(57)【要約】  本発明は、植物から抽出して使用可能なゲニピンの特性によって、従来の毒性の高い架橋剤に比べて高い生体適合性を有するだけでなく、アミン基を有する化合物、例えば、電子伝達媒介体との反応時、ＵＶ測定または存在するアミン基の量を測定して反応の進行程度を簡単に確認でき、さらに、グルコースに対する適切な敏感度を維持しながらも、高濃度のグルコースによるセンサ寿命の急激な減少を抑制できるという利点を有する、ゲニピン（ｇｅｎｉｐｉｎ）またはその誘導体を含む電気化学的バイオセンサのセンシング膜または拡散制御膜を製造するための架橋剤用組成物に関する。  【選択図】  図１
2021525371.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式１のゲニピンを含む電気化学的センサ製造用架橋剤：
【化１】
2021525371.tif 000010
【請求項２】
電気化学的センサのセンシング膜用高分子支持体または拡散制御膜を製造するためのものである、請求項１に記載の架橋剤。
【請求項３】
請求項１に記載の架橋剤を含む電気化学的センサのセンシング膜。
【請求項４】
電子伝達媒介体および酸化還元酵素をさらに含む、請求項３に記載の電気化学的センサのセンシング膜。
【請求項５】
前記酸化還元酵素は、
脱水素酵素（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、酸化酵素（ｏｘｉｄａｓｅ）、およびエステル化酵素（ｅｓｔｅｒａｓｅ）からなる群より選択された１種以上の酸化還元酵素である、請求項４に記載の電気化学的センサのセンシング膜。
【請求項６】
前記酸化還元酵素と共に、
フラビンアデニンジヌクレオチド（ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＮＡＤ）、およびピロロキノリンキノン（Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｑｕｉｎｏｎｅ、ＰＱＱ）からなる群より選択された１種以上の補助因子を含むものである、請求項４に記載の電気化学的センサのセンシング膜。
【請求項７】
請求項１に記載の架橋剤を含む電気化学的センサの拡散制御膜。
【請求項８】
ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ；ＰＶＰ）、ポリビニルイミダゾール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）などのようなＮ原子を有するヘテロ環を有する高分子、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ；ＰＶＡ）、ポリフルオロスルホネート（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ヒドロキシエチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙ  ｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＣＭＣ）、セルロースアセテート（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、ポリアミド（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ）、キトサンおよびゼラチンからなる群より選択される１種以上の高分子をさらに含むものである、請求項７に記載の電気化学的センサの拡散制御膜。
【請求項９】
請求項３に記載のセンシング膜または請求項７に記載の拡散制御膜を含む電気化学的センサ。
【請求項１０】
２種以上の電極、絶縁体（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）および基板をさらに含むものである、請求項９に記載の電気化学的バイオセンサ。
【請求項１１】
前記センサは、血中グルコース測定用である、請求項９に記載の電気化学的センサ。
【請求項１２】
前記センサは、連続的な血糖モニタリングセンサである、請求項１１に記載の電気化学的センサ。
【請求項１３】
ゲニピンを架橋剤として用いてセンシング膜または拡散制御膜を製造する段階を含む、電気化学的バイオセンサの製造方法。
【請求項１４】
電気化学的センサ製造用架橋剤としての、下記の化学式１のゲニピンの用途：
【化２】
2021525371.tif 000011
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１８年６月８日付の韓国特許出願第１０−２０１８−００６６１８８号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含まれる。
【０００２】
本発明は、電気化学的センサの製造に使用される新規な架橋剤に関し、より詳しくは、グルコース測定用電気化学的センサ中のセンシング膜または拡散制御膜の製造に使用されるゲニピンの架橋剤としての新規な用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
最近、医療分野から環境および食品分野まで目標分析物の定量、定性分析のためにバイオセンサの開発への関心がますます増大している。特に、酵素を用いたバイオセンサは、生物体の機能物質または微生物などの生物体が特定物質に敏感に反応する生物感知機能を利用して試料に含有されている化学物質を選択的に検出計測するのに用いる化学センサで、主に血糖センサのような医療計測用途に開発されており、その他、食品工学や環境計測分野の応用においても研究が活発に行われている。
【０００４】
糖尿管理において血糖の周期的な測定は極めて重要であり、よって、携帯用計測器を用いて簡単に血糖を測定できるように多様な血糖測定器が製作されている。このようなバイオセンサの作動原理は光学的方法または電気化学的方法に基づいており、このような電気化学的バイオセンサは、従来の光学的方法によるバイオセンサとは異なって酸素による影響を低減でき、試料が混濁していても試料を別途の前処理なしに使用可能であるという利点を有する。したがって、正確性と精密性を備えた多様な種類の電気化学的バイオセンサが幅広く用いられている。
【０００５】
現在商用化された電気化学的血糖センサは主に酵素電極を用いるものであり、より具体的には、電気的信号を変換できる電極上にグルコース酸化酵素を化学的または物理的方法で固定させた構造を有する。このような電気化学的血糖センサは、血液などの分析物内のグルコースが酵素によって酸化して発生する電子を電極に伝達して生成される電流を測定することによって、分析物内のグルコースの濃度を測定する原理によるものである。このような酵素を安定して固定するためには高分子支持体が必要であり、このような高分子支持体の製造のためには、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、エチレングリコール−ジグリシジルエーテル（ｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ−ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌｅｔｈｅｒ）などのような架橋剤を使用しなければならない。また、このような架橋剤は、生体内の試料から流入するグルコースの量を調節または制限するために使用される拡散制御膜の製造時にも使用可能である。
【０００６】
また、このようなバイオセンサを用いるにあたり、少量の試料で正確かつ迅速な測定値を得ることは使用者の利便性を極大化する点で極めて重要な問題である。
【０００７】
したがって、このような従来の電子伝達媒介体の欠点および測定時間の短縮を達成できる新たな電子伝達媒介体の開発は依然として要求されているのが現状である。
【０００８】
一方、血糖を持続的に観察して糖尿病などの疾患を管理するために連続的な血糖モニタリング（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；ＣＧＭ）システムを用いるが、指先から血液を採取する既存の酵素センサは、採血時、針によって大きな苦痛を誘発するため、測定頻度を制限することから、このようなＣＧＭに利用できない。このような問題点を解消するために、最近は身体に付着可能で侵襲を最小化する改善されたバージョンの酵素センサ（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｓｅｎｓｏｒ；ＣＧＭＳ）が開発されてきている。このような連続的な血糖モニタリング酵素センサの場合、人体内にセンサの一部が入るため、体内に入る部分に含まれうる遷移金属などを含む電子伝達媒介体や電子伝達媒介体を固定する高分子支持体または拡散制御膜の製造に使用され、前記センサに含まれうる架橋剤などが人体に吸収されて毒性および副作用を生じうるという問題点が発生することがあり、これを最小化できる安全な技術または物質の使用が必要でこのような安全な物質の開発が要求されてきている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、血糖を定量および定性分析可能にするセンサ材料、具体的には、電気化学的センサにおいて酵素の安定化および分散（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ）を助ける役割を果たすセンシング膜の高分子支持体の製造または拡散制御膜の製造のために使用される新規な架橋剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するために、本発明は、電気化学的センサにおいてセンシング膜の高分子支持体の製造または拡散制御膜の製造のために使用される、ゲニピンを含む架橋剤、これを用いて製造されたセンシング膜または拡散制御膜および前記センシング膜または拡散制御膜を含む電気化学的センサを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によるゲニピンを含む架橋剤を用いて電気化学的センサのセンシング膜の高分子支持体または拡散制御膜を製造する場合、植物から抽出して使用可能なゲニピンの特性によって、従来の毒性の高い架橋剤に比べて高い生体適合性を有するだけでなく、アミン基を有する化合物、例えば、電子伝達媒介体との反応時、ＵＶ測定または存在するアミン基の量を測定して反応の進行程度を簡単に確認でき、センサとして適切なグルコースに対する敏感度を示すと同時に、高濃度のグルコースによるセンサ寿命の短縮を低減させるという利点を有する点から、電気化学的センサの製造において非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】センシング膜の作製において本発明によるゲニピンを含む架橋剤の有無によるグルコース感応変化を比較したグラフである。図１で、ａは、架橋剤のないセンシング膜を含む電極ａの結果であり、電極ｂは、架橋剤としてゲニピンを用いて製造したセンシング膜を含む電極ｂの結果に相当する。
【図２】本発明によるゲニピンを含む架橋剤を用いて製造したＰＶＩ拡散制御膜の導入の有無によるグルコース感応変化を比較したグラフである。図２で、ｂは、架橋剤としてゲニピンを用いて製造したセンシング膜を有するものの拡散制御膜は有しない電極ｂの結果であり、ｃは、架橋剤としてゲニピンを用いて製造したセンシング膜を有し、拡散制御膜としてゲニピンを架橋剤として用いて製造したＰＶＩ拡散制御膜を有する電極ｃの結果を示す。
【図３】本発明によるゲニピンを含む架橋剤を用いて製造したゼラチン拡散制御膜の導入の有無によるグルコース感応変化を比較したグラフである。図３で、ｂは、架橋剤としてゲニピンを用いて製造したセンシング膜を有するものの拡散制御膜は有しない電極ｂの結果であり、ｄは、架橋剤としてゲニピンを用いて製造したセンシング膜を有し、拡散制御膜としてゲニピンを架橋剤として用いて製造したゼラチン拡散制御膜を有する電極ｄの結果を示す。
【図４】本発明によるゲニピンを含む架橋剤を用いて製造したキトサン拡散制御膜の導入の有無によるグルコース感応変化を比較したグラフである。図４で、ｂは、架橋剤としてゲニピンを用いて製造したセンシング膜を有するものの拡散制御膜は有しない電極ｂの結果であり、ｅは、架橋剤としてゲニピンを用いて製造したセンシング膜を有し、拡散制御膜としてゲニピンを架橋剤として用いて製造したキトサン拡散制御膜を有する電極ｄの結果を示す。
【図５】本発明によるゲニピンを架橋剤として用いた電極ｄの高濃度のグルコースに長期間保管時のグルコース敏感度を確認したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１４】
上記の目的を達成するための一つの態様として、本発明は、ゲニピン（ｇｅｎｉｐｉｎ）またはその誘導体を含む電気化学的バイオセンサのセンシング膜または拡散制御膜を製造するための架橋剤用組成物およびゲニピンの電気化学的バイオセンサの架橋剤としての用途に関する。
【００１５】
本発明における用語「ゲニピン（ｇｅｎｉｐｉｎ）」とは、イリドイド配糖体系の天然成分であるゲニポシド（ｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）の非糖部分であってクチナシ果実（梔子）の主要薬理効能を示す成分を意味し、下記の化学式１で表すことができる。ゲニピンは、胃酸の分泌を促進し、抗酸化作用および酸化窒素（ＮＯ）生成阻害作用または肝毒性モデルで病理学的組織病変を改善させるなど他の薬理学的な用途が報告されているが、本発明で明らかにした電気化学的バイオセンサ、特にバイオセンサで使用されるセンシング膜または拡散制御膜の製造時、高分子の単量体を架橋させる架橋剤としての用途は本発明者によって最初に究明された。
【００１６】
【化１】
2021525371.tif 000003
【００１７】
本発明における用語「ゲニピン（ｇｅｎｉｐｉｎ）の誘導体」とは、ゲニピンと同一の作用を示し、高分子単量体に対する架橋用途がある化合物は制限なく含まれるが、例えば、ゲニポシド（ｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、ゲニポシド酸（ｇｅｎｉｐｉｏｄｉｓｉｃ  ａｃｉｄ）、ペンタ−アセチルゲニポシド（ｐｅｎｔａ−ａｃｅｔｙｌ  ｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，７０（３），９９７−１００４，２００６）、６ａ−ヒドロキシゲニポシド（６ａ−ｈｙｄｒｏｘｙｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、６ｂ−ヒドロキシゲニポシド（６ｂ−ｈｙｄｒｏｘｙｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、６ａ−メトキシゲニポシド（６ａ−ｍｅｔｈｏｘｙｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）または６ｂ−メトキシゲニポシド（６ｂ−ｍｅｔｈｏｘｙｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）である（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，５２（６），７４３−７４７，２００６）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本発明において、前記ゲニピンは、電気化学的センサで測定しようとする代謝物質と反応して還元されて生体の酸化還元反応を触媒する酵素を含むセンシング膜を構成し、酵素の安定化および分散（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ）を助ける役割を果たす水溶性高分子支持体に固定するための架橋剤として使用できる。このような高分子支持体はさらに、センシング膜に含まれる電子伝達媒介体と連結可能であり、この場合、電子伝達媒介体の分子または電子伝達媒介体複合体の末端にアミン基（ＮＨ2）を含む物質を用いて前記ゲニピンと架橋が容易に行われる。
【００１９】
さらに、前記ゲニピンは、電気化学的センサ中の水溶性高分子拡散制御膜の製造において、架橋剤として使用できる。
【００２０】
従来の電気化学的センサにおいて、上記のようなセンシング膜中の高分子支持体または拡散制御膜に使用される架橋剤としては、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、エチレングリコール−ジグリシジルエーテル（ｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ−ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌｅｔｈｅｒ）などのような毒性の高い物質が使用されていたが、このような架橋剤を用いる場合、電気化学的センサ、特に連続的血糖測定センサのように人体に一定部分挿入される部分が存在する場合、それ自体の毒性によって人体に悪い影響を及ぼす可能性が高い。しかし、本発明による架橋剤であるゲニピンは、植物から抽出して使用可能な物質であって、従来の毒性の高い架橋剤に比べて高い生体適合性を有する点から、電気化学的センサの製造において非常に有用であるという利点を有する。さらに、アミン基を有する化合物、例えば、電子伝達媒介体との反応時、ＵＶ測定または存在するアミン基の量を測定して反応の進行程度を簡単に確認できるという利点も有している。
【００２１】
本発明によるゲニピンを架橋剤として使用可能な高分子としては、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ；ＰＶＰ）、ポリビニルイミダゾール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）などのようなＮ原子を有するヘテロ環を有する高分子、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ；ＰＶＡ）、ポリフルオロスルホネート（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ヒドロキシエチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙ  ｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＣＭＣ）、セルロースアセテート（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、ポリアミド（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ）、キトサンおよびゼラチンなどがあるが、これらに限定されるものではない。本発明によるゲニピンは前記高分子の架橋に十分な水準で使用できる。
【００２２】
他の態様として、本発明は、前記ゲニピンを架橋剤として用いて製造された電気化学的センサ用センシング膜に関する。前記センシング膜は、ゲニピンを架橋剤として含んで製造された高分子支持体の他に、電子伝達媒介体および酸化還元酵素を含むことができる。
【００２３】
酸化還元酵素は、生体の酸化還元反応を触媒する酵素を総称するもので、本発明では、測定しようとする対象物質、例えば、バイオセンサの場合には、測定しようとする代謝物質と反応して還元される酵素を意味する。このように還元された酵素は電子伝達媒介体と反応し、この時発生した電流変化などの信号を測定して代謝物質を定量する。本発明に使用可能な酸化還元酵素は、各種脱水素酵素（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、酸化酵素（ｏｘｉｄａｓｅ）、エステル化酵素（ｅｓｔｅｒａｓｅ）などからなる群より選択された１種以上であってもよいし、酸化還元または検出対象物質によって、前記酵素群に属する酵素の中から前記対象物質を基質とする酵素を選択して使用することができる。
【００２４】
より具体的には、前記酸化還元酵素は、グルコース脱水素酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、グルタミン酸脱水素酵素（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、グルコース酸化酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）、コレステロール酸化酵素（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ）、コレステロールエステル化酵素（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｓｔｅｒａｓｅ）、ラクテート酸化酵素（ｌａｃｔａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）、アスコルビン酸酸化酵素（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ）、アルコール酸化酵素（ａｌｃｏｈｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ）、アルコール脱水素酵素（ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ビリルビン酸化酵素（ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｏｘｉｄａｓｅ）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００２５】
一方、前記酸化還元酵素は、測定しようとする対象物質（例えば、代謝物質）から酸化還元酵素が奪ってきた水素を保管する役割を果たす補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）を共に含むことができるが、例えば、フラビンアデニンジヌクレオチド （ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＮＡＤ）、ピロロキノリンキノン（Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｑｕｉｎｏｎｅ、ＰＱＱ）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００２６】
また、電子伝達媒介体は、代謝物質と反応して還元された酵素と酸化還元反応して還元され、このように形成された還元状態の電子伝達媒介体は、酸化電位が印加された電極表面で電流を発生させる役割を果たす。このような電子伝達媒介体は１種または２種以上であってもよく、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｏｓ、Ｒｈ、Ｍｏ、およびＩｒからなる群より選択された１種以上を含む金属含有錯体であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００２７】
さらに他の態様として、本発明は、前記ゲニピンを架橋剤として用いて製造された電気化学的センサに関する。前記電気化学的センサは、好ましくは、血中グルコースを測定するための電気化学的センサであってもよいし、さらに好ましくは、連続的な血糖モニタリングセンサであってもよい。
【００２８】
具体的には、前記電気化学的バイオセンサの種類には制限がないが、好ましくは、連続的な血糖モニタリングセンサであってもよい。
【００２９】
このような連続的な血糖モニタリングセンサの構成として、本発明は、例えば、電極、絶縁体（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）、基板、前記電子伝達媒介体および酸化還元酵素を含むセンシング膜（ｓｅｎｓｉｎｇ  ｌａｙｅｒ）、拡散制御膜（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｌａｙｅｒ）、保護膜（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｌａｙｅｒ）などを含むことができる。電極の場合、作動電極および対向電極のような２種の電極を含んでもよく、作動電極、対向電極および基準電極のような３種の電極を含んでもよい。一実施形態において、本発明によるバイオセンサは、少なくとも２つ、好ましくは、２つまたは３つの電極を備えた基板に、電子伝達媒介体と液体性生体試料を酸化還元させることができる酵素を含む試薬組成物を塗布した後、乾燥して作製した電気化学的バイオセンサであってもよい。例えば、電気化学的バイオセンサにおいて、作動電極および対向電極が基板の互いに反対面に備えられ、前記作動電極上に本発明によるゲニピンを用いて架橋されたセンシング膜が積層され、作動電極および対向電極が備えられた基板の両面に、順次に、絶縁体、ゲニピンを用いて架橋された拡散制御膜および保護膜が積層されることを特徴とする平面型電気化学的バイオセンサが提供される。
【００３０】
具体的な態様として、前記基板は、ＰＥＴ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）、ＰＣ（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）およびＰＩ（ｐｏｌｙｉｍｉｄｅ）からなる群より選択される１種以上の素材からなるものであってもよい。
【００３１】
また、作動電極は、炭素、金、白金、銀または銀／塩化銀電極を使用することができる。
【００３２】
さらに、２電極を有する電気化学的バイオセンサの場合、対向電極が基準電極の役割まで一緒に果たすため、対向電極として金、白金、銀または銀／塩化銀電極を使用することができ、基準電極まで含む３電極の電気化学的バイオセンサの場合、基準電極として金、白金、銀または銀／塩化銀電極を使用することができ、対向電極として炭素電極を使用することができる。
【００３３】
制限されない例として、２電極の場合、対向電極が基準電極の役割まで一緒に果たすため、塩化銀または銀が使用可能であり、３電極の場合、基準電極は塩化銀または銀が使用され、対向電極は炭素電極を使用することができる。
【００３４】
さらに他の態様として、本発明は、ゲニピンを架橋剤として用いてセンシング膜または拡散制御膜を製造する段階を含む、電気化学的バイオセンサの製造方法に関する。このような本発明による電気化学的バイオセンサの製造方法は、ゲニピンをセンシング膜または拡散制御膜の製造のための架橋剤として用いることを特徴とし、具体的な製造工程、試薬などは、電気化学的バイオセンサの製造方法を制限なく使用することができる。好ましくは、前記電気化学的バイオセンサの製造方法によれば、高濃度のグルコースに対する感応線形性および電極の寿命が増加したバイオセンサを提供することができる。
【００３５】
具体的な一実施例において、本発明者らは、ゲニピンを架橋剤として用いて電子伝達媒介体としてオスミウム−重合体であるＰＶＩ−Ｏｓ（ｂｐｙ）2Ｃｌを合成してこれを用いてセンシング膜を製造し、また、ゲニピンを架橋剤として用いて拡散制御膜を製造して作動電極を製造し、これを架橋剤を用いずに製造したオスミウム−重合体を含むセンシング膜および拡散制御膜を用いた作動電極を製造して、電気化学的センサとしての性能を確認した。その結果、ゲニピンを含む架橋剤を用いたセンシング膜を電極に適用させる場合、電極表面にセンシング膜が効果的に形成されて敏感度が上昇するという効果を有し、ゲニピンを含む架橋剤を用いた拡散制御膜を電極に適用させる場合、グルコースの拡散を減少させて高濃度のグルコースに対する感応線形性を向上させることができ、同時に高濃度のグルコースによる電極の損傷による電極の急激な寿命減少を短縮させることができるという効果を示すことを確認できて、ゲニピンは、電気化学的センサの製造、特にセンサ膜または拡散制御膜の製造において非常に有用な架橋剤として使用できるということを確認した。
【００３６】
以下、本発明を下記の実施例によりさらに詳しく説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００３７】
［実施例］
参照例１：電子伝達媒介体オスミウム−重合体（Ｏｓ−ｐｏｌｙｍｅｒ）の合成
センシング膜の製造のために、下記の化学式２を有するオスミウム−重合体（ＰＶＩ−Ｏｓ（ｂｐｙ）2Ｃｌ2）を製造した。
【００３８】
【化２】
2021525371.tif 000004
【００３９】
１−１：Ｏｓ（ｂｐｙ）2Ｃｌ2の合成
ＰＶＩ−Ｏｓ（ｂｐｙ）2Ｃｌ2の製造のために、まず、下記の反応式１によりＯｓ（ｂｐｙ）2Ｃｌ2を合成した。
【００４０】
【化３】
2021525371.tif 000005
【００４１】
２５０ｍｌの丸底フラスコに、アンモニウムヘキサクロロオスメート（ＩＶ）５ｇ（１１．４ｍｍｏｌ）、２，２−ビピリジン３．５６ｇ（２２．８ｍｍｏｌ）、エチレングリコール１５０ｍｌを添加した後、温度を１８０℃に上げて１時間撹拌した。反応終結後、前記反応液を常温に温度を下げ、ソジウムヒドロスルファイト還元剤１Ｍ水溶液２０Ｌを添加して生成された固体をろ過して、蒸留水、エチレンエーテルで洗浄、乾燥してＯｓ（ｂｐｙ）2Ｃｌ2を得た。（１ｇ／７７％）ＨＲＭＳ（Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  ５７４．０３６７、Ｆｏｕｎｄ：５７４．０３６２）
【００４２】
１−２：ＰＶＩ−Ｏｓ（ｂｐｙ）2Ｃｌの合成
前記参照例１−１で製造されたＯｓ（ｂｐｙ）2Ｃｌ2を用いて、下記の反応式１によりＰＶＩ−Ｏｓ（ｂｐｙ）2Ｃｌを合成した。
【００４３】
【化４】
2021525371.tif 000006
【００４４】
１００ｍｌの丸底フラスコに、ＰＶＩ０．８２ｇ（８．７ｍｍｏｌ）、Ｏｓ（ｂｐｙ）2Ｃｌ2  １ｇ（１．７４ｍｍｏｌ）、エタノール２５−３０ｍｌを添加した後、温度を１００℃に上げて３日間撹拌した。反応終結後、前記反応液を常温に温度を下げた後、エーテル溶液１Ｌに滴下して沈殿物を生成した。生成された固体をろ過してエーテルで洗浄、乾燥してＰＶＩ−Ｏｓ（ｂｐｙ）2Ｃｌを得た。（１．５ｇ／８２％）
【００４５】
実施例１：センシング膜の製造
本発明によるゲニピンを含む電気化学的センサ製造用架橋剤の性能を確認するために、次の実験方法により、ゲニピン（Ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ、製品番号ｇ４７９６）を用いたセンシング膜を下記の表１による組成および重量比によって製造した。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
（１）参考例１で製造されたオスミウム−重合体（Ｏｓ−ｐｏｌｙｍｅｒ）１０ｍｇを０．１Ｍ酢酸バッファー（ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｕｆｆｅｒ；ｐＨ５．０）溶液１ｍＬに溶かした。
【００４８】
（２）ゲニピン５ｍｇをＤＭＳＯと脱イオン水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｗａｔｅｒ）を１：９で混合した溶液１ｍＬに溶かした。
【００４９】
（３）グルコース酸化酵素４０ｍｇを脱イオン水１ｍＬに溶かした。
【００５０】
（４）段階（１）で製造された４００ｕＬのＯｓ−ｐｏｌｙｍｅｒ溶液に一定量のＯｓ−ｐｏｌｙｍｅｒ溶液に、段階（２）で製造された８０ｕＬのゲニピン溶液を入れて３０分間反応させて、Ｏｓ−ｐｏｌｙｍｅｒおよびゲニピンを含む反応溶液を製造した。
【００５１】
（５）段階（４）で製造されたＯｓ−ｐｏｌｙｍｅｒおよびゲニピンを含む反応溶液に、段階（３）で製造された６７ｕＬのグルコース酸化酵素溶液を入れて１０分間反応させた。
【００５２】
（６）Ｃａｒｂｏｎ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ電極に、前記段階（５）で製造した溶液５μＬを落とした後、２３℃で２４時間乾燥させた。
【００５３】
実施例２：拡散制御膜の製造
次の段階により、電気化学的センサ製造のための拡散制御膜を下記の表２による組成および重量比によって製造した。
【００５４】
【表２】
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【００５５】
（１）ポリビニルイミダゾール（ＰＶＩ）１０ｍｇを０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）溶液１ｍＬに溶かした。
【００５６】
（２）ゼラチン１０ｍｇを０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）溶液１ｍＬに溶かした。
【００５７】
（３）キトサン５ｍｇを０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）溶液１ｍＬに溶かした。
【００５８】
（４）ゲニピン５ｍｇをＤＭＳＯと脱イオン水を１：９で混合した溶液１ｍＬに溶かした。
【００５９】
（５）ＰＶＩ溶液と段階（４）で製造されたゲニピン溶液、段階（２）で製造されたゼラチン溶液とゲニピン溶液、前記段階（３）で製造されたキトサン溶液とゲニピン溶液を表２の重量比に合わせてそれぞれ混合し、１時間反応させた。
【００６０】
（６）センシング膜上に１０μＬを落とした後、２３℃で２４時間乾燥させて拡散制御膜を製造した。
【００６１】
実施例３：作動電極の製造
実施例１および２で製造されたセンシング膜および拡散制御膜を用いて作動電極を製造した。
【００６２】
スクリーンプリントされた炭素電極（ｓｃｒｅｅｎ  ｐｒｉｎｔｅｄ  ｃａｒｂｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ；直径：５ｍｍ）を使用し、電極ａおよびｂの場合、実施例１で製造されたセンシング膜をそれぞれ前記炭素電極上に載せて乾燥させて作動電極を製造した。また、電極ｃ、ｄおよびｅの場合、実施例１で製造されたセンシング膜をそれぞれ前記炭素電極上に載せて乾燥させ、この後、実施例２で製造された拡散制御膜をそれぞれ前記センシング膜上に積層させて乾燥させて作動電極を製造した。
【００６３】
実験例１：電気化学的センサの性能の確認
本発明によるゲニピンを含む架橋剤を含む電気化学的センサの性能を確認すべく、次の実験条件および方法により、グルコースの濃度に応じた電気的信号の変化を測定した。
【００６４】
実験材料／条件
作動電極（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）：実施例３で製造された電極ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅ
基準電極（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）：Ａｇ／ＡｇＣｌ電極
対向電極（Ｃｏｕｎｔｅｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）：白金ロッド（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ｒｏｄ）
【００６５】
試験パラメータ
−装置：ＣＨＩ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｉ−ｔ  ｃｕｒｖｅ
−印加電位（ａｐｐｌｉｅｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）：０．３５Ｖ
−ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ：１０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ）
【００６６】
実験方法
ビーカーにＰＢＳ溶液５０ｍＬを入れて、実施例１および２で製造されたセンシング膜および／または拡散制御膜を含む電極を浸漬した後、３０分間安定化させた。安定化が完了すると、高濃度のグルコース溶液を前記ＰＢＳバッファー（１０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ））が入っているビーカーに添加し、これに電極を浸漬して濃度に応じた信号の変化を測定した。グルコースの濃度はそれぞれ１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭおよび５Ｍｍとなるようにした。この実験結果をそれぞれ図１〜４、そして表３に示した。
【００６７】
【表３】
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【００６８】
表３および図１から確認できるように、本発明による架橋剤を含まないセンシング膜を含む電極ａと、ゲニピンを含む架橋剤を用いて製造したセンシング膜を含む電極ｂを、それぞれグルコースが含まれている緩衝溶液に浸漬した場合、架橋剤なしに作製された電極ａは電極表面で継続して溶出が発生することを確認できた。
【００６９】
また、敏感度を比較すれば、架橋剤を用いずに作製したセンシング膜に比べて、架橋剤を用いて作製したセンシング膜の敏感度が７．１倍向上する結果を得ることができた。
【００７０】
このような結果によれば、本発明によるゲニピンを含む架橋剤を用いる場合、架橋剤を用いなかった場合よりも、電極表面にセンシング膜が効果的に形成されたことを間接的に確認できた。
【００７１】
さらに、表３および図２から確認できるように、ＰＶＩを拡散制御膜に導入した時のグルコース感応変化を比較した結果、グルコースの拡散程度を低下させるために、架橋剤としてゲニピンとＰＶＩを架橋して製造した拡散制御膜を有する電極ｃは、拡散制御膜を有しない電極ｂに比べて敏感度が約１／５０に低くなる効果を奏することができた。
【００７２】
また、表３および図３から確認できるように、ゼラチンを拡散制御膜に導入した時のグルコース感応変化を比較した結果、グルコースの拡散程度を低下させるために、架橋剤のゲニピンとゼラチンを架橋して製造した拡散制御膜を有するセンサｄは、拡散制御膜を有しない電極ｂに比べて敏感度が約１／６に低くなる効果を奏することができた。
【００７３】
さらに、表３および図４から確認できるように、キトサンを拡散制御膜に導入した時のグルコース感応変化を比較した結果、グルコースの拡散程度を低下させるために、架橋剤のゲニピンとキトサンを架橋して製造した拡散制御膜を有するセンサｅは、拡散制御膜を有しない電極ｂに比べて敏感度が約１／１０に低くなる効果を奏することができた。
【００７４】
このような結果をまとめると、ゲニピンを含む架橋剤を用いたセンシング膜を電極に適用させる場合、電極表面にセンシング膜が効果的に形成されて敏感度が上昇するという効果を有し、ゲニピンを含む架橋剤を用いた拡散制御膜を電極に適用させる場合、グルコースの拡散を減少させて高濃度のグルコースに対する感応線形性を向上させることができ、同時に高濃度のグルコースによる電極の損傷による電極の急激な寿命短縮を低減させることができるという効果を示すことを確認できた。
【００７５】
実験例２：時間によるセンサ性能の確認試験
実施例３により製造された電極ｄを用いて時間によるセンサの性能を確認した。１日目に、実験例１と同様の方法により、グルコースの濃度別（１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭおよび５Ｍｍ）によるセンサの電気的信号を測定し、この後、前記センサを高濃度のグルコース（５ｍＭ）を含むＰＢＳ緩衝溶液に浸漬した後、印加電位として０．３５Ｖをかけながら３日間保管した。
【００７６】
保管中の２日目および３日目に、それぞれ前記高濃度のグルコースに保管されていた電極を用いて、１日目と同様に、濃度に応じたセンサの敏感度を確認して、その結果を図５に示した。
【００７７】
図５から分かるように、１日目のセンサの敏感度傾きを基準として、２日目および３日目の傾きが９８．８％まで維持されることを確認できた。これはつまり、本発明によるゲニピンを含む架橋剤を用いてセンシング膜や拡散制御膜を製造してこれを電極に適用する場合、センサとして適切なグルコースに対する敏感度を示すと同時に、高濃度のグルコースによるセンサ寿命の短縮を低減させるという利点を有する点から、電気化学的センサの製造において非常に有用であることを確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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