(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）2021533118.tif 000016の少なくとも１つのホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドであって、式中、（Ａ１）、（Ａ２）およびＲが、本明細書および特許請求の範囲で定義された通りである、オリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴヌクレオチドは、薬剤として使用することができる。
2021533118.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
2021533118.tif 000015
の少なくとも１つのホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドであって、（Ａ１）が３’−ヌクレオシドであり、（Ａ２）が５’−ヌクレオシドであり、かつＲが水素またはリン酸保護基である、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記ヌクレオシド（Ａ１）が、ＤＮＡヌクレオシド、ＲＮＡヌクレオシド、または糖修飾ヌクレオシドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記ヌクレオシド（Ａ１）が、ＤＮＡヌクレオシドまたは糖修飾ヌクレオシドである、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記ヌクレオシド（Ａ２）が、ＤＮＡヌクレオシド、ＲＮＡヌクレオシド、または糖修飾ヌクレオシドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記ヌクレオシド（Ａ２）が、ＤＮＡヌクレオシドまたは糖修飾ヌクレオシドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記糖修飾ヌクレオシドが、２’糖修飾ヌクレオシドである、請求項２〜５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記ヌクレオシド（Ａ２）が、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、特に２’−メトキシ−ＲＮＡ、２’−アルコキシアルコキシ−ＲＮＡ、特に２’−メトキシエトキシ−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡまたは２’−フルオロ−ＡＮＡである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記ヌクレオシド（Ａ２）が、ＬＮＡヌクレオシドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記ＬＮＡヌクレオシドが、β−Ｄ−オキシＬＮＡ、６’−メチル−β−Ｄ−オキシＬＮＡおよびＥＮＡから独立して選択され、特にβ−Ｄ−オキシＬＮＡである、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ヌクレオシド（Ａ１）および（Ａ２）の少なくとも一方が２’−アルコキシアルコキシ−ＲＮＡである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記２’−アルコキシアルコキシ−ＲＮＡが２’−メトキシエトキシ−ＲＮＡである、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
ヌクレオシド（Ａ１）および（Ａ２）が両方ともＤＮＡヌクレオシドまたは両方とも２’糖修飾ヌクレオシドヌクレオシド、特にＬＮＡヌクレオシドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
ホスホジエステルヌクレオシド間結合、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合および請求項１で定義された式（Ｉ）のホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合から選択されるさらなるヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
ホスホロチオアートヌクレオシド間結合および請求項１で定義された式（Ｉ）のホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合から選択されるさらなるヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１で定義された式（Ｉ）の１〜１５個、特に１〜５個、より特には１、２、３、４または５個のホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記さらなるヌクレオシド間結合が、全て式−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＲ）Ｏ２−のホスホロチオアートヌクレオシド間結合であり、式中、Ｒが、請求項１で定義された通りである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
ＤＮＡヌクレオシド、ＲＮＡヌクレオシドおよび糖修飾ヌクレオシドから選択されるさらなるヌクレオシドを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
１つ以上のヌクレオシドが核酸塩基修飾ヌクレオシドである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ模倣物またはリボザイムである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記式（Ｉ）のホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合が前記ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域にある、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
前記式（Ｉ）のホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合が前記ギャップマーオリゴヌクレオチドの隣接領域にある、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
前記ギャップマーオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマー、混合ウイングギャップマー、または２’置換ギャップマー、特に２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマーである、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
前記ギャップマーオリゴヌクレオチドが式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’の連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｇが、ＲｎアーゼＨを動員することができる５〜１８ヌクレオシドの領域であり、前記領域Ｇが、それぞれ隣接領域ＦおよびＦ’によって５’および３’に隣接しており、領域ＦおよびＦ’は、独立して、１〜７つの２’糖修飾ヌクレオチドを含むか、またはそれからなり、領域Ｇに隣接する領域Ｆのヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドであり、領域Ｇに隣接する領域Ｆ’のヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドである、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項１で定義された前記式（Ｉ）の少なくとも１つのホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合が、領域Ｇの隣接するヌクレオシド間に、または領域Ｇと領域Ｆ’との間に配置されている、請求項２４に記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドミックスマーまたはトータルマー、特にスプライススイッチングオリゴヌクレオチドまたはマイクロＲＮＡ阻害剤オリゴヌクレオチドである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの医薬として許容され得る塩、特にナトリウム塩またはカリウム塩。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは医薬として許容され得る塩と、場合によりリンカー部分を介して、前記オリゴヌクレオチドまたは前記医薬として許容され得る塩に共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、医薬として許容され得る塩またはコンジュゲートと、治療上不活性である担体とを含む、医薬組成物。
【請求項３０】
治療活性のある物質としての使用のための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、医薬として許容され得る塩またはコンジュゲート。
【請求項３１】
心臓または血液の疾患の処置または予防に使用するための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、医薬として許容され得る塩またはコンジュゲート。
【請求項３２】
心臓または血液の疾患の処置または予防のための薬剤の調製のための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、医薬として許容され得る塩またはコンジュゲートの使用。
【請求項３３】
心臓または血液の疾患の処置または予防における、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、医薬として許容され得る塩またはコンジュゲートの使用。
【請求項３４】
その必要がある患者に、有効量の請求項１〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、医薬として許容され得る塩またはコンジュゲートを投与することを含む、心臓または血液の疾患の処置または予防のための方法。
【請求項３５】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造のためのプロセスであって、以下のステップ：
（ａ）ヌクレオシドチオホスホルアミダイトを５’Ｓ修飾ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの末端５’硫黄原子にカップリングして、ジチオホスファイトトリエステル中間体を生成するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記ジチオホスファイトトリエステル中間体をチオ酸化するステップ、および
（ｃ）場合により前記オリゴヌクレオチドをさらに伸長させるステップ
を含む、プロセス。
【請求項３６】
請求項３５に記載のプロセスによって製造されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
先に説明したような本発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式（Ｉ）の少なくとも１個のホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドに関し、
2021533118.tif 000003
式中、（Ａ１）は３’−ヌクレオシドであり、（Ａ２）は５’−ヌクレオシドであり、かつＲは水素またはリン酸保護基である。
【背景技術】
【０００２】
短い合成核酸は、治療薬として高い可能性を示している。１９７０年代後半の最初の概念実証研究で、未修飾のデオキシヌクレオチドがインビトロでウイルス産生を阻害することが実証されて以来（Ｐ．Ｃ．Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｍ．Ｌ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９７８，７５，２８０−２８４（非特許文献１））、化学修飾によって顕著な進歩が達成されている。核酸分解に対する感度が高いために、核酸のホスホジエステル骨格の安定化は、治療用オリゴヌクレオチドの化学的最適化の明らかな出発点であった。結果として、ホスホロチオアート（ＰＳ）（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００９，１０，１１７−１２１（非特許文献２））、ホスホロジチオアート（例えば、Ｗ．Ｔ．Ｗｅｉｓｌｅｒ，Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ  １９９６，６１，４２７２−４２８１．（非特許文献３））、ボラノホスファート（例えば、Ｊ．Ｓ．Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂ．Ｒ．Ｓｈａｗ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００１，８，１１４７−１１５５（非特許文献４））、（チオ）ホスホルアミダート（例えば、Ｓ．Ｇｒｙａｚｎｏｖ，Ｔ．Ｓｋｏｒｓｋｉ，Ｃ．Ｃｕｃｃｏ、Ｍ．Ｎｉｅｂｏｒｏｗｓｋａ−Ｓｋｏｒｓｋａ，Ｃ．Ｙ．Ｃｈｉｕ，Ｄ．Ｌｌｏｙｄ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｋｏｚｉｏｌｋｉｅｗｉｃｚ  Ｂ．Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９６，２４，１５０８−１５１４．（非特許文献５））、およびメチルホスホナート（例えば、Ｐ．Ｓ．Ｓａｒｉｎ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｍ．Ｐ．Ｃｉｖｅｉｒａ，Ｊ．Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｔ．Ｉｋｅｕｃｈｉ，Ｐ．Ｃ．Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８，２０，７４４８−７４５１（非特許文献６））を含む広範な種々のリン酸修飾が検討されてきた。これらのリン酸類似体の中で、おそらく最も成功した修飾は、非架橋リン酸酸素原子の１つが硫黄に置き換えられているホスホロチオアートである。ヌクレアーゼに対するその高い安定性とその薬物動態上の利点により、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド治療薬の第一世代となり、架橋型人工核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ））または２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−オリゴリボヌクレオチド（２’−ＭＯＥ）などの後の世代のための修飾への道を切り開いてきた。
【０００３】
しかしながら、ホスホジエステル結合をホスホロチオアートで置き換えると、リン原子にキラル中心がつくられる。結果として、これまでに承認された全てのオリゴヌクレオチド治療薬は、潜在的に異なる（かつおそらく反対の）物理化学的特性を有する大量のジアステレオ異性体化合物の混合物である。単一の立体化学的に定義されたホスホロチオアートオリゴヌクレオチドの立体特異的合成が今や可能である（Ｎ．Ｏｋａ，Ｍ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｗａｄａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１６０３１−１６０３７（非特許文献７））が、膨大な数の可能なジアステレオ異性体の中で最適な特性を有する立体異性体を特定する課題を残している。この脈絡において、非キラルなチオリン酸結合の使用によるジアステレオ異性体の複雑性の低減は大いに関心対象である。オリゴヌクレオチドに導入されたあらゆる非キラル（チオ）リン酸結合は、複雑性を５０％低減する。本発明者らは、種々のモノ、ジ、およびトリチオアートの特性を調べた。新規の対称性トリチオアートは、これらのうちであり、リン酸結合内で両末端の酸素原子と前のヌクレオチドのリボース糖部分の５’位にあるものとが硫黄によって置き換えられている（−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−結合）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｐ．Ｃ．Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｍ．Ｌ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９７８，７５，２８０−２８４
【非特許文献２】Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００９，１０，１１７−１２１
【非特許文献３】Ｗ．Ｔ．Ｗｅｉｓｌｅｒ，Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ  １９９６，６１，４２７２−４２８１．
【非特許文献４】Ｊ．Ｓ．Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂ．Ｒ．Ｓｈａｗ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００１，８，１１４７−１１５５
【非特許文献５】Ｓ．Ｇｒｙａｚｎｏｖ，Ｔ．Ｓｋｏｒｓｋｉ，Ｃ．Ｃｕｃｃｏ、Ｍ．Ｎｉｅｂｏｒｏｗｓｋａ−Ｓｋｏｒｓｋａ，Ｃ．Ｙ．Ｃｈｉｕ，Ｄ．Ｌｌｏｙｄ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｋｏｚｉｏｌｋｉｅｗｉｃｚ  Ｂ．Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９６，２４，１５０８−１５１４．
【非特許文献６】Ｐ．Ｓ．Ｓａｒｉｎ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｍ．Ｐ．Ｃｉｖｅｉｒａ，Ｊ．Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｔ．Ｉｋｅｕｃｈｉ，Ｐ．Ｃ．Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８，２０，７４４８−７４５１
【非特許文献７】Ｎ．Ｏｋａ，Ｍ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｗａｄａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１６０３１−１６０３７
【発明の概要】
【０００５】
非常に驚くべきことに、このような対称トリチオアートをオリゴヌクレオチドに導入すると、混合物全体のジアステレオ異性体の複雑性が低減するだけでなく、治療特性が改善された分子を生じることも本発明者らは発見した。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、ＬＴＫ細胞におけるＭａｌａｔ−１の低減についてのＩＣ５０値を示している示している。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本明細書において、用語「アルキル」は、単独または組み合わせで、１〜８個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、特に１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、より特には１〜４個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基を意味する。直鎖および分岐鎖Ｃ１−Ｃ８  アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ．−ブチル、異性体ペンチル、異性体ヘキシル、異性体ヘプチルおよび異性体オクチル、特にメチル、エチル、プロピル、ブチルおよびペンチルである。アルキルの詳しい例は、メチル、エチルおよびプロピルである。
【０００８】
用語「シクロアルキル」は、単独または組み合わせで、３〜８個の炭素原子を有するシクロアルキル環、特に３〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル環を意味する。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチル、より特にはシクロプロピルおよびシクロブチルである。「シクロアルキル」の詳しい例は、シクロプロピルである。
【０００９】
用語「アルコキシ」は、単独または組み合わせで、式アルキル−Ｏ−の基を意味し、用語「アルキル」は、以前付与した意味、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ．ブトキシおよびｔｅｒｔ．ブトキシを意味する。詳しい「アルコキシ」は、メトキシおよびエトキシである。メトキシエトキシは、「アルコキシアルコキシ」の詳しい例である。
【００１０】
用語「オキシ」は、単独または組み合わせで、−Ｏ−基を意味する。
【００１１】
用語「アルケニル」は、単独または組み合わせで、オレフィン結合と、８個まで、好ましくは６個まで、特に好ましくは４個までの炭素原子を含む直鎖または分岐鎖炭化水素残基を意味する。アルケニル基の例は、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニルおよびイソブテニルである。
【００１２】
用語「アルキニル」は、単独または組み合わせで、三重結合と、８個まで、特に２個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖炭化水素残基を意味する。
【００１３】
用語「ハロゲン」または「ハロ」は、単独または組み合わせで、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素、特にフッ素、塩素または臭素、より特にはフッ素を意味する。用語「ハロ」は、別の基と組合わせて、少なくとも１つのハロゲン、特に１〜５個のハロゲン、特に１〜４個のハロゲン、すなわち１個、２個、３個、または４個のハロゲンで置換された該基の置換を示す。
【００１４】
用語「ハロアルキル」は、単独または組み合わせで、少なくとも１つのハロゲンで置換された、特に１〜５個のハロゲン、特に１〜３個のハロゲンで置換されたアルキル基を意味する。ハロアルキルの例には、モノフルオロ−、ジフルオロ−またはトリフルオロ−メチル、−エチルまたは−プロピル、例えば３，３，３−トリフルオロプロピル、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、フルオロメチルまたはトリフルオロメチルが含まれる。詳しい「ハロアルキル」は、フルオロメチル、ジフルオロメチルおよびトリフルオロメチルである。
【００１５】
用語「ハロシクロアルキル」は、単独または組み合わせで、少なくとも１つのハロゲンで置換された、特に１〜５個のハロゲン、特に１〜３個のハロゲンで置換された、上記に定義したシクロアルキル基を意味する。用語「ハロシクロアルキル」の詳しい例は、ハロシクロプロピル、特にフルオロシクロプロピル、ジフルオロシクロプロピルおよびトリフルオロシクロプロピルである。
【００１６】
用語「ヒドロキシル」および「ヒドロキシ」は、単独または組み合わせで、−ＯＨ基を意味する。
【００１７】
用語「チオヒドロキシル」および「チオヒドロキシ」は、単独または組み合わせで、−ＳＨ基を意味する。
【００１８】
用語「カルボニル」は、単独または組み合わせで、−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。
【００１９】
用語「カルボキシ」または「カルボキシル」は、単独または組み合わせで、−ＣＯＯＨ基を意味する。
【００２０】
用語「アミノ」は、単独または組み合わせで、第１級アミノ基（−ＮＨ２）、第２級アミノ基（−ＮＨ−）、または第３級アミノ基（−Ｎ−）を意味する。
【００２１】
用語「アルキルアミノ」は、単独または組み合わせで、１個または２個の上記に定義したアルキル基で置換された、上記に定義したアミノ基を意味する。
【００２２】
用語「スルホニル」は、単独または組み合わせで、−ＳＯ２基を意味する。
【００２３】
用語「スルフィニル」は、単独または組み合わせで、−ＳＯ−基を意味する。
【００２４】
用語「スルファニル」は、単独または組み合わせで、−Ｓ−基を意味する。
【００２５】
用語「シアノ」は、単独または組み合わせで、−ＣＮ基を意味する。
【００２６】
用語「アジド」は、単独または組み合わせで、−Ｎ３基を意味する。
【００２７】
用語「ニトロ」は、単独または組み合わせで、ＮＯ２基を意味する。
【００２８】
用語「ホルミル」は、単独または組み合わせで、−Ｃ（Ｏ）Ｈ基を意味する。
【００２９】
用語「カルバモイル」は、単独または組み合わせで、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２基を意味する。
【００３０】
用語「カバミド」は、単独または組み合わせで、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２基を意味する。
【００３１】
用語「アリール」は、単独または組み合わせで、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立して選択される１〜３個の置換基で場合により置換された、６〜１０個の炭素環原子を含む、一価芳香族炭素環式単環または二環式環系を示す。アリールの例には、フェニルおよびナフチル、特にフェニルが含まれる。
【００３２】
用語「ヘテロアリール」は、単独または組み合わせで、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を含み、残りの環原子は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立して選択される１〜３個の置換基で場合により置換された炭素である、５〜１２個の環原子の一価芳香族複素環式単環または二環式環系を示す。ヘテロアリールの例には、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、イソオキサゾリル、ベンゾフラニル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、カルバゾリルまたはアクリジニルが含まれる。
【００３３】
用語「ヘテロシクリル」は、単独または組み合わせで、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１、２、３または４個の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立して選択される１〜３個の置換基で場合により置換された炭素である、４〜１２個、特に４〜９個の環原子の一価飽和または部分不飽和の単環式または二環式環系を意味する。単環式飽和ヘテロシクリルの例には、アゼチジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロ−チエニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、チアゾリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル、アゼパニル、ジアゼパニル、ホモピペラジニル、またはオキサゼパニルが含まれる。二環式飽和ヘテロシクロアルキルの例は、８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、キヌクリジニル、８−オキサ−３−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル、３−オキサ−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル、または３−チア−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニルである。部分不飽和ヘテロシクロアルキルの例は、ジヒドロフリル、イミダゾリニル、ジヒドロ−オキサゾリル、テトラヒドロ−ピリジニルまたはジヒドロピラニルである。
【００３４】
「医薬として許容され得る塩」という用語は、生物学的にまたは別様に望ましくないものではない、遊離塩基または遊離酸の生物学的な有効性および特性を保有する塩を指す。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、特に塩酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ−アセチルシステインなどの有機酸と共に形成される。加えて、これらの塩は、無機塩基または有機塩基を遊離酸に加えることにより調製され得る。無機塩基から誘導される塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩が含まれるがこれらに限定されない。有機塩基から誘導される塩には、第１級、第２級、および第３級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環式アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リシン、アルギニン、Ｎ−エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂の塩が含まれるがこれらに限定されない。本発明のオリゴヌクレオチドは、双性イオンの形態で存在することもできる。本発明の特に好ましい医薬として許容され得る塩は、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩およびトリアルキルアンモニウム塩である。
【００３５】
用語「保護基」は、単独または組み合わせで、化学反応が他の非保護の反応性部位で選択的に行われることができるように、多官能化合物の反応性部位を選択的に遮断する基を意味する。保護基は、除去することができる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基またはヒドロキシ保護基である。
【００３６】
「リン酸保護基」は、リン酸基の保護基である。リン酸保護基の例は、２−シアノエチルおよびメチルである。リン酸保護基の詳しい例は、２−シアノエチルである。
【００３７】
「ヒドロキシル保護基」は、ヒドロキシル基の保護基であり、チオール基を保護するためにも使用される。ヒドロキシル保護基の例は、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、β−メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル（またはビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル）（ＤＭＴ）、トリメトキシトリチル（またはトリス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル）（ＴＭＴ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル（ＭＭＴ）、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリチルまたはトリフェニルメチル（Ｔｒ）、シリルエーテル（例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリ−イソ−プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）およびトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）エーテル）、メチルエーテルおよびエトキシエチルエーテル（ＥＥ）である。ヒドロキシル保護基の詳しい例は、ＤＭＴおよびＴＭＴ、特にＤＭＴである。
【００３８】
「チオヒドロキシル保護基」は、チオヒドロキシル基の保護基である。チオヒドロキシル保護基の例は、「ヒドロキシル保護基」のものである。
【００３９】
本発明の出発物質または出発化合物のうち１つが、１つ以上の反応ステップの反応条件下で安定でないかまたは反応性である１つ以上の官能基を含む場合、適切な保護基（例えば、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」ｂｙ  Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  Ｅｄ．，１９９９，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに説明されているもの）を、当技術分野で周知の重要なステップ適用方法の前に導入することができる。このような保護基は、文献に説明する標準的な方法を用いて、合成の後の段階で除去することができる。保護基の例は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）である。
【００４０】
本明細書に説明される化合物は、数個の不斉中心を含むことができ、光学的に純粋なエナンチオマー、例えばラセミ体などのエナンチオマーの混合物、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性体ラセミ体またはジアステレオ異性体ラセミ体の混合物として存在することができる。
【００４１】
オリゴヌクレオチド
用語「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、それが当業者により、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として一般的に理解されているように定義される。このような共有結合ヌクレオシドは、核酸分子またはオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾が参照される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでもよい。
【００４２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの完全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）または相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二重鎖）を形成できることが理解される。
【００４３】
連続ヌクレオチド配列
用語「連続ヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で用語「連続核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列、例えばＦ−Ｇ−Ｆ’ギャップマー領域を含み、場合によりさらなるヌクレオチド、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。
【００４４】
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチドおよび非天然のヌクレオチドの両方を含む。天然では、ＤＮＡヌクレオチドおよびＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、「単位」または「モノマー」と互換的に称されてもよい。
【００４５】
修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、等価のＤＮＡヌクレオシドまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して、糖部分または（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。用語修飾ヌクレオシドはまた、用語「ヌクレオシド類似体」または修飾「単位」または修飾「モノマー」と互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域における修飾を有するヌクレオシドは、Ｗａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対形成が可能であれば、依然として一般にＤＮＡまたはＲＮＡと称される。
【００４６】
修飾ヌクレオシド間結合
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者により一般的に理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増大させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間のホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボ使用のためのオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの領域、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、ならびに領域ＦおよびＦ’などの修飾ヌクレオシドの領域におけるヌクレアーゼ切断から保護する役割を果たし得る。
【００４７】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合が、例えばヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性であるように、天然のホスホジエステルから修飾された１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることにより、またはヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を用いることにより決定することができ、これらの両方は当技術分野で周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強することができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と呼ばれる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合が修飾され、例えばオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０または例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基、例えばコンジュゲートを結合するヌクレオシドは、ホスホジエステルであり得ることが認識されるであろう。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドで使用するための好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアートである。
【００４９】
ホスホロチオアートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態および製造の容易さのために特に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオアートであり、例えばオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％または例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートである。いくつかの実施形態では、ホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合以外に、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオアートである。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロトリチオアート結合（複数可）に加えて、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合と少なくとも１つのホスホジエステル結合、例えば２、３または４個のホスホジエステル結合の両方を含む。ギャップマーオリゴヌクレオチドでは、ホスホジエステル結合は、存在する場合、ギャップ領域Ｇ内の連続ＤＮＡヌクレオシド間に適切には位置しない。
【００５０】
ホスホロチオアート結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、標的核酸と二重鎖を形成するときにヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域、例えばギャップマーの領域Ｇにおいて特に有用である。しかしながら、ホスホロチオアート結合は、非ヌクレアーゼ動員領域および／または親和性増強領域、例えばギャップマーの領域ＦおよびＦ’においても有用であり得る。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’、または領域ＦおよびＦ’の両方に１つ以上のホスホジエステル結合を含んでもよく、領域Ｇのヌクレオシド間結合は、完全にホスホロチオアートであり得る。
【００５１】
有利な方法では、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列中の全ヌクレオシド間結合、またはオリゴヌクレオチドの全ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアート結合である。
【００５２】
欧州特許第２７４２１３５号に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステルおよびホスホロチオアート以外の）、例えばアルキルホスホナート／メチルホスホナートヌクレオシド間結合を含んでもよいことが認識されており、これは欧州特許第２７４２１３５号によれば、例えば、別のＤＮＡホスホロチオアートのギャップ領域内で耐性であり得る。
【００５３】
立体的にランダムなホスホロチオアート結合
ホスホロチオアート結合は、非架橋酸素の１つが硫黄で置換されているヌクレオシド間リン酸結合である。非架橋酸素の１つを硫黄で置換すると、キラル中心が導入され、したがって単一のホスホロチオアートオリゴヌクレオチド内で、各ホスホロチオアートヌクレオシド間結合はＳ（Ｓｐ）またはＲ（Ｒｐ）立体アイソフォームのいずれかになる。このようなヌクレオシド間結合は、「キラルヌクレオシド間結合」と呼ばれる。それと比較して、ホスホジエステルヌクレオシド間結合は、２つの非末端酸素原子を有しているため、非キラルである。
【００５４】
立体中心のキラリティーの指定は、Ｃａｈｎ，Ｒ．Ｓ．；Ｉｎｇｏｌｄ，Ｃ．Ｋ．；Ｐｒｅｌｏｇ，Ｖ．（１９６６）「Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ」Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ５（４）：３８５−４１５．ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．１９６６０３８５１．で最初に公開された標準的なＣａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ則（ＣＩＰ順位則）によって決定される。
【００５５】
標準的なオリゴヌクレオチド合成中、カップリングの立体選択性とそれに続く硫化は制御されていない。このため、各ホスホロチオアートヌクレオシド間結合の立体化学はランダムにＳｐまたはＲｐであり、したがって従来のオリゴヌクレオチド合成によって生成されたホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、実際には２Ｘもの異なるホスホロチオアートジアステレオ異性体に存在し得、ここで、Ｘは、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合の数である。このようなオリゴヌクレオチドは、本明細書では立体的にランダムなホスホロチオアートオリゴヌクレオチドと呼ばれ、いずれの立体的に規定されたヌクレオシド間結合も含有しない。したがって、立体的にランダムなホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、立体的に規定されていない合成に由来する個々のジアステレオ異性体の混合物である。これに関連して、混合物は最大２Ｘの異なるホスホロチオアートジアステレオ異性体として定義される。
【００５６】
立体的に規定されたヌクレオシド間結合
立体的に規定されたヌクレオシド間結合は、その２つのジアステレオ異性形態であるＲｐまたはＳｐの一方に対してジアステレオ異性体過剰率を有するキラルなヌクレオシド間結合である。
【００５７】
当技術分野で使用される立体選択的オリゴヌクレオチド合成法は、典型的には、各キラルヌクレオシド間結合において少なくとも約９０％または少なくとも約９５％のジアステレオ選択性を提供することが認識されるものとし、したがってオリゴヌクレオチド分子の最大約１０％、例えば約５％が代替ジアステレオ異性形態を有していてもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態では、立体的に規定されたキラルな各ヌクレオシド間結合のジアステレオ異性体比は、少なくとも約９０：１０である。いくつかの実施形態では、キラルな各ヌクレオシド間結合のジアステレオ異性体比は、少なくとも約９５：５である。
【００５９】
立体的に規定されたホスホロチオアート結合は、立体的に規定されたヌクレオシド間結合の詳しい例である。
【００６０】
立体的に規定されたホスホロチオアート結合
立体的に規定されたホスホロチオアート結合は、その２つのジアステレオ異性形態であるＲｐまたはＳｐの一方に対してジアステレオマー過剰率を有するホスホロチオアート結合である。
【００６１】
ホスホロチオアートヌクレオシド間結合のＲｐ配置およびＳｐ配置を以下に示す：
2021533118.tif 000004
式中、３’Ｒ基は、隣接するヌクレオシド（５’ヌクレオシド）の３’位を表し、５’Ｒ基は、隣接するヌクレオシド（３’ヌクレオシド）の５’位を表す。
【００６２】
本明細書では、Ｒｐヌクレオシド間結合はｓｒＰとして表すこともでき、Ｓｐヌクレオシド間結合はｓｓＰとして表すことができる。
【００６３】
詳しい実施形態では、立体的に規定された各ホスホロチオアート結合のジアステレオマー比は、少なくとも約９０：１０または少なくとも９５：５である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、立体的に規定された各ホスホロチオアート結合のジアステレオマー比は、少なくとも約９７：３である。いくつかの実施形態では、立体的に規定された各ホスホロチオアート結合のジアステレオマー比は、少なくとも約９８：２である。いくつかの実施形態では、立体的に規定された各ホスホロチオアート結合のジアステレオマー比は、少なくとも約９９：１である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、立体的に規定されたヌクレオシド間結合は、オリゴヌクレオチド分子の集団に存在するオリゴヌクレオチド分子の少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、または（本質的に）全てが同じジアステレオマー形態（ＲｐまたはＳｐ）である。
【００６６】
ジアステレオマーの純度は、アキラルな骨格（すなわち、ホスホジエステル）のみを有するモデル系で測定することができる。各モノマーのジアステレオマー純度は、例えば、立体的に規定されたヌクレオシド間結合を有するモノマーを以下のモデルシステム「５’  ｔ−ｐｏ−ｔ−ｐｏ−ｔ−ｐｏ  ３’」にカップリングすることによって測定することができる。この結果は次のようになる：５’  ＤＭＴｒ−ｔ−ｓｒｐ−ｔ−ｐｏ−ｔ−ｐｏ−ｔ−ｐｏ  ３’または５’  ＤＭＴｒ−ｔ−ｓｓｐ−ｔ−ｐｏ−ｔ−ｐｏ−ｔ−ｐｏ  ３’であって、これらはＨＰＬＣを使用して分離することができる。ジアステレオマーの純度は、２つの可能なジアステレオ異性体からのＵＶ信号を積分し、これらの比、例えば、９８：２、９９：１または＞９９：１を与えることによって決定される。
【００６７】
具体的な単一のジアステレオ異性体（単一の立体的に規定されたオリゴヌクレオチド分子）のジアステレオマー純度は、各ヌクレオシド間位置での定義された立体中心に対するカップリング選択性、および導入されるべき立体的に規定されたヌクレオシド間結合の数の関数であることが理解されるであろう。例として、各位置でのカップリング選択性が９７％である場合、１５個の立体的に規定されたヌクレオシド間結合を有する立体的に規定されたオリゴヌクレオチドの結果として生じる純度は、０．９７１５となり、すなわち、他のジアステレオ異性体の３７％と比較して所望のジアステレオ異性体の６３％である。定義されたジアステレオ異性体の純度は、合成後、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーなどのＨＰＬＣによる精製によって改善することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの集団であって、該集団の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％が所望のジアステレオ異性体であるものを指す。
【００６９】
別様に記載すると、いくつかの実施形態では、立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの集団であって、該集団の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％が所望の（特定の）立体的に規定されたヌクレオシド間結合モチーフ（立体的に規定されたモチーフとも称される）からなるものを指す。
【００７０】
立体的にランダムなおよび立体的に規定されたヌクレオシド間キラル中心の両方を含む立体的に規定されたオリゴヌクレオチドの場合、立体的に規定されたオリゴヌクレオチドの純度は、所望の立体的に規定されたヌクレオシド間結合モチーフ（複数可）を保有するオリゴヌクレオチドの集団の％に関して決定され、立体的にランダムな結合は計算上無視される。
【００７１】
核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニンおよびグアニン）ならびにピリミジン（例えば、ウラシル、チミンおよびシトシン）部分を包含し、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンと、非天然の変異体との両方を指す。このような変異体は、例えばＨｉｒａｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ  ４５  ｐａｇｅ  ２０５５およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｕｐｐｌ．３７  １．４．１に説明されている。
【００７２】
いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを修飾プリンまたはピリミジン、例えば置換プリンまたは置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５−メチルシトシン、５−チアゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、２’チオ−チミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンから選択される核酸塩基に変えることにより修飾される。
【００７３】
核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵにより示されることができ、各文字は、等価の機能の修飾核酸塩基を場合により含むことができる。例えば、例示のオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃおよび５−メチルシトシンから選択される。場合により、ＬＮＡギャップマーについて、５−メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
【００７４】
修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを説明する。キメラ”オリゴヌクレオチドという用語は、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを説明するために文献で使用されている用語である。
【００７５】
立体的に規定されたオリゴヌクレオチド
立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合の少なくとも１つが、立体的に規定されたヌクレオシド間結合であるオリゴヌクレオチドである。
【００７６】
立体的に規定されたホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合の少なくとも１つが、立体的に規定されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合であるオリゴヌクレオチドである。
【００７７】
相補性
用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの塩基対形成の能力を説明する。Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対は、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば５−メチルシトシンは度々シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のＷａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を包含することが理解されるであろう（例えばＨｉｒａｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ  ４５  ｐａｇｅ  ２０５５およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｕｐｐｌ．３７  １．４．１を参照されたい）。
【００７８】
本明細書で使用される用語「％相補性」は、所定の位置において、別個の核酸（例えば、標的核酸）の所定の位置における連続ヌクレオチド配列に相補的な（すなわち、Ｗａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する）、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）中の連続ヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの割合を指す。百分率は、２つの配列間で対を形成する（標的配列５’−３’とオリゴヌクレオチド配列３’−５’を整列させたとき）、整列した塩基の数を計数し、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で除し、１００を乗じることにより計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。好ましくは、挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。
【００７９】
「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。
【００８０】
同一性
本明細書で使用される用語「同一性」は、所定の位置において、別個の核酸分子（例えば標的核酸）の所定の位置における連続ヌクレオチド配列と同一である（すなわち、相補的なヌクレオシドとＷａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する核酸分子の能力において）、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）中の連続ヌクレオチド配列におけるパーセント表記におけるオリゴヌクレオチドの数を指す。百分率は、２つの配列間で同一である整列した塩基の数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で除して１００を乗じることによって計算される。同一性パーセント＝（マッチ×１００）／整列した領域の長さ。好ましくは、挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。
【００８１】
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される用語「ハイブリッド形成している」または「ハイブリッド形成する」は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）が対向する鎖上の塩基対の間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成するとして理解するべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、度々、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔｍ）によって説明される。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ  ａｎｄ  Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １３：５１５−５３７）。標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表しており、ΔＧ°＝−ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）と関連付けられており、ここで、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍであり、ｐＨが７であり、温度が３７℃である反応と関係したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６−３８およびＨｏｌｄｇａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙに説明されているような等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）により、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９５：１４６０−１４６５に説明されているような、Ｓｕｇｉｍｏｔｏら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１２１１−１１２１６およびＭｃＴｉｇｕｅら，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：５３８８−５４０５に説明されている適切に得られた熱力学パラメータを使用した、最近接モデル（ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｍｏｄｅｌ）を用いることにより数値的に概算することもできる。その意図した核酸標的をハイブリダイゼーションによって調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で標的核酸へハイブリッド形成する。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば−１５ｋｃａｌ未満、例えば−２０ｋｃａｌ未満、および例えば−２５ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で標的核酸へハイブリッド形成し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、−１０〜−６０ｋｃａｌ、例えば−１２〜−４０、例えば−１５〜−３０ｋｃａｌ、または−１６〜−２７ｋｃａｌ、例えば−１８〜−２５ｋｃａｌの概算ΔＧ°値で標的核酸へハイ��リッド形成する。
【００８２】
糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。
【００８３】
リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善することを主な目的として作製されている。
【００８４】
このような修飾には、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）もしくは二環式環との置き換えによってリボース環構造が修飾されたものであって、典型的にはリボース環（ＬＮＡ）上のＣ２炭素とＣ４炭素との間にビラジカル架橋を有するものであるか、または典型的にはＣ２炭素とＣ３炭素との間の結合を欠いている非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）が含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）または三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドには、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはモルホリノ核酸の場合には、糖部分が非糖部分と置き換えられたヌクレオシドも含まれる。
【００８５】
糖修飾には、リボース環上の置換基を水素以外の基、またはＤＮＡヌクレオシドおよびＲＮＡヌクレオシド中に天然に存在する２’−ＯＨ基に変化させることを介して行われる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’または５’位で導入され得る。
【００８６】
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨもしくは−ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）、または２’炭素とリボース環上の第２の炭素との間に架橋を形成することができる２’結合ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’−４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドである。
【００８７】
実際、２’置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾ヌクレオシドは、向上した結合親和性、および／または増大したヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドに提供することができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡおよび２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９−４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３−２１３、およびＤｅｌｅａｖｅｙ  ａｎｄ  Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１２，１９，９３７に見出すことができる。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの説明である。
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【００８８】
本発明に関連して、２’置換は、ＬＮＡのような２’架橋分子を含まない。
【００８９】
架橋型人工核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、該ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合させるビラジカル（「２’−４’架橋」とも呼ばれる）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限または固定する。これらのヌクレオシドは、文献にて架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースのコンホメーションの固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の増強（二重鎖安定化）に関連している。これはオリゴヌクレオチド／補完二重鎖の融解温度を測定することにより日常的に決定され得る。
【００９０】
非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３−７６、Ｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ  ７５（５）ｐｐ．１５６９−８１およびＭｉｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００９，３７（４），１２２５−１２３８に開示されている。
【００９１】
２’−４’架橋は、２〜４個の架橋原子を含み、特に式−Ｘ−Ｙ−であって、ＸはＣ４’に結合し、ＹはＣ２’に結合しており、
式中、
Ｘは、酸素、硫黄、−ＣＲａＲｂ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（＝ＣＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−ＳＯ２−、−ＮＲａ−；−Ｏ−ＮＲａ−、−ＮＲａ−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｊ）−、Ｓｅ、−Ｏ−ＮＲａ−、−ＮＲａ−ＣＲａＲｂ−、−Ｎ（Ｒａ）−Ｏ−、または−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり；
Ｙは、酸素、硫黄、−（ＣＲａＲｂ）ｎ−、−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−ＳＯ２−、−ＮＲａ−、−Ｃ（＝Ｊ）−、Ｓｅ、−Ｏ−ＮＲａ−、−ＮＲａ−ＣＲａＲｂ−、−Ｎ（Ｒａ）−Ｏ−、または−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり；
但し、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−Ｏ−、Ｓｉ（Ｒａ）２−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−ＳＯ２−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、または−Ｓｅ−Ｓｅ−ではなく；
Ｊは、酸素、硫黄、＝ＣＨ２、または＝Ｎ（Ｒａ）であり；
ＲａおよびＲｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、−ＯＣ（＝Ｘａ）Ｒｃ、−ＯＣ（＝Ｘａ）ＮＲｃＲｄおよび−ＮＲｅＣ（＝Ｘａ）ＮＲｃＲｄから独立して選択され、
または、２つのジェミナルなＲａおよびＲｂは、一緒になって、場合により置換されたメチレンを形成し；
または、２つのジェミナルなＲａおよびＲｂは、結合している炭素原子と共にシクロアルキルまたはハロシクロアルキルを形成し、−Ｘ−Ｙ−の炭素原子は１個だけであり；
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシおよび置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択される１〜３個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニルおよびメチレンであり、
Ｘａは、酸素、硫黄、または−ＮＲｃであり；
Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、水素およびアルキルから独立して選択され；かつ
ｎは、１、２または３である。
【００９２】
本発明のさらに詳しい実施形態では、Ｘは、酸素、硫黄、−ＮＲａ−、−ＣＲａＲｂ−、または−Ｃ（＝ＣＲａＲｂ）−、特に酸素、硫黄、−ＮＨ−、−ＣＨ２−、または−Ｃ（＝ＣＨ２）−、特に酸素である。
【００９３】
本発明の別の詳しい実施形態では、Ｙは、−ＣＲａＲｂ−、−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−、または−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−、特に−ＣＨ２−ＣＨＣＨ３−、−ＣＨＣＨ３−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、または−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００９４】
本発明の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−（ＣＲａＲｂ）ｎ−、−Ｓ−ＣＲａＲｂ−、−Ｎ（Ｒａ）ＣＲａＲｂ−、−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−、−Ｏ−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、−Ｃ（＝ＣＲａＲｂ）−ＣＲａＲｂ−、−Ｎ（Ｒａ）ＣＲａＲｂ−、−Ｏ−Ｎ（Ｒａ）−ＣＲａＲｂ−または−Ｎ（Ｒａ）−Ｏ−ＣＲａＲｂ−である。
【００９５】
本発明の詳しい実施形態では、ＲａおよびＲｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、およびアルコキシアルキル、特に水素、ハロゲン、アルキル、およびアルコキシアルキルからなる群より独立して選択される。
【００９６】
本発明の別の実施形態では、ＲａおよびＲｂは、水素、フルオロ、ヒドロキシル、メチル、および−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、特に水素、フルオロ、メチル、および−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３からなる群より独立して選択される。
【００９７】
有利な方法で、−Ｘ−Ｙ−のＲａおよびＲｂの一方は先に定義された通りであり、他方は全て同時に水素である。
【００９８】
本発明のさらに詳しい実施形態では、Ｒａは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。
【００９９】
本発明の別の詳しい実施形態では、Ｒｂは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。
【０１００】
本発明の詳しい実施形態では、ＲａおよびＲｂの一方または両方は、水素である。
【０１０１】
本発明の詳しい実施形態では、ＲａおよびＲｂの一方のみが、水素である。
【０１０２】
本発明の詳しい一実施形態では、ＲａおよびＲｂの一方はメチルであり、他方は水素である。
【０１０３】
本発明の詳しい実施形態では、ＲａおよびＲｂは、両方とも同時にメチルである。
【０１０４】
本発明の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３）−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｃ（＝ＣＨ２）ＣＨ２−、−Ｃ（＝ＣＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｎ（ＯＣＨ３）ＣＨ２−、または−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２−である。
【０１０５】
本発明の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、式中、ＲａおよびＲｂは、水素、アルキル、およびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、および−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３からなる群より独立して選択される。
【０１０６】
詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−または−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−、特に−Ｏ−ＣＨ２−である。
【０１０７】
２’−４’架橋は、それぞれ式（Ａ）および式（Ｂ）に示すように、リボース環の平面の下（β−Ｄ−立体配置）または該環の平面の上（α−Ｌ−立体配置）のいずれかに位置し得る。
【０１０８】
本発明によるＬＮＡヌクレオシドは、特に式（Ｂ１）または式（Ｂ２）：
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であって、
式中、
Ｗは、酸素、硫黄、−Ｎ（Ｒａ）−または−ＣＲａＲｂ−、特に酸素であり；
Ｂは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり；
Ｚは、隣接するヌクレオシドまたは５’末端基へのヌクレオシド間結合であり；
Ｚ＊は、隣接するヌクレオシドまたは３’末端基へのヌクレオシド間結合であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は、水素、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アジド、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、およびアリールから独立して選択され；かつ
Ｘ、Ｙ、Ｒａ、およびＲｂは、先に定義した通りである。
【０１０９】
詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒａは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。別の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒｂは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。さらなる詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、ＲａおよびＲｂの一方または両方は、水素である。詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、ＲａおよびＲｂの一方のみが、水素である。詳しい一実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、ＲａおよびＲｂの一方はメチルであり、他方は水素である。詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、ＲａおよびＲｂは、両方とも同時にメチルである。
【０１１０】
さらなる詳しい実施形態では、Ｘの定義において、Ｒａは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。別の詳しい実施形態では、Ｘの定義において、Ｒｂは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。詳しい実施形態では、Ｘの定義において、ＲａおよびＲｂの一方または両方は、水素である。詳しい実施形態では、Ｘの定義において、ＲａおよびＲｂの一方のみが、水素である。詳しい一実施形態では、Ｘの定義において、ＲａおよびＲｂの一方はメチルであり、他方は水素である。詳しい実施形態では、Ｘの定義において、ＲａおよびＲｂは、両方とも同時にメチルである。
【０１１１】
さらなる詳しい実施形態では、Ｙの定義において、Ｒａは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。別の詳しい実施形態では、Ｙの定義において、Ｒｂは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。詳しい実施形態では、Ｙの定義において、ＲａおよびＲｂの一方または両方は、水素である。詳しい実施形態では、Ｙの定義において、ＲａおよびＲｂの一方のみが、水素である。詳しい一実施形態では、Ｙの定義において、ＲａおよびＲｂの一方はメチルであり、他方は水素である。詳しい実施形態では、Ｙの定義において、ＲａおよびＲｂは、両方とも同時にメチルである。
【０１１２】
本発明の詳しい実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は、水素およびアルキル、特に水素およびメチルから独立して選択される。
【０１１３】
本発明のさらに詳しい有利な実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は、全て同時に水素である。
【０１１４】
本発明の別の詳しい実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て同時に水素であり、Ｒ５およびＲ５＊の一方は水素であり、他方は先に定義した通り、特にアルキル、より詳しくはメチルである。
【０１１５】
本発明の詳しい実施形態では、Ｒ５およびＲ５＊は、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシアルキル、およびアジドから、特に水素、フルオロ、メチル、メトキシエチル、およびアジドから独立して選択される。本発明の詳しい有利な実施形態では、Ｒ５およびＲ５＊の一方は水素であり、他方はアルキル、特にメチル、ハロゲン、特にフルオロ、アルコキシアルキル、特にメトキシエチルもしくはアジドであるか、またはＲ５およびＲ５＊は、同時に水素もしくはハロゲン、特に同時にフルオロの水素である。このような詳しい実施形態では、Ｗは有利な方法では酸素であり得、−Ｘ−Ｙ−有利な方法では−Ｏ−ＣＨ２−であり得る。
【０１１６】
本発明の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は、全て同時に水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、同第００／６６６０４号、同第９８／０３９３５２号、および同第２００４／０４６１６０号に開示され、これらは全て参照により本明細書に組み込まれており、β−Ｄ−オキシＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシＬＮＡヌクレオシドとして当技術分野で一般的に公知のものを含む。
【０１１７】
本発明の別の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は、全て同時に水素である。このようなチオＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれている国際公開第９９／０１４２２６号および同第２００４／０４６１６０号に開示されている。
【０１１８】
本発明の別の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−ＮＨ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は、全て同時に水素である。このようなアミノＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれている国際公開第９９／０１４２２６号および同第２００４／０４６１６０号に開示されている。
【０１１９】
本発明の別の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は、全て同時に水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれている国際公開第００／０４７５９９号およびＭｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３−７６に開示されており、当技術分野で一般に２’−Ｏ−４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）として公知のものを含む。
【０１２０】
本発明の別の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て同時に水素であり、Ｒ５およびＲ５＊の一方は水素であり、他方は、アルキル、例えばメチルなど、水素ではない。このような５’置換ＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／１３４１８１号に開示されている。
【０１２１】
本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、ここで、ＲａおよびＲｂの一方または両方は水素ではなく、特にメチルなどのアルキルであり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て同時に水素であり、Ｒ５およびＲ５＊の一方は水素であり、他方は水素ではなく、特にアルキル、例えばメチルである。このようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／０７７５７８号に開示されている。
【０１２２】
本発明の別の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨＲａ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は、全て同時に水素である。このような６’置換ＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第２０１０／０３６６９８号および同第２００７／０９００７１号に開示されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。このような６’−置換ＬＮＡヌクレオシドにおいて、Ｒａは、特に、メチルなどのＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１２３】
本発明の別の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３）−（「２’Ｏ−メトキシエチル二環式核酸」、Ｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ  ７５（５）ｐｐ．１５６９−８１）である。
【０１２４】
本発明の別の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−である。
【０１２５】
本発明の別の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３）−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は、全て同時に水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドは、当技術分野では環状ＭＯＥ（ｃＭＯＥ）としても公知であり、国際公開第２００７／０９００７１号に開示されている。
【０１２６】
本発明の別の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−（「２’Ｏ−メトキシエチル二環式核酸」、Ｓｅｔｈ  ａｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ  ７５（５）ｐｐ．１５６９−８１）である。
【０１２７】
本発明の別の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−である（Ｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ  ２０１０  前掲）。
【０１２８】
本発明の別の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は、全て同時に水素である。このような６’−メチルＬＮＡヌクレオシドは、当技術分野ではｃＥＴヌクレオシドとしても公知であり、両方とも参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０９００７１号（β−Ｄ）および国際公開第２０１０／０３６６９８号（α−Ｌ）に開示されているように、（Ｓ）−ｃＥＴまたは（Ｒ）−ｃＥＴジアステレオ異性体のいずれかであり得る。
【０１２９】
本発明の別の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、ここで、ＲａもＲｂも水素ではなく、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は全て同時に水素である。詳しい実施形態では、ＲａおよびＲｂは両方とも同時にアルキル、特に両方とも同時にメチルである。このような６’−ジ−置換ＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／００６４７８号に開示されている。
【０１３０】
本発明の別の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨＲａ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は、全て同時に水素である。このような６’置換チオＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／１５６２０２号に開示されている。このような６’置換チオＬＮＡの特定の実施形態では、Ｒａは、アルキル、特にメチルである。
【０１３１】
本発明の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｃ（＝ＣＨ２）Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（＝ＣＨＦ）Ｃ（ＲａＲｂ）−、または−Ｃ（＝ＣＦ２）Ｃ（ＲａＲｂ）−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は全て同時に水素である。ＲａおよびＲｂは、有利な方法において、水素、ハロゲン、アルキル、およびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロ、およびメトキシメチルから独立して選択される。ＲａおよびＲｂは特に同時に両方とも水素またはメチルであるか、またはＲａおよびＲｂの一方が水素であり、他方がメチルである。このようなビニルカルボＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第２００８／１５４４０１号および同第２００９／０６７６４７号に開示されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３２】
本発明の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｎ（ＯＲａ）−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は全て同時に水素である。詳しい実施形態では、Ｒａは、メチルなどのアルキルである。このようなＬＮＡヌクレオシドはまた、Ｎ置換ＬＮＡとしても公知であり、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／１５０７２９号に開示されている。
【０１３３】
本発明の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−Ｎ（Ｒａ）−、−Ｎ（Ｒａ）−Ｏ−、−ＮＲａ−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−、または−ＮＲａ−ＣＲａＲｂ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は全て同時に水素である。ＲａおよびＲｂは、有利な方法において、水素、ハロゲン、アルキル、およびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロ、およびメトキシメチルから独立して選択される。詳しい実施形態では、Ｒａはアルキル、例えばメチルであり、Ｒｂは水素またはメチル、特に水素である。（Ｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ  ２０１０前掲）。
【０１３４】
本発明の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−である（Ｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ  ２０１０  前掲）。
【０１３５】
本発明の詳しい実施形態では、Ｒ５およびＲ５＊は、両方とも同時に水素である。本発明の別の詳しい実施形態では、Ｒ５およびＲ５＊の一方は水素であり、他方はメチルなどのアルキルである。このような実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、特に水素であり得、−Ｘ−Ｙ−は、特に−Ｏ−ＣＨ２−または−Ｏ−ＣＨＣ（Ｒａ）３−、例えば−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−などであり得る。
【０１３６】
本発明の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、例えば−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は、全て同時に水素である。このような詳しい実施形態では、Ｒａは、特にアルキル、例えばメチルであり、Ｒｂは、水素またはメチル、特に水素であり得る。このようなＬＮＡヌクレオシドはまた、立体配座制限ヌクレオチド（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ＣＲＮ）としても公知であり、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／０３６８６８号に開示されている。
【０１３７】
本発明の詳しい実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、例えば−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ５＊は、全て同時に水素である。ＲａおよびＲｂは、有利な方法において、水素、ハロゲン、アルキル、およびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロ、およびメトキシメチルから独立して選択される。このような詳しい実施形態では、Ｒａは、特にアルキル、例えばメチルであり、Ｒｂは、水素またはメチル、特に水素であり得る。このようなＬＮＡヌクレオシドはまた、ＣＯＣヌクレオチドとしても公知であり、参照により本明細書に組み込まれるＭｉｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００９，３７（４），１２２５−１２３８に開示されている。
【０１３８】
特に指定しない限り、ＬＮＡヌクレオシドはβ−Ｄまたはα−Ｌステレオアイソフォーム（ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｆｏｒｍ）であり得ると認識される。
【０１３９】
本発明のＬＮＡヌクレオシドの詳しい例をスキーム１に提示する（式中、Ｂは先に定義した通りである）。
【０１４０】
2021533118.tif 000007
2021533118.tif 000008
2021533118.tif 000009
【０１４１】
詳しいＬＮＡヌクレオシドは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、６’−メチル−β−Ｄ−オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）−６’−メチル−β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ（（Ｓ）ｃＥＴ）およびＥＮＡである。
【０１４２】
ＲＮアーゼＨ活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮアーゼＨ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二重鎖を形成するときにＲＮアーゼＨを動員するその能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮアーゼＨ活性を決定するためのインビトロ法を提供し、これはＲＮアーゼＨを動員する能力を決定するために使用され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸が提供された場合、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定して、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーのみを含み、オリゴヌクレオチドの全モノマー間にホスホロチオアート結合を有するオリゴヌクレオチドを使用し、また国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１〜９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期率の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％超を有する場合に、ＲＮアーゼＨを動員することができると見なされる。ＲＨアーゼＨ活性の測定に使用するために、組換えヒトＲＮアーゼＨ１がＬｕｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ，Ｌｕｃｅｒｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能である。
【０１４３】
ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、ギャップマーであってもよい。アンチセンスギャップマーは、通常、ＲＮアーゼＨ媒介分解を介して標的核酸を阻害するのに使用される。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの区別される構造領域、５’−フランク、ギャップおよび３’−フランク、Ｆ−Ｇ−Ｆ’を５’→３’配向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨを動員することを可能にする連続ＤＮＡヌクレオチド鎖を含む。ギャップ領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利な方法では高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’フランキング領域（Ｆ）と、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利な方法では高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’フランキング領域（Ｆ’）とが隣接する。領域ＦおよびＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する（すなわち、これは親和性増強糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡおよび２’−ＭＯＥから独立して選択される、例えば高親和性２’糖修飾である。
【０１４４】
ギャップマー設計において、ギャップ領域の最も５’および３’のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、各々、５’（Ｆ）または３’（Ｆ’）の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置されている。フランクはさらに、ギャップ領域から最も遠い端、すなわち５’フランクの５’末端および３’フランクの３’末端に少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義されてもよい。
【０１４５】
領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’は、連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ−Ｇ−Ｆ’のギャップマー領域を含んでもよい。
【０１４６】
ギャップマー設計Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長は、例えば１２〜３２ヌクレオシド、例えば１３〜２４、例えば１４〜２２ヌクレオシド、例えば１４〜１７、例えば１６〜１８ヌクレオシドであってもよい。
【０１４７】
例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’１−８、例えば
Ｆ１−８−Ｇ７−１６−Ｆ’２−８
但し、ギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全体長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。
【０１４８】
領域Ｆ、ＧおよびＦ’は、さらに以下に定義され、Ｆ−Ｇ−Ｆ’式に組み込まれることができる。
【０１４９】
ギャップマー−領域Ｇ
ギャップマーの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨ、例えばヒトＲＮアーゼＨ１を動員することを可能にするヌクレオシド、典型的にはＤＮＡヌクレオシドの領域である。ＲＮアーゼＨは、ＤＮＡとＲＮＡの間の二重鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素で開裂させる細胞酵素である。適切なギャップマーは、少なくとも５または６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば５〜１６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば６〜１５連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば７〜１４連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば８〜１２連続ＤＮＡヌクレオチド、例えば８〜１２連続ＤＮＡヌクレオチド長のギャップ領域（Ｇ）を有していてもよい。ギャップ領域Ｇは、いくつかの実施形態では、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６連続ＤＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。ギャップ領域のシトシン（Ｃ）ＤＮＡは、場合によってはメチル化されていてもよく、このような残基は、５−メチルシトシン（ｍｅＣまたはｃの代わりにｅ）として注解されている。ギャップ内のシトシンＤＮＡのメチル化は、ｃｇジヌクレオチドがギャップ内に存在して潜在的な毒性を低減させる場合に有利であり、この修飾はオリゴヌクレオチドの有効性に有意な影響を与えない。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、ギャップ領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６連続ホスホロチオアート結合ＤＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。いくつかの実施形態では、ギャップ内の全ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアート結合である。
【０１５１】
従来のギャップマーはＤＮＡギャップ領域を有するが、ギャップ領域内で使用される場合にＲＮアーゼＨ動員を可能にする修飾ヌクレオシドの多数の例が存在する。ギャップ領域内に含まれる場合にＲＮアーゼＨの動員が可能であるとして報告されている修飾ヌクレオシドには、例えば、α−Ｌ−ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ（ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９およびＶｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１８（２００８）２２９６−２３００に説明されているような、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）、ＡＮＡおよび２’Ｆ−ＡＮＡのようなアラビノース由来ヌクレオシド（Ｍａｎｇｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．１２５，６５４−６６１）、ＵＮＡ（非架橋型人工核酸）（参照により本明細書に組み込まれるＦｌｕｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９に説明されているような）が含まれる。ＵＮＡは、典型的には、リボースのＣ２とＣ３の間の結合が除去され、非架橋の「糖」残基を形成している非架橋型人工核酸である。このようなギャップマーに使用されている修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域内に導入された際に２’エンド（ｅｎｄｏ）（ＤＮＡ様）構造を採択する（すなわち、ＲＮアーゼＨ動員を可能にする修飾）ヌクレオシドであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に説明されるＤＮＡギャップ領域（Ｇ）は、場合により、ギャップ領域内に導入された際に２’エンド（ｅｎｄｏ）（ＤＮＡ様）構造を採択する１〜３糖修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
【０１５２】
領域Ｇ−「ギャップブレーカー」
あるいは、いくつかのＲＮアーゼＨ活性を保持しながら、ギャップマーのギャップ領域に３’エンドコンホメーションを付与する修飾ヌクレオシドの挿入についての多くの報告が存在する。１つ以上の３’エンド修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を有するこのようなギャップマーは、「ギャップブレーカー」または「ギャップ破壊」ギャップマーと称される。例えば、国際公開第２０１３／０２２９８４号を参照されたい。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨ動員を可能にするために、ギャップ領域内にＤＮＡヌクレオシドの十分な領域を保持する。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチド設計がＲＮアーゼＨを動員する能力は、典型的には、配列または化合物特異的でさえある（Ｒｕｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２０１５  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．４３  ｐｐ．８４７６−８４８７を参照されたい）。これは、いくつかの場合、標的ＲＮＡのより特異的な開裂を提供するＲＮアーゼＨを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドを開示している。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で使用される修飾ヌクレオシドは、例えば、３’エンドコンホメーションを付与する修飾ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−メチル（ＯＭｅ）または２’−Ｏ−ＭＯＥ（ＭＯＥ）ヌクレオシド、またはβ−Ｄ  ＬＮＡヌクレオシド（ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’の間の架橋は、βコンホメーションである）、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドであってもよい。
【０１５３】
上述した領域Ｇを含むギャップマーと同様に、ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ギャップマーは、ギャップの５’末端に（領域Ｆの３’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有し、ギャップの３’末端に（領域Ｆの５’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有する。破壊ギャップを含むギャップマーは、典型的には、ギャップ領域の５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも３または４連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を保持する。
【０１５４】
ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドの例示的な設計は、
Ｆ１−８−［Ｄ３−４−Ｅ１−Ｄ３−４］−Ｆ’１−８
Ｆ１−８−［Ｄ１−４−Ｅ１−Ｄ３−４］−Ｆ’１−８
Ｆ１−８−［Ｄ３−４−Ｅ１−Ｄ１−４］−Ｆ’１−８
を含み、領域Ｇは、枝分かれ［Ｄｎ−Ｅｒ−Ｄｍ］内であり、ＤはＤＮＡヌクレオシドの連続配列であり、Ｅは修飾ヌクレオシド（ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ヌクレオシド）であり、ＦおよびＦ’は本明細書に定義したフランキング領域であるが、但し、ギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全体長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ギャップ破壊ギャップマーの領域Ｇは、少なくとも６ＤＮＡヌクレオシド、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６ＤＮＡヌクレオシドを含む。上述したように、ＤＮＡヌクレオシドは連続であってもよく、場合により１つ以上の修飾ヌクレオシドが散在してもよいが、但し、ギャップ領域Ｇは、ＲＮアーゼＨ動員を媒介できることを条件とする。
【０１５６】
ギャップマー−フランキング領域、ＦおよびＦ’
領域Ｆは、領域Ｇの５’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、またはＬＮＡヌクレオシドである。
【０１５７】
領域Ｆ’は、領域Ｇの３’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆ’の最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、またはＬＮＡヌクレオシドである。
【０１５８】
領域Ｆは、１〜８連続ヌクレオチド長、例えば２〜６、例えば３〜４連続ヌクレオチド長である。有利な方法では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば２つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。
【０１５９】
領域Ｆ’は、２〜８連続ヌクレオチド長、例えば３〜６、例えば４〜５連続ヌクレオチド長である。有利な方法では、領域Ｆ’の最も３’の実施形態は、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば２つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。
【０１６０】
領域Ｆまたは領域Ｆ’の長さが１である場合、それは有利な方法ではＬＮＡヌクレオシドであることに留意するべきである。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、領域Ｆおよび領域Ｆ’は、独立して、糖修飾ヌクレオシドの連続配列からなり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、領域Ｆの糖修飾ヌクレオシドは、独立して、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位および２’−フルオロ−ＡＮＡ単位から選択されてもよい。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、領域Ｆおよび領域Ｆ’は、独立して、ＬＮＡおよび２’置換修飾ヌクレオシドの両方を含む（混合ウイング設計）。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、領域Ｆおよび領域Ｆ’は、１タイプのみの糖修飾ヌクレオシド、例えばＭＯＥのみ、またはβ−Ｄ−オキシＬＮＡのみ、またはＳｃＥＴのみからなる。このような設計は、均一フランクまたは均一ギャップマー設計とも称される。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’の全ヌクレオシド、またはＦおよびＦ’は、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡ、ＥＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択される、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆは、１〜５、例えば２〜４、例えば３〜４、例えば１、２、３、４または５連続ＬＮＡヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の全てのヌクレオシドは、β−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドである。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’の全ヌクレシド、またはＦおよびＦ’は、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥである。いくつかの実施形態では、領域Ｆは、１、２、３、４、５、６、７または８連続ＯＭｅまたはＭＯＥからなる。いくつかの実施形態では、フランキング領域の１つのみが、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥからなり得る。いくつかの実施形態では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥからなるのは５’（Ｆ）フランキング領域であり、一方、３’（Ｆ’）フランキング領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドまたはｃＥＴヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥからなるのは３’（Ｆ’）フランキング領域であり、一方、５’（Ｆ）フランキング領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドまたはｃＥＴヌクレオシドを含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の全修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡ、ＥＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択される、ＬＮＡヌクレオシドであり、領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’は、場合によりＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい（交互フランク、詳細にはこれらの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の全修飾ヌクレオシドがβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’は、場合によりＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい（交互フランク、詳細にはこれらの定義を参照されたい）。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の最も５’および最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドまたはＳｃＥＴヌクレオシドである。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、領域Ｆと領域Ｇの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｇの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、領域ＦまたはＦ’、ＦおよびＦ’のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合である。
【０１６９】
さらなるギャップマー設計は、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第２００７／１４６５１１号および国際公開第２００８／１１３８３２号に開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる、
【０１７０】
ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方のいずれかが、ＬＮＡヌクレオシドを含み、またはそれからなるギャップマーである。β−Ｄ−オキシギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方のいずれかが、β−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを含み、またはそれからなるギャップマーである。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］１−５−［領域Ｇ］−［ＬＮＡ］１−５のものであり、ここで、領域Ｇはギャップマー領域Ｇの定義に規定した通りである。
【０１７２】
ＭＯＥギャップマー
ＭＯＥギャップマーは、領域ＦおよびＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施形態では、ＭＯＥギャップマーは、設計［ＭＯＥ］１−８−［領域Ｇ］−［ＭＯＥ］１−８、例えば［ＭＯＥ］２−７−［領域Ｇ］５−１６−［ＭＯＥ］２−７、例えば［ＭＯＥ］３−６−［領域Ｇ］−［ＭＯＥ］３−６のものであり領域Ｇはギャップマーの定義に規定した通りである。５−１０−５設計（ＭＯＥ−ＤＮＡ−ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当技術分野で広く使用されている。
【０１７３】
混合ウイングギャップマー
混合ウイングギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位および２’−フルオロ−ＡＮＡ単位から独立して選択される２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマーである。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。いくつかの混合ウイング実施形態では、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドをさらに含んでもよい。
【０１７４】
混合ウイングギャップマー設計は、国際公開第２００８／０４９０８５号および国際公開第２０１２／１０９３９５号に開示されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７５】
交互フランクギャップマー
フランキング領域は、ＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシドの両方を含み得、それらがＬＮＡ−ＤＮＡ−ＬＮＡヌクレオシドの交互モチーフを含むので、「交互フランク」と称される。このような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と称される。したがって、「交互フランクギャップマー」は、フランク（ＦまたはＦ’）の少なくとも一方がＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含むＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’の少なくとも一方、または両領域ＦおよびＦ’は、ＬＮＡヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。このような実施形態では、フランキング領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’の両方は、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆおよび／またはＦ’領域の最も５’および３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。
【０１７６】
交互フランクＬＮＡギャップマーは、国際公開第２０１６／１２７００２号に開示されている。
【０１７７】
交互フランク領域は、１〜２個、または１個、または２個、または３個の連続したＤＮＡヌクレオシドといった最大３個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含むことができる。
【０１７８】
交互フラック（ｆｌａｋ）は、いくつかのＬＮＡヌクレオシド（Ｌ）、それに続くいくつかのＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）、例えば、
［Ｌ］１−３−［Ｄ］１−４−［Ｌ］１−３
［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−２−［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−２−［Ｌ］１−２を表す一連の整数として注解することができる。
【０１７９】
オリゴヌクレオチド設計においては、これらは、２−２−１が５’［Ｌ］２−［Ｄ］２−［Ｌ］３’を表し、１−１−１−１−１が５’［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］３’を表すような数として表されることが多い。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドにおけるフランクの長さ（領域ＦおよびＦ’）は、独立して、３〜１０ヌクレオシド、例えば４〜８ヌクレオシド、例えば５〜６ヌクレオシド、例えば４、５、６、または７個の修飾ヌクレオシドであり得る。いくつかの実施形態では、ギャップマーオリゴヌクレオチド中のフランクの一方のみが交互であるが、他方はＬＮＡヌクレオチドから構成される。さらなるエキソヌクレアーゼ耐性を付与するために、３’フランク（Ｆ’）の３’末端に少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを有することが有利であり得る。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドのいくつかの例は：
［Ｌ］１−５−［Ｄ］１−４−［Ｌ］１−３−［Ｇ］５−１６−［Ｌ］２−６
［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−２−［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−２−［Ｌ］１−２−［Ｇ］５−１６−［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−３−［Ｌ］２−４
［Ｌ］１−５−［Ｇ］５−１６−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］２であって、
但し、ギャップマーの全体長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。
【０１８０】
オリゴヌクレオチドにおける領域Ｄ’またはＤ”
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーＦ−Ｇ−Ｆ’、ならびにさらに５’および／もしくは３’ヌクレオシドを含み、またはそれからなり得る。さらなる５’および／または３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であってもよく、または完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる５’および／または３’ヌクレオシドは、本明細書で領域Ｄ’およびＤ”と称され得る。
【０１８１】
領域Ｄ’またはＤ”の追加は、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーをコンジュゲート部分または他の官能基に連結することを目的として用いられ得る。連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分に連結するのに使用される場合、生体開裂可能なリンカーとしての役割を果たし得る。あるいは、それはエキソヌクレオアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏａｓｅ）保護を提供するために、または合成もしくは製造を容易にするために使用され得る。
【０１８２】
領域Ｄ’およびＤ”は、各々、領域Ｆの５’末端または領域Ｆ’の３’末端に結合して、以下の式Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”または
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”の設計を生成することができる。この場合、Ｆ−Ｇ−Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’またはＤ”は、オリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。
【０１８３】
領域Ｄ’またはＤ”は、独立して、１、２、３、４または５個の追加のヌクレオチドを含み、またはそれからなり、標的核酸に相補的であっても、または相補的でなくてもよい。ＦまたはＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチドではなく、例えばＤＮＡまたはＲＮＡまたはこれらの塩基修飾バージョンである。Ｄ’およびＤ”領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体開裂可能なリンカーとして機能し得る（リンカーの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、追加の５’および／または３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で連結しており、ＤＮＡまたはＲＮＡである。領域Ｄ’およびＤ”としての使用に適切なヌクレオチドベースの生体開裂可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これは例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを含む。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体開裂可能なリンカーの使用は、国際公開第２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物（例えば、ギャップマー領域）を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。
【０１８４】
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’および／またはＤ”を含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ−Ｇ−Ｆ’；特にＦ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’２−８
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、特にＤ’１−３−Ｆ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’２−８
Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”、特にＦ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’２−８−Ｄ”１−３
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”、特にＤ’１−３−Ｆ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’２−８−Ｄ”１−３
【０１８６】
いくつかの実施形態では、領域Ｄ’と領域Ｆの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｄ”の間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。
【０１８７】
トータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシドの全てが糖修飾ヌクレオシドである。このようなオリゴヌクレオチドは、本明細書ではトータルマーと呼ばれる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、トータルマーの糖修飾ヌクレオシドの全ては、同じ糖修飾を含み、例えば、それらは、全てＬＮＡヌクレオシドであっても、全て２’Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドであってもよい。いくつかの実施形態では、トータルマーの糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドおよび２’置換ヌクレオシド、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、および２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドからなる群から選択される２’置換ヌクレオシドから独立して選択されてよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシドと、２’置換ヌクレオシド、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、および２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドからなる群から選択される２’置換ヌクレオシドの両方を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシドと２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドとを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、（Ｓ）ｃＥＴ  ＬＮＡヌクレオシドと２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド単位は、２’置換ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド単位は、２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドである。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の全てのヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオシドおよび／または（Ｓ）ｃＥＴヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、このようなＬＮＡトータルマーオリゴヌクレオチドは、７〜１２ヌクレオシド長である（例えば、国際公開第２００９／０４３３５３を参照されたい）。このような短い完全ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡの阻害に特に有効である。
【０１９０】
さまざまなトータルマー化合物は、特にマイクロＲＮＡを標的とするときの治療用オリゴマー（ａｎｔｉｍｉＲ）として、またはスプライススイッチングオリゴマー（ＳＳＯ）として非常に有効である。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、トータルマーは、反復配列ＸＹＸまたはＹＸＹなどの少なくとも１つのＸＹＸまたはＹＸＹ配列モチーフを含むか、またはそれからなり、ＸはＬＮＡであり、Ｙは２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ単位および２’−フルオロＤＮＡ単位などの代替（すなわち、非ＬＮＡ）ヌクレオチド類似体である。先の配列モチーフは、いくつかの実施形態では、例えば、ＸＸＹ、ＸＹＸ、ＹＸＹまたはＹＹＸであり得る。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、トータルマーは、７〜２４ヌクレオチド、例えば、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなってもよい。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、トータルマーの連続ヌクレオチド配列は、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば９５％、例えば１００％のＬＮＡ単位を含む。完全なＬＮＡ化合物の場合、１２ヌクレオチド長未満、例えば７〜１０であることが有利である。
【０１９４】
残りの単位は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位、および２’ＭＯＥ  ＲＮＡ単位からなる群、または２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ単位および２’−フルオロＤＮＡ単位の群から選択されるものなど、本明細書で言及される非ＬＮＡヌクレオチド類似体から選択されてもよい。
【０１９５】
ミックスマー
用語「ミックスマー」は、ＤＮＡヌクレオシドと糖修飾ヌクレオシドの両方を含むオリゴマーを指し、ＲＮアーゼＨを動員するには連続ＤＮＡヌクレオシド長が不十分である。適切なミックスマーは、最大３つまたは最大４つの連続ＤＮＡヌクレオシドを含み得る。いくつかの実施形態では、ミックスマーは、糖修飾ヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの交互領域を含む。オリゴヌクレオチドに組み込まれたときにＲＮＡ様（３’エンド）コンホメーションを形成する糖修飾ヌクレオシドの領域と、ＤＮＡヌクレオシドの短い領域と交互に配置することにより、非ＲＮａｓｅＨ動員オリゴヌクレオチドを作製することができる。有利な方法では、糖修飾ヌクレオシドは、親和性増強糖修飾ヌクレオシドである。
【０１９６】
オリゴヌクレオチドミックスマーは、スプライスモジュレーターやマイクロＲＮＡ阻害剤などの標的遺伝子の作業に基づく調節を提供するために使用されることが多い。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、ミックスマー中の糖修飾ヌクレオシド、またはその連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシド、例えば（Ｓ）ｃＥＴもしくはβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか、または全てそれらである。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、ミックスマーの糖修飾ヌクレオシドの全ては、同じ糖修飾を含み、例えば、それらは、全てＬＮＡヌクレオシドであっても、全て２’Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドであってもよい。いくつかの実施形態では、ミックスマーの糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドおよび２’置換ヌクレオシド、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、および２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドからなる群から選択される２’置換ヌクレオシドから独立して選択されてよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシドと、２’置換ヌクレオシド、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、および２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドからなる群から選択される２’置換ヌクレオシドの両方を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオイチドは、ＬＮＡヌクレオシドと２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドとを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、（Ｓ）ｃＥＴ  ＬＮＡヌクレオシドと２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドを含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、ミックスマーまたはその連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシドのみを含み、このようなＬＮＡミックスマーオリゴヌクレオチドは、例えば、８〜２４ヌクレオシド長であり得る（例えば、マイクロＲＮＡのＬＮＡ  ａｎｔｍｉＲ阻害剤を開示する国際公開第２００７１１２７５４号を参照されたい）。
【０２００】
さまざまなミックスマー化合物は、治療用オリゴマーとして、特にマイクロＲＮＡを標的とする場合（ａｎｔｉｍｉＲ）、またはスプライススイッチングオリゴマー（ＳＳＯ）として非常に有効である。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、ミックスマーは、次のモチーフを含む：
．．．［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ．．．または
．．．［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ．．．または
．．．［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ．．．または
．．．［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ．．．
ここで、Ｌは、ＬＮＡまたは２’置換ヌクレオシド（例えば２’−Ｏ−ＭＯＥ）などの糖修飾ヌクレオシドを表し、Ｄは、ＤＮＡヌクレオシドを表し、各ｍは、１〜６から独立して選択され、各ｎは、１、２、３および４、例えば１〜３から独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｌは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＬはＬＮＡヌクレオシドであり、少なくとも１つのＬは２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、各Ｌは、ＬＮＡおよび２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドから独立して選択される。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、ミックスマーは、１０〜２４ヌクレオチド、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなってもよい。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、ミックスマーの連続ヌクレオチド配列は、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％のＬＮＡ単位を含む。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、ミックスマーは、ヌクレオチド類似体と天然に存在するヌクレオチドとの繰り返しパターンの連続ヌクレオチド配列、または１種のヌクレオチド類似体と第２のタイプのヌクレオチド類似体を含むか、またはそれらからなる。繰り返しパターンは、例えば、次のようになり得る：１つ置きもしくは２つ置きのヌクレオチドは、ＬＮＡなどのヌクレオチド類似体であり、残りのヌクレオチドは、ＤＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドであるか、または本明細書で言及される２’フルオロ類似体の２’ＭＯＥなどの２’置換ヌクレオチド類似体、またはいくつかの実施形態では、本明細書で言及されるヌクレオチド類似体の群から選択されたものである。ＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体の繰り返しパターンは、固定位置、例えば５’末端または３’末端でヌクレオチド類似体と組み合わせられ得ることが認識されている。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、３’末端から数えて、オリゴマーの第１のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドまたは２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオチド類似体である。
【０２０６】
同じであっても異なっていてもよいいくつかの実施形態では、３’末端から数えて、オリゴマーの第２のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドまたは２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオチド類似体である。
【０２０７】
同じであっても異なっていてもよいいくつかの実施形態では、オリゴマーの５’末端は、ＬＮＡヌクレオチドまたは２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオチド類似体である。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、ミックスマーは、少なくとも２つの連続するヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも２つの連続するＬＮＡ単位を含む領域を含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、ミックスマーは、少なくとも３つの連続するヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも３つの連続するＬＮＡ単位を含む領域を含む。
【０２１０】
コンジュゲート
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す（コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第３の領域）。
【０２１１】
１つ以上の非ヌクレオチド部分に対する本発明のオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取り込み、または安定性に影響を及ぼすことにより、オリゴヌクレオチドの薬理学的性質を改善することができる。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、生物学的利用能、代謝、排泄、浸透性、および／または細胞取り込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を調節または増強する。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織または細胞型に標的化し、それにより、その器官、組織または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を増強し得る。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織または器官内のオリゴヌクレオチドの活性を低下させるのに役立ち得る（例えば、非標的細胞型、組織または器官内のオフ標的活性または活性）。
【０２１２】
国際公開第９３／０７８８３号および国際公開第２０１３／０３３２３０号は、適切なコンジュゲート部分を提供し、これらは参照により本明細書に組み込まれる。さらに適切なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合することができる部分である。特に、三価Ｎ−アセチルガラクトサミンのコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰＲへの結合に適しており、例えば、国際公開第２０１４／０７６１９６号、同第２０１４／２０７２３２号および同第２０１４／１７９６２０号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。このようなコンジュゲートは、肝臓へのオリゴヌクレオチドの取込みを増強するよう機能する一方で、腎臓におけるその存在を低減させ、それにより、結合オリゴヌクレオチドの肝臓／腎臓比を、同じオリゴヌクレオチドの未結合バージョンと比較して上昇させる。
【０２１３】
オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびそれらの合成は、Ｍａｎｏｈａｒａｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，ｅｄ．，Ｃｈ．１６，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２００１およびＭａｎｏｈａｒａｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００２，１２，１０３による包括的総説においても報告されており、それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２１４】
一実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０２１５】
リンカー
結合（ｌｉｎｋａｇｅ）またはリンカーは、１つ以上の共有結合を介して、ある関心対象の化学基またはセグメントを別の関心対象の化学基またはセグメントに連結する２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接または連結部分（例えば、リンカーまたはテザー）を介してオリゴヌクレオチドに付着させることができる。リンカーは、例えばコンジュゲート部分などの第３の領域（領域Ｃ）を、例えば標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列などの第１の領域（領域Ａ）に共有結合させるよう機能する。
【０２１６】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、場合により、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列（領域Ａまたは第１の領域）の間に位置するリンカー領域（第２の領域または領域Ｂおよび／または領域Ｙ）と、コンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）とを含み得る。
【０２１７】
領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇するまたは遭遇するものに類似した条件下で開裂可能である生理学的に不安定な結合を含み、またはそれからなる生体開裂可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、開裂）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化もしくは還元条件または薬剤などの化学条件、および哺乳動物細胞で見られる、または遭遇するものに類似した、塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体開裂可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ開裂の影響を受けやすい。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、１〜１０のヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のヌクレオシドを含み、より好ましくは２〜６のヌクレオシドを含み、最も好ましくは２〜４の連結されたヌクレオシドを含み、これは少なくとも３または４または５の連続したホスホジエステル結合といった少なくとも２つの連続ホスホジエステル結合を含む。好ましくは、ヌクレオシドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。ホスホジエステルを含む生体開裂可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号（参照により本明細書に組み込まれる）においてより詳細に説明されている。
【０２１８】
領域Ｙは、必ずしも生体開裂可能ではないが、主に、コンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａまたは第１の領域）に共有結合させるよう機能するリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位またはアミノアルキル基などの繰り返し単位の鎖構造またはオリゴマーを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の領域要素Ａ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｙ−Ｃ、Ａ−Ｙ−Ｂ−ＣまたはＡ−Ｙ−Ｃで構成されていてもよい。いくつかの実施形態において、リンカー（領域Ｙ）は、例えば、Ｃ６〜Ｃ１２のアミノアルキル基を含む、Ｃ２〜Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。好ましい実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。
【０２１９】
したがって、本発明は、特に次のものに関する：
【０２２０】
ヌクレオシド（Ａ１）がＤＮＡヌクレオシド、ＲＮＡヌクレオシドまたは糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２２１】
ヌクレオシド（Ａ１）がＤＮＡヌクレオシドまたは糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２２２】
ヌクレオシド（Ａ２）がＤＮＡヌクレオシド、ＲＮＡヌクレオシドまたは糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２２３】
ヌクレオシド（Ａ２）がＤＮＡヌクレオシドまたは糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２２４】
糖修飾ヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２２５】
ヌクレオシド（Ａ２）が２’−アルコキシ−ＲＮＡ、特に２’−メトキシ−ＲＮＡ、２’−アルコキシアルコキシ−ＲＮＡ、特に２’−メトキシエトキシ−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡまたは２’−フルオロ−ＡＮＡである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２２６】
ヌクレオシド（Ａ２）がＬＮＡヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２２７】
ＬＮＡヌクレオシドが、β−Ｄ−オキシＬＮＡ、６’−メチル−β−Ｄ−オキシＬＮＡおよびＥＮＡから独立して選択され、特にβ−Ｄ−オキシＬＮＡである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２２８】
ヌクレオシド（Ａ１）および（Ａ２）の少なくとも一方が２’−アルコキシアルコキシ−ＲＮＡである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２２９】
２’−アルコキシアルコキシ−ＲＮＡが２’−メトキシエトキシ−ＲＮＡである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２３０】
ヌクレオシド（Ａ１）および（Ａ２）が両方ともＤＮＡヌクレオシドまたは両方とも２  ’糖修飾ヌクレオシドヌクレオシド、特にＬＮＡヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２３１】
ホスホジエステルヌクレオシド間結合、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合および先に定義された式（Ｉ）のホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合から選択されるさらなるヌクレオシド間結合を含む、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２３２】
ホスホロチオアートヌクレオシド間結合および先に定義された式（Ｉ）のホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合から選択されるさらなるヌクレオシド間結合を含む、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２３３】
先に定義された式（Ｉ）の１〜１５個、特に１〜５個、より特には１、２、３、４または５個のホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合を含む、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２３４】
さらなるヌクレオシド間結合が全て式−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＲ）Ｏ２−（式中、Ｒは、先に定義された通りである）のホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２３５】
ＤＮＡヌクレオシド、ＲＮＡヌクレオシドおよび糖修飾ヌクレオシドから選択されるさらなるヌクレオシドを含む、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２３６】
１つ以上のヌクレオシドが核酸塩基修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２３７】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ模倣物またはリボザイムである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２３８】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２３９】
式（Ｉ）のホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合がギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内にある、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２４０】
式（Ｉ）のホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合がギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内にある、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２４１】
ギャップマーオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマー、混合ウイングギャップマーまたは２’置換ギャップマー、特に２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマーである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２４２】
本発明によるギャップオリゴヌクレオチドであって、ギャップマーオリゴヌクレオチドが式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’の連続ヌクレオチド配列を含み、Ｇが、ＲｎアーゼＨを動員することができる５〜１８ヌクレオシドの領域であり、該領域Ｇが、それぞれフランキング領域ＦおよびＦ’によって５’および３’に隣接されており、領域ＦおよびＦ’が、独立して、１〜７つの２’糖修飾ヌクレオチドを含むか、またはそれからなり、領域Ｇに隣接する領域Ｆのヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドであり、領域Ｇに隣接する領域Ｆ’のヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２４３】
本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチドであって、先に定義された式（Ｉ）の該少なくとも１つのホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合が、領域Ｇの隣接するヌクレオシド間に、または領域Ｇと領域Ｆ’との間に配置されている、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
【０２４４】
本発明によるオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドミックスマーまたはトータルマー、特にスプライススイッチングオリゴヌクレオチドまたはマイクロＲＮＡ阻害剤オリゴヌクレオチドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
【０２４５】
本発明によるオリゴヌクレオチドの医薬として許容され得る塩、特にナトリウム塩またはカリウム塩；
【０２４６】
本発明によるオリゴヌクレオチドまたは医薬として許容され得る塩と、場合によりリンカー部分を介して、該オリゴヌクレオチドまたは該医薬として許容され得る塩に共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート；
【０２４７】
本発明によるオリゴヌクレオチド、医薬として許容され得る塩またはコンジュゲートと、治療上不活性である担体とを含む、医薬組成物；
【０２４８】
治療活性のある物質として使用するための、本発明によるオリゴヌクレオチド、医薬として許容され得る塩またはコンジュゲート；
【０２４９】
心臓または血液の疾患の処置または予防に使用するための、本発明によるオリゴヌクレオチド、医薬として許容され得る塩またはコンジュゲート；
【０２５０】
心臓または血液の疾患の処置または予防のための薬剤の調製のための、本発明によるオリゴヌクレオチド、医薬として許容され得る塩またはコンジュゲートの使用；
【０２５１】
心臓または血液の疾患の処置または予防における、本発明によるオリゴヌクレオチド、医薬として許容され得る塩またはコンジュゲートの使用；
【０２５２】
心臓または血液の疾患の処置または予防を必要とする患者に、有効量の本発明によるオリゴヌクレオチド、医薬として許容され得る塩またはコンジュゲートを投与することを含む、心臓または血液の疾患の処置または予防のための方法；
【０２５３】
細胞内の標的ＲＮＡ、特にヒトｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡを阻害する方法であって、該標的ＲＮＡを発現する細胞に本発明によるオリゴヌクレオチドを投与することを含む、方法；
【０２５４】
本発明によるオリゴヌクレオチドまたはギャップマーオリゴヌクレオチドを前記標的ＲＮＡを発現する細胞に投与することを含む、細胞内の標的ＲＮＡ、特にヒトｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡを調節または阻害するインビトロでの方法；
【０２５５】
以下のステップを含む、本発明によるオリゴヌクレオチドを製造するためのプロセス：
（ａ）チオホスホルアミダイトを５’Ｓ修飾ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの末端５’硫黄原子にカップリングして、ジチオホスファイトトリエステル中間体を生成すること；
（ｂ）ステップａ）で得られたジチオホスファイトトリエステル中間体をチオ酸化するステップ；および
（ｃ）場合によりオリゴヌクレオチドをさらに伸長させるステップ；
【０２５６】
ステップ（ａ）の５’Ｓ−修飾ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを固体支持体に結合させる、本発明によるプロセス；
【０２５７】
固体支持体からのオリゴヌクレオチドの開裂をさらに含む、本発明によるプロセス；ならびに
【０２５８】
本発明のプロセスにより製造されたオリゴヌクレオチド。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、対応する完全にホスホロチオアート結合したオリゴヌクレオチドと比較して、その標的核酸を調節する際により高い活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、増強された活性、増強された効力、増強された特異的活性、または増強された細胞取り込みを有するオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、インビトロまたはインビボでの作用の持続期間の延長など、インビトロまたはインビボでの作用の持続期間が変さらされたオリゴヌクレオチドを準備する。いくつかの実施形態では、標的核酸を調節する際のより高い活性は、標的核酸を発現している細胞においてインビトロでまたはインビボで決定される。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、毒性の低下、例えば、腎毒性の低下、肝毒性の低下、または免疫刺激の低下などの薬理学的特性を変化させた。肝毒性は、例えば、インビボで、または国際公開第２０１７／０６７９７０号に開示されたインビトロアッセイを使用することによって決定することができ、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。腎毒性は、例えば、インビトロで、またはＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６４７７０に開示されたアッセイを使用することによって決定することができ、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、５’  ＣＧ  ３’ジヌクレオチド、例えばＤＮＡ  ５’ＣＧ  ３’ジヌクレオチドを含み、ＣとＧとの間のヌクレオシド間結合は、先に定義された式（Ｉ）のホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合である。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、改善されたヌクレアーゼ耐性、例えば血清中の改善された生体安定性を有する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシドは、ＡまたはＧ塩基、例えば３’末端ＬＮＡ−ＡまたはＬＮＡ−Ｇヌクレオシドを有する。適切には、オリゴヌクレオチドの２つの最も３’のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、先に定義された式（Ｉ）によるホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合であり得る。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、増強された生物学的利用能を有する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、より大きな血液曝露、例えばより長い血中滞留時間を有する。
【０２６３】
本発明によるオリゴヌクレオチドは、例えば、以下のスキームにより調製することができる。
【０２６４】
非架橋位置ならびに隣接するフラノース環の３’位および５’位に硫黄原子を有するトリチオホスファート結合は、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成によってオリゴヌクレオチドに導入することができる。合成は、支持体としてユニバーサルリンカーを備えた制御された細孔ガラス（ＣＰＧ）を使用して実行される。このような固体支持体上で、オリゴヌクレオチドは、典型的には、５’Ｏ−ＤＭＴ保護されたヌクレオシドホスホロアミダイトビルディングブロックのカップリングと、それに続く（チオ）酸化、キャッピングおよびＤＭＴ基の脱保護からなる連続的なサイクルによって３’−５’方向に構築される。本出願に説明されているホスホロトリチオアートの導入のために、ＤＭＴ保護された５’−デオキシ−５’−メルカプトホスホロアミダイト構築ブロックが、固体支持体結合オリゴヌクレオチド鎖の遊離５’−ヒドロキシ基に結合されている。（チオ）酸化およびキャッピング後、得られた中間体を脱保護して５’−チオール基を遊離させる。
【０２６５】
2021533118.tif 000010
【０２６６】
この脱保護は困難であり、標準的な脱保護条件（典型的にはジクロロメタン中３〜５％のジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸）を繰り返し（１５回以上）適用するか、またはより高い酸濃度（例えば、ジクロロメタン中最大１０％のトリクロロ酢酸）もしくはより強い酸（例えば、ジクロロメタン中５％のトリフルオロ酢酸）を使用するかのいずれかによって、適切なカチオンスカベンジャー（典型的には、トリエチルシラン２０％、４−メトキシチオフェノール５％または両方の組み合わせ）を優先的に使用して最適な方法で行う。
【０２６７】
2021533118.tif 000011
【０２６８】
このようにして得られた遊離の５  ’チオール基は、次に、適切な５’Ｏ−ＤＭＴで保護されたチオホスホルアミダイト構築ブロックに結合する。このようなチオホスホルアミダイト構築ブロックは、典型的には、高濃度（例えば、０．１５Ｍ）の溶液として結合し、標準の未修飾ＤＮＡホスホルアミダイトと比較して結合時間が長くなる。次いで、得られたジチオホスファイト中間体は、適切な試薬（例えば、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン）を使用してチオ酸化を受けて、所望の対称性ホスホロトリチオアート結合を提供することができる。
【０２６９】
2021533118.tif 000012
【０２７０】
先のスキームでは：
Ｒ２ａとＲ４ａは一緒になって、先に定義した−Ｘ−Ｙ−を形成するか、または
Ｒ４ａは、水素およびＲ２ａは、アルコキシ、特にメトキシ、ハロゲン、特にフルオロ、アルコキシアルコキシ、特にメトキシエトキシ、アルケニルオキシ、特にアリルオキシおよびアミノアルコキシ、特にアミノエチルオキシから選択される。
Ｒ２ｂとＲ４ｂは一緒になって、先に定義した−Ｘ−Ｙ−を形成するか、または
Ｒ２ｂとＲ４ｂは両方とも同時に水素であるか、または
Ｒ４ｂは、水素およびＲ２ｂは、アルコキシ、特にメトキシ、ハロゲン、特にフルオロ、アルコキシアルコキシ、特にメトキシエトキシ、アルケニルオキシ、特にアリルオキシおよびアミノアルコキシ、特にアミノエチルオキシから選択される。
Ｒｘは、フェニル、ニトロフェニル、フェニルアルキル、ハロフェニルアルキル、シアノアルキル、フェニルカルボニルスルファニルアルキル、ハロフェニルカルボニルスルファニルアルキルアルキルカルボニルスルファニルアルキルまたはアルキルカルボニルカルボニルスルファニルアルキルであり；
Ｒ３は、ジアルキルアミノまたはピロリジニルであり、
Ｒ５は、チオヒドロキシル保護基であり；かつ
Ｒは、先に定義した通りである。
【０２７１】
次に、本発明を、限定的な特徴を有しない以下の実施例によって説明する。
【実施例】
【０２７２】
実施例１
オリゴヌクレオチド合成
Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ社のＭｅｒＭａｄｅ  １２自動ＤＮＡ合成装置を用いて、オリゴヌクレオチドを合成した。合成は、ユニバーサルリンカーを備えた制御された細孔ガラス支持体（５００Å）を使用して１μｍｏｌスケールで行った。
【０２７３】
ＤＮＡとＬＮＡホスホルアミダイトとのカップリングの標準的なサイクル手順では、ＤＭＴ脱保護は、ＣＨ２Ｃｌ２中の３％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を使用して２００μＬを３０秒間というのを３回適用して行った。それぞれのホスホルアミダイトを、アセトニトリル（またはＬＮＡ−ＭｅＣ構築ブロックの場合、アセトニトリル／ＣＨ２Ｃｌ２が１：１）中の０．１Ｍ溶液１００μＬ、および活性化因子としてのアセトニトリル中の５−（３，５−ビス（トリフルオロメチルフェニル））−１Ｈ−テトラゾールの０．１Ｍ溶液１１０μＬと３回、１８０秒間のカップリング時間でカップリングさせた。チオ酸化の場合、アセトニトリル／ピリジン１：１中の３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン０．１Ｍ溶液を使用した（３×１９０μＬ、５５秒）。ＴＨＦ／ルチジン／Ａｃ２Ｏ  ８：１：１（ＣａｐＡ、７５μｍｏｌ）およびＴＨＦ／Ｎ−メチルイミダゾール８：２（ＣａｐＢ、７５μｍｏｌ）を使用して、キャッピングを５５秒間行った。
【０２７４】
２’，５’−ジデオキシ−５’−メルカプトホスホロアミダイトを組み込むための合成サイクルには、アセトニトリル中の０．１Ｍ溶液１００μＬと、アセトニトリル中の５−（３，５−ビス（トリフルオロメチルフェニル））−１Ｈ−テトラゾール０．１Ｍ溶液１１０μＬを使用したホスホロアミダイトビルディングブロックのカップリングが含まれ、１８０秒のカップリング時間で行った。三重カップリングを実行した。アセトニトリル／ピリジン  １：１中の３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン０．１Ｍ溶液（３×１９０μＬ、５５秒）を使用して、チオ酸化を行った。キャッピングには、ＴＨＦ／ルチジン／Ａｃ２Ｏ  ８：１：１（ＣａｐＡ、７５μｍｏｌ）溶液およびＴＨＦ／Ｎ−メチルイミダゾール８：２（ＣａｐＢ、７５μｍｏｌ）溶液を５５秒間適用した。ＤＭＴの脱保護およびチオールの遊離は、ＣＨ２Ｃｌ２中の３％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を使用して、２００μＬを３０秒間というのを１５回適用して行った。ＤＭＴの脱保護およびチオールの遊離はまた、２００μＬを４５秒間、１〜１０％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸または５〜１０％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸の３〜６回の適用を、ＣＨ２Ｃｌ２中の５〜３０％（ｖ／ｖ）トリエチルシランおよび／またはＣＨ２Ｃｌ２中の２〜１０％のｐ−メトキシチオフェノールの存在下で用いて有利な方法で行った。
【０２７５】
チオホスホルアミダイトを、アセトニトリル中の１０％（ｖ／ｖ）ＣＨ２Ｃｌ２中の０．１５Ｍ溶液１００μＬ、および活性化因子としてのアセトニトリル中の５−（３，５−ビス（トリフルオロメチルフェニル））−１Ｈ−テトラゾールの０．１Ｍ溶液１１０μＬと３回、各々６００秒間のカップリング時間でカップリングさせた。アセトニトリル／ピリジン  １：１（３×１９０μＬ、５５秒）中の３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンの０．１Ｍ溶液を使用した標準的なチオ酸化、ならびにＴＨＦ／ルチジン／Ａｃ２Ｏ  ８：１：１（ＣａｐＡ、７５μｍｏｌ）およびＴＨＦ／Ｎ−メチルイミダゾール  ８：２（ＣａｐＢ、７５μｍｏｌ）溶液（５５秒）を使用したキャッピング手順を適用した。
【０２７６】
核酸塩基保護基の除去および固体支持体からの切断は、５５℃で１５〜１６時間、２０ｍＭ  ＤＴＴを含有するアンモニア（３２％）：エタノール（３：１、ｖ：ｖ）混合物を使用して達成した。粗ＤＭＴオンオリゴヌクレオチドは、固相抽出カートリッジを使用してイオン交換クロマトグラフィーでの再精製を用いるか、またはＣ１８カラムを使用したＲＰ−ＨＰＬＣ精製と、それに続く８０％酢酸水溶液によるＤＭＴ除去およびエタノール沈殿によってのいずれかで精製した。
【０２７７】
先の一般的な手順により、以下の分子を調製した。
2021533118.tif 000013
太字のヌクレオチドと下線を付したヌクレオチドとの間にトリチオアート修飾
Ａ、Ｇ、ｍＣ、Ｔは，ＬＮＡヌクレオチドを表す
ａ、ｇ、ｃ、ｔは、ＤＮＡヌクレオチドを表す
他の結合は全て、ホスホロチオアートとして調製した
【０２７８】
化合物＃１〜１３は、配列番号１に基づく。該化合物は、先の表に示されているように、式（Ｉ）のホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合の位置が異なる。
【０２７９】
実施例１
インビトロでの活性データ
ＬＴＫ細胞を、細胞培養培地（１０％ウシ胎児血清［Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ７５２４、および０．０２５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン［Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ１３９７］を補充したＤＭＥＭ［Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ０８１９］）で成長させた。細胞は、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）［Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ．ｎｏ  １４１９０−０９４］で洗浄し、次に０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｔ３９２４）を添加して３７°Ｃで２〜３分インキュベートし、摩砕することによって、５日ごとにトリプシン処理した後、細胞播種した。細胞は、最多１５回、継代培養で維持した。
【０２８０】
実験に使用するために、ウェルあたり２０００個の細胞を９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃカタログ番号１６７００８）内で１００μＬの成長培地中で播種した。オリゴヌクレオチドは７５０μＭストック溶液から調製した。ＰＢＳに溶解したオリゴを、細胞を１６〜５０，０００ｎＭの終濃度範囲で播種したおよそ２４時間後に添加した。細胞をオリゴの存在下で３日間培養した。
【０２８１】
培地を除去した後、１２５μＬのＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）Ｐｒｏ９６溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １２１７３．００１Ａ）および１２５μＬの７０％エタノールの添加によって、細胞を回収した。製造元の説明書によってＲＮＡを精製し、最終容積５０μＬの水で溶離した結果、ＲＮＡ濃度は１０〜２０ｎｇ／μｌであった。ＲＮＡを水で１０倍希釈したのち、ワンステップ定量的ＰＣＲ反応を行った。ワンステップ定量的ＰＣＲ反応には、定量的ＰＣＲミックス（ＱａｕｎｔａＢｉｏ製のｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＥ  １−ステップＲＴ−ｑＰＣＲ  ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）Ｌｏｗ  ＲＯＸ、カタログ番号９５１３４−５００）を２つのＴａｑｍａｎプローブと１０：１：１（定量的ＰＣＲミックス：プローブ１：プローブ２）の比率で混合して、マスターミックスを生成した。Ｔａｑｍａｎプローブは、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから獲得した：ＭＡＬＡＴ１：Ｍｍ０１２２７９１２；ＢＣＬ２：Ｍｍ００４７７６３１；ＧＡＰＤＨ  ４３５２３３９Ｅ。次に、マスターミックス（６μＬ）およびＲＮＡ（４μＬ、１〜２ｎｇ／μＬ）を定量的ＰＣＲプレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）光学３８４ウェル、４３０９８４９）内で混合した。密封後、プレートを１０００ｇで１分間室温で回転させ、Ｖｉｉａ（商標）７システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｈｅｒｍｏ）に移し、以下のＰＣＲ条件を使用した。５０℃で１５分間；９５℃で３分間；９５℃で５秒間、次いで１．６℃／秒の温度低下、次いで６０℃で４５秒間を４０サイクル。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）Ｒｅａｌ＿ｔｉｍｅ  ＰＣＲソフトウェアを使用してデータを解析した。
【０２８２】
結果を図１に示す。
【０２８３】
データは、この修正が十分に許容されることを明確に実証している。加えて、他の点では通常のホスホロチオアートオリゴヌクレオチドの最適化のためのこの修正の能力は大きい。多くの場合、わずか１回の修正を導入することによって、有意により低いＩＣ５０値が得られる。ギャップマーのＬＮＡフランクへこの修正を導入すると、特定の利点が得られる。このことは、効力を最適化し、かつホスホロチオアートオリゴヌクレオチドからキラル中心を除去することを超えるための、修正の価値を明確に示している。
【０２８４】
実施例２
１５ｍｇ／ｋｇの用量を用いた心臓における標的ｍＲＮＡレベル（Ｍａｌａｔ１）の測定
マウス（Ｃ５７／ＢＬ６）に、オリゴヌクレオチドを１５ｍｇ／ｋｇ、１、２、および３日後の３回用量で皮下投与した（ｎ＝５）。８日後にマウスを屠殺し、ＭＡＬＡＴ−１  ＲＮＡの低減を心臓について測定した。親化合物は、３×１５ｍｇ／ｋｇおよび３×３０ｍｇ／ｋｇの２回用量で投与した。
【０２８５】
結果を図２に示す。
【０２８６】
実施例３
ＡｐｏＢ  ＲＮＡに対する結合親和性
以下のＡｐｏＢ配列を、実施例１の手順により生成した。
2021533118.tif 000014
太字のヌクレオチドと下線を付したヌクレオチドとの間にトリチオアート修飾
Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔは，ＬＮＡヌクレオチドを表す
ａ、ｇ、ｃ、ｔは、ＤＮＡヌクレオチドを表す
他の結合は全て、ホスホロチオアートとして調製した
【０２８７】
化合物＃１４〜２１は、配列番号２に基づく。該化合物は、先の表に示されているように、式（Ｉ）のホスホロトリチオアートヌクレオシド間結合の位置が異なる。
【０２８８】
ＬＮＡ二重鎖の融解温度は、温度制御装置を装備したＣａｒｙ３００（Ａｇｉｌｅｎｔ）で測定した。ＬＮＡおよび反対鎖のＲＮＡをアニーリングして、リン酸緩衝塩類溶液（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７）中で等モル濃度の１．５μＭを得た。２６０ｎｍでの吸光度を測定した。温度勾配を２５℃〜９５℃の範囲について１℃／分に設定して維持し、保持時間を２５℃および９５℃でそれぞれ３分に設定した。吸光度の読み取りは、３０秒ごとに行った。融解プロファイルは、シグモイド状にあてはまり、Ｔｍはその微分によって決定した。
【図１】
2021533118.tif 000017
【図２】
2021533118.tif 000018
【配列表】
2021533118000001.app
【国際調査報告】
2021533118.tif 000019
2021533118.tif 000020
2021533118.tif 000021