(57)【要約】  本発明は、ビタミンＤ３又はその誘導体／代謝産物の生物工学的生成に対する重要な中間体である７−デヒドロコレステロール（７−ＤＨＣ）を生成するための改善された方法に関する。本発明は、改善されたＣ−５ステロール５デサチュラーゼ活性を有する酵素を発現する修飾宿主株並びにビタミンＤ３又はその誘導体及び／若しくは代謝産物を生成するプロセスにおけるその使用を特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
７−デヒドロコレステロール（７−ＤＨＣ）の生成のための適切な宿主細胞において（異種）発現される、配列番号２と少なくとも約４５％、例えば少なくとも５０、５２、６０、７０、８０、９０、９２、９５、９８又は１００％までなどの同一性を有するＣ５−ステロールデサチュラーゼを有する酵素を含むコレステロール産生酵母細胞であって、ラノステロール及び／又はラトステロールを含む副産物に対する７−ＤＨＣの比は、非修飾宿主細胞と比較して少なくとも約５％だけ増加される、コレステロール産生酵母細胞。
【請求項２】
Ｃ５−ステロールデサチュラーゼ活性を有する酵素を含み、ステロールの総量に基づいて少なくとも約８４％の７−ＤＨＣを含み、好ましくは少なくとも約８５、８８、９０、９２、９５、９７、９８又は１００％までの７−ＤＨＣを含むステロールミックスを産生する、請求項１に記載のコレステロール産生酵母細胞。
【請求項３】
コレスタ−７−エノール及び／又はラノステロールに対する７−ＤＨＣの比は、約１８の範囲である、請求項１又は２に記載のコレステロール産生酵母細胞。
【請求項４】
コレスタ−７−エノール及び／又はラノステロールに対する７−ＤＨＣの比は、少なくとも約５％だけ増加される、請求項１又は２に記載のコレステロール産生酵母細胞。
【請求項５】
配列番号２と少なくとも約４５％、例えば少なくとも５０、５２、６０、７０、８０、９０、９２、９５、９８又は１００％までなどの同一性を有するＣ５−ステロールデサチュラーゼ活性を有する異種酵素を発現する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコレステロール産生酵母細胞。
【請求項６】
Ｃ５−ステロールデサチュラーゼ活性を有する異種酵素を発現し、前記酵素は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）などのクルイベロミセス属（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などのシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）などのカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、Ｐ．ロックフォルティ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）などのペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）などのクリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、例えばイネいもち病菌（Ｍａｇｎｅｐｏｒｔｅ  ｏｒｙｚａｅ）、メタリジウム・アクリダム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｃｒｉｄｕｍ）などのメタリジウム属（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）及びトウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）などの黒穂菌属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）からなる群から選択される、請求項４に記載のコレステロール産生酵母細胞。
【請求項７】
ＥＲＧ５及びＥＲＧ６は、不活化されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載のコレステロール産生酵母細胞。
【請求項８】
ステロールΔ２４−レダクターゼ活性を有するＥＣ１．３．１．７２から選択される異種酵素を発現し、好ましくは、前記異種酵素は、植物又は脊椎動物に由来し、より好ましくはヒト、ブタ、イヌ、マウス、ラット、ウマ又はゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）に由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のコレステロール産生酵母細胞。
【請求項９】
Ｃ８−イソメラーゼ活性を有する異種酵素を発現し、好ましくは、前記異種酵素は、トウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）から、より好ましくは配列番号１４によるポリペプチドと少なくとも約４２％、例えば少なくとも４３、４４、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、７５、８０、９０、９２、９５、９８又は１００％までなどの同一性を有するポリペプチドから入手可能である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコレステロール産生酵母細胞。
【請求項１０】
ステロールを生成するための、好ましくはビタミンＤ３前駆物質を生成するための、より好ましくは７−ＤＨＣを生成するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のコレステロール産生酵母細胞の使用。
【請求項１１】
前記７−ＤＨＣは、ビタミンＤ３に更に変換される、請求項１０に記載のコレステロール産生酵母細胞の使用。
【請求項１２】
前記７−ＤＨＣは、２５−ヒドロキシビタミンＤ３に更に変換される、請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
酵母細胞によって産生されるステロールミックス中のコレスタ−７−エノール及び／又はラノステロールの量を低減するプロセスであって、Ｃ５−ステロールデサチュラーゼ活性を有する異種酵素を発現する工程を含み、前記酵素は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）などのクルイベロミセス属（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などのシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）などのカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、Ｐ．ロックフォルティ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）などのペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）などのクリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、例えばイネいもち病菌（Ｍａｇｎｅｐｏｒｔｅ  ｏｒｙｚａｅ）、メタリジウム・アクリダム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｃｒｉｄｕｍ）などのメタリジウム属（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）及びトウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）などの黒穂菌属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）からなる群から選択され、好ましくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）又はサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、プロセス。
【請求項１４】
酵母細胞において、ステロールミックス、好ましくはビタミンＤ３前駆物質、より好ましくは少なくとも約８４％の７−ＤＨＣを有するステロールミックスを生成するプロセスであって、
（ａ）ＥＲＧ５及びＥＲＧ６を不活化する工程、
（ｂ）コレスタ−７，２４−ジエノール、チモステロール又はトリエノールに対するステロールΔ２４−レダクターゼ活性を有するＥＣ１．３．１．７２から選択される異種酵素、好ましくは植物又は脊椎動物ステロールΔ２４−レダクターゼ、より好ましくは脊椎動物ステロールΔ２４−レダクターゼを発現する工程、
（ｃ）Ｃ５−ステロールデサチュラーゼ活性を有する異種酵素を発現する工程であって、前記酵素は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）などのクルイベロミセス属（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などのシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）などのカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、Ｐ．ロックフォルティ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）などのペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）などのクリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、例えばイネいもち病菌（Ｍａｇｎｅｐｏｒｔｅ  ｏｒｙｚａｅ）、メタリジウム・アクリダム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｃｒｉｄｕｍ）などのメタリジウム属（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）及びトウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）などの黒穂菌属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）からなる群から選択され、好ましくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）又はサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、工程、
（ｄ）ステロール産生に適切な条件下で前記酵母細胞を培養する工程であって、ステロールミックス中に存在するコレスタ−７−エノール及び／又はラノステロールに対する７−ＤＨＣの比は、約１７．２を超える、工程
を含むプロセス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ビタミンＤ３又はその誘導体／代謝産物の生物工学的生成に対する重要な中間体である７−デヒドロコレステロール（７−ＤＨＣ）を生成するための改善された方法に関する。本発明は、改善されたＣ−５ステロールデサチュラーゼ活性を有する酵素を発現する修飾宿主株並びにビタミンＤ３又はその誘導体及び／若しくは代謝産物を生成するプロセスにおけるその使用を特徴とする。
【０００２】
ビタミンＤ３（コレカルシフェロール又はカルシオールとしても知られる）は、哺乳動物の皮膚においてプロビタミンＤ３（７−デヒドロコレステロール又は７−ＤＨＣとしても知られる）から合成され得、それは、コレステロール生合成の産物であり、紫外線に曝露されると、７−ＤＨＣは、プロビタミンＤ３に光化学的に変換され、体温において生物活性型ビタミンＤ３に異性化する。肝臓において、ビタミンＤ３は、生物学的に不活性な２５−ヒドロキシビタミンＤ３（カルシジオール、カルシフェジオール、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール、２５−ＯＨ−Ｄ３又はＨｙＤとしても知られる）に変換され、それは、ビタミンＤ３の主要な循環形である。更なるヒドロキシル化が腎臓内で生じる。
【０００３】
ビタミンＤ３の工業的製造について、化学合成及び生物工学的合成のいずれも（原則的に）利用可能である。化学合成は、例えば、羊毛脂から単離されたコレステロールから開始され、それは、化学合成及び生物工学的合成のいずれでも重要な中間体である７−ＤＨＣに脱水素される。紫外線による曝露及び更なる精製／抽出工程により、７−ＤＨＣは、ビタミンＤ３に変換される。修飾酵母株を７−ＤＨＣの生合成に使用することができ、多段階酵素的プロセスにおいてアセチル−ＣｏＡが７−ＤＨＣに変換される。前記酵素的変換は、酵母の小胞体内で行われる。細胞膜で必要とされない、７−ＤＨＣ及びその前駆物質などの過剰量のステロールは、酵母に対して毒性であり、したがって細胞小器官内にステリルエステル（いわゆる脂肪滴）として貯蔵され、細胞小器官からそれを更に単離することができる。遊離ステロールと脂肪滴に貯蔵されるステロール（主にステリルエステルの形態における）との平衡状態は、ステロールアシルトランスフェラーゼの作用など、数種類のタンパク質（酵素）の作用を介して誘発される。
【０００４】
前記ステロールアシルトランスフェラーゼ酵素の非特異的作用のため、脂肪滴内に貯蔵されているステリルエステルプールは、比較的多様であり、限定されないが、例えばエルゴステロール、チモステロール、ラノステロール、ラトステロール、コレスタ−５，７，２４（２５）−トリエノール、コレスタ−８−エノール又は７−ＤＨＣのエステルなどが挙げられる。７−ＤＨＣのみがビタミンＤ３に更に処理され得る。
【０００５】
したがって、７−ＤＨＣに対する高い生産性／特異性を有し、且つ／又は副産物／中間体、例えばチモステロール、ラノステロール又はラトステロール、特に脂肪滴内に貯蔵される、かかる中間体のエステルの蓄積が低減された、ステロールを生成することができる酵母などの宿主細胞を生成することが継続的な課題である。
【０００６】
意外なことに、本発明者らは、ここで、宿主細胞における７−ＤＨＣの生産性、特にコレスタ−７−エノール及び／又はラトステロールに対する７−ＤＨＣの比が、宿主細胞内のＣ−５ステロールデサチュラーゼ活性の修飾、すなわちＣ−５ステロールデサチュラーゼ活性を有する異種酵素の発現により、７−ＤＨＣに対してシフトすることができ、それによりビタミンＤ３生成における重要な中間体としての７−ＤＨＣに対する宿主細胞の生産性が高くなることを見出した。
【０００７】
したがって、本発明は、７−ＤＨＣを生成するプロセスにおけるＣ−５ステロールデサチュラーゼ活性を有する酵素の使用であって、配列番号２と少なくとも４５％、例えば少なくとも５０、５２、６０、７０、８０、９０、９２、９５、９８又は１００％までなどの同一性を有する前記ポリペプチドは、７−ＤＨＣの生成のための適切な宿主細胞において（異種）発現され、ラノステロール及び／又はラトステロールなどの副産物に対する７−ＤＨＣの比は、非修飾宿主細胞と比較して少なくとも５％だけ増加される、使用に関する。
【０００８】
Ｃ−５ステロールデサチュラーゼ活性を示す、配列番号２によるポリペプチドであって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリペプチドがピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から単離されている。
【０００９】
「Ｃ−５ステロールデサチュラーゼ」、「Ｃ−５ステロールデサチュラーゼを有する酵素」、「デサチュラーゼ」又は「ＥＲＧ３ホモログ」は、本明細書において区別なく使用され、コレスタ−７，２４−ジエノールへのコレスタ−８−エノールの変換並びに／又はコレスタ−５，７，２４−トリエノール及び／若しくは７−ＤＨＣへのコレスタ−７−エノールの変換を触媒することができる酵素を意味する。本明細書で定義される酵素は、かかるポリペプチドをコードするポリペプチドなど、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のホモログＥＲＧ３（配列番号８）である。
【００１０】
例えば、７−ＤＨＣに対するコレスタ−７−エノール及び／又はコレスタ−５，７，２４−トリエノールに対するコレスタ−７，２４−ジエノールの酵素触媒作用と関連する「変換」、「酵素的変換」又は「不飽和化」という用語は、本明細書において区別なく使用され、本明細書で定義され、且つ当技術分野で公知のＣ−５ステロールデサチュラーゼの作用を意味する。
【００１１】
デサチュラーゼは、単離状態で（例えば、無細胞システムで）使用され得るか、又は適切な宿主細胞において異種酵素若しくは内因性酵素のエクストラコピーとして導入及び発現され得る。したがって、適切な宿主細胞は、本明細書で定義されるデサチュラーゼ酵素の１つ、２つ又はそれを超えるコピーを発現し、それによりコレスタ−７−エノール及び／又はラノステロールと比較して７−ＤＨＣが増加し、且つ／又は７−ＤＨＣの比が向上する。前記宿主細胞は、本明細書において、遺伝子修飾された宿主細胞と呼ばれる。本明細書で言及される遺伝子非修飾又は非修飾宿主細胞は、内因性ＥＲＧ３遺伝子によって発現される内因性Ｃ−５ステロールデサチュラーゼ活性のみを保有するそれぞれの宿主細胞である。
【００１２】
本明細書で使用される、ビタミンＤ３中間体を特定化する「チモステロール」、「ラノステロール」、「ラトステロール」、「コレスタ−５，８，２４（２５）−トリエノール」、「コレスタ−５，７，２４（２５）−トリエノール」又は「７−ＤＨＣ」という用語は、前記化合物の遊離型及びエステル型の両方を含む。本明細書で使用されるステロールミックスは、７−ＤＨＣ及び「副産物」又は中間体、限定されないが、チモステロール、ラノステロール、ラトステロール、コレスタ−８−エノール、コレスタ−５，８，２４（２５）−トリエノール若しくはコレスタ−５，７，２４（２５）−トリエノールを含有する。
【００１３】
本明細書で使用される「コレステロール産生酵母」は、もはやエルゴステロールを産生することはできないが、限定されないが、コレスタ−５，７，２４（２５）−トリエノール、コレスタ−５，８，２４（２５）−トリエノール、コレスタ−７，２４（２５）−ジエノール、コレスタ−８−エノール、７−ＤＨＣ又はチモステロールを含むコレステロール生成物を産生することができる。特に、これは、ｅｒｇ５ｅｒｇ６ダブルノックアウトの導入によって達成され得る。
【００１４】
本明細書で定義される適切なデサチュラーゼは、例えば、植物、ヒトなどの動物、藻類、酵母などの菌類又は細菌などの様々な起源から、好ましくは特にサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、マグネポルテ（Ｍａｇｎｅｐｏｒｔｅ）、メタリジウム属（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）及び黒穂菌属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）からなる群から選択される菌類から、より好ましくはＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｐ．ロックフォルティ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）又はトウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）から、最も好ましくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から入手可能であり得る。
【００１５】
好ましい実施形態において、Ｃ−５ステロールデサチュラーゼ活性を有する酵素は、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、特にピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、例えば配列番号１によるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質などから入手可能であり、より好ましくは、前記タンパク質は、配列番号２によるポリペプチドである。
【００１６】
更なる実施形態において、Ｃ−５ステロールデサチュラーゼ活性を有する酵素は、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、特にペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、例えば配列番号３によるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質などから入手可能であり、より好ましくは、前記タンパク質は、配列番号４によるポリペプチドである。
【００１７】
一実施形態において、Ｃ−５ステロールデサチュラーゼ活性を有する酵素は、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、特にシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、例えば配列番号５によるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質などから入手可能であり、より好ましくは、前記タンパク質は、配列番号６によるポリペプチドである。
【００１８】
他の実施形態において、Ｃ−５ステロールデサチュラーゼ活性を有する酵素は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、特にサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、例えば配列番号７によるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質などから入手可能であり、より好ましくは、前記タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ３２３５２に由来する配列番号８によるポリペプチドであり、前記酵素は、宿主としてＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を使用した場合、追加的に且つ／又は内因性ＥＲＧ３の代わりに発現される。
【００１９】
本明細書に開示される配列、並びにステロールミックス中の７−ＤＨＣの蓄積、並びに／又はコレスタ−７−エノール及び／若しくはラトステロールの低減の向上、すなわちステロールミックス中に存在する７−ＤＨＣが少なくとも８４％、例えば８５、９０、９２、９５、９７又は１００％などになることに基づき、本明細書で定義されるＣ−５ステロールデサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする更に適切な遺伝子を容易に推定することができ、本明細書に定義されるＣ−５ステロール、特にコレスタ−７−エノール及びコレスタ−７，２４−ジエノールの不飽和化にそれを使用することができる。したがって、本発明は、新規なデサチュラーゼを同定する方法であって、配列番号８によるポリペプチドと少なくとも４４％、例えば４８、５０、５２、６０、７０、８０、９０、９２、９５、９８％又は１００％までなどの同一性を有するポリペプチドは、新規なＣ−５ステロールデサチュラーゼのスクリーニングプロセスでプローブとして使用され、コレスタ−７−エノール及び／又はラトステロールと比べて７−ＤＨＣの生成に好ましく、適切な宿主株によって産生されるステロールミックス中の７−ＤＨＣは、少なくとも約８４％となる、方法に関する。デサチュラーゼの作用により、生成されるステロールの総量に基づいてステロールミックス中の７−ＤＨＣが少なくとも約８４％となり、且つ／又はコレスタ−７−エノール及び／若しくはラトステロールに対する７−ＤＨＣの比が増加する限り、Ｃ−５ステロールデサチュラーゼ活性を有し、且つ本明細書に記載のいずれかのポリペプチドが７−ＤＨＣの生成に使用され得る。
【００２０】
本発明は、特に、７−ＤＨＣを生成するプロセスにおける、かかる新規なデサチュラーゼ酵素、特に異種酵素の使用であって、コレスタ−７−エノール、チモステロール、コレスタ−８−エノール又はラトステロールを含むステロールミックス中の副産物の産生は、本明細書に記載の前記デサチュラーゼの作用により、ステロールの総量に基づいて約１６％以下、例えば１５、１２、１０、８、５、３％以下に低減され、特に７−ＤＨＣの量に対してコレスタ−７−エノール及び／又はラトステロールのパーセンテージが低減される、使用に関する。このプロセスは、前記異種デサチュラーゼを発現する適切なコレステロール産生酵母細胞で実施され得、好ましくは前記酵素をコードする遺伝子が異種発現され、すなわち前記宿主細胞に導入される。（既知の）適切な化学的又は生物工学的メカニズムの作用により、７−ＤＨＣは、ビタミンＤ３に更に変換される。宿主細胞中で発現されるＥＲＧ３ホモログのコピー数が１を超えて増加すると、副産物のパーセンテージを更に低減することができる。
【００２１】
「配列同一性」、「同一性％」という用語は、本明細書において区別なく使用される。本発明の目的では、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の配列同一性のパーセンテージを決定するために、最適な比較のために配列がアライメントされることが本明細書において定義される。２つの配列間のアライメントを最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにギャップが導入され得る。かかるアライメントは、比較される配列の完全長をわたって行うことができる。代わりに、アライメントは、より短い長さにわたり、例えば約２０、約５０、約１００以上の核酸／塩基又はアミノ酸にわたり行われ得る。配列同一性は、報告されるアライメント領域にわたる２つの配列間の同一マッチのパーセンテージである。２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の配列同一性％は、２つの配列のアライメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）を用いて決定され得る。アミノ酸配列とヌクレオチド配列とのいずれもアルゴリズムによってアライメントすることができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータープログラムＮＥＥＤＬＥにおいて実現されている。本発明の目的では、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムが使用された（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｌｏｎｇｄｅｎ  ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）ｐｐ２７６−２７７，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質の配列に関して、置換行列にＥＢＬＯＳＵＭ６２が使用される。ヌクレオチド配列について、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用される任意のパラメーターは、ギャップオープンペナルティ１０及びギャップ伸長ペナルティ０．５である。これらの異なるすべてのパラメーターによってわずかに異なる結果が生じるが、２つの配列の同一性の全体的なパーセンテージは、異なるアルゴリズムを使用した場合に有意に変化しないことを当業者は理解するであろう。
【００２２】
上述のＮＥＥＤＬＥプログラムによってアライメントした後、問い合わせ配列と本発明の配列との配列同一性のパーセンテージが以下の通りに計算される：両方の配列における同一アミノ酸又は同一ヌクレオチドを示すアライメントの対応する位置の数は、アライメントにおけるギャップの総数を引いた後にアライメントの全長で割られる。本明細書で定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用することによってＮＥＥＤＬＥから得られ、「最長の同一性」としてプログラムのアウトプットで標識される。比較される両方のアミノ酸配列がそれらのアミノ酸のいずれにおいても違いがない場合、それらは、同一であるか又は１００％の同一性を有する。本明細書において定義される植物に由来する酵素に関して、植物由来酵素は、例えば、葉緑体処理酵素（ＣＰＥ）などの特異的酵素によって切断される、葉緑体標的シグナルを含有し得るという事実が当業者によって認識される。
【００２３】
本明細書で定義されるＥＲＧ３酵素／ホモログは、酵素活性を変化させないアミノ酸置換を保持する酵素も包含し、すなわち、その酵素は、野生型酵素に関して同じ特性を示し、Ｃ−５ステロールの不飽和化を触媒し、それによってステロールミックス中の７−ＤＨＣのパーセンテージが少なくとも約８４％となる（７−ＤＨＣに対してコレスタ−７−エノール及び／又はラトステロールが減少する）。かかる変異は、「サイレント変異」とも呼ばれ、本明細書に記載の酵素の（酵素的）活性を変化させない。
【００２４】
宿主細胞に応じて、Ｃ−５ステロール不飽和化に関与する、本明細書で定義されるポリヌクレオチドは、それぞれの宿主細胞における発現に対して最適化され得る。かかる修飾ポリヌクレオチドをどのように作製するかは、当業者に公知である。本明細書で定義されるポリヌクレオチドは、本明細書で定義されるそれぞれの活性を有するポリペプチドを依然として発現する限り、かかる宿主最適化核酸分子も包含する。例えば、配列番号９、１０及び１１にかかる宿主最適化ＥＲＧ３ホモログの例を示す。
【００２５】
したがって、一実施形態において、本発明は、宿主細胞の増殖若しくは発現パターン又は酵素に対して影響を及ぼさず、前記宿主細胞における発現に対して最適化される、本明細書で定義される（異種）ＥＲＧ３ホモログをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。特に、酵母、例えばコレステロール産生酵母細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、例えばサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などから選択され、本明細書で定義されるＥＲＧ３酵素をコードするポリヌクレオチドの１つ、２つ又はそれを超えるコピーは、配列番号９と少なくとも５３％、例えば少なくとも５８、６０、７０、８０、９０、９２、９５、９８％又は１００％までなどの同一性を有するポリヌクレオチド、例えば配列番号９、１０又は１１によるポリペプチドなどから選択される。
【００２６】
本発明による核酸分子は、本発明によって提供される核酸配列の一部又は断片のみ、例えば配列番号１、３、５、７、９、１０又は１１で示される配列、例えばプローブ若しくはプライマーとして使用され得る断片又は本明細書で定義されるＥＲＧ３ホモログの一部をコードする断片などを含み得る。プローブ／プライマーは、通常、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含み、それは、通常、好ましくは高度にストリンジェントな条件下において、配列番号１、３、５、７、９、１０若しくは１１によるヌクレオチド配列又はその断片若しくは誘導体の、少なくとも約１２又は１５、好ましくは約１８又は２０、より好ましくは約２２又は２５、更により好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７５個以上の連続ヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【００２７】
かかるハイブリダイゼーション条件の非限定的な好ましい例は、約４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーションに続き、５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、更により好ましくは６５℃において１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で１回又は複数回洗浄することである。
【００２８】
高度にストリンジェントな条件は、例えば、サケ精子ＤＮＡ１００ｐｇ／ｍｌを含むか若しくは含まないＤｉｇＥａｓｙＨｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ））などの溶液中又は５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、０．０２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％Ｎ−ラウロイルザルコシン及び２％ブロッキング剤（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を含む溶液中において、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブ（ＤＩＧ標識システム；ロシュ・ダイアグノスティックス社，６８２９８  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して製造された）を使用して、４２℃で２時間〜４日間インキュベートし、続いて室温において２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中でフィルターを２回５〜１５分間洗浄し、次いで０．５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ又は０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で６５〜６８℃において２回、１５〜３０分間洗浄することを含む。
【００２９】
本発明は、特に、７−ＤＨＣ、ビタミンＤ３の中間体を生成するプロセスにおける、本明細書で定義されるＣ−５ステロールデサチュラーゼ活性を有する異種酵素の使用に関する。好ましくは、本発明の修飾酵素は、酵母、特にコレステロール産生酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、クルイウェロミセス属（Ｋｌｙｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．）又はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、好ましくはＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される酵母など、適切な宿主細胞に導入され、且つ／又は発現される。修飾宿主は、ビタミンＤ３及び／又は２５−ヒドロキシビタミンＤ３に更に変換され得る７−ＤＨＣを生成するために使用される。
【００３０】
適切な宿主細胞を更に修飾して、ビタミンＤ３の生合成に対する重要な中間体である７−ＤＨＣの生成が更に増加され、且つ／又は副産物の蓄積が低減され得る。
【００３１】
したがって、一実施形態において、本発明は、修飾Ｃ−５ステロールデサチュラーゼ活性を有する酵母株に関し、更に、ＥＲＧ５及びＥＲＧ６は、不活化されている。酵母細胞は、前記酵母細胞内で発現することができる限り、コレスタ−７，２４−ジエノール、チモステロール又はトリエノール（例えば、コレスタ−５，７，２５−トリエノール）上で活性である異種Ｃ２４−レダクターゼ、好ましくは植物又は脊椎動物ステロールΔ２４−レダクターゼ、より好ましくは脊椎動物由来のレダクターゼ、更により好ましくはヒト、ブタ、イヌ、マウス、ラット、ウマ、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）又は既知のいずれかの源由来のレダクターゼなど、ＥＣ１．３．１．７２から更に特に選択される、Ｃ２４−レダクターゼ活性を有する異種酵素の発現によって修飾され得る。最も好ましくは、ステロールΔ２４−レダクターゼは、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）、ラット又はヒトから選択される。前記ステロールΔ２４−レダクターゼ酵素を発現する配列は、公的に入手可能であり、限定されないが、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ参照番号Ｑ１５３９２、Ｑ６０ＨＣ５、Ｑ８ＶＣＨ６、Ｑ５ＢＱＥ６、Ｑ３９０８５又はＰ９３４７２（例えば、国際公開第２００３０６４６５０号パンフレット）が挙げられる。
【００３２】
他の実施形態において、本発明による宿主細胞は、例えば、Ｃ８−ステロールイソメラーゼ（ＥＲＧ２）など、７−ＤＨＣの生合成に関与する内因性酵素のホモログの導入によって更に修飾され得、その結果、７−ＤＨＣの特異性及び／又は生産性が増加すると共に、限定されないが、チモステロール、ラノステロール及び／若しくはラトステロールなどの副産物又はビタミンＤ３中間体の蓄積が低減される。好ましくは、本明細書で定義される修飾宿主細胞は、異種ＥＲＧ２を含み、ＥＲＧ２は、好ましくは、トウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ３２３６０に由来するポリペプチドなど）から選択される。
【００３３】
更なる実施形態において、本発明による宿主細胞は、ステロールアシルトランスフェラーゼ活性、特にステロールアシルトランスフェラーゼアイソフォームＡｒｅ１ｐ及び／又はＡｒｅ２ｐの活性において更に修飾され得、配列番号１２によるポリペプチドにおける５９２及び／又は５９５から選択される残基に対応する位置での１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。
【００３４】
したがって、本発明は、特定の実施形態において、ステロール、特に７−ＤＨＣを生成するプロセスにおいて使用される修飾酵母株であって、ＥＲＧ５及びＥＲＧ６は、不活化されており、任意選択的に、本明細書で定義されるＣ２４−レダクターゼ活性を有する異種酵素を発現し、本明細書に記載のＥＲＧ３ホモログを発現する、修飾酵母株に関する。かかる酵母株を使用すると、ステロールミックス中に存在する７−ＤＨＣのパーセンテージがステロールの総量に基づいて約８４％以上、好ましくは例えば８５、９０、９２、９５、９７又は１００％の範囲である。
【００３５】
特定の実施形態において、本発明は、７−ＤＨＣの生成に関して酵母細胞を改善するプロセスであって、その細胞は、例えば、本明細書で定義されるデサチュラーゼ酵素の１、２又はそれを超えるコピーを導入することにより、本明細書で定義される修飾宿主細胞、すなわち本明細書で定義されるＥＲＧ３ホモログを発現する細胞、特にコレステロール産生酵母細胞、好ましくはＥＲＧ５及びＥＲＧ６が不活化されており、且つ任意選択的に、本明細書で定義されるＣ−２４−レダクターゼ活性を有する異種酵素が発現され、且つ／又はＡＲＥ１及び／若しくはＡＲＥ２が本明細書に記載のように修飾され、且つ／又は任意選択的に、ＥＲＧ２のホモログが発現される、酵母細胞であり、宿主細胞は、前記宿主細胞によって産生されるステロールの総量中の７−ＤＨＣのパーセンテージが、本明細書で定義される非修飾酵母株、すなわち野生型（内因性）ＥＲＧ３活性のみを発現する酵母株と比較して少なくとも約８４％だけ増加され、特にコレスタ−８−エノールを含む副産物に対する７−ＤＨＣの比が少なくとも２％だけ増加されるように改善される、プロセスに関する。
【００３６】
特定の実施形態において、本発明は、７−ＤＨＣの生成に関して酵母細胞を改善するプロセスであって、その細胞は、特に、ＥＲＧ５及びＥＲＧ６が不活化されている酵母細胞などのコレステロール産生酵母細胞であり、且つ任意選択的に、本明細書で定義されるＣ−２４−レダクターゼ活性を有する異種酵素が発現され、前記酵母細胞は、例えば、本明細書で定義されるデサチュラーゼ酵素の１つ、２つ又はそれを超えるコピーを導入することにより、本明細書で定義されるＥＲＧ３ホモログを発現し、酵母細胞は、前記酵母によって産生されるステロールの総量中の７−ＤＨＣのパーセンテージが、ステロールの総量に基づいて且つ野生型（内因性）ＥＲＧ３活性を発現する非修飾酵母株と比較して約８１％以下から、少なくとも約８４％、例えば８５、９０、９２、９５、９７又は１００％まで増加され、且つコレスタ−７−エノール、ラトステロール、及び／又はコレスタ−８−エノール、及び／又はチモステロールを含むステロールミックス中の副産物のパーセンテージがステロールの総量に基づいて約１６％以下に低減され、すなわちコレスタ−７−エノール、ラトステロール、及び／又はコレスタ−８−エノール、及び／又はチモステロールが少なくとも約１６％の範囲で低減されるように改善される、プロセスに関する。
【００３７】
一実施形態において、本発明は、コレステロール産生酵母細胞における、７−ＤＨＣと、コレスタ−７−エノール（ラトステロール）及び／又はラノステロールのミックスとのステロールミックスを生成するプロセスであって、７−ＤＨＣのパーセンテージは、ラノ−／ラトステロールのパーセンテージと比較して、ステロールの総量に基づいて少なくとも約２％、例えば３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０％だけ増加され、前記コレステロール産生酵母細胞は、本明細書で定義される（異種）デサチュラーゼ、すなわち配列番号２と少なくとも４５％、例えば少なくとも５０、５２、６０、７０、８０、９０、９２、９５、９８又は１００％までなどの同一性を有するポリペプチドを発現し、より好ましくは本明細書で定義されるそれぞれのコドン最適化ポリヌクレオチドによって発現され、例えば好ましくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、又はサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、特にピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から入手可能である、プロセスに関する。
【００３８】
一実施形態において、本発明は、コレステロール産生酵母細胞における、７−ＤＨＣ及びコレスタ−８−エノールを含むステロールミックスを生成するプロセスであって、ステロールの総量に基づいて、コレスタ−８−エノールに対する７−ＤＨＣの比は、例えば、３、４、５又は少なくとも約１０％など、少なくとも約２％だけ増加され、前記コレステロール産生酵母細胞は、本明細書で定義される（異種）デサチュラーゼ、すなわち配列番号２と少なくとも約４５％、例えば少なくとも５０、５２、６０、７０、８０、９０、９２、９５、９８又は１００％までなどの同一性を有するポリペプチドを発現し、より好ましくは本明細書で定義されるそれぞれのコドン最適化ポリヌクレオチドによって発現され、例えば好ましくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から入手可能である、プロセスに関する。
【００３９】
一実施形態において、本発明は、コレステロール産生酵母細胞における、７−ＤＨＣ及びチモステロールを含むステロールミックスを生成するプロセスであって、７−ＤＨＣのパーセンテージは、チモステロールのパーセンテージと比較して、ステロールの総量に基づいて例えば３、４、５又は少なくとも約１０％など、少なくとも約２％だけ増加され、前記コレステロール産生酵母細胞は、本明細書で定義される（異種）デサチュラーゼ、すなわち配列番号２と少なくとも４５％、例えば少なくとも５０、５２、６０、７０、８０、９０、９２、９５、９８又は１００％までなどの同一性を有するポリペプチドを発現し、より好ましくは本明細書で定義されるそれぞれのコドン最適化ポリヌクレオチドによって発現され、例えば好ましくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から入手可能である、プロセスに関する。
【００４０】
特定の実施形態において、本発明は、コレステロール産生酵母細胞における、７−ＤＨＣ、チモステロール、コレスタ−８−エノール、ラノステロール及び／又はラトステロールを含むステロールミックスを生成するプロセスであって、７−ＤＨＣのパーセンテージは、ステロールミックス中の前記副産物のパーセンテージと比較して、例えば４、５、７、１０、１５％又はそれを超えるなど、少なくとも約２％だけ増加され、前記コレステロール産生酵母細胞は、本明細書で定義される（異種）デサチュラーゼ、すなわち配列番号２と少なくとも約４５％、例えば少なくとも５０、５２、６０、７０、８０、９０、９２、９５、９８又は１００％までなどの同一性を有するポリペプチドを発現し、より好ましくは本明細書で定義されるそれぞれのコドン最適化ポリヌクレオチドによって発現され、例えば好ましくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から入手可能である、プロセスに関する。
【００４１】
本明細書で使用される、ステロールミックス内の７−ＤＨＣのパーセンテージ増加は、例えば、ＥＲＧ３によって発現される、内因性Ｃ−５ステロールデサチュラーゼのみを発現する宿主細胞と比較した、本明細書で定義されるデサチュラーゼ活性を有する異種ポリペプチドを発現する宿主細胞によって産生された７−ＤＨＣの量として定義される。ステロール生成プロセスにおいて、前記宿主細胞、例えば酵母、特にコレステロール産生酵母細胞を使用した場合、前記宿主細胞によって産生されるステロールの総量に基づいて少なくとも約８４％に７−ＤＨＣのパーセンテージを増加させることができる。本明細書で使用される「ＥＲＧ３ホモログの発現」は、ＥＲＧ３ポリペプチドのエクストラコピーの発現、すなわち内因性ＥＲＧ３のエクストラコピーなど、ＥＲＧ３の２つ以上のコピーの発現を含む。
【００４２】
特定の実施形態において、本発明は、ステロールミックスを生成するプロセスであって、上述の酵母細胞が使用され、且つ前記ステロールミックス中に存在するコレスタ−８−エノール、及び／又はチモステロール、及び／又はラノステロール、及び／又はラトステロールのパーセンテージが低減される、すなわちステロールの総量に基づいて約１６％以下の範囲であり、すなわちステロールミックス中の７−ＤＨＣの比が高くなる、プロセスに関する。
【００４３】
本明細書で定義されるＥＲＧ３ホモログ並びにビタミンＤ３前駆物質及び／又は中間体の生合成に必要な更なる遺伝子を発現することができる修飾宿主細胞は、ビタミンＤ３前駆物質７−ＤＨＣを生成するプロセスで使用される。それぞれのコレステロール産生宿主細胞に関して、好気性又は無気的条件下において且つ当業者に公知のように、適切な栄養で補われた水性媒体中で修飾宿主細胞が培養され得る。任意選択的に、かかる培養は、当技術分野で公知のように、タンパク質及び／又は電子の移行に関与する補因子の存在下にある。宿主細胞の培養／増殖は、バッチ、フェドバッチ、半連続又は連続式で行われ得る。宿主細胞に応じて、好ましくは、ビタミンＤ３及び７−ＤＨＣなどのその前駆物質の生成は、当業者に公知であるように様々であり得る。ビタミンＤ３の生成における７−ＤＨＣ及び他の中間体の培養及び単離は、例えば、国際公開第２０１１０６７１４４号パンフレット又は国際公開第２０１７１０８７９９号パンフレットに記載されている。
【００４４】
本明細書に記載の宿主細胞を用いて、Ｃ−５ステロールデサチュラーゼ活性の生産性／特異性を７−ＤＨＣに対してシフトすることができ、それにより、前記宿主細胞によって産生された総ステロール中の７−ＤＨＣの比が少なくとも約８４％となり、適切な培養条件下において約１１０時間発酵させた後に産生される７−ＤＨＣの力価が約１０ｇ／ｌまでとなる。
【００４５】
「ＥＲＧ５」及び「Ｅｒｇ５ｐ」、「ＥＲＧ６」及び「Ｅｒｇ６ｐ」という用語は、本明細書において区別なく使用され、それぞれの遺伝子ｅｒｇ３、ｅｒｇ５及びｅｒｇ６によってコードされるポリペプチドを意味する。
【００４６】
ＥＲＧ５、ＥＲＧ６、ＥＲＧ３、ＡＲＥ１、ＡＲＥ２又はステロールΔ２４−レダクターゼ（ＥＲＧ４）をコードする遺伝子、本明細書において使用される酵母細胞の培養及び遺伝子操作は、公知であり、例えば米国特許第７６０８４２１号明細書に記載されている。
【００４７】
本明細書で使用される「Ｃ−２４−レダクターゼ」又は「Δ２４−レダクターゼ」は、本明細書において区別なく使用される。酵母において、この酵素は、ｅｒｇ４によってコードされ、位置２４の炭素原子のメチル基に対して活性である。したがって、前記位置でかかるメチル基を示さないトリエノールは、酵母ＥＲＧ４に対して許容可能な基質ではない。
【００４８】
「Ｃ−８ステロールイソメラーゼ」、「Ｃ−８ステロールイソメラーゼ活性を有する酵素」は、本明細書において区別なく使用され、コレスタ−７−エノールへのコレスタ−８−エノールの変換及び／又はコレスタ−７，２４−ジエノールへのチモステロールの変換を触媒することができる酵素を意味する。酵母において、この酵素は、ｅｒｇ２によってコードされる。本発明による修飾宿主細胞において使用される好ましいＥＲＧ２ホモログは、Ｃ−８ステロールイソメラーゼ活性を示す、配列番号１４と少なくとも約４１％、例えば少なくとも４４、４５、４８、４９、５３、５６、６０、７０、８０、９０、９２、９５、９８％又は１００％までなどの同一性を有するポリペプチドであり、Ｃ−８ステロールイソメラーゼ活性を示す配列番号１４よるポリヌクレオチド、例えばトウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）から入手可能なかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどを含む。特に、前記ＥＲＧ２ホモログの少なくとも１、２、３、５つなど、１つ又は複数のコピーは、本明細書で定義される修飾宿主細胞において発現される。
【００４９】
本明細書で使用される、酵素に関する「特異的活性」又は「活性」とは、その触媒活性、すなわち所定の基質からの産物の形成を触媒するその能力を意味する。所定の時間内及び定義された温度において、タンパク質の定義された量当たりで消費される基質及び／又は生成される産物の量が特異的活性によって定義される。通常、特異的活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１分当たりで消費される基質又は生成される産物μｍｏｌで表される。通常、μｍｏｌ／分は、Ｕ（＝単位）によって省略される。したがって、μｍｏｌ／分／（タンパク質ｍｇ）又はＵ／（タンパク質ｍｇ）の特異的活性の単位定義は、本明細書全体を通して区別なく使用される。酵素がその触媒活性を生体内、すなわち本明細書で定義される宿主細胞内又は適切な基質の存在下において適切な（無細胞）システム内で発揮する場合、酵素は、活性である。当業者であれば、例えばＨＰＬＣなどによるなど、どのように酵素活性を測定するのかを知っている。
【００５０】
本発明に関して、例えば、微生物、菌類、藻類又は植物などの生物は、原核生物の命名法の国際コード又は菌類、藻類若しくは植物の命名法の国際コード（メルボルンコード）によって定義される、同じ生理学的特性を有するかかる種の異名又はバソニムも包含する。
【００５１】
特に、本発明は、本発明の以下の実施形態を特徴とする：
１．７−ＤＨＣの生成のための適切な宿主細胞において（異種）発現される、配列番号２と少なくとも約４５％、例えば少なくとも５０、５２、６０、７０、８０、９０、９２、９５、９８又は１００％までなどの同一性を有するＣ５−ステロールデサチュラーゼを有する酵素を含むコレステロール産生酵母細胞であって、ラノステロール及び／又はラトステローを含む副産物に対する７−ＤＨＣの比は、非修飾宿主細胞と比較して少なくとも約５％だけ増加される、コレステロール産生酵母細胞。
２．Ｃ５−ステロールデサチュラーゼ活性を有する酵素を含み、ステロールの総量に基づいて少なくとも約８４％の７−デヒドロコレステロール（７−ＤＨＣ）を含み、好ましくは少なくとも約８５、８８、９０、９２、９５、９７、９８又は１００％までの７−ＤＨＣを含むステロールミックスを産生する、上記の酵母細胞。
３．コレスタ−７−エノール及び／又はラノステロールに対する７−ＤＨＣの比は、約１８の範囲である、上記のコレステロール産生酵母細胞。
４．コレスタ−７−エノール及び／又はラノステロールに対する７−ＤＨＣの比は、少なくとも約５％だけ増加される、上記のコレステロール産生酵母細胞。
５．配列番号２と少なくとも約４５％、例えば少なくとも５０、５２、６０、７０、８０、９０、９２、９５、９８又は１００％までなどの同一性を有するＣ５−ステロールデサチュラーゼ活性を有する異種酵素を発現する、上記のコレステロール産生酵母細胞。
６．Ｃ５−ステロールデサチュラーゼ活性を有する異種酵素を発現し、前記酵素は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）などのクルイベロミセス属（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などのシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）などのカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、Ｐ．ロックフォルティ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）などのペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）などのアスペルギルス属、Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）などのクリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、マグネポルテ（Ｍａｇｎｅｐｏｒｔｅ）、メタリジウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）及びトウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）などの黒穂菌属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）からなる群から選択される、上記のコレステロール産生酵母細胞。
７．ＥＲＧ５及びＥＲＧ６は、不活化されている、上記のコレステロール産生酵母細胞。
８．ステロールΔ２４−レダクターゼ活性を有するＥＣ１．３．１．７２から選択される異種酵素を発現し、好ましくは、異種酵素は、植物又は脊椎動物に由来し、より好ましくはヒト、ブタ、イヌ、マウス、ラット、ウマ又はゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）に由来する、上記のコレステロール産生酵母細胞。
９．Ｃ８−イソメラーゼ活性を有する異種酵素を発現し、好ましくは、異種酵素は、トウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、より好ましくは配列番号１４によるポリペプチドと少なくとも約４２％、例えば少なくとも４３、４４、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、７５、８０、９０、９２、９５、９８又は１００％までなどの同一性を有するポリペプチドから入手可能である、上記のコレステロール産生酵母細胞。
１０．ステロールを生成するための、好ましくはビタミンＤ３前駆物質を生成するための、より好ましくは７−ＤＨＣを生成するための、上記のコレステロール産生酵母細胞の使用。
１１．７−ＤＨＣは、ビタミンＤ３に更に変換される、上記のコレステロール産生酵母細胞の使用。
１２．７−ＤＨＣは、２５−ヒドロキシビタミンＤ３に更に変換される、上記の使用。
１３．酵母細胞によって産生されるステロールミックス中のコレスタ−７−エノール及び／又はラノステロールの量を低減するプロセスであって、Ｃ５−ステロールデサチュラーゼ活性を有する異種酵素を発現する工程を含み、前記異酵素は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）などのクルイベロミセス属（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などのシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）などのカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、Ｐ．ロックフォルティ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）などのペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）などのクリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、マグネポルテ（Ｍａｇｎｅｐｏｒｔｅ）、メタリジウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）及びトウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）などの黒穂菌属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）からなる群から選択され、好ましくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）又はサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、プロセス。
１４．酵母細胞において、ステロールミックス、好ましくはビタミンＤ３前駆物質、より好ましくは少なくとも約８４％の７−ＤＨＣを有するステロールミックスを生成するプロセスであって、
（ａ）ＥＲＧ５及びＥＲＧ６を不活化する工程、
（ｂ）コレスタ−７，２４−ジエノール、チモステロール又はトリエノールに対するステロールΔ２４−レダクターゼ活性を有するＥＣ１．３．１．７２から選択される異種酵素、好ましくは植物又は脊椎動物ステロールΔ２４−レダクターゼ、より好ましくは脊椎動物ステロールＤ２４−レダクターゼを発現する工程、
（ｃ）Ｃ５−ステロールデサチュラーゼ活性を有する異種酵素を発現する工程であって、前記酵素は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）などのクルイベロミセス属（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などのシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）などのカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、Ｐ．ロックフォルティ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）などのペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）などのクリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、マグネポルテ（Ｍａｇｎｅｐｏｒｔｅ）、メタリジウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）及びトウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）などの黒穂菌属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）からなる群から選択され、好ましくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）又はサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、工程、
（ｄ）ステロール産生に適切な条件下で前記酵母細胞を培養する工程であって、ステロールミックス中に存在するコレスタ−７−エノール及び／又はラノステロールに対する７−ＤＨＣの比は、１７．２を超える、工程
を含むプロセス。
【００５２】
以下の実施例は、単に例証となるものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００５３】
［実施例］
［実施例１：一般的方法、株及びプラスミド］
本明細書に記載のすべての基礎的分子生物学及びＤＮＡ操作手順は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）又はＡｕｓｕｂｅｌら（１９９８．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に準拠して実施した。使用されたＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株及びプラスミドの遺伝子型を表１及び２に示す。実施例４に記載のように、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）７−ＤＨＣ産生酵母株Ｙ２１５９を作製した。示されるすべての株は、ＭＡＴαである。
【００５４】
【表１】
2021523691.tif 000002
【００５５】
【表２】
2021523691.tif 000003
【００５６】
［実施例２：Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙ２１５９への様々なＥＲＧ３ホモログのクローニング］
すべてのＥＲＧ３カセットを以下のように作製した。オープンリーディングフレームを推定アミノ酸配列に基づいてコドン最適化し、５’−ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣａｔｇ．．．）部位及び３’−ＥｃｏＲＩ部位を用いて合成した。ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ−消化ＥＲＧ３断片をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ−消化ｐＭＢ７６２１に挿入することにより、これらをクローン化し、それによりＲＫＲ１及びＧＡＤ１遺伝子間の染色体ＸＩＩＩの右腕上に遺伝子間相遺伝子座ＩＮＴ６６に標的化することが可能となる（およその位置７６９，０００）。
【００５７】
Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＲＧ３（配列番号７；プラスミドｐＭＢ７６７７）に加えて、合成される遺伝子は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（配列番号９；プラスミドｐＭＢ７７３２）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）（配列番号１０；プラスミドｐＭＢ７７２１）及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（配列番号１１；プラスミドｐＭＢ７６８１）からのＥＲＧ３ホモログ（コドン最適化された）を含み、配列表を参照されたい。
【００５８】
７−ＤＨＣの産生における異なるＥＲＧ３遺伝子の影響を試験するために、選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性（ＨｙｇＲ）及び制御因子として強い構成的ＴＤＨ３−プロモーターを用いて、ＩＮＴ６６遺伝子座において、上述の４つの種の１つを意味する４つの異なるＳｆｉＩ産生断片でＹ２１５９株を形質転換した。
【００５９】
３０℃において、３日後、ハイグロマイシン２００ｍｇ／Ｌを含むＹＰＤ寒天上で形質転換体を選択した。これらの形質転換から生じる株を上記の表１に示す。続いて、以下に記載のその７−ＤＨＣ生産性及び総７−ＤＨＣステロール純度に関して、これらの株をアッセイした。
【００６０】
［実施例３：形質転換株からのステロールのＨＰＬＣ分析］
株を以下のように培養した。試験される株を最初にＹＰＤ寒天上にプレーティングし、３０℃において４８時間インキュベートした。ＹＰＤ前培養物２ｍＬをこれらのプレートから接種し、３０℃において２４時間ローラーホイール上で増殖させた。２４穴マイクロタイタープレートにおいて、前培養物からＹＰＤ０．８ｍＬ＋エタノール１０ｇ／Ｌを最終ＯＤ６０００．５に接種した。マイクロタイタープレートを加湿環境内で３０℃において増殖し、軌道３ｍｍの振盪機で８００ｒｐｍにおいて振盪した。接種から２４及び４８時間後、エタノール１６μｌをそれぞれのウェルにフィードとして添加した。接種から７２時間後、ステロール含有量に関して細胞をサンプリングした。
【００６１】
培養物からステロールを抽出し、以下のようにアッセイした。ガラスビーズを有する２ｍＬ  Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓチューブに全ブロス８０マイクロリットルをピペットで移した。けん化溶液（エタノール中の５％ＫＯＨ）８００マイクロリットルを添加し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ  ２４ホモジナイザーに試料を入れ、１５秒／サイクルにおいて６５００ｒｐｍで３サイクル攪拌した。次いで、氷酢酸６０マイクロリットルを添加し、最高速度でチューブを１分間遠心した。ステロール含有量に関して、ＨＰＬＣによって上澄をアッセイした。その結果を表３、４及び５に示す。
【００６２】
【表３】
2021523691.tif 000004
【００６３】
【表４】
2021523691.tif 000005
【００６４】
【表５】
2021523691.tif 000006
【００６５】
［実施例４：Ｙ２１５９の作製］
ＸｂａＩ部位を５’末端に（ＴＣＴＡＧＡＡＣＡＡＡａｔｇ．．．）、ＰｓｔＩ部位を３’末端に組み込んで、野生型Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＥ１をＤＮＡ２．０によって合成した。固有のＸｂａＩ及びＰｓｔＩ部位を用いて、ｅｒｇ４Δ：：ＨｙｇＲ欠失プラスミドにこれをクローニングした。続いて、ＬＥＵ２を使用して、ＫｐｎＩ−ＡｇｅＩクローニングによってＨｙｇＲ部位を置換した。その結果がプラスミドｐＨｙＤ４５９であった。
【００６６】
ＡＲＥ１から産生されたＢｓｒＧＩ−ＢｓａＩ−切断ＰＣＲ産物（配列番号１６＆１７によるオリゴ）を、配列番号１９及び２０をＢｓｒＧＩ−ＰｓｔＩ−切断ｐＨｙＤ４５９にアニーリングすることによって誘導された二本鎖オリゴとライゲートすることにより、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＥ１変異バリアントｐＭＢ７５８４（Ｆ５９２Ｌ）を産生した。同様に、ＡＲＥ１から産生されたＢｓｒＧＩ−ＢｓａＩ−切断ＰＣＲ産物（配列番号１６＆１８によるオリゴ）を、配列番号２１及び２２をＢｓｒＧＩ−ＰｓｔＩ−切断ｐＨｙＤ４５９にアニーリングすることによって誘導された二本鎖オリゴとライゲートすることにより、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＥ１変異バリアントｐＭＢ７５８５（Ｇ５９５Ｄ）を産生した。本明細書で使用されるオリゴ並びに更なる配列は、表５に示す。
【００６７】
【表６】
2021523691.tif 000007
【配列表】
2021523691000001.app
【国際調査報告】
2021523691.tif 000008
2021523691.tif 000009
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