では、ペプチドリガンドは、化合物１〜２８６、２８９、２９２〜２９３および２９６〜２９７のいずれか１つまたは薬学的に許容されるその塩から選択される。
【００２１】
他に定義されなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、ペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学および生化学などの技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。標準技術が、分子生物学、遺伝学および生化学的方法のために使用され、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  ２００１，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９９）  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．を参照）参照により本明細書に組み込まれる。
【００２２】
＜命名法＞
ナンバリング
本発明のペプチド内のアミノ酸残基位置を指す場合、システイン残基（Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉ）は不変であるのでナンバリングから省略し、したがって、本発明のペプチド内のアミノ酸残基のナンバリングは、以下：
−Ｃｉ−Ｍ１−Ｎ２−Ｄ３−Ｗ４−Ｌ５−Ｃｉｉ−Ｓ６−Ｌ７−Ｇ８−Ｗ９−Ｔ１０−Ｃｉｉｉ−（配列番号１）
のように称される。
【００２３】
この記載の目的のために、全ての二環ペプチドは、ＴＢＭＢ（１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン）のいずれかと共に環化されて、三置換１，３，５−トリスメチルベンゼン構造をもたらすことが仮定される。ＴＢＭＢとの環化は、Ｃｉ、Ｃｉｉ、およびＣｉｉｉにおいて起こる。
【００２４】
分子フォーマット
二環コア配列へのＮまたはＣ末端伸長は、ハイフンにより分離されて、配列の左または右側に付加される。例えば、Ｎ末端（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａｌａテイルは、
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ−（配列番号Ｘ）
として表される。
【００２５】
反転ペプチド配列
Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０（３），  １３６２−１３７３の開示に照らして、本明細書に開示されるペプチド配列はまた、レトロインベルソ形態において有用性を有することが想定される。例えば、配列が逆転され（すなわち、Ｎ末端はＣ末端となり、逆もまた成り立つ）、立体化学もまた同様に逆転する（すなわち、Ｄ−アミノ酸はＬ−アミノ酸となり、逆もまた成り立つ）。
【００２６】
＜ペプチドリガンド＞
ペプチドリガンドは、本明細書において称されるように、分子スキャフォールドに共有結合的に結合したペプチド、ペプチド性化合物（ｐｅｐｔｉｄｉｃ）またはペプチド模倣物を指す。典型的には、そのようなペプチド、ペプチド性化合物またはペプチド模倣物は、天然または非天然アミノ酸、スキャフォールドへの共有結合を形成できる２つ以上の反応性基（すなわち、システイン残基）、および前記反応性基の間に張られる配列を有するペプチドを含み、前記反応性基の間に張られる配列は、ペプチド、ペプチド性化合物またはペプチド模倣物がスキャフォールドに結合した場合にループを形成するので、ループ配列と称される。本発明の場合において、ペプチド、ペプチド性化合物またはペプチド模倣物は、少なくとも３つのシステイン残基（本明細書においてＣｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉのように称される）を含み、かつスキャフォールド上に少なくとも２つのループを形成する。
【００２７】
＜ペプチドリガンドの利点＞
本発明のある特定の二環ペプチドは、注射、吸入、経鼻、眼、経口または局所投与のために好適な薬物様分子として該二環ペプチドを考えることを可能とする多数の有利な特性を有する。そのような有利な特性としては以下が挙げられる。
−  種交差反応性。これは、前臨床の薬力学および薬物動態評価のための典型的な要件である；
−  プロテアーゼ安定性。二環ペプチドリガンドは、ほとんどの状況において、血漿プロテアーゼ、上皮（「膜アンカー」）プロテアーゼ、胃および腸プロテアーゼ、肺表面プロテアーゼ、ならびに細胞内プロテアーゼなどに対して安定性を実証するべきである。二環ペプチドリード候補を動物モデルにおいて開発できることの他に、ヒトに対して信頼性と共に投与できるように、プロテアーゼ安定性は異なる種間で維持されるべきである；
−  望ましい溶解性プロファイル。これは、疎水性残基に対する荷電性および親水性残基の割合ならびに分子内／分子間Ｈ結合の関数であり、配合および吸収目的のために重要である；
−  循環中での最適な血漿中半減期。臨床的適応および治療レジメンに依存して、慢性または急性のいずれかの病態の管理のために短いまたは長いインビボ曝露時間を有する二環ペプチドの開発が必要とされることがある。最適な曝露時間は、薬剤への持続的な曝露から生じる毒物学的効果を最小化するための短い曝露時間の要件に対する持続的な曝露（最大の治療効率のため）の要件により支配される；ならびに
−  選択性。本発明のある特定のペプチドリガンドは、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７およびＥｐｈＢ１などの他のＥｐｈ受容体チロシンキナーゼならびにＸＩＩＡ因子、炭酸脱水酵素９およびＣＤ３８に対して良好な選択性を実証する（本発明の選択されるペプチドリガンドについての選択性データを表１２に見出すことができる）。本発明の選択されるペプチドリガンドは他の種（例えば、マウス）との交差反応性を呈して、動物モデルにおける試験を可能とすることもまた留意されるべきである（表３、５、７、８および表１１）。
【００２８】
＜薬学的に許容される塩＞
塩形態は本発明の範囲内にあり、ペプチドリガンドへの言及は前記リガンドの塩形態を含むことが理解されるであろう。
【００２９】
本発明の塩は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｕｓｅ，  Ｐ．  Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｓｔａｈｌ  （Ｅｄｉｔｏｒ），  Ｃａｍｉｌｌｅ  Ｇ．  Ｗｅｒｍｕｔｈ  （Ｅｄｉｔｏｒ），  ＩＳＢＮ：  ３−９０６３９−０２６−８，  Ｈａｒｄｃｏｖｅｒ，  ３８８  ｐａｇｅｓ，  Ａｕｇｕｓｔ  ２００２に記載される方法などの従来の化学的方法により塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成され得る。一般的に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、水中または有機溶媒中、または２つの混合物中で適切な塩基または酸と反応させることにより調製され得る。
【００３０】
酸付加塩（単塩または二塩）は、無機および有機の両方の、多様な酸と共に形成されてもよい。酸付加塩の例としては、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸（例えば、Ｌ−アスコルビン酸）、Ｌ−アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、ブタン酸、（＋）ショウノウ酸、ショウノウ−スルホン酸、（＋）−（１Ｓ）−ショウノウ−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−二スルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、Ｄ−グルコン酸、グルクロン酸（例えば、Ｄ−グルクロン酸）、グルタミン酸（例えば、Ｌ−グルタミン酸）、α−オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、ハロゲン化水素酸（例えば、臭化水素酸、塩化水素酸、ヨウ化水素酸）、イセチオン酸、乳酸（例えば、（＋）−Ｌ−乳酸、（±）−ＤＬ−乳酸）、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、（−）−Ｌ−リンゴ酸、マロン酸、（±）−ＤＬ−マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−二スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモン酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、Ｌ−ピログルタミン酸、サリチル酸、４−アミノ−サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、（＋）−Ｌ−酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ウンデシレン酸および吉草酸の他に、アシル化されたアミノ酸およびカチオン交換樹脂からなる群から選択される酸と共に形成される単塩または二塩が挙げられる。
【００３１】
塩の１つの特定の群は、酢酸、塩化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、硫酸、メタンスルホン酸（メシル酸）、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、吉草酸、プロパン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸およびラクトビオン酸から形成される塩からなる。１つの特定の塩は塩酸塩である。別の特定の塩は酢酸塩である。
【００３２】
化合物がアニオン性であるか、またはアニオン性であり得る（例えば、−ＣＯＯＨは−ＣＯＯ−であり得る）官能基を有する場合、塩は、有機または無機塩基と共に形成されて、好適な陽イオンを生成してもよい。好適な無機カチオンの例としては、Ｌｉ＋、Ｎａ＋およびＫ＋などのアルカリ金属イオン、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋などのアルカリ土類金属カチオン、ならびにＡｌ３＋またはＺｎ＋などの他のカチオンが挙げられるがそれに限定されない。好適な有機カチオンの例としては、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ４＋）および置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ３Ｒ＋、ＮＨ２Ｒ２＋、ＮＨＲ３＋、ＮＲ４＋）が挙げられるがそれに限定されない。一部の好適な置換アンモニウムイオンの例は、メチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、プロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、およびトロメタミンの他に、リジンおよびアルギニンなどのアミノ酸に由来するものである。一般的な第四級アンモニウムイオンの例は、Ｎ（ＣＨ３）４＋である。
【００３３】
本発明のペプチドがアミン官能基を含有する場合、これらは、例えば、当業者に周知の方法によるアルキル化剤との反応により、第四級アンモニウム塩を形成してもよい。そのような第四級アンモニウム化合物は本発明のペプチドの範囲内である。
【００３４】
＜修飾誘導体＞
本明細書において定義されるようなペプチドリガンドの修飾誘導体は本発明の範囲内であることが理解されるであろう。そのような好適な修飾誘導体の例としては、Ｎ末端および／またはＣ末端修飾；１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の非天然アミノ酸残基による置換（例えば、１つまたは複数の極性アミノ酸残基の１つまたは複数の等配電子または等電子アミノ酸による置換；１つまたは複数の非極性アミノ酸残基の他の非天然の等配電子または等電子アミノ酸による置換）；スペーサー基の付加；１つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の１つまたは複数の酸化抵抗性アミノ酸残基による置換；１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の置換アミノ酸、例えば、アラニンによる置換、１つまたは複数のＬ−アミノ酸残基の１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基による置換；二環ペプチドリガンド内の１つまたは複数のアミド結合のＮ−アルキル化；１つまたは複数のペプチド結合のサロゲート結合による置換；ペプチド骨格長さの修飾；１つまたは複数のアミノ酸残基のアルファ炭素上の水素の別の化学基による置換、システイン、リジン、グルタミン酸／アスパラギン酸およびチロシンなどのアミノ酸を官能基化するような、前記アミノ酸の好適なアミン、チオール、カルボン酸およびフェノール反応性試薬を用いた修飾、ならびに、例えば、アルキンまたはアジド含有部分を用いた官能基化を可能とするそれぞれアジドまたはアルキン基含有アミノ酸といった、官能基化のために好適な直交反応性を導入するアミノ酸の導入または置換から選択される１つまたは複数の修飾が挙げられる。
【００３５】
一実施形態では、修飾誘導体はＮ末端および／またはＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体は、好適なアミノ反応化学を使用するＮ末端修飾、および／または好適なカルボキシ反応化学を使用するＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、前記Ｎ末端またはＣ末端修飾は、細胞傷害剤、ラジオキレーター（ｒａｄｉｏｃｈｅｌａｔｏｒ）または発色団が挙げられるがそれに限定されないエフェクター基の付加を含む。
【００３６】
さらなる実施形態では、修飾誘導体はＮ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、Ｎ末端修飾はＮ末端アセチル基を含む。この実施形態では、Ｎ末端残基は、ペプチド合成の間に無水酢酸または他の適切な試薬を用いてキャップ付加されて、Ｎ末端がアセチル化された分子をもたらす。この実施形態は、アミノペプチダーゼの潜在的な認識点を除去する利点を提供し、二環ペプチドの分解の可能性を回避する。
【００３７】
代替的な実施形態では、Ｎ末端修飾は分子スペーサー基の付加を含み、分子スペーサー基は、エフェクター基のコンジュゲーションおよびその標的への二環ペプチドの効力の保持を促進する。
【００３８】
さらなる実施形態では、修飾誘導体はＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、Ｃ末端修飾はアミド基を含む。この実施形態では、Ｃ末端残基は、ペプチド合成の間にアミドとして合成されて、Ｃ末端がアミド化された分子をもたらす。この実施形態は、カルボキシペプチダーゼの潜在的な認識点を除去する利点を提供し、二環ペプチドのタンパク質分解の可能性を低減する。
【００３９】
一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の非天然アミノ酸残基による置換を含む。この実施形態では、分解性プロテアーゼにより認識されず、かつ標的効力に対する何らの有害効果も有しない等配電子／等電子の側鎖を有する非天然アミノ酸が選択されてもよい。
【００４０】
あるいは、近くのペプチド結合のタンパク質加水分解が配座によりおよび立体的に妨害されるように、束縛されたアミノ酸側鎖を有する非天然アミノ酸が使用されてもよい。特に、これらは、プロリンアナログ、バルキーな側鎖、Ｃα二置換誘導体（例えば、アミノイソ酪酸、Ａｉｂ）、およびシクロアミノ酸に関し、単純な誘導体はアミノ−シクロプロピルカルボン酸である。
【００４１】
一実施形態では、修飾誘導体はスペーサー基の付加を含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体は、Ｎ末端システイン（Ｃｉ）および／またはＣ末端システイン（Ｃｉｉｉ）へのスペーサー基の付加を含む。
【００４２】
一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の１つまたは複数の酸化抵抗性アミノ酸残基による置換を含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体は、トリプトファン残基のナフチルアラニンまたはアラニン残基による置換を含む。この実施形態は、結果として生じる二環ペプチドリガンドの薬学的安定性プロファイルを向上させる利点を提供する。
【００４３】
一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数の荷電性アミノ酸残基の１つまたは複数の疎水性アミノ酸残基による置換を含む。代替的な実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数の疎水性アミノ酸残基の、１つまたは複数の荷電性アミノ酸残基による置換を含む。疎水性アミノ酸残基に対する荷電性アミノ酸残基の正しい均衡は、二環ペプチドリガンドの重要な特徴である。例えば、疎水性アミノ酸残基は、血漿タンパク質の結合の程度およびしたがって血漿中の遊離の利用可能な画分の濃度に影響を及ぼし、荷電性アミノ酸残基（特に、アルギニン）は、細胞表面上のリン脂質膜とのペプチドの相互作用に影響を及ぼすことがある。２つの組合せは、ペプチド薬物の半減期、分布の体積および曝露に影響を及ぼすことがあり、臨床的なエンドポイントにしたがって調整することができる。加えて、疎水性アミノ酸残基に対する荷電性アミノ酸残基の正しい組合せおよび数は、注射部位（ペプチド薬物が皮下に投与された場合）において刺激を低減し得る。
【００４４】
一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数のＬ−アミノ酸残基の１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基による置換を含む。この実施形態は、立体障害によりおよびβ−ターンコンホメーションを安定化させるＤ−アミノ酸の傾向によりタンパク質分解の安定性を増加させると考えられる（Ｔｕｇｙｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  ＰＮＡＳ，  １０２（２），  ４１３−４１８）。
【００４５】
一実施形態では、修飾誘導体は、任意のアミノ酸残基の除去およびＤ−アラニンなどのアラニンによる置換を含む。この実施形態は、鍵となる結合性残基を同定し、かつ潜在的なタンパク質分解攻撃部位を除去する利点を提供する。Ｄ−アラニン置換などのそのようなアラニンの結果（アラニンスキャニングとしても公知）は、表９において見ることができる。
【００４６】
上記の各修飾は、ペプチドの効力または安定性を意図的に向上させるように働くことが留意されるべきである。修飾に基づくさらなる効力向上は、以下の機序を通じて達成されてもよい。
−  より高い親和性が達成されるように、疎水性効果を活用し、より低い解離速度に繋がる疎水性部分を組み込むこと；
−  ロングレンジのイオン相互作用を活用して、より速い会合速度およびより高い親和性をもたらす荷電性基を組み込むこと（例えば、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｒａｐｉｄ，  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （１９９６），  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ３，  ４２７−３１を参照）；ならびに
−  例えば、エントロピーの損失が標的結合時に最小となるように正しくアミノ酸の側鎖を束縛すること、エントロピーの損失が標的結合時に最小となるように骨格のねじり角度を束縛することおよび同一の理由から分子中に追加の環化を導入することにより、ペプチドに追加の束縛を組み込むこと。
（総説について、Ｇｅｎｔｉｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，  （２０１０），  １６，  ３１８５−２０３、およびＮｅｓｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ  （２００９），  １６，  ４３９９−４１８を参照）。
【００４７】
＜同位体バリエーション＞
本発明は、１つまたは複数の原子が、同じ原子数を有するが天然に通常見出される原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子により置き換えられた、本発明の全ての薬学的に許容される（放射性）同位体標識されたペプチドリガンド、および、関連する（放射性）同位体を保持することができる金属キレーティング基（「エフェクター」と称される）が取り付けられた本発明のペプチドリガンド、および、ある特定の官能基が、関連する（放射性）同位体または同位体標識された官能基により共有結合的に置き換えられた本発明のペプチドリガンドを含む。
【００４８】
本発明のペプチドリガンドに含めるために好適な同位体の例は、２Ｈ（Ｄ）および３Ｈ（Ｔ）などの水素、１１Ｃ、１３Ｃおよび１４Ｃなどの炭素、３６Ｃｌなどの塩素、１８Ｆなどのフッ素、１２３Ｉ、１２５Ｉおよび１３１Ｉなどのヨウ素、１３Ｎおよび１５Ｎなどの窒素、１５Ｏ、１７Ｏおよび１８Ｏなどの酸素、３２Ｐなどのリン、３５Ｓなどの硫黄、６４Ｃｕなどの銅、６７Ｇａまたは６８Ｇａなどのガリウム、９０Ｙなどのイットリウム、１７７Ｌｕなどのルテチウム、ならびに２１３Ｂｉなどのビスマスの同位体を含む。
【００４９】
本発明のある特定の同位体標識されたペプチドリガンド、例えば、放射活性同位体を組み込んだものは、薬物および／または基質の組織分布研究において、ならびに疾患組織におけるＥｐｈＡ２標的の存在および／または非存在を臨床的に評価するために有用である。本発明のペプチドリガンドは、標識された化合物と他の分子、ペプチド、タンパク質、酵素または受容体との間の複合体の形成を検出または同定するために使用され得るという点で価値のある診断特性をさらに有し得る。検出または同定方法は、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質（例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリンおよびルシフェラーゼ）などの標識化剤を用いて標識された化合物を使用し得る。放射活性同位体トリチウム、すなわち、３Ｈ（Ｔ）、および炭素−１４、すなわち、１４Ｃは、組込みの容易さおよび検出の手段が用意されていることを考慮してこの目的のために特に有用である。
【００５０】
重水素、すなわち、２Ｈ（Ｄ）などのより重い同位体による置換は、より大きい代謝安定性、例えば、増加したインビボでの半減期または低減した投与量の必要性の結果としてもたらされるある特定の治療的な利点が得られることがあり、それゆえ、一部の状況において好ましいことがある。
【００５１】
１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎなどのポジトロン放出同位体による置換は、標的占有を調べるためのポジトロン断層法（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）（ＰＥＴ）研究において有用であり得る。
【００５２】
本発明のペプチドリガンドの同位体標識された化合物は、一般的に、当業者に公知の従来技術によりまたは以前に用いられた非標識化試薬の代わりに適切な同位体標識された試薬を使用する本明細書中の実施例において記載されるものに類似の方法により調製され得る。
【００５３】
＜芳香族分子スキャフォールド＞
「芳香族分子スキャフォールド」という用語への本明細書における言及は、芳香族（すなわち、不飽和）炭素環式または複素環式環系を含有する本明細書において定義されるような任意の分子スキャフォールドを指す。
【００５４】
芳香族分子スキャフォールドは芳香族部分を含んでもよいことが理解されるであろう。芳香族スキャフォールド内の好適な芳香族部分の例としては、ビフェニレン、テルフェニレン、ナフタレンまたはアントラセンが挙げられる。
【００５５】
芳香族分子スキャフォールドは複素芳香族部分を含んでもよいことも理解されるであろう。芳香族スキャフォールド内の好適な複素芳香族部分の例としては、ピリジン、ピリミジン、ピロール、フランおよびチオペン（ｔｈｉｏｐｅｎｅ）が挙げられる。
【００５６】
芳香族分子スキャフォールドは、ビス（ブロモメチル）ベンゼン、トリス（ブロモメチル）ベンゼン、テトラ（ブロモメチル）ベンゼンまたはその誘導体などのハロメチルアレーン部分を含んでもよいことも理解されるであろう。芳香族分子スキャフォールドの非限定的な例としては、ビス−、トリス−、またはテトラ（ハロメチル）ベンゼン；ビス−、トリス−、またはテトラ（ハロメチル）ピリジン；ビス−、トリス−、またはテトラ（ハロメチル）ピリダジン；ビス−、トリス−、またはテトラ（ハロメチル）ピリミジン；ビス−、トリス−、またはテトラ（ハロメチル）ピラジン；ビス−、トリス−、またはテトラ（ハロメチル）−１，２，３−トリアジン；ビス−、トリス−、またはテトラ−ハロメチル）−１，２，４−トリアジン；ビス−、トリス−、またはテトラ（ハロメチル）ピロール、−フラン、−チオフェン；ビス−、トリス−、またはテトラ（ハロメチル）イミダゾール、−オキサゾール、−チアゾール；ビス−、トリス−、またはテトラ（ハロメチル）−３Ｈ−ピラゾール、−イソオキサゾール（ｉｓｏｏｘａｚｏｌｅ）、−イソチアゾール（ｉｓｏｔｈｉａｚｏｌ）；ビス−、トリス−、またはテトラ（ハロメチル）ビフェニレン；ビス−、トリス−、またはテトラ（ハロメチル）テルフェニレン；１，８−ビス（ハロメチル）ナフタレン；ビス−、トリス−、またはテトラ（ハロメチル）アントラセン；およびビス−、トリス−、またはテトラ（２−ハロメチルフェニル）メタンが挙げられる。
【００５７】
芳香族分子スキャフォールドのより具体例としては、１，２−ビス（ハロメチル）ベンゼン；３，４−ビス（ハロメチル）ピリジン；３，４−ビス（ハロメチル）ピリダジン；４，５−ビス（ハロメチル）ピリミジン；４，５−ビス（ハロメチル）ピラジン；４，５−ビス（ハロメチル）−１，２，３−トリアジン；５，６−ビス（ハロメチル）−１，２，４−トリアジン；３，４−ビス（ハロメチル）ピロール、−フラン、−チオフェンおよび他の位置異性体；４，５−ビス（ハロメチル）イミダゾール、−オキサゾール、−チアゾール；４，５−ビス（ハロメチル）−３Ｈ−ピラゾール、−イソオキサゾール、−イソチアゾール；２，２’−ビス（ハロメチル）ビフェニレン；２，２’’−ビス（ハロメチル）テルフェニレン；１，８−ビス（ハロメチル）ナフタレン；１，１０−ビス（ハロメチル）アントラセン；ビス（２−ハロメチルフェニル）メタン；１，２，３−トリス（ハロメチル）ベンゼン；２，３，４−トリス（ハロメチル）ピリジン；２，３，４−トリス（ハロメチル）ピリダジン；３，４，５−トリス（ハロメチル）ピリミジン；４，５，６−トリス（ハロメチル）−１，２，３−トリアジン；２，３，４−トリス（ハロメチル）ピロール、−フラン、−チオフェン；２，４，５−ビス（ハロメチル）イミダゾール、−オキサゾール、−チアゾール；３，４，５−ビス（ハロメチル）−１Ｈ−ピラゾール、−イソオキサゾール、−イソチアゾール；２，４，２’−トリス（ハロメチル）ビフェニレン；２，３’，２’’−トリス（ハロメチル）テルフェニレン；１，３，８−トリス（ハロメチル）ナフタレン；１，３，１０−トリス（ハロメチル）アントラセン；ビス（２−ハロメチルフェニル）メタン；１，２，４，５−テトラ（ハロメチル）ベンゼン；１，２，４，５−テトラ（ハロメチル）ピリジン；２，４，５，６−テトラ（ハロメチル）ピリミジン；２，３，４，５−テトラ（ハロメチル）ピロール、−フラン、−チオフェン；２，２’，６，６’−テトラ（ハロメチル）ビフェニレン；２，２’’，６，６’’−テトラ（ハロメチル）テルフェニレン；２，３，５，６−テトラ（ハロメチル）ナフタレンおよび２，３，７，８−テトラ（ハロメチル）アントラセン；ならびにビス（２，４−ビス（ハロメチル）フェニル）メタンが挙げられる。
【００５８】
以上の文献において記載されているように、分子スキャフォールドは、小有機分子などの小分子であってもよい。
【００５９】
一実施形態では、分子スキャフォールドは高分子（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）であってもよい。一実施形態では、分子スキャフォールドは、アミノ酸、ヌクレオチドまたは炭水化物から構成される高分子である。
【００６０】
一実施形態では、分子スキャフォールドは、ポリペプチドの官能基と反応して共有結合を形成できる反応性基を含む。
【００６１】
分子スキャフォールドは、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、無水物、スクシンイミド、マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルなどの、ペプチドと連結を形成する化学基を含んでもよい。
【００６２】
一実施形態では、分子スキャフォールドは、トリス（ブロモメチル）ベンゼン、特に１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（「ＴＢＭＢ」）、またはその誘導体を含んでもよい、またはそれらからなってもよい。
【００６３】
一実施形態では、分子スキャフォールドは２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンである。この分子は１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼンに類似しているが、ベンゼン環に結合した３つの追加のメチル基を含有する。これは、追加のメチル基がポリペプチドとさらなる接触を形成し、それゆえ追加の構造的束縛を加え得るという利点を有する。
【００６４】
本発明の分子スキャフォールドは、本発明のコードされるライブラリーのポリペプチドの官能基が分子スキャフォールドと共有結合連結を形成することを可能とする化学基を含有する。前記化学基は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、無水物、スクシンイミド、マレイミド、アジド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルを含む広範囲の官能基から選択される。
【００６５】
システインのチオール基と反応するために分子スキャフォールド上で使用され得るスキャフォールド反応性基はハロゲン化アルキル（またはハロゲノアルカンもしくはハロアルカンとも命名されている）である。
【００６６】
例としては、ブロモメチルベンゼン（ＴＢＭＢにより例示されるスキャフォールド反応性基）またはヨードアセトアミドが挙げられる。タンパク質中のシステインに化合物を選択的に連結させるために使用される他のスキャフォールド反応性基は、マレイミド、αβ不飽和カルボニル含有化合物およびα−ハロメチルカルボニル含有化合物である。本発明において分子スキャフォールドとして使用され得るマレイミドの例としては、トリス−（２−マレイミドエチル）アミン、トリス−（２−マレイミドエチル）ベンゼン、トリス−（マレイミド）ベンゼンが挙げられる。α−ハロメチルカルボニル含有化合物の例はＮ，Ｎ’，Ｎ’’−（ベンゼン−１，３，５−トリイル）トリス（２−ブロモアセトアミド）である。セレノシステインもまた、システインへの類似の反応性を有して同じ反応のために使用され得る天然のアミノ酸である。したがって、システインが記載される場合は常に、文脈が他に示されなければセレノシステインで代替することが典型的には許容される。
【００６７】
＜エフェクターおよび官能基＞
本発明のさらなる態様によれば、１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされている本明細書において定義されるようなペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲートが提供される。
【００６８】
エフェクターおよび／または官能基は、例えば、ポリペプチドのＮおよび／もしくはＣ末端、ポリペプチド内のアミノ酸、または分子スキャフォールドに取り付けられ得る。
【００６９】
適切なエフェクター基としては、抗体およびその部分または断片が挙げられる。例えば、エフェクター基は、１つまたは複数の定常領域ドメインに加えて、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）、抗体ＣＨ１重鎖ドメイン、抗体ＣＨ２重鎖ドメイン、抗体ＣＨ３重鎖ドメイン、または任意のその組合せを含み得る。エフェクター基はまた、抗体のヒンジ領域を含んでもよい（そのような領域は通常、ＩｇＧ分子のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に見出される）。
【００７０】
本発明のこの態様のさらなる実施形態では、本発明によるエフェクター基はＩｇＧ分子のＦｃ領域である。有利には、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基は、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上または７日以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合物を含むまたはからなる。より有利には、本発明によるペプチドリガンドは、１日以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合物を含むまたはからなる。
【００７１】
官能基としては、一般に、結合性基、薬物、他の実体の取付けのための反応性基、および細胞への大環状ペプチドの取込みを補助する官能基などが挙げられる。
【００７２】
細胞中に透過するペプチドの能力は、細胞内標的に対してペプチドが効果的となることを可能とする。細胞中に透過する能力を有するペプチドによりアクセスされ得る標的としては、転写因子、チロシンキナーゼおよびアポトーシス経路に関与する分子などの細胞内シグナル伝達分子が挙げられる。細胞の透過を可能とする官能基としては、ペプチドまたは分子スキャフォールドのいずれかに付加されたペプチドまたは化学基が挙げられる。例えば、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  （２００７）  Ｖｏｌｕｍｅ  ３５，  ｐａｒｔ  ４，  ｐ８２１；  Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （２００４）  Ｖｏｌｕｍｅ  ５７  ９６３７に記載されるような、ＶＰ２２、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ショウジョウバエのホメオボックスタンパク質（アンテナペディア）などに由来するものなどのペプチド。細胞膜を通る移行において効率的であることが示されている短いペプチドの例としては、ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質からの１６アミノ酸ペネトラチンペプチド（Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９９４）  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌｕｍｅ  ２６９  ｐ１０４４４）、１８アミノ酸「モデル両親媒性ペプチド」（Ｏｅｈｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １４１４  ｐ１２７）およびＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質のアルギニンリッチ領域が挙げられる。非ペプチド性アプローチとしては、生体分子に容易に取り付けることができる小分子模倣体またはＳＭＯＣの使用が挙げられる（Ｏｋｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４  ｐ１５３）。分子にグアニジニウム基を付加する他の化学的戦略はまた、細胞透過を増進する（Ｅｌｓｏｎ−Ｓｃｗａｂ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２８２  ｐ１３５８５）。ステロイドなどの低分子量分子は、細胞への取込みを増進するために分子スキャフォールドに付加されてもよい。
【００７３】
ペプチドリガンドに取り付けられ得る官能基の１つのクラスとしては、抗体およびＦａｂ、Ｆｖまたは単一ドメイン断片などのその結合断片が挙げられる。特に、インビボにおいてペプチドリガンドの半減期を増加させることができるタンパク質に結合する抗体が使用されてもよい。
【００７４】
一実施形態では、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基は、１２時間以上、２４時間以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上、１５日以上または２０日以上からなる群から選択されるｔβ半減期を有する。有利には、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基または組成物は、１２〜６０時間の範囲内のｔβ半減期を有する。さらなる実施形態では、それは１日以上のｔβ半減期を有する。いっそうさらなる実施形態では、それは１２〜２６時間の範囲内である。
【００７５】
本発明の１つの特定の実施形態では、官能基は、医薬的関連性のある金属放射性同位体を錯化させるために好適な金属キレーターから選択される。
【００７６】
可能なエフェクター基としては酵素もまた挙げられ、酵素は、例えば、ペプチドリガンドがＡＤＥＰＴにおいて抗体を置き換える酵素／プロドラッグ療法において使用するためのカルボキシペプチダーゼＧ２などである。
【００７７】
本発明の１つの特定の実施形態では、官能基は、がん療法用の細胞傷害剤などの薬物から選択される。好適な例としては、シスプラチンおよびカルボプラチンの他に、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミドなどのアルキル化剤；プリンアナログであるアザチオプリンおよびメルカプトプリンまたはピリミジンアナログを含む抗代謝物；ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシンなどのビンカアルカロイドを含む植物アルカロイドおよびテルペノイド；ポドフィロトキシンおよびその誘導体エトポシドおよびテニポシド；元々はタキソールとして公知のパクリタキセルを含むタキサン；イリノテカンおよびトポテカンといったカンプトテシン類を含むトポイソメラーゼ阻害剤；ならびにアムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩、およびテニポシドを含むＩＩ型阻害剤が挙げられる。さらなる薬剤としては、免疫抑制剤ダクチノマイシン（腎臓移植において使用される）、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎｓ）、およびその他を含む抗腫瘍性抗生物質を挙げることができる。
【００７８】
本発明の１つのさらなる特定の実施形態では、細胞傷害剤は、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１）またはモノメチルアウリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ）から選択される。
【００７９】
ＤＭ１は、メイタンシンのチオール含有誘導体である細胞傷害剤であり、以下の構造を有する。
【００８０】
【化１】
2021507909.tif 000002
【００８１】
モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）は合成の抗新生物剤であり、以下の構造を有する。
【００８２】
【化２】
2021507909.tif 000003
【００８３】
本発明の１つのまたさらなる特定の実施形態では、細胞傷害剤はメイタンシノイド（例えば、ＤＭ１）から選択される。ＤＭ１を含有する毒素にコンジュゲートされているペプチドリガンドの効果を実証するデータが本明細書の表１１に提示される。
【００８４】
一実施形態では、細胞傷害剤は、ジスルフィド結合またはプロテアーゼ感受性結合などの切断可能な結合により二環ペプチドに連結される。さらなる実施形態では、ジスルフィド結合に隣接する基は、ジスルフィド結合の障害、ならびにこれにより切断および細胞傷害剤の付随的な放出の速度を制御するように修飾される。
【００８５】
公開された研究は、ジスルフィド結合のいずれかの側に立体障害を導入することにより還元に対するジスルフィド結合の感受性を修飾する可能性を確立した（Ｋｅｌｌｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ  （２０１１）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２２，  ７１７）。より大きい程度の立体障害は、細胞内グルタチオン、そしてまた細胞外（全身性）の還元剤による還元の速度を低減し、結果的に、細胞の内部および外部の両方において、毒素が放出される容易さを低減する。したがって、細胞内環境における効率的な放出（これは治療効果を最大化する）と対比した循環中のジスルフィド安定性（これは毒素の望ましくない副作用を最小化する）における最適条件の選択は、ジスルフィド結合のいずれかの側における障害の程度の注意深い選択により達成され得る。
【００８６】
ジスルフィド結合のいずれかの側における障害は、標的化実体（ここでは、二環ペプチド）または分子構築物の毒素側のいずれか上に１つまたは複数のメチル基を導入することを通じてモジュレートされる。
【００８７】
一実施形態では、細胞傷害剤およびリンカーは、ＷＯ２０１６／０６７０３５（その細胞傷害剤およびリンカーは参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものの任意の組合せから選択される。
【００８８】
一実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは、式（Ａ）：
【化３】
2021507909.tif 000004
の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるような化合物７２のいずれか１つから選択される。
【００８９】
代替的な実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは、式（Ｂ）：
【化４】
2021507909.tif 000005
の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるような化合物７２、２２６、２２７および３０３のいずれか１つから選択される。
【００９０】
一実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは式（Ａ）の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるような化合物７２から選択される。このＢＤＣは本明細書においてＢＤＣ−１として知られる。表１１に示すように、ＥｐｈＡ２競合結合アッセイにおいてＢＤＣ−１について優れた競合結合を実証するデータが本明細書において提示される。
【００９１】
代替的な実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは式（Ｂ）の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるような化合物７２から選択される。このＢＤＣは本明細書においてＢＤＣ−２として知られる。表１１に示すように、ＥｐｈＡ２競合結合アッセイにおいてＢＤＣ−２について優れた競合結合を実証するデータが本明細書において提示される。
【００９２】
代替的な実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは式（Ｂ）の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるような化合物２２６から選択される。このＢＤＣは本明細書においてＢＤＣ−３として知られる。表１１に示すように、ＥｐｈＡ２競合結合アッセイにおいてＢＤＣ−３について優れた競合結合を実証するデータが本明細書において提示される。
【００９３】
代替的な実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは式（Ｂ）の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるような化合物２２７から選択される。このＢＤＣは、ＢＤＣ−４として本明細書において知られる。表１１に示すように、ＥｐｈＡ２競合結合アッセイにおいてＢＤＣ−４についての優れた競合結合を実証するデータを本明細書において提示する。
【００９４】
代替的な実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは式（Ｂ）の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるような化合物３０３から選択される。このＢＤＣは本明細書においてＢＤＣ−５として知られる。表１１に示すように、ＥｐｈＡ２競合結合アッセイにおいてＢＤＣ−５について優れた競合結合を実証するデータが本明細書において提示される。
【００９５】
一実施形態では、薬物コンジュゲートはＢＤＣ−１〜ＢＤＣ−５から選択される。さらなる実施形態では、薬物コンジュゲートはＢＤＣ−１〜ＢＤＣ−４から選択される。
【００９６】
＜合成＞
本発明のペプチドは、標準技術による合成の後に、インビトロでの分子スキャフォールドとの反応により製造されてもよい。これが行われる場合、標準的な化学が使用されてもよい。これは、さらなる下流の実験または検証のために可溶性の材料の迅速な大規模の調製を可能とする。そのような方法は、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（上掲）に開示されるものなどの従来の化学を使用して達成され得る。
【００９７】
したがって、本発明はまた、本明細書において示されるような選択されるポリペプチドまたはコンジュゲートの製造であって、以下において説明するような任意選択のさらなるステップを含む製造に関する。一実施形態では、これらのステップは、化学合成により作製された最終生成物のポリペプチド／コンジュゲートに対して実行される。
【００９８】
任意選択で、目的のポリペプチド中のアミノ酸残基は、コンジュゲートまたは複合体を製造する時に置換されてもよい。
【００９９】
ペプチドはまた、例えば、別のループを組み込み、したがって複数の特異性を導入するために伸長され得る。
【０１００】
ペプチドを伸長するために、それは単純に、標準的な固相または溶液相化学を使用して直交的に保護されたリジン（およびアナログ）を使用してそのＮ末端もしくはＣ末端においてまたはループ内において化学的に伸長されてもよい。標準的な（生物）コンジュゲーション技術を使用して、活性化されたまたは活性化可能なＮまたはＣ末端を導入してもよい。あるいは、付加は、例えば（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）に記載されるような断片凝縮もしくは天然の化学的ライゲーションにより、または、例えば（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９４  Ｄｅｃ  ２０；  ９１（２６）：１２５４４−８もしくはＨｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １８，  Ｉｓｓｕｅ  ２２，  １５  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８，  Ｐａｇｅｓ  ６０００−６００３）に記載されるようなサブチリガーゼを使用して、酵素により為されてもよい。
【０１０１】
あるいは、ペプチドは、ジスルフィド結合を通じたさらなるコンジュゲーションにより伸長または修飾されてもよい。これは、第１および第２のペプチドが、細胞の還元性環境内に入ると互いに解離することを可能とするという追加の利点を有する。この場合、分子スキャフォールド（例えば、ＴＢＭＢ）は、３つのシステイン基と反応するように第１のペプチドの化学合成の間に付加されてもよく、さらなるシステインまたはチオールは次に、第１のペプチドのＮまたはＣ末端に付加されてもよく、それにより、このシステインまたはチオールは第２のペプチドの遊離のシステインまたはチオールとのみ反応して、ジスルフィド連結した二環ペプチド−ペプチドコンジュゲートを形成する。
【０１０２】
類似の技術は、２つの二環二重特異性大環状分子の合成／連結に等しく適用され、四重特異性分子を潜在的に作製する。
【０１０３】
さらには、他の官能基またはエフェクター基の付加は、適切な化学を使用して、ＮもしくはＣ末端においてまたは側鎖を介して連結させて、同様に達成されてもよい。一実施形態では、連結は、いずれの実体の活性も遮断しないような方式において実行される。
【０１０４】
＜医薬組成物＞
本発明のさらなる態様によれば、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて本明細書において定義されるようなペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。
【０１０５】
一般的に、本発明のペプチドリガンドは、薬理学的に適切な賦形剤または担体と共に精製された形態において利用される。典型的には、これらの賦形剤または担体は、生理食塩水および／または緩衝化媒体を含む、水性またはアルコール／水性溶液、エマルションまたは懸濁液を含む。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸リンゲル液が挙げられる。好適な生理的に許容される佐剤は、ポリペプチド複合体を懸濁状態に保つために必要な場合、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネートなどの増粘剤から選択されてもよい。
【０１０６】
静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充液および電解質補充液、例えば、リンゲルのデキストロースに基づくものが挙げられる。防腐剤ならびに他の添加物、例えば、抗菌物質、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスもまた存在してもよい（Ｍａｃｋ  （１９８２）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【０１０７】
本発明のペプチドリガンドは、別々に投与される組成物としてまたは他の薬剤と組み合わせて使用されてもよい。これらとしては、抗体、抗体断片および様々な免疫療法薬物、例えば、シクロスポリン（ｃｙｌｃｏｓｐｏｒｉｎｅ）、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチナムおよび免疫毒素を挙げることができる。医薬組成物は、本発明のタンパク質リガンドと組み合わせて様々な細胞傷害剤もしくは他の薬剤の「カクテル」、または、投与前にプールされるか否かによらず、異なる標的リガンドを使用して選択されるポリペプチドなどの、異なる特異性を有する本発明による選択されるポリペプチドの組合せさえも含み得る。
【０１０８】
本発明による医薬組成物の投与の経路は、当業者に一般的に公知の任意のものであってもよい。療法のために、本発明のペプチドリガンドは、標準技術にしたがって任意の患者に投与され得る。投与は、任意の適切な様式によるものであり得、該様式としては、非経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、肺経路を介して、または適宜、カテーテルを用いる直接注入によるものが挙げられる。好ましくは、本発明による医薬組成物は吸入により投与される。投与の量および頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時的な投与、禁忌および臨床医により考慮される他のパラメーターに依存する。
【０１０９】
本発明のペプチドリガンドは、貯蔵および使用前に好適な担体中に復元するために凍結乾燥され得る。この技術は効果的であることが示されており、当該技術分野において公知の凍結乾燥および復元技術が用いられ得る。凍結乾燥および復元は様々な程度の活性損失に繋がることがあり、補償のためにレベルを上方に調整する必要があり得ることが当業者により理解されるであろう。
【０１１０】
本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防および／または治療処置のために投与され得る。ある特定の治療応用では、選択される細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、モジュレーション、殺傷、または何らかの他の測定可能なパラメーターを達成するために充分な量は、「治療有効量」として定義される。この投与量を達成するために必要とされる量は、疾患の重篤度および患者自身の免疫系の全般的状態に依存するが、概ね体重１キログラム当たり０．００５〜５．０ｍｇの選択されるペプチドリガンドの範囲内であり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般的に使用される。予防応用のために、本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物はまた、類似のまたはわずかにより低い投与量において投与されてもよい。
【０１１１】
本発明によるペプチドリガンドを含有する組成物は、哺乳動物における選択標的細胞集団の変化、不活性化、殺傷または除去を補助するために予防的および治療的な設定において利用されてもよい。加えて、本明細書に記載のペプチドリガンドは、細胞の異成分集合物から標的細胞集団を選択的に殺傷し、枯渇させまたは他に効果的に除去するために生体外またはインビトロにおいて使用されてもよい。哺乳動物からの血液を選択されるペプチドリガンドと生体外において合わせることにより、望まない細胞を殺傷し、またはそれ以外に標準技術にしたがって哺乳動物に戻すために血液から除去してもよい。
【０１１２】
＜治療的使用＞
本発明の二環ペプチドは、ＥｐｈＡ２結合剤として特定の有用性を有する。
【０１１３】
Ｅｐｈ受容体チロシンキナーゼ（Ｅｐｈ）は、チロシン残基においてタンパク質をリン酸化するキナーゼである受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の大きい群に属する。Ｅｐｈおよびその膜結合型エフリンリガンド（エフリン）は、細胞の位置決めおよび組織編成を制御する（Ｐｏｌｉａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ７，  ４６５−８０）。機能的および生化学的なＥｐｈ応答は、より高いリガンドオリゴマー化状態において起こる（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２，  ６６７−６７８）。
【０１１４】
他のパターニング機能の中で、様々なＥｐｈおよびエフリンは血管発生において役割を果たすことが示されている。ＥｐｈＢ４およびエフリン−Ｂ２のノックアウトは、毛細血管床を血管に再モデル化する能力の欠如（Ｐｏｌｉａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）および胚致死性を結果としてもたらす。一部のＥｐｈ受容体およびエフリンの持続性の発現もまた、新たに形成された成体微小血管において観察されている（Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  １０，  ３４３１−４２；  Ａｄａｍｓ  （２００３）  Ｊ  Ａｎａｔ  ２０２，  １０５−１２）。
【０１１５】
成体における一部のエフリンおよびその受容体の脱調節された再出現はまた、腫瘍浸潤、転移および血管新生に寄与することが観察されている（Ｎａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｉｃｒｏｓｃ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈ  ５９，  ５８−６７；Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）。さらには、一部のＥｐｈファミリーメンバーは、様々なヒト腫瘍からの腫瘍細胞上に過剰発現されることが見出されている（Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）；Ｍａｒｍｅ  （２００２）  Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ８１  Ｓｕｐｐｌ  ２，  Ｓ６６；  Ｂｏｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８，  １３６０−１）。
【０１１６】
ＥＰＨ受容体Ａ２（エフリンＡ型受容体２）は、ヒトにおいてＥＰＨＡ２遺伝子によりコードされるタンパク質である。
【０１１７】
ＥｐｈＡ２は、ヒトにおける複数のがんにおいて上方調節されており、多くの場合に、疾患進行、転移および予後不良と相関する。例えば、乳房（Ｚｅｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１，  ２３０１−２３０６；  Ｚｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７０，  ２９９−３０８；  Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  （２０１１）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，  ｅ２４４２６）、肺（Ｂｒａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ  （Ｐｈｉｌａ）  ２，  １０３９−１０４９；  Ｋｉｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９，  ６１３−６１８；  Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ  （２０１３）  Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｏｎｃｏｌ．  ８，  ３０１−３０８）、胃（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  ９６，  ４２−４７；  Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  ５４，  ２４１０−２４１７）、膵臓（Ｍｕｄａｌｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００６）  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２３，  ３５７−３６５）、前立腺（Ｗａｌｋｅｒ−Ｄａｎｉｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ  （１９９９）  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４１，  ２７５−２８０）、肝臓（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｈｅｐａｔｏｌ  Ｒｅｓ．  ３９，  １１６９−１１７７）および膠芽腫（Ｗｙｋｏｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ３，  ５４１−５５１；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．  ３１，  ４７７−４８８）。
【０１１８】
がんの進行におけるＥｐｈＡ２の全体的役割は依然として定義されていないが、腫瘍細胞の増殖、生存、浸潤および血管新生を含むがんの進行の多数のステージにおける相互作用について証拠が存在する。ＥｐｈＡ２発現の下方調節は腫瘍のがん細胞繁殖を抑制し（Ｂｉｎｄａ  ｅｔ  ａｌ  （２０１２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２２，  ７６５−７８０）、ＥｐｈＡ２の遮断は、ＶＥＧＦ誘導性の細胞遊走（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１，  ３２５０−３２５５）、出芽および血管新生（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １，  ２−１１；  Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｃａｎｃｅｒ  １０９，  ３３２−４０）ならびに転移の進行（Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １９，  １８８４−１８８６）を阻害する。
【０１１９】
ＥｐｈＡ２への抗体薬物コンジュゲートは、ラットおよびマウス異種移植モデルにおいて腫瘍成長を有意に減少させることが示されており（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６８，  ９３６７−９３７４）、類似のアプローチが男性において試みられたが、治療関連有害事象のために治療は中止されなければならなかった（Ａｎｎｕｎｚｉａｔａ  ｅｔ  ａｌ  （２０１３）  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  ｄｒｕｇｓ  ３１，  ７７−８４）。
【０１２０】
本発明の方法により選択されるポリペプチドリガンドは、インビボでの治療および予防応用、インビトロおよびインビボでの診断応用、インビトロアッセイならびに試薬応用などにおいて用いられてもよい。選択されるレベルの特異性を有するリガンドは、交差反応性が望まれる非ヒト動物における試験を伴う応用、または、ホモログもしくはパラログとの交差反応性が慎重に制御される必要がある診断応用において有用である。ワクチン応用などの一部の応用では、予め決定された範囲の抗原に対し免疫応答を誘発する能力を活用して、特定の疾患および病原体に対するワクチンを調整することができる。
【０１２１】
少なくとも９０〜９５％の均質性の実質的に純粋なペプチドリガンドは哺乳動物への投与のために好ましく、９８〜９９％またはより高い均質性は、特に哺乳動物がヒトである場合に、医薬的使用のために最も好ましい。所望に応じて部分的にまたは均質になるまで精製されると、選択されるポリペプチドは、診断的もしくは治療的（生体外を含む）にまたはアッセイ手順および免疫蛍光染色などの開発および実行において使用され得る（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｅ  ａｎｄ  Ｐｅｒｎｉｓ，  （１９７９  ａｎｄ  １９８１）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ）。
【０１２２】
本発明のさらなる態様によれば、疾患組織（例えば、腫瘍）におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害の予防、抑制または治療において使用するための、本明細書において定義されるようなペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートが提供される。
【０１２３】
本発明のさらなる態様によれば、疾患組織（例えば、腫瘍）におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害を予防、抑制または治療する方法であって、それを必要とする患者に本明細書において定義されるようなペプチドリガンドのエフェクター基および薬物コンジュゲートを投与することを含む方法が提供される。
【０１２４】
一実施形態では、ＥｐｈＡ２は哺乳動物ＥｐｈＡ２である。さらなる実施形態では、哺乳動物ＥｐｈＡ２はヒトＥｐｈＡ２である。
【０１２５】
一実施形態では、疾患組織におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害はがんから選択される。
【０１２６】
治療（または阻害）され得るがん（およびその良性の対応物）の例としては、上皮起源の腫瘍（腺癌、扁平癌、移行細胞癌および他の癌腫を含む様々な種類の腺腫および癌腫）、例えば、膀胱および尿路、乳房、胃腸管（食道、胃、小腸、結腸、直腸および肛門を含む）、肝臓（肝細胞癌）、胆嚢および胆汁系、外分泌膵臓、腎臓、肺（例えば、腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、気管支肺胞上皮癌および中皮腫）、頭頸部（例えば、舌、頬腔、喉頭、咽頭、鼻咽頭、扁桃、唾液腺、鼻腔および副鼻腔のがん）、卵巣、卵管、腹膜、膣、外陰部、陰茎、子宮頸部、子宮筋層、子宮内膜、甲状腺（例えば、甲状腺濾胞癌）、副腎、前立腺、皮膚および付属器（例えば、黒色腫、基底細胞癌、扁平細胞癌、ケラトアカントーマ、形成異常母斑）の癌腫；血液学的悪性腫瘍（すなわち、白血病、リンパ腫）および前悪性血液学的障害およびリンパ系列の血液学的悪性腫瘍および関連する状態を含む境界型悪性腫瘍の障害（例えば、急性リンパ性白血病［ＡＬＬ］、慢性リンパ性白血病［ＣＬＬ］、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫［ＤＬＢＣＬ］、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫および白血病、ナチュラルキラー［ＮＫ］細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、意義不明のモノクローナルガンマグロブリン血症、形質細胞腫、多発性骨髄腫、および移植後リンパ増殖性障害）、および骨髄系列の血液学的悪性腫瘍および関連する状態（例えば、急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］、慢性骨髄性白血病［ＣＭＬ］、慢性骨髄単球性白血病［ＣＭＭＬ］、好酸球増多症候群、骨髄増殖性障害、例えば、真性赤血球増加症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症、骨髄増殖性症候群、骨髄異形成症候群、および前骨髄球性白血病）；間葉起源の腫瘍、例えば軟組織肉腫、骨または軟骨の腫瘍、例えば、骨肉腫、線維肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、類上皮肉腫、消化管間質腫瘍、良性および悪性組織球腫、および隆起性皮膚線維肉腫；中枢または末梢神経系の腫瘍（例えば、星状細胞腫、神経膠腫および膠芽腫、髄膜腫、上衣腫、松果体腫瘍および神経鞘腫）；内分泌腫瘍（例えば、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、膵島細胞腫瘍、副甲状腺腫瘍、カルチノイド腫瘍および甲状腺の髄様癌）；目および付属器の腫瘍（例えば、網膜芽腫）；生殖細胞および栄養膜腫瘍（例えば、奇形腫、精上皮腫、未分化胚細胞腫、胞状奇胎および絨毛癌）；ならびに小児性および胎児性腫瘍（例えば、髄芽腫、神経芽腫、ウィルムス腫瘍、および未分化神経外胚葉性腫瘍）；または患者を悪性腫瘍にかかりやすくする症候群、先天性もしくはその他（例えば、色素性乾皮症）が挙げられるがそれに限定されない。
【０１２７】
さらなる実施形態では、がんは、乳がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、前立腺がん、肝臓がん、膠芽腫および血管新生から選択される。
【０１２８】
さらなる実施形態では、がんは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺がんから選択される。本発明のＢＤＣ（ＢＤＣ−８）は、３２日目から非小細胞肺癌を完全に根絶し、２８日目における懸濁液の投与後に腫瘍再成長は起こらなかったことを実証するデータが本明細書において提示される。このデータは、肺がん、特に非小細胞肺癌などのがんにおける本発明のＢＤＣの臨床的有用性を明確に実証する。
【０１２９】
「予防」という用語への本明細書における言及は、疾患の誘導前の保護的な組成物の投与を伴う。「抑制」は、誘導性の事象の後であるが疾患の臨床的出現の前の組成物の投与を指す。「治療」は、疾患症状が現れた後の保護的な組成物の投与を伴う。
【０１３０】
疾患からの保護または疾患の治療におけるペプチドリガンドの有効性をスクリーニングするために使用され得る動物モデル系が利用可能である。動物モデル系の使用は本発明により促進され、本発明は、ヒトおよび動物標的と交差反応して、動物モデルの使用を可能とし得るポリペプチドリガンドの開発を可能とする。
【０１３１】
以下の実施例を参照して本発明を以下においてさらに記載する。
【実施例】
【０１３２】
【表１−１】
2021507909.tif 000006
【表１−２】
2021507909.tif 000007
【表１−３】
2021507909.tif 000008
【０１３３】
［材料および方法］
ペプチド合成
ペプチド合成は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓにより製造されたＳｙｍｐｈｏｎｙおよびＳｙｍｐｈｏｎｙＸペプチド合成装置ならびにＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈによるＳｙｒｏ  ＩＩ合成装置を使用し、Ｆｍｏｃ化学に基づいた。標準的なＦｍｏｃ−アミノ酸（Ｓｉｇｍａ、Ｍｅｒｃｋ）を適切な側鎖保護基と共に用い、適用可能な場合、標準的な連結条件を各場合において使用した後、標準的な方法論を使用して脱保護を行った。ペプチドをＨＰＬＣにより精製し、単離の後にそれらを１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ、Ｓｉｇｍａ）を用いて修飾した。このために、直鎖状のペプチドを最大約３５ｍＬまでＨ２Ｏを用いて希釈し、アセトニトリル中の１００ｍＭのＴＢＭＢ（約５００μＬ）を加え、Ｈ２Ｏ中の１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３（約５ｍＬ）を用いて反応を開始させた。反応をＲＴにおいて約３０〜６０分間進行させ、反応が完了（ＭＡＬＤＩにより判断）したら約５００ｕｌの１Ｍの塩酸システイン（Ｓｉｇｍａ）を用いて停止させた。凍結乾燥後、移動相として０．１％のトリフルオロ酢酸と共に水／アセトニトリルを使用してＧｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）において修飾ペプチドを精製した。正しい環化材料を含有する純粋な画分をプールし、凍結乾燥し、貯蔵のために−２０℃で保った。
【０１３４】
他に記載しなければ、全てのアミノ酸はＬ配置において使用した。
【０１３５】
二環ペプチド薬物コンジュゲートＢＤＣ−１〜ＢＤＣ−５の調製
表１１に列記する二環ペプチド薬物コンジュゲートＢＤＣ−１〜ＢＤＣ−５の合成をＷＯ２０１６／０６７０３５に開示されるプロトコールを使用して行った。
【０１３６】
式（Ｃ）および（Ｄ）：
【化５】
2021507909.tif 000009
を有する活性化二環ペプチドを、二環前駆体の遊離アミノ基をＤＭＳＯ中のそれぞれＳＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート、Ａｎｎｏｖａ  Ｃｈｅｍ）およびＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、Ａｎｎｏｖａ  Ｃｈｅｍ）と反応させることにより合成した。二環前駆体の濃度は１０ｍＭ以上、室温において１．３倍過剰のＳＰＰまたはＳＰＤＢ、および２０倍過剰のジイソプロピルエチルアミンであった。ＬＣＭＳによる判断により、１時間後に反応は完了したと判断した。上記のように逆相により精製を行った。適切な画分を凍結乾燥した。
【０１３７】
式（Ｃ）および（Ｄ）を有する活性化二環ペプチドを、窒素ガスブランケット下の室温で２１時間、半水性条件（２ｍＭのＥＤＴＡを添加したｐＨ５．０の５０％のジメチルアセトアミドおよび５０％の１００ｍＭの酢酸ナトリウム）中で１．１５当量のＤＭ１（遊離チオールとして）を用いてジスルフィド交換した。反応液中の構造ＣおよびＤを有する活性化二環ペプチドの濃度は１０ｍＭ以上であった。
【０１３８】
この後に、Ｃ１８カラムを使用する標準的な逆相精製を行った。９５％より高い純度の画分を単離し、凍結乾燥した。材料は、測定可能な量の遊離の毒素を含有しなかった。
【０１３９】
［生物学的データ］
１．蛍光偏光測定
（ａ）直接結合アッセイ
蛍光タグ（フルオレセイン、ＳＩＧＭＡまたはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（商標）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのいずれか）を有するペプチドを、０．０１％のｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳまたは１００ｍＭのＮａＣｌおよび０．０１％のｔｗｅｅｎを含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（共にアッセイ緩衝液と称する）を用いて２．５ｎＭに希釈した。これをペプチドと同じアッセイ緩衝液中のタンパク質の滴定と合わせて、黒壁および黒底の低結合低体積３８４ウェルプレート中の２５μＬの総体積の１ｎＭのペプチド、典型的には、５μＬのアッセイ緩衝液、１０μＬのタンパク質（表１）、そして１０μＬの蛍光ペプチドを得た。２倍の段階希釈を使用して、既知の高親和性結合剤のための５００ｎＭから低親和性結合剤および選択性アッセイのための１０μＭまでの範囲内の最高濃度を有する１２の異なる濃度を得た。測定は、４８５ｎｍにおいて励起されて５２０ｎｍにおいて平行および垂直な放射を検出する「ＦＰ  ４８５  ５２０  ５２０」の光学モジュールを備えたＢＭＧ  ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳにより実行した。ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳを２５℃においてウェル当たり２００のフラッシュおよび０．１秒の配置遅延で設定し、各ウェルを５〜１０分間隔で６０分間測定した。ウェル中にタンパク質が存在しない６０分の終わりに各トレーサーについて解析のために使用される増加を決定した。Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｉｇｍａｐｌｏｔバージョン１２．０を使用してデータを解析した。ｍＰ値をユーザー定義の二次式にフィッティングしてＫｄ値を生成した：ｆ＝ｙｍｉｎ＋（ｙｍａｘ−ｙｍｉｎ）／Ｌｉｇ＊（（ｘ＋Ｌｉｇ＋Ｋｄ）／２−ｓｑｒｔ（（（（ｘ＋Ｌｉｇ＋Ｋｄ）／２）＾２）−（Ｌｉｇ＊ｘ）））。「Ｌｉｇ」は、使用したトレーサーの濃度の定義された値であった。
【０１４０】
（ｂ）競合結合アッセイ
蛍光タグを有しないペプチドを蛍光タグおよび既知のＫｄを有するペプチドとの競合において試験した（表２）。最大５％のＤＭＳＯを用いて直接結合アッセイにおいて記載したようなアッセイ緩衝液中に適切な濃度までペプチドを希釈した後、２倍に段階希釈した。５μＬの希釈したペプチドをプレートに加えた後に使用する蛍光ペプチドに依存する固定濃度（表２）の１０μＬのヒトまたはマウスＥｐｈＡ２（表１）、次に１０μＬの蛍光ペプチドを加えた。直接結合アッセイと同様に測定を実行したが、最初の測定の前に増加を決定した。データ解析をＳｙｓｔａｔ  Ｓｉｇｍａｐｌｏｔバージョン１２．０において行い、ｍＰ値をユーザー定義の三次式にフィッティングしてＫｉ値を生成した：
ｆ＝ｙｍｉｎ＋（ｙｍａｘ−ｙｍｉｎ）／Ｌｉｇ＊（（Ｌｉｇ＊（（２＊（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾０．５＊ＣＯＳ（ＡＲＣＣＯＳ（（−２＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾３＋９＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ）−２７＊（−１＊Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ＊Ｐｒｏｔ＊ｃ））／（２＊（（（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾３）＾０．５）））／３））−（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）））／（（３＊Ｋｌｉｇ）＋（（２＊（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾０．５＊ＣＯＳ（ＡＲＣＣＯＳ（（−２＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾３＋９＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ）−２７＊（−１＊Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ＊Ｐｒｏｔ＊ｃ））／（２＊（（（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾３）＾０．５）））／３））−（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ））））。
「Ｌｉｇ」、「ＫＬｉｇ」および「Ｐｒｏｔ」はいずれも、それぞれ蛍光ペプチド濃度、蛍光ペプチドのＫｄおよびＥｐｈＡ２濃度に関する定義された値であった。
【０１４１】
【表２】
2021507909.tif 000010
【０１４２】
【表３】
2021507909.tif 000011
【０１４３】
本発明のペプチドリガンドを上記のアッセイにおいて試験し、結果を表３〜１２に示す。
【０１４４】
【表４−１】
2021507909.tif 000012
【表４−２】
2021507909.tif 000013
【０１４５】
【表５−１】
2021507909.tif 000014
【表５−２】
2021507909.tif 000015
【表５−３】
2021507909.tif 000016
【０１４６】
【表６】
2021507909.tif 000017
【０１４７】
【表７−１】
2021507909.tif 000018
【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
2021507909.tif 000022
【０１４８】
【表８−１】
2021507909.tif 000023
【表８−２】
2021507909.tif 000024
【０１４９】
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【表９−８】
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【表９−９】
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【表９−１０】
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【表９−１１】
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【表９−１２】
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【０１５０】
【表１０−１】
2021507909.tif 000037
【表１０−２】
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【表１０−３】
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【０１５１】
【表１１】
2021507909.tif 000040
【０１５２】
【表１２】
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【０１５３】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【配列表】
2021507909000001.app
【国際調査報告】
2021507909.tif 000044
2021507909.tif 000045
2021507909.tif 000046
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