(57)【要約】生物医学工学の技術分野に関し、抗心不全薬の製造におけるＲｙＲ２タンパク質又はＲｙＲ２組換えタンパク質の用途を提供し、ＲｙＲ２組換えタンパク質は、天然に存在するＲｙＲ２タンパク質断片又は変異体であり、たとえば、天然ＲｙＲ２タンパク質のＳＰＲＹ１ドメインタンパク質、Ｐ１ドメインタンパク質、ＳＰＲＹ２ドメインタンパク質、ＳＰＲＹ３ドメインタンパク質、Ｈａｎｄｌｅドメインタンパク質、ＨＤ１ドメインタンパク質、ＨＤ２ドメインタンパク質、中央ドメインタンパク質、ＥＦ−ｈａｎｄドメインタンパク質、Ｕ−モチーフタンパク質、Ｐ２ドメインタンパク質、Ｐ２ドメイン断片タンパク質１、Ｐ２ドメイン断片タンパク質２又はＲｙＲ２タンパク質Ｐ２変異体であってもよく、外因性ＲｙＲ２組換えタンパク質は、正常小動物モデル及び小動物疾患モデルのいずれにおいても高い発現レベルを示し、それにより、実験動物の左室駆出率は、程度が異なるが、対照群と比べて向上し、また、疾患モデル動物では、程度が異なるが、βアドレナリンでトリガーされる心室性頻脈性不整脈を減少することができ、程度が異なるが、各処理群の心機能には回復が認められる。【選択図】図２
2021525281.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗心不全薬の製造における、ＲｙＲ２タンパク質又はＲｙＲ２組換えタンパク質の用途。
【請求項２】
ＲｙＲ２組換えタンパク質は、１５個以上の連続するアミノ酸残基の長さを有する、天然
に存在するＲｙＲ２タンパク質断片又は変異体である、ことを特徴とする抗心不全薬の製
造における請求項１に記載のＲｙＲ２タンパク質又はＲｙＲ２組換えタンパク質の用途。
【請求項３】
前記ＲｙＲ２タンパク質断片は、天然ＲｙＲ２タンパク質のＳＰＲＹ１ドメインタンパク
質、Ｐ１ドメインタンパク質、ＳＰＲＹ２ドメインタンパク質、ＳＰＲＹ３ドメインタン
パク質、Ｈａｎｄｌｅドメインタンパク質、ＨＤ１ドメインタンパク質、ＨＤ２ドメイン
タンパク質、中央ドメインタンパク質、ＥＦ−ｈａｎｄドメインタンパク質、Ｕ−モチー
フタンパク質、Ｐ２ドメインタンパク質、Ｐ２ドメイン断片タンパク質１又はＰ２ドメイ
ン断片タンパク質２であり、
ＲｙＲ２タンパク質変異体はＲｙＲ２タンパク質Ｐ２変異体であり、
前記ＳＰＲＹ１ドメインタンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示され
るアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有し、前記Ｐ１ドメインタンパク質のアミ
ノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性
を有し、前記ＳＰＲＹ２ドメインタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に
示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有し、前記ＳＰＲＹ３ドメインタン
パク質のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に示されるアミノ酸配列と少なくとも６
０％の同一性を有し、前記Ｈａｎｄｌｅドメインタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ．９に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有し、前記ＨＤ１ド
メインタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１に示されるアミノ酸配列と
少なくとも６０％の同一性を有し、前記ＨＤ２ドメインタンパク質のアミノ酸配列はＳＥ
Ｑ  ＩＤ  ＮＯ．１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有し、前記
中央ドメインタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５に示されるアミノ酸
配列と少なくとも６０％の同一性を有し、前記ＥＦ−ｈａｎｄドメインタンパク質のアミ
ノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一
性を有し、前記Ｕ−モチーフタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９に示
されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有し、前記Ｐ２ドメインタンパク質の
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の
同一性を有し、前記Ｐ２ドメイン断片タンパク質１のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ
．２３に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有し、前記Ｐ２ドメイン断
片タンパク質２のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５に示されるアミノ酸配列と少
なくとも６０％の同一性を有し、前記ＲｙＲ２タンパク質Ｐ２変異体のアミノ酸配列はＳ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２９に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する、
ことを特徴とする抗心不全薬の製造における請求項２に記載のＲｙＲ２タンパク質又はＲ
ｙＲ２組換えタンパク質の用途。
【請求項４】
前記ＳＰＲＹ１ドメインタンパク質をコードする遺伝子配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に
示される遺伝子配列と少なくとも６０％の同一性を有し、前記Ｐ１ドメインタンパク質を
コードする遺伝子配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示される遺伝子配列と少なくとも６０
％の同一性を有し、前記ＳＰＲＹ２ドメインタンパク質をコードする遺伝子配列はＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ．６に示される遺伝子配列と少なくとも６０％の同一性を有し、前記ＳＰＲ
Ｙ３ドメインタンパク質をコードする遺伝子配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８に示される遺
伝子配列と少なくとも６０％の同一性を有し、前記Ｈａｎｄｌｅドメインタンパク質をコ
ードする遺伝子配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０に示される遺伝子配列と少なくとも６０
％の同一性を有し、前記ＨＤ１ドメインタンパク質をコードする遺伝子配列はＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ．１２に示される遺伝子配列と少なくとも６０％の同一性を有し、前記ＨＤ２ド
メインタンパク質をコードする遺伝子配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４に示される遺伝子
配列と少なくとも６０％の同一性を有し、前記中央ドメインタンパク質をコードする遺伝
子配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示される遺伝子配列と少なくとも６０％の同一性を
有し、前記ＥＦ−ｈａｎｄドメインタンパク質をコードする遺伝子配列はＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ．１８に示される遺伝子配列と少なくとも６０％の同一性を有し、前記Ｕ−モチーフ
タンパク質をコードする遺伝子配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０に示される遺伝子配列と
少なくとも６０％の同一性を有し、前記Ｐ２ドメインタンパク質をコードする遺伝子配列
はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２に示される遺伝子配列と少なくとも６０％の同一性を有し、
前記Ｐ２ドメイン断片タンパク質１をコードする遺伝子配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４
に示される遺伝子配列と少なくとも６０％の同一性を有し、前記Ｐ２ドメイン断片タンパ
ク質２をコードする遺伝子配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２６に示される遺伝子配列と少な
くとも６０％の同一性を有し、前記ＲｙＲ２タンパク質Ｐ２変異体をコードする遺伝子配
列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３０に示される遺伝子配列と少なくとも６０％の同一性を有す
る、ことを特徴とする抗心不全薬の製造における、請求項３に記載のＲｙＲ２タンパク質
又はＲｙＲ２組換えタンパク質の用途。
【請求項５】
前記Ｐ２ドメインタンパク質、前記Ｐ２ドメイン断片タンパク質１又は前記Ｐ２ドメイン
断片タンパク質２は、すべて少なくともＰ２コアペプチドセグメントを含み、該Ｐ２コア
ペプチドセグメントのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２７に示されるアミノ酸配列
と少なくとも６０％の同一性を有し、該Ｐ２コアペプチドセグメントをコードする遺伝子
配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８に示される遺伝子配列と少なくとも６０％の同一性を有
し、
前記Ｐ２コアペプチドセグメントは、ＲｙＲ２Ｓ２８０８部位とＳ２８１４部位の一方又
は両方を含む、ことを特徴とする抗心不全薬の製造における、請求項３に記載のＲｙＲ２
タンパク質又はＲｙＲ２組換えタンパク質の用途。
【請求項６】
請求項４に記載のＲｙＲ２タンパク質又はＲｙＲ２組換えタンパク質をコードする遺伝子
の送達ベクターであって、
前記送達ベクターには心臓組織特異的プロモーターが設けられている、ことを特徴とする
遺伝子の送達ベクター。
【請求項７】
前記送達ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、又は
ウイルスベクターであり、前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随
伴ウイルスベクター、αウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベ
クター、ポックスウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、レトロウイルスベ
クター又はレンチウイルスベクターから選択され、
前記心臓組織特異的プロモーターは、心筋アクチンエンハンサ／伸長因子１プロモーター
、又はサイトメガロウイルスエンハンサ／ミオシン軽鎖２プロモーターから選択される、
ことを特徴とする請求項６に記載の送達ベクター。
【請求項８】
前記抗心不全薬は、ＲｙＲ２タンパク質の心臓組織の細胞内レベルを上昇させるか、又は
細胞におけるＲｙＲ２タンパク質の特定部位の化学修飾レベルを低下させる医薬品である
、ことを特徴とする抗心不全薬の製造における請求項１に記載のＲｙＲ２タンパク質又は
ＲｙＲ２組換えタンパク質の用途。
【請求項９】
前記ＲｙＲ２タンパク質の特定部位は、Ｓ２８０８とＳ２８１４の一方又は両方であり、
前記化学修飾は、リン酸化、ニトロ化、メチル化又はアセチル化である、ことを特徴とす
る抗心不全薬の製造における請求項１に記載のＲｙＲ２タンパク質又はＲｙＲ２組換えタ
ンパク質の用途。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載のＲｙＲ２タンパク質又はＲｙＲ２組換えタンパク質を含
有する抗心不全薬組成物であって、
医学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤をさらに含む、ことを特徴とする抗心不全薬
組成物。
【請求項１１】
請求項４に記載のＲｙＲ２タンパク質又はＲｙＲ２組換えタンパク質をコードする遺伝子
を含有する抗心不全薬組成物であって、
請求項６又は７に記載の送達ベクター及び医薬的に許容される担体をさらに含む、ことを
特徴とする抗心不全薬組成物。
【請求項１２】
心筋細胞におけるＲｙＲ２タンパク質濃度の向上方法であって、
ＲｙＲ２組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＲｙＲ２組換えタンパク質
を含む組換えベクターを投与することにより、心筋におけるＲｙＲ２タンパク質濃度を増
加させる、ことを特徴とする心筋細胞におけるＲｙＲ２タンパク質濃度の向上方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学工学の技術分野に関し、具体的には、心筋細胞の収縮力を増強するた
めのＩＩ型リアノジン受容体（Ｒｙａｎｏｄｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２、ＲｙＲ２）
組換えタンパク質、ＲｙＲ２組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、それ
を含むベクター及び医薬品、並びにそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全は大多数の心臓疾患の進行の終末段階であり、人間の発病率と死亡率の最も主要な
原因の１つであり、しかも全世界では、心不全の発病率は絶えず増加している。現在の薬
物治療は心不全の疾患症状と致死率を抑制するのに一定の役割を果たしているが、疾患の
進行を根本的に逆転することはできず、５０％の心不全患者は５年以内に死亡する。細胞
レベルでは、心不全は主に心筋細胞の収縮異常及びリズム異常を示す。
【０００３】
筋肉組織は骨格筋、心筋及び平滑筋組織に分けられ、脊椎動物の最大の器官であると考え
られる。骨格筋と心筋はともに横紋筋組織に属し、類似した生物学的調節作用を持ってい
る。たとえば、骨格筋細胞と心筋細胞の興奮-収縮結合プロセスは非常に類似している。
筋細胞の膜が脱分極し、活性化された電圧依存性Ｌ−型カルシウムチャネルが筋細胞の細
胞質（筋小胞体）へのカルシウムの流入を引き起こす。細胞質カルシウム濃度の上昇はさ
らにカルシウム誘導性カルシウム放出（ｃａｌｃｉｕｍ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｌｃｉｕ
ｍ  ｒｅｌｅａｓｅ、ＣＩＣＲ）メカニズムを介して、リアノジン受容体（ｒｙａｎｏｄ
ｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＲｙＲ）を活性化する。これにより、筋小胞体（ＳＲ）か
らカルシウムが放出され、細胞質カルシウム濃度がさらに急速に上昇する。カルシウムイ
オンは細胞質を介して拡散し、トロポニンＣなどのアクチン収縮タンパク質と結合し、筋
細胞の収縮を引き起こす。収縮後、主に筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰ酵素（ｓａｒ
ｃｏｐｌａｓｍｉｃ／ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃａｌｃｉｕｍ  
ＡＴＰａｓｅ、ＳＥＲＣＡ）の作用により、筋小胞体にカルシウムイオンを再取り込みさ
せ、最終的に細胞質中のカルシウムを除去する。これらの生物学的プロセスは骨格筋細胞
と心筋細胞では基本的に同じであるが、これらの生物学的プロセスに関与するわずかな違
いもある。たとえば、ＲｙＲ１タンパク質は骨格筋細胞における主要な筋小胞体カルシウ
ム放出チャネルであるが、ＲｙＲ２は心筋細胞において優位である。同様に、骨格筋の筋
小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰ酵素はＳＥＲＣＡ１ａであり、ＳＥＲＣＡ２ａは心筋細
胞に特異的なものである。
【０００４】
心筋細胞のカルシウム循環とカルシウム定常状態は複数の重要なタンパク質によって維持
され、カルシウム循環の乱れはさまざまな筋細胞の病理学的プロセス、たとえば心不全、
収縮性心室機能障害、不整脈、心不全、心原性ショック、心筋梗塞や心臓弁膜機能障害を
招くことがある。心筋細胞の筋小胞体上の２型リアノジン受容体（Ｒｙａｎｏｄｉｎｅ  
Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２、ＲｙＲ２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｑ９２７３６）は主要なカ
ルシウム放出チャンネルであり、ＲｙＲ２が放出するカルシウムイオンの数はカルシウム
過渡の程度を決定し、心筋細胞の収縮能力はカルシウム過渡の程度に依存する。心不全と
いう病理学的状態のプロセスにおいて、前期研究の結果から、心不全患者と疾患動物モデ
ルのいずれにもＲｙＲ２の特定部位の異常修飾、たとえばＲｙＲ２の２８０８位セリン残
基のリン酸化、２８１４位セリン残基のリン酸化などが観察された（Wehrens X H T,Lehn
art S E,Reiken S,et al.Ryanodine receptor/calcium release channel PKA phosphoryl
ation:a critical mediator of heart failure progression[J].Proceedings of the Nat
ional Academy of Sciences,2006,103(3):511-518；Respress J L,van Oort R J,Li N,et
al.Role of RyR2 phosphorylation at S2814 during heart failure progression[J].Ci
rculation research,2012:CIRCRESAHA.112.268094.）。一般には、ＲｙＲ２の特定部位の
異常修飾後に、タンパク質のコンフォメーションに一定の変化を引き起こし、チャンネル
スイッチタンパク質ＦＫＢＰ１２．６を解離させ、カルシウムイオンチャンネルの開放確
率を増加させ、毎回放出するカルシウムイオンの数を減少させ、カルシウム漏洩の病理学
的プロセスを増強すると考えられている。
【０００５】
そのため、生物医学手段を利用して心筋の病理学的プロセスにおけるＲｙＲ２異常修飾を
減少することは急務となっている科学的課題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記研究の背景に基づき、心筋細胞の収縮力を増強する新規なII型リアノジン
受容体(Ｒｙａｎｏｄｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２、ＲｙＲ２)組換えタンパク質、Ｒｙ
Ｒ２組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、それを含むベクター及び医薬
品、並びにそれらの用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様は、１５個以上の連続するアミノ酸残基の長さを有する、天然に存在
するＲｙＲ２タンパク質断片又は変異体である、ＲｙＲ２組換えタンパク質を提供する。
【０００８】
本発明のＲｙＲ２組換えタンパク質は、心筋細胞の収縮能及び／又はカルシウム循環を増
強する能力を示す陽性変力ペプチドである（Ｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）。
【０００９】
好ましい実施形態では、前記断片又は変異体は、心臓能力を増強することができ、この断
片又は変異体は、以下詳述する抗不整脈、抗アポトーシス、心臓の自発的カルシウムスパ
ークの頻度の減少、筋小胞体カルシウム漏洩の予防及び／又は減少のうちの１つ又は複数
の機能を示し、また、心不全に罹患した対象において血行動態を回復する機能を有する。
【００１０】
好ましくは、ＲｙＲ２組換えタンパク質は、天然ＲｙＲ２タンパク質のＳＰＲＹ１ドメイ
ンタンパク質、Ｐ１ドメインタンパク質、ＳＰＲＹ２ドメインタンパク質、ＳＰＲＹ３ド
メインタンパク質、Ｈａｎｄｌｅドメインタンパク質、ＨＤ１ドメインタンパク質、ＨＤ
２ドメインタンパク質、中央ドメインタンパク質、ＥＦ−ｈａｎｄドメインタンパク質、
Ｕ−モチーフタンパク質、Ｐ２ドメインタンパク質、Ｐ２ドメイン断片タンパク質１又は
Ｐ２ドメイン断片タンパク質２である。
【００１１】
本発明の第２の態様は、ＲｙＲ２組換えタンパク質、好ましくは、天然ＲｙＲ２タンパク
質のＳＰＲＹ１ドメインタンパク質、Ｐ１ドメインタンパク質、ＳＰＲＹ２ドメインタン
パク質、ＳＰＲＹ３ドメインタンパク質、Ｈａｎｄｌｅドメインタンパク質、ＨＤ１ドメ
インタンパク質、ＨＤ２ドメインタンパク質、中央ドメインタンパク質、ＥＦ−ｈａｎｄ
ドメインタンパク質、Ｕ−モチーフタンパク質、Ｐ２ドメインタンパク質、Ｐ２ドメイン
断片タンパク質１又はＰ２ドメイン断片タンパク質２をコードする遺伝子を提供する。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質又はＲｙＲ２組換えタンパク
質をコードするポリヌクレオチドを用いて心臓の生物学的機能を増強することができ、前
記心臓の生物学的機能は、抗不整脈、抗心筋細胞アポトーシス、心臓の自発的カルシウム
スパークの頻度の減少、筋小胞体カルシウム漏洩の予防及び／又は減少、及び心不全に罹
患した対象における血行動態機能の回復から選択される１つ又は複数の機能である。
【００１３】
したがって、ＲｙＲ２組換えタンパク質又はＲｙＲ２組換えタンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドは、心筋細胞に抗不整脈機能を達成させることに用いられ、このため、心筋
細胞及び心臓組織を不整脈、特に心臓突然死に関連する心室性不整脈などのカテコールア
ミンに起因する不整脈から保護することが好ましい。
【００１４】
さらに、ＲｙＲ２組換えタンパク質又はＲｙＲ２組換えタンパク質をコードするポリヌク
レオチドは、アドレナリン受容体（ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）によって
媒介される致死性心室頻拍やカテコールアミンによって媒介される致死性心室性頻脈性不
整脈から被験者を保護することができる。
【００１５】
さらに好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質又はＲｙＲ２組換えタンパク質
をコードするヌクレオチドは、心筋細胞におけるカルシウムスパークの頻度を低下させる
能力をさらに有する。
【００１６】
本発明の１つの好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質が天然ＲｙＲ２タンパ
ク質のＳＰＲＹ１ドメインタンパク質である場合、前記タンパク質のアミノ酸配列は、Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくと
も６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好まし
くは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも
９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の
同一性を有し、このタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ．２に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５
％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少
なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％
、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同一性
を有する。
【００１７】
本発明の１つの好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質が天然ＲｙＲ２タンパ
ク質のＰ１ドメインタンパク質である場合、前記タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  
ＩＤ  ＮＯ．３に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５
％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少
なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％
、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同一性
を有し、このタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４
に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好
ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくと
も８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さら
に好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有す
る。
【００１８】
本発明の１つの好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質が天然ＲｙＲ２タンパ
ク質のＳＰＲＹ２ドメインタンパク質である場合、前記タンパク質のアミノ酸配列は、Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくと
も６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好まし
くは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも
９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の
同一性を有し、このタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ．６に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５
％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少
なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％
、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同一性
を有する。
【００１９】
本発明の１つの好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質が天然ＲｙＲ２タンパ
ク質のＳＰＲＹ３ドメインタンパク質である場合、前記タンパク質のアミノ酸配列は、Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくと
も６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好まし
くは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも
９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の
同一性を有し、このタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ．８に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５
％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少
なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％
、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同一性
を有する。
【００２０】
本発明の１つの好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質が天然ＲｙＲ２タンパ
ク質のＨａｎｄｌｅドメインタンパク質である場合、前記タンパク質のアミノ酸配列は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なく
とも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ま
しくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくと
も９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして及び最も好ましくは少なくとも９
９％の同一性を有し、このタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ．１０に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なく
とも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ま
しくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくと
も９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％
の同一性を有する。
【００２１】
本発明の１つの好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質が天然ＲｙＲ２タンパ
ク質のＨＤ１ドメインタンパク質である場合、前記タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ．１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも
６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましく
は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９
０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同
一性を有し、このタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ
．１２に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５
％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少
なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％
、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同一性
を有する。
【００２２】
本発明の１つの好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質が天然ＲｙＲ２タンパ
ク質のＨＤ２ドメインタンパク質である場合、前記タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ．１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも
６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましく
は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９
０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同
一性を有し、このタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ
．１４に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５
％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少
なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％
、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同一性
を有する。
【００２３】
本発明の１つの好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質が天然ＲｙＲ２タンパ
ク質の中央ドメイン（Ｃｅｎｔｒａｌ  ｄｏｍａｉｎ）タンパク質である場合、前記タン
パク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５に示されるアミノ酸配列と少なくと
も６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは
少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％
、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も
好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、このタンパク質をコードするポリヌクレオ
チド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも６
０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少な
くとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さ
らに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ま
しくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質が天然ＲｙＲ２タンパク質の
ＥＦ−ｈａｎｄドメインタンパク質である場合、前記タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥ
Ｑ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくと
も６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好まし
くは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも
９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の
同一性を有し、このタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ．１８に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６
５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは
少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０
％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同一
性を有する。
【００２５】
本発明の１つの好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質が天然ＲｙＲ２タンパ
ク質のＵ−モチーフ（Ｕ−ｍｏｔｉｆ）タンパク質である場合、前記タンパク質のアミノ
酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ま
しくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５
％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好まし
くは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少な
くとも９９％の同一性を有し、このタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましく
は少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、
より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは
少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくと
も９９％の同一性を有する。
【００２６】
本発明の１つの好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質が天然ＲｙＲ２タンパ
ク質のＰ２ドメインタンパク質である場合、前記タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  
ＩＤ  ＮＯ．２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６
５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは
少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０
％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同一
性を有し、このタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．
２２に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％
、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少な
くとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、
さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を
有する。
【００２７】
本発明の１つの好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質が天然ＲｙＲ２タンパ
ク質のＰ２ドメイン断片タンパク質１である場合、前記タンパク質のアミノ酸配列は、Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なく
とも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ま
しくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくと
も９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％
の同一性を有し、このタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ．２４に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも
６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましく
は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９
０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同
一性を有する。
【００２８】
本発明の１つの好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質が天然ＲｙＲ２タンパ
ク質のＰ２ドメイン断片タンパク質２である場合、前記タンパク質のアミノ酸配列は、Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なく
とも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ま
しくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくと
も９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％
の同一性を有し、このタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ．２６に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも
６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましく
は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９
０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同
一性を有する。
【００２９】
なお、本発明の好ましい実施形態では、天然ＲｙＲ２タンパク質Ｐ２ドメイン由来の断片
タンパク質は、少なくともＰ２コアペプチドセグメントを含む必要があり、このコアペプ
チドセグメントのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２７に示されるアミノ酸配列と
少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好
ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくと
も８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そ
して最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、このタンパク質をコードするポリ
ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８に示されるポリヌクレオチド配列と少な
くとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好まし
くは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８
５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、そして
最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。好ましくは、コアペプチドセグメン
トは、ＲｙＲ２Ｓ２８０８部位及び／又はＳ２８１４部位を含んでいなければならない。
【００３０】
本発明の１つの好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質は、ＲｙＲ２タンパク
質Ｐ２変異体であり、前記タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２９に示
されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少な
くとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、よ
り好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは
少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、このタンパ
ク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３０に示されるポリヌ
クレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくと
も７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好
ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少な
くとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【００３１】
本発明の第３の態様は、ＲｙＲ２遺伝子と組換え、心筋細胞のゲノムに組み込まれ得るＲ
ｙＲ２遺伝子の送達ベクターを提供する。心臓組織におけるＲｙＲ２遺伝子の発現に対応
するために、送達ベクターに心臓組織特異的プロモーターが設けられている。
【００３２】
ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクターたとえばλバク
テリオファージ、糸状バクテリオファージベクター、ウイルスベクター、ウイルス様粒子
や細菌胞子などから選択される。ウイルスベクターが好ましく、このウイルスベクターは
、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、αウイルスベクタ
ー、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、水
疱性口内炎ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターから
選択される。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、たとえばＡＡＶ６及びＡＡＶ９が
最も好ましい。
【００３３】
ウイルスベクターの適用用量は、５×１０９-１×１０１５ｔｖｐ、より好ましくは１×
１０１１-１×１０１３ｔｖｐ、最も好ましくは１×１０１２ｔｖｐである。
【００３４】
ＲｙＲ２タンパク質の発現は、心臓組織特異的プロモーターによって制御され、つまり、
好ましいベクターはさらに心臓組織特異的プロモーターを含む。好ましくは、心臓組織特
異的プロモーターは、心筋アクチンエンハンサ／伸長因子１プロモーター（Ｃａｒｄｉａ
ｃ  Ａｃｔｉｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ／ＥｌｏｎｇａｔｉｏｎＦａｃｔｏｒ  １  ｐｒｏｍ
ｏｔｅｒ）、サイトメガロウイルスエンハンサ／ミオシン軽鎖２プロモーター（Ｃｙｔｏ
ｍｅｇｏｌｏ−ｖｉｒｕｓｅｎｈａｎｃｅｒ／Ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  
ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ  ２  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）などから選択されるが、これらに限定され
ない。
【００３５】
本発明の第４の態様は、ＲｙＲ２組換えタンパク質を含み、さらに医学的に許容される賦
形剤、担体又は希釈剤を含む形態と、ＲｙＲ２遺伝子を含み、さらに送達ベクター及び医
薬的に許容される担体を含む形態との２つの形態を含む抗心不全薬組成物を提供する。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質の細胞内レベルは、対象の心
臓組織の少なくとも３０％の細胞において上昇し、ＲｙＲ２タンパク質を発現させる心臓
細胞の具体的な数は、潜在的な疾患状態に依存する。ＲｙＲ２の細胞内レベルは、治療さ
れた心臓領域において上記のように上昇することが好ましい。
【００３７】
ＲｙＲ２タンパク質の細胞内レベルが対象の心臓組織の細胞内で上昇すると、細胞内Ｒｙ
Ｒ２タンパク質の特定部位の化学修飾レベルの低下がさらに仲介され得る。好ましくは、
修飾は、リン酸化、ニトロ化、メチル化、アセチル化などであってもよい。最も好ましく
は、部位がＳ２８０８及び／又はＳ２８１４であり、修飾がリン酸化である。
【００３８】
本発明の実施形態では、抗心不全薬組成物は、経口、静脈内、粘膜内、動脈内、筋肉内又
は冠動脈内で投与することができる。好ましくは静脈内投与である。
【００３９】
本発明のさらなる実施形態では、ＲｙＲ２タンパク質の細胞内レベルは、少なくとも７日
間、より好ましくは少なくとも１４日間、さらに好ましくは少なくとも２８日間上昇する
。この結果は、単回投与又は繰り返し投与の結果として得られることが好ましい。
【００４０】
本発明において、被験者対象は、健康であるか、心臓疾患に罹患しているか、又は心臓疾
患に罹患するリスクがある。心臓疾患の発症メカニズムとしては、心筋細胞中のカルシウ
ム循環の定常状態の破壊及び／又は心筋細胞収縮能障害が関連している。好ましい実施形
態では、心臓疾患は、虚血後収縮機能障害から選択され、好ましくは虚血後右室及び／又
は左室収縮機能障害、うっ血性心不全、好ましくは代償性及び／又は非代償性うっ血性心
不全、心原性ショック、感染性ショック、心筋梗塞、心筋症、心臓弁機能障害や心室疾患
などである。たとえば、急性又は慢性の右心室機能障害である。特に好ましい心臓疾患は
、原発性又は続発性心筋症である。原発性心筋症は、好ましくは、遺伝性心筋症、自発変
異に起因する心筋症から選択される。続発性心筋症は、好ましくは、動脈硬化に起因する
虚血性心筋症、感染又は中毒に起因する拡張性心筋症、肺動脈及び／又は動脈高血圧に起
因する高血圧性心臓疾患や心臓弁疾患から選択される。
【００４１】
本発明の第５の態様は、抗心不全薬の製造における、ＲｙＲ２タンパク質、ＲｙＲ２組換
えタンパク質、又はこれらのＲｙＲ２タンパク質、ＲｙＲ２組換えタンパク質をコードす
る遺伝子の用途を提供する。
【００４２】
好ましくは、この抗心不全薬は、心臓組織の細胞内におけるＲｙＲ２タンパク質のレベル
を上昇させるか、又は細胞におけるＲｙＲ２タンパク質の特定部位の化学修飾のレベルを
低下させる医薬品である。
【００４３】
好ましくは、ＲｙＲ２タンパク質の特定部位は、Ｓ２８０８とＳ２８１４の一方又は両方
であり、化学修飾は、リン酸化、ニトロ化、メチル化又はアセチル化である。
【００４４】
したがって、本発明の第６の態様は、ＲｙＲ２タンパク質、ＲｙＲ２組換えタンパク質、
又はこのＲｙＲ２タンパク質、ＲｙＲ２組換えタンパク質をコードする遺伝子のポリヌク
レオチドの、被験者の心臓機能を増強することによって心臓疾患を治療するという用途を
提供し、被験者は、心臓疾患に罹患しているか、又は心臓疾患に罹患するリスクがあり、
治療ウィンドウ内で対象の心筋細胞におけるＲｙＲ２タンパク質濃度を増加させることに
用いられる。
【００４５】
好ましくは、ＲｙＲ２組換えタンパク質又はＲｙＲ２組換えタンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドは、心臓疾患に罹患しているか又は発症するリスクのある対象の心臓収縮力
を増強することによって心臓疾患を治療し、治療ウィンドウ内で対象の心筋細胞における
ＲｙＲ２タンパク質濃度を増加させることに用いられる。
【００４６】
心臓機能は、心臓の筋肉機能、収縮能及び／又はカルシウム処理能を改善することにより
、筋肉収縮機能を高めることができる。好ましい実施形態では、心臓機能は、対照群と比
べて、少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３５
％、最も好ましくは少なくとも４５％、最も好ましくは少なくとも５０％増強される。
【００４７】
好ましくは、対照群は、健常者の筋肉機能、収縮能及び／又はカルシウム処理能、又は健
常者群の平均値とする。好ましい実施形態では、ＲｙＲ２組換えタンパク質又はＲｙＲ組
換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドにより心臓機能が増強され、ＲｙＲ２タン
パク質は、抗不整脈の可能性、抗アポトーシス能、カルシウムスパークの頻度減少能力、
筋小胞体カルシウム漏洩を予防及び／又は減少させる能力、及び好ましくは心不全に罹患
している対象において血行動態機能を回復させる能力から選択される１つ又は複数の機能
を示す。
【００４８】
本発明の第７の態様は、ＲｙＲ２組換えタンパク質又はＲｙＲ２組換えタンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを投与することにより、心筋細胞における
ＲｙＲ２タンパク質濃度を増加させる、心筋細胞におけるＲｙＲ２タンパク質濃度の向上
方法を提供する。
【発明の効果】
【００４９】
発明の有益な保障及び効果
本発明は、抗心不全薬の製造におけるＲｙＲ２タンパク質又はＲｙＲ２組換えタンパク質
の用途を提供し、このＲｙＲ２タンパク質は、天然ＲｙＲ２タンパク質断片又は変異体か
ら選択され、実験を通じて、外因性ＲｙＲ２組換えタンパク質は、正常小動物モデル及び
小動物疾患モデルのいずれにおいても高い発現レベルを有することを証明し、それにより
、実験動物の左室駆出率は、程度が異なるが、対照群と比べて向上し、また、程度が異な
るが、疾患モデル動物はβアドレナリンによりトリガーされる心室性頻脈性不整脈を減少
することができ、程度が異なるが、各処理群の心機能には回復が認められた。したがって
、本発明のＲｙＲ２組換えタンパク質は、心不全に対して有効な緩和及び治療作用を奏す
ることができ、心不全治療薬の製造に用いることができ、臨床応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ウイルスベクターの構築図である。
【図２】正常マウスの各処理群の外因性ＲｙＲ２組換えタンパク質の発現の状況である。
【図３】正常マウスの各処理群の左室駆出率の結果である。
【図４】疾患モデルマウスの各処理群の外因性ＲｙＲ２タンパク質の発現の状況である。
【図５】疾患モデルマウスの各処理群の左室駆出率の結果である。
【図６】疾患モデルマウスの各処理群のＣｒｐ／ＡＴＰ値の結果である。
【図７Ａ】疾患モデルマウスの各処理群のＲｙＲ２  ２８０８のリン酸化程度の結果である。
【図７Ｂ】疾患モデルマウスの各処理群のＲｙＲ２  ２８１４のリン酸化程度の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
以下の実施例、実験例は、本発明をさらに説明するものであり、本発明を限定するものと
理解すべきではない。実施例は、ベクター及びプラスミドを構築する方法、そのようなベ
クター及びプラスミドにタンパク質をコードする遺伝子を挿入する方法、又は宿主細胞に
プラスミドを導入する方法など、従来の方法の詳細な説明を含まない。このような方法は
、当業者に周知であり、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Clo
ning：A Laboratory Manual，2 ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Pressを含
む多くの刊行物に記載されている。
【００５２】
実施例１、正常小動物モデルの心臓機能に対するＲｙＲ２タンパク質の心筋特異的外因性
発現の影響
ＡＡＶ９によって仲介されたＲｙＲ２ｃＤＮＡ心筋遺伝子伝達による心機能増強効果を測
定するために、６月齢の正常Ｃ５７Ｂ／６マウスを用いて処理群と対照群に群分けした。
すべてのＲｙＲ２の組換えタンパク質の細胞内伝達はｐＡＡＶベクターを用い、検出の容
易されからＣ−末端にＦＬＡＧタグを付加していた。ウイルスベクターの構築図を図１に
示す。下記組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、図に示すようなベクター
組換えタンパク質領域であり、必要に応じて５’末端にＡＴＧ開始コドンを付加した。群
分けは具体的には以下のとおりである。
【００５３】
ＣＴＲＬ対照群は空ウイルス群であり、ｒＳＰＲＹ１群は組換えＳＰＲＹドメイン発現タ
ンパク質群であり、すなわち、図１に示すベクター組換えタンパク質領域のポリヌクレオ
チドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示されており、ｒＰ１群は組換えＰ１ドメイン発現タン
パク質群であり、すなわち、図１に示すベクター組換えタンパク質領域のポリヌクレオチ
ドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示されていおり、ｒＳＰＲＹ２群は組換えＳＰＲＹ２ドメ
イン発現タンパク質群であり、すなわち、図１に示すベクター組換えタンパク質領域のポ
リヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６に示されており、ｒＳＰＲＹ３群は組換えＳＰ
ＲＹ３ドメイン発現タンパク質群であり、すなわち、図１に示すベクター組換えタンパク
質領域のポリヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８に示されており、ｒＨａｎｄｌｅ群
は組換えＨａｎｄｌｅドメイン発現タンパク質群であり、すなわち、図１に示すベクター
組換えタンパク質領域のポリヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０に示されており、
ｒＨＤ１群は組換えＨＤ１ドメイン発現タンパク質群であり、すなわち、図１に示すベク
ター組換えタンパク質領域のポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤ  ＮＯ．１２に示されており
、ｒＨＤ２群は組換えＨＤ２ドメイン発現タンパク質群であり、すなわち、図１に示すベ
クター組換えタンパク質領域のポリヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４に示されて
おり、ｒＣｅｎｔｒａｌ  ｄｏｍａｉｎ群は組換え中央ドメイン発現タンパク質群であり
、すなわち、図１に示すベクター組換えタンパク質領域のポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤ
ＮＯ．１６に示されており、ｒＥＦ−ｈａｎｄ群はＥＦ−ｈａｎｄドメイン発現タンパ
ク質群であり、すなわち、図１に示すベクター組換えタンパク質領域のポリヌクレオチド
はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８に示されており、ｒＵ−ｍｏｔｉｆ群はＵドメイン発現タン
パク質群であり、すなわち、図１に示すベクター組換えタンパク質領域のポリヌクレオチ
ドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０に示されており、ｒＰ２群はＰ２ドメイン発現タンパク質
群であり、すなわち、図１に示すベクター組換えタンパク質領域のポリヌクレオチドはＳ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２に示されており、
ｒＰ２−ｐｅｐｔｉｄｅ−１群はＰ２ドメイン断片１発現群であり、すなわち、図１に示
すベクター組換えタンパク質領域のポリヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４に示さ
れており、ｒＰ２−ｐｅｐｔｉｄｅ−２群はＰ２ドメイン断片２発現群であり、すなわち
、図１に示すベクター組換えタンパク質領域のポリヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．
２６に示されており、ｒＰ２−Ｃｏｒｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ群はＰ２ドメインコア断片発現
群であり、すなわち、図１に示すベクター組換えタンパク質領域のポリヌクレオチドはＳ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８に示されており、ｒＰ２−ｍｕｔ群はＰ２ドメイン発現変異体群
であり、すなわち、図１に示すベクター組換えタンパク質領域のポリヌクレオチドはＳＥ
Ｑ  ＩＤ  ＮＯ．３０に示されている。
【００５４】
ウイルス心筋細胞感染とタンパク質発現の特異的検出の技術は、非特許文献Voelkers et 
al.Circ Res(2011)108:27-39を参照し、心エコー図を用いて心機能を評価する方法は、非
特許文献Most et al.JCI(2004)114:1550-1563を参照し、ウイルスベクターの構築及び心
筋特異的プロモーターの利用方法は、非特許文献Pleger et al.Science Translational M
edicine(2011)
2021525281.tif 000003
を参照し、ウイルス粒子の注射量は１×１０１２ｔｖｐ（ｔｏｔａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｐａ
ｒｔｉｃｌｅｓ；ｔｖｐ）である。心筋外因性ＲｙＲ２タンパク質の発現レベルは、ＥＬ
ＳＩＡ法又はＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法により検出された。
【００５５】
各群のマウスの心筋外因性ＲｙＲ２タンパク質の発現レベルは図２に示され、図２の結果
によると、対照群に比べて、各外因性ＲｙＲ２組換え遺伝子はマウス心筋組織中で比較的
に高いレベルで発現している。
【００５６】
各群のマウスの左室駆出率（ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｆ
ｒａｃｔｉｏｎ）は図３に示され、結果により、各処理群のマウスの左室駆出率は対照群
と比べても異なる程度の増加があることを示し、このことから、各外因性ＲｙＲ２組換え
タンパク質は心臓の血液ポンプ能力を高めることができ、心不全の予防に役立つことを示
した。
【００５７】
実施例２、小動物疾患モデルの心臓機能に対するＲｙＲ２タンパク質の心筋特異的外因性
発現の影響
さらに、疾患モデルにおいて、ＡＡＶ９によって仲介されたＲｙＲ２ｃＤＮＡ心筋遺伝子
伝達による心機能増強効果を以下のステップで評価した。
【００５８】
まず、６月齢のＣ５７Ｂ／６マウス心筋梗塞モデルを作成し、モデルの作成には、非特許
文献Brinks et al.Circ Res(2010)107:1140-1149を参照して左前冠動脈を一時的に閉塞さ
せ、その後、マウスを処理群と対照群に群分けし、検出の容易さからすべてのＲｙＲ２の
タンパク質のＣ−末端にＦＬＡＧタグを付加し、具体的な構築方法は実施例１と同様であ
った。ウイルス心筋細胞の感染技術、ウイルスベクターの構築と心筋特異性プロモーター
の利用方法は前記と同じであり、ウイルス粒子の注射量は１×１０１２ｔｖｐ（ｔｏｔａ
ｌ  ｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ｔｖｐ）である。心筋外因性ＲｙＲ２タンパク質
の発現レベルはＥＬＳＩＡ法又はＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法により検出された。
【００５９】
各群の疾患モデルマウスの心筋外因性ＲｙＲ２タンパク質の発現レベルは図４に示され、
図４の結果によると、対照群に比べて、各外因性ＲｙＲ２組換え遺伝子はマウスの心筋組
織中で高いレベルで発現している。
【００６０】
各群の疾患モデルマウスの左室駆出率（ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｅｊｅｃｔ
ｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）は図５に示され、結果により、各処理群のマウスの左室駆出
率は対照群と比べてそれぞれ異なる程度の増加があり、Ｐ２ドメイン断片１組換えタンパ
ク質の増加程度が最も大きく、その次はＰ２ドメイン組換えタンパク質であることを示し
、このことから、各外因性ＲｙＲ２組換えタンパク質は心臓の血液ポンプ能力を高めるこ
とができ、心不全を治療する効果が顕著であり、心機能の回復に役立つことを示した。
【００６１】
図６は各疾患モデル処理群のマウスＣＲＰ／ＡＴＰ比のレベルを示し、結果は各疾患モデ
ル処理群の心機能に異なる程度の回復があり、Ｐ２ドメイン組換えタンパク質処理群の回
復の程度が最も大きく、６７％増加し、図５の結果と対応することを示した。
【００６２】
図７は各疾患モデル処理群のマウスのＥＬＩＳＡによるＳ２８０８（Ａ）とＳ２８１４（
Ｂ）の測定を示している（アミノ酸コードは文献Shan J.et al,J Clin Invest.2010Dec；
120(12):4375-87)に記載）。
【００６３】
以上、本発明の好適な実施例について具体的に説明したが、、本発明は前記実施例に限定
されるものではなく、当業者であれば、本発明の精神に反しないことなく、様々な等価変
形や置換を行うことができ、これらの等価変形や置換はいずれも本願の特許請求の範囲で
限定される範囲に含まれる。
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110>  ▲ふぇん▼潮医薬科技（上海）有限公司
<120> 抗心不全薬の製造におけるRyR2タンパク質又はRyR2組換えタンパク質の用途
<130>  特許請求の範囲 明細書
<160>  30
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  189
<212>  PRT
<213>  SPRY1
<400>  1
Val Ser Ser Met Arg Pro Asn Ile Phe Leu Gly Val Ser Glu Gly Ser
1               5                   10                  15
Ala Gln Tyr Lys Lys Trp Tyr Tyr Glu Leu Met Val Asp His Thr Glu
20                  25                  30
Pro Phe Val Thr Ala Glu Ala Thr His Leu Arg Val Gly Trp Ala Ser
35                  40                  45
Thr Glu Gly Tyr Ser Pro Tyr Pro Gly Gly Gly Glu Glu Trp Gly Gly
50                  55                  60
Asn Gly Val Gly Asp Asp Leu Phe Ser Tyr Gly Phe Asp Gly Leu His
65                  70                  75                  80
Leu Trp Ser Gly Cys Ile Ala Arg Thr Val Ser Ser Pro Asn Gln His
85                  90                  95
Leu Leu Arg Thr Asp Asp Val Ile Ser Cys Cys Leu Asp Leu Ser Ala
100                 105                 110
Pro Ser Ile Ser Phe Arg Ile Asn Gly Gln Pro Val Gln Gly Met Phe
115                 120                 125
Glu Asn Phe Asn Ile Asp Gly Leu Phe Phe Pro Val Val Ser Phe Ser
130                 135                 140
Ala Gly Ile Lys Val Arg Phe Leu Leu Gly Gly Arg His Gly Glu Phe
145                 150                 155                 160
Lys Phe Leu Pro Pro Pro Gly Tyr Ala Pro Cys Tyr Glu Ala Val Leu
165                 170                 175
Pro Lys Glu Lys Leu Lys Val Glu His Ser Arg Glu Tyr
180                 185
<210>  2
<211>  567
<212>  DNA
<213>  SPRY1
<400>  2
gtgagcagca tgagacccaa catcttcctg ggcgtgagcg agggcagcgc ccagtacaag     60
aagtggtact acgagctgat ggtggaccac accgagccct tcgtgaccgc cgaggccacc    120
cacctgagag tgggctgggc cagcaccgag ggctacagcc cctaccccgg cggcggcgag    180
gagtggggcg gcaacggcgt gggcgacgac ctgttcagct acggcttcga cggcctgcac    240
ctgtggagcg gctgcatcgc cagaaccgtg agcagcccca accagcacct gctgagaacc    300
gacgacgtga tcagctgctg cctggacctg agcgccccca gcatcagctt cagaatcaac    360
ggccagcccg tgcagggcat gttcgagaac ttcaacatcg acggcctgtt cttccccgtg    420
gtgagcttca gcgccggcat caaggtgaga ttcctgctgg gcggcagaca cggcgagttc    480
aagttcctgc ccccccccgg ctacgccccc tgctacgagg ccgtgctgcc caaggagaag    540
ctgaaggtgg agcacagcag agagtac                                        567
<210>  3
<211>  205
<212>  PRT
<213>  P1
<400>  3
Phe Thr Pro Ile Pro Val Asp Thr Ser Gln Ile Val Leu Pro Pro His
1               5                   10                  15
Leu Glu Arg Ile Arg Glu Lys Leu Ala Glu Asn Ile His Glu Leu Trp
20                  25                  30
Val Met Asn Lys Ile Glu Leu Gly Trp Gln Tyr Gly Pro Val Arg Asp
35                  40                  45
Asp Asn Lys Arg Gln His Pro Cys Leu Val Glu Phe Ser Lys Leu Pro
50                  55                  60
Glu Gln Glu Arg Asn Tyr Asn Leu Gln Met Ser Leu Glu Thr Leu Lys
65                  70                  75                  80
Thr Leu Leu Ala Leu Gly Cys His Val Gly Ile Ser Asp Glu His Ala
85                  90                  95
Glu Asp Lys Val Lys Lys Met Lys Leu Pro Lys Asn Tyr Gln Leu Thr
100                 105                 110
Ser Gly Tyr Lys Pro Ala Pro Met Asp Leu Ser Phe Ile Lys Leu Thr
115                 120                 125
Pro Ser Gln Glu Ala Met Val Asp Lys Leu Ala Glu Asn Ala His Asn
130                 135                 140
Val Trp Ala Arg Asp Arg Ile Arg Gln Gly Trp Thr Tyr Gly Ile Gln
145                 150                 155                 160
Gln Asp Val Lys Asn Arg Arg Asn Pro Arg Leu Val Pro Tyr Thr Leu
165                 170                 175
Leu Asp Asp Arg Thr Lys Lys Ser Asn Lys Asp Ser Leu Arg Glu Ala
180                 185                 190
Val Arg Thr Leu Leu Gly Tyr Gly Tyr Asn Leu Glu Ala
195                 200                 205
<210>  4
<211>  615
<212>  DNA
<213>  P1
<400>  4
ttcaccccca tccccgtgga caccagccag atcgtgctgc ccccccacct ggagagaatc     60
agagagaagc tggccgagaa catccacgag ctgtgggtga tgaacaagat cgagctgggc    120
tggcagtacg gccccgtgag agacgacaac aagagacagc acccctgcct ggtggagttc    180
agcaagctgc ccgagcagga gagaaactac aacctgcaga tgagcctgga gaccctgaag    240
accctgctgg ccctgggctg ccacgtgggc atcagcgacg agcacgccga ggacaaggtg    300
aagaagatga agctgcccaa gaactaccag ctgaccagcg gctacaagcc cgcccccatg    360
gacctgagct tcatcaagct gacccccagc caggaggcca tggtggacaa gctggccgag    420
aacgcccaca acgtgtgggc cagagacaga atcagacagg gctggaccta cggcatccag    480
caggacgtga agaacagaag aaaccccaga ctggtgccct acaccctgct ggacgacaga    540
accaagaaga gcaacaagga cagcctgaga gaggccgtga gaaccctgct gggctacggc    600
tacaacctgg aggcc                                                     615
<210>  5
<211>  134
<212>  PRT
<213>  SPRY2
<400>  5
Arg Phe Arg Ile Phe Arg Ala Glu Lys Thr Tyr Ala Val Lys Ala Gly
1               5                   10                  15
Arg Trp Tyr Phe Glu Phe Glu Thr Val Thr Ala Gly Asp Met Arg Val
20                  25                  30
Gly Trp Ser Arg Pro Gly Cys Gln Pro Asp Gln Glu Leu Gly Ser Asp
35                  40                  45
Glu Arg Ala Phe Ala Phe Asp Gly Phe Lys Ala Gln Arg Trp His Gln
50                  55                  60
Gly Asn Glu His Tyr Gly Arg Ser Trp Gln Ala Gly Asp Val Val Gly
65                  70                  75                  80
Cys Met Val Asp Met Asn Glu His Thr Met Met Phe Thr Leu Asn Gly
85                  90                  95
Glu Ile Leu Leu Asp Asp Ser Gly Ser Glu Leu Ala Phe Lys Asp Phe
100                 105                 110
Asp Val Gly Asp Gly Phe Ile Pro Val Cys Ser Leu Gly Val Ala Gln
115                 120                 125
Val Gly Arg Met Asn Phe
130
<210>  6
<211>  402
<212>  DNA
<213>  SPRY2
<400>  6
agattcagaa tcttcagagc cgagaagacc tacgccgtga aggccggcag atggtacttc     60
gagttcgaga ccgtgaccgc cggcgacatg agagtgggct ggagcagacc cggctgccag    120
cccgaccagg agctgggcag cgacgagaga gccttcgcct tcgacggctt caaggcccag    180
agatggcacc agggcaacga gcactacggc agaagctggc aggccggcga cgtggtgggc    240
tgcatggtgg acatgaacga gcacaccatg atgttcaccc tgaacggcga gatcctgctg    300
gacgacagcg gcagcgagct ggccttcaag gacttcgacg tgggcgacgg cttcatcccc    360
gtgtgcagcc tgggcgtggc ccaggtgggc agaatgaact tc                       402
<210>  7
<211>  398
<212>  PRT
<213>  SPRY3
<400>  7
Asn Arg Asp Ile Thr Met Trp Leu Ser Lys Arg Leu Pro Gln Phe Leu
1               5                   10                  15
Gln Val Pro Ser Asn His Glu His Ile Glu Val Thr Arg Ile Asp Gly
20                  25                  30
Thr Ile Asp Ser Ser Pro Cys Leu Lys Val Thr Gln Lys Ser Phe Gly
35                  40                  45
Ser Gln Asn Ser Asn Thr Asp Ile Met Phe Tyr Arg Leu Ser Met Pro
50                  55                  60
Ile Glu Cys Ala Glu Val Phe Ser Lys Thr Val Ala Gly Gly Leu Pro
65                  70                  75                  80
Gly Ala Gly Leu Phe Gly Pro Lys Asn Asp Leu Glu Asp Tyr Asp Ala
85                  90                  95
Asp Ser Asp Phe Glu Val Leu Met Lys Thr Ala His Gly His Leu Val
100                 105                 110
Pro Asp Arg Val Asp Lys Asp Lys Glu Ala Thr Lys Pro Glu Phe Asn
115                 120                 125
Asn His Lys Asp Tyr Ala Gln Glu Lys Pro Ser Arg Leu Lys Gln Arg
130                 135                 140
Phe Leu Leu Arg Arg Thr Lys Pro Asp Tyr Ser Thr Ser His Ser Ala
145                 150                 155                 160
Arg Leu Thr Glu Asp Val Leu Ala Asp Asp Arg Asp Asp Tyr Asp Phe
165                 170                 175
Leu Met Gln Thr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Ser Val Arg Ile Phe Pro Gly
180                 185                 190
Gln Glu Pro Ala Asn Val Trp Val Gly Trp Ile Thr Ser Asp Phe His
195                 200                 205
Gln Tyr Asp Thr Gly Phe Asp Leu Asp Arg Val Arg Thr Val Thr Val
210                 215                 220
Thr Leu Gly Asp Glu Lys Gly Lys Val His Glu Ser Ile Lys Arg Ser
225                 230                 235                 240
Asn Cys Tyr Met Val Cys Ala Gly Glu Ser Met Ser Pro Gly Gln Gly
245                 250                 255
Arg Asn Asn Asn Gly Leu Glu Ile Gly Cys Val Val Asp Ala Ala Ser
260                 265                 270
Gly Leu Leu Thr Phe Ile Ala Asn Gly Lys Glu Leu Ser Thr Tyr Tyr
275                 280                 285
Gln Val Glu Pro Ser Thr Lys Leu Phe Pro Ala Val Phe Ala Gln Ala
290                 295                 300
Thr Ser Pro Asn Val Phe Gln Phe Glu Leu Gly Arg Ile Lys Asn Val
305                 310                 315                 320
Met Pro Leu Ser Ala Gly Leu Phe Lys Ser Glu His Lys Asn Pro Val
325                 330                 335
Pro Gln Cys Pro Pro Arg Leu His Val Gln Phe Leu Ser His Val Leu
340                 345                 350
Trp Ser Arg Met Pro Asn Gln Phe Leu Lys Val Asp Val Ser Arg Ile
355                 360                 365
Ser Glu Arg Gln Gly Trp Leu Val Gln Cys Leu Asp Pro Leu Gln Phe
370                 375                 380
Met Ser Leu His Ile Pro Glu Glu Asn Arg Ser Val Asp Ile
385                 390                 395
<210>  8
<211>  1194
<212>  DNA
<213>  SPRY3
<400>  8
aacagagaca tcaccatgtg gctgagcaag agactgcccc agttcctgca ggtgcccagc     60
aaccacgagc acatcgaggt gaccagaatc gacggcacca tcgacagcag cccctgcctg    120
aaggtgaccc agaagagctt cggcagccag aacagcaaca ccgacatcat gttctacaga    180
ctgagcatgc ccatcgagtg cgccgaggtg ttcagcaaga ccgtggccgg cggcctgccc    240
ggcgccggcc tgttcggccc caagaacgac ctggaggact acgacgccga cagcgacttc    300
gaggtgctga tgaagaccgc ccacggccac ctggtgcccg acagagtgga caaggacaag    360
gaggccacca agcccgagtt caacaaccac aaggactacg cccaggagaa gcccagcaga    420
ctgaagcaga gattcctgct gagaagaacc aagcccgact acagcaccag ccacagcgcc    480
agactgaccg aggacgtgct ggccgacgac agagacgact acgacttcct gatgcagacc    540
agcacctact actacagcgt gagaatcttc cccggccagg agcccgccaa cgtgtgggtg    600
ggctggatca ccagcgactt ccaccagtac gacaccggct tcgacctgga cagagtgaga    660
accgtgaccg tgaccctggg cgacgagaag ggcaaggtgc acgagagcat caagagaagc    720
aactgctaca tggtgtgcgc cggcgagagc atgagccccg gccagggcag aaacaacaac    780
ggcctggaga tcggctgcgt ggtggacgcc gccagcggcc tgctgacctt catcgccaac    840
ggcaaggagc tgagcaccta ctaccaggtg gagcccagca ccaagctgtt ccccgccgtg    900
ttcgcccagg ccaccagccc caacgtgttc cagttcgagc tgggcagaat caagaacgtg    960
atgcccctga gcgccggcct gttcaagagc gagcacaaga accccgtgcc ccagtgcccc   1020
cccagactgc acgtgcagtt cctgagccac gtgctgtgga gcagaatgcc caaccagttc   1080
ctgaaggtgg acgtgagcag aatcagcgag agacagggct ggctggtgca gtgcctggac   1140
cccctgcagt tcatgagcct gcacatcccc gaggagaaca gaagcgtgga catc         1194
<210>  9
<211>  458
<212>  PRT
<213>  HANDLE
<400>  9
Lys Phe His Tyr His Thr Leu Arg Leu Tyr Ser Ala Val Cys Ala Leu
1               5                   10                  15
Gly Asn His Arg Val Ala His Ala Leu Cys Ser His Val Asp Glu Pro
20                  25                  30
Gln Leu Leu Tyr Ala Ile Glu Asn Lys Tyr Met Pro Gly Leu Leu Arg
35                  40                  45
Ala Gly Tyr Tyr Asp Leu Leu Ile Asp Ile His Leu Ser Ser Tyr Ala
50                  55                  60
Thr Ala Arg Leu Met Met Asn Asn Glu Tyr Ile Val Pro Met Thr Glu
65                  70                  75                  80
Glu Thr Lys Ser Ile Thr Leu Phe Pro Asp Glu Asn Lys Lys His Gly
85                  90                  95
Leu Pro Gly Ile Gly Leu Ser Thr Ser Leu Arg Pro Arg Met Gln Phe
100                 105                 110
Ser Ser Pro Ser Phe Val Ser Ile Ser Asn Glu Cys Tyr Gln Tyr Ser
115                 120                 125
Pro Glu Phe Pro Leu Asp Ile Leu Lys Ser Lys Thr Ile Gln Met Leu
130                 135                 140
Thr Glu Ala Val Lys Glu Gly Ser Leu His Ala Arg Asp Pro Val Gly
145                 150                 155                 160
Gly Thr Thr Glu Phe Leu Phe Val Pro Leu Ile Lys Leu Phe Tyr Thr
165                 170                 175
Leu Leu Ile Met Gly Ile Phe His Asn Glu Asp Leu Lys His Ile Leu
180                 185                 190
Gln Leu Ile Glu Pro Ser Val Phe Lys Glu Ala Ala Thr Pro Glu Glu
195                 200                 205
Glu Ser Asp Thr Leu Glu Lys Glu Leu Ser Val Asp Asp Ala Lys Leu
210                 215                 220
Gln Gly Ala Gly Glu Glu Glu Ala Lys Gly Gly Lys Arg Pro Lys Glu
225                 230                 235                 240
Gly Leu Leu Gln Met Lys Leu Pro Glu Pro Val Lys Leu Gln Met Cys
245                 250                 255
Leu Leu Leu Gln Tyr Leu Cys Asp Cys Gln Val Arg His Arg Ile Glu
260                 265                 270
Ala Ile Val Ala Phe Ser Asp Asp Phe Val Ala Lys Leu Gln Asp Asn
275                 280                 285
Gln Arg Phe Arg Tyr Asn Glu Val Met Gln Ala Leu Asn Met Ser Ala
290                 295                 300
Ala Leu Thr Ala Arg Lys Thr Lys Glu Phe Arg Ser Pro Pro Gln Glu
305                 310                 315                 320
Gln Ile Asn Met Leu Leu Asn Phe Lys Asp Asp Lys Ser Glu Cys Pro
325                 330                 335
Cys Pro Glu Glu Ile Arg Asp Gln Leu Leu Asp Phe His Glu Asp Leu
340                 345                 350
Met Thr His Cys Gly Ile Glu Leu Asp Glu Asp Gly Ser Leu Asp Gly
355                 360                 365
Asn Ser Asp Leu Thr Ile Arg Gly Arg Leu Leu Ser Leu Val Glu Lys
370                 375                 380
Val Thr Tyr Leu Lys Lys Lys Gln Ala Glu Lys Pro Val Glu Ser Asp
385                 390                 395                 400
Ser Lys Lys Ser Ser Thr Leu Gln Gln Leu Ile Ser Glu Thr Met Val
405                 410                 415
Arg Trp Ala Gln Glu Ser Val Ile Glu Asp Pro Glu Leu Val Arg Ala
420                 425                 430
Met Phe Val Leu Leu His Arg Gln Tyr Asp Gly Ile Gly Gly Leu Val
435                 440                 445
Arg Ala Leu Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn
450                 455
<210>  10
<211>  1374
<212>  DNA
<213>  HANDLE
<400>  10
aagttccact accacaccct gagactgtac agcgccgtgt gcgccctggg caaccacaga     60
gtggcccacg ccctgtgcag ccacgtggac gagccccagc tgctgtacgc catcgagaac    120
aagtacatgc ccggcctgct gagagccggc tactacgacc tgctgatcga catccacctg    180
agcagctacg ccaccgccag actgatgatg aacaacgagt acatcgtgcc catgaccgag    240
gagaccaaga gcatcaccct gttccccgac gagaacaaga agcacggcct gcccggcatc    300
ggcctgagca ccagcctgag acccagaatg cagttcagca gccccagctt cgtgagcatc    360
agcaacgagt gctaccagta cagccccgag ttccccctgg acatcctgaa gagcaagacc    420
atccagatgc tgaccgaggc cgtgaaggag ggcagcctgc acgccagaga ccccgtgggc    480
ggcaccaccg agttcctgtt cgtgcccctg atcaagctgt tctacaccct gctgatcatg    540
ggcatcttcc acaacgagga cctgaagcac atcctgcagc tgatcgagcc cagcgtgttc    600
aaggaggccg ccacccccga ggaggagagc gacaccctgg agaaggagct gagcgtggac    660
gacgccaagc tgcagggcgc cggcgaggag gaggccaagg gcggcaagag acccaaggag    720
ggcctgctgc agatgaagct gcccgagccc gtgaagctgc agatgtgcct gctgctgcag    780
tacctgtgcg actgccaggt gagacacaga atcgaggcca tcgtggcctt cagcgacgac    840
ttcgtggcca agctgcagga caaccagaga ttcagataca acgaggtgat gcaggccctg    900
aacatgagcg ccgccctgac cgccagaaag accaaggagt tcagaagccc cccccaggag    960
cagatcaaca tgctgctgaa cttcaaggac gacaagagcg agtgcccctg ccccgaggag   1020
atcagagacc agctgctgga cttccacgag gacctgatga cccactgcgg catcgagctg   1080
gacgaggacg gcagcctgga cggcaacagc gacctgacca tcagaggcag actgctgagc   1140
ctggtggaga aggtgaccta cctgaagaag aagcaggccg agaagcccgt ggagagcgac   1200
agcaagaaga gcagcaccct gcagcagctg atcagcgaga ccatggtgag atgggcccag   1260
gagagcgtga tcgaggaccc cgagctggtg agagccatgt tcgtgctgct gcacagacag   1320
tacgacggca tcggcggcct ggtgagagcc ctgcccaaga cctacaccat caac         1374
<210>  11
<211>  569
<212>  PRT
<213>  HD1
<400>  11
Gly Val Ser Val Glu Asp Thr Ile Asn Leu Leu Ala Ser Leu Gly Gln
1               5                   10                  15
Ile Arg Ser Leu Leu Ser Val Arg Met Gly Lys Glu Glu Glu Lys Leu
20                  25                  30
Met Ile Arg Gly Leu Gly Asp Ile Met Asn Asn Lys Val Phe Tyr Gln
35                  40                  45
His Pro Asn Leu Met Arg Ala Leu Gly Met His Glu Thr Val Met Glu
50                  55                  60
Val Met Val Asn Val Leu Gly Gly Gly Glu Ser Lys Glu Ile Thr Phe
65                  70                  75                  80
Pro Lys Met Val Ala Asn Cys Cys Arg Phe Leu Cys Tyr Phe Cys Arg
85                  90                  95
Ile Ser Arg Gln Asn Gln Lys Ala Met Phe Asp His Leu Ser Tyr Leu
100                 105                 110
Leu Glu Asn Ser Ser Val Gly Leu Ala Ser Pro Ala Met Arg Gly Ser
115                 120                 125
Thr Pro Leu Asp Val Ala Ala Ala Ser Val Met Asp Asn Asn Glu Leu
130                 135                 140
Ala Leu Ala Leu Arg Glu Pro Asp Leu Glu Lys Val Val Arg Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Ala Gly Cys Gly Leu Gln Ser Cys Gln Met Leu Val Ser Lys Gly Tyr
165                 170                 175
Pro Asp Ile Gly Trp Asn Pro Val Glu Gly Glu Arg Tyr Leu Asp Phe
180                 185                 190
Leu Arg Phe Ala Val Phe Cys Asn Gly Glu Ser Val Glu Glu Asn Ala
195                 200                 205
Asn Val Val Val Arg Leu Leu Ile Arg Arg Pro Glu Cys Phe Gly Pro
210                 215                 220
Ala Leu Arg Gly Glu Gly Gly Asn Gly Leu Leu Ala Ala Met Glu Glu
225                 230                 235                 240
Ala Ile Lys Ile Ala Glu Asp Pro Ser Arg Asp Gly Pro Ser Pro Asn
245                 250                 255
Ser Gly Ser Ser Lys Thr Leu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Asp Asp Thr
260                 265                 270
Ile His Met Gly Asn Ala Ile Met Thr Phe Tyr Ser Ala Leu Ile Asp
275                 280                 285
Leu Leu Gly Arg Cys Ala Pro Glu Met His Leu Ile His Ala Gly Lys
290                 295                 300
Gly Glu Ala Ile Arg Ile Arg Ser Ile Leu Arg Ser Leu Ile Pro Leu
305                 310                 315                 320
Gly Asp Leu Val Gly Val Ile Ser Ile Ala Phe Gln Met Pro Thr Ile
325                 330                 335
Ala Lys Asp Gly Asn Val Val Glu Pro Asp Met Ser Ala Gly Phe Cys
340                 345                 350
Pro Asp His Lys Ala Ala Met Val Leu Phe Leu Asp Arg Val Tyr Gly
355                 360                 365
Ile Glu Val Gln Asp Phe Leu Leu His Leu Leu Glu Val Gly Phe Leu
370                 375                 380
Pro Asp Leu Arg Ala Ala Ala Ser Leu Asp Thr Ala Ala Leu Ser Ala
385                 390                 395                 400
Thr Asp Met Ala Leu Ala Leu Asn Arg Tyr Leu Cys Thr Ala Val Leu
405                 410                 415
Pro Leu Leu Thr Arg Cys Ala Pro Leu Phe Ala Gly Thr Glu His His
420                 425                 430
Ala Ser Leu Ile Asp Ser Leu Leu His Thr Val Tyr Arg Leu Ser Lys
435                 440                 445
Gly Cys Ser Leu Thr Lys Ala Gln Arg Asp Ser Ile Glu Val Cys Leu
450                 455                 460
Leu Ser Ile Cys Gly Gln Leu Arg Pro Ser Met Met Gln His Leu Leu
465                 470                 475                 480
Arg Arg Leu Val Phe Asp Val Pro Leu Leu Asn Glu His Ala Lys Met
485                 490                 495
Pro Leu Lys Leu Leu Thr Asn His Tyr Glu Arg Cys Trp Lys Tyr Tyr
500                 505                 510
Cys Leu Pro Gly Gly Trp Gly Asn Phe Gly Ala Ala Ser Glu Glu Glu
515                 520                 525
Leu His Leu Ser Arg Lys Leu Phe Trp Gly Ile Phe Asp Ala Leu Ser
530                 535                 540
Gln Lys Lys Tyr Glu Gln Glu Leu Phe Lys Leu Ala Leu Pro Cys Leu
545                 550                 555                 560
Ser Ala Val Ala Gly Ala Leu Pro Pro
565
<210>  12
<211>  1707
<212>  DNA
<213>  HD1
<400>  12
ggcgtgagcg tggaggacac catcaacctg ctggccagcc tgggccagat cagaagcctg     60
ctgagcgtga gaatgggcaa ggaggaggag aagctgatga tcagaggcct gggcgacatc    120
atgaacaaca aggtgttcta ccagcacccc aacctgatga gagccctggg catgcacgag    180
accgtgatgg aggtgatggt gaacgtgctg ggcggcggcg agagcaagga gatcaccttc    240
cccaagatgg tggccaactg ctgcagattc ctgtgctact tctgcagaat cagcagacag    300
aaccagaagg ccatgttcga ccacctgagc tacctgctgg agaacagcag cgtgggcctg    360
gccagccccg ccatgagagg cagcaccccc ctggacgtgg ccgccgccag cgtgatggac    420
aacaacgagc tggccctggc cctgagagag cccgacctgg agaaggtggt gagatacctg    480
gccggctgcg gcctgcagag ctgccagatg ctggtgagca agggctaccc cgacatcggc    540
tggaaccccg tggagggcga gagatacctg gacttcctga gattcgccgt gttctgcaac    600
ggcgagagcg tggaggagaa cgccaacgtg gtggtgagac tgctgatcag aagacccgag    660
tgcttcggcc ccgccctgag aggcgagggc ggcaacggcc tgctggccgc catggaggag    720
gccatcaaga tcgccgagga ccccagcaga gacggcccca gccccaacag cggcagcagc    780
aagaccctgg acaccgagga ggaggaggac gacaccatcc acatgggcaa cgccatcatg    840
accttctaca gcgccctgat cgacctgctg ggcagatgcg cccccgagat gcacctgatc    900
cacgccggca agggcgaggc catcagaatc agaagcatcc tgagaagcct gatccccctg    960
ggcgacctgg tgggcgtgat cagcatcgcc ttccagatgc ccaccatcgc caaggacggc   1020
aacgtggtgg agcccgacat gagcgccggc ttctgccccg accacaaggc cgccatggtg   1080
ctgttcctgg acagagtgta cggcatcgag gtgcaggact tcctgctgca cctgctggag   1140
gtgggcttcc tgcccgacct gagagccgcc gccagcctgg acaccgccgc cctgagcgcc   1200
accgacatgg ccctggccct gaacagatac ctgtgcaccg ccgtgctgcc cctgctgacc   1260
agatgcgccc ccctgttcgc cggcaccgag caccacgcca gcctgatcga cagcctgctg   1320
cacaccgtgt acagactgag caagggctgc agcctgacca aggcccagag agacagcatc   1380
gaggtgtgcc tgctgagcat ctgcggccag ctgagaccca gcatgatgca gcacctgctg   1440
agaagactgg tgttcgacgt gcccctgctg aacgagcacg ccaagatgcc cctgaagctg   1500
ctgaccaacc actacgagag atgctggaag tactactgcc tgcccggcgg ctggggcaac   1560
ttcggcgccg ccagcgagga ggagctgcac ctgagcagaa agctgttctg gggcatcttc   1620
gacgccctga gccagaagaa gtacgagcag gagctgttca agctggccct gccctgcctg   1680
agcgccgtgg ccggcgccct gcccccc                                       1707
<210>  13
<211>  547
<212>  PRT
<213>  HD2
<400>  13
Tyr Phe Leu Ser Ala Ala Ser Arg Pro Leu Cys Ser Gly Gly His Ala
1               5                   10                  15
Ser Asn Lys Glu Lys Glu Met Val Thr Ser Leu Phe Cys Lys Leu Gly
20                  25                  30
Val Leu Val Arg His Arg Ile Ser Leu Phe Gly Asn Asp Ala Thr Ser
35                  40                  45
Ile Val Asn Cys Leu His Ile Leu Gly Gln Thr Leu Asp Ala Arg Thr
50                  55                  60
Val Met Lys Thr Gly Leu Glu Ser Val Lys Ser Ala Leu Arg Ala Phe
65                  70                  75                  80
Leu Asp Asn Ala Ala Glu Asp Leu Glu Lys Thr Met Glu Asn Leu Lys
85                  90                  95
Gln Gly Gln Phe Thr His Thr Arg Asn Gln Pro Lys Gly Val Thr Gln
100                 105                 110
Ile Ile Asn Tyr Thr Thr Val Ala Leu Leu Pro Met Leu Ser Ser Leu
115                 120                 125
Phe Glu His Ile Gly Gln His Gln Phe Gly Glu Asp Leu Ile Leu Glu
130                 135                 140
Asp Val Gln Val Ser Cys Tyr Arg Ile Leu Thr Ser Leu Tyr Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gly Thr Ser Lys Ser Ile Tyr Val Glu Arg Gln Arg Ser Ala Leu Gly
165                 170                 175
Glu Cys Leu Ala Ala Phe Ala Gly Ala Phe Pro Val Ala Phe Leu Glu
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Thr His Leu Asp Lys His Asn Ile Tyr Ser Ile Tyr Asn Thr Lys Ser
195                 200                 205
Ser Arg Glu Arg Ala Ala Leu Ser Leu Pro Thr Asn Val Glu Asp Val
210                 215                 220
Cys Pro Asn Ile Pro Ser Leu Glu Lys Leu Met Glu Glu Ile Val Glu
225                 230                 235                 240
Leu Ala Glu Ser Gly Ile Arg Tyr Thr Gln Met Pro His Val Met Glu
245                 250                 255
Val Ile Leu Pro Met Leu Cys Ser Tyr Met Ser Arg Trp Trp Glu His
260                 265                 270
Gly Pro Glu Asn Asn Pro Glu Arg Ala Glu Met Cys Cys Thr Ala Leu
275                 280                 285
Asn Ser Glu His Met Asn Thr Leu Leu Gly Asn Ile Leu Lys Ile Ile
290                 295                 300
Tyr Asn Asn Leu Gly Ile Asp Glu Gly Ala Trp Met Lys Arg Leu Ala
305                 310                 315                 320
Val Phe Ser Gln Pro Ile Ile Asn Lys Val Lys Pro Gln Leu Leu Lys
325                 330                 335
Thr His Phe Leu Pro Leu Met Glu Lys Leu Lys Lys Lys Ala Ala Thr
340                 345                 350
Val Val Ser Glu Glu Asp His Leu Lys Ala Glu Ala Arg Gly Asp Met
355                 360                 365
Ser Glu Ala Glu Leu Leu Ile Leu Asp Glu Phe Thr Thr Leu Ala Arg
370                 375                 380
Asp Leu Tyr Ala Phe Tyr Pro Leu Leu Ile Arg Phe Val Asp Tyr Asn
385                 390                 395                 400
Arg Ala Lys Trp Leu Lys Glu Pro Asn Pro Glu Ala Glu Glu Leu Phe
405                 410                 415
Arg Met Val Ala Glu Val Phe Ile Tyr Trp Ser Lys Ser His Asn Phe
420                 425                 430
Lys Arg Glu Glu Gln Asn Phe Val Val Gln Asn Glu Ile Asn Asn Met
435                 440                 445
Ser Phe Leu Ile Thr Asp Thr Lys Ser Lys Met Ser Lys Ala Ala Val
450                 455                 460
Ser Asp Gln Glu Arg Lys Lys Met Lys Arg Lys Gly Asp Arg Tyr Ser
465                 470                 475                 480
Met Gln Thr Ser Leu Ile Val Ala Ala Leu Lys Arg Leu Leu Pro Ile
485                 490                 495
Gly Leu Asn Ile Cys Ala Pro Gly Asp Gln Glu Leu Ile Ala Leu Ala
500                 505                 510
Lys Asn Arg Phe Ser Leu Lys Asp Thr Glu Asp Glu Val Arg Asp Ile
515                 520                 525
Ile Arg Ser Asn Ile His Leu Gln Gly Lys Leu Glu Asp Pro Ala Ile
530                 535                 540
Arg Trp Gln
545
<210>  14
<211>  1656
<212>  DNA
<213>  HD2
<400>  14
agatacagac acgactactt cctgagcgcc gccagcagac ccctgtgcag cggcggccac     60
gccagcaaca aggagaagga gatggtgacc agcctgttct gcaagctggg cgtgctggtg    120
agacacagaa tcagcctgtt cggcaacgac gccaccagca tcgtgaactg cctgcacatc    180
ctgggccaga ccctggacgc cagaaccgtg atgaagaccg gcctggagag cgtgaagagc    240
gccctgagag ccttcctgga caacgccgcc gaggacctgg agaagaccat ggagaacctg    300
aagcagggcc agttcaccca caccagaaac cagcccaagg gcgtgaccca gatcatcaac    360
tacaccaccg tggccctgct gcccatgctg agcagcctgt tcgagcacat cggccagcac    420
cagttcggcg aggacctgat cctggaggac gtgcaggtga gctgctacag aatcctgacc    480
agcctgtacg ccctgggcac cagcaagagc atctacgtgg agagacagag aagcgccctg    540
ggcgagtgcc tggccgcctt cgccggcgcc ttccccgtgg ccttcctgga gacccacctg    600
gacaagcaca acatctacag catctacaac accaagagca gcagagagag agccgccctg    660
agcctgccca ccaacgtgga ggacgtgtgc cccaacatcc ccagcctgga gaagctgatg    720
gaggagatcg tggagctggc cgagagcggc atcagataca cccagatgcc ccacgtgatg    780
gaggtgatcc tgcccatgct gtgcagctac atgagcagat ggtgggagca cggccccgag    840
aacaaccccg agagagccga gatgtgctgc accgccctga acagcgagca catgaacacc    900
ctgctgggca acatcctgaa gatcatctac aacaacctgg gcatcgacga gggcgcctgg    960
atgaagagac tggccgtgtt cagccagccc atcatcaaca aggtgaagcc ccagctgctg   1020
aagacccact tcctgcccct gatggagaag ctgaagaaga aggccgccac cgtggtgagc   1080
gaggaggacc acctgaaggc cgaggccaga ggcgacatga gcgaggccga gctgctgatc   1140
ctggacgagt tcaccaccct ggccagagac ctgtacgcct tctaccccct gctgatcaga   1200
ttcgtggact acaacagagc caagtggctg aaggagccca accccgaggc cgaggagctg   1260
ttcagaatgg tggccgaggt gttcatctac tggagcaaga gccacaactt caagagagag   1320
gagcagaact tcgtggtgca gaacgagatc aacaacatga gcttcctgat caccgacacc   1380
aagagcaaga tgagcaaggc cgccgtgagc gaccaggaga gaaagaagat gaagagaaag   1440
ggcgacagat acagcatgca gaccagcctg atcgtggccg ccctgaagag actgctgccc   1500
atcggcctga acatctgcgc ccccggcgac caggagctga tcgccctggc caagaacaga   1560
ttcagcctga aggacaccga ggacgaggtg agagacatca tcagaagcaa catccacctg   1620
cagggcaagc tggaggaccc cgccatcaga tggcag                             1656
<210>  15
<211>  385
<212>  PRT
<213>  Central domain
<400>  15
Tyr Phe Glu Asp Lys Leu Ile Glu Asp Leu Ala Lys Pro Gly Ala Glu
1               5                   10                  15
Pro Pro Glu Glu Asp Glu Gly Thr Lys Arg Val Asp Pro Leu His Gln
20                  25                  30
Leu Ile Leu Leu Phe Ser Arg Thr Ala Leu Thr Glu Lys Cys Lys Leu
35                  40                  45
Glu Glu Asp Phe Leu Tyr Met Ala Tyr Ala Asp Ile Met Ala Lys Ser
50                  55                  60
Cys His Asp Glu Glu Asp Asp Asp Gly Glu Glu Glu Val Lys Ser Phe
65                  70                  75                  80
Glu Glu Lys Glu Met Glu Lys Gln Lys Leu Leu Tyr Gln Gln Ala Arg
85                  90                  95
Leu His Asp Arg Gly Ala Ala Glu Met Val Leu Gln Thr Ile Ser Ala
100                 105                 110
Ser Lys Gly Glu Thr Gly Pro Met Val Ala Ala Thr Leu Lys Leu Gly
115                 120                 125
Ile Ala Ile Leu Asn Gly Gly Asn Ser Thr Val Gln Gln Lys Met Leu
130                 135                 140
Asp Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Asp Val Gly Phe Phe Gln Ser Leu Ala
145                 150                 155                 160
Gly Leu Met Gln Ser Cys Ser Val Leu Asp Leu Asn Ala Phe Glu Arg
165                 170                 175
Gln Asn Lys Ala Glu Gly Leu Gly Met Val Thr Glu Glu Gly Ser Gly
180                 185                 190
Glu Lys Val Leu Gln Asp Asp Glu Phe Thr Cys Asp Leu Phe Arg Phe
195                 200                 205
Leu Gln Leu Leu Cys Glu Gly His Asn Ser Asp Phe Gln Asn Tyr Leu
210                 215                 220
Arg Thr Gln Thr Gly Asn Asn Thr Thr Val Asn Ile Ile Ile Ser Thr
225                 230                 235                 240
Val Asp Tyr Leu Leu Arg Val Gln Glu Ser Ile Ser Asp Phe Tyr Trp
245                 250                 255
Tyr Tyr Ser Gly Lys Asp Val Ile Asp Glu Gln Gly Gln Arg Asn Phe
260                 265                 270
Ser Lys Ala Ile Gln Val Ala Lys Gln Val Phe Asn Thr Leu Thr Glu
275                 280                 285
Tyr Ile Gln Gly Pro Cys Thr Gly Asn Gln Gln Ser Leu Ala His Ser
290                 295                 300
Arg Leu Trp Asp Ala Val Val Gly Phe Leu His Val Phe Ala His Met
305                 310                 315                 320
Gln Met Lys Leu Ser Gln Asp Ser Ser Gln Ile Glu Leu Leu Lys Glu
325                 330                 335
Leu Met Asp Leu Gln Lys Asp Met Val Val Met Leu Leu Ser Met Leu
340                 345                 350
Glu Gly Asn Val Val Asn Gly Thr Ile Gly Lys Gln Met Val Asp Met
355                 360                 365
Leu Val Glu Ser Ser Asn Asn Val Glu Met Ile Leu Lys Phe Phe Asp
370                 375                 380
Met
385
<210>  16
<211>  1155
<212>  DNA
<213>  Central domain
<400>  16
tacttcgagg acaagctgat cgaggacctg gccaagcccg gcgccgagcc ccccgaggag     60
gacgagggca ccaagagagt ggaccccctg caccagctga tcctgctgtt cagcagaacc    120
gccctgaccg agaagtgcaa gctggaggag gacttcctgt acatggccta cgccgacatc    180
atggccaaga gctgccacga cgaggaggac gacgacggcg aggaggaggt gaagagcttc    240
gaggagaagg agatggagaa gcagaagctg ctgtaccagc aggccagact gcacgacaga    300
ggcgccgccg agatggtgct gcagaccatc agcgccagca agggcgagac cggccccatg    360
gtggccgcca ccctgaagct gggcatcgcc atcctgaacg gcggcaacag caccgtgcag    420
cagaagatgc tggactacct gaaggagaag aaggacgtgg gcttcttcca gagcctggcc    480
ggcctgatgc agagctgcag cgtgctggac ctgaacgcct tcgagagaca gaacaaggcc    540
gagggcctgg gcatggtgac cgaggagggc agcggcgaga aggtgctgca ggacgacgag    600
ttcacctgcg acctgttcag attcctgcag ctgctgtgcg agggccacaa cagcgacttc    660
cagaactacc tgagaaccca gaccggcaac aacaccaccg tgaacatcat catcagcacc    720
gtggactacc tgctgagagt gcaggagagc atcagcgact tctactggta ctacagcggc    780
aaggacgtga tcgacgagca gggccagaga aacttcagca aggccatcca ggtggccaag    840
caggtgttca acaccctgac cgagtacatc cagggcccct gcaccggcaa ccagcagagc    900
ctggcccaca gcagactgtg ggacgccgtg gtgggcttcc tgcacgtgtt cgcccacatg    960
cagatgaagc tgagccagga cagcagccag atcgagctgc tgaaggagct gatggacctg   1020
cagaaggaca tggtggtgat gctgctgagc atgctggagg gcaacgtggt gaacggcacc   1080
atcggcaagc agatggtgga catgctggtg gagagcagca acaacgtgga gatgatcctg   1140
aagttcttcg acatg                                                    1155
<210>  17
<211>  61
<212>  PRT
<213>  EF-HAND
<400>  17
Leu Thr Ser Ser Asp Thr Phe Lys Glu Tyr Asp Pro Asp Gly Lys Gly
1               5                   10                  15
Val Ile Ser Lys Arg Asp Phe His Lys Ala Met Glu Ser His Lys His
20                  25                  30
Tyr Thr Gln Ser Glu Thr Glu Phe Leu Leu Ser Cys Ala Glu Thr Asp
35                  40                  45
Glu Asn Glu Thr Leu Asp Tyr Glu Glu Phe Val Lys Arg
50                  55                  60
<210>  18
<211>  183
<212>  DNA
<213>  EF-HAND
<400>  18
ctgaccagca gcgacacctt caaggagtac gaccccgacg gcaagggcgt gatcagcaag     60
agagacttcc acaaggccat ggagagccac aagcactaca cccagagcga gaccgagttc    120
ctgctgagct gcgccgagac cgacgagaac gagaccctgg actacgagga gttcgtgaag    180
aga                                                                  183
<210>  19
<211>  117
<212>  PRT
<213>  U-motif
<400>  19
Pro Ala Lys Asp Ile Gly Phe Asn Val Ala Val Leu Leu Thr Asn Leu
1               5                   10                  15
Ser Glu His Met Pro Asn Asp Thr Arg Leu Gln Thr Phe Leu Glu Leu
20                  25                  30
Ala Glu Ser Val Leu Asn Tyr Phe Gln Pro Phe Leu Gly Arg Ile Glu
35                  40                  45
Ile Met Gly Ser Ala Lys Arg Ile Glu Arg Val Tyr Phe Glu Ile Ser
50                  55                  60
Glu Ser Ser Arg Thr Gln Trp Glu Lys Pro Gln Val Lys Glu Ser Lys
65                  70                  75                  80
Arg Gln Phe Ile Phe Asp Val Val Asn Glu Gly Gly Glu Lys Glu Lys
85                  90                  95
Met Glu Leu Phe Val Asn Phe Cys Glu Asp Thr Ile Phe Glu Met Gln
100                 105                 110
Leu Ala Ala Gln Ile
115
<210>  20
<211>  351
<212>  DNA
<213>  U-motif
<400>  20
cccgccaagg acatcggctt caacgtggcc gtgctgctga ccaacctgag cgagcacatg     60
cccaacgaca ccagactgca gaccttcctg gagctggccg agagcgtgct gaactacttc    120
cagcccttcc tgggcagaat cgagatcatg ggcagcgcca agagaatcga gagagtgtac    180
ttcgagatca gcgagagcag cagaacccag tgggagaagc cccaggtgaa ggagagcaag    240
agacagttca tcttcgacgt ggtgaacgag ggcggcgaga aggagaagat ggagctgttc    300
gtgaacttct gcgaggacac catcttcgag atgcagctgg ccgcccagat c             351
<210>  21
<211>  207
<212>  PRT
<213>  P2
<400>  21
Asn Phe Asn Pro Gln Pro Val Asp Thr Ser Asn Ile Thr Ile Pro Glu
1               5                   10                  15
Lys Leu Glu Tyr Phe Ile Asn Lys Tyr Ala Glu His Ser His Asp Lys
20                  25                  30
Trp Ser Met Asp Lys Leu Ala Asn Gly Trp Ile Tyr Gly Glu Ile Tyr
35                  40                  45
Ser Asp Ser Ser Lys Val Gln Pro Leu Met Lys Pro Tyr Lys Leu Leu
50                  55                  60
Ser Glu Lys Glu Lys Glu Ile Tyr Arg Trp Pro Ile Lys Glu Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Thr Met Leu Ala Trp Gly Trp Arg Ile Glu Arg Thr Arg Glu Gly
85                  90                  95
Asp Ser Met Ala Leu Tyr Asn Arg Thr Arg Arg Ile Ser Gln Thr Ser
100                 105                 110
Gln Val Ser Val Asp Ala Ala His Gly Tyr Ser Pro Arg Ala Ile Asp
115                 120                 125
Met Ser Asn Val Thr Leu Ser Arg Asp Leu His Ala Met Ala Glu Met
130                 135                 140
Met Ala Glu Asn Tyr His Asn Ile Trp Ala Lys Lys Lys Lys Met Glu
145                 150                 155                 160
Leu Glu Ser Lys Gly Gly Gly Asn His Pro Leu Leu Val Pro Tyr Asp
165                 170                 175
Thr Leu Thr Ala Lys Glu Lys Ala Lys Asp Arg Glu Lys Ala Gln Asp
180                 185                 190
Ile Leu Lys Phe Leu Gln Ile Asn Gly Tyr Ala Val Ser Arg Gly
195                 200                 205
<210>  22
<211>  621
<212>  DNA
<213>  P2
<400>  22
aacttcaacc cccagcccgt ggacaccagc aacatcacca tccccgagaa gctggagtac     60
ttcatcaaca agtacgccga gcacagccac gacaagtgga gcatggacaa gctggccaac    120
ggctggatct acggcgagat ctacagcgac agcagcaagg tgcagcccct gatgaagccc    180
tacaagctgc tgagcgagaa ggagaaggag atctacagat ggcccatcaa ggagagcctg    240
aagaccatgc tggcctgggg ctggagaatc gagagaacca gagagggcga cagcatggcc    300
ctgtacaaca gaaccagaag aatcagccag accagccagg tgagcgtgga cgccgcccac    360
ggctacagcc ccagagccat cgacatgagc aacgtgaccc tgagcagaga cctgcacgcc    420
atggccgaga tgatggccga gaactaccac aacatctggg ccaagaagaa gaagatggag    480
ctggagagca agggcggcgg caaccacccc ctgctggtgc cctacgacac cctgaccgcc    540
aaggagaagg ccaaggacag agagaaggcc caggacatcc tgaagttcct gcagatcaac    600
ggctacgccg tgagcagagg c                                              621
<210>  23
<211>  156
<212>  PRT
<213>  P2-peptide-1
<400>  23
Gln Pro Val Asp Thr Ser Asn Ile Thr Ile Pro Glu Lys Leu Glu Tyr
1               5                   10                  15
Phe Ile Asn Lys Tyr Ala Glu His Ser His Asp Lys Trp Ser Met Asp
20                  25                  30
Lys Leu Ala Asn Gly Trp Ile Tyr Gly Glu Ile Tyr Ser Asp Ser Ser
35                  40                  45
Lys Val Gln Pro Leu Met Lys Pro Tyr Lys Leu Leu Ser Glu Lys Glu
50                  55                  60
Lys Glu Ile Tyr Arg Trp Pro Ile Lys Glu Ser Leu Lys Thr Met Leu
65                  70                  75                  80
Ala Trp Gly Trp Arg Ile Glu Arg Thr Arg Glu Gly Asp Ser Met Ala
85                  90                  95
Leu Tyr Asn Arg Thr Arg Arg Ile Ser Gln Thr Ser Gln Val Ser Val
100                 105                 110
Asp Ala Ala His Gly Tyr Ser Pro Arg Ala Ile Asp Met Ser Asn Val
115                 120                 125
Thr Leu Ser Arg Asp Leu His Ala Met Ala Glu Met Met Ala Glu Asn
130                 135                 140
Tyr His Asn Ile Trp Ala Lys Lys Lys Lys Met Glu
145                 150                 155
<210>  24
<211>  468
<212>  DNA
<213>  P2-peptide-1
<400>  24
cagcccgtgg acaccagcaa catcaccatc cccgagaagc tggagtactt catcaacaag     60
tacgccgagc acagccacga caagtggagc atggacaagc tggccaacgg ctggatctac    120
ggcgagatct acagcgacag cagcaaggtg cagcccctga tgaagcccta caagctgctg    180
agcgagaagg agaaggagat ctacagatgg cccatcaagg agagcctgaa gaccatgctg    240
gcctggggct ggagaatcga gagaaccaga gagggcgaca gcatggccct gtacaacaga    300
accagaagaa tcagccagac cagccaggtg agcgtggacg ccgcccacgg ctacagcccc    360
agagccatcg acatgagcaa cgtgaccctg agcagagacc tgcacgccat ggccgagatg    420
atggccgaga actaccacaa catctgggcc aagaagaaga agatggag                 468
<210>  25
<211>  69
<212>  PRT
<213>  P2-peptide-2
<400>  25
Ile Tyr Arg Trp Pro Ile Lys Glu Ser Leu Lys Thr Met Leu Ala Trp
1               5                   10                  15
Gly Trp Arg Ile Glu Arg Thr Arg Glu Gly Asp Ser Met Ala Leu Tyr
20                  25                  30
Asn Arg Thr Arg Arg Ile Ser Gln Thr Ser Gln Val Ser Val Asp Ala
35                  40                  45
Ala His Gly Tyr Ser Pro Arg Ala Ile Asp Met Ser Asn Val Thr Leu
50                  55                  60
Ser Arg Asp Leu His
65
<210>  26
<211>  207
<212>  DNA
<213>  P2-peptide-2
<400>  26
atctacagat ggcccatcaa ggagagcctg aagaccatgc tggcctgggg ctggagaatc     60
gagagaacca gagagggcga cagcatggcc ctgtacaaca gaaccagaag aatcagccag    120
accagccagg tgagcgtgga cgccgcccac ggctacagcc ccagagccat cgacatgagc    180
aacgtgaccc tgagcagaga cctgcac                                        207
<210>  27
<211>  17
<212>  PRT
<213>  P2-Core-peptide
<400>  27
Thr Arg Arg Ile Ser Gln Thr Ser Gln Val Ser Val Asp Ala Ala His
1               5                   10                  15
Gly
<210>  28
<211>  51
<212>  DNA
<213>  P2-Core-peptide
<400>  28
accagaagaa tcagccagac cagccaggtg agcgtggacg ccgcccacgg c              51
<210>  29
<211>  206
<212>  PRT
<213>  P2-mut
<400>  29
Asn Phe Asn Pro Gln Pro Val Asp Thr Ser Asn Ile Thr Ile Pro Glu
1               5                   10                  15
Lys Leu Glu Tyr Phe Ile Asn Lys Tyr Ala Glu His Ser His Asp Lys
20                  25                  30
Trp Ser Met Asp Lys Leu Ala Asn Gly Trp Ile Tyr Gly Glu Ile Tyr
35                  40                  45
Ser Asp Ser Ser Lys Ile Gln Pro Leu Met Lys Pro Tyr Lys Leu Leu
50                  55                  60
Ser Glu Lys Glu Lys Glu Ile Tyr Arg Trp Pro Ile Lys Glu Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Thr Met Leu Ala Trp Gly Trp Arg Ile Glu Arg Thr Arg Glu Gly
85                  90                  95
Asp Ser Met Ala Leu Tyr Asn Arg Thr Arg Arg Ile Ser Gln Thr Ser
100                 105                 110
Gln Val Ser Ile Asp Ala Ala His Gly Tyr Ser Pro Arg Ala Ile Asp
115                 120                 125
Met Ser Asn Val Thr Leu Ser Arg Asp Leu His Ala Met Ala Glu Met
130                 135                 140
Met Ala Glu Asn Tyr His Asn Ile Trp Ala Lys Lys Lys Lys Leu Glu
145                 150                 155                 160
Leu Glu Ser Lys Gly Gly Gly Asn His Pro Leu Leu Val Pro Tyr Asp
165                 170                 175
Thr Leu Thr Ala Lys Glu Lys Ala Lys Asp Arg Glu Lys Ala Gln Asp
180                 185                 190
Ile Leu Lys Phe Leu Gln Ile Asn Gly Tyr Ala Val Ser Arg
195                 200                 205
<210>  30
<211>  618
<212>  DNA
<213>  P2-mut
<400>  30
aacttcaacc cccagcccgt ggacaccagc aacatcacca tccccgagaa gctggagtac       60
ttcatcaaca agtacgccga gcacagccac gacaagtgga gcatggacaa gctggccaac      120
ggctggatct acggcgagat ctacagcgac agcagcaaga tccagcccct gatgaagccc      180
tacaagctgc tgagcgagaa ggagaaggag atctacagat ggcccatcaa ggagagcctg      240
aagaccatgc tggcctgggg ctggagaatc gagagaacca gagagggcga cagcatggcc      300
ctgtacaaca gaaccagaag aatcagccag accagccagg tgagcatcga cgccgcccac      360
ggctacagcc ccagagccat cgacatgagc aacgtgaccc tgagcagaga cctgcacgcc      420
atggccgaga tgatggccga gaactaccac aacatctggg ccaagaagaa gaagctggag      480
ctggagagca agggcggcgg caaccacccc ctgctggtgc cctacgacac cctgaccgcc      540
aaggagaagg ccaaggacag agagaaggcc caggacatcc tgaagttcct gcagatcaac      600
ggctacgccg tgagcaga                                                    618
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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