(57)【要約】  本発明は、インビボ、インビトロおよびエクスビボでの使用を含む、Ｌｃｋを活性化するための組成物および方法に関する。【選択図】図１６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
７個以上の近接カチオン性アミノ酸を有するＬｃｋ活性化カチオン性アミノ酸配列を含む、Ｌｃｋを活性化するためのペプチド。
【請求項２】
前記カチオン性アミノ酸配列が、８〜１０個の近接カチオン性アミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記カチオン性アミノ酸が、アルギニン、リシン、およびオルニチンからなる群より独立に選択される、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記カチオン性アミノ酸配列が、ＲＲＲＲＲＲＲＲ、ｒｒｒｒｒｒｒｒ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、およびｒｒｒｒｒｒｒｒｒからなる群より選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが、前記カチオン性アミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドが、式Ｉ：
Ｒ／Ｋ’−ｘ１−Ｒ／Ｋ−ｘ２−Ｒ／Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”      式Ｉ
のＬｃｋ活性化ポリペプチド部分またはその反転配列をさらに含み、式中、
各Ｒ／Ｋは独立に、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基であり；
Ｒ／Ｋ’は（Ｉ）、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基でありかつ存在しまたは非存在であり；
Ｒ／Ｋ”は、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基でありかつ存在しまたは非存在であり；
ｘ１〜ｘ６はそれぞれ独立に、１個のアミノ酸であり；かつアミノ酸ｘ３〜ｘ６はまとめて、存在しまたは非存在であり、かつＲ／Ｋ”は、アミノ酸ｘ３〜ｘ６が非存在である場合非存在である、
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
アミノ酸ｘ１〜ｘ６の１個または複数が、疎水性アミノ酸である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
前記Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分が、前記カチオン性アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に結合される、請求項６または請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドアミノ酸配列が、Ｌアミノ酸残基を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドアミノ酸配列が、Ｄアミノ酸残基を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドアミノ酸配列が、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒｒｒｒｒｒｒｒｒ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖｒｒｒｒｒｒｒｒｒ、ＲＳＫＡＫ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ−ｙｌｐｎｋａｋｓｒ、ＩＡＧＱ−ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＰＬＧ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＳＫＡＫＮＰＬＹＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＹＬＰＮＫＡＫＳＲ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、分岐＜ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、ＨＨＨＨＨ−ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＨＨＨＨＨ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨ−ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ−ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ、ＨＨＨＨＨ−ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＫＲＫＲＫＲＫＲＫ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−Ｒ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨ−ＨＨ、ＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨ、およびＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨからなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２】
アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲまたはＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲを含む、Ｌｃｋを活性化するためのペプチド。
【請求項１３】
前記アミノ酸配列が、前記ペプチドのＣ末端でアミド化される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記カチオン性アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に結合される式ＩＩ：
【化１】
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の化合物をさらに含み、式中、
ｎは、化合物のモノマー単位の数でありかつ１〜５の整数であり、
各ｍは独立に、０〜１８の整数であり、および
各Ｒ基は独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ１８の側鎖である、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５】
各モノマー単位の前記Ｒ基が独立に、Ｃ１〜Ｃ１８側鎖である、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
各Ｒ基が独立に、１８−ｍ炭素原子長であり、ｍは、０〜１７の値を有する、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
前記カチオン性アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に結合される化合物をさらに含み、前記化合物が、少なくとも１個の脂肪酸である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１８】
少なくとも４個の脂肪酸が、カチオン性アミノ酸配列のＣ末端に結合される、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
前記最遠位脂肪酸が、アミド化される、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２０】
２個以上の脂肪酸の結合が、直鎖である、請求項１８または請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
２個以上の脂肪酸の結合が、分岐される、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２２】
前記脂肪酸が、飽和される、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２３】
前記脂肪酸が、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸（デカン酸）、およびラウリン酸（ドデカン酸）からなる群より選択される、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２４】
ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒｒｒｒｒｒｒｒｒ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖｒｒｒｒｒｒｒｒｒからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２５】
ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒｒｒｒｒｒｒｒｒ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖｒｒｒｒｒｒｒｒｒからなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２６】
有効成分としての請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドおよび薬学的に許容可能な希釈剤または担体を含む、医薬組成物。
【請求項２７】
Ｌｃｋキナーゼの活性を高める方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物とＬｃｋキナーゼを接触させることを含む、方法。
【請求項２８】
ＬｃｋキナーゼのＹ３９４リン酸化を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物とＬｃｋキナーゼを接触させることを含む、方法。
【請求項２９】
細胞または細胞の集団からのＩＬ−２分泌を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３０】
細胞または細胞の集団のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３１】
細胞上または細胞の集団中のＩＬ−２ＲＢ（ＣＤ１２２）発現を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３２】
細胞のまたは細胞の集団でのＩＬ−２応答性を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３３】
細胞上または細胞の集団中のＣＤ２８発現を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３４】
細胞または細胞の集団からのＩＬ−１２分泌を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３５】
細胞上または細胞の集団中のＩＬ−１２Ｒ発現を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３６】
ＩＬ−１２Ｒが、ＩＬ−１２ＲＢ１および／またはＩＬ−１２ＲＢ２である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
細胞のまたは細胞の集団でのＩＬ−１２応答性を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３８】
細胞または細胞の集団からのＩＬ−２１分泌を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３９】
細胞または細胞の集団からのＩＬ−１５分泌を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項４０】
細胞上または細胞の集団中のＩＬ−１５Ｒ発現を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項４１】
細胞のまたは細胞の集団でのＩＬ−１５応答性を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項４２】
細胞上または細胞の集団中のＩＬ−１８Ｒ発現を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項４３】
細胞のまたは細胞の集団でのＩＬ−１８応答性を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項４４】
細胞または細胞の集団からのサイトカイン分泌を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項４５】
前記サイトカインが、ＩＦＮgである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
細胞または細胞の集団の増殖を誘導する方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項４７】
細胞の集団の増殖を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項４８】
前記細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞からなる群より選択される細胞である、または前記細胞の集団が、これらからなる群より選択される細胞を含む、請求項２７〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が、未感作細胞である、または前記細胞の集団が、未感作細胞を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
Ｔ細胞機能を強化する方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物とＴ細胞またはＴ細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項５１】
細胞傷害性細胞機能を強化する方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞傷害性細胞または細胞傷害性細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項５２】
Ｔ細胞またはＴ細胞の集団の疲弊を低減させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物とＴ細胞またはＴ細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項５３】
酸化的損傷を治療する方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項５４】
細胞集団中のＴｒｅｇ細胞の比率を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物とＴｒｅｇ含有細胞集団を接触させることを含む、方法。
【請求項５５】
前記Ｔｒｅｇ細胞が、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
チェックポイント阻害剤の存在下でＣＤ２５発現を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項５７】
前記接触させることが、インビボまたはインビトロで実施される、請求項２６〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記方法が、エクスビボで実施される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることにより得られる細胞または細胞の集団に由来する細胞または細胞集団。
【請求項６０】
前記ペプチドまたは医薬組成物が、インビボでＬｃｋの活性を高めるために対象に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項６１】
対象中のＬｃｋの活性を高める方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６２】
対象中の免疫応答を誘導する方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６３】
ＬｃｋまたはＬｃｋ活性の抑制または下方制御を特徴とする疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状を治療するおよび／または予防する方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項６４】
ＬｃｋまたはＬｃｋ活性の抑制または下方制御を特徴とする前記疾患または状態が、病原性感染症、病原性感染症に由来する敗血症（例えば、慢性敗血症）、免疫不全障害、低下した免疫応答、減少したＴ細胞数、Ｔ細胞異常、Ｔ細胞疲弊、およびＴ細胞チェックポイント阻害からなる群より選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記疾患または状態が、癌である、請求項６３または請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
それを必要としている対象にワクチン接種する方法であって、ワクチンと同時にまたは順次に請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６７】
それを必要としている対象において癌を治療するおよび／または予防する方法であって、チェックポイント阻害剤と同時にまたは順次に請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６８】
対象において免疫抑制を低減する方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６９】
対象において加齢関連免疫機能不全を治療するおよび／または予防する方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７０】
対象においてＴｈ１応答を誘導する方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７１】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含むＬｃｋまたはＬｃｋ活性の抑制または下方制御を特徴とする疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状の治療および／または予防のための投与単位剤形。
【請求項７２】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドを含む癌の治療または予防のための投与単位剤形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｌｃｋ（リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ）活性化の刺激および種々の疾患または状態の予防または治療で使用するためのＬｃｋ活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学では、ＣＤ４（分化４のクラスター）は、ヘルパーＴ細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞などの免疫細胞の表面上で認められる糖タンパク質である。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、免疫系の不可欠の部分である白血球であり、これは、ＣＤ８キラー細胞などの他の免疫細胞にシグナルを送り、感染性粒子を破壊する。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体が抗原ペプチド：主要組織適合抗原（ＭＨＣ）を結合し、それはＴＣＲ複合体をクラスター化させ細胞内カスケードを開始させる。Ｔ細胞活性化では、それぞれクラスＩＩまたはクラスＩ  ＭＨＣ分子への共受容体ＣＤ４およびＣＤ８の結合が、抗原に対するＴ細胞の感受性を高める。
【０００３】
Ｌｃｋは、Ｓｒｃファミリーキナーゼのメンバーであり、Ｔ細胞のエフェクター能力の発現、すなわち、効果的なサイトカインの転写と共に、発生中の胸腺細胞および成熟Ｔ細胞の両方の増殖と分化に不可欠である（Ｌｏｖａｔｔ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，２６（２２）：８６５５−８６６５）。
【０００４】
ＬｃｋによるＴＣＲのリン酸化は、細胞質ゾルキナーゼＺＡＰ７０（ゼータ鎖関連プロテインキナーゼ７０）を細胞膜に動員する結合部位を作り出すことにより、下流のシグナル伝達を開始させる（Ｉｗａｓｈｉｍａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，２６３：１１３６−１１３９）。さらに具体的には、Ｌｃｋは、Ｔｙｒ５０５をリン酸化するＣ末端Ｓｒｃキナーゼ（Ｃｓｋ）により調節され、ＣｓｋはＬｃｋの不活性化、活性部位の再配置を介してＬｃｋのキナーゼ活性を活性化するＬｃｋ活性化ループのＴｙｒ３９４のトランス自己リン酸化、およびホスファターゼによる脱リン酸化をもたらす（Ｆｕｌｏｐ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  ＆  Ｈｅａｌｔｈｓｐａｎ，２０１２，１：６）。
【０００５】
ＴＣＲ刺激時に、ＣＤ４／ＣＤ８結合Ｌｃｋは、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と近接し、ＣＤ３分子の免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）をリン酸化する。ＺＡＰ７０キナーゼがその後、リン酸化ＩＴＡＭへ動員され、続いてＬｃｋにより活性化される。これは、Ｔ細胞活性化およびＩＬ−２産生に最終的に繋がる複数の経路の活性化をもたらす（Ｗａｎｇ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１４，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１４／６８２０１０）。
【０００６】
加えて、Ｌｃｋの樹状細胞（ＤＣ）媒介活性化は、同族ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ抗原複合体に対するＴＣＲ応答の感度と大きさを劇的に高めるプロセスである、「ＴＣＲライセンシング」をもたらす（Ｍｅｒａｎｅｒ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７８（４）：２２６２−２２７１）。このような上皮内ＤＥＴＣ細胞（樹枝状表皮Ｔ細胞）またはガンマ／デルタＴ細胞は、恒常性、組織修復、炎症および悪性腫瘍からの保護において有用な役割を果たす（Ｗｉｔｈｅｒｄｅｎ  ＤＡ  ＆  Ｈａｖｒａｎ  ＷＬ，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ，２０１３，９４（１）：６９−７６）。
【発明の概要】
【０００７】
一実施形態では、本発明は、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドを提供し、このペプチドは、７個以上の近接カチオン性アミノ酸を有するＬｃｋ活性化カチオン性アミノ酸配列を含む。別の実施形態では、カチオン性アミノ酸配列は、８〜１０個の近接カチオン性アミノ酸を含む。
【０００８】
別の実施形態では、カチオン性アミノ酸は、アルギニン、リシン、およびオルニチンからなる群より独立に選択される、別の実施形態では、カチオン性アミノ酸配列は、ＲＲＲＲＲＲＲＲ、ｒｒｒｒｒｒｒｒ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、およびｒｒｒｒｒｒｒｒｒからなる群より選択される。
【０００９】
別の実施形態では、ペプチドは、カチオン性アミノ酸配列からなる。
【００１０】
別の実施形態では、ペプチドは、式Ｉ：
Ｒ／Ｋ’−ｘ１−Ｒ／Ｋ−ｘ２−Ｒ／Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”      式Ｉ
のＬｃｋ活性化ポリペプチド部分またはその反転配列をさらに含み、式中、
各Ｒ／Ｋは独立に、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基であり；
Ｒ／Ｋ’は、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基であり、存在するまたは非存在であり；Ｒ／Ｋ”は、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基であり、存在するまたは非存在であり；ｘ１〜ｘ６はそれぞれ独立に、１個のアミノ酸であり；アミノ酸ｘ３〜ｘ６は、ひとまとめで存在しまたは非存在であり、アミノ酸ｘ３〜ｘ６が非存在である場合、Ｒ／Ｋ”は非存在である。
【００１１】
別の実施形態では、ｘ１〜ｘ６の１個または複数のアミノ酸は、疎水性アミノ酸である。
【００１２】
別の実施形態では、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分は、カチオン性アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に結合される。
【００１３】
別の実施形態では、ペプチドアミノ酸配列は、Ｌアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、ペプチドアミノ酸配列は、Ｄアミノ酸残基を含む。
【００１４】
別の実施形態では、ペプチドアミノ酸配列は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒｒｒｒｒｒｒｒｒ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖｒｒｒｒｒｒｒｒｒ、ＲＳＫＡＫ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ−ｙｌｐｎｋａｋｓｒ、ＩＡＧＱ−ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＰＬＧ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＳＫＡＫＮＰＬＹＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＹＬＰＮＫＡＫＳＲ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、分岐＜ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、ＨＨＨＨＨ−ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＨＨＨＨＨ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨ−ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ−ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ、ＨＨＨＨＨ−ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＫＲＫＲＫＲＫＲＫ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−Ｒ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨ−ＨＨ、ＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨ、およびＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨからなる群より選択される。
【００１５】
別の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲまたはＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲを含む。
【００１６】
別の実施形態では、アミノ酸配列は、ペプチドのＣ末端でアミド化される。
【００１７】
別の実施形態では、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドは、カチオン性アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に結合される式ＩＩ：
【化１】
2021523945.tif 000003
の化合物をさらに含み、式中、
ｎは、化合物のモノマー単位の数であり、１〜５の整数であり、
各ｍは独立に、０〜１８の整数であり、および
各Ｒ基は独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ１８の側鎖である。
【００１８】
別の実施形態では、各モノマー単位のＲ基は、独立にＣ１〜Ｃ１８側鎖である。別の実施形態では、各Ｒ基は、独立に１８−ｍ炭素原子の長さであり、式中、ｍは、０〜１７の値を有する。
【００１９】
別の実施形態では、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドは、カチオン性アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に結合される化合物をさらに含み、この化合物は、少なくとも１個の脂肪酸である。別の実施形態では、少なくとも４個の脂肪酸が、カチオン性アミノ酸配列のＣ末端に結合される。
【００２０】
別の実施形態では、最遠位脂肪酸は、アミド化される。別の実施形態では、２個以上の脂肪酸は直鎖である。別の実施形態では、２個以上の脂肪酸の結合は分岐している。
【００２１】
別の実施形態では、脂肪酸は飽和している。
【００２２】
別の実施形態では、脂肪酸は、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸（デカン酸）、およびラウリン酸（ドデカン酸）からなる群より選択される。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒｒｒｒｒｒｒｒｒ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖｒｒｒｒｒｒｒｒｒからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒｒｒｒｒｒｒｒｒ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖｒｒｒｒｒｒｒｒｒからなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するための有効成分としてのペプチド、および薬学的に許容可能な希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、Ｌｃｋキナーゼの活性を高める方法を提供し、方法は、Ｌｃｋキナーゼを、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００２７】
別の実施形態では、本発明は、ＬｃｋキナーゼのＹ３９４リン酸化を増大させる方法を提供し、方法は、Ｌｃｋキナーゼを、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団からのＩＬ−２分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、細胞上または細胞集団中のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は、細胞上または細胞集団中のＩＬ−２ＲＢ（ＣＤ１２２）発現を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団のＩＬ−２応答性を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は、細胞上または細胞集団中のＣＤ２８発現を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団からのＩＬ−１２分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、細胞上または細胞集団中のＩＬ−１２Ｒ発現を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００３５】
別の実施形態では、ＩＬ−１２Ｒは、ＩＬ−１２ＲＢ１および／またはＩＬ−１２ＲＢ２である。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団のＩＬ−１２応答性を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団からのＩＬ−２１分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００３８】
別の実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団からのＩＬ−１５分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、細胞上または細胞集団中のＩＬ−１５Ｒ発現を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００４０】
別の実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団のＩＬ−１５応答性を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００４１】
別の実施形態では、本発明は、細胞上または細胞集団中のＩＬ−１８Ｒ発現を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００４２】
別の実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団のＩＬ−１８応答性を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００４３】
別の実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団からのサイトカイン分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００４４】
別の実施形態では、サイトカインはＩＦＮγである。
【００４５】
別の実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団の増殖を誘導する方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００４６】
別の実施形態では、本発明は、細胞集団の増殖を増大させる方法を提供し、方法は、細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００４７】
別の実施形態では、本発明は、細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞からなる群より選択される細胞である、または細胞集団がこれらからなる群より選択される細胞を含む、本明細書に記載の方法を提供する。
【００４８】
別の実施形態では、細胞は未感作細胞である、または細胞集団は未感作細胞を含む。
【００４９】
別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞機能を高める方法を提供し、方法は、Ｔ細胞またはＴ細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００５０】
別の実施形態では、本発明は、細胞傷害性細胞機能を高める方法を提供し、方法は、細胞傷害性細胞または細胞傷害性細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００５１】
別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞またはＴ細胞集団の疲弊を低減する方法を提供し、方法は、Ｔ細胞またはＴ細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００５２】
別の実施形態では、本発明は、酸化的損傷を治療する方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００５３】
別の実施形態では、本発明は、細胞集団中のＴｒｅｇ細胞の比率を減らす方法を提供し、方法は、Ｔｒｅｇ含有細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００５４】
別の実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞はＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞である。
【００５５】
別の実施形態では、本発明は、チェックポイント阻害剤の存在下でＣＤ２５発現を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることを含む。
【００５６】
別の実施形態では、接触は、インビボまたはインビトロで実施される。
【００５７】
別の実施形態では、方法は、エクスビボで実施される。
【００５８】
別の実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団を本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物と接触させることにより得られる細胞または細胞集団に由来する細胞または細胞集団を提供する。
【００５９】
別の実施形態では、本発明は、インビボでＬｃｋの活性を高めるためにペプチドまたは医薬組成物が対象に投与される、本明細書に記載の方法を提供する。
【００６０】
別の実施形態では、本発明は、対象においてＬｃｋの活性を高める方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００６１】
別の実施形態では、本発明は、対象において免疫応答を誘導する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００６２】
別の実施形態では、本発明は、ＬｃｋまたはＬｃｋ活性の抑制または下方制御を特徴とする疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状を治療および／または予防する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００６３】
別の実施形態では、本発明は、ＬｃｋまたはＬｃｋ活性の抑制または下方制御を特徴とする疾患または状態が病原性感染症、病原性感染症に由来する敗血症（例えば、慢性敗血症）、免疫不全障害、低下した免疫応答、減少したＴ細胞数、Ｔ細胞異常、Ｔ細胞疲弊、およびＴ細胞チェックポイント阻害からなる群より選択される、本明細書で記載の方法を提供する。
【００６４】
別の実施形態では、本発明は、疾患または状態が癌である、本明細書に記載の方法を提供する。
【００６５】
別の実施形態では、本発明は、それを必要としている対象にワクチンを接種する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００６６】
別の実施形態では、本発明は、それを必要としている対象において癌を治療するおよび／または予防する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００６７】
別の実施形態では、本発明は、対象において免疫抑制を低減する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００６８】
別の実施形態では、本発明は、対象において加齢関連免疫機能不全を治療するおよび／または予防する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００６９】
別の実施形態では、本発明は、対象において免Ｔｈ１応答を誘導する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む組成物または本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００７０】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のペプチドを含むＬｃｋまたはＬｃｋ活性の抑制または下方制御を特徴とする疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状の治療および／または予防のための投与単位剤形を提供する。
【００７１】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のペプチドを含む癌の治療または予防のための投与単位剤形を提供する。
【００７２】
本明細書の全体を通して、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記述した要素、整数もしくはステップまたは複数の要素、整数もしくはステップの群を含むが、いかなる他の要素、整数もしくはステップまたは複数の要素、整数もしくはステップの群を排除しないことを意味すると理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ポリペプチドによるインビトロでのＬｃｋ活性化を示す。
【図２】他のＳＦＫに比較したＬｃｋの選択的活性化を示す。
【図３】Ｌｃｋ活性化ポリアルギニンポリペプチドは、Ｌｃｋリン酸化を増大させ、Ｌｃｋ活性化ポリアルギニンポリペプチドは、Ｙ３９４でのＬｃｋリン酸化を増大させることを示す。Ａ：抗リン酸化チロシン抗体４Ｇ１０を用いた探査の結果を示す、発色させたウェスタンブロットの写真である。Ｌｃｋ酵素のリン酸化レベルは、ペプチド活性成分ＲＲＲＲＲＲＲＲ（「８Ａｒｇ」；レーン７（１μＭ）と比較してレーン８（１０μＭ））およびＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「１０Ａｒｇ」；レーン５（１μＭ）と比較してレーン６（１０μＭ））の漸増濃度と共に増大した。Ｂ：抗ｐＹ３９４抗体での探査後に８Ａｒｇおよび１０Ａｒｇペプチドにより誘導されたチロシンＹ３９４でＬｃｋの自己リン酸化を示す、発色させたウェスタンブロットの写真である。増大した自己リン酸化は、８Ａｒｇ（レーン７〜８）および１０Ａｒｇ（レーン５〜６）ポリペプチドの漸増濃度と関連した。
【図４】ポリペプチドによるインビトロでのＬｃｋ活性化を示す。
【図５】ポリペプチドによるインビトロでのＬｃｋ活性化を示す。
【図６】ＬｃｋをポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１４８００」）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４８０４」）と接触させた場合のＬｃｋ活性の用量依存性活性化を示す。
【図７】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ００９００」）は、野性型ジャーカット細胞中で対照に比較してＩＬ−２分泌を誘導することを示す。Ａ：野性型ジャーカット細胞（ヒトＴリンパ球細胞の不死化系）を、抗ＣＤ２８抗体およびアビジンの存在下で、ビオチン化抗ＣＤ３抗体への暴露により刺激した。培養期間（４８時間または７２時間）中、細胞を試験ポリペプチドに暴露した。細胞上清を、上述の標準的な市販ＥＬＩＳＡキットを用いて４８時間または７２時間の終わりにＩＬ−２についてアッセイした。Ｂ：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１４８００」）は、７２時間の暴露後に野性型ジャーカット細胞中で対照に比較してＩＬ−２分泌を誘導する。
【図８】Ｌｃｋ活性化融合ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１４８００」）は、単離ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中で対照に比較してＩＬ−２分泌を誘導することを示す。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で４８時間の刺激後の、単離ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（健康なヒトＰＢＭＣからの免疫磁気分離）からのＩＬ−２産生に与えるＬｃｋ活性化ペプチドの効果。データを、それぞれビークル対照に対し正規化された３人のドナーからの平均±ＳＥＭとして示す。統計的比較を、０．０８μＭまでの試験ペプチドの各濃度を比較するダネット事後検定を伴う２元配置分散分析を用いて実施した（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。点線は、正規化データ用のビークル対照値を示す。
【図９】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１４８００」）、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１５８００」）、およびＤアミノ酸のみを含むＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（すなわち、ｒｖｋｖｋｖｖｖｖ−ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ；「ＩＫＤ１５８００」）は、単離ヒトＴ細胞中で対照と比較してＩＬ−２分泌を誘導することを示す。簡単に説明すると、単離Ｔ細胞（ＣＤ３＋）を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１４８００」）、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１５８００」）、およびＤアミノ酸のみを含むＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫＤ１５８００」）の５種の濃度範囲＋ビークル対照（０〜１．２５μＭ）と一緒に、７２時間培養し、その後、上清を集め、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２についてアッセイした。提示されたデータは、平均ＩＬ−２ｐｇ／ｍｌおよび倍率変化（ビークルに対し正規化）±ＳＥＭ、ｎ＝４、を示す。データを、各ペプチド濃度をビークルと比較する、または正規化試験の場合には、濃度を最低試験濃度と比較する、ダネット事後検定を伴うＲＭ２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、正規化データ用のビークル対照値を示す（右）。
【図１０】ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）の発現が、刺激された細胞をペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１４９００」）、ＨＨＨＨＨ−ＲＳＫＳＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１１４８０」）、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（「ＩＫ１４８２０」）、特に、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１４８００」）に暴露した場合に、増大したことを示す。細胞を、ウェル（１２ウェルプレート、２ｍＬ体積）当たり１００万個で播種し、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびロノマイシン（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。細胞を次に、示したようにペプチドで処理し、その後３７℃で４８時間インキュベートした。上清（１００μＬ、ｎ＝３）をその後、ＩＬ−１２Ｒα含量について分析した。
【図１１】ＣＤ２５の発現が、Ｌｃｋ活性化融合ポリペプチドＩＫ１４８００（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）およびＩＫＤ１４８００（ｒｓｋａｋｎｐｌｙ−ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ）で再刺激時に、ＩＫ１４０００（対照）に比べて、疲弊したＣＤ４＋Ｔ細胞中で高められることを示す。細胞を、ＣＤ２５を評価するために、培養の７２時間後にフローサイトメトリー用に染色した（ＭＦＩ、最上段、発現および頻度のレベルを示すため、最下段）。生存可能集団内から、細胞を、ＣＤ４＋細胞に集中するためにゲートをかけ、それらをその後、ＣＤ２５＋集団でゲートをかけた。データを、４回の反復実験からの平均±ＳＥＭとして、絶対値（左）およびビークルに対する正規化値（右）として示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析を用いて、各試験濃度で各ペプチドを対照ペプチド（ＩＫ１４０００）と比較した。
【図１２】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＮＨ２（ＩＫ１４８００）の添加が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用により誘導されたＩＬ−２Ｒαの抑制をレスキューしたことを示す。簡単に説明すると、ジャーカット細胞を、抗ＣＤ３抗体付着培養皿への暴露により活性化して、プログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）の表面発現を誘導し、添加物の非存在下で、またはペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＮＨ２（２．５μＭのＩＫ１４８００）単独、細胞中のチェックポイント阻害を誘導するための５μｇ組換えＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−１に対するリガンド）単独、またはＩＫ１４８００ペプチド＋組換えＰＤ−Ｌ１と共に、４８時間培養した。ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）を、上述の市販の標準的ＥＬＩＳＡキットにより細胞ライセート中で測定した。
【図１３】ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）の発現が、抗ＣＤ３で刺激されると、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中で高められることを示す。刺激されたＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋（左）およびＣＤ８＋（右）細胞中のＣＤ２５発現。新たに単離したＰＢＭＣを、示した濃度（μＭ）での試験ペプチドＩＫ１４８００の存在下で２４時間、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）含有または非含有（−ａＣＤ３）で、刺激した。データを、４人のドナーからの平均±ＳＥＭとして示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析を用いて、各ペプチドの濃度（また刺激された細胞）をビークル（０）に対して比較した。
【図１４】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−１２分泌を増大させることを示す。Ａ：細胞をウェル（１２ウェルプレート、２ｍＬ体積）当たり１００万個で播種し、ビオチン−ＣＤ３、ＣＤ２８、およびアビジン（５：５：１．２５μｇ）で刺激した。細胞を次に、ペプチドＩＫ１４８００で処理した後、３７℃で４８時間インキュベートした。上清（１００ｕｌ、ｎ＝３）をその後、ＩＬ−１２含量について分析した。図１４Ｂは、対照と比較して、ジャーカット細胞中のＩＬ−１２分泌を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）の能力は、Ｌｃｋに依存することを示す。このデータは、Ｌｃｋ活性化融合ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）によるヒトＴ細胞株中のＩＬ−１２分泌が、Ｌｃｋに依存することを示す。細胞をウェル（１２ウェルプレート、２ｍＬ体積）当たり１００万個で播種し、ビオチン−ＣＤ３、ＣＤ２８、およびアビジン（５：５：１．２５μｇ）で刺激した。細胞を次に、ペプチドＩＫ１４８００で処理した後、３７℃で４８時間インキュベートした。上清（１００ｕｌ、ｎ＝３）を、ＩＬ−１２含量についてその後分析した。
【図１５】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲならびにＤアミノ酸のみを含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ｒｓｋａｋｎｐｌｙ−ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ）は、ＩＬ−１２の産生を抑制する抗ＣＤ４０Ｌ阻止抗体の存在下での抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣに比較して、抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣ中のＩＬ−１２分泌を誘導することを示す。Ｌｃｋ活性化ポリアルギニンポリペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲＲはまた、抗ＣＤ４０Ｌ阻止抗体の存在下での抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣに比較して、抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣ中でＩＬ−１２分泌を誘導する。抗ＣＤ３刺激されたＰＢＭＣを、抗ＣＤ４０Ｌ阻止抗体の存在下または非存在下で、ＩＫ１４８００、ＩＫＤ１４８００、ＩＫ１５８００およびＩＫＤ１５８００と共に２４時間培養した。上清を、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１２ｐ７０レベルについて評価した。示したデータは、平均ＩＬ−１２ｐ７０ｐｇ／ｍｌ値±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ペプチド処理単独と、ペプチド＋抗ＣＤ４０Ｌとを比較するシダックの事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、平均ビークル対照値を示す。
【図１６】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）は、２４時間で対照と比較してＩＬ−１２ｐ７０の分泌を誘導することを示す。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激および５種の濃度範囲（０〜１．２５μＭ）のペプチドと共に２４時間培養した後、上清を集め、ＥＬＩＳＡでＩＬ−１２ｐ７０について分析した。提示データは、ペプチド処理に応答した平均サイトカイン産生（ｐｇ／ｍＬ）、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、平均非刺激ＰＢＭＣ発現を示す。
【図１７】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）は、ＮＫ細胞集団（ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋細胞）中でＩＬ−１２Ｒβ２発現を誘導することを示す。抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣを、０．１６μＭのＩＫ１４８００＋ビークル対照（０）と共に７２時間培養した後、ＣＤ３ＮＥＧＣＤ５６＋ＮＫ細胞をフローサイトメトリーによりＩＬ−１２Ｒβ２発現について評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したそれぞれのＩＬ−１２Ｒβ２発現（ＣＤ３ＮＥＧＣＤ５６＋ＮＫ細胞）の平均を示す。
【図１８】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）は、非刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、ＩＦＮ−γ分泌を誘導することを示す。単離ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、５種の濃度範囲のＩＫ１４８００＋ビークル対照（０〜１．２５μＭ）と共に、２４時間培養した後、上清をＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γについて評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したそれぞれのＩＦＮ−γの平均値（ビークルに正規化したｐｇ／ｍｌ値）、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ＩＫ１４８００濃度をビークルと比較する、または最低ペプチド濃度に正規化する、ダネット事後検定を伴うＲＭ２元配置分散分析により解析した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１９】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＤアミノ酸のみを含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫＤ１４８００）は、非刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、刺激ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を誘導することを示す。単離ＣＤ８＋Ｔ細胞を、５種の濃度範囲（０〜１．２５μＭ）のＩＫＤ１４８００の存在下で、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コートＤｙｎａｂｅａｄｓ（４：１の細胞：ビーズ比率）刺激と共に培養した。２４時間後、上清をサンプリングし、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γについて評価した。提示データは、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団中の平均ＩＦＮ−γ産生（ｐｇ／ｍＬ）、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データをまた、ビークル対照に対して正規化し、平均倍率変化としても示した（ｎ＝３）。データを、ダネット事後検定を伴うＲＭ１元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。有意差は、それぞれのペプチド濃度とビークル対照の間で実施される比較、またはデータが最低ペプチド濃度（０．０８μＭ）に対し正規化される比較を示す。
【図２０】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖集団を増大させることを示す。単離ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、５種の濃度範囲のＩＫ１４８００＋ビークル対照（０〜１．２５μＭ）と共に、２４時間培養した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによりＫｉ６７発現について評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したそれぞれのＫｉ６７（ＭＦＩ）の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ペプチド濃度をビークルと比較するダネット事後検定を伴うＲＭ２元配置分散分析により解析した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、平均非刺激対照値を示す。
【図２１】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖集団を増大させることを示す。刺激ＰＢＭＣアッセイでの、ＩＫ１５８００に応答したＣＤ８＋Ｔ細胞中のＫｉ６７（増殖）発現。単離ＣＤ３刺激ＰＢＭＣを、５種の濃度範囲のＩＫＤ１５８００＋ビークル対照（０〜１．２５μＭ）と共に、７２時間培養した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによりＫｉ６７発現について評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したそれぞれの発現（ＭＦＩ）の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝３を示す。データを、それぞれのペプチド濃度をビークルと比較するダネット事後検定を伴うＲＭ２元配置分散分析により解析した。＊＊ｐ＜０．０１。点線は、非刺激対照値を示す。
【図２２】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣＤ２８発現を誘導することを示す。Ａ：ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激およびＩＫ１４８００と共に培養し５種の濃度範囲（０〜１．２５μＭ）で７２時間試験した後、細胞をフローサイトメトリーによりＣＤ２８の発現について評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したそれぞれのＣＤ８＋Ｔ細胞の発現の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。点線は、非刺激細胞を示す。Ｂ：ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激および試験ペプチドと共に培養し５種の濃度範囲（０〜１．２５μＭ）で７２時間試験した後、細胞をフローサイトメトリーによりＣＤ２８の発現について評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したそれぞれのＣＤ４＋Ｔ細胞の発現の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、非刺激細胞を示す。
【図２３Ａ】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ヒト刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−１５Ｒ発現、およびヒト刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＬ−１５分泌を高めることを示す。Ａ：ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激および５種の濃度範囲のＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）（０〜１．２５μＭ）と共に７２時間培養した後、細胞をフローサイトメトリーによりＣＤ２１５（ＩＬ−１５Ｒ）の発現について評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したそれぞれのＣＤ８＋Ｔ細胞集団中の発現の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。点線は、非刺激ＰＢＭＣ発現を示す。Ｂ：ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激および５種の濃度範囲のＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）（０〜１．２５μＭ）と共に培養した。上清を集め、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１５について評価した（±ＳＥＭ、ｎ＝３）。点線は、非刺激ＰＢＭＣ発現を示す。＊ｐ＜０．０５、１．２５μＭをｔ検定により０ペプチドと比較した。Ｃ：ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激および５種の濃度範囲のＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）（０〜１．２５μＭ）と共に７２時間培養した後、細胞をフローサイトメトリーによりＣＤ２１５（ＩＬ−１５Ｒ）の発現について評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したそれぞれのＣＤ８＋Ｔ細胞集団中の発現の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、非刺激ＰＢＭＣ発現を示す。
【図２４】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ４８００）は、ヒトＣＤ２８＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖集団を増大させることを示す。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激およびペプチドＩＫ１５８００およびＩＫ１４８００と共に培養し５種の濃度範囲（０〜１．２５μＭ）で７２時間試験した後、細胞をフローサイトメトリーによりＫｉ６７について評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したそれぞれのＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２８＋亜集団中で平均Ｋｉ６７（増殖に指標）発現、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、非刺激細胞を示す。
【図２５】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中でＩＬ−１２Ｒβ２発現を誘導することを示す。単離Ｔ細胞（ＣＤ３＋）を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、５種の濃度範囲のＩＫ１５８００＋ビークル対照（０〜１．２５μＭ）と共に、７２時間培養した後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによりＩＬ−１２ＲＰ２発現について評価した。提示データは、ペプチド処理に応答した平均ＩＬ−１２ＲＰ２発現（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の％）、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、それぞれのペプチド濃度をビークルと比較するダネット事後検定を伴うＲＭ２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、平均非刺激対照値を示す。
【図２６】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋／ｄｉｍＮＫ細胞中でＩＬ−２ＲＰ発現を誘導することを示す。健康なドナー由来のＰＢＭＣを、試験ペプチド（０．０８〜１．２５μＭ）またはビークル対照の存在下で、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）で７２時間刺激した。培養期間の最後に、細胞を集め、フローサイトメトリーによりＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋／ｄｉｍＮＫ細胞内のＩＬ−２ＲＰ（ＣＤ１２２）発現について評価した。データを、平均ＩＬ−２ＲＰ（ＣＤ１２２）発現（％陽性細胞またはＭＦＩ）±ＳＥＭ、ｎ＝４として示す。データを、試験物質をビークル対照に対し比較する、ホルム−シダック多重比較事後検定を伴う反復測定２元配置分散分析を用いて解析した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。青色点線は、非刺激試料での平均発現を示す。
【図２７】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）は、ＰＢＭＣ内のＣＤ８＋細胞集団の増殖を誘導することを示す。健康なドナー由来のＰＢＭＣを、ＩＫ１５８００（０．０８〜１．２５μＭ）またはビークル対照の存在下で１０日間ＴＣＲ＋ＩＬ−２を介して刺激した。培養期間の最後に、細胞を集め、フローサイトメトリーによりＣＤ８＋細胞比率について評価した。データは、平均発現パーセンテージ±ＳＥＭ、ｎ＝４として示す。データを、試験物質とビークル対照とを比較する、ホルム−シダック多重比較事後検定を伴う反復測定２元配置分散分析を用いて解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、非刺激試料での平均発現を示す。
【図２８】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２１産生を誘導することを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激およびＩＫ１４８００の存在下で４８時間培養した。培養の最後に、上清をＥＬＩＳＡによりＩＬ−２１について評価した。示したデータは、４８時間培養（左）後のＩＬ−２１産生（ｐｇ／ｍＬ）を表す（±ＳＥＭ、ｎ＝１）。サイトカインは、一人のドナー由来の上清中でのみ検出された（従って、統計計算はなし）。対照（右）は、ＩＬ−６がＩＬ−２１分泌を増強することを示す。
【図２９】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）は、抗原刺激の前に投与される場合、その後の抗原刺激時にヒトＴ細胞株によるＩＬ−２産生を増大させることを示す。５００万個の細胞をＴ２５フラスコ中に播種し、上記表に示すように種々の濃度の１４８００で１時間処理した後、細胞懸濁液を遠心分離し、新鮮培地で２回洗浄した。５００μＬの培地中のビオチン−抗ＣＤ３およびアビジン（５：１．２５μｇ）の混合物を、１２ウェルプレートのウェルに加えた。１０分後、細胞をウェル当たり１００万個の濃度で播種し、細胞懸濁液を、培地を用いて２ｍＬの体積にした。試料をその後、抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍＬ）でさらに刺激し、３７℃で４８時間インキュベートした後、上清（１００μＬ、ｎ＝３）をＩＬ−２含量について分析した。
【図３０】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）は、ルイス肺癌マウスの脾細胞中の、ＣＤ２８発現ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージ、およびＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２８の相対発現を高めることを示す。データは、対照試料（ビークル）と比較した、フローサイトメトリーで測定されたＣＤ２８陽性と特定されたＣＤ４＋Ｔ細胞比率（左）およびＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２８の幾何平均（右）を示す。両側ｔ検定で判定して、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図３１】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）は、ルイス肺癌マウスの脾細胞中の、ＣＤ２８発現ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ２１５のパーセンテージを高めることを示す。両側ｔ検定で判定して、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３２】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）は、ルイス肺癌マウスの脾細胞中の、ＮＫ細胞上のｐＳＴＡＴ４の発現を高めることを示す。データは、フローサイトメトリーで測定し、両側ｔ検定で判定した、ＮＫ細胞上のｐＳＴＡＴ４の幾何平均を示す（＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図３３】ポリペプチドＤＤＤＤＤＤＤＤＤは、Ｌｃｋの活性を高めないことを示す。
【図３４】対照と比較してジャーカット細胞中でＩＬ−２分泌を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）の能力は、Ｌｃｋに依存することを示す。このデータは、Ｌｃｋ活性化融合ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲによるヒトＴ細胞株のＩＬ−２分泌はＬｃｋに依存することを示す。ジャーカット細胞（ＷＴおよびＬｃｋ欠損）を、ＰＢＳ中で作製した２００μＬのＣＤ３／ＣＤ２８（それぞれ５μｇ／ｍｌ）を用いて３７℃で１時間刺激した。細胞をウェル当たり１００万個の濃度で播種し、ＩＫ１４８００で処理した。
【図３５】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）を用いた処理によるＩＬ−２産生の増大は、抗原刺激の不在下では起こらないことを示す。簡単に説明すると、１２ウェルプレートを、ＰＢＳ（２００μＬ）中で作製した抗ＣＤ３（５μｇ／ｍＬ）溶液でコートし、３７℃で一晩インキュベートした。その後、抗ＣＤ３溶液を吸引し、ウェルを培地で２回穏やかに洗浄した（１ｍＬ、１０分）。ジャーカット細胞をウェル当たり１００万個の濃度で播種し、抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍＬ）でさらに刺激した後、即座に、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）（２．５μＭ）を用いて処理した。細胞を７２時間インキュベートした後、上清をＥＬＩＳＡによりＩＬ−２について分析した。
【図３６】ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）の腹腔内投与は、ルイス肺癌（ＬＣＣ）モデルで、腫瘍面積を減らすことを示す。ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲを、接種（１ｘ１０６細胞）後１０に目に開始して、２週間にわたり週２回雌Ｃ５７ブラックマウスの腹腔内に投与し（２００μｇ）（コホート当たりｎ＝８）、その後、Ｈ＆Ｅ切片を腫瘍浸潤の証拠のために評価し、腫瘍量を健康な肺組織のパーセンテージとして計算した。データポイントは、試料当たりの腫瘍塊の平均面積を示す。＊＊ｐ＜０．００５、対応のないｔ検定。
【図３７】脂肪酸に結合したＬｃｋ活性化ポリペプチドは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株のＩＬ−２分泌を増大させることを示す。細胞をウェル（１２ウェルプレート、２ｍＬ体積）当たり１００万個で播種し、ビオチン−ＣＤ３、ＣＤ２８、およびアビジン（５：５：１．２５μｇ）で刺激した。次に、細胞をＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（ＩＫ１４８０４）で処理した後、３７℃で４８時間インキュベートした。その後、上清（１００μＬ、ｎ＝３）をＩＬ−２含量について分析した。
【図３８】脂肪酸に結合したＬｃｋ活性化ポリペプチドは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株のＩＬ−１２分泌を増大させることを示す。細胞をウェル（１２ウェルプレート、２ｍＬ体積）当たり１００万個で播種し、ビオチン−ＣＤ３、ＣＤ２８、およびアビジン（５：５：１．２５μｇ）で刺激した。次に、細胞をＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（ＩＫ１４８０４）およびＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（ＩＫ１５８０４）で処理した。次に、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。その後、上清（１００μｌ、ｎ＝３）をＩＬ−１２含量について分析した。
【図３９】Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、細胞膜中の脂質過酸化を抑制することを示す。［＃＝チオールレドックス状態］。テューキーの多重比較検定を伴う１元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。処理のない場合のシャムと紫外線照射の間のＴＲＳの有意差は、より低いＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）投与量と比べて、１２５Ｄまたは最高濃度（５μＭ）のＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）の存在下では認められない。
【図４０】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）は、ペプチド対照のない場合に比べて、抗ｐＹ３９４抗体で検出されるＬｃｋのＹ３９４の位置でのリン酸化を増大させるが、残っている合計Ｌｃｋのレベルは、変化しないことを示す。
【図４１Ａ】ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（「ＩＫ１４０００」）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ（「ＩＫ９４０００」）は、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−２分泌を増大させることを示す。
【図４１Ｂ】ｒｓｋａｋｎｐｌｙ（「ＩＫＤ９４０００」）は、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−１２分泌を増大させるが、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（「ＩＫ１４０００」）は分泌を増大させないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
哺乳動物の非受容体Ｓｒｃキナーゼファミリー（ＳＫＦ）のメンバーは、次の８種のキナーゼ：Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｆｇｒ、Ｌｙｎ、Ｈｃｋ、Ｌｃｋ、およびＢｌｋを含み、選択的Ｌｃｋ活性化剤は、特定されていない（Ｂａｅ  Ｏ−Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３２（２１）：７２７８−７２８６）。
【００７５】
本発明は、一部には、本明細書に記載の７個以上の近接カチオン性アミノ酸を含むポリカチオン性ペプチドが、Ｌｃｋの活性を刺激できるという発見に関する。少なくともいくつかの実施形態では、本発明によるＬｃｋ活性化剤は、ＳＫＦメンバー中でＬｃｋのみの活性化を刺激し得る。Ｌｃｋ活性化剤、特に特異的Ｌｃｋ活性化剤に対する必要性は、加齢または非加齢関連の多様な状態に直接的に関連する。
【００７６】
従って、一実施形態では、本発明は、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドを提供し、このペプチドは、７個以上の近接カチオン性アミノ酸を有するＬｃｋ活性化カチオン性アミノ酸配列を含む。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「活性化」という用語は、
一般に、少なくとも１つの標的タンパク質の活性を高めることを指す。キナーゼの特定の文脈では、この活性化は、少なくとも１つの標的基質または部位の増大したリン酸化をもたらす。この活性化は、限定されないが、プロテインキナーゼと、プロテインキナーゼの結合相手との間に複合体が形成される確率を増大させること、またはその標的にいったん結合したキナーゼの活性を増大させることを含む任意の手段により引き起こされ得る。このような活性化は、インビボあるいはインビトロで起こり得る。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「Ｌｃｋを活性化するためのペプチド」は、「Ｌｃｋ活性化ポリペプチド」または「Ｌｃｋ活性化剤」と同義に使用される。
【００７９】
Ｌｃｋは、ＬＣＫ癌原遺伝子、白血球Ｃ末端Ｓｒｃキナーゼ；リンパ球細胞特異的タンパク質チロシンキナーゼ；タンパク質ＹＴ１６；癌原遺伝子Ｌｃｋ；Ｔ細胞特異的タンパク質チロシンキナーゼ；およびｐ５６−ＬＣＫとも呼ばれる。
【００８０】
ヒトのＬｃｋの遺伝子およびタンパク質配列は、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ    Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＧＮＣ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ／）から得ることができる。ヒトのＳｒｃ（およびスプライスバリアント）のＨＧＮＣ番号は、ジェンバンク受入番号および遺伝子ＩＤと一緒に下表１に記載されている。
【表１】
2021523945.tif 000004
【００８１】
Ｌｃｋは、多数の活性を有する。Ｌｃｋは、その正の調節部位Ｔｙｒ３９４で自己リン酸化し、さらにＣＤ３受容体、ＣＥＡＣＡＭ１、ＺＡＰ−７０、ＳＬＰ−７６、ＩＬ−２受容体、レセプタータンパク質Ｃ、ＩＴＫ、ＰＬＣ、ＳＨＣ、ＲａｓＧＡＰ、Ｃｂｌ、Ｖａｖ１、およびＰＩ３Ｋを含む多数のタンパク質をリン酸化する。Ｌｃｋは、ＡＤＡＭ１５、ＣＤ２、ＣＤ４４、ＣＤ４、ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ、ＤＬＧ１、ＮＯＴＣＨ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＲＣ、ＵＮＣ１１９、ＳＹＫ、ＵＢＥ３Ａ、およびＺＡＰ７０と相互作用することが示されている。
【００８２】
本発明者らは、本明細書で記載の活性化剤が、Ｙ３９４でのＬｃｋのリン酸化、および増大したＩＬ−２産生を含むＬｃｋの活性を高めることができることを実証した。
【００８３】
従って、本明細書で使用される場合、「Ｌｃｋの活性」という用語は、Ｙ３９４でのＬｃｋのリン酸化、ＩＬ−２の産生、ＣＤ３受容体、ＣＥＡＣＡＭ１、ＺＡＰ−  ７０、ＳＬＰ−７６、ＩＬ−２受容体、プロテインキナーゼＣ、ＩＴＫ、ＰＬＣ、ＳＨＣ、ＲａｓＧＡＰ、Ｃｂｌ、Ｖａｖ１、および／またはＰＩ３Ｋのリン酸化；ＡＤＡＭ１５、ＣＤ２、ＣＤ４４、ＣＤ４、ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ、ＤＬＧ１、ＮＯＴＣＨ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＲＣ、ＵＮＣ１１９、ＳＹＫ、ＵＢＥ３Ａ、および／またはＺＡＰ７０との相互作用、および／またはＴＣＲのリン酸化を含む。
【００８４】
通常、ポリカチオン性ペプチドは、７〜３５アミノ酸長である。従って、ポリカチオン性ペプチドは、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５アミノ酸長であり得る。通常、ポリカチオン性ペプチドは、最大約２５アミノ酸長であり、より典型的には、最大約２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、または１６アミノ酸長である。
【００８５】
通常、ポリカチオン性ペプチドの全てのアミノ酸は、カチオン性アミノ酸残基である。しかし、上述のように相互に近接しているカチオン性アミノ酸および１個または複数の非カチオン性アミノ酸残基を含むポリカチオン性ペプチドも、本発明により明示的に提供される。通常、このような実施形態では、ポリカチオン性ペプチドを構成するアミノ酸の、少なくとも５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上がカチオン性ペプチドである。このようなポリカチオン性ペプチドの例は、１個または複数の非カチオン性アミノ酸が介在するカチオン性アミノ酸を含んでよく、および／または、例えば、それぞれのＮ末端および／またはＣ末端非カチオン性アミノ酸またはアミノ酸配列を含んでよく、全てのこのようなポリカチオン性ペプチドは明示的に本明細書に包含される。
【００８６】
本明細書に記載のポリカチオン性ペプチド（ＰＰ）は通常、少なくとも７個の近接カチオン性アミノ酸を含み、およびより一般的には、少なくとも８、９または１０個の近接カチオン性アミノ酸を含む。
【００８７】
特に好ましい実施形態では、ポリカチオン性ペプチドは通常、８〜１６個の近接カチオン性アミノ酸、より典型的には８〜１２個の近接カチオン性アミノ酸、最も典型的には、８〜１０個の近接カチオン性アミノ酸を含む。
【００８８】
ポリカチオン性ペプチドを構成するカチオン性アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、およびヒスチジン（Ｈ）およびオルニチンアミノ酸残基からなる群より独立に選択され得る。
【００８９】
カチオン性アミノ酸残基の種々の配列の組み合わせを用い得る。例えば、ポリカチオン性ペプチドは、ポリカチオン性ペプチドのＮ末端から開始されるアルギニンアミノ酸の直鎖アミノ配列（例えば、７、８、９、１０、１１、１２個またはそれを超えるアルギニン残基）と、これに続く、非アルギニンカチオン性アミノ酸の配列（例えば、ヒスチジンまたはリシン残基）を含み得、逆もまた同じである。このような実施形態では、非アルギニンは通常、最大約１６個のアミノ酸長であり（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６アミノ酸）、全てのこのようなポリカチオン性ペプチドの使用は、明示的に本明細書に包含される。
【００９０】
他の実施形態では、カチオン性アミノ酸は、アルギニンおよび非アルギニンアミノ酸のカプレットまたはトリプレット（例えば、ＲＨのカプレット）、あるいは、カプレット中のアミノ酸の位置が逆転しているカプレットまたはトリプレット（例えば、ＨＲのカプレット）などのカチオン性ペプチドの「カプレット」またはトリプレットの交代系列で配置され得る。同様に、ポリカチオン性ペプチドは、カチオン性アミノ酸の異なるアミノ酸の一連のカプレットまたはトリプレットの組み合わせ（例えば、ＲＨまたはＨＲのカプレット）と、それに続く、および／または、その前に存在するそれぞれのさらなる、通常、最大１６個のアミノ酸（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６アミノ酸）のカチオン性アミノ酸またはカチオン性アミノ酸配列（例えば、ヒスチジンまたはポリヒスチジン配列）を含み得る。当然のことながら、用語の「カプレット」は、２個の連続アミノ酸を意味する。同様に、用語の「トリプレット」は、３個の連続アミノ酸を意味する。反復カチオン性アミノ酸カプレット（例えば、ＲＨまたはＨＲ）を有する少なくともいくつかのポリカチオン性ペプチドでは、ポリカチオン性ペプチドは、１個または複数のさらなるそれぞれのカチオン性アミノ酸残基の少なくとも１つのカプレットまたはトリプレット（例えば、ＨＨ、ＲＲ、ＫＫ、ＨＨＨ、ＲＲＲ、ＫＫＫ、ＨＨＨＨ、ＲＲＲＲ、ＫＫＫＫ、など）で開始および／または終了し得る。
【００９１】
本発明によるＬｃｋ活性化剤のポリカチオン性ペプチドは、例えば、次の非限定的例：ＲＲＲＲＲＲＲ（７Ａｒｇ）、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（８Ａｒｇ）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（９Ａｒｇ）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（１０Ａｒｇ）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（１１Ａｒｇ）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（１２Ａｒｇ）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（１３Ａｒｇ）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（１５Ａｒｇ）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（１６Ａｒｇ）、ＫＫＫＫＫＫ（６Ｌｙｓ）、ＲＫＫＫＫＫＫＫＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（Ｒ８Ｋ１０Ｈｉｓ）；ＲＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（Ｒ１０Ｈｉｓ）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（８Ａｒｇ１０Ｈｉｓ）、およびＲＲＲＲＲＲＲＲＲＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ；（９Ａｒｇ１０Ｈｉｓ）ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（９Ａｒｇ１４Ｈｉｓ）、ＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＨ（９Ｒ／Ｈ−Ｈｉｓ）、ＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＨ（８Ｈ／Ｒ−２Ｈ）から選択され得る。
【００９２】
またさらなる実施形態では、上で例示されたポリカチオン性ペプチド中の１個または複数のアルギニン残基は、それぞれリシン残基で置換され得る。
【００９３】
前述のポリカチオン性ペプチドの逆転アミノ酸配列の使用も、明示的に本明細書に包含される。種々の他のアミノ酸配列パターンも採用可能で、全てのこのような配列パターンは、明示的に本明細書に包含される。好ましい実施形態では、本発明による方法で利用されるＬｃｋ活性化剤のポリカチオン性ペプチドは、直鎖ペプチドであるが、ポリカチオン性ペプチドが分岐ペプチドである実施形態も同様に提供され得る。分岐ポリカチオン性ペプチドは、例えば、ポリカチオン性ペプチドの骨格中でアミノ酸またはアミノ酸配列をリシン残基と結合させることにより提供され得る。このような分岐ポリカチオン性ペプチドの例は、ＲＫ［８Ａｒｇ］ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨであり、８Ａｒｇ配列（ＲＲＲＲＲＲＲＲ）は、リシン残基Ｋに結合された側鎖である。本明細書に記載の分岐ポリカチオン性ペプチドの側鎖は、最大約１６個のアミノ酸長、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６アミノ酸長であり得る。通常、ポリカチオン性ペプチドの側鎖は、最大１０アミノ酸長、より典型的には約９アミノ酸長、および最も典型的には最大約８アミノ酸長である。
【００９４】
通常、ペプチド活性成分のカチオン性アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）およびオルニチンから、最も典型的にはアルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）およびヒスチジン（Ｈ）からなる群より選択される。これらの残基のうち、隣接アルギニン残基は、リシンまたはヒスチジン残基の対応する配列よりもＬｃｋ活性を良好に刺激することが明らかにされた。ポリカチオン性ペプチドがアルギニンおよび非アルギニンアミノ残基（例えば、ヒスチジン）を含む場合、ポリカチオン性ペプチドは通常、約１．２以下、または約１．１以下、または約１．０以下、または約０．９以下、または約０．８以下、または約０．７以下の非アルギニンアミノ酸残基の、アルギニン残基に対する比率を有する。
【００９５】
少なくともいくつかの実施形態では、ポリカチオン性ペプチドは、単一カチオン性アミノ酸残基（例えば、アルギニン）の２つ以上のカプレットまたはトリプレットを含む。カプレットまたはトリプレットは、相互に並び得る（それにより、４つまたは６つのカチオン性アミノ酸の隣接残基配列を形成する）、またはポリカチオン性ペプチドを構成する１個または複数の他の隣接カチオン性アミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個などの隣接カチオン性アミノ酸）を介して相互に配置され得る。
【００９６】
通常、ポリカチオン性ペプチドの少なくとも大部分のカチオン性アミノ酸は、アルギニンアミノ酸である。最も典型的には、近接カチオン性アミノ酸は全て、アルギニンアミノ酸である。
【００９７】
好ましい実施形態では、カチオン性アミノ酸配列は、ＲＲＲＲＲＲＲＲ、ｒｒｒｒｒｒｒｒ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、およびｒｒｒｒｒｒｒｒｒからなる群より選択され、ここで、小文字は、右旋性（ｄｅｘｔｒｏｒｏｔａｔｏｒｙ）（「右旋性（ｄｅｘｔｒｏ）」）アミノ酸を示す。
【００９８】
本発明により実施されるＬｃｋ活性化剤は、ポリカチオン性ペプチドからなり得、または他の実施形態では、さらなるペプチド部分に結合されたポリカチオン性ペプチドを含み得る。さらなるペプチド部分は、例えば、ポリカチオン性ペプチドのＬｃｋ刺激剤活性を強化し得る。他の実施形態では、ポリカチオン性ペプチド単独では、Ｌｃｋ活性を刺激せず、Ｌｃｋの活性は、ポリカチオン性ペプチドがさらなるペプチド部分に結合された場合にのみ刺激される。
【００９９】
便宜上、上述のように、本発明の少なくともいくつかの実施形態でポリカチオン性ペプチド（ＰＰ）が結合される強化ペプチド、または他のペプチド部分は、下の記述では、（ＡＰ／Ｐ）と呼ばれる。
【０１００】
少なくともいくつかの実施形態では、強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）は、式Ｉ：
Ｒ／Ｋ’−ｘ１−Ｒ／Ｋ−ｘ２−Ｒ／Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”      式Ｉ
のアミノ酸配列、またはその反転配列を含み、式中、
各Ｒ／Ｋは独立に、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基であり；
Ｒ／Ｋ’は、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基であり、存在するまたは非存在であり；
Ｒ／Ｋ”は、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基であり、存在するまたは非存在であり；
ｘ１〜ｘ６はそれぞれ独立に、１個のアミノ酸であり；アミノ酸ｘ３〜ｘ６は、ひとまとめにして存在するまたは非存在であり、アミノ酸ｘ３〜ｘ６が存在する場合、Ｒ／Ｋ”は非存在である。
【０１０１】
通常、式Ｉの強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）では、
ｘ１、ｘ３およびｘ６は独立に、アミノ酸から選択され、および
ｘ２、ｘ４、およびｘ５は、それぞれ独立に疎水性アミノ酸である。
【０１０２】
少なくともいくつかの実施形態では、ｘ１、ｘ３およびｘ６は、親水性アミノ酸であり、ｘ２、ｘ４およびｘ５は、疎水性アミノ酸である。
【０１０３】
他の実施形態では、ｘ３およびｘ６は、親水性アミノ酸であり、ｘ１、ｘ２、ｘ４およびｘ５は、疎水性アミノ酸である。
【０１０４】
他の実施形態では、ｘ１およびｘ３は、親水性アミノ酸であり、
ｘ２、ｘ４、ｘ５およびｘ６は、疎水性アミノ酸である。
【０１０５】
さらにその他の実施形態では、アミノ酸ｘ１〜ｘ６は全て疎水性アミノ酸でありまたは少なくともアミノ酸ｘ１〜ｘ６の大部分は、疎水性アミノ酸である。
【０１０６】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤のポリカチオン性ペプチドの親水性および疎水性アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされ得るか、または合成アミノ酸を含み得る。通常、アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされる。ポリカチオン性ペプチドの親水性アミノ酸は、極性、塩基性、および酸性アミノ酸から独立して選択できる。
【０１０７】
極性アミノ酸は、例えば、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）、およびグルタミン（Ｑ）アミノ酸残基からなる群より選択され得る。
【０１０８】
塩基性アミノ酸は、例えば、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）およびオルニチンからなる群より選択され得る。
【０１０９】
酸性アミノ酸は、例えば、グルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｄ）から選択され得る。
【０１１０】
非極性疎水性アミノ酸は、例えば、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびグリシン（Ｇ）からなる群より選択され得る。通常、疎水性アミノ酸は、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）およびフェニルアラニン（Ｆ）から選択され得る。
【０１１１】
通常、式Ｉのペプチド中に、少なくとも１つのＲ／Ｋ’およびＲ／Ｋ”が存在する。
【０１１２】
最も典型的には、式Ｉのアミノ酸残基Ｒ／Ｋ’が存在する。
【０１１３】
通常、式Ｉの強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）は、下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む：
（ａ）Ｒ−ｘ１−Ｋ−ｘ２−Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”；
（ｂ）Ｒ−ｘ１−Ｒ−ｘ２−Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”；および
（ｃ）Ｋ−ｘ１−Ｋ−ｘ２−Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”。
【０１１４】
通常、式Ｉａの強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）では、
ｘ１、ｘ３およびｘ６は、親水性アミノ酸であり、および
ｘ２、ｘ４、およびｘ５は、疎水性アミノ酸である。
【０１１５】
式Ｉａの強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）の少なくともいくつかの実施形態では、
ｘ１、ｘ３およびｘ６は、極性アミノ酸であり、および
ｘ２、ｘ４、およびｘ５は、非極性アミノ酸である。
【０１１６】
通常、式Ｉａのいくつかの実施形態では、
ｘ１はセリンであり；
ｘ２はアラニン、ロイシンまたはバリンであり；
ｘ３はアスパラギンであり；
ｘ４は、プロリン、バリンまたはアラニンであり；
ｘ５はロイシン、バリンまたはアラニンであり、および
ｘ６はチロシンである。
【０１１７】
最も典型的には、式Ｉａのいくつかの実施形態では、ｘ２はアラニン、ｘ４はプロリン、およびｘ５はロイシンである。
【０１１８】
通常、式Ｉｂの強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）では、
ｘ３およびｘ６は、親水性アミノ酸であり、および
ｘ１、ｘ２、ｘ４、およびｘ５は、疎水性アミノ酸である。
【０１１９】
式Ｉｂの強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）の少なくともいくつかの実施形態では、
ｘ３およびｘ６は、極性アミノ酸であり、および
ｘ１、ｘ２、ｘ４、およびｘ５は、非極性アミノ酸である。
【０１２０】
通常、式Ｉｂのいくつかの実施形態では、
ｘ１はアラニンまたはグルタミン酸であり；
ｘ２はアラニン、ロイシンまたはバリンであり；
ｘ３はアスパラギンであり；
ｘ４は、プロリン、バリンまたはアラニンであり；
ｘ５はロイシン、バリンまたはアラニンであり、および
ｘ６はチロシンである。
【０１２１】
最も典型的には、式Ｉｂのいくつかの実施形態では、ｘ２はアラニン、ｘ４はプロリン、およびｘ５はロイシンである。
【０１２２】
あるいは、式Ｉｂの強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）の少なくともいくつかの実施形態では、
ｘ１、ｘ３およびｘ６は、親水性アミノ酸であり、および
ｘ２、ｘ４、およびｘ５は、疎水性アミノ酸である。
【０１２３】
通常、式Ｉｂのいくつかの実施形態では、
ｘ１はセリンであり；
ｘ２はアラニン、ロイシン、またはバリンであり；
ｘ３はアスパラギンであり；
ｘ４は、プロリン、バリンまたはアラニンであり；
ｘ５はロイシン、バリンまたはアラニンであり、および
ｘ６はチロシンである。
【０１２４】
最も典型的には、式Ｉｂのこのような実施形態では、ｘ２はアラニン、ｘ４はプロリン、およびｘ５はロイシンである。
【０１２５】
式Ｉｃの強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）の少なくともいくつかの実施形態では、
ｘ１およびｘ３は、親水性アミノ酸であり、および
ｘ２、ｘ４、ｘ５およびｘ６は、疎水性アミノ酸である。
【０１２６】
通常、式Ｉｃのいくつかの実施形態では、
ｘ１はグルタミン酸、バリンまたはアラニンであり；
ｘ２はアラニン、ロイシンまたはバリンであり；
ｘ３はアスパラギンであり；
ｘ４は、プロリン、バリンまたはアラニンであり；
ｘ５はロイシン、バリンまたはアラニンであり、および
ｘ６はチロシンである。
【０１２７】
さらなる実施形態では、式Ｉの強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）は、次記を含み得る：
バリン、アラニン、グルタミン酸、およびセリンから独立に選択されるｘ１；
バリン、アラニン、およびロイシンから独立に選択されるｘ２；
バリン、アラニン、およびアスパラギンから独立に選択されるｘ３；
バリン、アラニン、およびプロリンから独立に選択されるｘ４；
バリン、アラニン、およびロイシンから独立に選択されるｘ５；
バリン、アラニン、フェニルアラニンおよびチロシンから独立に選択されるｘ６。
【０１２８】
一実施形態では、式Ｉのペプチド（Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分）は、カチオン性アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に結合される。
【０１２９】
少なくともいくつかの実施形態では、式Ｉの強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）は、アミノ酸配列Ｒ／Ｋ’−Ｓ−Ｒ／Ｋ−Ａ−Ｒ／Ｋ−Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｙ−Ｒ／Ｋ”（例えば、Ｒ／Ｋ−ＳＫＡＫＮＰＬＹ−Ｒ／Ｋ”）、またはその反転配列を含む。
【０１３０】
他の実施形態では、強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）は、改変またはバリアント配列Ｒ／Ｋ’−ｘ１−Ｒ／Ｋ−ｘ２−Ｒ／Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”を含む、またはそれからなり、式中、アミノ酸ｘ１〜ｘ６は、ペプチドＲ／Ｋ’−Ｓ−Ｒ／Ｋ−Ａ−Ｒ／Ｋ−Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｙ−Ｒ／Ｋ”の対応するアミノ酸と、３０％を超える、より一般的には５０％以上、より一般的には６５％を超える、および最も一般的には８０％を超える全体アミノ酸配列同一性を有する、または改変配列またはバリアント配列の反転配列を有する。このようなペプチドの例としては、ＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫおよびＲＡＫＡＫＮＰＬＦが挙げられる。
【０１３１】
さらなる実施形態では、式Ｒ／Ｋ’−ｘ１−Ｒ／Ｋ−ｘ２−Ｒ／Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”の強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）のアミノ酸ｘ１〜ｘ６は、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、およびグリシン（Ｇ）残基からなる群より独立に選択され得る。少なくともいくつかのこのような実施形態では、ペプチドは、位置ｘ１に、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）（これらの両方は、極性アミノ酸である）を有しない。通常、アミノ酸ｘ１〜ｘ６のそれぞれは、独立に非極性アミノ酸から、最も典型的には、アラニン、バリンおよびセリンから選択される。通常、この実施形態では、アミノ酸ｘ１〜ｘ６のそれぞれは、独立に、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）から選択される。このようなペプチドの例としては、Ｒ／Ｋ’−ＡＫＡＫＡＡＡＡ−Ｒ／Ｋ”およびＲ／Ｋ’−ＶＫＶＫＶＶＶＶ−Ｒ／Ｋ”が挙げられる。
【０１３２】
通常、式Ｉの強化ペプチドまたは他のペプチドのアミノ酸Ｒ／Ｋ”は、存在しない。このようなペプチドの例としては、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹが挙げられる。
少なくともいくつかの実施形態では、アミノ酸ｘ３〜ｘ６およびＲ／Ｋ”は存在しない。
少なくともいくつかの実施形態では、アミノ酸ｘ３〜ｘ６は存在し、Ｒ／Ｋ”は存在しない。
通常、Ｒ／Ｋ’は存在する。最も典型的には、Ｒ／Ｋ’はアルギニンである。
通常、各Ｒ／Ｋは、それぞれリシンアミノ酸である。
【０１３３】
少なくともいくつかの実施形態では、アミノ酸ｘ１〜ｘ６は疎水性アミノ酸である。
特に好ましい実施形態では、アミノ酸ｘ１〜ｘ６は同じである。
【０１３４】
さらに別の実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の強化または他のペプチド部分は、以下の式Ｉ：
Ｒ／Ｋ’−ｘ１−Ｒ／Ｋ−ｘ２−Ｒ／Ｋ      式Ｉ’
のペプチド、またはその反転配列を含み、式中、
Ｒ／Ｋ’は、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基であり；
各Ｒ／Ｋは独立に、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基であり；ｘ１およびｘ２は、上述の式Ｉおよびその実施形態と同様に、それぞれ独立にアミノ酸である。
【０１３５】
少なくともいくつかの実施形態では、式Ｉまたは式Ｉ’のペプチドは、Ｒ−ｘ１−Ｋ−ｘ２−Ｋを含む。
【０１３６】
特に好ましい実施形態では、式ＩまたはＩａのペプチドのアミノ酸ｘ１およびｘ２はそれぞれ独立に、疎水性アミノ酸（例えば、バリン（Ｖ）またはアラニン（Ａ））であり、通常、同じである。
【０１３７】
従って、上記から、強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）は、式Ｉまたは式Ｉ’のペプチドを含む、またはそれからなり得る。従って、式ＩまたはＩ’のペプチドを含むペプチドは、式ＩまたはＩ’のペプチドと近接している１個または複数の追加のアミノ酸も同様に含むことが理解されよう。例えば、ペプチドは、ペプチドの片末端または両末端（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端）にそれぞれ結合しされる１個または複数の独立に選択されたアミノ酸を含み得る。一例として、またさらなる実施形態では、アミノ酸配列式ＩまたはＩ’を含む強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）は、アミノ酸Ｒ／Ｋ’が存在する場合、これに結合された、またはアミノ酸Ｒ／Ｋ’が存在しないいくつかの実施形態では、アミノ酸ｘ１に結合された、アミノ酸部分（ＡＡ）をさらに含み得る。これは、以下のように式Ｉ”で示される：
ＡＡ−Ｒ／Ｋ’−ｘ１−Ｒ／Ｋ−ｘ２−Ｒ／Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ’’      式Ｉ”
式中、ＡＡはアミノ酸またはアミノ酸配列であり、各Ｒ／Ｋ、Ｒ／Ｋ’、Ｒ／Ｋ”およびアミノ酸残基ｘ１〜ｘ６は、上記式Ｉと同様である。
【０１３８】
同様に、（ＡＡ）部分が代わりに、式Ｉ”の強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）の他の末端に結合される実施形態が提供され得る。
【０１３９】
通常、アミノ酸部分ＡＡは、存在する場合、１つまたは複数の独立に選択されるカチオン性アミノ酸からなる。通常、アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、およびオルニチンアミノ酸残基から独立に選択され、最も典型的には、全てがアルギニン（Ｒ）残基である。少なくともいくつかの実施形態では、ＡＡ部分は、存在する場合、最大３０個のカチオン性アミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のカチオン性アミノ酸残基）のカチオン性アミノ酸配列からなる。
【０１４０】
特に好ましいこのような実施形態では、ＡＡ部分は、存在する場合、少なくとも２個のカチオン性アミノ酸を含む。このようなＡＡ部分の例としては、ポリアルギン、ポリヒスチジンおよびポリリシン配列（例えば、ＨＨ（２Ｈｉｓ）、ＨＨＨ（３Ｈｉｓ）、ＨＨＨＨ（４Ｈｉｓ）、ＨＨＨＨＨ（５Ｈｉｓ）；ＲＲＲＲＲＲＲＲ（８Ａｒｇ）、およびＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（９Ａｒｇ））が挙げられる。他の実施形態では、ＡＡ部分は、式Ｉ’の強化ペプチドのＲ／Ｋ’アミノ酸が存在する場合、これに結合される、またはＲ／Ｋ’アミノ酸残基が存在しない場合、アミノ酸残基ｘ１に結合される、９、８、７、６、５、４、３、２または１個のカチオン性アミノ酸で終端するペプチドを含み得る。
【０１４１】
強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）は、本発明によるＬｃｋ活性化剤中に存在する場合、通常、最大約４０アミノ酸長を有する。少なくともいくつかの実施形態では、強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）は、少なくとも５アミノ酸長である（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０アミノ酸）。少なくともいくつかの実施形態では、強化ペプチドは、約２５アミノ酸以下、または約２０、１５、１４、１３、１２、１１、または１０アミノ酸以下の長さを有する。特に好ましい実施形態では、強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）は、少なくとも９アミノ酸長を有する。同様に理解されるように、５〜例えば、４０アミノ酸の全ての範囲も明示的に本明細書のために提供される。
【０１４２】
一実施形態では、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分は、カチオン性アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に結合される。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、用語の「反転配列」は、アミノ酸配列が逆転していることを意味する。例えば、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹの反転配列は、ＹＬＰＮＫＡＫＳＲである。従って、反転配列のアミノ酸配列は、逆順であり、それにより、元の配列のＮ末端は、反転配列のＣ末端になり、元の配列のＣ末端は、反転配列のＮ末端になる。通常、本発明の実施形態により利用されるペプチドは、少なくともそれらのカルボキシ末端でアミド化されるなどして、タンパク分解に対して保護する。しかし、タンパク分解に対し保護するための任意の好適なＮまたはＣ末端修飾も採用できる（例えば、メチル化）。
【０１４４】
以下でさらに記載のように、強化ペプチドまたは他のペプチド（Ａ／Ｐ）のアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸および／またはＤ−アミノ酸であってよい。従って、反転配列のアミノ酸は、全てＬ−アミノ酸または全てＤ−アミノ酸であってよく、用語の「反転配列」は、レトロインベルソペプチドに拡張され、ここで全てのアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸であるが、これに限定されない。
【０１４５】
一実施形態では、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドは、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒｒｒｒｒｒｒｒｒ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖｒｒｒｒｒｒｒｒｒ、ＲＳＫＡＫ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ−ｙｌｐｎｋａｋｓｒ、ＩＡＧＱ−ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＰＬＧ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＳＫＡＫＮＰＬＹＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＹＬＰＮＫＡＫＳＲ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、分岐＜ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、ＨＨＨＨＨ−ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＨＨＨＨＨ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨ−ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ−ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ、ＨＨＨＨＨ−ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＫＲＫＲＫＲＫＲＫ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−Ｒ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨ−ＨＨ、ＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨ、およびＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１４６】
別の実施形態では、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドは、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲまたはＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲを含む。
【０１４７】
一態様では、本発明は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒｒｒｒｒｒｒｒｒ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖｒｒｒｒｒｒｒｒｒからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。
【０１４８】
別の態様では、本発明は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒｒｒｒｒｒｒｒｒ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖｒｒｒｒｒｒｒｒｒからなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
【表２】
2021523945.tif 000005
2021523945.tif 000006
【０１４９】
本明細書で使用される場合、用語の「アミノ酸配列」は、アミノ酸からなり、通常、アミド結合で連結された分子を指す。この用語は、配列の「プロドラッグ」、配列の荷電および非荷電型、配列の薬学的に許容可能な塩、および本開示の方法および使用で機能活性を保持する、配列の骨格および／または末端に対する改変を含む配列に対する任意の他のバリアント、誘導体または改変体を含む。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、用語の「配列」は、分子を形成できるアミノ酸の数の最大長を暗黙で指定するものと解釈されるべきではない。いくつかの実施形態では、最大長は１０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、最大長は９アミノ酸である。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、配列は、単離されたまたは精製された配列である。
【０１５２】
天然にまたは組換え技術により生成された配列の「単離」および「精製」の方法は、当技術分野において、例えば、Ｃ−Ｈ  Ｌｅｅ，Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｏｕｔｌｉｎｅ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；２０１７，Ｍａｒｃｈ；３２（１）：１８、により既知である。さらに、用語の「単離」または「精製」は、合成およびその他の人為的に作製された配列を含む。配列の合成方法は、当技術分野において既知である。通常、配列は、１つのアミノ酸のカルボキシル基の別のアミノ基への縮合反応により化学的に合成される。配列の化学合成は、溶液相または固相技術を用いて実施できる。合成技術は、非天然アミノ酸配列、骨格修飾およびＤ−異性体を組み込んだ配列の作製を可能にする。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本発明の配列は改変される。いくつかの実施形態では、改変は、配列の薬理学的特性を変える改変であり得る。いくつかの実施形態では、改変は、本発明の組成物または配列の半減期を延長する。いくつかの実施形態では、改変は、配列（および／または本発明の組成物）の生物活性を高め得る。いくつかの実施形態では、改変は、本発明の配列または組成物の選択性を高める改変であり得る。
【０１５４】
一実施形態では、改質は保護基の付加である。保護基は、Ｎ末端保護基、Ｃ末端保護基または側鎖保護基であり得る。本発明の配列は、これらの保護基の１個または複数を有し得る。当業者は、アミノ酸をこれらの保護基と反応させるための好適な技術を知っている。これらの基は、当該技術分野において既知の作製方法により付加できる。基は配列上に残ってもよく、または使用もしくは投与前に除去されてもよい。保護基は、合成中に付加されてもよい。
【０１５５】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドのアミド化が意外にも、Ｌｃｋ活性レベルを高めることを実証した。従って、一実施形態では、本発明は、アミノ酸配列、またはカチオン性アミノ酸配列が、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分のＣ末端でアミド化される、本明細書に記載のペプチドを提供する。
【０１５６】
別の実施形態では、本発明は、最遠位の脂肪酸がアミド化される、本明細書に記載のペプチドを提供する。
【０１５７】
本明細書でポリペプチド配列の文脈で使用される場合、「ＮＨ２」は、ポリペプチドが、例えば、そのＣ末端でアミド化されることを示す。例えば、Ｃ末端アミノ酸または最遠位脂肪酸がアミド化され得る。
【０１５８】
別段の指示（例えば、−ＯＨにより）がない限り、本明細書で使用される全てのペプチドは、ポリペプチド部分のＣ末端でアミド化される。
【０１５９】
別の実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分のＣ末端でアミド化される、本明細書に記載のペプチドを提供する。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、配列は、そのＣ末端でアミド化される。アミド化は、内部および端部タンパク質分解によるグリシン延長基質のＮ−酸化切断のプロセスを指す。アミド化配列をインビトロで作製する方法は、例えば、酵素的アミド化；組換えで作製された配列およびタンパク質のＣ末端の化学修飾；固相配列合成でのアミド樹脂の使用；アンモニアの存在下でカルボキシペプチダーゼの使用；および配列のＣ末端のメチルエステルへの変換、および低温でのアンモニアの付加などのように、当技術分野において既知である。好適な技術の本開示の例としては、ＤＪ  Ｍｅｒｋｌｅｒ，Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｍｉｄａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｍｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｉｄｅ  ｔｏ  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ；Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９４，Ｊｕｎｅ；１６（６）：４５０−６およびＶ  Ｃｅｒｏｖｓｋｙ  ａｎｄ  Ｍ−Ｒ  Ｋｕｌａ  Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ａｍｉｄａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｆｌａｖｅｄｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ａｍｉｄａｓｅ；Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，１９９８，Ａｕｇｕｓｔ；３７（１３−１４）：１８８５、が挙げられる。
【０１６１】
Ｃ末端のアミド化により、Ｃ末端が非電荷になり、そのため、改変配列は、より厳密に未変性タンパク質を模倣する。これは、配列の細胞中に入るための高められた能力；配列のインビボでの代謝安定性の改善；アミノペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、およびシンテターゼによる配列のインビボ酵素分解の低減；および配列の貯蔵寿命の改善、を含む一連の利点をもたらす。
【０１６２】
本明細書に記載のように、本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドがＬおよびＤアミノ酸を含むことができ、かつ生物活性を有することを明らかにした。従って、一実施形態では、本発明は、Ｌｃｋ活性化剤を本明細書に記載のアミノ酸配列がＬ−アルギニン残基を含むとして記述する。別の実施形態では、本発明は、Ｌｃｋ活性化剤を本明細書に記載のアミノ酸配列がＤ−アルギニン残基を含むとして記述する。
【０１６３】
従来技術で公知なように、アルファアミノ酸は、α位置でキラル炭素を含む。従って、全てのアルファアミノ酸は、グリシンを除いて、２つの鏡像異性体のＬ−またはＤ−異性体のいずれかとして存在できる。一般に、Ｌ−アミノ酸のみが、哺乳動物細胞中で製造され、タンパク質中に組み込まれる。Ｄ−アミノ酸は、人為的に合成され得るか、または細菌タンパク質中で見つけられることがある。ＬおよびＤ規則は、アミノ酸の立体化学に直接言及するためには使用されず、むしろ、それはアミノ酸配置の参照に使用され、およびアミノ酸それ自体の光学活性に言及せず、むしろ、そのアミノ酸を合成し得る元の原料のグリセルアルデヒドの異性体の光学活性に言及する（Ｄ−グリセルアルデヒドは右旋性である；Ｌ−グリセルアルデヒドは左旋性である）。
【０１６４】
少なくともいくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ、ＲＳＲＡＲＮＰＬＹ、ＲＡＲＡＫＮＰＬＹ、ＫＥＫＬＫＮＰＬＦ、ＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ、ＲＡＫＡＫＡＡＡＡ、ＲＡＫＡＫＮＰＬＦ、ＲＳＫＡＫ、ＲＡＫＡＫおよびＲＶＫＶＫからなる群より選択されるペプチド活性成分を含み得る、またはそれからなり得る。
【０１６５】
他の実施形態では、強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）は、反転配列ＹＬＰＮＫＡＫＳＲ、ＲＹＬＰＮＫＡＫＳＲ、ＹＬＰＮＲＡＲＳＲ、ＹＬＰＮＫＡＲＡＲ、ＦＬＰＮＫＬＫＥＫ、ＫＦＬＰＮＫＬＫＥＫ、ＶＶＶＶＫＶＫＶＲ、ＡＡＡＡＫＡＫＡＲ、ＦＬＰＮＫＡＫＡＲ、ＫＡＫＳＲ、ＫＡＫＡＲおよびＫＶＫＶＲからなる群から選択され得る。
【０１６６】
最も典型的には、強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ、ＹＬＰＮＫＡＫＳＲ、ＲＳＫＡＫまたはＫＡＫＳＲを含む、またはそれらからなる。
【０１６７】
本発明者らは、少なくとも１つの脂肪酸の、本明細書に記載のペプチドへの結合が、意外にも、Ｌｃｋを活性化する増大した能力をペプチドに付与することを実証した。
【０１６８】
従って、いくつかの実施形態では、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドは、１つまたは複数の結合脂肪酸部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｌｃｋの活性化剤は、４つの結合脂肪酸部分を含む。この結果は意外であり、その理由は、それら単独では、１〜４個の結合脂肪酸を含む脂肪酸部分はＬｃｋを活性化しないためである。いくつかの実施形態では、結合脂肪酸部分は、少なくとも１つのアミノドデカン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、全ての脂肪酸部分は、アミノドデカン酸である。
【０１６９】
別の好ましい実施形態では、２個以上の脂肪酸が式Ｉのポリペプチド部分のＣ末端で結合される。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個またはそれを超える脂肪酸が式Ｉのポリペプチド部分に結合される。
【０１７０】
少なくとも１個の脂肪酸は、１個の脂肪酸鎖のアミノ基置換基と、次の脂肪酸の末端カルボキシル基との間のそれぞれのアミド結合を連続的に形成することにより、一緒に脂肪酸を結合して、それにより結合脂肪酸をもたらし得る。
【０１７１】
従って、脂肪酸のαまたはβ炭素上のアミノ基（ＮＨ２）置換基を有する脂肪酸は、特に結合に好適である。
【０１７２】
好ましい一実施形態では、本発明は、少なくとも４個の脂肪酸が、活性化剤のＣ末端に結合される、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１７３】
別の好ましい実施形態では、本発明は、最遠位の脂肪酸がアミド化される、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１７４】
脂肪酸の結合は、直鎖および／または分岐であり得る。一実施形態では、本発明は、少なくとも４個の脂肪酸の結合が直鎖である、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも４個の脂肪酸の結合が分岐である、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１７５】
上記で考察したように、脂肪酸部分は、任意の位置でＬｃｋを活性化するためのペプチドに結合されて、リポペプチドを形成できる。しかし、好ましい実施形態では、脂肪酸部分は、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドのＣ末端で結合される。アミノ酸配列に結合される脂肪酸部分は、分岐脂肪酸または直鎖脂肪酸であり得る。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１、２、３または４個の脂肪酸部分は直鎖である。例えば、少なくとも１個の脂肪酸の結合が直鎖である場合、一実施形態では、少なくとも１個の脂肪酸が、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドのＣ末端にアミド結合を介して結合される。
【０１７７】
本明細書で使用される場合、「直鎖」という用語は、脂肪酸の炭化水素鎖がＬｃｋ活性化するためのペプチドの骨格中に組み込まれていることを指す。例えば、脂肪酸は、オメガ炭素の位置でアミノ基置換基を含むことができる。一実施形態では、１２アミノラウリン脂肪酸アミド（例えば、１２−アミノドデカン酸；「Ａｄｏｄ」）が使用され、従ってアミド結合は、炭素１２の位置のアミノ置換基と別の基（例えば、カルボキシル基）との間で形成され得る。
【０１７８】
従って、別の実施形態では、少なくとも１個の脂肪酸の結合が直鎖である場合、第１の脂肪酸は、アミド結合を介して、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドのＣ末端に結合され、さらなる脂肪酸は、脂肪酸の末端カルボキシル基とさらなる脂肪酸のアミノ基置換基（例えば、アミノドデカン酸）との間でアミド結合を形成することにより脂肪酸に結合される。別の実施形態では、第３の脂肪酸は、さらなる脂肪酸の末端カルボキシル基と第３の脂肪酸のアミノ基置換基との間でアミド結合を形成することによりさらなる酸に結合される。別の実施形態では、第４の脂肪酸は、第３の脂肪酸の末端カルボキシル基と第４の脂肪酸のアミノ基置換基との間でアミド結合を形成することにより第３の酸に結合される。
【０１７９】
任意の数の脂肪酸を、脂肪酸モノマーから、１個の脂肪酸の末端カルボキシル基と、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドに結合されるべき別の脂肪酸のアミノ基置換基との間でアミド結合の形成により脂肪酸の直鎖ポリマー鎖を形成することにより、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドのC末端に結合できる。
【０１８０】
他の実施形態では、脂肪酸の炭化水素鎖は、「直鎖」ではなく、例えば、脂肪酸の炭化水素鎖の全てまたは一部は、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドの骨格の一部ではない（例えば、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドの骨格に「垂直」である）。例えば、脂肪酸は、脂肪酸のαまたはβ炭素の位置にアミノ基置換基を含むことができる。例えば、一実施形態では、２−アミノラウリン脂肪酸アミド（例えば、２−アミノドデカン酸；「Ａｄｏｄ」）が使用され、従って、アミド結合は、炭素２の位置のアミノ置換基と別の基（例えば、式Ｉ、またはポリカチオン性ペプチドのカルボキシル基）との間で形成され得る。
【０１８１】
本明細書で使用される場合、Ａｄｏｄという用語は、アミノドデカン酸を指し、および「２Ａｄｏｄ」は、２−アミノドデカンを指し、；「１２Ａｄｏｄ」は、１２−アミノドデカン酸を指す、等々である。２個以上の脂肪酸が結合される場合、結合される脂肪酸の数は、下付き文字で表記される。例えば、「（２Ａｄｏｄ）２」は、２個の２−アミノドデカン酸を意味する。従って、本明細書に記載の単一単位のポリアミド部分は、１個の２−アミノドデカン酸残基に対応する（本明細書では、「（２Ａｄｏｄ）１」とも表現される）。本明細書に記載の２単位のポリアミド部分は、２個の２−アミノドデカン酸残基に対応する（本明細書では、「（２Ａｄｏｄ）２」とも表現される）。本明細書に記載の３単位のポリアミド部分は、３個の２−アミノドデカン酸残基に対応する（本明細書では、「（２Ａｄｏｄ）３」とも表現される）。本明細書に記載の４単位のポリアミド部分は、４個の２−アミノドデカン酸残基に対応する（本明細書では、「（２Ａｄｏｄ）４」とも表現される）。
【０１８２】
他の実施形態では、例えば、脂肪酸は、脂肪酸の別の炭素の位置にアミノ基置換基を含むことができる。
【０１８３】
アミノ脂肪酸が１つのキラル中心を有し、キラルである他の実施形態では、２つの可能な鏡像異性体（例えば、ＲおよびＳ）が存在する。従って、一実施形態では、本発明のＬｃｋを活性化するためのペプチドは、アミノ脂肪酸の１つの鏡像異性体またはもう一方の鏡像異性体、または１個または複数のアミノ脂肪酸のもう一つの鏡像異性体を含むことができる。
【０１８４】
従って、本発明は、直鎖および／または非直鎖（例えば、分岐方式）で結合される脂肪酸を含むＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、「分岐」という用語は、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドの骨格に対し「直鎖」または「垂直」にならないように、アミノ酸残基に結合される、または最初の脂肪酸に結合される２個以上の脂肪酸を含む。
【０１８６】
一実施形態では、少なくとも１個の脂肪酸は、１３〜２１個の炭素原子を含む長鎖脂肪酸、６〜１２個の炭素原子を含む中鎖脂肪酸、または６個未満の炭素原子を有する短鎖脂肪酸である。好ましい実施形態では、脂肪酸は、約６〜１６炭素原子長を含む。例えば、脂肪酸は、６〜１６個の炭素、８〜１４個の炭素または１０〜１２個の炭素を含む。
【０１８７】
一実施形態では、脂肪酸は、６個の炭素を含み、カプロン酸またはヘキサン酸である。例えば、一実施形態では、脂肪酸はアミノヘキサン酸である。
【０１８８】
別の実施形態では、脂肪酸は、８個の炭素を含み、カプリル酸またはオクタン酸である。例えば、一実施形態では、脂肪酸はアミノオクタン酸である。
【０１８９】
別の実施形態では、脂肪酸は、１０個の炭素を含み、カプリン酸またはデカン酸である。例えば、一実施形態では、脂肪酸はアミノデカン酸である。
【０１９０】
別の実施形態では、脂肪酸は、１２個の炭素を含み、ラウリン酸またはドデカン酸である。例えば、一実施形態では、脂肪酸はアミノドデカン酸（例えば、（Ｓ）−２−アミノドデカン酸）である。脂肪酸は、飽和であっても、または１個または複数の二重結合を有する不飽和であってもよい。好ましくは、脂肪酸は飽和している。
【０１９１】
一実施形態では、本発明は、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドを提供し、このペプチドはさらにＬｃｋ活性化ポリペプチド部分のＮ末端またはＣ末端に結合された化合物を含み、この化合物は、少なくとも１個の脂肪酸である。
【０１９２】
一実施形態では、本発明は、少なくとも４個の脂肪酸が、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分のＣ末端に結合される、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１９３】
一実施形態では、本発明は、２個以上の脂肪酸の結合が直鎖である、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１９４】
一実施形態では、本発明は、２個以上の脂肪酸の結合が分岐である、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１９５】
一実施形態では、本発明は、脂肪酸が飽和している、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１９６】
一実施形態では、本発明は、脂肪酸がカプロン酸、カプリル酸、カプリン酸（デカン酸）、およびラウリン酸（ドデカン酸）からなる群より選択される、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１９７】
一実施形態では、本発明は、最遠位の脂肪酸がアミド化される、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１９８】
一実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分のＣ末端でアミド化される、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１９９】
特に好ましい実施形態では、細胞化合物は、飽和または不飽和脂肪族化合物、脂肪酸、ポリアミドまたは最大２０原子またはそれを超える長さの、１個または複数の側鎖を有してよい他の骨格を含み得る。通常、骨格鎖は、約６〜２０原子（すなわち、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０原子）の範囲の長さを有し、１個または複数のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰから独立に選択される）を含み得る。分岐の場合、骨格鎖は通常、１〜５側鎖（例えば、１、２、３、４または５側鎖）を有し、これらのそれぞれは、独立に最大１８原子長さ（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８原子長）である。通常、各側鎖は、独立に、飽和または不飽和脂肪族炭素鎖（例えば、Ｃ１〜Ｃ１８鎖）である。最も典型的には、促進剤部分は、脂肪族またはポリアミド骨格を有する。
【０２００】
少なくともいくつかの実施形態では、化合物は、３〜５反復単位を有するポリアミドであり、各反復単位は独立に、３〜９原子長（すなわち、３、４、５、６、７、８、９原子の長さ）であり、側鎖がないか、または単一側鎖を有する。通常、それぞれの反復単位は３〜６原子長であり、より典型的には、３〜６、３〜５、または３〜４原子長であり、最も典型的には、３原子長である。各反復単位の側鎖の長さは通常、独立に４〜１８炭素原子長さ（すなわち、Ｃ４〜Ｃ１８）、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８炭素原子であり、より一般的には、８〜１８、８〜１６、８〜１４、８〜１２または８〜１０炭素原子長である。各反復単位の側鎖は通常、独立に、反復単位のαまたはβ炭素原子から伸びる。
【０２０１】
通常、本発明の実施形態により結合されるべき化合物は、以下の式ＩＩ：
【化２】
2021523945.tif 000007
の化合物を含み、式中、
ｎは、化合物のモノマー単位の数であり、１〜５の整数であり、
各ｍは独立に、０〜１８の整数であり、および
各Ｒ基は独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ１８の側鎖である。通常、モノマー単位のＲ側鎖の長さは、そのモノマー単位のｍの値にほぼ反比例する。通常、各Ｒは、１８−ｍ炭素原子長であり、式中、ｍは、０〜１７の値を有する。例えば、ｍが０の場合、ＲはＣ１８側鎖であり、ｍが２の場合、ＲはＣ１６側鎖であり、ｍが４の場合、ＲはＣ１４側鎖である、等々。
【０２０２】
通常、式ＩＩの化合物では、ｎは２〜５であり、各ｍは独立に０、１、２または３であり；各Ｒは独立に炭素鎖である。
【０２０３】
通常、各Ｒは独立に、４〜１８炭素原子長の炭素鎖である。従って、少なくともいくつかの実施形態では、本発明によるＬｃｋ活性化剤の化合物は、以下の式ＩＩａ：
【化３】
2021523945.tif 000008
のポリアミド部分（ＰＭ）であり、式中、
ｎは、化合物のモノマー単位の数であり、３〜５の整数であり、
各ｍは独立に０、１、２、または３であり、および
各Ｒ基は独立に、４〜１８炭素原子長の炭素鎖である。
【０２０４】
通常、式ＩＩまたは式ＩＩａの化合物では、各ｍは独立に、０、１または２である。より典型的には、ｍは０または１である。最も典型的には、ｍは０である。
【０２０５】
当然のことながら、本明細書に記載の式ＩＩの化合物のモノマー単位は、化合物の１個または複数の他のモノマー単位とは異なり得る。
【０２０６】
式ＩＩまたは式ＩＩａの化合物／ポリアミド部分は、例えば、示されるようにアミノ基置換基を有し、かつＲとｍは上で記載の通りである、式Ｒ−ＣＨＮＨ２−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨの脂肪酸を一緒に結合することにより、１個の脂肪酸鎖のアミノ基置換基と次の脂肪酸の末端カルボキシル基の間のそれぞれのアミド結合を連続的に形成することにより、それによりポリアミド骨格を生じ、そこから各脂肪酸のＲ基が側鎖として伸びることによりもたらされ得る。即ち、得られるポリアミド部分の各モノマー単位のＲ基側鎖は、それぞれの脂肪酸の残部であり、それぞれの脂肪酸からポリアミド部分の骨格が形成される。
【０２０７】
脂肪酸のαまたはβ炭素上にアミノ基（ＮＨ２）置換基を有する脂肪酸は、ポリアミド部分（ＰＭ）の合成での使用に特に好適であり、それにより得られるポリアミド部分は、αまたはβポリアミド骨格を有する。最も典型的には、式ＩＩの化合物では、各モノマー単位のｍは０である。従って、ポリアミド部分は、それぞれの脂肪酸の炭素原子がアミノ基で置換される脂肪酸から形成できる。
【０２０８】
本発明のいくつかの実施形態では、各脂肪酸部分は、６〜１６個の炭素、８〜１４個の炭素または１０〜１２個の炭素を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの脂肪酸部分は、飽和、不飽和または多価不飽和である。好ましい実施形態では、１、２、３または４個の脂肪酸は飽和している。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、カプロン酸（ヘキサン酸）、カプリル酸（オクタン酸）、カプリン酸（デカン酸）、およびラウリン酸（ドデカン酸）からなる群より選択される。好ましい実施形態では、脂肪酸は、ドデカン酸（アミノドデカン酸／ａｄｏｄ）である。
【０２０９】
本発明による方法で利用されるＬｃｋ活性化剤のいくつかの実施形態では、式ＩＩの化合物の各Ｒ基の炭素鎖は、独立に直鎖または分岐鎖であり得、および飽和または１個または複数の二重結合を有する不飽和であり得る。通常、各Ｒ基は、飽和炭素鎖である。
【０２１０】
通常、式ＩＩの化合物の各Ｒ基は独立に、８〜１８、８〜１６、より好ましくは８〜１４、および最も好ましくは８〜１２炭素原子長の炭素鎖である。最も典型的には、各Ｒ基は独立に、８〜１０炭素原子長の炭素鎖である。
【０２１１】
従って、例えば、２−アミノカプリンおよびラウリン脂肪酸（それぞれ、１０および１２炭素原子長さである）は、本明細書に記載の式ＩＩの化合物の提供での使用のために特に好適である。当然のことながら、カプリン酸脂肪酸の場合には、得られる式ＩＩの化合物のモノマー単位のＲ基は、カプリン脂肪酸鎖の炭素１および２（α炭素）が化合物の骨格中に組み込まれることを考慮すると、８炭素原子長である。同様に、ラウリン脂肪酸の場合には、得られる化合物のモノマー単位（ｎ＝１）のＲ基は、１０炭素原子長である。
【０２１２】
式ＩＩの化合物のＲ基の炭素鎖の長さは独立に、化合物の１つのモノマー単位と次のモノマー単位で変わり得る。通常、式ＩＩの化合物のＲ基の炭素鎖は、相互に同じ長さである。式ＩＩの化合物の提供で２−アミノラウリン脂肪酸アミドの使用は、特に好ましい。従って、この例での化合物の各モノマー単位のＲ基は、１０炭素原子長である。
【０２１３】
通常、式ＩＩの化合物では、ｎは３、４または５であり、より典型的には、ｎは３または４であり、最も典型的には、ｎは４である。
【０２１４】
しかし、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の式ＩＩの化合物の全ての違いは、明示的に包含される。
【０２１５】
通常、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の式ＩＩａの化合物は、下記スキーム１に示すようにアミノ基（ＮＨ２）で終端する。
【化４】
2021523945.tif 000009
スキーム１：式ＩＩの化合物
【０２１６】
他の実施形態では、水素原子またはＮＨ２以外の末端基で終端する式ＩＩの化合物（スキーム１のように）も採用されてよく、本発明は明示的に、全ての好適な生理学的に許容可能なこのような化合物（生理学的に許容可能なその塩を含む）を含む治療薬の使用にまで及ぶ。
【０２１７】
本発明により利用される式ＩＩの化合物は、例えば、ＮＨ２、Ｈ、ＣＯＯＨ、ＯＨ、ハロ（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ＳＨ、アルキル、低級アルキル、アルケニル、低級アルケニル、ＯＲ、ＮＨＲ’およびＮＲ’Ｒ”から選択される末端基を有し得、低アルキル基、低級アルケニル基、ＯＲ、ＮＨＲ’およびＮＲ’Ｒ”は、任意に置換されてよく、およびＲ、Ｒ’およびＲ”は、それぞれ独立に任意に置換されてよい低級アルキルまたは低級アルケニルである。
【０２１８】
低級アルキル、低級アルケニル、ＯＲ、ＮＨＲ’およびＮＲ’Ｒ”基の任意の置換基は、例えば、ＯＨ、ハロ（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ１−Ｃ３アルキル（例えば、メチル）、ＣＯＯＨなどから選択され得る。
【０２１９】
「低級アルキル」は、Ｃ１−Ｃ６アルキル（例えば、直鎖または分岐であってよい、メチル、エチル、またはプロピル基など）を意味する。
【０２２０】
同様に、「低級アルケニル」は、その最長鎖中に１個または複数の二重結合を含むＣ２−Ｃ６アルケニル基を意味する。
【０２２１】
しかし、通常、式ＩＩの化合物は、ＮＨ２またはＣＯＯＨ基で終端する。
【０２２２】
通常、本明細書に記載のポリカチオン性ペプチド（ＰＰ）は、それ自体、本発明によるＬｃｋ活性化剤であり、少なくとも６個の近接カチオン性アミノ酸を含む。同様に、６個未満の長さの近接カチオン性アミノ酸を含む本明細書に記載のポリカチオン性ペプチドが通常、式Ｉまたは化合物（Ｃ）または式ＩＩの強化ペプチドもしくは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）に結合される。
【０２２３】
改変またはバリアント型の強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）と、野生型または親ペプチド（例えば、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ）の間のアミノ酸差異は通常、保存的アミノ酸変化である。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸残基の、類似の立体化学的特性（例えば、構造体、電荷、酸性または塩基性特性）を有する別のアミノ酸による置換を意味し、これは、構造または特徴的な生物学的機能の所望の特徴または特徴（複数）に実質的に影響しない。例えば、アスパラギン酸（Ｄ）などの酸性アミノ酸は、グルタミン酸残基（Ｅ）により置換され得、セリン（Ｓ）などの極性アミノ酸は、トレオニン（Ｔ）またはアスパラギン（Ｎ）などの別の極性アミノ酸により置換され得る、などである。
【０２２４】
本明細書に記載のアミノ酸配列間の配列同一性は、配列が比較のために最適に整列される場合、配列中の各位置でのアミノ酸を比較することにより決定できる。配列の整列は、任意の好適なプログラムまたはアルゴリズム、例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を用いて実施できる。コンピュータ支援配列整列は好都合に、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）の一部であるＧＡＰなどの標準的ソフトウェアプログラムを使用し、５０のギャップ生成ペナルティ（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）および３のギャップ伸張ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）のデフォルトスコアマトリックスを用いて実施できる。比較のためのアミノ酸配列の他の整列方法もまたよく知られており、例えば、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９８１）およびＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）のアルゴリズム、このようなアルゴリズムのコンピュータ−実装（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ）、および配列のマニュアル整列および検査である。
【０２２５】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、Ｌｃｋ活性化剤は、式ＩＩＩおよび式ＩＶで下に示すようにポリカチオン性ペプチド（ＰＰ）のＮ末端またはＣ末端に結合された、上述の式Ｉの強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）を含み得る。
【０２２６】
他の実施形態では、式ＩＩの化合物などの化合物は、下記式Ｖおよび式ＶＩで例示されるように、ポリカチオン性ペプチド（ＰＰ）のＮ末端またはＣ末端に結合されてよい。
【０２２７】
式Ｉの強化ペプチドまたは他のペプチド、または上述の他のペプチド部分がポリカチオン性ペプチド（ＰＰ）のＮ末端またはＣ末端に結合されるさらにその他の実施形態では、式ＩＩの化合物（Ｃ）は、式ＶＩＩおよび式ＶＩＩＩで例示されるように、もう一方のポリカチオン性ペプチド（ＰＰ）のＮ末端またはＣ末端に結合されてよい。
ＡＰ／Ｐ−ＰＰ        式ＩＩＩ
ＰＰ−ＡＰ／Ｐ        式ＩＶ
Ｃ−ＰＰ              式Ｖ
ＰＰ−Ｃ              式ＶＩ
ＡＰ／Ｐ−ＰＰ−Ｃ    式ＶＩＩ
Ｃ−ＰＰ−ＡＰ／Ｐ    式ＶＩＩＩ
【０２２８】
成分、例えば、ポリカチオン性ペプチド（ＰＰ）、化合物（Ｃ）、および／または本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）は通常、それぞれのペプチド結合または他の好適な（例えば、共有またはイオン）結合により、場合に応じて、相互に直接結合される。他の実施形態では、ポリカチオン性ペプチド（ＰＰ）は、強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）および／または化合物（Ｃ）にリンカー基（ＬＧ）を介して結合され得る。リンカー基は、相互に同じであっても異なっていてもよい。リンカー基は、例えば、１〜１０原子またはそれを超える（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０原子）の長さを含む、またはそれからなり得、その結合原子または１個または複数の原子は、例えば、Ｎ、ＳおよびＯから選択される、非炭素原子であってよい。しかし、任意の好適な結合系を用い得る。
【０２２９】
上記から、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の少なくともいくつかの実施形態は、リポペプチドであるか、またはそれを含む。
【０２３０】
また、式ＩＩＩ〜式ＶＩＩＩのいずれかにおける強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）は、式Ｉの強化ペプチドの反転配列であり得ることも理解されよう。
【０２３１】
またさらなる実施形態では、本発明によるＬｃｋ活性化剤は、Ｌｃｋ活性化剤をＬｃｋ活性化剤の標的細胞へのおよび／または１つまたは複数の本明細書に記載の他のＬｃｋ活性化剤への標的化送達のためのターゲティング部分に結合するためのリンカー部分（ＬＭ）に結合され得る。リンカー基は、例えば、下記で式ＩＸ〜ＸＩに示すような式ＩＩＩ〜ＶＩＩＩのいずれかのＬｃｋ活性化剤のポリカチオン性ペプチド（ＰＰ）または強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）に結合されてよい。
ＬＭ−ＡＰ／Ｐ−ＰＰ        式ＩＸ
ＰＰ−ＡＰ／ＰＡ−ＬＭ      式Ｘ
Ｃ−ＰＰ−ＬＭ              式ＸＩ
ＬＭ−ＰＰ−Ｃ              式ＸＩＩ
ＬＭ−ＡＰ／Ｐ−ＰＰ−Ｃ    式ＸＩＩＩ
Ｃ−ＰＰ−ＡＰ／Ｐ−ＬＭ    式ＸＩＶ
ＡＰ／Ｐ−ＰＰ−ＬＭ        式Ｘ
ＡＰ／Ｐ−ＰＰ−Ｃ−ＬＭ    式ＸＩ
【０２３２】
いくつかの実施形態では、リンカー部分は、ターゲティング部分に直接Ｌｃｋ活性化剤を結合できる。
【０２３３】
他の実施形態では、リンカー部分は、１対のＬｃｋ活性化剤を一緒に結合するための架橋部分を含むことができ、ここでＬｃｋ活性化剤は相互に同じであるまたは異なる。
【０２３４】
リンカー部分（ＬＭ）は、任意選択で、Ｌｃｋ活性化剤を放出するために標的細胞の表面でまたは標的細胞の細胞内で酵素切断されるための、下に例示するような１つまたは複数の酵素切断部位をコードするアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０２３５】
通常、リンカー部分は、リンカー部分のターゲティング部分への結合のために、結合部分を含む。
【０２３６】
結合部分は、ターゲティング部分への結合のための任意の好適なアミノ酸またはアミノ酸配列、例えば、システイン（Ｃ）アミノ酸残基（ターゲティング部分により提供される末端システイン残基とのジスルフィド架橋の形成のため）、リシン残基（Ｋ）、または例えば、リシン（Ｋ）またはシステイン（Ｃ）残基をリンカー部分の酵素切断部位（存在する場合）から隔てるためのＫＡＡ、ＣＡＡからなる群より選択されるスペーサーアミノ酸配列を含み得、ここでＡはアラニン残基である。スペーサーアミノ酸配列はさらに、選択されたターゲティング部分への結合の決定のためのマーカーとして機能を果たすことができる。特に好ましい実施形態では、結合部分は、１個または複数のβアミノ酸（例えば、ＫＡＡおよびＣＡＡの場合、アラニン残基はβアミノ酸であり得る）を含む。
【０２３７】
一実施形態では、結合部分はアジド部分である。
【０２３８】
別の実施形態では、結合部分（例えば、アジド部分）は、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に結合される。
【０２３９】
リンカー部分（ＬＭ）の１つまたは複数の酵素切断部位は、カテプシン切断部位、例えば、ＧＦＬＧＦＫ（例えば、Ｏｒｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，２０１１，４１（２）：４６９−４８３を参照）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断部位で、この例としてはＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２、例えば、ＧＰＬＧＩＡＧＱ、ＰＡＧＬＬＧＣおよびＧＰＬＧＬＷＡＱ（例えば、Ｋｒａｔｚ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００１，１１：２００１−２００６を参照）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）切断部位、例えば、ＫＧＩＳＳＱＹおよびＳＳＫＹＱＬ（Ｋｕｍａｒ  ＳＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，２００８，１６（６）：２７６４−２７６８；Ｎｉｅｍｅｌａ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，２００２，４８（８）：１２５７−１２６４）、およびグルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼなどの細胞内酵素により切断可能なジスルフィド架橋（−Ｓ−Ｓ−）からなる群から選択され得る。これらの全ての使用は明示的に本明細書に包含される。
【０２４０】
従って、リンカー部分（ＬＭ）は、特に、ＧＦＬＧＦＫ、ＫＡＡＧＦＬＧＦＫ、ＣＡＡＧＦＬＧＦＫ、ＧＰＬＧＩＡＧＱ、ＫＡＡＧＰＬＧＩＡＧＱ、ＣＡＡＧＰＬＧＧＩＡＧＱ、ＰＡＧＬＬＧＣ、ＫＡＡＰＡＧＬＬＧＣ、ＣＡＡＰＡＧＬＬＧＣ、ＧＰＬＧＬＷＡＱ、ＫＡＡＧＰＬＧＬＷＡＱおよびＣＡＡＧＰＬＧＬＷＡＱからなる群から選択されるように、例えば、本明細書に記載の結合部分および／または酵素切断部位の種々の組み合わせを含むか、またはそれらからなる。少なくともいくつかの実施形態では、本明細書に記載のリンカー部分（ＬＭ）は、２つ以上の酵素切断部位を含み得る。
【０２４１】
重要なことに、本発明者らは、本明細書で記載のペプチドがＭＭＰ９により切断されないということを示した（データは示さず）。
【０２４２】
本明細書に記載の実施形態に従って、リンカー部分（ＬＭ）により一緒に結合される１対のＬｃｋ活性化剤の例は、下記のスキームＩＩで示される。
【化５】
2021523945.tif 000010
【０２４３】
スキームＩＩで示されるダイマーＬｃｋ活性化剤は、架橋部分により一緒に結合されたＬｃｋ活性化剤Ｌｃｋ１およびＬｃｋ２を含む。この例では、架橋部分は、３個のグリシン（Ｇ）アミノ酸残基（Ｇｌｙ３）の配列にグルタミン酸（Ｇｌｕ）部分を介して結合される酵素切断部位Ｘ１およびＸ２（例えば、ＰＳＡおよび／またはＭＭＰアミノ酸切断配列）を含み、Ｇｌｙ３は以下でさらに記述されるようにソルターゼＡ媒介ライゲーションによりターゲティング部分にＬｃｋ活性化剤を結合するための結合部分を形成する。酵素切断部位Ｘ１およびＸ２は、相互に異なっていても同じでもよい。Ｌｃｋ１およびＬｃｋ２は、例えば、それぞれ独立に上記式ＩＩＩ〜ＶＩＩＩのいずれか１つから選択されるＬｃｋ活性化剤であり得、架橋部分は、例えば、ダイマーのそれぞれのＬｃｋ活性化剤の、それぞれのポリカチオン性ペプチド（ＰＰ）、強化部分または他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）、または化合物（Ｃ）の末端に結合される。
【０２４４】
Ｇｌｙ３以外の結合部分も、本発明の実施形態で採用できる。例えば、結合部分は、３〜５グリシンアミノ酸残基、別のアミノ酸配列（例えば、３〜５アミノ酸長さ）、または他の好適なリンカー鎖の配列を含み得る。
【０２４５】
さらにその他の実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤、ダイマーまたはＬｃｋ活性化剤の他のマルチマーは、デンドリマーまたは他の生理学的に許容可能な足場／フレームワークにより、１つまたは複数の他の個別のＬｃｋ活性化剤またはＬｃｋ活性化剤マルチマーに結合され得る。
【０２４６】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の細胞中への侵入は、外側細胞膜を横切る核酸を介することを含む、いくつかの機序を介して起こり得、または、例えば、カテプシン酵素に富むリソソームを介することを含む、受容体媒介輸送または内部移行により起こり得る。
【０２４７】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の標的化のためのターゲティング部分は、標的細胞の細胞表面または組織環境中で発現される受容体または他の分子に結合する、リガンド、結合ペプチド、抗体またはその結合フラグメント（ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２フラグメントなど）、または単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）などのターゲティング部分の使用により実現され得る。抗体ターゲティング部分の例としては、抗ＣＤ３および抗ＣＤ４抗体（例えば、ＴＲＸ１，Ｎｇ  ＣＨ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１０９５−００５−８８１４−３）、およびＢＴ−０６１（Ｈｕｍｂｌｅｔ−Ｂａｒｏｎ  Ｓ  ＆  Ｂａｒｏｎ  Ｆ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｉｃｂ．２０１４．１２０）が挙げられる。利用され得るターゲティング部分はまた、特に、トランスフェリン、ビオチン、葉酸、およびヒアルロン酸を含み得る。例えば、Ｏｊｉｍａ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，２０１２，４（１）：３３−５０を参照。この文献の全内容は、相互参照により本明細書に組み込まれる。
【０２４８】
ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１）は、例えば、Ｔ細胞中に侵入するために、ウィルスエンベロープタンパク質ｇｐ１２０を介してＴリンパ球上に発現されるＣＤ４に結合する。ＣＤ４への結合後にｇｐ１２０タンパク質で生じる立体構造変化は、ウィルスを、リンパ球の共受容体ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４に結合させ、ウィルスと細胞の融合を可能にする。ＣＤ４、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４は、本発明により治療薬をリンパ球に送達するために、本発明の実施形態により標的化され得る細胞表面受容体の例である。本発明により標的化され得る標的細胞上の細胞表面受容体または表面発現分子の他の例としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８およびＣＤ４５（例えば、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢおよびＣＤ４５ＲＯアイソフォーム）が挙げられる。
【０２４９】
本発明の実施形態により治療薬の標的細胞への送達のために標的化され得るさらなる分子の例としては、インテグリンファミリーおよびそのサブユニットのメンバー、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）ホルモン受容体、神経伝達物質受容体、受容体チロシンキナーゼ受容体、Ｇ−タンパク質結合受容体、Ｇタンパク質結合受容体、成長因子受容体、膜貫通型プロテアーゼ受容体、細胞表面プロテオグリカン、ＣＤ４４、ＣＤ５５、Ｆｃｙ受容体、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ヒアルロネート受容体、トランスフェリン受容体、葉酸受容体、前立腺特異的膜抗原、血管細胞接着分子、フィブロネクチン、コラーゲンビトロネクチンおよびラミニンなどのマトリックスタンパク質が挙げられる。
【０２５０】
化学療法剤イバリズマブ（以前はＴＮＸ−３５５）（Ｂｒｕｎｏ  ＣＪ  ａｎｄ  Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＪＭ，Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１０，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｊａｃ／ｄｋｑ２６１）はＣＤ４を標的とし、本発明による癌または他の疾患または状態の治療のための他の薬物のように、本発明によるＬｃｋ活性化剤の標的細胞への送達のためのターゲティング部分として用いられ得る。同様に、ＣＤ４（例えば、ＯＫＴ４）またはＣＸＣＲ４に結合する抗体またはその抗体結合フラグメントも利用され得る。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、Ｌｃｋ活性化剤は、治療標的抗体と一緒に別々に、または抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）のように標的化抗体に結合されて投与され得る。例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞上に発現された、これらの受容体のＴ細胞活性化およびＩＬ−２産生の抑制効果を阻害するプログラム死リガンド１（ＰＤ−１）受容体または細胞傷害性Ｔリンパ球結合タンパク質４（ＣＴＬＡ４）受容体に対する抗体、例えば、トレメリムマブ／イピリムマブ（ヤーボイ）またはＭＳＢ００１０７１８Ｃは、それぞれ、このような抗体により標的化される黒色腫、腎臓癌および肺癌などの癌の治療における使用のために、本明細書で記載のＬｃｋ活性化剤に結合されてＡＤＣを形成し得る（Ｏｔｔ  ＰＡ，ＯｎｃＬｉｖｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２１，２０１４）。ＣＴＬＡ−４受容体の、Ｔ細胞の抑制剤から活性化剤への変換はまたこれまで、Ｌｃｋ活性化を介してその効果を媒介する二重特異的タンデム型ｓｃＦｖリガンドを用いて説明されている（Ｍａｄｒｅｎａｓ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，１７２：５９４８−５９５６およびＴｅｆｔ  ＷＡ  ｅｔ  ａｌ，ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００９；ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１７２−１０−２３，Ｔｅｆｔ  ＷＡ  ｅｔ  ａｌ，ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００９；ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１７２−１０−２３）。従って、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤へのｓｃＦｖの結合は、本発明の実施形態によるＴ細胞活性化をさらに促進し得る。さらなる例として、当業者に既知の二重特異的抗体を用いて、例えば、本明細書に記載のＰＥＧ結合Ｌｃｋ活性化剤を、例えば、ＣＤ２８などの細胞表面受容体に対する抗体に連結させ得る。
【０２５２】
本発明の実施形態でターゲティング部分として使用される抗体またはその結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖフラグメントなど）は、望ましくは、選択標的分子に対し特異的であり、そのため通常、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントを含む。モノクローナル抗体およびその結合フラグメントの産生は、よく知られている。キメラおよびヒト化モノクローナル抗体、およびその結合フラグメントが、特に好ましい。キメラ抗体は、例えば、標的分子に特異的な非ヒト抗体のＦｃ領域を、ヒト抗体のＦｃ領域で置換することによりもたらされ得る。ヒト化抗体は、非ヒト（例えば、マウス、ラット、ヒツジまたはヤギ）モノクローナル抗体のＦａｂフラグメントの可変領域中の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、同様に当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術を用いてヒト抗体骨格中に継ぎ合わせることにより得ることができる。
【０２５３】
上記のように、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）およびそのマルチマー型、例えば、二価ｓｃＦｖ（例えば、タンデム型ｓｃＦｖおよびディアボディ）、三価ｓｃＦｖ（トリアボディ）および四価ｓｃＦｖ（テトラボディ）もまた、本発明の実施形態のターゲティング部分として利用し得、ディアボディの使用が特に好ましい。本発明の実施形態で有用なｓｃＦｖは、２つの可能な配向ＶＬ−ＡＡＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＡＡＬ−ＶＬのいずれかで、アミノ酸リンカー配列（ＡＡＬ）により一緒に結合されたヒト化または天然抗体重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）を含み得る。リンカー配列の長さは、モノマーｓｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディまたはテトラボディのいずれが形成されるべきかに応じて、変わり得る。ｓｃＦｖのリンカー配列（ＡＡＬ）は通常、約５〜約３０アミノ酸の範囲の長さ、より一般的には、５〜２５アミノ酸の範囲の長さである。ディアボディの形成のために、リンカー配列は通常、約５アミノ酸長であり、それにより、ｓｃＦｖが二量体化される。トリアボディに対しては、リンカー配列は、わずか１または２アミノ酸長さであり得る。インビボ画像処理および治療法で使用するための、ディアボディを含むｓｃＦｖの設計は、例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，Ｆｅｂ  １；２４８（１−２）：４７−６６，Ｗｏｒｎ  Ａ．ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１，３０５，９８９−１０１０、およびＡｈｍｅｄ  Ｚ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０１２，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ９８０２５０，Ｈｉｎｄａｗｉ  Ｐｕｂ．Ｃｏｒｐ．に記載され、これらの全ての内容は、相互参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５４】
ｓｃＦｖがターゲティング部分として採用される場合、本明細書に記載のそれぞれのＬｃｋ活性化剤は、本明細書に記載の１つまたは複数の酵素切断部位を含むリンカー部分を介してそのＶＨおよび／またはＶＬ鎖の遊離末端に結合され得る。即ち、本明細書に記載の２つのＬｃｋ活性化剤が、ｓｃＦｖに結合され得、Ｌｃｋ活性化剤の１つは、ＶＨ鎖の遊離末端に結合され、もう一方は、ＶＬ鎖の遊離末端に結合され、ここでＬｃｋ活性化剤は、同じであっても、または異なっていてもよい。
【０２５５】
同様に、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、任意の好適な方式で上述の１つまたは複数の酵素切断部位を含むリンカー部分を介して、抗体、その結合フラグメント、または他のターゲティング部分に結合されてよい。
【０２５６】
さらに他の実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、組換えＤＮＡ技術を利用して、ターゲティング部分それ自体（例えば、抗体、抗体結合フラグメント、またはｓｃＦｖ）中に組み込まれて提供され得る。このような実施形態では、Ｌｃｋ活性化剤は、Ｌｃｋ活性化剤のそれぞれの末端で、酵素切断部位（例えば、カテプシン切断部位）を含むそれぞれの結合部分によりターゲティング部分に結合されてよく、これは、各末端のＬｃｋ活性化剤をターゲティング部分に連結する。このような実施形態では、Ｌｃｋ活性化剤は、ターゲティング部分の結合または標的化機能を損なわない、かつ使用される酵素切断部位の切断を可能にする、ターゲティング部分中の任意の好適な位置で組み込まれ得る。例えば、本明細書に記載のそれぞれのＬｃｋ活性化剤は、ｓｃＦｖの結合または標的化機能を保持しながら上記の方式でｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ鎖の片方または両方に挿入され得、例えば、Ｌｃｋ活性化剤は、ＭＭＰおよびＰＳＡ切断配列から選択される酵素切断配列に隣接される。β６インテグリンサブユニットを特異的に標的とし、かつ他のαＶ結合βインテグリンサブユニットを標的にしない１７マーペプチド（すなわち、ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡ）が、例えば、癌胎児抗原（ＣＥＡ）と反応性のマウスｓｃＦｖである、ＭＦＥ−２３のＣＤＲ  Ｈ３ループ中に挿入されている。
【０２５７】
オンターゲット組織または標的細胞上の異なる部位を標的化するために、または標的細胞に免疫エフェクター細胞を動員するための手段として、２つ以上のターゲティング部分を用いる二重特異的標的化プロトコルは、本発明により明示的に包含される（例えば、二重特異的抗体標的化は、Ｗｅｉｄｌｅ  ＵＨ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１３，１０：１−１８により最近概説された）。即ち、本明細書に記載の単一Ｌｃｋ活性化剤は、異なる標的分子を相互に標的とする２つの異なるターゲティング部分を組み込み得る。一例として、ＨＥＲ２およびＣＤ４などの２個の異なる標的分子を標的にするための二重特異的タンデム型ｂｉ−ｓｃＦｖが、例えば、それぞれの対のＶＨおよびＶＬ鎖の間の１つまたは複数の酵素（例えば、ＭＭＰおよび／またはＰＳＡ）の切断配列を用いて得られる。
【０２５８】
本明細書に記載のポリカチオン性ペプチドおよび任意選択で、強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）を含み、ターゲティング部分を含有または非含有で、および／または本明細書に記載の結合部分を含むキメラタンパク質（すなわち、融合タンパク質）の形のＬｃｋ活性化剤は、本発明の方法でこれらの使用のように、明示的に包含される。
【０２５９】
例えば、細胞免疫応答が加齢と共に低下することはよく知られている。特に、リンパ球増殖は、高齢患者由来のＴリンパ球中で顕著に低下すること、およびこれはＬｃｋ活性の大きな低下に関連していることが示されている（Ｆｕｌｏｐ  Ｔ  Ｊｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ，１９９９，３４（２）：１９７−２１６）。従って、特異的Ｌｃｋ活性化剤の予防薬投与は、年配者での消耗性感染症の発生または重症度の予防または低減において特に有益であり得る。さらに、適切なＴ細胞免疫応答の減少は、癌化学療法の副作用であり、複数のチロシンキナーゼを標的にする癌療法に付随する免疫抑制を克服するためのＬｃｋ活性化剤コンビナトリアル使用の必要性を強調する。抗癌剤に対する薬剤耐性ならびに急性白血病および非ホジキンリンパ腫での細胞周期進行の抑制の克服におけるＬｃｋ活性化の潜在的役割に加えて、Ｌｃｋ活性化は、多様な病原性感染（ウィルス、細菌、真菌、原生動物および寄生虫）ならびにＬｃｋ欠損に関連する種々の障害の管理においても重要である。
【０２６０】
免疫系のＴリンパ球は、胸腺で産生され、循環および皮膚、リンパ節、ならびに口内、肺気道、消化管、および膣などの粘膜組織などの特定の組織中に存在できる。上皮内Ｔ細胞は、恒常性および悪性病変からの保護で重要な役割を果たす。皮膚、消化管、肺などの上皮組織は、常時の環境暴露下にあり、微生物の侵入に対し第一線の防御を形成する。マウスでの上皮内Ｔ細胞（Ｌｃｋを発現することが知られている）の非存在は、腫瘍拒絶における欠陥を生じる。特に、上皮内のこのようなＴ細胞の存在は、黒色腫を含む上皮悪性腫瘍の下方制御に必要である（Ｇｉｒａｒｄｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９４（５５４２）：６０５−９；Ｓｃｈｏｎ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２００３，１２１：９５１−９６２）。胸腺内でのこのような組織特異的Ｔ細胞の成熟は、Ｌｃｋ依存性であり、この細胞は、病原性感染およびそれらの病理学的影響（例えば、マラリア）からの保護に寄与する（Ｉｎｏｕｅ  Ｓ−Ｉ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，２０１２，１０９：１２１２９−１２１３４）。さらに、ガンマ−デルタ（γ／δ）Ｔ細胞は、原生動物、寄生生物、細菌およびウィルスによる感染に対する免疫応答で重要な役割を果たす。このようなＴ細胞の組織特異的局在化は、皮膚での免疫監視のための要件である（Ｊａｍｉｅｓｏｎ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，９：２６４０−２６５１；Ｓｃｈｏｎ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２００３，１２１：９５１−９６２）。
【０２６１】
いくつかのＴ細胞株で、活性化Ｌｃｋタンパク質は、抗原刺激の非存在下で、Ｔ細胞活性化の証明である、インターロイキン２（ＩＬ−２）産生を刺激することが示された（Ｌｕｏ  Ｋ，ａｎｄ  Ｓｅｆｔｏｎ  ＢＭ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９９２，１２（１０）：４７２４−４７３２）。
【０２６２】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、γ／δＴ細胞とは別のＴ細胞のサブセットであり、癌に対する免疫応答の抑制で重要な役割を果たす。Ｔｒｅｇは、末梢性ＣＤ４＋Ｔ細胞プールの５〜１０％を構成し、ＩＬ−２Ｒαおよび転写因子ＦＯＸＰ３の構成的発現により認識される。
【０２６３】
腫瘍浸潤リンパ球内のＦＯＸＰ３  Ｔｒｅｇ細胞の存在は、様々な種類のヒト癌での予後不良と相関し、ＩＬ−２１はＴ細胞応答を促進するその能力により、抗腫瘍免疫を促進し免疫系に対するＴｒｅｇ媒介抑制性効果の影響を弱めることが知られている（Ｋａｎｎａｐｐａｎ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１７，６６（５）：６３７−６４５）。
【０２６４】
本発明者らは、本発明のＬｃｋ活性化ポリペプチドが、細胞からのＩＬ−２１分泌を増大させることを示した（例えば、図２８）。従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドは、エクスビボまたはインビボでＴｒｅｇの数を低減する潜在力を有する。実際に、本発明者らは、本明細書で記載のポリペプチドを活性化するＬｃｋがインビトロでＴｒｅｇを減らすことを示した。
【０２６５】
重要なことに、本発明者らは意外にも、本明細書で記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドが選択的にＬｃｋを活性化し、他のＳｒｃファミリーキナーゼを活性化しないことを実証した。例えば、図２は、Ｂｌｋ、ｃＳｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｈｃｋ、ＬｙｎおよびＹｅｓが、本明細書で記載のＬｃｋを活性するためのペプチドにより活性化されないことを示している。
【０２６６】
従って、一実施形態では、本発明は、Ｌｃｋキナーゼの活性を高める方法を提供し、方法は、Ｌｃｋキナーゼを、本明細書に記載のペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０２６７】
一実施形態では、インビボでのＬｃｋの活性を高めるために、ペプチドまたはペプチドを含む医薬組成物が対象に投与される。
【０２６８】
本明細書で使用される場合、「活性を高める」および「を活性化する」という用語は通常、ホスホトランスフェラーゼ活性などのキナーゼの活性の増加（例えば、ＬｃｋキナーゼのＹ３９４リン酸化を増やすこと）を指す。例えば、キナーゼの酵素活性の活性化は、活性化剤の非存在下でのキナーゼ活性に比べて、活性化剤の存在下での同じキナーゼ活性の任意の増加を意味する。用語プロテインキナーゼを活性化するは、自己リン酸化の増加、活性化時に、１つの細胞内位置からベルの位置へ移動の増加、キナーゼを所定の位置に固定する１個または複数のタンパク質への結合またはそれからの解放の増加、またはプロテインキナーゼの他の活性もしくは機能の増加も含む。この増加は、限定されないが、プロテインキナーゼと、プロテインキナーゼの結合相手との間に複合体が形成される確率を増大させること、またはその標的に以前に結合したキナーゼ活性の増大を含む任意の手段により引き起こされ得る。このような活性化は、インビボあるいはインビトロのいずれかで起こり得る。
【０２６９】
キナーゼの酵素活性は、当業者に既知の種々の方法、例えば、Ｐａｒｋｅｒ，Ｌａｗ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｋｉｎａｓｅ／ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｓｓａｙｓ，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ５（２）：７７−８８；Ｂａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ６（４）：２５５−６４）；Ｌｉｕ，Ｆ．，Ｘ．Ｈ．Ｍａ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ５  ａｎｄ  ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｂｙ  ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．”  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９８（２０）：１１０６２−８；Ｅｖａｎｓ，Ｄ．Ｂ．，Ｋ．Ｂ．Ｒａｎｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．“Ａ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ／Ｃｄｋ５  ｕｓｉｎｇ  ａ  ９６−ｗｅｌｌ  ｆｏｒｍａｔ．”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５０（２−３）：１５１−６１で開示の方法により監視できる。
【０２７０】
このような標準的方法を用いて、目的のキナーゼを含む試料を、放射性ＡＴＰおよびリン酸化の位置を与えるための適切な組成の合成ペプチド基質に適切な条件下で暴露する。ペプチドと新しく結合した放射性リン酸を次に、測定する。基質ペプチドに共有結合したビオチンなどの化学的部分を付加して、ストレプトアビジンコートビーズによる基質ペプチドの結合を可能にする。ビーズ結合ペプチドを単離し結合した放射能を測定できる、または好ましくは、基質ペプチドと結合した放射能を、シンチレーション近接アッセイに好適するビーズを用いて直接測定できる。
【０２７１】
ペプチド基質のリン酸化はまた、リン酸化部位特異的抗体の直接結合を介して、または競合リンペプチドからのリン酸化部位特異的抗体の移動を測定することにより、検出できる（例えば、Ｐａｒｋｅｒ，Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｋｉｎａｓｅ／ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｓｓａｙｓ，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ５（２）：７７−８８を参照）。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）または蛍光偏光法（ＦＰ）などの蛍光法を使用して、特定のリンペプチド−抗体複合体を検出できる。これらの方法は、それらが、結合種の単離に依存せず、むしろ、溶液中の特異的結合のために起こる蛍光の変化に依存する「ホモジニアス」検出法を採用するという利点を有する。
【０２７２】
リン酸化部位特異的抗体の作製方法は、当該技術分野において周知である。一実施形態では、Ｂｉｂｂらにより１９９９年１０月１５日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｔｈａｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｏｐａｍｉｎｅ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ」という名称の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、およびＢｉｂｂらにより２０００年１０月１３日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｔｈａｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｏｐａｍｉｎｅ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ」という名称の米国特許出願第０９／６８７，９５９号（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で開示される方法を使用して、リン酸化標的に対し特異性を有するリン酸化状態特異的抗体を作製する。
【０２７３】
ホスホセリン、ホスホトレオニン、またはフォスフォチロシンに対するリン酸化状態特異的抗体は、市販品として入手できる。これらの抗体は、一般にタンパク質がリン酸化されるかどうか、およびどの残基でリン酸化されるかを決定するのに有用である。このような抗体は、市販品入手源から入手できる（例えば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｓｉｇｍａ  ＲＢＩ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｕｐｓｔａｔｅ  ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＺｙｍｅｄを含む、市販品入手源のリストについては、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  １５［４］：２４，Ｆｅｂ．１９，２００１を参照）。
【０２７４】
蛍光共鳴エネルギー転移、またはＦＲＥＴは、高分子の特異的結合を検出できるホモジニアスアッセイに広く使用されている。ＦＲＥＴは、放射光ではなく、励起された「ドナー」蛍光分子（フルオロフォア）が近くの「アクセプター」フルオロフォアへそれらのエネルギーを伝達する能力に依存する。従って、２つのフルオロフォアが基質標的に結合することにより空間で１つにされると、通常のドナー波長で放出される蛍光は減少し、アクセプターフルオロフォアにより放出される蛍光は増加する。ドナー蛍光の減少またはアクセプター蛍光の増加のいずれかを用いて、結合イベントを測定できる。
【０２７５】
キナーゼ活性を評価するための好適な方法は、Ｂａｄｅｒら（２００１，Ａ  ｃＧＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ６（４）：２５５−６４）で開示の方法を含み、例えば、ホスホジエステラーゼ、キナーゼまたはタンパク質ホスファターゼの活性を決定するために用いられる。Ｂａｄｅｒらは、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（「ＦＲＥＴ」）をベースにした高スループットスクリーニングのためのｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼアッセイを開示し、これは、当業者なら分かるように、ホスホジエステラーゼまたはタンパク質ホスファターゼのアッセイに適応され得る。目的のキナーゼを含む試料が、キナーゼ特異的リン酸化部位およびアミノ末端ビオチン部分を有するＡＴＰおよび合成ペプチド基質に暴露される。リン酸化されたペプチドは、アロフィコシアニン標識ストレプトアビジン、リンペプチド特異的抗体およびユーロピウムキレート標識二次抗体を用いて検出される。リン酸化基質分子へのストレプトアビジンおよびリン酸化部位特異的抗体の同時結合は、蛍光共鳴エネルギー転移が起こるためのアロフィコシアニンフルオロフォア「アクセプター」の十分近くに二次抗体上のユーロピウムキレート「ドナー」を運び、蛍光共鳴エネルギー転移は６１５ｎｍ波長でのユーロピウム放射の減少として、および６６５ｎｍ波長でのアロフィコシアニン放射の増加として測定できる。ユーロピウム−アロフィコシアニンのドナー−アクセプター対は、励起ユーロピウムの長い蛍光寿命を利用するためによく使われ、従って、シグナルは、時間分解される。
【０２７６】
クマリンとフルオレセインイソチオシアネートなどの他のフルオロフォア対も使用できる。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に関与できるこのような分子対は、ＦＲＥＴ対と呼ばれる。エネルギー転移が起こるためには、ドナーおよびアクセプター分子は通常、最大で７０〜１００Åの近接状態でなければならない（Ｃｌｅｇｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１１：３５３−３８８；Ｓｅｌｖｉｎ，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４６：３００−３３４）。エネルギー転移の効率は、ドナーとアクセプター分子の間の距離と共に急速に低下する。ＦＲＥＴでよく使用される分子としては、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、および５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）が挙げられる。フルオロフォアがドナーであるかアクセプターであるかは、その励起および発光スペクトル、およびそれと対形成するフルオロフォアにより決まる。例えば、ＦＡＭは、４８８ｎｍの波長の光により最も効率的に励起され、５００〜６５０ｎｍのスペクトルと、５２５ｎｍの最大発光を有する光を放出する。ＦＡＭは、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、およびＲＯＸ（これらの全ては、５１４ｎｍで最大励起を有する）で使用するのに好適なドナーフルオロフォアである。
【０２７７】
蛍光偏光測定もまた、ホスホジエステラーゼ、プロテインキナーゼまたはホスファターゼの活性の測定に使用できる（例えば、Ｐａｒｋｅｒ，Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｋｉｎａｓｅ／ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｓｓａｙｓ，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ５（２）：７７−８８；Ｔｕｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９９：４５−５３を参照）。
【０２７８】
小さい蛍光リンペプチドへの大きな特異的抗体の結合は、そのタンブリング速度を遅らせ、蛍光偏光シグナルを高める。従って、蛍光偏光は、結合した蛍光のリンペプチドの量に比例する。このアッセイは、競合モードで使用でき、このモードでは、固定濃度の蛍光のペプチドおよび抗体が生体試料に加えられ、非蛍光リン酸化タンパク質またはリンペプチドの存在が、シグナルの減少として記録される。それは、直接結合モードでも使用でき、このモードでは、リン酸付加（例えば、キナーゼによる）または除去（例えば、ホスファターゼによる）が抗体結合を、従って、偏光シグナルを調節する。特定の実施形態では、蛍光偏光アッセイは、Ｔｕｒｅｋら（２００１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９９：４５−５３）の方法を用いて実施され、この場合、生成物特異的抗リン酸化ペプチド特異的（例えば、抗リン酸化セリン）抗体が用いられる。
【０２７９】
キナーゼ活性を評価するための他の好適な方法としては、リン酸化のための細胞ベースアッセイが挙げられる。例えば、タンパク質リン酸化に基づくシグナル伝達は、例えば、Ｓａｔｏら（２００２，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０（３）：２８７−９４）で開示されたものなどの方法を用いて、蛍光指示薬を使い単一生細胞中で、インビボで可視化される。このようなセンサーは、フレキシブルリンカーで分離された、２個の蛍光タンパク質分子からなる。リンカーペプチドは、リン酸化部位およびリン酸化タンパク質認識要素を含む。リンカーのリン酸化は、立体構造変化を生じ、これが、２個の蛍光タンパク質を近接距離に動かし、ＦＲＥＴを生じさせ、系の蛍光出力を変える。
【０２８０】
Ｌｃｋ遺伝子異常および疾患
多数のヒト疾患が、Ｌｃｋ座位の異常により引き起こされ、一例は、Ｔ細胞急性リンパ性白血病である（Ｃｏｎｖｅｒｓｅ  ＰＪ，２００３  Ｓｅｐｔ  ２４．Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ；Ｌｃｋ．Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ．，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｄｉｓｐｏｍｉｍ．ｃｇｉ？ｉｄ＝１５３３９０．ｉｎ）。加えて、ＡＭＬ関連のほとんどのＤＮＡ変化は、誕生前に遺伝により受け継がれるのではなく、人の寿命の間に発生する。いくつかのこれらの後天性変化は、放射線または発癌化学薬品などの外的原因を有し得るが、ほとんどの事例では、それらが起こる理由は分かっていない（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｌｅｕｋｅｍｉａ−ａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄａｍｌ／ｄｅｔａｉｌｅｄｇｕｉｄｅ／ｌｅｕｋｅｍｉａ−ａｃｕｔｅ−ｍｙｅｌｏｉｄ−ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ−ｗｈａｔ−ｃａｕｓｅｓ）。
【０２８１】
免疫応答におけるＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）軸
慢性感染症および癌では、Ｔ細胞は持続性抗原および／または炎症性シグナルに暴露される。このシナリオは多くの場合、細胞機能の低下：「疲弊」と呼ばれる状態に関連する（Ｗｈｅｒｒｙ  ＥＪ  ＆  Ｋｕｒａｃｈｉ  Ｍ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１５，１５：４８６−４９９）。疲弊Ｔ細胞は、強固なエフェクター機能を失い、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＣＤ１６０、または２Ｂ４などのシグナル伝達チェックポイントで複数の抑制性受容体を発現し、かつ変化した転写プログラムにより規定される。しかし、疲弊Ｔ細胞の再活性化は免疫を再活性化でき、これはＨＩＶ−１、Ｃ型肝炎ウィルス、およびなどの持続性感染症、および癌に対し、新しい治療標的を提供する（Ｗｈｅｒｒｙ  ＆  Ｋｕｒａｃｈｉ、前出参照）。
【０２８２】
初期の活性化時に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、爆発的にＩＬ−２を産生するが、その後、一過性の不応期に入り、その間、いくつかのエフェクター機能を維持するがＩＬ−２を産生する能力を失う。この期間中、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それらの増殖の継続および完全な機能的能力の回復のため、ＣＤ４＋Ｔ細胞により供給される外因性ＩＬ−２に依存する（Ｃｏｘ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１，３２（４）：１８０−１８６で概説される）。ＩＬ−２は、ＣＤ２４（ＩＬ−２Ｒα）、ＣＤ１２２（ＩＬ−２Ｒβ）およびガンマサブユニットからなるトリマー受容体を介してシグナル伝達を行う。ＣＤ２５は、構成的に発現されないが、ＩＬ−１２およびＩＬ−２それ自体などの炎症性サイトカインへの暴露後に発現上昇される。この炎症性サイトカインは、ＣＤ２５発現の量と期間を調節し、これは次に、応答細胞の能力を制御してＩＬ−２依存性シグナルを受信し、それにより、Ｔ細胞のエフェクターおよび記憶集団（ｍｅｍｏｒｙ  ｐｏｏｌ）の形成に影響を与える（上記Coxらへ参照）。
【０２８３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２の生来の産生細胞であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞と協働して応答の初期拡大ならびに耐久性のある防御二次反応を誘発できる記憶細胞形成を促進する。重要なことに、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２の分泌は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に応答することによりＣＤ２５発現を上方制御し、また、ＣＤ２５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増やすＩＬ−２源も提供する（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ，ｖｉｄｅ  ｓｕｐｒａ，Ｏｂａｒ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，２０１０，１０７（１）：１９３−１９８）。さらに、ＩＬ−２は、外来性の刺激の非存在下でＣＤ２５陰性Ｔリンパ球上のＩＬ−２受容体のアルファ鎖の用量依存性発現をもたらすことが示された（Ｓｅｒｅｔｉ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０００，９７（３）：２６６−７６）。従って、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５発現の非存在は、病原性特異的応答の拡大期を制限する。従って、ＣＤ２５などのサイトカイン受容体発現の調節は、エフェクター細胞の生成における律速段階になる可能性が高く、ＣＤ２５のより高い発現により細胞がより強力なＩＬ−２シグナルを受けることを可能にする（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。
【０２８４】
慢性敗血症および癌に対して応答するエフェクターおよび記憶細胞の調節におけるＣＤ２５発現の重要性に加えて、ＣＤ２５発現ＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、老齢期の効力の高い記憶細胞であることが明らかになり、高齢者でのこれらの細胞の蓄積は、老齢期の未感作Ｔ細胞の非存在下で、インタクト免疫応答性の前提条件であるように見える（Ｈｅｒｎｄｌｅｒ−Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００５，１７５：１５６６−１５７４）。この知見は、高齢者集団における免疫コンピテントＣＤ８＋ＣＤ２５＋記憶Ｔ細胞の長期生存の支援を目的とする新規ワクチン接種手法の提案をもたらした（Ｈｅｒｎｄｌｅｒ−Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。
【０２８５】
本発明者らは、本明細書で記載のペプチドが、ヒトＰＢＭＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞（実施例１５、図１７）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（実施例２８、図２５）上のＩＬ−１２ＲＢ２発現を高めることを示した。従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを、本明細書で記載のＩＬ−１２ＲおよびＩＬ−１２の生理学的効果を強化するために使用できる。
【０２８６】
従って、一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団からのＩＬ−１２分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０２８７】
一実施形態では、細胞または細胞集団からのＩＬ−１２分泌のレベルは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団からのＩＬ−１２分泌レベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）からのＩＬ−１２分泌のレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０２８８】
別の実施形態では、本発明は、細胞上または細胞集団中のＩＬ−１２Ｒ発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０２８９】
一実施形態では、細胞または細胞集団のＩＬ−１２Ｒ発現レベルは、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団のＩＬ−１２Ｒ発現のレベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）のＩＬ−１２Ｒのレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０２９０】
一実施形態では、ＩＬ−１２Ｒは、ＩＬ−１２ＲＢ１および／またはＩＬ−１２ＲＢ２である。
【０２９１】
別の実施形態では、本発明は、細胞のＩＬ−１２応答性を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０２９２】
一実施形態では、ＩＬ−１２に対する細胞または細胞集団の応答性のレベルは、ＩＬ−１２に対する本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団の応答性のレベルがＩＬ−１２に対する本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）の応答性のレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０２９３】
好ましい実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。
【０２９４】
上記で考察したように、本明細書記載の方法は、インビボで（例えば、対象中で）またはインビトロのいずれかで（例えば、エクスビボで）、細胞または細胞集団に対し実施できる。
【０２９５】
慢性ウィルス感染症または担癌状態中に、Ｔ細胞記憶形成および機能は、最終的に宿主保護を付与する能力に影響を及ぼす、応答抗原特異的Ｔ細胞のエフェクター機能および増殖能力の段階的障害に起因して、かなり変化するようになる（Ｊｉｎ  Ｈ−Ｔ  ｅｔ  ａｌ，ＢＭＢ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１１，４４（４）：２１７−２３１）。腫瘍環境では、ＣＤ８＋腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）は、低レベルのＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）発現を示し、従って、ＩＬ−２シグナル伝達に対し不応性であり、それらが増殖、エフェクターサイトカインの産生および機能的記憶細胞への分化ができないことを示す（Ｍｕｍｐｒｅｃｈｔ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４：１５２８−１５３６）。例えば、ＣＭＬ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、レトロウィルス誘導マウスＣＭＬモデルにおけるＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−２などのエフェクターサイトカインの産生低下を示す（Ｍｕｍｐｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。
【０２９６】
ＣＤ２５発現は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性と正に相関する。本発明者らは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）が、ルイス肺癌マウスの脾細胞中のＮＫ細胞上のＣＤ２５の相対発現も高めることを示した（データは示されていない)。
【０２９７】
従って、一態様では、本発明は、細胞傷害性細胞機能を高める方法を提供し、方法は、細胞傷害性細胞または細胞傷害性細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０２９８】
一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞の疲弊を低減する方法を提供し、方法は、Ｔ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０２９９】
用語「疲弊」は、多くの慢性感染症および癌の間に発生する持続的ＴＣＲシグナル伝達から生じるＴ細胞機能不全の状態としてのＴ細胞疲弊を指す。これは、アネルギーが不完全なまたは欠陥シグナル伝達により生じず、持続的シグナル伝達から生ずるという点で、アネルギーとは区別される。これは、不十分なエフェクター機能、抑制性受容体の持続性発現および機能的エフェクターまたは記憶Ｔ細胞とは異なる転写状態により定義される。疲弊は、感染症および腫瘍の最適制御を妨げる。疲弊は、外因性負の調節経路（例えば、免疫調節性サイトカイン）ならびに細胞内因性負の調節（共刺激）経路（ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、など）の両方から生じ得る。一実施形態では、疲弊の低減のレベルは、少なくとも１０％、あるいは、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％である。疲弊の測定方法は、当業者に既知である。
【０３００】
一実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞集団の疲弊のレベルは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させたＴ細胞またはＴ細胞集団のＴ細胞機能のレベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていないＴ細胞またはＴ細胞集団（例えば、対照のＴ細胞機能のレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、減少される。
【０３０１】
抗原および／または炎症が除去される急性感染症の設定では、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞は、二次感染症時に複数のサイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−２）を産生でき強いリコール応答を開始できる、機能的記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞にさらに分化する。対照的に、慢性感染症中は、抗原および炎症はエフェクター作動相後にも持続する。感染症が継続しＴ細胞刺激が継続するにつれて、Ｔ細胞は、階層的にエフェクター機能を失い、疲弊状態になる。通常、ＩＬ−２産生およびサイトカイン多機能性、ならびに高増殖能力などの機能は早期に失われる。この後に、ＩＦＮγおよびＴＮＦα産生の障害が続く。Ｔ細胞疲弊はまた、上に示した抑制性受容体の量と多様性の漸進的増大に付随して起こり、これは、それらのそれぞれのリガンドへの結合時に、機能障害性Ｔ細胞を生ずる。
【０３０２】
複数の抑制性受容体の同時発現がＴ細胞疲弊の主要な特徴であることを考慮して、これらの受容体の同時標的化は、Ｔ細胞疲弊の相乗的逆転をもたらすことが示された（Ｗｈｅｒｒｙ  ＆  Ｋｕｒａｃｈｉ、前出参照）。例えば、慢性ＬＣＭＶ感染症では、マウスにおけるＩＬ−１０およびプログラム死受容体１（ＰＤ−１）経路の同時遮断は、ＣＤ８＋Ｔ細胞疲弊の相乗的逆転に繋がり、ＩＬ−２治療とＰＤ−１経路の遮断の組み合わせを有し、ウィルス制御を強化する（上記のWherry & Kurachiを参照）。加えて、ＬＣＭＶマウスモデルでは、ＣＤ２５コンピテントＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＬＣＭＶでの感染後にＣＤ２５欠損Ｔ細胞よりも５倍大きい数に増殖することが示された（Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＭＦ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，３７：１５０２−１５１２）。さらに、これらの研究者は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導および維持がＣＤ２５シグナル伝達とほとんど無関係である急性／既往感染と対照的に、ＣＤ２５シグナル伝達は、持続性ウィルス感染症中のウィルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の維持に重要であることを示した。
【０３０３】
別の抑制性受容体であるＣＴＬＡ−４は、慢性ＨＩＶ感染症において、ＣＤ４＋Ｔ細胞中で選択的に発現上昇されるが、ＣＤ８＋Ｔ細胞中では発現上昇されず、これは、ウィルス抗原に応答してＩＬ−２を産生するＴ細胞の能力の低下と相関し、ＣＤ４＋Ｔ細胞機能不全と選択的に関連する可逆的調節経路を示している（Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＤＥ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００７，８：１２４６−１２５４）。Ｔ細胞機能の階層的損失は、抗原暴露、炎症および抑制分子（ＰＤ−１、ＣＤ１６０、２Ｂ４）の発現増大の継続時間と関連している（Ｗｈｅｒｒｙ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１１）。さらには、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカインの分泌が減少する（例えば、ＩＬ−２、ＴＮＦαおよびＩＦＮγ）。同時に、慢性的感染ＨＩＶ−１患者などの慢性敗血症の状態では、ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型は、チェックポイント分子（例えば、ＰＤ−１、ＣＤ１６０）の蓄積を明らかにする。
【０３０４】
Ｔ細胞疲弊は、慢性ＨＩＶ感染症の間の病原体除去失敗の重要な因子である可能性が高く、一部には、負の調節経路により調節される（Ｐｏｒｉｃｈｉｓ  Ｆ  ＆  Ｋａｕｆａｍｍ  ＤＥ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  ＨＩＶ  ＡＩＤＳ，２０１１，６（３）：１７４−１８０で概説される）。例えば、ＣＴＬＡ−４抑制性免疫調節受容体ならびにプログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）は、ＨＩＶ感染対象においてＣＤ４＋Ｔ細胞中で発現上昇されるが、ＣＤ８＋Ｔ細胞中では、発現上昇されない（Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＤＥ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，８：１２６４−１２５４）。これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞がウィルス抗原に応答してＩＬ−２を産生する能力がないことと相関する。ＨＩＶ患者由来のＴ細胞は、ＩＬ−２を産生する能力が障害され、リコール抗原に対する増殖性応答がＨＩＶ感染の早期に妨害されており、ＩＬ−２によりインビトロで回復できる（Ｆａｕｅｒ  ＡＳ  ＆  Ｐａｎｔｅｌｅｏ  Ｇ（Ｅｄｓ），Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＨＩＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−３−６４２−６０８６７−４，ｐｐ  ４１−４２）。
【０３０５】
従って、高レベルの抗原の場合でのＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の抑制は、ウィルス特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の前駆細胞頻度が制限される機序によるものであり得る（ＭｃＮｅｉｌ  ＡＣ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，２００１，９８：１３８７８−３８８３）。さらに、ＰＤ−Ｌ１遮断抗体によるＰＤ−１経路の遮断は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を増大させる（Ｐｏｒｉｃｈｉｓ  ＆  Ｋａｕｆｍａｎｎ、前出参照）。
【０３０６】
しかし、ＣＤ４＋Ｔ細胞のみが疲弊し、その後の抗原刺激に対し無効力になるのではなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞も同様である。ＨＩＶ感染症では、ＣＤ４＋Ｔ細胞の減少は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の疲弊の増加および疾患進行と関連し、ＣＤ８＋Ｔ細胞疲弊に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答における変化の影響は、大いに関連性がある（Ｗｈｅｒｒｙ  ＥＪ  ＆  Ｋｕｒａｃｈｉ  Ｍ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１５，１５：４８６−４９９）。疲弊したＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、高発現のＰＤ−１を有するが、一方、老化細胞は有しない（Ｗｈｅｒｒｙ  ＆  Ｋｕｒａｃｈｉで概説、前出参照）。さらに、ＩＬ−２治療とＰＤ−１媒介阻害経路の遮断の組み合わせは、疲弊したＣＤ８＋Ｔ細胞を再活性化しウィルス量を低減するための顕著な相乗効果を有することが示された（Ｗｈｅｒｒｙ  ＆  Ｋｕｒａｃｈｉ、前出参照）。ＨＩＶ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のエクスビボ増殖は、ＩＬ−２に大きく依存する（Ｌｉｃｈｔｅｒｆｉｅｌｄ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，ＪＥＭ，２００４，２００：７０１−７１２）。まとめると、ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞機能の低下は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞ヘルパー機能の増強により、慢性感染症において回復され得る。
【０３０７】
Ｔ細胞疲弊の別の表現型マーカーは、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴｉｍ−３発現であり、それはＴｉｍ−３およびＰＤ−１が慢性ウィルス感染症におけるＣＤ８  Ｔ細胞機能不全を回復する最も効果的な手段である可能性があるという提案に繋がった（Ｊｉｎ  ＨＴ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，２０１０，１０７（３３）：１４７３３−８）。さらに、最近の文献は、ＣＤ８＋Ｔ細胞疲弊におけるＴｉｍ−３との関連でＬｃｋの潜在的重要性を強調する。例えば、Ｔｉｍ−３の生理学的リガンドであるガレクチン−９は、受容体ホスファターゼＣＤ４５に結合し、これは、高レベルで存在する場合には、Ｌｃｋ上のＹ３９４を脱リン酸化し、それにより、Ｌｃｋ活性を低減させる（Ｃｌａｙｔｏｎ  ＫＬ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１４，１９２（２）：７８２−７９１）。
【０３０８】
さらに、ガレクチン−９は、Ｔｉｍ−３ならびにＣＤ３シグナル伝達ラフト内のＣＤ４５のレベルを高めることができ、シナプスでの高濃度のこのホスファターゼは、それによりＬｃｋが負に制御されＴＣＲシグナル伝達の抑制をもたらす手段であると示唆された（Ｃｌａｙｔｏｎ  ＫＬ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１４，１９２（２）：７８２−７９１）。加えて、ＴＣＲと抗ＣＤ３／ＣＤ２８のライゲーションにより活性化されたＴ細胞由来の細胞ライセートの分析は、Ｔｉｍ−３へのＬｃｋの動員をもたらし、Ｔｉｍ−３によるＬｃｋの隔離は細胞内Ｌｃｋプールを枯渇させ、ＴＣＲ鎖上のＩＴＡＭモチーフのリン酸化を妨害することによりＴＣＲの不完全な活性化を生ずることも提唱された（Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，２０１５，１０（１０）：ｅ０１４０６９４（ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４０６９４）。
【０３０９】
癌において、今日では、腫瘍が特定の免疫チェックポイント経路を、特に、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する免疫耐性の主要機序として利用することが明らかであり、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）の抗体遮断薬を用いた臨床試験は、持続性のある臨床的応答を生成する潜在力を有する強化された抗腫瘍免疫を示した（Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，１２：２５２−２６４）。
【０３１０】
ＣＴＬＡ−４は活性化ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞により発現されるが、ＣＴＬＡ−４の主要な生理学的役割は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の２つの主要なサブセットに対する別々の効果：ヘルパーＴ細胞活性の抑制的調節および調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞免疫抑制活性の強化、を介するものであるように思われる。（上記Pardolに評価された）しかし、癌免疫療法でのＰＤ−１経路の遮断はまた、腫瘍内Ｔｒｅｇ細胞の数および／または抑制活性を漸減させることにより、免疫応答を高め得る（Ｐａｒｄｏｌｌ、前出参照）。さらに、ＰＤ−１遮断は、組織中および腫瘍微小環境中のエフェクターＴ細胞の活性を強化するのみでなく、ＰＤ−１  Ｂ細胞に対する直接的作用を介して腫瘍中のナチュラルキラー細胞活性および抗体産生もおそらく強化する（Ｐａｒｄｏｌｌ、前出参照）。癌では、発現される主要なＰＤ−１リガンドは、ＰＤ−Ｌ１であり、ＰＤ−Ｌ１の高発現は、ほぼ全ての癌型で認められている（Ｐａｒｄｏｌｌ、前出参照）。従って、１つまたは複数の抑制性チェックポイントを単独でまたは組み合わせて標的とする治療は、癌の全身制御に対する大きな可能性を有すると考えられる（Ａｌｌｉｓｏｎ  ＪＰ，ＪＡＭＡ，２０１５，３１４（１１）：１１１３−１１１４；Ｃｒｅｅｌａｎ  ＢＣ，ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，２０１４，２１（１）：８０−９）。
【０３１１】
本発明者らは、本明細書で記載のペプチドは、図１、２、４、５および６に示すように、Ｌｃｋを活性化し、図３および図４０に示すように、Ｙ３９４でのＬｃｋリン酸化を増大させることを示した。
【０３１２】
従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のＬｃｋの生理学的効果を高めるために使用できる。
【０３１３】
一実施形態では、本発明は、Ｌｃｋキナーゼの活性を高める方法を提供し、方法は、Ｌｃｋキナーゼを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。本発明はまた、ＬｃｋキナーゼのＹ３９４リン酸化を増大させる方法を提供し、方法は、Ｌｃｋキナーゼを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３１４】
一実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させたＬｃｋの活性は、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させたＬｃｋ活性レベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていないＬｃｋ（例えば、対照）の活性と比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。同様に、ＬｃｋキナーゼのＹ３９４リン酸化のレベルは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させたＬｃｋキナーゼのＹ３９４リン酸化レベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていないＬｃｋキナーゼ（例えば、対照）のＹ３９４リン酸化と比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０３１５】
Ｌｃｋ活性化の下流効果を含むＬｃｋの活性は、本明細書で記載される。
【０３１６】
本明細書で使用される場合、「接触させること」という用語は、インビトロ系またはインビボ系中で示される部分（例えば、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドとＬｃｋキナーゼ）を一緒にすることを指す。例えば、プロテインキナーゼを本明細書に記載の活性化剤と「接触させること」は、キナーゼを有するヒトなどの個体または患者への本発明の化合物の投与、ならびに、例えば、キナーゼを含む細胞調製物または精製調製物を含む試料中に本明細書に記載の活性化剤を導入することを含む。
【０３１７】
本発明者らはまた、本明細書で記載のペプチドは、ヒトＴ細胞からのＩＬ−２分泌を増大させることも示した（図７、図８、図９、図２９、図３３、図３４、図３５、および図３７）。重要なことに、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドによる細胞の前処理は、Ｔ細胞がその後に刺激されると、ＩＬ−２分泌を増大させる（例えば、図２９参照）。
【０３１８】
従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のＩＬ−２の生理学的効果を高めるために使用できる。
【０３１９】
一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団からのＩＬ−２分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３２０】
一実施形態では、細胞または細胞集団からのＩＬ−２分泌のレベルは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団からのＩＬ−２分泌レベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）からのＩＬ−２分泌のレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０３２１】
一実施形態では、細胞はＴ細胞である。
【０３２２】
本発明は、細胞の増殖を誘発する方法を提供し、方法は、細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３２３】
本明細書で使用される場合、増殖という用語は、細胞数の増大、または細胞または細胞集団の細胞分裂数の増大を含み、増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）と同義に使用される。一実施形態では、細胞または細胞集団の増殖レベルは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させた細胞または細胞集団の細胞増殖レベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）の細胞増殖レベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０３２４】
別の実施形態では、本発明は、細胞集団の増殖を増大させる方法を提供し、方法は、細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３２５】
一実施形態では、本発明は、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞からなる群より選択される細胞である、または細胞集団はこれらからなる群より選択される細胞を含む。
【０３２６】
別の実施形態では、細胞は未感作細胞である、または細胞集団は未感作細胞を含む。
【０３２７】
好ましい実施形態では、本方法は、インビボでまたはインビトロで細胞または細胞集団に対し実施される。別の好ましい実施形態では、本方法は、エクスビボで細胞または細胞集団に対し実施される。
【０３２８】
別の実施形態では、本発明は、動物の細胞または細胞集団の増殖を増大させる方法を提供し、方法は、動物に、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を投与することを含む。
【０３２９】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物は通常、有効量で投与される。本明細書で使用される場合、用語「有効量」（例えば、「治療有効量」または「薬学的有効量」）は、Ｌｃｋキナーゼ活性の活性化を可能とする、または分子または細胞応答を高めるまたは低減させる、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドの量を指す。上記「有効量」は、個々の年齢および全身状態に応じて、および治療または予防される特定の状態、治療期間、以前の治療、および状態の性質および既存期間などの因子により対象毎に変化する。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドは通常、例えば、任意の年齢の健常者に、疾患または状態の症状のない対象に有効量で投与されてＬｃｋを活性化する。
【０３３１】
具体的には、活性化剤の有効量は、過剰のまたは許容できない毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題または合併症なしに、適度なベネフィットリスク比に見合って対象に投与できるが、本明細書全体を通して開示されるものなどの適切な技術で評価して所望の効果を与えるのに十分である、Ｌｃｋ活性化ペプチドの量を規定する。従って、正確な有効量を指定するのは可能ではないが、当業者なら、定型実験および背景的一般知識を用いて、任意の個々の症例に適切な「有効」量を決定できる。これに関する治療結果は、症状の根絶または軽減を含む。治療結果は状態の完全な回復（すなわち、治癒）である必要はない。
【０３３２】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団に由来する細胞または細胞集団を提供する。例えば、本明細書に記載の方法に由来する（例えば、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と細胞または細胞集団をインビボまたはインビトロで接触させた後）細胞または細胞集団に由来する、Ｔ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞、またはそれらの集団。別の態様では、本発明は、例えば、養子細胞移入のための、方法および本明細書で記載の細胞または細胞集団の使用を提供する。
【０３３３】
本発明者らはまた、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、Ｔ細胞株（図１０および図１２）、ＰＢＭＣ内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図１３）、および疲弊したＣＤ４＋Ｔ細胞（図１１）上のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現を増大させることも示した。
【０３３４】
従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のＩＬ−２Ｒの生理学的効果（例えば、ＩＬ−２に対する応答性）を高めるために使用できる。
【０３３５】
一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団のＩＬ−２応答性を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３３６】
一実施形態では、細胞または細胞集団のＩＬ−２に対する応答性のレベルは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団のＩＬ−２に対する応答性のレベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）のＩＬ−２に対する応答性のレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０３３７】
一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団上のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３３８】
一実施形態では、本発明は、チェックポイント阻害剤の存在下でＣＤ２５発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３３９】
一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団上のＩＬ−２ＲＢ（ＣＤ１２２）発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３４０】
一実施形態では、細胞または細胞集団上のＩＬ−２ＲαまたはＩＬ−２ＲＢ発現のレベルは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させた細胞または細胞集団上のＩＬ−２ＲαまたはＩＬ−２ＲＢ発現のレベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）上のＩＬ−２ＲαまたはＩＬ−２ＲＢ発現のレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０３４１】
一実施形態では、細胞は未感作細胞である、または細胞集団は未感作細胞を含む。
【０３４２】
一実施形態では、細胞はＴ細胞である。好ましい実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０３４３】
上記で考察したように、本明細書記載の方法は、インビボ（例えば、対象中で）またはインビトロ（例えば、エクスビボで）のいずれかで、細胞または細胞集団に対し実施できる。同様に上述したように、本発明は、本明細書で記載の方法に由来する細胞および細胞集団、および本明細書で記載の細胞または細胞集団の方法および使用を提供する。
【０３４４】
本明細書で記載のペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２０、図２１、および図２７）の増殖およびＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２４）の増殖を増大させる。
【０３４５】
従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のＣＤ２８＋Ｔ細胞の生理学的効果を高めるために使用できる。
【０３４６】
一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団上のＣＤ２８発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３４７】
一実施形態では、細胞または細胞集団上のＣＤ２８発現のレベルは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させた細胞または細胞集団上のＣＤ２８発現のレベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）上のＣＤ２８発現のレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０３４８】
一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞の増殖を増大させる方法を提供し、方法は、Ｔ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。好ましい実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０３４９】
人口統計学的進化は、公衆衛生に対する課題を示している。世界の住民、特に先進国の住民は、高齢化しており、６０歳を超える人口の比率は、１９５０年の８％から２０５０年の予測値２１％に増える見込みである（Ｃｏｍｐｔｅ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，２０１３，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６５３２５で概説されている）。免疫機能の低下は加齢の特徴であり、高齢者は、細菌およびウィルス感染症の比率および重症度の増加、癌ならびに低いワクチン応答を示す（上記Compte et sl）。
【０３５０】
ヒトの免疫系は年齢と共に次第に劣化し、この欠陥は、ワクチンおよび感染症に対する免疫記憶の誘導能力の低下として顕在化する。病原体および腫瘍発生からの保護は、多様なＴＣＲレパートリーの生成と維持に依存し、高齢期にＴＣＲ多様性が顕著に低下することにより、新規病原体との戦いおよび反復感染に対する活発なリコール応答の開始が困難になる（Ｍｏｒｏ−Ｇａｒｃｉａ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１３．００１０７で概説される）。
【０３５１】
病原体に対して戦う能力およびワクチン接種に応答する能力の低下は、加齢におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞で観察される変化に反映され、加齢における獲得免疫反応の劣化の防止は、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の「若返り」により実現され得ることが提案された（Ｍｏｒｏ−Ｇａｒｃｉａ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１３．００１０７）。
【０３５２】
ＣＤ２８発現の減少は、加齢に伴うＣＤ４＋Ｔ細胞機能の低下の証拠である。ＣＤ２８は、Ｔ細胞活性化中に、サイトカイン産生（ＩＬ−２）の誘導および細胞増殖の促進などの重要な役割を果たすので、活性化中のこの共刺激シグナルの欠如は、部分的な活性化のみ、あるいはＴ細胞のアネルギー性状態を生ずる（Ｇｏｄｌｏｖｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ，２００７，４２（５）：４１２−５）。このように、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞の蓄積は、高齢者における病原体およびワクチン剤に対する低減した全体免疫応答に関連し（Ｓａｕｅｒｗｅｉｎ−Ｔｅｉｓｓｌ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００２，１６８：５８９３−５８９９）、ＣＤ４＋／ＣＤ２８−Ｔ細胞は、６５歳を超える一部の個人において総ＣＤ４＋Ｔ細胞コンパートメントの最大５０％を占める場合がある（Ｖａｌｌｅｊｏ  Ａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０００，１６５：６３０１−６３０７）。
【０３５３】
哺乳動物の加齢中に、胸腺の健全性および機能が徐々に低下し、胸腺退縮は、免疫老化の重要な因子であると考えられる（Ｌｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２（５）：２９０９−２９１６）。マウス研究は、ＩＬ−１２ノックアウトマウスでの加速胸腺退縮を示し、ＩＬ−１２が高齢の野生型およびＩＬ−１２ノックアウトの両方のマウスでＩＬ−２誘導胸腺細胞増殖を増強する強力な相乗的効果をもたらすことを示した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。
【０３５４】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２８発現を高めることを示した（実施例２１、図２２、図３０、および図３１）。
【０３５５】
別の実施形態では、本発明は、対象における加齢関連免疫機能不全の治療および／または予防方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０３５６】
一実施形態では、ＬｃｋまたはＬｃｋ活性の抑制または下方制御を特徴とする疾患または状態は、病原性感染症、病原性感染症に由来する敗血症（例えば、慢性敗血症）、免疫不全障害、低下した免疫応答、減少したＴ細胞数、Ｔ細胞異常、Ｔ細胞疲弊、およびＴ細胞チェックポイント阻害からなる群より選択される。
【０３５７】
好ましい実施形態では、疾患または障害は、癌である。
【０３５８】
本明細書で使用される場合、「加齢関連免疫機能不全」という用語は、上述した加齢関連免疫変化を含む。
【０３５９】
別の実施形態では、本発明は、ＬｃｋまたはＬｃｋ活性の抑制または下方制御を特徴とする疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状を治療および／または予防する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０３６０】
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、治療処置ならびに予防処置（障害または障害の症状の発症（加齢関連変化を含む）を完全に予防すること、または障害の症状の発生（加齢関連変化を含む）、もしくは前臨床で明らかな個別の障害の段階を遅延させることのいずれか）を含む。
【０３６１】
「予防」という用語は、障害または障害の症状の発症の全体的予防、または障害もしくは障害の症状の発生、または前臨床で明らかな個別の障害の段階の遅延化のいずれかを含む。これは、例えば、癌などの疾患を発症する危険のある人の予防処置を含む。「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」は予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）のもう一つの用語である。
【０３６２】
加えて、高齢者における損傷ＩＦＮガンマ産生も、免疫リスク表現型の一因であり、高齢者の細菌生成物またはウィルス抗原による刺激に対して、このサイトカインを産生する能力の低下もまた、加齢に伴う疾患感受性の一因である（Ｏｕｙａｎｇ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ，２００２，１３（４）：３９２−４）。特に、加齢マウスは、一部には、低減したＩＬ−１８受容体（ＩＬ−１８Ｒ）ｍＲＮＡ発現が原因であると考えられる、インフルエンザウィルスに対する漸減したＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を示し、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８の両方は、加齢マウスにおけるＩＦＮガンマ産生を顕著に増大させることができ、それにより、加齢に伴うＣＤ８＋ＣＴＬ欠損を元に戻すことができる（Ｚｈａｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ＆  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ，２００４，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８９／１０７９９９００１７５３２３８０９７）。
【０３６３】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１８）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図１９）によるＩＦＮγ産生を増大させることを示した。
【０３６４】
従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のＩＦＮγの生理学的効果を高めるために使用できる。
【０３６５】
一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団からのサイトカイン分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３６６】
好ましい実施形態では、サイトカインはＩＦＮγである。
【０３６７】
一実施形態では、細胞または細胞集団からのサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）分泌のレベルは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団からのサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）分泌レベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）から分泌されたサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）のレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０３６８】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞もまた、感染症および癌に対する免疫で重要な役割を果たす。加齢関連機能的ＮＫ細胞欠損は、ヒトおよびマウスで十分に報告されており、加齢マウス中への可溶性ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体の注射は、加齢関連ＮＫ細胞欠損を完全に回復することが示された（Ｃｈｉｕ  Ｂ−Ｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３，ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１３０１６２５）。さらに、ＩＬ−１５は、早期感染症に対する免疫応答で重要な役割を果たし、ＣＤ４＋ＣＤ２８−Ｔ細胞の細胞溶解性特性を高め、それらの抗原特異的応答を強化することが示された（Ａｌｏｎｓｏ−Ａｒｉａｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ，２０１１，１０：８４４−８５２）。
【０３６９】
ＩＬ−１５は、ＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の発生、機能および生存を促進し、ＩＬ−１５によるシグナル伝達は、ＣＤ２１５（ＩＬ−１５Ｒ）受容体を介して起こる。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＩＬ−１５（図２３）分泌およびＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２１５発現を高めることを示した（図２３、実施例２２）。従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のＩＬ−１５ＲおよびＩＬ−１５の生理学的効果を強化するために使用できる。
【０３７０】
従って、一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団からのＩＬ−１５分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３７１】
一実施形態では、細胞または細胞集団からのＩＬ−１５分泌のレベルは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団からのＩＬ−１５分泌レベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）からのＩＬ−１５分泌のレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０３７２】
一実施形態では、本発明は、細胞上のＩＬ−１５Ｒ（ＣＤ２１５）発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３７３】
一実施形態では、細胞または細胞集団上のＩＬ−１５Ｒ発現レベルは、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団上のＩＬ−１５Ｒ発現のレベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）上のＩＬ−１５Ｒのレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０３７４】
別の実施形態では、本発明は、ＮＫ細胞のＩＬ−１５応答性を高める方法を提供し、方法は、ＮＫ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３７５】
一実施形態では、細胞または細胞集団のＩＬ−１５に対する応答性のレベルは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団のＩＬ−１５に対する応答性のレベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）のＩＬ−１５に対する応答性のレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０３７６】
好ましい実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０３７７】
理論に束縛されることを意図するものではないが、ＩＬ−１５に対する増大した応答性は、ＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の発生、機能および生存を調節することが予測される。
【０３７８】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（実施例２５）およびＮＫ細胞（図３２）上のｐＳＴＡＴ４発現を高めることを示した。
【０３７９】
従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のｐＳＴＡＴ４の生理学的効果を強化するために使用できる。
【０３８０】
例えば、ヘルパーＴ１型（ＴＨ１）細胞発生は、シグナル伝達物質を介したインターフェロンγ（ＩＦＮγ）シグナル伝達および転写活性化剤１（ＳＴＡＴ１）ならびにＳＴＡＴ４を介したインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）シグナル伝達を含む。
【０３８１】
従って、一実施形態では、本発明は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞中のｐＳＴＡＴ４の発現を高める方法を提供し、方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３８２】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、主にヘルパーＴ細胞により産生され細胞免疫および体液性免疫に関与する種々の細胞の成長および機能を調節する、成長促進サイトカインである。ＩＬ−２の発現は、年齢と共に減少し、この減少は、免疫機能の加齢関連低下と平行であることが示された（Ｐａｈｌａｖａｎｉ  ＭＡ  ＆  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  Ａ，Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ，１９９６，８９（３）：１２５−５４）。さらに、加齢マウスへのＩＬ−２１投与は、新たに胸腺リンパ球形成を誘発することにより、それらの末梢Ｔ細胞プールを若返らせることが示された（Ａｌ−Ｃｈａｍｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ，Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ，２０１６，１５（２）：３４９−６０）。例えば、ｒＩＬ−２１治療加齢マウス由来のＴ細胞の刺激は、Ｌｃｋキナーゼの強化された活性化を示し、これは最終的に、対照加齢マウス由来のＴ細胞と比較して、それらのＩＬ−２産生、ＣＤ２５発現、および増殖能力を高めた（Ａｌ−Ｃｈａｍｉ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。
【０３８３】
本発明者らはまた、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、Ｔ細胞株（図１０）上、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１１）上、ＰＢＭＣ中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞（図１３）上のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現を増大させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２０、図２１、図２７）の増殖、ＮＫ細胞（実施例２０）の増殖を増大させることを示した。
【０３８４】
従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のＩＬ−２Ｒαの生理学的効果を高めるために使用できる。
【０３８５】
本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のＣＤ８＋Ｔ細胞の生理学的効果を高めるために使用できる。本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の生理学的効果を高めるために使用できる。本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のＮＫ細胞の生理学的効果を高めるために使用できる。
【０３８６】
一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞上のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現を高める方法を提供し、方法は、Ｔ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞のＩＬ−２応答性を高める方法を提供し、方法は、Ｔ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。好ましい実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０３８７】
別の実施形態では、本発明は、細胞の増殖を誘発する方法を提供し、方法は、細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。好ましい実施形態では、細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。
【０３８８】
別の実施形態では、本発明は、細胞集団の増殖を増大させる方法を提供し、方法は、細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。好ましい実施形態では、細胞集団はＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の集団である。上で示したように、本方法は、インビボでまたはインビトロで細胞または細胞集団に対し実施できる。別の好ましい実施形態では、本方法は、エクスビボで細胞または細胞集団に対し実施される。
【０３８９】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団に由来する細胞集団を提供する。例えば、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団に由来する、Ｔ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞、またはそれらの集団。
【０３９０】
一態様では、本発明は、本明細書で記載の細胞または細胞集団の方法および使用を提供する。例えば、本明細書で記載の細胞または細胞集団は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を含む養子免疫細胞療法のために使用できる。
【０３９１】
サイトカインＩＬ−２１は、狂犬病感染症に対する最適ワクチン誘導１次応答の発生に重要であり、ＩＬ−７との組み合わせで、全細胞癌ワクチンでの強力な補助剤効力を有することが示された（Ｄｏｒｆｍｅｉｅｒ  ＣＬ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉ，２０１３，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｎｔｄ．０００２１２９；Ｇｕ  Ｙ−Ｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３２３５１）。
【０３９２】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、Ｔ細胞によるＩＬ−２１産生を高めることを示した（図２８）。
【０３９３】
従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のＩＬ−２１の生理学的効果を高めるために使用できる。
【０３９４】
一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団からのＩＬ−２１分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３９５】
一実施形態では、細胞または細胞集団からのＩＬ−２１分泌のレベルは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団からのＩＬ−２１分泌レベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）からのＩＬ−２１分泌のレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０３９６】
一実施形態では、本発明は、対象の免疫応答を誘導する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０３９７】
一実施形態では、本発明は、それを必要としている対象にワクチン接種する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を、ワクチンと同時にまたは順次に対象に投与することを含む。本発明はまた、ワクチン（例えば、ワクチン抗原）と共に処方された、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を提供する。
【０３９８】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドは、チェックポイント阻害剤ＰＤ−Ｌ１の存在下で、ＣＤ２５発現をレスキューできることを示した（実施例１１）。
【０３９９】
従って、一実施形態では、本発明は、対象の癌を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の癌を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物をチェックポイント阻害剤と順次にまたは同時に対象に投与することを含む。
【０４００】
代表的な癌は、本明細書で言及される。
【０４０１】
別の実施形態では、本発明は、対象の免疫応答を活性化する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０４０２】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、Ｔｒｅｇ細胞の比率を減らすことも示した（実施例２６）。
【０４０３】
従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のＴｒｅｇ細胞の比率を減らす生理学的効果を強化するために使用できる。
【０４０４】
一実施形態では、本発明は、細胞集団中のＴｒｅｇ細胞の比率を減らす方法を提供し、方法は、Ｔｒｅｇ含有細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０４０５】
一実施形態では、細胞集団中のＴｒｅｇの比率は、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞集団中のＴｒｅｇの比率が本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞集団（例えば、対照）中のＴｒｅｇの比率と比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後で比較する場合、減少される。
【０４０６】
一実施形態では、本発明は、対象のＴｒｅｇ細胞の比率を減らす方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０４０７】
一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞はＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞である。
【０４０８】
別の実施形態では、本発明は、対象の免疫抑制を低減させる方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０４０９】
ＰＤ−１標的療法による疲弊したＣＤ８＋Ｔ細胞のレスキューは、ＣＤ２８依存性である。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ２８の発現を高めることを示した。
【０４１０】
従って、一実施形態では、本発明は、対象のＴ細胞の疲弊を減らす方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。別の実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物が、チェックポイント阻害剤と順次にまたは同時に投与される。
【０４１１】
癌
低減した細胞免疫は、多くの癌および高レベルのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）に関連する。ホジキンリンパ腫におけるＣＤ４＋細胞は、インビトロでＴ細胞中のＰＧＥ２による健常者とは変化した類似の遺伝子調節を示し、これはＬｃｋの不活性化およびＺＡＰ７０の低減したリン酸化を含むことが示された（Ｃｈｅｍｎｉｔｚ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，６６：１１１４）。
【０４１２】
ホジキンリンパ腫および他の腫瘍では、損なわれたＣＤ４＋Ｔ細胞活性化のために細胞免疫が低下し、ホジキンリンパ腫に関連する高レベルのＰＧＥ２が、Ｌｃｋを抑制することによりＣＤ４＋Ｔ細胞機能を抑制することが示唆された（Ｃｈｅｍｎｉｔｚ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６６（２），＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｂ＝ｐｕｂｍｅｄ＆ｄｏｐｔ＝Ａｂｓ  ｔｒａｃｔ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝１６４２４０４８＆ｑｕｅｒｙ＿ｈｌ＝５＆ｉｔｏｏｌ＝ｐｕｂｍｅｄ＿ｄｏｃｓｕｍ＞）。Ｌｃｋはまた、薬剤耐性でも重要な役割を果たし、Ｌｃｋ欠損であるＴ細胞は抗癌剤に対し耐性であることが示された（Ｓａｍｒａｊ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２５：１８６−１９７，＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｂ＝ｐｕｂｍｅｄ＆ｄｏｐｔ＝Ａｂｓ  ｔｒａｃｔ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝１６１１６４７３＆ｑｕｅｒｙ＿ｈｌ＝１８＆ｉｔｏｏｌ＝ｐｕｂｍｅｄ＿ｄｏｃｓｕｍ＞）。
【０４１３】
シタラビンは、急性骨髄性白血病の治療で使用される最も効果的な化学療法剤の１つである（Ｆｒｅｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９６９，２９：１３２５−１３３２）。セリン／トレオニンキナーゼのｐ３４ｃｄｃ２キナーゼは、サイクリンＡおよびＢと複合体形成し、ｐ３４ｃｄｃ２活性は、細胞分裂の開始のために必要である。従って、ｐ３４ｃｄｃ２は、ＤＮＡ合成の完了およびＤＮＡ損傷の存在を監視する有糸分裂チェックポイントである（Ｎｕｒｓｅ  Ｐ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４４：５０３−５０７）。しかし、ＤＮＡ複製の状態は、ｐ３４ｃｄｃ２のセリン／トレオニン活性に依存する一方で、これはインビボでＴｙｒ１５上のｐ３４ｃｄｃ２のリン酸化により調節され（Ａｔｈｅｒｔｏｎ−Ｆｅｓｓｌｅｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９９３，１３：１６７５−１６８５）、ｐ３４ｃｄｃ２のセリン／トレオニン活性は、ｐ３４ｃｄｃ２の触媒サブユニット中のＴｙｒ１５のリン酸化により抑制されることが示された（Ｇｏｕｌｄ  Ｋ  ＆  Ｎｕｒｓｅ  Ｐ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：３９−４４）。Ｌｃｋキナーゼは、ｐ３４ｃｄｃ２のＴｙｒ１５をリン酸化することが示され（Ｄｒａｅｔｔａ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３６：７３８−７４４）、白血病および他の固形癌の治療におけるＬｃｋ活性化剤の潜在的役割を示唆する。
【０４１４】
ゾレドロン酸およびＩＬ−２の組み合わせによる末梢血リンパ球のエクスビボまたはインビボ刺激による癌免疫療法のためのγ／δ  Ｔリンパ球の標的化は、以前に記載され（Ｇｏｍｅｓ  ＡＱ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１０，ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−１０−３２３６；Ｄｉｅｌｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００７，６７（１５）：７４５０−７；Ｗｉｌｈｅｌｍ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２００３，１０２（１）：２００−６）、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、γ／δＴ細胞をエクスビボで生成するためのＩＬ−２の使用の代替物として機能し、乳癌、前立腺癌〜リンパ系悪性腫瘍に及ぶ悪性腫瘍の患者のための治療投与への用途を有し得る（Ｄｉｅｌｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，ｖｉｄｅ  ｓｕｐｒａ；Ｗｉｌｈｅｍ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ  ｖｉｄｅ  ｓｕｐｒａ；Ｃａｐｉｅｔｔｏ  ＡＨ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１１，１８７（２）：１０３１−８）。加えて、腫瘍細胞に対するγ／δ  Ｔ細胞傷害性は、リツキシマブおよびトラスツズマブを含む組み合わせ方式で強化されることが示され（Ｔｏｋｕｙａｍａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，２００８，１２２（１１）：２５２６−３４３；Ｃａｐｉｅｔｔｏ  ＡＨ、前出参照）、本発明は、上述の抗癌剤、および／または本発明による癌または他の疾患もしくは状態のための他の薬物との併用療法での本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の使用に及ぶ。
【０４１５】
本発明者らは、本発明のポリペプチドによる疲弊したＣＤ４＋細胞の治療がＣＤ２５発現を誘導することを示した（図１１）。
【０４１６】
従って、一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞の疲弊を低減する方法を提供し、方法は、Ｔ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０４１７】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＰＢＭＣ共培養でのカルセイン−ＡＭ染色したＫ５６２細胞の特異的細胞毒性における細胞傷害性を高めることを示した（実施例４４）。
【０４１８】
従って、一態様では、本発明は、細胞傷害性細胞機能を高める方法を提供し、方法は、細胞傷害性細胞または細胞傷害性細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させることを含む。
【０４１９】
一実施形態では、細胞または細胞集団の細胞傷害性細胞機能のレベルは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させた細胞または細胞集団の細胞傷害性細胞機能のレベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）の細胞傷害性細胞機能のレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、高められる。
【０４２０】
別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞機能を高める方法を提供し、方法は、Ｔ細胞またはＴ細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０４２１】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞機能を高めること」は、持続的または増幅された生物学的機能を有するように、または疲弊したまたは不活性Ｔ細胞を再生もしくは再活性化するために、Ｔ細胞を誘導、誘発または刺激することを意味する。Ｔ細胞機能の強化の例としては、介入前のレベルと比較した、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγの分泌の増大、増殖の増大、抗原応答性（例えば、ウィルス、病原体、または腫瘍の除去）の増大、が挙げられる。一実施形態では、強化のレベルは、少なくとも５０％、あるいは、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％である。この強化を測定する方法は、当業者に既知である。
【０４２２】
一実施形態では、細胞または細胞集団のＴ細胞機能のレベルは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させた細胞または細胞集団のＴ細胞機能のレベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）のＴ細胞機能のレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、高められる。
【０４２３】
代表的な細胞傷害性細胞機能およびＴ細胞機能は、本明細書で考察される。
【０４２４】
上で考察したように、本明細書に記載の方法は、インビボ（例えば、対象中で）またはインビトロ（例えば、エクスビボで）のいずれかで、細胞または細胞の集団に対し実施できる。
【０４２５】
加齢
Ｔ細胞は、細胞免疫で中心的な役割を果たし、加齢随伴病の多くは、免疫系の調節不全により影響を受け、増加している。免疫応答、主にＴ細胞応答は、加齢で調節不全になっていることを示唆する数多くの証拠が存在する（Ｆｕｌｏｐ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  ＆  Ｈｅａｌｔｈｓｐａｎ，２０１２，１：６）。老化過程に関連するＴ細胞のシグナル伝達経路でのいくつかの変化が記載され、細胞膜（脂質ラフト）内のリン脂質構造体がＴＣＲカスケードの成分を集める働きをすることが提唱されている（Ｆｕｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ（前出参照）で概説される）。さらにＬｃｋおよびその活性化型の脂質ラフトへの動員が高齢者由来の活性化Ｔ細胞中で低減していることが示された（Ｌａｒｂｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ，２００４，７５（２）：３７３−３８１）。
【０４２６】
Ｔ細胞活性化経路での加齢に伴う変化が、実験動物モデルおよびヒトで観察されており、最も重要な変化はＣＤ４＋Ｔ細胞中で起こり、サイトカインインターロイキン２（ＩＬ−２）の産生およびクローン増殖の低減をもたらす（Ｆｕｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ（前出参照）で概説される）。
【０４２７】
ＩＬ−２系では、細胞内シグナル伝達がＩＬ−２受容体のベータ鎖により誘発され、Ｌｃｋの触媒ドメインの特異的部位と、ＩＬ−２Ｒβ受容体の細胞質ドメインとの間の結合の結果として、ＩＬ−２Ｒβ受容体がリン酸化Ｌｃｋによりリン酸化される（Ｈａｔａｋｅｙａｍａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５２：１５２３０８）。Ｌｃｋは、Ｔ細胞のＩＬ−２刺激時に活性化されることが示された唯一のＳｒｃファミリーキナーゼであり（Ｂｒｏｃｋｄｏｒｆｆ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ，２０００，１１（２）：２２５−３１）、活性化されたＬｃｋタンパク質は、抗原刺激の非存在下でＩＬ−２産生を刺激することが示された（Ｌｕｏ  Ｋ  ＆  Ｓｅｆｔｏｎ  ＢＭ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９９２，１２（１０）：４７２４−４５７３２）。
【０４２８】
損なわれたＴ細胞活性化および増殖は、加齢中の免疫機能低下における重要な変化であり（ＮＡＳＡ−Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｇｉｎｇ，Ｒｅｐｏｒｔ  ２０１６；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｓａ．ｇｏｖ／ｍｉｓｓｉｏｎ  ｐａｇｒｅｓ／ｓｔａｔｉｏｎ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｗｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ／８５７．ｈｔｍｌ）、宇宙飛行と地上操作の比較から得られた情報は、これに関与する特定の因子を理解することおよび特定することについての洞察を提供する。宇宙飛行および模擬微小重力は、早期Ｔ細胞活性化における重要な遺伝子発現の顕著な低下をもたらすことが知られており、多数の宇宙飛行任務は、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン２受容体アルファ（ＩＬ−２ＲαまたはＣＤ２５）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の顕著な低減を示した（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＥＭ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１５，３０８：Ｒ４８０−Ｒ４８８で概説される）。
【０４２９】
宇宙飛行中の免疫抑制に関する懸念は、宇宙飛行関連免疫系弱体化が地球の軌道を超えた人の存在の拡大を妨げる可能性があるかどうかが疑問視されていることである（Ｇｕｅｇｕｉｎｏｕ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，ｄｏｉ：１０．１１８９／ｊｉｂ．０３０９１６７）。本明細書に記載のように、少なくともいくつかの実施形態では、上述のサイトカインの発現ならびにＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、通常および疲弊Ｔ細胞の両方で、本明細書で記載の方法で利用される化合物により誘導され得る。従って、本発明の方法は、低および微小重力環境での使用に明示的に拡大される。
【０４３０】
免疫抑制
多くの新規抗癌剤の望ましくない重要な副作用は、壊滅的な敗血症に繋がる免疫抑制である。例えば、転移性腎臓癌用の薬剤であるソラフェニブは、休薬後でも１０μＭ超の投与量で回復できないＴ細胞増殖性抑制を引き起こすことが報告された（Ｚｈａｏ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００８，２２：１２２６−１２３３）。Ｌｃｋ発現上昇の増大は、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤治療を受けている慢性骨髄性白血病患者の免疫応答を再刺激するための実施可能な選択肢であると提案された（Ｗａｎｇ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１４，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１４／６８２０１０）。さらに、例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ抑制剤のイマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ，ＳＴ１５７１）は、慢性骨髄性白血病の治療で極めて効果的である。しかし、この薬物による慢性治療は、免疫抑制を誘導し、これは主に、ＬｃｋおよびＺＡＰ７０などのチロシンキナーゼの抑制に伴うＴ細胞機能不全に起因する（Ｗａｎｇ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。加えて、グルココルチコイドは、ＴＣＲ活性化に必要なシグナル伝達イベントを遮断する強力な免疫抑制剤として作用し、デキサメタゾンによるＬｃｋの抑制は、イノシトールホスフェート３下方制御し、それによりＴＣＲシグナル強度の低下により免疫応答を抑制することが示された（Ｈａｒｒ  ＭＷ  ｅｔ  ａｌ，ＪＢＣ，２００９，２８４：３１８６０−３１８７１）。急速に拡大している癌におけるチロシンキナーゼ阻害剤の開発と使用に伴い、これらの薬物の生じ得る副作用は、臨床的にかなり重要である。イマチニブに加えて、ニロチニブおよびダサチニブも、例えば、Ｌｃｋ抑制の原因とされる、Ｔ細胞機能を抑制すると報告された。
【０４３１】
従って、癌療法は、細菌スーパー抗原などの免疫強化薬物との組み合わせ治療から恩恵を受ける可能性がある。しかし、細菌スーパー抗原は、Ｔ細胞の非特異的活性化および大量のサイトカイン放出を引き起こす抗原のクラスであり毒性ショックおよび多臓器不全を含む重度の命を脅かす症状をもたらす。ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）は、抗生物質関連下痢のよくある原因であるので、臨床現場での懸念材料である。ＳＥＡが原因の潜在的疾病率にもかかわらず、ＬｃｋがＳＥＡにより活性化されること（Ｗａｎｇ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１４，２０１４：Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ６８２０１０）および選択的Ｌｃｋ活性化剤の事前の欠乏を考慮して、慢性骨髄性白血病のイマチニブ媒介Ｔ細胞免疫抑制防止のためにＳＥＡを使用すべきであることが提案されてきた。
【０４３２】
これらの報告は、Ｔ細胞の発生および活性化および従って獲得免疫応答のためのＬｃｋの重要性を強調する（Ｓｔｉｒｎｗｅｉｓｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ，６（２６３）：ｒａ１３．Ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｓｉｇｎａｌ．２００３６０７）。Ｌｃｋの樹状細胞（ＤＣ）媒介活性化は、同族ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ抗原複合体に対するＴＣＲ応答の感度と大きさを劇的に高めるプロセスである、「ＴＣＲライセンシング」に繋がる（Ｍｅｒａｎｅｒ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７８（４）：２２６２−２２７１）。しかし、例えば、イマチニブは、Ｌｃｋ活性の抑制によりＴＣＲ誘導性の増殖および活性化を低減させる（Ｓｅｇｇｅｗｉｓｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｂｌｏｏｄ，１０５：２４７３−２４７９）。これは、幹細胞移植後の、日和見感染および移植片対宿主または移植片対白血病反応の誘導という含意を有する（Ｓｅｇｇｅｗｉｓｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｂｌｏｏｄ，１０５：２４７３−２４７９）。
【０４３３】
上で考察したように、本発明者らは、本明細書で記載のペプチドは、図１、２、３、４、５および６で示すように、Ｌｃｋ活性を高め、および図３および図４０で示すようにＹ３９４でのＬｃｋリン酸化を増大させ、ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増大させる（例えば、図２０、図２１、図２７）ことを示した。
本発明者らはまた、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、
・ルイス肺癌（ＬＣＣ）モデルにおいて腫瘍面積を減らすこと（図３６）；
・ペプチド治療ルイス肺癌マウスから取り出した脾細胞中でＣＤ２８およびＣＤ２１５を発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を高めること（図３０、図３１）；および
・ペプチド治療ルイス肺癌マウスから取り出した脾細胞中のＮＫ細胞上のｐＳＴＡＴ４の発現を高める（図３２）こと、
を示した。
【０４３４】
従って、一実施形態では、本発明は、対象の肺癌を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０４３５】
従って、一実施形態では、本発明は、対象の肺癌の進行を防止または遅らせる方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０４３６】
多発性骨髄腫／白血病／リンパ腫
ホジキンリンパ腫に対するＩＬ−２およびＩＬ−１２の同時標的化は、休止ＮＫ細胞および腫瘍細胞溶解の活性化を強化する（Ｈｏｍｂａｃｈ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，２００５，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｉｊｃ．２０８２９）。
【０４３７】
本発明者らは、本明細書で記載のペプチドが、ＮＫ細胞（図１７）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（実施例１５、実施例２８）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（実施例２８、図２５）上のＩＬ−１２ＲＢ２発現を高めることを示した。
【０４３８】
本発明者らはまた、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図８、図９）を含むＴ細胞（図７）、およびＴ細胞株（実施例４４）によるＩＬ−２分泌を増大させることも示した。
【０４３９】
急性骨髄性白血病では、診断時に乱れたＴ細胞機能の複数の局面が作動し、疲弊および老化が主要な過程である（Ｋｎａｕｓ  ＨＡ  ｅｔ  ａｌ，ＪＣＩ  Ｉｎｓｉｇｈｔ，２０１８，ｄｏｉ：１０．１１７２／ｊｃｉ．ｉｎｓｉｇｈｔ．１２０９７４）。実際に、急性および慢性白血病の患者のＴ細胞は、ＰＤ−１またはＴＩＭ−３などの疲弊マーカーを発現し、不十分に応答性、例えば、損なわれた増殖およびＩＬ−２およびＩＦＮγの低減された産生、であり得る（Ｓｉｓｋａ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１４，１２４：４１２１）。
【０４４０】
本発明者らは、本発明のペプチドによる疲弊したＣＤ４＋細胞の処理がＣＤ２５発現を誘導すること（図１０、図１１、および図１２）、および本明細書で記載のペプチドがＰＢＭＣ（実施例１７）およびＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（実施例１８）中でＩＦＮγを誘導することを示した。
【０４４１】
本発明者らはまた、本明細書で記載のペプチドが、ヒトＴ細胞からのＩＬ−２分泌を増大させることも示した（図７、図８、図９、図３７）。
【０４４２】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、悪性のプラズマ細胞のクローン増殖を特徴とする進行性Ｂ系統腫瘍である。多発性骨髄腫中のＴ細胞もまた、腫瘍部位で疲弊および老化の特徴を示し、Ｔ細胞サブセットの数と機能は、ＭＭ患者では異常であり；例えば、ＣＤ４：ＣＤ８比率は逆転し、ＣＤ４細胞中のヘルパーＴ細胞１型：２型（Ｔｈ１：Ｔｈ２）比率は異常であり、Ｔ細胞活性化に必要なＣＤ２８発現レベルは、Ｔ細胞中で下方制御されており、ＭＭ患者からの循環する樹状細胞は機能障害性である（Ｓｈａｒａｂｉ  Ａ  ＆  Ｈａｒａｎ−Ｇｈｅｒａ  Ｎ，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｒｅｓ，２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ２６９５１９で概説される）。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２８発現を高めることを示した（図２２、図３０、図３１）。
【０４４３】
重要なことに、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドによる細胞の前処理は、その後の抗原刺激時に、ヒトＴ細胞からのＩＬ−２分泌を増大させる（例えば、図２９）。
【０４４４】
本明細書で使用される場合、抗原刺激は、細胞または細胞集団の抗原への暴露またはそれらとの接触、またはＣＤ３またはＣＤ２８抗体などの抗体への暴露またはそれらとの接触を含む。
【０４４５】
本明細書で使用される場合、未感作細胞は、抗原に暴露されていないまたはそれと接触させられていない細胞を含む。
【０４４６】
従って、本発明は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、例えば、疾患の症状の発生前に、抗原刺激の前に、病原体への暴露の前になど、予防的に投与される、方法および使用を提供する。
【０４４７】
加えて、骨髄腫腫瘍部位由来のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８インビトロ刺激後にＩＦＮγを産生できず、Ｔ細胞刺激物質に応答して脱顆粒する能力の低下を示す（Ｚｅｌｌｅ−Ｒｉｅｓｅｒ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１６，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３０４５−０１６−０３４５−３０）。ＭＭにおける損なわれた免疫応答は、ＭＭ患者の末梢血中の機能的に活性な免疫抑制Ｔｒｅｇの増大によりさらに強調される（Ｄｏｓａｎｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１５，５：ｅ３０６で概説される）。
【０４４８】
本発明者らはまた、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、免疫抑制Ｔｒｅｇ細胞の比率を減らすことも示した（実施例２６）。
【０４４９】
腫瘍浸潤リンパ球中のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の存在は、様々なタイプのヒト癌での予後不良と相関する。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を減らすことを示した（実施例２６）。
【０４５０】
従って、本発明は、細胞集団中のＦｏｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の比率を減らす方法を提供し、方法は、細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０４５１】
ＩＬ−２１は、免疫抑制Ｔｒｅｇを抑制する。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドが、Ｔ細胞によるＩＬ−２１産生を高めることを示した（図２８）。
【０４５２】
養子免疫細胞療法（ＡＣＴ）
難治性または進行性癌に対するワクチン接種の代用物は、養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）、すなわち、エクスビボ処理Ｔ細胞の投与である（Ｋａａｒｔｉｎｅｎ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１７，１９（６）：６８９−７０２）。さらに、ＡＣＴの前の、エクスビボ増殖中のＴ細胞のコンディショニングもまた、インビボ効力に影響を及ぼす重要なパラメーターであることも、マウス試験から明らかになった（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１５，６４（５）：５３９−５４９）。Ｔ細胞の養子移入は、患者中で強力な抗腫瘍および抗ウィルス免疫を媒介でき、このような療法は、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または他のエフェクター分子を含む遺伝子情報の移入に依存し得る（Ａｎｄｒｉｊａｕｓｋａｉｔｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２０１５，２２（７）：３６０−３６７で概説される）。
【０４５３】
インターロイキンは、Ｔ細胞のエクスビボ増殖中に培地中に組み込まれる場合Ｔ細胞機能を強化するためにうまく用いられた。例えば、ＩＬ−１２コンディショニングは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のレトロウィルス媒介形質導入効率を改善し（Ａｎｄｒｉｊａｕｓｋａｉｔｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）；ＩＬ−２１の添加は、培養物中のリンパ球のより大きな増殖、およびＣＤ８＋中枢記憶Ｔ細胞の増大した収率を誘導することが示され（Ｚｏｏｎ  ＣＫ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ，２０１５，１６：８７４４−８７６０）；ＩＬ−２１と共に培養したＣＡＲ＋Ｔ細胞の養子移入は、マウスでＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍の制御を改善することが示された（Ｓｉｎｇｈ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１１，７１（１０：３５１６−３５２７）。
【０４５４】
養子免疫療法で、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８培養腫瘍灌流リンパ節（ｔｕｍｏｕｒ−ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）細胞（ＴＤＬＮ）は、ＩＬ−１２またはＩＬ−１８単独生成Ｔ細胞より効率的に、肺転移を根絶することを示した（Ｌｉ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５，６５（３）：１０６３−７０）。これは、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８を使って、Ｔｈ１表現型に対し抗体活性化ＴＤＬＮ細胞を相乗的に極性化させることにより、強力なＣＤ４＋およびＣＤ８＋抗腫瘍エフェクター細胞を生成できることを示す（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを用いて、強力なＣＤ４＋およびＣＤ８＋抗腫瘍エフェクター細胞を生成する。
【０４５５】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＩＬ−１８Ｒの発現を高めることを示した。
【０４５６】
一実施形態では、細胞または細胞集団上のＩＬ−１８Ｒ発現レベルは、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団上のＩＬ−１８Ｒ発現のレベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）上のＩＬ−１８Ｒのレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０４５７】
別の実施形態では、本発明は、ＮＫ細胞のＩＬ−１８応答性を高める方法を提供し、方法は、ＮＫ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０４５８】
一実施形態では、細胞または細胞集団のＩＬ−１８に対する応答性のレベルは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団のＩＬ−１８に対する応答性のレベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）のＩＬ−１８に対する応答性のレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０４５９】
好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０４６０】
上で考察したように、本明細書で記載のペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２０、図２１、および図２７）の増殖およびＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２４）の増殖を増大させる。従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを用いて、例えば、養子免疫細胞療法のために、インビボおよびインビトロで細胞および細胞集団の増殖を誘導できる。
【０４６１】
ＩＬ−１２受容体発現は、ＩＬ−１２結合およびＴｈ１免疫応答の誘導と相関する。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドが、ＰＢＭＣ上のＩＬ−１２Ｒ（図１７）およびＴ細胞（図２５）の発現を促進することを示した。
【０４６２】
従って、一実施形態では、本発明は、対象においてＴｈ１応答を誘導する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０４６３】
Ｔ細胞は、ＩＬ−２１を使って、養子免疫細胞療法のためにインビトロ／エクスビボで増殖できる。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドが、ＩＬ−２１の発現を促進することを示した（図２８）。
【０４６４】
酸化ストレス
脂質過酸化プロセスの種々の工程を遮断し、それにより免疫応答を高める薬剤の能力は、４０年近くにわたり知られていた（Ｔｅｒｒｅｌｌ  Ｈｏｆｆｅｌｄ  Ｊ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８１，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｅｊｉ．１８３０１１０５０５）。
【０４６５】
加えて、リン脂質ヒドロペルオキシドの除去剤は、病原性感染の存在下で活性化されたばかりのＴ細胞の生存と増殖に不可欠である（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，ＪＥＭ，２０１５，ｄｏｉ．１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１４０８５７）。
【０４６６】
骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）などの免疫サプレッサー細胞は、加齢と共に増殖し、ＭＤＳＣのこの増殖はまた、ペルオキシナイトライト（身体中で最も強力な酸化剤の１つ）を含む酸素種の生成が主な理由で、Ｔ細胞応答の抑制にも関与する（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ＤＩ  ＆  Ｎａｇａｒａｊ  Ｓ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，９（３）：１６２−１７４；Ｂｕｅｎｏ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ，Ａｇｅ（Ｄｏｒｄｒ），２０１４，３６（６）：９７２９）。
【０４６７】
一酸化窒素と超酸素ラジカル（ペルオキシナイトライト形成に繋がる）の間の反応は、生体膜およびリポタンパク質中に存在する多価不飽和脂肪酸の脂質過酸化を誘導し、ＵＶＢ照射は高レベルのペルオキシナイトライトを生成し、これが酸化損傷および細胞死をもたらす（Ｒａｄｉ  Ｒ，ＰＮＡＳ，２０１８，ｄｏｉ．１０．１０７３／ｐｎａｓ．１９０４９３２１１５；Ｗｕ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ，２０１０，８６（２）：３８９−３９６；Ｂａｒｔｅｓａｇｈｉ  Ｓ  ＆  Ｒａｄｉ  Ｒ，Ｒｅｄｏｘ  Ｂｉｏｌ，２０１８，１４：６１８−６２５）。
【０４６８】
さらに、たばこの煙誘導酸化ストレスもまた、ＣＤ４０Ｌ成熟樹状細胞（ＤＣ）によるＩＬ−１２産生を抑制することが示され（Ｋｒｏｅｎｉｎｇ  ＰＲ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００８，１８１（２）：１５３６）、このサイトカインは能動的Ｔｈ１免疫応答に必要である。
【０４６９】
本発明者らは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、ＤＣによるＣＤ４０Ｌ媒介ＩＬ−１２産生を誘導するのみでなく、細胞膜中の脂質過酸化も抑制することを示した（例えば、図３９）。
【０４７０】
従って、一実施形態では、本発明は、酸化的損傷を治療する方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。好ましい実施形態では、細胞は、Ｔｒｅｇ細胞またはＴｒｅｇ細胞を含む細胞の集団である。
【０４７１】
一実施形態では、酸化的損傷のレベルは、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団の酸化的損傷のレベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）の酸化的損傷のレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後を比較する場合、低減される。
【０４７２】
一実施形態では、低減のレベルは、少なくとも１０％、あるいは、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％である。このような低減を測定する方法は、当業者に既知である。
【０４７３】
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）は、ＣＤ１４陰性樹状細胞の集団を増大させる（データは示さず）。
【０４７４】
従って、一実施形態では、本発明は、樹状細胞または樹状細胞の集団の増殖を誘導する方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物と接触させることを含む。別の実施形態では、本発明は、樹状細胞の集団の増殖を増大させる方法を提供し、方法は、細胞の集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０４７５】
アルツハイマー病（ＡＤ）
アルツハイマー病は、認知症の主要な原因であり、神経の変性および消失ならびに老人斑および神経原線維濃縮体の生成を特徴とする。
【０４７６】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路チェックポイント阻害剤は近年、脳中の単球由来マクロファージ集団においてＩＦＮγ依存性増大を誘発し脳アミロイドの除去および認知障害の改善をもたらすことにより、遺伝子導入マウスモデルでＡＤを回復させることが報告された（Ｂａｒｕｃｈ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ，２０１６，２２：１３５−３７）。本明細書に記載のように、少なくともいくつかの実施形態では、本発明で利用される化合物は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用により抑制された免疫応答をレスキューし得る。
【０４７７】
さらに、Ｌｃｋは、神経突起成長の調節に関与し、臨床的報告は、ＡＤ患者の海馬中のＬｃｋの下方調節レベルについて記載した（Ｈａｔａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，ＢＢＲＣ，２００１，２８４：３１０−３１６）。実際に、ヒトＬｃｋ遺伝子は、アルツハイマー病関連遺伝的結合領域１ｐ３４〜３６に位置している（Ｂｌａｃｋｅｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，２００３，１２：２３−３２）。最近の哺乳動物脳中のＬｃｋのインビトロおよびインビボでの機能的特性評価は、Ｌｃｋが、記憶の取得と維持の重要なメディエーターであり、これは、ＡＤで最も顕著に障害されたプロセスであることをさらに示唆している（Ｋｉｍ  Ｅ−Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，２０１２，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ０００１８−１０２−１１６８−１）。
【０４７８】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドは、チェックポイント阻害剤ＰＤ−Ｌ１の存在下で、Ｔ細胞株上のＩＬ−２Ｒα発現をレスキューできることを示した（図１２、実施例１１）。
【０４７９】
ＨＩＶ感染症
ＬｃｋはＣＤ４とＣＤ８の両方に結合するが、Ｌｃｋ活性は、ＣＤ４と結合した場合の方がより高い（Ｄｅｌｖｅｓ  ＰＪ  ａｎｄ  Ｒｏｉｔｔ  ＩＭ，ｅｄｉｔｏｒｓ．１９９８．Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。ＨＩＶは、ＣＤ４＋細胞の枯渇を特徴とし、Ｎｅｆを欠くＨＩＶ株はＡＩＤＳに進行しない（Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，２００４，ＰＮＡＳ．ＵＳＡ，１０１（３９）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｆｕｌｌ／１０１／３９／１４０７９）。ＨＩＶ感染症におけるＬｃｋの重要な役割は十分に認識されている。例えば、不活性Ｌｃｋを発現する細胞は、加速されたウィルス複製を示すが、一方、通常のまたは高い酵素活性を有するＬｃｋを発現する細胞は、初期の内在性Ｌｃｋ酵素活性に比例して、ウィルス複製の遅延を示す（Ｙｏｕｓｅｆｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３３（１）：７８−９０）。
【０４８０】
Ｎｅｆ遺伝子は、霊長類レンチウィルス（ヒト免疫不全１型（ＨＩＶ−１）、２型（ＨＩＶ−２）、およびサル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ））に特有であり、約２５ｋｄのミリストイル化膜結合タンパク質をコードする（Ｇｒｅｅｎｗａｙ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，７３（７）：６１５２−６１５８）。細胞レベルでは、Ｎｅｆは、ＣＤ４、インターロイキン２受容体、ＭＨＣクラスＩを含むＴ細胞表面受容体のレベルを低減させ、細胞内シグナル伝達を妨害し、特定のサイトカイン産生を損なう（Ｇｒｅｅｎｗａｙ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ，１９９９（前出参照）で概説される）。
【０４８１】
Ｎｅｆは、Ｔ細胞拘束性Ｌｃｋチロシンキナーゼ（リンパ球タンパク質チロシンキナーゼ）と直接相互作用し、インビトロおよびインタクト細胞中の両方でＬｃｋキナーゼ活性を低減させ、それにより近位および遠位Ｌｃｋ媒介シグナル伝達イベントの両方の障害を生ずる（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，ＪＢＣ，２７１：６３３３−６３４１）。ＬｃｋのＮｅｆへの結合は、他のビリオンまたは細胞質タンパク質を必要としない。その理由は、Ｌｃｋの触媒活性の抑制が、精製ＬｃｋとＨＩＶ−１  ＮｅｆまたはＳＩＶタンパク質の間の結合により起こると示されているためであり、Ｎｅｆ媒介病態形成の複雑さを示している。
【０４８２】
具体的には、ＮｅｆはＬｃｋのＳＨ３ドメインに結合し、Ｌｃｋ触媒活性の抑制をもたらし（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，ＪＢＣ，２７１：６３３３−６３４１；Ｇｒｅｅｎｗａｙ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７０（１０）：６７０１−６７０８；Ｇｒｅｅｎｗａｙ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７３（７）：６１５２−６１５８）、Ｌｃｋの活性化剤の開発は、抗レトロウィルス治療法の開発を補完し得る。
【０４８３】
Ｌｃｋは、Ｔ細胞中でインターロイキン２（ＩＬ−２）刺激時に活性化される唯一のファミリーキナーゼである（Ｂｒｏｃｋｄｏｒｆｆ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．，１１（２）：２２５−２３１）が、以前の研究は、ＨＩＶ感染症の患者でのＩＬ−２療法は抗レトロウィルス療法単独の使用を超える臨床的便益を付加しないことを示唆し、ＣＤ４＋細胞数でかなりの持続的増大が観察された（Ｔｈｅ  ＩＮＳＩＧＨＴ−ＥＳＰＲＩＴ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ  ａｎｄ  ＳＩＬＣＡＡＴ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ，２００９，３６１：１５４８−１５５９）。しかし、さらに最近のデータは、ＨＩＶ  ＤＮＡまたはタンパク質ワクチン剤と共に、アジュバントとしてのＩＬ−２の投与は、将来のＨＩＶワクチン試験デザインで考慮されるべきであることを示唆し（Ｂａｄｅｎ  ＬＲ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２０４（１０）：１５４１−１５４９）、ＩＬ−２は実際に、いくつかの感染細胞株においてＨＩＶ−１複製を抑制する（Ｒａｐｈａｅｌ  ＭＯ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，ＪＢＣ，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１３．４６８９７５）。
【０４８４】
これらの報告は、Ｔ細胞発生および活性化および従って獲得免疫応答のためのＬｃｋの重要性を強調する（Ｓｔｉｒｎｗｅｉｓｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ，６（２６３）：ｒａ１３．Ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｓｉｇｎａｌ．２００３６０７）。
【０４８５】
一実施形態では、本発明は、対象のＨＩＶ感染症を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０４８６】
その他の病原性感染症
ウィルス、細菌、原虫および寄生生物に起因する感染症に抵抗するための適切な免疫応答は、特定のキナーゼ活性の欠如によりそこなわれ、微生物の複製および細胞への侵入を容易にし、および／または効果的な免疫応答を抑制する。
【０４８７】
例えば、多くの細菌性病原菌が、宿主細胞と密接に結合する。一部は、細胞表面に結合したままで残るが、他のものは、内部移行する。腸内粘膜中のγ／δ上皮内Ｔ細胞は、隣接上皮細胞とのクロストークを介して侵入細菌の存在を検出でき、腸内微生物叢と共に恒常性を維持する免疫防御の階層の不可欠な要素である（Ｉｓｍａｉｌ  ＡＳ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ，２０１１，１０８：８７４３−８７４８）。
【０４８８】
それにより細菌が浸潤後細胞内でそれらの生活環を確立できる高度に保存された進化手段は、細菌により産生されたＵＤＰ糖加水分解酵素を介する。これらは、ＵＤＰ糖加水分解酵素および５−ヌクレオチダーゼ活性を有する二官能性の酵素である。例えば、大腸菌は、ＵＤＰ糖加水分解酵素を産生でき、この生成物は、Ｌｃｋ活性を著しく抑制する（Ｂｅｒｇｅｒ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ，ＪＢＣ，１９９６，２７１：２３４３１−２３４３７）。具体的には、大腸菌によるＨｅＬａ細胞の感染後に、この比較的非特異的ヌクレオチダーゼは、アデノシンの蓄積を生じ、これは、Ｌｃｋ抑制に直接関与する。さらに、ＵＤＰ糖加水分解酵素の過剰発現は、一旦ＨｅＬａ細胞内に入った細菌の生存を強化することが示された。細胞内のＡＴＰの減少は、Ｌｃｋ抑制の原因ではなく、むしろ、原因は、ＡＤＰ、ＡＭＰおよびアデノシンの蓄積であり（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）、他の病原体も、感染状況中にこの酵素を用い得ることが、これらの研究者により提唱された。実際に、カンジダ・アルビカンス培養物は、好中球機能を抑制する原因であると示されているアデノシンを含む（Ｓｍａｉｌ  ＥＨ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９２，１４８：３５８８−３５９５）。
【０４８９】
細菌性赤痢の原因物質であるフレクスナー赤痢菌もまた、インビトロで活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に侵入し、化学誘引物質刺激に向かうＴ細胞遊走を抑制し、また、獲得免疫刺激部位内（すなわち、リンパ節）のインビトロＴ細胞動力学を低下させ、それにより、細菌に対する効率的免疫応答の誘導を妨げる（Ｎｏｔｈｅｌｆｅｒ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０１４，２１１（６）：１２１５；Ｓａｌｇａｄｏ−Ｐａｂｏｎ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ，２０１３，１１０：４４５８−４４６３、で概説されている）。さらに、細菌性赤痢マウスモデルでは、Ｕｎｃ１１９による治療は、赤痢菌感染症を抑制する（Ｖｅｐａｃｈｅｄｕ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬＯＳ  ｏｎｅ，２００９，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００５２１１）。逆に、Ｕｎｃ１１９ノックダウンは、細菌性侵入および死亡率を高めることが示された。同様に、ＴＨＰ−１のウシ結核菌ＢＣＧ感染症の高められた感染力がＵｎｃ１１９ノックダウン後に報告され、Ｕｎｃ１１９の作用は赤痢菌に特異的ではないことを示唆している（Ｖｅｐａｃｈｅｄｕ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。Ｕｎｃ１１９の抑制効果は、そのＡｂｌファミリーキナーゼとの相互作用が原因であり、Ｓｒｃファミリーキナーゼによる媒介によるものではなく、これについては研究されなかった。さらに、Ｕｎｃ１１９ノックダウンは、用いた細胞株において赤痢菌感染（ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を倍増させることが明らかになった。本発明までに、選択的Ｌｃｋ活性化剤は、以前に報告されていないと考えられる。（Ｂａｅ  Ｏ−Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３２（２１）：７２７８−７２８６）。最近報告されたデータは、Ｕｎｃ１１９がＴ細胞中のＬｃｋを活性化できることを示唆するが、Ｕｎｃ１１９およびそのＳＨ３ペプチドモチーフの両方は、Ｌｃｋだけでなく、Ｓｒｃキナーゼファミリー中のＨｃｋ、ＬｙｎおよびＦｙｎキナーゼメンバーも活性化することが示された（Ｃｅｎ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ，ＪＢＣ，２００３，２７８：８８３７−８８４５；Ｇｏｒｓｋａ  ＭＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２００４，１９９（３）：３６９−３７９）。従って、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、代用抗生物質として作用し、または従来の抗生物質療法に対する補完療法として機能し得、本発明は、全てのこのような使用に拡張される。
【０４９０】
マラリアは、肝細胞および赤血球に感染するマラリア原虫種により引き起こされる非常に蔓延している疾患である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、慢性血液期マラリアに対し保護し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇は、寄生生物の除去を遅らせ、これらの細胞を慢性疾患に対する保護に関係づける（Ｗｙｋｅｓ  ＭＮ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１３，５：１２０４−１２１３で概説されている）。さらに、プログラム細胞死１受容体（ＰＤ−１）を介するシグナル伝達がＨＩＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させると考えられているのと全く同じように、ＰＤ−１は、マラリア寄生生物特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の減少および枯渇、およびより少ない程度でＣＤ４＋Ｔ細胞の機能の低下を媒介することが示された（Ｗｙｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。重要なことに最近、ＣＤ８＋Ｔ細胞により高められたＩＦＮγ分泌は、マラリア感染に対する保護に関連付けられることがＰＤ−１ノックアウトマウスで示され、将来のマラリアワクチン剤はＣＤ８＋Ｔ細胞の応答性を高めることを考慮すべきであるという提案に至った（Ｗｙｋｅｓ  ＭＮ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１６，６：２６２１０）。本明細書に記載のように、少なくともいくつかの実施形態では、本発明の方法により利用される化合物は、例えば、疲弊したマウスＣＤ４＋Ｔ細胞、ヒト末梢血単核球および例えば、ＣＤ８＋発現ジャーカット細胞でのＩＦＮγ分泌を強化でき、それによりマラリアの治療における役割をさらに示し、このための本明細書に記載の化合物の使用が、明示的に包含される。
【０４９１】
Ｔリンパ球向性ウィルス、例えばヘルペスウィルスは、例えば、ヘルペスウィルスサイミリチロシンキナーゼ相互作用タンパク質（Ｔｉｐ）がＬｃｋと物理的に相互作用し、かつ安定に発現する細胞株中でＬｃｋ活性を抑制することを考慮すると、Ｌｃｋ活性化剤のための、および本発明により実施される方法のための特定の標的である（Ｉｓａｋｏｖ  Ｎ  ａｎｄ  Ｂｉｅｓｉｎｇｅｒ  Ｂ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０００，２６７（１２）：３４１３−２１）。
【０４９２】
さらに、エボラウィルス属およびマールブルグウィルス属で代表されるフィロウィルスは、ヒトおよび非ヒト霊長類での致死性出血熱の原因である。このウィルスは、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の数を減らすことにより免疫系を攻撃する。ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球などのＢ細胞およびＴ細胞は、免疫制御因子としてサイトカインを産生するのに必要であり、２，３日内に死亡する患者は、アポトーシスによりＢ細胞およびＴ細胞数が減少していることが示された。Ｔ細胞は、ウィルス感染細胞の破壊のために、活性化される必要があり（Ｗａｕｑｕｉｅｒ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，４（１０）：８３７−８４７）、不活化エボラザイールウィルスへのヒト血液末梢単核球の暴露は、低減したＩＬ−２産生をもたらすことが示された（Ｙａｄｄａｎａｐｕｄｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  ｊｏｕｒｎａｌ，２００６，２０：２５１９−２５３０）。本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の使用は従って、これらの疾患に対抗して、Ｔ細胞活性化およびＩＬ−２産生を刺激することへの用途がある。
【０４９３】
さらに、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の使用はまた、結核などの他の感染症においても役割がある。例えば、ほとんどの個体は、ＭＴＢを根絶できないにしても、結核菌（ＭＴＢ）を制御するために、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を必要とする。ＣＤ４＋Ｔ細胞による認識を回避するためにＭＴＢにより使用される分子機序は、ＭＴＢ壁に最も豊富な糖脂質の１つである糖脂質ＭａｎＬＡＭによるシグナル伝達であり、これは、Ｌｃｋリン酸化を阻害することによりＴＣＲシグナル伝達を妨害するが、Ｔｙｒ５０５のリン酸化は阻害しない（Ｍａｈｏｎ  ＲＮ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７５（１−２）：９８−１０５；Ｍａｈｏｎ  ＲＮ  ＩＩＩ，ＰｈＤ学位論文，２０１０，ｈｔｔｐ：／／ｒａｖｅ．ｏｈｉｏｌｉｎｋ．ｅｄｕ／ｅｔｄｃ／ｖｉｅｗ？ａｃｃ  ｎｕｍ＝ｃａｓｅ１２７５６６８６８６）。
【０４９４】
ＩＬ−１２ＲＢ１は、結核菌感染症に対するヒトの抵抗力にとって不可欠であることが知られている。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−１２ＲＢ１発現を誘導することを示した（例えば、実施例２８、図２５、実施例１５、図１７）。
【０４９５】
従って、一実施形態では、本発明は、対象において結核菌感染症を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０４９６】
Ｌｃｋ活性の上方制御により本発明に従って抑制または治療され得る他の感染症としては、ペストおよび肝炎ウィルスが挙げられる（例えば、Ｂ型肝炎ウィルスおよびＣ型肝炎ウィルス）。Ｂ型肝炎は、肝損傷および炎症などに繋がる最も蔓延しているウィルスであり、Ｃ型肝炎ウィルスは、Ｔ細胞疲弊に関連している（Ｙｅ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ＆  Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１５，６，ｅ１６９４）。伝染病のペスト菌病の原学的薬剤に対する重要な病原性因子は、チロシンホスファターゼＹｏｐＨである。細菌は、ＹｏｐＨを宿主細胞に注入し、Ｌｃｋは、活性ＹｏｐＨを含む細胞中のその正の調節部位Ｔｙｒ３９４で脱リン酸化されることが示された。Ｌｃｋを遮断することにより、ＹｏｐＨはそのごく最初のステップでＴ細胞抗原受容体シグナル伝達を遮断し、この致死性疾患に対する防御免疫応答の発生を効果的に防止する（Ａｌｏｎｓｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，２００３，ＪＢＣ，２７９：４９２２−４９２８）。Ｃ型肝炎では、Ｃ型肝炎ウィルスコアタンパク質がＴ細胞に結合し、Ｌｃｋ活性化を抑制し、コアタンパク質がＴ細胞活性化の極初期イベントを抑制することを示唆する（Ｙａｏ  ＳＱ  ｅｔ  ａｌ，２００４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７８（１２）：６４０９−６４１９）。
【０４９７】
全身感染、術後感染あるいは癌再発に対するかかりやすさの観点からの輸血の危険性は、１９７３年以来知られており、最近のメタアナリシスは、赤血球輸血後のこの健康管理関連感染のリスクを再確認している（Ｒｈｏｄｅ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ，ＪＡＭＡ，２０１４，３１１（１３）：１３１７−１３２６；Ｂｌｕｍｂｅｒｇ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，２００７，４７（４）：５７３−８１；Ｆｅｒｇｕｓｓｏｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎ  Ｊ  Ａｎａｅｓｔｈ，２００４，５１（５）：４１７−２４）。輸血誘導免疫調節の提案された機序は不明確なままであるが、役割を果たすと見なされる実証された変化としては、低減したＣＤ４／ＣＤ８比率および低減したＩＬ−２分泌が挙げられる（Ｋｉｒｋｌｅｙ  ＳＡ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９９，６（５）：６５２−６５７）。従って、輸血に共同したＬｃｋ活性化剤の投与は、これらの状態の１つまたは複数のリスクを改善し得る。
【０４９８】
さらに、リンホカイン活性化キラー細胞を生成するための同系脾臓細胞のインビトロＩＬ−２治療は、熱傷マウスモデルで敗血症に関連する死亡のＩＬ−２防止を強化することが示され、活性化Ｌｃｋは、抗原刺激の非存在下でＩＬ−２産生を刺激することが示された（Ｍｅｎｄｅｚ  ＭＶ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ，１９９３，５４（６）：５６５−７０；Ｌｕｏ  Ｋ  ａｎｄ  Ｓｅｆｔｏｎ  ＢＭ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９９２，１２（１０）：４７２４−４７３２）。さらに、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、敗血症中のＴ細胞抑制で重要な役割を果たすことが知られており、敗血症中のＴ細胞抑制の新生児スプラーグドーリーラットモデルでは、ＩＬ−２産生の低減が付随して起こることが示された。このような抑制はＣＯＸ−２阻害剤で改善され、それによりＰＧＥ２をこのプロセスに関連付ける。これを考慮して、およびＴ細胞のＰＧＥ２への暴露がＬｃｋの不活化およびＺＡＰ７０の低減したリン酸化に繋がるので（Ｄａｌｌａｌ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｌ  Ｎｅｐｏｎａｔｅ，２００３，８３（３）：２０１−７；Ｃｈｅｍｎｉｔｚ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００６，６６：１１１４）、本発明によるＬｃｋ活性化剤による治療は、Ｔ細胞活性の刺激を介した敗血症中の免疫応答の刺激、およびＩＬ−２産生刺激にも適用し得る。
【０４９９】
従って、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、一連の用途で広く使用される。本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤によりおよび／または本発明により実施される方法により治療され得る疾患および状態としては、Ｌｃｋの最適未満の発現またはＬｃｋの抑制またはＬｃｋもしくはＬｃｋ活性の下方制御を特徴とする疾患および状態、上皮内および粘膜内常在性Ｔ細胞機能不全および／または病原性感染症（例えば、慢性感染症を含む）、病原性感染症由来の敗血症（例えば、慢性敗血症）および輸血関連敗血症、癌および皮膚性および上皮悪性腫瘍に反応したＴ細胞活性化に対する要求に関連する障害；リンパ腫、ホジキン病および白血病を含む癌一般（例えば、乳癌、結腸直腸癌、および前立腺癌）の予防または治療；Ｔ細胞機能を抑制する治療法（例えば、癌および非癌状態の治療法）に起因する免疫抑制；限定されないが、重症複合型免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、ＣＤ４／ＣＤ８  Ｔ細胞の生存を必要とする状態および細胞数を低下させる状態または障害（例えば、肺炎、インフルエンザ、ヘルペス感染症などの感染症）を含む免疫不全障害；ウィルス、細菌、真菌および寄生生物による病原性感染症；Ｔ細胞疲弊（例えば、癌または非癌状態（病原性感染症由来の敗血症（例えば、慢性敗血症）および／または癌または非癌状態の治療に関連する））、およびＴ細胞中のチェックポイント阻害（例えば、癌または慢性敗血症に関連する）、およびＴ細胞活性化経路の加齢に伴う変化が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５００】
種々のリガンド−受容体相互作用は、チェックポイントシグナル伝達阻害に寄与することが知られており（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，１２：２５２−２６４参照）、本発明の少なくともいくつかの実施形態では、Ｔ細胞機能は、これらの相互作用の１つまたは複数を抑制することにより回復され得る（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用）。従って、少なくともいくつかの実施形態では、本発明は、疲弊Ｔ細胞におけるＴ細胞シグナル伝達のチェックポイント阻害／抑制を克服するための、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の投与に明示的に拡張される。
【０５０１】
病原体および病原性感染のさらなる例としては、ヘルペスウィルス、ミクソウィルス、レオウィルス、エンテロウィルス、コクサッキーウィルス、エコーウィルス、口蹄疫ウィルス、Ｃ型肝炎を引き起こすウィルス（例えば、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスおよびＣ型肝炎ウィルス）、脳炎および脈絡髄膜炎、サル免疫不全ウィルス、ＳＡＲＳ、コロナウィルス、デング熱ウィルス、インフルエンザウィルスインフルエンザウィルス、黄熱病ウィルス、ウエストナイルウィルス、アレノウィルス、水泡性口内炎ウィルス、ライノウィルス、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）、呼吸器多核体ウィルス、ヒトサイトメガロウィルス、および水痘帯状疱疹ウィルス（ＶＺＶ）に加えて、ポックスウィルス、その他のＴリンパ球向性ウィルスなどによるウィルス感染症；結核（例えば、ハンセン病）、グラム陽性球菌およびグラム陰性球菌、およびグラム陰性桿菌および球桿菌などのグラム陽性およびグラム陰性菌により引き起こされる疾患、溶血性連鎖球菌、腸球菌、および破傷風、ジフテリア、ならびにクロストリジウムおよびボツリヌス中毒感染症などの毒素産生細菌に加えて、他のマイコバクテリア感染症などによる細菌感染症；アメーバ症、マラリア（この原因物質は、熱帯熱マラリア原虫である）、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症およびランブル鞭毛虫症などの原生動物感染症；および腸管寄生線虫、糸状虫、条虫（サナダムシ）および包虫などによる蠕虫感染症が挙げられる。
【０５０２】
上記の疾患または状態の予防または治療における本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の使用に加えて、本発明の他の実施形態では、本発明によるＬｃｋ活性化剤は、幹細胞治療、胚性幹細胞自己複製、および胚性幹細胞（例えば、胚盤胞胚芽の）の多能性の維持に対してさらなる用途があり得、全てのこのような使用は、本発明により明示的に包含される。
【０５０３】
特に、誘導多能性細胞は、胚性幹細胞の定義特性の維持のために重要な遺伝子および因子を発現させることにより、胚性幹細胞様状態に遺伝的にリプログラミングされた成熟細胞である。成熟細胞が幹細胞になるように一旦プログラムされてしまうだけで、それらはその後、所望生殖細胞層に分化するように誘導できる。Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼのメンバーは、ヒト胚性幹細胞の分化に不可欠であるが、Ｌｃｋ発現レベルは、胚性幹細胞分化の関数として劇的に低下する（Ｚｈａｎｇ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，２０１４，１３（３  Ｐｔ  Ａ）：３７９−３８９）。
【０５０４】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）は、マウス胚性および誘導多能性幹細胞の培養と誘導のために使用される重要な外因性因子の１つであり、マウス胚性幹細胞自己複製の重要な制御因子である「シグナル伝達性転写因子３」（ＳＴＡＴ３）を活性化する（Ｄａｎｇ−Ｎｇｕｙｅｎ  ＴＱ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１４，８１：２３０）。さらには、ＳＴＡＴ３は、系統特異的差別化プログラムの活性化を妨げることにより、中胚葉および内胚葉系統の両方への分化を抑制することが知られている（Ｇｒａｆ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ，２０１１，２（１）：２８０−２９７）。従って、ＳＴＡＴ３は、未分化胚性幹細胞表現型の維持のために不可欠である（Ｒａｚ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１９９９，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９６：２８４６−２８５１）。
【０５０５】
重要なことに、ＳＴＡＴ３の活性化は、多能性の誘導のための制約要因であり、その過剰発現は、多能性を達成するための追加の因子に対する要求を排除する（Ｙａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２０１０，７（３）：３１９−３２８）。従って、ＳＴＡＴ３シグナル伝達は、ＳＴＡＴ３が自己複製因子の発現を推進することから、主にナイーブ多能性を指示するマスターリプログラミング因子の１つと見なされる（Ｌｉ  Ｙ−Ｑ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ，２０１０，１２（１）：３−１３）。Ｌｃｋは、ＳＴＡＴ３を直接活性化することが示され、外来性ＬｃｋによるＳＴＡＴ３の活性化は、Ｌｃｋ特異的抑制剤ＰＰ１により減弱される（Ｌｕｎｄ  ＴＣ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ，１９９９，１１（１１）：７８９−７９６）。従って、本発明によるＬｃｋ活性化剤は、Ｌｃｋ活性の刺激を介してＳＴＡＴ３活性を上方制御する働きをし得るので、幹細胞自己複製の促進と維持への用途がある。
【０５０６】
さらに、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、Ｔ細胞、細胞媒介免疫を含む免疫および免疫応答の増強、細胞の免疫レシュキュー、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の上方制御、１つまたは複数のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαから選択される）産生の上方制御、Ｔ細胞の再活性化、Ｔ細胞免疫応答の再活性化への、および補助剤としての（例えば、ワクチン組成物中で、または抗原に対する免疫応答を刺激するための個体への別々の投与のため）特定の用途がある。
【０５０７】
従って、個体のワクチン接種用のワクチン組成物がさらに本明細書で提供され、組成物は、薬学的に許容可能な担体と一緒に、本発明により実施される１種または複数のＬｃｋ活性化剤を含む。ワクチンは、ワクチンの投与により免疫応答が生成される任意の好適な抗原、および任意選択で、その抗原に対する免疫応答を刺激するための任意の追加の補助剤を含む。
【０５０８】
少なくともいくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の刺激は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤による治療に由来するＴ細胞の生理学的結果（例えば、高められたＩＬ−２サイトカイン産生、上方制御されたＴ細胞シグナル伝達、など）を達成するために必要であり得る。即ち、Ｌｃｋ活性化剤は、根本的にＴ細胞を活性化するのではなく、Ｔ細胞受容体刺激の生理学的結果を高めるように作用し得る。従って、本明細書で記載の方法の少なくともいくつかの実施形態では、Ｌｃｋ活性化剤の投与により治療されるＴ細胞は刺激されたＴ細胞である。
【０５０９】
本発明の１つまたは複数の実施形態によるＬｃｋ活性化剤に応答するＴ細胞集団は、例えば、上皮内Ｔ細胞、粘膜内Ｔ細胞、γ／δＴ細胞、樹枝状表皮Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、および前述の細胞集団の組み合わせからなる群より選択され得る。
【０５１０】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤またはその成分（例えば、ポリカチオン性ペプチド（ＰＰ）、強化ペプチド（ＡＰ／Ｐ）および／または式ＩＩの化合物）は、当業者に周知の合成または組換え技術により得ることができる。さらに、本発明によるＬｃｋ活性化剤の本明細書に記載のポリカチオン性ペプチドおよび／または強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）は、アミノ酸または遺伝子コードによりコードされていないアミノ酸、またはアミノ酸類似体を組み込むことができる。
【０５１１】
例えば、１個または複数のＤ−アミノ酸、ベータアミノ酸、および／またはホモアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸の代わりに利用され得る。実際に、本明細書に記載のポリカチオン性ペプチド（ＰＰ）および／またはＬｃｋ活性化剤の強化ペプチドは、部分的にまたは完全にＤアミノ酸からなる、または例えば、Ｄ−アミノ酸、ベータアミノ酸、ホモアミノ酸、ベータホモアミノ酸、Ｌ−アミノ酸、およびＬ−またはＤ−ホモアミノ酸の１個または複数の組み合わせからなり得る。ベータアミノ酸の例としては、カチオン性アミノ酸のベータバリアント型を含む、ベータアラニン（ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）、ベータフェニルアラニン、ベータトリプトファン、ベータチロシン、ベータロイシンなどが挙げられる。アミノ酸のホモバリアント型の例としては、Ｌ−システインと比較して追加のＣＨ２基を有するホモシステインが挙げられる。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリカチオン性ペプチド（ＰＰ）および／またはＬｃｋ活性化剤の強化または他のペプチドは、例えば、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはＬ−、Ｄ−アミノ酸および／または上述の他のアミノ酸型を含み得る。Ｄ−アミノ酸を含むペプチドの使用は、例えば、ペプチダーゼ活性（例えば、エンドペプチダーゼ）を抑制し、それによりインビボでのペプチドおよびその結果としてのＬｃｋ活性化剤の安定性を高め、半減期を延長できる。
【０５１２】
本明細書に記載のペプチドまたは融合タンパク質は、本明細書に記載の方法で使用するために、三次元構造中で拘束され得る。例えば、それは、側鎖構造で合成され得る、あるいは既知のインビボで安定な構造を有する分子中に組み込まれ得る、または環化されてインビボで高められた剛性およびそれによる安定性を得る。環化ペプチド、融合タンパク質などのための種々の方法が既知である。ペプチドは、４種の異なる経路、すなわち、頭−尾（Ｃ末端からＮ末端）、頭−側鎖、側鎖−尾、または側鎖−側鎖により環化され得る。例えば、融合タンパク質のペプチドは、ペプチドまたは融合タンパク質に沿って相互に離れた２個のシステイン残基を与えられ、残基のチオール基チオール基を酸化してそれらの間にジスルフィド架橋を形成することにより環化されてよい。環化はまた、ペプチドのＮ末端とＣ末端アミノ酸または、例えば、リシン残基の側鎖上の正に帯電しているアミノ基と、グルタミン酸残基の側鎖上の負に帯電しているカルボキシル基との間で結合を形成することにより、実現し得る。環化を達成するための、アミノ酸間の直接化学結合の形成、または任意の好適なリンカーの使用もまた、十分に当業者の範囲内にある。本発明による環化を達成するために特に好ましい方法は、ラクタム基の形成を含みおよび環化型のペプチドおよび／または本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の形成するためのラクタム化の使用は、明示的に包含される。好適なラクタム化方法を含む、環化を達成するための方法は、例えば、Ｗｈｉｔｅ  ＣＪ  ａｎｄ  Ｙｕｄｉｎ  ＡＫ．，Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｕｎｅ  ２０１１，ｐｐ．５０９、に記載され、この文献の全内容は、相互参照により本明細書に組み込まれる。
【０５１３】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤を含む、ペプチドまたは融合タンパク質（例えば、ポリカチオン性ペプチド−強化ペプチド部分）はまた、炭水化物部分の結合またはアミノ酸残基のアルキル化またはアセチル化を生じる化学反応または化学結合の形成を伴う他の変化などの翻訳後または合成後修飾も含み得る。
【０５１４】
本発明によるＬｃｋ活性化剤を含むペプチドのペプチド模倣体の使用も意図され、本明細書に明示的に包含される。ペプチド模倣体は、例えば、ペプチドの１個または複数のアミノ酸のアミノ酸類似体による置換を含み、ここでアミノ酸類似体は、従来の活性、細胞毒性および／または他の好適なアッセイにより評価される、親ペプチドの活性を基本的に低減させない。
【０５１５】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤およびその成分は、化学的に合成、または従来の組換え技術を用いて製造できる。融合タンパク質をコードする核酸は、例えば、平滑末端化末端およびオリゴヌクレオチドリンカーを用い、必要に応じて消化して付着末端を得て、付着末端のライゲーションにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする別々のｃＤＮＡフラグメントを連結することにより得られる。あるいは、後で一緒に連結できる相補的末端を有するアンプリコンを発生させるプライマーを用いて、ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を利用できる。
【０５１６】
本明細書に記載のペプチドおよび融合タンパク質は、任意の好適な技術を利用して、インビトロで発現され、哺乳動物対象への投与のために、または式ＩＩの化合物に結合されてＬｃｋ活性化剤を得て、本発明により実施される方法で使用するために、細胞培養物から精製され得る。
【０５１７】
ペプチド成分を一緒に結合する、および／またはターゲティング部分、例えば、ｓｃＦｖなどに結合するなどのために、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）、クリックケミストリーおよびブドウ球菌ソルターゼＡ媒介ペプチド−ペプチド融合プロトコル、または前述の組み合わせを利用して、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤を提供し得る。このような合成法のための種々のプロトコルはよく知られており、任意の好適なこのような方法を用い得る。
【０５１８】
治療薬の合成のためのＦｍｏｃまたはＴ−ｂｏｃまたは保護基を用いるＳＰＰＳ法は、特に好ましい。このような合成法は、よく知られ、脱保護ステップの前後で洗浄ステップを有する、結合および脱保護反復サイクルを含む。本明細書で記載の少なくともいくつかの実施形態では、治療薬の全体が、ＳＰＳＳにより固体担体上で合成できる。例えば、式ＩＩのポリアミド部分の合成では、例えば、Ｆｍｏｃで保護された２−アミノ基を有する疑似脂肪酸構成単位は、順次一緒に結合されて、それぞれが上述のＲ基側鎖を有する３〜５反復単位を有するポリアミド骨格部分を形成する。同様に、Ｌｃｋ活性化剤のペプチド成分はその後、ポリアミド部分（ＰＭ）に順次結合されて活性化剤をＣ末端からＮ末端方向に伸張し、その後合成されたＬｃｋ活性化剤が固体担体から切り離され、収集され得る。
【０５１９】
ソルターゼＡ（Ｓｒｔ  Ａ）は、黄色ブドウ球菌で最初に記載された細菌性酵素であり、これは切断配列ＬＰＸＴＧ中のトレオニンとグリシンの間で切断し、アシル酵素中間体を生成し、これはその後、Ｎ末端グリシン残基と反応して、酵素を放出し、グリシンとＬＰＸＴＧタグ付き成分をペプチド結合により一緒に融合する。Ｌｅｖａｒｙ，Ｄ．Ａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃａｔａｌｙｓｅｄ  ｂｙ  ｓｏｒｔａｓｅ  Ａ”．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，Ａｐｒｉｌ  ２０１１，Ｖｏｌ．６（４）：１−６，ｅ１８３４２参照。また、例えば、Ｗｉｔｔｅ，Ｍ．Ｄ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｒｔａｓｅ−ｃａｔａｌｙｓｅｄ  ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｓｅｐ  ２０１３，８（９）：１８０８−１８１９、およびＢｅｎｔｌｙ  ＭＬ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００８，２８３：１４７６２−１４７７１、およびＭａｚｍａｎｉａｎ  ＳＫ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：７６０−７６３も参照されたい。ソルターゼＡ媒介タンパク質ライゲーションを介して蛍光タグまたは毒素に連結された組換えＨＥＲ１およびＨＥＲ２標的化抗体が記載された。例えば、Ｍａｄｅｊ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１２，１０９：１４６１−１４７０，ａｎｄ  Ｋｏｒｎｂｅｒｇｅｒ  Ｐ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｉａ  Ａ．，２０１４，ｍＡｂｓ  ６（２）：３５４−３６６を参照されたい。前出の全ての内容は、相互参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０５２０】
クリックケミストリーは、１つの成分上の末端アジド基ともう一方の成分上のアジド基との間の金属触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ））アジド−アルキン付加環化反応により、成分がペプチド結合ではなく１、２、３トリアゾール結合により一緒に結合されることによるなどの、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の提供において、一緒に成分を結合するのに好適なもう一つの高収率法である。１、２、３トリアゾール結合は、従来のペプチド結合に対し生物学的等価体として機能し、それらは加水分解に耐性であるという優位性を有する。例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１３，１８，ｐｐ：９７９７−９８１７；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ１８０８９７９７参照。ジベンゾビシクロオクチン（ＤＢＣＯ）などのシクロオクチンも同様に、アジドと高反応性であり、上述のアジド−アルキン環化付加に対する代替形態のクリックケミストリー反応を提供する、またはアジド−アルキン環化付加と組み合わせて使用されて、本発明により実施されるＬｃｋ活性化剤を提供し得る。シクロオクチンベースクリック合成反応は、それらが銅または他の金属触媒なしで実施できるという点で優位性を有する。
【０５２１】
ｓｃＦｖ、抗体または抗体フラグメントなどのターゲティング部分は、例えば、最初に２つの成分のシステイン誘導体を作製し、これを切断し、ＨＣｌ塩として精製した後、溶液相中でシステインの遊離スルフヒドリルを利用する、マレイミド結合を採用してそれぞれのクリック試薬に結合させることにより、上述のＬｃｋ活性化剤のリンカー部分（ＬＭ）に結合させることができる。ターゲティング部分はその後、アジドまたはアルキン（または、例えば、ＤＢＣＯ）試薬のいずれかで誘導体化され、リンカー部分（ＬＭ）に結合した相補性試薬を介してクリックコンジュゲーションが起こる。
【０５２２】
他の実施形態では、哺乳動物対象の標的細胞に、本発明による治療処置（例えば、病原性感染の予防または治療）を実施するために、宿主細胞の細胞転写エレメントおよび翻訳リボソーム複合体を利用して核酸をインビボ発現させるために、本明細書に記載の融合タンパク質（すなわち、キメラタンパク質）Ｌｃｋ活性化剤（例えば、ポリカチオン性ペプチド（ＰＰ）および強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）を含む）をコードする核酸を遺伝子導入し得る。
【０５２３】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤成分（例えば、ペプチド活性成分および強化ペプチド）をコードする核酸の発現のために、核酸は通常、最初にクローニングベクターに導入され、宿主細胞中で増幅され、その後、核酸が摘出され、細胞の遺伝子導入のために好適な発現ベクター中に組み込まれる。発現ベクターは、宿主細胞のゲノムＤＮＡとは無関係に核酸挿入断片の発現のために、または宿主細胞中での核酸挿入断片のその後の発現のための宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への部位特異的、相同的、または異種の組換えのために設計され得る。
【０５２４】
通常のクローニングベクター（例えば、コスミド）は、ベクターの効率的複製を可能にするための複製起点（ｏｒｉ）、ベクターで形質転換された宿主細胞の選択を可能にするためのレポーターまたはマーカー遺伝子、および目的の核酸配列の挿入およびその後の切除を容易にするための制限酵素切断部位を組み込む。好ましくは、クローニングベクターは、一連の制限酵素部位を組み込むポリリンカー配列を有する。マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性のためのＡｍｐｒ）、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ラクタマーゼ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、または、例えば、大腸菌ＬａｃＺ遺伝子（ＬａｃＺ’）によりコードされるβ−ガラクトシダーゼなどの酵素をコードする遺伝子であり得る。酵母レポーター遺伝子としては、イミダゾールグリセリンリン酸デヒドラターゼ（ＨＩＳ３）、Ｍ−（５’−ホスホリボシル）アントラニレート異性化酵素（ＴＲＰ１）およびｐ−イソプロピルマレート脱水素酵素（ＬＥＵ２）が挙げられる。発現ベクターはまた、このようなマーカー遺伝子を組み込んでもよい。使用可能なクローニングベクターとしては、哺乳動物用クローニングベクター、酵母および昆虫細胞が挙げられる。適用可能な特定のベクターとしては、ｐＢＲ３２２ベースベクターおよびｐＵＣ１１８およびｐＵＣ１１９などのｐＵＣベクターが挙げられる。
【０５２５】
好適な発現ベクターとしては、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）挿入断片の発現が可能なプラスミドが挙げられる。発現ベクターは通常、挿入された核酸配列が作動可能に連結される転写調節制御配列を含む。「作動可能に連結される」は、挿入断片の読み枠のずれなしに挿入配列の転写を可能にするために、核酸挿入断片が転写調節制御配列に連結されることを意味する。このような転写調節制御配列は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼの結合を容易にするためのプロモーター、リボソームの転写ｍＲＮＡへの結合を可能にする発現制御配列、およびプロモーター活性を調節するためのエンハンサーを含む。プロモーターは、特異的細胞系統でのみ核酸挿入断片の転写を容易にし、他の細胞型では容易にしない、またはこのような他の細胞型中では相対的に低レベルでのみ容易にする、組織特異性プロモーターであり得る。発現ベクターの設計は、遺伝子導入されるべき宿主細胞、遺伝子導入方式、および核酸挿入断片の転写の所望のレベルに依存する。
【０５２６】
原核生物（例えば、細菌細胞）または真核生物（例えば、酵母、昆虫または哺乳動物細胞）の遺伝子導入に好適な多数の発現ベクターが当技術分野において既知である。真核細胞の遺伝子導入に好適する発現ベクターとしては、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＥＦ．ＰＧＫ．ｐｕｒｏ、ｐＴｋ２、ｐＲｃ／ＣＮＶ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ポリアデニル化部位および伸長因子１−αプロモーターを組み込んだ非複製アデノウィルスシャトルベクターおよび最も好ましくはサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターを組み込むｐＡｄＥａｓｙベース発現ベクターが挙げられる。昆虫細胞中での発現のために、バキュロウィルス発現ベクターを利用し得、この例としては、ｐＶＬ１３９２およびｐＶＬ９４１などのｐＶＬベースベクター、およびｐＡｃＵＷ１などのｐＡｃＵＷベースベクターが挙げられる。本発明の実施形態による哺乳動物細胞中での核酸挿入断片の発現のために好ましい発現ベクターとしては、ｐＥＦ．ＰＧＫ．ｐｕｒｏなどのＣＭＶまたは伸長因子１ａプロモーターを有するプラスミドが挙げられる（Ｈｕａｎｇ，Ｄａｖｉｄ  Ｃ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９７）１４：４０５−４１４）。ｐＥＦ．ＰＧＫ．ｐｕｒｏプラスミドは、ＳＶ４０起点、ＥＦ−１ａプロモーター、ポリクローニング部位およびポリＡ領域を含み、本明細書に記載のペプチドまたはキメラタンパク質をコードする核酸挿入断片の発現に特に好ましい。
【０５２７】
種々の形態の発現ベクターが当技術分野において既知であり、このような任意の好適な発現構築物を意図する目的のために使用され得る。ウィルス移入方法も本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤をコードする核酸の標的細胞中へのインビトロまたはインビボでの導入を行うために使用できる。標的細胞への送達のために発現ベクターをパッケージ可能な好適なウィルスとしては、アデノウィルス、ワクシニアウィルス、トリのレトロウィルス、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）およびＥＢＶを含むマウスおよびヒト起源ヘルペスウィルス、ＳＶ４０などのパポバウィルス、ならびにアデノ随伴ウィルスが挙げられる。本明細書で記載の方法で有用な特に好ましいウィルスとしては、複製能欠損型組換えアデノウィルスまたはその他のウィルスが挙げられる。組換えウィルスを、局所投与または全身投与して、ペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸の標的細胞への送達を行い得る。本明細書に記載のペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸はまた、当技術分野において既知の、従来の低温ショックまたはヒートショックまたは例えば、リン酸カルシウム共沈法電気穿孔プロトコルを用いて、細胞内にインビトロ送達され得る。
【０５２８】
遺伝子導入された細胞をスクリーニングして、核酸挿入断片の安定で再現可能な発現、および付随するコードされたペプチドまたは融合タンパク質の産生を示す培養物または細胞株を特定できる。種々の宿主細胞内の核酸の安定な統合および発現は当該技術分野において周知である。本明細書に記載のペプチドまたは融合タンパク質の発現に使用できる宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、ラクチス乳酸菌、ストレプトマイセスおよびシュードモナス、ブレビバクテリウムおよび特にＢ．リネンス菌株などの細菌およびプロバイオティクス細菌、サッカロマイセスおよびピキアなどの酵母、昆虫細胞、鳥類細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＨａＲａｓ、ＷＩ３８、ＳＷ４８０、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞などの哺乳動物細胞が挙げられる。組換えタンパク質産生のための大腸菌の使用はよく知られており、このような発現系で使用するための好適なプロモーターとしては、Ｔ７、ｔｒｃおよびｌａｃＵＶ５（Ｔｅｇｅｌ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１１，２７８：７２９−７３９）が挙げられる。宿主細胞は、標準的精製技術を使用し得る場合は、宿主細胞、および／または上清由来の発現された産物の精製の前に、導入された核酸の発現を容易にするための条件下で好適な培地中にて培養される。さらに、発現産物は、下記の標的化ミニ細胞調製物が作製される宿主細胞（例えば、大腸菌などの細菌細胞）内でのＥＬＩＳＡによる定量化のためにヒスチジンタグを含み得る（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２００７，１１：４３１−４４５）。
【０５２９】
特に、ミニ細胞（例えば、Ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｄｅｄ  ｆｏｒ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｉｎｉｃｅｌｌ  ｌｏｃｕｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｐｒｏｐｅｒ  ｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｓｅｐｔｕｍ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｃｅｌｌ，５６；６４１−６４９，１９８９）、リポソーム、ゴースト細菌細胞、ｃａｖｅｏｓｐｈｅｒｅ、合成ポリマー薬剤、超遠心分離ナノ粒子および他の無核ナノ粒子を、標的細胞へのカーゴの標的化送達のために、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤、核酸または発現ベクター（例えば、プラスミド）と共に添加し得る。このようなシャトルは、注射のために、または放出のため胃の酸環境を通過する移行および小腸を介するカーゴの取り込みのための経口摂取のために、処方され得る。
【０５３０】
ミニ細胞は、正常細胞分裂を制御する遺伝子の変異により産生され得るナノサイズの細胞であり、細胞質を含み、従って親細胞のタンパク質発現のための細胞質成分を含むが、これは無染色体性であり、自己複製できない。細胞分裂を制御する遺伝子を抑制すること（または上方制御すること）によるミニ細胞の生成は、静脈内注射で通常使用されるよりも遙かに少ない投与量で腫瘍への薬物を送達するための解決策を提供することが示された（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＪＣ（２００７），Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ；１１；４３１−４４５）。本発明との関連でのミニ細胞は、遺伝子変異および／または関与する細胞成分の抑制によるなどの細胞分裂工程（例えば、二分裂）の乱れまたは障害から生ずる場合があるように、親細胞の異常細胞分裂により産生される任意の無染色体細胞であり得る。本明細書に記載の方法で使用するためのミニ細胞は、従来から既知の方法、例えば、国際公開第０３／０３３５１９号および米国特許第７，１８３，１０５号、ならびにＭａｃＤｉａｒｍｉｄ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２００７に記載の方法により作製できる。これらの全ての内容は、相互参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。細菌性ミニ細胞を生成するための細胞分裂を制御する細菌遺伝子の不活性化は、例えば、Ｄｅ  Ｂｏｅｒ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｄ  ａ  ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｄｅｄ  ｆｏｒ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｉｎｉｃｅｌｌ  ｌｏｃｕｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｓｅｐｔｕｍ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ”．Ｃｅｌｌ  ５６，１９８９，ｐｐ．６４１−６４９でさらに記載される。密度勾配遠心分離（例えば、オプティプレップ（登録商標）、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ  ＰＬＣ，Ｄｕｎｄｅｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）およびクロスフロー濾過を利用するインタクトミニ細胞の精製方法は、米国特許第７，６１１，８８５号および同第８，００３，０９１号に記載されている。両特許の内容も、相互参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
【０５３１】
本明細書で有用なミニ細胞が誘導される細菌細胞の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、ＭｉｎＡ、ＭｉｎＢ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ＭｕｋＡ１、またはＭｕｋｅＥに変異を有する、またはｍｉｎＢ、ｍｉｎＥ、ｆｌｓＺ、ｓｄｉを過剰発現するもの）、枯草菌属菌種（例えば、ｍｉｎＣ、ｍｉｎＤ、ｒｉｐＸに変異を有する、またはｓｍｃ変異またはＯｒｉＣ欠失を有する）、ラクトバチルス属菌種、およびシュードモナス属種種などの細菌が挙げられる。細菌は、グラム陽性（例えば、リステリア・モノサイトゲネス）またはグラム陰性（例えば、緑膿菌）であり得る。外膜中にポリンを有する細菌（すなわち、通常グラム陰性菌であるが、いくつかのグラム陽性菌もポリンを有する）から分離されたミニ細胞は、標的細胞に送達されるべき核酸、発現ベクターまたは本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤のミニ細胞への添加を容易にするために特に好ましい。ミニ細胞はまた、始原細菌または真核細胞からも誘導され得る。例えば、米国特許第７，１８３，１０５号を参照されたい。しかし、通常、細菌由来のミニ細胞、すなわち、細菌性親細胞から誘導されたミニ細胞が利用される。
【０５３２】
本発明による治療を実施するための細胞へのミニ細胞の標的化は、任意の好適なターゲティング部分の使用により達成され得る（例えば、ミニ細胞またはリポソームなど上の二重特異性抗体、ｓｃＦｖ標的化ペプチドなどを介して）。ターゲティング部分は、ミニ細胞の表面上で発現され得る、または、例えば、ミニ細胞は、１個または複数の選択ターゲティング部分でタグ付けまたは標識され得る。特に好ましい実施形態では、ミニ細胞の腫瘍細胞への標的化は、ミニ細胞表面リポ多糖類のＯ抗原成分および標的化される哺乳動物細胞に特異的な細胞表面受容体（例えば、ＥＦＧＲ）を認識する二重特異的抗体複合体の形のターゲティング部分を用いて達成され得、複合体の２個の抗体はプロテインＡ／Ｇを使用して、Ｆｃ領域を介して一緒に連結されている（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，ＪＣ（２００７），Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ；１１；４３１−４４５、および国際公開第０３／０３３５１９号を参照）。しかし、本発明はこれに限定されず、他のターゲティング部分も上述のように採用し得る。
【０５３３】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、ミニ細胞内で、またはミニ細胞上で標的細胞または組織に輸送される。例えば、Ｌｃｋ活性化剤は、ミニ細胞中に添加され、ミニ細胞の膜中で発現され、またはミニ細胞の膜上で、例えば、電荷会合により運搬され得る。
【０５３４】
ミニ細胞は、Ｌｃｋ活性化剤または核酸を含むインキュベーション培地中でのミニ細胞のインキュベーションを介する受動的拡散により、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤または核酸（例えば、発現ベクター）を装填され得る。装填を支援するために、ミニ細胞はＬｃｋ活性化剤または核酸に対し透過性にされ得る（例えば、ミニ細胞に穴を開けることにより）、または薬剤に対するミニ細胞の透過性を、従来から既知の技術によるなどの他の方法で増大または強化し得る。
【０５３５】
特に、細菌性ミニ細胞の膜を介する本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤および核酸の侵入は、種々の既知の可逆的および不可逆的方法を使用して容易にされ得る。これらは、電気穿孔（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，２００５，４：１−７）、ジギトニン（Ｍｅｌｏ  ＲＦ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，１９９８，１６：９９−１０５）、ＮＳＡＩＤＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  Ｔ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，２００８，２８：１００−１０５）、トリトン−Ｘ１００（ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｎ  ＡＬ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ，２００９，１４（２）：１−１０）、植物サポニン（Ｂａｃｈｒａｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｎｉ−Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，８：５７５−５８４）、乳酸（Ａｌａｋｏｍｉ  ＨＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，６６（５）：２００１−５）などへの暴露を含む。
【０５３６】
あるいは、そこからミニ細胞が産生され得る細菌または他の細胞は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の発現の発現ベクターで遺伝子導入され得、産生されるとミニ細胞は、発現されたＬｃｋ活性化剤を装填される。
【０５３７】
標的細胞中へのミニ細胞の含有物またはカーゴの侵入は、標的細胞上に発現された細胞表面受容体とのミニ細胞の相互作用から生ずる食作用による（例えば、好中球およびマクロファージによる）またはエンドサイトーシス（クラスリン媒介またはクラスリン非依存性エンドサイトーシス）によるミニ細胞の標的細胞中への移動、およびその後のミニ細胞の分解と標的細胞の細胞質中へのミニ細胞の内容物の放出（例えば、細胞内区画、例えば、エンドソームおよび／またはリソソームから）により行われる。
【０５３８】
ミニ細胞の装填を支援するために、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の実施形態のペプチド成分は、細菌由来ミニ細胞上に存在するＬａｍＢポリンを介した輸送を容易にするために、炭水化物部分、例えば、グルコース（ＤまたはＬ異性体）に連結されてよい。ポリンスーパーファミリーは、グラム陰性菌の外側細胞膜を横切る水充填細孔を形成する多数のホモトリマー膜貫通型タンパク質を含む。ほとんどのポリンは、環境変化により調節される通常の非特異的チャネルを形成する。マルトポリン（ＬａｍＢポリン）は、大腸菌細胞中へのマルトースおよびマルトデキストリンの誘導拡散に関与する。特に、ＬａｍＢタンパク質はまた、グルコースの拡散を容易にでき（ｖｏｎ  Ｍｅｙｅｒｂｕｒｇ  Ｋ  ａｎｄ  Ｎｉｋａｉｄｏ  Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．７８：ｐｐ１１００−１１０７，（１９７７））、グルコースは、広範囲の試験された糖類からインビトロでＬａｍＢタンパク質を横切る最速の拡散速度を有することが明らかにされた（Ｌｕｃｋｅｙ  Ｍ  ａｎｄ  Ｎｉｋａｉｄｏ  Ｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．７７：ｐｐ１６７−  １７１，（１９８０））。本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤、融合タンパク質およびそのペプチド成分は、超音波処理または界面活性剤を用いた細胞膜の破壊、遠心分離による膜および固体断片の除去、および適用可能な場合には、親和性または免疫親和性クロマトグラフィーにより、当該技術分野において既知の方法で溶液または上清からの精製により細胞培養物から精製できる。使用可能なこのような好適な固体基材および支持体としては、限定されないが、アガロース、セファロースおよび他の商業的に入手できる支持体（例えば、ラテックス、ポリスチレン、またはデキストランなどのビーズ）が挙げられる。その後の溶出およびそれからの濃縮のために、本発明のペプチドまたは融合タンパク質を固体支持体上に固定するための抗体、その結合フラグメントまたは他の好適な結合分子を、一般に用いられるアミドまたはエステルリンカーを利用して、または吸着により、固体基材に共有結合させ得る。
【０５３９】
さらに、リポソーム、高分子、固体金属含有ナノ粒子などでの使用に好適なアルブミン、ゼラチン、リン脂質などのナノ粒子を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の送達のために利用し得る（例えば、Ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ＷＨ  ＆  Ｂｏｒｍ  ＰＪＡ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，３（２）：１３３−１４９を参照）。標的細胞の種々のリガンドまたは受容体への抗体を用いたナノ粒子の外側コーティングの技術は、十分に認められており、本発明の実施形態でも用いることができる。
【０５４０】
特に、本発明によるＬｃｋ活性化剤の脂質送達は、リポソーム、固体脂質ナノ粒子、逆脂質ミセル、脂質微小管および脂質マイクロシリンダーによるものを含む（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｍ  Ｊ  ＆  Ｅｈｒｈａｒｄｔ  Ｃ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ，２０１２，９（１２）：１４８９−１５０３）。ペプチドカーゴ含有リポソームは、例えば、噴霧器として経皮送達用に、鼻腔内用に、眼および頬側経路用に、および経口用に、非経口および肺性経路用に提案されてきた（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｍ  Ｊ  ＆  Ｅｈｒｈａｒｄｔ  Ｃ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ，２０１２，９（１２）：１４８９−１５０３で概説されている）。リポソームは、薬物および遺伝子送達担体として、さらに最近は、ペプチド送達担体として広範に研究されており（Ｐｈａｒｍａｇａｐ  Ｉｎｃより２０１２年８月２１日出願の国際公開第２０１３／０３３８３８Ａ１号、発明者：Ｓｏｋｏｌｉ  Ｋ  ＆  Ｃｈａｂｏｔ  ＪＭ）、ペグ化リポソーム製剤は、大抵の場合、中性脂質とアニオン性脂質の混合物を含む。
【０５４１】
多数の臨床的に実証されたリポソームベース薬物療法が利用でき、非標的化リポソームと比較して、標的化リポソームは、腫瘍組織中で高められた細胞内薬物送達を達成する（Ｋｉｒｐｏｔｉｎ  ＤＢ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００６，６６：６７３２）。さらに、神経膠腫の治療のための、血液脳関門を横切るリポソーム媒介遺伝子送達の成功が最近報告された（Ｙｕｅ  Ｐ−Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１４，１３：１９１）。リポソームベース細胞標的化と、細胞内部移行手法との組み合わせは、本発明の方法によるＬｃｋ活性化剤の細胞への送達に利用できる（例えば、病原体または癌細胞などに対する免疫系／免疫応答を高めるためにＴ細胞へ）
【０５４２】
標的細胞（例えば、免疫細胞）への本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の送達を改善する方法は、ＣＤ３またはヒト化抗ＣＤ４抗体（ＴＮＸ−３５５、現在ではイバリズマブ（ＴＭＢ−３５５）として知られる）Ｚｈａｎｇ  Ｘ−Ｑ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００６，５０（６）：ｐｐ  ２２３１−２２３３、により記載された）などの免疫細胞により選択的に発現された受容体を認識する標的化リガンドでのリポソームの表面の官能化を含む。イバリズマブは、ＨＩＶの一次受容体であるＣＤ４を結合する非免疫抑制モノクローナル抗体であり、ウィルス侵入プロセスを抑制する（イバリズマブ（ＴＭＢ−３５５）：ＴａｉＭｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ．２００９−０９−０９）。リポソームの外表面上のペグ化はまた、免疫細胞または癌細胞上のＰＥＧユニットおよび受容体を同時に標的化する二重特異的抗体またはその誘導体の使用を容易にする。本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドを切断する、ＭＭＰ９／２切断配列に連結されたＬｃｋ活性化剤で癌細胞を標的化することにより、腫瘍浸潤リンパ球抗癌活性を強化できる。発明者らは、ＭＭＰ９／２は、本明細書で記載のＬｃｋ活性化剤ポリペプチドを切断しないことを示した。従って、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、標的細胞（例えば、癌細胞または免疫細胞）上に発現されたＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）または別の抗原などの表面抗原を標的にするリポソーム内に封入され得る。
【０５４３】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤、ペプチド、融合タンパク質、遺伝子改変抗体および他の結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）は、例えば、それらの精製および／またはそれらの細胞株に対する結合能力の評価のために、当該技術分野において公知のタグ（例えば、ｃ−ｍｙｃおよびポリヒスチジンタグ）を有して宿主細胞中で発現され得る。このようなタグが利用される場合、コードされたＬｃｋ活性化剤、ペプチドなどは、エンドペプチダーゼを用いてタグの除去を容易にする好適なアミノ酸配列をさらに含み得る。同様に、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤、ペプチド、融合タンパク質などをコードする核酸は、上述の親和性クロマトグラフィーによる精製のために宿主細胞からの翻訳産物の分泌を容易にするために、シグナルペプチド配列をさらに含み得る。免疫親和性クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィープロトコル用の固体基材の作製のためのプロトコルは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ．ｅｔ  ａｌ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８およびその後の最新情報に記載される。
【０５４４】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤、そのペプチド成分、融合タンパク質、および核酸は、単離または精製された形態で提供できる。本明細書で使用される場合、用語の「精製された」は、例えば、電気泳動および／または他の技術で評価して、８０％純度超のレベル、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、またはそれを超える（例えば、９９％以上）のレベルへの部分精製を包含する。
【０５４５】
またさらなる実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤のペプチド成分の遊離末端は、例えば、メチル化され、アセチル化され、または複数のエチレングリコールモノマー単位でペグ化されて、インビボでのプロテアーゼによる分解に対しそれほど耐性でなくされる、または腎臓を介するＬｃｋ活性化剤の循環からの除去を抑制し得る。ポリペプチド／ペプチドのペグ化方法は、当該技術分野において周知であり、全てのこのような方法は明示的に包含される。通常、本発明により実施される方法で使用されるペグ化ペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の２個以上のモノマー単位、通常、ＰＥＧの約２〜約１１モノマーに結合される（すなわち、（ＰＥＧ）ｎのｎは２〜１１に等しい）。通常、ｎは２である。さらに、本発明により実施されるＬｃｋ活性化剤を含むペプチドは、環化されて剛性、およびその結果としてのインビボ安定性が高められ、種々のこのような方法は、当技術分野において既知である。
【０５４６】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、本発明により適用可能な疾患または状態の予防または治療のために、単一の薬物として対象に投与され得るが、少なくともいくつかの実施形態では、治療薬は、疾患または状態の治療のための１種または複数の他の薬物（すなわち、予防薬または治療薬）と組み合わせて投与され得る。チェックポイント遮断薬などの、特定の疾患または状態の治療に従来使用される任意の好適な薬物を、併用療法において本明細書に記載の治療薬と共に利用し得る。
【０５４７】
本発明による併用療法で使用され得る従来の抗ウィルス薬は、例えば、レトロウィルス薬物、プロテアーゼ阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、細胞進入阻害剤、およびノイラミニダーゼ阻害剤から選択され得る。
【０５４８】
例としては、ジドブジン（ＡＺＴ）、アバカビル、ラミブジン、エムトリシタビンおよびアシクロビルなどのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤；テノホビルなどのヌクレオチド逆転写酵素阻害剤；ネビラピンおよびエファビレンツなどの非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤；マラビロクおよびエンフビルチドなどの細胞進入阻害剤；ラルテグラビル、エルビテグラビル、およびドルテグラビルなどのインテグラーゼ阻害剤；ダルナビル、アタザナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、およびリトナビルなどのプロテアーゼ阻害剤；ならびにザナミビルおよびオセルタミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤が挙げられる。
【０５４９】
少なくともいくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、コンビビル（ジドブジンおよびラミブジン）、トリジビル（アバカビル、ジドブジンおよびラミブジン）、カレトラ（ロピナビルおよびリトナビル）、エプジコム（アバカビルおよびラミブジン）、ツルバダ（テノホビルおよびエムトリシタビン）、アトリプラ（エファビレンツ、テノホビルおよびエムトリシタビン）、スタリビルド（エルビテグラビル、コビシスタット、テノホビルおよびエムトリシタビン）およびトリーメク（ドルテグラビル、アバカビルおよびラミブジン）からなる群から選択され得るものなどのＨＩＶまたは他のレトロウィルス感染症の治療のための従来の併用療法剤に含まれ得る。
【０５５０】
本発明による併用療法で使用され得る従来の抗菌薬は、例えば、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、アミノグリコシド、スルホンアミド、キノロン、およびオキサゾリジノンなどの抗生物質からなる群より選択され得る。
【０５５１】
本発明の方法による併用療法で使用され得る従来の抗原虫薬は、例えば、メトロニダゾール、オルニダゾール、エフロルニチン、フラゾリドン、メラルソプロール、チニダゾールおよびピリメタミンからなる群より選択され得る。
【０５５２】
本明細書に記載の併用療法で使用され得る従来の蠕虫駆虫薬としては、アルベンダゾール、メベンダゾール、トリクラベンダゾール、フルベンダゾール、およびフェンベンダゾールなどのベンゾイミダゾールが挙げられる。
【０５５３】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤はまた、別の疾患または状態のための従来の薬物による治療から生ずる日和見感染の治療にも使用され得る。例えば、慢性骨髄性白血病の治療によく使用される薬物グリベック（イマチニブ、ＳＴ１５７１）は、強力なチロシンキナーゼの阻害剤であり、Ｌｃｋ活性の抑制を介してＴＣＲ誘導増殖および活性化を低減させ（Ｓｅｇｇｅｗｉｓｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｂｌｏｏｄ，１０５：２４７３−２４７９）、これは、日和見感染の誘導を暗示する。これはまた、イマチニブ、ニロチニブまたはダサチニブなどの他のチロシンキナーゼ阻害剤からの副作用の改善にも同様に適合する。例えば、細菌スーパー抗原（例えば、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ））などの免疫強化薬物により生じる潜在的な病的状態にもかかわらず、ＬｃｋがＳＥＡにより活性化されること、および選択的Ｌｃｋ活性化剤の欠乏を考慮して、慢性骨髄性白血病におけるイマチニブ媒介Ｔ細胞免疫抑制の予防にＳＥＡを使用すべきとの提案がなされてきた（Ｗａｎｇ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１４，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ６８２０１０）。
【０５５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の病原性感染または他の疾患または状態の予防または治療のための従来の薬物は、例えば、共有結合により、電荷引力により、または好適なリンカーの使用により、本発明によるＬｃｋ活性化剤と複合体形成され得る。薬物をＬｃｋ活性化剤に連結するための好適なリンカーとしては、例えば、１〜１０原子長のリンカー、スルフヒドリルリンカーおよび／または好ましくは、薬物の放出のための、標的細胞または組織で、またはそれら内で、１つまたは複数の酵素切断部位（例えば、ＭＭＰ切断部位）を規定するアミノ酸またはアミノ酸配列が挙げられる。一例として、薬物は、上述の好適なリンカー系を用いて直接的にまたは間接的に、Ｌｃｋ活性化剤の化合物（例えば、式ＩＩのポリアミド部分）に（例えば、ポリアミド部分の末端ＮＨ２基または他の好適な末端基を介して）、または、例えば、ポリカチオン性ペプチド（ＰＰ）もしくは強化ペプチドまたは他のペプチド（ＡＰ／Ｐ）の末端に結合され得る。
【０５５５】
細胞に対する本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の活性および／または細胞毒性プロファイルは、細胞形態の評価、トリパンブルー色素排除法、アポトーシスの評価、細胞増殖試験（例えば、細胞数、３Ｈ−チミジン取り込みおよびＭＴＴアッセイ）、キナーゼ活性アッセイ、ウェスタンブロットおよび免疫蛍光法試験の１種または複数などの種々の従来から既知のアッセイにより測定され得る。
【０５５６】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、本発明の方法により哺乳動物に投与でき、または細胞をインビトロでＬｃｋ活性化剤と接触させることができる。同様に、本発明は、エクスビボ治療を提供し、この場合、細胞は、哺乳動物の外部でＬｃｋ活性化剤により治療され、その後、哺乳動物に戻す、哺乳動物に投与する、または細胞を哺乳動物中に移植する。
【０５５７】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤、ベクター（例えば、発現ベクター）または核酸は、目的の対象への投与のために、薬学的に許容可能な希釈剤、担体および／または賦形剤を含む医薬組成物として提供できる。Ｌｃｋ活性化剤または核酸は、経口、鼻腔内、吸入により（例えば、エアロゾル噴霧により）、静脈内、非経口、直腸内、皮下、注入により、局所、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、脊髄内、眼内、または任意の他の適切と見なされる経路を介して、投与できる。
【０５５８】
直腸および／または結腸は、エナミン（フェニルアラニンおよびフェニルグリシン）、５−アミノまたは−メトキシサリチレート、キレート化剤、中鎖脂肪酸、シクロデキストリン、ｐＨ感受性高分子コート薬物、アゾポリマープロドラッグなどの、ペプチドに結合された種々の吸収促進薬を用いてペプチドの薬物吸収を高めるための経路を提供し（例えば、Ｔｉｗａｒｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２０１０，２：０１−１１；Ｋｏｌｔｅ  ＢＰ  ｅｔ  ａｌ，Ａｓｉａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，２（１４）：２１−２８；Ｐｈｉｌｉｐ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ，ＯＭＪ，２０１０，２５：７０−７８；およびＬａｋｓｈｍｉ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ａｓｉａｎ  Ｊ  Ｒｅｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，２（４）：１４３−１４９を参照）、このような投与方法および本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の形態も本明細書に明示的に包含される。
【０５５９】
医薬組成物は、例えば、液体、懸濁剤、乳剤、シロップ、クリーム、摂取可能錠剤、カプセル、丸薬、坐剤、粉剤、トローチ剤、エリキシル剤、または選択投与経路に適切な他の形態であり得る。
【０５６０】
本発明による方法に有用な医薬組成物は、医薬水溶液を含む。注射可能な組成物は、通針性が存在する程度に流体であり、通常、製造後の貯蔵を可能にするために、所定の期間の間、常態で安定である。さらに、薬学的に許容可能な担体は、任意の好適な従来から既知の溶媒、分散媒、水、生理食塩水および等張性配合物または溶液、界面活性剤を含み得、任意の好適な薬学的に許容可能な担体（例えば、経口または局所的に許容可能な担体）が利用され得る。好適な分散媒は、例えば、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、など）、植物油およびこれらの混合物の１種または複数を含み得る。特に、Ｌｃｋ活性化剤または核酸は、例えば、不活性希釈剤、同化可能な食用担体と共に処方でき、および／またはそれは、硬または軟シェルゼラチンゲル中に封入され得る。
【０５６１】
本明細書に記載の医薬組成物浜田、インビボおよび／または局所投与に好適な１種または複数の、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸、およびチメロサールなどの保存剤を組み込むことができる。加えて、組成物の持続的吸収は、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤組成物中で使用することにより生じさせ得る。本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤または核酸を含む錠剤、トローチ剤、丸薬、カプセル剤などはまた、１種または複数の次記を含むことができる：トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたはアルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；スクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤；および香味料。
【０５６２】
医薬組成物中での上述の成分および媒体の使用は、よく知られている。任意の従来の媒体または成分が本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤と適合しない場合を除いて、本明細書に記載の治療および予防医薬組成物中でのそれらの使用が含まれる。
【０５６３】
本明細書で使用される場合、「併用療法」は、同じまたは異なる経路による他の薬物と同じまたは異なる配合物中の本発明によるＬｃｋ活性化剤または核酸の事前の、同時のまたは逐次の投与を意味し、それによりＬｃｋ活性化剤および／または核酸は、重なり合う治療濃度域中でそれらの効果を発揮する。
【０５６４】
投与および投与量の均一性の達成を容易にするために、非経口組成物を投薬単位形態で処方することが特に好ましい。本明細書で使用される場合、投与単位剤形は、治療すべき対象にとって単位投与量として適する物理的に別々の単位を意味し、各単位が、使われる適切な担体および／または賦形剤と共同して所望の治療または予防効果を生じるように計算された、所定量の少なくとも１種の本発明によるＬｃｋ活性化剤または核酸を含む。投与単位剤形が、例えば、カプセル剤、錠剤または丸薬である場合、種々の成分は、投与単位の物理的形態を別の状態に変えるための、または対象への投与を容易にするためのコーティング（例えば、シェラック、糖類またはその両方）として使用され得る。
【０５６５】
医薬組成物は通常、少なくとも約１重量％の本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤を含む。パーセンテージは変わってもよく、通常は、組成物または製剤の約５重量％〜約８０重量％であり得る。この場合も、本発明によるＬｃｋ活性化剤または核酸の量は、提案された投与経路を考慮して、好適な有効投与量が対象に送達されるような量である。好ましい経口医薬組成物は、約０．１μｇ〜１５ｇのＬｃｋ活性化剤を含む。
【０５６６】
本発明によるＬｃｋ活性化剤または核酸の投与量は、Ｌｃｋ活性化剤または核酸が予防的用途で投与さるのかまたは治療的用途で投与されるのか、意図される薬剤投与の疾患、状態または目的、疾患または状態の重症度、対象の年齢、ならびに対象の体重および認められた原則に従って医師または看護助手により決定され得る総体的な健康などの関連因子を含む多くの因子に依存する。例えば、低投与量が初期に投与され、これはその後、対象の応答の評価後に投与毎に増大される。同様に、投与頻度は、同様の方法で、すなわち、各投与間で対象の応答を継続的に監視し、さらに必要に応じて、投与頻度を増やす、あるいは投与頻度を減らすことにより、決定され得る。
【０５６７】
通常、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、本発明により実施される方法に従って投与されて、最大約１００ｍｇ／ｋｇの個々の体重、より一般的には、最大約５０ｍｇ／ｋｇ体重、および最も一般的には、約５ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲のＬｃｋ活性化剤の投与量を与える。少なくともいくつかの実施形態では、Ｌｃｋ活性化剤は、約５〜２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、通常約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲、および最も一般的には、約１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲のＬｃｋ活性化剤の投与量を与えるように投与される。経口投与される場合には、１日当たり最大約２０ｇのＬｃｋ活性化剤が投与され得る（例えば、１日当たり４経口用量で、各用量は５ｇのＬｃｋ活性化剤を含む）。
【０５６８】
静脈内経路については、特に好適な経路は、Ｌｃｋ活性化剤または核酸の血管中への全身分布のための注射を介するもので、これは、治療されるべき組織または特定の臓器に供給する。さらに、Ｌｃｋ活性化剤は、任意の好適な注入または灌流技術により送達できる。Ｌｃｋ活性化剤または核酸（例えば、細菌由来ミニ細胞中に添加された発現ベクター）はまた、例えば、胸膜腔または腹膜腔などの腔中に送達されるか、または治療される組織中に直接注射される。
【０５６９】
本明細書で記載の方法で有用な好適なクローニングおよび発現ベクターおよびそれらの作製および送達のための方法は、当業者によく知られたマニュアルおよびハンドブックに記載されており、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１  ａｎｄ  ２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ならびにリプリントおよびその最新情報を参照されたい。これらの内容は、相互参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。同様に、本明細書に記載の組成物で有用な好適な薬学的に許容可能な担体および配合物は、例えば、当業者に周知のハンドブックおよびテキスト、例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９５）”、ならびにその任意のリプリントおよび最新情報で見つけることができる。細胞の遺伝子導入および核酸挿入断片のインビボ発現の方法およびプロトコルは、例えば、国際公開第２００６／３１９９６号、同第２００６／３１６８９号、同第２００６／２９９８１号、同第２００６／２９００５号、米国特許出願公開第２００６／００６３７３１号、同第２００６／００６３９２４号に記載されている。全ての前述の刊行物、上記マニュアルおよびハンドブックは、相互参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５７０】
本明細書に記載のように治療される哺乳動物は、本発明により治療可能な任意の哺乳動物であり得る。例えば、哺乳動物は、ウシ、ブタ、ヒツジまたはウマファミリーのメンバー、マウス、ウサギ、モルモット、ネコまたはイヌなどの臨床試験動物、または霊長類もしくはヒトであり得る。通常、哺乳動物はヒトである。
【０５７１】
本発明の別の態様は、本明細書で言及される疾患および／または状態（加齢関連変化を含む）を治療するおよび／または予防することにおける使用のための薬物の製造における本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドの使用を提供する。
【０５７２】
本発明の別の態様は、本明細書で言及される疾患および／または状態（加齢関連変化を含む）を治療するおよび／または予防することにおける使用のための、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドの使用を提供する。
【０５７３】
本発明は、多くの非限定的実施例により以降でさらに説明される。
【０５７４】
実施例
実施例１：インビトロでのポリアルギニンポリペプチドによるリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）の活性化。
Ｌｃｋを活性化する本発明のポリペプチドの能力をインビトロで調査した。Ｌｃｋは、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーのメンバーである。インビトロＬｃｋ活性化キナーゼ試験を、ペプチド基質（ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ）および片対数用量範囲の試験ポリペプチドの存在下で、１５μＭの見かけのＫｍ内のＡＴＰ濃度を用いて、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｄｕｎｄｅｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐａｒｋ，Ｄｕｎｄｅｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）で実施した。全ての結果は、対照（１００％）に対するパーセンテージＬｃｋ活性である。
【０５７５】
試験ポリペプチドを、１．０μＭの濃度で評価した。
図１は、４、５、または６個の連続したアルギニン残基を含むポリペプチドが１μＭのペプチド濃度でＬｃｋを活性化しないことを示す。
【０５７６】
１０個の連続したヒスチジン残基（デカヒスチジンペプチド；１０Ｈｉｓ）を含むペプチドを１μＭの濃度で使用した場合、Ｌｃｋ活性の増大は観察されなかった。
【０５７７】
１０個の連続したオルニチン残基（デカオルニチンペプチド；１０Ｏｒｎ）を含むペプチドを１μＭの濃度で使用した場合、無視できる程度のＬｃｋ活性が観察された。
【０５７８】
しかし、意外にも、例えば、８〜２０個の連続したアルギニン残基を含むポリペプチドは、Ｌｃｋを活性化できる。８、９、１０、１２、１４、２０個の連続したアルギニン残基を含むポリペプチドは、１μＭのペプチド濃度でＬｃｋを活性化する。
【０５７９】
例えば、１２マーのアルギニン配列（ＩＫ０１２００）はＬｃｋを活性化し、対照に対して、４０１％のＬｃｋ活性化をもたらす。
【０５８０】
図１はまた、１０個の連続したリシン残基（デカリシンペプチド；１０Ｌｙｓ）が１μＭのペプチドの濃度でＬｃｋ活性を１６１％増大させると見出されたことを示す。
【０５８１】
図１は、連続したＤアルギニン残基を含むペプチドが１μＭのペプチド濃度でＬｃｋを活性化することを示す。例えば、８マーのアルギニン配列（ＩＫＤ００８００）は、Ｌｃｋを活性化し、対照に対し８０％のＬｃｋ活性をもたらす。１４マーのアルギニン配列（ＩＫＤ１４００）はＬｃｋを活性化し、対照に対し２２８％のＬｃｋ活性化をもたらす。
【０５８２】
図１はまた、連続したアルギニン残基および連続したヒスチジン残基を含むペプチドが１μＭのペプチド濃度でＬｃｋを活性化することを示す。例えば、９マーのアルギニン配列および１０マーのヒスチジン配列（ＩＫ００９１０）はＬｃｋを活性化し、対照に対し３４８％のＬｃｋ活性化をもたらす。
【０５８３】
重要なことに、図１はまた、アニオン性残基を含むペプチドもＬｃｋを活性化することも示す。例えば、９マーのアスパラギン酸配列（ＩＫＤ９；ＤＤＤＤＤＤＤＤ）は、１μＭのペプチド濃度でＬｃｋを活性化しない。
【０５８４】
このデータは、本発明のペプチドがリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）を活性化することを示す。
【０５８５】
実施例２：ポリアルギニンおよびポリリシンポリペプチドによる選択的リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）活性化。
Ｓｒｃファミリーキナーゼを活性化する本発明のポリペプチドの能力をインビトロで調査した。ペプチドを利用したキナーゼ活性化試験を、実施例１に記載のように実施し、全てのキナーゼ活性値を、対照に対するパーセンテージとして示す。
【０５８６】
図２は、Ｌｃｋは、図１のポリアルギニンＬｃｋ活性化ポリペプチドにより選択的に活性化され、Ｌｃｋ以外のＳｒｃファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）は、１μＭのペプチド濃度でポリアルギニンおよびポリリシンペプチドにより活性化されないことを示す。実施例１および図１と一致して、デカヒスチジンペプチド（１０Ｈｉｓ）は、この濃度でＬｃｋの活性化をなんら誘導しなかった。このデータは、Ｌｃｋ活性化ペプチドが選択的にＬｃｋを活性化し、Ｂｌｋ、ｃＳＲＣ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｈｃｋ、ＬｙｎまたはＹｅｓを活性化しないことを示す。
【０５８７】
実施例３：Ｌｃｋ活性化ポリアルギニンポリペプチドは、Ｌｃｋリン酸化を増大させ、Ｌｃｋ活性化ポリアルギニンポリペプチドは、Ｙ３９４でのＬｃｋリン酸化を増大させる。
ＬｃｋのＴｙｒ３９４のリン酸化は、Ｌｃｋキナーゼを活性化する高次構造開口部（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｏｐｅｎｉｎｇ）を生じる。
【０５８８】
ウェスタンブロット調査を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｄｕｎｄｅｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）により実施した。簡単に説明すると、Ｌｃｋ（ｈ）を、標準的ＫｉｎａｓｅＰｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）反応条件（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）および１５μＭのＫｍ内のＡＴＰ濃度を用いて試験ペプチドの存在下でインキュベートした。反応を室温で４０分間進行させた後、ＳＤＳサンプルバッファーの添加により停止させた。それぞれの場合で、Ｌｃｋ酵素を２５μｌの反応当たり２０ｎｇが得られるように希釈した。化合物およびペプチドの非存在下での適切な対照、ならびにＬｃｋ（ｈ）およびＬｃｋ（ｈ）活性化キナーゼ両方の未処理試料も同様に実験した。その後、得られた試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび、抗体４Ｇ１０（抗リン酸化チロシン抗体）（図３参照）および抗ｐＹ３９４  Ｌｃｋ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ７５００）（図２参照）を用いるウェスタンブロット分析に供した。二次検出抗体（抗マウスＨＲＰ）を用いて追加のブロットも実施した。膜をＰｏｎｃｅａｕ  Ｓにより染色し、試料装填および効果的タンパク質転写を確認した。４Ｇ１０抗体は、一般的な抗リン酸化チロシン抗体であり、Ｌｃｋ中にはいくつかのチロシン残基が存在するが、自己リン酸化チロシン残基がただ１個、すなわち、Ｙ３９４の位置に存在する。従って、抗ｐｙ３９４抗体は、Ｌｃｋの自己リン酸化を特異的に検出する。試料は以下の通りであった（数字は、ゲルのレーンに対応する）：
１．分子量マーカー
２．標準Ｌｃｋ
３．標準Ｌｃｋ＋ペプチド基質＋ＡＴＰ（試験ペプチドなし）
４．標準Ｌｃｋ−ペプチド基質＋ＡＴＰ（試験ペプチドなし）
５．標準Ｌｃｋ＋ＡＴＰ＋１０Ａｒｇペプチド（ＩＫ００１００；１μＭ（ペプチド基質なし）
６．標準Ｌｃｋ＋ＡＴＰ＋１０Ａｒｇペプチド（ＩＫ００１００；１０μＭ（ペプチド基質なし）
７．標準Ｌｃｋ＋ＡＴＰ＋８Ａｒｇペプチド（ＩＫ００８００；１μＭ（ペプチド基質なし）
８．標準Ｌｃｋ＋ＡＴＰ＋８Ａｒｇペプチド（ＩＫ００８００；１０μＭ（ペプチド基質なし）
９．１０Ａｒｇ（ＩＫ００１００）（１０μＭ）（試験ペプチドのみ）
１０．８Ａｒｇ（ＩＫ００８００）（１０μＭ）（試験ペプチドのみ）
ウェスタンブロットプロトコルのステップは以下の通りであった：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル：            ２００Ｖで５０分
ウェスタンブロット転写：          ２５Ｖで９０分
膜：                    ニトロセルロースプレカットブロッティング膜
０．２μｍ細孔径（ＬＣ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ））
ポンソー染色：                    ５％酢酸中の０．１％ポンソーＳ（ｗ／ｖ）
膜を１０ｍＬのＰＢＳＴおよび１０％ＢＳＡで１時間ブロックし、その後、一次および二次抗体を適用した。
【０５８９】
一次抗体：
１．ＰＢＳＴ中の抗４Ｇ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０５−７７７）１／１０００、４℃で一晩インキュベーション後、４ｘ２０ｍＬのＰＢＳＴで洗浄。
２．ＰＢＳＴ中の抗ｐｙ３９４Ｌｃｋ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）１／２５００、４℃で一晩インキュベーション後、４ｘ２０ｍＬのＰＢＳＴで洗浄。
【０５９０】
二次抗体：
ＰＢＳＴ中の抗マウスｈｒｐ（Ｓｉｇｍａ  Ａ５２７８）１／５０００、室温でスパイラルシェーカ上にて５時間４ｘ２０ｍＬのＰＢＳＴで洗浄。検出をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光基質−３７０７０（Ｐｉｅｒｃｅ）で行った。
【０５９１】
抗リン酸化チロシン４Ｇ１０抗体による検出は、図３Ａに示すようにレーン２〜８の全レーンでバンドを得た。レーン１の標準Ｌｃｋが微弱バンドをもたらしたことは、いくらかの内在性Ｌｃｋリン酸化を示唆する。ＡＴＰの存在下でのインキュベーションは、自己リン酸化と一致するバンドの強度の増大をもたらしたが、インキュベーションにおけるペプチド基質ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫの存在は、自己リン酸化の程度に大きく影響するようには見えなかった（レーン３〜４参照）。試験ペプチド（８Ａｒｇ：ＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ００８００）；または１０Ａｒｇ：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ００１００））の存在下でのインキュベーションは、Ｌｃｋで観察されるリン酸化のレベルの顕著な増大をもたらした。さらに、リン酸化のレベルは、試験ペプチド濃度の増大と共に増大した（レーン５〜８参照）。対応するバンドはレーン９および１０（試験ペプチドのみ）では認められない。
【０５９２】
このデータは、Ｌｃｋを選択的に活性化するポリアルギニンポリペプチドがＬｃｋの自己リン酸化を高めることを示す。このデータはまた、ポリアルギニンポリペプチドが用量依存的にＬｃｋの自己リン酸化を高めることを示す。
【０５９３】
図３Ｂでの発色したウェスタンブロットは、抗ｐＹ３９４抗体により検出されたＹ３９４の位置のＬｃｋの自己リン酸化に関して得られた結果を示す。図から分かるように、標準Ｌｃｋレーン（レーン２）はバンドを示さず、チロシンＹ３９４位置での内在性Ｌｃｋリン酸化がないことを示している。ペプチド基質ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫのある場合とない場合のＡＴＰの存在下でのインキュベーションは、バンドの強度の増大をもたらさなかった（レーン３〜４）。試験ペプチドの存在下でのインキュベーションは、Ｌｃｋのアミノ酸位置Ｙ３９４で検出されるリン酸化レベルの顕著な増大をもたらした。この場合も、リン酸化のレベルは、試験ペプチド濃度の増大と共に増大した（図３Ｂのレーン５〜８参照）。対応するバンドはレーン９または１０で認められず、試験ペプチド８Ａｒｇ（ＩＫ００８００）および１０Ａｒｇ（ＩＫ００１００）との交差反応性がないことを示している。
【０５９４】
このデータは、Ｌｃｋを選択的に活性化するポリアルギニンポリペプチドがＹ３９４でＬｃｋの自己リン酸化を高めることを示す。このデータはまた、ポリアルギニンポリペプチドが用量依存的にＹ３９４でのＬｃｋのリン酸化を高めることを示す。
【０５９５】
実施例４：ポリアルギニンポリペプチドによるインビトロＬｃｋ活性化の増強
Ｌｃｋをインビトロで活性化するリシンおよびアルギニンの両方を含むポリペプチドの能力を調査した。ペプチドを利用するＬｃｋ活性化試験を、実施例１に記載のように実施し、全てのキナーゼ活性値を、対照に対するパーセンテージとして示す。
【０５９６】
図４は、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ（ＩＫ０９４００）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（ＩＫ１４０００）が１μＭでＬｃｋを活性化しないことを示す。同様に、このポリペプチドのより短い誘導体は、Ｌｃｋ活性化を示さないか、無視できる程度の活性化しか示さない。
例えば、ＲＳＫＡＫおよびＲＳＫＡＫ−ＲＲは、対照に対しわずか５％のＬｃｋの活性化を示す。
【０５９７】
図４は、非Ｌｃｋ活性化ポリペプチドが図１に記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドに融合されると、融合体は驚くべきことに、Ｌｃｋを活性化できるのみでなく、Ｌｃｋ活性化の予想外の強化が観察される。例えば、非Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹが、図１で示す選択的にＬｃｋを活性化する９個の連続したアルギニン残基を含むポリペプチド（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ；３２５％）に融合されると、得られたＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ融合体は、増大したＬｃｋ活性化（４９６％）を示す。
【０５９８】
図４から分かるように、Ｌｃｋ活性化は、ペプチドＲＳＫＡＫ単独について、または１〜４個のアルギニン残基に結合された場合は、観察されなかったか、または無視できる程度観察された。同様に、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹまたはＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ単独について、またはペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹが４個のアルギニン残基配列に結合された場合は、Ｌｃｋ活性化は観察されなかった。しかし、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹが５個の近接するポリアルギニン残基（ペプチドＩＫ１４４００）に結合された場合は、中程度のレベルのＬｃｋ活性化が観察された（８５％）。類似の結果が、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４５００）（８２％）により得られ、および全てＤアミノ酸からなるデキストロ−レベルソ（ｄｅｘｔｒｏ−ｒｅｖｅｒｓｏ）ペプチドｒｓｋａｋｎｐｌｙ−ｒｒｒｒｒｒ（ＩＤ９４６００）の場合は、これはＬｃｋ活性の６０％の増大を誘導した。
【０５９９】
意外にも、図４にも示すように、Ｌｃｋ活性のかなりの増大が、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲがシステインアミノ酸のペプチドの各末端への結合（すなわち、ペプチドＣ−ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲ−Ｃ：ＩＫ４５００Ｃ）（２２１％）により環化された場合、またはより長いポリアルギニン配列がペプチドＲＳＫＡＫおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹに結合された場合に得られた。類似のＬｃｋ活性化のかなりの増大がまた、より長いポリアルギニンがレベルソまたはデキストロ−レベルソ型のペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹに結合された場合にも得られた。例えば、ペプチドＲＳＫＡＫ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ５０９００）では５３１％のＬｃｋ活性の増大が観察され、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＹＬＰＮＫＡＫＳＲ（ＩＫ９Ｒ９４Ｙ）では６３０％のＬｃｋ活性の増大が得られ、ならびにｒｓｋａｋｎｐｌｙ−ｒｒｒｒｒｒｒｒｒｒ（ＩＫＤ１４８００）およびｒｒｒｒｒｒｒｒｒ−ｙｌｐｎｋａｋｓｒ（ＩＫＲ８１４００）では、それぞれ、４９０％および６１６％のＬｃｋ活性の増大が得られた。
【０６００】
さらに、ペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（ＩＫ９Ｒ９４Ｓ）では、Ｌｃｋ活性の５４２％の大幅な増大が得られた。図４にも示すように、Ｌｃｋ活性のわずかな増大が、ポリカチオン配列ＫＫＫＫＫＫＫＫＫまたはＲＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨをペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ（ペプチドＩＫ９４Ｋ９０およびＩＫ１４０１０参照）（それぞれ、４９％および３０％）ペプチドに結合した場合に得られ、Ｌｃｋ活性化／刺激は、ポリリシンおよびポリヒスチジン配列よりも、ポリアルギニン配列により、より大きな程度で強化されることを示す。
【０６０１】
Ｌｃｋ活性の大幅な増大がまた、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹを２個または３個の近接しているポリカチオン配列（すなわち、それぞれ、ポリアルギンまたはポリヒスチジン配列からなる）に結合した場合、または図４および図５で示されるように、反復ＲＫアミノ酸カプレットを含むポリカチオン配列に結合した場合に得られた。実際に、８８３％および８９９％のＬｃｋ活性の増大が、ペプチドＩＫ１１４８０およびＩＫ１４８１０で、それぞれ得られた。Ｌｃｋ活性の大幅な増大はまた、分岐ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（Ｂｒ  ＩＫ１４８１０）でも保持された。
【０６０２】
さらに、Ｌｃｋ活性の大幅な増大が、図５で認められるように、ペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ（ＩＫ９５０００）単独によりまたは５〜９個の範囲の近接アルギニンアミノ酸残基で試験したポリアルギニン配列に結合された場合に得られた。その表でまた示すように、類似のＬｃｋ活性の増大がペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−Ｒ（ＩＫ８０１５０）で得られた。
【０６０３】
ＲＶＫＶＫＶＶＶ（ＩＫ９５０００）がポリアルギニンおよびポリヒスチジン配列の組み合わせに結合される、または反復アルギニンおよびヒスチジン（ＲＨ）カプレットを含むポリカチオン配列に結合される場合の、ペプチドＬｃｋの刺激に対する結果も図５に記載される。この場合も、Ｌｃｋ活性の大幅な増大が観察され、ペプチドＲＶＫＶＫ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（ＩＫ５０８１０）の場合で、ペプチド対照の活性の７７８％のＬｃｋ活性の増大が観察された。
【０６０４】
これらの結果は、意外にも、非Ｌｃｋ活性化ポリペプチド（例えば、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ）が、１μＭのＬｃｋ活性化ポリアルギニンポリペプチド（例えば、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）を含む、本発明のＬｃｋ活性化ポリペプチドにより、Ｌｃｋ活性化を強化できることを示す。
【０６０５】
実施例５：Ｌｃｋ活性化融合ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、Ｌｃｋを用量依存的に活性化する。
図６は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１４８００」）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４８０４」）は、Ｌｃｋを用量依存的に活性化することを示す。「（２Ａｄｏｄ）４」は、４個の２−アミノドデカン酸を意味する。
【０６０６】
実施例６：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−２分泌を増大させる。
ＩＬ−２分泌を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
簡単に説明すると、野性型ジャーカット細胞（ヒトＴリンパ球細胞の不死化系）を、抗ＣＤ２８抗体およびアビジンの存在下で、ビオチン化抗ＣＤ３抗体への暴露により刺激した。培養期間（４８時間または７２時間）中、細胞を試験ポリペプチドに暴露した。細胞上清を、４８時間または７２時間の終わりに、上述の標準的な市販ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−２についてアッセイした。
【０６０７】
図７Ａは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド「ＩＫ００９００」ＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、４８時間の暴露後、野性型ジャーカット細胞中で対照に比較してＩＬ−２分泌を誘導することを示す。
【０６０８】
図７Ｂは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド「ＩＫ１４８００」ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、７２時間の暴露後、野性型ジャーカット細胞中で対照に比較してＩＬ−２分泌を誘導することを示す。
【０６０９】
これらのデータは、本発明のＬｃｋ活性化ポリペプチドは、ヒトＴ細胞株のＩＬ−２分泌を誘導でき、ＩＬ−２分泌は、非刺激ジャーカット細胞中で誘導されないことを示す。
【０６１０】
実施例７：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは単離ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を増大させる。
単離ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌に対するＬｃｋ活性化ポリペプチドの効果を調査した。
簡単に説明すると、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を健康なヒトＰＢＭＣから単離し免疫磁気的に分離した。ＩＬ−２のレベルを、Ｌｃｋ活性化融合ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲの存在下で、４８時間にわたる抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８刺激後に調査した。
【０６１１】
図８は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１４８００」）が、単離ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中で、対照に比較してＩＬ−２分泌を誘導することを示す。
【０６１２】
実施例８：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは単離ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を増大させる。
単離Ｔ細胞（ＣＤ３＋Ｔ細胞）からのＩＬ−２分泌に対するＬｃｋ活性化ポリペプチドの効果を調査した。
簡単に説明すると、単離Ｔ細胞（ＣＤ３＋）を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１４８００」）、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１５８００」）、およびＤアミノ酸のみを含むＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（すなわち、ｒｖｋｖｋｖｖｖｖ−ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ；「ＩＫＤ１５８００」）の５種の濃度範囲＋ビークル対照（０〜１．２５μＭ）と一緒に、７２時間培養し、その後、上清を集めて、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２についてアッセイした。
【０６１３】
図９は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、およびＤアミノ酸のみを含む、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（すなわち、ｒｖｋｖｋｖｖｖｖ−ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ）が、単離ヒトＴ細胞中で、対照と比較してＩＬ−２分泌を誘導することを示す。
【０６１４】
刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌に対するＬｃｋ活性化ポリペプチドの効果も調査した。簡単に説明すると、単離ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、５種の濃度範囲のＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ００９００」）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１４８００」）＋ビークル対照（０〜１．２５μＭ）と一緒に、２４時間培養した後、上清をＥＬＩＳＡによりＩＬ−２およびＩＦＮ−γについて評価した。Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲＲおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、刺激Ｔ細胞アッセイにおいて、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞中で対照に比較して、ＩＬ−２分泌を誘導する（データは示さず）。これらのデータは、本発明のＬｃｋ活性化ポリペプチドが、刺激ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を誘導できることを示す（データは示さず）。
【０６１５】
実施例９：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株中のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現を増大させる。
Ｔ細胞株上のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現に対するＬｃｋ活性化ポリペプチドの効果を調査した。
簡単に説明すると、野性型ジャーカット細胞（１ｘ１０６細胞）を、上記のように標準的ＲＰＭＩ媒体および１０％胎児の仔ウシ血清中で、非刺激でまたはＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシンで刺激して、９６時間にわたり培養した。細胞を図１０に記載した試験ペプチド（２．５μＭ濃度）に、全体で９６時間の培養期間にわたり暴露し、細胞ライセート中のＩＬ−２Ｒαレベルを上記の標準的な市販のＥＬＩＳＡフォーマットを用いて測定した。
【０６１６】
図１０は、ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）の発現が、刺激細胞をペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１４９００」）、ＨＨＨＨＨ−ＲＳＫＳＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１１４８０」）、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（「ＩＫ１４８２０」）、特に、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１４８００」）に暴露した場合に増大したことを示す。
【０６１７】
これらのデータは、本発明のＬｃｋ活性化ポリペプチドが、ヒトＴ細胞株上のＩＬ−２Ｒαの発現を誘導できることを示す。
【０６１８】
実施例１０：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、再刺激時に、疲弊したＣＤ４＋細胞上のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現を増大させる。
Ｔ細胞疲弊は、Ｔ細胞機能の段階的および進行性消失を特徴とし、結果的に応答細胞の物理的欠損に至り得る。インターロイキン２（ＩＬ−２）産生は、失われる最初のエフェクター作用の１つであり、その後に、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）産生の消失が続き、一方、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を産生する能力は、不活性化に対してより高い抵抗性がある。
【０６１９】
１μＭでＬｃｋを活性化しないペプチドＩＫ１４０００（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ）、およびＬｃｋ活性化融合ポリペプチドＩＫ１４８００（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）およびＩＫＤ１４８００（ｒｓｋａｋｎｐｌｙ−ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ）の、ＩＬ−２Ｒα発現に対する効果を調査した。
【０６２０】
マウスモデル（Ｔｇ４  Ｌｙ５．１（ＭＢＰトラッカーマウス）、Ｂ１０ＰｌｘＣ５７ＢＬ／６）を用いるＣＤ４＋Ｔ細胞疲弊アッセイを使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞受容体遺伝子導入Ｔ細胞を野性型ミエリン塩基性タンパク質ペプチド（ＷＴ−ＭＢＰ）で刺激し、完全応答性エフェクターＴ細胞を産生する、または改変ペプチドリガンド−ペプチドＭＢＰ（ＡＰＬ−ＭＢＰ）で刺激し、疲弊Ｔ細胞を産生する。これらを、ＩＬ−２中で静置しその後、調査下のいずれかの処理と共にＡＰＣ、単一用量のＡＰＬ−ＭＢＰペプチドで二次刺激する。
【０６２１】
細胞培養手順
上述のマウスから脾臓を取り出し、処理して脾細胞の単細胞懸濁液を生成した。ＭＢＰトラッカー脾細胞を３ｘ１０６／ｍＬで再懸濁し、ＷＴ−ＭＢＰ（対照、非疲弊細胞）またはＡＰＬ−ＭＢＰ（疲弊細胞を生成するために）で刺激した。細胞を７２時間刺激した。刺激後、Ｔ細胞をフィコール密度勾配により精製し、その後、２０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２中で２ｘ１０６／ｍＬで４日間再播種した。この静置期間の終わりに、細胞を再懸濁し（４ｘ１０５／ｍＬ、最終２ｘ１０４／ウェル）、照射ＡＰＣ（Ｂ１０ＰＬｘＣ５７ＢＬ／６マウス、４ｘ１０６／ｍＬ、最終濃度２ｘ１０５細胞／ウェル）、単一用量のＡＰＬ−ＭＢＰペプチドおよび一連の濃度の試験ペプチドを用いて再刺激した。培養の４８〜７２時間後、細胞をフローサイトメトリーによりＩＬ−２Ｒαおよび増殖マーカー（それぞれ、ＣＤ２５およびＫｉ−６７）について評価し、上清をＥＬＩＳＡまたは多重化イムノアッセイによるサイトカイン産生（ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）の評価のために集めた。
【０６２２】
細胞を７２時間後に、培養物中でＣＤ２５を評価するためのフローサイトメトリー用に染色した（ＭＦＩ、最上段、発現および頻度のレベルを示す、最下段）。生存可能集団内から、ＣＤ４＋細胞に注目するために細胞にゲートをかけ、その後、ＣＤ２５＋集団にゲートをかけた。
【０６２３】
図１１は、ＣＤ２５の発現が、Ｌｃｋ活性化融合ポリペプチドＩＫ１４８００（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）およびＩＫＤ１４８００（ｒｓｋａｋｎｐｌｙ−ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ）で再刺激時に、疲弊ＣＤ４＋Ｔ細胞中で増大することを示す。このデータは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドが、再刺激された疲弊Ｔ細胞における生理学的制御の結果（例えば、ＩＬ−２Ｒα発現）を強化できることを示している。
【０６２４】
実施例１１：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、チェックポイント阻害からヒトＴ細胞株をレスキューする。
免疫系の過剰活性化を防ぐために、プログラム死１（ＰＤ−１）経路はＴ細胞活性化を制御するためのチェックポイントとして機能する。リガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２がＰＤ−１受容体に結合すると、この経路が活性化され、Ｔ細胞活性化および増殖の逆抑制であるＴ細胞の「疲弊」が生じる。本発明のＬｃｋ活性化融合ポリペプチドの能力を、ＰＤ−Ｌ１により誘導されたチェックポイント阻害からヒトＴ細胞をレスキューする能力について調査した。
簡単に説明すると、ジャーカット細胞を、抗ＣＤ３抗体付着培養皿に暴露してプログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）の表面発現を誘導することにより活性化し、添加物の非存在下で、またはペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＮＨ２（２．５μＭのＩＫ１４８００）単独で、細胞中のチェックポイント阻害を誘導するために５μｇ組換えＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−１に対するリガンド）単独で、またはＩＫ１４８００ペプチド＋組換えＰＤ−Ｌ１と共に、４８時間培養した。ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）を、上述の市販の標準的ＥＬＩＳＡキットにより細胞ライセート中で測定した。
【０６２５】
上記で示したデータと一致して、図１２は、ＣＤ３刺激された細胞（ＰＤ−Ｌ１の非存在下で）が、本発明のＬｃｋ活性化融合ポリペプチドで処理した場合、増大したレベルのＣＤ２５発現を有したことを示す。
【０６２６】
重要なことに、図１２は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＮＨ２の添加が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用により誘導されるＩＬ−２Ｒαの抑制をレスキューしたことを示す。
このデータは、本発明のＬｃｋ活性化融合ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１により誘導されたチェックポイント阻害からヒトＴ細胞をレスキューできることを示す。
【０６２７】
実施例１２：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、抗ＣＤ３刺激されたＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞上のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現を増大させる。
抗ＣＤ３刺激されたＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現に対するＬｃｋ活性化ポリペプチドの効果を調査した。新たに単離したＰＢＭＣを、示した濃度（μＭ）の本発明によるＬｃｋ活性化ポリペプチド；ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＮＨ２（「ＩＫ１４８００」）の存在下で２４時間、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）含有または非含有（−ａＣＤ３）で刺激した。
【０６２８】
図１３は、抗ＣＤ３で刺激されるとＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中でＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）の発現が増大することを示す。
このデータは、Ｌｃｋ活性化ペプチドがＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＬ−２Ｒα発現を強化することを示す。
【０６２９】
実施例１３：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−１２分泌を増大させる。
ＩＬ−１２分泌を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。簡単に説明すると、野性型ジャーカット細胞（ヒトＴリンパ球細胞の不死化系）を、抗ＣＤ２８抗体およびアビジンの存在下で、ビオチン化抗ＣＤ３抗体への暴露により刺激した。培養期間（４８時間）中、細胞を試験ポリペプチドに暴露した。細胞上清を、上述の標準的な市販ＥＬＩＳＡキットを用いて４８時間の終わりにＩＬ−１２についてアッセイした。
【０６３０】
図１４Ａは、Ｌｃｋ活性化融合ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、４８時間の暴露後に野性型ジャーカット細胞中で対照に比較してＩＬ−１２分泌を誘導することを示す。Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲＲもまた、４８時間の暴露後に野性型ジャーカット細胞中で対照に比較してＩＬ−１２分泌を誘導する（データは示さず）。このデータは、本発明のＬｃｋ活性化ポリペプチドが、ヒトＴ細胞株でのＩＬ−１２の分泌を誘導できることを示す。
【０６３１】
ＩＬ−１２分泌を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力におけるＬｃｋの役割も調査した。簡単に説明すると、Ｌｃｋ欠損ジャーカット細胞（Ｊ．Ｃａｍ  １．６）を、抗ＣＤ２８抗体およびアビジンの存在下で、ビオチン化抗ＣＤ３抗体への暴露により刺激した。培養期間（４８時間）中、細胞を試験ポリペプチドに暴露した。細胞上清を、上述の標準的な市販ＥＬＩＳＡキットを用いて４８時間の終わりにＩＬ−１２についてアッセイした。
【０６３２】
図１４Ｂは、対照と比較してジャーカット細胞でのＩＬ−１２分泌を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）の能力が、Ｌｃｋの存在により強化されることを示す。このデータは、Ｌｃｋ活性化融合ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲによるヒトＴ細胞株でのＩＬ−１２分泌が、Ｌｃｋの存在により強化されることを示す。
【０６３３】
実施例１４：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、刺激されたＰＢＭＣでのＩＬ−１２分泌を増大させる。
ＩＬ−１２（ＩＬ−１２ｐ７０）分泌を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力をさらに調査した。簡単に説明すると、抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣを、抗ＣＤ４０Ｌ阻止抗体の存在下または非存在下で２４時間、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１５８００」）、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（「ＩＫ１４８００」）、ならびにＤアミノ酸のみを含むＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲおよびにＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（それぞれ、「ＩＫＤ１５８００」および「ＩＫＤ１４８００」）と共に培養した。上清をＥＬＩＳＡによりＩＬ−１２ｐ７０レベルについて評価した。
【０６３４】
図１５は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ならびにＤアミノ酸のみを含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲおよびＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（それぞれ、「ＩＫＤ１５８００」および「ＩＫＤ１４８００」）が、ＩＬ−１２の産生を抑制する抗ＣＤ４０Ｌ阻止抗体の存在下で抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣに比較して抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣのＩＬ−１２分泌を誘導することを示す。
これらのデータは、本発明のＬｃｋ活性化ポリペプチドが、ＰＢＭＣでＩＬ−１２ｐ７０分泌を誘導できることも示す。
【０６３５】
ＩＬ−１２（ＩＬ−１２ｐ７０）分泌を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力をペプチドなしと比較して調査した。簡単に説明すると、ＰＢＭＣを２４時間または７２時間、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）およびＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲまたはＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲと一緒に培養した。上清をＥＬＩＳＡによりＩＬ−１２ｐ７０レベルについて評価した。
【０６３６】
図１６は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）が、２４時間で（および７２時間で；データは示さず）ペプチドなしと比較してＩＬ−１２ｐ７０分泌を誘導することを示す。Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）は、７２時間でペプチドなしと比較してＩＬ−１２ｐ７０分泌を誘導した（データは示さず）。
【０６３７】
実施例１５：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、刺激されたＰＢＭＣでのＩＬ−１２Ｒβ２分泌を増大させる。
ＩＬ−１２受容体サブユニットベータ２（ＩＬ−１２Ｒβ２）発現を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
【０６３８】
抗ＣＤ３刺激されたＰＢＭＣを７２時間、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）＋ビークル対照と共に培養した後、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞（ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋細胞）をフローサイトメトリーによりＩＬ−１２Ｒβ２発現について評価した。
【０６３９】
図１７は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ＮＫ細胞集団（ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋細胞）中でＩＬ−１２Ｒβ２発現を誘導することを示す。Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲはまた、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中でＩＬ−１２Ｒβ２発現を誘導した（データは示さず）。
【０６４０】
実施例１６：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ−２１Ｒ発現を高めない。
刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＩＬ−２１Ｒ（ＣＤ３６０）発現に対するＬｃｋ活性化ポリペプチドの効果を調査した。簡単に説明すると、単離ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲＲおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲと一緒に培養した後、細胞を、フローサイトメトリーによりＩＬ−２１Ｒ発現について評価した。Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ００９００）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）は、ヒト刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ−２１Ｒ発現を高めない（データは示さず）。
【０６４１】
実施例１７：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ＩＦＮ−γ分泌を誘導する。
ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ分泌を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。簡単に説明すると、抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣを４８時間、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲと共に培養した後、上清を集め、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γについて評価した。Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、ペプチドなし対照と比較して、ＩＦＮ−γ分泌を誘導する（データは示さず）。
【０６４２】
刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイにおいて、単離ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力も調査した。簡単に説明すると、単離ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ００９００）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）と一緒に、２４時間培養した後、上清をＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γについて評価した。図１８は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ペプチドなし対照と比較して、ＩＦＮ−γ分泌を誘導することを示す。Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、ペプチドなし対照と比較して、ＩＦＮ−γ分泌を誘導した（データは示さず）。
【０６４３】
刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイにおいて、単離ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。簡単に説明すると、単離ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ００９００）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）と一緒に、２４時間培養した後、上清をＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γについて評価した。Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲＲおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、ペプチドなし対照と比較して、ＩＦＮ−γ分泌を誘導した（データは示さず）。これらのデータは、本発明のＬｃｋ活性化ポリペプチドが、刺激ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの分泌を誘導できることを示す。
【０６４４】
実施例１８：Ｄアミノ酸を含むＬｃｋ活性化ポリペプチドは、刺激されたヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を誘導する。
刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイにおいて、単離ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を変えるＤアミノ酸含有Ｌｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
簡単に説明すると、単離ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＤアミノ酸のみを含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫＤ１４８００）と一緒に、２４時間培養した後、上清をＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γについて評価した。図１９は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドのＤアミノ酸のみを含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫＤ１４８００）が、ペプチドなし対照と比較して、刺激ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を誘導することを示す。
【０６４５】
刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイにおいて、単離ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を変えるＤアミノ酸含有Ｌｃｋ活性化ポリペプチドの能力も調査した。簡単に説明すると、単離ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）、またはＬｃｋ活性化ポリペプチドＤアミノ酸のみを含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫＤ１４８００）と一緒に、２４時間培養した後、上清をＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γについて評価した。Ｌｃｋ活性化ポリペプチドのＤアミノ酸のみを含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、Ｌアミノ酸のみを含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲと同様に、ペプチドなし対照と比較して、刺激ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を誘導する（データは示さず）。
【０６４６】
実施例１９：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増大させる。
刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイにおいて、単離ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。簡単に説明すると、単離ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓで刺激し、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＤアミノ酸のみを含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲと一緒に、２４時間培養した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによりＫｉ６７発現について評価した。Ｋｉ６７は、所与の細胞集団、この場合ＣＤ８＋細胞の成長画分を測定する増殖マーカーである。図２０は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）が、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖集団を増大させることを示す。
【０６４７】
実施例２０：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ＰＢＭＣ内のＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増殖を増大させる。
ＰＢＭＣ内の単離ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。簡単に説明すると、抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣを、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ００９００）およびＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）と一緒に、７２時間培養した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによりＫｉ６７発現について評価した。Ｋｉ６７は、所与の細胞集団、この場合ＣＤ８＋細胞の成長画分を測定する増殖マーカーである。図２１は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）が、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖集団を増大させることを示す。
【０６４８】
ＰＢＭＣ内の単離ヒトＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増殖を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。簡単に説明すると、抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣを、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドｒｖｋｖｋｖｖｖｖ−ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ（ＩＫＤ１５８００）と一緒に、７２時間培養した後、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋ＮＫ細胞をフローサイトメトリーによりＫｉ６７発現について評価した。Ｋｉ６７は、所与の細胞集団、この場合ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋ＮＫ細胞の成長画分を測定する増殖マーカーである。Ｌｃｋ活性化ポリペプチドｒｖｋｖｋｖｖｖｖ−ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ（ＩＫＤ１５８００）は、ヒトＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増殖集団を増大させた（データは示さず）。
【０６４９】
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドｒｖｋｖｋｖｖｖｖ−ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ（ＩＫＤ１５８００）はまた、ＣＤ２５陽性であったヒトＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋ＮＫ細胞集団、ＣＤ２１５陽性であったヒトＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋ＮＫ細胞集団、およびＣＤ３６０陽性であったヒトＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋ＮＫ細胞集団も増大させた（データは示さず）。
【０６５０】
実施例２１：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＤ２８発現を高める。
ＣＤ２８発現を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。簡単に説明すると、抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣを、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲと一緒に、７２時間培養した後、細胞をフローサイトメトリーによりＣＤ２８発現について評価した。
【０６５１】
図２２Ａは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）が、ペプチドなし対照に比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ２８発現を誘導することを示す。
【０６５２】
図２２Ｂは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）が、ペプチドなし対照に比べて、ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＤ２８発現を誘導することを示す。
【０６５３】
実施例２２：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ＰＢＭＣ上のＩＬ−１５Ｒ発現およびＰＢＭＣからのＩＬ−１５分泌を高める。
ＰＢＭＣでのＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２１５（ＩＬ−１５Ｒ）発現に対するＬｃｋ活性化ポリペプチドの効果を調査した。簡単に説明すると、ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激および５種の濃度範囲（０〜１．２５μＭ）のＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）と共に、７２時間培養した後、細胞をフローサイトメトリーによりＣＤ２１５（ＩＬ−１５Ｒ）の発現について評価した。Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、ヒト刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＩＬ−１５Ｒ発現を高めた（データは示さず）。
【０６５４】
刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−１５Ｒの発現およびＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＬ−１５分泌に対するＬｃｋ活性化ポリペプチドの効果も調査した。簡単に説明すると、ＰＢＭＣを、５種の濃度範囲（０〜１．２５μＭ）の、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）と共に培養した。上清を集め、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１５について評価した。図２３Ａは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）が、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−１５Ｒ発現を高めることを示し、図２３Ｂは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）がＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＬ−１５分泌を増大させることを示す。図２３Ｃは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）が、ヒト刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−１５Ｒ発現も増大させることを示す。
【０６５５】
実施例２３：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ＰＢＭＣ内のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増大させる。
ＰＢＭＣの増殖を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。簡単に説明すると、抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣを、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲと一緒に、７２時間培養した後、細胞をフローサイトメトリーによりＫｉ６７発現について評価した。Ｋｉ６７は、所与の細胞集団、この場合ＣＤ２８＋／ＣＤ８＋細胞の成長画分を測定する増殖マーカーである。
【０６５６】
図２４は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）が、ヒトＣＤ２８＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖集団を増大させることを示す。
【０６５７】
実施例２４：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−１８Ｒα発現を増大させる。
刺激ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイにおいて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−１８Ｒα発現に対するＬｃｋ活性化ポリペプチドの効果を調査した。簡単に説明すると、単離ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、およびＤアミノ酸のみを含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲと一緒に、２４時間培養した後、細胞をフローサイトメトリーによりＩＬ−１８Ｒα発現について評価した。Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）、およびＤアミノ酸のみを含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫＤ１５８００）は、ヒト刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−１８Ｒα発現を高める（データは示さず）。
【０６５８】
単離ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、およびＤアミノ酸のみを含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲと一緒に、２４時間培養した後、細胞をフローサイトメトリーによりＩＬ−１８Ｒα発現について評価した。Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）、およびＤアミノ酸のみを含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫＤ１５８００）は、ヒト刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＩＬ−１８Ｒα発現を高める（データは示さず）。
【０６５９】
実施例２５：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中のｐＳＴＡＴ４発現を変える。
刺激Ｔ細胞アッセイにおいて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中の細胞内ｐＳＴＡＴ４発現に対するＬｃｋ活性化ポリペプチドの効果を調査した。簡単に説明すると、単離Ｔ細胞（ＣＤ３＋）を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、およびＤアミノ酸のみを含むＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲの５種の濃度範囲＋ビークル対照（０〜１．２５μＭ）と一緒に、７２時間培養し、その後、上清を集めて、フローサイトメトリーによりp-ＳＴＡＴ４発現についてアッセイした。
【０６６０】
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）、およびＤアミノ酸のみを含むＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫＤ１５８００）は、ヒト刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞上のｐ−ＳＴＡＴ４発現を高める（データは示さず）。
【０６６１】
実施例２６：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドはヒトＰＢＭＣ内の制御性Ｔ細胞のパーセンテージを低減する。
ヒトＰＢＭＣ中の制御性Ｔ細胞に対するＬｃｋ活性化ポリペプチドの効果を調査した。簡単に説明すると、抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣを、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲと一緒に、４８時間培養した後、Ｔｒｅｇ集団を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ集団中の細胞のＦｏｘｐ３＋比率を測定することにより決定した。Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）は、Ｔｒｅｇ（Ｆｏｘｐ３＋）の比率を低減させた（データは示さず）。
【０６６２】
実施例２７：ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ１４ｎｅｇＣＤ１１ｃ＋樹状細胞表現型を増強する。
単離未成熟ＤＣ細胞培養物中の樹状細胞表現型（ＣＤ１４発現）に対するＣＤ４０Ｌの効果を調査した。簡単に説明すると、未成熟単球由来ＤＣ（ｉＭｏＤＣ）を、ＭｏＤＣ分化培地中で７日間培養した単離ＣＤ１４＋単球から誘導した。ｉＭｏＤＣをＣＤ４０Ｌ（５μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）の存在下で７２時間培養した。７２時間後、細胞をフローサイトメトリーによりＣＤ１４およびＣＤ１１ｃ発現について評価して、ＤＣ細胞表現型を決定した。ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ１４ｎｅｇＣＤ１１ｃ＋樹状細胞の比率を高めた（データは示さず）。
【０６６３】
単離未成熟ＤＣ培養物中の樹状細胞ＤＣ細胞表現型（ＣＤ１４発現）に対する試験ペプチドの効果も調査した。
簡単に説明すると、未成熟単球由来ＤＣ（ｉＭｏＤＣ）を、Ｍｏ−ＤＣ分化培地中で７日間培養した単離ＣＤ１４＋単球から誘導した。ｉＭｏＤＣを、５点濃度曲線にわたり試験ペプチドの存在下で、＋ビークル（０〜１．２５μＭ）および抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）で７２時間培養した。７２時間後、細胞をフローサイトメトリーによりＣＤ１４およびＣＤ１１ｃ発現について評価して、ＤＣ細胞表現型を決定した。提示データは、ペプチド治療に応答したＣＤ１１ｃ陽性集団内のそれぞれのＣＤ１４陽性または陰性細胞集団（％）の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、それぞれのペプチド濃度をビークルと比較するダネット事後検定を伴うＲＭ２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０６６４】
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）は、ＣＤ１４陰性樹状細胞集団を増大させた（データは示さず）。
【０６６５】
実施例２８：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、刺激Ｔ細胞アッセイにおいてＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−１２Ｒβ２発現を増大させる。
Ｔ細胞上のＩＬ−１２受容体サブユニットベータ２（ＩＬ−１２Ｒβ２）発現を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
簡単に説明すると、単離Ｔ細胞（ＣＤ３＋）を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、５種の濃度範囲のＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ＋ビークル対照（０〜１．２５μＭ）と共に、７２時間培養した後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによりＩＬ−１２Ｒβ２発現について評価した。
【０６６６】
図２５は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＬ−１２Ｒβ２発現を誘導することを示す。
【０６６７】
実施例２９：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、刺激ＰＢＭＣアッセイにおいてＮＫ細胞上のＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）発現を増大させる。
ＮＫ細胞上のＩＬ−２受容体サブユニットベータ２（ＩＬ−２Ｒβ）発現を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
簡単に説明すると、健康なドナー由来のＰＢＭＣを、試験ペプチド（０．０８〜１．２５μＭ）またはビークル対照の存在下で、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）で７２時間刺激した。培養期間の最後に、細胞を集め、フローサイトメトリーによりＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋／ｄｉｍＮＫ細胞内のＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）について評価した。
【０６６８】
図２６は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）が、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋／ｄｉｍＮＫ細胞中でＩＬ−２Ｒβ発現を誘導することを示す。
【０６６９】
実施例３０：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ＣＤ８＋細胞集団の増殖を誘発する。
ＰＢＭＣ内のＣＤ８＋細胞集団の増殖を誘発するＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
簡単に説明すると、健康なドナー由来のＰＢＭＣまたは単離ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＴＣＲ＋ＩＬ−２を介して、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（０．０８〜１．２５μＭ）またはビークル対照の存在下で）１０日間刺激した。培養期間の最後に、細胞を集め、フローサイトメトリーによりＣＤ８＋細胞比率について評価した。
【０６７０】
図２７は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）が、ＰＢＭＣ内のＣＤ８＋細胞集団の増殖を誘発することを示す。
【０６７１】
実施例３１：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドはＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２１産生を誘導する。
ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２１産生を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
簡単に説明すると、ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲの存在下で２４時間または４８時間培養した。培養の最後に、上清をＥＬＩＳＡでＩＬ−２１について評価した。
【０６７２】
図２８は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）が、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２１産生を誘導することを示す。
【０６７３】
実施例３２：抗原刺激の前に提供されるＬｃｋ活性化ポリペプチドは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−２分泌を誘導する。
ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株によるＩＬ−２産生を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
簡単に説明すると、５００万個の細胞をＴ２５フラスコ中に播種し、上記表に示すように種々の濃度のＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）で１時間処理した後、細胞懸濁液を遠心分離し、新鮮培地で２回洗浄した。５００μＬの培地中のビオチン−抗ＣＤ３およびアビジン（５：１．２５μｇ）の混合物を１２ウェルプレートのウェルに加えた。１０分後、細胞をウェル当たり１００万個の濃度で播種し、細胞懸濁液を、培地を用いて２ｍＬの体積にした。その後、試料を抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍＬ）でさらに刺激し、３７℃で４８時間インキュベートした後、上清（１００μＬ、ｎ＝３）をＥＬＩＳＡでＩＬ−２含量について分析した。
【０６７４】
図２９は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）が、抗原刺激の前に投与される場合、その後の刺激時に、ヒトＴ細胞株によるＩＬ−２産生を誘導することを示す。
【０６７５】
実施例３３：マウスに投与されたＬｃｋ活性化ポリペプチドは、ルイス肺癌マウス（転移モデル）中でＣＤ４＋ＣＤ２８＋Ｔ細胞を誘導する。
マウス中のＣＤ４＋ＣＤ２８＋Ｔ細胞を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
簡単に説明すると、ＡＴＣＣから入手したルイス肺癌細胞をＤＭＥＭ中で７０％コンフルエンスに増殖し、剥離させ、ＰＢＳで洗浄した。０日目に、各マウスは、０．５ｘ１０６個のＬＬＣ細胞を静脈内注射により尾静脈中に投与を受けた。治療（ＩＫ１４８００を、２００μｌの水中の２５０μｇの投与量で）を週２回Ｉ．Ｐ．投与した（細胞導入後、１、４、８、および１１日目）。細胞接種の１５日後、マウスを安楽死させ、脾臓を取り出して、上記プロトコル（イタリック体）で詳細に記載のように単細胞懸濁液を生成した。単離脾細胞細胞懸濁液を次に、フローサイトメトリーによりＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１、ＣＤ２８、ＣＤ２１５およびｐＳＴＡＴ４の発現について評価した。
【０６７６】
図３０は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）が、ルイス肺癌マウスの脾細胞中の、ＣＤ２８発現ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージ、およびＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２８の相対発現を高めることを示す。
【０６７７】
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）はまた、ルイス肺癌マウスの脾細胞中のＮＫ細胞上のＣＤ２５の相対発現を高める。
【０６７８】
本発明者らはまた、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）が、ヒト肺癌腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のＣＤ２５＋ＭＦＩおよびＣＤ２５＋ＣＤ５７＋ＭＦＩにより測定される、ＴＩＬから単離したＣＤ５７＋ＮＫ細胞中のＣＤ２５発現を誘導することを示した。簡単に説明すると、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）は１．２５μＭで治療時に、ＣＤ２５発現を増大させた。
【０６７９】
実施例３４：ルイス肺癌マウス（転移モデル）に投与されたＬｃｋ活性化ポリペプチドは、脾細胞中でＣＤ２８およびＣＤ２１５発現ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する。
マウス中のＣＤ２８およびＣＤ２１５発現ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
【０６８０】
ＡＴＣＣから入手したルイス肺癌細胞をＤＭＥＭ中で７０％コンフルエンスに増殖し、剥離させ、ＰＢＳで洗浄した。０日目に、各マウスは、０．５ｘ１０６個のＬＬＣ細胞を静脈内注射により尾静脈中に投与を受けた。治療（ＩＫ１４８００を、２００μｌの水中の２５０μｇの投与量で）を週２回Ｉ．Ｐ．投与した（細胞導入後、１、４、８、および１１日目）。細胞接種の１５日後、マウスを安楽死させ、脾臓を取り出して、上記プロトコル（イタリック体）で詳細に記載のように単細胞懸濁液を生成した。単離脾細胞細胞懸濁液を次に、フローサイトメトリーによりＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１、ＣＤ２８、ＣＤ２１５およびｐＳＴＡＴ４の発現について評価した。
簡単に説明すると、脾細胞をＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲで治療したルイス肺癌マウスから単離し、治療したルイス肺癌マウスのＣＤ２８＋ＣＤ８＋細胞の比率を調査した。
【０６８１】
図３１は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）が、ルイス肺癌マウスの脾細胞中の、ＣＤ２１５（ＩＬ−１５Ｒ）発現ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋細胞上のＣＤ２８発現のパーセンテージを高めることを示す。
【０６８２】
実施例３５：マウスに投与されたＬｃｋ活性化ポリペプチドは、ＮＫ細胞上のｐＳＴＡＴ４の発現を高める。
マウスでのｐＳＴＡＴ４発現を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
【０６８３】
ＡＴＣＣから入手したルイス肺癌細胞をＤＭＥＭ中で７０％コンフルエンスに増殖し、剥離させ、ＰＢＳで洗浄した。０日目に、各マウスは、０．５ｘ１０６個のＬＬＣ細胞を静脈内注射により尾静脈中に投与を受けた。治療（ＩＫ１４８００を、２００μｌの水中の２５０μｇの投与量で）を週２回Ｉ．Ｐ．投与した（細胞導入後、１、４、８、および１１日目）。細胞接種の１５日後、マウスを安楽死させ、脾臓を取り出して、上記プロトコル（イタリック体）で詳細に記載のように単細胞懸濁液を生成した。単離脾細胞懸濁液を次に、フローサイトメトリーによりＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１、ＣＤ２８、ＣＤ２１５およびｐＳＴＡＴ４の発現について評価した。
簡単に説明すると、脾細胞をＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲで治療したルイス肺癌マウスから単離し、治療したルイス肺癌マウスのＮＫ細胞上のｐＳＴＡＴ４の発現を調査した。
【０６８４】
図３２は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）が、ルイス肺癌マウスの脾細胞中の、ＮＫ細胞上のｐＳＴＡＴ４の発現を高めることを示す。
【０６８５】
実施例３６：アニオン性残基を含むペプチドは、Ｌｃｋを活性化しない。
Ｌｃｋを活性化するアニオン性残基を含むペプチドの能力を調査した。図３３は、ポリペプチドＤＤＤＤＤＤＤＤＤが、Ｌｃｋの活性を高めないことを示す。
【０６８６】
実施例３７：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−２分泌を増大させる。
ＩＬ−２分泌を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力におけるＬｃｋの役割も調査した。
簡単に説明すると、１２ウェルプレートをＰＢＳ（２００μＬ）中で作製した抗ＣＤ３（５μｇ／ｍＬ）溶液でコートし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、抗ＣＤ３溶液を吸引し、ウェルを培地（１ｍＬ、１０分）で２回穏やかに洗浄した。ジャーカット細胞（ＷＴおよびＬｃｋ欠損）をウェル当たり１００万個の濃度で抗ＣＤ３コート１２ウェルプレートに播種し、抗ＣＤ２８（５ｍｇ／ｍＬ）でさらに刺激し、即座に、ＩＫ１４８００）（２．５μＭ）で処理した。細胞を２４時間インキュベートした後、上清をＥＬＩＳＡでＩＬ−２について分析した。
【０６８７】
図３４は、対照と比較してジャーカット細胞でのＩＬ−２分泌を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）の能力が、Ｌｃｋに依存することを示す。このデータは、Ｌｃｋ活性化融合ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲによるヒトＴ細胞株でのＩＬ−２分泌が、Ｌｃｋに依存することを示す。
【０６８８】
実施例３８：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、刺激された場合にのみヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−２分泌を増大させる。
刺激の存在下または非存在下で、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株によるＩＬ−２産生を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
簡単に説明すると、１２ウェルプレートをＰＢＳ（２００μＬ）中で作製した抗ＣＤ３（５μｇ／ｍＬ）溶液でコートし、３７℃で一晩インキュベートした。その後、抗ＣＤ３溶液を吸引し、ウェルを培地で２回穏やかに洗浄した（１ｍＬ、１０分）。ジャーカット細胞をウェル当たり１００万個の濃度で播種し、抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍＬ）でさらに刺激した後、即座に、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）（２．５μＭ）で処理した。細胞を７２時間インキュベートした後、上清をＥＬＩＳＡでＩＬ−２について分析した。
【０６８９】
図３５は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）での処理によるＩＬ−２産生の増大は、抗原刺激がない場合には、起こらないことを示す。
【０６９０】
実施例３９：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドによるルイス肺癌マウス（異種移植片モデル）での腫瘍量の抑制。
ルイス肺癌（ＬＬＣ）マウスの腫瘍量を低減させるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
【０６９１】
ルイス肺癌細胞株を約７０％集密度まで培養した後、細胞を集め、計数して、５ｘ１０６／ｍＬで無菌ＨＢＳＳ中に再懸濁させた。Ｃ５７ＢＬ／６の右脇腹に１ｘ１０６細胞（１００μｌ）を皮下注射した。腫瘍細胞移植の５日後に、マウスを、２つの群間で平均腫瘍サイズがほぼ等しくなるように、ランダムに治療群に割り付けた。ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（２００μｌ中２００μｇ）またはビークル（水）を、腫瘍細胞移植後１０日目から、ビークル治療群で腫瘍の直径が平均１０ｍｍに達するまで、週２回（月曜と木曜）腹腔内（ｉ．ｐ）に投与した。腫瘍を、デジタルノギスを用いて週３回（月曜、水曜、および金曜）、治療群に関して知らされていない技術者により測定した。ビークル群の平均腫瘍サイズが直径１０ｍｍに達すると、マウスを頸椎脱臼により屠殺し、腫瘍および脾臓を収集した。
【０６９２】
腫瘍を、２ｍＬのコラゲナーゼＤ（２ｍｇ／ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｏｔ＃  ２８９６０１２６）およびＤＮアーゼＩ（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  Ｌｏｔ＃  ＳＬＢＶ１４４６）を含むＲＰＭＩ−１６４０中に入れ、機械的に消化した後、８０ｒｐｍの振盪インキュベーター中、３７℃で３０分間インキュベートした。消化腫瘍試料を７０μｍのストレーナーを通し、氷冷ＲＰＭＩ−１０で２回洗浄した。試料を遠心分離し、赤血球溶解を実施した後、洗浄し、ＲＰＭＩ−１０に再懸濁させた。腫瘍細胞をトリパンブルー色素排除により計数し、免疫細胞マーカーＣＤ４５（ＡＦ７００）について染色した。
【０６９３】
図３６は、腹腔内に投与された場合、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）が、対照と比較して、腫瘍塊の平均面積を低減させることを示す。
【０６９４】
実施例４０：脂肪酸に結合されたＬｃｋ活性化ポリペプチドは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株からのＩＬ−２分泌を増大させる。
ＩＬ−２分泌を変える脂肪酸に結合されたＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
簡単に説明すると、細胞をウェル（１２ウェルプレート、２ｍＬ体積）当たり１００万個で播種し、ビオチン−ＣＤ３、ＣＤ２８、およびアビジン（５：５：１．２５μｇ）で刺激した。細胞を次に、ＩＫ１４８０４で処理した後、３７℃で４８時間インキュベートした。その後、上清（１００μＬ、ｎ＝３）をＩＬ−２含量について分析した。
【０６９５】
図３７は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（ＩＫ１４８０４）が、４８時間の暴露後、野性型ジャーカット細胞中で対照に比較してＩＬ−２分泌を誘導することを示す。
これらのデータは、本発明の脂肪酸結合Ｌｃｋ活性化ポリペプチドが、ヒトＴ細胞株のＩＬ−２分泌を誘導できることを示す。
【０６９６】
実施例４１：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−１２分泌を増大させる。
ＩＬ−１２分泌を変える脂肪酸結合Ｌｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
簡単に説明すると、細胞をウェル（１２ウェルプレート、２ｍＬ体積）当たり１００万個で播種し、ビオチン−ＣＤ３、ＣＤ２８、およびアビジン（５：５：１．２５μｇ）で刺激した。次に、細胞をＩＫ１４８００、ＩＫ１５８００、ＩＫ１４８０４およびＩＫ１５８０４で処理した。細胞を次に、３７℃で４８時間インキュベートした。その後、上清（１００μＬ、ｎ＝３）をＩＬ−１２含量について分析した。
【０６９７】
図３８は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（ＩＫ１４８０４）およびＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（ＩＫ１５８０４）が、４８時間の暴露後に野性型ジャーカット細胞中で対照に比較して、ＩＬ−２分泌を誘導することを示す。
【０６９８】
実施例４２：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、細胞膜中のＵＶＢ脂質過酸化を抑制する。
細胞膜中の脂質過酸化を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
【０６９９】
簡単に説明すると、酸化剤は、脂質構造を変えることができ、マロンジアルデヒドの形成をもたらす過酸化脂質を生じ、マロンジアルデヒドは、チオバルビツル酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）として測定できる。
【０７００】
皮膚線維芽細胞および／またはケラチノサイトの照射または疑似照射後に、試験ペプチドを加え、９０分間インキュベートした後、上清（９００μＬ）を収集した。９０μＬのブチルヒドロキシトルエン（エタノール中の２％ｗ／ｗ）を加え、試料をＴＢＡＲＳアッセイまで凍結（−２０℃）保持した。ペトリ皿を１ｍＬのＨＢＳＳで２回洗浄し、細胞を６００μＬの水中にかき落とし、６０μＬの０．５％水性トリトンＸ１００をこの溶液に加え、タンパク質測定をローリー法により実施した（Ｌｏｗｒｙ  ＯＨ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５１，１９３：２６５−２７５）。ＴＢＡＲＳは、記載されるように蛍光定量アッセイである（Ｍｏｒｌｉｅｒｅ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９１，１０８４：２６１−２６８）。手短に説明すると、解凍のために、試料を酸性条件にて、チオバルビツル酸の存在下で加熱し、ＴＢＡＲＳを１−ブタノールで抽出し、蛍光定量により定量した（λｅｘｃ＝５１５ｎｍおよびλｅｍ＝５５０ｎｍ）。アッセイ条件でマロンジアルデヒド−チオバルビツル酸付加物を定量的に生じるテトラエトキシプロパンを、較正に使用する。マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）当量で表されるＴＢＡＲＳ値を、各ペトリ皿の細胞タンパク質に正規化する。各ＴＢＡＲＳ測定を、３回繰り返して実施する（例えば、データポイント当たり３個のペトリ皿を用いて）。
【０７０１】
図３９は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）が、％ＴＲＳを用量依存的に低減させることを示す。
【０７０２】
実施例４３：ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲは、Ｙ３９４の位置でＬｃｋのリン酸化を増大させる。
上記で考察したように、ＬｃｋのＴｙｒ３９４のリン酸化は、Ｌｃｋキナーゼを活性化するＬｃｋの構造的開口を生じる。
【０７０３】
ウェスタンブロット試験を以下のように実施した。
細胞型：ジャーカット野生型
細胞数：５ｘ１０５／ｍｌ
培地：ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ、Ｒ８７５８）、１Ｘ  ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、１００Ｘ、Ｐ０７８１）、１０％ＦＢＳ
ペプチド：ＩＫ１４８００（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）
ペプチド濃度：１μＭ
ペプチド曝露時間：２時間
細胞溶解溶液：
（１００μｌ／ウェル／３０分：氷上）
ＲＩＰＡバッファー（Ｓｉｇｍａ、Ｒ０２７８）：９７μｌ
プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ８３４０）：１．５μｌ
ホスファターゼ阻害剤カクテル２（Ｓｉｇｍａ、Ｐ５７２６）：１．５μｌ
タンパク質アッセイ：Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（＃２３２２５）
ゲル：ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＰ０３３５ＢＯＸ）、  ２０μｇのタンパク質をロード
ランニングバッファー（１ｘ）：ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＯＰＳ  ＳＤＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＮＰ０００１）
転写ブロット：ｉＢｌｏｔ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｔａｃｋ、ニトロセルロース、Ｎｏｖｅｘ，ｍｉｎｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＩＢ３０１０−３２）
ブロッキング溶液：ＴＢＳ  Ｂｌｏｔｔｏ  Ｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＳＣＺＳＣ−２３３５）
一次抗体：ｐ−Ｌｃｋ（Ｔｙｒ３９４）、ウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−１０１７２８）、１／２００希釈、４℃で一晩；抗Ｌｃｋ抗体［Ｙ１２３］、ウサギモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ３２１４９）、１／１０００希釈、４℃で一晩
二次抗体：ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ｓｃ−２００４）、１／５０００希釈、１時間
ＥＣＬ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ
【０７０４】
図４０は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲが、ペプチド対照のない場合に比べて、抗ｐＹ３９４抗体により検出されるＬｃｋのＹ３９４の位置でリン酸化を増大させるが、合計Ｌｃｋのレベルは、変化しないままであることを示す。
このデータは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲがＬｃｋを選択的に活性化し、Ｌｃｋの自己リン酸化を高めることを示す。
【０７０５】
実施例４４：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−２分泌を増大させ、およびｒｓｋａｋｎｐｌｙは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−１２分泌を高めるが、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲは、ＩＬ−１２分泌を高めない。
ＩＬ−２およびＩＬ−１２分泌を変えるポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（「１４０００」）、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ（「ＩＫ９４０００」）およびｒｓｋａｋｎｐｌｙ（「ＩＫＤ９４０００」）の能力を調査した。
簡単に説明すると、野性型ジャーカット細胞（ヒトＴリンパ球細胞の不死化系）を、抗ＣＤ２８抗体およびアビジンの存在下で、ビオチン化抗ＣＤ３抗体への暴露により刺激した。細胞をウェル（１２ウェルプレート、２ｍＬ体積）当たり１００万個で播種し、ビオチン−ＣＤ３、抗ＣＤ２８、およびアビジン（５：５：１．２５μｇ）で刺激した。次に、細胞を試験ペプチドで処理した後、３７℃で４８時間インキュベートした。その後、上清（１００μｌ、ｎ＝３）をＩＬ−２およびＩＬ−１２含量について分析した。培養期間（４８時間）中、細胞を試験ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２に暴露した。細胞上清を、上述の標準的な市販ＥＬＩＳＡキットを用いて４８時間の終わりにＩＬ−２およびＩＬ−１２についてアッセイした。
【０７０６】
図４１Ａは、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹが、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−２分泌を増大させることを示す。
【０７０７】
図４１Ｂは、ｒｓｋａｋｎｐｌｙは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−１２分泌を増大させるが、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲは分泌を増大させないことを示す。
【０７０８】
多くの本発明の実施形態が上で説明されてきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、さまざまな修正および変更がなされ得ることは理解されよう。上記の実施形態は、従って、例示に過ぎず、限定するものと解釈されるべきではない。
【０７０９】
実施例４４：Ｌｃｋ活性化ペプチドは、ＰＢＭＣ共培養でのカルセイン−ＡＭ染色Ｋ５６２細胞の特異的細胞毒性パーセンテージを高める。
細胞傷害性応答を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（ＩＫ１４８０４）およびＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（ＩＫ１５８０４）の能力を調査した。
簡単に説明すると、ＰＢＭＣを４８時間インキュベートした後、ヒト組換えＩＦＮ−α２Ａ（５ｎｇ／ｍＬ）による刺激のある場合とない場合のカルセインＡＭ染色Ｋ５６２細胞と共に４時間共培養した。上清を、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒを用いてカルセイン緑蛍光強度について評価し、特異的細胞毒性パーセンテージを計算した。  示したデータは、平均特異的細胞毒性パーセンテージ±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ビークル対照と比較して対応のあるｔ検定により分析した。＊ｐ＜０．０５。
【０７１０】
ＰＢＭＣを４８時間、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（ＩＫ１４８０４）およびＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（ＩＫ１５８０４）（０．０８〜１．２５μＭ）を含んでまたは含まずに前処理し、カルセインＡＭ染色Ｋ５６２細胞と５：１の比率で共培養し、さらに４時間インキュベートした。上清を、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒを用いてカルセイン緑蛍光強度について評価し、特異的細胞毒性パーセンテージを計算した。  示したデータは、平均特異的細胞毒性パーセンテージ±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ビークル対照によるペプチド処理と比較する、ホルム−シダックの事後検定を伴う反復測定２元配置分散分析により分析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【０７１１】
Ｌｃｋ活性化ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１４８００）、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＩＫ１５８００）、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（ＩＫ１４８０４）およびＲＶＫＶＫＶＶＶＶ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（ＩＫ１５８０４）は、ＩＦＮ−α２Ａで観察されたものより高いレベルに、ＰＢＭＣ共培養でのカルセイン−ＡＭ染色Ｋ５６２細胞の特異的細胞毒性パーセンテージを高めた（データは示さず）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【国際調査報告】
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