(57)【要約】  本発明は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の抑制剤を含むがん治療または予防用薬学的組成物に関する。また、本発明は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の抑制剤を含む免疫増強用薬学的組成物に関する。また、本発明は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１を利用した抗がん剤スクリーニング方法、および、がん予後分析に必要な情報を提供する方法に関する。
2021519802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の抑制剤を有効成分として含む、がん治療または予防用の薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の遺伝子のＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはリボザイムであることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上のタンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス、融合タンパク質、抗体またはアプタマーであることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記がんは、胃癌、肺癌、肝癌、大腸癌、結腸癌、小腸癌、膵癌、脳癌、骨癌、黒色腫、乳癌、硬化性腺症、子宮癌、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎癌、肉腫、前立腺癌、尿道癌、膀胱癌、血液癌、リンパ腫、または線維腺腫であることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の抑制剤は、がん細胞のＴ細胞回避機能を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の抑制剤を有効成分として含む、個体の免疫増強用の薬学的組成物。
【請求項７】
個体内のＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の発現または活性を抑制してＴ−細胞媒介性免疫反応の水準を増大させることを特徴とする、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
免疫欠乏、免疫低下、免疫系損傷または免疫妥協による疾患の予防、治療または改善を必要とする個体に使用することを特徴とする、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
（ａ）抗がん剤候補物質とがん細胞を接触させるステップと、
（ｂ）がん細胞内のＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の発現または活性を測定するステップと、を含む抗がん剤スクリーニング方法。
【請求項１０】
前記（ｂ）ステップは、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準またはＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上によるＴ細胞活性抑制水準を測定することで遂行されることを特徴とする、請求項９に記載の抗がん剤スクリーニング方法。
【請求項１１】
前記抗がん剤候補物質で処理されていない対照群に比して、抗がん剤候補物質で処理された群でＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準が有意的に減少するかＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上のＴ細胞活性抑制水準が有意的に減少する場合、前記抗がん剤候補物質を抗がん剤と判断する（ｃ）ステップをさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載の抗がん剤スクリーニング方法。
【請求項１２】
個体から分離した細胞または組織でＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の発現または活性を測定するステップを含む、がん予後分析に必要な情報を提供する方法。
【請求項１３】
前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の発現または活性測定は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準またはＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上によるＴ細胞活性抑制水準を測定することを特徴とする、請求項１２に記載のがん予後分析に必要な情報を提供する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年４月５日に出願された米国出願番号６２／６５２，９４８を優先権で主張し、その開示内容は、本明細書に全体として参照により挿入される。
【０００２】
本発明は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の抑制剤を含むがん治療または予防用薬学的組成物、およびＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の抑制剤を個体に投与することでがんを治療または予防する方法に関する。また、本発明は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の抑制剤を含む免疫増強用薬学的組成物、およびＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の抑制剤を個体に投与することで免疫力を増加させる方法に関する。また、本発明は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上を利用した抗がん剤スクリーニング方法、およびがん予後分析に必要な情報を提供する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
過去数年間、がんに関する集中的な研究がなされたにも関わらず、依然として、がんは、全世界的に主要な死亡原因である。多数のがん治療方法が開発されたが、全てのがん腫に対して、そして全ての患者に対して効果的ではない。がんを治療するために、現在、ほとんど使用されている方法は、相対的に非選択的である。手術により疾病を持つ組織を除去したり、放射線治療により固形腫瘍の大きさを減少させたり、化学治療によりがん細胞を速く死滅させたりする。特に、化学治療は、薬物に対する耐性を発達させることがあり、一部の場合は、投与可能な容量を制限して、結局、潜在的に有効な薬物の使用を排除させる程度に深刻な副作用を引き起こす。従って、ターゲット特異的で、より効果的ながん治療の開発が急を要している。
【０００４】
人体適応免疫体系は、がん細胞を特異的に除去できる非常に精巧なシステムである。特に、Ｔ細胞の場合、細胞性適応免疫を決定する役割を果たし、細胞が非自己または非正常な抗原に露出される場合、抗原を認知して除去する。Ｔ細胞の場合、１細胞当たり約２０，０００〜４０，０００ＴＣＲ分子を発現し、ＡＰＣの１００，０００ｐＭＨＣ分子のうちいくつかの抗原（ペプチド配列により決定）を特異的に認知して信号伝達を開始するようになる。このようなＴＣＲ分子は、非常に精巧で、微妙な抗原変化を認知して信号を伝達しなければならない高感度センサとしての役割を果たさなければならない。このような細胞性適応免疫は、非常に精巧に作動されてがん細胞を効果的に除去できなければならない。仮に、抗原特異的適応免疫体系が正常に作動しなくなると、がん細胞除去機能に深刻な問題をもたらす。例えば、がん細胞の表面にあるタンパク質ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２がＴ細胞の表面にあるタンパク質ＰＤ−１と結合すると、Ｔ細胞は、がん細胞を攻撃できない。従って、効果的ながん治療のために、Ｔ細胞ががん細胞を除去するのに妨げられる要素を除去することが必要である。
【０００５】
そこで、本発明者らは、人体免疫体系を利用したがん治療方法を見出すために研究を進行した結果、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の活性および発現の阻害ががんの発達、成長、浸潤および転移を顕著に抑制することを確認することで本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の一目的は、がん治療または予防用薬学的組成物を提供することであり、がんを治療または予防する方法を提供する。
【０００７】
本発明の他の目的は、免疫増強用薬学的組成物を提供するものであり、免疫力を増加させる方法を提供する。
【０００８】
本発明のまた他の目的は、抗がん剤スクリーニング方法を提供することである。
【０００９】
本発明のまた他の目的は、がん予後分析に必要な情報を提供する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明の一様態は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の抑制剤を有効成分として含む、がん治療または予防用薬学的組成物、およびＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の抑制剤を個体に投与することでがんを治療または予防する方法を提供する。
【００１１】
用語「ＫＩＲＲＥＬ３（Ｋｉｎ  ｏｆ  ＩＲＲＥ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）」は、ＫＩＲＲＥＬ３遺伝子によりコーディングされるタンパク質であり、ネフリン様タンパク質（ｎｅｐｈｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の構成員に属し、「ＮＥＰＨ２」とも命名される。このタンパク質は、胎児および成人の脳、腎臓糸球体の足細胞（ｐｏｄｏｃｙｔｅｓ）で発現され、腎臓の血液ろ過機能、シナプス形成等と関連しているものと知られている。
【００１２】
用語「ＣＮＴＮ４（Ｃｏｎｔａｃｔｉｎ−４）」は、ＣＮＴＮ４遺伝子によりコーディングされるタンパク質であり、免疫グロブリン上科（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属し、細胞接着分子として機能するＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）−ａｎｃｈｏｒｅｄ神経細胞膜タンパク質であって、神経系の発達過程で軸索（ａｘｏｎ）コネクションを形成する役割を果たすものと知られている。
【００１３】
用語「ＣＤ３５１（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ３５１）」は、ＩｇＡおよびＩｇＭに高い親和性で結合するＦｃ受容体であり、「Ｆｃα／μＲ」とも命名される。マウスで大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）、濾胞性樹状突起細胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）、辺縁部および濾胞性Ｂ細胞（ｍａｒｇｉｎａｌ  ｚｏｎｅ  ａｎｄ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ）、および腎臓管上皮細胞（ｋｉｄｎｅｙ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）で発現され、ヒトでは、腸の粘膜固有層細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ  ｃｅｌｌｓ）、パネート細胞（Ｐａｎｅｔｈ  ｃｅｌｌｓ）、扁桃腺内濾胞性樹状突起細胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｏｎｓｉｌｓ）、活性化された大食細胞（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）および一部類型の前−胚中心ＩｇＤ＋／ＣＤ３８＋  Ｂ細胞（ｐｒｅ−ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｒｅ  ＩｇＤ＋／ＣＤ３８＋  Ｂ  ｃｅｌｌｓ）で発現されるものと知られている。
【００１４】
前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１は、ヒト由来ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１であってよい。より具体的に、前記ＫＩＲＲＥＬ３のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩに開示されたＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿１１５９２０．１の配列であるか、それを含むことができ、前記ＣＮＴＮ４のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩに開示されたＮＰ＿７８３２００．１の配列であるか、それを含むことができ、前記ＣＤ３５１のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩに開示されたＡＡＬ５１１５４．１の配列であるか、それを含むことができる。また、前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のアミノ酸配列は、それぞれＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿１１５９２０．１、ＮＰ＿７８３２００．１、ＡＡＬ５１１５４．１の配列と８０％、８５％、９０％または９５％以上の相同性を有する配列であるか、それを含むことができるが、これに限定されるものではなく、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１の特性または機能を示すアミノ酸配列であればいずれも含まれる。
【００１５】
前記ＫＩＲＲＥＬ３の遺伝子は、ヒト由来ＫＩＲＲＥＬ３のアミノ酸配列をコーディングする核酸配列であるか、それを含むか、またはＮＣＢＩに開示されたＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０３２５３１．４の核酸配列であるか、それを含むことができる。前記ＣＮＴＮ４の遺伝子は、ヒト由来ＣＮＴＮ４のアミノ酸配列をコーディングする核酸配列であるか、それを含むか、またはＮＣＢＩに開示されたＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿１７５６０７．３の核酸配列であるか、それを含むことができる。前記ＣＤ３５１の遺伝子は、ヒト由来ＣＤ３５１のアミノ酸配列をコーディングする核酸配列であるか、それを含むか、またはＮＣＢＩに開示されたＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＡＹ０６３１２５．１の核酸配列であるか、それを含むことができる。また、前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１の核酸配列は、それぞれＮＣＢＩに開示されたＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０３２５３１．４、ＮＭ＿１７５６０７．３、ＡＹ０６３１２５．１の核酸配列と８０％、８５％、９０％または９５％以上の相同性を有する配列であるか、それを含むことができるが、これに限定されるものではなく、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１の特性または機能を示すアミノ酸を生産できる核酸配列であればいずれも含まれる。
【００１６】
用語「ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の抑制剤」は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１の中から選択された一つ以上の活性または発現を阻害する物質を意味する。「ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の抑制剤」と「ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１抑制剤」は、相互交換的に使用される。例えば、前記抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１の活性または発現を阻害する物質であってよい。また他の例として、前記抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ３およびＣＮＴＮ４の活性または発現を阻害する物質であるか、またはＫＩＲＲＥＬ３およびＣＤ３５１の活性または発現を阻害する物質であるか、またはＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１の活性または発現を阻害する物質であってよい。また他の例として、前記抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ３の活性または発現を阻害する物質であるか、またはＣＮＴＮ４の活性または発現を阻害する物質であるか、またはＣＤ３５１の活性または発現を阻害する物質であってよい。また他の例として、前記抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ３抑制剤、ＣＮＴＮ４抑制剤およびＣＤ３５１抑制剤の組み合わせであってよい。また他の例として、前記抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ３抑制剤およびＣＮＴＮ４抑制剤の組み合わせであるか、またはＫＩＲＲＥＬ３抑制剤およびＣＤ３５１抑制剤の組み合わせであるか、またはＣＮＴＮ４抑制剤およびＣＤ３５１抑制剤の組み合わせであってよい。
【００１７】
前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１抑制剤は、好ましくは、Ｔ細胞のがん細胞回避機能を阻害できる。ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１抑制剤がＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の活性を遮断することで、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１によりＴ細胞ががん細胞を攻撃できなくなる作用機序を抑制し、またＴ細胞のがん細胞に対する免疫活性を維持させ得る。または、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１タンパク質に特異的に結合してＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１とＴ細胞の結合を妨害するか、またはＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の特定代謝経路を阻害してタンパク質発現を減少させるか活性を有し得ないように変性させ得る。従って、本発明に係るＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１抑制剤は、がん治療または予防に非常に効果的である。
【００１８】
前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の活性または発現を阻害する物質であれば、化合物、タンパク質、融合タンパク質、抗体、アミノ酸、ペプチド、ウイルス、炭水化物、脂質、核酸、抽出物、分画物等を含むことができ、これに限定されるものではない。前記ＫＩＲＲＥＬ３抑制剤、ＣＮＴＮ４抑制剤およびＣＤ３５１抑制剤は、互いに独立して異なるか同一の形態の物質であってよい。例えば、全ての抑制剤が抗体であってよい。また他の例として、２個の抑制剤は抗体であり、残りの１個の抑制剤は化合物であってよい。
【００１９】
一具現例において、前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１抑制剤で処理されていないがん細胞に対比してがん細胞内のＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の発現を減少させるものであってよい。前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の発現減少は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の遺伝子から生成するｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の水準が減少したか除去されたことを意味し得る。前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１抑制剤は、例えば、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１遺伝子のＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム等を含むことができ、これに限定されるものではない。前記ＫＩＲＲＥＬ３抑制剤、ＣＮＴＮ４抑制剤およびＣＤ３５１抑制剤は、互いに独立して異なるか同一の形態の物質であってよい。例えば、全ての抑制剤がｓｉＲＮＡであってよい。また他の例として、２個の抑制剤はｓｉＲＮＡであり、残りの１個の抑制剤はアンチセンス核酸であってよい。
【００２０】
用語「アンチセンス核酸」は、特定ｍＲＮＡの配列に対して相補的な核酸配列を含有しているＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの断片または誘導体を意味し、ｍＲＮＡの配列に相補的に結合または混成化してｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害する作用をする。
【００２１】
用語「ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）」は、特定ｍＲＮＡの切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）を通してＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導できる短い二重鎖ＲＮＡを意味する。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡと相同な配列を有するセンスＲＮＡ鎖と、これと相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖を含む。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制できるので、遺伝子ノックダウン方法または遺伝子治療方法等に使用される。
【００２２】
用語「ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）」は、一本鎖ＲＮＡであって、水素結合により二本鎖部分を形成するステム（ｓｔｅｍ）部分と、環状を帯びるループ（ｌｏｏｐ）部分とに区分され、Ｄｉｃｅｒ等のタンパク質によりプロセシングされてｓｉＲＮＡに変換され、ｓｉＲＮＡと同じ機能を果たすことができる。
【００２３】
用語「ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）」は、標的ＲＮＡの分解を促進させるか、またはこれらの翻訳を抑制させることで遺伝子発現を転写後に調節する２１〜２３個の非コーディングＲＮＡをいう。
【００２４】
用語「リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）」は、特定塩基配列を認識して自体的にそれを切断する酵素のような機能を有するＲＮＡ分子を意味する。リボザイムは、ターゲットメッセンジャーＲＮＡ鎖の相補的な塩基配列に特異性を有して結合する領域と、ターゲットＲＮＡを切断する領域とで構成される。
【００２５】
前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１遺伝子のＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム等は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１のｍＲＮＡの翻訳、細胞質内への転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）、成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）または他の任意のＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の生物学的機能に対する必須な活性を阻害できる。
【００２６】
一具現例において、前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１抑制剤で処理されていないがん細胞と比較してがん細胞内のＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の機能を不活性化させるか活性を減少させるものであってよい。前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１抑制剤は、例えば、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス、融合タンパク質、抗体、アプタマー等を含むことができ、これに限定されるものではない。前記ＫＩＲＲＥＬ３抑制剤、ＣＮＴＮ４抑制剤およびＣＤ３５１抑制剤は、互いに独立して異なるか同一の形態の物質であってよい。
【００２７】
用語「特異的」は、細胞内で他のタンパク質に影響を及ぼさず、目的タンパク質にのみ結合する能力を意味する。
【００２８】
用語「抗体」は、単一クローン抗体、多クローン抗体、二重特異的抗体、多重特異的抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体を含み、新規抗体の他に既に当該技術の分野において公知または市販の抗体も含まれる。前記抗体は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上に特異的に結合する限り、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む全長の形態だけではなく、抗体分子の機能的な断片を含む。前記抗体分子の機能的な断片は、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、ここには、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等が含まれ得るが、これに限定されるものではない。
【００２９】
用語「ペプチドミメティクス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の活性を誘導するＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上のタンパク質の結合ドメインを抑制するペプチドまたは非ペプチドである。
【００３０】
用語「アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒ）」は、それ自体で安定した三次構造を有しながら標的分子に高い親和性と特異性で結合できる特徴を有する一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは変形核酸）を意味する。
【００３１】
本発明の薬学的組成物に含まれるＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の活性または発現を阻害する物質は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１がＴ細胞の機能を抑制することを阻害することができ、これによって、Ｔ細胞ががん細胞を攻撃できる機能を維持または促進させる作用をすることができる。ここで、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の活性または発現を阻害する物質で処理した群において、Ｔ細胞のがん細胞攻撃能力は、非処理群に比して５％〜２００％増加し得る。従って、本発明の薬学的組成物は、がんの予防または治療に有用に使用され得る。
【００３２】
本発明の薬学的組成物が治療または予防できるがんには、例えば、胃癌、肺癌、肝癌、大腸癌、結腸癌、小腸癌、膵癌、脳癌、骨癌、黒色腫、乳癌、硬化性腺症、子宮癌、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎癌、肉腫、前立腺癌、尿道癌、膀胱癌、血液癌、白血病、リンパ腫、線維腺腫等が含まれ、これに限定されるものではない。
【００３３】
本発明に係る薬学的組成物は、前記有効成分を単独で含有するか、または一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、安定化剤、保存剤等をさらに含有することができる。
【００３４】
薬学的に許容される担体は、例えば、経口投与用担体または非経口投与用担体を含むことができる。前記経口投与用担体は、ラクトース、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸等を含むことができる。前記非経口投与用担体は、水、適した油、食塩水、水性グルコース、グリコール等を含むことができる。薬学的に許容される安定化剤は、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤等がある。薬学的に許容される保存剤は、塩化ベンザルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベン、クロロブタノール等がある。その他の薬学的に許容される担体としては、文献Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に記載されているものを参考にすることができる。
【００３５】
本発明の薬学的組成物は、ヒト等の動物に任意の方法で、例えば、経口または非経口的に投与できる。前記非経口的投与方法としては、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下、直腸内投与等であってよく、これに限定されない。
【００３６】
本発明の薬学的組成物は、上述したような投与経路によって経口投与用製剤または非経口投与用製剤に剤形化することができる。
【００３７】
前記経口投与用製剤は、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液等の形態に当業界に公知になった方法によって本発明の組成物を剤形化したものであってよい。例えば、本発明の有効成分を賦形剤と配合し、適した補助剤を添加した後、顆粒混合物に加工することで、経口投与のための錠剤または糖衣錠剤を収得することができる。前記賦形剤の例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトールおよびマルチトール等を含む糖類と、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、コメデンプンおよびジャガイモデンプン等を含むデンプン類、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチル−セルロース等を含むセルロース類、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等のような充填剤が含まれ得るが、これに限定されるものではない。選択的に、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム等を崩壊剤として添加できる。また、本発明の薬学的組成物は、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤等をさらに含むことができる。
【００３８】
前記非経口投与用製剤は、注射剤、ゲル剤、エアロゾル、鼻腔吸入剤の形態に当業界に公知になった方法によって本発明の組成物を剤形化したものであってよい。
【００３９】
これらの剤形は、文献Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １８０４２，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８７：Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒの記載内容を参考にすることができる。
【００４０】
本発明に係る薬学的組成物の総有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ）で個体に投与され得、または多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅ）で分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与され得る。
【００４１】
本発明の薬学的組成物の適切な有効投与量または有効成分の含量は、投与経路、投与回数、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌、排泄率等の多様な要因を考慮して患者に対する有効投与量を考慮し、当該分野における通常の知識を有する者が決定できるだろう。例えば、本発明の薬学的組成物の全容量は、１日当たり、患者の体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜１，０００ｍｇ、または０．１μｇ〜１００ｍｇであってよい。本発明に係る薬学的組成物は、本発明の効果を示す限り、その剤形、投与経路、投与方法に特に制限されない。
【００４２】
また、本発明の一様態は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の抑制剤を有効成分として含む、個体の免疫増強用薬学的組成物を提供する。
【００４３】
本発明の薬学的組成物を免疫増強を必要とする個体に投与する場合、個体内のＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の発現または活性を全体または部分的に減少させ、Ｔ−細胞媒介性免疫反応の水準を増大させ得る。
【００４４】
これによって、本発明の薬学的組成物は、免疫増強の用途に使用することができる。例えば、免疫欠乏、免疫低下または免疫系損傷による疾患の予防、治療または改善を必要とする個体に使用することができる。
【００４５】
また、本発明の一様態は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の抑制剤を個体に投与するステップを含む、がん治療または予防方法を提供する。また、本発明の一様態は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の抑制剤を個体に投与するステップを含む、個体の免疫増強方法を提供する。これらの方法において、特に断りのない限り、関連用語は、先に薬学的組成物で説明された用語と同じ意味を有するものと理解される。
【００４６】
また、本発明の一様態は、下記ステップを含む抗がん剤スクリーニング方法を提供する。
（ａ）抗がん剤候補物質でがん細胞を処理するステップ、および
（ｂ）前記がん細胞内のＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の発現または活性を測定するステップ。
【００４７】
選択的に、前記抗がん剤スクリーニング方法は、抗がん剤候補物質で処理していない群に比して抗がん剤候補物質で処理した群でＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準が減少するか、またはＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上によるＴ細胞の活性抑制水準が減少する場合、前記抗がん剤候補物質を抗がん剤であるものと判断するステップをさらに含むことができる。ここで、前記水準が減少するということは、有意的に減少することを意味し得る。例えば、前記水準が減少することまたは有意的に減少することは、５％〜９５％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％）減少した量を意味するものであってよい。また、前記減少した量は ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のそれぞれ減少した量の合計を意味することも、または ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１の独立して減少した量を意味することもできる。前記抗がん剤候補物質で処理していない群は、何の物質も添加されていないがん細胞であるか、またはＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の活性または発現抑制物質でない抗がん剤等の他の物質で処理されたがん細胞であってよい。
【００４８】
用語「スクリーニング」は、タンパク質、融合タンパク質、抗体、ペプチド、抗生物質、酵素、化合物等の物質に対して感受性または活性等の特定性質を有している特定物質を見つけることを意味する。
【００４９】
用語「抗がん剤候補物質」は、通常の選定方式によってＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の発現または活性を抑制できるものと推定されるか、または無作為に選定された核酸、タンパク質、抗体、化合物、抽出物または天然物等であってよい。前記抗がん剤候補物質は、好ましくは、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の発現および／または活性を阻害する物質であってよい。
【００５０】
前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の発現または活性の測定は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準を測定するか、またはＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１によるＴ細胞の活性抑制程度を測定することにより遂行され得る。
【００５１】
前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１のｍＲＮＡの発現水準を測定する方法は、当該技術の分野において公知になった方法を利用することができ、例えば、逆転写酵素重合酵素反応、競争的逆転写酵素重合酵素反応、リアルタイム逆転写酵素重合酵素反応、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノーザンブロット、ＤＮＡチップ、ＲＮＡチップ等を利用することができるが、これに制限されない。
【００５２】
前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１のタンパク質の発現水準を測定する方法は、当該技術の分野において公知になった方法を利用することができ、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析法、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、免疫組織化学染色、免疫沈殿分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ、タンパク質チップ等を利用することができるが、これに制限されない。
【００５３】
前記ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１によるＴ細胞の活性抑制程度を測定する方法は、当該技術の分野において公知になった方法を利用することができ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、免疫組織化学染色、免疫沈殿分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ等を利用することができるが、これに制限されない。
【００５４】
また、本発明のスクリーニング方法において、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の活性抑制確認は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１タンパク質と候補物質を反応させた後、活性を測定する方法、酵母二重混成法（ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１のタンパク質に結合するファージディスプレイペプチドクローン（ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｌｏｎｅ）の検索、天然物および化学物質ライブラリ（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ）等を利用したＨＴＳ（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）、ドラッグヒットＨＴＳ（ｄｒｕｇ  ｈｉｔ  ＨＴＳ）、細胞基盤スクリーニング（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）、またはＤＮＡアレイ（ＤＮＡ  ａｒｒａｙ）を利用するスクリーニング方法等を使用することができる。
【００５５】
前記抗がん剤スクリーニング方法は、イン・ビトロまたはイン・ビボで全て可能である。イン・ビボの場合、前記抗がん剤候補物質でがん細胞を処理するステップは、抗がん剤候補物質をがん細胞を持つ個体またはがん疾患を持っている個体に投与することで遂行され得る。前記個体は、例えば、ヒト、マウス等のような動物であってよい。
【００５６】
前記抗がん剤スクリーニング方法は、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４および／またはＣＤ３５１の活性または発現を抑制すると、がん細胞のＴ細胞回避機能を阻害できるという本発明において新規で明らかにした点に基づく。本発明のスクリーニング方法によれば、新規抗がん剤を安価で簡単な方法で容易に開発できるので非常に有利である。
【００５７】
また、本発明の一様態は、個体から分離した細胞または組織でＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の発現または活性を測定するステップを含むがん予後分析に必要な情報を提供する方法を提供する。
【００５８】
前記方法において、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の発現または活性およびその測定と関連した用語は、特に断りのない限り、前記組成物および前記スクリーニング方法において説明したものと同一である。
【００５９】
用語「予後」は、疾病の進行、疾病の改善、疾病の再発、転移および死亡可能性の側面での予測を指す。例えば、本発明における予後は、がん患者の疾病が完治するか、患者の状態が改善される可能性を意味する。
【００６０】
前記個体から分離した細胞または組織は、がん細胞であるか、またはがんが発生したか、がん細胞が存在する組織であってよい。
【００６１】
前記がん予後分析に必要な情報を提供する方法は、がん細胞のＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のうち一つ以上の活性または発現水準が低いほどＴ細胞の活性が高くなり、これによってがん治療効果が高くなり得るという点に基づく。
【００６２】
本明細書において使用される単数は、文法的に一つまたは複数を指すものである。例えば、「成分」は、一つの成分または一つより多くの成分を意味する。本明細書において、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」は、Ａ、またはＢ、またはＣ、またはＡおよびＢ、またはＡおよびＣ、またはＢおよびＣ、またはＡ、ＢおよびＣを意味するものとして使用される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＫＩＲＲＥＬ３により阻害されるＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖率（％）を示す。
【図２】ＫＩＲＲＥＬ３により阻害されるＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖率（％）を示す。
【図３】ＣＮＴＮ４により阻害されるＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖率（％）を示す。
【図４】ＣＮＴＮ４により阻害されるＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖率（％）を示す。
【図５】ＣＤ３５１により阻害されるＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖率（％）を示す。
【図６】ＣＤ３５１により阻害されるＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖率（％）を示す。
【図７ａ】肺癌細胞株Ａ５４９とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図７ｂ】肺癌細胞株Ａ５４９とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図７ｃ】肺癌細胞株Ａ５４９とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図７ｄ】肺癌細胞株Ａ５４９とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図８ａ】結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図８ｂ】結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図８ｃ】結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図８ｄ】結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図９ａ】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図９ｂ】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図９ｃ】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図９ｄ】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１０ａ】胃癌細胞株ＭＫＮ−７４とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１０ｂ】胃癌細胞株ＭＫＮ−７４とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１０ｃ】胃癌細胞株ＭＫＮ−７４とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１０ｄ】胃癌細胞株ＭＫＮ−７４とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１１ａ】白血病細胞株Ｕ９３７とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１１ｂ】白血病細胞株Ｕ９３７とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１１ｃ】白血病細胞株Ｕ９３７とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１１ｄ】白血病細胞株Ｕ９３７とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１２ａ】肺癌細胞株Ａ５４９とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１２ｂ】肺癌細胞株Ａ５４９とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１２ｃ】肺癌細胞株Ａ５４９とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１２ｄ】肺癌細胞株Ａ５４９とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１３ａ】結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１３ｂ】結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１３ｃ】結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１３ｄ】結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１４ａ】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１４ｂ】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１４ｃ】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１４ｄ】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１５ａ】胃癌細胞株ＭＫＮ−７４とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１５ｂ】胃癌細胞株ＭＫＮ−７４とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１５ｃ】胃癌細胞株ＭＫＮ−７４とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１５ｄ】胃癌細胞株ＭＫＮ−７４とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１６ａ】白血病細胞株Ｕ９３７とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１６ｂ】白血病細胞株Ｕ９３７とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１６ｃ】白血病細胞株Ｕ９３７とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１６ｄ】白血病細胞株Ｕ９３７とＰＢＭＣをＣＮＴＮ４抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１７ａ】肺癌細胞株Ａ５４９とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１７ｂ】肺癌細胞株Ａ５４９とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１７ｃ】肺癌細胞株Ａ５４９とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１７ｄ】肺癌細胞株Ａ５４９とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１８ａ】結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１８ｂ】結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１８ｃ】結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１８ｄ】結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１９ａ】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１９ｂ】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１９ｃ】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図１９ｄ】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図２０ａ】胃癌細胞株ＭＫＮ−７４とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図２０ｂ】胃癌細胞株ＭＫＮ−７４とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図２０ｃ】胃癌細胞株ＭＫＮ−７４とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図２０ｄ】胃癌細胞株ＭＫＮ−７４とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図２１ａ】白血病細胞株Ｕ９３７とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図２１ｂ】白血病細胞株Ｕ９３７とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図２１ｃ】白血病細胞株Ｕ９３７とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図２１ｄ】白血病細胞株Ｕ９３７とＰＢＭＣをＣＤ３５１抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図２２】ＫＩＲＲＥＬ３抑制剤で処理したマウスで腫瘍の大きさの変化を示したものである。
【図２３】ＣＮＴＮ４抑制剤で処理したマウスで腫瘍の大きさの変化を示したものである。
【図２４ａ】ＣＤ３５１抑制剤で処理したマウスで腫瘍の大きさの変化を示したものである。
【図２４ｂ】ＣＤ３５１抑制剤で処理したマウスで腫瘍の大きさの変化を示したものである。
【図２４ｃ】ＣＤ３５１抑制剤で処理したマウスで腫瘍の大きさの変化を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。
【００６５】
実施例１．Ｔ細胞の増殖および活性抑制能
本実施例においては、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１がＴ細胞の増殖および活性を阻害してがん細胞がＴ−細胞媒介免疫システムを回避するようにするか否かを確認しようとした。
【００６６】
１．１．ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の準備
ヒト血液をＥＤＴＡ（またはヘパリン）でコーティングされた１０ｍＬチューブに入れ、１：１の比率でＰＢＳと混合した。それから５０ｍＬチューブにＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳを入れ、前記血液試料を添加した。遠心分離した後、ヒトＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）を回収した。回収された結果物を遠心分離し、上澄みを除去した。次いで、ＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ（１ｘ）を添加し、ピペッティングした後、アイスで３分間保管した。次いで、１０％  ＦＢＳ  ＲＰＭＩ１６４０  ５０ｍｌを添加し、混合物を遠心分離して上澄みを除去した。それから、ＦＡＣＳバッファを添加し、上澄みを遠心分離により除去した。その後、５０ｍｌのＭＡＣＳバッファ（０．５％  ＢＳＡおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡ包含ＰＢＳ）を添加し、細胞数をカウンティングし、遠心分離により上澄みを除去した。
【００６７】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を１×１０７細胞数基準４０μｌ  ＭＡＣＳバッファを利用して再懸濁させ、チューブに抗ＣＤ４および抗ＣＤ８ビオチン抗体をそれぞれ１０μｌ入れた後、５分間冷蔵庫に保管した。その後、１×１０７細胞数基準ＭＡＣＳバッファ３０μｌを前記生成物に添加し、抗−ビオチンマイクロビーズ２０μｌを添加して混合した。次いで、ＬＳカラムを利用してＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を分離し、細胞数をカウンティングした。
【００６８】
このように準備されたＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を２×１０６細胞数基準ＣＦＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）１μｌと混合し、３７℃で３分間保管した。それからＣＤ４＋  Ｔ細胞とＣＤ８＋  Ｔ細胞をそれぞれ含有しているチューブにＦＢＳを添加し、１０分間アイスで保管した。その後、遠心分離により上澄みを除去した。生成物にＦＡＣＳバッファ３０ｍｌを添加した後、ピペッティングし、遠心分離して上澄みを除去した。それから１０％  ＦＢＳ  ＲＰＭＩ１６４０を添加した後、ピペッティングし、遠心分離して上澄みを除去した。その後、生成物を１０％  ＦＢＳ  ＲＰＭＩ１６４０  １０ｍｌと混合した後、細胞数をカウンティングした。
【００６９】
１．２．Ｔ細胞の活性測定
１．２．１．ＫＩＲＲＥＬ３によるＴ細胞の活性阻害測定
組換えヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１０−ＨＧ）および組換えヒトＰＤ−Ｌ１／Ｂ７−Ｈ１  Ｆｃ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５６−Ｂ７）をＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓで購入した。また、組換えヒトＫＩＲＲＥＬ３  Ｈｉｓ  Ｔａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．４９１０−Ｋ３）をＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓで購入した。
【００７０】
これらのｐｒｏｔｅｉｎそれぞれの７．５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌをＰＢＳ中ａｎｔｉ−ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３１７３２５）２．５μｇ／ｍｌと混合した。生成した混合物で９６−ウェルプレートを４℃でコーティングし、ＰＢＳで３回洗浄した。
【００７１】
先に実施例１．１において準備したＣＤ４＋  Ｔ細胞とＣＤ８＋  Ｔ細胞を９６−ウェルプレートのウェル毎に２００μｌずつ２×１０６個添加し、インキュベーションした。
【００７２】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ａｎｔｉ−ＣＤ３抗体により７２時間の間活性化させた。ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖は、ＣＦＳＥ染色の程度により確認することができ、それは、ＦＡＣＳＤｉＶａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用してフローサイトメトリーにより分析した。
【００７３】
１．２．２．ＣＮＴＮ４によるＴ細胞の活性阻害測定
組換えヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１０−ＨＧ）および組換えヒトＰＤ−Ｌ１／Ｂ７−Ｈ１  Ｆｃ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５６−Ｂ７）をＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓで購入した。また、組換えヒトＣＮＴＮ４  Ｈｉｓ  Ｔａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔ：２２０５−ＣＮ）をＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓで購入した。
【００７４】
これらのｐｒｏｔｅｉｎそれぞれの７．５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌをＰＢＳ中ａｎｔｉ−ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３１７３２５）２．５μｇ／ｍｌと混合した。生成した混合物で９６−ウェルプレートを４℃でコーティングし、ＰＢＳで３回洗浄した。
【００７５】
先に実施例１．１において準備したＣＤ４＋  Ｔ細胞とＣＤ８＋  Ｔ細胞を９６−ウェルプレートのウェル毎に２００μｌずつ２×１０６個添加し、インキュベーションした。
【００７６】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ａｎｔｉ−ＣＤ３抗体により７２時間の間活性化させた。ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖は、ＣＦＳＥ染色の程度により確認することができ、それは、ＦＡＣＳＤｉＶａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用してフローサイトメトリーにより分析した。
【００７７】
１．２．３．ＣＤ３５１によるＴ細胞の活性阻害測定
組換えヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１０−ＨＧ）および組換えヒトＰＤ−Ｌ１／Ｂ７−Ｈ１  Ｆｃ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５６−Ｂ７）をＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓで購入した。また、組換えヒトＣＤ３５１  Ｈｉｓ  Ｔａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．９２７８−ＦＣ）をＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓで購入した。
【００７８】
これらのｐｒｏｔｅｉｎそれぞれの１０μｇ／ｍｌをＰＢＳ中ａｎｔｉ−ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３１７３２５）１．０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、または６．０μｇ／ｍｌと混合した。生成した混合物で９６−ウェルプレートを４℃でコーティングし、ＰＢＳで３回洗浄した。
【００７９】
先に実施例１．１において準備したＣＤ４＋  Ｔ細胞とＣＤ８＋  Ｔ細胞を９６−ウェルプレートのウェル毎に２００μｌずつ２×１０６個添加し、インキュベーションした。
【００８０】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ａｎｔｉ−ＣＤ３抗体により７２時間の間活性化させた。ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖は、ＣＦＳＥ染色の程度により確認することができ、それは、ＦＡＣＳＤｉＶａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用してフローサイトメトリーにより分析した。
【００８１】
１．３．結果
１．３．１．ＫＩＲＲＥＬ３によるＴ細胞の活性阻害
ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖率（％）をそれぞれ図１および図２に示した。
【００８２】
ＰＤ−Ｌ１で処理した対照群は、ＩｇＧ１で処理した対照群に比してＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖が全て抑制された。ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞表面にあるタンパク質ＰＤ−１と結合し、Ｔ細胞の増殖を抑制する。これによって、Ｔ細胞ががん細胞を攻撃し、殺傷する機能を低下させる結果をもたらす。
【００８３】
ＫＩＲＲＥＬ３で処理した群は、ＩｇＧ１で処理した対照群に対比してＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖が顕著に抑制され、ＰＤ−Ｌ１で処理した対照群に対比してＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖抑制水準が類似していた。
【００８４】
これは、ＫＩＲＲＥＬ３をブロッキングするかノックダウンさせることで中和させればＫＩＲＲＥＬ３のＴ細胞増殖抑制能を低下させ得ることを意味する。その結果、効率的ながん治療が可能となる。
【００８５】
１．３．２．ＣＮＴＮ４によるＴ細胞の活性阻害
ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖率（％）をそれぞれ図３および図４に示した。
【００８６】
ＰＤ−Ｌ１で処理した対照群は、ＩｇＧ１で処理した対照群に比してＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖が全て抑制された。
【００８７】
ＣＮＴＮ４で処理した群は、ＩｇＧ１で処理した対照群に対比してＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖が顕著に抑制され、ＰＤ−Ｌ１で処理した対照群に対比してＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖抑制水準が類似していた。
【００８８】
これは、ＣＮＴＮ４をブロッキングするかノックダウンさせることで中和させればＣＮＴＮ４のＴ細胞増殖抑制能を低下させ得ることを意味する。その結果、効率的ながん治療が可能となる。
【００８９】
１．３．３．ＣＤ３５１によるＴ細胞の活性阻害
ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖率（％）をそれぞれ図５および図６に示した。
【００９０】
ＰＤ−Ｌ１で処理した対照群は、ＩｇＧ１で処理した対照群に比してＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖が有意的に抑制されたのに対し、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖に対しては、ＩｇＧ１で処理した対照群と有意的な差を示さなかった。
【００９１】
ＣＤ３５１で処理した群は、ＩｇＧ１で処理した対照群およびＰＤ−Ｌ１で処理した対照群の全てに対比してＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖が顕著に抑制された。
【００９２】
これは、ＣＤ３５１をブロッキングするかノックダウンさせることで中和させればＣＤ３５１のＴ細胞増殖抑制能を低下させ得るようになる。その結果、効率的ながん治療が可能となる。
【００９３】
実施例２．ＰＢＭＣ細胞毒性アッセイ
本実施例においては、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４またはＣＤ３５１をＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４またはＣＤ３５１抑制剤を利用して中和させたとき、ＰＢＭＣのがん細胞に対する細胞毒性、即ち、殺傷能を増加させ得るか否かを確認しようとした。
【００９４】
２．１．ＰＢＭＣの準備
ヒト血液をＥＤＴＡ（またはヘパリン）でコーティングされた１０ｍＬチューブに入れ、１：１の比率でＰＢＳと混合した。それから５０ｍＬチューブにＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳを入れ、前記血液試料を添加した。遠心分離した後、ヒトＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）を回収した。回収された結果物を遠心分離し、上澄みを除去した。次いで、ＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ（１ｘ）を添加し、ピペッティングした後、アイスで３分間保管した。次いで、１０％  ＦＢＳ  ＲＰＭＩ１６４０  ５０ｍｌを添加し、混合物を遠心分離して上澄みを除去した。それから、ＦＡＣＳバッファを添加し、上澄みを遠心分離により除去した。その後、５０ｍｌのＭＡＣＳバッファ（０．５％  ＢＳＡおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡ包含ＰＢＳ）を添加し、細胞数をカウンティングし、遠心分離により上澄みを除去した。
【００９５】
９６−ウェルプレートを４℃でＰＢＳ中ａｎｔｉ−ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３１７３２５）１．０μｇ／ｍｌでコーティングした。９６−ウェルプレートのウェルは、ＰＢＭＣを添加する前にＰＢＳで３回洗浄した。先に収得したＰＢＭＣを１０％  ＦＢＳ  ＲＰＭＩ１６４０と混合し、９６−ウェルプレートの各ウェル毎に６×１０５個を１００μｌずつ添加した。ＰＢＭＣは、７２時間の間、ａｎｔｉ−ＣＤ３抗体により活性化させた。
【００９６】
２．２．がん細胞の準備
肺癌細胞株Ａ５４９、結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、胃癌細胞株ＭＫＮ−７４、および白血病細胞株Ｕ９３７をそれぞれ１μｌのＣＦＳＥ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）と混合し、３７℃で３分間保管した。その後、それぞれの細胞株を含有したチューブにＦＢＳを添加し、１０分間ｉｃｅで保管した。次いで、上澄みを遠心分離により除去した。これによって収得された生成物にＦＡＣＳバッファ３０ｍｌを添加した後、ピペッティングし、遠心分離して上澄みを除去した。それから１０％  ＦＢＳ  ＲＰＭＩ１６４０を添加した後、ピペッティングし、遠心分離して上澄みを除去した。これによって収得された生成物を１０％  ＦＢＳ  ＲＰＭＩ１６４０  １０ｍｌと混合した後、細胞数をカウンティングした。
【００９７】
前記がん細胞を、先に実施例２．１において準備した９６−ウェルプレートのＰＢＭＣ含有ウェル毎に１００μｌずつ３×１０４個添加し、インキュベーションした。
【００９８】
２．３．がん細胞株に対するＰＢＭＣの細胞毒性の測定
先に実施例２．２においてＰＢＭＣおよびがん細胞株の混合物が準備された。これらの混合物を１０μｇ／ｍＬのａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＫＩＲＲＥＬ３抗体、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＮＴＮ４抗体またはａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３５１抗体、または５０ｎＭのＫＩＲＲＥＬ３  ｓｉＲＮＡ、ＣＮＴＮ４  ｓｉＲＮＡまたはＣＤ３５１  ｓｉＲＮＡと共に２４時間の間、インキュベーションした。
【００９９】
ＫＩＲＲＥＬ３をブロッキングするために４種の中和抗体を使用した実験群１乃至４と無処理対照群は、下記表１に示し、ＫＩＲＲＥＬ３をノックダウンするために３種のｓｉＲＮＡを使用した実験群５乃至７と無処理対照群は、下記表２に示した。
【０１００】
【表１】
2021519802.tif 000003
【０１０１】
【表２】
2021519802.tif 000004
【０１０２】
ＣＮＴＮ４をブロッキングするために５種の中和抗体を使用した実験群１乃至５と無処理対照群は、下記表３に示し、ＣＮＴＮ４をノックダウンするために３種のｓｉＲＮＡを使用した実験群６乃至８と無処理対照群は、下記表４に示した。
【０１０３】
【表３】
2021519802.tif 000005
【０１０４】
【表４】
2021519802.tif 000006
【０１０５】
ＣＤ３５１をブロッキングするために３種の中和抗体を使用した実験群１乃至３と無処理対照群は、下記表５に示し、ＣＤ３５１をノックダウンするために３種のｓｉＲＮＡを使用した実験群４乃至６と無処理対照群は、下記表６に示した。
【０１０６】
【表５】
2021519802.tif 000007
【０１０７】
【表６】
2021519802.tif 000008
【０１０８】
ＰＢＭＣおよび細胞株の混合物と抗体またはｓｉＲＮＡを共にインキュベーションし、２４時間後に溶菌された細胞を確認するために、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で細胞を染色した。ＦＡＣＳＤｉＶａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用してＦＬ−１（ＣＦＳＥ）およびＦＬ−３（７−ＡＡＤ）に対する染色を測定することでがん細胞株に対するＰＢＭＣの細胞溶解能を確認した。
【０１０９】
２．４．結果
肺癌細胞株Ａ５４９に対してＫＩＲＲＥＬ３中和抗体またはｓｉＲＮＡで処理した時の実験結果を図７ａ乃至図７ｄに示し、ＣＮＴＮ４中和抗体またはｓｉＲＮＡで処理した時の結果を図１２ａ乃至図１２ｄに示し、ＣＤ３５１中和抗体またはｓｉＲＮＡで処理した時の結果を図１７ａ乃至図１７ｄに示した。
【０１１０】
肺癌細胞株Ａ５４９とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ３中和抗体、ＣＮＴＮ４中和抗体またはＣＤ３５１中和抗体で処理したとき、抗体の種類によって程度の差はあるが、無処理対照群に比して肺癌細胞殺傷能が有意的に増加したことを確認することができる。また、肺癌細胞株をＫＩＲＲＥＬ３  ｓｉＲＮＡ、ＣＮＴＮ４  ｓｉＲＮＡまたはＣＤ３５１  ｓｉＲＮＡで処理した場合にも肺癌細胞殺傷能が有意的に増加したことが確認された。
【０１１１】
ＫＩＲＲＥＬ３中和抗体またはｓｉＲＮＡで処理したとき、結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６に対する実験結果を図８ａ乃至図８ｄに示し、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する実験結果を図９ａ乃至図９ｄに示し、胃癌細胞株ＭＫＮ−７４に対する実験結果を図１０ａ乃至図１０ｄに示し、白血病細胞株Ｕ９３７に対する実験結果を図１１ａ乃至図１１ｄに示した。
【０１１２】
また、ＣＮＴＮ４中和抗体またはｓｉＲＮＡで処理したとき、結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６に対する実験結果を図１３ａ乃至図１３ｄに示し、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する実験結果を図１４ａ乃至図１４ｄに示し、胃癌細胞株ＭＫＮ−７４に対する実験結果を図１５ａ乃至図１５ｄに示し、白血病細胞株Ｕ９３７に対する実験結果を図１６ａ乃至図１６ｄに示した。
【０１１３】
また、ＣＤ３５１中和抗体またはｓｉＲＮＡで処理したとき、結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６に対する実験結果を図１８ａ乃至図１８ｄに示し、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する実験結果を図１９ａ乃至図１９ｄに示し、胃癌細胞株ＭＫＮ−７４に対する実験結果を図２０ａ乃至図２０ｄに示し、白血病細胞株Ｕ９３７に対する実験結果を図２１ａ乃至図２１ｄに示した。
【０１１４】
抗体またはｓｉＲＮＡを利用してＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のいずれか一つを中和させたとき、ＰＢＭＣの殺傷能が増加する結果は、図８ａ乃至図１１ｄ、図１３ａ乃至図１６ｄおよび図１８ａ乃至図２１ｄから見られるように、結腸癌、乳癌、胃癌、白血病においても同様に確認された。
【０１１５】
実施例３．腫瘍マウスモデル実験
本実施例においては、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４またはＣＤ３５１をＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４またはＣＤ３５１抑制剤を利用して中和させたとき、マウス腫瘍の成長が抑制されるか否かをイン・ビボで確認しようとした。
【０１１６】
３．１．腫瘍マウスモデル構築
Ｃ５７ＢＬ６結腸腺癌腫細胞に由来したＭＣ３８細胞株を５０μｌ  ＰＢＳ中に２．０×１０５細胞数濃度で再懸濁させ、６週齢雌Ｃ５７ＢＬ６マウスの横腹に皮下注射した。
【０１１７】
下記表７にＫＩＲＲＥＬ３をノックダウンするためにｓｉＲＮＡを使用した実験群８と無処理対照群を示した。
【０１１８】
【表７】
2021519802.tif 000009
【０１１９】
下記表８にＣＮＴＮ４をノックダウンするためにｓｉＲＮＡを使用した実験群９と無処理対照群を示した。
【０１２０】
【表８】
2021519802.tif 000010
【０１２１】
下記表９にＣＤ３５１をノックダウンするために３種のｓｉＲＮＡを使用した実験群７，８および９と無処理対照群を示した。
【０１２２】
【表９】
2021519802.tif 000011
【０１２３】
全ての実験群は、ＭＣ３８細胞株を注射して１１日目になる日からマウスＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４またはＣＤ３５１をターゲットするｓｉＲＮＡを５日間隔で計３回マウスの腫瘍に注射した。具体的に、ｓｉＲＮＡ１０μｇをＰＢＳ中オリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）７．５μｌと製造会社の指示に従って混合した後、マウスに誘導した腫瘍組織に直接０．５ｍｇ／ｋｇの投与量で注射した。
【０１２４】
３．２．結果
無処理対照群とＫＩＲＲＥＬ３がノックダウンされた実験群８においてマウスの腫瘍の大きさを測定した結果を図２２に示し、ＣＮＴＮ４がノックダウンされた実験群９においてマウスの腫瘍の大きさを測定した結果を図２３に示し、ＣＤ３５１がノックダウンされた実験群７乃至９においてマウスの腫瘍の大きさを測定した結果を図２４ａ乃至図２４ｃに示した。
【０１２５】
無処理対照群は、マウスで腫瘍が生成した以降、持続的に成長することを確認することができた。これに対して、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のいずれか一つがノックダウンされたマウスの腫瘍は、無処理対照群に比してその成長速度が顕著に抑制されることが分かる。これは、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のいずれか一つ以上をブロッキングまたはノックダウンさせてその活性または発現を抑制する場合、がんの発達が遅延または中止され、がんの発生が抑制されるということを示すものである。従って、ＫＩＲＲＥＬ３、ＣＮＴＮ４およびＣＤ３５１のいずれか一つ以上の抑制剤は、がんを予防するために有用に使用され得る。
【０１２６】
当業者は、本明細書に記載された本発明の特定具現例に対する多数の均等物を認知するか、または通常の実験だけで確認することができるだろう。このような均等物は、下記の請求項に含まれるものと意図される。
【図１】
2021519802.tif 000012
【図２】
2021519802.tif 000013
【図３】
2021519802.tif 000014
【図４】
2021519802.tif 000015
【図５】
2021519802.tif 000016
【図６】
2021519802.tif 000017
【図７ａ】
2021519802.tif 000018
【図７ｂ】
2021519802.tif 000019
【図７ｃ】
2021519802.tif 000020
【図７ｄ】
2021519802.tif 000021
【図８ａ】
2021519802.tif 000022
【図８ｂ】
2021519802.tif 000023
【図８ｃ】
2021519802.tif 000024
【図８ｄ】
2021519802.tif 000025
【図９ａ】
2021519802.tif 000026
【図９ｂ】
2021519802.tif 000027
【図９ｃ】
2021519802.tif 000028
【図９ｄ】
2021519802.tif 000029
【図１０ａ】
2021519802.tif 000030
【図１０ｂ】
2021519802.tif 000031
【図１０ｃ】
2021519802.tif 000032
【図１０ｄ】
2021519802.tif 000033
【図１１ａ】
2021519802.tif 000034
【図１１ｂ】
2021519802.tif 000035
【図１１ｃ】
2021519802.tif 000036
【図１１ｄ】
2021519802.tif 000037
【図１２ａ】
2021519802.tif 000038
【図１２ｂ】
2021519802.tif 000039
【図１２ｃ】
2021519802.tif 000040
【図１２ｄ】
2021519802.tif 000041
【図１３ａ】
2021519802.tif 000042
【図１３ｂ】
2021519802.tif 000043
【図１３ｃ】
2021519802.tif 000044
【図１３ｄ】
2021519802.tif 000045
【図１４ａ】
2021519802.tif 000046
【図１４ｂ】
2021519802.tif 000047
【図１４ｃ】
2021519802.tif 000048
【図１４ｄ】
2021519802.tif 000049
【図１５ａ】
2021519802.tif 000050
【図１５ｂ】
2021519802.tif 000051
【図１５ｃ】
2021519802.tif 000052
【図１５ｄ】
2021519802.tif 000053
【図１６ａ】
2021519802.tif 000054
【図１６ｂ】
2021519802.tif 000055
【図１６ｃ】
2021519802.tif 000056
【図１６ｄ】
2021519802.tif 000057
【図１７ａ】
2021519802.tif 000058
【図１７ｂ】
2021519802.tif 000059
【図１７ｃ】
2021519802.tif 000060
【図１７ｄ】
2021519802.tif 000061
【図１８ａ】
2021519802.tif 000062
【図１８ｂ】
2021519802.tif 000063
【図１８ｃ】
2021519802.tif 000064
【図１８ｄ】
2021519802.tif 000065
【図１９ａ】
2021519802.tif 000066
【図１９ｂ】
2021519802.tif 000067
【図１９ｃ】
2021519802.tif 000068
【図１９ｄ】
2021519802.tif 000069
【図２０ａ】
2021519802.tif 000070
【図２０ｂ】
2021519802.tif 000071
【図２０ｃ】
2021519802.tif 000072
【図２０ｄ】
2021519802.tif 000073
【図２１ａ】
2021519802.tif 000074
【図２１ｂ】
2021519802.tif 000075
【図２１ｃ】
2021519802.tif 000076
【図２１ｄ】
2021519802.tif 000077
【図２２】
2021519802.tif 000078
【図２３】
2021519802.tif 000079
【図２４ａ】
2021519802.tif 000080
【図２４ｂ】
2021519802.tif 000081
【図２４ｃ】
2021519802.tif 000082
【配列表】
2021519802000001.app
【国際調査報告】
2021519802.tif 000083
2021519802.tif 000084