(57)【要約】  本発明は少なくとも1つの第1のアミノペプチダーゼ及び少なくとも1つの第2のアミノペプチダーゼを含む組成物に関し、第1のアミノペプチダーゼは組成物の全質量に対して40質量%までに相当する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの第1のアミノペプチダーゼ及び少なくとも1つの第2のアミノペプチダーゼを含む組成物であって、前記第1及び第2のアミノペプチダーゼは互いに異なっており、前記第1及び第2のアミノペプチダーゼは好極限性微生物から単離されており、前記第1及び第2のアミノペプチダーゼはテトラヘドラルアミノペプチダーゼ、即ちTETアミノペプチダーゼのファミリーのアミノペプチダーゼであり、前記第1のアミノペプチダーゼは組成物の全質量に対して40質量%までに相当し、前記第1及び第2のアミノペプチダーゼがPhTET2及びPhTET3と異なる場合には前記第1のアミノペプチダーゼは組成物の全質量に対して50質量%までに相当する、組成物。
【請求項２】
前記少なくとも1つの第1のアミノペプチダーゼ及び前記少なくとも1つの第2のアミノペプチダーゼが、PhTET1、PhTET2、PhTET3、PhTET4、及びMjTETからなる群からのアミノペプチダーゼから選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記アミノペプチダーゼがそれぞれ配列番号1〜配列番号5の配列のアミノ酸分子、又はアミノペプチダーゼ活性を示すタンパク質を含むか、実質的にそれからなるか、又はそれからなり、前記タンパク質がその配列が配列番号1〜配列番号5の配列のうちの1つと少なくとも65%の同一性を有するアミノ酸分子を含むか、実質的にそれからなるか、又はそれからなる、請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
前記第1のアミノペプチダーゼが前記組成物の全質量に対して10質量%まで、特に前記組成物の全質量に対して5質量%までに相当する、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記第1のアミノペプチダーゼが前記組成物の全質量に対して50質量%に相当し、ただし前記第1及び第2のアミノペプチダーゼがPhTET2及びPhTET3とは異なる、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも第3のアミノペプチダーゼを含み、前記第3のアミノペプチダーゼがテトラヘドラルアミノペプチダーゼ、即ちTETアミノペプチダーゼのファミリーのアミノペプチダーゼである、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記第1、第2、及び第3のアミノペプチダーゼが等モル又は実質的に等モルの割合である、請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
エンドペプチダーゼ、特にサーモリシン、特に配列番号6のサーモリシンを更に含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
1つ又は複数のアミノペプチダーゼが架橋した結晶の形態である、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
ペプチド、ポリペプチド、及び/又はタンパク質を含む基質のポリペプチド成分の全て又は一部の改変のための請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１１】
前記基質が少なくともグルテン及び/又は乳清のペプチド、ポリペプチド、及び/又はタンパク質を含む、請求項10に記載の使用。
【請求項１２】
前記基質が以下のタンパク質、グリアジン、β-ラクトグロブリン、α-ラクトアルブミン、免疫グロブリン、血清アルブミン、及びラクトフェリンのうちの少なくとも1つを含む、請求項10又は11に記載の使用。
【請求項１３】
前記アミノペプチダーゼが、同時に、別々に、又は所定時間にわたり用いられる、請求項10から12のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
ペプチド、ポリペプチド、及び/又はタンパク質を含む基質のポリペプチド成分の全て又は一部を改変する方法であって、
・前記基質を、
・請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物と
接触させる工程を含み、
前記少なくとも1つの第1のアミノペプチダーゼ及び前記少なくとも1つの第2のアミノペプチダーゼは80℃を超える温度で活性化されてもよく、前記接触させる工程の前に任意選択で前記基質のポリペプチドを変性する工程を含む、方法。
【請求項１５】
請求項14に記載の方法によって得ることができる食品混合物。
【請求項１６】
以下のタンパク質、即ちグリアジン、β-ラクトグロブリン、α-ラクトアルブミン、免疫グロブリン、血清アルブミン、及びラクトフェリンのうち少なくとも1つを改変された形態で含む食品混合物であって、請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物を更に含む、食品混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアミノペプチダーゼを含む組成物、より詳細には「TETアミノペプチダーゼ」とも呼ばれるテトラヘドラルアミノペプチダーゼを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品工業では、「複合体」としても知られる「長鎖」ペプチドが、消費される食品の中に天然に存在している。これらの長鎖ペプチドは一般に、不十分な分解プロセスの結果であり、毒性を有することもあって、これらのペプチドを含む食品に対する不耐性又はアレルギーを惹起し、またそれらの栄養効率を低下させる。これらのペプチドはまた、パン、チーズ、保存肉等の多くの食品の味及び質感を決定する。
【０００３】
グルテン不耐性はおそらく最も一般的な食品不耐性の1つである。これはグルテンの組成物の中に入る「グリアジン」と呼ばれる複雑なタンパク質のファミリーによって惹起され、これらのタンパク質は「免疫優勢」と呼ばれるペプチドを有していることがあり、これがグルテンに感受性が高い又は不耐性の人にアレルギー反応を惹起する。
【０００４】
これらの理由により、食品工業では多くのプロセスにおいて、グルテンを分解してその免疫原性を低下させることを目的としてタンパク質分解酵素が用いられている。これらは基本的にはタンパク質及び長鎖ペプチドを断片に開裂させることを可能にするエンドプロテアーゼである。これらのエンドプロテアーゼは特にペイストリー、チーズ、ビスケットの製造プロセスに、またフルーツジュース又はビールの製造に、更には特別食を意図したタンパク質加水分解物の製造にも用いられている。これらのプロテアーゼは一般に細菌又は真菌から得られ、それらの正確な性質は一般に秘密が保たれている。
【０００５】
しかし、現在用いられているプロテアーゼの不利な点は、食品ペプチドの全ての毒性部分を除去するために十分短く、又はペプチドが効率的に消化されることを可能にするペプチドの生産ができないことである。たとえばグルテンに感受性が高い又は不耐性の人では、グルテンの消化が不完全であることが消化系における「免疫優勢」ペプチドの存在を惹起し、究極的にはセリアック病の症状を惹起する。
【０００６】
これらの複雑な食品ペプチドの分解のために中等温度好性のアミノペプチダーゼが既に開発されてきたが、それらの触媒活性が弱いことと、それらが活性であるための物理化学的条件によって、それらの使用は食品の味を改変することのみに限定されている。
【０００７】
Asuncion Duraら(The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea、Molecular Microbiology (2009) 72(1)、26〜40頁)は3種のアミノペプチダーゼを発現するパイロコッカス・ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii)に関し、ペプチダーゼPhTET3を特徴解析してこれをPhTET1及びPhTET2と比較している。これらは好極限性微生物由来のアミノペプチダーゼを含む組成物、即ち好極限性微生物から単離されたアミノペプチダーゼを含む組成物ではなく、したがってこれらは元の微生物それ自体とは極めて異なっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Asuncion Duraら、「The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea」、Molecular Microbiology (2009) 72(1)、26〜40頁
【非特許文献２】Dr. Alexandre APPOLAIRE、「Study of the large proteolytic assemblies of the TET family: oligomerization process and associated functional regulation」
【非特許文献３】Schoehn, G., Vellieux, F.M.D., Asuncion Dura, M., Receveur-Brechot, V., Fabry, C.M.S., Ruigrok, R.W.H., Ebel, C., Roussel, A.,及びFranzetti, B.,(2006) An archaeal peptidase assembles into two different quaternary structures: A tetrahedron and a giant octahedron、The Journal of biological chemistry .281: 36327〜36337頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はこれら全ての欠点を改善することを目的とする。したがって本発明は少なくとも1つの第1のアミノペプチダーゼ及び少なくとも1つの第2のアミノペプチダーゼを含む組成物に関し、前記第1及び第2のアミノペプチダーゼは互いに異なっており、前記第1及び第2のアミノペプチダーゼは好極限性微生物由来であり、前記第1及び第2のアミノペプチダーゼはテトラヘドラルアミノペプチダーゼ、即ちTETアミノペプチダーゼのファミリーのアミノペプチダーゼであり、前記第1のアミノペプチダーゼは組成物の全質量に対して40質量%までに相当し、前記第1及び第2のアミノペプチダーゼがPhTET2及びPhTET3と異なる場合には前記第1のアミノペプチダーゼは組成物の全質量に対して50質量%までに相当する。本発明者らは驚くべきことに、少なくとも2つのTETアミノペプチダーゼを含む組成物を用いることによって、特に混合物中でペプチドを分解し、それぞれのTETタンパク質の個別の活性の合計効果を超える相乗効果を発揮することが可能であることを観察した。実際上、組成物中に存在する種々のTETアミノペプチダーゼの活性の組み合わせに対応する組成物の全体活性を観察する代わりに、本発明者らは反応媒体の物理化学的条件によって、又は組成物中の異なったTETアミノペプチダーゼの間の相互作用/干渉によって調節することができる異なった全体活性を発見した。
【００１０】
「アミノペプチダーゼ」は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の末端でアミノ酸開裂活性を示す酵素を意味する。本発明による「ペプチド」は、少なくとも2つのアミノ酸を含むアミノ酸の鎖を意味する。ペプチドはタンパク質の分解によって、又は化学合成によって得ることができる。本発明による「ポリペプチド」は、ペプチドのアミノ酸の鎖より長く、タンパク質の分解によって得られ、化学合成で得られたものではないアミノ酸の鎖を意味する。ペプチド及びポリペプチドは生物学的機能を有し得る。しかし、ペプチド及びポリペプチドは細胞プロセスの一部としてこの機能を単独で発揮することはできない。本発明による「タンパク質」は、生物学的機能を有するアミノ酸の鎖を含み、生命体中に自然に見出される分子を意味する。この生物学的機能は細胞中の天然のプロセスの一部である。したがって組成物は互いに異なる2つのアミノペプチダーゼを含み、それぞれが互いに異なるアミノ酸配列を有している。換言すれば、アミノペプチダーゼは1つのアミノ酸が相違するアミノ酸配列を有している。換言すれば、2つのアミノペプチダーゼの配列は1つ又は複数のアミノ酸が互いに相違している。
【００１１】
本発明の組成物において用いられるテトラヘドラルアミノペプチダーゼ、即ちTETアミノペプチダーゼは好極限性微生物から、より詳細には海生好極限性微生物から単離される。これらのテトラヘドラルアミノペプチダーゼ、即ちTETアミノペプチダーゼは、MEROPS分類によるメタロアミノペプチダーゼファミリーM42及びM18に属する。換言すれば、TETアミノペプチダーゼは自己アセンブルして典型的な四面体構造を形成する構造物になる特殊性を有する、12個のサブユニットを含む酵素複合体の形態を有している。そのような形態は酵素の大きな安定性に寄与している。「メタロアミノペプチダーゼ」は、これらのアミノペプチダーゼが全て共通に、活性部位の中に少なくとも1つの金属イオンの存在を有していることを意味している。
【００１２】
「好極限性微生物」は、裸眼では見ることができず、顕微鏡を用いてのみ観察できる生きた生命体を意味する。これらの微生物は細菌、微真菌、古細菌、原生生物、微緑藻、動物性プランクトン、プラナリア、アメーバ、及びウイルス等の種々の生命形態を取り得る。「好極限性」は、その通常の生存条件が一般に大部分の他の生命体にとって致死的な条件に相当する生命体を表す。これらの生存条件は、その生命体が生存する環境の高温若しくは低温、極端な圧力、高い塩分、酸性度若しくはアルカリ性度、放射活性の存在、又は酸素若しくは光の非存在であってよい。
【００１３】
これらのTETアミノペプチダーゼは、これらがある種のアミノ酸に極めて特異的であり得るという点で他のアミノペプチダーゼと異なっている。その結果、本発明による組成物は異なったTETアミノペプチダーゼと組み合わされ、それにより、ペプチド又はいわゆる複合体タンパク質を分解して十分に短いペプチドとすることが可能である。したがって、全ての毒性部分を分解して、それによりこれらを効果的に消化できるようにすることが可能である。そのような最終結果は、用いる組成物に特異的なアミノペプチダーゼ活性によって得られる。このアミノペプチダーゼ活性は、基質及び改変し又は完全に分解さえすることが望まれる部分のポリペプチド成分に関して規定される。そのため、本発明者らは本発明の組成物について、特定のアミノ酸に対する特異性及びその活性に関する相互作用/相互の介入に応じて、関連するTETアミノペプチダーゼを選択する。更に、本発明者らは、ある種のTETアミノペプチダーゼがある条件の下に、特定のアミノ酸の種類が富化されたペプチドの分解に対して、この種のアミノ酸に対して特異的であることが従来技術で知られている他のTETアミノペプチダーゼよりも高い活性を示すことを見出した。換言すれば、TETアミノペプチダーゼの種々の併用は、組成物中で併用されるTETアミノペプチダーゼの既知の活性の単なる合計ではない。
【００１４】
本発明による組成物中では、第1のアミノペプチダーゼは組成物の全質量に対して40質量%までに相当する。「組成物の全質量に対して40質量%まで」は、第1のアミノペプチダーゼが組成物の全質量に対して1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、又は40%に相当してよいことを意味する。したがって、組成物が2つのTETアミノペプチダーゼのみからなる場合には、第2のアミノペプチダーゼは組成物の全質量に対して少なくとも60質量%に相当してよく、これは60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%を意味する。次に、第1及び第2のTETアミノペプチダーゼは、組成物の全質量に対する第1のアミノペプチダーゼの質量に応じて、組成物の全質量に対して質量比1:99から組成物の全質量に対して質量比40:60までの範囲の割合であってよい。
【００１５】
しかし、第1のアミノペプチダーゼ及び第2のアミノペプチダーゼがPhTET2及びPhTET3でない場合には、第1のアミノペプチダーゼは組成物の全質量に対して50質量%までに相当してよい。本発明による「組成物の全質量に対して50質量%まで」は、第1のアミノペプチダーゼが組成物の全質量に対して1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、又は50%に相当してよいことを意味する。
【００１６】
「前記第1及び第2のアミノペプチダーゼがPhTET2及びPhTET3と異なる」は、その配列が前記第1及び第2のアミノペプチダーゼが配列PhTET2(配列番号2)又は配列PhTET3(配列番号3)と65%未満の同一性を有するアミノ酸分子を含むか、実質的にそれからなるか、又はそれからなることを意味する。「2つの配列の間の同一性パーセント」は、これら2つのアミノ酸配列を比較するために当業者には既知の任意の手段でこれらを整列させたときにこれら2つの配列がそのアミノ酸鎖が同一である配列の部分を提示することを意味する。これらの部分の全てが2つの配列の間の同一性パーセントを規定する。「PhTET2配列(配列番号2)又はPhTET3配列(配列番号3)と65%未満の同一性」は、PhTET2配列(配列番号2)又はPhTET3配列(配列番号3)と1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、又は64%の同一性を意味する。
【００１７】
これは、組成物が第1及び第2のTETアミノペプチダーゼのみからなる実施形態では、第2のTETアミノペプチダーゼは組成物の全質量に対して少なくとも50質量%に相当してよいことを意味し、これは第1のアミノペプチダーゼ及び第2のアミノペプチダーゼがPhTET2及びPhTET3でない場合には50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%を意味する。
【００１８】
有利には、前記少なくとも1つの第1のアミノペプチダーゼ及び前記少なくとも1つの第2のアミノペプチダーゼは、PhTET1、PhTET2、PhTET3、PhTET4、及びMjTETからなる群からのアミノペプチダーゼから選択される。
【００１９】
PhTET1はアミノ酸配列番号1、PhTET2はアミノ酸配列番号2、PhTET3はアミノ酸配列番号3、PhTET4はアミノ酸配列番号4、MjTETはアミノ酸配列番号5で表される。
【００２０】
換言すれば、本発明による組成物の第1及び第2のTETアミノペプチダーゼの対は、PhTET1-PhTET2、PhTET1-PhTET3、PhTET1-PhTET4、PhTET1-MjTET、PhTET2-PhTET3、PhTET2-PhTET4、PhTET2-MjTET、PhTET3-PhTET4、PhTET3-MjTET、PhTET4-MjTETからなる組のリストから選択してよい。
【００２１】
有利には、前記アミノペプチダーゼはそれぞれ配列番号1〜配列番号5の配列のアミノ酸分子、又はアミノペプチダーゼ活性を示すタンパク質を含むか、実質的にそれからなるか、又はそれからなり、前記タンパク質はその配列が配列番号1〜配列番号5の配列のうちの1つと少なくとも65%の同一性を有するアミノ酸分子を含むか、実質的にそれからなるか、又はそれからなる。
【００２２】
本発明による「配列番号1〜配列番号5の配列のうちの1つとの同一性パーセント」は、タンパク質が、2つの配列を比較するためにアミノ酸配列を配列番号1(PhTET1の配列)、配列番号2(PhTET2の配列)、配列番号3(PhTET3の配列)、配列番号4(PhTET4の配列)、又は配列番号5(MjTETの配列)の配列のうちの1つと整列させたときにそのアミノ酸配列が1つの配列ともう1つの配列とで同一である配列の部分を観察することを可能にするアミノ酸配列を有することを意味する。本発明による「配列番号1〜配列番号5の配列のうちの1つと少なくとも65%の同一性」は、同一性パーセントが65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%の同一性であってよいことを意味する。換言すれば、考慮するタンパク質は、配列番号1〜配列番号5の配列のうちの1つとの同一性パーセントが上述のものの1つであるアミノ酸配列を有し、アミノペプチダーゼ活性、即ちポリマーのN末端におけるアミノ酸開裂活性を有するタンパク質である。
【００２３】
相同性のレベルが低くても、酵素は特定の基準に基づいてTETファミリーに帰属させてよいことが構造研究によって明らかに示されている。しかし、種々の酵素複合体が大きな構造相同性を示す一方、TETの間の配列同一性パーセントは極めて高くはない。たとえば、PhTET1はPhTET2及びPhTET3と約37%の同一性(55%の相同性)を示す一方、PhTET2とPhTET3はその間に48%の同一性(70%の相同性)を示す。
【００２４】
参照により本明細書に組み込まれるDr. Alexandre APPOLAIREの「Study of the large proteolytic assemblies of the TET family: oligomerization process and associated functional regulation」の論文への参照の例におけるように、本発明者らはアミノペプチダーゼ活性を示すタンパク質を特徴解析するために5つの基準を保持した。
1)二量化ドメインの配列への挿入:アミノペプチダーゼをコードする遺伝子の中央部における特定のドメインのこの挿入は、TETアミノペプチダーゼの構造の第1の強力なマーカーである(Schoehn, G., Vellieux, F.M.D., Asuncion Dura, M., Receveur-Brechot, V., Fabry, C.M.S., Ruigrok, R.W.H., Ebel, C., Roussel, A.,及びFranzetti, B.,(2006) An archaeal peptidase assembles into two different quaternary structures: A tetrahedron and a giant octahedron、The Journal of biological chemistry .281: 36327〜36337頁)。
2)二量化インターフェース:「IDIGAXXXE」パターンの存在はTETダイマーのアセンブリーに決定的であると思われる。R320Y321残基の存在も重要であると思われる。
3)ドデカマー化インターフェース:これは相互作用があまりよく定義されていない区域である。これには極性、疎水性相互作用、水素結合及び塩架橋が関与している。長い側鎖がその上に負荷された残基の存在を伴う適切なコンフォメーションの中のモノマーの間のインターフェースにおけるα5ヘリックスの存在が決定的であると思われる。しかし、ゲノムにおいて特定できる標準的配列を決定することは困難なようである。
4)触媒ドメインの折り畳み:TETの触媒ドメインの折り畳みにはいくつかの極めて保存されたグリシンの存在が重要なようである。
5)活性部位:部位の保存はTET及びM42ファミリーのペプチダーゼの特徴の一部であり、これはPhTET3の以下の残基:H65XD67、D181、E213E214、E/D236、及びH319によって定義され、2つの金属イオンの配位を含む。これらのイオンは一般にCo2+又はZn2+イオンであるが、異なったイオンを含むある種の構造が特徴付けられている。たとえばQ11Z05_CYTH3の構造がFe2+イオンを含む活性サイトとともに特徴付けられている。
【００２５】
本発明者らによれば、ペプチダーゼをテトラヘドラルTETペプチダーゼと特定するためには、これら5つの基準を満たさなければならない。
【００２６】
有利には、前記第1のアミノペプチダーゼは組成物の全質量に対して10質量%まで、特に組成物の全質量に対して5質量%までに相当する。
【００２７】
したがって、第1のアミノペプチダーゼを少量添加することによって組成物のアミノペプチダーゼの作用を極めて正確に調節することが可能である。その結果、少量のTETアミノペプチダーゼを組成物に添加することによって、基質のポリペプチド成分を本発明の組成物と接触させて得られる生成物の性質に対して顕著な影響を与えることが可能になる。
【００２８】
有利には、前記第1のアミノペプチダーゼは組成物の全質量に対して50質量%に相当し、ただし前記第1及び第2のアミノペプチダーゼがPhTET2及びPhTET3とは異なる。
【００２９】
換言すれば、本発明による組成物の代替において、組成物が第1のアミノペプチダーゼ及び第2のアミノペプチダーゼのみからなる場合には、これら2つのTETアミノペプチダーゼは等モルの割合であってよく、ただし前記第1及び第2のアミノペプチダーゼがPhTET2及びPhTET3とは異なる。
【００３０】
有利には、本発明の組成物は少なくとも第3のアミノペプチダーゼを含み、前記第3のアミノペプチダーゼはテトラヘドラルアミノペプチダーゼ、即ちTETアミノペプチダーゼのファミリーのアミノペプチダーゼである。組成物が3種のTETアミノペプチダーゼを含む場合には、PhTET1-PhTET2-PhTET3、PhTET1-PhTET2-PhTET4、PhTET1-PhTET2-MjTET、PhTET1-PhTET3-PhTET4、PhTET1-PhTET3-MjTET、PhTET1-PhTET4-MjTET、PhTET2-PhTET3-PhTET4、PhTET2-PhTET3-MjTET、PhTET2-PhTET4-MjTET、PhTET3-PhTET4-MjTETからなるトリプレットのリストからトリプレットを選択してよい。更に、組成物が4種のTETアミノペプチダーゼを含む場合には、PhTET1-PhTET2-PhTET3-PhTET4、PhTET1-PhTET2-PhTET3-MjTET、PhTET2-PhTET3-PhTET4-MjTET、PhTET1-PhTET3-PhTET4-MjTETからなるクオードラプレットのリストからクオードラプレットを選択してよい。更に、組成物が5種のアミノペプチダーゼを含む場合には、クインタプレットはPhTET1-PhTET2-PhTET3-PhTET4-MjTETであってよい。
【００３１】
したがって、第1のTETアミノペプチダーゼ及び第2のTETアミノペプチダーゼとは異なる第3のTETアミノペプチダーゼの作用を添加し、それにより組成物の作用の分野を改善し、標的とした食品ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質をより良く改変することを可能にすることができる。その結果、第1のTETアミノペプチダーゼは組成物の全質量に対して40質量%までに相当する一方、組成物の残り全質量に対して少なくとも60質量%を第2のTETアミノペプチダーゼ及び第3のTETアミノペプチダーゼに配分してよい。
【００３２】
しかし、第1及び第2のアミノペプチダーゼがPhTET2及びPhTET3と異なる場合には、組成物は、第1のTETアミノペプチダーゼが組成物の全質量に対して50質量%までに相当する一方、組成物の残り全質量に対して少なくとも50質量%を第2のTETアミノペプチダーゼ及び第3のTETアミノペプチダーゼに分割してよい。
【００３３】
したがって例として、組成物が第1のTETアミノペプチダーゼ、第2のTETアミノペプチダーゼ、及び第3のTETアミノペプチダーゼからなり、第1、第2、及び第3のアミノペプチダーゼの組成物の全質量に対する質量割合が以下の50/25/25、40/30/30、40/40/20、10/10/80、又は10/20/70でさえある実施形態が存在する。
【００３４】
有利には、前記第1、第2、及び第3のアミノペプチダーゼは等モル又は実質的に等モルの割合である。
【００３５】
「等モル又は実質的に等モルの割合」は、第1、第2、及び第3のアミノペプチダーゼの量が同一又は実質的に同一であることを意味する。即ちこれらは互いに極めて近い。そのような正確さは組成物のアミノペプチダーゼ活性を正確に定義すること、したがって分解すべきペプチドによりよく適合させることを可能にする。
【００３６】
有利には、組成物はエンドペプチダーゼ、特にサーモリシン、特に配列番号6のサーモリシンをも含む。サーモリシンはメタロプロテイナーゼのファミリーに属するエンドペプチダーゼである。サーモリシンは種々のバチルス種によって産生されるメタロプロテイナーゼのファミリーの最も安定性の高い一員である。加熱及び変性の間にコンフォメーション変化を受ける多くのタンパク質と異なり、サーモリシンは少なくとも70℃までは主なコンフォメーション変化を受けない。したがって、サーモリシンはTETタンパク質の活性が最も高い温度で安定性及び活性を保っている。
【００３７】
「エンドペプチダーゼ」は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の非末端アミノ酸の間の結合を切断することができる酵素を意味する。
【００３８】
したがって、非末端アミノ酸を開裂させる可能性によって、組成物はより広いアミノペプチダーゼ活性を示す。
【００３９】
本発明はまた、ペプチド、ポリペプチド、及び/又はタンパク質を含む基質のポリペプチド成分の全て又は一部の改変のための本発明による組成物の使用に関する。
【００４０】
「基質のポリペプチド成分の全て又は一部の改変」は、基質のポリペプチド成分の部分の少なくとも1つの改変を意味する。換言すれば、基質のポリペプチド成分は本発明による組成物と接触させて得られる生成物のポリペプチド成分とは異なる。たとえば、ポリペプチドの成分が3つのタンパク質を構成する場合、全ての成分の改変は3つのタンパク質の完全な分解に対応する。逆に、この成分の一部の改変は3つのうちの1つのタンパク質の完全な分解、又は3つのうちの1つのタンパク質、2つのタンパク質の部分的改変、又は基質の3つのタンパク質の改変にさえも対応することがある。当業者であればタンパク質成分が完全に又は部分的に改変されるかを決定することができる。
【００４１】
本発明においては、表現「基質のポリペプチド成分の全て又は一部の改変」と「基質のポリペプチド成分の全て又は一部の分解」との間に区別はない。これらの表現は本発明の主題に関して問題なく相互に置き換えることができる。実際上、ポリペプチドの成分の改変はこの成分の構成成分(ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質)の少なくとも1つの分解の結果である。
【００４２】
したがって、ペプチド、ポリペプチド、及び/又はタンパク質を含む基質のポリペプチド成分の全て又は一部を改変するために、本発明による組成物を用いることができる。これらのペプチド、ポリペプチド、及び/又はタンパク質は、組成物の全て又は一部を形成するTETアミノペプチダーゼの作用を受けて短いペプチドに改変され、それにより、基質のポリペプチド成分を組成物と接触させて得られる生成物の毒性部分の除去及びペプチド成分のより良い消化が可能になる。
【００４３】
有利には、基質は少なくともグルテン及び/又は乳清のペプチド、ポリペプチド、及び/又はタンパク質を含む。
【００４４】
したがって、本発明による組成物を用いることによってグルテン又は乳清のペプチド、ポリペプチド、及び/又はタンパク質を改変することが可能であり、これら2つのタンパク質アセンブリーは、最終消費者の食品不耐性及びアレルギーの原因であるペプチド、ポリペプチド、及び/又はタンパク質を含む。先に述べたように、グルテンは主として2つのタンパク質ファミリー、グリアジン及びグルテニンからなる。これらのタンパク質は水に不溶で、小麦粉の再水和後に得られ、食品工業において製品にある種の構造を与えるために用いられる粘弾性特性を有するパン生地を生じる。乳清は大部分のミルク水を含む。これは94%の水、4〜5%のラクトース、可溶性タンパク質(乾燥物9%)、及び鉱物塩からなる。乳清タンパク質は高い組成の必須アミノ酸を含んでいるので、真に栄養的価値がある。最も重要なものはβ-ラクトグロブリン(β-LG)、α-ラクトアルブミン(α-LA)、ウシ免疫グロブリン(IgG)、ウシ血清アルブミン(BSA)、及びウシラクトフェリン(LF)である。
【００４５】
有利には、基質は以下のタンパク質、グリアジン、β-ラクトグロブリン、α-ラクトアルブミン、免疫グロブリン、血清アルブミン、及びラクトフェリンのうちの少なくとも1つを含む。
【００４６】
上述のように、本発明による組成物の使用により、最終消費者の食品不耐性及びアレルギーの原因であるこれらのタンパク質の改変が可能になる。
【００４７】
有利には、組成物の全て又は一部を形成する前記アミノペプチダーゼは、同時に、別々に、又は所定時間にわたり用いてもよい。
【００４８】
これらのアミノペプチダーゼを同時に、別々に、又は所定時間にわたり用いる可能性によって、組成物が用いられる基質のポリペプチド成分に組成物の全体の活性を適合させることが可能になる。実際上、所定時間にわたり基質ポリペプチドの成分を改変する作用を適合させるために、組成物の様々なアミノペプチダーゼ活性、とりわけアミノペプチダーゼの機能、その割合、及び活性に関する互いの相互作用を手段とすることができる。組成物を形成するアミノペプチダーゼは同時に用いてよい。したがって、これらはたとえば改変すべき基質を含む媒体に同時に添加してよい。アミノペプチダーゼは別々に用いてもよい。たとえば、大きな鎖の場合には、アミノペプチダーゼの一部を鎖の一端に添加し、もう1つの部分を鎖のもう1つの端に添加してもよい。そのような解決策は添加したアミノペプチダーゼの鎖の中の均一な分布をより迅速に得ることを目的として発展させてよい。この解決策は、鎖の一端に導入されたアミノペプチダーゼが鎖のもう1つの端に添加された他のアミノペプチダーゼと接触させるために好適になるまで、媒体中である程度の適合時間を必要とする場合に発展させてよい。アミノペプチダーゼは所定時間にわたり用いてもよい。したがって、基質のポリペプチド成分を改変するためにアミノペプチダーゼをある時間、添加することが可能である。したがって、反応媒体中に既に存在する第1のアミノペプチダーゼの新規に添加するアミノペプチダーゼの活性に対する相互作用/干渉を考慮しながら、第1のアミノペプチダーゼによる改変の結果であるポリペプチド成分の全て又は一部を改変するために、1つ又は複数の他のアミノペプチダーゼを添加することが可能である。
【００４９】
本発明の有利な一態様では、TETタンパク質は支持体、特にカラム、シリカ、若しくはまた磁性ビーズ、又はタンパク質の固定に適した任意の他の支持体の上に固定してもよい。
【００５０】
特に、酵素は架橋した酵素結晶、即ちCLEC(Cross-Linked Enzyme Crystals)の形態で用いてもよい。
【００５１】
したがって本発明は1つ又は複数のアミノペプチダーゼ、好ましくは組成物のアミノペプチダーゼの全てが架橋した結晶の形態である組成物に関する。
【００５２】
したがって本発明は1つ又は複数のアミノペプチダーゼ、好ましくは組成物のアミノペプチダーゼの全てが特に架橋した結晶の形態で固定化された組成物に関する。
【００５３】
本発明はまた、ペプチド、ポリペプチド、及び/又はタンパク質を含む基質のポリペプチド成分の全て又は一部を改変する方法に関し、前記方法は、
・前記基質を、
・上記発明による組成物と
接触させる工程を含み、
前記少なくとも1つの第1のアミノペプチダーゼ及び前記少なくとも1つの第2のアミノペプチダーゼは80℃を超える温度で活性化されてもよく、前記方法は前記接触させる工程の前に任意選択で前記基質のポリペプチドを変性する工程を含む。
【００５４】
用語「接触させる工程」は、基質のポリペプチドの成分と組成物のTETアミノペプチダーゼとを、基質のポリペプチドの成分を改変させることを目的として互いに相互作用させる工程を意味する。
【００５５】
「80℃を超える温度で活性化されてもよい前記少なくとも1つの第1のアミノペプチダーゼ及び前記少なくとも1つの第2のアミノペプチダーゼ」は、アミノペプチダーゼが基質のペプチド、ポリペプチド、及び/又はタンパク質のアミノ酸を開裂させない段階からこれらのアミノ酸を開裂させる段階に移ってもよいことを意味する。
【００５６】
基質ポリペプチドは最初に変性工程、たとえばプロパノールによる変性を受けてもよい。これは組成物のアミノペプチダーゼによる改変を促進する効果を有する。これらのポリペプチドは天然に三次構造を有するポリペプチドである。その結果、プロパノール等の有機溶媒はポリペプチドの非共有結合、たとえば内部水素結合の破壊を惹起する。しかし、そのような結合はポリペプチドの三次構造を安定化させている。したがって、そのような破壊はポリペプチドの不安定化、折り畳みの展開、又は変性さえも惹起する。
【００５７】
本発明はまた、本発明の方法によって得ることができる食品混合物に関する。
【００５８】
本発明はまた、以下のタンパク質、即ちグリアジン、β-ラクトグロブリン、α-ラクトアルブミン、免疫グロブリン、血清アルブミン、及びラクトフェリンのうち少なくとも1つを改変された形態で含む食品混合物に関し、前記食品混合物は本発明による組成物を更に含む。
【００５９】
本発明は添付した図面に照らしてよりよく理解することができる。図面は例として提供され、決して限定するものではない。
【００６０】
以下の全ての図面は溶出時間(秒で表す)の関数としての吸光度(mAuで表す)を示すクロマトグラムを表す。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】PhTET3(図1A及び曲線A)及びPhTET2(図1B及び曲線C)と15分インキュベートした合成ペプチド2の加水分解の逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)による分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせである。対照試料、即ちペプチダーゼなしでインキュベートしたペプチドを曲線Bに表す。図1Cは3つのクロマトグラムの重ね合わせを表す。
【図２】PhTET4と15分インキュベートした合成ペプチド4(図2A)及びPhTET1と15分インキュベートした合成ペプチド1(図2B)の加水分解の逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)による分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせである。
【図３】PhTET3(図3A及び曲線A)、MjTET(図3B及び曲線B)、又は10% PhTET3/90% MjTETの混合物(図3C及び曲線C)と15分インキュベートした合成ペプチド5の加水分解の逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)による分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせである。対照試料、即ちペプチダーゼなしでインキュベートしたペプチドを曲線Dに表す。図3Dは4つのクロマトグラムの重ね合わせを表す。
【図４】PhTET3(図4A及び曲線A)、MjTET(図4B及び曲線B)、又は5% PhTET3/95% MjTETの混合物(図4C及び曲線C)と15分インキュベートした合成ペプチド5の加水分解の逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)による分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせである。対照試料、即ちペプチダーゼなしでインキュベートしたペプチドを曲線Dに表す。図4Dは4つのクロマトグラムの重ね合わせを表す。
【図５】PhTET3(図5A)、MjTET(図5B)、又は5% PhTET3/95% MjTETの混合物(図5C)と異なる温度、即ち40℃(曲線A)又は60℃(曲線B)で15分インキュベートした合成ペプチド5の加水分解の逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)による分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせである。対照試料、即ちペプチダーゼなしでインキュベートしたペプチドは図5A、図5B、及び図5Cでは見られない。
【図６】PhTET4(図6A)、MjTET(図6B)、又は50% PhTET4/50% MjTETの混合物(図6C)と5分、15分、又は30分インキュベートした合成ペプチド7の加水分解の動力学の逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)による分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせである。曲線A:5分、曲線B:15分、曲線C:30分。対照試料、即ちペプチダーゼなしでインキュベートしたペプチドを曲線Dに表す。
【図７】MjTET(曲線A)、又は50% PhTET4/50% MjTETの混合物(曲線B)と30分インキュベートした合成ペプチド7の加水分解の動力学の逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)による分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。対照試料、即ちペプチダーゼなしでインキュベートしたペプチドを曲線Cに表す。
【図８】乳清タンパク質の加水分解物の逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)による分析の結果としてのクロマトグラムを示す図である。
【図９】乳清タンパク質のpH=6.2(実線)及びpH=9.5(点線)における加水分解物の逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)による分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。加水分解物の間の相違はほとんどない。
【図１０】乳清タンパク質のpH=6.2のみ(曲線D)及び種々のTETとの種々のインキュベーションの後の加水分解物の分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である(クロマトグラムの一部のみを示している)。図10AはPhTET2のみとのインキュベーションを示す(曲線A)。図10BはPhTET3のみとのインキュベーションを示す(曲線B)。図10Cは等モル量のPhTET2及びPhTET3とのインキュベーションを表す(曲線C)。
【図１１】乳清タンパク質の等モル量のPhTET2及びPhTET3とのインキュベーションの後の加水分解物の分析の結果としてのクロマトグラム(曲線A)の重ね合わせを種々の組成のTETアミノペプチダーゼと比較して示す図である(クロマトグラムの一部のみを示している)。図11AはPhTET2のみ(曲線B)及び90%のPhTET2と10%のPhTET3との混合物(曲線B1)とのインキュベーションを表す。図11BはPhTET3のみ(曲線C)及び10%のPhTET2と90%のPhTET3との組成物(曲線C1)とのインキュベーションを表す。図11Cは90%のPhTET2と10%のPhTET3との組成物(曲線B1)、及び10%のPhTET2と90%のPhTET3との組成物(曲線C1)とのインキュベーションを表す。
【図１２】図11A、図11B、及び図11Cのクロマトグラム並びに乳清タンパク質のpH=6.2のみにおける加水分解物の分析の結果としてのクロマトグラム(曲線D)の重ね合わせを示す図である。クロマトグラムの一部のみを示している。
【図１３】乳清タンパク質のpH=9.5のみ(曲線D)及び種々のTETアミノペプチダーゼとのインキュベーションの後の加水分解物の分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である(クロマトグラムの一部のみを示している)。
【図１３Ａ】PhTET4のみとのインキュベーションを示す図である(曲線A)。
【図１３Ｂ】MjTETのみとのインキュベーションを示す図である(曲線B)。
【図１３Ｃ】等モル量のPhTET4とMjTETとの組成物とのインキュベーションを表す図である(曲線C)。
【図１４】逆相HPLC(カラムZORBAX SB-300 C18)で得られたクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。曲線A:サーモリシンの存在下にインキュベートした乳清の試料、曲線B:サーモリシン及びTETアミノペプチダーゼの存在下にインキュベートした乳清の試料、曲線C:単独でインキュベートした乳清の試料。ここで用いたカラムは小ペプチドの分析を可能にするものであり、したがって「全体の」タンパク質は見ることができない。
【図１５】PhTET3(図15A)、MjTET(図15B)、PhTET4(図15C)、又はPhTET3 33%/PhTET4 33%/MjTET 33%の組成物(図15D)とインキュベートしたカゼイン加水分解物に組み込まれた合成ペプチド7の加水分解の逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)による分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。曲線A:対照(酵素なしにカゼイン加水分解物に組み込まれたペプチド7)、曲線B:PhTET3、曲線C:MjTET、曲線D:PhTET4、曲線E: PhTET3 33%/PhTET4 33%/MjTET 33%の混合物。
【図１６】グルテン試料の分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを表す図である。インキュベートしていない対照(曲線A)、酵素なしにインキュベート(曲線B)、等モル量の酵素PhTET1、PhTET2、及びPhTET3とインキュベート(線VS)。2時間のインキュベーションの後、いくつかの吸光ピークの減少があり、いくつかのグルテンタンパク質の顕著な分解を反映している。
【図１７】グルテン試料の加水分解の逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)による分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。曲線A:サーモリシンの存在下にインキュベートした全グルテンの試料、曲線B:サーモリシン及びTETアミノペプチダーゼPhTET1、PhTET2、及びPhTET3の存在下にインキュベートした全グルテンの試料。
【図１８】それぞれのミックスについて用いた新規な乳清タンパク質の加水分解物の対照試料のRP-HPLC分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。
【図１９】種々のTETの混合物(ミックス1〜5)による新規な乳清タンパク質の加水分解物の加水分解後の試料のRP-HPLC分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。
【図２０】TETの混合物#1(ミックス1)(70% PhTET2、15% PhTET3、15% PhTET4)による乳清タンパク質の加水分解物のペプチドの加水分解のRP-HPLC分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。
【図２１】TETの混合物#2(ミックス2)(70% PhTET2、15% PhTET4、15% MjTET)による乳清タンパク質の加水分解物のペプチドの加水分解のRP-HPLC分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。
【図２２】TETの混合物#3(ミックス3)(90% MjTET、10% PhTET4)による乳清タンパク質の加水分解物のペプチドの加水分解のRP-HPLC分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。
【図２３】TETの混合物#4(ミックス4)(70% MjTET、15% PhTET1、15% PhTET3)による乳清タンパク質の加水分解物のペプチドの加水分解のRP-HPLC分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。
【図２４】TETの混合物#5(ミックス5)(70% MjTET、15% PhTET3、15% PhTET4)による乳清タンパク質の加水分解物のペプチドの加水分解のRP-HPLC分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。
【図２５】TET(100% PhTET4)の混合物#6(TET4-1又はミックス6)による乳清タンパク質の加水分解物のペプチドの加水分解のRP-HPLC分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。
【図２６】TETの混合物#1及び#2による乳清タンパク質の加水分解物のペプチドの加水分解のRP-HPLC分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。
【図２７】PhTET2(「TET2」)と比較したTETの混合物#1による乳清タンパク質の加水分解物のペプチドの加水分解のRP-HPLC分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。
【図２８】PhTET2(「TET2」)と比較したTETの混合物#2による乳清タンパク質の加水分解物のペプチドの加水分解のRP-HPLC分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６２】
(実施例1)
材料及び方法
合成ペプチドに対するTETアミノペプチダーゼの活性の試験
合成ペプチドに対するTETアミノペプチダーゼの活性を試験するため、全濃度50μg/mlのTETアミノペプチダーゼの種々の混合物を、最終濃度0.5mMの種々のペプチドと最終体積100μLでインキュベートする。実験には反応の最後に内部標準として50μMのトリプトファンの試料を添加する(示したクロマトグラムでは見えない)。この内部標準は媒体中の生成物の量の計算の精度を高めるために用いる。換言すれば、カラムに注入する標準の量は正確に既知であり、したがって得られる応答シグナルを正規化することができる。標準は実験中に反応せず、そのシグナルへの応答が測定する生成物に極めて近似している化合物である。この場合、選択する内部標準はトリプトファンである。内部標準はRP-HPLCによる分析の前にその試料に示された濃度になるように添加する。活性試験は、150mMのKCl、50mMのCHES緩衝液中、pH=9.5で行うPhTET4が存在する場合を除き、150mMのKCl、50mMのPIPES緩衝液中、pH=7.5で行う。次いで反応媒体を振盪(500rpm)しながら所望の温度(40℃又は60℃)で様々な時間、インキュベートする。次いでチューブを氷の中に入れて加水分解反応を停止する。次いで、2%のアセトニトリル(ACN)及び0.1%のトリフルオロ酢酸(TFA)を含む320μlの溶液の中に80μlの反応媒体を添加する。次いで試料を10,000gで10分遠心分離してバイアルに移し、分析のためにRP-HPLCカラムに注入する。RP-HPLC分析に加えて、観察される加水分解生成物の大きさを正確に特定するため、これらの活性試験の反応媒体をマススペクトルでも分析した。それにより、クロマトグラムで観察される様々なピークを特定し、加水分解プロセスを最適に追跡することが可能になった。
【００６３】
ウシ乳清からのタンパク質加水分解物の調製
乳清はミルクの凝集後に得られる液体分画を表し、特にチーズ工業において得られる副産物である。これは約10%のタンパク質を含み、タンパク質は5つの主なファミリー、即ちβ-ラクトグロブリン(50%)、α-ラクトアルブミン(20%)、免疫グロブリン(10%)、ウシ血清アルブミン(10%)、及びラクトフェリン(2.8%)に分けられる。本例では、これら種々のタンパク質は加水分解され、得られるペプチドはモデル基質として用いられる。ウシの乳清溶液を振盪(500rpm)しながらサーモリシン(Sigma社(登録商標))の存在下に最終濃度100μg/mlで2時間、60℃でインキュベートする。加水分解の後、サーモリシンを不活化するため、溶液を95℃で15分インキュベートする。次いで乳清タンパク質加水分解物をアリコートとして使用まで-20℃で保存する。
【００６４】
乳清タンパク質加水分解物に対するTETアミノペプチダーゼの活性の試験
乳清タンパク質加水分解物中に存在するペプチドに対するTETアミノペプチダーゼの加水分解活性を試験するため、全濃度50μg/mlのTETタンパク質の種々の混合物を最終体積100μlで加水分解物とインキュベートする。反応にはコファクターを添加しない。乳清タンパク質加水分解物に対してその天然のpHである6.2でPhTET2及びPhTET3の活性試験を行った。PhTET4及びMjTETについて行った試験シリーズはpH=9.5で行った。次いで反応媒体を振盪(500rpm)しながら60℃で2時間インキュベートする。次いでチューブを氷の中に入れて加水分解反応を停止する。次いで、2%のアセトニトリル(ACN)及び0.1%のトリフルオロ酢酸(TFA)で構成される320μlの溶液の中に80μlの反応媒体を添加する。次いで試料を10,000gで10分遠心分離してバイアルに移し、分析のためにRP-HPLCカラムに注入する。
【００６５】
逆相HPLC分析(RP-HPLC)
100μlの各試料を、ペプチドの研究ではμRPC C2/C18カラム(4.6mm×100mm)(GE healthcare社(登録商標))、乳清の研究ではPerkin Elmer社(登録商標)HPLCシステムに連結したZORBAX SB-300 C8カラム(4.6mm×150mm)(Agilent(登録商標))に注入する。相Aは水中0.1%のTFA及び2%のACNからなり、相Bは水中0.1%のTFA及び80%のACNを含む。次いで吸着されたタンパク質を相Bの直線勾配0〜50%、1ml/分で溶出させ、ペプチドの研究では280nm、他の研究では214nmの吸光度を測定することによって検出する。タンパク質のピークはTotalChromソフトウェアバージョン6.3.1(Perkin Elmer社(登録商標))を用いて特定及び解析する。
【００６６】
グルテンタンパク質に対するTETアミノペプチダーゼの活性の試験
グルテンタンパク質(Sigma社(登録商標))の可溶化を可能にする溶液(150mMのNaCl、20mMのTris-HCl、50%のプロパノール、pH=7.5)中で金属撹拌器を用いてグルテンタンパク質の5%懸濁液を調製する。基質を含むこの溶液95μLを0.5mlのエッペンドルフチューブに移す。チューブをサーモスタットを装着したオービタルシェーカーに入れて振盪(500rpm)しながら60℃で10分インキュベートする。最終濃度250μg/mlで等モル量の3種の酵素、PhTET1、PhTET2、及びPhTET3の混合物を含む溶液を調製し、同じ条件でインキュベートする。5μlの酵素混合物を反応媒体に添加することによって反応を開始する。2時間のインキュベーションの後に試料を4℃に置くことによって反応を停止する。
【００６７】
逆相HPLC(RP-HPLC)分析
手順は上に示したものと同一である。しかし試料はJupiter C18カラム(4.6mm×200mm)(Phenomenex社)に堆積させ、吸着されたタンパク質は相Bの直線勾配0〜40%で溶出させる。
【００６８】
結果
これらの実験で用いたTET酵素はM42ファミリーの金属アミノペプチダーゼ(MEROPS)である。これらは全て同じ酵素のファミリーに属し、これらの中では極めて強い構造的同一性を有している。一方、これらは実際上、異なった特異性を有する異なった酵素である。
【００６９】
用いる種々のTETの三次元構造は、これらが全て異なった基質に対して特異性を有しているにも関わらず、極めて似通っている。即ち、PhTET1はグルタミルアミノペプチダーゼであり、PhTET2は非荷電疎水性残基及び極性残基のいくつかに対して顕著な残存活性を有するロイシルアミノペプチダーゼであり、PhTET3はリジルアミノペプチダーゼであり、PhTET4は厳密なグリシルアミノペプチダーゼであり、MjTETは疎水性残基及び陽性荷電残基に対して顕著な活性を有するロイシド(leucid)である。MjTETはまた、芳香族残基に対する加水分解活性を有する唯一のTETである。
【００７０】
上に提示した結果の全ては、モノアシルpNA(4-ニトロアニリン)又はモノアシルAMC(7-アミノ-4-メチルクマリン)型の基質を用いて得られた。これらは2つの残基のペプチドを表し、第1の残基はそれに対するペプチダーゼの活性を測定する残基であり、第2の残基は放出された際に可視領域のシグナルを発する発色団である。したがって、既知の残基のそれぞれに対するペプチダーゼの親和性を測定することができる。
【００７１】
したがって、特定の配列を有するいくつかのペプチドを設計し、合成した(以下のTable 1(表1))。一方、15残基の5つのペプチドは「富化された」と称する。即ち、これらのペプチドのN末端は特定の種類の残基が富化されている。
-  ペプチド1:陰性荷電残基が富化されている。
-  ペプチド2:疎水性残基が富化されている。
-  ペプチド3:陽性荷電残基が富化されている。
-  ペプチド4:グリシンが富化されている。
-  ペプチド5:芳香族残基が富化されている。
【００７２】
【表１】
2021505185.tif 000002
【００７３】
これらのペプチドのそれぞれは富化されたN末端を有している。富化されたゾーンの効果を相殺する4つの残基がそれに続く(特にペプチドの溶解性のため)。C末端は保存されており、その280nmにおける吸光度及び溶解性のために選択された同じ一連の7つの残基、YTSWNSE(配列番号7)を有している。
【００７４】
一方、5種のいわゆる「ランダム」ペプチドは、15個の同一残基を含んでいるが、異なった配列、即ちペプチド6、ペプチド7、ペプチド8、ペプチド9、ペプチド10に従って分布している。
【００７５】
上記のペプチドを基質として用いてTETアミノペプチダーゼで行った種々の実験の間に、本発明者らはいくつかの予期しない活性を観察した。
【００７６】
アミノペプチダーゼPhTET3は陽性荷電残基に対して最適の活性を示す。これはロイシン、メチオニン、グルタミン、及びアスパラギン酸に対する残留活性を有するリジルアミノペプチダーゼに分類される。しかし、合成ペプチドについて行った試験では、疎水性残基が富化されたペプチド、即ちペプチド2に対してPhTET3の顕著な活性が観察された(図1A)。
【００７７】
従来技術によればアミノペプチダーゼPhTET(即ちサーモモッカス起源のアミノペプチダーゼ)の中で疎水性残基に対して最も効果的であるアミノペプチダーゼPhTET2を用いて同じ試験を行った(図1B)。
【００７８】
疎水性残基が富化されたペプチドに対してPhTET3がPhTET2よりも大きな活性を示すことは注目に値する(図1C)。実際上、活性試験の15分の間に、ペプチドの第1の残基はPhTET3の存在下でPhTET2の存在下よりも速く加水分解された。
【００７９】
この種の「予期しない」活性は、それぞれグルタミン酸残基及びグリシン残基が富化されたペプチド1及びペプチド4の場合にも観察される。理論的にはその末端が富化された残基に対して最大の加水分解活性を示すペプチダーゼの存在下でこれらのペプチドをインキュベートしても、加水分解活性は観察されない(図2A及び図2B)。
【００８０】
PhTET3の活性をそのN末端に芳香族残基が富化されたペプチドについて測定すると、もう1つの予期しない結果が観察された(図3A)。文献で入手可能なデータを前提とすれば、PhTET3による芳香族残基の加水分解を観察することは極めて驚くべきことである。実際上、マススペクトルによって溶出するタンパク質の種々のピークの解析により、そのN末端においてチロシンが加水分解されたペプチドの顕著な集積が示される。
【００８１】
現在までに、TETアミノペプチダーゼの酵素の特異性の特徴解析はジペプチドに対するそれらの活性を解析することによって得られてきた。これらは文献で入手可能なデータである。合成ペプチド2及び5に対するPhTET3の活性の試験により、TETアミノペプチダーゼの活性は実際には基質ペプチドの性質によるかもしれないことが示されている。実際上、PhTET3はTyr-pNAジペプチドに含まれるチロシン残基を加水分解することはできないとしても、PhTET3はペプチド5に関してはこの残基に対して大きな加水分解効率を示す。今のところ、同じ型の予期しない活性は示されていない。しかし、大スケールでの試験、即ちより多くの種類の基質を用いた試験で他の活性が明らかにされる可能性は除外できない。
【００８２】
図1A、図1B、図1C、図2A、及び図2Bの結果から、これらの酵素のいくつかが記述されているという事実にも関わらず、それらの酵素組成物への統合は些細なことではない。実際上、特定の酵素組成物を設計する場合には、これらのアミノペプチダーゼの理論的特異性に加えて、改変すべき食品ペプチド及び改質すべき部位の周囲の残基の性質を、反応媒体の物理化学的パラメーターとともに考慮に入れなければならない。これらの結論、並びに本発明による組成物を用いることの利点を、以下の実験で強調する。
【００８３】
加水分解及び調節の加速
MjTET 90%/TET3 10%
ペプチドの加水分解の改善のためのTETアミノペプチダーゼ組成物の利点を実証するため、芳香族残基に富んだペプチド5に対する10% PhTET3及び90% MjTETの組成物の活性を試験した(図3A〜図3D)。それぞれのアミノペプチダーゼを基質ペプチドのみとインキュベートした。RP-HPLCで分析した反応媒体は、2つのアミノペプチダーゼがペプチドに対して活性であることを示している。反応媒体中で、未反応の基質(pep-0)の他に1つ(pep-1)、2つ(pep-2)、3つ(pep-3)、又は4つ(pep-4)の残基が加水分解された基質ペプチドに対応する4つの分解生成物が特定される。
【００８４】
PhTET3(図3A)の場合、ペプチドpep-1の蓄積がある一方、未反応の基質ペプチドは媒体中にもはや存在しない。
【００８５】
ペプチドMjTETの場合(図3B)、未反応ペプチドの一部が反応媒体中にまだ存在する一方、加水分解生成物の残留物がほとんど等量で存在する。最終加水分解生成物であるペプチドpep-4が僅かに蓄積している。
【００８６】
2つのアミノペプチダーゼの組成物の存在下におけるペプチドのインキュベーションの後、基質ペプチドは媒体中にもはや存在せず、ペプチドpep-4のより多い蓄積があり、ペプチド5の加水分解はTETアミノペプチダーゼを含む組成物の存在下の方がアミノペプチダーゼを単独で用いた場合よりも効果的であることが示される(図3C)。3つの試験結果のクロマトグラムを図3Dに重ね合わせて示す。それにより、10%のアミノペプチダーゼPhTET3(単独)を混合物に添加することによって、ペプチドに対して最適の活性を有するわけではないが、ペプチドの加水分解を有意に促進することが可能になったことが明らかに観察される。
【００８７】
MjTET 95%/PhTET3 5%
PhTET3/MjTETの混合物の比を改変することによって同じ実験を行った。今回は95%のMjTET及び5%のPhTET3の組成物の存在下にペプチドをインキュベートした。
【００８８】
PhTET3の場合にも、アミノペプチダーゼを基質ペプチドと15分インキュベートした後、ペプチドpep-1の強い蓄積がある(図4A)。未反応のペプチドpep-0はそれ自体、反応媒体中にまだかなりの量で存在する。95%で存在するMjTETによるペプチド5の加水分解プロファイル(図4B)は90%で得られたもの(図3B)に近い。
【００８９】
これらのデータは、95%のMjTET及び5%のPhTET3の組成物で得られたデータ(図4C)と比較して、アミノペプチダーゼPhTET3を反応混合物に添加することによってペプチドの加水分解が加速されることを再び示している。(図4D)。酵素を単独で用いる場合には、中間反応生成物、pep-1、pep-2、及びpep-3が蓄積することが観察される。この最後の実験では、これらの中間体の濃度の低下がある一方、最終生成物pep-4の濃度の増加がある。したがって5%のアミノペプチダーゼPhTET3を添加することによってペプチドの加水分解プロセスを促進することが可能になる。
【００９０】
この特定の場合に、理論的には加水分解させたい残基に特異的ではないアミノペプチダーゼの添加によってTETアミノペプチダーゼの組成物の一般的な効率を増大させることが可能になるということはいっそう注目に値する。
【００９１】
最後に、比を改変したTETアミノペプチダーゼ組成物のこれら2つの例は、加水分解の調節に関する本発明による組成物が提供する可能性、この場合にはペプチド基質を完全に破壊するよりはこれらを改変することができる可能性を示している。
【００９２】
上に提示した実験は60℃で行った。実験は40℃でも行い、得られたデータを前のデータと比較した(図5)。
【００９３】
PhTET3アミノペプチダーゼを単独で基質ペプチドと40℃でインキュベートすると、加水分解の顕著な低減が観察される。実際上、この場合にはペプチドpep-1のみが極めて少量で見られる(図5A)。
【００９４】
一方、MjTETの場合にも同じ効果が観察され、全ての中間ペプチドが最終生成物pep-4と同様に見られ、加水分解の顕著な低減のみがある(図5B)。
【００９５】
95%のMjTETと5%のPhTET3との組成物の場合(図5C)には、最終生成物pep-4の濃度は大きく低減する。一方、種々の中間体pep-1、pep-2、及びpep-3の方は60℃での加水分解とほとんど同等の量で存在することは注目に値する。したがって、第1の残基、即ちチロシンにおける加水分解は、TET組成物を用いた場合には40℃で60℃と同様に効果的であるが、アミノペプチダーゼを単独で用いた場合には後者は大きく低減される。一方、残りの加水分解プロセスの速度は低下するように思われ、そのため基質ペプチドがまだ大量に存在している一方、最終生成物はそれとは反対にごく僅かしか蓄積しないという観察結果がもたらされる。
【００９６】
この実施例は本発明による基質のポリペプチド成分を改変する方法に統合することが可能な調節を再び実証している。この部分では、量(TETアミノペプチダーゼの種々の比)及び温度の調節を示した。より細かく、より正確なペプチドの改変を得るためにpH及び時間の調節を統合することも可能である。これらの実施例は2つのTETアミノペプチダーゼを用いて行った。しかし他のTETアミノペプチダーゼを添加することにより、目的のペプチドをより広く、又はより正確にターゲットとすることが可能になる。
【００９７】
ランダムペプチドに対するMjTET/PhTET4組成物
アミノペプチダーゼMjTET及びPhTET4の組成物によるランダムペプチド7の加水分解の動力学を測定した(図6)。5分後、10分後、及び30分後にRP-HPLCによってペプチドの加水分解を分析した。ペプチド7はN末端にグリシンを提示するという特徴がある。
【００９８】
アミノペプチダーゼPhTET4の特徴解析により、これはグリシンアミノペプチダーゼであることが示されている。これは、その活性をペプチド7について試験したときに第1のグリシン残基の加水分解のみが観察された理由である(図6A)。したがってペプチドpep-1の蓄積を見ることができる。
【００９９】
アミノペプチダーゼMjTETによるペプチドの加水分解の場合には、ペプチドpep-1に加えてペプチドpep-2及びpep-3、並びにpep-4に対応するものが観察される(図6B)。一方、15分と30分の間で、基質ペプチドpep-0の濃度は低下したようには見えないことが注目される。同時に、pep-2の濃度が低下した一方、pep-3の濃度が増加したことが注目される。ここで観察された現象は、加水分解生成物に対するアミノペプチダーゼの親和性が出発基質に対する親和性よりも大きいという事実による。
【０１００】
2つのアミノペプチダーゼ、PhTET4及びMjTETを等モルの割合で含む組成物を基質ペプチドと接触させてインキュベートすると、ペプチドの加水分解が顕著に改善されることが観察される(図6C)。未反応のペプチドpep-0の濃度は5分〜30分の間に徐々に低下する。一方、ペプチドpep-1の濃度は最初の5分〜15分の間に上昇し、15分〜30分の間に急速に低下する。
【０１０１】
MjTETのみ又はMjTETとPhTET4の組成物と30分インキュベートした後に得られるクロマトグラムを図7に重ねている。このようにして、最終のペプチドは比較的同様の量で存在する一方、基質ペプチドはほぼ完全に加水分解されたことが観察される。実験の間、2つのペプチダーゼのいずれも単独ではペプチドの第1の残基を完全には加水分解できなかったことが注目される。第3のペプチド、PhTET3を用いる試験を行った。
【０１０２】
この実施例では、基質ペプチドの第1の残基の加水分解は、ここでも最適活性を示さないペプチダーゼの組成物への添加によって加速される。TETアミノペプチダーゼの種類、それらの比、温度、又はpHさえも特定の方法で調節することによって、改変方法は観察された加水分解中間体の1つを含むペプチドの混合物を富化することができることに注目されたい(この例では図6Bでpep-2ペプチドが15分で富化される)。
【０１０３】
複合混合物中のペプチドの加水分解の調節
乳清タンパク質加水分解物
乳清はミルクの凝集後に得られる液体分画を表す。これは約10%のタンパク質を含み、タンパク質は5つの主なファミリー、即ちβ-ラクトグロブリン(50%)、α-ラクトアルブミン(20%)、免疫グロブリン(10%)、ウシ血清アルブミン(10%)、及びラクトフェリン(2.8%)に分けられる。
【０１０４】
以下の試験に用いた基質は乳清タンパク質加水分解物であり、その調製は上で説明している。加水分解物の相対的ペプチド組成を解析するため、これをHPLCシステムを用いる逆相クロマトグラフィーによって分析する。対照加水分解物の分析結果であるクロマトグラムを図9に示す。
【０１０５】
最適活性条件下におけるこれらのペプチドに対するTET酵素の活性を解析することを可能にするため、異なるpHレベルで2つの加水分解物を調製した。2つのクロマトグラムを図9に重ねて示す。
【０１０６】
このようにして、クロマトグラムの一般的外観は変化していないことが観察される。したがって、pHの変化の間にペプチド組成の大きな変化はなかった。しかし、溶出プロファイルには微細な変化がある。結果の解析においては、これらのアドホック変化を考慮した。
【０１０７】
PhTET2/PhTET3組成物(50/50%、90/10%、及び10/90%)
ここでは、本発明の組成物等の特徴的な組成物においてTETアミノペプチダーゼを用いた場合の、複合混合物中の特定のペプチドの加水分解を調節できる可能性を実証する。
【０１０８】
最初に、アミノペプチダーゼを単独で用いた場合のPhTET2及びPhTET3の活性を測定する(図10)。TETアミノペプチダーゼによって全てのペプチドが処理されるわけではないことが観察される。これは、用いた2つのTETアミノペプチダーゼが異なった及びマークした基質に対して特異性を有していることによる。この実験に用いたペプチドの混合物は複合混合物であり、アミノペプチダーゼによって支持される異なったペプチドの加水分解の程度における相違も観察される。明瞭にするためにクロマトグラムの一部のみを示しているが、提示した結果はクロマトグラム全体で観察され得る。
【０１０９】
加水分解物を等モル量の2つのアミノペプチダーゼの組成物とインキュベートすると、溶液中の大部分のペプチドについて加水分解活性の改善が観察される。予期しないことに、組成物中の異なったTETの比を改変することによって、加水分解の程度が変化する(図11)。
【０１１０】
図12に、PhTET2とPhTET3の組成物の比を3段階に変化させて得られたクロマトグラムを示す。最初に、TETのそれぞれが50%であることに対応する「等モル」混合物が図10に見られる。点線で示すクロマトグラムはそれぞれのTETアミノペプチダーゼの異なった比に対応し、一方が90%で他方が10%、及びその逆である。このようにして加水分解プロファイルが改変され、混合物中のそれぞれのTETアミノペプチダーゼの割合の変化によって溶液中のペプチドの加水分解の程度が改変されることを意味していることが注目される。全ての異なったクロマトグラムの重ね合わせを図12に提示する。これにより、ペプチドの加水分解における可能な調節を明瞭に可視化することができる。
【０１１１】
これは予測することが不可能であった限りにおいて驚くべき結果である。更に、加水分解の調節はペプチドによって変動することが注目される。したがって、組成物中のそれぞれのTETアミノペプチダーゼの割合を細かく改変することによって、種々のペプチドの加水分解を調節することが可能である。先行技術における情報では、混合物中の種々のTETの濃度を変動させることによって標的化された様式でペプチドの加水分解を調節することが可能であると示唆することはできなかった。
【０１１２】
MjTET/PhTET4組成物(50/50%)
以下に提示する第2シリーズの試験は、アミノペプチダーゼMjTET及びPhTET4に関する。得られたクロマトグラムの分画の重ね合わせを図13に示す。この場合には、グリシン残基に特異的なアミノペプチダーゼPhTET4は単独で用いた場合にはペプチドを加水分解することができないことが観察される。したがって、対照クロマトグラムとPhTET4とのインキュベーションの後で得られたクロマトグラムとは極めて明瞭に重ね合わされる。反対に、MjTETはペプチド混合物中に存在するいくつかのペプチドを加水分解することができる。
【０１１３】
この試験シリーズの注目すべき結果は、組成物中でMjTETとPhTET4を混合した場合には、基質のペプチドの加水分解に顕著な増大があるという事実に関連している。
【０１１４】
再び、この予測できない結果は、特徴的なTETアミノペプチダーゼ組成物を用いた混合物中で種々のペプチドの加水分解を特異的に調節することがどの程度可能であるかを示している。現在までに得られた種々の結果は、反応媒体の物理化学的条件の関数としてTETアミノペプチダーゼの活性を調節することも可能であることを示している。したがって本発明者らは、これらの酵素の例外的な特性に基づいたプロセスを提示する。
【０１１５】
組成物PhTET1/PhTET2/PhTET3/サーモリシン
これらの実験で用いた乳清は、Haute-Savoieのチーズ工場から得たものである。乳清は4℃で輸送し、1mlの試料に分割して-20℃で保存した。
【０１１６】
サーモリシンとのインキュベーション(図14)の後、サーモリシンによる乳清タンパク質の加水分解の結果として多数の小さなペプチドが試料中に存在する。
【０１１７】
サーモリシン及びTETとのインキュベーションの後、これらのペプチドの大多数が分解していたことは注目に値する。TETアミノペプチダーゼの活性に関連する分解生成物を表すいくつかのペプチドの富化が注目される。
【０１１８】
カゼイン加水分解物中の特定のペプチドの加水分解
組成物PhTET3、MjTET、及びPhTET4(33/33/33%)
この実験では、複合ペプチドであるカゼイン加水分解物(Sigma社)の混合物中に合成ペプチド7を組み込んだ。アミノペプチダーゼPhTET3、MjTET、及びPhTET4の組成物とのインキュベーションの後、反応媒体をRP-HPLCで分析した。行った種々の実験の結果を図15に示す。ペプチドはあいまいさなしに特定することができ、その分解の第1段階を観察することができた。環境の複雑さのために短い断片の解析はより複雑になった。
【０１１９】
カゼイン加水分解物及びペプチド7の混合物をアミノペプチダーゼPhTET3又はMjTETとインキュベートすると、目的のペプチドはあまり加水分解されないことが観察される(図15A及び図15B)。しかし期待されるように、混合物中のカゼイン加水分解物からの少数のペプチドは少なくとも部分的にTETアミノペプチダーゼによって加水分解される。
【０１２０】
混合物をPhTET4の存在下にインキュベートすると、目的のペプチドのみがアミノペプチダーゼPhTET4によってほとんど完全に加水分解され(図15C)、現れる唯一のペプチドはペプチドpep-1である。
【０１２１】
ペプチドの混合物を3つのTETアミノペプチダーゼの組成物の存在下にインキュベートした場合にも、目的の未反応ペプチドpep-0は全く存在しない(図15D)。一方、組成物の場合にはPhTET4単独での実験と比較して、ペプチドpep-1の濃度が顕著に低下したので、ペプチドpep-1はそれ自体、加水分解されていることが注目される。
【０１２２】
この実験は、混合物中のペプチドを改変し又は除去するためにペプチドを正確に標的化することが本方法によって可能になることを示している。
【０１２３】
天然のグルテンタンパク質の一部の特異的加水分解
組成物PhTET1/PhTET2/PhTET3(33/33/33%)
グルテンは2つの主なファミリー、グルテニン及びグリアジンに分類される種々のタンパク質の混合物である。いくつかのグリアジンはグルテンに感受性が高い又は不耐性の人にアレルギー反応を惹起する「免疫優勢」と呼ばれるペプチドを含んでいる。この症状はセリアック病としてよく知られている。
【０１２４】
図16に示すクロマトグラムで、プロパノール中に可溶化した全グルテンの試料をアミノペプチダーゼPhTET1、PhTET2、及びPhTET3の等モル量の組成物とインキュベートした後で、試料中のグリアジンとしての濃度の顕著な減少が注目されることが観察される。
【０１２５】
この場合には、アミノペプチダーゼPhTET1、PhTET2、及びPhTET3の組成物単独で、即ちエンドペプチダーゼの添加なしで、プロパノールの50%溶液に溶解した全グルテンの試料中に免疫優勢ペプチドを含むタンパク質の濃度を低減させることが可能になった。
【０１２６】
組成物PhTET1/PhTET2/PhTET3/サーモリシン
グルテンをサーモリシンエンドプロテアーゼとインキュベートした後、図17で、エンドプロテアーゼによるグルテンタンパク質の極めて効率的な加水分解の結果としての試料中の多数の小さいペプチドが注目される。アミノペプチダーゼPhTET1、PhTET2、及びPhTET3を組成物中に統合すると、極めて多数の吸収ピークの減少があり、これはアミノペプチダーゼによってこれらのピークの全てが加水分解されたと解釈できる。
【０１２７】
アミノペプチダーゼの分解生成物を表すいくつかのピークの富化も注目される。
【０１２８】
(実施例2)
ペプチドプロファイルの改変の結果
材料及び方法
乳清タンパク質加水分解物に対するTETアミノペプチダーゼの活性の試験
乳清タンパク質加水分解物中に存在するペプチドに対するTETアミノペプチダーゼの種々の組み合わせの加水分解活性を試験するため、全濃度50μg/mlのTETタンパク質の種々の混合物を最終体積100μlで加水分解物とインキュベートする。反応にはコファクターを添加しない。pH=9.5で行うPhTET4が存在する場合を除いて、活性試験はpH=7.5で行う。次いで反応媒体を振盪(500rpm)しながら60℃で2時間インキュベートする。次いでチューブを氷の中に入れて加水分解反応を停止する。次いで、2%のアセトニトリル(ACN)及び0.1%のトリフルオロ酢酸(TFA)で構成される320μlの溶液に80μlの反応媒体を添加する。次いで試料を10,000gで10分遠心分離してバイアルに移し、分析のためにRP-HPLCカラムに注入する。
【０１２９】
逆相HPLC(RP-HPLC)分析
100μlの各試料を、Perkin Elmer社(登録商標)HPLCシステムに連結したZORBAX SB-300 C8カラム(4.6mm×150mm)(Agilent(登録商標))に注入する。相Aは水中0.1%のTFA及び2%のACNからなり、相Bは水中0.1%のTFA及び80%のACNを含む。次いで吸着されたタンパク質を相Bの直線勾配0〜50%、1ml/分で溶出させ、ペプチドの研究では280nm、他の研究では214nmの吸光度を測定することによって検出する。タンパク質のピークはTotalChromソフトウェアバージョン6.3.1(Perkin Elmer社(登録商標))を用いて特定及び解析する。
【０１３０】
クロマトグラム(図18〜図28)の「ウィンドウ」は意図的に限定してあり、それ自体の溶出勾配、即ち480秒〜4080秒のウィンドウのみを示している。実験の最初の数分は注入後のカラムの洗浄(0〜480秒)に対応し、洗浄の終了は勾配の後である(4080〜6000秒)。
【０１３１】
図18〜図28はRP-HPLC分析の結果のクロマトグラムの重ね合わせを示す。
【０１３２】
上で定義した混合物(「ミックス」又は「組み合わせ」)を用いて行った種々の試験を以下に記載する。
【０１３３】
用いた基質の対照
新たな乳清タンパク質加水分解物の分析における均一性及び再現性を確保するため、種々の「対照」試料を重ねて比較する(図18)。
【０１３４】
残念ながら、ミックス3の対照試料は技術的問題のためになくなっている。
【０１３５】
したがって、用いた新たな加水分解物は理論的にはペプチドの末端に多くの多様性を含むが、その分析結果の再現性が極めて良好であるので、完全に均一で安定であると思われる。
【０１３６】
種々のミックスによるペプチドの加水分解
この乳清タンパク質加水分解物を種々のTETの混合物とともにインキュベートする。種々のTETの混合物による新たな乳清タンパク質加水分解物の加水分解後の試料のRP-HPLC分析の結果であるクロマトグラムの重ね合わせを図19に示す。
【０１３７】
図19に示す重ね合わせにより、種々のTETの混合物による加水分解後に得られるペプチドに顕著な変動があることを観察することができる。この一連の実験で試験した混合物の中で、用いたペプチダーゼの大多数はPhTET2又はMjTETである。したがって、種々のTETミックスを用いて得られ得る変動の可能性はもっと大きいであろう。
【０１３８】
したがって、ペプチドを精細に改変することの結果として、「ペプチドプロファイルの再形成」が得られる。
【０１３９】
図20〜図28に、種々のTETの混合物による加水分解の後の反応媒体のRP-HPLC分析で得られた種々のクロマトグラムを示す。ミックスの番号及びその組成を説明に表示している。
【０１４０】
これらの種々の混合物の観察により、本発明による技術がペプチドのプロファイルをどのように「形成」することが可能かが明らかに示される。
【０１４１】
ペプチドを完全に分解することなしにペプチドの性質を大きく改変することが可能である:ミックス1、2。さもなければ媒体中のペプチドをより精細に改変することが可能である:ミックス5、6。
【０１４２】
種々の酵素をその間で混合することの利点をよりよく理解するため、種々の混合物又は酵素単独及び混合物による加水分解の後で得られたクロマトグラムのいくつかの重ね合わせを示す。
【０１４３】
ミックス1及びミックス2
図26に、TETの混合物#1及び#2(ミックス#1:70%のPhTET2、15%のPhTET3、15%のPhTET4;ミックス#2:70%のPhTET2、15%のPhTET4、15%のMjTET)による乳清タンパク質加水分解物のペプチドの加水分解のRP-HPLCによる分析の結果としてのクロマトグラムの1つを表す。
【０１４４】
2回の実験の間に僅かな相違があった。
【０１４５】
ここでの主なペプチダーゼは両方のミックスの中に70%まで存在するPhTET2である。この主なペプチダーゼの存在により、クロマトグラムの間で観察され得る類似性が説明できる。極めて類似しているが、これらは同一ではない。ここでの唯一の相違は、一つの例ではPhTET3、他の例ではMjTETの存在である。
【０１４６】
合成ペプチドに関する研究により、ペプチダーゼPhTET3とMjTETはペプチドに関しては類似の挙動を有することが示唆された。ここでは、まだ注目すべき相違があり、これら2つのペプチダーゼは他を置き換えるために用いることはできないと考えられる。
【０１４７】
PhTET2とミックス1及びミックス2との比較
数行前に述べたように、主なペプチダーゼ、ここではPhTET2は、一般的なペプチドプロファイルに大きく影響する。このことは、本例において、特にTETの混合物#1及び#2(ミックス#1:70%のPhTET2、15%のPhTET3、15%のPhTET4;ミックス#2:70%のPhTET2、15%のPhTET4、15%のMjTET)による乳清タンパク質加水分解物のペプチドの加水分解のRP-HPLCによる分析の結果としてのクロマトグラムの重ね合わせをそれぞれPhTET2と比較した図27及び図28によって、極めて明らかである。それは、両方の場合に、ペプチダーゼ単独による加水分解の後のペプチドプロファイルがペプチダーゼの混合物による加水分解の後で得られたものと極めて近似しているからである。
【０１４８】
観察された僅かな相違は「少数の」ペプチダーゼによる。この場合には、これらの相違は多数のペプチダーゼによって得られる改変と比較して相対的に小さいことに注目することは興味深い。
【０１４９】
(実施例3)
酵素PhTET3の結晶化
タンパク質PhTET3の結晶は、ブランドGreiner Bio-Oneの24ウェルComboPlateプレートに懸濁した液滴の方法を用いて得た。実験に用いた結晶は、以下の母液、100mMのトリスHCl、100mMのNaCl、100mMの(NH4)SO4、43%の2-メチル-2,4-ペンタンジオール及びpH=8を用いる条件下で形成した。結晶化のため、1mlの母液を結晶化プレートのウェルに入れ、20mg/mlに濃縮したPhTET3タンパク質溶液1.5μlと母液1.5μlとを混合することによって、シラン化カバースリップの上に液滴を形成させる。
【０１５０】
結晶の架橋
PhTET3結晶を架橋するため、最終1%(v/v)のグルタルアルデヒドを添加した母液から架橋溶液を調製する。架橋溶液1μlの液滴をシラン化したカバースリップの上に堆積し、先に得ていた種々の結晶をこれらの液滴の中に移す。架橋は一夜のインキュベーションによって得られる。次いで架橋した結晶を回収して最初の母液の液滴の中に入れ、使用まで待つ。得られた架橋結晶は少なくとも0.5mmの大きな寸法を有する。
【０１５１】
架橋した酵素の活性試験
目的はこれらの架橋した酵素結晶を工業的な酵素プロセスにおける使用を可能にすることであり、酵素がいったん架橋しても活性であることを確認するために実験を行った。
【０１５２】
結晶の活性の観察を容易にするため、発色性基質、この場合にはLys-pNAを用いた。したがって、架橋したPhTET3結晶を、Lys-pNA基質を5mMの濃度で含む150mMのNaCl及び50mMのPIPESで構成されるpH=7.5のいわゆる活性緩衝液の中でインキュベートした。この基質は、特に酵素PhTET3がアミノ酸リジンに対して最大の活性を有していることから選択した。
【０１５３】
その中でPhTET3の架橋した結晶が室温で10分インキュベートされた1μlの活性緩衝液の液滴が実質的に数mm、典型的には6〜7mmの直径を有していることが観察されよう(PhTET3の架橋した結晶と室温で10分インキュベートした後の5mMのLys-pNA基質の1μlの液滴について観察)。したがって、Lys-pNA基質の顕著な加水分解の兆候である液滴の明黄色を明瞭に観察することができる。この実験は、酵素PhTET3はいったん結晶化し、架橋しても、まだ活性であることを示している。これは大きな酵素複合体が架橋後もまだ活性である稀な例である。
【０１５４】
架橋した結晶の安定性の試験
これらの結晶を上述のプロセスに用いることを可能にするため、これらの結晶の機械的強度及び物理化学的安定性を評価した。
【０１５５】
結晶を150mMのNaCl、50mMのPIPESを含むpH=7.5の緩衝溶液中で10サイクルの16,000gの遠心分離と懸濁に供し、結晶の一体性又は活性の損失は何ら観察されなかった。
【０１５６】
同じ結晶を同じ緩衝液中で90℃で1時間インキュベートした。再び、インキュベーションの後で結晶の一体性又は活性の損失は観察されなかった。
【０１５７】
結晶をミリQ蒸留水中でも7日間インキュベートしたが、結晶の一体性又は活性の損失はなかった。結晶化していない同じ酵素ではそのような安定性を観察することはできないので、この最後の実験には特に興味がある。
【０１５８】
結論
これらの結果は、加水分解活性を示すCLECをTET酵素から生成させることが可能であることを示している。更に、これらの結晶は機械的抵抗性及び物理化学的安定性の極めて注目すべき特性を有している。工業的な意味では、これらの巨視的な結晶は基質とのインキュベーションの後で容易に濾過することができる。したがって、これらは工業的かつ独創的な観点から極めて現実的な酵素固定の戦略を表している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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