(57)【要約】  ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用のＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）９ベースのエピゲノム修飾剤組成物およびその使用方法が本明細書に開示される。
2021523696.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物であって、
（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、またはその組合せからなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ｉ）融合タンパク質または（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、および
（ｂ）（ｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｉｉ）少なくとも１つのガイドｇＲＮＡをコードする核酸配列であって、前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する、（ｉ）少なくとも１つのｇＲＮＡまたは（ｉｉ）少なくとも１つのガイドｇＲＮＡをコードする核酸配列核酸配列
を含む組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域を修飾する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域が、ＣｐＧ１、ＣｐＧ２、ＣｐＧ３、ＣｐＧ４、ＣｐＧ５、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１０、ＣｐＧ１１、ＣｐＧ１２、ＣｐＧ１３、ＣｐＧ１４、ＣｐＧ１５、ＣｐＧ１６、ＣｐＧ１７、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、ＣｐＧ２３、またはその組合せを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域が、ＣｐＧ１、ＣｐＧ３、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、またはその組合せを含む、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
前記第２のポリペプチドドメインが、メチラーゼ活性を有するペプチドを含み、かつ、前記融合タンパク質が、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域をメチル化する、請求項３〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その相補体、そのバリアント、またはその組合せのうちの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン４内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化し、かつ、イントロン４内の前記標的領域が、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ１および／またはＨ３Ｋ２７Ａｃマークであってもよい、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記第２のポリペプチドドメインが、ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ３Ａ（ＤＮＭＴ３Ａ）、その機能的断片、および／またはそのバリアントを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記融合タンパク質が前記ＳＮＣＡ遺伝子の転写を抑制する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性をノックアウトする少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのアミノ酸突然変異がＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａのうちの少なくとも１つである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記Ｃａｓタンパク質が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記第２のポリペプチドドメインが、前記第１のポリペプチドドメインのＣ末端、Ｎ末端、または両方に融合している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
核局在配列をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第１のポリペプチドドメインを前記第２のポリペプチドドメインに接続するリンカーをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第２のポリペプチドドメインが配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記融合タンパク質が、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉｉ）、（ａ）（ｉ）および（ｂ）（ｉ）、（ａ）（ｉ）および（ｂ）（ｉｉ）、もしくは（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉ）のいずれかを対象に投与することを含む、またはいずれかが対象中に提供される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
（ａ）（ｉｉ）および／または（ｂ）（ｉｉ）の核酸がＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
（ａ）および（ｂ）の一方または両方がウイルスベクター中にパッケージングされている、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
（ａ）および（ｂ）が同じウイルスベクター中にパッケージングされている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターを含む、請求項２２または２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ウイルスベクターがエピソーム性インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）またはエピソーム性インテグラーゼコンピテントレンチウイルスベクター（ＩＣＬＶ）を含む、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ウイルスベクターが、複数のプロモーター、ｐ２ａ、ｔ２ａ、ＩＲＥＳ、またはその組合せを含むポリシストロン性タンパク質組成物を含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１に記載の組成物をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２７に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２９】
ウイルスベクターである、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２８または２９に記載のベクター。
【請求項３１】
前記ウイルスベクターがエピソーム性インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）またはエピソーム性インテグラーゼコンピテントレンチウイルスベクター（ＩＣＬＶ）である、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３２】
請求項２７に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物、請求項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクター、請求項３２に記載の宿主細胞、またはその組合せのうちの少なくとも１つを含む医薬組成物。
【請求項３４】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物、請求項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクター、またはその組合せのうちの少なくとも１つを含むキット。
【請求項３５】
細胞または対象におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現のｉｎ  ｖｉｖｏモジュレーションの方法であって、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物、請求項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクター、請求項３３に記載の医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つを、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で前記細胞または対象と接触させることを含む方法。
【請求項３６】
対象においてＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を治療する方法であって、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物、請求項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクター、請求項３３に記載の医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つを前記対象または前記対象中の細胞に投与することを含む方法。
【請求項３７】
細胞または対象におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現をｉｎ  ｖｉｖｏでモジュレートする方法であって、
（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、ならびに
（ｂ）（ｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合分子を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列
を、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で前記細胞または対象と接触させることを含む方法。
【請求項３８】
対象においてＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を治療する方法であって、
（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、ならびに
（ｂ）（ｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合分子を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合分子を標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列
を、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で前記対象または前記対象中の細胞に投与することを含む方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡまたは前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列が、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記融合タンパク質が、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域を修飾する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域が、ＣｐＧ１、ＣｐＧ２、ＣｐＧ３、ＣｐＧ４、ＣｐＧ５、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１０、ＣｐＧ１１、ＣｐＧ１２、ＣｐＧ１３、ＣｐＧ１４、ＣｐＧ１５、ＣｐＧ１６、ＣｐＧ１７、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、ＣｐＧ２３、またはその組合せを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域が、ＣｐＧ１、ＣｐＧ３、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、またはその組合せを含む、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２のポリペプチドドメインが、メチラーゼ活性を有するペプチドを含み、かつ、前記融合タンパク質が、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域をメチル化する、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その相補体、そのバリアント、またはその組合せのうちの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡまたは前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列が、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン４内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化し、かつ、イントロン４内の前記標的領域が、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ１および／またはＨ３Ｋ２７Ａｃマークであってもよい、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記第２のポリペプチドドメインが、ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ３Ａ（ＤＮＭＴ３Ａ）、その機能的断片、および／またはそのバリアントを含む、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記融合タンパク質が前記ＳＮＣＡ遺伝子の転写を抑制する、請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性をノックアウトする少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼを含む、請求項３７〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも１つのアミノ酸突然変異がＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａのうちの少なくとも１つである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｃａｓタンパク質が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２のポリペプチドドメインが、前記第１のポリペプチドドメインのＣ末端、Ｎ末端、または両方に融合している、請求項３７〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
核局在配列をさらに含む、請求項３７〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１のポリペプチドドメインを前記第２のポリペプチドドメインに接続するリンカーをさらに含む、請求項３７〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記第２のポリペプチドドメインが配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項３７〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項３７〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記融合タンパク質が、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項３７〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉｉ）、（ａ）（ｉ）および（ｂ）（ｉ）、（ａ）（ｉ）および（ｂ）（ｉｉ）、もしくは（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉ）のいずれかを前記対象に投与することを含む、またはいずれかが前記対象中に提供される、請求項３７〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
（ａ）（ｉｉ）および／または（ｂ）（ｉｉ）の核酸がＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項３７〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
（ａ）および（ｂ）の一方または両方がウイルスベクター中にパッケージングされている、請求項３７〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
（ａ）および（ｂ）が同じウイルスベクター中にパッケージングされている、請求項３７〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターを含む、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ウイルスベクターがエピソーム性インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）またはエピソーム性インテグラーゼコンピテントレンチウイルスベクター（ＩＣＬＶ）を含む、請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞がＳＮＣＡ遺伝子三重化（ＳＮＣＡ−Ｔｒｉ）を含み、ＳＮＣＡのレベルが、ＳＮＣＡ−Ｔｒｉを有しない対照細胞における生理学的レベルと比較して上昇している、請求項３５〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＳＮＣＡレベルが、（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉｉ）、（ａ）（ｉ）および（ｂ）（ｉ）、（ａ）（ｉ）および（ｂ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉ）のいずれか１つを前記対象または前記対象中の細胞に投与または提供した後に生理学的レベルに低減される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＳＮＣＡ遺伝子の発現が少なくとも２０％低減される、請求項３５〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＳＮＣＡ遺伝子の発現が少なくとも９０％低減される、請求項３５〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
α−シヌクレインのレベルが少なくとも２５％低減される、請求項３５〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
α−シヌクレインのレベルが少なくとも３６％低減される、請求項３５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
ミトコンドリアスーパーオキシド産生が少なくとも２５％低減され、かつ／または、細胞生存能力が少なくとも１．４倍に増加する、請求項３５〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記疾患または障害が神経変性障害である、請求項３６または３８〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記神経変性障害がＳＮＣＡ関連疾患または障害である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記神経変性障害がシヌクレイン病である、請求項７０または７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記神経変性障害がパーキンソン病またはレビー小体を伴う認知症である、請求項７０〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞が、ドパミン作動性（腹側中脳）神経前駆細胞（ＭＤ  ＮＰＣ）、中脳ドパミン作動性ニューロン（ｍＤＡ）または前脳基底部コリン作動性ニューロン（ＢＦＣＮ）である、請求項３５〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記対象が哺乳動物である、請求項３５〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記対象がヒトまたはマウス対象である、請求項３５〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ウイルスベクターが、複数のプロモーター、ｐ２ａ、ｔ２ａ、ＩＲＥＳ、またはその組合せを含むポリシストロン性タンパク質組成物を含む、請求項３５〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
エピゲノム（ｅｐｉｇｅｎｅｍｉｃ）編集用のウイルスベクターシステムであって、
（ａ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、核酸配列、ならびに
（ｂ）ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸配列
を含むウイルスベクターシステム。
【請求項７９】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する、請求項７８に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項８０】
前記融合タンパク質が、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域を修飾する、請求項７９に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項８１】
前記少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域が、ＣｐＧ１、ＣｐＧ２、ＣｐＧ３、ＣｐＧ４、ＣｐＧ５、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１０、ＣｐＧ１１、ＣｐＧ１２、ＣｐＧ１３、ＣｐＧ１４、ＣｐＧ１５、ＣｐＧ１６、ＣｐＧ１７、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、ＣｐＧ２３、またはその組合せを含む、請求項８０に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項８２】
前記少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域が、ＣｐＧ１、ＣｐＧ３、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、またはその組合せを含む、請求項８０または８１に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項８３】
前記第２のポリペプチドドメインが、メチラーゼ活性を有するペプチドを含み、かつ、前記融合タンパク質が、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域をメチル化する、請求項８０〜８２のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項８４】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その相補体、そのバリアント、またはその組合せのうちの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項７８〜８３のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項８５】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン４内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化し、かつ、イントロン４内の前記標的領域が、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ１および／またはＨ３Ｋ２７Ａｃマークであってもよい、請求項７８に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項８６】
前記第２のポリペプチドドメインが、ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ３Ａ（ＤＮＭＴ３Ａ）、その機能的断片、および／またはそのバリアントを含む、請求項７８〜８５のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項８７】
前記第２のポリペプチドドメインが配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項７８〜８６のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項８８】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性をノックアウトする少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼを含む、請求項７８〜８７のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項８９】
前記少なくとも１つのアミノ酸突然変異がＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａのうちの少なくとも１つである、請求項８８に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項９０】
前記Ｃａｓタンパク質が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項８８または８９に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項９１】
前記第２のポリペプチドドメインが、前記第１のポリペプチドドメインのＣ末端、Ｎ末端、または両方に融合している、請求項７８〜９０のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項９２】
核局在配列をさらに含む、請求項７８〜９１のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項９３】
前記第１のポリペプチドドメインを前記第２のポリペプチドドメインに接続するリンカーをさらに含む、請求項７８〜９２のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項９４】
前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項７８〜９３のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項９５】
前記融合タンパク質が、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項７８〜９４のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項９６】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項７８〜９５のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項９７】
前記ウイルスベクターがエピソーム性インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）またはエピソーム性インテグラーゼコンピテントレンチウイルスベクター（ＩＣＬＶ）である、請求項７８〜９６のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
【請求項９８】
ＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を患う対象においてＤＮＡ損傷を逆転させる方法であって、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物、請求項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクター、請求項３３に記載の医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つを、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で細胞または前記対象と接触させることを含む方法。
【請求項９９】
ＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を患う対象において老化に関連する異常な核をレスキューする方法であって、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物、請求項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクター、請求項３３に記載の医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つを、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で細胞または前記対象と接触させることを含む方法。
【請求項１００】
ＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を患う対象において核真円度を増加させまたは折り畳まれた核を減少させる方法であって、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物、請求項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクター、請求項３３に記載の医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つを、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で細胞または前記対象と接触させることを含む方法。
【請求項１０１】
ＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を患う対象においてＤＮＡ損傷を逆転させる方法であって、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）の融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）の核酸配列、ならびに（ｂ）（ｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合分子を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で細胞または前記対象と接触させることを含む方法。
【請求項１０２】
ＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を患う対象において老化に関連する異常な核をレスキューする方法であって、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、ならびに（ｂ）（ｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合分子を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で細胞または前記対象と接触させることを含む方法。
【請求項１０３】
ＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を患う対象において核真円度を増加させまたは折り畳まれた核を減少させる方法であって、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、ならびに（ｂ）（ｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合分子を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で細胞または前記対象と接触させることを含む方法。
【請求項１０４】
前記ウイルスベクターが、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４０、または配列番号３９のポリヌクレオチド配列を含む、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０５】
前記ウイルスベクターが、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４０、または配列番号３９のポリヌクレオチド配列を含む、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１０６】
前記ウイルスベクターが、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４０、または配列番号３９のポリヌクレオチド配列を含む、請求項５９〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ウイルスベクターが、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４０、または配列番号３９のポリヌクレオチド配列を含む、請求項７８〜９７のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月２３日に出願された米国仮出願第６２／６６１，１３４号、２０１８年５月２４日に出願された米国仮出願第６２／６７６，１４９号、２０１９年１月８日に出願された米国仮出願第６２／７８９，９３２号、および２０１９年３月２６日に出願された米国仮出願第６２／８２４，１９５号の優先権を主張し、これらの各仮出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
政府の利益の声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ＆  Ｓｔｒｏｋｅ（ＮＩＨ／ＮＩＮＤＳ）により授与された連邦助成金番号ＮＳ０８５０１１の下での政府の支援により為された。米国政府は本発明に対してある特定の権利を有する。
技術分野
本開示は、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用のＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）９ベースのエピゲノム修飾剤組成物およびその使用方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（ＰＤ）は世界において２番目に一般的な神経変性障害である。ＰＤを予防しまたはその進行を停止させる効果的な治療はない。ＳＮＣＡ遺伝子は、ＰＤの高度に有意な遺伝学的リスク因子として関係付けられてきた。追加的に、蓄積しつつある証拠は、野生型α−シヌクレインのレベルの上昇はＰＤの病理発生の原因となることを示唆する。現在までに、ＳＮＣＡ遺伝子によりコードされるα−シヌクレインは、ＰＤの最も検証され、有望な治療標的の１つである。さらに、ＳＮＣＡレベルのマニピュレーションは有益な影響力を実証している。しかしながら、ＳＮＣＡレベルの堅牢な低減と関連付けられる神経毒性が、ＳＮＣＡ転写物を直接的に標的化するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ツールを利用する研究で報告された。そのため、α−シヌクレインの正常な生理学的レベルを維持することを可能とするＳＮＣＡ転写の緊密な調節を達成するための標的の同定および検証が必要とされる。
【０００３】
遺伝子およびエピジェネティック調節を含む、いくつかの調節機構がＳＮＣＡ発現レベルに寄与する。ＤＮＡメチル化は転写調節における重要な機構であり、ＳＮＣＡ発現の増加は、ＳＮＣＡイントロン１におけるＣｐＧの脱メチル化と同時発生的であり得る。さらには、研究は、ＳＮＣＡイントロン１の疾患に関連する差次的なＤＮＡメチル化を示している。ＰＤ患者からの死後の脳組織および血液の分析は、対照ドナーと比較してＳＮＣＡイントロン１におけるより低いメチル化レベルを実証した。ＳＮＣＡ−ｍＲＮＡ発現の上昇と相関したＳＮＣＡイントロン１におけるＤＮＡメチル化の変化もまた、レビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）患者において報告されている。ＤＮＡメチル化は、ＳＮＣＡ遺伝子発現のマニピュレーションのための魅力的なアプローチである。さらに、ＤＮＡメチル化は、遺伝子発現に対する長期効果の可能性を有する安定なエピジェネティックマークを表す。
【０００４】
α−シヌクレイン発現レベルを特異的に標的化することは魅力的な神経保護戦略であり、ＳＮＣＡレベルのマニピュレーションは有益な効果を実証している。ＳＮＣＡレベルをマニピュレートするための１つのアプローチはｓｉＲＮＡによるものである。しかしながら、ＲＮＡｉアプローチは２つの顕著な短所を有する。第１に、ＲＮＡｉは、「生理学的」レベルのＳＮＣＡ発現を達成するために緊密調節が所望されるノックダウンのために精密な分解能を提供しない。例えば、ＳＮＣＡ−ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを有するＡＡＶベクターは、ラットモデルにおいてＳＮＣＡレベルの堅牢な低減の結果として、高レベルの毒性を示し、黒質線条体ドパミン作動性ニューロンの有意な損失を引き起こした。これと一致して、ＭＮ９Ｄ細胞におけるＳＮＣＡの下方調節は細胞生存能力を減少させた。第２に、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後の全ゲノム発現プロファイリングにより実証されるように、ＲＮＡｉは、その意図する標的以外の遺伝子の発現に影響することがある。一方でＰＤ病理発生においてＳＮＣＡ過剰発現が役割を担い、他方でα−シヌクレインタンパク質の正常な生理学的レベルを維持する必要性があることは、ＳＮＣＡ発現の調節機構を標的化する新たな治療戦略を開発するこれまで満たされていない必要性を強調する。そのため、ＳＮＣＡ発現の調節を標的化する新たな治療戦略を開発する満たされていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物を対象とする。組成物は、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、またはその組合せからなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、および（ｂ）（ｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）少なくとも１つのガイドｇＲＮＡをコードする核酸配列であって、少なくとも１つのｇＲＮＡが、ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合タンパク質を標的化する、（ｂ）（ｉ）少なくとも１つのｇＲＮＡまたは（ｂ）（ｉｉ）少なくとも１つのガイドｇＲＮＡをコードする核酸配列を含む。
本発明は、前記組成物をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とする。
本発明は、前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを対象とする。
本発明は、前記単離されたポリヌクレオチドまたは前記ベクターを含む宿主細胞を対象とする。
本発明は、少なくとも１つの前記組成物、前記単離されたポリヌクレオチド、前記ベクター、前記宿主細胞、またはその組合せを含む医薬組成物を対象とする。
本発明は、前記組成物、前記単離されたポリヌクレオチド、前記ベクター、またはその組合せのうちの少なくとも１つを含むキットを対象とする。
【０００６】
本発明は、細胞におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現のｉｎ  ｖｉｖｏモジュレーションの方法を対象とする。方法は、遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量の前記組成物、前記単離されたポリヌクレオチド、前記ベクター、前記医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つと細胞を接触させることを含む。
【０００７】
本発明はまた、対象におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現のｉｎ  ｖｉｖｏモジュレーションの方法を対象とする。方法は、遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量の前記組成物、前記単離されたポリヌクレオチド、前記ベクター、前記医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つと対象を接触させることを含む。
【０００８】
本発明は、対象においてＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を治療する方法を対象とする。方法は、前記組成物、前記単離されたポリヌクレオチド、前記ベクター、前記医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つを対象に投与することを含む。方法は、前記組成物、前記単離されたポリヌクレオチド、前記ベクター、前記医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つを対象中の細胞に投与することを含んでもよい。
【０００９】
本発明は、細胞におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現をｉｎ  ｖｉｖｏでモジュレートする方法を対象とする。本発明は、対象中の細胞におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現をｉｎ  ｖｉｖｏでモジュレートする方法を対象とする。本発明は、対象におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現をｉｎ  ｖｉｖｏでモジュレートする方法を対象とする。方法は、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、ならびに（ｂ）（ｉ）ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合分子を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合タンパク質を標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を、遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で細胞または対象と接触させることを含む。
【００１０】
本発明は、対象においてＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を治療する方法を対象とする。本発明はまた、対象中の細胞におけるＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を治療する方法を対象とする。方法は、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、ならびに（ｂ）（ｉ）ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合分子を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合分子を標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を、遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で対象または対象中の細胞に投与することを含む。
【００１１】
本発明は、エピゲノム編集用のウイルスベクターシステムを対象とする。ウイルスベクターシステムは、（ａ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、核酸配列、ならびに（ｂ）ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合タンパク質を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｅは、ＳＮＣＡイントロン１標的化メチル化システムの設計を示す。図１Ａは、ＳＮＣＡイントロン１中の標的化された領域の図式的説明を示す。上パネルはＳＮＣＡ遺伝子構造を示す。下パネルは、ＣｐＧアイランドを含有するイントロン１中の配列を描写する［Ｃｈｒ４：８９，８３６，１５０〜８９，８３６，５９３（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）］。ｇＲＮＡ配列を太字フォント、ＰＡＭをＳフォントハイライトでマークしており、ＣｐＧをナンバリングし、大文字で表す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｅは、ＳＮＣＡイントロン１標的化メチル化システムの設計を示す。図１Ｂは、設計されたベクターカセットの図式的なマップを示す。ｇＲＮＡのクローニングのために使用される２つのＢｓｍＢＩ部位により隣接される特有のＢｓｒＧＩ制限酵素部位を含むようにレンチウイルスベクター骨格を作製した。ｄＣＡＳ９−ＤＮＭＴ３Ａ融合導入遺伝子をＥＦＳ−ＮＣプロモーターの下流の発現カセットに組み込んだ。ベクターはピューロマイシン選択マーカーも発現した。ベクターの他の調節エレメントは、プライマー結合部位（ＰＢＳ）、スプライスドナー（ＳＤ）およびスプライスアクセプター（ＳＡ）、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）およびＰＰＴ、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、ＷＰＲＥ、ならびにレトロウイルスベクターパッケージングエレメント、プサイ（ψ）シグナルを含む。ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター、コア伸長因子１αプロモーター（ＥＦＳ−ＮＣ）、およびヒトＵ６プロモーターを強調している。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｅは、ＳＮＣＡイントロン１標的化メチル化システムの設計を示す。図１Ｃは、ｐ２４ｇａｇ  ＥＬＩＳＡアッセイにより決定した場合のＩＣＬＶ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３ＡおよびＩＤＬＶ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａベクターの産生力価を示す。結果をコピー数／ミリリットルで記録したところ、１×１０4個のウイルス粒子（物理的粒子）、ｐｐ．）に対して１ｎｇのｐ２ｇａｇに等しい）。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｅは、ＳＮＣＡイントロン１標的化メチル化システムの設計を示す。図１Ｄは、ＩＣＬＶ−ＣＭＶ−Ｐｕｒｏ（ナイーブレンチウイルスベクターおよびＩＣＬＶ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａベクター）の比較を示す。ピューロマイシン耐性コロニーをカウントすることにより全体的な産生および発現力価を決定した。棒グラフデータは３連の実験からの平均±ＳＤを表す。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｅは、ＳＮＣＡイントロン１標的化メチル化システムの設計を示す。図１Ｅは、ＳＮＣＡ三重化を有するＰＤ患者からのｈｉＰＳＣ由来ドパミン作動性ニューロンにおけるｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３ＡによるＳＮＣＡ転写の抑制を示す。ゲノム三重化を有するヒトＳＮＣＡ遺伝子座のｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ標的化ＣｐＧの概略図（縮尺通りではない）。上パネル；ＳＮＣＡイントロン１領域内の低レベルのメチル化（オープンロリポップ）は高レベルの遺伝子発現に対応する（オン）。下パネル；発現の下方調節を結果としてもたらすメチル化（クローズドロリポップ）を増進するためにＳＮＣＡイントロン１内のＣｐＧを標的化するｇＲＮＡ−ｄＣＡＳ９−ＤＮＭＴ３Ａシステム（オフ）。
【図２Ａ−２Ｌ】図２Ａ〜２Ｌは、安定形質導入ＳＮＣＡ−Ｔｒｉ  ＭＤ  ＮＰＣの特徴付けを示す。図２Ａ〜２Ｊは、ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を有するＳＮＣＡ−Ｔｒｉ  ＭＤ  ＮＰＣの代表的な免疫細胞化学画像を示す。図２Ａ〜Ｅはネスチンの発現を示し、図２Ｆ〜２ＪはＦｏｘＡ２の発現を示す。スケールバー＝１０μ。図２Ｋおよび図２ＬはＭＤ  ＮＰＣ中のそれぞれネスチンおよびＦｏｘＡ２の発現レベルを示す。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用してマーカーを評価した。ＴａｑＭａｎ発現アッセイによりｍＲＮＡのレベルを測定し、２-ΔΔCT法を使用してＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡおよびＰＰＩＡ−ｍＲＮＡ参照対照の幾何平均と比較して算出した。各カラムは２つの生物学的および技術的複製物の平均を表す。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図３】図３は、ＳＮＣＡイントロン１  ＣｐＧアイランド領域におけるＤＮＡメチル化の特徴付けを示す。ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を有する４つのｈｉＰＳＣ由来ＭＤ  ＮＰＣ株、および無ｇＲＮＡ導入遺伝子を有する対照株におけるＳＮＣＡイントロン１［Ｃｈｒ４：８９，８３６，１５０〜８９，８３６，５９３（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）］中の２３のＣｐＧ部位のメチル化レベル（％）を示す。５つの細胞株のそれぞれからのＤＮＡをバイサルファイト変換し、個々のＣｐＧのメチル化（％）をパイロシークエンシングにより定量的に決定した。バーは２つの独立した実験についてのメチル化ＣｐＧの％の平均を表し、エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。ダネット法を使用してメチル化％の低減の有意性を検定し、多重比較（ｎ＝２３）のために追加の補正を適用した；＊＊ｐ＜０．００５、＊ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検定。表５は全てのメチル化％値および全ての統計的比較を要約する。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を有するＭＤ  ＮＰＣ株におけるＳＮＣＡ−ｍＲＮＡおよびα−シヌクレインタンパク質レベルを示す。図４ＡはＳＮＣＡ−ｍＲＮＡのレベルを示す。定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用してレベルを評価した。異なる株におけるＳＮＣＡ−ｍＲＮＡレベルをＴａｑＭａｎベースの遺伝子発現アッセイにより測定し、２-ΔΔCt法を使用してＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡおよびＰＰＩＡ−ｍＲＮＡ参照対照の幾何平均と比較して算出した。各バーは、特定のＭＤ  ＮＰＣ株についての４つの生物学的および２つの技術的複製物（ｎ＝８）の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｃは、ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を有するＭＤ  ＮＰＣ株におけるＳＮＣＡ−ｍＲＮＡおよびα−シヌクレインタンパク質レベルを示す。図４Ｂは、ＩｍａｇｅＪを使用した各ＭＤ  ＮＰＣ株についてのα−シヌクレインタンパク質シグナルの定量化を示す。バーは、２つの生物学的および技術的反復のバンドの強度±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を有するＭＤ  ＮＰＣ株におけるＳＮＣＡ−ｍＲＮＡおよびα−シヌクレインタンパク質レベルを示す。図４Ｃは、ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａベクターを有するＭＤ  ＮＰＣ株および無ｇＲＮＡベクターを有する対照株におけるα−シヌクレインタンパク質シグナルの定量化を示す。５０細胞を２つの独立した実験（ｎ＝１００細胞）においてイメージングした。バーは、１００細胞におけるα−シヌクレイン染色の強度の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図４Ｄ−４Ｇ】図４Ｄおよび図４Ｆは、ＭＤ  ＮＰＣ株のα−シヌクレインシグナルについての代表的な免疫細胞化学画像を示す。図４Ｅおよび図４Ｇは、ＭＤ  ＮＰＣ株のα−シヌクレインおよびネスチン二重染色シグナルについての代表的な免疫細胞化学画像を示す。スケールバー＝１０μ。
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ〜５Ｂは、ミトコンドリアスーパーオキシド産生および細胞生存能力に対するｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子の効果を示す。図５Ａはミトコンドリアスーパーオキシド産生を示し、図５Ｂは細胞生存能力を示す。ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を有するＳＮＣＡ−Ｔｒｉ  ＭＤ  ＮＰＣおよび無ｇＲＮＡ導入遺伝子を有する対照ＭＤ  ＮＰＣ株において両方を測定した。最後の１８時間の間に２０μＭのロテノンを用いてまたは用いずに細胞を処理し、次にＭｉｔｏＳｏｘアッセイを使用してミトコンドリア関連スーパーオキシド産生（図５Ａ）、およびレサズリンアッセイにより細胞生存能力（図５Ｂ）を決定した。バーは、６つの複製物のそれぞれにおける２つの技術的および２つの生物学的な独立した実験（ｎ＝２４）についての相対蛍光単位の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。＊＊ｐ＜０．００５、＊ｐ＜０．０５；両側スチューデントｔ検定。
【図６】図６は、グローバルＤＮＡメチル化の解析を示す。ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａおよび無ｇＲＮＡ  ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を有するｈｉＰＳＣ由来ＭＤ  ＮＰＣ株のグローバル５−ｍＣ％解析。ｇＲＮＡ４導入遺伝子を有するＭＤ  ＮＰＣ株のグローバルＤＮＡメチル化（５−ｍＣ％）は、元々の非形質導入ｈｉＰＳＣ由来ＭＤ  ＮＰＣ株と比較して統計的有意差を示さなかった（ｐ＝０．９７）。対照的に、無ｇＲＮＡ導入遺伝子を有する株は、元々の非形質導入ＭＤ  ＮＰＣ株と比べてグローバルＤＮＡメチル化の有意な増加を示した（ｐ＝０．００９）。各カラムは２つの生物学的および技術的複製物の平均を表す。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図７】図７は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によるｉＰＳＣ由来ＭＤ  ＮＰＣの細胞的特徴付けを示す。ドパミン作動性分化において発現される神経細胞内マーカーのＦＡＣＳプロファイル。ネスチン、ＦＯＸＡ２についてのフローサイトメトリー解析を示す。ＭＤ前駆体についてのネスチンおよびＦＯＸＡ２のコンビナトリアルＦＡＣＳ分析（８３．１％の二重陽性）。
【図８】図８は、ラット神経芽腫Ｆ９８細胞株におけるＩＣＬＶ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３ＡシステムによるＳＮＣＡ発現の下方調節を示す。ラットＦ９８細胞株においてｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を有するレンチウイルスベクターを用いてＳＮＣＡ−ｍＲＮＡを形質導入した。形質導入後１４日目に定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用してＳＮＣＡ−ｍＲＮＡのレベルを評価した。異なる株においてＳＮＣＡ−ｍＲＮＡのレベル（４つの異なるｇＲＮＡを設計および使用した）をＣｙｂｅｒ  ｇｒｅｅｎベースの遺伝子発現アッセイにより測定し、２-ΔΔCT法を使用してＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡおよびＰＰＩＡ−ｍＲＮＡ参照対照の幾何平均と比較して算出した。各バーは３つの生物学的複製物の平均を表す。結果をナイーブ（非形質導入）Ｆ９８細胞（レーン１；黒バー）からの低減倍数として示す。レーン２：ｇＲＮＡ１；レーン３：ｇＲＮＡ２；レーン４：ｇＲＮＡ３（ｐＢＫ７４４、（配列番号４１））；レーン５：ｇＲＮＡ４；レーン６：ｇＲＮＡ５。無ｇＲＮＡ対照を実験において使用した、ｐＢＫ５３９（配列番号４０）。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。
【図９Ａ】図９Ａは、ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を有するインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）を形質導入したＭＤ  ＮＰＣ株におけるＳＮＣＡ−ｍＲＮＡを示す。形質導入後７日目に定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用してＳＮＣＡｍＲＮＡを評価した。異なる株におけるＳＮＣＡ−ｍＲＮＡのレベルをＴａｑＭａｎベースの遺伝子発現アッセイにより測定し、２-ΔΔCt法を使用してＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡおよびＰＰＩＡ−ｍＲＮＡ参照対照の幾何平均と比較して算出した。各バーは、特定のＭＤ  ＮＰＣ株についての４つの生物学的および２つの技術的複製物（ｎ＝８）の平均を表す。レーン１−４９２は無ｇＲＮＡ対照ベクターを示す。レーン２−５００はｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａベクターを示し、レーン３はナイーブ（非形質導入）ＮＤを示す。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を有するインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）を形質導入したＭＤ  ＮＰＣ株の代表的な画像を示す。図９Ｂは、形質導入後７日目までのＩＤＬＶゲノムにおける８０％に近い低減を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ｐ２Ａ切断シグナルにより分離されたｄＣａｓ９およびＧＦＰマーカーに融合したＤＮＭＴ３Ａの触媒ドメインを含有するナイーブ（無ｇＲＮＡベクター）（配列番号４０）、ｐＢＫ５３９のマップを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ｐ２Ａ切断シグナルにより分離されたｄＣａｓ９およびピューロマイシン抵抗性遺伝子に融合したＤＮＭＴ３Ａの触媒ドメインを含有する（ラットＳＮＣＡ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを含有したｇＲＮＡ３ベクター）（配列番号４１）、ｐＢＫ７４４のマップを示す。
【図１１】図１１は、ｐ２Ａ切断シグナルにより分離されたｄＣａｓ９およびピューロマイシン抵抗性遺伝子に融合したＤＮＭＴ３Ａの触媒ドメインを含有するｇＲＮＡ４配列を含有するレンチウイルスベクター発現カセット（ｇＲＮＡ４ベクター）（配列番号３８）、ｐＢＫ５００のマップを示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ｄＣａｓ９に融合したＤＮＭＴ３Ａの触媒ドメインを含有するナイーブ（無ｇＲＮＡベクター）ｐＢＫ４９２（ｐＢＫ５４６としても公知）（配列番号３９）のマップを示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ｐ２Ａ切断シグナルにより分離されたｄＣａｓ９およびピューロマイシン抵抗性遺伝子に融合したＤＮＭＴ３Ａの触媒ドメインを含有するナイーブ（無ｇＲＮＡベクター）（配列番号３９）、ｐＢＫ５４６（ｐＢＫ４９２としても公知）のより詳細なマップを示す。
【図１３Ａ−１３Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｃは、ビヒクルまたはロテノンを用いて治療されたラットにおけるＳＮＣＡ−ｍＲＮＡおよびアルファ−シヌクレインタンパク質レベルを示す。図１３Ａは、ＴａｑＭａｎベースの遺伝子発現アッセイにより評価されたＳＮＣＡ−ｍＲＮＡレベルを示す。図１３Ｂは、アルファ−ｓｙｎタンパク質のレベルをウエスタンブロットにより半定量化したことを示す。図１３Ｃは、ＳＮおよび小脳におけるアルファ−シヌクレインタンパク質の相対的なレベルを示す。定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して行った（Schneideret al. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012）。
【図１４】図１４は、対照およびロテノン治療ラットの脳組織におけるＰＳｅｒ１２９−アルファ−シヌクレインおよびユビキチンを示す。ｐＳｅｒ１２９Ｓｙｎシグナルは、対照と比較してロテノン治療ラットにおいて増加した。
【図１５Ａ−１５Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｃは、ｇＲＮＡ３（ｐＢＫ７４４）またはＰＢＳを用いた治療後のラット黒質におけるＳＮＣＡ発現を示す。動物をロテノンを用いて５日間治療した。図１５ＡはｍＲＮＡレベルを示す。図１５Ｂおよび図１５Ｃはタンパク質レベルを示す。図１６Ｃに示される定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して行った（Schneideret al. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012）。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｃは、ＤＮＡ損傷に対するＳＮＣＡのＤＮＡメチル化媒介性減少の効果を示す。図１６Ａおよび図１６Ｂは、対照ベクター（無ｇＲＮＡ）またはｇＲＮＡを有するベクターをそれぞれ用いて処理した細胞におけるＤＮＡ損傷のオリーブテイルモーメント（ＯＴＭ）解析を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｃは、ＤＮＡ損傷に対するＳＮＣＡのＤＮＡメチル化媒介性減少の効果を示す。図１６Ａおよび図１６Ｂは、対照ベクター（無ｇＲＮＡ）またはｇＲＮＡを有するベクターをそれぞれ用いて処理した細胞におけるＤＮＡ損傷のオリーブテイルモーメント（ＯＴＭ）解析を示す。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｃは、ＤＮＡ損傷に対するＳＮＣＡのＤＮＡメチル化媒介性減少の効果を示す。図１６ＣはＯＴＭ値を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜１７Ｃは、異常な核エンベロープ形態：核真円度に対するＳＮＣＡのＤＮＡメチル化媒介性減少の効果を示す。図１７Ａおよび図１７Ｂは、対照ベクター（無ｇＲＮＡ）またはｇＲＮＡ４を有するベクターをそれぞれ用いて処理した細胞においてラミンＢ１マーカーを使用して行った核真円度の解析を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜１７Ｃは、異常な核エンベロープ形態：核真円度に対するＳＮＣＡのＤＮＡメチル化媒介性減少の効果を示す。図１７Ａおよび図１７Ｂは、対照ベクター（無ｇＲＮＡ）またはｇＲＮＡ４を有するベクターをそれぞれ用いて処理した細胞においてラミンＢ１マーカーを使用して行った核真円度の解析を示す。
【図１７Ｃ】図１７Ａ〜１７Ｃは、異常な核エンベロープ形態：核真円度に対するＳＮＣＡのＤＮＡメチル化媒介性減少の効果を示す。図１７Ｃは核真円度の量を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａ〜１８Ｃは、異常な核エンベロープ形態：核折り畳みに対するＳＮＣＡのＤＮＡメチル化媒介性減少の効果を示す。図１８Ａおよび図１８Ｂは、対照ベクター（無ｇＲＮＡ）またはｇＲＮＡを有するベクターをそれぞれ用いて処理した細胞においてラミンＡ／Ｃマーカーを使用した核折り畳みおよびバブリングの解析を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ａ〜１８Ｃは、異常な核エンベロープ形態：核折り畳みに対するＳＮＣＡのＤＮＡメチル化媒介性減少の効果を示す。図１８Ａおよび図１８Ｂは、対照ベクター（無ｇＲＮＡ）またはｇＲＮＡを有するベクターをそれぞれ用いて処理した細胞においてラミンＡ／Ｃマーカーを使用した核折り畳みおよびバブリングの解析を示す
【図１８Ｃ】図１８Ａ〜１８Ｃは、異常な核エンベロープ形態：核折り畳みに対するＳＮＣＡのＤＮＡメチル化媒介性減少の効果を示す。図１８Ｃは、折り畳まれた核のパーセントを示す。
【図１９Ａ】図１９は、ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子および無ｇＲＮＡ対応物を有するＮＰＣ細胞に対して適用した熱ショック処理および浸透処理を示す。処理後の核真円度の解析は、本出願の他の箇所に記載されるようにラミンＢ１マーカーを使用して行った（図１９Ｂ）。ｇＲＮＡ４を有するベクター（ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ）は、無ｇＲＮＡ対照ベクターと比較して核真円度の有意な増加を示し、それは異常な核の表現型をレスキューすることを指し示した（図１９Ｂ）。処理後の核折り畳みの解析は、他の箇所に記載されるようにラミンＡ／Ｃマーカーを使用して行った（図１９Ａ）。
【図１９Ｂ】図１９は、ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子および無ｇＲＮＡ対応物を有するＮＰＣ細胞に対して適用した熱ショック処理および浸透処理を示す。処理後の核真円度の解析は、本出願の他の箇所に記載されるようにラミンＢ１マーカーを使用して行った（図１９Ｂ）。ｇＲＮＡ４を有するベクター（ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ）は、無ｇＲＮＡ対照ベクターと比較して核真円度の有意な増加を示し、それは異常な核の表現型をレスキューすることを指し示した（図１９Ｂ）。処理後の核折り畳みの解析は、他の箇所に記載されるようにラミンＡ／Ｃマーカーを使用して行った（図１９Ａ）。
【図１９Ｃ】図１９は、ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子および無ｇＲＮＡ対応物を有するＮＰＣ細胞に対して適用した熱ショック処理および浸透処理を示す。ｇＲＮＡ４を有するベクター（ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ）は、無ｇＲＮＡ対照ベクターと比較して核折り畳みの有意な増加を示し、それは異常な核の表現型をレスキューすることを指し示した（図１９Ｃ）。ｇＲＮＡ４を有するベクター（ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ）は、無ｇＲＮＡ対照ベクターと比較して浸透処理に対する核の抵抗性の有意な増加を示し、それは異常な核の表現型をレスキューすることを指し示した（図１９Ｃ）。この実験において、ＳＮＣＡ遺伝子の三重化を有するＮＰＣを異なる濃度（０〜１０００ｍＭの範囲）のＮａＣｌとインキュベートして、浸透ショックに対する核エンベロープのレジリエンスを評価した。バーは３つの独立した実験の平均を表す。
【図２０】図２０は、ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ（ｐＢＫ５００）導入遺伝子または無ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ対照（ｐＢＫ４９２）を有するインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）を形質導入したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ヒト神経芽腫細胞）におけるＳＮＣＡ−ｍＲＮＡを示す。ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡは、形質導入後４、７、９、１６、２２、２７、２９、３３、および４２日目に定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して評価した。異なる株におけるＳＮＣＡ−ｍＲＮＡのレベルをＴａｑＭａｎベースの遺伝子発現アッセイにより測定し、２-ΔΔCt法を使用してＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡおよびＰＰＩＡ−ｍＲＮＡ参照対照の幾何平均と比較して算出した。各バーは４つの生物学的および２つの技術的複製物（ｎ＝８）の平均を表す。黒バーはｐＢＫ４９２を表し、灰色バーはｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ（ｐＢＫ５００）ベクターを表す。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図２１】図２１は、ＳＮＣＡイントロン１  ＣｐＧアイランド領域におけるＤＮＡメチル化の特徴付けを示す。ＳＮＣＡイントロン１［Ｃｈｒ４：８９，８３６，１５０〜８９，８３６，５９３（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）］における２３のＣｐＧ部位のメチル化レベル（％）（上の画像はＳＮＣＡイントロン１のＣｐＧアイランドを表す）。２３のＣｐＧを強調している。位置２２および２３におけるＣｐＧの間にあるｇＲＮＡ４を強調している。この実験において、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ（ｐＢＫ５００）導入遺伝子または無ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ対照（ｐＢＫ４９２）を有するインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）を形質導入した。ＤＮＡメチル化を３、１６および２９日目に測定した。試料からのＤＮＡをバイサルファイト変換し、個々のＣｐＧのメチル化（％）をパイロシークエンシングにより定量的に決定した。バーは２つの独立した実験についてのメチル化ＣｐＧの％の平均を表し、エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。ダネット法を使用してメチル化％の低減の有意性を検定し、多重比較（ｎ＝２３）のために追加の補正を適用した；＊＊ｐ＜０．００５、＊ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検定。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＳＮＣＡ遺伝子の標的化されたエピゲノム編集のためのオールインワンレンチウイルスベクターを含むシステムが本明細書に記載される。開示されるエピゲノム修飾剤組成物は、イントロン１およびイントロン４などのＳＮＣＡ遺伝子中の任意の調節標的を修飾するために使用することができる。システムは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａ（ＤＮＭＴ３Ａ）などの触媒ドメインと融合したＣＲＩＳＰＲ／不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９）に基づく。本開示は、エピゲノム編集による遺伝子発現のマニピュレーション、例えば、過剰発現の逆転は、遺伝子発現の調節異常を伴うＰＤなどの神経学的障害に対する価値のある治療戦略であるという概念の証明を提供する。
【００１４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、精密な様式で遺伝子発現をモジュレートするための特有の機会を提供する。エピゲノム編集の使用は、遺伝子療法のためのアプローチであり、特定の遺伝子を標的化するために設計されるので、新たな洗練された薬物を表す。本明細書において、疾患関連表現型をレスキューするために内因性ＳＮＣＡレベルをマニピュレートするための革新的なエピゲノム編集アプローチの開発および実施が記載される。例えば、ＳＮＣＡ遺伝子座の三重化を有するＰＤ患者からのヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来ニューロンにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エピゲノムベースのシステムの応用は、ＳＮＣＡ−ｍＲＮＡおよびタンパク質の下方調節などのＳＮＣＡ発現の下方調節を結果としてもたらし、ＳＮＣＡイントロン１のＣｐＧアイランドにおけるメチル化などの、ＳＮＣＡイントロン１の標的化されたＤＮＡメチル化により疾患関連表現型の乱れを逆転させた。ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＭＮＴ３ＡシステムによるＳＮＣＡレベルの低減は、ＳＮＣＡ三重化ｈｉＰＳＣ由来ドパミン作動性ニューロンに特徴的な細胞疾患関連表現型、例えば、ミトコンドリアＲＯＳ産生および細胞生存能力をレスキューした。これらの発見は、ＳＮＣＡイントロン１内のＣｐＧアイランドのＤＮＡ高メチル化は、ＳＮＣＡ発現レベルの効果的かつ十分な緊密下方調節を可能とすることを確立し、ＰＤに対する新規のエピジェネティックベースの治療アプローチとしてのＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９技術と組み合わせたこの標的配列の可能性を示唆する。
このセクションおよび本明細書の開示全体において使用されるようなセクションの見出しは、単に文書編成目的のためであり、限定的であることは意図されない。
【００１５】
１．定義
他に定義されなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾がある場合、定義を含めて本文献が優先される。好ましい方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができる。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は参照により全体が組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および例は実例的なものに過ぎず、限定的であることは意図されない。
【００１６】
「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））、「含む」（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））、「有する」（ｈａｖｉｎｇ）、「有する」（ｈａｓ）、「できる」（ｃａｎ）、「含有する」（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））という用語、およびこれらの変形形態は、本明細書において使用される場合、追加の行為または構造の可能性を不可能にしないオープンエンドの移行的な語句、用語、または単語であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に規定しなければ、複数の参照物を含む。本開示はまた、明示的に示されていてもそうでなくても、本明細書において提示される実施形態または要素「を含む」、「からなる」および「から本質的になる」他の実施形態を想定する。
本明細書における数値範囲の記載について、同じ精度でのその間の各介在する数が明示的に想定される。例えば、６〜９の範囲について、６および９に加えて数７および８が想定され、６．０〜７．０の範囲について、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明示的に想定される。
【００１７】
本明細書において使用される場合、「約」（ａｂｏｕｔ）または「約」（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）という用語は、どのように値が測定または決定されるか、すなわち、測定系の限界に部分的に依存する当業者により決定されるような特定の値についての許容される誤差範囲内であることを意味する。例えば、「約」は、当該技術分野における慣行にしたがって、３または３より大きい標準偏差内であることを意味することができる。代替的に、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、よりいっそう好ましくは１％までの範囲を意味することができる。代替的に、特に生物学的システムまたは方法に関して、該用語は、値の桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。
【００１８】
本明細書において交換可能に使用される「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、ヒトおよび一部の他の霊長動物種に感染するパルボウイルス科のディペンドウイルス属に属する小さいウイルスを指す。ＡＡＶは、疾患を引き起こすことは現在知られておらず、結果的にウイルスは非常に穏やかな免疫応答を引き起こす。
本明細書において使用される場合、「キメラ」は、少なくとも２つの成分が異なる供給源（例えば、異なる生物、異なるコーディング領域）に由来する核酸分子および／またはポリペプチドを指すことができる。本明細書において使用される場合、キメラはまた、核酸に連結されたポリペプチドを含む構築物を指す。
「Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ」および「ＣＲＩＳＰＲｓ」は、本明細書において交換可能に使用される場合、シークエンシングされた細菌の約４０％およびシークエンシングされた古細菌の９０％のゲノム中に見出される複数の短い直接反復を含有する遺伝子座を指す。
【００１９】
「コーディング配列」または「コーディング核酸」は、本明細書において使用される場合、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コーディング配列は、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞中で発現を指令することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結した開始および終結シグナルをさらに含むことができる。コーディング配列はコドン最適化されていてもよい。
「相補体」または「相補的」は、本明細書において使用される場合、核酸が、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの間のワトソン−クリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対形成を意味することができることを意味する。「相補性」は、２つの核酸配列が互いに逆平行にアライメントされた場合に、各位置におけるヌクレオチド塩基が相補的となるような、これらの配列の間で共有される特性を指す。
「相補体」は、本明細書において使用される場合、比較用ヌクレオチド配列との１００％の相補性（完全に相補的）を意味することができ、または１００％未満の相補性（例えば、実質的な相補性）（例えば、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％などの相補性）を意味することができる。相補体はまた、突然変異に対する「相補体」または突然変異と「相補的」の点で使用され得る。
【００２０】
「エピゲノム修飾」は、本明細書において使用される場合、ゲノムの改変に由来しない遺伝子活性および発現に影響する１つまたはより多くの染色体における修飾または変化を指す。エピゲノム修飾は、ヌクレオチド配列の変化を伴わないゲノムへの機能的に関連する変化に関する。エピゲノム修飾は、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、および／またはスモイル化などのヒストンへの修飾を含んでもよい。エピゲノム修飾は、メチル化などのＤＮＡへの修飾を含んでもよい。
「機能的」および「完全機能的」は、本明細書において使用される場合、生物学的活性を有するタンパク質を記載する。「機能的遺伝子」は、機能的タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡに転写される遺伝子を指す。
「融合タンパク質」は、本明細書において使用される場合、元々は別々のタンパク質をコードしていた２つまたはより多くの遺伝子の連結によって作製されるキメラタンパク質を指す。融合遺伝子の翻訳は、元々の各タンパク質に由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドを結果としてもたらす。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「遺伝子」という用語は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡ、および調節ＲＮＡなどを製造するために使用することができる核酸分子を指す。遺伝子は、機能的タンパク質または遺伝子産物を製造するために使用できてもよいし、そうでなくてもよい。遺伝子は、コーディング領域ならびに非コーディング領域（例えば、イントロン、調節エレメント、プロモーター、エンハンサー、終結配列および／または５’および３’非翻訳領域）の両方を含むことができる。遺伝子は「単離される」ことができ、これは、その天然の状態において核酸に付随して通常見出される成分を実質的または本質的に含まない核酸を意味する。そのような成分としては、他の細胞材料、組換え製造からの培養培地、および／または核酸の化学合成において使用される様々な化学物質が挙げられる。
【００２２】
「遺伝子構築物」は、本明細書において使用される場合、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コーディング配列は、核酸分子が投与される個体の細胞中での発現を指令することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結した開始および終結シグナルを含む。本明細書において使用される場合、「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞中に存在する場合にコーディング配列が発現されるように、タンパク質をコードするコーディング配列に作動可能に連結した必要な調節エレメントを含有する遺伝子構築物を指す。
「ゲノム」という用語は、本明細書において使用される場合、生物の染色体／核ゲノムの他に、任意のミトコンドリア、および／またはプラスミドゲノムを含む。
【００２３】
「同一」または「同一性」は、２つまたはより多くの核酸またはポリペプチド配列の文脈で本明細書において使用される場合、配列が、指定された領域にわたり同じである指定されたパーセンテージの残基を有することを意味する。パーセンテージは、２つの配列を最適にアライメントし、指定された領域にわたり２つの配列を比較し、両方の配列において同一の残基が起こる位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を指定された領域中の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出されてもよい。２つの配列が異なる長さであるか、またはアライメントが１つもしくはより多くの付着末端を生じさせ、比較の指定された領域が単一の配列のみを含む場合、単一の配列の残基は分母に含められ、算出の分子には含められない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は同等と考えてもよい。同一性は、手動でまたはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ  ２．０などのコンピューター配列アルゴリズムを使用することにより行われてもよい。
本明細書において使用される場合、「増加」、「増加させる」、「増加した」、「増進する」（ｅｎｈａｎｃｅ）、「増進した」、「増進する」（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）、および「増進」（およびこれらの文法的変形）という用語は、対照と比較して少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはより大きい上昇を記載する。
【００２４】
「単離された」ポリヌクレオチドまたは「単離された」ポリペプチドは、人の手により、その天然の環境から離れて存在するヌクレオチド配列またはポリペプチド配列であり、したがって天然の生成物ではない。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは「単離」されている。単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然に存在する生物またはウイルスの他の成分の少なくとも一部、例えば、該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと関連付けられて一般的に見出される細胞もしくはウイルス構造成分または他のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドから少なくとも部分的に分離された精製された形態において存在することができる。代表的な実施形態では、単離されたポリヌクレオチドおよび／または単離されたポリペプチドは、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはより高く純粋である。
【００２５】
他の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、例えば、組換え宿主細胞などの非天然の環境中に存在することができる。そのため、例えば、ヌクレオチド配列に関して、「単離された」という用語は、それが天然に存在する染色体および／または細胞から分離されていることを意味する。ポリヌクレオチドはまた、それが天然に存在する染色体および／または細胞から分離され、次にそれが天然に存在しない遺伝学的状況、染色体および／または細胞（例えば、天然に見出されるものとは異なる宿主細胞、異なる調節配列、および／またはゲノム中の異なる位置）に挿入されている場合に、単離されている。したがって、ポリヌクレオチドおよびそれによりコードされるポリペプチドは、人の手により、その天然の環境から離れて存在し、したがって天然の生成物ではないという点で「単離」されているが、一部の実施形態では、それは組換え宿主細胞に導入されて該細胞中に存在することができる。
【００２６】
本明細書において交換可能に使用される「マルチシストロン性」または「ポリシストロン性」は、ポリヌクレオチドが１つより多くのコーディング領域を有して同じポリヌクレオチドから１つより多くのタンパク質を製造することを指す。ポリシストロン性ポリヌクレオチド配列は、（内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、切断性ペプチド（ｐ２Ａ、ｔ２Ａおよびその他）、異なるプロモーターの利用などを含むことができる。
本明細書において交換可能に使用される「突然変異体遺伝子」または「突然変異した遺伝子」は、検出可能な突然変異を起こした遺伝子を指す。突然変異体遺伝子は、遺伝子の正常な伝達および発現に影響する、遺伝材料の喪失、獲得、または交換などの変化を起こしている。
【００２７】
「天然」または「野生型」の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、天然に存在するまたは内因性の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたはアミノ酸配列を指す。そのため、例えば、「野生型ｍＲＮＡ」は、生物中に天然に存在するまたは生物にとって内因性のｍＲＮＡである。「同種」核酸は、それが導入される宿主細胞と天然に関連付けられるヌクレオチド配列である。
【００２８】
「神経変性疾患」は、ニューロンの死を含む、ニューロンの構造または機能の進行性の喪失の結果としてもたらされること、または該損失を結果としてもたらすことにより特徴付けられる障害である。神経変性疾患としては、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、アミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病、プリオン病、運動ニューロン疾患、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、ニューロン喪失、認知障害、原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）／神経原線維変化優位型老年性認知症、拳闘家認知症を含む慢性外傷性脳症、レビー小体を伴う認知症（レビー小体型認知症）、神経軸索ジストロフィー、および複数系萎縮（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ）、進行性核上麻痺、ピック病、大脳皮質基底核変性症、第１７染色体に関連付けられる前頭側頭葉変性症、前頭側頭型認知症およびパーキンソニズムの一部の形態、リティコ−ボディグ病（グアムのパーキンソン−認知症複合体）、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、鉛脳症、結節硬化症、ハラーホルデン−スパッツ病、ならびにリポフスチン症が挙げられる。「正常遺伝子」は、本明細書において使用される場合、遺伝材料の喪失、獲得、または交換などの変化を起こしていない遺伝子を指す。正常遺伝子は、正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を起こす。
【００２９】
「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、共有結合的に連結されて一緒になった少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。単一の鎖の記述はまた、相補鎖の配列を定義する。そのため、核酸はまた、記述された単一の鎖の相補鎖を包含する。核酸の多くのバリアントが、所与の核酸と同じ目的のために使用されてもよい。そのため、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびその相補体を包含する。単一の鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。そのため、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを包含する。
【００３０】
核酸は一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または二本鎖配列および一本鎖配列の両方の部分を含有してもよい。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってもよく、ハイブリッドでは、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの組合せを含有してもよく、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組合せを含有してもよい。核酸は、化学合成方法または組換え法により得られてもよい。
本明細書において交換可能に使用される「核局在シグナル」、「核局在配列」、または「ＮＬＳ」は、核輸送による細胞核へのインポートのためにタンパク質を「タグ化」するアミノ酸配列を指す。典型的には、このシグナルは、タンパク質表面に露出される正に荷電したリジンまたはアルギニンの１つまたはより多くの短鎖配列からなる。異なる核局在化タンパク質は同じＮＬＳを共有することができる。ＮＬＳは、核の外にタンパク質を標的化する核外輸送シグナルの反対の機能を有する。
【００３１】
「作動可能に連結した」は、本明細書において使用される場合、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されたプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に配置されていてもよい。プロモーターと遺伝子との距離は、そのプロモーターと、プロモーターが由来する遺伝子においてプロモーターが制御する遺伝子との距離とおおよそ同じであってもよい。当該技術分野において公知のように、この距離におけるバリエーションが、プロモーター機能の喪失なしに適合され得る。
本明細書において使用される場合、「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」という用語は、試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）と比較して参照（「クエリ」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）の直鎖状ポリヌクレオチドにおける、２つの配列が最適にアライメントされた場合の同一のヌクレオチドのパーセンテージを指す。一部の実施形態では、「同一性パーセント」は、アミノ酸配列中の同一のアミノ酸のパーセンテージを指すことができる。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸分子の５’から３’末端へのヌクレオチドのヘテロポリマーまたはこれらのヌクレオチドの配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含み、これには、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ断片または部分、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば、化学合成）ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡが含まれ、そのいずれも一本鎖または二本鎖であることができる。「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、および「オリゴヌクレオチド」という用語もまた本明細書において交換可能に使用され、ヌクレオチドのヘテロポリマーを指す。他に指し示される場合を除いて、本明細書において提供される核酸分子および／またはポリヌクレオチドは、左から右に５’から３’方向で本明細書において提示され、米国配列規則３７  ＣＦＲ  §§１．８２１〜１．８２５およびＷｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＰＯ）  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＴ．２５に示されるようなヌクレオチドの特徴を表すための標準コードを使用して表される。
【００３３】
「予防する」（ｐｒｅｖｅｎｔ）、「予防する」（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）、および「予防」という用語（ならびにその文法的変形）は、対象における感染症、疾患、状態および／もしくは臨床症状の開始の予防および／もしくは遅延ならびに／または疾患、障害および／もしくは臨床症状の開始前に本開示の方法を実行しない場合に起こるものと比べた感染症、疾患、状態および／もしくは臨床症状の開始の重篤度の低減を指す。
【００３４】
「プロモーター」は、本明細書において使用される場合、細胞中での核酸の発現を付与、活性化または増進することができる合成または天然由来の核酸分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増進するためならびに／またはその空間的発現および／もしくは時間的発現を変化させるための１つまたはより多くの特定の転写調節配列を含んでもよい。プロモーターはまた、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含んでもよく、これは転写の開始部位から数千塩基対もの離れた位置にあってもよい。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む供給源に由来してもよい。プロモーターは、構成的に、または、発現が起こる細胞、組織もしくは臓器に関して、もしくは発現が起こる発生ステージに関して、もしくは生理学的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外的刺激に応答して、差次的に遺伝子成分の発現を調節してもよい。プロモーターの代表的な例としては、ＥＦＳプロモーター、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、ヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００３５】
「プロトスペーサー配列」は、ＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサー配列に完全または実質的に相補的な（およびハイブリダイズする）標的二本鎖ＤＮＡおよび特には標的ＤＮＡ（または例えば、ゲノム中の標的領域）の部分を指す。Ｉ型システム中のプロトスペーサー配列は、３’末端においてＰＡＭにより直接的に隣接されている。スペーサーは、プロトスペーサーに相補的となるように設計される。
「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）」は、プロトスペーサーのすぐ３’または５’に存在する２〜４塩基対の短いモチーフである。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「低減する」（ｒｅｄｕｃｅ）、「低減した」、「低減する」（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）、「低減」、「減少させる」、「抑制する」、および「減少させる」という用語（ならびにこれらの文法的変形）は、例えば、対照と比較して少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の減少を記載する。特定の実施形態では、低減は、検出可能な活性または量を全くまたは本質的（すなわち、わずかな量、例えば、約１０％未満もしくはさらには約５％未満）に結果としてもたらさない。
【００３７】
本明細書において使用される場合、「配列同一性」は、２つの最適にアライメントされたポリヌクレオチドまたはペプチド配列が、成分、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸のアライメントのウィンドウの全体を通じて不変である程度を指す。「同一性」は公知の方法により容易に算出することができ、該方法としては、Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987);およびSequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)に記載されるものが挙げられるがそれに限定されない。
【００３８】
本明細書において交換可能に使用される「対象」および「患者」は、任意の脊椎動物を指し、該脊椎動物としては、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長動物（例えば、サル、例えば、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ）またはアカゲザル、チンパンジーなど）およびヒト）が挙げられるがそれに限定されない。一部の実施形態では、対象はヒトまたは非ヒトであってもよい。対象または患者は、他の形態の治療を受けていてもよい。
「標的遺伝子」は、本明細書において使用される場合、既知または推定上の遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列を指す。標的遺伝子は、遺伝病または障害に関与する突然変異した遺伝子であってもよい。標的遺伝子はＳＮＣＡであってもよい。
「標的領域」は、本明細書において使用される場合、標的遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物が結合および修飾のために設計される標的遺伝子および／または染色体の領域を指す。
【００３９】
本明細書において交換可能に使用される「形質転換」、「トランスフェクション」、および「形質導入」という用語は、細胞への異種核酸分子の導入を指す。細胞へのそのような導入は、安定的または一過性のものであることができる。そのため、一部の実施形態では、宿主細胞または宿主生物は、本開示のポリヌクレオチドで安定的に形質転換される。他の実施形態では、宿主細胞または宿主生物は、本開示のポリヌクレオチドで一過的に形質転換される。ポリヌクレオチドの文脈における「一過性の形質転換」は、ポリヌクレオチドが細胞に導入されるが細胞のゲノムには組み込まれないことを意味する。細胞に導入されるポリヌクレオチドの文脈における「安定的に導入する」または「安定的に導入される」は、導入されたポリヌクレオチドが細胞のゲノムに安定的に組み込まれ、そのため細胞が該ポリヌクレオチドで安定的に形質転換されることを意図する。「安定な形質転換」または「安定的に形質転換される」は、本明細書において使用される場合、核酸分子が細胞に導入され、細胞のゲノムに組み込まれることを意味する。そのため、組み込まれた核酸分子は、その子孫、より特には、複数の連続する世代の子孫に遺伝することができる。「ゲノム」はまた、本明細書において使用される場合、核、プラスミドおよびプラスチドゲノムを含み、したがって、例えば、葉緑体またはミトコンドリアゲノムへの核酸構築物の組込みを含む。安定な形質転換はまた、本明細書において使用される場合、例えば、ミニ染色体またはプラスミドとして、染色体外に維持される導入遺伝子を指すことができる。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列、構築物、発現カセットは、一過的に発現されることができかつ／または宿主生物のゲノムに安定的に組み込まれることができる。
【００４０】
「導入遺伝子」は、本明細書において使用される場合、１つの生物から単離された、異なる生物に導入される遺伝子配列を含有する遺伝子または遺伝材料を指す。ＤＮＡのこの非天然のセグメントは、トランスジェニック生物においてＲＮＡもしくはタンパク質を産生する能力を保持してもよく、またはトランスジェニック生物の遺伝コードの正常な機能を変化させてもよい。導入遺伝子の導入は、生物の表現型を変化させる可能性を有する。
【００４１】
「治療する」（ｔｒｅａｔ）、「治療する」（ｔｒｅａｔｉｎｇ）、または「治療」という用語は、対象の疾患もしくは障害の重篤度が低減されもしくは少なくとも部分的に改善もしくは修飾されることならびに少なくとも１つの臨床症状における何らかの緩和、軽減もしくは減少が達成されること、ならびに／または疾患もしくは障害の進行の遅延、および／もしくは疾患もしくは障害の開始の遅延があることを意図する。一部の実施形態では、該用語は、例えば、疾患または障害の症状または他の外徴の減少を指す。一部の実施形態では、治療は、疾患または障害の症状または他の外徴の少なくとも約５％、例えば、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはより大きい低減を提供する。
【００４２】
核酸に関して本明細書において使用される「バリアント」は、（ｉ）参照されるヌクレオチド配列の部分もしくは断片、（ｉｉ）参照されるヌクレオチド配列もしくはその部分の相補体、（ｉｉｉ）参照される核酸もしくはその相補体と実質的に同一の核酸、または（ｉｖ）参照される核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味する。
【００４３】
アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列において異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチドまたはポリペプチドに関する「バリアント」。バリアントはまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照されるタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を意味することができる。アミノ酸の保存的置換、すなわち、類似した特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸によるアミノ酸の置換は、典型的には微小な変化を伴うものとして当該技術分野において認識される。これらの微小な変化は、当該技術分野において理解されるように、部分的には、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することにより同定されてもよい。Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)。アミノ酸のハイドロパシー指数は、その疎水性および電荷の考慮に基づく。類似したハイドロパシー指数のアミノ酸は置換されても依然としてタンパク質機能を保持し得ることが当該技術分野において公知である。一態様では、±２のハイドロパシー指数を有するアミノ酸が置換される。生物学的機能を保持するタンパク質を結果としてもたらす置換を明らかにするためにアミノ酸の親水性もまた使用されてもよい。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最も高い局所的な平均親水性の算出を可能とする。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて行われてもよい。アミノ酸の疎水性指数および親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖により影響される。その観察と合致して、生物学的機能と適合性のアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の特性により明らかにされるような、アミノ酸、および特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対的な類似性に依存することが理解される。
「ベクター」は、本明細書において使用される場合、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であることができる。ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡベクターであることができる。ベクターは、自己複製性の染色体外ベクターであることができ、好ましくはＤＮＡプラスミドである。
【００４４】
本明細書において他に定義されなければ、本開示との関連で使用される科学技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有する。例えば、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションとの関連で使用される任意の学術用語、およびその技術は、当該技術分野において周知かつ一般的に使用されるものである。用語の意味および範囲は明確なはずであるが、何らかの潜在的な曖昧性がある場合、本明細書において提供される定義が任意の辞典または外因性の定義に対して優先される。さらに、文脈により他に必要とされなければ、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含む。
【００４５】
２．ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物
本発明は、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物を対象とする。エピゲノム修飾は、直接的または間接的のいずれかでＳＮＣＡ遺伝子の発現を活性化させまたは抑止することができる。ＳＮＣＡ遺伝子はパーキンソン病（ＰＤ）と関連付けられており、蓄積しつつある証拠は、野生型ＳＮＣＡのレベルの上昇は病原性であることを示唆する。ＳＮＣＡ遺伝子の調節領域のエピゲノム修飾は、メチル化および他のエピジェネティック修飾を含むことができる。例えば、ＳＮＣＡ遺伝子、特にイントロン１またはイントロン４を標的とするＤＮＡメチル化編集は、ＳＮＣＡ発現の下方調節のためおよび疾患に関連する細胞の乱れを逆転させるための、ＳＮＣＡ関連疾患または障害などの神経変性障害に対する潜在的な治療標的である。他方、ＳＮＣＡの正常な生理学的レベルは、ニューロン機能を維持するために必要とされる。ＳＮＣＡイントロン１におけるＤＮＡメチル化はＳＮＣＡ転写の調節に寄与し、ＳＮＣＡイントロン１における差次的なメチル化レベルがＰＤと対照との間で見出された。ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン４は約９０ｋｂであり、遺伝子の全体的なゲノム配列の大きい割合にわたる。イントロン４は、ＤＮａｓｅＩ過敏部位（ＤＨＳ）とのオーバーラップ、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ１、またはＨ３Ｋ２７Ａｃマーク、および強いリピートマスカーシグナルに基づいて部分領域に分割することができる。イントロン４は、アルツハイマー病においてレビー小体病理と関連付けられ、ＳＮＣＡ発現に関与することができる。そのため、ＳＮＣＡイントロン１遺伝子座またはイントロン４におけるメチル化またはアセチル化を含むＤＮＡ修飾は、ＳＮＣＡレベルの微調整された下方調節のための魅力的な標的である。
【００４６】
組成物は、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾のために使用することができる、融合タンパク質、または融合タンパク質をコードする核酸を含むがそれに限定されない。融合タンパク質は２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインはＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインは、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
【００４７】
一部の実施形態では、組成物は、融合タンパク質、または融合タンパク質をコードする核酸、および、ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合タンパク質を標的化する、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、または少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのｇＲＮＡは、ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の標的領域に融合タンパク質を標的化する。一部の実施形態では、組成物は、ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域を修飾する。ＣｐＧアイランド領域は、ＣｐＧ１、ＣｐＧ２、ＣｐＧ３、ＣｐＧ４、ＣｐＧ５、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１０、ＣｐＧ１１、ＣｐＧ１２、ＣｐＧ１３、ＣｐＧ１４、ＣｐＧ１５、ＣｐＧ１６、ＣｐＧ１７、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、ＣｐＧ２３、またはその組合せを含むことができる。例えば、ＣｐＧアイランド領域は、ＣｐＧ１、ＣｐＧ３、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、またはその組合せを含むことができる。一部の実施形態では、少なくとも１つのｇＲＮＡは、ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン４内の標的領域に融合タンパク質を標的化する。
【００４８】
一部の実施形態では、第２のポリペプチドドメインは、メチルトランスフェラーゼ活性を有するペプチドを含む。そのような実施形態では、融合タンパク質は、ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域をメチル化する。一部の実施形態では、第２のポリペプチドドメインは、ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ３Ａ（ＤＮＭＴ３Ａ）、その機能的断片、および／またはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドドメインは、第１のポリペプチドドメインのＣ末端、Ｎ末端、または両方に融合している。一部の実施形態では、融合タンパク質は核局在配列をさらに含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、第１のポリペプチドドメインを第２のポリペプチドドメインに接続するリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドドメインは配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
【００４９】
ａ．ＣＲＩＳＰＲシステム
本明細書において交換可能に使用される「Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ」および「ＣＲＩＳＰＲｓ」は、シークエンシングされた細菌の約４０％およびシークエンシングされた古細菌の９０％のゲノム中に見出される複数の短い直接反復を含有する遺伝子座を指す。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ある形態の獲得免疫を提供する侵入性ファージおよびプラスミドに対する防御に関与する微生物ヌクレアーゼシステムである。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）遺伝子の他に、ＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラムすることができる非コーディングＲＮＡエレメントの組合せを含有する。スペーサーと呼ばれる外来ＤＮＡの短いセグメントがＣＲＩＳＰＲ反復の間でゲノムに組み込まれ、過去の曝露の「メモリー」として働く。Ｃａｓ９はｓｇＲＮＡ（本明細書において交換可能に「ｇＲＮＡ」とも称される）の３’末端と複合体を形成し、タンパク質−ＲＮＡペアは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端と、プロトスペーサーと呼ばれる予め定義された２０ｂｐのＤＮＡ配列との間の相補的塩基対形成によりそのゲノム標的を認識する。この複合体は、ｃｒＲＮＡ内にコードされる領域、すなわち、プロトスペーサー、および病原体ゲノム内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を介して病原体ＤＮＡの相同遺伝子座に方向付けられる。非コーディングＣＲＩＳＰＲアレイは転写され、直接反復内で個々のスペーサー配列を含有する短いｃｒＲＮＡに切断され、これはＣａｓヌクレアーゼを標的部位（プロトスペーサー）に方向付ける。発現されるｓｇＲＮＡの２０ｂｐの認識配列を単純に交換することにより、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを新たなゲノム標的に方向付けることができる。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、真核生物においてＲＮＡｉに類似した方式で外因性遺伝子エレメントを認識およびサイレンシングするために使用される。
【００５０】
３つのクラスのＣＲＩＳＰＲシステム（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型エフェクターシステム）が公知である。ＩＩ型エフェクターシステムは、単一のエフェクター酵素、Ｃａｓ９を使用して、４つの逐次的なステップにおいて標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を実行してｄｓＤＮＡを切断する。複合体として作用する複数の別個のエフェクターを必要とするＩ型およびＩＩＩ型エフェクターシステムと比較して、ＩＩ型エフェクターシステムは、真核細胞などの選択的な状況において機能し得る。ＩＩ型エフェクターシステムは、スペーサー含有ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される長いプレｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質、およびプレｃｒＲＮＡプロセシングに関与するｔｒａｃｒＲＮＡからなる。ｔｒａｃｒＲＮＡは反復領域にハイブリダイズしてプレｃｒＲＮＡのスペーサーを分離することで内因性ＲＮａｓｅ  ＩＩＩによるｄｓＲＮＡ切断を開始させる。この切断に続いて、Ｃａｓ９による各スペーサー内の第２の切断事象が起こり、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９と会合したままの成熟ｃｒＲＮＡを生じさせて、Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が形成される。
【００５１】
Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体はＤＮＡデュプレックスを巻き戻し、切断すべきｃｒＲＮＡにマッチする配列をサーチする。標的ＤＮＡ中の「プロトスペーサー」配列とｃｒＲＮＡ中の残りのスペーサー配列との間の相補性の検出時に標的認識が起こる。正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）もまたプロトスペーサーの３’末端に存在する場合にＣａｓ９は標的ＤＮＡの切断を媒介する。プロトスペーサーの標的化のために、配列は、ＤＮＡ切断のために必要とされるＣａｓ９ヌクレアーゼにより認識される短鎖配列であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）により直ちに後続されなければならない。異なるＩＩ型システムは異なるＰＡＭ要件を有する。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲシステムは、５’−ＮＲＧ−３’（ＲはＡまたはＧのいずれかである）としてこのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）のためのＰＡＭ配列を有することがあり、ヒト細胞においてこのシステムの特異性を特徴付けた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのエピゲノム修飾剤および修飾システムの特有の能力は、２つまたはより多くのｓｇＲＮＡと共に単一のＣａｓ９タンパク質を共発現することにより複数の別個のゲノム遺伝子座を同時に標的化する直接的な能力である。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型システムは、「ＮＧＧ」配列（「Ｎ」は任意のヌクレオチドであり得る）の使用を天然に好むが、操作されたシステムにおいて「ＮＡＧ」などの他のＰＡＭ配列もまた許容する（Hsu et al., Nature Biotechnology (2013) doi:10.1038/nbt.2647）。同様に、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）は、ＮＮＮＮＧＡＴＴの天然のＰＡＭを通常有するが、高度に縮重したＮＮＮＮＧＮＮＮ  ＰＡＭを含む様々なＰＡＭにわたり活性を有する（Esvelt et al. Nature Methods (2013) doi:10.1038/nmeth.2681）。
【００５２】
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＩＩ型エフェクターシステムの操作された形態は、ゲノム操作のためにヒト細胞において機能することが示された。このシステムにおいて、Ｃａｓ９タンパク質は、一般にＲＮａｓｅ  ＩＩＩおよびｃｒＲＮＡプロセシングの必要性を取り除くｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ融合物である合成的に再構成された「ガイドＲＮＡ」（「ｇＲＮＡ」；本明細書においてキメラシングルガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）としても交換可能に使用される）によりゲノム標的部位に方向付けられた。
【００５３】
ｂ．Ｃａｓ
ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物はＣａｓ融合タンパク質を含んでもよい。一部の実施形態では、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物は、ヌクレアーゼ活性が不活性化されるようにＣａｓ９タンパク質が突然変異したＣａｓ９融合タンパク質、すなわち、Ｃａｓ９バリアントを含んでもよい。Ｃａｓ９タンパク質は、核酸を切断するエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座によりコードされ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに関与する。Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、またはナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）などの任意の細菌または古細菌種からのものであってもよい。エンドヌクレアーゼ活性を有しない不活性化されたＣａｓ９タンパク質（「ｉＣａｓ９」；「ｄＣａｓ９」とも称される）は最近、立体障害によって遺伝子発現をサイレンシングするためにｇＲＮＡにより細菌、酵母、およびヒト細胞中の遺伝子にへと標的化された。本明細書において使用される場合、「ｉＣａｓ９」および「ｄＣａｓ９」は共に、アミノ酸置換Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａを有し、そのヌクレアーゼ活性が不活性化されたＣａｓ９タンパク質を指す。例えば、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物は配列番号１０のｄＣａｓ９を含んでもよい。
【００５４】
ｃ．Ｃａｓ融合タンパク質
組成物はＣａｓ融合タンパク質を含む。融合タンパク質は２つの異種ポリペプチドドメインを含むことができ、第１のポリペプチドドメインはＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインは、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドドメインは、第１のポリペプチドドメインのＣ末端、Ｎ末端、または両方に融合している。一部の実施形態では、融合タンパク質は核局在配列をさらに含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、第１のポリペプチドドメインを第２のポリペプチドドメインに接続するリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、融合タンパク質はＳＮＣＡ遺伝子の転写を抑制する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる。
【００５５】
ｉ．転写活性化活性
第２のポリペプチドドメインは転写活性化活性、すなわち、トランス活性化ドメインを有してもよい。例えば、トランス活性化ドメインは、ＶＰ１６タンパク質、ＶＰ４８ドメインもしくはＶＰ６４ドメインなどの複数のＶＰ１６タンパク質、またはＮＦカッパＢ転写活性化因子活性のｐ６５ドメインを含んでもよい。
【００５６】
ｉｉ．転写抑制活性
第２のポリペプチドドメインは転写抑制活性を有してもよい。第２のポリペプチドドメインは、ＫＲＡＢドメインなどのＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス活性、ＥＲＦリプレッサードメイン活性、Ｍｘｉ１リプレッサードメイン活性、ＳＩＤ４Ｘリプレッサードメイン活性、Ｍａｄ−ＳＩＤリプレッサードメイン活性またはＴＡＴＡボックス結合タンパク質活性を有してもよい。
ｉｉｉ．転写放出因子活性
第２のポリペプチドドメインは転写放出因子活性を有してもよい。第２のポリペプチドドメインは、真核放出因子１（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  １；ＥＲＦ１）活性または真核放出因子３（ＥＲＦ３）活性を有してもよい。
【００５７】
ｉｖ．ヒストン修飾活性
第２のポリペプチドドメインはヒストン修飾活性を有してもよい。ヒストン修飾は、メチル化、リン酸化、アセチル化、ユビキチン化、およびスモイル化を含むヒストンタンパク質への共有結合性の翻訳後修飾（ＰＴＭ）である。ヒストンに為されるＰＴＭは、クロマチン構造を変化させることまたはヒストン修飾因子をリクルートすることにより遺伝子発現に影響することができる。ヒストンは、８つのヒストンに巻き付いたＤＮＡを染色体にパッケージングするように作用する。ヒストン修飾は、転写活性化／不活性化、染色体パッケージング、およびＤＮＡ損傷／修復などの生物学的プロセスに関与する。第２のポリペプチドドメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、またはヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有してもよい。
【００５８】
ｖ．核酸会合活性
第２のポリペプチドドメインは核酸会合活性を有してもよく、または、核酸結合タンパク質−ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡを認識する少なくとも１つのモチーフを含有する独立して折り畳まれたタンパク質ドメインである。ＤＢＤは、特定のＤＮＡ配列（認識配列）を認識することができ、またはＤＮＡに対して全般的な親和性を有することができる。核酸会合領域は、ヘリックス−ターン−ヘリックス領域、ロイシンジッパー領域、ウィングドヘリックス領域、ウィングドヘリックス−ターン−ヘリックス領域、ヘリックス−ループ−ヘリックス領域、免疫グロブリンフォールド、Ｂ３ドメイン、ジンクフィンガー、ＨＭＧボックス、Ｗｏｒ３ドメイン、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインであることができる。
【００５９】
ｖｉ．メチルトランスフェラーゼ活性
第２のポリペプチドドメインはメチルトランスフェラーゼ活性を有してもよく、これは、メチル基をＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、小分子、シトシンまたはアデニンに転移させることを伴う。ＤＮＡメチル化は、α−シヌクレイン発現のモジュレートにおいて役割を果たす。ＳＮＣＡイントロン１中のＣｐＧリッチ領域の差次的なメチル化が、健常個体と比較してＰＤおよびレビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）患者において報告されており、特に、ＣｐＧにおける高メチル化がＰＤおよびＤＬＢ脳において検出された。本明細書の実施例は、ＳＮＣＡイントロン１内のＣｐＧの直接的なメチル化は、ＳＮＣＡ−ｍＲＮＡの持続可能かつ長期の下方調節を達成するために十分であることを実証する。さらに、ＳＮＣＡ−ｍＲＮＡの低減は、細胞生存能力を増加させ、ミトコンドリア機能を向上させ、かつミトコンドリアＲＯＳ産生および細胞生存能力の向上により測定されるような酸化ストレスの細胞誘導の感受性を緩和することによりＳＮＣＡ−ＴｒｉＭＤＮＰＣの異常な表現型を逆転させた。
【００６０】
一部の実施形態では、第２のポリペプチドドメインはＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含んでもよい。一部の実施形態では、メチラーゼ活性ドメインはＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ３Ａ（ＤＮＭＴ３ａ）であることができる。ＤＮＭＴ３ａは、ＤＮＡ中の特定のＣｐＧ構造へのメチル基の転移を触媒する酵素である。酵素は、ヒトにおいてＤＮＭＴ３Ａ遺伝子によりコードされる。一部の実施形態では、第２のポリペプチドドメインは、直接的または間接的のいずれかでＤＮＡのメチル化を引き起こすことができる。
【００６１】
ｖｉｉ．デメチラーゼ活性
第２のポリペプチドドメインはデメチラーゼ活性を有してもよい。第２のポリペプチドドメインは、核酸、タンパク質（特に、ヒストン）、および他の分子からメチル（ＣＨ３−）基を除去する酵素を含んでもよい。代替的に、第２のポリペプチドは、ＤＮＡを脱メチル化するための機構においてヒドロキシメチルシトシンにメチル基を転換（ｃｏｖｅｒｔ）してもよい。第２のポリペプチドはこの反応を触媒してもよい。例えば、この反応を触媒する第２のポリペプチドは、Ｔｅｎ−ｅｌｅｖｅｎトランスロケーションメチルシトシンジオキシゲナーゼ１（Ｔｅｔ１）またはリジン特異的ヒストンデメチラーゼ１（ＬＳＤ１）であってもよい。一部の実施形態では、第２のポリペプチドドメインは、直接的または間接的のいずれかでＤＮＡの脱メチル化を引き起こすことができる。
ｖｉｉｉ．アセチルトランスフェラーゼ活性
第２のポリペプチドドメインはアセチルトランスフェラーゼ活性を有してもよい。第２のポリペプチドドメインは、アセチル基（ＣＨ３ＣＯ−）を分子に転移する酵素を含んでもよい。第２のポリペプチドドメインはヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）を含んでもよい。ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、ヒストンタンパク質上の保存されたリジンアミノ酸をアセチル化する酵素である。
【００６２】
ｉｘ．デアセチラーゼ活性
第２のポリペプチドドメインはデアセチラーゼ活性を有してもよい。第２のポリペプチドドメインは、分子からアセチル（ＣＨ3ＣＯ−）基を除去する酵素を含んでもよい。第２のポリペプチドドメインは、リジンデアセチラーゼ（ＫＤＡＣ）とも称されるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を含んでもよい。ヒストンデアセチラーゼは、ヒストンタンパク質上のリジンアミノ酸からアセチル基を除去する酵素である。
【００６３】
ｄ．ｇＲＮＡ
一部の実施形態では、組成物は、融合タンパク質、または融合タンパク質をコードする核酸、および、ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合タンパク質を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、または少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする核酸を含む。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのエピゲノム修飾システムの標的化を提供する。ｇＲＮＡは、２つの非コーディングＲＮＡ：ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの融合物である。ｓｇＲＮＡは、所望のＤＮＡ標的との相補的塩基対形成によって標的化特異性を付与する２０ｂｐプロトスペーサーをコードする配列を交換することにより任意の所望のＤＮＡ配列を標的化することができる。ｇＲＮＡは、ＩＩ型エフェクターシステムに関与する天然に存在するｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡデュプレックスを模倣する。例えば、４２ヌクレオチドのｃｒＲＮＡおよび７５ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡを含んでもよいこのデュプレックスは、Ｃａｓ９用のガイドとして作用する。
【００６４】
ｇＲＮＡは、ＳＮＣＡ遺伝子の標的領域を標的化してそれに結合してもよい。一部の実施形態では、少なくとも１つのｇＲＮＡは、ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の標的領域に融合タンパク質を標的化する。一部の実施形態では、少なくとも１つのｇＲＮＡは、ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン４内の標的領域に融合タンパク質を標的化する。例えば、少なくとも１つのｇＲＮＡは、ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１のＣｐＧアイランド領域に融合タンパク質を標的化してもよい。一部の実施形態では、組成物は、ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域を修飾する。ＣｐＧアイランド領域は、ＣｐＧ１、ＣｐＧ２、ＣｐＧ３、ＣｐＧ４、ＣｐＧ５、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１０、ＣｐＧ１１、ＣｐＧ１２、ＣｐＧ１３、ＣｐＧ１４、ＣｐＧ１５、ＣｐＧ１６、ＣｐＧ１７、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、ＣｐＧ２３、またはその組合せを含むことができる。例えば、ＣｐＧアイランド領域は、ＣｐＧ１、ＣｐＧ３、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、またはその組合せを含むことができる。
【００６５】
一部の実施形態では、少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その相補体、そのバリアント、またはその組合せのうちの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、組成物は１〜１０の異なるｇＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、システムは２つまたはより多くのｇＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、本開示のエピゲノム修飾システムは、少なくとも１つのｇＲＮＡ、少なくとも２つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも３つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも４つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも５つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも６つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも７つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも８つの異なるｇＲＮＡ、少なくとも９つの異なるｇＲＮＡ、または少なくとも１０の異なるｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は４つの異なるｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、エピゲノム修飾システムは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡ、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡ、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡ、および配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡを含む。
【００６６】
３．構築物およびプラスミド
ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物は、組成物をコードする遺伝子構築物を含んでもよい。プラスミドなどの遺伝子構築物は、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物をコードする核酸を含んでもよい。遺伝子構築物は、ｃａｓ融合タンパク質および／またはｇＲＮＡのうちの少なくとも１つをコードしてもよい。上記のような組成物は、改変ＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクターをコードする遺伝子構築物および本明細書に開示されるような組成物をコードする核酸配列を含んでもよい。組換えプラスミドまたは組換えウイルス粒子などの遺伝子構築物は、Ｃａｓ融合タンパク質および少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸を含んでもよい。一部の実施形態では、遺伝子構築物は、Ｃａｓ融合タンパク質および少なくとも２つの異なるｇＲＮＡをコードする核酸を含んでもよい。一部の実施形態では、遺伝子構築物は、Ｃａｓ融合タンパク質および２つより多くの異なるｇＲＮＡをコードする核酸を含んでもよい。一部の実施形態では、本開示は、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の開示される組成物をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。単離されたポリヌクレオチドは、Ｃａｓ融合タンパク質および少なくとも１つのｇＲＮＡをコードしてもよい。単離されたポリヌクレオチドは配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００６７】
一部の実施形態では、遺伝子構築物は、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ融合タンパク質分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターを含んでもよい。一部の実施形態では、プロモーターは、２つもしくはより多くのｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ融合タンパク質分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している。遺伝子構築物は、機能性染色体外分子として細胞中に存在してもよい。遺伝子構築物は、セントロメア、テロメアまたはプラスミドまたはコスミドを含む直鎖状のミニ染色体であってもよい。
遺伝子構築物はまた、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス随伴ウイルスを含む、組換えウイルスベクターのゲノムの部分であってもよい。遺伝子構築物は、弱毒化された生きた微生物中のまたは細胞中で生きる組換え細菌ベクター中の遺伝材料の部分であってもよい。遺伝子構築物は、核酸のコーディング配列の遺伝子発現用の調節エレメントを含んでもよい。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、停止コドン、またはポリアデニル化シグナルであってもよい。
【００６８】
ある特定の実施形態では、遺伝子構築物はベクターである。ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターであることができる。ベクターはプラスミドあることができる。ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法のために使用することができる。ベクターは組換えであってもよい。ベクターは、Ｃａｓ融合タンパク質をコードする異種核酸を含んでもよい。ベクターは、Ｃａｓ融合タンパク質をコードする核酸を細胞にトランスフェクトするために有用であってもよく、形質転換された宿主細胞は、Ｃａｓ融合タンパク質の発現が起こる条件下で培養および維持される。
コーディング配列は、安定性および高レベルの発現のために最適化されてもよい。一部の事例では、コドンは、分子内結合に起因して形成されるものなどのＲＮＡの二次構造形成を低減するように選択される。
【００６９】
ベクターは、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物をコードする異種核酸を含んでもよく、コーディング配列の上流にあってもよい開始コドン、およびコーディング配列の下流にあってもよい停止コドンをさらに含んでもよい。開始および終止コドンは、コーディング配列とインフレームであってもよい。ベクターはまた、コーディング配列に作動可能に連結したプロモーターを含んでもよい。コーディング配列に作動可能に連結したプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）からのプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長鎖末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーターもしくはｈＣＭＶなどのＣＭＶプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ＥＦＳプロモーター、ヒトＵ６プロモーターなどのＵ６プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであってもよい。プロモーターはまた、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはヒトメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）などのヒト遺伝子からのプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターであってもよい。そのようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第ＵＳ２００４０１７５７２７号明細書および同第ＵＳ２００４０１９２５９３号明細書（これらの内容は全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。筋肉特異的プロモーターの例としては、Ｓｐｃ５−１２プロモーター（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２００４０１９２５９３号明細書；Hakim et al. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. (2014) 1:14002;およびLai et al. Hum Mol Genet. (2014) 23(12): 3189-3199に記載されている）、ＭＨＣＫ７プロモーター（Salva et al., Mol. Ther. (2007) 15:320-329に記載されている）、ＣＫ８プロモーター（Park et al. PLoS ONE (2015) 10(4): e0124914に記載されている）、およびＣＫ８ｅプロモーター（Muir et al., Mol. Ther. Methods Clin. Dev. (2014) 1:14025に記載されている）が挙げられる。一部の実施形態では、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物の発現はｔＲＮＡにより駆動される。
【００７０】
ｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ融合タンパク質分子をコードする各ポリヌクレオチド配列は、プロモーターにそれぞれ作動可能に連結していてもよい。ｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ融合タンパク質分子に作動可能に連結したプロモーターは同じプロモーターであってもよい。ｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ融合タンパク質分子に作動可能に連結したプロモーターは異なるプロモーターであってもよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節可能なプロモーターであってもよい。
【００７１】
ベクターはまた、コーディング配列の下流にあってもよいポリアデニル化シグナルを含んでもよい。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであってもよい。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであってもよい。
【００７２】
ベクターはまた、コーディング配列の上流のエンハンサーを含んでもよい。エンハンサーは、ＤＮＡ発現のために必要であってもよい。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンまたはウイルスエンハンサー、例えば、ＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶもしくはＥＢＶからのものであってもよい。ポリヌクレオチド機能性エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号明細書、同第５，９６２，４２８号明細書、およびＷＯ９４／０１６７３７（これらのそれぞれの内容は参照により全体が組み込まれる）に記載されている。ベクターはまた、ベクターを染色体外に維持するためおよび細胞中でベクターの複数のコピーを製造するために哺乳動物複製起点を含んでもよい。ベクターはまた、ベクターが投与される哺乳動物またはヒト細胞中での遺伝子発現によく適したものであってもよい調節配列を含んでもよい。ベクターはまた、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）などのレポーター遺伝子および／またはハイグロマイシン（「Ｈｙｇｒｏ」）などの選択マーカーを含んでもよい。
【００７３】
ベクターは、Sambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989)（参照により全体が組み込まれる）を含む、常用の技術および容易に利用可能な出発材料によりタンパク質を製造するための発現ベクターまたはシステムであってもよい。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１４のＣａｓ融合タンパク質をコードする核酸配列および配列番号２〜５のうちの少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列、またはその相補体を含む、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物をコードする核酸配列を含んでもよい。
【００７４】
単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドを含むベクターは、宿主細胞に導入されてもよい。宿主細胞に核酸を導入する方法は当該技術分野において公知であり、任意の公知の方法を使用して細胞に核酸（例えば、発現構築物）を導入することができる。好適な方法としては、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、共役、プロトプラスト融合、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、免疫リポソーム、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注射、およびナノ粒子媒介性核酸送達などが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡ送達およびリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体送達により導入されてもよい。
【００７５】
ａ．レンチウイルスベクター
ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９システムは、特定の調節配列およびエピジェネティックマークの直接的なマニピュレーションを可能とすることによりエピジェネティクスの分野を変革する可能性を有する。該技術は、特定のエピジェネティックマークを微調整しかつ疾患関連の発現異常を訂正する前例のない機会を与える。しかしながら、効果的なエピゲノム特異的修飾を達成するために、ｄＣａｓ９エフェクターツールの安定な形質導入が多くの場合に、特に初代細胞またはｉＰＳＣに応用される場合に、必要である。レンチウイルスベクター（ＬＶ）に基づく送達プラットフォームが実現可能であり、これは、大きいＤＮＡペイロードを収容しかつ広範囲の分裂および非分裂細胞に効率的かつ安定的に形質導入するその能力に起因してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分のために高度に効率的である。ＬＶはまた、低い細胞傷害性および免疫原性を示し、形質導入された細胞のライフサイクルに最小の影響力を有する。本明細書において、最適化されたオールインワンレンチウイルスベクターをＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ成分の高度に効率的な送達のために採用した。このＬＶシステムを使用して、効率的な形質導入（ｈｉＰＳＣ）由来ドパミン作動性ニューロンが達成され、これは、ＳＮＣＡイントロン１内のＣｐＧのメチル化状態の効果的かつ標的化された修飾を結果としてもたらした。
【００７６】
一部の実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターであってもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を安定的に送達するための一般的に使用される方法であるレンチウイルスベクターの高いパッケージング能力は、４．２ｋｂのＳ．ピオゲネスＣａｓ９、エピジェネティックモジュレーター融合物、シングルｇＲＮＡ、および発現のために必要とされる関連する調節エレメントを収容することができる。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、配列番号１４のＣａｓ融合タンパク質をコードする核酸配列および配列番号２〜５のうちの少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列、またはその相補体を含む、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物をコードする核酸配列を含んでもよい。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４０、または配列番号３９のポリヌクレオチド配列を含む。
【００７７】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは改変されたレンチウイルスベクターであってもよい。例えば、レンチウイルスベクターは、ベクター力価を増加させるために改変されてもよい。一部の実施形態では、ウイルスベクターはエピソーム性インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）であってもよい。ＩＤＬＶは、配列番号１４のＣａｓ融合タンパク質をコードする核酸配列および配列番号２〜５のうちの少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列、またはその相補体を含む、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物をコードする核酸配列を含んでもよい。
【００７８】
エピソーム性インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）は、導入遺伝子の一過性発現のみが所望される場合の大きい遺伝子カーゴの送達のための理想的なプラットフォームである。ＩＤＬＶは、約０．２％〜０．５％の残留（インテグラーゼ非依存および非正統的）組込み率（２００〜５００の形質導入細胞当たり１つの組込み事象）を保持し、これは、新規の３’ポリプリントラクト（ＰＰＴ）欠失レンチウイルスベクターをインテグラーゼ欠損粒子にパッケージングすることによりさらに低減させることができる可能性がある。ある特定の状況下でｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達のために有効であるが、レンチウイルス送達は、典型的には、挿入突然変異誘発の懸念に起因してｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子調節のために好適ではない。対照的に、ＩＤＬＶは、他のレンチウイルスベクターより低い、オフターゲット突然変異を誘導する能力を示すことがある。
一部の実施形態では、ウイルスベクターはエピソーム性インテグラーゼコンピテントレンチウイルスベクター（ＩＣＬＶ）を含んでもよい。ＩＣＬＶは、配列番号１４のＣａｓ融合タンパク質をコードする核酸配列および配列番号２〜５のうちの少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列、またはその相補体を含む、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物をコードする核酸配列を含んでもよい。
【００７９】
ｂ．アデノ随伴ウイルスベクター
組成物はまた、異なるウイルスベクター送達システムを含んでもよい。ある特定の実施形態では、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶベクターは、ヒトおよび一部の他の霊長動物種に感染するパルボウイルス科のディペンドウイルス属に属する小さいウイルスである。ＡＡＶベクターは、様々な構築物構成を使用してＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物を送達するために使用されてもよい。例えば、ＡＡＶベクターは、別々のベクター上または同じベクター上のＣａｓ融合タンパク質およびｇＲＮＡ発現カセットを送達してもよい。代替的に、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）またはナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）などの種に由来する小さいＣａｓ９タンパク質が使用される場合、Ｃａｓ融合タンパク質および２つまでのｇＲＮＡ発現カセットの両方は、４．７ｋｂのパッケージング限度内で単一のＡＡＶベクター中に組み合わせられてもよい。
【００８０】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは改変ＡＡＶベクターである。例えば、改変ＡＡＶベクターはＡＡＶ−ＳＡＳＴＧベクターであってもよい（Piacentino et al. (2012) Human Gene Therapy 23:635-646）。改変ＡＡＶベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨格筋および心筋にヌクレアーゼを送達してもよい。改変ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９を含む、いくつかのキャプシド型の１つまたはより多くに基づいてもよい。改変ＡＡＶベクターは、全身性および局所送達により骨格筋または心筋に効率的に形質導入を行うＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧベクターなどの代替的な筋肉トロピックＡＡＶキャプシドを有するＡＡＶ２シュードタイプに基づいてもよい（Seto et al. Current Gene Therapy (2012) 12:139-151）。改変ＡＡＶベクターはＡＡＶ２ｉ８Ｇ９であってもよい（Shen et al. J. Biol. Chem. (2013) 288:28814-28823）。
【００８１】
４．医薬組成物
本開示は、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物、単離されたポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、約１ｎｇ〜約１０ｍｇの、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の、組成物をコードするＤＮＡ、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を含んでもよい。例えば、約１ｎｇ〜約１００ｎｇ、約１０ｎｇ〜約２５０ｎｇ、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇ、約１００ｎｇ〜約７５０ｎｇ、約５００ｎｇ〜約１ｍｇ、約７５０ｎｇ〜約２ｍｇ、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、２ｍｇ〜約６ｍｇ、約３ｍｇ〜約７ｍｇ、約４ｍｇ〜約８ｍｇ、約５ｍｇ〜約１０ｍｇ、またはその間の任意の値である。本発明による医薬組成物は、使用される投与様式にしたがって配合される。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合、それは、水性の滅菌濾過された発熱物質非含有のものである。等張配合物が好ましくは使用される。概しては、等張のための添加物としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、および以上の任意の組合せを挙げることができる。一部の場合には、リン酸緩衝生理食塩水などの等張溶液が好ましい。一部の場合には、医薬組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｔｉｏｎｓ）は１つまたはより多くの安定化剤をさらに含む。安定化剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられるがそれに限定されない。一部の実施形態では、血管収縮剤が配合物に添加される。
【００８２】
ＤＮＡ標的化システムを含有する医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、佐剤、担体、または希釈剤としての機能分子であってもよい。投与の方法は、使用される担体の種類を指示する。所望の投与方法のための任意の好適な薬学的に許容される賦形剤が使用されてもよい。薬学的に許容される賦形剤はトランスフェクション促進剤であってもよい。トランスフェクション促進剤は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳアナログ、例えば、モノホスホリルリピドＡ、ムラミルペプチド、キノンアナログ、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤を含んでもよい。トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、例えば、ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）、または脂質であってもよい。トランスフェクション促進剤はポリ−Ｌ−グルタメートであってもよい。ポリ−Ｌ−グルタメートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で医薬組成物中に存在してもよい。医薬組成物は、トランスフェクション促進剤、例えば、脂質、ＤＮＡ−リポソーム混合物としてのリポソーム、例えば、レシチンリポソームもしくは当該技術分野において公知の他のリポソーム（例えば、Ｗ０９３２４６４０を参照）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤を含んでもよい。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、例えば、ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）、または脂質である。
【００８３】
５．ＳＮＣＡ遺伝子発現をモジュレートする方法
本開示は、ＳＮＣＡ遺伝子の発現のｉｎ  ｖｉｖｏモジュレーションの方法を提供する。方法は、細胞におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現のｉｎ  ｖｉｖｏモジュレーションを含むことができる。方法は、対象におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現のｉｎ  ｖｉｖｏモジュレーションを含むことができる。方法は、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の本開示の組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物を細胞または対象に投与することを含むことができる。方法は、それを含む医薬組成物を細胞または対象に投与することを含むことができる。
【００８４】
一部の実施形態では、本開示は、細胞または対象におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現をｉｎ  ｖｉｖｏでモジュレートする方法であって、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、または二／ポリシストロンシステムを共発現するための任意の他の手段（内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、切断性ペプチド（ｐ２Ａ、ｔ２Ａおよびその他）、異なるプロモーターの利用などであって、融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、またはその組合せからなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）の融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）の核酸配列または前記の任意の他の手段、ならびに（ｂ）（ｉ）ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合分子を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合タンパク質を標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を、遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で細胞または対象と接触させることを含む方法を提供する。方法は、（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉｉ）、（ａ）（ｉ）および（ｂ）（ｉ）、（ａ）（ｉ）および（ｂ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉ）のいずれかを細胞または対象に投与することを含んでもよい。
【００８５】
一部の実施形態では、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物の投与は、細胞または対象におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現の低減を結果としてもたらしてもよい。例えば、方法は、対照と比較して少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＳＮＣＡ遺伝子発現の低減を結果としてもたらしてもよい。一部の実施形態では、ＳＮＣＡ遺伝子の発現は少なくとも２０％低減されてもよい。一部の実施形態では、ＳＮＣＡ遺伝子の発現は少なくとも９０％低減されてもよい。方法は、対照における生理学的レベルまでＳＮＣＡ遺伝子発現を低減してもよい。
【００８６】
一部の実施形態では、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物の投与は、細胞または対象におけるα−シヌクレインのレベルの低減を結果としてもたらしてもよい。例えば、方法は、対照と比較して少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％のα−シヌクレインのレベルの低減を結果としてもたらしてもよい。一部の実施形態では、α−シヌクレインのレベルは少なくとも２５％低減されてもよい。一部の実施形態では、α−シヌクレインのレベルは少なくとも３６％低減されてもよい。
【００８７】
一部の実施形態では、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物の投与は、細胞または対象におけるミトコンドリアスーパーオキシド産生の低減を結果としてもたらしてもよい。例えば、方法は、対照と比較して少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％のミトコンドリアスーパーオキシド産生の低減を結果としてもたらしてもよい。一部の実施形態では、ミトコンドリアスーパーオキシド産生は少なくとも２５％低減されてもよい。一部の実施形態では、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物の投与は、細胞生存能力の増加を結果としてもたらしてもよい。例えば、細胞生存能力は、対照と比較して少なくとも１倍に増加してもよい。例えば、細胞生存能力は、対照と比較して少なくとも１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．８倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍に増加してもよい。一部の実施形態では、細胞生存能力は、対照と比較して少なくとも１．４倍に増加してもよい。一部の実施形態では、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物の投与は、対照と比較して低減したミトコンドリアスーパーオキシド産生および／または増加した細胞生存能力を結果としてもたらしてもよい。例えば、ミトコンドリアスーパーオキシド産生は少なくとも２５％低減され、かつ／または、細胞生存能力は少なくとも１．４倍に増加してもよい。一部の実施形態では、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物の投与は、ＤＮＡ損傷を逆転させかつ／または老化に関連する異常な核をレスキューしてもよく、例えば、核真円度を増加させまたは折り畳まれた核を減少させてもよい。
【００８８】
６．疾患を治療する方法
本開示は、ＳＮＣＡ遺伝子発現の上昇と関連付けられる疾患または障害を治療する方法を提供する。方法は、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の本開示の組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物を対象に投与することを含むことができる。方法は、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の本開示の組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物を細胞に投与することを含むことができる。細胞は対象中にあってもよい。一部の実施形態では、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物の投与は、ＤＮＡ損傷を逆転させかつ／または老化に関連する異常な核をレスキューし、例えば、核真円度を増加させまたは折り畳まれた核を減少させ、それにより、ＳＮＣＡ遺伝子発現の上昇と関連付けられる疾患または障害と関連付けられる状態を治療しかつ／または寛解させてもよい。
【００８９】
一部の実施形態では、本開示は、対象においてＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を治療する方法であって、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、またはその組合せからなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）の融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）の核酸配列、および（ｂ）（ｉ）ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合分子を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｉｉ）ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合分子を標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を、遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で対象または対象中の細胞に投与することを含む方法を提供する。方法は、（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉｉ）、（ａ）（ｉ）および（ｂ）（ｉ）、（ａ）（ｉ）および（ｂ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉ）のいずれかを対象または対象中の細胞に投与することを含んでもよい。
【００９０】
疾患または障害は神経変性障害であってもよい。一部の実施形態では、神経変性障害はＳＮＣＡ関連疾患または障害である。ＳＮＣＡ関連疾患または障害は、ＳＮＣＡ関連疾患または障害を有しない対照対象と比較してＳＮＣＡ遺伝子の異常な発現により特徴付けられる疾患または障害であってもよい。一部の実施形態では、ＳＮＣＡ関連疾患または障害は、対照と比較して増加したＳＮＣＡ遺伝子の発現により特徴付けられる。他の実施形態では、ＳＮＣＡ関連疾患または障害は、対照と比較して減少したＳＮＣＡ遺伝子の発現により特徴付けられる。一部の実施形態では、ＳＮＣＡ関連疾患または障害は神経変性障害である。神経変性障害はシヌクレイン病であってもよい。シヌクレイン病は、アルファ−シヌクレインタンパク質の凝集物の異常な蓄積により特徴付けられる神経変性疾患である。凝集物の蓄積は、ニューロン、神経線維、またはグリア細胞において起こることがある。シヌクレイン病（Ｓｙｎｕｃｌｅｉｏｎｏｐａｔｈｉｅｓ）としては、パーキンソン病、レビー小体を伴う認知症、および複数系萎縮が挙げられる。例えば、神経変性障害はパーキンソン病であることができる。別の例として、神経変性障害は、レビー小体を伴う認知症であることができる。
【００９１】
７．送達方法
ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の本開示の組成物を細胞に送達する方法が本明細書において提供される。細胞は、本明細書に記載の核酸組成物を用いてトランスフェクトされてもよい。核酸組成物は、エレクトロポレーションを介して送達されてもよい。細胞は、例えば、エレクトロポレーションを介してトランスフェクトされてもよい。送達された核酸分子は細胞中で発現されてもよく、結果として生じるタンパク質は細胞の表面に送達される。エレクトロポレーションの方法は、ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸｃｅｌｌまたはＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩｂデバイスを使用してもよい。いくつかの異なる緩衝液が使用されてもよく、これには、ＢｉｏＲａｄのエレクトロポレーション溶液、Ｓｉｇｍａのリン酸緩衝生理食塩水製品番号Ｄ８５３７（ＰＢＳ）、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ（ＯＭ）、またはＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖ（Ｎ．Ｖ．）が含まれる。トランスフェクションは、陽イオン性トランスフェクション剤などのトランスフェクション試薬を含んでもよい。陽イオン性トランスフェクション剤としては、ｓｉＬｅｎｔｉｆｅｃｔ（商標）、ＴｒａｎｓＦｅｃｔｉｎ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）  ２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）  ３０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）  ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）  ＲＮＡｉＭＡＸが挙げられるがそれに限定されない。ベクター媒介性遺伝子移入および関連付けられる製品は実施例１４に概説されている。
【００９２】
本開示の遺伝子構築物または組成物が組織に送達され、そこで哺乳動物の細胞にベクターが送達されると、トランスフェクトされた細胞はｇＲＮＡ分子およびＣａｓ融合タンパク質分子を発現する。遺伝子構築物または組成物は、遺伝子発現を変化させるためまたはゲノムを再操作もしくは変化させるために哺乳動物に投与されてもよい。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ属動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリであってもよく、好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリである。
【００９３】
ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ融合タンパク質分子をコードする遺伝子構築物（例えば、ベクター）は、ｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーション、リポソーム媒介、ナノ粒子促進、および／または組換えベクターを用いるおよび用いないＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも称される）により哺乳動物に送達することができる。組換えベクターは、任意のウイルス様式により送達することができる。ウイルス様式は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および／または組換えアデノ随伴ウイルスであることができる。本開示の遺伝子構築物（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物は、エピゲノム修飾のために細胞に導入することができる。
【００９４】
８．投与の経路
ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の本開示の組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物は、任意の好適な経路により対象または対象中の細胞に投与することができる。例えば、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の開示される組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸内、経粘膜、外用、吸入を介して、頬側投与を介して、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、および関節内またはその組合せを含む異なる経路により対象または対象中の細胞に投与することができる。ある特定の実施形態では、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の本開示の組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物は、対象に筋肉内、静脈内またはその組合せで投与される。一部の実施形態では、エピゲノム修飾用の開示される組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物は、対象の中枢神経系に直接的に投与される。例えば、対象の中枢神経系への直接的な投与は頭蓋内または脳室内注射を含んでもよい。獣医学的使用のために、本開示の遺伝子構築物（例えば、ベクター）または組成物は、通常の獣医学的プラクティスにしたがって好適に許容される配合物として投与されてもよい。獣医は、特定の動物のために最も適切な投与レジメンおよび投与の経路を容易に決定することができる。組成物は、伝統的なシリンジ、無針注射デバイス、「微粒子衝撃遺伝子銃」（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｇｏｎｅ  ｇｕｎｓ）、または他の物理的方法、例えば、エレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「ハイドロダイナミック法」、もしくは超音波により投与されてもよい。
【００９５】
ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の本開示の組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーション、リポソーム媒介、ナノ粒子促進、組換えベクター、例えば、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス随伴ウイルスを用いるおよび用いないＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも称される）を含むいくつかの技術により哺乳動物に送達されてもよい。組成物は、骨格筋または心筋に注射されてもよい。
【００９６】
９．細胞種
これらの任意の送達方法および／または投与の経路は、例えば、真核細胞または原核細胞が挙げられるがそれに限定されない無数の細胞種と共に利用することができる。一部の実施形態では、真核細胞は、任意の真核生物からの任意の真核細胞であることができる。真核生物の非限定的な例としては、哺乳動物、昆虫、両生類、爬虫類、鳥、魚、真菌、植物、および／または線虫が挙げられる。一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞はヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞はニューロン細胞である。例えば、細胞は中脳ドパミン作動性ニューロン（ｍＤＡ）であってもよい。細胞は前脳基底部コリン作動性ニューロン（ＢＦＣＮ）であってもよい。他の実施形態では、細胞は神経前駆細胞であってもよい。例えば、細胞はドパミン作動性（腹側中脳）神経前駆細胞（ＭＤ  ＮＰＣ）であってもよい。細胞は、ＳＮＣＡ遺伝子中の突然変異を含んでもよい。例えば、細胞は、細胞または対象におけるＳＮＣＡ遺伝子発現の増加を引き起こすＳＮＣＡ遺伝子中の突然変異を含んでもよい。一部の実施形態では、細胞はＳＮＣＡ遺伝子三重化（ＳＮＣＡ−Ｔｒｉ）を含んでもよく、ＳＮＣＡ−Ｔｒｉでは、ＳＮＣＡのレベルは、ＳＮＣＡ−Ｔｒｉを有しない対照細胞における生理学的レベルと比較して上昇している。細胞はヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）であってもよい。例えば、細胞は、疾患または障害を有する患者に由来するｈｉＰＳＣであってもよい。例えば、細胞は、パーキンソン病と診断されたまたはそれを発生するリスクがある患者に由来するｈｉＰＳＣであってもよい。細胞は、レビー小体を伴う認知症と診断されたまたはそれを発生するリスクがある患者に由来するｈｉＰＳＣであってもよい。
【００９７】
１０．キット
ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾のために使用されてもよいキットが本明細書において提供される。キットは、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の開示される組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物を含んでもよい。キットは、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の開示される組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物を使用するための説明書を含んでもよい。キットに含まれる説明書は、パッケージ材料に付随していてもよく、またはパッケージ挿入物として含まれていてもよい。説明書は、典型的には、書かれたまたは印刷された材料であるが、そのようなものに限定されない。そのような説明書を保存し、それをエンドユーザーに伝えることができる任意の媒体が本開示により想定される。そのような媒体としては、電子保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、および光学媒体（例えば、ＣＤＲＯＭ）などが挙げられるがそれに限定されない。本明細書において使用される場合、「説明書」という用語は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【実施例】
【００９８】
１１．実施例
本明細書に記載される本開示の方法の他の好適な改変および適合が容易に応用可能かつ理解可能であり、本開示の範囲または本明細書に開示される態様および実施形態から離れることなく好適な均等物を使用して為され得ることが当業者に容易に明らかとなる。本開示を詳細に記載したが、それは以下の実施例を参照することによってより明確に理解され、以下の実施例は、本開示の一部の態様および実施形態を説明することのみを単に意図したものであり、本開示の範囲に対する限定として見られるべきではない。本明細書において参照される全ての学術的参考文献、米国特許、および出願公開の開示は参照により全体が組み込まれる。
本発明は複数の態様を有し、それは以下の非限定的な実施例により示される。
【００９９】
（実施例１）
材料および方法
プラスミドの設計および構築。ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子はｐｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−ＥＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃７１６６６）に由来し、これを以下のようにｐＢＫ３０１（産生最適化されたレンチウイルスベクター）にクローニングした：ＡｇｅＩ−ＢａｍＨＩ制限酵素を用いて消化したｄＣａｓ９断片をｐＢＫ３０１にクローニングすることによりｐＢＫ４５６プラスミドを生成した。次に、ＢａｍＨＩ制限部位を含有するプライマー：ＢａｍＨＩ−４２９／Ｒ  ５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧ−３’（配列番号１５）、ＢａｍＨＩ−４２９／Ｌ  ５’−ＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ−３’（配列番号１６）を用いてプラスミドからＤＮＭＴ３Ａ断片を増幅することによりＤＮＭＴ３Ａ触媒ドメインをｐｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−ＥＧＦＰからｐＢＫ４５６に移した。ｐＢＫ４５６を次にクローニングのためにＢａｍＨＩ制限酵素で消化して、ｐＢＫ４９２プラスミド（無ｇＲＮＡプラスミド）を結果として得た。次に、ＤＮＭＴ３Ａ断片中に位置する余剰ＢｓｍＢＩ部位を部位特異的突然変異誘発により除去してｐＢＫ５４６（配列番号３９；図１２Ｂを参照）を作製した。このプラスミドは、ＥＦＳ−ＮＣプロモーターから発現されるｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−ｐ２ａ−ピューロマイシンおよびＵ６プロモーターの下流に位置するｇＲＮＡクローニング部位（ＢｓｍＢＩ−ＢｓｒＧＩ−ＢｓｍＢＩ）を含んでいた。イントロン１−ＳＮＣＡ遺伝子を標的化する４つのｇＲＮＡ配列を使用した：１）５’−ＴＴＧＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＧＡＧＣＣＴＡ−３’（配列番号２）；２）５’−ＡＡＴＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＧＣＡ−３’（配列番号３）；３）５’−ＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣＧＣＣＣＣＣＴ−３’（配列番号４）；４）５’−ＣＴＧＣＴＣＡＧＧＧＴＡＧＡＴＡＧＣＴＧ−３’（配列番号５）。ｇＲＮＡ含有プラスミドをそれぞれｐＢＫ４９７／ｇＲＮＡ１、ｐＢＫ４９８／ｇＲＮＡ２、ｐＢＫ４９９／ｇＲＮＡ３、ｐＢＫ５００／ｇＲＮＡ４（配列番号３８；図１１を参照）と命名した。全てのプラスミドを制限消化解析およびサンガーシークエンシングにより検証した。ｇＲＮＡ配列の標的配列を表１に示す。
【０１００】
【表１】
2021523696.tif 000003
【０１０１】
ラット／マウスＳｎｃａイントロン１配列を標的化するために以下のプラスミドを作製した。ピューロマイシンをＧＦＰマーカーで置換するためにｐＢＫ５３９を作製した。置換は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの導入遺伝子発現の評価のために必要である。ＰＢＫ５３９（配列番号４０；図１０Ａを参照）を以下のように作製した：ＧＦＰ断片は、ＦｓｅＩ制限での消化によりｐＢＫ２０１ａ（ｐＬＶ−ＧＦＰ）に由来した。断片をゲル精製し、ＦｓｅＩで消化したｐＢＫ５４６ベクターにクローニングした。結果として得られたプラスミドｐＢＫ５３９はｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−ｐ２ａ−ＧＦＰ導入遺伝子を有する。この親プラスミドをさらに使用してｐＢＫ７４４（配列番号４１；図１０Ｂを参照）を作製した。この目的のために、プラスミドをＢｓｍＢＩで消化し、以下の配列：５’−ＴＴＴＴＴＣＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＴＡ−３’（配列番号４２）を有するｇＲＮＡと共にクローニングした。
【０１０２】
ベクターの製造。一過性トランスフェクションプロトコールを使用してレンチウイルスベクターを生成した。１５μｇのベクタープラスミド、１０μｇのｐｓＰＡＸ２パッケージングプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃１２２６０、Ｄｒ．  Ｄｉｄｉｅｒ  Ｔｒｏｎｏの研究室、ＥＰＦＬ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄで生成された）、５μｇのｐＭＤ２．Ｇエンベローププラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃１２２５９、Ｄｒ．  Ｔｒｏｎｏの研究室で生成された）、および２．５μｇのｐＲＳＶ−Ｒｅｖプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃１２２５３、Ｄｒ．  Ｔｒｏｎｏの研究室で生成された）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に濾過した条件培地からベクター粒子を収集した。スクロース勾配法を使用して粒子を精製し、超遠心分離（２０，０００ｒｐｍで２時間）により＞２５０倍に濃縮した。ベクターおよびウイルスストックをアリコート化し、−８０℃で貯蔵した。
【０１０３】
ベクター調製物の滴定（Ｔｉｔｔｅｒｉｎｇ）。ピューロマイシン耐性コロニーをカウントすることによりおよび１ｎｇのｐ２４ｇａｇを１×１０4個のウイルス粒子に等しいとするｐ２４gagＥＬＩＳＡ法によりベクター発現ピューロマイシン選択マーカーについて力価を決定した。細胞数に対するウイルス粒子数の比により多重感染度（ＭＯＩ）を算出した。ＨＩＶ−１  ｐ２４  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃａｐｔｕｒｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ）中の説明書の通りにｐ２４gag  ＥＬＩＳＡアッセイを実行した。簡潔に述べれば、ＰＢＳ中で１：１５００に希釈した１００μＬのモノクローナル抗ｐ２４抗体（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ、カタログ＃  ３５３７）で高結合９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）をコーティングした。コーティングしたプレートを４℃で終夜インキュベートし、次にＰＢＳ中の１％のＢＳＡ（２００μＬ）でブロッキングし、冷ＰＢＳ中の０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（２００ｕＬ）で３回洗浄した。次に、プレートを２００μＬの試料とインキュベートし、３７℃で１時間の１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により不活性化した。ＨＩＶ−１標準物質（カタログ番号ＳＰ９６８Ｆ）を２倍の段階希釈に供し、４ｎｇ／ｍＬに等しい開始濃度でプレートに適用した。０．２％のＴｗｅｅｎ２０および１％のＢＳＡを添加したＲＰＭＩ１６４０中に試料を希釈し、プレートに適用し、４℃で終夜インキュベートした。プレートを次に６回洗浄し、１００μＬのポリクローナルウサギ抗ｐ２４抗体（カタログ＃  ＳＰ４５１Ｔ）と３７℃で２時間インキュベートし、ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＢＳ、０．２５％のＢＳＡ、および２％の正常マウス血清（ＮＭＳ；Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ）中に１：５００で希釈した。プレートを次に上記のように洗浄し、ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と３７℃で１時間インキュベートし、５％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ；Ｓｉｇｍａ）、２％のＮＭＳ、０．２５％のＢＳＡ、および０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＲＰＭＩ１６４０中に１：１００００で希釈した。プレートを上記のように洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）と室温で１０分間インキュベートした。１００ｕＬの１Ｎ  ＨＣＬを加えることにより反応を停止させた。４５０ｎｍでマイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ（商標）  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によりプレートを読み取り、Ｅｘｃｅｌで解析した。全ての実験は３連で行った。
【０１０４】
細胞培養、神経前駆細胞の分化および特徴付け。ＳＮＣＡ遺伝子の三重化（ＳＮＣＡ−Ｔｒｉ）を有する患者からのヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株（ＮＤ３４３９１）はＮＩＮＤＳ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから購入した。ＮＤ３４３９１細胞株は正常な核型を示す。ｈＥＳＣ適格マトリゲルコーティングプレート上のｍＴｅＳＲ（商標）１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でのフィーダー非依存条件下でｈｉＰＳＣを培養した。製造者のマニュアルにしたがってＧｅｎｔｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して細胞を継代した。
【０１０５】
ドパミン作動性ニューロンは、ＰＤにおいて影響される主要なニューロン種であり、したがって、ｈｉＰＳＣをドパミン作動性（腹側中脳）神経前駆細胞（ＭＤ  ＮＰＣ）に分化させる特定のプロトコールを使用した。胚様体ベースのプロトコールを使用してｈｉＰＳＣをＭＤ  ＮＰＣに分化させた。Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｈｉＰＳＣを解離させ、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ  ８００プレート（１００００細胞／マイクロウェル；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のＹ２７６３２（１０μＭ）を添加した神経誘導培地（ＮＩＭ  −  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に播種して胚様体（ＥＢ）を形成させた。５日目に、ＥＢをマトリゲルコーティングプレート上のＮＩＭに再プレーティングした。６日目に、ＮＩＭに２００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したところ神経ロゼットの形成に繋がった。１２日目に、神経ロゼット選択試薬（製造者の説明書の通りに使用した、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて神経ロゼットを選択し、マトリゲルコーティングプレート中の３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、２μＭのＳＢ４３１５４２、５μｇ／ｍｌのＢＳＡ、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、および２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを添加したＮ２Ｂ２７培地に再プレーティングしたところＭＤＮＰＣの形成に繋がった。Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＭＤ  ＮＰＣを２日毎に継代した。それぞれ表２および表３に列記されるＭＤ  ＮＰＣ特異的マーカーを使用してリアルタイムＰＣＲおよび免疫細胞化学により分化の成功を評価した。
【０１０６】
異なるｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を有する安定的に形質導入されたＭＤ  ＮＰＣ株を５日毎に継代し、マトリゲルコーティングプレート上のピューロマイシン選択培地中で培養した。分子および細胞の特徴付けを培養の７〜１４日後に行った。
【表２】
2021523696.tif 000004
【表３】
2021523696.tif 000005
【０１０７】
形質導入およびピューロマイシン選択。ＭＤ  ＮＰＣに多重感染度（ＭＯＩ）＝２でＬＶ／ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａベクターを形質導入した。形質導入の１６時間後に培地を置き換え、形質導入の４８時間後にピューロマイシンを１ｕｇ／ｍＬの最終濃度で適用した。細胞をピューロマイシン選択培地上で２１日間維持して、異なるＬＶ／ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａベクターのそれぞれを有する５つの安定なＭＤ  ＮＰＣ株を得た。
【０１０８】
ＤＮＡ抽出、バイサルファイト変換およびパイロシークエンシング。製造者の説明書の通りにＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して各安定的に形質導入された細胞株からｇＤＮＡを抽出した。Ｚｙｍｏ  ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して重亜硫酸ナトリウムを用いてｇＤＮＡ試料（８００ｎｇ）を処理した。ＳＮＣＡイントロン１領域［Ｃｈｒ４：８９，８３６，１５０〜８９，８３６，５９３（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）］中の２３のＣｐＧにおけるメチル化状態の特異的評価のためにＰｙｒｏＭａｒｋ  ａｓｓａｙ  ｄｅｓｉｇｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０．６（Ｂｉｏｔａｇｅ；Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してパイロシークエンシングアッセイを設計した。以下の比：１００Ｕ：０Ｍ、７５Ｕ：２５Ｍ、５０Ｕ：５０Ｍ、２５Ｕ：７５Ｍ、０Ｕ：１００Ｍで非メチル化（Ｕ）およびメチル化（Ｍ）バイサルファイト修飾ＤＮＡの混合物（ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ  Ｓｅｔ；Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰｙｒｏＭａｒｋ  Ｑ９６  ＭＤパイロシークエンサー上で線形性および範囲についてアッセイを検証した。バイサルファイト修飾ＤＮＡ（２０ｎｇ）をＰｙｒｏＭａｒｋ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）に加え、以下の条件：９５℃で１５分、５０サイクルの９４℃で３０秒、５６℃で３０秒および７２℃で３０秒、７２℃での最終の１０分の伸長ステップを使用するＰＣＲに供した。増幅およびシークエンシング用のプライマーを表４に列記する。製造者のプロトコールにしたがってＰｙｒｏＭａｒｋ  Ｇｏｌｄ  Ｑ９６  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してパイロシークエンシングを実行した。Ｐｙｒｏ  Ｑ−ＣｐＧ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  １．０．９（Ｂｉｏｔａｇｅ）を使用して各ＣｐＧ部位のメチル化値を算出した。各安定的に形質導入された細胞株を２つの独立した実験において解析した。
【０１０９】
【表４】
2021523696.tif 000006
【０１１０】
ＲＮＡ抽出および発現解析。ＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して各安定的に形質導入されたＭＤ  ＮＰＣ株からトータルＲＮＡを抽出し、続いて製造者のプロトコールの通りにＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製を行った。２６０ｎｍで分光光度的にＲＮＡ濃度を決定し、精製の質を２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比により決定したところ１．９〜２．１の値を示し、高いＲＮＡ品質を指し示した。以下の条件：２５℃で１０分および３７℃で１２０分を使用してＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  ＲＴ  ｅｎｚｙｍｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｃＤＮＡを合成した。
【０１１１】
リアルタイムＰＣＲを使用してＭＤ  ＮＰＣマーカーのレベルおよびＳＮＣＡ発現レベルを定量化した。簡潔に述べれば、ＴａｑＭａｎ発現アッセイおよびＡＢＩ  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７を使用して相対定量的リアルタイムＰＣＲにより各試料の重複物をアッセイした。使用したＡＢＩ  ＭＧＢプローブおよびプライマーセットアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は表２に列記される。ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および以下の条件：５０℃で２分、９５℃で１０分、４０サイクル：９５℃で１５秒、および６０℃で１分を使用して、２つの独立した実験のための少なくとも２つの独立した実行において各ｃＤＮＡ（２０ｎｇ）を２連で増幅した（全体として≧８の反復）。増幅の特異性の陰性対照として、各プレート中のｃＤＮＡ（無ＲＴ）および無ｃＤＮＡ／ＲＮＡ試料（無鋳型）に変換されないＲＮＡ対照試料を使用した。対照反応において増幅産物は検出されなかった。増幅の線形範囲中で閾値セットを用いてデータを解析した。任意の特定の試料がその閾値と交差したサイクル数（Ｃｔ）を次に使用して倍数差異（ｆｏｌｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を決定した一方、２つの対照遺伝子の幾何平均は正規化用の参照として働いた。倍数差異は、２-ΔΔCt（３１）；ΔＣｔ＝［Ｃｔ（標的）−Ｃｔ（参照の幾何平均）］；ΔΔＣｔ＝［ΔＣｔ（試料）］−［ΔＣｔ（キャリブレーター）］として算出した。キャリブレーターは、実行内および実行間の正規化のために各プレートにおいて繰り返し使用された対照ＭＤ  ＮＰＣから得られた特定のＲＮＡ試料であった。キャリブレーター複製物にわたるΔＣｔ値の変動は１０％より小さかった。
【０１１２】
免疫細胞化学およびイメージング。免疫染色の前に、ＭＤ  ＮＰＣをＭａｔｒｉｇｅｌ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓｅｓ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、００３０７４２０６０）にプレーティングした。ＭＤ  ＮＰＣを４％のパラホルムアルデヒド中に固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中で透過処理した。以下のように免疫細胞化学を行った：細胞を５％のヤギ血清中で１時間ブロッキングした後に一次抗体と４℃で終夜インキュベートした（表３）。二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を室温で１時間インキュベートした。製造者の説明書にしたがってＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）  Ｆｉｘｅｄ  Ｃｅｌｌ  ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（登録商標）  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて核を染色した。４０Ｘの対物レンズを使用してＬｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡で画像を取得した。２つの独立した実験において染色を行い、５０細胞を各実験において解析した（ｎ＝１００細胞）。
【０１１３】
ウエスタンブロッティング。α−シヌクレインウサギモノクローナル抗体（ａｂ１３８５０１、Ａｂｃａｍ）および正規化用のｍＡｂ  β−アクチン（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｓ）を用いてウエスタンブロッティングにより、安定的に形質導入されたＭＤ  ＮＰＣ株中のヒトα−シヌクレインタンパク質の発現レベルを決定した。細胞をディッシュから剥がし取り、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で１０倍容量の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０中でホモジナイズした。試料を３回、各サイクルにつき１５秒間超音波処理した。総タンパク質濃度をＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）により決定し、５０μｇの各試料を４〜２０％のトリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、５％のミルクＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ２０を用いてブロットをブロッキングした。一次抗体を４℃で終夜インキュベートした。二次抗体はヤギ抗ウサギ７７０およびヤギ抗マウス６８０（１：１００００、Ｂｉｏｔｉｕｍ）であった。蛍光免疫反応性をＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙでイメージングし、Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｌｉｔｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して定量化した。α−シヌクレイン発現を同じレーン中のβ−アクチン発現に対して正規化した。実験は２回繰り返し、２つの独立した生物学的複製物を表す。
【０１１４】
ミトコンドリアスーパーオキシドおよび細胞生存能力アッセイ。ＭＤ  ＮＰＣを３．５×１０4細胞／ｍｍ2で播種し、黒色９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中でフェノールレッドを含まない高グルコースＮ２Ｂ２７培地中で培養した。Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａ、ＢＭＧ）を実行した。簡潔に述べれば、プレーティングの２４時間後、２０μＭのロテノンで１８時間またはＤＭＳＯのみを用いてＭＤ  ＮＰＣを処理した。ＭｉｔｏＳｏｘアッセイをミトコンドリア関連スーパーオキシドレベルの検出のために使用した。９６ウェルプレート中の接着したＮＰＣを、フェノールレッドを含まない高グルコース培地中の２μＭのＭｉｔｏＳＯＸ（商標）（Ｅｘ．／Ｅｍ．  ５１０ｎｍ／５８０ｎｍ）および２μＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ（４８５ｎｍ／５２０ｎｍ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と３７℃の暗所で１５分間インキュベートした。１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を含有する培地を用いて細胞を２回洗浄した。逐次的な読取りにより蛍光を検出し、ＭｉｔｏＳＯＸ（商標）シグナルをミトコンドリア含有量（Ｍｉｔｒｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標））および細胞数（Ｈｏｅｃｈｓｔ）に対して正規化した。
【０１１５】
Ｃ１２レサズリンアッセイを使用して細胞生存能力を測定した。簡潔に述べれば、細胞を上記のように調製し、次にフェノールレッドを含まない高グルコース培地中３７℃の暗所で３０分間３μＭのＣ−１２レサズリン（Ｅｘ．／Ｅｍ：５６３／５８７ｎｍ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をロードした。１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を含有する培地を用いて細胞を２回洗浄した。Ｃ１２−レサズリン蛍光強度をＨｏｅｃｈｓｔ蛍光に対して正規化した。各実験はＭＤ  ＮＰＣ形質導入株当たり６つの技術的複製物において行い、各実験は２回繰り返し、２つの独立した生物学的複製物を表す。
【０１１６】
グローバルＤＮＡメチル化。ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、各安定的に形質導入されたＭＤ  ＮＰＣ株からＤＮＡを抽出した。製造者の説明書にしたがって市販の５−メチルシトシン（５−ｍＣ）ベースのイムノアッセイプラットフォーム（ＭｅｔｈｙｌＦｌａｓｈ（商標）  Ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（５−ｍＣ）  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ）を使用してグローバルＤＮＡメチル化を評価した。簡潔に述べれば、精製されたＤＮＡ（１００ｎｇ）および非メチル化（陰性）対照ＤＮＡ（１０ｎｇ）を、ＤＮＡ結合およびウェルへの接着を促進するための溶液とストリップウェル中でインキュベートした。希釈された５−ｍＣ捕捉および検出抗体を含有する溶液を用いてストリップウェル中の試料を処理した。ＤＮＡのメチル化比率を、ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ、ＢＭＧを使用して吸光度読取りにより比色測定で定量化した。式：
【数１】
2021523696.tif 000007
を使用して製造者の説明書にしたがって光学密度（ＯＤ）の割合としてメチル化ＤＮＡのパーセンテージを算出した。
２つの独立した実験のそれぞれにおいて２つの複製物を使用して５−ｍＣのパーセンテージを決定した。
統計解析。ＭＤ  ＮＰＣ安定株の間および異なる条件にわたる差異の有意性は、以下の一対比較検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７）：（ｉ）スチューデントｔ検定を使用する２群比較、（ｉｉ）ダネット法を使用する多重比較を使用して統計的に解析した。
【０１１７】
（実施例２）
エピジェネティックＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのツールの効率的な送達のための新規のレンチウイルスベクターシステムの開発
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの材料の送達のために使用されるオールインワン組込みレンチウイルスベクターシステムの１つの短所は低い産生力価である。そのような問題を克服する方法は、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ成分が別々に送達されるバイナリープラスミドベクターシステムの開発を含んでいた。このアプローチは製造の収率を向上させたが、ｉｎ−ｖｉｖｏスクリーニングおよび疾患モデリングを含む遺伝子編集応用のために好適でない。最近開発された第２世代のオールインワンベクターは、第１世代システムに対して産生力価および形質導入効率の増加を示すが、これらは伝統的なベクターと比較して依然として約２５分の１の製造収率である。単一のベクターによってＣａｓ９およびｓｇＲＮＡを同時に送達する能力は、簡易かつ堅牢なｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子編集を可能とし、これは翻訳可能な遺伝子療法製造物を開発するために特に有利である。本開示は、ＬＶ発現カセット中にＳｐ１転写因子結合部位（ヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーターの上流）、および５’  Ｕ３からＴＡＴＡボックスを除去する最先端のＵ３’欠失を含めることによるレンチウイルスベクター媒介性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子移入の効果的な手段に関する（図１Ｂ）。この新規のシステムは、インテグラーゼコンピテントレンチウイルス粒子（ＩＣＬＶ）およびインテグラーゼ欠損レンチウイルス粒子（ＩＤＬＶ）に効率的にパッケージングすることができる。さらには、システムは、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞および有糸分裂後の脳ニューロンにおいて迅速かつ堅牢な遺伝子編集を媒介することができる。
【０１１８】
エピジェネティックベースの遺伝子編集乱れ用のレンチウイルスベクターシステムをさらに開発するために、骨格にｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を組み込み、ＩＣＬＶ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−ピューロマイシン／ＧＦＰおよびＩＤＬＶ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−ピューロマイシン／ＧＦＰベクターを作製することにより骨格をさらに改変した（ＩＤＬＶベクターについて、点突然変異（Ｄ６４Ｅ）をＩｎｔ遺伝子の触媒ドメインに導入した（図１Ｂ）。結果として得られたベクターの産生力価をｐ２４ｇａｇ  ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。ＩＣＬＶ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３ＡおよびＩＤＬＶ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａの両方の力価は、１〜２×１０10ｖｇ／ｍｌの範囲にあることが見出され、これはナイーブレンチウイルスベクターシステムから得られる力価と同等である（図１Ｃ）。抗生物質抵抗性（ピューロマイシン）コロニー形成アッセイを使用して新規のＩＣＬＶシステムの製造効率をさらに評価した（図１Ｄ）。ＩＣＬＶ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３ＡおよびナイーブＩＣＬＶベクター（ＬＶ−ＣＭＶ−Ｐｕｒｏ）ベクターは類似したパッケージング効率および発現能力を実証した（図１Ｄ）。
【０１１９】
（実施例３）
結果  −  オールインワンレンチウイルスベクター−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａシステムを使用したＳＮＣＡイントロン１の標的化されたメチル化
ＳＮＣＡイントロン１は、２３のＣｐＧを含むＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）の領域［Ｃｈｒ４：８９，８３６，１５０〜８９，８３６，５９３（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）］を含有し（図１Ａ）、該領域においてメチル化状態はＳＮＣＡ発現の増加と共に変化した。さらには、ＳＮＣＡイントロン１部分領域は、疾患状態において差次的にメチル化されることがある。イントロン１のこの部分領域内のＣｐＧ部位は、ＳＮＣＡ転写の微調節と関連付けられるエピジェネティックマニピュレーションのための標的候補となる可能性がある一方、これらのＣｐＧ部位におけるＤＮＡメチル化の増進は、ＳＮＣＡ発現の緊密な下方調節およびＰＤ関連表現型の逆転を可能とするかもしれない。この前提を評価するために、ヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーターの上流の転写因子Ｓｐ１結合部位の反復、および３’長鎖末端反復（ＬＴＲ）のＵ３’領域内の最先端の欠失を含有する産生および発現が最適化された骨格を使用してオールインワンｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａレンチウイルスベクターを構築した（図１Ｂ）。この骨格ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分の送達および発現において高度に効率的である。骨格は、ｇＲＮＡカセットから下流で発現される融合版のｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａタンパク質と共にクローニングされた（図１Ｂ）。ＳＮＣＡイントロン内の異なるＣｐＧを標的化する４つのｇＲＮＡを設計し、親ベクター１にクローニングした（図１Ａ）。
【０１２０】
ＳＮＣＡ遺伝子座の三重化を有する患者は、ＳＮＣＡ−ｍＲＮＡ発現レベルの構成的に二重の発現を示し、ＰＤの早期発病を示す。したがって、ＳＮＣＡ−Ｔｒｉ細胞株は、ＳＮＣＡの過剰発現の文脈においてＰＤを研究するための十分なモデルを表す。イントロン１内のＣｐＧアイランド中のＤＮＡメチル化の増進が図１Ｃにおいて提唱されるようにＳＮＣＡ遺伝子発現を下方調節するかどうかを試験するために、ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ発現カセットをレンチウイルスベクターにパッケージングし、結果として得られた粒子を、ＰＤにおいて主に影響されるニューロン種であるドパミン作動性前駆体ニューロン（ＭＤ  ＮＰＣ）に分化したＳＮＣＡ三重化（ＳＮＣＡ−Ｔｒｉ）を有する患者に由来するｈｉＰＳＣ株に形質導入した。ニューロン種および分化ステージを再検証するために、安定的に形質導入されたｈｉＰＳＣ由来ＭＤ  ＮＰＣ株を、ＭＤ  ＮＰＣの特異的マーカーであるネスチンおよびフォークヘッドボックスプロテインＡ２（ＦＯＸＡ２）を使用して免疫蛍光およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより特徴付けた（図２）。
【０１２１】
次に、５つの安定的に形質導入されたｈｉＰＳＣ由来ＭＤ  ＮＰＣ株のそれぞれについてＳＮＣＡイントロン１中の個々の２３の各ＣｐＧのメチル化のパーセンテージを定量的に決定した。図３および表５は、ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を安定的に有する各ｈｉＰＳＣ由来ＭＤ  ＮＰＣ株についての個々のＣｐＧ部位におけるメチル化の％を示し、対照ＭＤ  ＮＰＣ無ｇＲＮＡ株と比べたメチル化％の増加の有意性を指し示す。各ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子は、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ無ｇＲＮＡ導入遺伝子を有する株と比較してＳＮＣＡイントロン１にわたるいくつかのＣｐＧのメチル化の有意な増加に繋がった。一部の有意に高メチル化のＣｐＧは特定のＭＤ  ＮＰＣ株に独占的であったが（ｇＲＮＡ２  ＣｐＧ９；ｇＲＮＡ３  ＣｐＧ１９；ｇＲＮＡ４  ＣｐＧ６および７）、いくつかのＣｐＧは複数のｇＲＮＡ導入遺伝子細胞株において修飾されたこと（ｇＲＮＡ１および４＞ＣｐＧ１、３；全てのｇＲＮＡ＞ＣｐＧ８、ｇＲＮＡ１、３および４＞ＣｐＧ１８、２０〜２２）に注意する価値がある（図３、表５）。
【０１２２】
【表５】
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2021523696.tif 000010
【０１２３】
（実施例４）
ＳＮＣＡ−ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの下方調節
先行する報告は、イントロン１メチル化の変化はＳＮＣＡ転写を調節することを示している。本実施例では、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ  ｇＲＮＡを有するｈｉＰＳＣ由来ＭＤ  ＮＰＣ株を使用してＳＮＣＡイントロン１のＤＮＡメチル化編集はＳＮＣＡ−ｍＲＮＡおよびα−シヌクレインタンパク質の内因性発現レベルを低減できるかどうかを試験した。
【０１２４】
最初に、各ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａベクターを形質導入したｈｉＰＳＣ由来ＭＤ  ＮＰＣにおけるＳＮＣＡ−ｍＲＮＡ発現レベルを測定した。ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を有するＭＤ  ＮＰＣ株におけるＳＮＣＡ−ｍＲＮＡの発現レベルは、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ無ｇＲＮＡ対応物を有する対照ＭＤ  ＮＰＣ株について観察されたものより有意に低く、約３０％の低減であった（ｐ＝０．００６；スチューデントｔ検定）（図４Ａ）。ｇＲＮＡ３含有導入遺伝子を有するＭＤ  ＮＰＣはまた、無ｇＲＮＡ導入遺伝子を有するＭＤ  ＮＰＣと比較してＳＮＣＡ−ｍＲＮＡレベルの低減を示したが、この低減はわずかであり、統計的有意性に達しなかった（１７％の低減、ｐ＝０．０６；スチューデントｔ検定）。ＳＮＣＡ−ｍＲＮＡ発現に対する有意な効果は、ｇＲＮＡ１またはｇＲＮＡ２含有導入遺伝子を有するＭＤ  ＮＰＣ株において観察されず（それぞれｐ＝０．２２８６およびｐ＝０．５２４８）、修飾ＣｐＧおよび／またはメチル化率の変化の程度はこれらの株において転写物発現の変化を駆動するために十分でなかったことを指し示す。全てのＭＤ  ＮＰＣ株についてのＳＮＣＡ−ｍＲＮＡ発現の変化とのＤＮＡメチル化プロファイルの統合された結果は、ＳＮＣＡ遺伝子の転写調節と関連付けられるＳＮＣＡイントロン１内のＣｐＧ部位の手掛かりを提供する。したがって、ＣｐＧ部位６、７は、ＳＮＣＡ発現レベルの正常化に向けたメチル化マニピュレーションのための強い標的候補である。
【０１２５】
次に、ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａベクターを安定的に形質導入されたＭＤ  ＮＰＣ株におけるα−シヌクレインタンパク質発現レベルに対するシステムの効果を評価した。ＳＮＣＡ−ｍＲＮＡの結果によれば、内因性α−シヌクレインタンパク質の量は、無ｇＲＮＡ導入遺伝子を有する対照ＭＤ  ＮＰＣ株と比較して２５％近く減少した（ｐ＝０．００５５；スチューデントｔ検定）（図４Ｂ）。ＳＮＣＡおよびＭＤ  ＮＰＣマーカー、ネスチンの二重染色を使用して免疫蛍光によりＭＤ  ＮＰＣの「純粋」集団におけるα−シヌクレインレベルをさらに検証した。二重染色細胞の解析は内因性α−シヌクレインレベルの低減を裏付け、対照無ｇＲＮＡ株と比べてｇＲＮＡ４  ＭＤ  ＮＰＣ株において約３６％低いレベルであった（ｐ＜０．０００１；スチューデントｔ検定）（図４Ｃ〜Ｇ）。なお、ＭＤ  ＮＰＣの分化の成功率は約８０％であり、全細胞培養物を含んだウエスタンブロットおよびリアルタイムＰＣＲ分析に対して二重免疫蛍光アプローチでは分化したニューロンのみに分析を制限したので、これは二重免疫蛍光アプローチにより観察されるα−シヌクレインレベルに対するより大きい効果を説明する可能性がある（図７）。
【０１２６】
合わせると、これらの一貫したデータは、ｇＲＮＡ４を含有するｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子により付与されたイントロン１の高メチル化は、内因性のＳＮＣＡ−ｍＲＮＡ発現およびα−シヌクレインタンパク質レベルを有意に変化させるために十分であり（それぞれｐ＝０．００６および０．００５５）、無ｇＲＮＡ導入遺伝子を有する対照細胞と比較してメチル化レベルの増加ならびに相対的なより低いＳＮＣＡ−ｍＲＮＡおよびタンパク質の量を結果としてもたらしたことを示唆する（図４）。
【０１２７】
（実施例５）
ＳＮＣＡ−Ｔｒｉ細胞表現型のレスキュー
ＰＤは、黒質および他の場所におけるニューロンの喪失、ならびにアポトーシス細胞死を誘導するニューロン細胞培養物中のＳＮＣＡの過剰発現により特徴付けられる。追加的に、より高いミトコンドリア活性酸素種（ＲＯＳ）の産生により測定されるミトコンドリア機能障害はＰＤと関連付けられている。これと一致して、ＳＮＣＡ−Ｔｒｉ  ｈｉＰＳＣ由来ニューロンは、環境上のミトコンドリア複合体Ｉ毒素ロテノンへの曝露下で生存能力の低減およびミトコンドリア関連スーパーオキシド産生の増加を示す。ＳＮＣＡ−Ｔｒｉ  ｈｉＰＳＣ由来ＮＰＣに特徴的な細胞表現型、すなわち、ミトコンドリアスーパーオキシド産生および細胞生存能力に対するイントロン１高メチル化により媒介されるα−シヌクレインレベルの低減の効果を、ｇＲＮＡ４含有導入遺伝子を有するＭＤ  ＮＰＣ株を対照無ｇＲＮＡ導入遺伝子と比較することにより決定した。ｇＲＮＡ４を含有するカセットを発現するＭＤ  ＮＰＣは、ミトコンドリア関連スーパーオキシド産生の増加を緩和し（２．５対３．３、ｐ＝０．００１６；スチューデントｔ検定）（図５Ａ）、細胞生存能力の増加を実証した（１．７対１．２、ｐ＝０．０４９２；スチューデントｔ検定）（図５Ｂ）。同様に、ロテノン（２０μＭ、１８時間）への曝露下で、対照無ｇＲＮＡ対応物と比較してｇＲＮＡ４−Ｃａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａベクターを形質導入されたＭＤ  ＮＰＣにおいてミトコンドリア関連スーパーオキシド産生は有意に低く（３．６対５．４、ｐ＝０．０４６２；スチューデントｔ検定）（図５Ａ）、生存能力は有意に高かった（２．３対１．１、ｐ＝０．０３６５；スチューデントｔ検定）（図５Ｂ）。全体として、ｇＲＮＡ４を発現する細胞株におけるミトコンドリア関連スーパーオキシド産生および細胞生存能力に対するα−シヌクレイン低減の効果は、細胞をロテノンを用いて負荷した場合により著しかった（スーパーオキシド産生の２５％低下が、ロテノン曝露では３３％低下、および生存能力の１．４倍の増加が、ロテノンありでは２倍の増加）。これらの結果は、ｇＲＮＡ４を有するＭＤ  ＮＰＣ株は、無ｇＲＮＡ対照細胞と比較してストレス条件により耐性であることを指し示した。さらに、ｇＲＮＡ４  ＭＤ  ＮＰＣ株は、無ｇＲＮＡベクターを有する対照ＭＤ  ＮＰＣに対するロテノンの効果と比較してロテノンに対してより低い脆弱性を呈し、ミトコンドリア関連スーパーオキシド産生においてそれぞれ４４％対６３％の増加が測定された（図５）。合わせると、結果は、より低いα−シヌクレインタンパク質レベルを伴うＳＮＣＡ−ｍＲＮＡの高メチル化媒介性低減はＳＮＣＡ−Ｔｒｉ  ｈｉＰＳＣ由来ニューロンの表現型の乱れをレスキューすることを実証した。
【０１２８】
（実施例６）
グローバルなメチル化に対するｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子の最小の効果
上記の実施例は、疾患関連の細胞表現型を逆転させるために十分なＳＮＣＡイントロン１にわたる堅牢かつ持続的なメチル化を媒介するｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子の能力を実証する。システムの標的特異性を次に評価した。この目的のために、ＥＬＩＳＡベースのイムノアッセイを用いて、非形質導入ＳＮＣＡ−Ｔｒｉ  ＭＤ  ＮＰＣ株と比較してｇＲＮＡ４および無ｇＲＮＡを有する安定的に形質導入されたｈｉＰＳＣ由来ＭＤ  ＮＣＰ試料の５−メチルシトシン（５−ｍｅｔｈｙｌｃｉｔｏｓｉｎｅ）（５−ｍＣ％）（４０）のパーセンテージを測定することによりグローバルＤＮＡメチル化を定量化した（図６）。ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を構成的に発現するｈｉＰＳＣ由来ＭＤ  ＮＰＣ株は、元々のＳＮＣＡ−Ｔｒｉ  ＭＤ  ＮＰＣ株と比較して５−ｍＣ％の有意な変化を示さず、それぞれ０．５３％対０．３７％であった（ｐ＝０．９７）（図６）。他方、ＳＮＣＡ−Ｔｒｉ／無ｇＲＮＡ  ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ株は、グローバルＤＮＡメチル化の有意な増加を実証した（５−ｍＣ％  ０．３７％対１．５１％、ｐ＝０．００９）（図６）。ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を有する細胞株において観察された安定したグローバルＤＮＡメチル化は、ＤＮＡメチル化のオフターゲットは最小であることを示唆する。そのため、ＳＮＣＡイントロン１中のＣｐＧアイランド領域のメチル化を特異的に標的化するシステムの妥当性および安全性が支持される。対照的に、ｇＲＮＡを含有しない導入遺伝子はＤＮＡメチル化の標的特異的な修飾を維持せず、グローバルなメチル化の増加を結果としてもたらした。
【０１２９】
（実施例７）
考察
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来ニューロンシステムは、ＰＤを含むヒト神経変性疾患の態様をより正確にモデル化するための強力なツールである。それは、神経学的疾患の基礎となる分子メカニズムをより良好に理解するため、細胞疾患プロセスを定義するため、そしてまた効率的な薬物スクリーニングのための価値のあるｉｎ−ｖｉｔｒｏシステムを表す。ＳＮＣＡ遺伝子のゲノム三重化（ＳＮＣＡ−Ｔｒｉ）を有するＰＤ患者に由来するｈｉＰＳＣの到来は、ＳＮＣＡ発現レベルを標的化する新規の治療手段の開発のための特有かつ価値のあるツールを提供する。本明細書において、このモデルシステムは、ニューロン機能を維持するために必要とされる正常な生理学的レベルに戻すＳＮＣＡの緊密な下方調節のための戦略としてエピゲノム編集を評価するために使用される。
【０１３０】
本明細書において、ＳＮＣＡイントロン１中のＣｐＧアイランドの異なる領域を標的化する４つのｇＲＮＡを発現するオールインワンレンチウイルスベクターを使用した。各ｇＲＮＡベクターの形質導入は、ＳＮＣＡイントロン１内の複数のＣｐＧのＤＮＡメチル化の増進を結果としてもたらした。しかしながら、ＣｐＧアイランド領域の３’に位置する１つのｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ４のみがＳＮＣＡ−ｍＲＮＡレベルの抑制を結果としてもたらした。注目に値することとして、各ｇＲＮＡベクターは、ヒトＳＮＣＡイントロン１にわたりＤＮＡメチル化プロファイルの特定の修飾を結果としてもたらした。２３の部位内の特定のＣｐＧ部位の実質的な変化は、他のものより効果的に転写効率に影響を及ぼす可能性がある。したがって、これらの特定のＣｐＧ部位の高メチル化は、メチル化編集を転写失活に転化させることに関与する可能性がある。本明細書において提示される結果の組合せに基づいて、ＣｐＧ部位６および７は、ＳＮＣＡ発現レベルの正常化を達成するための緊密な調節を発揮するための薬学的メチル化編集のための強い標的である可能性がある。
【０１３１】
正確かつ効率的な標的化は、ＳＮＣＡ調節異常により引き起こされるＰＤにおける遺伝子療法の究極的目標であり、エピゲノム編集は治療的介入に向けた魅力的な戦略である。制御された方式でＳＮＣＡ過剰発現を低減するための新たな戦略を開発することは重要であるので、この研究の結果は治療薬の開発において必須の不可欠な障害に対処する。
【０１３２】
（実施例８）
ラット細胞株におけるＳＮＣＡ発現の下方調節
ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を有するレンチウイルスベクターを用いてラットＦ９８細胞株においてＳＮＣＡ−ｍＲＮＡを形質導入した。形質導入後１４日目に定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用してＳＮＣＡ−ｍＲＮＡのレベルを評価した。図８は、Ｃｙｂｅｒ  ｇｒｅｅｎベースの遺伝子発現アッセイにより測定し、２-ΔΔCT法を使用してＧＡＰＤＨｍＲＮＡおよびＰＰＩＡ−ｍＲＮＡ参照対照の幾何平均と比較して算出した異なる株におけるＳＮＣＡ−ｍＲＮＡのレベルを示す（４つの異なるｇＲＮＡを設計および使用した；バー１〜４）。各バーは３つの生物学的複製物の平均を表す。ナイーブ（非形質導入）Ｆ９８細胞（レーン１；黒バー）からの低減倍数として結果を提示する。レーン２：ｇＲＮＡ１；レーン３：ｇＲＮＡ２；レーン４：ｇＲＮＡ３（ｐＢＫ７４４）；レーン５：ｇＲＮＡ４；レーン６：ｇＲＮＡ５。無ｇＲＮＡ対照を実験において使用している（ｐＢＫ５３９）。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。
【０１３３】
（実施例９）
ＩＤＬＶの使用
エピソーム性インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）は、導入遺伝子の一過性発現のみが所望される場合の大きい遺伝子カーゴの送達のための理想的なプラットフォームである。ＩＤＬＶは、約０．２％〜０．５％の残留（インテグラーゼ非依存および非正統的）組込み率（２００〜５００の形質導入細胞当たり１つの組込み事象）を保持し、これは、新規の３’ポリプリントラクト（ＰＰＴ）欠失レンチウイルスベクターをインテグラーゼ欠損粒子にパッケージングすることによりさらに低減させることができる可能性がある。ＩＤＬＶは、遺伝病の精密なｉｎ  ｖｉｖｏ解析のために研究者の間で大きな関心を集めたが、その理由は、それは組込み型送達プラットフォームに本来備わった挿入突然変異誘発のリスクを有意に低減するからである。単一のベクターによってＣａｓ９およびｓｇＲＮＡを同時に送達する能力は簡易かつ堅牢なｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子編集を可能とし、これは翻訳可能な遺伝子療法製造物を開発するために特に有利である。それにもかかわらず、多くのウイルスベクタープラットフォーム、特に臨床応用を意図したものは、特大のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを運ぶために十分に好適でない。追加的に、これらのベクターの産生および発現効率は低い。これらの短所に対処するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの高度に効率的な遺伝子編集のためのオールインワンＩＤＬＶ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを開発した。これらのベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＨＥＫ２９３Ｔ細胞および有糸分裂後の脳ニューロンにおいて効率的、迅速、かつ持続可能なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集を可能とする。さらには、ＩＤＬＶ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは一過的に発現され、その組込み型対応物より有意に低い、オフターゲット突然変異を誘導する能力を有する。以上を合わせると、ＩＤＬＶは、他の送達プラットフォームに対して実質的な利点を有する、プログラム可能なヌクレアーゼのｉｎ  ｖｉｖｏ送達のための堅牢、効果的、かつ安全な手段である。
【０１３４】
ここで、新規のエピジェネティック編集手段を確立するためにベクター発現カセットをさらに改変した。新規のＩＤＬＶベクターは、ＳＮＣＡ遺伝子座の三重化を有するヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する神経前駆細胞（ＮＰＣ）のＳＮＣＡイントロン１領域中の低メチル化ＣｐＧアイランド内のＤＮＡメチル化の効率的かつ特異的な標的化のためのオールインワンｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ導入遺伝子を有していた。形質導入後７日目に定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用してＳＮＣＡ−ｍＲＮＡのレベルを評価した。異なる株におけるＳＮＣＡ−ｍＲＮＡのレベルをＴａｑＭａｎベースの遺伝子発現アッセイにより測定し、２-DDCT法を使用してＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡおよびＰＰＩＡ−ｍＲＮＡ参照対照の幾何平均と比較して算出した（図９Ａ）。図９Ａにおいて、各バーは、特定のＭＤ  ＮＰＣ株についての４つの生物学的および技術的複製物（ｎ＝８）の平均を表す。レーン１は無ｇＲＮＡ対照ベクターを用いた４９２を示し、レーン２は５００−ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａベクターを示し、レーン３はナイーブ（非形質導入ＮＤ）を示す。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。ＩＤＬＶ−ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａシステムは、ＩＣＬＶ−ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａと同様に、形質導入の７日目後（ｐｔ）までにＳＮＣＡ遺伝子発現の２０％に近い低減を示したことを本発明者らは実証する（図９Ａ）。重要なことに、形質導入後７日目までのＩＤＬＶゲノムの９０％に近い低減を本発明者らは示す（図９Ｂ）。これらの結果は、ＩＤＬＶにより送達されるｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａは、遺伝子活性化の迅速かつ持続的な逆転を媒介することができ、それは発現機能障害を伴う障害に対する有効な治療戦略となる可能性があることを明確に実証する。
【０１３５】
（実施例１０）
老化表現型のレスキュー
ラミンＡ／Ｃマーカー（ラミンＡ／Ｃ抗体：Ａｂ１０８５９５、Ａｂｃａｍ）を使用して以下に記載されるように免疫細胞化学により核折り畳みを解析し、折り畳まれた核エンベロープ形状は異常であると考えた。２つの独立した実験のために染色当たり＞１００の細胞を解析した（図１８Ａ〜１８Ｃを参照）。
【０１３６】
免疫細胞化学：免疫染色の前に、細胞をＰＬＯ／Ｌａｍｉｎｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓｅｓ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、００３０７４２０６０）にプレーティングした。細胞を４％のパラホルムアルデヒド中に固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中で透過処理した。以下のように免疫細胞化学を行った：細胞を５％のヤギ血清中で１時間ブロッキングした後に一次抗体と４℃で終夜インキュベートした。二次抗体（Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を室温で１時間インキュベートした。製造者の説明書にしたがってＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）  Ｆｉｘｅｄ  Ｃｅｌｌ  ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（登録商標）  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて核を染色した。４０Ｘの対物レンズを使用してＬｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡で画像を取得した。
開示される実施例は、複数の老化関連マーカーに対するＳＮＣＡ上方調節（発現の増加）の効果を実証する。一般に、ＳＮＣＡ多重化はニューロン核老化を悪化させ、若年期において既に老化シグネチャーを示した。
【０１３７】
ラミンは核エンベロープの構造的完全性に関与し、核エンベロープの完全性の喪失は老化と関連付けられている。マーカーラミンＡ／Ｃ9を使用することにより核エンベロープの完全性を評価した一方、折り畳まれた核を異常としてカウントした。健常対象に由来するｈｉＰＳＣ由来ＢＦＣＮおよびｍＤＡは１３．５％および１４．５％の異常な核を示したが、ＳＮＣＡ三重化（ＳＮＣＡ−Ｔｒｉ）を有する患者に由来するニューロンにおいて検出されるＳＮＣＡ発現の２倍の増加は、それぞれ５６％および４５％の、有意により高いレベルの折り畳まれた（異常な）核に繋がった。そのため、ＳＮＣＡの過剰発現は、核折り畳みの有意な増加を結果としてもたらし、老化シグネチャーの増悪を指し示した。
老化に特徴的なＳＮＣＡ−Ｔｒｉ  ｈｉＰＳＣ由来ＮＰＣに特徴的な細胞表現型、すなわち、核折り畳み／核真円度に対するイントロン１高メチル化により媒介されるα−シヌクレインレベルの低減の効果を、ｇＲＮＡ４含有導入遺伝子を有するＭＤ  ＮＰＣ株を対照無ｇＲＮＡ導入遺伝子と比較することにより決定した。ｇＲＮＡ４を含有するカセットを発現するＭＤ  ＮＰＣは異常な核の増加を逆転させ、老化関連表現型のレスキューを実証した（図１７〜１８）。
これらの結果は、老化に関連する表現型の乱れの逆転に繋がる、より低いα−シヌクレインタンパク質レベルが付随するＳＮＣＡ−ｍＲＮＡの高メチル化媒介性低減の効果に拡張された。
【０１３８】
（実施例１１）
ＣＲＩＳＰＲベースのエピゲノム修飾剤ベースのシステムの使用
シヌクレイン病において一般的に乱れる遺伝学的病因および分子メカニズム、ならびにこの群の異なる疾患の間にある不均質性の基礎となり得る遺伝学的病因および分子メカニズムをさらに理解するために、老化の文脈において患者および健常対象に由来する異なる病理関連ニューロンのアイソジェニックｈｉＰＳＣ由来モデルを徹底的に特徴付けることが重要である。高齢者ドナーから得られる線維芽細胞から初期化されたｈｉＰＳＣは、分子的および細胞的特徴、例えば、テロメアサイズ、酸化的損傷、ミトコンドリア代謝、トランスクリプトームおよびエピジェネティックシグネチャーにより特徴付けられ、これらは胚性幹細胞により類似している。そのため、ｈｉＰＳＣ由来モデルは加齢関連状態の研究のために十分に好適ではないという懸念がある。
【０１３９】
これらの問題に対処するために、ｈｉＰＳＳ由来ニューロンにおいて老化を誘導する最適化された代替的な新たなアプローチを開発した。見たところ健常な個体およびＳＮＣＡ遺伝子（ＳＮＣＡ６７０）の三重化を有する患者からのヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）は、それぞれＣｏｒｉｅｌｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓおよびＮＩＮＤＳ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから購入した。ＧＭ２３２８０およびＮＤ３４３９１株は正常な核型を有する。ｈＥＳＣ適格マトリゲルコーティングプレート上のｍＴｅＳＲＴＭ１培地中でフィーダー非依存条件下でｈｉＰＳＣを培養した。製造者のマニュアルにしたがってＧｅｎｔｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して細胞を継代した。ドパミン作動性ニューロン（ｍＤＡ）は腹側中脳（ＭＤ）に由来し、前脳基底部コリン作動性ニューロン（ＢＦＣＮ）は内側基底核原基（ＭＧＥ）に由来する。ｈｉＰＳＣをｍＤＡおよびＢＦＣＮに分化させるために特定のプロトコールを使用した。ｍＤＡへの分化は、胚様体ベースのプロトコールを使用して行った。Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｈｉＰＳＣを解離させ、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ  ８００プレート（１００００細胞／マイクロウェル；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のＹ２７６３２（１０μＭ）を添加した神経誘導培地（ＮＩＭ  −  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に播種して胚様体（ＥＢ）を形成させた。５日目に、ＥＢをマトリゲルコーティングプレート上のＮＩＭに再プレーティングした。６日目に、ＮＩＭに２００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したところ神経ロゼットの形成に繋がった。１２日目に、神経ロゼット選択試薬（製造者の説明書の通りに使用した、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて神経ロゼットを選択し、マトリゲルコーティングプレート中の３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、２μＭのＳＢ４３１５４２、５μｇ／ｍｌのＢＳＡ、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、および２０ｎｇ／６９０ｍｌのＥＧＦを添加したＮ２Ｂ２７培地に再プレーティングしたところ神経前駆細胞（ＮＰＣ）の形成に繋がった。ｍＤＡへのＮＰＣの分化は、ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニンコーディングプレート上でのＮＰＣの継代の１日後に開始した。ＮＰＣ維持培地を１４日間、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２μＭのパルモルファミン、３００ｎｇ／ｍｌのジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂ−ｃＡＭＰ）、および２００μＭのＬ６９５アスコルビン酸（Ｌ−ＡＡ）を添加したＮ２Ｂ２７培地からなる最終分化培地により置き換えた。１４日目から、２０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、１０μＭのＤＡＰＴ、０．５ｍＭのｄｂ−ｃＡＭＰ、および２００μＭのＬ−ＡＡからなる成熟培地を細胞に与えた。培地は一日おきに交換した。ＢＦＣＮへの分化は以下のように行った。ＥＢをＡｇｇｒｅｗｅｌｌ  ８００プレート中のＮＩＭ中に形成させた。５日目に、ＥＢを再プレーティングし、培地を１日毎に交換した。８日目から、神経ロゼットをＮＥＭ��７部のＫＯ−ＤＭＥＭ対３部のＦ１２、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ、１％のペニシリンおよびストレプトマイシン、そこに２％のＢ２７（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に加えて、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、５ｇ／ｍｌのヘパリン、２０ＭのＳＢ４３１５４２および１０ＭのＹ２７６３２、１．５Ｍのパルモルファミンを添加した）中に成長させた。１２日目に、神経ロゼット選択試薬を用いて神経ロゼットを選択し、マトリゲルコーティングプレート上のＮＥＭに再プレーティングした。２３日目に、Ｙ２７６３２を取り去り、４５〜５０日目までＮ２、Ｂ２７、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、Ｌ−アスコルビン酸、およびｄｂ−ｃＡＭＰを添加したＢｒａｉｎＰｈｙｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下でＰＬＯ／ラミニンコーティングプレート上で最終分化を行った。培地を一日おきに交換した。
【０１４０】
若年および老化ニューロンを生成するために、各々の培地中でＮＰＣを２日毎に継代した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＮＰＣを継代し、マトリゲルコーティングプレートにプレーティングした（２．５×１０4細胞／ｃｍ2）。若年ニューロンを生成するために、上記に概説したプロトコールにしたがって最終分化手順を継代Ｐ２〜Ｐ５のＮＰＣに応用した。老化ニューロンの生成のために、ＮＰＣを複数回継代したところ、ＮＰＣは継代Ｐ１４〜Ｐ１６において最終のニューロンに分化した。
【０１４１】
開示される組成物を伴う実験において上記の老化ニューロンを使用する。例えば、上記の老化ニューロンは、ＳＮＣＡの発現を低減する方法において開示される組成物と共に使用されてもよい。例えば、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の開示される組成物を含む上記のＩＤＬＶは上記の老化ニューロンに添加されてもよい。ＳＮＣＡ、α−シヌクレイン、および老化の他のマーカーのレベルは、本明細書に記載の方法にしたがって測定されてもよい。
【０１４２】
ＳＮＣＡ−ｍＲＮＡのレベルを決定するためのＲＮＡ抽出および発現解析：ＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して各安定的に形質導入されたＭＤ  ＮＰＣ株からトータルＲＮＡを抽出し、続いて製造者のプロトコールの通りにＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製を行った。２６０ｎｍで分光光度的にＲＮＡ濃度を決定し、精製の質を２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比により決定したところ１．９〜２．１の値を示し、高いＲＮＡ品質を指し示した。以下の条件：２５℃で１０分および３７℃で１２０分を使用してＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  ＲＴ  ｅｎｚｙｍｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲを使用してＭＤ  ＮＰＣマーカーのレベルおよびＳＮＣＡ発現レベルを定量化した。簡潔に述べれば、ＴａｑＭａｎ発現アッセイおよびＡＢＩ  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ７を使用して相対定量的リアルタイムＰＣＲにより各試料の重複物をアッセイした。特定のアッセイは、ＳＮＣＡ標的用のＨｓ００２４０９０６、ならびにハウスキーピング参照、ＧＡＰＤＨおよびＰＰＩＡ用のそれぞれＨｓ９９９９９９０５およびＨｓ９９９９９９０４である。
【０１４３】
ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および以下の条件：５０℃で２分、９５℃で１０分、４０サイクル：９５℃で１５秒、および６０℃で１分を使用して、２つの独立した実験のための少なくとも２つの独立した実行において各ｃＤＮＡ（２０ｎｇ）を２連で増幅した（全体として≧８の反復）。増幅の特異性の陰性対照として、各プレート中のｃＤＮＡ（無ＲＴ）および無ｃＤＮＡ／ＲＮＡ試料（無鋳型）に変換されないＲＮＡ対照試料を使用した。対照反応において増幅産物は検出されなかった。増幅の線形範囲中で閾値セットを用いてデータを解析した。任意の特定の試料がその閾値と交差したサイクル数（Ｃｔ）を次に使用して倍数差異を決定した一方、２つの対照遺伝子の幾何平均は正規化用の参照として働いた。倍数差異は、２-ΔΔCt；ΔＣｔ＝［Ｃｔ（標的）−Ｃｔ（参照の幾何平均）］。ΔΔＣｔ＝［ΔＣｔ（試料）］−［ΔＣｔ（キャリブレーター）］として算出した。キャリブレーターは、実行内および実行間の正規化のために各プレートにおいて繰り返し使用された対照ＭＤ  ＮＰＣから得られた特定のＲＮＡ試料であった。キャリブレーター複製物にわたるΔＣｔ値の変動は１０％より小さかった。
【０１４４】
α−シヌクレインタンパク質のレベルを決定するためのウエスタンブロッティング：α−シヌクレインウサギモノクローナル抗体（ａｂ１３８５０１、Ａｂｃａｍ；１：１０００）および正規化用のｍＡｂ  β−アクチン（ＡＭ４３０２、Ａｍｂｉｏｎ；１：５０００）を用いてウエスタンブロッティングにより、安定的に形質導入されたＭＤ  ＮＰＣ株中のヒトα−シヌクレインタンパク質の発現レベルを決定した。細胞をディッシュから剥がし取り、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で１０倍容量の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０中でホモジナイズした。試料を３回、各サイクルにつき１５秒間超音波処理した。総タンパク質濃度をＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）により決定し、２５μｇの各試料を１２％のトリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、５％のミルクＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ２０を用いてブロットをブロッキングした。一次抗体を４℃で終夜インキュベートした（Ａｂｃａｍ、ａｂ１３８５０１、１：１０００；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ＡＭ４３０２、１：５０００）。西洋ワサビペルオキシダーゼ共役二次抗体を室温で１時間インキュベートした（Ａｂｃａｍ；１：１００００）。ＨｙＧＬＯ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｒａｙ（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてシグナルを検出し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して免疫ブロットをイメージングした。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してデンシトメトリーを測定し、α−シヌクレイン発現を同じレーン中のβ−アクチン発現に対して正規化した。実験は２回繰り返し、２つの独立した生物学的複製物を表す。
【０１４５】
α−シヌクレイン凝集物の免疫細胞化学定量化：Ｌｅｉｃａ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅ  Ｘ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してα−シヌクレイン凝集物の免疫蛍光画像を解析した。細胞株当たり５０細胞について凝集物の数およびサイズを解析した。解析に含まれる細胞当たりの凝集物の数のベースラインは、対照細胞株において観察された凝集物の数を参照して決定した。凝集物のサイズは３つの群：小（＜１μｍ）、中（１〜２μｍ）、大（２〜５μｍ）において定義する。頻度分布プロットは、データの自然なグループ分けに基づいて任意単位の増分によりビニングされた凝集物の数およびサイズを表す。
【０１４６】
コメットアッセイ：コメットアッセイを使用し、以下のようにプロトコールを適用してｈｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるＤＮＡ損傷を測定した。簡潔に述べれば、Ａ１溶液［１．２ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ、０．１％のラウロイルサルコシンナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｌａｕｒｙｌ  ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ）、０．２６ＭのＮａＯＨ（ｐＨ＞１３）］中にスライドを４℃の暗所で１８〜２０時間置くことによりアルカリ条件中に成熟ニューロンを溶解した。Ａ２溶液［（０．０３ＭのＮａＯＨ、２ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ（ｐＨ１２．３）］を使用してスライドを３回洗浄し、新鮮なＡ２溶液中０．６Ｖ／ｃｍの電圧で２５分間電気泳動を実行した。スライドを次に蒸留Ｈ2Ｏ中で５分間、２回洗浄した後、７０％のエタノールに浸し、室温で１５分間乾燥させ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いて３０分間染色した。過剰な染色を洗浄した後、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｗｉｄｅｆｉｅｌｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して細胞をイメージングした。ＯｐｅｎＣｏｍｅｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してコメットを解析して、各コメットのための定量的指標として選択されたパラメーターであるオリーブテイルモーメントを決定した。２つの独立したコメット実験のそれぞれにつき１００細胞、５０細胞においてＯＴＭを決定した。
【０１４７】
（実施例１２）
ｉｎ  ｖｉｖｏでのエピゲノム編集アプローチの検証
ＤＮＡメチル化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ツールを介してＳＮＣＡの遺伝子発現をモジュレートする開発されたアプローチを臨床の場へと移行させる主要なステップとして、微調整された精密な方式でＳＮＣＡ過剰発現を低減するＳＮＣＡ標的化ＬＶ−ｇＲＮＡ／ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−２システムの能力をロテノンに曝露されたラットにおいて検証した。簡潔に述べれば、６〜９か月齢の繁殖引退の４匹のルイスラットを、１日毎のｉ．ｐ．注射を介する５日の継続期間にわたる２．７５〜３．０ｍｇ／ｍＬのロテノンの投与を用いて治療した。対照動物（ｎ＝４）にはビヒクル（ロテノン希釈液）を与えた。黒質（ＳＮ）、および対照脳領域として小脳においてＳＮＣＡ発現レベルを解析した。ＳＮＣＡ−ｍＲＮＡ（図１３Ａ）およびタンパク質（図１３Ｂ〜１３Ｃ）のレベルの有意な増加がＳＮにおいて見出され、＞５０％のより高いレベルであった（Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。小脳において、ＳＮＣＡ−ｍＲＮＡの増加は検出されなかったが（図１３Ａ）、ＳＮＣＡタンパク質発現は中程度に上昇した（図１３Ｂ〜１３Ｃ）。ＳＮＣＡ転写の調節を標的化するように治療的開発を設計し、したがって、ｍＲＮＡレベルにおける上昇したＳＮＣＡ発現の結果は、ＬＶ−ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａシステムのｉｎ  ｖｉｖｏ検証研究用のロテノン誘導性ＰＤラットモデルの好適性を実証する。レビー小体（ＬＢ）におけるアルファ−シヌクレインの主な修飾は位置１２９におけるセリン残基のリン酸化（ｐＳｅｒ１２９Ｓｙｎ）であり、これは全てのアルファ−シヌクレイン病原性凝集物に特異的なマーカーである。そのため、ｐＳｅｒ１２９Ｓｙｎに対する反応性を評価した。ＰＳｅｒ１２９抗体を使用した固定脳の免疫蛍光（ＩＦ）分析は、対照ラットと比較してロテノンを用いて治療されたラットにおいてｐＳｅｒ１２９Ｓｙｎの増加を示した（図１４）。
【０１４８】
さらには、リン酸化アルファ−シヌクレインのインクルージョン（凝集）が、ロテノンを用いて治療されたラットにおいて検出され、ユビキチンとのリン酸化アルファ−シヌクレインの共局在性の証拠が見出された（図１４）。これらの結果は、ＰＤの病理学的表現型を捕捉するためのＰＤラットモデルの実現可能性を証明する。要約すると、ＰＤ動物モデルはＰＤの鍵となる表現型の態様を再現し、それゆえ、ｉｎ  ｖｉｖｏで本発明者らのシステムを試験するための優れたツールを提供する。
ｍＲＮＡレベルにおけるＳＮＣＡのロテノン誘導性過剰発現を訂正する試みにおいて、定位注射によりＳＮに送達されるウイルス粒子を用いてラットを治療した。注射の２週後にラットをロテノンまたはビヒクルで５日間治療した。
【０１４９】
図１５Ａに記載されるように、ＳＮＣＡ  ｍＲＮＡレベルはＬＶ−ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ送達後に増大した。アルファ−シヌクレイン発現レベルの約５０％の低減が、ベクター（２．５×１０7個のウイルス粒子を注射のために使用した）を用いて治療されたラットのＳＮにおいて実証された（ＳＤのバーは、ＰＢＳまたはｇＲＮＡを有するウイルスのいずれかを注射された各群から２匹の動物につき算出された）（図１５Ｂおよび図１５Ｃ）。
【０１５０】
（実施例１３）
ニューロン核ＰＤ表現型のレスキュー
コメットアッセイ、特に、オリーブテイルモーメント（ＯＴＭ）の指標を使用して、ＤＮＡ損傷を解析した。ＯＴＭは、泳動されるＤＮＡの最小の検出可能部分の他に、テイル中の壊れたＤＮＡの数を含むＤＮＡ損傷の包括的な指標である。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｗｉｄｅｆｉｅｌｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｇｅｒｍａｎｙを使用してイメージングを行った。ＯｐｅｎＣｏｍｅｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＭＡ、ＵＳＡを使用してコメットを解析して、各コメットのための定量的指標として選択されたパラメーターであるＯＴＭを決定した。２つの独立したコメット実験のそれぞれにつき１００細胞、５０細胞においてＯＴＭを決定した。ｇＲＮＡ４を有するベクター（ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ）は有意により低いＯＴＭ値を示し、それはＤＮＡ損傷表現型を逆転させることを指し示した（図１６Ａ〜１６Ｃ）。
【０１５１】
ＳＮＣＡ遺伝子の過剰発現（約２倍）は、核エンベロープの老化関連表現型の増悪と相関する。ラミンＢ１マーカーを使用して核真円度の解析を行った。ビルトインＩｍａｇｅＪ、真円度プラグインを使用して核真円度を定量化し、ラミンＢ１マーカーに基づいて評価した。１．０の真円度値は完璧な円を指し示す。０に近い値ほど、より細長い多角形であることを指し示す。核エンベロープ真円度の定量化は、無ｇｒｎａ対象ベクターに対してｇＲＮＡ４ベクターを形質導入されたＮＰＣ株における核エンベロープ真円度の増加を実証した。データは、２００細胞についての頻度分布としてプロットしている。ｎ＝２；２つの独立した実験について染色当たり１００細胞を解析した。コルモゴロフ−スミルノフ検定にしたがって＊＊＊＊Ｐ  ０．０００１＞。ビルトインＩｍａｇｅＪ、真円度プラグインを使用して核真円度を定量化し、ラミンＢ１マーカーに基づいて評価した。１．０の真円度値は完璧な円を指し示す。０に近い値ほど、より細長い多角形であることを指し示す。データは２つの独立した実験の平均を表す。ｇＲＮＡ４を有するベクター（ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ）は核真円度の有意な増加を示し、それは異常な核の表現型をレスキューすることを指し示した（図１７Ａ〜１７Ｃ）。
図１８Ａ〜１８Ｃは、ラミンＡ／Ｃマーカーを使用した核折り畳みおよびバブリングの解析を示す。ｇＲＮＡ４を有するベクター（ｇＲＮＡ４−ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ）は核の折り畳みの有意な減少を示し、それは異常な核形状の表現型をレスキューすることを指し示した。
【０１５２】
（実施例１４）
レンチウイルスベクターの設計および製造のためのプロトコール
ＬＶは、いくつかの理由：（ｉ）バルクＤＮＡインサートを運ぶ能力、（ｉｉ）分裂および非分裂細胞３０の両方を含む広範囲の細胞に形質導入する高い効率、（ｉｉｉ）最小の細胞傷害性および免疫原性応答を誘導する能力からＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９成分を送達する効果的な手段を表す。
【０１５３】
レンチウイルスプラットフォームは、最も普及したベクタープラットフォームであるアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）に対して大きな利点を有し、より大きい遺伝子挿入物を収容する前者の能力は強く印象付けられる。ＡＡＶは、顕著により高い収率で生成され得るが、低いパッケージング能力（＜４．８ｋｂ）を有しており、オールインワンＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するためのその使用を損なわせる。本明細書に記載のプロトコールは、ベクター発現カセット内のエレメントのシスでの修飾を介して、ベクターの産生および発現能力を増加させるための戦略をさらに概説する。戦略は、１０１０ウイルス単位（ＶＵ）／ｍＬの範囲内でウイルス粒子を製造するシステムの能力を強調する。
【０１５４】
【表６】
2021523696.tif 000011
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2021523696.tif 000013
表６の材料は、Tagliafierro L., et al. (J. Vis. Exp. 2019 Mar. 29:145)に見い出すことができる。
【０１５５】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の培養およびトランスフェクションのための細胞のプレーティング。注記：完全高グルコースＤＭＥＭ（１０％のウシ胎仔血清、１ｘの抗生物質−抗真菌剤、１ｘのピルビン酸ナトリウム、１ｘの非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン）中３７℃、５％のＣＯ2でヒト胎児腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ−２９３Ｔ）を培養する。プロトコールの再現性のために、異なるロット／バッチにスイッチした場合の仔ウシ血清を試験することが推奨される。レンチウイルス製造のために６つまでの１５ｃｍプレートが必要とされる。
低継代細胞を使用して新たな培養を開始する（継代２０未満）。細胞が９０〜９５％の密集度に達したら、培地を吸引し、無菌の１ｘのＰＢＳを用いて穏やかに洗浄する。
２ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％）を加え、３７℃で３〜５分間インキュベートする。解離試薬を不活性化するために、８ｍＬの完全高グルコースＤＭＥＭを加え、１０ｍＬの血清学的ピペットを用いて１０〜１５回ピペッティングして４ｘ１０6細胞／ｍＬの単一細胞懸濁液を作製する。
【０１５６】
トランスフェクションのために、０．２％のゼラチンで１５ｃｍプレートをコーティングする。２２．５ｍＬの高グルコース培地を加え、２．５ｍＬの細胞懸濁液（合計で約１×１０７細胞／プレート）を加えることにより細胞を播種する。７０〜８０％の密集度に達するまで５％のＣＯ2と共に３７℃でプレートをインキュベートする。
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のトランスフェクト  −  ３５にしたがって２ｘのＢＥＳ緩衝化溶液ＢＢＳおよび１ＭのＣａＣｌ2を調製する。０．２２μＭのフィルターに通すことにより溶液を濾過し、４℃で貯蔵する。トランスフェクションミックスは、細胞への添加前に透明である必要がある。ミックスがインキュベーションの間に濁った場合、新鮮な２ｘのＢＢＳ（ｐＨ＝６．９５）を調製する。
【０１５７】
プラスミドミックスを調製するために、列記されるような４つのプラスミドを使用する（以下のミックスは１つの１５ｃｍプレートのために十分である：３７．５μｇのＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９移入ベクター（ｐＢＫ４９２（ＤＮＭＴ３Ａ−ＰＵＲＯ−無ｇＲＮＡまたはｐＢＫ５３９、ＤＮＭＴ３Ａ−ＧＦＰ−無ｇＲＮＡ；２５μｇのｐＢＫ２４０（ｐｓＰＡＸ２）；１２．５μｇのｐＭＤ２．Ｇ；６．２５μｇのｐＲＳＶ−ｒｅｖ（図２６Ａ）。濃度に基づいてプラスミドの容量を算出し、１５ｍｌコニカルチューブに必要な量を加える。３１２．５μＬの１Ｍ  ＣａＣｌ２を加え、無菌ｄｄ−Ｈ2Ｏを使用して１．２５ｍＬの最終容量とする。ミックスをボルテックスしながら１．２５ｍＬの２ｘのＢＢＳ溶液を穏やかに加える。室温で３０分間インキュベートする。７０〜８０％コンフルエントになったら細胞はトランスフェクションのために準備済みである。
【０１５８】
培地を吸引し、血清を含まない２２．５ｍＬの新鮮に調製された高グルコースＤＭＥＭで置き換える。２．５ｍＬのトランスフェクション混合物を各１５ｃｍプレートに滴下で加える。プレートをスワールし、３７℃で５％のＣＯ２と共に２〜３時間インキュベートする。
３時間後、プレート当たり２．５ｍＬ（１０％）の血清を加え、３７℃、５％のＣＯ2で終夜インキュベートする。
トランスフェクション後１日目  −  トランスフェクション後１ｄ、細胞を観察して、細胞死がないまたは最小であること、および細胞がコンフルエントな培養物（１００％）を形成したことを確実にする。２５ｍＬの新鮮に調製された高グルコースＤＭＥＭ＋１０％の血清を各プレートを加えることにより培地を変更する。
３７℃、５％のＣＯ2で４８時間インキュベートする。
ウイルスの回収  −  全てのトランスフェクトされた細胞から上清を収集し、５０ｍＬコニカルチューブにプールする。４００〜４５０×ｇで１０分間遠心分離する。０．４５μｍの真空フィルターユニットを通じて上清を濾過する。濾過後、短期間の貯蔵（４日まで）のために上清を４℃で保つことができる。長期貯蔵のために、アリコートを調製し、アリコートを−８０℃で貯蔵する。
【０１５９】
注記：非濃縮ウイルス調製物は、約２〜３×１０7ｖｕ／ｍＬであることが予期される（力価決定について本明細書を参照）。複数の凍結解凍サイクルは機能力価の１０〜２０％の損失を結果としてもたらすので、単回使用アリコートを調製することが非常に推奨される。
ウイルス粒子の濃縮  −  注記：精製のために、スクロース勾配ステップおよびスクロースクッションステップを伴う２ステップ二重スクロース法が行われる（図２６Ｂ）。
スクロース勾配を作製するために、以下の順序でコニカル超遠心分離チューブを調製する：１ｘのＰＢＳ中の７０％のスクロース０．５ｍＬ、ＤＭＥＭ中の６０％のスクロース０．５ｍＬ、ＤＭＥＭ中の３０％のスクロース１ｍＬ、１ｘのＰＢＳ中の２０％のスクロース２ｍＬ。
慎重に、ステップ１．４において収集した上清を勾配に加える。４つの１５ｃｍプレートから収集される総容量は１００ｍＬであるので、６つの超遠心分離チューブを使用してウイルス上清を処理する。
【０１６０】
各超遠心分離チューブの間でウイルス上清を均等に分配する。遠心分離の間のチューブの破壊を回避するために、総体積容量の少なくとも４分の３まで超遠心分離チューブを満たす。チューブの残余に１ｘのＰＢＳを入れる。試料を１７℃で２時間７００００×ｇで遠心分離する。
注記：加速および減速ステップの間にスクロース層を維持するために、スピンの最初および最後の３分間に遠心分離機によりローターをそれぞれ０から２００ｇへおよび２００ｇから０へと緩徐に加速および減速させる。
３０〜６０％のスクロース画分をきれいなチューブに穏やかに収集する。１ｘの（冷）ＰＢＳを１００ｍＬの総容量まで加える。複数回ピペッティングすることにより混合する。
【０１６１】
慎重に、４ｍＬの２０％のスクロース（１ｘのＰＢＳ中）をチューブに加えることにより、スクロースクッション上にウイルス調製物を層化する。各チューブ当たり約２０〜２５ｍＬのウイルス溶液をピペッティングすることにより継続する。チューブの容量が４分の３未満の場合、１ｘのＰＢＳで満たす。慎重にチューブの残余を満たす。１７℃で２時間７００００×ｇで遠心分離する。上清を削除し、ペーパータオル上でチューブを反転させて残りの溶液を流す。
【０１６２】
残りの液体を注意して吸引することにより全ての液体を取り出す。このステップにおいて、ウイルスを含有するペレットは小さい半透明のスポットとしてかろうじて見える。７０μＬの１ｘのＰＢＳを第１のチューブに加えてペレットを再懸濁する。懸濁液を徹底的にピペッティングし、全てのペレットが再懸濁されるまでそれを次のチューブに移す。
追加の５０μＬの１ｘのＰＢＳを用いてチューブを洗浄し、以前のように混合する。このステップにおいて、最終懸濁液の容量は約１２０μＬであり、わずかに乳濁して見える。透明な懸濁液を得るために、１００００×ｇでの６０秒の遠心分離を行う。上清を新たなチューブに移し、５μＬのアリコートを作製し、それらを−８０℃で貯蔵する。
注記：レンチウイルスベクター調製物は、凍結および解凍の繰返しのサイクルに敏感である。追加的に、残りのステップは組織培養封じ込め、または十分なレベルの生物学的安全基準にあるという点で適格の指摘された区画において行われることが示唆される。（図２６Ｂ）。
【０１６３】
ウイルス力価の定量化  −  注記：ウイルス力価の推定は、ｐ２４酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法（ｐ２４ｇａｇ  ＥＬＩＳＡ）を使用し、わずかな改変と共にＨＩＶ−１  ｐ２４  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ａｓｓａｙ用のＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｇｒａｍプロトコールにしたがって行われる。
１ｘの冷ＰＢＳ中の０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）２００μＬを使用して９６ウェルプレートのウェルを３回洗浄する。
プレートをコーティングするために、１ｘのＰＢＳ中に１：１５００で希釈された１００μＬのモノクローナル抗ｐ２４抗体を使用する。プレートを４℃で終夜インキュベートする。
ブロッキング試薬（１ｘのＰＢＳ中の１％のＢＳＡ）を調製し、非特異的結合を回避するために各ウェルに２００μＬを加える。２００μＬのＰＢＳ−Ｔを使用して室温で少なくとも１時間３回ウェルを洗浄する。
試料調製の処理：濃縮されたベクター調製物を用いる作業の場合、１μＬの試料、８９μＬのｄｄ−Ｈ２０、および１０μＬのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１０％の最終濃度）を使用することによりベクターを１：１００に希釈する。非濃縮調製物について、試料を１：１０に希釈する。
２倍の段階希釈（開始濃度は５ｎｇ／ｍＬ）を使用することによりＨＩＶ−１標準物質を得る。
【０１６４】
０．２％のＴｗｅｅｎ２０および１％のＢＳＡを添加したＲＰＭＩ１６４０中に（ステップ１．６．４において調製された）濃縮試料を希釈して１：１００００、１：５００００、および１：２５００００の希釈液を得る。同様に、０．２％のＴｗｅｅｎ２０および１％のＢＳＡを添加したＲＰＭＩ１６４０中に（ステップ１．６．４において調製された）非濃縮試料を希釈して１：５００、１：２５００、および１：１２５００の希釈液を確立する。
試料および標準物質をプレートに３連で加える。４℃で終夜インキュベートする。
翌日、ウェルを６回洗浄する。
ＲＰＭＩ１６４０中に１：１０００で希釈された１００μＬのポリクローナルウサギ抗ｐ２４抗体、１０％のＦＢＳ、０．２５％のＢＳＡ、および２％の正常マウス血清（ＮＭＳ）を加え、３７℃で４時間インキュベートする。
【０１６５】
ウェルを６回洗浄する。５％の正常ヤギ血清、２％のＮＭＳ、０．２５％のＢＳＡ、および０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＲＰＭＩ１６４０中に１：１００００で希釈されたヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼＩｇＧを加える。３７℃で１時間インキュベートする。
ウェルを６回洗浄する。ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を加え、室温で１５分間インキュベートする。
反応を停止させるために、１００μＬの１Ｎ  ＨＣＬを加える。マイクロプレートリーダーにおいて、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
蛍光レポーター強度の測定  −  ウイルス懸濁液を使用して１ｘのＰＢＳ中の１０倍の段階希釈液（１０-1〜１０-5）を得る。
６ウェルプレートの各ウェルに５×１０5のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をプレーティングする。１０μＬの各ウイルス希釈液を細胞に適用し、３７℃、５％のＣＯ2で４８時間インキュベートする。
【０１６６】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析は以下のように進める：２００μＬの０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を加えることにより細胞を剥離する。細胞を３７℃で５分間インキュベートし、それを２ｍＬのＤＭＥＭ培地（血清を含む）に再懸濁する。試料を１５ｍＬコニカルチューブに収集し、４℃で４００ｇにおいて遠心分離する。５００μＬの１ｘの冷ＰＢＳにペレットを再懸濁する。
５００μｌの４％のＰＦＡを加えることにより細胞を固定し、室温で１０分間インキュベートする。
４℃で４００ｇにおいて遠心分離し、１ｍＬの１ｘのＰＢＳにペレットを再懸濁する。ＦＡＣＳ機器を使用してＧＦＰ発現を解析する。
ウイルス機能力価を決定するために、以下の式を使用する。
形質導入単位（ＴＵ）／ｍＬ＝Ｔｇ／Ｔｎ×Ｎ×１０００／Ｖ
Ｔｇ＝ＧＦＰ陽性細胞数；Ｔｎ＝細胞の総数；Ｎ＝形質導入された細胞の総数；Ｖ＝形質導入のために使用された容量（μＬ）。
ＧＦＰ陽性細胞をカウントする  −  注記：形質導入のために用いられる多重感染度（ＭＯＩ）を決定する。広範囲のＭＯＩ（ＭＯＩ＝１〜ＭＯＩ＝１０）を試験する。
６ウェルプレートの各ウェル当たり３〜４×１０5のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を播種する。
細胞が＞８０％の密集度に達した場合、目的のＭＯＩでベクターを形質導入する。
３７℃、５％のＣＯ2でインキュベートし、細胞中のＧＦＰシグナルを１〜７日間モニターする。
【０１６７】
ＧＦＰ陽性細胞数をカウントする。ＧＦＰフィルターを使用して蛍光顕微鏡（ＰＬＡＮ  ４Ｘの対物レンズ、０．１Ｎ．Ａ、４０Ｘの倍率）を用いる（励起波長：４７０ｎｍ、発光波長：５２５ｎｍ）。非形質導入細胞を使用してＧＦＰ陰性細胞の対照集団を設定する。
以下の式を用いてウイルスの機能力価を決定する。
形質導入単位（ＴＵ）／ｍＬ＝（Ｎ）×（Ｄ）×（Ｍ）×Ｖ
【０１６８】
注記：Ｎ＝ＧＦＰ陽性細胞数、Ｄ＝希釈係数、Ｍ＝倍率係数、Ｖ＝形質導入のために使用されたウイルスの容量。算出のためにこの実施例にしたがって結果を算出する：１０μＬの試料（Ｖ）中の２０×の倍率（Ｍ）での１０-4（１：１００００）の希釈（Ｄ）においてカウントされた１０のＧＦＰ陽性細胞（Ｎ）について、ＴＵ／ｍＬは（１０×１０4）×（２０）×（１０）×（１００）＝２×１０8ｖｕ／ｍＬとなる。
ＭＤ  ＮＰＣの分化
ｈｉＰＳＣの培養  −  注記：ＳＮＣＡ遺伝子座の三重化を有する患者からのヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ＮＤ３４３９１は、ＮＩＮＤＳカタログから得た（表６を参照）。
【０１６９】
ｈＥＳＣ適格塩基性マトリックス膜（ＢＭＭ）コーティングプレート（表６を参照）上のフィーダーフリーＥＳＣ−ｉＰＳＣ培養培地（表６を参照）中でフィーダー非依存条件下でｈｉＰＳＣを培養する。１ｍＬのＤＭＥＭ−Ｆ１２を用いてコンフルエントなコロニーを洗浄し、１ｍＬの解離試薬（表６を参照）を加え、室温で３分間インキュベートする。
解離試薬を吸引し、１ｍＬのフィーダーフリーＥＳＣ−ｉＰＳＣ培養培地を加える。
セルリフターを使用してプレートを掻爬し、ホウケイ酸ピペットを使用して４〜５回ピペッティングすることにより１１ｍＬのフィーダーフリーＥＳＣ−ｉＰＳＣ培養培地にコロニーを再懸濁する。
ＢＭＭコーティングプレートに２ｍＬのコロニー懸濁液をプレーティングし、３７℃、５％のＣＯ2にプレートを置く。培地交換を１日毎に行い、５〜７日毎に細胞を継代する。
【０１７０】
ＭＤ  ＮＰＣへの分化  −  注記：ドパミン作動性神経前駆細胞（ＭＤ  ＮＰＣ）へのｈｉＰＳＣの分化は、わずかな改変と共に製造者の説明書の通りに市販の神経誘導培地プロトコールを使用して行った（表６を参照）。分化の最初の日を０日目と考える。高品質ｈｉＰＳＣが効率的な神経分化のために必要とされる。ＭＤ  ＮＰＣの誘導は、胚様体（ＥＢ）ベースのプロトコールを使用して行った。
ｈｉＰＳＣの分化を開始する前に、製造者の説明書にしたがってマイクロウェル培養プレート（表６を参照）を調製する。
マイクロウェル培養プレートの調製後、１０μＭのＹ−２７６３２を添加した１ｍＬの神経誘導培地（ＮＩＭ、表６を参照）を加える。
使用の準備ができるまでプレートをそのままにする。
ＤＭＥＭ−Ｆ１２を用いてｈｉＰＳＣを洗浄し、１ｍＬの細胞剥離溶液（表６を参照）を加え、３７℃、５％のＣＯ2で５分インキュベートする。
ＤＭＥＭ−Ｆ１２に単一細胞を再懸濁し、３００ｇで５分間遠心分離する。
上清を慎重に吸引し、ＮＩＭ＋１０μＭのＹ−２７６３２に細胞を再懸濁して３×１０6細胞／ｍＬの最終濃度を得る。
マイクロウェル培養プレートの単一のウェルに１ｍＬの単一細胞懸濁液を加え、１００ｇで３分間プレートを遠心分離する。
顕微鏡下でプレートを検査して、マイクロウェルの間の細胞の均等な分布を確実にし、３７℃、５％のＣＯ2で細胞をインキュベートする。
１日目〜４日目：１日毎に部分的な培地交換を行う。
１ｍＬのマイクロピペットを使用して、１．５ｍＬの培地を取り出し、廃棄する。Ｙ−２７６３２を含まない１．５ｍＬの新鮮なＮＩＭを緩徐に加える。
４日目までステップ２．２．１０を繰り返す。
５日目：６ウェルプレートの１つのウェルをＢＭＭでコーティングする。
３７μｍのリバーシブルストレーナー（表６を参照）を５０ｍＬコニカルチューブの上に置く（廃棄物）。リバーシブルストレーナーの矢印を上に向ける。
形成されたＥＢを妨害することなくマイクロウェル培養プレートから培地を除去する。
１ｍＬのＤＭＥＭ−Ｆ１２を加え、ホウケイ酸ピペットを用いてＥＢを迅速に収集し、ストレーナーを通じて濾過する。
全てのＥＢがマイクロウェル培養プレートから取り出されるまでステップを繰り返す。
新たな５０ｍＬコニカルチューブ上でストレーナーを反転させ、２ｍＬのＮＩＭを加えて全てのＥＢを収集する。
ホウケイ酸ピペットを使用してＢＭＭコーティングプレートの単一のウェルに２ｍＬのＥＢ懸濁液を入れる。３７℃、５％のＣＯ2でＥＢをインキュベートする。
６日目：２ｍＬのＮＩＭ＋２００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨ（材料の表を参照）を調製し、１日毎に培地交換を行う。
８日目：ニューロン誘導のパーセンテージを調べる。
【０１７１】
全ての接着したＥＢをカウントし、神経ロゼットで満たされた各個々のＥＢの数を具体的に決定する。以下の式を使用して神経ロゼット誘導を定量化する：
【数２】
2021523696.tif 000014
注記：神経誘導が＜７５％の場合、神経ロゼット選択は非効率的なことがある。
【０１７２】
１２日目：以下のように２５０ｍＬのＮ２Ｂ２７培地を調製する：１１９ｍＬの神経基礎培地、１１９ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、２．５ｍＬのＧｌｕｔａｍａｘ、２．５ｍＬのＮＥＡＡ、２．５ｍＬのＮ２サプリメント、ビタミンＡを含まない５ｍＬのＢ２７、２５０μＬのゲンタマイシン５０ｍｇ／ｍＬ、１９．６６？ｌのＢＳＡ  ７ｍｇ／ｍＬ。
５０ｍＬの完全Ｎ２Ｂ２７培地を調製するために、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、２μＭのＳＢ４３１５４２、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、および２００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨを加える。
注記：完成した培地を使用の直前に調製することが重要である。
神経ロゼットを含有するウェルから培地を吸引し、１ｍＬのＤＭＥＭ−Ｆ１２を用いて洗浄する。
１ｍＬの神経ロゼット選択試薬（表６を参照）を加え（ａｄ）、３７℃、５％のＣＯ2で１時間インキュベートする。
選択試薬を除去し、１ｍＬのピペッターを使用してロゼットクラスターに直接狙いを定める。
１５ｍＬコニカルチューブに懸濁液を加え、神経ロゼットクラスターの大部分が収集されるまで繰り返す（選択試薬を除去し、１ｍＬのピペッターを使用してロゼットクラスターに直接狙いを定め、標準的なチューブに加える）。
注記：非ニューロン細胞種を含む夾雑物を回避するために、過剰選択しないようにする。
【０１７３】
ロゼット懸濁液を３５０ｇで５分間遠心分離する。上清を吸引し、Ｎ２Ｂ２７＋２００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨに神経ロゼットを再懸濁する。神経ロゼット懸濁液をＢＭＭコーティングウェルに加え、プレートを３７℃、５％のＣＯ2でインキュベートする。
１３日目〜１７日目：完全Ｎ２Ｂ２７培地を使用して１日毎に培地交換を行う。培養物が８０〜９０％の密集度の場合、細胞を継代する。
細胞を継代するために、ＢＭＭコーティングプレートを調製する。
１ｍＬのＤＭＥＭ−Ｆ１２を用いて細胞を洗浄し、培地を吸引し、１ｍＬの解離試薬（表６を参照）を加える。
３７℃で５分間インキュベートし、１ｍＬのＤＭＥＭ−Ｆ１２を加え、上下にピペッティングすることにより接着した細胞を取り外す。ＮＰＣ懸濁液を１５ｍＬコニカルチューブに収集する。３００ｇで５分間遠心分離する。
上清を吸引し、１ｍＬの完全Ｎ２Ｂ２７＋２００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨに細胞を再懸濁する。
細胞をカウントし、１．２５×１０5細胞／ｃｍ2の密度でプレーティングし、３７℃、５％のＣＯ2で細胞をインキュベートする。
完全Ｎ２Ｂ２７＋２００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨを使用して一日おきに培地を交換する。
注記：この継代において、ＮＰＣを継代Ｐ０と考える。ＳＨＨはＰ２においてＮ２Ｂ２７培地から取り去ることができる。
細胞が８０〜９０％の密集度に達したら継代する。
このステージにおいて、免疫細胞化学およびｑＰＣＲを使用することにより細胞がネスチンおよびＦｏｘＡ２マーカーを発現することを確認する。このプロトコールは、ネスチンおよびＦｏｘＡ２マーカーについて８５％の二重陽性細胞の生成に繋がる。
【０１７４】
細胞を継代するために、段落［００３１８］〜［００３２４］におけるステップを繰り返す。継代Ｐ２から開始して細胞を凍結する。細胞を凍結するために、ステップ２．［００３１８］〜［００３２４］を繰り返し、冷却した神経前駆体凍結培地（表６を参照）を使用して２〜４×１０6細胞／ｍＬで細胞ペレットを再懸濁する。
１ｍＬの細胞懸濁液を各クライオバイアルに移し、標準的な低速制御冷却システムを使用して細胞を凍結する。長期貯蔵のために、細胞を液体窒素中に保つ。
ＭＤ  ＮＰＣの解凍  −  ＢＭＭコーティングプレートを調製し、完全Ｎ２Ｂ２７を温める。１０ｍＬの温ＤＭＥＭ−Ｆ１２を１５ｍＬコニカルチューブに加える。クライオバイアルを３７℃のヒートブロックに２分間置く。
細胞をクライオバイアルからＤＭＥＭ−Ｆ１２を含有するチューブに移す。３００ｇで５分間遠心分離する。
上清を吸引し、２ｍＬのＮ２Ｂ２７に細胞を再懸濁し、細胞懸濁液をＢＭＭコーティングプレートの１つのウェルに加える。３７℃、５％のＣＯ2で細胞をインキュベートする。
【０１７５】
ＭＤ  ＮＰＣの形質導入およびメチル化変化の解析。
ＭＤ  ＮＰＣの形質導入。
７０％の密集度のＭＤ  ＮＰＣにＬＶ−ｇＲＮＡ／ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａベクターを多重感染度（ＭＯＩ）＝２で形質導入する。形質導入の１６時間後にＮ２Ｂ２７培地を交換する。
形質導入の４８時間後に１〜５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを添加したＮ２Ｂ２７培地を加えて安定なＭＤ  ＮＰＣ株を得る。細胞は下流の応用（本明細書に記載されるようなＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質解析、および表現型の特徴付け、凍結および継代）のために準備済みである。
ＭＤ  ＮＰＣの分化。本明細書に記載のＥＢベースのプロトコールはＭＤ  ＮＰＣの分化を可能とする。Tagliafierro, L., et al., J. Vis. Exp. 2019 Mar 29: 145を参照。この分化プロトコールは、ネスチンおよびＦＯＸＡ２マーカーについて二重陽性の細胞を８３．３％で製造し、これらの細胞の分化の成功を裏付ける。
【０１７６】
ＳＮＣＡイントロン１メチル化プロファイルのためのパイロシークエンシングアッセイの検証。ＳＮＣＡイントロン１中のＤＮＡメチル化状態を評価するために７つのパイロシークエンシングアッセイを確立した。Kantor et al., Mol. Ther. 2018; Nov. 7:26(11): 2638-2649を参照。Ｃｈｒ４：８９，８３６，１５０〜８９，８３６，５９３（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）領域は２３のＣｐＧを含有する。非メチル化（Ｕ）およびメチル化（Ｍ）バイサルファイト変換ＤＮＡの異なる混合物を標準物質として使用して、設計したアッセイを線形性について検証した。混合物を以下の比で使用した：１００Ｕ：０Ｍ、７５Ｕ：２５Ｍ、５０Ｕ：５０Ｍ、２５Ｕ：７５Ｍ、０Ｕ：１００Ｍ。７つ全てのアッセイを検証したところ、線形の相関Ｒ２＞０．９３を示した）。検証したアッセイを使用して、ｇＲＮＡ  １〜４のベクターで処理したおよび処理しなかったＳＮＣＡイントロン１中の２３のＣｐＧにおけるメチル化レベルを決定することができた（図３）。
以上の詳細な説明および付随する実施例は単に実例的なものであり、添付の特許請求の範囲およびその均等によってのみ定義される本発明の範囲に対する限定として解釈されるべきではないことが理解される。
【０１７７】
開示される実施形態に対する様々な変更および修飾は当業者に明らかである。本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、配合物、または使用方法に関するものが挙げられるがそれに限定されないそのような変更および修飾が本発明の精神および範囲から離れることなく為され得る。
完全性の理由から、本発明の様々な態様が以下の番号付けされた条項に示される。
【０１７８】
条項１．ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物であって、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、またはその組合せからなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、および（ｂ）（ｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）少なくとも１つのガイドｇＲＮＡをコードする核酸配列であって、前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する、（ｂ）（ｉ）少なくとも１つのｇＲＮＡまたは（ｂ）（ｉｉ）少なくとも１つのガイドｇＲＮＡをコードする核酸配列を含む組成物。
条項２．前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する、条項１に記載の組成物。
条項３．前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域を修飾する、条項２に記載の組成物。
【０１７９】
条項４．前記少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域が、ＣｐＧ１、ＣｐＧ２、ＣｐＧ３、ＣｐＧ４、ＣｐＧ５、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１０、ＣｐＧ１１、ＣｐＧ１２、ＣｐＧ１３、ＣｐＧ１４、ＣｐＧ１５、ＣｐＧ１６、ＣｐＧ１７、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、ＣｐＧ２３、またはその組合せを含む、条項３に記載の組成物。
条項５．前記少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域が、ＣｐＧ１、ＣｐＧ３、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、またはその組合せを含む、条項３または４に記載の組成物。
条項６．前記第２のポリペプチドドメインが、メチラーゼ活性を有するペプチドを含み、かつ、前記融合タンパク質が、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域をメチル化する、条項３〜５のいずれか１項に記載の組成物。
条項７．前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その相補体、そのバリアント、またはその組合せのうちの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、条項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【０１８０】
条項８．前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン４内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化し、かつ、イントロン４内の前記標的領域が、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ１および／またはＨ３Ｋ２７Ａｃマークであってもよい、条項１に記載の組成物。
条項９．前記第２のポリペプチドドメインが、ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ３Ａ（ＤＮＭＴ３Ａ）、その機能的断片、および／またはそのバリアントを含む、条項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
条項１０．前記融合タンパク質が前記ＳＮＣＡ遺伝子の転写を抑制する、条項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
条項１１．前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性をノックアウトする少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼを含む、条項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
条項１２．前記少なくとも１つのアミノ酸突然変異がＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａのうちの少なくとも１つである、条項１１に記載の組成物。
条項１３．前記Ｃａｓタンパク質が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、条項１１または１２に記載の組成物。
条項１４．前記第２のポリペプチドドメインが、前記第１のポリペプチドドメインのＣ末端、Ｎ末端、または両方に融合している、条項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
条項１５．核局在配列をさらに含む、条項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
条項１６．前記第１のポリペプチドドメインを前記第２のポリペプチドドメインに接続するリンカーをさらに含む、条項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
条項１７．前記第２のポリペプチドドメインが配列番号１１のアミノ酸配列を含む、条項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
条項１８．前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸配列を含む、条項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
条項１９．前記融合タンパク質が、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、条項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【０１８１】
条項２０．（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉｉ）、（ａ）（ｉ）および（ｂ）（ｉ）、（ａ）（ｉ）および（ｂ）（ｉｉ）、もしくは（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉ）のいずれかを対象に投与することを含む、またはいずれかが対象中に提供される、条項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
条項２１．（ａ）（ｉｉ）および／または（ｂ）（ｉｉ）の核酸がＤＮＡまたはＲＮＡを含む、条項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
条項２２．（ａ）および（ｂ）の一方または両方がウイルスベクター中にパッケージングされている、条項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
条項２３．（ａ）および（ｂ）が同じウイルスベクター中にパッケージングされている、条項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
条項２４．前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターを含む、条項２２または２３に記載の組成物。
【０１８２】
条項２５．前記ウイルスベクターがエピソーム性インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）またはエピソーム性インテグラーゼコンピテントレンチウイルスベクター（ＩＣＬＶ）を含む、条項２２〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
条項２６．前記ウイルスベクターが、複数のプロモーター、ｐ２ａ、ｔ２ａ、ＩＲＥＳ、またはその組合せを含むポリシストロン性タンパク質組成物を含む、条項２２〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
条項２７．条項１〜２６のいずれか１に記載の組成物をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
条項２８．条項２７に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
条項２９．ウイルスベクターである、条項２８に記載のベクター。
条項３０．前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、条項２８または２９に記載のベクター。
条項３１．前記ウイルスベクターがエピソーム性インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）またはエピソーム性インテグラーゼコンピテントレンチウイルスベクター（ＩＣＬＶ）である、条項２８〜３０のいずれか１項に記載のベクター。
条項３２．条項２７に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは条項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
条項３３．条項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物、条項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド、条項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクター、条項３２に記載の宿主細胞、またはその組合せのうちの少なくとも１つを含む医薬組成物。
条項３４．条項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物、条項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド、条項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクター、またはその組合せのうちの少なくとも１つを含むキット。
【０１８３】
条項３５．細胞または対象におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現のｉｎ  ｖｉｖｏモジュレーションの方法であって、条項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物、条項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド、条項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクター、条項３３に記載の医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つを、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で前記細胞または対象と接触させることを含む方法。
【０１８４】
条項３６．対象においてＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を治療する方法であって、条項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物、条項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド、条項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクター、条項３３に記載の医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つを前記対象または前記対象中の細胞に投与することを含む方法。
【０１８５】
条項３７．細胞または対象におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現をｉｎ  ｖｉｖｏでモジュレートする方法であって、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、ならびに（ｂ）（ｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合分子を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で前記細胞または対象と接触させることを含む方法。
【０１８６】
条項３８．対象においてＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を治療する方法であって、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、ならびに（ｂ）（ｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合分子を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合分子を標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で前記対象または前記対象中の細胞に投与することを含む方法。
条項３９．前記少なくとも１つのｇＲＮＡまたは前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列が、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する、条項３７または３８に記載の方法。
条項４０．前記融合タンパク質が、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域を修飾する、条項３９に記載の方法。
【０１８７】
条項４１．前記少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域が、ＣｐＧ１、ＣｐＧ２、ＣｐＧ３、ＣｐＧ４、ＣｐＧ５、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１０、ＣｐＧ１１、ＣｐＧ１２、ＣｐＧ１３、ＣｐＧ１４、ＣｐＧ１５、ＣｐＧ１６、ＣｐＧ１７、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、ＣｐＧ２３、またはその組合せを含む、条項４０に記載の方法。
条項４２．前記少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域が、ＣｐＧ１、ＣｐＧ３、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、またはその組合せを含む、条項４０または４１に記載の方法。
条項４３．前記第２のポリペプチドドメインが、メチラーゼ活性を有するペプチドを含み、かつ、前記融合タンパク質が、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域をメチル化する、条項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
条項４４．前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その相補体、そのバリアント、またはその組合せのうちの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、条項３７〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【０１８８】
条項４５．前記少なくとも１つのｇＲＮＡまたは前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列が、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン４内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化し、かつ、イントロン４内の前記標的領域が、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ１および／またはＨ３Ｋ２７Ａｃマークであってもよい、条項３７または３８に記載の方法。
条項４６．前記第２のポリペプチドドメインが、ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ３Ａ（ＤＮＭＴ３Ａ）、その機能的断片、および／またはそのバリアントを含む、条項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
条項４７．前記融合タンパク質が前記ＳＮＣＡ遺伝子の転写を抑制する、条項３７〜４６のいずれか１項に記載の方法。
条項４８．前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性をノックアウトする少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼを含む、条項３７〜４７のいずれか１項に記載の方法。
条項４９．前記少なくとも１つのアミノ酸突然変異がＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａのうちの少なくとも１つである、条項４８に記載の方法。
条項５０．前記Ｃａｓタンパク質が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、条項４８または４９に記載の方法。
条項５１．前記第２のポリペプチドドメインが、前記第１のポリペプチドドメインのＣ末端、Ｎ末端、または両方に融合している、条項３７〜５０のいずれか１項に記載の方法。
条項５２．核局在配列をさらに含む、条項３７〜５１のいずれか１項に記載の方法。
条項５３．前記第１のポリペプチドドメインを前記第２のポリペプチドドメインに接続するリンカーをさらに含む、条項３７〜５２のいずれか１項に記載の方法。
条項５４．前記第２のポリペプチドドメインが配列番号１１のアミノ酸配列を含む、条項３７〜５３のいずれか１項に記載の方法。
条項５５．前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸配列を含む、条項３７〜５４のいずれか１項に記載の方法。
条項５６．前記融合タンパク質が、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、条項３７〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【０１８９】
条項５７．（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉｉ）、（ａ）（ｉ）および（ｂ）（ｉ）、（ａ）（ｉ）および（ｂ）（ｉｉ）、もしくは（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉ）のいずれかを前記対象に投与することを含む、またはいずれかが前記対象中に提供される、条項３７〜５６のいずれか１項に記載の方法。
条項５８．（ａ）（ｉｉ）および／または（ｂ）（ｉｉ）の核酸がＤＮＡまたはＲＮＡを含む、条項３７〜５７のいずれか１項に記載の方法。
条項５９．（ａ）および（ｂ）の一方または両方がウイルスベクター中にパッケージングされている、条項３７〜５８のいずれか１項に記載の方法。
条項６０．（ａ）および（ｂ）が同じウイルスベクター中にパッケージングされている、条項３７〜５９のいずれか１項に記載の方法。
条項６１．前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターを含む、条項５９または６０に記載の方法。
条項６２．前記ウイルスベクターがエピソーム性インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）またはエピソーム性インテグラーゼコンピテントレンチウイルスベクター（ＩＣＬＶ）を含む、条項５９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
条項６３．前記細胞がＳＮＣＡ遺伝子三重化（ＳＮＣＡ−Ｔｒｉ）を含み、ＳＮＣＡのレベルが、ＳＮＣＡ−Ｔｒｉを有しない対照細胞における生理学的レベルと比較して上昇している、条項３５〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【０１９０】
条項６４．前記ＳＮＣＡレベルが、（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉｉ）、（ａ）（ｉ）および（ｂ）（ｉ）、（ａ）（ｉ）および（ｂ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉ）のいずれか１つを前記対象または前記対象中の細胞に投与または提供した後に生理学的レベルに低減される、条項６３に記載の方法。
条項６５．前記ＳＮＣＡ遺伝子の発現が少なくとも２０％低減される、条項３５〜６４のいずれか１項に記載の方法。
条項６６．前記ＳＮＣＡ遺伝子の発現が少なくとも９０％低減される、条項３５〜６５のいずれか１項に記載の方法。
条項６７．α−シヌクレインのレベルが少なくとも２５％低減される、条項３５〜６６のいずれか１項に記載の方法。
条項６８．α−シヌクレインのレベルが少なくとも３６％低減される、条項３５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
条項６９．ミトコンドリアスーパーオキシド産生が少なくとも２５％低減され、かつ／または、細胞生存能力が少なくとも１．４倍に増加する、条項３５〜６８のいずれか１項に記載の方法。
条項７０．前記疾患または障害が神経変性障害である、条項３６または３８〜６９のいずれか１項に記載の方法。
条項７１．前記神経変性障害がＳＮＣＡ関連疾患または障害である、条項７０に記載の方法。
条項７２．前記神経変性障害がシヌクレイン病である、条項７０または７１に記載の方法。
条項７３．前記神経変性障害がパーキンソン病またはレビー小体を伴う認知症である、条項７０〜７２のいずれか１項に記載の方法。
条項７４．前記細胞が、ドパミン作動性（腹側中脳）神経前駆細胞（ＭＤ  ＮＰＣ）、中脳ドパミン作動性ニューロン（ｍＤＡ）または前脳基底部コリン作動性ニューロン（ＢＦＣＮ）である、条項３５〜７３のいずれか１項に記載の方法。
条項７５．前記対象が哺乳動物である、条項３５〜７４のいずれか１項に記載の方法。
条項７６．前記対象がヒトまたはマウス対象である、条項３５〜７５のいずれか１項に記載の方法。
条項７７．前記ウイルスベクターが、複数のプロモーター、ｐ２ａ、ｔ２ａ、ＩＲＥＳ、またはその組合せを含むポリシストロン性タンパク質組成物を含む、条項３５〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【０１９１】
条項７８．エピゲノム（ｅｐｉｇｅｎｅｍｉｃ）編集用のウイルスベクターシステムであって、（ａ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、核酸配列、ならびに（ｂ）ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸配列を含むウイルスベクターシステム。
条項７９．前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する、条項７８に記載のウイルスベクターシステム。
条項８０．前記融合タンパク質が、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域を修飾する、条項７９に記載のウイルスベクターシステム。
【０１９２】
条項８１．前記少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域が、ＣｐＧ１、ＣｐＧ２、ＣｐＧ３、ＣｐＧ４、ＣｐＧ５、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１０、ＣｐＧ１１、ＣｐＧ１２、ＣｐＧ１３、ＣｐＧ１４、ＣｐＧ１５、ＣｐＧ１６、ＣｐＧ１７、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、ＣｐＧ２３、またはその組合せを含む、条項８０に記載のウイルスベクターシステム。
条項８２．前記少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域が、ＣｐＧ１、ＣｐＧ３、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、またはその組合せを含む、条項８０または８１に記載のウイルスベクターシステム。
【０１９３】
条項８３．前記第２のポリペプチドドメインが、メチラーゼ活性を有するペプチドを含み、かつ、前記融合タンパク質が、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域をメチル化する、条項８０〜８２のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
条項８４．前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その相補体、そのバリアント、またはその組合せのうちの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、条項７８〜８３のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
【０１９４】
条項８５．前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン４内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化し、かつ、イントロン４内の前記標的領域が、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ１および／またはＨ３Ｋ２７Ａｃマークであってもよい、条項７８に記載のウイルスベクターシステム。
条項８６．前記第２のポリペプチドドメインが、ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ３Ａ（ＤＮＭＴ３Ａ）、その機能的断片、および／またはそのバリアントを含む、条項７８〜８５のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
条項８７．前記第２のポリペプチドドメインが配列番号１１のアミノ酸配列を含む、条項７８〜８６のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
条項８８．前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性をノックアウトする少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼを含む、条項７８〜８７のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
条項８９．前記少なくとも１つのアミノ酸突然変異がＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａのうちの少なくとも１つである、条項８８に記載のウイルスベクターシステム。
条項９０．前記Ｃａｓタンパク質が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、条項８８または８９に記載のウイルスベクターシステム。
条項９１．前記第２のポリペプチドドメインが、前記第１のポリペプチドドメインのＣ末端、Ｎ末端、または両方に融合している、条項７８〜９０のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
条項９２．核局在配列をさらに含む、条項７８〜９１のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
条項９３．前記第１のポリペプチドドメインを前記第２のポリペプチドドメインに接続するリンカーをさらに含む、条項７８〜９２のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
条項９４．前記融合タンパク質が配列番号１３のアミノ酸配列を含む、条項７８〜９３のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
条項９５．前記融合タンパク質が、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、条項７８〜９４のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
条項９６．前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、条項７８〜９５のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
条項９７．前記ウイルスベクターがエピソーム性インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）またはエピソーム性インテグラーゼコンピテントレンチウイルスベクター（ＩＣＬＶ）である、条項７８〜９６のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
【０１９５】
条項９８．ＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を患う対象においてＤＮＡ損傷を逆転させる方法であって、条項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物、条項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド、条項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクター、条項３３に記載の医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つを、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で細胞または前記対象と接触させることを含む方法。
【０１９６】
条項９９．ＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を患う対象において老化に関連する異常な核をレスキューする方法であって、条項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物、条項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド、条項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクター、条項３３に記載の医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つを、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で細胞または前記対象と接触させることを含む方法。
【０１９７】
条項１００．ＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を患う対象において核真円度を増加させまたは折り畳まれた核を減少させる方法であって、条項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物、条項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド、条項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクター、条項３３に記載の医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つを、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で細胞または前記対象と接触させることを含む方法。
【０１９８】
条項１０１．ＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を患う対象においてＤＮＡ損傷を逆転させる方法であって、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、ならびに（ｂ）（ｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合分子を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で細胞または前記対象と接触させることを含む方法。
【０１９９】
条項１０２．ＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を患う対象において老化に関連する異常な核をレスキューする方法であって、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、ならびに（ｂ）（ｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合分子を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で細胞または前記対象と接触させることを含む方法。
【０２００】
条項１０３．ＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を患う対象において核真円度を増加させまたは折り畳まれた核を減少させる方法であって、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、ならびに（ｂ）（ｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合分子を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を、前記遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で細胞または前記対象と接触させることを含む方法。
条項１０４．前記ウイルスベクターが、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４０、または配列番号３９のポリヌクレオチド配列を含む、条項２２〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
条項１０５．前記ウイルスベクターが、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４０、または配列番号３９のポリヌクレオチド配列を含む、条項２８〜３１のいずれか１項に記載のベクター。
条項１０６．前記ウイルスベクターが、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４０、または配列番号３９のポリヌクレオチド配列を含む、条項５９〜６２のいずれか１項に記載の方法。
条項１０７．前記ウイルスベクターが、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４０、または配列番号３９のポリヌクレオチド配列を含む、条項７８〜９７のいずれか１項に記載のウイルスベクターシステム。
【０２０１】
付録（配列）
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓアミノ酸配列（配列番号１０）
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ＤＮＭＴ３Ａアミノ酸配列（配列番号１１）
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ＤＮＭＴ３Ａヌクレオチド配列（配列番号１２）
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ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質（ａａ配列）（配列番号１３）
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ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質（ｎｔ配列）（配列番号１４）
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ｐＢＫ５００（ｇＲＮＡ４を有するオールインワンレンチウイルスベクター）−融合タンパク質およびｇＲＮＡを含有するレンチウイルス構築物配列（配列番号３８）
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ｐＢＫ５４６完全配列、プラスミドはｐ２Ａ切断シグナルを介してピューロマイシン選択遺伝子に連結したｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ融合導入遺伝子を有した（かつてはｐＢＫ４９２ベクターとして公知（ナイーブ（無ｇＲＮＡベクター）−ｄＣａｓ９に融合したＤＮＭＴ３Ａの触媒ドメインを含有する）（配列番号３９）
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ｐＢＫ５３９完全配列、プラスミドはｐ２Ａ切断シグナルを介してＧＦＰ選択遺伝子に連結したｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ融合導入遺伝子を有した（ｎｔ配列）（配列番号４０）
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ｐＢＫ７４４完全配列、プラスミドはｐ２Ａ切断シグナルを介してＧＦＰ選択遺伝子に連結したｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ融合導入遺伝子を有した。プラスミドはラット／マウスイントロンＳｎｃａイントロン１配列を標的化するｇＲＮＡ３（図８を参照）を有した（ｎｔ配列）（配列番号４１）
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ−２Ｌ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ−４Ｇ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ−１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ−１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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