(57)【要約】本出願は、遺伝子編集のための直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターについて説明する。ｃｅＤＮＡベクターは、２つのＩＴＲ配列が隣接する発現カセットを含み、発現カセットは、遺伝子編集分子をコードする。一部のｃｅＤＮＡベクターは、調節スイッチを含むシス調節エレメントをさらに含む。ｃｅＤＮＡベクターを使用する信頼できる遺伝子編集のための方法および細胞株が、本明細書でさらに提供される。
2021505159.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターであって、
隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）間に少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの遺伝子編集分子をコードする、ｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２】
少なくとも１つの遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、およびアクチベーターＲＮＡから選択される、請求項１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３】
少なくとも１つの遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼである、請求項２に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼが、配列特異的ヌクレアーゼである、請求項３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項５】
前記配列特異的ヌクレアーゼが、核酸誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはｍｅｇａＴＡＬから選択される、請求項４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項６】
前記配列特異的ヌクレアーゼが、一塩基エディター、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、およびＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼから選択される核酸誘導型ヌクレアーゼである、請求項５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項７】
少なくとも１つの遺伝子編集分子が、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡである、請求項２または請求項６に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項８】
少なくとも１つの遺伝子編集分子が、アクチベーターＲＮＡである、請求項２、６、または７に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項９】
前記核酸誘導型ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである、請求項６〜８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡ。
【請求項１０】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項９に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１１】
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、ニッキングＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、および不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）から選択される、請求項１０に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１２】
前記ｎＣａｓ９が、ＣａｓのＨＮＨまたはＲｕＶｃドメインに突然変異を含む、請求項１１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１３】
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、標的遺伝子のプロモーター領域を標的とするｇＲＮＡと複合体を形成する不活性化Ｃａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）である、請求項１１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１４】
ＫＲＡＢエフェクタードメインをさらに含む、請求項１３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１５】
前記ｄＣａｓが、プロモーター領域に向けられ得る異種転写活性化ドメインに融合される、請求項１３または請求項１４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１６】
前記ｄＣａｓ融合が、標的遺伝子の発現を上方調節するために追加のトランス活性化ドメインを動員するガイドＲＮＡによって前記標的遺伝子のプロモーター領域に向けられる、請求項１５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１７】
前記ｄＣａｓが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ｄＣａｓ９である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１８】
前記ガイドＲＮＡ配列が、標的遺伝子のプロモーターを標的とし、ＣＲＩＳＰＲが、前記標的遺伝子をサイレンシングする（ＣＲＩＳＰＲｉ系）、請求項７〜１７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１９】
前記ガイドＲＮＡ配列が、標的遺伝子の転写開始部位を標的とし、前記標的遺伝子を活性化する（ＣＲＩＳＰＲａ系）、請求項７〜１７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの遺伝子編集分子が、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、請求項６〜１９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２１】
前記ｇＲＮＡが、スプライスアクセプターまたはスプライスドナー部位を標的とする、請求項７〜２０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２２】
前記スプライスアクセプターまたはスプライスドナー部位を標的とすることが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および欠陥遺伝子の訂正をもたらす、請求項２１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２３】
前記ベクターが、１つのガイドＲＮＡ配列の複数のコピーをコードする、請求項７〜２２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２４】
第１の異種ヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第１の調節配列を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２５】
前記第１の調節配列が、プロモーターを含む、請求項２４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２６】
前記プロモーターが、ＣＡＧ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｕ６、またはＨ１である、請求項２５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２７】
前記第１の調節配列が、モジュレーターを含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２８】
前記モジュレーターが、エンハンサーおよびリプレッサーから選択される、請求項２７に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２９】
前記第１の異種ヌクレオチド配列が、前記ヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列の上流にイントロン配列を含み、前記イントロン配列が、ヌクレアーゼ切断部位を含む、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３０】
第２の異種ヌクレオチド配列が、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第２の調節配列を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３１】
前記第２の調節配列が、プロモーターを含む、請求項３０に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３２】
前記プロモーターが、ＣＡＧ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｕ６、またはＨ１である、請求項３１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３３】
前記第２の調節配列が、モジュレーターを含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３４】
前記モジュレーターが、エンハンサーおよびリプレッサーから選択される、請求項３３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３５】
第３の異種ヌクレオチド配列が、アクチベーターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第３の調節配列を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３６】
前記第３の調節配列が、プロモーターを含む、請求項３５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３７】
前記プロモーターが、ＣＡＧ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｕ６、またはＨ１である、請求項３６に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３８】
前記第３の調節配列が、モジュレーターを含む、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３９】
前記モジュレーターが、エンハンサーおよびリプレッサーから選択される、請求項３８に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４０】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、標的核酸配列に対する５’相同性アームおよび３’相同性アームを含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４１】
前記５’相同性アームおよび前記３’相同性アームが各々、約２５０〜２０００ｂｐである、請求項４０に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４２】
前記５’相同性アームおよび／または前記３’相同性アームが、ＩＴＲの近位にある、請求項４０または請求項４１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４３】
少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、前記５’相同性アームと前記３’相同性アームとの間にある、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４４】
前記５’相同性アームと前記３’相同性アームとの間にある前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、標的遺伝子を含む、請求項４３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４５】
遺伝子編集分子をコードする前記ｃｅＤＮＡベクター少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、前記５’相同性アームと前記３’相同性アームとの間にはない、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４６】
遺伝子編集分子をコードする前記異種ヌクレオチド配列のいずれも、前記５’相同性アームと前記３’相同性アームとの間にはない、請求項４５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４７】
前記５’相同性アームの上流に第１のエンドヌクレアーゼ制限部位を含み、かつ／または前記３’相同性アームの下流に第２のエンドヌクレアーゼ制限部位を含む、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４８】
前記第１のエンドヌクレアーゼ制限部位および前記第２のエンドヌクレアーゼ制限部位が、同じ制限エンドヌクレアーゼ部位である、請求項４７に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４９】
少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ制限部位が、同じく前記ｃｅＤＮＡベクター上にコードされるエンドヌクレアーゼによって切断される、請求項４７または請求項４８に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項５０】
１つ以上のポリＡ部位をさらに含む、請求項４０〜４９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項５１】
導入遺伝子調節エレメント、ならびに下流にありかつ前記３’相同性アームに近接する、および／または上流にありかつ前記５’相同性アームに近接するポリＡ部位のうちの少なくとも１つを含む、請求項４０〜５０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項５２】
上流にありかつ前記３’相同性アームに近接する２Ａおよび選択マーカー部位を含む、請求項４０〜５１のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項５３】
前記５’相同性アームが、染色体上のヌクレアーゼ切断部位の上流のヌクレオチド配列と相同である、請求項４０〜５２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項５４】
前記３’相同性アームが、染色体上のヌクレアーゼ切断部位の下流のヌクレオチド配列と相同である、請求項４０〜５３のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項５５】
相同組み換えのエンハンサーをコードする異種ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項５６】
相同組み換えの前記エンハンサーが、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー配列、サイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメント、ＲＳＶエンハンサー、およびＣＭＶエンハンサーから選択される、請求項５５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項５７】
少なくとも１つのＩＴＲが、機能性末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む、請求項１〜５６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項５８】
前記隣接するＩＴＲが、対称または非対称である、請求項１〜５７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項５９】
前記隣接するＩＴＲが、非対称であり、前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ配列から、前記ＩＴＲの全体的な３次元コンフォメーションに影響を与える欠失、付加、または置換によって変更されている、請求項５８に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項６０】
少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、ｃＤＮＡである、請求項１〜５９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項６１】
前記隣接するＩＴＲのうちの１つ以上が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項１〜６０に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項６２】
前記ＩＴＲのうちの１つ以上が、合成のものである、請求項１〜６１のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項６３】
前記ＩＴＲのうちの１つ以上が、野生型ＩＴＲではない、請求項１〜６２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項６４】
前記ＩＴＲのうちの１つ以上両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択されるＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つにおける欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１〜６３のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項６５】
前記欠失、挿入、および／または置換が、通常はＡ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、またはＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、請求項６４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項６６】
前記ＩＴＲが、対称である、請求項１〜５８または５６〜６５のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項６７】
前記ＩＴＲが、野生型である、請求項１〜５８、６０、６１、および６６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項６８】
両方のＩＴＲが、前記ＩＴＲが互いに対して反転されたときに全体的な３次元対称性をもたらすように変更されている、請求項１〜６６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項６９】
前記変更が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択される前記ＩＴＲ領域における欠失、挿入、および／または置換である、請求項６８に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項７０】
ゲノム編集のための方法であって、
細胞を遺伝子編集系と接触させることを含み、前記遺伝子編集系の１つ以上の構成成分が、前記細胞を、隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）の間に少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含む非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターと接触させることによって前記細胞に送達され、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの遺伝子編集分子をコードする、方法。
【請求項７１】
少なくとも１つの遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、およびアクチベーターＲＮＡから選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
少なくとも１つの遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ヌクレアーゼが、配列特異的ヌクレアーゼである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記配列特異的ヌクレアーゼが、核酸誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはｍｅｇａＴＡＬから選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記配列特異的ヌクレアーゼが、一塩基エディター、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、およびＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼから選択される核酸誘導型ヌクレアーゼである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
少なくとも１つの遺伝子編集分子が、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡである、請求項７０または７５に記載の方法。
【請求項７７】
少なくとも１つの遺伝子編集分子が、アクチベーターＲＮＡである、請求項７０、７５、または７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記核酸誘導型ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである、方法７４〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、ニッキングＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、および不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）から選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ｎＣａｓ９が、ＣａｓのＨＮＨまたはＲｕＶｃドメインに突然変異を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、標的遺伝子のプロモーター領域を標的とするｇＲＮＡと複合体を形成する不活性化Ｃａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
ＫＲＡＢエフェクタードメインをさらに含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記ｄＣａｓが、プロモーター領域に向けられ得る異種転写活性化ドメインに融合される、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記ｄＣａｓ融合が、標的遺伝子の発現を上方調節するために追加のトランス活性化ドメインを動員するガイドＲＮＡによって前記標的遺伝子のプロモーター領域に向けられる、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ｄＣａｓが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ｄＣａｓ９である、請求項８２〜８５のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
前記ガイドＲＮＡ配列が、標的遺伝子のプロモーターを標的とし、ＣＲＩＳＰＲが、前記標的遺伝子をサイレンシングする（ＣＲＩＳＰＲｉ系）、請求項７８〜８６のいずれかに記載の方法。
【請求項８８】
前記ガイドＲＮＡ配列が、標的遺伝子の転写開始部位を標的とし、前記標的遺伝子を活性化する（ＣＲＩＳＰＲａ系）、請求項７８〜８６のいずれかに記載の方法。
【請求項８９】
前記少なくとも１つの遺伝子編集分子が、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、請求項７６〜８８のいずれかに記載の方法。
【請求項９０】
前記ｇＲＮＡが、スプライスアクセプターまたはスプライスドナー部位を標的とする、請求項７６〜８９のいずれかに記載の方法。
【請求項９１】
前記スプライスアクセプターまたはスプライスドナー部位を標的とすることが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および欠陥遺伝子の訂正をもたらす、請求項２２に記載の方法。
【請求項９２】
前記ベクターが、１つのガイドＲＮＡ配列の複数のコピーをコードする、請求項７６〜９１に記載の方法。
【請求項９３】
第１の異種ヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第１の調節配列を含む、請求項７０〜９２のいずれかに記載の方法。
【請求項９４】
前記第１の調節配列が、プロモーターを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記プロモーターが、ＣＡＧ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｕ６、またはＨ１である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記第１の調節配列が、モジュレーターを含む、請求項９３〜９５のいずれかに記載の方法。
【請求項９７】
前記モジュレーターが、エンハンサーおよびリプレッサーから選択される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記第１の異種ヌクレオチド配列が、前記ヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列の上流にイントロン配列を含み、前記イントロン配列が、ヌクレアーゼ切断部位を含む、請求項９３〜９７のいずれかに記載の方法。
【請求項９９】
第２の異種ヌクレオチド配列が、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第２の調節配列を含む、請求項７０〜９８のいずれかに記載の方法。
【請求項１００】
前記第２の調節配列が、プロモーターを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記プロモーターが、ＣＡＧ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｕ６、またはＨ１である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記第２の調節配列が、モジュレーターを含む、請求項９９〜１０１のいずれかに記載の方法。
【請求項１０３】
前記モジュレーターが、エンハンサーおよびリプレッサーから選択される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
第３の異種ヌクレオチド配列が、アクチベーターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第３の調節配列を含む、請求項７０〜１０３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０５】
前記第３の調節配列が、プロモーターを含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記プロモーターが、ＣＡＧ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｕ６、またはＨ１である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記第３の調節配列が、モジュレーターを含む、請求項１０４〜１０６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０８】
前記モジュレーターが、エンハンサーおよびリプレッサーから選択される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、標的核酸配列に対する５’相同性アームおよび３’相同性アームを含む、請求項７０〜１０８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１０】
前記５’相同性アームおよび前記３’相同性アームが各々、約２５０〜２０００ｂｐである、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記５’相同性アームおよび／または前記３’相同性アームが、ＩＴＲの近位にある、請求項１０９または１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、前記５’相同性アームと前記３’相同性アームとの間にある、請求項１０９〜１１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１１３】
前記５’相同性アームと前記３’相同性アームとの間にある前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、標的遺伝子を含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
遺伝子編集分子をコードする前記ｃｅＤＮＡベクター少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、前記５’相同性アームと前記３’相同性アームとの間にはない、請求項１０９〜１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
遺伝子編集分子をコードする前記異種ヌクレオチド配列のいずれも、前記５’相同性アームと前記３’相同性アームとの間にはない、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記５’相同性アームの上流の第１のエンドヌクレアーゼ制限部位および／または前記３’相同性アームの下流の第２のエンドヌクレアーゼ制限部位を含む、請求項１０９〜１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記第１のエンドヌクレアーゼ制限部位および前記第２のエンドヌクレアーゼ制限部位が、同じ制限エンドヌクレアーゼ部位である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ制限部位が、同じく前記ｃｅＤＮＡベクター上にコードされるエンドヌクレアーゼによって切断される、請求項１１６または１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
１つ以上のポリＡ部位をさらに含む、請求項１０９〜１１８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２０】
導入遺伝子調節エレメント、および下流にありかつ前記３’相同性アームに近接する、および／または上流にありかつ前記５’相同性アームに近接するポリＡ部位のうちの少なくとも１つを含む、請求項１０９〜１１９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２１】
上流にありかつ前記３’相同性アームに近接する２Ａおよび選択マーカー部位を含む、請求項１０９〜１２０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２２】
前記５’相同性アームが、染色体上のヌクレアーゼ切断部位の上流のヌクレオチド配列と相同である、請求項１０９〜１２１のいずれかに記載の方法。
【請求項１２３】
前記３’相同性アームが、染色体上のヌクレアーゼ切断部位の下流のヌクレオチド配列と相同である、請求項１０９〜１２２のいずれかに記載の方法。
【請求項１２４】
相同組み換えのエンハンサーをコードする異種ヌクレオチド配列を含む、請求項１０９〜１２３のいずれかに記載の方法。
【請求項１２５】
相同組み換えの前記エンハンサーが、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー配列、サイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメント、ＲＳＶエンハンサー、およびＣＭＶエンハンサーから選択される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
少なくとも１つのＩＴＲが、機能性末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む、請求項７０〜１２５のいずれかに記載の方法。
【請求項１２７】
前記隣接するＩＴＲが、対称または非対称である、請求項７０〜１２６のいずれかに記載の方法。
【請求項１２８】
前記隣接するＩＴＲが、非対称であり、前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ配列から、前記ＩＴＲの全体的な３次元コンフォメーションに影響を与える欠失、付加、または置換によって変更されている、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、ｃＤＮＡである、請求項７０〜１２８のいずれかに記載の方法。
【請求項１３０】
前記隣接するＩＴＲのうちの１つ以上が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項７０〜１２９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３１】
前記ＩＴＲのうちの１つ以上が、合成のものである、請求項７０〜１３０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３２】
前記ＩＴＲのうちの１つ以上が、野生型ＩＴＲではない、請求項７０〜１３１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３３】
前記ＩＴＲのうちの１つ以上両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択されるＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つにおける欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項７０〜１３２のいずれかに記載の方法。
【請求項１３４】
前記欠失、挿入、および／または置換が、通常はＡ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、またはＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記ＩＴＲが、対称である、請求項７０〜１２７または１２９〜１３４のいずれかに記載の方法。
【請求項１３６】
前記ＩＴＲが、野生型である、請求項７０〜１２７または１２９〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
両方のＩＴＲが、前記ＩＴＲが互いに対して反転されたときに全体的な３次元対称性をもたらすように変更されている、請求項７０〜１３６のいずれかに記載の方法。
【請求項１３８】
前記変更が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択される前記ＩＴＲ領域における欠失、挿入、および／または置換である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
接触される前記細胞が、真核細胞である、請求項７０〜１３８のいずれかに記載の方法。
【請求項１４０】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、前記真核細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項８４〜１３９のいずれかに記載の方法。
【請求項１４１】
前記Ｃａｓタンパク質が、前記真核細胞での発現のためにコドン最適化される、請求項８４〜１４０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４２】
標的遺伝子を編集するのに適した条件下、かつそのために十分な時間にわたって、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の有効量の非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡベクター）を細胞に投与することを含む、ゲノム編集の方法。
【請求項１４３】
前記標的遺伝子が、１つ以上のガイドＲＮＡ配列を使用して標的化され、相同性指向修復（ＨＤＲ）ドナーテンプレートの存在下でＨＤＲにより編集される遺伝子である、請求項１１３〜１４２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４４】
前記標的遺伝子が、１つのガイドＲＮＡ配列を使用して標的化され、前記標的遺伝子が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって編集される、請求項１４２または１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記方法が、疾患に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）を訂正するためにインビボで実施される、請求項７０〜１４４のいずれかに記載の方法。
【請求項１４６】
前記疾患が、鎌状赤血球貧血、遺伝性ヘモクロマトーシス、または癌遺伝性失明を含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
少なくとも２つの異なるＣａｓタンパク質が、前記ｃｅＤＮＡベクターに存在し、前記Ｃａｓタンパク質のうちの１つが、触媒的に不活性（Ｃａｓ−ｉ）であり、前記Ｃａｓ−Ｉに関連する前記ガイドＲＮＡが、前記標的細胞の前記プロモーターを標的とし、前記Ｃａｓ−Ｉをコードする前記ＤＮＡが、誘導性プロモーターの制御下にあるため、所望の時点で前記標的遺伝子の前記発現を止めることができる、請求項７０〜１４６のいずれかに記載の方法。
【請求項１４８】
細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系と接触させることを含む、細胞の標的遺伝子における単一ヌクレオチド塩基対を編集するための方法であって、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系の１つ以上の構成成分が、前記細胞を非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター組成物と接触させることによって前記細胞に送達され、
前記ｃｅＤＮＡベクターから発現された前記Ｃａｓタンパク質が、触媒的に不活性であり、塩基編集部分に融合されており、
前記方法が、前記標的遺伝子の発現を調整するのに十分な条件下、かつそのために十分な時間にわたって実施される、方法。
【請求項１４９】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、請求項１〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターである、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記塩基編集部分が、一本鎖特異的シチジンデアミナーゼ、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤、またはｔＲＮＡアデノシンデアミナーゼを含む、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５１】
前記触媒的に不活性なＣａｓタンパク質が、ｄＣａｓ９である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５２】
前記細胞が、Ｔ細胞またはＣＤ３４＋である、請求項７０〜１５１のいずれかに記載の方法。
【請求項１５３】
前記標的遺伝子が、プログラム死タンパク質（ＰＤ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）をコードする、請求項７０〜１５２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５４】
産生された細胞を、それを必要とする対象に投与することをさらに含む、請求項７０〜１５３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５５】
治療を必要とする前記対象が、遺伝性疾患、ウイルス感染、細菌感染、癌、または自己免疫疾患を有する、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
細胞における２つ以上の標的遺伝子の発現を調整する方法であって、
（ｉｖ）隣接する末端反復（ＴＲ）配列、および２つ以上の標的遺伝子に相補的な少なくとも２つのガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含むベクターを含む第１の組成物であって、前記ベクターが、非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターである、第１の組成物と、
（ｖ）隣接する末端反復（ＴＲ）配列、および各々がガイドＲＮＡと関連し、２つ以上の標的遺伝子に結合する少なくとも２つの触媒的に不活性なＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むベクターを含む第２の組成物であって、前記ベクターが、非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターである、第２の組成物と、
（ｖｉ）隣接する末端反復（ＴＲ）配列、および少なくとも２つの転写調節因子タンパク質またはドメインをコードする核酸配列を含むベクターを含む第３の組成物であって、前記ベクターが、非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターである、第３の組成物と、を前記細胞に導入することを含み、
前記少なくとも２つのガイドＲＮＡ、前記少なくとも２つの触媒的に不活性なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、および少なくとも２つの転写調節因子タンパク質またはドメインが、前記細胞で発現され、
ガイドＲＮＡ、触媒的に不活性なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、転写調節因子タンパク質またはドメイン、および標的遺伝子の間で２つ以上の共局在複合体が形成され、
前記転写調節因子タンパク質またはドメインが、少なくとも２つの標的遺伝子の発現を調節する、方法。
【請求項１５７】
前記第１の組成物の前記ｃｅＤＮＡベクターが、請求項１〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターであり、前記第２の組成物の前記ｃｅＤＮＡベクターが、請求項１〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターであり、前記第３の組成物が、請求項１〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターである、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
核酸配列をゲノムセーフハーバー遺伝子に挿入するための方法であって、細胞を（ｉ）遺伝子編集系、および（ｉｉ）ゲノムセーフハーバー遺伝子に対する相同性を有し、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列を含む相同性指向修復テンプレートと接触させることを含み、
前記遺伝子編集系の１つ以上の構成成分が、前記細胞を非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター組成物と接触させることによって前記細胞に送達され、前記ｃｅＤＮＡ核酸ベクター組成物が、隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）間に少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの遺伝子編集分子をコードし、
前記方法が、関心対象のタンパク質をコードする前記核酸配列を前記ゲノムセーフハーバー遺伝子に挿入するのに十分な条件下、かつそのために十分な時間にわたって実施される、方法。
【請求項１５９】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、請求項１〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターである、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
前記ゲノムセーフハーバー遺伝子が、高発現レベルでタンパク質を発現することが知られている少なくとも１つのコード配列に近い活性イントロンを含む、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６１】
前記ゲノムセーフハーバー遺伝子が、アルブミン遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、ＡＡＶＳ１遺伝子座のうちのいずれか１つの中または近くの部位を含む、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６２】
前記関心対象のタンパク質が、受容体、毒素、ホルモン、酵素、または細胞表面タンパク質である、請求項１５８〜１６１のいずれかに記載の方法。
【請求項１６３】
前記関心対象のタンパク質が、分泌タンパク質である、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記関心対象のタンパク質が、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）または第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を含む、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記方法が、血友病Ａまたは血友病Ｂの治療のためにインビボで実施される、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
宿主細胞内の染色体上の所定の挿入部位にドナー配列を挿入する方法であって、前記宿主細胞に請求項１〜６９に記載のｃｅＤＮＡベクターを導入することを含み、前記ドナー配列が、相同組み換えによって前記挿入部位において、または隣接して前記染色体に挿入される、方法。
【請求項１６７】
動物の染色体上の所定の挿入部位に挿入されたドナー配列を含む遺伝子操作された動物を生成する方法であって、ａ）請求項１６７に記載の染色体上の前記所定の挿入部位に挿入された前記ドナー配列を有する細胞を生成することと、ｂ）ａ）によって生成された前記細胞を担体動物に導入して、前記遺伝子操作された動物を産生する、方法。
【請求項１６８】
前記細胞が、接合体または多能性幹細胞である、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
請求項１６８に記載の方法によって生成された遺伝子操作された動物。
【請求項１７０】
前記動物が、非ヒト動物である、請求項１６９に記載の遺伝子操作された動物。
【請求項１７１】
細胞内の染色体上の挿入部位にドナー配列を挿入するためのキットであって、
ａ）
２つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、ならびに
５’相同性アーム、ドナー配列、および３’相同性アームを含む第１のヌクレオチド配列であって、前記ドナー配列が、遺伝子編集機能を有する、第１のヌクレオチド配列、
を含む、第１の非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターと、
（ｂ）
少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲ、および
少なくとも１つの遺伝子編集分子をコードするヌクレオチド配列、
を含む、第２のｃｅＤＮＡベクターと、を含み、
前記第１のｃｅＤＮＡベクターでは、前記５’相同性アームが、前記染色体上の遺伝子編集分子の切断部位の上流の配列と相同であり、前記３’相同性アームが、前記染色体上の前記遺伝子編集分子切断部位の下流の配列と相同であり、前記５’相同性アームまたは前記３’相同性アームが、前記ＩＴＲの近位にある、キット。
【請求項１７２】
前記遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼである、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
前記ヌクレアーゼが、配列特異的ヌクレアーゼである、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
前記第１のｃｅＤＮＡベクターが、請求項１、４０〜５６、５７〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターである、請求項１７１〜１７３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７５】
前記第２のｃｅＤＮＡベクターが、請求項１〜３９または請求項５７〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターである、請求項１７１〜１７３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７６】
宿主細胞の染色体上の所定の挿入部位にドナー配列を挿入する方法であって、
ａ）少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を有する第１の非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを前記宿主細胞に導入することであって、前記ｃｅＤＮＡベクターが、５’相同性アーム、ドナー配列、および３’相同性アームを含む第１の直鎖状核酸を含む、導入することと、
ｂ）隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）の間に少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含む第２のｃｅＤＮＡベクターを前記宿主細胞に導入することであって、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、前記挿入部位において、または隣接して前記染色体を切断する少なくとも１つの遺伝子編集分子をコードし、前記ドナー配列が、相同組み換えによって前記挿入部位において、または隣接して前記染色体に挿入される、導入することと、を含む、方法。
【請求項１７７】
前記遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼである、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
前記ヌクレアーゼが、配列特異的ヌクレアーゼである、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
前記第１のｃｅＤＮＡベクターが、請求項１、４０〜５６、５７〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターである、請求項１７６〜１７８のいずれかに記載の方法。
【請求項１８０】
前記第２のｃｅＤＮＡベクターが、請求項１〜３９または請求項５７〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターである、請求項１７６〜１７９のいずれかに記載の方法。
【請求項１８１】
前記第２のｃｅＤＮＡベクターが、前記挿入部位を認識するガイド配列をコードする第３のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１７９または１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
請求項１〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターを含む、細胞。
【請求項１８３】
請求項１〜６９のいずれかに記載のベクターおよび脂質を含む、組成物。
【請求項１８４】
前記脂質が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項１８４に記載の組成物。
【請求項１８５】
請求項１８３もしくは１８４に記載の組成物、または請求項１８２に記載の細胞を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１７年１２月６日に提出された米国仮特許出願第６２／５９５，３２８号および２０１７年１２月１８日に提出された仮特許出願第６２／６０７，０６９号の利益を主張し、各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１８年１２月６日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーは、０８０１７０−０９０４７０ＷＯＰＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前が付けられ、サイズは１９８，９２４バイトである。
【０００３】
本発明は、遺伝子編集機能を有する単離されたポリヌクレオチドを含む、遺伝子療法の分野に関する。本開示はまた、ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、プロモーター、ベクター、および宿主細胞、ならびに外因性ＤＮＡ配列を標的細胞、組織、器官、または生物に送達する方法に関する。例えば、本開示は、遺伝子編集非ウイルス性ＤＮＡベクターを提供する。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子療法は、遺伝子発現プロファイルにおける異常によって引き起こされる遺伝子突然変異または後天性疾患のいずれかを罹患している患者の臨床転帰を改善することを目的とする。遺伝子療法は、欠陥遺伝子、または障害、疾患、悪性腫瘍等をもたらし得る異常調節もしくは発現、例えば過小発現もしくは過剰発現から生じる医学的状態の治療または予防を含む。例えば、欠陥遺伝子によって引き起こされる疾患または障害は、患者の体内で遺伝物質の治療的発現をもたらす、患者への訂正遺伝物質の送達によって治療、予防、または改善され得る。欠陥遺伝子によって引き起こされる疾患または障害は、欠陥遺伝子を変更またはサイレンシングすること、例えば、欠陥遺伝子の全部もしくは一部を除去すること、および／または欠陥遺伝子の特定の部分を患者に対する訂正遺伝物質で編集して、患者の体内で遺伝物質の治療的発現をもたらすことによって治療、予防、または改善され得る。
【０００５】
遺伝子療法の基礎は、転写カセットに活性遺伝子産物（導入遺伝子と称される場合がある）を供給することであり、例えば、正の機能獲得効果、負の機能喪失効果、または例えば腫瘍溶解効果などの別の結果をもたらし得る。遺伝子療法を使用して、他の要因によって引き起こされる疾患または悪性腫瘍を治療することもできる。ヒト単一遺伝子障害は、標的細胞への正常遺伝子の送達および発現によって治療され得る。患者の標的細胞中の補正遺伝子の送達および発現は、操作されたウイルスおよびウイルス遺伝子送達ベクターの使用を含む、多くの方法を介して実行され得る。使用可能な多くのウイルス由来ベクター（例えば、組み換えレトロウイルス、組み換えレンチウイルス、組み換えアデノウイルス等）の中で、組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）は、遺伝子療法において多用途ベクターとして人気を集めている。
【０００６】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科に属し、より具体的にはディペンドパルボウイルス属を構成する。ＡＡＶゲノムは、およそ４．７キロベース（ｋｂ）を含み、非構造的Ｒｅｐ（複製）および構造的Ｃａｐ（カプシド）タンパク質をコードする２つの主要なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子で構成されている。アセンブリー活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするキャップ遺伝子内の第２のＯＲＦが特定された。ＡＡＶコード領域に隣接するＤＮＡは、およそ１４５ヌクレオチド長の２つのシス作用性逆位末端反復（ＩＴＲ）配列であり、ＤＮＡ複製のプライマーとして機能するエネルギー的に安定したヘアピン構造に折り畳まれ得る中断パリンドローム配列を有する。ＤＮＡ複製におけるそれらの役割に加えて、ＩＴＲ配列は、細胞ゲノム中のウイルスＤＮＡ組み込み、宿主ゲノムまたはプラスミドからのレスキュー、および成熟ビリオン中のウイルス核酸のカプシド化に関与することが示された（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９）。
【０００７】
ＡＡＶ由来のベクター（すなわち、組み換えＡＡＶ（ｒＡＶＶ）またはＡＡＶベクター）は、（ｉ）それらが筋細胞およびニューロンを含む多種多様な非分裂および分裂細胞型に感染する（形質導入する）ことができるため、（ｉｉ）それらがウイルス構造遺伝子を欠いていることによって、ウイルス感染に対する宿主細胞反応、例えばインターフェロン媒介性反応を減少させるため、（ｉｉｉ）野生型ウイルスが、ヒトにおいて非病理的であるとみなされるため、（ｉｖ）宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる野生型ＡＡＶと対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子を欠き、一般にエピソームとして持続し、したがって挿入変異または遺伝毒性の危険性を制限するため、ならびに（ｖ）他のベクター系と比較して、ＡＡＶベクターは、一般に比較的不良な免疫原であるとみなされるため、著しい免疫反応を誘起せず（ｉｉを参照）、したがって治療導入遺伝子のベクターＤＮＡおよび潜在的に長期発現の持続を得るため、遺伝物質を送達するために魅力的である。ＡＡＶベクターはまた、高力価で産生および製剤化され、動脈内、静脈内、または腹腔内注入を介して送達され得、齧歯類（Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｆｏｕｇｅｒｏｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｋｏｐｐａｎａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）およびイヌにおける単回注入による重要な筋領域へのベクター分布および遺伝子導入を可能にする。脊髄性筋萎縮症１型を治療するための臨床研究では、ＡＡＶベクターを、脳を標的とし、明らかな臨床改善をもたらすことを意図して、全身的に送達した。
【０００８】
しかしながら、ＡＡＶ粒子を遺伝子送達ベクターとして使用することには、いくつかの重大な欠陥が存在する。ｒＡＡＶに関連する１つの重大な欠点は、約４．５ｋｂの異種ＤＮＡの制限されたウイルスパッケージング能力である（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。結果として、ＡＡＶベクターの使用は、１５０，０００Ｄａ未満のタンパク質コード能力に制限されている。第２の欠点は、集団における野生型ＡＡＶ感染の流行の結果として、ｒＡＡＶ遺伝子療法の候補を、患者からベクターを排除する中和抗体の存在についてスクリーニングする必要があることである。第３の欠点は、初回治療から排除されなかった患者への再投与を予防するカプシド免疫原性に関する。患者における免疫系は、「ブースター」ショットとして有効に作用するベクターに反応して、将来の治療を妨げる高力価抗ＡＡＶ抗体を生成する免疫系を刺激し得る。いくつかの最近の報告は、高用量状況における免疫原性との関係を示している。一本鎖ＡＡＶ  ＤＮＡが異種遺伝子発現前に二本鎖ＤＮＡに変換されなければならないことを考えると、別の顕著な欠点は、ＡＡＶ媒介性遺伝子発現の始まりが比較的遅いことである。二本鎖ＤＮＡベクターを構築することによって、この問題を回避することが試みられているが、この戦略は、ＡＡＶベクターに組み込まれ得る導入遺伝子発現カセットのサイズをさらに制限する（ＭｃＣａｒｔｙ，２００８、Ｖａｒｅｎｉｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｆｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０００９】
追加として、カプシドを有する従来のＡＡＶビリオンは、ＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子、およびｃａｐ遺伝子を含有する１つまたは複数のプラスミドを導入することによって産生される（Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。トランスにおけるこれらのヘルパープラスミドの導入時に、ＡＡＶゲノムは、宿主ゲノムから「レスキュー」され（すなわち、放出された後に増幅され）、さらにカプシド化されて（ウイルスカプシド）、生物学的に活性なＡＡＶベクターを産生する。しかしながらそのようなカプシド化ＡＡＶウイルスベクターは、ある特定の細胞および組織型を非効率的に形質導入することがわかった。カプシドはまた、免疫反応を誘導する。
【００１０】
したがって、遺伝子療法のためのアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用は、（患者免疫反応に起因する）患者への単回投与、関連ＡＡＶカプシドの最小ウイルスパッケージング能力（約４．５ｋｂ）に起因するＡＡＶベクター中の送達に好適な導入遺伝子遺伝物質の制限された範囲、ならびに遅いＡＡＶ媒介性遺伝子発現に起因して制限される。ｒＡＡＶ臨床遺伝子療法のための適用は、同系マウスモデルにおける、または他のモデル種における用量反応によって予測されない患者間の変動性によってさらに妨げられる。
【００１１】
ＡＡＶを利用してドナーテンプレートを送達するものなどの現在の遺伝子編集アプローチには問題があり、いくつかの制限がある。第１に、ドナーテンプレートのサイズ、および例えば、相同性指向修復（ＨＤＲ）を誘導するための相同性アームは、ＡＡＶ粒子内のパッケージング要件によって制約される。第２に、ＡＡＶ投与によって誘導された免疫原性は、再投与を妨げるため、遺伝子編集プロセスは１回しか実行することができない。最後に、ＡＡＶに対するベースライン免疫により、かなりの割合の患者が潜在的な遺伝子編集療法を受けることができなくなる。本発明者らは、ヌクレアーゼ（複数可）、プロモーター（複数可）ガイドＲＮＡ（Ｃａｓ９がヌクレアーゼである場合）、「訂正された遺伝子」ドナーテンプレート（複数可）（例えば、相同性指向組み換え（ＨＤＲ）修復テンプレート）、および相同性領域の別個の送達などの様々な構成成分に関連する現在の遺伝子編集アプローチの他の制限を観察した。構成成分を単一の送達粒子にパッケージ化することができず、複数の粒子を使用すると免疫原性の問題が発生する可能性があるため、現在の構成成分の現送達にも問題がある。遺伝子編集では、すべての構成成分が編集対象の単一細胞内に存在する必要があるため、送達された構成成分のすべてを取得できない細胞が多いことにより、遺伝子編集の効率は低くなる。
組み換えカプシド不含ＡＡＶベクターは、発現可能な導入遺伝子、ならびにＲｅｐ結合部位および末端分解部位を含む２つの野生型ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）によって隣接されるプロモーター領域を含む、単離された直鎖状核酸分子として取得され得る。これらの組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列を欠いており、２つの野生型ＩＴＲパリンドローム配列を通して共有結合された一方または両方の末端を有する一本鎖、二本鎖、または二重鎖であり得る（例えば、ＷＯ２０１２／１２３４３０、米国特許第９，５９８，７０３号）。それらは、導入遺伝子能力がはるかに高く、導入遺伝子発現の始まりが速く、患者の免疫系がＤＮＡ分子を一掃されるべきウイルスとして認識するという点で、ＡＡＶ媒介性遺伝子療法の多くを回避する。しかしながら、導入遺伝子の定常発現は、すべての例において望ましくない場合があり、ＡＡＶ正準野生型ＩＴＲは、ｃｅＤＮＡ機能のために最適化されない場合がある。
新しい標的配列ごとに新しいタンパク質の設計を必要としない方法で、ヌクレアーゼ活性（または他のタンパク質活性）を標的ＤＮＡ内の異なる位置に正確に標的化できるようにする技術が、当該分野で必要である。さらに、最小のオフターゲット効果で遺伝子発現を制御する方法が当技術分野で必要であり、産生および／または発現特性が改善された制御可能な組み換えＤＮＡベクターの重要な満たされていないニーズが残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１２３４３０号
【特許文献２】米国特許第９，５９８，７０３号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本明細書に記載される発明は、遺伝子編集のための共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターである（本明細書では「閉端ＤＮＡベクター」または「ｃｅＤＮＡベクター」と称される）。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端（直鎖状、連続、および非カプシド化構造）を有する相補的ＤＮＡの連続鎖から形成されるカプシド不含直鎖状二重鎖ＤＮＡ分子であり、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および３’ＩＴＲ配列を含み、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、互いに対して同じ対称の３次元構成（すなわち、対称もしくは実質的に対称）を有し得るか、または代替として５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、互いに対して異なる３次元構成（すなわち、非対称ＩＴＲ）を有し得る。さらに、ＩＴＲは、同じまたは異なる血清型に由来し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターは、それらの構造が幾何学的空間で同じ形状であるか、または３Ｄ空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’ループを有するように、対称の３次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含み得る（すなわち、それらは同じであるか、または互いに対して鏡像である）。そのような実施形態では、対称のＩＴＲ対、または実質的に対称のＩＴＲ対は、両方が同じ方法で修飾型ＩＴＲ（例えば、ｍｏｄ−ＩＴＲ）であり得、両方が野生型ＩＴＲである必要はない。ｍｏｄ−ＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲからの１つ以上の修飾を有し、互いに逆相補（逆位）である同じ配列を有し得る。代替実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応するまたは同じ対称の３次元形状を有し得る。いくつかの実施形態では、一方のＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。
【００１５】
したがって、本明細書に記載される技術のいくつかの態様は、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ  ＩＴＲおよび少なくとも１つの修飾されたＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ−ＩＴＲ対が互いに対して異なる３次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、または（ｉｉｉ）各ＷＴ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のＷＴ−ＷＴ  ＩＴＲ対、または（ｉｖ）各ｍｏｄ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択されるＩＴＲ配列を含む、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターに関する。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、真核細胞中で産生され得、したがって昆虫細胞中の原核ＤＮＡ修飾および細菌内毒素汚染を欠き得る。
【００１６】
より具体的には、本発明の実施形態は、宿主細胞において遺伝子編集分子である導入遺伝子を発現し（例えば、導入遺伝子は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓなどのヌクレアーゼ；１つ以上のガイドＲＮＡ；ＣＲＩＳＰＲ；リボ核タンパク質（ＲＮＰ）；またはそれらの任意の組み合わせである）、効率的なゲノム編集をもたらすことができる遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターを含む方法および組成物に基づく。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、サイズに制限されないため、例えば、単一のベクター（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系（例えば、Ｃａｓ９もしくは修飾型Ｃａｓ９酵素、ガイドＲＮＡ、および／または相同性指向修復テンプレート）、あるいはＴＡＬＥＮまたはジンクフィンガー系に必須のすべての構成成分の発現を許可する。しかしながら、そのような構成成分のうちの１つまたは２つが、単一のｃｅＤＮＡベクター上でコードされる一方で、残りの構成成分（複数可）は、別個のｃｅＤＮＡベクターまたは従来のプラスミド上で発現され得る。
【００１７】
本明細書に記載される技術は、導入遺伝子または異種核酸に隣接する２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含むｃｅＤＮＡベクターに関し、異種核酸は、遺伝子編集核酸配列である。本明細書で提供されるすべての態様では、遺伝子編集核酸配列は、配列特異的ヌクレアーゼ、１つ以上のガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、またはＣＲＩＳＰＲｉもしくはＣＲＩＳＰＲａ系のための非活性化ＣＡＳ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子編集分子をコードする。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、（１）シス調節エレメント、プロモーター、および少なくとも１つの導入遺伝子（例えば、遺伝子編集分子）を含む発現カセット；（２）少なくとも１つの導入遺伝子（例えば、遺伝子編集分子）に操作可能に連結されたプロモーター；ならびに（３）当該発現カセットに隣接する２つの自己相補的配列、例えば、本明細書で定義される非対称または対称または実質的に対称のＩＴＲを含み、ｃｅＤＮＡベクターは、カプシドタンパク質と関連していない。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶゲノム中で見出される２つの自己相補的配列を含み、少なくとも１つのＩＴＲは、操作的Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）（本明細書では「ＲＢＳ」と称される場合もある）およびＡＡＶの末端分解部位（ｔｒｓ）またはＲＢＥの機能性異形、および導入遺伝子に操作可能に連結された１つ以上のシス調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子（例えば、遺伝子編集分子）の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書において「調節スイッチ」と題するセクションに記載されている、導入遺伝子の発現を制御および調節するための調節スイッチを含み、例えば、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターを、所望の核酸配列のノックインに使用することができる。特に、本明細書に記載される方法および組成物を使用して、新しい核酸配列を導入する、ゲノム配列の突然変異を訂正する、または宿主細胞の標的遺伝子配列に突然変異を導入することができる。そのような方法は、「ＤＮＡノックイン系」と呼ぶことができる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、標的遺伝子に対する標的化の特異性を高めるために、相同性アームを含む。相同性指向修復（ＨＤＲ）は、相同組み換えのプロセスであり、ＤＮＡテンプレートを使用して、関心対象のドナー配列の挿入の二本鎖切断（ＤＳＢ）の正確な修復に必要な相同性を提供する。例えば、非限定的な一例では、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターは、特定の遺伝子または標的統合部位に対する５’および３’相同性アームを含み得る。いくつかの実施形態では、特定の制限部位は、５’相同性アームに対する５’、３’相同性アームに対する３’、または両方で操作することができる。ｃｅＤＮＡベクターが、操作された制限部位（複数可）に特異的な１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで切断されると、結果として得られるカセットは、５’相同性アームドナー配列−３’相同性アームを含み、所望のゲノム遺伝子座とより容易に組み換えられ得る。いくつかの実施形態では、標的とされ、３’相同性アームの５’末端が相同である場所の５’およびその近く、ならびに／または５’相同性アームの３’末端が相同である場所の３’およびその近くに位置するゲノムＤＮＡ配列において、ｓｇＲＮＡ標的配列がある（例えば、図１７および１８Ａを参照）。この切断されたカセットは、限定されないが、以下：調節領域、ヌクレアーゼ、および追加のドナー配列のうちの１つ以上などの他のエレメントをさらに含み得ることが当業者によって理解されるであろう。ある特定の態様では、ｃｅＤＮＡベクター自体が、制限エンドヌクレアーゼをコードすることができ、それによりｃｅＤＮＡベクターが核に送達されると、制限エンドヌクレアーゼが発現され、ベクターを切断することができる。ある特定の態様では、制限エンドヌクレアーゼは、別個に送達される第２のｃｅＤＮＡベクター上でコードされる。ある特定の態様では、制限エンドヌクレアーゼは、非ｃｅＤＮＡベースの送達手段によって核に導入される。ある特定の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、ｃｅＤＮＡベクターが核に送達された後に導入される。ある特定の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼおよびｃｅＤＮＡベクターは、同時に核に輸送される。ある特定の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、ｃｅＤＮＡベクターの導入時に既に存在している。
【００２１】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術は、複数の遺伝子編集ｃｅＤＮＡが対象に送達されるのを可能にする。本明細書で論じられるように、一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、特定の標的遺伝子または遺伝子座を標的とするドナー配列に隣接する相同性アームを有することができ、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるゲノムＤＮＡの切断を標的とするための１つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）も含むことができ、別のｃｅＤＮＡは、実際の遺伝子編集ステップについて本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ酵素およびアクチベーターＲＮＡを含むことができる。
【００２２】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼは、ＴＡＬヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＡＳ９、ｃｐｆ１、ｄＣＡＳ９、ｎＣＡＳ９）を含む。
【００２３】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、遺伝子編集核酸配列は、相同性指向修復テンプレートである。
【００２４】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、相同性指向修復テンプレートは、５’相同性アーム、ドナー配列、および３’相同性アームを含む。
【００２５】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、組成物は、エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列をさらに含み、エンドヌクレアーゼは、標的遺伝子のＤＮＡ上の特定のエンドヌクレアーゼ部位またはｃｅＤＮＡベクター上の標的部位で切断またはニッキングする。
【００２６】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、５’相同性アームは、染色体上のＤＮＡエンドヌクレアーゼ切断またはニッキング部位の上流のヌクレオチド配列と相同である。
【００２７】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、３’相同性アームは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ切断またはニッキング部位の下流のヌクレオチド配列と相同である。
【００２８】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、相同性アームは各々、約２５０〜２０００ｂｐである。
【００２９】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）を含む。
【００３０】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ酵素を含む。
【００３１】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ９である。
【００３２】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、ニッキングＣａｓ９（ｎＣａｓ９）である。
【００３３】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ｎＣａｓ９は、ＣａｓのＨＮＨまたはＲｕＶｃドメイン（例えば、Ｄ１０Ａ）に突然変異を含む。
【００３４】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、標的遺伝子のプロモーター領域を標的とするｇＲＮＡと複合体を形成する非活性化Ｃａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）である。
【００３５】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、組成物は、ＫＲＡＢエフェクタードメインをさらに含む。
【００３６】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ｄＣａｓは、プロモーター領域に向けることができる異種転写活性化ドメインに融合される。
【００３７】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ｄＣａｓ融合は、標的遺伝子の発現を上方調節する追加のトランス活性化ドメインを動員するガイドＲＮＡによって標的遺伝子のプロモーター領域に向けられる。
【００３８】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ｄＣａｓは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ｄＣａｓ９である。
【００３９】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、標的遺伝子のプロモーターの近接を標的とし、ＣＲＩＳＰＲは、標的遺伝子をサイレンシングする（ＣＲＩＳＰＲｉ系）。本明細書で使用される場合、「標的遺伝子のプロモーターの近接」という語句は、物理的に標的遺伝子のプロモーター配列上の、隣接する、または近くの領域を指し、触媒的に不活性なＤＮＡエンドヌクレアーゼは、標的遺伝子の発現を阻害するように機能することができる。いくつかの実施形態では、、「プロモーターへの近接」は、プロモーター配列自体内、プロモーター配列（いずれかの末端）に直接隣接する、またはプロモーター配列の終端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド以上の配列を指す。
【００４０】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、標的遺伝子の転写開始部位を標的とし、標的遺伝子を活性化または調節する（ＣＲＩＳＰＲａ系）。本明細書で使用される場合、「標的遺伝子の転写開始部位」という用語は、物理的に標的遺伝子の転写開始配列（「ＡＴＧ」、開始メチオニン）上の、隣接する、または近くの領域を指し、触媒的に不活性なＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＲＮＡポリメラーゼなどの転写機構を動員して、標的遺伝子の発現を、例えば少なくとも１０％増加させるように機能し得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、「ＡＴＧ」転写開始部位を含む配列を含み得る。他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、転写開始部位のすぐ上流の配列を含み得る。追加の実施形態では、ガイドＲＮＡは、距離がそれほど大きくないため、動員された翻訳機序が標的遺伝子の発現を強化するように機能しないことを条件として、転写開始部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド以上上流の配列を含むことができる。
【００４１】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、標的遺伝子のプロモーターの近接を標的とし、標的遺伝子（ＣＲＩＳＰＲａ系）を活性化または調節して、例えば、標的遺伝子の発現を増加させる。
【００４２】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、組成物は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸をさらに含む。
【００４３】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、欠陥遺伝子のスプライスアクセプターまたはスプライスドナー部位を標的として、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および機能性タンパク質の発現のための欠陥遺伝子の訂正を行う。本明細書で使用される「スプライスアクセプター」という用語は、エクソンと接合するイントロンの３’末端の核酸配列を指す。スプライスアクセプターのコンセンサス配列には、ＮＴＮ（ＴＣ）（ＴＣ）（ＴＣ）ＴＴＴ（ＴＣ）（ＴＣ）（ＴＣ）（ＴＣ）（ＴＣ）（ＴＣ）ＮＣＡＧｇ（配列番号５５８）が含まれるが、これに限定されない。イントロン配列は大文字で、エクソン配列は小文字フォントで表される。本明細書で使用される「スプライスドナー」という用語は、エクソンと接合するイントロンの５’末端の核酸配列を指す。スプライスドナー配列のコンセンサス配列には、ｎａｇｇｔ（ａｇ）ａＧＴ（配列番号５５９）が含まれるが、これに限定されない。イントロン配列は大文字で、エクソン配列は小文字フォントで表される。これらの配列は、ウイルスから霊長類のゲノムに保存されているものを表す。
【００４４】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ベクターは、１つのガイドＲＮＡ配列の複数のコピーをコードする。
【００４５】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、組成物は、遺伝子編集配列をコードする核酸配列に操作可能に連結された調節配列をさらに含む。
【００４６】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、調節配列は、エンハンサーおよび／またはプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。
【００４７】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、プロモーターは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列に操作可能に連結され、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列は、エンドヌクレアーゼ配列の上流にイントロン配列をさらに含み、イントロンは、ヌクレアーゼ切断部位を含む。
【００４８】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ポリＡ部位は、上流であり、５’相同性アームに近接している。
【００４９】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ドナー配列は、５’相同性アームまたは３’相同性アームに対して外来である。
【００５０】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、５’相同性アームまたは３’相同性アームは、本明細書で定義される少なくとも１つのＩＴＲの近位にある。
【００５１】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡである。
【００５２】
別の実施形態では、編集は、ＤＮＡではなくＲＮＡに向けられる。例えば、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．細菌からのＣａｓ１３などのＣａｓ１３を使用する。この酵素は、ＲＮＡを訂正する別の分子と組み合わされる。例えば、ＡＤＡＲ２タンパク質は、個々のＲＮＡをアデノシンからイノシンに変更する。例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｏｘ，Ｄ．Ｂ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．２５  Ｏｃｔ  ２０１７″ＲＮＡ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３を参照されたい。本明細書に記載される遺伝子編集系をコードするｃｅＤＮＡベクター（複数可）を使用するＲＮＡ編集および／または追跡は、当該技術分野、例えば、Ａｂｕｄａｙｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５３：１−９（２０１６）、Ｏ‘Ｃｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１６：２６３−２６６（２０１４）、Ｎｅｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １６５：４８８−４９６（２０１６）（各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）において既知の方法で実施することができる。
【００５３】
本明細書で提供される別の態様は、細胞を遺伝子編集系と接触させることを含むゲノム編集のための方法に関し、遺伝子編集系の１つ以上の構成成分は、細胞を本明細書に開示されるようなｃｅＤＮＡベクターを含む組成物と接触させることによって細胞に送達され、ｃｅＤＮＡ核酸ベクター組成物は、隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）配列（ＩＴＲ配列が、本明細書で定義されるように互いに対して非対称、対称、または実質的に対称である）、および少なくとも１つの遺伝子編集核酸配列を含む。
【００５４】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、遺伝子編集系は、ＴＡＬＥＮ系、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系、ＣＲＩＳＰＲｉ系、ＣＲＩＳＰＲａ系、およびメガヌクレアーゼ系からなる群から選択される。
【００５５】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子編集核酸配列は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、ガイドＤＮＡ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子もしくはそのオルソログ、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、またはＣＲＩＳＰＲｉもしくはＣＲＩＳＰＲａ系のための非活性化ＣＡＳからなる群から選択される遺伝子編集分子をコードする。
【００５６】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、単一のｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子編集系のすべての構成成分を含む。
【００５７】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、真核細胞での発現のためにコドン最適化される。
【００５８】
また別の態様では、標的遺伝子を編集するのに適した条件下、かつそのために十分な時間にわたって、本明細書に記載される有効量のｃｅＤＮＡ組成物を細胞に投与することを含むゲノム編集の方法が本明細書で提供される。
【００５９】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、標的遺伝子は、１つ以上のガイドＲＮＡ配列を使用して標的化され、相同性指向修復（ＨＤＲ）ドナーテンプレートの存在下ではＨＤＲによって編集される。
【００６０】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、標的遺伝子は、１つのガイドＲＮＡ配列を使用して標的化され、標的遺伝子は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって編集される。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、スプライスドナーまたはアクセプターを標的化して、エクソンスキッピングおよび機能性タンパク質、例えばジストロフィンタンパク質の発現を促進する。
【００６１】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、この方法をインビボで実施して、疾患に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）、または欠失もしくは挿入を訂正する。
【００６２】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用する遺伝子編集に適した疾患は、本明細書における「遺伝子編集ｃｅＤＮＡで治療される例示的な疾患」および「遺伝子編集のための追加の疾患」と題するセクションで論じられる。治療される例示的な疾患は、例えば、限定されないが、デュシェン型筋ジストロフィー（ＤＭＤ遺伝子）、トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）（正しいｍｕｔＴＴＲ遺伝子）、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ＯＴＣ欠損症）、血友病、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、遺伝性ヘモクロマトーシス、癌、または遺伝性失明であり、訂正される遺伝子には、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）、グロビン、レプチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、サイトカイン、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、またはペプチド成長因子等が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、少なくとも２つの異なるＣａｓタンパク質が、ｃｅＤＮＡベクターに存在し、Ｃａｓタンパク質のうちの１つが、触媒的に不活性（Ｃａｓ−ｉ）であり、Ｃａｓ−Ｉに関連するガイドＲＮＡが、標的細胞のプロモーターを標的とし、Ｃａｓ−ＩをコードするＤＮＡが、誘導性プロモーターの制御下にあるため、所望の時点で標的遺伝子の発現を止めることができる。本明細書で使用される場合、「触媒的に不活性」という用語は、活性状態から不活性状態に変化し、それによりその活性を妨げる触媒部位を有する分子（例えば、酵素またはキナーゼ）を指す。分子は、例えば、変性、阻害結合、触媒部位への突然変異、または二次プロセシング（例えば、リン酸化もしくは他の翻訳後修飾）により、触媒的に不活性にされ得る。例えば、触媒的に不活性または非活性化されたＣａｓ９（ｄＣａｓ９）は、エンドヌクレアーゼ活性を持たず、例えば、Ｃａｓ９をコードする遺伝子の２つの触媒残基Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａに点突然変異を導入することによって生成され得る。一実施形態では、分子の触媒的に不活性な状態は、その触媒的に活性な状態と比較して０．１％未満の触媒活性を有する分子を指し、標準的な実験室方法によって識別可能な任意の活性を有する分子をさらに包含する。
【００６４】
また別の態様では、細胞の標的遺伝子内の単一ヌクレオチド塩基対を編集するための方法であって、細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系と接触させることを含む方法が本明細書に提供され、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系の１つ以上の構成成分は、細胞を閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）核酸ベクター組成物と接触させることによって細胞に送達され、ｃｅＤＮＡ核酸ベクター組成物は、隣接する末端反復（ＴＲ）配列、および標的遺伝子または当該標的遺伝子の調節配列を標的とするための少なくとも１つの遺伝子編集核酸配列を含む直鎖状閉端二重鎖ＤＮＡであり、ベクターから発現されるＣａｓタンパク質は、触媒的に不活性であり、塩基編集部分に融合され、当該方法は、標的遺伝子の発現を調整するのに十分な条件下、かつそのために十分な時間にわたって実施される。
【００６５】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、塩基編集部分は、一本鎖特異的シチジンデアミナーゼ、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤、またはｔＲＮＡアデノシンデアミナーゼを含む。
【００６６】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ベクターから発現される触媒的に不活性なＣａｓタンパク質は、ｄＣａｓ９である。
【００６７】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、接触される細胞は、Ｔ細胞またはＣＤ３４＋細胞である。
【００６８】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、標的遺伝子は、プログラム死タンパク質（ＰＤ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）をコードする。
【００６９】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生された細胞（例えば、Ｔ細胞またはＣＤ３４＋細胞）を、それを必要とする対象に投与することをさらに含む。
【００７０】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、治療を必要とする対象は、ウイルス感染、細菌感染、癌、または自己免疫疾患を有する。
【００７１】
本明細書で提供される別の態様は、細胞内の２つ以上の標的遺伝子の発現を調整する方法に関し、（ｉ）隣接するＩＴＲ配列（このＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように互いに対して非対称、対称、または実質的に対称である）および２つ以上の標的遺伝子に相補的な少なくとも２つのガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含むｃｅＤＮＡベクター（このベクターは、直鎖状閉端二重鎖ＤＮＡである）を含む組成物と、（ｉｉ）隣接するＩＴＲ配列（このＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように互いに対して非対称、対称、または実質的に対称である）および各々がガイドＲＮＡに関連し、２つ以上の標的遺伝子に結合する少なくとも２つの触媒的に不活性なＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むｃｅＤＮＡベクター（このベクターは、直鎖状閉端二重鎖ＤＮＡである）を含む第２の組成物と、（ｉｉｉ）隣接するＩＴＲ配列（このＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように互いに対して非対称、対称、または実質的に対称である）および少なくとも２つの転写調節因子タンパク質またはドメインをコードする核酸配列（このベクターは、直鎖状閉端二重鎖ＤＮＡである）を含むｃｅＤＮＡベクターを含む第３の組成物とを細胞に導入することを含み、少なくとも２つのガイドＲＮＡ、少なくとも２つの触媒的に不活性なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、および少なくとも２つの転写調節因子タンパク質またはドメインは、細胞内で発現され、２つ以上の共局在複合体は、ガイドＲＮＡ、触媒的に不活性なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、転写調節因子タンパク質またはドメイン、および標的遺伝子の間で形成され、転写調節因子タンパク質またはドメインは、少なくとも２つの標的遺伝子の発現を調節する。
【００７２】
一態様では、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターは、好ましくは直鎖状二重鎖分子であり、２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードするベクターポリヌクレオチドから取得可能であり、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、末端分解部位および複製タンパク質結合部位（ＲＰＳ）（時として複製的タンパク質結合部位と称される）、例えば、Ｒｅｐ結合部位を含む。５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、互いに対して対称または実質的に対称（５’および３’ＩＴＲは、同じ３次元空間構成（すなわち、対称ｍｏｄ−ＩＴＲ対または対称もしくは実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲ対）を有する）、あるいは５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲが互いに対して互いに対して異なる３次元構成（すなわち、非対称ＩＴＲ）を有するように互いに対して非対称であり得る（例えば、ＷＴ−ＩＴＲおよびｍｏｄ−ＩＴＲまたはｍｏｄ−ＩＴＲ対。これらの用語は本明細書で定義されるとおりである。
【００７３】
いくつかの実施形態では、２つの自己相補的配列は、任意の既知のパルボウイルス、例えばＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１〜ＡＡＶ１２）などのディペンドウイルスからのＩＴＲ配列であり得る。ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１）などのＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ｔｒｓ）を保持する修飾型ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列を含むが、これらに限定されない任意のＡＡＶ血清型を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１）などの機能性Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ＴＲＳ）を保持する合成ＩＴＲ配列である。いくつかの実施例では、ＩＴＲ配列は、ＲＢＳ、ｔｒｓの配列、ならびに野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲの対応する配列からの１つのＩＴＲヘアピン二次構造の末端ループ部分を形成するＲｅｐ結合エレメントの構造および位置を保持する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対を含むｃｅＤＮＡベクターは、本明細書の表４Ａもしくは４Ｂのいずれか１つ以上、または参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の表２、３、４、５、６、７、８、９、および１０Ａ〜１０Ｂのうちの１つ以上に示されるＩＴＲ配列またはＩＴＲ部分配列の修飾のいずれかに対応するＩＴＲの修飾を有するＩＴＲを含み得る。例示的な例として、本開示は、非対称ＩＴＲを含む遺伝子編集のための閉端ＤＮＡベクターを提供し、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを含み、ｃｅＤＮＡはカプシドタンパク質を欠き、（ａ）そのヘアピン二次構成（好ましくは、これらの参照配列と比較して、この構成での任意のＡＡＡもしくはＴＴＴ末端ループの欠失を除外する）において配列番号２と同数の分子内的に二重化した塩基対を有する突然変異型右側ＡＡＶ２  ＩＴＲまたは配列番号５１と同数の分子内的に二重化した塩基対を有する突然変異型左側ＡＡＶ２  ＩＴＲをコードするｃｅＤＮＡ−プラスミド（例えば、実施例１〜２および／もしくは図１Ａ〜Ｂを参照）から産生され、（ｂ）実施例１における未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるｃｅＤＮＡの同定のためのアッセイを使用して、ｃｅＤＮＡとして同定される。非対称ＩＴＲを含むｃｅＤＮＡベクターのそのような５’および３’修飾型ＩＴＲ配列の例は、本明細書の表４Ａもしくは４Ｂ、または参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の表２、３、４、５、６、７、８、９、および１０Ａ〜１０Ｂのうちの１つ以上に提供されている。
【００７５】
あるいは、いくつかの実施形態では、対称修飾型ＩＴＲを含むｃｅＤＮＡベクターで使用するための例示的な修飾型ＩＴＲ配列、すなわち、修飾型５’ＩＴＲおよび修飾型３’ＩＴＲを含むｃｅＤＮＡ（修飾型５’ＩＴＲおよび修飾型３’ＩＴＲは、互いに対して対称または実質的に対称である）は、ＩＴＲの対（修飾型５’ＩＴＲおよび対称修飾型３’ＩＴＲ）を示す表５に示すとおりである。いくつかの実施形態では、対称ＩＴＲ対は、表２に示されるＷＴ−ＷＴ  ＩＴＲ対である。
【００７６】
本明細書に記載される技術はさらに、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターに関し、ｃｅＤＮＡベクターは、異種核酸発現カセットを含み、例えば、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、もしくは２０，０００ヌクレオチド、もしくは３０，０００ヌクレオチド、もしくは４０，０００ヌクレオチド、もしくは５０，０００ヌクレオチド、または約４０００〜１０，０００ヌクレオチド、もしくは１０，０００〜５０，０００ヌクレオチドの間の任意の範囲、または５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ＡＡＶベクターのサイズ制限を有さず、したがって、大サイズの発現カセットの送達が導入遺伝子の効率的な発現をもたらすようにすることができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞特異的メチル化を欠いている。
【００７７】
発現カセットはまた、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）および／または２Ａエレメントを含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分を含む。例えば、追加の調節構成成分は、本明細書に開示される調節スイッチであり得、ｃｅＤＮＡ感染細胞、ならびに必要に応じて他の誘導性および／または抑制性エレメントを殺傷し得るキルスイッチを含むが、これに限定されない。
【００７８】
本明細書に記載される技術はさらに、ｃｅＤＮＡベクターを使用した遺伝子編集の新規方法を提供する。ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドの非存在下で、宿主細胞中に取り込まれるとともに、核中に輸送される能力を有する。さらに、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、カプシドを欠いているため、カプシド含有ベクターに反応して生じ得る免疫反応を回避する。
【００７９】
本発明の態様は、本明細書に記載されるような遺伝子編集に有用なｃｅＤＮＡベクターを産生する方法に関する。他の実施形態では、本明細書に提供される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターに関する。一実施形態では、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）は、最初の５’逆位末端反復（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）、異種核酸配列、および３’ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）をこの順序で含むポリヌクレオチド発現構築物テンプレートを含むプラスミド（本明細書では「ｃｅＤＮＡ−プラスミド」と呼ばれる）から得られ、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称または対称（例えば、ＷＴ−ＩＴＲまたは修飾型対称ＩＴＲ）であり得る。
【００８０】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、本開示を読むことにより、熟練者に既知のいくつかの手段によって取得可能である。例えば、本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド発現構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ−プラスミド（例えば、表８もしくは図７Ｂを参照）、ｃｅＤＮＡ−バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスであり得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ＩＴＲの間に操作可能に位置付けられた制限クローニング部位（例えば、配列番号７）を含み、例えば、導入遺伝子、例えばレポーター遺伝子および／または治療的遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを挿入することができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、対称または非対称ＩＴＲ（修飾型またはＷＴ  ＩＴＲ）を含むポリヌクレオチドテンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス）から産生される。
【００８１】
許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下では、少なくとも２つのＩＴＲを有するポリヌクレオチドテンプレートが複製して、ｃｅＤＮＡベクターを産生する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、第１の、Ｒｅｐタンパク質を介したテンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスゲノム等）からのテンプレートの切除（「レスキュー」）、および第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。様々なＡＡＶ血清型のＲｅｐタンパク質およびＲｅｐ結合部位は、当業者に周知である。当業者は、少なくとも１つの機能的ＩＴＲに基づいて、核酸配列に結合し、複製する血清型からＲｅｐタンパク質を選択することを理解する。例えば、複製可能ＩＴＲがＡＡＶ血清型２に由来する場合、対応するＲｅｐは、その血清型と共働するＡＡＶ血清型に由来し、例えばＡＡＶ２  ＩＴＲはＡＡＶ２またはＡＡＶ４  Ｒｅｐと共働するが、ＡＡＶ５  Ｒｅｐとは共働しない。複製時に、共有結合性閉端ｃｅＤＮＡベクターは、許容細胞中で蓄積し続け、ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは標準複製条件下、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、長期間にわたって十分に安定して、例えば、少なくとも１ｐｇ／細胞、好ましくは少なくとも２ｐｇ／細胞、好ましくは少なくとも３ｐｇ／細胞、より好ましくは少なくとも４ｐｇ／細胞、さらにより好ましくは少なくとも５ｐｇ／細胞の量で蓄積する。
【００８２】
したがって、本発明の一態様は、ａ）ポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス）を内包する宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベートするステップであって、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠いており、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベートするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から採取し、単離するステップと、を含む、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターを産生するプロセスに関する。Ｒｅｐタンパク質の存在は、修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でｃｅＤＮＡベクターを産生する。しかしながら、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶビリオン）は発現されない。したがって、ビリオン強制サイズ制限はない。
【００８３】
宿主細胞から単離された遺伝子編集に有用なｃｅＤＮＡベクターの存在は、宿主細胞から単離されたＤＮＡを、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を変性ゲルおよび非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。
【００８４】
また別の態様では、核酸配列をゲノムセーフハーバー遺伝子に挿入するための方法が本明細書に提供され、この方法は、細胞を（ｉ）遺伝子編集系および（ｉｉ）ゲノムセーフハーバー遺伝子に対する相同性を有し、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列を含む相同性指向修復テンプレートと接触させることを含み、遺伝子編集系の１つ以上の構成成分は、細胞を本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター組成物と接触させることによって細胞に送達され、ｃｅＤＮＡベクター組成物は、隣接するＩＴＲ配列を含む直線状の閉端二重鎖ＤＮＡであり、ＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように互いに対して非対称、対称、または実質的に対称であり、少なくとも１つの遺伝子編集核酸配列は、ゲノムセーフハーバー遺伝子に相補的な領域を有し、この方法は、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列をゲノムセーフハーバー遺伝子に挿入するのに十分な条件下、かつそのために十分な時間にわたって実施される。
【００８５】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ゲノムセーフハーバー遺伝子は、高発現レベルでタンパク質を発現することが知られている少なくとも１つのコード配列に近い活性イントロンを含む。
【００８６】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ゲノムセーフハーバー遺伝子は、アルブミン遺伝子の中または近くの部位を含む。
【００８７】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、ゲノムセーフハーバー遺伝子は、ＡＡＶＳ１遺伝子座である。
【００８８】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、関心対象のタンパク質は、受容体、毒素、ホルモン、酵素、または細胞表面タンパク質である。この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、関心対象のタンパク質は、受容体である。この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、関心対象のタンパク質は、プロテアーゼである。
【００８９】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、標的化される例示的な非限定的遺伝子、または関心対象のタンパク質は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）または第ＩＸ因子（ＦＩＸ）であり得る。この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、方法は、血友病Ａまたは血友病Ｂの治療のためにインビボで実施される。本明細書に開示されるような遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターの使用は、本明細書における「遺伝子編集ｃｅＤＮＡで治療される例示的な疾患」および「遺伝子編集のための追加の疾患」と題するセクションで論じられる。治療される例示的な疾患は、例えば、限定されないが、デュシェン型筋ジストロフィー（ＤＭＤ遺伝子）、トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）（正しいｍｕｔＴＴＲ遺伝子）、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ＯＴＣ欠損症）、血友病、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、遺伝性ヘモクロマトーシス、癌、または遺伝性失明であり、訂正される遺伝子には、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）、グロビン、レプチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、サイトカイン、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、またはペプチド成長因子等が含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本出願は、以下のパラグラフのうちのいずれかに定義され得る。
１．非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターであって、
隣接する逆位末端配列（ＩＴＲ）間に少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの遺伝子編集分子をコードする、ｃｅＤＮＡベクター。
２．少なくとも１つの遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、およびアクチベーターＲＮＡから選択される、パラグラフ１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３．少なくとも１つの遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼである、パラグラフ２に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４．ヌクレアーゼが、配列特異的ヌクレアーゼである、パラグラフ３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
５．配列特異的ヌクレアーゼが、核酸誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはｍｅｇａＴＡＬから選択される、パラグラフ４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
６．配列特異的ヌクレアーゼが、一塩基エディター、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、およびＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼから選択される核酸誘導型ヌクレアーゼである、パラグラフ５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
７．少なくとも１つの遺伝子編集分子が、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡである、パラグラフ２またはパラグラフ６に記載のｃｅＤＮＡベクター。
８．少なくとも１つの遺伝子編集分子が、アクチベーターＲＮＡである、パラグラフ２、６、または７に記載のｃｅＤＮＡベクター。
９．核酸誘導型ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである、パラグラフ６〜８のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡ。
１０．ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼである、パラグラフ９に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１１．Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、ニッキングＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、および不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）から選択される、パラグラフ１０に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１２．ｎＣａｓ９が、ＣａｓのＨＮＨまたはＲｕＶｃドメインに突然変異を含む、パラグラフ１１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１３．Ｃａｓヌクレアーゼが、標的遺伝子のプロモーター領域を標的とするｇＲＮＡと複合体を形成する不活性化Ｃａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）である、パラグラフ１１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１４．ＫＲＡＢエフェクタードメインをさらに含む、パラグラフ１３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１５．ｄＣａｓが、プロモーター領域に向けられ得る異種転写活性化ドメインに融合される、パラグラフ１３またはパラグラフ１４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１６．ｄＣａｓ融合が、標的遺伝子の発現を上方調節するために追加のトランス活性化ドメインを動員するガイドＲＮＡによって標的遺伝子のプロモーター領域に向けられる、パラグラフ１５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１７．ｄＣａｓが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ｄＣａｓ９である、パラグラフ１３〜１６のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１８．ガイドＲＮＡ配列が、標的遺伝子のプロモーターを標的とし、ＣＲＩＳＰＲが、標的遺伝子をサイレンシングする（ＣＲＩＳＰＲｉ系）、パラグラフ７〜１７のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１９．ガイドＲＮＡ配列が、標的遺伝子の転写開始部位を標的とし、標的遺伝子を活性化する（ＣＲＩＳＰＲａ系）、パラグラフ７〜１７のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
２０．少なくとも１つの遺伝子編集分子が、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、パラグラフ６〜１９のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
２１．ｇＲＮＡが、スプライスアクセプターまたはスプライスドナー部位を標的とする、パラグラフ７〜２０のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
２２．スプライスアクセプターまたはスプライスドナー部位を標的とすることが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および欠陥遺伝子の訂正をもたらす、パラグラフ２１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２３．ベクターが、１つのガイドＲＮＡ配列の複数のコピーをコードする、パラグラフ７〜２２のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
２４．第１の異種ヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第１の調節配列を含む、パラグラフ１〜２３のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
２５．第１の調節配列が、プロモーターを含む、パラグラフ２４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２６．プロモーターが、ＣＡＧ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｕ６、またはＨ１である、パラグラフ２５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２７．第１の調節配列が、モジュレーターを含む、パラグラフ２４〜２６のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
２８．モジュレーターが、エンハンサーおよびリプレッサーから選択される、パラグラフ２７に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２９．第１の異種ヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の上流にイントロン配列を含み、イントロン配列が、ヌクレアーゼ切断部位を含む、パラグラフ２４〜２８のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
３０．第２の異種ヌクレオチド配列が、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第２の調節配列を含む、パラグラフ１〜２９のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
３１．第２の調節配列が、プロモーターを含む、パラグラフ３０に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３２．プロモーターが、ＣＡＧ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｕ６、またはＨ１である、パラグラフ３１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３３．第２の調節配列が、モジュレーターを含む、パラグラフ３０〜３２のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
３４．モジュレーターが、エンハンサーおよびリプレッサーから選択される、パラグラフ３３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３５．第３の異種ヌクレオチド配列が、アクチベーターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第３の調節配列を含む、パラグラフ１〜３４のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
３６．第３の調節配列が、プロモーターを含む、パラグラフ３５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３７．プロモーターが、ＣＡＧ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｕ６、またはＨ１である、パラグラフ３６に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３８．第３の調節配列が、モジュレーターを含む、パラグラフ３５〜３７のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
３９．モジュレーターが、エンハンサーおよびリプレッサーから選択される、パラグラフ３８に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４０．ｃｅＤＮＡベクターが、標的核酸配列に対する５’相同性アームおよび３’相同性アームを含む、パラグラフ１〜３９のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
４１．５’相同性アームおよび３’相同性アームが各々、約２５０〜２０００ｂｐである、パラグラフ４０に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４２．５’相同性アームおよび／または３’相同性アームが、ＩＴＲの近位にある、パラグラフ４０またはパラグラフ４１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４３．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、５’相同性アームと３’相同性アームとの間にある、パラグラフ４０〜４２のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
４４．５’相同性アームと３’相同性アームとの間にある少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、標的遺伝子を含む、パラグラフ４３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４５．遺伝子編集分子をコードするｃｅＤＮＡベクター少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、５’相同性アームと３’相同性アームとの間にはない、パラグラフ４０〜４４のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
４６．遺伝子編集分子をコードする異種ヌクレオチド配列のいずれも、５’相同性アームと３’相同性アームとの間にはない、パラグラフ４５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４７．５’相同性アームの上流の第１のエンドヌクレアーゼ制限部位および／または３’相同性アームの下流の第２のエンドヌクレアーゼ制限部位を含む、パラグラフ４０〜４６のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
４８．第１のエンドヌクレアーゼ制限部位および第２のエンドヌクレアーゼ制限部位が、同じ制限エンドヌクレアーゼ部位である、パラグラフ４７に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４９．少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ制限部位が、同じくｃｅＤＮＡベクター上にコードされるエンドヌクレアーゼによって切断される、パラグラフ４７またはパラグラフ４８に記載のｃｅＤＮＡベクター。
５０．１つ以上のポリＡ部位をさらに含む、パラグラフ４０〜４９のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
５１．導入遺伝子調節エレメント、および下流にありかつ３’相同性アームに近接する、および／または上流にありかつ５’相同性アームに近接するポリＡ部位のうちの少なくとも１つを含む、パラグラフ４０〜５０のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
５２．上流にありかつ３’相同性アームに近接する２Ａおよび選択マーカー部位を含む、パラグラフ４０〜５１のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
５３．５’相同性アームが、染色体上のヌクレアーゼ切断部位の上流のヌクレオチド配列と相同である、パラグラフ４０〜５２のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
５４．３’相同性アームが、染色体上のヌクレアーゼ切断部位の下流のヌクレオチド配列と相同である、パラグラフ４０〜５３のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
５５．相同組み換えのエンハンサーをコードする異種ヌクレオチド配列を含む、パラグラフ１〜５４のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
５６．相同組み換えのエンハンサーが、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー配列、サイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメント、ＲＳＶエンハンサー、およびＣＭＶエンハンサーから選択される、パラグラフ５５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
５７．少なくとも１つのＩＴＲが、機能性末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む、パラグラフ１〜５６のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
５８．隣接するＩＴＲが、対称または非対称である、パラグラフ１〜５７のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
５９．隣接するＩＴＲが、非対称であり、ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ配列から、ＩＴＲの全体的な３次元コンフォメーションに影響を与える欠失、付加、または置換によって変更されている、パラグラフ５８に記載のｃｅＤＮＡベクター。
６０．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、ｃＤＮＡである、パラグラフ１〜５９のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
６１．隣接するＩＴＲのうちの１つ以上が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、パラグラフ１〜６０に記載のｃｅＤＮＡベクター。
６２．ＩＴＲのうちの１つ以上が、合成のものである、パラグラフ１〜６１のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
６３．ＩＴＲのうちの１つ以上が、野生型ＩＴＲではない、パラグラフ１〜６２のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
６４．ＩＴＲのうちの１つ以上または両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択されるＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つにおける欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、パラグラフ１〜６３のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
６５．欠失、挿入、および／または置換が、通常はＡ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、またはＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、パラグラフ６４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
６６．ＩＴＲが、対称である、パラグラフ１〜５８または５６〜６５のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
６７．ＩＴＲが、野生型である、パラグラフ１〜５８、６０、６１、および６６のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
６８．両方のＩＴＲが、ＩＴＲが互いに対して反転されたときに全体的な３次元対称性をもたらすように変更されている、パラグラフ１〜６６のいずれか１つに記載のｃｅＤＮＡベクター。
６９．変更が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択されるＩＴＲ領域における欠失、挿入、および／または置換である、パラグラフ６８に記載のｃｅＤＮＡベクター。
７０．ゲノム編集のための方法であって、
細胞を遺伝子編集系と接触させることを含み、遺伝子編集系の１つ以上の構成成分が、細胞を、隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）の間に少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含む非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターと接触させることによって細胞に送達され、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの遺伝子編集分子をコードする、方法。
７１．少なくとも１つの遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、およびアクチベーターＲＮＡから選択される、パラグラフ７０に記載の方法。
７２．少なくとも１つの遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼである、パラグラフ７１に記載の方法。
７３．ヌクレアーゼが、配列特異的ヌクレアーゼである、パラグラフ７２に記載の方法。
７４．配列特異的ヌクレアーゼが、核酸誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはｍｅｇａＴＡＬから選択される、パラグラフ７３に記載の方法。
７５．配列特異的ヌクレアーゼが、一塩基エディター、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、およびＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼから選択される核酸誘導型ヌクレアーゼである、パラグラフ７３に記載の方法。
７６．少なくとも１つの遺伝子編集分子が、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡである、パラグラフ７０または７５に記載の方法。
７７．少なくとも１つの遺伝子編集分子が、アクチベーターＲＮＡである、パラグラフ７０、７５、または７６に記載の方法。
７８．核酸誘導型ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである、方法７４〜７７のいずれか１つに記載の方法。
７９．ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼである、パラグラフ７８に記載の方法。
８０．Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、ニッキングＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、および不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）から選択される、パラグラフ７９に記載の方法。
８１．ｎＣａｓ９が、ＣａｓのＨＮＨまたはＲｕＶｃドメインに突然変異を含む、パラグラフ８０に記載の方法。
８２．Ｃａｓヌクレアーゼが、標的遺伝子のプロモーター領域を標的とするｇＲＮＡと複合体を形成する不活性化Ｃａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）である、パラグラフ８０に記載の方法。
８３．ＫＲＡＢエフェクタードメインをさらに含む、パラグラフ８２に記載の方法。
８４．ｄＣａｓが、プロモーター領域に向けられ得る異種転写活性化ドメインに融合される、パラグラフ８２または８３に記載の方法。
８５．ｄＣａｓ融合が、標的遺伝子の発現を上方調節するために追加のトランス活性化ドメインを動員するガイドＲＮＡによって標的遺伝子のプロモーター領域に向けられる、パラグラフ８４に記載の方法。
８６．ｄＣａｓが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ｄＣａｓ９である、パラグラフ８２〜８５のいずれかに記載の方法。
８７．ガイドＲＮＡ配列が、標的遺伝子のプロモーターを標的とし、ＣＲＩＳＰＲが、標的遺伝子をサイレンシングする（ＣＲＩＳＰＲｉ系）、パラグラフ７８〜８６のいずれかに記載の方法。
８８．ガイドＲＮＡ配列が、標的遺伝子の転写開始部位を標的とし、標的遺伝子を活性化する（ＣＲＩＳＰＲａ系）、パラグラフ７８〜８６のいずれかに記載の方法。
８９．少なくとも１つの遺伝子編集分子が、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、パラグラフ７６〜８８のいずれかに記載の方法。
９０．ｇＲＮＡが、スプライスアクセプターまたはスプライスドナー部位を標的とする、パラグラフ７６〜８９のいずれかに記載の方法。
９１．スプライスアクセプターまたはスプライスドナー部位を標的とすることが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および欠陥遺伝子の訂正をもたらす、パラグラフ２２に記載の方法。
９２．ベクターが、１つのガイドＲＮＡ配列の複数のコピーをコードする、パラグラフ７６〜９１に記載の方法。
９３．第１の異種ヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第１の調節配列を含む、パラグラフ７０〜９２のいずれかに記載の方法。
９４．第１の調節配列が、プロモーターを含む、パラグラフ９３に記載の方法。
９５．プロモーターが、ＣＡＧ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｕ６、またはＨ１である、パラグラフ９４に記載の方法。
９６．第１の調節配列が、モジュレーターを含む、パラグラフ９３〜９５のいずれかに記載の方法。
９７．モジュレーターが、エンハンサーおよびリプレッサーから選択される、パラグラフ９６に記載の方法。
９８．第１の異種ヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の上流にイントロン配列を含み、イントロン配列が、ヌクレアーゼ切断部位を含む、パラグラフ９３〜９７のいずれかに記載の方法。
９９．第２の異種ヌクレオチド配列が、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第２の調節配列を含む、パラグラフ７０〜９８のいずれかに記載の方法。
１００．第２の調節配列が、プロモーターを含む、パラグラフ９９に記載の方法。
１０１．プロモーターが、ＣＡＧ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｕ６、またはＨ１である、パラグラフ１００に記載の方法。
１０２．第２の調節配列が、モジュレーターを含む、パラグラフ９９〜１０１のいずれかに記載の方法。
１０３．モジュレーターが、エンハンサーおよびリプレッサーから選択される、パラグラフ１０２に記載の方法。
１０４．第３の異種ヌクレオチド配列が、アクチベーターＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第３の調節配列を含む、パラグラフ７０〜１０３のいずれかに記載の方法。
１０５．第３の調節配列が、プロモーターを含む、パラグラフ１０４に記載の方法。
１０６．プロモーターが、ＣＡＧ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｕ６、またはＨ１である、パラグラフ１０５に記載の方法。
１０７．第３の調節配列が、モジュレーターを含む、パラグラフ１０４〜１０６のいずれかに記載の方法。
１０８．モジュレーターが、エンハンサーおよびリプレッサーから選択される、パラグラフ１０７に記載の方法。
１０９．ｃｅＤＮＡベクターが、標的核酸配列に対する５’相同性アームおよび３’相同性アームを含む、パラグラフ７０〜１０８のいずれかに記載の方法。
１１０．５’相同性アームおよび３’相同性アームが各々、約２５０〜２０００ｂｐである、パラグラフ１０９に記載の方法。
１１１．５’相同性アームおよび／または３’相同性アームが、ＩＴＲの近位にある、パラグラフ１０９または１１０に記載の方法。
１１２．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、５’相同性アームと３’相同性アームとの間にある、パラグラフ１０９〜１１１のいずれかに記載の方法。
１１３．５’相同性アームと３’相同性アームとの間にある少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、標的遺伝子を含む、パラグラフ１１２に記載の方法。
１１４．遺伝子編集分子をコードするｃｅＤＮＡベクター少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、５’相同性アームと３’相同性アームとの間にはない、パラグラフ１０９〜１１３に記載の方法。
１１５．遺伝子編集分子をコードする異種ヌクレオチド配列のいずれも、５’相同性アームと３’相同性アームとの間にはない、パラグラフ１１４に記載の方法。
１１６．５’相同性アームの上流の第１のエンドヌクレアーゼ制限部位および／または３’相同性アームの下流の第２のエンドヌクレアーゼ制限部位を含む、パラグラフ１０９〜１１５に記載の方法。
１１７．第１のエンドヌクレアーゼ制限部位および第２のエンドヌクレアーゼ制限部位が、同じ制限エンドヌクレアーゼ部位である、パラグラフ１１６に記載の方法。
１１８．少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ制限部位が、同じくｃｅＤＮＡベクター上にコードされるエンドヌクレアーゼによって切断される、パラグラフ１１６または１１７に記載の方法。
１１９．１つ以上のポリＡ部位をさらに含む、パラグラフ１０９〜１１８のいずれかに記載の方法。
１２０．導入遺伝子調節エレメント、および下流にありかつ３’相同性アームに近接する、および／または上流にありかつ５’相同性アームに近接するポリＡ部位のうちの少なくとも１つを含む、パラグラフ１０９〜１１９のいずれかに記載の方法。
１２１．上流にありかつ３’相同性アームに近接する２Ａおよび選択マーカー部位を含む、パラグラフ１０９〜１２０のいずれかに記載の方法。
１２２．５’相同性アームが、染色体上のヌクレアーゼ切断部位の上流のヌクレオチド配列と相同である、パラグラフ１０９〜１２１のいずれかに記載の方法。
１２３．３’相同性アームが、染色体上のヌクレアーゼ切断部位の下流のヌクレオチド配列と相同である、パラグラフ１０９〜１２２のいずれかに記載の方法。
１２４．相同組み換えのエンハンサーをコードする異種ヌクレオチド配列を含む、パラグラフ１０９〜１２３のいずれかに記載の方法。
１２５．相同組み換えのエンハンサーが、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー配列、サイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメント、ＲＳＶエンハンサー、およびＣＭＶエンハンサーから選択される、パラグラフ１２４に記載の方法。
１２６．少なくとも１つのＩＴＲが、機能性末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む、パラグラフ７０〜１２５のいずれかに記載の方法。
１２７．隣接するＩＴＲが、対称または非対称である、パラグラフ７０〜１２６のいずれかに記載の方法。
１２８．隣接するＩＴＲが、非対称であり、ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ配列から、ＩＴＲの全体的な３次元コンフォメーションに影響を与える欠失、付加、または置換によって変更されている、パラグラフ１２７に記載の方法。
１２９．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、ｃＤＮＡである、パラグラフ７０〜１２８のいずれかに記載の方法。
１３０．隣接するＩＴＲのうちの１つ以上が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、パラグラフ７０〜１２９のいずれかに記載の方法。
１３１．ＩＴＲのうちの１つ以上が、合成のものである、パラグラフ７０〜１３０のいずれかに記載の方法。
１３２．ＩＴＲのうちの１つ以上が、野生型ＩＴＲではない、パラグラフ７０〜１３１のいずれかに記載の方法。
１３３．ＩＴＲのうちの１つ以上両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択されるＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つにおける欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、パラグラフ７０〜１３２のいずれかに記載の方法。
１３４．欠失、挿入、および／または置換が、通常はＡ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、またはＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、パラグラフ１３３に記載の方法。
１３５．ＩＴＲが、対称である、パラグラフ７０〜１２７または１２９〜１３４のいずれかに記載の方法。
１３６．ＩＴＲが、野生型である、パラグラフ７０〜１２７または１２９〜１３０のいずれか１つに記載の方法。
１３７．両方のＩＴＲが、ＩＴＲが互いに対して反転されたときに全体的な３次元対称性をもたらすように変更されている、パラグラフ７０〜１３６のいずれかに記載の方法。
１３８．変更が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択されるＩＴＲ領域における欠失、挿入、および／または置換である、パラグラフ１３７に記載の方法。
１３９．接触される細胞が、真核細胞である、パラグラフ７０〜１３８のいずれかに記載の方法。
１４０．ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、真核細胞における発現のためにコドン最適化される、パラグラフ８４〜１３９のいずれかに記載の方法。
１４１．Ｃａｓタンパク質が、真核細胞での発現のためにコドン最適化される、パラグラフ８４〜１４０のいずれかに記載の方法。
１４２．標的遺伝子を編集するのに適した条件下、かつそのために十分な時間にわたって、パラグラフ１〜６９のいずれか１つに記載の有効量の非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡベクター）を細胞に投与することを含む、ゲノム編集の方法。
１４３．標的遺伝子が、１つ以上のガイドＲＮＡ配列を使用して遺伝子標的化され、相同性修復（ＨＤＲ）ドナーテンプレートの存在下でＨＤＲにより編集される遺伝子である、パラグラフ１１３〜１４２のいずれかに記載の方法。
１４４．標的遺伝子が、１つのガイドＲＮＡ配列を使用して標的化され、標的遺伝子が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって編集される、パラグラフ１４２または１４３に記載の方法。
１４５．方法が、疾患に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）を訂正するためにインビボで実施される、パラグラフ７０〜１４４のいずれかに記載の方法。
１４６．疾患が、鎌状赤血球貧血、遺伝性ヘモクロマトーシス、または癌遺伝性失明を含む、パラグラフ１４５に記載の方法。
１４７．少なくとも２つの異なるＣａｓタンパク質が、ｃｅＤＮＡベクターに存在し、Ｃａｓタンパク質のうちの１つが、触媒的に不活性（Ｃａｓ−ｉ）であり、Ｃａｓ−Ｉに関連するガイドＲＮＡが、標的細胞のプロモーターを標的とし、Ｃａｓ−ＩをコードするＤＮＡが、誘導性プロモーターの制御下にあるため、所望の時点で標的遺伝子の発現を止めることができる、パラグラフ７０〜１４６のいずれかに記載の方法。
１４８．細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系と接触させることを含む、細胞の標的遺伝子における単一ヌクレオチド塩基対を編集するための方法であって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系の１つ以上の構成成分が、細胞を非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター組成物と接触させることによって細胞に送達され、
ｃｅＤＮＡベクターから発現されたＣａｓタンパク質が、触媒的に不活性であり、塩基編集部分に融合されており、
方法が、標的遺伝子の発現を調整するのに十分な条件下、かつそのために十分な時間にわたって実施される、方法。
１４９．ｃｅＤＮＡベクターが、パラグラフ１〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターである、パラグラフ１４８に記載の方法。
１５０．塩基編集部分が、一本鎖特異的シチジンデアミナーゼ、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤、またはｔＲＮＡアデノシンデアミナーゼを含む、パラグラフ１４８に記載の方法。
１５１．触媒的に不活性なＣａｓタンパク質が、ｄＣａｓ９である、パラグラフ１４８に記載の方法。
１５２．細胞が、Ｔ細胞またはＣＤ３４＋である、パラグラフ７０〜１５１のいずれかに記載の方法。
１５３．標的遺伝子が、プログラム死タンパク質（ＰＤ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）をコードする、パラグラフ７０〜１５２のいずれかに記載の方法。
１５４．産生された細胞を、それを必要とする対象に投与することをさらに含む、パラグラフ７０〜１５３のいずれかに記載の方法。
１５５．治療を必要とする対象が、遺伝性疾患、ウイルス感染、細菌感染、癌、または自己免疫疾患を有する、パラグラフ１５４に記載の方法。
１５６．細胞における２つ以上の標的遺伝子の発現を調整する方法であって、
（ｉ）隣接する末端反復（ＴＲ）配列、および２つ以上の標的遺伝子に相補的な少なくとも２つのガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含むベクターを含む第１の組成物であって、ベクターが、非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターである、第１の組成物と、
（ｉｉ）隣接する末端反復（ＴＲ）配列、および各々がガイドＲＮＡと関連し、２つ以上の標的遺伝子に結合する少なくとも２つの触媒的に不活性なＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むベクターを含む第２の組成物であって、ベクターが、非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターである、第２の組成物と、
（ｉｉｉ）隣接する末端反復（ＴＲ）配列、および少なくとも２つの転写調節因子タンパク質またはドメインをコードする核酸配列を含むベクターを含む第３の組成物であって、ベクターが、非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターである、第３の組成物と、を細胞に導入することを含み、
少なくとも２つのガイドＲＮＡ、少なくとも２つの触媒的に不活性なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、および少なくとも２つの転写調節因子タンパク質またはドメインが、細胞で発現され、
ガイドＲＮＡ、触媒的に不活性なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、転写調節因子タンパク質またはドメイン、および標的遺伝子の間で２つ以上の共局在複合体が形成され、
転写調節因子タンパク質またはドメインが、少なくとも２つの標的遺伝子の発現を調節する、方法。
１５７．第１の組成物のｃｅＤＮＡベクターが、パラグラフ１〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターであり、第２の組成物のｃｅＤＮＡベクターが、パラグラフ１〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターであり、第３の組成物が、パラグラフ１〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターである、パラグラフ１５６に記載の方法。
１５８．核酸配列をゲノムセーフハーバー遺伝子に挿入するための方法であって、細胞を（ｉ）遺伝子編集系、および（ｉｉ）ゲノムセーフハーバー遺伝子に対する相同性を有し、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列を含む相同性指向修復テンプレートと接触させることを含み、
遺伝子編集系の１つ以上の構成成分が、細胞を非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター組成物と接触させることによって細胞に送達され、ｃｅＤＮＡ核酸ベクター組成物が、隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）間に少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの遺伝子編集分子をコードし、
当該方法が、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列をゲノムセーフハーバー遺伝子に挿入するのに十分な条件下、かつそのために十分な時間にわたって実施される、方法。
１５９．ｃｅＤＮＡベクターが、パラグラフ１〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターである、パラグラフ１５８に記載の方法。
１６０．ゲノムセーフハーバー遺伝子が、高発現レベルでタンパク質を発現することが知られている少なくとも１つのコード配列に近い活性イントロンを含む、パラグラフ１５８に記載の方法。
１６１．ゲノムセーフハーバー遺伝子が、アルブミン遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、ＡＡＶＳ１遺伝子座のうちのいずれか１つの中または近くの部位を含む、パラグラフ１５８に記載の方法。
１６２．関心対象のタンパク質が、受容体、毒素、ホルモン、酵素、または細胞表面タンパク質である、パラグラフ１５８〜１６１のいずれかに記載の方法。
１６３．関心対象のタンパク質が、分泌タンパク質である、パラグラフ１６２に記載の方法。
１６４．関心対象のタンパク質が、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）または第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を含む、パラグラフ１６３に記載の方法。
１６５．方法が、血友病Ａまたは血友病Ｂの治療のためにインビボで実施される、パラグラフ１６４に記載の方法。
１６６．宿主細胞内の染色体上の所定の挿入部位にドナー配列を挿入する方法であって、宿主細胞にパラグラフ１〜６９に記載のｃｅＤＮＡベクターを導入することを含み、ドナー配列が、相同組み換えによって挿入部位において、または隣接して染色体に挿入される、方法。
１６７．動物の染色体上の所定の挿入部位に挿入されたドナー配列を含む遺伝子操作された動物を生成する方法であって、ａ）パラグラフ１６７に記載の染色体上の所定の挿入部位に挿入されたドナー配列を有する細胞を生成することと、ｂ）ａ）によって生成された細胞を担体動物に導入して、遺伝子操作された動物を産生することと、を含む、方法。
１６８．細胞が、接合体または多能性幹細胞である、パラグラフ１６７に記載の方法。
１６９．パラグラフ１６８に記載の方法によって生成された遺伝子操作された動物。
１７０．動物が、非ヒト動物である、パラグラフ１６９に記載の遺伝子操作された動物。
１７１．細胞内の染色体上の挿入部位にドナー配列を挿入するためのキットであって、
２つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、ならびに
５’相同性アーム、ドナー配列、および３’相同性アームを含む第１のヌクレオチド配列であって、ドナー配列が、遺伝子編集機能を有する、第１のヌクレオチド配列を含む、第１の非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターと、
（ａ）
少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲ、および
少なくとも１つの遺伝子編集分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のｃｅＤＮＡベクターと、を含み、
第１のｃｅＤＮＡベクターでは、５’相同性アームが、染色体上の遺伝子編集分子の切断部位の上流の配列と相同であり、３’相同性アームが、染色体上の遺伝子編集分子切断部位の下流の配列と相同であり、５’相同性アームまたは３’相同性アームが、ＩＴＲの近位にある、キット。
１７２．遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼである、パラグラフ１７１に記載の方法。
１７３．ヌクレアーゼが、配列特異的ヌクレアーゼである、パラグラフ１７２に記載の方法。
１７４．第１のｃｅＤＮＡベクターが、パラグラフ１、４０〜５６、５７〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターである、パラグラフ１７１〜１７３のいずれかに記載の方法。
１７５．第２のｃｅＤＮＡベクターが、パラグラフ１〜３９またはパラグラフ５７〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターである、パラグラフ１７１〜１７３のいずれかに記載の方法。
１７６．宿主細胞の染色体上の所定の挿入部位にドナー配列を挿入する方法であって、
ａ）少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を有する第１の非ウイルス性カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを宿主細胞に導入することであって、ｃｅＤＮＡベクターが、５’相同性アーム、ドナー配列、および３’相同性アームを含む第１の直鎖状核酸を含む、導入することと、
ｂ）隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）の間に少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含む第２のｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞に導入することであって、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、挿入部位において、または隣接して染色体を切断する少なくとも１つの遺伝子編集分子をコードし、ドナー配列が、相同組み換えによって挿入部位において、または隣接して染色体に挿入される、導入することと、を含む、方法。
１７７．遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼである、パラグラフ１７６に記載の方法。
１７８．ヌクレアーゼが、配列特異的ヌクレアーゼである、パラグラフ１７７に記載の方法。
１７９．第１のｃｅＤＮＡベクターが、パラグラフ１、４０〜５６、５７〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターである、パラグラフ１７６〜１７８のいずれかに記載の方法。
１８０．第２のｃｅＤＮＡベクターが、パラグラフ１〜３９またはパラグラフ５７〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターである、パラグラフ１７６〜１７９のいずれかに記載の方法。
１８１．第２のｃｅＤＮＡベクターが、挿入部位を認識するガイド配列をコードする第３のヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ１７９または１８０に記載の方法。
１８２．パラグラフ１〜６９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターを含む、細胞。
１８３．パラグラフ１〜６９のいずれかに記載のベクターおよび脂質を含む、組成物。
１８４．脂質が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、パラグラフ１８４に記載の組成物。
１８５．パラグラフ１８３もしくは１８４の組成物またはパラグラフ１８２の細胞を含む、キット。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術の一態様は、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）に関し、ｃｅＤＮＡベクターは、非対称逆位末端反復配列（非対称ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、非対称ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能性末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含み、任意に異種核酸配列は、導入遺伝子をコードし、ベクターは、ウイルスカプシド中に存在しない。
【００９２】
本発明のこれらおよび他の態様は、下記でさらに詳述される。
【００９３】
上記に簡単に要約され、以下により詳細に論じられる本開示の実施形態は、添付の図面に描かれた本開示の例示的な実施形態を参照することによって理解することができる。しかしながら、添付の図面は、本開示の典型的な実施形態のみを示し、したがって、本開示は他の等しく有効な実施形態を認めることができるため、範囲を限定するものと見なされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１Ａ】遺伝子編集のための非対称ＩＴＲを含む、ｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。この実施形態では、例示的なｃｅＤＮＡベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを含む。ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位（Ｒ３／Ｒ４）に挿入される。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）−発現カセットの上流（５’端）の野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲおよび下流（３’端）の修飾型ＩＴＲによって隣接され、したがって、発現カセットに隣接する２つのＩＴＲは、互いに対して非対称である。
【図１Ｂ】ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含む発現カセットを用いた遺伝子編集のための非対称ＩＴＲを含む、ｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）−発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲおよび下流（３’端）の野生型ＩＴＲによって隣接される。
【図１Ｃ】エンハンサー／プロモーターを含む発現カセット、遺伝子編集分子である導入遺伝子の挿入のためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、または遺伝子編集核酸配列、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを備えた、非対称ＩＴＲを含む、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、遺伝子編集分子である導入遺伝子、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への遺伝子編集核酸配列の挿入を可能にする。発現カセットは、互いに対して非対称である２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）、発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲおよび下流（３’端）の修飾型ＩＴＲによって隣接され、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方は、修飾型ＩＴＲであるが、異なる修飾を有する（すなわち、同じ修飾を有しない）。
【図１Ｄ】ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含む発現カセットを備えた、本明細書で定義される対称の修飾型ＩＴＲまたは実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、５’修飾型ＩＴＲおよび３’修飾型ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの修飾型逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。
【図１Ｅ】エンハンサー／プロモーターを含む発現カセット、遺伝子編集分子である導入遺伝子の挿入のためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、または遺伝子編集核酸配列、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを備えた、本明細書で定義される対称の修飾型ＩＴＲまたは実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、遺伝子編集分子である導入遺伝子、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への遺伝子編集核酸配列の挿入を可能にする。発現カセットは、５’修飾型ＩＴＲおよび３’修飾型ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの修飾型逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。
【図１Ｆ】ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含む発現カセットを備えた、本明細書で定義される対称のＷＴ−ＩＴＲまたは実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲを含む、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、５’ＷＴ−ＩＴＲおよび３’ＷＴ  ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの野生型逆位末端反復（ＷＴ−ＩＴＲ）に隣接している。
【図１Ｇ】エンハンサー／プロモーターを含む発現カセット、遺伝子編集分子である導入遺伝子の挿入のためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、または遺伝子編集核酸配列、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを備えた、本明細書で定義される対称の修飾型ＩＴＲまたは実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、遺伝子編集分子である導入遺伝子、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への遺伝子編集核酸配列の挿入を可能にする。発現カセットは、５’ＷＴ−ＩＴＲおよび３’ＷＴ  ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの野生型逆位末端反復（ＷＴ−ＩＴＲ）に隣接している。
【図２Ａ】Ａ−Ａ’アーム、Ｂ−Ｂ’アーム、Ｃ−Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥおよびＲＢＥ’）の特定を有するＡＡＶ２（配列番号５３８）の野生型左ＩＴＲのＴ形ステムループ構造を提供し、末端分解部位（ｔｒｓ）も示す。ＲＢＥは、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８のいずれかと相互作用すると考えられる一連の４つの二重四量体を含有する。さらに、ＲＢＥ’はまた、構築物中の野生型ＩＴＲまたは変位型ＩＴＲ上で集成したＲｅｐ複合体と相互作用すると考えられる。ＤおよびＤ’領域は、転写因子結合部位および他の保存構造を含有する。
【図２Ｂ】Ａ−Ａ’アーム、Ｂ−Ｂ’アーム、Ｃ−Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥおよびＲＢＥ’）、および末端分解部位（ｔｒｓ）の特定を有するＡＡＶ２の野生型左ＩＴＲのＴ形ステムループ構造を含む、野生型ＩＴＲ（配列番号５３９）中の提案されたＲｅｐ触媒ニッキングおよび結紮活性を示し、またいくつかの転写因子結合部位を含むＤおよびＤ’領域、および他の保存構造も示す。
【図３Ａ】野生型左ＡＡＶ２  ＩＴＲ（配列番号５４０）のＡ−Ａ’アームおよびＣ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（ポリヌクレオチド配列）（左）および二次構造（右）を提供する。
【図３Ｂ】左ＩＴＲの例示的な突然変異型ＩＴＲ（修飾型ＩＴＲとも称される）配列を示す。例示的な突然変異型左ＩＴＲ（ＩＴＲ−１、左）（配列番号１１３）のＡ−Ａ’アーム、Ｃアーム、およびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ部分の一次構造（左）および予測される二次構造（右）が示される。
【図３Ｃ】野生型右ＡＡＶ２  ＩＴＲ（配列番号５４１）のＡ−Ａ’ループ、ならびにＢ−Ｂ’およびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）および二次構造（右）を示す。
【図３Ｄ】例示的な右修飾型ＩＴＲを示す。例示的な突然変異型左ＩＴＲ（ＩＴＲ−１、右）（配列番号１１４）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＢ−Ｂ’およびＣアームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）および予測される二次構造（右）が示される。左および右のＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２  ＩＴＲまたは他のウイルス血清型または合成ＩＴＲ）の任意の組み合わせを、本明細書で教示されるように使用することができる。図３Ａ〜３Ｄポリヌクレオチド配列の各々は、本明細書に記載されるようにｃｅＤＮＡを産生するために使用されるプラスミドまたはバクミド／バキュロウイルスゲノム中で使用される配列を指す。プラスミドまたはバクミド／バキュロウイルスゲノム中のｃｅＤＮＡベクター構成および予測されたＧｉｂｂ自由エネルギー値から推定される対応するｃｅＤＮＡ二次構造もまた、図３Ａ〜３Ｄの各々に含まれる。
【図４Ａ】図４Ｂの概略図に記載されるプロセスにおけるｃｅＤＮＡの産生に有用である、バキュロウイルス感染した昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を作製するための上流プロセスを示す概略図である。
【図４Ｂ】ｃｅＤＮＡ産生の例示的な方法の概略図である。
【図４Ｃ】ｃｅＤＮＡベクター産生を確認するための生化学方法およびプロセスを示す。
【図４Ｄ】（図４Ｄおよび図４Ｅ）図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。（図４Ｅ）非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成し得る。図４Ｅはまた、直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、変性条件ではなく中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができ、鎖は接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する単鎖を産生する。図４Ｄは、左が未切断であるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかで電気泳動に共される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から二番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断されたとき、元のバンドが消え、分裂後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さい）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは単鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から二番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、単鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される単鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。
【図４Ｅ】（図４Ｄおよび図４Ｅ）図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。（図４Ｅ）非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成し得る。図４Ｅはまた、直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、変性条件ではなく中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができ、鎖は接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する単鎖を産生する。図４Ｄは、左が未切断であるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかで電気泳動に共される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から二番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断されたとき、元のバンドが消え、分裂後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さい）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは単鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から二番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、単鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される単鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。
【図５】エンドヌクレアーゼでの消化を有する（＋）または有しない（−）ｃｅＤＮＡベクターの変性ゲル流動例の例示的な図である（ｃｅＤＮＡ構築物１および２の場合ＥｃｏＲＩ、ｃｅＤＮＡ構築物３および４の場合ＢａｍＨ１、ｃｅＤＮＡ構築物５および６の場合ＳｐｅＩ、ならびにｃｅＤＮＡベクター７および８の場合ＸｈｏＩ）。アスタリスクで強調されたバンドのサイズを判定し、図の下に示した。
【図６Ａ】Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ７８の核酸配列を含むｐＦＢＤＬＳＲプラスミド中の例示的なＲｅｐ−バクミドである。この例示的なＲｅｐ−バクミドは、ＩＥ１プロモーター断片（配列番号６６）、Ｋｏｚａｋ配列を含むＲｅｐ７８ヌクレオチド配列（配列番号６７）、Ｒｅｐ５２のポリヘドロンプロモーター配列（配列番号６８）、およびＫｏｚａｋ配列（ｇｃｃｇｃｃａｃｃ）で始まるＲｅｐ５８ヌクレオチド配列（配列番号６９）を含む。
【図６Ｂ】ｗｔ−Ｌ  ＩＴＲ、ＣＡＧプロモーター、ルシフェラーゼ導入遺伝子、ＷＰＲＥおよびポリアデニル化配列、ならびにｍｏｄ−Ｒ  ＩＴＲを有する、例示的なｃｅＤＮＡ−プラスミド−１の概略図である。
【図７Ａ−１】表４Ａに列挙される例示的な修飾型右ＩＴＲのＡ−Ａ’アーム、ならびに修飾型Ｂ−Ｂ’アームおよび／または修飾型Ｃ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された構造を示す。
【図７Ａ−２】同上。
【図７Ａ−３】同上。
【図７Ａ−４】同上。
【図７Ａ−５】同上。
【図７Ａ−６】同上。
【図７Ａ−７】同上。
【図７Ｂ−１】表４Ｂに列挙される例示的な修飾型左ＩＴＲのＡ−Ａ’アーム、ならびに修飾型Ｃ−Ｃ’アームおよび／または修飾型Ｂ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された構造を示す。示される構造は、予測された最低自由エネルギー構造である。カラーコード：赤色＝確率９９％超、橙色＝確率９９％〜９５％、ベージュ色＝確率９５〜９０％、濃緑色９０％〜８０％、明緑色＝８０％〜７０％、明青色＝７０％〜６０％、濃青色６０％〜５０％、およびピンク色＝５０％未満。
【図７Ｂ−２】同上。
【図７Ｂ−３】同上。
【図７Ｂ−４】同上。
【図７Ｂ−５】同上。
【図７Ｂ−６】同上。
【図７Ｂ−７】同上。
【図７Ｂ−８】同上。
【図８】本開示によるｃｅＤＮＡベクターの概略図である。
【図９】図２０とは異なる、本開示によるｃｅＤＮＡベクターの概略図である。
【図１０Ａ−Ｄ】本開示によるｃｅＤＮＡベクターの概略図を描く。
【図１０Ｅ−Ｆ】本開示によるｃｅＤＮＡベクターの概略図を描く。
【図１１】本開示によるｃｅＤＮＡベクターの概略図である。Ｅｎｈ：エンハンサー、Ｐｒｏ＝プロモーター、ｉｎｔｒｏｎ＝スプライスドナーおよびアクセプター配列を持つ合成または天然に存在するイントロン、ＮＬＳ＝核局在化シグナルヌクレアーゼ＝Ｃａｓ９、ＺＦＮ、Ｔａｌｅｎ、または他のエンドヌクレアーゼ配列のＯＲＦ。塗りつぶされた矢印は、ｓｇＲＮＡ配列を表し（単一のガイドＲＮＡ標的配列（例えば、４）は、選び出され、実験的に検証された自由に利用できるソフトウェア／アルゴリズムを使用して選択される）、白抜きの矢印は、代替ｓｇＲＮＡ配列を表す。
【図１２】本開示によるｃｅＤＮＡベクターの概略図である。
【図１３】本開示によるｃｅＤＮＡベクターの概略図である。
【図１４】ｓｇＲＮＡを発現させるための発現カセットの概略図である。
【図１５】図２０および２１とは異なる、本開示によるｃｅＤＮＡベクターの概略図である。
【図１６】本開示によるｃｅＤＮＡベクターの概略図である。ｃｅＤＮＡベクターのうちの３つは、５’および３’相同性アームと、アルブミンへの挿入に適したプロモーターレス導入遺伝子で構成されている。また、プロモーター駆動の導入遺伝子、例えば、任意のセーフハーバー部位に挿入され得るレポーター遺伝子を含む、５’および３’相同性アームを有するｃｅＤＮＡも描かれる。挿入が重大な悪影響を引き起こさない標的領域。所与のゲノム（例えば、ヒトゲノム）におけるゲノムセーフハーバー部位は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ，ＥＲ＆Ｓｃｈａｍｂａｃｈ，Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２４（４）：６７８−６８４（２０１６）またはＳａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：５１−５８（２０１２）に記載されており、各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【図１７−１】アルブミンマウス遺伝子座の標的中心およびＦＩＸをコードするドナーテンプレートの概略図および配列である。図１７は、配列番号８３５を開示する。
【図１７−２】アルブミンマウス遺伝子座の標的中心およびＦＩＸをコードするドナーテンプレートの概略図および配列である。図１７は、配列番号８３５を開示する。
【図１８Ａ】（図１８Ａおよび図１８Ｂ）アルブミンマウス遺伝子座相同性アームの標的中心、および例示的なガイドＲＮＡ位置（図１８Ａ）、およびガイドＲＮＡＳ（図１８Ｂ）の概略図および配列である。図１８Ａおよび１８Ｂは、出現順に、それぞれ配列番号８３５〜８４１を開示する。
【図１８Ｂ】（図１８Ａおよび図１８Ｂ）アルブミンマウス遺伝子座相同性アームの標的中心、および例示的なガイドＲＮＡ位置（図１８Ａ）、およびガイドＲＮＡＳ（図１８Ｂ）の概略図および配列である。図１８Ａおよび１８Ｂは、出現順に、それぞれ配列番号８３５〜８４１を開示する。
【図１９】（ｉ）発現ベクターの細胞送達、（ｉｉ）ｇＲＮＡの設計、（ｉｉｉ）細胞培養法および最適化、（ｉｖ）Ｃａｓ９  ＲＮＰアセンブリー、（ｖ）相同性指向修復テンプレートを含むｃｅＤＮＡベクター、ならびに（ｖｉ）良好な遺伝子編集の検出を含む、本明細書に記載される方法および組成物で有用な遺伝子編集実験プロトコルの例示的なワークフロー方法の概略図が、本明細書に提供される。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
Ｉ．定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関して使用される科学的および技術的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ．，２０１１（ＩＳＢＮ  ９７８−０−９１１９１０−１９−３）、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ（２０１３），Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，１９９９−２０１２（ＩＳＢＮ  ９７８３５２７６００９０８）、およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｌｕｔｔｍａｎｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００６、Ｊａｎｅｗａｙ‘ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ  Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ  Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ．），Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ  ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ  Ｇｅｎｅｓ  ＸＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０１４（ＩＳＢＮ−１４４９６５９０５５）、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ  １９３６１１３４１４）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ  ０４４４６０１４９Ｘ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ���：ＤＮＡ，Ｊｏｎ  Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ  ０１２４１９９５４２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ  Ｍ  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ  Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ  ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）に見出すことができ、これらの内容はすべて、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「異種ヌクレオチド配列」および「導入遺伝子」は、交換可能に使用され、本明細書で開示されるｃｅＤＮＡベクターに組み込まれ、それによって送達および発現され得る、関心対象の（カプシドポリペプチドをコードする核酸以外の）核酸を指す。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」および「転写カセット」という用語は、交換可能に使用され、導入遺伝子の転写を配向するのに十分な１つ以上のプロモーターまたは他の調節配列に操作可能に連結された導入遺伝子を含むが、カプシドをコードする配列、他のベクター配列、または逆位末端反復領域を含まない核酸の直鎖状ストレッチを指す。発現カセットは、追加として、１つ以上のシス作用性配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサー）、１つ以上のイントロン、および１つ以上の転写後調節エレメントを含んでもよい。
【００９８】
本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、または多重らせんＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基または他の天然、化学的もしくは生化学的修飾、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの約５〜約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、この開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離するか、または当技術分野で知られている方法によって化学的に合成することができる。「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、記載されている実施形態に適用可能であるように、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。
【００９９】
本明細書で使用される「核酸構築物」という用語は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、またはそうでなければ天然に存在しないような方法で核酸のセグメントを含むように修飾されるか、または合成のものである、一本鎖または二本鎖の核酸分子を指す。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本開示のコード配列の発現に必要な制御配列を含む場合、「発現カセット」という用語と同義である。「発現カセット」は、プロモーターに操作可能に連結されたＤＮＡコード配列を含む。
【０１００】
「ハイブリダイズ可能」または「相補的」または「実質的に相補的」とは、核酸（例えば、ＲＮＡ）が、非共有結合する、すなわち、ワトソン・クリック塩基対および／またはＧ／Ｕ塩基対を形成する、温度および溶液イオン強度の適切なインビトロおよび／またはインビボ条件下で配列特異的、逆平行方法で別の核酸に「アニール」または「ハイブリダイズ」する（すなわち、核酸は、相補的核酸に特異的に結合する）のを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。当該技術分野で知られているように、標準的なワトソン・クリック塩基対合には、チミジン（Ｔ）とのアデニン（Ａ）対合、ウラシル（Ｕ）とのアデニン（Ａ）対合、およびシトシン（Ｃ）とのグアニン（Ｇ）対合が含まれる。さらに、２つのＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）間のハイブリダイゼーションのために、グアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）と対合することも当該技術分野で知られている。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対合は、ｍＲＮＡ中のコドンとのｔＲＮＡアンチコドン塩基対合の状況で、遺伝暗号の縮重（すなわち、冗長性）を部分的に担っている。この開示の文脈において、対象のＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）に相補的であると見なされ、逆もまた同様である。したがって、対象のＤＮＡ標的ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）の所与のヌクレオチド位置でＧ／Ｕ塩基対を作製できる場合、その位置は、非相補的であると見なされないが、代わりに相補的であると見なされる。
【０１０１】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、コードおよび非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。
【０１０２】
特定のＲＮＡまたはタンパク質遺伝子産物を「コードする」ＤＮＡ配列は、特定のＲＮＡおよび／またはタンパク質に転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードし得るか、またはＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはＤＮＡ標的ＲＮＡ、「非コード」ＲＮＡまたは「ｎｃＲＮＡ」とも呼ばれる）をコードし得る。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「遺伝子編集分子」という用語は、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上を指し、タンパク質は、トランスポザーゼ、ヌクレアーゼ、インテグラーゼ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ガイドＤＮＡ、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、またはアクチベーターＲＮＡを含む群から選択される。ヌクレアーゼ遺伝子編集分子は、ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であり、非限定的な例には、ＣＲＩＳＰＲタンパク質（Ｃａｓ）、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）；ＩＩＳ型制限酵素；転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、操作された部位特異的ヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲｉもしくはＣＲＩＳＰＲａ系のための非活性化ＣＡＳが含まれる。遺伝子編集分子はまた、ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼを含み得る。ある特定の実施形態では、遺伝子編集分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ガイドＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子編集分子は、１つ以上の転移因子を含む。ある特定の実施形態では、１つ以上の転移因子は、環状ＤＮＡを含む。ある特定の実施形態では、１つ以上の転移因子は、プラスミドベクターまたは小環状ＤＮＡベクターを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子編集分子は、１つ以上の転移因子を含む。ある特定の実施形態では、１つ以上の転移因子は、直鎖状ＤＮＡを含む。トランスポゾンをコードする直鎖状組み換えおよび非天然に存在するＤＮＡ配列は、インビトロで産生され得る。本開示の直鎖状組み換えおよび非天然に存在するＤＮＡ配列は、環状ＤＮＡの制限消化の産物であり得る。ある特定の実施形態では、環状ＤＮＡは、プラスミドベクターまたは小環状ＤＮＡベクターである。本開示の直鎖状組み換えおよび非天然に存在するＤＮＡ配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の産物であり得る。本開示の直鎖状組み換えおよび非天然に存在するＤＮＡ配列は、二本鎖ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡ配列であり得る。本開示のＤｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡ配列は、抗原発現カセット、コンプリシン抗原、プロモーター、ポリＡテール、およびテロメア末端のみをコードする酵素プロセスによって産生され得る。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「遺伝子編集機能」という用語は、機能の喪失または獲得を伴う、ゲノムの特定の部位でのＤＮＡの挿入、欠失、または置換を指す。特定の部位でのＤＮＡの挿入、欠失、または置換は、例えば、相同性指向修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、または単一塩基の変更編集によって実現され得る。いくつかの実施形態では、ドナーテンプレートが、例えば、ＨＤＲのために使用され、それによりドナーテンプレート内の所望の配列が、相同組み換え事象によってゲノムに挿入される。一実施形態では、「ドナーテンプレート」または「修復テンプレート」は、宿主ゲノムに導入される核酸配列に所望の突然変異または挿入を含むドナー配列のいずれかの側に隣接する２つの相同性アーム（例えば、５’相同性アームおよび３’相同性アーム）を含む。５’および３’相同性アームは、エンドヌクレアーゼ媒介切断の部位における標的遺伝子のゲノム配列と実質的に相同である。３’相同性アームは、一般に、エンドヌクレアーゼが切断する（例えば、二本鎖ＤＮＡ切断）、またはいくつかの実施形態ではＤＮＡをニッキングするプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位のすぐ下流にある。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「遺伝子編集系」という用語は、細胞内でゲノム編集を行うのに必要な最小限の構成成分を指す。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮ系は、標的遺伝子の配列に相補的な核酸に融合したエンドヌクレアーゼの発現のみを必要とする場合があるが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系の場合、最小構成成分は、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを必要とする場合がある。遺伝子編集系は、必要に応じて単一のｃｅＤＮＡベクターまたは複数のベクター上でコードされ得る。当業者は、遺伝子編集系に必要な構成成分（複数可）を容易に理解するであろう。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「塩基編集部分」という用語は、配列内の単一ヌクレオチド、例えば、シトシン／グアニンヌクレオチド対「Ｇ／Ｃ」をアデニンおよびチミン「Ｔ」／ウリジン「Ｕ」ヌクレオチド対（Ａ／Ｔ、Ｕ）に（例えば、Ｓｈｅｖｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ３１（２０１７）ＰＭＩＤ：２８８５７３３８、Ｋｙｏｕｎｇｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３５：４３５−４３７（２０１７）を参照、各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）またはアデニン／チミン「Ａ／Ｔ」ヌクレオチド対からグアニン／シトシン「Ｇ／Ｃ」ヌクレオチド対に（例えば、Ｇａｕｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１７），ｉｎ  ｐｒｅｓｓ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２４６４４を参照、この内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）変更することができる酵素または酵素系を指す。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「ゲノムセーフハーバー遺伝子」または「セーフハーバー遺伝子」という用語は、内因性遺伝子活性に重大な悪影響を及ぼすことなく、または癌を促進することなく、配列が予測可能な方法で統合および機能し得る（例えば、関心対象のタンパク質を発現する）ように、核酸配列を挿入することができる遺伝子または遺伝子座を指す。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子はまた、挿入された核酸配列が非セーフハーバー部位よりも効率的かつ高レベルで発現され得る遺伝子座または遺伝子である。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「遺伝子送達」という用語は、外来ＤＮＡが遺伝子療法の適用のために宿主細胞に導入されるプロセスを意味する。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復を表し、これは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集技術の基礎を形成する細菌防御系の特徴である。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「ジンクフィンガー」という用語は、折り目を安定させるために、１つ以上の亜鉛イオンの配位によって特徴付けられる小さなタンパク質構造モチーフを意味する。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「相同組み換え」という用語は、ヌクレオチド配列がＤＮＡの２つの類似または同一の分子間で交換される一種の遺伝子組み換えを意味する。相同組み換えはまた、ＤＮＡ配列の新しい組み合わせを産生する。ＤＮＡのこれらの新しい組み合わせは、遺伝的変異を表す。相同組み換えは、ウイルスの異なる株と種との間で遺伝物質を交換するために、水平遺伝子導入にも使用される。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「末端反復」または「ＴＲ」という用語は、少なくとも１つの最小限必要な複製起源、および回文ヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス末端配列または合成配列を含む。Ｒｅｐ結合配列（「ＲＢＳ」）（ＲＢＥ（Ｒｅｐ結合エレメント）とも称される）および末端分解部位（「ＴＲＳ」）は、一緒に「最小限必要な複製起源」を構成し、したがって、ＴＲは、少なくとも１つのＲＢＳおよび少なくとも１つのＴＲＳを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内で互いの逆相補鎖であるＴＲは、典型的に、各々「逆位末端反復」または「ＩＴＲ］と称される。ウイルスの文脈において、ＩＴＲは、複製、ウイルスパッケージング、統合、およびプロウイルスレスキューを媒介する。本明細書で本発明において予想外に見出されたように、全長にわたって逆相補鎖でないＴＲは、依然としてＩＴＲの従来の機能を行うことができ、したがって、ＩＴＲという用語は、本明細書において、ｃｅＤＮＡベクターの複製を媒介することができるｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター中のＴＲを指すように使用される。複合ｃｅＤＮＡベクター構成中、２つより多くのＩＴＲまたは非対称ＩＴＲ対が存在し得ることは、当業者によって理解されるであろう。ＩＴＲは、ＡＡＶ  ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ  ＩＴＲであり得るか、またはＡＡＶ  ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ  ＩＴＲに由来し得る。例えば、ＩＴＲは、パルボウイルスおよびディペンドウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ−１９）を包含するパルボウイルス科に由来し得るか、またはＳＶ４０複製の起源として役立つＳＶ４０ヘアピンは、切断、置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によってさらに修飾され得る、ＩＴＲとして使用され得る。Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーウイルスは、脊椎動物に感染するＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅおよび無脊椎動物に感染するＤｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅの２つのサブファミリーで構成されている。ディペンドパルボウイルスは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、ヒツジ種を含むが、これらに限定されない脊椎動物宿主における複製が可能である、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）のウイルスファミリーを含む。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」または「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」または「右ＩＴＲ」と称される。
【０１１３】
「野生型ＩＴＲ」または「ＷＴ−ＩＴＲ」は、例えば、Ｒｅｐ結合活性およびＲｅｐニッキング能力を保持する、ＡＡＶまたは他のディペンドウイルスにおける天然に存在するＩＴＲ配列の配列を指す。任意のＡＡＶ血清型からのＷＴ−ＩＴＲのヌクレオチド配列は、遺伝コードまたはドリフトの縮退のために、天然に存在する正準配列とわずかに異なる場合があり、したがって本明細書における使用のために包含されるＷＴ−ＩＴＲ配列は、産生プロセス中に発生する天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果としてＷＴ−ＩＴＲ配列を含む。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲ」または「実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する野生型ＩＴＲである単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内のＷＴ−ＩＴＲの対を指す。例えば、変化が配列の特性および全体的な３次元構造に影響を及ぼさない限り、天然に存在する正準配列から逸脱する１つ以上のヌクレオチドを有する場合でも、ＩＴＲが野生型の配列であると見なすことができる。いくつかの態様では、逸脱するヌクレオチドは、保存的配列変化を表す。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（例えば、デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、他のＷＴ−ＩＴＲに対して対称の３次元空間構成を有する。実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲは、３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’、Ｂ−Ｂ’ループを有する。実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲは、適切なＲｅｐタンパク質と対合する操作可能なＲｅｐ結合部位（ＲＢＥまたはＲＢＥ’）および末端分解部位（ｔｒｓ）を有することを決定することによって、ＷＴとして機能的に確認することができる。任意に、許容条件下での導入遺伝子発現を含む他の機能を試験することができる。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「修飾型ＩＴＲ」または「ｍｏｄ−ＩＴＲ」または「突然変異体ＩＴＲ」の語句は、本明細書で交換可能に使用され、同じ血清型からのＷＴ−ＩＴＲと比較して、少なくとも１つ以上のヌクレオチドに突然変異を有するＩＴＲを指す。突然変異は、同じ血清型のＷＴ−ＩＴＲの３次元空間構成と比較して、ＩＴＲのＡ、Ｃ、Ｃ’、Ｂ、Ｂ’領域のうちの１つ以上の変化をもたらし得、３次元空間構成（すなわち、幾何学的空間におけるその３次元構造）の変化をもたらし得る。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「非対称ＩＴＲ対」とも呼ばれる「非対称ＩＴＲ」という用語は、全長にわたって逆相補鎖ではない単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内のＩＴＲの対を指す。非限定的な一例として、非対称ＩＴＲ対は、それらの３次元構造が、幾何学的空間において異なる形状であるように、それらの同族ＩＴＲに対して対称の３次元空間構成を有しない。言い換えると、非対称のＩＴＲ対は、全体的な幾何学的構造が異なり、すなわち、３次元空間でのそれらのＡ、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’ループの構成が異なる（例えば、同族ＩＴＲと比較して、１つのＩＴＲは、短いＣ−Ｃ’アームおよび／または短いＢ−Ｂ’ループを有し得る）。２つのＩＴＲ間の配列の相違は、１つ以上のヌクレオチド付加、欠失、切断、または点突然変異に起因し得る。一実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のＩＴＲは、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ配列であり得、他方のＩＴＲは、本明細書で定義される修飾型ＩＴＲ（例えば、非野生型または合成ＩＴＲ配列）であり得る。別の実施形態では、非対称ＩＴＲ対のどちらのＩＴＲも野生型ＡＡＶ配列ではなく、２つのＩＴＲは、幾何学的空間において異なる形状（すなわち、異なる全体的な幾何学的構造）を有する修飾型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のｍｏｄ−ＩＴＲは、短いＣ−Ｃ’アームを有することができ、他のＩＴＲは、それらが同族の非対称ｍｏｄ−ＩＴＲと比較して、異なる３次元空間構成を有するように異なる修飾（例えば、単一アーム、または短いＢ−Ｂ’アーム等）を有し得る。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「対称ＩＴＲ」という用語は、野生型ディペンドウイルスＩＴＲ配列に対して突然変異または修飾され、それらの全長にわたって逆相補鎖である単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内の一対のＩＴＲを指す。どちらのＩＴＲも野生型ＩＴＲ  ＡＡＶ２配列ではなく（すなわち、それらは修飾型ＩＴＲであり、突然変異体ＩＴＲとも呼ばれる）、ヌクレオチドの付加、欠失、置換、切断、または点突然変異により、野生型ＩＴＲとは配列が異なり得る。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」または「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」または「右ＩＴＲ」と称される。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「実質的に対称の修飾型ＩＴＲ」または「実質的に対称のｍｏｄ−ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内の修飾型ＩＴＲの対を指す。例えば、修飾型ＩＴＲは、変化が特性および全体的な形状に影響を及ぼさない限り、逆相補配列から逸脱するいくつかのヌクレオチド配列がある場合でも、実質的に対称と見なすことができる。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、それらの同族の修飾型ＩＴＲに対して対称の３次元空間構成を有する。言い換えると、実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対は、３次元空間に構成された同じＡ、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’ループを有する。いくつかの実施形態では、ｍｏｄ−ＩＴＲ対からのＩＴＲは、異なる逆相補鎖ヌクレオチド配列を有し得るが、依然として同じ対称の３次元空間構成を有し得る。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ全体的な３次元形状をもたらす突然変異を有する。例えば、ｍｏｄ−ＩＴＲ対の１つのＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、１つの血清型に由来し得、他方のＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、異なる血清型に由来し得るが、両方が同じ対応する突然変異を有し得（例えば、５’ＩＴＲがＣ領域に欠失を有する場合、異なる血清型の同族の修飾型３’ＩＴＲは、Ｃ’領域の対応する位置に欠失を有する）、それにより修飾型ＩＴＲ対が同じ対称の３次元空間構成を有する。そのような実施形態では、修飾型ＩＴＲ対の各ＩＴＲは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６の組み合わせなどの異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２）に由来し得、１つのＩＴＲの修飾は、異なる血清型の同族のＩＴＲの対応する位置に反映される。一実施形態では、実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対は、ＩＴＲ間のヌクレオチド配列の相違が特性または全体的な形状に影響を与えず、それらが３次元空間で実質的に同じ形状を有する限り、一対の修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ−ＩＴＲ）を指す。非限定的な例として、ｍｏｄ−ＩＴＲは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）またはデフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなどの当該該技術分野において周知の標準的な手段によって決定される、正準ｍｏｄ−ＩＴＲに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、対称の３次元空間構成を有する。実質的に対称のｍｏｄ−ＩＴＲ対は、３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称のｍｏｄ−ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ−Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ−ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ−ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡおよびＢ−Ｂ’ループの同様の３次元構造を有する。
【０１１９】
「隣接する」という用語は、別の核酸配列に対するある核酸配列の相対位置を指す。一般に、配列ＡＢＣでは、Ｂの両側にＡおよびＣが隣接している。配置ＡｘＢｘＣについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前または後に続くが、隣接される配列と連続している、またはすぐ隣である必要はない。一実施形態では、隣接するという用語は、直鎖状二重鎖ｃｅＤＮＡベクターの各末端における末端反復を指す。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡゲノム」という用語は、少なくとも１つの逆位末端反復領域をさらに組み込む発現カセットを指す。ｃｅＤＮＡゲノムは、１つ以上のスペーサー領域をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミドまたはウイルスゲノムに組み込まれる。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡスペーサー領域」という用語は、ｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡゲノム中の機能的エレメントを分離する介在配列を指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、最適機能性のための所望の処理で２つの機能的エレメントを保持する。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、例えば、プラスミドまたはバキュロウイルス内のｃｅＤＮＡゲノムの遺伝的安定性を提供する、または増大させる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、クローニング部位等に便利な位置を提供することによって、ｃｅＤＮＡゲノムの容易な遺伝子操作を促進する。例えば、ある特定の態様では、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するオリゴヌクレオチド「ポリリンカー」、または既知のタンパク質（例えば、転写因子）結合部位を有しないように設計された非オープンリーディングフレーム配列をｃｅＤＮＡゲノム中に位置付けて、シス作用性因子を分離することができ、例えば、末端分解部位と、上流転写調節エレメントとの間に６ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、４８ｍｅｒ、８６ｍｅｒ、１７６ｍｅｒ等を挿入する。同様に、スペーサーを、ポリアデニル化シグナル配列と３’末端分解部位との間に組み込むことができる。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐ結合部位」、「Ｒｅｐ結合エレメント」、「ＲＢＥ」、および「ＲＢＳ」は、交換可能に使用され、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＡＡＶ  Ｒｅｐ７８またはＡＡＶ  Ｒｅｐ６８）の結合部位を指し、Ｒｅｐタンパク質による結合時に、Ｒｅｐタンパク質が、ＲＢＳを組み込む配列上でその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を実行できるようにする。ＲＢＳ配列およびその逆相補鎖は、一緒に単一ＲＢＳを形成する。ＲＢＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において特定されたＲＢＳ配列である５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１）を含む。任意の既知のＲＢＳ配列は、他の既知のＡＡＶ  ＲＢＳ配列および他の天然に既知のまたは合成ＲＢＳ配列を含む、本発明の実施形態において使用され得る。理論に束縛されるものではないが、Ｒｅｐタンパク質のヌクレアーゼドメインは、二重鎖ヌクレオチド配列ＧＣＴＣに結合し、したがって２つの既知のＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質は、二重鎖オリゴヌクレオチド、５’−（ＧＣＧＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）−３’（配列番号５３１）に直接結合し、安定に集成すると考えられる。加えて、可溶性凝集配座異性体（すなわち、不定数の相互関連Ｒｅｐタンパク質）は解離し、Ｒｅｐ結合部位を含有するオリゴヌクレオチドに結合する。各Ｒｅｐタンパク質は、各鎖上の窒素塩基およびホスホジエステル骨格の両方と相互作用する。窒素塩基との相互作用は、配列特異性を提供するが、ホスホジエステル骨格との相互作用は、非配列特異性または低配列特異性であり、タンパク質−ＤＮＡ複合体を安定させる。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「末端分解部位」および「ＴＲＳ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、Ｒｅｐが、細胞ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡ  ｐｏｌ  δまたはＤＮＡ  ｐｏｌ  εを介してＤＮＡ伸長の基質として役立つ３’ＯＨを生成する５’チミジンとのチロシン−ホスホジエステル結合を形成する領域を指す。代替として、Ｒｅｐ−チミジン複合体は、配位ライゲーション反応に関与し得る。いくつかの実施形態では、ＴＲＳは、最小限で非塩基対チミジンを包含する。いくつかの実施形態では、ＴＲＳのニッキング効率は、ＲＢＳからの同じ分子内のその距離によって少なくとも部分的に制御され得る。受容体基質が相補的ＩＴＲであるとき、得られる産生物は、分子間二重鎖である。ＴＲＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において特定されたヘキサヌクレオチド配列である５’−ＧＧＴＴＧＡ−３’（配列番号４５）を含む。他の既知のＡＡＶ  ＴＲＳ配列、ＡＧＴＴ（配列番号４６）、ＧＧＴＴＧＧ（配列番号４７）、ＡＧＴＴＧＧ（配列番号４８）、ＡＧＴＴＧＡ（配列番号４９）などの他の天然に既知のまたは合成ＴＲＳ配列、およびＲＲＴＴＲＲ（配列番号５０）などの他のモチーフを含む、任意の既知のＴＲＳ配列を、本発明の実施形態において使用することができる。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−プラスミド」という用語は、分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むプラスミドを指す。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−バクミド」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして操作し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指す。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指す。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス感染昆虫細胞」および「ｃｅＤＮＡ−ＢＩＩＣ」という用語は、交換可能に使用され、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞（限定されないが、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を含む）を指す。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「閉端ＤＮＡベクター」、「ｃｅＤＮＡベクター」、および「ｃｅＤＮＡ」は、交換可能に使用され、少なくとも１つの共有結合性閉端を有する非ウイルスカプシド不含ＤＮＡベクター（すなわち、分子間二重鎖）を指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、２つの共有結合性閉端を含む。
【０１２９】
本明細書で定義されるように、「レポーター」は、検出可能な読み出しを提供するために使用することができるタンパク質を指す。レポーターは、一般に、蛍光、色、または発光などの測定可能なシグナルを産生する。レポータータンパク質コード配列は、細胞または生物中の存在が容易に観察されるタンパク質をコードする。例えば、蛍光タンパク質は、特定波長の光で励起されたときに細胞を蛍光させ、ルシフェラーゼは、細胞に光を生成する反応を触媒させ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素は、基質を着色産生物に変換する。実験または診断目的のために有用な例示的なレポーターポリペプチドとしては、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリンホスファターゼ（ＡＰ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および他の蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ならびに当該技術分野において周知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「エフェクタータンパク質」という用語は、例えば、レポーターポリペプチドとして、あるいはより適切には、細胞を殺傷するポリペプチド、例えば毒素、または選択された薬剤もしくはその欠失で細胞を殺傷しやすくする薬剤として、検出可能な読み出しを提供するポリペプチドを指す。エフェクタータンパク質は、宿主細胞のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを直接標的または損傷する任意のタンパク質またはペプチドを含む。例えば、エフェクタータンパク質としては、宿主細胞ＤＮＡ配列を標的とする制限エンドヌクレアーゼ（ゲノム因子であるか染色体外因子であるかにかかわらず）、細胞生存に必要なポリペプチドを標的とするプロテアーゼ、ＤＮＡギラーゼ阻害剤、およびリボヌクレアーゼ型毒素が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成生物的回路によって制御されるエフェクタータンパク質の発現は、別の合成生物的回路における因子として関与し得、それによって生物的回路系の反応性の範囲および複雑性を拡張する。
【０１３１】
転写調節因子は、関心対象の遺伝子の転写を活性化または抑制する、転写アクチベーターおよびリプレッサーを指す。プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始する核酸の領域である。転写アクチベーターは、典型的に、転写プロモーターの近くに結合し、ＲＮＡポリメラーゼを動員して転写を直接開始する。リプレッサーは、転写プロモーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を立体的に妨害する。他の転写調節因子は、それらが結合する場所、ならびに細胞条件および環境条件に応じて、アクチベーターまたはリプレッサーのいずれかとして役立ち得る。転写調節因子クラスの非限定例としては、ホメオドメインタンパク質、亜鉛フィンガータンパク質、翼状らせん（フォークヘッド）タンパク質、およびロイシン−ジッパータンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「リプレッサータンパク質」または「誘導因子タンパク質」は、調節配列エレメントに結合するタンパク質であり、調節配列エレメントに操作可能に連結した配列の転写をそれぞれ抑制または活性化する。本明細書に記載される好ましいリプレッサーおよび誘導因子タンパク質は、少なくとも１つの入力剤または環境入力の存在または非存在に敏感である。本明細書に記載される好ましいタンパク質は、例えば、分離可能なＤＮＡ結合および入力剤結合、または反応性エレメントもしくはドメインを含む形態のモジュールである。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「担体」としては、任意かつすべての溶媒、分散媒質、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等が挙げられる。薬学的活性物質に対するそのような媒質および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されたときに、毒性反応、アレルギー性反応、または同様の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「入力剤反応性ドメイン」は、条件または入力剤に結合するか、またはそうでなければ連結ＤＮＡ結合融合ドメインをその条件もしくは入力の存在に対して反応性にするように、条件または入力剤に反応する転写因子のドメインである。一実施形態では、条件または入力の存在は、入力剤反応性ドメインまたはそれが融合するタンパク質の立体構造変化をもたらし、それが転写因子の転写調節活性を修飾する。
【０１３５】
「インビボ」という用語は、多細胞動物などの生物中または生物内で起こるアッセイまたはプロセスを指す。本明細書に記載される態様のうちのいくつかでは、方法または使用は、細菌などの単細胞生物が使用されるときに「インビボで」起こると言われ得る。「エクスビボ」という用語は、多細胞動物または植物、例えば、とりわけ外植片、培養細胞（一次細胞および細胞株を含む）、形質転換細胞株、および抽出組織または細胞（血液細胞を含む）の体外に無傷膜を有する生細胞を使用して実行される方法および使用を指す。「インビトロ」という用語は、細胞抽出物などの無傷膜を有する細胞の存在を必要としないアッセイおよび方法を指し、非細胞系、例えば細胞抽出物などの細胞または細胞系を含まない媒質にプログラム可能な合成生物的回路を導入することを指し得る。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、タンパク質またはＲＮＡをコードする異種標的遺伝子であり得る、核酸配列の転写を駆動することによって、別の核酸配列の発現を調節する任意の核酸配列を指す。プロモーターは、構成的、誘導性、抑制性、組織特異性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始および速度が制御される、核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合し得る、遺伝子エレメントを含有し得る。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、プロモーターは、プロモーター自体の発現を調節する転写因子の発現を駆動することができる。プロモーター配列内では、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出されるであろう。真核生物プロモーターは、必ずしもそうではないが、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子の発現を駆動することができる。プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合され、バックグラウンドより上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むように上流（５’配向）に伸びる。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、１つ以上のタンパク質（例えば、活性因子タンパク質または転写因子）に結合して、核酸配列の転写活性化を増加させるシス作用性調節配列（例えば、５０〜１，５００塩基対）を指す。エンハンサーは、それらが調節する遺伝子開始部位の上流または遺伝子開始部位の下流で最大１，０００，０００塩基対に位置付けられ得る。エンハンサーは、非関連遺伝子のイントロン領域内またはエクソン領域内に位置付けられ得る。
【０１３８】
プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、または転写を駆動すると言うことができる。「操作可能に連結された」、「操作可能に位置付けられた」、「作動可能に連結された）、「制御下」、および「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸配列に関して正しい機能的位置および／または配向にあり、その配列の転写開始および／または発現を制御するように調節することを示す。本明細書で使用される場合、「逆位プロモーター」は、核酸配列が逆配向にあるプロモーターを指し、それによりコード鎖であったものは、今は非コード鎖であり、逆も同様である。逆位プロモーター配列を様々な実施形態で使用して、スイッチの状態を調節する。加えて、様々な実施形態では、プロモーターをエンハンサーと併せて使用することができる。
【０１３９】
プロモーターは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得され得る、遺伝子または配列と天然に関連するものであり得る。そのようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれ得る。同様に、いくつかの実施形態では、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に関連するものであり得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、コード核酸セグメントは、「組み換えプロモーター」または「異種プロモーター」の制御下で位置付けられ、これらの両方が、その自然環境において操作可能に連結されたコードされた核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す。組み換えまたは異種エンハンサーは、その自然環境において所与の核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他の原核、ウイルス性、または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在」しない合成プロモーターまたはエンハンサーを含み得、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、および／または当該技術分野において既知である遺伝子操作の方法を通じて発現を変更する突然変異を含み得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、プロモーター配列は、本明細書に開示される合成生物的回路およびモジュールに関して、ＰＣＲを含む組み換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を使用して産生され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照、各々が参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ミトコンドリア、クロロプラスト等の非核性細胞小器官内の配列の転写および／または発現を配向する制御配列が同様に用いられ得ることが企図される。
【０１４１】
本明細書に記載される場合、「誘導性プロモーター」は、誘導因子または誘導剤の存在下、それによって影響されるとき、またはそれによって接触されるときに、転写活性を開始または強化することによって特徴付けられるものである。本明細書に定義される場合、「誘導因子」または「誘導剤」は、内因性であり得るか、または誘導性プロモーターからの転写活性を誘導することにおいて活性であるような方法で投与される、通常は外因性の化合物またはタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、誘導因子または誘導剤、すなわち、化学物質、化合物、またはタンパク質は、それ自体が核酸配列の転写または発現の結果であり得（すなわち、誘導因子は、別の構成成分またはモジュールによって発現される誘導因子タンパク質であり得る）、それ自体が誘導性プロモーターの制御下であり得る。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、リプレッサーなどのある特定の薬剤の非存在下で誘導される。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、およびマウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ））、ならびに他のステロイド反応性プロモーター、ラパマイシン反応性プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
本明細書で交換可能に使用される「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、および「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル等の転写および翻訳制御配列を指し、これらは非コード配列（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）またはコード配列（例えば、部位特異的修飾ポリペプチドもしくはＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド）の転写を提供および／もしくは調節し、かつ／またはコードされたポリペプチドの翻訳を調節する。
【０１４３】
「操作可能に連結された」とは、そのように記載された構成成分が、それらが意図された方法で機能することを許可する関係にある並列を指す。例えば、プロモーターがその転写または発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に操作可能に連結されている。「発現カセット」は、ｃｅＤＮＡベクターにおける導入遺伝子の転写を指示するのに十分なプロモーターまたは他の調節配列に操作可能に連結されている外因性ＤＮＡ配列を含む。好適なプロモーターには、例えば、組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターは、ＡＡＶ起源でもあり得る。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本発明によるｃｅＤＮＡベクターでの予防的治療を含む治療が提供される、ヒトまたは動物を指す。通常、動物は、限定されないが、霊長類、齧歯類、飼育動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが挙げられるが、これらに限定されない。齧歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが挙げられる。飼育動物および狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚、例えば、トラウト、ナマズ、およびサケが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される態様のある特定の実施形態では、対象は、哺乳類、例えば、霊長類またはヒトである。対象は、男性または女性であり得る。追加として、対象は、幼児または子供であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、新生児または胎児対象であり得、例えば、対象は、子宮内に存在する。好ましくは、対象は、哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類は、疾患および障害の動物モデルを代表する対象として有利に使用され得る。追加として、本明細書に記載される方法および組成物は、飼育動物および／またはペットに使用され得る。ヒト対象は、任意の年齢、性別、人種、または民族グループ、例えば、コーカサス人（白人）、アジア人、アフリカ人、黒人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ系ヨーロッパ人、スペイン人、中東人等であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、臨床設定において患者または他の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、既に治療を受けている。いくつかの実施形態では、対象は、胚、胎児、新生児、幼児、子供、青年、または成人である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胎児、ヒト新生児、ヒト幼児、ヒト子供、ヒト青年、またはヒト成人である。いくつかの実施形態では、対象は、動物胚、または非ヒト胚もしくは非ヒト霊長類胚である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胚である。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本開示の核酸構築物またはｃｅＤＮＡ発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けやすい任意の細胞型を含む。非限定的な例として、宿主細胞は、単離された初代細胞、多能性幹細胞、ＣＤ３４＋細胞）、人工多能性幹細胞、またはいくつかの不死化細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）のいずれかであり得る。あるいは、宿主細胞は、組織、器官、または生物における原位置またはインビボの細胞であり得る。
【０１４６】
「外因性」という用語は、その天然源以外の細胞中に存在する物質を指す。本明細書で使用される「外因性」という用語は、通常見られず、核酸またはポリペプチドをそのような細胞または生物に導入することが望まれる、人の手が関与するプロセスによって細胞または生物などの生物系に導入された核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）またはポリペプチドを指し得る。あるいは、「外因性」とは、それが比較的少量で見られ、細胞または生物における核酸またはポリペプチドの量を増加させること、例えば、異所性発現またはレベルをもたらすことが望まれる、人の手が関与するプロセスによって細胞または生物などの生物系に導入された核酸またはポリペプチドを指し得る。これとは対照的に、「内因性」という用語は、生物系または細胞に対して天然である物質を指す。
【０１４７】
「配列同一性」という用語は、２つのヌクレオチド配列間の関連性を指す。本開示の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，上記）、好ましくはバージョン３．０．０以降において実装されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，上記）を使用して決定される。使用される任意のパラメーターは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ拡張ペナルティ０．５、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされたＮｅｅｄｌｅの出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得される）は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される：（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数）。アラインメントの長さは、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドである。
【０１４８】
本明細書で使用される「相同性」または「相同」という用語は、必要に応じて配列を整列させ、ギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、標的染色体上の対応する配列のヌクレオチド残基と同一である相同性アームのヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。ヌクレオチド配列相同性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当該技術の範囲内である様々な方法で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。いくつかの実施形態では、例えば修復テンプレートの相同性アームの核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）は、配列が、宿主細胞の対応する未変性または未編集の核酸配列（例えば、ゲノム配列）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上同一である場合、「相同」と見なされる。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「相同性アーム」は、相同組み換えを通じてドナー配列をゲノムに標的化するのに適したポリヌクレオチドを指す。典型的には、２つの相同性アームがドナー配列に隣接し、各相同性アームは、組み込みの遺伝子座の上流および下流のゲノム配列を含む。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、「ドナー配列」は、宿主細胞ゲノムに挿入されるか、または宿主細胞ゲノムの修復テンプレートとして使用されるポリヌクレオチドを指す。ドナー配列は、遺伝子編集中に行われることが望まれる修飾を含み得る。組み込まれる配列は、標的配列での相同性指向修復を介して標的核酸分子に導入することができ、それによって元の標的配列からドナー配列に含まれる配列への標的配列の変更を引き起こす。したがって、ドナー配列に含まれる配列は、標的配列と比較して、挿入、欠失、インデル、点突然変異、突然変異の修復等であり得る。ドナー配列は、例えば、一本鎖ＤＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子、およびＤＮＡ／ｍｏｄＲＮＡ（修飾型ＲＮＡ）ハイブリッド分子であり得る。一実施形態では、ドナー配列は、相同性アームに対して外来である。編集は、ＲＮＡ編集およびＤＮＡ編集であり得る。ドナー配列は、所望の遺伝子編集の性質に応じて、宿主細胞ゲノムに対して内因性または外因性であり得る。
【０１５１】
本明細書で使用される「異種」という用語は、それぞれ天然の核酸またはタンパク質には見られないヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。例えば、キメラＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質において、天然に存在する細菌Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド（またはその変異体）のＲＮＡ結合ドメインは、異種ポリペプチド配列（すなわち、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１以外のタンパク質からのポリペプチド配列または別の生物のポリペプチド配列）に融合されてもよい。異種ポリペプチド配列は、キメラＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質によっても示される活性（例えば、酵素活性）を示し得る（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性等）。異種核酸配列は、天然に存在する核酸配列（またはその変異体）に（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成し得る。別の例として、融合変異体Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドにおいて、変異体Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドは、融合変異体Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドによっても示される活性を示す異種ポリペプチド（すなわち、Ｃａｓ９以外のポリペプチド）に融合されてもよい。異種核酸配列は、変異体Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドに（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、融合変異体Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成し得る。
【０１５２】
「ベクター」または「発現ベクター」は、細胞において結合されたセグメントの複製をもたらすために別のＤＮＡセグメント、すなわち「挿入」が結合され得る、プラスミド、バクミド、ファージ、ウイルス、ビリオン、またはコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、宿主細胞への送達のために、または異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物であり得る。本明細書で使用される場合、ベクターは、起源および／または最終形態でウイルス性または非ウイルス性であり得るが、本開示の目的のために、「ベクター」は、その用語が本明細書で使用されるとき、一般にｃｅＤＮＡベクターを指す。「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと関連する場合に複製することができ、遺伝子配列を細胞に移すことができる任意の遺伝的エレメントを包含する。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターまたは組み換えベクターであり得る。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのＲＮＡまたはポリペプチドの発現を指示するベクターを指す。発現される配列は、必ずしもそうではないが、細胞にとって異種であることが多い。発現ベクターは、追加のエレメントを含むことができ、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有することができるため、それを２つの生物、例えば発現の場合はヒト細胞、ならびにクローニングおよび増幅の場合は原核生物宿主で維持することができる。「発現」という用語は、ＲＮＡおよびタンパク質、また必要に応じて、例えば、転写、転写処理、翻訳およびタンパク質の折りたたみ、修飾および処理を含むがこれらに限定されない分泌タンパク質の産生に関与する細胞プロセスを指す。「発現産物」には、遺伝子から転写されたＲＮＡ、および遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドが含まれる。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に操作可能に連結された場合に、インビトロまたはインビボでＲＮＡに転写される核酸配列（ＤＮＡ）を意味する。遺伝子には、コード領域の前後の領域、例えば、５’未翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）が含まれる場合と含まれない場合がある。
【０１５４】
「組み換えベクター」とは、異種核酸配列を含むベクター、またはインビボで発現することができる「導入遺伝子」を意味する。本明細書に記載されるベクターは、いくつかの実施形態では、他の好適な組成物および治療法と組み合わせることができることを理解されたい。いくつかの実施形態では、ベクターは、エピソームである。好適なエピソームベクターの使用は、対象における関心対象のヌクレオチドを高コピー数の染色体外ＤＮＡに維持し、それによって染色体組み込みの潜在的な影響を排除する手段を提供する。
【０１５５】
本明細書で使用される「訂正」、「ゲノム編集」、および「復元」という用語は、完全長機能または部分完全長機能性タンパク質の発現が得られるように、切断されたタンパク質をコードするか、またはタンパク質を全くコードしない突然変異体遺伝子を変化させることを指す。変異体遺伝子の訂正または復元は、突然変異を有する遺伝子の領域を置き換えること、または突然変異体遺伝子全体を、相同性指向修復（ＨＤＲ）などの修復機序を用いて、突然変異を持たない遺伝子のコピーで置き換えることを含み得る。突然変異体遺伝子の訂正または復元はまた、遺伝子に二本鎖切断を生成して非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用して修復することにより、未成熟終止コドン、異常スプライスアクセプター部位、または異常スプライスドナー部位を引き起こすフレームシフト突然変異を修復することを含み得る。ＮＨＥＪは、修復中に少なくとも１つの塩基対を付加または削除する可能性があり、これが適切なリーディングフレームを復元し、未成熟終止コドンを排除し得る。突然変異体遺伝子の訂正または回復はまた、異常なスプライスアクセプター部位またはスプライスドナー配列の破壊を含み得る。突然変異体遺伝子の訂正または復元はまた、２つのヌクレアーゼ標的部位間のＤＮＡを除去し、ＮＨＥＪによってＤＮＡ切断を修復することによって適切なリーディングフレームを復元するために、同じＤＮＡストランド上の２つのヌクレアーゼの同時作用によって非必須遺伝子セグメントを削除することを含み得る。
【０１５６】
本明細書で使用される「遺伝性疾患」という語句は、ゲノムの１つ以上の異常、特に出生時から存在する状態によって部分的または完全に、直接的または間接的に引き起こされる疾患を指す。異常は、突然変異、挿入、または欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を与える可能性がある。遺伝性疾患は、ＤＭＤ、血友病、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損）、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝ポルフィリン症、肝代謝の遺伝性疾患、レッシュ・ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコーニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、およびテイ・サックス病であり得るが、これらに限定されない。
【０１５７】
本明細書で使用される「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路」という語句は、相同テンプレートを必要とせずに切断末端を直接ライゲーションすることによってＤＮＡの二本鎖切断を修復する経路を指す。ＮＨＥＪによるＤＮＡ末端のテンプレートに依存しない再ライゲーションは、ＤＮＡブレークポイントにランダムなマイクロ挿入およびマイクロ欠失（インデル）を導入する確率的でエラーが発生しやすい修復プロセスである。この方法を使用して、標的遺伝子配列のリーディングフレームを意図的に破壊、削除、または変更することができる。ＮＨＥＪは典型的に、修復を誘導するためにマイクロホモロジーと呼ばれる短い相同ＤＮＡ配列を使用する。これらのマイクロホモロジーは、二本鎖切断の終わりにある一本鎖オーバーハングに存在することが多い。オーバーハングが完全に互換性がある場合、ＮＨＥＪは通常、切断を正確に修復するが、ヌクレオチドの損失につながる不正確な修復が発生する可能性もあるが、オーバーハングが互換性がない場合にはるかにより一般的である。本明細書で使用される「ヌクレアーゼ媒介ＮＨＥＪ」は、ｃａｓ９または他のヌクレアーゼなどのヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡを切断した後に開始されるＮＨＥＪを指す。ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系では、ＮＨＥＪは、単一ガイドＲＮＡ配列を使用することによって標的化され得る。
【０１５８】
本明細書で交換可能に使用される「相同性指向修復」または「ＨＤＲ」という語句は、ＤＮＡの相同片が核に存在する場合に二本鎖ＤＮＡ損傷を修復する細胞の機序を指す。ＨＤＲは、修復を誘導するためにドナーＤＮＡテンプレートを使用し、遺伝子全体の標的化された付加を含む、ゲノムへの特定の配列変化を作成するために使用される場合がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの系など、部位特異的ヌクレアーゼとともにドナーテンプレートが提供されている場合、細胞機構は、相同組み換えによって切断を修復し、これはＤＮＡ切断の存在下で数桁強化される。相同ＤＮＡ片が存在しない場合、代わりに非相同末端結合を行うことができる。ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系では、１つのガイドＲＮＡ、または２つの異なるガイドＲＮＡＳをＨＤＲに使用することができる。
【０１５９】
本明細書で交換可能に使用される「反復可変残基」または「ＲＶＤ」という語句は、３３〜３５アミノ酸を含む、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ認識モチーフ（「ＲＶＤモジュール」としても知られる）内の隣接するアミノ酸残基の対を指す。ＲＶＤは、ＲＶＤモジュールのヌクレオチド特異性を決定する。ＲＶＤモジュールを組み合わせて、ＲＶＤアレイを産生することができる。本明細書で使用される「ＲＶＤアレイ長」は、ＴＡＬＥＮによって認識されるＴＡＬＥＮ標的領域、すなわち結合領域内のヌクレオチド配列の長さに対応するＲＶＤモジュールの数を指す。
【０１６０】
本明細書で使用される「部位特異的ヌクレアーゼ」または「配列特異的ヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡ配列を特異的に認識および切断することができる酵素を指す。部位特異的ヌクレアーゼを操作することができる。操作された部位特異的ヌクレアーゼの例には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびに様々な天然および非天然のＣａｓ酵素を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの系が含まれる。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、方法または組成物に必須であるが、必須であるか否かにかかわらず、不特定要素の包含に対して開かれている、その組成物、方法、およびそれぞれの構成成分（複数可）に関して使用される。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、その実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴（複数可）に物質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
【０１６３】
「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されてない任意の要素を除いて、本明細書に記載される組成物、方法、およびそれらそれぞれの構成成分を指す。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、本発明の実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴（複数可）に物質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を許容する。
【０１６５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書に記載される、および／または本開示等を読むことにより当業者に明らかとなるであろうタイプの１つ以上の方法、および／またはステップを含む。同様に、「または」という語は、文脈が別途明らかに示されない限り、「および」を含むことが意図される。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料は、下記で説明される。省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定例を示すように使用される。したがって、省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。
【０１６６】
作動例または別途示される場合を除いて、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されたい。パーセンテージに関連して使用される「約」という用語は、±１％を意味する場合がある。本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、本発明の範囲は、それに限定されてはならない。
【０１６７】
本明細書に開示される本発明の代替要素または実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別に、またはグループの他のメンバーまたは本明細書で見られる他の要素との任意の組み合わせで参照および主張することができる。グループの１つ以上のメンバーは、利便性および／または特許性の理由から、グループに含める、またはグループから削除することができる。そのような任意の包含または削除が発生した場合、本明細書では、明細書が修正されたグループを含むと見なされ、したがって添付の特許請求の範囲で使用されているすべてのマーカッシュグループの記述を満たす。
【０１６８】
いずれかの態様のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される開示は、人間のクローン化プロセス、人間の生殖細胞系列の遺伝的同一性を修正するプロセス、産業もしくは商業目的でのヒト胚の使用、または人もしくは動物にいかなる実質的な医学的利益ももたらすことなく苦しみを引き起こす可能性が高い動物、およびそのようなプロセスから生じる動物の遺伝的同一性を修正するためのプロセスに関係しない。
【０１６９】
本明細書では、本発明の様々な態様の説明内で他の用語が定義されている。
【０１７０】
文献参照、発行済み特許、公開済みの特許出願、および係属中の特許出願を含む、本出願を通して引用されるすべての特許および他の出版物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を説明および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関するいかなるものも、発明者が先行発明のおかげで、またはいかなる他の理由のためにもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関するすべての記述またはこれらの文書の内容に関する表現は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。
【０１７１】
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、または本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示の特定の実施形態および実施例が、例示の目的で本明細書で説明されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップまたは機能は、所与の順序で提示されるが、代替の実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、または機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参考文献および出願の構成、機能、および概念を用いて本開示のさらなる実施形態を提供するように修正することができる。さらに、生物学的機能の同等性の考慮により、種類または量の生物学的または化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更および他の変更を本開示に加えることができる。そのような修正はすべて、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【０１７２】
前述の実施形態のいずれかの特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせるか、または置き換えることができる。さらに、本開示のある特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で説明されたが、他の実施形態もそのような利点を示し得、すべての実施形態が本開示の範囲内にあるために必ずしもそのような利点を示す必要はない。
【０１７３】
本明細書に記載される技術は、以下の実施例によってさらに説明されており、決してこれらをさらに限定するものと解釈されるべきではない。
【０１７４】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１７５】
ＩＩ．遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクター
本発明の実施形態は、宿主細胞において遺伝子編集分子である導入遺伝子を発現し（例えば、導入遺伝子は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓなどのヌクレアーゼである、１つ以上のガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、またはそれらの任意の組み合わせである）、より効率的なゲノム編集をもたらすことができる閉端直鎖二重化（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含む方法および組成物に基づく。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、サイズに制限されないため、例えば、単一ベクターからの遺伝子編集系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系（例えば、Ｃａｓ９もしくは修飾型Ｃａｓ９酵素、ガイドＲＮＡ、および／または相同性指向修復テンプレート）、またはＴＡＬＥＮもしくはジンクフィンガー系に必須のすべての構成成分の発現を許可する。しかしながら、そのような構成成分のうちの１つまたは２つのみが、単一ベクター上でコードされる一方で、残りの構成成分（複数可）は、別個のｃｅＤＮＡベクターまたは例えば従来のプラスミド上で発現され得ることも企図される。
【０１７６】
本明細書の一態様は、例えば、細胞染色体上の特定の標的部位に高効率で１つ以上の外因性ドナー配列を導入するための、ＤＮＡノックイン法（複数可）のための新規のｃｅＤＮＡベクターに関する。遺伝子編集のための１つ以上のｃｅＤＮＡベクターの使用に加えて、ｃｅＤＮＡベクターは、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ  ＩＴＲおよび少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ−ＩＴＲ対が互いに対して異なる３次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、または（ｉｉｉ）各ＷＴ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のＷＴ−ＷＴ  ＩＴＲ対、または（ｉｖ）各ｍｏｄ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択されるＩＴＲ配列を含み、本明細書に開示される方法および組成物は、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系をさらに含み得る。使用のために包含される非限定的な例示的リポソームナノ粒子系が、本明細書に開示されている。いくつかの態様では、本開示は、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡおよびイオン化脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、プロセスにより得られた遺伝子編集ｃｅＤＮＡを用いて作製および負荷される脂質ナノ粒子製剤は、２０１８年９月７日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されており、本明細書に組み込まれる。
【０１７７】
本明細書では、共有結合性閉端を有する新規の非ウイルス性カプシド不含ｃｅＤＮＡ分子（ｃｅＤＮＡ）が提供される。これらの非ウイルス性カプシド不含ｃｅＤＮＡ分子は、２つの異なる逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた異種遺伝子（導入遺伝子）を含有する発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス、または統合型細胞株）からの許容宿主細胞中で産生され得、ＩＴＲは、互いに関して異なる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲのうちの１つは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）と比較した欠失、挿入、および／または置換によって修飾され、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能性末端分解部位（ｔｒｓ）およびＲｅｐ結合部位を含む。ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、発現カセットなどの分子の少なくとも一部分にわたって二重鎖、例えば、自己相補的である（例えば、ｃｅＤＮＡは、二本鎖環状分子ではない）。ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、例えば、１時間以上３７℃でエキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩまたはエキソヌクレアーゼＩＩＩ）に対して耐性である。
【０１７８】
本明細書に開示される遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシド内の限定空間によって課されるパッケージング制約を有しない。ｃｅＤＮＡベクターは、封入されたＡＡＶゲノムとは対照的な原核細胞的に産生されたプラスミドＤＮＡベクターに対する可変の真核細胞的に産生された代替物を表す。これは、制御エレメント、例えば、本明細書に開示される調節スイッチ、大きな導入遺伝子、複数の導入遺伝子等の挿入を許可する。
【０１７９】
一態様では、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターは、５’〜３’配向に、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、および第２のＡＡＶ  ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）および第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して非対称であり、すなわち、それらは、互いに異なる３次元空間構成を有する。例示的な実施形態として、第１のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、突然変異型または修飾型ＩＴＲであり得るか、またはその逆であり、第１のＩＴＲは、突然変異型または修飾型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得る。別の実施形態では、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、両方とも修飾されているが、異なる配列であるか、または異なる修飾を有するか、または同一の修飾型ＩＴＲではなく、異なる３次元空間構成を有する。言い換えると、非対称ＩＴＲを用いた遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターは、ＷＴ−ＩＴＲに対する１つのＩＴＲのいかなる変更も他のＩＴＲに反映されないＩＴＲを有するか、あるいは非対称ＩＴＲが修飾された非対称ＩＴＲ対を有する場合は、互いに対して異なる配列および異なる３次元形状を有し得る。ｃｅＤＮＡベクター中の、ｃｅＤＮＡ−プラスミドを生成するために使用するための例示的な非対称ＩＴＲは、「非対称ＩＴＲ」と題するセクションで後述されている。
【０１８０】
別の態様では、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターは、５’〜３’配向に、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、および第２のＡＡＶ  ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）および第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して対称または実質的に対称であり、すなわち、遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、対称の３次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含み得、それによりそれらの構造は、幾何学的空間で同じ形状であるか、または３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’、Ｂ−Ｂ’ループを有する。そのような実施形態では、対称のＩＴＲ対、または実質的に対称のＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲではない修飾型ＩＴＲ（例えば、ｍｏｄ−ＩＴＲ）であり得る。ｍｏｄ−ＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲからの１つ以上の修飾を有し、互いに逆相補（逆位）である同じ配列を有し得る。代替実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応するまたは同じ対称の３次元形状を有し得る。いくつかの実施形態では、対称のＩＴＲ、または実質的に対称のＩＴＲは、本明細書に記載されるように野生型（ＷＴ−ＩＴＲ）であり得る。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ−ＩＴＲである必要はない。すなわち、いくつかの実施形態では、一方のＷＴ−ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ−ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称的な３次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。
【０１８１】
対称のＩＴＲまたは実質的に対称のＩＴＲについては、以下の「対称ＩＴＲ対」と題するセクションで論じられる。
【０１８２】
本明細書に提供される野生型または突然変異型または他の方法で修飾されたＩＴＲ配列は、ｃｅＤＮＡベクターの産生のために発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス）に含まれるＤＮＡ配列を表す。したがって、ｃｅＤＮＡ−プラスミドまたは他の発現構築物から産生されたｃｅＤＮＡベクター中に実際に含有されるＩＴＲ配列は、産生プロセス中に起こる天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果として、本明細書に提供されるＩＴＲ配列に対して同一であっても同一でなくてもよい。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集分子である導入遺伝子を有する発現カセット、または遺伝子編集核酸配列を含む本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を可能にするかまたは制御する１つ以上の調節配列（複数可）に操作可能に連結され得る。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１のＩＴＲ配列および第２のＩＴＲ配列を含み、関心対象のヌクレオチド配列は、第１および第２のＩＴＲ配列によって隣接され、第１および第２のＩＴＲ配列は、互いに対して非対称であるか、または互いに対して対称である。
【０１８４】
これらの態様の各々における一実施形態では、発現カセットは、２つのＩＴＲ間に位置し、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、転写後調節エレメント、ならびにポリアデニル化および終結シグナルのうちの１つ以上をこの順に含む。一実施形態では、プロモーターは、調節可能−誘導可能または抑制可能である。プロモーターは、導入遺伝子の転写を促進する任意の配列であり得る。一実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター（例えば、配列番号０３）またはその変形である。転写後調節エレメントは、導入遺伝子の発現を調整する配列であり、非限定的な例として、遺伝子編集分子である導入遺伝子の発現を強化する三次構造を作成する任意の配列、または遺伝子編集核酸配列である。
【０１８５】
一実施形態では、転写後調節エレメントは、ＷＰＲＥ（例えば、配列番号０８）を含む。一実施形態では、ポリアデニル化および終結シグナルは、ＢＧＨポリＡ（例えば、配列番号０９）を含む。当該技術分野において既知の任意のシス調節エレメント、またはその組み合わせ、例えば、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー配列（ＵＳＥ）または他の転写後処理エレメント（限定されないが、単純ヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子を含む）が追加として使用され得る。一実施形態では、５’〜３’配向の発現カセット長は、ＡＡＶビリオン中でカプシド化されることが知られている最大長を超える。一実施形態では、長さは、４．６ｋｂ超、または５ｋｂ超、または６ｋｂ超、または７ｋｂ超である。様々な発現カセットが、本明細書に例示される。
【０１８６】
発現カセットは、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、もしくは２０，０００ヌクレオチド、もしくは３０，０００ヌクレオチド、もしくは４０，０００ヌクレオチド、または５０，０００ヌクレオチド、または約４０００〜１０，０００ヌクレオチド、もしくは１０，０００〜５０，０００ヌクレオチドの間の任意の範囲、または５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、遺伝子編集分子である導入遺伝子、または５００〜５０，０００ヌクレオチド長の範囲の遺伝子編集核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、遺伝子編集分子である導入遺伝子、または５００〜７５，０００ヌクレオチド長の範囲の遺伝子編集核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、遺伝子編集分子である導入遺伝子を含み得るか、または遺伝子編集核酸配列は、５００〜１０，０００ヌクレオチド長の範囲である。いくつかの実施形態では、発現カセットは、遺伝子編集分子である導入遺伝子を含み得るか、または遺伝子編集核酸配列は、１０００〜１０，０００ヌクレオチド長の範囲である。いくつかの実施形態では、発現カセットは、遺伝子編集分子である導入遺伝子を含み得るか、または遺伝子編集核酸配列は、５００〜５，０００ヌクレオチド長の範囲である。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化されたＡＡＶベクターのサイズ制限を有しないため、大型の発現カセットの送達を可能にして、遺伝子編集分子である効率的な導入遺伝子、または遺伝子編集核酸配列を提供する。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞特異的メチル化を欠いている。
【０１８７】
発現カセットはまた、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）および／または２Ａエレメントを含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書において「調節スイッチ」と題するセクションに記載されている、導入遺伝子の発現を制御および調節するための調節スイッチを含み、所望される場合、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。
【０１８８】
図１Ａ〜１Ｅは、非限定の例示的なｃｅＤＮＡベクター、またはｃｅＤＮＡプラスミドの対応する配列の概略図を示す。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド不含であり、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子カセットおよび第２のＩＴＲをこの順にコードするプラスミドから取得され、第１および／または第２のＩＴＲ配列のうちの少なくとも１つは、対応する野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列に関して突然変異される。カセットは、好ましくは、エンハンサー／プロモーター、ＯＲＦレポーター（導入遺伝子）、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、ならびにポリアデニル化および終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ）のうちの１つ以上をこの順序で含む。
【０１８９】
発現カセットは、遺伝子編集分子である任意の導入遺伝子、または遺伝子編集核酸配列を含み得る。遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、ポリペプチドをコードする核酸、または非コード核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲ等）、ならびに対象のゲノム中のウイルス配列、例えば、ＨＩＶウイルス配列等を含む外因性遺伝子およびヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されない、対象における任意の関心対象の遺伝子を編集する。好ましくは、本明細書に開示される遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、治療目的（例えば、医療、診断、もしくは獣医学的使用）または免疫原性ポリペプチドに使用される。ある特定の実施形態では、遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、対象における任意の関心対象の遺伝子を編集することができる。
【０１９０】
ｃｅＤＮＡ発現カセットは、例えば、レシピエント対象において存在しない、不活性、もしくは不十分な活性であるタンパク質をコードする発現可能な外因性配列（例えば、オープンリーディングフレーム）、または所望の生物学的もしくは治療的効果を有するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。ドナー配列などの外因性配列は、欠陥遺伝子または転写産物の発現を訂正するように機能することができる遺伝子産物をコードすることができる。発現カセットはまた、訂正ＤＮＡ鎖をコードし、ポリペプチド、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＲＮＡ（コードもしくは非コード；例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびそれらのアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））をコードし得る。発現カセットは、実験または診断の目的で使用されるレポータータンパク質をコードする外因性配列、例えばβ−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、および当該技術分野において周知の他のものを含み得る。
【０１９１】
原則として、発現カセットは、突然変異のために減少もしくは欠如しているタンパク質、ポリペプチド、もしくはＲＮＡをコードする、または過剰発現が本開示の範囲内であると見なされる場合に治療効果をもたらす任意の遺伝子を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、ヌクレアーゼによって提供される二本鎖切断（またはニック）の後に挿入される訂正ＤＮＡ鎖として使用されるテンプレートまたはドナーヌクレオチド配列を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、誘導型ＲＮＡヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼによって提供される二本鎖切断（またはニック）の後に挿入される訂正ＤＮＡ鎖として使用されるテンプレートヌクレオチド配列を含み得る。好ましくは、挿入されていない細菌ＤＮＡは存在せず、好ましくは、本明細書に提供されるｃｅＤＮＡ組成物中に細菌ＤＮＡは存在しない。いくつかの例では、タンパク質は、ニックなしでコドンを変えることができる。
【０１９２】
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの発現カセット、発現構築物、またはドナー配列で提供される配列は、宿主細胞についてコドン最適化することができる。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」または「コドン最適化」という用語は、関心対象の脊椎動物、例えばマウスまたはヒトの細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、または相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。典型的には、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化およびカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，２１９０  Ｆｏｘ  Ｍｉｌｌ  Ｒｄ．Ｓｕｉｔｅ  ３００，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ．２０１７１）または別の公開データベースを使用して決定することができる。
【０１９３】
多くの生物は、特定のコドンを使用して、成長するペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードする偏向を示す。生物間のコドン使用頻度の違いであるコドン優先またはコドン偏向は、遺伝暗号の縮退によってもたらされ、多くの生物の間で十分に文書化されている。コドン偏向は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関関係があることが多く、特に翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の可用性に依存すると考えられている。細胞内の選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般にペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整することができる。
【０１９４】
多種多様な動物、植物、および微生物種で利用可能な多数の遺伝子配列を考えると、コドン使用頻度の相対頻度を計算することが可能である（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．″Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００″Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００））。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集遺伝子（例えば、ドナー配列）またはガイドＲＮＡは、治療遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、抗体、または抗体断片、またはその抗原結合断片、例えば、中和抗体または抗体断片等を標的とする。
【０１９６】
特に、遺伝子編集遺伝子（例えば、ドナー配列）またはガイドＲＮＡは、例えば、疾患、機能不全、傷害、および／または障害の１つ以上の症状の治療、予防、および／または改善における使用のための、タンパク質（複数可）、ポリペプチド（複数可）、ペプチド（複数可）、酵素（複数可）、抗体、抗原結合断片、ならびにその変異体および／または活性断片を含むが、これらに限定されない１種以上の治療剤（複数可）を標的とする。ガイドＲＮＡで標的化するための例示的な遺伝子は、本明細書において、「治療の方法」と題するセクションに記載されている。
【０１９７】
プラスミド系発現ベクターとは異なるｃｅＤＮＡベクターの多くの構造特徴が存在する。ｃｅＤＮＡベクターは、以下の特徴：元の（すなわち、挿入されていない）細菌ＤＮＡの欠失、原核細胞複製起源の欠失、自蔵である（すなわち、Ｒｅｐ結合および末端分解部位（ＲＢＳおよびＴＲＳ）を含む２つのＩＴＲ以外のいかなる配列も、ＩＴＲ間の外因性配列も必要としない）、真核起源（すなわち、それらは真核細胞中で産生される）のヘアピンを形成するＩＴＲ配列の存在、ならびに細菌型ＤＮＡメチル化、または実際に哺乳動物宿主によって異常であるとみなされる任意の他のメチル化の非存在のうちの１つ以上を有し得る。一般に、本ベクターは、いかなる原核細胞ＤＮＡも含有しないことが好ましいが、いくつかの原核細胞ＤＮＡが、外因性配列として、非限定例としてプロモーターまたはエンハンサー領域に挿入されてもよいことが企図される。ｃｅＤＮＡベクターをプラスミド発現ベクターと区別する別の重要な特徴は、ｃｅＤＮＡベクターが、閉端を有する一本鎖直鎖状ＤＮＡであるが、プラスミドは、常に二本鎖ＤＮＡである。
【０１９８】
本明細書に提供される方法によって産生された遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、制限酵素消化アッセイによって判定して、非連続的な構造ではなく直鎖状で連続的な構造を有する（図４Ｄ）。直鎖状で連続的な構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してより安定であると同時に、組み換えられて突然変異誘発を引き起こす可能性が低いと考えられる。したがって、直鎖状で連続的な構造の遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、好ましい実施形態である。連続的な直鎖状の一本鎖分子内二重鎖ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列なしに、終端に共有結合している可能性がある。これらの遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、細菌起源の環状二重鎖核酸分子であるプラスミド（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡプラスミドを含む）とは構造的に異なる。プラスミドの相補鎖は、変性に続いて分離されて２つの核酸分子を産生することができるが、反対に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有するが、単一ＤＮＡ分子であり、したがって変性された場合でも単一分子のままである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、プラスミドとは異なり、原核細胞タイプのＤＮＡ塩基メチル化なしに産生され得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクターおよびｃｅＤＮＡ−プラスミドは、構造（特に、直鎖状対環状）およびこれらの異なる対象物（下記を参照）を産生および精製するために使用される方法の両方に関して、またｃｅＤＮＡ−プラスミドの場合は原核細胞タイプおよびｃｅＤＮＡベクターの場合は真核細胞タイプのものである、それらのＤＮＡメチル化に関して異なる。
【０１９９】
プラスミド系発現ベクターを超える遺伝子編集のための本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用するいくつかの利点があり、そのような利点としては、次のことが挙げられるが、これらに限定されない。１）プラスミドは、細菌ＤＮＡ配列を含有し、原核細胞特異的メチル化、例えば、６−メチルアデノシンおよび５−メチルシトシンメチル化に供されるが、カプシド不含ＡＡＶベクター配列は、真核細胞起源であり、原核細胞特異的メチル化を受けず、結果として、カプシド不含ＡＡＶベクターは、プラスミドと比較して炎症および免疫反応を誘導する可能性が低い。２）プラスミドは、産生プロセス中に耐性遺伝子の存在を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは必要としない。３）環状プラスミドは、細胞への導入時に核に送達されず、細胞ヌクレアーゼによる分解をバイパスするために過負荷を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは、ヌクレアーゼに対する耐性を付与するウイルスシスエレメント、すなわちＩＴＲを含有し、核に対して標的化され、送達されるように設計され得る。ＩＴＲ機能に不可欠な最小定義エレメントは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ、ＡＡＶ２の場合５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１））および末端分解部位（ＴＲＳ、ＡＡＶ２の場合５’−ＡＧＴＴＧＧ−３’（配列番号４８））に加えて、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列であると仮定する。４）ｃｅＤＮＡベクターは、報告によれば受容体のＴｏｌｌ様ファミリーのメンバーに結合し、Ｔ細胞媒介性免疫反応を誘起する原核細胞由来のプラスミドにおいてしばしば見出されるＣｐＧジヌクレオチドの過剰提示を有しない。対照的に、本明細書に開示されるカプシド不含ＡＡＶベクターでの形質導入は、様々な送達試薬を使用し、従来のＡＡＶビリオンで形質導入することが困難である細胞および組織型を効率的に標的とし得る。
【０２００】
ＩＩＩ．所望の核酸配列のノックイン
本明細書に記載される遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクター、方法、および組成物を使用して、新しい核酸配列を導入する、ゲノム配列の突然変異を訂正する、または宿主細胞の標的遺伝子配列に突然変異を導入することができる。そのような方法は、「ＤＮＡノックイン系」と呼ぶことができる。ＤＮＡノックイン系は、本明細書に記載されているように、ドナー配列を任意の所望の標的部位に高効率で挿入できるため、例えば、外因性の非コード配列（配列タグまたは調節エレメントなど）をゲノムに付加することによって、外因性遺伝子を発現するトランスジェニック動物の作成、疾患の細胞培養モデルの調製、スクリーニングアッセイ系の調製、操作された組織構築物の遺伝子発現の修飾、ゲノム遺伝子座の修飾（例えば、突然変異）、および遺伝子編集などの多くの用途に実行可能にする。本明細書で提供される方法を使用して産生された細胞および動物は、例えば、細胞療法として、疾患モデルとして、研究ツールとして、および様々な目的に有用なヒト化動物として、様々な用途を見出すことができる。
【０２０１】
本開示のＤＮＡノックイン系はまた、大きなドナー配列（＜５ｋｂ）を使用する遺伝子編集技法がゲノムの任意の所望の標的部位に挿入されることを可能にし、したがって現在の技法よりも大きな遺伝子の遺伝子編集を提供する。いくつかの実施形態では、大きな相同性アーム、例えば５０塩基対〜２，０００塩基対が含まれ、優れた効率（高いオンターゲット）および優れた特異性（低いオフターゲット）を備えた遺伝子編集、いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼを使用しないＨＤＲを提供する。
【０２０２】
本開示のＤＮＡノックイン系はまた、遺伝子編集のためのドナー配列の投与に関していくつかの利点を提供する。第１に、本開示の送達粒子内で本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターを投与することは、ベースライン免疫によって排除されず、したがって、特定の障害を有する任意かつ潜在的にすべての患者に投与され得る。第２に、本開示の粒子を投与することは、ウイルスベクターベースの送達系に対して典型的に引き起こされるような送達される治療に対する適応免疫応答を生み出さないため、臨床効果のために必要に応じて実施形態を再投与することができる。インビボ送達などの、本開示による１つ以上のｃｅＤＮＡベクターの投与は、反復可能であり、頑強である。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、本開示のｃｅＤＮＡベクターによる遺伝子編集は、治療された患者からの適切なバイオマーカーでモニターして遺伝子訂正の効率を評価することができ、適切なレベルの遺伝子編集が達成されるまで治療用製品の反復投与を行うことができる。
【０２０４】
別の態様では、本開示に従って、本明細書に記載される遺伝子ノックイン系を、ｃｅＤＮＡベクターとともに使用することによって、遺伝子修飾された動物を生成する方法が提供される。これらの方法については、以下でさらに説明される。
【０２０５】
ある特定の実施形態では、本開示は、真核細胞または原核細胞などの宿主細胞の染色体上の所定の挿入部位にドナー配列を挿入するためにｃｅＤＮＡベクターを使用する方法に関する。
【０２０６】
ＩＶ．遺伝子編集系構成成分−一般
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含むものなどのさらなる実施形態では、遺伝子編集に必要な構成成分は、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ（Ｃａｓ９などが利用される場合）、ドナー配列、および本開示の単一のｃｅＤＮＡベクター内に含まれる１つ以上の相同性アームを含み得る。そのような実施形態は、遺伝子編集構成成分を送達するために別個のまたは様々な粒子を必要とするアプローチと比較して、遺伝子編集の効率を高める。
【０２０７】
さらなる実施形態では、ヌクレアーゼは、遺伝子編集後に不活性化／減少され得、そうでなければ、細胞内の付加されたヌクレアーゼの存続とともに生じるはずのオフターゲット編集を減少または排除する。
【０２０８】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される方法のうちのいずれか１つで使用するための１つ以上のｃｅＤＮＡベクターを含むキットに関する。
【０２０９】
本明細書に記載される方法および組成物はまた、例えば、Ｏａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４：６４６−６５１（２０１６）（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、細胞スイッチを含む遺伝子編集系を提供する。
【０２１０】
本明細書に記載される方法および組成物が、当該技術分野で知られている方法を使用してハイスループット方式で実施できることも本明細書で特に企図される（例えば、Ｓｈａｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １６：２９９−３１１（２０１５）、Ｓｈａｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３：８４−８８（２０１４）を参照。各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２１１】
Ｖ．  ＩＴＲｓ
本明細書に開示されているように、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた遺伝子編集核酸配列を含み、これらの用語は、本明細書に定義されるように、ＩＴＲ配列は、非対称ＩＴＲ対または対称もしくは実質的に対称のＩＴＲ対であり得る。本明細書に開示される遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターは、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ  ＩＴＲおよび少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ−ＩＴＲ対が互いに対して異なる３次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、または（ｉｉｉ）各ＷＴ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のＷＴ−ＷＴ  ＩＴＲ対、または（ｉｖ）各ｍｏｄ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択されるＩＴＲ配列を含み得、本開示の方法は、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系をさらに含み得る。
【０２１２】
Ａ．対称ＩＴＲ対
いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、２つのサブファミリー：脊椎動物に感染するＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅおよび昆虫に感染するＤｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅを含む、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのウイルスに由来し得る。パルボウイルス亜科（パルボウイルスと称される）は、ディペンドウイルス族を含み、そのメンバーは、ほとんどの条件下で、増殖性感染のためにアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの共感染を必要とする。ディペンドウイルス族は、通常はヒト（例えば、血清型２、３Ａ、３Ｂ、５、および６）または霊長類（例えば、血清型１および４）に感染するアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ならびに他の温血動物に感染する関連ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、およびヒツジアデノ関連ウイルス）を含む。パルボウイルスおよびＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーの他のメンバーは、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，″Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，″Ｃｈａｐｔｅｒ  ６９  ｉｎ  ＦＩＥＬＤＳ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ（３ｄ  Ｅｄ．１９９６）に一般に記載されている。
【０２１３】
ＩＴＲは、明細書において例証されており、本明細書における例は、ＡＡＶ２  ＷＴ−ＩＴＲであるが、当業者であれば、上述のように、任意の既知のパルボウイルス、例えば、ディペンドウイルス、例えばＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ、およびＡＡＶ−ＤＪ８ゲノムからのＩＴＲを使用できることを認識する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７；ＮＣ００１４０１；ＮＣ００１７２９；ＮＣ００１８２９；ＮＣ００６１５２；ＮＣ００６２６０；ＮＣ００６２６１）、キメラＩＴＲ、または任意の合成ＡＡＶからのＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、温血動物、例えば、鳥類（ＡＡＡＶ）、ウシ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、およびヒツジアデノ関連ウイルスに感染し得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、Ｂ１９パルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ０００８８３）、マウスからの微小ウイルス（ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１５１０）、ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１７０１）、ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００６１４８）に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書で論じられるように、５’ＷＴ−ＩＴＲは、１つの血清型に由来し、３’ＷＴ−ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得る。
【０２１４】
熟練者であれば、ＩＴＲ配列が、二本鎖ホリデージャンクションの一般構造を有し、典型的には、Ｔ形またはＹ形ヘアピン構造であり（例えば、図２Ａおよび図３Ａを参照）、各ＷＴ−ＩＴＲが、より大きなパリンドロームアーム（Ａ−Ａ’）に埋め込まれた２つのパリンドロームアームまたはループ（Ｂ−Ｂ’およびＣ−Ｃ’）、ならびに一本鎖Ｄ配列によって形成される（これらのパリンドローム配列の順序は、ＩＴＲのフリップまたはフロップ配向を定義する）ことを知っている。例えば、異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜ＡＡＶ６）からのＩＴＲの構造分析および配列比較を参照されたい。Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６−４３９、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００５；３６４−３７９、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９９；２６１；８−１４に記載されている。当業者は、本明細書に提供される例示的なＡＡＶ２  ＩＴＲ配列に基づいて、ｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡ−プラスミドで使用するための任意のＡＡＶ血清型からＷＴ−ＩＴＲ配列を容易に決定することができる。例えば、Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６−４３９に記載される異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜ＡＡＶ６、ならびにトリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）およびウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ））からのＩＴＲの配列比較を参照されたい。これは、他の血清型からの左ＩＴＲに対するＡＡＶ２の左ＩＴＲの同一性％を示す：ＡＡＶ−１（８４％）、ＡＡＶ−３（８６％）、ＡＡＶ−４（７９％）、ＡＡＶ−５（５８％）、ＡＡＶ−６（左ＩＴＲ）（１００％）、およびＡＡＶ−６（右ＩＴＲ）（８２％）。
【０２１５】
本明細書で論じられるように、いくつかの実施形態では、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターは、対称ＩＴＲ配列（例えば、対称ＩＴＲ対）を含むことができ、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、互いに対して同じ対称の３次元構成を有することができる（すなわち、対称または実質的に対称）。すなわち、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターは、それらの構造が幾何学的空間で同じ形状であるか、または３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’ループを有するように、対称の３次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含み得る（すなわち、それらは同じであるか、または互いに対して鏡像である）。そのような実施形態では、対称のＩＴＲ対、または実質的に対称のＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲではない修飾型ＩＴＲ（例えば、ｍｏｄ−ＩＴＲ）であり得る。ｍｏｄ−ＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲからの１つ以上の修飾を有し、互いに逆相補（逆位）である同じ配列を有し得る。代替実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応するまたは同じ対称の３次元形状を有し得る。
【０２１６】
（ｉ）野生型ＩＴＲ
いくつかの実施形態では、対称のＩＴＲ、または実質的に対称のＩＴＲは、本明細書に記載されるように野生型（ＷＴ−ＩＴＲ）である。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ−ＩＴＲである必要はない。すなわち、いくつかの実施形態では、一方のＷＴ−ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ−ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称的な３次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。
【０２１７】
したがって、本明細書で開示されるように、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターは、２つの隣接する野生型逆位末端反復（ＷＴ−ＩＴＲ）配列の間に位置する遺伝子編集配列を含み、互いに逆相補（逆位）であるか、または代替として互いに実質的に対称である。すなわち、ＷＴ−ＩＴＲ対は、対称の３次元空間構成を有する。いくつかの実施形態では、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ  ＷＴ−ＩＴＲ）は、機能性Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ、例えば、ＡＡＶ２の場合５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’、配列番号５３１）および機能性末端分解部位（ＴＲＳ、例えば５’−ＡＧＴＴ−３’、配列番号４６）を含む。
【０２１８】
一態様では、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターは、２つのＷＴ逆位末端反復配列（ＷＴ−ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ  ＷＴ−ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードするベクターポリヌクレオチドから取得可能である。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ−ＩＴＲである必要はない。すなわち、いくつかの実施形態では、一方のＷＴ−ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ−ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称の３次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。いくつかの実施形態では、５’ＷＴ−ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し、３’ＷＴ−ＩＴＲは、同じまたは異なるＡＡＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態では、５’ＷＴ−ＩＴＲおよび３’ＷＴ−ＩＴＲは、互いの鏡像であり、すなわち、それらは対称である。いくつかの実施形態では、５’ＷＴ−ＩＴＲおよび３’ＷＴ−ＩＴＲは、同じＡＡＶ血清型に由来する。
【０２１９】
ＷＴ  ＩＴＲは周知である。一実施形態では、２つのＩＴＲは、同じＡＡＶ２血清型に由来する。ある特定の実施形態では、他の血清型からのＷＴを使用することができる。相同であるいくつかの血清型、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８がある。一実施形態では、密接に相同なＩＴＲ（例えば、類似のループ構造を有するＩＴＲ）を使用することができる。別の実施形態では、より多様なＡＡＶ  ＷＴ  ＩＴＲ、例えばＡＡＶ２およびＡＡＶ５を使用することができ、さらに別の実施形態では、実質的にＷＴであるＩＴＲを使用することができる、すなわち、それはＷＴの基本ループ構造を有するが、特性を変更しないかまたは影響しないいくつかの保存的ヌクレオチド変化を有する。同じウイルス血清型に由来するＷＴ−ＩＴＲを使用する場合、１つ以上の調節配列をさらに使用することができる。ある特定の実施形態では、調節配列は、ｃｅＤＮＡの活性の調整を可能にする調節スイッチである。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術の一態様は、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）に関し、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの野生型逆位末端反復配列（ＷＴ−ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、ＷＴ−ＩＴＲは、同じ血清型、異なる血清型に由来し得るか、または互いに対して実質的に対称であり得る（すなわち、それらの構造が幾何学的空間で同じ形状であるように対称の３次元空間構成を有するか、または３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’ループを有する）。いくつかの実施形態では、対称ＷＴ−ＩＴＲは、機能性末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、異種核酸配列は、導入遺伝子をコードし、ベクターは、ウイルスカプシドにはない。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲは同じであるが、互いの逆相補鎖である。例えば、５’ＩＴＲの配列ＡＡＣＧは、対応する部位の３’ＩＴＲのＣＧＴＴ（すなわち、逆相補鎖）であり得る。一実施例では、５’ＷＴ−ＩＴＲセンス鎖は、ＡＴＣＧＡＴＣＧの配列を含み、対応する３’ＷＴ−ＩＴＲセンス鎖は、ＣＧＡＴＣＧＡＴ（すなわち、ＡＴＣＧＡＴＣＧの逆相補鎖）を含む。いくつかの実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲ  ｃｅＤＮＡは、末端分解部位および複製タンパク質結合部位（ＲＰＳ）（複製タンパク質結合部位と呼ばれることもある）、例えばＲｅｐ結合部位をさらに含む。
【０２２２】
ＷＴ−ＩＴＲを含むｃｅＤＮＡベクターで使用するための例示的なＷＴ−ＩＴＲ配列は、ＷＴ−ＩＴＲの対（５’ＷＴ−ＩＴＲおよび３’ＷＴ−ＩＴＲ）を示す本明細書の表２に示されている。
【０２２３】
例示的な実施例として、本開示は、調節スイッチの有無にかかわらず、導入遺伝子（例えば、遺伝子編集配列）に操作可能に連結されたプロモーターを含む閉端ＤＮＡベクターを提供し、ｃｅＤＮＡはカプシドタンパク質を欠き、（ａ）ＷＴ−ＩＴＲをコードするｃｅＤＮＡ−プラスミド（例えば、図１Ｆ〜１Ｇを参照）から産生され、各ＷＴ−ＩＴＲは、そのヘアピン二次構成で同じ数の分子内二重化塩基対を有し（好ましくはこれらの参照配列と比較して、この構成のいかなるＡＡＡまたはＴＴＴ末端ループの欠失も除外する）、および（ｂ）実施例１の未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるｃｅＤＮＡの同定のためのアッセイを使用してｃｅＤＮＡとして同定される。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、隣接するＷＴ−ＩＴＲは、互いに実質的に対称である。この実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲが同一の逆相補鎖ではないように、５’ＷＴ−ＩＴＲは、ＡＡＶの１つの血清型に由来し、３’ＷＴ−ＩＴＲは、ＡＡＶの異なる血清型に由来し得る。例えば、５’ＷＴ−ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来し得、３’ＷＴ−ＩＴＲは、異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２）に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例えば、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、または昆虫ＡＡＶのうちのいずれかから選択される２つの異なるパルボウイルスから選択され得る。いくつかの実施形態では、ＷＴ  ＩＴＲのそのような組み合わせは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６からのＷＴ−ＩＴＲの組み合わせである。一実施形態では、実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲは、一方が他方のＩＴＲに対して反転されたときに、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％…９７％…９８％…９９％…９９．５％、およびその間のすべてのポイントであり、同じ対称の３次元空間構成を有する。いくつかの実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲ対は、それらが対称の３次元空間構成を有する、例えば、Ａ、Ｃ−Ｃ’、Ｂ−Ｂ’、およびＤアームの同じ３次元構成を有するため、実質的に対称である。一実施形態では、実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲ対は、他方に対して反転され、互いに少なくとも９５％同一、少なくとも９６％…９７％…９８％…９９％…９９．５％、およびその間のすべてのポイントであり、一方のＷＴ−ＩＴＲは、５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１）のＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ｔｒｓ）を保持する。いくつかの実施形態では、実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲ対は、互いに対して反転され、互いに少なくとも９５％同一、少なくとも９６％…９７％…９８％…９９％…９９．５％、およびその間のすべてのポイントであり、一方のＷＴ−ＩＴＲは、ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１）のＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ｔｒｓ）を保持する。相同性は、ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメント検索ツール）、デフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなど、当該技術分野で周知の標準的な手段によって決定することができる。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲの構造エレメントは、ＩＴＲと大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８）との機能的相互作用に関与する任意の構造エレメントであり得る。ある特定の実施形態では、構造エレメントは、ＩＴＲと大きなＲｅｐタンパク質との相互作用に対する選択性を提供する。すなわち、少なくとも部分的に、どのＲｅｐタンパク質がＩＴＲと機能的に相互作用するかを判定する。他の実施形態では、構造エレメントは、Ｒｅｐタンパク質がＩＴＲに結合されたとき、大きなＲｅｐタンパク質と物理的に相互作用する。各構造エレメントは、例えば、ＩＴＲの二次構造、ＩＴＲのヌクレオチド配列、２つ以上のエレメント間の空間、または上記のうちのいずれかの組み合わせであり得る。一実施形態では、構造エレメントは、ＡおよびＡ’アーム、ＢおよびＢ’アーム、ＣおよびＣ’アーム、Ｄアーム、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＥ）およびＲＢＥ’（すなわち、相補的ＲＢＥ配列）、ならびに末端分解部位（ｔｒｓ）からなる群から選択される。
【０２２６】
単なる例として、表１は、ＷＴ−ＩＴＲの例示的な組み合わせを示す。
【０２２７】
表１：同じ血清型もしくは異なる血清型、または異なるパロウイルスからのＷＴ−ＩＴＲの例示的な組み合わせ。示されている順序は、ＩＴＲ位置を示すものではなく、例えば、「ＡＡＶ１、ＡＡＶ２」は、ｃｅＤＮＡが５’位置にＷＴ−ＡＡＶ１  ＩＴＲおよび３’位置にＷＴ−ＡＡＶ２  ＩＴＲ、またはその逆、５’位置にＷＴ−ＡＡＶ２  ＩＴＲおよび３’位置にＷＴ−ＡＡＶ１  ＩＴＲを含み得ることを明示する。略語：ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型３（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、またはＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）；ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ、およびＡＡＶ−ＤＪ８ゲノム（例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７；ＮＣ００１４０１；ＮＣ００１７２９；ＮＣ００１８２９；ＮＣ００６１５２；ＮＣ００６２６０；ＮＣ００６２６１）、温血動物のＩＴＲ（トリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）、ウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、およびヒツジＡＡＶ）、Ｂ１９パルボウイルスからのＩＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ０００８８３）、マウスからの微小ウイルス（ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１５１０）；ガチョウ：ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ００１７０１）；ヘビ：ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００６１４８）。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【０２２８】
単なる例として、表２は、いくつかの異なるＡＡＶ血清型からの例示的なＷＴ−ＩＴＲの配列を示す。
表２
【表２−１】
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【表２−２】
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【０２２９】
いくつかの実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲ配列のヌクレオチド配列は、（例えば、１、２、３、４もしくは５個以上のヌクレオチドまたはその中の任意の範囲を修飾することにより）修飾され得、それにより修飾は、相補的ヌクレオチドの置換、例えば、Ｃの場合はＧ、およびその逆、Ａの場合はＴ、およびその逆である。
【０２３０】
本発明のある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５５０〜５５７のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列からなるＷＴ−ＩＴＲを有しない。
【０２３１】
本発明の代替実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターが、配列番号５５０〜５５７のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含むＷＴ−ＩＴＲを有する場合、隣接するＩＴＲもＷＴであり、ｃＤＮＡは、例えば、本明細書およびＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６に開示されているように、調節スイッチを含む（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の表１１を参照）。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示されるような調節スイッチ、および配列番号５５０〜５５７からなる群のいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する選択されたＷＴ−ＩＴＲを含む。
【０２３２】
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、操作可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、およびＲＢＥ’部分を保持するＷＴ−ＩＴＲ構造を含み得る。例示の目的で野生型ＩＴＲを使用する図２Ａおよび図２Ｂは、ｃｅＤＮＡベクターの野生型ＩＴＲ構造部分内のｔｒｓ部位の操作のための１つの可能な機序を示す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ−結合部位（ＲＢＳ、ＡＡＶ２の場合５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１））および末端分解部位（ＴＲＳ、５’−ＡＧＴＴ（配列番号４６））を含む１つ以上の機能性ＷＴ−ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＷＴ−ＩＴＲは、機能的である。ｃｅＤＮＡベクターが互いに実質的に対称である２つのＷＴ−ＩＴＲを含む代替実施形態では、少なくとも１つのＷＴ−ＩＴＲが機能的であり、少なくとも１つのＷＴ−ＩＴＲが非機能的である。
【０２３３】
Ｂ．非対称ＩＴＲ対または対称ＩＴＲ対を含むｃｅＤＮＡベクターの一般的な修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ−ＩＴＲ）
本明細書で論じられるように、ｃｅＤＮＡベクターは、対称ＩＴＲ対または非対称ＩＴＲ対を含み得る。どちらの場合も、ＩＴＲは修飾型ＩＴＲであり得、その違いは、第１の場合（すなわち、対称ｍｏｄ−ＩＴＲ）では、ｍｏｄ−ＩＴＲは、同じ３次元空間構成を有する（すなわち、同じＡ−Ａ’、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’アーム構成を有する）が、第２の場合（すなわち、非対称ｍｏｄ−ＩＴＲ）では、ｍｏｄ−ＩＴＲは、異なる３次元空間構成を有する（すなわち、Ａ−Ａ’、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’アームの異なる構成を有する）ことである。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）と比較して、欠失、挿入、および／または置換によって修飾されるＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能性Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；例えば、ＡＡＶ２の場合は５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’、配列番号５３１）および機能性末端分解部位（ＴＲＳ；例えば、５’−ＡＧＴＴ−３’、配列番号４６）を含む。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、非機能性ＩＴＲである。一実施形態では、異なるまたは修飾型ＩＴＲは各々、異なる血清型からの野生型ＩＴＲではない。
【０２３５】
ＩＴＲの特定の変更および突然変異が本明細書において詳細に説明されているが、ＩＴＲの文脈では、「変更型」または「突然変異型」または「修飾型」とは、ヌクレオチドが野生型、参照、または元のＩＴＲ配列に対して挿入、欠失、および／または置換されたことを示す。変更型または突然変異型ＩＴＲは、操作されたＩＴＲであり得る。本明細書で使用される場合、「操作された」とは、人の手によって操作された態様を指す。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドの少なくとも１つの態様、例えば、その配列が、人の手によって操作され、それが天然に存在するときの態様とは異なるとき、「操作された」とみなされる。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、ｍｏｄ−ＩＴＲは、合成のものであり得る。一実施形態では、合成ＩＴＲは、２つ以上のＡＡＶ血清型からのＩＴＲ配列に基づいている。別の実施形態では、合成ＩＴＲは、ＡＡＶ系配列を含まない。さらに別の実施形態では、合成ＩＴＲは、上記のＩＴＲ構造を保存するが、わずかなＡＡＶ源配列を有するか、または全く有しない。いくつかの態様では、合成ＩＴＲは、野生型Ｒｅｐまたは特定血清型のＲｅｐと選好的に相互作用し得るか、または場合によっては、野生型Ｒｅｐによって認識されず、突然変異型Ｒｅｐによってのみ認識される。
【０２３７】
熟練者であれば、既知の手段によって他の血清型における対応する配列を判定することができる。例えば、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、またはＤ領域中に変化が存在するかどうかを判定し、別の血清型における対応する領域を判定する。ＢＬＡＳＴ（登録商標）（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）または他の相同性アラインメントプログラムをデフォルト状態で使用して、対応する配列を判定することができる。本発明は、異なるＡＡＶ血清型の組み合わせからｍｏｄ−ＩＴＲを含む集団および複数のｃｅＤＮＡベクターをさらに提供する。すなわち、１つのｍｏｄ−ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他のｍｏｄ−ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得る。理論に束縛されるものではないが、一実施形態では、１つのＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列に由来し得るか、またはそれに基づき得、ｃｅＤＮＡベクターの他のＩＴＲは、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、またはＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）の任意の１つ以上のＩＴＲ配列に由来し得るか、またはそれに基づき得る。
【０２３８】
任意のパルボウイルスＩＴＲを、ＩＴＲとして、または塩基ＩＴＲとして修飾に使用することができる。好ましくは、パルボウイルスは、ディペンドウイルスである。より好ましくは、ＡＡＶである。選択される血清型は、その血清型の組織向性に基づき得る。ＡＡＶ２は、広い組織向性を有し、ＡＡＶ１は、ニューロンおよび骨格筋を選好的に標的し、ＡＡＶ５は、ニューロン、網膜色素上皮、および光受容体を標的とする。ＡＡＶ６は、骨格筋および肺を選好的に標的とする。ＡＡＶ８は、肝臓、骨格筋、心臓、および膵臓組織を選好的に標的とする。ＡＡＶ９は、肝臓、骨格、および肺組織を選好的に標的とする。一実施形態では、修飾型ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲに基づいている。
【０２３９】
より具体的には、構造エレメントが特定の大きなＲｅｐタンパク質と機能的に相互作用する能力は、構造エレメントを修飾することによって変更され得る。例えば、構造エレメントのヌクレオチド配列は、ＩＴＲの野生型配列と比較して修飾され得る。一実施形態では、ＩＴＲの構造エレメント（例えば、Ａアーム、Ａ’アーム、Ｂアーム、Ｂ’アーム、Ｃアーム、Ｃ’アーム、Ｄアーム、ＲＢＥ、ＲＢＥ’、およびｔｒｓ）を除去し、異なるパルボウイルスからの野生型構造エレメントと置き換えることができる。例えば、置換構造は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例えば、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、または昆虫ＡＡＶからのものであり得る。例えば、ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲであり得、ＡもしくはＡ’アームまたはＲＢＥは、ＡＡＶ５からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＩＴＲは、ＡＡＶ５  ＩＴＲであり得、ＣまたはＣ’アーム、ＲＢＥ、およびｔｒｓは、ＡＡＶ２からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ５  ＩＴＲであり得、ＢおよびＢ’アームは、ＡＡＶ２  ＩＴＲ  ＢおよびＢ’アームで置き換えられる。
【０２４０】
単なる例として、表３は、修飾型ＩＴＲの領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの例示的な修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を示し、Ｘは、対応する野生型ＩＴＲに対するそのセクションにおける少なくとも１つの核酸の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を示す。いくつかの実施形態では、Ｃおよび／またはＣ’および／またはＢおよび／またはＢ’の領域のうちのいずれかにおける少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。例えば、修飾が、単一アームＩＴＲ（例えば、単一Ｃ−Ｃ’アーム、もしくは単一Ｂ−Ｂ’アーム）、または修飾型Ｃ−Ｂ’アームもしくはＣ’−Ｂアーム、または少なくとも１つの切断されたアーム（例えば、切断されたＣ−Ｃ’アームおよび／もしくは切断されたＢ−Ｂ’アーム）を有する２つのアームＩＴＲのうちのいずれかをもたらす場合、少なくとも単一アーム、または２つのアームＩＴＲのアーム（１つのアームは切断され得る）のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。いくつかの実施形態では、切断されたＣ−Ｃ’アームおよび／または切断されたＢ−Ｂ’アームは、末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を有する。
【０２４１】
表３：ＩＴＲの異なるＢ−Ｂ’およびＣ−Ｃ’領域またはアームに対する少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）の例示的な組み合わせ（Ｘは、ヌクレオチド修飾、例えば、領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、または置換を示す）。
【表３】
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【０２４２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される非対称ＩＴＲ対または対称ｍｏｄ−ＩＴＲ対を含む遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターで使用するためのｍｏｄ−ＩＴＲは、表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’とＣとの間、ＣとＣ’との間、Ｃ’とＢとの間、ＢとＢ’との間、およびＢ’とＡとの間から選択される領域のうちのいずれか１つ以上における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣもしくはＣ’またはＢもしくはＢ’領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、依然としてステムループの末端ループを保存する。いくつかの実施形態では、ＣとＣ’との間および／またはＢとＢ’との間の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。代替実施形態では、ＣとＣ’との間および／またはＢとＢ’との間の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ａヌクレオチド（すなわち、ＡＡＡ）を保持する。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’、Ａ、および／またはＤから選択される領域のうちのいずれか１つ以上における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ領域における少なくとも１つの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）も含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡおよび／またはＡ’領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＤ領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。
【０２４３】
一実施形態では、構造エレメントのヌクレオチド配列を修飾して（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０以上のヌクレオチド、またはその中の任意の範囲）、修飾型構造エレメントを産生することができる。一実施形態では、ＩＴＲに対する特定の修飾が本明細書に例示される（例えば、配列番号２、５２、６３、６４、９９〜１００、４６９〜４９９、または本明細書の図７Ａ〜７Ｂに示される（例えば、９７〜９８、１０１〜１０３、１０５〜１０８、１１１〜１１２、１１７〜１３４、５４５〜５４）。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０以上のヌクレオチド、またはその中の任意の範囲を修飾することによって）修飾され得る。他の実施形態では、ＩＴＲは、配列番号４６９−４９９もしくは５４５−５４７の修飾型ＩＴＲのうちの１つ、または配列番号９７〜９８、１０１〜１０３、１０５〜１０８、１１１〜１１２、１１７〜１３４、５４５〜５４７の、または参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の表２〜９（すなわち、配列番号１１０〜１１２、１１５〜１９０、２００〜４６８）に示されているＡ−Ａ’アームおよびＣ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有セクションと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し得る。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、例えば、特定アームの全部、例えば、Ａ−Ａ’アームの全部もしくは一部、またはＢ−Ｂ’アームの全部もしくは一部、またはＣ−Ｃ’アームの全部もしくは一部の除去または欠失、あるいはステム（例えば、単一アーム）をキャップする最終ループが依然として存在する限り、ループのステムを形成する１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去（例えば、図７ＡのＩＴＲ−２１を参照）を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｂ−Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る（例えば、図３ＢのＩＴＲ−１または図７ＡのＩＴＲ−４５を参照）。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去、およびＢ−Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る。塩基対の除去の任意の組み合わせが想起され、例えば、Ｃ−Ｃ’アームにおける６つの塩基対、およびＢ−Ｂ’アームにおける２つの塩基対が除去され得る。例示的な実施例として、図３Ｂは、修飾型ＩＴＲが、少なくとも１つのアーム（例えば、Ｃ−Ｃ’）が切断される２つのアームを含むように、Ｃ部分およびＣ’部分の各々から欠失された少なくとも７つの塩基対、Ｃ領域とＣ’領域との間のループ中のヌクレオチドの置換、ならびにＢ領域およびＢ’領域の各々からの少なくとも１つの塩基対の欠失を有する例示的な修飾型ＩＴＲを示す。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲはまた、Ｂ領域およびＢ’領域の各々からの少なくとも１つの塩基対の欠失を含み、それによりＢ−Ｂ’アームもＷＴ  ＩＴＲに対して切断される。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して１〜５０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）ヌクレオチド欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して１〜３０ヌクレオチド欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して２〜２０ヌクレオチド欠失を有す。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、ＤＮＡ複製（例えば、Ｒｅｐタンパク質によるＲＢＥへの結合、もしくは末端分解部位でのニッキング）に干渉しないように、ＡまたはＡ’領域のＲＢＥ含有部分にいかなるヌクレオチド欠失も含まない。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のために包含される修飾型ＩＴＲは、本明細書に記載されるＢ、Ｂ’、Ｃ、および／またはＣ領域に１つ以上の欠失を有する。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、対称ＩＴＲ対または非対称ＩＴＲ対を含む遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示されるような調節スイッチおよび配列番号５５０〜５５７からなる群のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する選択された少なくとも１つの修飾型ＩＴＲを含む。
【０２４８】
別の実施形態では、構造エレメントの構造は、修飾され得る。例えば、構造エレメントは、ステムの高さおよび／またはループ内のヌクレオチドの数の変化。例えば、ステムの高さは、約２、３、４、５、６、７、８、もしくは９ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲であり得る。一実施形態では、ステムの高さは約５ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用し得る。別の実施形態では、ステムの高さは、約７ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用し得る。別の例では、ループは３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲を有し得る。
【０２４９】
別の実施形態では、ＲＢＥまたは伸長ＲＢＥ内のＧＡＧＹ結合部位またはＧＡＧＹ関連結合部位の数は、増加または減少され得る。一実施例では、ＲＢＥまたは伸長ＲＢＥは、１、２、３、４、５、もしくは６以上のＧＡＧＹ結合部位、またはその中の任意の範囲を含み得る。各ＧＡＧＹ結合部位は、独立して、配列がＲｅｐタンパク質に結合するのに十分である限り、正確なＧＡＧＹ配列またはＧＡＧＹと同様の配列であり得る。
【０２５０】
別の実施形態では、２つのエレメント（限定されないが、ＲＢＥおよびヘアピンなど）の間の空間を変更して（例えば、増加または減少）、大きなＲｅｐタンパク質との機能的相互作用を変更することができる。例えば、空間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲であり得る。
【０２５１】
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲ構造に関して修飾されるＩＴＲ構造を含み得るが、依然として操作可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、およびＲＢＥ’部分を保持する。図２Ａおよび図２Ｂは、ｃｅＤＮＡベクターの野生型ＩＴＲ構造内のｔｒｓ部位の操作のための１つの可能な機序を示す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ−結合部位（ＲＢＳ、ＡＡＶ２の場合５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１））および末端分解部位（ＴＲＳ、５’−ＡＧＴＴ（配列番号４６））を含む１つ以上の機能的ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＩＴＲ（野生型または修飾型ＩＴＲ）は、機能的である。ｃｅＤＮＡベクターが、互いに異なるか、または非対称である２つの修飾型ＩＴＲを含む代替実施形態では、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲは、機能的であり、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲは、非機能的である。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に提供されるように、配列番号５００〜５２９からなる、または本質的にそれからなる任意の配列から選択される修飾型ＩＴＲを有しない。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５００〜５２９から選択される任意の配列から選択されるＩＴＲを有しない。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）は、ループアーム、切断アーム、またはスペーサー内に修飾を有する。ループアーム、切断アーム、またはスペーサー内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の表２（すなわち、配列番号１３５〜１９０、２００〜２３３）；表３（例えば、配列番号２３４〜２６３）；表４（例えば、配列番号２６４〜２９３）；表５（例えば、本明細書の配列番号２９４〜３１８）；表６（例えば、配列番号３１９〜４６８）；および表７〜９（例えば、配列番号１０１〜１１０、１１１〜１１２、１１５〜１３４）または表１０Ａもしくは１０Ｂ（例えば、配列番号９、１００、４６９〜４８３、４８４〜４９９）に列挙されている。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対または対称ｍｏｄ−ＩＴＲ対を含むｃｅＤＮＡベクターにおける使用のための修飾型ＩＴＲは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の表２、３、４、５、６、７、８、９、および１０Ａ〜１０Ｂに示されるもののうちのいずれか、またはそれらの組み合わせから選択される。
【０２５５】
上記のクラスの各々に非対称ＩＴＲ対または対称ｍｏｄ−ＩＴＲ対を含むｃｅＤＮＡベクターで使用するための追加の例示的な修飾型ＩＴＲを表４Ａおよび４Ｂに示す。表４Ａの右修飾型ＩＴＲの予測される二次構造は、図７Ａに示され、表４Ｂの左修飾型ＩＴＲの予測される二次構造は、図７Ｂに示される。
【０２５６】
表４Ａおよび表４Ｂは、例示的な右および左修飾型ＩＴＲを示す。
【０２５７】
表４Ａ：例示的な修飾型右ＩＴＲこれらの例示的な修飾型右ＩＴＲは、ＲＢＥであるＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１）、スペーサーであるＡＣＴＧＡＧＧＣ（配列番号５３２）、スペーサー補体ＧＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号５３５）、およびＲＢＥ’（すなわち、ＲＢＥに対する補体）であるＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣ（配列番号５３６）を含み得る。
【表４Ａ−１】
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【表４Ａ−２】
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【表４Ａ−３】
2021505159.tif 000012
【０２５８】
表４Ｂ：例示的な修飾型左ＩＴＲこれらの例示的な修飾型左ＩＴＲは、ＲＢＥであるＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１）、スペーサーであるＡＣＴＧＡＧＧＣ（配列番号５３２）、スペーサー補体ＧＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号５３５）、およびＲＢＥ補体（ＲＢＥ’）であるＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣ（配列番号５３６）を含み得る。
【表４Ｂ−１】
2021505159.tif 000013
【表４Ｂ−２】
2021505159.tif 000014
【表４Ｂ−３】
2021505159.tif 000015
【０２５９】
一実施形態では、遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、２つの対称的なｍｏｄ−ＩＴＲを含む。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ配列を有するが、互いの逆相補鎖（逆位）である。いくつかの実施形態では、対称ｍｏｄ−ＩＴＲ対は、同じＡＡＶ血清型からの野生型ＩＴＲ配列と比較して、欠失、挿入、または置換の少なくとも１つまたは任意の組み合わせを含む。対称ＩＴＲの付加、欠失、または置換は同じであるが、互いの逆相補鎖である。例えば、５’ＩＴＲのＣ領域への３ヌクレオチドの挿入は、３’ＩＴＲのＣ’領域の対応するセクションへの３つの逆相補ヌクレオチドの挿入に反映される。単に説明の目的でのみ、付加が５’ＩＴＲのＡＡＣＧである場合、付加は、対応する部位における３’ＩＴＲのＣＧＴＴである。例えば、５’ＩＴＲセンス鎖が
【化１】
2021505159.tif 000016
であり、ＧとＡとの間に
【化２】
2021505159.tif 000017
の付加を伴い、配列
【化３】
2021505159.tif 000018
をもたらす場合。対応する３’ＩＴＲセンス鎖は、
【化４】
2021505159.tif 000019
であり、ＴとＣとの間に
【化５】
2021505159.tif 000020
（すなわち、ＡＡＣＧの逆相補鎖）の付加を伴い、配列
【化６】
2021505159.tif 000021
をもたらす。
【０２６０】
代替実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応するまたは同じ対称の３次元形状を有し得る。例えば、１つの修飾型ＩＴＲは、１つの血清型に由来し得、他の修飾型ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得るが、それらは同じ領域において同じ突然変異（例えば、ヌクレオチド挿入、欠失、または置換）を有する。言い換えると、単なる説明の目的で、５’ｍｏｄ−ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来し得、Ｃ領域に欠失を有し、３’ｍｏｄ−ＩＴＲは、ＡＡＶ５に由来し得、Ｃ’領域に対応する欠失を有する。５’ｍｏｄ−ＩＴＲおよび３’ｍｏｄ−ＩＴＲが同じまたは対称の３次元空間構成を有することを条件として、それらは本明細書における修飾型ＩＴＲ対としての使用に包含される。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、実質的に対称のｍｏｄ−ＩＴＲ対は、３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称のｍｏｄ−ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ−Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ−ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ−ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡおよびＢ−Ｂ’ループの同様の３次元構造を有する。単なる例として、実質的に対称のＩＴＲは、それらの構造が幾何学的空間において同じ形状であるように、対称空間構成を有し得る。これは、例えば、Ｇ−Ｃ対が、例えばＣ−Ｇ対に、もしくはその逆に修飾されたとき、またはＡ−Ｔ対がＴ−Ａ対に、もしくはその逆に修飾されたときに起こり得る。したがって、
【化７】
2021505159.tif 000022
（配列番号５７０）としての修飾型５’ＩＴＲ、および
【化８】
2021505159.tif 000023
（配列番号５７１）としての修飾型３’ＩＴＲ（すなわち、
【化９】
2021505159.tif 000024
の逆相補（配列番号５７０））の上記の例示的な実施例を使用し、例えば、５’ＩＴＲが
【化１０】
2021505159.tif 000025
の配列（配列番号５７２）を有していた場合（付加部のＧは、Ｃに修飾される）、これらの修飾型ＩＴＲは、依然として対称であり、実質的に対称の３’ＩＴＲは、付加部のＴを対応するＡに修飾することなく、
【化１１】
2021505159.tif 000026
の配列（配列番号５７１）を有する。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲ対が対称立体化学を有するため、そのような修飾型ＩＴＲは、実質的に対称である。
【０２６２】
表５は、例示的な対称修飾型ＩＴＲ対（すなわち、左修飾型ＩＴＲおよび対称右修飾型ＩＴＲ）を示す。配列の太字（赤）部分は、図３１Ａ〜４６Ｂにも示されている部分的なＩＴＲ配列（すなわち、Ａ−Ａ’、Ｃ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’ループの配列）を識別する。これらの例示的な修飾型ＩＴＲは、ＲＢＥであるＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１）、スペーサーであるＡＣＴＧＡＧＧＣ（配列番号５３２）、スペーサー補体ＧＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号５３５）、およびＲＢＥ’（すなわち、ＲＢＥに対する補体）であるＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣ（配列番号５３６）を含み得る。
【表５−１】
2021505159.tif 000027
【表５−２】
2021505159.tif 000028
【表５−３】
2021505159.tif 000029
【表５−４】
2021505159.tif 000030
【０２６３】
いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対を含む遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書の表４Ａ〜４Ｂのいずれか１つ以上に示されるＩＴＲ配列もしくはＩＴＲ部分配列、あるいは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１８年９月７日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の図７Ａもしくは７Ｂに示されているか、または表２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０Ａ〜１０Ｂに開示されている配列における修飾のうちのいずれかに対応する修飾を有するＩＴＲを含み得る。
【０２６４】
ＶＩ．例示的な遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクター
上記のように、本開示は、上記のような非対称のＩＴＲ対、対称のＩＴＲ対、または実質的に対称のＩＴＲ対のうちのいずれか１つを含む組み換えｃｅＤＮＡ発現ベクター（例えば、ドナーベクター（プロモーターに操作可能に連結されてもされなくてもよい）および遺伝子編集分子をコードするｃｅＤＮＡベクター）に関する。ある特定の実施形態では、本開示は、隣接するＩＴＲ配列および遺伝子編集能力を有する組み換えｃｅＤＮＡベクターに関し、ＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、または実質的に対称であり、ｃｅＤＮＡは、隣接するＩＴＲの間に位置する関心対象のヌクレオチド配列（例えば、遺伝子編集配列の発現カセット、またはガイドＲＮＡ）をさらに含み、当該核酸分子は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ヌクレアーゼ、１つ以上の相同性アーム、ガイドＲＮＡ、アクチベーターＲＮＡ、および制御エレメントのうちの少なくとも１つを包含する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’相同性アーム、ドナー配列、および３’相同性アームを含む。本開示による好適なｃｅＤＮＡベクターは、以下の実施例に従って取得することができる。ある特定の実施形態では、本開示は、遺伝子編集系の少なくとも２つの構成成分、例えば、ＣＡＳおよび少なくとも１つのｇＲＮＡ、または２つのＺＮＦ等を含む、組み換えｃｅＤＮＡ発現ベクターに関する。したがって、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子編集系の複数の構成成分を含む。
【０２６５】
組み換えｃｅＤＮＡ発現ベクターは、少なくとも１つのＩＴＲが変更されている場合、本明細書に記載されるヌクレオチド配列（複数可）を含む組み換えＤＮＡ手順に都合よく供することができる任意のｃｅＤＮＡベクターであってよい。本開示のｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターが導入される宿主細胞と適合性がある。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、直鎖状であってもよい。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、染色体外実体として存在し得る。ある特定の実施形態では、本開示のｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞のゲノムへのドナー配列の組み込みを可能にするエレメント（複数可）を含み得る。本明細書で使用される場合、「ドナー配列」および「導入遺伝子」および「異種ヌクレオチド配列」は同義である。
【０２６６】
ここで図１Ａ〜１Ｇを参照すると、本開示のｃｅＤＮＡベクターを作製するのに有用な２つの非限定的プラスミドの機能的構成成分の概略図が示されている。図１Ａ、１Ｂ、１Ｄ、１Ｆは、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターの構築物または対応するｃｅＤＮＡプラスミドの配列を示す。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシドを含まず、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子カセット、および第２のＩＴＲをこの順序でコードするプラスミドから取得することができ、第１および第２のＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、または実質的に対称である。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシドを含まず、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子（タンパク質もしくは核酸）またはドナーカセット（例えば、ＨＤＲドナー）、および第２のＩＴＲをこの順序でコードするプラスミドから取得することができ、第１および第２のＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、または実質的に対称である。いくつかの実施形態では、発現可能な導入遺伝子カセットは、必要に応じて、エンハンサー／プロモーター、１つ以上の相同性アーム、ドナー配列、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ、例えば、配列番号８））、ならびにポリアデニル化および終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ、例えば、配列番号７）を含む。
【０２６７】
図５は、実施例に記載される方法を使用して、複数のｃｅＤＮＡプラスミド構築物からｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルである。ｃｅＤＮＡは、上記の図４Ａに関して、および実施例で論じられるように、ゲル中の特徴的なバンドパターンによって確認される。
【０２６８】
ここで図８を参照すると、第１および第２のＩＴＲを含む、本開示による非限定的な例示的ｃｅＤＮＡベクターが示され、ＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、または実質的に対称であり、第１のヌクレオチド配列は、５’相同性アーム、ドナー配列、および３’相同性アームを含み、ドナー配列は、遺伝子編集機能を有する。いくつかの実施形態では、上記のＴＲ（例えば、ＩＴＲ）は、関心対象の遺伝子編集分子（例えば、ヌクレアーゼ（例えば、配列特異的ヌクレアーゼ）、１つ以上のガイドＲＮＡ、Ｃａｓもしくは他のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）、またはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸配列の隣接する末端に含まれる。本開示の核酸構築物の非限定的な例には、配列番号１または配列番号５１のヌクレオチド配列を有するＡＡＶ２の野生型機能的ＩＴＲ、およびさらに配列番号２または配列番号５２のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するＡＡＶ２の変更されたＩＴＲを含む、核酸構築物が含まれる。追加のＩＴＲは、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１５２１４９およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号に記載されている。
【０２６９】
図８を参照すると、ｃｅＤＮＡは、示されるような第１のヌクレオチド配列の上流に第２のヌクレオチド配列を含み得る。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターのうちのいずれかのある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ドナー配列を含む第１のヌクレオチド配列の５’または３’のような第２のヌクレオチド配列、および任意に相同性アームをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、図８を参照すると、ｃｅＤＮＡベクターは、ガイド配列および／またはアクチベーターＲＮＡ配列をコードする１つ以上のヌクレオチドに操作可能に連結された第２のプロモーターを含む第３のヌクレオチド配列を含み得る。ある特定の実施形態では、プロモーターは、Ｐｏｌ  ＩＩＩ（Ｕ６（配列番号１８）またはＨ１（配列番号１９））である。
【０２７０】
別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ねじれ解放およびより効率的なホモロイ指向修復（ＨＤＲ）のために、ヌクレアーゼ、および各ｃｅＤＮＡ  ＩＴＲに向けられるか、または相同性ドメイン領域の外側に向けられる１つ以上のガイドＲＮＡをコードする。ヌクレアーゼは、突然変異体ヌクレアーゼである必要はなく、例えば、ドナーＨＤＲテンプレートは、そのような切断によってｃｅＤＮＡから解放されてもよい。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、非限定的な一実施例では、遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターは、特定の遺伝子に対する５’および３’相同性アーム、または本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼに特異的な制限部位を５’相同性アームおよび３’相同性アームのいずれかの末端に有する標的統合部位を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターが、制限部位（複数可）に特異的な１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで切断されると、結果として得られるカセットは、５’相同性アームドナー配列−３’相同性アームを含み、所望のゲノム遺伝子座とより容易に組み換えられ得る。ある特定の態様では、ｃｅＤＮＡベクター自体が、制限エンドヌクレアーゼをコードすることができ、それによりｃｅＤＮＡベクターが核に送達されると、制限エンドヌクレアーゼが発現され、ベクターを切断することができる。ある特定の態様では、制限エンドヌクレアーゼは、別個に送達される第２のｃｅＤＮＡベクター上でコードされる。ある特定の態様では、制限エンドヌクレアーゼは、非ｃｅＤＮＡベースの送達手段によって核に導入される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術は、複数の遺伝子編集ｃｅＤＮＡが対象に送達されるのを可能にする。本明細書で論じられるように、一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、特定の標的遺伝子または遺伝子座を標的とするドナー配列に隣接する相同性アームを有することができ、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるゲノムＤＮＡの切断を標的とするための１つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）も含むことができ、別のｃｅＤＮＡは、実際の遺伝子編集ステップについて本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ酵素およびアクチベーターＲＮＡを含むことができる。
【０２７２】
Ａ．ＤＮＡエンドヌクレアーゼ
本開示のｃｅＤＮＡベクターは、配列特異的ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含み得る。配列特異的または部位特異的ヌクレアーゼを使用して、標的ゲノム遺伝子座に部位特異的二本鎖切断またはニックを導入することができる。このヌクレオチド切断、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ切断は、天然の修復機構、例えば、ＤＮＡ修復機構を刺激し、２つの可能な修復経路のうちの１つにつながる。ドナーテンプレートがない場合、ＤＮＡの小さな挿入または欠失につながるエラーが発生しやすい修復経路である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって切断が修復される（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５４０：１４４−１４９（２０１６）を参照）。この方法を使用して、標的化遺伝子配列のリーディングフレームを意図的に破壊、削除、または変更することができる。しかしながら、ヌクレアーゼに加えてドナーテンプレートが提供されている場合、細胞機構は相同組み換え（ＨＤＲ）によって切断を修復し、これはＤＮＡ切断の存在下で、またはＮＨＥＪを介したドナーテンプレートの挿入によって数桁強化される。
【０２７３】
この方法を使用して、標的部位のＤＮＡ配列に特定の変化を導入することができる。本明細書で使用される「部位特異的ヌクレアーゼ」という用語は、特定のＤＮＡ配列を特異的に認識して切断することができる酵素を指す。部位特異的ヌクレアーゼを操作することができる。操作された部位特異的ヌクレアーゼの例には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ならびにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素および操作された誘導体が含まれる。当業者によって理解されるように、遺伝子編集が完了すると、エンドヌクレアーゼは一般にそれ以上必要とされないため、遺伝子編集に必要なエンドヌクレアーゼを一時的に発現させることができる。そのような一時的な発現は、オフターゲット効果と免疫原性の可能性を低下させることができる。一時的な発現は、当該技術分野で知られている任意の手段によって達成することができ、本明細書に記載される調節スイッチを使用して都合よく行うことができる。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡである。配列特異的ヌクレアーゼの非限定的な例には、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガヌクレアーゼが含まれる。好適なＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの非限定的な例には、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素が含まれる。
【０２７５】
本明細書に記載されるヌクレアーゼは、偏向され得、例えば、配列特異的ヌクレアーゼを設計するように操作され得る（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号を参照）。ヌクレアーゼは、例えば、Ｃｅｒｔｏ，ＭＴ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）９：０７３−９７５、米国特許第８，３０４，２２２号、同第８，０２１，８６７号、同第８，１１９，３８１号、同第８，１２４，３６９号、同第８，１２９，１３４号、同第８，１３３，６９７号、同第８，１４３，０１５号、同第８，１４３，０１６号、同第８，１４８，０９８号、または同第８，１６３，５１４号（各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を使用して設計することができる。あるいは、市販の技術、例えばＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ’Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｅｄｉｔｏｒ（商標）ゲノム編集技術を使用して、部位特異的な切断特性を持つヌクレアーゼを取得することができる。
【０２７６】
ある特定の実施形態では、例えば、相同性指向修復テンプレートを含むプロモーターレスｃｅＤＮＡ構築物を使用する場合、ガイドＲＮＡおよび／もしくはＣａｓ酵素、または任意の他のヌクレアーゼは、例えばｉ）ガイドＲＮＡをコードする核酸、ｉｉ）または所望のヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ酵素、もしくは他のヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを投与することによって、ｉｉｉ）またはＣａｓ酵素およびガイドＲＮＡを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体を投与するか、またはｉｖ）例えば、ベクター、例えば、ウイルス、プラスミド、または別のｃｅＤＮＡベクターによる組み換えヌクレアーゼタンパク質の送達によってトランスで送達される。ある特定の態様では、トランスで送達される分子は、同時投与され得るか、または第１のｃｅＤＮＡベクターに連続的に投与され得る１つ以上の追加のｃｅＤＮＡベクターによって送達される。
【０２７７】
したがって、一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、誘導性プロモーターによって転写調節されるエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を含むことができる。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、相同性アームおよび任意にガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）も含み得るドナー配列を含むｃｅＤＮＡとともに対象に投与することができる、別個のｃｅＤＮＡベクター上にある。別の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、本明細書に記載されるオールインワンのｃｅＤＮＡベクター上にあり得る。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、プロモーターの制御下で本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼをコードする。誘導性プロモーターの非限定的な例には、化学的に調節されたプロモーター（例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属、および病因関連タンパク質（例えば、サリチル酸、エチレン、およびベンゾチアジアゾール）の存在または非存在によって転写活性を調節する）、ならびに物理的に調節されるプロモーター（例えば、光の存在または非存在および低温または高温によって転写活性を調節する）が含まれる。誘導性プロモーターの調整により、ｃｅＤＮＡベクターの遺伝子編集活性をオフまたはオンにすることを可能にする。誘導可能なＣａｓ９プロモーターは、例えばＣａｏ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４４（１９）２０１６、およびＬｉｕ  ＫＩ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ．１２：９０−９８７（２０１６）（それら全体が本明細書に組み込まれる）においてさらに検討されている。
【０２７９】
一実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、第１のエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の活性を一時的に標的とし、阻害する第２のエンドヌクレアーゼをさらに含む。他のエンドヌクレアーゼの活性を標的とし、阻害するエンドヌクレアーゼは、当業者によって決定され得る。別の実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、「抗ＣＲＩＳＰＲ遺伝子」（例えば、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  Ａｒｃｌｌａ）の一時的発現をさらに含む。本明細書で使用される場合、「抗ＣＲＩＳＰＲ遺伝子」は、一般的に使用されるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅ  Ｃａｓ９を阻害することが示されている遺伝子を指す。別の実施形態では、第１のエンドヌクレアーゼ活性または抗ＣＲＩＳＰＲ遺伝子の活性を標的とし、阻害する第２のエンドヌクレアーゼは、所望の遺伝子編集が完了した後に投与される第２のｃｅＤＮＡベクターに含まれる。あるいは、第２のエンドヌクレアーゼは、関心対象の遺伝子、例えば、本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターによって転写的に強化された遺伝子を標的とし、阻害する。
【０２８０】
本明細書に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターまたはその組成物は、標的遺伝子を活性化する転写アクチベーターをコードするヌクレオチド配列を含み得る。例えば、転写アクチベーターを操作することができる。例えば、操作された転写アクチベーターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの系、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥ融合タンパク質であり得る。上記のように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの系を使用して、ＲＮＡによる標的遺伝子の転写を活性化することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの系は、上記のように、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性またはヒストン修飾活性を有する融合タンパク質を含み得る。例えば、第２のポリペプチドドメインは、ＶＰ６４またはｐ３００を含み得る。あるいは、転写アクチベーターは、ジンクフィンガー融合タンパク質であり得る。ジンクフィンガーを標的とするＤＮＡ結合ドメインは、上記のように、転写活性化活性またはヒストン修飾活性を有するドメインと組み合わせることができる。例えば、ドメインは、ＶＰ６４またはｐ３００を含み得る。ＴＡＬＥ融合タンパク質を使用して、標的遺伝子の転写を活性化することができる。ＴＡＬＥ融合タンパク質は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化活性またはヒストン修飾活性を有するドメインを含み得る。例えば、ドメインは、ＶＰ６４またはｐ３００を含み得る。
【０２８１】
転写レベルで遺伝子発現を調整する別の方法は、本明細書に記載されるように、修飾型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを使用して後成的修飾を標的とすることによる。後成的レベルでの遺伝子発現の調整には、ＣＲＩＳＰＲａまたはＣＲＩＳＰＲｉを使用して達成される活性化／阻害よりも高い速度で娘細胞に受け継がれるという利点がある。一実施形態では、ｐ３００アセチルトランスフェラーゼの触媒ドメインに融合されたｄＣａｓ９を、本明細書に記載される方法および組成物とともに使用して、ゲノムの所望の領域に後成的修飾（例えば、ヒストン修飾を増加させる）を行うことができる。後成的修飾は、Ｔｅｔ１デメチラーゼ触媒ドメインへのＴＡＬＥＮの融合などの修飾型ＴＡＬＥＮ構築物（Ｍａｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１（１２）：１１３７−４２（２０１３）を参照）またはＬＳＤ１ヒストンデメチラーゼに融合されたＴＡＬエフェクター（Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１（１２）：１１３３−６（２０１３））を使用して実現することもできる。
【０２８２】
（ｉ）修飾型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ死Ｃａｓ９、およびその使用
ウイルスベクターとは異なり、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、細胞に送達され得る核酸配列、エフェクター配列、調節配列等のサイズまたは数を制限するカプシドを有しない。したがって、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、ヌクレアーゼ死ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ニッカーゼ、または所望のベクターの産生および／もしくは細胞へのベクターの送達の強化のための修飾された機能（例えば、固有のＰＡＭ結合配列）を有する他のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含み得る。そのようなｃｅＤＮＡベクターはまた、プロモーター配列および必要に応じて他の調節配列またはエフェクター配列を含み得る。サイズの制約がないため、当業者は、例えば、機能が修飾された所望のヌクレアーゼの発現、および任意に、少なくとも１つのガイドＲＮＡが同じベクター上の核酸配列からのものであり得、同じまたは異なるプロモーターの制御下にあり得ることを容易に理解するであろう。また本明細書では、例えば、多重遺伝子発現調整（本明細書の「多重遺伝子発現調整」のセクションを参照）のために、同じまたは異なるプロモーターの制御下で、少なくとも２つの異なる修飾エンドヌクレアーゼが同じベクターにコードされ得ることも企図されている。したがって、当業者は、必要に応じて、例えば、１つ以上の誘導性プロモーターによる少なくとも２つの異なる修飾エンドヌクレアーゼの一時的に調節された発現を含む、少なくとも２つの異なるＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれ以上）の所望の機能を組み合わせることができる。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物とともに使用するためのＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、例えば、ガイドＲＮＡ配列によって決定されるゲノムの標的部位でＤＮＡ結合活性を保持するが、切断活性を保持しない（例えば、ヌクレアーゼ死Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９））ように修飾され得るか、または非修飾型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）と比較して、切断活性が（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％）低減している。いくつかの実施形態では、修飾型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、標的遺伝子の発現を阻害するために本明細書で使用される。例えば、修飾型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合活性を保持しているため、ＲＮＡポリメラーゼの結合を防止する、および／またはＲＮＡポリメラーゼを置き換えることができ、これが次に標的遺伝子の転写を防止する。したがって、所望の遺伝子からの遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質）の発現が防止される。
【０２８４】
例えば、「不活性化されたＣａｓ９（ｄＣａｓ９）」、「ヌクレアーゼ死Ｃａｓ９」、または他の方法で不活性化された形態のＣａｓ９は、特定の遺伝子への結合を指示するガイドＲＮＡとともに導入され得る。そのような結合は、必要に応じて、標的遺伝子の発現の阻害を低減することができる。いくつかの実施形態では、そのような遺伝子発現阻害を逆転させる能力を有することが望まれる場合がある。これは、例えば、死Ｃａｓ９タンパク質に異なるガイドＲＮＡを提供して、ゲノム部位へのＣａｓ９の結合を弱めることによって達成することができる。そのような逆転は、死Ｃａｓ９結合の安定性を低下させるように設計された少なくとも２つまたは一連のガイドＲＮＡが連続して投与される反復様式で起こり得る。例えば、連続する各ガイドＲＮＡは、前の反復でガイドＲＮＡによって産生された死Ｃａｓ９結合の不安定性／安定性の程度から不安定性を増加させる可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子が機能的タンパク質形態で発現されないように、ゲノム配列を切断することなく、ガイドＲＮＡとともに標的遺伝子配列に向けられたｄＣａｓ９を使用して「所望の遺伝子を不活性化」することができる。代替実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｄＣａｓ９結合の安定性が低減されるが、排除されないように設計され得る。すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの置換は完全ではなく、それにより所望の遺伝子の「遺伝子発現の低下」が可能になる。
【０２８５】
ある特定の実施形態では、ハイブリッドリコンビナーゼは、標的ＤＮＡに組み込み部位を作成するための本開示のｃｅＤＮＡベクターでの使用に好適であり得る。例えば、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーまたはＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合されたセリンリコンビナーゼのリゾルバーゼ／インベルターゼファミリーに由来する活性化触媒ドメインに基づくハイブリッドリコンビナーゼは、哺乳類細胞の標的特異性を改善し、優れた部位特異的組み込み率を実現できる試薬のクラスである。本開示によるｃｅＤＮＡベクターのヌクレオチドによってコードされる好適なハイブリッドリコンビナーゼは、Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｄｉｍｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｒｅｄｅｓｉｇｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ  １０，２０１４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含む。
【０２８６】
（ｉｉ）ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼおよびＴＡＬＥＮ
ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮベースの制限エンドヌクレアーゼテクノロジーは、ジンクフィンガーおよび転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）などの特定のＤＮＡ配列認識ペプチド（複数可）に連結された非特異的ＤＮＡ切断酵素を利用する。典型的には、ＤＮＡ認識部位および切断部位が互いに離れているエンドヌクレアーゼを選択し、その切断部分を分離して、配列認識ペプチドに連結することにより、所望の配列に対して非常に高い特異性を有するエンドヌクレアーゼが得られる。そのような特性を有する例示的な制限酵素は、ＦｏｋＩである。さらに、ＦｏｋＩには、ヌクレアーゼ活性を得るのに二量体化が必要であるという利点があり、これは、各ヌクレアーゼパートナーが固有のＤＮＡ配列を認識するため、特異性が劇的に高まることを意味する。この効果を強化するために、ヘテロ二量体としてのみ機能することができ、触媒活性を高めるＦｏｋＩヌクレアーゼが設計された。ヘテロ二量体機能ヌクレアーゼは、不要なホモ二量体活性の可能性を回避し、したがって二本鎖切断の特異性を高める。
【０２８７】
ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの両方のヌクレアーゼ部分は、同様の特性を有し、これらの操作されたヌクレアーゼの相違は、ＤＮＡ認識ペプチドにある。ＺＦＮは、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ上のＴＡＬＥＮに依存している。これらのＤＮＡ認識ペプチドドメインの両方が、それらのタンパク質に組み合わせて天然に見られるという特徴を有する。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーは、典型的に、３ｂｐ離れた反復において発生し、転写因子などの様々な核酸相互作用タンパク質の多様な組み合わせで見られる。一方、ＴＡＬＥは、アミノ酸と認識されたヌクレオチド対との間に１対１の認識比を持つ反復で見られる。ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥの両方が反復パターンで発生するため、異なる組み合わせを試して、多様な配列特異性を作成することができる。部位特異的ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼを作製するためのアプローチには、特に、例えばモジュラーアセンブリー（必要な配列をカバーするためにトリプレット配列と相関するジンクフィンガーが連続して接続されている）、ＯＰＥＮ（ペプチドドメイン対トリプレットヌクレオチドの低ストリンジェンシー選択、続いて細菌系におけるペプチドの組み合わせ対最終標的の高ストリンジェンシーの選択）、およびジンクフィンガーライブラリーの細菌ワンハイブリッドスクリーニングが含まれる。本明細書に記載される方法および組成物とともに使用するためのＺＦＮは、例えばＳａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から商業的に入手することができる。
【０２８８】
本明細書で交換可能に使用される「転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ」または「ＴＡＬＥＮ」という用語は、エンドヌクレアーゼＦｏｋＩなどのヌクレアーゼの触媒ドメインの操作された融合タンパク質、およびカスタムＤＮＡ配列に標的化され得る設計されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを指す。「ＴＡＬＥＮモノマー」は、触媒ヌクレアーゼドメインおよび設計されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを有する操作された融合タンパク質を指す。２つのＴＡＬＥＮモノマーは、ＴＡＬＥＮ標的領域を標的とし、切断するように設計され得る。
【０２８９】
本明細書で使用される「転写アクチベーター様エフェクター」または「ＴＡＬＥ」という用語は、特定のＤＮＡ配列を認識し、それに結合するタンパク質構造を指す。「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」は、各々がＤＮＡの単一塩基対を特異的に認識する、ＲＶＤモジュールとしても知られるタンデム３３〜３５アミノ酸反復のアレイを含む、ＤＮＡ結合ドメインを指す。ＲＶＤモジュールは、定義された配列を認識する配列を組み立てるために、任意の順序で配置され得る。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの結合特異性は、ＲＶＤアレイとそれに続く２０個のアミノ酸の単一の切断された反復によって決定される。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは１２〜２７個のＲＶＤモジュールを有し得、各々がＲＶＤを含み、ＤＮＡの単一塩基対を認識する。４つの可能なＤＮＡヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧ）の各々を認識する特定のＲＶＤが識別されている。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインはモジュール式であるため、４つの異なるＤＮＡヌクレオチドを認識する反復を一緒に連結して、任意の特定のＤＮＡ配列を認識することができる。これらの標的化ＤＮＡ結合ドメインを触媒ドメインと組み合わせて、人工転写因子、メチルトランスフェラーゼ、インテグラーゼ、ヌクレアーゼ、およびリコンビナーゼを含む機能的酵素を作成することができる。
【０２９０】
ＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼ、およびＴＡＬＥＮ標的領域内の標的配列または遺伝子に結合するＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含み得る。「ＴＡＬＥＮ標的領域」は、２つのＴＡＬＥＮの結合領域および結合領域の間に生じるスペーサー領域を含む。２つのＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥＮ標的領域内の異なる結合領域に結合し、その後、ＴＡＬＥＮ標的領域が切断される。ＴＡＬＥＮの例は、参照によりその全体が組み込まれる国際特許出願第ＷＯ２０１３／１６３６２８号に記載されている。
【０２９１】
本明細書で交換可能に使用される「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ＺＦＮ」という用語は、完全に集成したときにＤＮＡを切断できる少なくとも１つのヌクレアーゼまたはヌクレアーゼの一部に効果的に連結された少なくとも１つのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む、キメラタンパク質分子を指す。本明細書で使用される「ジンクフィンガー」は、ＤＮＡ配列を認識し、それに結合するタンパク質構造を指す。ジンクフィンガードメインは、ヒトプロテオームで最も一般的なＤＮＡ結合モチーフである。単一ジンクフィンガーは、およそ３０アミノ酸を含み、ドメインは、典型的に塩基対ごとに単一アミノ酸側鎖の相互作用を介してＤＮＡの３つの連続した塩基対を結合することによって機能する。
【０２９２】
ある特定の実施形態では、本開示によるｃｅＤＮＡベクターは、哺乳類細胞などの細胞に標的化修飾を導入するのに適したジンクフィンガーリコンビナーゼ（ＺＦＲ）またはキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。標的化ヌクレアーゼおよび従来のＳＳＲ系とは異なり、ＺＦＲの特異性は、モジュラー部位特異的ＤＮＡ認識および配列依存的触媒作用の協同産物である。多様な標的能力を備えたＺＦＲは、プラグ・アンド・プレイ方式で生成され得る。強化された触媒ドメインを含むＺＦＲは、改善された標的特異性および効率を実証し、低毒性で治療遺伝子のヒトゲノムへの部位特異的送達を可能にする。Ｃｒｅリコンビナーゼ二量体界面の突然変異誘発もまた、組み換え特異性を向上させる。
【０２９３】
実施形態では、本開示によるｃｅＤＮＡベクターは、Ｐｏｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｒｅｓｃｕｅｓ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊａｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｕｌｙ  ２７，２０１７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどのヌクレアーゼ不含ＨＤＲ系での使用に好適である。そのような実施形態では、インビボ遺伝子標的アプローチは、ヌクレアーゼを使用せずに、ドナー配列の挿入に基づくｃｅＤＮＡ適用に適している。いくつかの実施形態では、ドナー配列は、プロモーターレスであってもよい。
【０２９４】
ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮは、ＤＮＡ編集（例えば、ゲノムＤＮＡ編集）のためのｃｅＤＮＡベクターの使用について例示されているが、Ｍａｅｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．“Ｇｅｎｏｍｅ−ｅｄｉｔｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｓｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２４．３（２０１６）：４３０−４４６  ａｎｄ  Ｇａｍｍａｇｅ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍａｙ  Ｎｏｔ  Ｂｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｉｚｅｄ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２０１８；３４（２）：１０１−１１０に記載されるように、ｍｔＺＦＮおよびｍｉｔｏＴＡＬＥＮ機能の使用、またはミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の編集のためのｃｅＤＮＡベクターの使用のためのミトコンドリアに適合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォームもまた本明細書に包含される。
【０２９５】
（ｉｉｉ）核酸誘導型エンドヌクレアーゼ
異なるタイプの核酸誘導型エンドヌクレアーゼを本発明の組成物および方法で使用して、ｃｅＤＮＡ媒介遺伝子編集を促進することができる。本発明の組成物および方法に適した例示的で非限定的なタイプの核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、および一塩基エディターを含む。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり得る。本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」という用語は、ＲＮＡ分子が選択された配列に結合して、選択された標的ＤＮＡ配列にエンドヌクレアーゼ活性を指示するように、選択された標的ＤＮＡ配列に相補的な領域を含むＲＮＡ分子と複合体を形成するエンドヌクレアーゼを指す。
【０２９７】
一実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、本明細書で論じられるように、ＣＲＩＳＰＲ酵素である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ニッカーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、標的配列内および／または標的配列の相補体内などの標的配列の位置で一方または両方の鎖の切断を指示する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、またはそれ以上の塩基対内の一方または両方の鎖の切断を指示する。他の実施形態では、ニッカーゼ活性は、例えば、ＨＤＲテンプレートが標的遺伝子のゲノム配列とのＨＤＲ相互作用に曝されるように、配列制約を緩めるために、ｃｅＤＮＡベクター自体の１つ以上の配列に向けられる。
【０２９８】
ある特定の実施形態では、ニッカーゼが、所望の核酸配列上の少なくとも１部位、少なくとも２部位、少なくとも３部位、少なくとも４部位、少なくとも５部位、少なくとも６部位、少なくとも７部位、少なくとも８部位、少なくとも９部位、少なくとも１０部位以上（例えば、ｃｅＤＮＡベクターの１つ以上の領域）で切断することが企図される。別の実施形態では、ニッカーゼは、トランスニッキングを介して１つおよび／または２つの部位で切断することが企図される。トランスニッキングは、ＨＤＲによるゲノム編集を強化することができ、これは、忠実度が高く、エラーが少ないため、不要なオフターゲット効果を低減する。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、発現構築物またはベクターは、対応する野生型酵素に関して突然変異したＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードし、それにより突然変異型エンドヌクレアーゼは、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの１つの鎖を切断する能力を欠く。
【０３００】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現のためにコドン最適化される。真核細胞は、哺乳動物などの特定の生物に由来し得る。哺乳動物の非限定的な例には、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類が含まれ得る。一般に、コドン最適化とは、未変性配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれ以上のコドン）を、未変性のアミノ酸配列を維持しながらその宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、関心対象の宿主細胞での発現を強化するために核酸配列を修飾するプロセスを指す。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼに加えて、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、および任意の２つのドメイン間のリンカー配列を任意に含み得る。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに融合され得るタンパク質ドメインの例には、限定されないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、精製タグ、蛍光タンパク質、および以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、および核酸結合活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインが含まれる。エピトープタグの非限定的な例には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデム親和性精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｇｔａｇ  ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、ＳＩ、Ｔ７、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、カルモジュリン、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが含まれる。レポ−タ−遺伝子の例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＥＧＦＰ、エメラルド、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、モノマーＡｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、シトリン、Ｖｅｎｕｓ  ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ  ＡｍＣｙａｎ１、緑石−シアン）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、橙色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、モノマーＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自家蛍光タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に結合するか、または他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質の断片をコードする遺伝子配��に融合することができ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ  Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン融合、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、タグ付けされたエンドヌクレアーゼを使用して、標的配列の位置を同定する。
【０３０２】
本明細書では、少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、もしくはそれ以上）の異なるＣａｓ酵素が投与されるか、または実質的に同時に細胞と接触している。二本鎖切断誘導Ｃａｓ酵素、Ｃａｓニッカーゼ、触媒的に不活性なＣａｓ酵素（例えば、ｄＣａｓ９）、修飾型Ｃａｓ酵素、切断型Ｃａｓ９等の任意の組み合わせは、本明細書に記載される方法および組成物と組み合わせて使用することが企図される。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。例えば、Ｖａｒｓｈｎｅｙ  ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅｓｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．１７：１８７（２０１６）を参照されたい。一実施形態では、ＤＮＡ修復および／または複製に関与する酵素は、エンドヌクレアーゼに融合されて、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼを形成し得る。非限定的な一例は、フラップエンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ−１）とＦｏｋ１エンドヌクレアーゼとの融合である（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．１７：１８６（２０１６）。別の実施形態では、天然に存在するＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用することができる。そのような天然に存在するヌクレアーゼの非限定的な例は、アルゴノートタンパク質ファミリーからの原核生物エンドヌクレアーゼである（Ｋｒｏｐｏｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏ．８（Ｓ１）：Ｐ０１−０７４（２０１８）。いくつかの実施形態では、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、「一塩基エディター」であり、これは、ＤＮＡ標的モジュールおよび単一タイプのヌクレオチド塩基を修飾できる触媒ドメインで構成されるキメラタンパク質である（Ｒｕｓｋ，Ｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５：７６３  （２０１８）、Ｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＪ．４７５（１１）：１９５５−６４（２０１８））。そのような一塩基エディターは、ＤＮＡ塩基の編集を行うために標的ＤＮＡに二本鎖切断を生成しないため、挿入および欠失（例えば、インデル）の生成が制限され、したがって、編集プロセスの忠実度を向上させる。異なる種類の一塩基エディターが知られている。例えば、シチジンデアミナーゼ（シトシンからウラシルへの変換を触媒する酵素）は、ＡＰＯＢＥＣ−ｄＣａｓ９などのヌクレアーゼに連結され得る。ＡＰＯＢＥＣは、シチジンデアミナーゼの機能に寄与し、ｄＣａｓ９によって誘導されて、特定のシチジンをウラシルに脱アミノ化する。結果として生じるＵ−Ｇミスマッチは、修復機序を介して解決され、Ｕ−Ａ塩基対を形成し、ＣからＴへの点突然変異に翻訳される（Ｋｏｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５３３：４２０−４２４（２０１６）、Ｓｈｉｍａｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５：４４１−４４３（２０１７））。アデニンデアミナーゼベースのＤＮＡ一塩基エディターが設計された。それらは、アデノシンを脱アミノ化してイノシンを形成し、これはシチジンと塩基対合し、グアニンに訂正され、それによりＡ−Ｔ対がＧ−Ｃ対に変換され得る。そのようなエディターの例には、ＴａｄＡ、ＡＢＥ５．３、ＡＢＥ７．８、ＡＢＥ７．９、およびＡＢＥ７．１０が含まれる（Ｇａｕｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５５１：４６４−４７１（２０１７）。
【０３０４】
（ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系
当該技術分野で知られているように、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９系は、生物の遺伝的配列を変更することができるタンパク質およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）の組み合わせを含む、核酸誘導型ヌクレアーゼベースの系の特定のセットである。ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９系は、微生物、真菌、植物、および動物などの多くの生物のゲノムに含まれる特定のデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）を修飾する強力なツールとして発達し続ける。例えば、ヒト疾患のマウスモデルをすばやく発達させて、個々の遺伝子をより速く研究し、細胞内の複数の遺伝子を一度に容易に変えてそれらの相互作用を研究することができる。当業者は、タイプＩ、タイプＩＩ、およびタイプＩＩＩなどのいくつかの既知のＣＲＩＳＰＲ系から選択することができる。タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ系は、３つの構成成分：（１）「ガイド配列」または「標的因子−ＲＮＡ」と呼ばれるｃｒＤＮＡ分子、（２）「ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ」または「アクチベーターＲＮＡ」、および（３）Ｃａｓ９と呼ばれるタンパク質を含む、周知の機序を有する。
【０３０５】
ＤＮＡ分子を変更するために、系内で次のようないくつかの相互作用が発生する：（１）ガイド配列が、特定の塩基対合によって関心対象の特定のＤＮＡ配列（「標的ＤＮＡ」）に結合する、（２）ガイド配列が、別の配列で特定の塩基対合によってアクチベーターＲＮＡに結合する、（３）アクチベーターＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）と相互作用し、次いでヌクレアーゼとして機能して、特定の部位で標的ＤＮＡを切断する。本開示によるｃｅＤＮＡベクターに従って使用するための適切な系は、Ｖａｎ  Ｎｉｅｒｏｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｔ  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｌｏｃｕｓ  ｂｙ  ａ  ｎｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｕｇｕｓｔ  ２００９およびＲａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｏｕｂｌｅ  ｎｉｃｋｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙにおいてさらに記載されている。
【０３０６】
本開示によるｃｅＤＮＡベクターは、ガイド配列、ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ、またはＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）などのこれらの系の１つ以上の構成成分をコードするヌクレオチドを含むように設計することができる。ある特定の実施形態では、単一プロモーターが、ガイド配列およびｔｒａｃｒ  ＲＮＡの発現を駆動し、別個のプロモーターがＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）の発現を駆動する。当業者は、ある特定のＣａｓヌクレアーゼが、標的核酸配列に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在を必要とすることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、標的配列の３’末端の１、２、３、または４ヌクレオチドに隣接するかまたはその中にあり得る。ＰＡＭの長さおよび配列は、特定のＣａｓタンパク質に依存し得る。例示的なＰＡＭ配列には、ＮＧＧ、ＮＧＧＮＧ、ＮＧ、ＮＡＡＡＡＮ、ＮＮＡＡＡＡＡＷ、ＮＮＮＮＡＣＡ、ＧＮＮＮＣＮＮＡ、ＴＴＮ、およびＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎは任意のヌクレオチドとして定義され、ＷはＡまたはＴのいずれかとして定義される）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、例えば、ＲＮＡを編集するとき、ガイドＲＮＡ上にあり得る。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、ＣａｓおよびＣａｓ９を含むＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を使用してゲノム操作のための１つ以上の構成成分を提供するように設計されたｃｅＤＮＡベクターでの使用に適している。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１４／０１７０７５３号を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は、哺乳類細胞における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性指向修復（ＨＤＲ）を介したＣａｓ９媒介ゲノム編集、および下流機能研究のための修飾型細胞株の生成のためのツールのセットを提供する。オフターゲットの切断を最小限に抑えるために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系には、対合したガイドＲＮＡを有するＣａｓ９ニッカーゼ突然変異体を使用するダブルニッキング戦略が含まれる場合がある。この系は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２４  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１３およびＺｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｋｎｏｃｋｉｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ  ｃｕｔ  ＨＤＲ  ｄｏｎｏｒ  ａｆｔｅｒ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１７に記載されている（両方の参考文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３０８】
ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮａ系は、ヌクレアーゼと、ｃｅＤＮＡ配列に向けられるガイドＲＮＡとを含む。例えば、ｎＣＡＳ９  Ｄ１０ＡなどのニッキングＣＡＳを使用して、遺伝子編集の効率を高めることができる。ガイドＲＮＡは、ｃｅＤＮＡのｎＣＡＳニッキングを指示し、それによってより効率的な遺伝子修復および／または発現のために、ｃｅＤＮＡのねじれ拘束を解放する。ニッキングヌクレアーゼを使用すると、配列および構造の完全性を維持しながらねじれ拘束が緩和され、ニッキングされたＤＮＡが核内に残ることができる。ガイドＲＮＡは、同じＤＮＡ鎖または相補鎖に向けることができる。ガイドＲＮＡは、例えば、ＩＴＲＳ、または配列進行プロモーター、または相同性ドメイン等に向けられ得る。
【０３０９】
一実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素である。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｃ、ＣａｓＦ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｕｌ９６６、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、それらの相同体、またはそれらの修正版が含まれる。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。別の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ死Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）またはＣａｓ９ニッカーゼである。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ニッキングＣａｓ酵素（ｎＣａｓ）である。
【０３１０】
典型的には、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９によって開始される二本鎖切断などのＤＮＡ切断活性を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃｓ９、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＣａｓ９である。Ｃａｓ９の他の非限定的な細菌源には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃ  ｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒ��  ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｎｅｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、またはＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａが含まれる。
【０３１１】
一実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ｎＣａｓ９  Ｄ１０Ａを含む。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９のＲｕｖＣ  Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする突然変異の他の例には、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、およびＮ８６３Ａが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＤＮＡ標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ標的とするガイド配列（複数可）、例えば２つのガイド配列と組み合わせて使用することができる。この組み合わせにより、両方の鎖をニッキングし、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復を誘導するために使用することができる。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１３である。触媒的に不活性なＣａｓ１３（ｄＣａｓ１３）を使用して、例えば、Ｃｏｘ，Ｄ  ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｑ０１８０（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ｍＲＮＡ配列を編集することができる。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼをコードする本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターは、Ｃａｓ９（例えば、配列番号８２９）、または配列番号８２９（Ｃａｓ９）に対して少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するか、もしくは配列番号８２９からなるヌクレアーゼのアミノ酸もしくは機能的断片である。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９は、触媒ドメインに１つ以上の突然変異を含み、Ｃａｓ９を、米国特許公開第２０１７／０１９１０７８−Ａ９号（参照によりその全体が組み込まれる）に記載されているものなどの単一ＤＮＡ鎖を切断するニッカーゼにする。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、本開示のｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子標的およびゲノム編集機能を有するＲＮＡプログラムされたＣａｓ９に基づく系および方法での使用に適している。例えば、本開示のｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子標的および遺伝子編集のためのクラスター化された規則的に間隔を空けられた短いパリンドローム反復またはＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系での使用に適している。ＣＲＩＳＰＲ  ｃａｓ９系は、当該技術分野において知られており、例えば、２０１３年３月に提出された米国特許出願第１３／８４２，８５９号、および米国特許第８，６９７，３５９号、同第８，７７１，９４５号、同第８，７９５，９６５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，８７１，４４５号に記載されている（すべては参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３１５】
本明細書ではまた、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、または不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９、もしくはヌクレアーゼ死Ｃａｓ９もしくは「触媒的に不活性」とも呼ばれる）も、ＦｏｋＩとの融合タンパク質として調製され、それにより遺伝子編集または遺伝子発現調節が、ＦｏｋＩヘテロ二量体の形成時に発生する。
【０３１６】
さらに、ｄＣａｓ９を使用して、標的遺伝子配列の上流の調節配列のレベルで、所望の遺伝子の発現を活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）または阻害（ＣＲＩＳＰＲｉ）することができる。ＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉは、例えば、ｄＣａｓ９をエフェクター領域（例えば、ｄＣａｓ９／エフェクター融合）と融合し、ｄＣａｓ９／エフェクター融合タンパク質が所望の遺伝子または標的遺伝子（例えば、プロモーター領域内）の上流の配列に結合するように指示するガイドＲＮＡを供給することによって実施され得る。ｄＣａｓ９にはヌクレアーゼ活性がないため、プロモーター領域の標的部位に結合したままであり、ｄＣａｓ９／エフェクター融合タンパク質のエフェクター部分は、転写アクチベーターまたはリプレッサーをプロモーター部位に動員することができる。したがって、必要に応じて、標的遺伝子の遺伝子発現を活性化または低減することができる。文献における以前の研究は、ｄＣａｓ９と共発現した複数のガイドＲＮＡの使用は、所望の遺伝子の発現を増加させる可能性があることを示している（例えば、Ｍａｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｓ  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０（１０）：９７７−９７９（２０１３）を参照）。いくつかの実施形態では、所望の遺伝子の誘導性抑制を可能にすることが望ましい。これは、例えば、転写開始部位の上流のプロモーター領域においてガイドＲＮＡ結合部位を使用することによって達成され得る（例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｄＣａｓ９  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１６）を参照）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ死バージョン（例えば、ｄＣａｓ９）を使用して、例えば、ｄＣａｓ９／エフェクター融合タンパク質のエフェクタードメイン（例えば、小分子または少なくとも１つのガイドＲＮＡ）と相互作用する薬剤の導入によって、所望の遺伝子の発現を誘導的に活性化または増加させることができる。他の実施形態では、遺伝子発現を外因性シグナルを使用して調整できるように、ｄＣａｓ９を化学的または光誘導性ドメインに融合できることも本明細書で企図される。一実施形態では、標的遺伝子の発現の阻害は、ＫＲＡＢリプレッサードメインに融合されたｄＣａｓ９を使用して実施され、これは、哺乳類系における遺伝子発現の阻害の改善に有益であり得、オフターゲット効果がほとんどない。あるいは、遺伝子の転写ベースの活性化は、ＲＮＡポリメラーゼのオメガサブユニットに融合されたｄＣａｓ９、または転写アクチベーターＶＰ６４もしくはｐ６５を使用して実施され得る。
【０３１７】
したがって、いくつかの実施形態では、、本明細書に記載される方法および組成物、例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、ＣＲＩＳＰＲｉ（ＣＲＩＳＰＲ干渉）および／もしくはＣＲＩＳＰＲｉａ（ＣＲＩＳＰＲ活性化）系を含み、かつ／またはそれを用いて宿主細胞に送達することができる。ＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａ系は、二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成することができない不活性化されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）で構成されている。これにより、エンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと組み合わせて、ゲノム内の標的配列に特異的に結合し、ＲＮＡにより指向された可逆的転写制御を提供することができる。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡをコードする核酸を含むが、相同性指向修復テンプレートまたは対応する相同性アームを含まない。
【０３１８】
ＣＲＩＳＰＲｉのいくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＫＲＡＢエフェクタードメインを含み得る。ＫＲＡＢエフェクタードメインの有無にかかわらず、不活性化されたヌクレアーゼのゲノム配列への結合は、例えば、転写の開始または進行を阻止する、および／または転写機構または転写因子の結合を干渉する可能性がある。
【０３１９】
ＣＲＩＳＰＲａでは、不活性化されたエンドヌクレアーゼを１つ以上の転写活性化ドメインと融合させることができ、それによってエンドヌクレアーゼにより標的とされる部位またはその近くの転写を増加させる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲａは、さらなる転写活性化ドメインを動員するｇＲＮＡをさらに含むことができる。ＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａのｓｇＲＮＡ設計は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｈｏｒｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅＬｉｆｅ．５，ｅ１９７６０（２０１６）、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１５９，６４７−６６１（２０１４）、およびＺａｌａｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１６０，３３９−３５０（２０１５）を参照。各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａ互換性のｓｇＲＮＡは、所与の標的に対して商業的に入手することもできる（例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ；Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯを参照）。ＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａの詳細は、例えばＱｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１５２，１１７３−１１８３（２０１３）、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１５４，４４２−４５１（２０１３）、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３，１１６３−１１７１（２０１３）、Ｔａｎｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．１５９，６３５−６４６（２０１４）、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．５１７，５８３−５８８（２０１５）、Ｃｈａｖｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１２，３２６−３２８（２０１５）、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５５（２０１７）、およびＧｏｙａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１６）において見ることができ、各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３２０】
したがって、本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、非活性化エンドヌクレアーゼ、例えばＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび／またはＣａｓ９を含むｃｅＤＮＡベクターであり、非活性化エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ活性を欠くが、例えば、１つ以上のガイドＲＮＡおよび／またはｓｇＲＮＡと組み合わせて、部位特異的な方法でＤＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、非活性化エンドヌクレアーゼは、転写活性化ドメインをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示のｃｅＤＮＡベクターは、すべて当該技術分野において周知である、ＣＲＩＳＰＲｉもしくはＣＲＩＳＰＲａ  ｄＣＡＳ系、ｎＣａｓ、またはＣａｓ１３系などの非活性化ヌクレアーゼ系にも有用である。
【０３２１】
本明細書に記載されるベクターをｄＣａｓ９と組み合わせて使用して、生きている細胞のゲノム遺伝子座を可視化することができることも本明細書で企図されている（例えば、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｌｏｃｉ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ＰＮＡＳ  １１２（１０）：３００２−３００７（２０１５）を参照）。ＣＲＩＳＰＲを介したゲノムおよびその核内の組織の可視化は、４−Ｄヌクレオームとも呼ばれる。一実施形態では、ｄＣａｓ９は、蛍光タグを含むように修飾される。複数の遺伝子座は、例えば、各々が異なる蛍光標識に融合されたオルソログを使用して、異なる色で標識され得る。この手法を拡張して、例えば、Ａｌｕ配列に結合するガイドＲＮＡを使用してガイドＲＮＡで指定された反復の場所のマッピングを支援することによって、ゲノム構造を研究することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４４（２）：ｅ１１（２０１６）を参照）。したがって、いくつかの実施形態では、臨床的に重要な遺伝子座のマッピングは、例えば、とりわけ、ハンチントン病の識別および／または診断のために、本明細書で企図される。遺伝子編集系をコードするｃｅＤＮＡベクター（複数可）を用いてゲノム可視化または遺伝的スクリーニングを実施する方法は、当該技術分野で知られており、かつ／または例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５５：１４７９−１４９１（２０１３）、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ７：１−８（２０１６）、Ｋｏｒｋｍａｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３４：１−１０（２０１６）、Ｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １６３：１５１５−１５２６（２０１５）（各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、例えば、特定の疾患に関連する一塩基多型を修飾するなど、ゲノム内の単一塩基を編集することが望ましい場合がある（例えば、Ｋｏｍｏｒ，ＡＣ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５３３：４２０−４２４（２０１６）、Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１６）を参照）。単一ヌクレオチド塩基編集は、標的遺伝子座を切断しない、触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼ（例えば、ヌクレアーゼ死Ｃａｓ９）につながれた塩基変換酵素を利用する。塩基編集酵素による塩基変換後、系は、反対側の編集されていない鎖にニックを作り、それは細胞自身のＤＮＡ修復機序によって修復される。これにより、元のヌクレオチドの置換をもたらし、これが「ミスマッチヌクレオチド」になり、したがって単一ヌクレオチド塩基対の変換が完了する。内因性酵素、例えば、シチジンデアミナーゼは、Ｇ／Ｃヌクレオチド対からＡ／Ｔヌクレオチド対への変換を行うために利用可能であるが、Ａ／Ｔヌクレオチド対からＧ／Ｃヌクレオチド対への逆変換を触媒するための内因性酵素はない。通常、ＲＮＡにのみ作用してアデニンをイノシンに変換するアデニンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ）は、細菌系で進化的に選択され、ＤＮＡに作用してアデノシンをイノシンに変換するアデニンデアミナーゼ突然変異体を同定した（例えば、Ｇａｕｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ（２０１７），ｉｎ  ｐｒｅｓｓ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２４６４４、その内容は参照によりその全体が組み込まれる）。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、ニッカーゼ機能を有するｄＣａｓ９または修飾型Ｃａｓ９は、塩基編集機能を有する酵素（例えば、シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ１または突然変異体ＴａｄＡ）に融合され得る。ゲノムＤＮＡからウラシルを除去する内因性の塩基除去修復系の阻害剤を含めることにより、塩基編集効率をさらに向上させることができる。Ｇａｕｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  Ａ−Ｔ  ｔｏ  Ｇ−Ｃ  ｉｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２５  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０３２４】
本明細書では、所望のエンドヌクレアーゼが、ユビキチン鎖またはポリユビキチン鎖の付加によって修飾されることも企図される。いくつかの実施形態では、ユビキチンは、ユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）であり得る。ユビキチン様タンパク質の非限定的な例には、小さなユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン交差反応性タンパク質（ＵＣＲＰ、インターフェロン刺激遺伝子１５（ＩＳＧ−１５）としても知られる）、ユビキチン関連修飾因子−１（ＵＲＭ１）、神経前駆細胞で発現した発達的に下方調節されたタンパク質−８（ＮＥＤＤ８、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではＲｕｂＩとも呼ばれる）、ヒト白血球抗原Ｆ関連（ＦＡＴ  １０）、オートファジー−８（ＡＴＧ８）、および−１２（ＡＴＧ１２）、Ｆａｕユビキチン様タンパク質（ＦＵＢ１）、膜アンカー型ＵＢＬ（ＭＵＢ）、ユビキチン折りたたみ修飾因子１（ＵＦＭ１）、およびユビキチン様タンパク質−５（ＵＢＬ５）が含まれる。
【０３２５】
ＣｅＤＮＡベクターまたはその組成物は、例えば、Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３２：２７９−２８４（２０１３）、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５４：１３８０−１３８９（２０１３）、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１：８３３−８３８（２０１３）、Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３２：５７７−５８２（２０１４）、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１：８４−８８（２０１５）、Ｋｌｅｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５２３：４８１−４８５（２０１５）、Ｂｏｌｕｋｂａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２：１−９（２０１５）、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５４；４４２−４５１（２０１２）、Ａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６１：８９５−９０２（２０１６）、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１２：２９８４−２９８９（２０１５）、Ｔｒｕｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４３：６４５０−６４５８（２０１５）（各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に記載される修飾型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードすることができる。
【０３２６】
（ｖ）ＭｅｇａＴＡＬＳ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼは、ｍｅｇａＴＡＬであり得る。ＭｅｇａＴＡＬは、転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクタードメインおよびメガヌクレアーゼドメインを含む操作された融合タンパク質である。ＭｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬの標的特異性操作の容易さを保持しながら、オフターゲット効果および全体的な酵素サイズを低減し、活性を増加させる。ＭｅｇａＴＡＬの構築および使用については、例えばＢｏｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４２（４）：２５９１−６０１およびＢｏｉｓｓｅｌ  ２０１５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １２３９：１７１−１９６（各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により詳細に記載される。ｍｅｇａＴＡＬを介した遺伝子ノックアウトおよび遺伝子編集のプロトコルは、当該技術分野において知られており、例えば、Ｓａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１５  ７（３０７）：ｒａ１５６  ａｎｄ  Ｂｏｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４２（４）：２５９１−６０１（各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ＭｅｇａＴＡＬは、本明細書に記載されている方法および組成物のいずれかの代替エンドヌクレアーゼとして使用され得る。
【０３２７】
（ｖｉ）遺伝子発現および複合系の多重調整
必要に応じて、複数のガイドＲＮＡを同じｃｅＤＮＡベクターから発現させることができるため、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターのサイズ制限がないことは、多重化編集、ＣＲＩＳＰＲａ、またはＣＲＩＳＰＲｉで特に有用である。ＣＲＩＳＰＲは堅牢な系であり、複数のガイドＲＮＡを付加しても、遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲａ、ＣＲＩＳＰＲｉ、またはＣＲＩＳＰＲを介した核酸の標識の効率は実質的に変わらない。他に記載されているように、複数のガイドＲＮＡは、単一のプロモーター（例えば、ポリシストロニック転写産物）の制御下、または複数のプロモーター（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６等、最大１：１の比率の限界のガイドＲＮＡ：プロモーター配列）の制御下にあり得る。
【０３２８】
多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの系は、ｓｇＲＮＡ設計の簡潔性および低コストを利用しており、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用したハイスループットゲノム研究の進歩を活用するのに役立ち得る。例えば、本明細書に記載されているｃｅＤＮＡベクターは、困難な細胞株でＣａｓ９および多数の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を発現させるのに役立つ。多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの系は、上記のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの系と同じ方法で使用することができる。多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、Ｃｏｎｇ，  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８１９（２０１３）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５３：９１０−９１８（２０１３）、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３４：５２８−５３０（２０１６）（各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように実施され得る。
【０３２９】
記載されている転写活性化およびヌクレアーゼ機能に加えて、この系は、ゲノムアーキテクチャーの照合および内因性遺伝子調節の経路を含む、様々な目的で後成的な修飾を制御する他の新規Ｃａｓ９ベースのエフェクターを表現するのに役立つ。内因性遺伝子調節は、複数の酵素間の微妙なバランスであるため、異なる機能を持つＣａｓ９系を多重化することで、異なる調節シグナル間の複雑な相互作用を調べることができる。本明細書に記載されるベクターは、アプタマー修飾型ｇＲＮＡおよび直交Ｃａｓ９と互換性があり、単一のｇＲＮＡセットを使用して独立した遺伝子操作を行うことができる。
【０３３０】
多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの系を使用して、細胞内の少なくとも１つの内因性遺伝子を活性化することができる。この方法は、細胞を修飾型レンチウイルスベクターと接触させることを含む。内因性遺伝子は、一時的に活性化されるか、または安定して活性化され得る。内因性遺伝子は、一時的に抑制されるか、安定して抑制され得る。融合タンパク質は、ｓｇＲＮＡと同様のレベルで発現され得る。融合タンパク質は、ｓｇＲＮＡと比較して、異なるレベルで発現され得る。細胞は、初代ヒト細胞であり得る。
【０３３１】
多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの系は、細胞内の多重遺伝子編集の方法で使用され得る。この方法は、細胞をｃｅＤＮＡベクターと接触させることを含む。多重遺伝子編集は、突然変異体遺伝子の訂正または導入遺伝子の挿入を含み得る。突然変異体遺伝子の訂正には、突然変異体遺伝子の欠失、再配置、または置換が含まれ得る。突然変異体遺伝子の訂正には、ヌクレアーゼを介した非相同末端結合または相同性指向修復が含まれ得る。多重遺伝子編集は、少なくとも１つの遺伝子を削除または訂正することを含むことができ、遺伝子は、内因性正常遺伝子または突然変異体遺伝子である。
【０３３２】
多重遺伝子編集は、少なくとも２つの遺伝子を削除または訂正することを含み得る。例えば、少なくとも２遺伝子、少なくとも３遺伝子、少なくとも４遺伝子、少なくとも５遺伝子、少なくとも６遺伝子、少なくとも７遺伝子、少なくとも８遺伝子、少なくとも９遺伝子、または少なくとも１０遺伝子は、削除または訂正され得る。
【０３３３】
多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの系は、細胞における遺伝子発現の多重調整の方法で使用され得る。この方法は、細胞を修飾型レンチウイルスベクターと接触させることを含む。この方法は、少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現レベルを調整することを含み得る。少なくとも１つの標的遺伝子の遺伝子発現レベルは、少なくとも１つの標的遺伝子の正常な遺伝子発現レベルと比較して、少なくとも１つの標的遺伝子の遺伝子発現レベルが増加または減少すると調整される。遺伝子発現レベルは、ＲＮＡまたはタンパク質レベルであり得る。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、複数の遺伝子の発現が、複数の直交Ｃａｓを複数のガイドＲＮＡとともに導入することによって調整されることもまた、本明細書において企図される（例えば、遺伝子発現または「直交ｄＣａｓ９系」の多重調整）。例えば、異なるＣａｓタンパク質またはＣａｓ９タンパク質。当業者は、複数のガイドＲＮＡが、オフターゲット効果またはＲＮＡの互いの相互作用を最小化するように設計されるべきであることを理解するであろう。直交ｄＣａｓ９系は、ある特定の所望の遺伝子の同時活性化と他の所望の遺伝子の抑制を可能にする。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｉｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、およびＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａなどの細菌種の組み合わせに由来する複数の直交Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、例えば、Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０（１１）：１１１６−１１２１（２０１３）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように組み合わせで使用され得る。いくつかの実施形態では、複数のガイドＲＮＡをコードする複数の核酸配列が同じベクター上に存在する。さらに、各ｄＣａｓ９は、別個の誘導性系と対合することができ、これにより、所望の遺伝子の活性化および／または抑制の独立した制御が可能になり得る。さらに、この誘導性直交ｄＣａｓ９系は、一時的に遺伝子発現の調節を可能にすることもできる（例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｄＣａｓ９  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ（２０１６）を参照）。
【０３３５】
Ｂ．相同性指向修復テンプレート
いくつかの実施形態では、、相同性指向組み換えテンプレートまたは「修復」テンプレートはまた、例えば、ドナー配列および／またはドナー配列の一部として、ｃｅＤＮＡベクター中に提供される。本明細書では、相同性指向修復テンプレートを使用して、遺伝子配列を修復するか、または例えば治療用タンパク質を製造するために新しい配列を挿入できることが企図される。いくつかの実施形態では、修復テンプレートは、本明細書に記載されるヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部としてのＣＲＩＳＰＲ酵素、またはＺＦＮもしくはＴＡＬＥなどのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼによってニッキングまたは切断された標的配列内またはその近くの相同組み換えにおけるテンプレートとして機能するように設計される。テンプレートポリヌクレオチドは、約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００、またはそれ以上のヌクレオチド長など、任意の好適な長さであり得る。いくつかの実施形態では、テンプレートポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノム内の標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適に整列された場合、テンプレートポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のヌクレオチド）と重複し得る。いくつかの実施形態では、、テンプレート配列および標的配列を含むポリヌクレオチドが最適に整列される場合、テンプレートポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００、またはそれ以上のヌクレオチド以内にある。一実施形態では、修復テンプレートの相同性アームは、指向性である（すなわち、同一ではなく、したがって特定の配向で配列に結合する）。いくつかの実施形態では、細胞内の単一遺伝子、または細胞内の２つの異なる遺伝子を修復するために、２つ以上のＨＤＲテンプレートが提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのテンプレートの複数のコピーが細胞に提供される。
【０３３６】
いくつかの実施形態では、テンプレート配列は、内因性標的遺伝子配列の一部と実質的に同一であり得るが、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む。いくつかの実施形態では、切断された標的核酸分子の修復は、例えば、（ｉ）標的遺伝子から発現されるＲＮＡにおける１つ以上のヌクレオチド変化、（ｉｉ）標的遺伝子の発現レベルの変更、（ｉｉｉ）遺伝子ノックダウン、（ｉｖ）遺伝子ノックアウト、（ｖ）遺伝子機能の回復、または（ｖｉ）遺伝子ノックアウトおよび遺伝子の同時挿入をもたらし得る。当業者によって容易に理解されるように、テンプレートによる切断された標的核酸分子の修復は、標的遺伝子のエクソン配列、イントロン配列、調節配列、転写制御配列、翻訳制御配列、スプライシング部位、または非コード配列の変化をもたらし得る。他の実施形態では、テンプレート配列は、遺伝子ノックインをもたらし得る外因性配列を含み得る。外因性配列の統合は、遺伝子ノックアウトをもたらし得る。
【０３３７】
ある特定の実施形態では、ドナー配列は、５’相同性アームおよび／または３’相同性アームなどの１つ以上の統合要素も含むカプシド不含ｃｅＤＮＡベクター内にある。ある特定のそのような実施形態では、最低でも、ｃｅＤＮＡは、５’〜３’に、５’ＨＤＲアーム、ドナー配列、３’ＨＤＲアーム、および少なくとも１つのＩＴＲを含み、少なくとも１つのＩＴＲは、５’ＨＤＲアームの上流または３’ＨＤＲアームの下流にある。ある特定の実施形態では、ドナー配列（例えば、限定されないが、第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子（または例えば、任意の他の関心対象の治療用タンパク質）など）は、宿主細胞の染色体に挿入されるヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態では、ドナー配列は、本来宿主細胞に存在しないか、または宿主細胞にとって外来性であり得る。ある特定の実施形態では、ドナー配列は、所定の標的部位以外の部位に存在する内因性配列である。ある特定の実施形態では、ドナー配列は、所定の標的部位の配列と同様の内因性配列である（例えば、既存の誤った配列を置き換える）。ある特定の実施形態では、ドナー配列は、宿主細胞にとって内因性であるが、所定の標的部位以外の部位に存在する配列である。いくつかの実施形態では、ドナー配列は、コード配列または非コード配列である。いくつかの実施形態では、ドナー配列は、遺伝子の突然変異体遺伝子座である。ある特定の実施形態では、ドナー配列は、染色体に挿入される外因性遺伝子、標的部位で内因性配列を置き換える修飾型配列、調節エレメント、タグまたはレポータータンパク質および／もしくはＲＮＡをコードするコード配列であり得る。いくつかの実施形態では、ドナー配列は、融合タンパク質の発現のために標的遺伝子のコード配列にインフレームで挿入されてもよい。ある特定の実施形態では、ドナー配列は、ＯＲＦ全体（コード／ドナー配列）ではなく、所望の標的を置き換えることを意味するＤＮＡの訂正部分のみである。ある特定の実施形態では、ドナー配列は、ドナー配列が天然に存在する配列と同様に調節されるように、内因性プロモーターの後ろにインフレームで挿入される。
【０３３８】
ある特定の実施形態では、ドナー配列は、コード配列を駆動するために、上記のようにプロモーターをその中に任意に含んでもよい。そのような実施形態は、発現を容易にするためにドナー配列内にポリＡテールをさらに含み得る。
【０３３９】
ある特定の実施形態では、ドナー配列は、所定のサイズであり得るか、または当業者によってサイズ決定され得る。ある特定の実施形態では、ドナー配列は、少なくともまたは約１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、５０塩基対、６０塩基対、７５塩基対、１００塩基対、少なくとも１５０塩基対、２００塩基対、３００塩基対、５００塩基対、８００塩基対、１０００塩基対、１，５００塩基対、２，０００塩基対、２５００塩基対、３０００塩基対、４０００塩基対、４５００塩基対、５，０００塩基対の長さ、または約１塩基対〜約１０塩基対、または約１０塩基対〜約５０塩基対、または約５０塩基対〜約１００塩基対、または約１００塩基対〜約５００塩基対、または約５００塩基対〜約５，０００塩基対の長さのいずれかであり得る。ある特定の実施形態では、ドナー配列は、ゲノム中の単一の突然変異型ヌクレオチドを修復するために１塩基対のみを含む。
【０３４０】
本開示による使用のための好適なドナー配列（複数可）の非限定的な例には、本明細書に記載される疾患関連分子のうちの１つに対して少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上の疾患関連配列に対応するプロモーターレスコード配列を含む。一実施形態では、コード配列は、配列番号８２５または配列番号８２５からなるドナー配列に対して少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。配列が置換されるのではなく付加される場合などの、ある特定の実施形態では、プロモーターを提供することができる。
【０３４１】
宿主細胞ゲノムへのドナー配列の統合のために、ｃｅＤＮＡベクターは、ドナー配列をコードするポリヌクレオチド配列、またはその中に示される５’および３’相同性アームなどの相同組み換えによるゲノムへの統合のためのベクターの任意の他のエレメントに依存し得る（例えば、図８を参照）。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、染色体（複数可）における正確な位置（複数可）での宿主細胞のゲノムへの相同組み換えによる統合を指示するために、５’および３’相同性アームをコードするヌクレオチドを含み得る。正確な位置での統合の可能性を高めるために、５’および３’相同性アームは、５０〜５，０００塩基対、または１００〜５，０００塩基対、または５００〜５，０００塩基対などの十分な数の核酸を含むことができ、これらは相同組み換えの確率を高めるために、対応する標的配列に対して高度の配列同一性または相同性を有する。５’および３’相同性アームは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同である任意の配列であり得る。さらに、５’および３’相同性アームは、非コードまたはコードヌクレオチド配列であり得る。ある特定の実施形態では、５’相同性アームと染色体上の対応する配列との間の相同性は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれかである。ある特定の実施形態では、３’相同性アームと染色体上の対応する配列との間の相同性は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれかである。ある特定の実施形態では、５’および／または３’相同性アームは、染色体上の統合またはＤＮＡ切断部位のすぐ上流および／または下流の配列に相同であり得る。あるいは、５’および／または３’相同性アームは、統合もしくはＤＮＡ切断部位から離れている、例えば統合もしくはＤＮＡ切断部位から少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２００、３００、４００、もしくは５００ｂｐ離れているか、またはＤＮＡ切断部位と部分的にもしくは完全に重複している配列に相同であり得る。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列の３’相同性アームは、変更型ＩＴＲの近位にある。
【０３４２】
ある特定の実施形態では、ドナー配列の統合の効率は、統合の前に、ｃｅＤＮＡベクターからドナー配列を含むカセットを抽出することによって改善される。非限定的な一例では、特定の制限部位は、５’相同性アームに対する５’、３’相同性アームに対する３’、または両方で操作することができる。そのような制限部位が両方の相同性アームに関して存在する場合、制限部位は、２つの相同性アーム間で同じであっても異なっていてもよい。ｃｅＤＮＡベクターが、操作された制限部位（複数可）に特異的な１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで切断されると、結果として得られるカセットは、５’相同性アームドナー配列−３’相同性アームを含み、所望のゲノム遺伝子座とより容易に組み換えられ得る。この切断されたカセットは、限定されないが、以下：調節領域、ヌクレアーゼ、および追加のドナー配列のうちの１つ以上などの他のエレメントをさらに含み得ることが当業者によって理解されるであろう。ある特定の態様では、ｃｅＤＮＡベクター自体が、制限エンドヌクレアーゼをコードすることができ、それによりｃｅＤＮＡベクターが核に送達されると、制限エンドヌクレアーゼが発現され、ベクターを切断することができる。ある特定の態様では、制限エンドヌクレアーゼは、別個に送達される第２のｃｅＤＮＡベクター上でコードされる。ある特定の態様では、制限エンドヌクレアーゼは、非ｃｅＤＮＡベースの送達手段によって核に導入される。ある特定の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、ｃｅＤＮＡベクターが核に送達された後に導入される。ある特定の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼおよびｃｅＤＮＡベクターは、同時に核に輸送される。ある特定の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、ｃｅＤＮＡベクターの導入時に既に存在している。
【０３４３】
ある特定の実施形態では、ドナー配列は、５’相同性アームまたは３’相同性アームに対して外来である。ある特定の実施形態では、ドナー配列は、５’相同性アームおよび３’相同性アームを含む配列の間に内因的に見られない。ある特定の実施形態では、ドナー配列は、５’相同性アームまたは３’相同性アームを含む未変性配列に対して内因性ではない。ある特定の実施形態では、５’相同性アームは、染色体上のヌクレアーゼ切断部位の上流のヌクレオチド配列に相同である。ある特定の実施形態では、３’相同性アームは、染色体上のヌクレアーゼ切断部位の下流のヌクレオチド配列に相同である。ある特定の実施形態では、５’相同性アームまたは３’相同性アームは、少なくとも１つの変更型ＩＴＲの近位にある。ある特定の実施形態では、５’相同性アームまたは３’相同性アームは、約２５０〜２０００ｂｐである。
【０３４４】
本開示による使用のための、特に肝細胞または組織の遺伝子編集における使用のための好適な５’相同性アームの非限定的な例には、配列番号８２３もしくは配列番号８２６内の好適なセグメントに対して少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する５’アルブミン相同性アーム、または配列番号８２３内の好適なセグメントもしくは配列番号８２６内の好適なセグメントからなる５’相同性アームが含まれる。そのようなセグメントは、それぞれの配列のすべてであり得る。
【０３４５】
本開示による使用のための、好適な３’相同性アームの非限定的な例には、配列番号８２４もしくは配列番号１４８２７内の好適なセグメントに対して少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する３’アルブミン相同性アーム、または配列番号８２４もしくは配列番号８２７内の好適なセグメントからなる３’相同性アームが含まれる。そのようなセグメントは、それぞれの配列のすべてであり得る。
【０３４６】
一実施形態では、本明細書に記載されるように、ドナー配列に隣接する５’および３’相同性アームを含む遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、Ｃａｓニッカーゼ（ｎＣａｓ、例えばＣａｓ９ニッカーゼ）をコードする別のベクター（例えば、追加のｃｅＤＮＡベクター、レンチウイルスベクター、ウイルスベクター、またはプラスミド）と併せて投与され得る。本明細書では、そのようなｎＣａｓ酵素は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターとの相同性を含むガイドＲＮＡと併せて使用され、例えば、物理的に拘束された配列を解放するため、またはねじれ解放を提供するために使用され得ることが企図される。物理的に拘束された配列を解放すると、例えば、ｃｅＤＮＡベクター内の相同性指向修復（ＨＤＲ）テンプレート相同性アーム（複数可）がゲノム配列との相互作用に曝されるように、ｃｅＤＮＡベクターを「ほどく」ことができる。さらに、本明細書では、必要に応じて、そのような系を使用して、ｃｅＤＮＡベクターを不活性化できることが企図される。ｃｅＤＮＡベクターにおいて二本鎖切断を誘導するＣａｓ酵素が、そのようなｃｅＤＮＡベクターのより強力なディアクチベーターであることは、当業者によって理解されるであろう。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、ヌクレアーゼをコードする配列またはドナー配列もしくはテンプレートなどの、ｃｅＤＮＡベクターに挿入された配列に対する相同性を含む。別の実施形態では、ガイドＲＮＡは、逆位末端反復（ＩＴＲ）またはｃｅＤＮＡベクターの相同性／挿入エレメントに対する相同性を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、５’および３’末端の各々にＩＴＲを含み、したがって、ＩＴＲと相同性を有するガイドＲＮＡは、１つ以上のＩＴＲのニッキングを実質的に等しく産生する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、（例えば、ｃｅＤＮＡベクターのほどきを支援するために）ｃｅＤＮＡベクターおよびドナー配列またはテンプレートの一部と相同性を有する。また、本明細書では、ニッキングされると、ｃｅＤＮＡベクターが核内に保持されなくなる可能性がある、ｃｅＤＮＡベクター上のある特定の部位が存在することも企図される。当業者は、そのような配列を容易に同定することができ、したがって、そのような配列領域へのガイドＲＮＡの操作を回避することができる。あるいは、必要に応じて、または所望される場合、核の局在化に関与する配列をニッキングするガイドＲＮＡを使用して、ヌクレアーゼの外側の領域にｃｅＤＮＡベクターの細胞内局在を修正することを、ｃｅＤＮＡベクターを非活性化する方法として使用することができる。
【０３４７】
ある特定の実施形態では、他の統合戦略および構成成分は、本開示のｃｅＤＮＡベクターによる使用に適している。例えば、図１Ａ〜１Ｇまたは図８または図９には示されていないが、一実施形態では、本開示によるｃｅＤＮＡベクターは、ゲノムｒＤＮＡへの相同組み換えが可能であるリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）配列が隣接する発現カセットを含み得る。同様の戦略は、例えば、Ｌｉｓｏｗｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｒＡＡＶ−ｒＤＮＡ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ａｌｌｏｗ  ｆｏｒ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１８  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で実施されており、ここではｒＡＡＶ−ｒＤＮＡベクターが示された。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ−ｒＤＮＡベクターの送達は、増加した頻度でゲノムｒＤＮＡ遺伝子座に統合することができ、統合はｒＤＮＡ遺伝子座に特異的である。さらに、ヒト第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）またはヒト第ＶＩＩＩ因子発現カセットを含むｃｅＤＮＡ−ｒＤＮＡベクターは、血清ｈＦＩＸまたはヒト第ＶＩＩＩ因子の治療レベルを高める。ｒＤＮＡ遺伝子座への統合は比較的安全であるため、ｃｅＤＮＡ−ｒＤＮＡベクターは、分裂細胞への長期的な遺伝子導入を必要とする治療のためのｃｅＤＮＡの使用を拡大する。
【０３４８】
一実施形態では、プロモーターレスｃｅＤＮＡベクターは、相同性修復テンプレート（例えば、２つの隣接する相同性アームを有する修復配列）の送達のために企図されるが、ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含まない。
【０３４９】
本明細書に記載される方法および組成物は、例えば、Ｒｏｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９１：６０６４−６０６８（１９９４）、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３：５４３−５４８（２０１５）、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３：３３９−３４４（２０１６）、Ｋｏｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５３３：４２０−４２４（２０１６）（各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、相同性組み換えを含む方法で使用され得る。
【０３５０】
本明細書に記載される方法および組成物は、例えば、Ｒｏｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９１：６０６４−６０６８（１９９４）、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３：５４３−５４８（２０１５）、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３：３３９−３４４（２０１６）、Ｋｏｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５３３：４２０−４２４（２０１６）（各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、相同性組み換えを含む方法で使用され得る。
【０３５１】
Ｃ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、選択されたゲノム標的配列へのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ複合体の配列特異的標的化を指向するために標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡが結合し、例えば、Ｃａｓタンパク質が、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を形成することができる。
【０３５２】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列は、ガイド配列とＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとの会合を可能にするｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列に融合された、ｇＲＮＡ配列をゲノム内の所望の部位に指向する標的配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適に整列された場合、少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれ以上である。最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ  Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ、およびＭａｑに基づくアルゴリズムなどの、配列を整列させるための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、またはそれ以上のヌクレオチド長である。本明細書では、ガイドＲＮＡの標的配列および標的核酸分子上の標的配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチを含み得ることが企図される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、パリンドローム配列を含み、例えば、自己標的配列は、パリンドロームを含む。ガイドＲＮＡの標的配列は、典型的に、１９〜２１塩基対の長さであり、ガイドＲＮＡ全体（標的配列＋ヘアピン）をＣａｓ９などのＣａｓに結合するヘアピンの直前にある。パリンドローム配列が、ガイドＲＮＡの自己標的配列として用いられる場合、逆位反復エレメントは、例えば、９、１０、１１、１２、またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。ガイドＲＮＡの標的配列が、最も頻繁に１９〜２１ｂｐである場合、９または１０ヌクレオチドのパリンドローム逆位反復エレメントは、望ましい長さの標的配列を提供する。次いで、Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡヘアピン複合体は、任意のヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、例えば１９〜２１塩基対配列と一致し、その後に「ＰＡＭ」配列、例えばＮＧＧもしくはＮＧＡ、または他のＰＡＭが続くＤＮＡ配列を認識して切断することができる。
【０３５３】
ＲＮＡ誘導誘導型エンドヌクレアーゼ複合体の、標的配列への配列特異的結合を指示するガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイによって評価することができる。例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ複合体を形成するのに十分なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ系の構成成分は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ配列の構成成分をコードするベクターでのトランスフェクションなどによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供することができ、続いて、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ（商標）、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）などによって標的配列内の優先的切断を評価する。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、試験されるガイド配列および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含む、標的配列、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ複合体の構成成分を提供し、試験ガイド配列の反応と対照ガイド配列の反応と間で、標的配列での結合または切断率を比較することによって、試験管内で評価することができる。当業者は、他のアッセイを使用して、ｇＲＮＡ配列を試験することもできることを理解するであろう。
【０３５４】
ガイド配列を選択して、任意の標的配列を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。いくつかの実施形態では、標的配列は、本明細書に記載されるように、自己クローニングプラスミド中の第１のガイドＲＮＡをコードする配列である。典型的には、ゲノム中の標的配列は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの結合のためのプロトスペーサー隣接（ＰＡＭ）配列を含む。当業者は、エンドヌクレアーゼと標的配列との適切な会合を可能にするために、ＰＡＭ配列およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが同じ（細菌）種から選択されるべきであることを理解するであろう。例えば、ＣＡＳ９のＰＡＭ配列は、ｃｐＦ１のＰＡＭ配列とは異なる。設計は、適切なＰＡＭ配列に基づいている。ガイドＲＮＡの分解を防ぐために、ガイドＲＮＡの配列にはＰＡＭ配列を含めてはならない。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡにおける標的配列の長さは、１２ヌクレオチドである。他の実施形態では、ガイドＲＮＡにおける標的配列の長さは、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、または４０ヌクレオチドである。ガイドＲＮＡは、標的化ＤＮＡ配列のいずれかの鎖に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、挿入または欠失を含むようにゲノムを修飾する場合、ｇＲＮＡは、タンパク質コード領域のＮ末端により近く標的化され得る。
【０３５５】
当業者は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼによる標的化された切断の目的のために、ゲノムにおいて固有の標的配列が、ゲノムにおいて１回より多く生じる標的配列よりも好ましいことを理解するであろう。Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓソフトウェアを使用して、ガイドＲＮＡのオフターゲット効果を予測し、最小化することができる（例えば、特にＮａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．″ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ：ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅｓ″Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１４），ｅｐｕｂ、Ｈｅｉｇｗｅｒ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．″Ｅ−ＣＲＩＳＰ：ｆａｓｔ  ＣＲＩＳＰＲ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ″Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１，１２２−１２３（２０１４）、Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．″Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ：ａ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｔｈａｔ  ｓｅａｒｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ″Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０（１０）：１４７３−１４７５  （２０１４）、Ａａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．″ＣａｓＦｉｎｄｅｒ：Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃａｓ９  ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  ｇｅｎｏｍｅｓ″ＢｉｏＲｘｉｖ（２０１４）を参照）。
【０３５６】
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９の場合、ゲノム内の固有の標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（配列番号５９０）という形式のＣａｓ９標的部位を含み得、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（配列番号５９１）（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり、Ｘは任意のヌクレオチドであり得る）は、ゲノム内で１回だけ発生する。ゲノム内の固有の標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（配列番号５９２）の形式のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９標的部位を含み得、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（配列番号５９３）（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり、Ｘは任意のヌクレオチドであり得る）は、ゲノム内で１回だけ発生する。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ１  Ｃａｓ９の場合、ゲノム内の固有の標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号５９４）という形式のＣａｓ９標的部位を含み得、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号５９５）（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり、Ｘは任意のヌクレオチドであり得る）は、ゲノム内で１回だけ発生する。ゲノム内の固有の標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号５９６）という形式のＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ１  Ｃａｓ９標的部位を含めることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号５９７）（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり、Ｘは任意のヌクレオチドであり得、ＷはＡまたはＴである）は、ゲノム内で１回だけ発生する。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９の場合、ゲノム内の固有の標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（配列番号５９８）という形式のＣａｓ９標的部位を含み得、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（配列番号５９９）（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり、Ｘは任意のヌクレオチドであり得る）は、ゲノム内で１回だけ発生する。ゲノム内の固有の標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（配列番号６００）の形式のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９標的部位を含み得、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（配列番号６０１）（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり、Ｘは任意のヌクレオチドであり得る）は、ゲノム内で１回だけ発生する。これらの配列の各々において、「Ｍ」は、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり得、配列を固有であると同定する際に考慮される必要はない。
【０３５７】
一般に、「ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ融合配列」は、その用語が本明細書で使用される場合、固有の標的配列に融合され、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを含む複合体の形成を可能にするように機能する核酸配列を指す。そのような配列は、原核生物のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列の後にモデル化することができ、（ｉ）本明細書に記載されるように標的配列に対応する「プロトスペーサー」と呼ばれる可変配列、および（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ反復を含む。同様に、融合のｔｒａｃｒＲＮＡ（「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）部分は、原核生物のｔｒａｃｒＲＮＡ配列と同様の二次構造（例えば、ヘアピン）を含むように設計して、エンドヌクレアーゼ複合体の形成を可能にすることができる。いくつかの実施形態では、融合は、（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含む細胞においてｔｒａｃｒＲＮＡ配列に隣接されるガイド配列の切除、（２）標的配列でのエンドヌクレアーゼ複合体の形成（複合体は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズしたｃｒＲＮＡ配列を含む）のうちの１つ以上を促進するために、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列との十分な相補性を有する。一般に、相補性の程度は、２つの配列のうち短い方の長さに沿った、ｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列の最適なアラインメントに関するものである。最適なアラインメントは、任意の好適なアラインメントアルゴリズムによって決定することができ、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｃｒＲＮＡ配列内の自己相補性などの二次構造をさらに説明することができる。いくつかの実施形態では、最適に整列させた場合の、２つのうちの短い方の長さに沿ったｔｒａｃｒＲＮＡ配列とｃｒＲＮＡ配列との間の相補性の程度は、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のヌクレオチド長（例えば、７０〜８０、７０〜７５、７５〜８０ヌクレオチド長）である。一実施形態では、ｃｒＲＮＡは、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、または２０未満のヌクレオチド長である。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、３０〜５０ヌクレオチド長である。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４０〜４５、４５〜５０、または５０〜５５ヌクレオチド長である。いくつかの態様では、ｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、単一の転写産物内に含まれ、その結果、２つの間のハイブリダイゼーションは、ヘアピンなどの二次構造を有する転写産物を産生する。いくつかの実施形態では、ヘアピン構造で使用するためのループ形成配列は、４ヌクレオチド長であり、例えば、配列ＧＡＡＡである。しかしながら、代替配列と同様に、より長いまたはより短いループ配列を使用することができる。配列は、好ましくはヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）、および追加のヌクレオチド（例えば、ＣまたはＧ）を含む。ループ形成配列の例には、ＣＡＡ��およびＡＡＡＧが含まれる。一実施形態では、転写産物または転写されたｇＲＮＡ配列は、少なくとも１つのヘアピンを含む。一実施形態では、転写産物または転写されたポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。他の実施形態では、転写産物は、２つ、３つ、４つ、または５つのヘアピンを有する。さらなる実施形態では、転写産物は、最大で５つのヘアピンを有する。いくつかの実施形態では、単一の転写産物は、ポリＴ配列、例えば６つのＴヌクレオチドなどの転写終結配列をさらに含む。ガイド配列、ｃｒＲＮＡ配列、およびｔｒａｃｒ配列を含む単一のポリヌクレオチドの非限定的な例は次のとおりであり（５’〜３’に示されている）、ここで「Ｎ」は、ガイド配列の塩基を表し、小文字の最初のブロックは、ｃｒＲＮＡ配列を表し、小文字の２番目のブロックは、ｔｒａｃｒ配列を表し、最後のポリＴ配列は、転写ターミネーターを表す。
（ｉ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａａｇａｔｔｔａＧＡＡＡｔａａａｔｃｔｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔ  ｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ（配列番号６０２）、（ｉｉ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｈｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａ  ａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ（配列番号６０３）、（ｉｉｉ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａ  ａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔＴＴＴＴＴＴ（配列番号６０４）、（ｉｖ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａ  ａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ（配列番号６０５）、（ｖ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａ  ａａａｇｔＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号６０６）、および（ｖｉ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａＴＴＴＴＴ  ＴＴＴ（配列番号６０７）。いくつかの実施形態では、配列（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ１からのＣａｓ９と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、配列（ｉｖ）〜（ｖｉ）は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列を含む転写産物とは別個の転写産物である。
【０３５８】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ分子を含むことができ、本明細書では「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ｄｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子、およびｔｒａｃｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子を含み得る。第１および第２のＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡ上のフラッグポールとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対合を介してＲＮＡ二重鎖を形成し得る。ｄｇＲＮＡを使用する場合、フラッグポールの長さに上限を設ける必要はない。
【０３５９】
他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子を含むことができ、本明細書では「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに共有結合されたｃｒＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、リンカーを介して共有結合され得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ上のフラッグポールとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対合を介してステムループ構造を含み得る。いくつかの実施形態では、単一ガイドＲＮＡは、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、またはそれ以上のヌクレオチド長（例えば、７５〜１２０、７５〜１１０、７５〜１００、７５〜９０、７５〜８０、８０〜１２０、８０〜１１０、８０〜１００、８０〜９０、８５〜１２０、８５〜１１０、８５〜１００、８５〜９０、９０〜１２０、９０〜１１０、９０〜１００、１００〜１２０、１００〜１２０ヌクレオチド長）である。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターまたはその組成物は、少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸を含む。例えば、第２のポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つのｇＲＮＡ、少なくとも２つのｇＲＮＡ、少なくとも３つのｇＲＮＡ、少なくとも４つのｇＲＮＡ、少なくとも５つのｇＲＮＡ、少なくとも６つのｇＲＮＡ、少なくとも７つのｇＲＮＡ、少なくとも８つのｇＲＮＡ、少なくとも９つのｇＲＮＡ、少なくとも１０のｇＲＮＡ、少なくとも１１のｇＲＮＡ、少なくとも１２のｇＲＮＡ、少なくとも１３のｇＲＮＡ、少なくとも１４のｇＲＮＡ、少なくとも１５のｇＲＮＡ、少なくとも１６のｇＲＮＡ、少なくとも１７のｇＲＮＡ、少なくとも１８のｇＲＮＡ、少なくとも１９のｇＲＮＡ、少なくとも２０のｇＲＮＡ、少なくとも２５のｇＲＮＡ、少なくとも３０のｇＲＮＡ、少なくとも３５のｇＲＮＡ、少なくとも４０のｇＲＮＡ、少なくとも４５のｇＲＮＡ、または少なくとも５０のｇＲＮＡをコードし得る。第２のポリヌクレオチド配列は、１つのｇＲＮＡ〜５０のｇＲＮＡ、１つのｇＲＮＡ〜４５のｇＲＮＡ、１つのｇＲＮＡ〜４０のｇＲＮＡ、１つのｇＲＮＡ〜３５のｇＲＮＡの間、１つのｇＲＮＡ〜３０のｇＲＮＡ、１つのｇＲＮＡ〜２５の異なるｇＲＮＡ、１つのｇＲＮＡ〜２０のｇＲＮＡ、１つのｇＲＮＡ〜１６のｇＲＮＡ、１つのｇＲＮＡ〜８つの異なるｇＲＮＡ、４つの異なるｇＲＮＡ〜５０の異なるｇＲＮＡ、４つの異なるｇＲＮＡ〜４５の異なるｇＲＮＡ、４つの異なるｇＲＮＡ〜４０の異なるｇＲＮＡ、４つの異なるｇＲＮＡ〜３５の異なるｇＲＮＡ、４つの異なるｇＲＮＡ〜３０の異なるｇＲＮＡ、４つの異なるｇＲＮＡ〜２５の異なるｇＲＮＡ、４つの異なるｇＲＮＡ〜２０の異なるｇＲＮＡ、４つの異なるｇＲＮＡ〜１６の異なるｇＲＮＡ、４つの異なるｇＲＮＡ〜８つの異なるｇＲＮＡ〜５０の異なるｇＲＮＡ、８つの異なるｇＲＮＡ〜４５の異なるｇＲＮＡ、８つの異なるｇＲＮＡ〜４０の異なるｇＲＮＡ、８つの異なるｇＲＮＡ〜３５の異なるｇＲＮＡ、８つの異なるｇＲＮＡ〜３０の異なるｇＲＮＡ、８つの異なるｇＲＮＡ〜２５の異なるｇＲＮＡ、８つの異なるｇＲＮＡ〜２０の異なるｇＲＮＡ、８つの異なるｇＲＮＡ〜１６の異なるｇＲＮＡ、１６の異なるｇＲＮＡ〜５０の異なるｇＲＮＡ、１６の異なるｇＲＮＡ〜４５の異なるｇＲＮＡ、１６の異なるｇＲＮＡ〜４０の異なるｇＲＮＡ、１６の異なるｇＲＮＡ〜３５の異なるｇＲＮＡ、１６の異なるｇＲＮＡ〜３０の異なるｇＲＮＡ、１６の異なるｇＲＮＡ〜２５の異なるｇＲＮＡ、または１６の異なるｇＲＮＡ〜２０の異なるｇＲＮＡをコードし得る。異なるｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列の各々は、プロモーターに操作可能に連結され得る。異なるｇＲＮＡに操作可能に連結されているプロモーターは、同じプロモーターであり得る。異なるｇＲＮＡに操作可能に連結されているプロモーターは、異なるプロモーターであり得る。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節可能なプロモーターであり得る。
【０３６０】
いくつかの実験では、ガイドＲＮＡは、ノックインもしくはノックアウト欠失、または欠陥遺伝子の訂正に成功した既知のＺＦＮ配列標的領域を標的とする。既知のＺＦＮ標的領域に結合する複数のｓｇＲＮＡ配列が設計されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１５／００５６７０５号の表１〜２に記載されており、例えば、ヒトβグロビン、ヒト、ＢＣＬＩＩＡ、ヒトＫＬＦ１、ヒトＣＣＲ５、ヒトＣＸＣＲ４、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、マウスおよびヒトＨＰＲＴ、ヒトアルブミン、ヒト第ＩＸ因子、ヒト第ＶＩＩＩ因子、ヒトＬＲＲＫ２、ヒトＨｔｔ、ヒトＲＨ、ＣＦＴＲ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ヒトＰＤ１、ヒトＣＴＬＡ−４、ＨＬＡ  ｃ１１、ＨＬＡ  Ａ２、ＨＬＡ  Ａ３、ＨＬＡ  Ｂ、ＨＬＡ  Ｃ、ＨＬＡ  ｃ１．ＩＩ  ＤＢｐ２．ＤＲＡ、Ｔａｐ１および２、Ｔａｐａｓｉｎ、ＤＭＤ、ＲＦＸ５等）のｇＲＮＡ配列を含む。
【０３６１】
修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、ガイドＲＮＡまたはｍＲＮＡに存在することができる。ガイドＲＮＡまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）をコードするｍＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み得る。そのようなｍＲＮＡは、「修飾型」と呼ばれ、正準Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵ残基の代わりにまたはそれに加えて使用される１つ以上の非天然および／または天然に存在する構成成分または構成の存在を説明する。いくつかの実施形態では、修飾型ＲＮＡは、ここでは「修飾型」と呼ばれる非正準ヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いて合成される。修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、（ｉ）変更、例えば、ホスホジエステル骨格連結における非連結リン酸酸素の一方もしくは両方および／または連結リン酸酸素のうちの１つ以上の置換（例示的な骨格修飾）；（ｉｉ）リボース糖の成分、例えばリボース糖上の２’ヒドロキシルの変更、例えば置換（例示的な糖修飾）；（ｉｉｉ）リン酸部分の「デホスホ」リンカーによる大量置換（例示的な糖修飾）；（ｉｖ）非正準核酸塩基によるものを含む、天然に存在する核酸塩基の修飾または置換（例示的な塩基修飾）；（ｖ）リボース−リン酸骨格の置換または修飾（例示的な骨格修飾）；（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、または部分、キャップ、もしくはリンカーの結合（そのような３’または５’キャップ修飾は、糖および／または骨格の修飾を含み得る）；（ｖｉｉ）糖の修飾または置換（例示的な糖修飾）のうちの１つ以上を含み得る。未修飾の核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を受けやすい可能性がある。例えば、ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解することができる。したがって、一態様では、本明細書に記載されるガイドＲＮＡは、例えば、ヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むことができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡは、例えば、ヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むことができる。一実施形態では、修飾は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む。他の実施形態では、修飾は、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。
【０３６２】
修飾型リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレン酸、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、ホスホン酸アルキルまたはアリールおよびホスホトリエステルが含まれる。非修飾型リン酸基のリン原子は、アキラルである。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つを上記の原子または原子群のうちの１つで置き換えることにより、リン原子をキラルにすることができる。不斉リン原子は、「Ｒ」構成（ここではＲｐ）または「Ｓ」構成（ここではＳｐ）のいずれかを有し得る。骨格はまた、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）を窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）で置換することによって修飾することもできる。置換は、いずれかの連結酸素で、または両方の連結酸素で起こり得る。リン酸基は、ある特定の骨格修飾において、非リン含有コネクターで置き換えることができる。いくつかの実施形態では、電荷リン酸基は、中性部分で置き換えることができる。リン酸基を置き換えることができる部分の例には、限定することなく、例えば、ホスホン酸メチル、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが含まれ得る。
【０３６３】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖基に対する、すなわち糖修飾での１つ以上の修飾を含むことができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、修飾することができ、例えば、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で置き換えることができる。いくつかの実施形態では、２’−アルコキシドイオンを形成するために、もはやヒドロキシルを脱プロトン化することができないため、２’ヒドロキシル基への修飾は、核酸の安定性を高めることができる。２’ヒドロキシル基修飾の例には、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、ここで「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、０（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲが含まれ得、式中、Ｒは、例えば、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり得、ｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、４〜２０）の整数であり得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅであり得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロキシル基をフッ化物で置き換える２’−フルオロ修飾であり得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロキシルが、例えばＣｉ−６アルキレンまたはＣｉ−６ヘテロアルキレン架橋によって、同じリボース糖の４’炭素に接続され得る「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）を含むことができ、例示的な架橋は、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋を含み得る。Ｏ−アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）およびアミノアルコキシ、０（ＣＨ２）ｎ−アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）を含み得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、リボース環がＣ２’−Ｃ３’結合を欠く「ロックされていない」核酸（ＵＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えば、ＰＥＧ誘導体）を含み得る。
【０３６４】
「デオキシ」２’修飾という用語は、水素（すなわち、例えば、部分的にｄｓＲＮＡのオーバーハング部分にあるデオキシリボース糖）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）；アミノ（アミノは、例えば、−ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミノ（アミノは、例えば、本明細書に記載されているとおりであり得る）、−ＮＨＣ（０）Ｒ（Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルを含み得、これらは、例えば、本明細書に記載されるアミノで任意に置換されてもよい。糖修飾は、リボース中の対応する炭素の立体化学的構成とは逆の立体化学的構成を有する１つ以上の炭素を含むこともできる糖基を含み得る。したがって、修飾核酸は、糖として、例えばアラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。修飾核酸はまた、脱塩基糖を含み得る。これらの無塩基糖は、構成糖原子のうちの１つ以上でさらに修飾することもできる。修飾核酸はまた、Ｌ型である１つ以上の糖、例えばＬ−ヌクレオシドを含み得る。
【０３６５】
修飾核酸に組み込むことができる、本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、核酸塩基とも呼ばれる修飾塩基を含み得る。核酸塩基の例には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれるが、これらに限定されない。これらの核酸塩基を修飾または完全に置換して、修飾核酸に組み込むことができる修飾残基を提供することができる。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリン類似体、またはピリミジン類似体から独立して選択することができる。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、例えば、塩基の天然に存在する誘導体および合成誘導体を含み得る。
【０３６６】
デュアルガイドＲＮＡを用いる実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの各々が修飾を含み得る。そのような修飾は、ｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡの一端または両端にあってもよい。ｓｇＲＮＡを含むある特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡの一端もしくは両端にある１つ以上の残基を化学修飾することができるか、またはｓｇＲＮＡ全体を化学修飾することができる。ある特定の実施形態は、５’末端修飾を含む。ある特定の実施形態は、３’末端修飾を含む。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ分子の一本鎖オーバーハング中の１つ以上またはすべてのヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドである。修飾型ｍＲＮＡは、５’末端および／または３’末端修飾を含むことができる。
【０３６７】
Ｄ．調節エレメント
本明細書で定義される非対称ＩＴＲ対または対称ＩＴＲ対を含む遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターは、シス調節エレメントの特定の組み合わせをさらに含む発現構築物から産生することができる。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書に記載される調節スイッチを含み、導入遺伝子、またはｃｅＤＮＡベクターを含む細胞を殺傷し得るキルスイッチの発現を調節する。本発明で使用され得る調節スイッチを含む調節エレメントは、ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）においてより完全に論じられている。
【０３６８】
実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、調節配列、およびヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、遺伝子調節配列は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されている。ある特定の実施形態では、調節配列は、宿主細胞におけるヌクレアーゼの発現を制御するのに適している。ある特定の実施形態では、調節配列は、本開示のヌクレアーゼ（複数可）をコードするヌクレオチド配列などのプロモーター配列に操作可能に連結された遺伝子の転写を指示することができる、好適なプロモーター配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の５’末端に連結されたイントロン配列を含む。ある特定の実施形態では、エンハンサー配列がプロモーターの上流に提供されて、プロモーターの効力を増大させる。ある特定の実施形態では、調節配列は、エンハンサーおよびプロモーターを含み、第２のヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の上流のイントロン配列を含み、イントロンは、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位（複数可）を含み、プロモーターは、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されている。
【０３６９】
ｃｅＤＮＡベクターは、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（例えば、配列番号８）およびＢＧＨポリＡ（配列番号９）などのシス調節エレメントの特定の組み合わせをさらに含む発現構築物から産生され得る。発現構築物における使用のための好適な発現カセットは、ウイルスカプシドによって課されるパッケージング制約によって制限されない。
【０３７０】
（ｉ）．プロモーター：
当業者は、本発明の遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターで使用されるプロモーターが、それらが促進する特定の配列に対して適切に調整されるべきであることを理解するであろう。例えば、ガイドＲＮＡは、その機能が、未変性ＤＮＡ上の特定の標的配列と二重鎖を形成して組み換え事象を発生させるため、プロモーターをまったく必要としない場合がある。対照的に、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされるヌクレアーゼは、プロモーターから恩恵を受けるため、ベクターから効率的に、かつ任意に調節可能な方法で発現させることができる。
【０３７１】
本発明の発現カセットは、全体発現レベルとともに細胞特異性に影響を及ぼし得るプロモーターを含む。導入遺伝子発現の場合、それらは、非常に活発なウイルス由来の最初期プロモーターを含み得る。発現カセットは、導入遺伝子発現を特定の細胞型に制限し、無秩序な異所性発現から生じる毒性効果および免疫反応を低減するために組織特異的真核細胞プロモーターを含有し得る。好ましい実施形態では、発現カセットは、ＣＡＧプロモーター（配列番号３）などの合成調節エレメントを含有し得る。ＣＡＧプロモーターは、（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）早期エンハンサーエレメント、（ｉｉ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン遺伝子の第１のエクソンおよび第１のイントロン、ならびに（ｉｉｉ）ウサギβ−グロブリン遺伝子のスプライスアクセプターを含む。代替として、発現カセットは、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター（配列番号４もしくは配列番号７４）、肝臓特異的（ＬＰ１）プロモーター（配列番号５もしくは配列番号１６）、またはヒト伸長因子−１α（ＥＦ１ａ）プロモーター（例えば、配列番号６もしくは配列番号１５）を含有し得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１つ以上の構成的プロモーター、例えば、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを有する、例えば、配列番号２２）を含む。代替として、誘導性プロモーター、導入遺伝子の未変性プロモーター、組織特異的プロモーター、または当該技術分野において既知の様々なプロモーターを使用することができる。
【０３７２】
上記のものを含む好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得るため、ウイルスプロモーターと称され得るか、またはそれらは、原核生物または真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端配列（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６、例えば、配列番号１８（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０，４９７−５００（２００２））、強化Ｕ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３  Ｓｅｐ．１；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）（例えば、配列番号１９）、ＣＡＧプロモーター、ヒトα１−抗チプシン（ＨＡＡＴ）プロモーター（例えば、配列番号２１）等が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、これらのプロモーターは、それらの下流イントロン含有端で変更され、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位（複数可）を含有するＤＮＡは、プロモーターＤＮＡに対して外来である。
【０３７３】
一実施形態では、使用されるプロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子の未変性プロモーターである。治療タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子のプロモーターおよび他の調節配列は既知であり、特徴付けられている。使用されるプロモーター領域は、１つ以上の追加の調節配列（例えば、未変性）、例えば、エンハンサー（例えば、配列番号２２および配列番号２３）をさらに含み得る。
【０３７４】
本発明に従う使用のための好適なプロモーターの非限定例としては、例えば、ＣＡＧプロモーター（配列番号３）、ＨＡＡＴプロモーター（配列番号２１）、ヒトＥＦ１−αプロモーター（配列番号６）、またはＥＦ１ａプロモーター（配列番号１５）、ＩＥ２プロモーター（例えば、配列番号２０）、およびラットＥＦ１−αプロモーター（配列番号２４）の断片が挙げられる。
【０３７５】
（ｉｉ）ポリアデニル化配列：
ポリアデニル化配列をコードする配列は、ｃｅＤＮＡベクターから発現されたｍＲＮＡを安定化するため、および核輸送および翻訳を助けるために、ｃｅＤＮＡベクター中に含まれ得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ポリアデニル化配列を含まない。他の実施形態では、ベクターは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、またはそれ以上のアデニンジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列は、約４３ヌクレオチド、約４０〜５０ヌクレオチド、約４０〜５５ヌクレオチド、約４５〜５０ヌクレオチド、約３５〜５０ヌクレオチド、またはその間の任意の範囲を含む。
【０３７６】
発現カセットは、当該技術分野において既知のポリアデニル化配列またはその変形、例えば、ウシＢＧＨｐＡ（例えば、配列番号７４）もしくはウイルスＳＶ４０ｐＡ（例えば、配列番号１０）から単離された天然に存在する配列、または合成配列（例えば、配列番号２７）を含み得る。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（ＵＳＥ）配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＵＳＥは、ＳＶ４０ｐＡまたは異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。
【０３７７】
発現カセットはまた、導入遺伝子の発現を増加させるために、転写後エレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（例えば、配列番号８）を使用して、導入遺伝子の発現を増加させる。他の転写後処理エレメント、例えば、単純ヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後エレメントを使用することができる。分泌配列は、導入遺伝子、例えば、ＶＨ−０２およびＶＫ−Ａ２６配列、例えば、配列番号２５および配列番号２６に連結され得る。
【０３７８】
（ｉｉｉ）．核局在化配列
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするベクターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳは、アミノ末端またはその近く、カルボキシ末端またはその近く、またはこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端における１つ以上のＮＬＳおよび／またはカルボキシ末端における１つ以上のＮＬＳ）に位置する。複数のＮＬＳが存在する場合、各々を他のＮＬＳから独立して選択することができ、それにより、単一のＮＬＳが複数のコピーに、および／または１つ以上のコピーに存在する１つ以上の他のＮＬＳと組み合わせて存在する。ＮＬＳの非限定的な例を表６に示す。
【０３７９】
表６：核局在化シグナル
【表６−１】
2021505159.tif 000031
【表６−２】
2021505159.tif 000032
【０３８０】
Ｅ．遺伝子編集系の追加の構成成分
本開示のｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子編集のための他の構成成分をコードするヌクレオチドを含み得る。例えば、特定の遺伝子標的事象を選択するには、保護ｓｈＲＮＡをマイクロＲＮＡに埋め込み、アルブミン遺伝子座などの高活性遺伝子座に部位特異的に統合するように設計された組み換えｃｅＤＮＡベクターに挿入することができる。そのような実施形態は、Ｎｙｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｓｅｌｅｃｔ  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｊｕｎｅ  ８，２０１６に記載されているような任意の遺伝的背景における遺伝子修飾肝細胞のインビボ選択および拡大のための系を提供し得る。本開示のｃｅＤＮＡベクターは、形質転換、トランスフェクト、形質導入などされた細胞の選択を可能にする１つ以上の選択可能なマーカーを含み得る。選択可能なマーカーは、その産生物が殺生物剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養性、ＮｅｏＲ等を提供する遺伝子である。ある特定の実施形態では、正の選択マーカーが、ＮｅｏＲなどのドナー配列に組み込まれる。負の選択マーカーは、ドナー配列の下流に組み込むことができ、例えば、負の選択マーカーをコードする核酸配列ＨＳＶ−ｔｋを、ドナー配列の下流の核酸構築物に組み込むことができる。図８を参照すると、導入遺伝子は、任意に、０．０５〜６ｋｂの伸長相同性アームが隣接するウイルス２Ａペプチド切断部位（２Ａ）を介して選択マーカー（ＮｅｏＲ）に融合される。ある特定の実施形態では、ＨＳＶ  ＴＫ）などの負の選択マーカーおよび成功した正しい部位の使用を制御および選択することを可能にする発現ユニットは、任意に、相同性アームの外側に位置付けられ得る。
【０３８１】
実施形態では、本開示のｃｅＤＮＡベクターは、５’相同性アームの上流かつ近位にポリアデニル化部位を含み得る。
【０３８２】
図９を参照すると、本開示によるｃｅＤＮＡベクターが、ｃｅＤＮＡ特異的ＩＴＲを含めて示されている。ｃｅＤＮＡベクターは、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター駆動型（Ｕ６およびＨ１など）のｓｇＲＮＡ発現ユニットを、転写方向に関して任意の配向で含む。「二重突然変異体ニッカーゼ」のｓｇＲＮＡ標的配列は、任意に、突然変異体ＩＴＲに近い３’相同性アームの下流のねじれを解放するために提供される。そのような実施形態は、アニーリングを増加させ、ＨＤＲの頻度を助長する。
【０３８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターに含まれるヌクレアーゼは、遺伝子編集後に不活化／減少させることができる。例えば、本明細書の実施例６（図８、９、および１３も参照）を参照されたい。
【０３８４】
Ｆ．調節スイッチ
分子調節スイッチは、シグナルに反応して、状態の測定可能な変化を生成するものである。そのような調節スイッチを、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターと有用に組み合わせて、ｃｅＤＮＡベクターの出力を制御することができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を微調整するのに役立つ調節スイッチを含む。例えば、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的封じ込め機能として役立ち得る。いくつかの実施形態では、スイッチは、ｃｅＤＮＡベクターにおける関心対象の遺伝子の、制御可能かつ調節可能な発現を開始または停止（すなわち、シャットダウン）するように設計された「オン／オフ」スイッチである。いくつかの実施形態では、スイッチは、一旦スイッチが起動されると、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞がプログラム細胞死を受けるよう指示することができる「キルスイッチ」を含み得る。遺伝子編集ｃｅＤＮＡで使用して、遺伝子編集分子（例えば、導入遺伝子、例えば、エンドヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、ｇＤＮＡ、ＲＮＡアクチベーター、またはドナー配列をコードする）の発現を調節するために包含される例示的な調節スイッチについては、ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）においてより完全に論じられている。
【０３８５】
（ｉ）バイナリ調節スイッチ
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を制御可能に調整するのに役立ち得る調節スイッチを含む。例えば、ｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲの間に位置する発現カセットは、追加として、関心対象の遺伝子に操作可能に連結された調節領域、例えば、プロモーター、シスエレメント、リプレッサー、エンハンサー等を含み得、この調節領域は、１つ以上の共因子または外因性薬剤によって調節される。単なる例として、調節領域は、小分子スイッチまたは誘導性もしくは抑制性プロモーターによって調節され得る。誘導性プロモーターの非限定例は、ホルモン誘導性または金属誘導性プロモーターである。他の例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとしては、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８６】
（ｉｉ）小分子調節スイッチ
様々な当該技術分野において既知の小分子系調節スイッチは、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターと組み合わせて、調節スイッチによって制御されるｃｅＤＮＡベクターを形成することができる。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、直交リガンド／核受容体対、例えば、レチノイド受容体変異形／ＬＧ３３５およびＧＲＱＣＩＭＦＩ（Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０（２０１０）：１５に開示されているものなどの、操作可能に連結された導入遺伝子の発現を制御する人工プロモーターとともに）；操作されたステロイド受容体、例えば、プロゲステロンに結合することはできないが、ＲＵ４８６（ミフェプリストン）には結合するＣ末端切断を有する修飾型プロゲステロン受容体（米国特許第５，３６４，７９１号）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａからのエクジソン受容体およびそれらのエクジステロイドリガンド（Ｓａｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７（２６）（２０００），１４５１２−１４５１７）、またはＳａｎｄｏ  Ｒ  ３ｒｄ；Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３，１０（１１）：１０８５−８に開示される抗生物質トリメトプリム（ＴＭＰ）によって制御されるスイッチのうちのいずれか１つまたは組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、米国特許第８，７７１，６７９号および同第６，３３９，０７０号に開示されているものなどのプロドラッグ活性化スイッチである。
【０３８７】
（ｉｉｉ）「パスコード」調節スイッチ
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、「パスコードスイッチ」または「パスコード回路」であり得る。パスコードスイッチは、特定の条件が起こったときに、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現の制御の微調整を可能にする。すなわち、導入遺伝子の発現および／または抑制が起こるためには、条件の組み合わせが存在する必要がある。例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも条件ＡおよびＢが起こらなければならない。パスコード調節スイッチは、任意の数の条件であり得、例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも２、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、またはそれ以上の条件が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの条件（例えば、Ａ、Ｂ条件）が起こる必要があり、いくつかの実施形態では、少なくとも３つの条件が起こる必要がある（例えば、Ａ、Ｂ、およびＣまたはＡ、Ｂ、およびＤ）。単なる例として、パスコード「ＡＢＣ」調節スイッチを有するｃｅＤＮＡからの遺伝子発現が起こるためには、条件Ａ、Ｂ、およびＣが存在しなければならない。条件Ａ、Ｂ、およびＣは、以下のとおりであり得る。条件Ａは、病態または疾患の存在であり、条件Ｂは、ホルモン反応であり、条件Ｃは、導入遺伝子の発現に対する反応である。例えば、導入遺伝子が欠陥ＥＰＯ遺伝子を編集する場合、条件Ａは、慢性腎疾患（ＣＫＤ）の存在であり、条件Ｂは、対象が腎臓中に低酸素状態を有する場合に起こり、条件Ｃは、腎臓中のエリスロポエチン産生細胞（ＥＰＣ）動員が不全であるか、または代替としてＨＩＦ−２活性化が不全である。一旦酸素レベルが増加するか、または所望のＥＰＯレベルに達すると、導入遺伝子は、３つの条件が起こるまで再度オフになり、オンに戻る。
【０３８８】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用のために包含されるパスコード調節スイッチまたは「パスコード回路」は、生物学的封じ込め条件を定義するために使用される環境シグナルの範囲および複雑性を拡張するために、ハイブリッド転写因子（ＴＦ）を含む。既定条件の存在下で細胞死をトリガーするデッドマンスイッチとは対照的に、「パスコード回路」は、特定の「パスコード」の存在下での細胞生存または導入遺伝子発現を可能にし、所定の環境条件またはパスコードが存在する場合にのみ導入遺伝子発現および／または細胞生存を可能にするように容易に再プログラムされ得る。
【０３８９】
本明細書に開示される調節スイッチ、例えば、小分子スイッチ、核酸系スイッチ、小分子−核酸ハイブリッドスイッチ、転写後導入遺伝子調節スイッチ、翻訳後調節放射線制御スイッチ、低酸素媒介性スイッチ、および本明細書に開示される当業者に既知の他の調節スイッチのうちのいずれかおよびすべての組み合わせを、本明細書に開示されるパスコード調節スイッチにおいて使用することができる。使用のために包含される調節スイッチはまた、レビュー論文Ｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．１２：２０１４１０００（２０１５）において考察され、Ｋｉｓの表１に要約されている。いくつかの実施形態では、パスコード系における使用のための調節スイッチは、表１１のスイッチのうちのいずれか、またはそれらの組み合わせから選択され得る。
【０３９０】
（ｉｖ）．導入遺伝子発現を制御するための核酸系調節スイッチ
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡによって発現された導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、核酸系制御機序に基づく。例示的な核酸制御機序は、当該技術分野において既知であり、使用が想定される。例えば、そのような機序としては、リボスイッチ、例えば、ＵＳ２００９／０３０５２５３、ＵＳ２００８／０２６９２５８、ＵＳ２０１７／０２０４４７７、ＷＯ２０１８／０２６７６２Ａ１、米国特許第９，２２２，０９３号、および欧州特許出願第ＥＰ２８８０７１号に開示されるもの、またＶｉｌｌａ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｓｐｅｃｔｒ．２０１８  Ｍａｙ；６（３）によるレビューに開示されるものなどが挙げられる。ＷＯ２０１８／０７５４８６およびＷＯ２０１７／１４７５８５に開示されるものなどの、代謝物反応性転写バイオセンサーもまた含まれる。使用が想定される他の当該技術分野において既知の機序としては、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子（例えば、ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ）による導入遺伝子のサイレンシングが挙げられる。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子に対して相補的であるＲＮＡｉ分子をコードする調節スイッチを含み得る。導入遺伝子は、ｃｅＤＮＡベクターによって発現されたとしてもそのようなＲＮＡｉが発現される場合、相補的ＲＮＡｉ分子によってサイレンシングされ、導入遺伝子がｃｅＤＮＡベクターによって発現されたときにＲＮＡｉが発現されない場合、導入遺伝子は、ＲＮＡｉによってサイレンシングされない。
【０３９１】
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、ＵＳ２００２／００２２０１８に開示されている組織特異的自己不活化調節スイッチであり、これにより調節スイッチは、そうでなければ導入遺伝子発現が不利益となり得る部位において、導入遺伝子発現を意図的にスイッチオフする。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、ＵＳ２０１４／０１２７１６２および米国特許第８，３２４，４３６号に開示されるリコンビナーゼ可逆的遺伝子発現系である。
【０３９２】
（ｖ）．転写後および翻訳後調節スイッチ。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された関心対象の導入遺伝子または遺伝子を制御するための調節スイッチは、転写後修飾系である。例えば、そのような調節スイッチは、ＵＳ２０１８／０１１９１５６、ＧＢ２０１１／０７７６８、ＷＯ２００１／０６４９５６Ａ３、欧州特許第２７０７４８７号、およびＢｅｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，２０１５，４（５），ｐｐ  ５２６−５３４、Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１６  Ｎｏｖ  ２；５．ｐｉｉ：ｅ１８８５８に開示されているように、テトラサイクリンまたはテオフィリンに感受性であるアプタザイムリボスイッチであり得る。いくつかの実施形態では、当業者であれば、導入遺伝子、およびリガンド感受性（オフスイッチ）アプタマーを含有し、その最終結果がリガンド感受性オンスイッチである、阻害性ｓｉＲＮＡの両方をコードすることができると想定される。
【０３９３】
（ｖｉ）．他の例示的な調節スイッチ
任意の既知の調節スイッチをｃｅＤＮＡベクター中で使用して、環境変化によってトリガーされるものを含む、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された導入遺伝子の遺伝子発現を制御することができる。追加の例としては、Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ８；１００５１（２０１８）のＢＯＣ方法、遺伝子コード拡張および非生理的アミノ酸、放射線制御型または超音波制御型オン／オフスイッチが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｓｃｏｔｔ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００  Ｊｕｌ；７（１３）：１１２１−５、米国特許第５，６１２，３１８号、同第５，５７１，７９７号、同第５，７７０，５８１号、同第５，８１７，６３６号、およびＷＯ１９９９／０２５３８５Ａ１を参照）。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、米国特許第７，８４０，２６３号、ＵＳ２００７／０１９００２８Ａ１に開示されている、埋め込み可能な系によって制御され、遺伝子発現は、ｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを活性化する電磁エネルギーを含む、１つ以上のエネルギー形態によって制御される。
【０３９４】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用が想定される調節スイッチは、低酸素媒介性またはストレス活性化スイッチ、例えば、ＷＯ１９９９／０６０１４２Ａ２、米国特許第５，８３４，３０６号、同第６，２１８，１７９号、同第６，７０９，８５８号、ＵＳ２０１５／０３２２４１０、Ｇｒｅｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ９，Ｓ３６８に開示されるものなど、ならびにＦＲＯＧ、ＴＯＡＤ、およびＮＲＳＥエレメント、および条件的に誘導可能なサイレンスエレメント（例えば、米国特許第９，３９４，５２６号に開示される、低酸素反応エレメント（ＨＲＥ）、炎症反応エレメント（ＩＲＥ）、および剪断応力活性化エレメント（ＳＳＡＥ）を含む）である。そのような実施形態は、虚血後、または虚血性組織および／もしくは腫瘍において、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現をオンにするために有用である。
【０３９５】
（ｉｖ）．キルスイッチ
本発明の他の実施形態は、キルスイッチを含むｃｅＤＮＡベクターに関する。本明細書に開示されるキルスイッチは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞が殺滅されるか、または導入されたｃｅＤＮＡベクターを対象の系から永久に除去する手段としてプログラム細胞死を受けるようにすることができる。本発明のｃｅＤＮＡベクターにおけるキルスイッチの使用が、通常は、対象が許容可能に喪失し得る限定数の細胞、またはアポトーシスが望ましい細胞型（例えば、癌細胞）へのｃｅＤＮＡベクターの標的と結びつけられることは、当業者によって理解されるであろう。すべての態様では、本明細書に開示される「キルスイッチ」は、入力生存シグナルまたは他の指定条件の非存在下でｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の急速かつロバストな細胞殺滅をもたらすように設計される。言い換えれば、本明細書においてｃｅＤＮＡベクターによりコードされるキルスイッチは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の細胞生存を、特定の入力シグナルによって定義される環境に制限し得る。そのようなキルスイッチは、対象からｃｅＤＮＡベクターを除去すること、またはコードされた導入遺伝子を発現しないことを保証することが望ましいときに、生物学的封じ込め機能として役立つ。
【０３９６】
ＶＩＩ．ｃｅＤＮＡベクターの産生の詳細な方法
Ａ．一般的な産生
本明細書で定義される非対称ＩＴＲ対または対称ＩＴＲ対を含む遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターのある特定の産生方法は、２０１８年９月７日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６のセクションＩＶに記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、ａ）ポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス）を内包する宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベートするステップであって、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠いており、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベートするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から採取し、単離するステップと、を含むプロセスによって取得され得る。Ｒｅｐタンパク質の存在は、修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でｃｅＤＮＡベクターを産生する。しかしながら、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶビリオン）は発現されない。したがって、ＡＡＶまたは他のウイルス系ベクターにおいて天然に課されるものなどのサイズ制限はない。
【０３９７】
宿主細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターの存在は、宿主細胞から単離されたＤＮＡをｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。
【０３９８】
さらに別の態様では、本発明は、例えば、Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ８（８）：ｅ６９８７９に記載されるように、非ウイルスＤＮＡベクターの産生において、ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（ｃｅＤＮＡテンプレート）をそれら自体のゲノムに安定して組み込んでいる宿主細胞株の使用を提供する。好ましくは、Ｒｅｐは、約３のＭＯＩで宿主細胞に付加される。宿主細胞株が哺乳類細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である場合、細胞株は、安定して組み込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有し得、ヘルペスウイルスなどの第２のベクターを使用して、Ｒｅｐタンパク質を細胞に導入することができ、Ｒｅｐおよびヘルパーウイルスの存在下でのｃｅＤＮＡの切除および増幅を可能にする。
【０３９９】
一実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを作製するために使用される宿主細胞は、昆虫細胞であり、バキュロウイルスは、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、例えば図４Ａ〜４Ｃおよび実施例１に記載される、ｃｅＤＮＡの非ウイルス性ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現構築物テンプレートとを両方送達するために使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｒｅｐタンパク質を発現するために操作される。
【０４００】
次いで、ｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞から採取され、単離される。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを細胞から採取するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存性、細胞形態論、細胞増殖等を考慮して選択され得る。一実施形態では、細胞は、十分な条件下で増殖し、ｃｅＤＮＡベクターを産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の対部分がバキュロウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取される。ＤＮＡ−ベクターは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅプラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ＤＮＡ−ベクターに対して適合され得る。一般に、任意の核酸精製方法が採用され得る。
【０４０１】
ＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームまたは微粒子として精製される。
【０４０２】
ｃｅＤＮＡベクターの存在は、細胞から単離されたベクターＤＮＡをＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、ならびにゲル電気泳動を使用し、消化されたＤＮＡ材料および未消化のＤＮＡ材料の両方を分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡの存在を確認することによって確認され得る。図４ＣおよびＦＩＧ．４Ｄは、本明細書におけるプロセスによって産生された閉端ｃｅＤＮＡベクターの存在を特定するための一実施形態を示す。
【０４０３】
Ｂ．ｃｅＤＮＡプラスミド
ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ｃｅＤＮＡベクターの後期産生に使用されるプラスミドである。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、転写方向の操作可能に連結された構成成分として、少なくとも（１）５’ＩＴＲ配列、（２）シス調節エレメントを含有する発現カセット、例えば、プロモーター、誘導性プロモーター、調節スイッチ、エンハンサー等、および（３）修飾型３’ＩＴＲ配列（３’ＩＴＲ配列は、５’ＩＴＲ配列に対して非対称である）を提供する既知の技法を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲによって隣接された発現カセットは、外因性配列を導入するためのクローニング部位を含む。発現カセットは、ＡＡＶゲノムのｒｅｐおよびｃａｐコード領域を置き換える。
【０４０４】
一態様では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書では、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、導入遺伝子を含む発現カセット、および突然変異型または修飾型ＡＡＶ  ＩＴＲをこの順序でコードする「ｃｅＤＮＡ−プラスミド」と参照されるプラスミドから取得され、当該ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いている。代替実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、第１の（または５’）修飾型または突然変異型ＡＡＶ  ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、および第２の（または３’）修飾型ＡＡＶ  ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’および３’ＩＴＲは、互いに対して対称である。代替実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、第１の（または５’）修飾型または突然変異型ＡＡＶ  ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、および第２の（または３’）突然変異型または修飾型ＡＡＶ  ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’および３’修飾型ＩＴＲは、同じ修飾を有する（すなわち、それらは互いに対して逆相補または対称である）。
【０４０５】
さらなる実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミド系は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている（すなわち、ＡＡＶカプシド遺伝子だけでなく、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている）。追加として、特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドはまた、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。したがって、好ましい実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、機能的ＡＡＶ  ｃａｐおよびＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子（ＡＡＶ２の場合ＧＧ−３’）に加えて、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列を欠いている。
【０４０６】
本発明のｃｅＤＮＡ−プラスミドは、当該技術分野において周知の任意のＡＡＶ血清型のゲノムの天然ヌクレオチド配列を使用して生成され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミド骨格は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ、およびＡＡＶ−ＤＪ８ゲノムに由来する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７、ＮＣ００１４０１、ＮＣ００１７２９、ＮＣ００１８２９、ＮＣ００６１５２、ＮＣ００６２６０、ＮＣ００６２６１、Ｓｐｒｉｎｇｅｒによって維持されるＵＲＬで入手可能なＫｏｔｉｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｔｈｅ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（ｗｗｗウェブアドレス：ｏｅｓｙｓ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｄｅ／ｖｉｒｕｓｅｓ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｍｋｃｈａｐｔｅｒ．ａｓｐ？ｖｉｒＩＤ＝４２．０４）（注記−ＵＲＬまたはデータベースに対する参照は、本出願の有効な出願日現在のＵＲＬまたはデータベースの内容を指す）。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミド骨格は、ＡＡＶ２ゲノムに由来する。別の特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミド骨格は、これらのＡＡＶゲノムのうちの１つに由来する５’および３’ＩＴＲに含まれるように遺伝子操作された合成骨格である。
【０４０７】
ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ｃｅＤＮＡベクター産生細胞株の確立における使用のための選択可能または選択マーカーを任意に含み得る。一実施形態では、選択マーカーは、３’ＩＴＲ配列の下流（すなわち、３’）に挿入され得る。別の実施形態では、選択マーカーは、５’ＩＴＲ配列の上流（すなわち、５’）に挿入され得る。適切な選択マーカーは、例えば、薬物耐性を付与するものを含む。選択マーカーは、例えば、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子、カナマイシン、ゲネチシン等であり得る。好ましい実施形態では、薬物選択マーカーは、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子である。
【０４０８】
例示的なｃｅＤＮＡ（例えば、ｒＡＡＶ０）は、ｒＡＡＶプラスミドから産生される。ｒＡＡＶベクターの産生のための方法は、（ａ）宿主細胞に上記のようなｒＡＡＶプラスミドを提供することであって、宿主細胞およびプラスミドの両方が、カプシドタンパク質コード遺伝子を描いている、提供することと、（ｂ）ｃｅＤＮＡゲノムの産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、（ｃ）細胞を採取し、当該細胞から産生されたＡＡＶゲノムを単離することと、を含み得る。
【０４０９】
Ｃ．ｃｅＤＮＡプラスミドからｃｅＤＮＡベクターを作製する例示的な方法
カプシド不含ｃｅＤＮＡベクターを作製するための方法、特にインビボ実験に十分なベクターを提供するために十分に高い収率を有する方法もまた、本明細書に提供される。
【０４１０】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの産生方法は、（１）発現カセットおよび２つの対称ＩＴＲ配列を含む核酸構築物を宿主細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中に導入するステップと、（２）任意に、例えば、プラスミド上に存在する選択マーカーを使用することによってクローン細胞株を確立するステップと、（３）Ｒｅｐコード遺伝子を（当該遺伝子を担持するバキュロウイルスでのトランスフェクションまたは感染のいずれかによって）前述の昆虫細胞中に導入するステップと、（４）細胞を採取し、ｃｅＤＮＡベクターを精製するステップと、を含む。ｃｅＤＮＡベクターの産生のために上記の発現カセットおよび２つのＩＴＲ配列を含む核酸構築物は、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、または下記のようにｃｅＤＮＡプラスミドで生成されたバクミドもしくはバキュロウイルスの形態であり得る。核酸構築物は、トランスフェクション、ウイルス形質導入、安定した組み込み、または当該技術分野において既知の他の方法によって宿主細胞中に導入され得る。
【０４１１】
Ｄ．細胞株：
ｃｅＤＮＡベクターの産生において使用される宿主細胞株は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９、Ｓｆ２１など）もしくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞に由来する昆虫細胞株、または他の無脊椎動物、脊椎動物、もしくは哺乳類細胞を含む他の真核細胞株を含み得る。熟練者に既知の他の細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ−７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１  １８０、単球、ならびに成熟および未成熟樹状細胞を使用することもできる。宿主細胞株は、高収率のｃｅＤＮＡベクター産生のために、ｃｅＤＮＡ−プラスミドの安定した発現のためにトランスフェクトされ得る。
【０４１２】
ＣｅＤＮＡ−プラスミドは、当該技術分野において既知の試薬（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム）または物理的手段（例えば、電気穿孔）を使用し、一時的なトランスフェクションによってＳｆ９細胞中に導入され得る。代替として、ｃｅＤＮＡ−プラスミドをそれらのゲノム中に安定して組み込んでいる安定したＳｆ９細胞株が確立され得る。そのような安定した細胞株は、選択マーカーを上記のｃｅＤＮＡ−プラスミド中に組み込むことによって確立され得る。細胞株をトランスフェクトするために使用されるｃｅＤＮＡ−プラスミドが、抗生物質などの選択マーカーを含む場合、ｃｅＤＮＡ−プラスミドでトランスフェクトされ、ｃｅＤＮＡ−プラスミドＤＮＡをそれらのゲノム中に組み込んでいる細胞は、細胞増殖培地への抗生物質の添加によって選択され得る。次いで、細胞の耐性クローンは、単一細胞希釈またはコロニー移動技法によって単離され、伝播され得る。
【０４１３】
Ｅ．ｃｅＤＮＡベクターを単離し、精製する
遺伝子編集のためにｃｅＤＮＡベクターを入手し、単離するためのプロセスの例は、図４Ａ〜４Ｅおよび下記の特定の実施例に記載されている。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡ−ベクターは、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質（複数可）を発現するプロデューサー細胞から取得され、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスでさらに形質転換され得る。ｃｅＤＮＡベクターの産生に有用なプラスミドとしては、図６Ａ（Ｒｅｐ  ＢＩＩＣ産生に有用な）、図６Ｂ（ｃｅＤＮＡベクターを取得するために使用されるプラスミド）に示されるプラスミドが挙げられる。
【０４１４】
一態様では、ポリヌクレオチドは、プラスミド（Ｒｅｐ−プラスミド）、バクミド（Ｒｅｐ−バクミド）、またはバキュロウイルス（Ｒｅｐ−バキュロウイルス）中のプロデューサー細胞に送達されたＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８もしくは６８）をコードする。Ｒｅｐ−プラスミド、Ｒｅｐ−バクミド、およびＲｅｐ−バキュロウイルスは、上記の方法によって生成され得る。
【０４１５】
例示的なｃｅＤＮＡベクターである、ｃｅＤＮＡベクターを産生するための方法は、本明細書に記載されている。本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用される発現構築物は、プラスミド（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド）、バクミド（例えば、ｃｅＤＮＡ−バクミド）、および／またはバキュロウイルス（例えば、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス）であり得る。単なる例として、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスおよびＲｅｐ−バキュロウイルスに共感染した細胞から生成され得る。Ｒｅｐ−バキュロウイルスから産生されたＲｅｐタンパク質は、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを複製して、ｃｅＤＮＡベクターを生成する。代替として、ｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ−プラスミド、Ｒｅｐ−バクミド、またはＲｅｐ−バキュロウイルス中で送達されるＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８／５２）をコードする配列を含む構築物で安定してトランスフェクトされた細胞から生成され得る。ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスは、細胞に一時的にトランスフェクトされ、Ｒｅｐタンパク質によって複製され、ｃｅＤＮＡベクターを産生し得る。
【０４１６】
バクミド（例えば、ｃｅＤＮＡ−バクミド）は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎｉ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞などの許容昆虫細胞中にトランスフェクトされ得、対称ＩＴＲおよび発現カセットを含む配列を含む組み換えバキュロウイルスである、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを生成し得る。ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを昆虫細胞中に再度感染させて、次世代の組み換えバキュロウイルスを取得することができる。任意に、このステップを一回または複数回繰り返して、より多い量の組み換えバキュロウイルスを産生することができる。
【０４１７】
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを細胞から採取するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存性、細胞形態論、細胞増殖等を考慮して選択され得る。通常、細胞は、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）を産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の対部分がウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、Ｑｉａｇｅｎ  ＥＮＤＯ−ＦＲＥＥ  ＰＬＡＳＭＩＤ（登録商標）キットなどのプラスミド精製キットを使用して、Ｓｆ９細胞から単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ｃｅＤＮＡベクターに対して適合され得る。一般に、任意の当該技術分野において既知の核酸精製方法、ならびに市販のＤＮＡ抽出キットが採用され得る。
【０４１８】
代替として、細胞ペレットをアルカリ溶解プロセスに供し、得られた溶解物を遠心分離し、クロマトグラフィー分離を実施することによって、精製が実装され得る。１つの非限定例として、このプロセスは、核酸を保持するイオン交換カラム（例えば、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ  Ｑ（登録商標））上に上澄を負荷し、次いで溶出し（例えば、１．２Ｍ  ＮａＣｌ溶液で）、ゲル濾過カラム（例えば、６高速流ＧＥ）上でさらなるクロマトグラフィー精製を実施することによって実施され得る。次いで、カプシド不含ＡＡＶベクターは、例えば、沈殿によって回収される。
【０４１９】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターはまた、エキソソームまたは微粒子の形態で精製され得る。多くの細胞型が、膜微小胞の脱落を介して、可溶性タンパク質だけでなく、複合タンパク質／核酸カーゴも放出することは、当該技術分野において既知である（Ｃｏｃｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，２００９、ＥＰ１０３０６２２６．１）。そのような小胞は、微小胞（微粒子とも称される）およびエキソソーム（ナノ小胞とも称される）を含み、それらの両方が、タンパク質およびＲＮＡをカーゴとして含む。微小胞は、形質膜の直接出芽から生成され、エキソソームは、多小胞エンドソームと形質膜との融合時に細胞外環境に放出される。したがって、ｃｅＤＮＡベクターを含有する微小胞および／またはエキソソームは、ｃｅＤＮＡプラスミド、またはｃｅＤＮＡプラスミドで生成されたバクミドもしくはバキュロウイルスで形質導入された細胞から単離され得る。
【０４２０】
微小胞は、培養培地を２０，０００ｘｇでの濾過または超遠心分離、および１００，０００ｘｇでのエキソソームにかけることによって単離され得る。超遠心分離の最適な期間は、実験的に決定することができ、小胞が単離される特定の細胞型に依存する。好ましくは、培養培地は、最初に低速遠心分離（例えば、２０００×ｇで５〜２０分間）によって一掃され、例えば、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｗａｔｆｏｒｄ，ＵＫ）を使用し、スピン濃度に供される。微小胞およびエキソソームは、微小胞およびエキソソーム上に存在する特定の表面抗原を認識する特定の抗体を使用することによって、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを介してさらに精製され得る。他の微小胞およびエキソソーム精製方法としては、免疫沈殿、親和性クロマトグラフィー、濾過、および特定の抗体またはアプタマーでコーティングされた磁気ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。精製時に、小胞を、例えば、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。ｃｅＤＮＡ含有小胞を送達するために微小胞またはエキソソームを使用する１つの利点は、これらの小胞が、それぞれの細胞型上の特定の受容体によって認識されるそれらの膜タンパク質上に含めることによって、様々な細胞型に標的化され得ることである。（ＥＰ１０３０６２２６も参照）
【０４２１】
本明細書における本発明の別の態様は、ｃｅＤＮＡ構築物をそれら自体のゲノム中に安定して組み込んでいる宿主細胞株からｃｅＤＮＡベクターを精製する方法に関する。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームまたは微粒子として精製される。
【０４２２】
ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の図５は、実施例に記載される方法を使用して、複数のｃｅＤＮＡプラスミド構築物からｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルを示す。ｃｅＤＮＡは、実施例の図４Ｄに関して考察されるように、ゲル中の特徴的なバンドパターンによって確認される。
【０４２３】
ＶＩＩＩ．薬学的組成物
別の態様では、薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、本明細書に開示される遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクター、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
【０４２４】
本明細書に開示される遺伝子編集ＤＮＡベクターは、対象の細胞、組織、または器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。典型的に、薬学的組成物は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターおよび薬学的に許容される担体を含む。例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、ならびに細胞内注入、例えば、核内微量注入もしくは細胞質内注入もまた企図される。治療目的のための薬学的組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌注射液は、必要に応じて、上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに、適切なバッファーに必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を組み込んだ後、ｃｅＤＮＡベクターを含む濾過滅菌によって調製することができ、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達するように製剤化して、その中の導入遺伝子またはドナー配列の治療的発現をもたらし得る。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。
【０４２５】
ｃｅＤＮＡベクターを含む薬学的に活性な組成物は、細胞、例えば、対象の細胞に、様々な目的のための導入遺伝子またはドナー配列を送達するように製剤化され得る。
【０４２６】
治療目的のための薬学的組成物は、典型的に、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせに組み込み、濾過滅菌することによって調製され得る。
【０４２７】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、局所、全身、羊膜内、くも膜下腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管、組織内（例えば、筋肉内、心臓内）、肝内、腎臓内、脳内）、くも膜下腔内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、間質内、房内、および硝子体内）、蝸牛内、ならびに粘膜（例えば、経口、直腸、経鼻）投与に適した薬学的組成物に組み込むことができる。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、ならびに細胞内注入、例えば、核内微量注入もしくは細胞質内注入もまた企図される。
【０４２８】
治療目的のための薬学的組成物は、典型的に、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせに組み込み、濾過滅菌することによって調製され得る。
【０４２９】
いくつかの態様では、本明細書で提供される方法は、本明細書に開示される遺伝子編集のための１つ以上のｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞に送達することを含む。本明細書ではまた、そのような方法によって産生される細胞、およびそのような細胞を含むかまたはそのような細胞から産生される生物（動物、植物、または真菌など）も提供される。核酸の送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、裸のＤＮＡ、およびＤＮＡでの薬剤強化取り込みが含まれ得る。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。送達は、細胞（例えば、インビトロもしくはエクスビボ投与）または標的組織（例えば、インビボ投与）に対するものであり得る。
【０４３０】
核酸を細胞に送達するための様々な技法および方法が、当該技術分野において既知である。例えば、ｃｅＤＮＡなどの核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、またはコアシェルナノ粒子中に製剤化され得る。典型的に、ＬＮＰは、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）分子、１つ以上のイオン化またはカチオン性脂質（もしくはそれらの塩）、１つ以上の非イオン性または中性脂質（例えば、リン脂質）、凝集を防ぐ分子（例えば、ＰＥＧもしくはＰＥＧ−脂質複合体）、および任意にステロール（例えば、コレステロール）で構成される。
【０４３１】
ｃｅＤＮＡなどの核酸を細胞に送達するための別の方法は、細胞によって内在化されるリガンドと核酸を複合することによるものである。例えば、リガンドは、細胞表面上の受容体に結合し、エンドサイトーシスを介して内在化され得る。リガンドは、核酸中のヌクレオチドに共有結合され得る。核酸を細胞中に送達するための例示的な複合体は、例えば、ＷＯ２０１５／００６７４０、ＷＯ２０１４／０２５８０５、ＷＯ２０１２／０３７２５４、ＷＯ２００９／０８２６０６、ＷＯ２００９／０７３８０９、ＷＯ２００９／０１８３３２、ＷＯ２００６／１１２８７２、ＷＯ２００４／０９０１０８、ＷＯ２００４／０９１５１５、およびＷＯ２０１７／１７７３２６に記載されている。
【０４３２】
ｃｅＤＮＡなどの核酸はまた、トランスフェクションによって細胞に送達され得る。有用なトランスフェクション方法としては、脂質媒介性トランスフェクション、カチオン性ポリマー媒介性トランスフェクション、またはリン酸カルシウム沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェクション試薬は、当該技術分野において周知であり、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｒｏ−Ｊｅｃｔ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（商標）Ｐタンパク質トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）タンパク質送達試薬（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）、ＰＲＯＴＥＯＪＵＩＣＥ（商標）タンパク質トランスフェクション試薬（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２９３フェクチン、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＴＦＸ−１０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ−２０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ−５０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＩＬＥＮＴＦＥＣＴ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＣ−ｃｈｏｌ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ（商標）（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  １（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  ２（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  ３（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  ４（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、およびＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＶ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）が挙げられるが、これらに限定されない。ｃｅＤＮＡなどの核酸もまた、当業者に既知のマイクロフルイディクス方法を介して細胞に送達され得る。
【０４３３】
インビボまたはエクスビボでの核酸の非ウイルス性送達の方法としては、電気穿孔、リポフェクション（米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、ならびにＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）などの市販試薬）、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０−７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号）、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、裸のＤＮＡ、ならびにＤＮＡの薬剤により強化された取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションもまた、核酸の送達のために使用され得る。
【０４３４】
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターはまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与され得る。投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによるものであり、注入、注射、局所適用、および電気穿孔が挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって使用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時であり、効果的な反応をもたらし得る。
【０４３５】
核酸ベクターの導入のための方法
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、例えば米国特許第５，９２８，６３８号に記載される方法によって、例えば造血幹細胞中に送達され得る。
【０４３６】
本発明によるｃｅＤＮＡベクターは、対象中の細胞または標的器官への送達のためにリポソームに付加され得る。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
【０４３７】
いくつかの態様では、本開示は、免疫原性／抗原性を低減し、化合物（複数可）に対する親水性および疎水性を提供し、投与頻度を低減することができる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基を有する１つ以上の化合物（いわゆる「ＰＥＧ化化合物」）を含む、リポソーム製剤を提供する。または、リポソーム製剤は、単にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを追加の構成成分として含む。そのような態様では、ＰＥＧまたはＰＥＧ官能基の分子量は、６２Ｄａ〜約５，０００Ｄａであり得る。
【０４３８】
いくつかの態様では、本開示は、延長放出または制御放出プロファイルを有するＡＰＩを、数時間〜数週間の期間にわたって送達するリポソーム製剤を提供する。いくつかの関連態様では、リポソーム製剤は、脂質二層によって結合される水性チャンバを含み得る。他の関連態様では、リポソーム製剤は、数時間〜数週間の期間にわたってＡＰＩを放出する、高温で物理的移行を経る構成成分を有するＡＰＩを封入する。
【０４３９】
いくつかの態様では、リポソーム製剤は、スフィンゴミエリンおよび本明細書に開示される１つ以上の脂質を含む。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、Ｏｐｔｉｓｏｍｅを含む。
【０４４０】
いくつかの態様では、本開示は、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩、（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）複合脂質、ＨＳＰＣ（水素化ダイズホスファチジルコリン）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＤＳＰＥ（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）；ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）；ＥＰＣ（卵ホスファチジルコリン）；ＤＯＰＳ（ジオレオイルホスファチジルセリン）；ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）；ＳＭ（スフィンゴミエリン）；ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）；ＤＥＰＣ（ジエルコイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＥ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）、硫酸コレステリル（ＣＳ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ＤＯＰＣ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスファチジルコリン）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。
【０４４１】
いくつかの態様では、本開示は、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を５６：３８：５のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤の全体脂質含有量は、２〜１６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を、それぞれ３：０．０１５：２のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基、エタノールアミン官能基、およびＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基およびコレステロールを含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥである。いくつかの態様では、本開示は、ＤＰＰＧ、ダイズＰＣ、ＭＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質複合体、およびコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。
【０４４２】
いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する１つ以上の脂質、およびエタノールアミン官能基を含有する１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ以上のホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびステロール、例えば、コレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、ＤＯＰＣ／ＤＥＰＣ、およびＤＯＰＥを含む。
【０４４３】
いくつかの態様では、本開示は、１種以上の薬学的賦形剤、例えば、スクロースおよび／またはグリシンをさらに含むリポソーム製剤を提供する。
【０４４４】
いくつかの態様では、本開示は、単一ラメラ構造または多重ラメラ構造のいずれかであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡系粒子を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、一般的なナノ粒子に対する相対サイズでより大きく、約１５０〜２５０ｎｍのサイズであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、凍結乾燥粉末である。
【０４４５】
いくつかの態様では、本開示は、リポソームの外側に単離されたｃｅＤＮＡを有する混合物に弱塩基を付加することにより、本明細書に開示または記載されるｃｅＤＮＡベクターで作製され、負荷されたリポソーム製剤を提供する。この付加は、リポソームの外側のｐＨをおよそ７．３に増加させ、ＡＰＩをリポソーム中に駆動する。いくつかの態様では、本開示は、リポソームの内側で酸性であるｐＨを有するリポソーム製剤を提供する。そのような場合、リポソームの内側は、ｐＨ４〜６．９、より好ましくはｐＨ６．５であり得る。他の態様では、本開示は、リポソーム内薬物安定化技術を使用することにより作製されたリポソーム製剤を提供する。そのような場合、ポリマーまたは非ポリマー高電荷アニオンおよびリポソーム内捕捉剤、例えばポリリン酸塩またはオクタ硫酸スクロースが利用される。
【０４４６】
他の態様では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンを含むリポソーム製剤を提供する。
【０４４７】
例えば、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、微小球、脂質粒子、小胞等の送達試薬は、好適な宿主細胞中への本開示の組成物の導入のために使用され得る。特に核酸は、送達のために製剤化され得るか、または脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノ粒子、金粒子等に封入され得る。そのような製剤は、本明細書に開示される核酸の薬学的に許容される製剤の導入のために好ましい場合がある。
【０４４８】
当該技術分野において既知の様々な送達方法またはそれらの修正を使用して、ｃｅＤＮＡベクターをインビトロまたはインビボで送達することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、機械的、電気的、超音波、流体力学的、またはレーザー系エネルギーによって細胞膜に一時的な貫通を作製することによって送達され、それにより標的化細胞へのＤＮＡ進入が促進される。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、サイズ制限されたチャネルを通して細胞を圧搾することによるか、または当該技術分野において既知の他の手段によって細胞膜を一時的に崩壊させることにより送達され得る。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは単独で、裸のＤＮＡとして皮膚、甲状腺、心筋、骨格筋、または肝臓細胞中に直接注入される。
【０４４９】
場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子銃によって送達される。カプシド不含ＡＡＶベクターでコーティングされた金またはタングステン球状粒子（１〜３μｍ径）は、加圧ガスによって高速に加速され、標的組織細胞中に貫通することができる。
【０４５０】
本明細書では、ｃｅＤＮＡベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物が具体的に企図されている。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、脂質送達系、例えば、本明細書に記載されるリポソームで製剤化される。いくつかの実施形態では、そのような組成物は、熟練した開業医によって望まれる任意の経路によって投与される。組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を介した、口腔内投与を介した、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、および関節内、またはそれらの組み合わせを含む異なる経路によって対象に投与され得る。獣医学的使用のために、組成物は、通常の獣医学的慣習に従って適切に許容される製剤として投与され得る。獣医師は、特定の動物に最も適切な投与計画および投与経路を容易に決定することができる。組成物は、従来のシリンジ、無針注射デバイス、「マイクロプロジェクタイルボンバードメントガン」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、または超音波などの他の物理的方法によって投与することができる。
【０４５１】
組成物は、本明細書に記載されるように、インビボ電気穿孔、リポソーム媒介、またはナノ粒子促進を伴うおよび伴わない、ＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）を含むいくつかの技術によって対象に送達され得る。
【０４５２】
いくつかの実施形態では、電気穿孔を使用して、ｃｅＤＮＡベクターを送達する。電気穿孔は、組織への電極対の挿入によって細胞膜標的細胞組織の一時的な不安定化を引き起こし、それにより不安定化した膜の周囲媒質中のＤＮＡ分子は、細胞の細胞質および核質中に貫通することができる。電気穿孔は、皮膚、肺、および筋肉などの多くの組織型にインビボで使用されている。
【０４５３】
場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、内臓および肢全体の骨格筋への、任意の水溶性化合物および粒子の直接細胞内送達のための単純かつ非常に効率的な方法である流体力学的注入によって送達される。
【０４５４】
場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、膜中にナノスコピック孔を作製することにより、超音波によって送達され、内臓または腫瘍の細胞へのＤＮＡ粒子の細胞内送達を促進するため、プラスミドＤＮＡのサイズおよび濃度は、この系の効率性において大きな役割を果たす。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、磁場を使用することによってマグネトフェクションにより送達され、核酸を含有する粒子を標的細胞中に濃縮する。
【０４５５】
場合によっては、化学送達系は、例えば、カチオン性リポソーム／ミセルまたはカチオン性ポリマーに俗するポリカチオン性ナノマー粒子による負電荷核酸の圧縮を含むナノマー複合体を使用することによって使用され得る。送達方法に使用されるカチオン性脂質としては、一価カチオン性脂質、多価カチオン性脂質、グアニジン含有化合物、コレステロール誘導体化合物、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、プロタミン、他のカチオン性ポリマー）、および脂質−ポリマーハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５６】
Ａ．エキソソーム：
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームにパッケージ化されることによって送達される。エキソソームは、多胞体と形質膜との融合に続いて、細胞外環境中に放出されるエンドサイトーシス起源の小膜小胞である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二層からなり、それらは、エキソソームを産生したｓ細胞からのサイトゾルを含有し、表面上の親細胞からの膜タンパク質を呈する。エキソソームは、上皮細胞、ＢおよびＴリンパ球、マスト細胞（ＭＣ）、ならびに樹状細胞（ＤＣ）を含む様々な細胞型によって産生される。いくつかの実施形態では、１０ｎｍ〜１μｍ、２０ｎｍ〜５００ｎｍ、３０ｎｍ〜２５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍの直径を有するエキソソームが、使用のために想定される。エキソソームは、それらのドナー細胞を使用するか、または特定の核酸をそれらに導入するかのいずれかによって、標的細胞への送達のために単離され得る。当該技術分野において既知の様々なアプローチを使用して、本発明のカプシド不含ＡＡＶベクターを含有するエキソソームを産生することができる。
【０４５７】
Ｂ．微粒子／ナノ粒子：
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子によって送達される。一般に、脂質ナノ粒子は、例えば、Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ５（３）：４９８−５０７によって開示されるように、イオン化アミノ脂質（例えば、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ホスファチジルコリン（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＳＰＣ）、コレステロール、およびコート脂質（ポリエチレングリコール−ジミリストールグリセロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含む。
【０４５８】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０〜約１０００ｎｍの間の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０〜約３００ｎｍの間の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２５〜約２００ｎｍの間の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子調製物（例えば、複数の脂質ナノ粒子を含む組成物）は、サイズ分布を有し、平均サイズ（例えば、直径）は、約７０ｎｍ〜約２００ｎｍであり、より典型的に、平均サイズは、約１００ｎｍ以下である。
【０４５９】
当該技術分野において既知の様々な脂質ナノ粒子を使用して、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを送達することができる。例えば、脂質ナノ粒子を使用する様々な送達方法は、米国特許第９，４０４，１２７号、同第９，００６，４１７号、および同第９，５１８，２７２号に記載される。
【０４６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、金ナノ粒子によって送達される。一般に、核酸は、例えば、Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２（６）；１０７５−１０８３によって記載されるように、金ナノ粒子に共有結合され得るか、または金ナノ粒子に非共有結合され得る（例えば、電荷−電荷相互作用によって結合される）。いくつかの実施形態では、金ナノ粒子−核酸複合体は、例えば、米国特許第６，８１２，３３４号に記載されている方法を使用して産生される。
【０４６１】
Ｃ．複合体
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、複合される（例えば、細胞取り込みを増加させる薬剤に共有結合される）。「細胞取り込みを増加させる薬剤」は、脂質膜を通した核酸の輸送を促進する分子である。例えば、核酸は、親油性化合物（例えば、コレステロール、トコフェロール等）、細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）（例えば、ペネトラチン、ＴＡＴ、Ｓｙｎ１Ｂ等）、およびポリアミン（例えば、スペルミン）に複合され得る。細胞取り込みを増加させる薬剤のさらなる例は、例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ（２０１３）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４（７）；７９１−８０９に開示されている。
【０４６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、ポリマー（例えば、ポリマー分子）または葉酸塩分子（例えば、葉酸分子）に複合される。一般に、ポリマーに複合された核酸の送達は、例えば、ＷＯ２０００／３４３４３およびＷＯ２００８／０２２３０９に記載されているように、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，９８７，３７７号によって記載されているように、ポリ（アミド）ポリマーに複合される。いくつかの実施形態では、本開示によって記載される核酸は、米国特許第８，５０７，４５５号に記載されているように、葉酸分子に複合される。
【０４６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号に記載されているように、炭水化物に複合される。
【０４６４】
Ｄ．ナノカプセル
代替として、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターのナノカプセル製剤が使用され得る。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再生可能な方法で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を避けるために、そのような微細粒子（およそ０．１μｍのサイズ）は、ポリマーを使用して、インビボで分解され得るように設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。
【０４６５】
Ｅ．リポソーム
本発明によるｃｅＤＮＡベクターは、対象中の細胞または標的器官への送達のためにリポソームに付加され得る。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
【０４６６】
リポソームの形成および使用は、一般に、当業者に既知である。改善された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号、同第５，５５２，１５７号、同第５，５６５，２１３号、同第５，７３８，８６８号、および同第５，７９５，５８７号）。
【０４６７】
リポソームは、通常は他の手順によるトランスフェクションに対して耐性があるいくつかの細胞型とともに良好に使用されている。加えて、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長さの制約を含まない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線療法剤、ウイルス、転写因子、アロステリックエフェクターを、様々な培養細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。加えて、リポソーム媒介性薬物送達の有効性を調べるいくつかの良好な臨床治験が完了している。
【０４６８】
リポソームは、水性媒質中に分散されるリン脂質から形成され、同時に多重ラメラ同心円二層小胞（多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの音波処理は、コアに水溶液を含有する、２００〜５００ＡＮＧの範囲の直径を有する小さい単一ラメラ小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。
【０４６９】
いくつかの実施形態では、リポソームは、カチオン性脂質を含む。「カチオン性脂質」という用語は、極性ドメインおよび非極性ドメインの両方を有し、生理的ｐＨまたはその付近で正に電荷されることができ、核酸などのポリアニオンに結合し、細胞への核酸の送達を促進する脂質および合成脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、飽和および不飽和アルキル、およびアミンの脂環式エーテルおよびエステル、またはそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、直鎖、分岐鎖アルキル、アルケニル基、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、１〜約２５個の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、２５個より多くの炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケン基は、６個以上の炭素原子を有する。カチオン性脂質はまた、いくつかの実施形態では、１つ以上の脂環式基を含み得る。脂環式基の非限定例としては、コレステロールおよび他のステロイド基が挙げられる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、１つ以上の対イオンで調製される。対イオン（アニオン）の例としては、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、Ｆ−、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、硫酸塩、亜硝酸塩、および硝酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４７０】
いくつかの態様では、本開示は、免疫原性／抗原性を低減し、化合物（複数可）に対する親水性および疎水性を提供し、投与頻度を低減することができる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基を有する１つ以上の化合物（いわゆる「ＰＥＧ化化合物」）を含む、リポソーム製剤を提供する。または、リポソーム製剤は、単にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを追加の構成成分として含む。そのような態様では、ＰＥＧまたはＰＥＧ官能基の分子量は、６２Ｄａ〜約５，０００Ｄａであり得る。
【０４７１】
いくつかの態様では、本開示は、延長放出または制御放出プロファイルを有するＡＰＩを、数時間〜数週間の期間にわたって送達するリポソーム製剤を提供する。いくつかの関連態様では、リポソーム製剤は、脂質二層によって結合される水性チャンバを含み得る。他の関連態様では、リポソーム製剤は、数時間〜数週間の期間にわたってＡＰＩを放出する、高温で物理的移行を経る構成成分を有するＡＰＩを封入する。
【０４７２】
いくつかの態様では、リポソーム製剤は、スフィンゴミエリンおよび本明細書に開示される１つ以上の脂質を含む。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、Ｏｐｔｉｓｏｍｅを含む。
【０４７３】
いくつかの態様では、本開示は、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩、（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）複合脂質、ＨＳＰＣ（水素化ダイズホスファチジルコリン）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＤＳＰＥ（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）；ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）；ＥＰＣ（卵ホスファチジルコリン）；ＤＯＰＳ（ジオレオイルホスファチジルセリン）；ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）；ＳＭ（スフィンゴミエリン）；ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）；ＤＥＰＣ（ジエルコイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＥ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）、硫酸コレステリル（ＣＳ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ＤＯＰＣ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスファチジルコリン）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。
【０４７４】
いくつかの態様では、本開示は、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を５６：３８：５のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤の全体脂質含有量は、２〜１６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を、それぞれ３：０．０１５：２のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基、エタノールアミン官能基、およびＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基およびコレステロールを含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥである。いくつかの態様では、本開示は、ＤＰＰＧ、ダイズＰＣ、ＭＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質複合体、およびコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。
【０４７５】
いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する１つ以上の脂質、およびエタノールアミン官能基を含有する１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ以上のホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびステロール、例えば、コレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、ＤＯＰＣ／ＤＥＰＣ、およびＤＯＰＥを含む。
【０４７６】
いくつかの態様では、本開示は、１種以上の薬学的賦形剤、例えば、スクロースおよび／またはグリシンをさらに含むリポソーム製剤を提供する。
【０４７７】
いくつかの態様では、本開示は、単一ラメラ構造または多重ラメラ構造のいずれかであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡系粒子を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、一般的なナノ粒子に対する相対サイズでより大きく、約１５０〜２５０ｎｍのサイズであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、凍結乾燥粉末である。
【０４７８】
いくつかの態様では、本開示は、リポソームの外側に単離されたｃｅＤＮＡを有する混合物に弱塩基を付加することにより、本明細書に開示または記載されるｃｅＤＮＡベクターで作製され、負荷されたリポソーム製剤を提供する。この付加は、リポソームの外側のｐＨをおよそ７．３に増加させ、ＡＰＩをリポソーム中に駆動する。いくつかの態様では、本開示は、リポソームの内側で酸性であるｐＨを有するリポソーム製剤を提供する。そのような場合、リポソームの内側は、ｐＨ４〜６．９、より好ましくはｐＨ６．５であり得る。他の態様では、本開示は、リポソーム内薬物安定化技術を使用することにより作製されたリポソーム製剤を提供する。そのような場合、ポリマーまたは非ポリマー高電荷アニオンおよびリポソーム内捕捉剤、例えばポリリン酸塩またはオクタ硫酸スクロースが利用される。
【０４７９】
他の態様では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンを含むリポソーム製剤を提供する。
【０４８０】
カチオン性脂質の非限定例としては、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）星形デンドリマー、リポフェクチン（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥの組み合わせ）、リポフェクターゼ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００）、ＤＯＰＥ、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、およびＥｕｆｅｃｔｉｎ（ＪＢＬ，Ｓａｎ  Ｌｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。例示的なカチオン性リポソームは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル硫酸塩（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、２，３，−ジオレイロキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム臭化物、およびジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）から作製され得る。核酸（例えば、ＣＥＬｉＤ）はまた、例えばポリ（Ｌ−リジン）またはアビジンと複合され得、脂質は、この混合物、例えばステリル−ポリ（Ｌ−リジン）に含まれ得るか、または含まれない場合がある。
【０４８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、米国特許第８，１５８，６０１号に記載されるカチオン性脂質、または米国特許第８，０３４，３７６号に記載される脂質を使用して送達される。
【０４８２】
Ｆ．例示的なリポソームおよび脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物
本発明によるｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子編集を必要とする、例えばドナー配列を必要とする細胞への送達のためにリポソームに付加することができる。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
【０４８３】
いくつかの態様では、本開示は、免疫原性／抗原性を低減し、化合物（複数可）に対する親水性および疎水性を提供し、投与頻度を低減することができる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基を有する１つ以上の化合物（いわゆる「ＰＥＧ化化合物」）を含む、リポソーム製剤を提供する。または、リポソーム製剤は、単にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを追加の構成成分として含む。そのような態様では、ＰＥＧまたはＰＥＧ官能基の分子量は、６２Ｄａ〜約５，０００Ｄａであり得る。
【０４８４】
いくつかの態様では、本開示は、延長放出または制御放出プロファイルを有するＡＰＩを、数時間〜数週間の期間にわたって送達するリポソーム製剤を提供する。いくつかの関連態様では、リポソーム製剤は、脂質二層によって結合される水性チャンバを含み得る。他の関連態様では、リポソーム製剤は、数時間〜数週間の期間にわたってＡＰＩを放出する、高温で物理的移行を経る構成成分を有するＡＰＩを封入する。
【０４８５】
いくつかの態様では、リポソーム製剤は、スフィンゴミエリンおよび本明細書に開示される１つ以上の脂質を含む。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、Ｏｐｔｉｓｏｍｅを含む。
【０４８６】
いくつかの態様では、本開示は、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩、（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）複合脂質、ＨＳＰＣ（水素化ダイズホスファチジルコリン）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＤＳＰＥ（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）；ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）；ＥＰＣ（卵ホスファチジルコリン）；ＤＯＰＳ（ジオレオイルホスファチジルセリン）；ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）；ＳＭ（スフィンゴミエリン）；ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）；ＤＥＰＣ（ジエルコイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＥ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）、硫酸コレステリル（ＣＳ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ＤＯＰＣ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスファチジルコリン）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。
【０４８７】
いくつかの態様では、本開示は、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を５６：３８：５のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤の全体脂質含有量は、２〜１６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を、それぞれ３：０．０１５：２のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基、エタノールアミン官能基、およびＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基およびコレステロールを含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥである。いくつかの態様では、本開示は、ＤＰＰＧ、ダイズＰＣ、ＭＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質複合体、およびコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。
【０４８８】
いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する１つ以上の脂質、およびエタノールアミン官能基を含有する１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ以上のホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびステロール、例えば、コレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、ＤＯＰＣ／ＤＥＰＣ、およびＤＯＰＥを含む。
【０４８９】
いくつかの態様では、本開示は、１種以上の薬学的賦形剤、例えば、スクロースおよび／またはグリシンをさらに含むリポソーム製剤を提供する。
【０４９０】
いくつかの態様では、本開示は、本開示は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造のいずれかであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡系粒子を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、一般的なナノ粒子に対する相対サイズでより大きく、約１５０〜２５０ｎｍのサイズであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、凍結乾燥粉末である。
【０４９１】
いくつかの態様では、本開示は、リポソームの外側に単離されたｃｅＤＮＡを有する混合物に弱塩基を付加することにより、本明細書に開示または記載されるｃｅＤＮＡベクターで作製され、負荷されたリポソーム製剤を提供する。この付加は、リポソームの外側のｐＨをおよそ７．３に増加させ、ＡＰＩをリポソーム中に駆動する。いくつかの態様では、本開示は、リポソームの内側で酸性であるｐＨを有するリポソーム製剤を提供する。そのような場合、リポソームの内側は、ｐＨ４〜６．９、より好ましくはｐＨ６．５であり得る。他の態様では、本開示は、リポソーム内薬物安定化技術を使用することにより作製されたリポソーム製剤を提供する。そのような場合、ポリマーまたは非ポリマー高電荷アニオンおよびリポソーム内捕捉剤、例えばポリリン酸塩またはオクタ硫酸スクロースが利用される。
【０４９２】
他の態様では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンを含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの実施形態では、リポソーム製剤は、以下の表７に記載されている製剤である。
表７：例示的なリポソーム製剤
【表７−１】
2021505159.tif 000033
【表７−２】
2021505159.tif 000034
【表７−３】
2021505159.tif 000035
【０４９３】
いくつかの態様では、本開示は、ｃｅＤＮＡおよびイオン化脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、プロセスにより得られたｃｅＤＮＡを用いて作製および負荷される脂質ナノ粒子製剤は、２０１８年９月７日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２に開示されており、本明細書に組み込まれる。これは、イオン化脂質をプロトン化し、粒子のｃｅＤＮＡ／脂質会合および核形成に好ましいエネルギー論を提供する、低ｐＨでのエタノール脂質と水性ｃｅＤＮＡとの高エネルギー混合によって達成され得る。粒子は、水性希釈および有機溶媒の除去によってさらに安定化され得る。粒子は、所望のレベルに濃縮され得る。
【０４９４】
一般に、脂質粒子は、約１０：１〜３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ（質量または重量）比で調製される。いくつかの実施形態では、脂質対ｃｅＤＮＡ比（質量／質量比、ｗ／ｗ比）は、約１：１〜約２５：１、約１０：１〜約１４：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１の範囲内であり得る。脂質およびｃｅＤＮＡの量を調整して、所望のＮ／Ｐ比、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のＮ／Ｐ比を提供し得る。一般に、脂質粒子製剤の全体脂質含有量は、約５ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
【０４９５】
イオン化脂質は、典型的に、核酸カーゴ、例えばｃｅＤＮＡを低ｐＨで凝縮させるため、および膜会合および膜融合性を駆動するために用いられる。一般に、イオン化脂質は、正に電荷される、または例えばｐＨ６．５以下の酸性条件下でプロトン化される少なくとも１つのアミノ基を含む脂質である。イオン化脂質はまた、本明細書ではカチオン性脂質と称される。
【０４９６】
例示的なイオン化可脂質は、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１５／０９５３４０号、同第ＷＯ２０１５／１９９９５２号、同第ＷＯ２０１８／０１１６３３号、同第ＷＯ２０１７／０４９２４５号、同第ＷＯ２０１５／０６１４６７号、同第ＷＯ２０１２／０４０１８４号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、同第ＷＯ２０１５／０７４０８５号、同第ＷＯ２０１６／０８１０２９号、同第ＷＯ２０１７／００４１４３号、同第ＷＯ２０１７／０７５５３１号、同第ＷＯ２０１７／１１７５２８号、同第ＷＯ２０１１／０２２４６０号、同第ＷＯ２０１３／１４８５４１号、同第ＷＯ２０１３／１１６１２６号、同第ＷＯ２０１１／１５３１２０号、同第ＷＯ２０１２／０４４６３８号、同第ＷＯ２０１２／０５４３６５号、同第ＷＯ２０１１／０９０９６５号、同第ＷＯ２０１３／０１６０５８号、同第ＷＯ２０１２／１６２２１０号、同第ＷＯ２００８／０４２９７３号、同第ＷＯ２０１０／１２９７０９号、同第ＷＯ２０１０／１４４７４０号、同第ＷＯ２０１２／０９９７５５号、同第ＷＯ２０１３／０４９３２８号、同第ＷＯ２０１３／０８６３２２号、同第ＷＯ２０１３／０８６３７３号、同第ＷＯ２０１１／０７１８６０号、同第ＷＯ２００９／１３２１３１号、同第ＷＯ２０１０／０４８５３６号、同第ＷＯ２０１０／０８８５３７号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０１号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０６号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０５号、同第ＷＯ２０１０／０５４３８４号、同第ＷＯ２０１２／０１６１８４号、同第ＷＯ２００９／０８６５５８号、同第ＷＯ２０１０／０４２８７７号、同第ＷＯ２０１１／０００１０６号、同第ＷＯ２０１１／０００１０７号、同第ＷＯ２００５／１２０１５２号、同第ＷＯ２０１１／１４１７０５号、同第ＷＯ２０１３／１２６８０３号、同第ＷＯ２００６／００７７１２号、同第ＷＯ２０１１／０３８１６０号、同第ＷＯ２００５／１２１３４８号、同第ＷＯ２０１１／０６６６５１号、同第ＷＯ２００９／１２７０６０号、同第ＷＯ２０１１／１４１７０４号、同第ＷＯ２００６／０６９７８２号、同第ＷＯ２０１２／０３１０４３号、同第ＷＯ２０１３／００６８２５号、同第ＷＯ２０１３／０３３５６３号、同第ＷＯ２０１３／０８９１５１号、同第ＷＯ２０１７／０９９８２３号、同第ＷＯ２０１５／０９５３４６号、および同第ＷＯ２０１３／０８６３５４号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１６／０３１１７５９号、同第ＵＳ２０１５／０３７６１１５号、同第ＵＳ２０１６／０１５１２８４号、同第ＵＳ２０１７／０２１０６９７号、同第ＵＳ２０１５／０１４００７０号、同第ＵＳ２０１３／０１７８５４１号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、同第ＵＳ２０１５／０１４１６７８号、同第ＵＳ２０１５／０２３９９２６号、同第ＵＳ２０１６／０３７６２２４号、同第ＵＳ２０１７／０１１９９０４号、同第ＵＳ２０１２／０１４９８９４号、同第ＵＳ２０１５／００５７３７３号、同第ＵＳ２０１３／００９０３７２号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５２３号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５０４号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５０４号、同第ＵＳ２００９／００２３６７３号、同第ＵＳ２０１２／０１２８７６０号、同第ＵＳ２０１０／０３２４１２０号、同第ＵＳ２０１４／０２００２５７号、同第ＵＳ２０１５／０２０３４４６号、同第ＵＳ２０１８／０００５３６３号、同第ＵＳ２０１４／０３０８３０４号、同第ＵＳ２０１３／０３３８２１０号、同第ＵＳ２０１２／０１０１１４８号、同第ＵＳ２０１２／００２７７９６号、同第ＵＳ２０１２／００５８１４４号、同第ＵＳ２０１３／０３２３２６９号、同第ＵＳ２０１１／０１１７１２５号、同第ＵＳ２０１１／０２５６１７５号、同第ＵＳ２０１２／０２０２８７１号、同第ＵＳ２０１１／００７６３３５号、同第ＵＳ２００６／００８３７８０号、同第ＵＳ２０１３／０１２３３３８号、同第ＵＳ２０１５／００６４２４２号、同第ＵＳ２００６／００５１４０５号、同第ＵＳ２０１３／００６５９３９号、同第ＵＳ２００６／０００８９１０号、同第ＵＳ２００３／００２２６４９号、同第ＵＳ２０１０／０１３０５８８号、同第ＵＳ２０１３／０１１６３０７号、同第ＵＳ２０１０／００６２９６７号、同第ＵＳ２０１３／０２０２６８４号、同第ＵＳ２０１４／０１４１０７０号、同第ＵＳ２０１４／０２５５４７２号、同第ＵＳ２０１４／００３９０３２号、同第ＵＳ２０１８／００２８６６４号、同第ＵＳ２０１６／０３１７４５８号、同第ＵＳ２０１３／０１９５９２０号に記載されており、これらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
【０４９７】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、以下の構造を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡまたはＭＣ３）である：
【化１２】
2021505159.tif 000036
。
【０４９８】
脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡは、Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．（２０１２），５１（３４）：８５２９−８５３３に記載されており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４９９】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、以下の構造を有する脂質ＡＴＸ−００２である
【化１３】
2021505159.tif 000037
。
【０５００】
脂質ＡＴＸ−００２は、ＷＯ２０１５／０７４０８５（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０５０１】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、以下の構造を有する（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン（化合物３２）である
【化１４】
2021505159.tif 000038
。
【０５０２】
化合物３２は、ＷＯ２０１２／０４０１８４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０５０３】
いくつかの実施形態では、イオン化可脂質は、以下の構造を有する化合物６または化合物２２である。
【化１５】
2021505159.tif 000039
【０５０４】
化合物６および２２は、ＷＯ２０１５／１９９９５２（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０５０５】
無制限に、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の２０〜９０％（ｍｏｌ）を構成し得る。例えば、イオン化脂質モル含有量は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の２０〜７０％（ｍｏｌ）、３０〜６０％（ｍｏｌ）、または４０〜５０％（ｍｏｌ）であり得る。いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％を含む。
【０５０６】
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、非カチオン性脂質をさらに含み得る。非イオン性脂質としては、両親媒性脂質、中性脂質、およびアニオン性脂質が挙げられる。したがって、非カチオン性脂質は、中性の非電荷、双性イオン性、またはアニオン性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、典型的に、膜融合性を強化するために用いられる。
【０５０７】
例示的な非カチオン性脂質としては、ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン（１６−Ｏ−モノメチルＰＥなど）、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン（１６−Ｏ−ジメチルＰＥなど）、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジカシド、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リソホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。他のジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質もまた使用され得ることが理解される。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０〜Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。
【０５０８】
脂質ナノ粒子中での使用に好適な非カチオン性脂質の他の例としては、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリル系ポリマー、トリエタノールアミン−硫酸ラウリル、アルキル−アリールサルフェートポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチル臭化アンモニウム、セラミド、スフィンゴミエリン等の非亜リン脂質が挙げられる。
【０５０９】
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、リン脂質である。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭから選択される。いくつかの好ましい実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＰＳＣである。
【０５１０】
例示的な非カチオン性脂質は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０９９８２３号および米国特許公開第ＵＳ２０１８／００２８６６４号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施例では、非カチオン性脂質は、オレイン酸、またはＵＳ２０１８／００２８６６４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化１６】
2021505159.tif 000040
、式（ＩＩ）
【化１７】
2021505159.tif 000041
、または式（ＩＶ）
【化１８】
2021505159.tif 000042
の化合物である。
【０５１１】
非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０〜３０％（ｍｏｌ）を構成し得る。例えば、非カチオン性脂質含有量は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の５〜２０％（ｍｏｌ）または１０〜１５％（ｍｏｌ）である。様々な実施形態では、イオン化脂質対中性脂質のモル比は、約２：１〜約８：１の範囲である。
【０５１２】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質を全く含まない。
【０５１３】
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、膜統合性を提供するために、ステロールなどの構成成分をさらに含み得る。
【０５１４】
脂質ナノ粒子中で使用され得る１つの例示的なステロールは、コレステロールおよびその誘導体である。コレステロール誘導体の非限定例としては、５α−コレスタノール、５β−コプロスタノール、コレステリル−（２’−ヒドロキシ）−エチルエーテル、コレステリル−（４’−ヒドロキシ）−ブチルエーテル、および６−ケトコレスタノールなどの極性類似体、５α−コレスタン、コレステノン、５α−コレスタノン、５β−コレスタノン、およびデカン酸コレステリルなどの非極性類似体、ならびにそれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、コレステロール誘導体は、コレステリル−（４’−ヒドロキシ）−ブチルエーテルなどの極性類似体である。
【０５１５】
例示的なコレステロール誘導体は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／１２７０６０号および米国特許公開第ＵＳ２０１０／０１３０５８８に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０５１６】
ステロールなどの膜統合性を提供する構成成分は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０〜５０％（ｍｏｌ）を構成し得る。いくつかの実施形態では、そのような構成成分は、脂質ナノ粒子の全脂質含有量の２０〜５０％（ｍｏｌ）、３０〜４０％（ｍｏｌ）である。
【０５１７】
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または複合脂質分子をさらに含み得る。一般に、これらを使用して、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、かつ／または立体安定化を提供する。例示的な複合脂質としては、ＰＥＧ−脂質複合体、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）−脂質複合体、ポリアミド−脂質複合体（ＡＴＴＡ−脂質複合体など）、カチオン性−ポリマー脂質（ＣＰＬ）複合体、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、複合脂質分子は、ＰＥＧ−脂質複合体、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）−複合脂質である。
【０５１８】
例示的なＰＥＧ−脂質複合体としては、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（１−（モノメトキシ−ポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ））、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ−ＤＡＧ）（４−Ｏ−（２’，３’−ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル−１−Ｏ−（ｗ−メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的なＰＥＧ−脂質複合体は、例えば、ＵＳ５，８８５，６１３、ＵＳ６，２８７，５９１、
ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００５／０１７５６８２、ＵＳ２００８／００２００５８、ＵＳ２０１１／０１１７１２５、ＵＳ２０１０／０１３０５８８、ＵＳ２０１６／０３７６２２４、およびＵＳ２０１７／０１１９９０４に記載されており、それらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０５１９】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−脂質は、ＵＳ２０１８／００２８６６４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（ＩＩＩ）
【化１９】
2021505159.tif 000043
、式（ＩＩＩ−ａ−Ｉ）
【化２０】
2021505159.tif 000044
、式（ＩＩＩ−ａ−２）
【化２１】
2021505159.tif 000045
、式（ＩＩＩ−ｂ−１）
【化２２】
2021505159.tif 000046
、式（ＩＩＩ−ｂ−２）
【化２３】
2021505159.tif 000047
、または式（Ｖ）
【化２４】
2021505159.tif 000048
の化合物である。
【０５２０】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−脂質は、ＵＳ２０１５／０３７６１１５またはＵＳ２０１６／０３７６２２４（それら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（ＩＩ）
【化２５】
2021505159.tif 000049
のである。
【０５２１】
ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ−脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ−ジステリルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスト−５−エン−３［β］−オキシ）カルボキシアミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−［ω］−メチル−ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−［ω］−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］のうちの１つ以上であり得る。いくつかの実施例では、ＰＥＧ−脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、
【化２６】
2021505159.tif 000050
【化２７】
2021505159.tif 000051
からなる群から選択され得る。
【０５２２】
ＰＥＧ以外の分子と複合した脂質は、ＰＥＧ−脂質の代わりに使用することもできる。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）−脂質複合体、ポリアミド−脂質複合体（ＡＴＴＡ−脂質複合体など）、およびカチオン性−ポリマー脂質（ＣＰＬ）複合体を、ＰＥＧ−脂質の代わりに、またはそれに加えて使用することができる。
【０５２３】
例示的な複合脂質、すなわち、ＰＥＧ−脂質、（ＰＯＺ）−脂質複合体、ＡＴＴＡ−脂質複合体、およびカチオン性ポリマー−脂質は、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ１９９６／０１０３９２号、同第ＷＯ１９９８／０５１２７８号、同第ＷＯ２００２／０８７５４１号、同第ＷＯ２００５／０２６３７２号、同第ＷＯ２００８／１４７４３８号、同第ＷＯ２００９／０８６５５８号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、同第ＷＯ２０１７／１１７５２８号、同第ＷＯ２０１７／０９９８２３号、同第ＷＯ２０１５／１９９９５２号、同第ＷＯ２０１７／００４１４３号、同第ＷＯ２０１５／０９５３４６号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、および同第ＷＯ２０１０／００６２８２号、米国特許出願公開第ＵＳ２００３／００７７８２９号、同第ＵＳ２００５／０１７５６８２号、同第ＵＳ２００８／００２００５８号、同第ＵＳ２０１１／０１１７１２５号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、同第ＵＳ２０１８／００２８６６４号、同第ＵＳ２０１５／０３７６１１５号、同第ＵＳ２０１６／０３７６２２４号、同第ＵＳ２０１６／０３１７４５８号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、および同第ＵＳ２０１１０１２３４５３号、ならびに米国特許第ＵＳ５，８８５，６１３号、同第ＵＳ６，２８７，５９１号、同第ＵＳ６，３２０，０１７号、および同第ＵＳ６，５８６，５５９号に記載されており、これらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０５２４】
ＰＥＧまたは複合脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０〜２０％（ｍｏｌ）を構成し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧまたは複合脂質含有量は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０．５〜１０％または２〜５％（ｍｏｌ）である。
【０５２５】
イオン化脂質、非カチオン性脂質、ステロール、およびＰＥＧ／複合脂質のモル比は、必要に応じて変化し得る。例えば、脂質粒子は、組成物のモルまたは全重量で３０〜７０％のイオン化脂質、組成物のモルまたは全重量で０〜６０％のコレステロール、組成物のモルまたは全重量で０〜３０％の非カチオン性脂質、および組成物のモルまたは全重量で１〜１０％の複合脂質を含み得る。好ましくは、組成物は、組成物のモルまたは全重量で３０〜４０％のイオン化脂質、組成物のモルまたは全重量で４０〜５０％のコレステロール、および組成物のモルまたは全重量で１０〜２０％の非カチオン性脂質を含む。いくつかの他の実施形態では、組成物は、組成物のモルまたは全重量で５０〜７５％のイオン化脂質、組成物のモルまたは全重量で２０〜４０％のコレステロール、および組成物のモルまたは全重量で５〜１０％の非カチオン性脂質、および組成物のモルまたは全重量で１〜１０％の複合脂質である。組成物は、組成物のモルまたは全重量で６０〜７０％のイオン化脂質、組成物のモルまたは全重量で２５〜３５％のコレステロール、および組成物のモルまたは全重量で５〜１０％の非カチオン性脂質を含有してもよい。組成物はまた、組成物のモルまたは全重量で最大９０％のイオン化脂質、および組成物のモルまたは全重量で２〜１５％の非カチオン性脂質を含有してもよい。製剤はまた、例えば、組成物のモルもしくは全重量で８〜３０％のイオン化脂質、組成物のモルもしくは全重量で５〜３０％の非カチオン性脂質、および組成物のモルもしくは全重量で０〜２０％のコレステロール；組成物のモルもしくは全重量で４〜２５％のイオン化脂質、組成物のモルもしくは全重量で４〜２５％の非カチオン性脂質、組成物のモルもしくは全重量で２〜２５％のコレステロール、組成物のモルもしくは全重量で１０〜３５％の複合脂質、および組成物のモルもしくは全重量で５％のコレステロール；または組成物のモルもしくは全重量で２〜３０％のイオン化脂質、組成物のモルもしくは全重量で２〜３０％の非カチオン性脂質、組成物のモルもしくは全重量で１〜１５％のコレステロール、組成物のモルもしくは全重量で２〜３５％の複合脂質、および組成物のモルもしくは全重量で１〜２０％のコレステロール；またはさらには組成物のモルもしくは全重量で最大９０％のイオン化脂質、および組成物のモルもしくは全重量で２〜１０％の非カチオン性脂質；またはさらには組成物のモルもしくは全重量で１００％のカチオン性脂質を含む、脂質ナノ粒子であってもよい。いくつかの実施形態では、脂質粒子製剤は、イオン化脂質、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。いくつかの他の実施形態では、脂質粒子製剤は、イオン化脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を６０：３８．５：１．５のモル比で含む。
【０５２６】
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、イオン化脂質、非カチオン性脂質（例えば、リン脂質）、ステロール（例えば、コレステロール）、およびＰＥＧ化脂質を含み、脂質のモル比は、イオン化脂質の場合、２０〜７０モルパーセントの範囲であり（目標４０〜６０）、非カチオン性脂質のモルパーセントは、０〜３０の範囲であり（目標０〜１５）、ステロールのモルパーセントは、２０〜７０の範囲であり（目標３０〜５０）、ＰＥＧ化脂質のモルパーセントは、１〜６の範囲である（目標２〜５）。
【０５２７】
ｃｅＤＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、２０１８年９月７日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されており、これはその全体が本明細書に組み込まれ、本明細書に開示される方法および組成物における使用が想定される。
【０５２８】
脂質ナノ粒子の粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用する準弾性光散乱によって判定され得、およそ５０〜１５０ｎｍの直系、およそ５５〜９５ｎｍの直径、またはおよそ７０〜９０ｎｍの直径である。
【０５２９】
製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９−８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８，１７２−１７６（２０１０）を参照。それら両方は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。ｐＫａの好ましい範囲は、約５〜約７である。各カチオン性脂質のｐＫａは、２−（ｐ−トルイジノ）−６−ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質ナノ粒子中で判定される。０．４ｍＭ全脂質の濃度でのＰＢＳ中のカチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−脂質（５０／１０／３８．５／１．５ｍｏｌ％）からなる脂質ナノ粒子は、本明細書および他に記載されるインラインプロセスを使用して調製され得る。ＴＮＳは、蒸留水中の１００μＭストック溶液として調製され得る。小胞は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１３０ｍＭのＮａＣｌを含有する２ｍＬの緩衝溶液中の２４μＭ脂質に希釈され得、ｐＨは、２．５〜１１の範囲である。ＴＮＳ溶液のアリコートを添加して、１μＭの最終濃度にすることができ、続いて渦流混合発光強度を、３２１ｎｍの励起波長および４４５ｎｍの発振波長を使用し、ＳＬＭ  Ａｍｉｎｃｏ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２発光分光光度計において室温で測定する。Ｓ字状最良適合分析は、蛍光データに適用することができ、ｐＫａは、半最適蛍光強度を生じるｐＨとして測定される。
【０５３０】
相対活性は、尾静脈注入を介した投与の４時間後に肝臓内のルシフェラーゼ発現を測定することによって判定され得る。０．３および１．０ｍｇ  ｃｅＤＮＡ／ｋｇの用量で活性を比較し、投与の４時間後に測定された肝臓１ｇあたりのルシフェラーゼｎｇとして表される。
【０５３１】
無制限に、本発明の脂質ナノ粒子は、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターを関心対象の標的部位（例えば、細胞、組織、器官等）を送達するように使用され得る脂質製剤を含む。一般に、脂質ナノ粒子は、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターおよびイオン化脂質またはその塩を含む。
【０５３２】
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、イオン化脂質／非カチオン性脂質／ステロール／複合脂質を、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
【０５３３】
他の態様では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンを含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。
【０５３４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の化合物もまた含まれ得る。それらの化合物は、別々に投与され得るか、または追加の化合物は、本発明の脂質ナノ粒子中に含まれ得る。言い換えれば、脂質ナノ粒子は、ｃｅＤＮＡに加えて他の化合物、または少なくとも第１のものとは異なる第２のｃｅＤＮＡを含有し得る。無制限に、他の追加の化合物は、小さいまたは大きい有機または無機分子、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖類、多糖類、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体およびそれらの誘導体、ペプチド模倣体、核酸、核酸類似体および誘導体、生体物質から作製される抽出物、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。
【０５３５】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の化合物は、治療剤であり得る。治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、所望の治療目的および生物作用に従って選択され得る。例えば、ＬＮＰ内のｃｅＤＮＡが、癌を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗癌剤（例えば、化学療法剤、標的癌療法（小分子、抗体、または抗体−薬物複合体を含むが、これらに限定されない）であり得る。別の実施例では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、感染症を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗菌剤（例えば、抗生物質または抗ウイルス化合物）であり得る。さらに別の実施例では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、免疫疾患または障害を治療するために有用である場合、追加の化合物は、免疫反応を調節する化合物（例えば、免疫抑制剤、免疫刺激性化合物、または１つ以上の特定の免疫経路を調節する化合物）であり得る。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質または異なる化合物（治療剤など）をコードするｃｅＤＮＡなどの、異なる化合物を含有する異なる脂質ナノ粒子の異なるカクテルを、本発明の組成物および方法で使用することができる。
【０５３６】
いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫調節剤である。例えば、追加の化合物は、免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫刺激性である。
【０５３７】
本明細書では、脂質ナノ粒子および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物もまた提供される。
【０５３８】
いくつかの態様では、本開示は、１種以上の薬学的賦形剤をさらに含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、スクロース、トリス、トレハロース、および／またはグリシンをさらに含む。
【０５３９】
一般に、本発明の脂質ナノ粒子は、意図した治療効果を提供するように選択された平均直径を有する。したがって、いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約８５ｎｍ〜約１０５ｎｍ、好ましくは約１００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの態様では、本開示は、一般的なナノ粒子に対する相対サイズでより大きく、約１５０〜２５０ｎｍのサイズである脂質粒子を提供する。脂質ナノ粒子粒径は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）システムを使用して準弾性光散乱によって判定され得る。
【０５４０】
脂質粒子の意図した使用に応じて、構成成分の割合は変化し得、特定の製剤の送達効率は、例えば、エンドソーム放出パラメーター（ＥＲＰ）アッセイを使用して測定され得る。
【０５４１】
ｃｅＤＮＡは、粒子の脂質部分と複合され得るか、または脂質ナノ粒子の脂質位置に封入され得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、脂質ナノ粒子の脂質位置に完全に封入され得、それによって例えば水溶液中のヌクレアーゼによる分解からそれを保護する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、または６０分間のヌクレアーゼへの脂質ナノ粒子の曝露後に実質的に分解されない。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約３０、４５、もしくは６０分、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、もしくは３６時間の血清中の粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。
【０５４２】
ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象、例えばヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。
【０５４３】
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子製剤は、凍結乾燥粉末である。
【０５４４】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの脂質二層を有する固体コア粒子である。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、非二層構造、すなわち非ラメラ（すなわち、非二層）形態を有する。無制限に、非二層形態としては、例えば、３次元管、棒、立方対称性等を挙げることができる。脂質粒子の非ラメラ形態（すなわち、非二層構造）は、当業者に既知であり、当業者によって使用される分析技法を使用して判定され得る。そのような技法としては、低温透過型電子顕微鏡（「Ｃｒｙｏ−ＴＥＭ」）、示差走査熱量計（「ＤＳＣ」）、Ｘ線回折等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、脂質ナノ粒子の形態（ラメラ対非ラメラ）は、容易に評価され、ＵＳ２０１０／０１３０５８８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるＣｒｙｏ−ＴＥＭ分析を使用して容易に評価され、特性化され得る。
【０５４５】
いくつかのさらなる実施形態では、非ラメラ形態を有する脂質ナノ粒子は、高電子密度である。
【０５４６】
いくつかの態様では、本開示は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造のいずれかである脂質ナノ粒子を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡系粒子を含む脂質ナノ粒子を提供する。
【０５４７】
脂質構成成分の組成物および濃度を制御することによって、脂質複合体が脂質粒子外で交換する速度、順に脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。さらに、例えば、ｐＨ、温度、またはイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を変化および／または制御することができる。脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御するために使用され得る他の方法は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。脂質複合体の組成物および濃度を制御することによって、脂質粒径を制御できることも明らかとなるであろう。
【０５４８】
製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９−８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８，１７２−１７６（２０１０）を参照。それら両方は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。ｐＫａの好ましい範囲は、約５〜約７である。カチオン性脂質のｐＫａは、２−（ｐ−トルイジノ）−６−ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質ナノ粒子中で判定され得る。
【０５４９】
脂質粒子中のｃｅＤＮＡの封入は、核酸と会合したときに蛍光を強化した色素を使用する、膜不透過性蛍光色素排除アッセイ、例えばＯｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイまたはＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイを実施することによって判定され得る。一般に、封入は、脂質粒子製剤に色素を添加し、得られた蛍光を測定し、それを少量の非イオン性界面活性剤の添加時に観察される蛍光と比較することによって判定される。脂質二層の界面活性剤媒介性崩壊は、封入されたｃｅＤＮＡを放出し、それが膜不透過性色素と相互作用できるようにする。ｃｅＤＮＡの封入は、Ｅ＝（Ｉ０−Ｉ）／Ｉ０として計算することができ、ＩおよびＩ０は、界面活性剤の添加前および添加後の蛍光強度を指す。
【０５５０】
ＩＸ．ｃｅＤＮＡベクターを送達する方法
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、様々な好適な方法によってインビトロまたはインビボで標的細胞に送達され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、単独で適用または注入され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、トランスフェクション試薬または他の物理的手段の助けなしに細胞に送達され得る。代替として、ｃｅＤＮＡベクターは、細胞へのＤＮＡの進入を促進する任意の当該技術分野において既知のトランスフェクション試薬または他の当該技術分野において既知の物理的手段、例えば、リポソーム、アルコール、高ポリリジン化合物、高アルギニン化合物、リン酸カルシウム、微小胞、マイクロインジェクション、電気穿孔等を使用して送達され得る。
【０５５１】
対照的に、本明細書に開示されるカプシド不含ＡＡＶベクターでの形質導入は、様々な送達試薬を使用し、従来のＡＡＶビリオンで形質導入することが困難である細胞および組織型を効率的に標的とし得る。
【０５５２】
別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＣＮＳ（例えば、脳または眼）に投与される。ｃｅＤＮＡベクターは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉、および前頭葉、皮質、基底核、海馬、および偏桃体を含む大脳）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、ならびに下丘中に導入されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターはまた、網膜、角膜、および／または視神経などの眼の異なる領域に投与されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターは、脳脊髄液中に（例えば、腰椎穿刺によって）送達されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターは、さらに、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）において、ＣＮＳに血管内投与されてもよい。
【０５５３】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、当該技術分野において既知の任意の経路によってＣＮＳの所望の領域（複数可）に投与され得、髄腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）、および眼周囲（例えば、テノン下領域）送達、ならびに運動ニューロンへの逆行性送達を伴う筋肉内送達を含むが、これらに限定されない。
【０５５４】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＣＮＳ中の所望の領域または区画への直接注入（例えば、定位的注入）によって、液体製剤中で投与される。他の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、所望の領域への局所適用によって、またはエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の局所適用によって行われてもよい。さらなる代替例として、ｃｅＤＮＡベクターは、固体の徐放性製剤として投与され得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照）。さらに追加の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを、逆行性輸送に使用して、運動ニューロンが関与する疾患および障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）等）を治療、改善、および／または予防することができる。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、筋組織に送達され、そこからニューロン中に移動し得る。
【０５５５】
Ｘ．ｃｅＤＮＡベクターの追加の使用
本明細書に提供される組成物およびｃｅＤＮＡベクターを使用して、様々な目的のために標的遺伝子を編集することができる。いくつかの実施形態では、得られる導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、導入遺伝子産生物の機能を研究するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、得られる導入遺伝子は、哺乳類対象における疾患状態または障害の治療、予防、または改善に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。得られる導入遺伝子は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、または機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で対象に導入され得る（例えば、発現され得る）。いくつかの実施形態では、得られる導入遺伝子は、発現の増加、遺伝子産物の活性、または遺伝子の不適切な上方調節（得られる導入遺伝子が、その発現を抑制する、または他の方法でその発現を低減させる）に関連した疾患を治療するのに十分な量で対象において発現され得る。さらに他の実施形態では、得られる導入遺伝子は、未変性遺伝子の欠陥コピーを置換または補足する。導入遺伝子は、それ自体が転写される遺伝子のオープンリーディングフレームでなくてもよいことが当業者によって理解されるであろう。代わりに、それは標的遺伝子のプロモーター領域またはリプレッサー領域であり得、ｃｅＤＮＡ遺伝子編集ベクターは、関心対象の遺伝子の発現をそのように調整する結果でそのような領域を修飾し得る。
【０５５６】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳類対象における疾患状態の治療または予防に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。導入遺伝子またはドナー配列は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、または機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で患者に導入され得る（例えば、発現され得る）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子編集分子（例えば、ヌクレアーゼ）である。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓヌクレアーゼ）である。
【０５５７】
ＸＩ．使用方法
本明細書に開示される遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターはまた、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、遺伝子編集分子、例えば、ヌクレアーゼまたはガイド配列）を標的細胞（例えば、宿主細胞）に送達するための方法で使用され得る。この方法は、特に関心対象の標的遺伝子を、それを必要とする対象の細胞に送達するため、および関心対象の標的遺伝子を編集するための方法であり得る。本発明は、遺伝子編集機構の治療効果が生じるように、遺伝子編集分子、例えば、対象の細胞内のｃｅＤＮＡベクターにおいてコードされるヌクレアーゼまたはガイド配列のインビボ発現を可能にする。これらの結果は、ｃｅＤＮＡベクター送達のインビボおよびインビトロ両方の形態で見られる。
【０５５８】
加えて、本発明は、当該関心対象の核酸を含む本発明のｃｅＤＮＡベクターの多回投与を含む、それを必要とする対象の細胞中の遺伝子編集分子の送達のための方法を提供する。本発明のｃｅＤＮＡベクターは、カプシド形成されたウイルスベクターに対して典型的に観察されるような免疫応答を誘導しないため、そのような複数回投与戦略は、ｃｅＤＮＡベースの系においてより大きな成功を収めるであろう。
【０５５９】
ｃｅＤＮＡベクター核酸（複数可）は、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の有害作用なしに、十分なレベルの遺伝子導入および発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、静脈内（例えば、リポソーム製剤）、選択された器官への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、筋肉内、および他の投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。所望される場合、投与経路を組み合わせることができる。
【０５６０】
ｃｅＤＮＡ送達は、遺伝子編集構成成分をコードするすべてのヌクレオチドのｃｅＤＮＡベクター送達に限定されない。例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子編集構成成分の一部を提供するために提供される他の送達系とともに使用されてもよい。本開示に従ってｃｅＤＮＡベクターと組み合わせることができる系の１つの非限定的な例には、治療または遺伝子編集を必要とする宿主細胞にＣａｓ９を別々に送達する系が含まれる。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｄｏｎｏｒ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどのナノ粒子に送達され得るが、ドナー配列などの他の構成成分は、ｃｅＤＮＡによって提供される。
【０５６１】
本発明はまた、治療有効量のｃｅＤＮＡベクターを、任意選択的に薬学的に許容される担体とともに、それを必要とする対象の標的細胞（特に筋細胞または組織）に導入することを含む、対象における疾患を治療する方法を提供する。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実装されるｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な関心対象のヌクレオチド配列を含む。特に、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に結合された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
【０５６２】
本明細書に提供される組成物およびベクターを使用して、様々な目的のために導入遺伝子を送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、導入遺伝子産生物の機能を研究するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳類対象における疾患状態の治療または予防に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。導入遺伝子は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、または機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で患者に導入され得る（例えば、発現され得る）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子編集分子（例えば、ヌクレアーゼ）である。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓヌクレアーゼ）である。
【０５６３】
原則として、発現カセットは、突然変異によって減少もしくは欠如しているタンパク質またはポリペプチドをコードする、または過剰発現が本発明の範囲内であると考えられるときに、治療効果をもたらす任意の遺伝子を標的とする核酸またはヌクレアーゼを含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、メガヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼによって提供される二本鎖切断の後に挿入される訂正ＤＮＡ鎖として使用される、テンプレートヌクレオチド配列を含む。ｃｅＤＮＡベクターは、メガヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼによって提供される二本鎖切断の後に挿入される訂正ＤＮＡ鎖として使用される、テンプレートヌクレオチド配列を含み得る。好ましくは、挿入されていない細菌ＤＮＡは存在せず、好ましくは、本明細書に提供されるｃｅＤＮＡ組成物中に細菌ＤＮＡは存在しない。
【０５６４】
遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクター送達は、１種のｃｅＤＮＡベクターに限定されない。そのようなものとして、別の態様では、異なるドナー配列および／または遺伝子編集配列を含む複数のｃｅＤＮＡベクターは、標的細胞、組織、器官、または対象に同時にまたは順次に送達され得る。したがって、この戦略では、複数の遺伝子の遺伝子編集を同時に行うことができる。遺伝子編集機能の異なる部分を、同時にまたは異なる時間に投与することができ、別々に調節することができる別々のｃｅＤＮＡベクターに分離することも可能である。送達はまた、複数回、および重要なことに、ウイルスカプシドの非存在に起因する抗カプシド宿主免疫反応の欠失を仮定して、後に増加または減少する用量で臨床状況において遺伝子療法のために実施され得る。カプシドが存在しないため、抗カプシド反応は起こらないと予想される。
【０５６５】
本発明はまた、治療有効量の遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターを、任意に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（特に筋細胞または組織）に導入することを含む、対象における疾患を治療する方法を提供する。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実装されるｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な関心対象のヌクレオチド配列を含む。特に、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に結合された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
【０５６６】
ＸＩＩ．治療の方法
本明細書に記載される技術はまた、開示されるｃｅＤＮＡベクターを作製するための方法、ならびにそれを様々な方法（例えば、原位置外、インビトロおよびインビボ適用、方法論、診断手順、ならびに／または遺伝子療法レジメン）で使用する方法を実証する。
【０５６７】
治療有効量の遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターを、任意に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（例えば、筋細胞もしくは組織、または他の罹患した細胞型）に導入することを含む、対象における疾患または障害を治療する方法が、本明細書に提供される。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実装されるｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な関心対象のヌクレオチド配列を含む。特に、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に結合された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
【０５６８】
本発明のｃｅＤＮＡベクターのうちの１つ以上を、１種以上の薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、または賦形剤と一緒に含む、ｃｅＤＮＡベクター組成物および製剤が、本明細書に開示される。そのような組成物は、疾患、傷害、障害、外傷、または機能不全の１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するための、１つ以上の診断的または治療的キットに含まれ得る。一態様では、疾患、傷害、障害、外傷、または機能不全は、ヒト疾患、傷害、障害、外傷、または機能不全である。
【０５６９】
本明細書に記載される技術の別の態様は、診断的または治療的に有効な量のｃｅＤＮＡベクターを、それを必要とする対象に提供するための方法を提供し、この方法は、本明細書に開示されるある量のｃｅＤＮＡベクターを、それを必要とする対象の細胞、組織、または器官に、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現を可能にするのに有効な時間にわたって提供し、それによって診断的または治療的に有効な量のｃｅＤＮＡベクターによって発現されるタンパク質、ペプチド、核酸を対象に提供することを含む。さらなる態様では、対象は、ヒトである。
【０５７０】
本明細書に記載される技術の別の態様は、対象における疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、または外傷のうちの少なくとも１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するための方法を提供する。全体的かつ一般的な意味において、この方法は、少なくとも開示されるｃｅＤＮＡベクターのうちの１つ以上を、それを必要とする対象に、対象の疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、または外傷の１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するための量および時間にわたって投与するステップを含む。さらなる態様では、対象は、ヒトである。
【０５７１】
別の態様は、疾患または疾患状態の１つ以上の症状を治療または低減するためのツールとしての、ｃｅＤＮＡベクターの使用である。欠陥遺伝子が知られているいくつかの遺伝疾患が存在し、典型的に、通常は一般に劣性的に遺伝される酵素の欠乏状態と、調節または構造タンパク質に関与し得るが、典型的には常に優性的に遺伝されるとは限らない不均衡状態との２つのクラスに分類される。欠乏状態の疾患の場合、ｃｅＤＮＡベクターを使用し、導入遺伝子を送達して、置換療法のために正常な遺伝子を罹患した組織に運び入れるとともに、いくつかの実施形態では、アンチセンス突然変異を使用して、疾患の動物モデルを創り出すことができる。不均衡疾患状態の場合、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、モデルシステムにおいて病態を創り出すことができ、次いでこれを使用して、その病態に対処する試みに使用することができる。したがって、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターおよび方法は、遺伝子疾患の治療を可能にする。本明細書で使用される場合、病態は、疾患を引き起こす、またはそれをより重篤にする欠乏または不均衡を部分的または全体的に修繕することによって治療される。
【０５７２】
Ａ．宿主細胞：
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、対象の宿主細胞に導入遺伝子を送達する。いくつかの実施形態では、対象の宿主細胞は、ヒト宿主細胞であり、例えば、血液細胞、幹細胞、造血細胞、ＣＤ３４＋細胞、肝細胞、癌細胞、血管細胞、筋細胞、膵臓細胞、神経細胞、眼もしくは網膜細胞、上皮もしくは内皮細胞、樹状細胞、線維芽細胞、または哺乳類起源の任意の他の細胞（無制限に、肝（すなわち、肝臓）細胞、肺細胞、心臓細胞、膵臓細胞、腸細胞、横隔膜細胞、腎（すなわち、腎臓）細胞、ニューロン細胞、血液細胞、骨髄細胞、もしくは遺伝子療法が企図される対象の任意の１つ以上の選択された組織を含む）が挙げられる。一態様では、対象宿主細胞は、ヒト宿主細胞である。
【０５７３】
本開示はまた、本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターを含む、上記のような組み換え宿主細胞に関する。したがって、当業者には明らかであるように、目的に応じて複数の宿主細胞を使用することができる。ドナー配列を含む構築物またはｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞に導入して、ドナー配列が、前述のように染色体組み込み体として維持されるようにする。宿主細胞という用語は、複製中に生じる突然変異のために親細胞と同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ドナー配列およびその供給源に大きく依存する。宿主細胞はまた、哺乳類、昆虫、植物、または真菌細胞などの真核生物であってもよい。一実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞（例えば、初代細胞、幹細胞、または不死化細胞株）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、欠陥遺伝子の訂正のために、または遺伝子の発現を切除するために遺伝子編集される。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳを使用して、ＮＨＥＪまたはＨＤＲ修復、ならびに他の遺伝子編集系、例えばＺＦＮまたはＴＡＬＥによって、１つ以上のｇＲＮＡでゲノムを編集することができる。宿主細胞は、任意の細胞型、例えば、体細胞または幹細胞、人工多能性幹細胞、または血液細胞、例えば、Ｔ細胞もしくはＢ細胞、または骨髄細胞であり得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、同種細胞である。例えば、Ｔ細胞ゲノム操作は、癌免疫療法、ＨＩＶ療法（例えば、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５などの受容体ノックアウト）などの疾患調整、および免疫不全療法に有用である。Ｂ細胞上のＭＨＣ受容体は、免疫療法の標的となり得る。ゲノム編集された骨髄幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞、または人工多能性幹細胞を、治療用タンパク質の発現のために患者に移植して戻すことができる。
【０５７４】
Ｂ．遺伝子編集ｃｅＤＮＡで治療される例示的な疾患
ｃｅＤＮＡ遺伝子編集ベクターはまた、ドナーＤＮＡがない場合に欠陥遺伝子を訂正するためにも有用であり、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ  ｃｅＤＮａ系では、スプライスアクセプターまたはスプライスドナーを標的とする単一のガイドＲＮＡは、欠陥遺伝子のフレームシフト突然変異を訂正することができ、機能性タンパク質の発現をもたらす。非限定的な例として、機能的なジストロフィンの発現のために、単一のガイドＲＮＡ  ＮＨＥＪを使用してエクソンスキッピングにより、および複数のガイドＲＮＡを使用することにより、デュシェン型筋ジストロフィーのＤＭＤ遺伝子を訂正した。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１６／０２０１０８９を参照されたい。
【０５７５】
ｃｅＤＮＡ遺伝子編集ベクターはまた、遺伝子発現の除去にも有用である。例えば、一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、例えば、フレームシフト突然変異を引き起こすことによって、ナンセンスインデル（例えば、非コード塩基対の挿入または欠失）に標的遺伝子のノックダウンを誘導することができる。非限定的な例として、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５、ＨＩＶ受容体の発現は、ＣＡＳ９  ＲＮＰおよび１つ以上のガイドＲＮＡを使用して、ＮＨＥＪまたはＨＤＲ経路のいずれかを誘導することによって、初代ヒトＴ細胞で良好に除去された。Ｓｃｈｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｎｏｃｋ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃａｓ９  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＰＮＡＳ  １１２（３３）：１０４３７−１０４４２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。この系は、単一のガイドＲＮＡおよびＲＮＰ（例えば、ＣＡＳ９）のみを必要とする。ＣｅＤＮＡベクターを使用して、発現を除去するためにＰＤ−１遺伝子座を標的とすることもできる。ＰＤ−１は、悪性腫瘍で起こる慢性的に活性なＴ細胞に免疫チェックポイント細胞表面受容体を発現する。上記のＳｃｈｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。
【０５７６】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡ遺伝子編集ベクターは、罹患した遺伝子を標的とするベクターを使用することによって、欠陥遺伝子を訂正するために使用される。一実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、ＤＮＡの所望の領域を切除し、フレームシフト突然変異を訂正する、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療する、またはレーバー先天性黒内障の治療においてＬＣＡ１０の突然変異型イントロンを除去することができる。ｃｅＤＮＡベクターを使用した遺伝子編集による治療の影響を受けやすい疾患または障害の非限定的な例は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１４／０１７０７５３号のそれらの遺伝子およびそれらの関連遺伝子とともに表Ａ〜Ｃに示されている。代替実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、セーフハーバー遺伝子、例えば不活性イントロンにおける治療用タンパク質またはレポータータンパク質の発現のための発現カセットの挿入に使用される。ある特定の実施形態では、プロモーターレスカセットが、セーフハーバー遺伝子に挿入される。そのような実施形態では、プロモーターレスカセットは、セーフハーバー遺伝子調節エレメント（プロモーター、エンハンサー、およびシグナル伝達ペプチド）を利用することができ、セーフハーバー遺伝子座での挿入の非限定的な例は、Ｂｌｏｏｄ（２０１５）１２６（１５）：１７７７−１７８４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているアルブミン遺伝子座への挿入である。アルブミンへの挿入は、血液への導入遺伝子の分泌を可能にするという利点を有する（例えば、実施例２２を参照）。さらに、ゲノムセーフハーバー部位は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ，ＥＲ＆Ｓｃｈａｍｂａｃｈ，Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２４（４）：６７８−６８４（２０１６）またはＳａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：５１−５８（２０１２）（各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている技法を使用して決定され得る。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムのセーフハーバー部位（例えば、ＡＡＶＳ１セーフハーバー部位）は、本明細書に記載される方法および組成物とともに使用され得る（例えば、Ｏｃｅｇｕｅｒａ−Ｙａｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０１：４３−５５（２０１６）またはＴｉｙａｂｏｏｎｃｈａｉ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １２（３）：６３０−７（２０１４）を参照。各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、ＡＡＶＳ１ゲノムセーフハーバー部位は、胚性幹細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）における造血特異的導入遺伝子発現および遺伝子サイレンシングの目的のために、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターおよび組成物とともに使用することができる。さらに、染色体１９上のＡＡＳＶ１セーフハーバー部位に挿入するための、合成または市販の相同性指向修復ドナーテンプレートを、本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターまたは組成物とともに使用できることが本明細書において企図される。例えば、相同性指向修復テンプレート、およびガイドＲＮＡは、例えば、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から商業的に購入し、ｃｅＤＮＡベクターにクローニングすることができる。
【０５７７】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子をノックアウトまたは編集するために、例えば、養子細胞移入および／またはＣＡＲ−Ｔ治療の改善のためにＴ細胞を操作するために使用される（例えば、実施例２４を参照）。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に記載されるような遺伝子編集ベクターであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書の他の箇所に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、エンドヌクレアーゼ、テンプレート核酸配列、またはエンドヌクレアーゼおよびテンプレート核酸の組み合わせを含むことができる。Ｔ細胞の治療に関連するノックアウトおよび遺伝子編集の非限定的な例は、ＰＮＡＳ（２０１５）１１２（３３）：１０４３７−１０４４２に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５７８】
遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターまたはその組成物は、任意の遺伝性疾患の治療に使用され得る。非限定的な例として、ｃｅＤＮＡベクターまたはその組成物は、トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、突然変異体タンパク質が神経、心臓、胃腸系等でミスフォールドして凝集する奇病の治療に使用することができる。本明細書に記載される遺伝子編集系を使用して、突然変異体疾患遺伝子（ｍｕｔＴＴＲ）の欠失によって疾患を治療できることが本明細書で企図される。遺伝性疾患のそのような治療は、疾患の進行を止めることができ、確立された疾患の後退または疾患の少なくとも１つの症状の少なくとも１０％の軽減を可能にし得る。
【０５７９】
別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターまたはその組成物は、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ＯＴＣ欠損症）、高アンモニア血症、または新生児もしくは幼児のアンモニアを解毒する能力を損なう他の尿素サイクル障害の治療に使用することができる。先天性代謝のすべての疾患と同様に、野生型対照と比較した酵素活性の部分的回復でさえ（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）、ＯＴＣ欠乏症を有する対象の少なくとも１つの症状ＯＴＣの低減および／または生活の質の改善に十分であり得る。一実施形態では、ＯＴＣをコードする核酸は、インビボタンパク質置換のためにアルブミン内因性プロモーターの後ろに挿入され得る。
【０５８０】
別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターまたはその組成物を、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸配列を送達することによるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の治療において使用して、ＰＫＵ患者に毒性であり得る食事性フェニルアラニンの蓄積を低減することができる。先天性代謝のすべての疾患と同様に、野生型対照と比較した酵素活性の部分的回復でさえ（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）、ＰＫＵを有する対象のＰＫＵの少なくとも１つの症状の低減および／または生活の質の改善に十分であり得る。一実施形態では、フェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードする核酸を、インビボタンパク質置換のためにアルブミン内因性プロモーターの後ろに挿入することができる。
【０５８１】
別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターまたはその組成物は、酵素をコードする核酸配列を送達して、ＧＳＤを有する対象における異常なグリコーゲン合成または分解を訂正することによる、グリコーゲン蓄積症（ＧＳＤ）の治療に使用され得る。本明細書に記載される遺伝子編集方法を使用して訂正され得る酵素の非限定的な例には、グリコーゲンシンターゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、酸−αグルコシダーゼ、グリコーゲン分岐酵素、グリコーゲン分岐酵素、筋肉グリコーゲンホスホリラーゼ、肝臓グリコーゲンホスホリラーゼ、筋肉ホスホフルクトキナーゼが含まれる、ホスホリラーゼキナーゼ、グルコース輸送体−２（ＧＬＵＴ−２）、アルドラーゼＡ、β−エノラーゼ、ホスホグルコムターゼ−１（ＰＧＭ−１）、およびグリコゲニン−１が含まれる。先天性代謝のすべての疾患と同様に、野生型対照と比較した酵素活性の部分的回復でさえ（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）、ＧＳＤを有する対象のＧＳＤの少なくとも１つの症状の低減および／または生活の質の改善に十分であり得る。一実施形態では、異常なグリコーゲン貯蔵を訂正するために酵素をコードする核酸を、インビボタンパク質置換のためにアルブミン内因性プロモーターの後ろに挿入することができる。
【０５８２】
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターはまた、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、ポリＱリピートを含むポリグルタミン病、およびα−１アンチトリプシン欠乏症（Ａ１ＡＴ）のインビボ修復での使用も企図されている。ＬＣＡは、失明を引き起こす稀な先天性眼疾患であり、以下の遺伝子：ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＰＥ６５、ＳＰＡＴＡ７、ＡＩＰＬ１、ＬＣＡ５、ＲＰＧＲＩＰ１、ＣＲＸ、ＣＲＢ１、ＮＭＮＡＴ１、ＣＥＰ２９０、ＩＭＰＤＨ１、ＲＤ３、ＲＤＨ１２、ＬＲＡＴ、ＴＵＬＰ１、ＫＣＮＪ１３、ＧＤＦ６、および／またはＰＲＰＨ２のうちのいずれか１つにおける突然変異によって引き起こされ得る。本明細書では、本明細書に記載される遺伝子編集方法および組成物が、ＬＣＡの症状の原因である遺伝子（複数可）のエラーを訂正するために、ＬＣＡに関連する１つ以上の遺伝子の送達に適合され得ることが企図される。ポリグルタミン病には、歯列核淡蒼球ルイ体萎縮症、ハンチントン病、脊髄および球根筋萎縮症、ならびに脊髄小脳失調１型、２型、３型（マシャド・ジョセフ病としても知られている）、６型、７型、および１７型が含まれるが、これらに限定されない。本明細書では、ｃｅＤＮＡベクターを使用する遺伝子編集方法を使用して、ポリグルタミン病に関連するものなどのトリヌクレオチドリピート伸長（例えば、ポリＱリピート）をもたらすＤＮＡ突然変異を修復できることが特に企図される。Ａ１ＡＴ欠乏症は、α−１アンチトリプシンの産生不良を引き起こす遺伝性疾患であり、血液および肺での酵素活性の低下を招き、次にそれが罹患した対象の肺気腫または慢性閉塞性肺疾患につながり得る。本明細書では、本明細書に概説されるようなｃｅＤＮＡベクターまたはその組成物を使用したＡ１ＡＴ欠損症の修復が本明細書で具体的に企図される。本明細書では、ＬＣＡ、ポリグルタミン疾患、またはＡ１ＡＴ欠乏症の治療のための所望のタンパク質をコードする核酸を、インビボタンパク質置換のためにアルブミン内因性プロモーターの後ろに挿入できることが企図される。
【０５８３】
さらなる実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む組成物を使用して、とりわけウイルス配列、病原体配列、染色体配列、転座接合部（例えば、癌に関連する転座）、非コードＲＮＡ遺伝子またはＲＮＡ配列、疾患関連遺伝子配列の遺伝子を編集することができる。
【０５８４】
本明細書に開示される遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターを使用して、関心対象の任意の核酸または標的遺伝子を編集することができる。標的核酸および標的遺伝子には、ポリペプチドをコードする核酸、または非コード核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲｓ等）、好ましくは治療剤（例えば、医療、診断、もしくは獣医用途用）、または免疫原性ポリペプチド（例えば、ワクチン用）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターによって標的とされる標的核酸または標的遺伝子は、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、またはそれらの任意の組み合わせをコードする。
【０５８５】
特に、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターによる遺伝子編集のための遺伝子標的は、例えば、限定されないが、疾患、機能不全、傷害、および／または障害の１つ以上の症状の治療、予防、および／または改善における使用のための、タンパク質（複数可）、ポリペプチド（複数可）、ペプチド（複数可）、酵素（複数可）、抗体、抗原結合断片、ならびにその変異型、および／または活性断片をコードし得る。一態様では、疾患、機能不全、外傷、傷害、および／または障害は、ヒト疾患、機能不全、外傷、傷害、および／または障害である。
【０５８６】
本明細書に記載されるように、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用する遺伝子編集のための遺伝子標的は、タンパク質もしくはペプチド、または治療核酸配列をコードすることができ、または治療剤としては、１種以上のアゴニスト、アンタゴニスト、抗アポトーシス因子、阻害剤、受容体、サイトカイン、細胞毒、エリスロポエチン剤、糖タンパク質、増殖因子、増殖因子受容体、ホルモン、ホルモン受容体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、神経増殖因子、向神経活性ペプチド、向神経活性ペプチド受容体、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質デカルボキシラーゼ、タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼ阻害剤、酵素、受容体結合タンパク質、輸送タンパク質もしくはその１種以上の阻害剤、セロトニン受容体、またはその１種以上の取り込み阻害剤、セルピン、セルピン受容体、腫瘍抑制剤、診断的分子、化学療法剤、細胞毒、あるいはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５８７】
Ｃ．遺伝子編集のための追加の疾患：
一般に、上記の説明に従って本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して任意の導入遺伝子を送達して、遺伝子発現に関する任意の障害に関連する症状を治療、予防、または改善することができる。例示的な病態としては、嚢胞性線維症（および他の肺の疾患）、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血症および他の血液障害、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、癲癇および他の神経障害、癌、糖尿病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型）、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害、網膜変性疾患（および他の眼の疾患）、ミトコンドリオパチー（例えば、レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、リー症候群、および亜急性硬化性脳炎）、ミオパチー（例えば、顔面肩甲上腕型ミオパチー（ＦＳＨＤ）および心筋症）、固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患等が挙げられるが、これらに限定されない。．いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、代謝障害（例えば、オミチントランスカルバミラーゼ欠損症）を有する個体の治療において有利に使用され得る。
【０５８８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、遺伝子または遺伝子産生物中の突然変異によって引き起こされる疾患または障害を治療、改善、および／または予防することができる。ｃｅＤＮＡベクターで治療され得る例示的な疾患または障害としては、代謝疾患または障害（例えば、ファブリー病、ゴーシェ病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、グリコーゲン蓄積疾患）；尿素サイクル疾患または障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症）；リソソーム蓄積疾患または障害（例えば、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ、ハンター症候群））；肝疾患または障害（例えば、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）；血液疾患または障害（例えば、血友病（ＡおよびＢ）、サラセミア、および貧血症）；癌および腫瘍、ならびに遺伝子疾患または障害（例えば、嚢胞性線維症）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５８９】
なおもさらなる態様として、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを用いて、導入遺伝子（例えば、本明細書に記載される、ホルモンまたは増殖因子をコードする導入遺伝子）の発現レベルを調節することが望ましい状況において、異種ヌクレオチド配列を送達することができる。
【０５９０】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、疾患または障害をもたらす遺伝子産生物の異常なレベルおよび／または機能（例えば、タンパク質中の非存在または欠損）を訂正することができる。ｃｅＤＮＡベクターは、機能的タンパク質を産生し、かつ／またはタンパク質のレベルを修正して、タンパク質中の非存在もしくは欠損によって引き起こされる特定の疾患もしくは障害から生じる症状を緩和もしくは低減するか、または利益を付与することができる。例えば、ＯＴＣ欠損症の治療は、機能的ＯＴＣ酵素を産生することによって達成され得る。血友病ＡおよびＢの治療は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子のレベルを修正することによって達成され得る。ＰＫＵの治療は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素のレベルを修正することによって達成され得る。ファブリー病またはゴーシェ病の治療は、それぞれ機能的αガラクトシダーゼまたはβグルコセレブロシダーゼを産生することによって達成され得る。ＭＬＤまたはＭＰＳＩＩの治療は、それぞれ機能的アリールスルファターゼＡまたはイズロネート−２−スルファターゼを産生することによって達成され得る。嚢胞性線維症の治療は、機能的嚢胞性線維症の膜貫通コンダクタンス調節剤を産生することによって達成され得る。グリコーゲン蓄積疾患の治療は、機能的Ｇ６Ｐａｓｅ酵素機能を回復することによって達成され得る。ＰＦＩＣの治療は、機能的ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、またはＴＪＰ２遺伝子を産生することによって達成され得る。
【０５９１】
代替実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、アンチセンス核酸をインビトロまたはインビボで細胞に提供することができる。例えば、導入遺伝子が、ＲＮＡｉ分子である場合、標的細胞中のアンチセンス核酸またはＲＮＡｉの発現は、細胞による特定のタンパク質の発現を減少させる。したがって、ＲＮＡｉ分子またはアンチセンス核酸である導入遺伝子を投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させることができる。アンチセンス核酸をインビトロで細胞に投与して、細胞生理学を調節する、例えば、細胞または組織培養系を最適化することもできる。
【０５９２】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされる例示的な導入遺伝子としては、Ｘ、リソソーム酵素（例えば、タイ・サックス病に関連するヘキソサミニダーゼＡ、またはハンター症候群／ＭＰＳ  ＩＩに関連するイズロネートスルファターゼ）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、スーパーオキシドジスムターゼ、グロビン、レプチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ならびにサイトカイン（例えば、インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン１２、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン等）、ペプチド増殖因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１および２、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子−３および４、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来増殖因子（ＧＤＮＦ）、形質転換増殖因子−αおよび−β等）、受容体（例えば、腫瘍壊死因子受容体）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、１つ以上の所望の標的に特異的なモノクローナル抗体をコードする。いくつかの例示的な実施形態では、２つ以上の導入遺伝子が、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされる。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、関心対象の２つの異なるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書に定義されるように、全長抗体または抗体断片を含む、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義されるように、抗原結合ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列である。他の例示的な導入遺伝子配列は、自殺遺伝子産生物（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、および腫瘍壊死因子）、癌治療において使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、および腫瘍抑制因子遺伝子産生物をコードする。
【０５９３】
代表的な実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子は、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象における治療のために使用され得る。この方法は、治療、改善、または予防に有効な量の、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを投与することを含み、ｃｅＤＮＡベクターは、異種核酸をコードするジストロフィン、ミニジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ−１、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩκＢ優性突然変異体、サルコスパン、ウトロフィン、マイクロジストロフィン、ラミニン−α２、α−サルコグリカン、β−サルコグリカン、γ−サルコグリカン、δ−サルコグリカン、ＩＧＦ−１、ミオスタチンもしくはミオスタチンポリペプチドに対する抗体もしくは抗体断片、および／またはミオスタチンに対するＲＮＡｉを含む。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書の別の場所に記載されるように、骨格筋、横隔膜筋、および／または心筋に投与され得る。
【０５９４】
いくつかの実施形態では、通常は血液中で循環するポリペプチド（例えば、酵素）もしくは機能的ＲＮＡ（例えば、ＲＮａｉ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の産生のため、あるいは障害（例えば、代謝障害、例えば糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、ＶＩＩＩ）、ムコ多糖障害（例えば、スライ症候群、ハーラー症候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群等）またはリソソーム蓄積症（ゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］、ポンペ病［リソソーム酸α−グルコシダーゼ］もしくはファブリー病［α−ガラクトシダーゼＡ］）またはグリコーゲン蓄積疾患（ポンペ病［リソソーム酸αグルコシダーゼ）を治療、改善、および／または予防するための他の組織への全身送達のため、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、導入遺伝子を骨格筋、心筋、または横隔膜筋に送達することができる。代謝障害を治療、改善、および／または予防するための他の好適なタンパク質は、上に記載される。
【０５９５】
他の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、代謝障害の治療、改善、および／または予防を必要とする対象においてそれを行う方法において、導入遺伝子を送達することができる。例示的な代謝障害およびポリペプチドをコードする導入遺伝子が、本明細書に記載される。任意に、ポリペプチドが分泌される（例えば、その未変性状態の分泌ポリペプチドであるポリペプチド、または例えば、当該技術分野において既知のような分泌シグナル配列との操作可能な会合によって分泌されるように操作されたポリペプチド）。
【０５９６】
本発明の別の態様は、先天性心疾患またはＰＡＤの治療、改善、および／または予防を必要とする対象においてそれを行う方法に関し、その方法は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを哺乳類対象に投与することを含み、ｃｅＤＮＡベクターが、例えば、筋形質小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、血管新生因子、ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ−１）、ホスホランバンなどのＲＮＡｉ；ホスホランバン阻害剤または優性陰性分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅ、ホスホランバン遺伝子を調節する亜鉛フィンガータンパク質、β２−アドレナリン受容体、β２−アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ＰＩ３キナーゼ、カルサルシン、β−アドレナリン受容体キナーゼ阻害剤（βＡＲＫｃｔ）、タンパク質ホスファターゼ１の阻害剤１、Ｓ１００Ａ１、パルバルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇ−タンパク質連結受容体キナーゼ２型ノックダウンに影響を及ぼす分子、例えば、切断された構成的活性型のβＡＲＫｃｔ、Ｐｉｍ−１、ＰＧＣ−１α、ＳＯＤ−１、ＳＯＤ−２、ＥＣ−ＳＯＤ、カリクレイン、ＨＩＦ、チモシン−β４、ｍｉｒ−１、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−２０６、および／またはｍｉｒ−２０８をコードする導入遺伝子を含む。
【０５９７】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを、任意の好適な手段によって、任意に、ｃｅＤＮＡベクターを含む呼吸域粒子のエアロゾル懸濁液を投与することによって、対象の肺に投与することができ、これを対象が吸入する。呼吸域粒子は、液体または固体であり得る。ｃｅＤＮＡベクターを含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に既知であるように、圧力駆動型エアロゾル噴霧器または超音波噴霧器を用いるなど、任意の好適な手段によって産生され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。ｃｅＤＮＡベクターを含む固体粒子のエアロゾルは、薬学分野において既知の技法によって、任意の固体粒子薬剤エアロゾル生成器を用いて同様に産生され得る。
【０５９８】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＣＮＳ（例えば、脳、眼）の組織に投与され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子障害、神経変性障害、精神障害、および腫瘍を含むＣＮＳの疾患を治療、改善、または予防するために投与され得る。ＣＮＳの例示的な疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥーレット症候群、原発性側索硬化症、筋委縮性側索硬化症、進行性筋萎縮、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊椎または頭部傷害に起因する外傷、タイ・サック病、リーシュ・ナイアン病、癲癇、脳梗塞、気分障害（例えば、抑うつ、双極性感情障害、持続性感情障害、二次気分障害）を含む精神障害、統合失調症、薬物依存（例えば、アルコール依存および他の薬物依存）、ノイローゼ（例えば、不安症、強迫性障害、身体表現性障害、解離性障害、悲痛、産後うつ病）、精神病（例えば、幻覚および妄想）、認知症、偏執病、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛障害、摂食または体重障害（例えば、肥満、悪液質、拒食症、および過食症）、ならびにＣＮＳの癌および腫瘍（例えば、下垂体腫瘍）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５９９】
本発明のｃｅＤＮＡベクターを治療、改善、または予防され得る眼障害としては、網膜、後視床路、および／または視神経に関与する眼科障害（例えば、網膜色素変性、糖尿病性網膜症、および他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性、緑内障）が挙げられる。多くの眼科疾患および障害は、（１）血管新生、（２）炎症、および（３）変性の３種類の適応症の１つ以上に関連している。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを用いて、抗血管新生因子、抗炎症性因子、細胞変性を遅らせる、細胞節約を促進する、または細胞増殖を促進する因子、およびそれらの組み合わせを送達することができる。糖尿病性網膜症は、例えば、血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、眼内（例えば、硝子体内）または眼周囲（例えば、テノン嚢下領域内）のいずれかで１つ以上の抗血管新生因子を送達することによって治療され得る。１つ以上の神経栄養因子を、眼内（例えば、硝子体内）または眼周囲のいずれかに共送達することもできる。本発明のｃｅＤＮＡベクターを治療、改善、または予防され得る追加の眼疾患としては、地図状萎縮、血管性または「滲出型」黄斑変性、スタルガルト病、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、アッシャー症候群、弾性線維性偽性黄色腫（ＰＸＥ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性（ＸＬＲＰ）、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、全脈絡膜萎縮、レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）、色盲、錐体杆体変性、フックス角膜内皮変性症、糖尿病黄斑浮腫、ならびに眼の癌および腫瘍が挙げられる。
【０６００】
いくつかの実施形態では、炎症性眼疾患または障害（例えば、ブドウ膜炎）は、本発明のｃｅＤＮＡベクターによって治療、改善、または予防され得る。１つ以上の抗炎症性因子は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの眼内（例えば、硝子体または前眼房）投与によって発現され得る。他の実施形態では、網膜変性（例えば、網膜色素変性）によって特徴付けられる眼疾患または障害は、本発明のｃｅＤＮＡベクターによって治療、改善、または予防され得る。１つ以上の神経栄養因子をコードする本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの眼内（例えば、硝子体）投与を使用して、そのような網膜変性に基づく疾患を治療することができる。いくつかの実施形態では、血管新生および網膜変性（例えば、加齢性黄斑変性）の両方に関与する疾患または障害は、本発明のｃｅＤＮＡベクターで治療され得る。加齢性黄斑変性は、眼内に１つ以上の神経栄養因子および／または眼内もしくは眼周囲（例えば、テノン嚢下領域内）に１つ以上の抗血管新生因子をコードする本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを投与することによって治療され得る。緑内障は、増加した眼圧および網膜神経節細胞の喪失を特徴とする。緑内障の治療は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して興奮毒性損傷から細胞を保護する１種以上の神経保護剤の投与を含む。したがって、そのような薬剤としては、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、サイトカイン、および神経栄養因子は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、眼内、任意に硝子体内に送達され得る。
【０６０１】
他の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、発作を治療する、例えば、発作の徴候、発生率、または重症度を低減することができる。発作の治療的処置の有効性は動作的（例えば、揺動、眼もしくは口のチック）および／または電子記録的手段（ほとんどの発作は、顕著な電子記録的異常を有する）によって評価され得る。したがって、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、経時的に複数の発作によってマークされる癲癇を治療することもできる。代表的な一実施形態では、脳下垂体腫瘍を治療するために、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、ソマトスタチン（またはその活性断片）が脳に投与される。この実施形態に従い、ソマトスタチン（またはその活性断片）をコードする本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、脳下垂体への微小注入によって投与される。同様に、そのような治療を使用して、末端肥大症（脳下垂体からの異常な成長ホルモン分泌）を治療することができる。ソマトスタチンの核酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００３０６）およびアミノ酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１６６、処理された活性ペプチドソマトスタチン−２８およびソマトスタチン−１４を含有する）配列は、当該技術分野において既知のとおりである。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、米国特許第７，０７１，１７２号に記載される分泌シグナルを含む導入遺伝子をコードすることができる。
【０６０２】
本発明の別の態様は、インビボでの対象への全身送達のためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、または他の機能的ＲＮＡ（例えば、リボザイム）を産生するための、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの使用に関する。したがって、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載される）、スプライソソーム媒介性トランススプライシングに影響を及ぼすＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６、米国特許第６，０１３，４８７号、米国特許第６，０８３，７０２号を参照）、遺伝子サイレンシングを媒介する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：２４３１を参照）または他の非翻訳ＲＮＡ、例えば「ガイド」ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：４９２９、Ｙｕａｎらへの米国特許第５，８６９，２４８号）等をコードする導入遺伝子を含み得る。
【０６０３】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターはまた、レポーターポリペプチド（例えば、緑色蛍光タンパク質またはアルカリホスファターゼなどの酵素）をコードする導入遺伝子をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、実験または診断の目的で有用なレポータータンパク質をコードする導入遺伝子は、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、および当該技術分野において周知の他のもののうちのいずれかから選択される。いくつかの態様では、レポーターポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むｃｅＤＮＡベクターを、診断目的のために、またはそれらが投与される対象におけるｃｅＤＮＡベクターの活性のマーカーとして使用することができる。
【０６０４】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、宿主染色体と相同性を共有し、宿主染色体上の遺伝子座と組み替える、導入遺伝子または異種ヌクレオチド配列を含み得る。このアプローチを利用して、宿主細胞中の遺伝子欠陥を訂正することができる。
【０６０５】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、対象における免疫原性ポリペプチドを発現するため、例えば、ワクチン接種のために使用され得る導入遺伝子を含み得る。導入遺伝子は、当該技術分野において既知の関心対象の任意の免疫原をコードし得、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、癌抗原、細菌抗原、ウイルス抗原等からの免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６０６】
Ｄ．遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターを使用した良好な遺伝子編集の試験
当該技術分野で周知のアッセイを使用して、インビトロおよびインビボの両方のモデルにおけるｃｅＤＮＡによる遺伝子編集の効率を試験することができる。ｃｅＤＮＡによる所望の導入遺伝子のノックインまたはノックアウトは、所望の導入遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを測定することによって（例えば、逆転写ＰＣＲ、ウエスタンブロット分析、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））当業者により評価され得る。ｃｅＤＮＡによる核酸変更（例えば、点突然変異、ＤＮＡ領域の欠失）は、ゲノム標的ＤＮＡのディープシーケンシングによって評価することができる。一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、例えば、蛍光顕微鏡法または発光プレートリーダーによりレポータータンパク質の発現を調べることによって、所望の導入遺伝子の発現を評価するために使用できるレポータータンパク質を含む。インビボ適用の場合、タンパク質機能アッセイを使用して、所与の遺伝子および／または遺伝子産物の機能を試験して、遺伝子編集が成功したかどうかを判断することができる。例えば、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子遺伝子（ＣＦＴＲ）の点突然変異は、アニオン（例えば、Ｃｌ−）をアニオンチャネルを介して移動させる能力を阻害し、ｃｅＤＮＡの遺伝子編集能力によって訂正され得ることが想定される。ｃｅＤＮＡの投与後、当業者は、アニオンがアニオンチャネルを通って移動する能力を評価して、ＣＦＴＲの点突然変異が訂正されたかどうかを決定することができる。当業者は、インビトロまたはインビボでタンパク質の機能性を測定するための最良の試験を決定することができるであろう。
【０６０７】
本明細書では、細胞または対象における遺伝子編集の効果は、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１０か月、少なくとも１２か月、少なくとも１８か月、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも２０年にわたって継続し得るか、または永続的であり得ることが企図される。
【０６０８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセット、発現構築物、またはｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子は、宿主細胞に対して最適化されたコドンであり得る。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」または「コドン最適化」という用語は、関心対象の脊椎動物、例えばマウスまたはヒト（例えば、ヒト化）の細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、または相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。典型的には、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化およびカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）または別の公的に入手可能なデータベースを使用して判定され得る。
【０６０９】
ＸＩＩＩ．投与
特定の実施形態では、２回以上の投与（例えば、２、３、４回またはそれ以上の投与）を用いて、様々な間隔の期間にわたって（例えば、毎日、毎週、毎月、毎年等）、所望のレベルの遺伝子発現を達成することができる。
【０６１０】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの例示的な投与形態としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介した）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、内皮内、子宮内（または卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内［骨格、横隔膜、および／または心筋への投与を含む］、胸膜内、脳内、および動脈内）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚および粘膜表面への、ならびに経皮投与）、リンパ内等、ならびに直接組織または器官注入（例えば、肝臓、眼、骨格筋、心筋、横隔膜、筋肉、もしくは脳への）が挙げられる。
【０６１１】
ｃｅＤＮＡベクターの投与は、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、および眼からなる群から選択される部位を含むが、これらに限定されない、対象の任意の部位に対して行われ得る。ｃｅＤＮＡベクターの投与はまた、腫瘍（例えば、腫瘍またはリンパ節内またはその付近）に対するものであり得る。任意の所与の症例における最も好適な経路は、治療、改善、および／または予防される病態の性質および重症度、ならびに使用されている特定のｃｅＤＮＡベクターの性質に依存する。追加として、ｃｅＤＮＡは、単一のベクターまたは複数のｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡカクテル）中に複数の導入遺伝子を投与できるようにする。
【０６１２】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの、本発明に従う骨格筋への投与としては、肢（例えば、上腕、下腕、上肢、および／または下肢）、腰、首、頭（例えば、舌）、咽頭、腹部、骨盤／会陰、および／または指の骨格筋への投与が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内、四肢灌流（任意に、脚および／もしくは腕の単離された四肢灌流、例えば、Ａｒｒｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０５：３４５８−３４６４を参照）ならびに／または直接筋肉内注入によって骨格筋に送達され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを有する対象）に、四肢灌流、任意に単離された四肢灌流（例えば、静脈内または動脈内投与による）によって投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、「流体力学的技法」を用いることなく投与され得る。
【０６１３】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの、心筋への投与としては、左心房、右心房、左心室、右心室、および／または中隔への投与が挙げられる。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、静脈内投与、大動脈内投与などの動脈内投与、直接心臓注入（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室への）、および／または冠動脈灌流によって心筋に送達され得る。横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。一実施形態では、投与は、平滑筋内、その付近、および／またはその上に存在する内皮細胞に対して行われ得る。
【０６１４】
いくつかの実施形態では、本発明によるｃｅＤＮＡベクターは、骨格筋、横隔膜筋、および／または心筋に投与される（例えば、筋ジストロフィーまたは心疾患（例えば、ＰＡＤもしくはうっ血性心不全）を治療、改善、および／または予防するため）。
【０６１５】
Ａ．エクスビボ治療
いくつかの実施形態では、細胞を対象から除去し、ｃｅＤＮＡベクターをその中に導入した後、細胞を対象に戻す。エクスビボでの治療のために対象から細胞を除去し、続いて対象に戻す方法は、当該技術分野において既知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。代替として、ｃｅＤＮＡベクターは、別の対象からの細胞中に、培養細胞中に、または任意の他の好適な源からの細胞中に導入され、これらの細胞は、それを必要とする対象に投与される。
【０６１６】
ｃｅＤＮＡベクターで形質導入された細胞は、好ましくは薬学的担体と組み合わせて、「治療有効量」で対象に投与される。当業者であれば、いくらかの利益が対象にもたらされる限り、治療効果が完全または治癒的である必要はないことを理解するであろう。
【０６１７】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、望ましくはインビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞中で産生される任意のポリペプチドである、導入遺伝子（時には異種ヌクレオチド配列と呼ばれる）をコードすることができる。例えば、本明細書で論じられる治療方法におけるｃｅＤＮＡベクターの使用とは対照的に、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、抗原またはワクチンの産生のために、培養した細胞、およびそれから単離された発現遺伝子産物中に導入されてもよい。
【０６１８】
ｃｅＤＮＡベクターは、獣医用途および医療用途の両方に使用することができる。上記のエクスビボ遺伝子送達方法に好適な対象としては、鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、七面鳥、およびキジ）および哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、およびウサギ類）が挙げられ、哺乳動物が好ましい。ヒト対象が最も好ましい。ヒト対象は、新生児、幼児、少年、および成人を含む。
【０６１９】
本明細書に記載される技術の一態様は、導入遺伝子を細胞に送達する方法に関する。典型的には、インビトロ方法の場合、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される方法ならびに当該技術分野において既知の他の方法を使用して導入され得る。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは生物学的有効量で細胞に投与される。ｃｅＤＮＡベクターがインビボで細胞に（例えば、対象に）投与される場合、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的有効量は、標的細胞における導入遺伝子の形質導入および発現をもたらすのに十分な量である。
【０６２０】
Ｂ．用量範囲
インビボおよび／またはインビトロアッセイを任意に用いて、使用のための最適投与量範囲を特定するのを助けることができる。製剤に用いられる正確な用量はまた、投与経路および病態の重症度に依存し、当業者の判断および各対象の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から推定され得る。
【０６２１】
ｃｅＤＮＡベクターは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の副作用なしに十分なレベルの遺伝子導入および発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、「投与」セクションで上述されるもの、例えば選択された器官への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（鼻腔内および気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の非経口投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与経路は、所望の場合、組み合わせることができる。
【０６２２】
特定の「治療効果」を達成するために必要なｃｅＤＮＡベクターの量の用量は、核酸投与の経路、治療効果を達成するために必要な遺伝子またはＲＮＡ発現のレベル、治療される特定の疾患または障害、および遺伝子（複数可）、ＲＮＡ産物（複数可）、または得られる発現タンパク質（複数可）の安定性を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に基づいて変化する。当業者は、前述の因子ならびに当該技術分野において周知の他の因子に基づいて、特定疾患または障害を有する患者を治療するためのｃｅＤＮＡベクター用量範囲を容易に判定することができる。
【０６２３】
最適な治療反応を提供するように、投与量レジームを調整することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、繰り返し投与することができ、例えば、いくつかの用量が毎日投与され得るか、または治療状況の急迫によって示されるように、用量を比例的に低減することができる。当業者は、オリゴヌクレオチドが細胞に投与されるか、または対象に投与されるかにかかわらず、対象オリゴヌクレオチドの投与の適切な用量およびスケジュールを容易に判定することができる。
【０６２４】
「治療有効量」は、臨床治験を通じて判定され得る比較的広い範囲内に含まれ、特定の用途に依存する（神経細胞は、極少量を必要とするが、全身注入は、多量を必要とする）。例えば、ヒト対象の骨格筋または心筋への直接インビボ注入の場合、治療有効量は、およそ約１μｇ〜１００ｇのｃｅＤＮＡベクターとなる。ｃｅＤＮＡベクターを送達するためにエキソソームまたは微粒子が使用される場合、治療有効量は、経験的に判定され得るが、１μｇ〜約１００ｇのベクターを送達することが予想される。さらに、治療上有効な量とは、疾患の１つ以上の症状の低減をもたらすが、オフターゲット遺伝子の遺伝子編集には至らない、標的遺伝子の編集に影響を与えるのに十分な量の遺伝子編集分子を発現するｃｅＤＮＡベクターの量である。
【０６２５】
薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の配合は、様々な治療レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するための好適な投与および治療レジメンの開発と同様に、当業者に周知である。
【０６２６】
インビトロトランスフェクションの場合、細胞（１×１０６細胞）に送達されるｃｅＤＮＡベクターの有効量は、およそ０．１〜１００μｇのｃｅＤＮＡベクター、好ましくは１〜２０μｇ、より好ましくは１〜１５μｇまたは８〜１０μｇとなる。より大きなｃｅＤＮＡベクターは、より多い用量を必要とする。エキソソームまたは微粒子が使用される場合、有効なインビトロ用量は、経験的に判定されるが、一般に同量のｃｅＤＮＡベクターを送達することが意図される。
【０６２７】
治療は、単一用量または複数用量の投与を必要とし得る。いくつかの実施形態では、複数の用量を対象に投与することができ、ｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシドの非存在に起因して、抗カプシド宿主免疫反応を誘起する誘起しないため、実際に、必要に応じて複数の用量を投与することができる。そのようなものとして、当業者は、適切な用量数を判定することができる。投与される用量数は、例えば、およそ１〜１００、好ましくは２〜２０用量であり得る。
【０６２８】
任意の特定の理論に束縛されるものではないが、本開示によって記載されるｃｅＤＮＡベクターの投与によって誘起される典型的な抗ウイルス免疫反応の欠失（すなわち、カプシド構成成分の非存在）は、複数の場合にｃｅＤＮＡベクターを宿主に投与できるようになる。いくつかの実施形態では、異種核酸が対象に送達される場合の数は、２〜１０回の範囲内（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回）である。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１０回より多く対象に送達される。
【０６２９】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦日（例えば、２４時間）あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、２、３、４、５、６、または７暦日あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、歴週（例えば、７歴日）あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、２週間に１回（例えば、２暦週期間に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦月あたり１回（例えば、３０歴日に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、６暦月あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、歴年（例えば、３６５日または閏年では３６６日）あたり１回だけ対象に投与される。
【０６３０】
Ｃ．単位剤形
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、単位剤形で便宜的に提示され得る。単位剤形は、典型的に、薬学的組成物の１つ以上の投与経路に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、蒸発器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、または舌下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、または皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内または脳室内投与のために適合される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体材料と複合され得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となる。
【０６３１】
ＸＩＶ．様々な適用
本明細書に提供される組成物およびｃｅＤＮＡベクターを使用して、上記のような様々な目的のために遺伝子編集分子を送達することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集分子は、研究目的のために、例えば、１つ以上の突然変異または訂正された遺伝子配列を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、標的遺伝子の機能を研究するために編集される、標的遺伝子、例えばタンパク質または機能的ＲＮＡを標的とする。別の実施例では、遺伝子編集分子を使用して、タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする標的遺伝子を遺伝子編集して、疾患の動物モデルを作成する。
【０６３２】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集分子の標的遺伝子は、哺乳類対象における疾患状態の治療、改善、または予防に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。遺伝子編集分子は、ｃｅＤＮＡベクターを介して、異常な遺伝子配列に関連する疾患を治療するのに十分な量で患者に転送（例えば、発現）され得、これは標的遺伝子の発現の低減、発現の欠如、または機能不全のうちのいずれか１つ以上をもたらし得る。
【０６３３】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、診断およびスクリーニング方法における使用のために想定され、遺伝子編集分子は、細胞培養系または代替としてトランスジェニック動物モデルにおいて一時的または安定して発現される。
【０６３４】
本明細書に記載される技術の別の態様は、哺乳類細胞の集団を形質導入する方法を提供する。全体的かつ一般的な意味において、この方法は、少なくとも有効量の本明細書に開示されるｃｅＤＮＡのうちの１つ以上を含む組成物を、その集団の１つ以上の細胞に導入するステップを含む。
【０６３５】
追加として、本発明は、１つ以上の追加の成分で配合されるか、またはそれらの使用のために１つ以上の指示で調製された、開示されるｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡ組成物の１つ以上を含む、組成物、ならびに治療および／または診断キットを提供する。
【０６３６】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターが投与される細胞は、任意のタイプのものであり得、神経細胞（末梢および中枢神経系の細胞、特に脳細胞を含む）、肺細胞、腎細胞、上皮細胞（例えば、胃および呼吸器上皮細胞）、筋細胞、樹状細胞、膵細胞（島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。代替として、細胞は、任意の前駆細胞であり得る。さらなる代替として、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝幹細胞）であり得る。なおもさらなる代替として、細胞は、癌または腫瘍細胞であり得る。さらに、細胞は、上に示されるように、任意の種の起源に由来し得る。
【０６３７】
いくつかの実施形態では、本出願は、以下のパラグラフのうちのいずれかに定義され得る。
１．（ｉ）少なくとも１つの変更されたＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）；（ｉｉ）５’相同性アーム、ドナー配列、および３’相同性アームを含む第１のヌクレオチド配列を含み、少なくともドナー配列が、遺伝子編集機能を有する、ｃｅＤＮＡベクター。
２．第１のヌクレオチド配列が、第１のヌクレオチド配列の上流に第２のヌクレオチド配列をさらに含み、第２のヌクレオチド配列が、遺伝子調節配列、およびヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、遺伝子調節配列が、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されている、パラグラフ１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３．ヌクレアーゼが、配列特異的ヌクレアーゼである、パラグラフ１または２に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４．配列特異的ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、パラグラフ１〜３のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
５．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、ＣａｓまたはＣａｓ９である、パラグラフ１〜４のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
６．調節配列が、エンハンサーおよびプロモーターを含み、第２の核酸配列が、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の上流のイントロン配列を含み、イントロンが、ヌクレアーゼ切断部位を含み、プロモーターが、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されている、パラグラフ１〜５のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
７．ガイド配列および／またはアクチベーターＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列を含む第３のヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ１〜６のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
８．第３のヌクレオチド配列が、ガイド配列および／またはアクチベーターＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されたプロモーターをさらに含む、パラグラフ１〜７のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
９．ポリＡ部位が、上流にあり、当該相同性アームに近接している、パラグラフ１〜８のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１０．ドナー配列が、５’相同性アームまたは３’相同性アームに対して外来である、パラグラフ１〜９のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１１．５’相同性アームが、染色体上のヌクレアーゼ切断部位の上流のヌクレオチド配列と相同である、パラグラフ１〜１０のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１２．３’相同性アームが、染色体上のヌクレアーゼ切断部位の下流のヌクレオチド配列と相同である、パラグラフ１〜１１のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１３．５’相同性アームまたは３’相同性アームが、少なくとも１つの変更されたＩＴＲの近位にある、パラグラフ１〜１２のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１４．５’相同性アームおよび３’相同性アームが、約２５０〜２０００ｂｐである、パラグラフ１〜１３のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１５．ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が、ｃＤＮＡである、パラグラフ１〜１４のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１６．プロモーターが、ＣＡＧプロモーターである、パラグラフ１〜１５のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１７．プロモーターが、Ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｕ６、またはＨ１である、パラグラフ１〜１７のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
１８．宿主細胞の染色体上の所定の挿入部位にドナー配列を挿入する方法であって、少なくとも１つの変更されたＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞に導入することを含み、ｃｅＤＮＡベクターが、５’相同性アーム、ドナー配列、および３’相同性アームを含むヌクレオチド配列を含み、ドナー配列が、相同組み換えにより、挿入部位でまたは挿入部位に隣接して染色体に挿入される、方法。
１９．挿入部位を認識するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を細胞に導入することをさらに含む、パラグラフ１８に記載の方法。
２０．挿入部位でまたは挿入部位に隣接して染色体を切断する配列特異的ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を細胞に導入することをさらに含む、パラグラフ１８または１９に記載の方法。
２１．配列特異的ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、パラグラフ１８〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、ＣａｓまたはＣａｓ９である、パラグラフ１８〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．導入するステップが、カプシドを含まない、パラグラフ１８〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．５’相同性アームが、染色体上のヌクレアーゼ切断部位の上流の配列と相同である、パラグラフ１８〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．３’相同性アームが、染色体上のヌクレアーゼ切断部位の下流の配列と相同である、パラグラフ１８〜２４のいずれかに記載の方法。
２６．５’相同性アームまたは３’相同性アームが、変更型ＩＴＲの近位にある、パラグラフ１８に記載の方法。
２７．５’相同性アームおよび３’相同性アームが、少なくとも約５０〜２０００塩基対である、パラグラフ１８〜２６のいずれかに記載の方法。
２８．ヌクレオチド配列が、５’相同性アームの上流の５’隣接配列および３’相同性アームの下流の３’隣接配列をさらに含む、パラグラフ１８〜２７のいずれかに記載の方法。
２９．動物の染色体上の所定の挿入部位に挿入されたドナー配列を含む遺伝子操作された動物を生成する方法であって、ａ）パラグラフ１８に記載の染色体上の所定の挿入部位に挿入されたドナー配列を有する細胞を生成することと、ｂ）ａ）によって生成された細胞を担体動物に導入して、遺伝子操作された動物を産生する、方法。
３０．細胞が、接合体または多能性幹細胞である、パラグラフ２９に記載の方法。
３１．パラグラフ２９または３０に記載の方法によって生成された遺伝子操作された動物。
３２．細胞内の染色体上の挿入部位にドナー配列を挿入するためのキットであって、（ｉ）少なくとも１つの変更されたＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、および（ｉｉ）５’相同性アーム、ドナー配列、および３’相同性アームを含む第１のヌクレオチド配列であって、ドナー配列が、遺伝子編集機能を有する、第１のヌクレオチドを含む、第１のｃｅＤＮＡベクターと、（ｂ）（ｉ）少なくとも１つの変更されたＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、および（ｉｉ）ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、第２のｃｅＤＮＡベクターと、を含み、５’相同性アームが、染色体上のヌクレアーゼ切断部位の上流の配列に相同であり、３’相同性アームが、染色体上のヌクレアーゼ切断部位の下流の配列に相同であり、５’相同性アームまたは３’相同性アームが、変更されたＩＴＲの近位にある、キット。
３３．宿主細胞の染色体上の所定の挿入部位にドナー配列を挿入する方法であって、（ａ）少なくとも１つの変更されたＩＴＲを有する第１のｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞に導入することであって、ｃｅＤＮＡベクターが、５’相同性アーム、ドナー配列、および３’相同性アームを含む第１の直鎖状核酸を含む、導入することと、（ｂ）少なくとも１つの変更されたＩＴＲを有する第２のｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞に導入することであって、第２のｃｅＤＮＡベクターが、挿入部位でまたは挿入部位に隣接して染色体を切断する配列特異的ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第２の直鎖状核酸を含む、導入することと、を含み、ドナー配列が、相同組み換えにより、挿入部位でまたは挿入部位に隣接して染色体に挿入される、方法。
３４．第２のｃｅＤＮＡベクターが、挿入部位を認識するガイド配列をコードする第３のヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ１８〜３３のいずれかに記載の方法。
３５．導入遺伝子強化エレメント、および下流にありかつ３’相同性アームに近接するポリＡ  ｃｉｔｅのうちの少なくとも１つをさらに含む、パラグラフ１〜１７のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
３６．変更されたＩＴＲに近接する代替ヌクレアーゼ標的配列をさらに含む、パラグラフ１〜１７または３５のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
３７．上流にありかつ３’相同性アームに近接する２Ａおよび選択マーカー部位をさらに含む、パラグラフ１〜１７または３５〜３６のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクター。
３８．隣接する末端反復（ＴＲ）、および少なくとも１つの遺伝子編集核酸配列を含み、ゼクターが、直鎖状閉端二重鎖ＤＮＡである、ｃｅＤＮＡ核酸ベクター組成物。
３９．末端反復が、逆位ＴＲ（ＩＴＲ）である、パラグラフ３８に記載の組成物。
４０．末端反復のうちの少なくとも１つが修飾されている、パラグラフ３８または３９に記載の組成物。
４１．ベクターが、核酸変性条件下の一本鎖環状ＤＮＡである、パラグラフ３８〜４０のいずれかに記載の組成物。
４２．遺伝子編集核酸配列が、配列特異的ヌクレアーゼ、１つ以上のガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、またはＣＲＩＳＰＲｉもしくはＣＲＩＳＰＲａ系のための非活性化ＣＡＳ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子編集分子をコードする、パラグラフ３８〜４１のいずれかに記載の組成物。
４３．配列特異的ヌクレアーゼが、ＴＡＬヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＡＳ９、ｃｐｆ１、ｄＣＡＳ９、ｎＣＡＳ９）を含む、パラグラフ３８〜４２のいずれかに記載の組成物。
４４．少なくとも２つの修飾型ＩＴＲをさらに含む、パラグラフ３８〜４３のいずれかに記載の組成物。
４５．関心対象の核酸をさらに含む、パラグラフ３８〜４４のいずれかに記載の組成物。
４６．遺伝子編集核酸配列が、相同性指向修復テンプレートである、パラグラフ３８〜４５のいずれかに記載の組成物。
４７．相同性指向修復テンプレートが、５’相同性アーム、ドナー配列、および３’相同性アームを含む、パラグラフ３８〜４６のいずれかに記載の組成物。
４８．エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列をさらに含み、エンドヌクレアーゼが、標的遺伝子のＤＮＡ上の特定のエンドヌクレアーゼ部位またはｃｅＤＮＡベクター上の標的部位で切断またはニッキングする、パラグラフ３８〜４７のいずれかに記載の組成物。
４９．５’相同性アームが、染色体上のＤＮＡヌクレアーゼ部位の上流のヌクレオチド配列と相同である、パラグラフ３８〜４８のいずれかに記載の組成物。
５０．３’相同性アームが、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ部位の下流のヌクレオチド配列と相同である、パラグラフ３８〜４９のいずれかに記載の組成物。
５１．相同性アームが、各々約２５０〜２０００ｂｐである、パラグラフ３８〜４０のいずれかに記載の組成物。
５２．ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＴＡＬヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９もしくはＣｐｆ１）を含む、パラグラフ３８〜５２のいずれかに記載の組成物。
５３．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ酵素を含む、パラグラフ３８〜５２のいずれかに記載の組成物。
５４．Ｃａｓ酵素が、Ｃａｓ９である、パラグラフ３８〜５３のいずれかに記載の組成物。
５５．Ｃａｓ酵素が、ニッキングＣａｓ９（ｎＣａｓ９）である、パラグラフ３８〜５３のいずれかに記載の組成物。
５６．ｎＣａｓ９が、ＣａｓのＨＮＨまたはＲｕＶｃドメインに突然変異を含む、パラグラフ３８〜５５のいずれかに記載の組成物。
５７．Ｃａｓ酵素が、標的遺伝子のプロモーター領域を標的とするｇＲＮＡと複合体を形成する不活性化Ｃａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）である、パラグラフ３８〜５３のいずれかに記載の組成物。
５８．ＫＲＡＢエフェクタードメインをさらに含む、パラグラフ３８〜５７のいずれかに記載の組成物。
５９．ｄＣａｓが、プロモーター領域に向けられ得る異種転写活性化ドメインに融合される、パラグラフ３８〜５７のいずれかに記載の組成物。
６０．ｄＣａｓ融合が、標的遺伝子の発現を上方調節するために追加のトランス活性化ドメインを動員するガイドＲＮＡによって標的遺伝子のプロモーター領域に向けられる、パラグラフ３８〜５９のいずれかに記載の組成物。
６１．ｄＣａｓが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ｄＣａｓ９である、パラグラフ３８〜５７のいずれかに記載の組成物。
６２．ガイドＲＮＡ配列が、標的遺伝子のプロモーターの近位を標的とし、ＣＲＩＳＰＲが、標的遺伝子をサイレンシングする（ＣＲＩＳＰＲｉ系）、パラグラフ３８〜６１のいずれかに記載の組成物。
６３．ガイドＲＮＡ配列が、標的遺伝子の転写開始部位を標的とし、標的遺伝子を活性化する（ＣＲＩＳＰＲａ系）、パラグラフ３８〜６１のいずれかに記載の組成物。
６４．ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸をさらに含む、パラグラフ３８〜６３のいずれかに記載の組成物。
６５．ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が、欠陥遺伝子のスプライスアクセプターまたはスプライスドナー部位を標的として、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および欠陥遺伝子の訂正をもたらす、パラグラフ３８〜６４のいずれかに記載の組成物。
６６．ベクターが、１つのガイドＲＮＡ配列の複数のコピーをコードする、パラグラフ３８〜６５のいずれかに記載の組成物。
６７．ヌクレアーゼをコードする核酸配列に操作可能に連結された調節配列をさらに含む、パラグラフ３８〜６６のいずれかに記載の組成物。
６８．調節配列が、エンハンサーおよび／またはプロモーターを含む、パラグラフ３８〜６７のいずれかに記載の組成物。
６９．プロモーターが、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列に操作可能に連結され、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列が、エンドヌクレアーゼ配列の上流にイントロン配列をさらに含み、イントロンが、ヌクレアーゼ切断部位を含む、パラグラフ３８〜６８のいずれかに記載の組成物。
７０．ポリＡ部位が、上流にありかつ５’相同性アームに近接している、パラグラフ３８〜６９のいずれかに記載の組成物。
７１．ドナー配列が、５’相同性アームまたは３’相同性アームに対して外来である、パラグラフ４７＊＊＊のいずれかに記載の組成物。
７２．５’相同性アームまたは３’相同性アームが、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲの近位にある、パラグラフ４７に記載の組成物。
７３．ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が、ｃＤＮＡである、パラグラフ４８に記載の組成物。
７４．プロモーターが、ＣＡＧプロモーターである、パラグラフ６８に記載の組成物。
７５．プロモーターが、Ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｕ６、またはＨ１である、パラグラフ６８に記載の組成物。
７６．パラグラフ３８〜７５のいずれかに記載のベクターを含む、細胞。
７７．パラグラフ３８〜７５のいずれかに記載のベクターおよび脂質を含む、組成物。
７８．パラグラフ３８〜７５のいずれかに記載のベクター、またはパラグラフ７６に記載の細胞を含む、キット。
７９．細胞を遺伝子編集系と接触させることを含む、ゲノム編集のための方法であって、遺伝子編集系の１つ以上の構成成分が、細胞を閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）核酸ベクター組成物と接触させることによって細胞に送達され、ｃｅＤＮＡ核酸ベクター組成物が、隣接する末端反復（ＴＲ）配列と、任意に、少なくとも１つの標的遺伝子に相補的な領域を有する少なくとも１つの遺伝子編集核酸配列を含む、直線状閉端二重鎖ＤＮＡである、方法。
８０．末端反復が、逆位ＴＲ（ＩＴＲ）である、パラグラフ７９に記載の方法。
８１．ＩＴＲが、修飾型ＩＴＲである、パラグラフ７９または８０に記載の方法。
８２．遺伝子編集系が、ＴＡＬＥＮ系、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系、およびメガヌクレアーゼ系からなる群から選択される、パラグラフ７９〜８１のいずれかに記載の方法。
８３．少なくとも１つの遺伝子編集核酸配列が、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、ＴＡＬＥＮ、およびジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）からなる群から選択される遺伝子編集分子をコードする、パラグラフ７９〜８２のいずれかに記載の方法。
８４．単一ｃｅＤＮＡベクターが、遺伝子編集系のすべての構成成分を含む、パラグラフ７９〜８３のいずれかに記載の方法。
８５．細胞を接触させるステップが、遺伝子編集系と組み合わせてトランスフェクション試薬または脂質試薬を投与することをさらに含む、パラグラフ７９〜８４のいずれかに記載の方法。
８６．遺伝子編集系が、トランスフェクション試薬またはリポソーム試薬をさらに含む、パラグラフ７９〜８５のいずれかに記載の方法。
８７．ｃｅＤＮＡ核酸ベクター組成物が、パラグラフ１〜７７のいずれか１つである、パラグラフ７９〜８６のいずれかに記載の方法。
８８．標的遺伝子の発現が変更されている、パラグラフ７９〜８７のいずれかに記載の方法。
８９．接触される細胞が、真核細胞である、パラグラフ７９〜８８のいずれかに記載の方法。
９０．Ｃａｓタンパク質が、真核細胞における発現のためにコドン最適化される、パラグラフ７９〜８８のいずれかに記載の方法。
９１．標的遺伝子を編集するのに適した条件下、かつそのために十分な時間にわたって、パラグラフ１〜７７のいずれか１つに記載の有効量のｃｅＤＮＡ組成物を細胞に投与することを含む、ゲノム編集の方法。
９２．標的遺伝子が、１つ以上のガイドＲＮＡ配列を使用して標的化され、相同性修復（ＨＤＲ）ドナーテンプレートの存在下でＨＤＲにより編集される遺伝子である、パラグラフ７９〜９１のいずれかに記載の方法。
９３．標的遺伝子が、１つのガイドＲＮＡ配列を使用して標的化され、標的遺伝子が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって編集される、パラグラフ７９〜９１のいずれかに記載の方法。
９４．方法が、疾患に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）を訂正するためにインビボで行われる、パラグラフ７９〜９３のいずれか１つに記載の方法。
９５．疾患が、鎌状赤血球貧血、遺伝性ヘモクロマトーシス、または癌遺伝性失明を含む、パラグラフ９４に記載の方法。
９６．少なくとも２つの異なるＣａｓタンパク質が、ｃｅＤＮＡベクターに存在し、Ｃａｓタンパク質のうちの１つが、触媒的に不活性（Ｃａｓ−ｉ）であり、Ｃａｓ−Ｉに関連するガイドＲＮＡが、標的細胞のプロモーターを標的とし、Ｃａｓ−ＩをコードするＤＮＡが、誘導性プロモーターの制御下にあるため、所望の時点で標的遺伝子の発現を止めることができる、パラグラフ９１に記載の方法。
９７．細胞の標的遺伝子における単一ヌクレオチド塩基対を編集するための方法であって、当該方法が、細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系と接触させることを含み、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系の１つ以上の構成成分が、細胞を閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）核酸ベクター組成物と接触させることによって細胞に送達され、ｃｅＤＮＡ核酸ベクター組成物が、隣接する末端反復（ＴＲ）配列、および少なくとも１つの標的遺伝子またはその標的遺伝子の調節配列に相補的な領域を有する少なくとも１つの遺伝子編集核酸配列を含む、直線状閉端二重鎖ＤＮＡであり、
ベクターから発現されたＣａｓタンパク質が、触媒的に不活性であり、塩基編集部分に融合されており、
方法が、標的遺伝子の発現を調整するのに十分な条件下、かつそのために十分な時間にわたって実施される、方法。
９８．末端反復が、逆位ＴＲ（ＩＴＲ）である、パラグラフ７９〜９７のいずれかに記載の方法。
９９．隣接する末端反復の少なくとも１つが、修飾された末端反復である、パラグラフ７９〜９８のいずれかに記載の方法。
１００．塩基編集部分が、一本鎖特異的シチジンデアミナーゼ、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤、またはｔＲＮＡアデノシンデアミナーゼを含む、パラグラフ７９〜９９のいずれかに記載の方法。
１０１．ベクターから発現される触媒的に不活性なＣａｓタンパク質が、ｄＣａｓ９である、パラグラフ７９〜１００のいずれかに記載の方法。
１０２．ｃｅＤＮＡベクターが、パラグラフ１〜７７のいずれかに記載の構造を有し、接触される細胞が、Ｔ細胞またはＣＤ３４＋である、パラグラフ７９〜１０１のいずれかに記載の方法。
１０３．標的遺伝子が、プログラム死タンパク質（ＰＤ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）をコードする、パラグラフ７９〜１０２のいずれかに記載の方法。
１０４．パラグラフ１０２により産生された細胞を、それを必要とする対象に投与することをさらに含む、パラグラフ７９−１０３のいずれかに記載の方法。
１０５．治療を必要とする対象が、遺伝性疾患、ウイルス感染、細菌感染、癌、または自己免疫疾患を有する、パラグラフ１０４に記載の方法。
１０６．細胞における２つ以上の標的遺伝子の発現を調整する方法であって、
（ｉ）隣接する末端反復（ＴＲ）配列、および２つ以上の標的遺伝子に相補的な少なくとも２つのガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含むベクターを含む組成物であって、ベクターが、直鎖状閉端二重鎖ＤＮＡである、組成物と、
（ｉｉ）隣接する末端反復（ＴＲ）配列、および各々がガイドＲＮＡと関連し、２つ以上の標的遺伝子に結合する少なくとも２つの触媒的に不活性なＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むベクターを含む第２の組成物であって、ベクターが、直鎖状閉端二重鎖ＤＮＡベクターである、第２の組成物と、
（ｉｉｉ）隣接する末端反復（ＴＲ）配列、および少なくとも２つの転写調節因子タンパク質またはドメインをコードする核酸配列を含むベクターを含む第３の組成物であって、ベクターが、直鎖状閉端二重鎖ＤＮＡベクターである、第３の組成物と、を細胞に導入することを含み、
少なくとも２つのガイドＲＮＡ、少なくとも２つの触媒的に不活性なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、および少なくとも２つの転写調節因子タンパク質またはドメインが、細胞で発現され、
ガイドＲＮＡ、触媒的に不活性なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、転写調節因子タンパク質またはドメイン、および標的遺伝子の間で２つ以上の共局在複合体が形成され、
転写調節因子タンパク質またはドメインが、少なくとも２つの標的遺伝子の発現を調節する、方法。
１０７．末端反復が、逆位ＴＲ（ＩＴＲ）である、パラグラフ１０６に記載の方法。
１０８．隣接するＴＲ配列のうちの少なくとも１つが、修飾型ＴＲである、パラグラフ１０６または１０７に記載の方法。
１０９．核酸配列をゲノムセーフハーバー遺伝子に挿入するための方法であって、細胞を（ｉ）遺伝子編集系、および（ｉｉ）ゲノムセーフハーバー遺伝子に対する相同性を有し、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列を含む相同性指向修復テンプレートと接触させることを含み、
遺伝子編集系の１つ以上の構成成分が、細胞を閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）核酸ベクター組成物と接触させることによって細胞に送達され、ｃｅＤＮＡ核酸ベクター組成物が、隣接する末端反復（ＴＲ）配列と、少なくとも１つの遺伝子編集核酸配列を含む、直線状閉端二重鎖ＤＮＡであり、
方法が、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列をゲノムセーフハーバー遺伝子に挿入するのに十分な条件下、かつそのために十分な時間にわたって実施される、方法。
１１０．末端反復が、逆位ＴＲ（ＩＴＲ）である、パラグラフ１０９に記載の方法。
１１１．隣接するＴＲ配列の少なくとも１つが、修飾型ＴＲである、パラグラフ１０９または１１０に記載の方法。
１１２．ゲノムセーフハーバー遺伝子が、高発現レベルでタンパク質を発現することが知られている少なくとも１つのコード配列に近い活性イントロンを含む、パラグラフ１０９〜１１１のいずれかに記載の方法。
１１３．ｃｅＤＮＡベクターが、パラグラフ１〜７７のいずれか１つのような構造を含む、パラグラフ１０９〜１１２のいずれかに記載の方法。
１１４．ゲノムセーフハーバー遺伝子が、アルブミン遺伝子の中または近くの部位を含む、パラグラフ１０９〜１１３のいずれかに記載の方法。
１１５．関心対象のタンパク質が、受容体、毒素、ホルモン、酵素、または細胞表面タンパク質である、パラグラフ１０９〜１１４のいずれかに記載の方法。
１１６．関心対象のタンパク質が、分泌タンパク質である、パラグラフ１０９〜１１５のいずれかに記載の方法。
１１７．関心対象のタンパク質が、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）または第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を含む、パラグラフ１０９〜１１６のいずれかに記載の方法。
１１８．方法が、血友病Ａまたは血友病Ｂの治療のためにインビボで実施される、パラグラフ１０９〜１１７のいずれかに記載の方法。
【実施例】
【０６３８】
以下の実施例は、限定ではない例証によって提供される。本明細書に記載される野生型または修飾型ＩＴＲのうちのいずれかからｃｅＤＮＡベクターを構築できること、および以下の例示的な方法を使用して、そのようなｃｅＤＮＡベクターの活性を構築し、評価できることを当業者は理解するであろう。これらの方法は、ある特定のｃｅＤＮＡベクターを用いて例示されているが、それらは、説明に沿って任意のｃｅＤＮＡベクターに適用可能である。
【０６３９】
実施例１：ｃｅＤＮＡベクターを構築する
ポリヌクレオチド構築物テンプレートを使用したｃｅＤＮＡベクターの産生は、ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の実施例１に記載されている。例えば、本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスであり得る。理論に限定されるものではないが、許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下、２つの対称ＩＴＲ（ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＩＴＲ配列に対して修飾されている）および発現構築物を有するポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡベクターを産生するように複合する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、第１の、テンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスゲノム等）からのテンプレートの切除（レスキュー）、および第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。
【０６４０】
ｃｅＤＮＡベクターを産生するための例示的な方法は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ−プラスミドに由来する。図１Ａおよび１Ｂを参照すると、各ｃｅＤＮＡ−プラスミドのポリヌクレオチド構築物テンプレートは、左修飾型ＩＴＲおよび右修飾型ＩＴＲの両方を含み、ＩＴＲ配列の間には、（ｉ）エンハンサー／プロモーター、（ｉｉ）導入遺伝子のクローニング部位、（ｉｉｉ）転写後応答エレメント（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））、（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨｐＡ）から）を有する。固有の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｒ１〜Ｒ６）（図１Ａおよび図１Ｂに示される）もまた、各構成成分の間に導入して、構築物中の特定部位への新たな遺伝子構成成分の導入を促進した。Ｒ３（ＰｍｅＩ）ＧＴＴＴＡＡＡＣ（配列番号７）およびＲ４（ＰａｃＩ）ＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号５４２）酵素部位は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを導入するために、クローニング部位の中に設計される。これらの配列を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから取得したｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴ  Ｂプラスミドにクローニングした。
【０６４１】
手短に言えば、遺伝子編集のための一連のｃｅＤＮＡベクターは、図４Ａ〜４Ｃに示されるプロセスを使用して、ｃｅＤＮＡ−プラスミド構築物から得られた。表８は、本明細書で使用するための遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターを生成するための例示的な構築物を示し、遺伝子編集分子に操作可能に連結されたプロモーターのいずれかの末端に複製タンパク質部位（ＲＰＳ）（例えば、Ｒｅｐ結合部位）などの配列も含み得る。表８の番号は、各構成成分の配列に対応する、本文書中の配列番号を指す。表８のプラスミドは、導入遺伝子と右側ＩＴＲとの間の３’未翻訳領域において、配列番号８を含むＷＰＲＥ、続いて配列番号９を含むＢＧＨｐＡにより構築された。
【０６４２】
表８：例示的な遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターの生成のための非対称ＩＴＲ対または対称ｍｏｄ−ＩＴＲ対を含む例示的な構築物。
【表８−１】
2021505159.tif 000052
【表８−２】
2021505159.tif 000053
【０６４３】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターを作製するための構築物は、本明細書に記載される調節スイッチ、例えば、誘導性プロモーターである、プロモーターを含む。
【０６４４】
ｃｅＤＮＡ−バクミドの産生：
図４Ａを参照して、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を、製造元の指示によるプロトコルに従って、試験プラスミドまたは制御プラスミドのいずれかで形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えｃｅＤＮＡ−バクミドを生成した。バクミドおよびトランスポサーゼプラスミドの形質転換体および維持のために選択する抗生物質とともに、Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニングに基づいて（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−相補性を提供する）正の選択をスクリーニングすることによって、組み換えバクミドを選択した。β−ガラクトシダーゼ指標遺伝子を妨害する転位によって引き起こされる白色コロニーを採取し、１０ｍＬの培地中で培養した。
【０６４５】
組み換えｃｅＤＮＡ−バクミドをＥ．ｃｏｌｉから単離し、ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用してＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクトして、感染性バキュロウイルスを産生した。付着したＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、２５℃のＴ２５フラスコ中の５０ｍＬの培地で培養した。４日後、培養培地（Ｐ０ウイルスを含有する）を細胞から取り除き、０．４５μｍフィルターで濾過し、感染性バキュロウイルス粒子を細胞または細胞残屑から分離した。
【０６４６】
任意に、第１世代のバキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって５０〜５００ｍＬの培地中で増幅させた。オービタルシェーカー培養器内の懸濁液培養物中の細胞を、１３０ｒｐｍ、２５℃で維持し、細胞が（１４〜１５ｎｍのナイーブ直径から）１８〜１９ｎｍの直径に到達するまで、細胞直径および生存性、ならびに約４．０Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度を監視した。感染３日後〜８日後の間に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離後に収集し、細胞および残屑を除去した後、０．４５μｍフィルターで濾過した。
【０６４７】
試験構築物を含むｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性または力価を判定した。具体的には、２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ  Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、２５〜２７℃でインキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存性の変化によって４〜５日間にわたって毎日判定した。
【０６４８】
図４Ａを参照すると、例えば、図７Ａによる「Ｒｅｐ−プラスミド」は、Ｒｅｐ７８（配列番号１３）またはＲｅｐ６８（配列番号１２）およびＲｅｐ５２（配列番号１４）またはＲｅｐ４０（配列番号１１）の両方を含むｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）二重発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において産生された。
【０６４９】
Ｒｅｐ−プラスミドを、製造元によって提供されるプロトコルに従って、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中に形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のＲｅｐ−プラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えバクミド（「Ｒｅｐ−バクミド」）を生成した。Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニング（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−相補性を提供する）を含む正の選択によって、組み換えバクミドを選択した。単離された白色コロニーを採取し、１０ｍＬの選択培地（ＬＢブロス中のカナマイシン、ゲンタマイシン、テトラシクリン）中に播種した。組み換えバクミド（Ｒｅｐ−バクミド）をＥ．ｃｏｌｉから単離し、Ｒｅｐ−バクミドをＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクトして、感染性バキュロウイルスを産生した。
【０６５０】
Ｓｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、５０ｍＬの培地中で４日間培養し、感染性組み換えバキュロウイルス（「Ｒｅｐ−バキュロウイルス）を、培養物から単離した。任意に、第１世代のＲｅｐ−バキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって増幅させ、５０〜５００ｍＬの培地中で培養した。感染３日後〜８日後の間に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離によって細胞を分離するか、または濾過もしくは別の分画プロセスのいずれかによって収集した。Ｒｅｐ−バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を判定した。具体的には、２．５×１０６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ  Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、インキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存性の変化によって４〜５日間にわたって毎日判定した。
【０６５１】
ｃｅＤＮＡベクター生成および特徴付け
図４Ｂを参照して、次に、（１）ｃｅＤＮＡ−バクミドを含有する試料またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス、および（２）上記のＲｅｐ−バキュロウイルスのいずれかを含有するＳｆ９昆虫細胞培養培地を、Ｓｆ９細胞（２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬ、２０ｍＬ）の新鮮な培養物に、それぞれ１：１０００および１：１０，０００の比で添加した。次いで、細胞を２５℃、１３０ｒｐｍで培養した。同時感染の４〜５日後に、細胞の直径および生存率が検出される。細胞直径が１８〜２０ｎｍに到達し、生存性が約７０〜８０％であったとき、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを収集した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地（水または緩衝液のいずれか）に再懸濁する。ｃｅＤＮＡベクターを単離し、Ｑｉａｇｅｎ  ＭＩＤＩ  ＰＬＵＳ（商標）精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、カラムあたり０．２ｍｇの処理された細胞ペレット質量）を使用して、細胞から精製した。
【０６５２】
Ｓｆ９昆虫細胞から産生および精製されるｃｅＤＮＡベクターの収率は、最初に、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて判定した。
【０６５３】
ｃｅＤＮＡベクターは、図４Ｄに例示されるような未変性条件または変性条件下で、アガロースゲル電気泳動によって特定することによって評価することができ、（ａ）制限エンドヌクレアーゼ切断およびゲル電気泳動分析後の、未変性ゲルに対して変性ゲル上で２倍のサイズで移行する特徴的なバンドの存在、ならびに（ｂ）未切断材料の変性ゲル上の単量体および二量体（２ｘ）バンドの存在は、ｃｅＤＮＡベクターの存在に特有である。
【０６５４】
単離されたｃｅＤＮＡベクターの構造を、共感染Ｓｆ９細胞から得られたＤＮＡ（本明細書に記載される）を、制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ａ）ｃｅＤＮＡベクター内の単一切断部位のみの存在、およびｂ）０．８％変性アガロースゲル（＞８００ｂｐ）上で分画したときに明らかに見えるほど十分に大きい、得られる断片についてさらに分析した。図４Ｄおよび４Ｅに示されるように、非連続的な構造を有する直鎖状ＤＮＡベクターおよび直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、それらの反応産物のサイズによって区別することができ、例えば、非連続的な構造を有するＤＮＡベクターは、１ｋｂおよび２ｋｂ断片を産生することが期待されるが、連続的な構造を有する非カプシド化ベクターは、２ｋｂおよび４ｋｂ断片を産生することが期待される。
【０６５５】
したがって、定義によって必要とされるように、単離されたｃｅＤＮＡベクターが共有結合性閉端であることを定性的に実証するために、試料を、特定のＤＮＡベクター配列の文脈において、単一制限部位を有すると特定された制限エンドヌクレアーゼで消化させ、好ましくは、等しくないサイズ（例えば、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐ）の２つの切断産物をもたらす。変性ゲル（２つの相補的ＤＮＡ鎖を分離する）上の消化および電気泳動に続いて、直鎖状の非共有結合的に閉じたＤＮＡは、２つのＤＮＡ鎖が連結され、展開されて２倍の長さであるとき（但し、一本鎖である）、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐのサイズで溶解するが、共有結合的に閉じたＤＮＡ（すなわち、ｃｅＤＮＡベクター）は、２倍サイズ（２０００ｂｐおよび４０００ｂｐ）で溶解するであろう。さらに、ＤＮＡベクターの単量体、二量体、およびｎ量体形態の消化は、多量体ＤＮＡベクターの末端間連結に起因して、同じサイズの断片としてすべて溶解する（図４Ｄを参照）。
【０６５６】
本明細書で使用される場合、「未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡベクターの特定のためのアッセイ」という語句は、制限エンドヌクレアーゼ消化に続いて、消化産物の電気泳動的評価を実施することによって、ｃｅＤＮＡの閉端性を評価するためのアッセイを指す。１つのそのような例示的アッセイを以下に示すが、当業者であれば、この実施例に関する当該技術分野において既知の多くの変形が可能であることを理解するであろう。およそ１／３×および２／３×のＤＮＡベクター長の産生物を生成するであろう関心対象のｃｅＤＮＡベクターに対する単一切断酵素であるように、制限エンドヌクレアーゼが選択される。これは、未変性ゲルおよび変性ゲルの両方でバンドを溶解する。変性前に、試料から緩衝液を取り除くことが重要である。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットまたは脱塩「スピンカラム」、例えば、ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ  ＩＬＵＳＴＲＡ（商標）  ＭＩＣＲＯＳＰＩＮ（商標）  Ｇ−２５カラムは、エンドヌクレアーゼ消化のための当該技術分野において既知のいくつかのオプションである。アッセイは、例えば、ｉ）ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼ（複数可）で消化すること、２）例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットに適用し、蒸留水で溶出すること、ｉｉｉ）１０×変性溶液（１０×＝０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、１０×色素を添加し、緩衝せず、１０×変性溶液を、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２００ｍＭ  ＮａＯＨで以前にインキュベートされた０．８〜１．０％ゲル上で４×に添加することによって調製されたＤＮＡラダーと一緒に分析して、ＮａＯＨ濃度が、ゲルおよびゲルボックス中で均一であり、１×変性溶液（５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）の存在下でゲルを流動させることを保証することを含む。当業者であれば、サイズおよび所望のタイミングの結果に基づいて、電気泳動を実行するために使用する電圧を理解すであろう。電気泳動後に、ゲルを排出し、１×ＴＢＥまたはＴＡＥ中で中和し、蒸留水または１×ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄを含む１×ＴＢＥ／ＴＡＥに移す。次いで、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染料（ＤＭＳＯ中１０，０００Ｘ濃縮物）および落射蛍光灯（青色）またはＵＶ（３１２ｎｍ）を用いてバンドを可視化することができる。
【０６５７】
生成されたｃｅＤＮＡベクターの純度は、任意の当該技術分野において既知の方法を使用して評価され得る。１つの例示的な非限定的方法として、試料の全体ＵＶ吸光度に対するｃｅＤＮＡ−プラスミドの寄与は、ｃｅＤＮＡベクターの蛍光強度を標準と比較することによって推定され得る。例えば、ＵＶ吸光度に基づいて、４μｇのｃｅＤＮＡベクターをゲル上に負荷し、ｃｅＤＮＡベクター蛍光強度が、１μｇであることが知られている２ｋｂバンドに相当する場合、１μｇのｃｅＤＮＡベクターが存在し、ｃｅＤＮＡベクターは、全ＵＶ吸光材料の２５％である。次いで、ゲル上のバンド強度を、バンドが表す計算されたインプットに対してプロットする。例えば、全ｃｅＤＮＡベクターが８ｋｂであり、切除された比較バンドが２ｋｂである場合、バンド強度は、全インプットの２５％としてプロットされ、この場合、１．０μｇのインプットに対して０．２５μｇとなる。ｃｅＤＮＡベクタープラスミド滴定を使用して、標準曲線をプロットする場合、回帰直線等式を使用して、ｃｅＤＮＡベクターバンドの量を計算し、次いで、これを使用して、ｃｅＤＮＡベクターにより表される全インプットのパーセント、または純度パーセントを判定することができる。
【０６５８】
実施例２：ｃｅＤＮＡベクターは、ルシフェラーゼ導入遺伝子をインビトロで発現する
構築物は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするオープンリーディングフレームを、ｃｅＤＮＡ−プラスミド構築物：ルシフェラーゼコード配列を含む構築物−１５〜３０（表８の上記を参照）のクローニング部位に導入することによって生成された。ＨＥＫ２９３細胞を培養し、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）をトランスフェクション剤として使用し、１００ｎｇ、２００ｎｇ、または４００ｎｇのプラスミド構築物１〜３１でトランスフェクトした。各プラスミドからのルシフェラーゼの発現は、各細胞培養におけるルシフェラーゼ活性に基づいて決定され、ルシフェラーゼ活性がプラスミドからの遺伝子発現に起因することを確認した。
【０６５９】
実施例３：ｃｅＤＮＡベクターからのルシフェラーゼ導入遺伝子のインビボタンパク質発現
構築物から産生されるｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子のインビボタンパク質発現は、マウスにおいて評価され得る。例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド構築物１〜３１から取得されたｃｅＤＮＡベクター（表８に記載される）を試験し、外因性ホタルルシフェラーゼｃｅＤＮＡのリポソームを含まないｃｅＤＮＡ構築物の流体力学的注入後のマウスモデルにおける持続した耐性のあるルシフェラーゼ導入遺伝子発現、再投与（２８日目）、および耐性（４２日目まで）を実証した。異なる実験では、選択されたｃｅＤＮＡベクターのルシフェラーゼ発現は、インビボで評価され、ｃｅＤＮＡベクターは、ルシフェラーゼ導入遺伝子を含み、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、表２、表４Ａ、表４Ｂ、もしくは表５のうちのいずれかにリストされている任意のＩＴＲ対、または図７Ａ〜７Ｂに示されている修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択される。以下の例示的な方法は、ｃｅＤＮＡベクターからのインビボタンパク質発現を評価するために使用されてきた。
【０６６０】
インビボルシフェラーゼ発現：５〜７週齢の雄ＣＤ−１  ＩＧＳマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、０日目の尾静脈への静脈内流体力学的投与を介して１．２ｍＬ量のルシフェラーゼを発現する０．３５ｍｇ／ｋｇのｃｅＤＮＡベクターを投与する。３、４、７、１４、２１、２８、３１、３５、および４２日目に、ルシフェラーゼ発現をＩＶＩＳ撮像によって評価する。手短に言えば、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン基質を腹腔内的に注入した後、全身発光をＩＶＩＳ（登録商標）撮像を介して評価する。
【０６６１】
ＩＶＩＳ撮像を、３日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３１日目、３５日目、および４２日目に実施し、収集した器官を４２日目の屠殺後にエクスビボで撮像する。
【０６６２】
研究の経過中、動物を計量し、健康全般および幸福について毎日監視する。屠殺後、終端心臓穿刺によって各動物から血液を収集し、および２つの部分に分割し、１）血漿および２）血清に処理し、血漿は急速冷凍し、血清は肝臓酵素パネルに使用した後に急速冷凍する。追加として、肝臓、脾臓、腎臓、および鼠径リンパ節（ＬＮ）を収集し、ＩＶＩＳによってエクスビボで撮像する。
【０６６３】
ルシフェラーゼ発現を、ＭＡＸＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（登録商標）ルシフェラーゼＥＬＩＳＡアッセイ（ＢＩＯＯ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、肝臓試料のルシフェラーゼのためのｑＰＣＲ、肝臓試料の組織病理学、および／または血清肝臓酵素パネル（ＶｅｔＳｃａｎＶＳ２、Ａｂａｘｉｓ  Ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｐｌｕｓ）によって、肝臓において評価する。
【０６６４】
実施例４：修飾型ＩＴＲスクリーニング
Ａ．非対称および対称ＩＴＲ対を含むｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲスクリーニング。
ｍｏｄ−ＩＴＲ構造とｃｅＤＮＡ形成との関係の分析は、参照により全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号に記載されているように実施することができる。本明細書の図７Ａ〜７Ｂならびに表４Ａおよび４Ｂに示される一連のｍｏｄ−ＩＴＲは、ｃｅＤＮＡ形成およびｃｅＤＮＡコード化導入遺伝子を発現する能力に対する特定の構造変化の影響を問い合わせるために構築された。ヒト細胞培養物中の突然変異体構築、ｃｅＤＮＡ形成のアッセイ、およびｃｅＤＮＡ導入遺伝子発現の評価を、以下でさらに詳細に説明する。予想されるとおり、３つの負の対照（培地のみ、模擬トランスフェクション欠失ドナーＤＮＡ、およびＲｅｐ含有バキュロウイルス細胞の非存在下で処理された試料）は、著しいルシフェラーゼ発現を示さなかった。突然変異体試料の各々においてロバストルシフェラーゼ発現が観察され、各試料について、ｃｅＤＮＡをコードした導入遺伝子が、良好にトランスフェクトされ、突然変異にかかわらず発現されたことを示す。したがって、突然変異体試料は、非対称のｍｏｄ−ＩＴＲ対を含むｃｅＤＮＡを正しく形成するように思われた。Ｍｏｄ−ＩＴＲは、本発明の組成物および方法で使用することができ、以下の例示的な方法を使用して活性についてスクリーニングすることができる。
【０６６５】
上記の実施例１に記載され、図４Ｂに記載されるように、対称ＩＴＲ対を有するｃｅＤＮＡベクターが生成され、構築された。対称ｍｏｄ−ＩＴＲおよび対称ＷＴ−ＩＴＲの関係の分析は、ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている方法に従って評価した。ＩＴＲ配列への突然変異は、左右両方のＩＴＲ領域で対称的に作成された。表５に開示されているように、ライブラリーには、１６個の右側二重突然変異体（例えば、対称ｍｏｄ−ＩＴＲ対）が含まれていた。
【０６６６】
実施例５：遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターの生成
例示の目的で、例示的な遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、第ＶＩＩＩ因子を編集するためのｃｅＤＮＡベクターの生成に関して記載されており、以下に記載されている。しかしながら、本明細書に記載される方法および構築物において有用な遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターを生成する方法を説明するために、この実施例では第ＶＩＩＩ因子が例示されているが、当業者は、上述の使用のように、遺伝子編集が望まれる任意の遺伝子を使用できることを承知している。編集のための例示的な遺伝子は、本明細書において、例えば、「遺伝子編集ｃｅＤＮＡで治療される例示的な疾患」および「遺伝子編集のための追加の疾患」と題するセクションに記載されている。
【０６６７】
第ＶＩＩＩ因子遺伝子編集ｃｅＤＮＡの生成：関心対象の導入遺伝子を含むオープンリーディングフレーム（例えば、１つの非限定的な例として、第ＶＩＩＩ因子）をｃｅＤＮＡベクターに挿入し、オープンリーディングフレームに隣接するゲノムＤＮＡ配列の大きな（各々２Ｋｂまでの）相動性アームによって隣接されて、導入遺伝子の欠陥のある未変性コピーに関連する疾患または障害を有する患者（第ＶＩＩＩ因子の場合、血友病Ａに罹患した患者）の内因性導入遺伝子座内のＨＤＲを促進する。部位特異的ヌクレアーゼオープンリーディングフレームは、任意に、ｓｇＲＮＡなどの任意の必要な補助構成成分とともに、未変性の導入遺伝子座（例えば、第ＶＩＩＩ因子遺伝子座）またはその近くの部位に特異的であり、組み換えを増加させるために効果的なヌクレアーゼとともにベクターに含まれている。ｃｅＤＮＡベクターはまた、ヌクレアーゼが、ｃｅＤＮＡベクターからのヌクレアーゼの発現を無効にするｃｅＤＮＡベクター自体の部位にさらに特異的であるように操作することもできる。そのようなさらなる特異性は、ｃｅＤＮＡベクターによって発現されるさらなるｇＲＮＡによって提供される。ｃｅＤＮＡは、例えば、本明細書に記載されるように脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で送達されてもよい。
【０６６８】
ｃｅＤＮＡ−導入遺伝子構築物は、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、ＴＡＬＥ、ＭｅｇａＴａｌｅｓ、またはＺＦＮ）、および必要に応じて遺伝子編集プロセスにＤＮＡ特異性を提供するガイドＲＮＡを含むようにさらに操作され得る。したがって、この「オールインワン」ｃｅＤＮＡ構造は、コアｃｅＤＮＡ骨格エレメントに加えて、次のエレメント：導入遺伝子コード配列（例えば、第ＶＩＩＩ因子をコードする導入遺伝子）、２つのゲノム相同性領域（例えば、内因性第ＶＩＩＩ因子遺伝子座に特異的なＨＲ）、ヌクレアーゼコード領域およびヌクレアーゼの発現を駆動するためのプロモーター、ならびにＣＲＩＳＰＲ系が利用されている場合、ガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９の場合）を有する。ｃｅＤＮＡベクターが、導入遺伝子とともにｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９発現カセットをシスに有し、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９が、相同性アームの外側にあり、したがって細胞ゲノムに組み込まれないように、ｃｅＤＮＡベクターを操作することができる。遺伝子編集事象の後、ＨＤＲ後の直鎖状ｃｅＤＮＡは、ＤＮＡ末端を露出しているため分解され、したがってこの構築物からの発現を低減する。
【０６６９】
第ＶＩＩＩ因子構築物を有する例示的なｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ配列をヌクレアーゼ配列（またはそのプロモーター）に組み込み、それ自体の不活性化を誘導するようにさらに修飾することができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質が産生されると、それは遺伝子編集（すなわち、所望の効果）を誘導するだけでなく、ｃｅＤＮＡに結合してｃｅＤＮＡ内で二本鎖ＤＮＡ切断を誘導し、Ｃａｓ９の下方調節／排除を確実にする（持続的なＣａｓ９によって誘導されるオフターゲットＤＮＡ切断の可能性を低減する）。
【０６７０】
第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、アルブミン遺伝子座または他のゲノム遺伝子座（挿入された第ＶＩＩＩ因子の発現を促進する強力なプロモーターの近く）に対するゲノム相同性アームを用いて生成され得る。実施例５に列挙された様々な実験は、この枠組みで繰り返される。
【０６７１】
図１０Ａは、本開示による試験ベクター発現ユニットを示し、ｃｅＤＮＡ設計に組み込まれる５’および３’相同性アームが隣接している。この実施形態では、ｃｅＤＮＡは、アルブミンゲノム遺伝子座にハイブリダイズし、したがって内因性アルブミンプロモーター下でＦＩＸの発現を駆動する５’および３’相同性アームが隣接する第ＩＸ因子（ＦＩＸ）オープンリーディングフレームで設計される。対照は、５’相同性アームのみの発現単位であり、１つは、３’相同性アームのみを含む（それぞれ図１０Ｂおよび１０Ｃ）。プロモーター、ＷＰＲＥエレメント、ｐＡを含むレポーター遺伝子の発現ユニット、例えば、ＧＦＰを使用して、実験的に発現を確認することができる（図１０Ｄ）。
【０６７２】
ヌクレアーゼ発現ユニットを含むｃｅＤＮＡベクターは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、突然変異型「ニッカーゼ」エンドヌクレアーゼ、クラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系（ＣＰＦ１）（図１０Ｅ）などのトランスで送達され得る。本明細書に記載されるＬＮＰは、送達オプションとして使用され得る。ヌクレアーゼ発現ユニットの核への輸送は、５’または３’酵素ペプチド配列（例えば、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ等のヌクレアーゼ発現ユニット）に融合した核局在化シグナル（ＮＬＳ）を使用することによって増加または改善され得る。ｃｅＤＮＡによって発現されるヌクレアーゼに応じて、所望の部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導するために、１つ以上の単一誘導型ＲＮＡをトランスで送達することもできる。例えば、ｓｇＲＮＡ発現ベクターまたは化学合成された合成ｓｇＲＮＡとして。（ｓｇ＝単一ガイドＲＮＡ標的配列）（図１０Ｆ）。ｓｇＲＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターまたは他の発現ベクターであり得る。単一ガイドＲＮＡ配列は、自由に利用できるソフトウェア／アルゴリズムを使用して選択され、検証され得る。４つの潜在的な候補配列が選択され、検証される。（ｔｏｏｌｓ．ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇなどの公開リソースを使用して、好適な単一ガイドＲＮＡ配列を選択することができる。）
【０６７３】
例示的な５’および３’相同性アーム：５’および／または３’相同性アームは、図８、９、および１０Ａ〜１０Ｆに示されるようなｃｅＤＮＡ構築物での使用のために、約３５０ｂｐの長さであり得る。例えば、５’相同性アームは、５０〜２０００ｂｐの範囲であり得る。同様に、３’相同性アームは、約２０００ｂｐの長さであり得、５０〜２０００ｂｐの範囲であり得る。当業者は、Ｚｈａｎｇ，Ｊｉａｎ−Ｐｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｋｎｏｃｋｉｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ  ｃｕｔ  ＨＤＲ  ｄｏｎｏｒ  ａｆｔｅｒ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ．″Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １８．１（２０１７）：３５．ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｙｕａｎｍｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．″Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｅｓｉｇｎ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．″Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １９．１（２０１８）：６２に記載されるように、５’および／または３’相同性アームの長さおよび／または組み換え頻度を修正することができる。本明細書で図１６に示すように、ＦＩＸまたはＦＶＩＩＩは、任意のプロモーターレスのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）で置換することができる。ＷＰＲＥおよびＢＧＨｐＡなどのポリアデニル化シグナルを含むがこれらに限定されない追加のエレメントを、遺伝子編集ｃｅＤＮＡ構築物に付加することができる。例えば、挿入される遺伝子（例えば、例示的な遺伝子としてのＦＩＸまたはＦＶＩＩ）の発現は、内因性かつ非常に強力なアルブミンプロモーターによって駆動される。ＷＰＲＥなどの転写強化エレメントが、ＯＲＦの３’に付加される。ポリアデニル化シグナル（例えば、ＢＧＨ−ｐＡ）も付加され得る。本明細書に開示されるように、ｃｅＤＮＡ構築物の容量は大きいため、ＩＴＲ間のＤＮＡ断片の長さを１５ｋｂ以上にすることができる。したがって、大きなＯＲＦを備えたｃｅＤＮＡベクター系が使用に含まれる。また、強力なプロモーター単位を有する他の発現単位を使用することができる。他のセーフハーバー遺伝子座を標的とする相同性アームを持つｃｅＤＮＡベクターを使用することができる。例えば、アルブミン遺伝子座を標的とする代わりに、限定されないが、ＣＣＲ５またはＡＡＶセーフハーバー−Ｓ１（ＡＡＶＳ１）遺伝子座などの他のセーフハーバー遺伝子座を標的とする相同性アームを有する。これにより、標的細胞または組織にいかなる影響も与えることなく、遺伝子編集分子または標的遺伝子をイントロン部位に挿入することができる。図１１に示すように、合成プロモーターユニット、例えばｃｅＤＮＡベクターに記載されているＣＡＧプロモーターのイントロンにｓｇＲＮＡ配列を導入することにより、ヌクレアーゼ活性の自己不活性化機能の滴定のために発現構築物を作製することができる。不活性化の程度は、ｓｇＲＮＡ配列もしくは組み合わせの数、および／または突然変異型（最適化されていない）ｓｇＲＮＡ標的配列によって調節される。（Ｚｈａｎｇ  ｅ���  ａｌ，ＮａｔＰｒｏ，２０１３  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅ−ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｓｇＲＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．）図１１では、ｓｇＲＮＡは、単独または複数（例えば４）であり、いくつかの実施形態では、異なる黒または白で表される複数の固有の標的配列からなり得る。
【０６７４】
図１２は、１つ以上のｓｇＲＮＡの発現を駆動するために、ｃｅＤＮＡベクターが様々なＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターユニット配置を含み得る例を示す。この例では、複数の最適なプロモーターがＩＴＲの間に配置されている。転写方向は、順方向または逆方向であり得る。ｓｇＲＮＡは、複合および／または複製され得る。図１４は、ｃｅＤＮＡがＵ６プロモーターを利用するなど、複数のｓｇＲＮＡ（ｓｇ１、ｓｇ２、ｓｇ３、またはｓｇ４）を発現し得る別の例を示す。
【０６７５】
したがって、本明細書で使用するための遺伝子編集のためのｃｅＤＮＡベクターは、これらの修飾のうちのいずれか１つ以上を含み得る。
【０６７６】
実施例６：マスターＯＲＦを備えたオールインワン遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクター
図１５に示されるような特徴を含む遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターを作製することができる。ラベル付けされていない含まれている機能は、ヌクレアーゼ発現ユニット（ハッシュされたヌクレアーゼエレメントを含む）、および図示されたｓｇＲＮＡ標的配列を有するプロモーターの下流のイントロンである。機能には、ｃｅＤＮＡ特異的ＩＴＲ；転写方向に関して任意の配向を有するＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター駆動（Ｕ６またはＨ１）ｓｇＲＮＡ発現ユニット；最適化解除の有無にかかわらず、ｓｇＲＮＡ標的配列を含み得る合成プロモーター駆動型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、二重突然変異型ニッカーゼ、Ｔａｌｅｎ、または他の突然変異体）発現ユニット（実験では、示されている以外の場所にある）；０．０５〜６ｋｂのストレッチ相同性アームが隣接するウイルス２Ａペプチド切断部位（２Ａ）を介して選択マーカー（例えば、ＮｅｏＲ）に融合する可能性のある導入遺伝子（例えば、ＦＩＸ）が含まれる。（２Ａ系に関する：Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＩＲＥＳ  ａｎｄ  Ｆ２Ａ−Ｂａｓｅｄ  Ｌｏｃｕｓ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  ＬｉｎｅｓＨＳＶ−ＴＫ  ｓｕｉｃｉｄｅ，ＰＬＯＳ  ２０１１  ＨＳＶ−ＴＫ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｆｅｓｎａｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｍｉｓｅ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ＮａｔＲｅｖＣａｎ  ２０１６．）
【０６７７】
好適であれば、相同性アームの外側に位置付けられた、良好な正しい部位の使用のために制御し、選択できるようにする、負の選択マーカー（例えば、ＨＳＶ  ＴＫ）および発現ユニットが想定される。本明細書に開示される他の調節エレメントまたは調節スイッチもまた、負の選択マーカー遺伝子の代わりに、またはそれに対して補足的に含まれる。
【０６７８】
ＨＤＲエレメントの挿入のための相同性アームを含む例示的なｃｅＤＮＡベクターを図１３に示す。そのようなｃｅＤＮＡベクターでは、ランダムな統合がある場合、負の選択可能マーカーを持つベクター全体がゲノムに統合される。そのような誤ってトランスフェクトされた細胞は、ＨＳＶ  ＴＫ負の選択可能マーカーのためのＧＶＣなどの、適切な薬物で殺すことができる。あるいは、マークされた負の選択可能は、本明細書に記載される調節スイッチ、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の表１１に開示されるキルスイッチ遺伝子または任意の遺伝子で置き換えることができる。
【０６７９】
この実施例と同様の別の例示的なｃｅＤＮＡベクターが図９に示されているが、負の選択マーカーを「二重突然変異体ニッカーゼ」のｓｇＲＮＡ標的配列で置き換えている（下向きの実線矢印で示されている）。一本鎖ＤＮＡカット（ニッキング）の導入は、突然変異体ＩＴＲに近い３’相同性アームの下流のねじれを解放し、アニーリングを増加させ、したがってＨＤＲ頻度を増加させるのを助け得る。そのようなｃｅＤＮＡベクターでは、負のマーカーは、「二重突然変異体ニッカーゼ」のｓｇＲＮＡ標的配列で使用される。
【０６８０】
この実施例で論じられるｃｅＤＮＡベクターは、説明のみを目的としており、熟練者は、異なる標的遺伝子を挿入するように修飾することができ、例えば、ＦＩＸを使用する代わりに第ＸＩＩＩ因子を使用し、第ＸＩＩＩ因子を使用する場合は、ＦＩＸを使用する。同様に、当業者は、遺伝子編集が望まれる任意の標的遺伝子を使用できることを知っている。
【０６８１】
実施例７：疾患の治療のための遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターの生成。
例示の目的で、実施例７は、異なる疾患を治療するための例示的な遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターを生成することを説明する。しかしながら、嚢胞性線維症、肝臓障害、全身性障害、ＣＮＳ障害、および筋障害の遺伝子がこの実施例で例示され、本明細書に記載される方法および構築物において有用な遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターを生成する方法を例示しているが、当業者は、上述の使用のように、遺伝子編集が望まれるあらゆる疾患を治療するために標的遺伝子を修飾できることを承知している。本明細書に記載されるように遺伝子編集がｃｅＤＮＡ編集ベクターで疾患を治療するための望ましい戦略である例示的な疾患または遺伝性障害は、「遺伝子編集ｃｅＤＮＡで治療される例示的な疾患」および「遺伝子編集のための追加の疾患」と題するセクションで論じられている。
【０６８２】
一実施例では、２〜４などの複数のヌクレアーゼ切断部位を有するｓｇＲＮＡを含むｃｅＤＮＡベクターを生成することができ、ヌクレアーゼの上流イントロンおよび５’相同性アームの一方または両方に入れられる。これらは、別個または共有のｓｇＲＮＡによって駆動される特異性を有し得る。これらの特徴のすべてを有する例示的な「オールインワン」ｃｅＤＮＡベクターを図１５に示す。
【０６８３】
ｃｅＤＮＡベクターを置換または提供する例示的な導入遺伝子は、肝臓障害（例えば、ＯＴＣ、ＧＳＤ１ａ、Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊａｒ、ＰＫＵ等）または全身障害（例えば、ＭＰＳＩＩ、ＭＬＤ、ＭＰＳＩＩＩＡ、Ｇａｕｃｈｅｒ、Ｆａｂｒｙ、Ｐｏｍｐｅ等）を含む、他の遺伝性障害のための別個の導入遺伝子で遺伝子編集を誘導するように構成され得る。
【０６８４】
遺伝性障害または疾患を治療するための遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターの例は、ｃｅＤＮＡベクターを修飾して、例えば嚢胞性線維症（ＣＦ）などの肺で遺伝子編集を誘導できるという点で、実施例６で論じたものと同様であり得る。そのようなｃｅＤＮＡベクターは、ＣＦで突然変異する遺伝子であるＣＦＴＲをコードするために作成される。ＣＦＴＲは、ＡＡＶ内に含めることができない大きな遺伝子である。したがって、ｃｅＤＮＡベクターは、独特の解決策を提供し、いくつかの実施形態では、肺上皮の遺伝子編集を誘導するために、対象に静脈内投与および／または噴霧製剤として投与することができる。上記のように、ｃｅＤＮＡ遺伝子編集ベクターは、ＣＦＴＲが内因性ＣＦＴＲ遺伝子座に挿入されるように構成されている。そのような例では、ｃｅＤＮＡベクターは、ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含むだけでなく、大きな相同性アームを利用して遺伝子編集の効率および忠実度を高めることもできる。
【０６８５】
ＣＮＳ障害の遺伝子編集のための遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターの例は、実施例６で論じられるものと同様であり、ｃｅＤＮＡは、神経変性障害（例えば、家族型のアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病）、リソソーム蓄積症（例えば、ＭＰＳＩＩ、ＭＬＤ、ＭＰＳＩＩＩＡ、Ｃａｎａｖａｎ、Ｂａｔｔｅｎ等）、または神経発達障害（例えば、ＳＭＡ  レット症候群等）を含む障害について、ＣＮＳで遺伝子編集を誘導するように修飾されている。
【０６８６】
筋肉の遺伝性障害または疾患を治療するための遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターの例は、ｃｅＤＮＡベクターを修飾して、限定されないが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋膜肩甲上腕筋ジストロフィー等を含む障害について、筋肉における遺伝子編集を誘導することができるという点で、実施例６で論じたものと同様であり得る。
【０６８７】
実施例６〜７で論じられ、例示された遺伝子編集ｃｅＤＮＡ（すなわち、ｃｅＤＮＡベクターを置換または提供する導入遺伝子）を、欠陥のある導入遺伝子の動物モデルの標的細胞に送達して、遺伝子編集の有効性を評価し、より効果的な遺伝子産物を産生する細胞を提供することもできる。
【０６８８】
実施例８：ｃｅＤＮＡは、メガヌクレアーゼが標的二本鎖切断（ＤＳＢ）を実施する遺伝子編集での使用に適している。
遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、メガヌクレアーゼによって提供される二本鎖切断の後に挿入される訂正ＤＮＡ鎖として、テンプレートヌクレオチド配列を含み得る。例示の目的で、例示的な遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、Ａｐｏ  Ａ−Ｉ遺伝子を編集および訂正するためのｃｅＤＮＡベクターの生成に関して記載されており、以下に記載される。しかしながら、本明細書に記載される方法および構築物において有用な遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターを生成する方法を説明するために、この実施例ではＡｐｏ  Ａ−Ｉ遺伝子の訂正が例示されているが、当業者は、上述のように、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、遺伝子編集が所望される任意の他の遺伝子の配列を訂正できることを承知している。編集のための例示的な遺伝子は、本明細書において、例えば、「遺伝子編集ｃｅＤＮＡで治療される例示的な疾患」および「遺伝子編集のための追加の疾患」と題するセクションに記載されている。
【０６８９】
インビボでの突然変異型ヒトＡｐｏＡＩ遺伝子のメガヌクレアーゼにより誘導される訂正
血流中のメガヌクレアーゼ発現カセットおよびｃｅＤＮＡの混合物を直接注入することによって、インビボでの哺乳類の二本鎖切断（ＤＳＢ）により誘導される遺伝子変換が使用される。インビボでのマウスにおけるヒトＡｐｏ  Ａ−Ｉ導入遺伝子の修復に基づく系が提供される。アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡＰＯ  Ａ−Ｉ）は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要なタンパク質成分であり、ＨＤＬ代謝に重要な役割を果たす。高密度リポタンパク質は、コレステロール逆輸送の主要なメディエーターとして主要な心臓保護の役割を有する。Ａｐｏ  Ａ−Ｉ遺伝子は、肝臓で発現され、タンパク質は、血中に分泌される。さらに、ヒトにおけるＡｐｏ  Ａ−Ｉ欠乏症は、早期の冠状動脈性心疾患につながる。総合すると、これらの基準により、Ａｐｏ  Ａ−Ｉ遺伝子は、ｃｅＤＮＡを含むメガヌクレアーゼにより誘導された遺伝子訂正の研究に適した候補になる。
【０６９０】
導入遺伝子：ヒトＡｐｏ  Ａ−Ｉ遺伝子をコードするゲノム配列は、導入遺伝子の構築に使用される。Ａｐｏ  Ａ−Ｉ遺伝子の発現は、肝臓での導入遺伝子発現を促進するのに十分であることが示されている独自の最小プロモーター（３２８ｂｐ）によって駆動される（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４，６４８８−６４９４）。簡単に言えば、ヒトＡｐｏ  Ａ−Ｉ遺伝子は、ヒト肝臓ゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でのＰＣＲによって取得され、プラスミドｐＵＣ１９においてクローニングされる。２つの終止コドンを含むＩ−ＳｃｅＩ部位は、エクソン４などの好適なエクソンの先頭にＰＣＲによって挿入される（ＵＳ２０１２／０２８８９４３  Ａ９の図１７）。突然変異型遺伝子（１−ＳｃｅＩ−ｈＡｐｏ  Ａ−Ｉ）は、未変性のヒトＡＰＯ  Ａ−Ｉ（野生型ＡＰＯ  Ａ−Ｉでは８０残基対２６７アミノ酸）の切断型をコードするように作製されている。すべての構築物は、配列決定され、ヒトＡｐｏ  Ａ−Ｉ遺伝子配列に対してチェックされる。
【０６９１】
トランスジェニックマウスの生成：突然変異型ヒトＡｐｏ  Ａ−Ｉ遺伝子を担持するＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩゲノムＤＮＡ断片は、トランスジェニック初代の生成に使用される。マイクロインジェクションは、マウスａｐｏ  ａ−Ｉ遺伝子のノックアウト雄（ＷＴ  ＫＯマウス）（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、＃００２０５５）およびＢ６ＳＪＬＦ１雌（Ｊａｎｖｉｅｒ）の繁殖からの受精卵母細胞に行われる。トランスジェニック初代マウス（Ｆ０）は、尾から抽出されたゲノムＤＮＡのＰＣＲおよびサザンブロット分析によって識別される。次いで、内因性マウスａｐｏ  ａ−Ｉ遺伝子のノックアウト遺伝的バックグラウンドでＩ−ＳｃｅＩ−ｈＡｐｏ  Ａ−Ｉトランスジェニック系統を誘導するために、Ｆ０をＷＴ  ＫＯマウスと交配させる。合計７つの独立したトランスジェニック系統を研究する。導入遺伝子統合の分子特性は、サザンブロット実験によって行われる。
【０６９２】
各トランスジェニック系統における導入遺伝子発現の分析は、肝臓から抽出された全ＲＮＡ（Ｔｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＲＴ−ＰＣＲによって行われる。マウス転写産物との交差反応を回避するために、ヒトトランスジェニックＩ−ＳｃｅＩ−ｈＡｐｏ  Ａ−Ｉ  ｃＤＮＡに特異的なプライマーが使用される。アクチンプライマーは、内部対照として使用される。
【０６９３】
インビボでの流体力学に基づく形質導入  インビボでのトランスジェニックマウス肝細胞の形質導入は、流体力学的尾静脈注射によって行われる。１０〜２０ｇの動物に、１０秒未満で、ＰＢＳ中の体重の１／１０の量の環状プラスミドＤＮＡを注射する。ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＩ−ＳｃｅＩをコードする２０または５０マイクログラムのｃｅＤＮＡの混合物。
【０６９４】
遺伝子訂正の分析：Ｉ−ＳｃｅＩ発現カセットおよびｃｅＤＮＡ修復マトリックスの注入後のマウスの導入遺伝子の訂正は、ランダムヘキサマーを使用して逆転写された全肝ＲＮＡに対するネストされたＰＣＲによって分析される。訂正されていないものではなく、訂正された遺伝子を検出するために、修復された遺伝子を特異的に増幅したプライマーセットを使用する。特異性は、前方が修復マトリックスの外側に位置しているＩ−ＳｃｅＩ部位にまたがる逆オリゴヌクレオチドを使用して達成される。アクチンプライマーを内部対照として使用した。
【０６９５】
結果：
これらの実験では、Ｉ−ＳｃｅＩ−ｈａｐｏ  Ａ−Ｉ導入遺伝子の１つまたはいくつかのコピーを担持する様々なトランスジェニック系統が使用される。マウスには、Ｉ−ＳｃｅＩ発現ベクターおよびｃｅＤＮＡの混合物、またはＩ−ＳｃｅＩ発現カセットおよびｃｅＤＮＡの両方を担持するベクターを注入する。突然変異型ヒトＡｐｏ  Ａ−Ｉ遺伝子の修復は、訂正されたヒトＡｐｏ  Ａ−Ｉ遺伝子とのみ対合するように特別に設計されたプライマーを使用して、全肝ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって監視される。ＰＣＲ断片は、Ｉ−ＳｃｅＩを発現するカセットおよびｃｅＤＮＡ修復マトリックスが注入されたトランスジェニックマウスで特に可視化される。遺伝子訂正は、導入遺伝子の１つまたは複数のコピーを含む、試験したすべてのトランスジェニック系統で検出可能である。
【０６９６】
メガヌクレアーゼにより誘導される遺伝子変換を使用して、インビボゲノム手術を実施できること、およびメガヌクレアーゼをそのような適用のための薬物として使用できることが示されている。ｃｅＤＮＡベクターは、メガヌクレアーゼによって提供される二本鎖切断の後に挿入される訂正ＤＮＡ鎖として使用される、テンプレートヌクレオチド配列を含む。
【０６９７】
実施例９：初代ヒト肝細胞のインビトロＡＡＶ形質導入
細胞培養皿（４８ウェル、ＣＭ１０４８、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）は、プレコートで購入され得るか、またはプレート（３５４８、ＶＷＲ）を、１ウェルあたり１５０ｍＬで１０ｍＬの肝細胞基本培地（ＣＣ−３１９９、Ｌｏｎｚａ）中の２５０ｍＬのＢＤＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の混合物でコーティングすることができる。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。１８ｍＬのＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ  ＣＰ培地（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ）および４００ｍＬのＴｏｒｐｅｄｏ抗生物質ミックス（Ｃｅｌｓｉｓ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を組み合わせることによって、解凍／プレーティング培地を調製する。プレートを調製したら、プレート可能なヒト肝細胞（ロット＃  ＡＫＢ、カタログ＃Ｆ００９９５−Ｐ）を液体窒素蒸気相から３７°水浴に直接移す。細胞が完全に解凍されるまで、バイアルを穏やかに撹拌する。細胞を、５ｍＬのあらかじめ温められた解凍／プレーティング培地を含む５０ｍＬの円錐チューブに直接移す。細胞を完全に移すために、バイアルを１ｍＬの解凍／プレーティング培地で洗浄する。チューブを穏やかに回転させることによって、細胞を再懸濁する。少量のアリコート（２０ｍＬ）を取り出して、トリパンブルー溶液１：５（２５−９００−Ｃ１、Ｃｅｌｌｇｒｏ）を使用することによって細胞数を測定し、細胞生存率を決定する。次いで、細胞を７５ｇで５分間遠心分離する。上澄を完全にデカントし、細胞を１３１０６細胞／ｍＬで再懸濁する。マトリゲル混合物をウェルから吸引し、細胞を４８ウェル皿に１ウェルあたり２３１０５細胞で播種する。次いで、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃でインキュベートする。形質導入時に、細胞は、維持のために肝細胞培養培地（ＨＣＭ）に切り替えられる（肝細胞基本培地、ＣＣ−３１９９、Ｌｏｎｚａ；ＨＣＭ、ＣＣ−４１８２、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ）。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターおよびｍＡｌｂ  ＺＦＮメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）［あるいは実験では、各々ＺＦＮメッセンジャーと同じ部位に標的されるＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｍＡｌｂ  ｇＲＮＡもしくはＴＡＬＥＮもしくはＭＮで置き換えるか、または実験では、ｃｅＤＮＡ上の発現エレメントを統合する］は、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）（または本明細書に開示されている他の適切な試薬）でトランスフェクトされる。２４時間後、培地を新鮮なＨＣＭで交換し、これは、初代肝細胞培養の健康を最大にするために毎日行われる。ＥＬＩＳＡによるｈＦＩＸ検出が必要な実験では、ｈＦＩＸが上澄に蓄積するように、培地を数日間交換しない場合がある。
【０６９８】
実施例１０：ＺＦＮ系を使用したインビボ血友病治療のためのｃｅＤＮＡベクター
ジンクフィンガーヌクレアーゼベースの遺伝子編集系を含むｃｅＤＮＡベクターも構築することができる。例示の目的で、例示的な遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、ヌクレアーゼ導入遺伝子としてジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするｃｅＤＮＡベクターの生成に関して記載されており、以下に記載される。しかしながら、本明細書に記載される方法および構築物において有用なヌクレアーゼをコードする遺伝子編集ｃｅＤＮＡを生成する方法を説明するために、この実施例ではＺＦＮが例示されているが、当業者は、上述の使用のように、本明細書に記載される任意のヌクレアーゼ、例えば、限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−酵素、および操作された部位特異的誘導体ヌクレアーゼを使用できることを承知している。ｃｅＤＮＡベクターによってコードされる例示的なヌクレアーゼは、本明細書、例えば、「ＤＮＡエンドヌクレアーゼ」と題するセクションおよびその中のサブセクションに記載されている。
【０６９９】
前述の実施例に記載された方法を利用して、ｃｅＤＮＡベクターに導入遺伝子として含まれるヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり得る。非限定的な一例として、Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ  １２６：１７７７−１７８４（２０１５）によって記載されたアルブミン遺伝子座への治療用導入遺伝子のＺＦＮ媒介標的は、本発明のｃｅＤＮＡベクターを使用してもたらされ得る。そのようなｃｅＤＮＡベクターは、その遺伝子座を標的とするｃｅＤＮＡコード化ＺＦＮの活性を介して、標的対象のアルブミン遺伝子座におけるヒト第ＶＩＩＩ因子および／または第ＩＸ因子の統合を可能にする。本明細書に記載される送達方法のうちのいずれかを使用して、ｃｅＤＮＡベクターを患者に投与することができる。血友病ＡおよびＢのマウスモデルにおける治療レベルでの、例えばヒト第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子（ｈＦＶＩＩＩおよびｈＦＩＸ）の長期発現は、この方法を使用して達成される。
【０７００】
実施例１１：ＺＦＮ系を使用したインビボでの嚢胞性線維症治療のためのｃｅＤＮＡベクター
実施例１０の実験に対する類似のアプローチを適用して、例えば嚢胞性線維症（ＣＦ）を有する対象において、肺での遺伝子編集を誘導する。この実験では、野生型ＣＦＴＲ（ＣＦで突然変異している遺伝子）をコードするために、ｃｅＤＮＡが作成される。ＣＦＴＲ、はＡＡＶ内に含めることができない大きな遺伝子である。ｃｅＤＮＡは、ＡＡＶよりも大幅に大きい核酸インサートに対応するため、ＣＦＴＲの治療に独自の解決策を提供する。ＺＦＮ  ＣＦＴＲ特異的遺伝子編集系をコードするｃｅＤＮＡベクターは、肺上皮の遺伝子編集を誘導するために、静脈内または噴霧製剤として投与され得る。上記のように、実験では、ＣＦＴＲは、その遺伝子座を標的としたコードされたＺＦＮの活性と、ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡのパッケージ化とを通じて内因性ＣＦＴＲ遺伝子座に挿入され、大きな相同性アームを利用することで、遺伝子編集の効率および忠実度を高めることができる。
【０７０１】
実施例１２：インビボでのデュシェンヌ型筋ジストロフィー治療のためのｃｅＤＮＡベクター
実施例１０および１１の実験への類似のアプローチを適用して、ジストロフィン遺伝子の突然変異を訂正することによって、筋肉組織、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーにおけるＺＦＮ媒介遺伝子編集を誘導する。
【０７０２】
あるいは、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１スプライスアクセプターに隣接する少なくとも２つのニックおよび／またはＤＳＢを作成するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＮＦまたはＴＡＬＥＳ）をコードするために、ｃｅＤＮＡベクターが作成される。これらのニックおよび／または切断の修復は、エクソン５１の欠失をもたらす。エクソン５１の欠失は、ジストロフィン転写産物からエクソン５１の除外をもたらし、それによってある特定のＤＭＤを引き起こす突然変異、例えばエクソン４８〜５０の欠失を訂正する。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの大きなペイロード容量は、２つのエンドヌクレアーゼ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１５  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１４．２３４に記載されるような２つのＺＦＮ）またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび複数のｓｇＲＮＡが、単一ベクターで筋細胞に送達され、効率を高めることができるようにする。ｃｅＤＮＡベクターを静脈内または筋内に投与して、筋組織の遺伝子編集を誘導することができる。
【０７０３】
さらに、１つのみのガイドＲＮＡ標的配列（例えば、１つまたは複数のコピー数）、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを（シスまたはトランスで）発現するｃｅＤＮＡ遺伝子編集ベクターを使用して、ＤＭＤ遺伝子の個々のスプライスドナーまたはスプライスアクセプターを標的とすることができる。これが、エクソンスキッピング（例えば、エクソン５１スキッピング）および遺伝子の訂正を引き起こし、機能性タンパク質を発現させる、ＮＨＥＪをもたらす。ＤＭＤ遺伝子を標的とする複数のガイドＲＮＡは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／０２０１０８９に見られ、例えば、その中の実施例５〜１１を参照されたい。ジストロフィン発現の訂正は、ＤＭＤ筋芽細胞株で試験することができる。
【０７０４】
実施例１３：ゲノムセーフハーバー遺伝子からの長期治療的発現のためのｃｅＤＮＡ遺伝子編集ベクター。
相同性ドメインを含むｃｅＤＮＡ遺伝子編集ベクターを使用して、治療用導入遺伝子の挿入および発現のために、ゲノムセーフハーバー遺伝子を標的とすることができる。ｃｅＤＮＡベクターは、実施例１に従って作製される。任意のセーフハーバー遺伝子座を標的とすることができ、そのようなセーフハーバーは、例えば、既知の不活性イントロンであるか、あるいはタンパク質を高発現レベルで発現することが知られているコード配列に近い活性イントロンである。セーフハーバー遺伝子への挿入は、挿入がない場合と比較して、著しい悪影響を及ぼさない。例えば、血清アルブミンは、肝細胞におけるその高い発現レベルと存在のために、関心対象の典型的な標的である。アルブミンの最初のエクソンが最終タンパク質産物から切断される分泌ペプチドをコードするため、スプライスアクセプター部位および導入遺伝子を持つプロモーターレスカセットの、アルブミンのイントロン配列への統合は、多くの異なるタンパク質の発現および分泌をサポートする。少なくとも１つのｃｅＤＮＡベクターは、イントロン１を標的とするジンクフィンガー対をコードする。例示的なジンクフィンガー対は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｌｏｏｄ（２０１５）１２６（１５）：１７７７−１７８４（例えば、補足の図６のＡ−ＢおよびＣ−Ｄの対）に完全に記載されている。さらに、ｃｅＤＮＡベクターには制限がないため、ｃｅＤＮＡベクターは、同じまたは異なるｃｅＤＮＡベクター上にドナーＤＮＡを提供するように操作されている。
【０７０５】
例示の目的で、例示的な遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、アルブミンセーフハーバーを標的とする相同性アーム（相同性ドメインとも呼ばれる）を含むｃｅＤＮＡベクターの生成に関して記載されており、以下に記載されている。しかしながら、本明細書に記載される方法および構築物において有用な導入遺伝子（またはドナーＤＮＡ）の標的挿入のための相同性アームを持つ遺伝子編集ｃｅＤＮＡを生成する方法を示すために、この実施例では、アルブミンアルブミンのイントロン１への導入遺伝子（またはドナーＤＮＡ）の標的挿入のための相同性アームを持つ遺伝子編集ｃｅＤＮＡが例示されているが、当業者は、上述の使用のように、セーフハーバー遺伝子または遺伝子座を含むがこれに限定されない任意の遺伝子に対して相同性アームを使用できること、例えば、ＣＣＲ５またはＡＡＶ−セーフ−ハーバー−Ｓ１遺伝子座が標的とされ得ることを承知している。
【０７０６】
図１６は、ドナーＤＮＡを標的アルブミンイントロン配列に組み込むためのいくつかのプロモーターレス構築物を描く概略図を示し、そのような構築物は、ヌクレアーゼと同じまたは異なるベクター上にある。一実施形態では、プロモーターレスｃｅＤＮＡ構築物は、末端反復（例えば、ＩＴＲ）が隣接する挿入／修復配列を含み、ヌクレアーゼ／ガイドＲＮＡは、別個の構築物（例えば、第２のｃｅＤＮＡベクター、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、組み換えヌクレアーゼ、ＲＮＰ複合体等）を使用して提供される。プロモーターのない（プロモーターレス）任意の導入遺伝子、例えば、ＦＶＩＩＩまたは第ＩＸ因子、またはＧＦＰ、またはＧＦＰおよびｎｅｏをコードするｃｅＤＮＡは、アルブミン遺伝子座に対するゲノム相同性アームを用いて作製される（実施例４を参照）。いくつかの実験では、ＺＦＮの代わりに、Ｃａｓ９またはｃｐｆ１ヌクレアーゼが、ｃｅＤＮＡベクターに組み込まれ、ガイドＲＮＡが、ＺＦＮ領域を標的とするように設計される。いくつかの実験では、同じｃｅＤＮＡをさらに操作してガイドＲＮＡを発現させ（例えば、図１４、１５、および１６を参照）、ＣＡＳまたはｃｐｆ１酵素が使用される場合、同じもしくは異なるｃｅＤＮＡ上、またはプラスミド上のいずれかでＣＲＩＳＰＲが提供され得る。ガイドＲＮＡは、標的配列を整列させ、使用されるＣＡＳ酵素（例えば、ｓａＣＡＳ９、またはｓｐＣＡＳ９、またはｃｐｆ１等）に関連するＰＡＭモチーフを識別することによって、例えば、Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（２０１５）１２６（１５）：１７７７−１７８４におけるＺＦＮ標的配列（例えば、補足図６のＡ−ＢおよびＣ−Ｄの対）に結合するように操作されている。ガイドＲＮＡのためのアルブミンにおける１つのｃｅＤＮＡ標的中心を図１７に示す。類似の部位が、ヒトアルブミンに使用される。
【０７０７】
例示の導入遺伝子（例えば、分泌タンパク質、例えば第ＩＸ因子）を発現するためのアルブミン遺伝子への例示の挿入のためのｃｅＤＮＡｓ遺伝子編集系は、ヒト標的遺伝子に向けられたガイドＲＮＡを使用するときに初代ヒト肝細胞（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのヒト肝細胞）でインビトロで試験し、マウスモデルではインビボで試験する。例えば、上記のＳｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるように、マウス肝臓は、第ＩＸ因子ｍＲＮＡレベルの測定および発色アッセイおよび抗原を使用した第ＩＸ因子活性の測定のために、ｃｅＤＮａ系の全身投与後に分離される。第ＩＸ因子を組み込んだ系では、ｍＲＮＡレベル、タンパク質活性アッセイ、ウエスタンブロットの技術的に既知であり、かつ市販の試験は、任意の所望の導入遺伝子のノックインの評価、およびインビトロヒト初代細胞およびインビボマウスモデルの両方における訂正を試験するために好適である。アルブミン遺伝子座への挿入は、例えば、血液への分泌タンパク質の分泌を可能にする。導入遺伝子の血漿中濃度が評価される。ヒト第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の分泌は、血友病の動物モデルでインビボで試験される。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡを使用して、任意の分泌されたタンパク質をアルブミンに「ノックイン」できることは、当業者には理解されるであろう。非限定的な例には、α−ガラクトシダーゼ、イズラネート−２−スルファターゼ、ベータ−グルコシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ等が含まれ、適切な動物モデルで試験することができる。一実施形態では、ノックインは、Ｇａｌ１などの誘導性プロモーターの制御下にある。
【０７０８】
本明細書ではさらに、ｃｅＤＮＡベクターのねじれ拘束が、ｃｅＤＮＡベクター自体を標的とするガイドＲＮＡと組み合わせてｎＣａｓ９ニッカーゼを介して解放されることが企図される。そのようなねじれ拘束の解放により、ｃｅＤＮＡベクター上に見られるＨＤＲテンプレートの１つ以上の相同性アームの能力が向上し得る。加えて、本明細書ではさらに、ＩＴＲを標的とするガイドＲＮＡを、染色体のガイドＲＮＡと組み合わせてＣａｓ９とともに使用できることが企図される。ｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲ（または相同性）領域ならびに染色体上の標的部位の両方を標的とする単一ガイドＲＮＡを設計することができる。ｃｅＤＮＡベクター内の切断部位は、ＤＮＡベクターの片端または両端に位置し得る。
【０７０９】
実施例１４：ｃｅＤＮＡベクターで使用するための例示的な標的遺伝子およびｓｇＲＮＡ
例示の目的で、例示的な遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、編集のためのＺＮＦヌクレアーゼのｓｇＤＮＡを含むｃｅＤＮＡベクターの生成に関して記載されており、以下に記載されている。しかしながら、遺伝子を編集するためのＺＮＦヌクレアーゼのｓｇＲＮＡ配列は、本実施例において例示され、本明細書に記載される方法および構築物において有用な遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターを生成する方法を説明するが、本明細書の「ＤＮＡエンドヌクレアーゼ」と題するセクションおよびその中のサブセクションにおいて論じられるように、当業者は、上述の使用のように、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９および操作された部位特異的ヌクレアーゼのｓｇＲＮＡを含む、本書に記載されている任意のヌクレアーゼのｓｇＲＮＡを使用できることを承知している。
【０７１０】
非限定的な例示的標的遺伝子およびＺＦＮの標的配列対、ならびにＺＮＦ標的配列に基づくｇＲＮＡ配列は、表９に見られる。ｃｅＤＮＡベクターは、標的遺伝子の訂正および／または調整のためにこれらの配列を標的とするＺＮＦを発現するように操作されている。ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、任意のＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系を使用して標的遺伝子を訂正するために、そのような例示的なｇＲＮＡを発現するように操作されている。したがって、ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、表９または表１０から選択される遺伝子を標的とする。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、表９から選択されるガイドＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、以下の表９から選択される標的配列を標的とするＺＦＮをコードする遺伝子を含む。
【０７１１】
表９：ＺＦＮ標的配列を標的とするｓｇＲＮＡ
【表９−１】
2021505159.tif 000054
【表９−２】
2021505159.tif 000055
【表９−３】
2021505159.tif 000056
【表９−４】
2021505159.tif 000057
【表９−５】
2021505159.tif 000058
【表９−６】
2021505159.tif 000059
【表９−７】
2021505159.tif 000060
【表９−８】
2021505159.tif 000061
【表９−９】
2021505159.tif 000062
【表９−１０】
2021505159.tif 000063
【０７１２】
表１０：標的とするための例示的な遺伝子（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５／００５６７０５を参照）
【表１０−１】
2021505159.tif 000064
【表１０−２】
2021505159.tif 000065
【表１０−３】
2021505159.tif 000066
【０７１３】
実施例１５：Ｔ細胞を操作するためのｃｅＤＮＡ遺伝子編集ベクター
本明細書に開示されるように、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ遺伝子編集ベクターを使用して、任意の細胞のゲノム、例えば、Ｔ細胞における遺伝子を編集、修復、および／またはノックアウトすることができる。例示の目的で、例示的な遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、Ｔ細胞におけるＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＰＤ−１遺伝子のうちのいずれかを編集するためのｃｅＤＮＡベクターの生成に関して記載されており、以下に記載される。しかしながら、本明細書に記載される方法および構築物において有用な遺伝子編集ベクターｃｅＤＮＡを生成する方法を説明するために、本実施例ではＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、またはＰＤ−１遺伝子を標的とすることが例示されるが、当業者は、上述の使用のように、例えば、本明細書における「遺伝子編集ｃｅＤＮＡで治療される例示的な疾患」および「遺伝子編集のための追加の疾患」と題するセクションに記載されるように、遺伝子編集が望ましい任意の遺伝子を使用できることを承知している。さらに、この例示的な実施例では、Ｔ細胞のゲノムが修飾されているが、当業者は、エクスビボまたはインビボで任意の細胞、例えば本明細書において「宿主細胞」と題するセクションＸＩＩ．Ａに記載されている任意の細胞を修飾できることを承知している。また、この例示的な実施例では、ゲノムＤＮＡが修飾されるように示されているが、熟練者がｃｅＤＮＡベクターを修飾して、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を修飾する、例えば、Ｍａｅｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．″Ｇｅｎｏｍｅ−ｅｄｉｔｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｓｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２４．３（２０１６）：４３０−４４６  ａｎｄ  Ｇａｍｍａｇｅ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍａｙ  Ｎｏｔ  Ｂｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｉｚｅｄ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２０１８；３４（２）：１０１−１１０に記載されているように、ｍｔＺＦＮおよびｍｉｔｏＴＡＬＥＮ機能、またはミトコンドリア適合型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォームをコードできることも想定される。
【０７１４】
治療に関連する任意の遺伝子（例えば、ＣＸＣＲ４、またはＣＣＲ５、ＨＩＶ侵入の補助受容体）が標的とされ得、切除、編集、修復、または置換され得る（ＣＸＣＲ４の場合、例えば、ＨＩＶ侵入を防止するため）。さらなる非限定的な例では、Ｔ細胞消耗のメディエーターであるＰＤ−１を切除することができる。標的遺伝子の切除は、テンプレート核酸配列、例えばドナーＨＤＲテンプレートの有無にかかわらず実施される。ＨＤＲテンプレートがない場合の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）および対応するヌクレアーゼの使用は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）をもたらす。
【０７１５】
任意の治療関連遺伝子座を標的とすることができ、そのような標的遺伝子座は、例えば、Ｔ細胞枯渇の既知の調節因子、ウイルス補助受容体等である。ｃｅＤＮＡ遺伝子編集ベクターは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、例えば、「ＤＮＡエンドヌクレアーゼ」と題するセクションおよびその中のサブセクションにおいて本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、および操作された部位特異的誘導ヌクレアーゼを含む他のエンドヌクレアーゼを含む、本明細書に記載される任意のエンドヌクレアーゼを含み得る。例示的な好適なエンドヌクレアーゼと、ＣＸＣＲ４およびＰＤ−１のＨＤＲのテンプレート核酸は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０１５）１１２（３３）：１０４３７−１０４４２に完全に記載されている（例えば、Ｓｃｈｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，における図１〜４を参照）。
【０７１６】
さらに、ｃｅＤＮＡにはサイズ制限がないため、ｃｅＤＮＡベクターは、同じｃｅＤＮＡベクター上にドナーＤＮＡおよび／または遺伝子編集分子を提供するように操作することができる。あるいは、ドナーＤＮＡおよび／または遺伝子編集分子は、１つ以上の異なるｃｅＤＮＡベクター上に提供することができる。
【０７１７】
標的遺伝子座の切除、例えば、プロモーターの破壊または未成熟終止コドンの挿入またはミスセンス突然変異に適したテンプレート核酸をコードするｃｅＤＮＡは、標的遺伝子座へのゲノム相同性アームを用いて作製される（例えば、実施例１０を参照）。そのようなものとして、修飾された細胞では、遺伝子は切断されるか、または遺伝子サイレンシングされる。いくつかの実験では、Ｃａｓ９またはｃｐｆ１ヌクレアーゼが、同じまたは異なるｃｅＤＮＡベクターに組み込まれる。いくつかの実験では、ｃｅＤＮＡは、ガイドＲＮＡを発現するようにさらに操作され（例えば、図１２、１５、１６を参照）、Ｃａｓまたはｃｐｆ１酵素が使用される場合、同じもしくは異なるｃｅＤＮＡ上で、またはプラスミドによって、またはｍＲＮＡによって、または組み換えタンパク質によって提供され得る。ガイドＲＮＡは、標的配列を整列させ、使用されるＣＡＳ酵素（例えば、ｓａＣａｓ９、またはｓｐＣＡＳ９、またはｃｐｆ１等）に関連するＰＡＭモチーフを同定することによって、例えば、ＰＮＡＳ（２０１５）１１２（３３）：１０４３７−１０４４２における標的配列に結合するように操作されている。
【０７１８】
いくつかの実験では、ガイドＲＮＡは、他の既知の配列領域を標的とする。既知の標的領域に結合する複数のｓｇＲＮＡ配列が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１５／００５６７０５号の表１〜２に記載されており、例えば、ヒトβグロビン、ヒト、ＢＣＬＩＩＡ、ヒトＫＬＦ１、ヒトＣＣＲ５、ヒトＣＸＣＲ４、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、マウスおよびヒトＨＰＲＴ、ヒトアルブミン、ヒト第ＩＸ因子、ヒト第ＶＩＩＩ因子、ヒトＬＲＲＫ２、ヒトＨｔｔ、ヒトＲＨ、ＣＦＴＲ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ヒトＰＤ１、ヒトＣＴＬＡ−４、ＨＬＡ  ｃ１１、ＨＬＡ  Ａ２、ＨＬＡ  Ａ３、ＨＬＡ  Ｂ、ＨＬＡ  Ｃ、ＨＬＡ  ｃ１．ＩＩ  ＤＢｐ２．ＤＲＡ、Ｔａｐ１および２、Ｔａｐａｓｉｎ、ＤＭＤ、ＲＦＸ５等）のｇＲＮＡ配列が含まれる。
【０７１９】
ｃｅＤＮＡベクターは、エクスビボでＴ細胞に送達されるが、全身送達も本明細書で企図される。いくつかの実験では、Ｃａｓ９またはｃｐｆ１ヌクレアーゼの代わりに、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮＳ、またはｍｅｇａＴＡＬが同じまたは異なるｃｅＤＮＡベクターに組み込まれる。
【０７２０】
実施例１６：ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）を治療するためのエクスビボ遺伝子編集
ＡＡＶを使用したエクスビボ遺伝子編集は、ＡＡＶが相同性修復テンプレートまたはＤＮＡドナーテンプレートの唯一のソースであるため、困難である。ＡＡＶベクターは、カプシド化ＤＮＡを含み、これは送達され得る相同性アームのサイズを制限する。さらに、ＡＡＶに関連する複雑性および高いコストにより、エクスビボ遺伝子編集に関してその有用性が制限される。さらに、培養中の細胞に十分な相同性指向修復を誘導するには、非常に高い力価のＡＡＶベクターが必要である。
【０７２１】
本明細書に記載されるＣｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡドナーテンプレートのＡＡＶベクター媒介送達に関連する問題の多くを克服することができる。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、従来のＡＡＶベクターで使用される相同性アームよりも長い相同性アームを有するドナーテンプレートの使用を可能にし、これはより高いオンターゲット効果およびより低いオフターゲット効果を伴って、より効率的な遺伝子編集を可能にする利点をもたらす。
【０７２２】
例示の目的で、例示的な遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターは、ＷＡＳ遺伝子ＣＤ３４＋幹細胞をエクスビボで編集するためのｃｅＤＮＡベクターの生成に関して記載されており、以下に記載される。しかしながら、本明細書に記載される方法および構築物において有用な遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターを生成する方法を説明するために、この実施例ではＷＡＳ遺伝子の標的が例示されているが、当業者は、上述の使用のように、遺伝子編集が望まれる任意の遺伝子を使用できることを承知している。編集のための例示的な遺伝子は、本明細書において、例えば、「遺伝子編集ｃｅＤＮＡで治療される例示的な疾患」および「遺伝子編集のための追加の疾患」と題するセクションに記載されている。さらに、この例示的な実施例では造血ＣＤ３４＋細胞のゲノムが修飾されているが、体細胞、培養細胞、ならびに幹細胞および／または多能性細胞を含む任意の細胞、例えば、「宿主細胞」と題する本明細書のセクションＸＩＩ．Ａ．に記載される任意の細胞が、エクスビボまたはインビボで修飾され得る。
【０７２３】
エクスビボ実験を、ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞を使用して実施して、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするｃｅＤＮＡベクターが培養で遺伝子編集を行う能力を試験する。５つの異なる治療アームを含む例示的な実験は、本明細書において以下に概説される。
【０７２４】
最初に、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、現在ＡＡＶベクターを使用して送達され、ＷＡＳ  ＯＲＦ（ミニ遺伝子、エクソンのみ）および相同性領域をコードする構築物を送達する。遺伝子編集結果の効率は、ＡＡＶを使用して達成された効率（３０〜４０％）と比較され、ｃｅＤＮＡベクターベースの送達が同じミニ遺伝子のＡＡＶを介した送達の効率を満たし得るか、または超え得るかを決定する。
【０７２５】
次に、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、イントロン１を保持したＷＡＳミニ遺伝子（エクソンのみ）を送達する。イントロン−１は、ＷＡＳタンパク質の発現に重要であることがわかっているが、イントロン−１は、ＡＡＶベクターのサイズ制限を超えている。したがって、ＷＡＳミニ遺伝子＋イントロン−１の送達が成功すると、ｃｅＤＮＡベクターが、遺伝子編集、ＷＡＳミニ遺伝子＋イントロン−１の標的送達、およびＷＡＳタンパク質の良好な発現についてＡＡＶベクターより優れていることが示される。
【０７２６】
次に、ＷＡＳ  ＯＲＦミニ遺伝子またはＷＡＳミニ遺伝子＋イントロン−１を含むｃｅＤＮＡベクターは、より長い相同性アームで設計され、そのような相同性アームの長さの増加が、遺伝子編集のオンターゲット効率またはオフターゲット忠実度に影響を及ぼすかどうかを評価する。
【０７２７】
次に、ＷＡＳ  ＯＲＦミニ遺伝子またはＷＡＳミニ遺伝子＋イントロン−１を含むＣｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡにＣａｓ９切断部位を含むように設計されており、Ｃａｓ９部位の存在が、ｃｅＤＮＡベクターのねじれ張力を解放することによって、ドナーテンプレートとして機能するようにｃｅＤＮＡの効率を高めるかどうかを決定する。最後に、ｃｅＤＮＡ−ＧＦＰ／ｃｅＤＮＡ−ＬＵＣなどのレポーター構築物をコードするｃｅＤＮＡベクターは、エクスビボ細胞におけるｃｅＤＮＡベクターの電気穿孔の効率を最適化および／または最大化するように設計され得る。
【０７２８】
実施例１７：培養細胞における遺伝子編集のための例示的なワークフロー方法（複数可）
別の実施例では、図１９に描かれる方法を本明細書において使用して、培養細胞における遺伝子編集を実施する。例えば、本発明のｃｅＤＮＡベクターのうちのいずれかは、本出願および実施例に記載されている方法により、肝細胞培養物などの培養細胞に送達することができる。次いで、ＮＨＥＪ経路（ｃｅＤＮＡベクターがＨＤＲテンプレートを含まない場合）を使用して、またはＨＤＲ経路（ｃｅＤＮＡベクターがＨＤＲテンプレートを含む場合）を介して、遺伝子編集をもたらすのに十分な時間および条件下でインキュべートされる。遺伝子編集が成功したかどうかを判断するには、ドナーテンプレートタンパク質、例えば、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の発現について、またはゲノム標的ＤＮＡのディープシーケンシングによって細胞をアッセイして、ドナーテンプレートの良好な組み込みが起こったかどうかを判断することができる。この実施例に関するさらなる考慮事項が以下に概説される。
【０７２９】
ガイドＲＮＡの設計：当該技術分野で知られている任意の方法を使用して、本発明のｃｅＤＮＡベクターに組み込むための標的遺伝子編集部位と相同性を有するカスタムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計および／または合成することができる。本明細書では、カスタムｇＲＮＡは、複数のベンダー、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒを通じて設計および合成され得ることが本明細書で特に企図されている。
【０７３０】
初代細胞培養：いくつかの実施形態では、肝細胞などの肝臓細胞の遺伝子編集部位を標的とすることが望ましい場合がある。これは、例えば、アルブミン遺伝子内の遺伝子編集部位を利用することによって達成できる。当業者は、肝臓細胞を含む初代細胞の良好な単離および増殖は困難であり得、解凍およびプレーティング手順、プレートのコーティング、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、および／または増殖培地（例えば、肝細胞基本培地）の最適化を必要とし得ることを理解するであろう。一実施形態では、肝臓細胞を培養するための方法は、当該技術分野で既知の方法、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｈａｒｍａ  Ｂｌｏｏｄ（２０１７）（上記）に由来する。初代肝臓細胞の増殖条件は、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからの試薬、解凍培地、プレーティング培地、インキュベーション培地、およびマトリックス試薬（ＧｅｌＴｒｅｘ（商標）、ＭａｔｒｉＧｅｌ（商標））などを使用して最適化され得る。
【０７３１】
ＨＤＲテンプレートｃｅＤＮＡ：非限定的な実施例では、ＨＤＲテンプレートを含むｃｅＤＮＡベクターは、図１９に示されるように設計される。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、所望の長さを有する５’相同性アームおよび所望の長さの３’相同性アームを含み得る。非特異的効果を排除するために、本明細書では、ｃｅＤＮＡ対照が、（ｉ）５’相同性アームのみ（ドナーテンプレート配列の有無にかかわらず）、または（ｉｉ）３’相同性アームのみ（ドナーテンプレート配列の有無にかかわらず）は、ＨＤＲテンプレート全体（例えば、５’相同性アーム、ドナーテンプレート配列、および３’相同性アーム）を含むｃｅＤＮＡベクターと実質的に同様のプロトコルで使用することができる。これらの対照により、当業者は、相同性アームによって単独でもたらされ得る非特異的効果またはオフターゲット効果がある場合、それを識別することができる。
【０７３２】
実施例１８：対象におけるインビボでの遺伝子編集のための例示的なワークフロー方法（複数可）
実施例１７に記載される方法およびｃｅＤＮＡ構築物は、多細胞生物、例えば、動物または人間において遺伝子編集を行うように適合させることができる。ｃｅＤＮＡベクターは、任意の便利な方法で生物（例えば、マウス）の胚性幹細胞に送達することができる。いくつかの実施例では、生物は、非ヒト生物である。生物は、疾患の動物モデルを生成するための齧歯類または動物（例えば、非ヒト霊長類）であり得る。得られた細胞をスクリーニングして、適切に組み換えられた導入遺伝子の存在を確認する。陽性細胞を野生型生物（例えば、マウスおよび非ヒト齧歯類）に移植し、得られた子孫を導入遺伝子の存在についてスクリーニングすることができる。標的とされる突然変異は、生物（例えば、マウス）の任意の系統における関心対象の遺伝子において作製され得るため、子孫の戻し交配は、所望の遺伝的バックグラウンドでトランスジェニック子孫を得るために必要ない。
【０７３３】
例示の目的で、この実施例は、細胞を編集して動物モデルを生成するためのｃｅＤＮＡベクターの生成に関して、例示的な遺伝子編集ｃｅＤＮＡベクターの使用について考察する。しかしながら、本明細書に記載される遺伝子編集ベクターｃｅＤＮＡを使用する方法を説明するために、この実施例では動物（例えば、マウス）の修飾が例示されているが、当業者は、上述の使用のように、遺伝子編集が望まれる任意の生物または対象の細胞上のｃｅＤＮＡベクターを使用できることを承知している。遺伝子編集の例示的な対象は、本明細書の「対象」の定義で論じられている。
【０７３４】
参考文献
特許および特許出願を含むがこれらに限定されない、本明細書および本明細書の実施例で引用されるすべての刊行物および参考文献は、あたかも個々の刊行物または参考文献が、完全に記載されるように参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、それら全体が参照により組み込まれる。この出願が優先権を主張する任意の特許出願もまた、刊行物および参考文献について上述した方法で、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2021505159.tif 000067
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
2021505159.tif 000074
【図２Ｂ】
2021505159.tif 000075
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2021505159.tif 000083
【図４Ｅ】
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【図５】
2021505159.tif 000085
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2021505159.tif 000087
【図７Ａ−１】
2021505159.tif 000088
【図７Ａ−２】
2021505159.tif 000089
【図７Ａ−３】
2021505159.tif 000090
【図７Ａ−４】
2021505159.tif 000091
【図７Ａ−５】
2021505159.tif 000092
【図７Ａ−６】
2021505159.tif 000093
【図７Ａ−７】
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【図７Ｂ−１】
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【図７Ｂ−２】
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【図７Ｂ−３】
2021505159.tif 000097
【図７Ｂ−４】
2021505159.tif 000098
【図７Ｂ−５】
2021505159.tif 000099
【図７Ｂ−６】
2021505159.tif 000100
【図７Ｂ−７】
2021505159.tif 000101
【図７Ｂ−８】
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【図８】
2021505159.tif 000103
【図９】
2021505159.tif 000104
【図１０Ａ−Ｄ】
2021505159.tif 000105
【図１０Ｅ−Ｆ】
2021505159.tif 000106
【図１１】
2021505159.tif 000107
【図１２】
2021505159.tif 000108
【図１３】
2021505159.tif 000109
【図１４】
2021505159.tif 000110
【図１５】
2021505159.tif 000111
【図１６】
2021505159.tif 000112
【図１７−１】
2021505159.tif 000113
【図１７−２】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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