(57)【要約】  本発明は、マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸及びそれの用途に関するもので、本発明によるマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸は、マイクロＲＮＡのシード領域に相補的に結合する最小６個の塩基配列からなるマイクロＲＮＡ標的サイトを２個以上連続的に配列してマイクロＲＮＡと強く結合することができ、マイクロＲＮＡ標的サイトの間に非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）を導入して、効率的にマイクロＲＮＡを阻害するだけでなく、変形核酸に導入された配列が意図せずに他のマイクロＲＮＡと結合することを阻むことができる効果があり、正規的な標的だけでなくマイクロＲＮＡの非正規標的認識形態であるバルジ標的（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ  ｓｉｔｅ）及びＧ：Ａ又はＧ：Ｕウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列サイトも使用が可能であるので、マイクロＲＮＡの非正規標的認識により起きる生物学的機能のみを選択的に阻害することができると期待される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸において、
前記変形核酸は、少なくとも６個以上のヌクレオチドで構成されたマイクロＲＮＡ標的サイト配列を少なくとも２個以上連続的に含み、
前記マイクロＲＮＡ標的サイト配列は、
１）マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から７番目まで又は３番目から８番目までの塩基に相補的な配列；
２）マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から７番目までの塩基に相補的な配列であると共に５番目と６番目塩基の間にバルジ（ｂｕｌｇｅ）を含む配列；又は
３）マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から７番目まで又は３番目から８番目までの塩基に相補的な配列であると共にＧ：Ａ又はＧ：Ｕウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）塩基配列を相補的に含む配列；からなる群より選択された一つであってもよく、
前記マイクロＲＮＡ標的サイト配列間の間には、少なくとも１個以上の塩基が非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）に置換されることを特徴とする、マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸。
【請求項２】
前記マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１であることを特徴とする、請求項１に記載のマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸。
【請求項３】
前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸は、５’−ＡＣＡＵＵＣＣＡ−３’又は５’−ＡＡＡＵＵＣＣＡ−３’配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸。
【請求項４】
前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸は、前記５’−ＡＣＡＵＵＣＣＡ−３’配列を少なくとも２個以上連続して含み、前記配列の前後に非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）を少なくとも一つ以上含むことを特徴とする、請求項３に記載のマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸。
【請求項５】
前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸は、５’−ＡＡＡＵＵＣＣＡ−３’配列を少なくとも２個以上連続して含み、前記配列の前後に非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）を少なくとも一つ以上含むことを特徴とする、請求項３に記載のマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸。
【請求項６】
前記マイクロＲＮＡ標的サイト配列は、マイクロＲＮＡのシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）に相補的なヌクレオチドを６〜８個含むことを特徴とする、請求項１に記載のマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸。
【請求項７】
前記シード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）は、マイクロＲＮＡの５’末端を基準として１番目から８番目の間の配列であることを特徴とする、請求項６に記載のマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸。
【請求項８】
前記非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）は、塩基を含まない非塩基リボ核酸スペーサー（ｒＳｐａｃｅｒ、ｒＳｐ）、非塩基核酸スペーサー（ｄＳｐａｃｅｒ）、Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ及びＣ６  ｓｐａｃｅｒからなる群より選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載のマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸。
【請求項９】
１）マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から７番目まで又は３番目から８番目までの塩基に相補的な配列；
２）マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から７番目までの塩基に相補的な配列であると共に５番目と６番目塩基の間にバルジ（ｂｕｌｇｅ）を含む配列；又は
３）マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から７番目まで又は３番目から８番目までの塩基に相補的な配列であると共にＧ：Ａ又はＧ：Ｕウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）塩基配列を相補的に含む配列；からなる群より選択された一つの配列を連続して配列するステップ；及び
前記連続して配列した塩基配列間の間に少なくとも１個以上の塩基を非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）に置換して連結するステップ；を含むことを特徴とする、マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜請求項８のうちいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸を試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）細胞に導入させるステップを含むことを特徴とする、マイクロＲＮＡを抑制する方法。
【請求項１１】
請求項１〜請求項８のうちいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸を含むことを特徴とする、遺伝子伝達システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸及びその用途に関するもので、マイクロＲＮＡに相補的に結合してマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸及びその用途などに関する。
【０００２】
本出願は、２０１８年５月３１日に出願された大韓民国特許出願第１０−２０１８−００６３０４７号及び２０１９年５月３１日に出願された大韓民国許出願第１０−２０１９−００６４７６７号に基づく優先権の利益を主張し、当該出願の明細書及び図面に開示されたすべての内容は本出願に援用される。
【０００３】
【背景技術】
【０００４】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）は、転写後の段階で遺伝子の発現を抑制する現象であって、これを起こすＲＮＡ素材を細胞内に導入することで人工的に遺伝子抑制を誘導して所望するターゲット遺伝子を阻害する技術として広く用いられている。このようなＲＮＡ干渉現象は、実際に細胞内ではマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる〜２１個の塩基で構成された小さいＲＮＡにより起き、マイクロＲＮＡは、特に５’末端に位置するシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  １−８）の塩基配列を通じて数百個のターゲット遺伝子をｍＲＮＡで認識してその発現を抑制して生物学的な機能を示す。
【０００５】
具体的に、自然的に存在するＲＮＡ干渉誘導核酸であるマイクロＲＮＡは、アルゴノートタンパク質と複合体を成した後に相補的な塩基配列を通じて標的と結合するが、このとき、動物から発見されるマイクロＲＮＡの場合、マイクロＲＮＡのシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる５’末端を基準として１番目から８番目の間、最も重要には、５’末端を基準として２番目から７番目の間で最小限６個以上の連続的な塩基配列を標的ｍＲＮＡと成すようになれば、その標的ｍＲＮＡの発現を抑制する。上記のような形態の塩基配列が最も多く起きるため、このような標的はマイクロＲＮＡの正規標的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ）と定義し、このような形態の相補的塩基配列は、マイクロＲＮＡの正規的な生物学的機能において非常に重要である。しかし、最近には、マイクロＲＮＡ標的を実験的にシークエンシングできるＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰのような技術により、シード領域のような正規標的認識ではないこのような規則から脱する不正規標的（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ）も多数存在することが分かるようになった。
【０００６】
マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを認識してその遺伝子の発現を阻害することで生物学的機能を示すので、マイクロＲＮＡシード領域と相補的に配列できる塩基配列は、マイクロＲＮＡに標的ｍＲＮＡと競争しながら付くことになり、マイクロＲＮＡにより誘導される生物学的機能を阻害する機作として応用され得る（Ｅｂｅｒｔ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ。２００７  Ｓｅｐ；４（９）：７２１−６）。特に、マイクロＲＮＡのうち疾病を誘発させる機能を示す場合には、これを特異的に抑制することで治療剤として活用され得る。このようなマイクロＲＮＡの阻害剤は、一般的に、マイクロＲＮＡの全体配列にほとんど完璧に相補的な配列を含んでマイクロＲＮＡに特異的に塩基配列してその機能を抑制する形態で多く用いている。しかし、このような形態は、特定マイクロＲＮＡを抑制することはできるが、マイクロＲＮＡが認識する正規的な標的と不正規的な標的を区別して抑制することはできず、これによって、薬物で用いる場合、生物学的に必要なマイクロＲＮＡの機能も全て抑制するという副作用があり得る。
【０００７】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、研究の末、実際にマイクロＲＮＡで標的を認識する部分は５’末端を基準として１番目から８番目の間のシード領域、最も重要には、５’末端を基準として２番目から７番目の間の塩基のみを用いるので、このようなシード領域に相補的な配列のみを有していても十分にマイクロＲＮＡと結合が可能であることを確認した。このように８個の核酸程度の短い塩基のみをシード領域に連続的に相補的な配列で有していると、マイクロＲＮＡの正規標的認識のみを競争的に阻害することができるだけでなく、実際にこのような短いマイクロＲＮＡ結合サイトが数回繰り返して同一分子に存在するようになると、マイクロＲＮＡと塩基配列において全体塩基が相補的な場合より一層強く結合できることを確認した。実際に、多くのマイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡでこのような短いシード標的サイトが多数３’ＵＴＲに連鎖的に存在することがＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ実験から観察された。
【０００９】
したがって、上述した確認内容に基づいて本発明が解決しようとする課題は、マイクロＲＮＡの標的認識規則によってマイクロＲＮＡと結合するマイクロＲＮＡ標的サイトとして認識され得る短い塩基配列を２個以上含むマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記のような目的を達成するために、本発明は、次のような特徴を有するマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸を提供する。
【００１２】
【００１３】
本発明は、マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸において、
【００１４】
前記変形核酸は、少なくとも６個以上のヌクレオチドで構成されたマイクロＲＮＡ標的サイト配列を少なくとも２個以上連続して含み、
【００１５】
前記マイクロＲＮＡ標的サイト配列は、
【００１６】
１）マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から７番目まで又は３番目から８番目までの塩基に相補的な配列；
【００１７】
２）マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から７番目までの塩基に相補的な配列であると共に５番目と６番目塩基の間にバルジ（ｂｕｌｇｅ）を含む配列；又は
【００１８】
３）マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から７番目まで又は３番目から８番目までの塩基に相補的な配列であると共にＧ：Ａ又はＧ：Ｕウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）塩基配列を相補的に含む配列；からなる群より選択された一つであってもよく、
【００１９】
前記マイクロＲＮＡ標的サイト配列の間には、少なくとも１個以上の塩基が非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）に置換されることを特徴とする、マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸を提供する。
【００２０】
また、本発明は、１）マイクロＲＮＡで５’末端から２番目から７番目まで又は３番目から８番目までの塩基に相補的な配列；
【００２１】
２）マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から７番目までの塩基に相補的な配列であると共に５番目と６番目塩基の間にバルジ（ｂｕｌｇｅ）を含む配列；又は
【００２２】
３）マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から７番目まで又は３番目から８番目までの塩基に相補的な配列であると共にＧ：Ａ又はＧ：Ｕウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）塩基配列を相補的に含む配列；からなる群より選択された一つの配列を連続して配列するステップ；及び
【００２３】
前記連続して配列した塩基配列の間に少なくとも１個以上の塩基を非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）に置換して連結するステップ；を含むマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸の製造方法を提供する。
【００２４】
また、本発明は、前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸を試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）細胞に導入させるステップを含むマイクロＲＮＡを抑制する方法を提供する。
【００２５】
また、本発明は、前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸を含む遺伝子伝達システムを提供する。
【００２６】
本発明の一具現例として、前記マイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１であってもよい。
【００２７】
本発明の他の具現例として、前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸は、５’−ＡＣＡＵＵＣＣＡ−３’（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ  ｓｉｔｅ；配列番号１）又は５’−ＡＡＡＵＵＣＣＡ−３’（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ  ｓｅｅｄ  ｓｉｔｅ；配列番号２）配列を含むものであってもよい。
【００２８】
本発明のまた他の具現例として、前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸は、前記５’−ＡＣＡＵＵＣＣＡ−３’配列を少なくとも２個以上連続して含み、前記配列の前後に非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）を少なくとも一つ以上含むものであってもよい。
【００２９】
本発明のまた他の具現例として、前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸は、前記５’−ＡＡＡＵＵＣＣＡ−３’配列を少なくとも２個以上連続して含み、前記配列の前後に非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）を少なくとも一つ以上含むものであってもよい。
【００３０】
本発明のまた他の具現例として、前記マイクロＲＮＡ標的サイト配列は、マイクロＲＮＡのシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）に相補的なヌクレオチドを６〜８個含んでもよい。
【００３１】
本発明のまた他の具現例として、前記シード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）は、マイクロＲＮＡの５’末端を基準として１番目から８番目の間の配列であってもよい。
【００３２】
本発明のまた他の具現例として、前記非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）は、塩基を含まない非塩基リボ核酸スペーサー（ｒＳｐａｃｅｒ、ｒＳｐ）、非塩基核酸スペーサー（ｄＳｐａｃｅｒ）、Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ及びＣ６  ｓｐａｃｅｒからなる群より選択される一つ以上であってもよく、塩基がない全てのスペーサー変形の一種であってもよい。
【００３３】
【発明の効果】
【００３４】
本発明によるマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸は、マイクロＲＮＡのシード領域に相補的に結合する最小６個の塩基配列からなるマイクロＲＮＡ標的サイトを２個以上連続的に配列してマイクロＲＮＡと強く結合することができ、マイクロＲＮＡ標的サイトの間に非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）を導入して効率的にマイクロＲＮＡを阻害するだけでなく、変形核酸に導入された配列の境界部分で作られる塩基配列により意図せずに他のマイクロＲＮＡやＲＮＡ結合タンパク質と結合して競争的に阻害することを阻むことができる効果がある。
【００３５】
また、正規的な標的だけでなくマイクロＲＮＡの非正規標的認識形態であるバルジ標的（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ  ｓｉｔｅ）及びＧ：Ａ又はＧ：Ｕウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列サイトも使用が可能なので、マイクロＲＮＡの非正規標的認識により起きる生物学的機能のみを選択的に阻害することができると期待される。
【００３６】
【図面の簡単な説明】
【００３７】
図１は、本発明によるマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸である連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤の作用機作を図式化して示した図である。
【００３８】
図２の（ａ）は、ｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１の正規シード標的サイト（ｍｉＲ−１  ｓｅｅｄ  ｓｉｔｅ）を示し、これを含むルシフェラーゼレポーター（Ｌｕｃ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ）を表示した図であり、図２の（ｂ）は、ルシフェラーゼレポーターを用いたｍｉＲ−１の正規シード標的効率を測定した結果を示した図であり、図２の（ｃ）は、ｍｉＲ−１の正規シード標的サイトを２個含む連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ（２ｘ））と対照群（ａｎｔｉ−ＮＴ（２ｘ））を示した図であり、図２の（ｄ）は、本発明による図２の（ｃ）のａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ（２ｘ）及びａｎｔｉ−ＮＴ（２ｘ）をｍｉＲ−１に適用したときのｍｉＲ−１の活性阻害効果を確認した結果を示した図である。
【００３９】
図３の（ａ）〜図３の（ｃ）は、本発明による連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤が心臓筋肉母細胞株であるＨ９ｃ２細胞でｍｉＲ−１の正規的なシード（ｓｅｅｄ）標的サイトを抑制する効果を観察した結果を示した図である。
【００４０】
図４の（ａ）及び図４の（ｂ）は、マイクロＲＮＡがシード領域を通じて非典型的にウォブル塩基配列（Ｇ：Ａ  ｗｏｂｂｌｅ）を形成して標的ｍＲＮＡに結合できるという事実をマイクロＲＮＡの標的結合配列であるＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰデータ分析を通じて確認した結果を示した図であり、図４の（ｃ）は、ｍｉＲ−１２４に対する正規シード配列サイト（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｅｅｄ  ｓｉｔｅｓ）と５’末端を基準として４番目のＧ（４Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）又は５番目のＧを通じた非正規Ｇ：Ａウォブル配列シードサイト（５Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）を例示した図である。
【００４１】
図５（ａ）は、心筋梗塞患者の心臓組織で実行したＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰデータ分析を簡略に図式化した図であり、図５（ｂ）は、ｍｉＲ−１がシード領域を通じて非典型的にウォブル塩基配列（Ｇ：Ａ  ｗｏｂｂｌｅ）を形成して標的ｍＲＮＡに結合できることを確認して示した図であり、図５の（ｃ）は、ｍｉＲ−１で配列変異が当該Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅで起きることを確認した結果を示した図である。
【００４２】
図６の（ａ）〜図６の（ｄ）は、図５で発見したｍｉＲ−１の非典型的Ｇ：Ａウォブルシード標的サイトを通じてｍｉＲ−１が標的遺伝子を抑制することのできることを当該蛍光タンパク質レポーター分析を行って心臓筋肉母細胞株であるＨ９ｃ２細胞から確認した結果を示した図である。
【００４３】
図７の（ａ）及び図７の（ｂ）は、マイクロＲＮＡの非正規標的認識方式であるバルジ（ｂｕｌｇｅ）塩基配列に対してルシフェラーゼレポーター実験を実施してマイクロＲＮＡの非正規的なバルジ（ｂｕｌｇｅ）塩基配列を通じたマイクロＲＮＡの標的遺伝子発現抑制をｍｉＲ−１２４から確認し、これを通じた抑制剤開発が可能である事実を提示しようと示した図である。
【００４４】
図８の（ａ）〜図８の（ｃ）は、ｍｉＲ−１がシード配列でＧ：Ａウォブル配列標的抑制を通じてｍｉＲ−１での機能とは異なり心肥大症を誘導させ得ることを１次心筋細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｒａｔ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）から観察した結果を示した図である。
【００４５】
図９の（ａ）は、ｍｉＲ−１の非正規Ｇ：Ａウォブル配列標的認識のみを阻害するための連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（２ｘ））を示した図であり、図９の（ｂ）は、ｍｉＲ−１の非正規Ｇ：Ａウォブルシード標的サイト（ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）及びこれを含むルシフェラーゼレポーター遺伝子を示した図であり、図９の（ｃ）は、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（２ｘ）がＧ：Ａウォブル配列標的遺伝子を阻害するｍｉＲ−１：Ｇ７Ｕに対して阻害効果を示すかを確認した結果を示した図である。
【００４６】
図１０の（ａ）は、図９での連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（２ｘ））が心臓筋肉母細胞株（Ｈ９ｃ２）の細胞に存在するｍｉＲ−１の非正規Ｇ：Ａウォブル配列を抑制できるということをルシフェラーゼレポーター実験で確認した結果を示した図であり、図１０の（ｂ）及び図１０の（ｃ）は、これによる生物学的な効果としてａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（２ｘ）により心臓筋肉母細胞（Ｈ９ｃ２）のサイズが小さくなる現象を確認した結果を示した図である。
【００４７】
図１１の（ａ）は、９個のｍｉＲ−１の非正規Ｇ：Ａウォブルサイトを有している連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ））を示した図であり、図１１の（ｂ）は、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）を適用して非正規Ｇ：Ａウォブルサイトによる遺伝子抑制現象を阻むことができるということをルシフェラーゼレポーター実験から確認した結果を示した図であり、図１１の（ｃ）は、これによってＨ９ｃ２細胞でＰＥ薬物による心筋肥大誘導現象が抑制されることを確認した結果を示した図である。
【００４８】
図１２の（ａ）は、ｍｉＲ−１の非正規Ｇ：Ａウォブルサイトの間に非塩基スペーサー変形を有している連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ））と非塩基スペーサー変形がない対照群（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）ＮＳ）の配列を示した図であり、図１２の（ｂ）は、当該ターゲットサイトの間に連結された隣接部位の配列に結合するマイクロＲＮＡの場合には、意図せずに連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤がこれを抑制する副作用が現れるが、ターゲットサイトの間に非塩基スペーサー変形がある場合には、そうではない場合を示した図であり、図１２の（ｃ）は、図１２の（ｂ）をルシフェラーゼレポーター実験で証明した結果を示した図である。
【００４９】
【発明を実施するための最先の形態】
【００５０】
本発明は、多様な変換を加えるかさまざまな実施例を有することができ、特定実施例を図面に例示して詳細な説明で詳細に説明しようとする。しかし、これは本発明を特定の実施形態に対して限定しようとするものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物ないし代替物を含むことと理解されなければならない。本発明を説明するにおいて関連された公知技術に対する具体的な説明が本発明の要旨を濁すと判断される場合、その詳細な説明を省略する。
【００５１】
【００５２】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００５３】
【００５４】
本発明者は、既存のマイクロＲＮＡ阻害剤で阻害効果を高めようと競争的にマイクロＲＮＡに結合できる配列を多数個配列するようになるが、このとき、導入された多重配列境界で新たに生成される塩基配列の相補性によって意図せずに他のマイクロＲＮＡと結合し得るという副作用が現れ得る。そこで、当該配列の多重性は継続して増加させ得ると共に、境界配列により起きる副作用を解決できるマイクロＲＮＡ阻害剤の開発のために努力した結果、マイクロＲＮＡのシード領域に相補的な配列を有したマイクロＲＮＡ標的サイトを２個以上連続的に含み、マイクロＲＮＡ標的サイトの間に塩基がないので塩基配列できない非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）を導入したマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸を発明することで、本発明を完成した。
【００５５】
【００５６】
本発明は、マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸において、
【００５７】
前記変形核酸は、少なくとも６個以上のヌクレオチドで構成されたマイクロＲＮＡ標的サイト配列を少なくとも２個以上連続して含み、
【００５８】
前記マイクロＲＮＡ標的サイト配列は、
【００５９】
１）マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から７番目まで又は３番目から８番目までの塩基に相補的な配列；
【００６０】
２）マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から７番目までの塩基に相補的な配列であると共に５番目と６番目塩基の間にバルジ（ｂｕｌｇｅ）を含む配列；又は
【００６１】
３）マイクロＲＮＡの５’末端で２番目から７番目まで又は３番目から８番目までの塩基に相補的な配列であると共にＧ：Ａ又はＧ：Ｕウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）塩基配列を相補的に含む配列；からなる群より選択された一つであってもよく、
【００６２】
前記マイクロＲＮＡ標的サイト配列の間には、少なくとも１個以上の塩基が非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）に置換されることを特徴とするマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸を提供する。
【００６３】
【００６４】
本発明において、前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸は、５’−ＡＣＡＵＵＣＣＡ−３’又は５’−ＡＡＡＵＵＣＣＡ−３’配列を含むことができるが、前記１）〜３）のうちいずれか一つに該当するマイクロＲＮＡ標的サイト配列を含む場合であれば、特に制限されない。
【００６５】
【００６６】
本発明において、前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸は、前記５’−ＡＣＡＵＵＣＣＡ−３’配列を少なくとも２個以上連続して含み、前記配列の前後に非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）を少なくとも一つ以上含む変形核酸を含んでもよく、５’−ＡＡＡＵＵＣＣＡ−３’配列を少なくとも２個以上連続して含み、前記配列の前後に非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）を少なくとも一つ以上含む変形核酸を含んでもよい。
【００６７】
【００６８】
本発明による前記マイクロＲＮＡの種類には制限がなく、本発明の具体的な実施例によると、前記マイクロＲＮＡはｍｉＲＮＡ−１であってもよい。
【００６９】
【００７０】
本発明において、前記マイクロＲＮＡ標的サイト配列は、少なくとも６個以上のヌクレオチドを含み、好ましくは、２１個以下のヌクレオチドを含み、最も好ましくは、ヌクレオチドを６〜８個含むことができるが、これに制限されない。
【００７１】
マイクロＲＮＡは、実際に５’末端で１番目から８番目の間の少なくとも６個以上の塩基配列のみを認識するので、前記１番目から８番目の間の塩基配列に相補的な配列のみを有していても十分にマイクロＲＮＡと結合が可能であり、前記マイクロＲＮＡ標的サイト配列が６〜８個のヌクレオチドを含む場合、マイクロＲＮＡの正規標的認識のみを競争的に阻害することができる。
【００７２】
本発明において、前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸は、前記マイクロＲＮＡ標的サイト配列を少なくとも２個以上連続して含むことができ、前記マイクロＲＮＡ標的サイト配列を連続して２個以上多く含むほどよく、例えば、１００個以下を含んでもよく、好ましくは、前記マイクロＲＮＡ標的サイト配列は、２個〜７０個、２個〜５０個、２個〜３０個、２個〜９個、９個〜３０個、９個〜５０個、９個〜７０個を連続して含んでもよいが、これに制限されない。前記マイクロＲＮＡ標的サイト配列を１個のみ含む場合に比べて、２個連続して含む場合、マイクロＲＮＡと一層強く結合でき、本発明の一実施例では、前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸がマイクロＲＮＡ標的サイト配列を２回連続して含む場合に比べて、９回連続して含む場合、一層増加された阻害効果を示すことを確認した（実施例４−２参照）。
【００７３】
前記「連続（して含む）」は、マイクロＲＮＡ標的サイト配列が変形核酸の単一鎖に線形に含まれることを意味し、マイクロＲＮＡ標的サイト配列の間に離隔して含まれてもよい。
【００７４】
本発明において、前記連続して配列したマイクロＲＮＡ標的サイト配列の間に少なくとも１個以上の塩基を非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）に置換して連結することができ、好ましくは、１個以上多く置換するほどよく、例えば、１０個以下の塩基を非塩基スペーサーに置換することができるが、これに制限されない。
【００７５】
マイクロＲＮＡの場合、５’末端で１番目から８番目の間の６個〜８個の塩基配列のみ合う場合にも十分に結合できるので、マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸に導入された配列が意図しなかった他のマイクロＲＮＡと偶然に塩基配列して作用できるが、前記非塩基スペーサーでマイクロＲＮＡ標的サイト配列の間に１個の塩基を置換する場合、マイクロＲＮＡ標的サイト配列が結合して新しいサイト（ｓｉｔｅ）を作らないようにして、マイクロＲＮＡ標的サイトに導入された配列が意図せずに他のマイクロＲＮＡと結合することを阻むことができる。
【００７６】
本発明で用語「非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）は、単一ヌクレオチドの代わりにその空間を維持させるための置換体であってもよく、空間を維持させることのできる形態で隣接するヌクレオチドを連結させ得るものであればいずれか一つに限定されるものではないが、好ましくは、有機化合物であってもよく、より好ましくは、リン酸基（−Ｈ２ＰＯ４）又は硫酸基（−Ｈ２ＰＳＯ４）を含む（連結した）炭化水素鎖であってもよく、最も好ましくは、少なくとも炭素数が３であるアルキル基（Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ）又は６であるアルキル基（Ｃ６  ｓｐａｃｅｒ）であってもよい。また、前記非塩基スペーサーは、非塩基（ａｂａｓｉｃ）形態のヌクレオチドを含み、このような非塩基ヌクレオチド形態のスペーサーは、一般的に塩基が全くない形態の単一ヌクレオチド類似体を意味するものであって、非塩基ジオキシリボ核酸スペーサー（ｄＳｐａｃｅｒ）、非塩基リボ核酸スペーサー（ｒＳｐａｃｅｒ）を含み、包括的には、ＲＮＡをはじめとするすべての他の生体塩基と結合することのできない形態のすべての変形を意味する。本発明の具体的な実施例によると、前記非塩基スペーサーは、リボヌクレオチド（Ｒｉｂｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をバックボーンとするｒＳｐａｃｅｒ分子であってもよい。
【００７７】
【００７８】
本発明において、マイクロＲＮＡ標的サイト配列は、マイクロＲＮＡのシード領域の塩基配列に相補的である。
【００７９】
本発明において、前記シード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）は、マイクロＲＮＡの５’末端を基準として１番目から８番目の間の配列を意味する。
【００８０】
本発明によるマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸は、マイクロＲＮＡの正規標的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ）だけでなく非正規標的認識（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）形態であるバルジ標的（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ  ｓｉｔｅ）及びＧ：Ａ又はＧ：Ｕウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）塩基配列サイトも使用が可能である。
【００８１】
このとき、前記非正規標的認識は、マイクロＲＮＡが標的ｍＲＮＡと結合するとき、マイクロＲＮＡのシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）と正確に相補関係ではなくともマイクロＲＮＡの標的と認識する場合を言う。
【００８２】
本発明において、前記非バルジ標的は、マイクロＲＮＡの５’末端で５番目及び６番目の塩基に相補的な塩基の間に塩基がバルジ状に押し出されたものを言うものであって、マイクロＲＮＡの５’末端で５番目までの塩基とは全て相補関係を有し、６番目の塩基が認識する（マイクロＲＮＡの５’末端で６番目の塩基と配列される）遺伝子は、前記マイクロＲＮＡの５’末端で５番目の塩基と相補関係を有する塩基と直に連続される塩基ではなく、直に連続される塩基は、バルジ状に押し出し、その次に、マイクロＲＮＡと相補関係を有する塩基がマイクロＲＮＡの５’末端で６番目の塩基の認識する塩基になる場合を言う。
【００８３】
本発明において、前記Ｇ：Ａ又はＧ：Ｕウォブル塩基配列は、マイクロＲＮＡとマイクロＲＮＡが認識する標的遺伝子の塩基がＡ：Ｕ、Ｇ：Ｃ、Ｃ：Ｇ、Ｕ：Ａの相補関係の配列外にもＧ：Ａ又はＧ：Ｕの塩基配列を有することを言う。
【００８４】
例えば、マイクロＲＮＡとマイクロＲＮＡが認識する標的遺伝子がＧ：Ａのウォブル関係にあるとき、特定マイクロＲＮＡの塩基：前記特定マイクロＲＮＡが認識する標的遺伝子の塩基の配列は、Ｇ：Ａであり、マイクロＲＮＡとマイクロＲＮＡが認識する標的遺伝子がＧ：Ｕのウォブル関係にあるとき、特定マイクロＲＮＡの塩基：前記特定マイクロＲＮＡが認識する標的遺伝子の塩基の配列は、Ｇ：Ｕである。
【００８５】
また、マイクロＲＮＡとマイクロＲＮＡが認識する標的遺伝子がＧ：Ａのウォブル関係にあるとき、前記特定マイクロＲＮＡが認識する標的遺伝子：特定マイクロＲＮＡの塩基：特定マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸の塩基は、Ａ：Ｇ：Ａであってもよく、マイクロＲＮＡとマイクロＲＮＡが認識する標的遺伝子がＧ：Ｕのウォブル関係にあるとき、前記特定マイクロＲＮＡが認識する標的遺伝子：特定マイクロＲＮＡの塩基：特定マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸の塩基は、Ｕ：Ｇ：Ｕであってもよい。
【００８６】
【００８７】
本発明において、マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸は、ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＵＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＤｓｉＲＮＡ、ｌｓｉＲＮＡ、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ、ａｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ又はｅｎｄｏ−ｓｉＲＮＡなどの核酸及び核酸誘導体であってもよく、これに制限されない。
【００８８】
また、本発明は、１）マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から７番目まで又は３番目から８番目までの塩基に相補的な配列；
【００８９】
２）マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から７番目までの塩基に相補的な配列であると共に５番目と６番目塩基の間にバルジ（ｂｕｌｇｅ）を含む配列；又は
【００９０】
３）マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から７番目まで又は３番目から８番目までの塩基に相補的な配列であると共にＧ：Ａ又はＧ：Ｕウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）塩基配列を相補的に含む配列；からなる群より選択された一つの配列を連続して配列するステップ；及び
【００９１】
前記連続して配列した塩基配列の間に少なくとも１個以上の塩基を非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）に置換して連結するステップ；を含むマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸の製造方法を提供する。
【００９２】
前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸の製造方法に対しては、上述した内容を繰り返す内容であるため詳しい説明を省略する。
【００９３】
また、本発明は、前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸を試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）細胞に導入させるステップを含むマイクロＲＮＡを抑制する方法を提供する。
【００９４】
本発明において、前記「細胞」の種類は、脊椎動物、例えば、ヒトを含めた哺乳動物（ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシなど）、鳥類（ニワトリ、ダチョウなど）、両生類（カエルなど）及び魚類、又は無脊椎動物、例えば、昆虫類（カイコ、ガ、ショウジョウバエなど）、植物、酵母のような微生物などが含まれ、好ましくは、ヒトを含めた哺乳動物であってもよいが、これに制限されない。
【００９５】
本発明において、前記「導入」は、細胞に核酸を注入して細胞の遺伝形質を変異させることを言い、細胞に核酸を導入させる方法においては、特に制限がなく、例えば、リン酸カルシウムを用いた形質感染（Ｇｒａｈａｍ、ＦＬなど、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６（１９７３））、ＤＥＡＥデキストランによる形質感染、微細注射による形質感染（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、ＭＲ、Ｃｅｌｌ、２２：４７９（１９８０））、陽イオン性脂質による形質感染（Ｗｏｎｇ、ＴＫなど、Ｇｅｎｅ、１０：８７（１９８０））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ  ＥなどＥＭＢＯ  Ｊ、１：８４１（１９８２））、形質導入又はトランスフェクションのように文献（Ｂａｓｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓなど、１９８６及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｄａｖｉｓなど、１９８６）に記載されたように、本発明が属した技術分野で通常の知識を有した者によく公知されている方法によって行われ得る。好ましくは、トランスフェクションによることができる。トランスフェクション効率は、細胞の種類だけでなく細胞培養条件、トランスフェクション試薬などによって多くの差があり得る。
【００９６】
また、本発明は、前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸を含む遺伝子伝達システムを提供する。
【００９７】
本発明において、前記「遺伝子伝達（ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）」は、遺伝子が細胞内に運搬されることを意味し、遺伝子の細胞内浸透（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）と同一の意味を有することができる。組織レベルで、前記用語「遺伝子伝達」は、遺伝子の拡散（ｓｐｒｅａｄ）と同一の意味を有することができる。また、本発明で遺伝子伝達システムは、多様な形態で製作でき、例えば、ネイキッド（ｎａｋｅｄ）組換えＤＮＡ分子、プラスミド、ウイルスベクター及び前記ネイキッド組換えＤＮＡ分子又はプラスミドを内包するリポソーム又はニオソームの形態などで製作できるが、これに制限されない。
【００９８】
また、本発明は、マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸を含む心筋肥大現象調節用組成物を提供する。本発明の具体的な実施例で、心筋細胞から心筋肥大を誘導したとき、ｍｉＲ−１の正規的な標的認識によって心筋細胞のサイズが減少し、Ｇ：Ａウォブル配列を通じた非正規的標的認識によっては心筋肥大を誘導した細胞と類似するレベルに大きくなったことを確認した（実施例３参照）。
【００９９】
本発明による前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸は、マイクロＲＮＡに相補的に結合してマイクロＲＮＡが標的ｍＲＮＡと結合することを競争的に阻害することができ、前記マイクロＲＮＡを抑制する変形核酸である連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤の作用機作は、図１に図式化して示した。
【０１００】
本発明のまた他の実施例では、マイクロＲＮＡがシード配列でＧ：Ａウォブル配列を通じて標的遺伝子を抑制できることを確認し、ルシフェラーゼレポーターによるマイクロＲＮＡの非正規的なバルジ（ｂｕｌｇｅ）塩基配列標的抑制を確認した（実施例２参照）。
【０１０１】
本発明のまた他の実施例では、マイクロＲＮＡがシード配列でＧ：Ａウォブル配列標的抑制を通じて他の生物学的機能を示すことを確認した（実施例３参照）。
【０１０２】
本発明のまた他の実施例では、連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤によるマイクロＲＮＡの非正規的Ｇ：Ａウォブル結合機能抑制効果を確認した（実施例４参照）。
【０１０３】
本発明のまた他の実施例では、連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤でスペーサー変形導入を通じて標的サイトの間の連結配列による副作用除去効果を確認した（実施例５参照）。
【０１０４】
【０１０５】
以下、本発明の好ましい実施例及び実験例を添付図面を参照して詳しく説明する。ただし、これら実施例及び実験例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例及び実験例によって制限されると解析してはならない。
【０１０６】
【０１０７】
実施例１．連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤によるマイクロＲＮＡの正規的シード結合機能抑制効果の確認
【０１０８】
【０１０９】
１−１．連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤の製造方法
【０１１０】
図１に示した例として、アルゴノートタンパク質に結合されたマイクロＲＮＡの塩基配列のうち５’末端を基準として１番目から８番目までの塩基配列である５’−ＵＡＡＧＧＣＡＣＧ−３’が当該マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２４に対する例示）のシード塩基配列として、マイクロＲＮＡは、これを用いて標的ｍＲＮＡに相補的に結合する。このとき、マイクロＲＮＡシードと相補的に配列できる８個の短い標的塩基配列を２個以上導入してマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸である連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤（Ｔａｍｄｅｍ−ｔａｒｇｅｔ  ｍｉＲＮＡ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を製造すると、マイクロＲＮＡシード（５’−ＵＡＡＧＧＣＡＣＧ−３’）と連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤の５’−ＵＧＣＣＵＵ−３’配列が完全相補的に配列するようになり、これによって、実際の標的ｍＲＮＡ塩基との配列が相対的に抑制されてマイクロＲＮＡの正規標的抑制機能が阻害される。連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤は、より強力で効率的な塩基配列のために当該塩基配列（５’−ＵＧＣＣＵＵ−３’）を２回以上連続的に配列し、これは、マイクロＲＮＡシードと連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤の間に一回以上の塩基配列結合を可能にする。また、連鎖的に配列した塩基配列（５’−ＵＧＣＣＵＵ−３’）を非塩基スペーサーで連結することで、当該塩基配列の境界で新たに生成される連続された配列によるオフターゲット阻害効果を基本的に阻むことができる。
【０１１１】
【０１１２】
１−２．ｍｉＲ−１の正規シード標的サイトに対する連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤の効果の確認
【０１１３】
前記実施例１−１で示した連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤の効果を確認するために、これをｍｉＲ−１に対して適用し、このとき、ｍｉＲ−１の標的遺伝子阻害効能を実験的に確認するためにルシフェラーゼレポーター実験（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ）を行った。このために、図２の（ａ）に示したように、ｍｉＲ−１の正規シード標的サイト（ｍｉＲ−１  ｓｅｅｄ  ｓｉｔｅ）として最小基準であるｍｉＲ−１の５’末端を基準として２番目から８番目まで連続的に相補的な配列を含んだ標的サイト配列をルシフェラーゼレポーター遺伝子の３’ＵＴＲに５個連続的に配置してルシフェラーゼレポーターベクター（ｐｓｉ−ｃｈｅｃｋ２、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を製作した（Ｌｕｃ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ）。
【０１１４】
その後、前記ルシフェラーゼレポーターベクターを用いてｍｉＲ−１の濃度変化による正規的標的シードサイト（ｓｅｅｄ  ｓｉｔｅ）を有している遺伝子の阻害能とともに、上記で製作したルシフェラーゼレポーターベクターの作用能を測定するために、複数の濃度（０、０．０１、０．１、０．５、２．５、１５ｎＭ）のｍｉＲ−１を細胞に導入させた後、ルシフェラーゼの活性でＩＣ５０（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ５０）を測定した。当該濃度のｍｉＲ−１は、前記方法で製作されたルシフェラーゼレポーターベクターと一緒にＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００試薬(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を用いて製造者のプロトコルによって細胞に伝達（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させてその効果を調査した。このときのｍｉＲ−１は、ガイド鎖（ｇｕｉｄｅ  ｓｔｒａｎｄ）、パッセンジャー鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）の二つの核酸配列にＢｉｏｎｅｅｒ社で化学的に合成製作した後、ＨＰＬＣによって分離し、前記会社で提供した方法によって二重体（ｄｕｐｌｅｘ）で製造して用いた。ＨｅＬａ細胞は、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌステップトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改質Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、トランスフェクションの実行時に抗生剤のない完全培地細胞を培養した。このようにトランスフェクションを行った後、２４時間後に、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍを用いて製造社のプロトコルにしたがってルシフェラーゼの活性を測定した。このとき、レニラルシフェラーゼ活性計測は、ｐｒｏｍｅｇａ社のＧｌｏｍａｘ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて最小３回以上反復実験を行い、ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼの活性に基づいて標準化して計算した。
【０１１５】
その結果、図２の（ｂ）に示したように、ｍｉＲ−１のＩＣ５０値は、２．２ｎＭであることが分かり、製作したルシフェラーゼベクターを用いてｍｉＲ−１による標的遺伝子の阻害能力を正確に測定できることが分かった。
【０１１６】
前記実施例１−１で示した連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤の効果を確認するために、その後、ｍｉＲ−１の正規標的なシード標的サイトを阻害するための連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤であるａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ（２ｘ）を、図２の（ｃ）に示した配列によってＢｉｏｎｅｅｒ社で化学的に合成した後、ＨＰＬＣによって分離して製作した。このときの塩基配列及び組成は、次のとおりである（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ（２ｘ）：５’ｐ−ｄＴｄＴ（ｒＳＰ）ＡＣＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＣＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ｄＴｄＴ−３’、配列番号３）。具体的に、ｍｉＲ−１の塩基配列（５’ｐ−ＵＧＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ−３’、配列番号４）のうち、正規的な標的を認識するシード領域塩基配列は、５’−ＵＧＧＡＡＵＧＵ−３’であるので、連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤は、ｍｉＲ−１シード領域塩基配列と完全相補的に配列する塩基配列（５’−ＡＣＡＵＵＣＣＡ−３’）を２回繰り返す配列を有し、このような正規的標的配列の間は、塩基を含まない非塩基（ａｂａｓｉｃ）リボ核酸であるｒＳｐａｃｅｒ（ｒＳＰ）で連結して、二つの標的配列が隣接しながらその境目で連続的に新たに生成され得る潜在的な標的サイトの生成を阻むことで、これによるオフターゲットを阻んだ。
【０１１７】
上記方法で作ったｍｉＲ−１シード（ｓｅｅｄ）標的を対象とした連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ）の配列は、図２の（ｃ）に示した。また、前記連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤の５’末端と３’末端の先がｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅの攻撃を受けて細胞内で分解されることを阻むために、両先端の２個の核酸はデオキシヌクレノチド（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）でチミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）を合成して（ｄＴ）付けた。同時に、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のマイクロＲＮＡであるｃｅｌ−ｍｉＲ−６７（ＮＴ；ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：５’−ＵＣＡＣＡＡＣＣＵＣＣＵＡＧＡＡＡＧＡＧＵＡＧＡ−３’、配列番号５）の正規シード標的サイトを用いて同一に対照群として連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤（ａｎｔｉ−ＮＴ（２ｘ））を次のような配列によって考案した（ａｎｔｉ−ＮＴ（２ｃ）：５’ｐ−ｄＴｄＴ（ｒＳＰ）ＧＧＵＵＧＵＧＡ（ｒＳＰ）ＧＧＵＵＧＵＧＡ（ｒＳＰ）ｄＴｄＴ−３’、配列番号６）。連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤もＢｉｏｎｅｅｒ社で化学的に合成製作した後、ＨＰＬＣによって分離して用いた。
【０１１８】
また、図２の（ｂ）に示したＩＣ５０実験を通じて４０％の標的遺伝子発現抑制を示す１ｎＭ濃度のｍｉＲ−１と、５０ｎＭ濃度の阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ（２ｘ）又はａｎｔｉ−ＮＴ（２ｘ））を一緒にＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００試薬(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を用いて製造者のプロトコルにしたがって細胞に伝達（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させてａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ（２ｘ）のｍｉＲ−１の正規シード標的抑制を阻害する効果を調査した。
【０１１９】
その結果、図２の（ｄ）に示したように、１ｎＭのｍｉＲ−１がトランスフェクションされて観察されたルシフェラーゼ活性値は、ｍｉＲ−１がトランスフェクションされない値に基づいて計算された相対的ルシフェラーゼ活性パーセント値が５６．５８＋／−４．２７であって、ＩＣ５０で予想したものと類似した〜５０％レベルのルシフェラーゼ活性を示した。同一濃度のｍｉＲ−１が５０ｎＭのａｎｔｉ−ＮＴ（２ｘ）と一緒に導入された実験群の相対的ルシフェラーゼ活性パーセント値は、５４．０７＋／−３．８９であって、ｍｉＲ−１が調節したルシフェラーゼ活性値と有意的に差異がなく、したがって、ａｎｔｉ−ＮＴ（２ｘ）が与える阻害効果を観察することができなかった。一方で、ｍｉＲ−１とａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ（２ｘ）が同時に導入された実験群の相対的ルシフェラーゼ活性パーセント値は、９６．４３＋／−８．４４であって、ｍｉＲ−１が調節したルシフェラーゼ活性値が完全に回復する効果を確認した。これは、統計的に有意（ｐ＝１．０ｘ１０−８）であることを観察した。上記から、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ（２ｘ）がｍｉＲ−１により誘導される正規シード標的遺伝子の阻害を特異的に完全に阻むことのできることを確認できた。
【０１２０】
【０１２１】
１−３．心筋細胞で連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤によるｍｉＲ−１の心筋細胞収縮機能の抑制効果の確認
【０１２２】
【０１２３】
前記実施例１−１の方法で製造して実施例１―２でマイクロＲＮＡの阻害剤としての効果を確認した連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤がマイクロＲＮＡの生物学的機能を抑制することができるかを確認するために、これをｍｉＲ−１の正規シード結合サイトに適用した。まず、心筋細胞でのｍｉＲ−１を確認するために、心臓筋肉母細胞株（Ｈ９ｃ２）をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入した後、ｍｉＲ−１を導入し、ｍｉＲ−１の心筋細胞での知られた機能である細胞サイズ縮小が誘導されるかを観察した。このとき、前記Ｈ９ｃ２細胞は、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌステップトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改質Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、前記ｍｉＲ−１は、マイクロＲＮＡのデータベースであるｍｉＲＢａｓｅ（ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）に現れたヒトのｍｉＲ−１配列（ＭＩＭＡＴ００００４１６）の通り二本鎖をＢｉｏｎｅｅｒ社を通じて化学的に合成し、ＨＰＬＣによって分離した。また、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のマイクロＲＮＡであるｃｅｌ−ｍｉＲ−６７（ＭＩＭＡＴ０００００３９）の配列と同一に合成して用いた。その後、合成された二本鎖のマイクロＲＮＡは、上記会社で提供した方法にしたがってガイド鎖とパッセンジャー鎖の二重体（ｄｕｐｌｅｘ）で製造し、マイクロＲＮＡのＨ９ｃ２細胞の導入は、ＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、５０ｎＭのマイクロＲＮＡを製造者のプロトコルにしたがってトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させてその効果を４８時間後に調査した。
【０１２４】
その結果、図３の（ａ）の左図に示したように、対照群に比べてｍｉＲ−１が導入されたＨ９ｃ２細胞のサイズが小さくなったことを観察した。また、これを定量的にイメージＪプログラム（ＮＩＨ）を通じて１００個以上の細胞で分析した結果、図３の（ａ）の右図に示したように、ｍｉＲ−１二重体が入った細胞のサイズが対照群細胞に比べて約６０％レベルに小さくなったことを観察した。
【０１２５】
また、上記でｍｉＲ−１が心筋細胞のサイズを減らすという機能をＨ９ｃ２細胞で確認した後、前記実施例１−２と同一にｍｉＲ−１のシード領域に相補的に配列できる塩基配列２個を連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ（２ｘ））で製作し（図２の（ｃ））、これを心臓筋肉母細胞株（Ｈ９ｃ２）にトランスフェクションしてｍｉＲ−１の機能を抑制することができるかを確認する実験を進行した。
【０１２６】
上述した方法と同じ実験方法で、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ（２ｘ）とｍｉＲ−１を同時にそれぞれ２５ｎＭの濃度で一緒にトランスフェクションしてＨ９ｃ２に導入した場合、図３の（ｂ）及び図３の（ｃ）に示したように、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ；ＮＴ）とｍｉＲ−１を一緒に導入した場合には、依然としてｍｉＲ−１が誘導する細胞サイズの減少を観察することができたが、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ（２ｘ）の場合には、このような効果が抑制されることを確認した。
【０１２７】
上記から、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ（２ｘ）がｍｉＲ−１の機能である心筋細胞のサイズを減らす機能を阻害する現象が観察された。そこからシード領域で認識する８個の塩基で構成された正規結合サイトを活用してこれを２個以上連鎖的に配列したとき、マイクロＲＮＡの正規標的抑制機能を効果的に阻害できることが分かった。
【０１２８】
【０１２９】
実施例２．マイクロＲＮＡのシード領域でウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）塩基配列を許容する非正規標的サイトの発見及び検証
【０１３０】
【０１３１】
２−１．Ａｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ分析を通じた大脳皮質から発現されるマイクロＲＮＡの非正規Ｇ：Ａウォブル配列サイトの発見
【０１３２】
マイクロＲＮＡの標的を転写体レベルで分析できる方法としては、Ａｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰという実験方法が開発されて広く用いられているが、Ａｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ実験は、細胞や組織サンプルにＵＶを照射して細胞内でＲＮＡとアルゴノートタンパク質の間に共有結合を誘導し、このように生成されたＲＮＡ−アルゴノート複合体をアルゴノートを特異的に認識する抗体を用いて免疫沈降法によって分離した後、分離されたＲＮＡを次世代塩基配列（Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって分析する方法である。このように得られた塩基配列データは、生物情報学的分析を通じてマイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡを同定できるだけではなく、その結合位置と配列も正確に分析できる。Ａｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰは、最初にマウスの大脳皮質組織に適用されて脳組織でのマイクロＲＮＡの標的に対する地図を作成し、その後、今まで多様な組織に当該方法が適用された。このような多くのＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ分析を通じて多様な組織でのマイクロＲＮＡ結合位置が明らかになった。特に、このような標的配列でマイクロＲＮＡのシード結合とは類似しているが、標的ｍＲＮＡの配列で他の形態の非正規的結合標的が多く存在するという点が知られるようになった。
【０１３３】
明らかになった非正規的結合法則の一部は、既存の知られている塩基配列以外にＧ：Ｕ塩基配列を通じたウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）で存在することが観察された。ウォブル塩基配列は、既存の塩基配列とは異なり特定のＲＮＡで発見され、よく知られたＧ：Ｕウォブルは、マイクロＲＮＡの非正規標的でも配列ができることが提示された。しかし、それに比べて結合が弱くて頻繁に観察されないＧ：Ａウォブルの場合は、特定のＲＮＡで塩基配列を形成することができるが、それ以外では全く調査されなかった。しかし、マイクロＲＮＡのシード配列のような場合には、塩基配列の自由エネルギー（ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ）が構造的にアルゴノートタンパク質により安定化されるので、一般的に弱いＧ：Ａ塩基配列が相対的に重要であり得る。
【０１３４】
そこで、まず、Ｇ：Ａを含んだウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）塩基配列がヒトの脳組織でのマイクロＲＮＡ標的に存在するかを確認するために死後脳組織の灰白質（ｇｒａｙ  ｍａｔｔｅｒ）にＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰを実行したデータを分析した。このときの分析は、Ａｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰを開発したときの方法にしたがってアルゴノート−マイクロＲＮＡと一緒に結合したＲＮＡ配列をシークエンシングされたＦＡＳＴＱファイルでＢｏｗｔｉｅ２プログラムでヒトゲノム配列に配列して行った。また、同時に当該シークエンシング結果をヒトマイクロＲＮＡ配列に配列して、当該脳組織でアルゴノートタンパク質と頻繁に結合している２０種類のマイクロＲＮＡ（ｔｏｐ２０  ｍｉＲＮＡ）も分析した。最終的に、前記方法で把握したｔｏｐ２０  ｍｉＲＮＡに対して当該シード（ｓｅｅｄ）配列である５’末端から２番目から８番目までの配列に対して相補的な配列を有する正規標的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ）サイトをよく観察した。このとき、図４の（ａ）に示したように、マイクロＲＮＡ結合位置にかなり多数の正規シード標的サイトが発見されることを観察した（中央値１２９２．５サイト、誤差範囲＋／−７０６．６２）。その後、このようなマイクロＲＮＡのシード塩基配列でＧ：Ｕ又はＧ：Ａウォブル塩基配列によって結合できる非正規的標的サイトが存在するかをＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰデータで分析した。このとき、分析に対する対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）としてマイクロＲＮＡシード（ｓｅｅｄ）塩基配列と同一の塩基配列によって塩基の相補的配列が不可能な標的配列を用いて分析した。
【０１３５】
その結果、図４の（ａ）に示したように、Ｇ：Ａウォブルが許容された標的（中央値１１１９．５サイト、誤差範囲＋／−５２６．４８）とＧ：Ｕウォブルが許容された標的（中央値９９５サイト、誤差範囲＋／−５２３．２２）サイトの両方で対照群（中央値８９１サイト、誤差範囲＋／−４１０．７１）に比べて高い分布を示した。特に、Ｇ：Ａウォブルが存在するマイクロＲＮＡ標的サイトは、Ｇ：Ｕウォブルより約１．１倍多く存在することが示された。
【０１３６】
また、脳組織で特異的に発現されるｍｉＲ−１２４は、シード領域に２個のＧを５’末端から４番目と５番目に有しているので、これを通じたＧ：Ｕ及びＧ：Ａウォブル塩基配列ができる。したがって、このような特定位置のＧによるＧ：Ａ及びＧ：Ｕウォブル塩基配列を区別して分析した結果、図４の（ｂ）に示したように、ｍｉＲ−１２４の正規シード標的サイト（Ｓｅｅｄ  ｓｉｔｅ）が最も多く発見された（１，９９２個）。しかし、これと比較できる程度に４番目がＧ：Ｕウォブル（１，８００個）を成すこと（４Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）を発見し、その次には、Ｇ：Ａウォブル（１，５４２個）を成すことを観察した。また、５番目のＧもＧ：Ｕウォブル（１，４２７個）とＧ：Ａウォブル（１，１９６個）を成す標的サイト（５Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）が多く観察され、このように調査したすべてのサイトは、対照群の個数（６４７個）よりいずれも多く存在することを確認することができた。ｍｉＲ−１２４に対するＳｅｅｄ  ｓｉｔｅ、４Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ、５Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅの配列と塩基配列は、図４の（ｃ）に示した。したがって、マイクロＲＮＡは、シード領域の塩基配列を通じた標的ｍＲＮＡを認識するとき、シード領域を通じた正規的な塩基配列だけでなく非正規的にＧ：Ｕ又はＧ：Ａウォブル塩基配列を許容し、このような結合を通じて標的ｍＲＮＡと結合できるということが分かった。このようなＧ：Ａウォブル塩基を通じたマイクロＲＮＡの標的認識は、報告されたことがない新しい結果であり、上記で観察したように、多くのマイクロＲＮＡで非正規的な標的と認識されることを確認することができた。
【０１３７】
【０１３８】
２−２．心筋梗塞患者の心臓組織でのＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ分析結果ｍｉＲ−１の非正規Ｇ：Ａウォブル配列サイト発見
【０１３９】
前記実施例２−１で、ヒトの脳組織から得られたＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰデータをマイクロＲＮＡのシード領域と標的ｍＲＮＡの間にＧ：Ａウォブル塩基結合を分析してこれらが非正規標的で存在することを明らかにした。これと同様に、心筋梗塞患者 （Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）６人の心臓組織から得られたＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰデータ（図５の（ａ））を分析してＧ：Ａを含んだウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）塩基配列がマイクロＲＮＡ標的に存在するかを分析した。このとき、アルゴノート−マイクロＲＮＡと一緒に結合したＲＮＡ配列シークエンシング結果をヒトマイクロＲＮＡ配列に配列して、当該心臓組織でアルゴノートタンパク質と頻繁に結合しているマイクロＲＮＡのうち心臓−筋組織で特異的に発現されるｍｉＲ−１に集中して当該シード領域のＧ：Ａウォブル塩基配列を中心として分析を進行した。特に、ｍｉＲ−１のシード領域には、３個のＧを５’末端から２番目、３番目と７番目に有しているので、この３個のＧ塩基がＡと配列されてアルゴノートと一緒に標的遺伝子のｍＲＮＡに結合することができる。
【０１４０】
したがって、このような特定位置のＧによるＧ：Ａウォブル塩基配列を区別して分析した結果、図５の（ｂ）に示したように、２番のＧ：Ａウォブルが２７個、３番のＧ：Ａウォブルが１９個、７番のＧ：Ａウォブルが２６個分析された。このように調査したすべてのサイトは、対照群の個数（９個）より多く存在することを確認することができた。また、このとき、以前の報告と同一にｍｉＲ−１の正規シード標的サイトが最も多く発見された（１２８個）。したがって、心筋細胞で最も多く発現されるｍｉＲ−１は、シード領域の塩基配列を通じた標的ｍＲＮＡを認識するとき、シード領域を通じた正規的な塩基配列だけでなく非正規的にＧ：Ａウォブル塩基配列を許容し、このような結合を通じて標的ｍＲＮＡと結合できるということが分かった。
【０１４１】
上記の実施例を通じてマイクロＲＮＡが非正規的にＧ：Ａウォブルサイトと結合して標的遺伝子発現を阻害するという事実を確認した。このように既存のマイクロＲＮＡシード配列にあるＧを通じてウォブル配列によって標的ｍＲＮＡのＡと結合することがマイクロＲＮＡの機能を変える場合、このような機作が疾病でマイクロＲＮＡの配列の変異を通じて現れ得ると予想され、心筋梗塞患者の心臓組織でＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰを実行した結果からアルゴノートと結合したマイクロＲＮＡの配列を分析して、ｍｉＲ−１のＧ配列がＴに変わった場合があるかを確認した。ｍｉＲ−１のシード領域でｍｉＲ−１の５’末端を基準として２０番までの塩基のうちすべての変異を分析した結果、図５の（ｃ）に示したように、ｍｉＲ−１の５’末端を基準として２番目、３番目、７番目、１２番目、１５番目のＧがＴに変わった場合があることを観察した。特に、シード領域の２番目、３番目、７番目のＧが他の変異より高い頻度でＴに変わってシークエンシングされていることは、当該位置のＧが標的遺伝子ｍＲＮＡを認識するとき、既存のｍｉＲ−１の配列が非正規的にＧ：Ａウォブル配列を通じて標的ｍＲＮＡと配列されることから拡張されて心筋梗塞疾病ではＧがＵに変異されて既存の非正規Ｇ；Ａウォブル配列を既存の正規シード標的サイトに変えることであることが分かった。
【０１４２】
【０１４３】
２−３．心筋細胞のｍｉＲ−１シード配列でのＧ：Ａウォブル配列を通じた標的遺伝子の発現抑制の確認
【０１４４】
前記実施例２−１と２−２で、マイクロＲＮＡが非正規的にシード領域でＧ：Ａウォブル配列を許容して標的ｍＲＮＡと結合できるという事実を発見した後、このような結合が実際に標的遺伝子の抑制を起こすことができるかを細胞レベルで確認するレポーター実験を進行した。このとき、確認実験は、心臓筋肉母細胞株であるＨ９ｃ２のように筋肉系細胞で多く発現されることが知られ実施例２−２で確認したｍｉＲ−１を対象として進行した。特に、ｍｉＲ−１の５’末端から７番目に存在するＧに注目して、これを通じたＧ：Ａウォブル塩基配列を対象として行った。マイクロＲＮＡによる遺伝子抑制は、より精密に個別細胞レベルで測定するために蛍光タンパク質発現レポーターシステムを構築して用いた。蛍光タンパク質発現レポーターシステムは、二つの色の蛍光タンパク質が一つのベクターに発現するように構成され、このとき、ＳＶ４０プローモーターには、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）が発現されるようにし、その３’ＵＴＲ（３’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）部分にマイクロＲＮＡの標的サイトを多数個連続的に配列して、緑色蛍光タンパク質の強度を通じてマイクロＲＮＡによる遺伝子抑制効果を測定するようにし、それと同時に、赤色蛍光タンパク質（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＲＦＰ）は、Ｔｋプローモーターにより発現されるようにしてその強度程度に緑色蛍光信号を標準化して用いた（図６の（ａ））。
【０１４５】
上記のように構築された蛍光タンパク質発現レポーターベクターにｍｉＲ−１の５’ 末端から２番目から８番目までの塩基に対して相補的であると共に、７番目の塩基であるＧに対してはＧ：Ａウォブルに塩基配列をする非正規標的サイト（７Ｇ：Ａ−ｓｉｔｅ）（５’ｐ−ＡＡＡＵＵＣＣＡ−３’、配列番号２）を挿入してレポーターを製作した後（ＧＦＰ−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）、これがｍｉＲ−１によって抑制されるかを実験を通じて確認した。このとき、実験は、５００ｎｇ  ＧＦＰ−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅレポーターベクターと２５ｎＭのｍｉＲ−１をｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）試薬を用いて会社で提供するプロトコルにしたがって心臓筋肉母細胞株であるＨ９ｃ２に同時に導入（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後にフローサイトメーター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｕ社のＡｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ）を通じてそれぞれの蛍光信号を測定した。
【０１４６】
その結果、図６の（ａ）に示したように、ｍｉＲ−１の発現によりｍｉＲ−１の７Ｇ：Ａサイトが非常に効率的に抑制されることを対照群核酸（ｃｏｎｔ；ＮＴ）を導入した細胞と比較して確認した。すなわち、心臓筋肉母細胞株であるＨ９ｃ２で二つの蛍光タンパク質の発現程度によって四つの部分（Ｑ５−１、Ｑ５−２、Ｑ５−３、Ｑ５−４）で分析した結果、ｍｉＲ−１が導入された細胞の場合、対照群の核酸が導入された場合より１０３強度の赤色蛍光タンパク質と１０３強度の緑色蛍光タンパク質を示す細胞の分布が５９．５１％（ｃｏｎｔｒｏｌ：Ｑ５−３）から４１．８０％（ｍｉＲ−１：Ｑ５−３）に減少したことを観察した。
【０１４７】
上記から、ＧＦＰ−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅレポーターベクターは、ｍｉＲ−１の導入なしでもＨ９ｃ２細胞である程度抑制されていることが対照群から観察された。これは、Ｈ９ｃ２細胞内で既に発現されているｍｉＲ−１によりレポーター標的ｍＲＮＡとのＧ：Ａウォブル塩基配列を通じて抑制されるものと予想できる。前記内容を確認するために、Ｈ９ｃ２細胞内のｍｉＲ−１の発現を抑制することのできるｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｈａｉｒｐｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｍｉＲ−１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）をＤｈａｒｍａｃｏｎ社から購入して５０ｎＭ濃度で細胞にトランスフェクションさせて用いた。
【０１４８】
その結果、対照群に比べてｍｉＲ−１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを導入した場合、１０３強度の赤色蛍光タンパク質と１０３強度の緑色蛍光タンパク質を示す細胞の分布が８１．５６％（ｍｉＲ−１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：Ｑ５−３）に増加することから、細胞内に存在するｍｉＲ−１がｍｉＲ−１の７Ｇ：Ａサイトを通じて遺伝子発現を抑制できることを確認した。
【０１４９】
また、蛍光タンパク質発現レポーターにマイクロＲＮＡ標的サイトを入れない対照群（ＧＦＰ−ｎｏ  ｓｉｔｅ）とｍｉＲ−１の７Ｇ：Ａサイトが入ったレポーターであるＧＦＰ−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅをＨ９ｃ２細胞に導入してその活性を比較して確認し、陽性対照群としては、ｍｉＲ−１を一緒に導入した場合と定量的に比較して確認した。このときの分析は、フローサイトメーターで測定した赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）値を区間別に分け、このときの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）値を平均してログ割合に変換し、対照群であるＧＦＰ−ｎｏ  ｓｉｔｅの緑色蛍光タンパク質の数値を１にして（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｏｇ  ＧＦＰ）相対的に計算した。
【０１５０】
その結果、図６の（ｂ）に示したのように、ｍｉＲ−１と７番Ｇ塩基に対して、Ｇ：Ａウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）を通じて相補的に塩基配列されるサイトがある場合（ＧＦＰ−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）、特に、１．５〜２．５値の赤色蛍光タンパク質の発現（ｌｏｇ  ＲＦＰ）を示す区間で、Ｇ：Ａウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）を通じた緑色蛍光タンパク質の発現（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｏｇ  ＧＦＰ）が１より１２．５％程度低くなることを確認した。このような抑制は、陽性対照群では、特に１．５〜２．５区間の赤色蛍光タンパク質の発現（ｌｏｇ  ＲＦＰ）から４０％〜２５％程度緑色蛍光タンパク質の発現（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｏｇ  ＧＦＰ）が抑制されるパターンと同一に現れる点を観察した。
【０１５１】
上記で観察した結果が当該蛍光タンパク質レポーターで用いた互いに異なるプローモーターの強度と二つ他の蛍光タンパク質が有する蛍光活性度の差により影響を受けないことを確認するために、二つの蛍光タンパク質が互いに変えられている蛍光タンパク質レポーターであるｐ．ＵＴＡ．３．０をＡｄｄｇｅｎｅ（ｐｌａｓｍｉｄ＃８２４４７）から購入して用いた。このとき、レポーター実験は、ｐ．ＵＴＡ．３．０ベクターでＳＶ４０プローモーターによって調節される赤色蛍光タンパク質（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＲＦＰ）の３’ＵＴＲ部分にｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ配列を５回繰り返して挿入した後にレポーターベクター（ＲＦＰ−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）を製作して進行し、このとき、赤色蛍光タンパク質発現数値は、Ｔｋプローモーターによって発現される緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）値を細胞内に導入された程度を反映した標準化に用いて変形して用いた。
【０１５２】
その結果、図６の（ｃ）に示したように、上記と同一にｍｉＲ−１の７Ｇ：ＡサイトがＨ９ｃ２で発現されるｍｉＲ−１により抑制されることを、ｍｉＲＮＡ標的位置のないレポーター（ＲＦＰ−ｎｏ  ｓｉｔｅ）の対照群とｍｉＲ−１の７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅが入ったレポーター（ＲＦＰ−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）の結果を比較して確認し、同時に、図６の（ｄ）に示したように、陽性対照群がｍｉＲ−１とのｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎでも前記図６の（ｂ）に示した結果のようにｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａサイトを抑制する現象を観察した。
【０１５３】
上記から、Ａｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ分析を通じて発見したマイクロＲＮＡの非正規標的が実際にマイクロＲＮＡのシード配列でＧ：Ａウォブル配列を通じて結合できるだけでなく、当該標的遺伝子の発現を抑制できることを確認した。
【０１５４】
したがって、このような点から判断するとき、Ｇ：Ａウォブル配列を通じた標的サイトを用いてマイクロＲＮＡと十分に結合することができ、このような結合が競争的に行われてマイクロＲＮＡを抑制することができる場合、Ｇ：Ａウォブルを通じた非正規的標的抑制によるマイクロＲＮＡの生物学的機能のみを阻害できることを類推することができた。
【０１５５】
【０１５６】
２−４．ルシフェラーゼレポーターによるマイクロＲＮＡの非正規的なバルジ（ｂｕｌｇｅ）塩基配列標的の発現抑制の確認
【０１５７】
マイクロＲＮＡは、シード領域の連続的な塩基配列を通じた正規的な標的認識以外に非正規的に標的を認識することが知られており、そのうち、特に、マイクロＲＮＡのシード領域と標的ｍＲＮＡが配列されたとき、マイクロＲＮＡの５’末端から５番目と６番目の間で標的ｍＲＮＡがバルジを成す形態が存在すると報告された。特に、このようなバルジ標的がｍｉＲ−１２４から発見されたとき、５番と６番目の間にＧがバルジを成すことが確認されたが、このような標的が既存の知られたシード配列を通じた正規標的に比べてどの程度標的遺伝子の発現を抑制するかは知られていなかった。
【０１５８】
前記のようにバルジを形成する塩基配列とマイクロＲＮＡが機能的に活性化され得る程度に結合できるかを確認するために、ルシフェラーゼレポーターを用いて調査した。このときに用いた正規標的シードサイト（ｓｅｅｄ  ｓｉｔｅ）は、図７の（ａ）の上図に示したように、ｍｉＲＮＡ−１２４（５’−ＵＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣＡＡ−３’、配列番号７）のシード配列のうち５末端から２−７番目の塩基配列である５’−ＡＡＧＧＣＡＣ−３’に完璧に相補的な５’−ＧＵＧＣＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２４−ｓｅｅｄ  ｓｉｔｅ、配列番号８）であり、ルシフェラーゼレポーターベクター（ｐｓｉ−ｃｈｅｃｋ２、Ｐｒｏｍｅｇａ社）にあるレニラルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ（３’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）部分に２回連続配列によって挿入した。また、図７の（ａ）の下面に示したように、５’末端を基準として６番目塩基と相補的に配列できる塩基配列がシードサイト標的の５番と６番の間にバルジ（ｂｕｌｇｅ）で存在する場合であるバルジサイトは、ｍｉＲ−１２４で５’−ＧＵＧＧＣＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２４−ｂｕｌｇｅ  ｓｉｔｅ、配列番号９）の塩基配列を有するようになり、したがって、これを同一にレニラルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ部分に２回連続配列してレポーターベクターを製作した。
【０１５９】
上記方法で製作されたルシフェラーゼレポーターベクターは、多くの濃度（０．０２、０．１、０．５、２．５、１５ｎＭ）のｍｉＲ−１２４と一緒にＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造者のプロトコルにしたがって細胞に伝達（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させてその効果を調査した。このときのｍｉＲ−１２４は、ガイド鎖（ｇｕｉｄｅ  ｓｔｒａｎｄ）、パッセンジャー鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）の二つの核酸配列にＢｉｏｎｅｅｒ社で化学的に合成製作した後、ＨＰＬＣによって分離し、前記会社で提供した方法によって二重体（ｄｕｐｌｅｘ）で製造して用いた。ＨｅＬａ細胞は、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌステップトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改質Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、トランスフェクションの実行時は、抗生剤のない完全培地で細胞を培養した。このようにトランスフェクションを行った２４時間後、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍを用いて製造社のプロトコルにしたがってルシフェラーゼの活性を測定してｍｉＲ−１２４の効果を調査し、ルシフェラーゼ活性計測は、ｐｒｏｍｅｇａ社のＧｌｏｍａｘ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて最小３回以上の繰り返し実験し、ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼの活性によって標準化して計算した。このようにｍｉＲ−１２４の多くの濃度でバルジ標的の阻害効果を測定し、ＩＣ５０（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ５０）をｍｉＲ−１２４の正規的なシードサイトと比較して観察した結果、図７の（ｂ）に示したように、バルジ標的は、０．８ｎＭ、シード標的は、０．４ｎＭとして、バルジ標的を通じた遺伝子発現抑制効率がシード標的より２倍程度低いが、依然としてｍｉＲ−１２４は、バルジ標的のような非正規標的もよく抑制することを観察することができた。
【０１６０】
上記から、Ａｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ分析を通じて非正規標的として以前に報告されたバルジ標的サイトは、マイクロＲＮＡと結合できるだけでなく、これを有している遺伝子の発現を効率的に抑制することが分かった。また、このような点から類推するとき、バルジ標的を用いてマイクロＲＮＡと十分に結合することができ、このような結合が競争的に行われてマイクロＲＮＡを抑制することができる場合、バルジ標的抑制を通じたマイクロＲＮＡの生物学的機能のみを阻害できることを類推することができた。
【０１６１】
【０１６２】
実施例３．マイクロＲＮＡのシード配列でＧ：Ａウォブル配列標的抑制を通じた他の生物学的機能調節可能性の確認
【０１６３】
３−１．実験材料及び方法
【０１６４】
前記実施例２で、ヒトの脳組織及び心筋梗塞患者の心臓組織から得られたＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰデータをマイクロＲＮＡのシード領域と標的ｍＲＮＡの間Ｇ：Ａウォブル塩基結合を分析してこれらが非正規標的に存在することを明らかにし、追加的なレポーター実験を通じてこのような非正規標的サイトがマイクロＲＮＡによる遺伝子抑制効果を示すことのできるということを確認した。このような非正規的な遺伝子抑制現象は、Ｇ：Ａウォブル塩基配列がマイクロＲＮＡの非正規標的として作用して生物学的機能を調節できるという可能性を提示した。したがって、このような可能性を確認しようと、前記実施例で説明した心筋細胞マイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１を中心として実験を進行した。非正規的なＧ：Ａウォブル標的が特定の生物学的機能を有しているかを調査するためには、ｍｉＲ−１が正規的な標的は認識せずに非正規的なＧ：Ａウォブル配列標的サイトのみを認識するようにしなければならないので、ｍｉＲ−１のシード領域にあるＧがＣではないＡと塩基配列をするように当該ＧをＵに置換して製作した後に実験に用いた。本実験では、より生理学的に心臓と類似した条件で実行するためにラット（ｒａｔ）の心臓組織から１次心筋細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｒａｔ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を培養して行った。このとき、心筋細胞の培養は、生後１日目のラット（ｒａｔ  ｎｅｏｎａｔｅ）の心臓組織から酵素反応を通じて心筋細胞を分離し（Ｃｅｌｌｕｔｒｏｎ社のｎｅｏｍｙｔ  ｋｉｔ）、心筋細胞は、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、５％ＨＳ（ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌステップトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改質Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＭ１９９（ＷｅｌｌＧｅｎｅ）培地を４：１で交ぜて準備した培地にｂｒｄＵを添加して、心臓組織に存在する細胞周期を有する他の細胞と区別して培養した。
【０１６５】
【０１６６】
３−２．ｍｉＲ−１による心筋細胞サイズ減少の確認
【０１６７】
上記から得られた１次培養心筋細胞で心筋肥大現象が誘導されるかを優先的に確認した。心筋細胞は、細胞周期を止め、心筋細胞のサイズを増加させ得る特徴を有しているが、これを心筋肥大現象と言う。心筋肥大現象は、心筋細胞の機能低下を補う役目をし、心臓疾病の病理中間段階としても知られており、細胞形態学的観察及び遺伝子発現プロファイルの変化がよく知られた心臓疾病モデルシステムである。心筋肥大症の細胞モデルでは、フェニレフリン（ＰＥ）のようなアドレナリン受容体作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）を心筋細胞に処理すると、心筋肥大症を誘導することができる。
【０１６８】
したがって、培養した心筋細胞に１００ｕＭのフェニレフリンを処理して心筋肥大を誘導した。これによって、図８の（ａ）に示したように、何も処理しない対照群（ｒＣＭＣ）と比較して心筋細胞のサイズが増加することを形態学的に確認した（＋ＰＥ）。また、前記実施例１でのように、ｍｉＲ−１が心臓筋肉母細胞株であるＨ９ｃ２から発現された場合、細胞のサイズを減らす現象が現れ、同じ現象で、培養した１次心筋細胞にｍｉＲ−１を導入したときも心筋細胞のサイズが減少することを観察した。これはよく知られた心筋肥大現象とｍｉＲ−１の心筋細胞での心筋細胞萎縮機能と一致する。
【０１６９】
【０１７０】
３−３．ｍｉＲ−１置換体を用いてマイクロＲＮＡのシード配列でＧ：Ａウォブル配列標的抑制を通じて現れる他の生物学的機能可能性の確認
【０１７１】
ｍｉＲ−１は、シード領域に３個のＧを含んでおり、これによって、正規的な標的は認識せずに、非正規的なＧ：Ａウォブル配列標的サイトのみを認識するようにするために、このようなＧをＵに置換したｍｉＲ−１をデザインし、これをＧがある位置によって５’末端を基準として２番目の位置（ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ）、３番目の位置（ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ）、７番目の位置（ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ）に適用してｍｉＲ−１置換体を合成した。このとき、用いたｍｉＲ−１の置換塩基配列は次のようであり（ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ：５’ｐ−ＵＵＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ−３’（配列番号１０）；ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ：５’ｐ−ＵＧＵＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ−３’（配列番号１１）；ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ：５’ｐ−ＵＧＧＡＡＵＵＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ−３’（配列番号１２））、これは、ガイド鎖で合成され、前記置換されたｍｉＲ−１の５’末端から２、３、７番目塩基に対しては、完全相補的ではないが、ガイド鎖と二重体を形成するパッセンジャー鎖（ｈｓａ−ｍｉＲ−１−５ｐ；ｍｉＲＢａｓｅ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＭＩＭＡＴ００３１８９２、５’−ＡＣＡＵＡＣＵＵＣＵＵＵＡＵＡＵＧＣＣＣＡＵ−３’、配列番号１３）は、ｍｉＲＢａｓｅに記録されたヒトのｍｉＲ−１塩基配列をデザインしてＢｉｏｎｅｅｒ社で化学的に合成製作した後、ＨＰＬＣによって分離し、前記会社で提供した方法によってガイド鎖とパッセンジャー鎖の二重体（ｄｕｐｌｅｘ）で製造して用いた。当該マイクロＲＮＡの１次心筋細胞株への導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）は、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）試薬を用いて５０ｎＭ濃度で実行した。
【０１７２】
その結果、図８の（ａ）に示したように、ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ又はｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ又はｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕを１次心筋細胞培養に導入したとき、心筋細胞の形態が心筋肥大を誘導した細胞（＋ＰＥ）と類似するレベルに大きくなったことを観察することができた。このとき、それぞれの細胞サイズを定量的に分析するために、１００個以上の細胞がイメージＪプログラム（ＮＩＨ）を通じて定量化された。図８の（ｂ）に示したように、ｍｉＲ−１のＧ：Ａウォブル配列サイトのみを認識するように合成したｍｉＲ−１置換体（ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ、ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ、ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ）が全て対照群（ＮＴ）核酸を導入したときと比較して約１．５〜１．８倍程度そのサイズが大きくなったことが分析された。これは、フェニレフリン（ＰＥ）薬物が誘導する心筋細胞肥大症モデルの心筋細胞サイズと同様のレベルであり、ｍｉＲ−１自体は、心筋細胞形態上では細胞サイズを減少させる効果を示すことで、その正規的な標的抑制効果がＧ：Ａウォブルを通じた標的抑制とは細胞形態学上異なる機能を示すことを観察した。また、追加的に本実施例で観察した心筋肥大現象を分子的レベルで確認するために、マーカーによりその発現が増加することが知られたＡＮＰ（ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）遺伝子の発現をｑＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）実験を通じてＧＡＰＤＨと比較して相対的な値で測定した。このときの実験は、すべてのＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ)で抽出し、当該プロトコルにしたがってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に逆転写し、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でｑＰＣＲを実行して当該プライマーでＡＮＰのｍＲＮＡを増幅してその量を測定した。
【０１７３】
その結果、図８の（ｃ）に示したように、ｍｉＲ−１のＧ：Ａウォブル配列サイトのみを認識するように合成したｍｉＲ−１置換体（ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ、ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ、ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ）を心筋細胞に導入した場合には、全てＡＮＰ発現量を対照群（ＮＴ）に比べて１．２〜１．５倍程度有意に増加させたことを４回の実験を通じて確認することができた。このようなＡＮＰ発現増加は、フェニレフリン（ＰＥ）薬物を処理した心筋細胞実験群が対照群に比べてサイズが約２倍程度増加したことよりは少ないが、元々のｍｉＲ−１が導入されたときにＡＮＰ発現が有意に減少する現象とは反対になることで、これを通じて、ｍｉＲ−１はＧ：Ａウォブル配列サイトを通じて完全に異なる生物学的機能を示すと判断できる。
【０１７４】
上記から、マイクロＲＮＡシード領域でＧ：Ａウォブル配列を通じて抑制する非正規標的は、既存の正規的な標的認識とは生物学的に異なる機能を示すことができるという点が最終的に分かった。このような発見は、マイクロＲＮＡの正規的な標的を通じた機能と非正規的標的を通じた機能が互いに異なることを示し、このような点から類推するとき、マイクロＲＮＡのＧ：Ａウォブル標的のみを抑制することができると、Ｇ：Ａウォブル標的により起きる生物学的機能のみを選択的に制御できることが予測された。
【０１７５】
【０１７６】
実施例４．連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤によるマイクロＲＮＡの非正規的Ｇ：Ａウォブル結合機能抑制効果の確認
【０１７７】
【０１７８】
４−１．ｍｉＲ−１の非正規Ｇ：Ａシード結合サイトに対する連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤（２ｘ）効果の確認
【０１７９】
前記実施例１で、ｍｉＲ−１の正規標的なシード標的サイトを阻害するために製作した連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤であるａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−ｓｅｅｄ（２ｘ）（５’ｐ−ｄＴｄＴ（ｒＳＰ）ＡＣＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＣＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ｄＴｄＴ−３’）は、ｍｉＲ−１の機能である心筋細胞のサイズを減らす機能を阻害する現象を示した。したがって、連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤は、マイクロＲＮＡと結合できる配列であれば、全て適用が可能であり、これによって、前記実施例２及び３で確認したマイクロＲＮＡの非正規標的配列に対しても使用が可能である。したがって、前記実施例２及び３で確認したＧ：Ａウォブルサイトの生物学的機能のみを抑制しようと、連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤をｍｉＲ−１に適用した。
【０１８０】
まず、図９の（ａ）に示した配列のように、ｍｉＲ−１シード配列で５末端から７番目ＧがＵに置換された配列に相補的な配列２個を連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤に導入した（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（２ｘ））。すなわち、前記実施例３のｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕに対するシード配列と相補的に塩基配列ができる５’−ＡＡＡＵＵＣＣＡ−３’を連続的に配列し、その配列された配列の間には、前記実施例１でのように非塩基核酸であるｒＳｐａｃｅｒで構成して、連続的に配列された配列の境界線上の新しいサイト生成によるオフターゲット効果を阻むようにデザインした。
【０１８１】
このとき、ｍｉＲ−１の非正規Ｇ：Ａウォブルシード標的遺伝子に対する阻害効能を実験的に確認するために、前記実施例１−２でのようにルシフェラーゼレポーター実験（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ）を行った。これのために、図９の（ｂ）に示したように、ｍｉＲ−１の非正規Ｇ：Ａウォブルシード標的サイト（ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）をルシフェラーゼレポーター遺伝子の３’ＵＴＲに５個連続的に配置した（Ｌｕｃ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）。
【０１８２】
ｍｉＲ−１の非正規Ｇ：Ａウォブルシード標的サイトを通じて確実に遺伝子を抑制させた後にこれを当該連鎖標的ｍｉＲ−１Ｇ：Ａウォブルサイト阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（２ｘ））が抑制するかを確認するために、ｍｉＲ−１の５’末端の７番目ＧをＵに置換したｍｉＲ−１：Ｇ７ＵをＢｉｏｎｅｅｒ社で前記実施例と同じ方法で合成して５ｎＭを用い、これと共に、５０ｎＭ濃度の阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（２ｘ）、配列番号１４）を一緒にＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造者のプロトコルにしたがって細胞に伝達（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させてａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（２ｘ）がｍｉＲ−１の非正規Ｇ：Ａウォブルシード標的抑制を阻害する効果を示すかを調査した。
【０１８３】
その結果、図９の（ｃ）に示したように、ｍｉＲ−１：Ｇ７Ｕがトランスフェクションされて観察されたルシフェラーゼ活性値は、ｍｉＲ−１：Ｇ７Ｕがトランスフェクションされない値に基づいて計算された相対的ルシフェラーゼ活性パーセント値の８８％に阻害されることを確認し、このとき、ｍｉＲ−１とａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（２ｘ）が同時に導入された実験群の相対的ルシフェラーゼ活性パーセント値は、９５％であって、ｍｉＲ−１：Ｇ７Ｕにより発現が抑制されたルシフェラーゼ活性値が元々の阻害されない値に同様に回復する效果を確認した。これは、統計的に有意（ｐ＝０．０２７）であることを観察した。
【０１８４】
【０１８５】
４−２．ｍｉＲ−１の非正規Ｇ：Ａシード結合サイトによる生物学的機能を連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤（２ｘ）が抑制できることを確認
【０１８６】
前記実施例で、ｍｉＲ−１の７番Ｇ：Ａウォブル標的調節機能を特異的に阻害するａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（２ｘ）の機能をｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ置換塩基を外部からトランスフェクションさせたＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）でルシフェラーゼレポーター活性の調査を通じて確認した。したがって、心筋母細胞で自然的に存在するｍｉＲ−１の７番Ｇ：Ａウォブル標的調節機能を確認するために、前記実施例４−１実験で用いたｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａサイトが含まれたルシフェラーゼレポーターベクターであるＬｕｃ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅと５０ｎＭのａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（２ｘ）又は対照群であるａｎｔｉ−ＮＴ（２ｘ）をトランスフェクションさせて前記実施例４−１のようにルシフェラーゼ活性を調査した。
【０１８７】
その結果、図１０の（ａ）に示したように、ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａサイトを含むルシフェラーゼ活性値をｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａサイトを含まないルシフェラーゼレポーター活性値（Ｌｕｃ−ｎｏ  ｓｉｔｅ）によって標準化して計算した相対的活性パーセント値は、８６．２８＋／−２．５９であって、これは心筋母細胞に自然的に存在するｍｉＲ−１の７番Ｇ：Ａウォブル標的調節機能を測定した値に該当する。このとき、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａをトランスフェクションした実験群のルシフェラーゼ相対活性パーセント値は、８９．９６＋／−２．１３であって、統計的に有意にｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕの活性が阻害されることを観察した。
【０１８８】
心臓筋肉母細胞株であるＨ９ｃ２細胞は、その細胞自体で自然的にｍｉＲ−１を発現しており、このようなｍｉＲ−１は、７番目Ｇ塩基を通じたＧ：Ａウォブル配列で標的遺伝子を抑制できることを示した。また、前記実施例３−３では、ｍｉＲ−１の７番目塩基がＡと配列するようにするために７番目ＧをＵに置換したｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕがその発現を通じて心筋細胞のサイズを増大させるという事実も観察した。したがって、Ｈ９ｃ２細胞に存在するｍｉＲ−１の７番目Ｇを通じたＧ：Ａウォブル配列標的を本発明によるマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸により抑制することができると、心筋細胞が小さくなる現象を示すものと予測し、これを確認するために、Ｈ９ｃ２細胞に対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ；ａｎｔｉ−ＮＴ（２ｘ））とａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（２ｘ）を前記実施例で実験した方法と同一にトランスフェクションしてその効果を確認した結果、図１０の（ｂ）に示したように、Ｈ９ｃ２細胞のサイズを減らすことを観察した。
【０１８９】
また、追加的にＨ９ｃ２細胞のサイズは、１００個以上イメージＪプログラム（ＮＩＨ）を用いて定量的に分析した。その結果、図１０の（ｃ）に示したように、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（２ｘ）が導入された細胞のサイズは、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ；ａｎｔｉ−ＮＴ（２ｘ））と比較して約４０％程度減少するという事実を確認した。このような点から、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（２ｘ）は、ｍｉＲ−１の７番目Ｇ塩基を通じたＧ：Ａウォブル標的認識機作を競争的に抑制してその当該機能を阻害できることが分かった。
【０１９０】
前記のように連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤は、既存の知られたマイクロＲＮＡの正規的なシード標的認識を阻むだけでなく、Ｇ：Ａウォブル配列のような非正規標的にも適用してマイクロＲＮＡの特定機能を効果的に阻害できることが分かった。
【０１９１】
【０１９２】
４−３．ｍｉＲ−１の非正規Ｇ：Ａシード結合サイトによる生物学的機能を連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤（９ｘ）が抑制できることを確認
【０１９３】
前記実施例で用いたｍｉＲ−１の非正規Ｇ：Ａシード結合サイトに対する連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（２ｘ））は、特異的に阻害しようとするｍｉＲ−１の非正規Ｇ：Ａシード結合サイトが２回繰り返された形態を有している。これを拡張して、図１１の（ａ）に示したように、当該サイトの繰り返し形態を９回に増加させた連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ））を考案し、それの阻害効果を確認するルシフェラーゼレポーター実験を進行した（図１１の（ｂ））。
【０１９４】
ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）は、次のような配列にＴｒｉｌｉｎｋ社で化学的に合成製作した後、ＨＰＬＣによって分離して用いた（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）：５’−ｐ−ＮＮ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＮＮ−３’、配列番号１５）。実験に対照群で用いられたｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒも同一にＮＴの標的サイトが９回繰り返されるように次のような塩基配列にＴｒｉｌｉｎｋ社で化学的に合成製作した後、ＨＰＬＣによって分離して用いた（ａｎｔｉ−ＮＴ（９ｘ）：５’−ｐ−ＮＮ（ｒＳＰ）ＧＧＵＵＧＵＧＡ（ｒＳＰ）ＧＧＵＵＧＵＧＡ（ｒＳＰ）ＧＧＵＵＧＵＧＡ（ｒＳＰ）ＧＧＵＵＧＵＧＡ（ｒＳＰ）ＧＧＵＵＧＵＧＡ（ｒＳＰ）ＧＧＵＵＧＵＧＡ（ｒＳＰ）ＧＧＵＵＧＵＧＡ（ｒＳＰ）ＧＧＵＵＧＵＧＡ（ｒＳＰ）ＧＧＵＵＧＵＧＡ（ｒＳＰ）ＮＮ−３’、配列番号１６）。このとき、ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａサイトが含まれたルシフェラーゼレポーターベクターＬｕｃ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅと２５又は５０ｎＭのａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）又は対照群であるａｎｔｉ−ＮＴ（９ｘ）を５ｎＭのｍｉＲ−１：Ｇ７Ｕと一緒に図９の（ｂ）実験と同一にＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造者のプロトコルにしたがって細胞にトランスフェクションさせてルシフェラーゼ活性を調査した。
【０１９５】
その結果、図１１の（ｂ）に示したように、ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕとａｎｔｉ−ＮＴ（９ｘ）が一緒にトランスフェクションされた実験群のルシフェラーゼ活性値をｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕがトランスフェクションされないルシフェラーゼレポーター活性値に標準化して計算した相対的活性パーセント値が７４．５７＋／−６．３６であることを観察し、当該マイクロＲＮＡによる遺伝子抑制効果を確認した。このとき、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）を一緒に導入した実験群では、相対的活性パーセント値は、８７．２３＋／−５．６８であって、２５ｎＭのａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）が統計的に有意にｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕの活性を阻害することを観察した（Ｐ＝０．０５）。また、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）の量を５０ｎＭに増加させたときは、相対的なルシフェラーゼレポーターの活性パーセント値が１０７．１５＋／−９．５８であって、完璧にｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕによる標的遺伝子抑制を阻害することを統計的に有意に観察した（Ｐ＝０．０００８）。
【０１９６】
したがって、連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤の阻害効果は、阻害効果をターゲットとする塩基配列の繰り返しが２回であるときからその阻害効果を確認することができるが、９回繰り返したとき一層増加された阻害効果を示すことが分かった。
【０１９７】
ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）が効果的にｍｉＲ−１の７番Ｇ：Ａウォブル配列標的に対する抑制を阻害することをルシフェラーゼレポーターを通じて確認した後、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）がｍｉＲ−１の７番Ｇ：Ａウォブルシード標的を抑制することで現れる心筋細胞肥大効果に対しても効果的に抑制できるかを確認した。このとき、実験には、心筋母細胞株であるＨ９ｃ２を用い、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）による細胞サイズの変化をトランスフェクションした後、時間差（０、２４、４８及び６０時間）を置いてＬｕｍａｓｃｏｐｅ  ４００（Ｅｔａｌｕｍａ社）を用いて同一細胞で進行した。当該実験でａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａの導入は、トランスフェクションと同時にＦＢＳを除去し、１００ｕＭ濃度のａｌｐｈａ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ａｇｏｎｉｓｔであるＰＥ（Ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ）を処理して６０時間まで培養しながら観察した。
【０１９８】
その結果、図１１の（ｃ）に示したように、ＰＥ処理により誘導される心筋母細胞株の細胞サイズの増加が対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ；ａｎｔｉ−ＮＴ（９ｘ））から観察されるのに比べて、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）がトランスフェクションされた実験群では、心筋母細胞株の肥大が全く観察されなかった。
【０１９９】
上記のように、連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤は、阻害しようとするマイクロＲＮＡの標的個数が増加するほど阻害効果が増加し、このような阻害能力は、当該マイクロＲＮＡの生物学的機能を抑制できる程度に強力であることが分かった。
【０２００】
【０２０１】
実施例５．連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤でスペーサー変形導入を通じて標的サイトの間の連結配列による副作用除去の確認
【０２０２】
前記実施例で製作した連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤は、抑制しようとするマイクロＲＮＡの標的サイトを２回以上連続して配列されるようにデザインされた。したがって、標的サイトの間の連結配列により意図せずに他のマイクロＲＮＡ又は他のＲＮＡ結合タンパク質と結合して、これを阻害することになる副作用が発生し得る。このような場合をｍｉＲ−１の７番目Ｇを通じた非正規Ｇ：Ａシード標的を抑制する阻害剤（ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ））配列を通じて例示すると、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）塩基配列は、図１２の（ａ）に示した、繰り返される標的サイトの間に非塩基変形によってｒＳｐａｃｅｒが入っており、当該配列は次のようである（５’−ｐ−ＮＮ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＡＡＡＵＵＣＣＡ（ｒＳＰ）ＮＮ−３’）。これに反して、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）−ＮＳは、同一な塩基配列を有するが、繰り返される標的サイト配列の間に非塩基が含まれておらず、その塩基配列は次のようである（５’−ＮＮＡＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＵＵＣＣＡＮＮ−３’、配列番号１７）。
【０２０３】
このとき、図１２の（ａ）のように、連続配列時に相補結合ができる塩基配列は、５’−ＡＡＡＵＵＣＣＡ−３’であるが、非塩基変形のないａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）−ＮＳの場合には、元々の標的サイトである５’−ＡＡＡＵＵＣＣＡ−３’のみならずそれぞれのサイトが接合する７個の部位を通じて次のようにマイクロＲＮＡと結合できる配列が意図せずに生成され、その塩基配列は次のようである（５’−ＡＡＵＵＣＣＡＡ−３’、５’−ＡＵＵＣＣＡＡＡ−３’、５’−ＵＵＣＣＡＡＡＡ−３’、５’−ＵＣＣＡＡＡＡＵ−３’、５’−ＣＣＡＡＡＡＵＵ−３’、５’−ＣＡＡＡＡＵＵＣ−３’、５’−ＡＡＡＡＵＵＣＣ−３’）。したがって、本発明の実施例で用いたすべての連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤は、標的サイトの間に非塩基変形であるｒＳｐａｃｅｒに変形されているが、これは、図１２の（ｂ）に示したように、標的サイトの間の連結配列により発生する新しい配列自体が偶然に他のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の標的サイトになるか、他のＲＮＡ結合タンパク質の結合サイトになることを阻むためである。
【０２０４】
そこで、本発明の連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤が非塩基変形を通じて上記に列挙した副作用効果を阻むかを確認するためにルシフェラーゼレポーター実験を前記実施例と同じ方法で進行した。これを確認するために、標的サイトの間の連結配列を認識するマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−ｊｕｎｃｔｉｏｎを図１２の（ｂ）に示した配列で合成して用いた。これは、標的サイトの間の連結配列に完全相補的な塩基が５’末端を基準として１−８番目に存在し、その後、９番から２１番までは、Ｃｅｌ−ｍｉＲ−６７−３ｐの配列を含む（ｍｉＲ−ｊｕｎｃｔｉｏｎ：５’−Ａ  ＡＡＵＵＵＵＧ  ＣＣＵＡＧＡＡＡＧＡＧＵＡ−３’、配列番号１８）。これを二重重合体で作って実験するために、パッセンジャー鎖（ｍｉＲ−ｊｕｎｃｔｉｏｎ−ｐａｓｓｅｎｇｅｒ：５’−ＴＡＣＴＣＴＴＴＣＴＡＧＧＣＡＡＡＡＴＴＴ−３’）と一緒にＢｉｏｎｅｅｒ社で化学的に合成製作した後、ＨＰＬＣによって分離して用いた。また、当該ｍｉＲ−ｊｕｎｃｔｉｏｎの抑制効果を測定するために、ｍｉＲ−ｊｕｎｃｔｉｏｎの１−８番に対する相補塩基配列である標的サイト（５’−ＣＡＡＡＡＴＴ−３’）が５回繰り返されるようにルシフェラーゼレポーターベクターを製作して前記実施例と同じ方法で用いた。
【０２０５】
ｍｉＲ−ｊｕｎｃｔｉｏｎによる抑制効果をルシフェラーゼレポーター実験を通じて確認した結果、図１２の（ｃ）に示したように、５ｎＭのｍｉＲ−ｊｕｎｃｔｉｏｎ発現により〜１２％抑制された遺伝子抑制効果が、標的サイトの間にスペーサー変形を有しているａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）の場合には、当該標的サイトがｒＳｐａｃｅｒによって分けられているので全く統計的に有意に抑制しない一方（Ｐ＝０．２３）、スペーサー変形を有していないａｎｔｉ−ｍｉＲ−１−７Ｇ：Ａ（９ｘ）−ＮＳの場合には、ｍｉＲ−ｊｕｎｃｔｉｏｎによる遺伝子抑制を統計的に有意（Ｐ＝０．０１）に阻害することが現れた。
【０２０６】
上記のように、連鎖標的マイクロＲＮＡ阻害剤は、阻害しようとするマイクロＲＮＡの標的サイトの間に非塩基変形を含むことで、サイトの間の連結配列による副作用を除去できることを確認できた。
【０２０７】
【０２０８】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく説明したが、当業界の通常の知識を有した者において、このような具体的技術は、好ましい実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とそれらの等価物によって定義される。
【０２０９】
【産業上の利用可能性】
【０２１０】
本発明によるマイクロＲＮＡを抑制する変形核酸は、マイクロＲＮＡ標的サイトの間に非塩基スペーサー（ａｂａｓｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）を導入することで、効率的にマイクロＲＮＡを阻害するだけでなく、変形核酸に導入された配列が意図せずに他のマイクロＲＮＡと結合することを阻むことができるので、マイクロＲＮＡの非正規標的認識により起きる生物学的機能のみを選択的に阻害するのに有用に用いられ得ると期待される。
【図１】
2021525762.tif 000003
【図２ａ】
2021525762.tif 000004
【図２ｂ】
2021525762.tif 000005
【図２ｃ】
2021525762.tif 000006
【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
2021525762.tif 000009
【図３ｃ】
2021525762.tif 000010
【図４ａ】
2021525762.tif 000011
【図４ｂ】
2021525762.tif 000012
【図４ｃ】
2021525762.tif 000013
【図５ａ】
2021525762.tif 000014
【図５ｂ】
2021525762.tif 000015
【図５ｃ】
2021525762.tif 000016
【図６ａ】
2021525762.tif 000017
【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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