(57)【要約】Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）、１つ以上のＭＵＣ１６  ＴＦＰまたはＩＬ１３Ｒα２  ＴＦＰまたはＭＳＬＮ  ＴＦＰを発現するように操作されたＴ細胞、及び疾患（がんを含む）を治療するためのその使用方法が本明細書で提供される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｉ）ヒト対象に由来するＴ細胞であって、前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子を含み、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、
（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び
（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗ＭＵＣ１６結合ドメインを含む抗原結合ドメインと、
を含む、
前記Ｔ細胞、ならびに
（ＩＩ）医薬的に許容可能な担体
を含む医薬組成物であって、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗ＭＵＣ１６結合ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記ＴＦＰが、前記Ｔ細胞に発現すると、ＴＣＲと機能的に相互作用する、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記抗ＭＵＣ１６結合ドメインをコードする配列が、リンカーをコードする配列によって、前記ＴＣＲ細胞外ドメインをコードする配列に連結される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記リンカーが、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、Ｇが、グリシンであり、Ｓが、セリンであり、ｎが、１〜４の整数である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗ＭＵＣ１６結合ドメインが、
（ｉ）重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１配列（ＧＲＴＶＳＳＬＦ、ＧＲＡＶＳＳＬＦ、またはＧＤＳＬＤＧＹＶ）と、
（ｉｉ）ＨＣ  ＣＤＲ２配列（ＩＳＲＹＳＬＹＴまたはＩＳＧＤＧＳＭＲ）と、
（ｉｉｉ）ＨＣ  ＣＤＲ３配列（ＡＳＫＬＥＹＴＳＮＤＹＤＳまたはＡＡＤＰＰＴＷＤＹ）と、
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗ＭＵＣ１６結合ドメインが、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、または配列番号４０の配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物が、血清を実質的に含まない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記抗原結合ドメインが、単一ドメイン抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記単一ドメイン抗体が、ＶＨドメインである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
コードされる前記抗ＭＵＣ１６結合ドメインが、抗ＭＵＣ１６結合ドメインを含み、前記Ｔ細胞の細胞傷害活性が、（ａ）前記抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、（ｂ）ＣＤ２８細胞外ドメインの少なくとも一部、（ｃ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、（ｄ）ＣＤ２８細胞内ドメインの少なくとも一部、及び（ｅ）ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを含み、前記抗ＭＵＣ１６結合ドメインが、前記ＣＤ２８細胞外ドメインの少なくとも一部に機能可能なように連結されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、高いか、またはより効率的である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
コードされるＴＦＰ分子が、前記Ｔ細胞に発現すると、内在性のＴＣＲ複合体、少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチド、またはそれらの組み合わせと機能的に相互作用する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記Ｔ細胞が、初代Ｔ細胞である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記Ｔ細胞が、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞が、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記Ｔ細胞が、ＰＤ−１及びＢＴＬＡからなる群から選択される抑制分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、前記抑制分子の少なくとも一部が、正のシグナルを生成する、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の第２のポリペプチドと結び付けられる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記第２のポリペプチドが、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＣＤ３ζ、４１−ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、及びＢ７−Ｈ３からなる群から選択されるタンパク質に由来する共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞によるＩＬ−２またはＩＦＮγの産生が、前記ＴＦＰを含まないＴ細胞と比較して、前記抗ＭＵＣ１６結合ドメインと特異的に相互作用する抗原を発現する細胞の存在下で増加する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記細胞が、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であり、前記集団の個々のＴ細胞が、少なくとも２つのＴＦＰ分子を含むか、または前記集団の少なくとも２種類のＴ細胞が、少なくとも２つのＴＦＰ分子を集合的に含み、前記少なくとも２つのＴＦＰ分子が、抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記少なくとも２つのＴＦＰ分子の少なくとも１つが、内在性のＴＣＲ複合体、少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチド、またはそれらの組み合わせと機能的に相互作用する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＣＤ３イプシロンのみに由来する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＣＤ３ガンマのみに由来する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＣＤ３デルタのみに由来する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記ＴＣＲサブユニットの前記ＴＣＲ細胞外ドメイン、前記ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び前記ＴＣＲ細胞内ドメインが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタに由来する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記ＴＣＲサブユニットの前記ＴＣＲ細胞外ドメイン、前記ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び前記ＴＣＲ細胞内ドメインが、ＴＣＲ複合体の単一のサブユニットに由来し、前記単一のサブユニットが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記Ｔ細胞が、前記ＴＦＰを含まないＴ細胞と比較して、前記抗ＭＵＣ１６結合ドメインと特異的に相互作用する抗原を発現する細胞に対して、増強された細胞傷害性を示す、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法であって、前記方法が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子で形質導入されたＴ細胞の集団を有効量で前記哺乳類に投与することを含み、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＴＣＲ細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗ＭＵＣ１６結合ドメインである抗原結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記ＴＦＰが、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれ、
同じ抗体ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞で治療された哺乳類のサイトカインのレベルと比較して、治療後に放出される前記サイトカインのレベルが低い、前記方法。
【請求項２６】
前記抗体ドメインが、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、または配列番号４０に示される配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％であるＶＨＨドメインである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が、自家Ｔ細胞である、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、同種異系Ｔ細胞である、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ＭＵＣ１６の発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、前記方法が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子で形質導入されたＴ細胞の集団を有効量で前記哺乳類に投与することを含み、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＴＣＲ細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗ＭＵＣ１６結合ドメインである抗原結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記ＴＦＰが、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれ、
同じ抗体ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞で治療された哺乳類のサイトカインのレベルと比較して、治療後に放出される前記サイトカインのレベルが低い、前記方法。
【請求項３１】
前記抗体ドメインが、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、または配列番号４０に示される配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％であるＶＨＨドメインである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が、自家Ｔ細胞である、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が、同種異系Ｔ細胞である、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＴＦＰの前記ＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ膜貫通ドメインをさらに含む、請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＴＣＲ細胞外ドメイン、前記ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び前記ＴＣＲ細胞内ドメインが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタに由来する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＴＣＲサブユニットの前記ＴＣＲ細胞外ドメイン、前記ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び前記ＴＣＲ細胞内ドメインが、ＴＣＲ複合体の単一のサブユニットに由来し、前記単一のサブユニットが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＴＣＲ細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３イプシロンまたはＣＤ３ガンマに由来する、請求項２５〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
ＭＵＣ１６の発現と関連する前記疾患が、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、及びＭＵＣ１６の発現と関連する非がん関連徴候からなる群から選択される、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患が、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、肝癌、膵癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿管癌、腎癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、胸腺癌、胆管癌、胃癌、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるがんである、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患が、中皮腫、漿液性乳頭状卵巣腺癌、卵巣明細胞癌、混合型ミュラー管卵巣癌、類内膜粘液性卵巣癌、膵臓腺癌、膵管腺癌、子宮体部漿液性腺癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳腺癌、ＭＵＣ１６の発現と関連する疾患、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるがんである、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
ＴＦＰ分子を発現する前記細胞が、ＴＦＰ分子を発現する細胞の有効性を高める薬剤と組み合わせて投与される、請求項３０〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
所与のサイトカインについて、前記同じ抗体ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞で治療された哺乳類の前記所与のサイトカインの量と比較して、治療後に放出される前記所与のサイトカインの量が少なくとも１０％少ない、請求項２５〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記所与のサイトカインが、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ｓＣＤ１３７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のサイトカインを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記哺乳類における腫瘍増殖が抑制され、その結果、前記ＴＦＰを発現するＴ細胞で治療された前記哺乳類と、前記ＴＦＰを発現しないＴ細胞で治療された前記哺乳類とが、少なくとも８日間の治療の前に同じ腫瘍サイズを有した場合、前記治療の後に、前記腫瘍のサイズが、前記ＴＦＰを発現しない前記Ｔ細胞で治療された前記哺乳類における腫瘍のサイズの最大でも１０％、最大でも２０％、最大でも３０％、最大でも４０％、最大でも５０％、または最大でも６０％である、請求項２５〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記哺乳類における前記腫瘍増殖が完全に抑制される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記哺乳類における前記腫瘍増殖が、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間、少なくとも４０日間、少なくとも５０日間、少なくとも６０日間、少なくとも７０日間、少なくとも８０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１００日間、またはそれを超える期間、完全に抑制される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＴＦＰで形質導入された前記Ｔ細胞の集団が、前記同じ抗体ドメインを含む前記ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して同様の量の腫瘍細胞を死滅させる、請求項２５〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＴＦＰで形質導入された前記Ｔ細胞の集団が、前記同じ抗体ドメインを含む前記ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して異なる遺伝子発現プロファイルを有する、請求項２５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
遺伝子の発現レベルが、前記同じ抗体ドメインを含む前記ＣＡＲ−Ｔ細胞における前記遺伝子の発現レベルと比較して、前記ＴＦＰで形質導入された前記Ｔ細胞では異なる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記遺伝子が、抗原提示、ＴＣＲシグナル伝達、ホメオスタシス、代謝、ケモカインシグナル伝達、サイトカインシグナル伝達、ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達、ＭＭＰ及び接着分子シグナル伝達、またはＴＮＦＲ関連シグナル伝達において機能を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＣＤ３イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗ＭＵＣ１６結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記ＴＦＰが、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれる、前記組換え核酸分子。
【請求項５２】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＣＤ３ガンマの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン、
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗ＭＵＣ１６結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記ＴＦＰが、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれる、前記組換え核酸分子。
【請求項５３】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗ＭＵＣ１６結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記ＴＦＰが、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれる、前記組換え核酸分子。
【請求項５４】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＴＣＲアルファ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗ＭＵＣ１６結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記ＴＦＰが、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれる、前記組換え核酸分子。
【請求項５５】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＴＣＲベータ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗ＭＵＣ１６結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記ＴＦＰが、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれる、前記組換え核酸分子。
【請求項５６】
前記抗体ドメインが、ヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインである、請求項５１〜５５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項５７】
コードされる抗原結合ドメインが、リンカー配列によって前記ＴＣＲ細胞外ドメインに連結される、請求項５１〜５６のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項５８】
コードされる前記リンカー配列が、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜４）を含む、請求項５７に記載の組換え核酸分子。
【請求項５９】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ細胞外ドメインを含む、請求項５１〜５８のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項６０】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ膜貫通ドメインを含む、請求項５１〜５９のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項６１】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ細胞内ドメインを含む、請求項５１〜６０のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項６２】
前記ＴＣＲサブユニットが、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインと、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインと、を含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つが、同じＴＣＲサブユニットに由来する、請求項５１〜６１のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項６３】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、もしくはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれに対する少なくとも１つの改変を有するアミノ酸配列、から選択される刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む、請求項５１〜６２のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項６４】
前記ＴＣＲサブユニットが、４−１ＢＢの機能性シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ゼータの機能性シグナル伝達ドメイン、あるいはそれに対する少なくとも１つの改変を有するアミノ酸配列、から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む、請求項５１〜６３のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項６５】
前記抗体ドメインが、抗体断片を含む、請求項５１〜６４のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項６６】
前記抗体ドメインが、ｓｃＦｖまたはＶＨドメインを含む、請求項５１〜６５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項６７】
（ｉ）重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１配列（ＧＲＴＶＳＳＬＦ、ＧＲＡＶＳＳＬＦ、またはＧＤＳＬＤＧＹＶ）と、
（ｉｉ）ＨＣ  ＣＤＲ２配列（ＩＳＲＹＳＬＹＴまたはＩＳＧＤＧＳＭＲ）と、
（ｉｉｉ）ＨＣ  ＣＤＲ３配列（ＡＳＫＬＥＹＴＳＮＤＹＤＳまたはＡＡＤＰＰＴＷＤＹ）と、
をコードする、請求項５１〜６６のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項６８】
配列番号１５、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、または配列番号４０に示される配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である重鎖可変ドメインをコードする、請求項５１〜６７のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項６９】
前記ＴＦＰが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、その機能性断片、及び１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、ＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインを含む、請求項５１〜６８のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項７０】
コードされる前記ＴＦＰが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、その機能性断片、及び１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、請求項５１〜６９のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項７１】
コードされる前記ＴＦＰが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、その機能性断片、及び１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、請求項５１〜７０のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項７２】
共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む、請求項５１〜７１のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項７３】
前記共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ならびにそれに対する１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能性シグナル伝達ドメインである、請求項７２に記載の組換え核酸分子。
【請求項７４】
前記それに対する１〜２０個の改変が、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の改変、または前記ＴＦＰに対するリガンド結合に応じてリン酸化されるアミノ酸の改変を含む、請求項５１〜７３のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項７５】
単離された核酸分子が、ｍＲＮＡである、請求項５１〜７４のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項７６】
前記ＴＦＰが、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＴＣＲゼータ鎖、Ｆｃイプシロン受容体１鎖、Ｆｃイプシロン受容体２鎖、Ｆｃガンマ受容体１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃガンマ受容体３ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体３ｂ鎖、Ｆｃベータ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、その機能性断片、及びそれに対する１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部を含む、ＴＣＲサブユニットのＩＴＡＭを含む、請求項５１〜７５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項７７】
前記ＩＴＡＭによって、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはＣＤ３イプシロンのＩＴＡＭが交換される、請求項７６に記載の組換え核酸分子。
【請求項７８】
前記ＩＴＡＭが、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択され、前記ＩＴＡＭによって、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択される異なるＩＴＡＭが交換される、請求項７６に記載の組換え核酸分子。
【請求項７９】
前記核酸が、ヌクレオチド類似体を含む、請求項５１〜７８のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項８０】
前記ヌクレオチド類似体が、２’−Ｏ−メチル修飾を受けたもの、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾を受けたもの、２’−デオキシ修飾を受けたもの、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ修飾を受けたもの、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）修飾を受けたもの、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾を受けたもの、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される、請求項７９に記載の組換え核酸分子。
【請求項８１】
リーダー配列をさらに含む、請求項５１〜８０のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項８２】
請求項５１〜８１のいずれか１項に記載の組換え核酸分子によってコードされる、組換えポリペプチド分子。
【請求項８３】
抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、組換えＴＦＰ分子。
【請求項８４】
抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換えＴＦＰ分子であって、前記ＴＦＰ分子が、内在性のＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する、前記組換えＴＦＰ分子。
【請求項８５】
抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換えＴＦＰ分子であって、前記ＴＦＰ分子が、内在性のＴＣＲ複合体に機能的に組み込まれる能力を有する、前記組換えＴＦＰ分子。
【請求項８６】
抗ＭＵＣ１６結合ドメインを含む抗体または抗体断片、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、請求項８３に記載の組換えＴＦＰ分子。
【請求項８７】
前記抗ＭＵＣ１６結合ドメインが、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、またはＶＨドメインである、請求項８３〜８６のいずれか１項に記載の組換えＴＦＰ分子。
【請求項８８】
前記抗ＭＵＣ１６結合ドメインが、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、もしくは配列番号４０のアミノ酸配列との同一性が９５〜１００％である重鎖、その機能性断片、または１〜３０個の改変を有するそのアミノ酸配列を含む、請求項８３〜８７のいずれか１項に記載の組換えＴＦＰ分子。
【請求項８９】
ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、その機能性断片、及び１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むＴＣＲ細胞外ドメインを含む、請求項８３〜８８のいずれか１項に記載の組換えＴＦＰ分子。
【請求項９０】
前記抗ＭＵＣ１６結合ドメインが、リンカー配列によって前記ＴＣＲ細胞外ドメインに連結される、請求項８３〜８９のいずれか１項に記載の組換えＴＦＰ分子。
【請求項９１】
前記リンカー領域が、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜４）を含む、請求項９０に記載の組換えＴＦＰ分子。
【請求項９２】
請求項８３〜９１のいずれか１項に記載のＴＦＰをコードする配列を含む、核酸。
【請求項９３】
前記核酸が、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される、請求項９２に記載の核酸。
【請求項９４】
前記核酸が、ｍＲＮＡである、請求項９２または請求項９３に記載の核酸。
【請求項９５】
前記核酸が、ヌクレオチド類似体を含む、請求項９２〜９４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９６】
前記ヌクレオチド類似体が、２’−Ｏ−メチル修飾を受けたもの、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾を受けたもの、２’−デオキシ修飾を受けたもの、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ修飾を受けたもの、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）修飾を受けたもの、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾を受けたもの、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される、請求項９５に記載の核酸。
【請求項９７】
プロモーターをさらに含む、請求項９２〜９６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９８】
前記核酸が、インビトロで転写された核酸である、請求項９２〜９７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９９】
前記核酸が、ポリ（Ａ）尾部をコードする配列をさらに含む、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１００】
前記核酸が、３’ＵＴＲ配列をさらに含む、請求項９２〜９９のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０１】
請求項８３〜１００のいずれか１項に記載のＴＦＰをコードする核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１０２】
前記ベクターが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１０１に記載のベクター。
【請求項１０３】
プロモーターをさらに含む、請求項１０１または請求項１０２に記載のベクター。
【請求項１０４】
前記ベクターが、インビトロで転写されるベクターである、請求項１０１〜１０３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１０５】
前記ベクター中の核酸配列が、ポリ（Ａ）尾部をさらに含む、請求項１０１〜１０４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１０６】
前記ベクター中の核酸配列が、３’ＵＴＲをさらに含む、請求項１０１〜１０５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１０７】
請求項５１〜８１のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、請求項８２に記載のポリペプチド分子、請求項８３〜９１のいずれか１項に記載のＴＦＰ分子、請求項９２〜１００のいずれか１項に記載の核酸、請求項１０１〜１０６のいずれか１項に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１０８】
前記細胞が、ヒトＴ細胞である、請求項１０７に記載の細胞。
【請求項１０９】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項１０８に記載の細胞。
【請求項１１０】
正のシグナルを生成する、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の第２のポリペプチドと結び付いた、抑制分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む、請求項１０７〜１０９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１１１】
前記抑制分子が、ＰＤ１の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドと、を含む、請求項１１０に記載の細胞。
【請求項１１２】
少なくとも２つのＴＦＰ分子を含むヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞であって、前記ＴＦＰ分子が、抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記ＴＦＰ分子が、前記ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞または前記ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の中、特定位置、及び／または表面上の内在性のＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する、前記ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞または前記ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞。
【請求項１１３】
ｉ）抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子と、
ｉｉ）少なくとも１つの内在性のＴＣＲサブユニットまたは内在性のＴＣＲ複合体と、
を含む、タンパク質複合体。
【請求項１１４】
前記ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、請求項１１３に記載のタンパク質複合体。
【請求項１１５】
前記抗ＭＵＣ１６結合ドメインが、リンカー配列によって前記ＴＣＲ細胞外ドメインに連結される、請求項１１３または請求項１１４に記載のタンパク質複合体。
【請求項１１６】
前記リンカー領域が、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜４）を含む、請求項１１５に記載のタンパク質複合体。
【請求項１１７】
（ａ）請求項５１〜８１のいずれか１項に記載の組換え核酸分子によってコードされるＴＦＰと、
（ｂ）少なくとも１つの内在性のＴＣＲサブユニットまたは内在性のＴＣＲ複合体と、
を含む、タンパク質複合体。
【請求項１１８】
ｉ）抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子と、
ｉｉ）少なくとも１つの内在性のＴＣＲサブユニットまたは内在性のＴＣＲ複合体と、
を含む、タンパク質複合体。
【請求項１１９】
前記ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、請求項１１８に記載のタンパク質複合体。
【請求項１２０】
前記抗ＭＵＣ１６結合ドメインが、リンカー配列によって前記ＴＣＲ細胞外ドメインに連結される、請求項１１８または請求項１１９に記載のタンパク質複合体。
【請求項１２１】
前記リンカー領域が、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜４）を含む、請求項１２０に記載のタンパク質複合体。
【請求項１２２】
請求項１１３〜１２１のいずれか１項に記載のタンパク質複合体当たり少なくとも２つの異なるＴＦＰタンパク質を含む、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞。
【請求項１２３】
請求項５１〜８１のいずれか１項に記載の単離された核酸分子によってコードされる少なくとも２つの異なるＴＦＰ分子を含む、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞。
【請求項１２４】
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、前記集団の前記Ｔ細胞が、少なくとも２つのＴＦＰ分子を個々または集合的に含み、前記ＴＦＰ分子が、抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記ＴＦＰ分子が、前記ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞または前記ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の中、特定位置、及び／または表面上の内在性のＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する、前記集団。
【請求項１２５】
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、前記集団の前記Ｔ細胞が、請求項５１〜８１のいずれか１項に記載の組換え核酸分子によってコードされる少なくとも２つのＴＦＰ分子を個々または集合的に含む、前記集団。
【請求項１２６】
細胞を調製する方法であって、前記方法が、請求項５１〜８１のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、請求項９２〜１００のいずれか１項に記載の核酸、または請求項１０１〜１０６のいずれか１項に記載のベクターでＴ細胞の形質導入を行うことを含む、前記方法。
【請求項１２７】
ＲＮＡで操作された細胞の集団を生成させる方法であって、前記方法が、インビトロで転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含み、前記ＲＮＡが、請求項８３〜９１のいずれか１項に記載のＴＦＰ分子をコードする核酸を含む、前記方法。
【請求項１２８】
哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法であって、前記方法が、請求項５１〜８１のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、請求項８２に記載のポリペプチド分子、請求項８２に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項８３〜９１のいずれか１項に記載のＴＦＰ分子、請求項９２〜１００のいずれか１項に記載の核酸、請求項１０１〜１０６のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１０７〜１１２及び請求項１２２〜１２６のいずれか１項に記載の細胞、を有効量で前記哺乳類に投与することを含む、前記方法。
【請求項１２９】
前記細胞が、自家Ｔ細胞である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記細胞が、同種異系Ｔ細胞である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項１２８〜１３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３２】
ＭＵＣ１６の発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、前記方法が、請求項５１〜８１のいずれか１項に記載の単離された核酸分子、請求項８２に記載のポリペプチド分子、請求項８２に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項８３〜９１のいずれか１項に記載のＴＦＰ分子、請求項９２〜１００のいずれか１項に記載の核酸、請求項１０１〜１０６のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１０７〜１１２及び請求項１２２〜１２５のいずれか１項に記載の細胞、を有効量で前記哺乳類に投与することを含む、前記方法。
【請求項１３３】
ＭＵＣ１６の発現と関連する前記疾患が、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、前白血病、ＭＵＣ１６の発現と関連する非がん関連徴候からなる群から選択される、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記疾患が、膵癌、卵巣癌、乳癌、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３５】
ＴＦＰ分子を発現する前記細胞が、ＴＦＰ分子を発現する細胞の有効性を高める薬剤と組み合わせて投与される、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３６】
前記哺乳類において放出されるサイトカインが、抗ＭＵＣ１６キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞が有効量で投与された哺乳類と比較して少ない、請求項１３２〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
ＴＦＰ分子を発現する前記細胞が、ＴＦＰ分子を発現する細胞の投与と関連する１つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される、請求項１３２〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
ＴＦＰ分子を発現する前記細胞が、ＭＵＣ１６と関連する前記疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される、請求項１３２〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
薬剤として使用するための、請求項５１〜８１のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、請求項８２に記載のポリペプチド分子、請求項８２に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項８３〜９１のいずれか１項に記載の組換えＴＦＰ、請求項９２〜１００のいずれか１項に記載の核酸、請求項１０１〜１０６のいずれか１項に記載のベクター、請求項１１３〜１２１のいずれか１項に記載の複合体、または請求項１０７〜１１２及び請求項１２２〜１２５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１４０】
ＭＵＣ１６の発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、前記方法が、請求項５１〜８１のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、請求項８２に記載のポリペプチド分子、請求項８２に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項８３〜９１のいずれか１項に記載の組換えＴＦＰ分子、請求項９２〜１００のいずれか１項に記載の核酸、請求項１０１〜１０６のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１０７〜１１２及び請求項１２２〜１２５のいずれか１項に記載の細胞、を有効量で前記哺乳類に投与することを含み、前記哺乳類において放出されるサイトカインが、抗ＭＵＣ１６キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞が有効量で投与された哺乳類と比較して少ない、前記方法。
【請求項１４１】
（Ｉ）ヒト対象に由来するＴ細胞であって、前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子を含み、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、
（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び
（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインを含む抗原結合ドメインと、
を含む、
前記Ｔ細胞、ならびに
（ＩＩ）医薬的に許容可能な担体
を含む医薬組成物であって、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記ＴＦＰが、前記Ｔ細胞に発現すると、ＴＣＲと機能的に相互作用する、前記医薬組成物。
【請求項１４２】
前記ＴＣＲサブユニットの前記ＴＣＲ細胞外ドメイン、前記ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び前記ＴＣＲ細胞内ドメインが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、またはＣＤ３ガンマに由来する、請求項１４１に記載の医薬組成物。
【請求項１４３】
前記ＴＣＲサブユニットの前記ＴＣＲ細胞外ドメイン、前記ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び前記ＴＣＲ細胞内ドメインが、ＴＣＲ複合体の単一のサブユニットに由来し、前記単一のサブユニットが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタである、請求項１４１に記載の医薬組成物。
【請求項１４４】
前記Ｔ細胞が、前記ＴＦＰを含まないＴ細胞と比較して、前記抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインと特異的に相互作用する抗原を発現する細胞に対して、増強された細胞傷害性を示す、請求項１４１〜１４３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４５】
前記抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインをコードする配列が、リンカーをコードする配列によって、前記ＴＣＲ細胞外ドメインをコードする配列に連結される、請求項１４１〜１４４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４６】
前記リンカーが、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、Ｇが、グリシンであり、Ｓが、セリンであり、ｎが、１〜４の整数である、請求項１４５に記載の医薬組成物。
【請求項１４７】
前記抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインが、
（ｉ）重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１配列（ＧＦＴＳＤＹＹＩまたはＧＦＡＳＤＤＹＩ）と、
（ｉｉ）ＨＣ  ＣＤＲ２配列（ＩＳＳＫＹＡＮＴまたはＩＳＳＲＹＡＮＴ）と、
（ｉｉｉ）ＨＣ  ＣＤＲ３配列（ＡＡＤＴＲＲＹＴＣＰＤＩＡＴＭＨＲＮＦＤＳまたはＡＭＤＳＲＲＶＴＣＰＥＩＳＴＭＨＲＮＦＤＳ）と、
を含む、請求項１４１〜１４６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４８】
前記抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインが、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７１、または配列番号７６の配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である配列を含む、請求項１４１〜１４７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４９】
前記配列同一性が、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長６、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、存在ペナルティ１１、及び伸長ペナルティ１が使用される、請求項１４８に記載の医薬組成物。
【請求項１５０】
前記医薬組成物が、血清を実質的に含まない、請求項１４１〜１４８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５１】
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項１４１〜１５０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５２】
前記抗原結合ドメインが、単一ドメイン抗体である、請求項１４１〜１５０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５３】
前記単一ドメイン抗体が、ＶＨドメインである、請求項１５２に記載の医薬組成物。
【請求項１５４】
前記コードされる抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインが、抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインを含み、前記Ｔ細胞の細胞傷害活性が、（ａ）前記抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメイン、（ｂ）ＣＤ２８細胞外ドメインの少なくとも一部、（ｃ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、（ｄ）ＣＤ２８細胞内ドメインの少なくとも一部、及び（ｅ）ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを含み、前記抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインが、前記ＣＤ２８細胞外ドメインの少なくとも一部に機能可能なように連結されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、高いか、またはより効率的である、請求項１４１〜１５３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５５】
前記コードされるＴＦＰ分子が、前記Ｔ細胞に発現すると、内在性のＴＣＲ複合体、少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチド、またはそれらの組み合わせと機能的に相互作用する、請求項１４１〜１５４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５６】
前記Ｔ細胞が、初代Ｔ細胞である、請求項１４１〜１５５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５７】
前記Ｔ細胞が、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項１４１〜１５６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５８】
前記Ｔ細胞が、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１４１〜１５６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５９】
前記Ｔ細胞が、ＰＤ−１及びＢＴＬＡからなる群から選択される抑制分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、前記抑制分子の少なくとも一部が、正のシグナルを生成する、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の第２のポリペプチドと結び付けられる、請求項１４１〜１５８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６０】
前記第２のポリペプチドが、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＣＤ３ζ、４１−ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、及びＢ７−Ｈ３からなる群から選択されるタンパク質に由来する共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項１５９に記載の医薬組成物。
【請求項１６１】
前記Ｔ細胞によるＩＬ−２またはＩＦＮγの産生が、前記ＴＦＰを含まないＴ細胞と比較して、前記抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインと特異的に相互作用する抗原を発現する細胞の存在下で増加する、請求項１４１〜１６０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６２】
前記細胞が、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であり、前記集団の個々のＴ細胞が、少なくとも２つのＴＦＰ分子を含むか、または前記集団の少なくとも２種類のＴ細胞が、少なくとも２つのＴＦＰ分子を集合的に含み、前記少なくとも２つのＴＦＰ分子が、抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記少なくとも２つのＴＦＰ分子の少なくとも１つが、内在性のＴＣＲ複合体、少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチド、またはそれらの組み合わせと機能的に相互作用する、請求項１４１〜１６１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６３】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＣＤ３イプシロンのみに由来する、請求項１４１〜１６２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６４】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＣＤ３ガンマのみに由来する、請求項１４１〜１６２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６５】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＣＤ３デルタのみに由来する、請求項１４１〜１６２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６６】
哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法であって、前記方法が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子で形質導入されたＴ細胞の集団を有効量で前記哺乳類に投与することを含み、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＴＣＲ細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインである抗原結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記ＴＦＰが、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれ、
同じ抗体ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞で治療された哺乳類のサイトカインのレベルと比較して、治療後に放出される前記サイトカインのレベルが低い、前記方法。
【請求項１６７】
前記抗体ドメインが、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７１、または配列番号７６に示される配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％であるＶＨＨドメインである、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
前記配列同一性が、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長６、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、存在ペナルティ１１、及び伸長ペナルティ１が使用される、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記細胞が、自家Ｔ細胞である、請求項１６６〜１６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７０】
前記細胞が、同種異系Ｔ細胞である、請求項１６６〜１６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７１】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項１６６〜１７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７２】
ＩＬ１３Ｒα２の発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、前記方法が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子で形質導入されたＴ細胞の集団を有効量で前記哺乳類に投与することを含み、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＴＣＲ細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインである抗原結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記ＴＦＰが、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれ、
同じ抗体ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞で治療された哺乳類のサイトカインのレベルと比較して、治療後に放出される前記サイトカインのレベルが低い、前記方法。
【請求項１７３】
前記抗体ドメインが、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７１、または配列番号７６に示される配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％であるＶＨＨドメインである、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
前記配列同一性が、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長６、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、存在ペナルティ１１、及び伸長ペナルティ１が使用される、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記細胞が、自家Ｔ細胞である、請求項１７２〜１７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７６】
前記細胞が、同種異系Ｔ細胞である、請求項１７２〜１７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記ＴＦＰの前記ＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１６６〜１７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７８】
前記ＴＣＲ細胞外ドメイン、前記ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び前記ＴＣＲ細胞内ドメインが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタに由来する、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
前記ＴＣＲサブユニットの前記ＴＣＲ細胞外ドメイン、前記ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び前記ＴＣＲ細胞内ドメインが、ＴＣＲ複合体の単一のサブユニットに由来し、前記単一のサブユニットが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタである、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１８０】
前記ＴＣＲ細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３イプシロンまたはＣＤ３ガンマに由来する、請求項１６６〜１７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８１】
ＩＬ１３Ｒα２の発現と関連する前記疾患が、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、及びＩＬ１３Ｒα２の発現と関連する非がん関連徴候からなる群から選択される、請求項１７２〜１８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８２】
前記疾患が、神経膠芽腫、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、肝癌、膵癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿管癌、腎癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、胸腺癌、胆管癌、胃癌、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるがんである、請求項１７２〜１８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８３】
前記疾患が、神経膠芽腫、中皮腫、漿液性乳頭状卵巣腺癌、卵巣明細胞癌、混合型ミュラー管卵巣癌、類内膜粘液性卵巣癌、膵臓腺癌、膵管腺癌、子宮体部漿液性腺癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳腺癌、ＩＬ１３Ｒα２の発現と関連する疾患、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるがんである、請求項１７２〜１８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８４】
ＴＦＰ分子を発現する前記細胞が、ＴＦＰ分子を発現する細胞の有効性を高める薬剤と組み合わせて投与される、請求項１６６〜１８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８５】
所与のサイトカインについて、前記同じ抗体ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞で治療された哺乳類の前記所与のサイトカインの量と比較して、治療後に放出される前記所与のサイトカインの量が少なくとも１０％少ない、請求項１６６〜１８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８６】
前記所与のサイトカインが、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ｓＣＤ１３７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のサイトカインを含む、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
前記哺乳類における腫瘍増殖が抑制され、その結果、前記ＴＦＰを発現するＴ細胞で治療された前記哺乳類と、前記ＴＦＰを発現しないＴ細胞で治療された哺乳類とが、少なくとも８日間の治療の前に同じ腫瘍サイズを有した場合、前記治療の後に、前記腫瘍のサイズが、前記ＴＦＰを発現しない前記Ｔ細胞で治療された前記哺乳類における腫瘍のサイズの最大でも１０％、最大でも２０％、最大でも３０％、最大でも４０％、最大でも５０％、または最大でも６０％である、請求項１６６〜１８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８８】
前記哺乳類における前記腫瘍増殖が完全に抑制される、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
前記哺乳類における前記腫瘍増殖が、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間、少なくとも４０日間、少なくとも５０日間、少なくとも６０日間、少なくとも７０日間、少なくとも８０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１００日間、またはそれを超える期間、完全に抑制される、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記ＴＦＰで形質導入された前記Ｔ細胞の集団が、前記同じ抗体ドメインを含む前記ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して同様の量の腫瘍細胞を死滅させる、請求項１６６〜１８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９１】
前記ＴＦＰで形質導入された前記Ｔ細胞の集団が、前記同じ抗体ドメインを含む前記ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して異なる遺伝子発現プロファイルを有する、請求項１６６〜１９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９２】
遺伝子の発現レベルが、前記同じ抗体ドメインを含む前記ＣＡＲ−Ｔ細胞における前記遺伝子の発現レベルと比較して、前記ＴＦＰで形質導入された前記Ｔ細胞では異なる、請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
前記遺伝子が、抗原提示、ＴＣＲシグナル伝達、ホメオスタシス、代謝、ケモカインシグナル伝達、サイトカインシグナル伝達、ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達、ＭＭＰ及び接着分子シグナル伝達、またはＴＮＦＲ関連シグナル伝達において機能を有する、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＣＤ３イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記ＴＦＰが、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれる、前記組換え核酸分子。
【請求項１９５】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＣＤ３ガンマの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン、
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記ＴＦＰが、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれる、前記組換え核酸分子。
【請求項１９６】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記ＴＦＰが、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれる、前記組換え核酸分子。
【請求項１９７】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＴＣＲアルファの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記ＴＦＰが、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれる、前記組換え核酸分子。
【請求項１９８】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＴＣＲベータの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記ＴＦＰが、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれる、前記組換え核酸分子。
【請求項１９９】
前記抗体ドメインが、ヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインである、請求項１９４〜１９８のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２００】
前記コードされる抗原結合ドメインが、リンカー配列によって前記ＴＣＲ細胞外ドメインに連結される、請求項１９４〜１９９のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２０１】
前記コードされるリンカー配列が、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜４）を含む、請求項２００に記載の組換え核酸分子。
【請求項２０２】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ細胞外ドメインを含む、請求項１９４〜２０１のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２０３】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ膜貫通ドメインを含む、請求項１９４〜２０２のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２０４】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ細胞内ドメインを含む、請求項１９４〜２０３のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２０５】
前記ＴＣＲサブユニットが、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインと、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインと、を含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つが、同じＴＣＲサブユニットに由来する、請求項１９４〜２０４のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２０６】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、もしくはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれに対する少なくとも１つの改変を有するアミノ酸配列、から選択される刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む、請求項１９４〜２０５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２０７】
前記ＴＣＲサブユニットが、４−１ＢＢの機能性シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ゼータの機能性シグナル伝達ドメイン、あるいはそれに対する少なくとも１つの改変を有するアミノ酸配列、から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む、請求項１９４〜２０６のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２０８】
前記抗体ドメインが、抗体断片を含む、請求項１９４〜２０７のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２０９】
前記抗体ドメインが、ｓｃＦｖまたはＶＨドメインを含む、請求項１９４〜２０８のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２１０】
（ｉ）重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１配列（ＧＦＴＳＤＹＹＩまたはＧＦＡＳＤＤＹＩ）と、
（ｉｉ）ＨＣ  ＣＤＲ２配列（ＩＳＳＫＹＡＮＴまたはＩＳＳＲＹＡＮＴ）と、
（ｉｉｉ）ＨＣ  ＣＤＲ３配列（ＡＡＤＴＲＲＹＴＣＰＤＩＡＴＭＨＲＮＦＤＳまたはＡＭＤＳＲＲＶＴＣＰＥＩＳＴＭＨＲＮＦＤＳ）と、
をコードする請求項１９４〜２０９のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２１１】
配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７１、または配列番号７６に示される配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である重鎖可変ドメインをコードする、請求項１９４〜２１０のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２１２】
前記配列同一性が、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長６、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、存在ペナルティ１１、及び伸長ペナルティ１が使用される、請求項２１１に記載の組換え核酸分子。
【請求項２１３】
前記ＴＦＰが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、その機能性断片、及び１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、ＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインを含む、請求項１９４〜２１２のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２１４】
前記コードされるＴＦＰが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、その機能性断片、及び１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、請求項１９４〜２１３のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２１５】
前記コードされるＴＦＰが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、その機能性断片、及び１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、請求項１９４〜２１４のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２１６】
共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む、請求項１９４〜２１５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２１７】
前記共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ならびにそれに対する１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能性シグナル伝達ドメインである、請求項２１６に記載の組換え核酸分子。
【請求項２１８】
前記それに対する１〜２０個の改変が、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の改変、または前記ＴＦＰに対するリガンド結合に応じてリン酸化されるアミノ酸の改変を含む、請求項１９４〜２１７のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２１９】
前記単離された核酸分子が、ｍＲＮＡである、請求項１９４〜２１８のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２２０】
前記ＴＦＰが、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＴＣＲゼータ鎖、Ｆｃイプシロン受容体１鎖、Ｆｃイプシロン受容体２鎖、Ｆｃガンマ受容体１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃガンマ受容体３ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体３ｂ鎖、Ｆｃベータ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、その機能性断片、及びそれに対する１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部を含む、ＴＣＲサブユニットのＩＴＡＭを含む、請求項１９４〜２１９のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２２１】
前記ＩＴＡＭによって、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはＣＤ３イプシロンのＩＴＡＭが交換される、請求項２２０に記載の組換え核酸分子。
【請求項２２２】
前記ＩＴＡＭが、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択され、前記ＩＴＡＭによって、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択される異なるＩＴＡＭが交換される、請求項２２１に記載の組換え核酸分子。
【請求項２２３】
前記核酸が、ヌクレオチド類似体を含む、請求項１９４〜２２２のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２２４】
前記ヌクレオチド類似体が、２’−Ｏ−メチル修飾を受けたもの、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾を受けたもの、２’−デオキシ修飾を受けたもの、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ修飾を受けたもの、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）修飾を受けたもの、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾を受けたもの、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される、請求項２２３に記載の組換え核酸分子。
【請求項２２５】
リーダー配列をさらに含む、請求項１９４〜２２４のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項２２６】
請求項１９４〜２２５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子によってコードされる、組換えポリペプチド分子。
【請求項２２７】
抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、組換えＴＦＰ分子。
【請求項２２８】
抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換えＴＦＰ分子であって、前記ＴＦＰ分子が、内在性のＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する、前記組換えＴＦＰ分子。
【請求項２２９】
抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換えＴＦＰ分子であって、前記ＴＦＰ分子が、内在性のＴＣＲ複合体に機能的に組み込まれる能力を有する、前記組換えＴＦＰ分子。
【請求項２３０】
抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインを含む抗体または抗体断片、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、請求項２２７に記載の組換えＴＦＰ分子。
【請求項２３１】
前記抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインが、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、またはＶＨドメインである、請求項２２７〜２３０のいずれか１項に記載の組換えＴＦＰ分子。
【請求項２３２】
前記抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインが、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７１、もしくは配列番号７６のアミノ酸配列との同一性が９５〜１００％である重鎖、その機能性断片、または１〜３０個の改変を有するそのアミノ酸配列を含む、請求項２２７〜２３１のいずれか１項に記載の組換えＴＦＰ分子。
【請求項２３３】
前記配列同一性が、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長６、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、存在ペナルティ１１、及び伸長ペナルティ１が使用される、請求項２３２に記載の組換えＴＦＰ分子。
【請求項２３４】
ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、その機能性断片、及び１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むＴＣＲ細胞外ドメインを含む、請求項２２７〜２３３のいずれか１項に記載の組換えＴＦＰ分子。
【請求項２３５】
前記抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインが、リンカー配列によって前記ＴＣＲ細胞外ドメインに連結される、請求項２２７〜２３４のいずれか１項に記載の組換えＴＦＰ分子。
【請求項２３６】
前記リンカー領域が、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜４）を含む、請求項２３５に記載の組換えＴＦＰ分子。
【請求項２３７】
請求項２２７〜２３６のいずれか１項に記載のＴＦＰをコードする配列を含む、核酸。
【請求項２３８】
前記核酸が、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される、請求項２３７に記載の核酸。
【請求項２３９】
前記核酸が、ｍＲＮＡである、請求項２３７または請求項２３８に記載の核酸。
【請求項２４０】
前記核酸が、ヌクレオチド類似体を含む、請求項２３７〜２３９のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項２４１】
前記ヌクレオチド類似体が、２’−Ｏ−メチル修飾を受けたもの、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾を受けたもの、２’−デオキシ修飾を受けたもの、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ修飾を受けたもの、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）修飾を受けたもの、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾を受けたもの、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される、請求項２４０に記載の核酸。
【請求項２４２】
プロモーターをさらに含む、請求項２３７〜２４１のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項２４３】
前記核酸が、インビトロで転写された核酸である、請求項２３７〜２４２のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項２４４】
前記核酸が、ポリ（Ａ）尾部をコードする配列をさらに含む、請求項２３７〜２４３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項２４５】
前記核酸が、３’ＵＴＲ配列をさらに含む、請求項２３７〜２４４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項２４６】
請求項２２７〜２３６のいずれか１項に記載のＴＦＰをコードする核酸分子を含む、ベクター。
【請求項２４７】
前記ベクターが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２４６に記載のベクター。
【請求項２４８】
プロモーターをさらに含む、請求項２４６または請求項２４７に記載のベクター。
【請求項２４９】
前記ベクターが、インビトロで転写されるベクターである、請求項２４６〜２４８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２５０】
前記ベクター中の核酸配列が、ポリ（Ａ）尾部をさらに含む、請求項２４６〜２４９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２５１】
前記ベクター中の核酸配列が、３’ＵＴＲをさらに含む、請求項２４６〜２５０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２５２】
請求項１９４〜２２５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、請求項２２６に記載のポリペプチド分子、請求項２２７〜２３６のいずれか１項に記載のＴＦＰ分子、請求項２３７〜２４５のいずれか１項に記載の核酸、請求項２４６〜２５１のいずれか１項に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２５３】
前記細胞が、ヒトＴ細胞である、請求項２５２に記載の細胞。
【請求項２５４】
前記ヒトＴ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項２５３に記載の細胞。
【請求項２５５】
正のシグナルを生成する、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の第２のポリペプチドと結び付いた、抑制分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む、請求項２５２〜２５４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２５６】
前記抑制分子が、ＰＤ１の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドと、を含む、請求項２５５に記載の細胞。
【請求項２５７】
少なくとも２つのＴＦＰ分子を含むヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞であって、前記ＴＦＰ分子が、抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記ＴＦＰ分子が、前記ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞または前記ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の中、特定位置、及び／または表面上の内在性のＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する、前記ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞または前記ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞。
【請求項２５８】
ｉ）抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子と、
ｉｉ）少なくとも１つの内在性のＴＣＲサブユニットまたは内在性のＴＣＲ複合体と、
を含む、タンパク質複合体。
【請求項２５９】
前記ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、請求項２５８に記載のタンパク質複合体。
【請求項２６０】
前記抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインが、リンカー配列によって前記ＴＣＲ細胞外ドメインに連結される、請求項２５８または請求項２５９に記載のタンパク質複合体。
【請求項２６１】
前記リンカー領域が、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜４）を含む、請求項２６０に記載のタンパク質複合体。
【請求項２６２】
（ａ）請求項１９４〜２２５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子によってコードされるＴＦＰと、
（ｂ）少なくとも１つの内在性のＴＣＲサブユニットまたは内在性のＴＣＲ複合体と、
を含む、タンパク質複合体。
【請求項２６３】
ｉｉｉ）抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子と、
ｉｖ）少なくとも１つの内在性のＴＣＲサブユニットまたは内在性のＴＣＲ複合体と、
を含む、タンパク質複合体。
【請求項２６４】
前記ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、請求項２６３に記載のタンパク質複合体。
【請求項２６５】
前記抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインが、リンカー配列によって前記ＴＣＲ細胞外ドメインに連結される、請求項２６３または請求項２６４に記載のタンパク質複合体。
【請求項２６６】
前記リンカー領域が、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜４）を含む、請求項２６５に記載のタンパク質複合体。
【請求項２６７】
請求項２５８〜２６６のいずれか１項に記載のタンパク質複合体当たり少なくとも２つの異なるＴＦＰタンパク質を含む、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞。
【請求項２６８】
請求項１９４〜２２５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子によってコードされる少なくとも２つの異なるＴＦＰ分子を含む、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞。
【請求項２６９】
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、前記集団の前記Ｔ細胞が、少なくとも２つのＴＦＰ分子を個々または集合的に含み、前記ＴＦＰ分子が、抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記ＴＦＰ分子が、前記ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞または前記ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の中、特定位置、及び／または表面上の内在性のＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する、前記集団。
【請求項２７０】
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、前記集団の前記Ｔ細胞が、請求項１９４〜２２５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子によってコードされる少なくとも２つのＴＦＰ分子を個々または集合的に含む、前記集団。
【請求項２７１】
細胞を調製する方法であって、前記方法が、請求項１９４〜２２５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、請求項２３７〜２４５のいずれか１項に記載の核酸、または請求項２４６〜２５１のいずれか１項に記載のベクターでＴ細胞の形質導入を行うことを含む、前記方法。
【請求項２７２】
ＲＮＡで操作された細胞の集団を生成させる方法であって、前記方法が、インビトロで転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含み、前記ＲＮＡが、請求項２２７〜２３６のいずれか１項に記載の組換えＴＦＰ分子をコードする核酸を含む、前記方法。
【請求項２７３】
哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法であって、前記方法が、請求項１９４〜２２５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、請求項２２６に記載のポリペプチド分子、請求項２２６に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項２２７〜２３６のいずれか１項に記載の組換えＴＦＰ分子、請求項２３７〜２４５のいずれか１項に記載の核酸、請求項２４６〜２５１のいずれか１項に記載のベクター、または請求項２５２〜２５７及び請求項２６７〜２７０のいずれか１項に記載の細胞、を有効量で前記哺乳類に投与することを含む、前記方法。
【請求項２７４】
前記細胞が、自家Ｔ細胞である、請求項２７３に記載の方法。
【請求項２７５】
前記細胞が、同種異系Ｔ細胞である、請求項２７３に記載の方法。
【請求項２７６】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項２７３〜２７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７７】
ＩＬ１３Ｒα２の発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、前記方法が、請求項１９４〜２２５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子、請求項２２６に記載のポリペプチド分子、請求項２２６に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項２２７〜２３６のいずれか１項に記載の組換えＴＦＰ分子、請求項２３７〜２４５のいずれか１項に記載の核酸、請求項２４６〜２５１のいずれか１項に記載のベクター、または請求項２５２〜２５７及び請求項２６７〜２７０のいずれか１項に記載の細胞、を有効量で前記哺乳類に投与することを含む、前記方法。
【請求項２７８】
ＩＬ１３Ｒα２の発現と関連する前記疾患が、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、前白血病、ＩＬ１３Ｒα２の発現と関連する非がん関連徴候からなる群から選択される、請求項２７７に記載の方法。
【請求項２７９】
前記疾患が、膵癌、卵巣癌、乳癌、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２７７に記載の方法。
【請求項２８０】
ＴＦＰ分子を発現する前記細胞が、ＴＦＰ分子を発現する細胞の有効性を高める薬剤と組み合わせて投与される、請求項２７７に記載の方法。
【請求項２８１】
前記哺乳類において放出されるサイトカインが、抗ＩＬ１３Ｒα２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞が有効量で投与された哺乳類と比較して少ない、請求項２７７〜２８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８２】
ＴＦＰ分子を発現する前記細胞が、ＴＦＰ分子を発現する細胞の投与と関連する１つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される、請求項２７７〜２８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８３】
ＴＦＰ分子を発現する前記細胞が、ＩＬ１３Ｒα２と関連する前記疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される、請求項２７７〜２８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８４】
薬剤として使用するための、請求項１９４〜２２５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、請求項２２６に記載のポリペプチド分子、請求項２２６に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項２２７〜２３６のいずれか１項に記載の組換えＴＦＰ、請求項２３７〜２４５のいずれか１項に記載の核酸、請求項２４６〜２５１のいずれか１項に記載のベクター、請求項２５８〜２６６のいずれか１項に記載の複合体、または請求項２５２〜２５７及び請求項２６７〜２７０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２８５】
ＩＬ１３Ｒα２の発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、前記方法が、請求項１９４〜２２５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、請求項２２６に記載のポリペプチド分子、請求項２２６に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項２２７〜２３６のいずれか１項に記載の組換えＴＦＰ分子、請求項２３７〜２４５のいずれか１項に記載の核酸、請求項２４６〜２５１のいずれか１項に記載のベクター、または請求項２５２〜２５７及び請求項２６７〜２７０のいずれか１項に記載の細胞、を有効量で前記哺乳類に投与することを含み、前記哺乳類において放出されるサイトカインが、抗ＩＬ１３Ｒα２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞が有効量で投与された哺乳類と比較して少ない、前記方法。
【請求項２８６】
ＩＬ１３Ｒα２を発現する細胞を含む固形腫瘍を有する哺乳類を治療する方法であって、前記方法が、請求項１９４〜２２５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、請求項２２６に記載のポリペプチド分子、請求項２２６に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項２２７〜２３６のいずれか１項に記載の組換えＴＦＰ分子、請求項２３７〜２４５のいずれか１項に記載の核酸、請求項２４６〜２５１のいずれか１項に記載のベクター、または請求項２５２〜２５７及び請求項２６７〜２７０のいずれか１項に記載の細胞、を有効量で前記哺乳類に投与することを含み、前記腫瘍の体積が低減されるか、または前記腫瘍の増殖が抑制される、前記方法。
【請求項２８７】
哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法であって、前記方法が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子で形質導入されたＴ細胞の集団を有効量で前記哺乳類に投与することを含み、前記ＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと、
（ｂ）抗メソテリン結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインと、
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、前記ＴＦＰが、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれ、前記Ｔ細胞の集団が、メソテリンを低発現する腫瘍細胞と比較して、メソテリンを高発現する腫瘍細胞を優先的に死滅させる、前記方法。
【請求項２８８】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ膜貫通ドメインをさらに含む、請求項２８７に記載の方法。
【請求項２８９】
前記ＴＣＲ細胞外ドメイン、前記ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び前記ＴＣＲ細胞内ドメインが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタに由来する、請求項２８７または請求項２８８に記載の方法。
【請求項２９０】
前記ＴＣＲサブユニットの前記ＴＣＲ細胞外ドメイン、前記ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び前記ＴＣＲ細胞内ドメインが、ＴＣＲ複合体の単一のサブユニットに由来し、前記単一のサブユニットが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタである、請求項２８７または２８８に記載の方法。
【請求項２９１】
前記ＴＣＲ細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３イプシロンまたはＣＤ３ガンマに由来する、請求項２８７〜２９０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１８年７月２６日出願の米国仮特許出願第６２／７０３，８２４号、２０１８年８月３０日出願の米国仮特許出願第６２／７２５，０６６号、２０１８年７月２６日出願の米国仮特許出願第６２／７０３，８３４号、２０１８年９月５日出願の米国仮特許出願第６２／７２７，４６９号、及び２０１８年９月５日出願の米国仮特許出願第６２／７２７，４５９号の利益を主張し、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
末期の固形腫瘍を有する患者のほとんどは、標準的な治療では治療不可能である。さらに、従来の治療選択肢では重篤な副作用が生じることが多い。患者の免疫系が、がん性細胞を拒絶するように仕向ける試み（まとめてがん免疫療法と称される手法）が幾度となく行われているものの、臨床効果の達成を困難にする障害がいくつか存在する。いわゆる腫瘍抗原は、その同定数が数百にも達しているが、こうした腫瘍抗原は、自己に由来するものであることが多いことから、がん免疫療法を健康な組織に向かわせ得るものであるか、または免疫原性が不十分なものである。さらに、がん細胞は、がん免疫療法による免疫攻撃の開始及び伝播から自体を不可視化するか、またはそれらに自体が対抗できるようにする機構を複数使用している。
【０００３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾自家Ｔ細胞療法（遺伝子操作されたＴ細胞をがん細胞上の適切な細胞表面分子へと再指向化することに依存する）を使用して得られた最近の進捗は、免疫系の力を利用してＢ細胞悪性腫瘍を治療する上で、得られる結果が有望なものであることを示している（例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ３：３８８−３９８（２０１３）を参照のこと）。ＣＤ−１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＴＬ０１９と呼ばれる）を用いた臨床結果では、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を患う患者ならびに小児急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を患う患者において完全寛解が得られたことが示されている（例えば、Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３：９５ｒａ７３（２０１１）、Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＥＪＭ  ３６５：７２５−７３３（２０１１）、Ｇｒｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＥＪＭ  ３６８：１５０９−１５１８（２０１３）を参照のこと）。別の手法は、自家Ｔ細胞を遺伝子操作するために、腫瘍関連ペプチド抗原に対して選択されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖を使用するものである。こうしたＴＣＲ鎖は、完全なＴＣＲ複合体を形成し、第２の規定された特異性を得るためのＴＣＲをＴ細胞に与えることになる。滑膜癌患者においてＮＹ−ＥＳＯ−１特異的なＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を発現するように操作された自家Ｔ細胞を用いて得られた結果は有望なものであった。
【０００４】
ＣＡＲまたは第２のＴＣＲを発現するように遺伝子改変されたＴ細胞が、それぞれの標的細胞をインビトロ／エクスビボで認識及び破壊する能力を有することに加えて、操作されたＴ細胞を用いる治療が患者において成功するには、そうしたＴ細胞が、長期的に強く活性化し、増殖し、存続する能力を有し、さらには、疾患が再発性の場合は「メモリー」応答を起こすことが可能である必要がある。現在のところ、ＣＡＲ−Ｔ細胞の臨床効果が高く、管理可能であるのは、ＢＣＭＡ陽性及びＣＤ−１９陽性のＢ細胞悪性腫瘍、ならびにＮＹ−ＥＳＯ−１−ペプチドを発現するＨＬＡ−Ａ２発現滑膜肉腫患者に限られている。遺伝子操作されたＴ細胞を改良してさまざまなヒト悪性腫瘍に対してより広く作用するようにすることが明確に求められている。
【発明の概要】
【０００５】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）、１つ以上のＴＦＰを発現するように操作されたＴ細胞、及び疾患を治療するためのその使用方法が本明細書で提供される。
【０００６】
一態様によれば、（Ｉ）ヒト対象に由来するＴ細胞と、（ＩＩ）医薬的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物が本明細書で提供され、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子を含み、ＴＦＰは、（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン、を含むＴＣＲサブユニットと、（ｂ）抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメイン、または抗メソテリン（ＭＳＬＮ）結合ドメインを含む抗原結合ドメインを含む抗原結合ドメインと、を含み、ＴＣＲサブユニットと抗原結合ドメインとは、機能可能なように連結され、ＴＦＰは、Ｔ細胞に発現すると、ＴＣＲと機能的に相互作用する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＴＦＰを含まないＴ細胞と比較して、抗原結合ドメインと特異的に相互作用する抗原を発現する細胞に対して、増強された細胞傷害性を示す。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットのＴＣＲ細胞外ドメイン、ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及びＴＣＲ細胞内ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタに由来する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットのＴＣＲ細胞外ドメイン、ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及びＴＣＲ細胞内ドメインは、ＴＣＲ複合体の単一のサブユニットに由来し、単一のサブユニットは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタである。
【００１０】
一態様によれば、（Ｉ）ヒト対象に由来するＴ細胞と、（ＩＩ）医薬的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物が本明細書で提供され、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子を含み、ＴＦＰは、（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン、を含むＴＣＲサブユニットと、（ｂ）抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインまたは抗メソテリン（ＭＳＬＮ）結合ドメインを含むｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体と、を含み、ＴＣＲサブユニットと、抗ＭＵＣ１６結合ドメインまたは抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインまたは抗ＭＳＬＮ結合ドメインとは、機能可能なように連結され、ＴＣＲサブユニットの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖またはＴＣＲベータ鎖以外の１つのＴＣＲサブユニットのみに由来し、ＴＦＰは、Ｔ細胞に発現すると、ＴＣＲと機能的に相互作用し、Ｔ細胞は、ＴＦＰを含まないＴ細胞と比較して、抗ＭＵＣ１６結合ドメインまたは抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインと特異的に相互作用する抗原を発現する細胞に対して、増強された細胞傷害性を示す。
【００１１】
いくつかの実施形態では、抗ＭＵＣ１６結合ドメインまたは抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインまたは抗ＭＳＬＮ結合ドメインをコードする配列は、リンカーをコードする配列によって、ＴＣＲ細胞外ドメインをコードする配列に連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、Ｇは、グリシンであり、Ｓは、セリンであり、ｎは、１〜４の整数である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、抗ＭＵＣ１６結合ドメインは、（ａ）重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１配列（ＧＲＴＶＳＳＬＦ、ＧＲＡＶＳＳＬＦ、またはＧＤＳＬＤＧＹＶ）と、（ｂ）ＨＣ  ＣＤＲ２配列（ＩＳＲＹＳＬＹＴまたはＩＳＧＤＧＳＭＲ）と、（ｃ）ＨＣ  ＣＤＲ３配列（ＡＳＫＬＥＹＴＳＮＤＹＤＳまたはＡＡＤＰＰＴＷＤＹ）と、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＭＵＣ１６結合ドメインは、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、または配列番号４０の配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である配列を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインは、（ａ）重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１配列（ＧＦＴＳＤＹＹＩまたはＧＦＡＳＤＤＹＩ）と、（ｂ）ＨＣ  ＣＤＲ２配列（ＩＳＳＫＹＡＮＴまたはＩＳＳＲＹＡＮＴ）と、（ｃ）ＨＣ  ＣＤＲ３配列（ＡＡＤＴＲＲＹＴＣＰＤＩＡＴＭＨＲＮＦＤＳまたはＡＭＤＳＲＲＶＴＣＰＥＩＳＴＭＨＲＮＦＤＳ）と、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインは、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７１、または配列番号７６の配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である配列を含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長（ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）６、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、存在ペナルティ（ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  ｐｅｎａｌｔｙ）１１、及び伸長ペナルティ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）１が使用される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、抗ＭＳＬＮ結合ドメインは、配列番号９７または配列番号９８の配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である配列を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、血清を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、ＶＨドメインである。いくつかの実施形態では、コードされる抗ＴＡＡ結合ドメインは、抗ＴＡＡ結合ドメインを含み、（ａ）抗ＴＡＡ結合ドメイン、（ｂ）ＣＤ２８細胞外ドメインの少なくとも一部、（ｃ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、（ｄ）ＣＤ２８細胞内ドメインの少なくとも一部、及び（ｅ）ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを含み、抗ＴＡＡ結合ドメインが、ＣＤ２８細胞外ドメインの少なくとも一部に機能可能なように連結されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、Ｔ細胞の細胞傷害活性は、高いか、またはより効率的である。いくつかの実施形態では、コードされるＴＦＰ分子は、Ｔ細胞に発現すると、内在性のＴＣＲ複合体、少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチド、またはそれらの組み合わせと機能的に相互作用する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＰＤ−１及びＢＴＬＡからなる群から選択される抑制分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、抑制分子の少なくとも一部は、正のシグナルを生成する、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の第２のポリペプチドと結び付けられる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＣＤ３ζ、４１−ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、及びＢ７−Ｈ３からなる群から選択されるタンパク質に由来する共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞によるＩＬ−２またはＩＦＮγの産生は、ＴＦＰを含まないＴ細胞と比較して、抗ＴＡＡ結合ドメインと特異的に相互作用する抗原を発現する細胞の存在下で増加する。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であり、集団の個々のＴ細胞は、少なくとも２つのＴＦＰ分子を含むか、または集団の少なくとも２種類のＴ細胞は、少なくとも２つのＴＦＰ分子を集合的に含み、少なくとも２つのＴＦＰ分子は、抗ＴＡＡ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、少なくとも２つのＴＦＰ分子の少なくとも１つは、内在性のＴＣＲ複合体、少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチド、またはそれらの組み合わせと機能的に相互作用する��いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３イプシロンのみに由来する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３ガンマのみに由来する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３デルタのみに由来する。
【００１５】
一態様によれば、哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法が本明細書で提供され、この方法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子で形質導入されたＴ細胞の集団を有効量で哺乳類に投与することを含み、ＴＦＰは、（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び（ｉｉ）ＴＣＲ細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン、を含むＴＣＲサブユニットと、（ｂ）抗ＴＡＡ結合ドメインである抗原結合ドメインを含む抗体ドメインと、を含み、ＴＣＲサブユニットと抗体ドメインとは、機能可能なように連結され、ＴＦＰは、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれ、同じ抗体ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞で治療された哺乳類のサイトカインのレベルと比較して、治療後に放出されるサイトカインのレベルは低い。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３イプシロンまたはＣＤ３ガンマに由来する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ細胞外ドメイン、ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及びＴＣＲ細胞内ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタに由来する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ細胞外ドメイン、ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及びＴＣＲ細胞内ドメインは、ＴＣＲ複合体の単一のサブユニットに由来し、単一のサブユニットは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、または配列番号４０に示される配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である抗ＭＵＣ１６  ＶＨＨドメインである。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７１、または配列番号７６に示される配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である抗ＩＬ１３Ｒα２  ＶＨＨドメインである。いくつかの実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長６、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、存在ペナルティ１１、及び伸長ペナルティ１が使用される。いくつかの実施形態では、細胞は、自家Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類は、ヒトである。
【００１７】
一態様によれば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）（例えば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮ）の発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法が本明細書で提供され、この方法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子で形質導入されたＴ細胞の集団を有効量で哺乳類に投与することを含み、ＴＦＰは、（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び（ｉｉ）ＣＤ３イプシロンまたはＣＤ３ガンマの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン、を含むＴＣＲサブユニットと、（ｂ）抗ＴＡＡ結合ドメインである抗原結合ドメインを含む抗体ドメインと、を含み、ＴＣＲサブユニットと抗体ドメインとは、機能可能なように連結され、ＴＦＰは、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれ、同じ抗体ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞で治療された哺乳類のサイトカインのレベルと比較して、治療後に放出されるサイトカインのレベルは低い。
【００１８】
いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、または配列番号４０に示される配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％であるＶＨＨドメインである。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７１、または配列番号７６に示される配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％であるＶＨＨドメインである。いくつかの実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長６、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、存在ペナルティ１１、及び伸長ペナルティ１が使用される。いくつかの実施形態では、細胞は、自家Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＡＡ発現と関連する疾患は、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、及びＴＡＡ（例えば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮ）の発現と関連する非がん関連徴候からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、疾患は、神経膠芽腫、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、肝癌、膵癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿管癌、腎癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、胸腺癌、胆管癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるがんである。いくつかの実施形態では、疾患は、神経膠芽腫、中皮腫、漿液性乳頭状卵巣腺癌、卵巣明細胞癌、混合型ミュラー管卵巣癌（ｍｉｘｅｄ  Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、類内膜粘液性卵巣癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ  ｍｕｃｉｎｏｕｓ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膵臓腺癌、膵管腺癌、子宮体部漿液性腺癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳腺癌、ＭＵＣ１６の発現と関連する疾患、ＩＬ１３Ｒα２の発現と関連する疾患、ＭＳＬＮの発現と関連する疾患、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるがんである。いくつかの実施形態では、ＴＦＰ分子を発現する細胞は、ＴＦＰ分子を発現する細胞の有効性を高める薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、所与のサイトカインについて、同じ抗体ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞で治療された哺乳類の所与のサイトカインの量と比較して、治療後に放出される所与のサイトカインの量は少なくとも１０％少ない。いくつかの実施形態では、所与のサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ｓＣＤ１３７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、哺乳類における腫瘍増殖が抑制され、その結果、ＴＦＰを発現するＴ細胞で治療された哺乳類と、ＴＦＰを発現しないＴ細胞で治療された哺乳類��が、少なくとも８日間の治療の前に同じ腫瘍サイズを有した場合、当該治療の後に、腫瘍のサイズは、ＴＦＰを発現しないＴ細胞で治療された哺乳類における腫瘍のサイズの最大でも１０％、最大でも２０％、最大でも３０％、最大でも４０％、最大でも５０％、または最大でも６０％である。いくつかの実施形態では、哺乳類における腫瘍増殖は、完全に抑制される。いくつかの実施形態では、哺乳類における腫瘍増殖は、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間、少なくとも４０日間、少なくとも５０日間、少なくとも６０日間、少なくとも７０日間、少なくとも８０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１００日間、またはそれを超える期間、完全に抑制される。いくつかの実施形態では、ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞の集団は、同じ抗体ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して同様の量の腫瘍細胞を死滅させる。いくつかの実施形態では、ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞の集団は、同じ抗体ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して異なる遺伝子発現プロファイルを有する。いくつかの実施形態では、遺伝子の発現レベルは、同じ抗体ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞における遺伝子の発現レベルと比較して、ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞では異なる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、抗原提示、ＴＣＲシグナル伝達、ホメオスタシス、代謝、ケモカインシグナル伝達、サイトカインシグナル伝達、ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達、ＭＭＰ及び接着分子シグナル伝達、またはＴＮＦＲ関連シグナル伝達において機能を有する。
【００１９】
一態様によれば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子が本明細書で提供され、ＴＦＰは、（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び（ｉｉ）ＣＤ３イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン、を含むＴＣＲサブユニットと、（ｂ）抗ＴＡＡ結合ドメインを含む抗体ドメインと、を含み、ＴＣＲサブユニットと抗体ドメインとは、機能可能なように連結され、ＴＦＰは、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれる。
【００２０】
一態様によれば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子が本明細書で提供され、ＴＦＰは、（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び（ｉｉ）ＣＤ３ガンマの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン、を含むＴＣＲサブユニットと、（ｂ）抗ＴＡＡ結合ドメインを含む抗体ドメインと、を含み、ＴＣＲサブユニットと抗体ドメインとは、機能可能なように連結され、ＴＦＰは、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれる。
【００２１】
一態様によれば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子が本明細書で提供され、ＴＦＰは、（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び（ｉｉ）ＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン、を含むＴＣＲサブユニットと、（ｂ）抗ＴＡＡ結合ドメインを含む抗体ドメインと、を含み、ＴＣＲサブユニットと抗体ドメインとは、機能可能なように連結され、ＴＦＰは、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれる。
【００２２】
一態様によれば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子が本明細書で提供され、ＴＦＰは、（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び（ｉｉ）ＴＣＲアルファの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン、を含むＴＣＲサブユニットと、（ｂ）抗ＴＡＡ結合ドメインを含む抗体ドメインと、を含み、ＴＣＲサブユニットと抗体ドメインとは、機能可能なように連結され、ＴＦＰは、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれる。
【００２３】
一態様によれば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子が本明細書で提供され、ＴＦＰは、（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び（ｉｉ）ＴＣＲベータの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン、を含むＴＣＲサブユニットと、（ｂ）抗ＴＡＡ結合ドメインを含む抗体ドメインと、を含み、ＴＣＲサブユニットと抗体ドメインとは、機能可能なように連結され、ＴＦＰは、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、ヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインである。いくつかの実施形態では、コードされる抗原結合ドメインは、リンカー配列によってＴＣＲ細胞外ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、コードされるリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜４）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインと、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインと、を含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つは、同じＴＣＲサブユニットに由来する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、もしくはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれに対する少なくとも１つの改変を有するアミノ酸配列、から選択される刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、４−１ＢＢの機能性シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ゼータの機能性シグナル伝達ドメイン、あるいはそれに対する少なくとも１つの改変を有するアミノ酸配列、から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、ｓｃＦｖまたはＶＨドメインを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、組換え核酸分子は、（ａ）重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１配列（ＧＲＴＶＳＳＬＦ、ＧＲＡＶＳＳＬＦ、またはＧＤＳＬＤＧＹＶ）と、（ｂ）ＨＣ  ＣＤＲ２配列（ＩＳＲＹＳＬＹＴまたはＩＳＧＤＧＳＭＲ）と、（ｃ）ＨＣ  ＣＤＲ３配列（ＡＳＫＬＥＹＴＳＮＤＹＤＳまたはＡＡＤＰＰＴＷＤＹ）と、をコードする。いくつかの実施形態では、組換え核酸分子は、（ａ）重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１配列（ＧＦＴＳＤＹＹＩまたはＧＦＡＳＤＤＹＩ）と、（ｂ）ＨＣ  ＣＤＲ２配列（ＩＳＳＫＹＡＮＴまたはＩＳＳＲＹＡＮＴ）と、（ｃ）ＨＣ  ＣＤＲ３配列（ＡＡＤＴＲＲＹＴＣＰＤＩＡＴＭＨＲＮＦＤＳまたはＡＭＤＳＲＲＶＴＣＰＥＩＳＴＭＨＲＮＦＤＳ）と、をコードする。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、または配列番号４０に示される配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である重鎖可変ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７１、または配列番号７６に示される配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％であるＶＨＨドメインである。いくつかの実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長６、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、存在ペナルティ１１、及び伸長ペナルティ１が使用される。いくつかの実施形態では、ＴＦＰは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、その機能性断片、及び１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、ＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、コードされるＴＦＰは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、その機能性断片、及び１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、コードされるＴＦＰは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、その機能性断片、及び１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、組換え核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ならびにそれに対する１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能性シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、それに対する１〜２０個の改変は、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の改変、またはＴＦＰに対するリガンド結合に応じてリン酸化されるアミノ酸の改変を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＴＦＰは、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＴＣＲゼータ鎖、Ｆｃイプシロン受容体１鎖、Ｆｃイプシロン受容体２鎖、Ｆｃガンマ受容体１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃガンマ受容体３ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体３ｂ鎖、Ｆｃベータ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、その機能性断片、及びそれに対する１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部を含む、ＴＣＲサブユニットのＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭによって、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはＣＤ３イプシロンのＩＴＡＭが交換される。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択され、このＩＴＡＭによって、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択される異なるＩＴＡＭが交換される。いくつかの実施形態では、核酸は、ヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド類似体は、２’−Ｏ−メチル修飾を受けたもの、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾を受けたもの、２’−デオキシ修飾を受けたもの、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ修飾を受けたもの、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）修飾を受けたもの、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾を受けたもの、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組換え核酸分子は、リーダー配列をさらに含む。
【００２７】
一態様によれば、本明細書に記載の組換え核酸分子によってコードされる組換えポリペプチド分子が本明細書で提供される。
【００２８】
一態様によれば、抗ＴＡＡ結合ドメイン（例えば、ＭＵＣ１６結合ドメイン、ＩＬ１３Ｒａ２結合ドメイン、またはＭＳＬＮ結合ドメイン）、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む組換えＴＦＰ分子が本明細書で提供される。
【００２９】
一態様によれば、抗ＴＡＡ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換えＴＦＰ分子が本明細書で提供され、ＴＦＰ分子は、内在性のＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する。
【００３０】
一態様によれば、抗ＴＡＡ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換えＴＦＰ分子が本明細書で提供され、ＴＦＰ分子は、内在性のＴＣＲ複合体に機能的に組み込まれる能力を有する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、組換えＴＦＰ分子は、抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメイン、または抗ＭＳＬＮ結合ドメインを含む抗体または抗体断片、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、またはＶＨドメインである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、もしくは配列番号４０のアミノ酸配列との同一性が９５〜１００％である重鎖、その機能性断片、または１〜３０個の改変を有するそのアミノ酸配列、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７１、もしくは配列番号７６のアミノ酸配列との同一性が９５〜１００％である重鎖、その機能性断片、または１〜３０個の改変を有するそのアミノ酸配列、を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長６、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、存在ペナルティ１１、及び伸長ペナルティ１が使用される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、組換えＴＦＰ分子は、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、その機能性断片、及び１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むＴＣＲ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、リンカー配列によってＴＣＲ細胞外ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜４）を含む。
【００３６】
一態様によれば、ＴＦＰをコードする配列を含む核酸が本明細書で提供される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、ヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド類似体は、２’−Ｏ−メチル修飾を受けたもの、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾を受けたもの、２’−デオキシ修飾を受けたもの、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ修飾を受けたもの、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）修飾を受けたもの、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）修飾を受けたもの、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾を受けたもの、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸は、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸は、インビトロで転写された核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は、ポリ（Ａ）尾部をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸は、３’ＵＴＲ配列をさらに含む。
【００３８】
一態様によれば、ＴＦＰをコードする核酸分子を含むベクターが本明細書で提供される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ベクターは、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、インビトロで転写されるベクターである。いくつかの実施形態では、ベクター中の核酸配列は、ポリ（Ａ）尾部をさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクター中の核酸配列は、３’ＵＴＲをさらに含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子を含む細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＴＦＰ分子が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、核酸が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ベクターが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、正のシグナルを生成する、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の第２のポリペプチドと結び付いた、抑制分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、抑制分子は、ＰＤ１の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドと、を含む。
【００４１】
一態様によれば、少なくとも２つのＴＦＰ分子を含むヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞が本明細書で提供され、これらのＴＦＰ分子は、抗ＴＡＡ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、ＴＦＰ分子は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の中、特定位置、及び／または表面上の内在性のＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する。
【００４２】
一態様によれば、（ａ）抗ＴＡＡ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子と、（ｂ）少なくとも１つの内在性のＴＣＲサブユニットまたは内在性のＴＣＲ複合体と、を含むタンパク質複合体が本明細書で提供される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、リンカー配列によってＴＣＲ細胞外ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜４）を含む。
【００４４】
一態様によれば、（ａ）本明細書に開示の組換え核酸分子のいずれかによってコードされるＴＦＰと、（ｂ）少なくとも１つの内在性のＴＣＲサブユニットまたは内在性のＴＣＲ複合体と、を含むタンパク質複合体が本明細書で提供される。
【００４５】
一態様によれば、（ａ）抗ＴＡＡ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子と、（ｂ）少なくとも１つの内在性のＴＣＲサブユニットまたは内在性のＴＣＲ複合体と、を含むタンパク質複合体が本明細書で提供される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、リンカー配列によってＴＣＲ細胞外ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜４）を含む。
【００４７】
一態様によれば、タンパク質複合体当たり少なくとも２つの異なるＴＦＰタンパク質を含むヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞が本明細書で提供される。
【００４８】
一態様によれば、本明細書に記載の単離された核酸分子によってコードされる少なくとも２つの異なるＴＦＰ分子を含むヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞が本明細書で提供される。
【００４９】
一態様によれば、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の集団が本明細書で提供され、集団のＴ細胞は、少なくとも２つのＴＦＰ分子を個々または集合的に含み、これらのＴＦＰ分子は、抗ＴＡＡ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、ＴＦＰ分子は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の中、特定位置、及び／または表面上の内在性のＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する。
【００５０】
一態様によれば、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の集団が本明細書で提供され、集団のＴ細胞は、本明細書に記載の組換え核酸分子によってコードされる少なくとも２つのＴＦＰ分子を個々または集合的に含む。
【００５１】
一態様によれば、細胞を調製する方法が本明細書で提供され、この方法は、本明細書に記載の組換え核酸分子、本明細書に記載の核酸、または本明細書に記載のベクターでＴ細胞の形質導入を行うことを含む。
【００５２】
一態様によれば、ＲＮＡで操作された細胞の集団を生成させる方法が本明細書で提供され、この方法は、インビトロで転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含み、ＲＮＡは、本明細書に記載のＴＦＰ分子をコードする核酸を含む。
【００５３】
一態様によれば、哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法が本明細書で提供され、この方法は、本明細書に記載の組換え核酸分子、本明細書に記載のポリペプチド分子、本明細書に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載のＴＦＰ分子、本明細書に記載の核酸、本明細書に記載のベクター、または本明細書に記載の細胞を有効量で哺乳類に投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、自家Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類は、ヒトである。
【００５４】
一態様によれば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮの発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法が本明細書で提供され、この方法は、本明細書に記載の単離された核酸分子、本明細書に記載のポリペプチド分子、本明細書に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載のＴＦＰ分子、本明細書に記載の核酸、本明細書に記載のベクター、または本明細書に記載の細胞を有効量で哺乳類に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮの発現と関連する疾患は、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、前白血病、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮの発現と関連する非がん関連徴候からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、疾患は、膵癌、卵巣癌、乳癌、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＴＦＰ分子を発現する細胞は、ＴＦＰ分子を発現する細胞の有効性を高める薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、当該哺乳類において放出されるサイトカインは、抗ＴＡＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞が有効量で投与された哺乳類と比較して少ない。いくつかの実施形態では、ＴＦＰ分子を発現する細胞は、ＴＦＰ分子を発現する細胞の投与と関連する１つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、ＴＦＰ分子を発現する細胞は、ＴＡＡ（例えば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮ）と関連する疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子、ポリペプチド分子を発現する細胞、組換えＴＦＰ、核酸、ベクター、複合体、または細胞は、薬剤として使用するためのものである。
【００５５】
一態様によれば、薬剤として使用するための、ＴＦＰをコードする組換え核酸分子、ＴＦＰのポリペプチド分子、ＴＦＰのポリペプチド分子を発現する細胞、組換えＴＦＰ、ＴＦＰをコードする核酸、ＴＦＰをコードする核酸を含むベクター、タンパク質複合体、または細胞が本明細書で提供される。一態様によれば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮの発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法が本明細書で提供され、この方法は、組換え核酸分子、ポリペプチド分子、ポリペプチド分子を発現する細胞、組換えＴＦＰ分子、核酸、ベクター、または細胞を有効量で哺乳類に投与することを含み、当該哺乳類において放出されるサイトカインは、抗ＴＡＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞が有効量で投与された哺乳類と比較して少ない。
【００５６】
一態様によれば、（Ｉ）ヒト対象に由来するＴ細胞と、（ＩＩ）医薬的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物が本明細書で提供され、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子を含み、ＴＦＰは、（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン、を含むＴＣＲサブユニットと、（ｂ）抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインを含む抗原結合ドメインと、を含み、ＴＣＲサブユニットと抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインとは、機能可能なように連結され、ＴＦＰは、Ｔ細胞に発現すると、ＴＣＲと機能的に相互作用する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットのＴＣＲ細胞外ドメイン、ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及びＴＣＲ細胞内ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、またはＣＤ３ガンマに由来する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットのＴＣＲ細胞外ドメイン、ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及びＴＣＲ細胞内ドメインは、ＴＣＲ複合体の単一のサブユニットに由来し、単一のサブユニットは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＴＦＰを含まないＴ細胞と比較して、抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインと特異的に相互作用する抗原を発現する細胞に対して、増強された細胞傷害性を示す。
【００５７】
一態様によれば、哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法が本明細書で提供され、この方法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組換え核酸分子で形質導入されたＴ細胞の集団を有効量で哺乳類に投与することを含み、ＴＦＰは、ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン、を含むＴＣＲサブユニットと、抗メソテリン結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインと、を含み、ＴＣＲサブユニットと抗体ドメインとは、機能可能なように連結され、ＴＦＰは、Ｔ細胞に発現するとＴＣＲに組み込まれ、Ｔ細胞の集団は、メソテリンを低発現する腫瘍細胞と比較して、メソテリンを高発現する腫瘍細胞を優先的に死滅させる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ細胞外ドメイン、ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及びＴＣＲ細胞内ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタに由来する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットのＴＣＲ細胞外ドメイン、ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及びＴＣＲ細胞内ドメインは、ＴＣＲ複合体の単一のサブユニットに由来し、単一のサブユニットは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタである。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３イプシロンまたはＣＤ３ガンマに由来する。
【００５９】
参照による組み込み
本明細書で言及される刊行物、特許、及び特許出願はすべて、個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ、参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示される場合と同様に、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６０】
特許ファイルまたは出願ファイルは、カラーで描かれた図面を少なくとも１つ含む。カラーの図面（複数可）を含むこの特許公開公報または特許出願公開公報のコピーは、要望及び必要経費の支払いに応じて特許庁から提供されることになる。本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に示される。例示の実施形態（本発明の原理が利用される）を示す後述の詳細な説明、及びそうした実施形態に関する添付の図面を参照することによって本発明の特徴及び利点についての理解が深まるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＩＬ１３Ｒα２クローンの配列の例を示す。
【図２】Ｐａｌｌ  Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｄｉｐ  ＆  Ｒｅａｄ  ＡＨＣエピトープビニングアッセイの実施方法を示す図である。ＡＨＣバイオセンサーの先端部を、Ｆｃドメインを介して４Ｈ１１  ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体（４Ｈ１１）とカップリングさせ、次に、この４Ｈ１１を、そのＦｖドメインを介して抗原ペプチド（「Ａｇ」（例えば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒａ２、ＭＳＬＮ））に結合させた。次に、４Ｈ１１  ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体と結合した抗原への結合に対する競合について、ｓｄＡｂ（Ａｂ２）を各１００ｎＭで添加して評価した。
【図３Ａ】抗ＩＬ１３Ｒα２ナノボディのインビトロでの活性を試験する腫瘍細胞溶解アッセイから得られたデータを示す。
【図３Ｂ】ＴＦＰ  Ｔ細胞がＩＦＮγ及びＩＬ−２の産生を誘導する能力を示す実験データを示す。
【図３Ｃ】抗ＩＬ１３Ｒα２ナノボディのインビトロでの活性を試験する腫瘍細胞溶解アッセイから得られた実験データを示す。
【図３Ｄ】ＴＦＰ  Ｔ細胞がＩＦＮγ及びＩＬ−２の産生を誘導する能力を示す実験データを示す。
【図３Ｅ】抗ＩＬ１３Ｒα２ナノボディのインビトロでの活性を試験する腫瘍細胞溶解アッセイから得られた実験データを示す。
【図３Ｆ】ＴＦＰ  Ｔ細胞がＩＦＮγ及びＩＬ−２の産生を誘導する能力を示す実験データを示す。
【図４】ＩＬ１３Ｒα２−ＴＦＰ  Ｔ細胞の有効性を試験するＩＬ１３Ｒα２  Ｕ２５１  ＧＢＭモデルから得られた実験データを示す。グラフは、ＮＳＧマウスに対して５×１０６個のＵ２５１細胞を皮下注射し、４日後に１×１０７個のＩＬ１３Ｒα２−ＴＦＰ  Ｔ細胞を静脈内投与した後、ノギスで平均腫瘍体積を経時的に測定したものを示す。
【図５Ａ】親（ラマ）抗ＭＵＣ１６一本鎖抗体（ＶＨＨ）及びヒト化抗ＭＵＣ１６一本鎖抗体（ＶＨＨ）の結合親和性を滴定及び測定したものを示す。この図は、実施例５において調製したこれらのＶＨＨ結合物質を、ＮＴＡバイオセンサー（ニッケルでコートされた表面）を使用してスクリーニングする実験手順を示す図である。Ｈｉｓタグを有するＭＵＣ１６  ｓｄＡｂ（３．２５μｇ／ｍｌ）がバイオセンサーに結合され、０ｎＭ、１．５６ｎＭ、６．２５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、または２００ｎＭの濃度でＭＵＣ１６ペプチドが添加される。緩衝液：１×Ｏｃｔｅｔ；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を０．０２％含む３０℃の１×Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｅｌｌｇｒｏ（登録商標）ＰＢＳ（カタログ番号２１−０４０−ＣＭ）。センサー：Ｐａｌｌ  Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｄｉｐ  ＆  Ｒｅａｄ（カタログ１８−５１０２）。
【図５Ｂ】親（ラマ）抗ＭＵＣ１６一本鎖抗体（ＶＨＨ）及びヒト化抗ＭＵＣ１６一本鎖抗体（ＶＨＨ）の結合親和性を滴定及び測定したものを示す。この図（クローンＲ３Ｍｕ４（親及びヒト化バリアント））は、ＭＵＣ１６標的に対するｓｄＡｂの結合カイネティクスを示す（表１も併せて参照のこと）。これらの曲線を使用して各タンパク質の結合親和性定数を導き出し、抗原結合に対するヒト化の効果を評価した。
【図５Ｃ】親（ラマ）抗ＭＵＣ１６一本鎖抗体（ＶＨＨ）及びヒト化抗ＭＵＣ１６一本鎖抗体（ＶＨＨ）の結合親和性を滴定及び測定したものを示す。この図（クローンＲ３Ｍｕ２９（親及びヒト化バリアント））は、ＭＵＣ１６標的に対するｓｄＡｂの結合カイネティクスを示す（表１も併せて参照のこと）。これらの曲線を使用して各タンパク質の結合親和性定数を導き出し、抗原結合に対するヒト化の効果を評価した。
【図６Ａ】陽性対象として使用したＭＵＣ−１６特異的ｓｃＦｖ−Ｆｃツール結合物質４Ｈ１１と比較して抗ＭＵＣ１６  ｓｄＡｂのエピトープビニングを行ったものを示す。この図は、Ｐａｌｌ  Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｄｉｐ  ＆  Ｒｅａｄ  ＡＨＣエピトープビニングアッセイの方法を示す図であり、このアッセイは、ＩＬ１３Ｒα２結合物質について図２に示されるように実施した。ＡＨＣバイオセンサーの先端部を、Ｆｃドメインを介して４Ｈ１１  ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体（４Ｈ１１）とカップリングさせ、次に、この４Ｈ１１を、そのＦｖドメインを介してＭＵＣ１６抗原ペプチド（Ａｇ）に結合させた。次に、４Ｈ１１  ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体と結合したＭＵＣ１６抗原への結合に対する競合について、ｓｄＡｂ（Ａｂ２）を各１００ｎＭで添加して評価した。
【図６Ｂ】陽性対象として使用したＭＵＣ−１６特異的ｓｃＦｖ−Ｆｃツール結合物質４Ｈ１１と比較して抗ＭＵＣ１６  ｓｄＡｂのエピトープビニングを行ったものを示す。この図では、４Ｈ１１ツール結合物質がＭＵＣ１６ペプチドに既に結合した後でもＭＵＣ１６  ｓｄＡｂ（親（ラマ）Ｒ３Ｍｕ４及び親（ラマ）Ｒ３Ｍｕ２９）がＭＵＣ１６ペプチドに結合することが示されており、このことは、これらの親ｓｄＡｂが、４Ｈ１１  ｓｃＦｖ−Ｆｃツール結合物質と比較して、ＭＵＣ１６ペプチドの異なるエピトープを認識するものであり、ＭＵＣ１６ペプチドのエピトープが異なるものにビン分類されることを実証している。抗原（ＭＵＣ１６ペプチド）を用いない陰性対象では結合が生じていないことから、非特異的な結合が生じている可能性は完全に排除されている。
【図６Ｃ】陽性対象として使用したＭＵＣ−１６特異的ｓｃＦｖ−Ｆｃツール結合物質４Ｈ１１と比較して抗ＭＵＣ１６  ｓｄＡｂのエピトープビニングを行ったものを示す。この図は、ＭＵＣ１６細胞外ドメイン配列中の関連抗体のエピトープを示す。
【図７】Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットと、抗ＭＵＣ１６結合ドメインを含む抗体ドメインと、を含むＴＣＲ融合タンパク質（ＴＦＰ）を発現するＴ細胞によってＭＵＣ１６−細胞外ドメイン（「ＭＵＣ１６細胞外」）発現細胞が用量依存的に溶解することを示すグラフを示す。細胞結合型のＣ末端ＭＵＣ１６形態を過剰発現するように形質導入されたＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６Ｃｔｅｒｍ卵巣癌細胞がＴ細胞によって用量依存的な様式で特異的に死滅した一方で、ＭＵＣ１６陰性の親ＳＫＯＶ３細胞はＴ細胞介在性の死滅を受けることなく残った。同様に、細胞結合形態のＭＵＣ１６を過剰発現するＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６−Ｃｔｅｒｍ細胞は、ＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって排除された。ＭＵＣ１６の発現レベルが低い親ＯＶＣＡＲ３細胞は、ＴＦＰ−Ｔ細胞：標的細胞比が最大のときにのみ死滅した。同様に、ＴＦＰ−Ｔ細胞は、標的細胞上にＭＵＣ１６が存在するときにのみサイトカインを放出しており、このことは、この単一ドメイン抗体の特異性を裏付けるものである。
【図８】ＭＵＣ１６を高レベルで発現する卵巣細胞株及びＭＵＣ１６を低レベルで発現する卵巣細胞株を使用する細胞アッセイにおけるＭＵＣ１６−ＴＦＰの効力を示す実験データ例を示す。こうした試験では、腫瘍細胞表面上のＭＵＣ１６のレベルに応じてＭＵＣ１６−ＴＦＰが死滅を優先的に引き起こす能力を有することが観測された。より明確には、ＭＵＣ１６を高発現する腫瘍細胞をＭＵＣ１６−ＴＦＰが用量依存的な様式で死滅させることが観測された一方で、ＭＵＣ１６を低発現する細胞をＭＵＣ１６−ＴＦＰが死滅させることは、こうしたアッセイで使用した用量レベルでは観測されなかった。
【図９Ａ】フローサイトメトリーに基づいてＭＵＣ１６細胞外のコピー数を定量化した結果を示す。４Ｈ１１−ＰＥ抗体で染色した腫瘍細胞をＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズと一緒にＦｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）Ｘ−２０で分析した。細胞ならびにビーズについて蛍光強度の幾何学的中央値（ｇＭＦＩ）を計算した。
【図９Ｂ】フローサイトメトリーに基づいてＭＵＣ１６細胞外のコピー数を定量化した結果を示す。ビーズストックは、ビーズ当たりのＰＥ分子数が異なるように製造された４つの集団（高、中、低、無）を含む。各ビーズセットについて、測定したＭＦＩに対するビーズ当たりの所与のＰＥ分子コピー数に基づいて標準曲線を作成した。次に、ビーズを用いて作成した標準曲線に基づいて腫瘍細胞上のＭＵＣ１６細胞外のコピー数を推定した。ＯＶＣＡＲ３細胞、ＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞、ＳＫＯＶ３細胞、及びＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞上のＭＵＣ１６細胞外のコピー数を、それぞれ７２６、３６１６、３９、及び２３５１と決定した。
【図１０Ａ】ＭＵＣ１６  ＴＦＰ−Ｔ細胞によってＭＵＣ１６細胞外特異的な腫瘍細胞溶解が生じることを示す一連のグラフを示す。細胞結合形態のＭＵＣ１６を過剰発現するＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞がＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって特異的に死滅した（Ａ）一方で、親ＳＫＯＶ３細胞は、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって死滅しなかった（Ｂ）。同様に、細胞結合形態のＭＵＣ１６を過剰発現するＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞は、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって排除された（Ｃ）。ＭＵＣ１６細胞外の発現レベルが低い親ＯＶＣＡＲ３細胞の死滅は部分的なものにすぎなかった（Ｄ）。
【図１０Ｂ】ＭＵＣ１６  ＴＦＰ−Ｔ細胞によってＭＵＣ１６細胞外特異的な腫瘍細胞溶解が生じることを示す一連のグラフを示す。細胞結合形態のＭＵＣ１６を過剰発現するＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞がＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって特異的に死滅した（Ａ）一方で、親ＳＫＯＶ３細胞は、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって死滅しなかった（Ｂ）。同様に、細胞結合形態のＭＵＣ１６を過剰発現するＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞は、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって排除された（Ｃ）。ＭＵＣ１６細胞外の発現レベルが低い親ＯＶＣＡＲ３細胞の死滅は部分的なものにすぎなかった（Ｄ）。
【図１０Ｃ】ＭＵＣ１６  ＴＦＰ−Ｔ細胞によってＭＵＣ１６細胞外特異的な腫瘍細胞溶解が生じることを示す一連のグラフを示す。細胞結合形態のＭＵＣ１６を過剰発現するＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞がＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって特異的に死滅した（Ａ）一方で、親ＳＫＯＶ３細胞は、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって死滅しなかった（Ｂ）。同様に、細胞結合形態のＭＵＣ１６を過剰発現するＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞は、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって排除された（Ｃ）。ＭＵＣ１６細胞外の発現レベルが低い親ＯＶＣＡＲ３細胞の死滅は部分的なものにすぎなかった（Ｄ）。
【図１０Ｄ】ＭＵＣ１６  ＴＦＰ−Ｔ細胞によってＭＵＣ１６細胞外特異的な腫瘍細胞溶解が生じることを示す一連のグラフを示す。細胞結合形態のＭＵＣ１６を過剰発現するＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞がＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって特異的に死滅した（Ａ）一方で、親ＳＫＯＶ３細胞は、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって死滅しなかった（Ｂ）。同様に、細胞結合形態のＭＵＣ１６を過剰発現するＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞は、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって排除された（Ｃ）。ＭＵＣ１６細胞外の発現レベルが低い親ＯＶＣＡＲ３細胞の死滅は部分的なものにすぎなかった（Ｄ）。
【図１１Ａ】ＭＵＣ１６  ＴＦＰ−Ｔ細胞によってＭＵＣ１６細胞外特異的なサイトカイン産生が生じることを示す一連のグラフを示す。ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞は、ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌し（それぞれＡ及びＥ）、またはＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌したが（それぞれＣ及びＧ）、ＳＫＯＶ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌せず（それぞれＢ及びＦ）、またはＯＶＣＡＲ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌しなかった（それぞれＤ及びＨ）。
【図１１Ｂ】ＭＵＣ１６  ＴＦＰ−Ｔ細胞によってＭＵＣ１６細胞外特異的なサイトカイン産生が生じることを示す一連のグラフを示す。ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞は、ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌し（それぞれＡ及びＥ）、またはＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌したが（それぞれＣ及びＧ）、ＳＫＯＶ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌せず（それぞれＢ及びＦ）、またはＯＶＣＡＲ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌しなかった（それぞれＤ及びＨ）。
【図１１Ｃ】ＭＵＣ１６  ＴＦＰ−Ｔ細胞によってＭＵＣ１６細胞外特異的なサイトカイン産生が生じることを示す一連のグラフを示す。ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞は、ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌し（それぞれＡ及びＥ）、またはＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌したが（それぞれＣ及びＧ）、ＳＫＯＶ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌せず（それぞれＢ及びＦ）、またはＯＶＣＡＲ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌しなかった（それぞれＤ及びＨ）。
【図１１Ｄ】ＭＵＣ１６  ＴＦＰ−Ｔ細胞によってＭＵＣ１６細胞外特異的なサイトカイン産生が生じることを示す一連のグラフを示す。ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞は、ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌し（それぞれＡ及びＥ）、またはＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌したが（それぞれＣ及びＧ）、ＳＫＯＶ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌せず（それぞれＢ及びＦ）、またはＯＶＣＡＲ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌しなかった（それぞれＤ及びＨ）。
【図１１Ｅ】ＭＵＣ１６  ＴＦＰ−Ｔ細胞によってＭＵＣ１６細胞外特異的なサイトカイン産生が生じることを示す一連のグラフを示す。ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞は、ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌し（それぞれＡ及びＥ）、またはＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌したが（それぞれＣ及びＧ）、ＳＫＯＶ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌せず（それぞれＢ及びＦ）、またはＯＶＣＡＲ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌しなかった（それぞれＤ及びＨ）。
【図１１Ｆ】ＭＵＣ１６  ＴＦＰ−Ｔ細胞によってＭＵＣ１６細胞外特異的なサイトカイン産生が生じることを示す一連のグラフを示す。ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞は、ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌し（それぞれＡ及びＥ）、またはＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌したが（それぞれＣ及びＧ）、ＳＫＯＶ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌せず（それぞれＢ及びＦ）、またはＯＶＣＡＲ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌しなかった（それぞれＤ及びＨ）。
【図１１Ｇ】ＭＵＣ１６  ＴＦＰ−Ｔ細胞によってＭＵＣ１６細胞外特異的なサイトカイン産生が生じることを示す一連のグラフを示す。ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞は、ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌し（それぞれＡ及びＥ）、またはＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌したが（それぞれＣ及びＧ）、ＳＫＯＶ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌せず（それぞれＢ及びＦ）、またはＯＶＣＡＲ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌しなかった（それぞれＤ及びＨ）。
【図１１Ｈ】ＭＵＣ１６  ＴＦＰ−Ｔ細胞によってＭＵＣ１６細胞外特異的なサイトカイン産生が生じることを示す一連のグラフを示す。ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞は、ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌し（それぞれＡ及びＥ）、またはＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌したが（それぞれＣ及びＧ）、ＳＫＯＶ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌せず（それぞれＢ及びＦ）、またはＯＶＣＡＲ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌しなかった（それぞれＤ及びＨ）。
【図１２】ＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞がＭＵＣ１６細胞外特異的に増殖することを示す。Ｔ細胞追跡シグナルの希釈（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）のシグナル強度の減少）をフローサイトメトリー分析によって監視することによってＭＵＣ１６−ＴＦＰ  Ｔ細胞がＭＵＣ１６細胞外特異的に増殖するかを決定した。ＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｆａｒ  Ｒｅｄ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎキット（カタログ番号Ｃ３４５６４ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識した後、ＳＫＯＶ３細胞またはＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と１：１の比で３日間共培養した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎキットで標識したＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞を、培地単独、またはプレートに１μｇ／ｍＬで結合させた抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ−３、カタログ番号１４−００３７−８２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３日間刺激することも行った。ＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞はＭＵＣ１６細胞外特異的に増殖することが示され、このことは、ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞との共培養時にはＣｅｌｌＴｒａｃｅシグナルが減少するが、ＳＫＯＶ３細胞との共培養時にはこの減少が生じないことによって実証された。
【図１３Ａ】ＭＵＣ１６−ＴＦＰ  Ｔ細胞のインビボでの活性を示す一連のグラフを示す。ヒト卵巣癌細胞株（ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞及びＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞）のＮＳＧマウス異種移植モデルにおいてＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞を評価した。ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞の腹腔内モデルでは、０日目（Ｔ細胞の注射日）のベースラインレベルと比較するとＭＵＣ１６  ＴＦＰ１が腫瘍量を有意に低減することが示された。
【図１３Ｂ】ＭＵＣ１６−ＴＦＰ  Ｔ細胞のインビボでの活性を示す一連のグラフを示す。ヒト卵巣癌細胞株（ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞及びＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞）のＮＳＧマウス異種移植モデルにおいてＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞を評価した。図１３Ａの結果と一致して、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ１は、ＮＴ  Ｔ細胞と比較してＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞の皮下モデルにおいて腫瘍増殖を有意に遅延させた。
【図１３Ｃ】ＭＵＣ１６−ＴＦＰ  Ｔ細胞のインビボでの活性を示す一連のグラフを示す。ヒト卵巣癌細胞株（ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞及びＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞）のＮＳＧマウス異種移植モデルにおいてＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞を評価した。ＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞の腹腔内モデルでは、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ１及びＭＵＣ１６  ＴＦＰ２は共に、マウスから腫瘍を完全に消失させた。
【図１４Ａ】ＭＳＴＯ−ＭＳＬＮ高腫瘍またはＭＳＴＯ−ＭＳＬＮ低腫瘍のいずれかを有するＮＳＧマウスにおいてＭＳＬＮ高発現腫瘍（ＭＳＴＯ−ＭＳＬＮ高（表面ＭＳＬＮのコピー数１１００６））に対するＭＳＬＮ−ＴＦＰ  Ｔ細胞の死滅誘発能力と、ＭＳＬＮ低発現腫瘍（ＭＳＴＯ−ＭＳＬＮ低（表面ＭＳＬＮのコピー数１９８））に対するＭＳＬＮ−ＴＦＰ  Ｔ細胞の死滅誘発能力と、には差があることを示すグラフである。担腫瘍マウスに対して、非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ、Ｔ細胞総数１×１０７）またはＭＳＬＮ−ＴＦＰ  Ｔ細胞（Ｔ細胞総数１×１０７）を静脈内注射した。ＮＴ  Ｔ細胞で処理したマウスと比較して、ＭＳＬＮ−ＴＦＰ  Ｔ細胞はＭＳＬＮ高発現腫瘍の増殖を劇的に制御した。
【図１４Ｂ】ＭＳＴＯ−ＭＳＬＮ高腫瘍またはＭＳＴＯ−ＭＳＬＮ低腫瘍のいずれかを有するＮＳＧマウスにおいてＭＳＬＮ高発現腫瘍（ＭＳＴＯ−ＭＳＬＮ高（表面ＭＳＬＮのコピー数１１００６））に対するＭＳＬＮ−ＴＦＰ  Ｔ細胞の死滅誘発能力と、ＭＳＬＮ低発現腫瘍（ＭＳＴＯ−ＭＳＬＮ低（表面ＭＳＬＮのコピー数１９８））に対するＭＳＬＮ−ＴＦＰ  Ｔ細胞の死滅誘発能力と、には差があることを示すグラフである。担腫瘍マウスに対して、非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ、Ｔ細胞総数１×１０７）またはＭＳＬＮ−ＴＦＰ  Ｔ細胞（Ｔ細胞総数１×１０７）を静脈内注射した。図１４Ａの結果とは対照的に、ＭＳＬＮ低発現腫瘍を有するマウスをＭＳＬＮ−ＴＦＰ  Ｔ細胞で処理して観測された抗腫瘍応答は限定されたものであった。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本明細書には、ＴＣＲサブユニット（ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、及びＣＤ３デルタを含む）と細胞表面抗原に特異的な結合ドメインとの新規の融合タンパク質、ならびにＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖と細胞表面抗原に特異的な結合ドメインとの新規の融合タンパク質が記載されており、こうした融合タンパク質は、現存する手法の限界を克服する潜在力を有する。
【００６３】
本明細書には、ＣＡＲと比較してより効率的に標的細胞を死滅させるが、炎症促進性サイトカインの放出レベルが同等以下である新規の融合タンパク質が記載されている。こうした融合タンパク質及びその使用方法は、ＣＡＲと比較してＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）に優位性があることを示すものであり、この優位性は、こうしたサイトカインのレベル上昇が、養子ＣＡＲ−Ｔ療法に対する用量制限毒性と関連していることに起因する。
【００６４】
一態様では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットと、抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）結合ドメイン（例えば、ＩＬ１３Ｒａ２結合ドメイン、ＭＵＣ１６結合ドメイン、またはＭＳＬＮ結合ドメイン）を含む抗体ドメインと、を含むＴＣＲ融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された核酸分子が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、ヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインである。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ細胞外ドメインを含む。他の実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ膜貫通ドメインを含む。さらに他の実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ細胞内ドメインを含む。別の実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインと、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインと、を含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つは、同じＴＣＲサブユニットに由来する。さらに別の実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、もしくはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれに対する少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つの改変を有するアミノ酸配列、から選択される刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む。さらに別の実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、４−１ＢＢの機能性シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ゼータの機能性シグナル伝達ドメイン、あるいはそれに対する少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つの改変を有するアミノ酸配列、から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、（ｉ）本明細書で提供される任意の抗ＴＡＡ軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、及びＬＣ  ＣＤＲ３、及び／または（ｉｉ）本明細書で提供される任意の抗ＴＡＡ重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、及びＨＣ  ＣＤＲ３を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、本明細書で提供される任意の抗ＴＡＡ重鎖抗体または抗ＴＡＡ単一ドメイン抗体のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、及びＨＣ  ＣＤＲ３を含む。例えば、重鎖抗体または単一ドメイン抗体は、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ科の動物に見られるものであり得る。Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ目Ｔｙｌｏｐｏｄａ亜目Ｃａｍｅｌｉｄａｅ科（ラクダ：ヒトコブのＣａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｅｓ及びフタコブのＣａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ、ラマ：Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ、Ｌａｍａ  ｇｕａｎｉｃｏｅ、Ｌａｍａ  ｖｉｃｕｇｎａ、アルパカ：Ｖｉｃｕｇｎａ  ｐａｃｏｓ）は、その血清中に古典的な抗体に加えて特殊な型の抗体を有する。こうした抗体は、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）と呼ばれており、軽鎖全体及び第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在しないという点において独特のものである。ラクダの重鎖のみの抗体（ｃＡｂ）と類似の抗体は、ウォビゴン、テンジクザメ、及びスポッテッドラットフィッシュにも見られている。
【００６７】
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対する１、２、もしくは３〜３０個、２０個、もしくは１０個の改変を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列との同一性が９５〜９９％である配列を含む。他の実施形態では、重鎖可変領域は、本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対する１、２、もしくは３〜３０個、２０個、もしくは１０個の改変を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列との同一性が９５〜９９％である配列を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＴＦＰは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖もしくはベータ鎖、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、もしくはＣＤ３ガンマ、またはその機能性断片、あるいはそれに対する１、２、または３〜２０個、１０個、または５つの改変を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、ＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインを含む。他の実施形態では、コードされるＴＦＰは、ＴＣＲのアルファ鎖、ＴＣＲのベータ鎖、もしくはＴＣＲサブユニット（ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、及びＣＤ３デルタ）、またはその機能性断片、あるいはそれに対する１、２、または３〜２０個、１０個、または５つの改変を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、コードされるＴＦＰは、ＴＣＲのアルファ鎖、ベータ鎖、もしくはゼータ鎖、またはＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、及びその機能性断片からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、コードされるＴＦＰは、自体に対する１、２、または３〜２０個、１０個、または５つの改変を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の膜貫通ドメインを含み、タンパク質は、ＴＣＲのアルファ鎖、ベータ鎖、もしくはゼータ鎖、またはＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、及びその機能性断片からなる群から選択される。
【００７０】
いくつかの実施形態では、コードされる抗ＴＡＡ結合ドメインは、リンカー配列によってＴＣＲ細胞外ドメインに連結される。場合によっては、コードされるリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜４）を含む。場合によっては、コードされるリンカー配列は、長鎖リンカー（ＬＬ）配列を含む。場合によっては、コードされる長鎖リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝２〜４）を含む。場合によっては、コードされるリンカー配列は、短鎖リンカー（ＳＬ）配列を含む。場合によっては、コードされる短鎖リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜３）を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。場合によっては、共刺激ドメインは、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはそれに対する１、２、もしくは３〜２０個、１０個、もしくは５つの改変を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能性シグナル伝達ドメインである。
【００７２】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、リーダー配列をさらに含む。
【００７３】
前述の核酸分子のいずれかによってコードされる単離されたポリペプチド分子もまた、本明細書で提供される。
【００７４】
別の態様では、抗ＴＡＡ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む単離されたＴ細胞受容体融合タンパク質（ＴＦＰ）分子もまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、単離されたＴＦＰ分子は、ヒト抗ＴＡＡ結合ドメインまたはヒト化抗ＴＡＡ結合ドメインを含む抗体または抗体断片、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、ヒト結合ドメインまたはヒト化結合ドメインである。いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、ヒト化されたものではない。いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、ラクダ抗体またはその抗体断片を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはＶＨドメインを含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインは、抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、ヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインは、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはＶＨドメインを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨＨ、またはＶＨドメインである。他の実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び重鎖、もしくはその機能性断片、または本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対する１、２、もしくは３〜３０個、２０個、もしくは１０個の改変を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列との同一性が９５〜９９％である配列を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、単離されたＴＦＰ分子は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖もしくはベータ鎖、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、またはＣＤ３ガンマ、あるいはそれに対する１、２、または３〜２０個、１０個、または５つの改変を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むＴＣＲ細胞外ドメインを含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、リンカー配列によってＴＣＲ細胞外ドメインに連結される。場合によっては、リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜４）を含む。場合によっては、リンカー配列は、長鎖リンカー（ＬＬ）配列を含む。場合によっては、長鎖リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝２〜４）を含む。場合によっては、リンカー配列は、短鎖リンカー（ＳＬ）配列を含む。場合によっては、短鎖リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜３）を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、単離されたＴＦＰ分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。他の実施形態では、単離されたＴＦＰ分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列をさらに含む。さらに他の実施形態では、単離されたＴＦＰ分子は、リーダー配列をさらに含む。
【００８１】
前述のＴＦＰ分子のいずれかをコードする核酸分子を含むベクターもまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ベクターは、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、インビトロで転写されるベクターである。いくつかの実施形態では、ベクター中の核酸配列は、ポリ（Ａ）尾部をさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクター中の核酸配列は、３’ＵＴＲをさらに含む。
【００８２】
記載のベクターのいずれかを含む細胞もまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、細胞は、正のシグナルを生成する、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の第２のポリペプチドと結び付いた、抑制分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む。場合によっては、抑制分子は、ＰＤ１の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドと、を含む。
【００８３】
別の態様では、抗ＴＡＡ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたＴＦＰ分子が本明細書で提供され、ＴＦＰ分子は、内在性のＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する。いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、ヒト抗ＴＡＡ結合ドメインまたはヒト化抗ＴＡＡ結合ドメインである。
【００８４】
別の態様では、抗ＴＡＡ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたＴＦＰ分子が本明細書で提供され、ＴＦＰ分子は、内在性のＴＣＲ複合体に機能的に組み込まれる能力を有する。
【００８５】
別の態様では、少なくとも２つのＴＦＰ分子を含むヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞が本明細書で提供され、これらのＴＦＰ分子は、ヒト抗ＴＡＡ結合ドメインまたはヒト化抗ＴＡＡ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、ＴＦＰ分子は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の中、特定位置、及び／または表面上の内在性のＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する。
【００８６】
別の態様では、ｉ）ヒト抗ＴＡＡ結合ドメインまたはヒト化抗ＴＡＡ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子と、ｉｉ）少なくとも１つの内在性のＴＣＲ複合体と、を含むタンパク質複合体が本明細書で提供される。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖もしくはベータ鎖、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、またはＣＤ３ガンマからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、リンカー配列によってＴＣＲ細胞外ドメインに連結される。場合によっては、リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜４）を含む。場合によっては、リンカー配列は、長鎖リンカー（ＬＬ）配列を含む。場合によっては、長鎖リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝２〜４）を含む。場合によっては、リンカー配列は、短鎖リンカー（ＳＬ）配列を含む。場合によっては、短鎖リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜３）を含む。
【００８８】
記載のタンパク質複合体のいずれか当たり少なくとも２つの異なるＴＦＰタンパク質を含むヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞もまた、本明細書で提供される。
【００８９】
別の態様では、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の集団が本明細書で提供され、集団のＴ細胞は、少なくとも２つのＴＦＰ分子を個々または集合的に含み、これらのＴＦＰ分子は、ヒト抗ＴＡＡ結合ドメインまたはヒト化抗ＴＡＡ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、ＴＦＰ分子は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の中、特定位置、及び／または表面上の内在性のＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内在性のＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する。
【００９０】
別の態様では、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の集団が本明細書で提供され、集団のＴ細胞は、本明細書で提供される単離された核酸分子によってコードされる少なくとも２つのＴＦＰ分子を個々または集合的に含む。
【００９１】
別の態様では、細胞を調製する方法が本明細書で提供され、この方法は、記載のベクターのいずれかでＴ細胞の形質導入を行うことを含む。
【００９２】
別の態様では、ＲＮＡで操作された細胞の集団を生成させる方法が本明細書で提供され、この方法は、インビトロで転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含み、ＲＮＡは、記載のＴＦＰ分子のいずれかをコードする核酸を含む。
【００９３】
別の態様では、哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法が本明細書で提供され、この方法は、記載のＴＦＰ分子のいずれかを発現する細胞を有効量で哺乳類に投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、自家Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類は、ヒトである。
【００９４】
別の態様では、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）（例えば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮ）の発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法が本明細書で提供され、この方法は、記載のＴＦＰ分子のいずれかを含む細胞を有効量で哺乳類に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＡ（例えば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＭＳＬＮ）の発現と関連する疾患は、増殖性疾患（がんもしくは悪性腫瘍または前がん性状態（膵癌、卵巣癌、胃癌、中皮腫、肺癌、または子宮内膜癌など）など）から選択されるか、あるいはＴＡＡ（例えば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＭＳＬＮ）の発現と関連する非がん関連徴候である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、記載のＴＦＰ分子のいずれかを発現する細胞は、ＴＦＰ分子を発現する細胞の投与と関連する１つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、記載のＴＦＰ分子のいずれかを発現する細胞は、ＴＡＡ（例えば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＭＳＬＮ）と関連する疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される。
【００９６】
薬剤として使用するための、記載の単離された核酸分子のいずれか、記載の単離されたポリペプチド分子のいずれか、記載の単離されたＴＦＰのいずれか、記載のタンパク質複合体のいずれか、記載のベクターのいずれか、または記載の細胞のいずれかも本明細書で提供される。
【００９７】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【００９８】
「ａ」及び「ａｎ」という用語は、冠詞の文法的な対象が１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）であることを指す。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
【００９９】
本明細書で使用される「約」は、状況に加えて、当業者に知られるか、または当業者が知り得るかに応じて、±１パーセント未満もしくは±１パーセント、±２パーセント、±３パーセント、±４パーセント、±５パーセント、±６パーセント、±７パーセント、±８パーセント、±９パーセント、±１０パーセント、±１１パーセント、±１２パーセント、±１３パーセント、±１４パーセント、±１５パーセント、±１６パーセント、±１７パーセント、±１８パーセント、±１９パーセント、±２０パーセント、±２５パーセント、±３０パーセント、または±３０パーセント超を意味し得る。
【０１００】
本明細書で使用される「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」または「対象（ｓｕｂｊｅｃｔｓ）」または「個体」は、限定されないが、哺乳類（ヒトまたは非ヒト哺乳類（例えば、家畜化動物、農業用動物、もしくは野生動物）など）、ならびに鳥類及び水生動物を含み得る。「患者」は、疾患、障害、もしくは状態を患っているか、またはその発症リスクを有するか、あるいは本明細書で提供される組成物及び方法をその他の理由で必要とする対象である。
【０１０１】
本明細書で使用される「治療すること」または「治療」は、疾患または状態の治療または改善が成功する任意の徴候を指す。治療することには、例えば、疾患もしくは状態の症状の１つ以上の重症度を低減、遅延、もしくは緩和させることが含まれ得るか、または疾患、異常、障害、もしくは有害な状態の症状、及び同様のものを患者が経験する頻度を低減することが含まれ得る。本明細書で使用される「治療または予防する」は、方法によって疾患または状態が何らかのレベルで治療または改善されることを指すために本明細書で使用されることがあり、その目標（限定されないが、状態の完全な予防を含む）に導かれるある一定範囲の結果を企図するものである。
【０１０２】
本明細書で使用される「予防すること」は、患者における疾患または状態（腫瘍形成）の予防を指す。例えば、腫瘍または他の形態のがんを発症するリスクを有する個体が本発明の方法で治療され、その後にそうした腫瘍または他の形態のがんを発症しないのであれば、そうした疾患は、その個体において少なくとも一定期間にわたって予防されている。
【０１０３】
本明細書で使用される「治療的に有効な量」は、組成物またはその活性成分が、そうした組成物が投与される個体に対して有益な作用を及ぼすか、または有害な非有益事象をその他の様式で低減する上で十分な量である。本明細書で使用される「治療的に有効な用量」は、その投与目的である１つ以上の所望の作用または望ましい作用（例えば、有益な作用）を生じさせる用量が意図され、そのような投与は、所与の期間にわたって１回以上行われる。正確な用量は、治療の目的に依存することになり、既知の手法を使用して当業者によって確かめられることになる（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）、Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）、及びＰｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）を参照のこと）。
【０１０４】
本明細書で使用される「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質」または「ＴＦＰ」は、ｉ）標的細胞上の表面抗原に結合すること、及びｉｉ）インタクトなＴＣＲ複合体の他のポリペプチド要素と相互作用すること（この相互作用は、典型的には、Ｔ細胞の中または表面上でそうした他のポリペプチド要素と共局在化するときに生じる）、が一般に可能な、さまざまなＴＣＲ構成ポリペプチド由来の組換えポリペプチドを含む。「ＴＦＰ  Ｔ細胞」は、本明細書に開示の方法に従って形質導入されており、ＴＦＰ（例えば、天然のＴＣＲに組み込まれるもの）を発現するＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＦＰ  Ｔ細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、
【０１０５】
本明細書で使用される「ＭＵＣ１６」という用語は、ムチン１６またはＣＡ１２５（がん抗原１２５（ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  １２５）、がん抗原１２５（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ  １２５）、もしくは糖質抗原１２５）としても知られており、ＭＵＣ１６遺伝子によってコードされるヒトタンパク質を指す。ＭＵＣ１６は、ムチンファミリー糖タンパク質のメンバーであり、特定の型のがんまたは他の良性状態を有する患者によってはその血液中で上昇し得る腫瘍マーカーまたはバイオマーカーとしての用途が見出されているものである。ＭＵＣ１６は、卵巣癌を検出するためのバイオマーカーとして使用され、他のがん（子宮内膜癌、卵管癌、肺癌、乳癌、及び胃腸癌を含む）においても上昇することが明らかとなっている。ＭＵＣ１６は、がん細胞に対する免疫応答においてナチュラルキラー細胞の活性を抑制することも示されている（例えば、Ｐａｔａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ９９（３）；７０４−１３を参照のこと）。
【０１０６】
本明細書で使用される「ＩＬ１３Ｒα２」という用語は、表面抗原分類２１３Ａ２（ＣＤ２１３Ａ２）としても知られており、ＩＬ１３Ｒα２遺伝子によってコードされる膜結合型ヒトタンパク質を指す。ＩＬ１３Ｒα２は、インターロイキン１３受容体複合体のサブユニットであり、ＩＬ１３タンパク質の受容体である。ＩＬ１３Ｒα２は、膵癌、卵巣癌、メラノーマ、及び悪性神経膠腫を含めて、さまざまながんにおいて過剰発現することが明らかになっている。
【０１０７】
本明細書で使用される「ＭＳＬＮ」または「メソテリン」という用語は、４０ｋＤａの細胞表面グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合型糖タンパク質を指す。ヒトメソテリンタンパク質は、６９ｋＤの前駆体として合成され、その後、この前駆体は、タンパク質分解によるプロセシングを受ける。メソテリンの３０ｋＤのアミノ末端は分泌され、このアミノ末端は、巨核球増強因子と称される（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：８０５  ８０８，１９９４）。４０ｋＤのカルボキシル末端は、成熟メソテリンとして膜結合状態で残存する（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３６  １４０，１９９６、Ｓｃｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２４７（２００７），１３０−１３６）。メソテリンの核酸配列及びアミノ酸配列の例は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００５８２３またはＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿０１３４０４にて見られるＭＳＬＮ遺伝子転写物から特定することもできる。したがって、本明細書に開示の複合体コンストラクトが、メソテリンまたはそのエピトープに対する参照抗体との交差競合によって特徴付けられる場合、メソテリンは、Ｓｃｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２４７（２００７），１３０−１３６に報告されているものである。
【０１０８】
ヒト及びマウスのアミノ酸配列及び核酸配列は、公的なデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなど）において見つけることができる。例えば、ヒトＭＵＣ１６のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ８ＷＸＩ７として見つけることができる。ヒトＭＵＣ１６をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＮＭ＿０２４６９０にて見つけることができる。ヒトＭＵＣ１６転写物バリアントＸ１をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＸＭ＿０１７０２７４８６にて見つけることができる。ヒトＭＵＣ１６転写物バリアントＸ２をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＸＭ＿０１７０２７４８７にて見つけることができる。ヒトＭＵＣ１６転写物バリアントＸ３をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＸＭ＿０１７０２７４８８にて見つけることができる。ヒトＭＵＣ１６転写物バリアントＸ４をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＸＭ＿０１７０２７４８９にて見つけることができる。ヒトＭＵＣ１６転写物バリアントＸ５をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＸＭ＿０１７０２７４９０にて見つけることができる。ヒトＭＵＣ１６転写物バリアントＸ６をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＸＭ＿０１７０２７４９１にて見つけることができる。ヒトＭＵＣ１６転写物バリアントＸ７をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＸＭ＿０１７０２７４９２にて見つけることができる。ヒトＭＵＣ１６転写物バリアントＸ８をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＸＭ＿０１７０２７４９３にて見つけることができる。ヒトＭＵＣ１６転写物バリアントＸ９をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＸＭ＿０１７０２７４９４にて見つけることができる。ヒトＭＵＣ１６転写物バリアントＸ１０をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＸＭ＿０１７０２７４９５にて見つけることができる。ヒトＭＵＣ１６転写物バリアントＸ１１をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＸＭ＿０１７０２７４９９にて見つけることができる。ヒトＭＵＣ１６転写物バリアントＸ１２をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＸＭ＿０１７０２７５００にて見つけることができる。ヒトＭＵＣ１６転写物バリアントＸ１３をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＸＭ＿０１７０２７５０１にて見つけることができる。一例では、ＴＦＰの抗原結合部分は、神経膠腫細胞上、神経膠腫始原細胞上、通常もしくは悪性の中皮腫細胞上、卵巣癌細胞上、膵臓腺癌細胞上、または扁平上皮癌細胞上に発現するＭＵＣ１６タンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープを認識し、それに結合する。
【０１０９】
ヒトＩＬ１３Ｒα２のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ１４６２７として見つけることができる。ヒトＩＬ１３Ｒα２をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＮＭ＿０００６４０にて見つけることができる。ヒトＩＬ１３Ｒα２前駆体をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＮＰ＿０００６３１にて見つけることができる。一例では、ＴＦＰの抗原結合部分は、神経膠腫細胞上、神経膠腫始原細胞上、通常もしくは悪性の中皮腫細胞上、卵巣癌細胞上、膵臓腺癌細胞上、または扁平上皮癌細胞上に発現するＩＬ１３Ｒα２タンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープを認識し、それに結合する。
【０１１０】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合するタンパク質を指すか、または抗原に特異的に結合する、免疫グロブリン分子由来のポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナル起源もしくはモノクローナル起源のインタクトな免疫グロブリンまたはその断片であり得、天然または組換えの供給源に由来し得る。
【０１１１】
「抗体断片」または「抗体結合ドメイン」という用語は、抗体またはその組換えバリアントの少なくとも１つの抗原結合ドメイン含有部分を指し、こうした抗原結合ドメインは、すなわち、インタクトな抗体の抗原決定可変領域であり、抗体断片が標的（抗原及びその規定エピトープなど）を認識し、それに特異的に結合するようになる上で十分なものである。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及びＦｖ断片、一本鎖（ｓｃ）Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）抗体断片、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体（「ｓｄＡｂ」と略される）（ＶＬまたはＶＨのいれずれか）、ラクダＶＨＨドメイン、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【０１１２】
「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片と、を含む融合タンパク質を指し、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とは、短い可動性ポリペプチドリンカーを介して隣接して連結され、単一のポリペプチド鎖として発現する能力を有し、ｓｃＦｖは、その由来元であるインタクトな抗体の特異性を保持する。
【０１１３】
抗体に関する「重鎖可変領域」もしくは「ＶＨ」（単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディ）の場合は「ＶＨＨ」）は、フレームワーク領域として知られる隣接区間の間に介在する３つのＣＤＲを含む重鎖断片を指し、こうしたフレームワーク領域は、一般に、ＣＤＲと比較して保存度が高く、ＣＤＲを支持する骨格を形成する。
【０１１４】
別段の指定がない限り、本明細書で使用されるｓｃＦｖは、ＶＬ可変領域及びＶＨ可変領域をいずれかの順序（例えば、当該ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関する順序）で有し得、ｓｃＦｖは、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含み得るか、またはＶＨ−リンカー−ＶＬを含み得る。
【０１１５】
本発明のＴＦＰ組成物のうちで抗体またはその抗体断片を含む部分は、抗原結合ドメインが連続ポリペプチド鎖の一部として発現するさまざまな形態で存在し得、こうした形態には、例えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）または重鎖抗体（ＨＣＡｂ）、マウス抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体に由来する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。一態様では、本開示のＴＦＰ組成物の抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。別の態様では、ＴＦＰは、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂを含む抗体断片を含む。
【０１１６】
「抗体重鎖」という用語は、天然に生じる高次構造を有する抗体分子に存在する２つの型のポリペプチド鎖のうちの大きい方のポリペプチド鎖を指し、このポリペプチド鎖によって、抗体が属するクラスが通常は決定される。
【０１１７】
「抗体軽鎖」という用語は、天然に生じる高次構造を有する抗体分子に存在する２つの型のポリペプチド鎖のうちの小さい方のポリペプチド鎖を指す。カッパ（「κ」）軽鎖及びラムダ（「λ」）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【０１１８】
「組換え抗体」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指し、こうした抗体は、例えば、バクテリオファージまたは酵母による発現系によって発現する抗体などである。この用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子（抗体タンパク質を発現する）を合成するか、または抗体を規定するアミノ酸配列を合成することによって生成されている抗体を意味するとも解釈されるべきであり、こうしたＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当該技術分野でよく知られる利用可能な組換えＤＮＡ技術またはアミノ酸配列技術を使用して得られている。
【０１１９】
「抗原」または「Ａｇ」という用語は、抗体による特異的な結合を受ける能力を有するか、またはその他の様式で免疫応答を誘発する分子を指す。この免疫応答は、抗体産生を伴うものであるか、もしくは免疫学的に能力を有する特定の細胞の活性化を伴うものであるか、またはこれら両方を伴うものであり得る。
【０１２０】
事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の巨大分子が抗原として働き得ることを当業者なら理解するであろう。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡにも由来し得る。任意のＤＮＡが、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含んでおり、それ故に、本明細書の用語として使用される「抗原」をコードすることを当業者なら理解するであろう。さらに、抗原は、１つの遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことを当業者なら理解するであろう。複数の遺伝子の部分的なヌクレオチド配列を使用すること（このことに限定されない）を本開示が含み、こうしたヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするようにさまざまな組み合わせで配置されることは容易に理解されよう。さらに、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことも当業者なら理解するであろう。抗原は、合成で生成され得るか、もしくは生物学的試料に由来し得るか、またはポリペプチド以外の巨大分子であり得ることも容易に理解されよう。そのような生物学的試料には、限定されないが、組織試料、腫瘍試料、細胞、または他の生物学的成分を含む液体が含まれ得る。
【０１２１】
「抗腫瘍作用」という用語は、さまざまな手段によって明らかになり得る生物学的作用を指し、こうした生物学的作用には、限定されないが、例えば、腫瘍体積の低減、腫瘍細胞数の低減、転移数の低減、平均余命の長期化、腫瘍細胞増殖の低減、腫瘍細胞生存率の低減、またはがん性状態と関連するさまざまな生理学的症状の改善が含まれる。「抗腫瘍作用」は、最初に腫瘍が発生することを予防する能力を本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、及び抗体が有することによっても明らかになり得る。
【０１２２】
「自家」という用語は、任意の材料が、それが後に再導入される個体と同じ個体に由来するものであることを指す。
【０１２３】
「同種異系」という用語は、任意の材料が、同じ種の異なる動物に由来するか、または当該材料が導入される個体とは異なる患者に由来するものであることを指す。２体以上の個体は、１つ以上の遺伝子座における遺伝子が同一ではない場合、互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様では、同じ種の個体に由来する同種異系材料は、抗原的に相互作用する上で遺伝子学的に十分に異なり得る。
【０１２４】
「異種」という用語は、移植片が、異なる種の動物に由来するものであることを指す。
【０１２５】
「がん」という用語は、異常な細胞が急速かつ無制御に増殖することによって特徴付けられる疾患を指す。がん細胞は、局所的に拡散するか、または血流及びリンパ系を介して体の他の部分に拡散し得る。本明細書には、さまざまながんの例が記載されており、こうした例としては、限定されないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、脳癌、肺癌、及び同様のものが挙げられる。
【０１２６】
ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮ「の発現と関連する疾患」という語句は、限定されないが、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、もしくはＭＳＬＮの発現と関連する疾患、またはＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、もしくはＭＳＬＮを発現する細胞と関連する状態を含み、こうした疾患及び状態には、例えば、増殖性疾患（がんもしくは悪性腫瘍または前がん性状態など）が含まれる。一態様では、がんは、神経膠芽腫である。一態様では、がんは、中皮腫である。一態様では、がんは、膵癌である。一態様では、がんは、卵巣癌である。一態様では、がんは、脳癌である。一態様では、がんは、胃癌である。一態様では、がんは、肺癌である。一態様では、がんは、子宮内膜癌である。ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮの発現と関連する非がん関連徴候には、限定されないが、例えば、自己免疫疾患（例えば、エリテマトーデス、関節リウマチ、大腸炎）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）、ならびに移植が挙げられる。
【０１２７】
「保存的配列改変」という用語は、そのアミノ酸配列を含む抗体または抗体断片の結合特徴に顕著な影響または変化を与えないアミノ酸改変を指す。そのような保存的改変には、アミノ酸の置換、追加、及び欠失が含まれる。改変は、当該技術分野で知られる標準的な手法（部位特異的変異導入及びＰＣＲ介在性変異導入など）によって本発明の抗体または抗体断片に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、類似側鎖を有するアミノ酸残基によってアミノ酸残基が交換される置換である。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。こうしたファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、本発明のＴＦＰに含まれるアミノ酸残基の１つ以上を、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ酸残基によって交換することができ、改変されたＴＦＰは、本明細書に記載の機能アッセイを使用して試験され得る。
【０１２８】
「刺激」という用語は、刺激ドメインまたは刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）がその同族リガンドと結合し、それによってシグナル伝達事象（限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介するシグナル伝達など）が媒介されることによって一次応答が誘導されることを指す。刺激は、ある特定の分子の発現変化、及び／または細胞骨格構造の再編成、ならびに同様のものを媒介し得る。
【０１２９】
「刺激分子」または「刺激ドメイン」という用語は、Ｔ細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの側面について刺激性の様式でＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する一次細胞質シグナル伝達配列（複数可）を与えるＴ細胞発現分子またはその一部を指す。一態様では、一次シグナルは、例えば、ペプチドが組み込まれたＭＨＣ分子とＴＣＲ／ＣＤ３複合体が結合することによって開始され、これによってＴ細胞応答が媒介される。こうしたＴ細胞応答には、限定されないが、増殖、活性化、分化、及び同様のものが含まれる。刺激性の様式で働く一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される）は、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたは「ＩＴＡＭ」として知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭを含む一次細胞質シグナル伝達配列のうちで本発明において特に有用なものの例としては、限定されないが、ＴＣＲゼータに由来するもの、ＦｃＲガンマに由来するもの、ＦｃＲベータに由来するもの、ＣＤ３ガンマに由来するもの、ＣＤ３デルタに由来するもの、ＣＤ３イプシロンに由来するもの、ＣＤ５に由来するもの、ＣＤ２２に由来するもの、ＣＤ７９ａに由来するもの、ＣＤ７９ｂに由来するもの、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」としても知られる）に由来するもの、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。
【０１３０】
「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」という用語は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体化した外来抗原を自体の表面上にディスプレイする免疫系細胞（アクセサリー細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、及び同様のもの）など）を指す。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこうした複合体を認識し得る。ＡＰＣは、抗原のプロセシングを行い、それをＴ細胞に提示する。
【０１３１】
本明細書で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＦＰ含有細胞（例えば、ＴＦＰ発現Ｔ細胞）の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。免疫エフェクター機能（例えば、ＴＦＰ発現Ｔ細胞におけるもの）の例としては、細胞溶解活性及びヘルパーＴ細胞活性（サイトカインの分泌を含む）が挙げられる。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。一次細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、一次刺激または抗原依存性刺激を担う分子に由来するものが挙げられる。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激を担う分子に由来するものが挙げられる。
【０１３２】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ（「免疫受容体チロシン活性化モチーフ」）を含み得る。ＩＴＡＭを含む一次細胞質シグナル伝達配列の例としては、限定されないが、ＣＤ３ゼータに由来するもの、ＦｃＲガンマに由来するもの、ＦｃＲベータに由来するもの、ＣＤ３ガンマに由来するもの、ＣＤ３デルタに由来するもの、ＣＤ３イプシロンに由来するもの、ＣＤ５に由来するもの、ＣＤ２２に由来するもの、ＣＤ７９ａに由来するもの、ＣＤ７９ｂに由来するもの、ＣＤ６６ｄに由来するもの、ＤＡＰ１０に由来するもの、及びＤＡＰ１２に由来するものが挙げられる。
【０１３３】
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによってＴ細胞による共刺激応答（限定されないが、増殖など）を媒介する、Ｔ細胞上の同族の結合パートナーを指す。共刺激分子は、抗原受容体以外の細胞表面分子、または効果的な免疫応答に必要であり得るそのリガンドである。共刺激分子には、限定されないが、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ、及びＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）が含まれる。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、下記のタンパク質ファミリーに代表され得る：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、及びＮＫ細胞活性化受容体。そのような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ならびに同様のものが挙げられる。細胞内シグナル伝達ドメインは、その由来元である分子の細胞内部分全体もしくは天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはその機能性断片を含み得る。「４−１ＢＢ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列を有するか、または非ヒト種（例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿、及び同様のもの）に由来する同等残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指す。「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４〜２５５として定義されるか、または非ヒト種（例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿、及び同様のもの）に由来する同等残基として定義されるものである。
【０１３４】
「コードする」という用語は、ポリヌクレオチド（遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなど）中の特定のヌクレオチド配列が、生物学的プロセスにおいて他のポリマー及び巨大分子（規定されたヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）または規定されたアミノ酸配列、ならびにそれから生じる生物学的特性を有するもの）を合成するためのテンプレートとして働くという固有の特性を有すること指す。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳によって細胞または他の生物学的系にタンパク質が生じるのであれば、当該タンパク質をコードする。コード鎖（ｍＲＮＡ配列と同一のヌクレオチド配列であり、配列表にて通常は提供されるもの）及び非コード鎖（遺伝子またはｃＤＮＡを転写するためのテンプレートとして使用されるもの）は共に、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードするものと称され得る。
【０１３５】
別段の指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに変性したバージョンであるヌクレオチド配列、及び同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をすべて含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句は、当該タンパク質をコードする当該ヌクレオチド配列が、そのバージョンによっては含み得る１以上のイントロン数の範囲内で、イントロンも含み得る。
【０１３６】
「有効量」または「治療的に有効な量」という用語は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載の化合物、製剤、材料、または組成物が特定の生物学的結果または治療結果を達成する上で有効な量を指す。
【０１３７】
「内在性」という用語は、任意の材料の由来元または生成元が生物、細胞、組織、または系の内部であることを指す。
【０１３８】
「外来性」という用語は、任意の材料の導入元または生成元が生物、細胞、組織、または系の外部であることを指す。
【０１３９】
「発現」という用語は、プロモーターによって特定のヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳が生じることを指す。
【０１４０】
「導入ベクター」という用語は、単離された核酸を含み、こうした単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用され得る組成物を指す。当該技術分野では多数のベクターが知られており、こうしたベクターには、限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性の化合物と結び付いたポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが含まれる。したがって、「導入ベクター」という用語は、自己複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語は、細胞への核酸の導入を促進する非プラスミド化合物及び非ウイルス化合物（例えば、ポリリジン化合物、リポソーム、及び同様のものなど）もさらに含むと解釈されるべきである。ウイルス導入ベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及び同様のものが挙げられる。
【０１４１】
「発現ベクター」という用語は、発現対象のヌクレオチド配列に機能可能なように連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシスエレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって供給され得るか、またはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターには、当該技術分野で知られるものがすべて含まれ、そうした発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドが組み込まれたコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドプラスミドまたはリポソームに含められたプラスミド）、ならびにウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）が含まれる。
【０１４２】
「レンチウイルス」という用語は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科の一属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することが可能であるという点においてレトロウイルスの中でも独特のものである。レンチウイルスは、かなりの量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達し得るため、遺伝子送達ベクターの中で最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶはすべて、レンチウイルスの例である。
【０１４３】
「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指し、こうしたベクターには、特に、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）に提供される自己不活化型レンチウイルスベクターが含まれる。医療機関において使用され得るレンチウイルスベクターの他の例としては、限定されないが、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａから提供されるＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（商標）遺伝子送達技術、Ｌｅｎｔｉｇｅｎから提供されるＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系、及び同様のものが挙げられる。非臨床型のレンチウイルスベクターもまた、利用可能であり、当業者には知られているであろう。
【０１４４】
「相同」または「同一性」という用語は、２つのポリマー分子（例えば、２つの核酸分子（２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子など）または２つのポリペプチド分子）の間のサブユニット配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が、同じモノマーサブユニットによって占有される場合（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置がアデニンによって占有される場合）、それらの分子は、その位置で相同または同一である。２つの配列の間の相同性は、マッチ位置または相同位置の数の直接的な関数である。例えば、２つの配列の全位置の半分（サブユニット長が１０のポリマーの５つの位置）が相同である場合、これら２つの配列は５０％相同であり、全位置の９０％（例えば、１０のうちの９）がマッチするか、または相同である場合、これら２つの配列は９０％相同である。
【０１４５】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列の含有率が最小限にとどまるキメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列など）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体及びその抗体断片は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（マウス、ラット、またはウサギなど）のＣＤＲに由来する残基によって交換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体または抗体断片）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって交換される。さらに、ヒト化抗体／抗体断片は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。こうした改変は、抗体または抗体断片の能力をさらに洗練及び最適化し得るものである。一般に、ヒト化抗体またはその抗体断片は、少なくとも１つ（典型的には２つ）の可変ドメインを実質的にすべて含むことになり、こうした可変ドメインでは、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたはかなりの部分が、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体または抗体断片は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含み得、このＦｃは、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものである。追加詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９，１９８８、Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６，１９９２を参照のこと。
【０１４６】
「ヒト」または「完全ヒト」という用語は、免疫グロブリン（抗体または抗体断片）の分子全体が、ヒト起源であるか、またはヒト形態の抗体もしくは免疫グロブリンと同一のアミノ酸配列からなることを指す。
【０１４７】
「単離された」という用語は、天然の状況から変更または取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離された」ことにはならないが、同じ核酸またはペプチドが、その天然の状況では共存する物質から部分的または完全に分離されているのであれば、そうした核酸またはペプチドは「単離された」ことになる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または非天然環境（例えば、宿主細胞など）に存在し得る。
【０１４８】
本発明との関連では、一般に生じる核酸塩基に対して下記の略語が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
【０１４９】
「機能可能なように連結された」または「転写制御」という用語は、異種核酸配列が発現するように制御配列と異種核酸配列とが機能的に連結されていることを指す。例えば、第１の核酸配列が、第２の核酸配列との機能的関連性が得られるように配置される場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と機能可能なように連結されている。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与えるのであれば、そのコード配列に機能可能なように連結されている。機能可能なように連結されたＤＮＡ配列は、互いに隣接し得、例えば２つのタンパク質コード領域が連結される必要がある場合、同じリーディングフレームに存在する。
【０１５０】
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）注射、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射、もしくは胸骨内注射、腫瘍内投与、または注入手法を含む。
【０１５１】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖形態または二本鎖形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、及びそのポリマーを指す。別段の指定がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然起源のヌクレオチドと同様の様式で代謝される既知の天然ヌクレオチド類似体を含む核酸を包含する。別段の指定がない限り、特定の核酸配列は、明示的に示される配列だけでなく、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換体）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列も暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換体は、１つ以上の選択コドン（またはすべてのコドン）の３番目の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成させることによって得ることができる（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）、及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【０１５２】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合で連結されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質配列またはペプチド配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で使用されるこの用語は、短鎖（一般に、当該技術分野では、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも称される）と、長鎖（一般に、当該技術分野ではタンパク質と称される）と、の両方を指し、これらには多くの型が存在する。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、ポリペプチドの生物学的に活性な断片、ポリペプチドの実質的な相同ポリペプチド、ポリペプチドのオリゴペプチド、ポリペプチドのホモダイマー、ポリペプチドのヘテロダイマー、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然のペプチド、組換えペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【０１５３】
「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的な転写を開始し得る細胞の転写装置または導入された合成装置によって認識されるＤＮＡ配列を指す。
【０１５４】
「プロモーター／制御配列」という用語は、遺伝子産物の発現に使用され得る核酸配列を指し、こうした遺伝子産物は、当該プロモーター／制御配列に機能可能なように連結される。場合によっては、この配列は、コアプロモーター配列であり得、他の場合では、この配列は、エンハンサー配列、及び遺伝子産物の発現に必要な他の制御エレメントも含み得る。プロモーター／制御配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現させるものであり得る。
【０１５５】
「構成的」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードまたは特定化するポリヌクレオチドと機能可能なように連結されると、ほとんどまたはすべての生理学的細胞条件の下で遺伝子産物を細胞に産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１５６】
「誘導性」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードまたは特定化するポリヌクレオチドと機能可能なように連結されると、実質的に、プロモーターに対応する誘導物質が細胞に存在するときにのみ、遺伝子産物を細胞に産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１５７】
「組織特異的」プロモーターという用語は、遺伝子をコードするか、または遺伝子によって特定化されるポリヌクレオチドと機能可能なように連結されると、実質的に、細胞が、プロモーターに対応する組織型の細胞であるときにのみ、遺伝子産物を細胞に産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１５８】
ｓｃＦｖと関連して使用される「リンカー」及び「可動性ポリペプチドリンカー」という用語は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結して一緒にするために単独または組み合わせて使用されるアミノ酸（グリシン残基及び／またはセリン残基など）からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態では、可動性ポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（ｎは、１以上の正の整数である）というアミノ酸配列を含む。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９、及びｎ＝１０。一実施形態では、可動性ポリペプチドリンカーには、限定されないが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３が含まれる。別の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）、または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）が複数回繰り返す配列を含む。ＷＯ２０１２／１３８４７５（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のリンカーもまた、本発明の範囲に含まれる。場合によっては、リンカー配列は、長鎖リンカー（ＬＬ）配列を含む。場合によっては、長鎖リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝２〜４）を含む。場合によっては、リンカー配列は、短鎖リンカー（ＳＬ）配列を含む。場合によっては、短鎖リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜３）を含む。
【０１５９】
本明細書で使用される５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ  ７−メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ  ｍ７Ｇキャップとも呼ばれる）は、転写の開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの「先端」または５’末端に付加される修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されたヌクレオチドに連結された末端基からなる。５’キャップの存在は、リボソームによる認識及びＲＮａｓｅからの保護に非常に重要である。キャップの付加は転写と結び付いており、かつ転写と同時に生じる結果、それぞれが互いに影響を及ぼし合う。転写の開始直後に、ＲＮＡポリメラーゼと結び付いたキャップ合成複合体が合成中のｍＲＮＡの５’末端に結合する。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要となり得る化学反応を触媒する。合成は、多段階生化学反応として進行する。キャッピング部分は、修飾されることでｍＲＮＡの機能性（その安定性または翻訳効率など）を調節し得る。
【０１６０】
本明細書で使用される「インビトロで転写されたＲＮＡ」は、インビトロで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。一般に、インビトロで転写されたＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから生成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロで転写されたＲＮＡの生成に使用されるテンプレートを含む。
【０１６１】
本明細書で使用される「ポリ（Ａ）」は、ｍＲＮＡに対するポリアデニル化によって付加される一連のアデノシンである。一過性発現のためのコンストラクトの好ましい実施形態では、ポリＡは、５０〜５０００であり、好ましくは６４超であり、より好ましくは１００超であり、最も好ましくは３００超または４００超である。ポリ（Ａ）配列は、化学的または酵素的に修飾されることでｍＲＮＡの機能性（局在化、安定性、または翻訳効率など）を調節し得る。
【０１６２】
本明細書で使用される「ポリアデニル化」は、ポリアデニル部分またはその修飾バリアントがメッセンジャーＲＮＡ分子へと共有結合することを指す。真核生物では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子のほとんどが、その３’末端にポリアデニル化を受ける。３’ポリ（Ａ）尾部は、酵素（ポリアデニル酸ポリメラーゼ）の作用によってｐｒｅ−ｍＲＮＡに付加されるアデニンヌクレオチド（多くの場合、数百）の長い配列である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）尾部は、特定の配列（ポリアデニル化シグナル）を含む転写物に付加される。ポリ（Ａ）尾部及びそれに結合するタンパク質によって、エキソヌクレアーゼによる分解からのｍＲＮＡの保護が支援される。ポリアデニル化は、転写終結、核からのｍＲＮＡの搬出、及び翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡがＲＮＡに転写された直後に核中で生じるが、細胞質中でも後に付加的に生じ得る。転写が終結した後、ＲＮＡポリメラーゼと結び付いたエンドヌクレアーゼの作用によってｍＲＮＡ鎖が切断される。切断部位は、通常、切断部位付近にＡＡＵＡＡＡという塩基配列が存在することによって特徴付けられる。ｍＲＮＡが切断された後、切断部位の遊離３’末端にアデノシン残基が付加される。
【０１６３】
本明細書で使用される「一過性」は、数時間、数日、または数週間という期間、導入遺伝子が組み込まれることなく発現することを指し、こうした発現期間は、遺伝子がゲノムに組み込まれるか、または宿主細胞中の安定なプラスミドレプリコン内に含まれた場合に当該遺伝子が発現する期間と比較すると短い。
【０１６４】
「シグナル伝達経路」という用語は、細胞の一部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を担うさまざまなシグナル伝達分子の間の生化学的関係を指す。「細胞表面受容体」という語句は、シグナルを受け、細胞膜を横切ってシグナルを伝達する能力を有する分子及び分子複合体を含む。
【０１６５】
「対象」という用語は、免疫応答を誘発し得る生体（例えば、哺乳類、ヒト）を含むことが意図される。
【０１６６】
「実質的に精製された」細胞という用語は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞は、それが天然に生じる状況では通常は伴う他の細胞型から分離されている細胞も指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団は、均一な細胞集団を指す。他の場合では、この用語は、自体の天然の状況では天然に伴う細胞から分離されている細胞を単に指す。いくつかの態様では、細胞は、インビトロで培養される。他の態様では、細胞は、インビトロで培養されない。
【０１６７】
本明細書で使用される「治療」という用語は、処置を意味する。治療効果は、病状の低減、抑制、寛解、または根絶によって得られる。
【０１６８】
本明細書で使用される「予防」という用語は、疾患または病状の阻止または保護的治療を意味する。
【０１６９】
本発明との関連では、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害と関連する抗原」は、特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。ある特定の態様では、本発明の過剰増殖性障害抗原は、がんに由来するものであり、こうしたがんには、限定されないが、原発性または転移性のメラノーマ、神経膠芽腫、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、肝癌、膵癌、腎癌、子宮内膜癌、及び胃癌が含まれる。
【０１７０】
場合によっては、疾患は、中皮腫、神経膠芽腫、漿液性乳頭状卵巣腺癌、卵巣明細胞癌、混合型ミュラー管卵巣癌、類内膜粘液性卵巣癌、悪性胸膜疾患、膵臓腺癌、膵管腺癌、子宮体部漿液性腺癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳腺癌、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮの発現と関連する疾患、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるがんである。
【０１７１】
「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」という用語は、外来性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」された細胞は、外来性核酸を用いるトランスフェクション、形質転換、または形質導入が行われている細胞である。こうした細胞には、初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
【０１７２】
「特異的に結合する」という用語は、抗体、抗体断片、または特異的リガンドが、試料に存在する同族の結合パートナー（例えば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮ）を認識し、それに結合するが、試料における他の分子は、必然的かつ実質的に、認識しないか、またはそれには結合しないことを指す。
【０１７３】
範囲：本開示を通じて、本開示のさまざまな態様は、範囲形式で示され得る。範囲形式の説明は、単に、簡便性を得るためのものであり、本開示の範囲を変更不可能に限定するものであると解釈すべきでないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の可能な部分範囲ならびに個々の数値をすべて具体的に開示しているものと考えられたい。例えば、ある範囲（１〜６など）の説明は、その範囲内の部分範囲（１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）ならびに個々の数値（例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６）を具体的に開示しているものと考えられたい。別の例として、９５〜９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する何かを含み、さらには、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％、及び９８〜９９％の同一性などの部分範囲を含む。このことは、範囲の幅を問わず適用される。
【０１７４】
説明
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質を使用する疾患（がんなど）の治療に使用するための組成物及び方法が本明細書で提供される。本明細書で使用される「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質」または「ＴＦＰ」は、ｉ）標的細胞上の表面抗原に結合すること、及びｉｉ）インタクトなＴＣＲ複合体の他のポリペプチド要素と相互作用すること（この相互作用は、典型的には、Ｔ細胞の中または表面上でそうした他のポリペプチド要素と共局在化するときに生じる）、が一般に可能な、さまざまなＴＣＲ構成ポリペプチド由来の組換えポリペプチドを含む。本明細書で提供されるＴＦＰは、キメラ抗原受容体と比較して実質的な利益を提供する。「キメラ抗原受容体」または代替的に使用される「ＣＡＲ」という用語は、ｓｃＦｖの形態の細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、以下に定義される刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）と、を含む組換えポリペプチドを指す。一般に、ＣＡＲの中心的な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体と結び付いた状態で通常は見られるＣＤ３ゼータ鎖に由来する。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの共刺激分子（４−１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、及び／またはＣＤ２８など）に由来する１つ以上の機能性シグナル伝達ドメインと融合され得る。
【０１７５】
ＭＵＣ１６
ＭＵＣ１６は、管支、卵管、及び子宮の粘膜に存在する腫瘍関連抗原ポリペプチドであり、このポリペプチドは、ヒトの眼表面上皮によっても発現する。粒子及び感染性病原体に対する保護的な潤滑バリアを粘膜表面に付与し得ることがＭＵＣ１６の機能の１つとして提唱されている。ＭＵＣ１６は、高度に多型性であり、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ高含有Ｎ末端ドメインと、平均各１５６個のアミノ酸が１１〜６０回超、直列に繰り返す部分的に保存された反復配列を有する反復配列ドメインと、膜貫通配列及び短い細胞質尾部を含むＣ末端非反復配列ドメインと、からなる３のドメインから構成される。ＭＵＣ１６は、重度にＯ−グリコシル化及びＮ−グリコシル化され得る。ＭＵＣ１６遺伝子から発現するＭＵＣ１６ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ある特定の型のがん性のヒト卵巣腫瘍、ヒト乳房腫瘍、及びヒト膵臓腫瘍では、それぞれ対応する正常なヒト卵巣組織、ヒト乳房組織、及びヒト膵臓組織と比較して、顕著に、再現性よく、かつ検出可能なほどに過剰発現し得る。さまざまな独立した異なる型のがん性ヒト卵巣組織試料のＭＵＣ１６発現の定量的な分析から、そうしたがん性試料におけるＭＵＣ１６の発現レベルが可変であり得、分析された正常な卵巣組織試料の群の平均ＭＵＣ１６発現レベルと比較すると、顕著な数のがん性試料においてＭＵＣ１６発現が少なくとも６倍（〜最大で約５８０倍）に増加していることが示されている。具体的には、卵巣癌型（類内膜腺癌、漿液性嚢胞腺癌（乳頭状腺癌及び明細胞腺癌を含む））では、正常な卵巣組織と比較して、検出可能かつ再現性のよいＭＵＣ１６過剰発現が観測され得る。ある特定のヒト腫瘍ではＭＵＣ１６が過剰発現することから、ＭＵＣ１６ポリペプチド及び当該ポリペプチドをコードする核酸は、さまざまな哺乳類組織試料の間で定量的及び定性的な比較を行うための標的となっている。ＭＵＣ１６ポリペプチドの発現プロファイル、及び当該ポリペプチドをコードする核酸の発現プロファイルは、哺乳類におけるある特定の型のがん性腫瘍の診断及び治療的処置に利用できるものである。
【０１７６】
ＣＡ１２５（がん抗原１２５（Ｏ７７２Ｐ、ＣＡ−Ｏ７７２Ｐ、ＣＡ−１２５））は、ＭＵＣ１６遺伝子によってコードされる細胞外切断型タンパク質であり、卵巣癌患者を監視するために日常的に使用される血清マーカーでもある。ＣＡ１２５は、ミュラー管分化抗原であり、この抗原は、上皮性卵巣癌細胞に過剰発現し、血液中に分泌されるものであるが、その発現は卵巣癌に完全には限局し得ない。血清中ＣＡ１２５レベルは、上皮性卵巣癌（ＥＯＣ）患者の約８０％で上昇し得るが、健康な女性でこの上昇が生じる率は１％に満たない。ＣＡ１２５は、ベータ−ガラクトシド結合性の細胞表面レクチンと結び付いた腫瘍細胞の細胞表面上に存在する巨大なムチン様糖タンパク質であり、こうしたレクチンは、細胞接着、アポトーシス、細胞増殖、及び腫瘍進行の制御に関与する細胞外マトリックスの構成成分であり得る。ＣＡ１２５の血清中濃度が高いことは、漿液性卵巣腺癌に典型的なことであり得る一方で、粘液性卵巣癌ではＣＡ１２５の血清中濃度は上昇しない。ＣＡ１２５は、そのレベルが正常であっても腫瘍が存在する可能性を排除し得ないため、卵巣癌のスクリーニングには推奨され得ない。しかしながら、ＣＡ１２５を検出することは、組織学的に確認された悪性腫瘍を有する患者において臨床経過及び病状を監視する際の標準ツールとなり得る。ＥＯＣ患者の進行監視においてＣＡ１２５レベルが有用であることに加えて、がん血清マーカーとしてもＣＡ１２５レベルが有用であることが多数の研究によって確認されている。ＣＡ１２５レベルは、典型的には、臨床検出の約３ヶ月前に上昇し得る。化学療法の間、血清中ＣＡ１２５レベルの変化は、疾患の経過と相関し得る。ＣＡ１２５は、新たな薬物の試験における臨床応答のサロゲートマーカーとして使用され得る。一方、ＣＡ１２５は、いくつかの良性状態において上昇することから、ＥＯＣの初期診断においては有用ではない可能性がある。ＣＡ１２５特異的抗体ＭＡｂ−Ｂ４３．１３（オレゴボマブ、ＯｖａＲｅｘ  ＭＡｂ−Ｂ４３．１３）は、卵巣癌患者を対象とする臨床試験において免疫療法剤として試験された。
【０１７７】
ＭＵＣ１６（ＣＡ−１２５）は、いくつかの異なる機構によって、腫瘍発生及び腫瘍増殖の進行において役割を担い得る。ナチュラルキラー細胞の応答を抑制し、それによって免疫応答からがん細胞を保護することが、ＭＵＣ１６が腫瘍の増殖を支援する１つの手段であり得る。ＭＵＣ１６の重度にグリコシル化された直列反復配列ドメインがガレクチン−１（免疫抑制タンパク質）に結合し得るという発見は、ＭＵＣ１６が免疫系から腫瘍細胞を保護し得るというさらなる証拠であり得る。ＭＵＣ１６は、腫瘍細胞の転移を可能にする細胞間相互作用に関与し得る。このことは、ＭＵＣ１６がメソテリン（腹膜（腹腔の内膜）の中皮細胞が通常発現する糖タンパク質）に選択的に結合し得ることを示す証拠によって裏付けられ得る。ＭＵＣ１６とメソテリンとの相互作用は、腫瘍細胞が腹膜に浸潤する第１のステップとなり得る。メソテリンは、中皮腫、卵巣癌、及び扁平上皮癌を含めて、いくつかの型のがんにおいても発現することが明らかになっている。メソテリンは、腫瘍細胞も発現するものであることから、ＭＵＣ１６と中皮との相互作用は、他の腫瘍細胞を転移位置に集め、それによって転移のサイズを大きくすることを助長し得る。ＭＵＣ１６の細胞質尾部の発現は、腫瘍細胞の増殖及び細胞運動性の促進を可能にし得ると共に、浸潤を促進し得ることが、証拠によって示唆されている。このことは、Ｅ−カドヘリンの発現の減少、ならびにＮ−カドヘリン及びビメンチンの発現の増加を引き起こすシグナル伝達を促進する能力をＭＵＣ１６のＣ末端ドメインが有することに起因していると思われ、こうした発現減少及び発現増加は、上皮間葉転換と一致する発現パターンであり得る。ＭＵＣ１６は、薬物療法に対するがん細胞の感受性低減においても役割を担い得る。例えば、ＭＵＣ１６が過剰発現すると、遺伝毒性剤（シスプラチンなど）の作用から細胞が保護され得る。
【０１７８】
ＩＬ１３Ｒα２
インターロイキン−１３は、正常な生理学的条件の下だけでなく、がんにおいても、免疫応答の間に免疫微小環境を制御する因子である。ＩＬ−１３は、ＩＬ１３Ｒα１及びＩＬ１３Ｒα２という２つの異なる受容体に結合する。ほとんどの細胞では、ＩＬ−１３は、受容体ＩＬ１３Ｒα１モノマーに低親和性で結合し、さらにＩＬ４Ｒａに結合することでヘテロダイマー複合体を形成し、これによってシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）６の経路を下流で活性化する。ＩＬ−１３は、いくつかの正常細胞（精巣細胞など）においてＩＬ１３Ｒα２受容体に結合するだけでなく、がん細胞においてもＩＬ１３Ｒα２受容体に結合し、これらの結合は高い親和性を伴って生じる。
【０１７９】
Ｘｑ１３．１−ｑ２８に位置するＩＬ１３Ｒα２遺伝子のＲＮＡ転写物は、アミノ酸数２６のシグナル伝達配列と、アミノ酸数１７の短い細胞内ドメインと、を含むアミノ酸数３８０のタンパク質をコードする。神経膠芽腫細胞では、ＩＬ１３Ｒα２の発現によってＩＬ−１３タンパク質に対する結合部位が当該細胞当たり最大で３０，０００個創出される。
【０１８０】
ＩＬ１３Ｒα１からＩＬ−１３を隔離するデコイ受容体として働くことがＩＬ１３Ｒα２の提唱機能の１つである。ＩＬ１３Ｒα２は、ＩＬ１３Ｒα１と比較して、利用可能なＩＬ−１３とより高い親和性で結合することに加えて、より多くの結合部位を提供することで、細胞におけるＩＬ−１３の隔離が促進される。正常細胞では、ＩＬ−１３がＩＬ１３Ｒα１に結合するとＳＴＡＴ６が活性化され、活性化されたＳＴＡＴ６は核に移動し、核において、Ｎ６−増殖停止特異的プロモーターを含む遺伝子（１５−リポキシゲナーゼ−１など）に対する転写制御を行う。これによって、カスパーゼ−３の活性上昇を介したアポトーシスが生じ得る。したがって、ＩＬ−１３を隔離することが、腫瘍細胞がアポトーシスを免れる機構となり得る。ＩＬ１３Ｒα２の別の提唱機能は、ＩＬ１３Ｒα１へのＳＴＳＴ６のドッキングをＩＬ１３Ｒα２が物理的に遮断することによるＩＬ１３Ｒα１の遮断である。ＳＴＡＴ６のドッキングが生じないと、下流のアポトーシス活性化が妨害される。ＩＬ１３Ｒα２は、神経膠腫細胞においてＳＴＡＴ３及びＢ細胞リンパ腫２の上方制御も誘導する。
【０１８１】
ＩＬ１３Ｒα２は、神経膠腫始原細胞上に発現し、成人脳腫瘍の約５８％及び小児脳腫瘍の約８３％で発現する。卵巣癌及び膵癌では、ＩＬ１３Ｒα２は、細胞外シグナル制御キナーゼ／アクチベータータンパク質１の経路を介して浸潤及び転移を促進する。免疫細胞（骨髄系由来サプレッサー細胞など）にＩＬ１３Ｒα２が発現しても、トランスフォーミング増殖因子βの上方制御を介して腫瘍の免疫回避及び進行が促進される。神経膠腫及び他の腫瘍モデルでは、ＩＬ１３Ｒα２の発現が増加すると腫瘍進行が促進され得る。ＩＬ１３Ｒα２の発現は、神経膠腫の悪性度と共に増加するため、患者生存の予後指標となり得る。ＩＬ１３Ｒα２ポリペプチドの発現プロファイル、及び当該ポリペプチドをコードする核酸の発現プロファイルは、哺乳類におけるある特定の型のがん性腫瘍の診断及び治療的処置に利用できるものである。
【０１８２】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）
本開示は、ＴＦＰをコードする組換えＤＮＡコンストラクトを包含し、ＴＦＰは、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮ（例えば、ヒトのＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮ）に特異的に結合する抗体断片を含み、抗体断片の配列は、ＴＣＲサブユニットまたはその一部をコードする核酸配列と隣接し、当該核酸配列と同じリーディングフレームに存在する。本明細書で提供されるＴＦＰは、１つ以上の内在性のＴＣＲサブユニット（または代替的に、１つ以上の外来性のＴＣＲサブユニット、もしくは内在性のＴＣＲサブユニットと外来性のＴＣＲサブユニットとの組み合わせ）と結び付いて機能性のＴＣＲ複合体を形成することが可能である。
【０１８３】
一態様では、本開示のＴＦＰは、標的特異的結合エレメント（抗原結合ドメインとも称される）を含む。この部分の選択は、標的細胞の表面を規定する標的抗原の型及び数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病状と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして働く標的抗原を認識するように選択され得る。したがって、本発明のＴＦＰにおける抗原結合ドメインの標的抗原として働き得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス感染症、細菌感染症、及び寄生虫感染症と関連するもの、自己免疫疾患と関連するもの、ならびにがん性疾患（例えば、悪性疾患）と関連するものが挙げられる。
【０１８４】
一態様では、ＴＦＰ介在性のＴ細胞応答は、抗原結合ドメインをＴＦＰに操作導入してＴＦＰが所望の抗原に特異的に結合するようにすることによって目的抗原へと指向化され得る。
【０１８５】
一態様では、ＴＦＰのうちで抗原結合ドメインを含む部分は、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮを標的とする抗原結合ドメインを含む。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒトのＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮを標的とする。
【０１８６】
抗原結合ドメインは、抗原に結合する任意のドメインであり得、こうしたドメインには、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及びその機能性断片（限定されないが、単一ドメイン抗体（重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ由来のナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）など）を含む）、ならびに抗原結合ドメインとして機能することが当該技術分野で知られる代替骨格（組換えフィブロネクチンドメイン、ａｎｔｉｃａｌｉｎ、ＤＡＲＰＩＮ、及び同様のものなど）が含まれる。同様に、標的抗原を特異的に認識し、それに結合する天然リガンドまたは合成リガンドが、ＴＦＰのための抗原結合ドメインとして使用され得る。場合によっては、抗原結合ドメインの由来元が、ＴＦＰが最終的に使用されることになる種と同じ種であることが有益である。例えば、ヒトにおける使用については、ＴＦＰの抗原結合ドメインが、抗体または抗体断片の抗原結合ドメインのためのヒト残基またはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
【０１８７】
したがって、一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化された抗体もしくは抗体断片、またはヒトの抗体もしくは抗体断片、あるいはラクダの抗体もしくは抗体断片、あるいはマウスの抗体もしくは抗体断片を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＴＡＡ結合ドメインまたはヒト抗ＴＡＡ結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化抗ＴＡＡ結合ドメインもしくはヒト抗ＴＡＡ結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上（例えば、３つすべて）、及び／または本明細書に記載のヒト化抗ＴＡＡ結合ドメインもしくはヒト抗ＴＡＡ結合ドメインの重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上（例えば、３つすべて）を含み、例えば、ヒト化抗ＴＡＡ結合ドメインまたはヒト抗ＴＡＡ結合ドメインは、ＬＣ  ＣＤＲの１つ以上（例えば、３つすべて）と、ＨＣ  ＣＤＲの１つ以上（例えば、３つすべて）と、を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＴＡＡ結合ドメインまたはヒト抗ＴＡＡ結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化抗ＴＡＡ結合ドメインまたはヒト抗ＴＡＡ結合ドメインの重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上（例えば、３つすべて）を含み、例えば、ヒト化抗ＴＡＡ結合ドメインまたはヒト抗ＴＡＡ結合ドメインは、２つの重鎖可変領域を含み、それぞれの重鎖可変領域は、本明細書に記載のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、及びＨＣ  ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＴＡＡ結合ドメインまたはヒト抗ＴＡＡ結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化軽鎖可変領域もしくはヒト軽鎖可変領域、及び／または本明細書に記載のヒト化重鎖可変領域もしくはヒト重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＴＡＡ結合ドメインまたはヒト抗ＴＡＡ結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化重鎖可変領域を含み、例えば、本明細書に記載のヒト化重鎖可変領域またはヒト重鎖可変領域を少なくとも２つ含む。一実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含むｓｃＦｖである。一実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対する１、２、もしくは３〜３０個、２０個、もしくは１０個の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列との同一性が９５〜９９％である配列を含む軽鎖可変領域、及び／または本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対する１、２、もしくは３〜３０個、２０個、もしくは１０個の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列との同一性が９５〜９９％である配列を含む重鎖可変領域、を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＴＡＡ結合ドメインまたはヒト抗ＴＡＡ結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域へと、リンカー（例えば、本明細書に��載のリンカー）を介して結合される。一実施形態では、ヒト化抗ＴＡＡ結合ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（ｎは、１、２、３、４、５、または６であり、好ましくは３または４である）を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、下記の配向のいずれかのものであり得る：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域、または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。場合によっては、リンカー配列は、長鎖リンカー（ＬＬ）配列を含む。場合によっては、長鎖リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝２〜４）を含む。場合によっては、リンカー配列は、短鎖リンカー（ＳＬ）配列を含む。場合によっては、短鎖リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜３）を含む。
【０１８８】
いくつかの態様では、非ヒト抗体は、ヒト化され、ヒトにおいて天然に産生される抗体またはその断片に対する類似性が向上するように抗体の特定の配列または領域が改変される。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化される。
【０１８９】
ヒト化抗体は、当該技術分野で知られるさまざまな手法を使用して生成させることができ、こうした手法には、限定されないが、ＣＤＲ移植（例えば、欧州特許第ＥＰ２３９，４００号、国際公開公報第ＷＯ９１／０９９６７号、ならびに米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、及び同第５，５８５，０８９号（これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（例えば、欧州特許第ＥＰ５９２，１０６号及び同第ＥＰ５１９，５９６号、Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４、ならびにＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３（これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと）、鎖シャッフリング（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号（当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと）、ならびに例えば、米国特許出願公開公報第ＵＳ２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開公報第ＵＳ２００５／００４８６１７号、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開公報第ＷＯ９３１７１０５号、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：１１１９−２５（２００２）、Ｃａｌｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１３（５）：３５３−６０（２０００）、Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０（３）：２６７−７９（２０００）、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（１６）：１０６７８−８４（１９９７）、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９（１０）：８９５−９０４（１９９６）、Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（２３  Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ−５９７７ｓ（１９９５）、Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（８）：１７１７−２２（１９９５）、Ｓａｎｄｈｕ  Ｊ  Ｓ，Ｇｅｎｅ，１５０（２）：４０９−１０（１９９４）、及びＰｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５（３）：９５９−７３（１９９４）（これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に開示の手法が含まれる。多くの場合、フレームワーク領域中のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体に由来する対応残基で置換されることになり、その結果、抗原結合が変更（例えば、改善）される。こうしたフレームワーク置換は、当該技術分野でよく知られる方法によって特定され、こうした方法は、例えば、ＣＤＲ残基とフレームワーク残基との相互作用をモデル化して抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定することによるもの、及び配列を比較して特定の位置に稀なフレームワーク残基を特定することによるものである（例えば、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号、及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３（これらの文献は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１９０】
ヒト化された抗体または抗体断片には、非ヒト供給源に由来するアミノ酸残基が１つ以上残存する。こうした非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称されることが多く、こうした「移入」残基は、典型的には、「移入」可変ドメインから取得される。本明細書で提供されるヒト化された抗体または抗体断片は、非ヒト免疫グロブリン分子に由来する１つ以上のＣＤＲと、フレームワーク領域と、を含み、フレームワークを構成するアミノ酸残基は、完全にヒト生殖系列に由来するものであるか、またはほとんどがヒト生殖系列に由来するものである。抗体または抗体断片をヒト化するための手法については、多く手法が当該技術分野でよく知られており、こうした手法は、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応配列を置換すること（すなわち、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ９１／０９９６７号、及び米国特許第４，８１６，５６７号、同第６，３３１，４１５号、同第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第６，５４８，６４０号（これらの文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）））によって、本質的には、下記のＷｉｎｔｅｒ及び共同研究者らの方法に従って実施され得る（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））。そのようなヒト化された抗体及び抗体断片では、インタクトなヒト可変ドメインに実質的に満たない部分が、非ヒト種に由来する対応配列によって置換されている。ヒト化抗体は、いくつかのＣＤＲ残基及び可能性としてはいくつかのフレームワーク（ＦＲ）残基が、げっ歯類抗体の類似部位に由来する残基によって置換されたヒト抗体であることが多い。抗体及び抗体断片のヒト化は、ベニヤリングまたはリサーフェイシング（ＥＰ５９２，１０６、ＥＰ５１９，５９６、Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４（１９９４）、及びＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３（１９９４））または鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）（これらの文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）によっても達成され得る。
【０１９１】
ヒト化抗体の調製において行われるべきヒト可変ドメイン（軽鎖及び重鎖の両方のもの）の選択の目的は、抗原性の低減である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対して、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列がスクリーニングされる。次に、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として認められる（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７）（これらの文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定の部分群に属するすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークが使用される。いくつかの異なるヒト化抗体に対して同じフレームワークが使用され得る（例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６−１７）：１１５７−１１６５（１９９７）、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）（これらの文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域のフレームワーク領域（例えば、４つすべてのフレームワーク領域）は、ＶＨ４−４−５９生殖系列配列に由来する。一実施形態では、フレームワーク領域は、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの改変（例えば、置換）を含み得、こうした改変は、例えば、対応するマウス配列のアミノ酸を使用したものである。一実施形態では、軽鎖可変領域のフレームワーク領域（例えば、４つすべてのフレームワーク領域）は、ＶＫ３−１．２５生殖系列配列に由来する。一実施形態では、フレームワーク領域は、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの改変（例えば、置換）を含み得、こうした改変は、例えば、対応するマウス配列のアミノ酸を使用したものである。
【０１９２】
いくつかの態様では、本開示のＴＦＰ組成物のうちで抗体断片を含む部分は、標的抗原に対する親和性の高さ、及び他の好ましい生物学的特性を維持しつつヒト化される。本開示の一態様によれば、ヒト化された抗体及び抗体断片は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して親配列及び様々な概念的なヒト化産物を解析するプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体構造を図示及び表示するコンピュータープログラムが利用可能である。こうした表示を検証することで、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基の考え得る役割を解析することが可能となり、例えば、候補免疫グロブリンが標的抗原に結合する能力に影響を与える残基を解析することが可能となる。このように、レシピエント配列及び移入配列からＦＲ残基を選択及び組み合わせることができ、その結果、所望の抗体特徴または抗体断片特徴（標的抗原に対する親和性の上昇など）が達成される。一般に、ＣＤＲ残基は、直接的かつほぼ実質的に抗原結合に影響を与えるものである。
【０１９３】
ヒト化された抗体または抗体断片は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持し得、例えば、本開示の場合、ヒト腫瘍関連抗原（ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮなど）に結合する能力を保持し得る。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体または抗体断片は、ヒトのＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮに対する親和性及び／または結合特異性が改善されたものであり得る。
【０１９４】
一態様では、抗ＴＡＡ結合ドメイン（すなわち、ＭＵＣ１６結合ドメイン、ＩＬ１３Ｒα２結合ドメイン、またはＭＳＬＮ結合ドメイン）は、抗体または抗体断片の特定の機能特徴または機能特性によって特徴付けられる。例えば、一態様では、本発明のＴＦＰ組成物のうちで抗原結合ドメインを含む部分は、ヒトのＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮに特異的に結合する。一態様では、本開示は、抗体または抗体断片を含む抗原結合ドメインに関し、抗体結合ドメインは、ＭＵＣ１６タンパク質、ＩＬ１３Ｒα２タンパク質、もしくはＭＳＬＮタンパク質、またはその断片に特異的に結合し、抗体または抗体断片は、本明細書で提供されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び／または可変重鎖を含む。ある特定の態様では、ｓｃＦｖは、リーダー配列と隣接し、当該リーダー配列と同じリーディングフレームに存在する。
【０１９５】
一態様では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、断片（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））である。一態様では、抗ＴＡＡ結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または二機能性（例えば二重特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））である。一態様では、本明細書に開示の抗体及びその断片は、野生型の親和性または強化された親和性でＭＵＣ１６タンパク質、ＩＬ１３Ｒα２タンパク質、またはＭＳＮタンパク質に結合する。
【０１９６】
標的抗原（例えば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＭＬＳＮ、または融合部分である結合ドメインの標的として本明細書の他の箇所に記載される任意の標的抗原）に特異的な抗体抗原結合ドメインを得るための方法も本明細書で提供され、この方法は、本明細書に示されるＶＨドメインのアミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入を導入することによって当該ＶＨドメインのアミノ酸配列バリアントであるＶＨドメインを提供すること、このようにして提供されるＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと任意選択で組み合わせること、及びこのＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの組み合わせ（複数可）を試験して、目的の標的抗原（例えば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＭＳＬＮ）に対して特異的であり、１つ以上の所望の特性を任意選択で有する特異的な結合メンバーまたは抗体抗原結合ドメインを同定すること、を含む。
【０１９７】
場合によっては、ＶＨドメイン及びｓｃＦｖは、当該技術分野で知られる方法に従って調製され得る（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）。ｓｃＦｖ分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用してＶＨ領域とＶＬ領域とを連結して一緒にすることによって生成され得る。ｓｃＦｖ分子は、長さ及び／またはアミノ酸組成が最適化されたリンカー（例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域がどのようにフォールディングし、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短いポリペプチドリンカー（例えば、アミノ酸数５〜１０）が用いられる場合、鎖内フォールディングが阻止される。２つの可変領域を一緒にして機能性のエピトープ結合部位を形成させるには鎖間フォールディングが必要にもなり得る。場合によっては、リンカー配列は、長鎖リンカー（ＬＬ）配列を含む。場合によっては、長鎖リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝２〜４）を含む。場合によっては、リンカー配列は、短鎖リンカー（ＳＬ）配列を含む。場合によっては、短鎖リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜３）を含む。リンカーの配向及びサイズの例については、例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８、米国特許第７，６９５，９３６号、米国特許出願公開公報第２００５０１００５４３号及び同第２００５０１７５６０６号、ならびにＰＣＴ公開公報第ＷＯ２００６／０２０２５８号及び同第ＷＯ２００７／０２４７１５号（これらの文献はすべて、参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０１９８】
ｓｃＦｖは、そのＶＬ領域とＶＨ領域との間に、残基数が約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、または１５を超えるリンカーを含み得る。リンカー配列は、天然起源の任意のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、アミノ酸グリシン及びアミノ酸セリンを含む。別の実施形態では、リンカー配列は、グリシン及びセリンが繰り返す配列のセット（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ｎは、１以上の正の整数である）など）を含む。一実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３であり得る。リンカーの長さを変化させると、活性が保持または増強されることで、活性試験において優れた効力が生じ得る。場合によっては、リンカー配列は、長鎖リンカー（ＬＬ）配列を含む。場合によっては、長鎖リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝２〜４）を含む。場合によっては、リンカー配列は、短鎖リンカー（ＳＬ）配列を含む。場合によっては、短鎖リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜３）を含む。
【０１９９】
安定性及び変異
抗ＴＡＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ分子（例えば、可溶性ｓｃＦｖ））の安定性は、従来の対照ｓｃＦｖ分子または全長抗体の生物物理学的特性（例えば、熱安定性）に関して評価され得る。一実施形態では、記載のアッセイにおけるヒト化ｓｃＦｖまたはヒトｓｃＦｖの熱安定性は、親ｓｃＦｖと比較して、約０．１℃、約０．２５℃、約０．５℃、約０．７５℃、約１℃、約１．２５℃、約１．５℃、約１．７５℃、約２℃、約２．５℃、約３℃、約３．５℃、約４℃、約４．５℃、約５℃、約５．５℃、約６℃、約６．５℃、約７℃、約７．５℃、約８℃、約８．５℃、約９℃、約９．５℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、または約１５℃高い。
【０２００】
抗ＴＡＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）の熱安定性が改善されると、この改善はその後にＴＡＡ−ＴＦＰコンストラクト全体に波及し、抗ＴＡＡ  ＴＦＰコンストラクトの治療特性が改善される。抗ＴＡＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）の熱安定性は、従来の抗体と比較して少なくとも約２℃または３℃改善され得る。一実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）の熱安定性は、従来の抗体と比較して１℃改善されている。別の実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）の熱安定性は、従来の抗体と比較して２℃改善している。別の実施形態では、ｓｃＦｖの熱安定性は、従来の抗体と比較して４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、または１５℃改善されている。比較は、例えば、本明細書に開示のｓｃＦｖ分子と、当該ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬの由来元である抗体のｓｃＦｖ分子またはＦａｂ断片と、の間で行われ得る。熱安定性は、当該技術分野で知られる方法を使用して測定され得る。例えば、一実施形態では、ＴＭが測定され得る。ＴＭの測定方法、及びタンパク質の安定性を決定する他の方法は、以下に記載される。
【０２０１】
ｓｃＦｖの変異（可溶性ｓｃＦｖのヒト化または変異導入を介して生じる）は、ｓｃＦｖの安定性を変化させ、ｓｃＦｖ及び抗ＴＡＡ  ＴＦＰコンストラクトの全体安定性を改善する。ヒト化ｓｃＦｖの安定性は、測定値（ＴＭ、変性温度、及び凝集温度など）を使用してマウスｓｃＦｖと比較される。一実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、ヒト化プロセスから生じる少なくとも１つの変異を含み、その結果、変異したｓｃＦｖは、抗ＴＡＡ  ＴＦＰコンストラクトの安定性を改善する。別の実施形態では、抗ＴＡＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、ヒト化プロセスから生じる少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個の変異を含み、その結果、変異したｓｃＦｖは、抗ＴＡＡ−ＴＦＰコンストラクトの安定性を改善する。
【０２０２】
一態様では、ＴＦＰの抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗原結合ドメインアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を含み、抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗ＴＡＡ抗体断片の所望の機能特性を保持する。特定の一態様では、本発明のＴＦＰ組成物は、抗体断片を含む。別の態様では、その抗体断片は、ｓｃＦｖを含む。
【０２０３】
さまざまな態様において、ＴＦＰの抗原結合ドメインは、一方または両方の可変領域（例えば、ＶＨ及び／またはＶＬ）（例えば、１つ以上のＣＤＲ領域及び／または１つ以上のフレームワーク領域）に含まれるアミノ酸を１つ以上改変することによって操作される。特定の一態様では、本発明のＴＦＰ組成物は、抗体断片を含む。別の態様では、その抗体断片は、ｓｃＦｖを含む。
【０２０４】
本開示の抗体または抗体断片は、さらに改変され得る結果、そうした抗体または抗体断片のアミノ酸配列は変化する（例えば、野生型から変化する）が、所望の活性は不変であることを当業者なら理解するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基のアミノ酸置換が生じる追加のヌクレオチド置換がタンパク質に対して行われ得る。例えば、分子中の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基によって交換され得る。別の実施形態では、アミノ酸の鎖を、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成が異なる構造的に類似した鎖によって交換することができ、例えば、保存的置換（アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基によって交換される）が行われ得る。
【０２０５】
類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されており、こうしたファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【０２０６】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列と関連する同一性パーセントは、２つ以上の配列が同じであることを指す。下記の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して測定するか、または手動でアライメントし、目視で検証することによって、比較範囲または指定領域にわたって最大一致が得られるように２つの配列の比較及びアライメントを行うと、それら２つの配列が、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定のパーセントで有する場合（例えば、特定の領域にわたる同一性、または指定がないときは配列全体にわたる同一性が、６０％であるか、任意選択で、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である場合）、それら２つの配列は「実質的に同一」である。任意選択で、同一性が存在する領域は、長さが少なくとも約５０個のヌクレオチド（または１０個のアミノ酸）の領域、あるいはより好ましくは、長さが１００〜５００個もしくは１０００個以上のヌクレオチド（または２０個、５０個、２００個、もしくはそれを超える数のアミノ酸）の領域である。
【０２０７】
配列比較については、典型的には１つの配列が参照配列として働き、この参照配列に対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列がコンピューターに入力され、部分配列座標が指定され、必要に応じて配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターが使用され得るか、または代替のパラメーターが指定され得る。次に、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントが配列比較アルゴリズムによって計算される。配列比較アライメント方法は、当該技術分野でよく知られている。最適な配列比較アライメントを実施することができ、こうした配列比較アライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索方法、こうしたアルゴリズムがコンピューター化されて実装されたもの（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、または手動でアライメントし、目視で検証するもの（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと）によって実施される。配列同一性及び配列類似性のパーセントの決定に適したアルゴリズムの例としては、ＢＬＡＳＴアルゴリズム及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムの２つが挙げられ、これらのアルゴリズムについては、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に利用可能である。ヌクレオチドＢＬＡＳＴを使用してヌクレオチド配列同一性を決定するためのアルゴリズムパラメーターは、１、−２のマッチ／ミスマッチスコアを用いるスコア付けパラメーターを使用するものであり得、ギャップコストは線形である。配列アライメントについては、アライメントを開始する配列の長さ、またはＢＬＡＳＴアルゴリズムにおける文字列長は２８に設定され得る。タンパク質ＢＬＡＳＴを使用してペプチド配列同一性を決定するためのアルゴリズムパラメーターは、残基対をアライメントし、全アライメントスコアを決定するためのスコアを割り当てるためにＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いるスコア付けパラメーターを使用するものであり得、ギャップコストは、１１の存在ペナルティ及び１の伸長ペナルティを有するものであり得る。��列のアミノ酸組成を補正するための行列調整法は、条件的組成スコア行列調整であり得る。配列アライメントについては、アライメントを開始する配列の長さ、またはＢＬＡＳＴアルゴリズムにおける文字列長は６に設定され得る。
【０２０８】
一態様では、本発明は、出発抗体または出発断片（例えば、ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列を改変して機能的に同等の分子を得ることを企図する。例えば、ＴＦＰに含める抗ＴＡＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）のＶＨまたはＶＬは、当該抗ＴＡＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）の出発ＶＨフレームワーク領域または出発ＶＬフレームワーク領域との同一性が少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％に維持されるように改変され得る。本発明は、ＴＦＰコンストラクト全体を改変して（例えば、ＴＦＰコンストラクトのさまざまなドメインのアミノ酸配列を１つ以上改変して）機能的に同等の分子を得ることを企図する。ＴＦＰコンストラクトは、出発ＴＦＰコンストラクトとの同一性が少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％に維持されるように改変され得る。
【０２０９】
細胞外ドメイン
細胞外ドメインは、天然または組換えの供給源に由来し得る。供給源が天然のものの場合、このドメインは、任意のタンパク質に由来し得るが、具体的には、膜結合型または膜貫通型のタンパク質に由来し得る。一態様では、細胞外ドメインは、膜貫通ドメインと結び付く能力を有する。本開示における特定用途の細胞外ドメインは、細胞外領域（複数可）（例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、ガンマ鎖、デルタ鎖、もしくはゼータ鎖の細胞外領域、またはＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、もしくはＣＤ３デルタの細胞外領域）を少なくとも含み得るか、あるいは代替の実施形態では、細胞外ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４の細胞外ドメインを少なくとも含み得る。場合によっては、ＴＣＲ細胞外ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、その機能性断片、及び１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。
【０２１０】
膜貫通ドメイン
一般に、ＴＦＰ配列は、単一のゲノム配列によってコードされる細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含む。代替の実施形態では、ＴＦＰは、当該ＴＦＰの細胞外ドメインに対して異種である膜貫通ドメインを含むように設計され得る。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１つ以上の追加のアミノ酸を含み得る。この１つ以上の追加のアミノ酸は、例えば、膜貫通タンパク質の由来元であるタンパク質の細胞外領域と結び付いた１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、もしくはそれを超える数のアミノ酸）、及び／または膜貫通タンパク質の由来元であるタンパク質の細胞内領域と結び付いた１つ以上の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、もしくはそれを超える数のアミノ酸）である。場合によっては、膜貫通ドメインは、細胞外領域の少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、またはそれを超える数のアミノ酸を含み得る。場合によっては、膜貫通ドメインは、細胞内領域の少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、またはそれを超える数のアミノ酸を含み得る。一態様では、ＴＦＰのその他のドメインのうちの１つと結び付いたものが膜貫通ドメインとして使用される。場合によっては、膜貫通ドメインを、そのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することが回避されるように、選択されるか、またはアミノ酸置換によって改変することができ、この改変の結果、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用が最小化される。一態様では、膜貫通ドメインは、ＴＦＰ  Ｔ細胞表面上の別のＴＦＰとホモダイマー化する能力を有する。異なる態様では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＴＦＰに存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用が最小化するように改変または置換され得る。
【０２１１】
膜貫通ドメインは、天然または組換えの供給源に由来し得る。供給源が天然のものの場合、このドメインは、膜結合型または膜貫通型の任意のタンパク質に由来し得る。一態様では、膜貫通ドメインは、ＴＦＰが標的に結合しているときはいつでも細胞内ドメイン（複数可）にシグナル伝達を行う能力を有する。場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、その機能性断片、及び１〜２０個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。場合によっては、膜貫通ドメインは、ヒンジ（例えば、ヒトタンパク質に由来するヒンジ）を介してＴＦＰの細胞外領域（例えば、ＴＦＰの抗原結合ドメイン）に付加され得る。例えば、一実施形態では、ヒンジは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ（例えば、ＩｇＧ４ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジ）であり得る。
【０２１２】
リンカー
任意選択で、アミノ酸数が２〜１０の長さの短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーによって、ＴＦＰの膜貫通ドメインと細胞質領域との間に結合が形成され得る。グリシン−セリンダブレットは、特に適したリンカーを与える。例えば、一態様では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳというアミノ酸配列（配列番号９９）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣというヌクレオチド配列（配列番号１００）によってコードされる。リンカーの他の例は表４に示される。
【０２１３】
細胞質ドメイン
ＴＦＰの細胞質ドメインは、ＴＦＰがＣＤ３ガンマポリペプチド、ＣＤ３デルタポリペプチド、またはＣＤ３イプシロンポリペプチドを含むのであれば、細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る（ＴＣＲアルファサブユニット及びＴＣＲベータサブユニットは、一般に、シグナル伝達ドメインを含まない）。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般に、ＴＦＰが導入されている免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つを活性化することを担う。「エフェクター機能」という用語は、特殊な細胞機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、タンパク質のうちで、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞が特殊機能を発揮するように導く部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメイン全体が通常は利用され得るが、多くの場合、鎖全体を使用することは必ずしも必要ではない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分が使用されるされる場合、そのような短縮部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことが意図される。
【０２１４】
本発明のＴＦＰにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原と受容体との結合後にシグナル伝達が開始されるように協奏的に働くＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び共受容体の細胞質配列、ならびにこうした配列の任意の誘導体またはバリアント、及び同じ機能的能力を有する任意の組換え配列が挙げられる。
【０２１５】
ナイーブＴ細胞が完全に活性化するにはＴＣＲのみを介して生成するシグナルでは不十分であり得、二次シグナル及び／または共刺激シグナルが必要となり得ることが知られている。したがって、ナイーブＴ細胞の活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると言うことができ、この２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列は、ＴＣＲを介して抗原依存的一次活性化を開始するもの（一次細胞内シグナル伝達ドメイン）、及び抗原非依存的様式で働いて二次シグナルまたは共刺激シグナルを生成するもの（二次細胞質ドメイン（例えば、共刺激ドメイン））である。
【０２１６】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激様式または抑制様式のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を制御し得る。刺激性の様式で働く一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
【０２１７】
ＩＴＡＭを含む一次細胞内シグナル伝達ドメインで本発明に特に有用なものの例としては、ＣＤ３ゼータのもの、ＦｃＲガンマのもの、ＦｃＲベータのもの、ＣＤ３ガンマのもの、ＣＤ３デルタのもの、ＣＤ３イプシロンのもの、ＣＤ５のもの、ＣＤ２２のもの、ＣＤ７９ａのもの、ＣＤ７９ｂのもの、及びＣＤ６６ｄのものが挙げられる。一実施形態では、本開示のＴＦＰは、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３−イプシロンの一次シグナル伝達ドメイン）を含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、改変ＩＴＡＭドメイン（例えば、天然のＩＴＡＭドメインと比較して活性が変化（例えば、増加または減少）している変異ＩＴＡＭドメイン）を含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、改変ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、最適化され及び／または短縮されたＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
【０２１８】
ＴＦＰの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを単独で含み得るか、または本開示のＴＦＰとの関連で有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）と組み合わせられ得る。例えば、ＴＦＰの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３イプシロン鎖部分及び共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、ＴＦＰのうちで、共刺激分子の細胞内ドメインを含む部分を指す。共刺激分子は、抗原に対してリンパ球が効率的に応答する上で必要となり得る、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ならびに同様のものが挙げられる。例えば、ＣＤ２７共刺激は、インビトロでヒトＴＦＰ−Ｔ細胞の増殖、エフェクター機能、及び生存を増進し、インビボでヒトＴ細胞の存続性及び抗腫瘍活性を増強することが実証されている（Ｓｏｎｇｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（３）：６９６−７０６）。
【０２１９】
本開示のＴＦＰの細胞質部分に含まれる細胞内シグナル伝達配列は、無作為な順序または特定の順序で互いに 連結され得る。任意選択で、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー（例えば、アミノ酸数が２〜１０（例えば、アミノ酸数が２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の長さのもの）によって細胞内シグナル伝達配列間に結合が形成され得る。
【０２２０】
一実施形態では、適切なリンカーとしてグリシン−セリンダブレットが使用され得る。一実施形態では、適切なリンカーとして単一のアミノ酸（例えば、アラニン、グリシン）が使用され得る。
【０２２１】
一態様では、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞は、第２のＴＦＰ（例えば、異なる抗原結合ドメイン（例えば、同じ標的（例えば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＭＳＬＮ）または異なる標的（例えば、ＣＤ１２３）に対するもの）を含む第２のＴＦＰ）をさらに含み得る。一実施形態では、ＴＦＰ発現細胞が２つ以上の異なるＴＦＰを含む場合、それらの異なるＴＦＰの抗原結合ドメインは、それらの抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであり得る。例えば、第１のＴＦＰ及び第２のＴＦＰを発現する細胞は、第１のＴＦＰの抗原結合ドメインを、例えば、第２のＴＦＰの抗原結合ドメインと結び付かない断片（例えば、ｓｃＦｖ）として有し得、例えば、第２のＴＦＰの抗原結合ドメインは、ＶＨＨである。一実施形態では、抗原結合ドメインは、ＳＤ１（配列番号１５）、ＳＤ２（配列番号２０）、ＳＤ３（配列番号２５）、ＳＤ４（配列番号３０）、ＳＤ５（配列番号３５）、またはＳＤ６（配列番号４０）である。一実施形態では、抗原結合ドメインは、ＬＳＤ１（配列番号５１）、Ｈ１−ＬＳＤ１（配列番号５６）、Ｈ２−ＬＳＤ１（配列番号６１）、ＬＳＤ２（配列番号６６）、Ｈ１−ＬＳＤ１（配列番号７１）、またはＨ２−ＬＳＤ２（配列番号７６）である。一実施形態では、抗原結合ドメインは、抗ＭＳＬＮ  ＶＨＨ１（配列番号９６）または抗ＭＳＬＮ  ＶＨＨ２（配列番号９７）である。
【０２２２】
別の態様では、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞は、別の薬剤（例えば、ＴＦＰ発現細胞の活性を増進する薬剤）をさらに発現し得る。例えば、一実施形態では、薬剤は、抑制分子を阻害する薬剤であり得る。抑制分子（例えば、ＰＤ１）は、いくつかの実施形態では、ＴＦＰ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低減し得る。抑制分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦＲベータが挙げられる。一実施形態では、抑制分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを与える第２のポリペプチド（例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン）と結び付いた第１のポリペプチド（例えば、抑制分子）を含む。一実施形態では、薬剤は、第１のポリペプチド（例えば、抑制分子（ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ３、２Ｂ４、及びＴＩＧＩＴ、またはこれらのいずれかの断片（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部）など）であるもの）と、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン（例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、もしくはＣＤ２８のもの（例えば、本明細書に記載のもの）、及び／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含むもの）である第２のポリペプチドと、を含む。一実施形態では、薬剤は、ＰＤ１またはその断片（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部）である第１のポリペプチドと、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及び／または本明細書に記載のＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）である第２のポリペプチドと、を含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、及びＢＴＬＡも含むＣＤ２８受容体ファミリーの抑制メンバーである。ＰＤ１は、活性化Ｂ細胞上、活性化Ｔ細胞上、及び活性化骨髄系細胞上に発現し得る（Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：７６５−７５）。ＰＤ１に対する２つのリガンド（プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）及びプログラム細胞死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２））は、ＰＤ１に結合するとＴ細胞活性化を下方制御することが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０２７−３４、Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：６３４−４３）。ＰＤ−Ｌ１は、ヒトのがんに大量に存在し得る（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８１：２８１−７、Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５４：３０７−３１４、Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：５０９４）。ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１との局所的な相互作用を阻害することによって免疫抑制を逆転させることができる。
【０２２３】
一実施形態では、薬剤は、抑制分子（例えば、プログラム細胞死１（ＰＤ１））の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（膜貫通ドメイン及び任意選択で細胞内シグナル伝達ドメイン（４１ＢＢ及びＣＤ３ゼータなど）と融合され得る）を含む（本明細書ではＰＤ１  ＴＦＰとも称される）。一実施形態では、ＰＤ１  ＴＦＰは、本明細書に記載の抗ＴＡＡ  ＴＦＰと組み合わせて使用されると、Ｔ細胞の存続性を改善する。一実施形態では、ＴＦＰは、ＰＤ  １の細胞外ドメインを含むＰＤ１  ＴＦＰである。あるいは、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する抗体または抗体断片（ｓｃＦｖなど）を含むＴＦＰが提供される。
【０２２４】
別の態様では、本開示は、ＴＦＰ発現Ｔ細胞（例えば、ＴＦＰ−Ｔ細胞）の集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＦＰ発現Ｔ細胞の集団は、異なるＴＦＰを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一実施形態では、ＴＦＰ−Ｔ細胞の集団は、本明細書に記載の抗ＴＡＡ結合ドメインを有するＴＦＰを発現する第１の細胞と、異なる抗ＴＡＡ結合ドメイン（例えば、第１の細胞が発現するＴＦＰ中の抗ＴＡＡ結合ドメインとは異なる本明細書に記載の抗ＴＡＡ結合ドメイン）を有するＴＦＰを発現する第２の細胞と、を含み得る。別の例として、ＴＦＰ発現細胞の集団は、抗ＴＡＡ結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のもの）を含むＴＦＰを発現する第１の細胞と、第１の細胞の抗ＴＡＡ  ＴＦＰ（例えば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮに特異性を有するもの）の標的とは異なる標的（例えば、別の腫瘍関連抗原）に対する抗原結合ドメインを含むＴＦＰを発現する第２の細胞と、を含み得る。
【０２２５】
別の態様では、本開示は、細胞の集団（当該集団における少なくとも１種類の細胞は、本明細書に記載の抗ＴＡＡドメインを有するＴＦＰを発現する）と、別の薬剤（例えば、ＴＦＰ発現細胞の活性を増進する薬剤）を発現する第２の細胞と、を提供する。例えば、一実施形態では、薬剤は、抑制分子を阻害する薬剤であり得る。抑制分子は、例えば、いくつかの実施形態では、ＴＦＰ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低減し得る。抑制分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦＲベータが挙げられる。一実施形態では、抑制分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを与える第２のポリペプチド（例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン）と結び付いた第１のポリペプチド（例えば、抑制分子）を含む。
【０２２６】
ＴＦＰをコードするインビトロで転写されたＲＮＡを生成させる方法が本明細書に開示される。本発明は、細胞に直接的にトランスフェクションし得るＴＦＰコードＲＮＡコンストラクトも含む。トランスフェクションにおいて使用するためのｍＲＮＡを生成させる方法は、特別に設計されたプライマーを用いてテンプレートのインビトロ転写（ＩＶＴ）を行った後にポリＡを付加することで、３’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）及び５’ＵＴＲ、５’キャップ、及び／または配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現対象の核酸、ならびにポリＡ尾部（典型的には長さが５０〜２０００塩基のもの）、を含むコンストラクトを得るというものであり得る。そのようにして生成したＲＮＡは、異なる種類の細胞に効率的にトランスフェクションされ得る。一態様では、テンプレートは、ＴＦＰのための配列を含む。
【０２２７】
一態様では、抗ＴＡＡ  ＴＦＰは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされる。一態様では、抗ＴＡＡ  ＴＦＰをコードするｍＲＮＡは、ＴＦＰ−Ｔ細胞を得るためにＴ細胞に導入される。一実施形態では、インビトロで転写されたＲＮＡ  ＴＦＰは、一過性のトランスフェクションの形態として細胞に導入され得る。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成したテンプレートを使用するインビトロ転写によって生成される。適切なプライマー及びＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロでのｍＲＮＡ合成のためのテンプレートへと、任意の供給源に由来する目的ＤＮＡをＰＣＲによって直接的に変換することができる。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列、または任意の他の適切なＤＮＡ供給源であり得る。インビトロ転写のための所望のテンプレートは、本発明のＴＦＰである。一実施形態では、ＰＣＲに使用すべきＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノムに由来する天然起源のＤＮＡ配列に由来するものであり得る。一実施形態では、核酸は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または３’ＵＴＲをいくらかまたはすべて含み得る。核酸は、エクソン及びイントロンを含み得る。一実施形態では、ＰＣＲに使用すべきＤＮＡは、ヒト核酸配列である。別の実施形態では、ＰＣＲに使用すべきＤＮＡは、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。あるいは、ＤＮＡは、天然起源の生物に通常は発現しない人工ＤＮＡ配列であり得る。人工ＤＮＡ配列の例は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するように、連結されて一緒になった複数の遺伝子部分を含むものである。連結されて一緒になる複数のＤＮＡ部分は、単一の生物または複数の生物に由来し得る。
【０２２８】
トランスフェクションに使用されるｍＲＮＡのインビトロ転写のためのテンプレートを生成させるためにＰＣＲが使用される。ＰＣＲを実施するための方法は、当該技術分野でよく知られている。ＰＣＲにおいて使用するためのプライマーは、ＰＣＲのためのテンプレートとして使用すべきＤＮＡの領域と実質的に相補的な領域を有するように設計される。本明細書で使用される「実質的に相補的」は、ヌクレオチドの配列が、プライマー配列中の塩基の大部分もしくはすべてと相補的であるか、または１つ以上の塩基と非相補的であるか、もしくはミスマッチであることを指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用されるアニーリング条件の下で、意図されるＤＮＡ標的とアニーリングまたはハイブリダイズすることが可能である。ＤＮＡテンプレートの任意の部分と実質的に相補的になるようにプライマーを設計することができる。例えば、プライマーは、核酸のうちで、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含めて、細胞において通常は転写される部分（オープンリーディングフレーム）が増幅されるように設計され得る。プライマーは、核酸のうちで特定の目的ドメインをコードする部分が増幅されるようにも設計され得る。一実施形態では、プライマーは、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲのすべてまたは一部を含めて、ヒトｃＤＮＡのコード領域が増幅されるように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当該技術分野でよく知られる合成方法によって生成され得る。「フォワードプライマー」は、増幅対象のＤＮＡ配列の上流に位置するＤＮＡテンプレート上のヌクレオチドと実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「上流」は、コード鎖を基準として増幅対象のＤＮＡ配列の５’側の位置を指すために本明細書で使用される。「リバースプライマー」は、二本鎖ＤＮＡテンプレートと実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含み、この領域が、増幅対象のＤＮＡ配列の下流に位置するプライマーである。「下流」は、コード鎖を基準として増幅対象のＤＮＡ配列の３’側の位置を指すために本明細書で使用される。
【０２２９】
本明細書に開示の方法では、ＰＣＲに有用な任意のＤＮＡポリメラーゼが使用され得る。試薬及びポリメラーゼは、多くの供給源から市販されている。
【０２３０】
安定性及び／または翻訳効率を高める能力を有する化学構造も使用され得る。ＲＮＡは、好ましくは、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを有する。一実施形態では、５’ＵＴＲは、ヌクレオチド数が１〜３，０００の長さを有する。コード領域に付加されるべき５’ＵＴＲ配列及び３’ＵＴＲ配列の長さは、さまざまな方法によって変更することができ、こうした方法には、限定されないが、ＵＴＲの異なる領域にアニーリングするＰＣＲプライマーを設計するものが含まれる。この手法を使用することで、転写されたＲＮＡをトランスフェクションした後の翻訳効率の最適化達成に使用され得る５’ＵＴＲ長及び３’ＵＴＲ長を当業者なら改変することができる。
【０２３１】
５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、目的核酸に対して内在性である天然起源の５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲであり得る。あるいは、目的核酸に対して内在性ではないＵＴＲ配列が、フォワードプライマー及びリバースプライマーにそうしたＵＴＲ配列を組み込むことによって付加されるか、またはテンプレートの任意の他の改変によって付加され得る。目的核酸に対して内在性ではないＵＴＲ配列を使用することは、ＲＮＡの安定性及び／または翻訳効率の改変に有用であり得る。例えば、ＡＵ高含有エレメントが３’ＵＴＲ配列に存在するとｍＲＮＡの安定性が低下し得ることが知られている。したがって、当該技術分野でよく知られるＵＴＲの特性に基づいて、転写されたＲＮＡの安定性が向上するように３’ＵＴＲが選択または設計され得る。
【０２３２】
一実施形態では、５’ＵＴＲは、内在性の核酸のコザック配列を含み得る。あるいは、目的核酸に対して内在性ではない５’ＵＴＲが、上記のようにＰＣＲによって付加されている場合、当該５’ＵＴＲ配列の付加によってコンセンサスコザック配列が再設計され得る。コザック配列は、ＲＮＡ転写物によってはその翻訳効率を向上させ得るが、効率的な翻訳を可能にする上ですべてのＲＮＡに必要なものではないと思われる。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、細胞において自体のＲＮＡゲノムが安定に存在するＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであり得る。他の実施形態では、エキソヌクレアーゼによってｍＲＮＡが分解されることを妨げるために、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲ中にさまざまなヌクレオチド類似体が使用され得る。
【０２３３】
遺伝子クローニングを必要とすることなくＤＮＡテンプレートからＲＮＡが合成されることを可能にするために、転写対象の配列の上流に位置するようにＤＮＡテンプレートに転写プロモーターが付加されるべきである。ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの５’末端に付加される場合、当該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、ＰＣＲ産物に組み込まれて転写対象のオープンリーディングフレームの上流に位置する。好ましい一実施形態では、プロモーターは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターであり、このことは本明細書の他の箇所に記載される。他の有用なプロモーターには、限定されないが、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれる。Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、及びＳＰ６プロモーターのためのコンセンサスヌクレオチド配列は、当該技術分野で知られている。
【０２３４】
好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、５’末端上のキャップも３’ポリ（Ａ）尾部も有し、これらによってリボソームの結合、翻訳の開始、及び細胞中でのｍＲＮＡの安定性が決定される。環状ＤＮＡテンプレート（例えば、プラスミドＤＮＡ）では、真核細胞における発現に適さない長い鎖状産物がＲＮＡポリメラーゼによって生成される。３’ＵＴＲの末端位置で直鎖化したプラスミドＤＮＡの転写では通常サイズのｍＲＮＡが得られるが、このｍＲＮＡは、転写後にポリアデニル化されたとしても、真核生物へのトランスフェクションに有効なものではない。
【０２３５】
直鎖ＤＮＡテンプレートでは、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、テンプレートの最終塩基を超えて転写物の３’末端を延長し得る（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ  ａｎｄ  Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：６２２３−３６（１９８５）、Ｎａｃｈｅｖａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１４８５−６５（２００３）。
【０２３６】
ポリＡ／Ｔ区間をＤＮＡテンプレートに組み込む従来の方法は分子クローニングである。しかしながら、ポリＡ／Ｔ配列がプラスミドＤＮＡに組み込まれるとプラスミドが不安定化し得る。このことが、細菌細胞から得られるプラスミドＤＮＡテンプレートには欠失及び他の異常が高度に混入することが多い理由である。このことによってクローニング手順が難儀かつ時間のかかるものとなっているだけでなく、不確実なものにもなっている。このことが、クローニングを伴うことなくポリＡ／Ｔ３’区間を有するＤＮＡテンプレートを構築することを可能にする方法が非常に望ましい理由である。
【０２３７】
転写ＤＮＡテンプレートのポリＡ／Ｔセグメントは、ポリＴ尾部（Ｔ数が１００の尾部など）（Ｔ数５０〜５０００のサイズのものであり得る）を含むリバースプライマーを使用してＰＣＲの間に生成されるか、または任意の他の方法（限定されないが、ＤＮＡライゲーションもしくはインビトロでの組換えを含む）によってＰＣＲの後に生成され得る。ポリ（Ａ）尾部は、ＲＮＡに安定性を付与すると共に、ＲＮＡの分解も低減する。一般に、ポリ（Ａ）尾部の長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正に相関する。一実施形態では、ポリ（Ａ）尾部のアデノシン数は、１００〜５０００である。
【０２３８】
ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）など）を使用するとインビトロ転写後にＲＮＡのポリ（Ａ）尾部をさらに伸長させることができる。一実施形態では、ポリ（Ａ）尾部の長さをヌクレオチド数１００からヌクレオチド数３００〜４００に伸ばすと、ＲＮＡの翻訳効率が約２倍に増加する。さらに、異なる化学基を３’末端に付加すると、ｍＲＮＡの安定性が向上し得る。そのような付加は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマー、及び他の化合物を含み得る。例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してＡＴＰ類似体がポリ（Ａ）尾部に組み込まれ得る。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性をさらに向上させ得る。
【０２３９】
５’キャップの付加もまた、ＲＮＡ分子に安定性を付与する。好ましい実施形態では、本明細書に開示の方法によって生成されるＲＮＡは、５’キャップを含む。５’キャップは、当該技術分野で知られる手法及び本明細書に記載の方法を使用して生成される（Ｃｏｕｇｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２９：４３６−４４４（２００１）、Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，７：１４６８−９５（２００１）、Ｅｌａｎｇｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３０：９５８−９６６（２００５））。
【０２４０】
本明細書に開示の方法によって生成されるＲＮＡは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存的なリボソーム結合を開始させ、翻訳の開始を促進する任意のウイルス配列、染色体配列、または人工的に設計された配列であり得る。細胞の電気穿孔に適した任意の溶質（細胞の透過性及び生存率を促進する因子（糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤、及び界面活性剤など）を含み得る）が含められ得る。
【０２４１】
標的細胞へのＲＮＡの導入は、多くの異なる方法（例えば、商業的に利用可能な方法）のいずれかを使用して行われ得る。こうした商業的に利用可能な方法には、限定されないが、電気穿孔（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ−ＩＩ（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、ＥＣＭ  ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）、もしくはＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ，Ｄｅｎｖｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ，Ｈａｍｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ）、リポフェクションを使用する陽イオン性リポソーム介在性のトランスフェクション、ポリマー被包、ペプチド介在性のトランスフェクション、または微粒子送達系（「遺伝子銃」など）（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１２（８）：８６１−７０（２００１）を参照のこと）が含まれる。
【０２４２】
ＴＦＰをコードする核酸コンストラクト
本開示は、本明細書に記載のＴＦＰコンストラクトを１つ以上コードする核酸分子も提供する。一態様では、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。一態様では、核酸分子は、ＤＮＡコンストラクトとして提供される。
【０２４３】
所望の分子をコードする核酸配列は、当該技術分野で知られる組換え方法を使用して得ることができ、こうした方法は、例えば、遺伝子を発現する細胞に由来するライブラリーをスクリーニングすることによるもの、遺伝子を含むことが知られるベクターから遺伝子を得ることによるもの、または遺伝子を含む細胞及び組織から直接的に遺伝子を単離することによるものなど（標準的な手法を使用して行われる）である。あるいは、目的遺伝子は、クローニングではなく、合成的に生成され得る。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組換え核酸を含むベクターが本明細書で提供される。場合によっては、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。場合によっては、ベクターは、ＡＡＶ６ベクターである。場合によっては、ベクターは、プロモーターをさらに含む。場合によっては、ベクターは、インビトロで転写されるベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、環状ＲＮＡベクター（例えば、同時係属中の仮特許出願第６２／８３６，９７７号に開示にもの）である。
【０２４５】
本開示は、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも提供する。レトロウイルス（レンチウイルスなど）に由来するベクターは、導入遺伝子を長期的かつ安定的に組み込み、組み込んだ導入遺伝子を娘細胞に受け継がせて複製することを可能にするため、遺伝子の長期的な導入達成に適したツールである。レンチウイルスベクターは、非増殖細胞（肝細胞など）への形質導入を生じさせ得るという点において、オンコレトロウイルス（マウス白血病ウイルスなど）に由来するベクターを上回る追加利点を有する。レンチウイルスベクターは、免疫原性が低いという追加利点も有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組換え核酸を含むベクターが開示される。
【０２４６】
別の実施形態では、本開示の所望のＴＦＰをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態では、ＴＦＰをコードする核酸の発現は、トランスポゾン（スリーピングビューティーなど）、ｃｒｉｓｐｅｒ、ＣＡＳ９、及びジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して達成され得る（Ｊｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９．１０：７０４−７１６（参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０２４７】
本開示の発現コンストラクトは、標準的な遺伝子送達プロトコールを使用する核酸による免疫化及び遺伝子治療にも使用され得る。遺伝子送達のための方法は、当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号（これらの文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと））。別の実施形態では、本開示は、遺伝子治療ベクターを提供する。
【０２４８】
核酸は、多くの型のベクターにクローニングされ得る。例えば、核酸をベクターにクローニングすることができ、こうしたベクターには、限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドが含まれる。特定目的のベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及びシークエンシングベクターが含まれる。
【０２４９】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に導入され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、ならびにウイルス学及び分子生物学の他の手引書に記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが含まれる。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択可能マーカー（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び米国特許第６，３２６，１９３号）を含む。
【０２５０】
哺乳類細胞への遺伝子導入についてはウイルスベースの系が多く開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットホームを提供する。当該技術分野で知られる手法を使用して選択遺伝子がベクターに挿入され、レトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次に、組換えウイルスが単離され、インビボまたはエクスビボのいずれかで対象の細胞に送達され得る。当該技術分野では多くのレトロウイルス系が知られている。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。当該技術分野では多くのアデノウイルスベクターが知られている。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
【０２５１】
追加のプロモーターエレメント（例えば、エンハンサー）は、転写開始の頻度を制御する。典型的には、こうしたものは、開始部位から３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多くのプロモーターは開始部位の下流にも機能性エレメントを含むことが示されている。プロモーターエレメント間の間隔は融通が利くことが多く、結果的に、エレメントを互いに反転または移動させてもプロモーター機能は保たれる。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔を空けていくと、間隔が５０ｂｐに到達したところで初めて活性の低下が始まり得る。プロモーターに応じて、個々のエレメントが協同的または独立的に機能して転写を活性化し得るものと思われる。
【０２５２】
哺乳類Ｔ細胞においてＴＦＰ導入遺伝子を発現させる能力を有するプロモーターの一例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然のＥＦ１ａプロモーターは、伸長因子−１複合体のアルファサブユニット（アミノアシルｔＲＮＡを酵素的にリボソームに送達することを担う）の発現を生じさせる。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳類発現プラスミドにおいて広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローニングされた導入遺伝子からＴＦＰ発現を生じさせる上で有効であることが示されている（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照のこと）。プロモーターの別の例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期プロモーター配列である。このプロモーター配列は、そこに機能可能なように連結された任意のポリヌクレオチド配列の発現を高レベルで生じさせる能力を有する強力な構成的プロモーター配列である。一方で、他の構成的プロモーター配列を使用することもでき、こうした構成的プロモーター配列には、限定されないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター（限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子−１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターなど）が含まれる。さらに、本開示は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきものではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターを使用することで、それが機能可能なように連結されたポリヌクレオチド配列の発現をそのような発現が望まれるときに生じさせるか、または発現が望まれないときには発現を生じさせなくする能力を有する分子スイッチが得られる。誘導性プロモーターの例としては、限定されないが、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリン制御型プロモーターが挙げられる。
【０２５３】
ＴＦＰポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入すべき発現ベクターは、選択可能マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれか、またはこれら両方も含むことで、ウイルスベクターを介したトランスフェクションまたは感染の対象である細胞の集団から発現細胞を同定及び選択することが容易になり得る。他の態様では、選択可能マーカーは、別個のＤＮＡ断片上に組み込まれ、コトランスフェクション手順において使用され得る。選択可能マーカー及びレポーター遺伝子は共に、適切な制御配列と隣接することで、宿主細胞での発現が可能になり得る。有用な選択可能マーカーには、例えば、抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子など）及び同様のものが含まれる。
【０２５４】
レポーター遺伝子は、トランスフェクションされた可能性のある細胞を同定すること、及び制御配列の機能性を評価することに使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物もしくはレシピエント組織に存在しないか、またはレシピエント生物もしくはレシピエント組織が発現しない遺伝子であって、検出が容易に可能な何らかの特性（例えば、酵素活性）によって自体の発現が明らかとなるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時間にアッセイされる。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼをコードする遺伝子、ベータ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子が含まれ得る（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９−８２）。適切な発現系はよく知られており、既知の手法を使用して調製されるか、または商業的に得ることができる。一般に、最小の５’隣接領域でレポーター遺伝子の発現が最大レベルとなるコンストラクトが、プロモーターを有するものとして同定される。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーターによって生じる転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用され得る。
【０２５５】
細胞へ遺伝子を導入し、発現させる方法は、当該技術分野で知られている。発現ベクターとの関連では、当該技術分野の任意の方法によってベクターが宿主細胞（例えば、哺乳類細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞）に容易に導入され得る。例えば、物理的、化学的、または生物学的な手段によって発現ベクターが宿主細胞に導入され得る。
【０２５６】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的な方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、パーティクルボンバードメント、マイクロインジェクション、電気穿孔、及び同様のものが含まれる。ベクター及び／または外来性核酸を含む細胞を調製するための方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参考のこと）。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための方法の１つは、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０２５７】
目的ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的な方法には、ＤＮＡベクター及びＲＮＡベクターを使用するものが含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類（例えば、ヒト）の細胞に挿入するために最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス、ならびに同様のものに由来するものであり得る（例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照のこと）。
【０２５８】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的な方法には、コロイド分散系が含まれ、こうしたコロイド分散系は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、及び脂質ベースの系（水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む）などである。インビトロ及びインビボでの送達媒体として使用するためのコロイド系の例は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。他の最先端の標的化核酸送達方法も利用可能であり、こうした方法は、標的化ナノ粒子または他の適切なサブミクロンサイズの送達系を用いてポリヌクレオチドを送達するものなどである。
【０２５９】
非ウイルス送達系が利用される場合、送達媒体の例はリポソームである。宿主細胞への核酸の導入（インビトロ、エクスビボ、またはインビボでのもの）については脂質製剤の使用が企図される。別の態様では、核酸は、脂質と結び付けられ得る。脂質と結び付いた核酸は、リポソームの水性内部に被包されるか、リポソームの脂質二重層内に散在されるか、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方を結び付ける連結分子を介してリポソームに付加されるか、リポソームに封入されるか、リポソームと複合体化されるか、脂質を含む溶液に分散されるか、脂質と混合されるか、脂質と組み合わせられるか、懸濁液として脂質に含められるか、ミセルに含められるか、もしくはミセルと複合体化されるか、またはその他の様式で脂質と結び付けられ得る。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクターと結び付いた組成物は、いずれの特定の溶液中構造にも限定されない。例えば、そうした組成物は、ミセルとして二重層構造中に存在し得るか、または「崩壊」構造をとって存在し得る。そうした組成物は、単純に溶液中に散在し、サイズまたは形状が不均一な集合体を形成する可能性もあり得る。脂質は、天然起源の脂質または合成の脂質であり得る脂肪性物質である。例えば、脂質には、細胞質に天然に生じる脂肪滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体を含むクラスの化合物（脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドなど）が含まれる。
【０２６０】
使用に適した脂質は、商業的な供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．から入手することができる。リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ  ＆  Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）から入手することができる。コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができる。ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から入手することができる。脂質を含むクロロホルムまたはクロロホルム／メタノールの保存溶液は、約−２０℃で保管され得る。クロロホルムは、メタノールと比較してより容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、閉鎖された脂質二重層または凝集体が生成することによって形成されるさまざまな単層脂質媒体及び多重層脂質媒体を包含する一般用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜を有し、内部に水性媒体を含む小胞構造を有するものとして特徴付けられ得る。多重層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。多重層リポソームは、過剰な水溶液にリン脂質が懸濁されると自発的に形成される。脂質成分は、自己再編成を起こした後、閉鎖構造を形成し、脂質二重層の間に水及び溶解溶質を閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５０５−１０）。しかしながら、溶液中の構造が通常の小胞構造とは異なる組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとることが想定されるか、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在し得る。ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−核酸複合体も企図される。
外来性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法、またはその他の様式で本発明の阻害剤に細胞を曝露するために使用される方法にかかわらず、組換えＤＮＡ配列が宿主細胞に存在するかを確認するために、さまざまなアッセイが実施され得る。そのようなアッセイには、例えば、当業者によく知られる「分子生物学的」アッセイ（サザンブロット及びノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ならびにＰＣＲなど）、「生化学的」アッセイ（特定のペプチドの存在有無を検出するもの（例えば、免疫学的な手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）によって検出するもの、または本発明の範囲に入る薬剤を同定するための本明細書に記載のアッセイによって検出するもの）など）が含まれる。
【０２６１】
遺伝子編集技術
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の改変Ｔ細胞は、遺伝子編集手法を使用して操作され、こうした遺伝子編集手法は、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ（登録商標）、例えば、米国特許第８，６９７，３５９号を参照のこと）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、例えば、米国特許第９，３９３，２５７号を参照のこと）、メガヌクレアーゼ（１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を含む大きな認識部位を有するエンドデオキシリボヌクレアーゼ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ、例えば、Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）ｖ１１，６３６−６４６を参照のこと）、またはメガＴＡＬヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼとＴＡＬ反復配列との融合タンパク質）を使用する方法などである。このように、各サブユニットの望ましい特徴（高次構造またはシグナル伝達能力など）が組み合わさるようにキメラコンストラクトが操作創出され得る。Ｓａｎｄｅｒ  ＆  Ｊｏｕｎｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１４）ｖ３２，３４７−５５、及びＪｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９．１０：７０４−７１６（それぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる）も併せて参照のこと。いくつかの実施形態では、ＴＦＰサブユニットの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞質ドメインの１つ以上は、複数の天然のＴＣＲサブユニットドメインの側面を有するように操作される（すなわち、キメラとされる）。
【０２６２】
ヒトゲノムを恒久的に変化させるための技術、及びゲノム改変を部位特異的に疾患関連遺伝子に導入するための技術が最近開発されたことによって、治療への応用の基礎が築かれている。こうした技術は、今や「ゲノム編集」として一般に知られている。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集手法は、内在性のＴＣＲ遺伝子を破壊するために用いられる。いくつかの実施形態では、言及した内在性のＴＣＲ遺伝子は、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、またはＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子編集手法は、マルチプレックスゲノム編集への道を切り開いており、マルチプレックスゲノム編集では、内在性のＴＣＲ遺伝子における複数のゲノム遺伝子座を同時に破壊することが可能である。いくつかの実施形態では、マルチプレックスゲノム編集手法が適用されることで、内在性のＴＣＲ及び／またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）及び／またはプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）及び／または他の遺伝子を発現しない遺伝子破壊Ｔ細胞が得られる。
【０２６４】
現在の遺伝子編集技術は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及び規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系を含む。これら４つの主要クラスの遺伝子編集手法は、使用者が定義したＤＮＡ配列に結合すること、及び二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を媒介することにおいて共通の作用様式を共有している。次に、ＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復されるか、またはドナーＤＮＡが存在する場合は、相同組換え（ＨＲ）（ドナーＤＮＡ断片に由来する相同的配列を導入する事象）によって修復され得る。さらに、ニッカーゼヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡ切断（ＳＳＢ）を生成させる。ＤＳＢは、一本鎖ＤＮＡ組み込み（ｓｓＤＩ）または一本鎖テンプレート修復（ｓｓＴＲ）（ドナーＤＮＡに由来する相同的配列を導入する事象）によって修復され得る。
【０２６５】
ゲノムＤＮＡの遺伝子改変は、目的遺伝子座中のＤＮＡ配列を認識するように操作された部位特異的レアカッターエンドヌクレアーゼを使用して実施され得る。操作された部位特異的エンドヌクレアーゼを得る方法は、当該技術分野で知られている。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ゲノム中の所定部位を認識及び切断するように操作され得る。ＺＦＮは、Ｆｏｋｌ制限酵素のヌクレアーゼドメインと融合したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。ジンクフィンガードメインは、合理的または実験的な手段によって長さが〜１８塩基対の所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質が得られるように再設計され得る。この操作されたタンパク質ドメインをＦｏｋｌヌクレアーゼと融合させることによって、ゲノムレベルの特異性でＤＮＡ切断が生じるように狙いを定めることが可能である。ＺＦＮは、広範な真核生物において遺伝子の付加、除去、及び置換が生じるように狙いを定めるために広く使用されている（Ｄｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３，５９７８に概説されている）。同様に、ゲノムＤＮＡ中の特定の部位を切断するようにＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を生成させることができる。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮは、Ｆｏｋｌヌクレアーゼドメインと融合した操作された部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む（Ｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．２３：９３−９に概説されている）。しかしながら、この場合、ＤＮＡ結合ドメインは、直列に配置された複数のＴＡＬ−エフェクタードメインを含み、これらのＴＡＬ−エフェクタードメインはそれぞれ、単一のＤＮＡ塩基対を特異的に認識する。コンパクトＴＡＬＥＮは、二量体化が必要とならない代替のエンドヌクレアーゼ構造を有する（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．４：１７６２）。コンパクトＴＡＬＥＮは、Ｉ−ＴｅｖＩホーミングエンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインと融合した操作された部位特異的ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。Ｆｏｋｌとは異なり、Ｉ−ＴｅｖＩは、二本鎖ＤＮＡ切断を生成する上で二量体化する必要がないため、コンパクトＴＡＬＥＮは、モノマーとして機能する。
【０２６６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系に基づく操作されたエンドヌクレアーゼもまた、当該技術分野で知られている（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１−２３０８、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０：９５７−６３）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集技術は、短いガイドＲＮＡまたは二本鎖ｃｒＲＮＡ／ＴｒａｃｒＲＮＡによってＤＮＡ標的化特異性及び切断活性をプログラミングすることが可能なエンドヌクレアーゼタンパク質から構成される。ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、（１）カスパーゼエフェクターヌクレアーゼ（典型的には、微生物Ｃａｓ９）、及び（２）ゲノム中の目的位置へとヌクレアーゼを指向化するヌクレオチド数１８〜２０の標的化配列を含む短い「ガイドＲＮＡ」またはＲＮＡ二本鎖、という２つの構成要素を含む。異なる標的化配列をそれぞれが有する複数のガイドＲＮＡを同じ細胞に発現させることによって、ゲノム中の複数の部位に同時にＤＮＡ切断が生じるように狙いを定めることが可能である（マルチプレックスゲノム編集）。
ＣＲＩＳＰＲ系には２つのクラスが存在することが当該技術分野では知られており（Ａｄｌｉ（２０１８）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９：１９１１）、それぞれのクラスは、複数のＣＲＩＳＰＲ型を含む。クラス１は、古細菌に一般に見られるＩ型及びＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ系を含む。クラスＩＩは、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、及びＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ系を含む。最も広く使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系であるが、研究者は数々のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をゲノム編集という本来とは別の目的で使用している。この数年の間に１０を超える異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質がリモデリングされている（Ａｄｌｉ（２０１８）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９：１９１１）。こうしたものの中でも、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種に由来するＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）タンパク質（ＡｓＣｐｆ１）、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍに由来するＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）タンパク質（ＬｂＣｐｆ１）などは、特に興味深いものである。
【０２６７】
ホーミングエンドヌクレアーゼは、植物及び真菌のゲノムに一般に見られる１５〜４０塩基対の切断部位を認識する天然起源のヌクレアーゼの一群である。ホーミングエンドヌクレアーゼは、寄生虫ＤＮＡエレメント（群１の自己スプライシング型のイントロン及びインテインなど）と関連することが多い。ホーミングエンドヌクレアーゼは、天然では、染色体に二本鎖切断を生じさせ、これによって細胞のＤＮＡ修復装置を動員することによって宿主ゲノム中の特定の位置に対する相同組換えまたは遺伝子挿入を促進する（Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６），Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９−９５）。特定のアミノ酸置換を行えば、ホーミングヌクレアーゼのＤＮＡ切断特異性がリプログラミングされ得る（Ｎｉｙｏｎｚｉｍａ（２０１７），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．３０（７）：５０３−５２２）。メガヌクレアーゼ（ＭＮ）は、細菌のホーミングエンドヌクレアーゼに由来する、固有のヌクレアーゼ活性を有するモノマータンパク質であり、特有の標的部位を標的とするように操作される（Ｇｅｒｓｂａｃｈ（２０１６），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２４：４３０−４４６）。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼは、操作されたＩ−ＣｒｅＩホーミングエンドヌクレアーゼである。他の実施形態では、メガヌクレアーゼは、操作されたＩ−ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼである。
【０２６８】
言及した４つの主要な遺伝子編集技術に加えて、メガヌクレアーゼ、ＺＦＮ、及びＴＡＬＥＮの融合体を含むキメラタンパク質が操作されることで、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの結合親和性、ならびにメガヌクレアーゼの切断特異性を利用する新規のモノマー酵素が得られている（Ｇｅｒｓｂａｃｈ（２０１６），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２４：４３０−４４６）。例えば、メガＴＡＬは、ＴＡＬＥＮ由来のＤＮＡ結合ドメインの調整容易性とメガヌクレアーゼの高い切断効率性とを兼ね備えた単一のキメラタンパク質である。
【０２６９】
遺伝子編集手法を実施するために、ヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の場合はｇＲＮＡが目的細胞に効率的に送達されなくてはならない。当該技術分野では、送達方法（物理的方法、化学的方法、及びウイルスを使用する方法など）も知られている（Ｍａｌｉ（２０１３）．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３−８．）。場合によっては、物理的な送達方法は、限定されないが、電気穿孔法、マイクロインジェクション法、または加速粒子を利用する方法から選択され得る。一方で、化学的な送達方法では、複合体形成分子（リン酸カルシウム、脂質、またはタンパク質など）を使用する必要がある。いくつかの実施形態では、ウイルスによる送達方法は、ウイルス（限定されないが、アデノウイルス、レンチウイルス、及びレトロウイルスなど）を使用する遺伝子編集手法に適用される。
【０２７０】
本発明は、ＴＦＰをコードする核酸分子を含むベクターをさらに提供する。一態様では、ＴＦＰベクターを使用して細胞（例えば、Ｔ細胞）への直接的な形質導入が行われ得る。一態様では、ベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、例えば、こうしたベクターには、限定されないが、１つ以上のプラスミド（例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体）、レトロウイルスベクターコンストラクト、及びレンチウイルスベクターコンストラクトが含まれる。一態様では、ベクターは、哺乳類Ｔ細胞においてＴＦＰコンストラクトを発現させる能力を有する。一態様では、哺乳類Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。
【０２７１】
Ｔ細胞の供給源
増殖及び遺伝子改変に先立って、対象からＴ細胞の供給源が得られる。「対象」という用語は、免疫応答を誘発し得る生体（例えば、哺乳類）を含むことが意図される。対象の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞は、多くの供給源から得ることができ、こうした供給源には、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍が含まれる。本発明のある特定の態様では、当該技術分野で利用可能な任意の数のＴ細胞株が使用され得る。本発明のある特定の態様では、当業者に知られる任意の数の手法（Ｆｉｃｏｌｌ（商標）による分離など）を使用して対象から収集された血液単位からＴ細胞を得ることができる。好ましい一態様では、アフェレーシスによって個体の循環血液に由来する細胞が得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、リンパ球（Ｔ細胞を含む）、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含む。一態様では、アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄によって血漿画分が除去され、その後の処理ステップに適した緩衝液または培地に細胞が含められ得る。本発明の一態様では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の態様では、洗浄溶液はカルシウムを含まず、かつマグネシウムを含み得ないか、またはすべてではないにせよ二価陽イオンの多くを含み得ない。最初の活性化ステップでは、カルシウムを存在させないことが活性化の増強に繋がり得る。当業者なら容易に理解するであろうが、洗浄ステップは、製造者の説明に従って、当業者に知られる方法（半自動化「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を使用することによるものなど）によって達成され得る。洗浄後、さまざまな生体適合性緩衝液（例えば、ＣａもＭｇも含まないＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅＡ、または緩衝剤含有もしくは緩衝剤非含有の他の生理食塩水など）に細胞が再浮遊され得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去することができ、細胞が培養培地に直接的に再浮遊される。
【０２７２】
一態様では、Ｔ細胞は、赤血球の溶解及び単球の枯渇によって末梢血リンパ球から単離される（例えば、ＰＥＲＣＯＬＬＴＭグラジエントを介する遠心分離法、または対向流遠心溶出法によって行われる）。正の選択手法または負の選択手法によってＴ細胞の特定の亜集団（ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ２８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞など）がさらに単離され得る。例えば、一態様では、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）結合型ビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔなど）と共に、所望のＴ細胞の正の選択に十分な時間インキュベートすることによって単離される。一態様では、時間は、約３０分である。別の態様では、時間は、３０分〜３６時間以上の範囲であり、そこに介在するすべての整数値を含む。別の態様では、時間は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、または少なくとも６時間である。さらに別の好ましい態様では、時間は、１０〜２４時間である。一態様では、インキュベート時間は、２４時間である。他の細胞型と比較してＴ細胞の存在数が少ない任意の状況ではインキュベート時間を長くしてＴ細胞が単離され得る。こうした状況は、腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する場合、または免疫が損なわれた個体からＴＩＬを単離する場合などである。さらに、インキュベート時間を長くすると、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率が向上し得る。したがって、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を単に短縮もしくは延長し、及び／またはＴ細胞に対するビーズの比を上昇もしくは低下させることによって（このことについては、本明細書にさらに記載される）、培養開始時点またはプロセス中の他の時点で、Ｔ細胞の亜集団を得るための選択、またはＴ細胞の亜集団に対する選択が優先的に行われ得る。さらに、ビーズ上または他の表面上の抗ＣＤ３抗体及び／または抗ＣＤ２８抗体の比を上昇または低下させることによって、培養開始時点または他の所望の時点で、Ｔ細胞の亜集団を得るための選択、またはＴ細胞の亜集団に対する選択が優先的に行われ得る。本発明との関連では複数回の選択も行われ得ることを当業者なら認識するであろう。ある特定の態様では、選択手順を実施し、「非選択」細胞を活性化プロセス及び増殖プロセスにおいて使用することが望ましくあり得る。「非選択」細胞をさらなる複数回の選択に供すこともできる。
【０２７３】
負の選択によるＴ細胞集団の濃縮は、負の選択を受ける細胞に特有の表面マーカーに指向化された抗体の組み合わせを用いて達成され得る。１つの方法は、負の選択を受ける細胞上に存在する細胞表面マーカーに指向化されたモノクローナル抗体のカクテルを使用する負の磁気免疫粘着またはフローサイトメトリーを介して細胞を選別及び／または選択するものである。例えば、負の選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４に対する抗体、ＣＤ２０に対する抗体、ＣＤ１１ｂに対する抗体、ＣＤ１６に対する抗体、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体、及びＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の態様では、制御性Ｔ細胞（典型的には、発現がＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及びＦｏｘＰ３＋である）の濃縮または正の選択を行うことが望ましくあり得る。あるいは、ある特定の態様では、抗Ｃ２５結合型ビーズまたは他の同様の選択方法によって制御性Ｔ細胞の枯渇が行われる。
【０２７４】
一実施形態では、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢ、及びパーフォリンのうちの１つ以上、または他の適切な分子（例えば、他のサイトカイン）を発現するＴ細胞集団が選択され得る。細胞発現をスクリーニングするための方法は、例えば、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載の方法によって決定され得る。
【０２７５】
正の選択または負の選択によって所望の細胞集団を単離するために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度が変更され得る。ある特定の態様では、ビーズと細胞とが一緒に混合される体積を大幅に減らして（例えば、細胞の濃度を上昇させて）細胞とビーズとが確実に最大限接触するようにすることが望ましくあり得る。例えば、一態様では、２０億個細胞／ｍＬの濃度が使用される。一態様では、１０億個細胞／ｍＬの濃度が使用される。別の態様では、１億超個細胞／ｍＬが使用される。別の態様では、１千万個細胞／ｍＬ、１千５百万個細胞／ｍＬ、２千万個細胞／ｍＬ、２千５百万個細胞／ｍＬ、３千万個細胞／ｍＬ、３千５百万個細胞／ｍＬ、４千万個細胞／ｍＬ、４千５百万個細胞／ｍＬ、または５千万個細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。さらなる一態様では、７千５百万個細胞／ｍＬ、８千万個細胞／ｍＬ、８千５百万個細胞／ｍＬ、９千万個細胞／ｍＬ、９千５百万個細胞／ｍＬ、または１億個細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。別の態様では、１億２千５百万個細胞／ｍＬまたは１億５千万個細胞／ｍＬの濃度が使用され得る。濃度を高めると、細胞収量、細胞活性化、及び細胞増殖が増大し得る。さらに、細胞濃度を高めることで、目的の標的抗原の発現が弱くあり得る細胞（ＣＤ２８陰性Ｔ細胞など）の捕捉効率を向上させることが可能になるか、または腫瘍細胞が多く存在する試料（例えば、白血病血液、腫瘍組織など）に由来する細胞の捕捉効率を向上させることが可能になる。そのような細胞集団は、治療的な価値を有し得、取得することが望ましいと想定される。例えば、細胞濃度を高めることで、ＣＤ２８の発現が通常は弱いＣＤ８＋Ｔ細胞の選択効率を向上させることが可能になる。
【０２７６】
関連する態様では、細胞濃度を下げることが望ましくあり得る。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）との混合物を大幅に希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用が最小化される。これによって、粒子に結合すべき所望の抗原の発現量が多い細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ２８をより高いレベルで発現しており、希釈濃度ではＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して高い効率で捕捉される。一態様では、使用される細胞濃度は５×１０６個／ｍＬである。他の態様では、使用される濃度は、約１×１０５個／ｍＬ〜１×１０６個／ｍＬ、及びこの範囲に介在する任意の整数値であり得る。他の態様では、細胞は、ローテーター上でさまざまな速度でさまざまな時間、２〜１０℃または室温でインキュベートされ得る。
【０２７７】
刺激のためのＴ細胞もまた、洗浄ステップ後に凍結され得る。理論によって拘束されることは望まないが、凍結及びその後の解凍ステップを行うことで、細胞集団における顆粒球及びある程度の単球が除去されることによって均一性が向上した産物が得られる。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップの後、凍結用溶液に細胞が再浮遊され得る。当該技術分野では多くの凍結用溶液及びパラメーターが知られており、こうした状況において有用であろうが、１つの方法は、ＤＭＳＯ含有率２０％及びヒト血清アルブミン含有率８％のＰＢＳ、またはデキストラン４０含有率１０％及びデキストロース含有率５％、ヒト血清アルブミン含有率２０％、ならびにＤＭＳＯ含有率７．５％の培養培地、もしくはＰｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ含有率３１．２５％、５％デキストロース含有率３１．２５％、ＮａＣｌ含有率０．４５％、デキストラン４０含有率１０％及びデキストロース含有率５％、ヒト血清アルブミン含有率２０％、ならびにＤＭＳＯ含有率７．５％の培地、あるいは他の適切な細胞凍結媒体（例えば、Ｈｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅＡを含むもの）を使用し、次に、細胞を１／分の速度で−８０℃にして凍結し、液体窒素保管タンクの気相中で保管するというものである。−２０℃または液体窒素中で制御を行わずに急速凍結するものに加えて、他の制御凍結方法も使用され得る。ある特定の態様では、凍結保存された細胞は、解凍され、本明細書に記載のように洗浄され、室温での１時間の休息が与えられた後、本発明の方法を使用して活性化される。
【０２７８】
本発明との関連では、本明細書に記載のように増殖させる細胞が必要となり得る時点よりも前の時点に対象から血液試料またはアフェレーシス産物の収集を行うことも企図される。したがって、増殖すべき細胞の供給源を必要な任意の時点で収集することができ、所望の細胞（Ｔ細胞など）が単離され、Ｔ細胞療法から恩恵を受けると想定される任意の数の疾患または状態（本明細書に記載のものなど）に対するＴ細胞療法において後に使用するために凍結される。一態様では、血液試料またはアフェレーシス産物は、総体的に健康な対象から採取される。ある特定の態様では、血液試料またはアフェレーシス産物は、疾患を発症するリスクがあるが、今のところは疾患を発症していない総体的に健康な対象から採取され、目的細胞が単離され、後に使用するために凍結される。ある特定の態様では、Ｔ細胞は、増殖され、凍結され、後の時点で使用され得る。ある特定の態様では、試料は、本明細書に記載の特定の疾患の診断後すぐに、いずれかの治療を行う前に患者から収集される。別の態様では、細胞は、任意の数の適切な治療方法を行う前に、対象から得られた血液試料またはアフェレーシス産物から単離され、こうした治療方法には、限定されないが、薬剤（ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤など）、化学療法、放射線、免疫抑制薬剤（シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びＦＫ５０６など）、抗体、または他の免疫除去剤（アレムツズマブ、抗ＣＤ３抗体、ｃｙｔｏｘａｎ、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、及び照射など）を用いて治療するものが含まれる。
【０２７９】
本発明の別の態様では、Ｔ細胞は、対象の機能性Ｔ細胞が残る治療が行われた直後に患者から取得される。これに関しては、ある特定のがん治療、具体的には免疫系が損なわれる薬物での治療が行われてからすぐ（通常ならそうした治療から患者が回復すると想定される期間中）に、エクスビボでの増殖能力について取得Ｔ細胞の品質が最適化または改善され得ることが観測されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用するエクスビボでの操作の後に、こうした細胞は、生着及びインビボでの増殖が増進する上で好ましい状態とされ得る。したがって、本発明との関連では、この回復期の間に血液細胞（Ｔ細胞、樹状細胞、または他の造血系細胞を含む）を収集することが企図される。さらに、ある特定の態様では、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦを用いる動員）及びコンディショニングレジメンを使用することで対象においてある状態を創出することができ、こうした状態では、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、及び／または増殖が生じることが好ましく、特に、治療後の規定時間範囲中にこうしたことが生じることが好ましい。細胞型の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び他の免疫系細胞が挙げられる。
【０２８０】
Ｔ細胞の活性化及び増殖
Ｔ細胞の活性化及び増殖は、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同６，５３４，０５５号、同６，９０５，６８０号、同６，６９２，９６４号、同５，８５８，３５８号、同６，８８７，４６６号、同６，９０５，６８１号、同７，１４４，５７５号、同７，０６７，３１８号、同７，１７２，８６９号、同７，２３２，５６６号、同７，１７５，８４３号、同５，８８３，２２３号、同６，９０５，８７４号、同６，７９７，５１４号、同６，８６７，０４１号、及び同７，５７２，６３１号に記載の方法を使用して行われ得る。
【０２８１】
一般に、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤と、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドと、が付加された表面と接触させることによって増殖し得る。具体的には、本明細書に記載のようにＴ細胞集団を刺激することができ、こうした刺激は、表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片または抗ＣＤ２抗体と接触させるか、あるいはカルシウムイオノフォアと共にタンパク質キナーゼＣアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）と接触させるなどすることによって行われる。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激については、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖刺激に適した条件の下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するには、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体が使用される。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、こうした抗ＣＤ２８抗体は、当該技術分野で一般に知られる他の方法と同様に使用され得る（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８、Ｈａａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９、Ｇａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）。
【０２８２】
刺激に曝露された回数が異なるＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシス末梢血単核球産物は、細胞傷害性または抑制性のＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）と比較してヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を多く含む。ＣＤ３受容体及びＣＤ２８受容体を刺激することによってＴ細胞をエクスビボで増殖させると、約８〜９日目に至る前には主にＴＨ細胞からなるＴ細胞集団が得られる一方で、約８〜９日目以後はＴＣ細胞集団の含量が日増しに高まったＴ細胞集団が得られる。したがって、治療の目的によっては、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されているのであれば、このサブセットの増殖を大幅に進めることが有利であり得る。
【０２８３】
さらに、ＣＤ４マーカー及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーもまた、細胞増殖プロセスの過程で、ごく一部を除いて再現性良く顕著に異なる。したがって、そのような再現性の良さによって、特定の目的に合わせて活性化Ｔ細胞産物を調製することが可能になる。
【０２８４】
抗ＴＡＡ  ＴＦＰが構築されると、さまざまなアッセイを使用して当該分子の活性を評価することができ、こうした活性は、限定されないが、抗原刺激後にＴ細胞を増殖させ、再刺激がなくてもＴ細胞の増殖を維持し、適切なインビトロモデル及び動物モデルにおいて抗がん活性を生じさせる能力などである。抗ＴＡＡ  ＴＦＰの作用を評価するためのアッセイについては、以下にさらに詳述される。
【０２８５】
初代Ｔ細胞におけるＴＦＰ発現のウエスタンブロット分析を行うことで、モノマー及びダイマーの存在を検出することができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照のこと）。非常に簡潔に記載すると、ＴＦＰを発現するＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との１：１混合物）をインビトロで１０日超増殖させた後、溶解させ、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥが実施される。ＴＦＰは、ＴＣＲ鎖に対する抗体を使用してウエスタンブロットによって検出される。同じＴ細胞サブセットを非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用することで共有結合ダイマーの形成を評価することが可能になる。
【０２８６】
抗原刺激後のＴＦＰ＋Ｔ細胞のインビトロでの増殖は、フローサイトメトリーによって測定され得る。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との混合物が、アルファＣＤ３／アルファＣＤ２８及びＡＰＣで刺激された後、プロモーターの制御下でＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを用いる形質導入に供されて分析される。プロモーターの例としては、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１アルファ、ユビキチンＣ、またはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）のプロモーターが挙げられる。培養６日目にＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおけるＧＦＰ蛍光がフローサイトメトリーによって評価される（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照のこと）。あるいは、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との混合物が、アルファＣＤ３／アルファＣＤ２８でコートされた磁気ビーズで０日目に刺激され、２Ａリボソームスキッピング配列の使用によってｅＧＦＰと共にＴＦＰを発現するバイシストロン性レンチウイルスベクターを使用するＴＦＰの形質導入に１日目に供される。洗浄後、ＴＡＡ＋細胞（例えば、Ｋ５６２細胞）、野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野生型）、または抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の存在下でｈＣＤ３２及び４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８）、のいずれかを用いて培養物の再刺激が行われる。培養物には外来性のＩＬ−２が１日おきに１００ＩＵ／ｍＬで添加される。ビーズベースの計数を行ってフローサイトメトリーによってＧＦＰ＋Ｔ細胞の数が数えられる。（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照のこと）。
【０２８７】
再刺激がなくてもＴＦＰ＋Ｔ細胞の増殖が維持されるかということも測定され得る（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照のこと）。簡潔に記載すると、アルファＣＤ３／アルファＣＤ２８でコートされた磁気ビーズを用いた刺激が０日目に行われ、１日目に指定のＴＦＰでの形質導入が行われ、その後、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩＩ粒子計測器を使用して培養８日目に平均Ｔ細胞体積（ｆｌ）が測定される。
【０２８８】
動物モデルを使用してＴＦＰ−Ｔ活性も測定され得る。例えば、異種移植モデルにおいてヒトＴＡＡ特異的ＴＦＰ＋Ｔ細胞を使用して免疫不全マウスにおけるがん治療が行われる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照のこと）。非常に簡潔に記載すると、がんが確立された後、処理群にマウスが無作為化される。異なる数の操作されたＴ細胞が、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ−／−担癌マウスへと１：１の比で同時注射される。Ｔ細胞の注射後、マウスに由来する脾臓ＤＮＡにおける各ベクターのコピー数が、さまざまな回数で評価される。１週間に１回の間隔で動物のがんが評価される。アルファ−ＴＡＡ−ゼータＴＦＰ＋Ｔ細胞またはモック形質導入Ｔ細胞が注射されたマウスにおいて末梢血ＴＡＡ＋癌細胞の数が測定される。ログランク検定を使用して群ごとの生存曲線が比較される。さらに、Ｔ細胞注射から４週間後に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ−／−マウスにおける末梢血中のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数も分析され得る。マウスには、がん細胞が注射され、ｅＧＦＰに連結されたＴＦＰをコードするバイシストロン性レンチウイルスベクターによってＴＦＰを発現するように操作されたＴ細胞が３週間後に注射される。Ｔ細胞は、注射前にモック形質導入細胞と混合されることによってインプットＧＦＰ＋Ｔ細胞が４５〜５０％となるように正規化され、フローサイトメトリーによって確認される。１週間に１回の間隔で動物のがんが評価される。ログランク検定を使用してＴＦＰ＋Ｔ細胞群ごとの生存曲線が比較される。
【０２８９】
用量依存的ＴＦＰ治療応答が評価され得る（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照のこと）。例えば、ＴＦＰ  Ｔ細胞、等しい数のモック形質導入Ｔ細胞、またはＴ細胞なしの注射を２１日目に行ったマウスにおいて、がんの確立から３５〜７０日後に末梢血が取得される。末梢血ＴＡＡ＋癌細胞の数を決定するために各群から無作為に選んだマウスの採血が行われた後、３５日目及び４９日目にマウスが屠殺される。残った動物の評価は５７日目及び７０日目に行われる。
【０２９０】
細胞増殖及びサイトカイン産生の評価については、以前に報告されており、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）に記載されている。簡潔に記載すると、ＴＦＰ介在性の増殖の評価は、洗浄したＴ細胞を、ＴＡＡ発現細胞またはＣＤ３２及びＣＤ１３７を発現する細胞（ＫＴ３２−ＢＢＬ）とＴ細胞：ＴＡＡ発現細胞の最終比が２：１となるように混合することによってマイクロタイタープレートにおいて実施される。ＴＡＡ発現細胞は、使用前にガンマ線照射される。ＫＴ３２−ＢＢＬ細胞を含む培養物は、抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）モノクローナル抗体及び抗ＣＤ２８（クローン９．３）モノクローナル抗体が添加されることで、Ｔ細胞増殖刺激に対する陽性対象として役立てられ、これは、これらのシグナルによってエクスビボでのＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が長期的に支援されることによるものである。ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）蛍光ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びフローサイトメトリーを製造者の説明に沿って使用して培養物中のＴ細胞数が数えられる。ｅＧＦＰ−２Ａが連結されたＴＦＰを発現させるレンチウイルスベクターで操作されたＴ細胞を使用することで、ＧＦＰ発現によってＴＦＰ＋Ｔ細胞が同定される。ＧＦＰを発現しないＴＦＰ＋Ｔ細胞については、ビオチン化組換えＴＡＡタンパク質及び二次アビジン−ＰＥ結合体を用いてＴＦＰ＋Ｔ細胞が検出される。特異的モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＴ細胞上のＣＤ４＋発現及びＣＤ８＋発現も同時に検出される。再刺激から２４時間後に収集した上清に対するサイトカイン測定が、製造者の説明に従ってヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカインサイトメトリービーズアレイキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施される。蛍光は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して評価され、データは、製造者の説明に従って解析される。
【０２９１】
細胞傷害性は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって評価され得る（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照のこと）。簡潔に記載すると、頻繁に攪拌しながら３７℃で２時間、５１Ｃｒ（ＮａＣｒＯ４としてのもの、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）が標的細胞に組み込まれ、完全ＲＰＭＩ培地で標的細胞が２回洗浄された後、マイクロタイタープレートに蒔かれる。完全ＲＰＭＩを含むウェル中でエフェクターＴ細胞が標的細胞とさまざまなエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で混合される。培地のみを含むウェル（自発的放出（ＳＲ））、またはｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００界面活性剤の１％溶液を含むウェル（全放出（ＴＲ））も追加調製される。３７℃での４時間のインキュベート後、各ウェルから上清が収集される。次に、放出された５１Ｃｒが、ガンマ粒子計測器（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）を使用して測定される。各条件は、少なくとも３回反復実施され、溶解％＝（ＥＲ−ＳＲ）／（ＴＲ−ＳＲ）という式（式中、ＥＲは、各実験条件の平均５１Ｃｒ放出を表す）を使用して溶解パーセントが計算される。
【０２９２】
画像化技術を使用して担腫瘍動物モデルにおけるＴＦＰの特異的な輸送及び増加が評価され得る。そのようなアッセイは報告されており、例えば、Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２２：１５７５−１５８６（２０１１）に記載されている。簡潔に記載すると、がん細胞がＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−（ＮＳＧ）マウスにＩＶ注射され、その７日後に、ＴＦＰコンストラクトを用いた電気穿孔から４時間後のＴ細胞がマウスにＩＶ注射される。このＴ細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現するようにレンチウイルスコンストラクトが安定的にトランスフェクションされたものであり、生物発光についてマウスの画像化が行われる。あるいは、がん異種移植モデルにおけるＴＦＰ＋Ｔ細胞の単回注射による治療の有効性及び特異性が下記のように測定され得る：ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するように形質導入されたがん細胞がＮＳＧマウスに注射された後、その７日後に、ＴＡＡ  ＴＦＰ７を用いた電気穿孔が行われたＴ細胞が尾静脈に単回注射される。注射後のさまざまな時点で動物の画像化が行われる。例えば、５日目（処理の２日前）及び８日目（ＴＦＰ＋ＰＢＬから２４時間後）に、代表的なマウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性癌の光子密度ヒートマップが作成され得る。
【０２９３】
本明細書の実施例セクションに記載のものならびに当該技術分野で知られるものを含めて、他のアッセイもまた、本開示の抗ＴＡＡ  ＴＦＰコンストラクトの評価に使用され得る。
【０２９４】
治療への応用
ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、及びＭＳＬＮと関連する疾患及び／または障害
一態様では、本開示は、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮの発現と関連する疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、本開示は、腫瘍の一部がＭＵＣ１６陰性、ＩＬ１３Ｒα２陰性、またはＭＳＬＮ陰性であり、腫瘍の一部がＭＵＣ１６陽性、ＩＬ１３Ｒα２陽性、またはＭＳＬＮ陽性である疾患を治療するための方法を提供する。例えば、本開示のＴＦＰは、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮの発現上昇と関連する疾患の治療を受けている対象の治療に有用であり、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮのレベル上昇の治療を受けている対象は、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮのレベル上昇と関連する疾患を患っている。
【０２９５】
一態様では、本開示は、哺乳類Ｔ細胞における発現のためのプロモーターに機能可能なように連結された抗ＴＡＡ  ＴＦＰを含むベクターに関する。一態様では、本開示は、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮを発現する腫瘍の治療において使用するための、それぞれＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現組換えＴ細胞、ＩＬ１３Ｒα２  ＴＦＰ発現組換えＴ細胞、またはＭＳＬＮ  ＴＦＰ発現組換えＴ細胞を提供し、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現組換えＴ細胞、ＩＬ１３Ｒα２  ＴＦＰ発現組換えＴ細胞、またはＭＳＬＮ  ＴＦＰ発現組換えＴ細胞は、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ−Ｔ、ＩＬ１３Ｒα２  ＴＦＰ−Ｔ、またはＭＳＬＮ  ＴＦＰ−Ｔと呼ばれる。一態様では、本開示のＭＵＣ１６  ＴＦＰ−Ｔ、ＩＬ１３Ｒα２  ＴＦＰ−Ｔ、またはＭＳＬＮ  ＴＦＰ−Ｔは、その表面に発現した少なくとも１つの本発明のＭＵＣ１６  ＴＦＰ、ＩＬ１３Ｒα２  ＴＦＰ、またはＭＳＬＮ  ＴＦＰと腫瘍細胞を接触させる能力を有し、その結果、ＴＦＰ−Ｔは、腫瘍細胞を標的とし、腫瘍の増殖が抑制される。
【０２９６】
一態様では、本開示は、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に関し、この方法は、本開示の抗ＭＵＣ１６  ＴＦＰ  Ｔ細胞、抗ＩＬ１３Ｒα２  ＴＦＰ  Ｔ細胞、または抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰ  Ｔ細胞と腫瘍細胞を接触させることを含み、その結果、抗原（例えば、がん細胞の表面上に存在するＭＵＣ１６抗原、ＩＬ１３Ｒα２抗原、またはＭＳＬＮ抗原）に応答してＴＦＰ−Ｔが活性化され、がん細胞を標的とし、腫瘍の増殖が抑制される。
【０２９７】
一態様では、本開示は、対象におけるがんを治療する方法に関する。この方法は、本開示の抗ＴＡＡ  ＴＦＰ  Ｔ細胞を対象に投与することを含み、その結果、がんが対象において治療される。本発明の抗ＴＡＡ  ＴＦＰ  Ｔ細胞によって治療することが可能ながんの一例は、対応するＴＡＡの発現と関連する癌である。一態様では、がんは、中皮腫である。一態様では、がんは、膵癌である。一態様では、がんは、卵巣癌である。一態様では、がんは、胃癌である。一態様では、がんは、肺癌である。一態様では、がんは、子宮内膜癌である。いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ  ＴＦＰ治療は、１つ以上の追加の治療と組み合わせて行われ得る。
【０２９８】
本開示は、ＴＦＰを発現するようにＴ細胞が遺伝子改変され、ＴＦＰ発現Ｔ細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される型の細胞療法を含む。注入された細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を死滅させることが可能である。抗体治療とは異なり、ＴＦＰ発現Ｔ細胞は、インビボで複製することが可能であり、結果的に、腫瘍制御の維持に繋がり得る長期的な存続性が得られる。さまざまな態様において、Ｔ細胞は、患者またはその子孫に投与され、患者へのＴ細胞の投与後、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１３ヶ月間、少なくとも１４ヶ月間、少なくとも１５ヶ月間、少なくとも１６ヶ月間、少なくとも１７ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも１９ヶ月間、少なくとも２０ヶ月間、少なくとも２１ヶ月間、少なくとも２２ヶ月間、少なくとも２３ヶ月間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、または少なくとも５年間、患者において存続する。
【０２９９】
本開示は、ＴＦＰを一過性に発現するようにＴ細胞が改変され（例えば、インビトロで転写されたＲＮＡによって改変される）、ＴＦＰ発現Ｔ細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される型の細胞療法も含む。注入された細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を死滅させることが可能である。したがって、さまざまな態様において、Ｔ細胞は、患者に投与され、患者へのＴ細胞の投与後、１ヶ月未満の期間（例えば、３週間、２週間、または１週間）存在する。
【０３００】
いずれの特定の理論によっても拘束されることは望まないが、ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動的または受動的な免疫応答であり得るか、あるいは直接的または間接的な免疫応答に起因するものであり得る。一態様では、ＴＦＰ形質導入Ｔ細胞は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）（例えば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮ）を発現するヒト癌細胞に応答して生じる特定の炎症促進性サイトカインの分泌及び強力な細胞溶解活性を示し、可溶性ＴＡＡによる阻害に抵抗し、バイスタンダー効果による死滅を媒介し、及び／または確立されたヒト腫瘍の退縮を媒介する。例えば、ＴＡＡ発現腫瘍の不均一領域内の無抗原腫瘍細胞は、隣接する抗原陽性癌細胞に対して既に反応しているＴＡＡ再指向化Ｔ細胞による間接的な破壊に感受性であり得る。
【０３０１】
一態様では、本開示のヒトＴＦＰ改変Ｔ細胞は、エクスビボでの免疫化及び／または哺乳類におけるインビボでの治療のための型のワクチンであり得る。一態様では、哺乳類は、ヒトである。
【０３０２】
エクスビボでの免疫化に関しては、細胞を哺乳類に投与する前に、下記のもののうちの少なくとも１つがインビトロで行われる：ｉ）細胞を増殖させること、ｉｉ）ＴＦＰをコードする核酸を細胞に導入すること、またはｉｉｉ）細胞を凍結保存すること。
【０３０３】
エクスビボでの手順は、当該技術分野でよく知られており、より完全に以下に論じられる。簡潔に記載すると、細胞は、哺乳類（例えば、ヒト）から単離され、本明細書に開示のＴＦＰを発現させるベクターを用いて遺伝子改変される（すなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクションされる）。ＴＦＰ改変細胞は、哺乳類レシピエントに投与されることで治療効果を与え得る。哺乳類レシピエントは、ヒトであり得、ＴＦＰ改変細胞は、レシピエントに対して自家のものであり得る。あるいは、細胞は、レシピエントに対して同種異系、同系、または異種のものであり得る。
【０３０４】
造血幹細胞及び前駆細胞をエクスビボで増殖させるための手順は、米国特許第５，１９９，９４２号（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されており、本発明の細胞に適用され得る。適切な方法は当該技術分野で他にも知られており、したがって、本発明は、細胞をエクスビボで増殖させる特定の方法のいずれにも限定されない。簡潔に記載すると、エクスビボでのＴ細胞の培養及び増殖は、（１）収集末梢血または骨髄外植片から哺乳類由来のＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞を収集すること、及び（２）そのような細胞をエクスビボで増殖させること、を含む。米国特許第５，１９９，９４２号に記載の細胞増殖因子に加えて、他の因子（ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、及びｃ−ｋｉｔリガンドなど）も細胞の培養及び増殖に使用され得る。
【０３０５】
エクスビボでの免疫化に関して細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本発明は、インビボでの免疫化を行うことで、患者の抗原に対して指向化された免疫応答を誘発するための組成物及び方法も提供する。
【０３０６】
一般に、本明細書に記載ように活性化及び増殖させた細胞は、免疫が損なわれている個体で生じる疾患の治療及び予防に利用され得る。具体的には、本発明のＴＦＰ改変Ｔ細胞は、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮの発現と関連する疾患、障害、及び状態の治療において使用される。ある特定の態様では、本発明の細胞は、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮの発現と関連する疾患、障害、及び状態を発症するリスクを有する患者の治療において使用される。したがって、本発明は、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮの発現と関連する疾患、障害、及び状態を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に対して本開示のＴＦＰ改変Ｔ細胞を治療的に有効な量で投与することを含む。
【０３０７】
一態様では、本開示のＴＦＰ−Ｔ細胞は、増殖性疾患（がんもしくは悪性腫瘍または前がん性状態など）の治療に使用され得る。一態様では、がんは、中皮腫である。一態様では、がんは、膵癌である。一態様では、がんは、卵巣癌である。一態様では、がんは、胃癌である。一態様では、がんは、肺癌である。一態様では、がんは、乳癌である。一態様では、がんは、子宮内膜癌である。ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮの発現と関連する別の疾患には、限定されないが、例えば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮを発現する非定型的及び／または非古典的な癌、悪性腫瘍、前がん性状態、あるいは増殖性疾患が含まれる。ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、またはＭＳＬＮの発現と関連する非がん関連徴候には、限定されないが、例えば、自己免疫疾患（例えば、エリテマトーデス）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）、炎症性腸疾患、肝硬変、心不全、腹膜感染症、ならびに腹部手術及び移植が含まれる。
【０３０８】
本開示のＴＦＰ改変Ｔ細胞は、単独で投与されるか、あるいは希釈剤及び／または他の成分（ＩＬ−２もしくは他のサイトカイン、または細胞集団など）と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。
【０３０９】
本発明は、ＴＡＡ発現細胞集団の増殖抑制または低減のための方法も提供し、この方法は、ＴＡＡ発現細胞を含む細胞集団を、ＴＡＡ発現細胞に結合する本開示の抗ＴＡＡ  ＴＦＰ−Ｔ細胞と接触させることを含む。いくつかの態様では、本開示は、ＴＡＡを発現する癌細胞集団の増殖抑制または低減のための方法を提供し、この方法は、ＴＡＡ発現癌細胞集団を、ＴＡＡ発現細胞に結合する本開示の抗ＴＡＡ  ＴＦＰ−Ｔ細胞と接触させることを含む。一態様では、本開示は、腫瘍関連抗原を発現する癌細胞集団の増殖抑制または低減のための方法を提供し、この方法は、ＴＡＡ発現癌細胞集団を、ＴＡＡ発現細胞に結合する本開示の抗ＴＡＡ  ＴＦＰ−Ｔ細胞と接触させることを含む。ある特定の態様では、本開示の抗ＴＡＡ  ＴＦＰ−Ｔ細胞は、陰性対象と比較して、ＴＡＡ発現細胞と関連する癌を有する対象または動物モデルにおいて細胞及び／またはがん細胞の含量、数、量、またはパーセントを少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減する。一態様では、対象は、ヒトである。
【０３１０】
本開示は、ＴＡＡ発現細胞と関連する疾患（例えば、ＴＡＡを発現する癌）を予防、治療、及び／または管理するための方法も提供し、この方法は、必要な対象に対して、ＴＡＡ発現細胞に結合する本開示の抗ＴＡＡ  ＴＦＰ−Ｔ細胞を投与することを含む。一態様では、対象は、ヒトである。ＴＡＡ発現細胞と関連する障害の例としては、限定されないが、自己免疫障害（エリテマトーデスなど）、炎症性障害（アレルギー及び喘息など）、ならびにがん（膵癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、もしくは子宮内膜癌、またはＴＡＡを発現する非定型癌など）が挙げられる。
【０３１１】
本開示は、ＴＡＡ発現細胞と関連する疾患を予防、治療、及び／または管理するための方法も提供し、この方法は、必要な対象に対して、ＴＡＡ発現細胞に結合する本開示の抗ＴＡＡ  ＴＦＰ−Ｔ細胞を投与することを含む。一態様では、対象は、ヒトである。
【０３１２】
本開示は、ＴＡＡ発現細胞と関連するがんの再発を予防するための方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に対して、ＴＡＡ発現細胞に結合する本開示の抗ＴＡＡ  ＴＦＰ−Ｔ細胞を投与することを含む。一態様では、方法は、それを必要とする対象に対して、別の治療を有効量で組み合わせて、ＴＡＡ発現細胞に結合する本明細書に記載の抗ＴＡＡ  ＴＦＰ−Ｔ細胞を有効量で投与することを含む。
【０３１３】
併用療法
本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞は、他の既知の薬剤及び治療と組み合わせて使用され得る。本明細書で使用される「組み合わせて」投与されるとは、対象が障害に罹患している過程において２つ（または３つ以上）の異なる治療が対象に送達されることを意味し、例えば、障害を有すると対象が診断された後であり、かつ障害が治癒するか、もしくは除去されるか、または治療が他の理由で中止される前に、２つ以上の治療が送達されることを意味する。いくつかの実施形態では、１つの治療の送達は、第２の治療の送達が始まった時にも依然として行われており、その結果、投与に関してオーバーラップが存在する。このことは、「同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）送達」または「同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）送達」と本明細書で称されることがある。他の実施形態では、一方の治療の送達は、もう一方の治療の送達が始まる前に終了する。いずれかの場合の実施形態のいくつかでは、治療は、組み合わせて行うことで、その有効性が向上する。例えば、第１の治療を行うことなく第２の治療が行われた場合に見られると想定されるものと比較すると、第２の治療の有効性が向上し、例えば、第２の治療を減らしても同等の効果が見られるか、もしくは第２の治療が低減する症状の度合いが上昇し、または類似の状況が第１の治療で見られる。いくつかの実施形態では、送達は、一方の治療がもう一方の治療を行うことなく送達された場合に観測されると想定されるものと比較して、症状の低減度、または障害と関連する他のパラメーターの低減度が大きいものである。２つの治療の効果は、部分的に相加的であるか、完全に相加的であるか、または相加を超え得る。送達は、送達される第１の治療の効果が、第２の治療が送達されるときに依然として検出可能なものであり得る。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、「少なくとも１つの追加の治療剤」は、ＴＦＰ発現細胞を含む。複数のＴＦＰを発現するＴ細胞も提供され、これらのＴＦＰは、同じもしくは異なる標的抗原に結合するか、または同じ標的抗原上の同じもしくは異なるエピトープに結合する。第１のＴ細胞サブセットが第１のＴＦＰを発現し、第２のＴ細胞サブセットが第２のＴＦＰを発現するＴ細胞集団も提供される。
【０３１５】
本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞、及び少なくとも１つの追加の治療剤は、同じもしくは別々の組成物において同時に投与されるか、または連続的に投与され得る。連続投与については、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞は最初に投与され得、追加の薬剤は２番目に投与され得るか、または投与順序が逆にされ得る。
【０３１６】
別の態様では、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞は、手術、化学療法、放射線、免疫抑制薬剤（シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びＦＫ５０６など）、抗体、または他の免疫除去剤（アレムツズマブ、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体治療、サイトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、及び照射など）と組み合わせる治療レジメンにおいて使用され得る。本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞は、ペプチドワクチン（Ｉｚｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  １０８：９６３−９７１に記載のものなど）と組み合わせても使用され得る。別の態様では、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞は、骨髄系細胞分化の促進剤（例えば、全トランス型レチノイン酸）、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）増殖の阻害剤（例えば、ｃ−ｋｉｔ受容体の阻害剤もしくはＶＥＧＦ阻害剤）、ＭＤＳＣ機能の阻害剤（例えば、ＣＯＸ２阻害剤もしくはホスホジエステラーゼ−５阻害剤）、またはＭＤＳＣの治療的除去（例えば、化学療法レジメン（ドキソルビシン及びシクロホスファミドを用いる治療など）を用いるもの）と組み合わせても使用され得る。ＭＤＳＣの増殖を阻止し得る他の治療剤には、アミノ−ビホスホネート（ａｍｉｎｏ−ｂｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、ビホスファネート（ｂｉｐｈｏｓｐｈａｎａｔｅ）、シルデナフィル及びタダラフィル、ニトロアスピリン、ビタミンＤ３、ならびにゲムシタビンが含まれる（例えば、Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｇａｒａｊ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，（２００９）ｖ９（３）：１６２−１７４を参照のこと）が含まれる。
【０３１７】
一実施形態では、ＴＦＰ発現細胞の投与と関連する副作用を低減または改善する薬剤が対象に投与され得る。ＴＦＰ発現細胞の投与と関連する副作用には、限定されないが、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、及び血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）（マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）とも呼ばれる）が含まれる。ＣＲＳの症状には、高熱、嘔気、一過性低血圧、低酸素、及び同様のものが含まれる。したがって、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞を対象に投与すること、この投与に加えて、ＴＦＰ発現細胞を用いる治療に起因する可溶性因子のレベル上昇を管理するための薬剤を投与すること、を含み得る。一実施形態では、対象において上昇する可溶性因子は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−６、及びＩＬ８のうちの１つ以上である。したがって、この副作用を治療するために投与される薬剤は、こうした可溶性因子の１つ以上を中和する薬剤であり得る。そのような薬剤には、限定されないが、ステロイド、ＴＮＦαの阻害剤、及びＩＬ−６の阻害剤が含まれる。ＴＮＦα阻害剤の一例は、エンタネルセプト（ｅｎｔａｎｅｒｃｅｐｔ）である。ＩＬ−６阻害剤の一例は、トシリズマブ（ｔｏｃ）である。
【０３１８】
一実施形態では、ＴＦＰ発現細胞の活性を増進する薬剤が対象に投与され得る。例えば、一実施形態では、薬剤は、抑制分子を阻害する薬剤であり得る。抑制分子（例えば、プログラム細胞死１（ＰＤ１））は、いくつかの実施形態では、ＴＦＰ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低減し得る。抑制分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦＲベータが挙げられる。抑制分子の阻害（例えば、ＤＮＡレベル、ＲＮＡレベル、またはタンパク質レベルでの阻害によるもの）は、ＴＦＰ発現細胞の能力を最適化し得る。いくつかの実施形態では、阻害核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）などの阻害核酸）は、ＴＦＰ発現細胞における抑制分子の発現を阻害するために使用され得る。一実施形態では、阻害剤は、ｓｈＲＮＡである。一実施形態では、抑制分子は、ＴＦＰ発現細胞内で阻害される。こうした実施形態では、抑制分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、ＴＦＰの要素（例えば、ＴＦＰの要素のすべて）をコードする核酸に連結される。一実施形態では、抑制シグナルの阻害剤は、例えば、抑制分子に結合する抗体または抗体断片であり得る。例えば、薬剤は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、またはＣＴＬＡ４に結合する抗体または抗体断片（例えば、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０及びＭＤＸ−１０１とも称され、Ｙｅｒｖｏｙ（商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）として市販されている）、トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体であり、正式にはチシリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６）として知られる））であり得る。一実施形態では、薬剤は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体断片である。一実施形態では、薬剤は、ＬＡＧ３に結合する抗体または抗体断片である。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、レンチウイルス（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞を特異的に標的とするレンチウイルス）を介してインビボで（例えば、遺伝子導入によって）改変され得る（例えば、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５）１９５：２４９３−２５０１を参照のこと）。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、ＴＦＰ発現細胞の活性を増進する薬剤は、例えば、第１のドメイン及び第２のドメインを含む融合タンパク質であり得、第１のドメインは、抑制分子またはその断片であり、第２のドメインは、正のシグナルと関連するポリペプチド（例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチド）である。いくつかの実施形態では、正のシグナルと関連するポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７、及び／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメイン）、及び／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のもの）（例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメイン）を含み得る。一実施形態では、融合タンパク質は、ＴＦＰを発現する細胞と同じ細胞によって発現する。別の実施形態では、融合タンパク質は、細胞（例えば、抗ＴＡＡ  ＴＦＰを発現しないＴ細胞）によって発現する。
【０３２１】
医薬組成物
本開示の医薬組成物は、医薬的または生理学的に許容可能な１つ以上の担体、希釈剤、または医薬品添加物と組み合わせて、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞（例えば、複数のＴＦＰ発現細胞）を含み得る。そのような組成物は、緩衝剤（中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、及び同様のものなど）、糖質（グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトールなど）、タンパク質、ポリペプチド、またはアミノ酸（グリシンなど）、抗酸化剤、キレート剤（ＥＤＴＡまたはグルタチオンなど）、補助剤（例えば、水酸化アルミニウム）、ならびに保存剤を含み得る。本開示の組成物は、一態様では、静脈内投与向けに製剤化される。
【０３２２】
本開示の医薬組成物は、治療（または予防）すべき疾患に適した様式で投与され得る。適切な用量は、臨床試験によって決定され得るが、投与量及び投与頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の型及び重症度などの要因によって決定されることになる。
【０３２３】
一実施形態では、医薬組成物は、混入物を実質的に含まず、例えば、混入物が検出可能なレベルで存在しないものであり、存在しないこうした混入物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能なレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶｇａｇ、残留する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コートビーズ、マウス抗体、プールされたヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培地成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌、及び真菌からなる群から選択される。一実施形態では、細菌は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、及びＡ群のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓからなる群から選択される少なくとも１つである。
【０３２４】
「免疫学的に有効な量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」、または「治療量」が示される場合、本開示の組成物の正確な投与量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、及び状態の個々の差異を考慮して医師によって決定され得る。本明細書に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、１０４〜１０９個細胞／体重ｋｇ、場合によっては１０５〜１０６個細胞／体重ｋｇ（そうした範囲内のすべての整数値を含む）の用量で投与され得ると、一般には述べることができる。Ｔ細胞組成物は、こうした用量で複数回投与されることもあり得る。細胞は、免疫療法で一般に知られる注入手法を使用することによって投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照のこと）。
【０３２５】
ある特定の態様では、活性化Ｔ細胞を対象に投与した後、血液を再度採取し（またはアフェレーシスを実施し）、本開示に従ってそこからＴ細胞を活性化し、こうして活性化及び増殖させたＴ細胞を患者に再注入することが望ましくあり得る。このプロセスは、数週間ごとに複数回実施され得る。ある特定の態様では、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採取血液からＴ細胞が活性化され得る。ある特定の態様では、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採取血液からＴ細胞が活性化される。
【０３２６】
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、植え込み、または移植を含めて、任意の簡便な様式で実施され得る。患者への本明細書に記載の組成物の投与は、経動脈的なもの、皮下へのもの、皮内へのもの、腫瘍内へのもの、節内へのもの、髄内へのもの、筋肉内へのもの、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によるもの、または腹腔内へのものであり得る。一態様では、本開示のＴ細胞組成物は、皮内注射または皮下注射によって患者に投与される。一態様では、本開示のＴ細胞組成物は、ｉ．ｖ．注射によって投与される。Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接的に注射され得る。
【０３２７】
特定の態様例では、対象は、白血球アフェレーシスを受ける可能性があり、エクスビボで白血球が収集、濃縮、または枯渇されて目的細胞（例えば、Ｔ細胞）が選択及び／または単離される。こうした単離Ｔ細胞は、当該技術分野で知られる方法によって増殖され、本開示のＴＦＰコンストラクトの１つ以上が導入され得るように処理され、それによって本開示のＴＦＰ発現Ｔ細胞が創出され得る。次に、それを必要とする対象は、高用量化学療法での標準的な治療を受けた後、末梢血幹細胞移植を受け得る。ある特定の態様では、移植後または移植と同時に、増殖した本開示のＴＦＰ  Ｔ細胞が対象に注入される。追加の態様では、増殖した細胞は、手術の前または後に投与される。
【０３２８】
患者に施されるべき上記の治療の用量は、治療されている状態の正確な性質及び治療のレシピエントによって変わることになる。ヒトへの投与のための用量調整は、当該技術分野で認められた慣例に従って実施され得る。アレムツズマブの用量は、例えば、一般に、成人患者については１〜約１００ｍｇの範囲とされ、通常、１〜３０日の期間、毎日投与されることになる。１日の用量は、１日当たり１〜１０ｍｇが好ましいが、場合によっては、１日当たり最大で４０ｍｇまで用量が増やされ得る（米国特許第６，１２０，７６６号に記載されている）。
【０３２９】
一実施形態では、ＴＦＰがＴ細胞に導入され（例えば、インビトロ転写を使用して行われる）、対象（例えば、ヒト）に対して、本開示のＴＦＰ  Ｔ細胞が最初に投与され、この本開示のＴＦＰ  Ｔ細胞の１回以上の後続投与が行われ、この１回以上の後続投与は、前の投与から１５日が経過するまでに行われ、例えば、前の投与から１４日後、１３日後、１２日後、１１日後、１０日後、９日後、８日後、７日後、６日後、５日後、４日後、３日後、または２日後に行われる。一実施形態では、本開示のＴＦＰ  Ｔ細胞は、１週間当たり複数回、対象（例えば、ヒト）に投与され、例えば、本開示のＴＦＰ  Ｔ細胞は、１週間当たり２回、３回、または４回、投与される。一実施形態では、ＴＦＰ  Ｔ細胞は、１週間当たり複数回（例えば、１週間当たり２回、３回、または４回投与）（本明細書ではサイクルとも称される）対象（例えば、ヒト対象）に投与され、次の１週間はＴＦＰ  Ｔ細胞が投与されることはなく、その後、対象に対して、ＴＦＰ  Ｔ細胞の１回以上の追加投与（例えば、１週間に複数回のＴＦＰ  Ｔ細胞の投与）が行われる。別の実施形態では、ＴＦＰ  Ｔ細胞が複数回サイクルで対象（例えば、ヒト対象）に投与され、各サイクルの間の期間は、１０日未満、９日未満、８日未満、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満、または３日未満である。一実施形態では、ＴＦＰ  Ｔ細胞は、１週間当たり３回の投与となるように１日おきに投与される。一実施形態では、本開示のＴＦＰ  Ｔ細胞の投与期間は、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、またはそれを超える期間である。
【０３３０】
一態様では、ＴＡＡ  ＴＦＰ  Ｔ細胞は、レンチウイルスウイルスベクター（レンチウイルスなど）を使用して生成される。こうして生成したＴＦＰ−Ｔ細胞は、安定的にＴＦＰを発現することになる。
【０３３１】
一態様では、ＴＦＰ  Ｔ細胞では、形質導入から４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、ＴＦＰベクターによる発現が一過性に生じる。ＴＦＰの一過性発現は、ＲＮＡ  ＴＦＰベクターの送達によって生じ得る。一態様では、ＴＦＰ  ＲＮＡによるＴ細胞への形質導入は、電気穿孔によって行われる。
【０３３２】
一過性発現ＴＦＰ  Ｔ細胞を使用して治療されている患者（具体的にはマウスｓｃＦｖ含有ＴＦＰ  Ｔ細胞で治療されている患者）で生じ得る可能性のある問題は、複数回の治療後に生じるアナフィラキシーである。
【０３３３】
この理論によって拘束されないが、そのようなアナフィラキシー応答は、抗ＴＦＰ液性応答（すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＴＦＰ抗体によるもの）が生じている患者によって誘発され得ると考えられる。患者の抗体産生細胞では、抗原曝露が１０〜１４日間中断されると、ＩｇＧアイソタイプ（アナフィラキシーを誘発しない）からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチが生じると考えられる。
【０３３４】
一過性ＴＦＰ治療の過程で抗ＴＦＰ抗体応答（ＲＮＡ形質導入によって生じるものなど）が患者に生じるリスクが高いのであれば、ＴＦＰ  Ｔ細胞の注入中断期間が１０〜１４日を超えないようにすべきである。
【０３３５】
サイトカイン放出
サイトカイン放出症候群は、いくつかの疾患または感染症の合併症として生じる全身性の炎症応答症候群の一形態であり、いくつかのモノクローナル抗体薬ならびに養子Ｔ細胞療法の有害作用でもある。ＴＦＰ  Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して良好な死滅活性を示し得る。対象に投与されたＴＦＰ  Ｔ細胞は、対象に投与されたＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して良好な死滅活性を示し得る。このことは、ＣＡＲ−Ｔ細胞に勝るＴＦＰ  Ｔ細胞の利点の１つであり得る。ＴＦＰ  Ｔ細胞で生じるサイトカイン放出は、ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して少なくあり得る。ＴＦＰ  Ｔ細胞が投与された対象で生じるサイトカイン放出は、ＣＡＲ−Ｔ細胞が投与された対象と比較して少なくあり得る。このことは、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法に勝るＴＦＰ  Ｔ細胞療法の利点の１つであり得る。ＴＦＰ  Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して同様または良好な死滅活性を示し得、ＴＦＰ  Ｔ細胞で生じるサイトカイン放出は、ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して少なくあり得る。対象に投与されたＴＦＰ  Ｔ細胞は、対象に投与されたＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して同様または良好な死滅活性を示し得、この対象で生じるサイトカイン放出は、ＣＡＲ−Ｔ細胞が投与された対象と比較して少なくあり得る。このことは、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法に勝るＴＦＰ  Ｔ細胞療法の利点の１つであり得る。
【０３３６】
場合によっては、ＴＦＰ  Ｔ細胞を用いる治療で生じるサイトカイン放出は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を用いる治療で生じるサイトカイン放出と比較して少ない。いくつかの実施形態では、ＴＦＰ  Ｔ細胞を用いる治療で生じるサイトカイン放出は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を用いる治療で生じるサイトカイン放出と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％少ない。ＴＦＰ  Ｔ細胞を用いるＴ細胞治療では、ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、さまざまなサイトカインの放出が少なくあり得る。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ｓＣＤ１３７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、またはそれらの組み合わせである。場合によっては、ＴＦＰ  Ｔ細胞を用いる治療では、ＣＡＲ−Ｔ細胞を用いる治療と比較して、パーフォリン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、またはそれらの組み合わせの放出が少ない。いくつかの実施形態では、ＴＦＰ  Ｔ細胞を用いる治療で放出されるパーフォリン、グランザイムＡ、またはグランザイムＢは、ＣＡＲ−Ｔ細胞を用いる治療と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％少ない。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、所与のサイトカインについて、同じヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞で治療された哺乳類の所与のサイトカインの量と比較して、治療後に放出される所与のサイトカインの量は少なくとも１０％少ない。いくつかの実施形態では、所与のサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ｓＣＤ１３７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のサイトカインを含む。
【０３３８】
ＴＦＰ  Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して同様または良好な腫瘍細胞死滅活性を示し得る。いくつかの実施形態では、哺乳類における腫瘍増殖が抑制され、その結果、ＴＦＰを発現するＴ細胞で治療された哺乳類と、ＴＦＰを発現しないＴ細胞で治療された哺乳類とが、少なくとも８日間の治療の前に同じ腫瘍サイズを有した場合、当該治療の後に、腫瘍のサイズは、ＴＦＰを発現しないＴ細胞で治療された哺乳類における腫瘍のサイズの最大でも１０％、最大でも２０％、最大でも３０％、最大でも４０％、最大でも５０％、または最大でも６０％である。いくつかの実施形態では、哺乳類における腫瘍増殖は、完全に抑制される。いくつかの実施形態では、哺乳類における腫瘍増殖は、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間、少なくとも４０日間、少なくとも５０日間、少なくとも６０日間、少なくとも７０日間、少なくとも８０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１００日間、またはそれを超える期間、完全に抑制される。いくつかの実施形態では、ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞の集団は、同じヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して同様の量の腫瘍細胞を死滅させる。
【０３３９】
ＴＦＰ  Ｔ細胞は、ＴＦＰを発現しない細胞と比較して異なる遺伝子発現プロファイルを示し得る。場合によっては、ＴＦＰ  Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して同様の遺伝子発現プロファイルを示し得る。いくつかの他の場合では、ＴＦＰ  Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して異なる遺伝子発現プロファイルを示し得る。いくつかの実施形態では、ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞の集団は、同じヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して異なる遺伝子発現プロファイルを有する。いくつかの実施形態では、ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞における遺伝子の発現レベルは、同じヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞における当該遺伝子の発現レベルと比較して異なる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、抗原提示、ＴＣＲシグナル伝達、ホメオスタシス、代謝、ケモカインシグナル伝達、サイトカインシグナル伝達、ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達、ＭＭＰ及び接着分子シグナル伝達、またはＴＮＦＲ関連シグナル伝達において機能を有するものである。
【実施例】
【０３４０】
本開示は、下記の実験例を参照することによってさらに詳細に説明される。こうした例は、例示のみを目的として提供されており、別段の指定がない限り、限定を意図するものではない。したがって、本開示は、下記の例に限定されるものとしていかなる様式においても解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示内容の結果として明らかとなるいずれか及びすべての変更を包含すると解釈されるべきものである。さらに説明が与えられずとも、当業者なら、前述の説明及び下記の例示的な例を参照すれば、本開示の化合物を調製及び利用し、請求される方法を実施することができると考えられる。下記の実用例は、本開示のさまざまな態様を具体的に挙げるものであり、本開示の残りの部分を限定するものであるとは、いかなる様式においても解釈されない。
【０３４１】
実施例１：ＴＦＰコンストラクト
短鎖リンカー（ＳＬ）：ＡＡＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥ（配列番号２）または長鎖リンカー（ＬＬ）：ＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥ（配列番号３）をコードするＤＮＡ配列によってＣＤ３  ＤＮＡ断片またはＴＣＲ  ＤＮＡ断片に連結された抗ＴＡＡ  ＶＨＨドメイン（またはＳＤドメイン）ＤＮＡ断片をＸｂａＩ部位及びＥｃｏＲ１部位でｐ５１０ベクター（（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ））にクローニングすることによって抗ＴＡＡ  ＴＦＰコンストラクトが操作生成され得る。他のベクター（例えば、ｐＬＲＰＯベクター）も使用され得る。
【０３４２】
生成される抗ＴＡＡ  ＴＦＰコンストラクトの例としては、ｐ５１０＿抗ＴＡＡ＿ＬＬ＿ＴＣＲα（抗ＴＡＡ  ＶＨＨ−長鎖リンカー−ヒト全長Ｔ細胞受容体α鎖）、ｐ５１０＿ＴＡＡ＿ＬＬ＿ＴＣＲαＣ（抗ＴＡＡ  ＶＨＨ−長鎖リンカー−ヒトＴ細胞受容体α定常ドメイン鎖）、ｐ５１０＿抗ＴＡＡ＿ＬＬ＿ＴＣＲβ（抗ＴＡＡ  ＶＨＨ−長鎖リンカー−ヒト全長Ｔ細胞受容体β鎖）、ｐ５１０＿抗ＴＡＡ＿ＬＬ＿ＴＣＲβＣ（抗ＴＡＡ  ＶＨＨ−長鎖リンカー−ヒトＴ細胞受容体β定常ドメイン鎖）、ｐ５１０＿抗ＴＡＡ＿ＬＬ＿ＣＤ３γ（抗ＴＡＡ  ＶＨＨ−長鎖リンカー−ヒトＣＤ３γ鎖）、ｐ５１０＿抗ＴＡＡ＿ＬＬ＿ＣＤ３δ（抗ＴＡＡ  ＶＨＨ−長鎖リンカー−ヒトＣＤ３δ鎖）、ｐ５１０＿抗ＴＡＡ＿ＬＬ＿ＣＤ３ε（抗ＴＡＡ  ＶＨＨ−長鎖リンカー−ヒトＣＤ３ε鎖）、ｐ５１０＿抗ＴＡＡ＿ＳＬ＿ＴＣＲβ（抗ＴＡＡ  ＶＨＨ−短鎖リンカー−ヒト全長Ｔ細胞受容体β鎖）、ｐ５１０＿抗ＴＡＡ＿ＳＬ＿ＣＤ３γ（抗ＴＡＡ  ＶＨＨ−短鎖リンカー−ヒトＣＤ３γ鎖）、ｐ５１０＿抗ＴＡＡ＿ＳＬ＿ＣＤ３δ（抗ＴＡＡ  ＶＨＨ−短鎖リンカー−ヒトＣＤ３δ鎖）、ｐ５１０＿抗ＴＡＡ＿ＳＬ＿ＣＤ３ε（抗ＴＡＡ  ＶＨＨ−短鎖リンカー−ヒトＣＤ３ε鎖）が挙げられる。
【０３４３】
本明細書で使用される抗ＭＵＣ１６は、ヒトＭＵＣ１６特異的ｓｃＦｖ（例えば、４Ｈ１１）であり得る。
【０３４４】
対応する抗ＭＵＣ１６  Ａ  ＣＡＲコンストラクト、抗ＩＬ１３Ｒａ２  Ａ  ＣＡＲコンストラクト、または抗ＭＳＬＮ  Ａ  ＣＡＲコンストラクト（ｐ５１０＿抗ＴＡＡ＿２８ζ）の例は、抗ＴＡＡ、部分的ＣＤ２８細胞外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、及びＣＤ３ゼータをコードする合成ＤＮＡをＸｂａＩ部位及びＥｃｏＲ１部位でｐ５１０ベクターにクローニングすることによって生成され得る。
【０３４５】
さまざまな他のベクターを使用しても融合タンパク質コンストラクトが生成され得る。
【０３４６】
実施例２：抗体配列
抗体配列の生成
ｓｃＦｖの生成
ヒト抗ＴＡＡ  ＩｇＧまたはヒト化抗ＴＡＡ  ＩｇＧを使用することで、ＴＦＰコンストラクトのためのｓｃＦｖ配列が生成され得る。ヒトＶＬドメイン及びヒトＶＨドメインまたはヒト化ＶＬドメイン及びヒト化ＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を得ることができ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓに由来する細胞での発現についてコンストラクトのコドンを任意選択で最適化することができる。ｓｃＦｖ中でのＶＬドメイン及びＶＨドメインの配置順序は変更され（すなわち、ＶＬ−ＶＨ配向またはＶＨ−ＶＬ配向）、これらの可変ドメインが、「Ｇ４Ｓ」または「Ｇ４Ｓ」サブユニットの３つのコピーである（Ｇ４Ｓ）３によって連結されることでｓｃＦｖドメインが創出される。抗ＴＡＡ  ｓｃＦｖプラスミドコンストラクトは、Ｆｌａｇ、Ｈｉｓ、または他の親和性タグを任意選択で有し得、ＨＥＫ２９３または他の適切なヒト細胞株もしくは哺乳類細胞株へと電気穿孔によって導入され、精製され得る。検証アッセイには、ＦＡＣＳによる結合解析、Ｐｒｏｔｅｏｎを使用する動力学的解析、及びＭＵＣ１６発現細胞、ＩＬ１３Ｒα２発現細胞、またはＭＳＬＮ発現細胞の染色が含まれる。
【０３４７】
ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、及びＣＤＲを含む抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメイン、または抗ＭＳＬＮ結合ドメインで、本明細書に記載の組成物及び方法で使用され得るものの例は、いくつかの刊行物に記載のもの及び／または商業的な供給源から得られるものであり得る。例えば、３Ａ５及び１１Ｄ１０を含めて、ある特定の抗ＭＵＣ１６抗体は、ＷＯ２００７／００１８５１に開示されており、当該文献の内容は、参照によって組み込まれる。３Ａ５モノクローナル抗体は、ＭＵＣ１６ポリペプチドの複数部位に結合するものであり、ＯＶＣＡＲ−３でのスキャッチャード解析によるその結合親和性は４３３ｐＭである。ＶＬドメイン及びＶＨドメイン、ＣＤＲ、ならびにそれらをコードするヌクレオチド配列の例は、それぞれ下記のモノクローナル抗体のものであり得る：ＧＴＸ１００２９、ＧＴＸ２１１０７、ＭＡ５−１２４５２５、ＭＡ５−１１５７９、２５４５０００２、ＡＢＩＮ１５８４１２７、ＡＢＩＮ９３６５５、１１２８８９、１２０２０４、ＬＳ−Ｃ３５６１９５、ＬＳ−Ｂ６７５６、ＴＡ８０１２４１、ＴＡ８０１２７９、Ｖ３４９４、Ｖ３６４８、６６６９０２、６６６９０４、ＨＰＡ０６５６００、ＡＭＡｂ９１０５６。
【０３４８】
ヒトＩＬ１３Ｒα２ポリペプチド標準配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ１４６２７である。ヒトＭＵＣ１６ポリペプチド、ヒトＩＬ１３Ｒα２ポリペプチド、またはヒトＭＳＬＮポリペプチド、及びその断片またはドメインに特異的に結合する能力を有する抗体ポリペプチドが提供される。抗ＴＡＡ抗体は、さまざまな技術を使用して生成され得る（例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７を参照のこと）。マウス抗ＴＡＡ抗体が出発材料として使用される場合、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）治療（すなわち、ＴＦＰ．ＴＡＡコンストラクトで形質導入されたＴ細胞を用いる治療）を受ける対象においてマウス特異的残基がヒト抗マウス抗原（ＨＡＭＡ）応答を誘導し得る臨床状況については、マウス抗ＴＡＡ抗体をヒト化することが望まれる。ヒト化は、マウス抗ＴＡＡ抗体に由来するＣＤＲ領域を適切なヒト生殖系列アクセプターフレームワークに移植することによって達成され、その際、ＣＤＲ領域及び／またはフレームワーク領域に対する他の改変が任意選択で含められる。本明細書で提供される抗体及び抗体断片の残基付番は、Ｋａｂａｔに従う（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，１９９１、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，１９８７）。
【０３４９】
単一ドメイン結合物質
ラクダ及び他の単一ドメイン抗体を使用しても、抗ＭＵＣ１６  ＴＦＰコンストラクト、抗ＩＬ１３Ｒα２  ＴＦＰコンストラクト、抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰコンストラクト、または他の抗腫瘍抗原ＴＦＰコンストラクトが生成され得る。ＶＨＨドメインは、さまざまなＴＣＲサブユニットとの融合に使用され得る。いくつかの実施形態では、単一ドメイン（例えば、ＶＨＨ）結合物質（表４に示されるものなど）が使用される（例えば、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７１、配列番号７６、配列番号９７、または配列番号９８を非限定的な例として参照のこと）。抗ＴＡＡ単一ドメイン抗体の調製については、実施例３及び実施例５にさらに記載される。
【０３５０】
ＴＣＲサブユニットの供給源
ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のサブユニットはすべて、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。ヒトＴＣＲ複合体は、ＣＤ３−イプシロンポリペプチド、ＣＤ３−ガンマポリペプチド、ＣＤ３−デルタポリペプチド、ＣＤ３−ゼータポリペプチド、ＴＣＲアルファ鎖ポリペプチド、及びＴＣＲベータ鎖ポリペプチドを含む。ヒトＣＤ３−イプシロンポリペプチド標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ０７７６６である。ヒトＣＤ３−ガンマポリペプチド標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ０９６９３である。ヒトＣＤ３−デルタポリペプチド標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ０４３２３４である。ヒトＣＤ３−ゼータポリペプチド標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ２０９６３である。ヒトＴＣＲアルファ鎖標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ６ＩＳＵ１である。ヒトＴＣＲベータ鎖Ｃ領域標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ０１８５０であり、ヒトＴＣＲベータ鎖Ｖ領域配列は、Ｐ０４４３５である。
【０３５１】
ヒトＣＤ３−イプシロンポリペプチド標準配列は下記の配列である：
ＭＱＳＧＴＨＷＲＶＬＧＬＣＬＬＳＶＧＶＷＧＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤＶＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩ（配列番号４）。
【０３５２】
ヒトＣＤ３−ガンマポリペプチド標準配列は下記の配列である：
ＭＥＱＧＫＧＬＡＶＬＩＬＡＩＩＬＬＱＧＴＬＡＱＳＩＫＧＮＨＬＶＫＶＹＤＹＱＥＤＧＳＶＬＬＴＣＤＡＥＡＫＮＩＴＷＦＫＤＧＫＭＩＧＦＬＴＥＤＫＫＫＷＮＬＧＳＮＡＫＤＰＲＧＭＹＱＣＫＧＳＱＮＫＳＫＰＬＱＶＹＹＲＭＣＱＮＣＩＥＬＮＡＡＴＩＳＧＦＬＦＡＥＩＶＳＩＦＶＬＡＶＧＶＹＦＩＡＧＱＤＧＶＲＱＳＲＡＳＤＫＱＴＬＬＰＮＤＱＬＹＱＰＬＫＤＲＥＤＤＱＹＳＨＬＱＧＮＱＬＲＲＮ（配列番号５）。
【０３５３】
ヒトＣＤ３−デルタポリペプチド標準配列は下記の配列である：
ＭＥＨＳＴＦＬＳＧＬＶＬＡＴＬＬＳＱＶＳＰＦＫＩＰＩＥＥＬＥＤＲＶＦＶＮＣＮＴＳＩＴＷＶＥＧＴＶＧＴＬＬＳＤＩＴＲＬＤＬＧＫＲＩＬＤＰＲＧＩＹＲＣＮＧＴＤＩＹＫＤＫＥＳＴＶＱＶＨＹＲＭＣＱＳＣＶＥＬＤＰＡＴＶＡＧＩＩＶＴＤＶＩＡＴＬＬＬＡＬＧＶＦＣＦＡＧＨＥＴＧＲＬＳＧＡＡＤＴＱＡＬＬＲＮＤＱＶＹＱＰＬＲＤＲＤＤＡＱＹＳＨＬＧＧＮＷＡＲＮＫＳ（配列番号６）。
【０３５４】
ヒトＣＤ３−ゼータポリペプチド標準配列は下記の配列である：
ＭＫＷＫＡＬＦＴＡＡＩＬＱＡＱＬＰＩＴＥＡＱＳＦＧＬＬＤＰＫＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＬＴＡＬＦＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号７）。
【０３５５】
ヒトＴＣＲアルファ鎖標準配列は下記の配列である：
ＭＡＧＴＷＬＬＬＬＬＡＬＧＣＰＡＬＰＴＧＶＧＧＴＰＦＰＳＬＡＰＰＩＭＬＬＶＤＧＫＱＱＭＶＶＶＣＬＶＬＤＶＡＰＰＧＬＤＳＰＩＷＦＳＡＧＮＧＳＡＬＤＡＦＴＹＧＰＳＰＡＴＤＧＴＷＴＮＬＡＨＬＳＬＰＳＥＥＬＡＳＷＥＰＬＶＣＨＴＧＰＧＡＥＧＨＳＲＳＴＱＰＭＨＬＳＧＥＡＳＴＡＲＴＣＰＱＥＰＬＲＧＴＰＧＧＡＬＷＬＧＶＬＲＬＬＬＦＫＬＬＬＦＤＬＬＬＴＣＳＣＬＣＤＰＡＧＰＬＰＳＰＡＴＴＴＲＬＲＡＬＧＳＨＲＬＨＰＡＴＥＴＧＧＲＥＡＴＳＳＰＲＰＱＰＲＤＲＲＷＧＤＴＰＰＧＲＫＰＧＳＰＶＷＧＥＧＳＹＬＳＳＹＰＴＣＰＡＱＡＷＣＳＲＳＡＬＲＡＰＳＳＳＬＧＡＦＦＡＧＤＬＰＰＰＬＱＡＧＡＡ（配列番号８）。
【０３５６】
ヒトＴＣＲアルファ鎖Ｃ領域標準配列は下記の配列である：
ＰＮＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ（配列番号９）。
【０３５７】
ヒトＴＣＲアルファ鎖Ｖ領域ＣＴＬ−Ｌ１７標準配列は下記の配列である：
ＭＡＭＬＬＧＡＳＶＬＩＬＷＬＱＰＤＷＶＮＳＱＱＫＮＤＤＱＱＶＫＱＮＳＰＳＬＳＶＱＥＧＲＩＳＩＬＮＣＤＹＴＮＳＭＦＤＹＦＬＷＹＫＫＹＰＡＥＧＰＴＦＬＩＳＩＳＳＩＫＤＫＮＥＤＧＲＦＴＶＦＬＮＫＳＡＫＨＬＳＬＨＩＶＰＳＱＰＧＤＳＡＶＹＦＣＡＡＫＧＡＧＴＡＳＫＬＴＦＧＴＧＴＲＬＱＶＴＬ（配列番号１０）。
【０３５８】
ヒトＴＣＲベータ鎖Ｃ領域標準配列は下記の配列である：
ＥＤＬＮＫＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＶＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＦ（配列番号１１）。
【０３５９】
ヒトＴＣＲベータ鎖Ｖ領域ＣＴＬ−Ｌ１７標準配列は下記の配列である：
ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＴＧＶＳＱＮＰＲＨＮＩＴＫＲＧＱＮＶＴＦＲＣＤＰＩＳＥＨＮＲＬＹＷＹＲＱＴＬＧＱＧＰＥＦＬＴＹＦＱＮＥＡＱＬＥＫＳＲＬＬＳＤＲＦＳＡＥＲＰＫＧＳＦＳＴＬＥＩＱＲＴＥＱＧＤＳＡＭＹＬＣＡＳＳＬＡＧＬＮＱＰＱＨＦＧＤＧＴＲＬＳＩＬ（配列番号１２）。
【０３６０】
ヒトＴＣＲベータ鎖Ｖ領域ＹＴ３５標準配列は下記の配列である：
ＭＤＳＷＴＦＣＣＶＳＬＣＩＬＶＡＫＨＴＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩＳＧＨＮＳＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＩＹＦＮＮＮＶＰＩＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦＣＡＳＳＦＳＴＣＳＡＮＹＧＹＴＦＧＳＧＴＲＬＴＶＶ（配列番号１３）。
【０３６１】
ＴＣＲドメイン及びｓｃＦｖからのＴＦＰの生成
ＭＵＣ１６  ｓｃＦｖ、ＩＬ１３Ｒα２  ｓｃＦｖ、またはＭＳＬＮ  ｓｃＦｖは、リンカー配列（Ｇ４Ｓ、（Ｇ４Ｓ）２（Ｇ４Ｓ）３、または（Ｇ４Ｓ）４など）を使用してＣＤ３−イプシロンまたは他のＴＣＲサブユニットと組換えで連結され得る。さまざまなリンカー及びｓｃＦｖ構成が利用され得る。ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖は、全長ポリペプチドまたはその定常ドメインのみのものとしてＴＦＰの生成に使用され得る。ＴＦＰの調製には、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖の任意の可変配列を使用することが可能であり得る。
【０３６２】
ＴＦＰ発現ベクター
プロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター）、分泌を可能にするためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子）、エピソームの複製及び原核生物での複製を可能にするエレメント（例えば、ＳＶ４０起源のもの及びＣｏｌＥ１のものまたは当該技術分野で知られる他のもの）、ならびに選択を可能にするエレメント（アンピシリン耐性遺伝子及びｚｅｏｃｉｎマーカー）を含む発現ベクターが提供される。
【０３６３】
ＴＦＰをコードする核酸コンストラクトは、レンチウイルス発現ベクターにクローニングされ、ＴＡＡ＋標的細胞（「ＴＡＡ」は、例えば、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒａ２、またはＭＳＬＮである）に応じたＴＦＰ．ＴＡＡ形質導入Ｔ細胞（「ＴＡＡ．ＴＦＰ」または「ＴＡＡ．ＴＦＰ  Ｔ細胞」または「ＴＦＰ．ＴＡＡ」または「ＴＦＰ．ＴＡＡ  Ｔ細胞」）のエフェクターＴ細胞応答の量及び質に基づいて発現の検証が行われ得る。エフェクターＴ細胞応答には、限定されないが、細胞増殖、増殖、倍加、サイトカイン産生、及び標的細胞溶解または細胞溶解活性（すなわち、脱顆粒）が含まれる。
【０３６４】
抗ＴＡＡ  ＴＦＰレンチウイルス導入ベクターを使用することで、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化レンチウイルス粒子にパッケージングされるゲノム物質が生成され得る。レンチウイルス導入ベクターＤＮＡは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）試薬と共にＶＳＶ−Ｇの３つのパッケージング要素（ｇａｇ／ｐｏｌ、及びｒｅｖ）と混合されて、まとめて一緒にＨＥＫ−２９３（胎児腎臓、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３（商標））細胞にトランスフェクションされる。２４時間後及び４８時間後に培地が回収され、ろ過され、超遠心分離法によって濃縮される。得られたウイルス調製物は−８０℃で保管される。形質導入単位数は、Ｓｕｐ−Ｔ１（Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１９４２（商標））細胞での力価測定によって決定され得る。新鮮なナイーブＴ細胞を活性化させ（例えば、抗ＣＤ３抗ＣＤ２８ビーズで２４時間活性化させる）、その後に適切な数の形質導入単位を添加して所望のパーセントの形質導入Ｔ細胞を得ることによって再指向化ＴＦＰ  Ｔ細胞が生成される。こうした改変Ｔ細胞は、休ませられ、後の分析に向けて凍結保存されるサイズになるまで増殖させられることになる。細胞の数及びサイズは、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ（商標）ＩＩＩを使用して測定される。凍結保存前に、形質導入された（細胞表面上にＴＦＰを発現する）細胞のパーセント及びその発現の相対蛍光強度がフローサイトメトリー分析によって決定されることになる。ＴＦＰの相対発現レベルは、ヒストグラムプロットから、その相対蛍光強度と形質導入パーセントを比較することによって調べられ得る。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、複数のウイルスベクターを用いてＴ細胞の形質導入が行われることによって複数のＴＦＰが導入される。
【０３６６】
ヒト化ＴＦＰ再指向化Ｔ細胞の細胞溶解活性、増殖能力、及びサイトカイン分泌の評価
ＴＦＰ  Ｔ細胞の機能的な能力（細胞表面に発現するＴＦＰを産生する能力、及び標的腫瘍細胞を死滅させ、増殖し、サイトカインを分泌する能力）は、当該技術分野で知られるアッセイを使用して決定され得る。
【０３６７】
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ（例えば、Ｔ細胞（ＣＤ４＋リンパ球及びＣＤ８＋リンパ球）を得るための負の選択によってナイーブＴ細胞が得られることになる正常なアフェレーシスドナーに由来する血液））が、ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）で処理された後、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２８ビーズで活性化され（例えば、３７℃、５％ＣＯ２下、１０％ＲＰＭＩ中で活性化される）、その後、ＴＦＰコードレンチウイルスベクターでの形質導入に供されることになる。フローサイトメトリーアッセイを使用して細胞表面上のＴＦＰの存在が確認されることになり、この確認は、抗ＦＬＡＧ抗体または抗マウス可変ドメイン抗体などによって行われる。サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）産生は、ＥＬＩＳＡまたは他のアッセイを使用して測定されることになる。
【０３６８】
実施例３：抗ＩＬ１３Ｒα２ナノボディの生成
ライブラリーの構築
免疫化
０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、及び３５日目にラマの皮下注射を行い、各注射時には、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと融合した組換えヒトＩＬ１３Ｒα２（ｈＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を約１５０μｇ注射した。ＧＥＲＢＵ  ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｐ（ＧＥＲＢＵ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ）をアジュバントとして使用した。４０日目に、リンパ球調製用に血液約１００ｍｌをラマから収集し、抗凝固処理した。
【０３６９】
ＶＨＨライブラリーの構築
抗原特異的ナノボディの存在をスクリーニングするために、ラマリンパ球からＶＨＨライブラリーを構築した。この目的を達成するために、末梢血リンパ球から得られた全ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いる第１鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用した。このｃＤＮＡを使用してＰＣＲによってＶＨＨコード配列を増幅し、ＰｓｔＩ及びＮｏｔＩで消化し、ファージミドベクターｐＭＥＣＳのＰｓｔＩ部位及びＮｏｔＩ部位にクローニングした。こうして得られたＶＨＨライブラリーをＣｏｒｅ９４と命名した。このライブラリーは、約７×１０８個の独立した形質転換体からなり、これらの形質転換体の１００％が、正しい挿入サイズのベクターを保有するものである。
【０３７０】
ヒトＩＬ１３Ｒα２特異的ナノボディの単離
ｈＩＬ１３Ｒα２抗原でコートされた固相（１００ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．２）中１００μｇ／ｍｌ）に対してＣｏｒｅ９４ライブラリーのパニングを３ラウンド行った：第Ｘａ因子によってｈＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ抗原からＦｃを除去した。ウェル上にコートされた抗原上に残存するあらゆるヒトＩｇＧ１  Ｆｃに対するファージの結合、及びあらゆる混入第Ｘａ因子に対するファージの結合を、組換えヒトＩｇＧ１Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１１０−ＨＧ）及び第Ｘａ因子（各最終濃度１μＭ）によって競合させて除去した。抗原でコートされたウェルから溶出したファージミド粒子の数と、陰性対象ウェル（コートされておらず、ブロッキングされたウェル）から溶出したファージミド粒子の数と、を比較することによってパニングの各ラウンド後に抗原特異的ファージの濃縮を評価した。こうした実験から、ファージ集団中の抗原特異的ファージが、１回目のラウンド後、２回目のラウンド後、及び３回目のラウンド後に、それぞれ約７倍、約２００倍、及び約１０００倍に濃縮されたことが示唆された。全部で１９０個のコロニー（２ラウンド目から９５個、及び３ラウンド目から９５個）を無作為に選択し、そのペリプラズム抽出物における抗原特異的ナノボディの存在についてＥＬＩＳＡ（可溶性ナノボディを含む未精製のペリプラズム抽出物を使用するＥＬＩＳＡ）によって分析した。ＥＬＩＳＡスクリーニングについては、パニングに使用した抗原と同じ抗原を使用し、ブロッキングされた非コートウェル、ならびに組換えヒトＩｇＧ１  Ｆｃと第Ｘａ因子との混合物でコートされたウェルを陰性対象として使用して実施した。組換えヒトＩｇＧ１  Ｆｃ／Ｘａでコートされたウェルでは、二次抗体（抗マウス抗体）によってわずかなバックグラウンドシグナル（４０５ｎｍでのＯＤ約０．３）が生じ、これによって５つのクローンがＦｃに交差反応性を有するものとして分類された。これら１９０個のコロニーのうち、このアッセイにおいてｈＩＬ１３Ｒα２に陽性であるが、ｈＩｇＧ１  Ｆｃ／第Ｘａ因子混合物には陰性と判定されたコロニーは１４１個であった。ｈＩＬ１３Ｒα２に陽性であるが、ｈＩｇＧ１  Ｆｃ／第Ｘａ因子混合物には陰性のこれら１４１個のコロニーの配列データに基づいて５４個の異なる全長ナノボディが識別され、これらの全長ナノボディは、１６個の異なるＣＤＲ３群（Ｂ細胞系譜）に属するものであった。同じＣＤＲ３群（同じＢ細胞系譜）に属するナノボディは非常に類似しており、それらのアミノ酸配列は、そうしたナノボディが、体細胞超変異に起因して生じたクローン的に関連するＢ細胞に由来するものであるか、あるいは同じＢ細胞に由来するが、ライブラリー構築中にＲＴエラー及び／またはＰＣＲエラーに起因して多様化したものであることを示唆している。同じＣＤＲ３群に属するナノボディは、同じエピトープを認識するが、それらの他の特徴（例えば、親和性、効力、安定性、発現収量など）は異なり得る。Ｈｉｓタグ付きヒトＩＬ１３Ｒα１（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＩＬ１−Ｈ５２２４）に対するヒトＩＬ１３Ｒα２特異的ナノボディの結合もＥＬＩＳＡによって試験した。こうしたＥＬＩＳＡ実験から、ＩＬ１３Ｒα２特異的ナノボディはいずれもヒトＩＬ１３Ｒα１には結合しないことが明らかとなった。こうしたパニングに由来するクローンは、その名称にＴＩＧというコードを有する。
【０３７１】
ｈＩＬ１３Ｒα２特異的ナノボディのフローサイトメトリー分析
ナノボディ及び細胞
上記の最初のＥＬＩＳＡスクリーニングを行うために実施した方法と同じ方法で、各抗ｈＩＬ１３Ｒα２  Ｎｂを得るためのペリプラズム抽出物を調製した。各細胞株（Ｕ２５１＿Ｌｕｃ＿Ｍｃｈ及びＡ４３１＿Ｌｕｃ）に由来する細胞を解凍し、洗浄し、数を数えた。各Ｎｂクローンから得られたペリプラズム抽出物を約２×１０５個の細胞と共にインキュベートした。洗浄後、マウス抗ＨＡタグ抗体と抗マウス−ＰＥとの混合物と共に細胞をインキュベートした。洗浄をもう一回行った後、生死判定染色剤としてＴｏｐｒｏを各試料に添加し、細胞をフローサイトメーターで分析した。Ｍａｂ（ＰＥ結合型抗ＩＬ１３Ｒα２クローン４７）（＋Ｔｏｐｒｏ）を陽性対象として使用した。無関係のＮｂ（ＢＣＩＩ１０−細菌βラクタマーゼ特異的）を含む試料、すべての検出Ｍａｂを含む試料、二次抗マウス−ＰＥ  Ｍａｂを単独で含む試料、及び細胞を単独で含む試料（Ｔｏｐｒｏ含有及びＴｏｐｒｏ非含有）を各細胞株に対する陰性対象とした。
【０３７２】
抗体のヒト化
２つのクローンをヒト化用に選択した。図１は、クローン１及びクローン２の配列アライメントを示し、この配列アライメントには、各クローンの親（非ヒト化）配列及び１０個のヒト化バリアントが含まれる。各ヒト化ナノボディの分析はＯｃｔｅｔによって行い、この分析では、各ヒト化ナノボディをＮｉ−ＮＴＡセンサー上に５００ｎＭで固定化し、抗原（ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ）の３倍希釈系列（１２５ｎＭ、４１．６６ｎＭ、及び１３．８６ｎＭ）を用いた。実験手順の図面は、図２に示される。図１に示されるヒト化バリアントのそれぞれについてのｏｃｔｅｄ測定値のまとめは、表１（クローン１）及び表２（クローン２）に示される。
【０３７３】
【表１】
2021530503.tif 000003
【０３７４】
【表２】
2021530503.tif 000004
【０３７５】
各クローンにつき２つのヒト化配列を追加試験用に選択し、これら２つのヒト化配列は、それぞれ配列番号１９〜２８及び配列番号３５〜４３に対応する。
【０３７６】
実施例４：抗ＩＬ１３Ｒα２ナノボディのインビトロでの活性
実施例３に記載のヒト化ｓｄＡｂをｐＬＲＰＯ骨格で発現させ、ＣＤ３εＴＦＰに組み込んだ。対応するＩＬ１３Ｒα２−ＴＦＰ  Ｔ細胞の活性をＩＬ−１３発現細胞株（Ｕ８７）及びＩＬ１３Ｒα２陰性細胞株（Ａ４３１）で試験した。クローン１  ＴＦＰ  Ｔ細胞及びクローン２  ＴＦＰ  Ｔ細胞は共に、Ｕ８７細胞では腫瘍細胞溶解を誘導したが、Ａ４３１細胞では腫瘍細胞溶解を誘導しなかった（図３Ａ）。
【０３７７】
同じＴＦＰ  Ｔ細胞について、ＩＦＮγ及びＩＬ−２の産生を誘導する能力を試験した。図３Ｂに示されるように、これらのＴＦＰ  Ｔ細胞は、ＩＬ１３Ｒα２陰性細胞（Ａ４３１）ではＩＦＮγまたはＩＬ−２を誘導しなかったが、クローン１  ＴＦＰ  Ｔ細胞及びクローン２  ＴＦＰ  Ｔ細胞は、３０００ｐｇ／ｍｌを超えるＩＦＮγ応答、及び約１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−２低産生を誘発した。Ｕ２５１神経膠芽腫細胞においてこの実験を繰り返したところ、同様の結果が得られた。
【０３７８】
実施例５：ヒトＭＵＣ１６ペプチド：ＮＦＳＰＬＡＲＲＶＤＲＶＡＩＹＥＥＦＬＲＭＴＲＮＧＴＱＬＱＮＦＴＬＤＲＳＳＶＬＶＤＧＹＳＰＮＲＮＥＰＬＴＧＮＳＤＬＰに特異的なナノボディの生成及び同定
材料及び方法
ＶＨＨの形質転換、再クローニング、及び発現
組換えｐＭＥＣＳ  ＧＧを用いる非サプレッサー株（例えば  ＷＫ６）の形質転換
ｐＭＥＣＳ  ＧＧベクターにクローニングされたナノボディ遺伝子は、ＰｅｌＢシグナル配列をＮ末端に含み、ＨＡタグ及びＨｉｓ６タグをＣ末端に含む（ＰｅｌＢリーダー−ナノボディ−ＨＡ−Ｈｉｓ６）。ＰｅｌＢリーダー配列は、ナノボディをＥ．ｃｏｌｉのペリプラズム間隙へと導き、ＨＡタグ及びＨｉｓ６タグは、ナノボディの精製及び検出に使用され得る（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどで使用される）。
【０３７９】
ｐＭＥＣＳ  ＧＧベクターでは、Ｈｉｓ６タグの下流にアンバー終止コドン（ＴＡＧ）が存在し、このアンバー終止コドンの下流にＭ１３ファージの遺伝子ＩＩＩが存在する。サプレッサーＥ．ｃｏｌｉ株（例えばＴＧ１）では、アンバー終止コドンはグルタミンとして読まれ、それ故に、ナノボディは、パニングを行うためのファージコート上でのナノボディのディスプレイを可能にするファージのタンパク質ＩＩＩとの融合タンパク質として発現する。非サプレッサーＥ．ｃｏｌｉ株（例えば、ＷＫ６）では、アンバー終止コドンは終止コドンとして読まれ、それ故に、得られるナノボディは、タンパク質ＩＩＩと融合していない。
【０３８０】
ｐＭＥＣＳ  ＧＧベクターにクローニングされたナノボディを発現させ、精製するためには、単に、目的ナノボディの遺伝子を含むｐＭＥＣＳ  ＧＧを調製し、このプラスミドを用いて非サプレッサー株（例えば、ＷＫ６）の形質転換を行うのみである。得られるクローンのナノボディの配列がＭＰ０５７プライマー（５’−ＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧ−３’）を使用して検証されることでクローンの独自性が検証される。ＥＬＩＳＡまたは任意の他の適切なアッセイによって抗原結合能力が再試験される。この時点で、ナノボディ遺伝子を含む組換えｐＭＥＣＳ  ＧＧベクターを含む非サプレッサー株（例えば、ＷＫ６）をナノボディの発現及び精製に使用することができる。
【０３８１】
ｐＭＥＣＳ  ＧＧからｐＨＥＮ６ｃベクターへのナノボディ遺伝子の再クローニング
プライマー配列：
−プライマーＡ６Ｅ（５’  ＧＡＴ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＲ  ＧＧＡ  ＧＧ  ３’）。
【０３８２】
−プライマーＰＭＣＦ（５’  ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  Ｔ  ３’）。
【０３８３】
−ユニバーサルリバースプライマー（５’  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  Ｃ  ３’）。
【０３８４】
−ユニバーサルフォワードプライマー（５  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ３’）。
【０３８５】
テンプレートとしてのナノボディ遺伝子を保有する組換えｐＭＥＣＳ  ＧＧを含むＥ．ｃｏｌｉ、ならびにプライマーＡ６Ｅ及びプライマーＰＭＣＦを使用するＰＣＲ（ＰＣＲサイクル回数は約３０であり、各サイクルは、９４℃３０秒、５５℃３０秒、及び７２℃４５秒からなり、ＰＣＲの終了時点で７２℃１０分の伸長反応が行われる）によってナノボディ遺伝子が増幅される。約４００ｂｐの断片が増幅される。次に、ＰＣＲ産物は精製され（例えば、Ｑｉａｇｅｎから供給されるＱｉａｑＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットによって精製される）、ＰｓｔＩで一晩消化される。
【０３８６】
ＰＣＲ産物は精製され、ＢｓｔＥＩＩで一晩消化される（またはＦｅｒｍｅｎｔａｓから供給されるＥｃｏ９１Ｉで消化される）。ＰＣＲ産物は上記のように精製され、ｐＨＥＮ６ｃベクターはＰｓｔＩで３時間消化される。消化されたベクターは上記のように精製された後、ＢｓｔＥＩＩで２〜３時間消化される。消化されたベクターは、１％のアガロースゲルで泳動され、ゲルからベクターのバンドが切り出され、精製される（例えば、Ｑｉａｇｅｎから供給されるＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キットによって精製される）。ＰＣＲ産物とベクターとがライゲーションされる。このライゲーション反応物を用いてエレクトロコンピテントＷＫ６細胞の形質転換が行われる。ＬＢ／寒天／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）／グルコース（１〜２％）プレートを使用して形質転換体が選択される。
【０３８７】
ナノボディの発現及び精製：
新たに形質転換されたＷＫ６コロニーは、１０〜２０ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）＋グルコース（１％）への植菌に使用され、２００〜２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩インキュベートされる。この前培養物が、３３０ｍｌのＴＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、２ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．１％のグルコースが添加されたもの）に１ｍｌ添加され、ＯＤ６００が０．６〜０．９に達するまで振とう（２００〜２５０ｒｐｍ）しながら３７℃で増殖される。最終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加することによってナノボディの発現が誘導され、培養物のインキュベートが、振とうしながら２８℃で一晩行われる（約１６〜１８時間行われ、理想的には一晩の誘導後のＯＤ６００は２５〜３０であるべきである）。
培養物は、８０００ｒｐｍで８分間遠心分離され、１リットルの培養物から得られるペレットが１２ｍｌのＴＥＳに再懸濁され、氷上で１時間振とうされる。使用される１２ｍｌのＴＥＳのそれぞれにつき１８ｍｌのＴＥＳ／４が添加され、さらに１時間（振とうしながら）氷上でさらにインキュベートされた後、４℃、８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離される。ペリプラズム間隙から抽出されたタンパク質は上清に含まれる。
【０３８８】
ＩＭＡＣによる精製：
Ｈｉｓ−ｓｅｌｅｃｔがＰＢＳで平衡化される：１リットルの培養物から得られるペリプラズム抽出物につき、１ｍｌの樹脂（約２ｍｌのＨｉｓ−ｓｅｌｅｃｔ溶液）が５０ｍｌのｆａｌｃｏｎチューブに添加され、最終体積が５０ｍｌとなるようにＰＢＳが添加され、混合された後、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離され、上清が廃棄される。樹脂がＰＢＳで２回洗浄された後、ペリプラズム抽出物が添加され、穏やかに振とうしながら室温で３０分〜１時間インキュベートされる（インキュベート時間を長くすると非特異的な結合が生じ得る）。
底にフィルターを備えたＰＤ−１０カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７−０４３５−０１）に試料がロードされ、５０〜１００ｍｌのＰＢＳ（使用樹脂１ｍｌ当たり５０〜１００ｍｌのＰＢＳ）で洗浄される。溶出は３回実施され（それぞれの溶出時には使用樹脂１ｍｌ当たり１ｍｌのＰＢＳ／０．５Ｍイミダゾールが使用される）、ＰＢＳに対する透析（カットオフ３５００ダルトン）が４℃で一晩行われることでイミダゾールが除去される。
【０３８９】
この時点で、溶出試料のＯＤ２８０を測定することによってタンパク質の量が推定され得る。各クローンの吸光係数は、Ｅｘｐａｓｙプロテオミクスサーバーにおいて一次構造解析の下でｐｒｏｔＰａｒａｍツールによって決定され得る。ナノボディの追加精製は、さまざまな方法によって達成され得る。例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  １６／６０へのロードに適した体積（最大４ｍｌ）が得られるまで４℃、２０００ｒｐｍで遠心分離することによって試料が濃縮され得る（Ｖｉｖａｓｐｉｎ（カットオフ５０００ＭＷ）、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）。次に、ＰＢＳで平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １６／６０カラムに濃縮試料がロードされる。ピーク画分がプールされ、定量化のために試料のＯＤ２８０が測定される。約１ｍｇ／ｍｌの濃度で一定分量が−２０℃で保存される。
【０３９０】
免疫化
Ｃ末端がＫＬＨに結合したヒトＭＵＣ１６ペプチド（ｈＭＵＣ１６）（ＮＦＳＰＬＡＲＲＶＤＲＶＡＩＹＥＥＦＬＲＭＴＲＮＧＴＱＬＱＮＦＴＬＤＲＳＳＶＬＶＤＧＹＳＰＮＲＮＥＰＬＴＧＮＳＤＬＰ−Ｃ−ＫＬＨ）及び／またはＣ末端がビオチン化されたヒトＭＵＣ１６ペプチド（ＮＦＳＰＬＡＲＲＶＤＲＶＡＩＹＥＥＦＬＲＭＴＲＮＧＴＱＬＱＮＦＴＬＤＲＳＳＶＬＶＤＧＹＳＰＮＲＮＥＰＬＴＧＮＳＤＬＰ−Ｃ−ビオチン）及び／またはＮ末端がビオチン化されたヒトＭＵＣ１６ペプチド（ビオチン−ＮＦＳＰＬＡＲＲＶＤＲＶＡＩＹＥＥＦＬＲＭＴＲＮＧＴＱＬＱＮＦＴＬＤＲＳＳＶＬＶＤＧＹＳＰＮＲＮＥＰＬＴＧＮＳＤＬＰ）を、０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、及び３５日目にラマに皮下注射した。ビオチン化ペプチドについては、中和のためのアビジンと注射前に混合した。ＧＥＲＢＵ  ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｐ（ＧＥＲＢＵ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ）をアジュバントとして使用した。４０日目に、リンパ球調製用に血液約１００ｍｌをラマから収集し、抗凝固処理した。
【０３９１】
ＶＨＨライブラリーの構築
抗原特異的ナノボディの存在をスクリーニングするために、ラマリンパ球からＶＨＨライブラリーを構築した。この目的を達成するために、末梢血リンパ球から得られた全ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いる第１鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用した。このｃＤＮＡを使用してＰＣＲによってＶＨＨコード配列を増幅し、ＳＡＰＩで消化し、ファージミドベクターｐＭＥＣＳ−ＧＧのＳＡＰＩ部位にクローニングした。こうして得られたＶＨＨライブラリーをＣｏｒｅ９３ＧＧと命名した。このライブラリーは、約１０８個の独立した形質転換体からなり、これらの形質転換体の約８７％が、正しい挿入サイズのベクターを保有するものである。
【０３９２】
ヒトＭＵＣ１６ペプチド特異的ナノボディの単離
Ｃ末端またはＮ末端のいずれかがビオチン化されたｈＭＵＣ１６ペプチドＮＦＳＰＬＡＲＲＶＤＲＶＡＩＹＥＥＦＬＲＭＴＲＮＧＴＱＬＱＮＦＴＬＤＲＳＳＶＬＶＤＧＹＳＰＮＲＮＥＰＬＴＧＮＳＤＬＰ（ｂｉｏ−ｈＭＵＣ１６）に対してＣｏｒｅ９３ＧＧライブラリーのパニングを４ラウンド行った。ストレプトアビジンでコートされたプレートとｂｉｏ−ｈＭＵＣ１６ペプチドとを相互作用させた後、ライブラリー由来のファージをプレートに添加した。抗原でコートされたウェルから溶出したファージミド粒子の数と、陰性対象ウェル（ストレプトアビジンでコートされており、ブロッキングされているが、ペプチドを含まないウェル）から溶出したファージミド粒子の数と、を比較することによってパニングの各ラウンド後に抗原特異的ファージの濃縮を評価した。こうした実験から、ファージ集団中の抗原特異的ファージが、２回目のラウンド後に約２倍に濃縮されたことが示唆された。１回目のラウンド後、３回目のラウンド後、及び４回目のラウンド後には濃縮は観測されなかった。全部で３８０個のコロニー（３ラウンド目から１９０個、４ラウンド目から１９０個）を無作為に選択し、そのペリプラズム抽出物における抗原特異的ナノボディの存在についてＥＬＩＳＡ（可溶性ナノボディを含む未精製のペリプラズム抽出物を使用するＥＬＩＳＡ）によって分析した。ＥＬＩＳＡスクリーニングについては、パニングに使用したペプチドと同じペプチドを使用し、ストレプトアビジンでコートされたブロッキング済のペプチド無添加ウェルを陰性対象として使用して実施した。このアッセイでは、これら３８０個のコロニーのうち、３４個のコロニーが陽性判定された。陽性コロニーの配列データに基づいて６つの異なる全長ナノボディが識別され、これらの全長ナノボディは、２つの異なるＣＤＲ３群（Ｂ細胞系譜）に属するものであった（Ｅｘｃｅｌファイルを参照のこと）。同じＣＤＲ３群（同じＢ細胞系譜）に属するナノボディは非常に類似しており、それらのアミノ酸配列は、そうしたナノボディが、体細胞超変異に起因して生じたクローン的に関連するＢ細胞に由来するものであるか、あるいは同じＢ細胞に由来するが、ライブラリー構築中にＲＴエラー及び／またはＰＣＲエラーに起因して多様化したものであることを示唆している。同じＣＤＲ３群に属するナノボディは、同じエピトープを認識するが、それらの他の特徴（例えば、親和性、効力、安定性、発現収量など）は異なり得る。こうしたパニングに由来するクローンは、その名称にＭＵというコードを有する。
【０３９３】
ｈＭＵＣ１６ペプチド特異的ナノボディのフローサイトメトリー分析
ナノボディ及び細胞
上記の最初のＥＬＩＳＡスクリーニングを行うために実施した方法と同じ方法で、各抗ｈＭＵＣ１６−ペプチドＮｂを得るためのペリプラズム抽出物を調製した。各細胞株（ＳＫＯＶ３  Ｍｕｃ１６  Ｌｕｃ、ＯＶＣＡＲ３  Ｍｕｃ１６  Ｌｕｃ、Ｅｘｐｉ−２９３、及びＪｕｒｋａｔ）に由来する細胞を解凍し、洗浄し、数を数えた。各Ｎｂクローンから得られたペリプラズム抽出物を約２×１０５個の細胞と共にインキュベートした。洗浄後、マウス抗ＨＡタグ抗体と抗マウス−ＰＥとの混合物と共に細胞をインキュベートした。洗浄をもう一回行った後、生死判定染色剤としてＴｏｐｒｏを各試料に添加し、細胞をフローサイトメーターで分析した。ＳＫＯＶ３  Ｍｕｃ１６  Ｌｕｃ細胞及びＯＶＣＡＲ３  Ｍｕｃ１６  Ｌｕｃ細胞に対してＭａｂ（ヒト抗Ｍｕｃ１６−４ｈ１１（＋抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ＋Ｔｏｐｒｏ））を陽性対象として使用した。無関係のＮｂ（ＢＣＩＩ１０−細菌βラクタマーゼ特異的）を含む試料、すべての検出Ｍａｂを含む試料、二次抗マウス−ＰＥ  Ｍａｂを単独で含む試料、及び細胞を単独で含む試料（Ｔｏｐｒｏ含有及びＴｏｐｒｏ非含有）を各細胞株に対する陰性対象として使用した。
【０３９４】
実施例６：ｈＭＵＣ１６標的に対する抗ＭＵＣ１６  ｓｄＡｂのスクリーニング
実施例５において得られたＶＨＨ結合物質のスクリーニングは、ＮＴＡバイオセンサー（ニッケルカラム、方法の概要を示す図面については図５Ａを参照のこと）を使用して実施される。Ｈｉｓタグ付きＭＵＣ１６  ｓｄＡｂ（３．２５μｇ／ｍｌ）がカラムに結合された後、ＭＵＣ１６ペプチドが２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１．５６ｎＭ、及び０ｎＭの濃度でカラムを通過する。緩衝液：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を０．０２％含む３０℃の１×Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｅｌｌｇｒｏ（登録商標）ＰＢＳ  ｐＨ７．４（カタログ番号２１−０４０−ＣＭ）。センサー：Ｐａｌｌ  Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｄｉｐ  ＆  Ｒｅａｄ（カタログ１８−５１０２）。
【０３９５】
ＭＵＣ１６標的に対する２つのクローン（Ｒ３Ｍｕ４ラマｓｄＡｂ及びＲ３Ｍｕ４ヒト化ｓｄＡｂ（図１Ｃ）、ならびにＲ３Ｍｕ２９ラマｓｄＡｂ及びＲ３Ｍｕ２９ヒト化ｓｄＡｂ（図１Ｄ））の飽和結合から、親αＭｕｃ１６  ｓｄＡｂ及びヒト化αＭｕｃ１６  ｓｄＡｂバリアントが、６〜９４ｎＭの範囲のＫＤ値を伴ってＭＵＣ１６細胞外ドメイン（「ＭＵＣ１６細胞外」）ペプチドに対して高親和性結合を示すことが実証されている。ヒト化バリアントによって示された親和性は、それらのそれぞれの親ラマクローンと比較するといくらか失われている。表３にまとめが示される。
【０３９６】
【表３】
2021530503.tif 000005
【０３９７】
実施例７：４Ｈ１１ツール結合物質と比較して行う抗ＭＵＣ１６結合物質のエピトープビニング
ＭＵＣ１６親Ｒ３Ｍｕ４  ｓｄＡｂ及びＭＵＣ１６親Ｒ３Ｍｕ２９  ｓｄＡｂが、４Ｈ１１  ｓｃＦｖ−Ｆｃツール結合物質（４Ｈ１１ハイブリドーマ由来）と比較してエピトープが同じまたは異なるものにビン分類されるかどうかを決定するためにサンドイッチアッセイを使用した（図６Ａを参照のこと）。
【０３９８】
図６Ｂに示されるように、ＭＵＣ１６  ｓｄＡｂ（親（ラマ）Ｒ３Ｍｕ４及び親（ラマ）Ｒ３Ｍｕ２９）では４Ｈ１１ツール結合物質曝露後に結合が生じており、このことは、これらの親ｓｄＡｂが、４Ｈ１１  ｓｃＦｖ−Ｆｃツール結合物質と比較して、ＭＵＣ１６ペプチドの異なるエピトープを認識するものであり、ＭＵＣ１６ペプチドのエピトープが異なるものにビン分類されることを実証している。抗原（ＭＵＣ１６ペプチド）を用いない陰性対象では結合が生じていないことから、非特異的な結合が生じている可能性は完全に排除されている。図６Ｃには、これらの親ラマ抗体（Ｒ３Ｍｕ４及びＲ３Ｍｕ２９）の結合エピトープを示す図が示される。
【０３９９】
実施例８：ＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞を用いる前臨床試験
ＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞を前臨床インビトロ試験において評価した（図７）。細胞結合型のＣ末端ＭＵＣ１６形態を過剰発現するように形質導入されたＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６Ｃｔｅｒｍ卵巣癌細胞がＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって用量依存的な様式で特異的に死滅した一方で、ＭＵＣ１６陰性の親ＳＫＯＶ３細胞はＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞介在性の死滅を受けることなく残った。同様に、細胞結合形態のＭＵＣ１６を過剰発現するＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６−Ｃｔｅｒｍ細胞は、ＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって排除された。ＭＵＣ１６の発現レベルが低い親ＯＶＣＡＲ３細胞は、ＴＦＰ−Ｔ細胞：標的細胞比が最大のときにのみ死滅しており、このことは、腫瘍細胞が用量依存的に溶解することを明確に示している。同様に、ＴＦＰ−Ｔ細胞は、標的細胞上にＭＵＣ１６が存在するときにのみサイトカインを放出した。図８は、ＭＵＣ１６を高レベルで発現する卵巣細胞株及びＭＵＣ１６を低レベルで発現する卵巣細胞株を使用する細胞アッセイにおけるＭＵＣ１６−ＴＦＰの効力を示す実験データ例を示す。こうした試験では、腫瘍細胞表面上のＭＵＣ１６のレベルに応じてＭＵＣ１６−ＴＦＰが死滅を優先的に引き起こす能力を有することが観測された。より明確には、ＭＵＣ１６を高発現する腫瘍細胞をＭＵＣ１６−ＴＦＰが用量依存的な様式で死滅させることが観測された一方で、ＭＵＣ１６を低発現する細胞をＭＵＣ１６−ＴＦＰが死滅させることは、こうしたアッセイで使用した用量レベルでは観測されなかった。
【０４００】
実施例９．フローサイトメトリーベースのＭＵＣ１６細胞外コピー数の定量化
細胞結合型のＣ末端ＭＵＣ１６形態（ＭＵＣ１６細胞外）に特異的な抗体４Ｈ１１を、米国特許第９，１６９，３２８号に従って生成させた後、ＰＥと結合させた。抗体当たりの平均ＰＥ分子数は約１と推定された。卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ３及びＳＫＯＶ３）、またはＭＵＣ１６細胞外を安定的に過剰発現する派生体（ＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞及びＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞）を、試料当たり２μｇの４Ｈ１１−ＰＥ  Ａｂを用いて染色した。製造者の説明に従ってＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ  Ｂｅａｄｓ  ＰＥ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって細胞表面ＭＵＣ１６細胞外のコピー数を推定した。４Ｈ１１−ＰＥ抗体で染色した腫瘍細胞をＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズと一緒にＦｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）Ｘ−２０で分析した。細胞ならびにビーズについて蛍光強度の幾何学的中央値（ｇＭＦＩ）を計算した。ビーズストックは、ビーズ当たりのＰＥ分子数が異なるように製造された４つの集団（高、中、低、無）を含む。各ビーズセットについて、測定したＭＦＩに対するビーズ当たりの所与のＰＥ分子コピー数に基づいて標準曲線を作成した。次に、ビーズを用いて作成した標準曲線に基づいて腫瘍細胞上のＭＵＣ１６細胞外のコピー数を推定した。ＯＶＣＡＲ３細胞、ＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞、ＳＫＯＶ３細胞、及びＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞上のＭＵＣ１６細胞外のコピー数を、それぞれ７２６、３６１６、３９、及び２３５１と決定した（図９Ｂ）。
【０４０１】
実施例１０．ＭＵＣ１６−ＴＦＰ  Ｔ細胞によるＭＵＣ１６細胞外特異的な腫瘍細胞溶解
ＭＵＣ１６−ＴＦＰ  Ｔ細胞によるＭＵＣ１６細胞外特異的な腫瘍細胞溶解をインビトロ細胞傷害性アッセイによって評価した。ＭＵＣ１６細胞外を発現する腫瘍細胞株、またはＭＵＣ１６細胞外を発現しない腫瘍細胞株に対して、レポーターとしてホタルルシフェラーゼを発現するように、安定的な形質導入を行った。２４時間の共培養後、共培養した細胞のルシフェラーゼ活性を、残存する生存腫瘍細胞の代替指標としてＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２６１０）を用いて決定した。次に、下記の式を用いて腫瘍細胞の死滅パーセントを計算した：腫瘍細胞溶解％＝１００％×［１−ＲＬＵ（腫瘍細胞＋Ｔ細胞）／ＲＬＵ（腫瘍細胞）］。
【０４０２】
ＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞によってＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞が特異的に死滅した（図１０Ａ）一方で、親ＳＫＯＶ３細胞は、ＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞介在性の死滅を受けることなく残った（図１０Ｂ）。同様に、細胞結合形態のＭＵＣ１６を過剰発現するＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞は、ＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって排除された（図１０Ｃ）。ＭＵＣ１６細胞外の発現レベルが低い親ＯＶＣＡＲ３細胞の死滅は部分的なものにすぎなかった（図１０Ｄ）。
【０４０３】
実施例１１．ＭＵＣ１６−ＴＦＰ  Ｔ細胞によるＭＵＣ１６細胞外特異的なサイトカイン産生
ＭＵＣ１６細胞外を発現するさまざまな腫瘍細胞、またはＭＵＣ１６細胞外を発現しないさまざまな腫瘍細胞と、ＭＵＣ１６−ＴＦＰ  Ｔ細胞と、の共培養物から収集した上清について、ＭＵＣ１６−ＴＦＰ  Ｔ細胞によるＭＵＣ１６細胞外特異的なサイトカイン産生を決定した。この上清におけるヒトのＩＦＮ−γ及びＩＬ−２のレベルを、ＭＡＧＰＩＸ  Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＭＡＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して分析し、この分析では、２プレックスキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＨＣＹＴＯＭＡＧ−６０Ｋ）を用いた。
【０４０４】
ＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞は、抗原特異的な様式で炎症促進性サイトカインを分泌した。ＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞は、ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌し（それぞれ図１１Ａ及び図１１Ｅ）、またはＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と共培養されるとＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌したが（それぞれ図１１Ｃ及び図１１Ｇ）、ＳＫＯＶ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌せず（それぞれ図１１Ｂ及び図１１Ｆ）、またはＯＶＣＡＲ３細胞との共培養ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌しなかった（それぞれ図１１Ｄ及び図１１Ｈ）。
【０４０５】
実施例１２．ＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞のＭＵＣ１６細胞外特異的な増殖
Ｔ細胞追跡シグナルの希釈（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）のシグナル強度の減少）をフローサイトメトリー分析によって監視することによってＭＵＣ１６−ＴＦＰ  Ｔ細胞がＭＵＣ１６細胞外特異的に増殖するかを決定した。ＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｆａｒ  Ｒｅｄ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎキット（カタログ番号Ｃ３４５６４ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識した後、ＳＫＯＶ３細胞またはＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞と１：１の比で３日間共培養した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎキットで標識したＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞を、培地単独、またはプレートに１μｇ／ｍＬで結合させた抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ−３、カタログ番号１４−００３７−８２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３日間刺激することも行った。ＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞はＭＵＣ１６細胞外特異的に増殖することが示され、このことは、ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞との共培養時にはＣｅｌｌＴｒａｃｅｒシグナルが減少するが、ＳＫＯＶ３細胞との共培養時にはこの減少が生じないことによって実証された（図１２）。
【０４０６】
実施例１３．ＭＵＣ１６−ＴＦＰ  Ｔ細胞のインビボでの活性
ヒト卵巣癌細胞株（ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞及びＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞）のＮＳＧマウス異種移植モデルにおいてＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞を評価した。６週齢の雌性ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号００５５５７）マウスの腹腔内にＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞（５×１０５個細胞／マウス）もしくはＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞（５×１０６個細胞／マウス）を接種するか、または当該マウスの皮下にＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞（５×１０６個細胞／マウス、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）との１：１混合物）を接種した。腹腔内モデルについては、ＰＢＳで希釈した０．２ｍｌのルシフェリン基質（ＶＷＲ）（１５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して生物発光画像化法（ＢＬＩ）によって腫瘍量を決定した。皮下モデルの腫瘍量は、腫瘍体積としてノギスで測定した。腫瘍モデルが確立された時点で（腹腔内モデル：ＢＬＩシグナル＞１０８；皮下モデル：腫瘍体積＞７５ｍｍ３）、ＭＵＣ１６−ＴＦＰ発現Ｔ細胞（ＭＵＣ１６  ＴＦＰ１及びＭＵＣ１６  ＴＦＰ２）もしくは非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）をマウス当たり１０７個のＴ細胞用量で静脈内注射するか、または媒体（ＰＢＳ）を静脈内注射した。
【０４０７】
ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞及びＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞の腹腔内モデル及び皮下モデルにわたってＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞のインビボでの有効性が観測された。ＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞の腹腔内モデルでは、０日目（Ｔ細胞の注射日）のベースラインレベルと比較するとＭＵＣ１６  ＴＦＰ１が腫瘍量を有意に低減することが示された（図１３Ａ）。この結果と一致して、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ１は、ＮＴ  Ｔ細胞と比較してＳＫＯＶ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞の皮下モデルにおいて腫瘍増殖を有意に遅延させた（図１３Ｂ）。ＯＶＣＡＲ３−ＭＵＣ１６細胞外細胞の腹腔内モデルでは、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ１及びＭＵＣ１６  ＴＦＰ２は共に、マウスから腫瘍を完全に消失させた（図１３Ｃ）。
【０４０８】
実施例１４：抗ＭＵＣ１６単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質を使用する正常ヒト組織の免疫組織化学染色
この試験の目的は、正常ヒト組織のＭＵＣ１６発現に関する情報を得ることとした。
【０４０９】
ＨＲＰ結合型抗マウスＦｃ二次抗体を使用して検出するためのマウスＦｃ領域と遺伝子的に融合した抗ＭＵＣ１６単一ドメイン抗体を用いて対照材料及びＦＦＰＥ切片を染色した。２人のドナーから得られたヒト卵巣腫瘍のＦＦＰＥ切片を陽性対象とした。陰性対象は、ヒト心臓のＦＦＰＥ切片とした。試験した組織の一団には、下記のものが含まれる：１人のドナーごとから得られる血液細胞、小脳または大脳皮質、胃腸管（食道、小腸、胃、結腸（入手可能な場合））、脾臓、腎臓（糸球体、尿細管）、肝臓、リンパ節、皮膚、胎盤、精巣、及び扁桃腺。
【０４１０】
結果：異なるドナーから得られた２つのヒト卵巣癌組織を陽性対象として使用し、これらのヒト卵巣癌組織は、新生物性の細胞膜及び細胞質については、１〜３＋（低頻度〜高頻度）及び１〜４＋（低頻度〜高頻度）の範囲の異なる強度で染色された。正常組織については、１）ヒト胃上皮、胃壁（細胞質、細胞質顆粒）−  １〜２＋（低頻度〜高頻度）、ならびに２）ヒト扁桃腺上皮表面、扁桃陰窩（膜、細胞質、及び他の構成要素）−  １〜３＋（超低頻度〜低頻度）、の２つを除けば、すべてがＭＵＣ１６染色に陰性であった。
【０４１１】
こうしたデータは、ＭＵＣ１６の発現が正常ヒト組織では限られたものであり、ある特定の腫瘍でＭＵＣ１６の発現が上昇することを実証している。これによって、ＭＵＣ１６が、ＭＵＣ１６陽性悪性腫瘍のがん治療のための魅力的な標的となっている。ＭＵＣ１６特異的単一ドメイン抗体は、抗原陽性組織に結合し、それを染色することが可能であった。
【０４１２】
実施例１５：臨床試験
再発疾患または難治性疾患を伴って切除不能の卵巣癌を有する患者が、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞の臨床試験に参加することになる。最初の試験では、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞の安全性プロファイル、ならびに細胞動態及び薬力学アウトカムについて調査されることになる。そうした結果の知見からさらなる試験の用量が選択されることになり、次に、この用量が、切除不能の卵巣癌を有する患者のより大きなコホートに投与されてＭＵＣ１６  ＴＦＰ発現Ｔ細胞の有効性プロファイルが定義されることになる。
【０４１３】
実施例１６：抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰ  Ｔ細胞は、ＭＳＬＮを高発現する腫瘍細胞を優先的に死滅させる。
ＭＳＬＮ高発現腫瘍（ＭＳＴＯ−ＭＳＬＮ高（表面ＭＳＬＮのコピー数１１００６））に対するＭＳＬＮ−ＴＦＰ  Ｔ細胞の死滅誘発能力と、ＭＳＬＮ低発現腫瘍（ＭＳＴＯ−ＭＳＬＮ低（表面ＭＳＬＮのコピー数１９８））に対するＭＳＬＮ−ＴＦＰ  Ｔ細胞の死滅誘発能力と、の差異を、ＭＳＴＯ−ＭＳＬＮ高腫瘍またはＭＳＴＯ−ＭＳＬＮ低腫瘍のいずれかを有するＮＳＧマウスにおいて調べた。
【０４１４】
ＭＳＴＯ−ＭＳＬＮ高細胞及びＭＳＴＯ−ＭＳＬＮ低細胞を１×１０６個細胞／１００μＬの濃度で滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再浮遊させた。次に、このＰＢＳ細胞浮遊液を氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）と１：１で混合し、最終注射体積をマウス当たり２００μＬとした。滅菌ＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）における腫瘍細胞浮遊液２００μＬをすべての動物の背側及び腹側部に皮下投与によって注射した。１週間に２回、ノギスで腫瘍体積を測定することによって腫瘍増殖を監視した。腫瘍モデルが確立された時点で（腫瘍注射から１４日後）（平均腫瘍体積は約３００ｍｍ３に達していた）、担腫瘍マウスに対して、非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ、Ｔ細胞総数１×１０７）またはＭＳＬＮ−ＴＦＰ  Ｔ細胞（Ｔ細胞総数１×１０７）を静脈内注射した。
【０４１５】
ＮＴ  Ｔ細胞で処理したマウスと比較して、ＭＳＬＮ−ＴＦＰ  Ｔ細胞はＭＳＬＮ高発現腫瘍の増殖を劇的に制御した（図１４Ａ）。一方、ＭＳＬＮ低発現腫瘍を有するマウスをＭＳＬＮ−ＴＦＰ  Ｔ細胞で処理して観測された抗腫瘍応答は限定されたものであった（図１４Ｂ）。１匹の動物では腫瘍の退縮が観測されたが、ＭＳＬＮ−ＴＦＰ  Ｔ細胞で処理したその他の９匹のマウスでは、ＮＴ  Ｔ細胞を投与した動物と比較して腫瘍進行速度が遅い（ｎ＝２）、または同様（ｎ＝６）であった（図１４Ｂ）。
【０４１６】
注記
本発明の好ましい実施形態が本明細書に明示及び説明されているが、そのような実施形態は例として提供されるものにすぎないことが当業者には明らかであろう。この時点で、当業者なら本発明から逸脱することなく多数の変形、変更、及び置き換えを想到するであろう。本発明を実施する上では、本明細書に記載の本発明の実施形態に対するさまざまな代替形態を利用できると理解されたい。添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義するものであり、それによって、この特許請求の範囲に含まれる方法及び構造、ならびにその均等物が包含されることが意図される。
【０４１７】
【表４−１】
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【０４１８】
【表４−２】
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【０４１９】
【表４−３】
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【０４２０】
【表４−４】
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【０４２１】
【表４−５】
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【０４２２】
【表４−６】
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【０４２３】
【表４−７】
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【０４２４】
【表４−８】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１２】
2021530503.tif 000045
【図１３Ａ】
2021530503.tif 000046
【図１３Ｂ】
2021530503.tif 000047
【図１３Ｃ】
2021530503.tif 000048
【図１４Ａ】
2021530503.tif 000049
【図１４Ｂ】
2021530503.tif 000050
【配列表】
2021530503000001.app
【国際調査報告】
2021530503.tif 000051
2021530503.tif 000052
2021530503.tif 000053
2021530503.tif 000054
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2021530503.tif 000056
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