(57)【要約】  ＯＣＡ−ＢまたはそのＯＣＡ−Ｂ断片であるペプチド；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチドを含む化合物が、本明細書で開示される。１型糖尿病の処置のために化合物を対象に投与する方法、及びＯＣＡ−ＢとＪｍｊｄ１ａとの間の相互作用を阻止する方法も、本明細書に記載されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＣＡ−ＢまたはそのＯＣＡ−Ｂ断片であるペプチド；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチドを含む、化合物。
【請求項２】
ＯＣＡ−ＢもしくはＯＣＡ−Ｂ断片またはそれらの変異体であるペプチド；及び細胞膜透過性ペプチドを含む、化合物。
【請求項３】
炭化水素リンカーをさらに含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ＯＣＡ−Ｂ断片が配列番号２または配列番号３である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項５】
前記ＯＣＡ−Ｂまたはその断片が配列番号３である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記ＯＣＡ−Ｂまたはその断片が配列番号２である、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
前記ＯＣＡ−Ｂ断片が、ＯＣＡ−Ｂペプチドの野生型断片と比較した場合に少なくとも９０％の配列同一性であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
前記ＯＣＡ−Ｂ変異体が、参照配列と比較した場合に少なくとも９０％の配列同一性であるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項９】
前記ＯＣＡ−Ｂペプチドの前記野生型断片がヒトまたはマウスに由来する、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
前記リンカーがＧＳＧである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
前記細胞膜透過性ペプチドがＴＡＴ配列である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記ＴＡＴ配列が配列番号４である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記ペプチドがリンカーに直接コンジュゲートし、かつ前記リンカーが前記細胞膜透過性ペプチドに直接コンジュゲートしている、請求項１または請求項２に記載の化合物。
【請求項１５】
前記ペプチドが配列番号２であり、前記リンカーがＧＳＧであり、かつ前記細胞膜透過性ペプチドが配列番号４である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
配列番号２がＧＳＧに直接コンジュゲートし、かつＧＳＧが配列番号４に直接コンジュゲートしている、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
ＯＣＡ−ＢとＪｍｊｄ１ａとの相互作用を阻止することができる、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項１８】
前記化合物が環化またはＰＥＧ化されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１９】
請求項１または２に記載の化合物と薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２０】
静脈内投与用に製剤化されている、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
疾患を有する対象を処置する方法であって、
前記疾患の前記処置がＯＣＡ−Ｂの抑制を必要とし、
前記方法が、ＯＣＡ−ＢまたはそのＯＣＡ−Ｂ断片であるペプチド；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチドを含む化合物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２２】
前記化合物が薬学的に許容可能な賦形剤中に存在する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
治療有効量の前記化合物が投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象がヒト患者である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２５】
前記疾患が、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、セリアック病、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、乾癬、潰瘍性大腸炎または白血病である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
哺乳動物細胞においてＯＣＡ−Ｂを阻害する方法であって、
前記細胞を請求項１または２に記載の化合物で処置することを含む、前記方法。
【請求項２７】
前記細胞が免疫系細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫系細胞がＴ細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＯＣＡ−ＢとＪｍｊｄ１ａとの相互作用を阻止する化合物であって、
ＯＣＡ−Ｂまたはその断片、配列番号２または配列番号３からなるペプチド；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチドを含む、前記化合物。
【請求項３０】
前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３１】
前記リンカーがＧＳＧである、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
前記細胞膜透過性ペプチドがＴＡＴ配列である、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３３】
前記リンカーがＧＳＧであり、かつ前記細胞膜透過性ペプチドが配列番号４である、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３４】
薬学的に許容可能な賦形剤中に存在する、請求項２９に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月３日に出願された米国仮出願６２／６６６，３２５の出願日の利益を主張する。この先願出願の内容は、本明細書に参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府支援の研究に関する声明
本発明は、国立衛生研究所より授与された助成金番号第Ｒ０１ＮＳ０４１２４９号及び第Ｒ０１ＡＩ１００８７３号の下、政府の支援により行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表の組み込み
本出願は、本出願の出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩ形式により提出された、２０１９年４月１６日作成の１２，５５５バイトのファイル名「２１１０１＿０３６４Ｐ１＿ＳＬ．ｔｘｔ」を含む配列表を含み、この配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、宿主免疫系が内分泌膵臓のベータ細胞に関連する抗原に向けられる自己免疫疾患である。病理学的には、Ｔ１Ｄは、膵島炎、ベータ細胞の破壊及びインスリン産生不能を特徴とする。Ｔ１Ｄに対する主な処置は、生涯にわたるインスリン療法である。多くの研究がこの疾患に対する新しい処置の開発を目指しているが、残念ながらＴ１Ｄの病因の機序は完全には理解されておらず、新しい療法を開発する能力は限られている。Ｔ１Ｄを処置するための代替的アプローチが必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
ＯＣＡ−ＢまたはそのＯＣＡ−Ｂ断片であるペプチド；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチドを含む化合物が、本明細書で開示される。
【０００６】
ＯＣＡ−ＢとＪｍｊｄ１ａとの相互作用を阻止する化合物であって、ＯＣＡ−Ｂまたはその断片、配列番号２または配列番号３からなるペプチド；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチドを含む化合物が、本明細書で開示される。
【０００７】
疾患を有する対象を処置する方法であって、当該疾患がＯＣＡ−Ｂの抑制により緩和され、当該方法が、ＯＣＡ−ＢまたはそのＯＣＡ−Ｂ断片であるペプチド；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチドを含む化合物を対象に投与することを含む方法が、本明細書で開示される。処置方法のいずれも、「使用」方法として構成することができる。
【０００８】
疾患を有する対象を処置する方法であって、当該疾患がＯＣＡ−Ｂの抑制を必要とし、当該方法が、ＯＣＡ−ＢまたはそのＯＣＡ−Ｂ断片であるペプチド；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチドを含む化合物を対象に投与することを含む方法が、本明細書で開示される。処置方法のいずれも、「使用」方法として構成することができる。
【０００９】
ＯＣＡ−ＢもしくはＯＣＡ−Ｂ断片またはそれらの変異体であるペプチド；及び細胞膜透過性ペプチドを含む化合物が、本明細書で開示される。
【００１０】
本発明の組成物及び方法の他の特徴及び利点は、以下の説明、図面及び特許請求の範囲に示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】他の転写因子（例えば、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１）が遺伝子発現のオン／オフのトリガーとして機能する一方で、Ｏｃｔ１（緑色）及びＯＣＡ−Ｂ（青色）は、サイレントであるが以前に活性化された標的遺伝子を、ＣＤ４  Ｔ細胞において容易に再誘導可能な（または「待機の」）配置に維持することを示す。ＯＣＡ−Ｂは、Ｊｍｊｄ１ａ（Ｋｄｍ３ａとしても知られる）を動員することによって抗抑制モードでＯｃｔ１を「固定」して、抑制性ヒストンＨ３Ｋ９ｍｅ２マークを除去する（抗抑制）。動員によって、より許容的なクロマチン環境で標的遺伝子座を維持することにより、ナイーブではなく既往の二次応答が可能となる。稲妻は、本明細書に開示されるＯＣＡ−Ｂ／Ｊｍｊｄ１ａ相互作用の新規阻害剤を示す。
【図２Ａ】ＯＣＡ−ＢとＪｍｊｄ１ａとの相互作用を示す。特定のＯＣＡ−Ｂ残基を強調した、Ｏｃｔ１／ＯＣＡ−Ｂ／ＤＮＡの構造（Ｃｅｐｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９９６  Ａｕｇ．１５；１０（１６）：２０７９−８８）を示す。Ｏｃｔ１リンカーを赤色の破線で示す。
【図２Ｂ】ＯＣＡ−ＢとＪｍｊｄ１ａとの相互作用を示す。ＯＣＡ−Ｂ配列（配列番号２、ｈＯＣＡ−Ｂ）のＯｃｔ１（配列番号３３、ｈＯｃｔ１）及びＡＲ（配列番号３４、ｈＡＲ）とのトップアラインメントを示す。
【図２Ｃ】ＯＣＡ−ＢとＪｍｊｄ１ａとの相互作用を示す。Ｊｍｊｄ１ａの二重点突然変異ＯＣＡ−Ｂとの共免疫沈降を示す。対照（野生型ＯＣＡ−Ｂ）と異なり、突然変異体は相互作用することができなかったことから、この保存された領域をＪｍｊｄ１ａとの相互作用部位として特定した。内在性ＯＣＡ−Ｂを欠くＨＣＴ１１６細胞を使用した。
【図３Ａ】ＯＣＡ−Ｂ阻害剤、ならびに初代ＣＤ４  Ｔ細胞及びＮＯＤマウスモデルにおいてこれらのペプチドを使用した結果を示す。膜透過性のためにＴａｔ融合体として合成したペプチド（ペプチド＃１（配列番号１）、ペプチド＃２及びペプチド＃３）を示す。ペプチド＃２（配列番号２）及びペプチド＃３（配列番号３）は有効性を示す。矢印は図２Ｃの突然変異の位置を示す。下部：ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した２５μＭのペプチド＃２で処置した、初代ＣＤ４  Ｔ細胞におけるＩｌ２発現。
【図３Ｂ】ＯＣＡ−Ｂ阻害剤、ならびに初代ＣＤ４  Ｔ細胞及びＮＯＤマウスモデルにおいてこれらのペプチドを使用した結果を示す。糖尿病が新たに現れた雌ＮＯＤマウスにおける、３回用量（２０ｍｇ／ｋｇ）のペプチド＃２の効果を示す。これらの動物では、大部分の膵ベータ機能が失われ、糖尿病が膵臓の自己免疫性炎症（膵島炎）より生じて残存ベータ細胞を非機能にする。
【図３Ｃ】ＯＣＡ−Ｂ阻害剤、ならびに初代ＣＤ４  Ｔ細胞及びＮＯＤマウスモデルにおいてこれらのペプチドを使用した結果を示す。エンドポイントでの膵臓におけるＴ細胞のパーセントを示す。
【図３Ｄ】ＯＣＡ−Ｂ阻害剤、ならびに初代ＣＤ４  Ｔ細胞及びＮＯＤマウスモデルにおいてこれらのペプチドを使用した結果を示す。膵臓リンパ節（ＰＬＮ）を使用して採取した同様のデータを示す。
【図４Ａ】未発表のＯｃａｂ条件付き対立遺伝子を示す。標的化事象を示す。ＲＯＳＡ２６−ＦＬＰとの交配により、条件付き（ｆｌ）対立遺伝子が生じる。
【図４Ｂ】未発表のＯｃａｂ条件付き対立遺伝子を示す。標的化対立遺伝子及び後続の組換え事象の遺伝子型同定を示す。ファウンダー動物をレーン２に示す。
【図４Ｃ】未発表のＯｃａｂ条件付き対立遺伝子を示す。対照動物、ｆｌ／ｆｌ動物及びΔ／Δ動物の脾臓の免疫ブロットを示す。Ｂ−ＪＡＢ  Ｂ細胞核抽出物を、ＯＣＡ−Ｂ発現の陽性対照として示す（レーン１）。
【図４Ｄ】未発表のＯｃａｂ条件付き対立遺伝子を示す。Ｔ細胞特異的ＣＤ４遺伝子（ＣＤ４−Ｃｒｅ）の制御下でＣｒｅリコンビナーゼを発現しているマウスへの対立遺伝子の交配の効果を示す。刺激した総Ｔ細胞の免疫ブロットを示す。
【図５】ＯＣＡ−Ｂ条件付き対立遺伝子と交配した、自発的な自己免疫を促進する免疫原性ＮＯＤの決定因子の完全なセットを示す。ＮＯＤとＢ／６対立遺伝子とを識別するＰＣＲのアガロースゲルを示す。赤色の「Ｎ」は、ＮＯＤバックグラウンドから決定因子への戻し交配が成功したことを示す。
【図６】Ｔ細胞の条件付きＯｃｔ１喪失がマウスをＥＡＥから保護することを示す。Ａは、８週の雌Ｃ５７ＢＬ／６  Ｏｃｔ１ｆｌ／ｆｌ、ＣＤ４−ＣｒｅマウスにＭＯＧペプチド、ＣＦＡ及び百日咳毒素を接種し、尾の引きずり、後肢麻痺または四肢麻痺についてスコア化したことを示す。Ｂは、エンドポイントにおいて臨床的影響を有する動物（８匹のＷＴ及び３匹のＫＯ）から収集した頸部リンパ節を示す。ブレフェルジンＡの存在下で細胞をＰＭＡ／イオノマイシンで刺激した。ＣＤ４  Ｔ細胞のＩＬ−１７ａ及びＩＦＮｇをプロファイリングした。代表的な動物を示す。Ｃは、ＩＬ−１７ａ／ＩＦＮｇ二重産生株の定量化を示す。
【図７】ＣＤ４  Ｔ細胞における異所的なＯＣＡ−Ｂの発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの記憶を容易にすることを示す。左パネル：共導入したＴｈｙ１．１及び１．２  ＳＭＡＲＴＡ細胞（ＳＭＡＲＴＡはＬＣＭＶ反応性ＴＣＲトランスジェニックマウス系統である）の、ピークＬＣＭＶ応答時及びＬｍ−ｇｐ６１による異種性の再曝露後における代表的なプロット。最初に、細胞を対照ＭＩＧまたはＯＣＡ−Ｂをコードするベクターで形質導入した。右パネル：複数の動物からの定量化。エラーバーは標準偏差を示す。
【図８】ＮＯＤ戻し交配を介したＯｃａｂ  ｌｏｘＰ導入（ｆｌｏｘｅｄ）対立遺伝子を追跡するためのゲノムＰＣＲ（上部パネル）、ＮＯＤバックグラウンドスクリーニングのためのマーカー（下部パネル）を示す。
【図９Ａ】「ＪｕｍＯＣＡ」ペプチドの有効性を示す。血中グルコースが新たに２２５ｍｇ／ｄＬ超に上昇した雌ＮＯＤ動物を、１２時間の間隔を空けて３回のＩＶ／ＲＯペプチド注射（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置したことを示す。２回目の注射の前及び最終注射の１２時間後に採血した。
【図９Ｂ】「ＪｕｍＯＣＡ」ペプチドの有効性を示す。培養液中で刺激し静止させたＴ細胞を示す。Ｉｌ２遺伝子発現をＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。
【図９Ｃ】「ＪｕｍＯＣＡ」ペプチドの有効性を示す。膵臓から単離したＣＤ４  Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞のフローサイトメトリープロットを示す。
【図９Ｄ】「ＪｕｍＯＣＡ」ペプチドの有効性を示す。膵臓リンパ節（ＰＬＮ）を使用して実施した類似の分析を示す。
【図９Ｅ】「ＪｕｍＯＣＡ」ペプチドの有効性を示す。膵臓リンパ節（ＰＬＮ）を使用して実施した類似の分析を示す。
【図１０】Ｔ細胞における（転写因子ＯＣＡ−Ｂが関連する）Ｏｃｔ１の欠失が、多発性硬化症（ＭＳ）のミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）／百日咳毒素（ＰＴ）の実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスモデルにおける保護をもたらすことを示す。
【図１１Ａ】Ｏｃａｂ-/-マウスが白血病から保護されることを示す。腫瘍性タンパク質ＭＬＬ−ＡＦ９の融合を伴うマウスＡＭＬ白血病発生の一般的なモデルを示す。
【図１１Ｂ】Ｏｃａｂ-／-マウスが白血病から保護されることを示す。ＭＬＬ−ＡＦ９で形質導入されたＷＴ  ＢＭまたはＯｃａｂ-/-ＢＭを有する動物の生存率を示す。
【図１１Ｃ】Ｏｃａｂ-／-マウスが白血病から保護されることを示す。（Ｂ）からの代表的な動物を使用した末梢血塗抹標本を示す。
【図１１Ｄ】Ｏｃａｂ-／-マウスが白血病から保護されることを示す。レシピエントマウスにおけるＭＬＬ−ＡＦ９のゲノムＰＣＲを示し、それらのドナー血液が実際にウイルス性腫瘍性タンパク質で形質導入されていることを立証する。
【図１２Ａ】Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の喪失は、ＭＳのＥＡＥモデルを使用したマウスを保護する。ＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/fl（ｎ＝９）マウスまたはＯｃｔ１fl/fl（ｎ＝１０）マウスにＭＯＧ35-55ペプチド及びＰＴを注射して、ＥＡＥを発生させたことを示す。臨床スコアを処置後の時間経過中に決定した。
【図１２Ｂ】Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の喪失は、ＭＳのＥＡＥモデルを使用したマウスを保護する。ピーク疾患時（２１日目）で採取した動物からの胸髄切片の代表的なルクソールファストブルー（ＬＦＢ）染色を示す。脱髄領域を赤色で囲む。
【図１２Ｃ】Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の喪失は、ＭＳのＥＡＥモデルを使用したマウスを保護する。実験マウスにおける脱髄の定量化を示す。２匹のマウスの６つの切片からの脱髄の平均パーセント。
【図１２Ｄ】Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の喪失は、ＭＳのＥＡＥモデルを使用したマウスを保護する。ＥＡＥによって誘発されたＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/fl（ｎ＝６）マウスまたはＯｃｔ１fl/fl（ｎ＝６）マウスから単離して、フローサイトメトリーで分析した頸部リンパ節リンパ球を示す。代表的な動物からのＣＤ４  Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を示す。
【図１２Ｅ】Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の喪失は、ＭＳのＥＡＥモデルを使用したマウスを保護する。ＣＤ４+  Ｔ細胞及びＣＤ８+  Ｔ細胞の平均パーセンテージ（左パネル）及び総細胞数（右パネル）を示す。細胞は、６匹の別々のマウスの頸部リンパ節（ＣＬＮ）から独立して精製した。
【図１２Ｆ】Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の喪失は、ＭＳのＥＡＥモデルを使用したマウスを保護する。ＣＬＮにおけるサイトカイン産生ＣＤ４+細胞の頻度を示す代表的なデータを示す。
【図１２Ｇ】Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の喪失は、ＭＳのＥＡＥモデルを使用したマウスを保護する。サイトカイン産生ＣＤ４+  Ｔ細胞のパーセンテージ（左及び中央パネル）または総細胞数（右パネル）がプロットされていることを示す。各群につきＮ＝６。結果の平均値を示す。
【図１２Ｈ】Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の喪失は、ＭＳのＥＡＥモデルを使用したマウスを保護する。脊髄におけるＣＤ４+  Ｔ細胞及びＣＤ８+  Ｔ細胞の平均パーセンテージを示す。各群につきＮ＝３〜４。
【図１２Ｉ】Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の喪失は、ＭＳのＥＡＥモデルを使用したマウスを保護する。サイトカイン産生ＣＤ４+  Ｔ細胞のパーセンテージ（左パネル）及び総細胞数（右パネル）を示す。細胞は、６匹の別々のマウスの脊髄から独立して精製した。
【図１３Ａ】Ｏｃｔ１を欠くＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激は、活性化に関連するマーカーの発現の減少及びアネルギーに関連するマーカーの発現の増加をもたらすことを示す。Ｏｃｔ１欠損ＣＤ４+  Ｔ細胞及び対照ＣＤ４+  Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで指定の抗体で刺激し、フローサイトメトリーで分析したことを示す。ＩＣＯＳ発現ＣＤ４+ＣＤ４４+細胞の代表的な頻度を示す。
【図１３Ｂ】Ｏｃｔ１を欠くＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激は、活性化に関連するマーカーの発現の減少及びアネルギーに関連するマーカーの発現の増加をもたらすことを示す。各マウスについて３回の技術的培養反復を伴う、３匹のマウスの脾臓から独立して精製した細胞の定量化を示す。
【図１３Ｃ】Ｏｃｔ１を欠くＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激は、活性化に関連するマーカーの発現の減少及びアネルギーに関連するマーカーの発現の増加をもたらすことを示す。Ｏｃｔ１欠損ＣＤ４+  Ｔ細胞及び対照ＣＤ４+  Ｔ細胞におけるＣＤ２５発現ＣＤ４+ＣＤ４４+細胞の頻度を示す、代表的なフローサイトメトリープロットを示す。
【図１３Ｄ】Ｏｃｔ１を欠くＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激は、活性化に関連するマーカーの発現の減少及びアネルギーに関連するマーカーの発現の増加をもたらすことを示す。３匹の動物からの定量化を示す。
【図１３Ｅ】Ｏｃｔ１を欠くＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激は、活性化に関連するマーカーの発現の減少及びアネルギーに関連するマーカーの発現の増加をもたらすことを示す。ＣＤ４+ＣＤ４４+  Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ４の代表的な発現を、Ｏｃｔ１欠損ＣＤ４+  Ｔ細胞及び対照ＣＤ４+  Ｔ細胞のヒストグラムとしてプロットしたことを示す。
【図１３Ｆ】Ｏｃｔ１を欠くＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激は、活性化に関連するマーカーの発現の減少及びアネルギーに関連するマーカーの発現の増加をもたらすことを示す。各動物につき３回の培養反復を伴う、３匹の動物からのＣＴＬＡ４+パーセンテージをプロットしたことを示す。
【図１３Ｇ】Ｏｃｔ１を欠くＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激は、活性化に関連するマーカーの発現の減少及びアネルギーに関連するマーカーの発現の増加をもたらすことを示す。Ｏｃｔ１欠損ＣＤ４+ＣＤ４４+細胞及び対照ＣＤ４+ＣＤ４４+細胞におけるＦＲ４及びＣＤ７３の発現を示す。
【図１３Ｈ】Ｏｃｔ１を欠くＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激は、活性化に関連するマーカーの発現の減少及びアネルギーに関連するマーカーの発現の増加をもたらすことを示す。ＦＲ４hiＣＤ７３hiＣＤ４+ＣＤ４４+細胞のプロットされた平均パーセンテージを示す。
【図１４Ａ】Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の欠如が、マウス肝炎ウイルス（ＪＨＭＶ）の向神経性ＪＨＭ株に感染したマウスの疾患に影響を及ぼさないことを示す。ＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/flマウス（ｎ＝１５）またはＯｃｔ１fl/flマウス（ｎ＝１４）に、２００プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＪＨＭＶを頭蓋内（ｉ．ｃ．）感染させ、疾患の重症度を評価したことを示す。臨床疾患を感染後（ｐ．ｉ．）２１日目まで記録した。
【図１４Ｂ】Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の欠如が、マウス肝炎ウイルス（ＪＨＭＶ）の向神経性ＪＨＭ株に感染したマウスの疾患に影響を及ぼさないことを示す。脳のウイルス力価を、感染後７日目及び２１日目に測定したことを示す（ｎｄ＝未検出）。
【図１４Ｃ】Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の欠如が、マウス肝炎ウイルス（ＪＨＭＶ）の向神経性ＪＨＭ株に感染したマウスの疾患に影響を及ぼさないことを示す。感染後１２日目の実験マウスからの胸髄切片の代表的なＬＦＢ染色を示す。
【図１４Ｄ】Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の欠如が、マウス肝炎ウイルス（ＪＨＭＶ）の向神経性ＪＨＭ株に感染したマウスの疾患に影響を及ぼさないことを示す。ＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/flマウス（ｎ＝４、１２ｄｐｉ；ｎ＝３、２１ｄｐｉ）及びＯｃｔ１fl/flマウス（ｎ＝３、１２ｄｐｉ；ｎ＝５、１２ｄｐｉ）からの、感染後１２日目及び２１日目の平均脱髄の定量化を示す。
【図１５Ａ】ＪＨＭＶ感染中のＯｃｔ１  Ｔ細胞欠損マウスにおける正常な免疫応答を示す。ＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/flマウスまたはＯｃｔ１fl/flマウスに２００ＰＦＵのＪＨＭＶをｉ．ｃ．感染させ、感染後７日目（ｎ＝８）、１２日目（ｎ＝４〜５）及び２１日目（ｎ＝６）に屠殺して脳内へのＴ細胞浸潤を評価したことを示す。感染後７日目のマウスの脳内へのＣＤ４+  Ｔ細胞浸潤を示す代表的なフロー分析。
【図１５Ｂ】ＪＨＭＶ感染中のＯｃｔ１  Ｔ細胞欠損マウスにおける正常な免疫応答を示す。単離した細胞の頻度及び数の両方を算出することによって示されるＣＤ４+  Ｔ細胞の定量化を示す。
【図１５Ｃ】ＪＨＭＶ感染中のＯｃｔ１  Ｔ細胞欠損マウスにおける正常な免疫応答を示す。感染後７日目のマウスの脳内へのＣＤ８+  Ｔ細胞浸潤を示す代表的なフロー分析を示す。
【図１５Ｄ】ＪＨＭＶ感染中のＯｃｔ１  Ｔ細胞欠損マウスにおける正常な免疫応答を示す。単離した細胞の頻度及び数の両方を算出することによって示されるＣＤ８+  Ｔ細胞の定量化を示す。
【図１５Ｅ】ＪＨＭＶ感染中のＯｃｔ１  Ｔ細胞欠損マウスにおける正常な免疫応答を示す。ＪＨＭＶに感染した実験マウスの脳からのＣＤ４+  Ｔ細胞のＭ１３３−１４７テトラマーを使用した代表的なＪＨＭＶ特異的ＴＣＲ染色を示す。
【図１５Ｆ】ＪＨＭＶ感染中のＯｃｔ１  Ｔ細胞欠損マウスにおける正常な免疫応答を示す。実験群の細胞からのＭ１３３−１４７テトラマーＣＤ４+  Ｔ細胞の頻度及び数の定量化を示す。
【図１５Ｇ】ＪＨＭＶ感染中のＯｃｔ１  Ｔ細胞欠損マウスにおける正常な免疫応答を示す。ＪＨＭＶに感染した実験マウスの脳からのＣＤ８+Ｔ細胞の代表的なＳ５１０−５１８テトラマー染色を示す。
【図１５Ｈ】ＪＨＭＶ感染中のＯｃｔ１  Ｔ細胞欠損マウスにおける正常な免疫応答を示す。実験群の細胞からのＭ１３３−１４７テトラマーＣＤ４+  Ｔ細胞の頻度及び数の定量化を示す。提示したデータは、２つの独立した実験、すなわち、感染後７日目、ＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/flマウス  ｎ＝８、Ｏｃｔ１fl/flマウス  ｎ＝８；感染後１２日目、ＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/flマウス  ｎ＝５、Ｏｃｔ１fl/flマウス  ｎ＝４から得たものである。
【図１５Ｉ】ＪＨＭＶ感染中のＯｃｔ１  Ｔ細胞欠損マウスにおける正常な免疫応答を示す。代表的な動物について、ＩＦＮγ産生ＣＤ４+  ＣＮＳ浸潤性Ｔ細胞（左パネル）及びＣＤ８+  ＣＮＳ浸潤性Ｔ細胞（右パネル）のパーセンテージを示す。
【図１５Ｊ】ＪＨＭＶ感染中のＯｃｔ１  Ｔ細胞欠損マウスにおける正常な免疫応答を示す。（Ｂ）で分析したＣＤ４+細胞及びＣＤ８+細胞の平均頻度（左パネル）及び総細胞数（右パネル）を示す。各群につきＮ＝６。
【図１６】低下したレベルのＣＤ２５を発現するＯｃｔ１欠損Ｔ細胞においてＩＬ−１０発現が変化しないことを示す。細胞は図１３と同様に調製した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示は、本明細書に含まれる以下の本発明の詳細な説明、図面及び実施例を参照することによってより容易に理解することができる。
【００１３】
本組成物及び方法を開示及び説明する前に、それらは、別段の定めがない限り特定の合成方法に限定されず、または、別段の定めがない限り特定の試薬にも限定されず、したがって、当然のことながら異なるものになってもよいことを理解されたい。本明細書で使用する用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法及び材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法及び材料をここで記載する。
【００１４】
さらに、別段に明記しない限り、本明細書に記載のいずれの方法も、そのステップが特定の順序で実行されることを必要とすると解釈されることを決して意図するものではないことを理解されたい。したがって、方法の請求項がそのステップが従うべき順序を実際に記載していない場合、またはそのステップが特定の順序に限定されるべきであることが請求項または説明に具体的に述べられていない場合、いかなる点でも順序が推測されることを決して意図しない。これは、ステップの配置または操作の流れに関する論理的な問題、文法構成または句読法から派生する明らかな意味、及び本明細書に記載の態様の数または種類を含めた、任意のあり得る非明示的な解釈の根拠に対して成り立つ。
【００１５】
本明細書で言及されるすべての刊行物は、それらの刊行物の引用に関連した方法及び／または材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する権利を有さないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、本明細書に提供する公開日は、実際の公開日と異なる場合があり、個別の確認が必要な場合がある。
【００１６】
ＯＣＡ−Ｂ（ＯＢＦ−１及びＢｏｂ．１、遺伝子記号Ｐｏｕ２ａｆ１としても知られている）は、Ｂ細胞抗体のスイッチングならびにメモリーＴ細胞の生成及び機能にとって個々に重要な転写コレギュレーターである。ＯＣＡ−Ｂは、炎症性サイトカインを産生するＴ細胞にも特に重要である。複数のヒトＧＷＡＳ研究によって、ＯＣＡ−ＢはＴ１Ｄの病因に関連付けられている（Ｆａｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ，５１８（７５３９）：３３７−４３及びＭａｕｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９９）：１１９０−５）。
【００１７】
多発性硬化症（ＭＳ）は、宿主免疫系が中枢神経系（ＣＮＳ）の髄鞘内に埋め込まれたタンパク質に向けられる、多面的な病因を有する疾患である。病理学的には、ＭＳは炎症、脱髄及び関連する軸索障害を特徴とする。ＣＤ４  Ｔ細胞は、明らかにＭＳの病態生理に関係している。これらの細胞はしばしば疾患の境界に見られ、マスターレギュレーターと考えることができるが、一方で、単球及び顆粒球は組織の奥深くへと遊走して白質損傷を増大させる。ＭＳに対する理想的な処置は存在しない。例えば、ＩＦＮβ及びステロイドには多くの望ましくない副作用がある。疾患の最も悪性度の高い形態である原発性／進行性ＭＳに対する処置は存在しないが、リツキシマブをＭＳに対して適応外処方することがある。正常な免疫機能の大部分を損なわずに維持しながらＭＳの発症を阻止するための新しい処置を開発することは、当該分野における主要な長期目標となっているが、残念ながらＭＳの病因の機序は完全には理解されておらず、新しい療法を開発する能力は限られている。転写コアクチベーターであるＯＣＡ−Ｂが関与する経路の標的化が、ＭＳを処置するための治療手段をもたらす可能性がある。
【００１８】
ＭＳと同様に、Ｔ１Ｄも自己免疫疾患である。Ｔ１Ｄに対する主な処置は、生涯にわたるインスリン療法である。正常な免疫機能の大部分を損なわずに維持しながらＴ１Ｄの発症を阻止するための新しい処置を開発することは、当該分野における主要な長期目標となっている。ベータ細胞の再生は有望な療法方針であるが、Ｔ１Ｄ自己免疫を特異的に阻止する方法を開発できない限り、機能する可能性は低い。さらに優れた仮想的な療法は、患者を早期に捕らえ、正常な免疫機能を温存しながら自己免疫を阻止することであろう。本明細書に開示される知見は、ＯＣＡ−Ｂの標的化がそのような治療手段をもたらし得ることを示している。一態様では、本明細書に記載されているのは、初代細胞培養物及び１型糖尿病のマウスモデルで機能する膜透過性ペプチドであるＯＣＡ−Ｂ阻害剤である。
【００１９】
ＯＣＡ−ＢとＯＣＡ−Ｂが相互作用するクロマチン修飾酵素であるＪｍｊｄ１ａ（遺伝子記号Ｋｄｍ３ａ）との間の界面を模倣するペプチドの設計及び作製が、本明細書で開示される。このペプチドを膜透過性のためにＴａｔペプチドに融合させ、次の配列：ＶＫＥＬＬＲＲＫＲＧＨ−ＧＳＧ（リンカー）−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＹ（Ｔａｔ）（配列番号１０）を有する試薬を作製した。本明細書に記載されているように、これらのペプチドは、マウスにおける１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の症状（グルコース高値）の緩和に強力な有効性を示し、その根本原因は、膵臓内の浸潤性Ｔ細胞、特に炎症性サイトカインを産生する細胞の減少であることを示す。これらの試験はまた、膵臓リンパ節においてＴ細胞数及びサイトカイン産生能は無影響であったという対照結果を示しており、全体的な免疫調節解除がなかったことを示唆している。これらの結果は、このペプチドが、正常な免疫機能の大部分を損なわずに維持しながら１型糖尿病の病原性Ｔ細胞の機能を低下させることを裏付ける。
【００２０】
一態様では、本明細書に記載されているのは、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルのマウスにおいて糖尿病前症の進行を阻止することができる、開発された原型の薬剤（図１、稲妻）である。本薬剤の標的は、新規Ｔ細胞経路の中心的構成要素である、転写共調節タンパク質のＯＣＡ−Ｂ（Ｂｏｂ１／ＯＢＦ−１、遺伝子記号Ｐｏｕ２ａｆ１）である。ＯＣＡ−Ｂの喪失によって、Ｔ細胞の発生及び病原体応答は損なわれずに維持されるが、新規記憶の確立は障害される。Ｔ細胞のメモリー表現型は、さらには、自己抗原に持続的に曝露される場合であっても、自己免疫（Ｔ１Ｄを含む）の原因となり得る。ＯＣＡ−Ｂが、Ｔ細胞における重要な標的遺伝子、とりわけＩｌ２、Ｉｌ２１、Ｉｆｎｇ、Ｉｃｏｓ及びＣｓｆ２（Ｇｍｃｓｆ）の発現を直接制御することが示されてきたが、ただし、それは選択状況下においてである。例えば、これらの遺伝子は、刺激されたＯＣＡ−Ｂ欠損Ｔ細胞では変化しないが、抗原再遭遇のモデルである二次刺激によって最大５００分の１に減少する。多重抗原曝露は、自己免疫疾患の中心的な特質である。ヒトのＧＷＡＳ研究により、ＯＣＡ−Ｂ及びＯＣＡ−Ｂがドッキングする転写因子であるＯｃｔ１がＴ１Ｄリスクを媒介する物質として特定されている。したがって、本明細書に開示されるように支配的な仮説は、ＯＣＡ−Ｂが、サイトカイン及び他の免疫調節タンパク質をコードするＴ細胞の重要な遺伝子を協調的に制御して、Ｔ１Ｄの病因を促進するというものである。この態様は、新規条件付きＯｃａｂ（Ｐｏｕ２ａｆ１）対立遺伝子を使用して試験することができる（例えば、実施例１を参照されたい）。このタンパク質の分子生物学に基づいて開発された膜透過性ＯＣＡ−Ｂペプチド阻害剤の特性も試験することができる（例えば、実施例２を参照されたい）。
【００２１】
定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上別途明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。
【００２２】
本明細書で使用する「または」という用語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを意味するとともに、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。
【００２３】
範囲は、本明細書では、「約」もしくは「およそ」１つの特定の値から、及び／または「約」もしくは「およそ」別の特定の値までのように表され得る。そのような範囲が表される場合、さらなる態様は、１つの特定の値から、及び／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」または「およそ」を使用することによって、その特定の値がさらなる態様を形成することが理解される。さらに、その範囲の各々の端点は、他の端点との関連において、及び他の端点とは独立しての両方で重要であることが理解される。また、本明細書に開示される多くの値があること、及び各値もまた、その値自体に加えて、「約」その特定の値として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。また、２つの特定の単位間の各単位が開示されることも理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４も開示される。
【００２４】
本明細書で使用される、「任意の」または「任意に」という用語は、その後に記載される事象または状況が生じても生じなくてもよいこと、ならびにその記載が、当該事象または状況が生じる場合及びそれが生じない場合を含むことを意味する。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、投与の標的、例えば、ヒトを指す。したがって、本開示の方法の対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物、魚類、鳥類、爬虫類、または両生類であり得る。「対象」という用語にはまた、飼育動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ミバエなど）も含まれる。一態様では、対象は哺乳動物である。別の態様では、対象はヒトである。この用語は、特定の年齢または性別を示さない。したがって、雌雄にかかわらず、成年、幼年、青年、及び新生対象、ならびに胎児が包含されることが意図される。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「患者」という用語は、疾患または障害に罹患している対象を指す。「患者」という用語は、ヒト及び動物対象を含む。本開示の方法のいくつかの態様では、「患者」は、例えば、投与するステップの前などにがんの処置が必要であると診断されている。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「処置する」という用語は、特定の疾患、障害及び／または状態の１つ以上の症状もしくは特徴を部分的にもしくは完全に緩和、改善、軽減、その発症を遅延させること、その進行を抑制するもしくは緩徐にすること、その重症度を低減させること、及び／またはその発生率を低減させることを指す。疾患、障害及び／または状態と関連付けられる病態を発症するリスクを低下させるために、疾患、障害及び／または状態の徴候を示さない対象に対して、及び／または疾患、障害及び／または状態の初期の徴候のみを示す対象に対して、処置が施されてもよい。例えば、疾患、障害及び／または状態は、多発性硬化症、１型糖尿病、関節リウマチ、セリアック病、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、乾癬、潰瘍性大腸炎または白血病であり得る。
【００２８】
「防止する」、「阻止する」、「拮抗する」、または「反転する」という用語は、全体的にもしくは部分的に防止すること、または改善もしくは調節することを意味する。
【００２９】
本明細書の説明及び特許請求の範囲全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という言葉ならびにその言葉の変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むがそれらに限定されない」ことを意味しており、例えば、他の付加物、構成要素、整数またはステップを除外することを意図しない。特に、１つ以上のステップまたは操作を含むと記載された方法では、各ステップに示されたものを含むことが具体的に企図され（そのステップが「からなる」などの限定する用語を含まない限り）、各ステップが、例えば、そのステップに示されていない他の付加物、構成要素、整数またはステップを除外することを意図しないことを意味する。
【００３０】
「免疫系の細胞」または「免疫細胞」または「免疫系細胞」は、Ｂ細胞とも呼ばれるＢリンパ球、Ｔ細胞とも呼ばれるＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球、顆粒球、マスト細胞、血小板、ランゲルハンス細胞、幹細胞、樹状細胞、末梢血単核細胞、腫瘍浸潤（ＴＩＬ）細胞、ハイブリドーマを含む遺伝子改変免疫細胞、薬物改変免疫細胞、抗原提示細胞及び上記の細胞型の誘導体、前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）または前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）を含むがこれらに限定されない、標的化またはアッセイすることができる免疫系の任意の細胞を含むことを意味する。
【００３１】
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、細胞性免疫に関与するリンパ球の型、白血球の型を指す。Ｔ細胞は、その細胞表面にＴ細胞受容体が存在することにより他のリンパ球と区別することができる。Ｔ細胞型の例としては、ヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４+）、細胞傷害性キラーＴ細胞（例えば、ＣＤ８+）、メモリー（例えば、ＣＤ４+またはＣＤ８+）Ｔ細胞及びエフェクターＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３２】
「断片」という用語は、参照ペプチドと実質的に同一であり、参照ペプチドの生物活性を保持するペプチドの部分（例えば、少なくとも５つ、１０個、２５個、５０個、１００個、１２５個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個または５００個などのアミノ酸または核酸）を指し得る。いくつかの態様では、ペプチドの断片または部分は、本明細書に記載の参照ペプチドの生物活性の少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を保持する。参照ペプチドの断片は、参照ポリペプチドの連続部分または隣接部分であり得る（例えば、１０アミノ酸長である参照ペプチドの断片は、その参照ペプチド内の任意の２〜９つの隣接残基であり得る）。
【００３３】
「変異体」という用語は、野生型のペプチドまたは遺伝子産物と比較した場合に、配列及び／または機能特性の改変（すなわち、変更された特性）を示すペプチドまたは遺伝子産物を指し得る。一般に、本明細書に開示される遺伝子及びタンパク質の任意の既知の変異体及び誘導体または生じ得るものを規定する１つの方法が、特異的な既知の配列との相同性の点から変異体及び誘導体を規定することによるものであることが理解される。本明細書で開示される特定の配列のこの同一性は、本明細書の他の場所でも論じられている。一般に、本明細書に開示される遺伝子及びタンパク質の変異体は、通常、記載された配列または天然配列と少なくとも約７０パーセント、７１パーセント、７２パーセント、７３パーセント、７４パーセント、７５パーセント、７６パーセント、７７パーセント、７８パーセント、７９パーセント、８０パーセント、８１パーセント、８２パーセント、８３パーセント、８４パーセント、８５パーセント、８６パーセント、８７パーセント、８８パーセント、８９パーセント、９０パーセント、９１パーセント、９２パーセント、９３パーセント、９４パーセント、９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセントまたは９９パーセントの相同性を有する。当業者は、遺伝子などの２つのタンパク質または核酸の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性がその最高レベルになるように、２つの配列をアラインメントした後に相同性を計算することができる。一態様では、「変異体」という用語は、Ｎ末端及び／またはＣ末端のアミノ酸残基（複数可）の単なる欠失以外の、参照配列との何らかの相違を意味し得る。一態様では、変異体はアミノ酸残基の置換を含むことができ、この置換は、保存的または非保存的であるとみなすことができる。保存的置換とは、以下の群、すなわち、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＣｙｓ；Ｌｅｕ、ｌｉｅ及びＶａｌ；Ｇｌｕ及びＡｓｐ；Ｌｙｓ及びＡｒｇ；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ；ならびにＧｉｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ及びＨｉｓ内における置換である。変異体は、少なくとも１つの置換及び／または少なくとも１つの付加を含むことができ、少なくとも１つの欠失が存在してもよい。変異体は、１つ以上の非天然由来の残基を含んでもよい。例えば、変異体は、システインの位置を含む任意の位置にセレノシステイン（例えば、セレノ−Ｌ−システイン）を含み得る。他の多数の「非天然」アミノ酸代替物が当該技術分野において既知であり、商業的供給源から入手可能である。非天然由来のアミノ酸の例としては、Ｄ−アミノ酸、システインの硫黄原子に結合したアセチルアミノメチル基を有するアミノ酸残基、ＰＥＧ化アミノ酸、ならびに式ＮＨ２（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ（式中、ｎは２〜６である）のオメガアミノ酸、中性非極性アミノ酸、例えば、サルコシン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン及びノルロイシンが挙げられる。フェニルグリシンは、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅの代替となり得る。シトルリン及びメチオニンスルホキシドは中性非極性であり、システイン酸は酸性であり、オルニチンは塩基性である。プロリンはヒドロキシプロリンで置換され得、プロリンの特性をもたらす立体構造を保持し得る。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「置換された」という用語は、有機化合物のすべての許容される置換基を含むことが企図される。広範な態様では、許容される置換基には、有機化合物の非環式及び環式、分岐鎖及び直鎖、炭素環式及び複素環式、ならびに芳香族及び非芳香族の置換基が含まれる。例示的な置換基としては、例えば、以下に記載されるものが挙げられる。許容される置換基は、適切な有機化合物に対して１つまたは複数であってよく、同じであってもまたは異なっていてもよい。本開示の目的に関して、窒素などのヘテロ原子は、ヘテロ原子の原子価を満たす、本明細書に記載の有機化合物の水素置換基、及び／または任意の許容される置換基を有することができる。本開示は、いかなる様式においても、有機化合物の許容される置換基により限定されることを意図しない。同様に、「置換」または「〜で置換された」という用語は、そのような置換が、置換される原子及び置換基の許容される原子価に従っていること、ならびに置換が、安定化合物、例えば、転位、環化、脱離などにより自発的に変換を起こすことがない化合物をもたらすことという暗黙の条件を含む。特定の態様では、別途明白に否定されない限り、個々の置換基は、さらに任意に置換可能である（すなわち、さらに置換されるか、または無置換である）ことも企図される。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「アルキル」という用語は、１〜２４個の炭素原子を持つ分岐鎖または直鎖の飽和炭化水素基であり、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｓ−ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどである。アルキル基が非環式であることが理解される。アルキル基は分岐鎖であっても、または直鎖であってもよい。アルキル基はまた、置換されていても、または無置換であってもよい。例えば、アルキル基は、１つ以上の基で置換可能であり、そのような基としては、本明細書に記載されているような、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、またはチオールが挙げられるが、これらに限定されない。「低級アルキル」基とは、１〜６つ（例えば、１〜４つ）の炭素原子を含有するアルキル基である。アルキル基という用語はまた、Ｃ１アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ９アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルなどの、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル以下であり得る。
【００３６】
「アルキル」という用語は、概して、無置換アルキル基及び置換アルキル基の両方を指すのに使用される。しかしながら、本明細書中、アルキル基の特定置換基（複数可）を特定することにより、置換アルキル基を具体的に指す場合もある。例えば、「ハロゲン化アルキル」または「ハロアルキル」という用語は、１つ以上のハライド、例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素で置換されたアルキル基を具体的に指す。あるいは、「モノハロアルキル」という用語は、単一のハライド、例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素で置換されたアルキル基を具体的に指す。「ポリハロアルキル」という用語は、２つ以上のハライドで独立に置換されたアルキル基を具体的に指す。換言すれば、各ハライド置換基は別のハライド置換基と同じハライドである必要はなく、また、ハライド置換基の複数の事例が、同じ炭素上にある必要もない。「アルコキシアルキル」という用語は、以下で記載される通り、１つ以上のアルコキシ基で置換されたアルキル基を具体的に指す。「アミノアルキル」という用語は、１つ以上のアミノ基で置換されたアルキル基を具体的に指す。「ヒドロキシアルキル」という用語は、１つ以上のヒドロキシ基で置換されたアルキル基を具体的に指す。１つの事例で「アルキル」が使用され、別の事例で「ヒドロキシアルキル」などの特定の用語が使用される場合、「アルキル」という用語もまた「ヒドロキシアルキル」などの特定の用語などを指さないと暗に示すということを意味しない。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「アルケニル」という用語は、２〜２４個の炭素原子で構成され、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する構造式を持つ炭化水素基である。（Ａ1Ａ2）Ｃ＝Ｃ（Ａ3Ａ4）などの非対称構造は、Ｅ異性体及びＺ異性体の両方を含むことが意図される。これは、本明細書中、式中に非対称アルケンが存在する構造式において推定可能であり、または、結合記号Ｃ＝Ｃにより明確に示すことが可能である。アルケニル基は、１つ以上の基で置換可能であり、そのような基としては、本明細書に記載されているような、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、アジド、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、またはチオールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
組成物
ＯＣＡ−Ｂペプチドまたはその断片；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチドを含む化合物が、本明細書で開示される。ＯＣＡ−ＢペプチドもしくはＯＣＡ−Ｂペプチド断片またはそれらの変異体；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチドを含む化合物もまた、本明細書で開示される。ＯＣＡ−ＢペプチドもしくはＯＣＡ−Ｂペプチド断片またはそれらの変異体、及び細胞膜透過性ペプチドを含む化合物もまた、本明細書で開示される。ＯＣＡ−Ｂペプチド断片のＯＣＡ−Ｂペプチド変異体を開示している化合物が、本明細書でさらに開示される。いくつかの態様では、本明細書に開示される化合物は、リンカーをさらに含むことができる。一態様では、リンカーは、炭化水素リンカーであり得る。一態様では、ＯＣＡ−Ｂペプチドのその断片；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチドを含む化合物が、本明細書で開示される。一態様では、本明細書に記載の化合物は、ＯＣＡ−Ｂ阻害剤として作用することができ、ＯＣＡ−ＢとＪｍｊｄ１ａとの相互作用を阻止することができる。一態様では、本明細書に記載の化合物は、ＯＣＡ−Ｂ阻害剤として作用することができ、ＯＣＡ−ＢのＯｃｔ１との相互作用を阻止することができる。一態様では、本明細書に記載の化合物は、ＯＣＡ−ＢとＪｍｊｄ１ａとの相互作用を阻止することができる。一態様では、本明細書に記載の化合物は、ＯＣＡ−ＢのＯｃｔ１との相互作用を阻止することができる。同様に、本明細書に開示される化合物は、ＯＣＡ−ＢのＪｍｊｄ１ａまたはＯｃｔ１との相互作用を阻止することができる。一態様では、本明細書に開示される化合物は、配列番号２または配列番号３を含むペプチド；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチドを含む。一態様では、本明細書に開示される化合物は、配列番号２または配列番号３からなるペプチド；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチドを含む。一態様では、本明細書に開示される化合物は、ＯＣＡ−Ｂまたはその断片、配列番号２または配列番号３からなるペプチド；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチドを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示される化合物のいずれかは、ＯＣを含むことができる。
【００３９】
ＯＣＡ−Ｂペプチド、そのＯＣＡ−Ｂ断片、またはそのＯＣＡ−Ｂ変異体。一態様では、ペプチドは、ＯＣＡ−ＢペプチドまたはそのＯＣＡ−Ｂ断片であり得る。いくつかの態様では、ペプチドは、ＯＣＡ−ＢペプチドまたはＯＣＡ−Ｂ断片の変異体であり得る。本明細書で使用する場合、「断片」は、ＯＣＡ−Ｂタンパク質の完全長配列よりも短い（例えば、配列番号５または配列番号７に示される完全長配列よりも短い）ペプチドを指す。一態様では、ペプチドは、ＯＣＡ−Ｂペプチドまたはその断片の生物学的に活性な変異体であり得る。ＯＣＡ−Ｂペプチドの断片の例としては、配列番号１、配列番号２、配列番号３を含むか、またはこれらからなるペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。ＯＣＡ−Ｂペプチドの例としては、配列番号５または配列番号７を含むか、またはこれらからなるペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。一態様では、ＯＣＡ−Ｂ断片は、配列番号２または配列番号３であり得る。一態様では、ＯＣＡ−Ｂペプチド断片またはＯＣＡ−Ｂペプチドの生物学的に活性な変異体は、配列番号２であり得る。一態様では、ＯＣＡ−Ｂペプチドは、配列番号３に記載のＯＣＡ−Ｂペプチドの断片または生物学的に活性な変異体であり得る。ＯＣＡ−Ｂペプチド断片の変異体の例としては、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１もしくは配列番号３２を含むか、またはこれらからなるペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４０】
いくつかの態様では、ＯＣＡ−Ｂペプチドまたはその断片は、本明細書に記載のＯＣＡ−Ｂペプチドのいずれかの断片であり得る。いくつかの態様では、ＯＣＡ−Ｂ断片は、配列番号２または配列番号３を含み得る。一態様では、ＯＣＡ−Ｂペプチド断片は、少なくとも配列番号２を含む。一態様では、ＯＣＡ−Ｂペプチドまたは断片は、配列番号１ではない。
【００４１】
いくつかの態様では、ＯＣＡ−Ｂ変異体は、本明細書に記載のＯＣＡ−Ｂペプチドのいずれかの変異体であり得る。いくつかの態様では、ＯＣＡ−Ｂ変異体は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１または配列番号３２を含み得る。一態様では、ＯＣＡ−Ｂ変異体は、配列番号２または配列番号３の変異体であり得る。
【００４２】
さらに、本明細書に記載のまたは当業者に既知のＯＣＡ−Ｂペプチドのいずれかの断片または変異体は、内在性ＯＣＡ−ＢのＪｍｊｄ１ａまたはＯｃｔ１との相互作用を阻止する生物学的機能を保持するものである。ＯＣＡ−Ｂ断片の生物学的に活性な変異体は、内在性ＯＣＡ−ＢのＪｍｊｄ１ａまたはＯｃｔ１との相互作用を阻止することができる。ＯＣＡ−Ｂの生物学的に活性な変異体または断片（ＯＣＡ−Ｂ断片の変異体を含む）は、対象に投与されると、内在性ＯＣＡ−ＢのＪｍｊｄ１ａまたはＯｃｔ１との相互作用を十分に有用な親和性で阻止することができる。本明細書に記載されているように、ＯＣＡ−ＢまたはＯＣＡ−Ｂ断片のその断片または生物学的に活性な変異体は、任意の種に由来し得る。一態様では、ある種に由来する配列またはその生物学的に活性な変異体は、別の種に由来するものと同一であり得る。一態様では、ＯＣＡ−ＢまたはＯＣＡ−Ｂ断片のその断片または生物学的に活性な変異体は、マウス（配列番号５）に由来し得る。一態様では、ＯＣＡ−ＢまたはＯＣＡ−Ｂ断片のその断片または生物学的に活性な変異体は、ヒト（配列番号７）に由来し得る。
【００４３】
本明細書に記載されているように、ＯＣＡ−Ｂの断片は、約２５６個以下、２５０個以下、２４０個以下、２３０個以下、２２０個以下、２１０個以下、２００個以下、１９０個以下、１８０個以下、１７０個以下、１６０個以下、１５０個以下、１４０個以下、１３０個以下、１２０個以下、１１０個以下、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下または５つ以下のアミノ酸残基を有し得る。いくつかの態様では、ＯＣＡ−Ｂペプチドまたはその断片は、３〜３０個のアミノ酸残基であり得る。
【００４４】
ＯＣＡ−Ｂの生物学的に活性な断片を使用する場合、その断片は、対応する野生型のＯＣＡ−Ｂの断片と、少なくともまたは約８０％同一（例えば、少なくともまたは約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％同一）であり得る。いくつかの態様では、ＯＣＡ−Ｂペプチドは、配列番号２に対応するアミノ酸を有するＯＣＡ−Ｂの断片またはその生物学的に活性な変異体を含み得る。いくつかの態様では、ＯＣＡ−Ｂペプチドは、配列番号３に対応するアミノ酸を有するＯＣＡ−Ｂの断片またはその生物学的に活性な変異体を含み得る。ＯＣＡ−Ｂの生物学的に活性な断片を使用する場合、その断片は、本明細書に開示される対応するＯＣＡ−Ｂの断片と、少なくともまたは約８０％同一（例えば、少なくともまたは約８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）であり得る。いくつかの態様では、ＯＣＡ−Ｂの生物学的に活性な断片は、対応する野生型のＯＣＡ−Ｂアミノ酸配列と、少なくともまたは５％同一（例えば、少なくともまたは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）であり得る。
【００４５】
一態様では、ＯＣＡ−Ｂ断片は、ＯＣＡ−Ｂペプチドの野生型断片と比較した場合に少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一）であるアミノ酸配列を有し得る。一態様では、ＯＣＡ−Ｂペプチドの野生型断片は、ヒトまたはマウスに由来し得る。
【００４６】
本明細書に開示されるペプチドはまた、変異体を含み得る。概して、本明細書に開示されるＯＣＡ−Ｂペプチドまたは断片の１つ以上の個々の変異体の間におけるアミノ酸同一性は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり得る。したがって、「変異体ＯＣＡ−Ｂペプチド」は、本発明の親ＯＣＡ−Ｂペプチドもしくは参照ＯＣＡ−Ｂペプチドまたはそれらの断片と特定の同一性を有するものであり、限定されないが、親ＯＣＡ−Ｂペプチドもしくは参照ＯＣＡ−Ｂペプチドまたはそれらの断片の特異性及び／または活性の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％を含む生物学的機能を共有する。例えば、「変異体ＯＣＡ−Ｂペプチド」は、本発明の親ＯＣＡ−Ｂペプチドもしくは参照ＯＣＡ−Ｂペプチドまたはそれらの断片と比較して１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸の変化を含む配列であり得、親ＯＣＡ−Ｂペプチドもしくは参照ＯＣＡ−Ｂペプチドまたはそれらの断片の生物学的機能、特異性及び／または活性を共有するかまたはそれらを向上させる。
【００４７】
一態様では、ＯＣＡ−Ｂ変異体は、参照配列または親配列と比較した場合に少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一）であるアミノ酸配列を有し得る。一態様では、参照配列または親配列は、ＯＣＡ−Ｂペプチドの野生型断片であり得る。一態様では、ＯＣＡ−Ｂペプチドの野生型断片は、ヒトまたはマウスに由来し得る。
【００４８】
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＯＣＡ−Ｂペプチド変異体の配列のいずれかは、親ＯＣＡ−Ｂペプチドもしくは参照ＯＣＡ−Ｂペプチドまたはそれらの断片と比較した場合に、単一のアミノ酸変化を含み得る。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＯＣＡ−Ｂペプチド変異体の配列のいずれかは、親ＯＣＡ−Ｂペプチドもしくは参照ＯＣＡ−Ｂペプチドまたはそれらの断片と比較した場合に、少なくとも２つのアミノ酸変化を含み得る。一態様では、アミノ酸の変化は、任意のアミノ酸残基からシステイン残基への変化であり得る。一態様では、アミノ酸の変化は、任意のアミノ酸残基からアラニン残基への変化であり得る。個々のＯＣＡ−Ｂ変異体の間におけるアミノ酸同一性は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり得る。したがって、「ＯＣＡ−Ｂペプチド変異体」は、本発明の親ＯＣＡ−Ｂペプチドもしくは参照ＯＣＡ−Ｂペプチドまたはそれらの断片と特定の同一性を有するものであり得、限定されないが、親ＯＣＡ−Ｂペプチドもしくは参照ＯＣＡ−Ｂペプチドまたはそれらの断片の特異性及び／または活性の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％を含む生物学的機能を共有する。例えば、親ＯＣＡ−Ｂ配列は、配列番号５及び／または配列番号７のうちの１つ以上であり得る。例えば、参照ＯＣＡ−Ｂ配列は、配列番号１、配列番号２及び／または配列番号３のうちの１つ以上であり得る。変異体ＯＣＡ−Ｂ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５及び／または配列番号７のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得る。変異体ＯＣＡ−Ｂ配列はまた、親ＯＣＡ−Ｂペプチドもしくは参照ＯＣＡ−Ｂペプチドまたはそれらの断片の特異性及び／または活性の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を共有し得る。
【００４９】
本明細書で論じられるように、既知であり本明細書で企図される非常に多くのＯＣＡ−Ｂタンパク質またはＯＣＡ−Ｂペプチドの変異体が存在する。タンパク質及びペプチド断片、変異体及び誘導体は当業者に十分理解されており、アミノ酸配列の改変を含むことができる。例えば、アミノ酸配列の改変は、通常、置換変異体、挿入変異体、または欠失変異体の３つの種類のうちの１つ以上に分類される。挿入には、アミノ末端融合及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。挿入は、通常、アミノ末端融合またはカルボキシル末端融合の挿入よりも小さい（例えば、１〜４つ程度の残基の）挿入である。欠失は、ペプチド配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去を特徴とする。通常、約２〜６つ以下の残基が、ペプチド内の任意の一部位で欠失される。アミノ酸置換は通常、単一の残基に関するが、一度に多数の異なる位置で発生する場合があり、挿入は一般に、約１〜１０個程度のアミノ酸残基であり、欠失は、約１〜３０個の残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは、隣接する対、すなわち、２つの残基の欠失または２つの残基の挿入で行われる。置換、欠失、挿入、または任意のそれらの組み合わせを組み合わせて、最終コンストラクトを得てもよい。置換変異体は、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されたものである。このような置換は、概して、以下の表１及び表２に従って行われ、保存的置換と称される。
表１：アミノ酸の略称
2021523892.tif 000003
表２：アミノ酸置換
2021523892.tif 000004
【００５０】
機能的または免疫学的同一性の実質的な変化は、表２の置換よりも保存的でない置換を選択することにより、すなわち、（ａ）例えばシート状もしくは螺旋状の立体構造のような、置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の容積、の維持に対する残基の影響がより著しく異なる残基を選択することによりなされる。一般にタンパク質特性に最大の変化をもたらすと予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリルもしくはトレオニルが、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニルの代わりに（もしくはそれらによって）置換されているか、（ｂ）システインもしくはプロリンが任意の他の残基の代わりに（もしくは任意の他の残基によって）置換されているか、（ｃ）正に荷電した側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、もしくはヒスチジルが、負に荷電した残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルの代わりに（もしくはそれらによって）置換されているか、または（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、側鎖を持たない残基、例えばグリシンの代わりに（もしくはそれらによって）置換されているものであり、この場合、（ｅ）硫酸化部位及び／またはグリコシル化部位の数を増加させることによるものである。
【００５１】
例えば、あるアミノ酸残基の、生物学的及び／または化学的に類似している別のアミノ酸残基との置換は、保存的置換として当業者に知られている。例えば、保存的置換は、ある疎水性残基を別の疎水性残基に、またはある極性残基を別の極性残基に置換することであろう。置換には、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒのような組み合わせが含まれる。明示的に開示された各配列のそのような保存的に置換された変異は、本明細書にて提供されるモザイクポリペプチド内に含まれる。
【００５２】
置換変異導入または欠失変異導入を使用して、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）のための部位を挿入することができる。システインまたは他の不安定な残基の欠失が望ましい場合もある。タンパク質分解の可能性のある部位、例えば、Ａｒｇの欠失または置換は、例えば、塩基性残基の１つを欠失させるか、またはグルタミニル残基またはヒスチジル残基で塩基性残基を置換することにより実現される。
【００５３】
アミノ酸類似体及び類似体及びペプチド類似体は、多くの場合、増強されたまたは望ましい特性、例えば、より経済的な生成、より高い化学的安定性、より増強された薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性など）、特異性の変化（例えば、広範な生物活性）、抗原性の低下、及びその他のものを有する。
【００５４】
Ｄ−アミノ酸はペプチダーゼなどによって認識されないことから、Ｄ−アミノ酸を使用してより安定なペプチドを作製することができる。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸を、同じタイプのＤ−アミノ酸で系統的に置換して（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）、より安定なペプチドを作製することができる。システイン残基を使用して、２つ以上のペプチドを合わせて環化または結合できる。これは、ペプチドを特定の立体構造に拘束するのに有益であり得る。（参照により本明細書に組み込まれている、Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２））。
【００５５】
同一性の程度は変化する可能性があり、当該技術分野で十分に確立された方法によって決定することができる。「相同性」及び「同一性」はそれぞれ、２つのポリペプチド配列間の配列類似性を指しており、同一性はより厳密な比較である。相同性及び同一性はそれぞれ、比較を目的としてアラインされ得る各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列の位置が同じアミノ酸残基によって占有されている場合、そのポリペプチドはその位置で同一であると称すことができる。対応する部位が同じ（例えば、同一の）アミノ酸または類似の（例えば、立体的性質及び／または電子的性質において類似の）アミノ酸によって占有されている場合、その分子はその位置で相同であると称すことができる。配列間の相同性または同一性のパーセンテージは、それらの配列によって共有される一致する位置または相同の位置の数による。本明細書に記載のペプチドまたはポリペプチドの生物学的に活性な変異体または断片は、対応する天然由来のペプチドまたはポリペプチドに対して、少なくともまたは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性または相同性を有し得る。
【００５６】
本明細書で使用する場合、ＯＣＡ−Ｂ断片は、長さを変えることができ、ＯＣＡ−Ｂに天然に生じるかまたは天然由来のＯＣＡ−Ｂ配列とある程度異なる（ただし生物活性を保持した）隣接アミノ酸残基であり得るか、またはそれらを含むことができる。
【００５７】
ＯＣＡ−ＢペプチドまたはＯＣＡ−Ｂ断片が、そのＮ末端もしくはＣ末端（または両方）にＯＣＡ−Ｂに天然には見られないアミノ酸残基を含む場合、追加の配列（複数可）は約１〜２００アミノ酸残基長であり得、これらの残基をＮ末端とＣ末端の間で均一にまたは不均一に分けることができる。例えば、Ｎ末端及びＣ末端の両方とも、約１つ、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個のアミノ酸残基を含むことができる。あるいは、一方の末端に約１つ、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個または２００個の残基を含んでよく、他方の末端には１つも含まなくてもよい。
【００５８】
より具体的には、Ｎ末端またはＣ末端は、１〜約１００個（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個）の正に荷電したアミノ酸残基（例えば、アルギニン残基、ヒスチジン残基及び／またはリシン残基などの塩基性アミノ酸残基）、負に荷電した１〜約１００個のアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基などの酸性アミノ酸残基）、１〜約１００個のグリシン残基、１〜約１００個の疎水性アミノ酸残基（例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシンもしくはバリンなどの疎水性脂肪族残基、またはフェニルアラニン、トリプトファンもしくはチロシンなどの疎水性芳香族残基）、あるいは１〜約１００個（例えば、１〜４つ）のシステイン残基を含むことができる。ＯＣＡ−Ｂ断片の生物学的に活性な変異体が使用される場合、変異体は、これらのグループ内の１つ以上のアミノ酸残基の置換によって変化させることができる。変異体は、保存的アミノ酸置換を含むことができる。
【００５９】
上記の改変断片及び本明細書に開示されるＯＣＡ−Ｂ変異体を含む、ＯＣＡ−Ｂ及びＯＣＡ−Ｂの断片は、プロテアーゼ耐性であり得、アシル基、アミド基、ベンジル基もしくはベンゾイル基などの１つ以上の種類の保護基またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。
【００６０】
示したように、本発明の組成物において有用なＯＣＡ−Ｂ、ＯＣＡ−Ｂの断片及びそれらの変異体は、天然由来のＯＣＡ−Ｂ内の配列と同一のアミノ酸配列を含むことができるか、またはそれらは、その断片もしくは生物学的に活性な変異体を含むことができる。これらの配列は、例えば、アミノ末端、カルボキシ末端のいずれか、または両方で改変することができる。
【００６１】
ＯＣＡ−Ｂ及びＯＣＡ−Ｂ断片、ならびにそれらの生物学的に活性な変異体は、非常に多くの方法で改変することができる。例えば、追加のアミノ酸残基、他の置換基及び保護基を含む薬剤を、アミノ末端、カルボキシ末端のいずれかまたは両方に付加することができる。改変は、断片の形態を変化させること、または断片が他のペプチドもしくはポリペプチドに結合するもしくはそれらと相互作用する方法を変化させることを目的として行うことができる。例えば、ジスルフィド結合形成に関与することができるシステイン残基もしくは他の硫黄含有残基または薬剤を含むように、断片を改変することができる。例えば、少なくとも１つのシステイン残基を付加することができ、そのうちの１つは任意で、断片のＣ末端またはＮ末端にある。
【００６２】
リンカー。本明細書に記載の化合物は、１つ以上のリンカーを含むこともできる。リンカーは、任意の長さの柔軟な配列であってよく、電荷を有さない。一態様では、リンカーはペプチドリンカーであり得る。一態様では、１つ以上のリンカーは、ペプチドベースであり得る。一態様では、１つ以上のリンカーは、ＧＳＧであり得る。一態様では、１つ以上のリンカーは、かさ高くないアミノ酸であり得る。いくつかの態様では、１つ以上のリンカーは、ＡＡ、ＡＡＡ、ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＡＧＧまたはＧＡＧであり得る。いくつかの態様では、１つ以上のリンカーは、セリンを用いてコンビナトリアル的に使用され得る。
【００６３】
いくつかの態様では、リンカーは、炭化水素リンカーであり得る。いくつかの態様では、炭化水素リンカーは、アルファヘリックスを安定化させる部分であり得る。いくつかの態様では、炭化水素リンカーは、炭化水素ステープルであり得る。いくつかの態様では、炭化水素ステープルは、ｉ、ｉ＋３；ｉ、ｉ＋４；またはｉ、ｉ＋７の配置であり得る。いくつかの態様では、炭化水素ステープルは以下の構造：
【００６４】
【化１】
2021523892.tif 000005
【００６５】
を有することができる。一態様では、ｍは２、３または６であり得、ｎは１〜１０の整数（１と１０を含む）であり得、Ｒｂは、独立してＨまたはメチルであり、［Ｘａａ］ｍは、本明細書に開示されるペプチドのいずれかの２つ、３つまたは６つの隣接アミノ酸を表し得る。いくつかの態様では、炭化水素ステープルは以下の構造：
【００６６】
【化２】
2021523892.tif 000006
【００６７】
を有することができる。一態様では、ｍは２、３または６であり得、［Ｘａａ］ｍは、本明細書に開示されるペプチドのいずれかの２つ、３つまたは６つの隣接アミノ酸を表し得る。
【００６８】
いくつかの態様では、リンカーは、共有結合であり得る。共有結合を形成するために、例えば、ヒドロキシル部分がＯＣＡ−Ｂペプチド配列、ＯＣＡ−Ｂペプチド断片配列または細胞膜透過性ペプチド配列を改変するのに必要なレベルにおいて生理学的に許容可能である、多種多様な活性カルボキシル基（例えば、エステル）を有する化学反応性基を使用することができる。
【００６９】
本明細書に記載され、化合物に組み込まれるペプチド配列のいずれも、本明細書に記載のリンカーと化学的に相互作用するように、または本明細書に記載のリンカーを含むように改変することができる。これらの改変ペプチド配列及びペプチド−リンカーコンストラクトは、本開示の範囲内であり、例えば、ＯＣＡ−ＢペプチドもしくはそのＯＣＡ−Ｂペプチド断片もしくはＯＣＡ−Ｂ変異体及び／または細胞膜透過性ペプチドへのコンジュゲーションのプロセスを完了するための説明書を含むキットの構成要素として、これらをパッケージングすることができる。コンジュゲーションとは、カップリングすること、連結させること、例えば、共有結合を介して２つ以上の分子を結合させること、会合させることを指す。ペプチド配列は、Ｎ末端、Ｃ末端またはその両方にシステイン残基または他の硫黄含有部分（例えば、Ｃ−ＳＨ）を含むように改変することができる。
【００７０】
一態様では、本明細書に記載の化合物は、ペプチドと細胞膜透過性ペプチドとの間にリンカーを含むことができる。
【００７１】
細胞膜透過性ペプチド。一態様では、細胞膜透過性ペプチドは、ペプチドまたは化合物の細胞への進入を促進するものであり得る。一態様では、細胞膜透過性ペプチドは、ＨＩＶ  ｐＴＡＴタンパク質由来のタンパク質形質導入ドメインであり得る。いくつかの態様では、本明細書に開示される化合物の細胞膜透過性ペプチドは、ＴＡＴ配列であり得る。一態様では、ＴＡＴ配列は、配列番号４であり得る。一態様では、ＴＡＴ配列は、配列番号８であり得る。いくつかの態様では、細胞膜透過性ペプチドは、野生型ＴＡＴ配列の断片または誘導体であり得る。一態様では、ＴＡＴ配列は、野生型ＴＡＴ配列と９０〜１００％同一であり得る。
【００７２】
本明細書に記載されているように、細胞膜透過性ペプチドは、異なるサイズ、アミノ酸配列、及び電荷のものであり得る。概して、細胞膜透過性ペプチドは、「カーゴ」の細胞取り入れ／取り込みを促進する短いペプチドである。「カーゴ」は、共有結合を介した化学結合または非共有相互作用のいずれかによって、細胞膜透過性ペプチドと会合することができる。細胞膜透過性ペプチドの機能はカーゴを細胞内に送達することであり、これは、エンドサイトーシスによって通常発生するプロセスである。本開示の有用な細胞膜透過性ペプチドは、形質膜を移動して、本明細書に開示される化合物のその所望の標的への送達を容易にする能力を有するであろう。細胞膜透過性ペプチドは、リシンもしくはアルギニンなどの正に帯電したアミノ酸を高い相対存在比で含有するか、または極性／荷電アミノ酸（ポリカチオン性）と非極性疎水性アミノ酸（両親媒性）との交互のパターンを含有する配列を有するかのいずれかであるアミノ酸組成物を有し得る。細胞膜透過性ペプチドの第３の部類は、極性残基を含有し正味電荷が低いか、または細胞取り込みに重要な疎水性アミノ酸基を含有する、疎水性ペプチドである。細胞膜透過性ペプチドの例は、Ｂｅｃｈａｒａ  ａｎｄ  Ｓａｇａｎ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８７（２０１３），ｐｐ．１６９３−１７０２に見ることができ、これは、参照により本明細書に組み込まれている。
【００７３】
一態様では、細胞膜透過性ペプチドは、約６〜１２個のアルギニンアミノ酸残基を含むペプチド配列である、ポリアルギニン配列であり得る。一態様では、細胞膜透過性ペプチドは、配列番号６であり得る。
【００７４】
一態様では、細胞膜透過性ペプチドは、非共有結合的な方法を介してリンカーにコンジュゲートさせることができる。一態様では、細胞膜透過性ペプチドは、Ｐｅｐ−１であり得る。
【００７５】
配置。リンカーに直接コンジュゲートすることができるペプチドを含む化合物が、本明細書で開示される。細胞膜透過性ペプチドに直接コンジュゲートすることができるリンカーを含む化合物が、本明細書で開示される。配列番号２を含むかまたは配列番号２からなるペプチド、ＧＳＧであり得るリンカー、及び配列番号４であり得る細胞膜透過性ペプチドを含む化合物が、本明細書で開示される。ＧＳＧに直接コンジュゲートした配列番号２を含み、ＧＳＧもまた配列番号４に直接コンジュゲートしている化合物が、本明細書で開示される。配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１もしくは配列番号３２のいずれかを含むか、またはこれらからなるペプチドを含む化合物が、本明細書で開示される。
【００７６】
加えて、炭化水素ステープルは、ペプチド中のおよそ１つまたは２つの完全なヘリカルターンを表す次の配列、すなわち、ｉ、ｉ＋３；ｉ、ｉ＋４；またはｉ、ｉ＋７のうちの１つに存在し、さらにα−メチルアミノ酸、α−アルケニルアミノ酸で置換するのに適した残基の同定を制限する。提案された配列には、ｉ、ｉ＋７パターンで間隔を置いた残基が含まれる。理論的根拠は、ステープルがペプチドのより広い部分に及ぶためのものであり、７つの残基の間隔を空けることにより、２つの完全なヘリックスのターンを含有することができ、これにより、ｉ、ｉ＋３またはｉ、ｉ＋４の選択肢のいずれよりも高い安定性をもたらすことができることである。
【００７７】
いくつかの態様では、細胞膜透過性ペプチドは、炭化水素リンカー内に存在し得る。いくつかの態様では、細胞膜透過性ペプチドは、本明細書に開示されるペプチドのアルファヘリックスを安定させるように機能することができる。例えば、組成物は、細胞膜透過性ペプチドによって架橋された共有結合を互いに形成するシステイン残基を５’末端及び３’末端の両方に含むＯＣＡ−Ｂ変異体（例えば、ＣＬＬＲＲＫＲＧＣ、配列番号３６）を含むことができる。
【００７８】
環化化合物。本明細書に開示される化合物は、少なくとも２つのシステイン残基を含むことができ、その一方または両方は、任意で、化合物のＣ末端またはＮ末端にある。例えば、本明細書に開示される化合物は、Ｃ末端もしくはＮ末端またはその近傍にシステイン残基を有するＯＣＡ−Ｂ由来の配列、及びＣ末端もしくはＮ末端またはその近傍にシステイン残基を有する細胞膜透過性ペプチド配列を含むことができる。化合物は、これらの２つのシステイン残基の間（または、より一般的には、末端領域に存在する少なくとも２つのシステイン残基のうちの２つの間）のジスルフィド結合の形成によって環化され得る。本開示の化合物は直鎖状または環状であり得るが、環状ペプチドは一般に、それらの環状構造がより堅固であり、したがってそれらの生物学的活性が対応する直鎖状ペプチドのものよりも高い可能性があり、また、環状ペプチドは安定しており、その結果より低い用量または少ない投与（例えば、注射）が必要とされ得るという点で、直鎖状ペプチドよりも有利である。ペプチドを環化するための任意の方法を、本明細書に記載の化合物に適用することができる。
【００７９】
ステープルされた化合物。本明細書に開示されるペプチドは、ペプチドが合成のブレースを有することができるようにステープルすることができる。ステープルされたペプチドが効果的な治療薬として機能するためには、α−ヘリックス形状を維持しながら、全身に到達してその標的細胞を透過しなければならない。ペプチドステープリングを、ペプチドの薬理学的活性を増強させるために使用することができる。いくつかの態様では、ステープルされた化合物内で細胞膜透過性ペプチドを結合させることにより、本明細書に開示される化合物の毒性を低減させることができる。いくつかの態様では、炭化水素リンカーは、細胞膜透過性ペプチドを収容することができる。理論に束縛されることを望まないが、ヘリシティのこの戦略的な増強は、タンパク質分解耐性、細胞易透化及び標的親和性を含む、分子の生物物理学的及び生化学的特性の多くを向上させる可能性があると仮定される。実際、炭化水素ステープル（複数可）がヘリックス形状の維持を可能にすることから、ペプチドがタンパク質分解に必要な伸展した立体構造を得ることを防止することが予期される。いくつかの態様では、炭化水素ステープルは、本明細書に開示されるペプチドのいずれかのα−ヘリックス形状を誘導または維持するために使用することができる。一態様では、炭化水素ステープルは、ｉ、ｉ＋３；ｉ、ｉ＋４；もしくはｉ、ｉ＋７の配置で構成することができ、ここで、ｉが、ｉ、ｉ＋３；ｉ、ｉ＋４；もしくはｉ、ｉ＋７の配置の炭化水素ステープルに対してそれぞれ、１〜９、１〜８もしくは１〜４の任意のアミノ酸位置であり得るか、または配列番号２のその活性断片中の対応するアミノ酸であって、ここで、ｉが、ｉ、ｉ＋３；ｉ、ｉ＋４；もしくはｉ、ｉ＋７の配置の炭化水素ステープルに対してそれぞれ、１〜１８、１〜１９もしくは１〜１６の任意のアミノ酸位置であり得るか、または配列番号３のその活性断片中の対応するアミノ酸であって、ここで、ｉが、ｉ、ｉ＋３；ｉ、ｉ＋４；もしくはｉ、ｉ＋７の配置の炭化水素ステープルに対してそれぞれ、１〜９、１〜８もしくは１〜４の任意のアミノ酸位置であるか、または配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、もしくは配列番号３２のその活性変異体中の対応するアミノ酸である。
【００８０】
炭化水素ステープルを有するペプチドの作製方法。一態様では、少なくとも１つの炭化水素ステープル対を含むペプチドの作製方法であって、本明細書に開示されるような少なくとも１つの炭化水素ステープル前駆体対を含むペプチドを、閉環オレフィンメタセシスのための触媒の存在下で反応させるステップを含み、これにより、本明細書に開示されるような少なくとも１つの炭化水素ステープルを含むペプチドを提供する方法が開示される。
【００８１】
さらなる態様では、本方法の炭化水素ステープルの前駆体対は、ｉ、ｉ＋３；ｉ、ｉ＋４；もしくはｉ、ｉ＋７の配置に少なくとも１つの炭化水素ステープルの前駆体対を含むことができ、ここで、ｉが、ｉ、ｉ＋３；ｉ、ｉ＋４；もしくはｉ、ｉ＋７の配置の炭化水素ステープルに対してそれぞれ、１〜９、１〜８もしくは１〜４の任意のアミノ酸位置であり得るか、または配列番号２のその活性断片中の対応するアミノ酸であって、ここで、ｉが、ｉ、ｉ＋３；ｉ、ｉ＋４；もしくはｉ、ｉ＋７の配置の炭化水素ステープルに対してそれぞれ、１〜１８、１〜１９もしくは１〜１６の任意のアミノ酸位置であり得るか、または配列番号３のその活性断片中の対応するアミノ酸であって、ここで、ｉが、ｉ、ｉ＋３；ｉ、ｉ＋４；もしくはｉ、ｉ＋７の配置の炭化水素ステープルに対してそれぞれ、１〜９、１〜８もしくは１〜４の任意のアミノ酸位置であるか、または配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、もしくは配列番号３２のその活性変異体中の対応するアミノ酸であって、ここで、一対のα，α−二置換アミノ酸が、ペプチド配列のｉ、ｉ＋３；ｉ、ｉ＋４；もしくはｉ、ｉ＋７でアミノ酸を置換し、各α，α−二置換アミノ酸が、α−メチル、α−アルケニルグリシン残基またはα−ヒドロ、α−アルケニルグリシン残基である。
【００８２】
種々の態様では、閉環オレフィンメタセシスのための触媒は、シュロック触媒またはグラブス触媒であり得る。なおさらなる態様では、閉環オレフィンメタセシスのための触媒は、グラブス触媒であり得る。
【００８３】
理論に束縛されることを望まないが、サイズの縮小及び骨格への炭化水素ステープルの付加によることを含むこのペプチドの改変は、現行の送達の問題を克服するのに役立つ可能性がある。
【００８４】
骨格炭化水素ステープルの付加は、α−ヘリックスペプチドを安定化させるために使用される比較的新しい技術である（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｃ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２，５８９１−５８９２、Ｈｅｎｃｈｅｙ，Ｌ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１２，６９２−６９７）。ペプチドの合成前に特定のアミノ酸残基を選択し、ペプチドの二次構造におけるそれらの位置に基づいて改変する。より具体的には、これらの残基は、標的との相互作用に関与してはならず、ペプチド中のおよそ１つまたは２つの完全なヘリカルターンを表す次の配列、すなわち、ｉ、ｉ＋３；ｉ、ｉ＋４；またはｉ、ｉ＋７のうちの１つに存在しなければならない（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｃ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２，５８９１−５８９２、Ｋｉｍ，Ｙ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１２，３０４６−３０４９）。合成中、好ましいアミノ酸残基はα，α−二置換アミノ酸に置換され、これは、α位の水素原子の代わりに任意の長さの立体特異的アルキル鎖を含む（Ｂｉｒｄ，Ｇ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４４６，３６９−３８６）。配列が合成されると、アルキル鎖は、ルテニウム触媒閉環オレフィンメタセシスを使用して結合され、このようにして炭化水素ステープルが生成される（スキーム１）（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．６，７６１−７７１）。
【００８５】
理論に束縛されることを望まないが、このステープルの付加により、ペプチドがそのα−ヘリックス状態に固定され、これにより溶液中で実現可能な立体構造の数が制限される。これにより、ペプチドのパーセントヘリシティが上昇し、治療薬の効力の大幅な向上に寄与し得る。プロテアーゼは伸展した非ヘリックス立体構造でそれらの基質に結合することが知られていることから、ペプチドをα−ヘリックス状態に固定することは、ステープルされたペプチドで見られるタンパク質分解耐性の向上の主な要因である（Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｇ．Ｌ．ａｎｄ  Ｇ．Ｊ．Ｈｉｌｉｎｓｋｉ，（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０３，３−３３）。したがって、伸展した立体構造の形成を防止することにより、ステープルされたペプチドは、非改変ペプチドよりもタンパク質分解に対してより強い耐性を示す。さらに、このα−ヘリックス状態で存在するペプチドでは、極性アミド骨格は、ヘリックス形成のための特徴的な分子内水素結合によって内部に埋没する（Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｇ．Ｌ．ａｎｄ  Ｇ．Ｊ．Ｈｉｌｉｎｓｋｉ，（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０３，３−３３）。理論に束縛されることを望まないが、この親水性の遮蔽により、疎水性残基の露出を増加させ、細胞膜透過性の向上を付加する可能性がある。例えば、内在化されると、事前に組織化された固定されたペプチドの状態によって生じる、標的結合のエントロピーコストの大幅な削減によって、標的親和性が５〜５０００倍上昇する可能性がある（Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｇ．Ｌ．ａｎｄ  Ｇ．Ｊ．Ｈｉｌｉｎｓｋｉ，（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０３，３−３３、Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｃ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２，５８９１−５８９２、Ｂｉｒｄ，Ｇ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７，１４０９３−１４０９８）。全体として、タンパク質分解耐性、細胞内在化の向上及び標的親和性の増強は、ペプチド治療のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の劇的な向上をもたらす可能性がある。理論に束縛されることを望まないが、種々の態様では、これらの増強は、より大きなペプチドの骨格に別の炭化水素ステープルを付加することによりさらに増大させることができる（Ｂｉｒｄ，Ｇ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７，１４０９３−１４０９８）。
【００８６】
ＰＥＧ化。いくつかの態様では、本明細書に開示される化合物は、ＰＥＧ化することができる。ＰＥＧ化とは、ポリマーであるＰＥＧ（ポリエチレングリコール）の鎖を、ペプチドを含む分子に結合するプロセスである。当該ＰＥＧ化は、ペプチドの安全性及び効率を向上させることができる。より具体的には、ＰＥＧ化は、分子及びマクロ構造、例えば、薬物、治療用タンパク質または小胞へのポリエチレングリコールポリマー鎖の共有結合性及び非共有結合性の両方の結合または融合のプロセスである。ＰＥＧ化は、ＰＥＧの反応性誘導体と分子とのインキュベーションによって日常的に行われる。薬物または治療用タンパク質へのＰＥＧの共有結合は、宿主の免疫系から薬剤を「遮蔽」することができ、それにより免疫原性及び抗原性を低下させ、かつ腎クリアランスを低下させることにより循環時間を延長する薬剤の、流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）を増加させることができる。ＰＥＧ化は、疎水性の薬物及びタンパク質に水溶性を付与することもできる。
【００８７】
配列：配列を表３に示す。
表３．配列
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2021523892.tif 000008
【００８８】
医薬組成物
上記の化合物及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が、本明細書で開示される。いくつかの態様では、医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化することができる。本開示の組成物はまた、治療有効量の本明細書に記載の化合物も含む。化合物は、ＯＣＡ−ＢまたはそのＯＣＡ−Ｂ断片であるペプチド；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチドを含むことができる。組成物は、あらゆる種々の投与経路による投与用に製剤化することができ、投与経路に応じて異なり得る１つ以上の生理学的に許容可能な賦形剤を含むことができる。本明細書で使用する場合、「賦形剤」という用語は、「担体」または「希釈剤」とも称され得るものを含む、任意の化合物または物質を意味する。薬学的及び生理学的に許容可能な組成物を調製することは、当該技術分野では日常業務であると考えられており、したがって当業者は、必要に応じて、指導について多くの当局に相談することができる。
【００８９】
本明細書に開示される医薬組成物は、経口または非経口投与用に調製することができる。非経口投与用に調製される医薬組成物には、静脈内（もしくは動脈内）、筋肉内、皮下、腹腔内、経粘膜（例えば、鼻腔内、膣内もしくは直腸）、または経皮（例えば、局所）投与用に調製されるものが含まれる。エアロゾル吸入を、二機能性アロステリックタンパク質−薬物分子を送達するためにも使用することもできる。したがって、組成物は、例えば、水、緩衝水、生理食塩水、緩衝生理食塩水（例えば、ＰＢＳ）などの水性担体を含むがこれらに限定されない、許容可能な担体に溶解または懸濁した二機能性アロステリックタンパク質−薬物分子を含む、非経口投与用に調製することができる。含まれる賦形剤のうちの１つ以上は、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、界面活性剤などのように、おおよその生理学的状態を補助することができる。組成物が固体成分を含む場合（経口投与用であり得る場合）、賦形剤のうちの１つ以上は、（例えば、錠剤、カプセルなどの製剤用の）結合剤または充填剤として機能することができる。組成物が皮膚または粘膜表面への適用のために製剤化される場合、賦形剤のうちの１つ以上は、クリーム、軟膏などの製剤用の溶媒または乳化剤であり得る。
【００９０】
医薬組成物は、無菌であってもよく、従来の無菌化技術によって無菌化しても、または無菌濾過してもよい。水溶液は、そのままで使用するために包装するかまたは凍結乾燥することができ、本開示によって包含される凍結乾燥調製物を、投与前に無菌水性担体と組み合わせることができる。医薬組成物のｐＨは、通常、３〜１１（例えば、約５〜９）または６〜８（例えば、約７〜８）となる。固体形態で得られた組成物を、錠剤またはカプセルの密閉包装の中などに固定量の上記の薬剤（複数可）をそれぞれ含有する、複数の単回用量単位で包装してもよい。固体形態での組成物を、局所的に適用可能なクリームまたは軟膏のために設計された圧搾可能なチューブの中などで、融通が利く分量のための容器で包装することもできる。
【００９１】
処置方法
本明細書に記載の化合物のうちの１つ以上を用いて疾患を有する対象を処置する方法が、本明細書で開示される。一態様では、疾患の処置は、ＯＣＡ−Ｂの抑制またはＯＣＡ−ＢとＪｍｊｄ１ａ及び／またはＯｃｔ１との間の相互作用の阻止が必要となる場合がある。一態様では、方法は、処置を必要とする患者を特定することを含むことができる。一態様では、方法は、治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物（または化合物）を対象に投与することを含むことができる。一態様では、方法は、化合物、ＯＣＡ−ＢまたはそのＯＣＡ−Ｂ断片またはＯＣＡ−Ｂ変異体であるペプチド；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチド、ならびに薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む、治療有効量の医薬組成物（または化合物）を対象に投与することを含むことができる。一態様では、方法は、化合物、ＯＣＡ−ＢまたはそのＯＣＡ−Ｂ断片またはＯＣＡ−Ｂ変異体であるペプチド；及び細胞膜透過性ペプチド、ならびに薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む、治療有効量の医薬組成物（または化合物）を対象に投与することを含むことができる。
【００９２】
哺乳動物細胞においてＯＣＡ−Ｂを阻害する方法が、本明細書で開示される。一態様では、方法は、本明細書に記載の化合物のいずれかを用いて細胞を処置することを含むことができる。一態様では、方法は、化合物、ＯＣＡ−ＢまたはそのＯＣＡ−Ｂ断片またはＯＣＡ−Ｂ変異体であるペプチド；リンカー；及び細胞膜透過性ペプチド、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む、治療有効量の医薬組成物を用いて細胞を処置することを含むことができる。一態様では、方法は、化合物、ＯＣＡ−ＢまたはそのＯＣＡ−Ｂ断片またはＯＣＡ−Ｂ変異体であるペプチド；及び細胞膜透過性ペプチド、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む、治療有効量の医薬組成物を用いて細胞を処置することを含むことができる。一態様では、細胞は、免疫系細胞であり得る。一態様では、免疫系細胞は、Ｔ細胞であり得る。
【００９３】
上記の医薬組成物は、治療有効量の本明細書に開示される化合物を含むように製剤化することができる。治療的投与には予防的適用が包含される。患者がある種の自己免疫疾患（多発性硬化症、１型糖尿病、関節リウマチ、セリアック病、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、乾癬、潰瘍性大腸炎または白血病を含む）に対して臨床的に判定された素因または易罹患性の増加（場合によっては、易罹患性の大幅な増加）を有する場合、患者を診察している医師は、遺伝的検査及び他の予後方法に基づいて、予防投与を選択することができる。
【００９４】
本明細書に記載の医薬組成物は、臨床疾患の発症を遅延させ、低減させ、または好ましくは防止するのに十分な量で、対象（例えば、ヒト患者）に投与することができる。したがって、いくつかの態様では、患者はヒト対象またはヒト患者であり得る。治療適用においては、すでに疾患（例えば、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、セリアック病、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、乾癬、潰瘍性大腸炎もしくは白血病）を有するかまたは疾患と診断された対象（例えば、ヒト患者）に少なくとも部分的に徴候もしくは症状を改善するのに十分な量で、または状態の症状、その合併症及び結果の進行を阻害（及び好ましくは停止）するのに十分な量で組成物を投与することができる。これを達成するための適切な量は、「治療有効量」として定義される。医薬組成物の治療有効量は、治癒を達成する量であり得るが、その成果は、達成され得るいくつかのうちの１つにすぎない。示したように、治療効果量には、疾患の発症もしくは進行を遅延させ、妨害し、もしくは防止する、または疾患もしくは疾患の症状を改善させる処置を提供する量が含まれる。症状のうちの１つ以上は重症度が低い場合がある。処置された個体では、回復が促進される可能性がある。
【００９５】
いくつかの態様では、疾患は、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、セリアック病、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、乾癬、潰瘍性大腸炎または白血病であり得る。いくつかの態様では、疾患は、ＯＣＡ−Ｂ、例えば内在性ＯＣＡ−Ｂを抑制、阻止または阻害する必要を伴う。
【００９６】
１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、セリアック病、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、乾癬、潰瘍性大腸炎または白血病を有する患者を処置する方法が、本明細書で開示される。いくつかの態様では、方法は、処置を必要とする対象またはＯＣＡ−Ｂを抑制する必要性を決定するステップを含むことができる。
【００９７】
ＯＣＡ−ＢのＪｍｊｄ１ａまたはＯｃｔ１との相互作用を阻止する能力に関して、１つ以上のペプチドの有効性を決定するために実施することができる方法が、本明細書で開示される。いくつかの態様では、方法は、ロースループット試験のために初代ヒトまたはマウスＣＤ４  Ｔ細胞を処置することであって、それらの細胞を事前に刺激し試験ペプチド（１０〜５０μＭ）とともに培養液中で静止させ、阻害剤の存在下で細胞をＣＤ３／ＣＤ２８抗体で再刺激する、処置することであり得る。有効性は、例えば、（図３Ａに示すように）ＯＣＡ−Ｂ生殖細胞系列欠損マウスの表現型模写である、二次刺激を受けたＴ細胞におけるＩｌ２遺伝子発現の抑制によって決定することができる。いくつかの態様では、例えば、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の阻害を使用して、例えば、実質的に任意の細胞株に、一過性にトランスフェクトされたまたは安定して組み込まれたプラスミドからのレポーターの発現を駆動する合成プロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターを使用して、ハイスループットアッセイを実施することができる。別の無細胞の例は、共免疫沈降の阻害であり得る。
【００９８】
この用途に有効な量は、疾患の重症度、ならびに対象の体重及び全身状態及び健康状態に依存する場合がある。初回投与及び追加免疫投与に好適な体制は、初回投与と、次いで１回以上の１時間、１日、１週間、または１か月間隔での後続の投与による反復投与に代表される。治療的使用の場合、化合物は、薬学的に許容可能な賦形剤を含むことができる。そのような組成物は、ヒトを含む哺乳動物に投与するための過度の実験を行うことなく、特定の用途に適切であるように製剤化することができる。さらに、組成物の適切な投与量は、標準的な用量反応プロトコルを使用して、過度の実験を行うことなく決定することができる。例えば、本明細書に開示される化合物または組成物のいずれかを週に１回以上（例えば、週に２回、３回、４回、５回、６回または７回以上）、対象に投与することができる。
【００９９】
本明細書に開示される医薬組成物中の化合物のいずれかの総治療有効量を、ボーラスとしてもしくは比較的短期間にわたる注入のいずれかによって哺乳動物に単回用量として投与することができ、または複数用量をより長期間にわたり（例えば、４〜６時間、８〜１２時間、１４〜１６時間、もしくは１８〜２４時間ごと、もしくは２〜４日、１〜２週間ごと、もしくは月に１回の用量）投与する分割処置プロトコルを使用して投与することができる。あるいは、血液中の治療有効濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入もまた、本開示の範囲内である。
【０１００】
本明細書に記載の医薬組成物中に存在し、哺乳動物（例えば、ヒト）に適用される本明細書に開示される方法で使用される本明細書に開示される化合物のいずれかの治療有効量は、（前述のように）年齢、体重及びその他の全身状態における個体差を考慮して当業者によって決定することができる。
【実施例】
【０１０１】
実施例１：Ｔ細胞中のＯＣＡ−Ｂは、遺伝的マウスモデルにおけるＴ１Ｄを促進する。
Ｔ細胞中のＯＣＡ−Ｂの喪失がＴ１Ｄの保護をもたらすかどうかを判定するために、Ｏｃａｂ（Ｐｏｕ２ａｆ１）条件付きマウス対立遺伝子を使用することができる。ＯＣＡ−Ｂ対立遺伝子のＮＯＤ系統バックグラウンド（自発的なＴ１Ｄを生じやすい）への戻し交配を完了した。次に、この動物をＮＯＤ／ＣＤ４−Ｃｒｅと交配させることができる。これらのマウスに、Ｔ１Ｄの易罹患性及び重症度を測定するために完全な一連の試験を実施することができる。
【０１０２】
ＯＣＡ−Ｂは、Ｂ細胞の活性化後に高親和性抗体を産生することが求められるＢ細胞系におけるその強力な発現から命名されている。興味深いことに、抗体分泌細胞自体はＯＣＡ−Ｂを発現せず、これは、ＯＣＡ−Ｂが長寿命の抗体分泌細胞の形成を制御するが、維持は制御しないことを示している。したがって、ＯＣＡ−Ｂ阻害は、長寿命の抗体分泌細胞によって媒介される中和免疫に影響を及ぼさないであろう。ＯＣＡ−Ｂを欠くＴ細胞は正常に発生して正常な病原体応答を開始するが、明確に認められるほどの数のセントラルメモリーＣＤ４細胞を形成できない、というＣＤ４ヘルパーＴ細胞におけるＯＣＡ−Ｂの機能的役割が特定された。形成された細胞は、抗原再遭遇に対する応答が不完全である。Ｔ細胞中のＯＣＡ−ＢのレベルがＢ細胞の少なくとも５０分の１であることから、慎重に調整した用量の競合阻害剤によって、Ｔ細胞選択的な効果がもたらされることが示唆される。ＯＣＡ−Ｂが抗原の再遭遇時に標的遺伝子の発現を促進する基礎となる分子機構は、以下の通り、すなわち、転写因子Ｏｃｔ１が、Ｔ細胞における免疫調節遺伝子の大きなグループ中の調節領域に結合する、ということである。ＯＣＡ−Ｂの非存在下では、Ｏｃｔ１はシグナルに応答して、遺伝子発現を増強させるか、または阻害する。ＯＣＡ−Ｂは、活性化ＣＤ４  Ｔ細胞で発現するようになると、Ｏｃｔ１とＪｍｊｄ１ａ／Ｋｄｍ３ａ（抑制性ヒストンＨ３Ｋ９ｍｅ２のクロマチン修飾を除去するヒストンリシン脱メチル化酵素）との間のブリッジとして機能することによって、遺伝子発現を増強させるＯｃｔ１の能力を「固定」する。ＯＣＡ−Ｂの非存在下で観察される正常なＴ細胞の発生の表現型及び一次免疫応答の表現型は、ＯＣＡ−Ｂの標的化がベースラインの免疫機能に最小限の影響しか及ぼさないＴ１Ｄ患者に対する、潜在的な「治療指数」の基礎を形成するのに役立つ。エピジェネティックモデルは、Ｂ細胞における抗体分泌と同様に、ＣＤ４メモリーＴ細胞が一旦形成されると、ＯＣＡ−ＢはＣＤ４メモリーＴ細胞には不要となると予測している。
【０１０３】
Ｔ１ＤにおけるＯＣＡ−Ｂの役割のエビデンス：ＯＣＡ−Ｂレベルは異なるＴ細胞集団において変動する。ＯＣＡ−ＢはナイーブＣＤ４  Ｔ細胞では検出不能であるが、持続的な抗原刺激後に発現する。予想通り、ＯＣＡ−Ｂレベルは他のＴ細胞集団と比較してＣＤ４セントラルメモリー細胞で上昇する（図示せず）が、興味深いことに、プロファイリングした細胞中、最も高い発現は膵臓浸潤性の自己反応性ＣＤ４  Ｔ細胞中に見出され（ＩｍｍＧｅｎ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｇｅｎ．ｏｒｇ））、αβ  ＣＤ４  Ｔ細胞のサブセットにおけるＯｃａｂ（Ｐｏｕ２ａｆ１）の発現を示している。Ｔｎｆａ遺伝子座及びＣｔｌａ４遺伝子座において、ＯＣＡ−Ｂがドッキングする転写因子であるＯｃｔ１の結合部位に影響を与えるヒト多型が同定されている。これらの多型は、それぞれＩＢＤ及びＳＬＥに関連しており、自己免疫病因におけるＯＣＡ−Ｂの一般的な役割が示唆される。さらに、Ｏｃｔ１結合部位の多型は、ヒトのＴ１Ｄの病因に直接関係している。この研究（Ｍａｕｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２  Ｓｅｐ．７；３３７（６０９９）：１１９０−５）で同定された転写因子の中で、Ｏｃｔ１（Ｐｏｕ２ｆ１）が最も強力であり、Ｏｃｔ１に関連する最も強烈な疾患はＴ１Ｄである。この研究における他の関連は、セリアック病及び関節リウマチとの関連である。別の研究（Ｆａｒｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５  Ｆｅｂ．１９；５１８（７５３９）：３３７−４３）は、他のＯｃｔ１結合部位の多型を、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、セリアック病、乾癬及び潰瘍性大腸炎と関連付けている。
【０１０４】
ＯＣＡ−Ｂと、ＯＣＡ−Ｂが相互作用して転写を促進するクロマチンレギュレーターであるＪｍｊｄ１ａとの相互作用を阻止するペプチドを３回注射することにより、ＮＯＤマウスモデルにおける血中グルコース及びＴ細胞浸潤が減少する。対照的な経過によって対照ペプチドで処置された動物。この薬剤による長期的処置を決定することができ、この薬剤による当該処置により持続的な保護をもたらすことができるかどうか、及びあらゆる免疫学的または毒性の副作用が生じるかどうかも判定することができる。効果の持続性は、阻害剤を除去し、Ｔ１Ｄの進行をモニタリングすることによって判定することができる。最後に、十分に確立された疾患を有する動物における効果も判定することができ、ベータ細胞の補充なしでは改善が観察されないことが予想される。
【０１０５】
薬理学的なＯＣＡ−Ｂ阻害はＴ１Ｄの進行を阻止する。活性であるＭＥＫ／ＥＲＫシグナルの存在下では、Ｏｃｔ１はＯＣＡ−Ｂの非存在下でＪｍｊｄ１ａと相互作用することができる。Ｏｃｔ１には、２つのコンセンサスＥＲＫのリン酸受容体（ｐｈｏｓｐｈｏ−ａｃｃｅｐｔｏｒ）セリンが含まれる。Ｏｃｔ１  ＤＮＡ結合ドメイン、ＯＣＡ−Ｂ  Ｎ末端及びコンセンサス結合ＤＮＡの共結晶構造（Ｃｈａｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．（１９９９）１３（２）：２６５０−７）により、これらのＯｃｔ１セリンが、２つのＤＮＡ結合サブドメインを連結する、柔軟性があり溶媒に曝露されたループ（リンカードメイン）に位置していることが明らかとなる。（図２Ａ、赤色の破線）。図２は、Ｊｍｊｄ１ａの既知のリクルーターであるアンドロゲン受容体へのアラインメントを示し、ＯＣＡ−Ｂの相互作用面を特定している。ＯＣＡ−Ｂの結晶化領域には、Ｏｃｔ１の結合及び転写活性に重要な領域が含まれていることが知られている。Ｏｃｔ１とは対照的に、ＯＣＡ−Ｂは構成的にＪｍｊｄ１ａと相互作用する。Ｊｍｊｄ１ａと相互作用する可能性のあるアミノ酸を同定するために、完全長のＯｃｔ１及びＯＣＡ−Ｂアミノ酸配列を、Ｊｍｊｄ１ａと相互作用することが知られている別の転写因子であるアンドロゲン受容体（ＡＲ）にアラインメントした。アンドロゲン不応症を引き起こすヒトＡＲ突然変異は、残基６９８〜７２１にまたがる補因子相互作用面にマッピングされている。図２Ｂは、ＡＲ補因子相互作用領域とのＯｃｔ１／ＯＣＡ−Ｂのアラインメントを示す。アスタリスクは、アンドロゲン不応症を引き起こすＡＲ突然変異を示し、枠で囲んだセリンは予測されたＥＲＫ部位を示す。この配列はＯｃｔ１リンカードメイン（図２Ｂ）と整列し、これは、潜在的なＪｍｊｄ１ａとの相互作用面としてのリンカーを示している。アラインメントは、４つのＡＲ突然変異部位のうち３つのＯｃｔ１との保存を示す。保存されていないＡＲ突然変異部位は、潜在的なリン酸化模倣物であるグルタミン酸残基であり、Ｏｃｔ１では、コンセンサスＥＲＫの標的（Ｓｅｒ３７０）である。これらの知見は、Ｏｃｔ１リンカードメインが、ＥＲＫによってリン酸化されるとＪｍｊｄ１ａと相互作用する面を構成することを示唆する。Ｏｃｔ１の突然変異分析は、この仮定を裏付けている。
【０１０６】
Ｏｃｔ１と同様に、ＯＣＡ−Ｂとのアラインメントにより、潜在的なＪｍｊｄ１ａ相互作用面を同定する（図２Ｂ）。Ｏｃｔ１とは異なり、ＯＣＡ−Ｂのグルタミン酸残基（Ｇｌｕ３０）はＡＲと整列し、これは、ＥＲＫシグナル伝達の非存在下でＯＣＡ−ＢがＪｍｊｄ１ａと相互作用するという知見と一致する。興味深いことに、ＡＲと整列する残基は、溶媒に曝露されたヘリックスの片側に位置する（図２Ａ）。したがって、Ｇｌｕ３０（赤色）、Ｌｅｕ３１（黄色）、Ａｒｇ３４（青色）及びＨｉｓ３８（青色）は、Ｊｍｊｄ１ａドッキング面を構成し得る。これらの残基はヒトにおいて保存されている。ＯＣＡ−Ｂ一過性発現プラスミドにおける異なる点突然変異体を作製した。Ｊｍｊｄ１ａ抗体及び野生型ＯＣＡ−Ｂを使用した対照ｃｏ−ＩＰは、相互作用を識別する（図２Ｃ、左）。ある突然変異体タンパク質、例えば、Ｌ３１Ａ／Ｒ３４Ａは、依然としてＯｃｔ１と相互作用したが（図示せず）、Ｊｍｊｄ１ａとは相互作用することができなかった（図２Ｃ、左）。突然変異体は、ＨＣＴ１１６細胞において野生型と同等に発現した（図２Ｃ、右）。２つのタンパク質は同等に発現した（図２Ｃ、右端）。
【０１０７】
ＯＣＡ−ＢのＪｍｊｄ１ａ相互作用面（図４）は、ＯＣＡ−Ｂを薬理学的に標的とする可能性を明らかにする。ペプチドを、Ｊｍｊｄ１ａ結合を担うＯＣＡ−Ｂ表面と重複するように設計して、膜透過性のためにＴａｔ融合体として合成した（図３Ａ）。試験したペプチドのうち、２５μＭのペプチド＃２またはペプチド＃３はＯＣＡ−Ｂヌル表現型を模写しており、ＣＤ４  Ｔ細胞の再刺激後、選択的なＩｌ２及びＩｆｎｇの発現欠損を示す（図３Ａ及び図示せず、図９も参照されたい）。処置した細胞は、生存率、形態、または増殖に変化を示さない（図示せず）。ペプチド＃２を後続の実験に使用した。
【０１０８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験用にペプチドを合成及び精製した。ＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄ発症は自発的かつ急性であるため、症状が生じたときにペプチドを投与することが可能である。グルコースレベルが新たに２２５ｍｇ／ｄＬ超に上昇したが、依然として２７５ｍｇ／ｄＬを下回る１４〜１８週齢の雌ＮＯＤマウスを、２０ｍｇ／ｋｇのペプチドまたはＴａｔのみのペプチド対照の３回の静脈内注射で処置した。血清中のペプチド半減期は約５時間と予測されたため、注射の間隔を１２時間空けた。最終注射の１２時間後、血中グルコースを採取し、膵臓及び膵臓リンパ節（ＰＬＮ）についてフローサイトメトリーを実施した。顕著なことに、阻害剤は、血中グルコースの上昇（図３Ｂ、図９も参照されたい）、膵臓Ｔ細胞浸潤（総数とパーセンテージの両方、図３Ｃ及び図示せず、図９も参照されたい）ならびに炎症誘発性ＩＦＮγ及びＩＬ−１７Ａサイトカインの産生を反転させた（図示せず）。同じ濃度の対照ペプチドは効果を示さなかった。膵臓とは対照的に、ＰＬＮはＴ細胞の数またはパーセンテージに変化を示さず（図３Ｄ及び図示せず、図９も参照されたい）、炎症性サイトカイン産生にわずかな変化を示したことから、ベースラインの免疫応答は損なわれていないことが示唆される。Ｂ細胞中のＯＣＡ−ＢレベルはＴ細胞（Ｉｍｍｇｅｎ）中よりも少なくとも５０倍高いことから、観察された効果はＴ細胞における競合阻害による可能性がある。これらのデータは、このペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏで非毒性で効果的であるというエビデンスを提供し、新生Ｔ１Ｄを処置するための有効な戦略をもたらす。このペプチドを、機能及び生じ得る副作用を評価するための原型の薬剤として使用した。
【０１０９】
ＮＯＤ／Ｏｃａｂ条件付きノックアウトマウス。トランスジェニックコア施設を使用して、条件付きＯｃａｂマウス対立遺伝子（図４Ａ〜図４Ｂ）を作製した。ホモ接合型ｌｏｘＰ導入マウスは正常な量のタンパク質を産生するが、Δ／Δ脾臓にはタンパク質が存在せず、これは、ｆｌ対立遺伝子はＯＣＡ−Ｂが十分であるが、Ｃｒｅで欠失させた対立遺伝子はヌルであることを示している（図４Ｃ）。ＣＤ４−Ｃｒｅドライバーとの交配によって、脾臓Ｔ細胞が効率的に欠失される（図４Ｄ）。これらのマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドで作製した。Ｔ細胞におけるＯＣＡ−Ｂ発現がＴ１Ｄの発生に必要であるという予測を試験するために、ＮＯＤ系統バックグラウンドへのスピードコンジェニック戻し交配を実施した。この方法により、ＮＯＤ自己免疫感受性に関連する１３個のマイクロサテライト及びＳＮＰマーカーをスクリーニング及び選択することにより、マウスを迅速に作製することが可能となる。これらのマーカーに続いて、自発的な自己免疫を再現した（図示せず）戻し交配動物を作製した（図５）。これらの動物は、Ｔ細胞のＯＣＡ−Ｂを欠失させてＴ１Ｄに対する影響を評価するために、ＮＯＤ／ＣＤ４−Ｃｒｅと交配させている（実施例１）。
【０１１０】
理論的根拠：複数のエビデンスは、ＯＣＡ−ＢをＴ１Ｄに関連付ける。これらのデータは、ＯＣＡ−Ｂがこの疾患の標的化に向けて有効な治療手段も提供し得ることを示す。ここに記載する実験は、新規の条件付きＯｃａｂマウス対立遺伝子を活用して、遺伝的なＯｃａｂ欠失がＴ１Ｄのマウスモデルにおいて保護的であるという仮説を試験することにより、この一連の調査に対する機構的な裏付けを提供する。
【０１１１】
Ｔ細胞におけるＯＣＡ−Ｂ喪失の判定により、ＮＯＤマウスのＴ１Ｄ発生率または重症度が低減する。ＮＯＤモデルは自発的であり遺伝的に決定されるが、ヒトの疾患とほぼ同様に部分的に浸透する。雌ＮＯＤマウスのおよそ６０〜８０％が、標準的環境でＴ１Ｄを発症する。Ｔ細胞におけるＯＣＡ−Ｂ発現がＴ１Ｄの発生に必要であるという予測を試験するために、年齢を一致させた雌ＮＯＤ  Ｏｃａｂfl/fl；ＣＤ４−Ｃｒｅマウス、及びＣｒｅまたはｌｏｘＰ導入対立遺伝子を欠くＴ１Ｄ発生用の対照を追跡する。動物を、高血糖及び体重減少について週に２回モニタリングする。カプラン・マイヤープロットを作成し、無病生存期間を追跡する。糖尿病を認めると、動物を屠殺して疾患続発症、例えば、膵臓の浸潤性リンパ球（組織学的）、及び膵臓リンパ節の反応性細胞（フローサイトメトリー）を評価する。Ｔ細胞及びマクロファージの数ならびにサイトカイン産生（ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ及びＩＦＮγ）を測定する。自己反応性ＣＤ４Ｔ細胞を、ＢＤＣ２．５  ＭＨＣテトラマーを使用してスコア化する。並行実験として、１８週間のうちの定められた時点（ピーク疾患）で別のコホートを屠殺する。Ｔ１Ｄの影響を有する動物の割合をプロットする。
【０１１２】
ＮＯＤマウスの疾患は、Ｔ細胞の発生における不完全な陰性選択に起因し、Ｔ細胞の自己反応性を生じさせる。ＯＣＡ−Ｂを欠く動物では、Ｔ細胞の発生に影響を受けない。したがって、動物モデルにおけるペプチドの有効性は、ＯＣＡ−Ｂを標的にして動物を既存の自己反応性から保護することができることを示している。血中グルコースレベル及び体重減少のプロットの平均及び標準偏差も実施することができる。
【０１１３】
両方のモデルでＯＣＡ−Ｂの喪失が保護をもたらさない場合、ＢＤＣ２．５（ＣＤ４で選択したトランスジェニック）及びＮＹ８．３（ＣＤ８で選択したトランスジェニック）などのＮＯＤ  ＴＣＲトランスジェニックマウスを使用したＯＣＡ−Ｂのノックアウトが、より強力な効果をもたらす可能性がある。
【０１１４】
実施例２：ＮＯＤマウスにおけるＯＣＡ−Ｂ膜透過性ペプチド阻害剤の長期的効果及び持続性
本明細書に記載の知見は、ＯＣＡ−Ｂ阻害剤ペプチドがＮＯＤ動物において短い時間間隔にわたりＴ１Ｄの発生を阻止することを示している。ペプチドがＯＣＡ−ＢとＪｍｊｄ１ａとの相互作用面が関与する機序を通じて機能するかどうか（スクランブルペプチド及び点突然変異ペプチドを用いて試験可能）、ペプチドが疾患の発生を安定して阻止し、慢性毒性または急性毒性となるかどうか（長い注射持続時間を用いて試験可能）、ペプチドがすでに確立されたＴ細胞メモリーを阻害するかどうか（ＬＣＭＶ感染及びクリアランス後のペプチドによる処置を用いて試験可能）、ならびにペプチドがすでに確立されたＴ１Ｄに対して有効であるかどうか（処置前に動物を完全に糖尿病にさせておくことにより試験可能）をはじめとする、多くの重要な疑問が残されている。本実施例における実験では、これらの予測を試験する。
【０１１５】
ＯＣＡ−ＢとＪｍｊｄ１ａとの相互作用面に特異的な化学合成ペプチドが無毒性であり、ＮＯＤ動物において安定してＴ１Ｄを減弱させるかどうかを判定する。図４の結果は、ＯＣＡ−Ｂペプチドの短時間投与がＴ１Ｄの発生を減弱させることを示す。本明細書に記載のペプチドは、追加のスクランブルペプチド対照及び二重点突然変異ペプチド対照と同様に、ミリグラムスケールで合成することができる。
【０１１６】
Ｔ１Ｄの発生に対するペプチド処置の効果を試験するために、血中グルコースが２２５ｍｇ／ｄＬに達した後から、８匹の雌雄ＮＯＤマウスのコホートに注射を行う。その後、ペプチドを４日間または８日間のいずれかで１２時間ごとに投与する。本明細書に記載されているように、２０ｍｇ／ｋｇのペプチドを静脈内投与する。用量漸減スケジュールを使用し、短期間の有効性（血中グルコース、血清インスリン）のための最小用量を算出する。低用量で２０ｍｇ／ｋｇと同様の完全な保護が生じる場合は、次の実験でもその用量を使用する。Ｔａｔペプチド単独、スクランブルペプチド及び図３に示す点突然変異を含むペプチドを対照として使用する。各注射後、即時毒性を評価するためにマウスの努力呼吸及び振戦についてモニタリングする。長期にわたる影響を評価するために、体重減少の徴候及び乱れた外観について動物をモニタリングする。屠殺前に血中グルコースを採取する。コホートの半分を膵臓の組織診断のために屠殺する。固定及び包埋した切片を、病理医により盲検的にＨ＆Ｅ染色及び分析する。隣接する切片をＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ１１ｂに対する抗体を用いるＩＨＣに使用して、特定の浸潤性Ｔ細胞及び浸潤性Ｂ細胞ならびにマクロファージを同定することができる。残りの４匹のマウスは、膵臓及び膵臓リンパ節のフローサイトメトリーに使用する。Ｔ細胞及びマクロファージの数ならびにサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２、ＴＮＦγ及びＩＬ−１７Ａなどの、ＯＣＡ−Ｂ標的遺伝子によってコードされるサイトカイン）を測定する。自己反応性ＣＤ４Ｔ細胞を、ＢＤＣ２．５  ＭＨＣテトラマーを使用してスコア化する。
【０１１７】
長期的な持続性及び毒性を試験するために、１セットのマウスにペプチド＃２を１日２回、４週間注射する。注射直後に努力呼吸及び振戦について、ならびに長期的に体重減少または嗜眠性／乱れた外観について、マウスをモニタリングする。持続的な保護が認められる場合、ペプチドを４週間後に中止し、継続的な処置なしで保護を維持することができるかどうかを判断する。別の実験では、末期の疾患を有する高齢の雌ＮＯＤ動物を処置する。
【０１１８】
ペプチド阻害剤は、毒性及び副作用の可能性をはじめとする、他の薬剤と同様の警告を伴う。ＯＣＡ−Ｂはリンパ球及び肺上皮に発現すると考えられている。この限られた発現は、ＯＣＡ−Ｂに対する直接作用による副作用を最小化するはずである。さらに、ＯＣＡ−Ｂ生殖細胞系列ヌルマウスは生存可能かつ生殖能力があり、肺の病態のエビデンスはない。したがって、毒性はいずれもＯＣＡ−Ｂ阻害ではなく、オフターゲット効果により生じると予想される。急性または免疫毒性が観察される場合、ペプチド配列の登録を変更またはシフトして、用量または濃度を減少させてその効果を制限する。Ｔａｔ膜透過性ペプチドは、ＢＣＬ６阻害剤ペプチドとの関連ではないものの、毒性を伴う。必要に応じて、ポリアルギニンなどの他の膜透過性ペプチドを使用する。図３Ａと類似のアッセイにより、新規ペプチドが有効であることが確実となる。
【０１１９】
ＯＣＡ−Ｂ阻害が、事前に確立されたＴ細胞メモリーに影響を与えるかどうかを判定する。ＯＣＡ−Ｂは、現存の血漿Ｂ細胞の機能には不要であることがすでに示されている。さらに、ＯＣＡ−ＢレベルはＴ細胞（ＩｍｍＧｅｎ）と比較してＢ細胞ではるかに高く、特定のレベルの阻害剤ペプチドがＴ細胞ではＪｍｊｄ１ａとの相互作用を競合的に阻害するがＢ細胞では阻害しない、潜在的な治療域を生み出す。この生物学は、現存の及び発生中のＢ細胞の機能に対する阻害剤の効果を制限するはずである。重症度の低い自己免疫疾患及び既存の療法が利用可能な疾患に対する、臨床におけるＯＣＡ−Ｂ阻害の自己免疫のための療法としての潜在的用途は、ＯＣＡ−Ｂが既存のメモリーＴ細胞のレパートリーを維持するのに必要かどうかにある程度依存する。記憶形成及び想起応答への影響を試験するために、モデル病原体ＬＣＭＶの感染後にペプチド注射実験を実施して、確立されたまたは現存のＬＣＭＶ特異的メモリーＴ細胞に対する影響を評価する。エフェクターからメモリープールへの移行には４〜６週間を要する。感染後４２日目に、４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスのコホートを屠殺して、ＬＣＭＶ反応性Ｔ細胞を同定するために、テトラマーを使用してＣＤ４メモリーを試験する。他のコホートを４２日目にＬｍ−ｇｐ６１に感染させ、４２＋７日目における記憶想起応答を試験する。ＯＣＡ−Ｂ遺伝子欠失と同様に、ペプチド処置によりＣＤ４セントラルメモリーＴ細胞が減少し、この減少した集団が想起応答を開始できないことが予想される。８日間のスライディングウィンドウのペプチド処置を使用してＯＣＡ−Ｂが必要となる時点を特定する。事前に確立された記憶に対する影響を試験するために、感染後４２日目のマウスをペプチドで処置し、ＬＣＭＶ  ＧＰ61-80  ＣＤ４エピトープ（Ｌｍ−ｇｐ６１）を発現する組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに再曝露させる。この処置は、このエピトープに特異的なメモリーＣＤ４細胞を選択的に再活性化させる。
【０１２０】
事前に確立されたＣＤ４メモリーＴ細胞にＯＣＡ−Ｂが必要であるという知見は、標的遺伝子のクロマチンの調節におけるさらなる予想外の役割を示唆していることから、モデルに反する。ＯＣＡ−Ｂを標的とする実現可能な薬剤が出現する可能性はあるものの、このことはまた、治療指数及び潜在的な患者プロファイルを狭める。より重要なことには、そのような知見は、メモリーのエピジェネティック状態の維持ではなくその確立においてＯＣＡ−Ｂの下流で機能するこの経路の他の構成要素が、より良好な治療標的を構成することを示す。
【０１２１】
組換え精製ペプチドが化学合成ペプチドの代替となり得るかどうかを判定する。天然ペプチドは動物内では不安定であり、大量の合成を必要とする。実用的な薬物介入へ向けた道の暫定的な解決策として、ペプチドをＥ．ｃｏｌｉからクローニングし、発現させ、精製する。Ｔａｔに融合したペプチド＃２、スクランブルペプチド対照及び二重点突然変異対照ペプチドを、Ｈｉｓ10融合タンパク質として、それらの間のＴＥＶプロテアーゼリンカーとともに発現させる。ペプチドをコードするＤＮＡを、二本鎖遺伝子ブロック（ＩＤＴ）として合成し、ｐＮＲ１１１細菌発現ベクターのＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングする。ペプチドをＩＰＴＧで誘導し、ニッケル−ＮＴＡアガロースクロマトグラフィーを使用して変性（尿素）条件下で精製する。この戦略はまた、エンドトキシンも除去する。このクローニング戦略では、２つのＮ末端アミノ酸をペプチドに導入するため、再検証しなければならない。化学合成ペプチドは、定量化の目的ですでにＣ末端にチロシンを含有しており、これを、細菌の精製にも使用する。有効性は、マウスモデルに移行する前に、まず図３Ａのように細胞において試験することができる。
【０１２２】
組換えペプチドが化学合成ペプチドの効果を再現しない場合、別のアプローチは、ステープルされたペプチド、ＰＥＧ化ペプチド、または環状化ペプチドを利用することである。これらの改変により、血清半減期が長くなり、これにより必要なペプチドの量が減少する。長期的には、ペプチド阻害は、機能、副作用などを評価することを可能にする、本当の薬物介入に向けた中間ステップになり得る。ペプチドの効果を模倣する小分子の開発もまた、本開示の範囲内である。配列特異的ＤＮＡ結合転写因子は一般に（かつ誤って）「新薬の開発につながらない」と考えられているが、以前に標的化に成功した遺伝子調節領域である、転写補因子（ＯＣＡ−Ｂ）とクロマチン修飾酵素（Ｊｍｊｄ１ａ）との間の界面は、阻害されている。
【０１２３】
実施例３：Ｔ細胞にＯｃｔ１を欠くマウスは、ＭＯＧ／ＥＡＥモデルにおいて保護される。
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の存在下でマウスＭＯＧ３５−５５を接種し、その後百日咳毒素を注射したＯｃｔ１ｆｌ／ｆｌ；ＣＤ４−Ｃｒｅ動物では、ＭＯＧ35-55反応性ＣＤ４＋  Ｔ細胞に起因する自己免疫性の神経炎症性脱髄疾患の発生が引き起こされる。この標準的プロトコルは、体重減少、上行性麻痺及び消散を含む典型的な自然治癒の単相性疾患パターンを引き起こす。標準的な臨床スコアリングシステムを使用してマウスを評価した。図６Ａのデータ（レスポンダーのパーセントによる）及び臨床スコア（図示せず）により、Ｔ細胞特異的なＯｃｔ１の喪失が疾患の頻度及び重症度の低減をもたらすことが示される。疾患の消散後、より少ない病原性頸部リンパ節のＩＦＮγ／ＩＬ−１７Ａ二重産生Ｔ細胞が観察された（図６Ｂ、Ｃ）。脊髄の組織病理学的分析により、これらの所見が確認された。これらの結果は、Ｏｃｔ１の喪失がＭＯＧ／ＥＡＥモデルにおける動物を保護することを示す。
【０１２４】
実施例４：ＭＳマウスモデルにおけるＯＣＡ−Ｂ膜透過性ペプチド阻害剤の長期的効果及び持続性を判定する。
長期毒性を試験するために、１群あたり５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに、５〜２０ｍｇ／ｋｇを１日２回、４週間注射する。注射後、即時毒性を評価するためにマウスの努力呼吸及び振戦についてモニタリングする。長期的に、体重減少及び乱れた外観について動物をモニタリングする。ＯＣＡ−Ｂ阻害によって引き起こされる可能性のある副作用を試験するために、これらのマウスにおける新規メモリー細胞の形成を試験する。本明細書に記載のものと同様の実験を、ＬＣＭＶとして知られている広く特性決定されたマウスモデルウイルスによる感染を追加して実施する。テトラマーとして知られているＬＣＭＶ特異的Ｔ細胞の特異的プローブを使用して、ＬＣＭＶ特異的メモリーＴ細胞の確立に対する影響を評価する。ＭＳモデルにおける有効性を試験するために、ＭＯＧ35-55により誘発されたＥＡＥ（Ｗａｌｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：４１５−７）を使用する。簡潔に述べると、８週齢の雌動物を、４週間（または予期しない毒性が観察された場合はそれより短い期間）処置する。この時間経過内で、図６のようにマウスにＭＯＧペプチド／ＰＴを投与し、臨床経過をモニタリングする。ピーク疾患時に、各群のマウスのサブセットを屠殺して、頸部リンパ節及びＣＮＳのフローサイトメトリーに使用する。別のサブセットでは、脊髄を包埋し切片にして、浸潤性白血球及び脱髄について分析する。図１０は、Ｔ細胞の（転写因子ＯＣＡ−Ｂが位置する）Ｏｃｔ１の欠失：ＭＯＧ／ＰＴ  ＥＡＥにおける保護を示す。
【０１２５】
組織病理学的分析を使用して、ペプチド処置が神経炎症及び浸潤性白血球を減少させるという仮説を試験する。直接標的遺伝子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１７及びＩＦＮγ）によってコードされるサイトカインの発現が大幅に減少することを予期して、Ｌｕｍｉｎｅｘを使用して、Ｔ細胞及び血清サイトカインの産生を調査する。応答の持続性を試験するために、マウスを処置し、次いで追加の注射をせずに維持してＭＯＧ／ＰＴを投与する。最後に、ＮＯＤ動物を処置し、これら動物は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで見られる疾患寛解ではなく、進行性の臨床パターンでＭＯＧ／ＰＴに応答する。これらの実験は、ペプチド投与が悪性度の高い原発性進行性疾患において有効性を示すかどうかを立証する。
【０１２６】
ＯＣＡ−Ｂ生殖細胞系列ヌルマウスは生存可能かつ生殖能力がある。ＯＣＡ−Ｂは主にリンパ球及び肺上皮に発現する。この限られた発現スペクトルにより、ＯＣＡ−Ｂに対するペプチドの直接作用による副作用が最小化される。
【０１２７】
薬理学的実験に遺伝学的支持を提供するために、ＭＯＧ／ＥＡＥモデルにて、Ｔ細胞中で欠失させるためのＣＤ４−Ｃｒｅを備えた新規条件付きＯｃａｂマウス対立遺伝子（図４Ａ）を展開する。Ｔ細胞特異的なＯｃａｂの欠失は、両方のモデルにおいて疾患の影響を大幅に減弱させると予測される。
【０１２８】
実施例５：Ｔ細胞における異所的なＯＣＡ−Ｂの発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの記憶を容易にする。
材料及び方法：Ｔｈｙ１．１＋ドナーマウス及びＴｈｙ１．１＋／１．２＋ドナーマウスにＬＣＭＶ免疫優性ペプチドを接種して、刺激を促進し（完全な刺激は病原性シグナル及び共刺激シグナルなしでは発生しない）、形質導入を可能にした。２４時間後、Ｔ細胞を単離し、空ベクター（Ｔｈｙ１．１）またはマウスＯＣＡ−ＢをコードするＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ＭＩＧ）ベクター（Ｔｈｙ１．１／１．２）のいずれかで、ｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入した。細胞を１：１で結合させ、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｔｈｙ１．２）レシピエントに導入した。２４時間後、動物をＬＣＭＶに感染させた。マウスのサブセットをピーク応答時、ならびにウイルスクリアランス、記憶の確立、及びＳＭＡＲＴＡエピトープ（Ｌｍ−ＧＰ６１）を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによる異種性の再曝露の後に安楽死させて剖検した。ＣＤ４及びＧＦＰの発現に基づいて細胞をゲーティングし、Ｔｈｙ１．２陽性を使用して空ベクター対ＯＣＡ−Ｂ過剰発現細胞の比を算出した。結果を図７に示す。
【０１２９】
実施例６：Ｏｃａｂ-/-マウスは白血病から保護される。
マウスにおけるＭＬＬ−ＡＦ９に起因する白血病をモデル化するための形質導入／移植系を使用した（図１１を参照されたい）。このモデルでは、ＢＭ前駆細胞がＭＳＣＶ−ＭＬＬ−ＡＦ９−ＩＲＥＳ−ＧＦＰによって形質導入されている。このコンストラクトによってコードされた融合タンパク質は、悪性度の高い形態のＡＭＬを伴う。形質導入細胞を移植されたマウスは、オリゴクローナルＡＭＬを効率的に発症し、約１０週間以内に死亡する。細胞過多及び末梢血中の骨髄芽球の濃度上昇などの白血病の徴候を、Ｈｅｍａｖｅｔを使用してモニタリングすることができる。白血病細胞は、ベクターにコードされたＧＦＰを使用したモニターでもあった。
【０１３０】
実施例７：Ｏｃｔ１のＴ細胞選択的欠失は、向神経性病原体応答を維持しながら、自己免疫性神経炎症から動物を保護する。
要約
背景：自己免疫疾患のための処置は、正常な免疫機能を維持しながら自己反応性を弱めることを目的とする。ＣＤ４+  Ｔ細胞では、転写因子Ｏｃｔ１／Ｐｏｕ２ｆ１は、Ｔ細胞の発生及び一次感染への応答には不要な転写因子であるが、抗原再遭遇の条件下で、Ｉｌ２及びＩｆｎｇを含む標的遺伝子の発現を促進する。結果として、それらは二次刺激でより強く発現される。このような繰り返される抗原遭遇は、記憶想起応答において、自己抗原が複数回認識され得る自己免疫において、及び外来抗原が持続性である慢性感染症において生じる。これらの以前の知見に基づき、ＣＮＳにおいて、Ｏｃｔ１の喪失が動物を自己免疫から保護するが病原体に対する正常な応答を維持するかどうかを試験した。
【０１３１】
目的：条件付きマウスＯｃｔ１（Ｐｏｕ２ｆ１）対立遺伝子及びＣＤ４−Ｃｒｅドライバーを使用して、自己免疫の自己抗原に起因するＥＡＥモデル及びウイルス感染症のＪＨＭＶモデルを使用し、自己免疫性及びウイルス誘発性神経炎症に対するＴ細胞特異的なＯｃｔ１の喪失の影響を判定した。
【０１３２】
結果：Ｏｃｔ１の条件付き欠失により、ＥＡＥモデルにおいて臨床スコアが軽減し、浸潤性Ｔ細胞及びサイトカイン産生が減少した。一貫して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激されたＯｃｔ１欠損ＣＤ４+  Ｔ細胞は、特に共刺激シグナルの非存在下において、Ｔ細胞アネルギーに関連するマーカーの発現の増加を示した。対照的に、抗ウイルス性のＴ細胞エフェクター機能はＯｃｔ１の非存在下で損なわれず、神経炎症、浸潤性Ｔ細胞またはサイトカイン産生に変化はなかった。
【０１３３】
結論：これらの知見は、自己免疫に対するＯｃｔ１の喪失の影響と抗病原体応答の間に有意差があることを明らかにしており、このことを、治療的利益のために利用することができる可能性がある。
【０１３４】
概要
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞に対する宿主免疫系の不適切な応答によって引き起こされる炎症、脱髄及び神経障害を特徴とする慢性衰弱性神経疾患である（Ｓｔｅｉｎｍａｎ  Ｌ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；３２：２５７−８１）。ＭＳの病態生理学は完全には理解されていないが、活性ＭＳ病変は、ＣＤ４+  Ｔ細胞（活性ＭＳ病変の周囲に配置されている）及びＣＤ８+  Ｔ細胞（通常は血管周囲性）の両方による、後にミクログリア細胞、マクロファージ及びＢ細胞の活性化を伴うＣＮＳ浸潤を特徴とする（Ｒｕｍｂｌｅ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１５；２１２：２３−３５）。ＣＤ４+  Ｔ細胞は、ＭＳの間の免疫応答のマスターレギュレーターと考えることができるが、一方で、血管周囲ＣＤ８+  Ｔ細胞、ミクログリア細胞、マクロファージ及びさらには好中球は、主として白質損傷を媒介する（Ｒｕｍｂｌｅ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１５；２１２：２３−３５）。ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）により、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）領域に位置する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）遺伝子が疾患に対し最も強力な影響を有することが特定されており、さらに、ＭＳの病態生理学におけるＴ細胞の重要性が強調されている（Ｐａｔｓｏｐｏｕｌｏｓ  ＮＡ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｍｅｄ．２０１８；８：ａ０２８９５１）。
【０１３５】
Ｏｃｔ１／Ｐｏｕ２ｆ１は、ＰＯＵドメイン転写因子であり、これは、マウスにおけるＴ細胞の発生及び一次感染への応答には不要であるが、ＣＤ４+セントラルメモリー細胞の形成には重要である（Ｓｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１５；２１２：２１１５−３１）。結果として、Ｏｃｔ１を欠くＣＤ４+  Ｔ細胞は、記憶想起応答が完全に欠損している。メモリーＴ細胞は、炎症性サイトカインを産生する傾向が高く、持続的な自己抗原曝露の場合であっても、メモリー細胞またはメモリー様細胞が自己免疫（Ｔ１Ｄを含む）の原因となり得る（Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；１７５：６９−８１、Ｃｈｅｅ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；１９２：５７２−８０、及びＹｅｏ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１８；１２８：３４６０−７４）。Ｏｃｔ１及びその補因子ＯＣＡ−Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ｉｌ２、Ｉｌ２１、Ｓｔａｔ５ａ、Ｉｆｎｇ、Ｔｂｘ２１（Ｔｂｅｔ）、Ｃｓｆ２（Ｇｍｃｓｆ）、Ｔｎｆｒｓｆ４（Ｏｘ４０）、Ｉｃｏｓ及びＣｔｌａ４を含むＣＤ４+リンパ球における重要な直接標的遺伝子の広範なコホートを協調的に制御する（Ｓｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１５；２１２：２１１５−３１）。興味深いことに、Ｏｃｔ１及びＯＣＡ−Ｂはこれらの遺伝子のベースライン活性にとっては不要である。例えば、生殖細胞系列または条件付き欠失によってＯｃｔ１を欠くＣＤ４+  Ｔ細胞は、正常に発生し、一次刺激時に、正常レベルの重要なＴ細胞エフェクターサイトカイン遺伝子であるＩＬ−２を発現する（Ｓｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１５；２１２：２１１５−３１、及びＳｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６：４５０−９）。代わりに、Ｏｃｔ１及びＯＣＡ−Ｂは、抗原再遭遇の条件下でこれらの遺伝子を強力に調節し、それにより、休止しているが以前に活性化された細胞の二次刺激により、２０倍の発現欠損が生じる（Ｓｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６：４５０−９）。ＣＤ４+  Ｔ細胞の極性化の間、Ｏｃｔ１は別の転写因子であるＣＴＣＦとともに機能し、Ｉｌ４、Ｉｆｎｇ及びＩｌ１７ａ標的遺伝子座間の物理的伝達を媒介する（Ｋｉｍ  Ｌｋ，ｅｔ  ａｌ．２０１４；５４：５６−６６）。Ｏｃｔ１の補因子ＯＣＡ−Ｂ／Ｂｏｂ．１は、ＣＤ４+セントラルメモリー細胞の形成及び機能、ならびにＴｈ１７細胞の形成にも関連付けられている（Ｓｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１５；２１２：２１１５−３１、及びＹｏｓｅｆ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３；４９６：４６１−８）。累積的に、これらの知見は、ＣＤ４+  Ｔ細胞応答の制御におけるＯｃｔ１及びＯＣＡ−Ｂの強力な役割を示しているが、ただし、これは繰り返される抗原曝露を含む特定の条件下においてである。この正常な発生及び刺激応答は、Ｏｃｔ１及びそれに関連する経路の標的化を、正常な免疫機能を温存しながら自己免疫応答を処置するために使用できる、潜在的な「治療域」の一部を形成する。
【０１３６】
免疫記憶に加えて、繰り返される抗原遭遇は、慢性感染症、移植片対宿主病、腫瘍免疫及び自己免疫などの状況でも発生する。後者の場合、ヒトＧＷＡＳ研究により、Ｏｃｔ１の結合部位における多型と、関節リウマチ、セリアック病、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性甲状腺炎及びＭＳを含む自己免疫疾患の素因との間の強い関連性が示されている。（Ｍａｕｒａｎｏ  ＭＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２；３３７：１１９０−５ｌ  Ｆａｒｈ  ＫＫ−Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５；５１８：３３７−４３、ｖａｎ  Ｈｅｅｌ  ＤＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２００２；１１：１２８１−９、及びＧｒａｈａｍ  ＤＳＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２００６；１５：３１９５−２０５）。神経炎症性疾患、特にＭＳを制御するプロセスとの強い関連性は、自己抗原に対する神経炎症性Ｔ細胞応答及びウイルス感染におけるＯｃｔ１の役割の考察につながる。
【０１３７】
ここで、データは、Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の喪失が、ＪＨＭＶ感染に対する免疫応答を維持しながら、マウスの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおける臨床応答、Ｔ細胞浸潤及びサイトカイン産生を大幅に減弱させることを示す。ＥＡＥは自己抗原に起因しており、ＭＳのプロトタイプのマウスモデルである。臨床応答性の低下は、特に共刺激シグナルの非存在下における、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激時のＣＤ４+  Ｔ細胞上のアネルギー関連表面タンパク質の発現の変化と関連していた。マウス肝炎ウイルスの向神経性ＪＨＭ株（ＪＨＭＶ）によるｉ．ｃ．感染によって誘発される神経炎症のモデルを使用したところ、臨床スコア、浸潤性Ｔ細胞及びマクロファージ、ならびにサイトカイン発現にわずかな相違が観察された。Ｏｃｔ１欠損Ｔ細胞を有する動物において、ウイルスクリアランスは緩徐であったが、完全であった。累積的に、これらの結果は、ＣＤ４+  Ｔ細胞中のＯｃｔ１が関与する経路を標的とすることで、有益な免疫機能の大部分を温存しながら、ＭＳ及びその他の神経炎症性疾患の処置のための新規治療手段を提供することができることを示唆する。
【０１３８】
材料及び方法
実験用マウス：この試験で使用したマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のバックグラウンドであった。ＣＤ４−Ｃｒｅと交配したＯｃｔ１（Ｐｏｕ２ｆ１）条件付きマウスは以前に記載されている（Ｓｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１５；２１２：２１１５−３１）。
【０１３９】
ＥＡＥの誘発及びスコアリング。ＥＡＥを、ミオシンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）／Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（ＰＴ）法（Ｇｒｉｓｔ  ＪＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８；４８：１１９９−２１０）を使用して惹起した。簡潔に述べると、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Ｓｉｇｍａ、２ｍｇ／ｍＬ）中の０．２μｍｏｌのＭＯＧ35-55ペプチド（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号３５）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ  ＨＳＣ  Ｃｏｒｅにて合成）をマウスに皮下注射した。２００ｎｇのＰＴ（Ｓｉｇｍａ）をマウスに２回静脈内注射した。臨床スコアは、以下の基準、すなわち、０、臨床疾患なし；１、尾の張りの喪失；２、軽度の後肢不全麻痺；３、中等度の後肢麻痺；４、対麻痺；５、四肢麻痺、昏睡または死、に基づいて決定した。
【０１４０】
白血球の単離及び細胞内サイトカインの染色。白血球を、パーコール勾配法を使用して脊髄及び頸部リンパ節から単離した（Ｓｔｉｌｅｓ  ＬＮ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；１７７：８３７２−８０、Ｓｔｉｌｅｓ  ＬＮ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；３６：６１３−２２、及びＳｔｉｌｅｓ  ＬＮ，ｅｔ  ａｌ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００９；４２：４８４−９１）。簡潔に述べると、組織を粉砕によって解離させ、ナイロンストレーナーに通した。細胞を８０％及び４０％のパーコールで、室温にて１３００×ｇで遠心分離した。４０％〜８０％のパーコールの間の界面の細胞を採取した。細胞内染色のために、単離した細胞を、ブレフェルジンＡ（Ｇｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）とともにＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ、５０ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ、１μｇ／ｍＬ）で４時間刺激して、製造業者のプロトコルに従って細胞固定／透過処理溶液（ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標））で固定した。フローサイトメトリーに使用した抗体は、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰｅｒＣＰコンジュゲート抗マウスＣＤ８ａ、ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＩＦＮγ及びＰＥコンジュゲート抗マウスＩＬ−１７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）であった。
【０１４１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養。ＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/flマウスまたは対照Ｏｃｔ１fl/flマウスからの単細胞懸濁液を、７０μｍストレーナーを通して脾臓を粉砕することにより調製した。ＣＤ４+  Ｔ細胞を、マウスＣＤ４+  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって単離した。単離したＣＤ４+  Ｔ細胞を、以前に記載されているように（Ｓｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６：４５０−９）培養して、５μｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３ε（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で２４時間刺激した。
【０１４２】
ＪＨＭＶ。頭蓋内（ｉ．ｃ．）注射のために、年齢を一致させた（５〜７週）異なる遺伝子型のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中のケタミン（Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ，ＩＬ，ＵＳＡ）とキシラジン（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｓａｉｎｔ  Ｊｏｓｅｐｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）との混合物２００μＬの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射で麻酔した。３０μＬのＨＢＳＳ中に懸濁した２００プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＪＨＭＶ（株Ｖ３４）を、マウスにｉ．ｃ．注射した。臨床的重症度を、以前に記載された４点スコアリングスケールを使用して評価した（Ｄｉｃｋｅｙ  ＬＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１６；１３：２４０）。ウイルス力価の分析のために、指定の時点でマウスを屠殺した。各脳の半分をホモジナイズし、ＤＢＴマウス星状細胞腫細胞株（Ｄｉｃｋｅｙ  ＬＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１６；１３：２４０）を使用して実施するプラークアッセイに使用した。
【０１４３】
細胞の単離及びフローサイトメトリー。感染後（ｐ．ｉ．）の既定の時間における、ＪＨＭＶに感染したマウスの脳及び脊髄内に存在する免疫細胞の免疫表現型検査を、単離した組織をホモジナイズし、フローサイトメトリーによる分析のために単細胞懸濁液を作製することによって実現した（Ｄｉｃｋｅｙ  ＬＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１６；１３：２４０、Ｍａｒｒｏ  ＢＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１９６：１８５５−６４、及びＢｌａｎｃ  ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１４；１１：１３８）。簡潔に述べると、単離した細胞を次の抗体で染色した：総ＣＤ４+細胞及びウイルス特異的ＣＤ４+細胞をそれぞれ測定するための、ＡＰＣコンジュゲートラット抗マウスＣＤ４及びアミノ酸１３３〜１４７にまたがるＪＨＭＶマトリックス（Ｍ）糖タンパク質内に存在するＣＤ４免疫優性エピトープに特異的なＰＥコンジュゲートテトラマー（Ｍ１３３〜１４７テトラマー）（Ｄｉｃｋｅｙ  ＬＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１６；１３：２４０、Ｍａｒｒｏ  ＢＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１９６：１８５５−６４、及びＢｌａｎｃ  ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１４；１１：１３８）；総ＣＤ８+細胞及びウイルス特異的ＣＤ８+細胞をそれぞれ同定するための、ＡＰＣコンジュゲートラット抗マウスＣＤ８ａ及びアミノ酸５１０〜５１８にまたがるスパイク（Ｓ）糖タンパク質内に存在するＣＤ８免疫優性エピトープに特異的なＰＥコンジュゲートテトラマー（Ｓ５１０−５１８）（Ｄｉｃｋｅｙ  ＬＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１６；１３：２４０、Ｍａｒｒｏ  ＢＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１９６：１８５５−６４、及びＢｌａｎｃ  ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１４；１１：１３８）。テトラマーは、ＮＩＨテトラマーコア施設によって合成された。総制御性Ｔ細胞を測定するためのＡＰＣコンジュゲートラット抗マウスＣＤ４及びＰＥコンジュゲート抗ＣＤ２５、ならびにマクロファージを同定するためのＢＶ５１０コンジュゲートラット抗マウスＣＤ４５及びＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｆ４／８０。ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０フローサイトメーター及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して試料を分析した。
【０１４４】
組織診断。脊髄を既定の時点で単離し、４％パラホルムアルデヒドで４℃で一晩固定した。続いて、切片を３０％スクロースで５〜７日間凍結保護し、１２個の冠状切片に分離して、最適切削温度（ｏｐｔｉｍｕｍ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（ＯＣＴ）配合物（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）中に包埋した（Ｇｒｉｓｔ  ＪＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８；４８：１１９９−２１０、Ｄｉｃｋｅｙ  ＬＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１６；１３：２４０、Ｍａｒｒｏ  ＢＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１９６：１８５５−６４、及びＢｌａｎｃ  ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１４；１１：１３８）。総ＣＤ８+細胞及びウイルス特異的ＣＤ８+細胞をそれぞれ同定するための、ＡＰＣコンジュゲートラット抗マウスＣＤ８ａ及びアミノ酸５１０〜５１８にまたがるスパイク（Ｓ）糖タンパク質内に存在するＣＤ８免疫優性エピトープに特異的なＰＥコンジュゲートテトラマー（Ｓ５１０−５１８）（Ｄｉｃｋｅｙ  ＬＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１６；１３：２４０、Ｍａｒｒｏ  ＢＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１９６：１８５５−６４、及びＢｌａｎｃ  ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１４；１１：１３８）。冠状切片（厚さ８μｍ）を切断し、切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）と組み合わせたルクソールファストブルー（ＬＦＢ）で染色した。全白質及び脱髄白質の面積を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで測定した。脱髄のパーセントを、確立された方法（Ｄｉｃｋｅｙ  ＬＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１６；１３：２４０）を使用して、脱髄白質の面積を総白質面積で除することによって算出した。
【０１４５】
統計分析。エラーバーは±ＳＥＭを示す。スチューデントのＴ検定を使用して、統計学的有意性を求めた。すべての図について、＊＝ｐ値≦０．０５；＊＊＝ｐ値≦０．０１。
【０１４６】
結果
神経自己免疫疾患の病因に対するＴ細胞におけるＯｃｔ１の効果を判定するために、Ｏｃｔ１  Ｔ細胞条件付きマウス（ＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/fl）（Ｓｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１５；２１２：２１１５−３１）及び対照マウス（Ｏｃｔ１fl/fl）をＭＳのＭＯＧ−ＥＡＥモデルと組み合わせて使用した。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質に対応するペプチド（ＭＯＧ35-55、方法を参照されたい）及び完全フロイントアジュバントの接種後、百日咳毒素をマウスに注射して、血液脳関門の透過性を向上させた。疾患の重症度を、臨床スコアを評価することによって決定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＭＯＧ注射の９〜１４日後に臨床症状を発症する（Ｂｉｔｔｎｅｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１４；１５；（８６））。図１２Ａに示すように、ＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/flマウスは、臨床スコアが１未満であり大幅に保護されたが、一方で、対照のＯｃｔ１fl/flマウスは、疾患のピーク時にはるかに高い臨床的影響を示した（２０日目、図１２Ａ）。さらに、ＥＡＥの誘発の２１日後に、組織病理学的スコアリングのために脊髄を採取した。対照マウスの脱髄の程度は、ＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/fl群の程度の２倍であった（図１２Ｂ、１２Ｃ）。これらの結果により、Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の欠失が、ＭＳのＭＯＧ−ＥＡＥモデルにおける臨床症状からマウスを強力に保護することが明らかとなる。
【０１４７】
Ｔ細胞はＥＡＥ及びＭＳの病因に不可欠である（Ｇｏｖｅｒｍａｎ  Ｊ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；９：３９３−４０７）。ＥＡＥにおけるＣＮＳ浸潤Ｔｈ１及びＴｈ１７  ＣＤ４+  Ｔ細胞中のＩＦＮγ及びＩＬ−７の発現は、臨床的重症度と相関する（Ｇｏｖｅｒｍａｎ  Ｊ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；９：３９３−４０７、Ｓｅｇａｌ  ＢＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９６；１８４：７７１−５、及びＬａｎｇｒｉｓｈ  ＣＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００５；２０１：２３３−４０）。ＣＤ４+  Ｔ細胞及びＣＤ８+  Ｔ細胞は、いずれも臨床的及び組織学的疾患の一因となる。ＣＤ８+  Ｔ細胞は病変に動員され、オリゴデンドロサイト及び軸索の破壊を媒介する（Ｇｏｖｅｒｍａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ａｌｌｅｒｇｙ．２００５；４：２３９−４５及びＦｒｉｅｓｅ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒａｉｎ．２００５；１２８：１７４７−６３）。したがって、Ｏｃｔ１条件付きマウス及び対照マウスの流入領域頸部リンパ節（ＣＬＮ）及び脊髄におけるＴ細胞集団を疾患進行のピーク時にスクリーニングして、Ｏｃｔ１を欠くＴ細胞がＣＮＳ及びＣＬＮの自己免疫活性を低減させるかどうかを判定した。ＣＬＮ  ＣＤ４+及びＣＤ８+のパーセンテージは群間で類似していたが（図１２Ｄ、１２Ｅ左パネル）、ＣＤ４+  Ｔ細胞及びＣＤ８+  Ｔ細胞の総数は、対照Ｏｃｔ１fl/flマウスと比較して、ＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/fl群ではより少なく（ｐ＜０．０１）検出された（図１２Ｅ、右パネル）。この結果により、ＥＡＥモデルにおけるリンパ節の細胞充実性の低下が示唆される。ＣＤ４+  Ｔ細胞がＥＡＥモデルにおける主要な誘発物質であることから（Ｇｏｖｅｒｍａｎ  Ｊ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；９：３９３−４０７）、サイトカイン産生もこれらの細胞においてプロファイリングした。ＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/flマウスのＣＬＮにおいて、Ｏｃｔ１fl/fl対照と比較して、ＩＬ−１７産生ＣＤ４+  Ｔ細胞及びＩＦＮγ産生ＣＤ４+  Ｔ細胞の頻度及び総数の両方が減少した（図１２Ｆ、１２Ｇ）。ＣＬＮと同様に、ＣＤ４+  Ｔ細胞及びＣＤ８+  Ｔ細胞の頻度は、ＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/flマウス及びＯｃｔ１fl/flマウスの脊髄において類似していた（図１２Ｈ）。ＣＤ４+  Ｔ細胞及びＣＤ８+  Ｔ細胞の総数もまた、ＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/flマウスとＯｃｔ１fl/flマウスの間で類似していた。しかしながら、ＣＬＮと同様に、炎症性サイトカインの産生は、対照と比較してＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/flマウスの脊髄の浸潤性Ｔ細胞において大幅に減少した（図１２Ｉ）。これらのデータは、Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の喪失が、ＥＡＥの臨床症状から動物を強力に保護し、この保護がＣＮＳのＴ細胞浸潤及び炎症性サイトカインの発現の減少に関連していることを示す。
【０１４８】
Ｔ細胞アネルギーは、共刺激シグナルの非存在下でＴＣＲ刺激によって誘導される末梢性寛容機構であり、Ｔ細胞の反応性が不十分となり、これにより潜在的な自己反応性から動物を保護する（Ｋｅａｒｎｅｙ  ＥＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１９９４；１：３２７−３９、Ｖａｎａｓｅｋ  ＴＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１６７：５６３６−４４、Ｋａｌｅｋａｒ  ＬＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１７：３０４−１４、及びＣｈａｉ  ＪＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；９：９３５−４４）。Ｏｃｔ１の喪失により、繰り返されるＴ細胞刺激の状況において、Ｉｆｎｇなどの標的遺伝子の発現が選択的に低下する（Ｓｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６：４５０−９）。Ｏｃｔ１の補因子ＯＣＡ−Ｂを欠損したＣＤ４+  Ｔ細胞を使用した遺伝子発現プロファイリングにより、これらの遺伝子が下方制御されていることが明らかとなり、さらにアネルギーに関連する遺伝子（例えば、Ｃｔｌａ４）の発現の増加が同定される（Ｓｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１５；２１２：２１１５−３１）。共刺激の非存在下で、Ｔ細胞に（固定化した抗ＣＤ３εモノクローナル抗体を介して）一次ＴＣＲ刺激を与えることにより、アネルギー応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏでモデル化することができる（Ｃｈａｉ  ＪＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；９：９３５−４４）。Ｏｃｔ１喪失のアネルギー応答に対する影響を判定するために、ＣＤ４+ＣＤ４４+Ｔ細胞（主に前活性化した休止細胞からなる）をＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/fl動物及び対照ＣＤ４−Ｃｒｅ動物から収集して、それらをＣＤ２８共刺激とともにまたはＣＤ２８共刺激なしで抗ＣＤ３抗体を使用してｅｘ  ｖｉｖｏで２４時間刺激し、活性化及びアネルギーに関連するタンパク質の発現をプロファイリングした。
【０１４９】
ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共刺激分子）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞アネルギーの誘導及びｉｎ  ｖｉｖｏでの自己免疫の発生において、重要であるが複雑な役割を果たす（Ｔｕｅｔｔｅｎｂｅｒｇ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８２：３３４９−５６、Ｄｏｎｇ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４０９：９７−１０１、及びＤｏｎｇ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２００３；２１：２５５−６０）。フローサイトメトリーでＩＣＯＳ発現を分析したところ、ベースラインＩＣＯＳレベルはナイーブＯｃｔ１欠損細胞で約２倍高かったが、抗ＣＤ３／２８を投与された十分に刺激された細胞では相違が明らかでないことが判明した（図１３Ａ、１３Ｂ）。興味深いことに、抗ＣＤ３単独でＯｃｔ１欠損細胞を刺激すると、対照群と比較してＯｃｔ１欠損細胞におけるＩＣＯＳ発現が有意に減少した（図１３Ａ、１３Ｂ）。休止細胞におけるベースラインＩＣＯＳ発現の増加及びアネルギー性刺激時の発現の減少の両方は、抗原プライミング中のＩＣＯＳの阻止（１〜１０日目）が脳の炎症を増加させＥＡＥを促進するが、一方でＥＡＥ病変形成後の阻止（９〜２０日目）が、ＣＮＳ白血球の浸潤性を減少させ保護的であるため、ＥＡＥモデルで観察された保護と一致する（Ｄｏｎｇ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４０９：９７−１０１、及びＲｏｔｔｍａｎ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．２００１；２：６０５−１１）。さらに、ＣＤ４+  Ｔ細胞の活性化時に誘導される高親和性ＩＬ−２受容体であるＣＤ２５の発現（Ｃａｒｕｓｏ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．１９９７；２７：７１−６）は、Ｏｃｔ１欠損細胞において、共刺激を欠くアネルギー状態で特異的に減少した。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はＣＤ２５を発現しＩＬ−１０も産生するが、これらの細胞でのＩＬ−１０産生は対照ＣＤ４＋  Ｔ細胞と類似しており（図１６）、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの相違がエフェクターＴ細胞に関連していることを示している。ＣＤ２５とは対照的に、ＣＤ４４の発現レベルは群間で類似していた（図１３Ｃ、１３Ｄ）。これらの結果は、ＩＣＯＳ及びＣＤ２５レベルが、ＥＡＥモデルで観察された保護と一致する様式でＯｃｔ１欠損細胞において変化することを示す。
【０１５０】
アネルギー応答と相関する抑制性分子の発現も分析した。チェックポイント阻害剤及びアネルギーマーカーであるＣＴＬＡ４（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００１；１４：１４５−５５）の発現は、アネルギー状態及び完全活性化状態の両方においてＯｃｔ１の喪失によって増加した（図１３Ｅ、１３Ｆ）。同様に、ＦＲ４／ＣＤ７３二重陽性細胞の頻度は、対照細胞と比較してすべての条件下でＯｃｔ１欠損細胞において増加した（図１３Ｇ、１３Ｈ）。ＣＤ４+ＣＤ４４+ＦＲ４hiＣＤ７３hi細胞はアネルギーと関連している（Ｋａｌｅｋａｒ  ＬＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１７：３０４−１４、及びＭａｒｔｉｎｅｚ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１８８：１７０−８１）。Ｔｈ１またはＴｈ１７分化培養条件におけるＩＦＮγ産生細胞またはＩＬ−１７産生細胞の頻度も測定し、Ｏｃｔ１の喪失がサイトカインの発現レベルに影響を与えるかどうかを調査した。ＭＯＧ35-55ペプチドによる刺激の５日後に相違は観察されなかった。したがって、Ｏｃｔ１を欠くＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激は、活性化に関連する表面タンパク質の発現の減少及びアネルギーに関連するタンパク質の発現の増加をもたらす。
【０１５１】
上記の知見は、Ｏｃｔ１の標的化が、ＭＳの実行可能な治療戦略であり得ることを示唆している。モデル病原体ＬＣＭＶによる急性感染を使用した以前の知見は、Ｔ細胞におけるＯｃｔ１が、病原体応答及びクリアランスに不要であるが、強力な記憶想起応答には必要であることを示している（Ｓｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１５；２１２：２１１５−３１）。しかしながら、向神経性ウイルスに起因する神経炎症におけるＯｃｔ１の役割は試験されていない。ＪＨＭＶの場合に病態が大幅に増大していることから、自己免疫の処置としてＯｃｔ１を直接標的化することは、望ましくない副作用をもたらすことが示唆される。Ｏｃｔ１がウイルス誘発性脳脊髄炎の疾患の重症度に介在するかどうかを判定するために、ＪＨＭＶに対する応答を試験した。ＪＨＭＶは、グリア指向性コロナウイルスであり、ウイルス誘発性脳脊髄炎及び免疫介在性脱髄の広く受け入れられているモデルである（Ｌａｎｅ  ＴＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；３０：１１９−３０、Ｂｅｒｇｍａｎｎ  ＣＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６；４：１２１−３２、及びＬｉｕ  ＭＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２００１；２４：１１１−９）。ＪＨＭＶをＣ５７ＢＬ／６マウスに頭蓋内接種すると、通常、急性脳脊髄炎、免疫介在性脱髄及び後肢麻痺が生じる。Ｔ細胞応答は、ＣＮＳ内のＪＨＭＶ複製の調節に重要である（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９０；６４：４５８９−９２）。年齢を一致させたＯｃｔ１fl/flマウス及びＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/flマウスにＪＨＭＶ（２００ＰＦＵ）を頭蓋内（ｉ．ｃ．）接種し、臨床疾患の重症度及び生存率をモニタリングした。ＪＨＭＶに感染したＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/flマウスは、２１日目まで臨床疾患の重症度に相違を示さなかった（図１４Ａ）。対照マウスと比較した、ＪＨＭＶに感染したＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/flの脳のウイルス力価を、感染後の既定の時間に試験した。ウイルス力価はＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/flマウスのＣＮＳにおいて、感染後７日目に対照動物と比較して上昇したが、感染後２１日目までに、ウイルス力価は両群で検出レベル（約１００ＰＦＵ／ｇ組織）を下回った（図１４Ｂ）。この結果は、Ｏｃｔ１Ｔ細胞欠損マウスにおいてウイルスクリアランスが損なわれていないことを示す。これらの知見を裏付けるように、ピーク疾患時（感染後１２日目）及びエンドポイント時（感染後２１日目、図１４Ｃ、１４Ｄ）で同程度の脱髄が観察された。ＣＤ４−Ｃｒｅ；Ｏｃｔ１fl/flマウスにおける浸潤性ＣＤ４+  Ｔ細胞（図１５Ａ、１５Ｂ）または浸潤性ＣＤ８+  Ｔ細胞（図１５Ｃ、１５Ｄ）の数は、対照マウスと比較して類似していた。さらに、テトラマー染色（Ｄｉｃｋｅｙ  ＬＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１６；１３：２４０、Ｍａｒｒｏ  ＢＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１９６：１８５５−６４、及びＢｌａｎｃ  ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１４；１１：１３８）を使用したところ、ウイルス特異的ＣＤ４+  Ｔ細胞（図１５Ｅ、１５Ｆ）またはＣＤ８+  Ｔ細胞（図１５Ｇ、１５４Ｈ）に有意差は観察されなかった。また、いずれの時点においても、ＪＨＭＶに感染したマウスのＣＮＳ内のＣＤ２５+細胞またはマクロファージ蓄積のパーセンテージに相違はなかった。ＣＮＳのＴ細胞における炎症性サイトカインの発現は、感染後２１日目に安楽死させた動物で試験した。Ｔｈ１７細胞がこのモデルで顕著な役割を果たさないという以前の知見（Ｈｅｌｄ  ＫＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；２１：１７３−８８、及びＫａｐｉｌ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００９；８３：５９７８−８６）と一致して、有意なレベルのＩＬ−１７発現は観察されなかった。ＩＦＮγ発現細胞は存在したが、パーセンテージもしくは数、またはＩＦＮγ産生の程度のいずれにも有意差は観察されなかった（図１５Ｉ、１５Ｊ）。これらのデータを総合すると、Ｔ細胞におけるＯｃｔ１の喪失は、ＣＮＳのＪＨＭＶ感染に応答して、神経疾患もしくは免疫介在性脱髄またはＴ細胞の機能性に影響を及ぼさないことが示唆される。
【０１５２】
考察
本明細書に記載の結果は、Ｔ細胞における転写因子Ｏｃｔ１の発現がＭＯＧ−ＥＡＥモデルの使用でＣＮＳ自己免疫を促進するが、ＣＮＳ抗ウイルス免疫への関与は最小限であることを示す。これらの結果は、Ｏｃｔ１ならびにそれに関連する活性及び経路の標的化を、ウイルス性病原体に対する免疫機能を温存しながら、自己免疫を処置するために使用することができることを示唆する。
【０１５３】
Ｏｃｔ１の転写調節機構はＣＤ４+  Ｔ細胞において試験されている（Ｓｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１５；２１２：２１１５−３１、及びＳｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６：４５０−９）。直接標的遺伝子としては、Ｉｌ２、Ｉｆｎｇ、Ｃｓｆ２（Ｇｍｃｓｆ）、Ｉｃｏｓ及びＣｔｌａ４が挙げられる。しかしながら、ＮＦ−ＡＴまたはＡＰ−１と異なり、Ｏｃｔ１はこれらの遺伝子のベースライン活性にとっては不要である。初代ＣＤ４+  Ｏｃｔ１欠損ナイーブＴ細胞の刺激は、重要なＴ細胞エフェクターサイトカインであるＩＬ−２の正常なレベル及び誘導動態をもたらす（Ｓｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１５；２１２：２１１５−３１、及びＳｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６：４５０−９）。正常なＴ細胞の発生及び一次刺激に対する応答は、Ｏｃｔ１及びそれに関連する経路の標的化を、最小限の副作用で自己免疫応答を処置するために使用できる、潜在的な「治療域」の一部を形成する。代わりに、Ｏｃｔ１標的遺伝子は、抗原及び共刺激シグナルとの２回目の遭遇時に、重度の発現欠損（１００倍以上）を示す（Ｓｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１５；２１２：２１１５−３１、及びＳｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６：４５０−９）。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、Ｏｃｔ１を欠くＣＤ４+  Ｔ細胞は、急性ウイルス性病原体ＬＣＭＶに対して正常な応答を開始するが、明確に認められるほどの数のメモリー細胞を形成することができない。形成されたこれらのメモリー細胞は、病原体の想起応答が不完全である（Ｓｈａｋｙａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１５；２１２：２１１５−３１）。メモリー細胞は、炎症性サイトカインを産生する傾向が最も高く、持続的な自己抗原曝露の場合であっても、メモリー細胞またはメモリー様細胞が自己免疫の原因となり得る（Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；１７５：６９−８１、Ｃｈｅｅ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；１９２：５７２−８０、及びＹｅｏ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１８；１２８：３４６０−７４）。これらの知見及びＯｃｔ１の結合部位におけるヒト多型とＭＳを含む自己免疫疾患の素因との間の強い関連（Ｍａｕｒａｎｏ  ＭＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２；３３７：１１９０−５、Ｆａｒｈ  ＫＫ−Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５；５１８：３３７−４３、ｖａｎ  Ｈｅｅｌ  ＤＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２００２；１１：１２８１−９、Ｇｒａｈａｍ  ＤＳＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２００６；１５：３１９５−２０５）は、ＭＳの促進におけるＯｃｔ１のなし得る役割を示唆した。
【０１５４】
ＭＯＧ−ＥＡＥはＭＳの確立されたモデルであり、炎症誘発性シグナルの存在下で自己抗原を接種することによって引き起こされる。このモデルを使用して、本明細書に記載の結果はＴ細胞におけるＯｃｔ１の喪失がＥＡＥの臨床症状から動物を保護することを示した。この保護は、ＣＬＮのリンパ節腫脹及び炎症性サイトカイン発現の減少、ならびにＣＮＳのＴ細胞浸潤及びサイトカイン発現の減少と関連していた。
【０１５５】
Ｔ細胞寛容は、胸腺選択を通じて中枢的に誘導されるか、または誘導されたＴｒｅｇの活性もしくはアネルギーの誘導により末梢的に誘導され得る（Ｋｅａｒｎｅｙ  ＥＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１９９４；１：３２７−３９）。共刺激シグナルの非存在下におけるＴＣＲ刺激を模倣するために、ＣＤ３単独でＯｃｔ１を欠くＣＤ４+  Ｔ細胞を刺激すると、対照のＯｃｔ１が十分な細胞と比較して、アネルギーの徴候が大幅に増加することが判明した。共刺激の非存在下では、Ｏｃｔ１欠損細胞においてＩＣＯＳ及びＣＤ２５レベルの低下が観察されたが、一方で、共刺激を伴う場合には相違は観察されなかった。ＩＣＯＳは、活性化Ｔ細胞によって発現する共刺激分子であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞アネルギーの誘導及びｉｎ  ｖｉｖｏでの自己免疫の発生において、重要であるが複雑な役割を有する（Ｔｕｅｔｔｅｎｂｅｒｇ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８２：３３４９−５６、Ｄｏｎｇ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４０９：９７−１０１、及びＤｏｎｇ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２００３；２１：２５５−６０）。抗原プライミング中にＩＣＯＳを阻止するとＥＡＥが促進されるが、一方で、疾患経過の後半におけるＩＣＯＳの阻止は保護的である（Ｄｏｎｇ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４０９：９７−１０１、及びＲｏｔｔｍａｎ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；２：６０５−１１）。興味深いことに、アネルギー刺激時に観察されたＩＣＯＳレベルの低下に加えて、未刺激のＯｃｔ１を欠くＣＤ４+  Ｔ細胞が、より高いレベルでベースラインＩＣＯＳを発現することが判明した。したがって、両方の観察結果は、ＥＡＥモデルで観察された保護と一致する。Ｏｃｔ１欠損細胞はまた、高レベルの抑制性受容体ＣＴＬＡ−４ならびにアネルギーマーカーＣＤ７３及びＦＲ４を示した。
【０１５６】
これらの知見はまた、臨床スコア及び脱髄をこのモデルにおいて重ね合わせることができることから、Ｏｃｔ１はＪＨＭＶ誘発性神経疾患に対する臨床応答に不要であることを明らかにしている。Ｏｃｔ１の発現は促進されたが、効果的なウイルス制御には必要ではなかった。しかしながら、総Ｔ細胞数及び抗ウイルスＴ細胞数、サイトカイン発現ならびにマクロファージ動員には広範な影響を及ぼさなかった。例としては、Ｔ細胞のパーセンテージ、ならびにサイトカイン発現細胞及び制御性Ｔ細胞の数が挙げられる。
【０１５７】
結論
総合すると、これらの結果は、Ｏｃｔ１の喪失がウイルス誘発性炎症に中程度の影響を与える一方で、自己抗原に起因する疾患に対する応答を著しく改善することを示す。これらの結果は、Ｏｃｔ１ならびにそれに関連する上流及び下流経路（例えば補因子ＯＣＡ−Ｂ）の標的化が、ウイルス性病原体に対する免疫機能を温存しながら、自己免疫における治療的利益となり得ることを示唆する。
【０１５８】
本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、様々な修正及び変更を本発明に行うことが可能であることが当業者には明らかであろう。本発明の他の態様は、本明細書及び本明細書に開示された本発明の実施を検討することにより当業者に明らかとなるだろう。本明細書及び実施例は、例示にすぎないと解釈されることを意図し、本発明の真の範囲及び趣旨は、以下の特許請求の範囲により示される。
【図１】
2021523892.tif 000009
【図２Ａ】
2021523892.tif 000010
【図２Ｂ】
2021523892.tif 000011
【図２Ｃ】
2021523892.tif 000012
【図３Ａ】
2021523892.tif 000013
【図３Ｂ】
2021523892.tif 000014
【図３Ｃ】
2021523892.tif 000015
【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2021523892.tif 000020
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
2021523892.tif 000040
【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１３Ａ】
2021523892.tif 000043
【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１５Ｉ】
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【図１５Ｊ】
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【図１６】
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【配列表】
2021523892000001.app
【国際調査報告】
2021523892.tif 000066