(57)【要約】  抗ＣＤ１９重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂｓ（商標））、ならびにかかる抗体の作製方法、かかる抗体を含む医薬組成物を含む組成物、及びＣＤ１９の発現を特徴とするＢ細胞疾患を治療するためのそれらの使用を開示する。【選択図】図５Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１９に結合する重鎖単独抗体であって、
（ａ）配列番号１〜６のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ１、及び／または
（ｂ）配列番号７〜１２のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）配列番号１３に２個以下の置換を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、前記重鎖単独抗体。
【請求項２】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列がヒトフレームワーク内に存在する、請求項１に記載の重鎖単独抗体。
【請求項３】
ＣＨ１配列を含まず、重鎖定常領域配列をさらに含む、請求項１に記載の重鎖単独抗体。
【請求項４】
（ａ）配列番号１〜６からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、及び／または
（ｂ）配列番号７〜１２からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び／または
（ｃ）配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の重鎖単独抗体。
【請求項５】
（ａ）配列番号１〜６からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、及び
（ｂ）配列番号７〜１２からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び
（ｃ）配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む、請求項４に記載の重鎖単独抗体。
【請求項６】
配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１０のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む、請求項５に記載の重鎖単独抗体。
【請求項７】
配列番号１４〜２１の配列のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の重鎖単独抗体。
【請求項８】
配列番号１４〜２１からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む、請求項７の重鎖単独抗体。
【請求項９】
配列番号１７の重鎖可変領域配列を含む、請求項８に記載の重鎖単独抗体。
【請求項１０】
ＣＤ１９に結合する重鎖単独抗体であって、
（ａ）下式のＣＤＲ１配列：
Ｇ Ｆ Ｘ１ Ｆ Ｓ Ｘ２ Ｘ３ Ｗ （配列番号２２）
［式中、Ｘ１は、ＴまたはＳであり、
Ｘ２は、ＳまたはＮであり、
Ｘ３は、ＹまたはＦである］及び
（ｂ）下式のＣＤＲ２配列：
Ｘ４ Ｘ５ Ｘ６ Ｘ７ Ｇ Ｓ Ｘ８Ｘ９ （配列番号２３）
［式中、Ｘ４は、ＩまたはＭであり、
Ｘ５は、Ｎ、Ｓ、またはＫであり、
Ｘ６は、ＱまたはＫであり、
Ｘ７は、ＤまたはＡであり、
Ｘ８は、ＤまたはＥであり、
Ｘ９は、ＫまたはＥである］及び
（ｃ）ＡＳＧＶＹＳＦＤＹ（配列番号１３）のＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む、前記重鎖単独抗体。
【請求項１１】
ＣＤ１９に結合する重鎖単独抗体であって、ヒトＶＨフレームワーク内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含み、前記各ＣＤＲ配列が、配列番号１〜１３からなる群から選択されるＣＤＲ配列に２個以下の置換を有する配列である、重鎖単独抗体。
【請求項１２】
ヒトＶＨフレームワーク内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含み、前記各ＣＤＲ配列が、配列番号１〜１３からなる群から選択される、請求項１１に記載の重鎖単独抗体。
【請求項１３】
ＣＤ１９に結合する重鎖単独抗体であって、
ヒトＶＨフレームワーク内に配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１０のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む、前記重鎖単独抗体。
【請求項１４】
多重特異性である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の重鎖単独抗体。
【請求項１５】
二重特異性である、請求項１４に記載の重鎖単独抗体。
【請求項１６】
２つの異なるＣＤ１９タンパク質に結合親和性を有する、請求項１５に記載の重鎖単独抗体。
【請求項１７】
同じＣＤ１９タンパク質上の２つの異なるエピトープに結合親和性を有する、請求項１５に記載の重鎖単独抗体。
【請求項１８】
エフェクター細胞に結合親和性を有する、請求項１４に記載の重鎖単独抗体。
【請求項１９】
Ｔ細胞抗原に結合親和性を有する、請求項１４に記載の重鎖単独抗体。
【請求項２０】
ＣＤ３に結合親和性を有する、請求項１９に記載の重鎖単独抗体。
【請求項２１】
ＣＡＲ−Ｔフォーマットである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の重鎖単独抗体。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の重鎖単独抗体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
ＣＤ１９の発現を特徴とするＢ細胞疾患を治療するための方法であって、前記疾患を有する対象に請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体または請求項２２に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２４】
前記疾患が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記疾患が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記疾患が、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
請求項1〜２１のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項３０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３２】
請求項３１に記載のベクターを含む細胞。
【請求項３３】
抗体の発現を許容する条件下で請求項３２に記載の細胞を増殖させることと、前記細胞及び／または前記細胞を増殖させた細胞培養培地から前記抗体を単離することと、を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体を産生する方法。
【請求項３４】
ＵｎｉＲａｔ動物をＣＤ１９で免疫することと、ＣＤ１９結合重鎖配列を同定することと、を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体を製造する方法。
【請求項３５】
治療を要する個体に、有効量の請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体、または請求項２２に記載の医薬組成物を投与することを含む、治療方法。
【請求項３６】
治療を要する個体における疾患または障害の治療用の薬剤の調製における請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項３７】
治療を要する個体の治療に使用するための、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体、または請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体、または請求項２２に記載の医薬組成物と、使用説明書と、を含む、治療を要する個体の疾患または障害を治療するためのキット。
【請求項３９】
少なくとも１つのさらなる試薬をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記少なくとも１つのさらなる試薬が、化学療法薬を含む、請求項３９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、本明細書にその開示内容の全容を参照により援用するところの２０１８年７月２０日出願の米国特許仮出願第６２／７０１，２８１号に対する優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、ＣＤ１９に結合するヒト重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂｓ（商標））に関する。本発明はさらに、かかる抗体の作製方法、かかる抗体を含む医薬組成物を含む組成物、及びＣＤ１９の発現を特徴とするＢ細胞疾患を治療するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ１９
ＣＤ１９は、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１５３９１）としても知られ、すべてのヒトＢ細胞で発現するが形質細胞にはみられない細胞表面受容体である。ＣＤ１９は、細胞質のシグナル伝達タンパク質を膜に動員し、ＣＤ１９／ＣＤ２１複合体内でＢ細胞受容体シグナル伝達経路の閾値を低下させるように働く膜貫通タンパク質である。ＣＤ１９は、比較的大きな、アミノ酸２４０個からなる細胞質内尾部を有している。細胞外のＩｇ様ドメインは、潜在的なジスルフィド結合非Ｉｇ様ドメインとＮ結合炭水化物付加部位とによって分けられている。細胞質の尾部には、Ｃ末端近くに少なくとも９つのチロシン残基が含まれており、そのうちのいくつかはリン酸化されていることが示されている。ＣＤ２０及びＣＤ２２とともに、ＣＤ１９のＢ細胞系統での制限された発現のため、ＣＤ１９はＢ細胞悪性疾患の治療の魅力的な標的となっている。ＣＤ１９に特異的な多くのモノクローナル抗体及び抗体薬物複合体が報告されている（例えば、Ｎａｄｄａｆｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１５，ＰＭＣ４６４４５２５）。さらに、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体Ｔ細胞が白血病を治療する目的で承認されている（例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１７，ＰＭＩＤ：２９２４５００５）。
重鎖抗体
【０００４】
従来のＩｇＧ抗体では、重鎖と軽鎖との会合は、軽鎖定常領域と重鎖のＣＨ１定常ドメインとの間の疎水性相互作用に一部依っている。重鎖のフレームワーク２（ＦＲ２）及びフレームワーク４（ＦＲ４）領域には、重鎖と軽鎖の間のこの疎水性相互作用にやはり寄与するさらなる残基が存在する。
【０００５】
ただし、ラクダ（ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマを含むラクダ亜目 ）の血清には、Ｈ鎖のペアのみで構成される主要なタイプの抗体（重鎖単独抗体、またはＵｎｉＡｂｓ（商標））が含まれていることが知られている。ラクダ科（ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）、フタコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）、ラマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）、グアナコ（Ｌａｍａ  ｇｕａｎａｃｏ）、アルパカ（Ｌａｍａ  ａｌｐａｃａ）及びビクーニャ（Ｌａｍａ  ｖｉｃｕｇｎａ））のＵｎｉＡｂｓ（商標）は、１個の可変ドメイン（ＶＨＨ）、ヒンジ領域、及び２個の定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）からなる固有の構造を有しており、２個の定常ドメインは古典的な抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインと高度な相同性を有している。これらのＵｎｉＡｂｓ（商標）は、定常領域の第１のドメイン（ＣＨ１）を欠いており、これはゲノム中に存在するがｍＲＮＡプロセシングの間にスプライスされる。ＣＨ１ドメインがないことは、このドメインが軽鎖の定常ドメインの固定位置であることから、ＵｎｉＡｂｓ（商標）に軽鎖がないことを説明する。こうしたＵｎｉＡｂｓ（商標）は、従来の抗体、またはそのフラグメントに由来する３つのＣＤＲによって抗原結合特異性及び高い親和性を与えるように自然に進化したものである（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，  ２００１；  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７４：２７７−３０２；  Ｒｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：１１１−１２４）。サメなどの軟骨魚類も、ＩｇＮＡＲと呼ばれる異なるタイプの免疫グロブリンを進化させており、これは、軽鎖のポリペプチド鎖を欠き、全体が重鎖で構成されている。ＩｇＮＡＲ分子は、分子工学によって操作して単一の重鎖ポリペプチドの可変ドメイン（ｖＮＡＲ）を生成することができる（Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３−３５５４（２００３）；Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ５５，１８７−１９７（２００４）；Ｄｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４０，２５−３３（２００３））。
【０００６】
軽鎖を欠く重鎖単独抗体が抗原に結合する能力は、１９６０年代に確立されている（Ｊａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５−４１９５）。軽鎖から物理的に分離された重鎖免疫グロブリンは、四量体抗体と比較して抗原結合活性の８０％を維持していた。Ｓｉｔｉａ  ｅｔ  ａｌ.（１９９０） Ｃｅｌｌ，６０，７８１−７９０は、再構成後のマウスμ遺伝子からのＣＨ１ドメインを除去することによって、哺乳動物細胞培養中で軽鎖を欠く重鎖単独抗体が産生されることを示している。産生された抗体は、ＶＨの結合特異性及びエフェクター機能を保持していた。
【０００７】
免疫によって様々な抗原に対する高い特異性と親和性を有する重鎖抗体を生成することが可能であり（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４３１，３７−４６ （１９９９））、また、ＶＨＨ部分は、容易に酵母にクローニングして発現させることができる（Ｆｒｅｎｋｅｎ， Ｌ．Ｇ． Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８，１１−２１（２０００））。それらの発現、溶解度及び安定性のレベルは、古典的なＦ（ａｂ）またはＦｖフラグメントのものより有意に高い（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，５２１−５２６（１９９７））。
【０００８】
λ（ラムダ）軽（Ｌ）鎖遺伝子座及び／またはλ及びκ（カッパ）Ｌ鎖遺伝子座が機能的にサイレンシングされたマウス、及びそのようなマウスによって産生される抗体が、米国特許第７，５４１，５１３号及び同第８，３６７，８８８号に記載されている 。マウス及びラットにおける重鎖単独抗体の組換え産生については、例えば、ＷＯ２００６００８５４８号、米国特許出願公開第２０１００１２２３５８号；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１０９（１），９３−１０１；Ｂｒuｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．     Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；２００６，２６（５）：３７７−９０；及びＺｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７， Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ；２０４（１３）： ３２７１-３２８３に報告されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼの胚マイクロインジェクションによるノックアウトラットの作製は、Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５（５９３９）：４３３に記載されている。可溶性の重鎖単独抗体及びそのような抗体を産生する異種重鎖遺伝子座を有するトランスジェニックげっ歯類は、米国特許第８，８８３，１５０号及び第９，３６５，６５５号に記載されている。結合（ターゲティング）ドメインとしてのシングルドメイン抗体を含むＣＡＲ−Ｔ構造が、例えば、Ｉｒｉ−Ｓｏｆｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１７：２６３０−２６４１及びＪａｍｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１８４０：３７８−３８６．に記載されている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の各態様は、ＣＤ１９に対する結合親和性を有する、ＵｎｉＡｂｓ（商標）を含む（ただし、これに限定されない）重鎖抗体に関する。本発明のさらなる態様は、かかる抗体の作製方法、かかる抗体を含む組成物、及びＣＤ１９の発現を特徴とするＢ細胞疾患の治療におけるそれらの使用に関する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ＣＤ１９に結合する重鎖単独抗体は、以下を含む重鎖可変領域を含む：（ａ）配列番号１〜６のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ１、及び／または（ｂ）配列番号７〜１２のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ２、及び／または（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列に２つ以下の置換を有するＣＤＲ３。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、ヒトフレームワーク内に存在する。いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、ＣＨ１配列の存在しない重鎖定常領域配列をさらに含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、（ａ）配列番号１〜６からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、及び／または（ｂ）配列番号７〜１２からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び／または（ｃ）配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、（ａ）配列番号１〜６からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、及び（ｂ）配列番号７〜１２からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び（ｃ）配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、（ａ）配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１０のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、配列番号１４〜２１の配列のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、配列番号１４〜２１からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、配列番号１７の重鎖可変領域配列を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＣＤ１９に結合する重鎖単独抗体は、（ａ）下式のＣＤＲ１配列：
Ｇ Ｆ Ｘ１ Ｆ Ｓ Ｘ２ Ｘ３ Ｗ （配列番号２２）
［式中、Ｘ１は、ＴまたはＳであり、Ｘ２は、ＳまたはＮであり、Ｘ３は、ＹまたはＦである］及び（ｂ）下式のＣＤＲ２配列：
Ｘ４Ｘ５ Ｘ６ Ｘ７ Ｇ Ｓ Ｘ８ Ｘ９ （配列番号２３）
［式中、Ｘ４は、ＩまたはＭであり、Ｘ５は、Ｎ、Ｓ、またはＫであり、Ｘ６は、ＱまたはＫであり、Ｘ７は、ＤまたはＡであり、Ｘ８は、ＤまたはＥであり、Ｘ９は、ＫまたはＥである］及び（ｃ）ＡＳＧＶＹＳＦＤＹ（配列番号１３）のＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＣＤ１９に結合する重鎖単独抗体は、ヒトＶＨフレームワーク内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含み、各ＣＤＲ配列は、配列番号１〜１３からなる群から選択されるＣＤＲ配列に２個以下の置換を有する配列である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、ヒトＶＨフレームワーク内にＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含み、各ＣＤＲ配列は、配列番号１〜１３からなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ＣＤ１９に結合する重鎖単独抗体は、ヒトＶＨフレームワーク内に、（ａ）配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１０のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、多重特異性である。いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、二重特異性である。いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、２つの異なるＣＤ１９タンパク質に結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、同じＣＤ１９タンパク質上の２つの異なるエピトープに結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、エフェクター細胞に結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、Ｔ細胞抗原に結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、ＣＤ３に結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、ＣＡＲ−Ｔフォーマットである。
【００１８】
本発明の態様は、本明細書に記載される重鎖単独抗体を含む医薬組成物に関する。
【００１９】
本発明の態様は、ＣＤ１９の発現を特徴とするＢ細胞疾患を治療するための方法であって、前記疾患を有する対象に本明細書に記載される抗体または医薬組成物を投与することを含む方法に関する。いくつかの実施形態において、疾患は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。いくつかの実施形態において、疾患は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である。いくつかの実施形態において、疾患は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。いくつかの実施形態において、疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。いくつかの実施形態において、疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）である。いくつかの実施形態において、疾患は、多発性骨髄腫（ＭＳ）である。
【００２０】
本発明の態様は、本明細書に記載される抗体をコードするポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドを含むベクター、及びかかるベクターを含む細胞に関する。
【００２１】
本発明の態様は、本明細書に記載の抗体を産生する方法であって、抗体の発現を許容する条件下で本明細書に記載される細胞を増殖させることと、前記細胞及び／または細胞を増殖させた細胞培養培地から抗体を単離することと、を含む方法に関する。
【００２２】
本発明の態様は、本明細書に記載される抗体を製造する方法であって、ＵｎｉＲａｔ動物をＣＤ１９で免疫することと、ＣＤ１９結合重鎖配列を同定することと、を含む方法に関する。
【００２３】
本発明の態様は、治療を要する個体に有効量の本明細書に記載される抗体または医薬組成物を投与することを含む、治療方法に関する。
【００２４】
本発明の態様は、治療を要する個体の疾患または障害の治療用の薬剤の調製における本明細書に記載される抗体または医薬組成物の使用に関する。
【００２５】
本発明の態様は、治療を要する個体の疾患または障害を治療するためのキットであって、本明細書に記載される抗体または医薬組成物と、使用説明書と、を含むキットに関する。いくつかの実施形態において、キットは、少なくとも１つのさらなる試薬をさらに含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる試薬は、化学療法薬を含む。
【００２６】
これらの態様及びさらなる態様は、実施例を含む、本開示の残りの部分でさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】抗ＣＤ１９重鎖抗体の固有のＣＤＲアミノ酸配列を示す。
【図２】抗ＣＤ１９重鎖抗体の可変ドメインアミノ酸配列を示す。
【図３】抗ＣＤ１９重鎖抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【図４】抗ＣＤ１９重鎖抗体の生物学的活性を示す。
【図５Ａ】特異的溶解度（％）を抗体濃度の関数として示すグラフである。
【図５Ｂ】本発明の一実施形態による、二重特異性抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３の模式図である。
【図６】タンパク質結合反応を時間の関数として示すグラフである。
【図７】腫瘍モデル実験における腫瘍負荷を時間（移植後日数）の関数として示すグラフである。
【図８】標的細胞の溶解度（細胞傷害性）を抗体濃度の関数として示すグラフである。
【図９】放出されたサイトカインの濃度を抗体濃度の関数として示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の実施に当たっては、特に断らない限り、当該技術分野の技能の範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を用いる。かかる技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ）、“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，１９９４）、“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ  Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｖ．，１９８８）、“Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、Ｈａｒｌｏｗ，Ｌａｎｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．Ｉ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）、及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；（１９８８）などの文献に完全に説明されている。
【００２９】
ある値の範囲が与えられる場合、文脈上、そうでない旨が明らかに示されないかぎり、下限値の単位の１／１０までの値、その範囲の上限値と下限値との間のそれぞれの間の値、及びその記載された範囲内の他のすべての記載された値または間の値は、本発明に包含される点を理解されたい。これらのより狭い範囲の上限値及び下限値は、そのより狭い範囲に独立して含まれてよく、記載される範囲内のすべての具体的に除外された範囲を除き、本発明にやはり包含される。記載される範囲が一方または両方の限界値を含む場合、これらの含まれる限界値の一方または両方を除外した範囲もまた、本発明に含まれる。
【００３０】
特に明記しない限り、抗体残基は、カバット（Ｋａｂａｔ）の番号付けシステムに従って番号付けされる（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。
【００３１】
以下の説明では、本発明のより完全な理解を与えるために、多くの具体的な詳細を記載する。しかしながら、本発明がこれらの具体的な詳細の１つ以上を欠いても実施され得る点は、当業者には明らかであろう。他の例では、本発明を曖昧にすることを回避するため、当業者には周知の特徴及び手順は記載していない。
【００３２】
特許出願及び公報を含む、本開示の全体を通じて引用されるすべての参考文献をその全容にわたって参照により本明細書に援用するものである。
【００３３】
Ｉ．定義
「〜を含む」とは、記載された要素が組成物／方法／キットにおいて必要であるが、特許請求の範囲内において他の要素が組成物／方法／キットなどを形成するために含まれてもよいことを意味する。
【００３４】
「〜から本質的になる 」とは、記載される組成物または方法の範囲の、本発明の基本的かつ新規な特徴（複数可）に実質的に影響しない特定された材料または工程への限定を意味する。
【００３５】
「〜からなる」とは、特許請求の範囲において特定されていない要素、工程、または成分の、組成物、方法、またはキットからの除外を意味する。
【００３６】
本明細書における抗体残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステム及びＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされている。Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、一般的に可変ドメイン内の残基（概ね、重鎖の１〜１１３番目の残基）を指す場合に用いられる（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵ番号付けシステム」または「ＥＵインデックス」は、一般的に免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合に用いられる（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（前出）に報告されているＥＵインデックス）。「Ｋａｂａｔと同様のＥＵ指標」とは、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。本明細書では特に断らない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号の指定は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基の番号付けを意味する。本明細書で特に断らない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号の指定は、ＥＵ番号付けシステムによる残基の番号付けを意味する。
【００３７】
抗体は、免疫グロブリンとも呼ばれ、通常は少なくとも１つの重鎖と１つの軽鎖とを含み、重鎖及び軽鎖のアミノ末端ドメインの配列は可変であるため、一般に可変領域ドメイン、または可変重鎖（ＶＨ）もしくは可変軽鎖（ＶＨ）ドメインと呼ばれる。２つのドメインは通常、会合して特異的結合領域を形成するが、本明細書に述べるように、特異的結合は重鎖単独の可変配列でも得られ、抗体の様々な非天然形態が知られており、当該技術分野で使用されている。
【００３８】
「機能性」または「生物学的に活性な」抗体または抗原結合分子（本明細書に記載される重鎖単独抗体及び多重特異性（例えば、二重特異性）三本鎖抗体様分子（ＴＣＡ）を含む）とは、構造的、調節的、生化学的または生物物理学的事象においてその天然活性の１つ以上を発揮することが可能なものである。例えば、機能的抗体または他の結合分子、例えばＴＣＡは、抗原に特異的に結合する能力を有し、その結合はシグナル伝達または酵素活性などの細胞または分子的事象を誘発または変化させることができる。機能的抗体または他の結合分子、例えばＴＣＡはまた、受容体のリガンド活性化をブロックするか、またはアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用することもできる。抗体または他の結合分子、例えばＴＣＡがその天然の活性の１つ以上を発揮する能力は、ポリペプチド鎖の適切なフォールディング及び集合を含むいくつかの要因に依存する。
【００３９】
本明細書における「抗体」なる用語は広義の意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示す限りにおいて、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単量体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、重鎖単独抗体、三本鎖抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ナノボディなどを含み、抗体フラグメントを含む（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０：４８５４−４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラ、または他の種に由来するものであってよい。
【００４０】
抗体なる用語は、完全長の重鎖、完全長の軽鎖、インタクトな免疫グロブリン分子、またはこれらのポリペプチドのいずれかの免疫学的活性部分、すなわち、対象とする標的の抗原またはその部分と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含むポリペプチドのことを指し、かかる標的には、これらに限定されるものではないが、がん細胞または自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞が含まれる。本明細書に開示される免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子のいずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、または、低下もしくは上昇したエフェクター細胞活性を与える改変されたＦｃ部分を有する操作されたサブクラスを含むサブクラスのものであってもよい。免疫グロブリンはいずれの種に由来するものであってもよい。一態様において、免疫グロブリンは、大部分がヒト由来のものである。
【００４１】
本明細書で使用するところの「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す（すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在しうる可能な自然発生変異を除いて同じである）。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を標的としている。さらに、異なる決定基（エピトープ）を標的とする異なる抗体を通常含む通常のポリクローナル抗体調製物と異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を標的とする。例えば、本発明によるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって記載されたハイブリドーマ法によって作製するか、または、例えば組換えタンパク質産生法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって作製することもできる。
【００４２】
抗体との関連で用いられる「可変」なる用語は、抗体の可変ドメインの特定の部分はその配列が抗体間で大きく異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性に与っていることを指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布していない。可変性は、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインのいずれにおいても超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主としてβシートの形態をとる４つのＦＲを含み、これらのＦＲは、βシート構造を接続し、場合によりその一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によって連結されている。各鎖の超可変領域同士はＦＲによって互いに近接して保持されており、他の鎖の超可変領域とともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは抗体の抗原との結合に直接関与していないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「超可変領域」なる用語は、抗原結合を生じる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、重鎖可変ドメインの残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））、及び／または重鎖可変ドメインの「超可変ループ」の残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５  （Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）由来の残基（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク領域」すなわち「ＦＲ」残基は、本明細書に定義される超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４４】
例示的なＣＤＲの指定が本明細書に示されているが、当業者には、配列のばらつきに基づく、最も広く用いられているＫａｂａｔの定義を含むＣＤＲの多くの定義が広く用いられている点は理解されよう（“Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；４７：６９４-７００を参照されたい）。Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造的なループ領域の位置に基づいたものである（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｎａｔｕｒｅ．１９８９；３４２：８７７-８８３）。対象とする代替的なＣＤＲ定義としては、これらに限定されるものではないが、本明細書に援用によってそれぞれを詳細に援用する、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，“Ｙｅｔ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌ．”   Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００１；３０９：６５７-６７０；Ｏｆｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ（ＣＤＲｓ）  ｒｅｖｅａｌｓ  ｐｅｃｕｌｉａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ＣＤＲｓ  ａｎｄ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８１：６２３０-６２３５；Ａｌｍａｇｒｏ“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｉｚｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．”  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００４；１７：１３２-１４３；及びＰａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．” Ｆａｓｅｂ  Ｊ．１９９５；９：１３３-１３９．により開示されるものが挙げられる。
【００４５】
「重鎖単独抗体」及び「重鎖抗体」なる用語は本明細書では互換可能に使用され、最も広い意味で従来の抗体の軽鎖を欠いた抗体を指す。これらの用語には、具体的には、これらに限定されるものではないが、ＣＨ１ドメインを含まず、ＶＨ抗原結合ドメインとＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインと含むホモ二量体抗体；かかる抗体の機能性（抗原結合）変異体、可溶性ＶＨ変異体、１個の可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲ）と５個のＣ様定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲ）のホモ二量体を含むＩｇ−ＮＡＲ及びその機能性フラグメント；及び可溶性シングルドメイン抗体（ｓＵｎｉＤａｂｓ（商標））が含まれる。一実施形態において、重鎖単独抗体は、フレームワーク１、ＣＤＲ１、フレームワーク２、ＣＤＲ２、フレームワーク３、ＣＤＲ３、及びフレームワーク４からなる可変領域の抗原結合ドメインで構成される。別の実施形態において、重鎖単独抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２及びＣＨ３ドメインで構成される。別の実施形態において、重鎖単独抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ２ドメインで構成される。さらなる実施形態において、重鎖単独抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ３ドメインで構成される。ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインが切り詰められた重鎖単独抗体も本明細書に含まれる。さらなる実施形態において、重鎖は、抗原結合ドメインと、少なくとも１つのＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）ドメインとで構成されるが、ヒンジ領域は含まない。さらなる実施形態において、重鎖は、抗原結合ドメイン、少なくとも１つのＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）ドメイン、及びヒンジ領域の少なくとも一部で構成される。重鎖単独抗体は、２つの重鎖がジスルフィド結合しているか、そうでなければ、共有結合または非共有結合で互いに結合している二量体の形をとることができる。重鎖単独抗体はＩｇＧサブクラスに属するものでよいが、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥサブクラスなどの他のサブクラスに属する抗体も本明細書に含まれる。特定の実施形態において、重鎖抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、特にＩｇＧ１サブタイプのものである。一実施形態において、重鎖抗体は、ＩｇＧ４サブタイプのものであり、１つ以上のＣＨドメインが、抗体のエフェクター機能を変化させるように改変されたものである。一実施形態において、重鎖抗体は、ＩｇＧ１サブタイプのものであり、１つ以上のＣＨドメインが、抗体のエフェクター機能を変化させるように改変されたものである。エフェクター機能を変化させるＣＨドメインの改変については、本明細書でさらに説明する。重鎖抗体の非限定的な例が、例えば、本明細書に参照によりその全容を援用するところのＷＯ２０１８／０３９１８０に記載されている。
【００４６】
一実施形態において、本明細書の重鎖単独抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の結合（ターゲティング）ドメインとして用いられる。この定義には、ＵｎｉＡｂｓ（商標）と呼ばれるヒト免疫グロブリントランスジェニックラット（ＵｎｉＲａｔ（商標））によって産生されるヒト重鎖単独抗体が具体的に含まれる。ＵｎｉＡｂｓ（商標）の可変領域（ＶＨ）はＵｎｉＤａｂｓ（商標）と呼ばれ、多重特異性、高い効力及び長い半減期を有する新規治療薬を開発するため、Ｆｃ領域または血清アルブミンと結合させることができる汎用性の高い構成単位である。ホモ二量体のＵｎｉＡｂｓ（商標）は、軽鎖、したがってＶＬドメインを欠いているため、抗原は、単一のドメイン、すなわち重鎖抗体（ＶＨ）の重鎖の可変ドメイン（抗原結合ドメイン）によって認識される。
【００４７】
本明細書で使用するところの「インタクトな抗体鎖」とは、完全長の可変領域と完全長の定常領域（Ｆｃ）とを含むものである。インタクトな「従来の」抗体とは、インタクトな軽鎖及びインタクトな重鎖、ならびに分泌型ＩｇＧの軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＩｇＭまたはＩｇＡなどの他のアイソタイプは、異なるＣＨドメイン（例えば、ＣＨ４ドメインを含む）を有し得る。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であってよい。インタクトな抗体は、１つ以上の「エフェクター機能」を有することができるが、エフェクター機能とは、抗体のＦｃ定常領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因し得る生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害作用、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、及び細胞表面受容体の発現低下が挙げられる。定常領域変異体には、エフェクタープロファイル、Fc受容体への結合などを変化させるものが含まれる。
【００４８】
抗体及び様々な抗原結合タンパク質は、それらの重鎖のＦｃ（定常ドメイン）のアミノ酸配列に応じて、異なるクラスとして与えることができる。重鎖Ｆｃ領域には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つの主要な抗体クラスが存在し、そのうちのいくつかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２のようなサブクラス（アイソタイプ）にさらに分類することができる。抗体の異なるクラスに対応するＦｃ定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる場合がある。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元配置は周知のものである。Ｉｇの形態としては、ヒンジ改変またはヒンジなしの形態が含まれる（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３−４０９０；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：７２４６−７２５６；ＵＳ２００５／００４８５７２；ＵＳ２００４／０２２９３１０）。あらゆる脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの一方に割り当てることができる。
【００４９】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を保有する。エフェクター機能の非限定的な例としては、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）などの発現低下などが挙げられる。こうしたエフェクター機能は、一般的に、Ｆｃ領域が、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦＣγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦＣγＲＩＩＢ２、ＦＣγＲＩＩＩＡ、ＦＣγＲＩＩＩＢ受容体などの受容体、及び低親和性のＦｃＲｎ受容体と相互作用することを必要とし、当該技術分野では周知の様々なアッセイを用いて評価することができる。「デッド」または「サイレンス」Ｆｃとは、例えば、血清半減期の延長に関して活性を維持するように変異されているが、高親和性Ｆｃ受容体を活性化しないか、またはＦｃ受容体に対する親和性が低下しているものである。
【００５０】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然で見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域としては、例えば、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域、及び天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域、ならびにそれらの天然に存在する変異型が含まれる。
【００５１】
「変異型Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列と、少なくとも１つのアミノ酸の改変、好ましくは１つ以上のアミノ酸の置換（複数可）において異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異型Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域中または親ポリペプチドのＦｃ領域中に約１〜約１０個のアミノ酸置換、好ましくは約１〜約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書における変異型Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域及び／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは、それらと少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは、それらと少なくとも約９５％の相同性を有する。
【００５２】
変異型Ｆｃ配列は、ＥＵインデックスの２３４位、２３５位、及び２３７位において、ＦｃγＲＩ結合を減少させるＣＨ２領域内の３個のアミノ酸置換を有することができる（Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：５６３を参照）。ＥＵインデックスの３３０位及び３３１位の補体Ｃ１ｑ結合部位内の２個のアミノ酸置換は補体結合を減少させる（Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７８：６６１（１９９３）及びＣａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３（１９９１）を参照）。２３３〜２３６位のヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２残基への置換、ならびに３２７位、３３０位、及び３３１位のＩｇＧ４残基への置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に減少させる（例えば、Ａｒｍｏｕｒ  ＫＬ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３−２４；及びＳｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ．ｅｔ  ａｌ．，２００１． Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６０４）。ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ０１８５７）は、本明細書では配列番号２６として示される。ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ０１８６１）は、本明細書では配列番号２７として示される。サイレンスＩｇＧ１は、例えば、本明細書に参照によりその開示内容の全体を援用するところのＢｏｅｓｃｈ，Ａ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩｇＧ  Ｆｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．” ＭＡｂｓ，２０１４．６（４）：ｐ．９１５−２７に記載されている。
【００５３】
これらに限定されるものではないが、ジスルフィド結合を形成することができる領域が欠失されているもの、または天然ＦｃのＮ末端の特定のアミノ酸残基が除去されているもの、またはメチオニン残基が付加されているものを含む、他のＦｃ変異体も可能である。したがって、いくつかの実施形態において、結合化合物の１つ以上のＦｃ部分は、ヒンジ領域にジスルフィド結合を除去するための１つ以上の変異を含むことができる。さらに別の実施形態において、Ｆｃのヒンジ領域を完全に除去することができる。さらに別の実施形態において、結合化合物は、Ｆｃ変異体を含むことができる。
【００５４】
さらに、Ｆｃ変異体は、補体結合またはＦｃ受容体結合を引き起こすためのアミノ酸残基を置換（変異）、欠失、または付加することによってエフェクター機能を除去または大幅に低減させるように構築することもできる。例えば、限定するものではないが、欠失は、Ｃ１ｑ結合部位などの補体結合部位で行うことができる。免疫グロブリンＦｃフラグメントのそのような配列誘導体を調製するための技術が、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号及び同第ＷＯ９６／３２４７８号に開示されている。さらに、Ｆｃドメインは、リン酸化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化などによって修飾することができる。
【００５５】
「Ｆｃ領域含有抗体」なる用語は、Ｆｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リシン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の精製時に、または抗体をコードする核酸の組換え操作にって除去することができる。したがって、本発明によるＦｃ領域を有する抗体は、Ｋ４４７を有する、または有さない抗体を含むことができる。
【００５６】
本発明の態様は、これらに限定されるものではないが、二重特異性、三重特異性などを含む多重特異性形態を有する結合化合物を含む。二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）、三重特異性抗体などでは多岐にわたる方法及びタンパク質形態が知られ、使用されている。
【００５７】
多価人工抗体を製造するための様々な方法が、２つ以上の抗体の可変ドメインを組換えにより融合することによって開発されている。いくつかの実施形態において、ポリペプチド上の第１と第２の抗原結合ドメインが、ポリペプチドリンカーによって連結される。かかるポリペプチドリンカーの１つの非限定的な例として、４個のグリシン残基とそれに続く１個のセリン残基からなるアミノ酸配列を有し、その配列がｎ回繰り返されるＧＳリンカーがあり、ただし、ｎは１〜約１０の範囲の整数、例えば２、３、４、５、６、７、８、または９である。かかるリンカーの非限定的な例としては、ＧＧＧＧＳ（配列番号２４）（ｎ＝１）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２５）（ｎ＝２）が挙げられる。他の適当なリンカーも使用することができ、例えば、本明細書に参照によりその開示内容の全体を援用するところのＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１３  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５；６５（１０）：１３５７−６９に記載されている。
【００５８】
「三本鎖抗体様分子」または「ＴＣＡ」なる用語は、本明細書では、３個のポリペプチドサブユニットを含む、本質的になる、またはそれらからなる抗体様分子であって、そのうちの２個がモノクローナル抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖、または抗原結合領域と少なくとも１つのＣＨドメインとを含むそのような抗体鎖の機能性抗原結合フラグメントを含む、本質的になる、またはそれらからなる抗体様分子を指して用いられる。この重鎖/軽鎖のペアは、第１の抗原に対する結合特異性を有する。第３のポリペプチドサブユニットは、ＣＨ１ドメインを含まず、ＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分と、第２の抗原のエピトープまたは第１の抗原の異なるエピトープに結合する１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、単一の重鎖可変領域（「単一形態」））または上記に述べたように２個の抗原結合ドメインがリンカー配列によって互いに連結された「タンデム形態」の２個の抗原結合ドメイン（例えば、２個の単一重鎖可変領域））であって、抗体重鎖または軽鎖の可変領域に由来するかまたは可変領域と配列同一性を有する抗原結合ドメインと、を含む重鎖単独抗体を含む、本質的になる、またはそれらからなる。かかる可変領域の部分は、ＶＨ及び／またはＶＬ遺伝子セグメント、Ｄ及びＪＨ遺伝子セグメント、またはＪＬ遺伝子セグメントによってコードされてもよい。可変領域は、再編成されたＶＨＤＪＨ、ＶＬＤＪＨ、ＶＨＪＬ、またはＶＬＪＬ遺伝子セグメントによってコードされてもよい。ＴＣＡタンパク質は、上記で定義した重鎖単独抗体を利用したものである。
【００５９】
ＴＣＡ結合化合物は、「重鎖単独抗体」または「重鎖抗体」または「重鎖ポリペプチド」を利用したものであり、これは、本明細書で使用される場合、重鎖定常領域ＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４を含むが、ＣＨ１ドメインは含まない一本鎖抗体を意味する。一実施形態において、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン（例えば、単一またはタンデム形態の単一の重鎖可変領域）、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２及びＣＨ３ドメインで構成される。
【００６０】
別の実施形態において、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ２ドメインとで構成される。さらなる実施形態において、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ３ドメインで構成される。ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインが切り詰められた重鎖抗体も本明細書に含まれる。さらなる実施形態において、重鎖は、抗原結合ドメインと、少なくとも１つのＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）ドメインとで構成されるが、ヒンジ領域は含まない。重鎖単独抗体は、２本の重鎖が互いにジスルフィド結合しているか、他の形で互いに共有結合または非共有結合により結合している二量体の形態であってよく、場合により、２つ以上のＣＨドメイン間にポリペプチド鎖間の適切な対合を促進する非対称的界面を有することができる。重鎖抗体はＩｇＧサブクラスに属するものでよいが、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥサブクラスなどの他のサブクラスに属する抗体も本明細書に含まれる。特定の実施形態において、重鎖抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、特にＩｇＧ１サブタイプまたはＩｇＧ４サブタイプのものである。ＴＣＡ結合化合物の非限定的な例は、例えば、本明細書に参照によりその開示内容の全体を援用するところのＷＯ２０１７／２２３１１１及びＷＯ２０１８／０５２５０３に記載されている。
【００６１】
重鎖抗体は、ラクダ科動物、例えばラクダ及びラマによって産生されるＩｇＧ抗体の約４分の１を構成する（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．３６３，４４６−４４８（１９９３））。これらの抗体は２本の重鎖で形成されるが、軽鎖は含まない。結果として、可変抗原結合部分はＶＨＨドメインと呼ばれ、長さがわずかアミノ酸約１２０個である、天然に存在する最小のインタクトな抗原結合部位を表す（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２６２８５−２６２９０（２００１））。免疫によって様々な抗原に対する高い特異性と親和性を有する重鎖抗体を生成することが可能であり（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４３１，３７−４６ （１９９９））、また、ＶＨＨ部分は、容易に酵母にクローニングして発現させることができる（Ｆｒｅｎｋｅｎ， Ｌ．Ｇ． Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８，１１−２１（２０００））。それらの発現、溶解度及び安定性のレベルは、古典的なＦ（ａｂ）またはＦｖフラグメントより有意に高い（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，５２１−５２６（１９９７））。サメもまた、ＶＮＡＲと呼ばれる、単一のＶＨ様ドメインをそれらの抗体内に有していることが示されている（Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３−３５５４（２００３）；Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ５５，１８７−１９７（２００４）；Ｄｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４０，２５−３３（２００３））。
【００６２】
本明細書で使用するところの「ＣＤ１９」及び「ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（分化クラスター）１９」なる用語は、形質細胞への最終分化までのＢ細胞の発生のすべての段階で発現する分子を指す。「ＣＤ１９」なる用語は、あらゆるヒト及び非ヒト動物種のＣＤ１９タンパク質を含み、具体的には、ヒトＣＤ１９及び非ヒト哺乳動物のＣＤ１９を含む。
【００６３】
本明細書で使用するところの「ヒトＣＤ１９」なる用語は、その由来源または調製形態に関係なく、ヒトＣＤ１９（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１５３９１）の任意の変異体、アイソフォーム及び種ホモログを含む。したがって、「ヒトＣＤ１９」には、細胞により自然に発現されるヒトＣＤ１９と、ヒトＣＤ１９遺伝子をトランスフェクトした細胞上で発現されるＣＤ１９が含まれる。
【００６４】
「抗ＣＤ１９重鎖単独抗体」、「ＣＤ１９重鎖単独抗体」、「抗ＣＤ１９重鎖抗体」、及び「ＣＤ１９重鎖抗体」なる用語は、本明細書では、上記で定義したようなヒトＣＤ１９を含むＣＤ１９に免疫特異的に結合する、上記で定義した重鎖単独抗体を指して互換可能に使用される。この定義には、これらに限定されるものではないが、上記に定義したようなヒト抗ＣＤ１９  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体を産生するＵｎｉＲａｔｓ（商標）を含む、ヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニックラットまたはトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック動物によって産生されるヒト重鎖抗体が含まれる。
【００６５】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一率（％）」は、保存的置換を配列同一性の一部として考慮せず、最大の配列同一率（％）が得られるように配列同士を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同じである候補配列内のアミノ酸残基の割合（％）として定義される。アミノ酸配列同一率（％）を決定する目的でのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野の技能の範囲内である種々の方法で実現することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長にわたって最大のアライメントを得るために必要とされるあらゆるアルゴリズムを含む、配列同士を整列するために適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的では、アミノ酸配列同一率（％）の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。
【００６６】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から識別及び分離され、及び／または回収された抗体である。その自然環境の混入成分は、抗体の診断または治療における使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。好ましい実施形態において、抗体は、（１）ローリー法により測定した場合に９５重量％超の抗体、最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップシーケネータ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使用してＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに充分な程度にまで、または（３）クーマシーブルー、もしくは好ましくは銀染色を用いて還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質となるまで、精製される。単離抗体には、その抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイチューの抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００６７】
本発明の抗体には、多重特異性抗体が含まれる。多重特異性抗体は、複数の結合特異性を有する。「多重特異性」なる用語には、具体的には、「二重特異性」及び「三重特異性」、ならびにより高次のポリエピトープ特異性などのより高次の独立した特異的結合親和性、ならびに四価抗体及び抗体フラグメントが含まれる。「多重特異性抗体」、「多重特異性重鎖単独抗体」、「多重特異性重鎖抗体」、「多重特異性ＵｎｉＡｂ（商標）」、及び「多重特異性結合化合物」なる用語は、本明細書では最も広い意味で用いられ、複数の結合特異性を有するすべての抗体を包含する。本発明の多重特異性重鎖抗ＣＤ１９抗体は、ヒトＣＤ１９などのＣＤ１９タンパク質上の単一のエピトープと、例えば、ＣＤ３タンパク質などの異なるタンパク質上のエピトープとに免疫特異的に結合する（すなわち、二価及びモノパラトピック）抗体を具体的に含む。本発明の多重特異性重鎖抗ＣＤ１９抗体は、ヒトＣＤ１９などのＣＤ１９タンパク質上の２つ以上の重複しないエピトープに免疫特異的に結合する（すなわち、二価かつバイパラトピック）抗体を具体的に含む。本発明の多重特異性重鎖抗ＣＤ１９抗体はまた、ヒトＣＤ１９などのＣＤ１９タンパク質上のエピトープと、例えばヒトＣＤ３タンパク質などのＣＤ３タンパク質などの異なるタンパク質上のエピトープとに免疫特異的に結合する（すなわち、二価かつバイパラトピック）抗体も具体的に含む。本発明の多重特異性重鎖抗ＣＤ１９抗体はまた、ヒトＣＤ１９タンパク質などのＣＤ１９タンパク質上の２つ以上の重複しない、または部分的に重複するエピトープと、例えばヒトＣＤ３タンパク質などのＣＤ３タンパク質などの異なるタンパク質上のエピトープとに免疫特異的に結合する（すなわち、三価かつバイパラトピック）抗体も具体的に含む。
【００６８】
本発明の抗体は、１つの結合特異性を有する単一特異性抗体を含む。単一特異性抗体には、単一の結合特異性を有する抗体、及び同じ結合特異性を有する複数の結合単位を含む抗体が具体的に含まれる。「単一特異性抗体」、「単一特異性重鎖単独抗体」、「単一特異性重鎖抗体」、及び「単一特異性ＵｎｉＡｂ（商標）」なる用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、１つの結合特異性を有するすべての抗体を包含する。本発明の単一特異性重鎖抗ＣＤ１９抗体は、ヒトＣＤ１９などのＣＤ１９タンパク質上の１つのエピトープに免疫特異的に結合する（一価及び単一特異性）抗体を具体的に含む。本発明の単一特異性重鎖抗ＣＤ１９抗体はまた、ヒトＣＤ１９などのＣＤ１９タンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する複数の結合単位を有する抗体（例えば、多価抗体）も具体的に含む。例えば、本発明の実施形態による単一特異性抗体は、それぞれがＣＤ１９タンパク質上の同じエピトープに結合する２個の抗原結合ドメインを含む重鎖可変領域を含むことができる（すなわち、二価及び単一特異性）。
【００６９】
「エピトープ」とは、単一の抗体分子が結合する、抗原分子の表面上の部位である。一般に、抗原は数個または多数の異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応する。この用語は具体的には、線形エピトープ及びコンフォメーションエピトープを含む。
【００７０】
「エピトープマッピング」とは、標的抗原上の抗体の結合部位、すなわちエピトープを特定するプロセスである。抗体エピトープは、線形エピトープまたはコンフォメーションエピトープであってよい。線形エピトープは、タンパク質内のアミノ酸の連続した配列によって形成される。コンフォメーションエピトープは、タンパク質配列内で不連続であるが、タンパク質がその三次元構造に折り畳まれる際に互いに寄せ集められるアミノ酸で形成される。
【００７１】
「ポリエピトープ特異性」とは、同じまたは異なる標的(複数可)上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。上記のように、本発明は、ポリエピトープ特異性を有する抗ＣＤ１９重鎖抗体、すなわち、ヒトＣＤ１９などのＣＤ１９タンパク質上の２つ以上の重複しないエピトープに結合する抗ＣＤ１９重鎖抗体を具体的に含む。抗原の「重複しないエピトープ（複数可）」または「非競合的エピトープ（複数可）」なる用語は、本明細書では、抗原特異的抗体のペアの一方のメンバーによって認識されるが、他方のメンバーによっては認識されないエピトープ（複数可）を意味するものとして定義される。重複しないエピトープを認識する抗体のペア、または多重特異性抗体上の同じ抗原を標的とする抗原結合領域は、その抗原への結合について競合せず、その抗原に同時に結合することができる。
【００７２】
ある抗体と参照抗体の２つの抗体が同じまたは立体的に重複するエピトープを認識する場合、ある抗体は参照抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つの抗体が同じまたは立体的に重複するエピトープに結合するかどうかを決定するために最も広く使用されている迅速な方法は競合アッセイであり、標識抗原または標識抗体のいずれかを用いてあらゆる数の異なるフォーマットで構成することができる。通常、抗原は９６ウェルプレートに固定化され、標識抗体の結合をブロックする非標識抗体の能力を放射性標識または酵素標識を使用して測定する。
【００７３】
本明細書で使用するところの「価」なる用語は、抗体分子内の特定の数の結合部位を指す。
【００７４】
「一価」抗体は、１つの結合部位を有する。したがって、一価抗体は単一特異性でもある。
【００７５】
「多価」抗体は、２つ以上の結合部位を有する。したがって、「二価」、「三価」、及び「四価」なる用語は、それぞれ、２つの結合部位、３つの結合部位、及び４つの結合部位の存在を指す。したがって、本発明による二重特異性抗体は、少なくとも二価であり、三価、四価、または他の多価であってもよい。本発明の実施形態による二価抗体は、同じエピトープに対する（すなわち、二価、モノパラトピック）、または２つの異なるエピトープに対する（すなわち、二価、バイパラトピック）２つの結合部位を有し得る。
【００７６】
多種多様な方法及びタンパク質の形態が知られており、二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）、三重特異性抗体などの調製に使用されている。
【００７７】
「二重特異性三本鎖抗体様分子」または「ＴＣＡ」なる用語は、本明細書では、３個のポリペプチドサブユニットを含む、本質的になる、またはそれらからなる抗体様分子であって、そのうちの２個がモノクローナル抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖、または抗原結合領域と少なくとも１つのＣＨドメインとを含むそのような抗体鎖の機能性抗原結合フラグメントを含む、本質的になる、またはそれらからなる抗体様分子を指して用いられる。この重鎖/軽鎖のペアは、第１の抗原に対する結合特異性を有する。第３のポリペプチドサブユニットは、ＣＨ１ドメインを含まず、ＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分と、第２の抗原のエピトープまたは第１の抗原の異なるエピトープに結合する抗原結合ドメインであって、抗体重鎖または軽鎖の可変領域に由来するかまたは可変領域と配列同一性を有する抗原結合ドメインと、を含む重鎖単独抗体を含む、本質的になる、またはそれらからなる。かかる可変領域の部分は、ＶＨ及び／またはＶＬ遺伝子セグメント、Ｄ及びＪＨ遺伝子セグメント、またはＪＬ遺伝子セグメントによってコードされてもよい。可変領域は、再編成されたＶＨＤＪＨ、ＶＬＤＪＨ、ＶＨＪＬ、またはＶＬＪＬ遺伝子セグメントによってコードされてもよい。ＴＣＡタンパク質は、上記で定義した重鎖単独抗体を利用したものである。
【００７８】
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」なる用語は、本明細書において、所望の結合特異性（例えば、モノクローナル抗体または他のリガンドの抗原結合領域）を膜貫通及び細胞内シグナル伝達ドメインと結び付ける操作された受容体を指して最も広い意味で使用される。通常、受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に結び付けてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製するために使用される。（Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，２０１６；１０８（７）：ｄｊｖ４３９；及び  Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１６；１３：３７０―３８３．）．
【００７９】
「ヒト抗体」なる用語は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むものとして用いられる。本明細書のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基、例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入される変異を有することができる。「ヒト抗体」なる用語は、トランスジェニックラットまたはマウスなどのトランスジェニック動物によって産生される、ヒト重鎖可変領域配列を有する重鎖単独抗体、具体的には、上記で定義したＵｎｉＲａｔｓ（商標）によって産生されるＵｎｉＡｂｓ（商標）を具体的に含む。
【００８０】
「キメラ抗体」または「キメラ免疫グロブリン」とは、少なくとも２つの異なるＩｇ遺伝子座からのアミノ酸配列を含む免疫グロブリン分子、例えば、ヒトＩｇ遺伝子座によってコードされる部分とラットＩｇ遺伝子座によってコードされる部分とを含むトランスジェニック抗体を意味する。キメラ抗体には、非ヒトＦｃ領域または人工Ｆｃ領域を有するトランスジェニック抗体、及びヒトイディオタイプが含まれる。かかる免疫グロブリンは、かかるキメラ抗体を産生するように操作された本発明の動物から単離することができる。
【００８１】
本明細書で使用するところの「エフェクター細胞」なる用語は、免疫反応の認識及び活性化段階ではなく、免疫反応のエフェクター段階に関与する免疫細胞を指す。一部のエフェクター細胞は特定のFc受容体を発現し、特定の免疫機能を行う。いくつかの実施形態において、ナチュラルキラー細胞などのエフェクター細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。例えば、ＦｃＲを発現する単球及びマクロファージは、標的細胞の特異的な死滅及び免疫系の他の構成成分への抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与している。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食することができる。
【００８２】
「ヒトエフェクター細胞」は、Ｔ細胞受容体またはＦｃＲなどの受容体を発現し、エフェクター機能を行う白血球である。好ましくは、これらの細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を行う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球が挙げられ、ＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然由来源から、例えば、本明細書に記載されるように血液またはＰＢＭＣから単離することができる。
【００８３】
「免疫細胞」なる用語は本明細書において最も広い意味で使用され、これらに限定されるものではないが、骨髄またはリンパ組織由来の細胞、例えばリンパ球（Ｂ細胞及び細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞など）、キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好酸球、多形核細胞、例えば好中球、顆粒球、マスト細胞、好塩基球などを含む。
【００８４】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列変異型Ｆｃ領域）に起因し得る生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害作用、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の発現低下などが挙げられる。
【００８５】
「抗体依存性細胞媒介細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞に結合した抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞介在性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するには、例えば米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されるようなインビトロＡＤＣＣアッセイを行うことができる。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ）が挙げられる。上記に代えるかまたは加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  （ＵＳＡ）  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルで評価することもできる。
【００８６】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的を溶解させる分子の能力を指す。補体活性化経路は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）が、同種抗原と複合体化した分子（例えば、抗体）と結合することによって開始される。補体活性化を評価するには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されるようなＣＤＣアッセイを行うことができる。
【００８７】
「結合親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の残基相互作用を総和した強度のことを指す。特に明記しない限り、本明細書で使用するところの「結合親和性」とは、結合ペア（例えば、抗体と抗原）の要素間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は、当該技術分野では周知の一般的な方法により測定することができる。低親和性抗体が一般に抗原にゆっくり結合し、速やかに解離する傾向を有するのに対して、高親和性抗体は一般に抗原により速く結合し、結合したままである傾向がある。
【００８８】
本明細書で使用するところの「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」とは、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ３８４機器（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を動力学モードで使用してバイオレイヤー干渉法によって決定される解離定数を指す。例えば、抗マウスＦｃセンサーにマウスＦｃ融合抗原をロードしてから抗体が入ったウェルに浸漬することで、濃度依存性の結合速度（ｋｏｎ）が測定される。抗体の解離速度（ｋｏｆｆ）は、センサーをバッファーのみを含むウェルに浸漬する最終ステップで測定される。Ｋｄは、ｋｏｆｆ ／ ｋｏｎの比である。（詳細については、Ｃｏｎｃｅｐｃｉｏｎ， Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，１２（８），７９１−８００，２００９を参照されたい）。
【００８９】
「治療」、「治療する」、及びこれに類する用語は、本明細書では、所望の薬理学的及び／または生理学的作用を得ることを一般的に意味して用いられる。その効果は、疾患またはその症状を完全または部分的に予防する観点から予防的であってもよく、及び／または疾患及び／またはその疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という観点から治療的であってもよい。本明細書で使用するところの「治療」とは、哺乳動物における疾患のあらゆる治療を包含し、（ａ）その疾患の素因を有し得るがまだ疾患を有するとは診断されていない対象における発病を予防すること、（ｂ）その疾患を阻止すること、すなわち、その発現を阻止すること、または（ｃ）その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患を退行させることを含む。治療薬は、疾患または傷害の発症前、発症中、または発症後に投与することができる。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化または軽減するような進行中の疾患の治療が特に対象となり得る。こうした治療は、罹患組織の機能が完全に喪失する前に行われることが望ましい。対象の治療は、疾患の症候性ステージの間、及び場合により疾患の症候性ステージの後に投与することができる。
【００９０】
「治療有効量」とは、対象に治療効果をもたらすうえで必要な活性剤の量を意味する。例えば、「治療有効量」は、疾患に関連する病理学的症状、疾患の進行または生理学的状態の改善を誘発、改善、または他の形でもたらすか、または疾患に対する抵抗性を高める量である。
【００９１】
本発明との関連において、「Ｂ細胞新生物」または「成熟Ｂ細胞新生物」なる用語には、これらに限定されるものではないが、すべてのリンパ性白血病及びリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、前リンパ球性白血病、前駆体Ｂリンパ芽球性白血病、毛細胞白血病、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫などの形質細胞新生物、形質細胞腫、モノクローナル免疫グロブリン沈着症、重鎖疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、リンパ節辺縁Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、毛細胞白血病、原発性滲出液リンパ腫、及びＡＩＤＳ関連の非ホジキンリンパ腫が含まれる。
【００９２】
「ＣＤ１９の発現を特徴とする」なる用語は、ＣＤ１９の発現が、疾患または障害に特徴的な１つ以上の病理学的プロセスに関連するかまたは関与するあらゆる疾患または障害を広く指す。かかる疾患としては、これらに限定されるものではないが、Ｂ細胞新生物が挙げられる。
【００９３】
「対象」、「個体」、及び「患者」なる用語は、本明細書では、治療についての評価が行われる、及び／または治療が行われる哺乳動物を指して互換的に使用される。一実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。「対象」、「個体」、及び「患者」なる用語には、これらに限定されるものではないが、がんを有する個体、自己免疫疾患を有する個体、病原体感染症を有する個体などが含まれる。対象はヒトであってもよいが、他の哺乳動物、例えば、マウス、ラットなどの、特にヒトの疾患の実験モデルとして有用な哺乳動物も含まれる。
【００９４】
「医薬製剤」なる用語は、有効成分の生物学的活性が有効となるような形態であり、製剤が投与される対象にとって許容されない毒性を示すさらなる成分を含まない製剤のことを指す。かかる製剤は、無菌である。「薬学的に許容される」賦形剤（ビヒクル、添加物）とは、対象の哺乳動物に適度に投与されて、用いられる有効成分の有効用量を与えることができるものである。
【００９５】
「滅菌」製剤は、無菌であるか、またはあらゆる微生物及びそれらの芽胞を含まないか、または本質的に含まない。「凍結」製剤とは、０℃未満の温度のものである。
【００９６】
「安定した」製剤とは、その中に含まれるタンパク質が保管時にその物理的安定性及び／または化学的安定性及び／または生物学的活性を本質的に維持するような製剤である。好ましくは、製剤は、保管時にその物理的及び化学的安定性、ならびにその生物学的活性を本質的に維持する。保管期間は一般に、製剤の想定される貯蔵寿命に基づいて選択される。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術が当該技術分野で利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１．Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ．Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）に概説されている。安定性は、選択された温度で選択された期間にわたって測定することができる。安定性は、凝集体形成の評価（例えば、濁度を測定することによる、及び／または目視検査によるサイズ排除クロマトグラフィーを用いた）；カチオン交換クロマトグラフィー、イメージキャピラリー等電点フォーカシング（ｉｃＩＥＦ）またはキャピラリーゾーン電気泳動を用いて電荷不均一性を評価することによって；アミノ末端またはカルボキシ末端配列分析；質量分光分析；還元型とインタクトな抗体を比較するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析；ペプチドマップ（例えば、トリプシンまたはＬＹＳ−Ｃ）分析；抗体の生物学的活性または抗原結合機能を評価することによって、様々な異なる方法で定性的及び／または定量的に評価することができる。不安定性には、凝集、脱アミド化（例えば、Ａｓｎの脱アミド化）、酸化（例えば、Ｍｅｔの酸化）、異性化（例えば、Ａｓｐの異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えば、ヒンジ領域の断片化）、スクシンイミド形成、非対合システイン（複数可）、Ｎ末端の伸長、Ｃ末端のプロセシング、グリコシル化の差などのうちのいずれか１つ以上が関与しうる。
【００９７】
ＩＩ．詳細な説明
抗ＣＤ１９
本発明は、ヒトＣＤ１９に結合する、密接に関連した重鎖単独抗体のファミリーを提供する。このファミリーの抗体は、本明細書に定義され、図１に示されるようなＣＤＲ配列のセットを含み、図２に示される配列番号１４〜２１の提供される重鎖可変領域（ＶＨ）配列によって例示される。これらの抗体のファミリーは、臨床治療薬（複数可）としての有用性に寄与する数多くの利点を提供するものである。抗体には、広範な結合親和性を有するメンバーが含まれているため、所望の結合親和性を有する特定の配列を選択することができる。
【００９８】
適当な抗体は、例えば図５Ｂに示されるような二重特異性抗体、または三重特異性抗体、またはＣＡＲ−Ｔ構造の一部としての使用を含むがこれに限定されない、開発及び治療または他の使用のために本明細書に提供されるものから選択することができる。
【００９９】
候補タンパク質に対する親和性の決定は、Ｂｉａｃｏｒｅ測定などの当該技術分野では周知の方法を使用して行うことができる。抗体ファミリーのメンバーは、これらに限定されるものではないが、Ｋｄが、約１０−６〜約１０−１０ 、約１０−６ 〜約１０−９ 、約１０−６ 〜約１０−８ 、約１０−８ 〜約１０−１１ 、約１０−８ 〜約１０−１０ 、約１０−８ 〜約１０−９ 、約１０−９ 〜約１０−１１ 、約１０−９ 〜約１０−１０ 、またはこれらの範囲内の任意の値を含む、約１０−６〜約１０−１１の値であるような、ＣＤ１９に対する親和性を有することができる。親和性選択は、インビトロ アッセイ、前臨床モデル、及び臨床試験、ならびに潜在的な毒性の評価を含む、ＣＤ１９の生物学的活性を調節する、例えば阻止する生物学的評価によって確認することができる。
【０１００】
本明細書の抗体ファミリーのメンバーは、カニクイザルのＣＤ１９タンパク質との交差反応性を示さないが、必要に応じて、カニクイザルのＣＤ１９タンパク質、または他の任意の動物種のＣＤ１９との交差反応性を与えるように操作することができる。
【０１０１】
本明細書のＣＤ１９特異的抗体のファミリーは、ヒトＶＨフレームワーク内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含むＶＨドメインを含む。ＣＤＲ配列は、例として、配列番号１４〜２１に示される提供される例示的な可変領域配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３についてそれぞれ、アミノ酸残基２６〜３５、５３〜５９、及び９８〜１１７付近の領域に位置し得る。一般的に、配列の順序は同じままであるが、異なるフレームワーク配列が選択される場合には各ＣＤＲ配列は異なる位置に存在し得る点は当業者には理解されよう。
【０１０２】
本発明の抗ＣＤ１９抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、下記構造式に含まれ得る（式中、Ｘは、下記に示される特定のアミノ酸のいずれかであり得る可変アミノ酸を示す）。
ＣＤＲ１
Ｇ Ｆ Ｘ１ Ｆ Ｓ Ｘ２ Ｘ３ Ｗ （配列番号２２）
式中、Ｘ１は、ＴまたはＳであり、
Ｘ２は、ＳまたはＮであり、
Ｘ３は、ＹまたはＦである。
ＣＤＲ２
Ｘ４ Ｘ５ Ｘ６ Ｘ７ Ｇ Ｓ Ｘ８Ｘ９ （配列番号２３）
式中、Ｘ４は、ＩまたはＭであり、
Ｘ５は、Ｎ、Ｓ、またはＫであり、
Ｘ６は、ＱまたはＫであり、
Ｘ７は、ＤまたはＡであり、
Ｘ８は、ＤまたはＥであり、
Ｘ９は、ＫまたはＥである。
ＣＤＲ３
ＡＳＧＶＹＳＦＤＹ（配列番号１３）
【０１０３】
代表的なＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を、図１及び図３に示す。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ１９重鎖単独抗体は、配列番号１〜６のいずれか１つのＣＤＲ１配列を含む。特定の実施形態において、ＣＤＲ１配列は、配列番号４である。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ１９重鎖単独抗体は、配列番号７〜１２のいずれか１つのＣＤＲ２配列を含む。特定の実施形態において、ＣＤＲ２配列は、配列番号１０である。
【０１０６】
本発明の抗ＣＤ１９重鎖単独抗体は、配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む。
【０１０７】
さらなる実施形態において、本発明の抗ＣＤ１９重鎖単独抗体は、配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１０のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む。
【０１０８】
さらなる実施形態において、本発明の抗ＣＤ１９重鎖単独抗体は、配列番号１４〜２１の重鎖可変領域アミノ酸配列（図２）のいずれかを含む。
【０１０９】
さらに別の実施形態において、本発明の抗ＣＤ１９重鎖単独抗体は、配列番号１７の重鎖可変領域配列を含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ１９重鎖単独抗体のＣＤＲ配列は、配列番号１〜１３（図１）のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３配列、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列のセットに対する１つまたは２つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本明細書の重鎖単独抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１４〜２１の重鎖可変領域配列（図２に示される）のいずれかに対して少なくとも約８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域配列を含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、二重特異性または多重特異性抗体が提供されるが、これは、二重特異性三本鎖抗体様分子を含むがこれに限定されない、本明細書で検討される形態のいずれかを有することができる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＣＤ１９に対する結合特異性を有する少なくとも１つの重鎖可変領域と、ＣＤ１９以外のタンパク質に対する結合特異性を有する少なくとも１つの重鎖可変領域とを含むことができる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、第１の抗原に対して結合特異性を有する重鎖／軽鎖のペアと、ＣＨ１ドメインは含まないがＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分と第２の抗原のエピトープまたは第１の抗原の異なるエピトープに結合する抗原結合ドメインとを含む重鎖単独抗体由来の重鎖と、を含むことができる。特定の一実施形態において、二重特異性抗体は、エフェクター細胞上の抗原（例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質）に対する結合特異性を有する重鎖／軽鎖のペアと、ＣＤ１９に対する結合特異性を有する抗原結合ドメインを含む重鎖単独抗体由来の重鎖と、を含む。
【０１１２】
本発明のタンパク質が二重特異性抗体であるようないくつかの実施形態において、抗体の一方のアーム（１つの結合部分）はヒトＣＤ１９に対して特異的であり、他方のアームは標的細胞、腫瘍関連抗原、ターゲティング抗原（例えば、インテグリンなど）、病原体抗原、チェックポイントタンパク質などに対して特異的であってよい。標的細胞としては、以下で述べるように、これらに限定されるものではないが、血液腫瘍、例えば、Ｂ細胞腫瘍由来の細胞を含むがん細胞が具体的に挙げられる。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、本発明のタンパク質は、天然配列ヒトＩｇＧ１、天然配列ヒトＩｇＧ４、１つ以上のエフェクター機能を低下させるように操作された変異型配列ヒトＩｇＧ１、及び１つ以上のエフェクター機能を低下させるように操作された変異型配列ヒトＩｇＧ４に相当する、以下に示されるＦｃ領域配列のいずれか１つを含む。
【０１１４】
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【０１１５】
これらに限定されるものではないが、一本鎖ポリペプチド、二本鎖ポリペプチド、三本鎖ポリペプチド、四本鎖ポリペプチド、及びそれらの倍数を含む、様々なフォーマットの二重特異性抗体が本発明の範囲に含まれる。本明細書の二重特異性抗体としては、成熟Ｂ細胞上で選択的に発現されるＣＤ１９と、ＣＤ３とに結合するＴ細胞二重特異性抗体が具体的に挙げられる（抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３抗体）。かかる抗体は、ＣＤ１９を発現する細胞の強力なＴ細胞介在性殺滅を誘導する。
【０１１６】
抗ＣＤ１９重鎖抗体の調製
本発明の重鎖抗体は、当技術分野で知られている方法によって調製することができる。好ましい実施形態において、本明細書の重鎖抗体は、内因性の免疫グロブリン遺伝子をノックアウトまたは無効化したトランスジェニックマウス及びラット、好ましくはラットを含むトランスジェニック動物によって産生される。好ましい実施形態において、本明細書の重鎖抗体は、ＵｎｉＲａｔ（商標）で産生される。ＵｎｉＲａｔ（商標）は、内因性の免疫グロブリン遺伝子をサイレンシングし、ヒト免疫グロブリン重鎖の導入遺伝子座を用いて完全ヒトＨＣＡｂの多様で自然に最適化されたレパートリーを発現する。ラットの内因性免疫グロブリン遺伝子座は、様々な技術を用いてノックアウトまたはサイレンシングすることができるが、ＵｎｉＲａｔ（商標）では、ジンクフィンガー（エンド）ヌクレアーゼ（ＺＮＦ）技術を用いて内因性のラット重鎖Ｊ遺伝子座、軽鎖Ｃκ遺伝子座、及び軽鎖Ｃλ遺伝子座を不活性化させる。卵母細胞へのマイクロインジェクション用のＺＮＦコンストラクトによって、ＩｇＨ及びＩｇＬノックアウト（ＫＯ）系統を作製することができる。詳細については、例えば、Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５：４３３を参照されたい。Ｉｇ重鎖ノックアウトラットの特性評価は、Ｍｅｎｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：２９３２−２９４１により報告されている。ＺＮＦ技術の利点は、最大数ｋｂの欠失によって遺伝子または遺伝子座をサイレンシングさせる非相同末端結合が、相同組み込みの標的部位も与えることができる点である（Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：６４−６７）。ＵｎｉＲａｔ（商標）で産生されたヒト重鎖抗体はＵｎｉＡｂｓ（商標）と呼ばれ、従来の抗体では攻撃することができないエピトープに結合することができる。その高い特異性、親和性、及び小さなサイズのため、ＵｎｉＡｂｓ（商標）は、単一及び多重特異的な用途において理想的である。
【０１１７】
ＵｎｉＡｂｓ（商標）以外に、本明細書には、ラクダ科のＶＨＨフレームワーク及び変異、及びそれらの機能的なＶＨ領域を欠く重鎖単独抗体が具体的に含まれる。かかる重鎖単独抗体は、例えばＷＯ２００６ ／ ００８５４８に記載されるように完全ヒト重鎖単独遺伝子座を含むトランスジェニックラットまたはマウスで産生させることができるが、ウサギ、モルモット、ラットなどの他のトランスジェニック哺乳動物も使用することができ、ラット及びマウスが好ましい。それらのＶＨＨまたはＶＨ機能性フラグメントを含む重鎖単独抗体は、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、大腸菌または酵母を含む適当な真核生物または原核生物宿主内でのコード核酸の発現によって組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。。
【０１１８】
重鎖単独抗体のドメインは抗体と小分子薬の利点を兼ね備えている。すなわち、一価または多価とすることができ、毒性が低く、製造コストが低い。これらのドメインはその小さいサイズのため、経口または局所投与を含めた投与が容易であり、胃腸安定性を含む高い安定性を特徴とし、その半減期を所望の用途または適応症に合わせて調節することができる。さらに、ＨＣＡｂのＶＨ及びＶＨＨドメインは、コスト効率の高い方法で製造することができる。
【０１１９】
特定の実施形態において、ＵｎｉＡｂｓ（商標）を含む本発明の重鎖抗体は、ＦＲ４領域の第１の位置（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによるアミノ酸位置１０１）の天然アミノ酸残基が、その位置の天然アミノ酸残基を含むかまたは天然アミノ酸残基に関連した表面に露出した疎水性パッチを破壊することができる別のアミノ酸残基で置換されている。このような疎水性パッチは通常は抗体の軽鎖定常領域との界面に埋め込まれているが、ＨＣＡｂでは表面に露出し、ＨＣＡｂの望ましくない凝集及び軽鎖の会合に少なくとも部分的に有利に働く。置換されるアミノ酸残基は、好ましくは荷電しているものであり、より好ましくは、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）またはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、好ましくはアルギニン（Ｒ）などの正に荷電したものである。好ましい実施形態において、トランスジェニック動物に由来する重鎖単独抗体は、１０１位にＴｒｐからＡｒｇへの変異を含む。得られたＨＣＡｂは、好ましくは、凝集のない生理学的条件下で高い抗原結合親和性及び溶解性を有する。
【０１２０】
本発明の一環として、ＥＬＩＳＡ（組換えＣＤ１９細胞外ドメイン）タンパク質及び細胞結合アッセイにおいてヒトＣＤ１９に結合する、ＵｎｉＲａｔ（商標）動物 （ＵｎｉＡｂ（商標））由来の固有の配列を有するヒトＩｇＧ抗ＣＤ１９重鎖抗体を同定した。同定された重鎖可変領域（ＶＨ）配列（図２を参照）は、ヒトＣＤ１９タンパク質結合及び／またはＣＤ１９＋細胞への結合について陽性であり、ＣＤ１９を発現しない細胞への結合についてはすべて陰性である。
【０１２１】
本明細書に記載される抗体は、ＣＤ１９陽性バーキットリンパ腫細胞株であるＤａｕｄｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２１３（商標））、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−８６（商標））、及びＲａｍｏｓ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５９６（商標））に結合し、一部はカニクイザルのＣＤ１９タンパク質との交差反応性を示す。さらに、本明細書に記載される抗体は、必要に応じて、任意の動物種のＣＤ１９タンパク質との交差反応性を与えるように操作することができる。
【０１２２】
本明細書のＵｎｉＡｂｓ（商標）などの抗ＣＤ１９重鎖抗体は、Ｋｄが、約１０−６〜約１０−１０ 、約１０−６〜約１０−９、約１０−６〜約１０−８、約１０−８〜約１０−１１、約１０−８〜約１０−１０、約１０−８〜約１０−９、約１０−９〜約１０−１１、約１０−９〜約１０−１０、またはこれらの範囲内の任意の値を含む、約１０−６〜約１０−１１の値であるような、ＣＤ１９に対する親和性を有することができる。親和性選択は、インビトロアッセイ、前臨床モデル、及び臨床試験、ならびに潜在的な毒性の評価を含む、ＣＤ１９の生物学的活性を調節する、例えば阻止する生物学的評価によって確認することができる。
【０１２３】
ＣＤ１９タンパク質上の重複しないエピトープに結合する重鎖抗体、例えば、ＵｎｉＡｂｓ（商標）は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡアッセイ）またはフローサイトメトリー競合結合アッセイなどの競合結合アッセイによって同定することができる。例えば、標的抗原に結合する既知の抗体と対象とする抗体との間の競合を利用することができる。この手法を用いることにより、抗体のセットを参照抗体と競合するものと競合しないものとに分けることができる。非競合抗体は、参照抗体が結合するエピトープと重複しない異なるエピトープに結合するものとして特定される。多くの場合、１つの抗体を固定化し、抗原を結合させ、第２の標識された（例えば、ビオチン化された）抗体をＥＬＩＳＡアッセイで、捕捉された抗原に結合する能力について試験する。これは、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ、Ｉｎｃ）、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００及びＢｉａｃｏｒｅＴ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにＭＸ９６  ＳＰＲイメージャー（Ｉｂｉｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｂ．Ｖ．）などの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）プラットフォーム、ならびにＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄ３８４やＯｃｔｅｔ  ＨＴＸ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ  Ｉｎｃ）などのバイオレイヤー干渉法プラットフォームを用いて行うこともできる。さらなる詳細については、本明細書の実施例を参照されたい。
【０１２４】
一般的に、抗体は、上記に述べた競合結合アッセイなどの標準的な方法で測定した場合に、参照抗体と標的抗原との結合の約１５〜１００％の低下を生じる場合に参照抗体と「競合」する。様々な実施形態において、相対阻害率は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれ以上である。
【０１２５】
医薬組成物、使用及び治療方法
本発明の別の態様は、適当な薬学的に許容される担体と混合された本発明の１つ以上の抗体を含む医薬組成物を提供することである。本明細書で使用される薬学的に許容される担体としては、これらに限定されるものではないが、アジュバント、固体担体、水、緩衝液、または治療成分を保持するために当該技術分野で使用される他の担体、またはそれらの組み合わせが例示される。
【０１２６】
一実施形態において、医薬組成物は、ＣＤ１９に結合する重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂ（商標））を含む。別の実施形態において、医薬組成物は、ＣＤ１９タンパク質上の２つ以上の重複しないエピトープに対する結合特異性を有する多重特異性（二重特異性を含む）重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂ（商標））を含む。好ましい実施形態において、医薬組成物は、ＣＤ１９に対する結合特異性及びエフェクター細胞上の結合標的（例えば、Ｔ細胞上の結合標的、例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質）に対する結合特異性を有する多重特異性（二重特異性を含む）重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂ（商標））を含む。
【０１２７】
本発明に従って使用される抗体の医薬組成物は、例えば凍結乾燥製剤または水溶液の形態として、所望の純度を有するタンパク質を任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤(例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することにより保存用に調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量及び濃度で投与対象に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１２８】
非経口投与用の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、実質的に等張であり、適正製造基準（ＧＭＰ）条件下で製造される。医薬組成物は、単位剤形（すなわち、単回投与用量）で提供することができる。製剤は選択される投与経路によって決まる。本明細書の抗体は、静脈内注射または点滴または皮下投与によって投与することができる。注射投与の場合、本明細書の抗体を、水溶液、好ましくは注射部位の不快感を軽減するための生理学的に適合性を有する緩衝液として製剤化することができる。溶液は、上記に述べたように担体、賦形剤、または安定剤を含むことができる。あるいは、抗体は、使用に先立って適当なビヒクル、例えば無菌パイロジェンフリー水で戻すための凍結乾燥形態とすることもできる。
【０１２９】
抗体製剤については、例えば米国特許第９，０３４，３２４号に記載されている。同様の製剤を、本発明のＵｎｉＡｂｓ（商標）を含む重鎖抗体に使用することができる。皮下抗体製剤については、例えば、ＵＳ２０１６０３５５５９１及びＵＳ２０１６０１６６６８９に記載されている。
【０１３０】
使用方法
本明細書に記載される重鎖単独抗ＣＤ１９抗体、多重特異性抗体、及び医薬組成物は、本明細書にさらに記載される状態及び疾患を含むがこれらに限定されない、ＣＤ１９の発現を特徴とする疾患及び状態の治療に使用することができる。
【０１３１】
ＣＤ１９は、すべてのヒトＢ細胞で発現するが形質細胞にはみられない細胞表面受容体である。ＣＤ１９は、比較的大きな、アミノ酸２４０個からなる細胞質内尾部を持っている。細胞外のＩｇ様ドメインは、潜在的なジスルフィド結合非Ｉｇ様ドメインとＮ結合炭水化物付加部位とによって分けられている。細胞質の尾部には、Ｃ末端近くに少なくとも９つのチロシン残基が含まれており、そのうちのいくつかはリン酸化されていることが示されている。ＣＤ２０及びＣＤ２２とともに、ＣＤ１９のＢ細胞系統での制限された発現のため、ＣＤ１９はＢ細胞悪性疾患の治療の魅力的な標的となっている。ＣＤ１９は、多くの血液悪性腫瘍での発現が観察されているため、抗体ベースの治療法における有望な標的となっている。
【０１３２】
一態様では、本明細書のＣＤ１９重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂｓ（商標））及び医薬組成物は、これらに限定されるものではないが、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及びＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含む、ＣＤ１９の発現を特徴とする血液悪性腫瘍を治療するために使用することができる。
【０１３３】
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬまたはＤＬＢＬ）は、成人の非ホジキンリンパ腫の最も一般的な形態であり（Ｂｌｏｏｄ  １９９７  ８９（１１）：３９０９−１８）、米国及びイギリスにおける推定年間発生率は１０万人あたり年間７〜８例である。この疾患は、身体のほぼすべての部分で発生しうる侵攻性のがんとして特徴付けられる。ＤＬＢＣＬの原因はよく理解されておらず、正常なＢ細胞だけでなく、他の種類のリンパ腫または白血病細胞の悪性形質転換からも発生する場合がある。治療アプローチでは一般的に化学療法及び放射線療法を行い、成人の全体的な５年平均生存率は約５８％となっている。一部のモノクローナル抗体はＤＬＢＣＬの治療に有望であることが示されているが、安定的な臨床効果は依然、決定的には実証されてない。したがって、ＤＬＢＣＬに対する免疫療法を含む新たな治療法が強く求められている。
【０１３４】
別の局面において、本明細書におけるＣＤ１９重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂｓ（商標））及び医薬組成物は、これらに限定されるものではないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、及び多発性硬化症（ＭＳ）を含む、ＣＤ１９を発現する病原性Ｂ細胞を特徴とする自己免疫疾患を治療するために使用することができる。
【０１３５】
疾患を治療するための本発明の組成物の有効な用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び処置が予防的なものであるか治療的なものであるかを含む多くの異なる要因に応じて異なる。通常、患者はヒトであるが、例えば、イヌ、ネコ、ウマなどのコンパニオンアニマル、例えば、ウサギ、マウス、ラットなどの実験用哺乳動物などの非ヒト哺乳動物を治療することもできる。治療用量は、安全性及び有効性を最適化するために滴定してもよい。
【０１３６】
投与量は、当業者によって容易に決定することが可能であり、必要に応じて、例えば、治療に対する対象の応答を変化させるうえで必要に応じて変更することが可能である。単回剤形を与えるために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される宿主及び特定の投与様式に応じて異なる。単位剤形は一般的に約１ｍｇ〜約５００ｍｇの有効成分を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、薬剤の治療的投与量は、約０．０００１〜１００ｍｇ ／ｋｇ（宿主体重）、より一般的には０．０１〜５ｍｇ ／ ｋｇの範囲とすることができる。例えば、投与量は、１ｍｇ ／ｋｇ（体重）もしくは１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、または１〜１０ｍｇ ／ ｋｇの範囲内とすることができる。例示的な治療計画では、２週間に１回、または月１回、または３〜６ヶ月に１回の投与を行う。本発明の治療物は、通常、複数の機会に投与される。単回投与間の間隔は、週単位、月単位または年単位とすることができる。また、間隔は、患者の治療物の血中レベルを測定することによって示される場合、不規則であってもよい。あるいは、本発明の治療物は、徐放性製剤として投与してもよく、その場合、投与頻度を減らすことができる。用量及び頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期に応じて異なる。
【０１３８】
一般的に、組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注射剤として調製され、また、注射に先立って液体溶媒中に溶解または懸濁するのに適した固体形態も調製することができる。本明細書の医薬組成物は、直接または固体（例えば、凍結乾燥）組成物を戻した後での静脈内または皮下投与に適している。製剤はまた、上記で述べたようにアジュバント効果を高めるために、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはコポリマーなどのリポソームまたは微粒子中に乳化またはカプセル化することができる。Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７，１９９０及びＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８：９７−１１９，１９９７。本発明の薬剤は、有効成分の持続的またはパルス放出を可能とする形で製剤化することができるデポー注射またはインプラント製剤の形態として投与することもできる。医薬組成物は一般に、無菌で、実質的に等張であり、米国食品医薬品局の適正製造基準（ＧＭＰ）規制のすべてに完全に準拠したものとして製剤化される。
【０１３９】
本明細書に記載される抗体及び抗体構造の毒性は、細胞培養または実験動物で標準的な薬学的手順により、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％致死用量）またはＬＤ１００（集団の１００％致死用量）を決定することにより、決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数である。これらの細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータを、ヒトでの使用に毒性のない投与量範囲を決定するうえで使用することができる。本明細書に記載される抗体の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくない有効用量を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。正確な配合、投与経路、及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる。
【０１４０】
投与用の組成物は、一般に、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体に溶解された抗体または他の除去剤を含む。様々な水性担体、例えば、緩衝生理食塩水などを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、望ましくない物質を一般的に含まない。これらの組成物は従来の周知の滅菌法によって滅菌することができる。組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び乳酸ナトリウムなどのｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤など、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質を含むことができる。これらの製剤中の活性剤の濃度は大きく異なってよく、選択された特定の投与様式及び患者のニーズに応じて、主に液量、粘度、体重などに基づいて選択される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１５ｔｈ  ｅｄ．，１９８０）  ａｎｄ  Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｌｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９６）を参照）。
【０１４１】
本発明の活性剤及びその製剤、ならびにそれらの使用説明書を含むキットも本発明の範囲内に含まれる。キットは、少なくとも１つの追加の試薬、例えば、化学療法薬などをさらに含むことができる。キットは、通常、キットの内容物の目的とする用途を示すラベルを含む。本明細書で使用するところの「ラベル」なる用語には、キットの表面に、もしくはキットと一緒に提供される、または他の形でキットに付属する、あらゆる文書または記録物が含まれる。
【０１４２】
以上、本発明を完全に記載したが、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正を行うことができる点は当業者には明白であろう。
【実施例】
【０１４３】
材料及び方法
ＣＤ１９細胞結合
ＣＤ１９陽性細胞への結合を、Ｄａｕｄｉ細胞株（ＡＴＣＣ）を使用したフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって評価した。要約すると、１０万個の標的細胞を４℃で３０分間、精製したＵｎｉＡｂｓ（商標）の希釈系列で染色した。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリーバッファー（１Ｘ  ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）で２回洗浄し、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）に結合したヤギＦ（ａｂ ’）２抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０４２−０９）で染色して細胞に結合した抗体を検出した。４℃で２０分間インキュベートした後、細胞をフローサイトメトリーバッファーで２回洗浄し、次いで平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーで測定した。ＥＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７を使用して計算した。カニクイザルＣＤ１９陽性細胞への結合を以下の変更を加えた同じプロトコールを使用して測定した。すなわち、標的細胞は、カニクイザルＣＤ１９の細胞外ドメインを発現するように安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞由来のものとし、各抗体を単一濃度（約１．７μｇ ／ｍＬ）で試験したため、ＥＣ５０値は計算されなかった。
【０１４４】
実施例１：重鎖単独抗体を発現する遺伝子操作ラット
「ヒト−ラット」ＩｇＨ遺伝子座を構築し、いくつかの部分としてアセンブルした。ここで、ラットＣ領域遺伝子の改変及びヒトＪＨの下流への結合、及びその後のヒトＶＨ６−Ｄセグメント領域の上流への付加を行った。次に、ヒトＶＨ遺伝子の別々のクラスターを含む２つのＢＡＣ［ＢＡＣ６及びＢＡＣ３］を、ヒトＶＨ６、すべてのＤ、すべてのＪＨ、及び改変ラットＣγ２ａ／ １ ／２ｂを含むアセンブル及び改変された領域をコードする、Ｇｅｏｒｇと称されるＢＡＣと同時注入した（ΔＣＨ１）。
【０１４５】
再構成されていない形態の人工重鎖免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックラットを作製した。ＩｇＧ２ａ（ΔＣH１）、ＩｇＧ１（ΔＣH１）、ＩｇＧ２ｂ（ΔＣH１）遺伝子は、ＣH１セグメントを欠いたものである。定常領域遺伝子ＩｇＥ、ＩｇＡ及び３’エンハンサーはＧｅｏｒｇＢＡＣに含まれていた。トランスジェニックラットのＲＴ−ＰＣＲ及び血清分析（ＥＬＩＳＡ）により、トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座の生産的再編成及び血清中の様々なアイソタイプの重鎖単独抗体の発現が明らかになった。トランスジェニックラットを、米国特許公開第２００９／００９８１３４Ａ１号に以前に記載されている変異させた内因性重鎖及び軽鎖遺伝子座を有するラットと交配した。かかる動物の分析によって、ラット免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の発現の不活性化、ならびにヒトのＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子によってコードされる可変領域を有する重鎖抗体の高レベルの発現が示された。トランスジェニックラットの免疫化により、抗原特異的な重鎖抗体の高力価の血清応答が生じた。ヒトＶＤＪ領域を含む重鎖抗体を発現するこれらのトランスジェニックラットをＵｎｉＲａｔｓ（商標）と呼称した。
【０１４６】
実施例２：免疫
ＣＤ１９によるＤＮＡ免疫
ＣＤ１９配列を含む発現ベクターを使用して、標準的なＤＮＡベースの免疫プロトコールに従って６匹のＵｎｉＲａｔ動物を免疫した。４５日間の免疫時間の後、血清をラットから採取して血清力価を測定した。
【０１４７】
実施例３：ＣＤ１９発現細胞株との結合
図４に、記載される抗ＣＤ１９重鎖抗体（ＨＣＡｂ）の標的結合活性を要約する。列１は、ＨＣＡｂのクローンＩＤを示す。列２は、バックグラウンドＭＦＩシグナルに対する倍数として測定したＲａｊｉ細胞への結合を示す。列３は、バックグラウンドＭＦＩシグナルに対する倍数として測定したＲａｍｏｓ細胞への結合を示す。列４は、バックグラウンドＭＦＩシグナルに対する倍数として測定した、ヒトＣＤ１９を安定して発現するＣＨＯ細胞への結合を示す。列５は、バックグラウンドＭＦＩシグナルに対する倍数として測定した、ＣＤ１９タンパク質を発現しないＣＨＯ細胞への結合を示す。
【０１４８】
実施例４：活性化Ｔ細胞の再方向付けによる二重特異性抗体を媒介したＤａｕｄｉヒト腫瘍細胞の殺滅
ＣＤ１９陽性腫瘍細胞株を色素標識し、予め活性化されたヒトＴ細胞の存在下で増加する量の二重特異性抗体とともにインキュベートした。二重特異性抗体は、図５Ｂに示される、抗ＣＤ１９  ＶＨ結合ドメインとペアを形成した抗ＣＤ３結合アームで構成されるものとした（クローンＩＤ：３３４３５４）。同じフォーマットの２つのＣＤ２２ｘＣＤ３二重特異性抗体をポジティブコントロールとして含めた。ネガティブコントロール抗体は、ＣＤ１９に結合しないＶＨ結合ドメインを含むものとした。ＣＤ２２陰性Ｋ５６２細胞は特異的な溶解を示さなかった（データは示していない）。
【０１４９】
実施例５：ＣＤ１９タンパク質の結合
抗原及び抗体の親和性を決定するための速度論の実験を、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００機器で行った。Ｐｅｎｔａ  Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ  ｍＡＢを、標準的なアミンカップリングを用いてＣＭ７バイオセンサーチップに結合させた。Ａｃｒｏ  ＣＤ１９（２０−２９１）Ｈｉｓタグ付き（ロットＣ５２Ｐ２−７Ｃ１Ｆ１−ＧＪ）を２００ｕｌの水に溶解してから１／１００に希釈し、抗Ｈｉｓ  ｍＡｂチップ上に捕捉した。クローンＩＤ番号３３４３５４を、３倍希釈系列の最高濃度の３．６ｕＭで試験した。図６に示されるように、データを１：１相互作用モデルに当てはめた。
【０１５０】
実施例６：腫瘍モデル
手順の説明：ＮＯＧマウスに、ルシフェラーゼ標識したヒト腫瘍細胞を静脈内移植した。腫瘍移植の５日後にヒトＰＢＭＣを注射し、６日目に抗体を投与した。マウスを、抗ＣＤ１９ｘＣＤ３抗体及びネガティブコントロール（ＮＣ）を週４回、１用量当たり１０ｕｇを静脈内注射することによって処置した。腫瘍負荷を最大１か月間、２〜４日ごとに評価した。
【０１５１】
動物及び種の選択： 実験は、１５００万個のヒトＰＢＭＣを移植したＮＯＧマウスで行った。
【０１５２】
サンプルサイズ： グループ当たり５匹以上の動物を腫瘍に曝露し、抗ＣＤ１９ｘＣＤ３またはコントロール抗体で処置した。一般的に、過去の生化学的及び生理学的研究では、ｎ＝４〜６匹の動物のサンプルサイズが、２標本ｔ検定を両側有意水準０．０５で用いて各処置条件間で１．６ＳＤ単位の有効サイズを検出するうえで適当な統計的検定力（つまり、８０％の検定力）を与えることが示されている。図７のデータに示されるように、抗ＣＤ１９ｘＣＤ３抗体は動物モデルにおいて腫瘍増殖を統計的に有意に減少させた。
【０１５３】
実施例７：インビトロ細胞傷害モデル
ＣＤ１９陽性（ＣＤ１９＋）腫瘍細胞株を色素で標識し、予め活性化されたＴ細胞の存在下で増加する量の二重特異性抗体（ＣＤ１９ｘＣＤ３）とともにインキュベートした。６時間のインキュベーション後、色素の放出による蛍光を分析した。図５Ｂに模式的に示されるように、二重特異性抗体は、抗ＣＤ１９  ＶＨ結合ドメイン（３３４３５４）とペアを形成した抗ＣＤ３結合アーム（ファミリーＦ２Ｂ）で構成されるものとした。他の２つの二重特異性抗体、すなわち、ａ）抗ＣＤ１９  ＶＨ結合ドメイン（３３４３５４）とペアを形成した抗ＣＤ３結合アーム（ファミリーＦ１Ｆ）、及びｂ）ビーリンサイトを含めた。図８に示される結果は、試験した二重特異性抗体のすべてについて標的細胞溶解の割合（％）が濃度依存的に増加したことを示している。ＣＤ１９（Ｉｄ３３４３５４）ｘＣＤ３Ｆ２Ｂ及びＣＤ１９（Ｉｄ３３４３５４）ｘＣＤ３Ｆ１Ｆでは、ビーリンサイトと比較して、標的細胞溶解の割合（％）は抗体濃度の関数としてより速い速度で増加した。最大溶解度は、ＣＤ１９（Ｉｄ３３４３５４）ｘＣＤ３Ｆ２Ｂ、ＣＤ１９（Ｉｄ３３４３５４）ｘＣＤ３Ｆ１Ｆ、及びブリナツモマカで同じであった。
【０１５４】
実施例８：インビトロサイトカインモデル
ＣＤ１９陽性（ＣＤ１９＋）腫瘍細胞株を、休止Ｔ細胞の存在下で２４時間、増加する量の二重特異性抗体（ＣＤ１９ｘＣＤ３）とともにインキュベートした。インキュベーション後の上清を回収し、サイトカインを測定した。図５Ｂに模式的に示されるように、二重特異性抗体は、抗ＣＤ１９  ＶＨ結合ドメイン（３３４３５４）とペアを形成する抗ＣＤ３結合アーム（ファミリーＦ２Ｂ）で構成されるものとした。他の２つの二重特異性抗体、すなわち、ａ）抗ＣＤ１９  ＶＨ結合ドメイン（３３４３５４）とペアを形成した抗ＣＤ３結合アーム（ファミリーＦ１Ｆ）、及びｂ）ビーリンサイトを含めた。図９に示される結果は、サイトカイン放出の量が各抗体によって異なり、濃度依存的に増加したことを示している。具体的には、ＣＤ１９（Ｉｄ３３４３５４）ｘＣＤ３Ｆ２Ｂ二重特異性抗体は最低レベルのサイトカイン放出を示した。ビーリンサイトは抗体濃度の関数としてより高いサイトカイン放出を示し、ＣＤ１９（Ｉｄ３３４３５４）ｘＣＤ３Ｆ１Ｆ二重特異性抗体は最高レベルのサイトカイン放出を示した。最大サイトカイン産生は、ＣＤ１９（Ｉｄ３３４３５４）ｘＣＤ３Ｆ１Ｆで最も高く、次にビーリンサイトであり、ＣＤ１９（Ｉｄ３３４３５４）ｘＣＤ３Ｆ２Ｂで最も低かった。
【０１５５】
以上、本発明の好ましい実施形態について本明細書に図示及び記載したが、かかる実施形態はあくまで実例として与えられるものに過ぎない点は当業者には明らかであろう。ここで、当業者には、多数の変形、変更、及び置換を本発明から逸脱することなく想定されるであろう。本明細書に記載される発明の実施形態の様々な代替物を本開示の実施に当たって用いることが可能である点を理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲に含まれる方法及び構造、ならびにそれらの等価物が特許請求の範囲によって網羅されるものとする。
【図１】
2021530236.tif 000004
【図２】
2021530236.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
2021530236000001.app
【国際調査報告】
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