(57)【要約】  テガビビントおよび関連化合物の製剤、そのような製剤を作製する方法、およびそのような製剤を利用して様々な状態を治療する方法。
2021525759.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）式Ｉの化合物
【化１】
2021525759.tif 000031
（式中、ＲＡは水素であり、Ｒ７およびＲ８は独立して、ＨおよびＳＯ２ＮＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ７およびＲ８のうちの１つは水素であり、ＮＲ１Ｒ２およびＮＲ３Ｒ４は独立して、環に１個の窒素を含む６〜１５員ヘテロシクロアルキルである）、またはその薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体の粒子と、
ｂ）界面活性剤と、を含み、
レーザー回折を使用して測定した場合、前記粒子が５００ｎｍ以下の有効Ｄ５０および１．０マイクロメートル（μｍ）以下のＤ９０を有する、組成物。
【請求項２】
前記式Ｉの化合物は、テガビビントまたはその薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物はナノ粒子組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記界面活性剤はポロキサマー界面活性剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポロキサマー界面活性剤はポロキサマー１８８である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は安定剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記安定剤は、糖、ポリオール、ポリソルベート界面活性剤およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記糖は、スクロースおよびトレハロースからなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリオールはソルビトールおよびマンニトールを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記化合物の濃度は約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記化合物の濃度は約２５ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
ａ．１０〜２５ｍｇ／ｍｌのテガビビントまたはその薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体と、
ｂ．ポロキサマー１８８と、
Ｃ．ソルビトールと、を含み、
テガビビントまたはその薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体は、テガビビントまたは前記その薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体の粒子を含むナノ懸濁液の形態であり、レーザー回折を使用して測定した場合、前記粒子が５００ｎｍ以下の有効Ｄ５０および１．０マイクロメートル（μｍ）以下のＤ９０を有する、組成物。
【請求項１３】
テガビビントまたは前記その薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体の量は２５ｍｇ／ｍｌであり、
ポロキサマー１８８の量は０．６２５％であり、
ソルビトールの量は１０％であり、パーセンテージは組成物の重量によるものである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物は粉砕によって調製される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物はリヨセル技術によって調製される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
組成物を調製するプロセスであって、
ａ）前記式Ｉの化合物
【化２】
2021525759.tif 000032
（式中、ＲＡは水素であり、Ｒ７およびＲ８は独立して、ＨおよびＳＯ２ＮＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ７およびＲ８のうちの１つは水素であり、ＮＲ１Ｒ２およびＮＲ３Ｒ４は独立して、環に１個の窒素を含む６〜１５員ヘテロシクロアルキルである）、またはその薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体の粒子を、
界面活性剤および許容される担体と混合して懸濁液を生成することと、
ｂ）ローラーミルによってまたは高エネルギーミルを使用してステップ（ａ）の懸濁液を粉砕することと、
ｃ）ステップ（ｂ）の粒子にポリオールを加えることと、を含む、プロセス。
【請求項１７】
前記組成物は長期安定性を示す、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記式Ｉの化合物は、テガビビント、またはその薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物は、
（ａ）錠剤およびカプセルからなる群から選択される剤形、
（ｂ）制御放出製剤、速溶性製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、拍動性放出製剤、および混合即時放出および制御放出製剤からなる群から選択される剤形、
（ｃ）筋肉内、皮下、静脈内および皮内注射を含む、吸入もしくは非経口投与に適した剤形、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の任意の組み合わせに製剤化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
哺乳動物における癌または腫瘍転移を予防、治療または改善する方法であって、それを必要とする前記哺乳動物に有効量の請求項１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２１】
癌を治療するための方法であって、
１）薬学的に有効な量の請求項１に記載のナノ粒子組成物、および
２）薬学的に有効な量の少なくとも１つの追加の抗癌剤、の組み合わせを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
前記追加の抗癌剤は、抗有糸分裂剤、代謝拮抗剤、ＨＤＡＣ阻害剤、プロテオソーム阻害剤、免疫療法剤、ＦＬＴ−３  ＥＧＦＲ、ＭＥＫ、ＰＩ３Ｋおよび他のプロテインキナーゼ阻害剤、ＬＳＤ１阻害剤、およびＷＮＴ経路阻害剤、アルキル化剤およびＤＮＡ修復経路阻害剤、抗ホルモン剤、抗癌抗体、ならびに他の細胞毒性化学療法剤からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物における線維性疾患を治療および／または予防する方法であって、それを必要とする前記哺乳動物に有効量の請求項１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２４】
前記線維性疾患は、肺線維症、デュピュイトラン拘縮、強皮症、全身性硬化症、強皮症様障害、皮膚硬化のない強皮症、肝硬変、間質性肺線維症、ケロイド、慢性腎疾患、慢性移植片拒絶、および他の瘢痕／創傷治癒異常、術後癒着、反応性線維症からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、テガビビントおよび関連化合物の製剤、そのような製剤を作製する方法、およびそのような製剤を利用して様々な状態を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、米国で２番目に多い死因である。それは、新しい治療法の開発に複雑な課題を提示する。癌は、腫瘍塊の増殖をもたらす一連の遺伝的変化を経た悪性細胞の異常な成長および転移特性を特徴とする。
【０００３】
ベータカテニン（β−カテニン）は、接着結合（ＡＪ）を構成するタンパク質の複合体の一部である。ＡＪは、細胞成長および細胞間の接着を調節することにより、上皮細胞層の形成および維持に必要である。β−カテニンはまた、アクチン細胞骨格を固定し、上皮シートが完成したときに細胞分裂の停止を引き起こす接触抑制シグナルの伝達に関与している可能性がある。
【０００４】
Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、癌において役割を果たすことが示されている。異常なβ−カテニンシグナル伝達は、腫瘍形成において重要な役割を果たす。特に、結腸直腸癌は、β−カテニン経路に８０％を超える変異があり、無秩序な発癌性シグナル伝達をもたらすと推定されている。異常なβ−カテニンシグナル伝達は、限定されないが、メラノーマ、乳癌、肺癌、結腸癌、肝臓癌、胃癌、骨髄腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、結腸直腸および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の癌を含む様々な種類の癌に関与することが示されている。さらに、異常なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、骨粗鬆症、骨関節炎、多嚢胞性腎臓病、糖尿病、統合失調症、血管疾患、心臓病、過剰増殖性障害、神経変性疾患、および線維性疾患（限定されないが、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、デュピュイトラン拘縮、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）等を含む）を含む他の多くの障害に見出されている。骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）は、体の血球を産生する骨髄細胞が発達して異常に機能する、密接に関連した血液悪性腫瘍のグループである。３つの主要な骨髄増殖性腫瘍は、真性多血症（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）、および原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）である。ＪＡＫ２の遺伝子変異は、ほとんどのＰＶ患者と、ＥＴおよびＰＭＦ患者の５０％に見られる。ベータカテニン経路は、多くの場合ＭＰＮで活性化され、これらの細胞の生存に必要である。
【０００５】
テガビビントおよび関連化合物は、例えば、米国特許第８，１２９，５１９号に記載されている。テガビビントは、以下の構造式を有する。
【化１】
2021525759.tif 000003
【０００６】
テガビビントの分子式はＣ２８Ｈ３６Ｎ４Ｏ６Ｓ２である。
【０００７】
テガビビントの分子量は５８８．２０７６３ａｍｕである。
【０００８】
テガビビントおよび関連化合物の安定で、容易に生体利用可能な製剤を提供することが当技術分野で必要であり、製剤は、非経口および吸入を含むがこれらに限定されない異なる投与経路を介した投与を可能にし、テガビビントで治療可能な様々な疾患の臨床試験および治療に好適であるように安定である。
【発明の概要】
【０００９】
安定した非毒性テガビビント製剤を開発することは非常に課題が多く、困難であった。多数の製剤が開発され、試験が行われた。しかしながら、それらはバイオアベイラビリティが低く、かつ／または保存時に不安定であることが証明され、かつ／または非常に毒性が高いことが判明した。これらの製剤には、マイクロエマルジョン、固体懸濁液、リポソームベースの製剤、様々な経口製剤、およびＩＶ製剤が含まれる。
【００１０】
本発明者らは、予想外にかつ驚くべきことに、テガビビントのナノ懸濁液が効果的であり、該ナノ懸濁液は界面活性剤を含み、レーザー回折を使用して測定した場合、テガビビントの粒子が５００ｎｍ以下の有効Ｄ５０および１．０マイクロメートル（μｍ）以下のＤ９０を有することを発見した。テガビビントの特に好ましい濃度は１０〜２５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは２５ｍｇ／ｍｌであることも発見された。好ましい界面活性剤は、好ましくは０．６２５％の濃度のポロキサマー界面活性剤（好ましくはポロキサマー１８８）であり、ナノ懸濁液は、好ましくはポリオール、より好ましくはソルビトールを含むべきである。
【００１１】
したがって、最も好ましい製剤は、２５ｍｇ／ｍｌのテガビビント、０．６２５％のポロキサマー１８８、および１０％ソルビトールを含む組成物であって、テガビビントがテガビビントの粒子を含むナノ懸濁液の形態であり、レーザー回折を使用して測定した場合に、粒子が５００ｎｍ以下の有効Ｄ５０および１．０マイクロメートル（μｍ）以下のＤ９０を有する組成物である。
【００１２】
したがって、一実施形態では、本発明は、
ａ）式Ｉ
【化２】
2021525759.tif 000004
（式中、ＲＡは水素であり、Ｒ７およびＲ８は独立して、ＨおよびＳＯ２ＮＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ７およびＲ８のうちの１つは水素であり、ＮＲ１Ｒ２およびＮＲ３Ｒ４は独立して、環に１個の窒素を含む６〜１５員ヘテロシクロアルキルであるか、またはその薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体である）の化合物の粒子と、
ｂ）界面活性剤と、を含み、
レーザー回折を使用して測定した場合、粒子が５００ｎｍ以下の有効Ｄ５０および１．０マイクロメートル（μｍ）以下のＤ９０を有する、組成物を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、化合物の有効平均粒径は、約４９００ｎｍ、約４８００ｎｍ、約４７００ｎｍ、約４６００ｎｍ、約４５００ｎｍ、約４４００ｎｍ、約４３００ｍｍ、約４２００ｎｍ、約４１００ｎｍ、約４ミクロン、約３９００ｎｍ、約３８００ｎｍ、約３７００ｎｍ、約３６００ｎｍ、約３５００ｎｍ、約３４００ｍｍ、約３３００ｎｍ、約３２００ｎｍ、約３１００ｎｍ、約３ミクロン、約２９００ｍｍ、約２８００ｎｍ、約２７００ｎｍ、約２６００ｎｍ、約２５００ｎｍ、約２４００ｎｍ、約２３００ｎｍ、約２２００ｎｍ、約２１００ｎｍ、約２０００ｎｍ、約１９００ｎｍ、約１８００ｎｍ、約１７００ｎｍ、約１６００ｎｍ、約１５００ｎｍ、約１４００ｎｍ、約１３００ｎｍ、約１２００ｎｍ、約１１００ｎｍ、約１０００ｎｍ、約９００ｎｍ、約８００ｎｍ、約７００ｎｍ、約６００ｎｍ、約５００ｎｍ、約４００ｎｍ、または約３００ｎｍである。
【００１４】
さらに、いくつかの実施形態では、化合物の有効平均粒径は、９００ｎｍ未満、より好ましくは５００ｎｍ未満、さらにより好ましくは３００ｎｍ未満である。
【００１５】
好ましい実施形態では、界面活性剤はポロキサマー界面活性剤である。
【００１６】
別の好ましい実施形態において、ポロキサマー界面活性剤はポロキサマー１８８である。
【００１７】
好ましい実施形態では、粒子組成物は、安定剤をさらに含む。
【００１８】
好ましい実施形態では、安定剤は、糖、ポリオール、ポリソルベート界面活性剤、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）からなる群から選択される。
【００１９】
別の好ましい実施形態において、糖は、スクロースおよび／またはトレハロースからなる群から選択される。
【００２０】
好ましい実施形態では、ポリオールは、ソルビトールおよび／またはマンニトールを含む。
【００２１】
一実施形態では、提供される組成物中の化合物の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約２５ｍｇ／ｍｌである。
【００２２】
一実施形態では、本発明の組成物は、粉砕によって調製される。
【００２３】
別の実施形態では、本発明の組成物は、リヨセル技術によって調製される。米国特許第７，７１３，４４０号は、リヨセル技術について記載している。米国特許第７，７１３，４４０号の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２４】
別の実施形態では、本発明の組成物は、米国特許第８，８０８，７５１号に記載されるような乾式粉砕手法によって調製することができる。米国特許第８，８０８，７５１号の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。粉砕媒体および好適な研磨化合物を適切に選択することにより、従来の原薬粒子からナノ粒子組成物を生成し、乾式粉砕装置で生成される小さな粒子の凝集を防ぐことが可能である。
【００２５】
さらに別の実施形態では、本発明の組成物は、米国特許第６，５３７，５７９号に記載されているプロセス等の、担体としてヒト血清アルブミンを利用するプロセスによって調製することができる。米国特許第６，５３７，５７９号の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。このプロセスは、水溶性が低い化合物のナノ粒子組成物を作製するのに特に適している可能性がある。そのようなプロセスによって作製された組成物は、水溶性が低い生物学的に活性な化合物の効果的な投与を可能にし得る。
【００２６】
別の実施形態では、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）等のポリマーを含むナノ粒子組成物は、水溶性が低い生物学的に活性な化合物を送達することができる。米国特許第５，５４３，１５８号に示されるように、これらの組成物は長時間作用型ビヒクルとして設計することができる。米国特許第５，５４３，１５８号の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２７】
別の実施形態において、本発明の組成物は、生物学的に活性な化合物の溶解度を改善することに成功したポリマーミセルとして調製することができる。この技術を使用した市販製品であるＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭには、抗癌剤パクリタキセルが組み込まれており、２００７年に韓国で承認された。
【００２８】
一実施形態では、本発明は、以下のステップ（ａ）〜（ｃ）を含む組成物を調製するプロセスを提供する。
ａ）式Ｉ
【化３】
2021525759.tif 000005
（式中、ＲＡは水素であり、Ｒ７およびＲ８は独立して、ＨおよびＳＯ２ＮＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ７およびＲ８のうちの１つは水素であり、ＮＲ１Ｒ２およびＮＲ３Ｒ４は独立して、環に１個の窒素を含む６〜１５員ヘテロシクロアルキルであるか、
またはその薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体である）の化合物の粒子を、
界面活性剤および許容される担体と混合して懸濁液を生成するステップ、
ｂ）ローラーミルまたは高エネルギーミルを使用してステップ（ａ）の懸濁液を粉砕するステップ、ならびに
ｃ）ステップ（ｂ）の粒子にポリオールを加えるステップ。
【００２９】
一実施形態では、許容される担体は、液体担体（例えば、水）である。
【００３０】
一実施形態では、懸濁液は水性懸濁液である。
【００３１】
別の実施形態では、組成物を調製するプロセスは、以下のステップ（ａ）〜（ｂ）を含む。
ａ）式Ｉ
【化４】
2021525759.tif 000006
（式中、ＲＡは水素であり、Ｒ７およびＲ８は独立して、ＨおよびＳＯ２ＮＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ７およびＲ８のうちの１つは水素であり、ＮＲ１Ｒ２およびＮＲ３Ｒ４は独立して、環に１個の窒素を含む６〜１５員ヘテロシクロアルキルであるか、
またはその薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体である）の化合物の粒子を、
界面活性剤、ポリオール、および許容される担体と混合して懸濁液を生成するステップ、ならびに
ｂ）ローラーミルまたは高エネルギーミルを使用してステップ（ａ）の懸濁液を粉砕するステップ。
【００３２】
一実施形態では、許容される担体は、液体担体（例えば、水）である。
【００３３】
一実施形態では、懸濁液は水性懸濁液である。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は長期安定性を示す。
【００３５】
好ましい実施形態では、本発明の組成物はナノ粒子組成物である。
【００３６】
好ましい実施形態では、本発明の組成物中の式Ｉの化合物は、
以下の構造を有する。
【化５】
2021525759.tif 000007
、
またはその薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体。
【００３７】
上記の式を有する化合物は、テガビビント（ＢＣ２０５９）としても知られている。
【００３８】
一実施形態では、本発明の組成物は、（ａ）錠剤およびカプセルからなる群から選択される剤形、（ｂ）制御放出製剤、速溶性製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、拍動性放出製剤、および混合即時放出および制御放出製剤からなる群から選択される剤形、（ｃ）筋肉内、皮下、静脈内および皮内注射を含む、吸入または非経口投与に適した剤形、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の任意の組み合わせに製剤化され得る。
【００３９】
本発明の組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、担体、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。
【００４０】
別の実施形態において、本発明は、有効量の本発明の組成物を前記哺乳動物に投与することを含む、それを必要とする哺乳動物における癌または腫瘍転移を予防、治療または改善する方法を提供する。
【００４１】
投与の方法は、いずれか特定の投与経路に限定されず、限定されないが、静脈内、非経口、経口、吸入（エアロゾル化送達を含む）、頬側、鼻腔内、直腸、病巣内、腹腔内、皮内、経皮、皮下、動脈内、心臓内、脳室内、頭蓋内、気管内、髄腔内投与、筋肉内注射、硝子体内注射、および局所適用法を含む。
【００４２】
別の実施形態において、それを必要とする哺乳動物における癌または腫瘍転移を予防、治療または改善する方法は、追加の抗癌剤および／または癌療法（例えば、癌ワクチン、抗癌養子細胞療法および放射線療法）を投与することを含み得る。
【００４３】
一実施形態では、追加の抗癌剤は、抗有糸分裂剤、代謝拮抗剤、ＨＤＡＣ阻害剤、プロテオソーム阻害剤、免疫療法剤、ＦＬＴ−３  ＥＧＦＲ、ＭＥＫ、ＰＩ３Ｋおよび他のプロテインキナーゼ阻害剤、ＬＳＤ１阻害剤、およびＷＮＴ経路阻害剤、アルキル化剤およびＤＮＡ修復経路阻害剤、抗ホルモン剤、抗癌抗体、ならびに他の細胞毒性化学療法剤からなる群から選択される。
【００４４】
別の実施形態において、本発明は、有効量の本発明の組成物を前記哺乳動物に投与することを含む、それを必要とする哺乳動物における線維性疾患を治療および／または予防する方法を提供する。
【００４５】
一実施形態では、線維性疾患は、肺線維症、デュピュイトラン拘縮、強皮症、全身性硬化症、強皮症様障害、皮膚硬化のない強皮症、肝硬変、間質性肺線維症、ケロイド、慢性腎疾患、慢性移植片拒絶、および他の瘢痕／創傷治癒異常、術後癒着、および反応性線維症からなる群から選択される。
【００４６】
一実施形態では、それを必要とする哺乳動物における線維性疾患を治療および／または予防する方法は、追加の抗線維化剤を投与することを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の製剤の１つの粒径分布（ＰＳＤ）のグラフである。
【図２】本発明の製剤の別の１つのＰＳＤのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
定義
本明細書で使用される用語は、一般に、当技術分野において、本発明の文脈内で、および各用語が使用される特定の文脈において、それらの通常の意味を有する。本発明を説明するために使用される特定の用語は、本発明の記載に関して実行者にさらなる指導を与えるために、以下または本明細書の他の場所に記載される。特定の用語の同義語が提供される。１つ以上の同義語の列挙は、他の同義語の使用を排除しない。本明細書で論じられる任意の用語の例を含む本明細書の任意の場所での例の使用は、例示のみであり、本発明または任意の例示された用語の範囲および意味を決して制限するものではない。本発明は、本明細書に記載されている様々な実施形態に限定されない。
【００４９】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含む本明細書に従うものとする。
【００５０】
「テガビビント」という用語は、以下の構造を有する化合物を指す。
【化６】
2021525759.tif 000008
。
「ＢＣ２０５９」という用語は、「テガビビント」と互換的に使用される。
【００５１】
「長期保存」または「長期安定性」という用語は、医薬組成物が３ヶ月以上、６ヶ月以上、好ましくは１年以上保存できることを意味すると理解される。長期保存とは、医薬組成物が２〜８℃または室温１５〜２５℃で保存されることも意味すると理解されたい。
【００５２】
長期保存に関して「安定」または「安定化」という用語は、医薬組成物に含まれる有効成分が、保存開始時の組成物の活性と比較して、その活性の２０％、より好ましくは１５％、さらにより好ましくは１０％、最も好ましくは５％超を失わないことを意味すると理解されたい。
【００５３】
「哺乳動物」という用語には、ヒトが含まれるが、これに限定されない。
【００５４】
「薬学的に許容される担体」という用語は、毒性のない固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、製剤補助剤、または任意の従来のタイプの賦形剤を指す。薬学的に許容される担体は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、製剤の他の成分と適合性がある。
【００５５】
「治療」という用語は、哺乳動物における疾患に対する治療薬の任意の投与または適用を指し、疾患の抑制、その発症の抑止、疾患の緩和（例えば、退行を引き起こすこと、または失われたか、欠けているか、もしくは欠損した機能を回復もしくは修復することによる）、または非効率的なプロセスを刺激することを含む。この用語は、哺乳動物において、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ること、ならびに病態または障害の任意の治療を網羅することを含む。効果は、障害もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという点で予防的であり得、かつ／または障害および／もしくは障害に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒という点で治療的であり得る。これには、（１）障害の素因があり得るが、まだ症状がない対象における障害の発症または再発の予防、（２）発症の抑止等の障害の抑制、（３）宿主が障害またはその症状にもはや苦しまないように、障害または少なくともその関連する症状を止めるかまたは終結させること、例えば、失われたか、欠けているか、もしくは欠損した機能を回復もしくは修復すること、または非効率的なプロセスを刺激することによって、障害またはその症状の退行を引き起こすこと、あるいは（４）障害またはそれに関連する症状を軽減、緩和、または改善することが含まれ、この場合、改善は、炎症、疼痛、および／または腫瘍サイズ等のパラメータの大きさの少なくとも減少を指すために広義で使用される。
【００５６】
「治療有効量」という用語は、生体に投与されたときに、該生体に対して所望の効果を達成する量を指す。例えば、生体への投与のための本発明の組成物の有効量は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を介して媒介される疾患のいずれかを予防および／または治療する量である。正確な量は、治療の目的に依存し、既知の技術を使用して当業者によって確認可能である。当技術分野で知られているように、全身対局所送達、年齢、体重、総体的な健康、性別、食事、投与期間、薬物相互作用、および状態の重症度の調整が必要な場合があり、日常的な実験を用いて当業者により確認可能であろう。
【００５７】
「組成物」または「製剤」という用語は、当技術分野で従来的であり、治療、診断、または予防目的で対象に投与するのに適した、薬学的に許容される担体または賦形剤等の担体を通常含む混合物を指す。例えば、経口投与用の組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、経口リンスまたは散剤を形成することができる。「組成物」、「医薬組成物」および「製剤」という用語は互換的に使用される。
【００５８】
「ナノ粒子組成物」という用語は、全てまたはほとんど全ての粒子が１０００ｎＭ未満である組成物を指す。
【００５９】
本発明の組成物
一実施形態では、本発明は、
ａ）式Ｉ
【化７】
2021525759.tif 000009
（式中、Ｒａは水素であり、Ｒ７およびＲ８は独立して、ＨおよびＳＯ２ＮＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ７およびＲ８のうちの１つは水素であり、ＮＲ１Ｒ２およびＮＲ３Ｒ４は独立して、環に１個の窒素を含む６〜１５員ヘテロシクロアルキルであるか、
またはその薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体である）の化合物の粒子と、
ｂ）界面活性剤と、を含み、
レーザー回折を使用して測定した場合、粒子が５００ｎｍ以下の有効Ｄ５０および１．０マイクロメートル（μｍ）以下のＤ９０を有する、組成物を提供する。
【００６０】
Ｄ５０は、粒径分布のメジアン径としても知られる累積分布の５０％における粒子径の値を指す。換言すると、Ｄ５０値が５００ｎｍ以下の場合、粒子の５０％が直径５００ｎｍ未満であることを意味する。
【００６１】
Ｄ９０は、報告された粒径に満たない粒子のパーセンテージを指す。換言すると、Ｄ９０値が１．０μｍ以下の場合、粒子の９０％が直径１．０μｍ未満であることを意味する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、化合物の有効平均粒径は、約４９００ｎｍ、約４８００ｎｍ、約４７００ｎｍ、約４６００ｎｍ、約４５００ｎｍ、約４４００ｎｍ、約４３００ｍｍ、約４２００ｎｍ、約４１００ｎｍ、約４ミクロン、約３９００ｎｍ、約３８００ｎｍ、約３７００ｎｍ、約３６００ｎｍ、約３５００ｎｍ、約３４００ｍｍ、約３３００ｎｍ、約３２００ｎｍ、約３１００ｎｍ、約３ミクロン、約２９００ｍｍ、約２８００ｎｍ、約２７００ｎｍ、約２６００ｎｍ、約２５００ｎｍ、約２４００ｎｍ、約２３００ｎｍ、約２２００ｎｍ、約２１００ｎｍ、約２０００ｎｍ、約１９００ｎｍ、約１８００ｎｍ、約１７００ｎｍ、約１６００ｎｍ、約１５００ｎｍ、約１４００ｎｍ、約１３００ｎｍ、約１２００ｎｍ、約１１００ｎｍ、約１０００ｎｍ、約９００ｎｍ、約８００ｎｍ、約７００ｎｍ、約６００ｎｍ、約５００ｎｍ、約４００ｎｍ、または約３００ｎｍである。
【００６３】
さらに、いくつかの実施形態では、化合物の有効平均粒径は、９００ｎｍ未満、より好ましくは５００ｎｍ未満、さらにより好ましくは３００ｎｍ未満である。
【００６４】
好ましい実施形態では、界面活性剤はポロキサマー界面活性剤である。
【００６５】
別の好ましい実施形態において、ポロキサマー界面活性剤はポロキサマー１８８である。
【００６６】
好ましい実施形態では、組成物はさらに安定剤を含む。
【００６７】
好ましい実施形態では、安定剤は、糖、ポリオール、ポリソルベート界面活性剤、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）からなる群から選択される。
【００６８】
別の好ましい実施形態において、糖は、スクロースおよび／またはトレハロースからなる群から選択される。
【００６９】
好ましい実施形態では、ポリオールはソルビトールおよびマンニトールを含む。
【００７０】
一実施形態では、提供される組成物中の化合物の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約２５ｍｇ／ｍｌである。
【００７１】
テガビビントの特に好ましい濃度は、１０〜２５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは２５ｍｇ／ｍｌであり、好ましい界面活性剤は、好ましくは０．６２５％の濃度のポロキサマー界面活性剤（好ましくはポロキサマー１８８）であり、ナノ懸濁液は、好ましくはポリオール、より好ましくはソルビトールを含む。
【００７２】
したがって、最も好ましい製剤は、２５ｍｇ／ｍｌのテガビビント、０．６２５％のポロキサマー１８８、および１０％ソルビトールを含むナノ懸濁液である。
【００７３】
一実施形態では、本発明の組成物は、粉砕、好ましくは湿式粉砕によって調製される。
【００７４】
一実施形態では、本発明は、以下のステップ（ａ）〜（ｃ）を含む組成物を調製するプロセスを提供する。
ａ）式Ｉ
【化８】
2021525759.tif 000010
（式中、ＲＡは水素であり、Ｒ７およびＲ８は独立して、ＨおよびＳＯ２ＮＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ７およびＲ８のうちの１つは水素であり、ＮＲ１Ｒ２およびＮＲ３Ｒ４は独立して、環に１個の窒素を含む６〜１５員ヘテロシクロアルキルであるか、
またはその薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体である）の化合物の粒子を、
界面活性剤および許容される担体と混合して懸濁液を生成するステップ、
ｂ）ローラーミルまたは高エネルギーミルを使用してステップ（ａ）の懸濁液を粉砕するステップ、ならびに
ｃ）ステップ（ｂ）の粒子にポリオールを加えるステップ。
【００７５】
一実施形態では、許容される担体は、液体担体（例えば、水）である。
【００７６】
一実施形態では、懸濁液は水性懸濁液である。
【００７７】
別の実施形態では、組成物を調製するプロセスは、以下のステップ（ａ）〜（ｂ）を含む。
ａ）式Ｉ
【化９】
2021525759.tif 000011
（式中、Ｒａ  は水素であり、Ｒ７およびＲ８は独立して、ＨおよびＳＯ２ＮＲ３Ｒ４から選択され、Ｒ７およびＲ８のうちの１つは水素であり、ＮＲ１Ｒ２およびＮＲ３Ｒ４は独立して、環に１個の窒素を含む６〜１５員ヘテロシクロアルキルであるか、
またはその薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体である）の化合物の粒子を、
界面活性剤、ポリオール、および許容される担体と混合して懸濁液を生成するステップ、ならびに
ｂ）ローラーミルまたは高エネルギーミルを使用してステップ（ａ）の懸濁液を粉砕するステップ。
【００７８】
一実施形態では、許容される担体は、液体担体（例えば、水）である。
【００７９】
一実施形態では、懸濁液は水性懸濁液である。
【００８０】
別の実施形態では、本発明の組成物は、リヨセル技術によって調製される。米国特許第７，７１３，４４０号は、リヨセル技術について記載している。米国特許第７，７１３，４４０号の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８１】
別の実施形態では、本発明の組成物は、米国特許第８，８０８，７５１号に記載されるような乾式粉砕手法によって調製することができる。米国特許第８，８０８，７５１号の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。粉砕媒体および好適な研磨化合物を適切に選択することにより、従来の原薬粒子からナノ粒子組成物を生成し、乾式粉砕装置で生成される小さな粒子の凝集を防ぐことが可能である。
【００８２】
さらに別の実施形態では、本発明の組成物は、米国特許第６，５３７，５７９号に記載されているプロセス等の、担体としてヒト血清アルブミンを利用するプロセスによって調製することができる。米国特許第６，５３７，５７９号の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。このプロセスは、水溶性が低い化合物のナノ粒子組成物を作製するのに特に適している可能性がある。そのようなプロセスによって作製された組成物は、水溶性が低い生物学的に活性な化合物の効果的な投与を可能にし得る。
【００８３】
別の実施形態では、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）等のポリマーを含むナノ粒子組成物は、水溶性が低い生物学的に活性な化合物を送達することができる。米国特許第５，５４３，１５８号に示されるように、これらの組成物は長時間作用型ビヒクルとして設計することができる。米国特許第５，５４３，１５８号の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８４】
別の実施形態において、本発明の組成物は、生物学的に活性な化合物の溶解度を改善することに成功したポリマーミセルとして調製することができる。この技術を使用した市販製品であるＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭには、抗癌剤パクリタキセルが組み込まれており、２００７年に韓国で承認された。
【００８５】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は長期安定性を示す。
【００８６】
一実施形態では、本発明の組成物はナノ粒子組成物である。
【００８７】
好ましい実施形態では、本発明の組成物中の式Ｉの化合物は、以下の構造を有する。
【化１０】
2021525759.tif 000012
、
またはその薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体。
【００８８】
この化合物は、テガビビントとしても知られている。
【００８９】
本発明は、テガビビントおよびその薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体または幾何異性体を含む製剤を包含する。
【００９０】
テガビビントの水への溶解度は、２〜１０のｐＨ範囲にわたって測定され、該範囲にわたって＜０．２５ｍｃｇ／ｍＬであることが分かった。
【００９１】
有機溶媒では、テガビビントは示されるような溶解度を有する：ＤＭＳＯ（３３４μｇ／ｍＬ）、エタノール（２６０μｇ／ｍＬ）、メタノール（２９９μｇ／ｍＬ）、アセトン（１ｍｃｇ／ｍＬ）、ジクロロメタン：エタノール（１：４）（１ｍｇ／ｍＬ）。
【００９２】
一実施形態では、本発明の組成物は、（ａ）錠剤およびカプセルからなる群から選択される剤形、（ｂ）制御放出製剤、速溶性製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、拍動性放出製剤、および混合即時放出および制御放出製剤からなる群から選択される剤形、（ｃ）筋肉内、皮下、静脈内および皮内注射を含む、吸入または非経口投与に適した剤形、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の任意の組み合わせに製剤化され得る。
【００９３】
本発明の組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、担体、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。
【００９４】
本発明の製剤において使用される薬学的に許容される賦形剤は、２つ以上の方法で作用できる。例えば、分散剤の役割は、主に個々の粒子を分離したままにすること、すなわち凝集を最小限に抑えることである。しかしながら、この成分はまた、例えば、製剤の表面張力に変化を与える可能性もあり、粘度を低下させるように作用する可能性がある。
【００９５】
薬学的に許容される賦形剤は、例えば、分散媒体、分散乳化剤、分散促進剤、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００９６】
推進剤の例として、ＨＦＡ−１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）、ＨＦＡ−２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）、それらの組み合わせ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
分散媒体は、例えば、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、グリセリン、それらの組み合わせ等であり得る。
【００９８】
分散乳化剤（促進剤）は、例えば、Ｈ２Ｏ、オレイン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコール１０００、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸カリウム、ステアリン酸カルシウム、モノオレイン酸グリセリル、ステアリン酸ポリオキシエチレン、乳化ワックス、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタントリオレエート、ポロキサマー、それらの組み合わせ等であり得る。
【００９９】
分散促進剤の例として、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒプロメロース、エチレングリコールステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタントリオレエート、モノステアリン酸グリセリル、レシチン、メグルミン、ポロキサマー、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシル３５ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ポリオキシグリセリド、ピロリドン、ソルビタンエステル、ステアリン酸、ビタミンＥポリエチレングリコールスクシナート、ポリエチレングリコール１０００、ポビドン、それらの組み合わせ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
本発明の組成物は、限定されないが、静脈内、非経口、経口、吸入（エアロゾル化送達を含む）、頬側、鼻腔内、直腸、病巣内、腹腔内、皮内、経皮、皮下、動脈内、心臓内、脳室内、頭蓋内、気管内、髄腔内投与、筋肉内注射、硝子体内注射、および局所適用法を含む、全ての投与経路に好適であり得る
【０１０１】
本発明による医薬組成物はまた、１つ以上の結合剤、充填剤、潤滑剤、懸濁剤、甘味料、香味剤、防腐剤、緩衝剤、湿潤剤、崩壊剤、発泡剤、および他の賦形剤を含み得る。そのような賦形剤は当技術分野で知られている。
【０１０２】
充填剤の例は、ラクトース一水和物、無水ラクトース、および様々なデンプンであり、結合剤の例は、様々なセルロースおよび架橋ポリビニルピロリドン、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０１およびＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０２等の微結晶性セルロース、微結晶性セルロース、およびケイ化微結晶性セルロース（ＰｒｏＳｏｌｖＳＭＣＣ（商標））である。
【０１０３】
圧縮される粉末の流動性に作用する薬剤を含む適切な潤滑剤は、Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標）２００などのコロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、およびシリカゲルである。
【０１０４】
甘味料の例は、スクロース、キシリトール、サッカリンナトリウム、チクロ、アスパルテーム、およびアクスルファム等の任意の天然または人工甘味料である。香味剤の例は、Ｍａｇｎａｓｗｅｅｔ（登録商標）（ＭＡＦＣＯの商標）、バブルガム香味料、フルーツ香味料等である。
【０１０５】
防腐剤の例は、ソルビン酸カリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸およびその塩、ブチルパラベン等のパラヒドロキシ安息香酸の他のエステル、エチルまたはベンジルアルコール等のアルコール、フェノール等のフェノール化合物、または塩化ベンザルコニウム等の四級化合物である。
【０１０６】
好適な希釈剤には、薬学的に許容される不活性充填剤、例えば、微結晶性セルロース、ラクトース、第ニリン酸カルシウム、サッカリド、および／または前述のいずれかの混合物が含まれる。希釈剤の例として、微結晶性セルロース、例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０１およびＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０２；ラクトース、例えば、ラクトース一水和物、無水ラクトース、およびＰｈａｒｍａｔｏｓｅ（登録商標）ＤＣＬ２１；第ニリン酸カルシウム、例えば、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ（登録商標）；マンニトール；デンプン；ソルビトール；スクロース；ならびにグルコースが挙げられる。
【０１０７】
適切な崩壊剤には、軽度に架橋したポリビニルピロリドン、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、および改質デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、およびそれらの混合物が含まれる。
【０１０８】
発泡剤の例は、有機酸と炭酸塩または重炭酸塩などの発泡性のカップルである。好適な有機酸には、例えば、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、アジピン酸、コハク酸、およびアルギン酸、ならびに無水物および酸性塩が含まれる。好適な炭酸塩および重炭酸塩には、例えば、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、グリシン炭酸ナトリウム、炭酸Ｌ−リジン、および炭酸アルギニンが含まれる。あるいは、発泡性カップルの重炭酸ナトリウム成分のみが存在し得る。
【０１０９】
好ましい実施形態では、式Ｉの化合物は、以下の構造、
【化１１】
2021525759.tif 000013
またはその薬学的に許容される塩、エステル、アミド、立体異性体もしくは幾何異性体を有する。
【０１１０】
別の実施形態において、本発明は、有効量の本発明の組成物を前記哺乳動物に投与することを含む、それを必要とする哺乳動物における癌または腫瘍転移を予防、治療または改善する方法を提供する。
【０１１１】
別の実施形態において、それを必要とする哺乳動物における癌または腫瘍転移を予防、治療または改善する方法は、追加の抗癌剤および／または癌療法（例えば、癌ワクチン、抗癌養子細胞療法および放射線療法）を投与することを含み得る。
【０１１２】
一実施形態では、追加の抗癌剤は、抗有糸分裂剤、代謝拮抗剤、ＨＤＡＣ阻害剤、プロテオソーム阻害剤、免疫療法剤、ＦＬＴ−３  ＥＧＦＲ、ＭＥＫ、ＰＩ３Ｋおよび他のプロテインキナーゼ阻害剤、ＬＳＤ１阻害剤、およびＷＮＴ経路阻害剤、アルキル化剤およびＤＮＡ修復経路阻害剤、抗ホルモン剤、抗癌抗体、ならびに他の細胞毒性化学療法剤からなる群から選択される。
【０１１３】
別の実施形態において、本発明は、有効量の本発明のナノ粒子組成物を前記哺乳動物に投与することを含む、それを必要とする哺乳動物における線維性疾患を治療および／または予防する方法を提供する。
【０１１４】
一実施形態では、線維性疾患は、肺線維症、デュピュイトラン拘縮、強皮症、全身性硬化症、強皮症様障害、皮膚硬化のない強皮症、肝硬変、間質性肺線維症、ケロイド、慢性腎疾患、慢性移植片拒絶、および他の瘢痕／創傷治癒異常、術後癒着、反応性線維症からなる群から選択される。
【０１１５】
本発明は、その多くの修正例および変形例が当業者に明らかであるため、例示のみを意図する以下の実施例においてより具体的に説明される。以下の実施例では、様々な成分の重量パーセントがｗ／ｖパーセントとして表されることを理解されたい。
【実施例】
【０１１６】
効果のある、すなわち、安定で毒性のないテガビビントの製剤に到達することは非常に課題が多く、困難であった。
【０１１７】
効果のあった製剤は、テガビビントのナノ懸濁液であり、該ナノ懸濁液は界面活性剤を含み、レーザー回折を使用して測定した場合、テガビビントの粒子が５００ｎｍ以下の有効Ｄ５０および１．０マイクロメートル（μｍ）以下のＤ９０を有することが明らかになった。テガビビントの特に好ましい濃度は１０〜２５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは２５ｍｇ／ｍｌであることも発見された。好ましい界面活性剤は、好ましくは０．６２５％の濃度のポロキサマー界面活性剤（好ましくはポロキサマー１８８）であり、ナノ懸濁液は、好ましくはポリオール、より好ましくはソルビトールを含むべきである。
【０１１８】
実施例の項では、最初に、様々な理由から最終的には失敗に終わった、テガビビントを製剤化するための複数の実験について記載する。次に、この項では、様々な分散剤とともに水溶液に懸濁した場合にテガビビントをローラー粉砕できることを実証した粉砕の実現可能性の実験について記載する。しかしながら、ローラー粉砕した場合でも、多くのテガビビントの製剤は依然として成功しなかった。
【０１１９】
最後に、特許請求されるテガビビントのナノ懸濁液を含む成功した実験について記載する。
【０１２０】
失敗した実験
実施例１
テガビビントのマイクロエマルジョン製剤は非常に毒性が高かった
テガビビントのマイクロエマルジョン製剤を開発した。製剤は、２０ｍｇ／ｍｌのＢＣ２０５９、１０％Ｔｗｅｅｎ（ポリソルベート８０）、３０％エタノール、５０％プロピレングリコール（ＰＧ）および１０％Ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸塩を含んでいた。
【０１２１】
製剤の良好な安定性が観察されたが、該製剤はげっ歯類に対して非常に毒性が高く、したがってそれ以上追求されなかった。
【０１２２】
実施例２
リポソームベースの製剤は不安定であった
予備試験に基づいて、ＢＣ２０５９の２つのリポソーム製剤が１００ｍｌでのスケールアップおよび安定性評価のためのリードとして選択された。
【０１２３】
１つ目は、脂質と薬物の比が１５：１の１００％ｅＰＣ製剤であった。
【０１２４】
他方のリード製剤は、脂質と薬物の比が１０：１の８０：２０％のｅＰＣ：ＬｙｓｏＰＣリポソームを含んでいた。
【０１２５】
これらの製剤は両方とも、５℃で保存したときに不安定であることが証明された（沈殿が観察された）。さらに、製剤は凍結時にも不安定であった。
【０１２６】
実施例３
経口およびＩＶ製剤は失敗であった
大豆レシチン、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＧ、およびＴＰＧＳを含むテガビビントの経口製剤が最初にリード経口製剤として選出された。しかしながら、このリード経口製剤は、イヌの試験で低いバイオアベイラビリティを示したため、追求されなかった。
【０１２７】
さらなるスクリーニングが行われ、ＩＶベースの製剤が次のリードとして選出された。このＩＶ製剤は、油相（植物油および可溶化剤としてのポリソルベート８０（ＰＳ８０））と乳化剤としての大豆レシチンで構成されていた。製剤は以下の成分を含んでいた（全ての数字は重量％である）。
【０１２８】
ＢＣ２０５９：１％、ＰＳ８０：１０％、Ｍｉｇｌｙｏｌ８１２：１２％、大豆レシチン（ＬＩＰＯＩＤ  Ｓ−１００）：１２％、プロピレングリコール（ＰＧ）：５０％、脱イオン水：適量まで。
【０１２９】
この製剤は、良好な物理的および化学的安定性を示すと同時に、損失を最小限に抑えながら０．２ミクロンで濾過できる可能性を示した。しかしながら、げっ歯類試験で高い毒性を示したため、この製剤はこれ以上追求されなかった。
【０１３０】
テガビビントのナノ懸濁液に関する実験
実施例４
粉砕の実現可能性
最初に、原則として粉砕が可能であるかどうかを判断した。実験により、可能であることが示された。
【０１３１】
粉砕の実現可能性の実験は、静脈内投与の適合性のために選択された、以下の分散剤とともに水溶液中に５％（５０ｍｇ／ｍＬ）で懸濁したテガビビントの実験室規模のバッチをローラー粉砕することによって開始した。
・ポリソルベート２０（０．５％）
・ポロキサマー１８８（０．５％）
・ポリビニルピロリドン、Ｋ１７（１％）
・ポリビニルピロリドン、Ｋ１７（１％）およびデオキシコール酸ナトリウム（０．２５％）
・レシチン（１％）
【０１３２】
直径０．５ｍｍのイットリア安定化ジルコニア（ＹＴＺ）粉砕媒体を約１０ｍＬの媒体負荷で用いて５ｍＬの試験懸濁液をそれぞれ粉砕し、レーザー回折による粒径分布分析のために定期的にサンプリングした。１２時間の粉砕後、ポロキサマーおよびポリビニルピロリドン懸濁液のみが均一なナノ粒子分散液の生成を示し、レシチン懸濁液は明らかなサイズ縮小を示さず、ポリソルベート懸濁液は粉砕容器内でＢＣ２０５９の固化を示し、ポリビニルピロリドン／デオキシコール酸ナトリウム懸濁液は高アスペクト比の結晶を示した。非公式の粒径安定性のために、終了した試験懸濁液を、制御されていない周囲条件で４日間放置した。試験した全ての懸濁液は、ある程度の粒子成長を示し、粒子の伸びは、ポリビニルピロリドン／デオキシコール酸ナトリウム懸濁液で最初に見られたものと同様であった。
【０１３３】
結晶成長を防ぐために、ポロキサマーとポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の両方を分散剤として使用し、スクロース、ソルビトール、およびトレハロースをそれぞれ１０％で組み込んで、５％（５０ｍｇ／ｍＬ）のテガビビントで調製物を作製した。粉砕および保存は、最初の実現可能性の実験と同様の条件下で行った。全ての調製物をナノ懸濁液に粉砕したが、いずれの添加剤も結晶成長の阻害に識別可能な効果を有するとは考えられなかった。さらなる実験のために、ポロキサマー１８８を一次分散剤として選択した。
【０１３４】
さらなる材料をポロキサマー１８８中に５％（５０ｍｇ／ｍＬ）で粉砕した。規模の拡大を促進するために、ポロキサマー含有量を１％から１．５％に増加して均一なナノ懸濁液を確保した。粉砕されたナノ懸濁液を希釈して、第三者機関が行う初期薬物動態実験に使用するための２％（２０ｍｇ／ｍＬ）ＢＣ２０５９／０．６％ポロキサマー／０．９％塩化ナトリウム製剤を生成した。残りの粉砕された濃縮材料は、見かけの結晶成長を防ぐ上での凍結乾燥の有効性を試験するために保存した。
【０１３５】
次いで、この製剤を、実施例５に記載の実験で試験した。
【０１３６】
実施例５
凍結乾燥の実現可能性
この実験は、原則として凍結乾燥が実現可能であるかどうかを判断するためのものであった。原則として、テガビビントは凍結乾燥できることが示された。
【０１３７】
５％（５０ｍｇ／ｍＬ）テガビビントポロキサマー水性懸濁液を、可能性のある様々な凍結保護剤含有希釈剤で希釈して、２％（２０ｍｇ／ｍＬ）テガビビント、０．６％ポロキサマー、および以下の最終濃度になるようにした。
・スクロース（１０％）
・マンニトール（５％）
・スクロース（５％）およびマンニトール（２．５％）
・ソルビトール（１０％）
・ソルビトール（５％）およびマンニトール（２．５％）
・トレハロース（１０％）
・トレハロース（５％）およびマンニトール（２．５％）
【０１３８】
５ｍＬ血清バイアルに各調製物を２ｍＬまで充填し、−４０℃および１００ｍＴｏｒｒの圧力で凍結乾燥した。乾燥したバイアルを精製水に再懸濁し、粒径分布について分析した。試験した系のうち、１０％ソルビトールと１０％トレハロースの再懸濁物のみが、凍結乾燥前の懸濁液に匹敵する粒径分布に戻った。さらなるナノ懸濁液を粉砕し、成分濃度を１０％（１００ｍｇ／ｍＬ）ＢＣ２０５９および３％ポロキサマーに増加して、粉砕効率を高め、より大規模なバッチ製造を容易にした。
【０１３９】
以下の懸濁液は、低温示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析のために粉砕された材料から調製した。
・２％（２０ｍｇ／ｍＬ）ＢＣ２０５９と０．６％ポリソルベートおよび１０％ソルビトール
・２％（２０ｍｇ／ｍＬ）ＢＣ２０５９と０．６％ポリソルベートおよび１０％トレハロース。
【０１４０】
２５℃から−４０℃まで行い、次いで１℃／分の速度で２５℃まで戻したＤＳＣ分析により、以下の懸濁液のガラス転移値を得た。
・ソルビトール懸濁液：−１８℃
・トレハロース懸濁液：−３３℃
【０１４１】
懸濁液を凍結乾燥し、５ｍＬバイアルに２ｍＬを充填し、−３０℃／１５０ｍＴｏｒｒで一次乾燥し、−１６℃／５５０ｍＴｏｒｒで二次乾燥した。非公式には、凍結乾燥サンプルは、周囲実験室条件で最大１週間、再現性のある均一なサイズ分布を有し、物理的に安定していることが示された。後続実験のために、トレハロースではなくソルビトールが選択されたが、それは前者のガラス転移温度がより高く、過去の毒性データの利用可能性がより高いためであった。
【０１４２】
試験バッチを粉砕し、−２４℃／２５０ｍＴｏｒｒで一次乾燥し、−１６℃／５００ｍＴｏｒｒで二次乾燥して凍結乾燥し、動物実験用の材料を提供した。粉砕は、より大きなバッチサイズを容易にし、粉砕効率を高めるために、５％のポロキサマー含有量で２０％（２００ｍｇ／ｍＬ）のテガビビントを用いて行われた。乾燥製剤には、カールフィッシャー法により約１％の水が測定され、精製水で再構成した場合、２４時間後に適切な粒径の安定性を示した。
【０１４３】
次いで、これらの製剤を、実施例６に記載の実験で試験した。
【０１４４】
実施例６
非臨床毒性／薬物動態、バッチ生産
この実験の目的は、テガビビントの凍結乾燥製剤を試験することであった。
【０１４５】
それぞれが１５ｇのテガビビントを代表する、４つの連続して調製した懸濁液のサブバッチを、負荷を増加させて粉砕し、製品収率を高めるために１１．４３％ソルビトール水溶液の希釈剤を使用して粉砕媒体から抽出し、２％（２０ｍｇ／ｍＬ）テガビビント／０．５％ポロキサマー／１０％ソルビトールの懸濁液を得た。
【０１４６】
５ｍＬバイアルに２ｍＬのサブバッチを充填し、以前に最適化された条件で凍結乾燥した。いくつかのバイアルは、おそらくはバッチスケール拡大のために、メルトバックの兆候を示したが、乾燥された材料は、均一なナノ懸濁液に容易に再懸濁した。バイアルの各サブバッチの中間アッセイ、ＰＳＤ、および水の結果が許容できるバッチ間の一致を示したため、４セットのバイアルを組み合わせて、安定性試験および動物試験で使用するための単一バッチとして処理した。以下の表１を参照されたい。
【表１】
2021525759.tif 000014
【０１４７】
粉砕中、安定して気泡が生成され、それによって、さらなる粉砕が妨げられ、永久的な粒子の凝集が生じたために、サブバッチの１つが失敗に終わった。それを廃棄して、置き換えるための別のバッチを作製した。失敗したバッチ生産では、粉砕中のＰＳＤサンプリングを容易にするために、媒体ボトルの代わりに２５０ｍＬ血清ボトルを使用した。発泡は、ボトルの寸法の違いによるものであり、それが見かけ上は空気の巻き込みを可能にし、バッチの失敗をもたらす結果となった。全てのバッチの抽出中に、暗色の不溶性粒子を粉砕媒体から分離した。この材料を後にＸＲＰＤにより分析したところ、テガビビントの融合凝集体であることが分かった。
【０１４８】
１ヶ月の安定性の時点で、複合バッチは、ＡＰＩ（原薬）の熟成または結晶成長ではなく、ポロキサマーの凝集に起因する有意な粒径の増加を示した。被験物質を再利用して使用することができる、実験に適した経路を決定する試みがなされた。サンプルを再構成し、再密封し、凝集体を減少させることなく最大３時間５０℃に加熱した。再懸濁したバイアルを徐放性液体サイクルを使用して１２１℃で１０分間オートクレーブ処理し、周囲条件まで冷却すると、許容可能な粒径分布に戻った。
【０１４９】
この種の処理は、その先に好適な経路を示さなかったので、生成物を再製剤化することが決定された。
【０１５０】
実施例７
組成物の再製剤化および凍結乾燥は最終的に失敗したが、ポロキサマーを含む液体懸濁液は有望であると考えられた
この実験では、テガビビントのさらなる再製剤化組成物を試験した。最終的に、凍結乾燥はうまく行かなかったが、液体懸濁液（ナノ懸濁液）は有望な結果を示した。
【０１５１】
最初に試験した分散剤のいくつかで実現可能な規模のバッチが作製されたが、２０％に増加させた（２００ｍｇ／ｍＬ）テガビビント濃度を使用した。この変更が５％（５ｍｇ／ｍＬ）では見込みのなかった分散剤を実現可能にした可能性がある。以下の分散剤を、５％ポロキサマー１８８対照とともに試験した。
・ポリソルベート２０（２％）
・ポリビニルピロリドン（２％）
・ポリビニルピロリドン（２％）およびデオキシコール酸ナトリウム（１％）
・ポリビニルピロリドン（２％）およびポリソルベート２０（２％）
・部分加水分解したポリビニルアルコール（５％）
【０１５２】
１２時間の粉砕後、ポリソルベート調製物は、良好な均一性を有する対照よりも迅速な粉砕を示した。ポリビニルピロリドン調製物は、おそらくはポリビニルピロリドンの凝集体または残留物である非結晶性粒子の存在を示し、これは粒径分布測定に有意な影響を与えなかったが、光学顕微鏡で見ることができた。ポリビニルアルコール調製物は、おそらくは分散剤の粘度のために、有意なサイズ縮小をもたらさなかった。二成分ポリビニルピロリドン調製物はかなりの凝集体を示したが、ポリビニルピロリドン／デオキシコール酸ナトリウム調製物は、さらなる開発で有用であることが証明されるかもしれないと判断された。
【０１５３】
ポリビニルピロリドンおよびポリソルベート２０調製物、ならびに修飾ポリビニルピロリドン（１％）およびデオキシコール酸ナトリウム（０．５％）懸濁液を、以下の凍結保護剤に関する凍結乾燥開発実験で使用した。
・ソルビトール（１０％）
・スクロース（１０％）
・トレハロース（１０％）
・マンニトール（５％
・マンニトール（５％）
・ソルビトール（５％）およびマンニトール（２．５％）
・スクロース（５％）およびマンニトール（２．５％）
【０１５４】
凍結乾燥は、−１５℃のアニーリングステップを用いて、−３６℃／１００ｍＴｏｒｒおよび−１５℃／５００ｍＴｏｒｒで行った。再懸濁すると、１０％スクロース調製物のみが適切な粒径の回復を示した。追加の懸濁液は、１％ポリビニルピロリドン／０．５％デオキシコール酸ナトリウム調製物を使用して粉砕したが、ｐＨを約７．０に維持するためにクエン酸緩衝液が含まれていた。粉砕した懸濁液調製物は、放置すると可逆的にゲル化し、それを以下の凍結保護剤と組み合わせた。
・スクロース（１５％）
・２５ｍｇ／ｍＬのスクロース（１０％）ＢＣ２０５９
・ソルビトール（１０％）
・ラクトース（５％）
・スクロース（５％）およびソルビトール（５％）
【０１５５】
ＡＰＩと比較して高濃度のスクロースは、最良の粒径保護を提供することが示され、製剤はメルトバックの影響を受けやすいように見えたが、２５℃／６０％ＲＨおよび４０℃／７５ＲＨで実施された加速安定性試験は、製剤が４週間にわたって良好な物理的安定性を有していたことを示した。
【０１５６】
しかしながら、希釈試験において、製剤は、投与に使用された生理食塩水希釈剤中で凝結することが見出され、ポリビニルピロリドン／デオキシコール酸ナトリウム製剤の薬物動態学的放出は、最初に試験したポロキサマー製剤のものよりも有意に低かった。
【０１５７】
ポロキサマー１８８を含むナノ懸濁液
２００ｍｇ／ｍＬ（２０％）ＢＣ２０５９をポロキサマー１８８中に粉砕し、凍結乾燥の最適化のために第三者機関に提出した。懸濁液は、凍結乾燥実験で使用した以下の表２に列挙される一連の凍結保護剤と組み合わせた。最初、２．５％デキストラン／２．５％ソルビトール調製物は、再構成した時に最も有望な粒径の保持を示したが、４０℃／７５％ＲＨで１ヶ月後に、ナノ懸濁液を保持した唯一の調製物は未乾燥対照であった。
【０１５８】
したがって、これらの試験は、評価された条件下では凍結乾燥がうまく行かないことを示した。この知見はまた、驚くべきことに、液体懸濁液が以前に観察されたよりも安定であったことを示した。初期の粒子伸長は、即時的な限定された現象であり、分散剤の初期の過飽和が、粉砕の停止後にわずかな再沈殿を引き起こしたことから起こり得る結果であると判断された。以下の表２を参照されたい。
【表２】
2021525759.tif 000015
【０１５９】
実施例８
照射の実現可能性
開発された製剤分散剤系（ポリビニルピロリドン／デオキシコール酸ナトリウムおよびポロキサマー）の両方を使用して、照射による最終滅菌の実現可能性を決定した。両方のサンプルは、両方の照射の実現可能性のために調製した。両方の製剤のサンプルが、実験動物における並行薬物動態（ＰＫ）試験のために提供され、そのために、薬物のバイオアベイラビリティがポロキサマーと関連しているかどうかを決定するために、ポリビニルピロリドン／デオキシコール酸ナトリウム製剤とともに使用されるポロキサマー１８８を含有する希釈剤も提供された。ＰＫ試験の結果は、バイオアベイラビリティがポロキサマー含有量と驚くほど相関していることを示した。
【０１６０】
両方の製剤の凍結バイアルが照射のために送られた。ガンマ線照射と電子ビーム照射の両方を、１５ｋＧｙおよび２５ｋＧｙの両方で試験した。バイアルは凍結条件下で処理されたが、照射中の潜在的な解凍をシミュレートするための最悪のシナリオとして５℃でも処理した。劣化は温度とは無関係であったが、放射線の種類に関係なく、線量と相関していると考えられた。
【０１６１】
しかしながら、その後の安定性データによって指示される最初の粒径試験では、広範な粒子の凝集が示された。以前に成功した凍結／解凍試験に基づくと、凝集は照射に起因していた。しかしながら、その後、別の懸濁液に対する凍結／解凍サイクルで同様の凝集が示された。
【０１６２】
凍結保存は予測不可能な凝集をもたらし、ＧＬＰバッチを進めるための選択肢ではないと判断された。バイアルは照射前に−２０℃の冷凍庫に保存されており、棚の異なる場所にあるバイアル間で異なる凍結速度を示した可能性がある。
【０１６３】
実施例９
前臨床での生成
２５ｍｇ／ｍＬのテガビビントナノ懸濁液の生成は、最も清浄な条件を使用して行われた。すなわち、無菌性は保証されないが、微生物汚染を最小限に抑えるために様々な管理と予防措置が講じられた。
【０１６４】
微生物汚染だけでなく発熱性汚染も最小限に抑えるために、注射用滅菌水を使用して調製物を作製した。全ての賦形剤はＵＳＰ／ＮＦグレードであった。全ての製品接触用品は、オートクレーブで滅菌するか、加熱に適さない場合は７０％イソプロパノールで消毒した。全ての曝露調製は、無菌処理技術を使用して、ＩＳＯ５品質の層流フード内で行われた。前臨床バッチの製造に使用されたＡＰＩは、使用前に３０ｋＧｙでガンマ線照射した。
【０１６５】
実施例１０
ラット被験物質の調製
ラット毒性試験で投与するために、テガビビント懸濁液の１，６００グラム（公称）バッチを調製した。
【０１６６】
生成は、濃縮（２００ｍｇ／ｍＬ）ＢＣ２０５９ナノ懸濁液の２００グラムバッチから開始した。１０ｇのポロキサマー１８８を２５０ｍＬ血清ボトル内で１５０グラムの水に溶解した。２００グラムのＹＴＺ粉砕媒体を加え、ボトルに栓をして密封した。バッチサイズが小さいことを考慮して、アセンブリ全体およびポロキサマー溶液の調製物を１２１℃で１５分間オートクレーブ処理して、バイオバーデンを最小限に抑えることができた。照射されたＡＰＩ（原薬）４０グラムを加え、再びボトルに栓をして密封した。この調製物をローラーミル上で転がして、カスケードする媒体の破壊角度が視覚的に決定して約４５度になるようにした。
【０１６７】
空気の巻き込みにより配合が失敗する傾向があるため、使用される粉砕媒体の量は、２００グラムバッチの懸濁液を処理するために通常使用される量の約半分であることに留意した。使用したボトルも、ヘッドスペースを最小限に抑えるために通常よりも小さかった。週末にかけて粉砕を進行させ、隔壁を通した皮下注射針により懸濁液をサンプリングした。
【０１６８】
粒径分布のＤ９０は０．２３ミクロンであり、抽出に進むのに十分であると判断された。抽出は、１２４０グラムの水中の１６０グラムのソルビトールのオートクレーブ溶液と、６０ミクロンの焼結ガラスフリットを含むガラス製圧力漏斗を使用して行った。抽出した懸濁液を混合し、５．００ｍＬに設定した容積式ピペットを使用して、オートクレーブ処理した１０ｍＬガラスバイアルに充填した。２９５個のバイアルを充填し、栓をして密封し、９２％の収率を示した。バッチは使用するまで５℃で保存した。
【０１６９】
ナノ懸濁液は、ラットに投与する準備ができていると考えられた。
【０１７０】
実施例１１
ブタ被験物質の調製
ブタ毒性試験で投与するために、テガビビントの１０，４００グラム（公称）バッチを調製した。生成は、濃縮（２００ｍｇ／ｍＬ）ＢＣ２０５９ナノ懸濁液の１，３００グラムバッチから開始した。６５ｇのポロキサマー１８８を２０００ｍＬ媒体ボトル内で９７５グラムの水に溶解した。１０００グラムのＹＴＺ粉砕媒体をすすぎ、滅菌のために袋に入れた。媒体と溶液を別々にオートクレーブ処理し、媒体ボトル内で２６０グラムの滅菌ＡＰＩと組み合わせた。この調製物をローラーミル上で転がして、カスケードする媒体の破壊角度が視覚的に決定して約４５度になるようにした。粒径分布のＤ９０が０．３３であり、抽出に進むのに十分であると判断されるまで、合計約３日間、粉砕を進行させた。５２０ｇのソルビトールを４０３０ｇの水に溶解することによって作製されたソルビトール溶液の２つのアリコートをオートクレーブ処理し、ラット試験のバッチで行われたのと同様に、粉砕懸濁液を抽出するために使用した。
【０１７１】
明らかに粉砕されていない、またはより大きな粒径のＡＰＩが６０ミクロンのフィルターフリットを詰まらせ、媒体の除去およびフリットのすすぎを余儀なくされたため、抽出の難しさが指摘された。抽出した懸濁液を混合し、１０．０ｍＬに設定した容積式ピペットを使用して、オートクレーブ処理した１０ｍＬガラスバイアルに充填した。９７０個のバイアルを充填し、栓をして密封し、９３％の収率を示した。バッチは使用するまで５℃で保存した。
【０１７２】
ナノ懸濁液は、ブタに投与する準備ができていると考えられた。
【０１７３】
実施例１２
オートクレーブは劣化に有意な影響を与えなかった
前臨床試験用の被験物質の生成と併せて、テガビビント懸濁液の２つのバッチを調製した。１つのバッチはソルビトールを使用して作製し、もう１つはソルビトールを使用せずに作製した。５℃、２５℃／６０％ＲＨ、および４０℃／７５％ＲＨで保存したこれらの懸濁液の安定性評価は、懸濁液が全ての条件で適度に安定であることを示した。
【０１７４】
ブタ試験バッチからのバイアルの一部を、液体サイクルとバッチ５１５−７６およびＦＩＤ５９１０と表される製剤を使用して、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。
【０１７５】
安定性データにより、オートクレーブ処理は劣化に有意な影響を与えなかったが、粒径を増大させると考えられたことが示された。
【０１７６】
実施例１３
ナノ懸濁液の工学的試験
臨床用生産を見越してテガビビントのナノ懸濁液のエンジニアリングバッチをいくつか調製したが、コンプライアンスを維持し、損失と汚染を最小限に抑えるために、プロセスに対する特定の変更が必要であった。一部は安全上の理由から、また一部は抽出目的でより大きな表面積のフィルターを組み込むために、抽出に使用されていたガラス製圧力漏斗を、５５μｍのステンレス鋼フィルターエレメントが装着されたステンレス鋼インラインフィルターハウジング（Ｐａｌｌ）に置き換えた。
【０１７７】
以前は窒素を使用していた抽出装置の加圧は、蠕動ポンプを使用して行った、希釈剤と分散剤の両方をオートクレーブ処理ではなく滅菌濾過するための手段として、このポンプがプロセスに組み込まれたためである。計量された蠕動ポンプユニットをバイアルの充填に用いた。オートクレーブにより製剤の粒径が増大する傾向を考慮して、最初のエンジニアリングバッチ（ＲＤ４０５０−５）がガンマ線照射のために提出された。
【０１７８】
安定性の結果は、以前のバッチと同様に最小限の劣化および安定性を示した。
【表３】
2021525759.tif 000016
【０１７９】
予備的な粒子試験に基づくと、配合物は、処理されるといくつかのより大きな粒子を含み、それらはレーザー回折粒径測定に有意な影響を与えるほど密集しているようには見えなかったが、ＵＳＰ＜７８８＞試験に影響を与えるには十分に有意であった。微粒子を軽減するために、より大きな粒子を保持するのに十分小さいが、テガビビントアッセイに影響を与えるほど小さくはない多孔度を有する「研磨」フィルターが提案された。しかしながら、懸濁液を濾過するための以前の試みは、重大なアッセイの損失をもたらした。したがって、テガビビントナノ懸濁液の濾過適合性について、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのいくつかのメンブレンを評価する契約を同社と結んだ。
【０１８０】
フィルターの目詰まりおよび故障の前にどれだけの材料を処理できるかを決定するために使用される圧力フィードバックポンプシステムとともに、Ｐａｌｌから入手可能な様々な４７ｍｍメンブレンを使用して、最も清浄ではない懸濁液の一部を濾過した。以下のメンブレンタイプを使用し、濾液をＰＳＤおよびアッセイについて試験した。
【表４】
2021525759.tif 000017
【０１８１】
６ミクロンのＨＤＣＩＩメンブレンが、ナノ懸濁液のアッセイ値または粒径分布のいずれにも識別可能な影響を示さなかったため、最良の候補として選択された。しかしながら、Ｐａｌｌフィルターの比較的長いリードタイムは、臨床材料のタイムリーな生産における制限要因であった。したがって、代替案が求められ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ８ミクロンポリプロピレンフィルターが、滅菌検証の目的でバイオバーデンを決定する際に使用される２つのエンジニアリングバッチの製造に使用された。
【０１８２】
残念ながら、２つのバッチのアッセイ値は濾過によって悪影響を受けた（それぞれ８０．９％ＬＣおよび９１．９％ＬＣ）。それらは最終的な臨床バッチプロファイルを表していなかったため、バッチを廃棄し、Ｐａｌｌ  ＨＤＣメンブレンフィルターを使用して別のエンジニアリングバッチを処理した。このバッチは９０〜１１０％ＬＣ内にあり、Ｐａｌｌ  ＨＤＣフィルターが、バイアルを充填する前の製造プロセスの最終ステップに組み込まれた。
【０１８３】
実施例１４
雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの緩徐な静脈内ボーラス投与後のテガビビントの薬物動態試験
この試験の目的は、雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにテガビビントを単回、静脈内に緩徐ボーラス投与した後のテガビビントの薬物動態を調べることであった。
【０１８４】
この試験は、表５に要約されるように、連続サンプリングによる並行群間デザイン（ｎ＝４／群）を用いて行われた。
【表５】
2021525759.tif 000018
ソース：この試験に使用したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、Ａｄｖｉｎｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．（Ｂｅｎｇａｌｕｒｕ，Ｉｎｄｉａ）の社内動物資源施設から入手した。動物は、投薬日に約１０〜１１週齢であった。
【０１８５】
識別：各動物は、ケージカードに示された一意の識別番号と、動物の体に付けられたウコン溶液のマーキングにより識別した。ケージカードは、試験番号、識別番号、種および系統、用量および性別により各ケージを識別した。
【０１８６】
飼育および環境：投薬前の３日間、ラットを試験領域の条件に馴化させた。動物をポリプロピレンケージに収容し（ケージごとに１匹）、１２時間の明期と１２時間の暗期のサイクルで制御された環境条件に維持した。部屋の温度および湿度は、それぞれ２２±３℃および４０〜７０％に維持した。部屋には、１時間当たり１０〜１５回の新鮮な空気の換気サイクルを行った。
【０１８７】
食餌および水：実験動物には、標準的なペレット状の餌（Ｔｅｋｌａｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ（２０１４Ｃ）Ｇｌｏｂａｌ  １４％  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｄｉｅｔ：Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｂ．Ｖ（Ｍａａｓｈｅｓｅｗｅｇ  ８７ｃ  ＰＯ  Ｂｏｘ  ５５３，５８００，ＡＮ  Ｖｅｎｒａｙ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が製造するげっ歯類用ペレットフード）を自由に与えた。
【０１８８】
用量の調製と投与：ストック製剤（２５ｍｇ／ｍＬ）が提供された。正確には、６００μＬの投与製剤（ストック、２５ｍｇ／ｍＬ）をラベルの付いたガラス容器に移した。これに、２．４ｍＬの５％デキストロース溶液を加え、ボルテックス混合し、超音波処理して、５ｍｇ／ｍＬの強度の均一な懸濁液を得た。動物は摂食条件下で投与された。２ｍＬ／ｋｇの投与容量で、２３Ｇ鈍針に誘導された１ｍＬ  ＢＤ注射器を使用して、緩徐な静脈内ボーラス（１．５分以上）頸静脈カテーテルによって１０ｍｇ／ｋｇのテガビビントをラットに単回投与した。投薬に使用した注射器は、実際に投与された用量を計算するために、投与の前後に秤量した。
【０１８９】
サンプルの採取と処理：血液サンプルは、投与後０．０８３、０．２５、０．５、１、２、４、６、８、１２、および２４時間に収集した。各時点に、カニューレを挿入したラットの頸静脈から約０．２５ｍＬの血液を採取し、２００ｍＭ  Ｋ２ＥＤＴＡ（血液１ｍＬあたり２０μＬ）を含むラベル付きマイクロチューブに移した。サンプリング後、等量のヘパリン化生理食塩水をカテーテル内に代わりに入れた。採血直後は常に湿った氷上に血液サンプルを維持し、５０００ｇで５分間４±２℃で遠心分離することにより血漿を分離した。血漿サンプルは予定時間の１時間以内に分離し、バイオアナリシスまで−６０℃未満で保存した。
【０１９０】
バイオアナリシス：ラット血漿サンプル中のＢＣ２０５９の定量化のために、適合ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を使用してバイオアナリシスを行った。この方法の較正曲線（ＣＣ）は、少なくとも６つの非ゼロ構成標準、ならびにブランクおよび０．０５０μｇ／ｍＬの定量下限（ＬＬＯＱ）を有する内部標準サンプルを含むブランクで構成されていた。試験サンプルは、３セットの品質管理サンプル（９つのＱＣサンプル：３通りの低、中、高ＱＣサンプル）とともに分析した。
【０１９１】
薬物動態データ分析：テガビビントの薬物動態パラメータは、検証済みのＰｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェア（バージョン６．３）の非コンパートメント分析ツール（血管外）を使用して計算した。濃度時間曲線下の面積（ＡＵＣＩａｓｔおよびＡＵＣｉｎｆ）は、線形台形法によって計算した。Ｃ０（時間ゼロの逆外挿された濃度）は、最初の２つの濃度値を逆外挿することにより、静脈内ボーラス用量の投与後に推定された。総血漿クリアランス（ＣＬ）および定常状態での分布容積（Ｖｓｓ）は推定値であった。消失速度定数値（ｋ）は、相関係数＞０．８の終末相で少なくとも３つの減少する濃度を使用して、濃度−時間プロファイルの対数線形終末相の線形回帰によって計算した。終末半減期値（Ｔ１／２）は、式０．６９３／ｋを使用して計算した。αおよびβ半減期を計算して報告した。
【０１９２】
実験結果
テガビビント（用量：１０ｍｇ／ｋｇ）のラットへの単回の緩徐な静脈内ボーラス投与後、平均血漿クリアランス（ＣＬ）は９．９２ｍＬ／分／ｋｇであると推定されたが、これは正常なラット肝臓血流量である５５ｍＬ／分／ｋｇよりも約５．５倍少ない。定常状態での平均血漿分布容積（Ｖｓｓ）は、通常の体内水分である０．７Ｌ／ｋｇよりもほぼ９．３４倍多いことが分り、組織区画への広い分布を示唆している可能性がある。片対数血漿中濃度−時間プロットは、ＢＣ２０５９が０．５４６時間の急速な分布半減期（Ｔ１／２α）および１３．８時間の長い終末血漿半減期（Ｔ１／２β）を伴う双指数関数的消失パターンを示したことを示している。
【表６】
2021525759.tif 000019
【０１９３】
消失速度定数を計算するために、α相では０．５、１、２時間、終末β相では６、８、１２、２４時間の回帰点を選択した。
【０１９４】
実施例１５
雄のビーグル犬におけるテガビビントの用量漸増静脈内注入試験
試験動物
２０１７年４月２０日に、４匹のオスの非ナイーブビーグル犬が研究用にＸｅｎｏｍｅｔｒｉｃｓからリリースされた。動物には、試験全体を通して、Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ（登録商標）Ｇｌｏｂａｌ  ２５％  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｄｏｇ  Ｄｉｅｔ  ２０２５Ｃを自由に与えた（ただし、生存中の手順ｎ間の短い期間を除く）。
投薬：
動物には、静脈内（ＩＶ）注入（頸静脈を介して）により４時間（ｈ）￥［±５分（分）］投与した。
【表７】
2021525759.tif 000020
【０１９５】
薬物動態（ＰＫ）採血：
血液サンプルは、注入開始前の最終投薬日（用量６；１５ｍｇ／ｋｇ）と、注入開始後４、１２、２４、３６、４８、および７２時間に採取した。全ての血液サンプルを目標時間から１０分以内に収集し、プロトコルごとに処理した。バイオアナリシスの結果は、テガビビントが全ての血漿サンプルに存在することを示した。
【表８】
2021525759.tif 000021
【０１９６】
薬物動態パラメータは、４時間にわたる薬物の最終的な１５ｍｇ／ｋｇ注入後のＢＣ−２０５９について決定した。平均値は上記の表８に提示される。データは、５３．０時間の半減期と７３４８０ｎｇ×時間／ｍＬの全体的なＡＵＣ０−１２０ｈを示す。
【表９】
2021525759.tif 000022
【０１９７】
実施例１６
テガビビント製剤の噴霧送達
この実験の目的は、ナノ懸濁液の噴霧送達を試験することであった。この実験は、噴霧送達が成功したことを示した。
【０１９８】
２５ｍｇ／ｍＬの濃度でポロキサマー１８８／ソルビトール中に懸濁させたテガビビント粒子を使用した。
【０１９９】
これらの製剤をエアロゾルの形態で、全身曝露法によりマウスに適用した。マウスをプラスチックの箱の中に入れた。この箱を密封し、その側面の一方をネブライザーデバイスの排出口に接続し、他方の側面を密閉した水のシステムに接続した。動物の部屋のドラフト内で全手順を実行した。
【０２００】
最初の実験について、ＳＡＴＥＲ  ＬＡＢＳのネブライザーキットを使用した。このデバイスは、噴射システムを使用する。５匹のマウスの各群につき、５ｍｌの薬物、すなわち１２５ｍｇのテガビビント（ＢＣ２０５９）をデバイスに充填し、次いで、噴霧のためにデバイスを電源に接続した。エネルギーは、５〜７ポンドの圧力、および１分当たり６〜８リットルの流量を可能にするＤｅＶｉｌｂｉｓｓ圧縮機モデル６４６によって供給された。第２の実験のために使用したデバイスは、超音波ネブライザーＡｌｔｅｒａであった。
【０２０１】
２つの実験のために、１０匹の雄のｂｃａｔ−Ｅｘ３マウスを各セットに使用した。これらのマウスをそれぞれ５匹ずつの２つの群に分けた。第１の群には、５日間連続して毎日薬物を投与した。第２の群には、薬物を１回のみ（５日目）投与した。５日目に、全てのマウスを屠殺し、肺を採取し、各群からの５つのサンプルを各々入れた２つのラベル付きナイロン袋の中で、サンプルを−３０度で保存した。
【表１０】
2021525759.tif 000023
【０２０２】
実施例１７
テガビビントの液体製剤およびテガビビント液体懸濁液のナノ懸濁液を用いたブタの試験は、
ブタによる忍容性が低かった
一連の薬物動態試験においてテガビビントをミニブタに静脈内投与し、全身曝露と製剤への忍容性の両方の観点からＧＬＰ毒性試験に適した製剤を決定した。これらの試験は全てＳｉｎｃｌａｉｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｕｘｖａｓｓｅ，ＭＯ）で実施された。
【０２０３】
最初の試験では、薬物は、Ｔｗｅｅｎ  ８０、エタノール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびビタミンＥ  ＴＧＰＳ（ｄ−αトコフェニルポリエチレングリコール１０００コハク酸塩）からなる製剤で得られた。このストック製剤を、最終投与濃度になるまで２０％Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）（リン脂質安定化大豆油）に希釈した。２匹のブタに１．７ｍｇ／ｋｇを６時間かけて投与し、２匹のブタに２．２ｍｇ／ｋｇを２４時間かけて投与した。製剤は、良好な全身曝露を提供した。
【０２０４】
２４時間の持続時間に対してより短い６時間の持続時間で用量正規化値を比較すると、総用量がより短い持続時間で与えられたため、注入終了時により高いピーク濃度（Ｃｍａｘ／用量）が得られた。しかしながら、経時的な全体的全身曝露（ＡＵＣ／用量）は２つの注入時間の間で類似しており、すなわち、注入時間が長くなると、ピーク血漿濃度が高くなることを回避しながら、同様の全体的な全身曝露を得ることが可能であった。
【０２０５】
しかしながら、この製剤で良好な全身曝露が観察された一方で、顕著な注入反応が観察され、この製剤は、６時間または２４時間のいずれの注入期間にわたってもミニブタによって忍容されなかった。テガビビント自体ではなく、Ｔｗｅｅｎ／エタノール／ＰＥＧ／ビタミンＥ／脂質内溶媒ベースの賦形剤および可能性の高い薬物沈殿が、注入反応の原因であるという仮説が立てられた。実際、テガビビントは、ナノ粒子形態である場合も、ＤＭＳＯに溶解している場合も、赤血球の溶血を引き起こさない。
【０２０６】
テガビビントの凍結乾燥ナノ懸濁液はより良好な忍容性を示したが、安定性の問題のために最終的には破棄された
【０２０７】
その後の試験では、テガビビントをナノ粒径に粉砕し、非溶媒製剤を使用した。この試験、試験Ｂ０１−１０９では、凍結乾燥形態のテガビビントが得られ、水中で再構成して、テガビビント１０ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬポロキサマー１８８、および５ｍｇ／ｍＬソルビトールの懸濁液からなるストック製剤が得られた。このストック溶液を生理食塩水で希釈して、静脈内投与に必要な最終濃度とした。２匹のブタに２．９ｍｇ／ｋｇを注入し、２匹のブタに１２．３ｍｇ／ｋｇを４時間の注入時間をかけて注入した。１２．１ｍｇ／ｋｇ投与群の１匹のブタは、非常に高い全身曝露を示した。たとえこのブタであっても、用量正規化ＡＵＣ、およびより低い程度ではあるがＣｍａｘは、同じ期間をかけて与えた２．８〜１２．１ｍｇ／ｋｇの用量にわたって線形の用量であった。１２．１ｍｇ／ｋｇ用量群の１匹のブタを除いて、この凍結乾燥形態のナノ粉砕テガビビントでは、用量正規化曝露は、試験Ｂ０１−１０７で使用したＴｗｅｅｎ／エタノール／ＰＥＧ／ビタミンＥ／脂質内溶媒ベースの製剤と比較して低かった。
【０２０８】
それにもかかわらず、この製剤はミニブタによる忍容性が良好であり、試験Ｂ０１−１０７で観察された注入反応はなかったため、凍結乾燥プロセスが将来の実験に向けてスケールアップされた。しかしながら、スケールアッププロセスでは、十分な安定性を示す凍結乾燥生成物を得ることができず、テガビビントの代替の凍結乾燥製剤が必要となった。
【０２０９】
ＴＸＰＫ−００６−２０５９−２４ｈ試験では、粉砕されたテガビビントの凍結乾燥製剤を使用した。使用した凍結乾燥製剤を水中で再構成し、ＢＣ２０５９  ２５ｍｇ／ｍＬ、０．１２５％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、０．０６２５％デオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＯＣ）、および１０％スクロースの最終濃度とした。このバルク溶液を生理食塩水に希釈して、２４時間の注入で１２．３または４９．２ｍｇ／ｋｇで治療群当たり２匹のブタに投与するのに必要とされる濃度にした。注射器内で被験物質の凝結が観察されたため、２４時間の注入期間を通して注射器を撹拌した。それにもかかわらず、全身曝露は試験Ｂ０１−１０７およびＢ０１−１０９と比較して非常に低かった。その後の製剤化実験で、この凍結乾燥製剤を含む生理食塩水が被験物質の凝集を引き起こし、イオン性（生理食塩水）希釈剤を使用できないことが示された。
【０２１０】
テガビビントの凍結液体ナノ懸濁液が効果を示した
この時点で、凍結乾燥を中止して、粉砕されたテガビビントの凍結液体製剤を検討した。試験ＴＸＰＫ−００１−２０５９−ｐｉｇ  ２４ｈ  ＰＫでは、３匹のミニブタが群当たり１匹ずつ、３つの群の１つに割り当てられ、製剤は２４時間かけて投与された。２つの凍結粉砕懸濁液がＰａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから提供された。ＢＣ２０５９−１は、２５ｍｇ／ｍＬ  ＢＣ２０５９、０．１２５％ＰＶＰ、０．０６２５％ＮａＤＯＣ、１０％スクロース、懸濁液（バッチ番号５１５−１０）であり、ＢＣ２０５９−２は、２５ｍｇ／ｍＬ  ＢＣ２０５９、０．６２５％ポロキサマー１８８、１０％ソルビトール、懸濁液（バッチ番号５１５−１３）であった。これらの製剤の両方とも、希釈剤はＤ５Ｗであった。３つ目の群は、全身曝露におけるポロキサマー１８８の考えられる役割を調べるための、ポロキサマー１８８／生理食塩水希釈剤を含むＢＣ２０５９ＰＶＰ／ＮａＤＯＣ／スクロース凍結製剤ＢＣ２０５９−１であった。
【０２１１】
これらの３つの凍結被験物質製剤のうち、２５ｍｇ／ｍＬテガビビント、０．６２５％ポロキサマー１８８、１０％ソルビトール、Ｄ５Ｗで希釈されたナノ懸濁液が最も高い全身曝露を示した。この製剤の用量正規化ＡＵＣは、試験Ｂ０１−１０７の２４時間注入で観察された用量正規化曝露よりもいくらか少なかったが、著しく少ないというわけではなかった。用量正規化曝露は、試験Ｂ０１−１０９の４匹中３匹のブタで観察されたものよりもかなり高く、この試験の生理食塩水希釈剤は、テガビビントのＰＶＰ／ＮａＤＯＣ製剤で観察されたよりもはるかに少ない程度ではあるが、ＢＣ２０５９の凍結乾燥ポロキサマー１８８製剤による全身曝露に影響を及ぼした可能性があることを示唆している。
【表１１】
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【０２１２】
a３０％エタノール、５０％ＰＧ、１０％Ｔｗｅｅｎ  ８０、および１０％Ｄ−αトコフェロールポリエチレングリコール１０００スクシネート（ロットＰ４９２−０１）中２０ｍｇ／ｍＬのＢＣ２０５９：２匹のミニブタについて報告された値
ｂ１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＣ２０５９、２．５ｍｇ／ｍＬポロキサマー１８８および５ｍｇ／ｍＬソルビトール（ロット番号ＢＥＴ  １２１３−００１−２９）：２匹のミニブタについて報告された値
ｃ２５ｍｇ／ｍＬ  ＢＣ２０５９、０．１２５％ＰＶＰ、０．０６２５％ＮａＤＯＣおよび１０％スクロース（ロット番号ＢＥＴ  １２１３−００１−４９）：２匹のミニブタについて報告された値
ｄ２５ｍｇ／ｍＬ  ＢＣ２０５９、０．１２５％ＰＶＰ、０．０６２５％ＮａＤＯＣ、１０％スクロース、デキストロース５％で最終濃度２ｍｇ／ｍＬに希釈されたナノ懸濁液（ロット５１５−１０）：１匹のミニブタ
ｅ２５ｍｇ／ｍＬ  ＢＣ２０５９、０．６２５％ポロキサマー１８８、１０％ソルビトール、デキストロース５％で最終濃度２ｍｇ／ｍＬに希釈されたナノ懸濁液（ロット５１５−１３）：１匹のミニブタ
ｆ２５ｍｇ／ｍＬ  ＢＣ２０５９、０．１２５％ＰＶＰ、０．０６２５％ＮａＤＯＣ、１０％スクロース、最終濃度０．０５％のポロキサマーになるようにポロキサマー１８８／生理食塩水で最終濃度２ｍｇ／ｍＬに希釈したナノ懸濁液（Ｌｏｔ  ５１５−１０）：１匹のミニブタ
【０２１３】
ミニブタにおけるこれらの単回投与注入試験の結果に基づいて、反復２用量毒性試験のために選択された製剤は、０．６２５％ポロキサマー１８８、１０％ソルビトール（ナノ懸濁液）を含み、Ｄ５Ｗで希釈された２５ｍｇ／ｍＬＢＣ２０５９の凍結製剤であった。
【０２１４】
ＩＮＤ対応ＧＬＰ毒性試験の用量選択を支持するための２用量非ＧＬＰ試験の実施中に、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓバッチ番号５１５−３３のスケールアッププロセスおよび生成において、製剤を凍結させることによりバイアル内でテガビビントが凝集したことが分かった。
【０２１５】
凍結によるこの凝集を考慮して、その後、２〜４℃で保持した０．６２５％ポロキサマー１８８、１０％ソルビトール製剤中の２５ｍｇ／ｍＬナノ粉砕ＢＣ２０５９を追求することを決定した。製剤が凍結されていない限り、粉砕ＢＣ２０５９懸濁液の複数ロットに凝集は観察されなかった。２〜４℃で冷蔵されたポロキサマー／ソルビトール製剤は、ＩＮＤ対応ＧＬＰ毒性試験および非ＧＬＰビーグル犬試験に使用した。
【０２１６】
実施例１８
特発性肺線維症のマウスモデルにおける噴霧されたテガビビントの有効性
この実験の目的は、ブレオマイシン誘発性の特発性肺線維症（ＩＰＦ）のマウスモデルにおけるテガビビントナノ懸濁液を調べることであった。被験物質は以下の通りである。
【０２１７】
０．６２５％ポロキサマー１８８および１０％ソルビトール中のナノ粉砕懸濁液２５ｍｇ／ｍＬ中のテガビビント（ＢＣ２０５９）。被験物質を約４℃で冷蔵した。
【０２１８】
噴霧機器は、Ａｌｔｅｒａ超音波ネブライザーｅＲａｐｉｄ機（モデル番号６７８Ｇ１００２）であった。
【０２１９】
動物は、８〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）であった。
【０２２０】
実験手順
【表１２】
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【０２２１】
肺線維症のマウスモデルは、気管内（ＩＴ）注射したブレオマイシン（ＡＰＰ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ）によって誘発した。５０マイクロリットルの生理食塩水０．９％またはＰＢＳ中の０．０２５Ｕのブレオマイシンの１用量を、０日目に各動物に対照として投与した。
【０２２２】
テガビビントナノ懸濁液を、エアロゾルの形態で全身曝露法により群３に適用した。マウスをプラスチック箱の中に入れた。この箱を密封し、その側面の一方をネブライザーデバイスの排出口に接続し、他方の側面を密閉した水のシステムに接続した。動物の部屋のドラフト内で全手順を実行した。各処理セッションにおいて、チャンバー内の４〜５匹のマウスの各群に、１５分間かけて５ｍｌの２５ｍｇ／ｍｌテガビビント（１２５ｍｇ）を噴霧した。エアロゾルへのマウスの曝露を高めるために、エアロゾルチャンバ内に沈殿したテガビビントをシリンジで回収し、２回目および３回目に再噴霧した。ブレオマイシンの投与後５日目〜２１日目の間、１日２回マウスに噴霧した。群１および群２には、同様の様式でビヒクル５ｍｌを噴霧した。
【０２２３】
０、５、８、１２、１６、１９、および２１日目に動物の体重を記録した。
【０２２４】
Ｓｃｉｒｅｑによって確立されたプロトコルに従ってＦｌｅｘｉＶｅｎｔマウスベンチレーター（Ｓｃｉｒｅｑ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＰＱ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、以前に記載されたように（Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｎｅｂｒｅｄａ  Ｌら、ＡＪＲＣＭＢ  ２０１５）、２１日目に肺機能の測定を行った。気道抵抗、動的および準静的組織コンプライアンス、ならびにエラスタンスを計算するために使用した強制振動および準静的な圧力−容量曲線プロトコルの前に、合計３回の肺容量の操作により各マウスの標準換気履歴を得た。
【０２２５】
２１日目に、全ての動物を屠殺し、肺を採取した。以前に記載されたように（Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｎｅｂｒｅｄａ  Ｌら、ＡＪＲＣＭＢ  ２０１５）、ヒドロキシプロリンアッセイを使用して総肺コラーゲン含量を評価した。簡潔に述べると、マウスの肺を採取し、１ｍｌの０．５Ｍ酢酸に懸濁し、次いで、最初に組織ホモジナイザー（氷上で６０秒間）、次にＤｏｕｎｃｅホモジナイザー（氷上）で１５ストロークを用いて均質にした。得られたホモジネートを１０分間回転させ（１２，０００×ｇ）、上清を後続の分析に使用した。ラット尾コラーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して０．５Ｍ酢酸中でコラーゲン標準を調製した。０．２ｇのシリウスレッドＦ３Ｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を２００ｍｌの水と混合することによってピクロシリウスレッド染料を調製した。１ｍｌのピクロシリウスレッド染料を１００μｌのコラーゲン標準または肺ホモジネートに添加し、次いで、軌道振盪機上で３０分間連続して室温で混合した。次いで、沈殿したコラーゲンをペレット化し、０．５Ｍ酢酸で１回洗浄した（１２，０００×ｇで各１５分間）。得られたペレットを１ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨに再懸濁し、比色プレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用してシリウスレッド染色を分光光度的に定量化した（５４０ｎｍ）。
【０２２６】
結果
群２は、ブレオマイシン処理後に、ＩＰＦ誘発の指標の１つである統計学的に有意な体重減少を示した。対照的に、群３の吸入テガビビント処置は、ブレオマイシン誘発性肺損傷によって引き起こされた体重減少を逆転させた。
【表１３】
2021525759.tif 000026
【０２２７】
さらに、ブレオマイシンは、群２において肺コンプライアンス低下を誘導したが、これは線維症の誘発を示すものである。群３におけるブレオマイシン損傷後の吸入テガビビント処置は、群１の偽処置対照のコンプライアンス値近くまでコンプライアンス値を逆転させた。
【表１４】
2021525759.tif 000027
【０２２８】
さらに、ヒドロキシプロリンアッセイによって測定された総肺コラーゲン含量は、群２において著しい増加を示し、ブレオマイシン損傷後の活発な線維症が示唆された。対照的に、群３におけるブレオマイシン損傷後の吸入テガビビント処置は、この変化を逆転させ、コラーゲンレベルは群１における偽処置対照に近い。
【表１５】
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【０２２９】
このように、この実験は、テガビビントがＩＰＦを治療する大きな可能性を有することを示した。
【０２３０】
実施例１９
エアロゾル化テガビビント製剤の評価
最も効率的なエアロゾル生成方法を決定するために、一連のＢＣ−２０５９（テガビビント）製剤を、振動メッシュおよび圧縮空気ネブライザーを使用してエアロゾル化した。げっ歯類の鼻部曝露チャンバーで、エアロゾルをエアロゾル濃度および粒径分布について特徴づけた。各製剤は、エアロゾル性能に対する影響を評価するように調整された異なる変数を有していた。これらには、ＡＰＩの粒径の減少、賦形剤プロファイル、および使用されるネブライザーが含まれていた。
【０２３１】
この試験の目的は、げっ歯類の吸入試験のために被験物質ＢＣ−２０５９をエアロゾル化できる方法を決定することであった。
【０２３２】
被験物質ＢＣ−２０５９を、精製水中の０．１％Ｔｗｅｅｎ８０に１５ｍｇ／ｍＬの濃度で懸濁した。Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ２２０ｘ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｃｏｖａｒｉｓ、Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＡ）を使用して懸濁液を超音波処理し、次いでボルテックスで１分間混合した。超音波処理とボルテックスによる混合を合計１５回繰り返した。
【０２３３】
残りのバルクＢＣ−２０５９粉末は、遊星ボールミル（Ｒｅｔｓｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、１２ｍＬのボールミルジャーおよび３つの金属ボールを使用して１５０ＲＰＭで１０分間粉砕した。粉砕したＢＣ−２０５９粉末を、精製水中の０．１％Ｔｗｅｅｎ８０に１５ｍｇ／ｍＬの濃度で懸濁した。上で概説した手順を使用して、懸濁液を超音波処理した。
【０２３４】
残りのバルクＢＣ−２０５９粉末は、遊星ボールミル（Ｒｅｔｓｃｈ、ドイツ）で、１２ｍＬのボールミルジャーおよび３つの金属ボールを使用して３００ＲＰＭで６０分間粉砕した。粉砕したＢＣ−２０５９粉末を、精製水中の０．１％Ｔｗｅｅｎ  ８０および精製水中の１０％ＰＥＧ４００に１５ｍｇ／ｍＬの濃度で懸濁した。上で概説した手順を使用して、懸濁液を超音波処理した。精製水中の１０％エタノールを使用して追加の１５ｍｇ／ｍＬＢＣ−２０５９懸濁液を調製した。ＶＷＲ超音波破砕機（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ  ＰＡ）を使用して懸濁液を１０分間超音波処理し、ボルテックスミキサーを使用して４分間混合した。
【０２３５】
追加の製剤（０．６２５％ポロキサマー１８８および１０％ソルビトール中の２５ｍｇ／ｍＬ  ＢＣ−２０５９のナノ粉砕懸濁液）を、さらに変更することなく受け取ったまま使用した。
【０２３６】
４つの別々のネブライザー（Ａｅｒｏｎｅｂ  Ｓｏｌｏ（Ａｅｒｏｇｅｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）、Ｐａｒｉ  ＬＣ  Ｐｌｕｓ（Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｉｎｃ．Ｍｉｄｌｏｔｈｉａｎ  ＶＡ）、Ｈｏｓｐｉｔａｋ  Ｕｐ  Ｍｉｓｔ、Ｈｏｓｐｉｔａｋ  Ｉｎｃ．Ｆａｒｍｄａｌｅ，ＮＹ）、およびＨｕｄｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏ−Ｍｉｓｔ（Ｔｅｌｅｆｌｅｘ  Ｉｎｃ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）で、一連の界面活性剤で調製された製剤からエアロゾルを生成し、２層のフローパスト型げっ歯類曝露システムに移した。
【０２３７】
曝露雰囲気中のエアロゾルの総濃度は、フィルターサンプルの分析により決定した（ＧＦ／Ａ  ４７ｍｍフィルター）。フィルターサンプルは、０．３Ｌ／分の公称流量で収集した。試験を通して収集されたフィルターサンプルを、総エアロゾル濃度を決定するために重量分析し、ＨＰＬＣ分析のために提出した。
【０２３８】
被験物質を含むフィルターを１：１アセトニトリル：メタノール中で抽出し、ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイにより分析した。
【０２３９】
被験物質の粒径分布（ＰＳＤ）は、マーサースタイルカスケードインパクターＩｎ  Ｔｏｘを使用して呼吸域で測定した。
【０２４０】
結果
エアロゾル濃度（重量濃度および化学的濃度）を以下の表１６に示す。
【表１６】
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【０２４１】
試験雰囲気のための粒径は、超純水中の０．１％Ｔｗｅｅｎ  ８０で調製された懸濁液用のＩｎ−Ｔｏｘカスケードインパクターを使用して測定し、治験依頼者は、圧縮空気ネブライザーを使用してポロキサマー懸濁液を提供した。各製剤の空気力学的質量中央径および幾何標準偏差を以下の表１７に示す。粒径分布は図１および図２に示す。
【表１７】
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【０２４２】
結論
ＢＣ−２０５９の製剤を噴霧し、鼻部吸入曝露チャンバーに導入した。曝露雰囲気は、重量分析およびＨＰＬＣアッセイを使用してエアロゾル濃度について特徴づけた。最も高い重量エアロゾル濃度は、ポロキサマー製剤で２．４７ｍｇ／Ｌと測定され、これは、活性被験物質の０．４８ｍｇ／Ｌに相当する。この製剤の粒径分布をカスケードインパクターによって測定し、ＭＭＡＤは２．４６μｍ、幾何標準偏差は１．４５μｍであった。
【０２４３】
以前の結果に対してポロキサマー製剤の結果を検討すると、エアロゾル濃度０．４８４ｍｇ／ＬのＢＣ２０５９は、３０分で３０グラムのマウスに１．５ｍｇ／ｋｇの肺沈着用量（１０％ＤＦ）をもたらす。標準的なマウスの肺重量に基づくと、これは肺組織で約０．２ｍｇ／ｇになる。以前の試験では、約０．０２ｍｇ／ｇ（分析濃度）が得られた。
【０２４４】
したがって、噴霧されたこのＢＣ２０５９ナノ粉砕懸濁液は、他のＢＣ２０５９製剤と比較してエアロゾルで最適な濃度を示した。
【図１】
2021525759.tif 000033
【図２】
2021525759.tif 000034
【国際調査報告】
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