(57)【要約】  本発明は、複雑なサンプル中のグラム陽性菌の割合及びグラム陰性菌の割合を検出するための方法に関する。細菌は、そのグラム信号に従って検出される。本発明は、グラム陽性菌の種とグラム陰性菌の腫との間の区別を可能にする。本発明はまた、特に複雑なサンプル、例えばヒト又は動物微生物叢サンプルに関して、特にフローサイトメトリーへの使用のための、グラム陽性菌及びグラム陰性菌をマーキングするためのキットにも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌を含むサンプル中のグラム陽性菌の割合及びグラム陰性菌の割合を検出するための方法であって、下記工程：
ａ）前記サンプルと、
−蛍光色素に結合された小麦レクチン（ＷＧＡ）、
−ＷＧＡに結合されたものとは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
−任意には、蛍光色素（非標識）に結合されていないバンコマイシン、
−任意には、塩化カリウム、
とを同時に、又は順次にインキュベートする工程、
ｂ）前記サンプルを遠心分離する工程、
ｃ）任意には、前記サンプルを洗浄する工程、及び
ｄ）前記サンプルの蛍光を、フローサイトメトリーを用いて測定する工程、
を含む方法。
【請求項２】
ＷＧＡに結合された蛍光色素が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７であり、そしてバンコマイシンに結合された蛍光色素が３−ＢＯＤＩＰＹ−プロパン酸であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記測定工程が、工程ｃ）の終了後、４０分未満、好ましくは３０分未満で実施されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記測定工程ｄ）が、フローサイトメトリーにより実施されることを特徴とする、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）において、分析されるべきサンプル中の蛍光色素に結合された小麦レクチン（ＷＧＡ）の濃度が、５〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは２０μｇ／ｍｌであり、そして／又は分析されるべきサンプル中の蛍光色素に結合されたバンコマイシンの濃度が、０．１５〜４μｇ／ｍｌ、好ましくは２μｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）におけるインキュベーション時間が、１０〜３０分、好ましくは１５分であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、ヒト又は動物微生物叢のサンプルであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
細菌サンプル中のグラム陽性菌及びグラム陰性菌の科、属及び／又は種を検出し、任意には区別し、そして同定するための方法であって、
ａ）前記サンプルと、
−蛍光色素に結合された小麦レクチン（ＷＧＡ）、
−ＷＧＡに結合されたものとは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
−任意には、バンコマイシン、
−任意には、塩化カリウム、
とを同時に、又は順次にインキュベートする工程、
ｂ）前記サンプルを遠心分離する工程、
ｃ）任意には、前記サンプルを洗浄する工程、
ｄ）前記サンプルの蛍光を、フローサイトメトリーを用いて測定する工程、
ｅ）２つの蛍光色素の相対蛍光を分析する工程、及び
ｆ）任意には、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の科、属及び／又は区別し、そして同定する工程、
を含む方法。
【請求項９】
ＷＧＡに結合された蛍光色素が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７であり、そしてバンコマイシンに結合された蛍光色素が３−ＢＯＤＩＰＹ−プロパン酸であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｉ．蛍光色素に結合された小麦レクチン（ＷＧＡ）、
ｉｉ．ＷＧＡに結合された蛍光色素とは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
ｉｉｉ．任意には、バンコマイシン、及び
ｉｖ．任意には、塩化カリウム、
を含む、フローオサイトメトリーでグラム陽性菌を標識するためのキットの使用。
【請求項１１】
前記蛍光色素が、標識剤ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）、３−ＢＯＤＩＰＹ−プロパン酸又はその誘導体の１つ、フルオレセイン又はその誘導体、塩又はエステルの１つ、Ｃｙ標識剤、ＣＦ標識剤、共役蛍光色素の群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
ＷＧＡに結合された蛍光色素が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）標識剤、フルオレセイン又はその誘導体、塩、エステルの１つから選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
バンコマイシンに結合された蛍光色素が、３−ＢＯＤＩＰＹ−プロパン酸又はその誘導体の１つ、フルオレセイン又はその誘導体、塩又はエステルの１つ、特にＦＩＴＣから選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
ＷＧＡに結合された蛍光色素が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７であり、そしてバンコマイシンに結合された蛍光色素が３−ＢＯＤＩＰＹ−プロパン酸であることを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、サンプル、特に複雑なサンプル中のグラム陽性菌の割合及びグラム陰性菌の割合を検出するための方法に関する。細菌は、そのグラム信号に従って検出される。
【０００２】
また、特に複雑なサンプル、例えばヒト又は動物細菌叢サンプルに関して、フローサイトメトリーでグラム陽性菌を標識するためのキットにも関する。
【０００３】
特に、本発明は、特に本発明の対象を形成する方法において、蛍光色素に結合されたレクチン−小麦レクチン（小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ））と、ＷＧＡに結合された蛍光色素とは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合された抗生物質−バンコマイシンとを組合す、フローサイトメトリーで細菌を標識するためのキットの使用に関する。任意には、キットは、蛍光色素に結合されていない（非標識）バンコマイシン、及び／又は塩化カリウムを含むことができる。キットは、特に、２つの異なる蛍光色素の相対的蛍光測定を組合すことにより、グラム陽性菌の蛍光検出のために有用である。それらの相対的蛍光測定は、グラム陽性菌科の互いの区別を可能にする。それらはまた、細菌属の互いの区別を可能にする。それらは又は、グラム陽性菌の種、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．の互いの区別を可能にする。このリストは網羅的なものではなく、そしてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  及び  Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍなどの多数の好気性種と嫌気性種との区別を可能にする。
【背景技術】
【０００４】
一般的に「腸内細菌叢」と呼ばれるヒト腸内菌叢は、ヒト胃腸系（胃、腸及び結腸）に存在する微生物（細菌、酵母及び真菌）のグループである。細菌の多様性は、現在、成人個体の主な腸内細菌叢を構成する約１０３の細菌種と推定されており、そして１０１４の細菌の量は、各個体の２００，０００〜８００，０００の遺伝子の細菌メタゲノム、すなわちヒトゲノムにおける遺伝子数の１０〜５０倍に相当する。従って、ヒト腸内細菌叢は、各個人に固有である非常に多様で且つ複雑名生態系である。
【０００５】
フローサイトメトリーは、複雑な生態系、例えば腸内細菌叢を研究するための培養ベースの方法に比較して興味深い技法を提供する。最初は、細胞分析のために企画されていたが、フローサイトメトリーは、微生物集団を特徴づけ、そして計数するために採用されていた。特に、それは、微生物の特性評価、例えば抗生物質感受性の決定［Ｓａｉｎｔ−Ｒｕｆ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０１６．  ７  及びＰｅｒｅｉｒａ，  Ｐ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒａｔｉｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｓｈｏｗｓ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ａｃｃｅｓｓ  ｏｆ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，  ２００７．  ５１（１０）：  ｐ．  ３６２７−３３］、バイオフィルム形成中の分化の分析、集団又はさらに分化するグラム陽性菌及びグラム陰性菌の生存率の評価のために使用される。フローサイトメトリーにおいては、グラム陽性菌とグラム陰性菌との間の区別は、外膜の有無のみに基く従来のグラム染色技法とは異なる。サイトメトリーでは、識別は、細菌の表面で多かれ少なかれ発現されるか、又は多かれ少なかれアクセス可能である構造の存在を用いて実施され得る。従って、この標的化は、時々、細菌集団のより正確な識別の観察を可能にする。
【０００６】
複雑なサンプルに存在する微生物集団のグラム状態の決定は、例えばゲンチアナバイオレット及びサフラニン又はフクシンを用いての染色により行われ得る。細菌懸濁液を、染色を行う前、スライドに固定するべきである、これにより、異なる染色、定着液、脱色剤、及び洗浄及び乾燥工程を交互に行うことができる。従って、それらの技法は、時間がかかり、そして得られる結果は、変動する可能性がある。実際、使用される脱色剤（しばしば、アセトン及びエタノール）、及び暴露時間に依存して、識別結果が異なる可能性があり、そして分析されるサンプルのグラム状態の誤った解釈につながる可能性がある。結果の再現性を確保するために、グラム状態の識別のための新規技法が開発されて来た。これは、顕微鏡分析、又はますますフローサイトメトリー分析を行うために蛍光標識剤の使用につながる。
【０００７】
国際公開第０２／０５７４８２号は、ＤＮＡマーカーと組合わされた蛍光色素Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ（登録商標）により標識されたレクチンＷＧＡの使用を記載している。この組合せは、異なる細菌又は乳サンプルの純粋な培養混合物中のグラム陽性菌及びグラム陰性菌の割合の決定を可能にする。別の蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネートに結合されたレクチンＷＧＡはまた、好酸性細菌及び古細菌を分析するためにも使用されて来た［ＦＩＦＥ，  Ｄ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌｅｃｔｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｓｏｍｅ  Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｉｃ  Ｍｉｎｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ２０００．  ６６（５）：  ｐ．  ２２０８−２２１０］。
【０００８】
ＷＧＡを用いる欠点の１つは、グラム陽性菌に存在するが、必ずしもそれらの細菌に対して特異的ではない特定の構造にそれ自体を固定するその能力である。ＷＧＡを通して認識される構造のいくつかはまた、グラム陰性菌にも見出され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の方法及びキットは、分析されるサンプルの生存率に関係なく、及び細菌が好気性であるか、嫌気性であるかに関係なく、グラム陽性菌とグラム陰性菌とのより正確な区別を可能にできるよう開発されて来た。この方法は、複雑なサンプル、例えば細菌叢サンプルに適用され得る。それらはまた、細菌培養の（複雑でない）サンプルにも適用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、細菌を含むサンプル中のグラム陽性菌の割合及びグラム陰性菌の割合を検出するための方法に関し、前記方法は、下記工程：
ａ）前記サンプルと、
−蛍光色素に結合された小麦レクチン（小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ））、
−ＷＧＡに結合されたものとは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
−任意には、蛍光色素（非標識）に結合されていないバンコマイシン、
−任意には、塩化カリウム、
とを同時に、又は順次にインキュベートする工程、
ｂ）前記サンプルを遠心分離する工程、
ｃ）任意には、前記サンプルを洗浄する工程、及び
ｄ）前記サンプルの蛍光を、フローサイトメトリーを用いて測定する工程、
を含む。
【００１１】
本発明の実施形態によれば、ＷＧＡに結合された蛍光色素は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７であり、そしてバンコマイシンに結合された蛍光色素は３−ＢＯＤＩＰＹ−プロパン酸である。
【００１２】
本発明の実施形態によれば、前記測定工程は、工程ｃ）の終了後、４０分未満、好ましくは３０分未満で実施される。
【００１３】
本発明の実施形態によれば、前記測定工程ｄ）は、フローサイトメトリーにより実施される。
【００１４】
本発明の実施形態によれば、工程ａ）において、分析されるべきサンプル中の蛍光色素に結合された小麦レクチン（小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ））の濃度は、５〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは２０μｇ／ｍｌであり、そして／又は分析されるべきサンプル中の蛍光色素に結合されたバンコマイシンの濃度は、０．１５〜４μｇ／ｍｌ、好ましくは２μｇ／ｍｌである。
【００１５】
本発明の実施形態によれば、工程ａ）におけるインキュベーション時間は、１０〜３０分、好ましくは１５分である。
【００１６】
本発明の実施形態によれば、前記サンプルは、ヒト又は動物微生物叢のサンプルである。
【００１７】
本発明の実施形態によれば、前記サンプルは、細菌培養物である。
【００１８】
本発明はまた、細菌サンプル中のグラム陽性菌及びグラム陰性菌の科、属及び／又は種を検出し、任意には区別し、そして同定するための方法にも関し、前記方法は下記工程：
ａ）前記サンプルと、
−蛍光色素に結合された小麦レクチン（小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ））、
−ＷＧＡに結合されたものとは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
−任意には、バンコマイシン、
−任意には、塩化カリウム、
とを同時に、又は順次にインキュベートする工程、
ｂ）前記サンプルを遠心分離する工程、
ｃ）任意には、前記サンプルを洗浄する工程、
ｄ）前記サンプルの蛍光を、フローサイトメトリーを用いて測定する工程、
ｅ）２つの蛍光色素の相対蛍光を分析する工程、及び
ｆ）任意には、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の科、属及び／又は区別し、そして同定する工程、を含む。
【００１９】
本発明の実施形態によれば、ＷＧＡに結合された蛍光色素は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７であり、そしてバンコマイシンに結合された蛍光色素は３−ＢＯＤＩＰＹ−プロパン酸である。
【００２０】
本発明は、上記方法においてグラム陽性菌を標識するためのキットの使用にも関する。従って、本発明は、フローサイトメトリーにおいて、グラム陽性菌を標識するためのキットの使用に関し、ここで前記キットは、
ｉ．蛍光色素に結合された小麦レクチン（小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ））、
ｉｉ．ＷＧＡに結合された蛍光色素とは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
ｉｉｉ．任意には、バンコマイシン、及び
ｉｖ．任意には、塩化カリウム、を含む。
【００２１】
本発明の実施形態によれば、前記蛍光色素は、標識剤ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）、３−ＢＯＤＩＰＹ−プロパン酸又はその誘導体の１つ、フルオレセイン又はその誘導体、塩又はエステルの１つ、Ｃｙ標識剤、ＣＦ標識剤、共役蛍光色素の群から選択される。
【００２２】
本発明の実施形態によれば、ＷＧＡに結合された蛍光色素は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）標識剤、フルオレセイン又はその誘導体、塩、エステルの１つから選択される。
【００２３】
本発明の実施形態によれば、バンコマイシンに結合された蛍光色素は、３−ＢＯＤＩＰＹ−プロパン酸又はその誘導体の１つ、フルオレセイン又はその誘導体、塩又はエステルの１つ、特にＦＩＴＣから選択される。
【００２４】
本発明の実施形態によれば、ＷＧＡに結合された蛍光色素は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７であり、そしてバンコマイシンに結合された蛍光色素は３−ＢＯＤＩＰＹ−プロパン酸である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、実施例１のフローサイトメトリーの結果を示す。Ｘ軸は、５４０ｎｍ±１５ｎｍの波長での蛍光強度を示し、これはＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬに結合されたバンコマイシンの蛍光に対応する。Ｙ軸は６７０ｎｍ±１５ｎｍの波長での蛍光強度を示し、これは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（登録高評）６４７に結合されたＷＧＡの蛍光に対応する。
【００２６】
【図２】図２は、実施例２のフローサイトメトリーの結果を示す。Ｘ軸は、５４０ｎｍ±１５ｎｍの波長での蛍光強度を示し、これはＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬに結合されたバンコマイシンの蛍光に対応する。Ｙ軸は６７０ｎｍ±１５ｎｍの波長での蛍光強度を示し、これは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（登録高評）６４７に結合されたＷＧＡの蛍光に対応する。
【００２７】
【図３ａ】図３ａ及び３ｂは、実施例３に記載される実験の結果を示す。図３ａは、５４０ｎｍ±１５ｎｍの波長で、試験された種々の種について得られた蛍光の幾何平均を示し、図３ｂにおけるグラフは、６７０ｎｍ±１５ｎｍの波長で、試験された種々の種について得られた蛍光の幾何平均を示し、れは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（登録高評）６４７に結合されたＷＧＡの蛍光に対応する。
【００２８】
【図３ｂ】図３ａ及び３ｂは、実施例３に記載される実験の結果を示す。図３ａは、５４０ｎｍ±１５ｎｍの波長で、試験された種々の種について得られた蛍光の幾何平均を示し、図３ｂにおけるグラフは、６７０ｎｍ±１５ｎｍの波長で、試験された種々の種について得られた蛍光の幾何平均を示し、れは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（登録高評）６４７に結合されたＷＧＡの蛍光に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
グラム陽性菌をより正確に決定するための手段を模索している間、本発明者らは、異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合された、レクチン、ＷＧＡ及び抗生物質、バンコマイシンの組合せに基くキット及び方法を開発した。この組合せは、フローサイトメトリーを用いて、複雑なサンプル、例えば微生物叢におけるグラム陽性菌の割合及びグラム陰性菌の割合の分析を可能にする。
【００３０】
「グラム陽性菌」とは、グラム染色（ゲンチアナバイオレット）により強調される細菌を意味する。「グラム陰性菌」とは、グラム染色により強調されない細菌を意味する。
【００３１】
大きなバンコマイシン（１，５００〜２，０００ダルトン）は、末端Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ鎖に固定することにより、細菌のペプチドグリカンの合成を阻害する糖ペプチドである。それらの構造はまた、グラム陰性菌にも見出されるが、外膜の存在のためにバンコマイシンには、アクセスできない。さらに、バンコマイシンは、大き過ぎて、グラム陰性菌の外膜の細孔を通過できない。他方では、バンコマイシンは、このＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ鎖を有さない耐性細菌には固定されず、そして従って、それらを標識しない。
【００３２】
ＷＧＡは、バンコマイシンとは異なり、グラム陽性菌に対して特異的ではない。それは、グラム陽性菌に多かれ少なかれ存在する構造体、すなわちシアル酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの認識のために、それらの細菌を優先的に且つ差別的に固定する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｂ  （ＳＧＢ）という名称で一般的に知られており、その壁に多量のシアル酸を有し、ＷＧＡによる有意な標識につながる。
【００３３】
ＷＧＡ及びバンコマイシンの添加は、バンコマイシンに対して耐性になる可能性があり、そして従って、抗生物質のみでは同定されないグラム陽性菌の識別の強化を可能にする。従って、それらの２つの標識剤（最初の蛍光色素に結合されたバンコマイシン及び第２の蛍光色素に結合されたＷＧＡ）の組合せは、グラム陽性及びグラム陰性集団を区別するのみならず、またサンプルに存在するグラム陽性菌種の蛍光サイン信号を生成できるようにするための興味ある組合せを表す。この情報は、複雑な細菌集団、例えば微生物叢サンプル、特にヒト及び動物サンプルに典型的なそれらの集団の特徴づけを可能にする。
【００３４】
蛍光色素の例は、以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）標識剤、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、フルオレセイン又はその誘導体、塩又はエステルの１つ、標識剤ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ（登録商標）４８８及びＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ（登録商標）５１４、標識剤ＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎ及びＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎ−Ｘ、エオシン、テトラメチルローダミン、標識剤リサミンローダミンＢ及びローダミンＲｅｄ−Ｘ、Ｘ−ローダミン、標識剤Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）及びＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−Ｘ、ナフトフルオレセイン又はその誘導体、塩又はエステルの１つ、カルボキシロダミン６Ｇ、ＱＳＹ標識剤：蛍光不活性化剤、非蛍光マラカイトグリーン、クマリン誘導体、標識剤Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ，  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ及びその他のピレン誘導体、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ及び他のピリジルオキサゾール誘導体、ナフタレン（例えば、ダンシルクロリド）、標識剤ダポキシル、ビマン、１−ジメチルアミン−Ｎ（２−アジドエチル）ナフタレン−５−スルホンアミド、６−（６−アミノ−２−（２−アジドエチル）１，３−ジオキソ−１Ｈ−ベンゾ（デ）−  ２（３Ｈ）イソキノリン、６−（６−アミノ−２−（２−プロピニル）１，３−ジオキソ−１Ｈ−ベンゾ（デ）−２（３Ｈ）イソキノリン、８−（４−アジドエチルオキシフェニル）−２，６−ジエチル−１，３，５，７−テトラメチル−４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン、８−（４−プロピニルオキシフェニル）−２，６−ジエチル−１，３，５，７−テトラメチル  −４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン、１−（３−アジド−プロポキシ）−７−メチルアミノ−フェノキサジン−３−オン、１−（２−プロピニル）−７−メチルアミノ−フェノキサジン−３−オン、Ｎ−（５−（３−アジドプロピルアミノ）−９Ｈ  −ベンゾ（ａ）−フェノキサジン−９−イリデン）−Ｎ−メチル−塩化メタナミニウム、Ｎ−（５−（３−プロピニル−アミノ）−９Ｈ−ベンゾ（ａ）−フェノキサジン−９−イリデン）−Ｎ−メチル  −塩化メタナミニウム、（９−（３−アジド−プロポキシ）−７−ピペリジン−１−イル−フェノキサジン−３−イリデン）−ジメチル−過塩素酸アンモニウム。また以下についても言及され得る：４−メチルウンベリフェロンの誘導体、１−（２−ベンゾイルフェニル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−グルコピラノシド；  １−（２−ベンゾイルフェニル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−β−ガラクトピラノシド；  １−（２−ベンゾイルフェニル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−アセテート；  １−（２−ベンゾイルフェニル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ホスフェート、８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＨＰＴＳ）、シアニン化合物又はその誘導体の１つ。また、Ｋｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７：３４８６−３４９０；  Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｃｈｅｍ．  Ａｓｉａｎ  Ｊ．  ５：７７３−７７７；  Ｆｉｌｎｏｖ  ���ｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２９：７５７−７６１；  Ｓｕｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８：７７１−７７７；  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３３：９９６４−９９６７；  Ｚｉｎ  （２０１１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８：７２６−７２８；  及び  “Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｍｉｎｅ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ”，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １も参照のこと。
【００３５】
以下の表及び化学式の蛍光色素は、本発明での使用に好ましい蛍光色素として言及され得る：
結合された蛍光色素：
【表１−１】
2021529302.tif 000002
【表１−２】
2021529302.tif 000003
【００３６】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）標識剤：
【表２】
2021529302.tif 000004
【００３７】
いくつかのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）標識剤の構造が以下に示される。
【化１】
2021529302.tif 000005
【００３８】
Ｃｙ標識剤：
【表３】
2021529302.tif 000006
【００３９】
Ｃｙ標識剤：
例えば、以下のウェブサイトを参照のこと：
https://biotium.com/product/wheat-germ-agglutinin-wga-cf-dye-conjugates/
【表４】
2021529302.tif 000007
【００４０】
本発明の実施形態によれば、ＷＧＡに結合された蛍光色素は、サプライヤーＢｉｏｔｉｕｍ  （ＣＡ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）からのＣＦ（登録商標）標識剤から選択される（上記の「ＣＦ標識剤」の表を参照のこと）。
【００４１】
本発明の実施形態によれば、ＷＧＡに結合された蛍光色素は、サプライヤーＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  （Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）からの標識剤、例えばテトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ、Ｑｄｏｔ  ６５５、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８から選択される。
【００４２】
本発明の実施形態によれば、ＷＧＡに結合された蛍光色素は、フルオレセイン、特にその商品名、ＦＩＴＣにより、当業者に良く知られているフルオレセイン５−イソチオシアネート（ＣＡＳ番号３３２６−３２−７）から選択される。ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  （Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，  ＣＡ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）は、サプライヤーの例として言及され得る。
【００４３】
本発明の実施形態によれば、ＷＧＡに結合された蛍光色素は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７  （ＣＡＳ  Ｎｕｍｂｅｒ  ４０００５１−２３−２）である。それは、いくつかのサプライヤーから、市場で容易に入手できる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  （Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）は、サプライヤーの例として言及され得る。
【００４４】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７の化学構造は、以下である：
【化２】
2021529302.tif 000008
【００４５】
本発明の実施形態によれば、バンコマイシンに結合された蛍光色素は、３−ＢＯＤＩＰＹ−プロパン酸又はその誘導体、塩又はエステルの１つ、フルオレセイン又はその誘導体、塩又はエステルの１つ、特にその商品名、ＦＩＴＣにより当業者に良く知られているフルオレセイン５−イソチオシアネート（ＣＡＳ番号３３２６−３２−７）から選択される。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  （Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）は、サプライヤーの例として言及され得る。
【００４６】
本発明の実施形態によれば、バンコマイシンに結合された蛍光色素は、その商品名ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（登録商標）により、当業者により知られている３−ＢＯＤＩＰＹ−プロパン酸  （ＣＡＳ  Ｎｕｍｂｅｒ  １６５５００−６３−３）、又はその誘導体、塩又はエステルの１つから選択される。イソチオシアネートエステル、スクシンイミジル及びスルホン化スクシンイミジルがエステルとして言及され得る。名称ＢＯＤＩＰＹは、ホウ素ジピロメテンに対応する。ＢＯＤＩＰＹコアについてのＩＵＰＡＣ名は、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダゼンである。
【００４７】
本発明の実施形態によれば、３−ＢＯＤＩＰＹ−プロパン酸  （ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（登録商標））は、バンコマイシンに結合されるための特に好ましい蛍光色素である。ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬは、市販されている。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  （Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）は、サプライヤーの例として言及され得る。
【００４８】
ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬの化学構造は、以下に示される：
【化３】
2021529302.tif 000009
【００４９】
本発明の実施形態によれば、ＷＧＡは蛍光色素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に結合され、そしてバンコマイシンは、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（登録商標）に結合される。
【００５０】
ＷＧＡは市販されている。例えば、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  （Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）  及び  ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  （Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，  ＣＡ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）が言及され得る。ＷＧＡは通常、水又は別の適切な液体、好ましくは水溶液により再構成される準備ができている凍結乾燥物の形で供給される。ＷＧＡと蛍光色彩との結合は、当業者に知られている方法に従って実施される。特定数のＷＧＡ−蛍光色素、例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ＷＧＡ−蛍光色素は、市販されている。例えば、以下のサプライヤーが言及され得る：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  （Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ），  Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  （Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）  及び  Ｂｉｏｔｉｕｍ  （ＣＡ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）。
【００５１】
バンコマイシンは市販されており、例えばＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  （Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）及びＭｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  （Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）がサプライヤーとして挙げられる。バンコマイシンは、水又は適切な水溶液により再構成される準備ができている粉末の形で供給され得る。それはまた、溶液としても供給され得る。バンコマイシンと蛍光色素との結合は、当業者に知られている方法に従って実施される。一定数のバンコマイシン−蛍光色素が市販されている。例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  （Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）がサプライヤーとして挙げられる。
【００５２】
本発明者らは、０．３Ｍ〜３Ｍの濃度での塩化カリウム（ＫＣｌ）の添加が、特定のグラム陽性菌、例えばＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  及び  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓのためのＷＧＡ標識の改善、及びグラム陰性菌の標識を増強しないで、他のグラム陽性菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのためのＷＧＡ及びバンコマイシン標識の増強を可能にすることを観察した。従って本発明の実施形態によれば、分析されるサンプルの細菌の標識は、０．３Ｍ〜３Ｍ、好ましくは１Ｍの最終濃度でのＫＣｌとのインキュベーション工程を含む。好ましくは、ＫＣｌとのインキュベーションは、標識剤、蛍光色素に結合されたＷＧＡ及び蛍光色素に結合されたバンコマイシンとのインキュベーションと同時に起こる。
【００５３】
本発明者らは、蛍光色素に結合されていないバンコマイシン（非標識バンコマイシン）の添加が、特定の菌株、例えばＥ．  ｆａｅｃａｌｉｓのための標識を改善することを確認した。例えば、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬバンコマイシンがＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓに容易に固定せず、そしてＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬバンコマイシンと同様に非標識バンコマイシンの添加がこの標識を改善できることが知られている。
【００５４】
従って、本発明の実施形態によれば、分析されるサンプル中の細菌の標識は、非標識バンコマイシン及び蛍光色素に結合されたバンコマイシンの混合物を用いて実施され得る。非標識バンコマイシンと、蛍光色素に結合されたバンコマイシンとの間の比率は、０．３〜２．４、好ましくは０．７５〜１．２５、好ましくは１であり得る。
【００５５】
従って、本発明者らは、細菌を含むサンプル中のグラム陽性菌の割合及びグラム陰性菌の割合を検出するためのキットを開発した。一般的に、キットは、フローサイトメトリー法で実装される。
【００５６】
一般的に、グラム陽性菌を標識するためのキットは、以下を含む：
ｉ．蛍光色素に結合された小麦レクチン（（小麦胚芽凝集素ＷＧＡ））、
ｉｉ．ＷＧＡに結合された蛍光色素とは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
ｉｉｉ．任意には、非標識バンコマイシン、及び
ｉｖ．任意には、塩化カリウム（ＫＣｌ）。
【００５７】
本発明の実施形態によれば、グラム陽性菌を標識するためのキットは、以下を含む：
ｉ．蛍光色素に結合された小麦レクチン（（小麦胚芽凝集素ＷＧＡ））の凍結乾燥物又は溶液、
ｉｉ．ＷＧＡに結合された蛍光色素とは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシンの粉末又は溶液、
ｉｉｉ．任意には、粉末又は溶液の形での非標識バンコマイシン、及び
ｉｖ．任意には、粉末又は溶液の形での塩化カリウム。
【００５８】
本発明の実施形態によれば、グラム陽性菌を標識するためのキットは、以下を含む：
ｉ．Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７  （ＣＡＳ番号  ４０００５１−２３−２）に結合された小麦レクチン（小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ））の凍結乾燥物又は溶液、
ｉｉ．その商品名ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬにより当業者により知られている３−ＢＯＤＩＰＹ−プロパン酸（ＣＡＳ番号１６５５００−６３−３）に結合されたバンコマイシンの粉末又は溶液、
ｉｉｉ．任意には、バンコマイシン（非標識）、
ｉｖ．任意には、塩化カリウム（ＫＣｌ）。
【００５９】
本発明の実施形態によれば、キットにおいて、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬに結合されたバンコマイシンの溶液は、０．２〜４μｇ／ｍｌの濃度を有する。
【００６０】
本発明の実施形態によれば、キットにおいて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７  （ＣＡＳ番号  １６５５００−６３−３）に結合された小麦レクチン（小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ））の溶液は、５〜１００μｇ／ｍｌの濃度を有する。
【００６１】
本発明はまた、細菌を含むサンプル中のグラム陽性菌の割合、及びグラム陰性菌の割合を検出するための方法にも関する。上記キットは、本発明の方法を実施するよう企画される。一般的に、前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）細菌を含むサンプルと、
−蛍光色素に結合された小麦レクチン（小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ））、
−ＷＧＡに結合されたものとは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
−任意には、バンコマイシン、
−任意には、塩化カリウム、
とを同時に、又は順次にインキュベートする工程、
ｂ）前記サンプルを遠心分離する工程、
ｃ）任意には、前記サンプルを洗浄する工程、及び
ｄ）前記サンプルの蛍光を測定する工程。
【００６２】
典型的には、工程ｄ）は、選択された蛍光色素に従って適切な波長でフローサイトメトリーにより実行される。一般的に、工程ｄ）は、工程ｃ）の終了後、４０分未満、好ましくは３０分未満で実施される。
【００６３】
本発明の実施形態によれば、この方法は、標識の前又は後に行うことができる固定工程を含むことができる。本発明の実施形態によれば、その固定工程は、工程ｃ）と工程ｄ）との間で行うことができる。この固定工程は、サンプルが暗所で約４℃で維持されている場合、光の分散及びサンプルの標識を、最大約１週間、安定させる。
【００６４】
例えば、サンプルは、例えば１％（ｖ／ｖ）の濃度で、例えば周囲温度で、約３０分〜１．５時間の期間、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）と共にインキュベートされ得る。当業者は、この固定工程の条件を適応させる方法を知っている。固定工程が行われる場合、一般的に、ＰＦＡ残留物を除去するために、３，２００ｇ〜１５，０００ｇの少なくとも１回、好ましくは２回の遠心分離が５〜２０分間、続く。従って、固定工程は、終了（工程ｃ））と工程ｄ）との間の期間の延長を可能にし、そして取扱い時間の計画において柔軟であることを可能にする。
【００６５】
本発明の実施形態によれば、固定工程はまた、工程ａ）の前に行われ得る。この場合、標識（工程ａ））の実施の前、分析される細胞の状態を「修正」することができる。これは、細胞状態の大幅な修飾を行わないで、標識の前の時間の延長を可能にする。
【００６６】
本発明の実施形態によれば、工程ａ）の細胞のサンプルは、１０４〜１０９個の細胞／ｍｌ、好ましくは１０５〜１０７個の細胞／ｍｌの濃度を有する。蛍光色素に結合されたＷＧＡ、蛍光色素に結合されたバンコマイシン、任意には、非標識バンコマイシン及び任意には、ＫＣｌが、細胞サンプルに、次に、又は同時に添加され得る。好ましくは、それらは同時に添加される。典型的には、標識溶液は、任意には、非標識バンコマイシン及びＫＣｌを含む全ての標識剤を用いて調製される。
【００６７】
本発明の実施形態によれば、サンプル中の蛍光色素に結合されたＷＧＡの最終濃度は、試験されるサンプルにおいて、５〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜３０μｇ・ｍｌ、より好ましくは２０μｇ／ｍｌである。
【００６８】
本発明の実施形態によれば、サンプル中の蛍光色素に結合されたバンコマイシンの最終濃度は、試験されるサンプルにおいて、０．１５〜４μｇ／ｍｌ、好ましくは２μｇ／ｍｌである。
【００６９】
本発明の実施形態によれば、非標識バンコマイシンは、インキュベーション工程ａ）の間に組込まれる。この場合、非標識バンコマイシン及び蛍光色素に結合されたバンコマイシンが、０．２５〜２．２５の比率で、好ましくは１の比率で存在することができる。本発明の実施形態によれば、非標識バンコマイシン及び蛍光色素に結合されたバンコマイシンは、試験されるサンプルにおいて、０．１５〜４μｇ／ｍｌの濃度で存在することができる。本発明の実施形態によれば、非標識バンコマイシン及び蛍光色素に結合されたバンコマイシンは、試験されるサンプルにおいて、２μｇ／ｍｌの濃度で存在することができる。
【００７０】
一般的に、インキュベーションは、当業者に知られている標準条件下で行われる。例えば、サンプルは、暗室において、標識剤と共に、周囲温度で１０〜３０分、好ましくは１５分間インキュベートされる。インキュベーション時間は、インキュベーション温度が低い場合、より長く、そしてインキュベーション温度が高い場合、より短いことを、当業者は知っている。
【００７１】
遠心分離工程ｂ）は、当業者に知られている通常の条件下で行われる。本発明の実施形態によれば、遠心分離工程ｂ）は、３，２００ｇ〜１５，０００ｇで５〜２０分間、実施される。
【００７２】
本発明の実施形態によれば、洗浄工程ｃ）は、従来、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）と呼ばれる緩衝食塩水、又は約０．９％での塩化ナトリウム溶液により実施される。
【００７３】
本発明の実施形態によれば、サンプル中の蛍光の測定工程ｄ）は、フローサイトメトリーにより実施される。）ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）からの流入サイトメーター及びＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）からのＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６  サイトメーターが、そのような装置のサプライヤーとして言及される。
【００７４】
典型的には、サイトメーターは、４８８ｎｍのレーザー（２００ｍＷの出力）、４０５ｎｍのレーザー（１００ｍＷの出力）及び６４０ｎｍのレーザー（１２０ｍＷの出力）を装備されている。４８８ｎｍの波長のレーザーが、バンコマイシンを励起するために使用され、そしてその蛍光は、５４０／３０ｎｍ（５４０±１５ｎｍ）の通過帯域を通して収集される。ＷＧＡは６４０ｎｍのレーザーにより励起され、その蛍光は、６７０／３０ｎｍ（６７０±１５ｎｍ）の通過帯域を通して収集される。サンプルが通過する前、装置は、高品質の結果を確保するためにキャリブレーションされ得る。典型的には、サンプルスループットは、毎秒５００イベント〜毎秒５，０００イベントの範囲である。約４０，０００〜６０，０００のイベントの記録が可能である。当業者は、イベントの数が使用されるサイトメーターに応じて変化し得ることを知っている。本発明の実施形態によれば、標識された細菌の濃度は、約１０５〜１０７、好ましくは約１０６ＣＦＵ／ｍｌである。
【００７５】
実施例１及び２、及び図１及び２は、ＫＣｌを添加しないで（実施例１）及び１ＭのＫＣｌを添加して（実施例２）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬに結合されたバンコマイシン、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）に結合されたＷＧＡを使用する本発明の２つの実施形態の有効性を示す。ＫＣｌの添加は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの標識の改善を可能にする。両方の実施例においては、グラム陰性菌は、標識されておらず、そしてグラム陽性菌は十分に標識されている。
【００７６】
２つの蛍光色素の相対的蛍光を分析することにより、本発明者らは、異なる科、属及び／又は種の細菌がそれらは自体の特定のサインを有することを見出した。従って、本発明の別の主題は、細菌を含むサンプル中のグラム陽性菌の特定の科、属及び／又は種を検出し、そして任意には、区別し、そして同定するための方法である。
【００７７】
この方法は、上記工程だけでなく、２つの蛍光色素の相対的蛍光を分析する工程ｅ）も含む。典型的には、前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）前記サンプルと、
−蛍光色素に結合された小麦レクチン（小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ））、
−ＷＧＡに結合されたものとは異なる波長で蛍光を発する蛍光色素に結合されたバンコマイシン、
−任意には、バンコマイシン、
−任意には、塩化カリウム、
とを同時に、又は順次にインキュベートする工程、
ｂ）前記サンプルを遠心分離する工程、
ｃ）任意には、前記サンプルを洗浄する工程、
ｄ）前記サンプルの蛍光を、フローサイトメトリーを用いて測定する工程、
ｅ）２つの蛍光色素の相対蛍光を分析する工程、及び
ｆ）任意には、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の科、属及び／又は区別し、そして同定する工程。
【００７８】
本発明の実施形態によれば、工程ｆ）において、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の科、属及び／又は種が区別され、そして同定される。本発明の実施形態によれば、例えば適切なパラホルムアルデヒド溶液を用いての任意の固定工程は、工程ｃ）と工程ｄ）との間、又は工程ａ）の前に起こっていることができる。
【００７９】
分析工程ｅ）は、適切なソフトウェア、例えばＦｌｏｗＪｏ（ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ）（ｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ，  Ａｓｈｌａｎｄ，  Ｏｒｅｇｏｎ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）により実施され得る。
【００８０】
２つの蛍光色素の相対的蛍光の分析は、属を互いに、種を互いに及びさらに菌株を互いに区別することを可能にする。これは、分析されたサンプルの生存率に関係なく、及びまた、細菌が好気性であるか、又は嫌気性であるかに関係なく可能である。
【００８１】
本発明の実施形態によれば、得られた蛍光サインは、サンプルに存在する科、属及び／又は種の区別のみならず、また同定も可能にする。これはサンプルから得られたサインと、種の参照のサインとを比較することにより可能になる。
【００８２】
本発明の実施形態によれば、２つの蛍光色素の相対的蛍光の分析は、グラム陽性菌の科の互いの区別を可能にする。なぜならば、これは、各科が独自の蛍光サインを有するためである。
【００８３】
例えば、以下の科を互いに区別することが可能である：Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ。このリストは、網羅的ではない。
【００８４】
本発明の実施形態によれば、２つの蛍光色素の相対的蛍光の分析は、グラム陽性菌の属の互いの区別を可能にする。なぜならば、これは、各属が独自の蛍光サインを有するためである。
【００８５】
例えば、以下の属を互いに区別することが可能である：Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ及び  Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ。
【００８６】
本発明は、嫌気性グラム陽性菌と、嫌気性グラム陰性菌との区別を可能にする。また、好気性グラム陽性菌と、好気性グラム陰性菌との区別を可能にする。嫌気性細菌の例として、以下が言及される：
−Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ
−Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ
−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ
−Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ
−及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓに属するそれら。
【００８７】
本発明の実施形態によれば、２つの蛍光色素の相対的蛍光の分析は、グラム陽性菌の種の互いの区別を可能にする。なぜならば、これは、各種が独自の蛍光サインを有するためである。例えば、以下の種が、互いに区別され得る種として言及され得る：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｂｏｎｇｏｒｉ、  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ、  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｕｒａｎｓ、  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ、  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、  Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、  Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｉｒｏｆｏｒｍｅ、  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ、  Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ  ｐｌａｕｔｉｉ、  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、  Ｂｌａｕｔｉａ  ｈａｎｓｅｎｉｉ  及びＢｌａｕｔｉａ  ｓｃｈｉｎｋｉｉ。このリストは網羅的ではない。
【００８８】
実施例３は、実施形態による方法を実施することにより、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬに結合されたバンコマイシン、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に結合されたＷＧＡの２つの標識剤の相対的蛍光を分析することにより、少なくとも６つの異なる種を区別することがどのように可能であるかを示している。得られたサインと、参照サインとを比較することにより、種の同定を可能にする。
【００８９】
図３ａ及び３ｂは、実施例３に記載される実験の結果を示し、ここで、標識剤（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬに結合されたバンコマイシン、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に結合されたＷＧＡ）の相対的蛍光が測定される。図３ａにおけるグラフは、５４０±１５ｎｍの波長で、試験された異なる種について得られた蛍光の幾何平均を示し、これは、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬに結合されたバンコマイシンの蛍光に対応する。同じ種のメンバーが一緒にグループ化されていることがわかり、そしてその分析は以下の異なる種の区別を可能にすることに注意すること：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  及び  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ。各種は、グラフの異なる領域を占める。
【００９０】
図３ｂにおけるグラフは、６７０±１５ｎｍの波長で、試験された異なる種について得られた蛍光の幾何平均を示し、これはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に結合されたＷＧＡの蛍光に対応する。同じ種のメンバーは、メンバーがより分散しているＥ．  ｆａｅｃａｌｉｓ種を除いて、一緒にグループ化されていることに注意すること。従って、２つの標識剤による分析は、グラム陽性菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐの区別を可能にする。
【００９１】
本発明の実施形態によれば、２つの蛍光色素の相対的蛍光は、インビトロ微生物叢培養におけるグラム陽性菌とグラム陰性菌の比率の決定を可能にする。
【００９２】
バックゲーティングは、２つの選択された蛍光色素の相対的蛍光の分析で強調された集団に対して実施され得る。「バックゲーティング（Ｂａｃｋｇａｔｉｎｇ）」は、標識サイン（及び使用される「ゲーティング」法）の確認を可能にする、当業者に知られている、フローサイトメトリーに使用される技術である。本発明の実施形態によれば、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬに結合されたバンコマイシンの蛍光に対応する、例えば５４０ｎｍ±１５ｎｍの波長での蛍光の強度、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に結合されたＷＧＡの蛍光に対応する、６７０ｎｍ±１５ｎｍの波長での蛍光の強度をグラフ上に同定された集団から、バックゲーティングは、集団の１つの選択、及びそのＦＳＣ／ＳＳＣプロファイルへの戻りを含む。従って、請求された方法は、特定の集団の潜在的同定を可能にする。培養物に存在する科、属及び／又は種のレベルでの種々の集団の強調、及びそれらの多様性、並びにグラム陰性菌及びグラム陽性菌の割合の推定を可能にする。
【００９３】
本発明の実施形態によれば、請求された方法は、サイトメトリーにおけるグラム標識の結果と、１６Ｓ分析の結果とを相関させるために使用され得る。
【００９４】
この分析の有効性は、微生物叢サンプルなどの複雑なサンプルの分析に非常に役立つ。従って、本発明は、医学的用途、又は特にメタゲノミクスにおける研究ツールとしての用途を有することができる複雑なサンプルを特徴づけることを可能にする。したがって、分析の信頼性、再現性、精度、及び感度の重要性が最も重要である。
【００９５】
本発明はまた、以下の実施例を参照して説明される。特許請求される本発明は、これらの実施例によって決して限定されることを意図するものではないことが理解されるであろう。
【実施例】
【００９６】
実施例１：
試験された異なる種を、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ  （ＬＢ）  又はＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  （ＢＨＩ）培地において、それらの種々の菌株の要件に従って、１８０ｒｐｍでの攪拌を伴って、又は攪拌しないで、３７±１℃又は３０±１℃で一晩、培養した。異なる細菌懸濁液を、約１０６ＣＦＵ／ｍｌに調整した。標識剤を、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬに結合されたバンコマイシン、バンコマイシン、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に結合されたＷＧＡを、それぞれ０．５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌの濃度で組合すことにより、上流で調製した。標識剤を、試験される異なる種と接触せしめた。暗室で周囲温度で１５分間のインキュベーションの後、洗浄をＰＢＳ溶液により行い、続いて３，２００ｇで１５分間、遠心分離工程を行った。次に、サンプルを、流入サイトメーター（ＢＤ）により分析した。
【００９７】
４８８ｎｍのレーザー（２００ｍＷの出力）、４０５ｎｍのレーザー（１００ｍＷの出力）及び６４０ｎｍのレーザー（１２０ｍＷの出力）を備えた流入サイトメーター（ＢＤ）を、サイトメトリー分析のために使用した。サイズ（前方：ＦＳＣ）及び粒度（サイド：ＳＣＣ）信号を、４８８ｎｍで得た。４８８ｎｍの波長のレーザーを用いて、バンコマイシンを励起し、そしてその蛍光を５４０／３０ｎｍの通過帯域で収集した。ＷＧＡを６４０ｎｍのレーザーにより励起し、そしてその蛍光を６７０／３０ｎｍの通過帯域で収集した。サンプルが通過する前、キャリブレーション球を用いて、サイトメーターキャリブレーションの品質管理を実行した。サンプルスループットは、毎秒５００イベント〜５，０００イベントの間で維持された。５０，０００イベントの記録を行った。
【００９８】
分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて実行した。バックグラウンドノイズを、グラム標識の分析のために除去し、そしてグラム集団の標的化を、可視集団グループの周囲で手動的に実行した。
【００９９】
結果：
図１は、２つのグラム陰性菌  （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ  ７００６０３  及び  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ＡＴＣＣ  １３３１１）  及び  ２つのグラム陽性菌  （Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＪＨ２．２  及び  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３）のサンプルが、本発明の実施形態に行って分析される、実施例１に記載される実験の結果を示す。
【０１００】
グラフにおいては、Ｘ軸は、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬに結合されたバンコマイシンの蛍光に対応する、５４０ｎｍ±１５ｎｍの波長での蛍光の強度を示し、そしてＹ軸は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に結合されたＷＧＡの蛍光に対応する、６７０ｎｍ±１５ｎｍ波長での蛍光の強度を示す。
【０１０１】
グラム陰性菌は標識されておらず、そしてグラム陽性菌は十分に標識されていることに注意すること。
【０１０２】
実施例２：
試験された異なる種を、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ  （ＬＢ）  又はＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  （ＢＨＩ）培地において、それらの種々の菌株の要件に従って、１８０ｒｐｍでの攪拌を伴って、又は攪拌しないで、３７±１℃又は３０±１℃で一晩、培養した。異なる細菌懸濁液を、ＰＢＳ（ＰＢＳ条件の場合）又は１Ｍ  のＫＣｌ（ＫＣｌ条件の場合）のいずれかにより約１０６ＣＦＵ／ｍｌに調整した。特定の細菌懸濁液を、１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により、周囲温度で１時間、処理し、続いて３，２２０ｇで１５分間、２回、遠心分離し、ＰＦＡ残留物を除去した。細菌種を、試験される条件に従ってＰＢＳ又はＩＭのＫＣｌのいずれかに懸濁し、そしてＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬに結合されたバンコマイシン、バンコマイシン、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に結合されたＷＧＡを、それぞれ２μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌの濃度で組合すことにより、前もって調製された標識剤を、細菌懸濁液と接触せしめた。暗室で、周囲温度での標識剤の１５分間のインキュベーション、ＰＢＳ溶液による洗浄、及び３，２２０での１５分間の遠心分離の後、サンプルを、流入サイトメーター（ＢＤ）により分析した。
【０１０３】
結果：
図２は、３つのグラム陰性菌  （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ  ７００６０３  、  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ＡＴＣＣ  １３３１１及びＥ．  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ３５２１８）  及び  ３つのグラム陽性菌  （Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＪＨ２．２、  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２３８５７）のサンプルが、本発明の実施形態に行って分析される、実施例２に記載される実験の結果を示す。細菌を、１ＭのＫＣｌの存在下で、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に結合されたＷＧＡ及びＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬに結合されたバンコマイシンにより標識した。グラム陰性菌は標識されておらず、そしてグラム陽性菌は十分に標識されていることに注意すること。
【０１０４】
実施例３：
試験された異なる種を、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ  （ＬＢ）  又はＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  （ＢＨＩ）培地において、それらの種々の菌株の要件に従って、１８０ｒｐｍでの攪拌を伴って、又は攪拌しないで、３７±１℃又は３０±１℃で一晩、培養した。異なる細菌懸濁液を、約１０６ＣＦＵ／ｍｌに調整した。標識剤を、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬに結合されたバンコマイシン、バンコマイシン、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に結合されたＷＧＡを、１ＭのＫＣｌを含む溶液において、それぞれ２μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌの濃度で組合すことにより、上流で調製した。標識剤を、試験される異なる種と接触せしめた。暗室で、周囲温度での１５分間のインキュベーションの後、洗浄をＰＢＳ溶液により行い、続いて１５，０００ｇで１５分間、遠心分離を行った。次にサンプルを、流入サイトメーター（ＢＤ）により分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【国際調査報告】
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