(57)【要約】  造血幹細胞及び/又は前駆体細胞遺伝子治療で使用するための相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤であって、前記造血幹細胞が遺伝子編集されている薬剤。遺伝子編集された造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の生存及び／又は生着を増大させるための、又は造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の遺伝子編集の効率を増大させるための、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤の使用。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血細胞遺伝子治療、造血幹細胞遺伝子治療及び/又は造血前駆体細胞遺伝子治療で使用するための相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤であって、前記遺伝子治療が遺伝子編集を含む薬剤。
【請求項２】
遺伝子編集された造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の生存及び/又は生着を増大させることで使用するための、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤。
【請求項３】
遺伝子編集された造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の生存及び/又は生着を増大させるための、或いは、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の遺伝子編集の効率を増大させるための、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤の使用。
【請求項４】
薬剤がp53活性化の阻害剤であり、好ましくは阻害剤がp53リン酸化の阻害剤、より好ましくはp53セリン15リン酸化の阻害剤である、請求項1若しくは請求項2に記載の使用のための薬剤、又は請求項3に記載の使用。
【請求項５】
阻害剤が、p53ドミナントネガティブペプチド、血管拡張性失調症突然変異(ATM)キナーゼ阻害剤、又は血管拡張性失調症及びRad3関連タンパク質(ATR)阻害剤である、請求項4に記載の使用のための薬剤、又は請求項4に記載の使用。
【請求項６】
阻害剤がピフィスリン-α若しくはその誘導体; KU-55933若しくはその誘導体; GSE56若しくはそのバリアント; KU-60019、BEZ235、ウォルトマンニン（wortmannin）、CP-466722、Torin 2、CGK 733、KU-559403、AZD6738若しくはこれらの誘導体;又は、siRNA、shRNA、miRNA若しくはアンチセンスDNA/RNAである、請求項4若しくは5に記載の使用のための薬剤、又は請求項4若しくは5に記載の使用。
【請求項７】
造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞におけるp53の阻害が一時的である、請求項4から6のいずれか一項に記載の使用のための薬剤、又は請求項4から6のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
p53の一時的な阻害が、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の遺伝子編集の間に起こる、請求項4から7のいずれか一項に記載の使用のための薬剤、又は請求項4から7のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
阻害剤が造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞に約1〜50μMの濃度で加えられる、請求項4から8のいずれか一項に記載の使用のための薬剤、又は請求項4から8のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
薬剤が、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項1、2若しくは4〜9のいずれか一項に記載の使用のための薬剤、又は請求項3〜9のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質が、血清型4のアデノウイルス、血清型5のアデノウイルス、血清型7のアデノウイルス及び/又は血清型9のアデノウイルスに由来し、好ましくは少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質が血清型5のアデノウイルスに由来する、請求項10に記載の使用のための薬剤、又は請求項10に記載の使用。
【請求項１２】
少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質がE4ORF1であり、好ましくはE4ORF1のアミノ酸配列が配列番号1、57〜76で示される、請求項10若しくは請求項11に記載の使用のための薬剤、又は請求項10若しくは請求項11に記載の使用。
【請求項１３】
少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質がE4ORF6/7であり、好ましくはE4ORF6/7のアミノ酸配列が配列番号2、77〜107で示される、請求項10若しくは請求項11に記載の使用のための薬剤、又は請求項10若しくは請求項11に記載の使用。
【請求項１４】
薬剤が、好ましくはE4ORF1のアミノ酸配列が配列番号1、57〜76で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF1;及び好ましくはE4ORF6/7のアミノ酸配列が配列番号2、77〜107で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF6/7を含む、請求項1、2若しくは4〜13のいずれか一項に記載の使用のための薬剤、又は請求項4〜13のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
薬剤が、
(a)p53活性化の阻害剤及びアデノウイルスタンパク質;
(b)p53活性化の阻害剤及び好ましくはE4ORF1のアミノ酸配列が配列番号1、57〜76で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF1;
(c)p53活性化の阻害剤及び好ましくはE4ORF6/7のアミノ酸配列が配列番号2、77〜107で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF6/7;又は
(d)p53活性化の阻害剤、好ましくはE4ORF1のアミノ酸配列が配列番号1、57〜76で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF1、及び好ましくはE4ORF6/7のアミノ酸配列が配列番号2、77〜107で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF6/7
を含み、好ましくはp53活性化の阻害剤がGSE56若しくはそのバリアントである、請求項1、2若しくは4〜14のいずれか一項に記載の使用のための薬剤、又は請求項4〜14のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
アデノウイルスタンパク質をコードする核酸がmRNAである、請求項10から15のいずれか一項に記載の使用のための薬剤、又は請求項10から15のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
アデノウイルスタンパク質が、造血細胞、造血幹細胞又は造血前駆体細胞で一時的に発現され、好ましくは一時的な発現が造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の遺伝子編集の間に生じる、請求項10から16のいずれか一項に記載の使用のための薬剤、又は請求項10から16のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
遺伝子編集の標的が、CD40L、RAG-1、IL-2RG、CYBA、CYBB、NCF1、NCF2及びNCF4からなる群から選択され、好ましくはCD40Lである、請求項1、2若しくは4〜17のいずれか一項に記載の使用のための薬剤、又は請求項4〜17のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を遺伝子編集する方法であって、
(a)造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤と接触させるステップと;
(b)1つ以上のベクターによって造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団に遺伝子編集機構を導入するステップと;
(c)前記造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞のゲノムを編集するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
ステップ(a)及び(b)がex vivo又はin vitroで実行される、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤がp53活性化の阻害剤である、請求項19又は20に記載の方法。
【請求項２２】
p53活性化の阻害剤が、p53ドミナントネガティブペプチド、血管拡張性失調症突然変異(ATM)キナーゼ阻害剤、又は血管拡張性失調症及びRad3関連タンパク質(ATR)阻害剤である、請求項22に記載の方法。
【請求項２３】
p53活性化の阻害剤がピフィスリン-α若しくはその誘導体;KU-55933若しくはその誘導体; GSE56若しくはそのバリアント; KU-60019、BEZ235、ウォルトマンニン、CP-466722、Torin 2、CGK 733、KU-559403、AZD6738若しくはその誘導体;又は、siRNA、shRNA、miRNA若しくはアンチセンスDNA/RNAである、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
阻害剤が造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞に約1〜50μMの濃度で添加される、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
薬剤が、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項19〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質が血清型5のアデノウイルスに由来する、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質がE4ORF1であり、好ましくはE4ORF1のアミノ酸配列が配列番号1、57〜76で示される、請求項25又は請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質がE4ORF6/7であり、好ましくはE4ORF6/7のアミノ酸配列が配列番号2、77〜107で示される、請求項25又は請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
薬剤が、好ましくはE4ORF1のアミノ酸配列が配列番号1、57〜76で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF1;及び、好ましくはE4ORF6/7のアミノ酸配列が配列番号2、77〜107で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF6/7を含む、請求項19〜28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
薬剤が、
(a)p53活性化の阻害剤、及び好ましくはE4ORF1のアミノ酸配列が配列番号1、57〜76で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF1;
(b)p53活性化の阻害剤、及び好ましくはE4ORF6/7のアミノ酸配列が配列番号2、77〜107で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF6/7;又は
(c)p53活性化の阻害剤、好ましくはE4ORF1のアミノ酸配列が配列番号1、57〜76で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF1、及び、好ましくはE4ORF6/7のアミノ酸配列が配列番号2、77〜107で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF6/7
を含み、好ましくはp53活性化の阻害剤がGSE56若しくはそのバリアントである、請求項19〜29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
アデノウイルスタンパク質をコードする核酸がmRNAである、請求項25〜30のいずれか一項に記載の使用のための方法。
【請求項３２】
アデノウイルスタンパク質が、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞で一時的に発現される、請求項25〜31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を、遺伝子編集と同時に相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤と接触させる、請求項19〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の集団が、流動化末梢血、骨髄又は臍帯血から得られる、請求項19〜33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の集団を富化するさらなるステップを含む、請求項19〜34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
遺伝子編集の標的が、CD40L、RAG-1、IL-2RG、CYBA、CYBB、NCF1、NCF2及びNCF4からなる群から選択され、好ましくはCD40Lである、請求項19〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
遺伝子治療の方法であって、
(a)請求項19〜36のいずれか一項に記載の方法によって造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を遺伝子編集するステップと;
(b)遺伝子編集された造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞を対象に投与するステップと
を含む方法。
【請求項３８】
遺伝子編集された細胞が自家幹細胞移植処置又は同種異系幹細胞移植処置の一部として対象に投与される、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
請求項19〜38のいずれか一項に記載の方法によって調製された、遺伝子編集された造血細胞、造血幹細胞又は造血前駆体細胞の集団。
【請求項４０】
請求項39に記載の遺伝子編集された造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を含む医薬組成物。
【請求項４１】
治療で使用するための、請求項40に記載の遺伝子編集された造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団。
【請求項４２】
請求項41に記載の使用のための遺伝子編集された造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団であって、自家幹細胞移植処置又は同種異系幹細胞移植処置の一部として投与される集団。
【請求項４３】
バーコード配列を含むAAVベクター。
【請求項４４】
目的の遺伝子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項43に記載のAAVベクター。
【請求項４５】
目的の遺伝子がプロモーター及び/又はポリアデニル化配列に作動可能に連結され、必要に応じてバーコード配列がポリアデニル化配列の下流にある、請求項44に記載のAAVベクター。
【請求項４６】
AAVベクターがAAV6ベクターである、請求項43〜45のいずれか一項に記載のAAVベクター。
【請求項４７】
AAVベクターがセーフハーバー遺伝子座、好ましくはAAVS1遺伝子座、IL2RG、CD40L又はRAG-1のイントロン1、最も好ましくはAAVS1遺伝子座を標的にする、請求項43〜46のいずれか一項に記載のAAVベクター。
【請求項４８】
バーコード配列が縮重した及び/又はランダムな配列、好ましくはランダムな配列である、請求項43〜47のいずれか一項に記載のAAVベクター。
【請求項４９】
バーコード配列が、長さが20〜40bp、好ましくは長さが20〜30bp、最も好ましくは長さが20〜25bp又は長さが約22bpである、請求項43〜48のいずれか一項に記載のAAVベクター。
【請求項５０】
遺伝子治療、好ましくは造血遺伝子治療で使用するための、請求項43〜49のいずれか一項に記載のAAVベクター。
【請求項５１】
請求項43〜48のいずれか一項に記載のAAVベクターの使用であって、前記AAVベクターを使用して遺伝子編集された細胞のクローン追跡のための使用。
【請求項５２】
細胞のクローン追跡のための方法であって、
(a)細胞の単離された集団を用意するステップと;
(b)請求項43〜49のいずれか一項に記載のAAVベクターで形質導入することによって細胞の単離された集団を遺伝子編集するステップと;
(c)AAVベクターのバーコード配列を使用して遺伝子編集された細胞をクローン追跡するステップと
を含む方法。
【請求項５３】
遺伝子編集された細胞の単離された集団を増大させるステップ;及び/又は
遺伝子編集された細胞の単離された集団を対象に移植するステップ
をさらに含む、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
対象から血液及び/又は組織試料を採取するステップと;
血液及び/又は組織試料からゲノムDNAを単離するステップと;
ゲノムDNAの中のバーコード配列を定量化するステップと
をさらに含む、請求項52又は請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
細胞が、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞である、請求項51に記載の使用又は請求項52〜54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
細胞がヒト細胞であり、及び/又は対象がヒトである、請求項51若しくは請求項55に記載の使用又は請求項52〜55のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
細胞がCD34+細胞である、請求項51、55若しくは56のいずれか一項に記載の使用又は請求項52〜56のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
血液及び/又は組織試料が毎日、毎週、2週間ごと又は毎月採取される、請求項54〜57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
血液及び/又は組織試料が少なくとも1、2、3、4、8、12、24、36又は48週後に採取される、請求項54〜58のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
試料が血液試料である、請求項54〜59のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
バーコードの定量化が、
(i)バーコード配列をPCR増幅するステップと、
(ii)PCR増幅したバーコード配列を配列決定するステップと
を含む、請求項54〜60のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
細胞のクローン追跡のためのバーコード配列の使用。
【請求項６３】
バーコード配列が縮重した及び/又はランダムな配列、好ましくはランダムな配列である、請求項62に記載の使用。
【請求項６４】
バーコード配列が、長さが20〜40bp、好ましくは長さが20〜30bp、最も好ましくは長さが20〜25bp又は長さが約22bpである、請求項62又は請求項63に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の遺伝的改変に関する。より具体的には、本発明は、遺伝子編集の効率を向上させ、かつ遺伝子編集された造血幹細胞の生存及び／又は生着を向上させる薬剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血系は、種々の成熟細胞系譜の細胞の複雑な階層である。これらは病原体からの保護を与える免疫系の細胞、体に酸素を運ぶ細胞および創傷治癒に関与する細胞を含む。これらの成熟細胞は総て、自己再生能を有し、いずれの血液細胞系譜へも分化が可能な造血幹細胞（HSC）のプールに由来する。HSCは造血系全体を補充する能力を有する。
【０００３】
造血細胞移植(hematopoietic cell transplantation)（HCT）は、いくつかの遺伝性障害および後天性障害のための治癒的療法である。しかしながら、同種HCTは、適合ドナーの利用可能性の低さ、同種法に伴う死亡率（ほとんどが移植片対宿主病（GvHD）および重度で長期持続的な免疫不全状態によって引き起こされる感染性合併症に関連する）によって制限されている。
【０００４】
遺伝的に改変された自己HSCの移植に基づく遺伝子治療アプローチは、同種HCTよりも潜在的に向上した安全性および有効性を与える。このようなアプローチは適合ドナーのいない患者に特に関連している。
【０００５】
幹細胞遺伝子治療の概念は、比較的少数の幹細胞の遺伝子改変に基づく。これらは、自己再生を受けて体内で長期持続し、遺伝的に「矯正された」後代を生成する。これにより、その患者の生涯の残りの間、矯正された細胞の連続的供給が保証される。HSCは、それらが分化する際にそれらの遺伝子改変が血液細胞系譜の総てに受け渡されることから、遺伝子治療の特に魅力的な標的である。さらに、HSCは、例えば、骨髄、動員末梢血および臍帯血から容易かつ安全に得ることができる。
【０００６】
HSCおよびその後代の効率的で長期的な遺伝子改変は、HSC機能に影響を与えることなく、ゲノム内に矯正用DNAを安定して組み込むことを可能にする技術を必要とする。したがって、γ-レトロウイルス、レンチウイルス、およびスプーマウイルスなどの組換えウイルス系の組み込みの使用がこの分野の中心となっていた（Chang, A.H. et al. (2007) Mol. Ther. 15: 445-456）。アデノシンデアミナーゼ重症複合免疫不全（ADA-SCID; Aiuti, A. et al. (2009) N. Engl. J. Med. 360: 447-458)、X連鎖重症複合免疫不全（SCID-X1; Hacein-Bey-Abina, S. et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363: 355-364）およびウィスコット・アルドリッチ症候群（WAS; Boztug, K. et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363: 1918-1927）のためのγ-レトロウイルスに基づく臨床試験において、治療上の恩恵がすでに達成されている。さらに、レンチウイルスは、X連鎖副腎白質ジストロフィー（ALD; Cartier, N. et al. (2009) Science 326: 818-823）およびベータ-サラセミア（Cartier, N. et al. (2010) Bull. Acad. Natl. Med. 194: 255-264; discussion 264-258）の治療において、送達ビヒクルとして使用されており、近年は異染性白質ジストロフィー（MLD; Biffi, A. et al. (2013) Science 341: 1233158）およびWAS（Aiuti, A. et al. (2013) Science 341: 1233151）にも使用された。
【０００７】
レトロウイルスおよびレンチウイルスをベースとするベクターの使用に加えて、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（AAV）などの他のウイルス由来のベクターも、造血幹細胞および前駆細胞の改変に利用することができる。
【０００８】
近年、遺伝子操作の範囲は、遺伝子置き換えから、目的の遺伝子座の正確な配列改変を可能にする工学操作ヌクレアーゼを使用した標的化遺伝子編集まで広がった。遺伝子編集の応用は、遺伝子コード配列の標的化破壊、突然変異のin situ修正のための正確な配列置換、及び所定の遺伝子座への標的化導入遺伝子挿入を包含する。遺伝子編集は、ゲノムの中の目的の配列に二本鎖切断(DSB)又はニックを標的化させる人工エンドヌクレアーゼの設計に基づく。細胞は、2つの主要な機構、非相同末端結合(NHEJ)又は相同配列依存型修復(HDR)を通してDSBを修復するが、他の修復機構も最終的に用いられる可能性がある。NHEJは、標的部位で遺伝子のコード配列を破壊することができる小さい挿入又は欠失(「インデル」)をしばしば生成するが、HDRは、DSBに隣接する配列に対して相同性を有する外来性鋳型DNAを提供することによって、標的部位に新規配列を正確に導入するために用いられ得る。
【０００９】
目的の遺伝子座を標的にするために、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)及びより近年開発されたRNAベースのCRISPR/Cas9ヌクレアーゼを含む、人工エンドヌクレアーゼの複数のプラットホームを使用することができる。ウイルスベクターはDNA鋳型のための最も効率的な送達ビヒクルであり、例えば、AAV6ベクターはヒト初代細胞、例えば造血幹/前駆体(HSPC)細胞及びTリンパ球において高い形質導入効率を達成することができる。
【００１０】
遺伝子編集された初代細胞の生成における近年の進歩にもかかわらず、これらの新規の技術によって与えられる遺伝子操作の予測された安全性及び精度から我々が完全に恩恵を受けることができるまでに、いくつかの障害を解決する必要がある。主要な問題は、初代細胞、特に原始的HSPCサブセットにおける遺伝子編集は、おそらくHSCの静止状態のために、遺伝子導入効率及び相同配列依存型DNA修復(HDR)の限られた実力によって、HDR機構の低レベルの発現に、並びに、反対に、誤りがちな非相同末端結合(NHEJ)経路の高い活性に制約されることである。したがって、それらの長期再増殖活性を完全に保存しつつ、HSCにおけるHDRの効率を強化することが重要であろう。
【００１１】
同様に、HDR媒介遺伝子編集のためのドナー鋳型の供与源としてのアデノ随伴ウイルス(AAV)の影響はまだ十分に調査されておらず、HSPCにおけるこのベクターの臨床適用はまだ報告されていない。AAV用量依存的毒性が観察されており、それは、hESCモデルで記載されているように、アポトーシスのp53媒介誘導のために初期のS期における細胞蓄積を誘導する、ITRのGに富む領域と直接的に関係している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
造血幹細胞及び前駆体細胞の遺伝子改変のために用いられる方法には、かなりの困難が残されている。詳細には、既存の方法に付随した、必要とされる高いベクター用量の複数回の注入及び長期にわたるex vivo形質導入時間は、培養中の形質導入された造血幹細胞及び前駆体細胞の生存の問題を引き起こし、潜在的にそれらの生物学的性質に影響を与える。さらに、形質導入された細胞の生着の改善は、臨床適用に大いに恩恵を与えるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、驚くべきことに、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤(例えば、p53活性化の阻害剤又はアデノウイルスタンパク質)の使用が、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の遺伝子編集効率を向上させること、並びに処置された、遺伝子編集された造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の生存及び/又は生着を向上させることを見いだした。
【００１４】
本発明者らは、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤が、好都合にも造血幹細胞及び前駆体細胞、特により原始的なCD34+CD133+CD90+分画における遺伝子標的化効率を強化することを決定した。さらに、本薬剤は造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の分化状態に有意に影響を及ぼさず、したがって、それらの長期再増殖能力を保存する。
【００１５】
一態様では、本発明は、造血細胞遺伝子治療、造血幹細胞遺伝子治療及び/又は造血前駆体細胞遺伝子治療で使用するための相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤であって、前記遺伝子治療が遺伝子編集を含む、薬剤を提供する。
【００１６】
好ましい実施形態では、造血細胞、造血幹細胞及び造血前駆体細胞はヒト細胞である。
【００１７】
一実施形態では、細胞はHSCである。一実施形態では、細胞はHSPCである。
一実施形態では、造血幹細胞及び/又は前駆体細胞は、CD34+細胞である。
【００１８】
一実施形態では、造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の集団は、CD34+細胞を含むか、それが富化されているか、又は実質的にそれからなる。細胞の集団は、細胞の特定の亜集団、例えば、CD34+CD38-細胞についてさらに富化されてもよい。細胞の集団は、細胞の特定の亜集団、例えば、CD34+CD133+及びCD90+細胞についてさらに富化されてもよい。
【００１９】
好ましい実施形態では、遺伝子治療は造血幹細胞治療であり、造血幹細胞は遺伝子編集される。
【００２０】
一態様では、本発明は、遺伝子編集された造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の生存及び/又は生着を増大させる上で使用するための、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤を提供する。
【００２１】
一実施形態では、細胞が薬剤の非存在下でなく薬剤に曝露させられたとき、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、50%、75%又は90%、好ましくは少なくとも70%、より多くの細胞が一定期間(例えば、約6若しくは12時間、又は1、2、3、4、5、6、7日間若しくはそれより多くの日数、好ましくは約2日間)培養において生存する。好ましくは、その期間は、ウイルスベクターによる細胞の形質導入から開始する。
【００２２】
本発明は、形質導入のために細胞(さもなければ静止期の)を刺激するために、サイトカインによる細胞の前処理/条件付けの時間調整を短縮することを可能にすることができる。標準のタイミングは、3日である。この時間は、3日未満、又は2日未満、又は1日未満、例えば、0、1若しくは2日まで短縮することができる。
【００２３】
一実施形態では、薬剤は、特にin vitro培養の間、造血幹細胞及び/又は前駆体細胞におけるアポトーシスを実質的に阻止又は低減する。
【００２４】
一実施形態では、細胞が薬剤の非存在下でなく薬剤に曝露されたとき、一定期間(例えば、約6若しくは12時間、又は1、2、3、4、5、6、7日間若しくはそれより多くの日数、好ましくは約2日間)の培養の後に、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%又は75%、好ましくは少なくとも25%、より少ない細胞が、アポトーシスになる。好ましくは、その期間は、ウイルスベクターによる細胞の形質導入から始まる。
【００２５】
一実施形態では、細胞が薬剤の非存在下でなく薬剤に曝露させられたとき、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%又は75%、好ましくは少なくとも10%、より多くの移植された造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞及び/又はそれらの後代細胞(例えば、移植片由来の細胞)が、宿主対象に生着する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、遺伝子編集された造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の生存及び/又は生着を増加させるための、或いは、造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の遺伝子編集の効率を増加させるための、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤の使用を提供する。
【００２７】
一実施形態では、薬剤はp53活性化の阻害剤であり、好ましくは阻害剤はp53リン酸化の阻害剤、より好ましくはp53セリン15リン酸化の阻害剤である。
【００２８】
一実施形態では、阻害剤はp53ドミナントネガティブペプチド、血管拡張性失調症突然変異(ATM)キナーゼ阻害剤、及び/又は血管拡張性失調症及びRad3関連タンパク質(ATR)阻害剤である。
【００２９】
一実施形態では、阻害剤はピフィスリン-α又はその誘導体である。一実施形態では、阻害剤は環状のピフィスリン-αである。一実施形態では、阻害剤はピフィスリン-α  p-ニトロ; KU-55933若しくはその誘導体; GSE56若しくはその断片若しくはバリアント; KU-60019、BEZ235、ウォルトマンニン（wortmannin）、CP-466722、Torin 2、CGK 733、KU-559403、AZD6738若しくはその誘導体;又は、siRNA、shRNA、miRNA若しくはアンチセンスDNA/RNAである。
【００３０】
一実施形態では、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞におけるp53の阻害は一時的である。
【００３１】
一実施形態では、阻害剤は、一時的な阻害剤であり(例えば、約1、2、3、4、5、6、7又は14日未満持続する阻害作用を有する)、例えば、可逆的阻害剤である。好ましくは、細胞は約1〜48又は1〜24時間、好ましくは1〜24時間、阻害剤に曝露される。細胞は、例えば、ウイルスベクターと同時に、又はウイルスベクターの前に阻害剤に曝露させることができる。
【００３２】
一実施形態では、薬剤は遺伝子編集機構が細胞に導入される前に、それと同時に、及び/又はそれの後に投与される。
【００３３】
一実施形態では、p53の一時的な阻害は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の遺伝子編集の間に生じる。
【００３４】
一実施形態では、阻害剤は、約1〜50μMの濃度で造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞に添加される。
【００３５】
一実施形態では、阻害剤は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞に(例えば、in vitro又はex vivo培養において)約1〜50、1〜40、1〜30、1〜20又は1〜15μM、好ましくは約1〜15μMの濃度で添加される。別の実施形態では、阻害剤は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞に約5〜50、5〜40、5〜30、5〜20又は5〜15μM、好ましくは約5〜15μMの濃度で添加される。
【００３６】
一実施形態では、阻害剤は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞に(例えば、in vitro又はex vivo培養において)約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45又は50μM、好ましくは約10μMの濃度で添加される。
【００３７】
一実施形態では、薬剤は、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質を含む。
【００３８】
一実施形態では、薬剤は少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００３９】
好ましくは、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質はE4ORF1であり、好ましくはE4ORF1のアミノ酸配列は配列番号1、又は配列番号57〜76で示される。少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、完全長E4ORF1の生物活性、例えば、本明細書に規定される遺伝子編集された造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の生存及び/又は生着を増加させる能力を実質的に保持する場合、E4ORF1のバリアント又は断片であってよい。
【００４０】
好ましくは、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質はE4ORF6/7であり、好ましくはE4ORF6/7のアミノ酸配列は配列番号2、又は配列番号77〜107で示される。少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、完全長E4ORF6/7の生物活性、例えば、本明細書に規定される遺伝子編集された造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の生存及び/又は生着を増加させる能力を実質的に保持する場合、E4ORF6/7のバリアント又は断片であってよい。
【００４１】
一実施形態では、薬剤は、好ましくはE4ORF1のアミノ酸配列が配列番号1、又は配列番号57〜76で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF1;及び、好ましくはE4ORF6/7のアミノ酸配列が配列番号2、又は配列番号77〜107で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF6/7を含む。
【００４２】
一実施形態では、薬剤は、好ましくはE4ORF1のアミノ酸配列が配列番号1、又は配列番号57〜76で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF1をコードする核酸配列;及び、好ましくはE4ORF6/7のアミノ酸配列が配列番号2、又は配列番号77〜107で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF6/7をコードする核酸配列を含む。
【００４３】
アデノウイルスタンパク質は、特定のアデノウイルス血清型に限定されない。例えば、一実施形態では、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、血清型4のアデノウイルス、血清型5のアデノウイルス、血清型7のアデノウイルス及び/又は血清型9のアデノウイルスに由来する。一実施形態では、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、血清型5のアデノウイルスに由来する。
【００４４】
一実施形態では、薬剤は、相同配列依存型修復を促進する、本明細書に規定される2つの化合物を含む。一実施形態では、薬剤は、p53活性化の阻害剤、及びアデノウイルスタンパク質、又はそれをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、p53活性化の阻害剤は、GSE56又はそのバリアントである。
【００４５】
一実施形態では、薬剤は、以下を含む:
(a)p53活性化の阻害剤及びアデノウイルスタンパク質E4ORF1(又はそれをコードするヌクレオチド配列)。一実施形態では、E4ORF1は、配列番号1、又は配列番号57〜76で示されるE4ORF1のアミノ酸配列を有する;
(b)p53活性化の阻害剤及びアデノウイルスタンパク質E4ORF6/7(又はそれをコードするヌクレオチド配列)。一実施形態では、E4ORF6/7は、配列番号2、又は配列番号77〜107で示されるE4ORF6/7のアミノ酸配列を有する。
(c)p53活性化の阻害剤、好ましくはE4ORF1のアミノ酸配列が配列番号1、又は配列番号57〜76で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF1(又はそれをコードするヌクレオチド配列);及び、好ましくはE4ORF6/7のアミノ酸配列が配列番号2、又は配列番号77〜107で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF6/7(又はそれをコードするヌクレオチド配列)。好ましくは、p53活性化の阻害剤は、GSE56又はそのバリアントである。
【００４６】
一実施形態では、薬剤は、p53活性化の阻害剤、及びアデノウイルスタンパク質、又はそれをコードするヌクレオチド配列を含む組成物である。
【００４７】
一実施形態では、p53活性化の阻害剤は、アデノウイルスタンパク質又はそれをコードするヌクレオチド配列と組み合わせて同時に、逐次的に、又は別々に投与される。
【００４８】
一実施形態では、アデノウイルスタンパク質又はそれをコードするヌクレオチド配列は、p53活性化の阻害剤と組み合わせて同時に、逐次的に、又は別々に投与される。
【００４９】
一態様では、本発明は、療法における同時、別個又は逐次的使用のための組合せ調製物としての、(a)本発明のp53活性化の阻害剤;及び(b)本発明のアデノウイルスタンパク質を含む製品であって、使用が本開示の使用である、製品を提供する。
【００５０】
本明細書で使用される用語「組合せ」、又は「組み合わせて」、「と組み合わせて使用される」若しくは「組合せ調製物」は、2つ以上の実体の同時、逐次的又は別個の併用投与を指すことができる。
【００５１】
本明細書で使用される用語「同時に」は、実体が並行して、すなわち同時に投与されることを意味する。
【００５２】
本明細書で使用される用語「逐次的」は、実体が順々に投与されることを意味する。
【００５３】
本明細書で使用される用語「別個の」は、実体が、互いに独立しているが、組み合わせた、好ましくは相乗的な作用を実体が示すことを可能にする時間的間隔で投与されることを意味する。したがって、「別個の」投与は、一方の実体が、例えば、他方の実体の後の1分、5分又は10分以内に投与されることを許容し得る。
【００５４】
一実施形態では、アデノウイルスタンパク質をコードする核酸は、mRNAである。
【００５５】
一実施形態では、アデノウイルスタンパク質は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞で一時的に発現され、好ましくは、一時的な発現は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の遺伝子編集の間に生じる。
【００５６】
一実施形態では、遺伝子編集の標的は、CD40L、RAG-1、IL-2RG、CYBA、CYBB、NCF1、NCF2及びNCF4からなる群から選択される。一実施形態では、遺伝子編集の標的は、慢性肉芽腫症において突然変異している遺伝子、又はSCID、非定型的SCID及びオーメン症候群若しくは高IgM症候群で突然変異している遺伝子である。好ましくは、遺伝子編集の標的は、CD40Lである。
【００５７】
別の態様では、本発明は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を遺伝子編集する方法であって、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団に遺伝子編集機構を導入するステップを含む方法を提供し;
ここで、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団への遺伝子編集機構の導入の前、同時又は後に、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団は、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤と接触させられる。
【００５８】
別の態様では、本発明は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を遺伝子編集する方法であって、
(a)造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤と接触させるステップと;
(b)造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団に遺伝子編集機構を導入するステップと;
(c)前記造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞のゲノムを編集するステップと
を含む方法を提供する。
【００５９】
別の態様では、本発明は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を遺伝子編集する方法であって、
(a)造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団に遺伝子編集機構を導入するステップと;
(b)造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤と接触させるステップと;
(c)前記造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞のゲノムを編集するステップと
を含む方法を提供する。
【００６０】
別の態様では、本発明は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を遺伝子編集する方法であって、
(a)造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団に遺伝子編集機構、及び相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤を導入するステップと;
(b)前記造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞のゲノムを編集するステップと
を含む方法を提供する。
【００６１】
一実施形態では、方法のステップ(a)及び(b)は、ex vivo又はin vitroで実行される。したがって、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を遺伝子編集する方法の一実施形態では、ステップ(a)及び(b)はex vivo又はin vitroで実行される。一実施形態では、ステップ(a)及び(b)は同時に実行することができる。別の実施形態では、ステップ(a)及び(b)は、ステップ(b)の前にステップ(a)又はステップ(a)の前にステップ(b)のいずれかで、逐次的に実行される。
【００６２】
一実施形態では、遺伝子編集機構は、ヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、メガヌクレアーゼ又はクラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドローム反復配列(CRISPR)/Casシステムを含むことができる。
【００６３】
遺伝子編集機構(例えば、CRISPR/Casシステム)は、細胞内の少なくとも1つの標的遺伝子に相補的である1つ以上のガイドRNA、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ酵素、又は前記エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列(例えば、Cas9タンパク質又はCas9をコードするヌクレオチド配列)を含むことができる。一実施形態では、遺伝子編集機構は、CRISPR/Casシステムであってよい。
【００６４】
一実施形態では、遺伝子編集機構は、1つ以上のヌクレオチド配列によって提供することができる。好適には、遺伝子編集機構をコードするヌクレオチド配列は、逐次的又は同時に細胞に導入することができる。一実施形態では、HDRを促進する薬剤は、細胞への遺伝子編集機構の導入と同時に細胞と接触させることができる。一実施形態では、遺伝子編集機構をコードする1つ以上のヌクレオチド配列は、エレクトロポレーション法によって細胞に導入される。一実施形態では、1つ以上のヌクレオチド配列は、形質導入によって細胞に導入される。好適には、ヌクレオチド配列は、ウイルスベクターの形質導入によって導入することができる。例えば、Cas9リボ核タンパク質は、ドナーDNA鋳型の送達のためのAAV6形質導入の前にエレクトロポレーション法によって細胞に導入することができる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「導入する」は、外来のDNA又はRNAを細胞に挿入する方法を指す。本明細書で使用される場合、導入されるという用語は、形質導入及びトランスフェクションの両方法を含む。トランスフェクションは、ウイルス以外の方法によって核酸を細胞中に導入するプロセスである。形質導入は、ウイルスベクターを介して外来のDNA又はRNAを細胞中に導入するプロセスである。
【００６６】
一実施形態では、AAV形質導入が、ドナーDNA鋳型を送達するために使用される。
【００６７】
一実施形態では、AAV6形質導入が、ドナーDNA鋳型を送達するために使用される。
【００６８】
一実施形態では、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞(例えば、前記細胞の集団を遺伝子編集する方法のステップ(a)における細胞の集団)は、ウイルスベクターによって細胞の集団に形質導入する約15分〜約4時間;約15分〜約3時間;又は約15分〜約2時間前に、薬剤と接触させる。別の実施形態では、細胞は、ウイルスベクターによって細胞の集団に形質導入する約1〜4時間; 1〜3時間;又は1〜2時間前に、薬剤と接触させる。
【００６９】
一実施形態では、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞(例えば、本発明の細胞の集団を遺伝子編集する方法のステップ(a)における細胞の集団)は、ウイルスベクターによって細胞の集団に形質導入する約15分、30分、1時間、1.5時間、2時間、2.5時間、3時間、3.5時間又は4時間、好ましくは約15分前に、薬剤と接触させる。
【００７０】
好適には、薬剤は、遺伝子編集の間活性であり得る(例えば、相同配列依存型DNA修復を促進し得る)。
【００７１】
一実施形態では、ステップ(a)の接触させる時間は、ステップ(b)が開始される前の約12〜60時間、例えば、24〜60、36〜60又は42〜54時間、好ましくは約42〜54時間である。一実施形態では、ステップ(a)の接触させる時間は、ステップ(b)が開始される前の約12、18、24、30、36、42、48、54又は60時間、好ましくは約48時間である。
【００７２】
一実施形態では、ステップ(b)は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団の培養を開始してから(例えば、凍結状態から細胞を解凍した後に培養を開始してから)、約12〜60時間、例えば、24〜60、36〜60又は42〜54時間、好ましくは約42〜54時間後に実行される。一実施形態では、ステップ(b)は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団の培養を開始してから約12、18、24、30、36、42、48、54又は60時間、好ましくは約48時間後に実行される。
【００７３】
一実施形態では、ステップ(b)は、(例えば、凍結状態で保存されていた)造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を解凍してから、約12〜60時間、例えば、24〜60、36〜60又は42〜54時間、好ましくは約42〜54時間後に実行される。一実施形態では、ステップ(b)は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を解凍してから約12、18、24、30、36、42、48、54又は60時間、好ましくは約48時間後に実行される。
【００７４】
一実施形態では、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤は、p53活性化の阻害剤である。
【００７５】
一実施形態では、p53活性化の阻害剤は、p53ドミナントネガティブペプチド、血管拡張性失調症突然変異(ATM)キナーゼ阻害剤、又は血管拡張性失調症及びRad3関連タンパク質(ATR)阻害剤である。
【００７６】
一実施形態では、p53活性化の阻害剤は、ピフィスリン-α、若しくは環状のピフィスリン-α若しくはピフィスリン-α  p-ニトロを含むその誘導体; KU-55933若しくはその誘導体; GSE56若しくはそのバリアント; KU-60019、BEZ235、ウォルトマンニン、CP-466722、Torin 2、CGK 733、KU-559403、AZD6738若しくはその誘導体;又は、siRNA、shRNA、miRNA若しくはアンチセンスDNA/RNAである。好ましくは、p53活性化の阻害剤は、ドミナントネガティブペプチドである。好ましくは、p53活性化の阻害剤は、GSE56又はそのバリアントである。
【００７７】
一実施形態では、阻害剤は、約1〜50μMの濃度で造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞に添加される。
【００７８】
一実施形態では、薬剤は少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００７９】
好ましくは、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質はE4ORF1であり、好ましくはE4ORF1のアミノ酸配列は配列番号1、又は配列番号57〜76で示される。少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、完全長E4ORF1の生物活性、例えば、本明細書に規定される遺伝子編集された造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の生存及び/又は生着を増加させる能力を実質的に保持する場合、E4ORF1のバリアント又は断片であってよい。
【００８０】
好ましくは、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質はE4ORF6/7であり、好ましくはE4ORF6/7のアミノ酸配列は配列番号2、又は配列番号77〜107で示される。少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、完全長E4ORF6/7の生物活性、例えば、本明細書に規定される遺伝子編集された造血幹細胞/前駆体細胞の生存及び/又は生着を増加させる能力を実質的に保持する場合、E4ORF6/7のバリアント又は断片であってよい。
【００８１】
一実施形態では、薬剤は、好ましくはE4ORF1のアミノ酸配列が配列番号1、又は配列番号57〜76で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF1;及び、好ましくはE4ORF6/7のアミノ酸配列が配列番号2、又は配列番号77〜107で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF6/7を含む。
【００８２】
一実施形態では、薬剤は、好ましくはE4ORF1のアミノ酸配列が配列番号1、又は配列番号57〜76で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF1をコードする核酸配列;及び、好ましくはE4ORF6/7のアミノ酸配列が配列番号2、又は配列番号77〜107で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF6/7をコードする核酸配列を含む。
【００８３】
アデノウイルスタンパク質は、特定のアデノウイルス血清型に限定されない。例えば、一実施形態では、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、血清型4のアデノウイルス、血清型5のアデノウイルス、血清型7のアデノウイルス及び/又は血清型9のアデノウイルスに由来する。一実施形態では、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、血清型5のアデノウイルスに由来する。
【００８４】
一実施形態では、薬剤は、相同配列依存型修復を促進する、本明細書に規定される2つの化合物を含む。一実施形態では、薬剤は、p53活性化の阻害剤、及びアデノウイルスタンパク質、又はそれをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、p53活性化の阻害剤は、GSE56又はそのバリアントである。
【００８５】
一実施形態では、薬剤は以下を含む:
(a)p53活性化の阻害剤及びアデノウイルスタンパク質E4ORF1(又はそれをコードするヌクレオチド配列)。一実施形態では、E4ORF1は、配列番号1、又は配列番号57〜76で示されるE4ORF1のアミノ酸配列を有する;
(b)p53活性化の阻害剤及びアデノウイルスタンパク質E4ORF6/7(又はそれをコードするヌクレオチド配列)。一実施形態では、E4ORF6/7は、配列番号2、又は配列番号77〜107で示されるE4ORF6/7のアミノ酸配列を有する。
(c)p53活性化の阻害剤、好ましくはE4ORF1のアミノ酸配列が配列番号1、又は配列番号57〜76で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF1(又はそれをコードするヌクレオチド配列);及び、好ましくはE4ORF6/7のアミノ酸配列が配列番号2、又は配列番号77〜107で示されるアデノウイルスタンパク質E4ORF6/7(又はそれをコードするヌクレオチド配列)。好ましくは、p53活性化の阻害剤は、GSE56又はそのバリアントである。
好ましくは、p53活性化の阻害剤は、GSE56又はそのバリアントである。
【００８６】
一実施形態では、薬剤は、p53活性化の阻害剤、及びアデノウイルスタンパク質、又はそれをコードするヌクレオチド配列を含む組成物である。
【００８７】
一実施形態では、p53活性化の阻害剤は、アデノウイルスタンパク質又はそれをコードするヌクレオチド配列と組み合わせて同時に、逐次的に、又は別々に投与される。
【００８８】
一実施形態では、アデノウイルスタンパク質又はそれをコードするヌクレオチド配列は、p53活性化の阻害剤と組み合わせて同時に、逐次的に、又は別々に投与される。
【００８９】
一実施形態では、アデノウイルスタンパク質をコードする核酸は、mRNAである。
【００９０】
一実施形態では、アデノウイルスタンパク質は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞で一時的に発現される。
【００９１】
一実施形態では、遺伝子編集の標的は、CD40L、RAG-1、IL-2RG、CYBA、CYBB、NCF1、NCF2及びNCF4からなる群から選択される。好ましくは、遺伝子編集の標的は、CD40Lである。
【００９２】
一実施形態では、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団は、遺伝子編集と同時に、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤と接触させられる。
【００９３】
一実施形態では、造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の集団は、流動化末梢血、骨髄又は臍帯血から得られる。
【００９４】
一実施形態では、本発明による方法は、造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の集団を富化するさらなるステップを含む。
【００９５】
別の態様では、本発明は、
a)本発明の方法によって造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を遺伝子編集するステップと;
b)遺伝子編集された造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞を対象に投与するステップと
を含む遺伝子治療の方法を提供する。
【００９６】
一実施形態では、遺伝子編集された細胞は、自家幹細胞移植処置又は同種異系幹細胞移植処置の一部として対象に投与される。
【００９７】
遺伝子治療の方法は、例えば、ムコ多糖体症I型(MPS-1)、慢性肉芽腫性障害、ファンコーニ貧血(FA)、鎌状赤血球症、異染性ロイコジストロフィー(MLD)、グロボイド細胞性ロイコジストロフィー(GLD)、GM2ガングリオシド蓄積症、地中海貧血症及びがんからなる群から選択される疾患の処置の方法であり得る。
【００９８】
遺伝子治療の方法は、例えば、Rag-1突然変異によって引き起こされる疾患、例えばSCID、非定型的SCID及びオーメン症候群の処置の方法であり得る。
【００９９】
遺伝子治療の方法は、例えば、高IgM症候群の処置の方法であり得る(例えば、遺伝子編集の標的はCD40Lである)。
【０１００】
一実施形態では、対象は、哺乳動物対象、好ましくはヒト対象である。
【０１０１】
一態様では、本発明は、本発明による方法によって調製された、遺伝子編集された造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を提供する。
【０１０２】
別の態様では、本発明は、本発明による遺伝子編集された造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を含む医薬組成物を提供する。
【０１０３】
さらに別の態様では、本発明は、治療で使用するための、好ましくは遺伝子治療で使用するための、本発明による遺伝子編集された造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の集団を提供する。
【０１０４】
一態様では、本発明による使用のための遺伝子編集された造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の集団は、自家幹細胞移植処置又は同種異系幹細胞移植処置の一部として投与される。
【０１０５】
別の態様では、本発明は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞による遺伝子治療のための医薬の製造のための、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤の使用であって、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞は遺伝子編集されている、使用を提供する。
【０１０６】
別の態様では、本発明は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の生存及び/又は生着を増大させるための医薬の製造のための、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤の使用であって、造血幹細胞及び/又は前駆体細胞は遺伝子編集されている、使用を提供する。
【０１０７】
別の態様では、本発明は、バーコード配列を含むAAVベクターを提供する。
【０１０８】
別の態様では、本発明は、遺伝子治療、好ましくは造血遺伝子治療で使用するための、バーコード配列を含むAAVベクターを提供する。
【０１０９】
好ましいAAVベクターは、ヒト初代細胞、例えばHSPC細胞において高い形質導入効率を達成することができるものである。AAVベクターは、HDRに適したものであり得る。一実施形態では、ベクターは、AAV6ベクター又はAAV6ベクターから誘導されるベクターである。好ましくは、ベクターは、AAV6ベクターである。
【０１１０】
バーコード配列は、特異識別子として作用する、ランダムな高度に縮重した(degenerated)DNA配列である。好ましくは、バーコード配列は、ランダムなDNA配列である。DNA配列は、少なくとも15bp、又は少なくとも18、19若しくは20bp、例えば、20〜40bp、20〜30bp、20〜25bp若しくは約22bpを含むかそれからなることができる。好ましくは、バーコード配列は、いかなる望ましくない制限部位(すなわち、クローニング制限酵素のための制限部位)も含まない。
【０１１１】
AAVベクターは、目的の遺伝子をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。「目的の遺伝子」は、任意の遺伝子であってよい。遺伝子は、マーカー遺伝子及び/又はヒト疾患に関与する遺伝子であってよい。
【０１１２】
目的の遺伝子が宿主ゲノムに正しく組み入れられているかどうかについて及び/又は細胞のクローン追跡のために、バーコード配列が報告することができるように、AAVベクターは目的の遺伝子及びバーコード配列を含むことができる。言い換えると、目的の遺伝子及びバーコード配列は、相同配列に隣接しており、そのため、相同配列依存型DNA修復の間、目的のゲノム及びバーコード配列は宿主ゲノム中に一緒に挿入される。
【０１１３】
目的の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターは、当業者に公知である任意の好適なプロモーターであってよい。一部の実施形態では、プロモーターは、hPGKプロモーターである。
【０１１４】
目的の遺伝子は、ポリアデニル化配列に作動可能に連結することができる。ポリアデニル化配列は、当業者に公知である任意の好適なポリアデニル化配列であってよい。一部の実施形態では、プロモーターは、bGH-pAである。
【０１１５】
一部の実施形態では、AAVベクターは、セーフハーバー遺伝子座、好ましくはAAVS1遺伝子座、IL2RG、CD40L又はRAG-1のイントロン1、最も好ましくはAAVS1遺伝子座を標的にする。
【０１１６】
AAVベクターは、以下に示すヌクレオチド配列、又は、以下の配列(バーコード配列には下線を引く)と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る:
2021529184.tif 000002
2021529184.tif 000003
2021529184.tif 000004
【０１１７】
別の態様では、本発明は、前記ベクターを使用して遺伝子編集された細胞のクローン追跡のための、本発明のAAVベクターの使用を提供し、好ましくは、細胞は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞である。一実施形態では、使用はin vitroの使用である。
【０１１８】
別の態様では、本発明は、本発明のAAVベクターを使用した細胞のクローン追跡の方法を提供し、好ましくは、細胞は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞である。
【０１１９】
方法は、以下のステップを含むことができる:
(a)細胞の単離された集団を用意するステップ;
(b)本発明のAAVベクターを使用して細胞の単離された集団を遺伝子編集するステップ;及び
(c)AAVベクターのバーコード配列を使用して遺伝子編集された細胞をクローン追跡するステップ。
【０１２０】
好ましくは、方法は以下をさらに含む:必要に応じて、遺伝子編集された細胞の単離された集団を増大させるステップ;及び遺伝子編集された細胞の単離された集団を対象に移植するステップ。
【０１２１】
したがって、好ましい実施形態では、方法は以下のステップを含む:
(a)細胞の単離された集団を用意するステップ;
(b)本発明のAAVベクターを使用して細胞の単離された集団を遺伝子編集するステップ;
(c)必要に応じて、遺伝子編集された細胞の単離された集団を増大させるステップ;
(d)遺伝子編集された細胞の単離された集団を対象に移植するステップ;及び
(e)AAVベクターのバーコード配列を使用して遺伝子編集された細胞をクローン追跡するステップ。
【０１２２】
より好ましくは、方法は以下をさらに含む:対象から血液及び/又は組織試料を採取するステップ;血液及び/又は組織試料からゲノムDNAを単離するステップ;並びにゲノムDNAの中のバーコードを定量化するステップ。
【０１２３】
したがって、好ましい実施形態では、方法は以下のステップを含む:
(a)細胞の単離された集団を用意するステップ;
(b)本発明のAAVベクターを使用して細胞の単離された集団を遺伝子編集するステップ;
(c)必要に応じて、遺伝子編集された細胞の単離された集団を増大させるステップ;
(d)遺伝子編集された細胞の単離された集団を対象に移植するステップ;
(e)対象から血液及び/又は組織試料を採取するステップ;
(f)血液及び/又は組織試料からゲノムDNAを単離するステップ;並びに
(g)ゲノムDNAの中のAAVベクターからのバーコード配列を定量化するステップ。
【０１２４】
本明細書に記載されるように、細胞は任意の好適な細胞であってよい。細胞は、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞であってよい。細胞は、例えばヒト又はマウスの細胞であってよい。好ましくは、細胞はヒト細胞であり、対象はヒトである。細胞は、CD34+細胞であってよい。一部の実施形態では、細胞はHSCである。一部の実施形態では、細胞はHSPCである。
【０１２５】
AAVベクターは、細胞に形質導入することができる。好ましくは、形質導入は、1×104〜5×104vg/細胞で実行される。
【０１２６】
血液及び/又は組織試料は、少なくとも1、2、3、4、8、12、24、36又は48週後に採取することができる。例えば、血液及び/又は組織試料は、約1〜100週後、1〜50週後、1〜20週後、2〜20週後又は5〜20週後に採取することができる。
【０１２７】
好ましくは、血液及び/又は組織試料は、少なくともほぼ毎日、ほぼ毎週、ほぼ2週ごと、又はほぼ毎月採取される。例えば、一部の実施形態では、血液及び/又は組織試料は、ほぼ毎日、ほぼ毎週、ほぼ2週ごと、又はほぼ毎月採取される。
【０１２８】
好ましい実施形態では、試料は血液試料である。
【０１２９】
バーコード配列のクローン追跡又は定量化は、以下のステップを含むことができる:
(i)バーコード配列をPCR増幅するステップ;及び
(ii)PCR増幅したバーコード配列を配列決定するステップ。
【０１３０】
定量化は、遺伝子編集されたクローンの数及び分布を同定すること、すなわち、クローン追跡を可能にすることができる。
【０１３１】
別の態様では、本発明は、細胞のクローン追跡のためのバーコード配列の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１−１】HSPCにおける遺伝子編集の単一細胞転写に対する影響を示す図である。(A)遺伝子編集プロトコール及びscRNA-Seq解析の模式図。簡単に述べると、各実験条件に対して約3000個の細胞をCD133+及びCD90+表面マーカーについてFACSにより富化し、その後、エレクトロポレーションの24時間後にDrop-seq解析のために回収した。(B)編集されたCD34+細胞と偽処理CD34+細胞を比較するscRNA-Seqデータにおいて上方制御された上位100種の遺伝子(log2倍の変化(2FC)によって順位付けした)に対するReactome解析。(C)M. Fischer 2017 Oncogene 36、3943-3956から引き出された、RNP+AAV6を用いて編集された単一細胞又は偽処理された単一細胞におけるp53により活性化された遺伝子の一覧の発現レベルを示すヒートマップ。(D)示されている通り処理したCD34+細胞のエレクトロポレーションの24時間後に測定されたCDKN1Aの偽対照と比べた発現倍率(RNP+ssODN n=3、他の条件n=5)。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２】ピフィスリンによる一時的なp53阻害を示す図である。(A)遺伝子編集プロトコール及びピフィスリン(phithrins)添加のタイミングの模式図。(B)異なるピフィスリン(phfithin)-α誘導体の存在下又は非存在下での遺伝子編集の3日後に、示される亜集団内で測定されたGFP+細胞のパーセンテージ(n=2)。(C)環状(ciclic)ピフィスリン-αの存在下又は非存在下での遺伝子編集の3日後に、示される亜集団内で測定されたGFP+細胞のパーセンテージ及びバルク細胞で測定されたNHEJのパーセンテージ(n=5)(D)(C)の処理されたCD34+細胞の亜集団組成(n=5)。
【図３−１】GSE56 mRNAによる一時的なp53阻害を示す図である。(A)遺伝子編集プロトコール±GSE56及び細胞分析の模式図。(B)示されている通り処理したCD34+細胞(UT、RNP+AAV6、RNP+AAV6+GSE56 n=8; 偽エレクトロポレーションn=3)のエレクトロポレーションの24時間後に測定された、示されているp53-標的遺伝子(CDKN1A、PHLDA3、RPS27L、APOBEC3H)の未処理対照(UT)と比べた発現倍率。*P<0.05、**P<0.01; マン・ホイットニー検定。(C)(左側)GSE56 mRNAの存在下又は非存在下でのAAVS1又はIL2RG遺伝子編集の3日後のHDR(ddPCRによって測定)又はNHEJ(ヘテロ二本鎖アッセイによって測定)のパーセンテージ(n=9)。*P<0.05、**P<0.01; ウィルコクソンのマッチドペア符号順位検定。(右側)GSE56 mRNAの存在下又は非存在下でのAAVS1又はIL2RG遺伝子編集の3日後に、示される亜集団内で測定されたGFP+細胞のパーセンテージ(n=15)。**P<0.01; ウィルコクソンのマッチドペア符号順位検定。(D)GSE56 mRNAの存在下又は非存在下でAAVS1において編集された細胞の増殖曲線(n=2)。(E)(B)の処理されたCD34+細胞の亜集団組成。(F)CD133+CD90+又はCD133+CD90-について選別された編集された細胞のCFU-Cアッセイにおけるプレーティング時に計数された赤血球系又は骨髄系の単一コロニー数(n=11)。ns: P>0.05、*P<0.05; マン・ホイットニー検定。
【図３−２】図３−１の続き。
【図４−１】遺伝子編集によって誘導される転写シグネチャーを弱めることによりHSPCの長期間の再増殖能が増大することを示す図である。(A)遺伝子編集プロトコール±GSE56及びNSGマウスへの移植の模式図。(B)移植されたNSGマウスのPBにおいて示される時間に測定されたGSE56 mRNAの存在下(n=6)又は非存在下(n=5)でIL2RGにおいて編集された細胞のヒトCD45+生着。(C)(B)のマウスのPBにおいて測定されたヒトリンパ系(CD19+及びCD3+)集団及び骨髄系(CD13+)集団のパーセンテージ。(D)(B)のマウスにおける示されるヒトPB集団において測定されたGFP+細胞のパーセンテージ。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５】アデノウイルスE4遺伝子のスキームを示す図である。アデノウイルスは、AAV感染プロセスを最適化するために必要とされるヘルパー遺伝子機能のセット(E1a、E1b、E2a、E4)をもたらすAAVの天然のコヘルパーである。E4遺伝子は7種の異なるタンパク質をコードする7つのオープンORFで構成される。HSCにおける遺伝子編集効率を改善するためのE4orf1及びE4orf6/7アデノウイルスタンパク質の使用について調査した。
【図６−１】アデノウイルスE4orf1及びE4orf6/7タンパク質と組み合わせたAAVS1における遺伝子編集を示す図である。(A)遺伝子編集プロトコール±E4orf1及び/若しくはE4orf6/7並びに細胞分析の模式図。(B)アデノウイルスタンパク質E4orf6/7 mRNA(総mRNA 2μg)の存在下(E4orf6/7)又は非存在下(標準)、ドナー鋳型として漸増用量のAAV6をMOI=104vg/細胞(n=3)、MOI=5×104vg/細胞(n=12)、MOI=105vg/細胞(n=2)で使用した、臍帯血(CB)由来CD34+のCas9-RNP(25pmol)を用いたAAVS1編集の4日後の、示される亜集団内で測定されたGFP+細胞のパーセンテージ。(C)AAV6(MOI=5×104vg/細胞)又はIDLV(MOI=200)をドナー鋳型として使用し、RNP-Cas9(25pmol)を使用し、E4orf6/7(総RNA 2μg)を補充した、CB由来CD34+のAAVS1編集の4日後の、示される亜集団内で測定されたGFP+細胞のパーセンテージ。(D)AAV6をドナー鋳型としてMOI=5×104vg/細胞で使用し、RNP-Cas9(25pmol)を使用し、漸増用量のE4orf1(総RNA 1μgから5μgまで)又はE4orf6/7(総RNA 1μgから5μgまで)を補充した、CB由来CD34+のAAVS1編集の4日後の、示される亜集団内で測定されたGFP+細胞のパーセンテージ。
【図６−２】図６−１の続き。
【図７−１】ヒトCD34+における遺伝子編集プロトコールへのE4orf1及びE4orf6/7の補充。(A)AAV6をドナー鋳型としてMOI=5×104vg/細胞で使用し、RNP-Cas9(25pmol)を使用し、E4orf1(総RNA 3μg)及び/又はE4orf6/7(総RNA 2μg)を補充したか又は補充しなかった、CB由来CD34+のAAVS1編集の4日後の、示される亜集団内で測定されたGFP+細胞のパーセンテージ。(B)5'ベクター-ゲノム接合部に対するddPCRによって測定されるHDR媒介組込みのパーセンテージ、及び、AAV6をドナー鋳型としてMOI=5×104vg/細胞で使用し、RNP-Cas9(25pmol)を使用し、E4orf1(総RNA 3μg)及び/又はE4orf6/7(総RNA 2μg)を補充したか又は補充しなかった、CB由来CD34+の遺伝子編集の4日後に細胞蛍光分析によって測定されたバルク内のGFP+細胞。(C)コロニー形成細胞アッセイ。プレーティングの15日後に測定された赤血球系コロニーの総数が赤色で示され(n=3)、骨髄系コロニーの総数が白色で示されている(n=3)。(D)エレクトロポレーション後の細胞増殖曲線(n=1)。
【図７−２】図７−１の続き。
【図８−１】ヒトCD34+における遺伝子編集プロトコールへのE1B55K及びE4orf6の補充について示す図である。(A)AAV6をドナー鋳型としてMOI=5×104vg/細胞で使用し、RNP-Cas9(25pmol)を使用し、E1B55K(総RNA 3μg)及び/又はE4orf6(総RNA 2μg)を補充した、CB由来CD34+のAAVS1編集の4日後の、示される亜集団内で測定されたGFP+細胞のパーセンテージ。(B)AAV6をドナー鋳型としてMOI=5×104vg/細胞で使用し、RNP-Cas9(25pmol)を使用し、E1B55K(総RNA 3μg)及び/又はE4orf6(総RNA 2μg)を補充したCB由来CD34+の遺伝子編集の4日後の、5'ベクター-ゲノム接合部に対するddPCRによって測定されるHDR媒介組込みのパーセンテージ、及び細胞蛍光分析によって測定されたバルク内のGFP+細胞。(C)コロニー形成細胞アッセイ。プレーティングの15日後に測定された赤血球系コロニーの総数が赤色で示され(n=3)、骨髄系コロニーの総数が白色で示されている(n=3)。(D)エレクトロポレーション後の細胞増殖曲線(n=1)。
【図８−２】図８−１の続き。
【図９】E4orf6/7を使用したヒトT細胞の遺伝子編集を示す図である。(A)T細胞遺伝子編集プロトコール±E4orf6/7及び細胞分析の模式図。(B)AAV6をドナー鋳型としてMOI=5×104vg/細胞で使用し、RNP-Cas9(25pmol)を使用し、E4orf6/7(総RNA 2μg)を補充した、刺激したT細胞(n=3)のAAVS1における編集の20日後の、示される亜集団内で測定されたGFP+細胞のパーセンテージ。
【図１０】E4orf6/7を使用したヒトCB由来CD34+のAAVS1遺伝子編集、その後のNSGマウスへの移植。(A)標準の移植手順では、複合体AAVS1特異的RNP-cas9(25pmol)及びE4orf6/7(総RNA 2μg)を補充したエレクトロポレーション前にサイトカイン及び薬物を用いた3日間の細胞刺激が必要であった。エレクトロポレーション手順の後に、AAV6による形質導入を細胞当たりウイルスゲノム5×104個で行った。合計6×105個の処理細胞を各マウスに移植した(尾部への静脈内注射); 2つの実験条件を試験した(標準及びE4orf6/7を補充したもの)。(B)AAV6をドナー鋳型としてMOI=5×104vg/細胞で使用し、RNP-Cas9(25pmol)を使用し、E4orf6/7(総RNA 2μg)を補充した、CB由来CD34+のAAVS1編集の4日後の示される亜集団内で測定されたGFP+細胞のパーセンテージ。(C)(B)の処理されたCD34+細胞の培養中組成。(D)(B)の細胞のAAVS1対立遺伝子の分子解析。HDR(デジタルドロップレットPCR、ddPCR、5'ベクター-ゲノム接合部の媒介性定量化)による、又はNHEJ(T7ヘテロ二本鎖検出アッセイ)による野生型(WT)又は改変された対立遺伝子のパーセンテージとして表されている。
【図１１】E4orf6/7を使用したAAVS1標的化ヒトCB由来CD34+のin-vivo追跡を示す図である。(A)示される時間に測定された移植されたNSGマウスの末梢血(PB)中の、及び実験の最後に測定されたそれらの異なる器官(脾臓、胸腺及び骨髄)並びに骨髄の異なる血液系列中の(HSPC=CD34+; B細胞=CD19+; 骨髄細胞= CD33+; T細胞=CD3+)、E4orf6 mRNAの存在下(n=4)又は非存在下(n=5)で編集された細胞のヒトCD45+生着。(B)(A)のヒト細胞内で測定された、PB、造血器官及び骨髄系列中の測定されたGFP+細胞のパーセンテージ。(C)(A)の編集された対立遺伝子(細胞当たりの標的化されたコピー数)のPB、造血器官及び骨髄系列中のパーセンテージ。
【図１２】一時的なGSE56過剰発現により、AAVS1編集された再増殖HSPCのin vivo収量及びクローン性が改善されることを示す図である。(A)編集プロトコールの12〜24時間後にFACSによって測定された、Hoechst 33342染色によるバルク培養物及びCD90+中の細胞周期の状態のパーセンテージ[クラスカル・ワリス検定、標準RNP+AAV6に対して]。(B)AAVS1標的化遺伝子編集されたヒト臍帯血(CB)由来CD34+細胞を免疫不全NSGマウスに移植するための実験設定の模式図。(C、D)p53阻害剤を用いて処理された細胞(+GSE56)又は処理されていない細胞(標準)を異種移植した21週間後の脾臓(SPL)及び骨髄(BM)における総ヒト細胞中のヒト細胞のパーセンテージ(C)及びGFP+のパーセンテージ(D)[マン・ホイットニー検定]。(E)p53阻害剤を用いて処理された細胞(+GSE56)又は処理されていない細胞(標準)を移植したマウスの造血器官における特有の優性バーコードの数[マン・ホイットニー検定]。(F)特有の優性バーコードの数(X軸)とCD45+GFP+細胞のパーセンテージ(Y軸)の相関(スピアマン相関)。
【図１３】一時的なGSE56過剰発現により、CD40LG編集された再増殖HSPCのin vivo収量が改善されることを示す図である。(A)CD40LG標的化遺伝子編集されたヒト臍帯血(CB)由来CD34+細胞を免疫不全NSGマウスに移植するための実験設定の模式図。(B、C)p53阻害剤を用いて処理された細胞(+GSE56)又は処理されていない細胞(標準)を移植したNSGマウスの末梢血中のヒト細胞のパーセンテージ(B)及びGFPのパーセンテージ(C)。(D)(B)のマウスの造血器官におけるヒト細胞のパーセンテージ。(E)(D)のマウス由来の選別されたB細胞(CD19+)、骨髄系細胞(CD33+)、T細胞(CD3+)及び幹細胞(CD34+)における、デジタルドロップレットPCRによって測定された標的化組込みのパーセンテージ。
【図１４−１】アデノウイルスタンパク質Ad5-E4orf6/7及びAd5-E4orf1はどちらもHSPCにおけるAAVS1遺伝子座を標的とすることによってHDR効率を上昇させることを示す図である。(A)サイトカイン及び薬物を用いて予備刺激した後、3日目に標準の編集手順としてRNP-Cas9(25pmol)及びAAV6(2.104vg/ml)±mRNAとして送達されるGFP、GSE56、Ad5-E4orf1、Ad5-E4orf6/7又はGSE56/Ad5-E4orf6/7をエレクトロポレーションすることによるヒト臍帯血(CB)由来CD34+における標的化遺伝子編集プロトコールの模式図。(B)編集後数日間にわたるCD34+培養細胞増殖のモニタリング。(C、左側及び右側のパネル)標準RNP+AAV6±GSE56、Ad5-E4orf1、Ad5-E4orf6/7又はGSE56/Ad5-E4orf6/7についての編集プロトコールの96時間後にFACSによって測定された、示される亜集団内のGFP+細胞のパーセンテージ、及び関連する増加倍率値[一元配置ANOVA]。(D)編集プロトコールの96時間後の5'ベクター-ゲノム接合部に対するddPCRによって測定されるバルク培養物におけるHDR及びNHEJによるAAVS1編集された対立遺伝子のパーセンテージ[クラスカル・ワリス検定、標準RNP+AAV6に対して]。(E)編集プロトコールの96時間後の分化した細胞(CD34-)から最も原始的な区画(CD34+CD133+CD90+)までの培養中組成[クラスカル・ワリス検定、標準RNP+AAV6に対して]。(F)編集プロトコールの24時間後にFACSによって測定された7-AAD/アネキシン染色によるバルク培養物におけるアポトーシスである細胞の状態のパーセンテージ。(G)編集プロトコールの24時間後にバルク培養物からプレーティングされたコロニー数[クラスカル・ワリス検定、標準RNP+AAV6に対して]。(H)編集プロトコールの12〜24時間後にFACSによって測定されたHoechst 33342染色によるバルク培養物における細胞周期の状態のパーセンテージ[クラスカル・ワリス検定、標準RNP+AAV6に対して]。(I)標準RNP+AAV6±Ad5-E4orf6/7に関してIL2RG遺伝子座における編集プロトコールの96時間後にFACSによって測定された、示される亜集団内のGFP+細胞のパーセンテージ、及び関連する増加倍率値[対応のあるT検定]。(J)解凍の0日後、1日後及び2日後に標準の編集手順としてRNP-Cas9(25pmol)及びAAV6(2.104vg/ml)±mRNAとして送達されるGSE56、Ad5-E4orf6/7又はGSE56/Ad5-E4orf6/7を用いたエレクトロポレーションを実施することによるヒト臍帯血(CB)由来CD34+における標的化遺伝子編集プロトコールの模式図。(K)バルク(左側のパネル)及びCD90+(右側のパネル)における、標準RNP+AAV6±GSE56、Ad5-E4orf6/7又はGSE56/Ad5-E4orf6/7についての編集プロトコールの96時間後にFACSによって測定された、示される亜集団内のGFP+細胞のパーセンテージ(n=1)、及び関連する増加倍率値。(L)編集プロトコールの96時間後の5'ベクター-ゲノム接合部に対するddPCRによって測定されたバルク培養物における、HDRによってAAVS1編集された対立遺伝子のパーセンテージ(n=1)。
【図１４−２】図１４−１の続き。
【図１４−３】図１４−２の続き。
【図１４−４】図１４−３の続き。
【図１４−５】図１４−４の続き。
【図１４−６】図１４−５の続き。
【図１５−１】アデノウイルスタンパク質Ad5-E1B55KとAd5-E4orf6の組合せにより、HSPCにおけるドナー鋳型カセット発現が増大するが、HDR効率は上昇しないことを示す図である。(A)hCB由来CD34+において我々の標準手順RNP+AAV6±Ad5-E1B55K及び/又はAd5-E4orf6を使用することによって実施した編集プロトコールの96時間後にFACSによって測定された、示される亜集団内のGFP+細胞のパーセンテージ[一元配置ANOVA]。(B)編集プロトコールの96時間後の5'ベクター-ゲノム接合部に対するddPCRによって測定されるバルク培養物中のHDR及びNHEJによってAAVS1編集された対立遺伝子のパーセンテージ[クラスカル・ワリス検定、標準RNP+AAV6に対して]。(C)編集プロトコールの96時間後の培養中組成。(D)編集プロトコールの24時間後にFACSによって測定された7-AAD/アネキシン染色によるバルク培養物中のアポトーシスである細胞の状態のパーセンテージ。(E)編集プロトコールの24時間後にバルク培養物からプレーティングされたコロニー数[クラスカル・ワリス検定、標準RNP+AAV6に対して]。
【図１５−２】図１５−１の続き。
【図１５−３】図１５−２の続き。
【図１６−１】アデノウイルスタンパク質Ad5-E4orf6/7がHSPCにおける細胞周期を制御するE2Fs標的遺伝子に影響を及ぼすことを示す図である。(A)標準RNP+AAV6±GFP、GSE56、Ad5-E4orf6/7又はGSE56/Ad5-E4orf6/7での編集プロトコールの24時間後の、未処理細胞(UT)と比べたCDK2遺伝子発現倍率のTaqManアッセイ[クラスカル・ワリス検定、標準RNP+AAV6に対して]。(B)標準RNP+AAV6±GFP、GSE56、Ad5-E4orf6/7又はGSE56/Ad5-E4orf6/7での編集プロトコールの12時間後、24時間後、96時間後、及び168時間後の、UTと比べたCDK2遺伝子発現倍率のTaqManアッセイ。(C)標準RNP+AAV6±GFP、GSE56、Ad5-E4orf6/7又はGSE56/Ad5-E4orf6/7での編集プロトコールの24時間後の、UTと比べたCDKN2A遺伝子発現倍率のTaqManアッセイ[クラスカル・ワリス検定、標準RNP+AAV6に対して]。(D)標準RNP+AAV6±GFP、GSE56、Ad5-E4orf6/7又はGSE56/Ad5-E4orf6/7での編集プロトコールの12時間後、24時間後、96時間後、及び168時間後の、UTと比べたCDKN2A遺伝子発現倍率のTaqManアッセイ。(E)標準RNP+AAV6±GFP、GSE56、Ad5-E4orf6/7又はGSE56/Ad5-E4orf6/7での編集プロトコールの24時間後の、UTと比べたCDKN1A遺伝子発現倍率のTaqManアッセイ[クラスカル・ワリス検定、標準RNP+AAV6に対して]。(F)標準RNP+AAV6±GFP、GSE56、Ad5-E4orf6/7又はGSE56/Ad5-E4orf6/7での編集プロトコールの12時間後、24時間後、96時間後、及び168時間後の、UTと比べたCDKN1A遺伝子発現倍率のTaqManアッセイ。(G)標準RNP+AAV6±GFP、GSE56、Ad5-E4orf6/7又はGSE56/Ad5-E4orf6/7での編集プロトコールの24時間後の、UTと比べた、APOBEC3H遺伝子発現倍率のTaqManアッセイ[クラスカル・ワリス検定、標準RNP+AAV6に対して]。(H)標準RNP+AAV6±GFP、GSE56、Ad5-E4orf6/7又はGSE56/Ad5-E4orf6/7での編集プロトコールの12時間後、24時間後、96時間後、及び168時間後の、UTと比べた、APOBEC3H遺伝子発現倍率のTaqManアッセイ。(I)アデノウイルスタンパク質Ad5-E4orf6/7及び/又はp53阻害剤GSE56を使用した編集プロトコール後のHSPCにおける細胞周期の制御機構の模式図。
【図１６−２】図１６−１の続き。
【図１６−３】図１６−２の続き。
【図１６−４】図１６−３の続き。
【図１６−５】図１６−４の続き。
【図１７−１】AAVS1編集されたヒトCB由来CD34+の一次異種移植追跡を示す図である。(A)ヒト臍帯血(CB)由来CD34+における標的化遺伝子編集プロトコール及び編集プロトコールの24時間後のNSG異種移植の模式図。(B)移植後数週間にわたる末梢血(PB)中のヒトCD45+細胞の生着のモニタリング。(C)移植後数週間にわたる、PB中の生着したhCD45+の間でのGFP+編集された細胞のパーセンテージ。(D、E)脾臓及び骨髄(BM)中の長期間のhCD45+生着及びhCD45+内のGFP+の両方のパーセンテージ。(F)RNP+AAV6±GSE56/Ad5-E4orf6/7で処理した細胞を移植したマウスの造血器官における特有の優性バーコードの数[マン・ホイットニー検定]。線は中央値を示す。
【図１７−２】図１７−１の続き。
【図１７−３】図１７−２の続き。
【図１７−４】図１７−３の続き。
【図１８−１】AAVS1編集されたヒトCB由来CD34+の二次異種移植追跡を示す図である。(A)BMからのCD34+細胞選択後のNSGマウスにおける二次移植の模式図。(B)移植後数週間にわたる末梢血(PB)中のヒトCD45+細胞の生着のモニタリング。(C)移植後数週間にわたる、PB中の生着したhCD45+の中でのGFP+編集された細胞のパーセンテージ。(D、E)脾臓及び骨髄(BM)における非常に長期間でのhCD45+生着及びhCD45+内のGFP+の両方のパーセンテージ。(F、G)脾臓における血液系列組成(CD19+、CD33+及びCD3+)及び関連するGFP+細胞のパーセンテージ。線は中央値を示す。
【図１８−２】図１８−１の続き。
【図１８−３】図１８−２の続き。
【図１９】限定された用量のAAVS1において編集されたヒトCB由来CD34+の一次異種移植追跡を示す図である。(A)移植後数週間にわたる末梢血(PB)中のヒトCD45+細胞の生着のモニタリング。(B)移植後数週間にわたる、PB中の生着したhCD45+の間でのGFP+編集された細胞のパーセンテージ。線は中央値を示す。
【図２０−１】IL2RG編集されたヒトCB由来CD34+の一次及び二次異種移植追跡を示す図である。(A、B)一次移植後数週間にわたる末梢血(PB)中のヒトCD45+細胞の生着及び生着したhCD45+の間でのGFP+編集された細胞の両方のモニタリング。(C、D)二次移植後数週間にわたる末梢血(PB)中のヒトCD45+細胞の生着及び生着したhCD45+の間でのGFP+編集された細胞の両方のモニタリング。(E、F)脾臓及び骨髄(BM)における長期間のhCD45+生着及びhCD45+内のGFP+の両方のパーセンテージ。(G、H)脾臓における血液系列組成(CD19+、CD33+及びCD3+)及び関連するGFP+細胞のパーセンテージ。線は中央値を示す。(I)IL2RG遺伝子座を標的とするin vitro試料及びin vivo試料の両方からのddPCRによって測定される「X」染色体と「14」番染色体の間の転座事象のパーセンテージ[クラスカル・ワリス検定、標準RNP+AAV6に対して]。線は中央値を示す。
【図２０−２】図２０−１の続き。
【図２０−３】図２０−２の続き。
【図２１−１】アデノウイルスタンパク質E4orf1血清型バリアントの探索を示す図である。(A)高度に保存されたアミノ酸を含むE4orf1タンパク質配列アラインメント(T-Coffee)。(B)T-Coffee解析に基づき、アデノウイルス血清型の間で最も密接なアミノ酸組成を表す系統樹。(C)我々の標準手順RNP+AAV6±Ad4-E4orf1、Ad5-E4orf1、Ad7-E4orf1、又はAd9-E4orf1(選択されたバリアント)を使用することによってhCB由来CD34+において実施した編集プロトコールの96時間後にFACSによって測定された、示される亜集団内のGFP+細胞のパーセンテージ。(D)編集プロトコールの24時間後にバルク培養物からプレーティングされたコロニー数。(E)編集プロトコールの24時間後に未処理細胞(UT)と比べたCDK2、CDKN2A及びCDKN1A遺伝子発現倍率のTaqManアッセイ。
【図２１−２】図２１−１の続き。
【図２１−３】図２１−２の続き。
【図２１−４】図２１−３の続き。
【図２１−５】図２１−４の続き。
【図２１−６】図２１−５の続き。
【図２２−１】アデノウイルスタンパク質E4orf6/7血清型バリアントの探索を示す図である。(A)高度に保存されたアミノ酸を含むE4orf6/7タンパク質配列アラインメント(T-Coffee)。(B)T-Coffee解析に基づき、アデノウイルス血清型の間で最も密接なアミノ酸組成を表す系統樹。(C)我々の標準手順RNP+AAV6±Ad3-E4orf6/7、Ad4-E4orf6/7、Ad5-E4orf6/7、又はAd23-E4orf6/7(選択されたバリアント)を使用することによってhCB由来CD34+において実施した編集プロトコールの96時間後にFACSによって測定された、示される亜集団内のGFP+細胞のパーセンテージ。(D)編集プロトコールの24時間後にバルク培養物からプレーティングされたコロニー数。(E)編集プロトコールの24時間後に未処理細胞(UT)と比べたCDK2、CDKN2A及びCDKN1A遺伝子発現倍率のTaqManアッセイ。
【図２２−２】図２２−１の続き。
【図２２−３】図２２−２の続き。
【図２２−４】図２２−３の続き。
【図２２−５】図２２−４の続き。
【図２２−６】図２２−５の続き。
【図２２−７】図２２−６の続き。
【図２３】バーコード配列を含むベクターを示す図である。バーコード配列を含むAAVベクター設計の概略図。
【発明を実施するための形態】
【０１３３】
本明細書で使用される用語「含んでいる(comprising)」、「含む(comprises)」及び「を含む(comprised of)」は、「含んでいる(including)」若しくは「含む(includes)」;又は「含有している(containing)」若しくは「含有する(contains)」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、追加の列挙されていないメンバー、要素、ステップを排除しない。用語「含んでいる(comprising)」、「含む(comprises)」及び「を含む(comprised of)」は、用語「からなる(consisting of)」も含む。
【０１３４】
細胞の生存および生着
「生存」という用語は、造血細胞、造血幹細胞および/または造血前駆細胞が、インビトロまたはエクスビボ培養中に生き続けられる（例えば、死滅しない、またはアポトーシスとならない）能力を意味する。造血幹細胞および/または前駆細胞は、例えば、ウイルスベクターによる形質導入後、細胞培養中に、アポトーシスが増加する可能性がある；したがって、生存細胞は、アポトーシスおよび/または細胞死を回避した可能性がある。
【０１３５】
細胞生存は、当業者が容易に分析することができる。例えば、細胞培養における生細胞、死細胞、および/またはアポトーシス細胞の数を、培養の開始時点で、および/または一定期間（例えば、約6時間もしくは12時間、または1、2、3、4、5、6、もしくは７日間以上；好ましくは、その期間はウイルスベクターによる細胞の形質導入から始まる）の培養後に、定量化することができる。細胞生存に及ぼす、本発明の阻害剤またはアデノウイルスタンパク質のような薬剤の影響は、培養期間の開始時点および/または終了時点での、生細胞、死細胞、および/またはアポトーシス細胞の数および/またはパーセンテージを、薬剤の有無以外は実質的に同一条件下であるが、その薬剤の存在下で実施された実験と非存在下で行われた実験とで比較することによって、評価することができる。
【０１３６】
ある状態の細胞（例えば、生細胞、死細胞またはアポトーシス細胞）の数および/またはパーセンテージは、当技術分野で公知の数多くの方法のいずれによっても、定量化することができるが、その方法には、血球計数器、自動細胞計数器、フローサイトメーターおよび蛍光活性化セルソーターの使用を含む。これらの技術は、生細胞、死細胞および/またはアポトーシス細胞の区別を可能にすることができる。それに加えて、またはその代わりに、アポトーシス細胞は、利用しやすいアポトーシスアッセイ（例えば、露出したホスファチジルセリン（PS）に結合するアネキシンVを使用するような、細胞膜表面上のPSの検出に基づくアッセイ；アポトーシス細胞は蛍光標識されたアネキシンVの使用によって定量化することができる）を用いて検出することが可能であって、これは他の技術を補完するために使用することができる。
【０１３７】
「生着」という用語は、造血幹細胞および/または前駆細胞が、それらの移植後に、すなわち、移植後短期間、および/または移植後長期間、被験体において、定着して生存する能力を意味する。例えば、生着は、移植後約1日〜24週間、1日〜10週間、または1〜30日もしくは10〜30日に検出される、移植された造血幹細胞に由来する造血細胞（例えば、移植由来細胞）の数および/またはパーセンテージを指しうる。ヒト造血幹細胞および/または前駆細胞の生着および再増殖に関する異種移植モデルにおいて、生着は、例えばヒト異種移植片に由来する細胞（例えばCD45表面マーカー陽性）のパーセンテージとして、末梢血液中で評価することができる。一実施形態において、生着は、移植後約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、または30日の時点で評価される。別の実施形態において、生着は、移植後約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24週間の時点で評価される。別の実施形態において、生着は、移植後約16-24週間、好ましくは20週間の時点で評価される。
【０１３８】
当業者は生着を容易に分析することができる。例えば、マーカー（例えば、蛍光タンパク質などのレポータータンパク質）を含有するように、移植される造血幹細胞および/または前駆細胞を操作することが可能であって、それを用いて移植片由来細胞を定量することができる。分析用サンプルを関連組織から採取し、エクスビボで分析してもよい（例えば、フローサイトメトリーを用いて）。
【０１３９】
好適には、本発明による使用のための薬剤は、薬剤を使用しない遺伝子編集と比較して、遺伝子編集された造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の生着を改善することができる。好適には、所与の時点の生着は、未処置の遺伝子編集された造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の生着と比較したとき、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又はそれより多く増加させることができる。
【０１４０】
好ましい実施形態では、本発明による使用のための薬剤は、未処置の遺伝子編集された造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞と比較したとき、遺伝子編集された造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞の増殖に不利な影響を及ぼさない。
【０１４１】
遺伝子編集効率
一態様では、本発明は、造血細胞、造血幹細胞及び/若しくは造血前駆体細胞(例えば、ウイルスベクターによって形質導入した場合)の単離された集団の遺伝子編集の効率を増大させるための、並びに/又は遺伝子編集された造血細胞、造血幹細胞及び/若しくは造血前駆体細胞の生存及び若しくは生着を増加させるための、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤の使用を提供する。
【０１４２】
遺伝子編集の効率を増大させることは、薬剤の非存在下であるがそれ以外は実質的に同一の条件の下で達成される遺伝子編集と比較して、薬剤の存在下での細胞(例えば、造血細胞、造血幹細胞及び/又は造血前駆体細胞)の遺伝子編集の増大を指す。遺伝子編集機構を導入するためにウイルスベクターが使用される場合、効率の増大は、したがって、感染多重度(MOI)及び/又は有効な形質導入を達成するために必要とされる時間を低減させることができる。
【０１４３】
一実施形態では、編集された細胞のパーセンテージは、増加する。編集された細胞のパーセンテージを判定する方法は、当技術分野で公知である。好適な方法には、フローサイトメトリー、蛍光標示式細胞分取(FACS)及び蛍光顕微鏡検査法が含まれる。用いられる技術は、好ましくは、自動化及び/又はハイスループットスクリーニングに適合するものである。
【０１４４】
例えば、細胞の集団は、レポーター遺伝子を有するベクターで編集することができる。好適には、細胞が編集されたとき、レポーター遺伝子を発現させることができる。好適なレポーター遺伝子には、蛍光性タンパク質、例えば、緑色、黄色、サクランボ色、シアン又はオレンジ色の蛍光性タンパク質をコードする遺伝子が含まれる。細胞の集団が編集されると、レポーター遺伝子を発現している及び発現していない細胞の数の双方を、好適な技術、例えばFACSを使用して定量化することができる。その後、編集された細胞のパーセンテージを計算することができる。
【０１４５】
あるいはまた、レポーター遺伝子を使わずに遺伝子編集された細胞のパーセンテージを判定するために、定量的PCR(qPCR)を使用することができる。例えば、細胞(例えば、CD34+細胞)の単一のコロニーを半固体の培養から取り出し、各コロニーでqPCRを別々に実行して、分析されるものの中の遺伝子編集された陽性コロニーのパーセンテージを判定することができる。
【０１４６】
ベクターコピー数を決定する方法も、当技術分野で公知である。用いられる技術は、好ましくは、自動化及び/又はハイスループットスクリーニングに適合するものである。好適な技術には、定量的PCR(qPCR)及びサザンブロットベースのアプローチが含まれる。
【０１４７】
遺伝子編集の効率を増大させることは、薬剤の非存在下であるがそれ以外は実質的に同一の条件の下で達成されるものと比較して、薬剤(例えば、p53活性化の阻害剤又はアデノウイルスタンパク質)の存在下でのウイルスベクターによる細胞の集団の形質導入の後の、標的遺伝子又は部位が意図的に編集された(例えば、破壊された、置き換えられた、削除された、又はその中に若しくはそこで核酸配列が挿入された)細胞(例えば、造血細胞、造血幹細胞又は造血前駆体細胞)の数の増加を指すことができる。遺伝子編集効率の増大は、したがって、感染多重度(MOI)及び/又は有効な遺伝子編集を達成するために必要とされる形質導入時間を低減させることができる。標的遺伝子又は部位が編集されたかどうか判定する方法は、当技術分野で公知である。
【０１４８】
例えばCRISPR/Casシステムを使用する遺伝子編集との関連で、好ましくは、細胞の集団を形質導入するために使用するベクターは、非組入れベクター(例えば、組入れ欠陥(integration-defective)のあるレンチウイルスベクター、IDLV)である。
【０１４９】
一実施形態では、本発明による使用のための薬剤は、薬剤を使用しない遺伝子編集(すなわち、標準の遺伝子編集)と比較して、遺伝子編集効率を改善する。好適には、遺伝子編集効率は、少なくとも1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、3倍又はそれより大きく改善することができる。
【０１５０】
好適には、遺伝子編集効率は、特定の細胞コンパートメントの中で改善することができる。好適には、遺伝子編集は、原始的HSPC細胞コンパートメントの中で改善される。好適には、遺伝子編集は、CD34+CD133-細胞の中で改善することができる。好適には、遺伝子編集は、CD34+CD133+細胞の中で改善することができる。好適には、遺伝子編集は、CD34+CD133+CD90+細胞の中で改善することができる。
【０１５１】
好ましくは、CD34+CD133+CD90+細胞の遺伝子編集効率は、少なくとも1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、3倍又はそれより大きく改善することができる。
【０１５２】
相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤
本発明者らは、HSCにおけるHDRの効率を改善することは、遺伝子編集されたHSCの細胞生存及び生着を増大させると判定した。
【０１５３】
初代細胞及び特にHSPCにおける遺伝子編集は、おそらくHDR機構の低レベルの発現及びNHEJ経路の高い活性のために、遺伝子導入効率及び限られたHDRによって妨げられることがある。
【０１５４】
本明細書で使用される「相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤」は、薬剤で処置していない細胞におけるHDRのレベルと比較して、HDRの効率を増強及び/又は改善する薬剤を指す。
【０１５５】
好適には、HDRは、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又はそれより大きく増大させることができる。好適には、HDRは、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0倍又はそれより大きく増大させることができる。
【０１５６】
HDR効率は、当技術分野の任意の方法を使用して測定することができる。好適には、HDR効率は、標的化遺伝子座でのHDR媒介組入れによって細胞に導入されるドナー鋳型ベクターにおけるマーカーの存在を測定するFACSによって決定することができる。例えば、AAV6ドナー鋳型は、PGK.GFPレポーターカセットを含むことができる。図2Bは、GFP+細胞のパーセンテージを決定することによって測定して、HDR効率の増大が一時的なp53阻害を通して得られたことを実証する。
【０１５７】
標的化組入れ(「目標の(on target)」HDR)は、ベクター配列と標的化遺伝子座の間の接合部に対して、及び正規化のために使用された対照配列(ヒトTTC5遺伝子)に対して設計されたプライマー及びプローブを使用したデジタル式PCRによって決定することができる。
【０１５８】
ヌクレアーゼ標的部位の上の非相同末端結合(NHEJ)修復経路によって導入された挿入及び欠失(インデル)のパーセンテージは、ミスマッチ感受性エンドヌクレアーゼアッセイによって測定された(標的化遺伝子座のPCRベースの増幅及び続くT7エンドヌクレアーゼIによる消化;消化されたDNA断片は、LabChip GX Touch HT、Perkin Elmerでのキャピラリー電気泳動によって展開し、定量化した)。ヌクレアーゼ活性を評価するための代用の読み出しとして、NHEJ誘導突然変異のレベルを使用した。
【０１５９】
好ましくは、薬剤は低い細胞毒性を有する。
【０１６０】
好ましくは、薬剤は、遺伝子編集された細胞の組成を有意に変更しない。
【０１６１】
好ましくは、薬剤は、遺伝子編集された造血幹細胞及び/又は前駆体細胞の分化を有意に誘導しない。したがって、本発明による遺伝子編集された造血幹細胞及び/又は前駆体細胞は、それらの長期再増殖能力を保持する。
【０１６２】
好適には、遺伝子編集された細胞の組成又は分化の変化は、未処置対照と比較したとき、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満又は1%未満である。
【０１６３】
例えば、図3Eは、未処置対照と比較して、遺伝子編集細胞において編集の3日後に測定された造血集団の相対的組成に変化がなかったことを示す。
【０１６４】
P53活性化
「p53活性化」という用語は、例えばp53タンパク質の翻訳後修飾による、p53の活性の増加を意味する。翻訳後修飾の例には、リン酸化、アセチル化およびメチル化が挙げられ、Kruse, J.P. et al. (2008) SnapShot: p53 Posttranslational Modifications Cell 133: 930-931に記載されている。本発明の文脈において、p53活性化は、好ましくはp53のリン酸化に起因するものであって、詳細にはアミノ酸、セリン15におけるリン酸化が好ましい。
【０１６５】
このような翻訳後修飾を分析するための方法は、当技術分野で公知である（キナーゼ活性を分析するための方法の例が本明細書に開示されており、さらなる方法としては、例えば、質量分析法および抗体認識に基づく方法が挙げられる）。
【０１６６】
アミノ酸ナンバリング法を規定するために使用することができる、p53のアミノ酸配列の例は、以下のとおりである；
2021529184.tif 000005
【０１６７】
血管拡張性失調症変異（ATM）キナーゼ
血管拡張性失調症変異（ATM）キナーゼ（「血管拡張性失調症変異」としても知られる）は、二本鎖DNA切断に動員され、それによって活性化される、セリン/スレオニンキナーゼである。ATMキナーゼは、DNA損傷チェックポイントの活性化を開始し、細胞周期停止、DNA修復、またはアポトーシスをもたらす多くのタンパク質（p53、CHK2、BRCA1、NBS1およびH2AXを含む）をリン酸化することが知られている。
【０１６８】
一実施形態において、ATMキナーゼはヒトATMキナーゼである。
【０１６９】
一実施形態において、ATMキナーゼのアミノ酸配列は、NCBIアクセッション番号NP_000042.3のもとに寄託された配列である。
【０１７０】
ATMキナーゼのアミノ酸配列の例は、以下のとおりである；
2021529184.tif 000006
2021529184.tif 000007
【０１７１】
ATMキナーゼをコードする核酸配列の例は以下のとおりである；
2021529184.tif 000008
2021529184.tif 000009
2021529184.tif 000010
【０１７２】
血管拡張性失調症およびRad3関連タンパク質（ATR）
血管拡張性失調症およびRad3関連タンパク質（ATR）はセリン/スレオニンプロテインキナーゼATRもしくはFRAP関連タンパク質1（FRP1）としても知られており、DNA損傷センシングに関与するセリン/スレオニン特異的キナーゼである。これは、細胞周期停止をもたらすDNA損傷チェックポイントの活性化に関与しうる。
【０１７３】
一実施形態において、ATRはヒトATRである。
【０１７４】
一実施形態において、ATRのアミノ酸配列は、NCBIアクセッション番号NP_001175.2のもとに寄託された配列である。
【０１７５】
ATRのアミノ酸配列の例は、以下のとおりである；
2021529184.tif 000011
2021529184.tif 000012
【０１７６】
ATRをコードする核酸配列の例は以下のとおりである；
2021529184.tif 000013
2021529184.tif 000014
2021529184.tif 000015
【０１７７】
キナーゼ阻害剤
一態様において、本発明は、造血細胞、造血幹細胞および/または造血前駆細胞遺伝子治療における使用のための、血管拡張性失調症変異（ATM）キナーゼ阻害剤、または血管拡張性失調症およびRad3関連タンパク質（ATR）阻害剤を提供する。
【０１７８】
本発明はまた、ATMキナーゼ阻害剤またはATR阻害剤として作用することができる薬剤を同定する方法、ならびにそうした方法によって同定された薬剤を提供する。
【０１７９】
ATMキナーゼおよびATRの活性は、例えばインビトロでATMキナーゼもしくはATRの酵素活性を分析することによって、直接、分析することができる。
【０１８０】
ATMキナーゼまたはATRを阻害する（例えば、活性を低下させる）候補薬剤の能力は、IC50値の観点から表現することが可能であるが、その値はキナーゼ活性に50％の低下を生じさせるために必要とされる薬剤の濃度である。好ましくは、本発明の阻害剤は、（例えばATMキナーゼまたはATRの）阻害について100μM未満のIC50値を有するが、より好ましくは10μM未満、例えば1μM未満、100 nM未満、または10 nM未満である（例えば、KU-55933のIC50値はATMキナーゼに対して約13 nMである）。
【０１８１】
キナーゼ活性を測定するために、数多くの技術が当技術分野で知られている。好ましくは、キナーゼ活性アッセイは、細胞から単離されたキナーゼ（例えばATMキナーゼまたはATR）に対して行われる。キナーゼは組換え技術によって発現されていてもよく、精製されていることが好ましい。例えば、キナーゼ活性は、［γ-32P］標識ATPから基質への、放射性標識リン酸の取り込みをモニターすることによって測定することができる。このようなアッセイ技術は、例えば、Hastieら（Hastie, C.J. et al. (2006) Nat. Protocols 1: 968-971）に記載されている。
【０１８２】
阻害剤は、ヒトなどの哺乳動物に対して毒性が低いこと、より詳細には、造血幹細胞および/または前駆細胞に対して毒性が低いことが好ましい。
【０１８３】
候補の阻害剤は、本明細書に記載の方法を用いて、細胞生存および/または生着を増加させる能力についてさらに分析することができる。
【０１８４】
好ましくは、阻害剤は一過性の阻害剤である（例えば、持続期間が約1、2、3、4、5、6、7、もしくは14日未満の阻害作用を有する）。
【０１８５】
好ましくは、阻害剤は薬理学的阻害剤である。
【０１８６】
KU-55933
好ましい実施形態において、阻害剤はKU-55933またはその誘導体である。
【０１８７】
KU-55933（CAS No. 587871-26-9）は、選択的、競合的ATMキナーゼ阻害剤であって、以下の構造を有する：
【０１８８】
【化１】
2021529184.tif 000016
【０１８９】
本発明における使用のためのKU-55933溶液は、当技術分野で公知の常法によって調製することができ、例えばKU-55933は、DMSOおよびエタノールに可溶性であることが知られている。
【０１９０】
KU-55933またはその誘導体を造血幹細胞および/または前駆細胞集団に加える濃度は、細胞の生存（例えばインビトロもしくはエクスビボ培養中の）および/または生着を最適化するように、異なるベクター系に適合させることができる。
【０１９１】
本発明は、KU-55933およびKU-55933の誘導体の使用を包含する。本発明のKU-55933誘導体は、造血細胞、造血幹細胞および/または造血前駆細胞、特にウイルスベクターによって形質導入された細胞、の生存（例えばインビトロもしくはエクスビボ培養中の）および/または生着を増加させるものである。
【０１９２】
本発明のKU-55933誘導体は、例えば溶解性の増加、安定性の増加、および/または毒性の低減のために、開発されたものとすることができる。
【０１９３】
本発明のKU-55933誘導体は、哺乳動物、特にヒトに対して低毒性であることが好ましい。本発明のKU-55933誘導体は、造血細胞、造血幹細胞および/または造血前駆細胞に対して低毒性であることが好ましい。
【０１９４】
好適なKU-55933誘導体は、培養中の細胞生存および/または生着を測定するための、当技術分野で公知の方法を用いて同定することができる。そうした方法の例は上記に記載されている。使用する方法は、自動化、および/または、KU-55933誘導体候補のハイスループットスクリーニングに適した方法であることが好ましい。KU-55933誘導体候補は、KU-55933誘導体のライブラリーの一部となっていてもよい。
【０１９５】
追加の阻害剤
本発明に使用することができる、さらなるキナーゼ阻害剤には以下のものが挙げられる：
【０１９６】
KU-60019、これはKU-55933の改良型アナログであり、無細胞アッセイにおいてATMキナーゼについて6.3 nMのIC50を有する。KU-60019は以下の構造を有する：
【０１９７】
【化２】
2021529184.tif 000017
【０１９８】
BEZ235（NVP-BEZ235, Dactolisib）、これはp110α/γ/δ/βおよびmTOR（p70S6K）に対する二重のATP競合的PI3KおよびmTOR阻害剤であって、3T3TopBP1-ER細胞において約21 nMのIC50でATRを阻害する。BEZ235は以下の構造を有する：
【０１９９】
【化３】
2021529184.tif 000018
ウォルトマンニン（Wortmannin）、これは以下の構造を有する：
【０２００】
【化４】
2021529184.tif 000019
CP-466722、これは強力で可逆的なATMキナーゼ阻害剤であるが、ATRには影響を及ぼさない。CP-466722は以下の構造を有する：
【０２０１】
【化５】
2021529184.tif 000020
トリン2（Torin 2）、これはATMキナーゼおよびATRにそれぞれ、28 nMおよび35 nMのEC50値を有する。トリン2（Torin 2）は以下の構造を有する：
【０２０２】
【化６】
2021529184.tif 000021
【０２０３】
CGK 733 (CAS No. 905973-89-9)、これは強力で選択的な、ATMキナーゼおよびATRの阻害剤であって、IC50値は約200 nMである。CGK 733は以下の構造を有する：
【０２０４】
【化７】
2021529184.tif 000022
【０２０５】
KU-559403 (Weber et al. (2015) Pharmacology & Therapeutics 149: 124-138)。KU-559403は以下の構造を有する：
【０２０６】
【化８】
2021529184.tif 000023
AZD6738、これは以下の構造を有する：
【０２０７】
【化９】
2021529184.tif 000024
【０２０８】
KU-55933誘導体について記載されるような特性を有する上記阻害剤の誘導体も、本発明に使用することが可能であって、KU-55933誘導体について記載された方法と類似した方法によって同定することができる。
【０２０９】
好ましい実施形態において、p53阻害剤は、ピフィスリン-α、環状ピフィスリン-α及びピフィスリン-α p-ニトロ又はその誘導体であり得る。ピフィスリン-αは以下の構造を有する：
【０２１０】
【化１０】
2021529184.tif 000025
【０２１１】
siRNA、shRNA、miRNAおよびアンチセンスDNA/RNA
阻害（例えばキナーゼの阻害）は、転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）を用いて達成することができる。二本鎖RNA（dsRNA）に媒介される転写後遺伝子サイレンシングは、外来遺伝子の発現を制御するための保存された細胞防御機構である。トランスポゾンやウイルスなどのエレメントのランダムな組み込みは、相同な一本鎖mRNAまたはウイルスゲノムRNAの配列特異的分解を活性化するdsRNAの発現を引き起こすと考えられる。サイレンシング効果は、RNA干渉（RNAi）として知られている（Ralph et al. (2005) Nat. Medicine 11: 429-433）。RNAiのメカニズムは、長いdsRNAの、約21〜25ヌクレオチド(nt)RNAの二本鎖へのプロセシングを含む。これらの生成物は、mRNA分解の配列特異的媒介物である、低分子干渉またはサイレンシングRNA（siRNA）と呼ばれる。分化した哺乳動物細胞において、dsRNA>30 bpは、タンパク質合成のシャットダウンおよび非特異的mRNA分解をもたらすインターフェロン応答を活性化することが判明した（Stark et al. (1998) Ann. Rev. Biochem. 67: 227-64）。しかしながら、21nt siRNA二本鎖を用いることによってこの応答を回避することが可能であり（Elbashir et al. (2001) EMBO J. 20: 6877-88; Hutvagner et al. (2001) Science 293: 834-8）、培養された哺乳動物細胞において遺伝子機能を分析することを可能にする。
【０２１２】
shRNAは小ループ配列によって隔てられた短い逆方向RNA反復配列からなる。これらは、細胞機構によって19〜22nt siRNAに迅速にプロセシングされ、それによって標的遺伝子発現が抑制される。
【０２１３】
マイクロRNA（miRNA）は、標的mRNAの3’非翻訳領域（UTR）に結合することによって、その標的mRNAの翻訳を効果的に低下させることができる、低分子（22〜25ヌクレオチドの長さの）非コードRNAである。マイクロRNAは、生物において天然に生産される、非常に大きな一群の低分子RNAであって、少なくともその一部は標的遺伝子の発現を制御する。マイクロRNAファミリーの最初のメンバーはlet-7およびlin-4である。let-7遺伝子は、線虫の発生の際に内在性のタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御する、高度に保存された低分子RNA種をコードする。活性のあるRNA種は、はじめに〜70nt前駆体として転写され、それが転写後にプロセシングされて成熟〜21nt型となる。let-7もlin-4もヘアピンRNA前駆体として転写され、それらはダイサー酵素によってその成熟型へとプロセシングされる。
【０２１４】
アンチセンスという概念は、細胞において、低分子の、場合によっては改変された、DNAもしくはRNA分子をメッセンジャーRNAに選択的に結合させて、コードされたタンパク質の合成を妨げることである。
【０２１５】
標的タンパク質の発現を調節するためのsiRNA、shRNA、miRNAおよびアンチセンスDNA/RNAをデザインする方法、ならびにこれらの物質を目的の細胞に送達するための方法は、当技術分野で周知である。
【０２１６】
p53ドミナントネガティブペプチド
好ましい実施形態において、p53活性化の阻害剤は変異型p53ペプチドである。
好ましい実施形態において、P53活性化の阻害剤は、ドミナントネガティブペプチド（例えばドミナントネガティブp53ペプチド）である。
【０２１７】
好適には、ドミナントネガティブペプチドは、ホモ-オリゴマー形成ドメイン（homo-oligomerisation domain）中に変異を含み得る。好適には、ホモ-オリゴマー形成ドメイン中に変異を含むドミナントネガティブペプチドは、野生型p53と二量体形成して、野生型p53が転写を活性化することを防止し得る。
【０２１８】
好ましい実施形態において、ドミナントネガティブペプチドは、GSE56またはそのバリアントである。
【０２１９】
一実施形態において、GSE56のmRNA翻訳のためのヌクレオチド配列は、配列番号8に示される。
2021529184.tif 000026
2021529184.tif 000027
【０２２０】
一実施形態において、GSE56のアミノ酸配列は、配列番号9に示される。
2021529184.tif 000028
【０２２１】
好適には、p53活性化の阻害剤は、GSE56をコードするヌクレオチド配列であり得る。好適には、p53活性化の阻害剤は、GSE56をコードするアミノ酸配列であり得る。好適には、p53活性化の阻害剤は、GSE56 mRNAであり得る。
【０２２２】
アデノウイルスタンパク質
アデノウイルスは、AAV感染の天然のコヘルパーであり、AAV感染を最適化する遺伝子のセット：E1a、E1b、E2a及びE4を提供する。
【０２２３】
本発明者等は、遺伝子編集の間にアデノウイルスタンパク質を送達することが、HSCにおけるHDRの効率を改善し、HSCの長期の再増殖活性を増大することを実証した。理論に拘束されることを望むものではないが、アデノウイルスタンパク質は、遺伝子編集の間のAAV感染に対するヘルパー機能を提供し得る。アデノウイルスタンパク質は、p53経路に対して直接的または間接的に作用し得る。
【０２２４】
一実施形態において、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤は、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含む。アデノウイルスタンパク質は特定のアデノウイルス血清型に限定されない。例えば、一実施形態において、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、血清型4のアデノウイルス、血清型5のアデノウイルス、血清型7のアデノウイルス、および／または血清型9のアデノウイルス由来である。
【０２２５】
一実施形態において、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、E1a、E1b、E2aおよびE4を含む群から選択される。
好ましい実施形態において、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、E4遺伝子のオープンリーディングフレームである。
好ましい実施形態において、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、E4orf1またはそのバリアントである。
【０２２６】
Ad5-E4orf1をコードするヌクレオチド配列の例は、配列番号10に示される。好適には、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、配列番号10に示されるmRNA翻訳のためのヌクレオチド配列またはそのバリアントを含み得る。
2021529184.tif 000029
【０２２７】
Ad5-E4orf1のアミノ酸配列の例は、配列番号1に示される。好適には、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、配列番号1に示されるアミノ酸配列、またはそのバリアントを含み得る。
2021529184.tif 000030
【０２２８】
E4orf1のアミノ酸配列の他の例は、配列番号57〜配列番号76に示される。好適には、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、配列番号57〜配列番号76に示すアミノ酸配列、またはそのバリアントを含み得る。
【０２２９】
2021529184.tif 000031
2021529184.tif 000032
【０２３０】
好ましい実施形態において、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、E4orf6/7またはそのバリアントである。
【０２３１】
Ad5-E4orf6/7をコードするヌクレオチド配列の例は、配列番号11に示す。好適には、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、配列番号11に示すmRNA翻訳のためのヌクレオチド配列、またはそのバリアントを含み得る。
2021529184.tif 000033
【０２３２】
Ad5-E4orf6/7のアミノ酸配列の例は、配列番号2に示す。好適には、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、配列番号2に示すアミノ酸配列、またはそのバリアントを含み得る。
2021529184.tif 000034
【０２３３】
E4orf6/7のアミノ酸配列の他の例は、配列番号77〜配列番号107に示す。好適には、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、配列番号77〜配列番号107に示すアミノ酸配列、またはそのバリアントを含み得る。
【０２３４】
2021529184.tif 000035
2021529184.tif 000036
2021529184.tif 000037
【０２３５】
本明細書に記載する配列番号のバリアント配列は、参照配列の配列番号に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％または99％の配列同一性を有し得る。好ましくは、バリアント配列は、参照配列の1以上の機能を保持する（すなわち機能的バリアントである）。
【０２３６】
バリアント配列は、1以上の保存的置換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づいて行い得る。例えば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ、そして類似した親水性の値を有する非荷電の極性基を持つアミノ酸にはロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。
【０２３７】
保存的置換は、例えば以下の表に従って行い得る。第2列で同じブロック中のアミノ酸、および好ましくは第3列で同じ行にあるアミノ酸は、互いに置換することができる。
【０２３８】
2021529184.tif 000038
【０２３９】
本発明はまた、相同置換（置換(substitution)および置き換え(replacement)は本明細書において共に存在しているアミノ酸残基を別の残基と交換することを意味する）バリアント、すなわち塩基性と塩基性、酸性と酸性、極性と極性等の同種の置換を包含する。
具体的な個々のアミノ酸に対する言及によって本明細書においてそうでないことが明確に記載されていない限り、アミノ酸は、以下に記載するような保存的置換を用いて置換され得る。
【０２４０】
脂肪族の非極性アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、イソロイシン、ロイシンまたはバリン残基であり得る。
脂肪族の極性非荷電アミノ酸は、システイン、セリン、スレオニン、メチオニン、アスパラギン、またはグルタミン残基であり得る。
【０２４１】
脂肪族の極性荷電アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン残基であり得る。
芳香族アミノ酸は、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシン残基であり得る。
好適には、保存的置換は、上記の表の同じ行のアミノ酸の間でなされ得る。
【０２４２】
E4orf6をコードするヌクレオチド配列の例は、配列番号12に示される。
2021529184.tif 000039
【０２４３】
E4orf6のアミノ酸配列の例は、配列番号13に示される。
2021529184.tif 000040
【０２４４】
E1B55Kをコードするヌクレオチド配列の例は、配列番号14に示される。
2021529184.tif 000041
【０２４５】
E1B55Kのアミノ酸配列の例は、配列番号15に示される。
2021529184.tif 000042
【０２４６】
一実施形態において、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、E4orf6ではない。一実施形態において、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、E1B55Kではない。一実施形態において、少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質は、E4orf6またはE1B55Kを含まない。
【０２４７】
造血幹細胞および前駆細胞
【０２４８】
幹細胞は多くの細胞種に分化することができる。総ての細胞種に分化することができる細胞は全能性として知られる。哺乳動物では、接合子と初期胚細胞だけが全能性である。幹細胞は、総てではないとしてもほとんどの多細胞生物に見られる。幹細胞は、有糸細胞分裂によりそれ自身を再生しかつ多様な範囲の特殊化した細胞種に分化する能力を特徴とする。哺乳動物幹細胞の２つの幅広いタイプとして、胚盤胞の内部細胞塊から単離される胚性幹細胞と成体組織に見られる成体幹細胞がある。発生中の胚で、幹細胞は特殊化した胚組織の総てに分化することができる。成体生物では、幹細胞および前駆細胞は身体の修復系として働き、特殊化した細胞を補充するだけでなく、血液、皮膚または腸管組織などの再生器官の通常のターンオーバーを維持する。
【０２４９】
造血幹細胞（HSC）は、例えば、末梢血、骨髄および臍帯血に見出すことができる多能性幹細胞である。HSCは自己再生能およびいずれの血液細胞系列へも分化する能力を持つ。HSCは、全免疫系、ならびに総ての造血組織（例えば、骨髄、脾臓および胸腺）の赤血球および骨髄系列に再定着することができる。HSCは、総ての造血細胞系列の生涯に渡る生産を提供する。
【０２５０】
造血前駆細胞は、特定タイプの細胞に分化する能力を有する。しかしながら、幹細胞とは対照的に、造血前駆細胞はすでにかなり特異的であり、それらの「ターゲット」細胞への分化を課せられている。幹細胞と前駆細胞の違いは、幹細胞は無制限に増殖できるが、前駆細胞は限られた回数しか分裂できないことである。造血前駆細胞は、機能的インビボアッセイ（すなわち、移植および長期間総ての血液系列を生じ得るかどうかの実証）によってのみＨＳＣから厳密に区別することができる。
【０２５１】
本発明の造血幹細胞及び前駆細胞は、CD34細胞表面マーカーを含む（CD34+と表記される）。
一実施形態において、本発明における使用のための細胞は、HSPCである。
【０２５２】
一実施形態において、本発明における使用のための細胞は、原始的HSPCである。一実施形態において、HSPCの原始的サブセットは、CD90+であるHSCの集団をいう。一実施形態において、HSPCの原始的サブセットは、CD34+ CD133+およびCD90+である細胞の集団をいう。
一実施形態において、本発明における使用のための細胞は、HSCである。
【０２５３】
造血幹細胞及び／又は前駆細胞（HSPC）供給源
造血幹細胞及び／又は前駆細胞の集団は組織サンプルより取得しうる。
【０２５４】
例えば、造血幹細胞及び／又は前駆細胞の集団は末梢血（例えば成体及び胎児末梢血）、臍帯血、骨髄、肝臓又は脾臓より取得し得る。好ましくはこれらの細胞は末梢血又は骨髄より取得される。これらの細胞は、増殖因子処理の手段により細胞をインビボで動員した後に取得されうる。
【０２５５】
動員は、例えば、G-CSF、プレリキサフォルまたはそれらの組合せを用いて行ってもよい。NSAID、およびジペプチジルペプチダーゼ阻害剤などの他の薬剤も動員剤として有用でありうる。
【０２５６】
幹細胞増殖因子GM-CSFおよびG-CSFが利用可能であるので、ほとんどの造血幹細胞移植法は、今や、骨髄からではなく末梢血から採取された幹細胞を用いて行われる。末梢血幹細胞を採取することでより多量の移植対象物が得られ、ドナーが移植対象物を採取するために全身麻酔を受ける必要はなく、生着時間が短縮され、長期再発率は低くなりうる。
【０２５７】
骨髄は、標準的吸引法（定常状態もしくは動員後）により、または次世代採取ツール（例えば、Marrow Miner）により採取してもよい。
【０２５８】
加えて、造血幹細胞及び前駆細胞はまた、人工多能性幹細胞に由来してもよい。
【０２５９】
HSCの特徴
HSCは一般に、フローサイトメトリー法により低前方散乱および側方散乱プロファイルである。ミトコンドリア活性の判定を可能とするローダミン標識により示されるように、代謝が静止状態であるものもある。HSCは、CD34、CD45、CD133、CD90およびCD49fなどの特定の細胞表面マーカーを含みうる。HSCは、CD38およびCD45RA細胞表面マーカーの発現を欠く細胞としても定義できる。しかしながら、これらのマーカーのいくつかの発現は、HSCの発生段階および組織特異的コンテキストに依存する。「サイドポピュレーション細胞」と呼ばれる一部のHSCは、フローサイトメトリーにより検出した場合、Hoechst 33342色素を排除する。従って、HSCは、それらの同定および単離を可能とする分類的特性を有する。
【０２６０】
陰性マーカー
CD38は、ヒトHSCの最も確立された有用な単一の陰性マーカーである。
【０２６１】
ヒトHSCはまた、CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD2０、CD24、CD36、CD56、CD66b、CD271およびCD45RAなどの細胞系列マーカーについても陰性でありうる。しかしながら、これらのマーカーは、HSC富化のためには、組み合わせて使用しなければならない場合がある。
【０２６２】
「陰性マーカー」とは、ヒトHSCがこれらのマーカーの発現を欠くことをいうと理解されるべきである。
【０２６３】
陽性マーカー
CD34およびCD133は、HSCの最も有用な陽性マーカーである。
【０２６４】
一部のHSCはまた、CD90、CD49fおよびCD93などの細胞系列マーカーについても陽性である。しかしながら、これらのマーカーは、HSC富化のためには、組み合わせて使用しなければならない場合がある。
【０２６５】
「陽性マーカー」とは、ヒトHSCがこれらのマーカーを発現することをいうと理解されるべきである。
一実施形態において、造血幹細胞および前駆細胞は、CD34+ CD38-細胞である。
【０２６６】
分化細胞
分化細胞は、幹細胞または前駆細胞と比較して、より特殊化された細胞である。分化は、生物が一個の接合体から複雑な組織および細胞型の系に変化するにつれて、多細胞生物の発生の間に生じる。分化は、成体においても一般的なプロセスである：成体幹細胞は、組織修復時、および正常な細胞ターンオーバーの際に、分裂して完全に分化した娘細胞を生成する。分化は、細胞の大きさ、形状、膜電位、代謝活性およびシグナルに対する応答性を劇的に変化させる。これらの変化は主に、遺伝子発現における高度に制御された修飾によるものである。すなわち、分化細胞は、発生プロセスに起因する、特定の構造を有し特定の機能を果たす細胞であって、それには特定の遺伝子の活性化および不活性化が関わる。ここで、分化細胞は、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞、T細胞、B細胞、およびNK細胞などの、造血系列の分化細胞を含む。例えば、造血系列の分化細胞は、未分化細胞表面では発現されていないか、または発現が少ない細胞表面分子の検出によって、幹細胞および前駆細胞から区別することができる。適当なヒト細胞系列マーカーの例には、CD33、CD13、CD14、CD15 (骨髄性)、CD19、CD20、CD22、CD79a (B)、CD36、CD71、CD235a (赤血球)、CD2、CD3、CD4、CD8 (T)、CD56 (NK)が挙げられる。
一実施形態において、本明細書でいう造血細胞は、T細胞である。
【０２６７】
細胞集団の単離および濃縮
細胞の「単離された集団」との用語は、本明細書において使用する場合、身体からあらかじめ取り出された細胞集団を意味し得る。単離された細胞集団をエクスビボまたはインビトロで、当技術分野で公知の標準技術を用いて培養し、操作することができる。単離された細胞集団は、のちに被験体に再導入してもよい。前記被験体は、細胞が最初に単離された同一の被験体であってもよいし、異なる被験体であってもよい。
【０２６８】
細胞集団は、特定の表現型もしくは特性を示す細胞に対して選択的に、その表現型もしくは特性を示さないか、または示す程度が低い、他の細胞から精製することができる。例えば、特定のマーカー（CD34など）を発現する細胞集団を、出発細胞集団から精製することができる。その代わりに、またはそれに加えて、別のマーカー（CD38など）を発現しない細胞集団を精製することもできる。
【０２６９】
ある特定の細胞型について細胞集団を「濃縮（富化）」するとは、その集団内でその細胞型の濃度を増加させることと理解されるべきである。他の細胞型の濃度はそれに付随して低下しうる。
【０２７０】
精製または濃縮（富化）は、他の細胞型のないほぼ純粋な細胞集団をもたらしうる。
【０２７１】
特異的マーカー（例えば、CD34もしくはCD38）を発現する細胞集団に対する精製もしくは濃縮（富化）は、そのマーカーに結合する薬剤、好ましくはそのマーカーに実質的に特異的に結合する薬剤を使用することによって達成することができる。
【０２７２】
細胞マーカーに結合する薬剤は、抗体、例えば抗CD34または抗CD38抗体であってもよい。
【０２７３】
「抗体」という用語は、選択された標的と結合できる完全抗体または抗体フラグメントを意味し、Fv、ScFv、F(ab')およびF(ab')2、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、キメラ抗体、CDRグラフト抗体およびヒト化抗体を含む操作抗体、ならびにファージディスプレーまたは別の技術を用いて産生された人為的に選択した抗体が含まれる。
【０２７４】
加えて、古典的抗体の代替物、例えば、「アビボディ」、「アビマー」、「アンチカリン」、「ナノボディ」および「DARPins」も本発明において使用可能である。
【０２７５】
特異的マーカーに結合する薬剤は、当技術分野で公知の多数の技術のいずれかを用いて同定可能となるように標識することができる。薬剤は、固有に標識されてもよく、またはそれに標識をコンジュゲートすることによって修飾されてもよい。「コンジュゲート」により、薬剤と標識が機能するように連結されることが理解されるべきである。これは、薬剤と標識が両方とも実質的に障害なくそれらの機能（例えば、マーカーに結合する、蛍光同定を可能にする、または磁場に置いた場合に分離可能にする）を遂行できるように相互に連結されることを意味する。コンジュゲーションの好適な方法は当技術分野で周知であり、当業者によって容易に特定可能であろう。
【０２７６】
標識は、例えば、それが結合されている標識薬剤および任意の細胞をその環境から精製（例えば、薬剤は磁性ビーズ、またはアビジンなどの親和性タグで標識できる）、検出またはその両方を可能とすることができる。標識として使用するのに好適な検出可能マーカーとしては、フルオロフォア（例えば、緑色、チェリー、シアンおよびオレンジ蛍光タンパク質）およびペプチドタグ（例えば、Hisタグ、Mycタグ、FLAGタグおよびHAタグ）が含まれる。
【０２７７】
特異的マーカーを発現する細胞集団を分離するための多数の技術が当技術分野で公知である。これらには、磁性ビーズに基づく分離技術（例えば、閉回路磁性ビーズに基づく分離）、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（FACS）、親和性タグ精製（例えば、アフィニティーカラムまたはビーズ、例えば、アビジン標識薬剤を分離するためのビオチンカラム）および顕微鏡に基づく技術が含まれる。
【０２７８】
異なる技術の組合せ、例えば、磁性ビーズに基づく分離工程とその後の得られた細胞集団の、フローサイトメトリーによる１以上の付加的（陽性または陰性）マーカーに関する選別を用いて分離を行うこともできる。
【０２７９】
臨床グレードの分離は例えば、CliniMACS（登録商標）システム（Miltenyi）を用いて行うことができる。これは閉回路磁性ビーズに基づく分離技術の一例である。
【０２８０】
色素排除特性（例えば、サイドポピュレーションまたはローダミン標識）または酵素活性（例えば、ALDH活性）が造血幹細胞の富化のために使用可能であることも想定される。
好適には、薬剤は、未処理の遺伝子編集された細胞の集団と比較して、遺伝子編集された細胞の集団内のCD34+ CD133+ CD90+細胞画分を減少させない。
【０２８１】
遺伝子編集
用語「遺伝子編集」は、核酸が細胞において挿入されるか、欠失させられるか、又は置き換えられるタイプの遺伝子操作を指す。遺伝子編集は、工学操作ヌクレアーゼを使用して達成することができ、ポリヌクレオチド(例えばゲノム)の所望の部位を標的にすることができる。そのようなヌクレアーゼは、所望の位置で部位特異的二本鎖切断を生成することができ、それは、次いで非相同末端結合(NHEJ)又は相同組換え(HR)を通して修復され、標的化突然変異をもたらすことができる。
【０２８２】
そのようなヌクレアーゼは、ウイルスベクターを使用して標的細胞に送達することができる。本発明は、遺伝子編集プロセスの効率を増大させる方法を提供する。
【０２８３】
当技術分野で公知である好適なヌクレアーゼの例には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、及びクラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドローム反復配列(CRISPR)/Casシステムが含まれる(Gaj, T. et al. (2013) Trends Biotechnol. 31: 397-405; Sander, J.D. et al. (2014) Nat. Biotechnol. 32: 347-55)。
【０２８４】
遺伝子編集のための好適なヌクレアーゼとして、メガヌクレアーゼ(Silve, G. et al. (2011) Cur. Gene Ther. 11: 11-27)を用いることもできる。
【０２８５】
CRISPR/Casシステムは、RNA誘導型DNA結合システム(van der Oost et al. (2014) Nat. Rev. Microbiol. 12: 479-92)であり、ここでは、ガイドRNA(gRNA)は、Cas9ドメインが特定の配列を標的にすることができるように選択することができる。gRNAの設計の方法は、当技術分野で公知である。さらに、異なるエフェクタードメインに細胞の所望のゲノム部位を同時に及び方向的に標的化させるために、完全に直交性の（orthogonal）Cas9タンパク質、並びに異なるタンパク質に結合するためのCas9/gRNAリボ核タンパク質複合体及びgRNA構造/組成の改変が、近年開発されており(Esvelt et al. (2013) Nat. Methods 10: 1116-21; Zetsche, B. et al. (2015) Cell pii: S0092-8674(15)01200-3; Dahlman, J.E. et al. (2015) Nat. Biotechnol. 2015 Oct 5. doi: 10.1038/nbt.3390. [Epub ahead of print]; Zalatan, J.G. et al. (2015) Cell 160: 339-50; Paix, A. et al. (2015) Genetics 201: 47-54)、本発明で使用するのに好適である。
【０２８６】
ベクター
ベクターは、1つの環境から別の環境への実体の移入を可能にするか又は促進するツールである。本発明における造血幹細胞及び/又は前駆体細胞を形質導入するために使用されるベクターは、ウイルスベクターである。
【０２８７】
好ましくは、ウイルスベクターは、ウイルスベクター粒子の形態である。
【０２８８】
ウイルスベクターは、例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、レトロウイルス又はレンチウイルスのベクターであってよい。好ましくは、ウイルスベクターは、AAVベクター又はレトロウイルス若しくはレンチウイルスベクターであり、より好ましくはAAVベクターである。好ましくは、レトロウイルスベクターは、γ-レトロウイルスベクターでない。
【０２８９】
ある特定のタイプのウイルス「由来のベクター」は、そのベクターが、そのタイプのウイルスから誘導可能である少なくとも1つの構成部分を含むと理解すべきである。
【０２９０】
アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、それが高い頻度の組入れを有し、非分裂細胞に感染することができるので、本発明で使用するための魅力的なベクターシステムである。このことは、組織培養中の哺乳動物細胞への遺伝子の送達のためにそれを有用にする。
【０２９１】
AAVは、広い宿主範囲で感染性を有する。AAVベクターの作製及び使用に関する詳細は、米国特許第5,139,941号及び米国特許第4,797,368号に記載される。
【０２９２】
マーカー遺伝子及びヒト疾患に関与する遺伝子のin vitro及びin vivo形質導入のために組換えAAVベクターが使用され、成功している。
【０２９３】
好ましいベクターは、ヒト初代細胞、例えばHSPC細胞において高い形質導入効率を達成することができるものである。
【０２９４】
一実施形態では、ベクターは、AAV6ベクター又はAAV6ベクター由来のベクターである。好ましくは、ベクターはAAV6ベクターである。
【０２９５】
アデノウイルスベクター
アデノウイルスは、RNA中間体を経ない、二本鎖の線状DNAウイルスである。遺伝子配列の相同性に基づいて6つのサブグループに分類される、アデノウイルスの50を超える異なるヒト血清型がある。アデノウイルスの天然の標的は呼吸器及び胃腸の上皮であり、一般的に軽度の症状だけをもたらす。血清型2及び5(95%配列相同性を有する)がアデノウイルスベクターシステムにおいて最も一般的に使用され、これらは通常は若者の上気道感染に関連する。
【０２９６】
アデノウイルスは、遺伝子治療のための、及び異種遺伝子の発現のためのベクターとして使用されている。大きな(36kb)ゲノムは最高8kbの外来の挿入DNAを収容することができ、相補細胞系において効率的に複製して、最高1012の非常に高い力価を生成することができる。したがって、アデノウイルスは、一次複製不能細胞において遺伝子の発現を研究するための最良のシステムの1つである。
【０２９７】
アデノウイルスゲノムからのウイルス又は外来遺伝子の発現は、複製細胞を必要としない。アデノウイルスベクターは、受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞に入る。細胞の中に入ると、アデノウイルスベクターは宿主染色体に稀にしか組み入れられない。代わりに、それらは(宿主ゲノムから独立して)宿主核中の線状ゲノムのようにエピソーム的に機能する。したがって、組換えアデノウイルスの使用は、宿主ゲノムへのランダムな組入れに関連した問題を軽減する。
【０２９８】
レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター
レトロウイルスベクターは、任意の好適なレトロウイルスに由来してもよく、または由来しうる。多数の異なるレトロウイルスが同定されている。例として、マウス白血病ウイルス（MLV）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV）、マウス乳癌ウイルス（MMTV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、藤浪肉腫ウイルス（FuSV）、モロニーマウス白血病ウイルス（Mo-MLV）、FBRマウス骨肉腫ウイルス（FBR MSV）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Mo-MSV）、エーベルソンマウス白血病ウイルス（A-MLV）、トリ骨髄芽球腫症ウイルス-29（MC29）およびトリ赤芽球症ウイルス（AEV）が挙げられる。レトロウイルスの詳細なリストはCoffin, J.M. et al. (1997) Retroviruses, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 758-63に見出しうる。
【０２９９】
レトロウイルスは、「単純」および「複雑」の２つのカテゴリーに大別することができる。レトロウイルスは７群にさらに分けうる。これらの群のうち５つが、発癌能を有するレトロウイルスに相当する。残りの２群はレンチウイルスおよびスプーマウイルスである。これらのレトロウイルスの総説はCoffin, J.M. et al. (1997) Retroviruses, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 758-63に示されている。
【０３００】
レトロウイルスおよびレンチウイルスのゲノムの基本構造は、5’ LTRおよび3’ LTRなどの多くの共通の特徴を共有する。これらの間または内部に、ゲノムのパッケージングを可能とするパッケージングシグナル、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノムへの組み込みを可能とする組み込み部位、ならびにパッケージング成分をコードするgag、polおよびenv遺伝子が配置されており、これらはウイルス粒子の構築に必要なポリペプチドである。レンチウイルスは、核から感染した標的細胞の細胞質へ、組み込まれたプロウイルスのRNA転写産物の効率的輸送を可能とする、HIVにおけるrevおよびRRE配列などの付加的特徴を備える。
【０３０１】
プロウイルスでは、これらの遺伝子の両末端には長い末端反復配列（LTR）と呼ばれる領域が隣接している。LTRはプロウイルスの組み込みおよび転写を担う。LTRはまたエンハンサー−プロモーター配列としても働き、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。
【０３０２】
LTRはそれら自体、３つの要素である、U3、RおよびU5に分けることができる同一の配列である。U3は、RNAの3’末端にユニークな配列に由来する。Rは、RNAの両末端で繰り返される配列に由来し、U5は、RNAの5’末端にユニークな配列に由来する。これら３つの要素の大きさは、異なるレトロウイルス間でかなりの変動がありうる。
【０３０３】
欠損型レトロウイルスベクターゲノムでは、gag、polおよびenvは存在しない、または機能がない場合がある。
【０３０４】
典型的なレトロウイルスベクターでは、複製に不可欠な１以上のタンパク質コード領域の少なくとも一部をウイルスから除去することができる。これにより、ウイルスベクターは複製欠損となる。また、標的宿主細胞の形質導入および／またはそのゲノムの宿主ゲノムへの組み込みが可能な候補調節部分を含んでなるベクターを作出するために、ベクターゲノム内の調節制御領域およびレポーター部分と作動可能に連結された候補調節部分をコードするライブラリーでウイルスゲノムの一部を置換してもよい。
【０３０５】
レンチウイルスベクターは、より大きなレトロウイルスベクター群の一部である。レンチウイルスの詳細なリストは、Coffin, J.M. et al. (1997) Retroviruses, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 758-63に見出すことができる。要するに、レンチウイルスは、霊長類群および非霊長類群に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例としては、限定されるものではないが、ヒト後天性免疫不全症候群（AIDS）の病原体であるヒト免疫不全ウイルス（HIV）、およびサル免疫不全ウイルス（SIV）が挙げられる。非霊長類レンチウイルスの例としては、プロトタイプ「スローウイルス」  ビスナ／マエディウイルス（VMV）、ならびに関連のヤギ関節炎脳脊髄炎ウイルス（CAEV）、ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）およびより最近記載されたネコ免疫不全ウイルス（FIV）およびウシ免疫不全ウイルス（BIV）が挙げられる。
【０３０６】
レンチウイルスファミリーは、レンチウイルスは分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染能を持つという点でレトロウイルスとは異なる(Lewis, P et al. (1992) EMBO J. 11: 3053-8; Lewis, P.F. et al. (1994) J. Virol. 68: 510-6)。対照的に、MLVなどの他のレトロウイルスは、例えば、筋肉、脳、肺および肝臓組織を構成するものなどの非分裂細胞または分裂の遅い細胞には感染できない。
【０３０７】
レンチウイルスベクターは、本明細書で使用する場合、レンチウイルスに由来しうる少なくとも１つの構成成分を含んでなるベクターである。好ましくは、その構成成分は、ベクターが細胞に感染し、遺伝子を発現するかまたは複製される生物学的機構に関与する。
【０３０８】
レンチウイルスベクターは、「霊長類」ベクターであってもよい。レンチウイルスベクターは、「非霊長類」ベクターであってもよい（すなわち、主として霊長類、特にヒトには感染しないウイルスに由来する）。非霊長類レンチウイルスの例は、天然では霊長類には感染しないレンチウイルス科の任意のメンバーであってもよい。
【０３０９】
レンチウイルスベースのベクターの例として、HIV-1およびHIV-2ベースのベクターを以下に記載する。
【０３１０】
HIV-1ベクターは、単純レトロウイルスにも見出されるシス作用エレメントを含有する。gagオープンリーディングフレーム内に延びる配列は、HIV-1のパッケージングに重要であることが示されている。したがって、HIV-1ベクターは、翻訳開始コドンが変異したgagの関連部分を含むことが多い。さらに、ほとんどのHIV-1ベクターは、RREを含むenv遺伝子の一部も含む。RevはRREに結合し、これにより、核から細胞質への、全長mRNAまたは一回スプライシングされたmRNAの輸送が可能になる。Revおよび/またはRREの非存在下では、全長HIV-1 RNAが核内に蓄積する。あるいはまた、Mason-Pfizerサルウイルスなどのある種の単純レトロウイルス由来の恒常的輸送エレメントを使用して、RevおよびRREの必要性をなくすことができる。HIV-1 LTRプロモーターからの効率的な転写は、ウイルスタンパク質Tatを必要とする。
【０３１１】
ほとんどのHIV-2ベースのベクターは、構造的にHIV-1ベクターと非常に類似している。HIV-1ベースのベクターと同様に、HIV-2ベクターも全長ウイルスRNAまたは1回スプライシングされたウイルスRNAの効率的な輸送にRREを必要とする。
【０３１２】
1つの系において、ベクターおよびヘルパー構築物が2つの異なるウイルスに由来していると、ヌクレオチド相同性の低下が、組換えの確率を減少させる可能性がある。霊長類レンチウイルスに基づくベクターに加えて、FIVに基づくベクターも、病原性HIV-1ゲノム由来のベクターに代わるものとして開発されている。こうしたベクターの構造もHIV-1ベースのベクターと同様である。
【０３１３】
好ましくは、本発明で使用されるウイルスベクターは、最小のウイルスゲノムを有する。
【０３１４】
「最小ウイルスゲノム」とは、標的宿主細胞に感染し、形質導入し、対象とするヌクレオチド配列を送達するために必要とされる機能を提供するために、非必須要素を除去し、必須要素を保持するようにウイルスベクターが操作されていることを意味すると理解されるべきである。この戦略のさらなる詳細はWO1998/017815に見出すことができる。
【０３１５】
好ましくは、宿主細胞／パッケージング細胞内でウイルスゲノムを産生するために用いられるプラスミドベクターは、パッケージング成分の存在下で、標的細胞に感染することができるウイルス粒子へのRNAゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なレンチウイルス遺伝情報を有するが、最終的な標的細胞内で感染性ウイルス粒子を産生するための独立した複製は不可能である。好ましくは、ベクターは機能的なgag-polおよび／またはenv遺伝子および／または複製に必須の他の遺伝子を欠いている。
【０３１６】
しかしながら、宿主細胞／パッケージング細胞内でウイルスゲノムを産生するために使用されるプラスミドベクターは、宿主細胞／パッケージング細胞内でゲノムの転写を指示するために、レンチウイルスゲノムに作動可能に連結された転写調節制御配列も含む。これらの調節配列は、転写されたウイルス配列と会合している天然配列（すなわち、5’ U3領域）であってもよく、またはそれらは別のウイルスプロモーター（例えば、CMVプロモーター）などの異種プロモーターであってもよい。
【０３１７】
ベクターは、ウイルスエンハンサーおよびプロモーター配列が欠失されている自己不活化型（SIN）ベクターであってもよい。SINベクターは、野生型ベクターと同等の有効性でインビボにて生成され、非分裂細胞に形質導入することができる。SINプロウイルスにおける長い末端反復配列（LTR）の転写不活性化は、複製可能ウイルスによる動員を回避するべきである。これはまた、LTRのシス作用効果を排除することにより内部プロモーターからの遺伝子の発現調節を可能とするべきである。
【０３１８】
ベクターは組込み欠損であってもよい。組込み欠損レンチウイルスベクター（IDLV）は、例えば、触媒的に不活性なインテグラーゼ（例えば触媒部位にD64V突然を有するHIVインテグラーゼなど； Naldini, L. et al. (1996) Science 272: 263-7; Naldini, L. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11382-8; Leavitt, A.D. et al. (1996) J. Virol. 70: 721-8）を用いてベクターをパッケージングすることによって、またはベクターLTRから必須att配列を改変または欠失させることにより（Nightingale, S.J. et al. (2006) Mol. Ther. 13: 1121-32）、またはこれら上記の組み合わせによって、製造できる。
【０３１９】
一実施形態において、遺伝子編集は、造血幹細胞および／または前駆細胞遺伝子座を標的とする。一実施形態において、ドナー鋳型は、造血幹細胞および／または前駆細胞遺伝子座を標的とする。
【０３２０】
一実施形態において、アデノ随伴ウイルスの組み込み部位1（AAVS1）遺伝子座を標的とする。一実施形態において、ドナー鋳型はアデノ随伴ウイルスの組み込み部位1（AAVS1）遺伝子座を標的とする。
【０３２１】
AAVS1のためのAAVドナーカセットの例は、以下のヌクレオチド配列を含み得る：
2021529184.tif 000043
2021529184.tif 000044
【０３２２】
別の実施形態において、遺伝子編集は、インターロイキン2受容体サブユニットγ（IL2RG）を標的とし、好ましくはIL2RGのイントロン1を標的とする。別の実施形態において、ドナー鋳型はインターロイキン2受容体サブユニットγ（IL2RG）を標的とし、好ましくはIL2RGのイントロン1を標的とする。
【０３２３】
IL2RGのためのAAVドナーカセットの例は、以下のヌクレオチド配列を含み得る：
2021529184.tif 000045
2021529184.tif 000046
2021529184.tif 000047
【０３２４】
別の実施形態において、遺伝子編集は、CD40Lを標的とする。別の実施形態において、ドナー鋳型はCD40Lを標的とする。
別の実施形態において、遺伝子編集は、RAG-1を標的とする。別の実施形態において、ドナー鋳型はRAG-1を標的とする。
【０３２５】
対象のヌクレオチド
本発明において使用するベクターは、好ましくは1以上の対象のヌクレオチドを含む。
【０３２６】
好ましくは、対象のヌクレオチドは治療効果をもたらす。
好適には、本発明において使用するための1以上のNOIは、ガイドRNA、Cas9リボ核タンパク質をコードするヌクレオチド、1種以上のアデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤をコードするヌクレオチド配列（例えばp53活性化の阻害剤または1種以上のアデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列）から選択され得る。
【０３２７】
好適なNOIとしては、限定されるものではないが、酵素、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化分子、操作免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、免疫共刺激分子、免疫調節分子、アンチセンスRNA、マイクロRNA、shRNA、siRNA、ガイドRNA（gRNA、例えばCRISPR/Casシステムと関連して使用される）、リボザイム、miRNA標的配列、標的タンパク質のトランスドメイン陰性変異体、毒素、条件付き毒素、抗原、腫瘍抑制タンパク質、増殖因子、転写因子、膜タンパク質、表面受容体、抗癌分子、血管作用性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、ならびにそれらの誘導体（例えば、付随レポーター基を有する誘導体）をコードする配列が挙げられる。NOIはまた、プロドラッグ活性化酵素をコードしてもよい。好ましくは、NOIはガイドRNA（gRNA）である。
【０３２８】
医薬組成物
一実施形態において、本発明の細胞は、対象に投与するために薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤とともに製剤化することができる。好適な担体および希釈剤としては、等張生理食塩水、例えば、リン酸緩衝生理食塩水が含まれ、ヒト血清アルブミンが含有されてもよい。
【０３２９】
細胞療法製品の取り扱いは、好ましくは、細胞療法に関するFACT-JACIE国際規定に従って実施される。
【０３３０】
造血細胞、造血幹細胞および／または造血前駆細胞移植
本発明は、療法における使用のための、例えば、遺伝子治療における使用のための、本発明の方法に従って調製された造血細胞、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の集団を提供する。
【０３３１】
使用は細胞移植手順、例えば造血幹細胞移植手順の一部であってもよい。
【０３３２】
造血幹細胞移植（HSCT）は、骨髄（この場合、骨髄移植として知られる）または血液に由来する血液幹細胞の移植である。幹細胞移植は、血液学および腫瘍学の分野で、血液もしくは骨髄の疾患、またはある種の癌を有する人々に対して最もよく実施される医療処置である。
【０３３３】
HSCTの多くのレシピエントは、化学療法による長期処置から利益を受けない可能性のある、または化学療法に対してすでに耐性のある多発性骨髄腫または白血病患者である。HSCTの候補は、患者が欠陥幹細胞を伴う重症複合免疫不全症または先天性好中球減少症などの先天的欠陥を有する小児科症例、およびまた生後に幹細胞を失ってしまった再生不良性貧血を有する小児または成体を含む。幹細胞移植で処置される他の病態としては、鎌状赤血球症、骨髄異形成症候群、神経芽腫、リンパ腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍およびホジキン病が挙げられる。より最近では、必要な前化学療法および放射線の用量がより少ない非骨髄破壊的、またはいわゆる「ミニ移植」法が開発された。これにより、高齢者およびそれ以外で従来の治療レジメンに耐えるには弱すぎると考えられうる他の患者でHSCTの実施が可能となった。
【０３３４】
一実施形態において、本発明の方法により調製された造血幹細胞の集団は、自己幹細胞移植法の一部として投与される。
【０３３５】
別の実施形態において、本発明の方法により調製された造血幹細胞の集団は、同種幹細胞移植法の一部として投与される。
【０３３６】
本明細書中で使用する用語「自己幹細胞移植法」とは、出発細胞集団（本発明の方法によりその後形質導入される）が、形質導入細胞集団が投与される対象と同じ対象から得られる方法をいう。自己移植法は、免疫不適合性に伴う問題を避け、および遺伝的に適合するドナーが得られるかどうかに関わらず対象に利用できることから有利である。
【０３３７】
本明細書中で使用する用語「同種幹細胞移植法」とは、出発細胞集団（本発明の方法によりその後形質導入される）が形質導入細胞集団が投与される対象と異なる対象から得られる方法をいう。好ましくは、免疫不適合性のリスクを最小化するために、ドナーは細胞が投与される対象と遺伝的に適合するものである。
【０３３８】
形質導入細胞集団の好適な用量は、例えば治療上および／または予防上有効なものである。投与すべき用量は、処置される対象および病態によって異なる場合があり、当業者ならば容易に決定できる。
【０３３９】
造血前駆細胞は短期間の生着をもたらす。したがって、形質導入造血前駆細胞を投与することによる遺伝子治療は、被験体に永続しない効果をもたらすであろう。例えば、この効果は、形質導入造血前駆細胞の投与後1〜6ヶ月に限定されるかもしれない。
【０３４０】
このような造血前駆細胞遺伝子治療は、後天性疾患、例えば癌の治療に適していると考えられ、（毒性を有する可能性のある）目的の抗癌ヌクレオチドの時間制限された発現は、疾患を根絶するのに十分なものとなりうる。
【０３４１】
本発明は、WO1998/005635に挙げられている障害の治療に有用でありうる。参照しやすいように、そのリストの一部をここに示す：癌、炎症または炎症性疾患、皮膚科障害、発熱、心血管作用、出血、凝固および急性期応答、悪液質、食欲不振症、急性感染、HIV感染、ショック状態、移植片対宿主反応、自己免疫疾患、再潅流傷害、髄膜炎、片頭痛およびアスピリン依存性抗血栓症；腫瘍増殖、浸潤および拡散、血管新生、転移、悪性、腹水および悪性胸水；脳虚血、虚血性心疾患、骨関節炎、関節リウマチ、骨粗鬆症、喘息、多発性硬化症、神経変性、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、血管炎、クローン病および潰瘍性大腸炎；歯周炎、歯肉炎；乾癬、アトピー性皮膚炎、慢性潰瘍、表皮水疱症；角膜潰瘍、網膜症および外科的創傷治癒；鼻炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、アナフィラキシー；再狭窄、鬱血性心不全、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化症または内部硬化症(endosclerosis)。
【０３４２】
加えて、または代わりに、本発明は、WO1998/007859に挙げられている障害の治療に有用でありうる。参照しやすいように、そのリストの一部をここに示す：サイトカインおよび細胞増殖／分化活性；免疫抑制または免疫賦活活性（例えば、ヒト免疫不全ウイルス感染を含む免疫不全を治療するため；リンパ球増殖の調節；癌および多くの自己免疫疾患の治療、および移植拒絶の防止または腫瘍免疫の誘導のため）；造血調節、例えば、骨髄系またはリンパ系疾患の治療；例えば、創傷治癒、火傷、潰瘍および歯周病および神経変性の処置のための、骨、軟骨、腱、靱帯および神経組織の成長の促進；卵胞刺激ホルモンの阻害または活性化（受精能の調整）；化学走性／化学運動性活性（例えば、特定の細胞種を損傷または感染部位に動員するため）；止血および血栓溶解活性（例えば、血友病および脳卒中を治療するため）；抗炎症活性（例えば、敗血性ショックまたはクローン病を治療するため）；抗微生物剤として；例えば、代謝または行動のモジュレーター；鎮痛薬として；特定の欠乏性障害の治療；ヒトまたは獣医学における例えば乾癬の処置において。
【０３４３】
加えて、または代わりに、本発明は、WO1998/009985に挙げられている障害の治療に有用でありうる。参照しやすいように、そのリストの一部をここに示す：マクロファージ阻害活性および／またはＴ細胞阻害活性、および従って、抗炎症活性；抗免疫活性、すなわち、炎症に無関連の応答を含む、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答に対する阻害効果；マクロファージおよびＴ細胞の細胞外マトリックス成分およびフィブロネクチン接着能、ならびにＴ細胞においてアップレギュレートされた受容体発現の阻害；関節リウマチを含む関節炎、過敏症、アレルギー反応、喘息、全身性紅斑性狼瘡、膠原病および他の自己免疫疾患に関連する炎症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、アテローム動脈硬化性心疾患、再潅流傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性障害、呼吸窮迫症候群または他の心肺疾患に関連する炎症、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎および他の消化管疾患に関連する炎症、肝線維症、肝硬変または他の肝臓疾患、甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎または他の腎および泌尿器疾患、耳炎または他の耳鼻咽喉科疾患、皮膚炎または他の皮膚疾患、歯周病または他の歯科疾患、睾丸炎または精巣精巣上体炎、不妊症、睾丸外傷または他の免疫関連精巣疾患、胎盤機能不全、胎盤不全、習慣性流産、子癇、前子癇および他の免疫および／または炎症関連婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ぶどう膜網膜炎、視神経炎、眼内炎症、例えば、網膜炎または嚢胞様黄斑浮腫、交感性眼炎、強膜炎、色素性網膜炎、変性性眼底疾患(degenerative fondus disease)の免疫および炎症成分、眼球損傷の炎症成分、感染により引き起こされる眼の炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、例えば緑内障濾過手術後の過度の瘢痕化、眼内インプラントに対する免疫および／または炎症反応、ならびに他の免疫および炎症関連眼性疾患、中枢神経系（CNS）または他の任意の器官の療法において免疫および／または炎症抑制が有益であると思われる自己免疫疾患もしくは病態もしくは障害に関連する炎症、パーキンソン病、パーキンソン病の治療に由来する合併症および／または副作用、AIDS関連認知症複合HIV関連脳症、デビック病、ジデナム舞踏病、アルツハイマー病およびCNSの他の変性疾患、病態または障害、ストークスの炎症成分、ポリオ後症候群、精神障害の免疫および炎症成分、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性汎脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ギラン−バレー症候群、ジデナム舞踏病、重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、CNS圧迫もしくはCNS外傷もしくはCNS感染の炎症成分、筋萎縮および筋ジストロフィーの炎症成分、ならびに免疫および炎症関連疾患、中枢神経系および末梢神経系の病態または障害、外傷後炎症、敗血症性ショック、感染性疾患、手術の炎症性合併症または副作用、骨髄移植または他の移植合併症および／もしくは副作用、遺伝子治療の炎症および／または免疫合併症ならびに副作用（例えばウイルス担体の感染による）、あるいは、体液性および／もしくは細胞性の免疫応答を抑制または阻害するため、単球もしくは白血球増殖性疾患、例えば白血病を、単球もしくはリン��球の量を低減することによって治療または改善するため、角膜、骨髄、器官、水晶体、ペースメーカー、天然もしくは人工皮膚組織などの天然または人工の細胞、組織および器官を移植する場合の移植片拒絶を予防および／または治療するための、AIDSに関連する炎症を含む望ましくない免疫反応および炎症の阻害。
【０３４４】
加えて、または代わりに、本発明は、β-サラセミア、慢性肉芽腫症、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症および他のリソソーム蓄積症の治療において有用であり得る。
【０３４５】
キット
一態様において、本発明は、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤および／または本発明の細胞集団を含むキットを提供する。
別の態様において、本発明は、相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤、遺伝子編集機構をコードする1以上のヌクレオチド配列および造血幹細胞を選択する手段を含むキットを提供する。
【０３４６】
相同配列依存型DNA修復を促進する薬剤および／または細胞集団は好適な容器にて提供してもよい。
【０３４７】
好適には、キットはp53活性化の阻害剤を含んでもよい。
好適には、キットは少なくとも1種のアデノウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含んでもよい。
【０３４８】
本キットはまた、使用説明書を含んでもよい。
【０３４９】
治療方法
本明細書において処置（治療）という場合には総て、治癒的処置（治療）、対症的処置（治療）および予防的処置（治療）を含むと理解されるべきである。しかしながら、本発明の文脈において予防することに対して言及する場合、より一般的には予防的処置（治療）に関連する。一実施形態において、哺乳動物、特にヒトの治療が好ましい。ヒトの治療および獣医学的治療の両方が本発明の範囲内にある。
当業者は、本明細書において開示された本発明の全ての特徴を、開示された発明の範囲から逸脱することなく組み合わせることができることを理解するであろう。
【０３５０】
投与
本発明における使用のための薬剤（特に、本発明の方法によって作製された細胞集団）は、単独で投与することができるが、通常は、特にヒト治療用の、医薬担体、賦形剤もしくは希釈剤と混合して投与される。
【０３５１】
用量
当業者は、過度の実験を行うことなしに、被験体に投与するために、本発明の薬剤のうち一つの適当な用量を、容易に決定することができる。典型的には、医師は、個々の患者に最も適した実際の投与量を決定することになるが、それは、使用される個別の薬剤の活性、その薬剤の代謝安定性および作用時間、年齢、体重、全身状態、性別、食事、投与の方法および時間、排泄速度、薬物の組合せ、個別の病態の重篤度、ならびに個々の受けている治療を含めて、さまざまな要因によって決まる。より高い、または低い、用量範囲がふさわしい個々の例も当然ありうるが、そうしたことも本発明の範囲内である。
【０３５２】
被験体
「被験体（対象）」はヒト、または非ヒト動物のいずれかを意味する。
【０３５３】
非ヒト動物の例としては、脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類(特に高等霊長類)、イヌ、げっ歯類（例えばマウス、ラット、もしくはモルモット）、ブタ、およびネコなどの哺乳類が挙げられる。非ヒト動物はコンパニオンアニマルであってもよい。
【０３５４】
好ましくは、被験体はヒトである。
【０３５５】
本発明の好ましい特徴および実施形態を以下、非限定的な例によって説明する。
【０３５６】
本発明の実施は、特に断りのない限り、当業者の能力の範囲内にある化学、生化学、分子生物学、微生物学および免疫学の従来技術を使用する。このような技術は文献に説明されている。例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J. and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M. and McGee, J.O'D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and Lilley, D.M. and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Pressを参照されたい。これらの一般的テキストはそれぞれ引用により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０３５７】
[実施例1]
p53活性化の阻害剤
材料及び方法
ベクター及びヌクレアーゼ
HDRのためのAAV6ドナー鋳型を、以前に記載されている通り(J. Wangら、2015 Nat Biotechnol 33、1256-1263)三重トランスフェクション法によって作製され、塩化セシウム勾配上での超遠心分離によって精製された、AAV2末端逆位反復配列を含有する構築物から生成した。AAVS1遺伝子座(PGK.GFPレポーターカセットをコードする)について相同性を有する又はIL2RGのイントロン1を標的化する(後ろにPGK.GFPレポーターカセットが続くIL2RG補正cDNAをコードする)AAV6ドナー鋳型の設計は以前に報告されている(G. Schiroliら、2017 Sci Transl Med 9)。
【０３５８】
gRNAの配列を、オンラインCRISPR設計ツール(P.D. Hsuら、2013 DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol 31、827-832)を使用して設計し、予測される特異性スコア及びオンターゲット活性について選択した。gRNAによって認識されるゲノム配列を下記の表に示す。s.p.Cas9タンパク質(Aldevron)と合成cr:tracrRNA(Integrated DNA Technologies)をモル比1:1.5で、25℃で10分間インキュベートすることによってリボ核タンパク質(RNP)をアセンブルした。製造者の指示に従ってエレクトロポレーション増強剤(Integrated DNA Technologies)をエレクトロポレーションの前に添加した。
【０３５９】
gRNAの配列を以下に報告する。
【０３６０】
【表１】
2021529184.tif 000048
【０３６１】
GSE56.WPREを発現するレンチウイルスからGSE56.WPRE構築物をT7プロモーター、β-グロビン3'UTR及び64bp-ポリAを含有するmRNA in vitro転写用のpVaxプラスミドにクローニングした。
【０３６２】
ヒトCD34+細胞の遺伝子編集
CD34+細胞を、インフォームドコンセントを得、Ospedale San Raffaele Bioethical Committeeによる承認後にヒトCBから新しく精製したか、又は、凍結されたものをLonzaから購入した。以前に最適化されたプロトコールに従って、CD34+細胞を編集した(Schiroliら、2017、上記)。
【０３６３】
簡単に述べると、1ml当たり5×105個のCD34+細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、1μMのSR-1(Biovision)、50μMのUM171(STEMCell Technologies)、培養の開始時のみ添加した10μMのPGE2(Cayman)、及びヒト初期作用性サイトカイン(SCF 100ng/ml、Flt3-L 100ng/ml、TPO 20ng/ml、及びIL-6 20ng/ml;全てPeprotechから購入した)を補充した無血清StemSpan培地(StemCell Technologies)中で刺激した。3日間の予備刺激後、細胞をPBSで洗浄し、P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit及びプログラムEO-100(Lonza)を使用してエレクトロポレーションを行った。2.5〜1.25μMのRNPを細胞にエレクトロポレーションした。
【０３６４】
エレクトロポレーションの15分後に、AAV6を用いた形質導入を1〜2×104vg/細胞の用量で実施した。GSE56 mRNAを指示された150μg/mlの用量で利用した。以前に記載されている通り、GFPマーカーを発現する細胞のパーセンテージを測定するフローサイトメトリーによって、又は、ベクター配列と標的化遺伝子座の接合部に対して、及び正規化のためのものとして利用される対照配列に対してプライマー及びプローブを設計するデジタルドロップレットPCR解析によって、エレクトロポレーションの3日後にin vitroにおいて培養細胞から遺伝子編集効率を測定した(Schiroliら、2017、上記)。
【０３６５】
NSGマウスにおけるCD34+HSPC異種移植試験
NOD-SCID-IL2Rg-/-(NSG)マウスをJackson Laboratoryから購入し、特定病原体除去(SPF)条件下で維持した。動物を伴う手順は、Animal Care and Use Committee of the San Raffaele Hospitalの承認を得て設計及び実施し(IACUC #749)、イタリアの法律に基づいてMinistry of Health及び地元の当局に連絡した。
【０３６６】
移植に関しては、培養の5日目に編集のために処理したCD34+細胞3×105個を致死量以下の照射(150〜180cGy)後にNSGマウスに静脈内注射した。標本サイズは入手可能な処理細胞の総数によって決定した。マウスを各実験群にランダムに属させた。マウス尾部から段階的に血液を採取することによってヒトCD45+細胞の生着及び遺伝子編集された細胞の存在をモニタリングし、実験の最後に(移植後>20週)、BM及び脾臓を採取し、分析した。
【０３６７】
分子解析
分子解析に関しては、入手可能な細胞の数に応じてDNeasy Blood & Tissue Kit又はQIAamp DNA Micro Kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを単離した。ヌクレアーゼ活性(IL2RGイントロン1、AAVS1)を、製造者の指示に従って標的化遺伝子座のPCRベースの増幅、その後のT7エンドヌクレアーゼI(NEB)を用いた消化によるミスマッチ感受性エンドヌクレアーゼアッセイによって測定した。消化されたDNA断片を、製造者の指示に従ってLabChip GX Touch HT(Perkin Elmer)でキャピラリー電気泳動によって展開し定量化した。
【０３６８】
デジタルドロップレットPCR解析に関しては、QX200 Droplet Digital PCR System(Biorad)を製造者の指示に従って使用してゲノムDNA 5〜50ngを二連で解析した。
【０３６９】
HDR ddPCRに関しては、ベクター配列と標的化遺伝子座の接合部に対して、及び正規化のために使用される対照配列(ヒトTTC5遺伝子)に対してプライマー及びプローブを設計した。アニーリング及び伸長の熱的条件を特定の適用それぞれについて以下の通り調整した:AAVS1/イントロン1 IL2RG HDR 3'組込み接合部ddPCR: 55℃で30秒、72℃で2分。PCR及びddPCR増幅のためのプライマー及びプローブを以下に示す。
【０３７０】
【表２】
2021529184.tif 000049
【０３７１】
遺伝子発現解析に関しては、RNeasy Plus Micro Kit(QIAGEN)を使用して全RNAを抽出した。SuperScript VILO IV cDNA Synthesis Kit(Invitrogen)を用いてcDNAを合成し、CDKN1A、RPS27L、PHLDA3、APOBEC3H、及び正規化のためのものとしてHPRTにマッピングしたTaqMan Gene Expression Assay(Applied Biosystems)を使用したViia7リアルタイムPCRサーマルサイクラーでのQ-PCRに使用した。各遺伝子の相対的な発現をまずHPRT発現に対して正規化し、次いで、偽処理試料と比べた倍率変化として表した。
【０３７２】
フローサイトメトリー
免疫表現型分析(FACSCanto II; BD Pharmingenで実施)に関しては、以下に列挙する抗体を使用した。単一染色及びFluorescence Minus Oneで染色した細胞を対照として使用した。LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher)、7-アミノアクチノマイシン(Sigma Aldrich)を、製造者の指示に従ってフローサイトメトリー用の試料調製中に含めて、死細胞を分析から排除した。MoFlo XDP Cell Sorter(Beckman Coulter)又はFACSAria Fusion(BD Biosciences)を使用して細胞選別を実施した。
【０３７３】
【表３】
2021529184.tif 000050
【０３７４】
単一細胞RNA配列決定及び解析
ドロップレットベースのデジタル3'末端scRNA-Seqを、Chromium Single-Cell Controller(10X Genomics)でChromium Single Cell 3' Reagent Kit v2を製造者の指示に従って使用して実施した。編集処理の24時間後に、CD34+CD133+CD90+及びCD34+CD133+CD90-の表面発現に従ってCD34+細胞を選別した。Trypan Blue溶液0.4%(Gibco)を用いて生存細胞を計数し、5200個の生存細胞(各集団から2700個)をその後の手順に利用した(推定回収率: 試料当たり細胞3000個)。簡単に述べると、単一細胞をGel Beads in Emulsion(GEMs)中に分配し、溶解させ、その後、RNAバーコーディング、逆転写及びPCR増幅(入手可能なcDNAの量に応じて12〜14サイクル)を行った。scRNA-Seqライブラリーを製造者の指示に従って調製し、確認し、LabChip GX Touch HT(Perkin Elmer)及びQubit 3.0(Invitrogen)機器で定量化した。NextSeq 500 machine(Illumina)でNextSeq 500/550 High Output v2 kitを使用して配列決定を実施した(75サイクル)。
【０３７５】
FastqファイルをCell Ranger(v. 1.3、https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger)を用い、デフォルトパラメータを使用して処理した。読み取りを参照ゲノムhg19とアラインメントした。
【０３７６】
読み取り処理:遺伝子計数をSeurat(v 2.3.1、http://satijalab.org/seurat/)を用いて処理した。発現する特有の遺伝子が200種未満の細胞及び3つ未満の細胞/試料で発現される遺伝子を廃棄した。Seurat関数NormalizeDataを使用し、デフォルトパラメータを用いて計数を正規化した。平均発現が0.01未満の遺伝子を除外した。ミトコンドリア遺伝子発現の内在性遺伝子発現に対する比が0.15を超える細胞も除外した。次いで、発現データを、ScaleData関数を使用してスケーリングし、SスコアとG2Mスコアの差異に対して回帰させた。CellCycleScoring関数を使用して細胞周期スコアを算出した。次いで、Multi-Set Canonical Correlation Analysis(mCCA)、A. Butlerら、2018 Nat Biotechnol 36、411-420を全ての試料に対して実施した。mCCAコンピュータ計算のために、培養されたCD34+CB由来の原始的細胞と委任細胞の間で示差的に発現される遺伝子の一覧、I. Faresら、2017 Blood 129、3344-3351をインプットとして使用し、最初の20ディメンションをアラインメントした。
【０３７７】
示差的な発現の解析:異なる条件にわたって示差的に発現される遺伝子を、FindMarkers関数を使用し、MAST test G. Finakら、2015 Genome Biol 16, 278をボンフェローニ補正と共に使用して同定した。avglogFCをコンピュータ計算し、平均疑似カウント発現値0.001に付加し、少なくとも1つの試料中の細胞の少なくとも1%で発現された遺伝子のみを検討した。次いで、これらの遺伝子のセットに対してEnrichR(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)を使用して遺伝子オントロジー富化解析を実施した。
【０３７８】
結果
HSPCの遺伝子編集により、p53関連転写応答の制御解除が引き起こされる
遺伝子編集手順のヒトHSPCに対する影響を不偏性に詳細に分析するために、編集手順後24時間の時点でCD133及びCD90表面マーカーが富化された原始的HSPC集団に対して単一細胞(sc)RNA-Seqを実施した(図1A)。
【０３７９】
ドロップレットベースの手法(G.X. Zhengら、 2017 Nat Commun 8、14049)を使用して、IL2RGに特異的なRNP及びHDRのためのDNA鋳型としてAAV6で処理した細胞又は陰性対照として偽処理細胞からscRNA-Seqデータを生成した。編集された細胞と対照細胞とで示差的に発現されることが見いだされた遺伝子の経路解析を実施することにより、上位の富化された経路がp53転写活性と関連付けられる(図1B-C)。このp53関連転写応答は、ヌクレアーゼによって誘導されたDNA DSB後に穏やかに誘発され、大部分がAAV6ベクターを用いた形質導入と関連し、これは、編集手順の直後のp21発現の誘導によって測定して(図1D)、宿主細胞DDR機構と広範に相互作用するものと報告されている(M Fragkosら、2009 Mol Cell Biol 29、2828-2840)。
【０３８０】
ピフィスリン-α又はその誘導体による一時的なp53阻害によりHDR効率が改善され、原始的細胞区画における遺伝子編集が増大する
編集されたHSPCにおける大多数の制御解除された遺伝子がDDR及び特にp53シグナル伝達経路に有意に収束することが示されたので、遺伝子編集された細胞におけるHSPC自己再生、生存、及びDNA修復選択に関するこの応答の機能的帰結をさらに調査した。
【０３８１】
したがって、p53媒介アポトーシス及びp53依存性遺伝子転写を阻害することが報告されている分子であるピフィスリン-α又は誘導体(環状ピフィスリン-α及びピフィスリン-α p-ニトロ)を添加することによって一時的なp53阻害を試験した(P.G. Komarovら、1999 Science 285、1733-1737及びK. I. Lenovaら、2010 Cell Cycle 9、1434-1443)(図2A)。遺伝子編集プロトコールのウイルス形質導入の前日に分子を添加することにより、3種全ての化合物でHDR効率の上昇を測定することができた(図2B)。さらなる実験のために、ピフィスリン-α環式化合物を選択した。ピフィスリン-α環式化合物では、細胞毒性が最低であり、又、おそらく編集された細胞の生存率が高いことに起因して、最も高いp53転写活性が基礎的に付与されている(V. Pantら、2012 Blood 120、5118-5127)最も原始的なCD34+CD133+CD90+細胞区画における遺伝子編集に関して、及び、NHEJによるDNA修復に関して、2倍の増大が示された(図2C)。
【０３８２】
ドミナントネガティブペプチドによる一時的なp53阻害により、HDR応答が促進され、細胞分化に影響を及ぼすことなく原始的サブセットの増大が引き起こされる
エレクトロポレーション手順の間に、ドミナントネガティブペプチド(GSE56)のmRNAを過剰発現させることによってp53転写活性を一時的に阻害した(M. Milyavskyら、2010 Cell stem cell 7、186-197)(図3A)。
【０３８３】
GSE56を添加することにより、遺伝子編集手順によって高度に上方制御されることが見いだされているいくつかの下流の標的遺伝子の発現レベルによって測定して、p53依存性転写応答の大きさを低減することができた(図3B)。この処理によって、DNA修復の全体的な効率は負の影響を受けず、標的化遺伝子座において(図3C、左側のパネル)、特に、最も原始的な細胞区画において(CD34+133+90+画分において平均42%; 図3D、右側のパネル)HDR媒介組込みが促進され、これは、DNA修復選択のp53媒介調節(23)と一致する。GSE56で処理したHSPCでは、より大きな増大が示され(図3D)、これは、細胞周期阻害剤の誘導が低減したことと矛盾しない。又、編集の3日後に測定した編集された細胞における造血集団の相対的な組成は未処理対照と比較して変化しておらず(図3E)、これにより、分化の明白な誘導を伴わずに原始的細胞が有効に増殖したことが示唆される。CFU-Cアッセイにおいて選別された集団を播種すると、特にCD90+画分において赤血球及び骨髄系クローン原性アウトプットが増加し(図3F)、これにより、処理細胞の細胞分化に影響を及ぼすことなく最も原始的なサブセットの増大能が増したことが示される。
【０３８４】
GSE56で処理した編集された細胞では、免疫不全NSGマウスにおける分化が歪められることなく生着の増大が示される
次いで、編集された細胞の免疫不全NSGマウスへの移植を実施した。これは、長期間の再増殖HSCの代用アッセイである(図4A)。GSE56で処理した編集された細胞では、分化アウトプットのいかなる歪みも伴わずに(図4C)、生着の増大が示された(図4B)。興味深いことに、以前に報告された従来のプロトコール(Schiroliら、2017、上記及びS.S. De Ravin 2017 Science translational medicine 9)を用いて編集された細胞を移植したマウスでは、HDRにより編集された細胞の画分は経時的にわずかに減少したが、一時的なp53阻害により、この画分は長期間安定なままになり、移植後22週間の時点でPBにおいて平均32%に達していた(図4D)。
【０３８５】
全体として、これらの結果から、p53依存性転写応答が遺伝子編集された細胞の再増殖能の低下に寄与し、その一時的な低下が、最も原始的なHSPC区画の長期間の機能のより良好な保存の助けになり得ることが示される。
【０３８６】
[実施例2]
アデノウイルスタンパク質
材料及び方法
ベクター
AAV-ITR欠失、Rep2及びCap6タンパク質コード配列並びにアデノウイルスヘルパー遺伝子で組み立てられた目的のカセットを有するプラスミドのHEK293-T細胞系への三重トランスフェクションによってAAVストックを作製した。トランスフェクトされた細胞を48時間後に回収し、塩化セシウム勾配上で精製した(Wang, J.ら、(2015)、Nat Biotechnol 33: 1256-1263)。ウイルスストックの力価をAAVゲノムのqPCRによって決定した(vg/ml)。AAVS1遺伝子座に対する相同配列を含むAAV-6ドナー鋳型(PGK-GFPレポーターカセットをコードする)又はIL2RG遺伝子座内のイントロン1を含むAAV-6ドナー鋳型(IL2RG補正cDNA、その後にPGK-GFPレポーターカセットをコードする)の設計が以前に報告されている(Schiroli, G.ら、(2017)、Sci Transl Med 9)及びSchiroli, G. 2019 Celle stem cell）。
【０３８７】
以前報告されたAAVS1 AAV6導入ベクタープラスミドのポリアデニル化配列の下流に縮重した配列をサブクローニングすることにより、AAVS1遺伝子座を標的とするバーコード付けしたAAV6ドナー鋳型を得た。簡単に述べると、独特のクローニング制限部位(Bsu36I及びSphI)に挟まれたランダム配列が埋め込まれたssODNをSigma Aldrichから入手した。クローニング制限酵素によるあらゆる望ましくない切断を回避するように、縮重した領域を設計した。相補鎖を生成するために、ssODN 50 pmolを、Easy-A High-Fidelity enzyme(Agilent Technologies)を用い、妥当なフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用し、製造者の指示に従って10サイクルのPCRで増幅した。増幅産物を、MinElute PCR Purification kit(QIAGEN)を用いて精製し、制限酵素で消化し、キャピラリー電気泳動によって確認した。製造者のプロトコールをスケールアップすることにより、T4 DNAリガーゼ(NEB)を使用して、Bsu36I/SphIで消化したAAVS1 HDRドナー鋳型2μgを消化されたインサート(モル比1:7)とライゲーションした。最後に、XL-10 Gold Ultracompetent Cells(Agilent Technologies)をライゲーション産物で形質転換し、プレーティングし、組換えのリスクを最小限にするために30℃で12時間インキュベートした。コロニーをかき取り、混合し、LB培地中でさらに6時間増殖させ、NucleoBond Xtra MaxiPrepを用い、製造者の指示に従って処理した。最終的に、プラスミド調製物を、制限酵素を用いてITR及びプラスミド完全性についてスクリーニングした。
【０３８８】
ヌクレアーゼ
gRNAの配列を、オンラインCRISPR設計ツール(Hsu, P.D.ら、(2013)、Nat Biotechnol 31: 827-832)を使用して設計し、予測される特異性スコア及びオンターゲット活性について選択した。gRNAによって認識されるゲノム配列を下の表に示す。SpCas9タンパク質(Aldevron)と合成cr:tracrRNA(Integrated DNA Technologies)をモル比1:1.5で、25℃で少なくとも10分間インキュベートすることによってリボ核タンパク質(RNP)をアセンブルした。エレクトロポレーション増強剤(Integrated DNA Technologies)を製造者の指示に従ってエレクトロポレーションの前に添加した。
【０３８９】
【表４】
2021529184.tif 000051
【０３９０】
タンパク質
野生型血清型5に由来するE4orf1、E4orf6/7、GSE56/Ad5-E4orf6/7、E4orf6及びE1B55Kアデノウイルスタンパク質配列を、RCSB PDB及びUniProtオンラインデータバンクから収集した。さらに、T-Coffeeアルゴリズム(Notredame, C.ら、(2000)、J. Mol. Biol. doi:10.1006/jmbi.2000.4042)を使用して、各アデノウイルスタンパク質ファミリーE4orf1及びE4orf6/7について、種々のアデノウイルス血清型にわたって多配列アラインメントを実施して、いくつかのバリアントを選択した。全ての配列を、ヒト(Homo sapiens)に対するコドン最適化(GeneArt(商標))を用いて合成した。各構築物を、T7プロモーター、WPRE又は3'UTR及び64bp-ポリAを含有するmRNA in vitro転写用の「pVax」プラスミドにクローニングした。pVaxを制限酵素(SpeI)で直線化し、フェノール-クロロホルムを使用して精製した。市販の5xMEGAscript T7 kit(Invitrogen)を、ARCA(BioLabs)添加などの製造者のプロトコールからのわずかな改変を伴って使用してRNAをin vitroで転写した。合成RNAを、RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)を使用して精製し、その後、HPLCカラム精製を行って、RNA夾雑物及び試薬を除去した。Amicon Ultra-15(30K)(Millipore)管を使用してRNAを最終的に濃縮した。
【０３９１】
ヒトHSPCにおける遺伝子編集プロトコール
凍結したCD34+細胞をLonzaから購入した。CD34+細胞を以前に最適化されたプロトコール(Schiroli, G.ら、(2017)、Sci Transl Med 9)に従って編集した。簡単に述べると、1ml当たり1〜5×105個のCD34+細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、1μMのアリール炭化水素受容体アンタゴニストSR-1(Biovision)、50μMのピリミドインドール誘導体UM171(STEMCell Technologies)、培養の開始時にのみ添加した10μMの15-ヒドロキシPGDH競合阻害剤dmPGE-2(Cayman)、並びにヒト初期作用性サイトカイン(SCF 100ng/ml、Flt3-L 100ng/ml、TPO 20ng/ml、及びIL-6 20ng/ml;全てPeprotechから購入したもの)を補充した無血清StemSpan培地(StemCell Technologies)中で刺激した。3日間の予備刺激後、細胞をPBSで洗浄し、P3初代細胞4D-Nucleofector X Kit及びプログラムEO-100(Lonza)を使用してエレクトロポレーションを行った。細胞に1〜1.2μMのRNPをエレクトロポレーションした。規定されている場合、エレクトロポレーション混合物に、Ad5-E4orf1 mRNA、Ad5-E4orf6/7 mRNA及びGSE56/Ad5-E4orf6/7 mRNA（これらをそれぞれ120μg/ml、80μg/ml及び200μg/mlの用量で利用した）、又はAd5-E1B55K mRNA及びAd5-E4orf6 mRNA（120μg/ml及び80μg/mlで使用した）を補充した。他のアデノウイルスタンパク質バリアントは全て標準用量の120μg/mlで使用した。AAV-6を用いた形質導入をエレクトロポレーションの15分後に1〜5×104vg/細胞の用量で実施した。規定されている場合、CD34+細胞を培養下でより短時間刺激し(0時間、24時間又は48時間)、上記の通り編集した。編集の4日後に、GFPレポーター遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを測定するフローサイトメトリーによって、又は、ベクター配列と標的化遺伝子座の接合部に対して、及び以前に記載されている通り(Schiroli, G.ら、(2017)、Sci Transl Med 9及びSchiroliら、Cell Stem Cell 2019)、正規化のためのものとして利用される対照配列に対してプライマー及びプローブを設計するデジタルドロップレットPCR解析によって、in vitroで培養細胞から遺伝子編集効率を測定した。
【０３９２】
NSGマウスへのCD34+異種移植
NOD-SCID-IL2Rg-/-(NSG)マウスをJackson Laboratoryから購入し、特定病原体除去(SPF)条件下で維持した。動物を伴う手順は、Animal Care and Use Committee of the San Raffaele Hospitalの承認を得て設計及び実施し(IACUC #749)、イタリアの法律に基づいてMinistry of Health及び地元の当局に連絡した。移植に関しては、編集プロトコールの24時間後に1.5〜3×105個(一次)又は2×106個(二次)のCD34+処理細胞を、致死量以下の照射(180cGy)後にNSGマウスに静脈内注射した。試料サイズは入手可能な処理細胞の総数によって決定した。マウスを各実験群にランダムに属させた。ヒトCD45+細胞の生着及び編集されたGFP+細胞のパーセンテージを、移植後数週間にわたってマウス尾部から段階的に血液を採取することによってモニタリングし、実験の最後に(移植の18〜20週間後)、脾臓及び骨髄を摘出し、分析した。
【０３９３】
分子解析
分子解析に関しては、入手可能な細胞の数に応じてDNeasy Blood & Tissue Kit又はQIAamp DNA Micro Kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを単離した。ヌクレアーゼ活性(AAVS1)を、製造者の指示に従って標的化遺伝子座のPCRベースの増幅、その後のT7エンドヌクレアーゼI(NEB)を用いた消化によるミスマッチ感受性エンドヌクレアーゼアッセイによって測定した。消化されたDNA断片を、LabChip GX Touch HT(Perkin Elmer)で製造者の指示に従ってキャピラリー電気泳動によって展開し定量化した。
【０３９４】
デジタルドロップレットPCR解析に関しては、ゲノムDNA 5〜50ngを、QX200 Droplet Digital PCR System(Biorad)を製造者の指示に従って使用して二連で解析した。
【０３９５】
転座ddPCRなどのHDR ddPCRに関しては、プライマー及びプローブをベクター配列と標的化遺伝子座の接合部に対して、及び正規化のために使用される対照配列(ヒトTTC5遺伝子)に対して設計した。アニーリング及び伸長の熱的条件を特定の適用それぞれについて以下の通り調整した: AAVS1 HDR 3'組込み接合部ddPCR: 55℃で30秒、72℃で2分。PCR及びddPCR増幅のためのプライマー及びプローブを以下に示す。
【０３９６】
【表５】
2021529184.tif 000052
【０３９７】
バーコーディング解析
個々の試料について、Taq G2 Hot Start Polymerase(Promega)を使用した一段階PCRによってPCRアンプリコンを生成した。フォワードプライマーはバーコード配列の2bp上流のドナー鋳型に結合するように設計し、一方リバースプライマーは相同性領域の外側にアニーリングし、したがって、約350bpのオンターゲットの組み込まれたカセットが増幅する。プライマーに、多重化配列決定を可能にするためのP5/P7配列、i5/i7 Illuminaタグ、及びR1/R2プライマー相補配列を含有する尾部を付与する。PCRライブラリーアンプリコンを、MinElute PCR Purification kit(QIAGEN)を使用して別々に精製し、Agilent Tapestation(Agilent Technologies)によって品質を評価した。最後に、アンプリコンを多重化し、Illumina MiSeqペアエンド2×75bpにかけた。
【０３９８】
フローサイトメトリー
免疫表現型分析(FACSCanto II; BD Pharmingenで実施)に関しては、以下に列挙する抗体を使用した。単一染色及びFluorescence Minus Oneで染色した細胞を対照として使用した。LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher)、7-アミノアクチノマイシン(Sigma Aldrich)を、製造者の指示に従ってフローサイトメトリー用の試料調製に含めて、死細胞を分析から排除した。MoFlo XDP Cell Sorter(Beckman Coulter)又はFACSAria Fusion(BD Biosciences)を使用して細胞選別を実施した。
【０３９９】
【表６】
2021529184.tif 000053
【０４００】
細胞周期分析
編集の12〜24時間後に、培養物中の総HSPC 0.5〜1×105個を収集することにより、細胞周期をフローサイトメトリー(CytoFLEX LX; Beckman Coulter)によって分析した。細胞をPBS+2%FBSで洗浄し、PBS+2%FBS中10μg/mlのHoechst 33342(Sigma-Aldrich)を200μlと等しい最終体積で0.5〜1時間にわたって使用することによって染色した。
【０４０１】
結果
遺伝子編集の間のE4orf1又はE4orf6/7の発現により標的化効率が上昇する
アデノウイルスは、AAV感染の天然のコヘルパーであり、その機能がAAV感染プロセスを最適化するために必要とされるヘルパー遺伝子のセット(E1a、E1b、E2a、E4)をもたらす。我々は、7つの異なるタンパク質をコードする7つのオープンリーディングフレーム(ORF)で構成されるE4遺伝子を特に調査することに関心を持った(図5)。
【０４０２】
我々は、アデノウイルス血清型5(Ad5)に由来するE4orf1及びE4orf6/7と称される2つのアデノウイルスタンパク質の使用を調査することを決めた。これらをmRNAとしてCas9リボ核タンパク質(RNP)と一緒にヒトHSPC(臍帯血由来CD34+細胞)にエレクトロポレーションによって送達した後、ドナーDNA鋳型を送達するためのAAV6による形質導入を行った(図6A)。
【０４０３】
遺伝子編集手順の間にE4orf6/7タンパク質を発現させることにより、ドナー中に存在する、GFPレポーター遺伝子を発現する原始的HSPC(CD34+CD133+CD90+GFP+)のパーセンテージの平均1.5倍の上昇が測定された。この標的化効率の上昇は、ドナーベクターの形質導入に使用したAAV6ベクターの種々の用量の全てで得られた(図6B)。
【０４０４】
原始的CD90+細胞では、ドナー鋳型をインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター(Integrase Defective Lentiviral Vector)(IDLV; 図6C)によって送達した場合にも標的化組込みの同様の上昇が観察された。
【０４０５】
遺伝子編集手順の間に種々の用量のE4orf1 mRNAを送達した場合、標的化効率の用量依存的な上昇が見いだされ、最良に機能する用量では、種々の用量のE4orf6/7 mRNAを用いた条件で測定された上昇と同様に、標的化原始的HSPCのパーセンテージの平均1.5倍の上昇が測定された(図6D)。
【０４０６】
E4orf1又はE4orf6/7単独で及び組合せでの発現
次いで、標準の遺伝子編集手順を単独で又はE4orf1、E4orf6/7若しくは両方のタンパク質の組合せを加えたものと対照比較した。細胞蛍光分析から、E4orf1により、GFP+細胞の画分が標準と比較して平均1.2倍に増加し、全ての亜集団(最も原始的なCD90+前駆体区画から最も分化したCD34-区画まで)で等価であったこと、E4orf6/7により、主に最も原始的なHSPC区画(CD90+)でGFP+細胞の画分が1.45倍に増加したこと、及びこれらの組合せは相加効果を有し、それにより、GFP+細胞の画分の平均1.55倍の増加が可能になったことが観察された(図7A)。
【０４０７】
標的化効率を総バルクに対するデジタルPCRによって確認し、細胞蛍光分析によって測定されるGFPの総パーセンテージと対照比較した(図7B)。
【０４０８】
クローン原性アッセイを実施することにより、E4orf1及びE4orf6/7タンパク質を用いた共処理により、骨髄系及び赤血球コロニー形成単位(CFU)のどちらの数も標準手順と比較してそれぞれ3倍及び2倍に増加したことが見いだされた(図7C)。
【０４０９】
興味深いことに、編集の間にE4orf1を含めた両方の条件で、標準条件及びE4orf6/7単独条件と比較して、処理細胞の増殖曲線が4倍高いものであった(図7D)。
【０４１０】
これらの条件で処理した編集されたHSPCの長期間の生着及びin-vivo分化能を決定するために、NSGマウスにおける異種移植実験が進行中である。
【０４１１】
遺伝子編集の間のE1B55K及びE4orf6の発現
ヒトHSPCの編集のためのE1B55K及びE4orf6タンパク質の使用を試験し、これらをE4orf1及びE4orf6/7タンパク質と並行して比較した。
【０４１２】
E1B55KとE4orf6の組合せでは、主に最も原始的なHSPC区画においてGFP+細胞の画分で最大1.45倍の一時的な増加のみが可能になることが見いだされ、これはおそらく、形質導入が増大し、その結果、非組込みベクターからのGFPレポーターの高発現がもたらされたことに起因する(図8A)。
【０４１３】
これらの処理細胞から抽出したゲノムDNAに対する分子解析により、E1B55K及びE4orf6タンパク質はヒトHSPCに対する編集効率の上昇に関して有効でないが、一方E4orf1及びE4orf6/7タンパク質はどちらも再現性よくこの細胞型における編集を促進することができたことが確認された(図8B)。
【０４１４】
クローン原性アッセイを実施することにより、骨髄系及び赤血球コロニー形成単位(CFU)両方の数に関して、標準の条件と比較して主要な変化は観察されなかった(図8C)。
【０４１５】
興味深いことに、E1B55KとE4orf6の組合せを用いた処理細胞の増殖曲線は、標準と比較して低く、これにより、この組合せの使用に起因したある特定の毒性が示され得る(図8D)。
【０４１６】
E4orf6/7をCas9と共に送達することにより、ヒト初代T細胞におけるHDR駆動組込みが改善される
最後に、ドナーDNA鋳型を送達するためのAAV6による形質導入を行う前にE4orf6/7 mRNAをCas9リボ核タンパク質(RNP)と共にヒト初代T細胞(末梢血由来総CD3+細胞)に送達することを試験した(図9A)。
【０４１７】
処理の20日後に細胞を分析することにより、バルク処理したCD3+細胞並びにCD4亜集団及びCD8亜集団のいずれにおいても、E4orf6/7を用いて処理した細胞では標準の条件と比較してGFP+細胞発現のパーセンテージが1.5倍に上昇したことが見いだされた(図9B)。
【０４１８】
これらの結果から、E4orf6/7タンパク質により、異なる初代ヒト細胞におけるHDR駆動組込みを促進することが可能になることが示される。
【０４１９】
E4orf6/7 mRNAを用いて処理した編集された細胞を免疫不全NSGマウスに移植すると、最も原始的なHSPC区画においてHDR駆動組込みが増大し、長期間の再増殖能が保存される
細胞のNSGマウスへの移植を実施するために、最良に機能する用量のAAV6ドナー及びE4orf6/7 mRNAを用いて、遺伝子編集実験を繰り返した。これは、長期間の再増殖HSCの代用アッセイである(図10A)。
【０４２０】
E4orf6/7を用いて処理した編集された細胞では、標的化されたCD90+細胞のパーセンテージの1.4倍の上昇が示され(図10B)、培養組成の歪みは伴わなかった(図10C)。
【０４２１】
処理細胞から抽出されたゲノムDNAに対して実施した分子解析から、E4orf6/7及び標準の条件と比較して、HDR媒介組込みのレベルの上昇及び同様の量のNHEJにより誘導される突然変異が確認された(図10D)。
【０４２２】
これらの細胞をエレクトロポレーションの1日後にNSGマウスに移植し、それらの生着を段階的な血液分析によって縦方向に（longitudinally）追跡した。結果から、E4orf6/7との共処理がヒト細胞の生着の全体的なレベルには影響を及ぼさないことが示され、E4orf6/7処理細胞を移植したマウスでは、血液、造血器官及び異なる血液系列における編集された細胞の有意に高い画分(GFP+細胞又はHDR+細胞のパーセンテージとして測定される)が示された(図11)。
【０４２３】
全体として、これらの結果から、遺伝子編集手順の間のE4orf6/7タンパク質の一時的な発現により、最も原始的なHSPC区画におけるHDR駆動組込みのレベルが上昇する一方で、それらの長期間の再増殖能が保存されることが示される。
【０４２４】
[実施例3]
編集手順の間のp53阻害剤(GSE56)の一時的な過剰発現により、細胞周期のS/G2/M期にある細胞の割合が変更されるかどうかを調査した。遺伝子編集手順の24時間後に実施したHoechst細胞周期分析により、未処理対照と比較して標準のS/G2/M期にある細胞のパーセンテージが低下する傾向が見いだされ、これは、細胞をGSE56の存在下で編集した場合には部分的にレスキューされた(図12A)。in vivoにおけるHDRにより編集された細胞の収量の改善が標的化遺伝子座とは無関係に一貫しているかどうかを評価するために、GSE56 mRNAで処理した又は処理していないCD34+細胞を限定された用量(T0eq=1.5×105個/マウス)で移植した(図12B)。この実験のために、AAVS1遺伝子座を標的とし、22bpの高度に縮重した分子領域(バーコード)を含む我々が最近開発したAAV6ベクターを使用した。このベクターは、編集された細胞のin vivoクローン追跡、及び移植片のクローン性を改善することができる遺伝子編集プロトコールの同定を可能にするものである。移植されたNSGマウスを分析したところ、遺伝子編集された細胞の画分は標準プロトコールと同様であった(図12D)にもかかわらず、造血器官において有意に高い生着が見いだされた(図12C)。移植片のサイズの増大が、GSE56処理の存在下で編集された細胞のクローン性の改善と関連したかどうかを評価するために、HDRにより編集された細胞の再増殖に寄与する優性クローンの数を、我々の新規のバーコーディングベースのクローン追跡分析によって評価した。実際に、造血器官で6.5倍の優性クローン数が観察され(図12E)、これは、FACSによって測定されるヒトの編集された細胞の収量と直接相関する(図12F)。さらに、高IgM症候群に関連付けられる臨床的に関連性のあるCD40LG遺伝子を標的化することにより、同様の移植実験も実施した(図13A)。GSE56の存在下でCD40LG編集された細胞を移植したマウスの末梢血中のヒト細胞のパーセンテージがより高いことが一貫して見いだされ(図13B)、これは、経時的な遺伝子補正のより安定なパーセンテージと関連付けられる(図13C)。実験の終点で、ヒト細胞のパーセンテージは分析した全ての造血組織及び器官で改善される傾向が見られ(図13D)、CD34+細胞を含む選別された細胞型における補正された細胞のパーセンテージは3〜6倍であった(図13E)。全体として、これらの結果から、図3及び4に報告されていることが確認され、広がり、これにより、in vivoにおける編集された細胞の収量を頑強に改善する一時的なp53阻害の関連性のある役割が強調される。
【０４２５】
HSPCにおけるHDR効率を促進するための、アデノウイルスAd5-E4orf1及びAd5-E4orf6/7の能力に関する調査を継続した。我々の標準の編集手順(RNP+AAV6)の通り、サイトカイン及び薬剤(SR1、dmPGE-2及びUM171)を用いた予備刺激後、3日目に、予めアセンブルされたRNP-Cas9をエレクトロポレーションし、15分後にAAV6による形質導入を行うことにより、ヒト臍帯血(CB)由来CD34+における標的化遺伝子編集プロトコールを実施した。mRNA機構を利用することによるGFP(mRNA対照として)、GSE56、Ad5-E4orf1、Ad5-E4orf6/7又はGSE56/Ad5-E4orf6/7の一時的な送達を対照試験し、編集プロトコールに従った日数以内の各条件について種々のパラメータを特徴付けた(図14A)。まず、標準の編集プロトコールRNP+AAV6では、未処理細胞(UT)と比較して細胞増大が低減したことが観察された。Ad5-E4orf6/7は標準と同様の傾向を有したが、一方GSE56及びAd5-E4orf1では、細胞増殖が約2倍になり、これは、図3D及び7Dの結果と相関する。GSE56/Ad5-E4orf6/7の組合せでは、編集後7日目まで中間のパターンが示され、10日目にはGSE56及びAd5-E4orf1の両方のレベルに達した(図14B)。HSPC亜集団内でのGFP発現を測定することによって編集効率を評価した(図14Cの左側のパネル及び右側のパネル)。GSE56では、標準のRNP+AAV6と比較して、特に最も原始的な区画(CD34+133+90+)においてGFP発現の1.1倍の増大が示され、これは、図3C、右側のパネルに記載されている通り、わずかなものではあるが、有意であった。同様に、Ad5-E4orf1又はAd5-E4orf6/7±GSE56では、CD90+細胞においてGFP発現のそれぞれ最大1.3倍及び1.5倍の増大が示された。標的化AAVS1遺伝子座におけるHDR媒介組込みの促進についてバルク培養下でのデジタルPCRによって検討することにより、これらの結果を検証した(図14D)。HDRにより編集された対立遺伝子は、Ad5-E4orf6/7±GSE56を使用すると有意に増加したが、一方、NHEJ画分はいずれの条件でも同様のままであった。さらに、Ad5-E4orf6/7±GSE56を添加することによってのみ、CD90+画分の有意な歪みが観察され、これは、毒作用又は細胞分化の可能性を示唆するものであり得る(図14E)。次いで、7-AAD/アネキシン染色を実施して、我々の編集プロトコールの毒性を評価した。標準ではUTと比較して生細胞の数の減少が見られたが、RNAを添加することによる付加的な毒性は観察されなかった(図14F)。興味深いことに、CFU-Cアッセイを実施することにより、赤血球及び骨髄系クローン原性アウトプットは、標準プロトコールと比較して、mRNA対照としてのGFP又はAd5-E4orf6/7の送達の影響を受けなかった。図3Fに記載されている通りGSE56を用いた場合及びAd5-E4orf1を用いた場合には改善さえされた。しかし、Ad5-E4orf6/7±GSE56の利用は、培養組成物中に見られるCD90+画分の減少と相関し得ることが傾向のままであり、有意でなかったとしても、クローン原性に負の影響を及ぼすと思われる(図14G)。最後に、編集プロトコールの際のHSPCの細胞周期の状態を評価した。バルク処理細胞のG1期からS/G2/M期への有意な移行が明白に示されたAd5-E4orf6/7の使用は、GSE56と組み合わせることによって主に増幅された。最も原始的な区画を調査することにより、同様のパターンが観察された。GSE56又はAd5-E4orf1を使用すると、この効果は低く、有意でなかった(図14H)。二対立遺伝子AAVS1遺伝子座を標的とすることによって得られた以前の結果を確認するために、別のゲノム中の一対立遺伝子IL2RG遺伝子座を標的とすることによる編集戦略も展開した。HSPC亜集団内でのGFP発現を測定したところ、Ad5-E4orf6/7±GSE56を使用することにより、倍率が標準のRNP+AAV6と比較して低減したとしても有意な編集効率の上昇がなお存在した。これは、この遺伝子座が一対立遺伝子形態であることに起因すると推測することができた(図14I)。さらに、Ad5-E4orf6/7により細胞周期が後押しされることを考慮して、HSCP特性をさらに保存するためにex-vivo培養中の編集プロトコールのタイミングを再調査した。解凍後0日目から2日目までの、編集プロトコールを進行さ
せる種々の時点を評価した(図14J)。興味深いことに、総バルク及びCD90+細胞画分のどちらにおいても、Ad5-E4orf6/7の存在下では0日目から2日目まで編集効率が上昇したことが観察された(図14K)。これらの結果を、標的化AAVS1遺伝子座におけるHDR媒介組込みの促進についてバルク培養下でのデジタルPCRによって検討することによって確認した(図14L)。Ad5-E1B55K及びAd5-E4orf6タンパク質を用いて同様の特徴付けを実施した(図15A、B、C、D及びE)。以前に記載されている通り、これらの2つのタンパク質の組合せにより、AAV6ドナーからのGFP発現が有意に増大したが(Gwiazda, K.S.ら、(2016)、Mol. Ther. 24: 1-11)、一方で、すでに観察された通り、標的化AAVS1遺伝子座におけるHDR媒介組込みは標準手順と比較して低減した(図8)。
【０４２６】
細胞周期分析により、Ad5-E4orf6/7によりHSPCにおける細胞周期進行が誘導されることが実証された。1989年に、Huangら(Huang, M.M.ら、(1989)、Genes Dev. 3: 1699-1710)により、Ad5-E4orf6/7とE2Fs転写因子ファミリーの直接的相互作用が記載されている。HSPCにおけるRNAレベルでのE2Fs関連遺伝子発現を探究することにした。細胞周期の制御に関与し、p53に関連することが分かっている特定の遺伝子標的を選択した。TaqMan遺伝子発現アッセイを使用して、いくつかの編集プロトコールの際の特異的な転写物を定量化した。CDK2は、G1期からS/G2期への移行に特異的な細胞周期進行マーカーであることが分かっている。CDK2がAd5-E4orf6/7±GSE56の存在下で編集の24時間後に有意に上方制御され(図16A)、これは12時間から24時間までの時間ウインドウで検出可能であり、その後、96時間後に低減したが(図16B)、一方、RNP+AAV6±GSE56の場合では、常に基底レベルのままであったことが認められた。CDKN2Aは「p14ARF」として知られており、その主要なリプレッサーであるMDM2を阻害することによるp53モジュレーターであることが記載されている。再度、CDKN2AはAd5-E4orf6/7±GSE56の存在下で編集の24時間後に有意に上方制御され(図16C)、CDK2と同様に、12時間から24時間までの時間ウインドウで検出可能であり、その後、96時間後には低減したが(図16D)、一方、RNP+AAV6±GSE56では基底レベルのままであったことが認められた。次いで、おそらくE2Fsによって活性化されるCDKN1A及びAPOBEC3Hのようなp53下流エフェクターを調査した。CDKN1Aは「p21」として知られており、細胞周期静止に関与するp53の直接標的である。実際に、CDKN1Aは、標準プロトコールであるRNP+AAV6において編集の24時間後に高度に上方制御され、これは、編集プロトコールの直接の結果である(図16E)。p53阻害剤であるGSE56の使用により、図3Bに記載されている通り、RNP+AAV6と比較してp21活性化の大きさを約3分の1に縮小することが可能であった。しかし、Ad5-E4orf6/7を使用することにより、編集の12時間後に、標準と比較して約2倍よりも大きなCDKN1A発現の降下が認められた。興味深いことに、この降下は、GSE56/Ad5-E4orf6/7を組み合わせた場合には検出可能でなく、これはおそらく、Ad5-E4orf6/7に媒介されるp21過剰発現を釣り合わせるGSE56特性に起因する(図16F)。最後に、CDKN1Aでは編集の168時間後に基底レベルに戻った。最終的に、ウイルスゲノムにおけるCからTへの突然変異を誘導することによって抗ウイルス細胞応答に関与するAPOBEC3Hを試験した。APOBEC3Hは、編集プロトコールの際に、HSPCへのAAV6による形質導入に主に起因して高度に上方制御される(図3B)。しかし、APOBEC3Hは、Ad5-E4orf6/7及び/又はGSE56の存在下では、編集の24時間後に有意に下方制御された(図16G)。しかし、APOBEC3Hが96時間後に上昇し、その後、168時間後に低下することが認められた(図16H)。要約すると、Ad5-E4orf6/7とE2Fsの相互作用が、HSPC細胞周期進行及び編集プロトコールの際のHDR事象の増大に関与する機構であることが実証された。細胞周期を調節することを可能にするp53媒介フィードバックループの存在も強調された。しかし、p53活性を一時的に遮断することにより、特に最も原始的なCD90+細胞の細胞周期進行をさらに後押しすることができた(図16I)。
【０４２７】
次いで、編集の24時間後に多数の処理細胞(T0eq=3×105/マウス)を使用することによる、免疫不全NSGマウスモデルへの第1の移植を計画した(図17A)。血流中のヒトCD45+細胞の生着を移植後数週間にわたってモニタリングし、それにより、いくつかの群RNP+AAV6±Ad5-E4orf1、Ad5-E4orf6/7又はGSE56/Ad5-E4orf6/7の間でいかなる統計的有意性も示されず、これはおそらく、これらのレシピエントへの生着能の飽和に起因する(図17B)。興味深いことに、図4Dに記載されている時間の間、HDRにより編集されたGFP+細胞の画分がわずかに減少し、これは、標的化前駆体の喪失に起因する可能性がある。しかし、プロトコールRNP+AAV6+Ad5-E4orf6/7又はGSE56/Ad5-E4orf6/7では循環している編集された細胞の画分がそれぞれ1.5倍及び2倍に増大したことが認められた。Ad5-E4orf1を使用することによる編集では標準のパターンと同様のままであった(図17C)。これらの結果を、実験の最後にマウス脾臓及び骨髄器官を分析することによって確認した(図17D及びE)。さらに、我々のAAV6カセット内にバーコード配列を使用することによってクローン追跡を実施した。一次移植に沿って、細胞をGSE56/Ad5-E4orf6/7で処理することにより、標準と比較して編集されたクローンが最大3倍多く検出された(図17F)。
【０４２８】
最も原始的な細胞の長期間の再増殖能をさらに調査するために、一次レシピエントの骨髄からCD34+細胞を収集し、精製することにより、二次移植を実施することにした。マウス依存性異型遺伝子性を回避するために、同じ群内の精製されたCD34+プールから、及び1つの二次レシピエントに対して2つの一次レシピエントを考慮に入れることにより、マウス当たりおよそ2×106個の細胞を移植した(図18A)。生着は各群の間で極めて高く、同様であったが、それでもなお、循環している編集されたヒト細胞に関して有意差が観察され、特に、標準RNP+AAV6±GSE56/Ad5-E4orf6/7を比較してGFP発現細胞が2倍よりも大きく増加した(図18B及びC)。これは又、分析した区画の全て(骨髄及び脾臓)、並びに血液系列、CD19+、CD33+及びCD3+の全てに関して真であった(図18D、E及びF)。全体として、これらの結果から、GSE56/Ad5-E4orf6/7により、編集プロトコールの間に細胞周期進行が誘導されること及びおそらくp53依存性転写応答が低減することにより、移植されたマウスモデルにおける編集された細胞の画分の有意な増加が可能になり、これた最も原始的なHSPC区画の長期間の機能のより良好な保存の助けになることが示される。
【０４２９】
この最後の点をさらに解明するために、又、GSE56で処理した新しい群を並行して含めて、限定された細胞用量での移植(T0eq=1×105/マウス)を実施した。これらの状況では、編集された細胞画分は以前の実験と同様であったが、条件間での生着能に関する差異をよりよく理解できた(図19A及びB)。予測通り、GSE56では標準プロトコールと比較して処理細胞の生着が5〜6倍多く生じた(図4Bも参照されたい)。興味深いことに、GSE56/Ad5-E4orf6/7の組合せでは、生着が標準と比較して約2倍多くもたらされたが、それでもGSE56単独による処理と比較すると低い。次いで、推測により2つの仮説を立てることができた:一方では、Ad5-E4orf6/7により編集プロトコールの間に一時的なp53過剰発現が誘導され、これにより処理細胞がさらにいっそう損なわれることが分かっている。したがって、これを釣り合わせるためにより多くのGSE56用量が必要になる。他方では、p53阻害剤の使用により、細胞周期の調節を可能にするフィードバックループの喪失が誘導され、これはAd5-E4orf6/7によって後押しされることが分かっている。したがって、幹細胞がHDRをより起こしやすいが、対応してマウスにおける長期間の生着能に関しても影響を受けるのであろうか、という疑問が生じ得る。
【０４３０】
以前のデータを補強するために、IL2RG遺伝子座を標的とし、図17と同様にNSGマウスに移植することにより(T0eq=3×105/マウス)、RNP+AAV6±GSE56/Ad5-E4orf6/7を比較することによって別のin vivo実験を実施することにした。次いで、NSGマウスへの一次移植後及び二次移植後の両方の以前の結果を確認した。組合せGSE56/Ad5-E4orf6/7を使用することにより、標準プロトコールと比較して、二次移植においても器官及び血液系列内の編集された細胞の2/3倍の増加が観察された(図20A、B、C、D、E、F、G及びH)。GSE56及びAd5-E4orf6/7の両方を用いて補完することによる編集手順の潜在的な遺伝毒性を評価するために、我々の試薬を用いてIL2RG遺伝子座を標的化することによって転座分析を実施し、1つの主要なオフターゲットを同定した。興味深いことに、ddPCRにより、標準プロトコールと比較してゲノム転座事象の発生頻度の増加は観察されなかった。さらに、in vivo試料に関しては、事象は検出されず、分化した細胞ではこの現象がより起こりやすい可能性があることが示唆された(図20I)。
【０４３１】
最後に、種々の血清型のアデノウイルスファミリーに由来するE4orf1及びE4orf6/7の両方についてアデノウイルスタンパク質バリアントの使用も調査した。T-coffeeアルゴリズムを使用することによってタンパク質配列アラインメントを実施し、特定の保存されたアミノ酸を同定した(>95%コンセンサス)。共通の祖先の系統樹に沿って最も大きな配列変動性を示す最良の候補を選択した。次いで、各タンパク質について3種のバリアントを選択し、HSPCにおける編集効率を評価した(図21/22A及びB)。E4orf1バリアントでは、Ad5-E4orf1と比較して、HSPC亜集団内でのGFP発現の最大2倍の増大が示された(図21C)。しかし、Ad5-E4orf1が最も多いコロニー数を示すものであることに変わりはなかった(図21D)。驚いたことに、TaqMan解析では、いずれのE4orf1バリアントであってもE2Fs標的遺伝子にいかなる影響も示されなかった。これにより、処理細胞の細胞周期活性を刺激する代替機構が示唆される(図21E)。E4orf6/7に関しては、ただ1つのバリアントが最も原始的な区画への編集効率が最大2倍に上昇し、一方、2つの他のバリアントはAd5-E4orf6/7と同様のままであった(図22C)。しかし、コロニー形成細胞アッセイを検討することにより、これらのバリアントの全てが、処理細胞のクローン原性能を損なうと思われる(図22D)。RNAレベルでは、これらのバリアントにより、CDKN1A及びCDKN2Aの両方のフィードバックループ応答が強烈に誘導されることが明らかになっており、これにより、Ad5-E4orf6/7の使用と比較してある種の毒性があることが明らかになった(図22E)。
【０４３２】
考察
GSE56及びAd5-E4orf6/7の両方の一時的な発現により、HSPCにおける我々の標準の標的化遺伝子編集プロトコールを改善することができることが実証された。一方では、GSE56により、編集プロトコールの間の編集された細胞の機能障害がp53応答のモジュレーションによって低減する。移植後により大きな生着能が観察され、NSGマウスにおける豊富なクローンの数の増加が観察された。HDR効率に関する一貫しているが低い上昇にもかかわらず、編集された細胞画分が、標準プロトコールよりも長期間安定であることが明らかになり、最も原始的な細胞が編集プロトコールの間に受ける損害がGSE56のおかげで少ないことが示唆される。さらに、p53の一時的な阻害により、天然にp53が欠損したHSPCはおそらく選択されず、これにより、移植下で推定上の腫瘍になりやすいクローンが持ち越されることが回避される。他方では、Ad5-E4orf6/7アデノウイルスタンパク質により、細胞周期進行を後押しすることができ、それにより、HSPCのAAVS1遺伝子座におけるHDR事象の組込みの1.5倍の増大が導かれたことが発見された。GSE56と組み合わせたところ、p53媒介フィードバックループを迂回する最も原始的な細胞を直接標的化することが可能であった。したがって、この特定の場合にGSE56単独での使用と比較して生着能に部分的に影響を及ぼしたとしても、in-vivoにおける長期間の編集されたHSC画分を最大50%増大させることができ、又、豊富なクローンの総数を増加させることができた。この最後の点は、最も原始的な区画へのある種の細胞分化を誘導する細胞周期の後押しによって説明することができる。次いで、GSE56及びAd5-E4orf6/7用量の両方をモジュレートすることによってHDRと生着能を平衡化することができると想定した。
【０４３３】
要約すると、2つの戦略を区別することができる:一方では、GSE56を単独で用いる編集プロトコールを使用することにより、より大きな処理細胞の生着及びin-vivoにおけるホーミングした編集された細胞及び循環している編集された細胞の両方の小さな画分の長期間の安定性が得られる。他方では、GSE56/Ad5-E4orf6/7を使用することにより、GSE56単独と比較して、編集された細胞のパーセンテージが2/3倍に改善されたが、一方、生着は低減した。結論付けると、移植の間のレシピエントの能力は限定され、ホーミングプロセスの間に新しく移植された細胞間の競合が関与することが公知である。したがって、編集された細胞の画分、したがってそれらが骨髄ニッチに到達し得る確率はより大きくなるとにより、編集されていない細胞との競合が克服されるといえる。最後に、GSE56/Ad5-E4orf6/7の組合せが、編集された細胞が高レベルで必要とされる疾患に対して最良の選択肢であり得る。
【０４３４】
[実施例4]
説明
レトロウイルスベクターベースの遺伝子治療及びレンチウイルスベクター(LV)ベースの遺伝子治療は、組込み部位をモニタリングすることによるクローン追跡試験を可能とするが(Biffiら、2013)、HDR媒介標的化挿入の部位特異的かつ高忠実度な性質により、編集されたクローンの定量化及びモニタリングが妨害される。少数のNHEJベースの追跡解析(Wuら、2019)以外は、個々のHDRにより編集された長期間の再増殖HSPCの多系列再増殖能、並びにヒト移植片内でのクローン多様性に関するデータは入手可能ではない。したがって、遺伝子編集された細胞に対する新規の広範囲にわたるクローン追跡パイプラインの開発により、以下が可能になる:i)再増殖ダイナミクスを詳細に解析すること;ii)異なるHSPC遺伝子編集プロトコールの間でクローンの豊富さを比較すること、及びiii)編集されたHSPCを翻訳の状況で追跡する道を開くこと。以前の研究により、短いランダム配列(バーコード)をウイルスベクターのゲノムに導入して、細胞ゲノムにベクターを組み込んだ際のバーコード標識された細胞の運命を追跡することの価値が強調されている(Naikら、2014)。バーコード付けしたベクターの組込みは、異なる分野で、例えば、造血(Verovskayaら、2013)、T細胞挙動(Schepersら、2008)及び乳房組織発達(Nguyenら、2014)を研究するために以前に適用されている。最近、いくつかの報告により、CRISPRにより編集されたS.cerevisiaeクローンの運命を追跡するために、ゲノム編集とバーコーディング技術を組み合わせることの可能性が強調された(Royら、2018)。
【０４３５】
結果及び考察
in vitro及びin vivoにおける標的化HSPCのクローン追跡を可能にするために、22bpの高度に縮重した分子バーコードを、AAVS1遺伝子座を標的とするHDR能力を有するAAVベクターにクローニングした(図23及び方法を参照されたい)。理論的に、配列設計により、最大4.53×108種の異なるバーコードが可能になる。より短いインサートはクローニング手順の間に骨格内に優先的にライゲーションすることができ、ライブラリーの複雑さが減少するので、縮重したインサートがクローニング手順の間に所望の制限酵素(Bsu36I及びSphI)によって切断されることを回避するために、3つの固定された塩基を使用した。カセットがAAVS1遺伝子座に部位特異的に組み込まれたら、バーコードを含む標的配列をPCRによって増幅し、ディープシーケンシングによって解析して、HDRにより編集されたクローンの数及び分布を同定することができる。
【０４３６】
潜在的に、このAAVベクター/プラスミドを使用して、前臨床適用及び臨床適用のために、いずれの細胞型(マウス/ヒトHSPC、T細胞など)に関してもクローン追跡を実施することができる。さらに、縮重したバーコード配列も異なる型のベクター(短い若しくは長いネイキッドDNA断片、IDLVなど)、又は目的の他のゲノム領域(例えば IL2RG、CD40LG、RAG1、HBBなど)を標的化する構築物にクローニングすることができる。
【０４３７】
方法
縮重した配列をバーコード付けしていないAAVS1 HDRドナー鋳型のポリアデニル化配列の下流にサブクローニングすることによって、AAVS1遺伝子座を標的とするバーコード付けしたAAV6ドナー鋳型を得た(Schiroliら、2017)。簡単に述べると、独特のクローニング制限部位(Bsu36I及びSphI)に挟まれたランダム配列が埋め込まれたssODNをSigma Aldrichから購入した。クローニング制限酵素によるあらゆる望ましくない切断を回避するように、縮重した領域を設計した。相補鎖を生成するために、50pmolのssODNを、Easy-A High-Fidelity enzyme(Agilent Technologies)を用い、妥当なフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用し、製造者の指示に従って10サイクルのPCRで増幅した。MinElute PCR Purification kit(QIAGEN)を用いて増幅産物を精製し、制限酵素で消化し、キャピラリー電気泳動によって確認した。製造者のプロトコールをスケールアップすることにより、T4 DNAリガーゼ(NEB)を使用して、Bsu36I/SphIで消化したAAVS1 HDRドナー鋳型2μgを消化されたインサート(モル比1:7)とライゲーションした。最後に、XL-10 Gold Ultracompetent Cells(Agilent Technologies)をライゲーション産物で形質転換し、プレーティングし、組換えのリスクを最小限にするために30℃で12時間インキュベートした。コロニーをかき取り、混合し、LB培地中でさらに6時間増殖させ、NucleoBond Xtra MaxiPrepを用いて製造者の指示に従って処理した。最終的に、プラスミド調製物を、制限酵素を用いてITR及びプラスミド完全性についてスクリーニングした。
【０４３８】
配列
バーコード付けされたAAVのゲノムインサート(下線=バーコーディング配列)
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【０４３９】
ssODN増幅プライマー
Bar AAVS1センス5'-AGACTAGGAAGGAGGAGGCCTAAGGATG-3'
Bar AAVS1アンチセンス5'-ACAATAGCAGGCATGCTGGGGATG-3'
【０４４０】
ssODN
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【０４４１】
上記の明細書において言及されている刊行物は全て、参照により本明細書に組み込まれる。開示されている本発明の使用、方法、細胞及び組成物の種々の改変及び変形が本発明の範囲及び主旨から逸脱することなく当業者には明らかになろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関して開示してきたが、特許請求された本発明をそのような特定の実施形態に過度に限定すべきではないことが理解されるべきである。実際に、本発明を実行するための開示された方式の当業者にとって明白な種々の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内に入るものとする。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図２１−６】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２２−４】
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【図２２−５】
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【図２２−６】
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【図２２−７】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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