(57)【要約】  複数のタイプの担体を含む組成物が提供され、各担体は、単一細胞致死量の治療薬と、その担体を識別する一意のバーコードとを含み、組成物は、等しい数の各担体タイプと、等しい濃度の薬剤と、等しい濃度の各バーコードとを含む。組成物を使用して治療薬に対する対象の応答を予測する方法、ならびに組成物を製造する方法も提供される。【選択図】図２Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のタイプの担体を含む組成物であって、各タイプの担体が独立して、少なくとも単一細胞致死量の少なくとも１つの治療薬と、前記少なくとも１つの治療薬を一意的に識別する少なくとも１つのバーコードとを含み、前記組成物が、実質的に等しい数の各タイプの担体を含む、組成物。
【請求項２】
各タイプの担体は、実質的に等しいバーコード濃度を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
各タイプの担体が、有効治療用量（ＥＴＤ）の前記少なくとも１つの治療薬に対して実質的に等しい濃度の前記少なくとも１つの治療薬を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
各タイプの担体が、異なる少なくとも１つの治療薬を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記担体が、リポソームであり、各タイプのリポソームが、実質的に等しいサイズおよび実質的に等しい脂質濃度を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記実質的に等しい脂質濃度が、最大で１％の変動を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記脂質濃度が、３０〜５５ｍＭである、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つの治療薬の前記濃度が、前記少なくとも１つの治療薬の前記ＥＴＤの２％以下である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つの治療薬の前記ＥＴＤに対する前記少なくとも１つの治療薬の前記実質的に等しい濃度が、前記ＥＴＤの１％以下の変動を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも３つのタイプの担体を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つの治療薬に対する、疾患に罹患している対象の応答の予測に使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記使用が、前記対象の組織の生検を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記使用が、前記対象由来の液体生検を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
少なくとも１つの治療薬に対する、疾患に罹患している対象の応答を予測するための方法であって、前記方法が、
（ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与するステップと、
（ｂ）前記対象から試料を採取するステップと、
（ｃ）前記試料中で、前記一意のバーコードの存在によって、前記少なくとも１つの治療薬の有効性を識別するステップと、
を含み、それによって、治療薬に対する、疾患に罹患している対象の応答を予測する、方法。
【請求項１５】
前記試料が、前記対象由来の細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料が、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含有する生体液試料である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患が、癌である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与が、静脈内注射であり、前記組成物が、前記対象の単一疾患細胞当たり１〜２００の各タイプの担体を含む、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与が、腫瘍内注射であり、前記組成物が、前記対象の単一疾患細胞当たり１〜２０の各タイプの担体を含む、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記採取が、前記組成物の投与後４８〜１９２時間の時間枠内に実施される、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記バーコードが、核酸分子であり、前記識別が、前記核酸分子を配列決定することを含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記バーコードが、核酸分子であり、前記識別が、前記核酸分子を増幅させることを含む、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法であって、前記方法が、
（ａ）複数の溶液を生成することであって、各溶液が、あるタイプの担体を含み、各タイプの担体が独立して、少なくとも単一細胞致死量の少なくとも１つの治療薬と、前記少なくとも１つの治療薬を一意的に識別する少なくとも１つのバーコードとを含む、生成することと、
（ｂ）前記各溶液中の前記タイプの担体の分子の濃度を測定することと、
（ｃ）各タイプの担体の実質的に等しい数の分子を一緒に混合することと、
を含み、それによって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物を生成する、方法。
【請求項２４】
前記各溶液中の前記治療薬の前記濃度を測定することをさらに含み、前記一緒の混合が、有効治療用量（ＥＴＤ）の前記少なくとも１つの治療薬に対して実質的に等しい濃度の前記少なくとも１つの治療薬を一緒に混合することを含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月５日に出願された米国仮特許出願第６２／６９４，１０３号の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、治療薬の個別化された治療効力および活性を予測するのに有用なアッセイを対象とする。
【背景技術】
【０００３】
患者は投薬に対して異なる応答を示す。治療の成功は、各患者に適した薬物を選択することに大きく依存する。「個別化された薬剤」は、各患者の特有の症状に対処することを目的としている。個別化された薬剤を必要とする疾患および障害としては、悪性疾患、炎症性疾患、および神経変性疾患が挙げられる。
【０００４】
癌は、非限定的な例として、クリニックにおける薬剤に対する実際の応答率が低い。例えば、乳癌、食道癌、結腸癌、または胃癌の患者の６０％未満が療法に応答し、統計は、肺癌、黒色腫、膵臓癌、肝臓癌、または再発性卵巣癌の患者では３０％未満まで減少する。したがって、各患者の特有の症状に対処する適切な治療薬を選択することは、治療成果を著しく改善することができる。
【０００５】
遺伝情報および患者特異的バイオマーカーは、個別化された薬剤の促進に役立っている。しかしながら、患者のほぼ５０％はまだ、有効ではない治療に不適合であり、その後「非応答者」に分類される。
【０００６】
現在の個別化された治療方法は全て、患者からの組織の抽出を必要とする。そのような抽出は、しばしば生検の形態であり、患者にとって侵襲的であり、介護者にとって高価であり、疾患の場所に応じて不可能である場合もある。さらに、細胞抽出は、疾患の細胞の一部のみをサンプリングする一方で、他の細胞を見逃すリスクを冒す。これは、腫瘍転移、腫瘍の異種性、または疾患のびまん性に起因し得る。患者における潜在的な治療薬の有効性の非常に正確なスクリーニングを可能にする組成物が、大いに必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、治療薬または治療薬の組み合わせに対する、疾患に罹患している対象の応答を予測および決定するのに有用な組成物を提供する。
【０００８】
本発明は、均等な数の担体、および特に非常に正確な診断およびセラノーシスを可能にする脂質を有する組成物を初めて提示する。本明細書に開示される組成物の使用は、医師に、単一の患者に合わせた薬物を選択する新しい方法を与える。組成物を使用および製造する方法も提供される。
【０００９】
第１の態様によると、複数のタイプの担体を含む組成物が提供され、各タイプの担体は独立して、単一細胞致死量の少なくとも１つの治療薬と、少なくとも１つの治療薬を一意的に識別する少なくとも１つのバーコードとを含み、組成物は、実質的に等しい数の各タイプの担体を含む。
【００１０】
別の態様によると、少なくとも１つの治療薬に対する、疾患に罹患している対象の応答を予測するための方法が提供され、方法は、
ｉ．対象に本発明の組成物を投与するステップと、
ｉｉ．対象から試料を採取するステップと、
ｉｉｉ．試料中で、一意のバーコードの存在によって、少なくとも１つの治療薬の有効性を識別するステップと、
を含み、それによって、治療薬に対する、疾患に罹患している対象の応答を予測する。
【００１１】
別の態様によると、本発明の組成物を製造する方法が提供され、方法は、
ｉ．複数の溶液を生成することであって、各溶液が、あるタイプの担体を含み、各タイプの担体が独立して、単一細胞致死量の少なくとも１つの治療薬と、少なくとも１つの治療薬を一意的に識別する少なくとも１つのバーコードとを含む、生成することと、
ｉｉ．各溶液中のタイプの担体の分子の濃度を測定することと、
ｉｉｉ．各タイプの担体の実質的に等しい数の分子を一緒に混合することと、
を含み、それによって、本発明の組成物を製造する。
【００１２】
いくつかの実施形態によると、各タイプの担体は、実質的に等しいバーコード濃度を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態によると、各タイプの担体は、有効治療用量（ＥＴＤ）の少なくとも１つの治療薬に対して実質的に等しい濃度の少なくとも１つの治療薬を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態によると、各タイプの担体は、異なる少なくとも１つの治療薬を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態によると、担体は、リポソームであり、各タイプのリポソームは、実質的に等しいサイズおよび実質的に等しい脂質濃度を含む。いくつかの実施形態によると、実質的に等しい脂質濃度は、最大で１％の変動を含む。いくつかの実施形態によると、脂質濃度は、３０〜５５ｍＭである。
【００１６】
いくつかの実施形態によると、少なくとも１つの治療薬の濃度は、少なくとも１つの治療薬のＥＴＤの２％以下である。
【００１７】
いくつかの実施形態によると、少なくとも１つの治療薬のＥＴＤに対する少なくとも１つの治療薬の実質的に等しい濃度は、ＥＴＤの１％以下の変動を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態によると、本発明の組成物は、少なくとも３つのタイプの担体を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態によると、本発明の組成物は、少なくとも１つの治療薬に対する、疾患に罹患している対象の応答の予測に使用するためのものである。いくつかの実施形態によると、使用は、対象の組織の生検を含む。いくつかの実施形態によると、使用は、対象からの液体生検を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態によると、試料は、対象からの細胞を含む。いくつかの実施形態によると、試料は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含有する生体液試料である。
【００２１】
いくつかの実施形態によると、疾患は、癌である。
【００２２】
いくつかの実施形態によると、投与は、静脈内注射であり、組成物は、対象の単一疾患細胞当たり１〜２００の各タイプの担体を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態によると、投与は、腫瘍内注射であり、組成物は対象の単一疾患細胞当たり１〜２０の各タイプの担体を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態によると、採取は、組成物の投与後４８〜１９２時間の時間枠内に実施される。
【００２５】
いくつかの実施形態によると、バーコードは、核酸分子であり、識別は、核酸分子を配列決定することを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態によると、バーコードは、核酸分子であり、識別は、核酸分子を増幅させることを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態によると、方法は、各溶液中の治療薬の濃度を測定することをさらに含み、一緒の混合は、有効治療用量（ＥＴＤ）の少なくとも１つの治療薬に対して実質的に等しい濃度の少なくとも１つの治療薬を一緒に混合することを含む。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態および適用可能性の全範囲は、以下に示される詳細な説明から明らかになる。しかしながら、本発明の精神および範囲内の種々の変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示としてのみ与えられることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】：等しい相対薬物濃度を有するリポソーム混合物からのバーコードの検出。薬物が（１Ａ）５％、（１Ｂ）１％、および（１Ｃ）０．１％の有効治療用量（ＭＴＤ）で提供される場合の、トリプルネガティブ乳癌腫瘍に対するゲムシタビン、シスプラチン、およびドキソルビシンの効力を示す棒グラフ。薬物の効力を、生細胞中のバーコードの量に対する死細胞中のバーコードの量の比率として定義した。（１Ｄ）２つのリポソーム混合物で処理した後の死細胞からの蛍光を示す棒グラフ。
【図１Ｂ】：等しい相対薬物濃度を有するリポソーム混合物からのバーコードの検出。薬物が（１Ａ）５％、（１Ｂ）１％、および（１Ｃ）０．１％の有効治療用量（ＭＴＤ）で提供される場合の、トリプルネガティブ乳癌腫瘍に対するゲムシタビン、シスプラチン、およびドキソルビシンの効力を示す棒グラフ。薬物の効力を、生細胞中のバーコードの量に対する死細胞中のバーコードの量の比率として定義した。（１Ｄ）２つのリポソーム混合物で処理した後の死細胞からの蛍光を示す棒グラフ。
【図１Ｃ】：等しい相対薬物濃度を有するリポソーム混合物からのバーコードの検出。薬物が（１Ａ）５％、（１Ｂ）１％、および（１Ｃ）０．１％の有効治療用量（ＭＴＤ）で提供される場合の、トリプルネガティブ乳癌腫瘍に対するゲムシタビン、シスプラチン、およびドキソルビシンの効力を示す棒グラフ。薬物の効力を、生細胞中のバーコードの量に対する死細胞中のバーコードの量の比率として定義した。（１Ｄ）２つのリポソーム混合物で処理した後の死細胞からの蛍光を示す棒グラフ。
【図１Ｄ】：等しい相対薬物濃度を有するリポソーム混合物からのバーコードの検出。薬物が（１Ａ）５％、（１Ｂ）１％、および（１Ｃ）０．１％の有効治療用量（ＭＴＤ）で提供される場合の、トリプルネガティブ乳癌腫瘍に対するゲムシタビン、シスプラチン、およびドキソルビシンの効力を示す棒グラフ。薬物の効力を、生細胞中のバーコードの量に対する死細胞中のバーコードの量の比率として定義した。（１Ｄ）２つのリポソーム混合物で処理した後の死細胞からの蛍光を示す棒グラフ。
【図２Ａ】：血漿中のバーコード検出レベル。注射後の異なる時点で（２Ａ）ドキソルビシン、（２Ｂ）ゲムシタビン、および（２Ｃ）シスプラチンを含有するリポソームに対応する、血漿中のバーコード２、３、４のコピー数を示すチャート。（２Ｄ）共通軸を用いた２Ａ〜Ｃのチャートの組み合わせ。
【図２Ｂ】：血漿中のバーコード検出レベル。注射後の異なる時点で（２Ａ）ドキソルビシン、（２Ｂ）ゲムシタビン、および（２Ｃ）シスプラチンを含有するリポソームに対応する、血漿中のバーコード２、３、４のコピー数を示すチャート。（２Ｄ）共通軸を用いた２Ａ〜Ｃのチャートの組み合わせ。
【図２Ｃ】：血漿中のバーコード検出レベル。注射後の異なる時点で（２Ａ）ドキソルビシン、（２Ｂ）ゲムシタビン、および（２Ｃ）シスプラチンを含有するリポソームに対応する、血漿中のバーコード２、３、４のコピー数を示すチャート。（２Ｄ）共通軸を用いた２Ａ〜Ｃのチャートの組み合わせ。
【図２Ｄ】：血漿中のバーコード検出レベル。注射後の異なる時点で（２Ａ）ドキソルビシン、（２Ｂ）ゲムシタビン、および（２Ｃ）シスプラチンを含有するリポソームに対応する、血漿中のバーコード２、３、４のコピー数を示すチャート。（２Ｄ）共通軸を用いた２Ａ〜Ｃのチャートの組み合わせ。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、異なるタイプの担体の担体数が実質的に等しい組成物を提供する。本発明はまた、セラノスティック分析に有用な組成物を提供し、担体数、有効治療用量（ＥＴＤ）と比較した薬物濃度、およびバーコード濃度は全て実質的に等しい。そのような組成物は、本明細書に記載される方法などであるがこれらに限定されない、治療薬の組み合わせの治療効力を予測および決定するための方法の実施において有利である。本発明の組成物を使用および製造する方法も提供される。
【００３１】
本明細書で以下に実証されるように、担体（例えば、ナノ粒子）は、治療サイクルを開始する前に、患者内の薬物または薬物の組み合わせの治療効力を検査するためのセラノスティック測定基準として機能する。
【００３２】
第１の態様によると、複数のタイプの担体を含む組成物が提供され、各タイプの担体は独立して、単一細胞致死量の少なくとも１つの治療薬と、少なくとも１つの治療薬を一意的に識別する少なくとも１つのバーコードとを含み、組成物は、実質的に等しい数の各タイプの担体を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、投与される組成物は、国際特許公開第ＷＯ２０１６／０２４２８１号に記載される組成物であり、組成物は、実質的に等しい数の各タイプの担体を含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ＷＯ２０１６／０２４２８１に記載されるセラノスティック／診断方法に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、本明細書に記載されるセラノスティック／診断方法に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも１つの治療薬に対する、疾患に罹患している対象の応答の予測に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、複数の治療薬に対する、疾患に罹患している対象の応答を予測に使用するためのものである。
【００３４】
いくつかの実施形態において、担体は、治療薬および対応するバーコード、および任意にタグを含む。いくつかの実施形態において、各担体は、極めて低い用量の薬物を含有する。いくつかの実施形態において、各担体は、１つの細胞のみを治療するのに十分であり、全身治療閾値をはるかに下回る、極めて低い用量の薬物を含有する。いくつかの実施形態において、各担体は、実質的に等しい濃度の少なくとも１つの治療薬を含む。いくつかの実施形態において、各担体は、有効治療用量（ＥＴＤ）の少なくとも１つの治療薬に対して実質的に等しい濃度の少なくとも１つの治療薬を含む。いくつかの実施形態において、各担体は、少なくとも１つの治療薬について、ＭＴＤの１０％、７％、５％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、各担体は、少なくとも１つの治療薬について、ＭＴＤの０．１〜１０％、０．１〜７％、０．１〜５％、０．１〜３％、０．１〜２％、０．１〜１％、０．５〜１０％、０．５〜７％、０．５〜５％、０．５〜３％、０．５〜２％、０．５〜１％、１〜１０％、１〜７％、１〜５％、１〜３％、または１〜２％を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、各担体は、治療薬のＥＴＤの少なくとも０．００１、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．５、１．６、１．８、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、または５％を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、組成物は、実質的に等しい数の各担体を含み、各担体は、治療薬のＥＴＤの少なくとも０．００１、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．５、１．６、１．８、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、または５％の濃度の治療薬を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「ＥＴＤ」は、所望の効果をもたらす薬物または薬物の組み合わせの医学的に承認された用量を指す。様々な薬物のそのような用量は、当業者に周知であり、ｗｗｗ．ｄｒｕｇｓ．ｃｏｍおよびｒｅｆｅｒｅｎｃｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍなどの多数のソースから入手可能である。いくつかの実施形態において、ＥＴＤは、最小有効治療用量（ＭＥＴＤ）である。ＭＥＴＤは、所望の効果をもたらす可能な限り低い用量である。当業者は、そのような有効用量が対象を全体として治療するためのものであることを理解するであろう。本発明の診断／セラノスティック目的で、状態全体の治療は必要ではなく、むしろ少数の細胞の治療のみが必要である。
【００３６】
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つの担体を含み、少なくとも１つの担体は、治療有効量の少なくとも１つの治療薬、少なくとも１つの治療薬を一意的に識別する核酸分子、および任意にタグ（すなわち、トレーサ）を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの治療薬および核酸分子は、少なくとも１つの担体内に封入される。担体がタグをさらに含むいくつかの実施形態において、少なくとも１つの治療薬、核酸分子、およびタグは、少なくとも１つの担体内に封入される。担体がタグをさらに含むいくつかの実施形態において、少なくとも１つの治療薬および核酸分子は、少なくとも１つの担体内に封入され、タグは、担体上に固定される。担体がタグをさらに含むいくつかの実施形態において、少なくとも１つの治療薬および核酸分子は、少なくとも１つの担体内に封入され、タグは、少なくとも１つの担体内に封入されるか、または少なくとも１つの担体上に固定される。いくつかの実施形態において、タグは、担体の膜上に固定される。
【００３８】
別の実施形態において、組成物は、複数の担体を含み、各担体は独立して、少なくとも１つの治療薬と、前述の少なくとも１つの治療薬を一意的に識別する核酸分子とを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、治療薬またはその組み合わせを独立して含む、１〜５つのタイプの担体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、治療薬またはその組み合わせを独立して含む、１〜１０個のタイプの担体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、治療薬またはその組み合わせを独立して含む、１〜１００個のタイプの担体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、治療薬またはその組み合わせを独立して含む、１〜２００個の担体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、治療薬またはその組み合わせを独立して含む１〜３００、１〜４００、１〜５００、１〜６００、１〜７００、１〜７５０、１〜８００、１〜９００、１〜１０００、１〜１２００、１〜１４００、１〜１５００、１〜１６００、１〜１７５０、１〜１８００、または１〜２０００個の担体を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、組成物は、治療薬またはその組み合わせを独立して含む、２〜５００個のタイプの担体を含む。したがって、本発明の方法は、単一細胞解像度で、複数の治療薬またはそれらの組み合わせの同時スクリーニングを提供する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、単一細胞解像度で、複数の腫瘍治療薬またはそれらの組み合わせの同時スクリーニングを提供する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「担体のタイプ」は、異なる治療薬、または治療薬の組み合わせを含む担体を指す。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも２つのタイプの担体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも３つのタイプの担体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、複数の担体を含む。いくつかの実施形態において、担体は、ナノ粒子である。本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」は、直径が１〜９９９ナノメートルであり、かつ人工層を有する粒子を指す。いくつかの実施形態において、担体は、人工分子である。いくつかの実施形態において、担体は、リポソームである。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、リポソームおよびミセルから選択される。
【００４０】
いくつかの実施形態において、担体のタイプは全て、異なる治療薬または治療薬の組み合わせを有する同じ担体である。いくつかの実施形態において、担体は、リポソームである。いくつかの実施形態において、各タイプの担体は、同じタイプのリポソームである。いくつかの実施形態において、各タイプのリポソームは、同じ脂質組成を含む。いくつかの実施形態において、各タイプのリポソームは、等しいまたは実質的に等しいサイズ、体積、または直径を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、各タイプのリポソームは、同じ脂質濃度を含む。いくつかの実施形態において、各タイプのリポソームは、実質的に等しい脂質濃度を含む。いくつかの実施形態において、各タイプの担体は、実質的に等しいバーコード濃度を含む。いくつかの実施形態において、各タイプの担体は、等しいバーコード濃度を含む。いくつかの実施形態において、各タイプの担体は、実質的に等しい濃度の少なくとも１つの治療薬を含む。いくつかの実施形態において、各タイプの担体は、少なくとも１つの治療薬のＭＥＤまたはＭＴＤに対して実質的に等しい濃度の少なくとも１つの治療薬を含む。いくつかの実施形態において、各タイプの担体は、実質的に等しい相対用量の少なくとも１つの治療薬を含む。いくつかの実施形態において、各タイプの担体は、少なくとも１つの治療薬のＭＥＤまたはＭＴＤに対して等しい濃度の少なくとも１つの治療薬を含む。いくつかの実施形態において、各タイプの担体は、等しい相対用量の少なくとも１つの治療薬を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態において、実質的に等しいは、等しい。いくつかの実施形態において、実質的に等しいは、パラメータを測定する能力内で等しい。いくつかの実施形態において、実質的に等しいは、担体を産生する能力と等しい。いくつかの実施形態において、実質的に等しいは、最大で１、２、３、５、７、１０、１５、２０、２５、または３０％の変動である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、実質的に等しいは、最大で１０％の変動である。いくつかの実施形態において、実質的に等しいは、最大で１％の変動である。いくつかの実施形態において、各タイプの担体の数は、等しいか、または可能な限りほぼ等しい。いくつかの実施形態において、担体の数は等しく、バーコードの濃度および相対治療薬の濃度は、担体の数を等しく保ちながら、可能な限り等しくされる。いくつかの実施形態において、各タイプにおける担体の数は等しく、バーコード濃度および／または治療薬の相対濃度は実質的に等しい。
【００４２】
以下に詳述されるように、各タイプの担体における担体の数は、１つのタイプの担体に（およびそれによって１つの治療薬）に偏らないように等しくなければならない。担体が、等しいサイズおよび同じ脂質含有量（同じ割合の各脂質成分）を有するリポソームである場合、総脂質濃度は、担体数に比例する。したがって、各タイプのリポソームの脂質濃度を測定することはまた、それらが同じ総数の担体を有するように、異なるタイプの担体の混合。等しい数の担体が混合される場合、各治療薬の相対用量（ＭＥＤに基づく）が最後にはほぼ等しくなるように、各タイプの担体に充填される薬物の量は修正され得る。いくつかの実施形態において、実質的に等しい脂質濃度は、最大で０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、または２０％の変動を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、実質的に等しい脂質濃度は、最大で１％の変動を含む。いくつかの実施形態において、リポソームの脂質濃度は、２０〜５５、２０〜５０、２０〜４５、２０〜４０、２５〜５５、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、３０〜５５、３０〜５０、３０〜４５、または３０〜４０ｍＭである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、リポソームの脂質濃度は、３０〜４５ｍＭである。いくつかの実施形態において、リポソームの脂質濃度は、３０〜５５ｍＭである。
【００４３】
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも２つのタイプの担体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも３つのタイプの担体を含む。
【００４４】
治療薬
いくつかの実施形態において、治療薬は、対象が罹患している疾患または状態を治療する。いくつかの実施形態において、治療薬は、特異的細胞を標的とする。いくつかの実施形態において、治療薬は、その標的細胞に対して細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、治療薬は、その標的細胞を死滅させる。いくつかの実施形態において、治療薬は、その標的細胞において細胞死を誘導する。いくつかの実施形態において、治療薬は、その標的細胞においてアポトーシスを誘導する。いくつかの実施形態において、治療薬は、その標的細胞において壊死を誘導する。いくつかの実施形態において、治療薬は、その標的細胞においてアポトーシスまたは壊死を誘導する。いくつかの実施形態において、治療薬は、癌を治療する。いくつかの実施形態において、治療薬は、癌細胞を死滅させる。いくつかの実施形態において、治療薬は、癌細胞を死滅させると考えられる。当業者は、本発明の組成物および方法が、個別化された治療についての試験に使用されるためのものであることを理解するであろう。したがって、治療薬は、患者を治療することが可能であり得る任意の薬物または薬物の組み合わせであり得る。理論的または仮説的な治療薬でさえ、本発明のアッセイまたは本発明の組成物の使用として使用され得、薬剤が有効であるかを当業者に伝えるであろう。
【００４５】
いくつかの実施形態において、治療有効量は、実質的に単一細胞治療有効量である。いくつかの実施形態において、単一細胞治療有効量は、単一細胞致死量である。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「単一細胞致死量」は、単一細胞を死滅させるのに必要な投与量および期間において有効な量を指す。治療薬の致死量は、障害または状態の性質、標的とされる細胞、および特定の薬剤に依存し、当業者に既知の標準的な臨床技術によって決定され得る。いくつかの実施形態において、「単一細胞致死量」は、単一細胞を死滅させるのに十分な最小有効量を指す。量は、細胞のタイプ、薬物のタイプ、および／または治療期間によって異なり得る。
【００４７】
いくつかの実施形態において、治療薬の単一細胞致死量は、治療薬の有効治療用量（ＥＴＤ）と比較してかなり低い用量である。いくつかの実施形態において、単一細胞致死量は、治療薬の有効治療用量（ＥＴＤ）の最大で１０％、７％、５％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％、または０．０００１％である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、単一細胞致死量は、ＭＥＤの１０％〜０．００１％、５％〜０．００１％、３％〜０．００１％、２％〜０．００１％、１％〜０．００１％、０．５％〜０．００１％、０．１％〜０．００１％、１０％〜０．０１％、５％〜０．０１％、３％〜０．０１％、２％〜０．０１％、１％〜０．０１％、０．５％〜０．０１％、０．１％〜０．０１％、１０％〜０．１％、５％〜０．１％、３％〜０．１％、２％〜０．１％、１％〜０．１％、０．５％〜０．１％、１０％〜０．５％、５％〜０．５％、３％〜０．５％、２％〜０．５％、１％〜０．５％、１０％〜１％、５％〜１％、３％〜１％、または２％〜１％である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、単一細胞致死量は、ＭＥＤの０．１％〜３％である。
【００４８】
いくつかの実施形態において、各タイプの担体における治療薬の濃度は、単一細胞致死量を上回り、各タイプの担体における治療薬の濃度は、実質的に等しくある必要はない。いくつかの実施形態において、各タイプの担体における治療薬の濃度は、単一細胞致死量を上回り、各タイプの担体における治療薬の濃度は、１、２、３、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％以下変化する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。以下に実証されるように、等しい数の担体は、濃度が単一細胞致死用量程度である限り、薬剤の等しい相対濃度よりも重要である。いくつかの実施形態において、各タイプの担体における治療薬の濃度は、１、２、３、５、７、１０、１５、または２０％以下変化する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、各タイプの担体における治療薬の濃度は、１０％以下変化する。いくつかの実施形態において、各タイプの担体における治療薬の濃度は、１、２、３、５、７、１０、１５、もしくは２０％以下、またはＭＥＤ変化する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、各タイプの担体における治療薬の濃度は、ＭＥＤの１％以下変化する。
【００４９】
治療薬が組成物の他の成分と反応し得る別の実施形態において、単一細胞当たりの薬剤の致死量を提供するために、過剰量の薬剤が使用される。非限定的な例では、シスプラチンは、バーコードＤＮＡと反応し得、したがって、致死量のシスプラチンを細胞に提供するために、過剰量が封入され得る。
【００５０】
いくつかの実施形態において、限られた量の治療薬が使用されてもよい。非限定的な例として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ毒素の単一コピーは、単一細胞を死滅させるのに十分である。
【００５１】
別の実施形態において、単一細胞致死量は、単一細胞を死滅させるのに実質的に十分である。別の実施形態において、治療有効量は、単一細胞を死滅させるのに十分な量の５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％以下である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「致死的」または「致死率」という用語は、細胞の内部から細胞の外部へのＤＮＡの放出を含む任意の種類の細胞死を指す。いくつかの実施形態において、致死量は、細胞においてアポトーシスまたは壊死を誘導する。いくつかの実施形態において、致死量は、細胞においてアポトーシスを誘導する。いくつかの実施形態において、致死量は、細胞において壊死を誘導する。
【００５３】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの治療薬は、細胞の膜を通過することができない。そのような実施形態において、致死量は、例えば、単一細胞を死滅させるための濃度と比較して、より高い濃度であってもよい。細胞膜を通過すことができない治療薬の例としては、ＲＮＡおよび親水性薬物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
いくつかの実施形態において、単一細胞致死量は、１０、７、５、３、２、１、０．５、０．０５、または０．０１ｍｇ／ｍＬより小さいリポソーム薬物濃度を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、単一細胞致死量は、２ｍｇ／ｍＬ未満のリポソーム薬物濃度を含む。いくつかの実施形態において、単一細胞致死量は、１０〜０．１、１０〜０．０５、１０〜０．０１、７〜０．１、７〜０．０５、７〜０．０１、５〜０．１、５〜０．０５、５〜０．０１、３〜０．１、３〜０．０５、３〜０．０１、２〜０．１、２〜０．０５、２〜０．０１、１〜０．１、１〜０．０５、または１〜０．０１のリポソーム薬物濃度を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５５】
バーコード
一実施形態において、バーコードは、１つ以上の核酸分子である。ＤＮＡ鎖などの核酸分子は、無制限の数のバーコード化オプションを提示する。本発明全体を通して使用される場合、「バーコード」および「ＤＮＡバーコード」は、互いに交換可能であり、同じ意味を有する。ＤＮＡバーコードとして機能する核酸分子は、デオキシ核酸もしくはリボ核酸または両方のポリマーであり、一本鎖または二本鎖であり得、任意に合成、非天然、または改変ヌクレオチド塩基を含有する。いくつかの実施形態において、核酸分子は、例えば、ビオチン、放射標識、または蛍光標識で標識される。バーコードは、当該技術分野において周知であり、任意のそのようなバーコードが、本発明の実行に使用され得る。
【００５６】
当業者によって理解されるように、一意のＤＮＡバーコードを治療薬担体に組み込むこと（封入）は、マイクロアレイ系、ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーション（「ブロット」を含む）、または高スループット配列決定を含むが、これらに限定されないアッセイを使用して、個々の治療薬の識別を可能にする。
【００５７】
いくつかの実施形態において、負に帯電したＤＮＡバーコードが細胞の負に帯電した脂質二重層を貫通することは、担体内のＤＮＡバーコードの封入によって可能になる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、核酸分子の配列は、環境中に天然に存在するか、または特に本発明の方法によって標的とされる細胞中に天然に存在する材料／物質／粒子と関連付けられた配列、パターン、シグネチャ、または任意の他の核酸配列を除外する。追加の実施形態において、核酸分子の配列は、天然に存在するヌクレオチド配列、特にエクソンと会合することができる６、８、１０、または１２塩基を超えるヌクレオチド配列を欠いている。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態において、核酸分子は、細胞のゲノム材料と実質的に同一ではないか、または相補的ではない配列を含む（核酸分子と細胞のゲノム材料、特に細胞のエクソンのハイブリダイゼーションを防止するため、および／または偽陽性増幅結果を防止するためなど）。いくつかの実施形態において、バーコードは、完全ゲノムではない。いくつかの実施形態において、バーコードは、染色体ではない。いくつかの実施形態において、バーコードは、天然に存在する配列に対して６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％以上の相補性を有しない。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、バーコードは、天然に存在する配列に対して６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、３、または１％未満の相補性を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５９】
いくつかの実施形態において、核酸配列は、分子ビーコンとしてさらに機能し得る。核酸配列は典型的には、ヘアピンなどの一本鎖分子であり得る。核酸分子は、細胞内の相補的遺伝子を検出するために、例えば、細胞内の遺伝子変異を検出するために使用され得る。
【００６０】
いくつかの実施形態において、核酸は、変異担持配列に相補的な配列を有する。いくつかの実施形態において、核酸分子は、所定の一意の配列を含むか、またはそれからなる。本明細書で使用される場合、「一意の配列」または「一意的に識別すること」という用語は、個別性を保持する単射機能（１対１機能とも称される）に基づく配列を指す。
【００６１】
いくつかの実施形態において、核酸分子は、所定の一意の配列を含むか、またはそれからなる。本明細書で使用される場合、「一意の配列」または「一意的に識別すること」という用語は、個別性を保持する単射機能（１対１機能とも称される）に基づく配列を指す。
【００６２】
一意のバーコード（例えば、一意の配列を有する核酸）は、本発明の方法を実施した後、担体内の対応する少なくとも１つの治療薬を識別するのに適している。核酸配列の存在の検出および識別のための方法は、当業者に既知であり、複数のバーコードの存在を増強することが可能な配列決定およびアレイ（例えば、マイクロアレイ）系（例えばＩｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．によって市販されている）を含む。
【００６３】
高められた精度が望ましい場合などのいくつかの実施形態において、核酸分子は、配列決定および／または増幅アッセイ（例えば、ＰＣＲ）に好適な長さを有する。別の実施形態において、核酸分子は、好ましくはナノスケールでの本発明の担体への充填に好適な長さを有する。核酸分子の長さは、本発明の組成物および方法で使用される担体のタイプおよびサイズに依存することを理解されたい（例えば、より短い配列がナノ粒子での使用に好適である一方で、より長い配列は微粒子で使用され得る）。
【００６４】
別の実施形態において、核酸分子は、最大で１０００、最大で９００、最大で８００、最大で７００、最大で６００、最大で５００、最大で４５０、最大で４００、最大で３５０、最大で３００、最大で２５０、最大で２００、最大で１９０、最大で１８０、最大で１７０、最大で１６０、最大で１５０、最大で１４０、最大で１３０、または最大で１２０塩基の長さを有し、各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態において、核酸分子は、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０塩基、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９または少なくとも３０塩基、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００または少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００塩基の長さを有し、各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６５】
核酸長の非限定的な例としては、５〜５０塩基、５〜４０塩基、５〜３０塩基、５〜２５塩基、５〜２４塩基、５〜２３塩基、５〜２２塩基、５〜２１塩基、５〜２０塩基、５〜１９塩基、５〜１８塩基、５〜１７塩基、５〜１６塩基または５〜１５塩基、１５〜５０塩基、１５〜６０塩基、１５〜７０塩基、１５〜８０塩基、１５〜９０塩基、１５〜１００塩基、１５〜２００塩基、１５〜２５０塩基または１５〜５００塩基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
別の実施形態において、各担体内の核酸分子は、担体当たりまたは標的細胞当たり１つ以上の鎖の濃度を有する。核酸分子の量を決定することは、十分に当業者の能力の範囲内である。別の実施形態において、１つ以上の核酸分子は、１〜１００００個の核酸分子である。別の実施形態において、１つ以上の核酸分子は、１〜１０００個の核酸分子である。別の実施形態において、１つ以上の核酸分子は、１〜５０００個の核酸分子である。別の実施形態において、１つ以上の核酸分子は、１〜５００個の核酸分子である。別の実施形態において、１つ以上の核酸分子は、５〜５００個の核酸分子である。当業者は、実施される特定のアッセイ、例えば、配列決定および／または増幅アッセイに適するように、各粒子中の核酸分子の量が事前に決定され得ることを理解するだろう。
【００６７】
いくつかの実施形態によると、各粒子は、一意のバーコードを含む。当業者は、一意のバーコードで各粒子（すなわち、担体）をバーコード化することが、単一細胞に入った粒子の数を示し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、本発明は、疾患を治療するための治療用量を決定する方法を提供し、方法は、複数のタイプの担体を含む組成物を対象に投与することを含み、各タイプの担体は、１つ以上の治療薬を含み、各タイプの担体は、１つ以上の治療薬の用量が異なる。
【００６８】
いくつかの実施形態によると、各タイプの粒子（すなわち、担体）は、担体のタイプを識別する一意のバーコード（例えば、核酸配列）を含む。いくつかの実施形態によると、各粒子（すなわち、担体）は、担体のタイプを識別する一意のバーコード（例えば、核酸配列）を含む。
【００６９】
別の実施形態において、バーコードは、希土類元素、フルオロフォア、発色団、化学発光分子、磁性粒子、染料、および放射性同位体からなる群から選択される。
【００７０】
別の実施形態において、バーコードは、希土類元素である。別の実施形態において、希土類元素は、ランタニドである。いくつかの実施形態において、ランタニドは、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｎｄ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、スカンジウム（Ｓｃ）、およびイットリウム（Ｙ）から選択される。いくつかの実施形態において、ランタニドは、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、およびＬｕから選択される。
【００７１】
希土類元素（例えば、ランタニド）は、発光標識と複合体化される場合に有用であり得、一般に、検出可能な光学応答をもたらすように選択される条件下で、ランタニド複合体を対象となる試料と組み合わせることによって利用される。試料は、光学応答を誘発するように選択された波長で照射され得る。
【００７２】
別の実施形態において、組成物内の担体は、細胞内のバーコードとして核酸分子を作動可能に使用するための追加の薬剤（例えば、化学的または生物学的薬剤）をさらに含む。薬剤の非限定的な例としては、それぞれ、ＤＮＡまたはＲＮＡバーコードの内因性または外因性酵素による分解を防止するための、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅ阻害剤が挙げられる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、組成物を形成する溶液中のバーコード濃度は、０．００１〜１００、０．００５〜１００、０．０１〜１００、０．０５〜１００、０．１〜１００、０．５〜１００、１〜１００、２〜１００、５〜１００、１０〜１００、１５〜１００、２０〜１００、２５〜１００、３０〜１００、０．００１〜９０、０．００５〜９０、０．０１〜９０、０．０５〜９０、０．１〜９０、０．５〜９０、１〜９０、２〜９０、５〜９０、１０〜９０、１５〜９０、２０〜９０、２５〜９０、３０〜９０、０．００１〜８０、０．００５〜８０、０．０１〜８０、０．０５〜８０、０．１〜８０、０．５〜８０、１〜８０、２〜８０、５〜８０、１０〜８０、１５〜８０、２０〜８０、２５〜８０、３０〜８０、０．００１〜７０、０．００５〜７０、０．０１〜７０、０．０５〜７０、０．１〜７０、０．５〜７０、１〜７０、２〜７０、５〜７０、１０〜７０、１５〜７０、２０〜７０、２５〜７０、または３０〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）の間で異なり得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、溶液中のバーコード濃度は、２〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）の間で異なり得る。いくつかの実施形態において、溶液中のバーコード濃度は、１０〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）の間で異なり得る。いくつかの実施形態において、溶液中のバーコード濃度は、２０〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）の間で異なり得る。いくつかの実施形態において、溶液中のバーコード濃度は、３０〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）の間で異なり得る。
【００７４】
いくつかの実施形態において、各タイプの担体は、実質的に等しいバーコード濃度を含む。いくつかの実施形態において、各タイプの担体は、等しいバーコード濃度を含む。いくつかの実施形態において、バーコードのタイプにおけるバーコード濃度は、０．１、０．５、１、２、３、５、７、１０、１５、２０、または２５％以下で変化する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７５】
一実施形態において、本明細書に記載される組成物は、データの統計的有意性を確実にするために、分析された細胞の量と比較して少数のナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、疾患の細胞当たりのバーコード化ナノ粒子の数は、好ましくは５未満である。本発明は、疾患細胞当たり最大５つのバーコードタイプの存在を達成するために注射されるべき粒子の数が、静脈内注射用量の６〜７％が腫瘍部位に蓄積し、実際に腫瘍部位に到達するナノ粒子の５％が細胞によって取り込まれる一方で、残りが細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に閉じ込められることを考慮に入れることによって計算され得るという研究結果に部分的に基づいている。
【００７６】
一実施形態において、１〜５タイプの担体（すなわち、バーコード化ナノ粒子）が疾患細胞当たりに存在する。別の実施形態において、疾患細胞当たり１〜５タイプの担体の存在は、体液を分析するときに十分なデータおよび高いシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）を提供する。本明細書で使用される場合、「流体」および「体液」は、交換可能である。
【００７７】
一実施形態において、腫瘍細胞当たり１〜２００個の粒子または各タイプの粒子が、静脈内注射によって投与される。別の実施形態において、腫瘍細胞当たり１〜３００個の粒子または各タイプの粒子が、静脈内注射によって投与される。別の実施形態において、腫瘍細胞当たり１〜４００個の粒子または各タイプの粒子が、静脈内注射によって投与される。別の実施形態において、腫瘍細胞当たり１〜５００個の粒子または各タイプの粒子が、静脈内注射によって投与される。別の実施形態において、腫瘍細胞当たり１〜１０００個の粒子または各タイプの粒子が、静脈内注射によって投与される。
【００７８】
別の実施形態において、腫瘍細胞当たり１〜２０個の粒子または各タイプの粒子が、腫瘍内投与される。別の実施形態において、腫瘍細胞当たり１〜１０個の粒子または各タイプの粒子が、腫瘍内投与される。別の実施形態において、腫瘍細胞当たり１〜５０個の粒子または各タイプの粒子が、腫瘍内投与される。別の実施形態において、腫瘍細胞当たり１〜１００個の粒子または各タイプの粒子が、腫瘍内投与される。
【００７９】
いくつかの実施形態において、粒子内のバーコード分子の量は、少なくとも１、または代替的に少なくとも５、または代替的に少なくとも１０、または代替的に少なくとも２０、または代替的に少なくとも３０、または代替的に少なくとも４０、または代替的に少なくとも５０、または代替的に少なくとも６０、または代替的に少なくとも７０、または代替的に少なくとも８０、または代替的に少なくとも９０、または代替的に少なくとも１００、または代替的に少なくとも５００、または代替的に少なくとも１０００、または代替的に少なくとも５０００、または代替的に少なくとも１００００個のバーコード分子／粒子である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、粒子内のバーコード分子の量は、最大で５、または代替的に最大で１０、または代替的に最大で２０、または代替的に最大で３０、または代替的に最大で４０、または代替的に最大で５０、または代替的に最大で６０、または代替的に最大で７０、または代替的に最大で８０、または代替的に最大で９０、または代替的に最大で１００、または代替的に最大で５００、または代替的に最大で１０００、または代替的に最大で５０００個のバーコード分子／粒子である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、粒子内のバーコード分子の量は、５〜１００個のバーコード分子／粒子の範囲である。いくつかの実施形態において、粒子内のバーコード分子の量は、１０〜９０個のバーコード分子／粒子の範囲である。いくつかの実施形態において、粒子内のバーコード分子の量は、２０〜８０個のバーコード分子／粒子の範囲である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、粒子内のバーコード分子の量は、１〜１０００個のバーコード分子／粒子の範囲である。いくつかの実施形態において、粒子内のバーコード分子の量は、１〜１００００個のバーコード分子／粒子の範囲である。
【００８０】
開裂部位
いくつかの実施形態において、一意のバーコードは、少なくとも１つの開裂部位を含む。いくつかの実施形態において、一意のバーコードは、複数の開裂部位を含む。本明細書で使用される場合、開裂部位は、配列特異的または構造特異的ヌクレアーゼによって開裂または切断され得るヌクレオチド配列を指す。配列特異的または構造特異的のいずれかのヌクレアーゼのための開裂部位を有するＤＮＡおよびＲＮＡ分子の設計は、当業者にとって日常的であり、一本鎖、二本鎖、ニック、ミスマッチ、または任意の他の方法で一意のヌクレオチド構造または配列が、この目的のために用いられ得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態において、開裂部位は、疾患の細胞に特異的なヌクレアーゼによって特異的に切断される。そのようなヌクレアーゼは、例えば、腫瘍特異的ヌクレアーゼまたは幹細胞特異的ヌクレアーゼであり得る。
【００８１】
いくつかの実施形態において、開裂部位は、疾患の細胞内の細胞質に誤局在するヌクレアーゼによって特異的に切断される。いくつかの実施形態において、開裂部位は、疾患の細胞内で増加した細胞質局在化を有するヌクレアーゼに特異的である。多くのヌクレアーゼは、健康な細胞内で排他的またはほぼ排他的な核染色を有する。バーコードが核局在化または核輸入シグナルを欠く実施形態において、開裂部位を有するバーコードは、細胞質バーコードと核ヌクレアーゼとの間の相互作用が制限される健康な細胞内で開裂されないか、または低度に開裂される。ヌクレアーゼが細胞質に誤局在するか、または細胞質内で過剰発現する疾患細胞において、バーコードおよびヌクレアーゼは、自由に相互作用して開裂をもたらす。
【００８２】
非限定的な例としてのＤＮＡ２などのヌクレアーゼは、乳癌および膵臓癌を含む多くの癌において過剰発現することが知られており、過剰発現は、細胞質漏出をもたらし得る。疾患細胞内の細胞質に誤局在するヌクレアーゼの非限定的な例としては、乳癌、直腸癌、卵巣癌、甲状腺癌、および非小細胞肺癌における細胞質局在化を有することが示されているヒトアプリン／アピリミジンエンドヌクレアーゼＡＰＥ１、ならびに色素性乾皮症細胞内の細胞質局在化を有することが示されているＸＰＦ−ＥＲＣＣ１が挙げられる。いくつかの実施形態において、一意のバーコードは、ＡＰＥ１開裂部位を含む。
【００８３】
したがって、当業者は、対象からの試料中の開裂されたバーコードと比較した開裂されていないバーコードの測定が、疾患の細胞内で治療薬の有効性を特異的に測定することを可能にすることを理解するであろう。開裂されたヌクレオチド配列と開裂されていないヌクレオチド配列との区別は、本明細書で上記に記載されているような日常的なヌクレオチド検出／識別アッセイを通して達成され得る。
【００８４】
タグ
別の実施形態において、本発明の１つ以上の担体は、少なくとも１つのタグまたは検出可能な部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、同一のタグが、全ての担体に使用される。他の実施形態において、一意のタグが、担体のサブセットに使用される。
【００８５】
本発明の組成物および方法で使用され得るタグとしては、フルオロフォア、発色団、化学発光分子、放射性マーカー、金属、希土類、磁性粒子、または染料が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
いくつかの実施形態において、タグまたは検出可能な部分は、免疫アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ビーズベース、チップベース、もしくはプレートベースのマルチプレックス免疫測定、質量分析、電気泳動、免疫比濁、免疫比ろう、酵素アッセイ、比色分析、または蛍光分析が挙げられるが、これらに限定されないアッセイにおいて有用な、例えば、測光および蛍光結合細胞選別（ＦＡＣＳ）ベースの分析、または他の臨床的に確立されたアッセイによって評価可能なタグである。これらの方法は全て当業者に周知であり、文献に記載されている。
【００８７】
典型的には、タグの量は、実施されるアッセイに依存し、当業者によって決定され得、十分に当業者の能力の範囲内である。いくつかの実施形態において、担体は、前述のタグの１つの分子またはより多くの分子を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態において、タグは、担体内に封入される。いくつかの実施形態において、タグは、担体の外側に固定される。いくつかの実施形態において、タグは、担体の膜内に固定される。いくつかの実施形態において、タグは、リンカーを介して担体に固定されるか、または担体中に固定される。そのようなリンカーは、アミノ酸、脂質、炭水化物、またはそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。
【００８９】
担体
いくつかの実施形態において、治療薬（複数可）、前述の治療薬（複数可）をバーコード化するＤＮＡに有用な核酸配列、および任意にタグのための担体が提供される。本発明の方法を実施するために使用される前述の担体は、細胞表面ポリペプチド、例えば、異常増殖細胞、癌細胞、免疫細胞、および変性細胞上のポリペプチドを含むポリペプチドなど、生物学的分子を含む特定の分子を標的とし得る。
【００９０】
代替の実施形態において、本発明は、（本発明の方法を実施するために使用される化合物を含むことに加えて）異常増殖、疾患、感染、機能不全、および／または細胞受容体を選択的に標的とする分子、例えば、ペプチドまたは抗体を含む、ナノ粒子およびリポソーム膜の形態の担体を提供する。
【００９１】
いくつかの実施形態において、前述の少なくとも１つの担体は、担体材料（治療薬、核酸分子、および任意にタグ）が内部コア内にあるような小胞の形態である。いくつかの実施形態において、前述の少なくとも１つの担体は、脂質系粒子である。別の実施形態において、前述の脂質系粒子は、リポソームである。別の実施形態において、前述の少なくとも１つの担体は、ミセルである。
【００９２】
いくつかの実施形態において、溶液は、指定された細胞に対して不活性であり、かつ指定された細胞に影響を及ぼさない。いくつかの実施形態において、治療薬以外の組成物の全ての成分は、不活性であり、指定された細胞に影響を及ぼさない。いくつかの実施形態において、溶液は、水溶液である。別の実施形態において、本発明の組成物は、カチオン性界面活性剤を欠いている（それが細胞に影響を及ぼし、かつ／または治療薬の活性に影響を及ぼし、治療薬の効果の正確な分析を妨げ得るため）。
【００９３】
いくつかの実施形態において、前述の少なくとも１つの担体は、担体材料（治療薬、核酸分子、および任意にタグ）が、ポリマー／タンパク質／塩などの別の薬剤を伴うかまたは伴わないで、担体材料と複合体／微粒子を形成するような、小胞の形態である。いくつかの実施形態において、前述の少なくとも１つの担体は、成分がポリマー骨格に共役するか、またはファンデルワールスもしくは疎水性相互作用を介して複合体化される、デンドリマー様構造を形成する。
【００９４】
いくつかの実施形態において、前述の少なくとも１つの担体は、ポリマーナノ粒子である。いくつかの実施形態において、前述の少なくとも１つの担体は、ナノゲルである。いくつかの実施形態において、前述の少なくとも１つの担体は、金属ナノ粒子（例えば、金または酸化鉄ナノ粒子）である。いくつかの実施形態において、前述の少なくとも１つの担体は、カーボンナノチューブである。いくつかの実施形態において、前述の少なくとも１つの担体は、交互吸着（ｌａｙｅｒ  ｂｙ  ｌａｙｅｒ）粒子である。いくつかの実施形態において、前述の少なくとも１つの担体は、ゾル−ゲルセラミック粒子である。いくつかの実施形態において、前述の少なくとも１つの担体は、薬物とのタンパク質複合体である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、前述の少なくとも１つの担体は、成分がポリマー骨格に共役するか、またはファンデルワールスもしくは疎水性相互作用を介して複合体化される、デンドリマー様構造を形成する。
【００９６】
一実施形態において、担体（例えば、リポソーム）は、それが細胞外マトリックスを通して細胞に入ることを促進するために、直径５００ｎｍ未満である。一実施形態において、担体（例えば、リポソーム）は、それが細胞外マトリックスを通して細胞に入ることを促進するために、直径４００ｎｍ未満である。
【００９７】
一実施形態において、担体（例えば、リポソーム）は、直径３００ｎｍ未満、直径２５０ｎｍ未満、直径２００ｎｍ未満、直径１５０ｎｍ未満、直径１００ｎｍ未満、直径５０ｎｍ未満、直径２０ｎｍ未満、直径１０ｎｍ未満、または直径５ｎｍ未満である。別の実施形態において、担体（例えば、リポソーム）は、直径が少なくとも１ｎｍ、直径が少なくとも５ｎｍ、直径が少なくとも１０ｎｍ、直径が少なくとも２０ｎｍ、直径が少なくとも３０ｎｍ、直径が少なくとも４０ｎｍ、直径が少なくとも５０ｎｍ、直径が少なくとも６０ｎｍ、直径が少なくとも７０ｎｍ、直径が少なくとも８０ｎｍ、直径が少なくとも９０ｎｍ、直径が少なくとも１００ｎｍ、直径が少なくとも１５０ｎｍ、直径が少なくとも２００ｎｍ、直径が少なくとも２５０ｎｍ、または直径が少なくとも３００ｎｍである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９８】
別の実施形態において、担体は、直径１〜３００ｎｍである。別の実施形態において、担体は、直径１０〜２５０ｎｍである。別の実施形態において、担体は、直径５〜２５０ｎｍである。別の実施形態において、リポソームは、直径２０〜１５０ｎｍである。別の実施形態において、リポソームは、直径５〜１５０ｎｍである。別の実施形態において、リポソームは、直径２０〜１５０ｎｍである。
【００９９】
いくつかの実施形態において、静脈内投与用の担体は、直径５〜２５０ｎｍである。静脈内投与用の担体がリポソームであるいくつかの実施形態において、担体は、直径４０〜２５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、腫瘍内投与用の担体は、直径５〜３００ｎｍである。腫瘍内投与用の担体がリポソームであるいくつかの実施形態において、担体は、直径４０〜３００ｎｍである。
【０１００】
いくつかの実施形態において、担体の形態は、球状もしくは実質的に球状、非球状（例えば楕円形、管状など）、不規則などであってもよい。
【０１０１】
治療薬および核酸の標的細胞への送達を促進するためのリポソーム移入ビヒクルの使用が、本発明によって企図される。リポソーム（例えば、リポソーム脂質ナノ粒子）は一般に、研究、産業、および医学における様々な用途で、特に、インビボでの診断化合物または治療化合物の移入ビヒクルとしてのそれらの使用に有用であり（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７−３２１，１９９８、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，５１：６９１−７４３，１９９９）、通常、１つ以上の二重層の膜によって外側媒体から隔離された内部アクア空間を有する顕微鏡的小胞として特徴付けられる。リポソームの二重層膜は典型的には、空間的に分離された親水性および疎水性ドメインを含む合成または天然由来の脂質などの両親媒性分子によって形成される（Ｌａｓｉｃ、同書）。リポソームの二重層膜はまた、両親媒性ポリマーおよび界面活性剤（例えば、ポリメロソーム、ニオソームなど）によって形成され得る。
【０１０２】
一実施形態において、担体は、治療薬および核酸分子（ＤＮＡバーコード）の標的細胞への送達を最適化するように選択および／または調製され得る。例えば、標的細胞が肝細胞である場合、移入ビヒクルの特性（例えば、サイズ、電荷、および／またはｐＨ）は、そのような移入ビヒクルを標的細胞に効果的に送達するように最適化され得る。あるいは、標的細胞が中枢神経系である場合（例えば、神経変性疾患の治療予測のため）、移入ビヒクルの選択および調製は、血液脳関門の浸透および血液脳関門内の保持、ならびに／またはそのような移入ビヒクルをそのような標的細胞に直接送達する代替手段の使用を考慮しなければならない。
【０１０３】
リポソームに所望の実体を組み込むプロセスは、多くの場合、「充填」と称される（Ｌａｓｉｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５−２５８，１９９２）。リポソームが組み込まれた治療薬、核酸、および／またはタグは、リポソームの二層膜内のリポソームの内部空間内に完全にまたは部分的に位置し得る。薬剤のリポソームへの組み込みは、本明細書において「封入」とも称され、薬剤は、リポソームの内部空間内に完全に含有される。典型的には、担体（例えば、リポソーム）内の薬剤の封入のために、薬剤と担体との間の共有結合などの化学結合は必要とされない。薬剤をリポソームなどの移入ビヒクルに組み込む目的は、多くの場合、薬剤（例えば、核酸）を分解する酵素もしくは化学物質、および／または薬剤の急速な排泄を引き起こす系もしくは受容体を含有し得る環境から、薬剤を保護することである。したがって、本発明の好ましい実施形態において、選択された移入ビヒクルは、治療薬および核酸分子、ならびに任意にそれらの中に含有されるタグの安定性を増強することができる。リポソームは、封入された薬剤が標的細胞に到達することを可能にすることができ、かつ／または封入された薬剤が標的細胞に到達することを優先的に可能にし得るか、あるいは他の望ましくない標的部位もしくは細胞への薬剤の送達を制限し得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、担体は、封入された治療有効量の少なくとも１つの治療薬、少なくとも１つの治療薬を一意的に識別する核酸分子、および任意のタグの細胞への浸透を促進する。いくつかの実施形態において、治療有効量の少なくとも１つの治療薬、少なくとも１つの治療薬を一意的に識別する核酸分子、および任意のタグの細胞への浸透は、担体内の封入によって可能となる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、リポソーム移入ビヒクルは、組成物が高いトランスフェクション効率および増強された安定性を示すように、１つ以上の所望の薬剤を封入するために調製する。リポソームは、標的細胞への核酸の導入を促進することができるが、コポリマーとしてのポリカチオン（例えば、ポリＬ−リジンおよびプロタミン）の付加は、インビトロおよびインビボの両方の多数の細胞株において、いくつかのタイプのカチオン性リポソームのトランスフェクション効率を、２〜２８倍促進、場合によっては著しく増強することができる。（Ｎ．Ｊ．Ｃａｐｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９５；２：６０３、Ｓ．Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９７；４，８９１を参照）。
【０１０６】
別の実施形態において、前述の少なくとも１つの担体は、ナノリポソームまたは脂質ナノ粒子である。ナノリポソームは、それらの溶解度および生物学的利用能、インビトロおよびインビボ安定性を改善すること、ならびに他の分子とのそれらの望ましくない相互作用を防止することによって、生体活性剤の性能を増強することができる。ナノリポソームの別の利点は、細胞特異的標的化であり、これは、健康な細胞および組織への悪影響を最小限に抑えながら、標的細胞における最適な致死性に必要とされる薬物濃度を達成するための必須条件である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの担体は、リポソームである。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」という語句は、１つ以上の脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、およびＰＥＧ修飾脂質）を含む移入ビヒクルを指す。好ましくは、脂質ナノ粒子は、１つ以上の薬剤を１つ以上の標的細胞に送達するように製剤化される。好適な脂質の例としては、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシド）が挙げられる。単独でまたは他の移入ビヒクルと組み合わせてのいずれかで、ポリマーを移入ビヒクルとして使用することも企図される。好適なポリマーとしては、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド−ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギン酸塩、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、デンドリマー、およびポリエチレンミンが挙げられ得る。一実施形態において、移入ビヒクルは、核酸の標的細胞へのトランスフェクションを促進するその能力に基づいて選択される。
【０１０８】
本発明は、核酸の標的細胞への送達を封入および／または増強するためのカチオン性脂質を含む移入ビヒクルとしての脂質ナノ粒子の使用を企図する。本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という語句は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を担持する多数の脂質種のいずれかを指す。企図される脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、およびＰＥＧ修飾脂質を用いる様々な比率の多成分脂質混合物を含むことによって調製され得る。いくつかのカチオン性脂質が文献に記載されており、それらの多くは市販されている。
【０１０９】
本発明の組成物および方法で使用するのに好適なカチオン性脂質には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ  ２０１０／０５３５７２号に記載されるものが含まれる。ある特定の実施形態において、本発明の組成物および方法は、イオン化可能なカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子を用いる。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＴＭＡ」が使用される。（米国特許第４，８９７，３５５号）。ＤＯＴＭＡは、単独で製剤化され得るか、あるいは中性脂質、ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミンもしくは「ＤＯＰＥ」または他のカチオン性もしくは非カチオン性脂質と、リポソーム移入ビヒクルまたは脂質ナノ粒子に組み合わされ得、そのようなリポソームを使用して、標的細胞への核酸の送達を増強することができる。他の好適なカチオン性脂質としては、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミドまたは「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロ−パナミニウムまたは「ＤＯＳＰＡ」（米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＤＡＰ」、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＴＡＰ」が挙げられる。企図されるカチオン性脂質としては、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＯＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドもしくは「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミドもしくは「ＤＤＡＢ」、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドもしくは「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オク−タデカジエンオキシ）プロパンもしくは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−［５’−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル１−１−（シス，シス−９’，１−２’−オクタデカジエンオキシ）プロパンもしくは「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンもしくは「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンもしくは「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミンもしくは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、１，２−ジリノレイルカル���ミル−３−ジメチルアミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソランもしくは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソランもしくは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」、および２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジ−メチルエタンアミン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ））（ＷＯ  ２０１０／０４２８７７、Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２−１７６（２０１０）を参照）、またはそれらの混合物も挙げられる。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７：２７６−２８７（２００５）、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｄ  Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３−１００７（２００５）、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１号）。
【０１１０】
コレステロール系カチオン性脂質の使用も、本発明によって企図される。そのようなコレステロール系カチオン性脂質は、単独で、または他のカチオン性脂質もしくは非カチオン性脂質と組み合わせて使用され得る。好適なコレステロール系カチオン性脂質としては、例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）、Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３，１３９（１９９７）、米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥが挙げられる。
【０１１１】
加えて、いくつかの試薬は、トランスフェクション有効性を増強するために市販されている。好適な例としては、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＵＧＥＮＥ、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（ＤＯＧＳ）、およびＥＦＦＥＣＴＥＮＥが挙げられる。
【０１１２】
ジアルキルアミノ系、イミダゾール系、およびグアニジニウム系脂質などのカチオン性脂質も企図される。例えば、ある特定の実施形態は、１つ以上のイミダゾール系カチオン性脂質を含む組成物を対象とする。
【０１１３】
Ｎ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８  ＰＥＧ−２０００セラミド）を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−修飾リン脂質および誘導体化セラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）などの誘導体化脂質の使用も、単独で、または好ましくは、移入ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）を共に含む他の脂質と組み合わせて、本発明によって企図される。そのような成分の添加は、複合体凝集を防止し得、また循環寿命を延ばし、標的細胞への脂質−核酸組成物の送達を増加させるための手段を提供し得るか（Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５−２３７）、またはそれらは、インビボで製剤から迅速に交換するように選択されてもよい（米国特許第５，８８５，６１３号を参照）。特に有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧ−セラミドである。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化脂質は、リポソーム移入ビヒクル中に存在する全脂質の約０％〜約２０％、約０．５％〜約２０％、約１％〜約１５％、約４％〜約１０％、または約２％のモル比を含んでもよい。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１４】
本発明は、非カチオン性脂質の使用をさらに企図する。本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という語句は、任意の中性、双性イオン性、またはアニオン性脂質を指す。本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という語句は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の負電荷を担持する多数の脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質としては、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。そのような非カチオン性脂質は、単独で使用され得るが、好ましくは他の賦形剤、例えばカチオン性脂質と組み合わせて使用される。カチオン性脂質と組み合わせて使用される場合、非カチオン性脂質は、移入ビヒクル中に存在する全脂質の５％〜約９０％、または好ましくは約１０％〜約７０％のモル比を含んでもよい。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、移入ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）は、複数の脂質成分および／またはポリマー成分を組み合わせることによって調製される。脂質ナノ粒子を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および／またはＰＥＧ修飾脂質、ならびにそのような脂質の互いに対する相対モル比の選択は、選択された脂質（複数可）の特性、意図される標的細胞の性質、および送達される薬剤の特性に基づいている。さらなる考慮事項としては、例えば、アルキル鎖の飽和度、ならびに選択された脂質（複数可）のサイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、膜融合性、および毒性が挙げられる。
【０１１６】
本発明の組成物で使用するためのリポソーム移入ビヒクルは、当該技術分野において現在既知である様々な技術によって調製され得る。多層小胞（ＭＬＶ）は、従来の技術によって、例えば、限定されないが、適切な溶媒中に脂質を溶解し、次いで溶媒を蒸発させて、容器の内側に薄膜を残すことによって、または噴霧乾燥によって、好適な容器もしくは槽の内壁上に選択された脂質を堆積させることによって調製され得る。次いで、ＭＬＶの形成をもたらすボルテックス運動を伴って、水相が槽に添加されてもよい。次いで、単ラメラ小胞（ＵＬＶ）は、多重ラメラ小胞の均質化、超音波処理、または押出によって形成され得る。加えて、単ラメラ小胞は、洗剤除去技術によって形成され得る。
【０１１７】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、診断用放射性核種、蛍光材料、またはインビトロ用途およびインビボ用途の両方で検出可能である他の材料で充填され得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子担体は、粒子のハイスループット合成および標識化に対応するように適合されたインラインマイクロ流体セットアップを使用して、脂質から製造される。そのような製造方法、例えば、Ｊａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２３，６２８９−６２９３は、当該技術分野において既知である。典型的には、治療用ペイロードに対応するための適切なサイズの粒子が製造される。
【０１１９】
例えば、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２３，４０１９−４０２５によって示されるように、化学薬剤が安定したＨＳＰＣ粒子に充填されてもよい。生物学的治療薬（タンパク質／ＲＮＡ）は、「タンパク質産生ナノ粒子」内で合成され得る。いくつかの実施形態において、合成ナノ粒子は、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２，２６８５−２６８９，（２０１２）に示されるように、標的部位においてタンパク質およびＲＮＡを合成するように制御可能に誘発される。これらのナノ粒子は、アミノ酸、リボソーム、および光不安定性保護基でケージ化されたＤＮＡを含む、転写および翻訳を担う分子機構が充填された脂質小胞からなる。粒子は、ＲＮＡ／タンパク質を産生することができるナノ工場として機能する。インビトロおよびインビボでは、タンパク質／ＲＮＡ合成は、空間的および時間的に制御可能であり得、ミリ秒のタイムスケールでミクロンスケールの組織領域を照射することによって開始され得る。したがって、このプラットフォームを使用して、ＲＮＡ（Ｐｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２  Ｎａｔｕｒｅ  ４８１，１９０−１９４）およびタンパク質を、それらの活性、例えば抗癌活性についてスクリーニングしてもよい。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子（例えば、担体）は、リポソーム形成脂質がナノ粒子の４０〜１００％ｍｏｌを構成するナノ粒子である。いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、０〜５０％ｍｏｌのコレステロールを含む。いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、１〜８％ｍｏｌのＰＥＧ−脂質を含む。いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、０〜１０％ｍｏｌの機能性脂質（例えば、カチオン性脂質または標的化部分を有する脂質）を含む。
【０１２１】
本明細書および当該技術分野で使用される場合、モルパーセント（「％ｍｏｌ）は、ナノ粒子を構成する成分または化合物の総モルに基づく特定の成分または化合物のパーセントを指す。例えば、ナノ粒子が３ｍｏｌの化合物Ａおよび１ｍｏｌの化合物Ｂを含有する場合、化合物Ａは、混合物の７５ｍｏｌ％を構成し、化合物Ｂは、２５ｍｏｌ％を構成する。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子（例えば、担体）は、４０〜７０％ｍｏｌのリポソーム形成脂質を含む。いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、２０〜５０％ｍｏｌのコレステロールを含む。いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、４〜８％ｍｏｌのＰＥＧ−脂質を含む。いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、０〜３％ｍｏｌの機能性脂質（例えば、カチオン性脂質または標的化部分を有する脂質）を含む。特定の実施形態によると、４０〜７０％ｍｏｌのリポソーム形成脂質、２０〜５０％ｍｏｌのコレステロール、４〜８％ｍｏｌのＰＥＧ脂質、および０〜３％ｍｏｌの機能性脂質を含むナノ粒子は、静脈内投与に好適である。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子（例えば、担体）は、５０〜８０％ｍｏｌのリポソーム形成脂質を含む。いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、０〜５０％ｍｏｌのコレステロールを含む。いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、０〜３％ｍｏｌのＰＥＧ−脂質を含む。いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、４〜８％ｍｏｌの機能性脂質（例えば、カチオン性脂質または標的化部分を有する脂質）を含む。特定の実施形態によると、５０〜８０％ｍｏｌのリポソーム形成脂質、０〜５０％ｍｏｌのコレステロール、０〜３％ｍｏｌのＰＥＧ脂質、および４〜８％ｍｏｌの機能性脂質を含むナノ粒子は、腫瘍内投与に好適である。
【０１２４】
セラノスティック使用
別の態様によると、少なくとも１つの治療薬に対する、疾患に罹患している対象の応答を予測するための方法が提供され、方法は、
ａ．対象に本発明の組成物を投与するステップと、
ｂ．前述の対象から試料を採取するステップと、
ｃ．前述の試料中で、前述の一意のバーコードの存在によって、前述の少なくとも１つの治療薬の有効性を識別するステップと、
を含み、それによって、治療薬に対する、疾患に罹患している対象の応答を予測する。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、複数の治療薬に対する、疾患に罹患している対象の応答を決定または予測するのに有用である。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、複数の治療薬に対する、炎症性疾患または障害に罹患している対象の応答を決定または予測するに有用である。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、複数の治療薬に対する、変性疾患または障害に罹患している対象の応答を決定または予測するのに有用である。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、複数の治療薬に対する、神経疾患または障害に罹患している対象の応答を決定または予測するのに有用である。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、組成物は、対象からの生検を含む方法で使用するためのものである。いくつかの実施形態において、組成物は、対象からの液体生検を含む方法で使用するためのものである。いくつかの実施形態において、組成物は、対象から細胞および／または組織を抽出することを含む方法で使用するためのものである。いくつかの実施形態において、組成物は、対象から体液を抽出することを含む方法で使用するためのものである。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、試料は、対象からの細胞を含む。いくつかの実施形態において、試料は、対象からの生体液を含む。いくつかの実施形態において、試料は、生検である。いくつかの実施形態において、試料は、生体液である。いくつかの実施形態において、生体液は、細胞を含む。いくつかの実施形態において、生体液は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、方法は、試料からｃｆＤＮＡを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、試料から細胞を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、試料から細胞および／または細胞ＤＮＡを除去することをさらに含む。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「流体」および「体液」という用語は、互換的に使用され、対象の体内で産生される任意の流体を指す。いくつかの実施形態において、流体は、血液、血清、血漿、唾液、尿、リンパ液、腫瘍液、母乳、脳脊髄液、および精液からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、流体は、血液である。体液の吸引は、当業者にとって日常的であろう。例えば、考えられる体液および疾患をほんの数例を挙げると、脳脊髄液は、脳腫瘍について採取されてもよく、リンパ液は、転移性癌について採取されてもよく、母乳は、乳房腫瘍について採取されてもよく、または精液は、前立腺癌について採取されてもよいように、得られた体液は、疾患によって必要に応じて選択される。当業者であれば、得られる適切な流体を決定することができるであろうが、ほとんどの疾患では血液の吸引が用いられ得る。本明細書で「腫瘍体」と称される腫瘍の周囲または近傍からの流体は、固形腫瘍、例えば、嚢胞液の除去が日常的である悪性嚢胞についても採取され得る。本明細書で使用される場合、「液体生検」という用語は、癌患者からの体液、通常は血液のサンプリングを指す。いくつかの実施形態において、液体生検は、ｃｆｔＤＮＡを識別、チェック、または測定することを含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、治療薬（例えば、シスプラチン）は、一意のバーコードを含む。当業者であれば、そのような実施形態において、前述の担体が治療薬（例えば、シスプラチン）を含み得、追加のバーコードを追加する必要がないことを理解するであろう。
【０１３０】
別の実施形態において、前述の組成物は、全身投与用に製剤化される。別の実施形態において、前述の全身投与は、静脈内注射である。別の実施形態において、前述の投与は、腫瘍内注射などの組織への注射である。
【０１３１】
本発明の組成物を使用して、膨大な数の標的細胞型を優先的に標的化し得る。例えば、企図される標的細胞としては、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜表層細胞、卵巣細胞、睾丸細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「腫瘍細胞」は、原発性癌細胞ならびに転移性細胞を含む。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本発明の組成物および方法が投与されるヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含むが、これらに限定されない任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。いくつかの実施形態において、「対象」および「患者」という用語は、ヒト対象に関して本明細書で互換的に使用される。他の実施形態において、「対象」および「患者」という用語は、非ヒト対象に関して本明細書で互換的に使用される。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、治療薬に対する、悪性疾患に罹患している対象の応答を決定または予測するのに有用である。いくつかの実施形態において、疾患は、癌である。いくつかの実施形態において、疾患は、癌、癌転移、および前悪性病変である。いくつかの実施形態において、前述の悪性疾患は、癌、癌転移、および前悪性病変である。いくつかの実施形態において、対象は、癌に罹患している。いくつかの実施形態において、疾患は、炎症性疾患である。いくつかの実施形態において、疾患は、神経疾患である。いくつかの実施形態において、疾患は、特定の細胞または細胞型の死滅または減少から利益を受けるであろう疾患である。
【０１３４】
癌治療薬の例としては、例えば、４−ヒドロキシシクロホスファミド、５−ＦＵ、アビラテロン、アシトレチン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アミフォスチン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、ヒ素、アスパラギナーゼ、アスパラギナーゼエルウィニア、アキシチニブ、アザシチチジン（ａｚａＣＩＴＩｔｉｄｉｎｅ）、ＢＣＧ、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブレンツキシマブ、ブロモクリプチン、ブセレリン、ブスルファン、カバジタキセル、カベルゴリン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デガレリクス、デノスマブ、デキサメタゾン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、エンザルタミド、エピルビシン、エリブリン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イニパリブ、インターフェロンアルファ−２ｂ、イピリムマブ、イリノテカン、イクサベピロン、ランブロリズマブ、ランレオチド、ラパチニブ、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニロチニブ、ニルタミド、オクトレオチド、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、ナノ粒子アルブミン結合（ｎａｂ）−パクリタキセル、パミドロネート、パニツムマブ、パゾパニブペメトレキセド、ペルツズマブ、ポルフィマー、プロカルバジン、キナゴリド、ラルチトレキセド、レオウイルス血清型−３−Ｄｅａｒｉｎｇ株、リツキシマブ、ロミデプシン、ルキソリチニブ、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、タモキシフェン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、チロトロピンアルファ、トシリズマブ、トポテカン、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、トラスツズマブエムタンシン（ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標））、トレオスルファン、トレチノイン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
治療薬として使用される化学療法薬の例としては、例えば、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、アジリジン、エポキシド、スルホン酸アルキル）、シスプラチンおよびその類似体（例えば、カルボプラチン、オキサリプラチン）、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、フルダラビン）、トポシオメラーゼ（ｔｏｐｏｓｉｏｍｅｒａｓｅ）相互作用薬（例えば、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、テニポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン）、微小管阻害薬（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビノレルビンなどのビンカアルカロイド；パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン）、インターフェロン、インターロイキン−２、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、モノクローナル抗体、エストロゲン調節薬（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン）、メゲストロール、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、オクトレオチド）、オクトレオチド、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、カソデックス）、キナーゼおよびチロシン阻害剤（例えば、イマチニブ（ＳＴＩ５７１またはＧｌｅｅｖａｃ）；ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）；ならびにエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄｅｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５、第１５、１６、１７、および６３章を参照）。
【０１３６】
製造
別の態様によると、本発明の組成物を製造する方法が提供され、方法は、
（ａ）複数の溶液を生成することであって、各溶液が、あるタイプの担体を含み、各タイプの担体が独立して、単一細胞致死量の少なくとも１つの治療薬と、前述の少なくとも１つの治療薬を一意的に識別する少なくとも１つのバーコードとを含む、生成することと、
（ｂ）各溶液中のタイプの担体の分子の濃度を測定することと、
（ｃ）各タイプの担体の実質的に等しい数の分子を一緒に混合することと、
を含み、それによって、本発明の組成物を製造する。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、溶液は、１つのタイプの担体を含む。いくつかの実施形態において、溶液は、複数の担体を含む。いくつかの実施形態において、溶液は、単一の治療薬と単一タイプのバーコードとを有する、単一タイプの担体を含む。いくつかの実施形態において、各溶液中の担体の分子の総数が測定される。いくつかの実施形態において、各溶液中の担体分子の濃度が測定される。いくつかの実施形態において、各タイプの担体は、同じ組成を含む。いくつかの実施形態において、同じ組成は、同じ脂質組成である。いくつかの実施形態において、等しい担体濃度は、等しい脂質濃度である。いくつかの実施形態において、担体数／濃度を測定することは、脂質量／濃度を測定することを含む。いくつかの実施形態において、脂質濃度は、担体濃度に比例する。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、方法は、有効治療用量（ＥＴＤ）の少なくとも１つの治療薬に対して実質的に等しい濃度の少なくとも１つの治療薬を混合することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、各溶液中の治療薬の濃度を測定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、一緒に混合することは、有効治療用量（ＥＴＤ）の少なくとも１つの治療薬に対して実質的に等しい濃度の少なくとも１つの治療薬を混合することを含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、方法は、実質的に等しい濃度の各バーコードを混合することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、各溶液中のバーコードの濃度を測定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、一緒に混合することは、実質的に等しい濃度のバーコードを混合することを含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、方法は、実質的に等しい数の担体を混合することと、ＥＴＤの０．００１、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．５、１．６、１．８、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、または５％以上の濃度を有する治療薬を混合することとを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、値と組み合わされたとき、参照値のプラスおよびマイナス１０％を指す。例えば、約１０００ナノメートル（ｎｍ）の長さは、１０００ｎｍ＋−１００ｎｍの長さを指す。
【０１４２】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別段明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」への言及は、複数のそのようなポリヌクレオチドを含み、「ポリペプチド（ｔｈｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、１つ以上のポリペプチドおよび当業者に既知のその等価物などへの言及を含む。さらに、特許請求の範囲が、あらゆる任意の要素を排除するように起草され得ることに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連する「単に」、「のみ」などの排他的な用語の使用、または「否定的」な限定の使用のための先行詞としての役割を果たすことが意図される。
【０１４３】
「Ａ、Ｂ、およびＣなどのうちの少なくとも１つ」に類似する慣例が使用される場合、概して、そのような構成は、当業者がその慣例を理解する意味で意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢ共に、ＡおよびＣ共に、ＢおよびＣ共に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣ共になどを有するシステムを含むが、これらに限定されない）。説明、特許請求の範囲、または図面に関わらず、２つ以上の代替用語を提示する実質的に任意の離接語および／または語句が、用語のうちの１つ、用語のいずれか、または両方の用語を含む可能性を企図すると理解されるべきであることが、当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、「ＡまたはＢ」という語句は、「Ａ」または「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解されるであろう。
【０１４４】
明確にするために、別個の実施形態の文脈において説明される本発明のある特定の特徴がまた、単一の実施形態で組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈において説明される本発明の様々な特徴はまた、別個に、または任意の好適な部分的組み合わせで提供され得る。本発明に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、まさに、ありとあらゆる組み合わせが個々にかつ明示的に開示されるかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態およびそれらの要素の全ての部分的組み合わせもまた、本発明によって具体的に包含され、まさに、ありとあらゆるそのような部分的組み合わせが個々にかつ明示的に本明細書に開示されるかのように本明細書に開示される。
【０１４５】
本発明の追加の目的、利点、および新規の特徴は、限定することを意図するものではない以下の実施例を調査すると、当業者に明らかになるであろう。加えて、上記に記述され、かつ以下の特許請求の範囲のセクションで特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様の各々は、以下の実施例において実験的証拠を見出す。
【０１４６】
上記に記述され、かつ以下の特許請求の範囲のセクションで特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的証拠を見出す。
【実施例】
【０１４７】
一般に、本明細書で使用される命名法、および本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物、および組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は、文献中で十分に説明されている。例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）、”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）、Ｐｅｒｂａｌ，”Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）”Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）、米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に記載されるような方法、”Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、”Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），”Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）、Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたく、それらの全ては、参照により組み込まれる。他の一般的な参考文献は、本書全体を通して提供される。
【０１４８】
実施例１：等しい相対薬物濃度を有する等しい数のリポソームが、有効性の正確な評価に必要とされる。
実験を行って、セラノスティック使用のためにリポソーム混合物に含まれる各薬物の理想的な用量を試験した。ドキソルビシン（バーコード２）、ゲムシタビン（バーコード３）、またはシスプラチン（バーコード４）を充填したリポソームを、既存のプロトコルに従って生成した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１６／０２４２８１号を参照）。リポソームの各バッチについて、脂質濃度、封入薬物濃度、サイズ分布、およびゼータ電位を測定した。結果が表１に要約される。全ての異なるバッチは、同じ脂質組成（５５モル％のＨＳＰＣ、４０モル％のコレステロール、および５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ）ならびにサイズ（約１００ｎｍ）を有するリポソームであるため、脂質濃度（スチュワートアッセイによって評価）および脂質の導出量（モル単位）は、各バッチにおけるリポソームの総数に比例すると仮定した。
【表１】
2021529810.tif 000003
【０１４９】
各薬物は、その独自の特定の有効治療用量（ＥＴＤ）を有し、有効性を試験するために、各リポソーム混合物（一緒に注射される３つのタイプのリポソームの全ての混合物）が、同じ相対量の各薬物を有することが合理的である。すなわち、理想的な用量を決定するために、３つ全ての薬物が有効治療用量の５％、１％、または０．１％のいずれかの濃度で存在する混合リポソームのバッチを生成した。表２は、各総用量を提供するために混合物に添加された各リポソームバッチの量（ｕＬ）を提供する。
【表２】
2021529810.tif 000004
【０１５０】
トリプルネガティブ乳癌腫瘍由来の細胞をＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの脂肪パッドに移植し、マウスにおいて腫瘍を形成するために増殖させた。マウスを３つの群に分離し、次いで各群に５％、１％、または０．１％のリポソーム混合物を注射した。注射の４８時間後、腫瘍を切除し、生／死細胞分析をＦＡＣＳによって行い、その後、生細胞および死細胞において別々にバーコード分析を行った。ゲムシタビンは、使用される濃度に関係なく最も有効な治療であることが分かったが、予想外に、他の２つの薬剤よりも１０倍を超えて有効であることが分かった（図１Ａ〜Ｃ）。同じ腫瘍細胞を用いた以前の実験に基づいて、このゲムシタビンの極度の優位性は予想されず、実際には、何らかの形で分析のアーチファクトである可能性が高かった。
【０１５１】
ゲムシタビンは、ドキソルビシンまたはシスプラチンよりも２０倍超高い有効治療用量を有するが、有意に高い濃度ではリポソームに組み込まなかった。さらに、ゲムシタビンおよびシスプラチンを含むリポソームは、ドキソルビシンを含むものよりも有意に多く生成された（表１を参照）。したがって、均一な相対用量が存在するように、他の２つの薬物よりも多くのゲムシタビン含有リポソームが注射され、実際には、ドキソルビシン含有リポソームよりも多くのシスプラチン含有リポソームが注射された。混合物に添加した各リポソームバッチの体積に各バッチについての脂質濃度を乗算することによって、ゲムシタビン、シスプラチン、およびドキソルビシン間のリポソームの相対濃度が９１：３３：１であるということを理解する。すなわち、ｄｏｘ（ドキソルビシン）を含有する１個のリポソーム毎に、シスプラチン含有が３３個、およびゲムシタビン含有が９１個存在した。これは結果の偏りを説明するであろう。
【０１５２】
これらの薬物が０．１％の非常に低い用量であっても有効であった（バーコードが死細胞から検出され得た）ため、投与量の平等がリポソーム数の平等ほど有意ではないと仮定した。この２つの新しいバッチのリポソーム混合物を生成したことを試験するために、第１のバッチは、ほぼ等しい数のリポソームを含有し、一方で、第２のバッチは、比較的等しい有効薬物濃度を有するように設計された。ドキソルビシン、ゲムシタビン、およびシスプラチンを含有するリポソームを上記のように生成した。第１のリポソーム混合物の脂質濃度、薬物濃度、および他のパラメータが表３に記載される。
【表３】
2021529810.tif 000005
【０１５３】
混合物中の等しい数の各タイプのリポソームを確実にするために（各々８．８×１０＾１１のリポソーム）、１１．７マイクロリットルのＤｏｘリポソームを添加し、１６マイクロリットルのＧｅｍ（ゲムシタビン）リポソームを添加し、２０マイクロリットルのＣｉｓ（シスプラチン）リポソームを添加した。しかしながら、これは、１．０３ｕｇ／ｍＬのｄｏｘ／リポソーム、０．０６４ｕｇ／ｍＬのｇｅｍ／リポソーム、および２．１２ｕｇ／ｍＬのｃｉｓ／リポソームの薬物濃度をもたらした。培養物中の細胞の５０％を死滅させるのに必要な各遊離薬物の濃度（ＩＣ５０）を計算した。ＩＣ５０値を各リポソームにおける実際の値と比較することによって、ｃｉｓリポソームはほぼ正確にＩＣ５０濃度を含有し、ｄｏｘリポソームは減少した濃度を有し、ｇｅｍリポソームは増加した濃度を有したことが分かった。
【０１５４】
第２のリポソーム混合物の脂質濃度、薬物濃度、および他のパラメータが表４に記載される。
【表４】
2021529810.tif 000006
【０１５５】
この混合物は、等しい相対薬物濃度を有することを意図したが、乗算エラーのため、ゲムシタビンの濃度は、意図したよりも１０倍高かった。非常に興味深いことに、混合物中の総リポソームの数は、各薬物に対しても非常に異なっていた。１．７７ｘ１０＾１１のｄｏｘリポソーム、４．６９ｘ１０＾１０のｇｅｍリポソーム、および２．０４ｘ１０＾１２のｃｉｓリポソームが存在した。したがって、１ｇｅｍリポソーム毎に、３．８のｄｏｘリポソームおよび４３．４のシスリポソームが存在した。
【０１５６】
培養物中で増殖する細胞をリポソーム混合物で処理し、曝露の４８時間後、細胞を生存アッセイに供した。各研究群からの死細胞（三連で）を、上清の遠心分離によって最初にペレット化し、さらなる分析まで−２０℃で保持した。１０％  Ｐｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した新鮮な培地を細胞に添加し、３７Ｃで約９０分間インキュベートした。１００ｕＬの各ウェルを黒色９６ウェルプレートに移し、蛍光を記録した（発光：５６０ｎｍ、励起：５９０ｎｍ）。生存を、未処理細胞の蛍光と比較した各試料の蛍光として計算した。アッセイの結果が図１Ｄに示される。両方の混合物は、同様の量の細胞を死滅させた。
【０１５７】
生存アッセイの直後、ウェルにトリプシンを添加することによって、接着細胞を分離した。リアルタイムＰＣＲによるバーコード分析を以下のように行った。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ  １  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、異なるバーコードを分析した。ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、プライマー（ＩＤＴ）、ならびに蛍光ＦＡＭ染料で５’末端、およびＭｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ｂｉｎｄｅｒ（ＭＧＢ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に結合した非蛍光クエンチャーでその３’末端が標識されたバーコード特異的プローブを用いて、アッセイを実行した。
【０１５８】
バーコードコピー数の定量化のために、バーコードストック（１００μＭ）から始まり、連続希釈が続く各バーコードの標準曲線を生成した。全ての希釈液の調製後、リアルタイムＰＣＲを使用して標準曲線を検証した。全てのバーコードについての反応を一緒に実行した。反応設定は以下の通りであった。
【表５】
2021529810.tif 000007
【０１５９】
テンプレートなし対照（ＮＴＣ）については、２μＬのＵＰＷを関連するウェルに添加した。標準曲線は、１００ｐＭ〜１０−３ｐＭであった。ストリップを密封し、簡単に遠心分離して、ランの前に気泡がない均一性を確実にした。プレートを、以下の表６に詳述されるような実行条件でＡＢＩ７５００機器に装填した。
【表６】
2021529810.tif 000008
【０１６０】
ソフトウェアの設定メニューでは、標準ウェルを標準（Ｓ）として定義し、数量を追加した。各ウェルのコピー数を以下のように計算した：
【表７】
2021529810.tif 000009
【０１６１】
テンプレートなし対照（ＮＴＣ−テンプレートとしてのＵｌｔｒａＰｕｒｅ  Ｗａｔｅｒとの反応混合物）は、Ｎとして定義される。標準曲線を、機器ソフトウェア（７５００ソフトウェアｖ２．０６）を使用して分析する。全ての標準希釈液を等分し、さらなる実験のために−８０で保存する前に、勾配は、検証するために約−３．３である必要がある。アリコートを、使用前に１回のみ解凍する。
【０１６２】
高速テンプレートプロトコルを使用して、２μＬの試料をＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ１  ＰＣＲ機器で処理した。各試料を二連で処理した。試験した各バーコードを、同じプレート上で実行した標準曲線と比較した。各バーコード反応は、少なくとも４個のＮＴＣを含んだ。設定では、標的（試験したバーコード）、タスク（試料＝不明／標準／ＮＴＣ）、名称、および生物学的群を各試料に割り当てた。上記の設定に従ってランを行った。
【０１６３】
ランの後、ソフトウェアによる分析前に自動閾値設定を選択した。分析は、複製試料間のバーコードコピーの平均量を計算した。この量を２μＬの試料（ＲＴ−ＰＣＲ反応中の試料体積）に対して得て、試料の最終体積に調整した。
【０１６４】
死細胞対生細胞において見出された各バーコードの比を計算した。結果が表８に示される。
【表８】
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【０１６５】
第１のバッチのリポソーム（等しいリポソーム数）を使用したとき、ゲムシタビンおよびドキソルビシンの両方が細胞を死滅させるのに有効であることが分かったが、ｄｏｘは、３０％超優れていた。第２のバッチのリポソーム（等しい相対薬物濃度）を使用したとき、ドキソルビシンのみが有効であることが分かった。これは、導入したｇｅｍリポソームの全体数が著しく減少したことに起因する可能性が高い。この結果は、１０倍高い相対用量のゲムシタビンが誤って使用されたにもかかわらず観察された。
【０１６６】
これらの結果に基づいて、全ての将来の実験について、各リポソームタイプの混合物への充填を、脂質濃度に基づいて計算することが決定された。薬物濃度の平等は依然として重要であったが、等しいリポソーム数が最も重要であり、続いて、薬物濃度は可能な限り均等化される。
【０１６７】
実施例２：液体生検におけるセラノスティック検出
制御してより正確な結果をもたらしたリポソーム混合物を生成する方法では、バーコード分析は、腫瘍生検だけでなく、血流中で循環する無細胞腫瘍ＤＮＡ（ｃｆｔＤＮＡ）に対しても実施され得ると仮定した。マウス４Ｔ１乳房腫瘍モデルを使用して、血液中のセラノスティック使用のためのリポソームバーコードの実行可能性を試験した。４Ｔ１乳癌の癌細胞を標準組織培養条件下で増殖させた。５０μＬの６×１０６細胞／ｍＬの４Ｔ１細胞（３×１０５細胞／マウス）を、８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの左前乳頭に皮下注射した。注射から、体重および腫瘍サイズ（長さおよび幅）、ならびに動物の健康状態を２〜３日毎に記録した。腫瘍体積をキャリパーで測定し、長さ／２×（幅）２として計算した。
【０１６８】
ドキソルビシン含有（バーコード２）、ゲムシタビン含有（バーコード３）、およびシスプラチン含有（バーコード４）の３タイプのリポソームを混合物中で一緒に試験した（表９を参照）。４Ｔ１由来の癌および転移は、シスプラチンに対して高度に感受性であるが、ドキソルビシンに対しては感受性がより低く、ゲムシタビンに対しては感受性がさらに低いことが報告されている。さらに、これらの細胞は、ドキソルビシンに耐性を有することが示されており、ゲムシタビンは治療の最初の数日以内に腫瘍成長を遅らせるが、後の時点では有効ではないことが見出されている（Ｋｉｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ−Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｃｅ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．７３：  １２０−１２９）。
【０１６９】
リポソームは、５５モル％の水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、５モル％のポリエチレングリコールジステアロイル−ホスホエタノールアミン（ｍ２０００ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、および４０モル％のコレステロールから構成された。脂質の初期充填濃度は、５０ｍＭであった。リポソームを形成するために、脂質を無水エタノールに溶解し、６５℃まで温め、１ｍＬの適切なバーコード化溶液に注入した。リポソームを、Ｌｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒにおいて８００、４００、２００、１００、８０ｎｍ、次いで８０、５０、５０ｎｍの孔径のポリカーボネート膜を使用して、２つの連続した段階的押出によって小型化した。押出後、動的光散乱を使用してサイズを測定した。多分散指数は０．０５〜０．０９であり、粒子サイズは９０±１０ｎｍであった。全てのリポソームがほぼ同じ粒径および同じ脂質組成を有したため、脂質濃度はこの場合も、リポソームの総数を測定する有効な方法であった。いくつかのリポソームは、押出および様々な治療薬の充填中に失われるため、充填後に脂質濃度を測定して、最終混合物が等しい数の各リポソームで生成されたことを確実にした（表１０を参照）。
【表９】
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【０１７０】
ドキソルビシン−ＨＣｌを、硫酸アンモニウム（１２０ｍＭ）勾配を介してリポソームに能動的に充填した一方で、ゲムシタビンおよびシスプラチンはそれぞれ、硫酸アンモニウム（１２０ｍＭ）および０．９％  ＮａＣｌに受動的に充填した。非封入バーコードおよび薬物を、それぞれ１０００ｋＤａおよび１２〜１４ｋＤａ  ＭＷカットオフ膜を使用して、透析によって除去した。リポソームを含有する最終薬物を、０．２μｍを介して濾過し、光から保護する冷蔵条件（２℃〜８℃）で保存した。
【０１７１】
様々なタイプのリポソームは、ほぼ等しい量の総リポソーム（３１：３３：３７）を有し、さらに、ドキソルビシンの１４倍のゲムシタビンおよびシスプラチンの７倍超のゲムシタビンを充填した。リポソーム混合物（ＬＰＭ）を、表１０に記載されるように、等しい数の３つ全てのリポソームで生成した。ドキソルビシン含有バッチが最も低い脂質濃度を有したため、より多くのこのタイプのリポソームを混合物に添加した（ゲムシタビンの１８．７８およびシスプラチンの１６．６７に対して２０ｕＬ）。添加されるリポソームの体積に薬物濃度を乗算することによって、ＭＴＤのパーセントが計算され得る。０．１％のＭＴＤが有効であることが分かったが、このＬＰＭは、ＭＴＤのおよそ１％を有するように設計された。混合物は等しいリポソーム数を考慮に入れて設計されたため、用量は完全に均一ではなかったが、全ての薬物はＭＴＤのほぼ１％であり、全てが０．１％閾値を超えており、したがって有効であるはずである。スクロース−ヒスチジン緩衝液（ｐＨ＝６．５）をリポソームの担体として使用し、腫瘍体積が約１００〜３００ｍｍ３に達したときに、１５０ｕＬの最終体積を各マウスの外側尾静脈に注射した。
【表１０】
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【０１７２】
ＬＰＭ注射後０、３、２４、４８、７２、９６、および２４０時間の時点で、動物を屠殺し、血液を大静脈から吸引した。腫瘍を選択された群から切除し、以下に記載されるような分析のためにＭＡＣＳ保存液中に保存した。関与した合計２３匹のマウスを以下の群に従って屠殺した。
【表１１】
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【０１７３】
屠殺後、各動物から０．５〜０．７ｍＬの血液を採取し、腫瘍を除去したとき、処理するか、または処理するまで光から保護された４℃のＭＡＣＳ組織保存液３ｍＬ中に保存した。血液試料を１０００×ｇで１５分間２回遠心分離して、乏血小板血漿を得た。血漿試料を後で処理するために凍結させた。ＤＮＡ抽出のために、試料を室温で解凍し、１００μＬを取っておき、残りの血漿を再凍結させた。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ）を製造業者の指示に従って使用して、バーコードを単離した（さらなる詳細については以下を参照）。溶出した試料を、直ちにリアルタイムＰＣＲ分析に供すか、または凍結させた。
【０１７４】
腫瘍組織を単一細胞懸濁液中で解離した後、細胞をカウントし、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）溶液またはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）のいずれかを使用して染色した。ＣＦＳＥ希釈標準溶液（２．５μｇ／μＬ）を１：１０００に希釈した（１ｍＬの単一細胞懸濁液中１μＬの希釈ＣＦＳＥ）。細胞を、３７℃で３０分間ＣＦＳＥと共にインキュベートし、続いてＲＰＭＩ中での洗浄（×３）後、選別した。ＰＩストック（ＳＩＧＭＡ）溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を、選別の１０〜１５分前に、１：２００に希釈した（１ｍＬの単一細胞懸濁液中５μＬのストックＰＩ）。ｆｌｏｗ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ（ＦＡＣＳＡＲＩＡ  ＩＩＩ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して細胞を選別し、ＦＡＣＳＤＩＶＡ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析し、生存に従って分離した。したがって、純粋な生細胞集団を得た。染色されていない細胞を陰性対照として使用した。
【０１７５】
リアルタイムＰＣＲ分析の前に、リポソーム、血液、および生細胞試料からの核酸抽出を行った。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔを製造業者（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）の指示に従って使用して、リポソームからの抽出を行った。生腫瘍細胞について、２００μＬのＰＢＳを、ＦＡＣＳ選別後に得られた細胞ペレットに添加した。核酸（バーコードおよびゲノムＤＮＡ）を、以下のようにＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔで抽出した。試料の溶解および結合条件の調整後、ならびにカラム上への装填前に、遠心分離ステップを標準プロトコルに追加して（１３，０００ｇで１分間）、試料から全ての固体デブリを除去した。これにより、カラムの詰まりの問題が回避される。試料を４０μＬの予加温したヌクレアーゼフリー水で溶出した。最終試料体積を記録した。２回の連続した溶出（３０μＬ、次いで１０μＬ）によって溶出を行い、最終溶出体積は３２μＬであった。
【０１７６】
バーコードを定量化するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、異なるバーコードを分析した。ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、プライマー（ＩＤＴ）、ならびに蛍光ＦＡＭ染料で５’末端、およびＭｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ｂｉｎｄｅｒ（ＭＧＢ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に結合した非蛍光クエンチャーでその３’末端が標識された特異的プローブを用いて、アッセイを実行した。バーコードコピー数の定量化のために、バーコードストック（１００μＭ）から始まる各バーコードの標準曲線を生成した。全ての希釈液の調製後、リアルタイムＰＣＲを使用して標準曲線を検証した。全てのバーコードについての反応を、以下の成分および設定と共に実行した。
【表１２】
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【表１３】
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【０１７７】
ＰＣＲ定量化を（標準曲線を使用して）バーコードコピー数に変換し、様々なバーコードの結果を図２Ａ〜Ｃに示す。注射の直後、血液中のバーコードの濃度は非常に高く、その後４日間にわたって着実に低下し、その時点でベースラインレベルに達する。一緒にプロットした３つ全てのバーコードの結果が図２Ｄに示される。シスプラチンはＤＮＡに結合し、ＰＣＲによる検出を部分的に阻害し得る。これは、注射のわずか３時間後のバーコード４のレベルの著しい低下を説明している。それにもかかわらず、循環バーコードのレベルの減少の同じ傾向は、３つ全てのリポソームタイプで見ることができる。有意に、バーコード４は、１９２時間でバーコードコピー数のわずかな増加を示したが、他の２つは示さなかった（図２Ｄ）。新しいバーコード源を動物に投与しなかったため、バーコード数の増加は有意である。むしろ、この増加は、シスプラチンに感受性であったアポトーシス細胞に起因する可能性が高く、これは死滅後、液体生検においてその後検出可能であったｃｆｔＤＮＡとして、循環にバーコード４を放出した。これは、液体生検が対象における薬物有効性のセラノスティックモニタリングのための有効な方法であることを証明する。
【０１７８】
本発明は、その特定の実施形態と併せて説明されてきたが、多くの代替、修正、および変更が当業者には明白であろうことは明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広範な範囲内に入るそのような全ての代替、修正、および変更を包含することが意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【国際調査報告】
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