(57)【要約】【解決手段】スターターカルチャー及び該スターターカルチャーにより製造される発酵製品を提供する。スターターカルチャーは、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)株ＬＦ２６、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）株ＬＨ４３、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）株ＬＰＣ１２、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）株ＬＲＨ１０、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）株ＳＴ３０、の混合物を含む。また、疲労を軽減するための組成物、運動能力を向上するための組成物、腸内細菌叢を調整するための組成物のそれぞれの製造における該発酵製品の使用を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）に寄託された以下の５つの乳酸菌株の混合物を含む、発酵製品を製造するためのスターターカルチャー。
ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)株ＬＦ２６
（受託番号ＤＳＭ３２７８４）、
ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）株ＬＨ４３
（受託番号ＤＳＭ３２７８７）、
ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）株ＬＰＣ１２
（受託番号ＤＳＭ３２７８５）、
ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）株ＬＲＨ１０
（受託番号ＤＳＭ３２７８６）、
ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）株ＳＴ３０
（受託番号ＤＳＭ３２７８８）。
【請求項２】
液状、ペースト状、半固形状、固形状、及びこれらの複合状態からなる群から選ばれる１つの状態にある、請求項１に記載のスターターカルチャー。
【請求項３】
発酵性材料を請求項１または請求項２に記載のスターターカルチャーを用いて発酵処理にかけることを含む、発酵製品を製造する方法。
【請求項４】
前記発酵性材料は、乳製品、大豆材料、米材料、ナッツ材料、ココナッツ材料、果実材料、麦汁材料、生姜材料、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記発酵性材料が乳製品である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記発酵性材料は、乳、ホエイ、発酵乳、乳酸菌飲料、脱脂乳、脱脂粉乳、調製粉乳、粉乳、濃縮乳、濃縮脱脂乳、還元脱脂乳、練乳、脱脂練乳、加糖練乳、加糖脱脂練乳、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記発酵性材料が還元脱脂乳である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記発酵処理の後に脱水処理を行うことを更に含む、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記脱水処理は、凍結乾燥、流動床乾燥、噴霧床乾燥、減圧乾燥、熱風乾燥、流動床造粒、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記脱水処理が凍結乾燥である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記発酵処理は、３０℃〜４３℃で８時間〜２４時間行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
請求項３〜１１のいずれか一項に記載の方法で製造された発酵製品。
【請求項１３】
液状、ペースト状、半固形状、固形状、及びこれらの複合状態からなる群から選ばれる１つの状態にある、請求項１２に記載の発酵製品。
【請求項１４】
凍結状態、乾燥状態、凍結乾燥状態からなる群から選ばれる１つの状態にある、請求項１２に記載の発酵製品。
【請求項１５】
疲労を軽減するための組成物の製造における、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の発酵製品の使用。
【請求項１６】
運動能力を向上するための組成物の製造における、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の発酵製品の使用。
【請求項１７】
腸内細菌叢を調整するための組成物の製造における、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の発酵製品の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の乳酸菌株の混合物を含むスターターカルチャー、そのようなスターターカルチャーを使用して製造された発酵製品、及びその発酵製品の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヨーグルト、ヤクルト、ケフィアなどの発酵乳飲料は、栄養素とプロバイオティクスを含む飲料である。プロバイオティクスは、一般的には腸内細菌叢を改善または回復することによって健康にとって好ましい効果をもたらす微生物である。腸内微生物叢の組成の不利な変化は、各種疾患や障害、例えば、筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）、ＭＥ／ＣＦＳ患者の免疫機能障害、ＭＥ／ＣＦＳ患者における乳酸の著しい増加などを引き起こす可能性があることがわかっている。そこで、発酵乳飲料が、腸内細菌叢の組成を調整し、それに関連する生理学的状態を改善するために飲用されている。
【０００３】
腸内微生物叢の組成の不利な変化によって引き起こされる疲労に加えて、運動中では多くのグルコースやグリコーゲンといったエネルギー源が使い果たされ、乳酸、アンモニア、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、ブドウ糖、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）などのいくつかの生化学的指標に基づいて評価できる身体的疲労がもたらされる。特に、激しい運動は、活性酸素種と過酸化脂質の蓄積につながり、それによって臓器がダメージを受け、疲労を引き起こす。プロバイオティクスは、疲労からの回復を促進することで運動能力にプラスの効果をもたらし得るため、発酵乳飲料は、運動による身体的疲労を軽減できる。
【０００４】
コーカサス山脈一帯を起源とするケフィアは、微量のアルコールを含む酸性発酵乳飲料である。ケフィアは伝統的には、山羊の皮でできた袋や、陶器のポットや、木桶の中で、ミルク（牛乳、山羊乳、羊乳、ラクダ乳、水牛乳）に、乳酸菌と酵母を含む比較的安定した特定のケフィアグレイン（スターターカルチャー）を接種して、室温で約１日発酵させることによって製造される。このような飲料は重要な機能性乳製品として、胃腸疾患、高血圧、虚血性心疾患、及びアレルギーの臨床治療に使用されている。更に、ケフィアは、抗菌、抗真菌、抗変異原性、抗酸化、抗糖尿病、抗腫瘍、免疫刺激効果、脂肪肝症候群に対する効果など、多くの生物学的活性を備えている。スターターカルチャーにおける使用のために、ケフィアグレイン及び発酵ケフィア製品から多数の細菌及び酵母がランダムに分離されている。しかし、通常は伝統的なケフィアから得られるケフィア調製用の従来のスターターカルチャーは、組成が時間によって更に場所によって異なり、組成を完全に特定することが難しいため、満足できる品質のケフィアをコンスタントに製造することは難しい。
【０００５】
プロバイオティクスを含む発酵製品の開発に際して、本願出願人は、ケフィアから同定された各種の乳酸菌株の混合物を使用すると、優れた抗疲労能力を有し、腸内微生物叢の組成を調整することができ、且つ運動能力を向上する効果をも有する発酵製品をコンスタントに製造できることを予期せず発見した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、第１の態様によれば、本発明は、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）に寄託された以下に示す５つの乳酸菌株の混合物を含む、発酵製品を製造するためのスターターカルチャーを提供する。
ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)株ＬＦ２６
（受託番号ＤＳＭ３２７８４）、
ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）株ＬＨ４３
（受託番号ＤＳＭ３２７８７）、
ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）株ＬＰＣ１２
（受託番号ＤＳＭ３２７８５）、
ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）株ＬＲＨ１０
（受託番号ＤＳＭ３２７８６）、
ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）株ＳＴ３０
（受託番号ＤＳＭ３２７８８）。
【０００７】
第２の態様によれば、本発明は、発酵製品を製造する方法を提供する。当該方法は、発酵性材料を上記スターターカルチャーを用いて発酵処理にかけることを含む。
【０００８】
第３の態様によれば、本発明は、上記方法によって製造された発酵製品を提供する。この発酵製品は、疲労軽減、運動能力の向上、腸内細菌叢の調整に用いるのに適している。
【０００９】
したがって、第４の態様によれば、本発明は、疲労を軽減するための方法を提供する。当該方法は、対象への上記発酵製品の投与、疲労を軽減するための組成物の製造における上記発酵製品の使用、または上記発酵製品を含む疲労を軽減するための組成物の製造を含む。
【００１０】
第５の態様によれば、本発明は、運動能力を向上するための方法を提供する。当該方法は、対象への上記発酵製品の投与、運動能力を向上するための組成物の製造における上記発酵製品の使用、または上記発酵製品を含む運動能力を向上するための組成物の製造を含む。
【００１１】
第６の態様によれば、本発明は、腸内細菌叢を調整するための方法を提供する。当該方法は、対象への上記発酵製品の投与、腸内細菌叢を調整するための組成物の製造における上記発酵製品の使用、または上記発酵製品を含む腸内細菌叢を調整するための組成物の製造を含む。
【００１２】
疲労を軽減するための組成物、運動能力を向上するための組成物、及び腸内細菌叢を調整するための組成物は、例えば、医薬組成物、食品組成物、又は栄養補助食品組成物であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明に係る発酵製品の効果を示すための、各投与量での遊泳時間（分）を示す図であり、符号「#」は、ｐ＜０．０５であることを示す（対照群との比較）。
【図２】本発明に係る発酵製品の効果を示すための、各投与量での前肢握力（グラム）を示す図であり、符号「#」は、ｐ＜０．０５であることを示す（対照群との比較）。
【図３Ａ】本発明に係る発酵製品の効果を示すための、各投与量での１０分間の水泳運動後で且つ２０分間の休憩前の血清乳酸値（ｍｍоｌ／Ｌ）を示す図であり、符号「#」は、ｐ＜０．０５であることを示す（対照群との比較）。
【図３Ｂ】本発明に係る発酵製品の効果を示すための、各投与量での２０分間の休憩後の血清乳酸値（ｍｍоｌ／Ｌ）を示す図であり、符号「#」は、ｐ＜０．０５であることを示す（対照群との比較）。
【図４Ａ】本発明に係る発酵製品の効果を示すための、各投与量での１０分間の水泳運動後で且つ２０分間の休憩前の血清アンモニア値（μｍоｌ／Ｌ）を示す図であり、符号「#」は、ｐ＜０．０５であることを示す（対照群との比較）。
【図４Ｂ】本発明に係る発酵製品の効果を示すための、各投与量での２０分間の休憩後の血清アンモニア値（μｍоｌ／Ｌ）を示す図であり、符号「#」は、ｐ＜０．０５であることを示す（対照群との比較）。
【図５】本発明に係る発酵製品の効果を示すための、各投与量での９０分間の水泳運動及び６０分間の休憩後の、血清尿素窒素（ＢＵＮ）値を示す図であり、符号「#」は、ｐ＜０．０５であることを示す（対照群との比較）。
【図６】本発明に係る発酵製品の効果を示すための、各投与量での９０分間の水泳運動及び６０分間の休憩後の、血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）値を示す図であり、符号「#」は、ｐ＜０．０５であることを示す（対照群との比較）。
【図７Ａ】本発明に係る発酵製品の効果を示すための、各投与量での肝グリコーゲン含量（ｍｇ／肝臓ｇ）を示す図であり、符号「#」は、ｐ＜０．０５であることを示す（対照群との比較）。
【図７Ｂ】本発明に係る発酵製品の効果を示すための、各投与量での筋グリコーゲン含量（ｍｇ／筋肉ｇ）を示す図であり、符号「#」は、ｐ＜０．０５であることを示し（対照群との比較）、符号「＊」は、ｐ＜０．０５であることを示す（１Ｘ群、２Ｘ群との比較）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
先行技術の刊行物が本明細書で参照される場合、そのような参照は、その刊行物が台湾または他の国において本技術分野における一般的な知識の一部を形成することを認めるものではないことを理解されたい。
【００１５】
本明細書の目的のために、「含んでいる」という単語は「含めるがこれに限定されない」ことを意味し、「含む」という単語も同様の意味であることが明確に理解されよう。
【００１６】
本明細書で使用されるすべての技術用語及び学術用語は、別段の定義がない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。当業者は、ここに記載されたものと類似または同等の多くの方法及び材料が、本発明の実施において使用され得ることを認識するであろう。無論、本発明は記載された方法及び材料に限定されるものではない。
【００１７】
研究の結果、本願出願人は、伝統的なケフィアから分離された特定の乳酸菌株の混合物を使用すると、意外にも優れた抗疲労能力を有し且つ腸内微生物叢の組成を調整することができる発酵製品を製造できることを発見した。
【００１８】
したがって、本願発明は、発酵製品を製造するためのスターターカルチャーであって、以下の５つの乳酸菌株（Inhoffenstreet 7B, 38124, Braunschweig, Lower Saxony, Germanyにあるドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）に寄託）の混合物を含むスターターカルチャーを提供する。
ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）株ＬＦ２６
（受託番号ＤＳＭ３２７８４、寄託日２０１８年４月３日）、
ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）株ＬＨ４３
（受託番号ＤＳＭ３２７８７、寄託日２０１８年４月３日）、
ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）株ＬＰＣ１２
（受託番号ＤＳＭ３２７８５、寄託日２０１８年４月３日）、
ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）株ＬＲＨ１０
（受託番号ＤＳＭ３２７８６、寄託日２０１８年４月３日）、
ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）株ＳＴ３０
（受託番号ＤＳＭ３２７８８、寄託日２０１８年４月３日）。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「スターターカルチャー」という用語は、（高密度培養のために別個のまたは同じスターター培地で培養する過程を任意で経た後に）有機材料の発酵を引き起こすまたは誘起することができる生きた微生物を含む組成物を指す。また、スターターカルチャーは上記５種の乳酸菌株に加えて更に別の付加的な微生物を含むことができる。付加的な微生物としては例えば、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブルッキイ亜種ラクティス（Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・ジョーンソニイ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・ケフィア（Lactobacillus kefir）、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、ロイコノストック・メセンタロイド（Leuconostoc mesenteroides）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などが挙げられる。
【００２０】
本発明によれば、スターターカルチャーは、濃縮または非濃縮、液体、ペースト状、半固形状、または固形状（例えば、ペレット、顆粒、または粉末）であってもよく、凍結、乾燥、または凍結乾燥（例えば、凍結乾燥形態、または噴霧／流動床乾燥形態）であってもよい。いくつかの実施形態では、スターターカルチャーは、乾燥粉末の形態である。
【００２１】
本発明によれば、スターターカルチャーは、微生物に加えて、乳、豆乳、ホエイ、カゼイン、酵母エキス、穀物、種子、または栄養液などの培養培地を含んでもよい。更に、スターターカルチャーは、微生物に加えて、緩衝剤や成長促進栄養素（例えば、吸収可能な炭水化物や窒素源）、または防腐剤（例えば、凍結防止化合物）、または所望により糖類などの他の担体を含有していてもよい。
【００２２】
また、本発明は、発酵製品を製造する方法を提供し、この方法は、発酵性材料を上記スターターカルチャーを用いて発酵処理にかけることを含む。本発明はまた、このような方法によって製造された発酵製品を提供する。
【００２３】
ここでいう「発酵性材料」とは、スターターカルチャー中の微生物により発酵させることができる材料を意味する。
【００２４】
本発明によれば、上記発酵性材料は、例えば、乳製品、大豆材料、米材料、ナッツ材料、ココナッツ材料、果実材料、麦汁材料、生姜材料である。いくつかの実施形態において、上記発酵性材料は乳製品である。乳製品の例としては、これらに限らないが、乳、ホエイ、発酵乳、乳酸菌飲料、脱脂乳、脱脂粉乳、調製粉乳、粉乳、濃縮乳、濃縮脱脂乳、還元脱脂乳、練乳、脱脂練乳、加糖練乳、加糖脱脂練乳などが挙げられる。例示的な実施形態において、上記発酵性材料は、還元脱脂乳である。
【００２５】
発酵性材料が乳製品である場合、これにより得られる発酵製品は、例えば、ケフィア、ヨーグルト、バターミルク、サワークリームミルク、サワーミルク、発酵ホエイ、クワルク（quark）である。
【００２６】
本発明によれば、発酵処理は、３０℃〜４３℃で、８時間〜２４時間実施することができる。例示的な実施形態において、発酵処理は、３７℃で１６時間行われる。
【００２７】
本発明によれば、上述の方法によって製造される発酵製品は、液状、ペースト状、半固形状、または固形状（例えば、ペレット、顆粒、または粉末）の形態であり得、また、凍結、乾燥、または凍結乾燥（例えば、凍結乾燥形態または噴霧／流動床乾燥形態）であり得る。
【００２８】
本発明によれば、上述の方法は、発酵処理の後に脱水処理を行うことを更に含んでもよい。その結果、そのような方法によって製造された発酵製品は乾燥形態であり得る。脱水処理には、凍結乾燥、流動床乾燥、噴霧床乾燥、減圧乾燥、熱風乾燥、流動床造粒などが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な実施形態において、本発明に係る発酵製品は凍結乾燥形態にある。
【００２９】
本発明に係る発酵製品は、様々な分野で使用することができ、例えば医薬品、健康食品、加工食品、栄養補助食品等に使用することができる。また、形態に特別な制限はないので、発酵製品は、調製品の形態で使用することができ、無菌粉末、錠剤、トローチ、ロゼンジ、ペレット、カプセル、分散性粉末または顆粒、溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ、エリキシル、スラリー、ゼリーなど、一般に知られている方法で適切に調製することができる。更に、本発明に係る発酵製品は、様々な食品または飲料の成分としても使用することができる。
【００３０】
以下の例において、上記方法で調製された発酵製品が、疲労に関連する生化学的指標を改善し、運動持久力と握力を高め、腸内微生物叢の組成を調整できることが確認された。そこで、本発明は、そのような発酵製品の下記の使用を提供する。
【００３１】
第一に、本発明は、疲労を軽減する方法を提供する。当該方法は、対象への上記発酵製品の投与、疲労を軽減するための組成物の製造における上記発酵製品の使用、または上記発酵製品を含む疲労を軽減するための組成物の製造を含む。
【００３２】
ここで、「疲労」とは、運動によって生じる身体的疲労、細胞内グリコーゲン蓄積、乳酸脱水素酵素活性、クエン酸合成酵素活性などによって誘発される身体的疲労、筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）などの疾患や障害の生理的症状などを指す。
【００３３】
第二に、本発明は、運動能力を向上するための方法を提供する。当該方法は、対象への上記発酵製品の投与、運動能力を向上するための組成物の製造における上記発酵製品の使用、または上記発酵製品を含む運動能力を向上するための組成物の製造を含む。
【００３４】
ここで、運動能力とは、ランニングの速度及び持久力、筋力及び持久力、水泳の速度及び持久力、最大筋力、持ち上げる力及び持久力、引っ張る力及び持久力、及び投げる力及び持久力を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
第三に、本発明は、腸内細菌叢を調整するための方法を提供する。当該方法は、対象への上記発酵製品の投与、腸内細菌叢を調整するための組成物の製造における上記発酵製品の使用、または上記発酵製品を含む腸内細菌叢を調整するための組成物の製造を含む。
【００３６】
疲労を軽減するための組成物、運動能力を向上するための組成物、及び腸内細菌叢を調整するための組成物は、例えば、医薬組成物、食品組成物、又は栄養補助食品組成物であってもよい。
【００３７】
本発明によれば、本発明に係る発酵製品またはそれを含む組成物の投与量及び投与頻度は、治療対象の状態、投与経路、及び達成されるべき所望の効果（即ち、抗疲労効果、運動能力向上効果、または腸内細菌叢調整効果）などに応じて変化し得る。例えば、本発明に係る発酵製品またはそれを含む組成物を経口投与する場合は、１日の投与量は、体重１ｋｇあたり０．１７ｇ〜０．８７５ｇとすることができ、単回投与でもよく、複数回に分けて投与してもよい。
【００３８】
本発明を、以下の各実施例によって更に詳しく説明する。但し、以下の各実施例は、単に例示を目的とするものであり、本発明を限定する意図で示すものではないことを理解されたい。
【実施例】
【００３９】
実験材料：
１．実験動物
ＩＣＲ（The Institute of Cancer Research）の雄マウス（生後６週齢、体重２５ｇ）をＢｉｏＬＡＳＣＯ（Charles River licensee corporation、台湾宜蘭県）から購入した。ＩＣＲマウスは、室温（２４℃±２℃）、制御湿度（６５％±５％）、１２時間明暗サイクルで２週間馴化させた。ＩＣＲマウスには、げっ歯類飼料５００１（PMI Nutrition International、アメリカ合衆国ミズーリ州ブレントウッド）と蒸留水を不断給餌で与えた。以下に記載されているすべての動物実験は、国立台湾体育大学の研究所動物飼育及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認され、ＩＡＣＵＣ−１０５２３のガイドラインに準拠した。
【００４０】
基本手順：
１．統計解析
以下の実施例で得られた実験データは、全て平均値±ＳＤ（標準偏差）で表した。統計解析は、ダンカン検定を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて行った（統計的有意性はｐ＜０．０５で示す）。また、用量効果を調べるためにコクラン-アーミテージ傾向検定を適用した。
【００４１】
＜実施例１．各種乳酸菌株を組み合わせた本発明に係る発酵製品の製造＞
５種の乳酸菌株、即ち、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)株LF26（受託番号DSM 32784）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）株LH43（受託番号DSM 32787）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）株LPC12（受託番号DSM 32785）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）株LRH10（受託番号DSM 32786）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）株ST30（受託番号DSM 32788）を、粉末形態のスターターカルチャを製造するために用いた。低温殺菌済みの９．２％還元脱脂乳に、上記スターターカルチャーを接種し、３７℃で１６時間発酵させた。得られた発酵乳は、本発明に係る発酵製品となる。
【００４２】
上記発酵製品を、その後、１００℃で３０分間低温殺菌し、凍結乾燥した。凍結乾燥された発酵製品は、１００ｇあたりの含量が、カロリー３５４．７５ｋｃａｌ、タンパク質３０ｇ、脂肪０．７５ｇ、炭水化物５７ｇであり、密閉容器に４℃で保存した。
【００４３】
＜実施例２．本発明に係る発酵製品の疲労軽減、運動能力向上、生物学的・生化学的特性改善に対する効果に対する評価＞
各種乳酸菌株を組み合わせて調製した発酵製品が疲労回復、運動能力の向上、生物学的・生化学的特性の改善に有効であるかどうかを調べるために、以下の実験を行った。
【００４４】
Ａ．本発明に係る発酵製品の投与
２週間の馴化後、実験材料の第１項に記載のマウス（８週齢に成長）を、体重によって以下の４つのグループ（１グループあたりｎ＝８）に分けた。４つのグループは、溶媒投与対照群（対照群と略記）、単回投与群（１Ｘ群と略記）、２回投与群（２Ｘ群と略記）、５回投与群（５Ｘ群と略記）である。マウスの初期体重を記録した。実施例１で得られた凍結乾燥した発酵製品を、１Ｘ群、２Ｘ群、５Ｘ群のマウスにそれぞれ一日当たり２．１５ｇ／ｋｇ体重、４．３１ｇ／ｋｇ体重、１０．７６ｇ／ｋｇ体重の投与量で経口投与した。具体的には、実施例１で得られた凍結乾燥した発酵製品を水に溶解し、チューブを介して経口投与するための発酵製品溶液を調製した。対照群のマウスには、１Ｘ群、２Ｘ群、５Ｘ群に投与した発酵製品と同カロリーのグルコース水溶液を適量経口投与した。グルコース水溶液と発酵製品溶液を同量、１日１回、３６日間（すなわち、マウスを犠牲にするまで）経口投与した。
【００４５】
本実施例の項目Ｅに記載のマウスの犠牲まで、マウスの１日の食物摂取量及び水摂取量を記録した。
【００４６】
Ｂ．消耗性水泳試験（exhaustive swimming test）
２９日目の発酵製品水溶液またはグルコース水溶液投与を行った後、３０分後に消耗性遊泳試験を行った。具体的には、２７℃±１℃に保たれた円柱状のプール（半径２８ｃｍ、水深２５ｃｍ）にマウスを１匹ずつ入れた。各マウスの尾の付け根に体重の５％に相当する重量負荷をかけた。各マウスが浮かんだり、もがいたり、浮いたままでいたりするための動作（遊泳状態）を脱力して沈むまで行った時間を遊泳時間（消耗遊泳時間とも呼ぶ）とした。消耗は、それぞれのマウスの泳げなくなった状態（即ち、水面に留まることができなくなった状態）を観察することで判断した。持久力を評価するために、それぞれのマウスの泳ぎ始めから消耗するまでの遊泳時間を記録した。得られたデータは、上記基本手順の第１項に記載した方法に従って統計解析を行った。
【００４７】
結果：
図1に示されるように、１Ｘ群、２Ｘ群、５Ｘ群のそれぞれの消耗遊泳時間は、対照群の消耗遊泳時間よりも有意に長くなっており、本発明に係る発酵製品は、抗疲労効果を示すことができ、したがって、水泳持久力性能を向上させることができることが示された。更に、水泳持久力性能に有意な、本発明に係る発酵製品の用量依存的効果が観察された（ｐ＜０．０００１）。このように、本発明に係る発酵製品は、特に処置的な運動訓練を必要とせず、運動能力を向上させることができ、更に栄養素利用性を向上させることができることが明らかである。
【００４８】
Ｃ．前肢の握力テスト
２８日目の発酵製品水溶液またはグルコース水溶液投与を行った後、３０分後に、各マウスの前肢握力（前肢絶対握力）を低力試験装置（型番ＲＸ-５、アイコーエンジニアリング、愛知県名古屋市）を用いて測定した。具体的には、金属棒（直径２ｍｍ、長さ７．５ｃｍ）を装着した力変換器を用いて、各マウスの引張力を測定した。測定中は、それぞれのマウスを尾の付け根で把持し、棒に向かって垂直に吊り下げた。各マウスは、両前肢を伸ばして棒をつかんだとき、尾によってわずかに後方に引っ張られ、それにより引っ張り力が発生する。引っ張り中にそれぞれのマウスが発揮した握力を測定し、握力計でグラム単位で記録した。最大握力を前肢握力とした。得られたデータは、基本手順の第１項に記載した方法に従って統計解析を行った。
【００４９】
結果
図２に示されているように、１Ｘ群、２Ｘ群、及び５Ｘ群のそれぞれの前肢握力は、対照群よりも有意に大きく、本発明に係る発酵製品は、握力を向上させることができ、したがって、筋力を向上させることができることが示された。また、握力に有意な、本発明に係る発酵製品の用量依存的効果が観察された（ｐ＜０．０００１）。このように、本発明に係る発酵製品は、特に処置的な運動訓練を必要とせず、運動能力を向上させることができ、更に栄養素利用性を向上させることもできることが明らかである。
【００５０】
Ｄ．非消耗性水泳運動後の疲労関連生化学的指標の測定
本発明に係る発酵製品が、本実施例の項目Ｂで実施した消耗性水泳試験以外の水泳運動後の疲労関連生化学的指標に及ぼす影響を調べるために、以下の実験を行った。
【００５１】
Ｄ−１．１０分間の水泳運動及び２０分間の休憩
３１日目に、１０分間の水泳運動の前後及びこの１０分間の水泳運動の後の２０分間の休憩後に、各マウスから血液サンプルを採取した。１０分間の水泳運動の間、各マウスを本実施例の項目Ｂで使用した柱状プールに入れ、重量負荷をかけずに泳がせた。得られた血液サンプルを１５００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、得られた上清を回収して血清とした。血清中の乳酸値、アンモニア値、グルコース値を自動分析装置（型番７０６０、日立社、東京都日立市）を用いて測定した。
【００５２】
得られたデータは、基本手順の第１項に記載の方法に従って統計解析を行った。
【００５３】
Ｄ−２．９０分間の水泳運動及び６０分間の休憩
更に、３３日目に、各マウスに９０分間の水泳運動とその後の６０分間の休憩を与え、血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）値及び血清尿素窒素（ＢＵＮ）値の疲労に伴う変化を評価した。９０分間の水泳運動中、各マウスを本実施例の項目Ｂで使用した柱状プールに入れ、重量負荷をかけずに泳がせた。血清中のＣＫ値及びＢＵＮ値は、乳酸値、アンモニア値、及びグルコース値を測定するための前述の手順に概ねしたがって測定した。
【００５４】
得られたデータは、基本手順の第１項に記載の方法に従って統計分析を行った。
【００５５】
結果
Ｄ−１．１０分間の水泳運動及び２０分間の休憩
１０分間の水泳運動の前では、対照群、１Ｘ群、２Ｘ群、及び５Ｘ群の各群間で血清乳酸値の有意な差は見られなかった（データは特に示さない）。一方、図３Ａに示されているように、１０分間の水泳運動後で且つ２０分間の休憩前では、１Ｘ、２Ｘ、及び５Ｘの各群の血清乳酸値は、対照群よりも有意に低くなっている。これにより、本発明に係る発酵製品は、血中乳酸の除去及び利用を促進することができ、したがって、抗疲労効果を示すことが明らかになった。更に、１０分間の水泳運動の後で且つ２０分間の休憩の前では、本発明に係る発酵製品の血清乳酸値に対して有意な用量依存的効果が観察された（ｐ＝０．００３７）。更に、図３Ｂに示されているように、２０分間の休憩後の、１Ｘ、２Ｘ、及び５Ｘの各群の血清乳酸値は、対照群に比べて有意に低い。これにより、本発明に係る発酵製品は、血中の乳酸の除去及び利用を更に促進することができ、したがって、運動後の休憩中に抗疲労効果を発揮することが明らかになった。更に、２０分間の休憩の後、血清乳酸値に対する本発明に係る発酵製品の有意な用量依存的効果が観察された（ｐ＜０．０００１）。
【００５６】
図４Ａに示されているように、１０分間の水泳運動の後、１Ｘ、２Ｘ、及び５Ｘの各群の血中アンモニア値は、対照群よりも有意に低かった。これにより、本発明に係る発酵製品は、血中アンモニアの蓄積の減少を促進し、したがって、抗疲労効果を発揮することができることが示された。更に、１０分間の水泳運動の後で且つ２０分間の休憩の前で、本発明に係る発酵製品の血中アンモニア値に対する有意な用量依存的効果が観察された（ｐ＜０．０００１）。更に、図４Ｂに示されているように、２０分間の休憩後、１Ｘ、２Ｘ、及び５Ｘの各群において、対照群に比べて、血中アンモニア値が有意に低下している。これにより、本発明に係る発酵製品は、血中アンモニアの蓄積の低減を更に促進することができ、したがって、運動後の休憩時に抗疲労効果を発揮することが示された。更に、２０分間の休憩後において、本発明に係る発酵製品の血中アンモニア濃度に有意な用量依存的効果（ｐ＜０．０００１）が観察された。
【００５７】
以上のことから、本発明に係る発酵製品は、短時間の運動後の身体疲労を軽減し、運動後の回復を促進することができることが明らかである。
【００５８】
また、１０分間の水泳試験後で且つ２０分間の休憩前、及び２０分間の休憩後の血中グルコース値については、対照群、１Ｘ群、２Ｘ群、及び５Ｘ群の間で有意な差は認められなかった。したがって、本発明に係る発酵製品は、充分なエネルギー源として機能することができることがわかる。
【００５９】
Ｄ−２．９０分間の水泳運動及び６０分間の休憩
図５Ａに示されているように、９０分間の水泳運動及び６０分間の休憩の後では、１Ｘ、２Ｘ、及び５Ｘの各群の血中ＢＵＮ値が対照群よりも有意に低く、本発明に係る発酵製品が血中のＢＵＮを減少させ、したがって抗疲労効果を示すことが明らかになった。更に、９０分間の水泳運動及び６０分間の休憩の後において、血中ＢＵＮ値に対する本発明に係る発酵製品の有意な用量依存的効果が観察された（ｐ＝０．０３０１）。
【００６０】
図６に示されているように、９０分間の水泳運動及び６０分間の休憩後、１Ｘ、２Ｘ及び５Ｘの各群のそれぞれの血中ＣＫ値は、対照群に比べて有意に低下している。これにより、本発明に係る発酵製品は、血中のＣＫ値を低下させることができ、したがって、抗疲労効果を提供し、筋肉を傷めることを防止することができることが明らかになった。また、９０分間の水泳運動と６０分間の休憩の後において、本発明に係る発酵製品の血中ＣＫ値に対する有意な用量依存的効果が観察された（ｐ＜０．０００１）。
【００６１】
以上のことから、本発明に係る発酵製品は、長時間の運動後の身体的疲労を緩和し、運動後の回復を促進することができることが明らかである。
【００６２】
Ｅ．組織・臓器の重量測定、グリコーゲン含量の測定、組織学的染色、生化学的指標の評価、試験動物の犠牲後の腸内細菌叢の分析
３６日目に、マウスの最終体重を記録した。全てのマウスを８時間の絶食後に９５％二酸化炭素で窒息させて犠牲にした。その後、以下の実験を行った。
【００６３】
Ｅ-１．組織・臓器重量の測定
各マウスの肝臓、腎臓、精巣上体脂肪パッド（ＥＦＰ）、心臓、肺、筋肉（後肢後部の腓腹筋、ヒラメ筋を含む）、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を切除し、その重量を測定して、本発明に係る発酵製品がこれらの組織・臓器に栄養上の悪影響を及ぼすかどうかを調べた。得られたデータは、基本手順の第１項に記載の方法に従って統計解析した。
【００６４】
Ｅ-２．グリコーゲン含量の測定
本実施例の項目Ｅ-１で得られた各マウスの肝臓および筋肉に対して、Huang, C.C. et al. (2012), Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2012:364741に記載されている方法に従ってグリコーゲン含量の測定を行った。得られたデータは、基本手順の第１項に記載されている方法に従って統計分析した。
【００６５】
Ｅ-３．組織学的染色
本実施例の項目Ｅ-１で得られた各マウスの肝臓、腎臓、ＥＦＰ、心臓、肺、筋肉、ＢＡＴを以下のように組織学的染色を行った。即ち、前記各臓器及び組織からそれぞれ組織サンプルを採取し、１０％ホルマリンを用いて固定した。ホルマリン固定後、各組織サンプルをパラフィンに埋め込んだ後、形態学的、病理学的評価のために厚さ４μｍのスライスに切断した。こうして得られた組織切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色し、ＣＣＤカメラを備えた光学顕微鏡（ＢＸ-５１、オリンパス社、東京都）で２００倍または１００倍の倍率で観察した。
【００６６】
Ｅ-４．生化学的指標の評価
血液を各マウスから心臓穿刺で採取し、次いで遠心分離し、得られた上清（血清）を採取した。採取した血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルブミン、クレアチニン、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ＣＫ、総蛋白（ＴＰ）、グルコース、総コレステロール（ＴＣ）、トリアシルグリセロール（ＴＧ）のレベルを、本実施例の項目Ｄで用いた自動分析装置を用いて評価した。得られたデータは、基本手順の第１項に記載の方法に従って統計解析を行った。
【００６７】
Ｅ-５．腸内微生物叢の組成の分析
それぞれのマウスから盲腸サンプルを採取し、細菌ＤＮＡ抽出のために直ちに−８０℃で保存した。細菌ＤＮＡの抽出は、当分野で一般的に使用されているセチルトリメチルアンモニウムブロマイド／ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＴＡＢ／ＳＤＳ）法にしたがって行った。抽出したゲノムＤＮＡを−８０℃で保存した後、以下のようにして１６Ｓ ｒＲＮＡシークエンシングを行った。
【００６８】
バーコーディングされたユニバーサルプライマー３４１Ｆ（フォワードプライマー、配列ＩＤ番号：１）および８０６Ｒ（リバースプライマー、配列ＩＤ番号：２）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して、抽出されたゲノムＤＮＡから細菌性１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３−Ｖ４超可変領域を増幅した。ＤＮＡ濃度及び純度を１％アガロースゲル上でモニターした。アンプリコンＤＮＡサンプルのライブラリー構築及び配列は、ＢＩＯＴＯＯＬＳ社（台湾新北市）により行われた。ＴｒｕＳｅｑ  ＰＣＲフリーＤＮＡサンプル調製キット(イルミナ（Illumina）社、米国カリフォルニア州サンディエゴ)を用いてペアエンドライブラリー(各サンプルの挿入サイズ４５０〜４７０ｂｐ)を構築し、Illumina HiSeq2500プラットフォーム上でハイスループットシーケンシングを行った。
【００６９】
得られたデータは、ブレイ・カーティス（Bray-Curtis）距離測定による主座標解析、系統解析、線形判別分析効果量（ＬＥｆＳｅ）によるクラドグラム（分岐図）解析を行った。
【００７０】
結果
Ｅ-１．組織・臓器重量の測定
対照群、１Ｘ群、２Ｘ群、５Ｘ群の各群間で、初期体重、最終体重、食物摂取量及び水分摂取量に有意な差は認められなかった（データは特に示さず）。また、肝臓、腎臓、ＥＦＰ、心臓、肺の重量についても対照群、１Ｘ群、２Ｘ群、５Ｘ群の各群間で有意差は認められなかった。よって本発明に係る発酵製品は、臓器・組織に栄養面で悪影響を及ぼすことがないことがわかった（データは特に示さず）。
【００７１】
一方、下記の表１に示すように、１Ｘ群、２Ｘ群、および５Ｘ群の各群における筋肉およびＢＡＴの重量は、それぞれ対照群における重量よりも有意に大きかった。これにより、本発明に係る発酵製品は、筋肉およびＢＡＴを増加させることができ、よって筋力および脂肪燃焼を向上させることができることが示された。
【００７２】
【表１】
2021529529.tif 000003
【００７３】
Ｅ-２．グリコーゲン含有量の測定
図７Ａに示されているように、１Ｘ群、２Ｘ群、および５Ｘ群のそれぞれの肝グリコーゲン含量は、対照群の肝グリコーゲン含量よりも有意に高かった。このことから、本発明に係る発酵製品は肝グリコーゲン含量を増強し、よって抗疲労効果を発揮し、身体持久力をさらに向上させることができることが明らかになった。更に、本発明に係る発酵製品の肝グリコーゲン含量に対する有意な用量依存的効果（ｐ＝０．００４）が観察された。
【００７４】
図７Ｂに示されているように、１Ｘ群、２Ｘ群、および５Ｘ群のそれぞれの筋グリコーゲン含量は、対照群の筋グリコーゲン含量よりも有意に高かった。このことから、本発明に係る発酵製品は、筋グリコーゲン含量を高めることができ、したがって、抗疲労効果を発揮し、身体持久力を更に向上させることができることが明らかになった。更に、本発明に係る発酵製品の筋グリコーゲン含量に対する有意な用量依存的効果（ｐ＜０．０００１）が観察された。
【００７５】
以上のことから、本発明に係る発酵製品は、身体疲労を軽減し、身体持久力を向上させることができることが明らかになった。
【００７６】
Ｅ-３．組織学的染色
１Ｘ群、２Ｘ群、５Ｘ群の各群に関する肝臓、筋肉、心臓、腎臓、肺、ＥＦＰおよびＢＡＴの組織学的観察は、対照群に関するものと相違しなかった（特にデータは示さず）。本発明に係る発酵製品の投与後に毒性を示す臨床徴候は観察されず、このような発酵製品は、用いられ得る各種用量において特に安全であることが示された。
【００７７】
Ｅ-４．生化学的指標の評価
下記表２に示すように、１Ｘ群、２Ｘ群及び５Ｘ群のＡＬＴ値及びＣＫ値は、対照群のＡＬＴ値及びＣＫ値よりも有意に低かった。このことから、本発明に係る発酵製品は、血中ＡＬＴおよびＣＫを低下させることができることが示された（血中ＡＬＴが低下していることは、肝臓へのダメージがないことを意味し、血中ＣＫが低下していることは、抗疲労効果があることを意味する）。ＡＳＴ、アルブミン、クレアチニン、ＬＤＨ、ＴＰ、グルコース、ＴＣ、ＴＧといった他の生化学的指標は、４群間で差がなかった（データは特に示さず）。このことからも、本発明に発酵製品は、用いられ得る各種用量において特に安全であることがわかる。
【００７８】
【表２】
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【００７９】
Ｅ-５．腸内微生物叢の組成分析
主座標分析の結果（データは特に示さず）に基づくと、対照群、１Ｘ群、２Ｘ群、及び５Ｘ群がそれぞれ比較的明確なグループにクラスター化していることが判明した。このことにより、本発明に係る発酵製品は、腸内微生物叢を有意に変化させられることが示唆された。更に、菌門レベルで言うと、対照群、１Ｘ群、２Ｘ群、及び５Ｘ群のマウスの腸内マイクロバイオームの全体的な組成において、フィルミクテス門（Firmicutes）（対照群６５％、１Ｘ群６９％、２Ｘ群５１％、５Ｘ群５７％）及びバクテロイデス門（Bacteroidetes）（対照群２８％、１Ｘ群２５％、２Ｘ群４３％、５Ｘ群３９％）が優勢であった。４群の腸内細菌叢においては、フィルミクテス門とバクテロイデス門が優勢であったが（合わせて約９０％）、２Ｘ群と５Ｘ群ではフィルミクテス門の割合が少なく、バクテロイデス門の割合が多かった。本発明に係る発酵製品は、バクテロイデス門を増加させる能力を有し、バクテロイデス門は分岐鎖アミノ酸の異化に関与するタンパク質の発現を増加させ、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）（炎症の軽減、満腹感の向上、及び全体的な代謝効果に関与する）の産生を増加させるため、本発明に係る発酵製品を十分な量で使用した場合、炎症の軽減、満腹感の向上、および有益な代謝効果を提供するのに有効といえる。
【００８０】
また、５Ｘ群及び２Ｘ群のフィルミクテス門／バクテロイデス門（Ｆ／Ｂ）比（それぞれ１．４６、１．１９）は、１Ｘ群及び対照群におけるＦ／Ｂ比（それぞれ２．７６、２．３２）と比較して、いずれも低い値を示した。このＦ／Ｂ比の低下は、本発明に係る発酵製品が十分な量で使用された場合、満足のいくプレバイオティクス及びプロバイオティクスを提供し得ることを示唆している。
【００８１】
以下に、クラドグラム分析の結果について説明する。腸内微生物叢の組成を対照群と１Ｘ群とで比較した結果（データは特に示さず）については、ＬＥｆＳｅにより、１Ｘ群の方が対照群よりも、腸内の健康維持に関連するルミノコッカス科（Ruminococcaceae）の細菌の数が多いことが示された。更に、腸内微生物叢の組成を対照群と２Ｘ群とで比較した結果（データは特に示さず）については、宿主に対する有益性があることが知られているバクテロイデス目（Bacteroidales）とバクテロイディア綱（Bacteroidia）のそれぞれの割合において２Ｘ群の方が対照群よりも高いのに対し、クロストリジウム目（Clostridiales）とクロストリジウム綱（Clostridia）のそれぞれの割合においては対照群の方が２Ｘ群よりも高いことが明らかになった。そして、腸内微生物叢の組成を対照群と５Ｘ群とで比較した結果（データは特に示さず）によっては、リケネルラセア属（Rikenellaceae）、バクテロイデス目（Bacteroidales）、バクテロイディア綱（Bacteroidia）の割合において５Ｘ群の方が対照群よりも高く、これに対しクロストリジウム綱（Clostridia）の割合においては対照群の方が５Ｘ群よりも高いことがわかった。以上のことから、本発明に係る発酵製品は、腸内微生物叢の組成を調整することができ、身体疲労を軽減し、運動能力を向上させる代謝ネットワークに寄与することができることが明らかである。
【００８２】
本明細書で引用されたすべての特許および参考文献は、その全体が参考文献として本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合には、定義を含めて本明細書における記載が優先する。
【００８３】
本発明は、例示的な実施形態と考えられるものを記載したが、本発明は、開示された実施形態に限定されるものではなく、そのような修正および等価な設計をすべて包含するように、最も広い解釈の精神および範囲内に含まれる様々なアレンジを網羅することが意図されていることが理解されよう。
【図１】
2021529529.tif 000005
【図２】
2021529529.tif 000006
【図３Ａ】
2021529529.tif 000007
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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