(57)【要約】上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２またはＥｒｂＢ２）を発現するヒトがん細胞に結合し、これを死滅させるが、ＨＥＲ２を発現する非がん性の健康なヒト細胞を死滅させない多重特異性結合タンパク質、ならびにＨＥＲ２発現がんの処置に有用な医薬組成物および治療方法が、記載される。また、本発明は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍細胞殺滅を誘発する多重特異性結合タンパク質に関する。一態様では、本発明は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ断片を含む第１の抗原結合部位と；（ｂ）ＨＥＲ２に結合する一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を含む第２の抗原結合部位と；（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位とを含むタンパク質（例えば、多重特異性結合タンパク質）を提供する。
2021533161.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ断片を含む第１の抗原結合部位と；
（ｂ）ＨＥＲ２に結合する一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を含む第２の抗原結合部位と；
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。
【請求項２】
前記ｓｃＦｖが、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する前記第３の抗原結合部位に連結している、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記ｓｃＦｖが、前記抗体Ｆｃドメインに連結している、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記ｓｃＦｖが、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記ジスルフィド架橋が、前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ１００との間に形成される、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインが、フレキシブルリンカーを介して前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインに連結している、請求項４から６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記フレキシブルリンカーが、配列番号１４３のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記フレキシブルリンカーが、配列番号１４３のアミノ酸配列からなる、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記軽鎖可変ドメインが、前記重鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ末端に位置する、請求項４から９のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記軽鎖可変ドメインが、前記重鎖可変ドメインのＮ末端に位置する、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記Ｆａｂ断片が、ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する前記第３の抗原結合部位に連結している、請求項１から１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１３】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、
（ａ）それぞれ、配列番号１６８、９６および１６９のアミノ酸配列によって表される相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）それぞれ、配列番号１６８、９６および１７３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｃ）それぞれ、配列番号９５、９６および９７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｄ）それぞれ、配列番号１６６、８８および１６７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９１、９２および９３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｅ）それぞれ、配列番号１６２、７２および１７０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号１０７、１０８および１０９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｆ）それぞれ、配列番号１６２、７２および１６３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号７５、７６および７７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｇ）それぞれ、配列番号１６４、８０および１６５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号７５、７６および８５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｈ）それぞれ、配列番号１６８、９６および１７６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｉ）それぞれ、配列番号１６８、９６および１７９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｊ）それぞれ、配列番号１６８、９６および１８２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｋ）それぞれ、配列番号１６８、９６および１８５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（ｌ）それぞれ、配列番号１６８、９６および１８８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１４】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、配列番号８６および配列番号９４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１５】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、
（ａ）配列番号９４と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１４４と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）配列番号８６と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１６】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、
（ａ）配列番号９４と少なくとも９５％同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９８と少なくとも９５％同一の軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１４４と少なくとも９５％同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９８と少なくとも９５％同一の軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）配列番号８６と少なくとも９５％同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９０と少なくとも９５％同一の軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１７】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、
（ａ）配列番号９４と同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９８と同一の軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１４４と同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９８と同一の軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）配列番号８６と同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９０と同一の軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１８】
表面プラズモン共鳴によって測定して、２ｎＭ〜１２０ｎＭのＫＤでＮＫＧ２Ｄに結合する、請求項１から１７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１９】
ＨＥＲ２に結合する前記第２の抗原結合部位が、
（ａ）それぞれ、配列番号１１５、１１６および１１７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号１１９、１２０および１２１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）それぞれ、配列番号１２３、１２４および１２５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号１２７、１２８および１２９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）それぞれ、配列番号１３１、１３２および１３３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号１３５、１３６および１３７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２０】
ＨＥＲ２に結合する前記第２の抗原結合部位が、
（ａ）配列番号１９５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号１９６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１９７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号１９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）配列番号１９９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号２００と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２１】
ＨＥＲ２に結合する前記第２の抗原結合部位が、
（ａ）配列番号１９５と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号１９６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１９７と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号１９８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）配列番号１９９と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号２００と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２２】
ＨＥＲ２に結合する前記第２の抗原結合部位が、
（ａ）配列番号１９５と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号１９６と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１９７と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号１９８と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）配列番号１９９と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号２００と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２３】
ＨＥＲ２に結合する前記第２の抗原結合部位が、配列番号１３９、配列番号１８９または配列番号１７１のアミノ酸配列を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２４】
ＨＥＲ２に結合する前記第２の抗原結合部位が、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２５】
前記抗体Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２６】
前記抗体Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のタンパク質。
【請求項２７】
前記抗体Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、Ｋ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置で異なる、請求項２５または２６に記載のタンパク質。
【請求項２８】
前記抗体Ｆｃドメインが、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、請求項１から２７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２９】
前記置換を含む前記抗体Ｆｃドメインが、前記ｓｃＦｖに連結している、請求項２８に記載のタンパク質。
【請求項３０】
前記抗体Ｆｃドメインが、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、請求項１から２９のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３１】
前記置換を含む前記抗体Ｆｃドメインが、前記Ｆａｂ断片に連結している、請求項３０に記載のタンパク質。
【請求項３２】
前記抗体Ｆｃドメインが、Ｔ３６６Ｗ置換を含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、請求項１から２７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３３】
前記置換を含む前記抗体Ｆｃドメインが、前記Ｆａｂ断片に連結している、請求項３２に記載のタンパク質。
【請求項３４】
前記抗体Ｆｃドメインが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換を含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、請求項１から２７および３２から３３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３５】
前記置換を含む前記抗体Ｆｃドメインが、前記ｓｃＦｖに連結している、請求項３４に記載のタンパク質。
【請求項３６】
配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１９４、配列番号１５５または配列番号１４８の配列を含む、請求項１から３５のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項３７】
前記抗体Ｆｃドメインに連結した前記ｓｃＦｖが、配列番号１４０または配列番号１４６のアミノ酸配列によって表される、請求項１から３６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３８】
（ａ）配列番号１４１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；
（ｂ）配列番号１４０、配列番号１９０または配列番号１９２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号１４２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド
を含むタンパク質。
【請求項３９】
前記第２のポリペプチドが、配列番号１４０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載のタンパク質。
【請求項４０】
（ａ）配列番号１４１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；
（ｂ）配列番号１４０、配列番号１９０または配列番号１９２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号１４２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド
を含むタンパク質。
【請求項４１】
前記第２のポリペプチドが、配列番号１４０と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載のタンパク質。
【請求項４２】
（ａ）配列番号１４１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；
（ｂ）配列番号１４０、配列番号１９０または配列番号１９２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号１４２のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド
を含むタンパク質。
【請求項４３】
前記第２のポリペプチドが、配列番号１４０のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のタンパク質。
【請求項４４】
前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む製剤。
【請求項４５】
請求項１から４３のいずれか一項に記載のタンパク質を発現する１つまたは複数の核酸を含む細胞。
【請求項４６】
腫瘍細胞死を直接的および／または間接的に増強する方法であって、腫瘍およびナチュラルキラー細胞を、請求項１から４３のいずれか一項に記載のタンパク質に曝露するステップを含む方法。
【請求項４７】
がんを処置する方法であって、請求項１から４３のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項４４に記載の製剤を、患者に投与するステップを含む方法。
【請求項４８】
前記がんが、乳がん、甲状腺がん、胃がん、腎細胞癌、肺の腺癌、前立腺がん、胆管癌、子宮がん、膵臓がん、結腸直腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肺扁平上皮がん、中皮腫、肝臓がん、中皮腫、肉腫および胆嚢がんからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月８日出願の米国仮特許出願第６２／７１６，２５９号の利益および優先権を主張し、当該出願の開示は、全ての目的についてその全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
【０００２】
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１９年８月６日に作成された前記ＡＳＣＩＩ複製物は、ＤＦＹ−０５７ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、２０８，５１１バイトのサイズである。
発明の分野
【０００３】
本発明は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６および上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２またはＥｒｂＢ２）に結合する多重特異性結合タンパク質に関する。これらの多重特異性結合タンパク質は、ＨＥＲ２を発現する非がん性の健康なヒト細胞に対する有意な細胞傷害性を伴わずに、Ｈｅｒ２を発現するヒトがん細胞を死滅させるために有用である。
【背景技術】
【０００４】
がんは、この疾患を処置するための文献で報告されている相当な研究努力および科学的進歩にもかかわらず、重大な健康問題であり続けている。最も頻繁に診断されるがんの一部には、前立腺がん、乳がんおよび肺がんが含まれる。前立腺がんは、男性において最も一般的ながん形態である。乳がんは、女性の死亡の主な原因のままである。これらのがんのための現在の処置選択肢は、全ての患者に有効ではない、および／または相当な有害副作用を有する場合がある。他の種類のがんも、既存の治療選択肢を使用して処置するには困難なままである。
【０００５】
がん免疫療法は、高度に特異的であり、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進することができるので、望ましい。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの融合タンパク質は、腫瘍細胞およびＴ細胞に結合して、腫瘍細胞の破壊を促進する、文献に記載されているがん免疫療法である。ある特定の腫瘍関連抗原およびある特定の免疫細胞に結合する抗体が文献に記載されている。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１およびＷＯ２０１５／０９５４１２を参照されたい。
【０００６】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の成分であり、循環リンパ球のおよそ１５％を構成する。ＮＫ細胞は、事実上全ての組織に浸潤し、元々、事前の感作の必要性なしに腫瘍細胞を有効に死滅させる能力によって特徴付けられた。活性化ＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と類似の手段によって−すなわち、パーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞溶解性顆粒（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  ｇｒａｎｕｌｅ）を介して、ならびにデスレセプター経路を介して、標的細胞を死滅させる。活性化ＮＫ細胞はまた、ＩＦＮ−γなどの炎症性サイトカインおよび他の白血球の標的組織への動員を促進するケモカインを分泌する。
【０００７】
ＮＫ細胞は、その表面上のさまざまな活性化受容体および抑制性受容体を介してシグナルに応答する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇した場合、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化を介してその活性が阻害される。あるいは、ＮＫ細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇した場合、その活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ１）を介して活性化される。ＮＫ細胞はまた、その表面上のＣＤ１６受容体を介して一部の免疫グロブリンの定常領域によっても活性化される。活性化に対するＮＫ細胞の全体的な感度は、刺激シグナルと抑制シグナルの合計に依存する。
ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）は、上皮成長因子受容体ファミリーに属する膜貫通糖タンパク質である。それは、受容体チロシンキナーゼであり、細胞生存、増殖および成長を調節する。ＨＥＲ２は、ヒト悪性腫瘍において重要な役割を果たす。ＥＲＢＢ２遺伝子は、ヒト乳がんのおよそ３０％において増幅または過剰発現される。ＨＥＲ２過剰発現乳がんを有する患者は、がんがＨＥＲ２を過剰発現していない患者よりも実質的に低い全生存率および短い無病期間を有する。さらに、ＨＥＲ２の過剰発現は、乳がん転移の増大をもたらす。また、ＨＥＲ２の過剰発現は、乳がん、卵巣がん、食道がん、膀胱がんおよび胃がん、唾液腺導管癌、肺の腺癌、ならびに攻撃的形態の子宮がん、例えば、子宮漿液性子宮内膜癌を含む、多くの他のがんの種類において起こることが公知である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１３４３７１号
【特許文献２】国際公開第２０１５／０９５４１２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２またはＥｒｂＢ２）を発現するヒトがん細胞に結合し、これを死滅させる多重特異性結合タンパク質に関する。本発明は、がん細胞上のＨＥＲ２、ならびにナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。そのようなタンパク質は、１種類より多くのＮＫ活性化受容体と結合することができ、天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合を遮断し得る。ある特定の実施形態では、タンパク質は、ヒトにおいて、ならびにげっ歯類およびカニクイザルなどの他の種において、ＮＫ細胞に対してアゴニストとして作用することができる。ある特定の実施形態では、タンパク質は、ヒトにおいて、ならびにヒト、げっ歯類およびカニクイザルなどの他の種において、Ｔ細胞を刺激することができる。本発明のさまざまな態様および実施形態は、以下にさらに詳細に説明される。
【００１０】
一態様では、本発明は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ断片を含む第１の抗原結合部位と；（ｂ）ＨＥＲ２に結合する一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を含む第２の抗原結合部位と；（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位とを含むタンパク質（例えば、多重特異性結合タンパク質）を提供する。
【００１１】
ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位に連結している。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、抗体Ｆｃドメインに連結している。
【００１２】
ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する。ある特定の実施形態では、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４と軽鎖可変ドメインのＣ１００との間に形成される。
【００１３】
ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインは、フレキシブルリンカーを介してｓｃＦｖの重鎖可変ドメインに連結している。ある特定の実施形態では、フレキシブルリンカーは、配列番号１４３のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、フレキシブルリンカーは、配列番号１４３のアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ末端に位置する。ある特定の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインのＮ末端に位置する。
【００１４】
ある特定の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位に連結している。
【００１５】
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、それぞれ、配列番号１６８、９６および１６９のアミノ酸配列によって表される相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、それぞれ、配列番号９５、９６および９７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００１６】
ある特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、
（ａ）それぞれ、配列番号１６８、９６および１６９のアミノ酸配列によって表される相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）それぞれ、配列番号１６８、９６および１７３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｃ）それぞれ、配列番号９５、９６および９７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｄ）それぞれ、配列番号１６６、８８および１６７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９１、９２および９３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｅ）それぞれ、配列番号１６２、７２および１７０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号１０７、１０８および１０９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｆ）それぞれ、配列番号１６２、７２および１６３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号７５、７６および７７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｇ）それぞれ、配列番号１６４、８０および１６５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号７５、７６および８５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｈ）それぞれ、配列番号１６８、９６および１７６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｉ）それぞれ、配列番号１６８、９６および１７９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｊ）それぞれ、配列番号１６８、９６および１８２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｋ）それぞれ、配列番号１６８、９６および１８５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（ｌ）それぞれ、配列番号１６８、９６および１８８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９９、１００および１０１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；ならびに
（ａ）それぞれ、配列番号１１５、１１６および１１７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号１１９、１２０および１２１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）それぞれ、配列番号１２３、１２４および１２５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号１２７、１２８および１２９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）それぞれ、配列番号１３１、１３２および１３３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号１３５、１３６および１３７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、ＨＥＲ２に結合するｓｃＦｖを含む第２の抗原結合部位
を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号９４に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号９４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９４のＣＤＲ１（配列番号９５または１６８）、ＣＤＲ２（配列番号９６）およびＣＤＲ３（配列番号９７または１６９）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）およびＣＤＲ３（配列番号１０１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００１８】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１４４に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１４４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１４４のＣＤＲ１（配列番号９５または１６８）、ＣＤＲ２（配列番号９６）およびＣＤＲ３（配列番号１７２または１７３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）およびＣＤＲ３（配列番号１０１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００１９】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１７４に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１７４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１７４のＣＤＲ１（配列番号９５または１６８）、ＣＤＲ２（配列番号９６）およびＣＤＲ３（配列番号１７５または１７６）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）およびＣＤＲ３（配列番号１０１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２０】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１７７に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１７７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１７７のＣＤＲ１（配列番号９５または１６８）、ＣＤＲ２（配列番号９６）およびＣＤＲ３（配列番号１７８または１７９）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）およびＣＤＲ３（配列番号１０１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２１】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１８０に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１８０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１８０のＣＤＲ１（配列番号９５または１６８）、ＣＤＲ２（配列番号９６）およびＣＤＲ３（配列番号１８１または１８２）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）およびＣＤＲ３（配列番号１０１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２２】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１８３に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１８３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１８３のＣＤＲ１（配列番号９５または１６８）、ＣＤＲ２（配列番号９６）およびＣＤＲ３（配列番号１８４または１８５）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）およびＣＤＲ３（配列番号１０１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２３】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１８６に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１８６のＣＤＲ１（配列番号９５または１６８）、ＣＤＲ２（配列番号９６）およびＣＤＲ３（配列番号１８７または１８８）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）およびＣＤＲ３（配列番号１０１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２４】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号８６に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号９０に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号８７または１６６）、ＣＤＲ２（配列番号８８）およびＣＤＲ３（配列番号８９または１６７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９０のＣＤＲ１（配列番号９１）、ＣＤＲ２（配列番号９２）およびＣＤＲ３（配列番号９３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２５】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１０２に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１０６に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１０２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１０２のＣＤＲ１（配列番号７１または１６２）、ＣＤＲ２（配列番号７２）およびＣＤＲ３（配列番号１０５または１７０）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１０６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１０６のＣＤＲ１（配列番号１０７）、ＣＤＲ２（配列番号１０８）およびＣＤＲ３（配列番号１０９）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２６】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号７０に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号７４に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号７０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号７０のＣＤＲ１（配列番号７１または１６２）、ＣＤＲ２（配列番号７２）およびＣＤＲ３（配列番号７３または１６３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号７４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号７４のＣＤＲ１（配列番号７５）、ＣＤＲ２（配列番号７６）およびＣＤＲ３（配列番号７７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２７】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号７０に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号７４に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号７０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号７０のＣＤＲ１（配列番号７１または１６２）、ＣＤＲ２（配列番号７２）およびＣＤＲ３（配列番号７３または１６３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号７４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号７４のＣＤＲ１（配列番号７５）、ＣＤＲ２（配列番号７６）およびＣＤＲ３（配列番号７７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２８】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号７８に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号８２に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号７８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号７８のＣＤＲ１（配列番号７９または１６４）、ＣＤＲ２（配列番号８０）およびＣＤＲ３（配列番号８１または１６５）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号８２のＣＤＲ１（配列番号７５）、ＣＤＲ２（配列番号７６）およびＣＤＲ３（配列番号７７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２９】
ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴によって測定して、２ｎＭ〜１２０ｎＭのＫＤでＮＫＧ２Ｄに結合する。ある特定の実施形態では、タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定して、２ｎＭ〜１２０ｎＭのＫＤでＮＫＧ２Ｄに結合する。
【００３０】
一部の実施形態では、ＨＥＲ２に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１９５に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１９６に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１９５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１９５のＣＤＲ１（配列番号１１５）、ＣＤＲ２（配列番号１１６）およびＣＤＲ３（配列番号１１７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１９６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１９６のＣＤＲ１（配列番号１１９）、ＣＤＲ２（配列番号１２０）およびＣＤＲ３（配列番号１２１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。一部の実施形態では、ＨＥＲ２に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１３９のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。
【００３１】
あるいは、ＨＥＲ２に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１９７に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１９８に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１９７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１９７のＣＤＲ１（配列番号１２３）、ＣＤＲ２（配列番号１２４）およびＣＤＲ３（配列番号１２５）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１９８のＣＤＲ１（配列番号１２７）、ＣＤＲ２（配列番号１２８）およびＣＤＲ３（配列番号１２９）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。一部の実施形態では、ＨＥＲ２に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１８９のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。
【００３２】
あるいは、ＨＥＲ２に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１９９に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号２００に関連する軽鎖可変ドメインを含む。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１９９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１９９のＣＤＲ１（配列番号１３１）、ＣＤＲ２（配列番号１３２）およびＣＤＲ３（配列番号１３３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２００と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２００のＣＤＲ１（配列番号１３５）、ＣＤＲ２（配列番号１３６）およびＣＤＲ３（配列番号１３７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。一部の実施形態では、ＨＥＲ２に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１７１のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。
【００３３】
ある特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む。ある特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
ある特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含み、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、Ｋ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置で異なる。
【００３５】
ある特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、例えば、ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインにおいて、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、例えば、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインにおいて、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む。
【００３６】
ある特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、例えば、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインにおいて、Ｔ３６６Ｗ置換を含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、例えば、ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインにおいて、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換を含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む。
【００３７】
ある特定の実施形態では、タンパク質は、配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１９４、配列番号１５５または配列番号１４８の配列を含む。ある特定の実施形態では、この配列は、抗体Ｆｃドメインに連結したＦａｂ断片の重鎖部分を表す。
【００３８】
ある特定の実施形態では、タンパク質は、配列番号１４０または配列番号１４６の配列を含む。ある特定の実施形態では、この配列は、抗体Ｆｃドメインに連結したｓｃＦｖを表す。
【００３９】
別の態様では、本開示は、（ａ）配列番号１４１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；（ｂ）配列番号１４０、配列番号１９０または配列番号１９２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および（ｃ）配列番号１４２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含むタンパク質（例えば、多重特異性結合タンパク質）を提供する。ある特定の実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号１４０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
別の態様では、本開示は、（ａ）配列番号１４１と少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；（ｂ）配列番号１４０、配列番号１９０または配列番号１９２と少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および（ｃ）配列番号１４２と少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含むタンパク質（例えば、多重特異性結合タンパク質）を提供する。ある特定の実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号１４０と少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
別の態様では、本開示は、（ａ）配列番号１４１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；（ｂ）配列番号１４０、配列番号１９０または配列番号１９２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および（ｃ）配列番号１４２のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含むタンパク質（例えば、多重特異性結合タンパク質）を提供する。ある特定の実施形態では、タンパク質は、（ａ）配列番号１４１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；（ｂ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および（ｃ）配列番号１４２のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含む。
【００４２】
別の態様では、本開示は、本明細書で開示されるタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む製剤を提供する。
【００４３】
別の態様では、本開示は、本明細書で開示されるタンパク質を発現する１つまたは複数の核酸を含む細胞を提供する。
【００４４】
別の態様では、本開示は、腫瘍細胞死を直接的および／または間接的に増強する方法であって、腫瘍およびナチュラルキラー細胞を、本明細書で開示されるタンパク質に曝露するステップを含む方法を提供する。
【００４５】
別の態様では、本開示は、がんを処置する方法であって、本明細書で開示されるタンパク質または製剤を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、がんは、乳がん、甲状腺がん、胃がん、腎細胞癌、肺の腺癌、前立腺がん、胆管癌、子宮がん、膵臓がん、結腸直腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肺扁平上皮がん（ｌｕｎｇ  ｓｑｕａｍｏｕｓ）、中皮腫、肝臓がん、中皮腫、肉腫および胆嚢がんからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖと、ＮＫＧ２Ｄ標的化Ｆａｂと、ＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化抗体定常領域／ドメイン（「ＣＤドメイン」）とを含有する三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）（ｓｃＦｖ−Ｆａｂフォーマット）を示す。例示的な実施形態では、Ｆｃヘテロ二量体（図１でＦｃドメインの三角形の鍵と鍵穴のフォーマットとして示される）を形成するために、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗの変異を含み、ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、適合変異Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔを含む。抗体フォーマットは、本明細書でＦ３’−ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。別の例示的な実施形態では、ヘテロ二量体を形成するために、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔの変異を含み、ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、適合変異Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含む。
【００４７】
【図２】図２は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、ＨＥＲ２に結合するｓｃＦｖと、（ａ）重鎖可変ドメイン、およびＦｃドメインに接続したＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに（ｂ）軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む軽鎖部分を含むＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む「ノブインホール」（ＫｉＨ）ＴｒｉＮＫＥＴの描写である。例示的な実施形態では、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、ノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、適合「ホール」変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含む（図２でＦｃドメインの三角形の鍵と鍵穴のフォーマットとして示される）。例示的な実施形態では、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、ノブ変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、「ホール」変異Ｔ３６６Ｗを含む。
【００４８】
【図３】図３は、ＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴがＨＥＲ２＋（低）細胞系に対してトラスツズマブよりも強力であることを実証する線グラフである。
【００４９】
【図４】図４は、ＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴがＨＥＲ２＋＋細胞系に対してトラスツズマブよりも強力であることを実証する線グラフである。
【００５０】
【図５】図５は、ＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴがＨＥＲ２＋＋＋細胞系に対してトラスツズマブよりも強力であることを実証する線グラフである。
【００５１】
【図６】図６は、ＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴが長期殺滅アッセイにおいてトラスツズマブよりも優れていることを示す。
【００５２】
【図７】図７は、ＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴが長期殺滅アッセイにおいてトラスツズマブよりも優れていることを示す。
【００５３】
【図８−１】図８Ａ〜８Ｆは、ＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴがヒト血中において免疫細胞への最小限の結合を示すことを示すＦＡＣＳである。図８Ａは、ＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴがヒト血中においてＮＫ細胞への最小限の結合を示すことを示す；図８Ｂは、ＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴがＣＤ８＋Ｔ細胞への最小限の結合を示すことを示す；図８Ｃは、ＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴがＣＤ４＋Ｔ細胞への最小限の結合を示すことを示す；図８Ｄは、ＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴがＢ細胞への最小限の結合を示すことを示す；図８Ｅは、ＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴが単球への最小限の結合を示すことを示す；図８Ｆは、ＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴが顆粒細胞への最小限の結合を示すことを示す（点線−二次対照；破線−トラスツズマブ；実線−ＨＥＲ２−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ａ４９）。
【図８−２】同上。
【００５４】
【図９】図９は、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブのヒト心筋細胞、ＳＫＢＲ３、Ｈ６６１および７８６−Ｏがん細胞への結合を実証する線グラフである。
【００５５】
【図１０−１】図１０Ａは、１：１のＰＢＭＣ対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）での３日間の共培養後のＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ媒介ヒトＰＢＭＣによるＳＫＢＲ３がんの殺滅を示す。
【００５６】
【図１０−２】図１０Ｂは、１：１のＰＢＭＣ対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）での３日間の共培養後でさえも、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、非悪性の健康な心筋細胞を死滅させないことを示す。
【００５７】
【図１１−１】図１１Ａは、２０：１のＰＢＭＣ対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）での３日間の共培養後のＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ媒介ヒトＰＢＭＣによるＳＫＢＲ３がん細胞の殺滅を示す。
【００５８】
【図１１−２】図１１Ｂは、２０：１のＰＢＭＣ対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）での３日間の共培養後でさえも、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、非悪性の健康な心筋細胞を死滅させないことを示す。
【００５９】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、ｃｏｎＡ刺激で生成し、ＩＬ−１５を伴って培養したＣＤ８＋Ｔ細胞は、高純度であり（ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の９９％）（図１２Ａ）、全てＮＫＧ２Ｄを発現した（図１２Ｂ）が、ＣＤ１６を発現しなかった（図１２Ｃ）ことを示す。
【００６０】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、ＩＬ−１５を伴って培養した後の、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブの存在下でのＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を示すグラフである。図１３Ａは、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブによる短期共培養におけるＳｋＢｒ−３腫瘍細胞の殺滅の増強を示す。ＨＥＲ２標的化Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、ＩＬ−１５によって刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞によるＳｋＢｒ−３標的細胞の用量依存的溶解を誘発した。図１３Ｂは、６７ｎＭのＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴが、ＩＬ−２によって刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞によるＳｋＢｒ−３標的細胞の溶解を誘発したことを示す。点線は、ＳｋＢｒ−３腫瘍細胞と共培養したＣＤ８＋Ｔ細胞のみ（非処置）での効果を示す。
【００６１】
【図１４−１】図１４Ａは、各々抗ＣＤ３の存在下で、単独で培養した、ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと共培養したＳｋＢｒ−３細胞の成長レベルパーセントを示す。
【００６２】
【図１４−２】図１４Ｂは、各々抗ＣＤ３の非存在下で、単独で培養した、ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと共培養したＳｋＢｒ−３細胞の成長レベルパーセントを示す。
【００６３】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂは、一連の濃度のＴｒｉＮＫＥＴまたはトラスツズマブ、およびフルオロフォアとコンジュゲートした二次抗体とインキュベートしたＳｋＢｒ−３細胞のフローサイトメトリーによって測定した、ＴｒｉＮＫＥＴの、高レベルのＨＥＲ２発現を有するＳｋＢｒ−３細胞系への結合を示す。図１５Ａは、６７０ｎＭのＴｒｉＮＫＥＴとインキュベートした細胞で観察された最大の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）に対する、ＭＦＩのパーセンテージ値としての結合レベルを示す。図１５Ｂは、二次抗体のみとインキュベートした細胞で観察されたバックグラウンドＭＦＩに対する、ＭＦＩのバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）値としての結合レベルを示す。
【００６４】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、一連の濃度のＴｒｉＮＫＥＴまたはトラスツズマブ、およびフルオロフォアとコンジュゲートした二次抗体とインキュベートしたＮＣＩ−Ｈ６６１細胞のフローサイトメトリーによって測定した、ＴｒｉＮＫＥＴの、中程度のレベルのＨＥＲ２発現を有するＮＣＩ−Ｈ６６１細胞系への結合を示す。図１６Ａは、６７０ｎＭのＴｒｉＮＫＥＴとインキュベートした細胞で観察された最大の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）に対する、ＭＦＩのパーセンテージ値としての結合レベルを示す。図１６Ｂは、二次抗体のみとインキュベートした細胞で観察されたバックグラウンドＭＦＩに対する、ＭＦＩのバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）値としての結合レベルを示す。
【００６５】
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｂは、一連の濃度のＴｒｉＮＫＥＴまたはトラスツズマブ、およびフルオロフォアとコンジュゲートした二次抗体とインキュベートした７８６−Ｏ細胞のフローサイトメトリーによって測定した、ＴｒｉＮＫＥＴの、低レベルのＨＥＲ２発現を有する７８６−Ｏ細胞系への結合を示す。図１６Ａは、６７０ｎＭのＴｒｉＮＫＥＴとインキュベートした細胞で観察された最大の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）に対する、ＭＦＩのパーセンテージ値としての結合レベルを示す。図１６Ｂは、二次抗体のみとインキュベートした細胞で観察されたバックグラウンドＭＦＩに対する、ＭＦＩのバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）値としての結合レベルを示す。
【００６６】
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｂは、一連の濃度のＴｒｉＮＫＥＴまたはトラスツズマブ、およびフルオロフォアとコンジュゲートした二次抗体とインキュベートしたＥＬ４細胞のフローサイトメトリーによって測定した、ＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴの、ｈＮＫＧ２Ｄ発現ＥＬ４細胞への結合を示す。結合レベルは、二次抗体のみとインキュベートした細胞で観察されたバックグラウンドＭＦＩに対する、ＭＦＩのバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）値として示される。
【００６７】
【図１９】図１９は、ＴｒｉＮＫＥＴが、ＦｃサイレントＴｒｉＮＫＥＴとトラスツズマブとの組合せよりも、ＮＫ細胞による７８６−Ｏ標的細胞殺滅を媒介することにおいて強力かつ有効であることを示す。
【００６８】
【図２０】図２０は、ＴｒｉＮＫＥＴが、ＦｃサイレントＴｒｉＮＫＥＴとトラスツズマブとの組合せよりも、ＮＫ細胞によるＨ６６１標的細胞殺滅を媒介することにおいて強力かつ有効であることを示す。
【００６９】
【図２１】図２１は、ＴｒｉＮＫＥＴ  ＡおよびＴｒｉＮＫＥＴ  Ａ＊（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブのＭ１０２がＩで置換されている）の、ＮＫ細胞のＳＫＢＲ−３標的細胞に対する細胞傷害性を媒介することにおける効力を示す線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
本発明は、がん細胞上のＨＥＲ２、ならびにナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合する多重特異性結合タンパク質、そのような多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびにそのような多重特異性タンパク質および医薬組成物を使用するがんの処置のための治療方法を含む治療方法を提供する。本発明のさまざまな態様は、以下の節で示されるが、しかしながら、１つの特定の節で説明されている本発明の態様は、任意の特定の節に限定されるべきではない。
【００７１】
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語および句を以下で定義する。
【００７２】
本明細書で使用される「ａ」および「ａｎ」という用語は「１つまたは複数」を意味し、文脈が不適切でない限り、複数形を含む。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に参加する免疫グロブリン分子の部分を指す。ヒト抗体では、抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多様な範囲は「超可変領域」と呼ばれ、これらは「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存された隣接範囲の間に挿入されている。よって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間におよびこれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、抗原結合表面を形成するように三次元空間で互いに対して配置されている。抗原結合表面は、結合抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。ラクダおよび軟骨魚類などのある特定の動物では、抗原結合部位が単一抗体鎖によって形成されて、「単一ドメイン抗体」をもたらす。抗原結合部位は、インタクト抗体に、抗原結合性表面を保持する抗体の抗原結合性断片に、または単一のポリペプチドにおいて重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに接続するペプチドリンカーを使用するｓｃＦｖなどの組換えポリペプチドに存在し得る。本明細書で開示する重鎖または軽鎖可変領域の全てのアミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って番号付けている。
【００７４】
本明細書で使用される「腫瘍関連抗原」という用語は、それだけに限らないが、がんに関連するタンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物または脂質を含む任意の抗原を意味する。そのような抗原は、悪性細胞上、または腫瘍微小環境内、例えば、腫瘍関連血管、細胞外基質、間葉系間質もしくは免疫浸潤物において発現し得る。
【００７５】
抗原結合部位のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２，  ６６０９−６６１６  （１９７７）およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  （１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７  （１９８７）、およびＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６２：７３２−７４５  （１９９６）に記載される方法によって決定することができる。これらの定義の下で決定されるＣＤＲは、典型的には互いに対して比較すると、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。ある特定の実施形態では、「ＣＤＲ」という用語は、ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６２：７３２−７４５  （１９９６）およびＭａｒｔｉｎ  Ａ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ，  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，  ｅｄｓ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ３１，  ｐｐ．  ４２２−４３９，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ  （２００１）によって定義されるＣＤＲである。ある特定の実施形態では、「ＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２，  ６６０９−６６１６  （１９７７）およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  （１９９１）によって定義されるＣＤＲである。ある特定の実施形態では、抗体の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲは、種々の規則（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）を使用して定義される。例えば、ある特定の実施形態では、重鎖ＣＤＲはＭａｃＣａｌｌｕｍ（上記）に従って定義され、軽鎖ＣＤＲはＫａｂａｔ（上記）に従って定義される。ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は重鎖ＣＤＲを表し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は軽鎖ＣＤＲを表す。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書に記載される方法および組成物によって処置される生物を指す。このような生物には、好ましくは、それだけに限らないが、哺乳動物（例えば、マウス、類人猿、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれ、より好ましくは、ヒトが含まれる。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な化合物（例えば、本発明の化合物）の量を指す。有効量は、１回または複数回の投与、塗布または投与量で投与することができ、特定の製剤に限定されることも、投与経路に限定されることも意図していない。本明細書で使用される場合、「処置する」という用語は、状態、疾患、障害などの改善をもたらす、任意の効果、例えば軽減すること、減少させること、モジュレートすること、改善することもしくは排除すること、またはその症状を改善することを含む。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、活性剤と、組成物をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの診断的または治療的使用に特に適したものにする、不活性または活性の担体の組合せを指す。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝食塩溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水型もしくは水／油型エマルジョンなど）、およびさまざまな種類の湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかを指す。組成物はまた、安定剤および保存剤を含むことができる。担体、安定剤およびアジュバントの例については、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ  ［１９７５］を参照されたい。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、対象に投与すると、本発明の化合物またはその活性代謝産物もしくは残基を提供することができる、本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸または塩基）を指す。当業者に公知のように、本発明の化合物の「塩」は、無機酸または有機酸および無機塩基または有機塩基から得られ得る。例示的な酸としては、それだけに限らないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。シュウ酸などの他の酸も、それ自体は薬学的に許容されないが、本発明の化合物およびその薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製に使用され得る。
【００８１】
例示的な塩基としては、それだけに限らないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、および式ＮＷ４＋（式中、ＷはＣ１〜４アルキルである）の化合物などが挙げられる。
【００８２】
例示的な塩としては、それだけに限らないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩（ｆｌｕｃｏｈｅｐｔａｎｏａｔｅ）、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などが挙げられる。塩の他の例としては、Ｎａ＋、ＮＨ４＋およびＮＷ４＋（式中、ＷはＣ１〜４アルキル基である）等などの適切なカチオンと複合した本発明の化合物のアニオンが挙げられる。
【００８３】
治療的使用については、本発明の化合物の塩が、薬学的に許容されるとして企図される。しかしながら、薬学的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において用途を見出し得る。
【００８４】
本明細書を通して、組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている場合、またはプロセスおよび方法が特定のステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている場合、さらに、列挙される成分から本質的になるまたはそれからなる本発明の組成物が存在すること、ならびに列挙される処理ステップから本質的になるまたはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが企図される。
【００８５】
一般に、パーセンテージを指定する組成物は、特に指定しない限り、重量による。さらに、変数が定義を伴わない場合、変数の前の定義が支配する。
Ｉ．タンパク質
【００８６】
本発明は、がん細胞上のＨＥＲ２、ならびにナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合してナチュラルキラー細胞を活性化する多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書に記載される医薬組成物および治療方法において有用である。多重特異性結合タンパク質の、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体への結合は、ナチュラルキラー細胞の、がん細胞の破壊への活性を増強する。多重特異性結合タンパク質の、がん細胞上のＨＥＲ２への結合は、がん細胞をナチュラルキラー細胞に近づけ、このことは、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接的および間接的破壊を促進する。例示的な多重特異性結合タンパク質のさらなる説明を以下に提供する。
【００８７】
多重特異性結合タンパク質の第１の成分は、それだけに限らないが、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８＋αβＴ細胞を含み得るＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合する。ＮＫＧ２Ｄに結合すると、多重特異性結合タンパク質は、天然リガンド、例えばＵＬＢＰ６およびＭＩＣＡがＮＫＧ２Ｄに結合してＮＫ細胞を活性化するのを遮断し得る。
【００８８】
多重特異性結合タンパク質の第２の成分は、それだけに限らないが、乳がん、卵巣がん、食道がん、膀胱がんおよび胃がん、唾液腺導管癌、肺の腺癌、ならびに攻撃的形態の子宮がん、例えば、子宮漿液性子宮内膜癌を含み得るＨＥＲ２発現細胞に結合する。
【００８９】
多重特異性結合タンパク質の第３の成分は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞および濾胞樹状細胞を含む白血球の表面上のＦｃ受容体であるＣＤ１６を発現する細胞に結合する。
【００９０】
本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質は、さまざまなフォーマットをとることができる。例えば、１つのフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体多重特異性抗体を含む（図１）。第１の免疫グロブリン重鎖は、重鎖可変ドメインおよび重鎖ＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖部分からなるＦａｂ断片に、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して融合された第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを含み、Ｆａｂ断片の重鎖および軽鎖部分は、ＮＫＧ２Ｄと対形成し、これに結合する。第２の免疫グロブリン重鎖は、ＨＥＲ２抗原と対形成し、これに結合する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインからなる一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）に、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して融合された第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを含む。
【００９１】
一部の実施形態では、上記の一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）はヒンジ配列を介して抗体定常ドメインに連結している。一部の実施形態では、ヒンジはアミノ酸Ａｌａ−Ｓｅｒを含む。一部の他の実施形態では、ヒンジはアミノ酸Ａｌａ−ＳｅｒおよびＴｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙを含む。ヒンジ配列は、標的抗原への結合の柔軟性を提供し、柔軟性と最適な形状寸法との間のバランスをとることができる。
【００９２】
一部の実施形態では、上記の一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）は重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成して、ｓｃＦｖの安定性を増強する。例えば、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４残基と軽鎖可変ドメインのＣ１００残基との間に形成され得、アミノ酸位置はＫａｂａｔで番号付けされる。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインはフレキシブルリンカーを介して軽鎖可変ドメインに連結している。任意の適切なリンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号２０３）を使用することができる。ｓｃＦｖの一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは軽鎖可変ドメインのＮ末端に位置する。ｓｃＦｖの一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する。
【００９３】
本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質は、１つまたは複数の追加の抗原結合部位をさらに含んでもよい。追加の抗原結合部位は、必要に応じてリンカー配列を介して、定常領域ＣＨ２ドメインのＣ末端に、または定常領域ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合してもよい。ある特定の実施形態では、追加の抗原結合部位は、必要に応じてジスルフィド安定化されている一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）の形態をとり、四価または三価多重特異性結合タンパク質をもたらす。例えば、多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位と、ＨＥＲ２結合部位と、腫瘍関連抗原に結合する第３の抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常領域もしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第４の抗原結合部位とを含む。これらの抗原結合部位の任意の１つは、ＦａｂまたはｓｃＦｖ、例えば、上記のｓｃＦｖの形態のいずれかをとることができる。一部の実施形態では、第３の抗原結合部位は、ＨＥＲ２とは異なる腫瘍関連抗原に結合する。一部の実施形態では、第３の抗原結合部位は、同じ腫瘍関連抗原ＨＥＲ２に結合し、例示的なフォーマットを図２Ｃおよび２Ｄに示す。したがって、多重特異性結合タンパク質は、二価のＨＥＲ２結合を提供することができる。多重特異性タンパク質による二価のＨＥＲ２結合は、がん細胞表面上のＨＥＲ２を安定化し、ＮＫ細胞の、がん細胞に対する細胞傷害性を増強することができる。多重特異性タンパク質による二価のＨＥＲ２結合は、多重特異性タンパク質の、がん細胞へのより強い結合を与え、それによって、ＮＫ細胞の、がん細胞への、とりわけ低レベルのＨＥＲ２を発現するがん細胞へのより強い細胞傷害性応答を促進することができる。
【００９４】
Ｆｃドメイン内では、ＣＤ１６結合が、ヒンジ領域およびＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内では、ＣＤ１６との相互作用が、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５−Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７−Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７−Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４−Ｓｅｒ２３９、およびＣＨ２ドメイン中の炭水化物残基Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに主に集中している（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０６  （６７９３）：２６７−２７３参照）。公知のドメインに基づいて、例えば、ファージディスプレイライブラリーもしくは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリーを使用することにより、ＣＤ１６に対する結合親和性を増強もしくは減少させるように変異を選択することができる、または相互作用の公知の三次元構造に基づいて変異を設計することができる。
【００９５】
一部の実施形態では、抗体定常ドメインは、ＩｇＧ抗体、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。一部の実施形態では、抗体定常ドメインに変異を導入して、別の抗体定常ドメインとのヘテロ二量体化を可能にする。例えば、抗体定常ドメインがヒトＩｇＧ１の定常ドメインに由来する場合、抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでよく、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置で異なる。本明細書で開示するＦｃドメインまたはヒンジ領域の全てのアミノ酸位置は、ＥＵナンバリングに従って番号付けている。
【００９６】
一部の実施形態では、抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでよく、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９ＤおよびＫ４３９Ｅからなる群から選択される１つまたは複数の置換によって異なる。
【００９７】
多重特異性結合タンパク質の個々の成分を、以下により詳細に説明する。
ＮＫＧ２Ｄ結合部位
【００９８】
ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびにがん細胞上の腫瘍関連抗原への結合に際して、多重特異性結合タンパク質は、１種類より多くのＮＫ活性化受容体と結合することができ、天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合を遮断し得る。ある特定の実施形態では、タンパク質は、ヒトにおいてＮＫ細胞に対してアゴニストとして作用することができる。一部の実施形態では、タンパク質は、ヒトにおいて、ならびに他の種、例えば、げっ歯類およびカニクイザルにおいて、ＮＫ細胞に対してアゴニストとして作用することができる。
【００９９】
表１は、組み合わせて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列挙する。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、Ｆａｂフォーマットで配置される。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、互いに融合されてｓｃＦｖを形成する（ｆｒｏｍ  ａｎ  ｓｃＦｖ）。
【０１００】
表１で列挙されるＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、それらのＮＫＧ２Ｄへの結合親和性において異なり得るが、それにもかかわらず、それらは全て、ヒトＮＫ細胞を活性化する。
【０１０１】
別に指示しない限り、表１に提供されるＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔに基づいて決定される。
【表１−１】
2021533161.tif 000003
【表１−２】
2021533161.tif 000004
【表１−３】
2021533161.tif 000005
【表１−４】
2021533161.tif 000006
【表１−５】
2021533161.tif 000007
【表１−６】
2021533161.tif 000008
【表１−７】
2021533161.tif 000009
【表１−８】
2021533161.tif 000010
【表１−９】
2021533161.tif 000011
【表１−１０】
2021533161.tif 000012
【表１−１１】
2021533161.tif 000013
【表１−１２】
2021533161.tif 000014
【表１−１３】
2021533161.tif 000015
【０１０２】
あるいは、ＵＳ９，２７３，１３６で示されるように、配列番号１１０によって表される重鎖可変ドメインを配列番号１１１によって表される軽鎖可変ドメインと対形成させて、ＮＫＧ２Ｄに結合し得る抗原結合部位を形成することができる。
配列番号１１０
【化１】
2021533161.tif 000016
配列番号１１１
【化２】
2021533161.tif 000017
【０１０３】
あるいは、ＵＳ７，８７９，９８５で示されるように、配列番号１１２によって表される重鎖可変ドメインを配列番号１１３によって表される軽鎖可変ドメインと対形成させて、ＮＫＧ２Ｄに結合し得る抗原結合部位を形成することができる。
配列番号１１２
【化３】
2021533161.tif 000018
配列番号１１３
【化４】
2021533161.tif 000019
【０１０４】
多重特異性結合タンパク質は、それだけに限らないが、ＮＫ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８＋αβＴ細胞を含むＮＫＧ２Ｄ発現細胞に結合することができる。ＮＫＧ２Ｄに結合すると、多重特異性結合タンパク質は、天然リガンド、例えばＵＬＢＰ６およびＭＩＣＡがＮＫＧ２Ｄに結合してＮＫ細胞を活性化するのを遮断し得る。
【０１０５】
多重特異性結合タンパク質は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞および濾胞樹状細胞を含む白血球の表面上のＦｃ受容体であるＣＤ１６を発現する細胞に結合する。本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに２ｎＭ〜１２０ｎＭ、例えば、２ｎＭ〜１１０ｎＭ、２ｎＭ〜１００ｎＭ、２ｎＭ〜９０ｎＭ、２ｎＭ〜８０ｎＭ、２ｎＭ〜７０ｎＭ、２ｎＭ〜６０ｎＭ、２ｎＭ〜５０ｎＭ、２ｎＭ〜４０ｎＭ、２ｎＭ〜３０ｎＭ、２ｎＭ〜２０ｎＭ、２ｎＭ〜１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約１４ｎＭ、約１３ｎＭ、約１２ｎＭ、約１１ｎＭ、約１０ｎＭ、約９ｎＭ、約８ｎＭ、約７ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４．５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ〜約１ｎＭ、約１ｎＭ〜約２ｎＭ、約２ｎＭ〜３ｎＭ、約３ｎＭ〜４ｎＭ、約４ｎＭ〜約５ｎＭ、約５ｎＭ〜約６ｎＭ、約６ｎＭ〜約７ｎＭ、約７ｎＭ〜約８ｎＭ、約８ｎＭ〜約９ｎＭ、約９ｎＭ〜約１０ｎＭ、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約２ｎＭ〜約１０ｎＭ、約３ｎＭ〜約１０ｎＭ、約４ｎＭ〜約１０ｎＭ、約５ｎＭ〜約１０ｎＭ、約６ｎＭ〜約１０ｎＭ、約７ｎＭ〜約１０ｎＭ、または約８ｎＭ〜約１０ｎＭのＫＤの親和性で結合する。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、ＮＫＧ２Ｄに１０〜６２ｎＭのＫＤで結合する。
ＨＥＲ２結合部位
【０１０６】
本明細書で開示する多重特異性結合タンパク質のＨＥＲ２結合部位は、互いに融合されてｓｃＦｖを形成する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
【０１０７】
表２は、組み合わせて、ＨＥＲ２に結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列挙する。
【表２−１】
2021533161.tif 000020
【表２−２】
2021533161.tif 000021
【表２−３】
2021533161.tif 000022
【０１０８】
あるいは、ＨＥＲ２に結合することができる新規抗原結合部位は、配列番号１３８によって定義されるアミノ酸配列またはその成熟細胞外断片への結合についてのスクリーニングによって同定することができる。
【化５】
2021533161.tif 000023
（配列番号：１３８）
【０１０９】
ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬは、さまざまな向きで位置することができる。ある特定の実施形態では、ＶＬは、ＶＨのＮ末端に位置する。ある特定の実施形態では、ＶＬは、ＶＨのＣ末端に位置する。
【０１１０】
ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬは、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを介して接続することができる。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、フレキシブルリンカーである。リンカーのアミノ酸組成について、ペプチドは、柔軟性を与え、本発明のタンパク質の他のドメインの構造および機能に干渉せず、かつプロテアーゼによる切断に抵抗する特性を有するように選択される。例えば、グリシンおよびセリン残基は、一般的に、プロテアーゼ抵抗性を与える。ある特定の実施形態では、ＶＬは、ＶＨのＮ末端に位置し、リンカーを介してＶＨに接続している。
【０１１１】
リンカーの長さ（例えば、フレキシブルリンカー）は、「短く」てもよく、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２個のアミノ酸残基であってもよく、または「長く」てもよく、例えば、少なくとも１３個のアミノ酸残基であってもよい。ある特定の実施形態では、リンカーは、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０または２０〜２５個のアミノ酸残基の長さである。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、リンカーは、（ＧＳ）ｎ（配列番号２０４）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号２０５）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２０６）、（ＧＧＳＧ）ｎ（配列番号２０７）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（配列番号２０８）および（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２０９）配列を含むか、またはこれからなり、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。ある特定の実施形態では、リンカーは、表３で列挙される、配列番号１４３、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号８３、配列番号８４、配列番号１５０、配列番号１５２および配列番号１５４から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、リンカーは、配列番号１４３の配列からなる（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２０３）リンカーである。
【表３】
2021533161.tif 000024
Ｆｃドメイン
【０１１３】
Ｆｃドメイン内では、ＣＤ１６結合は、ヒンジ領域およびＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内では、ＣＤ１６との相互作用は、主に、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５−Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７−Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７−Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４−Ｓｅｒ２３９、およびＣＨ２ドメイン内の炭水化物残基Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに集中している（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０６  （６７９３）：２６７−２７３を参照されたい）。公知のドメインに基づいて、例えば、ファージディスプレイライブラリーまたは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリーを使用することによって、ＣＤ１６への結合親和性を増強または低減するように変異を選択してもよく、公知の相互作用の三次元構造に基づいて変異を設計してもよい。
【０１１４】
ヘテロ二量体抗体重鎖の組立は、同じ細胞中で２つの異なる抗体重鎖配列を発現させることにより達成することができるが、これは各抗体重鎖のホモ二量体の組立ならびにヘテロ二量体の組立をもたらし得る。ヘテロ二量体の優先的な組立の促進は、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０およびＵＳ１４／８３０３３６に示されるように、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメイン中に異なる変異を組み込むことにより達成することができる。例えば、ヒトＩｇＧ１に基づくＣＨ３ドメインで、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが互いに選択的にヘテロ二量体化することを可能にするアミノ酸置換の異なるペアをこれらの２つの鎖内に組み込んで、変異を導入することができる。以下に例示されるアミノ酸置換の位置は全てＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされている。
【０１１５】
１つのシナリオでは、第１のポリペプチド中のアミノ酸置換が元のアミノ酸をアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）から選択されるより大きなアミノ酸で置き換え、第２のポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸置換が元のアミノ酸（複数可）をアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）またはバリン（Ｖ）から選択されるより小さなアミノ酸（複数可）で置き換えて、結果としてより大きなアミノ酸置換（突出部）がより小さなアミノ酸置換（窪み）の表面にはまる。例えば、一方のポリペプチドがＴ３６６Ｗ置換を組み込むことができ、他方がＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込むことができる。
【０１１６】
本発明の抗体重鎖可変ドメインを、必要に応じて、ＣＨ１ドメインを含むまたは含まない、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ定常領域などの抗体定常領域と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列に連結することができる。一部の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域またはＩｇＧ４定常領域などのヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。一部の他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスまたはウマなどの別の哺乳動物の抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１および／またはＫ４３９で、１つまたは複数の変異を定常領域に組み込むことができる。例示的な置換としては、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９ＤおよびＫ４３９Ｅが挙げられる。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込むことができる変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１および／またはＶ１７３にあり得る。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに組み込むことができる変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４および／またはＴ１６４にあり得る。
【０１１８】
アミノ酸置換を、表４に示される以下の置換のセットから選択することができる。
【表４−１】
2021533161.tif 000025
【表４−２】
2021533161.tif 000026
【０１１９】
あるいは、アミノ酸置換を、表５に示される以下の置換のセットから選択することができる。
【表５】
2021533161.tif 000027
【０１２０】
あるいは、アミノ酸置換を、表６に示される以下の置換のセットから選択することができる。
【表６】
2021533161.tif 000028
【０１２１】
あるいは、各ポリペプチド鎖中の少なくとも１つのアミノ酸置換を表７から選択することができる。
【表７】
2021533161.tif 000029
【０１２２】
あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換を、第１のポリペプチドの列に示される位置（複数可）が任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドの列に示される位置（複数可）が任意の公知の正に帯電したアミノ酸によって置き換えられている、表８の以下の置換のセットから選択することができる。
【表８】
2021533161.tif 000030
【０１２３】
あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換を、第１のポリペプチドの例に示される位置（複数可）が任意の公知の正に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドの列に示される位置（複数可）が任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられている、表９の以下のセットから選択することができる。
【表９】
2021533161.tif 000031
【０１２４】
あるいは、アミノ酸置換を、表１０の以下のセットから選択することができる。
【表１０】
2021533161.tif 000032
【０１２５】
あるいは、またはさらに、第１または第２のポリペプチド鎖のいずれかにＳ３５４Ｃ、および反対側のポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入して、２つのポリペプチドの界面内に人工的なジスルフィド架橋を形成することにより、ヘテロ多量体タンパク質の構造的安定性を増加させることができる。
【０１２６】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、位置Ｔ３６６でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１２７】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、位置Ｔ３６６でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１２８】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１２９】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１３０】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１３１】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１３２】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１３３】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１３４】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１３５】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１３６】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１３７】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１３８】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１３９】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１４０】
一部の実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１４１】
一部の実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１４２】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１４３】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１４４】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１４５】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０１４６】
本開示で説明するある特定のタンパク質は、Ｆｃ配列の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）を誘導する能力を低減させる１つまたは複数の変異を含むＦｃドメインを有する。少なくとも１つの変異は、アミノ酸２３２〜２３９、２６５〜２７０、２９６〜２９９および３２５〜３３２位を含む領域に位置する（Ｗａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｌｌ  （２０１８）  ９（１）：６３−７３を参照されたい）。変異は、１つまたは複数の位置２３３、２３４、２３５、２９７および３２９におけるアミノ酸置換（野生型ヒトＩｇＧ１と比較して）を含み得る。１つまたは複数の変異は、野生型ヒトＩｇＧ１と比較してＥ２３３Ｐ；Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７ＧもしくはＮ２９７Ｄ；および／またはＰ３２９Ａ、Ｐ３２９ＧもしくはＰ３２９Ｒを含み得る。１つまたは複数の変異は、野生型ヒトＩｇＧ１と比較してＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含み得る。あるいは、１つまたは複数の変異は、野生型ヒトＩｇＧ１と比較してＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ａを含み得る。変異は、Ｆｃドメインの２つのポリペプチド鎖の各々に存在してもよい。
例示的な多重特異性結合タンパク質
【０１４７】
各々、抗体定常領域に連結した、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖおよびＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂを含むＴｒｉＮＫＥＴの例を以下に列挙し、抗体定常領域は、２つのＦｃ鎖のヘテロ二量体化を可能にする変異を含む。ｓｃＦｖは、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ）由来の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＬの１００位およびＶＨの４４位のアミノ酸残基についてＣｙｓの置換をさらに含み、それによって、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のジスルフィド架橋の形成を促進する。ＶＬは、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号２０３）を介してＶＨのＮ末端に連結しており、ＶＨは、Ａｌａ−Ｓｅｒリンカーを介してＦｃのＮ末端に連結している。Ａｌａ−Ｓｅｒリンカーはエルボーヒンジ領域配列に含まれ、柔軟性と最適形状寸法との間で平衡を保つ。ある特定の実施形態では、追加の配列Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙは、ヒンジのＡｌａ−Ｓｅｒ配列のＮ末端またはＣ末端に付加され得る。これらの例示的なＴｒｉＮＫＥＴを説明するために本明細書で使用される場合、Ｆｃとは、抗体ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。
【０１４８】
したがって、以下に説明するＴｒｉＮＫＥＴの各々は、以下の３つのポリペプチド鎖、
Ｎ末端〜Ｃ末端：ＮＫＧ２Ｄ結合ＦａｂのＶＨ、ＣＨ１、およびＦｃを含む、鎖Ａ；
Ｎ末端〜Ｃ末端：ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖのＶＬ、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号２０３）、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖのＶＨ、Ａｌａ−Ｓｅｒリンカー、およびＦｃを含む、鎖Ｂ；ならびに
Ｎ末端〜Ｃ末端：ＮＫＧ２Ｄ結合ＦａｂのＶＬ、およびＣＬを含む、鎖Ｃ
を含む。
【０１４９】
例示的なＴｒｉＮＫＥＴのアミノ酸配列を、表１１に要約する。
【表１１−１】
2021533161.tif 000033
【表１１−２】
2021533161.tif 000034
【０１５０】
ある特定の実施形態では、本開示の多重特異性結合タンパク質は、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖および第３のポリペプチド鎖を含み、第１、第２および第３のポリペプチド鎖は、表１１で開示するＴｒｉＮＫＥＴの、それぞれ、鎖Ａ、鎖Ｂおよび鎖Ｃのアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１、第２および第３のポリペプチド鎖は、表１１で開示するＴｒｉＮＫＥＴの、それぞれ、鎖Ａ、鎖Ｂおよび鎖Ｃのアミノ酸配列からなる。
【０１５１】
例示的な実施形態では、ヘテロ二量体を形成するために、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔの変異を含み、ＨＥＲ２  ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、適合変異Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含む。別の例示的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、ノブ（ｋｎｏｂ）変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、「ホール（ｈｏｌｅ）」変異Ｔ３６６Ｗを含む。例示的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｃ置換を含み、それは、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃのＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。
【０１５２】
特定のＴｒｉＮＫＥＴおよびそれらのポリペプチド鎖を、以下により詳細に説明する。アミノ酸配列では、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２０３）およびＡｌａ−Ｓｅｒリンカーは、太字下線で示し；ジスルフィド架橋を形成するｓｃＦｖのＣｙｓ残基は、太字イタリック体下線で示し；Ｆｃヘテロ二量体化変異は、太字下線で示し；Ｋａｂａｔに基づくＣＤＲ配列は、下線で示す。
【０１５３】
例えば、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブである。Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、ＨＥＲ２に結合するトラスツズマブ由来の一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）（配列番号１３９）と；重鎖可変ドメイン（配列番号９４）およびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン（配列番号９８）および軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含む、Ａ４９由来のＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含み、重鎖可変ドメインは、ＣＨ１ドメインに接続しており、ＣＨ１ドメインは、Ｆｃドメインに接続している。Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、配列番号１４０、配列番号１４１および配列番号１４２の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１５４】
配列番号１４０は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためのＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換、ならびに以下に説明する配列番号１４１のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖ（配列番号１３９）は、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号２０３）を介してトラスツズマブの軽鎖可変ドメインのＮ末端に接続したトラスツズマブの重鎖可変ドメインを含み、ｓｃＦｖは、ＶＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨと表される（「（Ｇ４Ｓ）４」は、配列番号２０３または配列番号１４３によって表される）。また、ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖可変ドメインは、それぞれ、ＶＬおよびＶＨのＱ１００ＣおよびＧ４４Ｃ置換の結果として、ＶＬのＣ１００とＶＨのＣ４４との間のジスルフィド架橋を通して接続している。
トラスツズマブｓｃＦｖ
【化６】
2021533161.tif 000035
（配列番号：１３９）
トラスツズマブｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＲＶＴ）
【化７】
2021533161.tif 000036
（配列番号：１４０）
【０１５５】
配列番号１４１は、Ｆａｂ断片の重鎖部分を表し、それは、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号９４）と、Ｆｃドメインに接続したＣＨ１ドメインとを含む。配列番号１４１のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインのＹ３４９Ｃ置換を含み、それは、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃ（配列番号１４０）のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。配列番号１４１では、また、Ｆｃドメインは、配列番号１４０のＦｃとのヘテロ二量体化のためのＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。
Ａ４９  ＶＨ
【化８】
2021533161.tif 000037
（配列番号：９４）
Ａ４９  ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ（ＥＷ）
【化９−１】
2021533161.tif 000038
【化９−２】
2021533161.tif 000039
（配列番号：１４１）
【０１５６】
配列番号１４２は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメイン（配列番号９８）と軽鎖定常ドメインとを含むＦａｂ断片の軽鎖部分を表す。
Ａ４９  ＶＬ
【化１０】
2021533161.tif 000040
（配列番号：９８）
Ａ４９  ＶＬ−ＬＣ
【化１１】
2021533161.tif 000041
（配列番号：１４２）
【０１５７】
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブである。Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１３９）と；重鎖可変ドメイン（配列番号１４４）およびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン（配列番号９８）および軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含む、Ａ４９ＭＩ由来のＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含み、重鎖可変ドメインは、ＣＨ１ドメインに接続しており、ＣＨ１ドメインは、Ｆｃドメインに接続している。Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、配列番号１４０（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）、配列番号１４５および配列番号１４２（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１５８】
配列番号１４５は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号１４４）と、Ｆｃドメインに接続したＣＨ１ドメインとを含む、Ｆａｂ断片の重鎖部分を表す。配列番号１４４では、配列番号９４のＣＤＲ３のメチオニンは、イソロイシンによって置換されている（Ｍ→Ｉ置換；配列番号１４４および配列番号１４５で第３の括弧［］内に示される）。配列番号１４５のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインのＹ３４９Ｃ置換を含み、それは、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃ（配列番号１４０）のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。配列番号１４５では、また、Ｆｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。
Ａ４９ＭＩ  ＶＨ
【化１２】
2021533161.tif 000042
（配列番号：１４４）
Ａ４９ＭＩ  ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ（ＥＷ）
【化１３】
2021533161.tif 000043
（配列番号：１４５）
【０１５９】
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブである。ＫｉＨは、ノブイントゥホール（ＫｉＨ）Ｆｃ技術を指し、それは、ＣＨ３ドメインを操作して、各重鎖において「ノブ」または「ホール」のいずれかを作製してヘテロ二量体化を促進することを伴う。ＫｉＨ  Ｆｃ技術の背景にある概念は、小さな残基の、嵩高い残基での置換（例えば、ＥＵナンバリングでＴ３６６ＷＣＨ３Ａ）によって一方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）に「ノブ」を導入することであった。「ノブ」を収容するために、ノブに最も近い隣接残基をより小さい残基で置き換えること（例えば、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７ＶＣＨ３Ｂ）によって他方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）上に相補的な「ホール」面が作製された。「ホール」変異は、構造に指南されたファージライブラリースクリーニングによって最適化された（Ａｔｗｅｌｌ  Ｓ，  Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ，  Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ，  Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．，  Ｓｔａｂｌｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｏｆ  ａ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９７）  ２７０（１）：２６−３５）。ＫｉＨ  ＦｃバリアントのＸ線結晶構造（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＪＭ，  Ｕｌｔｓｃｈ  Ｍ，  Ｌｅｅ  Ｊ，  Ｔｏｎｇ  Ｒ，  Ｔａｋｅｄａ  Ｋ，  Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｎｏｂ  ａｎｄ  ｈｏｌｅ  ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ＣＨ２−ＣＨ３  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （２０１４）  ４２６（９）：１９４７−５７；Ｍｉｍｏｔｏ  Ｆ，  Ｋａｄｏｎｏ  Ｓ，  Ｋａｔａｄａ  Ｈ，  Ｉｇａｗａ  Ｔ，  Ｋａｍｉｋａｗａ  Ｔ，  Ｈａｔｔｏｒｉ  Ｋ．  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｃ  ｖａｒｉａｎｔ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ＦｃγＲｓ．  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （２０１４）  ５８（１）：１３２−８）によって、ヘテロ二量体化が、ＣＨ３ドメイン間のコア界面で立体的相補性によって駆動される疎水性相互作用により熱力学的に好まれる一方で、ノブ−ノブおよびホール−ホール界面は、それぞれ立体障害および好ましい相互作用の破壊のためにホモ二量体化を好まないことが実証された。
【０１６０】
Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含むＦｃドメインに連結した、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１３９）と；ＣＨ１ドメインがＴ３６６Ｗの「ノブ」置換を含むＦｃドメインに接続している、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、配列番号１４６、配列番号１４７および配列番号１４２（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１６１】
配列番号１４６は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１３９）（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためのＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換、ならびに以下に説明する配列番号１４７のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換を含む。
トラスツズマブｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＫｉＨ）
【化１４】
2021533161.tif 000044
（配列番号：１４６）
【０１６２】
配列番号１４７は、Ａ４９由来のＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号９４）と、Ｆｃドメインに接続したＣＨ１ドメインとを含む、Ｆａｂ断片の重鎖部分を表す。配列番号１４７のＦｃドメインは、Ｓ３５４Ｃ置換を含み、それは、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃ（配列番号１４６）のＣＨ３ドメインのＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。配列番号１４７では、また、Ｆｃドメインは、Ｔ３６６Ｗ置換を含む。
Ａ４９  ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ（ＫｉＨ）
【化１５−１】
2021533161.tif 000045
【化１５−２】
2021533161.tif 000046
（配列番号：１４７）
【０１６３】
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブである。Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含むＦｃドメインに連結した、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１３９）と；ＣＨ１ドメインがＴ３６６Ｗの「ノブ」置換を含むＦｃドメインに接続している、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、配列番号１４６（Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）、配列番号１９４および配列番号１４２（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１６４】
配列番号１９４は、Ａ４９ＭＩ由来のＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号１４４）と、Ｆｃドメインに接続したＣＨ１ドメインとを含む、Ｆａｂ断片の重鎖部分を表す。配列番号１９４のＦｃドメインは、Ｓ３５４Ｃ置換を含み、それは、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃ（配列番号１４６）のＣＨ３ドメインのＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。配列番号１９４では、また、Ｆｃドメインは、Ｔ３６６Ｗ置換を含む。
Ａ４９ＭＩ  ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ（ＫｉＨ）
【化１６】
2021533161.tif 000047
（配列番号：１９４）
【０１６５】
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブである。Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１３９）と；重鎖可変ドメイン（配列番号８６）およびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン（配列番号９０）および軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含む、Ａ４４由来のＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含み、重鎖可変ドメインは、ＣＨ１ドメインに接続しており、ＣＨ１ドメインは、Ｆｃドメインに接続している。Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、配列番号１４０（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）、配列番号１５５および配列番号１４９の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１６６】
配列番号１５５は、Ｆｃドメインに接続した、Ａ４４由来のＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号８６）を表す。配列番号１５５のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインのＹ３４９Ｃ置換を含み、それは、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃ（配列番号１４０）のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。配列番号１５５では、また、Ｆｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。
Ａ４４  ＶＨ
【化１７】
2021533161.tif 000048
（配列番号：８６）
Ａ４４  ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ（ＥＷ）
【化１８】
2021533161.tif 000049
（配列番号：１５５）
【０１６７】
配列番号１４９は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメイン（配列番号９０）と軽鎖定常ドメインとを含む、Ｆａｂ断片の軽鎖部分を表す。
Ａ４４  ＶＬ
【化１９】
2021533161.tif 000050
（配列番号：９０）
Ａ４４  ＶＬ−ＣＬ
【化２０】
2021533161.tif 000051
（配列番号：１４９）
【０１６８】
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４４−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブである。Ａ４４−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含むＦｃドメインに連結した、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１３９）と；ＣＨ１ドメインがＴ３６６Ｗの「ノブ」置換を含むＦｃドメインに接続している、Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。Ａ４４−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、配列番号１４６（Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）、配列番号１４８および配列番号１４９（Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１６９】
配列番号１４８は、Ｆｃドメインに接続した、Ａ４４由来のＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号８６）を表す。配列番号１４８のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインのＹ３４９Ｃ置換を含み、それは、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃ（配列番号１４６）のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。配列番号１４８では、また、Ｆｃドメインは、Ｔ３６６Ｗ置換を含む。
Ａ４４  ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ（ＫｉＨ）
【化２１】
2021533161.tif 000052
（配列番号：１４８）
【０１７０】
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブである。Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブは、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、ＨＥＲ２に結合するペルツズマブ由来のｓｃＦｖ（配列番号１８９）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブは、配列番号１９０、配列番号１４１（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）および配列番号１４２（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１７１】
配列番号１９０は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためのＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換、ならびに上記の配列番号１４１のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖ（配列番号１８９）は、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号２０３）を介してペルツズマブの軽鎖可変ドメインのＮ末端に接続したペルツズマブの重鎖可変ドメインを含み、ｓｃＦｖは、ＶＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨと表される（「（Ｇ４Ｓ）４」は、配列番号２０３または配列番号１４３によって表される）。また、ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖可変ドメインは、それぞれ、ＶＬおよびＶＨのＱ１００ＣおよびＧ４４Ｃ置換の結果として、ＶＬのＣ１００とＶＨのＣ４４との間のジスルフィド架橋を通して接続している。
ペルツズマブｓｃＦｖ
【化２２】
2021533161.tif 000053
（配列番号：１８９）
ペルツズマブｓｃＦｖ−Ｆｃ
【化２３】
2021533161.tif 000054
（配列番号：１９０）
【０１７２】
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブである。Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブは、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１８９）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブは、配列番号１９０（Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブと同様）、配列番号１４５（Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）および配列番号１４２（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１７３】
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブである。Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブは、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１８９）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｗの「ノブ」置換を含む。Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブは、配列番号１９１、配列番号１４７（Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）および配列番号１４２（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１７４】
配列番号１９１は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１８９）（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためのＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換、ならびに上記の配列番号１９１のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換を含む。
ペルツズマブｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＫｉＨ）
【化２４】
2021533161.tif 000055
（配列番号：１９１）
【０１７５】
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブである。Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブは、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１８９）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｗの「ノブ」置換を含む。Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブは、配列番号１９１（Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブと同様）、配列番号１９４（Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）および配列番号１４２（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１７６】
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブである。Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブは、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１８９）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブは、配列番号１９０（Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブと同様）、配列番号１５５（Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）および配列番号１４９（Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１７７】
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４４−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブである。Ａ４４−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブは、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブと同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１８９）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｗの「ノブ」置換を含む。Ａ４４−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブは、配列番号１９１（Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ペルツズマブと同様）、配列番号１４８（Ａ４４−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）および配列番号１４９（Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１７８】
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２である。Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、ＨＥＲ２に結合するＭＧＡＨ２２由来のｓｃＦｖ（配列番号１７１）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２は、配列番号１９２、配列番号１４１（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）および配列番号１４２（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１７９】
配列番号１９２は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためのＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換、ならびに上記の配列番号１４１のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖ（配列番号１７１）は、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号２０３）を介してペルツズマブの軽鎖可変ドメインのＮ末端に接続したペルツズマブの重鎖可変ドメインを含み、ｓｃＦｖは、ＶＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨと表される（「（Ｇ４Ｓ）４」は、配列番号２０３または配列番号１４３によって表される）。また、ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖可変ドメインは、それぞれ、ＶＬおよびＶＨのＧ１００ＣおよびＧ４４Ｃ置換の結果として、ＶＬのＣ１００とＶＨのＣ４４との間のジスルフィド架橋を通して接続している。
ＭＧＡＨ２２  ｓｃＦｖ
【化２５】
2021533161.tif 000056
（配列番号：１７１）
ＭＧＡＨ２２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ
【化２６】
2021533161.tif 000057
（配列番号：１９２）
【０１８０】
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２である。Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２と同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１７１）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２は、配列番号１９２（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２と同様）、配列番号１４５（Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）および配列番号１４２（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１８１】
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２である。Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２と同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１７１）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｗの「ノブ」置換を含む。Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２は、配列番号１９３、配列番号１４７（Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）および配列番号１４２（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１８２】
配列番号１９３は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１７１）（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためのＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換、ならびに上記の配列番号１４７のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換を含む。
ＭＧＡＨ２２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＫｉＨ）
【化２７】
2021533161.tif 000058
（配列番号：１９３）
【０１８３】
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２である。Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２と同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１７１）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｗの「ノブ」置換を含む。Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２は、配列番号１９３（Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２と同様）、配列番号１９４（Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）および配列番号１４２（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１８４】
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２である。Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２と同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１７１）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２は、配列番号１９２（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２と同様）、配列番号１５５（Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）および配列番号１４９（Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１８５】
本開示の別の例示的なＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４４−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２である。Ａ４４−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２と同じＨｅｒ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１７１）と；ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続している、Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同じＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｔ３６６Ｗの「ノブ」置換を含む。Ａ４４−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２は、配列番号１９３（Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＧＡＨ２２と同様）、配列番号１４８（Ａ４４−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）および配列番号１４９（Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブと同様）の配列を有する３つのポリペプチドを含む。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ヘテロ二量体を形成するために、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインが、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔの置換を含み、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインが、適合置換Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含むことを除いては、ＥＷ−ＲＶＴ  Ｆｃ変異を含む上記の例示的なＴｒｉＮＫＥＴのうちの１つと同一である。ある特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ヘテロ二量体を形成するために、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインが、Ｔ３６６Ｗの「ノブ」置換を含むことを除いては、ＫｉＨ  Ｆｃ変異を含む上記の例示的なＴｒｉＮＫＥＴのうちの１つと同一である。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ジスルフィド結合を形成するために、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインが、ＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｃ置換を含み、ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインが、ＣＨ３ドメインの適合Ｙ３４９Ｃ置換を含むことを除いては、上記の例示的なＴｒｉＮＫＥＴのうちの１つと同一である。
【０１８８】
当業者は、タンパク質の産生および／または保存中、Ｎ末端グルタミン酸（Ｅ）またはグルタミン（Ｑ）を環化させて、ラクタムを形成してもよいこと（例えば、自発的に、または産生および／もしくは保存中に存在する酵素によって触媒して）を理解し得る。したがって、ポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端残基がＥまたはＱである一部の実施形態では、ピログルタメートで置き換えられたＥまたはＱを有する対応するアミノ酸配列もまた、本明細書で企図される。
【０１８９】
また、当業者は、タンパク質産生および／または保存中、タンパク質のＣ末端リシン（Ｋ）を除去してもよいこと（例えば、自発的に、または産生および／もしくは保存中に存在する酵素によって触媒して）を理解し得る。そのようなＫの除去は、多くの場合、Ｃ末端にＦｃドメインを含むタンパク質で観察される。したがって、ポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、Ｆｃドメイン配列）のＣ末端残基がＫである一部の実施形態では、Ｋが除去された対応するアミノ酸配列もまた、本明細書で企図される。
【０１９０】
上記の多重特異性タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製することができる。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列を第１の発現ベクターにクローニングすることができ；第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列を第２の発現ベクターにクローニングすることができ；免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列を第３の発現ベクターにクローニングすることができ；第１、第２および第３の発現ベクターを一緒に宿主細胞に安定的にトランスフェクトして、多量体タンパク質を生成することができる。
【０１９１】
多重特異性タンパク質の最高収量を達成するために、異なる比の第１、第２および第３の発現ベクターを調査して、宿主細胞へのトランスフェクションのための最適な比を決定することができる。トランスフェクション後、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡法またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどの当技術分野で公知の方法を使用して、単一クローンを細胞バンク生成のために単離することができる。
【０１９２】
クローンを、バイオリアクタースケールアップおよび多重特異性タンパク質の維持された発現に適した条件下で培養することができる。遠心分離、深層濾過、細胞溶解、ホモジナイゼーション、凍結−解凍、アフィニティ精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーを含む当技術分野で公知の方法を使用して、多重特異性タンパク質を単離および精製することができる。
ＩＩ．多重特異性タンパク質の特徴
【０１９３】
ある特定の実施形態では、本開示の多重特異性結合タンパク質、例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片およびＨＥＲ２結合ｓｃＦｖドメインを含むＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、同じＨＥＲ２結合ドメインを有するモノクローナル抗体よりも高いレベルで、低レベルのＨＥＲ２を発現する細胞に結合する。例えば、トラスツズマブ由来の、ＮＫＧ２Ｄ結合ＦａｂドメインおよびＨＥＲ２結合ｓｃＦｖドメインを含む多重特異性結合タンパク質、例えば、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、トラスツズマブよりも高いレベルで、低ＨＥＲ２発現細胞に結合することができる。
【０１９４】
さらに、本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質は、腫瘍成長を低減させることおよびがん細胞を死滅させることにおいてより有効である。例えば、ＨＥＲ２発現腫瘍／がん細胞を標的化する本開示の多重特異性結合タンパク質は、トラスツズマブよりも有効である。本開示のＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ（Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１３９）（配列番号１４０によって表されるｓｃＦｖ−Ｆｃ）と；ＡＤＩ−２７７４９（Ａ４９）の重鎖可変ドメイン（配列番号９４）およびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン（配列番号９８）および軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含む、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含み、重鎖可変ドメインが、ＣＨ１に接続しており、ＣＨ１ドメインが、Ｆｃドメインに接続している（重鎖部分はＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃと表され、アミノ酸配列は配列番号１４１で示される））は、低レベルのＨＥＲ２発現（ＨＥＲ２＋）を有するヒトがん細胞系のＮＫ媒介細胞溶解を促進することにおいて有効であり、一方で、トラスツズマブは、この細胞系に対してほとんど活性を示さない。さらに、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、トラスツズマブと比較して、ＨＥＲ２＋細胞系よりも高い発現（ＨＥＲ２＋＋）を有するヒトがん細胞系の優れたＮＫ媒介細胞溶解を有する。そして、最高レベルのＨＥＲ２発現（ＨＥＲ＋およびＨＥＲ２＋＋細胞系と比較して）（ＨＥＲ２＋＋＋）を有するヒトがん細胞系に対してでさえも、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、トラスツズマブと比較して、優れたＮＫ媒介細胞溶解を有する。
【０１９５】
一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを含む本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質（例えば、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ、Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ、Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ）は、同じ腫瘍抗原結合ドメインを含むモノクローナル抗体よりも有効に腫瘍の進行を遅延させる。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを含む多重特異性結合タンパク質（例えば、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ、Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ、Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ）は、同じ腫瘍抗原結合ドメインを含むモノクローナル抗体よりもがん転移に対して有効である。
【０１９６】
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを含む本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質（例えば、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ、Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ、Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ）は、ＨＥＲ２＋＋がん細胞（中程度のレベルの発現）に結合するのと同様の程度まで非がん性ヒト細胞（例えば、ヒト心筋細胞）に結合する。しかしながら、同等の結合にもかかわらず、多重特異性結合タンパク質は、健康な非がん性ヒト細胞（例えば、ヒト心筋細胞）のＮＫ媒介殺滅を誘導しない。
【０１９７】
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを含む本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質（例えば、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ、Ａ４９−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ、Ａ４４−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ）は、腫瘍関連抗原陽性（ＴＡＡ＋）腫瘍細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞溶解を誘発する。例えば、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、ヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＬ−１５を伴う培養後の細胞傷害活性を、用量依存的様式で増強する（図１３Ａ）。また、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、ヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＬ−２を伴う培養後の細胞傷害活性を増強する（図１３Ｂ）。対照的に、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体であるマルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）およびトラスツズマブは、同様の効果を有しない。
【０１９８】
マルゲツキシマブ（ＭＧＡＨ２２とも呼ばれる）は、ＨＥＲ２に結合するＦｃ最適化モノクローナル抗体である。マルゲツキシマブの重鎖可変ドメインは、配列番号１３０によって表され、マルゲツキシマブの軽鎖可変ドメインは、配列番号１３４によって表される。マルゲツキシマブは、ＦｃドメインのＦ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌ置換を含み、それは、ＡＤＣＣ増強変異になるように設計されている。重鎖および軽鎖配列は、それぞれ、配列番号１５１および配列番号１５３で示される。Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌ置換は、太字下線で示す。
ＭＧＡＨ２２重鎖
【化２８】
2021533161.tif 000059
（配列番号：１５１）
ＭＧＡＨ２２軽鎖
【化２９】
2021533161.tif 000060
（配列番号：１５３）
【０１９９】
いくつかのＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴと比較して、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、ＮＫＧ２Ｄを発現する細胞への弱い結合を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを含む本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質（例えば、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ）は、標的細胞がＨＥＲ２＋（７８６−Ｏ細胞）（図１９）またはＨＥＲ２＋＋（Ｈ６６１細胞）（図２０）であった場合、ＦｃサイレントＴｒｉＮＫＥＴ（「Ａ４９ｓｉ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ」；定常領域のアミノ酸配列は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）変異を有し、これは、Ｆｃのエフェクター機能を低減する）とトラスツズマブとの組合せと比較して、効力および標的細胞の最大溶解における有意な利点を示し、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブが、ＨＥＲ２を発現するがん細胞の、強固なエフェクター細胞依存的殺滅を媒介することができることを示唆する。
【０２００】
したがって、モノクローナル抗体と比較して、本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質（例えば、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ）は、ＨＥＲ２発現がんを処置することにおいて有利である。
ＩＩＩ．治療適用
【０２０１】
本発明は、本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質および／または本明細書に記載される医薬組成物を使用してがんを処置するための方法を提供する。方法は、ＨＥＲ２を発現するさまざまながんを処置することを必要とする患者に、治療有効量の本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質を投与することによって、ＨＥＲ２を発現するさまざまながんを処置するために使用することができる。
【０２０２】
治療方法は、処置されるべきがんによって特徴付けることができる。例えば、ある特定の実施形態では、がんは、乳がん、卵巣がん、食道がん、膀胱がんもしくは胃がん、唾液腺導管癌、唾液腺導管癌、肺の腺癌、または攻撃的形態の子宮がん、例えば、子宮漿液性子宮内膜癌である。
【０２０３】
特定の他の実施形態では、がんは、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、白血病、肺がん、肝臓がん、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、直腸がん、腎がん、胃がん、精巣がんまたは子宮がんである。さらに他の実施形態では、がんは、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肉腫（例えば、血管肉腫または軟骨肉腫）、喉頭がん、耳下腺がん、胆道がん（ｂｉｌａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺がん、末端黒子型黒色腫、日光角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管がん、肛門がん、肛門直腸がん、星細胞系腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆道がん（ｂｉｌａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）、骨がん、骨髄がん、気管支がん、気管支腺癌、カルチノイド、胆管癌、軟骨肉腫（ｃｈｏｎｄｏｓａｒｃｏｍａ）、脈絡叢乳頭腫／癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織がん、嚢胞腺腫、消化器系がん、十二指腸がん、内分泌系がん、卵黄嚢腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞がん、上衣がん、上皮細胞がん、ユーイング肉腫、眼と眼窩のがん、女性性器がん、限局性結節性過形成、胆嚢がん、胃幽門部がん、胃底部がん、ガストリノーマ、神経膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓がん、血管芽細胞腫（ｈｅｍａｎｇｉｂｌａｓｔｏｍａ）、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道がん、肝細胞癌、ホジキン病、回腸がん、インスリノーマ、上皮内腫瘍、上皮間扁平上皮腫瘍（ｉｎｔｅｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、肝内胆管がん、浸潤性扁平上皮癌、空腸がん、関節がん、カポジ肉腫、骨盤がん、大細胞癌、大腸がん、平滑筋肉腫、悪性黒子型黒色腫、リンパ腫、男性性器がん、悪性黒色腫、悪性中皮腫瘍、髄芽腫、髄上皮腫、髄膜がん、中皮がん、転移性癌、口腔がん、粘液性類表皮癌、多発性骨髄腫、筋がん、鼻道がん、神経系がん、神経上皮腺癌、結節型黒色腫、非上皮性皮膚がん、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起神経膠がん（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、口腔がん、骨肉腫、乳頭状漿液性腺癌、陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、直腸がん、腎細胞癌、呼吸器系がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、副鼻腔がん、皮膚がん、小細胞癌、小腸がん、平滑筋がん、軟部組織がん、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎がん、扁平上皮癌、横紋筋がん、中皮下がん、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌がん、未分化癌、尿管がん、尿道がん（ｕｒｅｔｈｒａ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱がん、泌尿器系がん、子宮頸がん、子宮体がん、ブドウ膜黒色腫、膣がん、疣状癌、ビポーマ、外陰がん、高分化癌またはウィルムス腫瘍である。
【０２０４】
ある特定の他の実施形態では、がんは、非ホジキンリンパ腫、例えば、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫である。ある特定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病または中枢神経系（ＣＮＳ）原発リンパ腫である。ある特定の他の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、Ｔ細胞リンパ腫、例えば、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫または末梢性Ｔ細胞リンパ腫である。
【０２０５】
ある特定の他の実施形態では、がんは、乳がん、甲状腺がん、胃がん、腎細胞癌、肺の腺癌、前立腺がん、胆管癌、子宮がん、膵臓がん、結腸直腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肺扁平上皮がん、中皮腫、肝臓がん、肉腫および胆嚢がんである。
【０２０６】
処置されるべきがんは、がん細胞の表面上に発現した特定の抗原の存在によって特徴付けることができる。ある特定の実施形態では、がん細胞は、ＨＥＲ２に加えて、以下のもの：ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４およびＰＤ１のうちの１つまたは複数を発現し得る。
ＩＶ．併用療法
【０２０７】
本発明の別の態様は併用療法を提供する。本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質は、がんを処置するための追加の治療剤と組み合わせて使用することができる。
【０２０８】
がんの処置で併用療法の一部として使用され得る例示的な治療剤としては、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、サイマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミゾール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−２アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、コロニー刺激因子−１、コロニー刺激因子−２、デニロイキン・ジフチトクス、インターロイキン−２、黄体ホルモン放出因子、およびその同族受容体に対する示差的結合、または増加もしくは減少した血清半減期を示し得る上記薬剤のバリエーションが挙げられる。
【０２０９】
がんを処置することにおいて併用療法の部分として使用され得る薬剤の追加のクラスは、免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤は、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７−Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７−Ｈ４および（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうちの１つまたは複数を阻害する薬剤を含む。ＣＴＬＡ４阻害剤イピリムマブは、黒色腫を処置することについて米国食品医薬品局によって承認されている。
【０２１０】
がんの処置で併用療法の一部として使用され得るさらに他の薬剤は、非チェックポイント標的を標的化するモノクローナル抗体剤（例えば、ハーセプチン）および非細胞傷害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）である。
【０２１１】
抗がん剤のさらに他のカテゴリーには、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトンチロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫとｍＴＯＲの両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤＋２−クロロ−デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１とＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼ−ＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤およびＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤；（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５またはＩＣＯＳのアゴニスト；ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦから選択されるサイトカインが含まれる。
【０２１２】
本発明のタンパク質を、原発巣の外科的除去の補助として使用することもできる。
【０２１３】
多重特異性結合タンパク質および追加の治療剤の量ならびに相対的な投与のタイミングは、所望の組合せ治療効果を達成するために選択され得る。例えば、併用療法を、このような投与を必要とする患者に投与する場合、組合せの治療剤、または治療剤を含む１つまたは複数の医薬組成物は、例えば、逐次的に、併せて、一緒に、同時になどの任意の順序で投与され得る。さらに、例えば、多重特異性結合タンパク質は、追加の治療剤（複数可）がその予防的もしくは治療的効果を発揮する時間の間に投与され得る、または逆もまた同様である。
Ｖ．医薬組成物
【０２１４】
本開示はまた、治療有効量の本明細書に記載されるタンパク質を含有する医薬組成物を特徴とする。組成物は、さまざまな薬物送達システムに使用するために製剤化することができる。１つまたは複数の生理学的に許容される賦形剤または担体を適切な製剤化のために組成物に含めることもできる。本開示で使用するための適切な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐａ．，  １７ｔｈ  ｅｄ．，  １９８５に見出される。薬物送達のための方法の簡潔な概要については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ  （Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，  １９９０）を参照されたい。
【０２１５】
本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペンまたはシリンジ中に含有され得る。ある特定の実施形態では、バッグは、チューブおよび／または針を含むチャネルに接続され得る。ある特定の実施形態では、製剤は、凍結乾燥製剤または液体製剤であり得る。ある特定の実施形態では、製剤は、フリーズドライ（凍結乾燥）され、１２〜６０個のバイアル中に含有され得る。ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライされ得、４５ｍｇのフリーズドライ製剤は１個のバイアルに含有され得る。ある特定の実施形態では、約４０ｍｇ〜約１００ｍｇのフリーズドライ製剤は１個のバイアルに含有され得る。ある特定の実施形態では、１２、２７または４５個のバイアルのフリーズドライ製剤を合わせて、静脈内薬物製剤中の治療用量のタンパク質を得る。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であり得、約２５０ｍｇ／バイアル〜約１０００ｍｇ／バイアルとして保管され得る。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であり得、約６００ｍｇ／バイアルとして保管され得る。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であり得、約２５０ｍｇ／バイアルとして保管され得る。
【０２１６】
タンパク質は、製剤を形成する緩衝溶液中に治療有効量のタンパク質を含む液体水性医薬製剤で存在することができる。
【０２１７】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得る、または滅菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装され得る、または凍結乾燥され得、凍結乾燥調製物は投与前に無菌水性担体と合わせられる。調製物のｐＨは、典型的には３〜１１の間、より好ましくは５〜９の間または６〜８の間、最も好ましくは７〜８の間、例えば７〜７．５となる。固体形態の得られた組成物は、各々が一定量の上記の１種または複数種の薬剤を含有する、複数の単回投与単位に包装され得る。固体形態の組成物はまた、柔軟な量で容器に包装することもできる。
【０２１８】
ある特定の実施形態では、本開示は、本開示のタンパク質を、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水および水酸化ナトリウムと組み合わせて含む、貯蔵寿命が延長された製剤を提供する。
【０２１９】
ある特定の実施形態では、ｐＨ緩衝溶液中に本開示のタンパク質を含む水性製剤が調製される。本発明のバッファーは、約４〜約８、例えば約４．５〜約６．０、もしくは約４．８〜約５．５の範囲のｐＨを有し得る、または約５．０〜約５．２のｐＨを有し得る。上に列挙されるｐＨまでの中間の範囲も本開示の一部であることが意図される。例えば、上限および／または下限として上に列挙される値のいずれかの組合せを使用した値の範囲が含まれることが意図される。ｐＨをこの範囲内に制御するバッファーの例としては、酢酸バッファー（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸バッファー（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸バッファー、ヒスチジンバッファー、クエン酸バッファーおよび他の有機酸バッファーが挙げられる。
【０２２０】
ある特定の実施形態では、製剤は、約４〜約８の範囲内のｐＨを維持するために、シトレートおよびホスフェートを含有する緩衝液系を含む。ある特定の実施形態では、ｐＨ範囲は、約４．５〜約６．０、または約ｐＨ４．８〜約５．５、または約５．０〜約５．２のｐＨ範囲内であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液系は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物および／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。ある特定の実施形態では、緩衝液系は、約１．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約０．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約１．５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、１．５３ｍｇ／ｍＬ）、約０．９ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば、０．８６）および約６．２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍＬ）を含む。ある特定の実施形態では、緩衝液系は、約１〜１．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸、約０．２５〜０．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム、約１．２５〜１．７５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物、約０．７〜１．１ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物および約６．０〜６．４ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムを含む。ある特定の実施形態では、製剤のｐＨは、水酸化ナトリウムで調整される。
【０２２１】
等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）として作用し、抗体を安定化し得るポリオールを製剤に含めてもよい。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して変えることができる量で製剤に添加される。ある特定の実施形態では、水性製剤は等張性であり得る。添加されるポリオールの量をポリオールの分子量に関して変化させてもよい。例えば、二糖（トレハロースなど）と比較して、少量の単糖（例えば、マンニトール）が添加され得る。ある特定の実施形態では、等張化剤として製剤に使用され得るポリオールはマンニトールである。ある特定の実施形態では、マンニトール濃度は約５〜約２０ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約７．５〜１５ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１０〜１４ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１２ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、ポリオールであるソルビトールが製剤に含まれ得る。
【０２２２】
界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）または界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）を製剤に添加してもよい。例示的な界面活性剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０等）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。添加される界面活性剤の量は、製剤化抗体の凝集を減少させる、および／または製剤中の微粒子の形成を最小化する、および／または吸着を減少させるようなものとする。ある特定の実施形態では、製剤はポリソルベートである界面活性剤を含み得る。ある特定の実施形態では、製剤は界面活性剤ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）  ８０を含有し得る。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを記載するために使用される用語である（Ｆｉｅｄｌｅｒ，  Ｌｅｘｉｋｏｎ  ｄｅｒ  Ｈｉｆｓｓｔｏｆｆｅ，  Ｅｄｉｔｉｏ  Ｃａｎｔｏｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  １９９６参照）。ある特定の実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの間、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの間のポリソルベート８０を含有し得る。ある特定の実施形態では、約０．１％のポリソルベート８０が製剤に添加され得る。
【０２２３】
実施形態では、本開示のタンパク質産物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム栓で閉じられ、アルミニウム圧着シールクロージャーで密封されたＵＳＰ／Ｐｈ  ＥｕｒＩ型５０Ｒバイアル中に約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され得る。栓は、ＵＳＰおよびＰｈ  Ｅｕｒを遵守したエラストマー製であり得る。ある特定の実施形態では、バイアルに、約６０ｍＬの抽出可能な体積を可能にするために、約６１．２ｍＬのタンパク質産物溶液が充填され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、約０．９％の食塩溶液で希釈され得る。
【０２２４】
ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、安定化レベルの糖と組み合わせた１０ｍｇ／ｍＬ濃度溶液として調製され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は水性担体中で調製され得る。ある特定の実施形態では、安定剤は、静脈内投与に望ましくないまたは不適切な粘度をもたらし得る量以下の量で添加され得る。ある特定の実施形態では、糖は二糖、例えばスクロースであり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、緩衝剤、界面活性剤および保存剤の１つまたは複数も含み得る。
【０２２５】
ある特定の実施形態では、液体製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって調節され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、塩基は水酸化ナトリウムであり得る。
【０２２６】
凝集に加えて、脱アミドが、発酵、収集／細胞清澄化、精製、原体／医薬品貯蔵中、および試料分析中に起こり得る、ペプチドおよびタンパク質の一般的な産物バリアントである。脱アミドは、タンパク質からＮＨ３が失われて、加水分解を受け得るスクシンイミド中間体を形成することである。スクシンイミド中間体は、親ペプチドの１７ダルトンの質量減少をもたらす。その後の加水分解によって、１８ダルトンの質量増加がもたらされる。スクシンイミド中間体の単離は、水性条件下での不安定性のために困難である。よって、脱アミドは、典型的には１ダルトンの質量増加として検出可能である。アスパラギンの脱アミドは、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸をもたらす。脱アミドの速度に影響を及ぼすパラメーターには、ｐＨ、温度、溶媒の誘電率、イオン強度、一次配列、局所的ポリペプチドコンフォメーションおよび三次構造が含まれる。ペプチド鎖中のＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は脱アミド速度に影響を及ぼす。タンパク質配列中のＡｓｎに続くＧｌｙおよびＳｅｒは脱アミドに対するより高い感受性をもたらす。
【０２２７】
ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、タンパク質産物の脱アミドを防ぐためのｐＨおよび湿度の条件下で保存され得る。
【０２２８】
本明細書の目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与にとって安全で非毒性であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌食塩溶液、リンゲル液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０２２９】
保存剤を必要に応じて本明細書の製剤に添加して細菌作用を減少させてもよい。保存剤の添加は、例えば、マルチユース（複数回投与）製剤の製造を容易にし得る。
【０２３０】
静脈内（ＩＶ）製剤は、特定の例で、例えば、患者がＩＶ経路を介して全ての薬物を受けて移植後に入院している場合に、好ましい投与経路であり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、投与前に０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈される。ある特定の実施形態では、注射用希釈医薬品は等張性であり、静脈内注入による投与に適している。
【０２３１】
ある特定の実施形態では、塩またはバッファー成分は、約１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加され得る。塩および／またはバッファーは、薬学的に許容され、かつ「塩基形成」金属またはアミンを伴うさまざまな公知の酸（無機および有機）に由来する。ある特定の実施形態では、バッファーは、リン酸バッファーであり得る。ある特定の実施形態では、バッファーは、グリシン酸バッファー、炭酸バッファー、クエン酸バッファーであり得、その場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンは、対イオンとして働き得る。
【０２３２】
保存剤を必要に応じて本明細書の製剤に添加して、細菌作用を減少させてもよい。保存剤の添加は、例えば、マルチユース（複数回投与）製剤の製造を容易にし得る。
【０２３３】
本明細書の目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与にとって安全で非毒性であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌食塩溶液、リンゲル液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０２３４】
本開示のタンパク質は、タンパク質およびリオプロテクタント（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む凍結乾燥製剤で存在し得る。リオプロテクタントは糖、例えば二糖であり得る。ある特定の実施形態では、リオプロテクタントはスクロースまたはマルトースであり得る。凍結乾燥製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、増量剤および／または保存剤の１つまたは複数を含み得る。
【０２３５】
凍結乾燥医薬品の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、少なくとも１：２のタンパク質のスクロースまたはマルトースに対する重量比であり得る。ある特定の実施形態では、タンパク質のスクロースまたはマルトースに対する重量比は１：２〜１：５であり得る。
【０２３６】
ある特定の実施形態では、製剤のｐＨは、凍結乾燥前に、薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって調節され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される塩基は水酸化ナトリウムであり得る。
【０２３７】
凍結乾燥前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のｐＨは６〜８の間に調整され得る。ある特定の実施形態では、凍結乾燥医薬品のためのｐＨ範囲は７〜８であり得る。
【０２３８】
ある特定の実施形態では、塩またはバッファー成分は１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加され得る。塩および／またはバッファーは、薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを用いてさまざまな公知の酸（無機および有機）から得られる。ある特定の実施形態では、バッファーはリン酸バッファーであり得る。ある特定の実施形態では、バッファーは、グリシン酸バッファー、炭酸バッファー、クエン酸バッファーであり得、この場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして働き得る。
【０２３９】
ある特定の実施形態では、「増量剤」が添加され得る。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に嵩（ｍａｓｓ）を加え、凍結乾燥ケークの物理構造に寄与する（例えば、開孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケークの製造を容易にする）化合物である。例示的な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびソルビトールが含まれる。本発明の凍結乾燥製剤はこのような増量剤を含有し得る。
【０２４０】
保存剤を必要に応じて本明細書の製剤に添加して、細菌作用を減少させてもよい。保存剤の添加は、例えば、マルチユース（複数回投与）製剤の製造を容易にし得る。
【０２４１】
ある特定の実施形態では、凍結乾燥医薬品は、水性担体で構成され得る。本明細書の目的の水性担体は、薬学的に許容され（例えば、ヒトへの投与にとって安全で非毒性であり）、凍結乾燥後の、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な希釈剤には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌食塩溶液、リンゲル液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０２４２】
ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥医薬品は、注射用滅菌水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）または約０．９％塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰのいずれかで復元される。復元中、凍結乾燥粉末は、溶液へと溶解する。
【０２４３】
ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥タンパク質産物は、約４．５ｍＬの注射用水に構成され、０．９％食塩溶液（塩化ナトリウム溶液）で希釈される。
【０２４４】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性となることなく、特定の患者、組成物および投与様式にとって所望の治療反応を達成するのに有効な有効成分の量を得るように変化させることができる。
【０２４５】
具体的な用量は、各患者に均一な用量、例えば、５０〜５０００ｍｇのタンパク質であり得る。あるいは、患者の用量を、患者のおおよその体重または表面積に適合させることができる。適切な投与量の決定における他の因子には、処置または予防される疾患または状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別および健康状態が含まれ得る。処置のための適切な投与量を決定するのに必要な計算のさらなる改良は、特に投与量情報および本明細書に開示されるアッセイに照らして、当業者によって日常的に行われる。投与量はまた、適切な用量−反応データと合わせて使用される投与量を決定するための公知のアッセイの使用を通して決定することもできる。個々の患者の投与量は、疾患の進行を監視しながら調整することができる。患者における標的化可能な構築物または複合体の血中レベルを測定して、有効濃度に達するまたはこれを維持するために投与量を調整する必要があるかどうかを確かめることができる。薬理ゲノミクスを使用して、どの標的化可能な構築物および／または複合体、ならびにその投与量が所与の個体にとって十中八九有効であるかを決定することができる（Ｓｃｈｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３０８：  ４３−５３，  ２００１；  Ｓｔｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３０８：  ３３−４１，  ２００１）。
【０２４６】
一般に、体重に基づく投与量は、体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ、例えば約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０２４７】
用量は、毎日、毎週、毎月もしくは毎年１回もしくは複数回、またはさらには２〜２０年毎に１回で与えられ得る。当業者であれば、測定された滞留時間および体液または組織中の標的化可能な構築物または複合体の濃度に基づいて、投与の反復率を容易に推定することができる。本発明の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、腔内、カテーテルを通した灌流によるまたは直接病巣内注射によることができる。これは、毎日１回または複数回、毎週１回または複数回、毎月１回または複数回、および毎年１回または複数回投与され得る。
【０２４８】
上記の説明は、本発明の複数の態様および実施形態を説明している。本出願は、態様および実施形態の全ての組合せおよび並べ替えを具体的に企図する。
【実施例】
【０２４９】
ここで一般的に説明されている本発明は、本発明のある特定の態様および実施形態の例示目的でのみ含まれ、本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。
（実施例１）
初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイ：
【０２５０】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから単離した。単離したＰＢＭＣを、ＮＫ細胞単離のために洗浄および調製した。ＮＫ細胞を、磁気ビーズによる負の選択技術を使用して単離し、単離したＮＫ細胞の純度は、典型的に、９０％より高いＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。単離したＮＫ細胞を一晩静止させ、静止ＮＫ細胞を、翌日細胞傷害性アッセイにおいて使用した。
ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ：
【０２５１】
ＨＥＲ２を発現するヒトがん細胞系を、培養物から収集し、細胞をＨＢＳで洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡＤ０１１６）で標識するために１０６／ｍＬで成長培地中に再懸濁した。標的細胞の標識について、製造業者の指示に従った。標識後、細胞をＨＢＳで３回洗浄し、培養培地中に０．５〜１．０×１０５／ｍＬで再懸濁した。バックグラウンドウェルを調製するために、一定分量の標識細胞を取っておき、遠心して細胞を培地から分離した。１００μｌの培地を三連でウェルに慎重に添加し、ペレット化細胞を乱さないようにした。１００μｌのＢＡＴＤＡ標識細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。複数のウェルを標的細胞からの自発的放出用に保全し、複数のウェルを１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘを添加することによって、標的細胞の最大溶解用に調製した。ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ（Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１３９）（配列番号１４０によって表されるｓｃＦｖ−Ｆｃ）と；ＡＤＩ−２７７４９（Ａ４９）の重鎖可変ドメイン（配列番号９４）およびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン（配列番号９８）および軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含む、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含み、重鎖可変ドメインが、ＣＨ１に接続しており、ＣＨ１ドメインが、Ｆｃドメインに接続している（重鎖部分はＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃと表され、アミノ酸配列は配列番号１４１で示される）））を、培養培地中に希釈し、５０μｌの希釈したｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを、各ウェルに添加した。静止ＮＫ細胞を培養物から収集し、細胞を洗浄し、所望のＥ：Ｔ比によって、培養培地中に１０５〜２．０×１０６／ｍＬで再懸濁した。５０μｌのＮＫ細胞をプレートの各ウェルに添加して、全部で２００μｌの培養体積にした。プレートを３７℃で５％ＣＯ２にて２〜３時間インキュベートし、その後、アッセイを行った。
【０２５２】
２〜３時間培養後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を２００ｇで５分間の遠心分離によってペレット化した。２０μｌの培養上清を、製造業者から提供された新しいマイクロプレートに移し、２００μｌの室温のユーロピウム溶液を各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、プレートシェーカー上で２５０ｒｐｍにて１５分間インキュベートした。Ｖｉｃｔｏｒ３またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３Ｘ機器のいずれかを使用してプレートを読み取った。特異的溶解％を、以下のように計算した：特異的溶解％＝（（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出））×１００％。
長期ヒトＰＢＭＣ細胞傷害性アッセイ：
【０２５３】
ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎを安定に発現するＳｋＢｒ−３細胞を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎ試薬（カタログ番号４４７５）を使用して生成した。ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎ発現細胞を、ピューロマイシン中で選択して相同の集団を得た。ＳｋＢｒ−３−ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎ細胞を、アッセイにおける使用前に、ピューロマイシンを含有する成長培地中で維持した。ＳｋＢｒ−３−ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎ標的細胞を、細胞傷害性アッセイのために以下のように調製した。
【０２５４】
ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎ発現細胞を培養物から収集し、洗浄して残留の選択抗生物質を除去し、細胞を新しい培養培地中に再懸濁し、９６ウェル平底プレートに播種した。プレートを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３に一晩入れて細胞付着および成長をモニターした。翌日、ヒトＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離を使用して単離し、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブまたはｍＡｂ希釈物を、初代細胞培養培地中に調製した。希釈したＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブおよびｍＡｂを、ＳｋＢｒ−３−ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎ細胞に添加し、次に、新しく単離したＰＢＭＣを添加した。その後、プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３に戻した。
【０２５５】
ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３で画像収集を設定した。相および緑色チャネルについての画像を、１ウェル当たり２つの画像で、毎時収集した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３ソフトウェアを使用して画像解析を行った。緑色チャネルについてのマスクを作出して、ＳｋＢｒ−３腫瘍細胞の数をカウントした。成長パーセントを、以下のように計算した：成長％＝（（時間Ｘでの緑色対象物カウント）／（時間０での緑色対象物カウント））×１００％。
【０２５６】
図３、図４および図５は、さまざまなレベルのＨＥＲ２発現を有する３種の細胞系のＴｒｉＮＫＥＴ媒介殺滅を示す。ＴｒｉＮＫＥＴは、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体トラスツズマブと比較して、全てのＨＥＲ２陽性細胞系に対してより強力かつより高い最大殺滅を与えた。
【０２５７】
図３は、ＨＥＲ２  １＋ヒトがん細胞系７８６−ＯのＮＫ媒介細胞溶解を示す。トラスツズマブは、ＨＥＲ２  １＋細胞系に対してほとんど活性を示さず、特異的溶解はバックグラウンド殺滅よりもわずかに高く増大させる。しかしながら、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ（Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１３９）（配列番号１４０によって表されるｓｃＦｖ−Ｆｃ）と；ＡＤＩ−２７７４９（Ａ４９）の重鎖可変ドメイン（配列番号９４）およびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン（配列番号９８）および軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含む、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含み、重鎖可変ドメインが、ＣＨ１ドメインに接続しており、ＣＨ１ドメインが、Ｆｃドメインに接続している（重鎖部分はＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃと表され、アミノ酸配列は配列番号１４１で示される））およびＡ４４−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ（Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、配列番号１３９を含むＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ（配列番号１４６によって表されるｓｃＦｖ−Ｆｃ）と；ＡＤＩ−２７７４４（Ａ４４）の重鎖可変ドメイン（配列番号８６）およびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン（配列番号９０）および軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含む、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含み、重鎖可変ドメインが、ＣＨ１ドメインに接続しており、ＣＨ１ドメインが、Ｆｃドメインに接続している（重鎖部分はＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃと表され、アミノ酸配列は配列番号１４８で示される））は、７８６−Ｏ細胞を標的化することにおいてより有効であり、モノクローナル抗体よりも大きな特異的溶解を示した。
【０２５８】
図４は、７８６−Ｏ細胞系よりも（ｔｈａｔ）高レベルのＨＥＲ２発現（ＨＥＲ２＋＋として示される）を有するヒトがん細胞系Ｈ６６１のＮＫ媒介細胞溶解を実証する。トラスツズマブは、７８６−Ｏ細胞系と比較して、Ｈ６６１標的細胞上で発現したより高レベルのＨＥＲ２に対して殺滅の改善を示した。トラスツズマブによって媒介される溶解の改善にもかかわらず、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、それでも、効力および最大殺滅の両方についてＨ６６１標的細胞のより優れた溶解を示した。
【０２５９】
図５は、試験した３種の細胞系の中で最高レベルのＨＥＲ２発現（ＨＥＲ２＋＋＋として示される）を有するがん細胞系ＳｋＢｒ−３のＮＫ媒介細胞溶解を示す。トラスツズマブは、ＨＥＲ２＋およびＨＥＲ２＋＋細胞系と比較して、ＳｋＢｒ−３細胞に対して効力の増大を示したが、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、それでも、より優れた効力および最大殺滅を示した。
【０２６０】
図６および図７は、ヒトＰＢＭＣおよびＳｋＢｒ−３  ＨＥＲ２＋標的細胞の７２時間共培養物に対するＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂの効果を示す。ＳｋＢｒ−３細胞は、エフェクターＰＢＭＣを伴わずに培養した場合、７２時間の期間にわたり約３倍に増殖した。エフェクターＰＢＭＣにおいてドナー変動性は明らかであった。ＰＢＭＣをＳｋＢｒ−３培養物に添加した場合、標的ＳｋＢｒ−３細胞の成長は、名目上低減した（図６）。別の実験では、ＰＢＭＣエフェクター細胞の添加は、ＳｋＢｒ−３細胞成長に対して無視できるほどの効果しか有しなかった（図７）。トラスツズマブを共培養物に添加した場合、エフェクターＰＢＭＣは、図６および図７の成長％における減少として示される、標的ＳｋＢｒ−３細胞を溶解する能力の増大を有した。Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ（図６および図７）およびＡ４４−Ｆ３’−ＫｉＨ−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ（図７）を共培養物に添加した場合、トラスツズマブと比較して、エフェクターＰＢＭＣは、ＳｋＢｒ−３標的細胞を溶解することにおいてさらにより有効であり、ＳｋＢｒ−３細胞のより速く、かつより完全な低減をもたらした。
（実施例２）
ヒト全血におけるＴｒｉＮＫＥＴの結合
【０２６１】
１００μｌのヘパリン処理ヒト全血を、各チューブ／ウェルに添加した。三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）またはモノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）を全血に直接添加し、試料を室温で２０分間インキュベートした。非標識ＴｒｉＮＫＥＴ／ｍＡｂの検出のために、血液を、ＴｒｉＮＫＥＴとのインキュベーション後に３回洗浄した。直接標識した免疫表現型検査用ｍＡｂ、およびトラスツズマブに特異的な二次抗体を、試料に添加した。２０分間のインキュベーション後、２ｍＬの１×ＲＢＣ溶解／固定溶液を、各試料に添加し室温（ＲＴ）で１５分間おき、その後、試料を洗浄して、赤血球（ＲＢＣ）を除去した。洗浄後、試料を、ＦＡＣＳ解析のために再懸濁した。
【０２６２】
Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブの結合を、トラスツズマブおよび二次抗体対照試料と比較した。図８Ａ〜８Ｆは、ヒト全血におけるＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ（クローンＡＤＩ−２７７４９からのＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン；およびトラスツズマブモノクローナル抗体由来の配列番号１３９を含むＨＥＲ２結合ｓｃＦｖ）の結合を示す。ヒト全血におけるＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ結合は、トラスツズマブと同じであった。Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブおよびトラスツズマブは、血中の全ての免疫細胞集団への最小限の結合を実証した。二次対照試料と比較して、Ｂ細胞および単球集団の両方において、トラスツズマブおよびＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブについて小シフトが観察された。Ｂ細胞および単球について観察された結合は、Ｆａｂ特異的ではなく、ＦｃＲ相互作用に起因するようであり得る。
（実施例３）
ヒト心筋細胞対さまざまなレベルのＨＥＲ２を発現するヒトがん細胞へのＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ結合の評価
【０２６３】
人工多能性幹細胞（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ／Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ）から分化させたヒト心筋細胞、７８６−Ｏ、Ｈ６６１およびＳＫＢＲ３がん細胞を使用して、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブのこれらの細胞への結合を評価した。ヒト腎細胞癌細胞系７８６−Ｏは低レベルのＨＥＲ２を発現し、ヒト肺がん細胞系Ｈ６６１は中程度のレベルのＨＥＲ２を発現し、一方で、ヒト乳がん細胞系ＳＫＢＲ３は高レベルのＨＥＲ２を発現する。ＴｒｉＮＫＥＴを３．８ｅ−４〜１００μｇ／ｍＬまで希釈し、希釈物を一次抗体染料として使用した。ＴｒｉＮＫＥＴの結合を、フルオロフォアをコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって解析した。ＨＥＲ２を発現する細胞への結合蛍光強度（ＭＦＩ）を、対照（非特異的）ＴｒｉＮＫＥＴで染色した細胞に対して正規化して、バックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）値を得た。
ヒトＰＢＭＣ細胞傷害性アッセイ
【０２６４】
ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから単離した。ＳＫＢＲ３標的細胞を、標的細胞の追跡を可能にするために、ＢａｃＭａｍ３．０  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎ（４６２２番）で標識した。ＳＫＢＲ３標的細胞の標識について、製造業者のプロトコールに従った。ヒト心筋細胞は標識しなかった。モノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを、培養培地に希釈した。５０μｌのＴｒｉＮＫＥＴおよびヒトＰＢＭＣを、既に標的細胞を含有している９６ウェルプレートのウェルに添加し、５０μｌの完全培養培地を添加して、全部で２００μｌの培養体積にした。
【０２６５】
ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３で画像収集を設定した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３ソフトウェアを使用して画像解析を行った。緑色チャネルについてのマスクを作出して、腫瘍細胞の数をカウントした。相チャネル中の心筋細胞の培養密度を使用して細胞生存率を評価し、殺滅％を計算した。
【０２６６】
Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、Ｈ６６１細胞への結合と同様の程度までヒト心筋細胞に結合する。図９は、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブのヒト心筋細胞、ＳＫＢＲ３、Ｈ６６１および７８６−Ｏがん細胞への結合を示し、心筋細胞への結合は、Ｈ６６１細胞（中程度のＨＥＲ２表面発現レベル）と同様である。
初代ヒトＰＢＭＣ細胞傷害性アッセイ
【０２６７】
図１０Ａ〜１０Ｂおよび図１１Ａ〜１１Ｂは、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブの存在下でのヒトＰＢＭＣによるＳＫＢＲ３細胞の殺滅を示し、一方で、心筋細胞の生存率は、最小限の影響しか受けない。
【０２６８】
図１０Ａは、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ媒介ヒトＰＢＭＣによるＳＫＢＲ３がん細胞の殺滅を示し；図１０Ｂは、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブが、１：１のＰＢＭＣ対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）での３日間の共培養後、非悪性の健康な心筋細胞を死滅させなかったことを示す。
【０２６９】
図１１Ａは、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ媒介ヒトＰＢＭＣによるＳＫＢＲ３がん細胞の殺滅を示し；図１１Ｂは、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブが、２０：１のＥ：Ｔでの３日間の共培養後、非悪性の健康な心筋細胞を死滅させなかったことを示す。
（実施例４）
ＴｒｉＮＫＥＴは、ＴＡＡ＋腫瘍細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞溶解を誘発する
初代ヒトＣＤ８Ｔ細胞の細胞傷害性アッセイ：初代ヒトＣＤ８エフェクターＴ細胞生成
【０２７０】
ヒトＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから単離した。単離したＰＢＭＣを、１μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で３７℃にて１８時間刺激した。その後、ＣｏｎＡを除去し、２５ユニット／ｍＬのＩＬ−２を伴って３７℃で４日間培養した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁気ビーズによる負の選択技術を使用して精製し、その後、２５ユニット／ｍＬのＩＬ−２または１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５を含有する培地中で３７℃にて８〜１０日間培養した。
初代ヒトＣＤ８エフェクターＴ細胞の特徴付け
【０２７１】
上記で生成したヒトエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによってＣＤ８＋Ｔ細胞純度ならびにＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６発現について解析した。細胞を、ＣＤ３、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６に対する、フルオロフォアをコンジュゲートした抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。
短期ＣＤ８エフェクターＴ細胞ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ
【０２７２】
目的の標的であるＨＥＲ２を発現するヒトがん細胞系ＳｋＢｒ−３を、培養物から収集した。細胞を洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡＤ０１１６）で標識するために１０６／ｍＬで成長培地中に再懸濁した。標的細胞の標識について、製造業者の指示に従った。標識後、細胞をＨＢＳで３回洗浄し、培養培地中に０．５×１０５／ｍＬで再懸濁した。１００μｌのＢＡＴＤＡ標識細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。複数のウェルを標的細胞からの自発的放出用に保全し、複数のウェルを１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘを添加することによって、標的細胞の最大溶解用に調製した。
【０２７３】
モノクローナル抗体、ＴｒｉＮＫＥＴおよび対照を、培養培地中に希釈し；５０μｌの希釈したｍＡｂ／ＴｒｉＮＫＥＴを、各ウェルに添加した。ＣＤ８エフェクターＴ細胞を、培養物から収集し、洗浄し、培養培地中に５×１０６／ｍＬで再懸濁した（Ｅ：Ｔ比＝５０：１）。その後、５０μｌのＣＤ８Ｔ細胞をプレートの各ウェルに添加して、全部で２００μｌの培養体積にした。プレートを３７℃で５％ＣＯ２にて３．５時間インキュベートし、その後、アッセイを行った。インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を５００ｇで５分間の遠心分離によってペレット化した。その後、２０μｌの培養上清を、製造業者から提供された新しいマイクロプレートに移し、２００μｌの室温のユーロピウム溶液を各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、プレートシェーカー上で２５０ｒｐｍにて１５分間インキュベートした。Ｖｉｃｔｏｒ３またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３Ｘ機器のいずれかを使用してプレートを読み取った。特異的溶解％を、以下のように計算した：特異的溶解％＝（（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出））×１００％。
長期ＣＤ８エフェクターＴ細胞Ｉｎｃｕｃｙｔｅ細胞傷害性アッセイ
【０２７４】
目的の標的であるＨＥＲ２を発現するヒトがん細胞系ＳｋＢｒ−３を、標的細胞の追跡を可能にするために、ＢａｃＭａｍ３．０  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎ（４６２２番）で標識した。ＳｋＢｒ−３標的細胞を培養物から収集し、洗浄し、成長培地中に再懸濁し、９６ウェルプレート中に５，０００／ウェルで播種した。プレートを３７℃で５％ＣＯ２にて一晩インキュベートした。モノクローナル抗体、ＴｒｉＮＫＥＴおよび対照を、培養培地中に希釈し；５０μｌの希釈したｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを、各ウェルに添加した。ＣＤ８エフェクターＴ細胞を、培養物から収集し、洗浄し、培養培地中に１×１０６／ｍＬで再懸濁した（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）。その後、５０μｌのＣＤ８＋Ｔ細胞をプレートの各ウェルに添加して、全部で２００μｌの培養体積にした。プレートを３７℃で５％ＣＯ２にて最長で７日間インキュベートした。ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３で画像収集を設定した。相および緑色チャネルについての画像を、１ウェル当たり２つの画像で、毎時収集した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３ソフトウェアを使用して画像解析を行った。緑色対象物カウント／ウェルを使用して、生腫瘍細胞の数を測定した。
細胞傷害性アッセイにおいて使用されるＣＤ８Ｔエフェクター細胞の特徴付け
【０２７５】
ｃｏｎＡ刺激で生成し、ＩＬ−１５を伴って培養したＣＤ８＋Ｔ細胞は、高純度（ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の９９％）であり、全て、ＮＫＧ２Ｄを発現したが、ＣＤ１６は発現しなかった（図１２Ａ〜１２Ｃ）。ＩＬ−２培養で生成したＣＤ８＋Ｔ細胞で、同様の結果が観察される。
短期ＣＤ８エフェクターＴ細胞ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ
【０２７６】
ヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＬ−１５を伴う培養後の細胞傷害活性に対するＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブの効果をアッセイした。Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、ヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＬ−１５を伴う培養後の細胞傷害活性を、用量依存的様式で増強した（図１３Ａ）。また、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブは、ヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＬ−２を伴う培養後の細胞傷害活性を増強した（図１３Ｂ）。
【０２７７】
マルゲツキシマブおよびハーセプチンは、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブで観察された効果を示さなかった。
長期ＣＤ８エフェクターＴ細胞Ｉｎｃｕｃｙｔｅ細胞傷害性アッセイ
【０２７８】
単独で培養した、またはＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養したＳｋＢｒ−３細胞は、培養物中で増殖した（図１４Ａ）。細胞をＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブで処理した場合、ＳｋＢｒ−３の成長は、ＨＥＲ２シグナル遮断のために一部の阻害を示した（図１４Ａ）。抗ＣＤ３抗体（Ｆ（ａｂ’）２で抗ｍＩｇＧ１に架橋結合したｍＩｇＧ１抗体）の存在下で（図１４Ａ）、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブをＳｋＢｒ−３細胞とＣＤ８Ｔ細胞との共培養物に添加すると、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ単独よりももっと大きな腫瘍細胞成長の阻害が示され、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブがＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を増強することが示された。Ｔ細胞を抗ＣＤ３によって活性化しなかった場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞の添加は、細胞成長をさらに阻害せず、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブの、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性を増強する能力は、抗ＣＤ３によるＴ細胞活性化に依存することが示された（図１４Ｂ）。
（実施例５）
ヒトがん抗原を発現した細胞へのＴｒｉＮＫＥＴ結合の評価
ＴｒｉＮＫＥＴ結合アッセイ
【０２７９】
ＨＥＲ２を発現するヒトがん細胞系を使用して、ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ）およびモノクローナル抗体の腫瘍抗原結合を評価した。ヒト腎細胞癌細胞系７８６−Ｏは低レベルのＨＥＲ２を発現し、ヒト肺がん細胞系ＮＣＩ−Ｈ６６１は中程度のレベルのＨＥＲ２を発現し、ヒト乳がん細胞系ＳｋＢｒ−３は高レベルのＨＥＲ２を発現した。全ての３種の細胞系を使用して、それらのＴｒｉＮＫＥＴへの結合親和性を評価した。ＴｒｉＮＫＥＴを、一連の濃度に希釈し、各々の細胞と共にインキュベートした。
【０２８０】
ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ）の細胞への結合を、抗ヒトＩｇＧ二次抗体にコンジュゲートしたフルオロフォアを使用して検出し、細胞をフローサイトメトリーによって解析した。ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ）の各濃度での結合レベルを、６７０ｎＭのＴｒｉＮＫＥＴとインキュベートした細胞で観察された最大の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）に対する、細胞のＭＦＩのパーセンテージ値として計算した。あるいは、ＴｒｉＮＫＥＴの各濃度での結合レベルを、二次抗体のみとインキュベートした細胞で観察されたバックグラウンドＭＦＩに対する、細胞のＭＦＩのバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）値として計算した。各実験において、ＴｒｉＮＫＥＴの代わりに、トラスツズマブを対照として使用した。
【０２８１】
図１５Ａ〜１５Ｂ、１６Ａ〜１６Ｂおよび１７Ａ〜１７Ｂで示されるように、ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ）およびトラスツズマブは、ＨＥＲ２の高発現レベル（ＨＥＲ＋＋＋）を有するＳｋＢｒ−３細胞への最も強力な結合を示した（図１５Ａ）。ＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴおよびトラスツズマブの、ＨＥＲ２の中程度の発現レベル（ＨＥＲ２＋＋）を有するＮＣＩ−Ｈ６６１への結合親和性（図１６Ａ）は、ＨＥＲ２の低発現レベル（ＨＥＲ２＋）を有する７８６−Ｏ細胞への結合親和性（図１７Ａ）と同様であったが、わずかに高かった。この結果は、ＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴおよびトラスツズマブのＨＥＲ２発現細胞への親和性は、細胞上のＨＥＲ２の発現レベルと概して相関することを示唆した。
【０２８２】
トラスツズマブは、３種の細胞系の各々で、ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ）よりも高い結合親和性を示した（ＳｋＢｒ−３（図１５Ａ）、ＮＣＩ−Ｈ６６１（図１６Ａ）および７８６−Ｏ（図１７Ａ））。しかしながら、バックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）値として表した場合、ＴｒｉＮＫＥＴの、３種の細胞系の各々への最大結合は、トラスツズマブの最大結合よりも大きかった（ＳｋＢｒ−３（図１５Ｂ）、ＮＣＩ−Ｈ６６１（図１６Ｂ）および７８６−Ｏ（図１７Ｂ））。高ＨＥＲ２発現レベルを有するＳｋＢｒ−３細胞で、差はとりわけ有意であった（図１５Ｂ）。
【０２８３】
ＴｒｉＮＫＥＴの、ＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞への親和性を、同様の方法によって測定した。図１８Ａ〜１８Ｂで示されるように、ＴｒｉＮＫＥＴで使用されるさまざまなＮＫＧ２Ｄ標的化ドメインは、ＥＬ４細胞上で発現するＮＫＧ２Ｄへのさまざまなレベルの結合をもたらした。クローンＡ４４、Ｆ６３およびＥ７９のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄに強く結合し（図１８Ａおよび図１８Ｂ）、一方で、クローンＡ４９のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄに弱く結合した（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。
初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイ
【０２８４】
ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから単離し、洗浄した。ＮＫ細胞を、磁気ビーズによる負の選択技術を使用してＰＢＭＣから単離した。典型的に、この技術で、収集した細胞の９０％より多くが、ＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。単離したＮＫ細胞を一晩静止させた。静止ＮＫ細胞を、翌日細胞傷害性アッセイにおいて使用した。
ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ
【０２８５】
目的の標的を発現するヒトがん細胞系を、培養物から収集した。細胞をＨＢＳで洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡＤ０１１６）で標識するために１０６個の細胞／ｍＬで成長培地中に再懸濁した。標的細胞の標識について、製造業者の指示に従った。標識後、細胞をＨＢＳで３回洗浄し、培養培地中に０．５〜１．０×１０５／ｍＬで再懸濁した。１００μｌのＢＡＴＤＡ標識細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。トラスツズマブおよびＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブを、培養培地中に希釈し、５０μｌの希釈したトラスツズマブおよびＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブを、それぞれ、実験のためのそれらの対応するウェルの各々に添加した。静止および／または活性化ＮＫ細胞を培養物から収集した。細胞を洗浄し、所望のＥ：Ｔ比によって、培養培地中に１０５〜２．０×１０６／ｍＬで再懸濁した。５０μｌのＮＫ細胞をプレートの各ウェルに添加して、全部で２００μｌの培養体積にした。ＢＡＴＤＡ加水分解生成物（例えば、自発的細胞死のための）の自発的放出を測定するために、ＮＫ細胞なし、ｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを、標的細胞に添加した。ＢＡＴＤＡ加水分解生成物の最大放出を測定するために、標的細胞を、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘの添加によって溶解した。プレートを３７℃で５％ＣＯ２にて２〜３時間インキュベートした。
【０２８６】
２〜３時間培養後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を２００ｇで５分間の遠心分離によってペレット化した。２０μｌの培養上清を、製造業者から提供された新しいマイクロプレートに移し、２００μｌの室温のユーロピウム溶液を各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、プレートシェーカー上で２５０ｒｐｍにて１５分間インキュベートした。Ｖｉｃｔｏｒ３またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３Ｘ機器のいずれかを使用して蛍光レベルを読み取った。
【０２８７】
特異的溶解のパーセンテージを：特異的溶解％＝（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）×１００％として計算した。
【０２８８】
別々の分子上でＴｒｉＮＫＥＴの結合特性を模倣するために、ＮＫＧ２ＤおよびＨＥＲ２を結合する二重特異性抗体をトラスツズマブと組み合わせ、１つの分子上に全ての３つの結合ドメインを含有するＴｒｉＮＫＥＴと比較した。したがって、７８６−ＯおよびＨ６６１標的細胞を、ＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴ、トラスツズマブ、ＦｃサイレントＴｒｉＮＫＥＴ（両方ともＦｃドメインのＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）置換（第３の括弧［］内に示される）を含む配列番号１５６および配列番号１５７を含む）またはＦｃサイレントＴｒｉＮＫＥＴとトラスツズマブとの組合せの存在下で、単離したＮＫ細胞とインキュベートした。注目すべきことに、標的細胞が７８６−Ｏ細胞（図１９）またはＨ６６１細胞（図２０）であった場合、ＴｒｉＮＫＥＴは、ＦｃサイレントＴｒｉＮＫＥＴとトラスツズマブとの組合せと比較して、効力および標的細胞の最大溶解における有意な利点を示した。
ｓｃＦｖ−Ｆｃ
（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）置換（第３の括弧［］内に示される）を含む）
【化３０−１】
2021533161.tif 000061
【化３０−２】
2021533161.tif 000062
（配列番号：１５６）
鎖全体ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ
（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）置換（第３の括弧［］内に示される）を含む）
【化３１】
2021533161.tif 000063
（配列番号：１５７）
（実施例６）
ＡＤＩ−２７７４９のバリアントおよびバリアントを含有するＴｒｉＮＫＥＴ
【０２８９】
上記のように、ＡＤＩ−２７７４９（Ａ４９）は、特に、ＧＡＰＭＧＡＡＡＧＷＦＤＰ（配列番号１６９）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含有する。配列番号９４の１０２位の（すなわち、このＣＤＲ３配列の４位の）Ｍｅｔは、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌによって置き換えられ、それによって、それぞれ、表１で示される対応する重鎖可変領域、軽鎖可変領域およびＣＤＲ配列を有するＮＫＧ２Ｄ結合部位Ａ４９ＭＱ、Ａ４９ＭＬ、Ａ４９ＭＩ、Ａ４９ＭＦおよびＡ４９ＭＶを生成し得る。
【０２９０】
Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−トラスツズマブ（「ＴｒｉＮＫＥＴ  Ａ」）、およびＭｅｔについてＩｌｅの置換を有するＴｒｉＮＫＥＴ  Ａの変異体形態（「ＴｒｉＮＫＥＴ  Ａ＊」）の、ヒトＮＫＧ２ＤとマウスＦｃとの融合タンパク質（「ｍＦｃ−ｈＮＫＧ２Ｄ」）への結合を、３７℃での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって特徴付けた。定常状態親和性フィットを利用して、平衡親和性データを得た。平衡親和性定数を計算し、ＴｒｉＮＫＥＴ  Ａ＊についての２回の独立実験およびＴｒｉＮＫＥＴ  Ａについての独立実験からのデータを平均した。
【表１２−１】
2021533161.tif 000064
【表１２−２】
2021533161.tif 000065
【０２９１】
表１２で示されるように、親和性フィットから得た平衡親和性定数（ＫＤ）は、反復間で非常に類似しており、このことは、測定されたパラメーターにおける高い信頼度を示唆した。ＫＤ値は、Ｍ１０２バリアントが、ＴｒｉＮＫＥＴ  Ａと比較して、ヒトＮＫＧ２Ｄについて２分の１未満に低減した親和性を有することを示した。ＴｒｉＮＫＥＴ  Ａ＊についてのＫＤは（４．８１±０．３９）×１０−７Ｍであり、一方で、ＴｒｉＮＫＥＴ  ＡについてのＫＤは、（３．３７±０．３０）×１０−７Ｍであった（親和性フィットから計算された）。これらのＫＤ値は、Ｍ１０２変異が、Ａ４９含有ＴｒｉＮＫＥＴのヒトＮＫＧ２Ｄへの結合に対して小さな影響のみ有したことを示唆した。
【０２９２】
加えて、Ｍ１０２変異の、ＴｒｉＮＫＥＴの効力に対する効果を、細胞傷害性アッセイにおいて評価した。簡潔に説明すると、レトロウイルス形質導入によって、ＣＤ１６ａ（１５８Ｖ）の高親和性バリアントを発現するＫＨＹＧ−１細胞を生成した。形質導入後、細胞を、ピューロマイシン含有成長培地中で選択して、選択されたＫＨＹＧ−１−ＣＤ１６Ｖ細胞集団を生成した。選択した集団を、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２を含有する培地中で維持した。細胞傷害性アッセイにおけるエフェクターとしての使用のためのＫＨＹＧ−１−ＣＤ１６Ｖ細胞を調製するために、細胞を、培養物から収集し、ペレット化し、ＩＬ−２を伴わない培養培地中で３回洗浄し、ＩＬ−２を伴わない培養培地中に再懸濁し、２４時間静止させた。
【０２９３】
ＴｒｉＮＫＥＴ  ＡおよびＴｒｉＮＫＥＴ  Ａ＊の活性を測定するために、腫瘍抗原ＨＥＲ２を発現するヒトがん細胞系ＳＫＢＲ−３を、標的細胞として選択した。ＨＥＲ２を発現するＳＫＢＲ−３を、培養物から収集した。細胞を、ヘペス緩衝食塩水（ＨＢＳ）で洗浄し、ＢＡＴＤＡ（ＴＤＡ（ビス（アセトキシメチル）２，２’：６’，２’’−テルピリジン−６，６’’−ジカルボキシレート）試薬の疎水性エステル化型）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃ１３６−１００）で標識するために１０６個の細胞／ｍＬで成長培地中に再懸濁した（ＢＡＴＤＡは、生細胞の細胞膜を通して拡散し、細胞内エステラーゼによって加水分解され、標的細胞内での膜浸透性ＴＤＡの蓄積をもたらす）。標的細胞とエフェクター細胞とのインキュベーション後、溶解した細胞から上清中へ放出されたＴＤＡを、Ｅｕ３＋でキレート化し、形成したＥｕＴＤＡキレートの強い蛍光を測定することによって、ＮＫ細胞活性を定量する（Ｂｌｏｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９９６）  １９３（２）：１９９−２０６を参照されたい）。標的細胞の標識について、製造業者の指示に従った。標識後、細胞をＨＢＳで３回洗浄し、培養培地中に０．５×１０５個の細胞／ｍＬで再懸濁した。１００μｌのＢＡＴＤＡ標識細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。
【０２９４】
ＴｒｉＮＫＥＴを培養培地中に段階希釈し、５０μｌの希釈したＴｒｉＮＫＥＴを各ウェルに添加した。静止ＮＫ細胞を培養物から収集し、洗浄し、培養培地中に１．０×１０６個の細胞／ｍＬで再懸濁した。５０μｌのＮＫ細胞をプレートの各ウェルに添加して、１０：１の所望のＥ：Ｔ比を得、各ウェル中全部で２００μｌの培養体積にした。プレートを３７℃で５％ＣＯ２にて２〜３時間インキュベートした。
【０２９５】
培養後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を２００×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化した。２０μｌの培養上清を、製造業者から提供された新しいマイクロプレートに移した。ＮＫ細胞を伴わずに単独でインキュベートした標識細胞からの上清を使用して、蛍光増強リガンド２，２’：６’，２’’−テルピリジン−６，６’’−ジカルボン酸（ＴＤＡ）の自発的放出を測定した（Ｂｌｏｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９９６）  １９３（２）：１９９−２０６を参照されたい）。１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘとインキュベートした標識細胞からの上清を使用して、標的細胞の最大溶解を測定した。２〜３時間のインキュベーション前の標識細胞からの上清を、バックグラウンドを測定するため、かつ質対照目的のために使用した。
【０２９６】
２００μｌの室温のユーロピウム溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃ１３５−１００）を、培養上清を含有する各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、プレートシェーカー上で２５０ｒｐｍにて１５分間インキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３Ｘ機器を使用して蛍光を測定した。蛍光レベルは、標的細胞の溶解を表した。特異的溶解％の値を、特異的溶解％＝（（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出））×１００％として計算した。
【０２９７】
特異的溶解％値を、図２１にプロットし、ＥＣ５０および最大特異的溶解％値を、表１３に要約する。
【表１３】
2021533161.tif 000066
【０２９８】
ＥＣ５０は、２倍未満増加し、ＴｒｉＮＫＥＴ  Ａ＊の最大特異的溶解％値は、ＴｒｉＮＫＥＴ  Ａの最大特異的溶解％値と同一であり、Ｍ１０２変異が、ＴｒｉＮＫＥＴ  Ａの生物活性に対して実質的な影響を有しないことを示唆した。
番号付き実施形態
【０２９９】
本明細書で開示する実施形態は、本開示の番号付き実施形態で提供されるように、実施形態Ｐ１〜Ｐ４９を含む。
【０３００】
実施形態Ｐ１：（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ断片を含む第１の抗原結合部位と；（ｂ）ＨＥＲ２に結合する一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を含む第２の抗原結合部位と；（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位とを含むタンパク質。
【０３０１】
実施形態Ｐ２：ｓｃＦｖが、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位に連結しており、ｓｃＦｖが、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、実施形態Ｐ１のタンパク質。
【０３０２】
実施形態Ｐ３：ｓｃＦｖが、抗体Ｆｃドメインに連結している、実施形態Ｐ２に記載のタンパク質。
【０３０３】
実施形態Ｐ４：ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインが、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、実施形態Ｐ２またはＰ３に記載のタンパク質。
【０３０４】
実施形態Ｐ５：ジスルフィド架橋が、重鎖可変ドメインのＣ４４と軽鎖可変ドメインのＣ１００との間に形成される、実施形態Ｐ４に記載のタンパク質。
【０３０５】
実施形態Ｐ６：ｓｃＦｖが、抗体Ｆｃドメインに連結しており、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインが、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインのＮ末端に位置し、かつフレキシブルリンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）４（（Ｇ４Ｓ）４）（配列番号２０３）を介してｓｃＦｖの重鎖可変ドメインに連結しており、Ｆａｂが、抗体Ｆｃドメインに連結している、実施形態Ｐ５に記載のタンパク質。
【０３０６】
実施形態Ｐ７：ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインが、フレキシブルリンカーを介してｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインに連結している、実施形態Ｐ２からＰ６のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３０７】
実施形態Ｐ８：フレキシブルリンカーが、（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）４（（Ｇ４Ｓ）４）（配列番号２０３）を含む、実施形態Ｐ７に記載のタンパク質。
【０３０８】
実施形態Ｐ９：ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインが、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ末端に位置する、実施形態Ｐ２からＰ８のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３０９】
実施形態Ｐ１０：ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインが、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインのＮ末端に位置する、実施形態Ｐ９に記載のタンパク質。
【０３１０】
実施形態Ｐ１１：Ｆａｂ断片が、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位に連結している、実施形態Ｐ１からＰ１０のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３１１】
実施形態Ｐ１２：Ｆａｂ断片の重鎖部分が、重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、重鎖可変ドメインが、ＣＨ１ドメインに連結している、実施形態Ｐ１１に記載のタンパク質。
【０３１２】
実施形態Ｐ１３：Ｆａｂが、抗体Ｆｃドメインに連結している、実施形態Ｐ１１またはＰ１２に記載のタンパク質。
【０３１３】
実施形態Ｐ１４：配列番号１３９の配列を含む、前記実施形態のいずれかに記載のタンパク質。
【０３１４】
実施形態Ｐ１５：抗体Ｆｃドメインに連結したｓｃＦｖを含み、抗体Ｆｃドメインに連結したｓｃＦｖが、配列番号１４０および配列番号１４６から選択される配列によって表される、実施形態Ｐ２からＰ１４のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３１５】
実施形態Ｐ１６：配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１４７または配列番号１４８の配列を含む、前記実施形態のいずれかに記載のタンパク質。
【０３１６】
実施形態Ｐ１７：配列番号１３９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含むタンパク質。
【０３１７】
実施形態Ｐ１８：配列番号１３９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を含むタンパク質。
【０３１８】
実施形態Ｐ１９：配列番号１３９のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一の配列を含むタンパク質。
【０３１９】
実施形態Ｐ２０：配列番号１４０および配列番号１４６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含むタンパク質。
【０３２０】
実施形態Ｐ２１：配列番号１４０および配列番号１４６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を含むタンパク質。
【０３２１】
実施形態Ｐ２２：配列番号１４０および配列番号１４６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一の配列を含むタンパク質。
【０３２２】
実施形態Ｐ２３：ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が、配列番号８６および配列番号９４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含む、実施形態Ｐ１からＰ１３のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３２３】
実施形態Ｐ２４：ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が、配列番号８６と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、実施形態Ｐ１からＰ１３のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３２４】
実施形態Ｐ２５：ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が、配列番号８６と少なくとも９５％同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９０と少なくとも９５％同一の軽鎖可変ドメインを含む、実施形態Ｐ１からＰ１３のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３２５】
実施形態Ｐ２６：ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が、配列番号９４と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、実施形態Ｐ１からＰ１３のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３２６】
実施形態Ｐ２７：ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が、配列番号９４と少なくとも９５％同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９８と少なくとも９５％同一の軽鎖可変ドメインを含む、実施形態Ｐ１からＰ１３のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３２７】
実施形態Ｐ２８：ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が、配列番号１４４と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、実施形態Ｐ１からＰ１３のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３２８】
実施形態Ｐ２９：ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が、配列番号１４４と少なくとも９５％同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９８と少なくとも９５％同一の軽鎖可変ドメインを含む、実施形態Ｐ１からＰ１３のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３２９】
実施形態Ｐ３０：ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が、配列番号８６と同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９０と同一の軽鎖可変ドメインを含む、実施形態Ｐ１からＰ１３のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３３０】
実施形態Ｐ３１：ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が、配列番号９４と同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９８と同一の軽鎖可変ドメインを含む、実施形態Ｐ１からＰ１３のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３３１】
実施形態Ｐ３２：ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が、配列番号１４４と同一の重鎖可変ドメイン、および配列番号９８と同一の軽鎖可変ドメインを含む、実施形態Ｐ１からＰ１３のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３３２】
実施形態Ｐ３３：抗体Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、実施形態Ｐ１からＰ１３およびＰ２３からＰ３２のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３３３】
実施形態Ｐ３４：Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｐ３３に記載のタンパク質。
【０３３４】
実施形態Ｐ３５：Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、Ｋ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置で異なる、実施形態Ｐ３３またはＰ３４に記載のタンパク質。
【０３３５】
実施形態Ｐ３６：Ｆｃドメインが、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、実施形態Ｐ１からＰ１３およびＰ２３からＰ３４のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３３６】
実施形態Ｐ３７：置換を含むＦｃドメインが、ｓｃＦｖに連結している、実施形態Ｐ３６に記載のタンパク質。
【０３３７】
実施形態Ｐ３８：Ｆｃドメインが、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、実施形態Ｐ１からＰ１３およびＰ２３からＰ３４のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３３８】
実施形態Ｐ３９：置換を含むＦｃドメインが、Ｆａｂ断片に連結している、実施形態Ｐ３８に記載のタンパク質。
【０３３９】
実施形態Ｐ４０：Ｆｃドメインが、Ｔ３６６Ｗ置換を含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、実施形態Ｐ１からＰ１３およびＰ２３からＰ３４のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３４０】
実施形態Ｐ４１：置換を含むＦｃドメインが、Ｆａｂ断片に連結している、実施形態Ｐ４０に記載のタンパク質。
【０３４１】
実施形態Ｐ４２：Ｆｃドメインが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換を含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、実施形態Ｐ１からＰ１３およびＰ２３からＰ３４のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３４２】
実施形態Ｐ４３：置換を含むＦｃドメインが、ｓｃＦｖに連結している、実施形態Ｐ４２に記載のタンパク質。
【０３４３】
実施形態Ｐ４４：１０ｎＭまたはそれよりも低いＫＤの親和性でＮＫＧ２Ｄに結合する、実施形態Ｐ１からＰ４３のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３４４】
実施形態Ｐ４５：前記実施形態のいずれか１つに記載のタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む製剤。
【０３４５】
実施形態Ｐ４６：実施形態Ｐ１からＰ４４のいずれか１つに記載のタンパク質を発現する１つまたは複数の核酸を含む細胞。
【０３４６】
実施形態Ｐ４７：腫瘍細胞死を直接的および／または間接的に増強する方法であって、腫瘍およびナチュラルキラー細胞を、実施形態Ｐ１からＰ４４のいずれか１つに記載のタンパク質に曝露するステップを含む方法。
【０３４７】
実施形態Ｐ４８：がんを処置する方法であって、実施形態Ｐ１からＰ４４のいずれか１つに記載のタンパク質または実施形態Ｐ４５に記載の製剤を、患者に投与するステップを含む方法。
【０３４８】
実施形態Ｐ４９：がんが、乳がん、甲状腺がん、胃がん、腎細胞癌、肺の腺癌、前立腺がん、胆管癌、子宮がん、膵臓がん、結腸直腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肺扁平上皮がん、中皮腫、肝臓がん、中皮腫、肉腫および胆嚢がんからなる群から選択される、実施形態Ｐ４８の方法。
参照による組込み
【０３４９】
本明細書で参照される特許文献および科学論文の各々の全開示を、全ての目的について参照により組み込む。
均等物
【０３５０】
本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。それゆえ、上記の実施形態は、全ての点において、本明細書に記載される本発明を限定するものではなく、実例であると考えられるべきである。したがって、本発明の範囲は、上記の説明によってではなく、附属の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等な意味および範囲内に入る全ての変更は、それに包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021533161.tif 000073
【図８−１】
2021533161.tif 000074
【図８−２】
2021533161.tif 000075
【図９】
2021533161.tif 000076
【図１０−１】
2021533161.tif 000077
【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
2021533161.tif 000081
【図１３】
2021533161.tif 000082
【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
2021533161.tif 000085
【図１６】
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【図１７】
2021533161.tif 000087
【図１８】
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【図１９】
2021533161.tif 000089
【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021533161.tif 000093
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