(57)【要約】  本発明は、架橋生体高分子ベースのヒドロゲルを動的濾過して、ゲルから不要な分子を除去する方法に関する。特に、本発明は、回転式および半透性のフィルターディスクを有する動的濾過構成を使用するヒアルロン酸ヒドロゲルの動的濾過に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋生体高分子ベースのヒドロゲルの動的濾過の方法であって、
ａ）半透性フィルターディスク（複数可）を備えた動的濾過装置に、架橋生体高分子ベースのヒドロゲルを移して、前記ゲルを透析濾過するステップであって、
ｉ）２０  １／分〜５００  １／分の範囲内の回転速度および０．５〜６バールの範囲内の過圧を適用することによって前記ゲルを所定の濃度まで濃縮するか、または前記動的濾過装置の処理チャンバに前記ゲルを直接ポンプで送るステップと、
ｉｉ）２０  １／分〜５００  １／分の範囲内の回転速度と、０．５〜６バールの範囲内の過圧を適用することによって不要な分子を減らすために透析濾過を行うステップと、を含む、透析濾過するステップと、
ｂ）任意選択で、非架橋ポリマー、特に非架橋ヒアルロン酸および水を含む混合物を前記ゲルに加えるステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記生体高分子ベースのヒドロゲルが、ヒアルロン酸、ヘパロサン、アルギネート、ペクチン、ジェランガム、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、セルロース、キトサン、カラギーナン、キサンタン、またはそれらの塩もしくは誘導体、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリマーから作られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒドロゲルが化学架橋剤によって架橋され、前記ヒドロゲルが余剰の前記化学架橋剤を含み、余剰の前記化学架橋剤および／または他の不要な分子が除去される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記半透性フィルターディスク（複数可）が、５ｎｍ〜２μｍの孔径、より詳細には３０ｎｍ〜６００ｎｍの孔径、より詳細には８０ｎｍ〜３００ｎｍの孔径、特に５ｎｍ〜６０ｎｍの孔径を呈する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記動的濾過装置が１〜１０枚の半透性フィルターディスク（複数可）を備える、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記半透性フィルターディスク（複数可）がセラミック、金属、またはポリマー材料で作られる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒドロゲルがＢＤＤＥによって架橋され、前記ヒドロゲルが余剰のＢＤＤＥを含み、余剰のＢＤＤＥおよび／または他の不要な分子が除去される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記生体高分子ベースのヒドロゲルがヒアルロン酸で作られており、ステップｉｉ）における前記透析濾過が、２０  １／分〜５００  １／分の範囲内の回転速度、および０．５〜３バールの範囲内の圧力を適用することによって実施され、ステップｉｉ）における前記透析濾過が、１０〜７０ｍｇ／ｇの範囲の前記ヒドロゲルの濃度で行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
透析濾過中または透析濾過後に麻酔剤が前記ゲルに添加される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
透析濾過中または透析濾過後にリドカインが前記ゲルに添加される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｉｉ）における前記透析濾過および任意選択の前記濃縮ステップｉ）が、６０℃〜７０℃の範囲の温度で、２〜４時間の期間実施される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ゲルが、約２〜３０分の保持時間、１２１℃〜１３５℃で前記装置内で滅菌される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、１０時間未満、特に５時間未満で行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のうちの一項に記載の方法によって得られる架橋生体高分子ベースのヒドロゲル。
【請求項１５】
審美的用途、特に軟組織増強のための、請求項１４に記載のヒドロゲルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋生体高分子ベースのヒドロゲルを動的濾過して、ゲルから不要な分子を除去する方法に関する。特に、本発明は、回転式および半透性のフィルターディスクを備えた動的濾過構造を使用するヒアルロン酸ヒドロゲルの動的濾過に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は体に自然なポリマーであり、整形外科や眼科などの医学のさまざまな分野で用いられている。今日、ヒアルロン酸は美容医学や形成外科でますます使用されている。ヒアルロン酸の用途が幅広いのは、特に水の結合能力が非常に高いためである。水性媒体中では、低濃度のヒアルロン酸であっても、粘弾性ゲルが形成され、これは生分解性であり、有利な特性を有する。
【０００３】
純粋なヒアルロン酸は、人体内で比較的速く分解される。このため、ヒアルロン酸分子は互いに化学的に架橋していることが多く、それによって分解が大幅に減少し、約６〜１２ヶ月の期間は望ましい効果が維持される。したがって、架橋ヒアルロン酸ゲルは、とりわけ、しわの治療、上唇および下唇の輪郭づけおよび量の増加、頬および顎の輪郭の改善、ならびに鼻の矯正などのために美容医学で頻繁に使用される。
【０００４】
既知のヒアルロン酸ゲルは、大まかに２つの異なるタイプ、すなわち単相ゲルと二相ゲルに分類することができる。単相ヒアルロン酸ゲルは単相で構成され、非粒子状である。そのような単相ゲルの調製は、例えば、ＷＯ２００８／０６８２９７、ＵＳ８，４５０，４７５、ＵＳ８，４５５，４６５、ＵＳ７，７４１，４７６、およびＵＳ８，０５２，９９０に開示されている。知られている市販の単相ヒアルロン酸ゲルは、例えば、Ｊｕｖｅｄｅｒｍ（登録商標）、Ｔｅｏｓｙａｌ（登録商標）、Ｇｌｙｔｏｎｅ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（登録商標）、ならびにＢｅｌｏｔｅｒｏ（登録商標）、Ｅｓｔｈｅｌｉｓ（登録商標）、Ｆｏｒｔｅｌｉｓ（登録商標）Ｅｘｔｒａ、およびＭｏｄｅｌｉｓ（登録商標）Ｓｈａｐｅとして知られる単相二重架橋ヒアルロン酸ゲルである。
【０００５】
二相ヒアルロン酸ゲルは、液相に分散している架橋ヒアルロン酸材料を含む。そのようなゲルは粒子状であり、例えば、ＥＰ０４６６３００に記載されているように作ることができる。市販の二相ゲルは、例えば、Ｈｙｌａｆｏｒｍ（登録商標）、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）、およびＰｅｒｌａｎｅ（登録商標）である。
【０００６】
架橋ヒアルロン酸ゲルの作製は、多段階プロセスによって行われ、ＷＯ２００５／０８５３２９により詳細に記載されている。
【０００７】
ヒアルロン酸などの多糖に基づくゲルを作製する方法は、ＷＯ２０１４／０６４６３３、ＵＳ２０１３／２１０７６０、ＵＳ２０１３／２０３６９６、ＷＯ２０１０／１１５０８１、ＷＯ２０１２／０６２７７５、ＷＯ２０１３／１８５９３４、ＷＯ２００９／０７７３９９、およびＷＯ２００８／０３４１７６にさらに開示されている。
【０００８】
ヒアルロン酸ゲルを透析するための従来の方法は、しばしば比較的長い手作業時間と労力を必要とする。これは、品質と再現性が低下し、製造時間とコストが増加するため、これまでのところ不利である。さらに、微生物汚染のリスクは、透析ステップの処理時間とともに増加する。
【０００９】
多くの場合、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）が、ヒアルロン酸ヒドロゲルの架橋剤として使用されている。しかしながら、ＢＤＤＥは有毒であることがあり、不要な分子が少ないヒドロゲルを製造する必要がある。
【００１０】
発明の目的
本発明は、架橋生体高分子ベースのヒドロゲルの製造中に生成される不要な分子を除去するための改善された方法を提供するという目的に基づいている。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、不要な分子を除去する半透性フィルターディスク（複数可）を備えた動的濾過装置を使用して、架橋生体高分子ベースのヒドロゲルを動的濾過する方法に関し、ｉ）２０  １／分〜５００  １／分の範囲内の回転速度、および０．５〜６バールの範囲内の過圧を適用することによって、所定の濃度までゲルを濃縮するか、または動的濾過装置の処理チャンバ内へゲルを直接ポンプ注入するステップと、ｉｉ）２０  １／分〜５００  １／分の範囲内の回転速度と、０．５〜６バールの範囲内の過圧を適用することによって、不要な分子を減らすために透析濾過を行うステップと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に従って処理されたゲル（「ＤＣＦゲル」；貯蔵弾性率（Ｇ’）２００Ｐａ）と標準的な方法に従って処理されたゲル（「標準ゲル」；貯蔵弾性率（Ｇ’）２１６Ｐａ）との間の周波数掃引比較。  １（点線）＝ＤＣＦゲル：Ｇ’  ２（実線）：標準ゲル：Ｇ’  ３（点線）＝ＤＣＦゲル：Ｇ’’  ４（実線）：標準ゲル：Ｇ’’  ５（点線）＝ＤＣＦゲル：複素粘度  ６（実線）＝標準ゲル：複素粘度
【図２】本発明に従って処理されたゲル（「ＤＣＦゲル」；貯蔵弾性率（Ｇ’）２４１Ｐａ）と標準的な方法に従って処理されたゲル（「標準ゲル」）；貯蔵弾性率（Ｇ’）２４９Ｐａ）との間の振幅掃引比較。クロスオーバーポイント＝フローポイント  １（点線）＝ＤＣＦゲル：Ｇ’  ２（実線）：標準ゲル：Ｇ’  ３（点線）＝ＤＣＦゲル：Ｇ’’  ４（実線）：標準ゲル：Ｇ’’
【図３】：  １：ＤＣＦゲル：Ｇ’  ２：ＤＣＦゲルＧ’’  ３：ＤＣＦゲル：複素粘度
【図４】実施例３／試行４によるゲルの周波数掃引  三角▲の実線：損失弾性率Ｇ’’  四角■の実線：貯蔵弾性率Ｇ’  円●の実線：複素粘度［η＊］
【図５】実施例３／試行４によるゲルの振幅掃引  三角▲の実線：損失弾性率Ｇ’’  四角■の実線：貯蔵弾性率Ｇ’  クロスオーバーポイントＧ’’＝Ｇ’：剪断応力４４０Ｐａ；貯蔵弾性率５４Ｐａ
【図６】実施例３／試行５によるゲルの周波数掃引  三角▲の実線：損失弾性率Ｇ’’  四角■の実線：貯蔵弾性率Ｇ’  円●の実線：複素粘度［η＊］
【図７】実施例３／試行５によるゲルの振幅掃引  三角▲の実線：損失弾性率Ｇ’’  四角■の実線：貯蔵弾性率Ｇ’  クロスオーバーポイントＧ’’＝Ｇ’：剪断応力３５０Ｐａ；貯蔵弾性率９８Ｐａ
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、本発明の以下の詳細な説明およびそこに含まれる実施例を参照することにより、より容易に理解することができる。
【００１４】
本明細書で使用される「動的濾過装置」という用語は、中空シャフト上で可動に配置された板またはディスクの形状の中空フィルター要素を使用する手段を指す。要素の相対運動により、濾過される媒体に乱流が発生し、それによってフィルター要素の表面が清掃される。このようなフィルター装置は、例えば、ＷＯ００／４７３１２に記載されている。回転式フィルター要素により、オーバーフロー速度を膜間圧（ＴＭＰ）から分離することができる。動的濾過モジュールの遠心力と剪断力の組み合わせにより、カバー層の蓄積の制御が改善される。この技術を使用することにより、目詰まり層の形成が減少する。さらに、相対運動により、濾過機内の保持液の混合が保証される。このような動的濾過装置は、さまざまな企業、例えば、Ａｎｄｒｉｔｚ  ＡＧ（本社Ｇｒａｚ  Ａｕｓｔｒｉａ）から入手できる。動的濾過装置の重要な要素は膜ディスクである。その直径、ディスクの数、および配置は、目的のスケールによって異なり得る。
【００１５】
本発明によれば、動的濾過の方法は、様々な架橋生体高分子ベースのヒドロゲル（以下、「ヒドロゲル（複数可）」とも呼ばれる）に適用することができる。架橋生体高分子ベースのヒドロゲルの製造方法は当技術分野で周知であり、例えば、架橋ヒアルロン酸ゲルの作製は、ＷＯ２００５／０８５３２９Ａ１に記載されている。多糖に基づくゲルを作製するさらなる方法は、ＷＯ２０１４／０６４６３３、ＵＳ２０１３／２１０７６０、ＵＳ２０１３／２０３６９６、ＷＯ２０１０／１１５０８１、ＷＯ２０１２／０６２７７５、ＷＯ２０１３／１８５９３４、ＷＯ２００９／０７７３９９、およびＷＯ２００８／０３４１７６に開示されている。
【００１６】
一態様では、本発明は、架橋生体高分子ベースのヒドロゲルの動的濾過の方法に関し、
ａ）半透性フィルターディスク（複数可）を備えた動的濾過装置に架橋生体高分子ベースのヒドロゲルを移し、ゲルを透析濾過するステップであって、
ｉ）２０  １／分〜５００  １／分の範囲内の回転速度および０．５〜６バールの範囲内の過圧を適用することによって所定の濃度までゲルを濃縮するか、または動的濾過装置の処理チャンバにゲルを直接ポンプで送るステップと、
ｉｉ）２０  １／分〜５００  １／分の範囲内の回転速度、および０．５〜６バールの範囲内の過圧を適用することによって、不要な分子を低減するために透析濾過を行うステップと、を含む、透析濾過するステップと、
ｂ）任意選択で、非架橋ポリマー、特に非架橋ヒアルロン酸および水を含む混合物をゲルに加えるステップと、を含む。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「透析濾過」という用語は、濾液が生成されるのと同じ速度で保持液に水または新しい緩衝液を加えることによって、保持液（試料）内に元からある緩衝液塩または他の低分子量種を洗い流すことを伴う、連続透析濾過（定量透析濾過とも呼ばれる）を意味するように使用される。
【００１８】
本明細書で使用される「不要な分子」という用語は、非反応性または非結合のポリマー架橋剤分子（例えば、ＢＤＤＥ）およびそれらの分解生成物を指す。
【００１９】
驚くべきことに、本発明による方法は、回転式フィルターディスクから生じる剪断応力にもかかわらず、ゲルの構造的安定性が維持されている間、ゲルから不要な分子を顕著に除去することが見出された。さらに、驚くべきことに、本発明による方法を実施するために必要な処理時間および必要な緩衝液が、従来の透析と比較して顕著に削減されたことが見出された。本発明による方法のさらなる利点は、従来のクロスフロー濾過と比較して流束速度が増加し（２〜１０倍）、保持液をより高濃度に濃縮することができることである。これらの利点は、架橋された高粘度のヒドロゲルから不要な分子を除去するための改善された方法につながる。
【００２０】
生体高分子ベースのヒドロゲルは、生分解性ポリマー、例えば、ヒアルロン酸、ヘパロサン、アルギネート、ペクチン、ジェランガム、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、セルロース、キトサン、カラギーナン、キサンタン、またはそれらの塩もしくは誘導体、またはそれらの組み合わせから作られる。「ヒアルロン酸」という用語は、「ヒアルロナン」という用語と同義的に使用される。
【００２１】
以下では、本発明をヒアルロン酸ヒドロゲルを用いて説明するが、これは、本開示が決してヒアルロン酸ヒドロゲルに限定されることを意味するものではない。むしろ、ヒアルロン酸ヒドロゲル、特に上記の例示的なポリマーのうちの１つから作られるヒドロゲルの代わりに、任意の生体高分子ベースのヒドロゲルを使用することができる。
【００２２】
生体高分子ベースのヒドロゲルは、化学架橋剤によって架橋されており、ヒドロゲルは、使用された化学架橋剤の余剰分を含んでいる。余剰の化学架橋剤は、本発明による方法によりヒドロゲルから除去される。さらに、他の不要な分子もまた、本発明による方法によってヒドロゲルから除去され得る。
【００２３】
「架橋剤」という用語は、生体高分子ベースのヒドロゲルの１つ以上の官能基と反応し、同じ官能基、例えば、ヒドロキシル基と架橋することができる、少なくとも２つの基を有するすべての化合物を含む。架橋のための架橋剤の適切な基は、カルボキシル基、エポキシド基、ハロゲン基、ビニル基、イソシアネート基、または保護されたイソシアネート基から選択され得る。架橋剤として使用できる例示的な化合物は、例えば、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、ポリビニルシラン（ＰＶＳ）、ＰＥＧベースの架橋剤、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）である。特定の実施形態では、本発明による方法は、ヒドロゲルから未結合または過剰の１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）および／または他の不要な分子を除去する。
【００２４】
好ましくは、架橋生体高分子ベースのヒドロゲル（特にヒアルロン酸で作られたヒドロゲル）は、１０〜７０ｍｇ／ｇ、好ましくは２０〜５０ｍｇ／ｇの範囲の初期濃度を呈する。本発明に関して、ヒドロゲルの濃度は、ヒドロゲルの総量（ｇで表される）に基づく架橋生体高分子の量（ｍｇで表される）を意味する。典型的には、初期濃度は、ステップａ）で動的濾過装置に移され、任意選択で、ステップｉ）で濃縮または処理チャンバに直接ポンプ注入されるヒドロゲルの濃度である。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、ヒドロゲルは、例えば、充填を容易にするために、動的濾過装置に移される前に（例えば、透析濾過に適用される緩衝溶液を使用して）希釈され、好ましくは、透析濾過の前に任意選択のステップｉ）で濃縮され得る。好ましくは、ヒドロゲルは、任意選択のステップｉ）において、３〜３０ｍｇ／ｇ、好ましくは５〜２０ｍｇ／ｇ、より好ましくは５〜１０ｍｇ／ｇの範囲のヒドロゲルの濃度から開始して濃縮される。
【００２６】
好ましくは、ヒドロゲルは、任意選択のステップｉ）において、所望の濃度に到達し、最大で７０ｍｇ／ｇの最大濃度に到達するまで濃縮される。特に、任意選択の濃縮ステップｉ）の後のヒドロゲルの濃度は、１０〜７０ｍｇ／ｇ、好ましくは２０〜５０ｍｇ／ｇ、より好ましくは２０〜３５ｍｇ／ｇの範囲である。
【００２７】
好ましくは、ステップｉｉ）における透析濾過は、１０〜７０ｍｇ／ｇ、好ましくは２０〜５０ｍｇ／ｇ、より好ましくは２０〜３５ｍｇ／ｇ、また好ましくは２３〜７０ｍｇ／ｇの範囲のヒドロゲルの濃度で行われる。典型的には、ヒドロゲル（特にヒアルロン酸で作られたヒドロゲル）の濃度は、透析濾過ステップｉｉ）の間、ほぼ同じレベルに維持される。
【００２８】
好ましくは、ステップｉｉ）における透析濾過は、ヒドロゲル中の不要な分子（ＢＤＤＥなど）の量が定量限界を下回るまで行われる。例えば、ステップｉｉ）における透析濾過は、１〜８時間、好ましくは２〜６時間の期間行われる。
【００２９】
好ましくは、ステップｉｉ）における透析濾過は、緩衝溶液、好ましくはリン酸緩衝溶液、例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４およびＮａＨ２ＰＯ４などのリン酸ナトリウムベースの緩衝溶液を使用して行われる。特に、ステップｉｉ）における透析濾過は、６〜８、好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨ値を有する緩衝溶液を使用して行われる。
【００３０】
好ましくは、ヒドロゲルは、ステップｉ）において、７０  １／分〜５００  １／分、好ましくは７０  １／分〜３００  １／分、より好ましくは１００  １／分〜３００  １／分の範囲の回転速度を適用することによって濃縮される。好ましくは、ヒドロゲルは、ステップｉ）において、１〜３バールの範囲の過圧によって濃縮される。
【００３１】
好ましくは、ステップｉｉ）における透析濾過は、７０  １／分〜５００  １／分、好ましくは７０  １／分〜３００  １／分、より好ましくは１００  １／分〜３００  １／分の範囲の回転速度を適用することによって実施される。好ましくは、ステップｉｉ）における透析濾過は、１〜３バールの範囲の過圧を適用することによって実施される。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明による方法で使用される動的濾過装置は、５ｎｍ〜２μｍの孔径、より詳細には３０ｎｍ〜６００ｎｍの孔径、より詳細には８０ｎｍ〜３００ｎｍの孔径、特に、５ｎｍ〜６０ｎｍの孔径を呈する半透性フィルターディスク（複数可）を備えている。
【００３３】
特定の実施形態では、本発明による方法で使用される動的濾過装置は、１枚以上の半透性フィルターディスクを備えている。好ましい実施形態では、動的濾過装置は、１〜１０枚、好ましくは４〜６枚の半透性フィルターディスク（複数可）を備えている。半透性フィルターディスクは、同じ寸法または異なる寸法を呈する場合がある。驚くべきことに、ヒドロゲルの粘度および架橋構造に悪影響を与えることなく、半透性フィルターディスク（複数可）の数を最大１０枚、または好ましくは最大６枚まで増やすことができることが見出された。通常、剪断力は、ディスクの数が増え、回転速度が上がると増加する。
【００３４】
特定の実施形態では、動的濾過装置は、セラミック、金属、またはポリマー材料で作られた半透性フィルターディスク（複数可）を備えている。
【００３５】
特定の実施形態では、生体高分子ベースのヒドロゲルはヒアルロン酸で作られており、ゲルは、約２０  １／分〜１５０  １／分の範囲内の回転速度および約０．５〜２バールの範囲内の圧力を適用して、１０〜３０ｍｇ／ｇの最終濃度まで濃縮され、透析濾過は、２０  １／分〜１５０  １／分の範囲内の回転速度および０．５〜２バールの範囲内の圧力を適用することによって実施される。
【００３６】
好ましい実施形態では、生体高分子ベースのヒドロゲルはヒアルロン酸で作られており、ステップｉｉ）における透析濾過は、２０  １／分〜５００  １／分、好ましくは７０〜３００  １／分の範囲内の回転速度、および０．５〜３バール、好ましくは１〜３バールの範囲内の圧力を適用することによって実施され、ステップｉｉ）の透析濾過は、１０〜７０ｍｇ／ｇ、好ましくは２０〜５０ｍｇ／ｇ、より好ましくは２０〜３５ｍｇ／ｇの範囲のヒドロゲルの濃度で行われる。
【００３７】
好ましい実施形態では、生体高分子ベースのヒドロゲルはヒアルロン酸で作られており、ゲルはステップ（ｉ）で動的濾過装置の処理チャンバに直接ポンプで送られ（すなわち、任意選択の濃縮ステップなし）、ステップｉｉ）における透析濾過は７０  １／分〜５００  １／分、好ましくは７０〜３００  １／分の範囲内の回転速度、および１〜３バールの範囲内の圧力を適用することによって実施され、ステップｉｉ）における透析濾過は、１０〜７０ｍｇ／ｇ、好ましくは２０〜３５ｍｇ／ｇの範囲のヒドロゲルの濃度で行われ、動的濾過装置は、１〜１０枚、好ましくは４〜６枚の半透性フィルターディスク（複数可）を備えている。
【００３８】
ヒドロゲルの透析濾過中または透析濾過後に、さらなる物質、例えば、塩、緩衝物質、ビタミン（例えば、ビタミンＥ、Ｃ、Ｂ６）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはその誘導体、酸化亜鉛）、ポリオール（例えば、グリセロール、マンニトール）、リン酸三カルシウム粒子（例えば、αリン酸三カルシウムおよびβリン酸三カルシウムならびにヒドロキシアパタイト粒子）、薬剤（例えば、麻酔薬、抗炎症剤、刺激低減剤、血管収縮剤または血管拡張剤、抗凝固剤、湿度提供物質、免疫抑制剤、抗生物質など）、ならびに成長因子、ペプチド、またはタンパク質（例えば、ニューロトキシン）が、ゲルに添加され得る。特に、リドカインなどの麻酔薬が、ゲルに添加され得る。好ましくは、リドカインは、組成物の総重量に対して０．０５〜５．０重量％、０．１〜２．０重量％、０．１〜１．０重量％、０．１〜０．５重量％、０．１〜０．４重量％、０．２〜０．４重量％、または０．２〜０．３重量％の濃度でゲル中に含まれる。
【００３９】
好ましくは、ステップｉ）における任意選択の濃縮および／またはステップｉｉ）における透析濾過は、１５℃〜８０℃、好ましくは２０℃〜７０℃の範囲の温度で実施される。
【００４０】
好ましい実施形態では、ステップｉｉ）における透析濾過および任意選択の濃縮ステップｉ）は、６０℃〜７０℃の範囲の温度で、好ましくは６０℃〜７０℃の範囲の温度で、２〜４時間（例えば、３．５時間）の期間実施される。ヒドロゲルの粘度が低下するため、特に６０℃〜７０℃の範囲の温度が有利である。
【００４１】
特定の実施形態では、ステップａ）において、ゲルは、不要な分子を低減するためにさらに熱処理を受けており、最大４時間、６０℃が適用される。
【００４２】
動的濾過装置は、装置および／または通路を蒸気でリンスするための滅菌手段、好ましくは純粋な蒸気、滅菌流体、特に洗浄液、好ましくは濾過水、および／または滅菌された／粒子を含まない空気を含み得る。滅菌手段は、滅菌流体を含む供給ユニット、および滅菌流体のための貯蔵ユニットを含み得る。
【００４３】
特定の実施形態では、ゲルは、動的濾過装置内において１２１℃〜１３５℃で約２〜３０分の保持時間で滅菌される。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明による方法は、１０時間未満、特に５時間未満で行われる。
【００４５】
本発明による方法は、
ｉ）真空（２０〜２００ミリバール）下で気泡を除去するためにゲルを脱気するステップ、
ｉｉ）ゲルをシリンジに充填するステップ、
ｉｉｉ）オートクレーブ内で熱によりシリンジ内のゲルを滅菌するステップ、をさらに含み得る。
【００４６】
別の態様では、本発明は、本発明による方法によって得られる架橋生体高分子ベースのヒドロゲルに関する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、審美的用途、特に軟組織増強のための、本発明による方法によって得られた架橋生体高分子ベースのヒドロゲルの使用に関する。
【実施例】
【００４８】
以下に、本発明による方法をより詳細に説明する。
【００４９】
実施例１：ゲルの希釈ステップ、濃縮ステップ、および透析濾過ステップを含む方法
ＢＤＤＥ（例えば、ＷＯ２００５／０８５３２９を参照）で架橋され、２４ｍｇ／ｇの初期濃度を呈するヒアルロン酸ヒドロゲルを、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ：０，９９４ｇ／Ｌ；ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ：０．５１ｇ／Ｌ；マンニトール：４２ｇ／Ｌ、および注入用水を含む緩衝液を使用して、１：４〜１：８の範囲で希釈した。希釈したゲルを容器に移し、パイプまたはチューブを介して動的濾過装置の入口に接続した。動的濾過装置は、１枚のフィルターディスク（０，０３４ｍ２のフィルター面積、直径１５２ｍｍ、孔径７ｎｍ）、ゲル貯蔵器としての１つの容器、および緩衝液貯蔵器としての第２の容器を有する、Ｋｒａｕｓｓ  Ｍａｆｆｅｉ動的クロスフローフィルターＤＣＦ１５２／Ｓ（Ａｎｄｒｉｔｚ  ＡＧ）で構成された。両方の容器は、チューブとボールバルブを介してＤＣＦ１５２／Ｓの入口ポートに接続され、さまざまな処理ステップでそれぞれの媒体を選択した。ＤＣＦ１５２／Ｓのハウジングのダブルジャケットを冷蔵サーキュレーターに接続し、ダブルジャケット内の温度を設定温度２０℃に維持した。ＤＣＦ１５２／Ｓの濾液を容器に集め、天秤上に置いて濾液の量を測定した。次のステップが適用された。
ｉ）希釈したゲルを含む閉じられたゲル容器に、圧力（１．５バール）を加えてゲルを濃縮し、ＤＣＦ１５２／Ｓの入口ポートへの道を開き、フィルターディスクと中空シャフトを介して濾液を除去するステップ（ＷＯ００／４７３１２を参照）。フィルターディスクは１５０ｒｐｍで回転させた。ゲル中のヒアルロン酸の濃度が２４ｍｇ／ｇになるまでゲルを濃縮した。
ｉｉ）緩衝液を含む閉じられた緩衝液容器に圧力（１．５バール）を加え、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ：０，９９４ｇ／Ｌ；ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ：０．５１ｇ／Ｌ；マンニトール：４２ｇ／Ｌ、および注入用水を含む緩衝溶液で透析濾過を行い、ＤＣＦ  １５２／Ｓの入口ポートへの道を開き、フィルターディスクおよび中空シャフトを介して濾液を除去するステップ（ＷＯ００／４７３１２を参照）。緩衝溶液にはリドカイン（０，２７〜０．３３ｗ／ｗ％）が含まれている場合がある。別の方法として、リドカインは透析濾過後に添加され得る。フィルターディスクは１５０ｒｐｍで回転させた。ＢＤＤＥが定量限界未満になるまでゲルを濾過した。
【００５０】
ＢＤＤＥの量は、以下の方法に従って測定された。
１．試料調製：
ａ．ＨＡの酵素分解
ＨＡは、ヒアルロニダーゼ溶液を添加し、その後粘度が低下するまでわずかに振盪させながら１〜４時間インキュベートすることにより分解した。
ｂ．ＢＤＤＥの抽出
ＢＤＤＥは、酢酸エチル（５％ｖ／ｖ）を添加し、４００ｒｐｍで２０分間軌道振盪させることにより、分解した試料（ａで説明）から抽出した。溶液を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離させて、有機相と水相を分離した。ＢＤＤＥを含む有機相をＧＣバイアルに移した。
２．ガスクロマトグラフ測定
ａ．５μＬの試料（１ｂで説明）をＧＣ（スプリットインジェクター、スプリット比１：５、２５０℃）に注入し、１００℃−４０℃／分−２８０℃の温度傾斜を使用して、および２８０℃で３０秒間の最終保持によって、ＤＢ−１カラム（ＡｇｉｌｅｎｔＤＢ−１、３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、０．２５μｍフィルム）で分離した。検出器は、ＦＩＤを使用した。
ｂ．データ評価は、欧州薬局方第２．２．４６章に準拠した内部標準法によって実施された。
実施例１による一つの実験の結果を以下の表１に示す。
【表１】
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【００５１】
ゲルの構造安定性は、２つの異なるゲルの比較を示す図１からわかるように、本発明による方法の間維持された。一方のゲルは本発明に従って処理され（「ＤＣＦゲル」）、他方のゲルは標準的な方法で処理された（「標準ゲル」）。
【００５２】
実線は、標準的な方法に従って生成された透析後のゲルのＧ’、Ｇ’’、およびηの特徴的な進行を表し、点線は、本発明に従って処理されたゲルの特徴的な進行を表す。
【００５３】
ゲルの特性評価に一般的に使用される周波数試験で示された曲線の進行に関して、有意差がなかったことは明らかである。本発明によるゲルに関連する曲線は、ゲルのＨＡ濃度がわずかに低いため、標準ゲルに関連する曲線よりもわずかに低い。ゲルの構造的安定性に関して、Ｇ’およびＧ’’の平行な増加（Ｇ’＞Ｇ’’）は、ゲルが本発明による方法の間、その架橋構造を維持したことを明確に示している。
【００５４】
さらに、図２は、両方のゲル（「ＤＣＦゲル」と標準ゲル」、上記参照）のフローポイントが同一であることを示し、これはさらに、本発明に従って処理されたゲルの構造安定性が維持されたことを示している。
【００５５】
実施例２：ゲルを希釈するステップなしでゲルを透析濾過する方法
ＢＤＤＥ（例えば、ＷＯ２００５／０８５３２９を参照）で架橋され、３２〜３５ｍｇ／ｇの濃度を呈するヒアルロン酸ヒドロゲルが、動的濾過装置の処理チャンバに直接ポンプで送られた。ゲルには２２６．８ｐｐｍの非結合ＢＤＤＥが含まれていた。動的濾過装置は、１枚のフィルターディスク（０，０３４ｍ２のフィルター面積、直径１５２ｍｍ、孔径５ｎｍ）、ゲル貯蔵器としての１つの容器、および緩衝液貯蔵器としての第２の容器を有するＫｒａｕｓｓ  Ｍａｆｆｅｉ動的クロスフローフィルターＤＣＦ  １５２／Ｓ（Ａｎｄｒｉｔｚ  ＡＧ）で構成された。両方の容器は、チューブとボールバルブを介してＤＣＦ  １５２／Ｓの入口ポートに接続され、さまざまな処理ステップでそれぞれの媒体を選択するようにした。ＤＣＦ  １５２／Ｓのハウジングのダブルジャケットを冷蔵サーキュレーターに接続し、ダブルジャケット内の温度を設定温度２０℃に維持した。ＤＣＦ  １５２／Ｓの濾液を容器に集め、天秤上に置いて濾液の量を測定した。次のステップが適用された。
ｉ）緩衝液を含む閉じられた緩衝液容器に圧力（１．５バール）を加え、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ：５，９６ｇ／Ｌ；ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ：２，５７ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ：２，２９ｇ／Ｌ、および注入用水を含む緩衝溶液で透析濾過を行い、ＤＣＦ１５２／Ｓの入口ポートへの道を開き、フィルターディスクおよび中空シャフトを介して濾液を除去するステップ（ＷＯ００／４７３１２を参照）。緩衝溶液には、リドカイン（０，２７〜０．３３ｗ／ｗ％）が含まれている場合がある。別の方法として、リドカインは透析濾過後に添加され得る。フィルターディスクを１５０ｒｐｍ（１／分）で回転させた。未結合のＢＤＤＥが定量限界（ＬＯＱ）未満になるまで、ゲルを濾過した。ＢＤＤＥの量は、上で説明したように測定された（実施例１を参照）。動的濾過処理は２時間１分以内に実施された。
さらなる実験の結果を次の表２に示す。
【表２】
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【００５６】
ゲルの構造的安定性が本発明による方法の間維持されたという事実のさらなる例を、図３に見ることができる。実施例２による方法が適用された後、ゲルの特性評価に一般的に使用される周波数試験を活用して、ゲルを分析した。使用した周波数範囲は０．１〜１０Ｈｚであった。Ｇ’およびＧ’’（Ｇ’＞Ｇ’’）の平行な増加は、ゲル（「ＤＣＦゲル」）が実施例２による方法の間、その架橋構造を維持したことを明確に示している。
【００５７】
実施例３：ゲルを希釈するステップなしでゲルを透析濾過し、６枚のフィルターディスクを備えた動的濾過装置を使用する方法
実施例３は、上記の実施例２に従って実施されたが、使用された動的濾過装置は、（実施例１および実施例２のように１枚ではなく）６枚のフィルターディスク（フィルター面積０，０３４ｍ２、直径１５２ｍｍ、孔径５ｎｍ）を有するＫｒａｕｓｓ  Ｍａｆｆｅｉ動的クロスフローフィルターＤＣＦ  １５２／Ｓ（Ａｎｄｒｉｔｚ  ＡＧ）である点が異なる。ＢＤＤＥ（例えば、ＷＯ２００５／０８５３２９を参照）で架橋され、６６ｍｇ／ｇの濃度を呈するヒアルロン酸ヒドロゲルを、実施例１および実施例２に記載の緩衝溶液を使用してファクター１：２で希釈した。約３３ｍｇ／ｇの濃度を有するヒアルロン酸ヒドロゲルを、動的濾過装置の処理チャンバに直接ポンプで送った。ゲルには２２６．８ｐｐｍの非結合ＢＤＤＥが含まれていた。
【００５８】
透析濾過は、実施例２に記載されているように実施され、異なる処理条件が表３に示されている。透析濾過は、ＢＤＤＥが定量限界未満になるまで、通常は濾液の体積が濾過装置のチャンバの体積の７倍になるまで実施された。
【表３】
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ＬＯＱ：定量限界
ゲルのＢＤＤＥ：最初のＢＤＤＥ含量
ＤＣＦのＢＤＤＥ：濾過後のヒドロゲルの最終のＢＤＤＥ含量
【００５９】
ゲルの構造安定性は、図４（試行４）および図５（試行５）に示すように、実施例３による試行４および試行５によるＤＣＦ方法の間維持された。実施例３による方法が適用された後、ゲルは、ゲルの特性評価に一般的に使用される周波数試験を活用して分析された。使用した周波数範囲は０．１〜１０Ｈｚであった。Ｇ’およびＧ’’の平行な増加（Ｇ’＞Ｇ’’）は、実施例３（試行４および試行５）による方法の間、ゲルがそれらの架橋構造を維持したことを明確に示している。
【００６０】
驚くべきことに、実施例２と比較して、フィルターディスクの数および回転速度が増加した場合、ヒドロゲルの構造が悪影響を受けない（すなわち、架橋構造が維持される）ことが見出された。典型的には、剪断力は、ディスクの数が増え、回転速度が上がると増加する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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