(57)【要約】  本発明は、植物由来の環状ペプチドを有効成分とする腫瘍細胞異常脂質代謝阻害剤を開示し、且つ、腫瘍細胞の異常な脂質代謝を阻害する薬剤の調製における前記阻害剤の適用を開示し、具体的に、肝がん、大腸がん、直腸がん、前立腺がんが含まれる異常脂質代謝関連がんを治療と予防する薬剤の調製に適用される。本発明に記載の細胞異常脂質代謝阻害剤は腫瘍細胞の異常な脂質代謝を効果的に阻害でき、その有効成分としての植物由来の環状ペプチドは幅広い供給源が存在し、抽出技術は成熟し、その剤形や投薬方法は多様化しており、臨床応用に期待される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分が植物由来の環状ペプチドであることを特徴とする、腫瘍細胞異常脂質代謝阻害剤。
【請求項２】
前記有効成分がアカネ科環状ペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
前記有効成分が、下記の構造式で示されるアカネ科環状ペプチドＲＡ−ＶまたはＲＡ−ＸＩＩであることを特徴とする、請求項２に記載の阻害剤。
【化１】
2021505574.tif 000003
【請求項４】
細胞の異常な脂質代謝による疾患の治療および予防のための薬剤の調製に用いられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の阻害剤の使用。
【請求項５】
腫瘍の異常な脂質代謝を阻害することを標的とした薬剤の調製に用いられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の阻害剤の使用。
【請求項６】
前記腫瘍は肝がん、大腸がん、直腸がん、肺がん、乳がん、前立腺がんを含む、ことを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記薬剤は、腫瘍細胞の異常な脂質代謝を阻害することにより、腫瘍細胞の異常増殖を阻害することを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍用薬の分野に属し、具体的に、植物由来の環状ペプチドを有効成分とする腫瘍細胞異常脂質代謝阻害剤、およびその調製方法と使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質は３つの主要な栄養素の１つであり、エネルギー供給と貯蔵に密接に関連するほか、さらに２つの作用を発揮する。１つ目は、細胞の主な構成分子であり、脂質分子はリン脂質（グリセロリン脂質とスフィンゴミエリンなど）とコレステロールを含み、細胞膜の主成分であり、脂質代謝の変化は細胞膜合成と細胞増殖に直接影響する。２つ目は、細胞生命活動における重要な活性分子であり、脂質分子とその代謝中間体は、さまざまな細胞シグナル伝達、炎症の緩和、血管の調整などに関与することができ、且つ細胞増殖、細胞接着および運動などにも密接に関連する。
【０００３】
腫瘍の異常な脂質代謝は腫瘍代謝リプログラミングの重要な構成要素である。正常な人体は、主に血流により脂質を提供するが、腫瘍細胞の脂質合成プロセスはゼロから始まる。正常な細胞は、主にグルコースの好気性酸化的リン酸化によりエネルギーを供給し、無酸素環境では、主に嫌気性解糖をするが、腫瘍細胞は大きく異なり、供給が十分であっても、依然として積極的にグルコースを摂取し、解糖を行い、同時に大量の乳酸を生成する。腫瘍細胞が好気性解糖を用いるのは、好気性解糖による生成物が腫瘍細胞の栄養素摂取を促進し、且つ生体高分子（ヌクレオシド、アミノ酸、脂質）を合成することが主因である。脂質合成中、多くの調節因子が腫瘍細胞で高度に発現するが、対応する正常組織細胞では、低発現または発現しない。そのため、脂質合成を標的とすることは選択性が高く、より多くの利点と開発の見通しがあり、これは、近年の抗腫瘍代謝薬の研究ホットスポットであり、科学研究従事者から注目を集めている。しかしながら、現在、腫瘍の異常な脂質代謝を標的とする薬剤は市場に出ていない。
【０００４】
アカネ科環状ペプチド（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ−ｔｙｐｅ  ｃｙｃｌｏｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＲＡｓ）はアカネ科植物に含まれ、一般的にアカネ属植物に存在し、二環式ホモ環式ヘキサペプチド化合物であり、主に１つのＤ型α−アラニン、１つのＬ型α−アラニン、３つのＬ型Ｎ置換α−チロシンおよび１つのほかのＬ型コード化α−アミノ酸をペプチド鎖で連結して形成した環状ヘキサペプチドであり、６つのアミノ酸が１８員環に縮合し、そのうち、２つの隣接するチロシン間に、ベンゼン環が、酸素ブリッジによって接続されて、大張力をもつ１４員環を形成する。ＲＡｓは、その新しい２環式構造と顕著なｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍活性で注目されている。しかしながら、従来技術においては、アカネ科の環状ペプチドが腫瘍の異常な脂質代謝を阻害するという報告はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、アカネ科環状ペプチドを有効成分として腫瘍細胞異常脂質代謝に作用する阻害剤およびその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に記載の腫瘍異常脂質代謝阻害剤であって、その有効成分は植物由来の環状ペプチドである。
【０００７】
さらに、植物由来の環状ペプチドはアカネ科環状ペプチドである。
【０００８】
よりさらに、アカネ科環状ペプチドは下記の構造式で示されるＲＡ−ＶまたはＲＡ−ＸＩＩである。
【化１】
2021505574.tif 000002
【０００９】
阻害剤は、任意の薬理学的に許容される剤形であってよく、その投与量は任意の薬理学的に許容される投与量である。
【００１０】
細胞の異常な脂質代謝による疾患の治療および予防のための薬剤の調製に用いられる上記阻害剤の使用も、本発明の保護範囲内にある。そのような用途には腫瘍細胞の異常脂質代謝に関連する疾患を阻害することにおける使用を含むが、それに限定されない。
【００１１】
上記アカネ科環状ペプチドＲＡｓの調製方法は中国発明特許ＣＮ２０１４１０４４５３２５．０を参照できる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に記載の脂質代謝阻害剤は腫瘍細胞の迅速な増殖と異常脂質代謝を効果的に阻害でき、その有効成分としての植物由来の環状ペプチドは幅広い供給源が存在し、抽出技術は成熟し、その剤形や投薬方法は多様化しており、関連するがんの治療に適用され、臨床応用に期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ヒト肝がん細胞の増殖に対するアカネ科環状ペプチドＲＡ−ＸＩＩの阻害作用を示す。
【図２】図２は、アカネ科環状ペプチドＲＡ−ＶおよびＲＡ−ＸＩＩがヒト肝がん細胞の脂質代謝に関連する指標の発現に影響を与えることを示す。
【図３】図３は、アカネ科環状ペプチドＲＡ−ＸＩＩがヒト肝がん細胞内の脂肪滴の形成を阻害することを示す。
【図４】図４は、アカネ科環状ペプチドＲＡ−ＸＩＩのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍試験である。ヒト肝がん細胞を用いてヌードマウス体内に移植された腫瘍モデルを確立した。（１）ＲＡ−ＸＩＩは腫瘍増殖に対して阻害作用を発揮する。（２）ＲＡ−ＸＩＩはヌードマウスの体重に影響を与える。（３）ヌードマウスの皮下移植腫瘍である。
【図５】図５は、アカネ科環状ペプチドＲＡ−ＸＩＩがヌードマウスの皮下移植腫瘍の組織内の脂質代謝に関連する指標の発現を阻害することを示す。
【図６】図６は、アカネ科環状ペプチドＲＡ−ＸＩＩがヌードマウスの皮下移植腫瘍の組織内の脂肪滴生成を阻害することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に図面と合わせて、具体的な実施例を挙げて本発明の実質的な内容をさらに説明するが、これにより本発明を限定するものではない。本発明の本質に基づいて本発明に対して行うすべての改良はいずれも本発明の範囲内に属する。
【００１５】
下記アカネ科環状ペプチドＲＡｓの調製方法は中国発明特許ＣＮ２０１４１０４４５３２５．０を参照できる。
【００１６】
実験方法：培養した腫瘍細胞をＲＡｓで処理し、ＳＲＢ方法を用いてその細胞増殖阻害活性を検出し、前記化合物が腫瘍細胞の異常増殖を阻害できることを確認した。市販のキットを使用して、細胞内コレステロール、トリグリセリド、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質の含量を検出し、オイルレッドＯ染色で腫瘍細胞内の脂肪滴の含量を検出し、化合物が腫瘍細胞の異常脂質代謝を阻害することを確認した。肝がん細胞でヌードマウスの皮下移植腫瘍モデルを確立し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＡｓの抗腫瘍および腫瘍の異常な脂質代謝を阻害する活性を確認した。
【００１７】
実施例１
【００１８】
ヒト肝がん細胞の増殖に対するＲＡ−ＸＩＩの阻害作用である。
【００１９】
ＳＲＢ法で細胞の生存率を測定した。一晩培養した１０％ＦＢＳ培地を含むヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞株（中国科学院典型培養物保蔵委員会の細胞バンクから購入）に、パンクレアチンを加えて消化して細胞懸濁液を調製し、適切な濃度、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、細胞が完全に壁に付着するまでＣＯ２インキュベーターの中で２４時間培養し、異なる最終濃度のＲＡ−ＸＩＩを加え、２４時間作用させた後、予め４℃で冷却した５０μｌのＴＣＡ溶液（３０％，ｗ／ｖ）を１ウェル毎に加えて細胞を固定した。ＴＣＡ溶液の最終濃度は１０％である。５分間静置した後に４℃の冷蔵庫の中に置き、１時間固定し、取り出して脱イオン水で５回洗浄し、室温で自然乾燥させた。染色：９６ウェルプレートを室温で自然乾燥させた後、１ウェル毎に０．４％（ｗ／ｖ）のＳＲＢ色素溶液（ｓｉｇｍａから購入、１％の酢酸で調製）７０μｌを加え、３０分間染色した後に色素溶液を捨て、１％（ｖ／ｖ）酢酸で４回洗浄し、結合していない色素を除去して、室温で自然乾燥させた。１００μｌの非緩衝Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅアルカリ液（１０ｍＭ，ｐＨ＝１０．５）を用いて細胞タンパク質に結合した色素を溶解し、横型振とう機で２０分間振とうし、マイクロプレートリーダーを使用して５４０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００２０】
試験結果を図１に示す。結果は、ＲＡ−ＸＩＩが腫瘍細胞の急速な増殖を阻害できることを示している。
【００２１】
実施例２
【００２２】
ＲＡ−ＶおよびＲＡ−ＸＩＩは、ヒト肝がん細胞の脂質代謝に関連する指標の発現に影響を与える。
【００２３】
一晩培養した１０％ＦＢＳ培地を含むヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞株に、パンクレアチンを加えて消化して細胞懸濁液を調製し、適切な濃度で６ウェルプレートに接種し、２４時間後にＲＡ−ＶまたはＲＡ−ＸＩＩを加え、２４時間処理し、パンクレアチンを加えて消化し、室温で２０００ｒｐｍで５〜１０分間遠心分離し、細胞を収集し、予め冷却した１×ＰＢＳ（４℃）を用いて細胞を再懸濁させ、２０００ｒｐｍで５〜１０分間遠心分離し、細胞を洗浄した。市販のキットを用いて、それぞれ単剤ＧＰＯ−ＰＡＰ法を使用して、細胞内の総コレステロールとトリグリセリドの含量を検出し、二重試薬の直接法により細胞内の低密度リポタンパク質と高密度リポタンパク質の含量を検出した（市販のキットは南京建成生物工程研究所から購入、型番はそれぞれＡ１１１−１、Ａ１１０−１、Ａ１１３−１、Ａ１１２−１である）。
【００２４】
試験結果を図２に示す。結果は、ＲＡ−ＶとＲＡ−ＸＩＩが腫瘍細胞における脂質代謝関連指標の総コレステロール、トリグリセリドおよび低密度リポタンパク質の発現を明らかに阻害し、人体に有益な高密度リポタンパク質に明らかな影響を与えないことを示している。
【００２５】
実施例３
【００２６】
ＲＡ−ＸＩＩがヒト肝がん細胞内の脂肪滴の形成を阻害する。
【００２７】
予め粉砕した０．５ｇのオイルレッド乾燥粉末（ｓｉｇｍａ社から購入）を秤取して、少量のイソプロピルアルコールに溶解し、その後、イソプロピルアルコールを加えて１００ｍｌにし、茶色のボトルに密封して（或いは、アルミ箔で包んで暗所に）４℃で保存した。保存溶液であるため、長期間保存できる。使用する際、６ｍｌを取り、３回の蒸留を経て収集した水４ｍｌを加えて均一に混合し、定性濾紙で濾過して使用液を調製した。希釈後は数時間内に使い切った。一晩培養した１０％ＦＢＳ培地を含むヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞株に、パンクレアチンを加えて消化して細胞懸濁液を調製し、適切な濃度で２４ウェルプレートに接種し、２４時間後にＲＡ−ＸＩＩを加え、２４時間処理した。まず慎重に培地をゆっくりと除去し、４％のパラホルムアルデヒドで３０分間固定し、オイルレッド使用液を用いて室温で約３０分間染色し、ＰＢＳで２回洗浄し、顕微鏡で写真を取った。
【００２８】
試験結果を図３に示す。結果は、ＲＡ−ＸＩＩが腫瘍細胞内の脂肪滴の数量を明らかに減少させることができることを示している。
【００２９】
実施例４
【００３０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＡ−ＸＩＩの抗腫瘍試験である。
【００３１】
ＨｅｐＧ２を無血清ＭＥＭ培地で１×１０７個／ｍＬに希釈し、１００μＬの細胞懸濁液を取り、ＢＡＢＬ／ｃのヌードマウスの左脇の下に皮下接種し、７日間増殖させ、担癌マウスモデルを形成する。接種して成長状況が良好である担癌マウスを取り、ランダムで組に分け、ＲＡ−ＸＩＩを尾静脈から投与し、隔日で投薬し、投薬すると同時にノギスで腫瘍のサイズ（腫瘍の体積＝長径×短径２／２）を測定し、且つヌードマウスの体重を記録し、統計処理した。２１日間投薬後にすべての動物を屠殺し、腫瘍を剥がして写真を取った。
【００３２】
試験の結果を図４に示す。結果は、ＲＡ−ＸＩＩがヌードマウスの皮下移植腫瘍の増殖速度を明らかに低下させ、且つヌードマウスの体重に明らかな影響を与えないことを示している。
【００３３】
実施例５
【００３４】
ＲＡ−ＸＩＩがヌードマウスの皮下移植腫瘍組織における脂質代謝に関連する指標の発現を阻害する。
【００３５】
実施例４で得られた腫瘍組織を取り、ＲＩＰＡライセートで溶解した後、市販のキットでコレステロール、トリグリセリド、低密度リポタンパク質および高密度リポタンパク質の含量（具体的な方法は実施例２と同じである）を検出した。
【００３６】
試験結果を図５に示す。結果は、ＲＡ−ＸＩＩがヌードマウスの皮下移植腫瘍組織における総コレステロール、トリグリセリドおよび低密度リポタンパク質の発現を明らかに阻害し、人体に有益な高密度リポタンパク質に明らかな影響を与えないことを示している。
【００３７】
実施例６
【００３８】
ＲＡ−ＸＩＩがヌードマウスの皮下移植腫瘍組織における脂肪滴の形成を阻害する。
【００３９】
実施例４で得られた腫瘍組織を取り、ＯＣＴで包埋した後に急速に冷却し、２０μｍの厚さの連続凍結切片を作製し、室温で３０分間自然乾燥させ、４％のパラホルムアルデヒドで３０分間固定し、オイルレッド使用液を用いて室温で約３０分間染色し、ＰＢＳで２回洗浄し、グリセリンゼラチン密封剤で密封し、一晩乾燥させ、顕微鏡で写真を取った。
【００４０】
試験結果を図６に示す。結果は、ＲＡ−ＸＩＩが腫瘍細胞内の脂肪滴の数量を明らかに減少させることができることを示している。
【００４１】
（付記）
（付記１）
有効成分が植物由来の環状ペプチドであることを特徴とする、腫瘍細胞異常脂質代謝阻害剤。
（付記２）
前記有効成分がアカネ科環状ペプチドであることを特徴とする、付記１に記載の阻害剤。
（付記３）
前記有効成分が、化１式の構造式で示されるアカネ科環状ペプチドＲＡ−ＶまたはＲＡ−ＸＩＩであることを特徴とする、付記２に記載の阻害剤。
（付記４）
細胞の異常な脂質代謝による疾患の治療および予防のための薬剤の調製に用いられる、付記１〜３のいずれか一つに記載の阻害剤の使用。
（付記５）
腫瘍の異常な脂質代謝を阻害することを標的とした薬剤の調製に用いられる、付記１〜３のいずれか一つに記載の阻害剤の使用。
（付記６）
前記腫瘍は肝がん、大腸がん、直腸がん、肺がん、乳がん、前立腺がんを含む、ことを特徴とする付記５に記載の使用。
（付記７）
前記薬剤は、腫瘍細胞の異常な脂質代謝を阻害することにより、腫瘍細胞の異常増殖を阻害する、ことを特徴とする付記５に記載の使用。
【図１】
2021505574.tif 000004
【図２】
2021505574.tif 000005
【図３】
2021505574.tif 000006
【図４】
2021505574.tif 000007
【図５】
2021505574.tif 000008
【図６】
2021505574.tif 000009
【国際調査報告】
2021505574.tif 000010
2021505574.tif 000011
2021505574.tif 000012
2021505574.tif 000013
2021505574.tif 000014
2021505574.tif 000015