(57)【要約】  本発明は、皮膚を冒す障害、特に炎症性障害、特にアトピー性皮膚炎等の皮膚科学的な目的となる自己炎症性障害を防止及び/又は処置するために使用される、プロバイオティクス、好ましくは細菌、特にラクトバチルス属の細菌に基づいたプロバイオティクスを含む組成物に関する。更に、本発明の組成物は、UV照射により誘発される損傷、特に皮膚老化を防止し及び/又は低減させるのに有用である。
2021505689.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚を冒す、好ましくは炎症型の、障害及び/若しくは病態の防止及び/若しくは処置における使用、並びに/又は前記障害/病態に関連した症状及び/若しくは影響の低減及び/若しくは処置における使用、並びに/又は創傷治癒過程及び/若しくは再上皮化過程及び/若しくは瘢痕形成過程を促進するための使用のためのプロバイオティクスを含む組成物であって、前記プロバイオティクスがラクトバチルス・パラカゼイDG(登録商標)CNCM1-1572株の細菌及び/又はラクトバチルス・パラカゼイLPC-S01 DSM26760株の細菌である、組成物。
【請求項２】
前記皮膚を冒す障害及び/又は病態が、刺激作用及び擦過傷に関連した可能性がある皮膚炎、ざ瘡、感染症、皮膚炎症、紅斑、潰瘍、乾癬、アトピー性皮膚炎、耳炎、ひび割れ、瘻孔、痔核、進行中の炎症過程が存在する任意の他の皮膚障害若しくは病変、並びに/又はそれらの組合せ及び/若しくは合併症及び/若しくは転帰から選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
UV照射、UV-A及び/又はUV-Bから皮膚、好ましくは唇及び/又は結膜を遮蔽するための、好ましくは、UV照射、UV-A及び/又はUV-Bへの曝露に起因/関係する損傷及び/又は影響を防止及び/又は軽減するための、より好ましくは、皮膚老化を防止及び/又は軽減するための、プロバイオティクスを含む組成物の使用。
【請求項４】
細菌、真菌、酵母、及びそれらの組合せから選択される微生物を更に含み、微生物が、好ましくは、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、バチルス属、プロピオニバクテリウム属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、アエロコッカス属、及びエンテロコッカス属から選択される少なくとも1つの属に属する細菌であり、微生物が、好ましくは、ラクトバチルス属に属する細菌である、請求項1若しくは2に記載の使用のための組成物、又は請求項3に記載の使用。
【請求項５】
ラクトバチルス属の細菌が、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・アミロリティカス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・アリメンタリウス、ラクトバチルス・アビアリウス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・セロビオサス、ラクトバチルス・コリニフォルミス、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・カルバータス、ラクトバチルス・デルブレッキイ、ラクトバチルス・ファルシミニス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ガリナルム、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・ヒルガルディイ、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバチルス・ケフィリ、ラクトバチルス・ムコーサエ、ラクトバチルス・パニス、ラクトバチルス・コリノイデス、ラクトバチルス・パラプランタラム、ラクトバチルス・ペントーサス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ポンティス、ラクトバチルス・ロイテリー、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・サケイ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・サンフランシセンシス、及びそれらの組合せから選択される少なくとも1つの種に属する、請求項4に記載の使用のための組成物又は使用。
【請求項６】
ビフィドバクテリウム属の細菌が、B.アニマーリス、B.ビフィダム、B.ブレーベ、B.インファンティス、B.ロングム、B.アドレスセンティス、B.カテヌラツム、B.アンギュラツム、B.アステロイデス、B.ボウム、B.コエリナム、B.コリネフォルメ、B.クニクリ、B.デンティコレンス、B.デンティウム、B.ガリクム、B.ガリナルム、B.インディカム、B.イノピナータ、B.ラクティス、B.マグヌム、B.メリシカム、B.ミニマム、B.シュードカテヌラツム、B.シュードロングム、B.プロラム、B.ルミナンティウム、B.サエクラレ、B.サーチレ、B.サーマシドフィルム、B.サーモフィルム、及びB.ツルミエンスから選択され、より好ましくは、バチルス・クラウシイ、バチルス・サブティリス、バチルス・コアグランス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ハロデュランス、バチルス・チューリンギエンシス、バチルス・インソライタス、及びバチルス・マリヌスから選択される少なくとも1つの種に属し、並びに/又はプロピオニバクテリウム属の細菌が、P.シャーマニイ、P.アクネス、P.オーストラリエンス、P.アビダム、P.シクロヘキサニカム、P.フリューデンレイッヒイ、P.グラヌローサム、P.ジェンセニイ、P.ミクロアエロフィラム、P.プロピオニカム、及びP.ソエニイから選択される少なくとも1つの種に属し、並びに/又はストレプトコッカス属の細菌が、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・アガラクティアエ、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス・カニス、ストレプトコッカス・コンステラタス、ストレプトコッカス・ダウネイ、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ、ストレプトコッカス・エクイナス、ストレプトコッカス・フェルス、ストレプトコッカス・インファンタリウス、ストレプトコッカス・イニアエ、ストレプトコッカス・インターメディウス、ストレプトコッカス・ミレリ、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・オリスラッティ、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・ペロリス、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・シュードニュ
ーモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ラッティ、ストレプトコッカス・チグリヌス)、ストレプトコッカス・サングイニス、ストレプトコッカス・ソブリナス、ストレプトコッカス・スイス、ストレプトコッカス・ユベリス、ストレプトコッカス・ベスティブラリス、ストレプトコッカス・ビリダンス、及びストレプトコッカス・ズーエピデミカスから選択される少なくとも1つの種に属し、並びに/又はラクトコッカス属の細菌が、L.チュンガンゲンシス、L.フォモセンシス、L.フジエンシス、L.ガルビエアエ、L.ラクティス、L.ピスシウム、L.プランタラム、L.ラフィノラクティス、及びL.タイワンエンシスから選択される少なくとも1つの種に属し、並びに/又はアエロコッカス属の細菌が、A.ウリナエ、A.サンギュニコーラ、A.クリステンセニイ、A.スイス、A.ウリナエクイー、及びA.ウリナエホミニスから選択される少なくとも1つの種に属し、並びに/又はエンテロコッカス属の細菌が、エンテロコッカス・アビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ヘモペロキシダス、エンテロコッカス・ヒラエ、エンテロコッカス・マロドーラツス、エンテロコッカス・モラビエンシス、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・シュードアビウム、エンテロコッカス・ラフィノーサス、及びエンテロコッカス・ソリタリウスから選択される少なくとも1つの種に属し、並びに/又は酵母が、サッカロミセス属、より好ましくは、サッカロミセス・セレビシア種及び/又はサッカロミセス・ブラウディ種に属する、請求項4に記載の使用のための組成物又は使用。
【請求項７】
前記微生物が、生きている、又は死滅している、又は間欠滅菌されている(tyndallized)、又は溶菌液及び/若しくは抽出物の形態である、又は細菌の産物の形態である、又は上清の形態である、又は好ましくは、その代謝産物、代謝バイオプロダクト、ポストバイオティクス、細胞壁及び成分、エキソポリサッカライド、並びに好ましくはリボソーム及び糖タンパク質、グルカン及び他のポリサッカライド等の免疫賦活剤誘導体、リポポリサッカライド、及び上清の任意の成分から選択される免疫原性成分を含有する化合物から選択される、派生物の形態である、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用のための組成物又は使用。
【請求項８】
前記微生物、好ましくは前記細菌が、106〜1011微生物単位の間、より好ましくは、108〜109微生物単位の間の範囲の量で存在し、前記量が、好ましくは、1日あたりの量/用量(一日量)である、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用のための組成物又は使用。
【請求項９】
局所的使用のための、好ましくは、クリーム剤、ゲル剤、オイル剤、乳濁液剤、スプレー剤、ガーゼ、パッチ剤、絆創膏、ローション剤、ムース剤、軟膏剤、ペースト剤、又は即時調製のための液体製剤の形態である、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のための組成物又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚を冒す障害、特に炎症性障害、特にアトピー性皮膚炎等の皮膚科学的な目的となる自己炎症性障害を防止及び/又は処置するために使用される、プロバイオティクス、好ましくは細菌、特にラクトバチルス属(Lactobacillus)の細菌に基づいたプロバイオティクスを含む組成物に関する。更に、本発明の組成物は、UV照射(radiation)により誘発される損傷、特に皮膚老化を防止し及び/又は低減させるのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
ヒト皮膚は、豊富なマイクロバイオームによりコロニー形成されている。これまで、この側面が潜在的な感染源を表すと考えられたものだったが、今日、一般的にヒト微生物叢、及びそれゆえに、皮膚微生物叢が、皮膚病原体の接着及び発症に対抗するその能力という理由だけでなく、免疫系と対話し、かつ相互作用するその能力という理由によっても、宿主において重要かつ有用な機能を果たすという事実の認識がある。
【０００３】
腸内毒素症が皮膚レベルで生じた場合、プロバイオティクスは、モジュレーターとして働き、皮膚微生物叢にバランスを回復させることができる。
【０００４】
過去10年間、新しいテクノロジーを使用することによって、皮膚微生物叢の分類学的分析が促され、皮膚微生物叢の細菌集団は、25を超える門に属する合計約1010種の微生物になり得、それらの門の最も多い代表物は、放射菌門(Actinobacteria)、グラム陽性菌門(Firmicutes)、及びプロテオバクテリア門(Proteobacteria)である。様々な皮膚疾患が、皮膚マイクロバイオームの変化に結びつけられている。
【０００５】
例えば、ざ瘡の場合、P.アクネス(P. acnes)が、それと主に関連した細菌と考えられ、これらの状態において、事実、皮脂の産生の増加が、その増殖の最適な環境を提供する。
【０００６】
これらの問題への通常のアプローチは、抗細菌剤を使用すること、すなわち、局所的消毒剤及び抗生物質を使用することである。
【０００７】
一方では、抗生物質は、疑いの余地なく効果的であるが、有益な細菌もまた除去することを除いてであり、それらは、特に広域性抗生物質の長期間使用の場合、感作及び潜在的有害事象のリスクを有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】US2005/158291A1
【特許文献２】US2013/095086A1
【特許文献３】US2010/226892A1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
この理由により、本出願人は、皮膚微生物叢にバランスを回復させるための新しい解決策として、特にラクトバチルス属に属する細菌の使用に基づいた、プロバイオティクス組成物の使用を同定している。事実、本出願人は、ラクトバチルス属に属するプロバイオティクスを含む組成物が、正確にはP.アクネス等の皮膚に危険である細菌の作用を防止し、又はとにかく緩和する能力があり、したがって、以下が可能であることを見出している:
1) 皮膚を冒す障害を防止、及び/又は処置することに寄与する;
2) 正常な治癒過程を促進する;並びに
3) 正常な再上皮化及び/又は瘢痕形成過程を促進及び/又は向上させる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様は、好ましくは皮膚科学的型の、皮膚を冒す、好ましくは炎症型の、障害及び/又は病態の処置及び/又は防止に使用される、プロバイオティクス、好ましくは1つ又は複数のプロバイオティクス細菌を含む組成物に関する。
【００１１】
本発明は、下記で詳細に記載され、添付の図も活用して、例として説明されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】以下の接着する、生きている生存細胞のパーセンテージという観点からのP.アクネスの接着をグラフで示す図である:・1A:  ケラチノサイトの、試験されるプロバイオティクスとの接触による予備刺激;・1B:  ケラチノサイトの、P.アクネス及び試験されるプロバイオティクスとの共インキュベーション;・1C:  真核細胞が病原体で負荷された後の、ケラチノサイトの、試験されるプロバイオティクスとのインキュベーション。100がプロバイオティクスによる刺激の非存在下でのP.アクネスの接着を表す場合、試験された菌株の阻害能力は、陽性対照と比較したP.アクネスによる接着の%低減として表現された。特に、図1Aは、両方のプロバイオティクス菌株の、P.アクネスの接着を、類似した%(L.カゼイDG(登録商標)について42%、及びL.パラカゼイ(L. paracasei)LPC-S01について35%)で防止する能力を示す。図1Bは、L.カゼイDG(登録商標)株の、接着を17%低減させる能力、一方、L.パラカゼイLPC-S01株が9%を示したことを示す。その菌株を混合することは、P.アクネスの接着の統計的に有意な低減を生じ、その低減は、個々としてみなされた菌株について観察された効果及びそれらの効果の合計のどちらよりも明確に高いパーセンテージである、42%を示した。図1Cは、2つのプロバイオティクスの混合物に関係した統計的に有意な相乗効果を示し、その混合物は、P.アクネスの接着を42%低減させる能力があることを示した。対照的に、個々のプロバイオティクスは、その混合物の効果の半分未満である、接着を低減させる能力を示し、L.カゼイDGについて18%、及びL.パラカゼイLPC-S01について11%であった。
【図２】ELISA試験を用いて得られた、上清の1mlあたりのピコグラム(pg)で表される、細胞の上清におけるサイトカインIL-10、IL-1ベータ、IL-8、及びTSLPに関するアッセイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
皮膚を冒す前記障害及び/又は病態は、好ましくは刺激作用及び/若しくは擦過傷に関連した皮膚炎、ざ瘡、感染症、皮膚炎症、紅斑、潰瘍、乾癬、アトピー性皮膚炎、耳炎、ひび割れ、瘻孔、痔核、及び進行中の炎症過程が存在する又は存在しない任意の他の皮膚障害若しくは病変、並びに/又はそれらの組合せ及び/若しくは合併症及び/若しくは転帰から選択される。
【００１４】
皮膚を冒す前記障害及び/又は病態は、好ましくは、病原体に関連し、又はそれにより引き起こされる。すなわち、組成物は、防止/予防を目的とするだけではなく、処置/治療目的としても、すなわち、前記病原体での負荷後も、特に効果的である。
【００１５】
本発明の好ましい態様によれば、本組成物はまた、創傷治癒過程並びに/又は再上皮化及び/若しくは瘢痕形成過程を助け/促し/促進し/加速することができる。
【００１６】
前記病原体は、好ましくは、細菌、真菌、酵母、ウイルス、及びそれらの組合せから選択される。
【００１７】
前記病原体は、好ましくは、細菌の中から選択され、前記細菌病原体は、好ましくは、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)、好ましくはアクネ(acnes)種、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、好ましくは、エピデルミディス(epidermidis)、アウレウス(aureus)、ワーネリ(warneri)、ピオゲネス(pyogenes)、mitis型コリネバクテリウム種(Corynebacterium ssp);シュードモナス属(Pseudomonas)、好ましくは、エルジノーサ(aeruginosa);アシネトバクター属(Acinetobacter)、好ましくは、ジョンソニイ(johnsonii);ストレプトコッカス属(Streptococcus)、好ましくはピオゲネス(pyogenes);ミクロコッカス種(Micrococcus ssp.)、及びブレビバクテリウム種(Brevibacterium ssp.)から選択される。
【００１８】
更に、下記に詳細に記載されているような、プロバイオティクス、好ましくは、1つ又は複数のプロバイオティクス細菌を含む組成物は、UV照射、UV-A及び/又はUV-Bから皮膚及び/又は唇及び/又は結膜を遮蔽することに適応される。換言すれば、本組成物は、UV照射、UV-A及び/又はUV-Bへの曝露に起因/関係する損傷及び/又は影響を防止及び/又は軽減するのに適応される。本組成物は、好ましくは、皮膚老化を防止及び/又は軽減するのに適応される。
【００１９】
この視点から、下記に詳細に記載されているような、プロバイオティクス、好ましくは、1つ又は複数のプロバイオティクス細菌を含む組成物は、美容上の目的を有する。本組成物の使用は、好ましくは、本組成物に含有されるプロバイオティクス、好ましくは、下記に定義及び記載されているようなプロバイオティクスの免疫調節作用に関係/起因する。前記免疫調節は、造血サイトカイン、好ましくは造血成長因子及び/又はCSF;一次炎症性サイトカイン、好ましくは、IL-1及び/又はTNF;抗炎症性及び/又は免疫抑制性サイトカイン、好ましくはIL-10及び/又はTGF-β;二次炎症性サイトカイン(ケモカイン);特定の免疫応答を制御するサイトカイン、好ましくはIL-2、及びそれらの組合せから選択される少なくとも1つのサイトカインの発現の調節、好ましくは低減に関与する。前記免疫調節は、好ましくは、IL-1β、IL-10、IL-8、TSLP、及びそれらの組合せから選択される少なくとも1つのサイトカインの発現の調節、好ましくは低減を含む。
【００２０】
この関連において、サイトカインは、免疫系の細胞間、及び免疫系の細胞と様々な器官及び組織との間の情報交換シグナルとして働く抗原非特異的ポリペプチドメディエーターであることに留意されたい。それらは、異なる型の細胞によって産生され、いったん身体において放出されたならば、それらは、隣接細胞において(パラクリン効果)、又非常に遠く離れた細胞において(エンドクリン効果)、又はそれらを生成した細胞において(オートクリン効果)、特異的反応を誘導する。特に、インターロイキン及びケモカイン等の免疫系の細胞により産生されたサイトカインは、本発明者等の防御機構を制御及び活性化することにおいて、並びに炎症過程において、基本的な役割を果たす。サイトカインの複雑なネットワークは、炎症促進性効果と抗炎症性効果との間のバランスを維持する。炎症促進性サイトカインと抗炎症性サイトカインとの間のインバランス、加えて、サイトカインの無制御な産生は、結果として、炎症型の疾患、アレルギー又は自己免疫病態を生じ得る。TSLP(胸腺間質性リンパ球新生因子)は、サイトカインファミリーに属するタンパク質であり、それは、抗原を示す細胞の活性化を通して、T細胞集団の成熟において重要な役割を果たす。TSLPは、主に、線維芽細胞、上皮細胞、及び様々な型の間質細胞等の非造血細胞によって産生され、その発現は、喘息、炎症性関節炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、好酸球性食道炎、及び他のアレルギー性状態を含む多くの病理学的状態に関係する。
【００２１】
特に、本出願人は、ケラチノサイトがプロバイオティクスに曝露された場合、プロバイオティクスは、細胞上清へのサイトカインアッセイの評価から明らかなように、免疫調節効果を発揮する能力があることを示している。特に、IL1β、IL10、及びIL8の発現が、個々としてみなされるプロバイオティクス菌株によって、特にL.パラカゼイLPC-S01によって、低減することが観察された。サイトカイン発現を含有することの効果は、ケラチノサイトのLPSでの負荷後、より明らかなように思われた。
【００２２】
TSLPに関して、プロバイオティクスとの接触が、(プロバイオティクスによって刺激されていないケラチノサイトの)ベースライン発現と比較して、この指標の低減を決定した。ケラチノサイトのLPSでの予備刺激は、TSLPのレベルの増加を生じず、他の分子がLPSのToll様受容体に関して、より刺激的であることが知られているように、それは、予想され得る現象であった。個々としてみなされての、及び混合物中のプロバイオティクス菌株は、この指標の発現を調整するのに効果的であることが示された。本指標は、アトピー性皮膚炎等のいくつかの皮膚病態において過剰発現しているため、かなり関心が高い。更に、このサイトカインは、ケラチノサイトと樹状細胞との間の機能的界面における重要なメディエータとみなされる。
【００２３】
本発明の好ましい態様によれば、本組成物は、創傷治癒の過程、並びに/又は傷害皮膚及び/若しくは障害により冒された皮膚の再上皮化及び/又は瘢痕形成の過程において有用である。
【００２４】
したがって、データは、プロバイオティクス、特に試験された菌株が、ケラチノサイト、及びそれゆえに、皮膚への抗炎症性及び/又は免疫調節性効果を発揮する能力があることを明らかに示している。
【００２５】
一般的に、本明細書に記載された効果を考えれば、本明細書に記載されたプロバイオティクスに基づいた組成物は、皮膚微生物叢にバランスを回復させるために有用である。
【００２６】
本発明の関連において、「皮膚」とは、外部環境に対する防御の最前線を意味する;特に、この防御は、最も外側の皮膚層(表皮)に散在したケラチノサイトの作用を通して実施され、そこで、ケラチノサイトは、皮膚の深層へ警告のメッセージを送達するためにサイトカイン及びケモカインの分泌を誘導し、したがって、炎症応答を発生させることができる。それらの発生の経過において、ケラチノサイトは、ケラチンを進行性に沈着させながら、より深層からより表面の層へ移動し、そのケラチンは、その根底にある細胞に対する保護作用を担う。
【００２７】
本発明の関連において、「皮膚老化」とは、全ての個体において生じる完全に自然でかつ回避不能な生理的過程を意味する。時間が経つにつれて、皮膚は、異なる起源の一連の因子によって引き起こされる構造変化を被り、そのことは、皮膚水分の喪失、縮緬皺の外観、弾力の喪失、過角化症、及び「年齢による染み」と呼ばれる色素沈着過剰斑点の形成をもたらす。
【００２８】
前記老化は、好ましくは、実質的に遺伝的(又は内因的)因子に依存する、内因的  -  又は経時的  -  老化である。或いは、前記皮膚老化は、外因的  -  又は環境因子による  -  すなわち、外部因子(外因子)により引き起こされる。
【００２９】
一般的に言えば、内因的老化は、通常、25歳から始まる。それは、通常、一般的に皮膚構造の菲薄化及び/又は降伏化(yielding of the skin structure)をもたらす一連の変化を含む。
【００３０】
外因的老化は、好ましくは、UV照射(光老化の原因である)、喫煙、アルコール中毒、公害、刺激物質との連続的接触、及びそれらの組合せから好ましくは選択される、外部の作用物質及び/又は環境因子の侵襲によって引き起こされる。
【００３１】
UV照射への曝露に起因/関係する損傷及び/又は影響は、好ましくは、紅斑、色素沈着、角化症、過角化症、皮膚発赤、日焼け、熱傷、光線性光老化若しくは日光弾力線維症、皮質白内障、翼状片、口腔ヘルペスの再活性化、任意の性質の皮膚損傷、好ましくは、唇及び/若しくは結膜への損傷、皮膚メラノーマ、皮膚の扁平上皮癌、基底細胞癌、角膜若しくは結膜の扁平上皮癌、並びに/又はそれらの組合せ及び/若しくは合併症及び/若しくは転帰から選択される。
【００３２】
本発明の関連において、「皮膚微生物叢にバランスを回復させること」とは、皮膚上に存在する微生物のセット全体として理解された、皮膚微生物叢の定性的-定量的な生理的組成を回復させ、したがって、生理的皮膚微生物生態を回復させることを意味する。
【００３３】
本発明の関連において、「負荷」とは、異なる種の微生物での混入、及びその後の、通常、一定の時間間隔における生きている微生物の数のプレートカウントの手段による、微生物荷重(microbial load)における変化の評価を含む任意の実験的検査又は負荷又は試行を意味する。
【００３４】
本発明の関連において、FAO及びWHOによって示された定義に従っての「プロバイオティクスの」とは、「十分な量で投与された時、宿主に健康上の利益を与える、生きている微生物」を意味する。換言すれば、プロバイオティクスは、適切な量で摂取されると、身体に有益である機能を発揮する能力があることを実証するす微生物である。
【００３５】
前記微生物は、好ましくは、細菌、真菌、酵母、及びそれらの組合せから選択される。
【００３６】
本発明の好ましい態様によれば、細菌は、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)、バチルス属(Bacillus)、プロピオニバクテリウム属、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、アエロコッカス属(Aerococcus)、及びエンテロコッカス属(Enterococcus)から選択される少なくとも1つの属に属する。より好ましくは、細菌はラクトバチルス属に属する。
【００３７】
本発明の更なる好ましい態様によれば、ラクトバチルス属の細菌は、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・アミロリティカス(Lactobacillus amylolyticus)、ラクトバチルス・アミロボラス(Lactobacillus amylovorus)、ラクトバチルス・アリメンタリウス(Lactobacillus Alimentarius)、ラクトバチルス・アビアリウス(Lactobacillus aviaries)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・セロビオサス(Lactobacillus cellobiosus)、ラクトバチルス・コリニフォルミス(Lactobacillus coryniformis)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ラクトバチルス・カルバータス(Lactobacillus curvatus)、ラクトバチルス・デルブレッキイ(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・ファルシミニス(Lactobacillus farciminis)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ラクトバチルス・ガリナルム(Lactobacillus gallinarum)、ラクトバチルス・ガセリ(Lactobacillus gasseri)、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・ヒルガルディイ(Lactobacillus hilgardii)、ラクトバチルス・ジョンソニイ(Lactobacillus johnsonii)、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス(Lactobacillus kefiranofaciens)、ラクトバチルス・ケフィリ(Lactobacillus kefiri)、ラクトバチルス・ムコーサエ(Lactobacillus mucosae)、ラクトバチルス・パニス(Lactobacillus panis)、ラクトバチルス・コリノイデス(Lactobacillus collinoides)、ラクトバチルス・パラプランタラム(Lactobacillus paraplantarum)、ラクトバチルス・ペントーサス(Lactobacillus pentosus)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ポンティス(Lactobacillus pontis)、ラクトバチルス・ロイテリー(Lactobacillus reuteri)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・サケイ(Lactobacillus sakei)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ラクトバチルス・サンフランシセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)、及びそれらの組合せから選択される少なくとも1つの種に属する。
【００３８】
より好ましくは、ラクトバチルス属は、ラクトバチルス・パラカゼイ種、好ましくは、ラクトバチルス・パラカゼイDG(登録商標)CNCM1-1572株及び/又はラクトバチルス・パラカゼイLPC-S01株である。
【００３９】
どちらの株も、SOFAR S.p.A社によって単離されて、寄託され、特に、ラクトバチルス・パラカゼイDG細菌株は、1995年5月5日に、パリにあるPasteur Instituteのthe National Collection of Cultures of Microorganisms(CNCM)に、寄託番号CNCM1-1572として寄託された。その菌株は、最初、ラクトバチルス・カゼイDG亜種カゼイと呼ばれた。
【００４０】
ラクトバチルス・パラカゼイLPC-S01細菌株は、受託番号DSM26760としてDSMZに寄託された。
【００４１】
前記株は、それらが、合同及び/又は組合せで使用される場合、本明細書に記載された使用について特に効果的であり、事実、それらは、相加及び/又は更に相乗効果を示す。
【００４２】
本発明の更なる好ましい態様によれば、ビフィドバクテリウム属の細菌は、B.アニマーリス(B. animalis)、B.ビフィダム(B. bifidum)、B.ブレーベ(B. breve)、B.インファンティス(B. infantis)、B.ロングム(B. longum)、B.アドレスセンティス(B. adolescentis)、B.カテヌラツム(B. catenulatum)、B.アンギュラツム(B. angulatum)、B.アステロイデス(B. asteroides)、B.ボウム(B. bourn)、B.コエリナム(B. choerinum)、B.コリネフォルメ(B. coryneforme)、B.クニクリ(B. cuniculi)、B.デンティコレンス(B. denticolens)、B.デンティウム(B. dentium)、B.ガリクム(B. gallicum)、B.ガリナルム(B. gallinarum)、B.インディカム(B. indicum)、B.イノピナータ(B. inopinatum)、B.ラクティス(B. lactis)、B.マグヌム(B. magnum)、B.メリシカム(B. merycicum)、B.ミニマム(B. minimum)、B.シュードカテヌラツム(B. pseudocatenulatum)、B.シュードロングム(B. pseudolongum)、B.プロラム(B. pullorum)、B.ルミナンティウム(B. ruminantium)、B.サエクラレ(B. saeculare)、B.サーチレ(B. subtile)、B.サーマシドフィルム(B. thermacidophilum)、B.サーモフィルム(B. thermophilum)、及びB.ツルミエンス(B. tsurumiense)から選択され、より好ましくは、バチルス・クラウシイ(Bacillus clausii)、バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・ハロデュランス(Bacillus halodurans)、バチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス・インソライタス(Bacillus insolitus)、及びバチルス・マリヌス(Bacillus marinus)から選択される少なくとも1つの種に属する。
【００４３】
本発明の更なる好ましい態様によれば、プロピオニバクテリウム属の細菌は、P.シャーマニイ(P. shermanii)、P.アクネス、P.オーストラリエンス(P. australiense)、P.アビダム(P. avidum)、P.シクロヘキサニカム(P. cyclohexanicum)、P.フリューデンレイッヒイ(P. freudenreichii)、P.グラヌローサム(P. granulosum)、P.ジェンセニイ(P. jensenii)、P.ミクロアエロフィラム(P. microaerophilum)、P.プロピオニカム(P. propionicum)、及びP.ソエニイ(P. thoenii)から選択される少なくとも1つの種に属する。
【００４４】
本発明の更なる好ましい態様によれば、ストレプトコッカス属の細菌は、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)、ストレプトコッカス・アガラクティアエ(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・カニス(Streptococcus canis)、ストレプトコッカス・コンステラタス(Streptococcus constellatus)、ストレプトコッカス・ダウネイ(Streptococcus downei)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・エクイナス(Streptococcus equinus)、ストレプトコッカス・フェルス(Streptococcus ferus)、ストレプトコッカス・インファンタリウス(Streptococcus infantarius)、ストレプトコッカス・イニアエ(Streptococcus iniae)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミレリ(Streptococcus milleri)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・オリスラッティ(Streptococcus orisratti)、ストレプトコッカス・パラサングイニス(Streptococcus parasanguinis)、ストレプトコッカス・ペロリス(Streptococcus peroris)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・シュードニューモニアエ(Streptococcus pseudopneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ラッティ(Streptococcus ratti)、ストレプトコッカス・チグリヌス(Streptococcus tigurinus)、ストレプトコッカス・サングイニス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)、ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)、ストレプトコッカス・ユベリス(Streptococcus uberis)、ストレプトコッカス・ベスティブラリス(Streptococcus vestibularis)、ストレプトコッカス・ビリダンス(Streptococcus viridans)、及びストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Streptococcus zooepidemicus)から選択される少なくとも1つの種に属する。
【００４５】
本発明の更なる好ましい態様によれば、ラクトコッカス属の細菌は、L.チュンガンゲンシス(L. chungangensis)、L.フォモセンシス(L. formosensis)、L.フジエンシス(L. fujiensis)、L.ガルビエアエ(L. garvieae)、L.ラクティス(L. lactis)、L.ピスシウム(L. piscium)、L.プランタラム(L. plantarum)、L.ラフィノラクティス(L. raffinolactis)、及びL.タイワンエンシス(L. taiwanensis)から選択される少なくとも1つの種に属する。
【００４６】
本発明の更なる好ましい態様によれば、アエロコッカス属の細菌は、A.ウリナエ(A. urinae)、A.サンギュニコーラ(A. sanguinicola)、A.クリステンセニイ(A. christensenii)、A.スイス(A. suis)、A.ウリナエクイー(A. urinaeequi)、及びA.ウリナエホミニス(A. urinaehominis)から選択される少なくとも1つの種に属する。
【００４７】
本発明の更なる好ましい態様によれば、エンテロコッカス属の細菌は、エンテロコッカス・アビウム(Enterococcus avium)、エンテロコッカス・デュランス(Enterococcus durans)、エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エンテロコッカス・ガリナルム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・ヘモペロキシダス(Enterococcus haemoperoxidus)、エンテロコッカス・ヒラエ(Enterococcus hirae)、エンテロコッカス・マロドーラツス(Enterococcus malodoratus)、エンテロコッカス・モラビエンシス(Enterococcus moraviensis)、エンテロコッカス・ムンチイ(Enterococcus mundtii)、エンテロコッカス・シュードアビウム(Enterococcus pseudoavium)、エンテロコッカス・ラフィノーサス(Enterococcus raffinosus)、及びエンテロコッカス・ソリタリウス(Enterococcus solitarius)選択される少なくとも1つの種に属する。
【００４８】
本発明の更なる好ましい態様によれば、酵母は、サッカロミセス属(Saccharomyces)、より好ましくは、サッカロミセス・セレビシア種(Saccharomyces cerevisiae)及び/又はサッカロミセス・ブラウディ種(Saccharomyces boulardii)に属する。
【００４９】
微生物、好ましくは、L.カゼイDG(登録商標)及び/又はラクトバチルス・パラカゼイLPC-S01細菌株が、好ましくは、生きている状態で使用され、すなわち、それらは、プロバイオティクスとして使用される。
【００５０】
或いは、微生物、好ましくは、L.カゼイDG(登録商標)及び/又はラクトバチルス・パラカゼイLPC-S01細菌株は、死滅している、又は間欠滅菌されている(tyndallized)。
【００５１】
更なる実施形態において、微生物、好ましくは、L.カゼイDG(登録商標)及び/又はラクトバチルス・パラカゼイLPC-S01細菌株は、溶菌液及び/又は抽出物の形態で使用され、すなわち、それらは、パラプロバイオティクス(paraprobiotic)として使用される。或いは、微生物、好ましくは、L.カゼイDG(登録商標)及び/又はラクトバチルス・パラカゼイLPC-S01細菌株は、細菌の産物、上清、派生物、好ましくは細菌派生物、好ましくはその代謝産物、代謝バイオプロダクト、ポストバイオティクス、細胞壁及び成分、エキソポリサッカライド、又は好ましくはリボソーム及び糖タンパク質、グルカン及び他のポリサッカライド、リポポリサッカライド、並びに上清の任意の成分等の免疫賦活剤誘導体から選択される免疫原性成分を含有する化合物の形態で使用される。
【００５２】
一般的に、前記微生物は、EFSAのQPSリストに示された任意の微生物種の、個々の微生物、又は微生物の組合せ、若しくはコンソーシアムである。
【００５３】
いずれの場合でも、本発明の組成物は、皮膚、腸、及び/若しくは身体の他の領域に安定的にコロニー形成する能力があり、病原性微生物/細菌からスペースを奪い取る能力があり、並びに/又はそれらと直接的に闘う能力がある、プロバイオティクス効果/作用/機能を有する任意の型の微生物、特に細菌、並びに/又は上記で定義されたような微生物、好ましくは細菌を含み得る。上記のような、化粧用組成物及び/又は医療用組成物は、好ましくは、上記で特定された株の、上記のような、好ましくは細菌、真菌、酵母、及びそれらの組合せから選択された、他の微生物との組合せを含む。
【００５４】
微生物、好ましくは、細菌は、皮膚、腸、及び/又は身体の他の領域の一時的なコロニー形成を可能にするのに十分である最小量で存在する。前記量は、好ましくは、106〜1011微生物単位の間、より好ましくは、108〜109微生物単位の間の範囲であり、前記量は、好ましくは、1日あたりの量/用量(一日量)である。
【００５５】
本組成物は更に、賦形剤並びに/又は更なる薬学的に許容される物質及び/若しくは担体を含む。
【００５６】
本発明の組成物は、好ましくは、血漿、PRP、瘢痕形成性物質、再上皮化性物質、湿潤剤、保湿剤、皮膚軟化剤、吸着剤、鎮痛及び瀉血剤、抗炎症剤、筋弛緩剤、ペプチド性及び/若しくはタンパク質性物質及び/若しくはタンパク質、例えば、コラーゲン、結合組織に属する物質、例えば、グリコサミノグリカン、好ましくはコンドロイチン硫酸、並びに/又はそれらの組合せから選択される物質を更に含む。
【００５７】
本発明の一実施形態において、本組成物は、好ましくは局所型の適用のために、好ましくは、クリーム剤、ゲル剤、オイル剤、乳濁液剤、スプレー剤、ガーゼ、パッチ剤、絆創膏、ローション剤、ムース剤、軟膏剤、ペースト剤、又は、本組成物が好ましくは皮膚への適用前に即時に加えられる液体製剤の形態で、製剤化される。
【００５８】
本発明の一実施形態において、本組成物は、皮膚微生物叢の移植に使用される。本発明の関連において、皮膚微生物叢の移植とは、正しいバランスを再確立して、それにより、存在している可能性がある任意の腸内毒素症を処置するための、皮膚障害をもたない健康な対象の皮膚微生物叢及び/又はその一部の投与、好ましくは局所的投与を意味する。これらの目的のために、本発明の組成物は、好ましくは、細菌、好ましくは、L.カゼイDG(登録商標)細菌株及び/又はラクトバチルス・パラカゼイLPC-S01細菌株、並びに任意で、真菌、ウイルス、ペプチド、タンパク質性及び/若しくはペプチド性物質、糖質、ビタミン、微量元素、又は皮膚及び/若しくは身体の他の領域の微生物叢を特徴付ける任意の他の物質も含む。そのような目的のために、前記組成物は、好ましくは、アミノ酸、サプリメント、ビタミン、亜鉛及びセレニウム等の微量元素、多量及び微量栄養素、酵素、及び/若しくは、フラクトオリゴ糖(FOS)、ガラクトオリゴ糖(GOS)、イヌリン、グアーガム等のプレバイオティクス物質、並びに/又はそれらの組合せと組み合わせて使用される。本発明の一実施形態において、本組成物は、経口投与のために、好ましくは、固体製剤、好ましくは、丸剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、ハードシェルカプセル剤、口腔内溶解顆粒剤、サシェ剤、又はトローチ剤として製剤化される。
【００５９】
或いは、本組成物は、液体として、好ましくは即時調製用に、製剤化される。
【００６０】
或いは、本組成物は、局所的作用を発揮する能力がある形態、例えば、浣腸、クリーム剤、スプレー剤、ゲル剤、パッチ剤、ローション剤、ムース剤、軟膏剤、ペースト剤、本組成物が好ましくは皮膚への適用前に即時に加えられ、及び/又は調製される液体製剤の形態である。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は、アミノ酸、サプリメント、ビタミン、亜鉛及びセレニウム等の微量元素、多量及び微量栄養素、酵素、及び/若しくは、フラクトオリゴ糖(FOS)、ガラクトオリゴ糖(GOS)、イヌリン、グアーガム等のプレバイオティクス物質、又はそれらの組合せと組み合わせて使用される。
【実施例】
【００６２】
細菌株及び細胞
例として、本発明は以下の細菌株を使用して実証された:
-  L.カゼイDG(登録商標)(ラクトバチルス・パラカゼイCNCM1-1572)
-  L.パラカゼイLPC-S01
-  L.カゼイDG(登録商標)+L.パラカゼイLPC-S01の1:1混合物。
【００６３】
細菌株を、MRS(de Man Rogosa Sharpe社)からなる選択培地中、37℃で16時間、培養した。増殖が静止期に達したならば、細菌の試料を収集し、試験に使用した。それらは、PBS(リン酸緩衝食塩水)で数回、洗浄し、消費された培地を除去するために遠心分離した。静止期の生きている細胞を使用し、静止期よりむしろこの期においては、細菌はより小さい免疫応答を誘導するからである。
【００６４】
下記の試験の全てを3連で行った。
【００６５】
好適なサプリメントを含む培養で維持された正常なヒトケラチノサイトを実験に使用した。
【００６６】
プロピオニバクテリウム・アクネス(P. acnes) CCUG 50865(CCUG(Culture Collection, University of Goteborg)から購入した)を、供給業者の使用説明書に従って調製されたクックドミート培地(液体と固体の両方)中、37℃で16時間、培養した。その後、細菌濃度を、分光光度法により、O.D. 600nmでの読み取りで決定し、接着試験に使用した。
【００６７】
接着試験及び細胞株の病原体での負荷
ケラチノサイトを、細胞培養プレートのウェルに、5%CO2、37℃で播種し、コンフルエンス(すなわち、合計約105細胞)に達するまで増殖させた。播種率は、2.5×105細胞/0.32cm2(すなわち、7.8×105細胞/cm2の細胞密度)であった。実験のその時点で、培地を除去し、細胞を、抗生物質を含まない培地で洗浄し、その後、試験のために細菌を加え、その試験は、下記の異なるプロトコールに従って行った。
【００６８】
1)  株のケラチノサイトへの接着
ウェルあたりのケラチノサイトの数を決定した後、L.パラカゼイの株を、MOI 1:10(ウェルあたり105細胞と細菌の106 CFU)で加えた。その株を、1:1比で、個々として、及び組合せの両方で、試験した。
【００６９】
細菌を、37℃でわずかに振盪させながら維持された細胞と60分間接触させたままにした。インキュベーションの終わりに、培地を除去し、細胞を、無菌培地で洗浄して、細胞単層に接着しなかった細菌を除去した。
【００７０】
接着細菌の数を計算するために、細胞を脱離させて、溶解し、細菌を寒天MRS培地に播種した後、超生体染色によりカウントした。
【００７１】
2)  接着排除試験
ケラチノサイトの数を各ウェルについて決定した後、L.パラカゼイの株を、細胞へ1:1比で、個々として、及び組合せの両方で、加えた。
【００７２】
細菌を、37℃でわずかに振盪させながら維持された細胞と60分間接触させたままにした。インキュベーションの終わりに、培地を除去し、細胞を、無菌培地で洗浄して、細胞単層に接着しなかった細菌を除去した。
【００７３】
その後、P.アクネス(1:10 MOIにおける)を、細胞と接触させるように置き、37℃で60分間、インキュベートした。インキュベーションの終わりに、培養培地を除去し、非接着細菌を無菌培地で洗浄することにより排除した。
【００７４】
ケラチノサイトに接着したP.アクネスの数を計算するために、細胞を脱離させて、溶解し、細菌を、5%ヒツジ血液寒天中、嫌気生活下、37℃で48〜72時間播種した後、超生体染色によりカウントした。L.パラカゼイの株とプレインキュベートされなかったが、P.アクネス単独を接種されたケラチノサイトを含むウェルを、P.アクネスの接着についての陽性対照として使用し(P.アクネス接着対照)、一方、いかなる細菌ともインキュベートされなかった細胞を含むウェルを、陰性対照として使用した(無菌対照)。
【００７５】
3)  接着競合の試験
ウェルあたりのケラチノサイトの数を決定した後、P.アクネスと同時に、L.パラカゼイの株を(個々として、及び1:1比の両方で)加えた。細菌は、1:10の全体的MOI、及び1:1のプロバイオティクス:病原体比で加えられた。
【００７６】
細菌を、37℃でわずかに振盪させながら、60分間細胞と接触させたままにした。インキュベーションの終わりに、培地を除去し、細胞を、無菌培地で洗浄して、細胞単層に接着しなかった細菌を除去した。
【００７７】
ケラチノサイトに接着したP.アクネスの数を計算するために、細胞を脱離させて、溶解し、細菌を、5%ヒツジ血液寒天中、嫌気生活下、37℃で48〜72時間播種した後、超生体染色によりカウントした。P.アクネス単独を接種されたケラチノサイトを含むウェルを、陽性対照として使用し(P.アクネス接着対照)、一方、いかなる細菌ともインキュベートされなかった細胞を含むウェルを、陰性対照として使用した (無菌対照)。
【００７８】
4)  接着した病原体除去の試験
ウェルあたりのケラチノサイトの数を決定した後、P.アクネスを加えた(MOI 1:10)。
【００７９】
細菌を、37℃でわずかに振盪させながら維持された細胞と60分間接触させたままにした。インキュベーションの終わりに、培地を除去し、細胞単層に接着しなかった細菌を無菌培地で繰り返し洗浄することにより除去した。
【００８０】
その後、L.パラカゼイの株(個々として、及び1:1比での組合せでの両方で)を、37℃でわずかに振盪させながら維持された細胞と60分間、接触させたままにした。インキュベーションの終わりに、培地を除去し、細胞を、無菌培地で洗浄して、細胞単層に接着しなかった細菌を除去した。
【００８１】
ケラチノサイトに接着したP.アクネスの数を計算するために、細胞を脱離させて、溶解し、細菌を、5%ヒツジ血液寒天中、嫌気生活下、37℃で48〜72時間播種した後、超生体染色によりカウントした。
【００８２】
P.アクネスで処理されたケラチノサイトを、陽性対照として使用し(P.アクネス接着対照)、一方、細菌で処理されなかったケラチノサイトを、陰性対照として使用した(無菌対照)。
【００８３】
純粋な形態での個々の株で、及び1:1混合物での両方で実施された試験を、2回繰り返した。
【００８４】
1)  株のケラチノサイトへの接着  -  結果
この試験の結果は、個々として、及び組み合わせても取り入れられた株の、ケラチノサイトへ接着する能力を示した。特に、L.カゼイDG(登録商標)株は、L.パラカゼイLPC-S01の能力より大きい、ケラチノサイトへの接着の能力を示した。したがって、組合せについて観察された接着能力は、おそらく、L.カゼイDG(登録商標)株により提供された寄与に起因する。
【００８５】
【表１】
2021505689.tif 000003
【００８６】
-  接着排除試験(真核細胞のプロバイオティクスでの前処理及びその後の病原体とのインキュベーション)  -  結果
上記で述べられたように、ケラチノサイトの単層を、最初、プロバイオティクスとの接触に曝露し、続いて、非接着細菌の除去後、P.アクネスとの接触に曝露し、その後、その非接着P.アクネスを洗浄により除去した;この後、P.アクネスの残留生存率を定量化した。
【００８７】
陰性対照は、細菌との接触による刺激がない真核細胞により表され、一方、陽性対照は、プロバイオティクスでのいかなる前処理もないケラチノサイトへ接着するP.アクネスの能力によって表される。図1Aは、試験される異なるプロバイオティクスでの接触によるケラチノサイトの予備刺激後に接着している生きた生存細胞のパーセンテージという観点からのP.アクネスの接着に関する結果を示す。100がプロバイオティクスでの刺激の非存在下でのP.アクネスの接着を表す場合、試験された株の阻害能力は、陽性対照と比較したP.アクネスによる接着の%低減として表現された。
【００８８】
どちらのプロバイオティクス株も、P.アクネスの接着を、類似した%(L.カゼイDG(登録商標)について42%、及びL.パラカゼイLPC-S01について35%)で防止する能力を示した。
【００８９】
-  接着競合試験(真核細胞のプロバイオティクスと及び病原体との共インキュベーション)  -  結果
これらの試験中、P.アクネスと共インキュベートした場合、プロバイオティクスにより発揮される潜在的な競合阻害効果を評価することを目的として、P.アクネスのケラチノサイトへの接着の低減(もしあれば)を、細胞株のプロバイオティクス及び病原体での同時処理後、アセスメントした。
【００９０】
P.アクネスで処理されたケラチノサイトを、陽性対照として使用し、一方、細菌で処理されなかったケラチノサイトを、陰性対照として使用した(無菌対照)。
【００９１】
図1Bは、ケラチノサイトのP.アクネスと及び試験される異なるプロバイオティクスとの共インキュベーション後の接着する生きた生存細胞のパーセンテージという観点からのP.アクネスの接着に関する結果をグラフで示す。前に記載されているように、100がプロバイオティクスによる刺激の非存在下でのP.アクネスの接着を表す場合、試験された株の阻害能力は、陽性対照と比較したP.アクネスによる接着の%低減として表現された。
【００９２】
プロバイオティクスと病原体との相互作用のこの様式において、L.カゼイDG(登録商標)株は、接着を17%低減させる能力を示し、一方、L.パラカゼイLPC-S01株は9%を示した。その株の組合せは、P.アクネスの接着において統計的に有意な低減を生じ、それは、42%を示し、個々としてみなされた株について観察されたものより明確により高く、且つ又、それらの効果の合計より高いパーセンテージである。
【００９３】
-  接着した病原体の除去に関する試験(真核細胞の病原体での前処理、及び引き続いての、プロバイオティクスとのインキュベーション)  -  結果
これらの試験中、P.アクネスのケラチノサイトへの接着におけるあらゆる低減を、その細胞株の病原体での前処理、及び引き続いての、非接着病原体の除去後のプロバイオティクスとのインキュベーション後に、アセスメントした。
【００９４】
P.アクネスで処理されたケラチノサイトを、陽性対照として使用し、一方、細菌で処理されなかったケラチノサイトを、陰性対照として使用した(無菌対照)。
【００９５】
図1Cは、真核細胞の病原体(P.アクネス)での負荷後、試験される異なるプロバイオティクスとケラチノサイトをインキュベートした後の、接着する生きた生存細胞のパーセンテージという観点からのP.アクネスの接着に関する結果をグラフで示す。前に記載されているように、100がプロバイオティクスの非存在下でのP.アクネスの接着を表す場合、試験された株の阻害能力は、陽性対照と比較したP.アクネスによる接着の%低減として表現された。
【００９６】
共インキュベーションプロトコールの場合のようにこれらの試験においても、2つのプロバイオティクスの組合せに関係する、興味深い、統計的に有意な相乗効果が観察され、その組合せは、P.アクネスの接着を42%低減させる能力があることを示した。対照的に、その個々のプロバイオティクスは、混合物のそれの半分未満である、接着を低減させる能力を示した。L.カゼイDG(登録商標)について18%、及びL.パラカゼイLPC-S01について11%。
【００９７】
免疫調節試験
プロバイオティクス株が、細菌リポポリサッカライド(LPS)の負の刺激に曝露されたヒトケラチノサイトによるサイトカインの遊離を調節する能力を有するかどうかを検証することを目的として、免疫調節試験を行った。
【００９８】
正常なヒトケラチノサイトを、上記のように細胞培養プレートに播種し、コンフルエンスに達したならば、それらを実験に使用した。特に、細胞単層を、抗生物質を含有しない新鮮な培地中で、洗浄及びインキュベートした。次いで、L.パラカゼイの株を、1:10のMOIで、個々として、及び1:1比の組合せで加えた。
【００９９】
その細菌を、37℃でわずかに振盪させながら120分間、ケラチノサイトと接触させたままにした。いくつかの場合、細胞を、100ng/mlの最終濃度でのLPSで予備刺激した(約24時間、負荷した)。
【０１００】
インキュベーションの終わりに、培地を除去し、細胞に接着しなかった細菌を排除するために、細胞を無菌培地で洗浄し、引き続いて、37℃で24時間、培養培地中に維持した。
【０１０１】
インキュベーションの終わりに、ELISAアッセイを用いて、産生されたサイトカイン(IL-10、IL-1ベータ、IL-8、胸腺間質性リンパ球新生因子[TSLP])を定量化するために培養培地を収集し、一方、シクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)及び活性化NF-kB(LPS又はIL-1ベータにより誘導される)のレベルを、溶解したケラチノサイトから抽出された総タンパク質上でのウェスタンブロット法により決定した。
【０１０２】
これらのマーカーが選択されたのは、それらが、急性炎症(phlogosis)及びアレルギー性皮膚炎においてと、慢性関連炎症(phlogosis)においてとの両方に関与するからである。特に、IL-10は、抗炎症性と考えられており、それの産生は、一般的に、IL-1ベータのような強力な炎症促進性サイトカインの産生と並行して増加する。TSLPは、リンパ球の作用を調節するサイトカインであり、慢性角膜炎の発症に関与している。
【０１０３】
結果
試験される株の、ケラチノサイトの免疫応答を刺激する能力を、上記のプロトコールに従って評価した。その試験の焦点を、サイトカイン(IL-8、IL-1ベータ、及びIL-10)を決定すること、及び2つのマーカー、COX-2及びNF-kBの活性化を評価することに当てた。
【０１０４】
COX-2(シクロオキシゲナーゼ-2)は、特定の炎症刺激に応答して、限られた数の細胞型によって産生される誘導性マーカーを表す。それは、皮膚新生物を含むいくつかの新生物において過剰発現する。NF-kB(活性化B細胞の核内因子カッパ軽鎖エンハンサー)は、炎症性のものを含む、様々な刺激に応答して全ての細胞型によって産生される、転写因子の機能を有するタンパク質複合体である。
【０１０５】
培養されたケラチノサイトを、すでに記載された手順により、プロバイオティクスL.パラカゼイのL.カゼイDG及びL.パラカゼイLPC-S01、並びにその2つの株の1:1比での組合せに曝露させた。その後、細胞上清をアッセイして、サイトカインを、特に、プロバイオティクス株と接触するように置かれたケラチノサイトにおいてアッセイすることができる抗炎症型のサイトカインに関して、決定した。アッセイの結果は、図2に要約されており、ELISA試験を用いて得られた上清の1mlあたりのpgで表される、細胞上清におけるIL-10、IL-1ベータ、及びIL-8のアッセイをグラフで示している。得られた結果の詳細な評価により、以下のように結論づけることができた:
-  IL1β:  ケラチノサイトの上清1mlあたり少量ナノグラムの発現のレベル。プロバイオティクスとの接触は、(プロバイオティクスにより刺激されていないケラチノサイトの)ベースライン発現と比較してこのサイトカインの統計的に有意な低減を引き起こさなかった。L.パラカゼイLPC-S01は、L.カゼイDGと比較して、中程度にプラスの影響を示し、組合せのそれと同等であった。免疫応答を最大限にするためのケラチノサイトのLPSでの予備刺激の場合も、同様の考察が当てはまる。
-  IL-10:  ケラチノサイトの上清1mlあたりの数十pgの発現のレベル。プロバイオティクスとの接触は、(プロバイオティクスにより刺激されていないケラチノサイトの)ベースライン発現と比較してこのサイトカインの低減を引き起こした。L.パラカゼイLPC-S01は、L.カゼイDGと比較して中程度にプラスの影響を示し、組合せのそれと同等であった。免疫応答を最大限にするためのケラチノサイトのLPSでの予備刺激の場合も、同様の考察が当てはまる。
-  IL-8:  ケラチノサイトの上清1mlあたり少量ナノグラムの発現のレベル。プロバイオティクスとの接触は、(プロバイオティクスにより刺激されていないケラチノサイトの)ベースライン発現と比較してこのサイトカインの低減を引き起こした。L.パラカゼイLPC-S01は、L.カゼイDGと比較して、プラスの影響を示し、組合せのそれと同等であった。免疫応答を最大限にするためのケラチノサイトのLPSでの予備刺激の場合、どちらのプロバイオティクスも、本サイトカインのコントロールにプラスに影響を及ぼす能力を示し、個々としてみなされたプロバイオティクス及び混合物のどちらについても同様の潜在能力があった。
-  TSLP:  ケラチノサイトの上清1mlあたり少量ナノグラムの発現のレベル。プロバイオティクスとの接触は、(プロバイオティクスにより刺激されていないケラチノサイトの)ベースライン発現と比較して本指標の低減を引き起こした。個々としてみなされての、及び組合せでのプロバイオティクス株は、この指標の発現を調整するのに効果的であることが示された。本指標は、アトピー性皮膚炎等のいくつかの皮膚病態において過剰発現しているため、かなり関心が高い。更に、このサイトカインは、ケラチノサイトと樹状細胞との間の機能的界面における重要なメディエータとみなされる。
【０１０６】
COX-2の発現のレベルの評価により、このマーカーのレベルが、L.パラカゼイLPC-S01との接触による中程度の封じ込め作用を除けば、ベースラインレベルと比較してケラチノサイトのプロバイオティクスとの接触後に特定の変化を受けないように思われることを示すことができた。LPSでの処理は、真核細胞によるCOX-2の発現のレベルの増加を示し、その増加は、プロバイオティクスの作用により、効果的に抑制され、かつ制限された。L.パラカゼイLPC-S01の存在は、L.カゼイDGと比較してより大きい程度で、そのマーカーの発現を削減し、一方、2つのプロバイオティクス株の組合せは、いかなる作用も示さないように思われた。
【０１０７】
IL8及びCOX-2の発現は、転写因子NF-kBによって制御されるため、プロバイオティクスに曝露されたケラチノサイトによるNF-kBの遊離を定量的にアセスメントした。その結果は、LPSにより表される炎症性刺激の非存在下で、そのマーカーの発現は検出できないように思われることを実証している。しかしながら、それは、細菌リポポリサッカライドによりp65のリン酸化を介して活性化される。2つのプロバイオティクス株は、NF-kBの発現を抑制する能力を顕在化し、特にL.パラカゼイLPC-S01に関して、それの存在は、単一の株として、及びDGとの混合物においてのどちらにおいても、LPS誘導化NF-kBの発現を抑制させるのに特に効果的であることを示した。
【０１０８】
UVにより引き起こされる損傷の低減の評価
プロバイオティクス株LPC-S01の、UV照射により引き起こされる損傷を低減させる能力を、完全3Dインビトロ再構築皮膚モデルにおいて評価し、その皮膚モデルは、真皮及び表皮のコンパートメントを再現し、したがって、真皮の細胞外マトリクスの改変及び生存可能な皮膚層の分化を研究することを可能にする(全層皮膚モデル)。本研究は、UV照射に応答したインフラマソームの活性化へのLPC-S01株の効果の評価に関連した。LPC-S01株を、3D皮膚モデルの表面に直接塗布し、一晩インキュベートし、その後、食塩水ですすいで、過剰な産物を除去した。組織を軽く引っ掻き、その後、通常の日光曝露を模倣するために1MED(最小紅斑生成性用量)のUVに曝露した。炎症の活性化を、UV照射への曝露から4時間後及び24時間後に試験した。食塩水で処理され、かつUV照射に曝露された組織を、陽性対照として使用した。食塩水を陰性対照として使用した。
【０１０９】
ヘマトキシリン/エオシン染色での組織形態学的分析
処理の終わりに、組織を食塩水で洗浄し、10%ホルマリン中に固定した。各試料について、生物学的複製物(n=3)を、同じパラフィンブロック中に含ませ、2つの非連続5pm切片を切断し、収集した。組織切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。組織学的試料を、光学顕微鏡(20×及び40×倍率)で分析し、組織の形態学的変化及び細胞毒性効果を評価した。
【０１１０】
NFkBの免疫染色
NFkBを標識することは、細胞質から核へのそれの移行を評価することを可能にする;それの移行は、事実、炎症過程を活性化することができる。NFkBを、当技術分野において公知の免疫染色技術を用いて標識した。特に、一次抗NFkB(Abeam社)抗体及びフルオロフォアAlexa 555で染色された二次抗体、並びに細胞核を強調するためにDAPIでの対比染色を使用した。画像を、蛍光顕微鏡を40×倍率で用いて取得した。
【０１１１】
インターロイキン1βのELISAによる定量化
抗体をELISAプレート上へ吸着させ、その後、試料をインキュベートした。二次抗体を加えて、「サンドイッチ」を形成させた。定量化は標準曲線に基づいた。データを、顕微分光測光法測定を用いて取得した。
【０１１２】
UVにより引き起こされる損傷の低減の結果
UV照射への曝露から4時間後、未処理の組織(陽性対照)は、変化していない形態を示したが、表皮の下層において細胞がUV照射により損傷した。4時間後、LPC-S01株で処理された組織は、組織の形態若しくは一般的な構造における、又は下層表皮に存在する熱傷の損傷における、実質的な変化を示さなかった。UV照射への曝露から24時間後、組織は、熱傷による表皮の典型的な変化を示し、濃縮した核、変化を有する表皮及び真皮を示した。LPC-S01株の投与は、UV照射により誘発された組織において形態学的変化を防止することに改善を示さなかった。
【０１１３】
Table 2(表2)は、UV照射への曝露から4時間後、NFkB移行の定量化の結果を要約する。
【０１１４】
【表２】
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【０１１５】
照射から4時間後、陽性対照は、特に表皮の基底層直上の層において、多数のNFkB移行を示した。
【０１１６】
プロバイオティクスLPC-S01での処理は、NFkBの核移行を、陽性対照と比較して有意な程度で阻害することができた。更に、LPC-S01株は、NFkBの細胞質レベルを低減させる能力があることも示した。
【０１１７】
最後に、IL-1βの分泌は、UV照射での傷害から4時間後、8時間後、及び24時間後、増加を示した。プロバイオティクスLPC-S01の投与は、傷害の4時間後、8時間後、及び24時間後にIL-1βの分泌が元の状態に戻るのを可能にした。特に、傷害の8時間後及び24時間後に有意な低減が見られた。
【０１１８】
【表３】
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【０１１９】
このように、プロバイオティクスLPC-S01は、UV照射による傷害に曝された細胞の、NFkBの核への移行を阻害することにより炎症の活性化を防止する能力を示した。更に、S01株は、照射傷害の4時間後、8時間後、及び24時間後、炎症促進性インターロイキン1βのレベルを低減させることにより炎症のレベルを低減することに直接的な効果を示した。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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