(57)【要約】  本開示は、対象において常染色体優性疾患を治療する方法を提供する。いくつかの態様では、本方法は、細胞内での破壊のために、常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型と野生型の両方を標的にする１対の特有のガイドＲＮＡ配列と遺伝子編集酵素の使用を含み、次いで、ガイドＲＮＡによる認識を避けるようにコドン改変された野生型の常染色体優性疾患関連遺伝子ｃＤＮＡを細胞に供給することを含む。これらの方法は、いかなる常染色体優性疾患にも広く適用可能である。【選択図】なし
2021519067.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中の常染色体優性疾患関連遺伝子を改変するための方法であって、
前記常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターと前記細胞を接触させることであって、前記常染色体優性疾患関連遺伝子が、眼疾患に関連し、前記少なくとも１種のベクターが：
（ｉ）前記常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列；
（ｉｉ）前記常染色体優性疾患関連遺伝子のイントロンにハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡをコードする第２の配列；及び
（ｉｉｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第３の配列
を含む、接触させること
を含み、
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む前記常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする前記変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする、
方法。
【請求項２】
前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、若しくは配列番号４９から選択されるヌクレオチド配列又はその各々の等価物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞中の常染色体優性疾患関連遺伝子を改変するための方法であって、前記常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターと前記細胞を接触させることを含み、前記常染色体優性疾患関連遺伝子が、眼疾患に関連し、前記少なくとも１種のベクターが、（ｉ）前記常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列；及び（ｉｉ）触媒的に欠損したＣａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）をコードする第２の配列を含み、前記Ｃａｓヌクレアーゼが、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む前記常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする前記変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする、方法。
【請求項４】
前記第２のガイドＲＮＡが、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８又は配列番号３９から選択されるヌクレオチド配列又はそれらの各々の等価物を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記ｉＰＳＣが、対象の線維芽細胞から誘導される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｉＰＳＣを培養して網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に分化させることをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
対象に前記ＲＰＥ細胞を投与することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＰＥ細胞が、前記対象に対し自己由来である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＰＥ細胞が、網膜下移植を介して投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、前記ＳＮＰに対しヘテロ接合型である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、変異型対立遺伝子及び野生型対立遺伝子を有する前記常染色体優性疾患関連遺伝子に対しヘテロ接合型である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１３】
前記常染色体優性疾患関連遺伝子が、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、若しくは配列番号３３から選択される配列、又はそれらの各々の等価物を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記常染色体優性疾患関連遺伝子にハイブリダイズする前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号３１の配列を含む、請求項１又は３〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、前記常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする前記野生型対立遺伝子を切断しないか又は標的にしない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
対象における常染色体優性眼疾患を治療するための方法であって、前記対象中の常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターの治療有効量を前記対象に投与することを含み、前記少なくとも１種のベクターが：
（ｉ）前記常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列；
（ｉｉ）前記常染色体優性疾患関連遺伝子のイントロンにハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡをコードする第２の配列；及び
（ｉｉｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第３の配列
を含み、
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む前記常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする前記変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする、方法。
【請求項１７】
対象における常染色体優性眼疾患を治療するための方法であって、前記対象中の常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターの治療有効量を前記対象に投与することを含み、前記少なくとも１種のベクターが：
（ｉ）前記常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列；及び
（ｉｉ）触媒的に欠損したＣａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）をコードする第２の配列
を含み、
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む前記常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする前記変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする、方法。
【請求項１８】
前記対象が、ＳＮＰに対しヘテロ接合型である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が、変異型対立遺伝子及び野生型対立遺伝子を有する前記常染色体優性疾患関連遺伝子に対しヘテロ接合型である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＳＮＰのバリアント及び前記変異型対立遺伝子が、同じ染色体上にある、請求項１、３、１６又は１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記ＳＮＰが、前記常染色体優性疾患関連遺伝子の非コード領域にある、請求項１、３、１６又は１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ＳＮＰが、前記常染色体優性疾患関連遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）領域にある、請求項１、３、１６又は１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓニッカーゼである、請求項１又は１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項１、３、１６又は１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記ｄＣａｓが、リプレッサードメインに融合される、請求項３又は１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１のガイドＲＮＡが、少なくとも１つのＰＵＦ（プミリオｍＲＮＡ結合因子）結合配列を含む、請求項３又は１７に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのＰＵＦ結合配列が、ＰＵＦ−ＫＲＡＢに結合する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記常染色体優性疾患関連遺伝子が、ＢＥＳＴ１である、請求項１、３、１６又は１７のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記ＳＮＰのバリアントが、ｒｓ９７２３５３：Ｇ  ＳＮＰ、ｒｓ９７２３５５：Ｇ  ＳＮＰ、又はｒｓ２６６８８９９ＳＮＰである、請求項１、３、１６又は１７のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記第２のガイドＲＮＡが、ＢＥＳＴ１のイントロン１にハイブリダイズする、請求項１又は１６に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１種のベクターが、少なくとも１種の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１、３、１６又は１７のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１種の組換えＡＡＶベクターが、少なくとも１種のＡＡＶ２ベクターである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１種の組換えＡＡＶベクターが、少なくとも１種のＡＡＶ８ベクターである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記常染色体優性疾患関連遺伝子が、ＰＲＤＭ１３、ＲＧＲ、ＴＥＡＤ１、ＡＩＰＬ１、ＣＲＸ、ＧＵＣＡ１Ａ、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＰＩＴＰＮＭ３、ＰＲＯＭ１、ＰＲＰＨ２、ＲＩＭＳ１、ＳＥＭＡ４Ａ、ＵＮＣ１１９、ＧＮＡＴ１、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＨＯ、ＷＳＦ１、ＩＭＰＤＨ１、ＯＴＸ２、ＢＥＳＴ１、Ｃ１ＱＴＮＦ５、ＣＴＮＮＡ１、ＥＦＥＭＰ１、ＥＬＯＶＬ４、ＦＳＣＮ２、ＧＵＣＡ１Ｂ、ＨＭＣＮ１、ＩＭＰＧ１、ＲＰ１Ｌ１、ＴＩＭＰ３、ＶＣＡＮ、ＭＦＮ２、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＡＲＬ３、ＣＡ４、ＨＫ１、ＫＬＨＬ７、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲＬ、ＰＲＰＦ３、ＰＲＰＦ４、ＰＲＰＦ６、ＰＲＰＦ８、ＰＲＰＦ３１、ＲＤＨ１２、ＲＯＭ１、ＲＰ１、ＲＰ９、ＲＰＥ６５、ＳＮＲＮＰ２００、ＳＰＰ２、ＴＯＰＯＲＳ、ＡＢＣＣ６、ＡＴＸＮ７、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＪＡＧ１、ＫＣＮＪ１３、ＫＩＦ１１、ＯＰＡ３、ＰＡＸ２、ＴＲＥＸ１、ＣＡＰＮ５、ＣＲＢ１、ＦＺＤ４、ＩＴＭ２Ｂ、ＬＲＰ５、ＭＡＰＫＡＰＫ３、ＭＩＲ２０４、ＯＰＮ１ＳＷ、ＲＢ１、ＴＳＰＡＮ１２、及びＺＮＦ４０８からなる群から選択される、請求項１、３、１６又は１７のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
２種類の組換えＡＡＶベクターが、前記対象に投与され、第１の種類の組換えＡＡＶベクターが、前記第１の配列及び前記第２の配列を含み、かつ第２の種類の組換えＡＡＶベクターが、前記第３の配列を含む、請求項１又は１６に記載の方法。
【請求項３７】
前記眼疾患が、卵黄様黄斑変性症（ＶＭＤ）、ベスト卵黄様黄斑変性症、常染色体優性網脈絡膜の萎縮若しくは変性、常染色体優性錐体若しくは錐体杆体ジストロフィー、常染色体優性先天性停止性夜盲、常染色体優性レーバー先天黒内障、常染色体優性黄斑変性症、常染色体優性眼性網膜発達疾患、常染色体優性視神経萎縮、常染色体優性網膜色素変性、網膜症を伴う常染色体優性症候性／全身性疾患、ソースビー黄斑変性症、加齢黄斑変性症、ドイン蜂巣状黄斑疾患、及び若年性黄斑変性症からなる群から選択される、請求項１、３、１６又は１７のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記眼疾患が、加齢性黄斑変性症である、請求項１、３、１６又は１７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記眼疾患が、若年性黄斑変性症である、請求項１、３、１６又は１７のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１種のベクターが、前記対象の眼中への注射により投与される、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項４１】
前記常染色体優性疾患関連遺伝子が、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３３から選択される配列を含む、請求項１６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記常染色体優性疾患関連遺伝子にハイブリダイズする前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号３１の配列を含む、請求項１６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、前記常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする前記野生型対立遺伝子を切断しないか又は標的にしない、請求項１６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１種のベクター：（ｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、（ｉｉ）前記常染色体優性疾患関連遺伝子のイントロンにハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡをコードする第２の配列；及び（ｉｉｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第３の配列を含むシステムであって、前記Ｃａｓヌクレアーゼが、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む前記常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする前記変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする、システム。
【請求項４５】
前記第１のガイドＲＮＡが、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、若しくは配列番号４９から選択されるヌクレオチド配列又はそれらの各々の等価物を含む、請求項４４に記載のシステム。
【請求項４６】
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓニッカーゼである、請求項４４に記載のシステム。
【請求項４７】
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項４４に記載のシステム。
【請求項４８】
少なくとも１種のベクター：（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、及び（ｉｉ）触媒的に欠損したＣａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）をコードする第２の配列を含むシステムであって、前記Ｃａｓヌクレアーゼが、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む前記常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする前記変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする、システム。
【請求項４９】
前記第２のガイドＲＮＡが、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８若しくは配列番号３９から選択されるヌクレオチド配列又はそれらの各々の等価物を含む、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５０】
前記ｄＣａｓが、リプレッサードメインに融合される、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５１】
前記リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインである、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５２】
前記第１のガイドＲＮＡが、少なくとも１つのＰＵＦ（プミリオｍＲＮＡ結合因子）結合配列を含む、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５３】
前記少なくとも１つのＰＵＦ結合配列が、ＰＵＦ−ＫＲＡＢに結合する、請求項５２に記載のシステム。
【請求項５４】
前記対象中の常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターの治療有効量を前記対象に投与する前に前記対象を遺伝子型判定する工程をさらに含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項５５】
前記常染色体優性疾患関連遺伝子が、ＲＨＯである、請求項１、３、１６又は１７のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記ＳＮＰのバリアントが、ｒｓ７９８４：Ｇ  ＳＮＰ、ｒｓ７９８４：Ａ  ＳＮＰ、ｒｓ２８５５５５８：Ｇ  ＳＮＰ、又はｒｓ２８５５５５８：Ａ  ＳＮＰである、請求項１、３、１６又は１７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１８年３月２３日出願の米国仮出願第６２／６４７，４１５号の優先権を主張する。
【０００２】
政府の特許権
本発明は、米国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与されたＲＯ１ＥＹ０２４６９８の下で政府の支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年３月２１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーを０１００１＿００６６６０−ＷＯ０＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名し、サイズは３７ＫＢである。
【０００４】
本開示は、常染色体優性疾患を治療するために、患者内で遺伝子編集を実行するためのＣＲＩＳＰＲベースの方法を使用することに関する。
【背景技術】
【０００５】
生活の質に対して非常にマイナスの影響を及ぼす多数の常染色体優性又は劣性疾患に対し、現在治療法はない。優性型の網膜色素変性症（ＲＰ）、錐体桿体ジストロフィー及び若年性黄斑変性症は、眼に影響を及ぼす優性の常染色体疾患の主要例である。網膜変性疾患は、少なくとも９百万人のアメリカ人に影響を及ぼしている（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＤＳら．Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００４  Ａｐｒ；１２２（４）：５６４−７２；Ｓｃｈｍｉｅｒ  ＪＫら．Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ．２００６；２４（４）：３１９−３４）。最も好ましくない網膜変性疾患は、遺伝的な神経変性の一般的な形態である、網膜色素変性症（ＲＰ）  であり、それは世界中で１５０万人の人々に影響を及ぼし、それに対する治療は不十分である。ＲＰは、網膜変性及び視覚損失をもたらす変性眼疾患である。ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）における遺伝的突然変異が、常染色体優性ＲＰの最も一般的な原因であり、症例の２０〜３０％を占める。現在、ＲＰに対する治療法はない。
【０００６】
これらの常染色体優性疾患は、欠損タンパク質を発現する変異遺伝子の存在により特徴付けられる。したがって、これらの疾患は、疾患原因遺伝子及びタンパク質がまだ存在しているので、正常で健康な遺伝子を単に追加する治療法（いわゆる「遺伝子補充」又は「遺伝子追加」）に容易に適合できない。ＲＰに対する遺伝子療法は、概念的な動物モデルにおいて試験され、後に臨床治療として使用され、そこで患者の上半分の視力が改善された。これらの治験において、患者の遺伝的異常は、遺伝子補充手法（すなわち、野生型（ｗｔ）遺伝子の過剰発現による救助）によって修正された。最初は、遺伝子の補充は、患者が機能的な救助を経験したのでうまくいくように思われたが、追跡調査は、光受容体の変性が継続しており、視覚損失が３年以内に進行することを示した（Ｃｉｄｅｃｉｙａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１３  Ｆｅｂ  ５；１１０（６）：Ｅ５１７−２５；Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅら．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｍａｙ  １４；３７２（２０）：１８８７−９７；Ｊａｃｏｂｓｏｎら．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｍａｙ  １４；３７２（２０）：１９２０−６））。他のＲＰ遺伝子に対する現在の遺伝子療法治験も遺伝子補充手法をとっており、失敗の理由が解決されない限り、同様の障害に直面する可能性が高い。ｗｔ遺伝子を補充しても患者の変異遺伝子は無傷の状態のままなので、変異遺伝子の存在は、ｗｔ遺伝子の存在にもかかわらず、損傷の進行を連続的に誘発し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ベスト病の卵黄様黄斑変性症（ＶＭＤ）は、カルシウム依存性塩素イオン（Ｃｌ−）チャネルをコードするベストロフィン−１（ＢＥＳＴ１）中の２５０個超の常染色体優性点変異から生じる、失明に至る黄斑障害である。ＢＥＳＴ１変異は、Ｃｌ−イオンを流出させるチャネルの能力を減少又は消滅させ、体液を網膜下空間に蓄積させる。この病態に対し治療を考案することは、２つの主要な障害：１）大部分のＶＭＤが常染色体優性であること；かつ２）ＢＥＳＴ１変異は非常に不均一であること、により複雑である。そのため、特異的変異を標的にする従来の患者特異的療法は、実用的な治療選択ではない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
優性障害は、劣性障害よりも治療することが非常に困難である。事実、優性遺伝障害のための効果的な治療は現在存在しない。本発明の方法は、満たされていない必要性に対処し、疾患関連遺伝子の変異を有する全ての患者に一般的に適用できる。本方法は、常染色体劣性疾患のみを治療する従来の患者特異的遺伝子療法の限界を克服し、かついずれの優性疾患にも広く適用可能であり得る。
【発明の効果】
【０００９】
一実施形態では、本開示は、細胞中の常染色体優性疾患関連遺伝子を改変する方法であって、常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターと細胞を接触させることを含むか、又は接触させることから本質的になるか、又は接触させることからさらになり、常染色体優性疾患関連遺伝子が、眼疾患に関連するか、又はそれを修正する、方法に関する。一態様では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、（ｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列；（ｉｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子のイントロンにハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡをコードする第２の配列；及び（ｉｉｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第３の配列、を含む少なくとも１種のベクター内に含まれ、Ｃａｓヌクレアーゼは、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする。細胞の非限定的な例は、動物細胞、哺乳動物細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウマ細胞及びヒト細胞を含む。
【００１０】
一実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、若しくは配列番号４９から選択されるヌクレオチド配列又はその各々の等価物を含む。
【００１１】
別の態様では、本開示は、細胞中の常染色体優性疾患関連遺伝子を改変する方法であって、常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターと細胞を接触させることを含むか、或いは接触させることから本質的になるか、又は接触させることからさらになり、常染色体優性疾患関連遺伝子が眼疾患に関連するか、又はそれを修正する、方法を提供する。一態様では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、（ｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、及び（ｉｉ）触媒的に欠損したＣａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）をコードする第２の配列、を含む少なくとも１種のベクター内に含まれる。細胞の非限定的な例は、動物細胞、哺乳動物細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウマ細胞及びヒト細胞を含む。
【００１２】
一実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８又は配列番号３９から選択されるヌクレオチド配列又はそれらの各々の等価物を含む。
【００１３】
一態様では、本開示は、対象中の常染色体優性眼疾患を治療する方法であって、対象中の常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられるか、又はそれを修正するためにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターの治療有効量を対象に投与することを含むか、又は投与することから本質的になるか、又は投与することからさらになる方法を提供する。一態様では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列；（ｉｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子のイントロンにハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡをコードする第２の配列；及び（ｉｉｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第３の配列、を含む少なくとも１種のベクター内に含まれ、Ｃａｓヌクレアーゼは、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする。対象の非限定的な例は、動物、哺乳動物、イヌ、ネコ、ウマ及びヒト患者を含む。
【００１４】
本開示は、さらに、対象中の常染色体優性眼疾患を治療する方法であって、対象中の常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターの治療有効量を対象に投与することを含むか、又は投与することから本質的になるか、又は投与することからさらになる。一態様では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列；及び（ｉｉ）触媒的に欠損したＣａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）をコードする第２の配列、を含む少なくとも１種のベクターを含み、Ｃａｓヌクレアーゼは、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする。対象の非限定的な例は、動物、哺乳動物、イヌ、ネコ、ウマ及びヒト患者を含む。
【００１５】
一実施形態では、常染色体優性疾患関連遺伝子は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、若しくは配列番号３３から選択される配列、又はそれらの各々の等価物を含む。別の実施形態では、常染色体優性疾患関連遺伝子にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡは、配列番号３１の配列又はその等価物を含む。一実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする野生型対立遺伝子を切断しないか又は標的にしない。
【００１６】
別の実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号３１の配列を含む常染色体優性疾患関連遺伝子にハイブリダイズする。
【００１７】
一実施形態では、常染色体優性疾患関連遺伝子はＲＨＯである。一実施形態では、ＳＮＰのバリアントは、ｒｓ７９８４：Ｇ  ＳＮＰ、ｒｓ７９８４：Ａ  ＳＮＰ、ｒｓ２８５５５５８：Ｇ  ＳＮＰ、又はｒｓ２８５５５５８：Ａ  ＳＮＰである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａは、ＣｈｏｐＳｔｉｃｋ  ＡＡＶベクターの模式図である。左側は、ＡＡＶ／Ｃａｓ９ベクターの模式図を示す。化膿レンサ球菌からのＣａｓ９は、１７３ｂｐの短いＣＭＶプロモーター（ｓＣＭＶ、配列番号１４）によって駆動され、５０ｂｐの合成ポリＡシグナル（ＳＰＡ）（配列番号１９）によって終結される。右側は、ＲＨＯ  ｓｇＲＮＡ及びコドン改変されたｃＤＮＡ（ｃｍＲＨＯ、配列番号９）発現ベクターの模式図を示す。ｓｇＲＮＡ１及びｓｇＲＮＡ２は、Ｕ６プロモーター（配列番号１２）によって駆動される。ｃ末端タグ付きｃ−Ｍｙｃを有するｃｍＲＨＯ  ｃＤＮＡは、ＣＢｈプロモーター（配列番号１０）により駆動され、ｂＧＨポリＡシグナル（配列番号１１）によって終結される。矢印は転写の方向を示す。５’−及び３’−ＩＴＲ、ＡＡＶの逆位末端反復配列。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣｈｏｐＳｔｉｃｋ  ＡＡＶ遺伝子療法計画の模式図である。左側の模式図（Ｉ）は、ＡＡＶ／Ｃａｓ９とＡＡＶ／ｓｇＲＮＡ１＆２＿ｃｍＲＨＯの同時感染後、Ｃａｓ９タンパク質と２つのｈＲＨＯエキソン１特異的ｓｇＲＮＡのｓｇＲＮＡ１及びｓｇＲＮＡ２の共発現が、宿主ＲＨＯエキソン１における１２１ｂｐ欠失をもたらすことを示す。図（ＩＩ）の右側は、オリジナルの及びコドン改変されたロドプシン配列を示す。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ〜２Ｂは、デュアルｓｇＲＮＡが単一のｓｇＲＮＡよりもＲＨＯのより効率的な「Ｃｈｏｐ」を提供することを示す。図２Ａは、ＲＨＯにおけるｓｇＲＮＡ１及びｓｇＲＮＡ２の標的部位の模式図である。２つのｓｇＲＮＡは両方とも、翻訳の開始であるＲＨＯエキソン１を標的にする。遺伝子編集が起こると、１つ又は２つのｓｇＲＮＡ部位が標的にされるかとは無関係に、コード領域の大部分が影響を受ける。この設計は、遺伝子発現の最大の破壊を確実にし、多くの異なる種類のＲＨＯ変異に適用できる。図２Ｂは、１つのｓｇＲＮＡのみを使用する場合と比較して、ヒト腎臓細胞株での「Ｃｈｏｐ」計画による遺伝子切断の向上された効率を示す。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、ｓｇＲＮＡを含まないか、単一ｓｇＲＮＡ１、単一ｓｇＲＮＡ２のいずれか、又はその両方を保有するＣａｓ９ベクター（ｐＸ４５９）でトランスフェクトした。９６時間後、ＤＮＡを抽出し、ＲＨＯ遺伝子座を増幅し、ミスマッチ検出のＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイにより分析した。２つのｓｇＲＮＡを一緒に適用することにより、約３０〜４０％の遺伝子欠失が生じ、これは、哺乳動物細胞において「Ｃｈｏｐ」遺伝子欠失／破壊）計画が効率的に機能することを示した（レーン４）。対照的に、一度に１つのｓｇＲＮＡ（レーン２及び３）を用いると、ＲＨＯ遺伝子の大きさは変化しない。ゲノムＤＮＡの約３０％が、１つのｓｇＲＮＡにより非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を受けた。対照的に、２つのｓｇＲＮＡを使用した場合、最高で８０％が編集された（欠失及びＮＨＥＪ）。対照として、等量のプラスミドＤＮＡ（１μｇ／１×１０５個の２９３ＦＴ細胞）を各グループで使用した。
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、単一のｓｇＲＮＡと比較した場合に、デュアルｓｇＲＮＡによる遺伝子の不活化（「Ｃｈｏｐ」又は遺伝子の欠失／破壊）の改善された有効性を示す。図３Ａは、ＲＨＯ発現ベクターにおけるｓｇＲＮＡ１及びｓｇＲＮＡ２の標的部位の模式図である。２つのｓｇＲＮＡは、示されるようにＲＨＯ  ｃＤＮＡの５’末端を標的にする。ｗｔのＲＨＯ  ｃＤＮＡをＣＭＶプロモーターによって駆動した。ＣＭＶプロモーターにより駆動されるＥＧＦＰを、イムノブロットアッセイで内部対照として使用し、トランスフェクション効率及びタンパク質負荷の差を正規化する。図３Ｂは、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、ＲＨＯ発現ベクターと、ｓｇＲＮＡ１、ｓｇＲＮＡ２のいずれか、又はその両方を保有するＣａｓ９機構（ｐＸ４５９）を発現する別のベクターとで同時トランスフェクトしたときに、イムノブロットによって測定したタンパク質レベルを示す。ｓｇ３グループは、非特異的な対照ｓｇＲＮＡである。図３Ｃは、ＥＧＦＰを用いて正規化した後に、２種のｓｇＲＮＡは共にＲＨＯ発現を７０％下げるが、単一ｓｇＲＮＡを用いると、（対照グループ（ｓｇ３）と比較して）０〜３０％しか発現を低下させないことを示す。この結果は、「Ｃｈｏｐ」計画を用いて、タンパク質発現を有意に低下又は不活化できることを示す。
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、「Ｃｈｏｐ」が、相同組換えのような機構を介して正確な修復を容易にするために、二本鎖切断を生じさせる可能性があることを示す。図４Ａは、ＲｈｏＤ１９０ＮマウスのＲＰモデルにおけるＡＡＶ媒介性ＣＲＩＳＰＲ編集の模式図である。ＡＡＶ／Ｃａｓ９ベクター、及びｗｔドナー鋳型とＤ１９０Ｎ変異を標的にするｓｇＲＮＡとを含有するバイシストロニックＡＡＶベクターのデュアルウイルス処理は、変異特異的修復をもたらす。ドナー鋳型構築物は、２つの改変：１）ＣＲＩＳＰＲ誘導相同組換え後のＤＮＡ置換の同定のためのＤ１９０コドンの上流での追加のＡｆｌＩＩ部位の作製、及び２）ドナー鋳型をｓｇＲＮＡが認識できないようにさせるか、ひいてはＣａｓ９耐性にさせるための５個の揺らぎ塩基対（ｂｐ）の導入、を有する野生型Ｒｈｏ配列を含有する。図４Ｂは、前述のＡＡＶウイルスで処理したマウス網膜ＤＮＡでの分解（ＴＩＤＥ）分析（ｈｔｔｐ：／／ｔｉｄｅ−ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ．ｎｋｉ．ｎｌで公に入手可能：２０１６年４月３０日検索）によるｉｎｄｅｌ（挿入及び欠失）の追跡を用いて評価した編集効率を示し、これは、約５０％の光受容体がＮＨＥＪを経験したことを示した。図４Ｃは、光受容体の大部分が相同組換えを介して修復されることを示す、ＲｈｏＤ１９０Ｎ／＋マウスからの網膜ＤＮＡの代表的なＡｆｌＩＩ消化である（レーン２）。ＲｈｏＤ１９０Ｎ／＋マウスを、野生型ドナー鋳型を有する（レーン２）又は含まない（レーン１）Ｃａｓ９ベクターで処置し、網膜ＤＮＡを抽出し、示したスクリーニングプライマーで増幅した。
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ〜５Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／ドナー鋳型媒介修復による組織学的及び機能的救助を示す。ＲｈｏＤ１９０Ｎ／＋ヘテロ接合体マウスを、出生後３日目に皮下注射によって、図４Ａ〜Ｃに記載のデュアルウイルス治療で処置した。図５Ｂは、処置後にＥＲＧによって評価したマウスの視覚機能を示す。図５Ａは、網膜組織切片の組織学的評価を示す。網膜切片のＨ＆Ｅ染色は、未処置の眼と比較して、光受容体（外核層、ＯＮＬ）生存の１３７％の増加を示す（図５Ａ）。長方形のバーは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（注射）及び対照（未処置）の眼における光受容体のＯＮＬの拡大断面積を示す。網膜電図（ＥＲＧ）は、３ヶ月齢のＲｈｏＤ１９０Ｎ／＋ヘテロ接合体の遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲ媒介療法のａ波とｂ波の両方における顕著な改善を示す（図５Ｂ）。
【図６Ａ−６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、マウスＲｈｏ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ媒介エキソン１置換によるＲＨＯヒト化動物モデルの作製を説明する。このシステムは、研究者がインビボでＣＲＩＳＰＲ構成要素を試験することを可能にする。図６Ａは、野生型（ｗｔ）又は変異型のヒト（ｈ）ＲＨＯエキソン１のいずれかとマウス（ｍ）Ｒｈｏエキソン１を置換する計画の説明図である。Ｃａｓ９及びＲｈｏエキソン１特異的ｓｇＲＮＡをコードするプラスミドｐＸ４５９を共エレクトロポレーションすることにより、ＥＳ細胞における相同組換えを容易にする二本鎖切断をマウスエキソン１中に生じさせることができる。図６Ｂは、ヒトＲＨＯエキソン１とマウスＲｈｏエキソン１の置換を示す追加のＡｖａＩＩ部位を特徴とするＥＳ細胞ＤＮＡの制限断片長多型（ＲＦＬＰ）アッセイ結果を示す（レーン１及び２）。図６Ｃ：ＰＣＲアンプリコンの配列決定電気泳動図は、１つの標的化ＥＳクローンからのヒト配列とマウス配列の融合を明らかにする。
【図７Ａ−７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、マウス胚幹細胞でのＣＲＩＳＰＲによるＰｄｅ６ａをコードする遺伝子中のＤ６７０Ｇ対立遺伝子の遺伝子置換の成功を示す。図７Ａは、２つの変化を有するＰｄｅ６ａ：（１）Ｄ６７０Ｇコドンの上流に追加のＳｐｈＩ部位を作製するＰｄｅ６ａコドン改変を導入した；かつ（２）ドナー鋳型をｓｇＲＮＡ標的に耐性にさせる、８個の揺らぎ塩基対を導入した、を含有するドナー構築物の模式図である。図７Ｂは、相同組換えが行われたＥＳ細胞から作製したＰＣＲアンプリコンを示す。図７Ｃは、ドナー鋳型とのＤ６７０Ｇ対立遺伝子の予想される置換を特徴とする、標的ＥＳクローンＤＮＡの配列決定電気泳動図のデータを示す。
【図８Ａ−８Ｃ】図８Ａ〜８Ｃは、「ＣｈｏｐＳｔｉｃｋ」（遺伝子欠損又は遺伝子破壊）を使用して、若年黄斑変性症（ＯＭＩＭ＃１２６６００）を有する患者からの誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞で、変異を含有するものなどの目的の遺伝子領域を効率的に欠失及び修正できることを示す。図８Ａは、ヒトｉＰＳＣ（ｉＰＳ細胞）中へのＣＲＩＳＰＲ構成要素の導入の模式図である。Ｃａｓ９タンパク質／ｓｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を、単鎖ドナー鋳型（ｓｓＯＤＮ）と共にヒトｉＰＳ細胞中に同時ヌクレオフェクトした。クローンをさらに選択し、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）アッセイによりスクリーニングした。図８Ｂは、この場合のｓｇＲＮＡ標的化部位の模式図である。ドットでマークしたヌクレオチドは変異部位に対応する。図８Ｃは、ドナー鋳型の置換を示す、コロニーＰＣＲの配列決定結果である。
【図９】図９は、自己切除ＡＡＶ／Ｃａｓ９ベクターの模式図である。１７３ｂｐの短いＣＭＶプロモーター（ｓＣＭＶ）により駆動され５０ｂｐの合成ポリＡシグナル（ＳＰＡ）により終結される、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９は、ｓｇＲＮＡ−Ｙ１（配列番号７）標的配列（ショウジョウバウ由来のＧＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＧＴＧＧ）に隣接している。細胞がＣａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡ−Ｙ１を同時に発現すると、このＡＡＶ／Ｃａｓ９ベクターはＣａｓ９自体によって破壊される。
【図１０Ａ−１０Ｄ】患者由来ｉＰＳ細胞中のいくつかの遺伝子のＣＲＩＳＰＲｒ修正。（Ａ）Ｃａｓ９発現ベクターのダイアグラム及びＲＨＯＲ１３５Ｌを標的にするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９修復計画の模式図。同じ設計をＢ〜Ｄで使用した。（Ｂ）Ｐｖｕｌ制限部位における制限断片長多型（ＲＦＬＰ）アッセイは、Ｃａｓ９がドナー鋳型を切断し、組み込んだことを明らかにする。（Ｃ）インビトロＳｕｒｖｅｙｏｒミスマッチ切断アッセイは、ｇ５９ｇＲＮＡによるＲＰＧＲの切断を示す（左パネルの右の矢印）。ＤＮＡ配列決定クロマトグラムは、修正された点変異（右パネルの下部クロマトグラム中の矢印）及び未修正の未処理対照（右パネルの上部クロマトグラム中の矢印）を示す。（Ｄ）ＨＴＲＡ１のＤＮＡ配列決定クロマトグラムは、修正された点変異（右パネルの下部クロマトグラム中の矢印）及び未修正未処理対照（右パネルの上部クロマトグラム中の矢印）を示す。
【図１１】ＣＲＩＳＰＲｒ、ＣＲＩＳＰＲｄ、及びＣＲＩＳＰＲｉの比較。ＨＤＲ：相同性特異的修復；ＳＮＰ：一塩基多型；ＴＳＳ：転写開始部位。ＣＲＩＳＰＲｒ：Ｐｒｏｓ：欠点のない遺伝子修正；ｃｏｎｓ：低頻度のＨＤＲ；変異特異的設計（ＢＥＳＴ１に見られる２５０個超の変異）を必要とする。ＣＲＩＳＰＲｄ：１つの設計が全ての変異を処理する；効率的な遺伝子切断。ＣＲＩＳＰＲｉ：１つの設計が全ての変異を処理する；リバーシブル。
【図１２】ヘテロ接合性が高いＳＮＰを標的にする２つのｇＲＮＡ。バリアントのレベルは領域によって示される。ＡＬＬ、全世界の罹患率；ＡＦＲ、アフリカ；ＡＭＲ、アメリカ；ＥＡＳ、東アジア；ＥＵＲ、欧州；ＳＡＳ、南アジア。
【図１３Ａ−１３Ｃ】ＣＲＩＳＰＲｄは、ＢＥＳＴ１エキソン１の選択的欠失を媒介する。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲｄの切断部位の模式図。ｇＲＮＡ１はＳＮＰ  ｒｓ９７２３５５を標的とし、ｇＲＮＡ３はイントロンの中心を標的にする。水平矢印は、スクリーニング用プライマーセットを示す。（Ｂ）ｇＲＮＡ１及びｇＲＮＡ３を保有するプラスミドｐｘ４５９を、ＳＮＰ  ｒｓ９７２３５５についてヘテロ接合型であるＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。４８時間のインキュベーション後、ゲノムＤＮＡを、ＣＲＩＳＰＲｄ媒介性欠失についてスクリーニングした。３０６ｂｐ切断断片を検出した（２，２５６ｂｐの親配列と比較する）。（Ｃ）総ＤＮＡをサンガー配列決定により解析し、標的配列が欠失されたことを確認した。
【図１４Ａ−１４Ｂ】インビトロＳＮＰ特異的ＢＥＳＴ１標的化は、対立遺伝子特異的ＳＮＰ計画を確証する。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ切断鋳型Ａ及びＢを、ｒｓ９７２３５３及びｒｓ９７２３５５においてヘテロ接合ＳＮＰバリアントを有する患者からのＢＥＳＴ１  ＴＳＳ領域のＰＣＲ増幅により作製した。両方のＳＮＰの場合、変異型ＧのみがＣＲＩＳＰＲ能力を有する。（Ｂ）鋳型Ａ又はＢ（６５０ｂｐ）をＣａｓ９及びｇＲＮＡ１又はｇＲＮＡ２のいずれかに暴露した（ＣＴＲＬ＝ｇＲＮＡなし）。ｇＲＮＡ２ではなく、ｇＲＮＡ１は、患者の鋳型Ａ上で切断を効率的に指示し、５９０ｂｐ＋７０ｂｐバンドをもたらす。（７０ｂｐバンドは、あまりにも薄いのでここでは見ることができず、鋳型ＡへのＣａｓ９／ｇＲＮＡ２の結合、−しかし適切なＰＡＭ部位がないため切断されない−により、ＤＮＡの分子量がシフトすることに留意されたい。）鋳型Ｂを用いて同じ実験を行った場合、ｇＲＮＡ２（ＲＮＡ１ではない）のみが切断を媒介できる。
【図１５Ａ−１５Ｃ】ＣＲＩＳＰＲｉは、変異型ＢＥＳＴ１対立遺伝子の発現を選択的に停止させる。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲｉは、二本鎖ＤＮＡ切断を生じず、代わりに、転写因子によるＴＳＳ結合を阻害することにより遺伝子の発現を停止する。ＣＲＩＳＰＲｒとは異なり、ＣＲＩＳＰＲｉは、ＤＮＡを切断しないが、ｇＲＮＡを介してそれを標的にする触媒的に欠損したＣａｓ９（ｄＣａｓ９）を使用する。ＣＲＩＳＰＲｉ機構がＴＳＳを結合すると、ｄＣａｓ９と融合されるクルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）遺伝子リプレッサーが、下流の遺伝子の発現を停止させる（第１世代）。第２世代のＣＲＩＳＰＲｉは、ＰＵＦ−ＫＲＡＢレプレッサーを介してより強く抑制する。ＰＵＦアダプタータンパク質は、ＰＵＦ結合配列で改変されたｇＲＮＡを結合する（Ｂ、Ｃ）。ＴＳＳでの２つの連続するＳＮＰ（ｒｓ９７２３５３又はｒｓ９７２３５５）は、対立遺伝子特異的ターゲティングを可能にする。例えば、ｇＲＮＡ２は、ＴＳＳの近傍のｒｓ９７２３５３：Ｇ  ＳＮＰを標的として、ＭＴ  ＢＥＳＴ１発現をノックダウンする。
【図１６Ａ−１６Ｃ】ｉＲＰＥ細胞でのＢＥＳＴ１  ｍＲＮＡ発現のＣＲＩＳＰＲｉノックダウン。ＳＮＰ  ｒｓ９７２３５５にＧＧＧバリアントを有するＶＭＤ患者からのｉＰＳ由来のＲＰＥ細胞。（Ａ）ｇＲＮＡ１標的部位の設計。（Ｂ）細胞を、２週間にわたりピューロマイシンにより選択されるプラスミドＰｕｒｏ−ＣＲＩＳＰＲｉ−ｓｇＲＮＡ１によりトランスフェクトした。（Ｃ）ＢＥＳＴ１  ｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲにより評価した。
【図１７Ａ−１７Ｂ】Ｃｌ−バイオセンサーを発現し５μＭのＡ２３１８７（左パネル）で刺激した野生型の（Ａ）及びｐＡｒｇ２１８Ｈ（Ｂ）患者由来のＲＰＥ細胞の代表的な静止画像。画像を、刺激後の指示された時間（分）で取得した。グラフは、ｔ＝０時点で正規化した、平均全細胞バイオセンサー放出強度の定量化を示す（Ｍｏｓｈｆｅｇｈ，Ｖｅｌｅｚら  ２０１６）。
【図１８Ａ−１８Ｄ】Ｃｉｒｒｕｓ  ＨＤＯＣＴ（Ｚｅｉｓｓ；Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で取得したＶＭＤを有する４５歳の男性（Ａ）及び３ｌ歳の女性（Ｃ）のＥｎ  ｆａｃｅ  ＯＣＴ、及びＩＳ／ＯＳバンドの近似レベルでの対応する３７μｍ切片の横断面（Ｂ、Ｄ）。中心の卵黄様病変は、この技術により高分解能で見られ、卵黄様病変の構造構成要素を評価する際に従来のＦＡＦ及びＳＤ−ＯＣＴイメージングを補うことができる。偽蓄膿は、各患者（白星印）で可視化されるが、３１歳の女性ではより進行している（Ｃ）。
【図１９Ａ−１９Ｆ】ｐ．Ｒ２１８Ｈ：ｃ．６５３Ｇ＞ＡによりＶＭＤを有する３１歳の女性におけるＳＷ−ＡＦ。（Ａ）及び（Ｄ）、それぞれ３０歳の時の２０１５年１１月４日に取得したＯＤ及びＯＳ。（Ｂｂ）及び（Ｅ）、それぞれ１２ヶ月後の、３１歳の時の２０１６年１０月２６日に取得したＯＤ及びＯＳ。（Ｃ）及び（Ｆ）、それぞれ１３ヶ月後の、３１歳の時の２０１６年１２月１４日に取得したＯＤ及びＯＳ。
【図２０】光干渉断層撮影（ＯＣＴ）は、信頼性のある評価項目であり得る。ＯＣＴ画像は１年以内の進行を監視する。ｐ．Ａｌａ１０Ｔｈｒにより常染色体優性ＶＭＤを有する１１歳の少女で進行が見られた。破線は、病変の初期の水平直径を示す。両面矢印は、病変の初期上昇を示す。
【図２１】ｐ．Ｇｌｎ２９３ＬｙｓによるＶＭＤを有する４４歳の男性で見られるＯＤとＯＳの間の対称性。ＦＡ画像は、ビスレチノイドリポフスチン蓄積及び色素上皮萎縮を検出する。
【図２２Ａ−２２Ｂ】ＣＲＩＳＰＲ３．０：異なる優性変異を保有するベストＶＭＤ患者での患者用の治療。（Ａ）１対の密接に関連付けられるＳＮＰ  ｒ９７２３５５及びｒｓ９７２３５３を、ＣＲＩＳＰＲ３．０（図２２Ｃ）で利用して、一対の相同における各相同体の同一性を特徴付ける。染色体上の両方のＳＮＰのヌクレオチドバリアントの全４つの可能な組み合わせが示される。ＣＲＩＳＰＲ３．０を達成するために、３つのｇＲＮＡを設計した：ｇＲＮＡ−ａはｒｓ９７２３５５ヌクレオチドバリアントＧ（かつＡではない）を標的にする；ｇＲＮＡ−ｂはｒｓ９７２３５３ヌクレオチドバリアントＧ（かつＣではない）を標的にする；ｇＲＮＡ−ｃは下流のイントロン領域を標的にする。相同体１（遺伝子型１）に変異が存在する場合、ｇＲＮＡ−ａ＋ｇＲＮＡ−ｃを用いて、相同体１からの変異型ＢＥＳＴ１遺伝子の発現を特異的に破壊する。変異が代わりに相同体２（遺伝子型２）上にある場合、ｇＲＮＡ−ｂ＋ｇＲＮＡ−ｃを用いる。これら２つのＳＮＰは遺伝子型３及び４における２つの相同体を区別しないので、これらの遺伝子型は、他のＳＮＰ及びｇＲＮＡの使用を必要とする。（Ｂ）ｒｓ９７２３５５及びｒｓ９７２３５３に基づき設計したｇＲＮＡセットは、ベストＶＭＤ患者集団の約５０％を治療できる（遺伝子型１＋２、ＴＯＰＭＥＤデータベースに基づく）。各患者からのＤＮＡを分析して、治療前に遺伝子型を決定できる（図２５、ワークフロー参照）。
【図２３Ａ−２３Ｂ】ＣＲＩＳＰＲ３．０：異なる優性変異を保有するベストＶＭＤ患者での患者用の潜在的治療。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ３．０において、一対の密接に関連付けられるＳＮＰのｒ９７２３５５及びｒｓ９７２３５３を利用して、一対の相同における各相同体の同一性を特徴付ける。染色体上の両方のＳＮＰのヌクレオチドバリアントの全４つの可能な組み合わせが示される。ＣＲＩＳＰＲ３．０を達成するために３つのｇＲＮＡを設計した：ｇＲＮＡ−ａはｒｓ９７２３５５ヌクレオチドバリアントＧ（かつＡではない）を標的にする；ｇＲＮＡ−ｂはｒｓ９７２３５３ヌクレオチドバリアントＧ（かつＣではない）を標的にする；ｇＲＮＡ−ｃは下流のイントロン領域を標的にする。相同体１（遺伝子型１）に変異が存在する場合、ｇＲＮＡ−ａ＋ｇＲＮＡ−ｃを用いて、相同体１からのＢＥＳＴ１遺伝子の発現を特異的に破壊する。変異が代わりに相同体２（遺伝子型２）上にある場合、ｇＲＮＡ−ｂ＋ｇＲＮＡ−ｃを用いる。これら２つのＳＮＰは、遺伝子型３及び４における２つの相同体を区別しないので、これらの遺伝子型は、他のＳＮＰ及びｇＲＮＡの使用を必要とする。（Ｂ）ｒｓ９７２３５５及びｒｓ９７２３５３に基づき設計したｇＲＮＡセットは、全ベストＶＭＤ患者集団の約５０％を治療できる（遺伝子型１＋２、ＴＯＰＭＥＤデータベースに基づく）。各患者からのＤＮＡを分析して、治療前の遺伝子型を決定する（図２２Ｄ、ワークフロー参照）。
【図２４】ＣＲＩＳＰＲ１．０、ＣＲＩＳＰＲ２．０及びＣＲＩＳＰＲ３．０の概要である。
【図２５】ＣＲＩＳＰＲ３．０治療のためのワークフローをまとめる。
【図２６Ａ−２６Ｃ】ＣＳＧＴ（ＣＲＩＳＰＲ３．０）−ベストＶＭＤ患者のほぼ半分のための治療。ＢＥＳＴ１遺伝子を、３５人のベストＶＭＤ患者からの血液サンプルを用いて配列決定して、上流のＳＮＰのｒｓ９７２３５５及びｒｓ９７２３５３の両方のヌクレオチドバリアントの全４つの可能な組み合わせを明らかにした（これらの２つのＳＮＰが遺伝的に関係することに留意されたい）。相同染色体間のＴＳＳ  ＳＮＰの相違を利用するＣＲＩＳＰＲ３．０は、標的化ＴＳＳ  ＳＮＰがヘテロ接合型である場合、選択的遺伝子切断を媒介する。そのため、患者集団の４９．９％を表す、遺伝子型１及び２（変異を有しシスにあるＳＮＰヘテロ接合体）は、ＣＲＩＳＰＲ３．０によって治療可能であり、遺伝子型３及び４（ＳＮＰホモ接合体）は、ＣＲＩＳＰＲ２．０によって治療できる。
【図２７Ａ−２７Ｂ】デュアルｇＲＮＡによるゲノムＢＥＳＴ１の対立遺伝子特異的切除及びインビトロでのＲＰＥ細胞中のＳＮＰ編集時のＢＥＳＴ１発現の測定。（Ａ）ゲノムＢＥＳＴ１を、異なるデュアルｇＲＮＡシステム（ＣＲＩＳＰＲ３．０）により、インビトロにて２９３ＦＴ細胞中で切断した。４つのグループのうち、異なるサイズの切断型ＢＥＳＴ１対立遺伝子（矢印）が３つのグループ（Ｉ、ＩＩ及びＩＶ）で検出された。（Ｂ）ＢＥＳＴ１発現は、ＣＲＩＳＰＲ２．０編集ＶＭＤ  ｉＲＰＥ及びＣＲＩＳＰＲ３．０編集ＶＭＤ  ｉＲＰＥにおいてロバストである。ＶＭＤ患者線維芽細胞由来のｉＲＰＥを、ＢＥＳＴ１対立遺伝子のＣＲＩＳＰＲ２．０又は３．０編集のためのレンチウイルスデュアルｇＲＮＡベクター；ＷＴ  ＢＥＳＴ１  ｃＤＮＡ（＋ＷＴ）を保有するベクター又は保有しないベクター、で形質導入した。ＷＴ  ｉＲＰＥは形質導入されなかった。２週間後に、ＲＮＡを収集し、ｃＤＮＡを作製し、ＢＥＳＴ１転写産物の発現をｑＰＣＲによって決定した。ＢＥＳＴ１のＰＣＲ産物は約２６０ｂｐである。ＷＴ、ＳＮＰ  ｒｓ９７２３５５についてホモ接合型のＷＴ  ＲＰＥ；対照、ＷＴ  ＢＥＳＴ１  ｃＤＮＡのみを保有するデュアルベクター（ｇＲＮＡを含まない）；ＧＡＰＤＨ、内部対照。対照グループではレンチウイルスベクターを用いなかった；ＧＡＰＤＨを内部対照として用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
本開示による実施形態は、以下でより十分に説明される。しかしながら、本開示の態様は、異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載の実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が全く完全であり、当業者に本発明の範囲を十分に伝達するように提供される。本明細書の説明において使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではない。
【００２０】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての用語（技術用語及び科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般に使用される辞書に定義されたものなどの用語は、本出願及び関連技術の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有するものとして解釈されるべきであり、本明細書において明確に定義されない限り、理想化された又は過度に正式な意味で解釈されるべきではないことがさらに理解されるであろう。以下に明確に定義されていないが、そのような用語は、それらの共通の意味に従って解釈されるべきである。
【００２１】
本明細書の説明において使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で述べられた全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【００２２】
本技術の実施は、特に指示がない限り、当業者の範囲内である、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、及び組換えＤＮＡの従来の技術を使用する。
【００２３】
文脈が特に示さない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特徴は任意の組み合わせで使用できることが特に意図される。さらに、本開示はまた、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の特徴又は特徴の組み合わせを除外又は省略できることも企図する。説明のために、複合体が構成要素Ａ、Ｂ及びＣを含むと本明細書が述べる場合、Ａ、Ｂ若しくはＣのいずれか、又はそれらの組み合わせは省略され、単独で又は任意の組み合わせでは請求され得ないことが特に意図される。
【００２４】
特に明記しない限り、全ての具体的な実施形態、特徴、及び用語は、列挙された実施形態、特徴、又は用語とそれらの生物学的等価物の両方を含むことを意図する。
【００２５】
範囲を含む全ての数値、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、及び分子量は、適切には１．０又は０．１の増分で、或いは＋／−１５％、或いは１０％、或いは５％、或いは２％の変動によって（＋）又は（−）に変化する近似値であり、そのような範囲が含まれる。必ずしも明示的に記載されていないが、全ての数値に用語「約」が先行することを理解されたい。必ずしも明示的に記載されていないが、本明細書に記載の試薬は単なる例示であり、そのような均等物は当技術分野で公知であることも理解されたい。
【００２６】
本開示全体を通して、様々な刊行物、特許及び公開された特許明細書は、識別の引用又はアラビア数字によって参照される。アラビア数字によって識別される刊行物についての完全な引用は、特許請求の範囲のすぐ前で見出される。これらの刊行物、特許及び公開された特許明細書の開示は、本発明が属する技術分野の状態をより完全に説明するために、参照によりその全体が本開示に組み込まれる。
【００２７】
定義
本技術の実施は、特に指示がない限り、当業者の範囲内である、有機化学、薬理学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学及び組換えＤＮＡの従来の技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：実験室マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版（１９８９）；分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編），（１９８７））；シリーズの酵素学の方法（ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：実践的手法（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ（編）（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（編）（１９８８）抗体、実験室マニュアル及び動物細胞培養（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（編）（１９８７））を参照されたい。
【００２８】
本発明の説明及び添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その」は、文脈が特に明確に示さない限り、複数形を含むことを意図する。
【００２９】
本明細書で使用される用語「含む」は、組成物及び方法が列挙された要素を含むが、他を除外しないことを意味することを意図する。本明細書で使用されるように、移行句の本質的にからなる（及び文法的な変形）は、列挙された材料又は工程を包含するものとして解釈されるべきであり、列挙された実施形態の基本的及び新規な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないものである。そのため、本明細書で使用される用語「本質的にからなる」は、「含む」と等価であると解釈されるべきではない。「からなる」は、本明細書に開示される組成物を投与するための他の成分の微量元素及び実質的な方法の工程より多くのものを排除することを意味する。これらの移行用語の各々によって定義される態様は、本開示の範囲内である。
【００３０】
量又は濃度などの測定可能な値を参照する際に本明細書で使用される用語「約」は、特定量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、又はさらに０．１％の変動を包含することを意味する。
【００３１】
本明細書に開示される任意の成分、範囲、剤形などの選択を記載するために使用される時の用語「許容される」又は「有効な」、又は「十分な」は、上記成分、範囲、剤形などが、開示される目的に適していることを意図する。
【００３２】
また、本明細書で使用される「及び／又は」は、関連する列挙された項目の１以上の任意の全ての可能な組み合わせ、並びに代替的に解釈される場合の組み合わせ（「又は」）の欠如を指し、それらを包含する。
【００３３】
本明細書で使用される用語「細胞」は、必要に応じて対象又は市販の供給源から得られる原核細胞又は真核細胞のいずれかを指してよい。
【００３４】
「真核生物細胞」は、モネラ界を除く生命界の全てを含む。それらは、膜結合核を介して容易に区別できる。動物、植物、真菌、及び原生生物は、その細胞が内部膜及び細胞骨格によって複合構造に組織化された真核生物又は生物体である。最も特徴的な膜結合構造は核である。特に列挙しない限り、用語「宿主」は、例えば、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含む、真核生物宿主を含む。真核細胞又は宿主の非限定的な例は、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、鳥類、爬虫類及びヒト、例えば、ＨＥＫ２９３細胞及び２９３Ｔ細胞を含む。
【００３５】
「原核細胞」は、通常、核又は任意の他の膜結合オルガネラを欠き、２つのドメイン、細菌及び古細菌に分けられる。染色体ＤＮＡに加えて、これらの細胞は、エピソームと呼ばれる円形ループに遺伝子情報を含有することもできる。細菌細胞は、非常に小さく、およそ動物のミトコンドリアの大きさ（直径が約１〜２μｍ、長さが１０μｍ）である。原核細胞は、３つの主な形状：棒状、球状、及びらせん、を特徴とする。真核生物のような精巧な複製プロセスを経る代わりに、細菌細胞は２分裂によって分裂する。例は、バチルス属細菌、大腸菌、及びサルモネラ属細菌を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
核酸配列に適用される場合の用語「コードする」は、その天然状態にある場合又は当業者に周知の方法によって操作される場合にポリペプチドを「コードする」と言われ、転写並びに／又は翻訳されてポリペプチド及び／若しくはその断片のｍＲＮＡを生成し得る、ポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補体であり、コード配列をそれから推定できる。
【００３７】
用語「等価な」又は「生物学的等価物」は、特定の分子、生物物質又は細胞物質を参照する場合には互換的に使用され、所望の構造又は機能をなお維持しながら最低限の相同性を有するものを意図する。等価ポリペプチドの非限定的な例は、それに対し少なくとも６０％、或いは少なくとも６５％、或いは少なくとも７０％、或いは少なくとも７５％、或いは８０％、或いは少なくとも８５％、或いは少なくとも９０％、或いは少なくとも９５％の同一性若しくはポリペプチド配列を有するポリペプチド、又はそのようなポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドに対して高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド又はその相補体によってコードされるポリペプチドを含む。高ストリンジェンシー条件は、本明細書中に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。或いは、その等価物は、ポリヌクレオチド又はそれに対する補体によってコードされ、参照ポリヌクレオチド、例えば、野生型ポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％、或いは少なくとも７５％、或いは８０％、或いは少なくとも８５％、或いは少なくとも９０％、或いは少なくとも９５％の同一性、又は少なくとも９７％の配列同一性を有するポリペプチドである。
【００３８】
等価ポリペプチドの非限定的な例は、参照ポリヌクレオチドに対して少なくとも６０％、或いは少なくとも６５％、或いは少なくとも７０％、或いは少なくとも７５％、或いは８０％、或いは少なくとも８５％、或いは少なくとも９０％、或いは少なくとも９５％、或いは少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。等価物はまた、高ストリンジェンシー条件下で参照ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド又はその相補体を意図する。
【００３９】
別の配列に対する「配列同一性」又は相同性（等価性又は複数の等価性）の特定の割合（例えば、８０％、８５％、９０％、又は９５％）を有するポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド領域（又はポリペプチド若しくはポリペプチド領域）は、整列させた場合に、２つの配列の比較において塩基（又はアミノ酸）の割合が同じであることを意味する。アラインメント及びパーセント相同性又は配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら（編）１９８７）補遺３０、節７．７．１８，表７．７．１に記載されているものを使用して決定できる。特定の実施形態では、デフォルトパラメータをアラインメントに使用する。非限定的で例示的なアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、例示的なプログラムは、以下のデフォルトパラメータ：遺伝子コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待＝１０；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；種類＝５０配列；ソート＝高いスコア（ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ）；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢＡｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用するＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰを含む。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴで見出すことができる。配列同一性及びパーセント同一性は、それらをｃｌｕｓｔａｌＷ（２０１７年１月１３日に最後にアクセスしたウェブアドレス：ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／で利用可能）に組み込むことによって決定され得る。
【００４０】
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のために整列させられ得る各配列における位置を比較することによって決定できる。比較配列中の位置が同じ塩基又はアミノ酸によって占有されている場合、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される一致する位置又は相同な位置の数の関数である。「無関係の」又は「非相同な」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、或いは２５％未満の同一性を共有する。
【００４１】
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」はまた、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸分子を指してよい。
【００４２】
「ハイブリダイゼーション」は、１以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化された複合体を形成する反応を指す。
【００４３】
水素結合は、ワトソン−クリック塩基対合、フーグスティーン結合、又は任意の他の配列特異的様式により生じ得る。複合体は、２本鎖を形成する２本鎖構造、３以上の鎖を形成する多本鎖複合体、単一の自己ハイブリダイズ鎖、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始、又はリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素切断などのより広範なプロセスにおいて、ある工程を構成し得る。
【００４４】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；及び約４×ＳＳＣ〜約８×ＳＳＣの洗浄溶液を含む。中程度のハイブリダイゼーション条件の例は、約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの緩衝濃度；約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度；及び約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの洗浄溶液を含む。高ストリンジェンシー条件の例は、約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣの緩衝濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；及び約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、又は脱イオン水の洗浄溶液を含む。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、５分〜２４時間であり、１、２又はそれより多い洗浄工程があり、洗浄インキュベーション時間は約１、２、又は１５分である。ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸緩衝液である。他の緩衝系を用いるＳＳＣの等価物を使用できることを理解されたい。
【００４５】
本明細書で使用する「発現」は、それによりポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又はそれにより転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから誘導される場合、発現は、真核細胞中のｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００４６】
本明細書で使用する用語「単離された」は、他の物質を実質的に含まない分子又は生物物質又は細胞物質を指す。
【００４７】
本明細書で使用する用語「機能性」は、それが特定の具体的な効果を達成することを意図する任意の分子、生物物質、又は細胞物質を修飾するために使用され得る。
【００４８】
本明細書で使用する用語「核酸配列」及び「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかのポリマー形態を指すために互換的に使用される。そのため、この用語は、一本鎖、二本鎖、若しくは多本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基を含むポリマー又は他の天然、化学的又は生化学的に改変された、非天然の、又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。
【００４９】
用語「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、アミノ酸、アミノ酸類似体又はペプチド模倣物の２以上のサブユニットの化合物を指すために、互換的に、最も広い意味で使用される。サブユニットは、ペプチド結合によって連結され得る。別の態様では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって連結され得る。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質又はペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に限定はない。本明細書で使用する用語「アミノ酸」は、グリシン、並びにＤとＬの両方の光学異性体、アミノ酸類似体及びペプチド模倣物を含む、天然の及び／又は非天然の又は合成のアミノ酸のいずれかを指す。
【００５０】
本明細書で使用する用語「組換え発現系」は、組換えによって形成されるある種の遺伝的物質の発現のための遺伝子構築物又は複数の構築物を指す。
【００５１】
「遺伝子送達ビヒクル」は、宿主細胞に挿入されるポリヌクレオチドを保有できる任意の分子として定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、リポソーム、天然ポリマー及び合成ポリマーを含むミセル生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖類；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；及び細菌、又はウイルス、例えば、バキュロウイルス、アデノウイルス及びレトロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター並びに当技術分野で一般的に使用される他の組換えビヒクルであり、それらは様々な真核生物宿主及び原核生物宿主における発現について説明されており、遺伝子療法及び単純なタンパク質発現のために使用され得る。
【００５２】
本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを用いて細胞又は組織に送達できる。本明細書で使用する「遺伝子送達」、「遺伝子導入」、及び「形質導入」などは、導入のために使用される方法に関係なく、外因性ポリヌクレオチド（時々「導入遺伝子」と呼ばれる）の宿主細胞への導入を指す用語である。このような方法は、ベクター媒介遺伝子導入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、又は様々な他のタンパク質ベース又は脂質ベースの遺伝子送達複合体による）並びに「裸」のポリヌクレオチドの送達を容易にする技術（エレクトロポレーション、「微粒子銃」送達、及びポリヌクレオチドの導入に使用される様々な他の技術）などの様々な周知の技術を含む。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞中で安定に又は一時的に維持され得る。安定な維持は典型的には、導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞に適合する複製起点を含有するか、又は染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）又は核又はミトコンドリア染色体などの宿主細胞のレプリコンに組み込まれることを必要とする。いくつかのベクターは、当技術分野で公知であり本明細書に記載されているような、哺乳動物細胞への遺伝子の移動を媒介できることが知られている。
【００５３】
「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して複製可能な染色体ＤＮＡとは別の染色体外ＤＮＡ分子である。多くの場合、それは環状であり、二本鎖である。プラスミドは、微生物集団内での水平遺伝子導入のための機構を提供し、典型的には、与えられた環境状態下で選択的な利点を提供する。プラスミドは、競合環境ニッチにおいて天然に存在する抗生物質に対して耐性を提供する遺伝子を保有し得るか、或いは生成されたタンパク質が同様の状況下で毒素として作用し得る。
【００５４】
遺伝子工学に使用される「プラスミド」は、「プラスミドベクター」と呼ばれる。多くのプラスミドは、そのような用途のために商業的に入手可能である。複製されるべき遺伝子は、特定の抗生物質に対し細胞を耐性にさせる遺伝子及びマルチクローニングサイト（ＭＣＳ、又はポリリンカー）を含むプラスミドのコピー中に挿入され、マルチクローニングサイトは、この位置でのＤＮＡ断片の容易な挿入を可能にするいくつかの一般的に使用される制限部位を含む短い領域である。プラスミドの別の主な用途は、大量のタンパク質を製造することである。この場合、研究者は、目的の遺伝子を有するプラスミドを含有する細菌を増殖させる。細菌がその抗生物質耐性を付与するタンパク質を生成するように、それは挿入された遺伝子から大量のタンパク質を生成するように誘導され得る。
【００５５】
本明細書で使用する「標的」、「複数の標的」又は「標的化」は、ポリヌクレオチドの共有骨格の部分的な破損又は破損なしを指す。一実施形態では、不活化されたＣａｓタンパク質（又はｄＣａｓ）は、ガイドＲＮＡとＤＮＡ結合複合体を形成した後のヌクレオチド配列を標的にする。ｄＣａｓのヌクレアーゼ活性は完全に又は部分的に不活化されているので、ｄＣａｓは、配列を切断又は完全に切断することなく配列に結合する。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓで遺伝子配列又はそのプロモーターを標的にすることは、ポリヌクレオチド若しくは遺伝子の転写及び／又は発現を阻害又は防止できる。
【００５６】
「酵母人工染色体」又は「ＹＡＣ」は、大型ＤＮＡ断片（１００ｋｂ以上で３０００ｋｂまで）をクローン化するために使用されるベクターを指す。それは、人工的に構築された染色体であり、酵母細胞での複製及び保存に必要なテロメア、セントロメア、及び複製起点配列を含有する。最初の環状プラスミドを用いて構築し、それらを、制限酵素を用いることによって直鎖化し、次いで、ＤＮＡリガーゼが、付着末端を利用して、線状分子内に目的の配列又は遺伝子を付加できる。ＹＡＣ、ＹＩｐｓ（酵母統合プラスミド）、及びＹＥｐｓ（酵母エピソームプラスミド）などの酵母発現ベクターは極めて有用である。なぜなら酵母はそれら自身が真核細胞なので、翻訳後修飾を有する真核生物タンパク質産物を得ることができるからである。しかしながら、ＹＡＣは、ＢＡＣよりも不安定であり、キメラ効果をもたらすことが判明している。
【００５７】
「ウイルスベクター」は、インビボ、エクソビボ又はインビトロのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む組換え生成ウイルス又はウイルス粒子として定義される。
【００５８】
ウイルスベクターの例は、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びアルファウイルスベクターなどを含む。感染性タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベースのベクターを用いてタンパク質を製造でき、それはタバコ葉でグリフィスシンを発現させることが報告されている（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６（１５）：６０９９−６１０４）。セムリキフォレストウイルスベースのベクター及びシンドビスウイルスベースのベクターなどのアルファウイルスベクターも、遺伝子療法及び免疫療法で使用するために開発されてきた。Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ  ＆  Ｄｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４−４３９及びＹｉｎｇら（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）：８２３−８２７を参照されたい。遺伝子導入がレトロウイルスベクターにより媒介される態様では、ベクター構築物は、レトロウイルスゲノム又はその一部を含むポリヌクレオチド、及び治療的遺伝子を指す。遺伝子導入に使用するためのベクターの最新の方法に関するさらなる詳細は、例えば、Ｋｏｔｔｅｒｍａｎら（２０１５）遺伝子療法のためのウイルスベクター：医用生体工学の翻訳及び臨床的見通しの年次レビュー（Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｕｔｌｏｏｋ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）１７に見出すことができる。
【００５９】
本明細書で使用する「レトロウイルス媒介遺伝子導入」又は「レトロウイルス形質導入」は、同じ意味を有し、細胞に侵入しそのゲノムを宿主細胞ゲノムに組み込むウイルスにより、遺伝子又は核酸配列が宿主細胞内に安定に導入されるプロセスを指す。ウイルスは、その正常な感染機構を介して宿主細胞に入ることができるか、又は異なる宿主細胞表面受容体又はリガンドに結合して細胞に入るように改変することができる。本明細書で使用するレトロウイルスベクターは、ウイルス性又はウイルス様の侵入機構を介して、外来性核酸を細胞に導入できるウイルス粒子を指す。
【００６０】
レトロウイルスは、ＲＮＡの形態でそれらの遺伝的情報を保有するが、ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡはＤＮＡ型に逆転写され、それは感染細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。この組み込まれたＤＮＡ型はプロウイルスと呼ばれる。
【００６１】
アデノウイルス（Ａｄ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのＤＮＡウイルスベクターにより遺伝子導入が媒介される態様では、ベクター構築物は、ウイルスゲノム又はその一部及び導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。アデノウイルス（Ａｄ）は、５０個以上の血清型を含む、比較的十分に特徴付けられた相同なウイルスグループである。Ａｄは、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。組換えＡｄ由来ベクター、特に、野生型ウイルスの組換え及び作製の可能性を低下させるものも構築されている。そのようなベクターは、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ），Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ），及びＣｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｇｅｎｅ（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ）などの供給元から市販されている。野生型ＡＡＶは、宿主細胞のゲノムに組み込まれるための高い感染性及び特異性を有する。Ｗｏｌｄ及びＴｏｔｈ（２０１３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１３（６）：４２１−４３３，Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０，及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６を参照されたい。
【００６２】
ポリヌクレオチドを作動可能に連結できるプロモーターとクローニング部位の両方を含有するベクターは、当技術分野において周知である。そのようなベクターは、インビトロ又はインビボでＲＮＡを転写することができ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．）及びＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などの供給元から市販されている。発現及び／又はインビトロ転写を最適化するために、クローンの５’及び／又は３’非翻訳部分を除去、追加又は変更して、余分な、潜在的に不適切な代替翻訳開始コドン、又は転写若しくは翻訳のレベルのいずれかにより発現を干渉するか又は低下させ得る他の配列を除去することが必要であり得る。或いは、コンセンサスリボソーム結合部位を、発現を増強するために、開始コドンの５’すぐそばに挿入できる。
【００６３】
遺伝子送達ビヒクルはまた、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセル及び標的化されたウイルスタンパク質−ＤＮＡ複合体を含む。標的抗体又はその断片を含むリポソームも、本明細書に開示される方法で使用できる。細胞又は細胞集団へのポリヌクレオチドの送達に加えて、本明細書に記載のタンパク質の細胞又は細胞集団への直接導入は、タンパク質トランスフェクションの非限定的な技術によって行うことができ、或いは、本明細書に開示されるタンパク質の発現を増強し、かつ／又は活性を促進できる代替培養条件は、他の非限定的な技術である。
【００６４】
本明細書で使用する用語「ウイルスキャプシド」又は「キャプシド」は、ウイルス粒子のタンパク質性シェル又はコートを指す。キャプシドは、ウイルスゲノムを宿主細胞中にキャプシド形成、保護、輸送、及び放出するように機能する。キャプシドは、一般に、タンパク質のオリゴマー構造サブユニット（「キャプシドタンパク質」）で構成される。本明細書で使用する用語「キャプシド形成される」は、ウイルスキャプシド内に封入されることを意味する。
【００６５】
ウイルス又はプラスミドを参照して、本明細書で使用する用語「ヘルパー」は、本明細書に開示される改変ＡＡＶなどのウイルス粒子又は組換えウイルス粒子の複製及びパッケージングに必要な追加の構成要素を提供するために使用されるウイルス又はプラスミドを指す。ヘルパーウイルスによってコードされる構成要素は、ビリオンアセンブリ、キャプシド形成、ゲノム複製、及び／又はパッケージングに必要な任意の遺伝子を含み得る。例えば、ヘルパーウイルスは、ウイルスゲノムの複製のために必要な酵素をコードし得る。ＡＡＶ構築物と共に使用するのに適するヘルパーウイルス及びプラスミドの非限定的な例は、ｐＨＥＬＰ（プラスミド）、アデノウイルス（ウイルス）、又はヘルペスウイルス（ウイルス）を含む。
【００６６】
本明細書で使用する用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの標準的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞でのみ増殖する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶの一般的な情報及び概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，１巻、ｐｐ．１６９−２２８，及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３−１７６４，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出すことができる。様々な血清型が構造的にも機能的にも、さらに遺伝的レベルで非常に密接に関連していることがよく知られているので、これらのレビューに記載された同じ原理は、レビューの公開日後に特徴付けられる追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが完全に予想される（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，パルボウイルスとヒトの疾患（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ），Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ（編）１９８８，ｐｐ．１６５−１７４；及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：１−６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を示し、全ては、ＡＡＶ２で発現されるものなどの３つの関連するキャプシドタンパク質を保有する。関連性の程度はヘテロ二本鎖分析によってさらに示唆され、それはゲノムの長さに沿う血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、及び「逆位末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにする。同様の感染性パターンも、各々の血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることを示唆する。
【００６７】
本明細書で使用する「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する１種以上の目的のポリヌクレオチド（又は導入遺伝子）を含むベクターを指す。そのようなＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物をコードし発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に存在する場合に、複製され、感染性ウイルス粒子中にパッケージングされ得る。
【００６８】
「ＡＡＶビリオン」又は「ＡＡＶウイルス粒子」又は「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質及びキャプシド形成ポリヌクレオチドＡＡＶベクターで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」又は単に「ＡＡＶベクター」と呼ばれる。そのため、ＡＡＶベクター粒子の生成は、そのようなベクターがＡＡＶベクター粒子内に含まれるので、ＡＡＶベクターの生成を必ず含む。
【００６９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、２つの１４５ヌクレオチドの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂ長である。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ−１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００２０７７に提供され、ＡＡＶ−２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５−５６４（１９８３）；ＡＡＶ−３の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿１８２９に提供され；ＡＡＶ−４の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１８２９に提供され；ＡＡＶ−５のゲノムはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０８５７１６に提供され；ＡＡＶ−６の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１８６２に提供され；ＡＡＶ−７及びＡＡＶ−８のゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提供され；ＡＡＶ−９のゲノムはＧａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８（２００４）に提供され；ＡＡＶ−１０のゲノムはＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７−７６（２００６）に提供され；かつＡＡＶ−１１のゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５−３８３（２００４）に提供される。ＡＡＶ  ｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許９，４３４，９２８号に提供される。ウイルスＤＮＡの複製（ｒｅｐ）、キャプシド形成／パッケージング及び宿主細胞染色体組込みを支持するシス作用配列は、ＡＡＶ  ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的なマップ位置についてｐ５、ｐｌ９、及びｐ４０と命名された）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を促進する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐｉ９）は、単一のＡＡＶイントロン（ヌクレオチド２１０７及び２２２７で）の差動スプライシングと関連し、ｒｅｐ遺伝子から４個のｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の生成をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製に最終的に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。他のスプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するキャプシドタンパク質の生成に関与する。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムの地図位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７−１２９（１９９２）に概説されている。
【００７０】
ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法における外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的な独特の特徴を有する。培養における細胞のＡＡＶ感染は、非細胞傷害性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、サイレントであり無症候性である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳類細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的にする可能性を可能にする。さらに、ＡＡＶは、分裂細胞及び非分裂細胞にゆっくり形質導入し、転写活性のある核エピソーム（染色体外エレメント）としてそれらの細胞の寿命の間本質的に存続できる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド中にクローニングされたＤＮＡとして挿入され、これは組換えゲノムの構築を可能にする。さらに、ＡＡＶ複製及びゲノムキャプシド形成を指示するシグナルはＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれているので、ゲノムの内部の約４．３ｋｂ（複製及び構造キャプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ−ｃａｐ）の一部又は全部を外来ＤＮＡと置換してよい。ＡＡＶベクターを作製するために、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質はトランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定で力強いウイルスであることである。それはアデノウイルスを不活化するために使用される条件（５６℃〜６５℃で数時間）に容易に耐えることができ、ＡＡＶの冷凍保存をそれほど重要にしない。ＡＡＶは凍結乾燥されてもよい。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、超感染に耐性でない。
【００７１】
複数の研究は、筋肉における長期（１．５年超）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現を実証した。Ｃｌａｒｋら，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，８：６５９−６６９（１９９７）；Ｋｅｓｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１４０８２−１４０８７（１９９６）；及びＸｉａｏら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８−８１０８（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏら，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２：６１９−６２３（２０００）及びＣｈａｏら，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，４：２１７−２２２（２００１）も参照されたい。さらに、筋肉は高度に血管が発達しているので、組換えＡＡＶ形質導入は、Ｈｅｒｚｏｇら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：５８０４−５８０９（１９９７）及びＭｕｒｐｈｙら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：１３９２１−１３９２６（１９９７）に記載されているように、筋肉内注射後の全身循環において導入遺伝子産物の出現をもたらした。さらに、Ｌｅｗｉｓら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９−８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正しい抗体グリコシル化、折り畳み、及び分泌に必要な細胞因子を有することを実証し、筋肉が分泌タンパク質治療薬の安定な発現を可能にすることを示した。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶのＤＮＡは、ＡＡＶ血清型のＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３及びＡＡＶ  ｒｈ７４を含むが、これらに限定されない、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、ＷＯ  ０１／８３６９２に開示されている。他の種類のｒＡＡＶバリアント、例えば、キャプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００−１９０９（２０１４）を参照されたい。様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野において公知である。
【００７２】
用語「Ｃａｓ９」は、この名前で言及されるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを指す。非限定的で例示的なＣａｓ９、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｇ３ＥＣＲ１（ＣＡＳ９＿ＳＴＲＴＲ）又は黄色ブドウ球菌のＣａｓ９に提供されるＣａｓ９、並びにそれらの各々のヌクレアーゼ死Ｃａｓ９、オルソログ及び生物学的等価物が、本明細書に提供される。オルソログは、化膿レンサ球菌のＣａｓ９（「ｓｐＣａｓ９」）；様々な細菌種からのストレプトコッカス・サーモフィルス、レジオネラ・ニューモフィラ、ナイセリア・ラクタミカ、髄膜炎菌、フランシセラ・ノビシダからのＣａｓ９；及びアシダミノコッカス種及びフランシセラ・ノビシダＵ１１２を含む様々な細菌種からのＣｐｆ１（Ｃａｓ９に類似の切断機能を実施する）を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
本明細書で使用する用語「ＣＲＩＳＰＲ」は、クラスター化された規則的に間隔を置いた短いパリンドローム反復経路に依存する配列特異的な遺伝子操作の技術を指す。ＣＲＩＳＰＲを使用して、遺伝子の編集及び／又は遺伝子調節を実施し、かつ特定のゲノム位置にタンパク質を単純に標的にすることができる。遺伝子編集は、ポリヌクレオチド配列に対して欠失、挿入、又は塩基置換を導入することにより、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を変化させる遺伝子工学の種類を指す。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換えの経路を利用して編集を実行する。遺伝子調節は、タンパク質又はＲＮＡなどの特定の遺伝子産物の生成を増加又は減少させることを指す。
【００７４】
本明細書で使用する用語「ｇＲＮＡ」又は「ガイドＲＮＡ」は、ＣＲＩＳＰＲ技術を用いる修正のための特定の遺伝子を標的にするために使用されるガイドＲＮＡ配列を指す。標的特異性のためのｇＲＮＡ及びドナー治療ポリヌクレオチドを設計する技術は、当技術分野において周知である。例えば、Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．ら  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１４；３２（１２）：１２６２−７，Ｍｏｈｒ，Ｓ．ら（２０１６）ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２８３：３２３２−３８，及びＧｒａｈａｍ，Ｄ．ら．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２０１５；１６：２６０。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む融合ポリヌクレオチド；又はＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む融合ポリヌクレオチドを含む、或いは融合ポリヌクレオチドから本質的になるか、又は融合ポリヌクレオチドからさらになる。いくつかの態様では、ｇＲＮＡは合成である（Ｋｅｌｌｅｙ，Ｍ．ら（２０１６）  Ｊ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３３（２０１６）７４−８３）。本明細書で使用するように、ｇＲＮＡの生物学的等価物は、細胞のゲノムの特定の領域などの特異的なヌクレオチド配列にＣａｓ９又はその等価物を導くことができるポリヌクレオチド又は標的化分子を含むが、これらに限定されない。
【００７５】
「組成物」は、活性ポリペプチド、不活性（例えば、検出可能な標識）の又は活性のある（例えば、遺伝子送達ビヒクル）ポリヌクレオチド又は抗体及び別の化合物若しくは組成物の組み合わせを意味することを意図する。
【００７６】
「医薬組成物」は、活性ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は抗体と、インビトロ、インビボ又はエクソビボでの診断又は治療用途に適した組成物を製造するための固体支持体などの不活性又は活性のある担体との組み合わせを含むことを意図する。
【００７７】
本明細書で使用する用語「医薬として許容される担体」は、リン酸緩衝生理食塩水、水、及び油／水又は水／油エマルジョンなどのエマルジョン、並びに様々な種類の湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかを包含する。組成物はまた、安定剤及び保存剤を含んでよい。担体、安定剤及びアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ（１９７５）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，第１５版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ）を参照されたい。
【００７８】
診断又は治療の「対象」は、細胞、又は哺乳動物若しくはヒトなどの動物である。対象は、特定の種に限定されず、診断又は治療される非ヒト動物を含み、感染される非ヒト動物又は動物モデル、例えば、サル、ラット、マウスなどのネズミ科の動物、チンチラ、イヌなどのイヌ科の動物、ウサギなどのウサギ科の動物、家畜、スポーツ動物、及びペットである。ヒト患者もその用語内に含まれる。
【００７９】
用語「組織」は、生きている若しくは死亡した生物の組織、又は生きている若しくは死んだ生物に由来する任意の組織、又はそれらを模倣するように設計された任意の組織を指すために本明細書で使用される。組織は、健康であっても、罹患していてもよく、かつ／又は遺伝的変異を有してもよい。生物学的組織は、任意の単一組織（例えば、相互結合され得る細胞の集合体）、又は生物体の器官又は体の部分若しくは領域を構成する組織のグループを含んでよい。組織は、均一な細胞材料を含むか、又はそれは、例えば肺組織、骨格組織、及び／又は筋肉組織を含み得る胸郭を含む身体の領域に見られる構造などの複合構造であってよい。例示的な組織は、肝臓、肺、甲状腺、皮膚、膵臓、血管、膀胱、腎臓、脳、胆管、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓及び腸に由来するものを含むが、これらに限定されない。
【００８０】
本明細書で使用する、対象における疾患の「治療すること」又は「治療」は、（１）疾患にかかりやすい対象若しくは疾患の症状をまだ表していない対象において生じる症状又は疾患を予防すること、（２）疾患を抑制するか若しくはその発症を停止すること、又は（３）疾患の回帰若しくは疾患の症状を改善するか又はもたらすこと、を指す。当技術分野で理解されているように、「治療」は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得るための手法である。本技術の目的のために、有益な又は所望の結果は、検出可能であろうと、検出不可能であろうと１以上の症状の緩和又は改善、（疾患を含む）病態の程度の減少、（疾患を含む）病態の安定化された（すなわち、悪化していない）状態、（疾患を含む）病態、進行の遅延又は減速、（疾患を含む）病態の寛解又は緩和、（部分的であろうと、全体的であろうと）状態及び緩解の１以上を含んでよいが、これらに限定されない。一態様では、用語「治療」は予防を除外する。
【００８１】
優性遺伝の疾患を治療するために、従来のＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子療法は、変異特異的遺伝子修復手法に焦点を当てている。対照的に、本発明の方法は、対立遺伝子特異的標的化を可能にするより一般化可能な計画を用いる。例えば、本発明の方法は、一塩基多型（ＳＮＰ）ヘテロ接合性を利用して、複数の変異に適用可能なシステムを作成できる。一実施形態では、ＢＥＳＴ１転写開始部位（ＴＳＳ）中のＳＮＰを使用して、ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡが変異型と野生型の対立遺伝子を区別できるようにすることができる。本開示は、これらの変異（例えば、ＳＮＰ）を病理学的変異にマッピングし、Ｃａｓヌクレアーゼが変異型対立遺伝子のみを切断するのを指示するようにｇＲＮＡを設計することを含む。本方法は、野生型対立遺伝子が正常な機能を支持するために無傷で残されるように対立遺伝子特異的に変異遺伝子を切除する。一実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする野生型対立遺伝子を切断しないか又は標的にしない。この手法は、唯一の変異ではなく、常染色体優性眼疾患関連遺伝子（例えば、ＢＥＳＴ１）の全ての変異の標的化及び編集を可能にする。本発明の方法を用いて、他の黄斑変性症及び優性遺伝の病態を治療できる。
【００８２】
本開示は、細胞中の常染色体優性疾患関連遺伝子（例えば、常染色体優性眼疾患関連遺伝子）を改変する方法を提供する。本方法は、常染色体優性疾患関連遺伝子（例えば、常染色体優性眼疾患関連遺伝子）の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターと細胞を接触させることを含み得る。少なくとも１種のベクターは、（ｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、（ｉｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子のイントロンにハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡをコードする第２の配列、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第３の配列、を含み得る。
【００８３】
本開示は、細胞中の常染色体優性疾患関連遺伝子（例えば、常染色体優性眼疾患関連遺伝子）を改変する方法を提供する。本方法は、常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターと細胞を接触させることを含み得る。少なくとも１種のベクターは、（ｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、及び（ｉｉ）触媒的に欠損したＣａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）をコードする第２の配列、を含み得る。
【００８４】
細胞は、常染色体優性眼疾患などの優性疾患を有する対象からのものであってよい。細胞は、常染色体優性眼疾患などの優性疾患状態を有する対象からの細胞に由来してよい。
【００８５】
細胞は、例えば、対象の線維芽細胞由来の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってよい。別の実施形態では、細胞は線維芽細胞であり得る。
【００８６】
本方法は、ｉＰＳＣを培養して、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に分化させることをさらに含み得る。本方法は、ＲＰＥ細胞を対象に投与することをさらに含み得る。一実施形態では、ＲＰＥ細胞は、網膜下移植を介して投与される。
【００８７】
ＲＰＥ細胞は、対象に対して自己由来又は同種であってよい。
【００８８】
細胞は、ＳＮＰに対してヘテロ接合型又はホモ接合型であってよい。細胞は、変異型対立遺伝子及び野生型対立遺伝子を有する常染色体優性疾患関連遺伝子に対してヘテロ接合型であってよい。細胞は、２つの変異型対立遺伝子を有する常染色体優性疾患関連遺伝子に対してホモ接合型であってよい。
【００８９】
本開示は、細胞中の常染色体優性疾患関連遺伝子を改変する方法であって、常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターと細胞を接触させることを含み、常染色体優性疾患関連遺伝子は眼疾患に関係し、少なくとも１種のベクターは、（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、（ｉｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子のイントロンにハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡをコードする第２の配列、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第３の配列、を含み、Ｃａｓヌクレアーゼが、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする、方法を提供する。いくつかの実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８若しくは配列番号４９から選択されるヌクレオチド配列又はそれらの各々の等価物を含む。一態様では、常染色体優性疾患関連遺伝子は、配列番号２８〜３３から選択される配列、又はそれらの各々の等価物を含む。一態様では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号３１の配列、又はそれらの各々の等価物を含む常染色体優性疾患関連遺伝子にハイブリダイズする。
【００９０】
別の実施形態では、本開示は、細胞中の常染色体優性疾患関連遺伝子を改変する方法であって、常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターと細胞を接触させることを含み、常染色体優性疾患関連遺伝子は眼疾患に関連し、少なくとも１種のベクターは、（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、（ｉｉ）触媒的に欠損したＣａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）をコードする第２配列、を含み、Ｃａｓヌクレアーゼは、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする、方法を提供する。いくつかの実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８若しくは配列番号３９から選択されるヌクレオチド配列又はそれらの各々の等価物を含む。一態様では、常染色体優性疾患関連遺伝子は、配列番号２８〜３３から選択される配列、又はそれらの各々の等価物を含む。一態様では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号３１の配列又はその等価物を含む常染色体優性疾患関連遺伝子にハイブリダイズする。
【００９１】
本開示は、少なくとも１種のベクター：（ｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、（ｉｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子のイントロンにハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡをコードする第２の配列、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第３の配列、を含み、Ｃａｓヌクレアーゼが、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする、システムを提供する。第１のガイドＲＮＡは、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、若しくは配列番号４９から選択されるヌクレオチド配列又はそれらの各々の等価物を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓニッカーゼである。別の実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９である。一態様では、Ｃａｓシステムは、配列番号２８〜３３から選択される配列、若しくはそれらの各々の等価物を含む常染色体優性疾患関連遺伝子を改変又は編集するために使用される。一態様では、第１のガイドＲＮＡは、配列番号３１の配列、又はその等価物を含む常染色体優性疾患関連遺伝子にハイブリダイズする。
【００９２】
本開示はまた、少なくとも１種のベクター：（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、及び（ｉｉ）触媒的に欠損したＣａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）をコードする第２の配列、を含み、Ｃａｓヌクレアーゼが、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする、システムを提供する。第２のガイドＲＮＡは、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８若しくは配列番号３９から選択されるヌクレオチド配列又はそれらの各々の等価物を含んでよい。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓはリプレッサードメインに融合される。別の実施形態では、リプレッサードメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインである。一実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、少なくとも１つのＰＵＦ（プミリオｍＲＮＡ結合因子）結合配列を含み、さらなる実施形態では、少なくとも１つのＰＵＦ結合配列は、ＰＵＦ−ＫＲＡＢに結合する。
【００９３】
本開示は、対象における常染色体優性疾患（例えば、常染色体優性眼疾患）を治療する方法を提供する。本方法は、対象中の常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターの治療有効量を対象に投与することを含み得る。少なくとも１種のベクターは、（ｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、（２）常染色体優性疾患関連遺伝のイントロンにハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡをコードする第２の配列；及び（ｉｉｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第３の配列、を含み得る。
【００９４】
また、本開示に包含されるのは、対象における常染色体優性疾患（例えば、常染色体優性眼疾患）を治療する方法である。本方法は、対象中の常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターの治療有効量を対象に投与することを含み得る。少なくとも１種のベクターは、（ｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、及び（ｉｉ）触媒的に欠損したＣａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）をコードする第２の配列、を含み得る。
【００９５】
対象は、ＳＮＰに対してヘテロ接合型又はホモ接合型であってよい。
【００９６】
対象は、変異型対立遺伝子及び野生型対立遺伝子を有する常染色体優性疾患関連遺伝子に対してヘテロ接合型であってよい。対象は、２つの変異型対立遺伝子を有する常染色体優性疾患関連遺伝子についてホモ接合型であってよい。
【００９７】
少なくとも１種のベクターは、対象の眼への注射によって投与されてよい。
【００９８】
ＳＮＰのバリアント及び常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子は、同一の染色体上にあってよい。ＳＮＰのバリアント及び常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子は、異なる染色体上にあってよい。
【００９９】
ＳＮＰは、非コード領域、コーディング領域、又は常染色体優性疾患関連遺伝子の遺伝子間領域にあってよい。一実施形態では、ＳＮＰは、常染色体優性疾患関連遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）領域にあってよい。
【０１００】
Ｃａｓタンパク質又は酵素／ヌクレアーゼは、野生型（ｗｔ）Ｃａｓ（例えば、野生型（ｗｔ）Ｃａｓ９）、Ｃａｓニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）、又はｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）であってよい。
【０１０１】
一実施形態では、ｄＣａｓ９は、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、又はそれらの組み合わせを含む本明細書に記載の任意の他のリプレッサードメインなどのリプレッサードメインに融合される。
【０１０２】
別の実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、例えば、ＰＵＦ又はＰＵＦ−ＫＲＡＢ融合タンパク質に結合し得る、少なくとも１つのＰＵＦ（プミリオｍＲＮＡ結合因子）結合配列を含む。
【０１０３】
常染色体優性疾患関連遺伝子は、ＢＥＳＴ１、ＲＨＯ、ＰＲＤＭ１３、ＲＧＲ、ＴＥＡＤ１、ＡＩＰＬ１、ＣＲＸ、ＧＵＣＡ１Ａ、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＰＩＴＰＮＭ３、ＰＲＯＭ１、ＰＲＰＨ２、ＲＩＭＳ１、ＳＥＭＡ４Ａ、ＵＮＣ１１９、ＧＮＡＴ１、ＰＤＥ６Ｂ、ＷＳＦ１、ＩＭＰＤＨ１、ＯＴＸ２、Ｃ１ＱＴＮＦ５、ＣＴＮＮＡ１、ＥＦＥＭＰ１、ＥＬＯＶＬ４、ＦＳＣＮ２、ＧＵＣＡ１Ｂ、ＨＭＣＮ１、ＩＭＰＧ１、ＲＰ１Ｌ１、ＴＩＭＰ３、ＶＣＡＮ、ＭＦＮ２、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＡＲＬ３、ＣＡ４、ＨＫ１、ＫＬＨＬ７、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲＬ、ＰＲＰＦ３、ＰＲＰＦ４、ＰＲＰＦ６、ＰＲＰＦ８、ＰＲＰＦ３１、ＲＤＨ１２、ＲＯＭ１、ＲＰ１、ＲＰ９、ＲＰＥ６５、ＳＮＲＮＰ２００、ＳＰＰ２、ＴＯＰＯＲＳ、ＡＢＣＣ６、ＡＴＸＮ７、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＪＡＧ１、ＫＣＮＪ１３、ＫＩＦ１１、ＯＰＡ３、ＰＡＸ２、ＴＲＥＸ１、ＣＡＰＮ５、ＣＲＢ１、ＦＺＤ４、ＩＴＭ２Ｂ、ＬＲＰ５、ＭＡＰＫＡＰＫ３、ＭＩＲ２０４、ＯＰＮ１ＳＷ、ＲＢ１、ＴＳＰＡＮ１２、又はＺＮＦ４０８であってよい。
【０１０４】
特定の実施形態では、常染色体優性疾患関連遺伝子はＢＥＳＴ１である。特定の実施形態では、ＳＮＰのバリアントは、ｒｓ９７２３５３：Ｇ  ＳＮＰ、ｒｓ９７２３５５：Ｇ  ＳＮＰ、又はｒｓ２６６８８９９ＳＮＰである。
【０１０５】
特定の実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、ＢＥＳＴ１のイントロン１にハイブリダイズする。
【０１０６】
疾患関連遺伝子の変異は、一塩基変異、ミスセンス変異（単一のミスセンス変異を含む）、欠失などであってよい。
【０１０７】
疾患関連遺伝子の変異は、１以上のコード領域、１以上の非コーディング領域、１以上の遺伝子間領域（遺伝子間の領域）、又は１以上のコード領域、及び／若しくは１以上の非コーディング領域、及び／若しくは１以上の遺伝子間領域の組み合わせにあってよい。変異は、１以上のイントロン、１以上のエキソン、又は１以上のイントロンと１以上のエキソンの組み合わせにあってよい。
【０１０８】
一態様では、ベクターはアデノ随伴ウイルスベクターである。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、遺伝子カーゴを細胞に効率的に送達するように遺伝子操作された複製欠損ウイルスである。それらは、それらのベクター形態で元のウイルスの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）のみを保有する、非エンベロープウイルスである。構造的及び酵素的ＡＡＶタンパク質は、追加のプラスミドによって「トランスで」供給され、細胞内に一緒にトランスフェクトされて、遺伝子送達のための遺伝子操作された粒子を作製する。ＡＡＶは、それらの安全性及び効率のため、遺伝療法のために、より具体的にはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムと共に、広く利用されている。ＡＡＶは、様々な細胞に効率的に感染し、感染過程中にキャプシドは、ベクターゲノムが送達される核に結合し、そこに入る。
【０１０９】
ＡＡＶ構造粒子は、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３で作られた６０個のタンパク質分子で構成される。各粒子は、２０面体構造に配列される約５個のＶＰ１タンパク質、５個のＶＰ２タンパク質及び５０個のＶＰ３タンパク質を含む。ＡＡＶ２粒子は、キャプシド構造内の様々な部位でのペプチド及びタンパク質の挿入を支持できることが示されている。ユニークなペプチドをキャプシド中に導入する能力は、向性が変わったＡＡＶ粒子の開発をもたらし、これは、ウイルスが、通常、感染に対して難治性であり得る細胞及び組織に結合し、感染するのを可能にする。加えて、大きなペプチド及びさらに機能的なタンパク質が、様々なレベルの成功を伴ってＡＡＶ２ベクターのキャプシド中に導入されてきた。
【０１１０】
遺伝子送達のためのＡＡＶベクターでの制約の一つは、粒子に効率的にパッケージングできる遺伝子挿入物のサイズ制限である。例えば、野生型ＡＡＶ２ゲノムのサイズは、一本鎖ＤＮＡの４６７９塩基である。Ｃａｓ９（黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９、ＳａＣａｓ９、１３０ｋＤのＭＷ）の新規のより小さいバリアントの１つのパッケージングでさえ、コーディング領域だけで約３２５５ｂｐを必要とする。構築物にユビキタス又は組織特異的プロモーターを付加することは、さらに５００〜８００ｂｐを加え得る。ポリＡ付加配列及びＩＴＲの別の５００ｂｐを含めると、ベクターはＡＡＶ粒子のパッケージング能力に近づく。機能性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子修正を達成するために、標的配列を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）も含めなければならない。このＲＮＡを発現させるためには、最小のｐｏｌＩＩＩプロモーター及び終結配列をさらに必要とする。共にこれらの要素は大きすぎて、効率的にパッケージングされるＡＡＶベクター中で組み合わされない。Ｃａｓ９構築物及びガイドＲＮＡ発現カセットを別々のベクター中にパッケージングすることを選択できるが、それらが機能的であるためには、両方のウイルスは同じ標的細胞に感染しなければならない。
【０１１１】
本開示のさらなる態様は、そのような改変ＡＡＶの作製のための組換え発現系に関する。いくつかの実施形態では、組換え発現系は、ＡＡＶウイルスタンパク質−ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の全てをコードする複数のプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、各ウイルスタンパク質は、異なるプラスミド中でコードされる。いくつかの実施形態では、１以上のウイルスタンパク質が同じプラスミド中でコードされる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのウイルスタンパク質は、Ｃａｓ９との融合タンパク質としてコードされる。一実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ８ベクターである。別の実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ２ベクターである。
【０１１２】
少なくとも１種のベクターは、少なくとも１種の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであってよい。例えば、少なくとも１種の組換えＡＡＶベクターは、少なくとも１種のＡＡＶ２ベクター、又は少なくとも１種のＡＡＶ８ベクターである。組換えＡＡＶベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はバキュロウイルスパッケージングシステムなどのウイルスパッケージングシステムを使用してパッケージングされてよく、本開示は、本開示の方法で使用されるベクターを生成するためのシステム及び要素を提供する。いくつかの実施形態では、パッケージングは、ヘルパーウイルス又はヘルパープラスミド及び細胞株を使用することによって達成される。ヘルパーウイルス又はヘルパープラスミドは、細胞中への遺伝子材料の送達を促進する要素及び配列を含む。別の態様では、ヘルパープラスミド又はヘルパープラスミドを含むポリヌクレオチドは、パッケージング細胞株のゲノム中に安定に組み込まれ、その結果、パッケージング細胞株はヘルパープラスミドでのさらなるトランスフェクションを必要としない。
【０１１３】
ヘルパープラスミドは、例えば、複製不能ＡＡＶをパッケージングするのに必要な全てのビリオンタンパク質をトランスでコードする複製不能ウイルスゲノムから誘導され、かつ複製能ＡＡＶを生成することなく、複製不能ＡＡＶを高力価でパッケージングできるビリオンタンパク質を生成するための少なくとも１つのウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含んでよい。ウイルスＤＮＡ配列は、ウイルスの天然エンハンサー及び／又はウイルス５’ＬＴＲのプロモーターをコードする領域を欠き、かつヘルパーゲノムをパッケージングするのに関与するプサイ機能配列と３’ＬＴＲの両方を欠くが、外来のポリアデニル化部位、例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化部位、並びにウイルスの生成が望まれる細胞型での効率的な転写を指示する外来エンハンサー及び／又はプロモーターをコードする。ウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、又はギボン猿白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）などの白血病ウイルスである。外来エンハンサー及びプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）極初期（ＩＥ）エンハンサー及びプロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）のエンハンサー及びプロモーター（Ｕ３領域）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＵ３領域、脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域、又は天然のモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターに結合したＨＣＭＶ  ＩＥエンハンサーであってよい。ヘルパープラスミドは、プラスミドベースの発現ベクターによってコードされる２つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列からなってよく、例えば、第１ヘルパー配列は、狭宿主性ＭＭＬＶ又はＧＡＬＶのｇａｇ及びｐｏｌタンパク質をコードするｃＤＮＡを含み、第２ヘルパー配列は、ｅｎｖタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。Ｅｎｖ遺伝子は、宿主範囲を決定し、異種指向性、広宿主性、狭宿主性、ポリトロピック（ミンクフォーカス形成）又は１０Ａ１マウス白血病ウイルスｅｎｖタンパク質、又はギボン猿白血病ウイルス（ＧＡＬＶ  ｅｎｖタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスｅｎｖ（ｇｐ１６０）タンパク質、水疱性口内性ウイルス（ＶＳＶ）Ｇタンパク質、ヒトＴ細胞白血病（ＨＴＬＶ）Ｉ型及びＩＩ型のｅｎｖ遺伝子産物をコードする遺伝子、前述のｅｎｖ遺伝子又は前述のｅｎｖ遺伝子産物の細胞質及び膜貫通をコードするキメラエンベロープ遺伝子の１以上の組み合わせから誘導されるキメラエンベロープ遺伝子から誘導できる。
【０１１４】
パッケージング工程において、ヘルパープラスミド及びＡＡＶウイルスタンパク質をコードするプラスミドは、ヒト胚性腎臓細胞、例えば、２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）などのウイルスを生成できる哺乳動物細胞の第１の集団に一過的に同時トランスフェクトされて、高力価の組換えレトロウイルス含有上清を生成する。本発明の別の方法において、この一過的にトランスフェクトされた第１の細胞集団を、次いで、哺乳動物の標的細胞、例えば、ヒトリンパ球と共培養して、標的細胞を高効率にて外来遺伝子で形質導入する。
【０１１５】
一実施形態では、２種類の組換えＡＡＶベクターが対象に投与され、第１の種類の組換えＡＡＶベクターが、第１の配列及び第２の配列を含み、第２の種類の組換えＡＡＶベクターが、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第３の配列を含む。
【０１１６】
本発明のシステムは、常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子（例えば、常染色体優性眼疾患関連遺伝子）に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターを含んでよい（又は本質的にそれからなってよい）。少なくとも１種のベクターは、（ｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、（ｉｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子のイントロンにハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡをコードする第２の配列、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第３の配列、を含んでよい。
【０１１７】
本発明のシステムは、常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターを含んでよい（又は本質的にそれからなってよい）。少なくとも１種のベクターは、（ｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）のバリアントにハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、及び（ｉｉ）触媒的に欠損したＣａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）をコードする第２の配列、を含んでよい。
【０１１８】
一実施形態では、本発明のシステムは、ＣＲＩＳＰＲシステムポリヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸配列を含み、ポリヌクレオチド配列は、（ｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子配列にハイブリダイズする１以上のガイドＲＮＡ配列、（ｉｉ）コドン改変された常染色体優性疾患関連遺伝子又は断片をコードする第２の配列であって、改変された常染色体優性疾患関連遺伝子又は断片中の少なくとも１つの疾患関連変異が修正されており、かつコドン改変された常染色体優性疾患関連遺伝子又は断片が、未改変の常染色体優性疾患関連遺伝子配列にハイブリダイズする１以上のｓｇＲＮＡ配列によって認識され得ない、第２の配列；及び（ｉｉｉ）Ｃａｓファミリー酵素をコードする配列、を含む。
【０１１９】
本発明の方法及びシステムは、対象における優性遺伝病態（眼疾患など）を治療若しくは予防するか、又は優性遺伝病態（眼疾患など）を有する対象からの細胞中の（又は対象からの細胞由来の）遺伝子を改変し得る。眼疾患は、卵黄様黄斑変性症（ＶＭＤ）、ベスト病の卵黄様黄斑変性症、常染色体優性網脈絡膜の萎縮若しくは変性、常染色体優性錐体若しくは杆体ジストロフィー、常染色体優性先天性停止性夜盲、常染色体優性レーバー先天黒内障、常染色体優性黄斑変性症、常染色体優性眼性網膜発達疾患、常染色体優性視神経萎縮、常染色体優性網膜色素変性、網膜症を伴う常染色体優性症候性／全身性疾患、ソースビー黄斑変性症、加齢黄斑変性症、ドイン蜂巣状黄斑疾患、及び若年性黄斑変性症を含むが、これらに限定されない。当業者に明らかなように、疾患又は病態の修正のために送達される遺伝子は、治療すべき疾患によって変化する。
【０１２０】
一実施形態では、眼疾患は、加齢性黄斑変性症である。別の実施形態では、眼疾患は、若年性黄斑変性症である。
【０１２１】
本システム（例えば、ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド及び本明細書に記載のタンパク質及び／又はポリヌクレオチドを含む組成物）は、任意の適切な手段によって送達され得る。特定の実施形態では、システムはインビボで送達される。他の実施形態では、システムは単離細胞／培養細胞（例えば、自己ｉＰＳ細胞）にインビトロで送達されて、常染色体優性疾患（例えば、眼の常染色体優性疾患）に罹患した患者へのインビボ送達に有用な改変細胞を提供する。
【０１２２】
本開示に記載のＣＲＩＳＰＲ構成要素（例えば、ｓｇＲＮＡ（複数可）、コドン改変ドナーの鋳型遺伝子の断片配列、及びＣａｓファミリーヌクレアーゼ）をコードするウイルス粒子の注射の代わりに、細胞置換療法を使用して、疾患を予防、修正又は治療でき、ここで本開示の方法は、単離された患者の細胞に（エクソビボで）適用され、次いでその後に、「修正された」細胞を患者に戻す注射が続く。
【０１２３】
一実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓをコードする１以上のベクターを真核細胞中に導入することを提供する。細胞は幹細胞であってよい。幹細胞の例は、多能性幹細胞、多分化能幹細胞及び単能性幹細胞が含まれる。多能性幹細胞の例には、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、胚性癌細胞及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む。一態様では、ｉＰＳＣは線維芽細胞から誘導される。
【０１２４】
眼疾患の治療のために、患者のｉＰＳ細胞を単離し、エクソビボで網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に分化させることができる。常染色体優性疾患関連遺伝子の変異により特徴付けられる患者のｉＰＳ細胞又はＲＰＥ細胞は、本開示の方法を用いて、常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子の切断（例えば、欠失）又はサイレンシング（例えば、転写の阻止）をもたらす方法で操作され得る。
【０１２５】
そのため、本開示は、対象における常染色体優性眼疾患を修正する方法であって、常染色体優性眼疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子の切断をもたらす、方法を提供する。本方法は、常染色体優性眼疾患関連遺伝子の切断された変異型対立遺伝子を有する自己又は同種網膜色素ＲＰＥ細胞の治療有効量を対象に投与することを含み得る。常染色体優性眼疾患関連遺伝子の切断された変異型対立遺伝子を有するＲＰＥ細胞を含む医薬製剤の投与は、症状の重篤度を低下させ、かつ／又は患者の病態のさらなる悪化を防止するのに有効であり得る。そのような投与は、任意の視覚喪失又は他の症状を完全に回復するのに有効であり得る。
【０１２６】
ｉＰＳ細胞又はｉＰＳＣと一般的に略される、「誘導された多能性幹細胞」は、再プログラミング因子と呼ばれる特定の因子を導入することにより、非多能性細胞、典型的には成体体細胞、又は線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、又は表皮細胞などの非多能性細胞から人工的に調製された多能性幹細胞の一種を指す。
【０１２７】
本発明の方法は、ｉＰＳ細胞を分化細胞、例えば、眼球細胞に分化させることをさらに含んでよい。
【０１２８】
例えば、患者の線維芽細胞を、皮膚生検から収集し、ｉＰＳ細胞に形質転換できる。Ｄｉｍｏｓ  ＪＴら（２００８）  ＡＬＳを有する患者から生成された誘導多能性幹細胞は運動ニューロンに分化させることができる（Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＡＬＳ  ｃａｎ  ｂｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：１２１８−１２２１；Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４，５８２−５８３（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８）。Ｌｕｏら，オリーブ橋小脳萎縮症を有する患者の皮膚線維芽細胞から誘導される多能性幹細胞の作製（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｓｋｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｏｆ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｏｌｉｖｏｐｏｎｔｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ），Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１２，２２６（２）：１５１−９。ＣＲＩＳＰＲ媒介改変を、この段階で行うことができる。修正された細胞クローンは、ＲＦＬＰアッセイによってスクリーニング及び選択できる。次いで、修正された細胞クローンをＲＰＥ細胞に分化させ、そのＲＰＥ特異的マーカー（例えば、ベストロフィン１、ＲＰＥ６５、細胞性網膜アルデヒド結合タンパク質、及びＭＦＲＰ）について試験する。十分に分化したＲＰＥ細胞は、ドナー患者に自己移植で戻すことができる。
【０１２９】
細胞は、細胞を投与される対象に対し自己又は同種であってよい。
【０１３０】
用語「自己」は、後に同一の個人に再導入される予定の同じ個体由来の任意の物質を指す。
【０１３１】
用語「同種」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物由来の任意の物質を指す。同一種の２以上の個体は、互いに同種であると言われる。
【０１３２】
本開示に記載の対象（例えば、ＲＰＥ細胞）に投与される細胞療法のために修正された細胞は、医薬として許容される担体と共に製剤化され得る。例えば、細胞は、単独で又は医薬製剤の成分として投与できる。細胞（例えば、ＲＰＥ細胞）は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、溶質又は懸濁剤又は増粘剤を含有し得る１以上の医薬として許容される無菌等張水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩溶液（ＢＳＳ））、分散液、懸濁液又は乳濁液、又は使用直前に滅菌注射溶液若しくは分散液中で再構成され得る無菌粉末と組み合わせて投与できる。
【０１３３】
本システムは、対象の網膜中に送達され得る。本システムは、皮下注射又は硝子体内注射などの注射によって投与され得る。
【０１３４】
医薬として許容される眼科用製剤中の修正された細胞（例えば、ＲＰＥ細胞）は、眼内注射により送達され得る。注射用の濃度は、有効かつ非毒性である任意の量であり得る。患者の治療のための本開示の細胞の医薬調製物は、少なくとも約１０４細胞／ｍＬの用量で製剤化され得る。患者の治療用の細胞調製物は、少なくとも又は約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、又は１０１０細胞／ｍＬの用量で製剤化できる。
【０１３５】
本開示に従って治療され得る対象は、本発明から利益を得ることができる全ての動物を含む。そのような対象は、哺乳動物、好ましくはヒト（幼児、子供、青年、及び／又は成人）を含むが、イヌ、ネコなどの動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、及びヤギなどの家畜、及び実験動物（例えば、ラット、マウス、及びモルモットなど）でもあり得る。
【０１３６】
用語「ヌクレアーゼ」は一般に、核酸配列を加水分解する任意の酵素を指すために使用される。
【０１３７】
用語「眼球細胞」は、眼の中の、又は眼の機能に関連する任意の細胞を指す。この用語は、桿体、錐体、及び感光性神経節細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、ミュラー細胞、双極性細胞、水平細胞、又はアマクリン細胞を含む、光受容体細胞のいずれか１以上を指してよい。一実施形態では、眼細胞は双極性細胞である。別の実施形態では、眼細胞は水平細胞である。さらに第３の実施形態では、眼細胞は神経節細胞を含む。
【０１３８】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、又は類似体を指す。ポリヌクレオチドの例は、遺伝子又は遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転写ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーを含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド配列内の１以上のヌクレオチドをさらに改変できる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドはまた、標識剤とのコンジュゲーションなどにより重合後に改変されてもよい。
【０１３９】
一塩基多型（ＳＮＰ）
ＳＮＰと略される場合が多い一塩基多型は、ゲノム内の特定の位置で生じる単一ヌクレオチドの置換であり、各変化は、集団内のある程度認識できる程度に存在する（例えば、１％超）。一実施形態では、ヒトゲノム中の特定の塩基位置で、Ａヌクレオチドがほとんどの個体に現れ得るが、少数の個体では、その位置はＧが占有する。これは、この特定の位置にＳＮＰが存在し、２つの可能なヌクレオチドの変化−Ａ又はＧ−が、この位置に対する対立遺伝子であると言われることを意味する。用語ＳＮＰは、２つの対立遺伝子が整列され比較される場合に同じ相対的な部位における一塩基の相違を指し、本明細書では、この用語は、場合によって、一塩基変化を意味するためにも使用される。
【０１４０】
単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）は、頻度にいかなる制限もない単一ヌクレオチドの変化であり、体細胞において生じ得る。
【０１４１】
ＳＮＰのバリアントは、Ｇバリアント、Ｃバリアント、Ａバリアント、又はＴバリアントであり得る。
【０１４２】
１以上のＳＮＰは、１以上のコーディング領域、１以上の非コーディング領域、１以上の遺伝子間領域（遺伝子間の領域）、又は１以上のコーディング領域及び／又は１以上の非コーディング領域、及び／又は１以上の遺伝子間領域の組み合わせに存在し得る。１以上のＳＮＰは、１以上のイントロン、１以上のエキソン、１以上のイントロンと１以上のエキソンの組み合わせに存在し得る。コード領域内のＳＮＰは、生成されるタンパク質のアミノ酸配列を変更しても、又は変更しなくてもよい。ＳＮＰは、同義ＳＮＰ又は非同義ＳＮＰであり得る。同義ＳＮＰはタンパク質配列に影響を及ぼさず、非同義ＳＮＰはタンパク質のアミノ酸配列を変える。非同義ＳＮＰは、ミスセンスＳＮＰ又はナンセンスＳＮＰであり得る。タンパク質コード領域に存在しないＳＮＰは、遺伝子スプライシング、転写因子結合、メッセンジャーＲＮＡ分解、及び／又は非コーディングＲＮＡの配列に影響を及ぼし得る。この種のＳＮＰによって影響を受ける遺伝子発現は、遺伝子の上流又は下流であり得る。
【０１４３】
多型バリアントの遺伝子型判定は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて実施できる。一塩基多型（ＳＮＰ）を遺伝子型決定するために使用できる技術は、ＤＮＡ配列決定；キャピラリー電気泳動；ライゲーション検出反応（Ｄａｙら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２９、１５２  ６２（１９９５））；マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）などの質量分析法；一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）；一塩基伸長；電気化学分析；変性ＨＰＬＣ及びゲル電気泳動；制限断片長多型；ハイブリダイゼーション分析；単一ヌクレオチドプライマー伸長及びＤＮＡチップ又はマイクロアレイを含む（Ｓｃｈａｆｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６巻、ｐｐ３３〜３９（１９９８）参照）。ＤＮＡチップ又はマイクロアレイの使用は、単一の個体における多くの異なる多型遺伝子座における同時遺伝子型判定を可能にするか、又は複数の個体における単一の多型遺伝子座の同時遺伝子型判定を可能にし得る。ＳＮＰはまた、ＤＮＡ配列決定によってスコア化され得る。
【０１４４】
上記に加えて、ＳＮＰは、対立遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲ−ＳＳＰなどの、ＰＣＲベースの技術を用いてスコア化され得る（Ｂｕｎｃｅら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、１９９５；５０：２３〜３１）。本方法は一般的に、鋳型としてゲノムＤＮＡ及び２つの異なるプライマー対を用いてＤＮＡ増幅反応を行うことを含み、第１のプライマー対は、適切な条件下で野生型対立遺伝子を選択的にハイブリダイズできる対立遺伝子特異的プライマーと、問題の遺伝子内のどこかの相補配列に結合する非対立遺伝子特異的プライマーとを含み、第２のプライマー対は、適切な条件下で変異型対立遺伝子に選択的にハイブリダイズできる対立遺伝子特異的プライマーと、同一の非対立遺伝子特異的プライマーを含む。ＳＮＰをスコア化するためのさらに適切な技術は、ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡ及び変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）を含む。
【０１４５】
ＳＮＰが制限部位の欠失又は生成をもたらす場合には、多型部位にまたがる非対立遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を適切な制限酵素（ＰＣＲ−ＲＦＬＰとしても知られている）を用いて消化することにより遺伝子型判定を実施できる。一塩基多型の存在から生じたものを含む制限断片長多型は、ゲノムＤＮＡを適当な酵素で消化し次いで、多型領域に対応する標識プローブを用いてサザンブロットを行うことによりスコア化され得る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。
【０１４６】
任意の所与の多型バリアントの「遺伝子型判定」は、対象のゲノム中の正常又は野生型対立遺伝子とバリアント又は変異型対立遺伝子の両方の有無についてのスクリーニングを含み得るか、又はいずれかの個々の対立遺伝子の有無についてのスクリーニングを含んでよく、それは一般に、単に特定の対立遺伝子の１以上をスクリーニングすることにより、２つの代替の対立遺伝子形態を有する多型遺伝子座における個体の遺伝子型についての結論を導き得る。
【０１４７】
複数の遺伝子内の多型又は多型バリアントの遺伝子型判定を行うことは、本開示の範囲内である。複数の遺伝子のそのようなパネルスクリーンを使用して、同じ対象における複数の多型を同時に分析してよい。一実施形態では、単一の対象試料中の複数の多型の遺伝子型判定を、例えば、マイクロアレイ又は遺伝子チップを使用して、同時に実施してよい。
【０１４８】
「複数の」は、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上などを意味するものとすべきである。
【０１４９】
遺伝子型判定は、インビトロで実施されてよく、被試験対象から得られた適切な試料から調製されたゲノムＤＮＡを含む単離試料にて行うことができる。例えば、ゲノムＤＮＡは、当技術分野で周知の標準的な手順に従って、全血又は組織の試料、又は本明細書に記載される任意の適切な試料から調製される。ＳＮＰを含む領域における被試験個体のゲノム配列データが、例えば、従来のゲノム配列決定の実施の結果としてのゲノム配列データベースにおいて、利用可能であれば、ＳＮＰの遺伝子型判定は、この利用可能な配列データを検索することにより達成され得る。
【０１５０】
所与の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ転写物に検出可能な影響を及ぼす遺伝子バリアント、例えば、改変されたスプライシングをもたらすか、若しくは転写終結に影響を与えるバリアント、又はレベル若しくはｍＲＮＡ発現に影響を与えるバリアントの場合には、ゲノムＤＮＡレベルでのバリアントの存在を検出する代わりとして、任意の適切な技術を用いてｍＲＮＡ発現パターンを評価することにより、バリアントの存在が推測され得る。同様に、遺伝子によってコードされるタンパク質産物に検出可能な影響を及ぼす遺伝子バリアント、例えば、コードされるタンパク質の一次アミノ酸配列、構造又は特性の変化をもたらすバリアントの場合には、任意の便利な技術を用いてタンパク質の配列、構造又は特性を評価することにより、バリアントの存在が推測され得る。
【０１５１】
一実施形態では、常染色体優性疾患関連遺伝子は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、若しくは配列番号３３から選択される配列、又はそれらの各々の等価物を含む。別の実施形態では、常染色体優性疾患関連遺伝子にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡは、配列番号３１の配列又はその等価物を含む。
【０１５２】
ベストロフィン−１（ＢＥＳＴ１）
ベストロフィン−１（ＢＥＳＴ）は、ヒト（ＲＰＤＩＤ−５Ｔ５Ｎ／４ＲＤＱ）において、ＢＥＳＴ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。タンパク質のベストロフィンファミリーは、膜内在性タンパク質をコードする４つの進化的に関連する遺伝子（ＢＥＳＴ１、ＢＥＳＴ２、ＢＥＳＴ３、及びＢＥＳＴ４）を含む。この遺伝子ファミリーは、４〜６個の膜貫通ドメインを有する高度に保存されたＮ末端を有するタンパク質によって特徴付けられる。具体的には、染色体１１ｑｌ２．３上のＢＥＳＴ１遺伝子は、ヒトにおけるベストロフィン−１タンパク質をコードし、その発現は網膜で最も高い。ベストロフィン類は、塩化物イオンチャネルを形成し得るか、又は電圧ゲートＬ型カルシウムイオンチャネルを調節し得る。ベストロフィン類は一般に、上皮細胞中にカルシウム活性化塩化物イオンチャネルを形成すると考えられているが、網膜組織における重炭酸イオン輸送に対して高度に透過性であることも示されている。この遺伝子中の変異は、成人発症卵黄様黄斑変性症（ＡＶＭＤ）及び他の網膜症に加えて、ベスト黄斑変性症としても知られている、若年発症卵黄様黄斑変性症（ＶＭＤ２）に関与する。別のスプライシングは、別個のアイソフォームをコードする複数のバリアントをもたらす。ヒトにおいて、ＢＥＳＴ１変異は、ベスト卵黄様黄斑変性症（ＢＶＭＤ）に関連付けられている。ＢＥＳＴ１遺伝子中の変異は、少なくとも５つの異なる変性網膜疾患の主要原因として同定されている。
【０１５３】
ヒトＢＥＳＴ１  ｍＲＮＡのＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）登録番号は、ＮＭ＿００１１３９４４３、ＮＭ＿００１３００７８６、ＮＭ＿００１３００７８７、ＮＭ＿００４１８３及びＮＭ＿００１３６３５９１を含み得る。ヒトＢＥＳＴ１タンパク質のＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）登録番号は、ＮＰ＿００１１３２９１５、ＮＰ＿００１２８７７１５、ＮＰ＿００１２８７７１６、ＮＰ＿００４１７４、及びＮＰ＿００１３５０５２０を含み得る。マウスＢＥＳＴ１  ｍＲＮＡに対するＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）登録番号は、ＮＭ＿０１１９１３を含み得る。マウスＢＥＳＴ１タンパク質のＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）登録番号は、ＮＰ＿０３６０４３を含み得る。
【０１５４】
ＢＥＳＴ１の一塩基多型（ＳＮＰ）は、ｒｓ９７２３５３、ｒｓ９７２３５５、ｒｓ２６６８８９９、ｒｓ９７２３５４、ｒｓ１８００００７、ｒｓ１８０１３９３、ｒｓ１１０９７４８、ｒｓ１９９５２９０４６、ｒｓ１８０５１４０、ｒｓ１７１５６６０２、ｒｓ２６６８８９７、ｒｓ２６６８８９８、ｒｓ２７３６５９７、ｒｓ１９５１５６、ｒｓ１９５１５７、ｒｓ１９５１５８、ｒｓ１９５１６０、ｒｓ１９５１６２、ｒｓ７４１８８６、ｒｓ７６０３０６、ｒｓ１８０１６２１、及びｒｓ１９５１６５を含むが、これらに限定されない。
【０１５５】
ＢＥＳＴ１の変異型は、ｐＲ２１８Ｈ、ｐＬ２３４Ｐ、及びｐＡ２４３Ｔを含むが、これらに限定されない。
【０１５６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ及び他のヌクレアーゼ
Ｃａｓタンパク質又は酵素／ヌクレアーゼは、野生型（ｗｔ）Ｃａｓ（例えば、野生型（ｗｔ）Ｃａｓ９）、Ｃａｓニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）、又はｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）であり得る。
【０１５７】
ヌクレアーゼドメイン上の１以上の変異を有するヌクレアーゼ欠陥又はヌクレアーゼ欠損Ｃａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９）は、ｇＲＮＡと複合体化されたときにＤＮＡ結合活性を保持する。ｄＣａｓタンパク質は、ｇＲＮＡによって整合された部位へのタンパク質融合により、エフェクタードメイン又はタンパク質タグをつなぎ、局在化させ、それによりＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合酵素を構成できる。ｄＣａｓは、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）又はリプレッサードメイン（例えば、ＫＲＡＢ）に融合され、ｇＲＮＡによって誘導されて、それぞれ標的遺伝子を活性化又は抑制できる。ｄＣａｓはまた、蛍光タンパク質と融合され、染色体領域の生細胞蛍光標識を達成することもできる。
【０１５８】
ｇＲＮＡが、特定の遺伝子、任意に、疾患、障害、又は病態に関連付けられる遺伝子、を標的にするための標的特異性用に作製できることは当業者には理解される。そのため、Ｃａｓ９と組み合わせて、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの標的特異性を促進する。上述のように、プロモーター選択などのさらなる態様は、標的特異性を達成する、例えば、特定の器官又は組織における発現を促進するポリヌクレオチドをコードするガイドＲＮＡのためのプロモーターを選択するさらなる機構を提供し得る。したがって、本明細書では、特定の疾患、障害、又は病態に対し適切なｇＲＮＡの選択が企図される。一実施形態では、ｇＲＮＡは、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子にハイブリダイズする。
【０１５９】
改変されたＡＡＶ又は組成物の投与は、治療の過程を通じて、１回の用量で、連続的に又は間欠的に行うことができる。投与は、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、髄腔内、脳室下、硬膜外、脳内、脳室内、網膜下、硝子体内、関節内、眼内、腹腔内、子宮内、皮内、皮下、経皮、経粘膜の投与、及び吸入を含むが、これらに限定されない任意の適切な投与形態を介して行うことができる。
【０１６０】
最も有効な手段及び投与量を決定する方法は、当業者に公知であり、治療のために使用される組成物、治療の目的及び治療される対象に応じて変化する。単回又は複数回の投与は、治療医師によって選択される用量レベル及びパターンで実施できる。投与量は投与経路によって影響を受ける可能性があることに留意されたい。適切な投与製剤及び薬剤を投与する方法は、当技術分野で公知である。そのような適切な投与量の非限定的な例は、投与あたり１Ｅ＋９ベクターゲノムほど低い〜１Ｅ＋１７ベクターゲノムほど多い、である。
【０１６１】
さらなる態様では、本発明のウイルス粒子及び組成物は、他の治療、例えば、特定の疾患、障害、又は病態に適する承認された治療と組み合わせて投与できる。非限定的な例は、改変されたウイルス粒子と１種以上のステロイドとの組み合わせを有する筋ジストロフィーの治療を含む。治療が成功したかどうかは、治療医によって決定されるように、遺伝子改変の臨床的又はサブ臨床的な証拠を監視することによって決定できる。
【０１６２】
本発明の改変されたウイルス粒子又は組成物の投与は、実験及びスクリーニングアッセイのための所望の疾患、障害、又は病態の動物モデルを作製するために行うことができる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、タンパク質の活性を変えるように改変される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）（又は触媒的に不活化された／欠陥のあるＣａｓ９又はｄＣａｓ９）である。一実施形態では、ｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）は、野生型Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）の１つ又は両方のエンドヌクレアーゼ触媒部位（ＲｕｖＣ及びＨＮＨ）における点変異によりエンドヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）である。例えば、ｄＣａｓ９は、触媒的に活性な残基（Ｄ１０及びＨ８４０）の変異を含有し、ヌクレアーゼ活性を有しない。場合により、ｄＣａｓ９は、標的ＤＮＡの相補鎖と非相補鎖の両方を切断する能力が低下している。非限定的な例として、場合により、ｄＣａｓ９は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のアミノ酸配列のＤ１０ＡとＨ８４０Ａ変異の両方を保有する。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９が低下するか又は欠陥のある触媒活性を有する場合（例えば、Ｃａｓ９タンパク質が、Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／又はＡ９８７変異、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、及び／又はＤ９８６Ａを有する場合）、Ｃａｓタンパク質は、対象ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）のＣａｓ結合配列と相互作用する能力を保持する限り、対象ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）のＤＮＡ標的配列によって標的ポリヌクレオチド配列にまだ誘導されるので、依然として標的ＤＮＡに部位特異的に結合できる。
【０１６４】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ活性の不活化は、触媒的に不活化されたＣａｓ（ｄＣａｓ、例えば、ｄＣａｓ９）を生成できる。ｄＣａｓは、ＤＮＡを結合するが切断せず、そのため、転写因子の作用に対して物理的障壁を作ることにより標的遺伝子の転写を防止する。ＣＲＩＳＰＲのこのふるまいは、可逆的に転写レベルで機能する。この戦略は、ＣＲＩＳＰＲ干渉、又はＣＲＩＳＰＲｉと呼ばれている。ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）では、ｄＣａｓ融合タンパク質（例えば、別のタンパク質又はその一部に融合されたｄＣａｓ）を、遺伝子抑制のために本方法で使用してよい。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓは、（転写）リプレッサードメイン又は転写サイレンサーに融合される。転写抑制ドメインの非限定的な例は、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）ドメイン、ＳＩＤのコンカテマー（例えば、ＳＩＤ４Ｘ）、又はそれらの相同体を含む。転写サイレンサーの非限定的な例は、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）を含む。ＣＲＩＳＰＲｉは、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）をクルッペル関連ボックス抑制ドメイン（ＫＲＡＢ）に融合することによって改変されてよく、これは、Ｃａｓの抑制効果を増強する。Ｇｉｌｂｅｒｔら  真核生物における転写のＣＲＩＳＰＲ媒介モジュラーＲＮＡ誘導調節（ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｒ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ）．Ｃｅｌｌ．２０１３；１５４（２）：４４２〜５１。
【０１６５】
第２世代のＣＲＩＳＰＲｉは、ＰＵＦ−ＫＲＡＢ抑制因子を介して強く抑制する。ＰＵＦタンパク質（ショウジョウバエプミリオ及び線虫ｆｅｒｎ−３結合因子にちなんで命名された）は、ｍＲＮＡ安定性及び翻訳の媒介に関与することが知られている。これらのタンパク質は、ＰＵＦドメインとして知られる特有のＲＮＡ結合ドメインを含有する。ヒトプミリオ１タンパク質（本明細書ではＰＵＭとも呼ばれる）のものなどの、ＲＮＡ結合ＰＵＦドメインは、連続した塩基を逆平衡で結合する８つの反復配列（各反復配列は、ＰＵＦモチーフ又はＰＵＦ反復配列と呼ばれる）を含有し、各反復配列は一塩基を認識し、すなわち、ＰＵＦ反復配列Ｒ１〜Ｒ８は、それぞれ、ヌクレオチドＮ８〜Ｎ１を認識する。例えば、ＰＵＭは、８個のタンデム反復配列で構成され、各反復配列は、アルファヘリックスで構成される密に詰められたドメインへと折り畳まれる３４個のアミノ酸からなる。ＰＵＦ及びその誘導体又は機能的バリアントは、対象ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）上の特定のＰＵＦ結合配列に任意のエフェクタードメインを移動させるＰＵＦドメイン融合物の一部として、本発明の方法及びシステムにおいて使用できる、プログラム可能なＲＮＡ結合ドメインである。
【０１６６】
本明細書で使用する「ＰＵＦドメイン」は、野生型又は天然に存在するＰＵＦドメイン、並びにプロトタイプのヒトプミリオ１ＰＵＦドメインなどの天然又は既存のＰＵＦドメインに基づく／由来するＰＵＦ相同体ドメインを指す。
【０１６７】
ＰＵＦアダプタータンパク質は、ＰＵＦ結合配列で改変されたｇＲＮＡを結合する。ｇＲＮＡは、１以上のＰＵＦ結合配列を含み得る。例えば、ｇＲＮＡは、短いＰＵＦ結合配列（例えば、８マー（ｍｅｒ））の多数のコピーを、例えば、ｇＲＮＡステムループの下流又は標的適合領域の上流に挿入することにより誘導できる。特定の実施形態では、ＰＵＦ結合配列の１以上のコピーの各々は、約８個のヌクレオチドを有する。ｇＲＮＡは、ＰＵＦ結合配列の２以上のコピーを有してよい。特定の実施形態では、ｇＲＮＡはＰＵＦ結合配列の約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５〜１５コピー、約５〜１４コピー、約５〜１３コピー、約５〜１２コピー、約５〜１１コピー、約５〜１０コピー、又は約５〜９コピー、例えば、ＰＵＦ結合配列の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５コピーを含む。特定の実施形態では、ＰＵＦ結合配列コピー数の範囲は、Ｌ〜Ｈであり、Ｌは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０のいずれか１つであり、Ｈは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、９０、又は１００のいずれか１つであり、ただし、ＨはＬよりも大きい。各ＰＵＦ結合配列は同じであっても異なっていてもよい。ＰＵＦ結合配列は、米国特許公開第２０１８００９４２５７号に開示されるものであってよく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ｇＲＮＡは１以上のタンデム配列を含んでよく、その各々は、特異的なＰＵＦドメインによって特異的に認識され、結合され得る。ＰＵＦドメインは、ＰＵＦドメインの個々のＰＵＦモチーフとそれらが認識する単一のＲＮＡヌクレオチドとの間のヌクレオチド特異的相互作用に基づいて、事実上任意のＰＵＦ結合配列に結合するように遺伝子操作できるので、ＰＵＦ結合配列の配列は、対応するＰＵＦドメインに結合する任意に設計された配列であり得る。特定の実施形態では、本発明のＰＵＦ結合配列は、８マーを有する。他の実施形態では、ＰＵＦ結合配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６以上のＲＮＡヌクレオチドを有する。ＰＵＦ結合配列は、ヒトプミリオ１ＰＵＦドメイン（野生型又は変異型）を結合してよい。
【０１６８】
特定の実施形態では、ＰＵＦドメインは、異なるタンパク質からの異なるＰＵＦドメインからのＰＵＦモチーフを含む。例えば、ＰＵＦドメインは、ヒトプミリオ１タンパク質からのＰＵＦモチーフと、ＰｕＤｐ又はＦＢＦなどの１以上の他のＰＵＦタンパク質からの１以上の他のＰＵＦモチーフで構築され得る。特定の実施形態では、ＰＵＦドメインはプミリオ相同性ドメイン（ＰＵ−ＨＵＤ）である。特定の実施形態では、ＰＵ−ＨＵＤはヒトプミリオ１ドメインである。特定の実施形態では、ＰＵＦドメインは、Ｐｕｍ−ＨＤドメインを有する任意のＰＵＦタンパク質ファミリーメンバーである。ＰＵＦファミリーメンバーの非限定的な例は、線虫のＦＢＦ、ショウジョウバエのＤｓ  ｐｕｍ、及びシロイヌナズナ及びイネなどの植物のＰＵＦタンパク質を含む。Ｔａｍら、植物のＲＮＡ結合タンパク質のＰｕｆファミリー：系統発生、構造モデリング、活性及び細胞内局在（Ｔｈｅ  Ｐｕｆ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ：ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ，ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）、ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．１０：４４，２０１０、その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
本発明の方法及びシステムは、ＣＲＩＳＰＲ欠失（ＣＲＩＳＰＲｄ）を使用してよい。ＣＲＩＳＰＲｄは、ＮＨＥＪに向けたデフォルトへのＤＮＡ修復戦略の傾向を利用し、切断された鎖を修復するためにドナー鋳型を必要としない。代わりに、Ｃａｓは最初に、変異を保有する遺伝子中にＤＳＢを作り、次いで、ＮＨＥＪが生じ、その配列を破壊する挿入及び／又は欠失（ＩＮＤＥＬ）が導入され、そのため、遺伝子の発現又は適切なタンパク質の折り畳みの発生を防止する。この戦略は、優性条件に特に適用可能であり、その場合、変異した優性な対立遺伝子をノックアウトし、野生型対立遺伝子を無傷で残しておくことは、表現型を野生型に回復させるのに十分であり得る。
【０１７０】
特定の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、触媒的に欠陥のあるＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）又はｄＣａｓ、又はＣａｓニッカーゼ又はニッカーゼであってよい。
【０１７１】
Ｃａｓ酵素（例えば、Ｃａｓ９）は、ＤＳＢの代わりに一本鎖切断を誘導することによりＤＮＡに「ニック」を入れるので、それにちなんで名づけられたニッカーゼとして機能するように改変されてよい。本明細書で使用する用語「Ｃａｓニッカーゼ」又は「ニッカーゼ」は、二本鎖核酸分子（例えば、二本鎖ＤＮＡ分子）の１つの鎖のみを切断できるＣａｓタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、米国特許出願第１０，１６７，４５７号に開示されているニッカーゼのいずれかであり得、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態では、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ニッカーゼは、活性ＨＮＨヌクレアーゼドメインを有し、ＤＮＡの非標的鎖、すなわち、ｇＲＮＡに結合される鎖を切断できる。一実施形態では、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ニッカーゼは、不活性のＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを有し、ＤＮＡの標的にされる鎖、すなわち、塩基の編集が望まれる鎖を切断できない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、２本鎖核酸分子の標的鎖を切断し、これは、Ｃａｓニッカーゼが、Ｃａｓに結合されるｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）と塩基対を形成する（相補的である）鎖を切断することを意味する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、２本鎖核酸分子の非標的化非塩基編集鎖を切断し、これは、Ｃａｓニッカーゼが、Ｃａｓに結合されるｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）と塩基対を形成しない鎖を切断することを意味する。一実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメインに変異を有するＣａｓ９  Ｄ１０Ａニッカーゼである。さらに適切なＣａｓ９ニッカーゼは、この開示並びにこの開示の分野及び範囲内の知識に基づいて、当業者には明らかである。
【０１７２】
例えば、ニッカーゼは、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のＤ１０Ａに相当する位置に変異を有するＣａｓ９ニッカーゼであり得るか、又は、ニッカーゼは、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のＨ８４０Ａに相当する位置に変異を有するＣａｓ９ニッカーゼであり得る。場合によって、Ｃａｓニッカーゼは、標的ＤＮＡの相補鎖を切断できるが、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断する能力は低下している。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインの機能を低下させる変異（例えば、アミノ酸置換）を有してよい。非限定的な例として、Ｃａｓ９ニッカーゼは、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異である。場合によって、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断できるが、標的ＤＮＡの相補鎖を切断する能力は低下している。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＨＮＨドメイン（ＲｕｖＣ／ＨＮＨ／ＲｕｖＣドメインモチーフ）の機能を低下させる変異（例えば、アミノ酸置換）を有してよい。非限定的な例として、Ｃａｓ９ニッカーゼは、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のＨ８４０Ａである。米国特許公開第２０１８００９４２５７号の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７３】
一実施形態では、互いに近接した２つのｇＲＮＡ標的部位は、各ＤＮＡ鎖上に切断を誘導するために、別々のＣａｓニッカーゼを導くことができる。再組み合わせを誘導するために２つの異なる切断事象を必要とすることにより、この戦略は、オフターゲット効果の可能性を減少させることができる。
【０１７４】
ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）では、ｄＣａｓは、ＶＰ６４又はＶＰＲなどの活性化ドメインに融合されてよい。そのようなｄＣａｓ融合タンパク質は、遺伝子活性化のために本明細書に記載の構築物と共に使用されてよい。いくつかの態様では、ｄＣａｓは、ヒストン脱メチル化酵素ドメイン又はヒストンアセチルトランスフェラーゼドメインなどの、エピジェネティック調節ドメインに融合される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓは、ＬＳＤ１又はｐ３００又はその一部に融合される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ融合は、ＣＲＩＳＰＲベースのエピジェネティック調節に使用される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ又はＣａｓはＦｏｋ１ヌクレアーゼドメインに融合される。いくつかの実施形態では、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインに融合されたＣａｓ又はｄＣａｓは、ゲノム編集に使用される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ又はｄＣａｓは、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙなど）に融合される。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質に融合されたＣａｓ／ｄＣａｓタンパク質は、ゲノム遺伝子座の標識及び／若しくは可視化、又はＣａｓエンドヌクレアーゼを発現する細胞の同定に使用される。
【０１７５】
本開示は、疾患を引き起こす変異型対立遺伝子を切除できる遺伝子編集方法を提供し、これを、次いで、常染色体優性疾患に罹患した患者のインビボ遺伝子療法に使用できる。
【０１７６】
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムを利用する。特定の実施形態では、本方法は、特異的に変異型対立遺伝子（複数可）を標的にする、又は破壊のための常染色体優性変異を保有する遺伝子の変異型対立遺伝子と野生型対立遺伝子の両方を標的にする、１つ又は複数の特有のガイドＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ又はｓｇＲＮＡなどのｇＲＮＡ）配列と共に遺伝子編集酵素を使用する。この標的化は、野生型遺伝子ｃＤＮＡの供給を伴ってもよいし、そうでなくてもよく、これは、ｓｇＲＮＡ（複数可）により、認識を避けるためにコドン改変されてもよいし、そうでなくてもよい。
【０１７７】
特定の実施形態では、本開示は、「ＣｈｏｐＳｔｉｃｋ」システムと呼ばれる遺伝子編集システムを提供する。「Ｃｈｏｐ」工程は、ｉ）修正されるべき遺伝子の変異型コピー、及び／又はｉｉ）常染色体優性疾患に罹患した患者における上記遺伝子の野生型コピー、の部分的な又は完全な破壊を伴う。そのため、「Ｃｈｏｐ」工程は、上記遺伝子の変異型及び／又は野生型の活性の部分的な又は完全な喪失をもたらす。「Ｓｔｉｃｋ」工程は、目的遺伝子又はその断片（常染色体優性変異により特徴づけられる）のコドン改変ｃＤＮＡの導入を包含し、細胞内の遺伝子又は遺伝子産物の機能を回復、修正、補充、又は増強することが意図される。遺伝子の変異型及び／又は野生型の両方を欠失させ、続いて、コドン改変されガイドＲＮＡによる認識に耐性のある野生型遺伝子ｃＤＮＡを供給することにより、変異が修正され、そのため、常染色体優性疾患で見られる表現型が回復する。
【０１７８】
一実施形態では、「Ｓｔｉｃｋ」工程は、目的の遺伝子又は断片（常染色体優性変異により特徴付けられる）のコドン改変ドナー鋳型を、内因性の常染色体疾患関連遺伝子中に組み込む。そのような標的化組み込みは、相同組換えによって達成される。一般に、Ｃａｓファミリーヌクレアーゼは、ゲノム中の所定の部位でＤＮＡ二本鎖切断を行い、これは次いで、相同組換え又は非相同末端結合によって修復され得る。
【０１７９】
或いは、「Ｓｔｉｃｋ」工程は、目的の遺伝子又は断片（常染色体優性変異によって特徴付けられる）のコドン改変ドナー鋳型を、内因性の常染色体疾患関連遺伝子中に組み込まない。例えば、染色体外、又はエピソーム（ｅｐｉｓｏｍａｌ）（エピソーム（ｅｐｉｓｏｍａｌｌｙ））ベクターは、染色体外状態で核内に存続し、宿主ゲノム中に組み込まれることなく導入遺伝子送達及び発現を提供する。そのようなベクターの中にはＡＡＶベクターがあり、それは非分裂細胞の形質導入において特に効率的であり、ベクターゲノムは主にエピソーム形態で存続する。
【０１８０】
本開示は、ロドプシン変異によって引き起こされる常染色体優性網膜色素変性症（ＲＰ）を治療するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集システムの改変である方法を提供する。この手法は、破壊のためにロドプシンの変異型と野生型の両方を標的にする１対の特有のガイドＲＮＡ配列を有する遺伝子編集酵素を使用すること、次いで、ガイドＲＮＡによる認識を避けるようにコドン改変された野生型ロドプシンｃＤＮＡを供給することである。ＣＭＶプロモーターによって駆動できかつ遺伝子編集酵素の作用に対し耐性である、このコドン改変され遺伝子操作されたヒトのロドプシン配列は、患者の表現型を救済するであろう。一般に、完全なロドプシンを有する患者は、優性のロドプシン変異を有する患者よりも穏やかな表現型を有する。
【０１８１】
コドン改変ドナー鋳型は、エピソームベクターを介して細胞又は患者に送達できる。エピソームベクターは、細胞あたり複数のコピーで存続するので、生じる目的の遺伝子の発現は、ＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方において比較的高いかもしれない。非分裂細胞において、エピソーム複製要素としてのＡＡＶベクターの存在は、遺伝子、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の安定な発現に十分であり得る。
【０１８２】
本発明の方法及びシステムでは、任意の適切なヌクレアーゼを使用してよい。ヌクレアーゼは、核酸を加水分解する酵素である。ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼとして分類され得る。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の内部で核酸間の結合の加水分解を触媒する酵素群のいずれかである。エキソヌクレアーゼは、ＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖の末端からの１つのヌクレオチドの加水分解を触媒する酵素群のいずれかである。ヌクレアーゼはまた、それらがＤＮＡ又はＲＮＡを特異的に消化するか否かに基づいて分類され得る。ＤＮＡの加水分解を特異的に触媒するヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼ又はＤＮアーゼと呼ばれ、ＲＮＡの加水分解を特異的に触媒するヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ又はＲＮアーゼと呼ばれ得る。いくつかのヌクレアーゼは、一本鎖又は二本鎖核酸配列のいずれかに特異的である。いくつかの酵素は、エキソヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼの特性の両方を有する。加えて、いくつかの酵素は、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列の両方を消化できる。
【０１８３】
エンドヌクレアーゼの非限定的な例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、ＺＦニッカーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）を含む。メガヌクレアーゼは、大きなＤＮＡ配列（１２塩基対以上）を認識し、切断する能力を特徴とするエンドヌクレアーゼである。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ及びＰＩ−Ｓｃｅファミリーのエンドヌクレアーゼを含む任意の適切なメガヌクレアーゼを、本発明の方法で使用して、宿主ゲノム中に二本鎖切断を作ってよい。
【０１８４】
本明細書に記載の方法及び組成物と共に使用できる配列特異的ヌクレアーゼシステムの一例は、ＣＲＩＳＰＲシステム（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ，Ｂ．ら  Ｎａｔｕｒｅ  ４８２，３３１−３３８（２０１２）；Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，８１６−８２１（２０１２）；Ｍａｌｉ，Ｐ．ら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８２６（２０１３）；Ｃｏｎｇ，Ｌ．ら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３（２０１３）を含む。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ））システムは、ＲＮＡに誘導されるＤＮＡ結合及び標的ＤＮＡの配列特異的切断を利用する。ガイドＲＮＡ／Ｃａｓの組み合わせは、ヌクレアーゼに対し部位特異性を付与する。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ゲノムＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）部位（例えば、ＮＧＧ）及び一定のＲＮＡ足場領域の上流の標的ゲノムＤＮＡ配列に相補的な約２０個のヌクレオチドを含有する。Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連の）タンパク質は、ｓｇＲＮＡ及びｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡに結合し、ＰＡＭ部位の上流の所定の位置で二本鎖切断を導入する。Ｃａｓ９は、ＨＮＨ及びＲｕｖＣエンドヌクレアーゼと相同な２つの独立したヌクレアーゼドメインを保有し、２つのドメインのいずれかを変異させることにより、Ｃａｓ９タンパク質を、一本鎖切断を導入するニッカーゼに変換できる（Ｃｏｎｇ，Ｌ．ら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３（２０１３））。本開示の方法及び組成物は、Ｃａｓ９の一本鎖又は二本鎖誘導バージョン、並びに他の細菌Ｃａｓ９様システムなどの他のＲＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼと共に使用できることが特に企図される。本発明の方法の配列特異的ヌクレアーゼ及び本明細書に記載の組成物は、遺伝子操作されるか、キメラ化されるか、又は生物から単離され得る。ヌクレアーゼは、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びタンパク質の形態で細胞に導入できる。
【０１８５】
一実施形態では、本開示の方法は、１以上のｓｇＲＮＡを使用して、常染色体優性疾患関連遺伝子を「切断（Ｃｈｏｐ）」、除去、又は抑制することを含む。別の実施形態では、１つのｓｇＲＮＡ（複数可）を使用して、常染色体優性疾患関連遺伝子を「切断」、除去、又は抑制する。さらなる実施形態では、２以上のｓｇＲＮＡ（複数可）を使用して、常染色体優性疾患関連遺伝子を「切断」、除去、又は抑制する。
【０１８６】
一実施形態では、ＤＮＡ消化剤は、部位特異的ヌクレアーゼであり得る。別の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓファミリーヌクレアーゼであり得る。より具体的な実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼであり得る。
【０１８７】
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の機能性誘導体であり得る。
【０１８８】
十分に特徴付けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに加えて、Ｃｐｆ１（ＰｒｅＦｒａｎサブタイプのＣａｓタンパク質１）と呼ばれる新しいＣＲＩＳＰＲ酵素を、本発明の方法及びシステムで使用できる（Ｚｅｔｓｃｈｅら  Ｃｅｌｌ．ｐｉｉ：Ｓ００９２−８６７４（１５）０１２００−３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０９．０３８（２０１５））。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一のＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼであり、Ｔリッチなプロトスペーサー隣接モチーフを利用する。この著者らは、Ｃｐｆ１が、Ｃａｓ９とは異なる特性を有して強力なＤＮＡ干渉を媒介することを実証した。そのため、本発明の一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１システムを用いて、標的遺伝子内の所望の領域を切断できる。
【０１８９】
さらなる実施形態では、ヌクレアーゼは、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬＥＮは、特定のヌクレオチド配列に結合するＴＡＬエフェクタードメイン及び標的部位における二本鎖切断を触媒するエンドヌクレアーゼドメインを含む（ＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１１０７２２４６；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９、１４３−１４８（２０１１））；Ｃｅｒｍａｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３９、ｅ８２（２０１１））。配列特異的エンドヌクレアーゼは、本質的にモジュラーであり得、ＤＮＡ結合特異性は、１以上のモジュールを整列させることによって得られる。Ｂｉｂｉｋｏｖａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１、２８９〜２９７（２００１）。Ｂｏｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６、１５０９〜１５１２（２００９）。
【０１９０】
ＺＦＮは、エフェクターエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼ）に融合される２以上（例えば、２〜８、３〜６、６〜８、又はそれ以上）の配列特異的ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガードメイン）を含有してよい。Ｐｏｒｔｅｕｓら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，９６７−９７３（２００５）．Ｋｉｍら（２００７）ハイブリッド制限酵素：ＦｏｋＩ切断ドメインへのジンクフィンガー融合（Ｈｙｂｒｉｄ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ：Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｆｏｋ  Ｉ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｄｏｍａｉｎ），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ＵＳＡ，９３：１１５６−１１６０．米国特許第６，８２４，９７８号、ＰＣＴ公開ＷＯ１９９５／０９２３３及びＷＯ１９９４０１８３１３。
【０１９１】
一実施形態では、ヌクレアーゼは、オメガ、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓからなる群の、又は群から選択される部位特異的ヌクレアーゼである。
【０１９２】
本明細書に記載の方法及び組成物の配列特異的エンドヌクレアーゼは、遺伝子操作されるか、キメラ化されるか又は生物から単離されてよい。エンドヌクレアーゼは、例えば、変異誘発により、特異的なＤＮＡ配列を認識するように遺伝子操作できる。Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２）ホーミングエンドヌクレアーゼの切断特異性を変える変異（Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｈｏｍｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０：３８７０−３８７９。コンビナトリアルアセンブリは、異なる酵素を形成するタンパク質サブユニットを結合又は融合できる方法である。Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６）新規ＤＮＡ標的への組換えを誘導する多数の高度に特異的なホーミングエンドヌクレアーゼの遺伝子操作（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｏｍｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｄｕｃｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｎｏｖｅｌ  ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔｓ），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３５５：４４３−４５８。特定の実施形態では、これらの２つの手法、変異誘発及びコンビナトリアルアセンブリを組み合わせて、所望のＤＮＡ認識配列を有するように遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼを生成できる。
【０１９３】
配列特異的ヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、又はｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡなどの配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸の形態で細胞に導入できる。核酸は、プラスミド又はウイルスベクターなどのより大きな構築物の一部として送達されるか、又は例えば、エレクトロポレーション、脂質小胞、ウイルストランスポーター、マイクロインジェクション、及び微粒子銃によって直接送達され得る。同様に、１以上の導入遺伝子を含有する構築物は、核酸を細胞に導入するのに適する任意の方法によって送達され得る。
【０１９４】
本開示の方法で使用される単一ガイドＲＮＡ（複数可）は、ゲノム中の予め決定された切断部位へのＣａｓ−ｓｇＲＮＡ複合体の結合を指示するように設計できる。一実施形態では、切断部位は、常染色体優性疾患関連遺伝子の領域を含有する断片又は配列を放出するように選択されてよい。さらなる実施形態では、切断部位は、常染色体優性疾患関連遺伝子の領域を含有する断片又は配列を放出するように選択されてよい。
【０１９５】
ＤＮＡにうまく結合するＣａｓファミリー酵素（Ｃａｓ９など）については、ゲノムＤＮＡ中の標的配列は、ｓｇＲＮＡ配列に相補的であり得、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ又は「ＰＡＭ」配列に直後に存在してよい。「相補性」は、伝統的なワトソン−クリックタイプ又は他の非伝統的なタイプのいずれかによって、別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する核酸の能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対合）を形成できる核酸分子中の残基の割合を示す。完全な相補性は、ハイブリダイゼーションを引き起こしＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する十分な相補性があるならば、必ずしも必要ではない。標的配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含んでよい。Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭから遠位のミスマッチを許容できる。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９が由来する細菌の種によって変化する。最も広く使用されるＣＲＩＳＰＲシステムは、化膿レンサ球菌に由来し、ＰＡＭ配列は、ｓｇＲＮＡ認識配列のすぐの３’末端に位置するＮＧＧである。典型的な細菌種からのＣＲＩＳＰＲシステムのＰＡＭ配列は、化膿レンサ球菌（ＮＧＧ）、髄膜炎菌（ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ＮＮＡＧＡＡ）及びトレポネーマデンティコラ（ＮＡＡＡＡＣ）を含む。
【０１９６】
本開示で使用されるｓｇＲＮＡ（複数可）は、約５〜１００ヌクレオチド長、又はそれより長く（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００ヌクレオチド長、又はそれより長く）てよい。一実施形態では、ｓｇＲＮＡ（複数可）は、約１５〜約３０ヌクレオチド長（例えば、約１５〜２９、１５〜２６、１５〜２５；１６〜３０、１６〜２９、１６〜２６、１６〜２５；又は約１８〜３０、１８〜２９、１８〜２６、又は１８〜２５ヌクレオチド長）であり得る。
【０１９７】
ｓｇＲＮＡ設計を容易にするために、多くの計算ツールが開発されている（Ｐｒｙｋｈｏｚｈｉｊら（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，１０（３）：  （２０１５））；Ｚｈｕら（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，９（９）（２０１４））；Ｘｉａｏら（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  Ｊａｎ  ２１（２０１４））；Ｈｅｉｇｗｅｒら（Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１（２）：１２２−１２３（２０１４））を参照されたい）。ガイドＲＮＡ設計のための方法及びツールは、Ｚｈｕ（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０（４）ｐｐ２８９−２９６（２０１５））に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、ｓｇＲＮＡ（複数可）の設計を容易にするために使用できる公に利用可能なソフトウェアツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｇＲＮＡ−ｄｅｓｉｇｎ−ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ）がある。
【０１９８】
改変された常染色体優性疾患関連遺伝子又は断片配列は、変異された常染色体優性疾患関連遺伝子の標的化又は認識に使用されるｓｇＲＮＡ（複数可）によって認識不可能であり、ｓｇＲＮＡ標的化に対して耐性であるようにコドン改変されたドナー配列である。そのような改変された常染色体優性疾患関連遺伝子配列は、常染色体優性疾患を有する対象において欠くか又は欠損するタンパク質の少なくとも機能的断片をコードするドナー配列である。
【０１９９】
前述したように、コドン改変されたｃＤＮＡ（ドナー鋳型）は、変異型及び野生型のいずれかの疾患関連遺伝子（複数可）を標的にするために使用されるｓｇＲＮＡ（複数可）により認識されないように改変され得る。これを達成するために、ドナー鋳型遺伝子又は断片に変異を導入して、ドナー鋳型遺伝子又は断片を、ｓｇＲＮＡ（複数可）によって認識されずその結果、細胞に導入されたＣａｓ酵素（Ｃａｓ９ヌクレアーゼなど）による分解に対して耐性であるようにさせる必要がある。ドナー鋳型遺伝子は、ドナー鋳型内に揺らぎ塩基（複数可）を導入することにより改変され得る。ＤＮＡにおける揺らぎ塩基（複数可）の導入は、サイレント変異を生じ、ｗｔ遺伝子の発現産物は無傷のままであるが、ヌクレオチド配列が十分に変化している場合は、それはドナー鋳型配列を、変異型及びｗｔの疾患関連遺伝子（複数可）のいずれかを標的にするために使用されるｓｇＲＮＡ（複数可）により認識されないようにし、最終的にＣａｓヌクレアーゼ切断に対し耐性にさせる。ドナー鋳型中に導入される必要がある揺らぎ塩基の数は変化してよいが、ｓｇＲＮＡハイブリダイゼーション及びＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を防止するのに十分である必要がある。
【０２００】
一実施形態では、ドナー鋳型配列は、Ｃａｓヌクレアーゼ（同じベクターに含まれる）を送達するために使用されるのと同じ遺伝子導入システムを使用して送達されてよく、又は異なる送達システムを用いて送達されてよい。別の実施形態では、ドナー鋳型配列は、ｓｇＲＮＡ（複数可）を送達するために使用されるのと同じ転移システムを使用して送達されてよい。特定の実施形態では、ドナーはウイルスベクター例えば、ＡＡＶ）を使用して送達される。
【０２０１】
一実施形態では、本開示は、コドン改変された常染色体優性疾患関連遺伝子配列（ドナー鋳型配列）を内在性の常染色体疾患関連遺伝子に組み込むことを含む。
【０２０２】
別の実施形態では、ドナー配列又は改変された常染色体優性疾患関連遺伝子配列は、相同組換え（ＨＲ）によって内因性遺伝子に組み込まれる。
【０２０３】
さらなる実施形態では、ドナー配列又は改変された常染色体優性疾患関連遺伝子配列は、上流及び下流の相同アームに隣接される。ドナー配列又は改変された常染色体優性疾患関連遺伝子配列に隣接する相同アームは、常染色体優性疾患関連遺伝子の標的遺伝子座内の領域に対応する。例えば、標的遺伝子座内の対応する領域は、本明細書では「標的部位」と呼ばれる。そのため、一例では、ドナー又は改変された常染色体優性疾患関連遺伝子配列を保有するベクターは、第１及び第２の相同アームが隣接するドナー又は改変された常染色体優性疾患関連遺伝子配列を含んでよい。
【０２０４】
ドナー又は改変された常染色体優性疾患関連遺伝子配列を保有するベクターの相同アームは、対応する標的部位との相同組換え事象を促進するのに十分な任意の長さであり得、例えば、５０〜１００塩基対、１００〜１０００塩基対、又は少なくとも５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、１００〜２００、若しくは２００〜３００塩基対の長さ又はそれより長い塩基対を含む。
【０２０５】
一実施形態では、ドナー鋳型は、二本鎖ＤＮＡとして送達される。そのような状況下では、相同アームは、各アームの１５〜４０００塩基対を含み得る。他の実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡフォーマットとして送達される。そのような状況下では、相同アームは、各アームの８〜１０００ｂｐを含み得る。
【０２０６】
相同アーム及び標的部位は、２つの領域が互いに十分なレベルの配列同一性を共有して相同組換え反応の基質として作用する場合に、互いに「対応する」又は「対応している」。「相同性」とは、対応する配列に対して同一であるか、又は配列同一性を共有するＤＮＡ配列を意味する。所与の標的部位と、ドナー又は改変された常染色体優性疾患関連遺伝子配列を保有するベクター上に見られる対応する相同アームとの間の配列同一性は、相同組換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であり得る。例えば、ドナー又は改変された常染色体優性疾患関連遺伝子配列（又はその断片）を保有するベクターの相同アームによって共有される配列同一性の量、及び標的部位（又はその断片）は、配列が相同組換えを受けるように、コドン改変領域を除いて、１００％配列同一性であるべきである。１００％未満の配列同一性は、Ｃａｓ酵素（Ｃａｓ９）が患者ＤＮＡのみを切断しドナー鋳型又はドナー鋳型によって修復／置換された患者ＤＮＡを切断しないならば、許容されてよい。
【０２０７】
或いは、目的遺伝子又は断片のドナー鋳型（コドン改変の有無問わず）は、内因性疾患関連遺伝子中に組み込まれない。ドナー鋳型は、染色体外にパッケージングされ得るか、又は染色体外状態で核に存続し宿主ゲノムに組み込まれることなくドナー鋳型の送達及び発現を提供する、エピソームベクター（ＡＡＶベクターなど）中にパッケージングされ得る。染色体外遺伝子ベクター技術の使用は、Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ  Ｒ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１１；７３８：１−１７）によって詳細に論じられている。
【０２０８】
本開示の方法及びシステムは、細胞中の常染色体優性疾患関連遺伝子を改変する方法であって、常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターと細胞を接触させることを含み、常染色体優性疾患関連遺伝子が、眼疾患に関係し、少なくとも１種のベクターが、（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、（ｉｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子のイントロンにハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡをコードする第２の配列、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第３の配列、を含み、Ｃａｓヌクレアーゼが、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする、方法を提供する。本発明の方法はまた、細胞中の常染色体優性疾患関連遺伝子を改変する方法であって、常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターと細胞を接触させることを含み、常染色体優性疾患関連遺伝子が、眼疾患に関係し、少なくとも１種のベクターが、（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、及び（ｉｉ）触媒的に欠損したＣａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）をコードする第２の配列、を含み、Ｃａｓヌクレアーゼが、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする、方法を提供する。これらの方法及びシステムは、本明細書ではＣＲＩＳＰＲ３．０と呼ばれる。
【０２０９】
本開示の方法及びシステムはまた、対象における常染色体優性眼疾患を治療する方法であって、対象における常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターの治療有効量を対象に投与することを含み、少なくとも１種のベクターが、（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、（ｉｉ）常染色体優性疾患関連遺伝子のイントロンにハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡをコードする第２の配列、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第３の配列、を含み、Ｃａｓヌクレアーゼが、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする、方法を提供する。本開示の方法及びシステムはまた、対象における常染色体優性眼疾患を治療する方法であって、対象における常染色体優性疾患関連遺伝子の変異型対立遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする少なくとも１種のベクターの治療有効量を対象に投与することを含み、少なくとも１種のベクターが、（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列、及び（ｉｉ）触媒的に欠損したＣａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）をコードする第２の配列、を含み、Ｃａｓヌクレアーゼが、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む常染色体優性疾患関連遺伝子をコードする変異型対立遺伝子のみを切断又は標的にする、方法を提供する。これらの方法及びシステムは、ＣＲＩＳＰＲ３．０と呼ばれる。
【０２１０】
治療すべき病態及び疾患関連遺伝子
本発明の方法及びシステムは、常染色体優性変異の存在により生じる眼疾患を予防、修正、又は治療するために使用されてよい。眼疾患の非限定的な例は、ベスト卵黄様黄斑変性症（ＢＶＭＤ）又は若年発症卵黄様黄斑変性症、及び成人発症卵黄様黄斑変性症（ＡＶＭＤ）などの卵黄様黄斑変性症（ＶＭＤ）；常染色体劣性ベストロフィノパチー；常染色体優性硝子体脈絡膜症（ｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｃｈｏｒｏｉｄｏｐａｔｈｙ）及び網膜色素変性症（ＲＰ）を含む。眼疾患の非限定的な例は、網膜症、網膜ジストロフィー、及び網膜変性疾患を含む。
【０２１１】
本発明のシステム及び方法は、任意の常染色体優性疾患に見られる変異（複数可）の修正のための遺伝子編集ツールとして使用できる。そのため、本開示の方法は、先端胸症候群（Ａｃｒｏｐｅｃｔｏｒａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、急性間欠性ポルフィリア、指紋欠如疾患、オルブライト遺伝性骨異栄養症、アラカワ症候群ＩＩ（Ａｒａｋａｗａ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ＩＩ）、アロマターゼ過剰症候群、常染色体優性小脳性小脳失調、常染色体優性網膜色素変性症、アクセンフェルト症候群、ベスレムミオパチー、バート・ホッグ・デュベ症候群、ブーメラン異形成、鰓耳腎症候群、ブシュケ・オレンドルフ症候群、カムラチ・エンゲルマン病、中心コア疾患、コラーゲン疾患、ＩＩ型コラーゲン異常症、ＸＩ型コラーゲン異常症、先天性遠位脊髄筋萎縮、先天性間質性角膜ジストロフィー、コステロ症候群、クラリーノ症候群、ダリエー病、デビボ病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、網状色素性皮膚症、胸腺低形成、ドイン蜂巣状疾患、低フィブリノゲン血症、家族性アミロイド多発性神経障害、家族性心房細動、家族性高コレステロール血症、家族性男性限定性早熟、ファインゴールド症候群、フェルティ症候群、フリン・エアード症候群、ガードナー症候群、ガレスピー症候群、グレー血小板症候群、グレイグ尖頭多合指症候群、ハジュ・チーニー症候群、ホーキンシヌリア（Ｈａｗｋｉｎｓｉｎｕｒｉａ）、ヘイ・ウェルズ症候群、遺伝性楕円赤血球症、遺伝性出血性毛細血管拡張症、遺伝性粘膜上皮形成異常、遺伝性球状赤血球症、ホルト・オラム症候群、ハンチントン病、肥大性心筋症、低アルファリポ蛋白血症、軟骨低形成症、ジャクソン・ワイス症候群、角質溶解性の冬の紅斑（Ｋｅｒａｔｏｌｙｔｉｃ  ｗｉｎｔｅｒ  ｅｒｙｔｈｅｍａ）、Ｋｎｉｅｓｔ骨異形成症、コストマン症候群、ランガー・ギデオン症候群、ラーセン症候群、リドル症候群、マルファン症候群、マーシャル症候群、髄質嚢胞性腎疾患、メタコンドロマトーシス、ミラー・ディッカー症候群、ＭＯＭＯ症候群、連珠毛、多発性内分泌腫瘍症、多発性内分泌腫瘍症１型、多発性内分泌腫瘍症２型、多発性内分泌腫瘍症２ｂ型、骨髄性細胞貯留、筋強直性ジストロフィー、Ｎａｅｇｅｌｉ−Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｅｔｔｉ−Ｊａｄａｓｓｏｈｎ症候群、ネイル・パテラ症候群、ヌーナン症候群、眼球咽頭型筋ジストロフィー、先天性爪甲硬厚症、パリスターホール症候群、ＰＡＰＡ症候群、乳頭腎症候群、歪捻肢骨異形成症、ペルゲル−フェット核異常、ポイツ・ジェガース症候群、多指症、膝窩翼状片症候群、晩発性皮膚ポルフィリン症、偽性軟骨無形成症、ラスオパシー、ライス−バクラース角膜ジストロフィー（Ｒｅｉｓ−Ｂｕｃｋｌｅｒｓ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ロマノ・ワード症候群、Ｒｏｓｓｅｌｌｉ−Ｇｕｌｉｅｎｅｔｔｉ症候群、ルーシー・レビー症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、ゼーツレ・コッツェン症候群、シュミット・ギレンウォーター・ケリー症候群、短ＱＴ症候群、シングルトン・メルテン症候群、下肢優位性の脊髄筋萎縮症、脊髄小脳変性症、脊髄小脳変性症６型、先天性脊椎骨端異形成症、脊椎末梢異形成症、スティックラー症候群、ティーツェ症候群、チモシー症候群、トリーチ���ー・コリンズ症候群、結節性硬化症、ユーピントン病、異型ポルフィリン症、卵黄様黄斑変性症、フォンヒッペル・リンドウ病、フォン・ヴィレブランド病、ワリス・ツィーフ・ゴールドブラット症候群、ＷＨＩＭ症候群、白色海綿状母斑、ワース症候群、ザスポパチー、チンメルマン・レーバンド症候群、及びゾリ・ストーカー・ウィリアムズ症候群を含むが、これに限定されない任意の常染色体優性疾患を治療するために使用できる。例えば、本開示に提供される実施例では、本発明者らは、ヒト腎臓細胞及びｉＰＳ細胞上で「Ｃｈｏｐ」を実行するデータを提示する。これらの知見は、腎血管筋脂肪腫、髄質嚢胞性腎疾患又は常染色体優性多嚢胞性腎臓疾患などの常染色体優性腎臓疾患を予防、修正、又は治療するために使用する本開示の方法の可能性を確認する。
【０２１２】
そのような眼疾患の例は、常染色体優性絨毛性萎縮又は変性、常染色体優性錐体ジストロフィー又は常染色体優性錐体杆体ジストロフィー、常染色体優性先天性停止性夜盲、常染色体優性レーバー先天黒内障、常染色体優性黄斑変性症、常染色体優性眼網膜発達疾患、染色体優性視神経萎縮、常染色体優性網膜色素変性症、網膜症を伴う常染色体優性症候性／全身性疾患、ソースビー黄斑変性症、加齢黄斑変性症、ドイン蜂巣状黄斑病、及び若年性黄斑変性症も含むが、これらに限定されない。
【０２１３】
一般に、網膜色素変性症の場合には、ヌルのロドプシン変異を有する患者は、重度の優性ロドプシン変異を有する患者よりも穏やかな表現型を有する。正常なロドプシン遺伝子が変異遺伝子と共に破壊されても、野生型エキソン又はｃＤＮＡの供給（すなわち、スティック）は、レシピエントの網膜機能を改善すると依然として期待される。
【０２１４】
本開示の方法は、対象における網膜色素変性症（ＲＰ）に関連付けられる視覚喪失の進行の停止又は視覚喪失の改善のために使用できる。
【０２１５】
視覚喪失は、末梢視野、中央（読み取り）視野、暗視、昼間視、色覚の喪失、コントラスト感度の喪失、又は視力の低下を含み得る。本開示の方法はまた、対象における光受容体機能喪失を防止若しくは停止させるために、又は光受容体機能を増加させるために使用できる。
【０２１６】
ＲＰは、網膜の検査を通して部分的に診断される。眼の検査は通常、網膜に画線する異常な暗色素沈着を明らかにする。ＲＰを診断するためのさらなる試験は、網膜電図（ＥＲＧ）及び視野検査を含む。
【０２１７】
対象における視覚機能、網膜機能（光刺激に対する応答性など）、又は網膜構造を測定又は評価する方法は、当業者に周知である。例えば、Ｋａｎｓｋｉ’ｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第８版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１５を参照されたい。光に対する網膜応答を測定又は評価する方法は、光刺激に対する網膜の電気的応答を検出することを含み得る。この応答は、網膜電図（ＥＲＧ；例えば、全視野ＥＲＧ、多焦点ＥＲＧ、又はＥＲＧ光ストレス試験）、視覚誘発電位、又は視運動性眼振を測定することによって検出できる（例えば、Ｗｅｓｔｅｒら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４８：４５４２−４５４８，２００７を参照されたい）。さらに、光に対する網膜応答は、網膜応答（例えば、網膜表面における微小電極の使用）を直接検出することによって測定されてよい。ＥＲＧは、Ｖｉｎｃｅｎｔら．Ｒｅｔｉｎａ，２０１３；３３（１）：５−１２により広範に説明されている。そのため、本開示の方法を使用して、眼疾患に罹患した対象における視覚機能、網膜機能（光刺激に対する応答性など）、網膜構造、又は眼疾患に関連付けられる他の臨床症状又は表現型変化を改善できる。
【０２１８】
一実施形態では、本開示の方法は、常染色体優性疾患の発生及び進行を防止するために使用できる。例えば、患者は、常染色体優性変異のキャリアであり得るが、疾患の表現型発現は、ゲノム欠損がスクリーニングによって同定されているにも関わらず、まだ現れていない。本開示の方法は、疾患の発症を防止するために、そのような患者に適用され得る。
【０２１９】
常染色体優性疾患の予防、修正、又は治療に使用されることに加えて、本開示の方法は、任意の常染色体劣性疾患を予防、修正、又は治療するために使用できる。そのため、常染色体優性疾患及び常染色体優性遺伝子又は断片に適用可能な、本明細書に記載の全ての方法は、常染色体劣性疾患の治療で使用するために採用できる。
【０２２０】
さらなる実施形態では、本開示の方法は、常染色体劣性変異の存在により生じる眼疾患を予防、修正、又は治療するために使用できる。そのような疾患の例は、常染色体劣性先天性停止性夜盲、常染色体劣性難聴単独又は症候性、常染色体劣性レーバー先天性黒内障、常染色体劣性視神経萎縮、常染色体劣性網膜色素変性症、網膜障害を伴う常染色体劣性症候性／全身性疾患、常染色体劣性アッシャー症候群、他の常染色体劣性網膜障害、常染色体劣性錐体又は錐体杆体ジストロフィー、常染色体劣性黄斑変性症、及び常染色体劣性バルデー・ビードル症候群を含むが、これらに限定されない。
【０２２１】
常染色体優性疾患を引き起こす様々な遺伝子中の変異が同定されている（そのような遺伝子は、常染色体優性疾患関連遺伝子とも呼ばれる）。本開示の方法は、そのような常染色体優性疾患関連遺伝子中の変異を完全に又は部分的に修正するために使用でき、野生型の部分的又は完全な修復をもたらす。
【０２２２】
登録番号が使用される全ての場合において、登録番号は、本開示の方法と共に使用され得る遺伝子の一実施形態を指す。一実施形態では、登録番号はＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）番号である。
【０２２３】
例えば、網膜色素変性症の常染色体優性疾患関連遺伝子は、ＡＲＬ３（ＮＣ＿００００１０．１１（１０２６７３７２７．．１０２７１４４３３、補体））、ＢＥＳＴ１（例えば、ＮＧ＿００９０３３．１）、ＣＡ４（ＮＧ＿０１２０５０．１）、ＣＲＸ（ＮＧ＿００８６０５．１）、ＦＳＣＮ２（ＮＧ＿０１５９６４．１）、ＧＵＣＡ１Ｂ（ＮＧ＿０１６２１６．１）、ＨＫ１（ＮＧ＿０１２０７７．１）、ＩＭＰＤＨ１（ＮＧ＿００９１９４．１）、ＫＬＨＬ７（ＮＧ＿０１６９８３．１）、ＮＲ２Ｅ３（ＮＧ＿００９１１３．２）、ＮＲＬ（ＮＧ＿０１１６９７．１）、ＰＲＰＦ３（ＮＧ＿００８２４５．１）、ＰＲＰＦ４（ＮＧ＿０３４２２５．１）、ＰＲＰＦ６（ＮＧ＿０２９７１９．１）、ＰＲＰＦ８（ＮＧ＿００９１１８．１）、ＰＲＰＦ３１（ＮＧ＿００９７５９．１）、ＰＲＰＨ２（ＮＧ＿００９１７６．１）、ＲＤＨ１２（ＮＧ＿００８３２１．１）、ＲＨＯ（ＮＧ＿００９１１５．１）、ＲＯＭ１（ＮＧ＿００９８４５．１）、ＲＰ１（ＮＧ＿００９８４０．１）、ＲＰ９（ＮＧ＿０１２９６８．１）、ＲＰＥ６５（ＮＧ＿００８４７２．１）、ＳＥＭＡ４Ａ（ＮＧ＿０２７６８３．１）、ＳＮＲＮＰ２００（ＮＧ＿０１６９７３．１）、ＳＰＰ２（ＮＧ＿００８６６８．１）、及びＴＯＰＯＲＳ（ＮＧ＿０１７０５０．１）を含み得るが、これらに限定されない。常染色体優性網膜色素変性症を引き起こす遺伝子及び変異は、Ｄａｉｇｅｒら（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｍｅｄ．２０１４  Ｏｃｔ  １０；５（１０））に詳細に記載されている。
【０２２４】
常染色体優性疾患関連遺伝子の別の種類は、常染色体優性網脈絡膜萎縮症又は変性関連遺伝子であり、これは、ＰＲＤＭ１３（ＮＣ＿０００００６．１２（９９６０６７７４．．９９６１５５７８）），ＲＧＲ（ＮＧ＿００９１０６．１）、及びＴＥＡＤ１（ＮＧ＿０２１３０２．１）を含み得る。
【０２２５】
常染色体優性疾患関連遺伝子の他の例は、常染色体優性錐体又は錐体杆体ジストロフィー関連遺伝子であり、これは、ＡＩＰＬ１（ＮＧ＿００８４７４．１）、ＣＲＸ（ＮＧ＿００８６０５．１）、ＧＵＣＡ１Ａ（ＮＧ＿００９９３８．１）、ＧＵＣＹ２Ｄ（ＮＧ＿００９０９２．１）、ＰＩＴＰＮＭ３（ＮＧ＿０１６０２０．１）、ＰＲＯＭ１（ＮＧ＿０１１６９６．１）、ＰＲＰＨ２（ＮＧ＿００９１７６．１）、ＲＩＭＳ１（ＮＧ＿０１６２０９．１）、ＳＥＭＡ４Ａ（ＮＧ＿０２７６８３．１）、及びＵＮＣ１１９（ＮＧ＿０１２３０２．１）を含み得る。
【０２２６】
一実施形態では、常染色体優性疾患関連遺伝子は、常染色体優性先天性停止性夜盲関連遺伝子であり、ＧＮＡＴ１（ＮＧ＿００９８３１．１）、ＰＤＥ６Ｂ（ＮＧ＿００９８３９．１）、及びＲＨＯ（ＮＧ＿００９１１５．１）を含む。
【０２２７】
別の実施形態では、常染色体優性疾患関連遺伝子は、ＷＳＦ１（ＮＣ＿０００００４．１２（６２６９８５０．．６３０３２６５））などの常染色体優性難聴（単独又は症候性）関連遺伝子である。
【０２２８】
常染色体優性疾患関連遺伝子の別の種類は、常染色体優性レーバー先天黒内障関連遺伝子であり、これは、ＣＲＸ（ＮＧ＿００８６０５．１）、（ＮＧ＿００９１９４．１）、及びＯＴＸ２（ＮＧ＿００８２０４．１）を含み得る。
【０２２９】
常染色体優性疾患関連遺伝子の別の例は、常染色体優性黄斑変性症関連遺伝子であり、これは、ＢＥＳＴ１（ＮＧ＿００９０３３．１）、Ｃ１ＱＴＮＦ５（ＮＧ＿０１２２３５．１）、ＣＴＮＮＡ１（ＮＣ＿０００００５．１０（１３８７５３３９６．．１３８９３５０３４））、ＥＦＥＭＰ１（ＮＧ＿００９０９８．１）、ＥＬＯＶＬ４（ＮＧ＿００９１０８．１）、ＦＳＣＮ２（ＮＧ＿０１５９６４．１）、ＧＵＣＡ１Ｂ（ＮＧ＿０１６２１６．１）、ＨＭＣＮ１（ＮＧ＿０１１８４１．１）、ＩＭＰＧ１（ＮＧ＿０４１８１２．１）、ＯＴＸ２（ＮＧ＿００８２０４．１）、ＰＲＤＭ１３（ＮＣ＿０００００６．１２（９９６０６７７４．．９９６１５５７８））、ＰＲＯＭ１（ＮＧ＿０１１６９６．１）、ＰＲＰＨ２（ＮＧ＿００９１７６．１）、ＲＰ１Ｌ１（ＮＧ＿０２８０３５．１）、及びＴＩＭＰ３（ＮＧ＿００９１１７．１）を含み得る。
【０２３０】
一実施形態では、常染色体優性疾患関連遺伝子は、ＶＡＮ（ＮＧ＿０１２６８２．１）などの常染色体優性眼網膜発生疾患関連遺伝子である。登録番号は、本開示の方法と共に使用され得る各遺伝子の特定例として提供される。
【０２３１】
別の実施形態では、常染色体優性疾患関連遺伝子は、ＭＦＮ２（ＮＧ＿００７９４５．１）、ＮＲ２Ｆ１（ＮＧ＿０３４１１９．１）、及びＯＰＡ１（ＮＧ＿０１１６０５．１）を含む、常染色体優性視神経萎縮関連遺伝子である。
【０２３２】
一実施形態では、常染色体優性疾患関連遺伝子は、ＡＢＣＣ６（ＮＧ＿００７５５８．２）、ＡＴＸＮ７（ＮＧ＿００８２２７．１）、ＣＯＬ１１Ａ１（ＮＧ＿００８０３３．１）、ＣＯＬ２Ａ１（ＮＧ＿００８０７２．１）、ＪＡＧ１（ＮＧ＿００７４９６．１）、ＫＣＮＪ１３（ＮＧ＿０１６７４２．１）、ＫＩＦ１１（ＮＧ＿０３２５８０．１）、ＭＦＮ２（ＮＧ＿００７９４５．１）、ＯＰＡ３（ＮＧ＿０１３３３２．１）、ＰＡＸ２（ＮＧ＿００８６８０．２）、ＴＲＥＸ１（ＮＧ＿００９８２０．１）、及びＶＣＡＮ（ＮＧ＿０１２６８２．１）を含む、網膜症を伴う常染色体優性症候性／全身性疾患関連遺伝子である。
【０２３３】
常染色体優性疾患関連遺伝子の別の例は、ＢＥＳＴ１（ＮＧ＿００９０３３．１）、ＣＡＰＮ５（ＮＧ＿０３３００２．１）、ＣＲＢ１（ＮＧ＿００８４８３．２）、ＦＺＤ４（ＮＧ＿０１１７５２．１）、ＩＴＭ２Ｂ（ＮＧ＿０１３０６９．１）、ＬＲＰ５（ＮＧ＿０１５８３５．１）、ＭＡＰＫＡＰＫ３（ＮＣ＿０００００３．１２（５０６１１８６２．．５０６４９２９７））、ＭＩＲ２０４（ＮＲ＿０２９６２１．１）、ＯＰＮ１ＳＷ（ＮＧ＿００９０９４．１）、ＲＢ１（ＮＧ＿００９００９．１）、ＴＳＰＡＮ１２（ＮＧ＿０２３２０３．１）、及びＺＮＦ４０８（ＮＣ＿００００１１．１０（４６７００７６７．．４６７０５９１６）を含む、常染色体優性網膜症関連遺伝子である。
【０２３４】
本明細書に記載の方法によれば、常染色体劣性疾患関連遺伝子を修正し、野生型遺伝子の機能を部分的又は完全に回復させることができる。
【０２３５】
常染色体劣性疾患関連遺伝子の１種は、ＣＡＢＰ４（ＮＧ＿０２１２１１．１）、ＧＮＡＴ１（ＮＧ＿００９８３１．１）、ＧＮＢ３（ＮＧ＿００９１００．１）、ＧＰＲ１７９（ＮＧ＿０３２６５５．２）、ＧＲＫ１（ＮＣ＿００００１３．１１（１１３６６７２７９．．１１３６７１６５９））、ＧＲＭ６（ＮＧ＿００８１０５．１）、ＬＲＩＴ３（ＮＧ＿０３３２４９．１）、ＲＤＨ５（ＮＧ＿００８６０６．１）、ＳＡＧ（ＮＧ＿００９１１６．１）、ＳＬＣ２４Ａ１（ＮＧ＿０３１９６８．２）、及びＴＲＰＭ１（ＮＧ＿０１６４５３．２）を含む、先天性停止性夜盲関連遺伝子である。
【０２３６】
常染色体劣性疾患関連遺伝子の別の種類は、ＡＤＩＰＯＲ１（ＮＣ＿０００００１．１（２０２９４０８２５．．２０２９５８５７２、補体））、ＡＲＬ６（ＮＧ＿００８１１９．２）、ＢＢＩＰ１（ＮＧ＿０４１７７８．１）、ＢＢＳ１（ＮＧ＿００９０９３．１）、ＢＢＳ２（ＮＧ＿００９３１２．１）、ＢＢＳ４（ＮＧ＿００９４１６．２）、ＢＢＳ５（ＮＧ＿０１１５６７．１）、ＢＢＳ７（ＮＧ＿００９１１１．１）、ＢＢＳ９（ＮＧ＿００９３０６．１）、ＢＢＳ１０（ＮＧ＿０１６３５７．１）、ＢＢＳ１２（ＮＧ＿０２１２０３．１）、Ｃ８ｏｒｆ３７（ＮＧ＿０３２８０４．１）、ＣＥＰ２９０（ＮＧ＿００８４１７．１）、ＩＦＴ１７２（ＮＧ＿０３４０６８．１）、ＩＦＴ２７（ＮＧ＿０３４２０５．１）、ＩＮＰＰ５Ｅ（ＮＧ＿０１６１２６．１）、ＫＣＮＪ１３（ＮＧ＿０１６７４２．１）、ＬＺＴＦＬ１（ＮＧ＿０３３９１７．１）、ＭＫＫＳ（ＮＧ＿００９１０９．１）、ＭＫＳ１（ＮＧ＿０１３０３２．１）、ＮＰＨＰ１（ＮＧ＿００８２８７．１）、ＳＤＣＣＡＧ８（ＮＧ＿０２７８１１．１）、ＴＲＩＭ３２（ＮＧ＿０１１６１９．１）、及びＴＴＣ８（ＮＧ＿００８１２６．１）を含む、バルデー・ビードル症候群関連遺伝子である。
【０２３７】
常染色体劣性疾患関連遺伝子の一例は、ＡＢＣＡ４（ＮＧ＿００９０７３．１）、ＡＤＡＭ９（ＮＧ＿０１６３３５．１）、ＡＴＦ６（ＮＧ＿０２９７７３．１）、Ｃ２１ｏｒｆ２（ＮＧ＿０３２９５２．１）、Ｃ８ｏｒｆ３７（ＮＧ＿０３２８０４．１）、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４（ＮＧ＿０１２６６３．１）、ＣＤＨＲ１（ＮＧ＿０２８０３４．１）、ＣＥＲＫＬ（ＮＧ＿０２１１７８．１）、ＣＮＧＡ３（ＮＧ＿００９０９７．１）、ＣＮＧＢ３（ＮＧ＿０１６９８０．１）、ＣＮＮＭ４（ＮＧ＿０１６６０８．１）、ＧＮＡＴ２（ＮＧ＿００９０９９．１）、ＫＣＮＶ２（ＮＧ＿０１２１８１．１）、ＰＤＥ６Ｃ（ＮＧ＿０１６７５２．１）、ＰＤＥ６Ｈ（ＮＧ＿０１６８５９．１）、ＰＯＣ１Ｂ（ＮＧ＿０４１７８３．１）、ＲＡＢ２８（ＮＧ＿０３３８９１．１）、ＲＡＸ２（ＮＧ＿０１１５６５．１）、ＲＤＨ５（ＮＧ＿００８６０６．１）、ＲＰＧＲＩＰ１（ＮＧ＿００８９３３．１）、及びＴＴＬＬ５（ＮＧ＿０１６９７４．１）を含むが、これらに限定されない錐体又は錐体杆体ジストロフィー関連遺伝子である。
【０２３８】
常染色体劣性疾患関連遺伝子の別の例は、ＣＤＨ２３（ＮＧ＿００８８３５．１）、ＣＩＢ２（ＮＧ＿０３３００６．１）、ＤＦＮＢ３１（ＮＧ＿０１６７００．１）、ＭＹＯ７Ａ（ＮＧ＿００９０８６．１）、ＰＣＤＨ１５（ＮＧ＿００９１９１．２）、ＰＤＺＤ７（ＮＧ＿０２８０３０．１）、及びＵＳＨ１Ｃ（ＮＧ＿０１１８８３．１）を含む難聴（単独又は症候性）関連遺伝子である。
【０２３９】
一実施形態では、常染色体劣性疾患関連遺伝子は、ＡＩＰＬ１（ＮＧ＿００８４７４．１）、ＣＡＢＰ４（ＮＧ＿０２１２１１．１）、ＣＥＰ２９０（ＮＧ＿００８４１７．１）、ＣＬＵＡＰ１（ＮＣ＿００００１６．１０（３５００９４５．．３５３９０４８））、ＣＲＢ１（ＮＧ＿００８４８３．２）、ＣＲＸ（ＮＧ＿００８６０５．１）、ＤＴＨＤ１（ＮＧ＿０３２９６２．１）、ＧＤＦ６（ＮＧ＿００８９８１．１）、ＧＵＣＹ２Ｄ（ＮＧ＿００９０９２．１）、ＩＦＴ１４０（ＮＧ＿０３２７８３．１）、ＩＱＣＢ１（ＮＧ＿０１５８８７．１）、ＫＣＮＪ１３（ＮＧ＿０１６７４２．１）、ＬＣＡ５（ＮＧ＿０１６０１１．１）、ＬＲＡＴ（ＮＧ＿００９１１０．１）、ＮＭＮＡＴ１（ＮＧ＿０３２９５４．１）、ＰＲＰＨ２（ＮＧ＿００９１７６．１）、ＲＤ３（ＮＧ＿０１３０４２．１）、ＲＤＨ１２（ＮＧ＿００８３２１．１）、ＲＰＥ６５（ＮＧ＿００８４７２．１）、ＲＰＧＲＩＰ１（ＮＧ＿００８９３３．１）、ＳＰＡＴＡ７（ＮＧ＿０２１１８３．１）、及びＴＵＬＰ１（ＮＧ＿００９０７７．１）を含む、レーバー先天黒内障関連遺伝子である。
【０２４０】
別の実施形態では、常染色体劣性疾患関連遺伝子は、ＲＴＮ４ＩＰ１（ＮＣ＿０００００６．１２（１０６５７１０２８．．１０６６３０５００、補体））、ＳＬＣ２５Ａ４６（ＮＣ＿０００００５．１０（１１０７３８１３６．．１１０７６５１６１））、及びＴＭＥＭ１２６Ａ（ＮＧ＿０１７１５７．１）を含む、視神経萎縮関連遺伝子である。
【０２４１】
常染色体劣性疾患関連遺伝子の一例は、ＡＢＣＡ４（ＮＧ＿００９０７３．１）、ＡＧＢＬ５（ＮＣ＿０００００２．１２（２７０５１４２３．．２７０７０６２２））、ＡＲＬ６（ＮＧ＿００８１１９．２）、ＡＲＬ２ＢＰ（ＮＧ＿０３３９０５．１）、ＢＢＳ１（ＮＧ＿００９０９３．１）、ＢＢＳ２（ＮＧ＿００９３１２．１）、ＢＥＳＴ１（ＮＧ＿００９０３３．１）、Ｃ２ｏｒｆ７１（ＮＧ＿０２１４２７．１）、Ｃ８ｏｒｆ３７（ＮＧ＿０３２８０４．１）、ＣＥＲＫＬ（ＮＧ＿０２１１７８．１）、ＣＬＲＮ１（ＮＧ＿００９１６８．１）、ＣＮＧＡ１（ＮＧ＿００９１９３．１）、ＣＮＧＢ１（ＮＧ＿０１６３５１．１）、ＣＲＢ１（ＮＧ＿００８４８３．２）、ＣＹＰ４Ｖ２（ＮＧ＿００７９６５．１）、ＤＨＤＤＳ（ＮＧ＿０２９７８６．１）、ＤＨＸ３８（ＮＧ＿０３４２０７．１）、ＥＭＣ１（ＮＧ＿０３２９４８．１）、ＥＹＳ（ＮＧ＿０２３４４３．２）、ＦＡＭ１６１Ａ（ＮＧ＿０２８１２５．１）、ＧＰＲ１２５（ＮＣ＿０００００４．１２（２２３８７３７４．．２２５１６０５８、補体））、ＨＧＳＮＡＴ（ＮＧ＿００９５５２．１）、ＩＤＨ３Ｂ（ＮＧ＿０１２１４９．１）、ＩＦＴ１４０ＮＧ＿０３２７８３．１）、ＩＦＴ１７２（ＮＧ＿０３４０６８．１）、ＩＭＰＧ２（ＮＧ＿０２８２８４．１）、ＫＩＡＡ１５４９（ＮＧ＿０３２９６５．１）、ＫＩＺ（ＮＧ＿０３３１２２．１）、ＬＲＡＴ（ＮＧ＿００９１１０．１）、ＭＡＫ（ＮＧ＿０３００４０．１）、ＭＥＲＴＫ（ＮＧ＿０１１６０７．１）、ＭＶＫ（ＮＧ＿００７７０２．１）、ＮＥＫ２（ＮＧ＿０２９１１２．１）、ＮＥＵＲＯＤ１（ＮＧ＿０１１８２０．１）、ＮＲ２Ｅ３（ＮＧ＿００９１１３．２）、ＮＲＬ（ＮＧ＿０１１６９７．１）、ＰＤＥ６Ａ（ＮＧ＿００９１０２．１）、ＰＤＥ６Ｂ（ＮＧ＿００９８３９．１）、ＰＤＥ６Ｇ（ＮＧ＿００９８３４．１）、ＰＯＭＧＮＴ１（ＮＧ＿００９２０５．２）、ＰＲＣＤ（ＮＧ＿０１６７０２．１）、ＰＲＯＭ１（ＮＧ＿０１１６９６．１）、ＲＢＰ３（ＮＧ＿０２９７１８．１）、ＲＧＲ（ＮＧ＿００９１０６．１）、ＲＨＯ（ＮＧ＿００９１１５．１）、ＲＬＢＰ１（ＮＧ＿００８１１６．１）、ＲＰ１（ＮＧ＿００９８４０．１）、ＲＰ１Ｌ１（ＮＧ＿０２８０３５．１）、ＲＰＥ６５（ＮＧ＿００８４７２．１）、ＳＡＧ（ＮＧ＿００９１１６．１）、ＳＬＣ７Ａ１４（ＮＧ＿０３４１２１．１）、ＳＰＡＴＡ７（ＮＧ＿０２１１８３．１）、ＴＴＣ８（ＮＧ＿００８１２６．１）、ＴＵＬＰ１（ＮＧ＿００９０７７．１）、ＵＳＨ２Ａ（ＮＧ＿００９４９７．１）、ＺＮＦ４０８（ＮＣ＿００００１１．１０（４６７００７６７．．４６７０５９１６））、及びＺＮＦ５１３（ＮＧ＿０２８２１９．１）を含む、網膜色素変性症関連遺伝子である。
【０２４２】
常染色体劣性疾患関連遺伝子の別の例は、ＡＢＣＣ６（ＮＧ＿００７５５８．２）、ＡＢＨＤ１２（ＮＧ＿０２８１１９．１）、ＡＣＢＤ５（ＮＧ＿０３２９６０．２）、ＡＤＡＭＴＳ１８（ＮＧ＿０３１８７９．１）、ＡＤＩＰＯＲ１（ＮＣ＿０００００１．１１（２０２９４０８２５．．２０２９５８５７２、補体））、ＡＨＩ１（ＮＧ＿００８６４３．１）、ＡＬＭＳ１（ＮＧ＿０１１６９０．１）、ＣＣ２Ｄ２Ａ（ＮＧ＿０１３０３５．１）、ＣＥＰ１６４（ＮＧ＿０３３０３２．１）、ＣＥＰ２９０（ＮＧ＿００８４１７．１）、ＣＬＮ３（ＮＧ＿００８６５４．２）、ＣＯＬ９Ａ１（ＮＧ＿０１１６５４．１）、ＣＳＰＰ１（ＮＧ＿０３４１００．１）、ＥＬＯＶＬ４（ＮＧ＿００９１０８．１）、ＥＸＯＳＣ２（ＮＣ＿０００００９．１２（１３０６９３７６０．．１３０７０４８９４））、ＦＬＶＣＲ１（ＮＧ＿０２８１３１．１）、ＦＬＶＣＲ１（ＮＧ＿０２８１３１．１）、ＧＮＰＴＧ（ＮＧ＿０１６９８５．１）、ＨＡＲＳ（ＮＧ＿０３２１５８．１）、ＨＧＳＮＡＴ（ＮＧ＿００９５５２．１）、ＨＭＸ１（ＮＧ＿０１３０６２．２）、ＩＦＴ１４０（ＮＧ＿０３２７８３．１）、ＩＮＰＰ５Ｅ（ＮＧ＿０１６１２６．１）、ＩＮＶＳ（ＮＧ＿００８３１６．１）、ＩＱＣＢ１（ＮＧ＿０１５８８７．１）、ＬＡＭＡ１（ＮＧ＿０３４２５１．１）、ＬＲＰ５（ＮＧ＿０１５８３５．１）、ＭＫＳ１（ＮＧ＿０１３０３２．１）、ＭＴＴＰ（ＮＧ＿０１１４６９．１）、ＮＰＨＰ１（ＮＧ＿００８２８７．１）、ＮＰＨＰ３（ＮＧ＿００８１３０．１）、ＮＰＨＰ４（ＮＧ＿０１１７２４．２）、ＯＰＡ３（ＮＧ＿０１３３３２．１）、ＰＡＮＫ２（ＮＧ＿００８１３１．３）、ＰＣＹＴ１Ａ（ＮＧ＿０４２８１７．１）、ＰＥＸ１（ＮＧ＿００８３４１．１）、ＰＥＸ２（ＮＧ＿００８３７１．１）、ＰＥＸ７（ＮＧ＿００８４６２．１）、ＰＨＹＨ（ＮＧ＿０１２８６２．１）、ＰＬＫ４（ＮＧ＿０４１８２１．１）、ＰＮＰＬＡ６（ＮＧ＿０１３３７４．１）、ＰＯＣ１Ｂ（ＮＧ＿０４１７８３．１）、ＰＲＰＳ１（ＮＧ＿００８４０７．１）、ＲＤＨ１１（ＮＧ＿０４２２８２．１）、ＲＰＧＲＩＰ１Ｌ（ＮＧ＿００８９９１．２）、ＳＤＣＣＡＧ８（ＮＧ＿０２７８１１．１）、ＳＬＣ２５Ａ４６（ＮＣ＿０００００５．１０（１１０７３８１３６．．１１０７６５１６１））、ＴＭＥＭ２３７（ＮＧ＿０３２０４９．１）、ＴＲＮＴ１（ＮＧ＿０４１８００．１）、ＴＴＰＡ（ＮＧ＿０１６１２３．１）、ＴＵＢ（ＮＧ＿０２９９１２．１）、ＴＵＢＧＣＰ４（ＮＧ＿０４２１６８．１）、ＴＵＢＧＣＰ６（ＮＧ＿０３２１６０．１）、ＷＤＰＣＰ（ＮＧ＿０２８１４４．１）、ＷＤＲ１９（ＮＧ＿０３１８１３．１）、ＷＦＳ１（ＮＧ＿０１１７００．１）、及びＺＮＦ４２３（ＮＧ＿０３２９７２．２）を含む、網膜症を伴う症候群／全身疾患関連遺伝子である。
【０２４３】
常染色体劣性疾患関連遺伝子の１種は、ＡＢＨＤ１２（ＮＧ＿０２８１１９．１）、ＣＤＨ２３（ＮＧ＿００８８３５．１）、ＣＥＰ２５０（ＮＣ＿００００２０．１１（３５４５５１３９．．３５５１７５３１））、ＣＩＢ２（ＮＧ＿０３３００６．１）、ＣＬＲＮ１（ＮＧ＿００９１６８．１）、ＤＦＮＢ３１（ＮＧ＿０１６７００．１）、ＧＰＲ９８（ＮＧ＿００７０８３．１）、ＨＡＲＳ（ＮＧ＿０３２１５８．１）、ＭＹＯ７Ａ（ＮＧ＿００９０８６．１）、ＰＣＤＨ１５（ＮＧ＿００９１９１．２）、ＵＳＨ１Ｃ（ＮＧ＿０１１８８３．１）、ＵＳＨ１Ｇ（ＮＧ＿００７８８２．１）、及びＵＳＨ２Ａ（ＮＧ＿００９４９７．１）を含む、アッシャー症候群関連遺伝子である。
【０２４４】
常染色体劣性疾患関連遺伝子の別の種は、ＢＥＳＴ１（ＮＧ＿００９０３３．１）、Ｃ１２ｏｒｆ６５（ＮＧ＿０２７５１７．１）、ＣＤＨ３（ＮＧ＿００９０９６．１）、ＣＮＧＡ３ＮＧ＿００９０９７．１）、ＣＮＧＢ３（ＮＧ＿０１６９８０．１）、ＣＮＮＭ４（ＮＧ＿０１６６０８．１）、ＣＹＰ４Ｖ２（ＮＧ＿００７９６５．１）、ＬＲＰ５（ＮＧ＿０１５８３５．１）、ＭＦＲＰ（ＮＧ＿０１２２３５．１）、ＭＶＫ（ＮＧ＿００７７０２．１）、ＮＢＡＳ（ＮＧ＿０３２９６４．１）、ＮＲ２Ｅ３（ＮＧ＿００９１１３．２）、ＯＡＴ（ＮＧ＿００８８６１．１）、ＰＬＡ２Ｇ５（ＮＧ＿０３２０４５．１）、ＰＲＯＭ１（ＮＧ＿０１１６９６．１）、ＲＢＰ４（ＮＧ＿００９１０４．１）、ＲＧＳ９（ＮＧ＿０１３０２１．１）、ＲＧＳ９ＢＰ（ＮＧ＿０１６７５１．１）、及びＲＬＢＰ１（ＮＧ＿００８１１６．１）を含む、網膜症関連遺伝子である。
【０２４５】
常染色体劣性疾患関連遺伝子のさらに別の種は、ＡＢＣＡ４（ＮＧ＿００９０７３．１）、ＣＦＨ（ＮＧ＿００７２５９．１）、ＤＲＡＭ２（ＮＣ＿０００００１．１１（１１１１１７３３２．．１１１１４０２１６、補体））、ＩＭＰＧ１（ＮＧ＿０４１８１２．１）、及びＭＦＳＤ８（ＮＧ＿００８６５７．１）を含む、黄斑変性症関連遺伝子である。
【０２４６】
常染色体優性及び劣性疾患の予防、修正、又は治療に使用されることに加えて、本開示の方法は、いずれのＸ連鎖疾患をも予防、修正、又は治療するのに使用できる。そのため、常染色体優性疾患及び常染色体優性遺伝子又は断片に適用できる本明細書に記載の全ての方法は、Ｘ連鎖疾患の治療に使用するために採用できる。
【０２４７】
さらに、本開示の方法は、Ｘ連鎖変異の存在により生じる眼疾患を予防、修正、又は治療するために使用できる。そのような疾患の例は、Ｘ連鎖錐体又は錐体杆体ジストロフィー、Ｘ連鎖先天性停止性夜盲失明、Ｘ連鎖黄斑変性症、Ｘ連鎖網膜色素変性症、Ｘ連鎖網膜症症候群／全身疾患、Ｘ連鎖視神経萎縮、及びＸ連鎖網膜症を含む。本明細書に記載の方法によれば、Ｘ連鎖疾患関連遺伝子を修正し、野生型遺伝子の機能を部分的又は完全に回復させることができる。
【０２４８】
Ｘ連鎖疾患関連遺伝子の一例は、ＣＡＣＮＡ１Ｆ（ＮＧ＿００９０９５．２）及びＲＰＧＲ（ＮＧ＿００９５５３．１）を含む、錐体又は錐体杆体ジストロフィー関連遺伝子である。
【０２４９】
Ｘ連鎖疾患関連遺伝子の別の例は、ＣＡＣＮＡ１Ｆ（ＮＧ＿００９０９５．２）及びＮＹＸ（ＮＧ＿００９１１２．１）を含む、先天性停止性夜盲関連遺伝子である。
【０２５０】
一実施形態では、Ｘ連鎖疾患関連遺伝子は、ＲＰＧＲ（ＮＧ＿００９５５３．１）などの、黄斑変性症関連遺伝子である。
【０２５１】
別の実施形態では、Ｘ連鎖疾患関連遺伝子は、ＴＩＭＭ８Ａ（ＮＧ＿０１１７３４．１）などの、視神経萎縮関連遺伝子である。
【０２５２】
Ｘ連鎖疾患関連遺伝子の１種は、ＯＦＤ１（ＮＧ＿００８８７２．１）、ＲＰ２（ＮＧ＿００９１０７．１）、及びＲＰＧＲ（ＮＧ＿００９５５３．１）を含む、網膜色素変性症関連遺伝子である。
【０２５３】
Ｘ連鎖疾患関連遺伝子の別の種は、ＯＦＤ１（ＮＧ＿００８８７２．１）及びＴＩＭＭ８Ａ（ＮＧ＿０１１７３４．１）を含む、網膜症を伴う症候性／全身性疾患関連遺伝子である。
【０２５４】
Ｘ連鎖疾患関連遺伝子のさらに別の例は、ＣＡＣＮＡ１Ｆ（ＮＧ＿００９０９５．２）、ＣＨＭ（ＮＧ＿００９８７４．２）、ＤＭＤ（ＮＧ＿０１２２３２．１）、ＮＤＰ（ＮＧ＿００９８３２．１）、ＯＰＮ１ＬＷ（ＮＧ＿００９１０５．２）、ＯＰＮ１ＭＷ（ＮＧ＿０１１６０６．１）、ＰＧＫ１（ＮＧ＿００８８６２．１）、及びＲＳ１（ＮＧ＿００８６５９．３）を含む、網膜症関連遺伝子である。
【０２５５】
疾患関連遺伝子はＨＴＲＡ１であり得る。
【０２５６】
別の実施形態では、本開示の方法は、ミトコンドリアＤＮＡ中の変異の存在により生じる疾患を予防、修正、又は治療するために使用できる。そのような疾患は、ミトコンドリアＤＮＡ中の遺伝子変異によって引き起こされる網膜症を含み得る。網膜症の発症を引き起こす、ミトコンドリアＤＮＡ中の変異によって特徴付けられ得る遺伝子の例は、ＭＴ−ＡＴＰ６（ＮＣ＿０１２９２０．１（８５２７．．９２０７））、ＭＴ−ＴＨ（ＮＣ＿０１２９２０．１（１２１３８．．１２２０６））、ＭＴ−ＴＬ１（ＮＣ＿０１２９２０．１（３２３０．．３３０４）），ＭＴ−ＴＰ（ＮＣ＿０１２９２０．１（１５９５６．．１６０２３、補体）、及びＭＴ−ＴＳ２（ＮＣ＿０１２９２０．１（１２２０７．．１２２６５））を含む。
【０２５７】
表１は、本開示の方法を用いて治療及び／又は修正できる疾患並びに疾患関連遺伝子（対応する登録番号を伴う）の例示的なリストを提供する。
表１：疾患関連障害及び遺伝子
【表１】
2021519067.tif 000003
2021519067.tif 000004
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【０２５８】
本開示の方法は、腫瘍抑制遺伝子内の変異の存在により生じる癌を予防、修正、又は治療するためにも使用できる。腫瘍抑制遺伝子の例は、網膜芽腫感受性遺伝子（ＲＢ）遺伝子、ｐ５３遺伝子、欠失した大腸癌（ＤＣＣ）遺伝子、腺腫様多発結腸ポリープ（ＡＰＣ）遺伝子、ｐ１６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＳＨ２、及び神経線維腫症１型（ＮＦ−１）腫瘍抑制遺伝子（（Ｌｅｅら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ．２０１０  Ｏｃｔ；２（１０））を含む。
【０２５９】
腫瘍抑制遺伝子は、それらの野生型対立遺伝子において、異常な細胞増殖を抑制するタンパク質を発現する遺伝子である。腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子が変異又は欠失される場合、生じる変異タンパク質又は腫瘍抑制タンパク質発現の完全な欠如は、細胞増殖を正確に調節できず、特に細胞調節機構に対し既に損傷が存在する場合に、異常な細胞増殖が起こり得る。いくつかの十分に研究されたヒト腫瘍及び腫瘍細胞株は、欠損又は非機能性腫瘍抑制遺伝子を有することが示されている。そのため、腫瘍抑制遺伝子の機能の喪失又は不活化は、かなり数のヒト癌の開始及び／又は進行において中心的な役割を果たし得る。
【０２６０】
本開示の方法は、疾患の異なる段階（例えば、初期、中期又は後期）で患者を治療するために使用してよい。本方法は、患者を１回又は複数回治療するために使用してよい。そのため、治療の長さは変化し得、複数の治療を含んでよい。
【０２６１】
本開示で議論されるように、本発明の方法又は本開示は、対象における常染色体優性眼疾患を修正又は治療するために使用できる。
【０２６２】
例えば、「Ｃｈｏｐ」工程は、修正すべき常染色体優性眼疾患関連遺伝子の変異型コピー、及び／又は常染色体優性眼疾患に罹患した患者における同じ遺伝子の内在性野生型コピーの両方の欠失を含む。そのため、「Ｃｈｏｐ」工程は、遺伝子の変異型及び／又は野生型活性の両方の完全な又は部分的な喪失をもたらす。次いで、常染色体優性眼疾患関連遺伝子は、「Ｓｔｉｃｋ」工程を用いて修正され、それは、改変された常染色体優性眼疾患関連遺伝子又は断片をコードする配列の導入を含む。改変された常染色体優性眼疾患関連遺伝子配列は、遺伝子の野生型又は変異型（遺伝子の非コドン改変型）を標的にするｓｇＲＮＡによって認識されない（認識不能である）ように改変できる。この改変は、コドン改変ドナー鋳型を、Ｃａｓファミリーヌクレアーゼに対して耐性にさせる。
【０２６３】
ベクター
本発明のシステムは、１以上の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれより多いＡＡＶベクター）を用いて、対象又は細胞に送達できる。１以上のｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）を、単一（１つ）の組換えＡＡＶベクター中にパッケージングできる。組換えＡＡＶベクターはまた、コドン改変された常染色体優性眼疾患関連遺伝子配列（ドナー鋳型）を含み得る。Ｃａｓファミリーヌクレアーゼを、同じ或いは別々の組換えＡＡＶベクター中にパッケージングできる。
【０２６４】
本明細書に記載の方法は、対象における常染色体優性眼疾患を修正することも提供し、本発明のシステムをコードする組換えＡＡＶウイルスの治療有効量を注射により上記対象に投与することを含む。
【０２６５】
ＡＡＶの運搬能力が負担を課す可能性があるので、２以上のＡＡＶベクターを同時に使用してもよい。例えば、Ｃａｓファミリーヌクレアーゼは、異なるＡＡＶベクターにパッケージングされてよい。さらに、ｓｇＲＮＡ（複数可）、（コドン改変された常染色体優性疾患関連遺伝子又は断片）及びＣａｓファミリーヌクレアーゼをコードする配列をそれぞれ、別々のＡＡＶベクターにパッケージングできる。
【０２６６】
ＲＰ治療の場合、本開示の方法は、（１）ＣＲＩＳＰＲシステムポリヌクレオチド配列を含む核酸配列をコードする組換えＡＡＶウイルスであって、ポリヌクレオチド配列が、（ｉ）変異型及び野生型ＲＨＯ配列にハイブリダイズする２つのガイドＲＮＡ配列、（ｉｉ）コドン改変されたＲＨＯ遺伝子又は断片をコードする第２の配列、を含み、内因性ＲＨＯ遺伝子の変異（複数可）は修正されておりかつ改変されたＲＨＯ遺伝子又は断片は、変異型及び野生型のＲＨＯ遺伝子配列にハイブリダイズする１以上のｓｇＲＮＡ配列によって認識され得ない、組換えＡＡＶウイルス；並びに（２）Ｃａｓファミリー酵素をコードする第２の組換えＡＡＶウイルス、の治療有効量を注射により対象に投与することを含み得る。
【０２６７】
一般に、眼の細胞でのＣａｓファミリー酵素及び常染色体優性疾患関連遺伝子特異的ｇＲＮＡの共発現は、常染色体優性疾患関連遺伝子の切断をもたらし、それにより、疾患原因変異型対立遺伝子（及び／又は野生型（ｗｔ）対立遺伝子）の発現を防止し得る。
【０２６８】
常染色体優性疾患関連遺伝子のコドン改変されたｃＤＮＡは、眼の細胞に供給されても、されなくてもよい。常染色体優性疾患関連遺伝子のコード配列は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに耐性を示すように改変されても、されなくてもよい。この戦略は、常染色体優性疾患関連遺伝子の発現をもたらし、内因性遺伝子（複数可）又は断片の欠失後に、常染色体優性疾患関連遺伝子若しくは断片の機能を回復又は修正できる。
【０２６９】
コドン改変されたｃＤＮＡ（ドナー鋳型）は、それが変異型及びｗｔの疾患関連対立遺伝子（複数可）／遺伝子（複数可）のいずれかを標的にするために使用されるｇＲＮＡ（複数可）によって認識されないように改変されてよい。そのため、変異は、このドナー鋳型遺伝子又は断片がｇＲＮＡ（複数可）によって認識され、その結果細胞に導入されているＣａｓ酵素（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）によって分解されるのを回避するために、このドナー鋳型遺伝子又は断片中に導入される必要がある。これは、ドナー鋳型中に揺らぎ塩基を導入することにより達成でき、そのため、ＤＮＡでの変化がサイレント変異をもたらすことを確実にし、ｗｔ遺伝子の発現産物を無傷のままにする。本開示において使用される用語「揺らぎ塩基」は、参照ヌクレオチド配列の１以上のヌクレオチド塩基の変化を指し、その変化は、参照配列に対して、ヌクレオチドがコードするアミノ酸の配列を変化させない。
【０２７０】
ドナー鋳型中に導入される必要がある揺らぎ塩基の数は、約１〜３０、約１〜２０、約２〜１９、約３〜１８、約４〜１７、約５〜１６、約６〜１５、約７〜１４、約８〜１３、約９〜１２、約１０〜１１の範囲、約９、約８、約７、約６、又は約５であり得る。さらに、ｇＲＮＡのインシリコ予測モデル化に利用可能な多くのソフトウェアアプリケーションが与えられると、コドン改変されたドナー鋳型がｓｇＲＮＡにより認識されるかどうかを試験するためにインシリコ分析を行うことができる。公に利用可能なＣＲＩＳＰＲ  ｓｇＲＮＡツールの例は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｇＲＮＡ−ｄｅｓｉｇｎ−ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ：ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ  Ａｐｒｉｌ  ３０，２０１６に見出すことができる。
【０２７１】
或いは、本方法が、遺伝子又は断片（例えば、変異型対立遺伝子）の変異型のみを除去、破壊、又は切断し、野生型（例えば、野生型対立遺伝子）が無傷のままで残すならば、細胞若しくは患者に補充されるドナー鋳型又は野生型遺伝子配列は、コドン改変されなくてもよい。そのような状況下では、ＣＲＩＳＰＲ構成要素の一部として使用されるｇＲＮＡ（複数可）は、疾患関連遺伝子の変異型のみを認識及び標的にする（かつ上記遺伝子の野生型を認識及び標的にしない）ように設計される。
【０２７２】
本開示の方法は、ＰＤＥ６Ａ、ＥＦＥＭＰ１、マウスロドプシン（ＲＨＯ）、及びヒトＲＨＯ遺伝子を含む、様々な遺伝子に適用されてきた。ＲＰは、ＰＤＥ６Ａ遺伝子中の常染色体劣性変異、又はＲＨＯ遺伝子中の常染色体優性変異によって引き起こされ得る。ＥＦＥＭＰ１中の変異は、常染色体優性マラティアレベンティネス（Ｍａｌａｔｔｉａ  Ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ（ＭＬ））及びドイン蜂巣状網膜ジストロフィー（ＤＨＲＤ）に関与する。さらに、本方法は、マウス網膜細胞及びヒトｉＰＳ細胞を含むがこれらに限定されない、様々な細胞型に適用されてきた。さらに、本明細書に記載の方法は、眼疾患のマウスモデルを使用してインビボでも適用されている。そのため、本開示の方法は、動物とヒトの両方の対象に適用できる。
【０２７３】
さらに、設計されたｓｇＲＮＡの効率並びに有効性及びヒト細胞での部位特異的組換え頻度を決定するのを可能にする、特定遺伝子ヒト化マウスモデル並びに患者由来細胞に適用されてきた本開示の方法は、次に、臨床設定におけるガイドとして使用できる。
【０２７４】
一実施形態では、「ＣｈｏｐＳｔｉｃｋ」システムは、以下の構成要素：２つの組換えＡＡＶベクター：変異型及び／又は天然のロドプシン遺伝子を「切断する（Ｃｈｏｐ）」ためのＣａｓ９酵素をコードするポリヌクレオチドを保有する第１のベクター、及び患者に戻す正常なロドプシンを「接着させる（Ｓｔｉｃｋ）」ためのコドン改変されたヒトロドプシンｃＤＮＡをコードするヌクレオチドを保有する第２のベクター、を含む。ＣＢｈプロモーターによって駆動される、コドン改変又は遺伝子操作されたヒトロドプシン配列は、遺伝子編集酵素による破壊に対して耐性を示し、患者の表現型を回復させる。
【０２７５】
一実施形態では、本発明の方法は、ＣＢｈプロモーターに駆動されるコドン改変ＲＨＯのｃＤＮＡから少なくとも５０％のロドプシンレベルを提供し、それは生存を改善するのに十分である。別の実施形態では、コドン改変されたＲＨＯドナー配列を用いて発現される過剰な量のロドプシンはしない。
【０２７６】
ヒト及び患者由来の細胞を用いる研究のために、ＡＡＶ２ベクターを、それがヒトｉＰＳを効率的に形質導入し得ることが示されているので、全ての構築物用の骨格ベクターとして使用し得る（Ｍｉｔｓｕｉ  Ｋら．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００９  Ｏｃｔ  ３０；３８８（４）：７１１−７；Ｄｅｙｌｅ  ＤＲら．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１２  Ｊａｎ；２０（１）：２０４−１３；及びＤｅｙｌｅ  ＤＲら．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１４  Ｍａｒ；４２（５）：３１１９−２４）。しかしながら、本開示の方法を実施するために、様々な他のＡＡＶベクターを使用してもよい。
【０２７７】
本発明の方法による常染色体優性疾患の改善の程度は、変化し得る。例えば、本発明の方法は、年齢及び性別が一致し得る、対照の対象での遺伝子産物の正常レベルの、常染色体優性疾患関連遺伝子発現の約２０％、約３０％、約４０％、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、又は９０％超を回復させ得る。
【０２７８】
特定の実施形態では、野生型遺伝子（例えば、ロドプシン）の発現は、対象及び／又は細胞への投与後約２週間で観察できる。発現は、非分裂性体細胞（例えば、光受容体、ニューロン細胞、筋細胞など）において無制限の期間維持され得る。一実施形態では、野生型ロドプシンの発現は、約３日、約１週間、約３週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約１週間〜約２週間、又は異なる時間枠内で観察される。
【０２７９】
本開示の様々な実施形態によれば、様々な既知のウイルス構築物を使用して、本システム（Ｃａｓファミリーヌクレアーゼ、ｓｇＲＮＡ（複数可）、コドン改変野生型遺伝子（コドン改変ドナー鋳型とも呼ばれる）、ドナー鋳型など）を標的細胞及び／又は対象に送達され得る。そのような組換えウイルスの非限定的な例は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、組換えポックスウイルス、及び当技術分野における他の公知のウイルス、並びにプラスミド、コスミド及びファージを含む。遺伝子送達ウイルス構築物の選択肢は周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．ら，２００１  Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃ．７（１）：３３−４０；並びにＷａｌｔｈｅｒ  Ｗ．及びＳｔｅｉｎ  Ｕ．，２０００  Ｄｒｕｇｓ，６０（２）：２４９−７１を参照されたい）。
【０２８０】
さらに、ナノ粒子及び脂質ベースのｍＲＮＡ又はタンパク質送達システムなどの送達ビヒクルを、ＡＡＶベクターの代替物として使用できる。代替的な送達ビヒクルのさらなる例は、レンチウイルスベクター、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体、脂質ベース送達システム、遺伝子銃、水力学的、エレクトロポレーション又はヌクレオフェクションマイクロインジェクション、及び生微粒子銃を含む。様々な遺伝子送達方法は、Ｎａｙｅｒｏｓｓａｄａｔら（Ａｄｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ．２０１２；１：２７）及びＩｂｒａｈｅｅｍら（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．２０１４  Ｊａｎ  １；４５９（１−２）：７０−８３）によって詳細に記載されている。
【０２８１】
本発明の方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介ゲノム操作を利用してよい。ＡＡＶベクターは、広い宿主範囲を有し、インビトロ及びインビボで分裂細胞と非分裂細胞の両方を形質導入し、形質導入された遺伝子の高レベルの発現を維持する。ウイルス粒子は、熱安定性であり、溶媒、界面活性剤、ｐＨの変化、温度に耐性を示し、かつＣｓＣｌ勾配で濃縮できる。ＡＡＶはいかなる病原性事象にも関連付けられておらず、ＡＡＶベクターによる形質導入は、細胞の増殖又は分化に持続的な負の作用を誘導するとは見出されていない。レンチウイルスベクターなどの他のベクターとは対照的に、ＡＡＶは組換え機構を欠き、臨床使用について承認されている（Ｗｉｒｔｈら．Ｇｅｎｅ．２０１３  Ａｕｇ  １０；５２５（２）：１６２−９）。
【０２８２】
一本鎖ＤＮＡのＡＡＶウイルスベクターは、多くの異なる種類の細胞及び組織において高い形質導入速度を有する。宿主細胞に入ると、ＡＡＶゲノムは宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体により二本鎖ＤＮＡに変換され、エピソームとして存在する。非分裂性宿主細胞において、エピソームＡＡＶゲノムは、治療用導入遺伝子の長期発現を持続させ、維持できる（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００８  Ａｕｇ；８２（１６）：７８７５〜７８８５）。
【０２８３】
本開示のＡＡＶベクター及びウイルス粒子は、様々な方法及び用途において使用され得る。一実施形態では、方法は、異種ポリヌクレオチド配列を患者若しくは患者由来の細胞に送達又は導入することを包含し、ウイルスＡＡＶ粒子、複数のＡＡＶウイルス粒子、又はＡＡＶウイルス粒子若しくは複数のＡＡＶウイルス粒子の医薬組成物を患者又は患者の細胞に投与することを含み、それにより、異種ポリヌクレオチド配列を患者若しくは患者の細胞中に送達又は導入する。
【０２８４】
別の実施形態では、本方法は、タンパク質発現若しくは機能が欠損しているか若しくは必要であるか、又は内因性タンパク質（例えば、望ましくない、異常な又は機能不全のタンパク質）の発現若しくは機能の低下を必要とする患者を治療するためのものであり、組換えＡＡＶウイルス粒子、複数の組換えＡＡＶウイルス粒子、又は組換えＡＡＶウイルス粒子又は複数のＡＡＶウイルス粒子の医薬組成物を提供することを含み、かつ組換えＡＡＶウイルス粒子、複数の組換えＡＡＶウイルス粒子、又はＡＡＶウイルス粒子又は複数のＡＶウイルス粒子の医薬組成物を患者に投与することを含み、異種ポリヌクレオチド配列が患者において発現するか、又は異種ポリヌクレオチド配列が、患者において内因性ＤＮＡセグメント（例えば、望ましくない、異常な、又は機能不全のＤＮＡセグメント）を低下させるか又は除去する１以上のｓｇＲＮＡ（複数可）をコードして、異種ポリヌクレオチド配列が、内因性ＤＮＡセグメントを低下及び／又は除去するために使用される１以上のｓｇＲＮＡ（複数可）によって認識できないコドン改変遺伝子又はその断片をコードする。
【０２８５】
新規ＡＡＶ血清型の特徴付けは、それらが多様な組織において形質導入の異なるパターンを有することを明らかにした。ＡＡＶウイルスベクターは、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０又は他の既知及び未知のＡＡＶ血清型を含む、任意のＡＡＶ血清型の中から選択され得る。特定の実施形態では、ＡＡＶ２及び／又はＡＡＶ８が使用される。
【０２８６】
ＡＡＶという用語は、別のものが必要とされる場合を除き、全てのサブタイプ、血清型及びシュードタイプ、並びに天然型と組換え型の両方を包含する。シュードタイプのＡＡＶは、１つの血清型からのキャプシドタンパク質及び第２の血清型のウイルスゲノムを含有するＡＡＶを指す。
【０２８７】
Ｃａｓ９発現及び潜在的なオフターゲッティング効果の強度並びに持続時間を最小化するために、自己切除ＡＡＶ−Ｃａｓ９ベクターも作製されており、これは、Ｃａｓ９生成の直後にＣａｓ９発現を自己不活性化する能力を有する。この手法は、Ｃａｓ９遺伝子を２つのｓｇＲＮＡ−Ｙ１標的部位と（ＣｒｅリコンビナーゼシステムにおけるｌｏｘＰ部位と同様に）隣接させて、Ｃａｓ９自体の発現を終了させることを含む（図９に示すように）。存在するＣａｓ９酵素の量（それ自体の発現を終了する前）は、所望の遺伝子座（例えば、Ｒｈｏ又はＰＤＥ６Ａ遺伝子座など）を切断するのにまだ十分であることが予想される。自己不活性化組換えＡＡＶベクター（図９参照）の設計は、本発明者らが、標的細胞内のＣａｓ９発現の量及び持続時間を制御することを可能にし、Ｃａｓ９タンパク質の過剰発現による望まれないオフターゲット効果を防止できる。
【０２８８】
本開示のベクターは、当技術分野において知られている多数のプロモーターのいずれを含んでもよく、プロモーターは、構成的、調節可能又は誘導性、細胞型特異的、組織特異的、又は種特異的である。転写を指示するのに十分な配列に加えて、本発明のプロモーター配列はまた、転写を調節する際に関与する他の調節要素の配列も含んでよい（例えば、エンハンサー、ｋｏｚａｋ配列及びイントロン）。遺伝子の構成的発現を促進するのに有用な多くのプロモーター／調節配列は、当技術分野において利用可能であり、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルスプロモーター）、ＥＦ１ａ（ヒト伸長因子１αプロモーター）、ＳＶ４０（サル空胞化ウイルス４０プロモーター）、ＰＧＫ（哺乳動物ホスホグリセレートキナーゼプロモーター）、Ｕｂｃ（ヒトユビキチンＣプロモーター）、ヒトβ−アクチンプロモーター、齧歯類β−アクチンプロモーター、ＣＢｈ（ニワトリβ−アクチンプロモーター）、ＣＡＧ（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター及びウサギβ−グロビンスプライスアクセプターを含有するハイブリッドプロモーター）、ＴＲＥ（テトラサイクリン応答エレメントプロモーター）、Ｈ１（ヒトポリメラーゼＩＩＩＲＮＡプロモーター）、Ｕ６（ヒトＵ６核内低分子プロモーター）などを含むが、これらに限定されない。さらに、ＲＮＡ、膜貫通タンパク質、又は他のタンパク質の誘導性の及び組織特異的な発現は、誘導性又は組織特異的プロモーター／調節配列の制御下にそのような分子をコードする核酸を配置することによって達成できる。この目的に有用な組織特異的又は誘導性プロモーター／調節配列の例は、ロドプシンプロモーター、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ誘導性プロモーター、ＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーター、シナプシン１プロモーター、ＥＴ肝細胞プロモーター、ＧＳグルタミンシンターゼプロモーター及び多くの他のものを含むが、これらに限定されない。様々な商業的に入手可能なユビキタスプロモーター及び組織特異的プロモーターは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｍ−ａ−ｌｉｓｔで見つけることができる。加えて、当技術分野で周知のプロモーターは、金属、グルココルチコイド、テトラサイクリン、及びホルモンなどの誘導剤に応答して誘導でき、本発明と共に使用することも企図される。そのため、本開示は、それに作動可能に連結された所望のタンパク質の発現を促進できる、当技術分野で公知の任意のプロモーター／調節配列の使用を含むことが理解されるであろう。
【０２８９】
本開示によるベクターは、多種多様な宿主細胞中に形質転換、トランスフェクト又は他の方法で導入できる。トランスフェクションは、コーディング配列が実際に発現しているか否かにかかわらず、宿主細胞によるベクターの取り込みを指す。多くのトランスフェクション方法は、当業者に公知であり、例えば、リポフェクタミン、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン処理、マイクロインジェクション、ウイルス感染、及び当技術分野で公知の他の方法である。形質導入は、ウイルスを細胞に導入すること、及びウイルスベクターゲノムによって送達される配列の発現（例えば、転写及び／又は翻訳）を指す。組換えベクターの場合、「形質導入」は、一般に、組換えウイルスベクターの細胞中への侵入、及びベクターゲノムにより送達される目的の核酸の発現を指す。
【０２９０】
患者における常染色体優性眼疾患の治療方法は、本明細書に記載の組換えＡＡＶ及び医薬として許容される担体のいずれかを含む有効濃度の組成物を患者に投与することを含み得る。一実施形態では、ウイルスの有効濃度は、１×１０６〜１１×１０１３ＧＣ／ｍｌ（ゲノムコピー／ｍｌ）である。治療に有効なウイルス濃度の範囲は、特定の変異、患者の年齢、及び他の臨床パラメータを含むが、これらに限定されない要因に応じて変化し得る。
【０２９１】
組換えＡＡＶベクター（複数可）は、患者への投与前にインビトロで生成できる。組換えＡＡＶベクターの生成及びインビトロ投与及びインビボ投与でのそれらの使用は、Ｇｒａｙら（Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１１  Ｏｃｔ，Ｃｈａｐｔｅｒ：Ｕｎｉｔ  ４．１７）によって詳細に論じられている。
【０２９２】
所望の組換えＤＮＡを含有する組換えＡＡＶは、網膜下又は硝子体内注射を意図する医薬組成物に製剤化できる。そのような製剤は、医薬として及び／若しくは生理学的に許容されるビヒクル又は担体、特に、例えば、適切な生理的レベルでｐＨを維持するための緩衝生理食塩水又は他の緩衝剤、例えば、ＨＥＰＥＳなどの網膜下注射による眼への投与に適するもの、及び必要に応じて、他の薬剤、医薬剤、安定化剤、緩衝剤、担体、アジュバント、希釈剤などの使用を含む。注射のために、担体は典型的には、液体である。生理的に許容される担体の例は、無菌で発熱物質を含まない水、及び無菌で発熱物質を含まないリン酸塩緩衝生理食塩水を含む。
【０２９３】
一実施形態では、担体は等張塩化ナトリウム溶液である。別の実施形態では、担体は平衡塩溶液である。一実施形態では、担体はｔｗｅｅｎを含む。ウイルスが長期保存される場合、それはグリセロール又はＴｗｅｅｎ−２０の存在下で凍結されてよい。
【０２９４】
別の実施形態では、医薬として許容される担体は、ペルフルオロオクタン（ペルフルオロン液体）などの界面活性剤を含む。特定の実施形態では、上記医薬組成物は、網膜下注射により対象に投与される。他の実施形態では、医薬組成物は硝子体内注射によって投与される。本明細書に記載の方法に有用であり得る他の投与形態は、所望の器官（例えば、眼）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、気管内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与経路を含むが、これらに限定されない。さらに、必要に応じて、投与経路を組み合わせてもよい。
【０２９５】
特定の実施形態では、投与経路は、網膜下注射又は硝子体内注射である。
【０２９６】
実施例
Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ
Ｓｕｒｖｅｙｏｒ変異検出アッセイは、ＤＮＡ混合物中の変異及び多型を検出するための簡便かつ堅固な方法を提供する。キットの重要な構成要素は、セロリ由来のミスマッチ特異的ヌクレアーゼのＣＥＬファミリーのメンバーである、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼである。Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼは、一塩基多型（ＳＮＰ）又は小さな挿入若しくは欠失の存在によるミスマッチを認識し、切断する。
【０２９７】
Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼは、全ての塩基置換及び最大で少なくとも１２個のヌクレオチドの挿入／欠失を含む、両方のＤＮＡ鎖中で任意のミスマッチ部位の３’側で、高い特異性で切断する。Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼ技術は４つの段階：（ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ媒介性切断を受けた細胞又は組織試料由来の標的ＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ；（ｉｉ）影響を受けたＤＮＡと影響を受けないＤＮＡの間でヘテロ二本鎖を形成するためのハイブリダイゼーション（影響を受けたＤＮＡ配列は、ミスマッチに起因する影響を受けた膨出構造とは異なり、変性及び再構築の後に形成し得るので）；（ｉｉｉ）ヘテロ二本鎖を切断する（すなわち、膨出を切断する）ためのアニーリングしたＤＮＡのＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼによる処理；及び（ｉｖ）例えば、アガロースゲル電気泳動などの選択した検出／分離プラットフォームを使用する、消化したＤＮＡ生成物の分析、を含む。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ媒介性切断効率は、未消化ＤＮＡに対するＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼ消化ＤＮＡの比率により推定できる。本技術は高感度であり、３２コピー中１コピー程度の低さで存在する稀な変異型を検出できる。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ変異アッセイキットは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）、Ｃｏｒａｖｉｖｉｌｌｅ、ＩＡから市販されている。
【０２９８】
ＲＦＬＰ分析
制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析は、当業者に周知の技術である。ＲＦＬＰは、相同ＤＮＡ配列における変化を利用する。ＲＦＬＰを検出するための基本的な技術は、制限酵素によってＤＮＡの試料を断片化することを含み、制限酵素は、制限消化として知られるプロセスにおいて、特異的な短い配列が存在する場所のどこででも、ＤＮＡを認識し切断できる。次いで、得られたＤＮＡ断片を、分析用のアガロースゲル電気泳動で長さにより分離する。ドナー鋳型置換（遺伝子修正としても知られる）の検出のために、１つ又は複数の種類のさらなる制限酵素部位が、全体的な長さに影響を与えることなく、コドン改変によりドナー鋳型中に導入される。ＰＣＲを用いて組織試料から標的ＤＮＡ配列を増幅した後に、遺伝子修正された試料を検出するために、ＰＣＲアンプリコンを前述の制限酵素（複数可）により評価できる。
【０２９９】
本発明を実施するための特定の態様の以下の例は、例示のためにのみ提供され、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０３００】
実施例１．ＣｈｏｐＳｔｉｃｋ  ＡＡＶ遺伝子療法戦略の評価
本実施例は、ＣｈｏｐＳｔｉｃｋ  ＡＡＶ遺伝子療法の戦略を概説する。ＣｈｏｐＳｔｉｃｋ戦略は、本明細書ではＣＲＩＳＰＲ２．０とも呼ばれる。この手法は、破壊のために、ロドプシンの変異型と野生型の両方を標的にする１以上の特有の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を有する遺伝子編集酵素を使用することに基づく。次いで、この初期段階に続いて、野生型のコドン改変されたロドプシンｃＤＮＡを細胞に供給する。このシステムの重要な利点は、コドン改変されたロドプシンｃＤＮＡがｓｇＲＮＡ（複数可）によって認識されず、そのため、ヌクレアーゼによる切断に対して耐性を示すことである。
【０３０１】
図１に示すように、本明細書に記載の「ＣｈｏｐＳｔｉｃｋ」システムは、２つの組換えＡＡＶベクター（図１Ａ）中にパッケージングされる。第１のベクターは、変異型と天然のロドプシン遺伝子を「切断する（Ｃｈｏｐ）」ことができるＣａｓ９酵素をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１７）を保有するが、第２のベクターは、正常なロドプシンを患者に戻して「接着させる（Ｓｔｉｃｋ）」ためのコドン改変されたヒトロドプシンをコードするポリヌクレオチドを含有する。コドン改変操作されたヒトロドプシン配列は、本実施例ではＣＢｈプロモーター（配列番号１０）によって促進され、遺伝子編集酵素（この例ではＣａｓ９）による破壊に対して耐性を示し、患者の表現型の救助を可能にする。コドン改変操作されたヒトロドプシン配列を保有することに加えて、第２のベクターは、ＤＮＡ二本鎖切断を導入するための標的部位を定義するためのガイドとして作用する２つの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１及びｓｇＲＮＡ２）を保有し、そのため、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを導くためのホーミングデバイスとして作用する。組換えＡＡＶベクターの各対は、ロドプシン遺伝子を標的にするために使用できる。コドン改変配列は、図１Ｂの節ＩＩに示されている。各ｓｇＲＮＡ標的部位は、下線を引いた４つのミスマッチを含む。
【０３０２】
ＡＡＶは、４．５〜４．９ｋｂのパッケージング能力を有する。ｓｐＣａｓ９のコード配列は約４．２ｋｂであり、ＡＡＶの２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）は約０．３ｋｂであるので、プロモーター及びポリアデニン終結シグナルのために約０．４ｋｂの領域が存在する。本開示の発明者らは、１７３ｂｐの短いＣＭＶプロモーター及び５０ｂｐの合成ポリアデニンシグナルを用いて、Ｃａｓ  ＡＡＶベクターを構築した。詳細な配列を列挙し、組換えＡＡＶベクターの全ての構成要素を下に示す：下線及び太字：ＩＴＲ（配列番号１３）；下線：短いＣＭＶプロモーター；太字：フラッグ（Ｆｌａｇ）タグ（配列番号１５）及びＳＶ４０ＮＬＳ（配列番号１６）；ＵＰＰＥＲＣＡＳＥ：ｓｐＣａｓ９  ＣＤＳ（配列番号１７）；枠付け：合成ポリＡ部位（ＳＰＡ）
【化１】
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【０３０３】
本実施例では、本発明者は、次に、ヒト胚性腎臓細胞株（ＨＥＫ２９３ＦＴ）において上記のＣＲＩＳＰＲ  ＲＨＯ戦略を試験した。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、ｓｇＲＮＡを含まないか、１つのｓｇＲＮＡ１（配列番号１）、１つのｓｇＲＮＡ２（配列番号２）、又はその両方を保有するＣａｓ９ベクター（ｐＸ４５９）（配列番号２２）でトランスフェクトした。９６時間後、ＤＮＡを抽出し、ＲＨＯ遺伝子座を増幅しミスマッチ検出ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイにより分析した。２つのｓｇＲＮＡを共に適用することは遺伝子欠失（約３０〜４０％）を生じさせ、「Ｃｈｏｐ」戦略が、哺乳動物細胞において効率的に機能することを示した（図２Ｂ、左、レーン４）。一度に１つのｓｇＲＮＡ（レーン２及び３）を用いると、サイズの変化は生じない。ゲノムＤＮＡの約３０％が、１つのｓｇＲＮＡによって非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を受け、２つのｓｇＲＮＡを使用したときに最大で８０％が編集された（欠失及びＮＨＥＪ）。等量のプラスミドＤＮＡ（１μｇ／１×１０５個の２９３ＦＴ細胞）を、各群で使用した。これらの知見は、２つのｓｇＲＮＡを適用するは、内因性ヒトＲＨＯ配列をより効率的に破壊、除去、又は分解できることを示している。
【０３０４】
本発明者らは、「Ｃｈｏｐ」がｗｔ  ＲＨＯ遺伝子発現を減少させることができるかどうかをさらに試験した。この実験では、２シストロン性構築物をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、ｗｔ  ＲＨＯ  ｃＤＮＡ（配列番号８）及びＥＧＦＰを発現させた（図３Ａ）。ＲＨＯ  ｃＤＮＡとＥＧＦＰ（配列番号２１）の両方の発現を独立して、同時にＣＭＶプロモーター（配列番号２０）によって促進し、それによりＥＧＦＰ発現をウェスタンブロットの内部対照として使用でき、これを用いて、トランスフェクション効率及びタンパク質負荷の差を正規化した。図３Ａはまた、このＲＨＯ発現ベクター上のｓｇＲＮＡ１（配列番号１）及びｓｇＲＮＡ２（配列番号２）の標的部位を示す。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、ＲＨＯ発現ベクターと、ｓｇＲＮＡ１及びｓｇＲＮＡ２を保有するＣａｓ９構成要素（ｐＸ４５９）を発現する別のベクターで同時トランスフェクトした場合、ＲＨＯタンパク質発現レベルははるかに低かった（図３Ｂ）。ｓｇ３グループは、非特異的な対照ｓｇＲＮＡである。これらの結果を、内部対照によってさらに正規化し、それを図３Ｃに示す。これらの知見は、２つのｓｇＲＮＡを一緒に適用するは、ＲＨＯ発現を約７０％低下させ、単一のｓｇＲＮＡのみを使用すると、対照グループ（ｓｇ３）と比較して０〜３０％発現を低下させたことを示す。まとめると、これらの結果は、「Ｃｈｏｐ」戦略が、ｗｔ  ＲＨＯタンパク質発現を著しく廃止又は不活化できることを示す。
【０３０５】
実施例２．網膜色素変性症のマウスモデルにおけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９誘導遺伝子編集は疾患進行を遅らせる
次に、本発明者らは、優性Ｄ１９０Ｎロドプシン変異を有するＲＰのマウスモデルにおいて、遺伝子編集治療様式としてのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼシステムの実行可能性及び有効性を検証した。これらの実験では、Ｃａｓ９コード配列と、ＡｆｌＩＩ制限部位で印をつけたｓｇＲＮＡ（配列番号４）／ドナー鋳型を含有する２つのＡＡＶ８ベクターを使用した。ＡｆｌＩＩ制限部位の挿入は、相同組換えを受けた細胞の識別を可能にする（図４Ａ〜４Ｃ）。簡単に説明すると、ヘテロ接合型ＲｈｏＤ１９０Ｎ／＋を、上記組換えＡＡＶ８ベクターを用いて出生後５日目の前に、右眼に形質導入した。ドナー鋳型（配列番号２３）のｓｇＲＮＡ標的化頻度及び組換えを、ＴＩＤＥ  ｉｎｄｅｌ追跡ツール（Ｂｒｉｎｋｍａら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２０１４  Ｄｅｃ  １６，４２（２２）：ｅ１６８）及びＡｆｌＩＩ酵素消化によって検証した（図４）。細胞の約５０％がＮＨＥＪ（大部分が１ｂｐ挿入である）を受け、細胞の約１０％がドナー鋳型をうまく取り入れた。構造的保存を、Ｈ＆Ｅ染色によって評価し、網膜機能の回復を、３ヶ月齢に網膜電図（ＥＲＧ）によって評価した（図５Ａ及び５Ｂ）。ＲｈｏＤ１９０Ｎ／＋３ヶ月齢マウスでは、処置した目は、ＡＡＶ注射を受けなかった目よりも良好な光受容体生存を示した（図５Ａ）。さらに、ＥＲＧで測定した網膜機能も、３ヶ月齢の対照眼と比較して、処置した目で増加した（図５Ｂ）。まとめると、これらの結果は、本開示に記載のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集を用いて、ＲＰの表現型をインビボで修正できることを実証する。コドン改変ドナー配列を以下に示す：下線及び太字：相同アーム；太字：ＡｆｌＩＩ部位；下線：５コドン改変揺らぎヌクレオチド；
【化２】
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【０３０６】
実施例３．マウスＲｈｏ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ媒介ヒト化エキソン１
本開示の発明者らは、次に、マウス胚幹（ＥＳ）細胞中で野生型（ｗｔ）（配列番号２４）又は変異型ヒト（ｈ）（配列番号２５）ＲＨＯエキソン１とマウスＲｈｏ遺伝子座を置換する能力を試験した（図６）。簡単に説明すると、ＥＳ細胞を、Ｒｈｏエキソン１特異的ｓｇＲＮＡを保有するＣａｓ９発現ベクター（マウスＲｈｏエキソン１を標的にするｓｇＲＮＡ−Ｒｈｏエキソン１、配列番号５）と、各側に約７５０ｂｐの相同アームが隣接するｈＲＨＯエキソン１の配列を含有するヒトＲＨＯドナー鋳型を保有するターゲティングベクターで同時トランスフェクトした（エレクトロポレーションにより）（図６Ａ）。ヒトＲＨＯドナー鋳型は、マウスエキソン１を置換し、ｓｇＲＮＡ−Ｒｈｏエキソン１に対する耐性を付与すると予想される。エレクトロポレーション後７日目に、ＥＳクローンを採取し、ＤＮＡを抽出しスクリーニングプライマーで増幅した。９６個中２個のクローンが、ＲＦＬＰ分析によりヒトエキソン１の置換を有すると検出された（図６Ｂ）。図６Ｃに示すように、アンプリコンの配列の電気泳動図は、１つの標的化ＥＳクローンの、ヒトとマウスの完全に融合された配列を示す（レーン２、図６Ｂ）。正しい標的化クローンをさらに使用して、ヒト化ＲＨＯエキソン１マウスモデルを生成できる。この患者特異的ヒト化マウスシステムは、本発明者がインビボでのＣｈｏｐＳｔｉｃｋ戦略のためのヒトゲノム配列を標的にするために使用できる様々なｓｇＲＮＡを試験することを可能にする。これらのマウスモデルを使用する利点は、長期観察用の生きた動物における回復組織の視覚機能イメージングのような機能的評価方法を介する「ＣｈｏｐＳｔｉｃｋ」の有効性及び安全性の検証も可能にする。ｓｇＲＮＡ配列は上に列挙され、ドナー鋳型配列を以下に列挙する：下線及び太字：相同アーム；ＵＰＰＥＲＣＡＳＥ：ヒトＲＨＯエキソン１。
【化３】
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【０３０７】
実施例４．幹細胞中のマウスＰｄｅ６ａ  Ｄ６７０Ｇ対立遺伝子の修復
桿体特異的酵素の環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）ホスホジエステラーゼ６（ＰＤＥ６Ａ及びＰＤＥ６Ｂ）のサブユニットをコードする遺伝子中の変異は、毎年世界中で約７２、０００症例のＲＰに関与し、治療モデル化を、開発中の機構に基づく治療に高度に関連させる。本実施例で、本発明者らは、マウスＥＳ細胞内の光受容体遺伝子変異を修正するためにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集システムを使用した。
【０３０８】
これらの研究のために、本発明者らは、Ｐｄｅ６ａＤ６７０Ｇ／Ｄ６７０Ｇマウスモデルから単離されたＥＳ細胞を使用した（Ｗｅｒｔ  ＫＪら．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２０１３  Ｆｅｂ  １；２２（３）：５５８−６７；Ｗｅｒｔ  ＫＪら．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１２  Ｎｏｖ  ２５；（６９））。図７Ａに示すように、本実施例で使用されるドナー構築物（配列番号２６）は、２つの改変を含む：１）Ｄ６７０Ｇコドンの上流に追加のＳｐｈＩ部位を生成するＰｄｅ６ａ−コドン改変、そこでＳｐｈＩ酵素消化はＣＲＩＳＰＲ媒介相同組換えを受けたＥＳ細胞を同定できる；及び２）８個の揺らぎ塩基対の導入、これはドナー鋳型を、ｓｇＲＮＡ（配列番号６）に認識されずしたがってＣａｓ９に対し耐性にし、かつｗｔアミノ酸配列に対して変異型アミノ酸配列の変化をもたらした。そのため、Ｃａｓ９切断及び相同組換えの際に、内因性変異型対立遺伝子が置換される（すなわち、修復される）。図７Ａにおいて、三角はｓｇＲＮＡ標的部位を示し、２つの矢印はＰＣＲ増幅に使用されるプライマー対を表す。図７Ｂに示すように、組み換え細胞から生成されたアンプリコンは、３０３ｂｐ及び４０２ｂｐであり、非編集アンプリコンは、７０５ｂｐである。さらに、標的クローンからのゲノムＤＮＡの直接配列決定を用いて、本発明者らは、ドナー鋳型によるＤ６７０Ｇエキソンの予測された置換を確認した（図７Ｃ）。これは、変異部位にｓｇＲＮＡ標的部位が存在しない例であるが、研究者は、近くにｓｇＲＮＡをさらに設計し、相同組換えを介して変異型対立遺伝子をうまく置換できる。
【０３０９】
そのため、本実施例で、本発明者らは、マウスＰＤＥ６ａ遺伝子座を編集し光受容体を救助するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの能力を検証した。
【０３１０】
実施例５．Ｐｄｅ６αＤ６７０Ｇ／Ｐｄｅ６αＤ６７０ＧマウスモデルにおけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９誘導性インビボ遺伝子編集
本発明者らは、マウスＲｈｏ遺伝子座を編集し光受容体を救助するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの使用を検証した（実施例２）。さらに、実施例４に示すように、本発明者らは、ＥＳ細胞においてマウスＰｄｅ６ａ  Ｄ６７０Ｇ対立遺伝子を修復できた。次に、出生後（Ｐ）５日目のＰｄｅαＤ６７０Ｇ／Ｐｄｅ６αＤ６７０Ｇマウスが、１つの眼の中に、コドン最適化Ｃａｓ９耐性ドナーＤＮＡにより（実施例４で検証した）組換えＡＡＶ８−Ｃａｓ９とＡＡＶ８−ｓｇＲＮＡの両方の網膜下形質導入を受ける、インビボ実験を行うことができる。対照動物において、１つの眼に、陰性対照として空のＡＡＶ８ベクター又はＡＡＶ８−Ｃａｓ９を形質導入する。
【０３１１】
本発明者らは、次に、ホモ接合型変異体におけるＰｄｅ６αＤ６７０Ｇ対立遺伝子の１つの組換え及び修正を定量的に検証する。簡単に説明すると、注射後（変性発症前）１ヶ月目に、発明者らは、網膜を切断し、ＤＮＡを単離し、ＰＣＲを行い、ＳｐｈＩ制限部位を（ＲＦＬＰを用いて）検証する。ＰＣＲ試料は３連で実施する。３週齢で、３匹のマウスから網膜を収集し、免疫ブロット法によりＰｄｅ６αレベルを定量する。
【０３１２】
光受容体機能及び生存を定量的に評価するために、本発明者らは、以前に公開された技術（Ｗｏｏｄｒｕｆｆら．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００８  Ｆｅｂ  ２７；２８（９）：２０６４−７４；Ｊａｎｉｓｃｈら．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３９０，１１４９−１１５３（２００９）；Ｔｓａｎｇら．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６  Ｍａｙ  １７；２７２（５２６４）：１０２６−９；Ｄａｖｉｓら．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２００８  Ｎｏｖ；４９（１１）：５０６７−７６）を使用して、８、１６、及び２４週目（総数ｎ＝３６匹の動物）にＳＤ−ＯＣＴでの外側セグメントの薄化、ＥＲＧ、及び桿体錐体密度の定量的ＡＦを実施する。全ての測定を両眼で行う。
【０３１３】
救助の重要な生化学的指標としてのＰＤＥ機能の有効性を決定するために、本発明者らは、明暗適合網膜からの全ｃＧＭＰレベル及びＰＤＥ活性が回復したかどうかを測定する。Ｐ１８、Ｐ２１、Ｐ２８、及びＰ３５で処置した３つの追加の試料の右眼、並びにＰｄｅ６ａＤ６７０Ｇ／Ｄ６７０Ｇの対照マウスの左眼をアッセイする。ＧＵＣＹ２Ｅ（グアニル酸シクラーゼ）は、全ての実験について安定なままであるべきであり、以前に記載されているように（Ｔｓａｎｇら  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６  Ｍａｙ  １７；２７２（５２６４）：１０２６−１０２９；Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８  Ｏｃｔ  ２；２８２（５３８６）：１１７−２１）決定する。
【０３１４】
実施例６：患者特異的幹細胞中のＰＤ６Ａを編集するための相同組換え対非相同末端結合（ＮＥＨＪ）の有効性及び頻度
本実施例において、本発明者らは、ＡＡＶ２−Ｃａｓ９システムがヒトＰＤＥ６Ａ遺伝子座を編集できるかどうかを調べる。ここで、６ウェルのマトリゲル被覆プレート（ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ  ＸＦ／ＦＦ培地（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ））中の０．２５×１０６個の患者ｉＰＳを、ＡＡＶ２−Ｃａｓ９とＡＡＶ２ベクター−ドナー鋳型混合物（ＭＯＩ：２０００）で同時形質導入して、ＰＤＥ６Ａを修復する。４８時間後、ｉＰＳを、Ａｃｃｕｔａｓｅで、規則的な１０ｃｍマトリゲル被覆培養皿上に継代する。
【０３１５】
次に、１０００ＰＤＥ６ＡＲ１０２Ｃ／ＰＤＥ６ＡＳ３０３Ｃ患者ｉＰＳクローンを採取し、ＰＣＲ用にＤＮＡを単離した；（プライマー：フォワード：ＧＣＡＧＡＣＴＧＣＡＡＡＡＣＴＧＣＣＡＴ；リバース：ＴＧＴＣＡＣＣＡＧＣＣＴＴＧＴＣＴＴＧＧ）。ＰＣＲ産物をＢｓｉＷＩで切断して、相同組換えを受けたクローンを同定する。ＢｓｉＷＩ消化後に、６５１ｂｐに１つのみのバンドを示した親配列と比較して、相同組換えを受けたｉＰＳから作製されたアンプリコンは、２７１ｂｐ及び３８０ｂｐにバンドを示す。
【０３１６】
ＮＨＥＪを受けたクローンの割合（相同組換え修復を受けたものとは対照的に）を決定するために、ＤＮＡを、ＢｓｉＷＩ部位のないクローン（すなわち、形質導入されていない、形質導入されたオフターゲット又はＮＨＥＪ）から分析し、ＰＤＥ６Ａ対立遺伝子の崩壊の頻度を決定する。ＤＮＡを、ＳＵＲＶＥＹＯＲミスマッチ検出アッセイにより分析し、陽性ＤＮＡ試料を、ｐＣＲ（商標）４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターなどのプラスミドベクター中にサブクローン化し、次いで、サンガー配列決定に送る。加えて、ｉＰＳ及び生きているマウスにおけるオフターゲットの評価は、ヒトへの適用前の前提条件である。オフターゲット部位を、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）次世代配列決定を用いる全ゲノム配列決定により分析する。
【０３１７】
本発明者らは、患者ｉＰＳと比較して、光受容体中のＡＡＶ８によりインビボで媒介されるはるかに高い割合の相同組換えを予想する。これは、ＡＡＶ８が、ｉＰＳ中への形質導入よりもはるかにより高い頻度でｓｇＲＮＡを光受容体中に導入するからである。ＡＡＶ８は、一般に各細胞中に単コピーＤＮＡを導入するリポフェクションとエレクトロポレーションの両方とは対照的に、約１０，０００コピーのｓｇＲＮＡとＣａｓ９を光受容体中に導入する。
【０３１８】
ＮＨＥＪを受ける形質導入クローンの割合は、ヒトの誘導多能性幹細胞で９０ｂｐのドナー鋳型を用いて相同組換えを受けるものよりも高い可能性があり、それぞれ約１０％対１％である。
【０３１９】
実施例７．ドイン蜂巣状患者から単離されたｉＰＳ細胞中の変異型対立遺伝子Ｒ３４５Ｗを置換するためのＣＲＩＳＰＲシステムの使用
ドイン蜂巣状網膜ジストロフィー（ＤＨＲＤ）は、目に影響を及ぼし視覚喪失を引き起こす、遺伝的な疾患である。これは、網膜色素上皮の周りに蓄積する小さな、円形の白い斑点（ドルーゼン（ｄｒｕｓｅｎ））によって特徴づけられる。経時的に、ドルーゼンは成長し、一緒になってハニカムパターンを生成し得る。これは通常、早期の成人期で始まるが、発症の年齢は異なる。また、視力喪失の程度も異なる。ＤＨＲＤは、ＥＦＥＭＰ１遺伝子中のＲ３４５Ｗ変異によって引き起こされ、これは、常染色体優性様式で遺伝する。
【０３２０】
この実施例で、発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ構成要素及びドナー鋳型（配列番号２７）を用いて、ドイン蜂巣状患者の線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞内のＲ３４５Ｗ変異を修正した（図８Ａ）。得られたｉＰＳ細胞は、コドン改変を伴う野生型ＥＦＥＭＰ１配列を含み、これはＣａｓ９によるさらなる切断に対し耐性を付与する。これらの細胞は、ＤＨＲＤの治癒のためにＲＰＥ細胞への分化後に自己移植に用いることができる。
【０３２１】
簡単に説明すると、本発明者らは、ＤＨＲＤ患者由来のｉＰＳを収集した。Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡ−ＥＦＥＭＰ１（配列番号３）（図８Ｂ）を混合し、ヌクレオフェクションによりｉＰＳ細胞中に、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）（配列：ｔａｇｔｔａｇｔａａａｃｔｃｔｔｔｇａｃｃｃｔａｃａｔｃｔｃｔａｃａｇａｔａｔａａａｔｇａｇｔｇｔｇａｇａｃｃａｃａａａＣｇａＧｔｇｃＣｇｇｇａｇｇａｔｇａａａｔｇｔｇｔｔｇｇａａｔｔａｔｃａｔｇｇｃｇｇｃｔｔｃｃｇｔｔｇｔｔａｔｃｃａｃｇａａａｔｃｃｔｔ）の形態のドナー鋳型と同時形質導入した。ドナー鋳型は、ＣＲＩＳＰＲ構成要素による反復認識及び切断を防止するためにコドン改変される。修正された配列を有するコロニーを、さらなるＳｃｒＦＩ制限部位でのＲＦＬＰアッセイによって確認した。ｉＰＳ細胞の遺伝子型を、配列決定によってさらに確認する（図（８Ｃ）。
【０３２２】
この実験は、「Ｃｈｏｐ」戦略が、常染色体優性網膜色素変性症以外の常染色体優性疾患を治療する可能性があるという証拠を提供する。
【０３２３】
実施例８．若年性黄斑変性症のためのＳＮＰ編集
患者特異的細胞は、媒介遺伝子編集のためのインビトロゲノム標的に最も臨床的に関連しており、患者由来の線維芽細胞（及びｉＰＳ細胞）は、網膜変性障害における遺伝子療法のインビトロレシピエントとして機能している（Ｌｉ，Ｔｓａｉら  ２０１２，Ｌｉ，Ｗｕら  ２０１４）。以前の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験のＦＤＡ承認は、患者由来線維芽細胞（及びｉＰＳ細胞）で示される有効性に基づいていた（Ｖａｓｉｒｅｄｄｙ，Ｍｉｌｌｓら  ２０１３）。本発明者らの対立遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲ戦略の有効性を評価するために、本発明者らは、患者のｉＰＳ細胞（ＢＥＳＴ１  ｐＲ２１８Ｈ、ｐＬ２３４Ｐ又はｐＡ２４３Ｔ対立遺伝子（Ｍｏｓｈｆｅｇｈ，Ｖｅｌｅｚら  ２０１６）を有する）を使用して異なるＣＲＩＳＰＲ手法の効率を試験する。
【０３２４】
本発明者らは、ゲノム編集技術ＣＲＩＳＰＲを用いる対立遺伝子特異的ゲノム編集を用いてこれらの障害に対処する。本発明者らは、３つの異なるＣＲＩＳＰＲシステムを試験する（図１１）：左）相同組換えに依存して野生型（ＷＴ）配列へ変異を修正する、ＣＲＩＳＰＲｒ（ｒ＝修復）；中央）非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介し変異型対立遺伝子を切断する、ＣＲＩＳＰＲｄ（ｄ＝崩壊）；及び右）転写開始部位（ＴＳＳ）に結合する（但し、切断しない）ために不活化したＣａｓ９（ｄＣａｓ９）を使用し、変異タンパク質の転写を特異的に防止する、ＣＲＩＳＰＲｉ（ｉ＝干渉）。発明者らは、ｉ）３つのＣＲＩＳＰＲシステムの効率を比較し、かつｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ処理した患者由来のＲＰＥ（ｉＲＰＥ）の形態及び機能を検証する。
【０３２５】
本発明者らは以前に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９相同組換えを介し作製した４匹のマウス種族について報告した（Ｏｒｔｅｇａ，Ｉｔｔｍａｎｎら．１９９８，Ｓａｎｃｈｏ−Ｐｅｌｌｕｚ及びＰａｑｕｅｔ−Ｄｕｒａｎｄ  ２０１２，Ｄａｖｉｓ，Ｈｓｕ  ら  ２０１３，Ｓｉｎｇｈ，Ｓｈｅｎら  ２０１３，Ｂａｓｓｕｋ，Ｚｈｅｎｇら  ２０１６）。網膜疾患の進行は、マルチモジュラーイメージング及び細胞計数を用いて定量され得る（Ｔｓａｎｇ，Ｇｏｕｒａｓら．１９９６，Ｔｓａｎｇ，Ｂｕｒｎｓら．１９９８，Ｄａｖｉｓ，Ｔｏｓｉら  ２００８，Ｔｓａｎｇ，Ｔｓｕｉら  ２００８，Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，Ｊａｎｉｓｃｈら  ２００８，Ｊａｎｉｓｃｈ，Ｋａｓａｎｕｋｉら  ２００９，Ｗａｎｇ，Ｔｏｓｉら  ２０１０，Ｔｏｓｉ，Ｄａｖｉｓら  ２０１１，Ｓａｎｃｈｏ−Ｐｅｌｌｕｚ及びＰａｑｕｅｔ−Ｄｕｒａｎｄ  ２０１２，Ｗｅｒｔ，Ｄａｖｉｓら  ２０１２，Ｙａｎｇ，Ｎａｕｍａｎｎら  ２０１２）。一実施形態では、ＡＡＶ−２ベクター（図１０）を使用してよい。ウイルス媒介遺伝子導入及び／又はフットプリントフリー遺伝子編集技術（Ｔｓａｎｇ，Ｃｈｅｎら．１９９６，Ｔｓａｎｇ，Ｇｏｕｒａｓら．１９９６，Ｏｒｔｅｇａ，Ｉｔｔｍａｎｎら．１９９８，Ｔｓａｎｇ，Ｂｕｒｎｓら．１９９８，Ｄａｖｉｓ，Ｔｏｓｉら  ２００８，Ｔｓａｎｇ，Ｔｓｕｉら  ２００８，Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，Ｊａｎｉｓｃｈら  ２００８，Ｊａｎｉｓｃｈ，Ｋａｓａｎｕｋｉら  ２００９，Ｗａｎｇ，Ｔｏｓｉら  ２０１０，Ｔｏｓｉ，Ｄａｖｉｓら  ２０１１，Ｓａｎｃｈｏ−Ｐｅｌｌｕｚ，Ｔｏｓｉら  ２０１２，Ｗｅｒｔ，Ｄａｖｉｓら  ２０１２，Ｙａｎｇ，Ｎａｕｍａｎｎら  ２０１２）を、本方法で用いてよい。
【０３２６】
ｉＰＳ細胞におけるＣＲＩＳＰＲｒ、ＣＲＩＳＰＲｄ、とＣＲＩＳＰＲｉの間の効率を比較する。
【０３２７】
患者特異的細胞は、媒介遺伝子編集のための臨床的に関連したインビトロゲノム標的であり、患者由来の線維芽細胞（及びｉＰＳ細胞）は、網膜変性障害における遺伝子療法のインビトロレシピエントとして機能している（Ｌｉ，Ｔｓａｉら  ２０１２，Ｌｉ，Ｗｕら  ２０１４）。以前の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験のＦＤＡ承認は、患者由来線維芽細胞（及びｉＰＳ細胞）で示される有効性に基づいていた（Ｖａｓｉｒｅｄｄｙ，Ｍｉｌｌｓら  ２０１３）。本発明者らの新規の対立遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲ戦略の有効性を評価するために、本発明者らは、患者のｉＰＳ細胞（ＢＥＳＴ１  ｐＲ２１８Ｈ、ｐＬ２３４Ｐ又はｐＡ２４３Ｔ対立遺伝子（Ｍｏｓｈｆｅｇｈ，Ｖｅｌｅｚら  ２０１６）を有する）を使用して異なるＣＲＩＳＰＲ手法の効率を試験する。
【０３２８】
ＣＲＩＳＰＲｒは、相同組換え修復（ＨＤＲ、内因性ＤＮＡ修復機構の形態）を介して単一変異を修復できる。ＣＲＩＳＰＲｄは、例えば、遺伝子（ＴＳＳ内の対立遺伝子特異的ＳＮＰなど）の上流の配列を標的にすることにより変異型対立遺伝子を特異的に切断し、健常な対立遺伝子を破壊することなく変異型対立遺伝子を破壊し得る。ＣＲＩＳＰＲｉは、変異型対立遺伝子の転写を防止する干渉手法を使用し、少数のオフターゲット効果をもたらし得る。
【０３２９】
ＣＲＩＳＰＲ編集された患者由来のＲＰＥのインビトロでの機能性／形態及び変異修復を検証する。
【０３３０】
この実験は、ＢＥＳＴ１−ＶＭＤの優性型を修正し、ＣＲＩＳＰＲ技術による操作がｉＲＰＥ成熟及び機能に悪影響を及ぼさないことを確認するように設計される。
【０３３１】
理論に縛られることなく、本発明者は、ＢＥＳＴ１ハプロ充足（ｈａｐｌｏｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）がヒトにおける正常な視覚を可能にし（Ｆｕｎｇ，Ｙｚｅｒら  ２０１５，Ｌｉ，Ｚｈａｎｇら  ２０１７）、ｉＰＳ再プログラミング又はＣＲＩＳＰＲプロトコルの適用がＲＰＥ成熟、適切なＲＰＥ分極、ＲＰＥ６５発現、正常なトランス網膜代謝、及び食作用活性を損なう可能性がある（Ｇｏｕｒａｓ，Ｋｏｎｇら  ２００２，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｌｉら  ２０１５，Ｌｉ，Ｃｈａｎら  ２０１６，Ｍｏｓｈｆｅｇｈ，Ｖｅｌｅｚら  ２０１６）と仮定する。
【０３３２】
ＣＲＩＳＰＲｒ、ＣＲＩＳＰＲｄ又はＣＲＩＳＰＲｉ編集の後のｉＲＰＥ細胞は、適切なＲＰＥマーカーを発現し、特にＣｌ−イオン恒常性を維持することにおいて正常な機能を有する。
【０３３３】
４０人の異なる年齢の既存のＢＥＳＴ１患者を調べて、進行を検出するためのＢＥＳＴ１マーカーを特徴付ける。ＢＥＳＴ１は、患者が３０代に達するまで、典型的には視覚に不可逆的に影響を与えない疾患である。この実験は、疾患対立遺伝子を有する患者を追跡して、臨床疾患経過及びＣＲＩＳＰＲ介入に最適な枠を決定する。４０人のＢＥＳＴ１患者を、５年間、イメージング及びバイオマーカー分析によって臨床的に追跡する。
【０３３４】
実験は、介入の準備ができた患者を識別できるバイオマーカー及び臨床試験を識別でき、患者のＢＥＳＴ１バイオマーカーを識別できる。
【０３３５】
実験方法
ｉＰＳ細胞におけるＣＲＩＳＰＲｒとＣＲＩＳＰＲｄの間の効率。
【０３３６】
患者ｉＰＳ細胞の確立：発明者らは、サイトチューン−ｉＰＳセンダイ（ＣｙｔｏＴｕｎｅ−ｉＰＳ  Ｓｅｎｄａｉ）再プログラミングキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（Ｌｉ，Ｔｓａｉら  ２０１２）を使用して、ｉＰＳ細胞を作製しゲノムウイルス残渣を残さない。品質管理のために、ｉＰＳ細胞を、核型分析、ゲノム配列決定、ヤマナカ導入遺伝子の欠如についての試験、及び多能性アッセイ（Ｌｉ，Ｔｓａｉら  ２０１２）に供した。
【０３３７】
ＡＡＶ運搬能力：ＡＡＶ運搬能力は４．７ｋｂであり得る。本発明者らは、２個のＡＡＶベクターを使用する。ＣＲＩＳＰＲｒについては、両方のｐＺａｃ２．１ベースの構築物をＡＡＶ２中にパッケージングする（Ｋｈａｎ，Ｈｉｒａｔａら  ２０１０，Ａｓｕｒｉ，Ｂａｒｔｅｌら  ２０１２，Ｄｅｙｌｅ，Ｋｈａｎら  ２０１２）。細胞を、ＡＡＶ２−ｓｇＲＮＡ及びＡＡＶ２−Ｃａｓ９ベクター（図１０Ａ）、並びにＷＴのＢＥＳＴ１を含有するＣａｓ９耐性ドナー鋳型で、インビトロとインビボの両方（各ベクターについて１×１０１３個のゲノムコピー／ｍｌのウイルス力価）で形質導入する。ＡＡＶ２血清型は、ＲＰＥ及び内部網膜細胞（マウスモデルで）、並びにｉＰＳ細胞を導入するのに効率的である（Ｐａｎｇ，Ｌａｕｒａｍｏｒｅら  ２００８，Ｇｕｚｉｅｗｉｃｚ，Ｚａｎｇｅｒｌら  ２０１３，Ｒａｐｔｉ，Ｓｔｉｌｌｉｔａｎｏら  ２０１５）。同質遺伝子的ＢＥＳＴ１を作製するために、発明者らは、１，０００個のＣＲＩＳＰＲｒ編集された患者幹細胞クローンを採取し、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）についてスクリーニングし、サンガー配列決定によりそれらを確認する。
【０３３８】
ｇＲＮＡ：２つのｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲｄに必要であり、一方はＴＳＳ（ｇＲＮＡ１又はｇＲＮＡ２）の上流及び他方はイントロン（ｇＲＮＡ３、図１３Ａ）の下流にある。イントロンを標的にするｇＲＮＡ３は、変異型とＷＴ対立遺伝子の両方を標的にできる。しかしながら、イントロン中の単一の切断のみはＷＴ対立遺伝子に害を与えない可能性がある。Ｃａｓ９切断のために上流及び下流のｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１＋ｇＲＮＡ３又はｇＲＮＡ２＋ｇＲＮＡ３）の両方により染色体が同時に標的化される場合にのみ、ＢＥＳＴ１の大規模な除去を達成できる。この遺伝子切断は、ＷＴ対立遺伝子を温存しながら、変異型ＢＥＳＴ１対立遺伝子（図１３Ａ〜１３Ｃ）の発現を防止できる。
【０３３９】
ＣＲＩＳＰＲｒについての１つのＢＥＳＴ１対立遺伝子の組換え及び修正の定量的検証。ＡＡＶ形質導入後１ヶ月目に、ＨＤＲ効率を、ＨＤＲ由来の細胞からのＤＮＡ中で切断される、ＣＲＩＳＰＲｒ処理細胞中の新しい制限断片長多型（ＲＦＬＰ）部位についてＰＣＲによりアッセイする。新しいＲＦＬＰ部位を欠くクローン（これは、それらが形質導入されていないか、形質導入されたオフターゲットであるか、又はＮＨＥＪを介して改変されたかのいずれかであることを示す）（図１０Ａ）も分析する。ＤＮＡを、直接サンガー配列決定に供する。
【０３４０】
Ｃｌ−バイオセンサーを保有するＣＲＩＳＰＲ編集されたｉＲＰＥ株（ｐＲ２１８Ｈ、ｐＬ２３４Ｐ、及びｐＡ２４３Ｔ対立遺伝子（Ｍｏｓｈｆｅｇｈ，Ｖｅｌｅｚら  ２０１６）を保有する患者由来）の機能性を、上記のように試験する。上記のＣＲＩＳＰＲｒによって作製された同質遺伝子的対照について、変異型ＢＥＳＴ１ゲノム配列を、追加のＲＦＬＰ部位を有するコドン改変ドナー鋳型と置き換え（図１０Ａの例と同様に）、相同組換えを受けた細胞の同定を可能にする。
【０３４１】
ＰＣＲ作製基質を用いるインビトロアッセイが優れた特異性を示すように（図１３Ｂ）、ＣＲＩＳＰＲｄがＮＨＥＪによりＷＴ対立遺伝子を破壊する可能性は低い。また、特に標的にされたエキソンにおいて、オフターゲット効果を最小にするために、本発明者らはｇＲＮＡ相補性領域を短くした（Ｆｕ，Ｆｏｄｅｎら  ２０１３，Ｒａｎ，Ｈｓｕら  ２０１３，Ｐｙｚｏｃｈａ，Ｒａｎら  ２０１４，Ｓｍｉｔｈ，Ｇｏｒｅら  ２０１４，Ｔｓａｉ，Ｗｙｖｅｋｅｎｓら  ２０１４，Ｓｍｉｔｈ，Ａｂａｌｄｅ−Ａｔｒｉｓｔａｉｎら  ２０１５）。場合によって、発明者らは、第２のｇＲＮＡを使用し、かつＡＡＶ：：Ｃａｓ９の代わりにＡＡＶ：：ニッカーゼを使用できる（Ｍａｌｉ，Ａａｃｈら  ２０１３，Ｒａｎ，Ｈｓｕら  ２０１３，Ｓｈｅｎ，Ｚｈａｎｇら  ２０１４，Ｔｓａｉ，Ｗｙｖｅｋｅｎｓら  ２０１４）。別の実施形態では、発明者らは、ＡＡＶに媒介される標的化ＣＲＩＳＰＲｒのための変異遺伝子座に対し単量体転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、２．７ｋｂ）を設計できる（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ，Ｂｉｅｔｚら  ２０１３，Ｍ  Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｄｕｃｈａｔｅａｕら  ２０１３）。デュアルＡＡＶベクターは、生きているマウスで約５５％超の光受容体を形質導入できる（Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ−Ｗａｒｄ，Ｃｈａｄｄｅｒｔｏｎら  ２０１１，Ｔｒａｐａｎｉ，Ｃｏｌｅｌｌａら  ２０１４，Ｃａｂｒａｌ，ＤｉＣａｒｌｏら  ２０１７）。デュアルＡＡＶ：：ＣＲＩＳＰＲベクターがＢＥＳＴ１  ＭＴ  対立遺伝子を切除しない場合、本発明者らは、単一のＡＡＶ２ベクター中でＡＡＶ：：ＳａＣａｓ９；Ｕ６：：ｇＲＮＡを試験する（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｐｒｅｗら  ２０１５，Ｒａｎ，Ｃｏｎｇら  ２０１５）。Ｃａｓ９発現のレベル及び持続時間（ひいては、オフターゲッティングの可能性）を最小化することは、Ｃａｓ９生成のすぐ後で自己不活性化するＡＡＶ：：Ｃａｓ９ベクターによって達成される。出願人は、代替的に、従来のＣｒｅ−ｌｏｘノックイン技術を適用できる（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｐｒｅｗら  ２０１５，Ｒａｎ，Ｃｏｎｇら  ２０１５）が、フットプリントを含まない遺伝子標的化は、そのシステムを使用して達成され得ない。細胞中のドナーＤＮＡの持続性はまた、低頻度修復として現れ得るＰＣＲアーチファクトを生み出す可能性がある。一本鎖ドナー（プラスミドよりむしろ）はこれを防止するはずである。
【０３４２】
患者由来のＲＰＥを用いるＣＲＩＳＰＲｉによるＢＥＳＴ１標的化。
ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＮＰ編集：ＣＲＩＳＰＲｉ（図１４Ａ〜１４Ｂ）は、ＰＵＦ−ＫＲＡＢの使用により転写を効果的に阻害する。アダプタータンパク質ＰＵＦは、１以上のＰＵＦ結合配列を含有する改変ｇＲＮＡに結合する。第２世代のＣＲＩＳＰＲｉの構成要素は、２つのＡＡＶ中にパッケージングでき、ｉＲＰＥ細胞中へのＣＲＩＳＰＲｉ機構の円滑な送達を可能にする。
【０３４３】
ＡＡＶ２の構築及び送達：本発明者らは、ＡＡ２：：ＰＵＦ−ＫＲＡＢとＡＡＶ２：：ｄＣａｓ９；Ｕ６：：ｇＲＮＡ１−ＰＵＦ結合部位構築物を手元に有し、ｉＲＰＥ中でＵ６：：ｇＲＮＡ１を試験した（図１５Ｂ）（Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ−Ｗａｒｄ，Ｃｈａｄｄｅｒｔｏｎら  ２０１１，Ｔｒａｐａｎｉ，Ｃｏｌｅｌｌａら  ２０１４）。ＣＲＩＳＰＲの親株は、ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑ／Ｉ１５２Ｌ蛍光Ｃｌ−バイオセンサーを保有するように操作されたｐＬ２３４Ｐ、ｐＲ２１８Ｈ、及びｐＡ２４３Ｔ患者由来のｉＲＰＥである（図１７Ａ〜１７Ｂ）。５個のＰＵＦ結合配列／部位を付加したｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ−ＰＢＳ）は、マルチサイレンサー複合体のアセンブリを作るためのＲＮＡ足場として作用する（図１７Ａ〜１７Ｂ）。２〜３継代後に、個々の「ポリクローナル」集団（異なるｇＲＮＡを保有する）を、ｑＰＣＲ及びイムノブロッティングによりＢＥＳＴ１ノックダウンについて試験する。
【０３４４】
ＡＡＶ形質導入したＢＥＳＴ１ＭＴ／＋ＲＰＥの遺伝子発現プロファイルを分析するためのＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）。ＣＲＩＳＰＲｉによるＢＥＳＴ１ＭＴ抑制を確認するために、発明者らは、対照の単一ＡＡＶ２：：ｄＣａｓ９単独に対しデュアルＡＡＶ２：：ＰＵＦ−ＫＲＡＢ；ＡＡＶ２：：ｄＣａｓ９で形質導入したｉＲＰＥのＲＮＡ−ｓｅｑ（３０００万の配列読み取り）を実行する。
【０３４５】
ＣＲＩＳＰＲにより生成される可能性のあるオフターゲット効果を分析するために、発明者らはＷＧＳ、ダイゲノム−ｓｅｑ、及びＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑを実行する。
【０３４６】
ＣＲＩＳＰＲｉは、ＤＮＡを切断しないので、オフターゲット効果がほとんどないはずである。その結果、これは、癌遺伝子の活性化を低下させるはずである。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲｉは、ＣＲＩＳＰＲｒによって媒介されるＮＨＥＪ破壊の約３分の１がさらなるインフレーム変異をもたらすので、ＣＲＩＳＰＲｒよりも高い有効性を有する可能性がある。ＣＲＩＳＰＲｉを用いてＭＴ（変異型）ＢＥＳＴ１対立遺伝子をサイレンシングすると、ゲノム全体の転写の乱れを無視できる。ＷＴ  ＢＥＳＴ１のｍＲＮＡレベルは、ＣＲＩＳＰＲｉによって変更されないはずである。ＲＮＡ−ｓｅｑは、ＣＲＩＳＰＲｉがｉＲＰＥにおいてＭＴ  ＢＥＳＴ１対立遺伝子をどれくらい効果的に阻害するかを示す。
【０３４７】
本発明者らは、対立遺伝子特異的な編集が、ＳＮＰのｒｓ９７２３５３及びｒｓ９７２３５５を標的にすることにより可能であるか否かも試験する。特定の実施形態では、これらのＳＮＰでホモ接合型である患者は、ＣＲＩＳＰＲｉ又はＣＲＩＳＰＲｄによって治療されない。これらの患者は、ＢＥＳＴ１遺伝子内の他のＳＮＰを標的にすることにより治療される。ＡＡＶ−２送達に続いて、触媒的に欠損したＣａｓ９（ｄＣａｓ９）は、非分裂ＲＰＥ細胞中に存続し、潜在的なｄＣａｓ９毒性を延長し得る（Ｐｌａｔｔ，Ｃｈｅｎら  ２０１４）。デュアルＡＡＶ２：：ｄＣａｓ９＋ＡＡＶ２：：ｇＲＮＡ  ＰＢＳ／ＰＵＦ−ＫＲＡＢが十分な抑制を促進しない場合、ＥＩＡＶ：：ｄＳａＣａｓ９−ＫＲＡＢを単一のベクター中に入れることができる（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｐｒｅｗら  ２０１５，Ｒａｎ，Ｃｏｎｇら  ２０１５）。レンチウイルス性ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）はＦＤＡに承認されており、したがってＬｅｎｔｉ：：ＣＲＩＳＰＲｉを臨床試験に容易に適合させることができる。
【０３４８】
ＣＲＩＳＰＲ編集細胞由来のＲＰＥが構造的に正常であり、適切なバイオマーカーを発現するか否かを決定する。
【０３４９】
本発明者らは、試験のための陽性対照を設定するために、健康ドナーからのＷＴ（野生型）ｉＲＰＥを含める。ＣＲＩＳＰＲｒ、ＣＲＩＳＰＲｄ及びＣＲＩＳＰＲｉ実験の各々も、陰性治療対照としてそれぞれのスクランブルｇＲＮＡ対照を含む。合計で、７グループの細胞を分析する。
【０３５０】
現在の基準としての同質遺伝子ＣＲＩＳＰＲｒ修復ｉＰＳ細胞は、ＣＲＩＳＰＲｄ及びＣＲＩＳＰＲｉの相対的有効性のための陽性対照として機能する。
【０３５１】
親株と同様に、ＣＲＩＳＰＲ編集クローンは、正常な表現型を示すＲＰＥ単層に分化できる（Ｇｏｕｒａｓ，Ｋｏｎｇら  ２００２，Ｗａｎｇ，Ｔｏｓｉら  ２０１０，Ｌｉ，Ｔｓａｉら  ２０１２，Ｌｉ，Ｗｕら  ２０１４；Ｂａｓｓｕｋ，Ｚｈｅｎｇら  ２０１６，Ｗｕ，Ｔｓａｉら  ２０１６）。
【０３５２】
細胞培養における可能性のあるモザイクの結果は、ＣＲＩＳＰＲ技術によってつくられ得る。免疫染色及び免疫ブロットによる特徴づけが十分でない場合、発明者らは、質量分析を行ってＣＲＩＳＰＲ編集後の細胞のプロテオームプロファイルを分析する。ＲＰＥ細胞を用いるＣａｓ９の長期発現の戦略をヒト治験で展開するために、眼内シクロスポリンＡインプラントを使用してよい（Ｌａｉ，Ｇｏｕｒａｓら  ２０００）。ＡＡＶ：：Ｃａｓ９治験について、免疫抑制は使用されない（Ｌｏｎｇ，ＭｃＡｎａｌｌｙら  ２０１４，Ｌｏｎｇ，Ａｍｏａｓｉｉら  ２０１６，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｈａｋｉｍら  ２０１６，Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ，Ｚｈｕら  ２０１６，Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ，Ｈａｌｌら  ２０１７）。
【０３５３】
ＣＲＩＳＰＲ編集ＲＰＥにおけるＣｌ−流出の回復を定量化する。
【０３５４】
ｉＲＰＥにおいてＣｌ−流出を測定するためのバイオセンサー：発明者らは、機能回復の試験及びＣＲＩＳＰＲ編集後の細胞機能の乱れの可能性を評価するのに、以前の課題の突破口として新規なＣｌ−バイオセンサーを含める。Ｃｌ−濃度バイオセンサーを用い、発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ編集ｉＰＳ細胞を使用して両方の可能性を直接試験できる。発明者らは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）−Ｈ１４８Ｑ／Ｉ１５２Ｌ陰イオンバイオセンサーの単一のコピーを有するｉＲＰＥを使用する発明者らのＣｌ−流出アッセイを発表した（図１７Ａ〜１７Ｂ）。このアッセイは、ＢＥＳＴ１チャネル活性のＣＲＩＳＰＲ媒介機能救済の認定を可能にする。
【０３５５】
バイオセンサーイメージング：発明者らは、ＣＲＩＳＰＲｄ編集細胞及びＣＲＩＳＰＲｉ編集細胞において、ＹＦＰＨ１４８Ｑ／Ｉ１５２Ｌ（Ｇａｌｉｅｔｔａ，Ｈａｇｇｉｅら  ２００１，Ｍｏｓｈｆｅｇｈ，Ｖｅｌｅｚら  ２０１６）を保有するＢＥＳＴＭＴ（ヘテロ接合ＳＮＰ  ｒｓ９７２３５５）ｉＲＰＥ中にＣｌ−流出を観察する。このバイオセンサーはＣｌ−に感受性であり、細胞内Ｃｌ−が増加すると、ＹＦＰ強度が低下し、その逆も同様である。Ｃａ２＋イオノホアＡ２３１８７による処理は、小胞体貯蔵所からのＣａ２＋放出を誘発し、ＢＥＳＴ１を活性化する（Ｍｏｓｈｆｅｇｈ，Ｖｅｌｅｚら  ２０１６）。以前に、刺激の２分以内に、バイオセンサーを発現するＷＴ  ＲＰＥ細胞は、低下された細胞内Ｃｌ−濃度を示し、続いて１５分以内に回復を示した（Ｇａｌｉｅｔｔａ，Ｈａｇｇｉｅら  ２００１，Ｍｏｓｈｆｅｇｈ，Ｖｅｌｅｚら  ２０１６）。
【０３５６】
特定のＣａ２＋濃度について、発明者らは、平均定常状態のＣｌ−電流、それらの９５％信頼区間を推定し、異なる電圧値でグループ間の比較をする。１００ｍＶで、Ｃｌ−電流密度も、異なるＣａ２＋濃度レベルでグループ間で比較する。蛍光バイオセンサーイメージング（Ｍｏｓｈｆｅｇｈ，Ｖｅｌｅｚら  ２０１６）を使用して、発明者らはまた、経時的なＣｌ−伝導度の軌跡を調べ、各時点でグループを比較する。この実験は、グループあたり２０個の異なる単一細胞で繰り返すことができる。グループ内の平均差（例えば、グループ内の異なる時点間）を比較すると、２０個の細胞が、０．０５の有意水準で０．６６の標準化された効果サイズ（すなわち、標準偏差の単位の平均差）を検出するのに８０％の力を有する。グループ間の平均差を比較すると（例えば、特定のＣａ２＋濃度でのグループ間の平均Ｃｌ−電流を比較すると）、グループあたり２０個の細胞が、０．０５の有意水準で０．９１の標準化された効果サイズ（すなわち、標準偏差の単位の平均差）を検出するのに８０％の力を有する。
【０３５７】
バイオセンサーの知見（Ｇａｌｉｅｔｔａ，Ｈａｇｇｉｅら  ２００１，Ｍｏｓｈｆｅｇｈ，Ｖｅｌｅｚら  ２０１６）を確認するために、ＥＰＣ１０パッチクランプ増幅器（ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）を用いて、ｉＲＰＥの全細胞記録を４８〜７２時間行う（Ｌｉ，Ｚｈａｎｇら  ２０１７）。
【０３５８】
発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ法がカルシウム依存性Ｃｌ−流出を回復させることを期待し、細胞をＲＰＥに分化させるか又はＣｌ−伝導度をイメージングする際の実験的な困難はないと予想する（Ｌｉ，Ｔｓａｉら  ２０１２，Ｌｉ，Ｗｕら  ２０１４，Ｙａｎｇ，Ｌｉら  ２０１４，Ｙａｎｇ，Ｌｉら  ２０１４，Ｍｏｓｈｆｅｇｈ，Ｖｅｌｅｚら  ２０１６，Ｌｉ，Ｚｈａｎｇら  ２０１７）。転写阻害の能力がＰＵＦ−ＫＲＡＢシステムによって強化されているので、第２世代のＣＲＩＳＰＲｉの性能は良好であるはずである。
【０３５９】
分化したＲＰＥが正常な極性、バイオマーカー発現、又は食作用能を示さない場合、発明者らはＲＰＥ分化プロトコルを変更するか、又はリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を使用する非ウイルス性ＣＲＩＳＰＲ送達システムを使用する。
【０３６０】
自然な病歴を特徴付けるためにＶＭＤ患者を調査する。
【０３６１】
短波長自己蛍光（ＳＷ−ＡＦ）、ＮＩＲ−ＡＦ、及びＯＣＴなどのイメージングモダリティは、発明者らのＣＲＩＳＰＲ介入を使用してＶＭＤを防止するための最適な枠を決定できる。
【０３６２】
マウスがヒトＶＭＤ表現型と似ていない（すなわち、適切なマウスモデルがない）（Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ，Ｗｕら  ２００６，Ｚｈａｎｇ，Ｓｔａｎｔｏｎら  ２０１０）ため、かつ組織病理学的材料が限定されているので、自然なＶＭＤ病歴の理解の進展は課題であった。また、どのようにＶＭＤが網膜の残りの部分よりも黄斑に不釣り合いに影響を及ぼすのか（Ｂｏｏｎ，Ｋｌｅｖｅｒｉｎｇら  ２００７，Ｂｏｏｎ，Ｔｈｅｅｌｅｎら  ２００９）、及び増加したＲＰＥリポフスチン形成が疾患の病因に寄与するか否かは、答えが出ていない。
【０３６３】
眼底異常は、典型的には、生涯の最初の２０年以内に可視的であるが、後期発症（例えば、年齢７５）の症例が報告されている（Ｍｕｌｌｉｎｓ、Ｏｈら  ２００５）。ＶＭＤの初期段階は、ＳＷ−ＡＦイメージングによって明確に説明され著しく強いように見える、中央黄斑中の体液に満たされているドーム状の病変（硝子体病変）によって特徴付けられる（Ｓｐａｉｄｅ，Ｎｏｂｌｅら  ２００６）。眼電図（ＥＯＧ）の暗谷に対する光ピークの比の減少は、ベストロフィノパチーの特徴であり、ＢＥＳＴ１の機能不全によって引き起こされる。外向きのＣａ２＋依存性Ｃｌ−伝導度及び重炭酸流出を含む、複数の陰イオンチャネル機能が、ＢＥＳＴ１の原因であった（Ｓｕｎ，Ｔｓｕｎｅｎａｒｉら  ２００２，Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｂａｋａｌｌら  ２００６，Ｑｕ及びＨａｒｔｚｅｌｌ  ２００８，Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ，Ｃｒｏｓｓら  ２００９）。発明者らは、光受容体細胞の健康に対する体液に満たされた病変の影響も追跡する。
【０３６４】
網膜下の体液の存続及び漿液性剥離によって引き起こされる形態学的並びに機能的変化にもかかわらず、中央の光受容体は治療可能であるので、ＶＭＤは年齢と共に着実に悪化するが、低下の速度は、典型的には遅く、長い治療枠を提供する（Ｐｏｎｊａｖｉｃ，Ｅｋｓａｎｄｈら  １９９９，Ｎｏｒｔｈ，Ｇｅｌｍａｎら  ２０１４，Ｙａｎｇ，Ｊｕｓｔｕｓら  ２０１５）。遺伝子型及び表現型の特徴の観察を組み合わせることにより、ＶＭＤを有する患者の進行速度及び予後を予測できる。現在、ＶＭＤを予測するための公開された指針はない。したがって、眼底検査に基づく層化及びカウンセリングは困難であった。  
【０３６５】
このデータは、ＯＣＴセグメント化、ｑＡＦ、ＮＩＲ−ＡＦイメージング及び機能試験を、患者の将来の視覚機能の分類及び予測に使用してよいことを示唆する（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｃｏｓｔａら  ２０１０，Ｄｕｎｃｋｅｒ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら  ２０１４，Ｆｕｎｇ，Ｙｚｅｒら  ２０１４，Ｎｏｒｔｈ，Ｇｅｌｍａｎら  ２０１４）。非侵襲性網膜イメージング法は、広く利用されており、子供にもやさしく、それらは網膜変性症及び疾患の進行の直接的で高感度の測定を迅速に提供する。ＶＭＤの特徴付けに以前に適用された現在のプロトコルの拡張（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｃｏｓｔａら  ２０１０，Ｄｕｎｃｋｅｒ，Ｍａｒｓｉｇｌｉａら  ２０１４，Ｆｕｎｇ，Ｙｚｅｒら  ２０１４，Ｎｏｒｔｈ，Ｇｅｌｍａｎら  ２０１４）は、これらの病態の治療試験における有効性を監視するための意味のある評価項目を提供することが期待される。
【０３６６】
ＶＭＤ患者の進行速度及び予後を評価するために、有効化された方法：遺伝子型判定、ＯＣＴセグメント化、ｑＡＦ、ＮＩＲ−ＡＦ、及び機能測定、の組み合わせを適用できる（Ｄｕｎｃｋｅｒ，Ｍａｒｓｉｇｌｉａら  ２０１４，Ｆｕｎｇ，Ｙｚｅｒら  ２０１４，Ｎｏｒｔｈ，Ｇｅｌｍａｎら  ２０１４）。正確なＯＣＴ−ｑＡＦ分類システムは、治療のための最良の段階を明らかにし、疾患の進行の重要な段階又は「戻れない」時点を特定する。治療的な編集は、卵黄破裂段階を超えて進行した患者に恩恵を与えない可能性がある（Ｐｏｎｊａｖｉｃ，Ｅｋｓａｎｄｈら  １９９９）。所見は、ＯＣＴの肥厚が最も早い病理学的マーカーであるという発見を実証できる（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｃｏｓｔａら  ２０１０，Ｑｕｅｒｑｕｅｓ，Ｚｅｒｂｉｂら  ２０１１）。この前駆症状段階は、まだ特徴付けられておらず、ＶＭＤにおけるＣＲＩＳＰＲベースの介入に最良の治療枠であり得る。
【０３６７】
自然病歴データは、臨床試験で使用される評価基準の設計を知らせることができる。確認された遺伝子型−表現型の相関及び正確な分類システムは、治験選択基準のための患者の層化を支援する。全ての臨床モダリティ、ＯＣＴセグメント化、ｑＡＦ及びＮＩＲ−ＡＦイメージングにおける増加の領域からの結果は、十分に大きなコホートにおける眼底誘導薄明視及び暗順応マイクロペリメトリー（Ｎｉｄｅｋ  ＭＰ−１Ｓ及びＭＡＩＡ）、及び自動化された明順応及び暗順応視野測定による桿体及び錐体機能の測定と組み合わせて、遺伝子型−表現型相関及び臨床分類の理解を容易にする。ＯＣＴセグメント化は、他の現在利用可能なイメージングツールよりも早い進行の検出を可能にし得る。進行速度は、眼の対側制御を可能にするように両側の一致を示す。発明者らのレジストリは、基本的な、臨床的研究及び薬理ゲノミクス研究のベンチマークとして役立つ。
【０３６８】
４年間にわたるＶＭＤ患者における疾患の進行を監視する際の信頼性のある評価項目としてのＳＷ−ＡＦ、ＮＩＲ−ＡＦ及びＳＤ−ＯＣＴイメージング対視覚機能試験（眼底視野測定及び自動化された明順応及び暗順応視野測定）の感度を比較する。
【０３６９】
疾患進行に起因する眼底での定量可能な変化は、ＳＷ−ＡＦ（４８８ｎｍ）及びＮＩＲ−ＡＦ（７８７ｎｍ）イメージング及びＯＣＴを含む現在のイメージングモダリティを用いて正確に実証できる。
【０３７０】
構造と機能のデータの感度及び比較は、４年間にわたる評価基準として評価できる。発明者らは、進行を検出し治療成績を決定するために、ＯＣＴ、ｑＡＦ、ＮＩＲ−ＡＦ及び眼底視野測定の有用性も評価する。
【０３７１】
実験
遺伝子型判定及び臨床的特徴づけ。全ての患者を、ＢＥＳＴ１中の変異についてスクリーニングする。診断は典型的に、国際臨床視覚電気生理学会（ＩＳＣＥＶ）の基準に従って記録されたＥＯＧにおける眼底の出現、家族病歴及びアーデン比の減少に基づいて行われる（Ｍａｒｍｏｒ，Ｂｒｉｇｅｌｌら  ２０１１）。ＶＭＤ患者を、眼底写真及びＯＣＴ所見に基づいて段階（無症候性、偽前房蓄膿、卵黄破裂、萎縮性）分けする（Ｇａｓｓ，Ｃｈｕａｎｇら  １９８８，Ｆｅｒｒａｒａ，Ｃｏｓｔａら  ２０１０）。
【０３７２】
ＳＷ−ＡＦ。定性的及び定量的なｑＡＦのために、ＳＷ−ＡＦ画像（３０°；４８８ｎｍ励起）を、記載されているような（Ｄｅｌｏｒｉ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら  ２０１１）様々なレーザパワー及び検出器ゲインを考慮するために内部蛍光基準物質を挿入することにより修正されたｃＳＬＯ（Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ  ＨＲＡ＋ＯＣＴ；Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて取得した。画像取得前に、瞳孔を、局所用１％のトロピカミド及び２．５％のフェニレフリンを用いて少なくとも７ｍｍに拡張する。焦点合わせ及びアライメントの間に、眼底を２０〜３０秒間露光して、ロドプシンを漂白する（Ｄｅｌｏｒｉ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら  ２０１１）。検出器の感度を、グレイレベル（ＧＬ）が検出器の線形範囲を超えない（ＧＬ＜１７５）ように調整する（Ｄｅｌｏｒｉ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら  ２０１１）。
【０３７３】
ＮＩＲ−ＡＦ。ＮＩＲ−ＡＦは主に、脈絡膜からの寄与がより小さいＲＰＥメラニンから生じる（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ及びＤｅｌｏｒｉ  ２００６，Ｄｕｎｃｋｅｒ，Ｔａｂａｃａｒｕら  ２０１３，Ｄｕｎｃｋｅｒ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら  ２０１４，Ｄｕｎｃｋｅｒ，Ｍａｒｓｉｇｌｉａら  ２０１４，Ｓｐａｒｒｏｗ，Ｍａｒｓｉｇｌｉａら  ２０１５，Ｌｅｅ，Ｘｉｅら  ２０１６，Ｓｃｈｕｅｒｃｈ，Ｍａｒｓｉｇｌｉａら  ２０１６）。発明者らは、４年間にわたり１年ごとに眼底ＡＦにおけるＮＩＲ−ＡＦの領域を実証し、それらとＳＷ−ＡＦ、ｑＡＦ、ＯＣＴで評価される網膜構造の変化、眼底視野測定により定量化された視覚的感度（ＭＡＩＡ−Ｎｉｄｅｔ−ＭＰ−１Ｓ）、並びに自動化された明順応及び暗順応視野測定とを相関させる。
【０３７４】
ＳＤ−ＯＣＴ。高分解能単一中心窩のスキャン（ｓｉｎｇｌｅ  ｆｏｖｅａｌ  ｓｃａｎ）及び体積厚さマップ（ｖｏｌｕｍｅ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｍａｐ）を利用する。ＯＣＴスキャンにおける反射バンドの割り当ては、Ｓｔａｕｒｅｎｇｈｉら（Ｓｔａｕｒｅｎｇｈｉ，Ｓａｄｄａら  ２０１４）に基づく。光受容体に起因する層の厚さを、コンピューター支援手動セグメント化技術を用いて評価する。光受容体の外側セグメントと等価の肥厚の進行を評価する（Ｑｕｅｒｑｕｅｓ，Ｚｅｒｂｉｂら  ２０１１，Ｄｕｎｃｋｅｒ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら  ２０１４）：ＳＤ−ＯＣＴ画像における楕円ゾーン（ＥＺ）喪失面積（Ｄｕｎｃｋｅｒ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら  ２０１４）を測定し、発明者らは、外側セグメントとＲＰＥ先端突起との間の嵌合ゾーン（ＩＺ）の肥厚が最も早い病理学的マーカーであるという知見を確証する（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｃｏｓｔａら  ２０１０，Ｑｕｅｒｑｕｅｓ，Ｚｅｒｂｉｂら  ２０１１）。この前駆症候段階は、まだ特徴付けられておらず、ＢＥＳＴ１予防のＣＲＩＳＰＲのための最良の治療枠であり得る。走査傾斜及びヘンレ線維の障害物を、画像取得と分析の両方の間に修正する。構造の変化（例えば、ＥＺ喪失の幅）を、マイクロペリメトリーと比較する。
【０３７５】
ＯＣＴ厚さ測定（ミクロン単位）における流体の解像度は、高感度の治療評価項目を提供し、遺伝子療法治験において必要とされる試料サイズを低下させることができる。
【０３７６】
ｑＡＦ強度が年齢に合った健康な眼の同じ位置で予想される強度よりも大きいかどうかを決定するために、疾患の各段階における卵黄様病変中のｑＡＦレベルを追跡する。
【０３７７】
光受容体細胞が機能しなくなり網膜アルデヒドを無毒化するためにエネルギーを消費できないので、ＰＯＳにおけるビスレチノイドの形成が加速される。
【０３７８】
背景。ＳＷ４８８ｎｍ光により励起され共焦点走査レーザー検眼鏡検査によりイメージングされる自然ＳＷ−ＡＦは、ＲＰＥビスレチノイドリポフスチンから主に派生することを示すスペクトルの特徴、位置、及び年齢の関係を示す。ＶＭＤの非病変領域においてＲＰＥリポフスチンが増加すると仮定された（Ｆｒａｎｇｉｅｈ，Ｇｒｅｅｎら  １９８２，Ｗｅｉｎｇｅｉｓｔ，Ｋｏｂｒｉｎら  １９８２，Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｆｌａｈｅｒｔｙら  １９８８，Ｄｅｌｏｒｉ，Ｄｏｒｅｙら  １９９５，Ｖｅｄａｎｔｈａｍ及びＲａｍａｓａｍｙ  ２００５，Ｓｐａｉｄｅ，Ｎｏｂｌｅら  ２００６，Ｂａｋａｌｌ，Ｒａｄｕら  ２００７，Ｚｈａｎｇ，Ｂｒｅｇｍａｎら  ２０１１，Ｓｉｎｇｈ，Ｓｈｅｎら  ２０１３）が、発明者らは、病変の外側のＳＷ−ＡＦ強度が年齢の通常の限界内にあることを非侵襲的ｑＡＦによって実証した（Ｄｕｎｃｋｅｒ，Ｍａｒｓｉｇｌｉａら  ２０１４）。この実験は、黄斑様病変の上昇したＳＷ−ＡＦを理解することである。本発明者らは、ＶＭＤ患者の黄斑様病変内に記録された発光スペクトルと健康な目のＲＰＥリポフスチンが同様の形状を有し、そのため、フルオロフォアが同じであることを示すと以前に報告した（Ｄｕｎｃｋｅｒ，Ｍａｒｓｉｇｌｉａら  ２０１４）。ＲＰＥリポフスチンはＰＯＳに由来することがよく知られているので（Ｓｐａｒｒｏｗ及びＹａｍａｍｏｔｏ  ２０１２）、黄斑様病変における自動蛍光物質は、病変内の外側セグメントのデブリの蓄積から派生する可能性が高い。実際に、ＰＯＳにおけるビスレチノイドの形成は、光受容体細胞が機能しなくなり網膜アルデヒドを無毒化するためにエネルギーを消費できないために加速される。そのため、強いＡＦは、機能障害性の光受容体細胞を示す。この考え方は、ＯＣＴで明らかなＯＮＬの薄化と一致している（Ｄｕｎｃｋｅｒ，Ｍａｒｓｉｇｌｉａら  ２０１４）。この問題は、光受容体細胞内で高められたビスレチノイドレベルが毒性であり、そのため光受容体の変性をさらに促進するかもしれないので、重要である。
【０３７９】
先行技術の研究の完了の成功は、ＣＲＩＳＰＲから、及びおそらく、ビスレチノイド形成の過剰生成に対抗する可能性を有する将来の小分子治療薬から恩恵を受けることができる患者を特定するのに役立つ（Ｓｐａｒｒｏｗ，Ｄｕｎｃｋｅｒら  ２０１６）。ビスレチノイド形成を減少させるために視覚サイクルを標的とすることは現在、前臨床研究及び臨床研究中である（Ｓｐａｒｒｏｗ，Ｄｕｎｃｋｅｒら  ２０１６）。
【０３８０】
実験設計
イメージング技術。黄斑様病変は、カラー眼底写真、ＮＩＲ反射率、ＮＩＲ−ＡＦ及びＳＷ−ＡＦ画像で特定される。ＳＷ−ＡＦ画像中の病変領域を、測定し（Ｉｍａｇｅ  Ｊ）、ペリメトリーによって画定される病変と比較する。黄斑及び偽前房蓄膿段階の患者について、病巣内のｑＡＦレベルを、ＶＭＤ患者の両眼における最小３つの位置（２６×２６ピクセル）で、矩形領域（関心領域、ＲＯＩ）で測定する。測定値は、２つの画像（各眼）から取得され、平均化して単一の値／眼を得る。ＶＭＤ患者におけるｑＡＦを、発明者らの健康な眼のデータベースから取得される値と比較する。対照値は、同じ偏心（画素）における５歳の類似の健康な目から、及び本発明者らのデータベース内の同じ人種／民族性の対象（２７７人の対象の３７４個の目；白人、アジア人、ヒスパニック系の女性及び男性））からのものである（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｄｕｎｃｋｅｒら  ２０１３）。
【０３８１】
ｑＡＦ分析のＳＷ−ＡＦ画像を、確立されたプロトコルに従って取得する（Ｄｅｌｏｒｉ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら  ２０１１）。簡単に説明すると、ＳＷ−ＡＦ画像（３０°、４８６ｎｍ励起）を、レーザパワー及び検出器ゲインの変動を考慮するために内部蛍光基準物質を挿入することにより修正された共焦点走査レーザー検眼鏡（Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ  ＨＲＡ＋ＯＣＴ；Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて取得した。グレイレベル（ＧＬ）が３０×３０°フィールド（７６８×７６８ピクセル）内で高速モード（８．９フレーム／秒）での検出器の線形範囲（ＧＬ＜１７５）を超えないように検出器の感度を調整する。フレームを整列させ、平均を「非正規化モード」（ヒストグラム伸張なし）で保存する。ＧＬを、ゼロＧＬ、倍率（屈折）、及び眼の媒体吸収を考慮した後に、内部基準物質のＧＬに対し較正する。
【０３８２】
統計的分析のために、混合効果モデルを、位置、偏心、年齢、性別及び人種−民族性を調整してデータに適合させ、これらから正規化したスコアを各眼の各位置について計算し、９５％の信頼区間の外側のｚスコアに注目した。
【０３８３】
病変内ｑＡＦは、網膜の非病変傍中心窩領域よりも何倍も高い。これらの非常に高いレベルのＡＦは、黄斑様病変の環境によって損なわれた光受容体細胞中で促進されたビスレチノイドを反映する。代替として、又はＲＯＩｑＡＦ手法に加えて、発明者らは、発明者らの標準的なｑＡＦセグメント分析（Ｄｅｌｏｒｉ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら  ２０１１）を用いてｑＡＦを測定する。この分析では、約５〜９°の偏心での８個の予め設定された円形配置セグメントの各々における平均ｑＡＦを計算し、平均化して、各画像に対する単一のｑＡＦ値を得る。セグメントは、病変と重複しない場合には除外できる。発明者らは、同じ患者の眼間の測定値及び一致の再現性を評価するためにＢｌａｎｄ−Ａｌｔｍａｎｎ手法を使用する。
【０３８４】
未治療の対側眼が適切な内部対照であるか否かを検証する。
【０３８５】
理論に縛られることなく、本発明者の仮説は、表現型の重症度及びＶＭＤ進行速度において両側の一致があるということである。
【０３８６】
方法
ＶＭＤを有する個体において、発明者らは、データセットを使用して、同じ患者の眼における疾患進行に関して両側一致の程度を長軸方向に計算する。発明者らは、ＯＣＴ、ＮＩＲ−ＡＦ及びＳＷ−ＡＦ画像における左右の黄斑様病変の変動性並びに対称性を評価し、ベースライン及び４年後の動的視野測定結果を評価する。発明者らは、黄斑様病変領域とｑＡＦも比較する。
【０３８７】
眼内一致／相関を、クラス内の相関係数（ＩＣＣ）及びピアソン係数を計算することによって試験する。ＩＣＣ推定値の９５％信頼区間に基づいて、０．５未満、０．５〜０．７５、０．７５〜０．９０、及び０．９０超の値は、それぞれ不良、中程度、良好、及び優れていると解釈される。
【０３８８】
表２．現在のｉＰＳドナーの人口統計及びＢＥＳＴ１の試験結果の状態
【表２】
2021519067.tif 000018
【０３８９】
試験は患者の眼間で同様の疾患進行率を示し、これは治療成果のために対照として反対側の未治療眼を使用するための支持を提供できる。患者の両眼の間で疾患進行に顕著な差がある場合、発明者らは、遺伝子療法後の光受容体疾患の進行を比較するために、ＶＭＤ進行の自然病歴について収集するデータを使用することを必要とする。
【０３９０】
発明者らは、４０人中２９人のＶＭＤ患者から線維芽細胞又はｉＰＳ細胞株を作製し、少なくとも合計５２人の患者を補充した。
【０３９１】
追加の患者を補充できる。以下は、追加患者を補充するためのいくつかの受入基準及び排除基準である。
【０３９２】
受入基準
１．完了／署名されたインフォームドコンセント又は両親の承諾を含む同意を提供する意思があり、提供できること。
２．４ヶ月間にわたる全ての要求される訪問で経過観察する能力。
３．年齢が４歳以上。
４．ＯＣＴ上でベスト疾患と一致する特徴を有する病原性ＢＥＳＴ１変異（複数可）又は特徴的な網膜電図（ＥＲＧ）及び眼球電図（ＥＯＧ）の分子確認を伴うベスト疾患の臨床的診断。
５．２０／４０又はそれより悪いベースライン基線視力。
６．マルチモード網膜イメージングに適する眼用媒体。品質の良い写真撮影を可能にする瞳孔拡張及び固定。
７．顕著な身体検査の所見又は臨床的に顕著な異常な実験結果を伴わない良好な一般的健康。
【０３９３】
除外基準
１．既存のＡＡＶ免疫。
２．疾患進行の長期的評価を混乱させ得る現在又は過去の網膜疾患。これは、硝子体出血、裂孔原性網膜剥離の病歴、及び緑内障を含むが、これらに限定されない。
３．病歴又は６ヶ月以内に実施された硝子体切除、白内障摘出術、及びＬＡＳＩＫを含むが、これに限定されない以前の眼内手術の証拠。
４．試験期間中のどこかで白内障を摘出することを望む患者。
５．優性又はＸ連鎖遺伝性網膜ジストロフィーを引き起こす遺伝子内の変異、又は劣性遺伝網膜疾患を引き起こすことが知られている２対立遺伝子変異の存在。
６．実験的治療を以前に受けたことがある。
７．結果を混乱させ得る過去の化学療法又は生物学的療法を受けたことがある。
【０３９４】
ＷＴ  ｃＤＮＡの送達を含む従来の遺伝子補充療法（Ｃｉｄｅｃｉｙａｎ，Ｊａｃｏｂｓｏｎら  ２０１３，Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ，Ｍｅｈａｔら  ２０１５）は、内因性変異型（ＭＴ）対立遺伝子が無傷のままであるという事実に起因して、常染色体優性又はドミナントネガティブの病態を改善する可能性は低い。ゲノム中の指定された位置で配列を特異的に編集するように操作されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）により指向されたＣａｓ９ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集技術が、変異遺伝子を破壊するために提唱された（Ｆｕ，Ｆｏｄｅｎら  ２０１３，Ｒａｎ，Ｈｓｕら  ２０１３，Ｐｙｚｏｃｈａ，Ｒａｎら  ２０１４，Ｓｍｉｔｈ，Ｇｏｒｅら  ２０１４，ＴｓａＩ，Ｗｙｖｅｋｅｎｓら  ２０１４，Ｓｍｉｔｈ，Ａｂａｌｄｅ−Ａｔｒｉｓｔａｉｎら  ２０１５，Ｗｕ，Ｔｓａｉら  ２０１６）。この手法は、この技術を次のレベルに上げ、そのような優性遺伝病態に対する従来の変異特異的標的よりむしろ、対立遺伝子特異的（又は親染色体特異的）標的化を可能にする。この困難に対処するために、この手法は、ＷＴ対立遺伝子が正常な機能を指示するために無傷のままであるように、対立遺伝子特異的に変異遺伝子を除去する（図１１）。本発明の方法は、他の黄斑変性症及び優性遺伝病態を治療するために使用されてよい。
【０３９５】
ｉＰＳ細胞の対立遺伝子特異的遺伝子編集標的としての正当化：ヒトにおいて、ＢＥＳＴ１は、Ｃａ２＋活性化Ｃｌ−チャネルとして機能し、ＶＭＤ患者のＲＰＥ細胞は、異常なＣｌ−流出を示す（Ｍｏｓｈｆｅｇｈ，Ｖｅｌｅｚら  ２０１６，Ｌｉ，Ｚｈａｎｇら  ２０１７）。しかしながら、ヘテロ接合型ＢＥＳＴ１＋／Ｗ９３ＣマウスからのＲＰＥ細胞は正常なＣｌ−伝導度を示すので、ＢＥＳＴ１は、マウスにおけるＣｌ−流出においては本質的にあまり重要でない役割を有し得る（Ｚｈａｎｇ，Ｓｔａｎｔｏｎら  ２０１０）。この同じ変異（＋／Ｗ９３Ｃ）は、ヒトでＶＭＤを引き起こす。適切な動物モデルが欠如しているので、発明者らは、患者自身のｉＰＳ細胞から誘導されたＣＲＩＳＰＲ編集ＲＰＥ（「ｉＲＰＥ」）を確立することにより、ＢＥＳＴ１機能の回復を試験するためのヒトモデルを開発した。発明者らはまた、ＣＲＩＳＰＲ編集されたＢＥＳＴ１タンパク質がＣｌ−を適切に放出するか否かを容易に評価するために、新規なＣｌ−バイオセンサーを作成した。
【０３９６】
多くのＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子療法は、変異特異的遺伝子修復戦略に焦点を当てているが、本発明の方法は、より一般化可能な手法を採用する。そうでない場合、２００超の異なるｇＲＮＡ及びそれぞれの臨床試験が、ＢＥＳＴ１に見られる全ての変異を包含するために必要とされる。そのため、発明者らは、複数の変異に適用可能なシステムを作成するためにＳＮＰヘテロ接合型を利用する新規な方法を考案した。ＢＥＳＴ１転写開始部位（ＴＳＳ）中のＳＮＰを使用して、ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡがＭＴ対立遺伝子とＷＴ対立遺伝子とを区別することを可能にできる。この手法は、これらのＳＮＰを病理学的変異にマッピングし、罹患した対立遺伝子のみを切断するようにＣａｓ９に指示するｇＲＮＡを設計することを含む。この革新的な手法は、ただ１つよりむしろ、全てのＢＥＳＴ１変異の標的化及び編集を可能にする。
【０３９７】
ＣＲＩＳＰＲｉの第２世代の適用は、ＰＵＦ−ＫＲＡＢ（プミリオｍＲＮＡ結合因子のクルッペル関連ボックスドメイン）リプレッサーの使用により、強力な遺伝子抑制活性を可能にする（図１５Ａ〜１５Ｂ）。ＣＲＩＳＰＲｉ設計は、ＫＲＡＢシステム（図１５Ｂ）をＡＡＶベクター中に適合させるための過剰サイズの困難を克服し、指定した遺伝子に対しより安定な遺伝子阻害をもたらす（Ｃｈｅｎｇ，Ｊｉｌｌｅｔｔｅら  ２０１６）。ＣＲＩＳＰＲｉはまた、ゲノムＤＮＡ改変を伴わないので、より安全な技術であると示唆される。
【０３９８】
提案された研究は革新的な評価基準を使用する。発明者らは、ＲＰＥに分化した正常なｉＰＳ細胞対ＶＭＤ患者由来ｉＰＳ細胞内の細胞内Ｃｌ−濃度の変化を評価するために、遺伝的にコードされた蛍光塩化物センサーを開発した。そのため、発明者らは、動物モデルでだけでなく患者のＲＰＥにおいても直接的に回復されたＢＥＳＴ１機能について試験できる。本発明の方法は、幹細胞療法を使用して、現在治療できない常染色体優性疾患を治癒できる。
【０３９９】
実施例９：ＣＲＩＳＰＲ３．０：異なる優性変異を保有するベストＶＭＤを有する患者の治療
本開示の方法及びシステムは、特定の種類のＳＮＰ遺伝子型の治療を提供する。最初に、サンガー配列決定を用いて、ベストＶＭＤを有する患者のＳＮＰ遺伝子型を決定する。約５０％の患者は、ＳＮＰの１つに対してヘテロ接合型であることが予想され、そのため、ＣＲＩＳＰＲ３．０を用いる治療の資格を得る。次に、資格のある患者を、ＳＮＰバリアントの各々と変異との間の対立遺伝子の連鎖を確認するために、血統分析（又は簡略化された連鎖遺伝子型判定）によりさらにハプロタイプ化する。最後に、患者を、変異型対立遺伝子の選択的切断のための２組の治療材料の１つで治療する。
【０４００】
ＣＲＩＳＰＲ３．０において、１対の密接に関連付けられるＳＮＰをＣＲＩＳＰＲ３．０で利用して、相同の対における各相同体の同一性をマークする。一実施形態では、密接に関連付けられるＳＮＰは、ｒ９７２３５５及びｒｓ９７２３５３を含む。しかしながら、ＢＥＳＴ１についてＳＮＰの密接に関連付けられるセットは、本明細書に記載の治療スキームに包含される。ＣＲＩＳＰＲ３．０は、少なくとも３つのｇＲＮＡの使用を含む。ＣＲＩＳＰＲ３．０を達成するために、３つのｇＲＮＡを設計する：ｇＲＮＡ−ａはＳＮＰバリアント１を標的にする；ｇＲＮＡ−ｂはＳＮＰバリアント２を標的にする；かつ、ｇＲＮＡ−ｃは下流のイントロン領域を標的にする。相同体１に変異が存在する場合（例えば、遺伝子型１）、ｇＲＮＡ−ａ＋ｇＲＮＡ−ｃを用いて、相同体１からの変異型ＢＥＳＴ１遺伝子の発現を特異的に破壊する。変異が、代わりに相同体２（例えば、遺伝子型２）上に存在する場合、ｇＲＮＡ−ｂ＋ｇＲＮＡ−ｃを用いる。
【０４０１】
図２２Ａ−（Ａ）に示すように、１対の密接に関連付けられるＳＮＰのｒ９７２３５５及びｒｓ９７２３５３を「ＣＲＩＳＰＲ３．０」で利用し、相同の対における各相同体の同一性をマークする。染色体上の両方のＳＮＰのヌクレオチドバリアントの全４つの可能な組み合わせが示されている。ＣＲＩＳＰＲ３．０を達成するために、３つのｇＲＮＡを設計した：ｇＲＮＡ−ａはｒｓ９７２３５５ヌクレオチドバリアントＧ（かつＡではない）を標的にする；ｇＲＮＡ−ｂはｒｓ９７２３５３ヌクレオチドバリアントＧ（かつＣではない）を標的にする；かつｇＲＮＡ−ｃは下流のイントロン領域を標的にする。変異が相同体１（遺伝子型１）に存在する場合、ｇＲＮＡ−ａ＋ｇＲＮＡ−ｃを用いて、相同体１からの変異型ＢＥＳＴ１遺伝子の発現を特異的に破壊する。変異が、代わりに相同体２（例えば、遺伝子型２）上に存在する場合、ｇＲＮＡ−ｂ＋ｇＲＮＡ−ｃを用いる。これらの２つのＳＮＰは遺伝子型３及び４における２つの相同体を区別しないので、これらの遺伝子型は、他のＳＮＰ及びｇＲＮＡの使用を必要とする。
【０４０２】
図２２Ｂ−（Ｂ）は、ｒｓ９７２３５５に基づいて設計されたｇＲＮＡセットを示し、ｒｓ９７２３５３は、ベストＶＭＤ患者集団（ＴＯＰＭＥＤデータベースに基づく遺伝子型１＋２）の約５０％を治療できる。各患者からのＤＮＡを分析して、治療前の遺伝子型を決定する（図２２Ｄ、ワークフロー参照）。
【０４０３】
図２３Ａは、ＣＲＩＳＰＲ３．０において、一対の密接に関連付けられるＳＮＰのｒ９７２３５５及びｒｓ９７２３５３を利用して相同の対における各相同体の同一性をマークすることを示す。染色体上の両方のＳＮＰのヌクレオチドバリアントの全４つの可能な組み合わせが示されている。ＣＲＩＳＰＲ３．０を達成するために、３つのｇＲＮＡを設計した：ｇＲＮＡ−ａはｒｓ９７２３５５ヌクレオチドバリアントＧ（かつＡではない）を標的にする；ｇＲＮＡ−ｂはｒｓ９７２３５３ヌクレオチドバリアントＧ（かつＣではない）を標的にする；かつ、ｇＲＮＡ−ｃは下流のイントロン領域を標的にする。変異が相同体１（遺伝子型１）に存在する場合、ｇＲＮＡ−ａ＋ｇＲＮＡ−ｃを用いて、相同体１からのＢＥＳＴ１遺伝子の発現を特異的に破壊する。変異が、代わりに相同体２（遺伝子型２）上に存在する場合、ｇＲＮＡ−ｂ＋ｇＲＮＡ−ｃを用いる。これらの２つのＳＮＰは遺伝子型３及び４における２つの相同体を区別しないので、これらの遺伝子型は、他のＳＮＰ及びｇＲＮＡの使用を必要とする。
【０４０４】
図２３Ｂ−（Ｂ）ｒｓ９７２３５５及びｒｓ９７２３５３に基づいて設計されたｇＲＮＡセットは、ベストＶＭＤ患者集団（ＴＯＰＭＥＤデータベースに基づく遺伝子型１＋２）の全体の約５０％を治療できる。各患者からのＤＮＡを分析して、治療前の遺伝子型を決定する（図２２Ｄ、ワークフロー参照）。
【０４０５】
図２４は、ＣＲＩＳＰＲ１．０、ＣＲＩＳＰＲ２．０及びＣＲＩＳＰＲ３．０戦略の概要である。
【０４０６】
図２５は、ＣＲＩＳＰＲ３．０治療のためのワークフローである。最初に、サンガー配列決定を用いて、ベストＶＭＤを有する患者のＳＮＰ遺伝子型を決定できる。患者の５０％は、ＳＮＰのうちの１つに対してヘテロ接合型であることが予想され（４９．９％、図２５参照）、そのため、治療の資格を得る。次に、資格のある患者を、血統分析（又は簡略化された連鎖遺伝子型判定）によりさらにハプロタイプ化し（図２４を参照）、ＳＮＰバリアントの各々と変異との間の対立遺伝子の連鎖を確認する。最後に、患者を、変異型対立遺伝子の選択的切断のために治療材料の２つのセットの１つで治療する（図２４参照）。
【０４０７】
実施例１０．ベストＶＭＤ患者の治療
ＣＳＧＴ（ＣＲＩＳＰＲ３．０）は、ベストＶＭＤ患者のほぼ半分のための治療である。３５人のベストＶＭＤ患者からの血液試料を用いてＢＥＳＴ１遺伝子を配列決定して、上流のＳＮＰのｒｓ９７２３５５とｒｓ９７２３５３の両方のヌクレオチドバリアントの全４つの可能な組み合わせを明らかにした（これらの２つのＳＮＰが遺伝的に連鎖していることに留意されたい）。相同染色体間のＴＳＳ  ＳＮＰの相違を利用するＣＲＩＳＰＲ３．０は、標的化ＴＳＳ  ＳＮＰがヘテロ接合型であるときに選択的遺伝子切断を媒介する。そのため、ベストＶＭＤ患者集団の４９．９％を表す遺伝子型１及び２（シス型で変異を有するＳＮＰヘテロ接合体）は、ＣＲＩＳＰＲ３．０によって治療可能であり、遺伝子型３及び４（ＳＮＰホモ接合体）は、ＣＲＩＳＰＲ２．０によって治療できる。図２６Ａ、Ｂ及びＣ。
【０４０８】
図２７Ｂにおける、デュアルｇＲＮＡによるゲノムＢＥＳＴ１の対立遺伝子特異的切除及びＲＰＥ細胞内のＳＮＰ編集におけるインビトロでのＢＥＳＴ１発現の測定。（Ａ）ゲノムＢＥＳＴ１を、異なるデュアルｇＲＮＡシステム（ＣＲＩＳＰＲ３．０）により、インビトロで２９３ＦＴ細胞において切断した。４つのグループのうち、切断された異なるサイズのＢＥＳＴ１対立遺伝子（矢印）が３つのグループ（Ｉ、ＩＩ及びＩＶ）で検出された。図２７Ａ（Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ２．０及び３．０編集ＶＭＤ  ｉＲＰＥにおけるＢＥＳＴ１発現は強い。ＶＭＤ患者の線維芽細胞由来のｉＲＰＥを、ＢＥＳＴ１対立遺伝子のＣＲＩＳＰＲ２．０又は３．０編集のためのレンチウイルスデュアルｇＲＮＡベクターで形質導入した；ＷＴ  ＢＥＳＴ１のｃＤＮＡ（＋ＷＴ）を保有するベクター又は保有しないベクター；ＷＴ  ｉＲＰＥは形質導入しなかった。２週間後に、ＲＮＡを収集し、ｃＤＮＡを作製し、ＢＥＳＴ１転写産物の発現をｑＰＣＲにより決定した。ＢＥＳＴ１のＰＣＲ産物は約２６０ｂｐである。ＷＴ、ＳＮＰ  ｒｓ９７２３５５についてホモ接合型のＷＴ  ＲＰＥ；対照、ＷＴ  ＢＥＳＴ１  ｃＤＮＡのみを保有するデュアルベクター（ｇＲＮＡを含まない）；ＧＡＰＤＨ、内部対照。対照グループではレンチウイルスベクターを用いず、内部対照としてＧＡＰＤＨを用いた。図２７Ｂ。
【０４０９】
等価物
特に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、この技術が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【０４１０】
本明細書に例示的に記載されている本技術は、本明細書に具体的に開示されていない要素又は複数の要素、制限又は複数の制限の非存在下で適切に実施され得る。そのため、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する」などは、拡張的に、限定されることなく読むべきである。さらに、本明細書で使用する用語及び表現は、限定ではなく、説明のための用語として使用されており、図示及び説明された特徴又はその一部の均等物を除外するというそのような用語並びに表現を使用する意図はないが、特許請求される本技術の範囲内で様々な変更が可能であることが認識される。
【０４１１】
そのため、本明細書で提供される材料、方法、及び実施例は、好ましい態様を代表するものであり、例示的なものであり、本技術の範囲を限定することを意図するものではないことを理解すべきである。
【０４１２】
本技術を、本明細書に広く、一般的に記載してきた。一般的な開示の範囲内のより狭い種及び亜属のグループ分けの各々も本技術の一部を形成する。これは、切除された物質が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から主題を除去する条件又は否定的な制限と共に本技術の一般的な説明を含む。
【０４１３】
加えて、本技術の特徴又は態様がマーカッシュ群に関して記載されている場合には、当業者は、本技術が、それによって、マーカッシュ群の個々のメンバー又はメンバーのサブグループに関して記載されていることを認識するであろう。
【０４１４】
本明細書で述べた全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、各々が参照により個々に本明細書に組み込まれる場合と同程度に、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。競合の場合、定義を含む本明細書が優先する。
【０４１５】
他の態様は、以下の特許請求の範囲に記載されている。
参考文献
Ａｓｕｒｉ，  Ｐ．，  Ｍ．  Ａ．  Ｂａｒｔｅｌ，  Ｔ．  Ｖａｚｉｎ，  Ｊ．−Ｈ．  Ｊａｎｇ，  Ｔ．  Ｂ．  Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｖ．  Ｓｃｈａｆｆｅｒ  （２０１２）．  ゛Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．゛  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０（２）：  ３２９−３３８．
Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ，  Ｊ．  Ｗ．，  Ｍ．  Ｓ．  Ｍｅｈａｔ，  Ｖ．  Ｓｕｎｄａｒａｍ，  Ｓ．  Ｊ．  Ｒｏｂｂｉｅ，  Ｓ．  Ｅ．  Ｂａｒｋｅｒ，  Ｃ．  Ｒｉｐａｍｏｎｔｉ，  Ａ．
Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ，  Ｆ．  Ｍ．  Ｍｏｗａｔ，  Ｓ．  Ｇ．  Ｂｅａｔｔｉｅ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｊ．  Ｇａｒｄｎｅｒ  （２０１５）．  ゛Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｎ  Ｌｅｂｅｒ’ｓ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ．゛  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３７２（２０）：  １８８７−１８９７．  
Ｂａｋａｌｌ，  Ｂ．，  Ｒ．  Ａ．  Ｒａｄｕ，  Ｊ．  Ｂ．  Ｓｔａｎｔｏｎ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｂｕｒｋｅ，  Ｂ．  Ｓ．  ＭｃＫａｙ，  Ｃ．  Ｗａｄｅｌｉｕｓ，  Ｒ．  Ｆ．  Ｍｕｌｌｉｎｓ，  Ｅ．  Ｍ．  Ｓｔｏｎｅ，  Ｇ．  Ｈ．  Ｔｒａｖｉｓ  ａｎｄ  Ａ．  Ｄ．  Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ  （２００７）．  ゛Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａ２Ｅ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｆｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＢＥＳＴ１  （ＶＭＤ２）．゛  Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ８５（１）：  ３４−４３．
Ｂａｓｓｕｋ，  Ａ．  Ｇ．，  Ａ．  Ｚｈｅｎｇ，  Ｙ．  Ｌｉ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｂ．  Ｍａｈａｊａｎ  （２０１６）．  ゛Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．゛  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ６：  １９９６９．
Ｂａｓｓｕｋ，  Ａ．  Ｇ．，  Ａ．  Ｚｈｅｎｇ，  Ｙ．  Ｌｉ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｂ．  Ｍａｈａｊａｎ  （２０１６）．  ゛Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ：  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ６．
Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ，  Ｎ．  Ｅ．，  Ｊ．  Ｋ．  Ｈａｌｌ，  Ｇ．  Ｌ．  Ｏｄｏｍ，  Ｍ．  Ｐ．  Ｐｈｅｌｐｓ，  Ｃ．  Ｒ．  Ａｎｄｒｕｓ，  Ｒ．  Ｄ．  Ｈａｗｋｉｎｓ，  Ｓ．  Ｄ．  Ｈａｕｓｃｈｋａ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓ．  Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  （２０１７）．  ゛Ｍｕｓｃｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．゛  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ８．
Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ，  Ｍ．，  Ｆ．  Ｂｉｅｔｚ，  Ｊ．  Ｌｉ，  Ｓ．  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｔ．  Ｓｔｏｄｄａｒｄ，  Ａ．  Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ，  Ｆ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｄ．  Ｆ．  Ｖｏｙｔａｓ，  Ｐ．
Ｄｕｃｈａｔｅａｕ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｈ．  Ｓｉｌｖａ  （２０１３）．  ゛Ｃｏｍｐａｃｔ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ＴＡＬＥＮｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．゛  Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ４：  １７６２．  
Ｂｏｏｎ，  Ｃ．  Ｊ．，  Ｂ．  Ｊ．  Ｋｌｅｖｅｒｉｎｇ，  Ａ．  Ｉ．  ｄｅｎ  Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，  Ｍ．  Ｎ．  Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ，  Ｔ．  Ｔｈｅｅｌｅｎ，  Ｆ．  Ｐ．  Ｃｒｅｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｂ．  Ｈｏｙｎｇ  （２００７）．  ゛Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．゛  Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １２５（８）：  １１００−１１０６．
Ｂｏｏｎ，  Ｃ．  Ｊ．，  Ｔ．  Ｔｈｅｅｌｅｎ，  Ｅ．  Ｈ．  Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔ，  Ｍ．  Ｊ．  ｖａｎ  Ｓｃｈｏｏｎｅｖｅｌｄ，  Ｊ．  Ｅ．  Ｋｅｕｎｅｎ，  Ｆ．  Ｐ．  Ｃｒｅｍｅｒｓ，  Ｂ．  Ｊ．  Ｋｌｅｖｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｂ．  Ｈｏｙｎｇ  （２００９）．  ゛Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｓｔ  ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．゛  Ｒｅｔｉｎａ  ２９（６）：  ８３５−８４７．
Ｃａｂｒａｌ，  Ｔ．，  Ｊ．  Ｅ．  ＤｉＣａｒｌｏ，  Ｓ．  Ｊｕｓｔｕｓ，  Ｊ．  Ｄ．  Ｓｅｎｇｉｌｌｏ，  Ｙ．  Ｘｕ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１７）．  ゛ＣＲＩＳＰＲ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ．゛  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ２８（３）：  ２５２−２５９．
Ｃｈｅｎｇ，  Ａ．  Ｗ．，  Ｎ．  Ｊｉｌｌｅｔｔｅ，  Ｐ．  Ｌｅｅ，  Ｄ．  Ｐｌａｓｋｏｎ，  Ｙ．  Ｆｕｊｉｗａｒａ，  Ｗ．  Ｗａｎｇ，  Ａ．  Ｔａｇｈｂａｌｏｕｔ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｗａｎｇ  （２０１６）．  ゛Ｃａｓｉｌｉｏ：  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−Ｐｕｍｉｌｉｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ．゛  Ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６（２）：  ２５４．
Ｃｈｏ，  Ｇ．  Ｙ．，  Ｙ．  Ａｂｄｕｌｌａ，  Ｊ．  Ｄ．  Ｓｅｎｇｉｌｌｏ，  Ｓ．  Ｊｕｓｔｕｓ，  Ｋ．  Ａ．  Ｓｃｈａｅｆｅｒ，  Ａ．  Ｇ．  Ｂａｓｓｕｋ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｂ．  Ｍａｈａｊａｎ  （２０１７）．  ゛ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．゛  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｒｅｐ  ５（３）：  １９９−２０６．
Ｃｈｏ，  Ｇ．  Ｙ．，  Ｓ．  Ｊｕｓｔｕｓ，  Ｊ．  Ｄ．  Ｓｅｎｇｉｌｌｏ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１７）．  ゛ＣＲＩＳＰＲ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒｅｔｉｎａ：  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．゛  Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  １０１６：  １４７−１５５．
Ｃｉｄｅｃｉｙａｎ，  Ａ．  Ｖ．，  Ｓ．  Ｇ．  Ｊａｃｏｂｓｏｎ，  Ｗ．  Ａ．  Ｂｅｌｔｒａｎ，  Ａ．  Ｓｕｍａｒｏｋａ，  Ｍ．  Ｓｗｉｄｅｒ，  Ｓ．  Ｉｗａｂｅ，  Ａ．  Ｊ．  Ｒｏｍａｎ，  Ｍ．  Ｂ．  Ｏｌｉｖａｒｅｓ，  Ｓ．  Ｂ．  Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ａ．  Ｍ．  Ｋｏｍａｒｏｍｙ  （２０１３）．  ゛Ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｌｅｂｅｒ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ  ｓｈｏｗｓ  ａｄｖａｎｃｉｎｇ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｖｉｓｕａｌ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ．゛  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １１０（６）：  Ｅ５１７−Ｅ５２５．
Ｄａｖｉｓ，  Ｒ．  Ｊ．，  Ｃ．−Ｗ．  Ｈｓｕ，  Ｙ．−Ｔ．  Ｔｓａｉ，  Ｋ．  Ｊ．  Ｗｅｒｔ，  Ｊ．  Ｓａｎｃｈｏ−Ｐｅｌｌｕｚ，  Ｃ．−Ｓ．  Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１３）．  ゛Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍａｒｇｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．゛  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３３（３３）：  １３４７５−１３４８３．
Ｄａｖｉｓ，  Ｒ．  Ｊ．，  Ｊ．  Ｔｏｓｉ，  Ｋ．  Ｍ．  Ｊａｎｉｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｋａｓａｎｕｋｉ，  Ｎ．−Ｋ．  Ｗａｎｇ，  Ｊ．  Ｋｏｎｇ，  Ｉ．  Ｔｓｕｉ，  Ｍ．  Ｃｉｌｌｕｆｆｏ，  Ｍ．  Ｌ．  Ｗｏｏｄｒｕｆｆ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｌ．  Ｆａｉｎ  （２００８）．  ゛Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｆｏｒ  ａ  ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ  ｃＧＭＰ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ６  ｂ  ａｌｌｅｌｅ  （Ｐｄｅ６ｂ  Ｈ６２０Ｑ）．゛  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ４９（１１）：  ５０６７−５０７６．
Ｄａｖｉｓ，  Ｒ．  Ｊ．，  Ｊ．  Ｔｏｓｉ，  Ｋ．  Ｍ．  Ｊａｎｉｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｋａｓａｎｕｋｉ，  Ｎ．  Ｋ．  Ｗａｎｇ，  Ｊ．  Ｋｏｎｇ，  Ｉ．  Ｔｓｕｉ，  Ｍ．  Ｃｉｌｌｕｆｆｏ，  Ｍ．  Ｌ．  Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，  Ｇ．  Ｌ．  Ｆａｉｎ，  Ｃ．  Ｓ．  Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２００８）．  ゛Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｆｏｒ  ａ  ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ  ｃＧＭＰ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ６  ｂ  ａｌｌｅｌｅ  （Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ）．゛  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４９（１１）：  ５０６７−５０７６．
Ｄｅｌｏｒｉ，  Ｆ．，  Ｊ．  Ｐ．  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，  Ｒ．  Ｌ．  Ｗｏｏｄｓ，  Ｊ．  Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｔ．  Ｄｕｎｃｋｅｒ，  Ｊ．  Ｓｐａｒｒｏｗ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｔ．  Ｓｍｉｔｈ  （２０１１）．  ゛Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｌａｓｅｒ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｓｃｏｐｅ．゛  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ５２（１３）：  ９３７９−９３９０．
Ｄｅｌｏｒｉ，  Ｆ．  Ｃ．，  Ｃ．  Ｋ．  Ｄｏｒｅｙ，  Ｇ．  Ｓｔａｕｒｅｎｇｈｉ，  Ｏ．  Ａｒｅｎｄ，  Ｄ．  Ｇ．  Ｇｏｇｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｊ．  Ｗｅｉｔｅｒ  （１９９５）．  ゛Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｃｕｌａｒ  ｆｕｎｄｕｓ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．゛  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３６（３）：  ７１８−７２９．
Ｄｅｙｌｅ，  Ｄ．  Ｒ．，  Ｉ．  Ｆ．  Ｋｈａｎ，  Ｇ．  Ｒｅｎ，  Ｐ．−Ｒ．  Ｗａｎｇ，  Ｊ．  Ｋｈｏ，  Ｕ．  Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ  （２０１２）．  ゛Ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ  ｉＰＳＣｓ．゛  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０（１）：  ２０４−２１３．
ＤｉＣａｒｌｏ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ａ．  Ｄｅｅｃｏｎｄａ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１７）．  ゛Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ
ＣＲＩＳＰＲ  Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．゛  Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  １０１６：  ３−２７．
Ｄｕｎｃｋｅｒ，  Ｔ．，  Ｊ．  Ｐ．  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，  Ｒ．  Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，  Ｄ．  Ｃ．  Ｈｏｏｄ，  Ｒ．  Ｔ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｔ．  Ｈｉｒｏｓｅ，  Ｒ．  Ｌ．  Ｗｏｏｄｓ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ，  Ｆ．  Ｃ．  Ｄｅｌｏｒｉ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｒ．  Ｓｐａｒｒｏｗ  （２０１４）．  ゛Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｆｕｎｄｕｓ  ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  ｂｅｓｔ  ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．゛  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ５５（３）：  １４７１−１４８２．
Ｄｕｎｃｋｅｒ，  Ｔ．，  Ｍ．  Ｍａｒｓｉｇｌｉａ，  Ｗ．  Ｌｅｅ，  Ｊ．  Ｚｅｒｎａｎｔ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ，  Ｒ．  Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ，  Ｖ．  Ｃ．  Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｒ．  Ｓｐａｒｒｏｗ  （２０１４）．  ゛Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ａｍｏｎｇ  ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ａｎｄ  ｓｈｏｒｔ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒａｌ−ｄｏｍａｉｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  Ｓｔａｒｇａｒｄｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．゛  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ５５（１２）：  ８１３４−８１４３．
Ｄｕｎｃｋｅｒ，  Ｔ．，  Ｍ．  Ｒ．  Ｔａｂａｃａｒｕ，  Ｗ．  Ｌｅｅ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｓｐａｒｒｏｗ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｃ．  Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ  （２０１３）．
゛Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ａｎｄ  ｓｈｏｒｔ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．゛  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ５４（１）：  ５８５−５９１．
Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｄ．  Ｃ．，  Ｒ．  Ａ．  Ｃｏｓｔａ，  Ｓ．  Ｔｓａｎｇ，  Ｄ．  Ｃａｌｕｃｃｉ，  Ｒ．  Ｊｏｒｇｅ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｂ．  Ｆｒｅｕｎｄ  （２０１０）．  ゛Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  ｆｕｎｄｕｓ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  Ｂｅｓｔ  ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．゛  Ｇｒａｅｆｅｓ  Ａｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ２４８（１０）：  １３７７−１３８６．
Ｆｒａｎｇｉｅｈ，  Ｇ．  Ｔ．，  Ｗ．  Ｒ．  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｌ．  Ｆｉｎｅ  （１９８２）．  ゛Ａ  ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｂｅｓｔ’ｓ  ｍａｃｕｌａｒ
ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．゛  Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １００（７）：  １１１５−１１２１．
Ｆｕ，  Ｙ．，  Ｊ．  Ａ．  Ｆｏｄｅｎ，  Ｃ．  Ｋｈａｙｔｅｒ，  Ｍ．  Ｌ．  Ｍａｅｄｅｒ，  Ｄ．  Ｒｅｙｏｎ，  Ｊ．  Ｋ．  Ｊｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｄ．  Ｓａｎｄｅｒ  （２０１３）．  ゛Ｈｉｇｈｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．゛  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１（９）：  ８２２−８２６．
Ｆｕｎｇ，  Ａ．  Ｔ．，  Ｓ．  Ｙｚｅｒ，  Ｎ．  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，  Ｈ．  Ｗａｎｇ，  Ｍ．  Ｎｉｓｓｅｎ，  Ａ．  Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ，  Ｊ．  Ｅ．  Ｍｅｒｒｉａｍ，  Ｅ．  Ｎ．  Ｂｕｋａｎｏｖａ，  Ｃ．  Ｃａｉ  ａｎｄ  Ｌ．  Ａ．  Ｙａｎｎｕｚｚｉ  （２０１５）．  ゛Ｎｅｗ  ｂｅｓｔ１  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎｏｐａｔｈｙ．゛  Ｒｅｔｉｎａ  （Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐａ．）  ３５（４）：  ７７３．
Ｇａｌｉｅｔｔａ，  Ｌ．  Ｊ．，  Ｐ．  Ｍ．  Ｈａｇｇｉｅ  ａｎｄ  Ａ．  Ｖｅｒｋｍａｎ  （２００１）．  ゛Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｈａｌｉｄｅ
ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ａｎｄ  ｉｏｄｉｄｅ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ．゛  ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ４９９（３）：  ２２０−２２４．
Ｇａｓｓ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｅ．  Ｌ．  Ｃｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｇｒａｎｅｋ  （１９８８）．  ゛Ａｃｕｔｅ  ｅｘｕｄａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ
ｍａｃｕｌｏｐａｔｈｙ．゛  Ｔｒａｎｓ  Ａｍ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｓｏｃ  ８６：  ３５４−３６６．
Ｇｏｕｒａｓ，  Ｐ．，  Ｊ．  Ｋｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２００２）．  ゛Ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＲＰＥ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ
ＲＰＥ６５−／−  ｍｉｃｅ．゛  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ４３（１０）：  ３３０７−３３１１．
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｐ．，  Ｔ．  Ｄｕｎｃｋｅｒ，  Ｒ．  Ｌ．  Ｗｏｏｄｓ，  Ｒ．  Ｔ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｓｐａｒｒｏｗ  ａｎｄ  Ｆ．  Ｃ．  Ｄｅｌｏｒｉ  （２０１３）．
゛Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｆｕｎｄｕｓ  ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｅｙｅｓ．゛  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ５４（８）：  ５６８４−５６９３．
Ｇｕｚｉｅｗｉｃｚ，  Ｋ．  Ｅ．，  Ｂ．  Ｚａｎｇｅｒｌ，  Ａ．  Ｍ．  Ｋｏｍａｒｏｍｙ，  Ｓ．  Ｉｗａｂｅ，  Ｖ．  Ａ．  Ｃｈｉｏｄｏ，  Ｓ．  Ｌ．  Ｂｏｙｅ，  Ｗ．  Ｗ．  Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ，  Ｗ．  Ａ．  Ｂｅｌｔｒａｎ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｄ．  Ａｇｕｉｒｒｅ  （２０１３）．  ゛Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＢＥＳＴ１  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ．゛  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８（１０）：  ｅ７５６６６．
Ｊａｎｉｓｃｈ，  Ｋ．  Ｍ．，  Ｊ．  Ｍ．  Ｋａｓａｎｕｋｉ，  Ｍ．  Ｃ．  Ｎａｕｍａｎｎ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｄａｖｉｓ，  Ｃ．−Ｓ．  Ｌｉｎ，  Ｓ．  Ｓｅｍｐｌｅ−Ｒｏｗｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２００９）．  ゛Ｌｉｇｈｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｍｍａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｃＧＭＰ−ｐｈｏｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  （ＰＤＥ６γ）  ａｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ２２  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ．゛  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３９０（４）：  １１４９−１１５３．
Ｊｕｓｔｕｓ，  Ｓ．，  Ｙ．−Ｔ．  Ｔｓａｉ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｗｕ，  Ｃ．  Ｗ．  Ｈｓｕ，  Ｗ．−Ｐ．  Ｗｕ，  Ａ．  Ｇ．  Ｂａｓｓｕｋ，  Ｖ．  Ｂ．  Ｍａｈａｊａｎ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１６）．  ゛Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒｅｔｉｎａ：  ａ  Ｃａｓｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ＣＲＩＳＰＲ  ｆｏｒ  ａ  Ｐａｔｉｅｎｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｕｔｏｓｏｍａｌ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ  Ｍｏｄｅｌ．゛  Ｔｕｒｋｓｋｅｎ  Ｋ，  ｅｄ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ００．
Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ，  Ｃ．  Ｎ．  ａｎｄ  Ｆ．  Ｃ．  Ｄｅｌｏｒｉ  （２００６）．  ゛Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｄｕｓ：
ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｃｕｌａｒ  ｍｅｌａｎｉｎ．゛  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４７（８）：  ３５５６−３５６４．
Ｋｈａｎ，  Ｉ．  Ｆ．，  Ｒ．  Ｋ．  Ｈｉｒａｔａ，  Ｐ．−Ｒ．  Ｗａｎｇ，  Ｙ．  Ｌｉ，  Ｊ．  Ｋｈｏ，  Ａ．  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｙ．  Ｈｕｏ，  Ｍ．  Ｚａｖａｌｊｅｖｓｋｉ，  Ｃ．  Ｗａｒｅ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ  （２０１０）．  ゛Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．゛  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８（６）：  １１９２−１１９９．
Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，  Ｂ．  Ｐ．，  Ｍ．  Ｓ．  Ｐｒｅｗ，  Ｓ．  Ｑ．  Ｔｓａｉ，  Ｎ．  Ｔ．  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｖ．  Ｖ．  Ｔｏｐｋａｒ，  Ｚ．  Ｚｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｋ．  Ｊｏｕｎｇ
（２０１５）．  ゛Ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｒａｎｇｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｂｙ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ＰＡＭ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．゛  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３（１２）：  １２９３−１２９８．
Ｋｏｃｈ，  Ｓ．  Ｆ．，  Ｙ．  Ｔ．  Ｔｓａｉ，  Ｊ．  Ｋ．  Ｄｕｏｎｇ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｗｕ，  Ｃ．  Ｗ．  Ｈｓｕ，  Ｗ．  Ｐ．  Ｗｕ，  Ｌ．  Ｂｏｎｅｔ−Ｐｏｎｃｅ，  Ｃ．  Ｓ．  Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１５）．  ゛Ｈａｌｔｉｎｇ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．゛  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２５（９）：  ３７０４−３７１３．
Ｌａｉ，  Ｃ．  Ｃ．，  Ｐ．  Ｇｏｕｒａｓ，  Ｋ．  Ｄｏｉ，  Ｆ．  Ｌｕ，  Ｈ．  Ｋｊｅｌｄｂｙｅ，  Ｓ．  Ｐ．  Ｇｏｆｆ，  Ｒ．  Ｐａｗｌｉｕｋ，  Ｐ．  Ｌｅｂｏｕｌｃｈ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （１９９９）．  ゛Ｔｒａｃｋｉｎｇ  ＲＰＥ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｂｙ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｗｉｔｈ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．゛  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４０（９）：  ２１４１−２１４６．
Ｌａｉ，  Ｃ．  Ｃ．，  Ｐ．  Ｇｏｕｒａｓ，  Ｋ．  Ｄｏｉ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ，  Ｓ．  Ｐ．  Ｇｏｆｆ  ａｎｄ  Ｐ．  Ａｓｈｔｏｎ  （２０００）．  ゛Ｌｏｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｌｏｎｇｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ＲＰＥ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｂｙ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．゛
Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ４１（１０）：  ３１３４−３１４１．
Ｌｅｅ，  Ｗ．，  Ｙ．  Ｘｉｅ，  Ｊ．  Ｚｅｒｎａｎｔ，  Ｂ．  Ｙｕａｎ，  Ｓ．  Ｂｅａｒｅｌｌｙ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｌｕｐｓｋｉ  ａｎｄ  Ｒ．  Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ  （２０１６）．  ゛Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｏｆ  ＡＢＣＡ４  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｆｏｕｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍａｃｕｌａｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．゛  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １３５（１）：  ９−１９．
Ｌｉ，  Ｙ．，  Ｌ．  Ｃｈａｎ，  Ｈ．  Ｖ．  Ｎｇｕｙｅｎ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１６）．  ゛Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｐａｔｉｅｎｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉＰＳＣ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  Ｃｅｌｌｓ．゛  Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ８５４：  ５４９−５５５．
Ｌｉ，  Ｙ．，  Ｙ．−Ｔ．  Ｔｓａｉ，  Ｃ．−Ｗ．  Ｈｓｕ，  Ｄ．  Ｅｒｏｌ，  Ｊ．  Ｙａｎｇ，  Ｗ．−Ｈ．  Ｗｕ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｄａｖｉｓ，  Ｄ．  Ｅｇｌｉ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１２）．  ゛Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  （ｉＰＳ）  ｇｒａｆｔｓ  ｉｎ  ａ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．゛  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８（１）：  １３１２．
Ｌｉ，  Ｙ．，  Ｙ．  Ｔ．  Ｔｓａｉ，  Ｃ．  Ｗ．  Ｈｓｕ，  Ｄ．  Ｅｒｏｌ，  Ｊ．  Ｙａｎｇ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｗｕ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｄａｖｉｓ，  Ｄ．  Ｅｇｌｉ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１２）．  ゛Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  （ｉＰＳ）  ｇｒａｆｔｓ  ｉｎ  ａ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．゛  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８：  １３１２−１３１９．
Ｌｉ，  Ｙ．，  Ｗ．−Ｈ．  Ｗｕ，  Ｃ．−Ｗ．  Ｈｓｕ，  Ｈ．  Ｖ．  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｙ．−Ｔ．  Ｔｓａｉ，  Ｌ．  Ｃｈａｎ，  Ｔ．  Ｎａｇａｓａｋｉ，  Ｉ．  Ｈ．  Ｍａｕｍｅｎｅｅ，  Ｌ．  Ａ．  Ｙａｎｎｕｚｚｉ  ａｎｄ  Ｑ．  Ｖ．  Ｈｏａｎｇ  （２０１４）．  ゛Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ａ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ  ｗｉｔｈ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｆｅｃｔｓ．゛  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２２（９）：  １６８８−１６９７．
Ｌｉ，  Ｙ．，  Ｗ．  Ｈ．  Ｗｕ，  Ｃ．  Ｗ．  Ｈｓｕ，  Ｈ．  Ｖ．  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｙ．  Ｔ．  Ｔｓａｉ，  Ｌ．  Ｃｈａｎ，  Ｔ．  Ｎａｇａｓａｋｉ，  Ｉ．  Ｈ．  Ｍａｕｍｅｎｅｅ，  Ｌ．  Ａ．  Ｙａｎｎｕｚｚｉ，  Ｑ．  Ｖ．  Ｈｏａｎｇ，  Ｈ．  Ｈｕａ，  Ｄ．  Ｅｇｌｉ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１４）．  ゛Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ａ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ  ｗｉｔｈ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｆｅｃｔｓ．゛  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２２（９）：  １６８８−１６９７．
Ｌｉ，  Ｙ．，  Ｙ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．  Ｘｕ，  Ａ．  Ｋｉｔｔｒｅｄｇｅ，  Ｎ．  Ｗａｒｄ，  Ｓ．  Ｃｈｅｎ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  ａｎｄ  Ｔ．  Ｙａｎｇ  （２０１７）．  ゛Ｐａｔｉｅｎｔｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｍｐａｉｒ  ＢＥＳＴＲＯＰＨＩＮ１’ｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｌ−ｃｕｒｒｅｎｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＲＰＥ．゛  ｅＬｉｆｅ  ６．
Ｌｏｎｇ，  Ｃ．，  Ｌ．  Ａｍｏａｓｉｉ，  Ａ．  Ａ．  Ｍｉｒｅａｕｌｔ，  Ｊ．  Ｒ．  ＭｃＡｎａｌｌｙ，  Ｈ．  Ｌｉ，  Ｅ．  Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｏｒｔｉｚ，  Ｓ．  Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｈｅｌｔｏｎ，  Ｒ．  Ｂａｓｓｅｌ−Ｄｕｂｙ  ａｎｄ  Ｅ．  Ｎ．  Ｏｌｓｏｎ  （２０１６）．  ゛Ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．゛  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１（６２７１）：  ４００−４０３．
Ｌｏｎｇ，  Ｃ．，  Ｊ．  Ｒ．  ＭｃＡｎａｌｌｙ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｈｅｌｔｏｎ，  Ａ．  Ａ．  Ｍｉｒｅａｕｌｔ，  Ｒ．  Ｂａｓｓｅｌ−Ｄｕｂｙ  ａｎｄ  Ｅ．  Ｎ．  Ｏｌｓｏｎ  （２０１４）．  ゛Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＤＮＡ．゛  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４５（６２０１）：  １１８４−１１８８．
Ｍ  Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，  Ａ．，  Ｐ．  Ｄｕｃｈａｔｅａｕ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓｍｉｔｈ  （２０１３）．  ゛Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＴＡＬ−ｅｆｆｅｃｔｏｒ
ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．゛  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  １３（４）：  ２９１−３０３．
Ｍａｌｉ，  Ｐ．，  Ｊ．  Ａａｃｈ，  Ｐ．  Ｂ．  Ｓｔｒａｎｇｅｓ，  Ｋ．  Ｍ．  Ｅｓｖｅｌｔ，  Ｍ．  Ｍｏｏｓｂｕｒｎｅｒ，  Ｓ．  Ｋｏｓｕｒｉ，  Ｌ．  Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｍ．  Ｃｈｕｒｃｈ  （２０１３）．  ゛ＣＡＳ９  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｉｒｅｄ  ｎｉｃｋａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．゛  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１（９）：  ８３３−８３８．
Ｍａｒｍｏｒ，  Ｍ．  Ｆ．，  Ｍ．  Ｇ．  Ｂｒｉｇｅｌｌ，  Ｄ．  Ｌ．  ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ，  Ｃ．  Ａ．  Ｗｅｓｔａｌｌ，  Ｍ．  Ｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  （２０１１）．  ゛ＩＳＣＥＶ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏ−ｏｃｕｌｏｇｒａｐｈｙ  （２０１０  ｕｐｄａｔｅ）．゛  Ｄｏｃ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １２２（１）：  １−７．
Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ，  Ａ．  Ｄ．，  Ｈ．  Ｅ．  Ｃｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｎ．  Ｓ．  Ｐｅａｃｈｅｙ  （２００９）．  ゛Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎｓ  ｉｎ  ｏｃｕｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａ．゛  Ｐｒｏｇ  Ｒｅｔｉｎ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ２８（３）：  ２０６−２２６．
Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ，  Ｌ．  Ｙ．，  Ｊ．  Ｗｕ，  Ｐ．  ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，  Ｊ．  Ｙｏｃｏｍ，  Ｍ．  Ｏ．  Ｋａｒｌ，  Ｒ．  Ｎｅｕｓｓｅｒｔ，  Ｓ．  Ｗｉｍｍｅｒｓ，  Ｊ．  Ｂ．  Ｓｔａｎｔｏｎ，  Ｒ．  Ｇ．  Ｇｒｅｇｇ，  Ｏ．  Ｓｔｒａｕｓｓ，  Ｎ．  Ｓ．  Ｐｅａｃｈｅｙ  ａｎｄ  Ａ．  Ｄ．  Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ  （２００６）．  ゛Ｔｈｅ  ｌｉｇｈｔ  ｐｅａｋ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ  （ｂｅｓｔ−１）．゛  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２７（５）：  ５７７−５８９．
Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ−Ｗａｒｄ，  Ｓ．，  Ｎ．  Ｃｈａｄｄｅｒｔｏｎ，  Ｍ．  Ｏ’ｒｅｉｌｌｙ，  Ａ．  Ｐａｌｆｉ，  Ｔ．  Ｇｏｌｄｍａｎｎ，  Ｃ．  Ｋｉｌｔｙ，  Ｍ．  Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，  Ｕ．  Ｗｏｌｆｒｕｍ，  Ｊ．  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ  （２０１１）．  ゛Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．゛  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  １９（４）：  ６４２−６４９．
Ｍｏｓｈｆｅｇｈ，  Ｙ．，  Ｇ．  Ｖｅｌｅｚ，  Ｙ．  Ｌｉ，  Ａ．  Ｇ．  Ｂａｓｓｕｋ，  Ｖ．  Ｂ．  Ｍａｈａｊａｎ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１６）．  ゛ＢＥＳＴＲＯＰＨＩＮ１  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｃａｕｓｅ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＲＰＥ．゛  Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５（１３）：  ２６７２−２６８０．
Ｍｕｌｌｉｎｓ，  Ｒ．  Ｆ．，  Ｋ．  Ｔ．  Ｏｈ，  Ｅ．  Ｈｅｆｆｒｏｎ，  Ｇ．  Ｓ．  Ｈａｇｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｅ．  Ｍ．  Ｓｔｏｎｅ  （２００５）．  ゛Ｌａｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｌｅｃｋｓ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｂｅｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ．゛  Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １２３（１１）：  １５８８−１５９４．
Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｃ．  Ｅ．，  Ｃ．  Ｈ．  Ｈａｋｉｍ，  Ｄ．  Ｇ．  Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ，  Ｐ．  Ｉ．  Ｔｈａｋｏｒｅ，  Ｅ．  Ａ．  Ｍｏｒｅｂ，  Ｒ．  Ｍ．  Ｃ．  Ｒｉｖｅｒａ，  Ｓ．
Ｍａｄｈａｖａｎ，  Ｘ．  Ｐａｎ，  Ｆ．  Ａ．  Ｒａｎ  ａｎｄ  Ｗ．  Ｘ．  Ｙａｎ  （２０１６）．  ゛Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｍｕｓｃｌｅ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．゛  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１（６２７１）：  ４０３−４０７．
Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｈ．  Ｖ．，  Ｙ．  Ｌｉ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１５）．  ゛Ｐａｔｉｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉＰＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＲＰＥ  ｆｏｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．゛  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４（４）：  ５６７−５７８．
Ｎｏｒｔｈ，  Ｖ．，  Ｒ．  Ｇｅｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１４）．  ゛Ｊｕｖｅｎｉｌｅ−ｏｎｓｅｔ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｌｉｅｄ
ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．゛  Ｄｅｖ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ５３：  ４４−５２．
Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，  Ｓ．，  Ｗ．  Ａ．  Ｆｌａｈｅｒｔｙ，  Ｇ．  Ａ．  Ｆｉｓｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｅ．  Ｌ．  Ｂｅｒｓｏｎ  （１９８８）．  ゛Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｂｅｓｔ’ｓ  ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．゛  Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １０６（９）：  １２６１−１２６８．
Ｏｒｔｅｇａ，  Ｓ．，  Ｍ．  Ｉｔｔｍａｎｎ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ，  Ｍ．  Ｅｈｒｌｉｃｈ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｂａｓｉｌｉｃｏ  （１９９８）．  ゛Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２．゛  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９５  （１０）：  ５６７２−５６７７．
Ｐａｎｇ，  Ｊ．−ｊ．，  Ａ．  Ｌａｕｒａｍｏｒｅ，  Ｗ．−ｔ．  Ｄｅｎｇ，  Ｑ．  Ｌｉ，  Ｔ．  Ｊ．  Ｄｏｙｌｅ，  Ｖ．  Ｃｈｉｏｄｏ，  Ｊ．  Ｌｉ  ａｎｄ  Ｗ．  Ｗ．  Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ  （２００８）．  ゛Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｒｅｔｉｎａ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．゛  Ｖｉｓｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４８（３）：  ３７７−３８５．
Ｐｅｔｅｒｓｅｎ−Ｊｏｎｅｓ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｌ．  Ｍ．  Ｏｃｃｅｌｌｉ，  Ｐ．  Ａ．  Ｗｉｎｋｌｅｒ，  Ｗ．  Ｌｅｅ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｓｐａｒｒｏｗ，  Ｍ．  Ｔｓｕｋｉｋａｗａ，  Ｓ．  Ｌ．  Ｂｏｙｅ，  Ｖ．  Ｃｈｉｏｄｏ，  Ｊ．  Ｅ．  Ｃａｐａｓｓｏ，  Ｅ．  Ｂｅｃｉｒｏｖｉｃ，  Ｃ．  Ｓｃｈｏｎ，  Ｍ．  Ｗ．  Ｓｅｅｌｉｇｅｒ，  Ａ．  Ｖ．  Ｌｅｖｉｎ，  Ｓ．  Ｍｉｃｈａｌａｋｉｓ，  Ｗ．  Ｗ．  Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１８）．  ゛Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ＣＮＧｂｅｔａ１−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｇｅｎｅ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ．゛  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２８（１）：  １９０−２０６．
Ｐｌａｔｔ，  Ｒ．  Ｊ．，  Ｓ．  Ｃｈｅｎ，  Ｙ．  Ｚｈｏｕ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｙｉｍ，  Ｌ．  Ｓｗｉｅｃｈ，  Ｈ．  Ｒ．  Ｋｅｍｐｔｏｎ，  Ｊ．  Ｅ．  Ｄａｈｌｍａｎ，  Ｏ．  Ｐａｒｎａｓ，  Ｔ．  Ｍ．  Ｅｉｓｅｎｈａｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ  （２０１４）．  ゛ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｋｎｏｃｋｉｎ  ｍｉｃｅ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ．゛  Ｃｅｌｌ  １５９（２）：  ４４０−４５５．
Ｐｏｎｊａｖｉｃ，  Ｖ．，  Ｌ．  Ｅｋｓａｎｄｈ，  Ｓ．  Ａｎｄｒｅａｓｓｏｎ，  Ｋ．  Ｓｊｏｓｔｒｏｍ，  Ｂ．  Ｂａｋａｌｌ，  Ｓ．  Ｉｎｇｖａｓｔ，  Ｃ．  Ｗａｄｅｌｉｕｓ  ａｎｄ  Ｂ．
Ｅｈｉｎｇｅｒ  （１９９９）．  ゛Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｓｔ’ｓ  ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ．゛  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｇｅｎｅｔ  ２０（４）：  ２５１−２５７．
Ｐｙｚｏｃｈａ，  Ｎ．  Ｋ．，  Ｆ．  Ａ．  Ｒａｎ，  Ｐ．  Ｄ．  Ｈｓｕ  ａｎｄ  Ｆ．  Ｚｈａｎｇ  （２０１４）．  ゛ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ
ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．゛  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  ２６９−２７７．
Ｑｕ，  Ｚ．  ａｎｄ  Ｈ．  Ｃ．  Ｈａｒｔｚｅｌｌ  （２００８）．  ゛Ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ  Ｃｌ−  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ａｒｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｔｏ  ＨＣＯ３．゛  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９４（６）：  Ｃ１３７１−１３７７．
Ｑｕｅｒｑｕｅｓ，  Ｇ．，  Ｊ．  Ｚｅｒｂｉｂ，  Ｒ．  Ｓａｎｔａｃｒｏｃｅ，  Ｍ．  Ｍａｒｇａｇｌｉｏｎｅ，  Ｎ．  Ｄｅｌｐｈｉｎ，  Ｌ．  Ｑｕｅｒｑｕｅｓ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｒｏｚｅｔ，  Ｊ．  Ｋａｐｌａｎ  ａｎｄ  Ｅ．  Ｈ．  Ｓｏｕｉｅｄ  （２０１１）．  ゛Ｔｈｅ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｅｓｔ  ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＢＥＳＴ１  ｇｅｎｅ．゛  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ５２（７）：  ４６７８−４６８４．
Ｒａｎ，  Ｆ．  Ａ．，  Ｌ．  Ｃｏｎｇ，  Ｗ．  Ｘ．  Ｙａｎ，  Ｄ．  Ａ．  Ｓｃｏｔｔ，  Ｊ．  Ｓ．  Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，  Ａ．  Ｊ．  Ｋｒｉｚ，  Ｂ．  Ｚｅｔｓｃｈｅ，  Ｏ．  Ｓｈａｌｅｍ，  Ｘ．  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｓ．  Ｍａｋａｒｏｖａ  （２０１５）．  ゛Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９．゛  Ｎａｔｕｒｅ  ５２０（７５４６）：  １８６−１９１．
Ｒａｎ，  Ｆ．  Ａ．，  Ｐ．  Ｄ．  Ｈｓｕ，  Ｃ．−Ｙ．  Ｌｉｎ，  Ｊ．  Ｓ．  Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，  Ｓ．  Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，  Ａ．  Ｅ．  Ｔｒｅｖｉｎｏ，  Ｄ．  Ａ．  Ｓｃｏｔｔ，  Ａ．
Ｉｎｏｕｅ，  Ｓ．  Ｍａｔｏｂａ  ａｎｄ  Ｙ．  Ｚｈａｎｇ  （２０１３）．  ゛Ｄｏｕｂｌｅ  ｎｉｃｋｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．゛  Ｃｅｌｌ  １５４（６）：  １３８０−１３８９．
Ｒａｐｔｉ，  Ｋ．，  Ｆ．  Ｓｔｉｌｌｉｔａｎｏ，  Ｉ．  Ｋａｒａｋｉｋｅｓ，  Ｍ．  Ｎｏｎｎｅｎｍａｃｈｅｒ，  Ｔ．  Ｗｅｂｅｒ，  Ｊ．−Ｓ．  Ｈｕｌｏｔ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｊ．  Ｈａｊｊａｒ  （２０１５）．  ゛Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ．゛  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＆  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２：  １４０６７．
Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，  Ｒ．，  Ｂ．  Ｂａｋａｌｌ，  Ｔ．  Ｋｉｎｎｉｃｋ，  Ｎ．  Ｐｅａｃｈｅｙ，  Ｓ．  Ｗｉｍｍｅｒｓ，  Ｃ．  Ｗａｄｅｌｉｕｓ，  Ａ．  Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｏ．  Ｓｔｒａｕｓｓ  （２００６）．  ゛Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ−１，  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＶＭＤ２  ｇｅｎｅ，  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃａ２＋  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．゛  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２０（１）：  １７８−１８０．
Ｓａｎｃｈｏ−Ｐｅｌｌｕｚ，  Ｊ．，  Ｊ．  Ｔｏｓｉ，  Ｃ．−Ｗ．  Ｈｓｕ，  Ｆ．  Ｌｅｅ，  Ｋ．  Ｗｏｌｐｅｒｔ，  Ｍ．  Ｒ．  Ｔａｂａｃａｒｕ，  Ｊ．  Ｐ．  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，  Ｓ．  Ｈ．
Ｔｓａｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．−Ｓ．  Ｌｉｎ  （２０１２）．  ゛Ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｄ１９０Ｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ：  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ−ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．゛  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８（１）：  ５４９．
Ｓａｎｃｈｏ−Ｐｅｌｌｕｚ，  Ｊ．，  Ｊ．  Ｔｏｓｉ，  Ｃ．  Ｗ．  Ｈｓｕ，  Ｆ．  Ｌｅｅ，  Ｋ．  Ｗｏｌｐｅｒｔ，  Ｍ．  Ｒ．  Ｔａｂａｃａｒｕ，  Ｊ．  Ｐ．  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，  Ｓ．  Ｈ．
Ｔｓａｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｓ．  Ｌｉｎ  （２０１２）．  ゛Ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｄ１９０Ｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ：  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ−ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．゛  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８（１）：  ５４９−５５５．
Ｓｃｈｕｅｒｃｈ，  Ｋ．，  Ｍ．  Ｍａｒｓｉｇｌｉａ，  Ｗ．  Ｌｅｅ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｒ．  Ｓｐａｒｒｏｗ  （２０１６）．  ゛Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｉｇｍｅｎｔａｒｙ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．゛  Ｒｅｔｉｎａ．
Ｓｈｅｎ，  Ｂ．，  Ｗ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．  Ｚｈｏｕ，  Ｊ．  Ｗａｎｇ，  Ｌ．  Ｃｈｅｎ，  Ｌ．  Ｗａｎｇ，  Ａ．  Ｈｏｄｇｋｉｎｓ，  Ｖ．  Ｉｙｅｒ  ａｎｄ  Ｘ．
Ｈｕａｎｇ  （２０１４）．  ゛Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｎｉｃｋａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ
ｅｆｆｅｃｔｓ．゛  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １１（４）：  ３９９−４０２．
Ｓｉｎｇｈ，  Ｒ．，  Ｗ．  Ｓｈｅｎ，  Ｄ．  Ｋｕａｉ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｘ．  Ｇｕｏ，  Ｍ．  Ａ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｅ．  Ｔ．  Ｐｅｒｅｚ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｉｍｏｎｅｔｔ，  Ｋ．  Ａ．  Ｗａｌｌａｃｅ，  Ａ．  Ｄ．  Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ，  Ｅ．  Ｅ．  Ｃａｐｏｗｓｋｉ，  Ｘ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．  Ｙｉｎ，  Ｐ．  Ｊ．  Ｈａｌｂａｃｈ，  Ｇ．  Ａ．  Ｆｉｓｈｍａｎ，  Ｌ．  Ｓ．  Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｂ．  Ｒ．  Ｐａｔｔｎａｉｋ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｍ．  Ｇａｍｍ  （２０１３）．  ゛ｉＰＳ  ｃｅｌｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｅｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．゛  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２２（３）：  ５９３−６０７．
Ｓｍｉｔｈ，  Ｃ．，  Ｌ．  Ａｂａｌｄｅ−Ａｔｒｉｓｔａｉｎ，  Ｃ．  Ｈｅ，  Ｂ．  Ｒ．  Ｂｒｏｄｓｋｙ，  Ｅ．  Ｍ．  Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ，  Ｐ．  Ｃｈａｕｄｈａｒｉ，  Ｙ．−Ｙ．  Ｊａｎｇ，  Ｌ．  Ｃｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｚ．  Ｙｅ  （２０１５）．  ゛Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｌｏｃｉ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉＰＳＣｓ．゛  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２３（３）：  ５７０−５７７．
Ｓｍｉｔｈ，  Ｃ．，  Ａ．  Ｇｏｒｅ，  Ｗ．  Ｙａｎ，  Ｌ．  Ａｂａｌｄｅ−Ａｔｒｉｓｔａｉｎ，  Ｚ．  Ｌｉ，  Ｃ．  Ｈｅ，  Ｙ．  Ｗａｎｇ，  Ｒ．  Ａ．  Ｂｒｏｄｓｋｙ，  Ｋ．  Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｌ．  Ｃｈｅｎｇ  （２０１４）．  ゛Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｈｉｇｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ａｎｄ  ＴＡＬＥＮ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉＰＳＣｓ．゛  Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  １５（１）：  １２−１３．
Ｓｐａｉｄｅ，  Ｒ．  Ｆ．，  Ｋ．  Ｎｏｂｌｅ，  Ａ．  Ｍｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｂ．  Ｆｒｅｕｎｄ  （２００６）．  ゛Ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．゛
Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １１３（８）：  １３９２−１４００．
Ｓｐａｒｒｏｗ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｔ．  Ｄｕｎｃｋｅｒ，  Ｒ．  Ｗｏｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆ．  Ｃ．  Ｄｅｌｏｒｉ  （２０１６）．  ゛Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｕｎｄｕｓ
Ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｂｅｓｔ  Ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ  Ｍａｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：  ＲＰＥ  Ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎ  ｉｓ  ｎｏｔ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  Ｎｏｎ−Ｌｅｓｉｏｎ  Ａｒｅａｓ  ｏｆ  Ｒｅｔｉｎａ．゛  Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ８５４：  ２８５−２９０．
Ｓｐａｒｒｏｗ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｍ．  Ｍａｒｓｉｇｌｉａ，  Ｒ．  Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ，  Ｓ．  Ｔｓａｎｇ，  Ｗ．  Ｌｅｅ，  Ｔ．  Ｄｕｎｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｚｅｒｎａｎｔ  （２０１５）．
゛Ｆｌｅｃｋｓ  ｉｎ  Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  Ｓｔａｒｇａｒｄｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ：  Ｓｈｏｒｔ−Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，  Ｎｅａｒ−Ｉｎｆｒａｒｅｄ
Ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ．゛  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ５６（８）：  ５０２９−５０３９．
Ｓｐａｒｒｏｗ，  Ｊ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ｋ．  Ｙａｍａｍｏｔｏ  （２０１２）．  ゛Ｔｈｅ  ｂｉｓｒｅｔｉｎｏｉｄｓ  ｏｆ  ＲＰＥ  ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎ：  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｉｘｔｕｒｅ．゛  Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ７２３：  ７６１−７６７．
Ｓｔａｕｒｅｎｇｈｉ，  Ｇ．，  Ｓ．  Ｓａｄｄａ，  Ｕ．  Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ，  Ｒ．  Ｆ．  Ｓｐａｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ
Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  （２０１４）．  ゛Ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ｌｅｘｉｃｏｎ  ｆｏｒ  ａｎａｔｏｍｉｃ  ｌａｎｄｍａｒｋｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ
ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｓｐｅｃｔｒａｌ−ｄｏｍａｉｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：  ｔｈｅ  ＩＮ＊ＯＣＴ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．゛
Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １２１（８）：  １５７２−１５７８．
Ｓｕｎ，  Ｈ．，  Ｔ．  Ｔｓｕｎｅｎａｒｉ，  Ｋ．  Ｗ．  Ｙａｕ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｎａｔｈａｎｓ  （２００２）．  ゛Ｔｈｅ  ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  ｎｅｗ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｈａｎｎｅｌｓ．゛  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９（６）：  ４００８−４０１３．
Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ，  Ｍ．，  Ｋ．  Ｚｈｕ，  Ｊ．  Ｋ．  Ｃｈｅｎｇ，  Ｗ．  Ｌ．  Ｃｈｅｗ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｗｉｄｒｉｃｋ，  Ｗ．  Ｘ．  Ｙａｎ，  Ｃ．  Ｍａｅｓｎｅｒ，  Ｅ．  Ｙ．  Ｗｕ，  Ｒ．  Ｘｉａｏ  ａｎｄ  Ｆ．  Ａ．  Ｒａｎ  （２０１６）．  ゛Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．゛  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１（６２７１）：  ４０７−４１１．
Ｔｏｓｉ，  Ｊ．，  Ｒ．  Ｊ．  Ｄａｖｉｓ，  Ｎ．  Ｋ．  Ｗａｎｇ，  Ｍ．  Ｎａｕｍａｎｎ，  Ｃ．  Ｓ．  Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１１）．  ゛ｓｈＲＮＡ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｏｆ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ２ｅ  ｏｒ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｌｐｈａ  １  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ａ  ｃＧＭＰ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．゛  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １５（８）：  １７７８−１７８７．
Ｔｏｓｉ，  Ｊ．，  Ｊ．  Ｓａｎｃｈｏ−Ｐｅｌｌｕｚ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｄａｖｉｓ，  Ｃ．  Ｗ．  Ｈｓｕ，  Ｋ．  Ｖ．  Ｗｏｌｐｅｒｔ，  Ｊ．  Ｄ．  Ｓｅｎｇｉｌｌｏ，  Ｃ．  Ｓ．  Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１１）．  ゛Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ａｎｄ  ｓｈＲＮＡ  ｓｌｏｗｓ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．゛  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  （Ｍａｙｗｏｏｄ）．
Ｔｒａｐａｎｉ，  Ｉ．，  Ｐ．  Ｃｏｌｅｌｌａ，  Ａ．  Ｓｏｍｍｅｌｌａ，  Ｃ．  Ｉｏｄｉｃｅ，  Ｇ．  Ｃｅｓｉ，  Ｓ．  ｄｅ  Ｓｉｍｏｎｅ，  Ｅ．  Ｍａｒｒｏｃｃｏ，  Ｓ．  Ｒｏｓｓｉ，  Ｍ．
Ｇｉｕｎｔｉ  ａｎｄ  Ａ．  Ｐａｌｆｉ  （２０１４）．  ゛Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎａ  ｂｙ  ｄｕａｌ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ．゛  ＥＭＢＯ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（２）：  １９４−２１１．
Ｔｓａｉ，  Ｓ．  Ｑ．，  Ｎ．  Ｗｙｖｅｋｅｎｓ，  Ｃ．  Ｋｈａｙｔｅｒ，  Ｊ．  Ａ．  Ｆｏｄｅｎ，  Ｖ．  Ｔｈａｐａｒ，  Ｄ．  Ｒｅｙｏｎ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｇｏｏｄｗｉｎ，  Ｍ．  Ｊ．  Ａｒｙｅｅ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｋ．  Ｊｏｕｎｇ  （２０１４）．  ゛Ｄｉｍｅｒｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．゛  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２（６）：  ５６９−５７６．
Ｔｓａｎｇ，  Ｓ．  Ｈ．，  Ｍ．  Ｅ．  Ｂｕｒｎｓ，  Ｐ．  Ｄ．  Ｃａｌｖｅｒｔ，  Ｐ．  Ｇｏｕｒａｓ，  Ｄ．  Ａ．  Ｂａｙｌｏｒ，  Ｓ．  Ｐ．  Ｇｏｆｆ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｙ．  Ａｒｓｈａｖｓｋｙ  （１９９８）．  ゛Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎ  ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．゛  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２（５３８６）：  １１７−１２１．
Ｔｓａｎｇ，  Ｓ．  Ｈ．，  Ｌ．  Ｃｈａｎ，  Ｙ．  Ｔ．  Ｔｓａｉ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｗｕ，  Ｃ．  Ｗ．  Ｈｓｕ，  Ｊ．  Ｙａｎｇ，  Ｊ．  Ｔｏｓｉ，  Ｋ．  Ｊ．  Ｗｅｒｔ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｂ．  Ｍａｈａｊａｎ  （２０１４）．  ゛Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｂｅｒｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ  （ａｎ  ａｍｅｒｉｃａｎ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｏｃｉｅｔｙ  ｔｈｅｓｉｓ）．゛  Ｔｒａｎｓ  Ａｍ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｓｏｃ  １１２：  １０３−１１５．
Ｔｓａｎｇ，  Ｓ．  Ｈ．，  Ｊ．  Ｃｈｅｎ，  Ｃ．  Ｋ．  Ｙａｍａｓｈｉｔａ，  Ｍ．  Ｉ．  Ｓｉｍｏｎ，  Ｐ．  Ｇｏｕｒａｓ，  Ｄ．  Ｂ．  Ｆａｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｐ．  Ｇｏｆｆ  （１９９６）．  ゛Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｕｔａｎｔ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｅｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．゛  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５９（Ｏｃｔ．）：  Ａ５４．
Ｔｓａｎｇ，  Ｓ．  Ｈ．，  Ｐ．  Ｇｏｕｒａｓ，  Ｃ．  Ｋ．  Ｙａｍａｓｈｉｔａ，  Ｈ．  Ｋｊｅｌｄｂｙｅ，  Ｊ．  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｄ．  Ｂ．  Ｆａｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｐ．  Ｇｏｆｆ  （１９９６）．  ゛Ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇａｍｍａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｄ  ｃＧＭＰ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ．゛  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２（５２６４）：  １０２６−１０２９．
Ｔｓａｎｇ，  Ｓ．  Ｈ．，  Ｐ．  Ｇｏｕｒａｓ，  Ｃ．  Ｋ．  Ｙａｍａｓｈｉｔａ，  Ｈ．  Ｋｊｅｌｄｂｙｅ，  Ｊ．  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｄ．  Ｂ．  Ｆａｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｐ．  Ｇｏｆｆｔ  （１９９６）．  ゛Ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  γ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｄ  ｃＧＭＰ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ．゛  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ）  ２７２（５２６４）：  １０２６．
Ｔｓａｎｇ，  Ｓ．  Ｈ．，  Ｉ．  Ｔｓｕｉ，  Ｃ．  Ｌ．  Ｃｈｏｕ，  Ｊ．  Ｚｅｒｎａｎｔ，  Ｅ．  Ｈａａｍｅｒ，  Ｒ．  Ｉｒａｎｍａｎｅｓｈ，  Ｊ．  Ｔｏｓｉ  ａｎｄ  Ｒ．  Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ
（２００８）．  ゛Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ６  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．゛  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １４６（５）：  ７８０−７８８．  ｅ７８１．
Ｔｓａｎｇ，  Ｓ．  Ｈ．，  Ｉ．  Ｔｓｕｉ，  Ｃ．  Ｌ．  Ｃｈｏｕ，  Ｊ．  Ｚｅｒｎａｎｔ，  Ｅ．  Ｈａａｍｅｒ，  Ｒ．  Ｉｒａｎｍａｎｅｓｈ，  Ｊ．  Ｔｏｓｉ  ａｎｄ  Ｒ．  Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ
（２００８）．  ゛Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ６  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．゛  Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ
１４６（５）：  ７８０−７８８．
Ｖａｓｉｒｅｄｄｙ，  Ｖ．，  Ｊ．  Ａ．  Ｍｉｌｌｓ，  Ｒ．  Ｇａｄｄａｍｅｅｄｉ，  Ｅ．  Ｂａｓｎｅｒ−Ｔｓｃｈａｋａｒｊａｎ，  Ｍ．  Ｋｏｈｎｋｅ，  Ａ．  Ｄ．  Ｂｌａｃｋ，  Ｋ．
Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，  Ｓ．  Ｚｈｏｕ，  Ａ．  Ｍ．  Ｍａｇｕｉｒｅ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｃ．  Ｃｈｕｎｇ  （２０１３）．  ゛ＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ
ｃｈｏｒｏｉｄｅｒｅｍｉａ：  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｍｏｄｅｌｓ．゛  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８（５）：  ｅ６１３９６．
Ｖｅｄａｎｔｈａｍ，  Ｖ．  ａｎｄ  Ｋ．  Ｒａｍａｓａｍｙ  （２００５）．  ゛Ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  Ｂｅｓｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａｎ
ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ  ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ．゛  Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １３９（２）：  ３５１−３５３．
Ｖｅｌｅｚ，  Ｇ．，  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ，  Ｙ．  Ｔ．  Ｔｓａｉ，  Ｃ．  Ｗ．  Ｈｓｕ，  Ａ．  Ｇｏｒｅ，  Ａ．  Ｈ．  Ａｂｄｅｌｈａｋｉｍ，  Ｍ．  Ｍａｈａｊａｎ，  Ｒ．  Ｈ．
Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｓｐａｒｒｏｗ，  Ａ．  Ｇ．  Ｂａｓｓｕｋ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｂ．  Ｍａｈａｊａｎ  （２０１７）．  ゛Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  Ｍｆｒｐ  ａｎｄ  Ｃｏｒｒｅｃｔｓ  Ａｘｉａｌ  Ｅｙｅ  Ｌｅｎｇｔｈ．゛  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ７（１）：  １６１５１．
Ｗａｎｇ，  Ｎ．  Ｋ．，  Ｊ．  Ｔｏｓｉ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｋａｓａｎｕｋｉ，  Ｃ．  Ｌ．  Ｃｈｏｕ，  Ｊ．  Ｋｏｎｇ，  Ｎ．  Ｐａｒｍａｌｅｅ，  Ｋ．  Ｊ．  Ｗｅｒｔ，  Ｒ．  Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ，  Ｃ．  Ｃ．  Ｌａｉ，  Ｃ．  Ｌ．  Ｃｈｉｅｎ，  Ｔ．  Ｎａｇａｓａｋｉ，  Ｃ．  Ｓ．  Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１０）．  ゛Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｖｉｓｕａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．゛  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８９（８）：  ９１１−９１９．
Ｗｅｉｎｇｅｉｓｔ，  Ｔ．  Ａ．，  Ｊ．  Ｌ．  Ｋｏｂｒｉｎ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｃ．  Ｗａｔｚｋｅ  （１９８２）．  ゛Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｅｓｔ’ｓ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．゛  Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １００（７）：  １１０８−１１１４．
Ｗｅｒｔ，  Ｋ．  Ｊ．，  Ｒ．  Ｊ．  Ｄａｖｉｓ，  Ｊ．  Ｓａｎｃｈｏ−Ｐｅｌｌｕｚ，  Ｐ．  Ｍ．  Ｎｉｓｈｉｎａ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１２）．  ゛Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ
ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｖｉｓｕａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．゛  Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２（３）：  ５５８−５６７．
Ｗｅｒｔ，  Ｋ．  Ｊ．，  Ｒ．  Ｊ．  Ｄａｖｉｓ，  Ｊ．  Ｓａｎｃｈｏ−Ｐｅｌｌｕｚ，  Ｐ．  Ｍ．  Ｎｉｓｈｉｎａ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１３）．  ゛Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ
ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｖｉｓｕａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．゛  Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２（３）：  ５５８−５６７．
Ｗｅｒｔ，  Ｋ．  Ｊ．，  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｋｅｉｅ，  Ａ．  Ｇ．  Ｂａｓｓｕｋ，  Ａ．  Ｋ．  Ｏｌｉｖｉｅｒ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｂ．  Ｍａｈａｊａｎ  （２０１４）．
゛Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ＣＡＰＮ５  ｅｘｏｍｅ  ｖａｒｉａｎｔ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｍｏｕｓｅ  ｒｅｔｉｎａ．゛  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２３（１０）：  ２６６５−２６７７．
Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，  Ｍ．  Ｌ．，  Ｋ．  Ｍ．  Ｊａｎｉｓｃｈ，  Ｉ．  Ｖ．  Ｐｅｓｈｅｎｋｏ，  Ａ．  Ｍ．  Ｄｉｚｈｏｏｒ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｌ．  Ｆａｉｎ  （２００８）．  ゛Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ６  ｔｕｒｎｏｆｆ  ｄｕｒｉｎｇ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｒｏｄ
ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．゛  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２８（９）：  ２０６４−２０７４．
Ｗｕ，  Ｗ．−Ｈ．，  Ｙ．−Ｔ．  Ｔｓａｉ，  Ｓ．  Ｊｕｓｔｕｓ，  Ｔ．−Ｔ．  Ｌｅｅ，  Ｌ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｃ．−Ｓ．  Ｌｉｎ，  Ａ．  Ｇ．  Ｂａｓｓｕｋ，  Ｖ．  Ｂ．  Ｍａｈａｊａｎ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１６）．  ゛ＣＲＩＳＰＲ  ｒｅｐａｉｒ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｃａｕｓａｔｉｖｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．゛  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．
Ｙａｎｇ，  Ｊ．，  Ｙ．  Ｌｉ，  Ｌ．  Ｃｈａｎ，  Ｙ．  Ｔ．  Ｔｓａｉ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｗｕ，  Ｈ．  Ｖ．  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｃ．  Ｗ．  Ｈｓｕ，  Ｘ．  Ｌｉ，  Ｌ．  Ｍ．  Ｂｒｏｗｎ，  Ｄ．  Ｅｇｌｉ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｓｐａｒｒｏｗ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１４）．  ゛Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  （ＧＷＡＳ）−ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｉｓｋ  ａｌｌｅｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐａｔｉｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．゛  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２３（１３）：  ３４４５−３４５５．
Ｙａｎｇ，  Ｊ．，  Ｙ．  Ｌｉ，  Ｄ．  Ｅｒｏｌ，  Ｗ．−Ｈ．  Ｗｕ，  Ｙ．−Ｔ．  Ｔｓａｉ，  Ｘ．−Ｒ．  Ｌｉ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１４）．
゛Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａ．゛  Ｇｒａｅｆｅ’ｓ  Ａｒｃｈｉｖｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ２５２（３）：  ４２３−４３１．
Ｙａｎｇ，  Ｊ．，  Ｍ．  Ｃ．  Ｎａｕｍａｎｎ，  Ｙ．−Ｔ．  Ｔｓａｉ，  Ｊ．  Ｔｏｓｉ，  Ｄ．  Ｅｒｏｌ，  Ｃ．−Ｓ．  Ｌｉｎ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１２）．  ゛Ｖｉｇａｂａｔｒｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｓ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｒｏｄ  ａｎｄ  ｃｏｎｅ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．゛  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ７（８）：  ｅ４３８８９．
Ｙａｎｇ，  Ｊ．，  Ｍ．  Ｃ．  Ｎａｕｍａｎｎ，  Ｙ．  Ｔ．  Ｔｓａｉ，  Ｊ．  Ｔｏｓｉ，  Ｄ．  Ｅｒｏｌ，  Ｃ．  Ｓ．  Ｌｉｎ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１２）．  ゛Ｖｉｇａｂａｔｒｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｓ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｒｏｄ  ａｎｄ  ｃｏｎｅ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．゛  Ｐｌｏｓ  ＯＮＥ  ７（８）：  ｅ４３８８９．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４３８８９．
Ｙａｎｇ，  Ｔ．，  Ｓ．  Ｊｕｓｔｕｓ，  Ｙ．  Ｌｉ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１５）．  ゛ＢＥＳＴ１：  ｔｈｅ  Ｂｅｓｔ  Ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ
Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．゛  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２３（１２）：  １８０５−１８０９．
Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．，  Ｊ．  Ｄｕ，  Ｓ．  Ｊｕｓｔｕｓ，  Ｃ．  Ｗ．  Ｈｓｕ，  Ｌ．  Ｂｏｎｅｔ−Ｐｏｎｃｅ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｗｕ，  Ｙ．  Ｔ．  Ｔｓａｉ，  Ｗ．  Ｐ．  Ｗｕ，  Ｙ．  Ｊｉａ，  Ｊ．  Ｋ．  Ｄｕｏｎｇ，  Ｖ．  Ｂ．  Ｍａｈａｊａｎ，  Ｃ．  Ｓ．  Ｌｉｎ，  Ｓ．  Ｗａｎｇ，  Ｊ．  Ｂ．  Ｈｕｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｔｓａｎｇ  （２０１６）．  ゛Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉｒｔｕｉｎ  ６  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．゛  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２６（１２）：  ４６５９−４６７３．
Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．，  Ｃ．  Ｊ．  Ｂｒｅｇｍａｎ，  Ａ．  Ｓ．  Ｒａｚａ，  Ｇ．  Ｄｅ  Ｍｏｒａｅｓ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｃ．  Ｈｏｏｄ  （２０１１）．  ゛Ｄｅｒｉｖｉｎｇ  ｖｉｓｕａｌ  ｆｉｅｌｄ  ｌｏｓｓ  ｂａｓｅｄ  ｕｐｏｎ  ＯＣＴ  ｏｆ  ｉｎｎｅｒ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｃｕｌａ．゛  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｐｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ２（６）：  １７３４−１７４２．
Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．，  Ｊ．  Ｂ．  Ｓｔａｎｔｏｎ，  Ｊ．  Ｗｕ，  Ｋ．  Ｙｕ，  Ｈ．  Ｃ．  Ｈａｒｔｚｅｌｌ，  Ｎ．  Ｓ．  Ｐｅａｃｈｅｙ，  Ｌ．  Ｙ．  Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ａ．  Ｄ．  Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ  （２０１０）．  ゛Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａ  ２＋  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｂｅｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．゛  Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９（６）：  １１０８−１１１８．
【０４１６】
表３は、本開示の実施例で使用したｇＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ配列、ドナー鋳型改変配列、及び追加の配列を提供する。
表３
【表３】
2021519067.tif 000019
2021519067.tif 000020
2021519067.tif 000021
2021519067.tif 000022
2021519067.tif 000023
2021519067.tif 000024
2021519067.tif 000025
2021519067.tif 000026
2021519067.tif 000027
2021519067.tif 000028
2021519067.tif 000029
2021519067.tif 000030
2021519067.tif 000031
2021519067.tif 000032
2021519067.tif 000033
2021519067.tif 000034
2021519067.tif 000035
2021519067.tif 000036
2021519067.tif 000037
2021519067.tif 000038
2021519067.tif 000039
2021519067.tif 000040
2021519067.tif 000041
2021519067.tif 000042
2021519067.tif 000043
2021519067.tif 000044
2021519067.tif 000045
2021519067.tif 000046
2021519067.tif 000047
2021519067.tif 000048
2021519067.tif 000049
【０４１７】
本発明の範囲は、具体的に上記に示され、記載されたものによって限定されない。当業者なら、材料、立体配置、構成及び大きさの示された例に対する適切な代替物があることを認識する。特許及び様々な刊行物を含む多数の参考文献が、本発明の説明で引用及び考察されている。そのような参考文献の引用及び考察は、単に本発明の説明を明らかにするために提供され、いずれの参考文献も本明細書に記載の本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。本明細書で引用及び考察される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、本明細書に記載のものの変形、改変及び他の実践は、当業者なら思いつくであろう。本発明の特定の実施形態を示し、記載してきたが、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、変更及び改変がなされ得ることは当業者なら明らかであろう。前述に記載の事項は、単なる例示のために与えられ、限定するものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年12月8日(2020.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2021519067.tif 000112
2021519067.tif 000113
2021519067.tif 000114
2021519067.tif 000115
2021519067.tif 000116