(57)【要約】  本開示は、単離されたＯＢＩ−８２１アジュバントの６つの異性体構造（ＯＢＩ−８２１−１９９０−Ｖ１Ａ、ＯＢＩ−８２１−１９９０−Ｖ１Ｂ、ＯＢＩ−８２１−１９９０−Ｖ２Ａ、ＯＢＩ−８２１−１９９０−Ｖ２Ｂ、ＯＢＩ−８２１−１８５８−Ａ、及びＯＢＩ−８２１−１８５８−Ｂ）、及びその品質を評価するための方法に関する。本開示の方法は、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）及び逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を単独で又はタンデムで採用し、結果として生じるクロマトグラフィーにおいてＯＢＩ−８２１アジュバントの異性体を分離することができる。したがって、ＯＢＩ−８２１アジュバントの品質をさらに評価することができる。
2021519329.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された下記式（Ｉ）の化合物又は医薬として許容可能なその塩：
【化１】
2021519329.tif 000018
式中、
Ｒ１は、β-Ｄ-アピオース、β-Ｄ-キシロース、又はＨから選択され、かつ、
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ又は
【化２】
2021519329.tif 000019
から選択される。
【請求項２】
Ｒ１がβ-Ｄ-アピオースであり、Ｒ２が
【化３】
2021519329.tif 000020
であり、Ｒ３がＨである、請求項１に記載の単離された化合物。
【請求項３】
Ｒ１がβ-Ｄ-アピオースであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３が
【化４】
2021519329.tif 000021
である、請求項１に記載の単離された化合物。
【請求項４】
Ｒ１がβ-Ｄ-キシロースであり、Ｒ２が
【化５】
2021519329.tif 000022
であり、Ｒ３がＨである、請求項１に記載の単離された化合物。
【請求項５】
Ｒ１がβ-Ｄ-キシロースであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３が
【化６】
2021519329.tif 000023
である、請求項１に記載の単離された化合物。
【請求項６】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２が
【化７】
2021519329.tif 000024
であり、Ｒ３がＨである、請求項１に記載の単離された化合物。
【請求項７】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３が
【化８】
2021519329.tif 000025
である、請求項１に記載の単離された化合物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された化合物の１つ又は複数と、医薬として許容可能な担体を含む、サポニン組成物。
【請求項９】
請求項８に記載のサポニン組成物であって、サポニン組成物の総質量に対して、
化合物１９９０の混合物約７５〜９０質量％、及び
化合物１８５８の混合物約１０〜２５質量％
を含み、
化合物１９９０の混合物が、化合物１９９０−Ｖ１Ａ、化合物１９９０−Ｖ１Ｂ、化合物１９９０−Ｖ２Ａ、化合物１９９０−Ｖ２Ｂ、又はそれらの混合物を含み；化合物１８５８が、化合物１８５８−Ａ、化合物１８５８−Ｂ、又はそれらの混合物を含み；
前記の化合物１９９０−Ｖ１Ａ、化合物１９９０−Ｖ１Ｂ、化合物１９９０−Ｖ２Ａ、化合物１９９０−Ｖ２Ｂ、化合物１８５８−Ａ、化合物１８５８−Ｂがそれぞれ以下の式で表される、サポニン組成物：
【化９】
2021519329.tif 000026
化合物１９９０−Ｖ１Ａ：Ｒ１がβ-Ｄ-アピオースであり、Ｒ２が
【化１０】
2021519329.tif 000027
であり、Ｒ３がＨである；
化合物１９９０−Ｖ１Ｂ：Ｒ１がβ-Ｄ-アピオースであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３が
【化１１】
2021519329.tif 000028
である；
化合物１９９０−Ｖ２Ａ：Ｒ１がβ-Ｄ-キシロースであり、Ｒ２が
【化１２】
2021519329.tif 000029
であり、Ｒ３がＨである；
化合物１９９０−Ｖ２Ｂ：Ｒ１がβ-Ｄ-キシロースであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３が
【化１３】
2021519329.tif 000030
である；
化合物１８５８−Ａ：Ｒ１がＨであり、Ｒ２が
【化１４】
2021519329.tif 000031
であり、Ｒ３がＨである；
化合物１８５８−Ｂ：Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３が
【化１５】
2021519329.tif 000032
である。
【請求項１０】
請求項９に記載のサポニン組成物であって、サポニン組成物の総質量に対して、
約４５〜６５質量％の化合物１９９０−Ｖ１Ａ；
約１９．３１〜２７．９９質量％の化合物１９９０−Ｖ２Ａ；
約０．２９〜７．７１質量％の化合物１９９０−Ｖ１Ｂ；
約０．１１〜３．１１質量％の化合物１９９０−Ｖ２Ｂ；
約１１．９４〜２１．２５質量％の化合物１８５８−Ａ；及び
約０．０６〜２．４４質量％の化合物１８５８−Ｂ
を含む、サポニン組成物。
【請求項１１】
（ａ）サポニン組成物を親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムに適用するステップ；
（ｂ）前記の親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムを移動相で溶出して、溶出液を得るステップ；及び
（ｃ）前記の溶出液のクロマトグラムを得るステップ
を含み、前記移動相がトリフルオロ酢酸水溶液及びアセトニトリルを含む、サポニン組成物の異性体組成を評価するための方法。
【請求項１２】
前記の溶出を０．１〜１０ｍＬ／分の流速で行う、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記の親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムがアミドカラムである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記クロマトグラムを紫外線検出によって得る、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記サポニン組成物が請求項８〜１０のいずれか一項に記載のサポニン組成物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）サポニン組成物を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用するステップ；
（ｂ）移動相を用いて前記の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムを溶出して溶出液を得るステップ；及び
（ｃ）前記溶出液のクロマトグラムを得るステップ、
を含み、前記移動相がトリフルオロ酢酸−水溶液及びトリフルオロ酢酸−アセトニトリル溶液を含む、サポニン組成物の純度を評価するための方法。
【請求項１７】
前記の溶出を０．１〜１０ｍＬ／分の流速で行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムが疎水性カラムである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記の疎水性カラムがＣ４カラム、Ｃ８カラム、又はＣ１８カラムである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記のクロマトグラムを紫外線検出によって得る、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記のサポニン組成物が請求項８〜１０のいずれか一項に記載のサポニン組成物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）サポニン組成物の溶液を親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムに適用するステップ；
（ｂ）第１の移動相で前記の親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムを溶出して、第１の溶出液を収集するステップ；
（ｃ）前記の第１の溶出液の画分を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用するステップ；
（ｄ）第２の移動相で前記の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムを溶出して、第２の溶出液を収集するステップ；及び
（ｅ）前記第２の溶出液のクロマトグラムを取得するステップ
を含み、
前記第１の移動相がトリフルオロ酢酸−水溶液及びアセトニトリルを含み；
前記第２の移動相がトリフルオロ酢酸−水溶液及びトリフルオロ酢酸−アセトニトリル溶液を含む、
サポニン組成物の品質を評価するための方法。
【請求項２３】
前記ステップ（ｂ）における溶出を０．１〜１０ｍＬ／分の流速で行う、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ステップ（ｄ）における溶出を０．１〜１０ｍＬ／分の流速で行う、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムがアミドカラムである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムが疎水性カラムである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記疎水性カラムがＣ４カラム、Ｃ８カラム、又はＣ１８カラムである、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、2018年3月28日に出願され、「NOVEL SAPONIN ADJUVANT」と題された米国特許仮出願第62/649,091号に基づく優先権を主張し、同特許仮出願は、あらゆる目的のためにその全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本開示は、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）の木の樹皮に由来するサポニンベースのアジュバントを開示している。それは、別のアジュバントであるＱＳ−２１について見られる説明と構造的に類似した精製されたサポニンアジュバントである。さらに、ここでの開示は、高速液体クロマトグラフィーによってサポニンの品質を評価するための方法を開示する。
【背景技術】
【０００３】
サポニンは、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮から抽出された化合物の一種である。以前の研究では、ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、及びＱＳ−２１と特定されたいくつかのサポニンが抗体レベルを劇的に高めることができることが示され、このことは、アジュバントとしてのそれらの医薬への応用を意味している（Charlotte R. Kensilら, The Journal of Immunology, Vol. 146, No. 02, 第431-437頁, 1991年）。その中でも、ＱＳ−２１はワクチンにおいてアジュバントとして実用的かつ広く使用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Charlotte R. Kensilら, The Journal of Immunology, Vol. 146, No. 02, 第431-437頁, 1991年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したことから、ここでの開示の目的は、サポニンベースのアジュバントの６つの異性体、及びそれらの異性体を分離してその純度及び／又は品質をさらに評価することができる方法を開示することである。
【０００６】
ここでの開示の別の目的は、サポニンベースのアジュバントから単離されたサポニン化合物を提供することであり、それによって医薬におけるその使用を評価でき且つ満たすことができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前述の目的を達成するために、ここでの開示は、式（Ｉ）：
【化１】
2021519329.tif 000003
の単離された化合物、又はその医薬として許容可能な塩を提供し、
上記式中、Ｒ１はβ-Ｄ-アピオース、β-Ｄ-キシロース、又は水素から選択され；Ｒ２及びＲ３は水素又は
【化２】
2021519329.tif 000004
から選択される。
【０００８】
好ましくは、前記の単離された化合物は、下の表に示した構造を有する：
【表１】
2021519329.tif 000005
【０００９】
表中、Ｒ１はアピオース、キシロース、又はＨであり、
Ｒ２及びＲ３は独立に水素又は脂肪アシル（fatty acyl）である。
【００１０】
ここでの開示はまた、前述の単離された化合物のうちの１つ以上及び医薬として許容可能な担体を含むサポニン組成物を提供する。
【００１１】
ここでの開示は、サポニン組成物の異性体組成物を評価するための方法をさらに提供し、その方法は以下のステップ：（ａ）サポニン組成物を親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムに適用するステップ；（ｂ）前記親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムを移動相で溶出して溶出液を得るステップ；及び（ｃ）前記溶出液のクロマトグラムを取得するステップ、を含み、
前記移動相は、トリフルオロ酢酸−水溶液及びアセトニトリルを含み；前記移動相中の前記トリフルオロ酢酸−水溶液の量は、０％（ｖ／ｖ）から２０％（ｖ／ｖ）まで変化し、一方で前記移動相中の前記アセトニトリルの量は３０分で８０％（ｖ／ｖ）から１００％（ｖ／ｖ）まで変化し;ここで、前記％（ｖ／ｖ）は、前記移動相の総体積に基づく。
【００１２】
好ましくは、前記溶出は、０．１から１０ｍＬ／分の流速で行われる。
【００１３】
好ましくは、前記溶出は、２から１１のｐＨ範囲で行われる。
【００１４】
好ましくは、前記親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムは、アミドカラムである。
【００１５】
好ましくは、前記クロマトグラムは、紫外線検出によって得られる。
【００１６】
ここでの開示はさらに、サポニン組成物の純度を評価するための方法を提供し、その方法は以下のステップ：（ａ）サポニン組成物を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用するステップ；（ｂ）移動相を用いて前記逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムを溶出して溶出液を得るステップ；及び（ｃ）前記溶出液のクロマトグラムを取得するステップ、を含み、
前記移動相は、トリフルオロ酢酸−水溶液及びトリフルオロ酢酸−アセトニトリル溶液を含み；前記トリフルオロ酢酸−アセトニトリル溶液は、前記トリフルオロ酢酸−アセトニトリル溶液の総体積に基づいて、２０から８０％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸を含み、一方で、前記移動相中のアセトニトリルの量は、３５分で２０％（ｖ／ｖ）から８０％（ｖ／ｖ）まで変化し；ここで、前記％（ｖ／ｖ）は、前記移動相の総体積に基づく。
【００１７】
好ましくは、前記溶出は、０．１から１０ｍＬ／分の流速で行われる。
【００１８】
好ましくは、前記溶出は、２から７．５のｐＨ範囲で行われる。
【００１９】
好ましくは、前記逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムは、逆相カラムである。
【００２０】
好ましくは、前記疎水性カラムは、Ｃ４カラム、Ｃ８カラム、又はＣ１８カラムである。
【００２１】
好ましくは、前記クロマトグラムは、紫外線検出によって得られる。
【００２２】
ここでの開示は、サポニン組成物の品質を評価するための方法をさらに提供し、その方法は以下のステップ：（ａ）サポニン組成物を親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムに適用するステップ；（ｂ）第１の移動相で前記親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムを溶出して、第１の溶出液を収集するステップ；（ｃ）前記第１の溶出液の画分（フラクション）を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用するステップ；（ｄ）第２の移動相で前記逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムを溶出して、第２の溶出液を収集するステップ；（ｅ）前記第２の溶出液のクロマトグラムを取得するステップ、 を含み、
ここで、前記第１の移動相は、トリフルオロ酢酸−水溶液及びアセトニトリルを含む。
【００２３】
好ましくは、前記第１の移動相中の前記トリフルオロ酢酸−水溶液の量は、３０分で、０％（ｖ／ｖ）から２０％（ｖ／ｖ）まで変化し、その一方で前記第１の移動相中のアセトニトリルの量は、８０％（ｖ／ｖ）から１００％（ｖ／ｖ）まで変化し; ここで、前記％（ｖ／ｖ）は、前記第１の移動相の総体積に基づく。
【００２４】
好ましくは、前記第２の移動相中のトリフルオロ酢酸−水溶液の量は、３５分で、２０％（ｖ／ｖ）から８０％（ｖ／ｖ）まで変化する一方、前記第２の移動相中のアセトニトリルの量は２０％（ｖ／ｖ）から８０％（ｖ／ｖ）まで変化し; ここで、前記％（ｖ／ｖ）は、前記第２の移動相の総体積に基づく。
【００２５】
好ましくは、前記工程（ｂ）における前記溶出は、０．１から１０ｍＬ／分の流速で行われる。
【００２６】
好ましくは、前記工程（ｂ）における前記溶出は、２から１１のｐＨ範囲で行われる。
【００２７】
好ましくは、前記工程（ｄ）における前記溶出は、０．１から１０ｍＬ／分の流速で行われる。
【００２８】
好ましくは、前記工程（ｄ）における前記溶出は、２から７．５のｐＨ範囲で行われる。
【００２９】
好ましくは、前記親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムは、アミドカラムである。
【００３０】
好ましくは、前記逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムは、疎水性カラムである。
【００３１】
より好ましくは、前記疎水性カラムは、Ｃ４カラム、Ｃ８カラム、又はＣ１８カラムである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＯＢＩ−８２１親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）紫外線（ＵＶ）クロマトグラム
【図２】親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）紫外線（ＵＶ）クロマトグラムから集めた、ピーク１画分（１８５８化合物、上）、ピーク２画分（１９９０−Ｖ１化合物、中）、及びピーク３画分（１９９０−Ｖ２化合物、下）のＯＢＩ−８２１ネガティブＥＳＩ  ＭＳスペクトル
【図３Ａ】ＯＢＩ−８２１からの１８５８化合物（左）及び１９９０化合物（右）の構造及びそれらのタンデムＭＳフラグメントイオン
【図３Ｂ】１９９０化合物（上）及び１９５８化合物（下）のＭＳ／ＭＳスペクトル
【図４】パルス電流検出装置を備えた高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）による、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）紫外線（ＵＶ）クロマトグラムにより集めたピーク２画分（１９９０−Ｖ１化合物、上）、ピーク３画分（１９９０−Ｖ２化合物、中）、及びピーク１画分（１８５８化合物、下）の単糖類（モノサッカリド）分析
【図５】ＯＢＩ−８２１逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のクロマトグラム
【発明を実施するための形態】
【００３３】
［詳細な説明］
サポニン組成物の一種であるＯＢＩ−８２１アジュバント物質（ＡＳ）は、キラヤ・サポナリア（Quillaja Saponaria）からの植物由来の複雑なサポニンであり、次の式（I）を共有する６つの異性体を含む。
【００３４】
【化３】
2021519329.tif 000006
上記式中、Ｒ１はアピオース、キシロース、又は水素であり；
Ｒ２及びＲ３は独立に、水素又は脂肪アシル（fatty acyl）である。
【００３５】
これら６つの異性体は、本明細書中での参照名とともに下の表１に列挙してある。これらの６つの異性体のなかで、末端アピオースを有するＯＢＩ−８２１−１９９０−Ｖ１、末端キシロースを有するＯＢＩ−８２１−１９９０−Ｖ２、及びＯＢＩ−８２１−１９９０異性体類におけるトリサッカリド残基の代わりに、フコシル残基に結合したジサッカリド（二糖）残基（Ｄ−キシロシル−（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−Ｌ−ラムノシル−（１→４））を有するＯＢＩ−８２１−１８５８が、その主要な３つの成分である。これら３つの成分はそれぞれ「Ａ型」及び「Ｂ型」位置異性体を有する。
【００３６】
「１９９０」という数は、ＯＢＩ−８２１−１９９０−Ｖ１Ａ、ＯＢＩ−８２１−１９９０−Ｖ１Ｂ、ＯＢＩ−８２１−１９９０−Ｖ２Ａ、及びＯＢＩ−８２１−１９９０−Ｖ２Ｂの理論的に推定された分子量である。同様に、「１８５８」という数は、ＯＢＩ−８２１−１８５８−Ａ及びＯＢＩ−８２１−１８５８−Ｂの理論的に推定された分子量である。
【００３７】
【表２】
2021519329.tif 000007
【００３８】
ＯＢＩ−８２１アジュバント物質（ＡＳ）中には合計６つの異性体が見いだされる。これらの６つの異性体は、ＯＢＩ−８２１−１９９０−Ｖ１、ＯＢＩ−８２１−１９９０−Ｖ２、及びＯＢＩ−８２１−１８５８の３つのグループに分類できる。各グループは、グループＡ及びＢとして識別できる２つの位置異性体を含む。ＯＢＩ−８２１アジュバントの命名法及び物理化学的特性を表２にまとめてある。
【００３９】
【表３】
2021519329.tif 000008
【００４０】
ＯＢＩ−８２１ＡＳの製造プロセスには、３つの精製段階（段階Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ）が含まれる。主要原材料であるＱｕｉｌ−Ａ中に含まれるＯＢＩ−８２１の初期含有量は、通常３％以下である。段階Ｉの精製プロセスでは、ＯＢＩ−８２１の含有量が約１５％に増加し、その中間体は、精製されたＱｕｉｌ−Ａ（ＰＱＡ）として識別される。段階ＩＩのプロセスにおいて、ＯＢＩ−８２１の含有量が塩を伴う約０．２ｇ／ｇ乾燥形態へと増加し（ＨＰＬＣによるクロマトグラフィー純度で、約５０％のメインピークＭＷ１９９０）、その中間体は粗製ＯＢＩ−８２１（Ｃｒｄ−８２１）として識別される。段階ＩＩＩの精製プロセスの後、ＯＢＩ−８２１含有量は９８％以上まで富化されることができ、これはＯＢＩ−８２１ＡＳとして識別される。
【００４１】
Ｑｕｉｌ−Ａは、Brenntag Biosector A/S（Brenntag; Frederikssund, デンマーク国）から商業的に入手し、これは食品添加物としての使用に対してデンマーク国の規制当局によって認定されている（証明書番号３２１１９）。
【００４２】
ここでの開示の第１の側面は、サポニンベースのアジュバントからの単離されたサポニン化合物に関する。「単離された」という用語は、サポニン化合物が実質的に純粋であることを記述することを言っている。より具体的には、一実施形態では、単離されたサポニン化合物は、不純物及びその他の異性体を含まない。例えば、一実施形態では、単離物サポニン化合物は、化合物１９９０−Ｖ１Ａであり、それは、化合物１９９０−Ｖ２Ａ、化合物１９９０−Ｖ１Ｂ、化合物１９９０−Ｖ２Ｂ、化合物１８５８−Ａ、及び化合物１８５８−Ｂを含まない。
【００４３】
ここでの開示の第２の側面は、前述の単離された化合物のうちの１つ又は複数及び医薬として許容可能な担体を含むサポニン組成物に関する。このサポニン組成物は、アジュバント効果を示すのに適した比率で、前述の単離された化合物の２つ以上を含み得る。医薬として許容可能な担体は、当技術分野において一般的に使用されている任意の担体であることができる。
【００４４】
好ましい実施形態では、サポニン組成物は、サポニン組成物の総質量に対し、化合物１９９０の混合物７５〜９０質量％及び化合物１８５８の混合物１０〜２５重量％を含み、 ここで、化合物１９９０の混合物は、化合物１９９０−Ｖ１Ａ、化合物１９９０−Ｖ１Ｂ、化合物１９９０−Ｖ２Ａ、化合物１９９０−Ｖ２Ｂ、又はそれらの混合物を含み、かつ化合物１８５８の混合物は、化合物１８５８−Ａ、化合物１８５８−Ｂ、又はそれらの混合物を含む。より好ましい実施形態において、サポニン組成物は、サポニン組成物の総質量に対して、化合物１９９０の混合物８０〜８８質量％及び化合物１８５８の混合物１２〜２３質量％を含む。
【００４５】
別の好ましい実施形態において、サポニン組成物は、サポニン組成物の総質量に対して、化合物１９９０−Ｖ１Ａを約４５〜６５質量％含む。特定の実施形態では、サポニン組成物は、サポニン組成物の総質量に対して、約４５〜６５質量％の化合物１９９０−Ｖ１Ａ化合物、約１９．３１〜２７．９９質量％の化合物１９９０−Ｖ２Ａ、約０．２９〜７．７１質量％の化合物１９９０−Ｖ１Ｂ、及び約０．１１〜３．１１質量％化合物１９９０−Ｖ２Ｂを含む。別の特定の実施形態では、サポニン組成物は、サポニン組成物の総質量に対して、約４９．２６〜６３．４２質量％の化合物１９９０−Ｖ１Ａ化合物、約１９．３１〜２７．９９質量％の化合物１９９０−Ｖ２Ａ、約０．２９〜７．７１質量％の化合物１９９０−Ｖ１Ｂ、及び約０．１１〜３．１１質量％化合物１９９０−Ｖ２Ｂを含む。
【００４６】
以下にいう「ＯＢＩ−８２１の異性体組成を評価する」とは、ＯＢＩ−８２１をある方法によって分離し、それによってＯＢＩ−８２１の３つの主成分を分離し、観察できることをいう。これは、対象とするＯＢＩ−８２１が３つの主要な成分の全てを含んでいるかどうかを確認するために不可欠であり、なぜなら、そのことが抗体又は細胞性免疫応答の増強におけるＯＢＩ−８２１の機能のための要因でありうるからである。以下にいう「ＯＢＩ−８２１の純度を評価する」とは、対象としているＯＢＩ−８２１中に存在する不純物の含有量を評価することである。好ましくは、不純物の含有量は、対象としているＯＢＩ−８２１中で１０質量％未満である。すなわち、ＯＢＩ−８２１の純度は９０％より高い。以下にいう「ＯＢＩ−８２１の品質を評価する」とは、対象としているＯＢＩ−８２１の純度及び３つの主要成分の存在の両方を評価することである。
【００４７】
ここでの開示の第３の側面においては、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）によってサポニン組成物の異性体組成を評価するための方法が提供される。この方法は、以下のステップを含む：（ａ）サポニン組成物を親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムに適用するステップ；（ｂ）前記親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムを移動相で溶出して溶出液を得るステップ；及び（ｃ）前記溶出液のクロマトグラムを取得するステップ。
【００４８】
好ましい実施形態では、上記の移動相は、移動相中のトリフルオロ酢酸−水溶液の量が、３０分で、０％（ｖ／ｖ）から２０％（ｖ／ｖ）まで変化し、一方で、移動相中のアセトニトリルの量は８０％（ｖ／ｖ）から１００％（ｖ／ｖ）まで変化する勾配で適用され、ここで、前記％（ｖ／ｖ）は、移動相の総体積に基づく。
【００４９】
上記の溶出は、操作の条件に応じて適切な流量で行うことができる。そうではあるが、好ましい実施形態では、溶出は、０．１から１０ｍＬ／分の流速で行われる。
【００５０】
好ましい実施形態では、前記のカラムは、分析が行われる前に緩衝液（バッファー）によって調整（コンディショニング）されなければならない。さらに、好ましい実施形態では、前記のカラムは、分析が完了した後、洗浄緩衝液によって洗浄されなければならない。前記の調整に使用される緩衝液は、トリフルオロ酢酸−水溶液、アセトニトリル、又はそれらの混合物であることができる。前記の洗浄緩衝液は、アセトニトリル、水、又はそれらの混合物であり得る。好ましくは、前記の洗浄緩衝液は、適切な勾配のアセトニトリルと水の混合物である。
【００５１】
好ましい実施形態では、前記のクロマトグラムは、それぞれ上記の６つの異性体の３つの主成分を表す３つのピークを含むであろう。実際には、対象としているＯＢＩ−８２１の純度を予め決定するためにその３つのピークのピーク面積を計算することができる。
【００５２】
ここでの開示の第４の側面では、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってサポニン組成物の純度を評価するための方法が提供される。この方法は、以下のステップを含む：（ａ）サポニン組成物を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用するステップ；（ｂ）移動相を用いて前記の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムを溶出して溶出液を得るステップ；及び（ｃ）前記溶出液のクロマトグラムを取得するステップ。
【００５３】
好ましい実施形態において、前記移動相は、前記移動相中のトリフルオロ酢酸−水溶液の量が、３５分で、２０％（ｖ／ｖ）から８０％（ｖ／ｖ）まで変化する一方で、前記移動相中のアセトニトリルの量は、２０％（ｖ／ｖ）から８０％（ｖ／ｖ）まで変化する勾配で適用され；ここで、前記％（ｖ／ｖ）は、前記移動相の総体積に基づく。
【００５４】
前記の溶出は、操作の条件に応じて適切な流量で行うことができる。そうではあるが、好ましい実施形態では、前記の溶出は、０．１から１０ｍＬ／分の流速で行われる。
【００５５】
好ましい実施形態では、前記クロマトグラムは、それぞれ「Ａ型」位置異性体及び「Ｂ型」位置異性体を表す２つのピークを含むであろう。具体的には、「Ａ型」位置異性体を表すピークは、ＯＢＩ−８２１−１９９０−Ｖ１Ａ、ＯＢＩ−８２１−１９９０−Ｖ２Ａ、及びＯＢＩ−８２１−１８５８−Ａの組み合わせになり；「Ｂ型」位置異性体を表すピークは、ＯＢＩ−８２１−１９９０−Ｖ１Ｂ、ＯＢＩ−８２１−１９９０−Ｖ２Ｂ、及びＯＢＩ−８２１−１８５８−Ｂの組み合わせになる。好ましい実施形態では、対象としているＯＢＩ−８２１の純度を決定するために、前記の２つのピークのピーク面積を計算することができる。
【００５６】
ここでの開示の第５の側面では、サポニン組成物の品質を評価するための方法が提供される。この方法は、前後（タンデム）に配置したＨＩＬＩＣとＲＰ−ＨＰＬＣによって実施される。基本的に、ここでの開示の第３の側面のサポニン組成物の異性体組成を評価する方法に対してサポニン組成物を適用し、次に、得られた画分を、ここでの開示の第４の側面のＯＢＩ−８２１の純度を評価する方法に適用した。
【００５７】
具体的には、この方法は以下のステップを含む：（ａ）サポニン組成物を親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムに適用するステップ；（ｂ）第１の移動相で前記の親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムを溶出して、第１の溶出液を収集するステップ、（ｃ）前記の第１の溶出液の画分を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用するステップ；（ｄ）第２の移動相で前記の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムを溶出して、第２の溶出液を収集するステップ；及び（ｅ）前記第２の溶出液のクロマトグラムを取得するステップ。
【００５８】
好ましくは、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）及び逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のカラム、移動相、流速などを含む条件は、これより前の段落に記載されたものと同じである。
【００５９】
好ましい実施形態において、６つの異性体の３つの主成分のいずれか１つに相当する前記の第１の溶出液の画分は、前記のステップ（ｃ）において、前記の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用され、それにより、画分の「Ａ型」位置異性体と「Ｂ型」位置異性体を分離することができる。
【００６０】
好ましい実施形態では、６つの異性体の３つの主成分に対応する３つの画分が、前記ステップ（ｃ）における前記の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムのために収集され、それにより、３つの主成分それぞれの「Ａ型」位置異性体及び「Ｂ型」位置異性体を分離することができる。したがって、３つのクロマトグラムを得ることができ、それらのそれぞれは、「Ａ型」位置異性体を示す１つのピークと、「Ｂ型」位置異性体を示す１つのピークを有する。得られた３つのクロマトグラムの２つのピークのピーク面積を計算することにより、対象としているＯＢＩ−８２１の６つの異性体それぞれの含有量を得ることができる。
【実施例】
【００６１】
＜例１：HILICによるOBI-821アジュバントの分離＞
この試験は、６つの異性体の３つの主成分を観察できるようにOBI-821アジュバントを分離するために実施した。分析方法及び条件を下の表３及び表４にまとめた。1.0〜2.0 mgのテストサンプルをブランクバッファー（脱イオン水中の80％（v/v）アセトニトリル）に溶解して、OBI-821溶液（500μg/mL）を調製した。次に、そのOBI-821溶液をWATERS XBridgeアミドカラム（Waters Corporation、部品番号186004896）に注入した。HILICの移動相は、溶離液Ａと溶離液Ｂの混合物だった。溶離液Ａは脱イオン水（DI水）に溶解した0.1％（v/v）トリフルオロ酢酸であり、溶離液Ｂはアセトニトリルだった。移動相の勾配は、表４に示す溶出プログラムとして以下のように設定した。
【００６２】
【表４】
2021519329.tif 000009
【００６３】
【表５】
2021519329.tif 000010
【００６４】
データ処理
１．214 nmでクロマトグラムを処理する。全てのピークを積分し、保持時間、ピーク面積（曲線下面積）、及び全てのピークの面積％を記録する。（注：ブランクからの溶媒ピークの積分は避けてください）。面積％は、質量％（wt/wt）として理解できる。
２．相対的保持時間（リテンションタイム，RRT）の計算
RRTは、ピーク1990-V1の保持時間に対する、そのピークの保持時間の比率である。1990-V1の保持時間は、OBI-821溶液のメインピークの平均保持時間によって定義される。
RRT = RTpeak / RT1990-Api
３．ピークの識別
３つのOBI-821成分（1858、1990-V1、及び1990-V2）は、表５に示す相対保持時間（RRT）によって次のように識別される。
【００６５】
【表６】
2021519329.tif 000011
【００６６】
データ解析
１．システム適合性テスト（SST）
SSTの結果は、OBI-821溶液の注入から得られる。1990-ApiのRTとピーク面積の相対標準偏差（RSD％）を計算する。RTとピーク面積の許容基準は2％未満であるべきである。
２．糖異性体の分布
糖異性体の分布は、ピークのピーク面積によって決定される。
1858（％）= 1858のピーク面積/3つのピーク（1858、1990-V1、及び1990-V2）のピーク面積の合計×100％
1990-V1（％）= 1990-V1のピーク面積/3つのピーク（1858、1990-V1、及び1990-V2）のピーク面積の合計×100％
1990-V2（％）= 1990-V2のピーク面積/3つのピーク（1858、1990-V1、及び1990-V2）のピーク面積の合計×100％
【００６７】
結果を平均し、相対標準偏差（％RSD）を計算する。最終結果を平均含有量±標準偏差として表す。
【００６８】
図１に示すように、OBI-821のクロマトグラフは、それぞれ9.661分（以下、ピーク1; OBI-821-1858）、10.113分（以下、ピーク2; OBI-821-1990-V1）、及び10.560分（以下、ピーク3; OBI-821-1990-V2）の保持時間に３つの主要なピークを示した。また、6.300分の保持時間に別のピークがあり、これはHILICの溶媒ピークである。
【００６９】
前述の３つの主要なピークの溶出液をさらに特定するために、OBI-821の前述の３つのピークの画分（フラクション）を収集し、ネガティブESI MSで調べた。図２に示すように、m/z 1989が、OBI-821-1990-V1（ピーク2）及び-V2（ピーク3）で観察され、m/z1857が、-1858（ピーク1）で観測された。これらのm/zの結果は、それぞれ理論分子量1990.13192（C92H148O46）及び1858.0173（C87H140O42）と一致している。
【００７０】
OBI-821異性体の構造を確認するために、ESI MSのおける３つのピークの溶出液を、直接注入MS/MSおよびMS/MS/MS分析による構造分析にさらに適用した。タンデムMSの構造情報を図３（Ａ）にまとめてある。MS/MSスペクトルを図３（Ｂ）に示し、図中の印をつけた質量ピークを、MS/MS/MS分析用に選択している。タンデム質量スペクトルは、フラグメントイオンと親イオンの間の対応する構造関係を示していた。
【００７１】
次に、パルス電流検出を備えた高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（HPAEC-PAD）単糖分析（Thermo Fisher Scientific, CarboPac PA1カラム（部品番号035391, 4x250 mm）を備えたDionexICS-5000）を実施して、３つの画分（フラクション）の固有性をさらに区別した。OBI-1990-V1、-V2、及び-1858を、HILICから収集し、ロータリーエバポレーターによって濃縮した。濃縮されたOBI-1990-V1、-V2、及び-1858を、4M TFAによって100℃で4時間加水分解し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、OBI-1990-V1、-V2、及び-1858をDI（脱イオン）水で再構成し、パルス電流検出を備えた高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（HPAEC-PAD）で分析した。移動相Ａとして200 mM水酸化ナトリウムを使用し、移動相ＢとしてDI（脱イオン）水を使用した。移動相Ｃとして500 mM酢酸ナトリウムを含む100 mM水酸化ナトリウムを使用した。
【００７２】
移動相の初期組成は、91％の移動相Ａ及び9％の移動相Bで10分間保持した。次に、90％の移動相Ａと10％の移動相Ｃに切り替え、その後10分で60％の移動相Ａと40％の移動相Ｃまで直線的に勾配を付けた。次に、100％の移動相Ａによる洗浄ステップを20分間実施した。
【００７３】
図４と表６に示す結果によると、３つの溶出液は全て、１つのフコース、１つのラムノース、１つのガラクトース、１つのグルクロン酸、及び１つのアラビノースを有していたが、キシロース及びアピオースの数が異なっていた。ピーク１の画分は、２つのキシロースを有していたが、アピオースは有していなかった。ピーク２の画分には、２つのキシロース及び１つのアピオースを有していた。ピーク３の画分は、３つのキシロースと０個のアピオースを有していた。したがって、３つの画分は、それぞれ、OBI-821-1858異性体、OBI-821-1990-V1異性体、及びOBI-821-1990-2異性体として同定された。つまり、この試験で実施されたHILIC分析は、OBI-821の６つの異性体の３つの主成分を分離することができた。言い換えれば、OBI-821の３つの主要な成分は、前述のHILIC分析を通じて明確に観察できる。
【００７４】
【表７】
2021519329.tif 000012
【００７５】
＜例２：RP-HPLCによるOBI-821アジュバントの位置異性体の同定＞
この試験では、OBI-821を、その位置異性体を同定するために逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）で分離した。当技術分野で知られているように、OBI-821は、フコースの4-ヒドロキシル位置に結合したアシル基を有するＡ型位置異性体、及び3-ヒドロキシル位置にアシル基を有するＢ型位置異性体を有する。RP-HPLCの条件を次の表７及び表８に示す。簡単に説明すると、テストサンプルを製剤バッファーに溶解（1.25 mg/mL）し、YMC-Pack C4カラム（部品番号BU30S05-2546WT, 5μm, 4.6×250mm）に注入し、カラムを15分で、0.1％TFA水溶液／アセトニトリル勾配からなる移動相によって溶出した。次に、溶出液を214 nmの紫外線で検出した。
【００７６】
【表８】
2021519329.tif 000013
【００７７】
【表９】
2021519329.tif 000014
【００７８】
データ処理
１．214 nmでクロマトグラムを処理する。統合パラメーターは以下のとおりである。
（a）ピーク幅：30
（b）しきい値：50.0
（c）最小ピーク高さ：2000
（d）積分時間：6〜17分
【００７９】
２．ピーク定義
YMC-Pack C4クロマトグラフィーにおいて、OBI-821はメジャーピークとマイナーピークから構成されている。メジャーピークとマイナーピークの保持時間を記録する。メジャーピークに対するマイナーピークの相対保持時間（RRT）は、0.95〜0.97の範囲内となるはずである。
【００８０】
データ解析
１．システムの適合性
平均保持時間及びピーク面積、並びに相対標準偏差（RSD）を計算する。RT及びピーク面積のRSDは2％未満である必要がある。SSTのピークもこの基準を満たす必要がある。
USPテーリング：0.5〜2.0
USPプレート数：≧8000
解像度：≧1.8
【００８１】
２．OBI-821の識別：
試験サンプルのピークの保持時間（リテンションタイム）を記録する。試験サンプルの保持時間は、OBI-821参照標準の保持時間に対応している必要がある。その標準との保持時間の差は2％以内である必要がある。
【００８２】
３．OBI-821の純度と不純物の測定
純度と不純物は、以下のように、ピーク面積％を記録するピーク面積分析によって決定される。
純度（％）=（AOBI-821/A総ピーク）
単一不純物（％）=（A単一不純物ピーク/A総ピーク）
総不純物（％）=（A総不純物ピーク/A総ピーク）
AOBI-821 = 試験サンプルのメジャーピークとマイナーピークのピーク面積の合計
A単一不純物ピーク = 溶媒ピークを除いた単一不純物ピークのピーク面積
A総不純物ピーク= 溶媒ピークを除いた全ての単一不純物ピークのピーク面積の合計
A総ピーク= 溶媒ピークを除いた全てのピークのピーク面積
各試験サンプルの純度（％）及び不純物（％）の値を平均する。
【００８３】
結果を図５に示す。9.912分の保持時間にメジャーピークがあり、9.526分にマイナーピークがあった。メジャーピークは、OBI-821-1858-A、OBI-821-1990-V1A、及びOBI-821-1990-V2Aを含むＡ型位置異性体を表している。マイナーピークは、OBI-821-1858-B、OBI-821-1990-V1B、及びOBI-821-1990-V2Bを含むＢ型位置異性体を表している。7.104分におけるさらなるピークが不純物として同定された。したがって、この結果は、この試験のRP-HPLCがOBI-821の2つの形態の位置異性体を分離することができるのでその存在と含有量を明確に観察できることを証明した。
【００８４】
さらに、前述の不純物ピーク、メジャーピーク、及びマイナーピークの相対保持時間を、メジャーピークの保持時間を標準として用いて計算した（表９）。さらに、純度は約96.72％だった。得られた結果とともに、ここで開示したRP-HPLCは、対象とするOBI-821の純度を決定するのに有用だった。
【００８５】
【表１０】
2021519329.tif 000015
【００８６】
＜例３：HILICとRP-HPLCの縦列組み合わせ（タンデムコンビネーション）によるOBI-821の６つの異性体の同定＞
例１に記載した試験は、ここでのHILIC分析がOBI-821の異性体の３つの主要な成分を分離することができるという証拠を提供した。例２の試験は、ここでのRP-HPLC分析がOBI-821の位置異性体を観察するのに有用であることを確認した。したがって、ここでのHILIC分析とRP-HPLC分析を縦列（タンデム）に組み合わせて、HILIC分析において収集されたフラクションを各フラクションのA型位置異性体とB型位置異性体にさらに分割できるようにすることは合理的である。次に、OBI-821の６つの異性体を分離し、それらの含有量を計算することができた。
【００８７】
この試験においては、前述の例１に記載されているように、６つのアジュバント物質サンプルをHILIC分析に適用して、３つの主成分に対応する３つの画分を収集した。その後、各画分を、前述の例２に開示されているようにそれぞれRP-HPLC分析にかけて、それらの位置異性体を分離した。したがって、分析の最後には、６つの異性体が各OBI-821サンプルから得られることが予想された。各異性体の含有量を計算するために、各サンプルの６つのピークのピーク面積を決定した。OBI-821 AS（アジュバント物質）及びOBI-821 AP（アジュバント製品）の結果を表１０及び表１１に示す。
【００８８】
【表１１】
2021519329.tif 000016
【００８９】
【表１２】
2021519329.tif 000017
【００９０】
報告したパーセント割合は正規化されており、HILIC及びRP-HPLCのクロマトグラフィーデータから計算したものである。３つの主要な異性体、OBI-821-1990-V1A、-V2A、及び1858-Aは、クロマトグラフィー組成によりOBI-821アジュバントの90％より多くを占めている。これらの３つの主要な異性体は、フコース残基の4-ヒドロキシル基に結合した脂肪アシル（fatty acyl）置換基から形成されていることが判明している。６つの異性体のうち、OBI-821-1990-V1Aは49〜63％を占め、OBI-821アジュバントの主要な異性体である。
【００９１】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語並びに全ての頭字語は、本発明の技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。 本明細書に記載されているものと類似又は同等の情報を伝えるための任意の組成物、方法、キット、及び手段を使用して本発明を実施することができるが、情報を伝えるための好ましい組成物、方法、キット、及び手段が本明細書に記載されている。
【００９２】
本明細書において引用されている全ての参考文献は、法律で許可される全範囲を参照することにより本明細書に援用する。これらの参考文献の説明は、単にその著者による主張を要約することを目的としている。参考文献（又は参考文献の一部）が、関連する先行技術であることは認められない。出願人は、引用された参考文献の正確性と適切性に異議を申し立てる権利を留保する。
【図１】
2021519329.tif 000033
【図２】
2021519329.tif 000034
【図３Ａ】
2021519329.tif 000035
【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
2021519329.tif 000038
2021519329.tif 000039
【国際調査報告】
2021519329.tif 000040
2021519329.tif 000041
2021519329.tif 000042