(57)【要約】肺疾患の処置に使用するためのリポソーム徐放性組成物を提供する。リポソーム徐放性組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含み、チロシンキナーゼ阻害剤を封入するリポソームを含む。チロシンキナーゼ阻害剤は、リポソームに安定に封入され、得られたリポソーム性薬物製剤は、吸入を介して投与するためにエアロゾル化または噴霧することができる。このエアロゾル化リポソーム製剤は、所望の有効性および安全性を達成しながら、一貫した薬物動態学的および薬力学的プロファイルをもたらす。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺疾患の処置に使用するためのリポソーム徐放性組成物であって、封入型チロシンキナーゼ阻害剤を有するリポソームを含み、各リポソームは以下：
１つ以上のリン脂質、ステロール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む脂質二層；ならびに
脂質二層に包まれ、チロシンキナーゼ阻害剤を包括する水性内部
を含む、リポソーム徐放性組成物。
【請求項２】
前記組成物が、約１００ｇ薬物／ｍｏｌリン脂質〜約１０００ｇ薬物／ｍｏｌリン脂質、約２００ｇ薬物／ｍｏｌリン脂質〜約１０００ｇ薬物／ｍｏｌリン脂質、および約０．１ｍｏｌ薬物／ｍｏｌリン脂質〜約２．５ｍｏｌ薬物／ｍｏｌリン脂質の範囲から選択される薬物対リン脂質比を有する、請求項１に記載のリポソーム徐放性組成物。
【請求項３】
前記組成物が、約１ｍＭ〜約２５ｍＭの範囲の脂質濃度を有する、請求項１に記載のリポソーム徐放性組成物。
【請求項４】
前記チロシンキナーゼ阻害剤の濃度が約１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬの範囲である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリポソーム徐放性組成物。
【請求項５】
前記ＰＥＧ修飾脂質が、総リン脂質およびステロールに基づいて６ｍｏｌ％未満の量で存在する、請求項４に記載のリポソーム徐放性組成物。
【請求項６】
前記肺疾患が、肺線維症、非小細胞肺癌、および全身性硬化症からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリポソーム徐放性組成物。
【請求項７】
前記ＰＥＧ修飾脂質が、約１，０００ｇ／ｍｏｌ〜約５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量を有するＰＥＧ部分を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリポソーム徐放性組成物。
【請求項８】
前記ＰＥＧ修飾脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）である、請求項７に記載のリポソーム徐放性組成物。
【請求項９】
前記１つ以上のリン脂質が中性リン脂質であり、前記リポソームの前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧが、総リン脂質およびステロールに基づいて約０．００１ｍｏｌ％〜約５ｍｏｌ％の範囲の量で存在する、請求項８に記載のリポソーム徐放性組成物。
【請求項１０】
前記１つ以上のリン脂質が、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、およびホスファチジルエタノールアミン脂質、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリポソーム徐放性組成物。
【請求項１１】
前記リン脂質対ステロールのモル比が約１：１〜約３：２の範囲である、請求項１に記載のリポソーム徐放性組成物。
【請求項１２】
前記組成物の前記リポソームが、約５０ｎｍ〜約４００ｎｍの平均粒径を有する、請求項１に記載のリポソーム徐放性組成物。
【請求項１３】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ニンテダニブ、サラカチニブ、アキシチニブ、カボザンチニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、およびスニチニブからなる群より選択される、請求項１に記載のリポソーム徐放性組成物。
【請求項１４】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が置換インドリン化合物である、請求項１記載のリポソーム徐放性組成物。
【請求項１５】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、捕捉剤を用いる膜貫通ｐＨ勾配で駆動された遠隔負荷法を介してリポソームの水性内部に封入されている、請求項１に記載のリポソーム徐放性組成物。
【請求項１６】
前記捕捉剤が硫酸アンモニウムである、請求項１５記載のリポソーム徐放性組成物。
【請求項１７】
肺疾患の処置に使用するための粒子のエアロゾル化組成物であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のリポソーム徐放性組成物を含む、粒子のエアロゾル化組成物。
【請求項１８】
前記粒子が、約０．５μｍ〜約５μｍの質量中央空気力学直径を有する、請求項１７に記載の粒子のエアロゾル化組成物。
【請求項１９】
前記封入されたチロシンキナーゼ阻害剤を有する前記リポソームが、最低約１２時間または最低約２４時間後に起こる封入されたチロシンキナーゼ阻害剤の完全な放出と共に、前記肺における１時間当たり総チロシンキナーゼ阻害剤の約０．５％〜約２５％の放出速度を有する、請求項１７に記載の粒子のエアロゾル化組成物。
【請求項２０】
０．００１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１７に記載の粒子のエアロゾル化組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年４月２３日に出願された米国仮出願第６２／６６１，２１７号の優先権の利益を主張し、その全体は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本開示は、徐放性リポソーム組成物の送達のための吸入可能な薬物送達系に関する。本開示は、薬物送達系を調製する方法に関する。本開示はまた、効果の延長された持続時間を有する、肺送達システムに適応された徐放性医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
望ましくない肺疾患は、様々な外部エフェクターから始まり、高齢化社会にとって圧倒的な問題となっている。例示的な肺疾患である特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、世界中で約３００万人の人々を苦しめており、患者のほとんどは５０歳超である。本疾患の予後は不良であり、ＩＰＦ患者の生存期間中央値は診断から２〜３年である。ＩＰＦは、ほとんど希少疾病の肺疾患であり、治療選択肢が限られた（市販されている２つの承認された薬物）破壊的な予後および消耗性症状を伴う。
【０００４】
ＩＰＦの処置のために承認されているチロシンキナーゼ阻害剤の１つであるニンテダニブは、１日３００ｍｇという高用量で投与され、１日２回１５０ｍｇを推奨用量としてカプセル剤として経口服用する。臨床試験において、このような経口チロシンキナーゼ阻害剤の投与計画は、プラセボと比較した場合、肺機能低下（努力肺活量の増加）を約５０％減少させた。
【０００５】
しかし、チロシンキナーゼ阻害剤の経口投与によって、非常に低いバイオアベイラビリティがもたらされ、例えばヒトにおけるニンテダニブのバイオアベイラビリティは４．７％である。ニンテダニブの現在の治療量による経口処置の望ましくない副作用には、下痢（最も頻度の高い有害事象）、悪心、胃痛、肝障害、嘔吐、食欲減退、頭痛、体重減少、および高血圧が含まれる。
【０００６】
リポソームは、自己組織化された脂肪酸小胞であり、水性の内部をもつリン脂質二層で構成される。これらの小胞は、何十年も持続的な薬物送達のための薬物担体として利用されてきた。薬物のリポソーム封入は、遊離型薬物の薬物動態プロファイルを変化させ、全身または疾患部位での緩徐な薬物放出をもたらし、薬物投与の頻度をより少なくして高い投与された用量を可能にし、副作用および毒性をおそらく軽減する。リポソームの内側の高い薬物封入は、遠隔負荷法（能動負荷としても知られる）を介して達成することができ、これは、リポソームへの遊離の非荷電薬物分子の拡散を可能にするために、膜貫通ｐＨおよびイオン勾配に依存する。一方リポソームの内側では、遊離薬物分子は、水性内部の捕捉剤（対イオン）と複合体化して、リポソームの内側に留まる薬物−対イオン塩に沈殿することができる。リポソーム性薬物製剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏで緩徐な薬物放出を達成するように調整することができ、これにより薬物の治療効果が延長されるであろう。これは、リポソーム製剤を調整し、ある種のリポソーム特性、例えば使用されるリン脂質（異なる鎖長、相転移温度）、脂質対コレステロール比、リポソーム上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の量（マクロファージによるクリアランスを回避するため）、薬物封入に使用される捕捉剤、およびおそらくリポソームの層状性を最適化することによって達成することができる。
【０００７】
リポソームに安定に捕捉された薬物は、エアロゾル化されるか、または吸入送達のために噴霧され得る。しかし、チロシンキナーゼ阻害剤を改質するためにリポソーム技術を利用することにより、ＩＰＦまたは他の肺疾患を処置するための治療用量での吸入用製剤を得ることができることは、容易には明らかではない。ｉｎ  ｖｉｖｏでリポソーム性薬物製剤の異なる投与経路により、予測不可能な放出プロファイル、血漿半減期、および生体内分布が得られることが、研究により示されている。これは、肺疾患を処置するために使用されてきた広範囲の活性医薬剤の中で観察されている。したがって、リポソーム性薬物製剤は、所望の有効性および安全性を達成しながら、吸入を介した投与が一貫した薬物動態学的および薬力学的プロファイルをもたらすような方法で調整されるべきである。
【０００８】
現在、臨床試験に達した開発中の吸入可能なリポソーム性薬物製品が２種類ある：リポソーム・アミカシンおよびリポソーム・シプロフロキサシンである。両方の吸入のためのリポソーム抗生物質は、のう胞性線維症（ＣＦ）、非ＣＦ気管支拡張症、非結核性抗酸菌性肺疾患、およびその他の病原性感染症など、複数の呼吸器疾患を処置するために検討されている。吸入療法用の両方のリポソーム性薬物製剤は、脂質含有量を電気的に中性となるように改変することにより（特許文献１）、または粒子サイズおよび遊離シプロフロキサシンの量を調節してマクロファージの誘引を減弱させることにより（特許文献２）、微生物または感染した組織に容易にアクセスする抗生物質用に設計されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第８，２２６，９７５号
【特許文献２】米国特許第８，０７１，１２７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
残念ながら、既存の吸入可能なリポソーム製剤は、ＩＰＦのような他の肺疾患の処置のための満たされていないニーズを満たすことができず、これは、深層肺沈着、粘液浸透の増強、肺における長期の薬物保持、およびリポソーム性薬物安定性の増加を含むが、これらに限定されない、種々の標的製品プロファイルを有する薬物製品を必要とする可能性がある。これまでのところ、チロシンキナーゼ阻害剤などによる肺疾患の処置に有効な吸入可能な薬物を、脂質ベースの徐放性組成物の形態で報告した関連研究はない。したがって、吸入可能であること、局所的肺界面活性剤による破壊に対する安定性または抵抗性が改善されていること、およびさらに、肺環境において所望の効力に到達する可能性を保証するための用量強度を有することなど、ＩＰＦなどの肺疾患を処置するのに適した製剤に対する満たされていないニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示は、リポソームの水性内部に包括したリン脂質（複数可）、ステロール、ＰＥＧ修飾リン脂質、およびチロシンキナーゼ阻害剤を含む吸入可能なリポソーム性薬物製剤を提供する。いくつかの実施形態において、包括されたチロシンキナーゼ阻害剤は、置換インドリン化合物である。いくつかの実施形態において、置換インドリン化合物は、ニンテダニブである。
【００１２】
肺線維症などの肺疾患の既存の処置パラダイムを改善し、遅い持続された薬物放出の利点を利用するために、本発明者らは、肺疾患の増強された処置のためにエアロゾル化および吸入され得る水性懸濁液中のリポソーム封入チロシンキナーゼ阻害剤および所定量の遊離チロシンキナーゼ阻害剤を含むチロシンキナーゼ阻害剤のリポソーム徐放性組成物を開発した。特に、ＩＰＦ処置には、吸入可能な形態のニンテダニブが必要である。
【００１３】
本開示は、以下の利点を有するＩＰＦの処置に使用するためのチロシンキナーゼ阻害剤のリポソーム徐放性組成物を提供する：１）はるかにより低い薬物用量で治療効果を達成する、２）薬物を疾患部位に直接送達する、３）より速い作用の発現、４）悪い薬物反応および全身作用を減少させる、５）経口投与で観察された初回通過代謝をバイパスし、したがって薬物のバイオアベイラビリティを増加させる（および場合によっては肝毒性を減少させる）、６）リポソーム性薬物製剤からの徐放を介して薬物の肺における滞留時間を増加させる、７）薬物投与の頻度を減少させる、８）非侵襲的吸入送達、ならびに９）患者の転帰およびコンプライアンスを改善する。エアロゾル化された粒子の形態でＩＰＦを処置するためのチロシンキナーゼ阻害剤のリポソーム徐放性組成物の吸入された薬物用量は、経口用量よりも有意に低くすることができ、その一方で、依然として同様の治療効果を達成することができる。
【００１４】
本開示による包括されたチロシンキナーゼ阻害剤を有するリポソームは、より長く持続的な薬物放出を達成するためにかなりの量のＰＥＧ部分を包含し、これは安全、有効であり、１日１回またはさらに低頻度の投与に適しているであろう。
【００１５】
いくつかの実施形態において、包括されたチロシンキナーゼ阻害剤を有するリポソームは、モル比が１：１〜３：２のホスホコリン：コレステロールを含み、ここで、ＰＣは、１：１のモル比での水素化された大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、またはその混合物、例えばＤＳＰＣおよび１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）であり得る。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ修飾ホスホエタノールアミン（ＰＥ）は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００であり得、リポソームの総脂質含有量の０．０００１ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％の範囲である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、リポソーム徐放性組成物の脂質濃度は、１０ｍＭ〜２５ｍＭの範囲であり、薬物対脂質（Ｄ／Ｌ）比は、３００ｇ／ｍｏｌ〜７００ｇ／ｍｏｌの範囲である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、包括チロシンキナーゼ阻害剤を有するリポソームの平均粒径は、１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲である。
【００１９】
様々な実施形態において、本開示は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の処置に使用するための、包括されたチロシンキナーゼ阻害剤を有するリポソームを含むリポソーム組成物の粒子のエアロゾル化組成物を提供し、包括されたチロシンキナーゼ阻害剤を有するリポソームは、少なくとも２００ｇ／ｍｏｌの薬物対脂質比を有する。
【００２０】
別の態様において、本開示は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の処置に使用するためのリポソーム徐放性組成物の粒子のエアロゾル化組成物を提供し、組成物は、総リン脂質およびステロールに基づいて、例えば６ｍｏｌ％未満であるが限定されない所定量のＰＥＧ修飾脂質を有する包括されたチロシンキナーゼ阻害剤を有するリポソームを含む。
【００２１】
さらに別の態様では、本開示は、リポソーム徐放性組成物の粒子のエアロゾル化組成物のチロシンキナーゼ阻害剤の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、チロシンキナーゼ阻害剤の治療有効量は、対象の体重当たり０．００１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲である、肺疾患を処置するための方法を提供する。
【００２２】
開示の他の目的、利点および新規の特徴は、添付する図面と併せると、以下の詳細な記述から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、３００ｍＭ硫酸アンモニウム（Ａ．Ｓ．）リポソーム性ニンテダニブの４℃における保存安定性を示すグラフである。
【図２】図２は、４℃で保存した３００ｍＭ硫酸アンモニウム（Ａ．Ｓ．）リポソーム性ニンテダニブの粒径を示すグラフである。
【図３】図３は、模擬肺液（ＳＬＦ）中のリポソームＴＫＩ製剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出プロファイルを示すグラフである；ＡＳ＝硫酸アンモニウム；白丸＝３００ｍＭのＡＳ、３．７４ｍｇ／ｍＬのニンテダニブ、および０．４５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含むリポソームＴＫＩ製剤；閉じた正方形＝３００ｍＭのＡＳ、３．７４ｍｇ／ｍＬのニンテダニブ、および１．７５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含むリポソームＴＫＩ製剤；エラーバーは、標準偏差を表す。
【図４】図４は、健常マウスの肺組織におけるニンテダニブ（Ｎｉｎ）の保持を示すグラフである；ＡＳ＝硫酸アンモニウム；白丸＝３．７４ｍｇ／ｍＬの遊離型ニンテダニブ（Ｎｉｎ）；開放三角形＝３００ｍＭのＡＳ、３．７４ｍｇ／ｍＬのニンテダニブ、および０．４５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含むリポソームＴＫＩ製剤；閉じた三角形＝３００ｍＭのＡＳ、３．７４ｍｇ／ｍＬのニンテダニブ、および１．７５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含むリポソームＴＫＩ製剤；エラーバーは、標準偏差を表す。
【図５】図５は、ＩＰＦ動物モデルにおけるマウス肺組織中のニンテダニブ（Ｎｉｎ）の保持を示すグラフである；当該図面は、３００ｍＭのＡＳ、３．７４ｍｇ／ｍＬのニンテダニブ、および３ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含むリポソームＴＫＩ製剤で気管内（ＩＴ）投与したニンテダニブの保持（閉じた円）を、経口投与したニンテダニブ（遊離ニンテダニブ）の保持（開放三角形）と比較したものである。ＡＳ＝硫酸アンモニウム；エラーバーは、標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
上記で用いるように、および開示の全体を通じて、別段の指示がない限り、以下の用語は、以下の意味を有するものと理解されるものとする。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、文脈が別段明確に示さない限り、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、複数の参照を含む。
【００２６】
本明細書中の全ての数字は、「約」によって改変されたものとして理解され得、それは、量、時間的持続時間などの測定可能な値を参照する場合、そのような変化量が、別段特定しない限りリポソーム性薬物の所望の量を得るために適切であるように、規定された値から±１０％、好ましくは±５％、より好ましくは±１％、さらに好ましくは±０．１％の変化量を包含することを意味する。
【００２７】
本明細書中で使用される用語「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置した（ｔｒｅａｔｅｄ）」、または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、防止的（例えば、予防的）、緩和的、および治癒的使用または結果を含む。
【００２８】
用語「対象」は、肺機能に影響する癌または他の疾患（複数可）を有する脊椎動物を含む。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトを含む哺乳動物などの温血動物である。
【００２９】
本明細書中で使用される、薬物対脂質比（「Ｄ／Ｌ比」）の用語は、総リン脂質含有量に対するチロシンキナーゼ阻害剤の比を指す。遊離型およびリポソーム性薬物のチロシンキナーゼ阻害剤含有量を、ＵＶ−Ｖｉｓ吸光度測定により測定した。リポソームおよびリポソーム性薬物のリン脂質含有量、または濃度は、リンアッセイ（Ｇ．Ｒｏｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ  １９７０，５，４９４−４９６から採用した）を使用して、リポソームおよびリポソーム性薬物試料のリン含有量をアッセイすることによって決定した。Ｄ／Ｌ比は、ｇ／ｍｏｌまたはｍｏｌ／ｍｏｌのいずれかの用語で表すことができる。例えば、リポソーム性ニンテダニブのｇ／ｍｏｌを、ｇ／ｍｏｌ値を５３９．６２で除してｍｏｌ／ｍｏｌ値を得ることにより、リポソーム性ニンテダニブのｍｏｌ／ｍｏｌに換算することができる。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語ｍｏｌ％は、混合物の総モルに対する混合物の所与の成分のモルのパーセンテージを意味する。
【００３１】
リポソーム
本明細書中で使用される用語「リポソーム」は、小胞を形成する１つ以上の二層膜の膜によって外部の媒体から封鎖された水性内部空間を有することによって特徴づけられる粒子を指す。リポソームの二層膜は、典型的には、脂質、すなわち、空間的に分離された疎水性および親水性ドメインを含む合成または天然起源の両親媒性分子によって形成される。本開示の特定の実施形態において、「リポソーム」という用語は、１つの脂質二層が膜を形成する小さな単ラメラ小胞（ＳＵＶ）リポソームを指す。
【００３２】
一般に、リポソームは、典型的には、リン脂質、ジグリセリド、二脂肪性糖脂質などの二脂肪鎖脂質、スフィンゴミエリンおよびスフィンゴ糖脂質などの単一脂質、コレステロールなどのステロイドおよびその誘導体、ならびにこれらの組合せからなる群より選択される１つ以上の脂質を含む脂質混合物を含む。
【００３３】
本開示によるリン脂質の例は、以下を含むが、これらに限定されない。１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＳＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ナトリウム塩）（ＤＭＰＧ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ナトリウム塩）（ＤＰＰＧ）、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ナトリウム塩）（ＰＳＰＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ナトリウム塩）（ＤＳＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ナトリウム塩）（ＤＭＰＳ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ナトリウム塩）（ＤＰＰＳ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ナトリウム塩）（ＤＳＰＳ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ナトリウム塩）（ＤＭＰＡ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ナトリウム塩）（ＤＰＰＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ナトリウム塩）（ＤＳＰＡ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ナトリウム塩）（ＤＯＰＡ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール）（アンモニウム塩）（ＤＰＰＩ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホイノシトール（アンモニウム塩）（ＤＳＰＩ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオ−イノシトール）（アンモニウム塩）（ＤＯＰＩ）、カルジオリピン、Ｌ−α−ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、およびＬ−α−ホスファチジルエタノールアミン（ＥＰＥ）。
【００３４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質
ポリエチレングリコール修飾脂質は、脂質と結合したポリエチレングリコール部分を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ部分は、約１，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ修飾脂質を、リン脂質と混合して、１つ以上の二層膜を有するリポソームを形成する。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ修飾脂質の量は、全リン脂質およびステロールに基づいて、０．０００１ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％、任意に０．００１ｍｏｌ％〜３０ｍｏｌ％、および任意に０．０１ｍｏｌ％〜２０ｍｏｌ％の範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ修飾脂質の量は、総リン脂質およびステロールに基づいて、６ｍｏｌ％以下、５ｍｏｌ％以下、３ｍｏｌ％以下、または２ｍｏｌ％以下である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ修飾脂質は、１，０００ｇ／ｍｏｌ〜５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量を有するＰＥＧ部分を有する。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ修飾脂質は、ポリエチレングリコール基（ＰＥＧ−ＰＥ）に結合したホスファチジルエタノールアミンである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）である。
【００３５】
リポソーム徐放性組成物
用語「リポソーム性薬物製剤」および「リポソーム徐放性組成物」は、本開示において互換的に使用される。本開示に従うリポソーム徐放性組成物は、膜貫通ｐＨ勾配で駆動された遠隔負荷法を介してリポソームの水性内部にチロシンキナーゼ阻害剤を封入することによって調製された包括されたチロシンキナーゼ阻害剤を有するリポソームを含むが、これには限定されない。いくつかの実施形態において、膜貫通ｐＨ勾配は、リポソームへのチロシンキナーゼ阻害剤の遠隔負荷のための捕捉剤を用いることによって作成される。様々な実施形態において、捕捉剤は、硫酸アンモニウム、メシル酸アンモニウム、トシル酸アンモニウム、トリエチルアンモニウムスクロースオクタサルフェート、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００３６】
ある実施形態では、包括されたチロシンキナーゼ阻害剤を有するリポソームは、（ａ）ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンを含むがこれらに限定されない、１つ以上のリン脂質、ステロール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む脂質二層；ならびに（ｂ）チロシンキナーゼ阻害剤を包含する脂質二層によって包含される水性内部を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、１以上のリン脂質は、中性リン脂質である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧであり、リポソーム中のＤＳＰＥ−ＰＥＧの量は、総リン脂質およびステロールに基づいて０．００１ｍｏｌ％〜５ｍｏｌ％の範囲である。
【００３８】
いくつかの実施形態において、包括されたチロシンキナーゼ阻害剤を有するリポソームは、５０ｎｍ〜４００ｎｍの平均粒径を有する。
【００３９】
用語「チロシンキナーゼ阻害剤」（ＴＫＩ）とは、チロシンキナーゼ、タンパク質にリン酸基を付加すること（リン酸化）によって多くのタンパク質を活性化する働きをする酵素を阻害する１つ以上の物質の群を指す。いくつかの実施形態において、用語ＴＫＩは、インドリン化合物を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＴＫＩは、ニンテダニブのような置換インドリン化合物またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本開示によるチロシンキナーゼ阻害剤は、ニンテダニブ、サラカチニブ、アキシチニブ、カボザンチニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、イマチニブ、ボスチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、アファチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、クリゾチニブおよびルキソリチニブからなる群から選択される。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本開示によるチロシンキナーゼ阻害剤は、ニンテダニブであり、１８０．６ｍｇのニンテダニブエシレートは、１５０ｍｇのニンテダニブ塩基と等価である。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本開示によるチロシンキナーゼ阻害剤は、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、および血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）を標的とする、１つ以上の置換基を有するインドール化合物を参照する、置換インドリン化合物である。
【００４３】
いくつかの実施形態において、置換インドリン化合物は、以下よりなる群より選択される：
（ａ）３−Ｚ−［１−（４−（ピペリジン−１−イル−メチル）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−エトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｂ）３−Ｚ−［（１−（４−（ピペリジン−１−イル−メチル）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−カルバモイル−２−インドリノン、
（ｃ）３−Ｚ−［１−（４−（ピペリジン−１−イル−メチル）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−メトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｄ）３−Ｚ−［１−（４−（ジメチルアミノメチル）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−エトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｅ）３−Ｚ−［１−（４−（（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−メチル）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−エトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｆ）３−Ｚ−［１−（４−（Ｎ−（２−ジメチルアミノ−エチル）−Ｎ−アセチル−アミノ）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−エトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｇ）３−Ｚ−［１−（４−（Ｎ−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−Ｎ−アセチル−アミノ）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−エトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｈ）３−Ｚ−［１−（４−（Ｎ−（２−ジメチルアミノ−エチル）−Ｎ−メチルスルホニル−アミノ）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−エトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｉ）３−Ｚ−［１−（４−（ジメチルアミノメチル）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−メトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｊ）３−Ｚ−［１−（４−（Ｎ−アセチル−Ｎ−ジメチルアミノカルボニルメチル−アミノ）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−メトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｋ）３−Ｚ−［１−（４−エチルアミノメチル−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−メトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｌ）３−Ｚ−［１−（４−（１−メチル−イミダゾール−２−イル）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−メトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｍ）３−Ｚ−［１−（４−（Ｎ−ジメチルアミノメチルカルボニル−Ｎ−メチル−アミノ）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−メトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｎ）３−Ｚ−［１−（４−（Ｎ−（２−ジメチルアミノ−エチル）−Ｎ−メチルスルホニル−アミノ）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−メトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｏ）３−Ｚ−［１−（４−（Ｎ−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−Ｎ−メチルスルホニル−アミノ）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−メトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｐ）３−Ｚ−［１−（４−（Ｎ−ジメチルアミノカルボニルメチル−Ｎ−メチルスルホニル−アミノ）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−メトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｑ）３−Ｚ−［１−（４−（Ｎ−（（２−ジメチルアミノ−エチル）−カルボニル）−Ｎ−メチル−アミノ）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−メトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｒ）３−Ｚ−［１−（４−（Ｎ−（２−ジメチルアミノ−エチル）−Ｎ−アセチル−アミノ）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−メトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｓ）３−Ｚ−［１−（４−メチルアミノメチル−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−メトキシカルボニル−２−インドリノン、
（ｔ）３−Ｚ−［１−（４−（Ｎ−（（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メチルカルボニル）−Ｎ−メチル−アミノ）−アニリノ）−１−フェニル−メチレン］−６−メトキシカルボニル−２−インドリノン、および
（ｕ）メチル（３Ｚ）−３−［［４−［メチル−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）アセチル］アミノ］アニリノ］−フェニルメチリデン］−２−オキソ−１Ｈ−インドール−６−カルボキシレート。
【００４４】
リポソーム徐放性組成物のエアロゾル化粒子
本開示によるリポソーム徐放性組成物は、粒子のエアロゾル化組成物の調製に適合させることができる。いくつかの実施形態において、包括されたチロシンキナーゼ阻害剤を有するリポソームは、（ａ）リン脂質、ステロール、およびＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンを含む脂質二層；ならびに（ｂ）脂質二層によって包含され、チロシンキナーゼ阻害剤を含む水性内部を含み、エアロゾル化後のリポソームからのチロシンキナーゼ阻害剤の薬物漏出は、１０％未満である。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本開示による使用のためのチロシンキナーゼ阻害剤のリポソーム徐放性組成物は、１ｍＭ〜２５ｍＭの範囲の脂質濃度を有する。特定の実施形態において、本開示に従う使用のためのチロシンキナーゼ阻害剤のリポソーム徐放性組成物は、１ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬの範囲のチロシンキナーゼ阻害剤の濃度を有する。様々な実施形態において、本開示に従う使用のためのチロシンキナーゼ阻害剤のリポソーム徐放性組成物は、１００ｇの薬物／ｍｏｌリン脂質〜１，０００ｇの薬物／ｍｏｌリン脂質、任意で５００ｇの薬物／ｍｏｌリン脂質〜１０００ｇの薬物／ｍｏｌリン脂質、および任意で０．０１ｍｏｌの薬物／ｍｏｌリン脂質〜２．５ｍｏｌの薬物／ｍｏｌリン脂質、０．０５ｍｏｌの薬物／ｍｏｌリン脂質〜２ｍｏｌの薬物／ｍｏｌリン脂質、０．１ｍｏｌの薬物／ｍｏｌリン脂質〜１．５ｍｏｌの薬物／ｍｏｌリン脂質、および０．５ｍｏｌの薬物／ｍｏｌリン脂質〜１．５ｍｏｌの薬物／ｍｏｌリン脂質の範囲の薬物対リン脂質比を有する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、リポソーム徐放性組成物の遊離チロシンキナーゼ阻害剤は、リポソーム徐放性組成物のチロシンキナーゼ阻害剤の総量（すなわち、遊離プラスリポソーム封入）の５０％未満、任意に０．５％〜４０％、１％〜３０％、２％〜２０％、または３％〜１０％の範囲の量で存在する。
【００４７】
ある態様において、粒子のエアロゾル化組成物は、噴霧器を使用することによって、リポソーム徐放性組成物から生成される。特定の実施形態において、噴霧器は、エアジェット噴霧器、超音波噴霧器、および振動メッシュ噴霧器からなる群から選択される。
【００４８】
いくつかの実施形態において、粒子のエアロゾル化された組成物は、０．５μｍ〜５μｍの質量中央空気力学直径を有する。
【００４９】
いくつかの実施形態において、粒子のエアロゾル化組成物は、１時間あたり投与されたチロシンキナーゼ阻害剤用量の約０．５％〜２５％の放出速度を達成するために、対象への肺送達によって、対象の体重あたり０．００１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの量で投与され、チロシンキナーゼ阻害剤の完全な放出が、最低約１２時間後に起こる。
【００５０】
肺疾患
本開示に従う肺疾患は、非感染性肺疾患において具体化される。非感染性肺疾患とは、グラム陰性菌によって生じた肺感染症を除く肺関連疾患を指す。いくつかの実施形態において、肺疾患は、肺線維症（例えば特発性肺線維症もしくは放射線療法誘発性線維症）、肺癌（例えば非小細胞肺癌）、または全身性硬化症（強皮症としても知られる）を含むが、これに限定されない。「特発性肺線維症」（ＩＰＦ）という用語は、進行性かつ不可逆的な肺機能の低下によって特徴づけられる慢性肺疾患の一種を指す。ＩＰＦは、間質性肺疾患（ＩＬＤ）またはより正確にはびまん性実質性肺疾患として知られる肺障害のファミリーに属する。びまん性肺疾患のこのカテゴリー内で、ＩＰＦは、特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）として知られるサブグループに属する。７つの異なるＩＩＰがあり、特定の臨床的特徴および病理学的パターンにより鑑別される。ＩＰＦは、ＩＩＰの最も一般的な型である。ＩＰＦの症状としては、典型的には、徐々に発症する息切れおよび乾いた咳がある。ＩＰＦのその他の症状には、疲労感およびばち状爪が含まれ得る。運動誘発性の息切れおよび慢性の乾性咳嗽も、同様にＩＰＦの顕著な症状であり得る。ＩＰＦの合併症には、肺高血圧症、心不全、肺炎、および肺塞栓症がある。
【００５１】
開示は、以下の特定の、非限定的な例を参照してさらに記述されるであろう。
【実施例】
【００５２】
以下の実施例は、本開示の特定の実施形態の調製および特性を例示する。
実施例１
リポソーム型チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）の調製
Ｉ．空のリポソームの調製
リポソームは、薄膜水和法または溶媒注入法により調製した。薄膜水和法によって空のリポソームを調製するための方法は、以下のステップを含む：
１．リン脂質およびコレステロールの脂質混合物を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の存在下または非存在下のいずれかで、所定のモル比で秤量し、丸底フラスコ中のクロロホルム１０ｍＬに脂質混合物を加えるステップ；
２．６０℃のロータリーエバポレーターにフラスコを配置し、フラスコを撹拌して脂質混合物を溶解させた後、撹拌しながらフラスコを真空下に配置してクロロホルムを蒸発させて、乾燥脂質膜を得るステップ；
３．蒸留水５ｍＬに捕捉剤を加えることによって捕捉剤溶液（例えば、硫酸アンモニウム（Ａ．Ｓ．））を調製し、その溶液をボルテックスして、粉末を溶解させるステップ；
４．乾燥脂質膜に捕捉剤溶液を加え、それを６０℃で３０分間撹拌して、プロリポソーム溶液を形成するステップ；
５．液体窒素および６０℃の水浴で５回プロリポソーム溶液を凍結−融解して、リポソーム試料を得るステップ；
６．０．２μｍポリカーボネート膜を通して６０℃で１０回、次に０．１μｍポリカーボネート膜を通して６０℃で１０回、リポソーム試料を押し出すステップ；
７．押し出されたリポソーム試料を透析して、遊離の捕捉剤を除去し、続いて試料を透析バッグ（ＭＷＣＯ：２５ｋＤａ）に添加し、バッグを密封し、透析バッグを１００×体積の９．４％（ｗ／ｖ）スクロース溶液中で撹拌し；さらに１時間後および４時間後にスクロース溶液を交換し、透析バッグを一晩撹拌させるステップ；ならびに
８．透析されたリポソーム試料を０．４５μｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜を通して濾過することにより滅菌して、空のリポソームを得るステップ。
【００５３】
チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ニンテダニブ）を負荷させるために使用される空のリポソームを形成するために調製された種々のリポソーム製剤を、以下の表１に列挙する（全てのリポソーム製剤は、９．４％（ｗ／ｖ）スクロース溶液中に調製した）。ＤＳＰＣおよびＤＰＰＥ脂質の両方を含むリポソーム製剤については、ステップ＃４〜６を、６３℃の比較的高いＴｍを有するＤＰＰＥのため、６０℃の代わりに７０℃で実施した。これらのリポソームの平均粒径は、約１２０ｎｍであった。
【００５４】
【表１】
2021522163.tif 000002
【００５５】
ＩＩ．リポソームＴＫＩを得るためのリポソームへのＴＫＩの薬物負荷
以下の方法は、遠隔負荷によるリポソームへのＴＫＩ（すなわち、ニンテダニブ）のカプセル化のための例示的なプロトコルであり、それは、以下のステップを含む：
１．ｐＨ６．５の３１ｍｇ／ｍＬのＬ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓ）を含む９．４％（ｗ／ｖ）スクロースおよび９．４％（ｗ／ｖ）スクロース緩衝液の溶液を調製するステップ；
２．ニンテダニブエタンスルホネート１５ｍｇ／ｍＬのスクロース９．４％（ｗ／ｖ）溶液を調製し、溶液を６０℃で短時間加熱して、ニンテダニブを含む原液（以下、Ｎｉｎ原液と示す）を得るステップ；
３．円錐管内で、（ａ）実施例１のＩ部によるプロセスによって調製された空のリポソーム（いくつかの実施形態では、３：２：０．０４５のモル比でのＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、３００ｍＭの硫酸アンモニウム（Ａ．Ｓ．）、および５８．２７ｍＭ脂質濃度の状態）、（ｂ）９．４％（ｗ／ｖ）スクロース溶液、（ｃ）３１ｍｇ／ｍＬのＬ−Ｈｉｓ、ｐＨ６．５を含む９．４％（ｗ／ｖ）スクロース緩衝液、および（ｄ）Ｎｉｎ原液を一緒に混合して、負荷溶液を得るステップ。いくつかの実施形態において、負荷溶液は、５００ｇ／ｍｏｌのＤ／Ｌ比を有する。１つの実施形態において、空のリポソーム、スクロース溶液、スクロース緩衝液、およびＮｉｎ原液は、以下の表２に提供されるように一緒に混合される；
４．負荷溶液を６０℃の水浴中で激しく振り混ぜ、６０℃で１５分間インキュベートして、リポソーム性薬物試料を生成した後、リポソーム性薬物試料を氷上に数分間置くステップ；
５．冷却したリポソーム性薬物試料を透析バッグ（ＭＷＣＯ：２５ｋＤａ）に加え、バッグを密封し、透析バッグを１００倍量の９．４％（ｗ／ｖ）スクロース溶液で撹拌し、１時間後および４時間後にスクロース溶液を交換し、透析バッグを一晩撹拌させることによって透析するステップ；
６．サイズ排除カラムクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ分析を使用して最終試料の薬物カプセル封入（すなわち、負荷効率）を決定するステップ（すべての試料、リポソームまたは全形態の薬物濃度は、３８８ｎｍでの吸光度測定によって決定した）。
【００５６】
【表２】
2021522163.tif 000003
【００５７】
実施例２
リポソーム中のＴＫＩの捕捉
実施形態のＴＫＩ、ニンテダニブを、約１２０ｎｍの平均粒径を有し、各種リン脂質（例えば、ＨＳＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＣ／ＤＰＰＥ、またはそれらの組み合わせ）を含む空のリポソームに、捕捉剤として３００ｍＭのＡ．Ｓ．と共に、およびＰＥＧ修飾リン脂質（例えば、０．９ｍｏｌ％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）の指示された内容物を、実施例１、セクションＩＩに記載の方法に従って負荷した。
【００５８】
表３は、これらの能動的負荷実験のニンテダニブ封入結果をまとめたものである。０．９ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む３００ｍＭのＡ．Ｓ．空のリポソームは、空のリポソーム製剤中のＰＣ脂質またはＰＣ／ＰＥ脂質の組み合わせにかかわらず、少なくとも０．９ｍｏｌ／ｍｏｌのニンテダニブのＤ／Ｌ率を封入した。したがって、同じ捕捉剤（硫酸アンモニウム）およびＰＥＧ内容物を含むリポソームについては、高い薬物封入、所望の徐放、および肺環境における長期の薬物保持を達成することができる吸入性リポソーム性ニンテダニブ製剤のための異なるリン脂質を選択することに柔軟性がある。
【００５９】
【表３】
2021522163.tif 000004
【００６０】
実施例３
噴霧リポソームＴＫＩの安定性に及ぼす空のリポソームサイズの影響
ニンテダニブを高カプセル化した低ＰＥＧ含有量の製剤について、種々の粒径のリポソーム性薬剤について、噴霧後のリポソームＴＫＩの安定性を検査した。様々な孔径（０．１μｍ、０．２μｍ、０．４μｍ、および１μｍ）のポリカーボネート膜を通して、ニンテダニブを前記リポソームに遠隔負荷させる前に、水和脂質を押し出すことにより、様々なサイズのリポソームを調製した。噴霧安定性試験に用いたリポソーム製剤は、トラッピング剤として３００ｍＭのＡ．Ｓ．を有するモル比３：２：０．０４５のＨＳＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の組成を有していた。リポソームＴＫＩ試料の噴霧のプロトコルは、以下のとおりであった：
１．Ｖｉｂ−Ｍｅｓｈ  Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  ＨＬ１００（Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製品化）の投薬チャンバにリポソーム製剤２ｍＬを加える；
２．投薬チャンバをスライドさせ、噴霧器の残りの部分に接続する；
３．噴霧器をオンにし、試料のエアロゾル化を開始し、２ｍＬの試料全体を噴霧する（総噴霧時間はほぼ６分であった）；
４．噴霧器の出口にしっかりと接続し、パラフィルムで密封した５０ｍＬの円錐管にエアロゾル粒子を採取する、ならびに
５．サイズ排除カラムクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ分析を用いて、噴霧器前後のリポソーム性薬剤試料の薬剤負荷効率を測定する。
【００６１】
噴霧安定性試験の結果を、以下の表４に示す。平均粒径が３００ｎｍ未満のリポソームを含むリポソーム性薬物製剤は、非常に安定であり、薬剤漏出は実際上なかった（１％以下）。平均粒径が３００ｎｍよりわずかに大きい薬物のリポソーム製剤では、少量の薬物漏出（約５％）が認められた。全体として、リポソームが１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の平均粒径を有するリポソーム性薬物製剤のエアロゾル化粒子は、薬剤漏出が最小であり、粒径が噴霧前後で有意に変化しなかったことから、安定であった。
【００６２】
【表４】
2021522163.tif 000005
【００６３】
実施例４
リポソーム性薬物製剤の保存安定性
４℃で保存したリポソームＴＫＩの安定性を、２年間モニターした。ニンテダニブを、３００ｍＭのＡ．Ｓ．を捕捉剤として、モル比３：２：０．０４５（０．９ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質）でＨＳＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含むリポソームに遠隔負荷した。リポソームに当該薬物を負荷した後、リポソーム性薬剤試料を撹拌し、１００Ｘ体積で９．４％（ｗ／ｖ）のスクロース溶液で透析した。スクロース溶液は１時間後および４時間後に交換し、試料を溶液中で一晩撹拌した。リポソームに対する薬物封入（Ｄ／Ｌ比）は、約０．９ｍｏｌ／ｍｏｌであった。透析したリポソーム性薬物試料を４℃で２年間保存した後、リポソームからは実際的にカプセル封入した薬物が漏出していなかった（３％以下）（図１）。さらに、リポソーム化ＴＫＩ懸濁液の粒径は、４℃で２年間の保存期間を通じて同程度（直径±１ｎｍ以内）で推移した（図２）。
【００６４】
実施例５
模擬肺液中のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物放出
０．４５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質または１．７５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を有する２種類のリポソームＴＫＩ製剤の薬物放出プロファイルを、それらの徐放特性を実証するために模擬肺液（ＳＬＦ）で評価した。２つのリポソームＴＫＩ試料は、いずれの試料にも遊離型薬物がほとんど存在せず、ほぼ同じニンテダニブ濃度（３．８５〜３．９５ｍｇ／ｍＬ薬物）で調製した（表５）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出（ＩＶＲ）実験のためのプロトコルは、以下の通りであった：
１．０．５ｍＬの各試料を４．５ｍＬのＳＬＦ（３７℃であらかじめ加温）と混合し、希釈した試料を１５ｍＬの遠心分離管に入れることによって、各リポソームＴＫＩ試料を１０倍に希釈する；
２．３７℃でインキュベートし、２０ｒｐｍで回転させているＩｎｔｅｌｌｉ−ｍｉｘｅｒ回転子の試料ウェルに、希釈した試料とともに遠心管を入れる；
３．所定の時点（例えば、０、４、および２４時間）における希釈リポソームＴＫＩ試料１ｍＬの試料；
４．カプセル封入効率を決定し、各１ｍＬ試料のカプセル封入効率を決定するための分析方法は、次のとおりであった：
ａ．９．４％スクロース溶液（５ｍＬ未満）でＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＬ−４Ｂカラム２ｍＬをパックし、洗浄する；
ｂ．試料０．１ｍＬをカラムに加え、更に９．４％スクロース溶液０．１５ｍＬを３回分離して加え、溶液がカラムから溶出するまで待つ；
ｃ．カラムに９．４％スクロース溶液１ｍＬを加え、溶離液（リポソーム性薬物画分）を１０ｍＬメスフラスコに採取し、メスフラスコにメタノールを加えて容量にし、よく混ぜ合わせる（これがリポソーム性薬物形態である）；
ｄ．別の１０ｍＬメスフラスコ中に、未精製試料０．１ｍＬをフラスコに加え、メスフラスコにメタノールを加えて容量にし、よく混ぜる（これが全薬物形態である）；
ｅ．ＵＶ−Ｖｉｓプレートリーダーを用いて最終希釈試料の３８０ｎｍにおける吸光度を測定し、各試料の薬物濃度を求める。
５．カプセル化効率（ＥＥ）は、薬物のリポソーム形態（ＬＦ）を薬物の全形態（ＴＦ）で除したものと定義されている：ＥＥ（％）＝ＬＦ／ＴＦ＊１００％。
【００６５】
【表５】
2021522163.tif 000006
【００６６】
２種類のリポソームＴＫＩ製剤のＩＶＲプロファイルを、図３に示す。リポソーム製剤は、総薬物含有量の相当なパーセンテージを保持し、２４時間にわたって遅い薬物放出を示した。ＰＥＧを有するリポソームは、最初の４時間でＳＬＦ中にほとんどニンテダニブが放出されず、それらの総薬物含有量の３０％までしか２４時間にわたってＳＬＦ中に放出されなかったことから、非常に安定であった。これらのＩＶＲ結果は、本発明者らのリポソーム製剤が肺環境においてｉｎ  ｖｉｖｏで徐放を達成できることを示している。
【００６７】
実施例６
健康な動物におけるリポソームＴＫＩの肺保持の延長および薬物毒性の低下
マウス肺における遊離型対リポソームＴＫＩ製剤の滞留時間を比較するため、健常マウスにおけるリポソームＴＫＩの肺保持研究を実施した。研究には４種類の組成物を用いた：
１）ブランク（生理食塩水）；
２）遊離ニンテダニブ（９．４％（ｗ／ｖ）スクロース溶液に溶解した薬物）；
３）３００ｍＭのＡ．Ｓ．リポソーム性ニンテダニブ（０．４５ｍｏｌ％のＰＥＧ）；および
４）３００ｍＭのＡ．Ｓ．リポソーム性ニンテダニブ（１．７５ｍｏｌ％のＰＥＧ）
組成＃２〜４の薬物濃度は同じであり、ニンテダニブ約３．７４ｍｇ／ｍＬであった。
【００６８】
保持研究のためのプロトコルは、以下のとおりであった：
１．７週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスをイソフルランで麻酔する；
２．微小散布器（ＨＲＨ−ＭＡＧ４）を用いて、麻酔したマウスに５０μＬの組成物を気管内（ＩＴ）投与する；
３．所定の時点（例えば２、６、および２４時間）でマウスを麻酔し、絶命させる；
４．同じ所定の時点（例えば２、６、および２４時間）で、肺組織試料を採取して、薬物を測定する；
５．肺組織中のニンテダニブを以下によって分析する：
ａ）各肺組織試料を６，０００ｒｐｍで２回（２回の試行／サイクル）、メタノール１ｍＬで均質化する；
ｂ）各試料を２０，０００ｇで１０分間４℃で遠心分離する；
ｃ）それぞれの上澄液０．５ｍＬを５ｍＬのメスフラスコに移し、メタノールで体積とする；
ｄ）ＵＶ−Ｖｉｓプレートリーダーを用いて最終希釈試料の３８０ｎｍにおける吸光度を測定して、試料の薬物濃度を求める。
【００６９】
肺保持研究の結果を、図４に示す。気管内に投与した遊離ニンテダニブ（水溶液に溶解した遊離薬物）については、２時間のみの後にほとんどいずれの薬物も肺に保持されなかった。このように、ほとんどすべての薬物は、当該短時間内に肺から吸収され、除去された。対照的に、リポソーム性ニンテダニブ（０．４５ｍｏｌ％または１．７５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む）を投与した動物は、ＩＴ投与の６時間後に全薬物用量の約半分を肺に保持した。さらに、全用量の１６％〜３０％超が、２４時間後も肺に依然として観察された。したがって、リポソーム性ニンテダニブの滞留時間は、遊離型薬物よりもはるかに長かった。さらに、リポソーム性薬物製剤は、１日１回またはさらに低頻度の投薬に適していると思われる。遊離型薬物と比較して、リポソーム性ニンテダニブは、２４時間にわたって肺で最大約２０倍多量のニンテダニブを保持した。
【００７０】
肺保持研究中、ブランク溶液またはリポソーム性ニンテダニブのいずれかを投与したマウスでは死亡は観察されなかった（表６）。しかし、リポソーム型と同じ３．７４ｍｇ／ｍＬの薬物濃度で遊離ニンテダニブ（水溶液として）を投与したマウスも、同様に経過しなかった。遊離ニンテダニブを投与した９匹のマウスのうち２匹が死亡し、７匹の生存マウスは有意な衰弱を示した（表６）。これらの結果から、ニンテダニブのリポソーム形態は、ニンテダニブの遊離形態よりも安全性が高く、毒性が低いことが実証される。これらの結果はまた、依然として安全性を維持しながら有効性を増強し、持続放出を延長するために、３．７４ｍｇ／ｍＬを超えるリポソーム性薬物形態でニンテダニブ用量を増加させることが可能であろうことを示している。
【００７１】
【表６】
2021522163.tif 000007
【００７２】
実施例７
ＩＰＦ動物モデルにおけるＴＫＩの肺保持
実施例６の肺保持研究を拡大するために、マウス肺組織におけるニンテダニブの保持も、ＩＰＦモデルにおいて検査された。研究設計の詳細を、表７に示す。簡潔に言うと、２１匹のマウスを、２つの群（２つの異なるニンテダニブ組成物）に分け、群＃１では９匹のマウス、群＃２では１２匹のマウスを用いた。
【００７３】
各々のニンテダニブ組成の記述を、以下に示す：
群＃１：ＡＳ−Ｎｉｎ  ３．７４ｍｇ／ｍＬ−ＰＥＧ３％は、３ｍｏｌ％のＰＥＧを含む３００ｍＭのＡ．Ｓ．リポソームに負荷したニンテダニブを表し、脂質濃度は１５ｍＭ、ニンテダニブ濃度は３．７４ｍｇ／ｍＬであった；
群＃２：遊離ニンテダニブは、ニンテダニブ柔軟カプセル１５０ｍｇを表した（遊離ニンテダニブ溶液は、ゴマ油に柔軟カプセル内容物を溶解することによって毎日調製して、投薬のための７．６ｍｇ／ｍＬのニンテダニブ濃度を得；経口投与のための容量は、２００μＬ／マウスであった。）
【００７４】
まず、肺線維症を、各マウスへの２．５ｍｇ／ｋｇのブレオマイシンのＩＴ点滴により誘発した。７日後、２５μＬのリポソーム性ニンテダニブ（群＃１）を気管内に点滴するか、またはＩＰＦ処置用の２つのＦＤＡ承認薬物の１つである経口ニンテダニブ（群＃２）を、線維症のマウスに経口投与した。投与計画は、表７に示す。Ｑ２Ｄｘ２は、１日おきに合計２用量投与された１用量を意味する。血液および肺組織試料を、所定の時点で採取した（表７）。
【００７５】
【表７】
2021522163.tif 000008
【００７６】
ＩＰＦ動物モデル研究からの肺保持結果を、図５に示す。マウス肺組織中のニンテダニブの量を測定し、最長５日間モニタリングした。ニンテダニブ６０ｍｇ／ｋｇを１日１回経口投薬したにもかかわらず、遊離ニンテダニブは、わずか数時間後に肺組織中にニンテダニブが検出されなかったため、マウス肺における薬物保持はあったとしても極めてわずかであった。対照的に、隔日投与した４．６８ｍｇ／ｋｇのリポソーム性ニンテダニブのＩＴ用量は、マウス肺組織において４８時間まで持続的な薬物放出をもたらした。さらに、３００ｍＭのＡ．Ｓ．リポソーム性ニンテダニブ配合物（薬剤約０．０６ｍｇ／肺組織ｇ）の点滴投与の１２％超が、４８時間後に肺組織中に依然として認められた。これらの結果は、本発明者らのリポソーム性薬物製剤が、有意に低い用量で、罹患したマウスの肺におけるニンテダニブの延長された保持において経口薬物よりも大幅に優れており、吸入されたリポソーム性ニンテダニブの低頻度投与が可能であることを例証している。
【００７７】
実施例８
ＩＰＦ動物モデルにおける吸入されたリポソーム性ニンテダニブの有効性
マウスのブレオマイシン誘発性肺線維症の処置におけるリポソームおよび経口ニンテダニブの有効性を、検査した。研究設計の詳細を、表８に示す。簡潔に言うと、８匹のマウスを、３つの群に分けた（２種類の異なるニンテダニブ組成および投与経路各々についてＮ＝３、無処置対照についてＮ＝２）。
【００７８】
各々のニンテダニブ組成の記述を、以下に示す：
群＃１：ＡＳ−Ｎｉｎ  ３．７４ｍｇ／ｍＬ−ＰＥＧ３％は、３ｍｏｌ％のＰＥＧを含む３００ｍＭのＡ．Ｓ．リポソームに負荷したニンテダニブを表し、脂質濃度は１５ｍＭ、ニンテダニブ濃度は３．７４ｍｇ／ｍＬであった；
群＃２：遊離ニンテダニブは、ニンテダニブ柔軟カプセル１５０ｍｇを表した（遊離ニンテダニブ溶液は、ゴマ油に柔軟カプセル内容物を溶解することによって毎日調製して、投薬のための７．６ｍｇ／ｍＬのニンテダニブ濃度を得；経口投与のための容量は、２００μＬ／マウスであった。）
【００７９】
まず、肺線維症を、０日目に２．５ｍｇ／ｋｇのブレオマイシンのＩＴ点滴により誘発した。７日後、２５μＬのリポソーム性ニンテダニブ（群＃１、Ｎ＝３）を気管内に点滴するか、または遊離ニンテダニブ（群＃２、Ｎ＝３）を、無処置対照（群＃３、Ｎ＝２）と比較した治療効果の評価のために、線維症のマウスに経口投与した。ニンテダニブ組成物の投与計画は、表８に示す。Ｑ２Ｄｘ４は、７、９、１５および１７日目に１日おきに投与された１用量を意味する。ＱＤｘ１０は、マウスに７、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、および１８日目に１日１回の投薬を施与したことを意味する。血液および肺組織試料を、２１日目に採取した。
【００８０】
【表８】
2021522163.tif 000009
【００８１】
有効性は、マウス肺組織の病理組織学的評価により判定された。表９は、群＃１〜３による線維症マウスの処置後の組織病理学的結果を示す。リポソームまたは遊離ニンテダニブ（線維症スコア約２）のいずれかでの処置後に、肺が軽度の慢性、細気管支肺胞炎症ならびに軽度の間質性および胸膜下線維症を示したことから、肺線維症の減少が群＃３と比較して群＃１および群＃２の両方で観察された。実施例７は、リポソーム性ニンテダニブのＩＴ投与が、より長期間、より高い濃度の薬物を肺組織中にもたらすことを実証するので、本発明者らのデータは、リポソーム性ニンテダニブの気管内点滴が、ＩＰＦの処置のために経口投与されるニンテダニブの必要な用量および頻度を大幅に減少させ得ることを示している。
【００８２】
【表９】
2021522163.tif 000010
【００８３】
引用した参考文献
米国特許文献
８，０７１，１２７  Ｂ２    １２／２０１１    Ｃｉｐｏｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．
８，１１９，１５６  Ｂ２    ２／２０１２      Ｃｉｐｏｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．
８，２２６，９７５  Ｂ２    ７／２０１２      Ｗｅｅｒｓ
８，６５２，５１２  Ｂ２    ２／２０１４      Ｓｃｈｍｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ．
８，８０２，１３７  Ｂ２    ８／２０１４      Ｂｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．
９，０７８，８９７  Ｂ１    ７／２０１５      Ｃｉｐｏｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．
９，３３３，２１４  Ｂ２    ５／２０１６      Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．
９，４０８，８３６  Ｂ２    ８／２０１６      Ａｒｍｅｎｄａｒｉｚ  Ｂｏｒｕｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．
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【００８４】
海外の特許文献
ＥＰ  ０２２３８３１    ７／１９９２
ＥＰ  ０２６７０５０    ９／１９９４
ＥＰ  １４３８９５５    ６／２００６
ＥＰ  １５３０４６６    １２／２０１４
ＥＰ  １６５８８５１    ５／２００６
ＥＰ  ２０７９４４３    ８／２０１４
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ＥＰ  ２３８４７５１    ９／２０１５
ＷＯ  ＷＯ  ２０１５／１０６１５０  １１／２０１６
ＷＯ  ＷＯ  ２０１６／１７８０６４  １１／２０１６
【００８５】
他の刊行物
Ｋ．Ｄ．Ｋｉｓｔｌｅｒ，Ｌ．Ｎａｌｙｓｎｙｋ，Ｐ．Ｒｏｔｅｌｌａ，Ｄ．Ｅｓｓｅｒ．Ｌｕｎｇ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．ＢＭＣ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１４：１３９（２０１４）．
Ｌ．Ｎａｌｙｓｎｙｋ，Ｊ．Ｃｉｄ−Ｒｕｚａｆａ，Ｐ．Ｒｏｔｅｌｌａ，Ｄ．Ｅｓｓｅｒ．Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｖ．２１（１２６）：３５５−３６１（２０１２）．
Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ，Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｏｆｅｖ：ＥＰＡＲ  −  Ｐｕｂｌｉｃ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔ，ＥＭＡ／７６７７７／２０１５，Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  Ｎｏ．ＥＭＥＡ／Ｈ／Ｃ／００３８２１／００００，２０１４年１１月２０日
Ｌ．Ｒｉｃｈｅｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ  ｉｎ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７０（２２）：２０７１−２０８２（２０１４）．
Ｔ．Ｃｏｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ，ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ  ｉｎ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１１６（２０１５）．
Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗ，ＮＤＡ  ＃２０５８３２，５０５（ｂ）（１）ｐｒｉｏｒｉｔｙ  ｒｅｖｉｅｗ．
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｘｌｉｓｔ．ｃｏｍ／ｏｆｅｖ−ｓｉｄｅ−ｅｆｆｅｃｔｓ−ｄｒｕｇ−ｃｅｎｔｅｒ．ｈｔｍ
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｘｌｉｓｔ．ｃｏｍ／ｅｓｂｒｉｅｔ−ｄｒｕｇ．ｈｔｍ
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｈｅａｌｔｈａｎｄｌｉｆｅ．ｃｏｍ．ｔｗ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ａｃｔｉｏｎ＝ｐｒｏｄｕｃｔｓ＿ｄａｔａ＆ｉｄ＝１４２＆ｗｉｄｔｈ＝１２８０
Ｌ．Ｗｏｌｌｉｎ，Ｅ．Ｗｅｘ，Ａ．Ｐａｕｔｓｃｈ，Ｇ．Ｓｃｈｎａｐｐ，Ｋ．Ｅ．Ｈｏｓｔｅｔｔｌｅｒ，Ｓ．Ｓｔｏｗａｓｓｅｒ，Ｍ．Ｋｏｌｂ．Ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ．１−１２（２０１５）．
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【図１】
2021522163.tif 000011
【図２】
2021522163.tif 000012
【図３】
2021522163.tif 000013
【図４】
2021522163.tif 000014
【図５】
2021522163.tif 000015
【国際調査報告】
2021522163.tif 000016
2021522163.tif 000017
2021522163.tif 000018