(57)【要約】  式：    【化１】2021530486.tif 000017による新規の選択的エストロゲン受容体分解物（ＳＥＲＤ）、その薬学的に許容される塩、薬学的組成物、使用、およびそれらの使用方法が提供される。
2021530486.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2021530486.tif 000015
の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記化合物が、
【化２】
2021530486.tif 000016
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、請求項１もしくは請求項２に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物。
【請求項４】
１つ以上の他の治療剤をさらに含む、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺を治療する方法であって、治療有効量の請求項１もしくは請求項２に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、そのような治療を必要としている患者に投与することを含む、方法。
【請求項６】
前記化合物、またはその薬学的に許容される塩が経口投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記乳癌がＥＲ陽性乳癌である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記胃癌がＥＲ陽性胃癌である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記肺癌がＥＲ陽性肺癌である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
治療における使用のための、請求項１または請求項２に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１１】
乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌の治療に使用するための、請求項１または請求項２の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
前記化合物が経口投与される、請求項１１に記載の使用のための、化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１３】
前記乳癌がＥＲ陽性乳癌である、請求項１２に記載の使用のための化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１４】
前記胃癌がＥＲ陽性胃癌である、請求項１２に記載の使用のための化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１５】
前記肺癌がＥＲ陽性肺癌である、請求項１２に記載の使用のための化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１６】
乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌を治療するための医薬の製造のための、請求項１もしくは請求項２に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１７】
前記化合物またはその薬学的に許容される塩が経口投与される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オールを調製する方法であって、１，４−ジオキサン中の（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）｛３−［２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−７−ヒドロキシキノリン−４−イル｝メタノンの溶液を約５℃に冷却することと、次いで水素化トリエチルホウ素リチウムを加えることと、を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法の生成物。
【請求項２０】
前記追加の治療剤が、５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オールである、請求項４に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
選択的エストロゲン受容体分解剤（ＳＥＲＤ）は、エストロゲン受容体（ＥＲ）に結合し、ＥＲ媒介転写活性を下方制御する。ＳＥＲＤによって引き起こされるこの分解と下方制御は、がんなどの細胞増殖障害の治療に役立つ可能性がある。ＳＥＲＤのいくつかの小分子の例が文献に開示されている（例えば、ＷＯ２００５０７３２０４、ＷＯ２０１４２０５１３６、およびＷＯ２０１６０９７０７１を参照されたい）。しかしながら、既知のＳＥＲＤは、がんを効果的に治療するために必要なほど有用ではない。例えば、薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）の特性が高く、診療所での効率が高く、経口バイオアベイラビリティが良好なＳＥＲＤを見つけることは、がんの治療に非常に役立つ。ＥＲ媒介転写を強力に阻害する純粋なアンタゴニストＳＥＲＤは、がんの治療に明らかに有益である。乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、および肺癌などのがん、ならびに、新たな耐性による変異を治療するための新しいＳＥＲＤが必要である。特に、ＥＲ陽性乳癌、胃癌、および／または肺癌を治療するための新しいＳＥＲＤが必要である。
【発明の概要】
【０００２】
式の化合物
【０００３】
【化１】
2021530486.tif 000003
【０００４】
の化合物、およびその薬学的に許容される塩、ならびにその薬学的組成物が本明細書に提供される。
【０００５】
乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌を治療するために、本明細書に記載の化合物、その薬学的に許容される塩、およびその薬学的組成物を使用する方法も提供される。この方法は、治療有効量の本明細書に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、必要とする患者に投与することを含む。
【０００６】
治療に使用するための、本明細書に記載の化合物、およびその薬学的に許容される塩がさらに提供される。本明細書に記載の化合物、およびその薬学的に許容される塩は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌の治療に使用することができる。
【０００７】
乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌を治療するための医薬の製造のための、本明細書に記載の化合物およびその薬学的に許容される塩の使用がさらに提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ＳＥＲＤとして作用する新規な四環式化合物およびその医薬塩が本明細書に開示されている。ＳＥＲＤは、ホルモン受容体陽性乳癌を治療するために、単剤として、または選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、アロマターゼ阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、およびｍＴＯＲ阻害剤などの他のクラスの薬剤と組み合わせて使用できる。
【０００９】
本明細書に記載の新規化合物は、以下の式の化合物である。
【００１０】
【化２】
2021530486.tif 000004
【００１１】
化合物の薬学的に許容される塩も記載されている。この化合物は、ＩＵＰＡＣの命名法を使用して、（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）｛３−［２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−７−ヒドロキシキノリン−４−イル｝メタノンと名付けることができる。
【００１２】
また、本明細書に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と組み合わせて含む薬学的組成物も記載される。本明細書に記載の薬学的組成物は、薬学的に許容される添加剤を使用して調製することができる。本明細書において使用されるとき、「薬学的に許容される添加剤」という用語は、組成物または製剤の他の成分と互換性があり、患者に有害でない１つ以上の担体、希釈剤、および賦形剤を指す。本明細書に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩は、経口またはＩＶなどの様々な経路によって投与される薬学的組成物として製剤化することができる。バイオアベイラビリティはしばしばがん治療における因子であり、有効成分のバイオアベイラビリティを制御または最適化するための投与方法および薬学的組成物を調整する能力は有用である。経口で生物学的に利用可能なＳＥＲＤ組成物は特に有用であろう。本明細書に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩は、経口バイオアベイラビリティを有すると考えられている。薬学的組成物およびそれらの調製のためのプロセスの例は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，Ｌ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ  Ｊｒ，Ｅｄｉｔｏｒ，２２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，２０１２に見出され得る。薬学的に許容される担体、希釈剤、および賦形剤の非限定的な例には、以下のものが挙げられる：生理的食塩水、水、デンプン、糖、マンニトール、およびシリカ誘導体、カルボキシメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、ならびにポリビニルピロリドンなどの結合剤、カオリンおよびベントナイト、ポリエチルグリコール。
【００１３】
本明細書でさらに説明されるのは、がんを治療する方法である。本明細書に記載の方法は、そのような治療を必要とする患者に、本明細書に記載の有効量の化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。例えば、本明細書に記載の有効量の化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与する方法は、経口投与であり得る。がんは、エストロゲン応答性のがんであり得る。さらに、がんは、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌であり得る。例えば、がんは、ＥＲ陽性乳癌、ＥＲ陽性胃癌、またはＥＲ陽性肺癌であり得る。
【００１４】
治療に使用するための、本明細書に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩も本明細書に記載される。本明細書に記載の化合物、または本明細書に記載のその薬学的に許容される塩は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌の治療に使用することができる。特に、がんは、ＥＲ陽性乳癌、ＥＲ陽性胃癌、またはＥＲ陽性肺癌であり得る。例えば、化合物、またはその薬学的に許容される塩は、経口投与することができる。
【００１５】
さらに、本明細書に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩については、がんの治療のための医薬の製造に使用することができる。例えば、医薬は経口投与することができる。本明細書に記載の医薬を治療に使用できる癌のタイプには、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌が含まれる。特に、がんは、ＥＲ陽性乳癌、ＥＲ陽性胃癌、またはＥＲ陽性肺癌であり得る。
【００１６】
本明細書に記載の化合物、およびその薬学的に許容される塩は、単剤として、または乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、および肺癌などのがんの治療のための他の抗がん剤と組み合わせて、臨床的有用性を有し得る。他の抗がん剤と組み合わせて使用する場合、本明細書に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、他の抗がん剤と同時に、逐次的に、または別々に使用することができる。本明細書に記載の化合物と組み合わせることができる他の抗癌剤の例は、５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オールである。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、用語「有効量」は、単回または複数回用量の患者への投与の際に、診断または治療下にある患者に所望の効果を提供する、本明細書に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩の量または用量を指す。好ましくは、所望の効果は、腫瘍細胞増殖の阻害、腫瘍細胞死、またはその両方である。本明細書に記載の化合物、または本明細書に記載のその薬学的に許容される塩は、一般に、広い投与量範囲にわたって有効である。例えば、１日あたりの投与量は、通常、約１００ｍｇから約２０００ｍｇの１日の範囲内にある。
【００１８】
本明細書中で使用する場合、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、存在する症状または障害の進行または重症度を抑制、減速、停止、または反転させることを指す。
【００１９】
本明細書で使用されるとき、「患者」という用語は、特定の疾患、障害、または状態に苦しんでいるヒトを指す。
【００２０】
本明細書に記載の化合物、または本明細書に記載のその薬学的に許容される塩は、当該技術分野において既知の様々な手順によって調製することができ、それらのうちのいくつかを、以下の調製物および実施例において示す。記載される各経路の具体的な合成ステップは、本明細書に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を調製するために、様々な方法と、または異なる手順からのステップと共に組み合わされてもよい。生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、磨砕、および結晶化を含む、当該技術分野で周知の従来の方法によって回収することできる。試薬および出発材料は、当業者にとって容易に入手可能である。
【００２１】
任意のステップにおいて、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩は、標準条件下で、適切な溶媒中で、本発明の化合物の適切な遊離塩基との適切な薬学的に許容される酸との反応によって形成され得る。さらに、そのような塩の形成は、窒素保護基の脱保護時に同時に起こり得る。薬学的に許容される塩の形成の可能性は周知である。例えば、Ｇｏｕｌｄ，Ｐ．Ｌ．，“Ｓａｌｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｄｒｕｇｓ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１−２１７（１９８６）、Ｂａｓｔｉｎ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｓａｌｔ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎｅｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｔｉｔｉｅｓ，”Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：４２７−４３５（２０００）、およびＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１−１９，（１９７７）を参照されたい。本明細書に記載の化合物は、薬学的に許容される塩に容易に変換され、薬学的に許容される塩として分離され得ることを当業者は理解するであろう。
【００２２】
特に明記しない限り、本明細書で使用される略語は、Ａｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．１，１９８４、または当業者の一般に認められている意味に従って定義される。その他の略語は次のように定義される。「ＡＵＣ」は曲線下面積を指す。「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを指す。「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンまたは塩化メチレンを指す。「ＤＭＡ」はジメチルアミンを指す。「ＤＭＥＭ」とは、ダルベッコ改変イーグル培地を指す。「ＤＭＦ」はＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドを指す。「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指す。「ＤＮＡ」はデオキシリボ核酸を指す。「ｃＤＮＡ」は相補的ＤＮＡを指す。「ＤＮａｓｅ」はデオキシリボヌクレアーゼを指す。「ＤＴＴ」はジチオスレイトールを指す。「ＥＣ５０」は、事前定義された陽性対照化合物（絶対ＥＣ５０）と比較して、標的活性の５０％の応答を生じる薬剤の濃度を指す。「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミン四酢酸を指す。「ＥＲα」はエストロゲン受容体アルファを指す。「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指す。「ＥｔＯＨ」はエタノールを指す。「ＦＢＳ」はウシ胎仔血清を指す。「ＨＢＳＳ」はハンクス平衡塩類溶液を指す。「ＨＥＰＥＳ」は、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピプαジンエタンスルホン酸を指す。「ＩＣ５０」は、その薬剤で可能な最大阻害応答の５０％を生成する薬剤の濃度（相対ＩＣ５０）、またはプラセボ対照と比較して標的酵素活性の５０％阻害を生成する薬剤の濃度（絶対ＩＣ５０）を指す。「ｉＰｒＯＨ」は、イソプロパノールまたはイソプロピルアルコールを指す。「ＩＶ」は静脈内投与を指す。「Ｋｉ」は阻害定数を指す。「ＭｅＯＨ」は、メチルアルコールまたはメタノールを指す。「ＭＴＢＥ」はメチルｔ−ブチルエーテルを指す。「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水を指す。「ＰＯ」は経口投与を指す。「ＰＲα」はプロゲステロン受容体アルファを指す。「ＱＤ」は１日１回の投与を指す。「ＲＮＡ」はリボ核酸を指す。「ＲＮａｓｅ」はリボヌクレアーゼを指す。「ＲＴ−ＰＣＲ」は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を指す。「ＲＴ−ｑＰＣＲ」は、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応を指す。「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指す。「ＸＰｈｏｓ  Ｐｄ  Ｇ２」は、クロロ（２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピル−１，１’−ビフェニル）［２−（２’−アミノ−１，１’−ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）を指す。
【実施例】
【００２３】
下記の調製物および実施例は、本発明をさらに例示する。
【００２４】
調製物および実施例
調製物１
２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エタン−１−オール
【００２５】
【化３】
2021530486.tif 000005
【００２６】
トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（４０５ｇ、１．９１ｍｏｌ）を、Ｎ２下で１５分間かけて少しずつ、ＤＣＭ（２．４Ｌ）中の３−（フルオロメチル）アゼチジン塩酸塩（１６０ｇ、１．２８ｍｏｌ）の撹拌０℃溶液に加え、０℃で１０分間攪拌する。１，４−ジオキサン−２，５−ジオール（９９ｇ、０．８３ｍｏｌ）を０℃で１時間かけて６回に分けて加え、０〜５℃で１５分間撹拌する。反応物を室温に温め、Ｎ２下で２時間撹拌する。反応物を２０分間かけて１０〜１５℃に冷却する。１０〜１５℃で２５〜３０分間かけて水（８００ｍＬ）を加え、５〜１０分間室温まで温めてから、層を分離する。水層をＤＣＭ（８００ｍＬ）で洗浄し、層を分離してから、合わせた水層を１０〜１５℃に冷却し、５０％水酸化ナトリウム溶液（約５４０ｍＬ）を使用してｐＨを１３〜１４に調整する。水層を室温まで温め、ＤＣＭ（４×８００ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウム（８０ｇ）で乾燥し、濾過し、濃縮乾固して、表題化合物を得る。この調製に続いて、１３４．１（Ｍ＋Ｈ）のＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）を有する濃い黄色の油状物として１３９ｇ（８２％）の表題化合物が得られた。
【００２７】
調製物２
２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エタン−１−オール塩酸塩
【００２８】
【化４】
2021530486.tif 000006
【００２９】
２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エタン−１−オール（５２９ｇ、４ｍｏｌ）をＭＴＢＥ（２．６Ｌ）に溶解し、０℃に冷却する。ＨＣｌ／ＥｔＯＨ溶液（４９２ｍＬ、３０ｗｔ％）を３０分かけて滴下し、０℃で３０分間撹拌する。固体を濾過し、濾過ケークをＭＴＢＥ（２×２００ｍＬ）で洗浄する。Ｎ２下で８時間乾燥して、表題化合物を得る。この調製に続いて、１３４．０（Ｍ＋Ｈ）のＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）を有する白色の固体として５８０ｇ（８６％）の表題化合物が得られた。
【００３０】
調製物３
（３−クロロ−７−メトキシキノリン−４−イル）−（４−フルオロフェニル）メタノン
【００３１】
【化５】
2021530486.tif 000007
【００３２】
４−ブロモ−３−クロロ−７−メトキシキノリン（７０ｇ、２５４ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（１Ｌ）の混合物をＮ２下で−４０℃に冷却し、材料を沈殿させる。イソプロピルマグネシウムクロリド（ＴＨＦ中２Ｍ、２５４ｍＬ、５０９ｍｍｏｌ）を２０分かけて加え、混合物を１時間撹拌する。ＴＨＦ（１４０ｍＬ）中の４−フルオロベンゾイルクロリド（６６ｍＬ、５５９ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、次いで室温まで温める。飽和塩化アンモニウム溶液（３００ｍＬ）および水（２００ｍＬ）で反応をクエンチし、層を分離する。飽和塩化アンモニウム溶液（３００ｍＬ）で有機層を洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮して油状残渣をもたらす。ＭＴＢＥ／ヘキサン（１：１）の混合物で溶出するシリカゲルで粗褐色油を濾過して、粗生成物を黄色の固体（８４ｇ）として得る。固体を１０％酢酸メチル／ヘプタン（８００ｍＬ）で処理し、室温で一晩撹拌する。固体を集めるために濾過し、保存する。濾液を濃縮し、１０〜４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するシリカで精製し、次いで生成物を１０％の酢酸メチル／ヘプタン（２００ｍＬ）で処理し、室温で３時間撹拌する。得られた固体を濾過し、前の濾過からの固体と合わせ、真空下で一晩乾燥させて、表題化合物を得る。この調製に続いて、３１６．０（Ｍ＋Ｈ）のＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）を有する黄色の固体として３１ｇ（３８％）の表題化合物が得られた。
【００３３】
調製物４
（３−クロロ−７−ヒドロキシキノリン−４−イル）−（４−フルオロフェニル）メタノン
【００３４】
【化６】
2021530486.tif 000008
【００３５】
三臭化ホウ素（ＤＣＭ中１Ｍ、２９５ｍＬ、２９５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２１７ｍｌ）中の（３−クロロ−７−メトキシキノリン−４−イル）−（４−フルオロフェニル）メタノン（３１ｇ、９８ｍｍｏｌ）の混合物に加え、混合物を室温で３日間撹拌する。混合物を二塩基性リン酸カリウム（水中２Ｍ、７００ｍＬ）と水（２００ｍＬ）の０℃溶液にゆっくりと注ぐ。混合物を室温に温め、１時間撹拌する。溶液を真空で濃縮して有機溶媒を除去し、濾過し、濾液を収集し、４５℃で一晩真空下で濾液を乾燥させる。固体をＤＣＭ／ヘプタン（１：１、４５０ｍＬ）で処理し、一晩撹拌する。固体を収集し、真空下で一晩乾燥させて、表題化合物を得る。この調製に続いて、３０２．０（Ｍ＋Ｈ）のＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）を有する薄茶色の固体として３２ｇ（定量的収率）の表題化合物が得られた。
【００３６】
調製物５
（３−クロロ−７−ヒドロキシキノリン−４−イル）−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）メタノン
【００３７】
【化７】
2021530486.tif 000009
【００３８】
ＤＭＦ（７５ｍｌ）中の（３−クロロ−７−ヒドロキシキノリン−４−イル）−（４−フルオロフェニル）メタノン（５．００ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エタン−１−オール塩酸塩（３．９０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を加え、続いて水素化ナトリウム（鉱油中６０％、３．０７ｇ、７６．６ｍｍｏｌ）を加える。Ｎ２下で攪拌し、４０℃で４５分間温める。水で溶液をクエンチし、濃縮する。残渣を２０％ｉＰｒＯＨ／ＣＨＣｌ３と飽和重炭酸ナトリウム水溶液に分配し、分離し、２×２０％ｉＰｒＯＨ／ＣＨＣｌ３で水層を抽出し、有機抽出物を合わせ、合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮して、粗生成物を暗赤色の油状物として得る。ＭｅＯＨ／ＤＣＭ中の５〜１０％の７ＮのＮＨ３の勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって粗製物質を精製して、表題化合物を得る。この調製に続いて、４１５．０（Ｍ＋Ｈ）のＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）を有する黄色の固体として５．３１ｇ（８４％）の表題化合物が得られた。
【００３９】
調製物６
（４−フルオロフェニル）−［３−［２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−７−ヒドロキシ−４−キノリル］メタノン
【００４０】
【化８】
2021530486.tif 000010
【００４１】
（３−クロロ−７−ヒドロキシ−４−キノリル）−（４−フルオロフェニル）メタノン（１４０ｇ、４４０．８ｍｍｏｌ）、２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸（１８３．３ｇ、８８１．７ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１８４．６ｇ、１．３ｍｏｌ）、２−メチル−２−ブタノール（１．７Ｌ）、および水（０．５６Ｌ）の混合物を５×Ｎ２で脱気／パージする。ＸＰｈｏｓ  Ｐｄ  Ｇ２（７．１ｇ、８．８２ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で２時間加熱する。混合物を室温まで冷却し、有機溶媒を蒸発させる。ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）および水（０．２Ｌ）を加える。有機層を分離し、それを硫酸マグネシウム上で乾燥させる。この材料をシリカゲルで濾過し、濃縮乾固する。ヘキサン（１．２５Ｌ）とＭＴＢＥ（０．２５Ｌ）の混合物で粗製物質を粉末化して、固体を得る。固体を濾過し、真空下で乾燥させる。固体をＴＨＦ（１．５Ｌ）に溶解し、ＳｉｌｉａＭｅｔＳ（登録商標）チオールの捕捉剤（１５０ｇ）を加える。反応混合物を室温で一晩撹拌する。捕捉剤を濾過し、濾液を蒸発乾固させて、表題化合物を得る。この調製に続いて、４３０．０（Ｍ＋Ｈ）のＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）を有する白色の固体として１８５．５ｇ（９６％）の表題化合物が得られた。
【００４２】
実施例１
（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）｛３−［２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−７−ヒドロキシキノリン−４−イル｝メタノン
【００４３】
【化９】
2021530486.tif 000011
【００４４】
Ｎ２注入口を備えた容器に、ＴＨＦ（２．８Ｌ）、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２７４．５ｇ、２．４５ｍｏｌ）および２−（３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル）エタン−１−オール（１６８ｇ、１．２２ｍｏｌ）を加える。混合物を１０分間撹拌する。ＴＨＦ（０．７Ｌ）中の（４−フルオロフェニル）−［３−［２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−７−ヒドロキシ−４−キノリル］メタノン（３５０ｇ、０．８１ｍｏｌ）の溶液を滴下する。室温で１時間攪拌する。ｐＨ８になるまで１ＮのＨＣｌで反応をクエンチし、ＥｔＯＡｃ（４Ｌ）で希釈する。有機層を分離し、ブライン（２Ｌ）で洗浄する。硫酸マグネシウムで溶液を乾燥させ、溶液を濾過し、濃縮乾固して、表題化合物を得る。この調製に続いて、５４３．２（Ｍ＋Ｈ）のＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）を有する淡褐色の固体として４１５ｇ（９３．８％）の表題化合物が得られた。
【００４５】
代替実施例１
マイクロ波バイアル中の混合物（３−クロロ−７−ヒドロキシキノリン−４−イル）−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）メタノン（２００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸（１５８ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２０２ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）、２−メチル−２−ブタノール（３ｍｌ）、および水（１ｍｌ）をＮ２×５で脱気／パージする。ＸＰｈｏｓ  Ｐｄ  Ｇ２（１２ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を密封し、８０℃で２時間マイクロ波をかける。ＭＴＢＥと飽和塩化アンモニウム溶液の間で残渣を分配する。層を分離し、水層をＭＴＢＥ抽出する。有機抽出物を合わせ、硫酸マグネシウム上でそれらを乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮してオレンジ色の残渣を得る。５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって粗製物質を精製して、表題化合物を得る。この調製に続いて、５４３．２（Ｍ＋Ｈ）のＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）を有する黄色の固体として２０５ｍｇ（７８％）の表題化合物が得られた。
【００４６】
実施例２
ラセミ体の５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール
【００４７】
【化１０】
2021530486.tif 000012
【００４８】
１，４−ジオキサン（１００ｍＬ）中の（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）｛３−［２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−７−ヒドロキシキノリン−４−イル｝メタノン（５．２７ｇ、９．７１ｍｍｏｌ）の溶液を５℃まで冷却する。水素化トリエチルホウ素水素化リチウム（ＴＨＦ中１Ｍ、３０．０ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ）を加える。冷却浴を取り外し、室温で１．５時間撹拌する。混合物を水でクエンチする。飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液とＥｔＯＡｃを加える。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を合わせ、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮する。粗残渣をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解する。水素化ナトリウム（鉱油中６０％溶液、１．９４ｇ、４８．５ｍｍｏｌ）を加える。溶液を１．５時間加熱還流する。追加の水素化ナトリウム（鉱油中６０％、１．９４ｇ、４８．５ｍｍｏｌ）を加え、次いでさらに３０分間還流する。溶液を室温まで冷却し、水でクエンチする。ＥｔＯＡｃと飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液を加える。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を合わせ、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮する。ＤＣＭ中の５〜７％ＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製して、表題化合物（３．７０ｇ、７２％）を淡黄色の泡状物質として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５２５．２（Ｍ＋Ｈ）。
【００４９】
生物学的アッセイ
エストロゲン受容体の発現と特定のがんとの関係は、文献で報告されている（乳癌については、例えば、Ｐｕｈａｌｌａ  Ｓ，Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ  Ｓ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｎ．，Ｈｏｒｍｏｎａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃａｒｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１２，６：２２２−２３６、Ｋｅｎｎｅｃｋｅ  Ｈ，Ｙｅｒｕｓｈａｌｍｉ  Ｒ，Ｗｏｏｄｓ  Ｒ，Ｃｈｅａｎｇ  ＭＣＵ，Ｖｏｄｕｃ  Ｄ，Ｓｐｅｅｒｓ  ＣＨ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＴＯ，Ｇｅｌｍｏｎ  Ｋ，Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２０１０，２８（２０）：３２７１−３２７７を参照されたい、卵巣癌については、例えば、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  ＡＪ，Ｍａｃｌｅｏｄ  ＫＧ，Ｂｕｒｎｓ  ＤＪ，Ｓｍｙｔｈ  ＪＦ，Ｌａｎｇｄｏｎ  ＳＰ，Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ，２００５；１２（４）：８５１−６６、Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ，ＭａｃＬｅｏｄ  Ｋ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＡＲ，Ｃａｍｅｒｏｎ  ＤＡ，Ｓｍｙｔｈ  ＪＦ，Ｌａｎｇｄｏｎ  ＳＰ，Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ，Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ，２００７，１０６（３）：４６１−８、Ｓｍｙｔｈ  ＪＦ，Ｇｏｕｒｌｅｙ  Ｃ，Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ，ＭａｃＫｅａｎ  ＭＪ，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  Ａ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＡＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｓ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃａｓｅｓ：Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ  ｉｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００７，１３（１２）：３６１７−２２を参照されたい、前立腺癌については、例えば、Ｂｏｎｋｏｈｏｆｆ  Ｈ，Ｆｉｘｅｍｅｒ  Ｔ，Ｈｕｎｓｉｃｋｅｒ  Ｉ  ａｎｄ  Ｒｅｍｂｅｒｇｅｒ  Ｋ，Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｌｅｓｉｏｎｓ，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１９９９，１５５：６４１−６４７を参照されたい、子宮内膜癌および子宮癌については、例えば、Ｋｒａｓｎｅｒ  Ｃ，Ａｒｏｍａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  ｃａｎｃｅｒ，Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００７，Ａｕｇ−Ｓｅｐ；１０６（１−５）：７６−８０、Ｂｏｉｓｅｎ  ＭＭ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ＣＬ，Ｓｒｅｅｋｕｍａｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｇｙｎｅｃｏｌｏ��ｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  （ＳＥＲＤｓ）：Ｐｒｏｍｉｓｅ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２０１５，４１８：３２２−３３３０を参照されたい、肺癌については、例えば、Ｂａｉｋ  ＣＳ，Ｅａｔｏｎ  ＫＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：Ａｎ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，４：９６９−９８８、Ｍａｒｑｕｅｚ−Ｇａｒｂａｎ  ＤＣ，Ｃｈｅｎ  Ｈ−Ｗ，Ｇｏｏｄｇｌｉｃｋ  Ｌ，Ｆｉｓｈｂｅｉｎ  ＭＣ  ａｎｄ  Ｐｉｅｔｒａｓ  ＲＪ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｒｏｍａｔａｓｅ  ａｎｄ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，２００９，１１５５：１９４−２０５、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＤＨ，Ｇｒｉｎｅｒ  ＬＭ，Ｋｅｌｌｅｒ  ＪＭ，Ｈｕ  Ｘ，Ｓｏｕｔｈａｌｌ  Ｎ，Ｍａｒｕｇａｎ  Ｊ，Ｄａｖｉｄ  ＪＭ，Ｆｅｒｒｅｒ  Ｍ  ａｎｄ  Ｐａｌｅｎａ  Ｃ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｆｕｌｖｅｓｔｒａｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１６，２２（２４）：６２０４−１６、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌａｒａ  Ｖ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＪＭ，Ａｒｒｉｅｔａ  Ｏ，Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１８，１０（１）：４８２−４９７を参照されたい、胃癌については、例えば、Ｔａｎｇ  Ｗ，Ｌｉｕ  Ｒ，Ｙａｎ  Ｙ，Ｐａｎ  Ｘ，Ｗａｎｇ  Ｍ，Ｈａｎ  Ｘ，Ｒｅｎ  Ｈ，ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１７，８（２５）  ４０７６５−７７７を参照されたい。
【００５０】
以下のアッセイは、例示された化合物がＥＲα野生型および変異タンパク質の強力な分解剤であることを実証する。アッセイの結果はまた、例示された化合物がＥＲα野生型および変異受容体の強力なアンタゴニストであり、ＥＲ媒介転写活性を阻害することを実証する。さらに、アッセイは、実施例１の化合物が、ＥＲ＋乳癌細胞株の増殖を阻害し、ＥＲ陽性乳癌異種移植モデルにおけるＥＲαシグナル伝達と腫瘍増殖の阻害を実証している。
【００５１】
ＥＲα（野生型）およびＥＲα（Ｙ５３７Ｓ変異体）の競合結合アッセイ
以下のＥＲ競合結合アッセイの目的は、ＥＲα（野生型）およびＥＲα（Ｙ５３７Ｓ変異体）に対する試験化合物の結合親和性を決定することである。Ｆａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  Ｙ５３７Ｓ  ａｎｄ  Ｄ５３８Ｇ  ｃｏｎｆｅｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｙ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ−２  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”  ｅＬｉｆｅ  ２０１６；５：ｅ１２７９２を参照されたい。
【００５２】
５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１．５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍｇ／ｍＬオボアルブミン、および５ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液中で、ウェルあたり０．０２５μＣｉの３Ｈ−エストラジオール（１１８Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１ｍＣｉ／ｍＬ）、７．２ｎｇ／ウェルのＥＲα（野生型）、または７．２ｎｇ／ウェルのＥＲα（Ｙ５３７Ｓ変異体）を使用して競合結合アッセイを実行する。１０，０００ｎＭ〜０．５ｎＭの範囲の１０種類の濃度で試験化合物を加え、１μＭの１７−βエストラジオールの存在下で非特異的結合を決定する。結合反応液（１４０μＬ）を室温で４時間インキュベートした後、冷デキストラン−チャコール緩衝液（７０μＬ）（５０ｍＬのアッセイ緩衝液あたり０．７５ｇのチャコールと０．２５ｇのデキストランを含む）を各反応液に加える。プレートを４℃の軌道式振盪機で８分間混合し、３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離する。混合物のアリコート（１２０μＬ）を別の９６ウェルの白い平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に移し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘシンチレーション液（１７５μＬ）を各ウェルに加える。プレートを密封し、軌道式振盪機で激しく振とうする。２．５時間のインキュベーション後、ＷａｌｌａｃＭｉｃｒｏｂｅｔａカウンターでプレートを読み取る。４パラメーターロジスティックカーブフィットを使用してＩＣ５０を計算し、１０μＭでの阻害％を計算する。化合物のＩＣ５０値は、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式を用いて、Ｋｉに変換する。このアッセイの結果は、実施例１の化合物が、３．７８±０．７４（ｎ＝３）のＫｉ（ｎＭ）で組換えＥＲα野生型に結合し、２１．２４±２．１２（ｎ＝３）のＫｉ（ｎＭ）でＥＲα変異体（Ｙ５３７Ｓ）に結合することを実証する。
【００５３】
このアッセイの結果は、ＥＲα野生型および変異体（ＥＳＲ１  Ｙ５３７Ｓ）に対する例示された化合物の結合親和性および効力を示している。
【００５４】
ＭＣＦ７細胞におけるＥＲα分解アッセイ
以下のＥＲα分解アッセイの目的は、ＭＣＦ７などのＥＲα陽性乳癌細胞株における試験化合物によるＥＲαの分解を測定することである。
【００５５】
１０％ＦＢＳ、０．０１ｍｇ／ｍＬヒトインスリン１、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を補充したＤＭＥＭ培地でＭＣＦ７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２から購入）細胞を培養し、１０％チャコール処理ＦＢＳを含むフェノールレッドフリーＤＭＥＭ培地（２０μＬ）中でウェルあたり４，０００細胞の密度で３８４ウェル平底プレートに播種する。細胞培養インキュベーター（５％ＣＯ２、９５％相対湿度、３７℃）で一晩細胞をインキュベートし、細胞をプレートに付着させる。翌日、細胞に試験化合物を投与する。Ｅｃｈｏ５５５音響ディスペンサーを使用して、６μＭから０．０００３μＭの範囲の試験化合物段階希釈液（１：３）を調製する。連続希釈プレートから細胞プレートに５μＬを加えることによって細胞に投与し、最終ＤＭＳＯ濃度が０．２％になり、最終試験化合物濃度が２〜０．０００１μＭの用量範囲になる。最大点には、０．２％のＤＭＳＯを含む培地を使用し、最小点には、０．２％ＤＭＳＯを含む増殖培地で２μＭの最終濃度に希釈したフルベストラントを使用する。試験化合物を投与後、２４時間３７℃、５％ＣＯ２で細胞プレートをインキュベートする。１４％パラホルムアルデヒド（１０μＬ）を室温で３０分間加えることによって、細胞を固定する。細胞をＰＢＳ（２０μＬ）で１回洗浄し、０．５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（２０μＬ）で１時間インキュベートする。０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（２×）を含むＰＢＳで細胞を洗浄し、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０および０．１％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００を含むＰＢＳ中の３％ＢＳＡ（２０μＬ／ウェル）で室温で１時間ブロッキングする。ウェルあたり０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳ中の１％ＢＳＡで希釈した１：５００一次抗体（２０μＬ）（ＥＲα（クローンＳＰ１）モノクローナルウサギ抗体＃ＲＭ−９１０１−Ｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、プレートを密封して４℃で一晩インキュベートする。翌日、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（２×）を含むＰＢＳで細胞を洗浄し、ＰＢＳ１％ＢＳＡ中の二次抗体（２０μＬ／ウェル）（１：１０００希釈、ヤギ抗ウサギＩｇＭ  ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（商標）４８８）と室温で１０５分間インキュベートする。プレートをＰＢＳ（２×２０μＬ）で洗浄した後、ＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）（５０μｇ／ｍＬを２０μＬ）およびウェルあたり（２０μＬ）のＰＢＳ中の１：１０００のヨウ化プロピジウム希釈液を加える。プレートを密封し、ベンチで室温で１時間インキュベートする（光から保護する）。ＡＣＵＭＥＮ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）［ＴＴＰＬＡＢＴＥＣＨ  ＬＴＤ製のレーザースキャン蛍光マイクロプレートサイトメーター］でプレートをスキャンして、ＥＲαを測定する。画像解析は、陽性細胞を識別するための細胞蛍光シグナルに基づく。平均強度によってエストロゲン受容体陽性細胞を識別する。ヨウ化プロピジウム／ＤＮＡからの５７５〜６４０ｎｍでの総強度を使用して、個々の細胞を識別する。アッセイのアウトプットはエストロゲン受容体陽性細胞％である。ＧＥＮＥ  ＤＡＴＡ（商標）を使用して、各アウトプットの４つのパラメーターロジスティックにカーブフィッティングすることにより、ＩＣ５０を決定する。
【００５６】
このアッセイの結果は、式（Ｉ）の化合物が、細胞において強力なＥＲα分解活性を有するＳＥＲＤであることを示している。具体的には、結果は、ＭＣＦ７乳癌細胞における実施例１の化合物によるＥＲαの強力な分解を示している。このアッセイを使用すると、実施例１の化合物の相対ＩＣ５０（μＭ）値は、２．１６±０．９６ｎＭ（ｎ＝１５）である。
【００５７】
ＭＣＦ７細胞におけるＰＲα誘導アッセイ
以下のＰＲα誘導アッセイの目的は、試験化合物がＥＲα受容体に対してアゴニスト活性を有するかどうかを判定することである（アゴニストは受容体を活性化すると予想される）。
【００５８】
１０％ＦＢＳ、０．０１ｍｇ／ｍＬヒトインスリン１、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を補充したＤＭＥＭ培地でＭＣＦ７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２から購入）を培養し、細胞（７０％コンフルエントになる前）を、１０％ＦＢＳ（チャコール処理）を含むＤＭＥＭフェノールレッドフリー培地中２０μＬ体積でウェルあたり４，０００細胞の密度で３８４ウェル平底プレートに播種する。細胞培養インキュベーター（５％ＣＯ２、９５％相対湿度、３７℃）で一晩細胞をインキュベートし、細胞をプレートに付着させる。翌日、細胞に試験化合物を投与する。Ｅｃｈｏ５５５音響ディスペンサーを使用して、６μＭから０．０００３μＭの範囲の化合物段階希釈液（１：３）を調製する。連続希釈プレートから細胞プレートに試験化合物（５μＬ）を加えることによって細胞に投与し、０．２％の最終ＤＭＳＯ濃度を生成し、試験化合物の最終濃度は２〜０．０００１μＭの用量範囲である。最大点には、０．２％のＤＭＳＯを含む培地を使用し、最小点には、０．２％ＤＭＳＯを含む増殖培地で２μＭの最終濃度に希釈したフルベストラントを使用する。試験化合物を投与後、２４時間３７℃、５％ＣＯ２で細胞プレートをインキュベートする。１４％パラホルムアルデヒド（１０μＬ）を室温で３０分間加えることによって、細胞を固定する。細胞をＰＢＳ（２０μＬ）で１回洗浄し、０．５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（２０μＬ）で１時間インキュベートする。０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（２０μＬ）で細胞を２回洗浄し、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０および０．１％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００を含むＰＢＳ中の３％ＢＳＡ（２０μＬ／ウェル）で室温で１時間ブロッキングする。ウェルあたり０．０５ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した１：５００一次抗体（２０μＬ）（プロゲステロン受容体モノクローナルマウス抗ヒト抗体、クローンＰｇＲ  ６３６  Ｄａｋｏ、Ｍ３５６９）を加え、プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートする。
【００５９】
翌日、ＰＢＳ  ０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（２×２０μＬ）で細胞を洗浄し、ＰＢＳ１％ＢＳＡ中の二次抗体（２０μＬ／ウェル）（１：１０００希釈、ヤギ抗ウサギＩｇＭ  ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（商標）４８８）と室温で１０５分間インキュベートする。ＰＢＳ（２×２０μＬ）で洗浄した後、ＲＮａｓｅ（５０μｇ／ｍＬを２０μＬ）（Ｓｉｇｍａ）およびウェルあたりＰＢＳ中１：１０００のヨウ化プロピジウム希釈液を加える。プレートを密封し、ベンチで室温で１時間インキュベートする（光から保護する）。ＡＣＵＭＥＮ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）［ＴＴＰＬＡＢＴＥＣＨ  ＬＴＤ製のレーザースキャン蛍光マイクロプレートサイトメーター］でプレートをスキャンして、プロゲステロン受容体アルファを測定する。画像解析は、陽性細胞を識別するための細胞蛍光シグナルに基づく。平均強度によってプロゲステロン受容体陽性細胞を識別する。ヨウ化プロピジウム／ＤＮＡからの５７５〜６４０ｎｍでの総強度を使用して、個々の細胞を識別する。アッセイのアウトプットはプロゲステロン受容体陽性細胞％である。ＧＥＮＥ  ＤＡＴＡ（商標）を使用して、各アウトプットの４つのパラメーターロジスティックにカーブフィッティングすることにより、ＩＣ５０を決定する。
【００６０】
このアッセイを使用すると、実施例１の化合物の相対ＩＣ５０（μＭ）は＞２μＭである。このアッセイの結果は、ＭＣＦ７乳癌細胞における実施例１の有意なアゴニスト活性を示さない。これらの結果はまた、実施例１の化合物が、ＭＣＦ７乳癌細胞におけるＥＲαの純粋なアンタゴニストであることを示している。
【００６１】
ＭＣＦ７−ＥＳＲ１  Ｙ５３７Ｎ  ６８２  ＣＲＩＳＰＲ細胞におけるＰＲα阻害（ＥＲα機能的拮抗作用）細胞アッセイ
以下のＰＲα阻害（ＥＲα機能的拮抗作用）細胞アッセイの目的は、Ｙ５３７Ｎ変異体ＥＲα受容体に対する試験化合物のアンタゴニスト活性を決定することである。このアッセイのアンタゴニストは、ＥＲα受容体の機能をブロックすると予想される。ＰＲα（ＰＧＲ）はＥＲαの下流の転写標的であるため、ＥＲαのアンタゴニストはＰＲαの発現を阻害すると予想される。
【００６２】
１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を補充したＤＭＥＭ培地でＭＣＦ７−ＥＳＲ１  Ｙ５３７Ｎ−６８２（ＭＣＦ７細胞のＥＳＲ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集により生成、クローン＃６８２）を培養し、細胞（７０％コンフルエントになる前）を、ＤＭＥＭフェノールレッドフリー培地、１０％ＦＢＳ（２０μＬ体積）（チャコール処理）中でウェルあたり４，０００細胞の密度で３８４ウェル平底プレートに播種する。細胞培養インキュベーター（５％ＣＯ２、９５％相対湿度、３７℃）で一晩細胞をインキュベートし、細胞をプレートに付着させる。翌日、細胞に試験化合物を投与する。Ｅｃｈｏ５５５音響ディスペンサーを使用して、６μＭから０．０００３μＭの範囲の化合物段階希釈液（１：３）を調製する。連続希釈プレートから細胞プレートに５μＬを加えることによって細胞に投与し、最終ＤＭＳＯ濃度が０．２％になり、最終試験化合物濃度が２〜０．０００１μＭの用量範囲になる。最大点には、０．２％のＤＭＳＯを含む培地を使用し、最小点には、０．２％ＤＭＳＯを含む増殖培地で２μＭの最終濃度に希釈したフルベストラントを使用する。試験化合物を投与後、７２時間３７℃、５％ＣＯ２で細胞プレートをインキュベートする。１４％パラホルムアルデヒド（１０μＬ）を室温で３０分間加えることによって、細胞を固定する。細胞をＰＢＳ（１×２０μＬ）で１回洗浄し、０．５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（２０μＬ）で１時間インキュベートする。０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（２×２０μＬ）で細胞を洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ  ０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、０．１％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００（２０μＬ／ウェル）で室温で１時間ブロッキングする。ウェルあたり１％ＢＳＡ／ＰＢＳ  ０．０５ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０で希釈した１：５００一次抗体（２０μＬ）（プロゲステロン受容体モノクローナルマウス抗ヒト抗体、クローンＰｇＲ  ６３６  Ｄａｋｏ、Ｍ３５６９）を加え、プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートする。
【００６３】
翌日、ＰＢＳ  ０．０５％（登録商標）（２×２０μＬ）で細胞を洗浄し、ＰＢＳ１％ＢＳＡ中の二次抗体（２０μＬ／ウェル）（１：１０００希釈、ヤギ抗ウサギＩｇＭ  ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（商標）４８８）と室温で１０５分間インキュベートする。ＰＢＳ（２×２０μＬ）で洗浄した後、ＲＮａｓｅ（５０μｇ／ｍＬを２０μＬ）（Ｓｉｇｍａ）およびウェルあたりＰＢＳ中１：１０００のヨウ化プロピジウム希釈液を加える。プレートを密封し、ベンチで室温で１時間インキュベートする（光から保護する）。ＡＣＵＭＥＮ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）［ＴＴＰＬＡＢＴＥＣＨ  ＬＴＤ製のレーザースキャン蛍光マイクロプレートサイトメーター］でプレートをスキャンして、プロゲステロン受容体アルファを測定する。画像解析は、陽性細胞を識別するための細胞蛍光シグナルに基づく。平均強度によってプロゲステロン受容体陽性細胞を識別する。ヨウ化プロピジウム／ＤＮＡからの５７５〜６４０ｎｍでの総強度を使用して、個々の細胞を識別する。アッセイのアウトプットはプロゲステロン受容体陽性細胞％である。ＧＥＮＥ  ＤＡＴＡ（商標）を使用して、各アウトプットの４つのパラメーターロジスティックにカーブフィッティングすることにより、ＩＣ５０を決定する。
【００６４】
このアッセイを使用すると、実施例１の化合物の相対ＩＣ５０（ｎＭ）は、７．６０２±４．８０４ｎＭ（ｎ＝１４）である。これらの結果は、ＭＣＦ７（ＥＳＲ１  Ｙ５３７Ｎ、ヘテロ接合変異体）乳癌細胞における実施例１によるＰＲαの強力な阻害および機能的拮抗作用を示している。したがって、実施例１の化合物は、ＥＲα変異体（Ｙ５３７Ｎ）の強力なアンタゴニストであり、ＥＲα媒介転写の強力な阻害剤である。ＰＲα（ＰＧＲ）もＥＲαの転写標的であり、このアッセイの結果は、ＰＲαのＥＲα媒介転写の強力な阻害を示す。
【００６５】
ＭＣＦ７細胞におけるＰＲα阻害（ＥＲα機能的拮抗作用）細胞アッセイ
以下のＰＲα阻害（ＥＲα機能的拮抗作用）細胞アッセイの目的は、ＥＲα受容体に対する試験化合物のアンタゴニスト活性を決定することである。このアッセイのアンタゴニストは、ＥＲα受容体の機能をブロックすると予想される。ＰＲαはＥＲαの下流の転写標的であるため、ＥＲαのアンタゴニストはＰＲαの発現を阻害すると予想される。
【００６６】
ＭＣＦ７細胞株を使用して、上述のＥＲα分解細胞ベースＡｃｕｍｅｎアッセイで詳述されているアッセイ条件を実行するが、ただし、試験化合物を分注する前に、細胞プレートから培地を除去し、陰性対照ウェル（プレートの列２４）を除く全てのウェルを０．４７ｎＭエストラジオールを含むアッセイ培地で３０分間前処理する。このアッセイでは、ＰＲαを検出するための免疫染色を行い、プレートをＡＣＵＭＥＮ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）［ＴＴＰ  ＬＡＢＴＥＣＨ  ＬＴＤ製のレーザースキャン蛍光マイクロプレートサイトメーター］でスキャンしてＰＲαを測定する。画像解析は、陽性細胞を識別するための細胞蛍光シグナルに基づく。平均強度によってＰＲα陽性細胞を識別する。ヨウ化プロピジウム／ＤＮＡからの５７５〜６４０での総強度を使用して、個々の細胞を識別する。アッセイのアウトプットはＰＲα陽性細胞％である。ＧＥＮＥ  ＤＡＴＡ（商標）を使用して、各アウトプットの４つのパラメーターロジスティックにカーブフィッティングすることにより、ＩＣ５０を決定する。
【００６７】
このアッセイを使用すると、このアッセイにおける実施例１の化合物の相対ＩＣ５０（ｎＭ）は、１５．７５±９．０３７ｎＭ（ｎ＝１５）である。このアッセイの結果は、ＭＣＦ７乳癌細胞における実施例１によるＰＲαの強力な阻害および機能的拮抗作用を示している。したがって、実施例１の化合物は、ＥＲα野生型タンパク質の強力なアンタゴニストであり、ＥＲα媒介転写の強力な阻害剤である。ＰＲα（ＰＧＲ）もＥＲαの転写標的であり、このアッセイの結果は、ＰＲαのＥＲα媒介転写の強力な阻害を示す。
【００６８】
ＭＣＦ７およびＭＣＦ７−ＥＳＲ１  Ｙ５３７Ｎ−６８２の細胞増殖アッセイ
以下の細胞増殖アッセイの目的は、概して、細胞培養実験での処理に応答する細胞増殖、細胞生存率、および細胞毒性に試験化合物が影響を与えるかどうかを検出することである。細胞増殖は、細胞数を経時的にモニタリングすることによってモニターされ、使用されるヨウ化プロポデウムアッセイにより、経時的に細胞生存率を継続的に測定できる。
【００６９】
ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２から購入）細胞を、ＤＭＥＭフェノールレッドフリー培地１０％ＦＢＳ（２０μＬ体積）（チャコール処理）でウェルあたり２，０００細胞の密度で、透明な底の３８４ウェル細胞培養プレートに播種する。１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を補充したＤＭＥＭ培地中のＭＣＦ７−ＥＳＲＹ５３７Ｎ−６８２（ＭＣＦ７細胞のＥＳＲ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によって生成、クローン＃６８２）を、ウェルあたり１０００細胞の密度で播種する。３７℃および５％ＣＯ２でプレートをインキュベートする。翌日、細胞に試験化合物を投与する。Ｅｃｈｏ５５５音響ディスペンサーを使用して、６０μＭから０．００３μＭの範囲の試験化合物段階希釈液（１：３）を調製する。連続希釈プレートから細胞プレートに５μＬを加えることによって細胞に投与し、最終ＤＭＳＯ濃度が０．２％になり、最終試験化合物濃度が２０〜０．００１μＭの用量範囲になる。最大点には、０．２％のＤＭＳＯを含む培地を使用し、最小点には、０．２％ＤＭＳＯを含む増殖培地で２μＭの最終濃度に希釈したフルベストラントを使用する。試験化合物を投与後、３７℃、５％ＣＯ２で細胞プレートをインキュベートする。試験化合物の添加から７日後、インキュベーターからプレートを取り出し、各ウェルに冷エタノール９６％（６５μＬ）を加える。３０分後、培地を除去し、ＲＮａｓｅ（５０μｇ／ｍＬを２０μＬ）（Ｓｉｇｍａ）およびウェルあたりＰＢＳ中１：１０００ヨウ化プロピジウム希釈液を添加する。プレートを密封し、ベンチで室温で１時間インキュベートする（光から保護する）。ＡＣＵＭＥＮ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）［ＴＴＰＬＡＢＴＥＣＨ  ＬＴＤ製のレーザースキャン蛍光マイクロプレートサイトメーター］でプレートをスキャンする。ＭＣＦ−７細胞株は増殖して凝集体を形成し、対象の数としての細胞数は読み出しとして使用できない可能性があり、したがって、細胞数は、推定細胞数（面積パラメーター（総細胞集団の総面積の比率（ＦＬ−１（ＰＩ）のピーク強度の指定範囲および単一細胞集団の平均面積（周囲長で定義））によって計算される）によって評価できる。ＧＥＮＥ  ＤＡＴＡ（商標）を使用して、各アウトプットの４つのパラメーターロジスティックにカーブフィッティングすることにより、ＩＣ５０を決定する。
【００７０】
このアッセイを使用すると、ＭＣＦ７  ＥＳＲ１野生型における実施例１の化合物の相対ＩＣ５０（ｎＭ）は９．２４３±１．７４１ｎＭ（ｎ＝２）であり、ＭＣＦ７−ＥＳＲ１Ｙ５３７Ｎ変異細胞では７．９６０±３．６９１ｎＭ（ｎ＝６）である。これらの結果は、ＭＣＦ７（ＥＳＲ１野生型）およびＭＣＦ７（ＥＳＲ１  Ｙ５３７Ｎ変異体）乳癌細胞における実施例１による強力な抗増殖活性および細胞増殖阻害を示す。
【００７１】
ＭＣＦ７腫瘍におけるｉｎ  Ｖｉｖｏ標的阻害（ＩＶＴＩ）アッセイ（ＰＧＲ  ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイ）
このＩＶＴＩアッセイの目的は、マウスに移植された異種移植腫瘍において、ＥＲαの下流でＰＧＲ（プロゲステロン受容体アルファ）遺伝子発現（転写）を阻害する試験化合物（ＳＥＲＤ）の能力を測定することである。
【００７２】
Ｅｎｖｉｇｏ  ＲＭＳ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓｃｏｎｓｉｎのメスのＮＯＤ  ＳＣＩＤマウス（２２〜２５ｇ）に、５×１０ｅ６のＭＣＦ７  ＥＲ＋ｖｅ乳癌細胞（ＡＴＣＣ、＃ＨＴＢ−２２）を右脇腹領域に１：１  ＨＢＳＳ＋ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）溶液（２００μＬ）で皮下移植する。腫瘍細胞移植の１日前に、１７−βエストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈからの０．１８ｍｇ／ペレット、９０日放出）を皮下に移植する。移植の７日後に開始して１週間に２回、腫瘍成長および体重を測定する。腫瘍の大きさが２５０〜３００ｍｍ３に達する時、動物を無作為化し、５匹の動物の群に分ける。特定のビヒクル（精製水中の１％ヒドロキシエチルセルロース／０．２５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０／０．０５％消泡剤）中の試験化合物またはビヒクル単独のいずれかを３日間、動物に経口投与し、最後の投与後に所望の時間間隔で腫瘍および血液を採取する。イソフルラン麻酔と頸椎脱臼を使用して動物を屠殺する。腫瘍を瞬間冷凍し、ＲＮＡ分離およびＲＴ−ｑＰＣＲアッセイのために処理するまで−８０℃で保存する。ＥＤＴＡチューブに血液を採取し、血漿のためにスピンダウンし、９６ウェルプレートで−８０℃で凍結する。質量分析を使用して、試験化合物の曝露を決定する。
【００７３】
ＦＡＳＴＰＲＥＰ−２４（商標）Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒマシン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）でＭａｔｒｉｘ  Ｄビーズ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、＃６９１３−５００）を使用して、液体窒素で腫瘍を粉砕し、１×ＲＮＡ溶解緩衝液（ＲＮＡ単離キットから）で溶解する。１４０００ｒｐｍで２０分間、４℃で回転させた後、腫瘍溶解物を新しいチューブに移す。ＰＵＲＥＬＩＮＫ（登録商標）ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１２１８３０１８Ａ）またはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ＃７４１０４および＃７４１０６）を使用して、腫瘍溶解物からＲＮＡを単離する。ＰＵＲＥＬＩＮＫ（登録商標）ＤＮａｓｅセット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１２１８５０１０）またはＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅセット（Ｑｉａｇｅｎ＃７９２５４）を使用してＤＮＡ混入物を除去する。ＲＮａｓｅフリー水で試料を希釈し、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０）で２６０ｎｍの吸光度を測定することにより、単離されたＲＮＡ濃度を測定する。他の全てのＲＮＡ試料の２６０ｎｍ測定値から、ブランク（ＲＮａｓｅフリー水のみ）の平均２６０ｎｍ吸光度測定値を差し引く。ＲＮＡ試料をＲＮａｓｅフリー水で等濃度に希釈する。ＲＴ−ＰＣＲ用のＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１８０８０−０５１）を使用して、希釈したＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。ＲＴ−ｑＰＣＲを実行するために、最初にＲＮａｓｅフリー水でｃＤＮＡを希釈する。２×Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｂｌｕｅ  ｑＰＣＲ  ＲＯＸ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ、＃ＡＢ−４１３９／Ａ）、ＰＧＲプライマー（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｈｓ０１５５６７０２＿ｍ１）、および各反応の希釈ｃＤＮＡをＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃４３０９８４９）で合わせる。サーモサイクラー（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ配列検出システム）で試料を５０℃で２分間、続いて９５℃で１５分間インキュベートすることにより、ｃＤＮＡを増幅する。９５℃で１５秒間、続いて５０℃で６０秒間を、合計４０サイクルインキュベートし続ける。サイクルはハウスキーピング遺伝子に対して正規化され、ビヒクル単独と比較したＰＧＲ阻害％を計算するために使用される。各試料を重複して分析し、計算に平均数を使用する。ＥｘｃｅｌとＸＬ  Ｆｉｔを使用して、標的（ＰＧＲ）阻害パーセントを計算する。
【００７４】
このアッセイの結果は、実施例１の化合物が腫瘍異種移植モデルにおいてＰＲα（ＰＧＲ）発現を阻害することを実証している。さらに、実施例１の化合物は、経口投与された場合、３０ｍｇ／ｋｇの用量で２４時間、腫瘍異種移植モデルにおいてＰＲα（ＰＧＲ）発現を５７％阻害する。これらの結果は、腫瘍異種移植モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＥＲα拮抗活性およびＥＲα媒介転写活性の有意かつ持続的な阻害を示している。
【００７５】
マウスに移植されたＭＣＦ７異種移植腫瘍におけるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖阻害研究
以下の異種移植腫瘍増殖阻害アッセイの目的は、試験化合物投与に応答する移植腫瘍体積の減少を測定することである。
【００７６】
培養中のヒト乳癌細胞ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２２）を増殖させ、採取して５×１０ｅ６細胞を１：１  ＨＢＳＳ＋ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）溶液（２００μＬ）でメスのＮＯＤ  ＳＣＩＤマウス（２２〜２５ｇ、Ｅｎｖｉｇｏ  ＲＭＳ，Ｉｎｃ）の右後部側面に皮下に注入する。ＭＣＦ７細胞移植の２４時間前に、エストロゲンペレット（０．１８ｍｇ／ペレット、１７βエストラジオール、９０日放出、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を皮下に移植する。移植の７日後に開始して１週間に２回、腫瘍成長および体重を測定する。腫瘍の大きさが２５０〜３５０ｍｍ３に達する時、動物を無作為化し、５匹の動物の群に分ける。適切なビヒクル（精製水中の１％ヒドロキシエチルセルロース／０．２５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０／０．０５％消泡剤）で試験化合物を調製し、４２日間強制経口投与する。腫瘍応答は、処理過程中に週に２回行われる腫瘍体積測定によって決定される。腫瘍体積が測定されるときはいつでも、毒性の一般的な尺度として体重を取得する。
【００７７】
このアッセイで使用される場合、実施例１の化合物は、以下の表６に提供されるように、デルタＴ／Ｃ％値を有することが見出されている。これらの結果は、実施例１の化合物が、マウスにおいて良好な経口バイオアベイラビリティを示し、ＭＣＦ７ヒト乳癌異種移植モデルにおいて有意な抗腫瘍活性または腫瘍退縮を実証することを示している。
【００７８】
マウスに移植されたＭＣＦ７異種移植腫瘍におけるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖阻害研究
【００７９】
【表１】
2021530486.tif 000013
【００８０】
退縮％は、エンドポイント体積がベースラインを下回る場合に算出する。式は、１００＊（Ｔ−Ｔ０）／Ｔ０であり、式中、Ｔ０は、処理群の平均ベースライン腫瘍体積である。
【００８１】
３２日目のベースライン（無作為化）からの全ての群の総平均を使用して、Ｔ／Ｃの変化％をコンピュータにより計算する。
【００８２】
ラット経口バイオアベイラビリティ
以下のアッセイの目的は、試験化合物が経口で生物学的に利用可能かどうかを実証することである。
【００８３】
試験化合物をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、１ｍｇ／ｋｇ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中の２０％ＣＡＰＴＩＳＯＬ（登録商標）、ｐＨ２適量、または２５％のＤＭＡ、１５％のＥｔＯＨ、１０％のプロピレングリコール、２５％の２−ピロリドン、および２５％の精製水のいずれかのビヒクルを使用）でＩＶで、１０ｍｇ／ｋｇ（１％のヒドロキシエチルセルロース、０．２５％のポリソルベート８０、０．０５％の消泡剤１５１０−ＵＳ、および適量の精製水のビヒクルを使用）をＰＯで投与する。一連の血液試料を、ＩＶボーラス投与後０．０８、０．２５、０．５、１、２、４、８、および１２時間、ならびに経口投与後０．２５、０．５、１、２、４、８、および１２時間で採取する。ＥＤＴＡ凝固剤で処理した後、血漿を遠心分離により取得し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析するまで−７０℃で保存した。試験物質の濃度は、血漿中で決定し、非コンパートメント分析を使用して、ＩＶ群とＰＯ群の両方の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算するＷａｔｓｏｎ  ＬＩＭＳ（商標）システムにアップロードする。次の式を使用して経口バイオアベイラビリティ（Ｆ％）を計算する。
【００８４】
【数１】
2021530486.tif 000014
【００８５】
このアッセイを使用すると、実施例１の化合物は、２７％のＦ％値を示す。このアッセイは、実施例１が良好な経口バイオアベイラビリティを有することを実証している。
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月8日(2021.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2021530486.tif 000018
の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記化合物が、
【化２】
2021530486.tif 000019
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、請求項１もしくは請求項２に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物。
【請求項４】
１つ以上の他の治療剤をさらに含む、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺を治療するための薬学的組成物であって、治療有効量の請求項１もしくは請求項２に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物。
【請求項６】
経口投与される、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記乳癌がＥＲ陽性乳癌である、請求項５または６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記胃癌がＥＲ陽性胃癌である、請求項５または６に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記肺癌がＥＲ陽性肺癌である、請求項５または６に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
治療における使用のための、請求項１または請求項２に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌を治療するための医薬の製造のための、請求項１もしくは請求項２に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１２】
前記化合物またはその薬学的に許容される塩が経口投与される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オールを調製する方法であって、１，４−ジオキサン中の（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）｛３−［２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−７−ヒドロキシキノリン−４−イル｝メタノンの溶液を約５℃に冷却することと、次いで水素化トリエチルホウ素リチウムを加えることと、を含む、方法。
【請求項１４】
５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オールである、化合物。
【請求項１５】
前記追加の治療剤が、５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オールである、請求項４に記載の薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
このアッセイを使用すると、実施例１の化合物は、２７％のＦ％値を示す。このアッセイは、実施例１が良好な経口バイオアベイラビリティを有することを実証している。
なお、本発明は以下の態様を含みうる。
［１］式：
【化１１−１】
2021530486.tif 000020
の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［２］前記化合物が、
【化１１−２】
2021530486.tif 000021
である、上記［１］に記載の化合物。
［３］１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、上記［１もしくは上記［２］に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物。
［４］１つ以上の他の治療剤をさらに含む、上記［３］に記載の薬学的組成物。
［５］乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺を治療する方法であって、治療有効量の上記［１］もしくは上記［２］に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、そのような治療を必要としている患者に投与することを含む、方法。
［６］前記化合物、またはその薬学的に許容される塩が経口投与される、上記［５］に記載の方法。
［７］前記乳癌がＥＲ陽性乳癌である、上記［５］に記載の方法。
［８］前記胃癌がＥＲ陽性胃癌である、上記［５］に記載の方法。
［９］前記肺癌がＥＲ陽性肺癌である、上記［５］に記載の方法。
［１０］治療における使用のための、上記［１］または上記［２］に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
［１１］乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌の治療に使用するための、上記［１］または上記［２］の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
［１２］前記化合物が経口投与される、上記［１１］に記載の使用のための、化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［１３］前記乳癌がＥＲ陽性乳癌である、上記［１２］に記載の使用のための化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［１４］前記胃癌がＥＲ陽性胃癌である、上記［１２］に記載の使用のための化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［１５］前記肺癌がＥＲ陽性肺癌である、上記［１２］に記載の使用のための化合物、またはその薬学的に許容される塩。
［１６］乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌を治療するための医薬の製造のための、上記［１］もしくは上記［２］に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。
［１７］前記化合物またはその薬学的に許容される塩が経口投与される、上記［１６］に記載の使用。
［１８］５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オールを調製する方法であって、１，４−ジオキサン中の（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）｛３−［２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−７−ヒドロキシキノリン−４−イル｝メタノンの溶液を約５℃に冷却することと、次いで水素化トリエチルホウ素リチウムを加えることと、を含む、方法。
［１９］上記［１８］に記載の方法の生成物。
［２０］前記追加の治療剤が、５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オールである、上記［４］に記載の薬学的組成物。
【国際調査報告】
2021530486.tif 000022
2021530486.tif 000023