(57)【要約】  本発明は概して、細胞培養を用いた診断アッセイに関するものであり、特に、試料（特に患者試料）を分析し、腫瘍抗原の発現を定量化することおよび／またはがん免疫療法に対する臨床応答を予測することによってがんを診断するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーター細胞アッセイに関する。本発明のさらなる態様は、例えばがん免疫療法の安全性を改善することである。【選択図】図１Ａおよび１Ｂ
2021519588.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の腫瘍細胞の存在を判定するための診断アッセイであって、
ａ）試料を、抗原結合ドメインと認識ドメインとを含む抗原結合分子と接触させるステップであって、抗原結合ドメインが、腫瘍細胞に特異的に結合可能な標的抗原結合部分を含む、接触させるステップ；
ｂ）試料を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞と接触させるステップであって、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が、
ｉ．応答エレメントに作動可能に結合されており、認識ドメインに特異的に結合可能なＣＡＲ；
ｉｉ．応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子；
を含む、接触させるステップ：および
ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定して腫瘍細胞の存在を確認することにより、Ｔ細胞の活性化を判定するステップ
を含む診断アッセイ。
【請求項２】
抗原結合ドメインがＦａｂ断片であり、認識ドメインがＦｃドメインである、請求項１に記載の診断アッセイ。
【請求項３】
抗原結合分子が、ＩｇＧクラス抗体、特にＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプ抗体である、請求項１または２に記載の診断アッセイ。
【請求項４】
認識ドメインが変異Ｆｃドメインであり、変異Ｆｃドメインが、非変異親Ｆｃドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ＣＡＲが、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することはできるが、非変異親Ｆｃドメインには特異的に結合することができない、請求項３に記載の診断アッセイ。
【請求項５】
変異体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基１１７、１１８、１３６、１８０、１９３、２１２、２１４および３１８からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を含み、特に、変異体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基１１７にロイシンからアラニン、残基１１８にロイシンからアラニン、位置１３６にイソロイシンからアラニン、残基１８０にアスパラギンからアラニン、残基１９３にヒスチジンからアラニン、残基２１２にプロリンからグリシン、残基２１４にプロリンからグリシン、および／または残基３１８にヒスチジンからアラニンへのアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の診断アッセイ。
【請求項６】
変異体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基２１２の位置にアミノ酸置換を含み、特に、変異体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基２１２にプロリンからグリシンへのアミノ酸置換を含む、請求項４または５に記載の診断アッセイ。
【請求項７】
認識ドメインがタグを含み、ＣＡＲが、タグを含む認識ドメインに特異的に結合することはできるが、タグを含まない認識ドメインには特異的に結合することができない、請求項１から３のいずれか一項に記載の診断アッセイ。
【請求項８】
タグがハプテン分子であり、ハプテン分子が、特に、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）およびフルオレセイン（ＦＩＴＣ）からなる群から選択される、請求項７に記載の診断アッセイ。
【請求項９】
タグがポリペプチドタグであり、ポリペプチドタグが、特に、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ａｖｉタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＧＣＮ４タグおよびＮＥタグからなる群から選択される、請求項７に記載の診断アッセイ。
【請求項１０】
ＣＡＲが、少なくとも１つの細胞内刺激シグナル伝達および／または補助刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の診断アッセイ。
【請求項１１】
細胞内シグナル伝達および／または補助シグナル伝達ドメインの活性化が応答エレメントの活性化をもたらす、請求項１０に記載の診断アッセイ。
【請求項１２】
応答エレメントの活性化がレポーター遺伝子の発現をもたらす、請求項１から１１のいずれか一項に記載の診断アッセイ。
【請求項１３】
試料が、疾患に罹患している個体に由来する患者試料であり、特に疾患ががんである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の診断アッセイ。
【請求項１４】
試料中の腫瘍細胞の存在を判定するための診断キットであって、
（ａ）変異Ｆｃドメインを含み、腫瘍細胞に特異的に結合可能な抗原結合分子であって、変異Ｆｃドメインが、非変異親Ｆｃドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、抗原結合分子；および
（ｂ）形質導入されたＴ細胞であって、（ｉ）抗原結合分子に特異的に結合することが可能なＣＡＲであって、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することはできるが、非変異親Ｆｃドメインには特異的に結合することができないＣＡＲと、（ｉｉ）ＣＡＲが作動可能に結合している応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子とを含む形質導入されたＴ細胞
を含む、診断キット。
【請求項１５】
試料中の腫瘍細胞の存在を判定するための診断キットであって、
（ａ）腫瘍細胞に特異的に結合可能な、タグを含む抗原結合分子；および
（ｂ）形質導入されたＴ細胞であって、（ｉ）抗原結合分子に特異的に結合可能なＣＡＲであって、タグを含む抗原結合分子に特異的に結合することはできるが、タグを含まない抗原結合分子には特異的に結合するこがでときないＣＡＲと、（ｉｉ）ＣＡＲが作動可能に結合されている応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子とを含む形質導入されたＴ細胞
を含む、診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、細胞培養を用いた診断アッセイに関するものであり、特に、試料（特に患者試料）を分析し、腫瘍抗原の発現を定量化することおよび／またはがん免疫療法に対する臨床応答を予測することによってがんを診断するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーター細胞アッセイに関する。本発明のさらなる態様は、例えばがん免疫療法の安全性を改善することである。
【背景技術】
【０００２】
がんは、全年齢コーホートを通して死因の代表的なものの一つである。がんは、１つ以上の細胞集団の制御不能な増殖につながる細胞の異常な段階である。最終的に、増殖は、複数の臨床的および非臨床的症状につながる正常な生物学的機能の異常をもたらす。腫瘍細胞は、典型的には、形態、胎児性抗原の発現、接触阻害の欠如および成長因子非依存性のような、腫瘍細胞を正常細胞から区別する１または複数の特性を示す。
【０００３】
残念なことに、ほとんどのがんは疾患の初期段階で無症候性であり、例えば、肺がんについては、初期の限局した段階で発見されるのはわずか１５％であるという困難な状況につながっている。ただし、このような早期診断された患者の５年生存率は８５％と高いが、がんが他の臓器に広がってから５年生存した患者はわずか２％である。何十年にもわたってがん治療が改善されてきたにもかかわらず、がん治療を成功させるための最も重要な予測因子は、早期発見と疾患の分類であることに変わりはない。
【０００４】
免疫系は、典型的には、腫瘍細胞が「自己」に由来するという性質のために、危険を知らせたり、これら腫瘍細胞の認識の誘因となったりはしない。がん免疫療法は、腫瘍によってのみ発現する独特のタンパク質を認識することと、同時に、例えば、腫瘍細胞の破壊を可能にする抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）またはＴ細胞の細胞傷害性を介して、免疫細胞の作用に関与することとにより、免疫系を利用して腫瘍細胞を標的とすることを目的とする。この関与は、古典的ＡＤＣＣが可能な抗体および／もしくはＴ細胞二重特異性抗体、または腫瘍抗原もしくは人工キメラ抗原（ＣＡＲ−Ｔ）を認識する天然Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ−Ｔ）を発現するように操作されたＴ細胞を介して達成され得る。これらの抗体は、従来の腫瘍表面タンパク質またはＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）との関連で提示されるタンパク質由来ペプチドのいずれかを認識する。いずれのアプローチにおいても、腫瘍細胞表面またはｐＭＨＣに発現される腫瘍抗原の密度は全てのがん型にわたって患者間で大きく異なるため、臨床において全ての患者が治療に反応するわけではない。
【０００５】
したがって、腫瘍抗原（表面および／またはｐＭＨＣ）の量を検出および定量するための有効なツールは、がん患者のより良い診断を保証し、それぞれのがん免疫療法に対する臨床反応の可能性を予測することができるであろう。さらに、がん免疫療法は、ときに正常組織を標的とする望ましくない免疫応答を引き起こし得る。免疫療法の安全性の早期予測は、医師が患者における潜在的な致死的副作用を監視するのに役立つであろう。
【０００６】
多様な体液中の腫瘍抗原の検出は、例えば、リンパまたは血液中のすでに非常に少数の生存可能な腫瘍細胞の存在が疾患進行における重要な特徴を示す可能性があることを考えると、依然として最も重要である。免疫学的診断アッセイは、様々な疾患状態を検出することができる、この目的に向けた重要なツールを提供する。しかしながら、このようなアッセイは、例えばＭＨＣ提示されたタンパク質由来ペプチドとの関連において、腫瘍細胞を確実に検出するのに十分な感度および／または特異性を常に有しているとは限らない。
【０００７】
したがって、免疫療法の安全性を向上させ、特定の免疫療法に対する患者（ｐａｔｅｎｔ）の反応を予測するために、悪性細胞を検出する際の使用に適したがん抗原を検出し、かつ／またはオンターゲットオフ組織の効果を予測する、高感度かつ堅牢な診断アッセイが依然として必要である。
【０００８】
本発明者らは、古典的表面がん抗原とＭＨＣ複合体提示タンパク質由来ペプチドの両方に適用可能な、がん患者の腫瘍抗原をスクリーニングするためのハイスループットフォーマットで実行可能な統合的かつ直接的な読み出しを備えた高度に柔軟なアッセイを開発した。本発明は、がん患者の診断、免疫療法に対する臨床応答の予測、および免疫療法の安全性測定に適用される。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、概して、標的抗原、例えば、試料中（特に患者由来の試料中）の腫瘍標的抗原および／または腫瘍細胞の存在を判定するための診断アッセイに関するものであり、また、標的抗原の検出を腫瘍細胞に応答するレポーター細胞の活性化と組み合わせる。本発明のアッセイは、患者試料をスクリーニングすること、ならびに表面抗原および／またはＭＨＣ提示されたタンパク質由来ペプチドとの関連での抗原密度の正確な測定を可能にすることに適している。本発明のアッセイは、がん免疫療法に対する臨床応答の可能性を予測するためにさらに有用である。
【００１０】
したがって、本明細書において提供されるのは、試料中の腫瘍細胞の存在を判定するための診断アッセイであって、以下のステップ：
ａ）試料を、抗原結合ドメインと認識ドメインとを含む抗原結合分子と接触させるステップであって、抗原結合ドメインが、腫瘍細胞に特異的に結合可能な標的抗原結合部分を含む、接触させるステップ；
ｂ）試料を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞と接触させるステップであって、レポーターＣＡＲ−細胞が、
ｉ．応答エレメントに作動可能に結合されており、認識ドメインに特異的に結合可能なＣＡＲ；
ｉｉ．応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子；
を含む、接触させるステップ：および
ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定して腫瘍細胞の存在を確認することにより、Ｔ細胞の活性化を判定するステップ
を含む診断アッセイである。
【００１１】
一実施態様において、抗原結合ドメインはＦａｂ断片であり、認識ドメインはＦｃドメインである。
【００１２】
一実施態様において、抗原結合分子は、ＩｇＧクラス抗体、特にＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプ抗体である。
【００１３】
一実施態様において、認識ドメインは、変異Ｆｃドメインであり、変異Ｆｃドメインは、非変異親Ｆｃドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ＣＡＲは、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することはできるが、非変異親Ｆｃドメインには特異的に結合することができない。
【００１４】
一実施態様において、変異体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基１１７、１１８、１３６、１８０、１９３、２１２、２１４および３１８からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を含み、特に、変異体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基１１７にロイシンからアラニン、残基１１８にロイシンからアラニン、位置１３６にイソロイシンからアラニン、残基１８０にアスパラギンからアラニン、残基１９３にヒスチジンからアラニン、残基２１２にプロリンからグリシン、残基２１４にプロリンからグリシン、および／または残基３１８にヒスチジンからアラニンへのアミノ酸置換を含む。
【００１５】
一実施態様において、変異体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基２１２の位置にアミノ酸置換を含み、特に、変異体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基２１２にプロリンからグリシンへのアミノ酸置換を含む。
【００１６】
一実施態様において、認識ドメインはタグを含み、ＣＡＲはタグを含む認識ドメインに特異的に結合することはできるが、タグを含まない認識ドメインには特異的に結合することができない。
【００１７】
一実施態様において、タグはハプテン分子であり、ハプテン分子は、特に、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）およびフルオレセイン（ＦＩＴＣ）からなる群から選択される。
【００１８】
一実施態様において、タグはポリペプチドタグであり、ポリペプチドタグは、特に、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ａｖｉタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＧＣＮ４タグおよびＮＥタグからなる群から選択される。
【００１９】
一実施態様において、ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞内刺激シグナル伝達および／または補助刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【００２０】
一実施態様において、細胞内シグナル伝達および／または補助シグナル伝達ドメインの活性化は、応答エレメントの活性化をもたらす。
【００２１】
一実施態様において、応答エレメントの活性化は、レポーター遺伝子の発現をもたらす。
【００２２】
一実施態様において、試料は、疾患に罹患している個人に由来する患者試料であり、特に疾患ががんである。
【００２３】
一実施態様において提供されるのは、試料中の腫瘍細胞の存在を判定するための診断キットであって、
（ａ）腫瘍細胞に特異的に結合可能な抗原結合分子；および
（ｂ）（ｉ）抗原結合分子に特異的に結合可能なＣＡＲと（ｉｉ）応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子とを含む形質導入Ｔ細胞であって、ＣＡＲが応答エレメントに作動的に結合されている、形質導入Ｔ細胞
を含む診断キットである。
【００２４】
一実施態様において提供されるのは、がんの診断における使用のための、本明細書に記載されるキットである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１は、診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイの模式図を示す。図１Ａは、診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイの一実施態様を示す。Ｆｃ（認識ドメイン）においてジゴキシゲニニル化（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎｙｌａｔｅｄ）された標的抗原結合ＩｇＧは、抗ジゴキシゲニンＣＡＲ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＴ細胞によって認識され得る。この認識は、発光（ｃｐｓ）を測定することによって検出可能な、細胞の活性化をもたらす。
【図１Ｂ】図１Ｂは、診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイのもう一つの実施態様を示す。Ｐ３２９Ｇ変異を有するＴＡＡ結合ＩｇＧは、抗Ｐ３２９Ｇ  ＣＡＲ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＴ細胞によって認識することができる。この認識は、発光（ｃｐｓ）を測定することによって検出可能な、細胞の活性化をもたらす。
【図２Ａ−Ｃ】図２は、本発明で使用される様々なＣＡＲフォーマットの構造を示す。図２ＡはＦａｂフォーマットの構造を示している。Ｉｇ重鎖断片およびＩｇ軽鎖からなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが描かれている。重鎖に結合したリンカーは、抗原認識ドメインと、細胞内補助刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）に融合され、ひいては刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）に融合されているアンカー型膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）とを接続する。図２Ｂは、重鎖と軽鎖の交換を伴うＦａｂフォーマットの構造を示す。Ｉｇ重鎖断片およびＩｇ軽鎖からなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが描かれている。軽鎖定常ドメインに結合したリンカーは、抗原認識ドメインと、細胞内補助刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）に融合され、ひいては刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）に融合されているアンカー型膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）とを接続する。図２Ｃは、ｓｃＦａｂフォーマットの構造を示す。描かれているのは、リンカーで接続されたＩｇ重鎖断片とＩｇ軽鎖からなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインである。重鎖に結合したリンカーは、抗原認識ドメインと、細胞内補助刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）に融合され、ひいては刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）に融合されているアンカー型膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）とを接続する。
【図２Ｄ−Ｆ】図２Ｄは、ＶＨ−ＶＬ交換を伴うｃｒｏｓｓＦａｂフォーマットの構造を示す。描かれているのは、ＶＨドメインとＶＬドメインが交換されているＩｇ重鎖断片とＩｇ軽鎖からなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインである。重鎖定常ドメインに結合したリンカーは、抗原認識ドメインと、細胞内補助刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）に融合され、ひいては刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）に融合されているアンカー型膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）とを接続する。図２Ｅは、ＣＨ−ＣＬ交換を伴うｃｒｏｓｓＦａｂフォーマットの構造を示す。描かれているのは、ＣＨドメインとＣＬドメインが交換されているＩｇ重鎖断片とＩｇ軽鎖からなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインである。軽鎖定常ドメインに結合したリンカーは、抗原認識ドメインと、細胞内補助刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）に融合され、ひいては刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）に融合されているアンカー型膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）とを接続する。図２Ｆは、リンカーによって接続された可変重鎖および可変軽鎖からなり、細胞外抗原認識ドメインを有する古典的ｓｃＦｖフォーマットの構造を示す。可変軽鎖に結合したリンカーは、抗原認識ドメインと、細胞内補助刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）に融合され、ひいては刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）に融合されているアンカー型膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）とを接続する。
【図３Ａ−Ｆ】図３は、本発明により使用されるＣＡＲをコードする例示的発現コンストラクトのモジュール成分を示す模式図である。図３Ａおよび図３Ｂは、例示的なＦａｂフォーマットを示す。図３Ｃは、例示的なｓｃＦａｂフォーマットを示す。図３Ｄおよび図３Ｅは、例示的なｃｒｏｓｓＦａｂフォーマットを示す。図３Ｆは古典的なｓｃＦｖフォーマットを示している。
【図４】ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）の構造式を示す。
【図５】抗ジゴキシゲニンＣＡＲによって特異的に認識され得る例示的なジゴキシゲニニル化ＩｇＧ１分子を示す。
【図６Ａ−Ｂ】図６は、抗ジゴキシゲニンＣＡＲによって認識される選択的ジゴキシゲニル化（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｙｌａｔｅｄ）抗原結合分子を示す。本実施態様では、標的抗原結合ドメインと認識ドメインは同一のドメインであり、すなわち、ジゴキシゲニンハプテンタグは抗原結合ドメインに結合されており、この場合抗原結合ドメインは認識ドメインの機能も発揮する。図６Ａは、抗ジゴキシゲニンＣＡＲによって認識され得るジゴキシゲニニル化されたＦａｂ分子を示す。図６Ｂは、抗ジゴキシゲニンＣＡＲによって認識され得るジゴキシゲニル化されたｓｃＦｖ分子を示す。
【図７】抗ＣＤ２０標的化抗体ＧＡ１０１のジゴキシゲニル化が成功したことを確認するウエスタンブロットを示す。ジゴキシゲニニル化は、ウエスタンブロット分析で抗ジゴキシゲニン−ＡＰ  Ｆａｂ断片により検出した。
【図８】Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター細胞上の抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖの表面検出を示す。
【図９】ＣＤ２０を発現する標的細胞としてのＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞と、１０倍モル過剰のジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでジゴキシゲニニル化された抗ＣＤ２０  ＩｇＧ抗体（ＧＡ１０１）とを用いる診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイを示す。この抗体は一方では腫瘍関連抗原を認識し、他方ではＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される。抗ジゴキシゲニン‐ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ‐Ｔ細胞のソート済みのプールをエフェクター細胞として用いた。
【図１０】本発明による抗Ｐ３２９Ｇ  ＣＡＲによって認識される、ＦｃドメインおけるＰ３２９Ｇ変異を有する例示的なＩｇＧ１分子を示す。
【図１１Ａ−Ｂ】図１１は、ＣＤ２０を発現するＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を標的細胞として用いる診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイを示す。Ｐ３２９Ｇ変異を有する抗ＣＤ２０  ＩｇＧ抗体（ＧＡ１０１）が用いられたが、これは一方では腫瘍関連抗原を認識し、他方でＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴのレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される。図１１Ａにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ‐Ｔ細胞のソート済みのプールをレポーター細胞として用いた。図１１Ｂにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ‐Ｔ細胞のソート済みのプールをレポーター細胞として用いた。
【図１２Ａ−Ｄ】図１２は、ＣＤ２０腫瘍細胞を標的細胞として用いるＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ‐Ｔ細胞アッセイを示す。Ｐ３２９Ｇ変異を有する抗ＣＤ２０  ＩｇＧ抗体（ＧＡ１０１）が用いられたが、これは、腫瘍関連抗原を認識し、本発明に従って使用されるＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識されるものである。図１２Ａにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の単一クローン５をレポーター細胞として使用し、ＷＳＵＤＬＣＬ２細胞を腫瘍細胞として使用した。図１２Ｂにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の単一クローン２をレポーター細胞として使用し、ＷＳＵＤＬＣＬ２細胞を腫瘍細胞として使用した。図１２Ｃにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の単一クローン５をレポーター細胞として使用し、ＳＵＤＨＬ４細胞を腫瘍細胞として使用した。図１２Ｄにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の単一クローン２をレポーター細胞として使用し、ＳＵＤＨＬ４細胞を腫瘍細胞として使用した。
【図１３Ａ】図１３は、接着性ＦＡＰを発現するＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ  ｃｌ  １９腫瘍細胞を標的細胞として用いて実施した診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原であり、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される、Ｐ３２９Ｇ変異を有する抗ＦＡＰ  ＩｇＧ抗体クローン４Ｂ９を使用した。アイソタイプ対照として、Ｐ３２９Ｇ変異を有するＩｇＧ  ＤＰ４７／ｖｋ３を含めた。図１３Ａにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済みのプールをレポーター細胞として使用した。
【図１３Ｂ】図１３Ｂにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済みのプールをレポーター細胞として使用した。
【図１３Ｃ】図１３Ｃにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済みのプールをレポーター細胞として使用した。
【図１３Ｄ】図１３Ｄにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済みのプールをレポーター細胞として使用した。
【図１４Ａ】図１４は、接着性ＣＥＡを発現するＭＫＮ４５腫瘍細胞を標的細胞として用いる診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原であり、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識され、Ｐ３２９Ｇ変異をともに有する抗ＣＥＡ  ＩｇＧクローンＡ５Ｂ７または抗ＣＥＡ  ＩｇＧクローン  Ｔ８４  ＬＣＨＡのいずれかを使用した。さらに、イソタイプ対照として、Ｐ３２９Ｇ変異を伴うＩｇＧ  ＤＰ４７／ｖｋ３を含めた。図１４Ａにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＮＦＡＴ  Ｔ細胞のソート済みのプールをレポーター細胞として使用した。
【図１４Ｂ】図１４Ｂにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＮＦＡＴ  Ｔ細胞のソート済みのプールをレポーター細胞として使用した。
【図１４Ｃ】図１４Ｃにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＮＦＡＴ  Ｔ細胞のソート済みのプールをレポーター細胞として使用した。
【図１４Ｄ】図１４Ｄにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＮＦＡＴ  Ｔ細胞のソート済みのプールをレポーター細胞として使用した。
【図１５Ａ】図１５は、接着性ＴＮＣを発現するＣＴ２６ＴＮＣ  ｃｌ  １９腫瘍細胞を標的細胞として用いる診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される、Ｐ３２９Ｇ変異を有する抗ＴＮＣ  ＩｇＧクローンＡ２Ｂ１０を使用した。さらに、アイソタイプ対照として、Ｐ３２９Ｇ変異を伴うＩｇＧ  ＤＰ４７／ｖｋ３を含めた。図１５Ａにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＮＦＡＴ  Ｔ細胞のソート済みのプールをレポーター細胞として使用した。
【図１５Ｂ】図１５Ｂにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＮＦＡＴ  Ｔ細胞のソート済みのプールをレポーター細胞として使用した。
【図１５Ｃ】図１５Ｃにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＮＦＡＴ  Ｔ細胞のソート済みのプールをレポーター細胞として使用した。
【図１５Ｄ】図１５Ｄにおいて、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＮＦＡＴ  Ｔ細胞のソート済みのプールをレポーター細胞として使用した。
【図１６Ａ−Ｂ】図１６Ａと図１６Ｂは、接着性ＴＮＣを発現するＣＴ２６ＴＮＣ  ｃｌ  １９腫瘍細胞を標的細胞として用いる診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイを示す。腫瘍関連抗原を認識し、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される、Ｐ３２９Ｇ変異を有する抗ＴＮＣ  ＩｇＧクローンＡ２Ｂ１０を使用した。さらに、アイソタイプ対照として、Ｐ３２９Ｇ変異を伴うＩｇＧ  ＤＰ４７／ｖｋ３を含めた。抗Ｐ３２９Ｇ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済みのプールをレポーター細胞として使用した。
【図１７】ＭＨＣ提示されたペプチドを検出するための診断用レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイの概略図を示す。
【図１８Ａ−Ｄ】Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞における、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１−ペプチド結合ＩｇＧ（Ｐ３２９Ｇ変異を有する）変異体によるＲＭＦまたはＶＬＤ−ペプチドパルスＴ２細胞へのＣＡＲ−ＮＦＡＴシグナル伝達の活性化を示す。レポーター細胞として、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済みのプールを使用した。各図は、特定のバインダー（３３Ｆ０５、１１Ｄ０６、３３Ｈ０９および５Ｅ１１）の希釈を示す。ＲＭＦ−ペプチド（標的）上のシグナルとＶＬＤ−ペプチド（オフターゲット）上のシグナルの比較は、活性化の特異性を評価するのに役立つ。
【図１９】Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＡＲ−ＮＦＡＴシグナル伝達の活性化を示し、ＲＭＦ−ペプチドまたはＶＬＤ−ペプチドでパルスされたＴ２細胞とのインキュベーション時の選択されたＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２−バインダー３３Ｆ０５、３３Ｈ０９、１１０６および５Ｅ１１の特異性を評価する。非パルスＴ２細胞あり、Ｔ２細胞なし、またはＩｇＧなしのＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞を使用した陰性対照が含まれる。その後ルシフェラーゼ基質を添加し、発光を測定することによって活性化（Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞からのルシフェラーゼシグナル）を測定した。
【図２０Ａ−Ｂ】ＲＭＦ−ペプチドまたはＶＬＤ−ペプチドでパルスされたＴ２細胞を用いたＦＡＣＳによるＷＴ１／ＨＬＡ−バインダー５Ｅ１１および３３Ｈ０９の特異性の評価を示す。
【図２１】ＡＭＬ患者の骨髄中のＷＴ１陽性細胞を検出するためにＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター細胞を形質導入した診断用レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイの概略図である。
【図２２Ａ】図２２Ａから図２２Ｃは、結腸癌のＣＥＡおよびＦＡＰ陽性ヒト肺転移と、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を有するヒトＩｇＧ１抗ＣＥＡ  Ｔ８４  ＬＣＨＡまたは抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗体との接触時の診断用レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化を示す。図２２Ａは、結腸癌試料の肺転移のＣＥＡおよびＦＡＰ抗原の発現レベルを示すＦＡＣＳプロットである。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化を示す。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
「親和性」は、分子（例えば抗体またはＣＡＲ）の単一結合部位とその結合パートナー（例えばリガンド）との間の非共有結合的相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原および／または受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（ＫＤ）によって表され、この解離定数は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ、ｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じである限り、同等の親和性が異なる速度定数を含むことがある。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で既知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性の好ましい測定方法は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）であり、好ましい測定温度は２５℃である。
【００２７】
用語「アミノ酸」（「ａａ」）は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸ミメティックを指す。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝子コードによってコードされたアミノ酸、および後に修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このようなアナログ（例えばノルロイシン）は、改変されたＲ基または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。アミノ酸ミメティックとは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。アミノ酸は、本明細書では、それらの一般的に知られている３文字の記号かＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される１文字の記号のいずれかによって表すことができる。
【００２８】
本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入および修飾を包含することを意図している。最終コンストラクトが所望の特性を有するという条件で、置換、欠失、挿入および修飾の任意の組み合わせを行って、最終コンストラクトに到達することができる。アミノ酸配列の欠失および挿入には、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失、ならびにアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸の置換である。アミノ酸置換には、天然に存在しないアミノ酸による置換、または２０種類の標準アミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）の天然に存在するアミノ酸誘導体による置換が含まれる。アミノ酸変異は、当技術分野で周知の遺伝学的または化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法には、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれ得る。化学修飾のような遺伝子工学以外の方法でアミノ酸の側鎖基を変化させる方法も有用であることが企図されている。
【００２９】
本明細書において「抗体」という用語は最も広い意味で用いられ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。したがって、本発明の文脈において、抗体という用語は、完全な免疫グロブリン分子およびそのような免疫グロブリン分子の部分に関する。さらに、本明細書で議論されるように、この用語は、修飾および／または改変された抗体分子、特に修飾された抗体分子に関する。この用語はまた、組換えでまたは人工的に生成／合成された抗体にも関する。本発明の文脈において、抗体という用語は、免疫グロブリンという用語と互換的に使用される。
【００３０】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合し、インタクトな抗体の一部分から構成されるインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、クロスオーバーＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ）、および単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、ＨｕｄｓｏｎらＮａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、ＰｌｕｃｋｔｈｕｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３巻，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ編，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），２６９−３１５頁（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号；および米国特許第５５７１８９４号と同第５５８７４５８号も参照されたい。ダイアボディは、２つの抗原結合部位を有する抗体断片であって、二価または二重特異性であり得る。例えば、ＥＰ第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照。トリアボディおよびテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ社、マサチューセッツ州ウォルサム；例えば米国特許第６２４８５１６号参照）。抗体断片は、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解、および組換え宿主細胞（例えば大腸菌またはファージ）による生成を含むがこれらに限定されない様々な技術で作製することができる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体／免疫グロブリンとその誘導体（例えば断片）である。さらに、本明細書で議論されるように、この用語は、修飾および／または改変された抗原結合分子、特に修飾された抗体分子に関する。この用語はまた、組換えでまたは人工的に生成／合成された抗体にも関する。本発明の文脈において、抗原結合分子は、好ましくは、抗体またはその断片である。
【００３２】
本明細書で使用される「抗原結合部分」という用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、それが付着している実体（例えば免疫グロブリンまたはＣＡＲ）を標的部位へ、例えば抗原決定基を有する特定の型の腫瘍細胞または腫瘍間質へ、または腫瘍細胞上の抗原決定基に結合している免疫グロブリンへ誘導することができる。別の実施態様では、抗原結合部分は、その標的抗原を介してシグナル伝達を活性化することができ、例えば、シグナル伝達は、抗原決定基がＴ細胞上のＣＡＲに結合すると活性化される。本発明の文脈において、抗原結合部分は、本明細書でさらに定義されるように、抗体およびその断片、ならびに抗原結合受容体（例えばＣＡＲ）およびその断片に含まれ得る。抗原結合部分には、例えば、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメインが含まれる。
【００３３】
本発明の文脈において、用語「抗原結合受容体」は、アンカー型膜貫通ドメインと、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む分子に関する。抗原結合受容体（例えばＣＡＲ）は、異なる供給源からのポリペプチド部分から作製することができる。したがって、それは、「融合タンパク質」および／または「キメラタンパク質」としても理解され得る。通常、融合タンパク質は、もともと別々のタンパク質をコードしていた２つ以上の遺伝子（または好ましくはｃＤＮＡ）が結合することによって作り出されるタンパク質である。この融合遺伝子（または融合ｃＤＮＡ）の翻訳は、好ましくは元のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドを生じる。組換え融合タンパク質は、生物学的研究または治療に使用するための組換えＤＮＡ技術によって人工的に作製される。本発明の文脈において、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）は、例えばＣＤ３ｚおよびＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインにスペーサー配列によって融合されるアンカー型膜貫通ドメインに融合される抗原結合部分を含む細胞外部分を含む抗原結合受容体であると理解される。
【００３４】
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、すなわち１または複数のアミノ酸残基を指す。天然の免疫グロブリン分子は一般に、２つの抗原結合部位を有し、ＦａｂまたはｓｃＦｖ分子は通常、単一の抗原結合部位を有する。
【００３５】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部または全部に特異的に結合し、かつ抗原の一部または全部に相補的な領域を含む抗体または抗原結合受容体（例えばＣＡＲ）の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば１または複数の免疫グロブリン可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）により提供され得る。特に、抗原結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。
【００３６】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗原への結合に関与する免疫グロブリン重鎖または軽鎖のドメインを指す。通常、天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ、ＶＬ）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）備える。例えば、Ｋｉｎｄｔら，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６編，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，９１頁（２００７）を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨまたはＶＬドメインで通常は十分である。
【００３７】
本明細書において使用される用語「ＡＴＤ」は、細胞の細胞膜（複数可）に組み込むことができるポリペプチド伸長部を画定する「アンカー膜貫通ドメイン」を指す。ＡＴＤは、これらの細胞外および／または細胞内ポリペプチドドメインも同様に細胞膜に閉じ込められるような、さらなる細胞外および／または細胞内ポリペプチドドメインに融合することができる。本発明で使用される抗原結合受容体の文脈では、ＡＴＤは、抗原結合受容体（例えば本発明に従って使用されるＣＡＲ）の膜付着および閉じ込めをもたらす。
【００３８】
本発明に従って使用される抗原結合受容体（例えばＣＡＲ）および抗体の文脈で使用される「〜への結合」という用語は、「抗原相互作用部位」と抗原との互いの結合（相互作用）を表す。用語「抗原相互作用部位」は、特定の抗原または特定の抗原群との特異的相互作用の能力を示すポリペプチドのモチーフを表す。上記結合／相互作用はまた、「特異的認識」を表すとも理解される。「特異的に認識する」という用語は、本発明に従って、抗原結合受容体が認識ドメイン、すなわち本明細書に記載の修飾分子と特異的に相互作用および／または結合することが可能であるが、非修飾分子は認識されないことを意味する。抗原結合受容体（例えばＣＡＲ）の抗原結合部分は、同一分子上の異なるエピトープを認識し、それと相互作用し、かつ／またはそれに結合することができる。この用語は、抗原結合受容体の特異性、すなわち、本明細書で記載されているような修飾分子の特定の領域、すなわち修飾されたＦｃドメインを識別するその能力に関する。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、例えば、抗原を含むポリペプチドの立体構造の変化の誘導、抗原を含むポリペプチドのオリゴマー化、抗原結合受容体のオリゴマー化等によるシグナルの開始をもたらし得る。このように、抗原相互作用部位のアミノ酸配列中の特定のモチーフと抗原は、それらの一次、二次または三次構造の結果として、および前記構造の二次修飾の結果として、互いに結合する。〜に結合するという用語は、線状エピトープに関するだけではなく、立体構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）、構造エピトープ（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）、または標的分子の２つの領域もしくはその一部からなる不連続なエピトープにも関係し得る。本発明の文脈において、立体構造エピトープは、ポリペプチドが天然タンパク質へと折り畳まれるときに分子の表面上で一緒になる、一次配列では離れていた２つ以上の別個のアミノ酸配列によって決定される（Ｓｅｌａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６６（１９６９），１３６５およびＬａｖｅｒ，Ｃｅｌｌ  ６１（１９９０），５５３−５３６）。さらに、「〜に結合する」という用語は、本発明の文脈において、「〜と相互作用する」という用語と互換的に使用される。抗原結合部分（例えばＦａｂまたはｓｃＦＶドメイン）の、特定の標的抗原決定基への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）または当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ計器での解析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ  Ｊ  １７，３２３−３２９（２０００））、および古典的結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｓ  ２８，２１７−２２９（２００２））により測定することができる。一実施態様では、抗原結合部分の無関係なタンパク質への結合の程度は、特にＳＰＲによって測定した場合、抗原結合部分の標的抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、標的抗原に結合する抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭまたは≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０��９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。抗原結合部分は、１μＭ以下のＫＤを有する場合、標的抗原に「特異的に結合」すると言われ、このような相互作用を本明細書では「特異的結合」と呼ぶ。本発明に従って使用される抗原結合受容体（例えばＣＡＲ）は、認識ドメイン、例えばＦｃドメイン、好ましくは修飾されたＦｃドメインに特異的に結合するか、またはそれと相互作用する。研究中のコンストラクトのパネルの交差反応性は、例えば、従来の条件下での抗原結合部分のパネル（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８８）ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９９）を参照のこと）の、対象の認識ドメインへの、例えば修飾Ｆｃドメインおよび親の非修飾Ｆｃドメインへの結合を評価することによって試験され得る。対象のドメインには結合するが、構造的に密接に関連するドメイン、例えば非修飾Ｆｃドメインには本質的に結合しないコンストラクト（すなわちＦａｂ断片、ｓｃＦｖｓなど）のみが対象の認識ドメインに特異的であると考えられ、本文書で提供する方法に従ってさらなる研究のために選択される。これらの方法は、とりわけ、構造的および／または機能的に密接に関連するドメインを用いた結合研究、遮断および競合研究を含み得る。結合研究はまた、ＦＡＣＳ解析、表面プラズモン共鳴（例えばＢＩＡｃｏｒｅによるＳＰＲ）、分析用超遠心法、等温滴定熱量測定、蛍光偏光測定法、蛍光分光法、または放射性標識リガンド結合アッセイによるものを含む。
【００３９】
本明細書で使用される用語「ＣＤＲ」は、当技術分野でよく知られている「相補的決定領域」をいう。ＣＤＲは、上記分子の特異性を決定し、特定のリガンドと接触させる免疫グロブリンまたは抗原結合受容体の一部である。ＣＤＲは分子の中で最も可変性の高い部分であり、上記分子の抗原結合の多様性に寄与している。各Ｖドメインには３つのＣＤＲ領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が存在する。ＣＤＲ−Ｈは可変重鎖のＣＤＲ領域を示し、ＣＤＲ−Ｌは可変軽鎖のＣＤＲ領域を指す。ＶＨは可変重鎖を意味し、ＶＬは可変軽鎖を意味する。Ｉｇ由来の領域のＣＤＲ領域は、「Ｋａｂａｔ」（Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th edit. NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services (1991); Chothia J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) )または「Ｃｈｏｔｈｉａ」(Nature 342 (1989), 877-883）に記載の通りに決定され得る。
【００４０】
用語「ＣＤ３ｚ」は、「Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖」および「ＣＤ２４７」としても知られる、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖を指す。
【００４１】
用語「キメラ抗原受容体」または「キメラ受容体」または「ＣＡＲ」は、スペーサー配列によって（例えばＣＤ３ｚおよびＣＤ２８）の細胞内シグナル伝達ドメインに融合された抗原結合部分（例えばｓｃＦｖまたはＦａｂ）の細胞外部分から構成される、抗原結合受容体を指す。
【００４２】
抗体または免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、およびＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、μと呼ばれる。
【００４３】
「クロスオーバーＦａｂ分子」（「ｃｒｏｓｓＦａｂ」または「クロスオーバーＦａｂ断片」とも称される）は、Ｆａｂ重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているＦａｂ分子を意味し、すなわちｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、軽鎖可変領域と重鎖定常領域とからなるペプチド鎖および重鎖可変領域と軽鎖定常領域とからなるペプチド鎖を含む。明確性のために、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変領域が交換されているｃｒｏｓｓＦａｂ断片における、重鎖定常領域を含むペプチド鎖を、本明細書ではクロスオーバーＦａｂ分子の重鎖と呼ぶ。逆に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常領域が交換されているｃｒｏｓｓＦａｂ断片における、重鎖可変領域を含むペプチド鎖を、本明細書ではｃｒｏｓｓＦａｂ断片の重鎖と呼ぶ。したがって、ｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、重鎖可変領域および軽鎖定常領域（ＶＨ−ＣＬ）から構成される重鎖または軽鎖、ならびに軽鎖可変領域および重鎖定常領域（ＶＬ−ＣＨ１）から構成される重鎖または軽鎖を含む。これに対して、「Ｆａｂ」または「従来のＦａｂ分子」とは、その天然フォーマットのＦａｂ分子、すなわち重鎖可変領域と定常領域（ＶＨ−ＣＨ１）からなる重鎖、および軽鎖可変領域と定常領域（ＶＬ−ＣＬ）からなる軽鎖を含むＦａｂ分子を意味する。
【００４４】
本明細書で使用される用語「ＣＳＤ」は、補助刺激シグナル伝達ドメインを指す。
【００４５】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；ならびにＢ細胞の活性化が含まれる。
【００４６】
本明細書において使用される「操作する」、「操作された」、「操作」という用語は、ペプチド骨格のいかなる操作、または天然に存在するポリペプチドもしくは組換えポリペプチドもしくはその断片の翻訳後修飾を含むと考えられる。操作には、アミノ酸配列の、グリコシル化パターンの、または個々のアミノ酸の側鎖基の修飾およびこれらの手法の組み合わせが含まれる。
【００４７】
用語「発現カセット」とは、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換えでまたは人工的に生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片に組み込むことができる。発現ベクターの組換え発現カセット部分には、数ある配列の中でも特に、転写される核酸配列およびプロモーターが典型的に含まれる。
【００４８】
「Ｆａｂ分子」は、抗原結合分子の重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨおよびＣＨ１ドメインと軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬおよびＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。
【００４９】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を表すのに使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変動するが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、重鎖のＣｙｓ２２６からまたはＰｒｏ２３０から、カルボキシル末端までと定義される。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもしてなくてもよい。本明細書中に別途指定のない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれる「ＥＵ番号付けシステム」による。本明細書で使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち安定した自己会合が可能な、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧＦｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ  ＣＨ２およびＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメインを含む。
【００５０】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは一般に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ配列およびＦＲ配列は一般に、ＶＨ（またはＶＬ）の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。
【００５１】
用語「完全長抗体」は、２つの「完全長抗体重鎖」および２つの「完全長抗体軽鎖」からなる抗体を意味する。「完全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）および抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）（略してＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３と称される）；（サブクラスＩｇＥの抗体の場合には）ならびに抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）で構成されるポリペプチドである。好ましくは、「完全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向にＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２およびＣＨ３で構成されるポリペプチドである。「完全長抗体軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）（略してＶＬ−ＣＬ）で構成されるポリペプチドである。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）はκ（カッパ）またはλ（ラムダ）であってもよい。２つの完全長抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間、および完全長抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して結合されている。典型的な完全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１およびＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのような天然抗体である。本発明により使用される完全長抗体は、単一種、例えばヒト由来であり得るか、またはそれらはキメラ化もしくはヒト化抗体であってもよい。いくつかの実施態様において、本発明に従って使用される完全長抗体は、両方とも同じ抗原に特異的に結合するＶＨとＶＬの対によってそれぞれ形成される２つの抗原結合部位を含む。さらなる態様において、本発明に従って使用される完全長抗体は、各々がＶＨとＶＬの対によって形成される２つの抗原結合部位を含み、ここで、２つの抗原結合部位は異なる抗原に結合し、例えば、この場合抗体は二重特異性である。上記完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端は、上記重鎖または軽鎖のＣ末端の最後のアミノ酸を指す。
【００５２】
「融合した」とは、構成要素同士（例えばＦａｂと膜貫通ドメイン）が、ペプチド結合により、直接、または１以上のペプチドリンカーを介し、結合されていることを意味する。
【００５３】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞と、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同じでなくてもよく、変異を伴っていてもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞でスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する変異子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明に従って使用される抗体を生成するのに使用できる任意の種類の細胞系である。宿主細胞には、いくつか例を挙げると、培養細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞のような哺乳動物の培養細胞；酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞を含み、さらには、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物または培養植物もしくは動物の組織の内部に含まれる細胞が含まれる。
【００５４】
本明細書で使用される用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、配列が超可変であり、かつ／または構造的に定義されるループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、天然の４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、超可変ループ由来および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を通常含み、最も高い配列可変性を有し、かつ／または抗原認識に関与している。ＶＨのＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して本明細書では交換可能に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８３）ａｎｄ  ｂｙ  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−９１７（１９８７）に記載されており、そこでの定義には、アミノ酸残基を互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。とは言え、抗体および／または抗原結合受容体またはそれらのバリアントのＣＤＲを指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義され使用される用語の範囲内にあることが意図されている。上記引用文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較のために以下の表Ａに示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列および大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列があれば、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを慣用的に決定することができる。
【００５５】
表１：ＣＤＲの定義１
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１表１のＣＤＲ定義の番号付けは全て、Ｋａｂａｔらが定めた番号付け規則に従っている（下記参照）。
２表１で使用されている、「ｂ」が小文字の「ＡｂＭ」は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの「ＡｂＭ」抗体モデリングソフトウエアによって定義されているＣＤＲを指す。
【００５６】
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列そのもの以外の実験データに頼らなくとも、このＫａｂａｔ番号付けのシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。「Ｋａｂａｔ番号付け」は、本明細書で使用される場合、Ｋａｂａｔら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって定められた番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗原結合部分の可変領域内の特定のアミノ酸残基位置への言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる。配列表のポリペプチド配列は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされていない。しかしながら、配列表の配列の番号をＫａｂａｔ番号付けに変換することは、当業者の通常の技術の範囲内である。
【００５７】
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えばヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えばマウスおよびラット）が含まれる。特に、個体または対象はヒトである。
【００５８】
「単離された」核酸分子またはポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明においては単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中の（部分的にまたは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外か、またはその天然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＲＮＡ転写物、ならびにプラスおよびマイナス鎖型および二本鎖型をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで含む。さらに、本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、人工的に生成された当該分子も含まれる。また、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーターといった調節エレメントを含んでも含まなくてもよい。
【００５９】
本発明の参照ヌクレオチド配列と、例えば、少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドにつき５つまでの点変異を含み得ること以外は、参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが欠失しているかまたは別のヌクレオチドで置換されていてもよく、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置で、またはこれら末端位置の間のどの位置で起こってもよく、参照配列中の残基の間に個々に散在してもよいし、あるいは参照配列内に１つもしくは複数の連続した群として散在してもよい。実際問題として、特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて後述するもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータープログラムを用いて慣例的に判定することができる。
【００６０】
「単離されたポリペプチド」またはその変異体もしくは誘導体は、その自然の環境にないポリペプチドであることが意図される。特定の精製度が求められるわけではない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然または自然の環境から除去することができる。宿主細胞に発現される組換え生産ポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって分離、分画または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様に、本発明において単離されたものとみなされる。
【００６１】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを得るために適宜ギャップを挿入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような一般に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当業者の技量の範囲内にある様々な方法で達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。ただし、本明細書において、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムはジェネンテック社によって作成されたもので、そのソースコードは、ユーザー文書と共に米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、ここで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ジェネンテック社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から一般に入手可能であり、またはソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含めたＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの（またはこれに対する）アミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ａは、所与のアミノ酸配列Ｂと（またはこれに対して）特定のアミノ酸配列同一性％を有するかまたは含む所与のアミノ酸配列Ａ、ということもできる）は次のように計算される：分数Ｘ／Ｙの１００倍（ここで、Ｘは、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によってＡとＢのそのプログラムのアライメントにおいて一致（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｍａｔｃｈ）としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。
【００６２】
用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチドによって構成されるプリン塩基およびピリミジン塩基を含む塩基の配列に関連し、ここで、該塩基は核酸分子の一次構造を表す。ここで、核酸分子という用語は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡの合成形態およびこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを含む。さらに、核酸分子という用語は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む。さらに、本明細書に記載の核酸分子は、当業者が容易に認識するように、非天然または誘導体化ヌクレオチド塩基を含むことができる。
【００６３】
本明細書中で使用される「ＮＦＡＴ」は、「活性化Ｔ細胞の核内因子」を指し、ほとんどの免疫細胞で発現される転写因子のファミリーである。ＮＦＡＴファミリーの転写因子の活性化は、カルシウムシグナル伝達に依存している。一例として、Ｔ細胞シナプスを介するＴ細胞活性化は、カルシウム流入をもたらす。細胞内カルシウムレベルが上昇すると、カルシウム感受性ホスファターゼであるカルシニューリンが活性化され、ＮＦＡＴタンパク質のアミノ末端のセリンリッチ領域（ＳＲＲ）とＳＰリピートを速やかに脱リン酸化する。その結果、核局在化シグナルが露出する立体構造変化が生じ、ＮＦＡＴの核内移行と標的遺伝子の活性化が促進される。
【００６４】
本明細書中で使用される「ＮＦＡＴ経路」とは、転写因子のＮＦＡＴファミリーのメンバーの活性の調節につながる刺激を指す。ＮＦＡＴ  ＤＮＡエレメントは、当技術分野で既知であり、本明細書では「ＮＦＡＴ経路の応答エレメント」とも呼ばれる。したがって、「ＮＦＡＴ経路の受容体」とは、ＮＦＡＴの活性の調節を引き起こすことができる受容体を指す。「ＮＦＡＴ経路の受容体」の例は、例えばＴ細胞受容体およびＢ細胞受容体である。
【００６５】
本明細書中で使用される「ＮＦ−κＢ」は、「活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー」を指し、アポトーシス、ウイルス複製、腫瘍形成、様々な自己免疫疾患および炎症反応のメディエーターをコードする多くの遺伝子の調節に関与する転写因子である。ＮＦκＢは、ほとんど全ての真核細胞に存在する。一般には、阻害性カッパＢ（ＩκＢ）タンパク質と複合体を形成することから、不活性な状態で細胞質ゾルに位置している。リガンドが膜内在受容体（「ＮＦ−κＢ経路の受容体」とも呼ばれる）に結合することにより、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）が活性化される。ＩＫＫは２つのキナーゼと１つの調節サブユニットからなる酵素複合体である。この複合体は、ＩκＢタンパク質をリン酸化し、それがユビキチン化を導き、したがってプロテアソームによるこれらのタンパク質の分解を導く。最後に、遊離ＮＦκＢは、活性状態にあり、核に移行し、κＢ  ＤＮＡエレメントに結合し、標的遺伝子の転写を誘導する。
【００６６】
本明細書で使用されるように、「ＮＦ−κＢ経路」とは、ＮＦ−κＢの活性の調節につながる刺激を意味する。例えば、Ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達、ＴＮＦ受容体シグナル伝達、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体シグナル伝達の活性化は、リガンドまたは抗体のいずれかの結合を介して、ＮＦ−κＢの活性化をもたらす。その後、リン酸化されたＮＦ−κＢ二量体はκＢ  ＤＮＡエレメントに結合し、標的遺伝子の転写を誘導する。κＢ  ＤＮＡエレメントは、当技術分野で既知であり、本明細書では「ＮＦ−κＢ経路の応答エレメント」とも呼ばれる。したがって、「ＮＦ−κＢ経路の受容体」とは、ＮＦ−κＢの活性の調節を引き起こすことができる受容体を指す。「ＮＦ−κＢ経路の受容体」の例は、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＮＦ受容体、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体である。
【００６７】
本明細書中で使用される「ＡＰ−１」は、「アクチベータータンパク質１」を指し、分化、増殖およびアポトーシスを含む複数の細胞過程に関与する転写因子である。ＡＰ−１機能は、ＡＰ−１二量体に寄与する特異的なＦｏｓおよびＪｕｎサブユニットに依存する。ＡＰ−１は、回文構造のＤＮＡモチーフ（５’−ＴＧＡ  Ｇ／Ｃ  ＴＣＡ−３’）に結合して、遺伝子発現を調節する。
【００６８】
用語「薬学的組成物」とは、中に含まれる活性成分の生物活性が有効になるような形態の調製物であり、かつ、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。薬学的組成物は、通常、１種以上の薬学的に許容される担体を含む。
【００６９】
「薬学的に許容される担体」は、薬学的組成物中の有効成分以外の成分で、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、バッファー、賦形剤、安定剤または保存剤が含まれる。
【００７０】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ結合（ペプチド結合としても知られる）により直鎖状に結合したモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。ポリペプチドという用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特異的な長さの生成物を指すのではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アミノ酸鎖、または２つ以上のアミノ酸の鎖を指す他のいかなる用語もポリペプチドの定義の範囲内に含まれ、用語ポリペプチドは、これらのいずれの用語の代わりに、またはそれらと互換的に使用することができる。用語ポリペプチドはまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然に発生するアミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されないポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことが意図されている。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から得られるか、または組換え技術により生成されるが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるものではない。ポリペプチドは、化学合成を含むあらゆる方法で生成されてよい。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、または２０００以上の大きさのアミノ酸からなってよい。ポリペプチドは、定義された三次元構造を有することができるが、必ずしもそのような構造を有するとは限らない。定義された三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれているといい、定義された三次元構造を持たないが、多数の異なる立体構造をとることができるポリペプチドは折り畳まれていないという。
【００７１】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子またはコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合または非一般的結合（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。核酸分子という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１または複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。
【００７２】
用語「内因性蛍光を有するタンパク質」とは、タンパク質内の内部アミノ酸の環化および酸化によって、または蛍光補因子の酵素的付加を介して、高度に蛍光性で内因性発色団を形成することができるタンパク質を指す。用語「内因性蛍光を有するタンパク質」には、野生型の蛍光タンパク質および変化したスペクトルまたは物理的性質を示す変異体が含まれる。この用語には、タンパク質内の非修飾チロシン、トリプトファン、ヒスチジンおよびフェニルアラニン基の蛍光寄与のみによって弱い蛍光を示すタンパク質は含まれない。内因性蛍光を有するタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｈｅｉｍら  １９９４，１９９６）変異体、ＣＦＰとしても知られるシアン蛍光変異体（Ｈｅｉｍら  １９９６；Ｔｓｉｅｎ  １９９８）；ＹＦＰとしても知られる黄色蛍光変異体（Ｏｒｍｏら  １９９６；Ｗａｃｈｔｅｒら  １９９８）；サファイアとして知られている紫色興奮性緑色蛍光変異体（Ｔｓｉｅｎ  １９９８；Ｚａｐａｔａ−Ｈｏｍｍｅｒら  ２００３）；および高感度緑色蛍光タンパク質またはＥＧＦＰとして知られているシアン興奮性緑色蛍光変異体（Ｙａｎｇら  １９９６）は、当技術分野で既知であり、例えば生細胞画像化（例、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ）または蛍光分光測光法によって測定することができる。
【００７３】
「結合の低減」、例えばＳＰＲによって測定される、それぞれの相互作用に対する親和性の低下を指す。明確性のために、この用語には、親和性をゼロに（または分析方法の検出限界未満に）下げること、つまり相互作用の完全な消失が含まれる。逆に、「結合の増大」は、それぞれの相互作用に対する結合親和性の上昇を指す。
【００７４】
用語「調節エレメント」とは、ライゲーションされるコード配列の発現に影響を及ぼすために必要なＤＮＡ配列を指す。このような制御配列の性質は、生物によって異なる。原核生物では、制御配列には、一般にプロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターが含まれる。真核生物では一般に、制御配列には、プロモーター、ターミネーター、およびいくつかの例ではエンハンサー、トランスアクチベーターまたは転写因子が含まれる。用語「制御配列」は、少なくとも、その存在が発現に必要である全ての構成要素を含むことが意図されており、また、付加的な有利な構成要素を含むこともできる。
【００７５】
本明細書中で使用される「レポーター遺伝子」は、その発現がアッセイされ得る遺伝子を意味する。１つの好ましい実施態様において、「レポーター遺伝子」は、その産生および検出が、試験される抗体またはリガンドの活性を間接的に検出するための代理として使用されるタンパク質をコードする遺伝子である。レポータータンパク質は、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質である。好ましくは、レポーター遺伝子は、レポーター遺伝子の発現を最小限の試料調製を必要とする簡単かつ迅速なアッセイで検出できるように、触媒活性が簡単なアッセイ法によって検出できる酵素、または内因性蛍光もしくは発光などの性質を有するタンパク質をコードする。触媒活性が検出され得る酵素の非限定的な例は、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼである。ルシフェラーゼは、分子量（ＭＷ）６１ｋＤａの単量体酵素である。それは、触媒物質として作用し、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）およびＭｇ２＋の存在下でＤ−ルシフェリンをルシフェリルアデニル酸に変換することができる。また、副産物としてピロリン酸（ＰＰｉ）およびアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）が生成される。その後、中間体のルシフェリルアデニル酸は、酸化されてオキシルシフェリン、二酸化炭素（ＣＯ２）および光になる。オキシルシフェリンは、反応から放出される光によってルミノメーターで定量的に測定できる生物発光産物である。ルシフェラーゼレポーターアッセイは、市販されており、当技術分野で既知であり、例えばルシフェラーゼ１０００アッセイシステムおよびＯＮＥ−ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイシステムがある。
【００７６】
「応答エレメント」とは、特定の転写因子結合エレメント、または特定の転写因子の結合時に活性化またはサイレンシングされ得るシス作用性エレメントを指す。一実施態様において、応答エレメントは、転写因子結合時にレポーター遺伝子の発現を促進する、最小限プロモーター（例えばＴＡＴＡボックスプロモーター）の上流に位置するシス作用性エンハンサーエレメントである。
【００７７】
本明細書において使用される用語「単鎖」は、ペプチド結合により直鎖状に結合したアミノ酸モノマーを含む分子を指す。特定の実施態様において、抗原結合部分の１つは、ｓｃＦｖ断片、すなわちペプチドリンカーによって接続されたＶＨドメインおよびＶＬドメインである。特定の実施態様では、抗原結合部分の１つは、単鎖Ｆａｂ分子、すなわちＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖がペプチドリンカーにより接続されて一本のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子である。このような特定の実施態様では、単鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端に接続している。
【００７８】
本明細書で使用される用語「ＳＳＤ」は、刺激シグナル伝達ドメインを指す。
【００７９】
本明細書で用いられる場合、「治療」（および「治療する」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などの文法的変形）は、治療されている個体の疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程の中で実施され得る。治療の望ましい作用には、限定されないが、疾患の発生または再発の防止、症状の緩和、疾患の直接的または間接的病理学的帰結の縮小、転移の防止、疾患進行の減速、病態の改善もしくは緩和、および寛解または予後の改善が含まれる。
【００８０】
本発明の文脈において、「タグ」という用語は、タンパク質、特に抗原結合分子のような生体分子に付着または生着した分子を指す。タグの機能は、「タグ付き」タンパク質（例えば免疫グロブリンまたはその断片）を、タグに結合することはできるがタグのないタンパク質には結合することができない特異的抗原結合部分が認識することができるように、標識することである。この用語は、「分子タグ」と同義であり、蛍光タグ、タンパク質タグ、アフィニティータグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグ、および小分子タグ（ハプテンタグなど）を包含するが、これらに限定されない。低分子タグ、例えばハプテンは、生体分子に共有結合または非共有結合で化学的に結合することができるが、一方、「タンパク質タグ」または「ポリペプチドタグ」は、タンパク質上に遺伝的に移植することができ、タグに結合することはできるがタグのないタンパク質には結合することができない特異的抗原結合部分がその後認識することが可能なペプチド配列である。ハプテンタグは、担体タンパク質に付着すると免疫応答を誘発することができ、したがって、タンパク質などの担体上のタグを認識することが可能な特異的な抗原結合部分を生成するのに適している。本発明の好ましい実施態様では、タグはハプテンタグまたはポリペプチドタグである。
【００８１】
本明細書で使用される用語「抗原決定基」は、「標的抗原」、「標的エピトープ」および「標的細胞抗原」と同義であり、抗体が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続ストレッチまたは非連続アミノ酸の様々な領域から形成される立体構造上の構成（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ））を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞（例、「腫瘍標的抗原」）の表面上に、ウイルス−感染細胞の表面上に、その他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中に遊離して、および／または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に、見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原と呼ばれるタンパク質（例えばＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ２、ＬｅＹ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＹＲＰ１およびＷＴ１）は、霊長類（例えばヒト）およびげっ歯類（例えばマウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型を指す。特定の実施態様では、標的抗原は、ヒトタンパク質である。本明細書において特定の標的タンパク質に言及する場合、その用語は、「完全長」、未処理の標的タンパク質だけではなく、標的細胞内でのプロセシングから生じる標的タンパク質の任意の型を包含する。この用語はまた、標的タンパク質の天然に存在する変異体、例えばスプライスバリアントまたは対立遺伝子変異体を包含する。抗原として有用な例示的なヒト標的タンパク質には、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ２、ＬｅＹ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＹＲＰ１およびＷＴ１が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
抗体は、１つ、２つ、３つ以上の結合ドメインを有していてもよく、単一特異性、二重特異性または多重特異性であってもよい。抗体は、単一種からの完全長であってもよく、またはキメラ化もしくはヒト化されていてもよい。３つ以上の抗原結合ドメインを有する抗体の場合、いくつかの結合ドメインが同一であり、かつ／または同じ特異性を有し得る。
【００８３】
本明細書で使用する「Ｔ細胞活性化」とは、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性および活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の１または複数の細胞応答を指す。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、当技術分野で既知であり、本明細書に記載される。
【００８４】
本発明によれば、用語「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、当技術分野で一般的に知られている。特に、本明細書において、用語「Ｔ細胞受容体」は、以下の３つの基準が満たされることを条件として、任意のＴ細胞受容体を意味する：（ｉ）腫瘍特異性、（ｉｉ）（大部分の）腫瘍細胞の認識、すなわち、抗原または標的が（大部分の）腫瘍細胞において発現されるはずであること、および（ｉｉｉ）ＴＣＲが治療対象のＨＬＡ型と一致することを意味する。この文脈において、上記の３つの基準を満たす適切なＴ細胞受容体は、ＮＹ−ＥＳＯ−１を認識する受容体（配列情報については、例えばＰＣＴ／イギリス特許出願第２００５／００１９２４号参照）および／またはＨＥＲ２ｎｅｕ（配列情報については、国際公開第２０１１／０２８０８９４号参照）など、当技術分野において既知である。主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子は、内因性抗原からＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞にペプチドを提示し、したがって、ＭＨＣ‐ペプチド複合体は、免疫療法アプローチに適した標的である。ＭＨＣ−ペプチド複合体は、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって標的化することができる。しかし、ほとんどのＴＣＲは免疫療法には低すぎる親和性を持っている可能性があるが、ＴＣＲ特異性を有する高親和性結合部分は有益であろう。このため、ＴＣＲ様特異性を有する高親和性可溶性抗体分子は、例えば、ファージディスプレイライブラリー（例、コンビナトリアルライブラリー）を作製し、本明細書で詳述されるようなライブラリーをスクリーニングすることによって生成され得る。本明細書中に記載されるようなＴＣＲ様特異性を有するこれらの可溶性抗原結合部分、例えばｓｃＦｖまたはＦａｂは、「Ｔ細胞受容体様抗原結合部分」または「ＴＣＲＬ抗原結合部分」と称される。
【００８５】
薬剤、例えば薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的または予防的結果を得るのに必要な用量および期間での有効な量を指す。薬剤の治療的有効量は、疾患の有害作用を、例えば排除し、低下させ、遅延させ、最小化し、または防止する。
【００８６】
用語「ベクター」または「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、ＤＮＡ分子であって、それが標的細胞内で作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入し、指示するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造物としてのベクター、および導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子またはタンパク質が、細胞転写および／または翻訳機構によって生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の抗原結合受容体をコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を含む発現カセットを含む。
【００８７】
この文脈において、本明細書で提供されるのは、試料における細胞、特に腫瘍細胞上の標的抗原（すなわち腫瘍標的抗原）を検出するための診断方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ法である。好ましい実施態様では、この試料は、例えば、生検または異常細胞を検出する必要がある体液から得られる患者試料である。本発明のアッセイは、抗原結合部分、特にｓｃＦｖおよび／またはＦａｂ断片を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の高い特異性と、レポーターシグナルの発光検出の感度とを組み合わせる。本明細書に記載の診断方法およびアッセイにおいて、本明細書に記載される標的抗原結合分子は、標的細胞（特にがん細胞）とレポーター細胞（特にＴ細胞）との間の接触を媒介する。この文脈において、本明細書に記載の方法は、抗原結合分子と抗原結合分子と特異的に相互作用可能なＣＡＲとの結合の特異性に基づいてがん細胞を検出するのに有用であり、ここでＣＡＲは、適切なレポーター細胞、好ましくはレポーターＴ細胞、例えばＪｕｒｋａｔ細胞に導入される。
【００８８】
したがって、一実施態様において提供されるのは、試料中の腫瘍細胞の存在を判定するための診断アッセイであって、以下のステップ：
ａ）試料を、抗原結合ドメインと認識ドメインとを含む抗原結合分子と接触させるステップであって、抗原結合ドメインが、腫瘍細胞に特異的に結合可能な標的抗原結合部分を含む、接触させるステップ；
ｂ）試料を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞と接触させるステップであって、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が、
ｉ．応答エレメントに作動可能に結合されており、認識ドメインに特異的に結合可能なＣＡＲ；
ｉｉ．応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子；
を含む、接触させるステップ：および
ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定して腫瘍細胞の存在を確認することにより、Ｔ細胞の活性化を判定するステップ
を含む診断アッセイである。
【００８９】
さら提供されるのは、本明細書に記載のＣＡＲ分子の発現が可能な形質導入Ｔ細胞を提供する。形質導入されたＴ細胞は、応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子をさらに含み、ここでＣＡＲは、本明細書に記載されるように応答エレメントと作動的に結合されている。標的抗原結合部分が標的細胞、例えば腫瘍細胞に結合し、ＣＡＲが認識ドメインに結合すると、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞は活性化され、レポーター遺伝子が発現される。したがって、レポーター遺伝子の発現は、例えば腫瘍細胞上の標的抗原へのＴ細胞の相互作用によって誘導されるＴ細胞活性化の文脈において、標的抗原結合部分を含む抗原結合分子の（特異的）結合の指標となる。
【００９０】
レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の標的細胞への結合は、標的細胞に特異的に結合可能な抗原結合分子によって媒介され、ここで、抗原結合分子は、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞によって特異的に検出することができる。この文脈で詳述され、本発明の診断アッセイに使用されるのは、抗原結合分子に特異的に結合することができるＣＡＲである。一実施態様では、抗原結合分子は、抗原結合ドメインと認識ドメインを含み、ここで抗原結合ドメインは標的抗原結合部分を含み、ＣＡＲは認識ドメインに特異的に結合することができる。この文脈で詳述され、本発明の診断アッセイに使用されるのは、標的抗原結合部分を含む抗原結合分子の認識ドメインに特異的に結合することができるＣＡＲである。認識ドメインは、分子タグ（例えばハプテンタグ）またはポリペプチドタグによってタグ付けされ得るタンパク質ドメインへの安定な折り畳みが可能な任意のポリペプチドドメインであり得る。あるいは、認識ドメインは、抗原結合部分によって特異的に検出される変異を含むことができる。例えばハプテンタグまたはポリペプチドタグによるタグ付けし、認識ドメインを変異させると、認識ドメインを非修飾ドメインとは異なるものにし、したがって、抗原結合部分による検出のための同定可能なエピトープを提供する。同定可能なエピトープは、標的細胞が特異的に認識される必要がある試料においては自然には生じない。
【００９１】
特定の実施態様において、認識ドメインは、免疫グロブリンドメインである。免疫グロブリンは、典型的には、安定な折り畳みが可能な可変および定常ドメインを含み、ここで可変ドメインは、標的抗原に対する免疫グロブリン分子の特異性を付与する。したがって、可変ドメインは、最も高度な配列変化をもつ免疫グロブリンの部分である。一方、定常ドメインは、同クラスの免疫グロブリンの中で変化が最小限の部分であり、したがって、本発明の方法のための認識ドメインとして、本発明の分脈では特に適している。しかしながら、可能な限り抗原結合分子の大きさを小さくすることも好ましい場合があり、そのような実施態様では、標的抗原に特異性を付与する免疫グロブリンの可変ドメインは認識ドメインの機能も発揮することができ、すなわち、抗原結合ドメインと認識ドメインは同一ドメインとなり得、例えば、可変ドメインは、例えばハプテンタグまたはポリペプチドタグと結合することができるか、または代替的に、ハプテンタグはＦａｂ断片の定常領域と結合することができる。一実施態様において、抗原結合部分は、Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ  Ｆｃドメイン、とりわけＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。一実施態様において、抗原結合分子は、修飾されたＦａｂドメイン、特に、ＣＡＲによる特異的認識のためのタグ（例えばハプテンタグまたはポリペプチドタグ）を含むＦａｂドメインを含む。
【００９２】
別の実施態様において、抗原結合分子は、修飾されたＦａｂ領域、例えば変異したＦｃ領域、またはＣＡＲによる特異的認識のためのタグ（例えばハプテンタグまたはポリペプチドタグ）を含むＦｃ領域を含む。このような実施態様では、本発明に従って使用されるＣＡＲは、修飾されたＦｃ領域に特異的に結合することができる。
【００９３】
一実施態様では、修飾されたＦｃ領域は、変異したＦｃである。特定の実施態様では、変異Ｆｃドメインは、ＥＵ番号付けによるＬ２３４、Ｌ２３５、Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｐ３３１、Ｐ３２９およびＨ４３５からなる群から選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、特にアミノ酸変異がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３３１Ｇおよび／またはＨ４３５Ａである。さらに、本明細書で提供されるのは、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することはできるが非変異親Ｆｃドメインには特異的に結合することができない抗原結合部分の使用である。抗原結合分子は、好ましくは、ＩｇＧクラス抗体、特にＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４アイソタイプ抗体またはその断片である。ある特定の実施態様では、抗原結合分子は、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＩｇＧ１クラス抗体である。一実施態様において、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。
【００９４】
したがって、一実施態様では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、変異している。一実施態様では、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基１１７、１１８、１３６、１８０、１９３、２１２、２１４および３１８からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。一実施態様では、変異体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの残基（配列番号１３２）１１７にロイシンからアラニンへの、残基１１８にロイシンからアラニンへの、位置１３６にイソロイシンからアラニンへの、残基１８０にアスパラギンからアラニンへの、残基１９３にヒスチジンからアラニンへの、残基２１２にプロリンからグリシンへの、残基２１４にプロリンからグリシンへの、および／または残基３１８にヒスチジンからアラニンへのアミノ酸置換を含む。一実施態様では、変異体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基２１２の位置にアミノ酸置換を含む。一実施態様では、変異体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基２１２にプロリンからグリシンへのアミノ酸置換を含む。
【００９５】
別の実施態様では、修飾されたＦｃドメインは、ハプテンタグを含む。特定の実施態様では、ハプテンタグは、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）およびフルオレセイン（ＦＩＴＣ）から選択される。
【００９６】
別の実施態様では、修飾されたＦｃドメインは、ポリペプチドタグを含む。一実施態様において、ポリペプチドタグは、１‐３０アミノ酸、１‐２５アミノ酸、１‐２０アミノ酸、１‐１５アミノ酸または１‐１０アミノ酸の長さを有する。特定の実施態様では、ポリペプチドタグは、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ａｖｉタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＧＣＮ４タグおよびＮＥタグからなる群から選択される。
【００９７】
本発明は、本明細書に記載のレポーターシステムおよび本明細書に記載のＣＡＲ（複数可）を導入するためのＴ細胞（ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ３＋  Ｔ細胞、γδＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、および不死化細胞株（例：Ｊｕｒｋａｔ細胞）等）の形質導入および使用、ならびに、標的抗原結合部分と認識ドメイン（好ましくはＦｃドメインまたはＦａｂドメイン、例えば、本明細書に記載の修飾ＦｃドメインまたはＦａｂ断片）とを含む抗原結合分子を介するそれらの標的化動員を詳述する。一実施態様において、抗原結合分子、例えば修飾ＩｇＧ１抗体またはタグ付きＦａｂ断片は、標的細胞、例えばがん細胞の表面に自然に存在する腫瘍特異的抗原に特異的に結合することができる。代替実施態様では、本明細書に記載されるＣＡＲは、標的細胞の表面、例えば腫瘍細胞の表面の標的抗原に直接結合することができる。
【００９８】
したがって、本発明は汎用診断プラットフォームを提供し、ここで、ＣＡＲは免疫細胞（例えばＴ細胞）のためのガイダンスとして使用することができ、特に、Ｔ細胞が、本明細書に記載されるように、ＣＡＲおよび抗原結合分子によって腫瘍細胞に特異的に標的化される。（抗原結合分子によって媒介される）腫瘍細胞の表面の標的抗原にＣＡＲを結合させた後、レポーターＴ細胞が活性化され、ここで、活性化を、例えば蛍光または発光シグナルの読み出しによって測定することができる。このプラットホームは、多様な既存または新たに開発された標的抗原結合部分の使用、または異なる抗原特異性を有するが同一の認識ドメインを含む複数の抗体の共投与を可能にすることによって、フレキシブルかつ特異的である。
【００９９】
標的抗原、例えば腫瘍抗原または認識ドメイン、例えば修飾されたＦｃドメインに特異的に結合することができる抗原結合部分は、例えば哺乳動物免疫系の免疫化によって生成することができる。このような方法は当技術分野で既知であり、例えば、分子生物学における方法における熱傷２９５：１−１２（２００５）に記載されている。代替的には、所望の活性を有する抗原結合部分は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法は、例えば、Ｌｅｒｎｅｒら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６：４９８−５０８（２０１６）に概説がある。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製して所望の結合特性を有する抗原結合部分の当該ライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で知られている。当該方法は、例えばＦｒｅｎｚｅｌらｍＡｂｓ  ８：１１７７−１１９４（２０１６）；Ｂａｚａｎら  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８：１８１７−１８２８（２０１２）およびＺｈａｏら  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３６：２７６−２８９（２０１６）、ならびにＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に概説があり、また、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）およびＭａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）；Ｓｉｄｈｕら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅら．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；およびＬｅｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）に詳述されている。特定のファージディスプレイ法において、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローン化し、ファージライブラリーにランダムに再結合させ、その後、ＷｉｎｔｅｒらＡｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２：４３３−４５５（１９９４）に記載されているように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫源からのライブラリーは、ハイブリドーマの構築を必要とせずに、免疫原に高親和性抗原結合部分を提供する。代替的に、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クロ���ン化し、ＧｒｉｆｆｉｔｈｓらＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １２：７２５−７３４（１９９３）に記載されているように、免疫化することなく、広範囲の非自己および自己抗原に抗原結合部分の単一の供給源を提供することができる。ナイーブライブラリーは、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２７：３８１−３８８（１９９２）によって記載されているように、幹細胞由来の再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローン化し、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて可変性に富むＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再配列を達成することにより、人工的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載している特許公開には、例えば：米国特許第５７５０３７３号；同第７９８５８４０号；同第７７８５９０３号および同第８６７９４９０号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０２３７７６４号および同第２００７／０００２３６０号が含まれる。コンビナトリアルライブラリーを所望の活性（複数可）を有する抗原結合部分についてスクリーニングするための当技術分野で既知の方法のさらなる例には、リボソームおよびｍＲＮＡディスプレイ、ならびに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞または酵母細胞でのための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイのための方法は、例えばＳｃｈｏｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５０３：１３５−５６（２０１２）およびＣｈｅｒｆら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １３１９：１５５−１７５（２０１５）、ならびにＺｈａｏら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８８９：７３−８４（２０１２）に総説されている。リボソームディスプレイのための方法は、例えばＨｅら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：５１３２−５１３４（１９９７）およびＨａｎｅｓら  ＰＮＡＳ  ９４：４９３７−４９４２（１９９７）に記載されている。
【０１００】
本発明の第１の例示的な実施態様では、概念実証として、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲが提供され、ここで、該少なくとも１つの抗原結合部分は、変異免疫グロブリンドメイン（例えばＦｃドメインまたはＦａｂドメイン）に特異的に結合することはできるが非変異免疫グロブリンドメインには特異的に結合することができず、該変異免疫グロブリンドメインは１つ以上のアミノ酸置換を含む。一実施態様において、変異免疫グロブリンは、Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。変異Ｆｃドメインは、非変異親Ｆｃドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここでＣＡＲは、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することはできるが、非変異親Ｆｃドメインには特異的に結合することができない。
【０１０１】
特定の実施態様において、変異Ｆｃドメインは、Ｐ３２９Ｇ変異を含む。Ｐ３２９Ｇ変異は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基２１２におけるプロリンからグリシンへのアミノ酸置換に対応する。Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異Ｆｃドメインは、非変異Ｆｃドメインに比べて親和性が低下また消失した状態でＦｃγ受容体に結合する。
【０１０２】
特定の実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号１、配列番号２および配列番号３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号４、配列番号５および配列番号６の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１０３】
好ましい実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、
（ａ）ＲＹＷＭＮの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列（配列番号１）；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤのＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列（配列番号２）；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳのＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列（配列番号３）；
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮの軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列（配列番号４）；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰのＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列（配列番号５）；および
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶのＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列（配列番号６）
を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１０４】
一実施態様では、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１０５】
一実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１０６】
一実施態様において、該少なくとも１つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂまたはｓｃＦａｂ断片である。一実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、Ｆａｂ断片を含む。
【０１０７】
一実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、Ｆａｂ断片を含む。好ましい実施態様では、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号３１の重鎖と配列番号３３の軽鎖とを含むＦａｂ断片を含む。
一実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能な抗原結合部位は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むかそれからなる重鎖と配列番号３３のアミノ酸配列を含むかそれからなる軽鎖とを含むＦａｂ断片である。
【０１０８】
特定の実施態様では、抗原結合部分は、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＦａｂ断片であり、ここで抗原結合受容体は、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと、配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０１０９】
好ましい実施態様において、抗原結合部分は、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＦａｂであり、ここで抗原結合受容体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０１１０】
一実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、ｓｃＦｖ断片を含む。ｓｃＦｖ断片は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであり、ここで、該可変ドメインと該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ａ）ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはｂ）ＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれかの構成を有する。好ましい実施態様では、ｓｃＦｖ断片は、ＶＨ−リンカー−ＶＬの構成を有する。
【０１１１】
好ましい実施態様において、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ断片を含む。
【０１１２】
特定の実施態様において、抗原結合部分は、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なｓｃＦｖ断片であり、ここで抗原結合受容体は、配列番号７のアミノ酸配列と約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。好ましい実施態様において、抗原結合部分は、Ｐ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なｓｃＦｖ断片であり、ここで抗原結合受容体は、配列番号７のアミノ酸配列（配列番号１９のヌクレオチド配列によってコードされる）を含むポリペプチドを含む。
【０１１３】
本発明によるさらなる実施態様では、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は、単鎖Ｆａｂ断片またはｓｃＦａｂである。
【０１１４】
別の特定の実施態様では、変異Ｆｃドメインは、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０ＡおよびＨ４３５Ａ（「ＡＡＡ」）変異を含む。ＡＡＡ変異は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の位置１３６におけるイソロイシンからアラニンへの、残基１９３におけるヒスチジンからアラニンへの、および残基３１８のヒスチジンからアラニンへのアミノ酸置換に対応する。ＡＡＡ変異は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を減少させる。したがって、ＡＡＡ変異を含む変異Ｆｃドメインは、非変異Ｆｃドメインに比べて親和性が低下また消失した状態でＦｃＲｎに結合する。
【０１１５】
一実施態様において、ＡＡＡ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号４４、配列番号４５および配列番号４６の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１１６】
好ましい実施態様において、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０ＡおよびＨ４３５Ａ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、
（ａ）ＳＹＧＭＳの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列（配列番号４４）；
（ｂ）ＳＳＧＧＳＹのＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列（配列番号４５）；
（ｃ）ＬＧＭＩＴＴＧＹＡＭＤＹのＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列（配列番号４６）
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＲＳＳＱＴＩＶＨＳＴＧＨＴＹＬＥの軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列（配列番号４７）；
（ｅ）ＫＶＳＮＲＦＳのＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列（配列番号４８）；および
（ｆ）ＦＱＧＳＨＶＰＹＴのＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列（配列番号４９）
を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１１７】
一実施態様では、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０ＡおよびＨ４３５Ａ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１１８】
一実施態様において、Ｉ２５３Ａ  Ｈ３１０ＡＩ２５３Ａ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１１９】
一実施態様において、該少なくとも１つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂまたはｓｃＦａｂ断片である。一実施態様において、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０ＡおよびＨ４３５Ａ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、Ｆａｂ断片を含む。特定の実施態様では、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０ＡおよびＨ４３５Ａ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能な抗原結合部分を含み、ここでＦａｂ断片は配列番号５５の重鎖と配列番号５６の軽鎖とを含む。
【０１２０】
特定の実施態様では、抗原結合部分は、ＡＡＡ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＦａｂ断片であり、ここで抗原結合受容体は、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと、配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０１２１】
好ましい実施態様において、抗原結合部分は、ＡＡＡ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＦａｂであり、ここで抗原結合受容体は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０１２２】
一実施態様において、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０ＡおよびＨ４３５Ａ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、ｓｃＦｖ断片を含む。好ましい実施態様において、ＡＡＡ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号５１のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ断片を含む。
【０１２３】
特定の実施態様において、抗原結合部分は、ＡＡＡ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なｓｃＦｖ断片であり、ここで抗原結合受容体は、配列番号５０のアミノ酸配列と約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。好ましい実施態様において、抗原結合部分は、ＡＡＡ変異を含むＦｃドメインに特異的に結合可能なｓｃＦｖであり、ここで抗原結合受容体は、配列番号５０のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１２４】
本発明によるさらなる実施態様では、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は、単鎖Ｆａｂ断片またはｓｃＦａｂである。
【０１２５】
本発明のさらなる例示的な実施態様では、概念実証として、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲが提供され、ここで、該少なくとも１つの抗原結合部分は、修飾された免疫グロブリンドメイン（例えばＦｃドメインまたはＦａｂドメイン）に特異的に結合することはできるが非修飾免疫グロブリンドメインには特異的に結合することができず、該修飾免疫グロブリンドメインはハプテンタグを含む。
【０１２６】
本発明の例示的な実施態様では、概念実証として、ハプテンタグジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を含む修飾免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲが提供される。ＤＩＧ分子の構造を図４に示す。
【０１２７】
一実施態様において、ハプテンタグＤＩＧを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号５７、配列番号５８および配列番号５９の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１２８】
一実施態様において、ハプテンタグＤＩＧ含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、
（ａ）ＲＹＷＭＮの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列（配列番号５７）；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤのＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列（配列番号５８）；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳのＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列（配列番号５９）；
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮの軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列（配列番号６０）；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰのＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列（配列番号６１）；および
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶのＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列（配列番号６２）
を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１２９】
一実施態様では、ハプテンタグＤＩＧ含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１３０】
一実施態様において、ハプテンタグＤＩＧ含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１３１】
一実施態様において、該少なくとも１つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂまたはｓｃＦａｂ断片である。一実施態様において、ハプテンタグＤＩＧ含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、Ｆａｂ断片を含む。好ましい実施態様では、ハプテンタグＤＩＧ含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号６８の重鎖と配列番号６９の軽鎖とを含むＦａｂ断片を含む。
【０１３２】
一実施態様において、ハプテンタグＤＩＧ含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであるｓｃＦｖ断片を含み、ここで、該可変ドメインと該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ａ）ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはｂ）ＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれかの構成を有する。好ましい実施態様では、ｓｃＦｖ断片は、ＶＨ−リンカー−ＶＬの構成を有する。
【０１３３】
好ましい実施態様において、ハプテンタグＤＩＧ含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号６６のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ断片を含む。
【０１３４】
本発明の別の例示的な実施態様では、概念実証として、ハプテンタグフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を含む修飾免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲが提供される。
【０１３５】
一実施態様において、ハプテンタグＦＩＴＣを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号７２、配列番号７３および配列番号７４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号７５、配列番号７６および配列番号７７の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１３６】
一実施態様において、ハプテンタグＦＩＴＣを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、
（ａ）ＲＹＷＭＮの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列（配列番号７２）；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤのＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列（配列番号７３）；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳのＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列（配列番号７４）；
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮの軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列（配列番号７５）；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰのＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列（配列番号７６）；および
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶのＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列（配列番号７７）
を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１３７】
一実施態様では、ハプテンタグＦＩＴＣを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号８０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１３８】
一実施態様において、ハプテンタグＦＩＴＣを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１３９】
一実施態様において、該少なくとも１つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂまたはｓｃＦａｂ断片である。
【０１４０】
一実施態様において、ハプテンタグＦＩＴＣを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであるｓｃＦｖ断片を含み、ここで、該可変ドメインと該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ａ）ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはｂ）ＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれかの構成を有する。好ましい実施態様では、ｓｃＦｖ断片は、ＶＨ−リンカー−ＶＬの構成を有する。
【０１４１】
好ましい実施態様において、ハプテンタグＦＩＴＣを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号７８のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ断片を含む。
【０１４２】
本発明のさらなる例示的な実施態様では、概念実証として、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲが提供され、ここで、該少なくとも１つの抗原結合部分は、修飾された免疫グロブリンドメイン（例えばＦｃドメインまたはＦａｂドメイン）に特異的に結合することはできるが非修飾免疫グロブリンドメインには特異的に結合することができず、該修飾免疫グロブリンドメインはポリペプチドタグを含む。
【０１４３】
本発明のある例示的な実施態様では、概念実証として、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）糖タンパク質からのポリペプチドタグを含む修飾免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲが提供される。一実施態様では、ＨＡタンパク質からのポリペプチドタグは、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡのアミノ酸配列（配列番号１０３）を含む。
【０１４４】
一実施態様において、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号８２、配列番号８３および配列番号８４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号８５、配列番号８６および配列番号８７の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１４５】
ある好ましい実施態様において、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、
（ａ）ＲＹＷＭＮの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列（配列番号８２）；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤのＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列（配列番号８３）；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳのＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列（配列番号８４）；
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮの軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列（配列番号８５）；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰのＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列（配列番号８６）；および
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶのＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列（配列番号８７）
を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１４６】
一実施態様では、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号９０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１４７】
一実施態様において、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号９０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１４８】
一実施態様において、該少なくとも１つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂまたはｓｃＦａｂ断片である。一実施態様において、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、Ｆａｂ断片を含む。
【０１４９】
一実施態様において、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであるｓｃＦｖ断片を含み、ここで、該可変ドメインと該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ａ）ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはｂ）ＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれかの構成を有する。好ましい実施態様では、ｓｃＦｖ断片は、ＶＨ−リンカー−ＶＬの構成を有する。
【０１５０】
好ましい実施態様において、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号８９のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ断片を含む。
【０１５１】
本発明の別の例示的な実施態様では、概念実証として、ヒトｃ−ｍｙｃタンパク質からのポリペプチドタグを含む修飾免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲが提供される。一実施態様では、ヒトｃ−ｍｙｃタンパク質からのポリペプチドタグは、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬのアミノ酸配列（配列番号１０４）を含む。
【０１５２】
一実施態様において、ｍｙｃタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号９２、配列番号９３および配列番号９４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号９５、配列番号９６および配列番号９７の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１５３】
ある好ましい実施態様において、ｍｙｃタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、
（ａ）ＲＹＷＭＮの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列（配列番号９２）；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤのＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列（配列番号９３）；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳのＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列（配列番号９４）；
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮの軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列（配列番号９５）；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰのＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列（配列番号９６）；および
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶのＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列（配列番号９７）
を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１５４】
一実施態様では、ｍｙｃタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号１０１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１５５】
一実施態様において、ｍｙｃタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１５６】
一実施態様において、該少なくとも１つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂまたはｓｃＦａｂ断片である。一実施態様において、ｍｙｃタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、Ｆａｂ断片を含む。好ましい実施態様では、ｍｙｃタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、配列番号９９の重鎖と配列番号１００の軽鎖とを含むＦａｂ断片を含む。
【０１５７】
特定の実施態様では、抗原結合部分は、ｍｙｃタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＦａｂ断片であり、ここで抗原結合受容体は、配列番号９８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと、配列番号１００のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０１５８】
好ましい実施態様において、抗原結合部分は、ｍｙｃタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＦａｂであり、ここで抗原結合受容体は、配列番号９８のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと配列番号１００のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０１５９】
一実施態様において、ｍｙｃタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合可能なＣＡＲは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであるｓｃＦｖ断片を含み、ここで、該可変ドメインと該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ａ）ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはｂ）ＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれかの構成を有する。好ましい実施態様では、ｓｃＦｖ断片は、ＶＨ−リンカー−ＶＬの構成を有する。
【０１６０】
ＦａｂおよびｓｃＦａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合によって安定化されている。重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗原結合部位分、例えば、本明細書に記載されているようなＦａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ、ｓｃＦｖおよびｓｃＦａｂ断片は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に鎖間ジスルフィド架橋を導入することによって、さらに安定化されてもよい。したがって、一実施態様では、本発明による抗原結合受容体に含まれるＦａｂ断片（複数可）、ｃｒｏｓｓＦａｂ断片（複数可）、ｓｃＦｖ断片（複数可）および／またはｓｃＦａｂ断片（複数可）は、システイン残基の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化されていてもよい（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位および可変軽鎖の１００位）。そのような安定化された抗原結合部位は、本明細書では「ｄｓ」という用語で呼ばれる。
【０１６１】
ハプテンは、当技術分野で知られている方法に従って、認識ドメインに共有結合的または非共有結合的に結合することができる。例えば、ビオチン化は、ハプテンビオチンをポリペプチド、例えば免疫グロブリンに結合させるために当技術分野で広く用いられている。ビオチンは、典型的には、第一級アミン（例えばリジン）を介してタンパク質にコンジュゲートされる。ＩｇＧ抗体の場合は通常、抗体分子当たり３から６の間のビオチン分子がコンジュゲートされる。代替的に、炭水化物は、当技術分野で知られている方法に従ってビオチン化することができる。
【０１６２】
一実施態様では、ハプテン分子は、部位特異的結合を用いて認識ドメインに結合される。一実施態様では、抗原結合分子へのポリペプチドタグの導入は、ハプテン分子のポリペプチドタグへの部位特異的結合と組み合わされる。本発明のそのような実施態様において、抗原結合分子に結合されたハプテン分子の数は、例えば、ポリペプチドタグ中に定められた数の結合部位を提供することによって制御され得る。部位特異的結合技術の例は、当技術分野で知られているＡｖｉＴａｇシステムである。ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨ配列番号１０６）のポリペプチドタグＡｖｉＴａｇは、ＢｉｒＡビオチン−タンパク質リガーゼを用いて選択的にビオチン化することができる天然のビオチン化部位を含む。一実施態様では、認識ドメインは、定めらされた数のハプテン分子を含む。一実施態様では、認識ドメインは、１、２、３または４以上のハプテン分子を含まない。好ましい実施態様では、認識ドメインは、２つのハプテン分子を含み、例えば、認識ドメインは、それぞれが１つのハプテン分子を含む２つのポリペプチド分子から構成されるＦｃドメインである。別の好ましい実施態様において、認識ドメインは、１つのハプテン分子を含み、例えば、認識ドメインは、重鎖または軽鎖断片のいずれかに結合されたハプテン分子を含むＦａｂ断片である。
【０１６３】
本明細書で提供され、使用されるＣＡＲは、認識ドメインに特異的に結合可能な抗原結合部分、アンカー型膜貫通ドメイン、ならびに少なくとも１つの細胞内シグナル伝達および／または少なくとも１つの補助刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞外ドメインを含む。アンカー型膜貫通ドメインは、レポーター細胞、例えばＴ細胞の細胞膜へのＣＡＲの閉じ込めを媒介する。細胞内シグナル伝達および／または少なくとも１つの補助刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの細胞内シグナルとの結合、例えば、レポーター遺伝子発現を測定することによって評価することができるＴ細胞活性化を伝達する。本発明の文脈において、本明細書に記載されているようなレポーター遺伝子の発現は、本明細書に記載されているような標的抗原結合部分の標的抗原への結合、およびその結果として生じるＴ細胞活性化の指標となる。
【０１６４】
ＣＡＲのアンカー型膜貫通ドメインは、哺乳動物プロテアーゼに対する切断部位を持たないことによって特徴付けることができる。プロテアーゼとは、プロテアーゼの切断部位を含む膜貫通ドメインのアミノ酸配列を加水分解することができるタンパク質分解酵素を指す。プロテアーゼという用語には、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの両方が含まれる。本発明の文脈において、とりわけＣＤ命名法によって定められた膜貫通タンパク質の任意のアンカー型膜貫通ドメインを使用して、本明細書に従った適切なＣＡＲを生成することができ、このＣＡＲは、例えば、本明細書に定義されている標的細胞または修飾免疫グロブリンドメインに結合すると、Ｔ細胞を活性化する。
【０１６５】
したがって、本発明の文脈において、アンカー型膜貫通ドメインは、ラット（ｍｕｒｉｎｅ）／マウス、または好ましくはヒト膜貫通ドメインの一部を含み得る。このようなアンカー型膜貫通ドメインの例は、例えば、（配列番号２３に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）本明細書の配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する、ＣＤ２８の膜貫通ドメインである。本発明の文脈において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、（配列番号２３に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０１６６】
あるいは、とりわけＣＤ命名法によって提供されるような、膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質を、本発明において提供され、使用されるＣＡＲのアンカー型膜貫通ドメインとして使用してもよい。上述のように、ＣＡＲは、（配列番号１１１に示されるｃＤＮＡによりコードされる）配列番号１１２に示されるように、ヒト完全長ＣＤ２８タンパク質のアミノ酸１５３‐１７９、１５４‐１７９、１５５‐１７９、１５６‐１７９、１５７‐１７９、１５８‐１７９、１５９‐１７９、１６０‐１７９、１６１‐１７９、１６２‐１７９、１６３‐１７９、１６４‐１７９、１６５‐１７９、１６６‐１７９、１６７‐１７９、１６８‐１７９、１６９‐１７９、１７０‐１７９、１７１‐１７９、１７２‐１７９、１７３‐１７９、１７４‐１７９、１７５‐１７９、１７６‐１７９、１７７‐１７９または１７８‐１７９に位置するＣＤ２８のアンカー型膜貫通ドメインを含み得る。したがって、本発明の文脈において、アンカー型膜貫通ドメインは、（配列番号２３に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０１６７】
本明細書に記載されるように、本発明に従って使用されるＣＡＲは、少なくとも１つの刺激シグナル伝達および／または補助刺激シグナル伝達ドメインを含む。刺激シグナル伝達および／または補助刺激シグナル伝達ドメインは、標的抗原結合部分を含む抗原結合分子のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞内の細胞内シグナルへの結合を伝達する。したがって、ＣＡＲは、好ましくは、Ｔ細胞活性化を提供する刺激シグナル伝達ドメインを含む。好ましい実施態様では、標的抗原結合部分の標的抗原への結合および／またはレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の標的抗原結合部分を含む抗原結合分子への結合は、細胞内シグナル伝達および／または補助シグナル伝達ドメインの活性化をもたらす。特定の実施態様において、本明細書で提供されるＣＡＲは、ラット／マウスもしくはヒトＣＤ３ｚ（ヒトＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０９６３（配列番号２のバージョン番号１７７）である；ラット／マウスＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはバージョン番号１４３および配列番号１のＰ２４１６１（一次引用可能なアクセッション番号）またはＱ９Ｄ３Ｇ３（二次引用可能なアクセション番号）である）、Ｆｃｇｒ３Ａ（ヒトＦＣＧＲ３ＡのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ０８６３７（配列番号２のバージョン番号１７８）である）、またはＮＫＧ２Ｄ（ヒトＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２６７１８（配列番号１のバージョン番号１５１）である；ラット／マウスＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＯ５４７０（配列番号２のバージョン番号１３２）である）の断片／ポリペプチド部分である刺激シグナル伝達ドメインを含む。したがって、ＣＡＲに含まれる刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚ、Ｆｃｇｒ３ＡまたはＮＫＧ２Ｄの全長の断片／ポリペプチド部分であり得る。ラット／マウス全長ＣＤ３ｚのアミノ酸配列は、本明細書中では、配列番号１０９（配列番号１１０に示されるＤＮＡ配列によってコードされるラット／マウス）として示される。ヒト全長ＣＤ３ｚのアミノ酸配列は、本明細書中では、配列番号１０７（配列番号１０８に示されるＤＮＡ配列によってコードされるヒト）として示される。本発明に従って提供され、使用されるＣＡＲは、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれていることを条件に、刺激ドメインとしてＣＤ３ｚ、Ｆｃｇｒ３ＡまたはＮＫＧ２Ｄの断片を含み得る。特に、ＣＤ３ｚ、Ｆｃｇｒ３ＡまたはＮＫＧ２Ｄの任意の部分／断片は、少なくとも１つのシグナル伝達モチーフ（ｍｏｔｉｖｅ）が含まれる限り、刺激ドメインとして適している。しかし、より好ましくは、ＣＡＲは、ヒト材料に由来するポリペプチドを含む。好ましくは、ＣＡＲは、配列番号１０７（ＣＤ３ｚ）（配列番号１０８（ＣＤ３ｚ）に示されるＤＮＡ配列によってコードされるヒト）として本明細書に示されるアミノ酸配列を含む。例えば、ＣＡＲに含まれ得るヒトＣＤ３ｚの断片／ポリペプチド部分は、（配列番号２５に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなっていてもよい。したがって、一実施態様において、ＣＡＲは、配列番号１３に示される配列を含むか、または配列番号１３と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０までの置換、欠失もしくは挿入を有し、刺激シグナル伝達活性を有することによって特徴付けることができる配列を含む。刺激シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲの特定の構成が、本明細書の以下に、および実施例と図に提供される。刺激シグナル伝達活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ（ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）によって測定されるサイトカイン放出の増強、（増強された細胞数によって測定される）増殖活性の増強、またはＬＤＨ放出アッセイによって測定される溶解活性の増強によって判定することができる。
【０１６８】
ＣＡＲは、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞にさらなる活性を提供する少なくとも１つの補助刺激シグナル伝達ドメインを好ましくは含む。ＣＡＲは、ラット／マウスもしくはヒトＣＤ２８（ヒトＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ１０７４７（配列番号１のバージョン番号１７３）である；ラット／マウスＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ３１０４１（配列番号２のバージョン番号１３４）である）、ＣＤ１３７（ヒトＣＤ１３７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ０７０１１（配列番号１のバージョン番号１４５）である；ラット／マウスＣＤ１３７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０３３４（配列番号１のバージョン番号１３９）である）、ＯＸ４０（ヒトＯＸ４０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２３５１０（配列番号１のバージョン番号１３８）である；ラット／マウスＯＸ４０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ４３４８８（配列番号１のバージョン番号１１９）である）、ＩＣＯＳ（ヒトＩＣＯＳのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９Ｙ６Ｗ８（配列番号１のバージョン番号１２６）である）；ラット／マウスＩＣＯＳのＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、バージョン番号１０２および配列バージョン２のＱ９ＷＶ４０（一次引用可能なアクセッション番号）またはＱ９ＪＬ１７（二次引用可能なアクセッション番号）である）、ＣＤ２７（ヒトＣＤ２７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２６８４２（配列番号２のバージョン番号１６０）である；ラット／マウスＣＤ２７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ４１２７２（配列バージョン１のバージョン番号１３７）である）、４−１−ＢＢ（ラット／マウス４−１−ＢＢのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０３３４（配列バージョン１のバージョン番号１４０）である；ヒト４−１−ＢＢのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ０７０１１（配列バージョンのバージョン番号１４６）である）、ＤＡＰ１０（ヒトＤＡＰ１０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９ＵＢＪ５（配列番号１のバージョン番号２５）である；ラット／マウスＤＡＰ１０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはバージョン番号１０１および配列番号１についてのＱ９ＱＵＪ０（一次引用可能なアクセッション番号）またはＱ９Ｒ１Ｅ７（二次引用可能なアクセッション番号）である）、またはＤＡＰ１２（ヒトＤＡＰ１２のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＯ４３９１４（バージョン番号１４６および配列番号１）である；ラット／マウスＤＡＰ１２のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはバージョン番号１２３および配列番号１についてのＯ０５４８８５（一次引用可能なアクセッション番号）またはＱ９Ｒ１Ｅ７（二次引用可能なアクセッション番号）である）の断片／ポリペプチド部分である補助刺激シグナル伝達ドメインを含んでもよい。特定の実施態様では、ＣＡＲは、本明細書で定義される補助刺激シグナル伝達ドメインの１つ以上、すなわち１、２、３、４、５、６または７つを含み得る。したがって、本発明の文脈において、ＣＡＲは、第１の補助刺激シグナル伝達ドメインとしてラット／マウスＣＤ２８か好ましくはヒトＣＤ２８の断片／ポリペプチド部分を含むことができ、第２の補助刺激シグナル伝達ドメインは、ラット／マウスか好ましくはヒトのＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２、またはこれらの断片からなる群から選択される。好ましくは、ＣＡＲは、ヒト材料に由来する補助刺激シグナル伝達ドメインを含む。したがって、より好ましくは、ＣＡＲに含まれる補助刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）は、（配列番号２４に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなっていてもよい。
【０１６９】
したがって、ＣＡＲに場合によって含まれる補助刺激シグナル伝達ドメインは、全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２の断片／ポリペプチド部分である。ラット／マウス全長ＣＤ２８のアミノ酸配列は、本明細書中では、配列番号１１４（配列番号１１３に示されるＤＮＡ配列によってコードされるラット／マウス）として示される。とはいえ、本明細書の文脈ではヒト配列が最も好ましいため、ＣＡＲタンパク質に場合によって含まれる補助刺激シグナル伝達ドメインは、ヒト全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２の断片／ポリペプチド部分である。ヒト全長ＣＤ２８のアミノ酸配列は、本明細書中では、配列番号１１２（配列番号１１１に示されるＤＮＡ配列によってコードされるヒト）として示される。
【０１７０】
ある好ましい実施態様では、ＣＡＲは、補助刺激シグナル伝達ドメインとしてＣＤ２８またはその断片を含む。ＣＡＲは、ＣＤ２８の少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれるという条件で、補助刺激シグナル伝達ドメインとしてＣＤ２８の断片を含み得る。特に、ＣＤ２８のシグナル伝達モチーフ（ｍｏｔｉｖｅｓ）の少なくとも１つが含まれている限り、ＣＤ２８の任意の部分／断片がＣＡＲに適している。例えば、ＣＡＲに含まれ得るＣＤ２８ポリペプチドは、（配列番号２４に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなっていてもよい。本発明において、補助刺激シグナル伝達ドメインとして機能するＣＤ２８の細胞内ドメインは、配列ＹＭＮＭ（配列番号１１５）および／またはＰＹＡＰ（配列番号１１６）を有するＣＤ２８ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列を含み得る。好ましくは、ＣＡＲは、ヒト材料に由来するポリペプチドを含む。例えば、ＣＡＲに含まれ得るヒトＣＤ２８の断片／ポリペプチド部分は、（配列番号２４に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなっていてもよい。したがって、一実施態様において、ＣＡＲは、配列番号１２に示される配列を含むか、または配列番号１３と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０までの置換、欠失もしくは挿入を有し、補助刺激シグナル伝達活性を有することによって特徴付けることができる配列を含む。補助刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）を含むＣＡＲの特定の構成が、本明細書の以下に、および実施例と図に提供される。補助刺激シグナル伝達活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ（ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）によって測定されるサイトカイン放出の増強、（増強された細胞数によって測定される）増殖活性の増強、またはＬＤＨ放出アッセイによって測定される溶解活性の増強によって判定することができる。
【０１７１】
上記のように、本発明の一実施態様では、ＣＡＲの補助刺激シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２８遺伝子（Ｕｎｉ  Ｐｒｏｔエントリー番号：Ｐ１０７４７（配列のエントリーバージョン：１７３およびバージョン１についてのアクセッション番号）に由来するものであってもよく、形質導入されたＴ細胞のような、本明細書に記載されている形質導入細胞のサイトカイン産生、増殖および溶解活性として定義されるＣＤ２８活性を提供する。ＣＤ２８活性は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）もしくはインターロイキン２（ＩＬ−２）のようなサイトカインのＥＬＩＳＡもしくはフローサイトメトリーによって、サイトカインの放出で、例えばｋｉ６７測定やフローサイトメトリーでの細胞定量により測定可能なＴ細胞の増殖で、または（例えば、Thakur et al., Biosens Bioelectron. 35(1) (2012), 503-506; Krutzik et al., Methods Mol Biol. 699 (2011), 179-202; Ekkens et al., Infect Immun. 75(5) (2007), 2291-2296; Ge et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 99(5) (2002), 2983-2988; Duwell et al., Cell Death Differ. 21(12) (2014), 1825-1837, Erratum in: Cell Death Differ. 21(12) (2014), 161等に記載のＩＣＥＬＬｌｉｇｅｎｃｅ装置の使用により）標的細胞のリアルタイムインピーダンス測定によって評価される溶解活性で、測定可能である。補助刺激シグナル伝達ドメインＰＹＡＰおよびＹＭＮＭは、ＣＤ２８ポリペプチドの機能および先に列挙した機能的効果に有益である。ＹＭＮＭドメインのアミノ酸配列は配列番号１１５に示され、ＰＹＡＰドメインのアミノ酸配列は配列番号１１６に示されている。したがって、本明細書で提供され、使用されるＣＡＲにおいて、ＣＤ２８ポリペプチドは、好ましくは、ＹＭＮＭ（配列番号１１５）および／またはＰＹＡＰ（配列番号１１６）の配列を有するＣＤ２８ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列を含む。これらのシグナル伝達モチーフ（ｍｏｔｉｖｅ）は、ＣＡＲの細胞内ドメイン内の任意の部位に存在してよい。
【０１７２】
認識ドメインに特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、哺乳動物プロテアーゼの切断部位を持たないアンカー型膜貫通ドメイン、補助刺激シグナル伝達ドメイン、および刺激シグナル伝達ドメインは、単鎖多機能性ポリペプチドであってもよい。単鎖融合コンストラクトは、例えば、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン（複数可）と、アンカー型膜貫通ドメイン（複数可）と、補助刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）および／または刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）とを含むポリペプチド（複数可）からなっていてもよい。代替実施態様では、ＣＡＲは、単鎖融合コンストラクトではない抗原結合部分を含み、すなわち、抗原結合部分はＦａｂまたはｃｒｏｓＦａｂ断片である。当該実施態様では、ＣＡＲは、１つのポリペプチド鎖のみを含む単鎖融合コンストラクトではない。好ましくは、そのようなコンストラクトは、免疫グロブリン軽鎖と組み合わされた単鎖重鎖融合ポリペプチドを含み、例えば重鎖融合ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖（複数可）と、アンカー型膜貫通ドメイン（複数可）と、補助刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）および／または刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）を含み、免疫グロブリン軽鎖（複数可）と組み合わされる。したがって、細胞外ドメイン、アンカー型膜貫通ドメイン、補助刺激シグナル伝達ドメインおよび刺激シグナル伝達ドメインは、１以上の同じかまたは異なるペプチドリンカーによって接続され得る。例えば、認識ドメインに特異的に結合可能な少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとアンカー型膜貫通ドメインとの間のリンカーは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなっていてよい。したがって、アンカー型膜貫通ドメイン、補助刺激シグナル伝達ドメインおよび／または刺激ドメインは、ペプチドリンカーによって、または代替的に、ドメインの直接融合によって、互いに接続され得る。
【０１７３】
いくつかの実施態様では、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は、１０から約２５のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより接続した、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）との融合タンパク質である単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンに、溶解度のためにセリンまたはスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続することができ、あるいはその逆も可能である。例えば、リンカーは、配列番号１６に示されるアミノ酸およびアミノ酸配列を有していてもよい。ｓｃＦｖ抗原結合部分は、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えばＨｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６−９６に記載されている。
【０１７４】
ＣＡＲまたはその一部は、シグナルペプチドを含み得る。このようなシグナルペプチドは、タンパク質をＴ細胞膜の表面に運ぶことになる。例えば、シグナルペプチドは、（配列番号１１８に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）配列番号１１７に示されるアミノ酸配列を有していてもよい。
【０１７５】
ＣＡＲの構成要素は、様々な構成で互いに融合して、Ｔ細胞活性化ＣＡＲを生成することができる。いくつかの実施態様において、ＣＡＲは、アンカー型膜貫通ドメインに接続された、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）から構成される細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＶＨドメインは、Ｃ末端においてＶＬドメインのＮ末端に、場合によってはペプチドリンカーを介して、融合される。他の実施態様では、ＣＡＲは、刺激シグナル伝達ドメインおよび／または補助刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。特定のこのような実施態様では、ＣＡＲは、１以上のペプチドリンカーによって接続された、ＶＨドメインおよびＶＬドメインと、アンカー型膜貫通ドメインと、場合によっては刺激シグナル伝達ドメインとから本質的になり、ここで、ＶＨドメインは、Ｃ末端においてＶＬドメインのＮ末端に融合され、ＶＬドメインは、Ｃ末端においてアンカー型膜貫通ドメインのＮ末端に融合され、アンカー型膜貫通ドメインは、Ｃ末端において刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合される。場合によっては、ＣＡＲは、補助刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。そのような特定の実施態様の１つでは、抗原結合受容体は、１以上のペプチドリンカーによって接続された、ＶＨドメインおよびＶＬドメインと、アンカー型膜貫通ドメインと、刺激シグナル伝達ドメインおよび補助刺激シグナル伝達ドメインとから本質的になり、ここで、ＶＨドメインは、Ｃ末端においてＶＬドメインのＮ末端に融合され、ＶＬドメインは、Ｃ末端においてアンカー型膜貫通ドメインのＮ末端に融合され、アンカー型膜貫通ドメインは、Ｃ末端において刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合され、刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端において補助刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合される。代替実施態様では、補助刺激シグナル伝達ドメインは、刺激シグナル伝達ドメインの代わりに、アンカー型膜貫通ドメインに接続される。好ましい実施態様では、ＣＡＲは、１以上のペプチドリンカーによって接続された、ＶＨドメインおよびＶＬドメインと、アンカー型膜貫通ドメインと、補助刺激シグナル伝達ドメインおよび刺激シグナル伝達ドメインとから本質的になり、ここで、ＶＨドメインは、Ｃ末端においてＶＬドメインのＮ末端に融合され、ＶＬドメインは、Ｃ末端においてアンカー型膜貫通ドメインのＮ末端に融合され、アンカー型膜貫通ドメインは、Ｃ末端において補助刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合され、補助刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端において刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合される。
【０１７６】
好ましい実施態様では、結合部分の１つは、Ｆａｂ断片またはｃｒｏｓｓＦａｂ断片である。一実施態様では、抗原結合部分は、ＦａｂまたはｃｒｏｓｓＦａｂ重鎖のＣ末端においてアンカー型膜貫通ドメインのＮ末端に、場合によってはペプチドリンカーを介して、融合している。代替実施態様では、抗原結合部分は、ＦａｂまたはｃｒｏｓｓＦａｂ軽鎖のＣ末端においてアンカー型膜貫通ドメインのＮ末端に、場合によってはペプチドリンカーを介して、融合している。他の実施態様では、ＣＡＲは、刺激シグナル伝達ドメインおよび／または補助刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。特定のこのような実施態様では、ＣＡＲは、１以上のペプチドリンカーによって接続された、ＦａｂまたはｃｒｏｓｓＦａｂ断片と、アンカー型膜貫通ドメインと、場合によっては刺激シグナル伝達ドメインとから本質的になり、ここで、ＦａｂまたはｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、重鎖または軽鎖のＣ末端においてアンカー型膜貫通ドメインのＮ末端に融合され、ＶＬドメインは、Ｃ末端においてアンカー型膜貫通ドメインのＮ末端に融合され、アンカー型膜貫通ドメインは、Ｃ末端において刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合される。好ましくは、ＣＡＲは、補助刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。特定のこのような実施態様では、ＣＡＲは、１以上のペプチドリンカーによって接続された、ＦａｂまたはｃｒｏｓｓＦａｂ断片と、アンカー型膜貫通ドメインと、刺激シグナル伝達ドメインおよび補助刺激伝達ドメインとから本質的になり、ここで、ＦａｂまたはｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、重鎖または軽鎖のＣ末端においてアンカー型膜貫通ドメインのＮ末端に融合され、刺激伝達ドメインは、Ｃ末端において補助刺激伝達ドメインのＮ末端に融合される。好ましい実施態様では、補助刺激シグナル伝達ドメインは、刺激シグナル伝達ドメインの代わりに、アンカー型膜貫通ドメインに接続される。最も好ましい実施態様では、ＣＡＲは、ＦａｂまたはｃｒｏｓｓＦａｂ断片と、アンカー型膜貫通ドメインと、補助刺激シグナル伝達ドメインおよび刺激シグナル伝達ドメインとから本質的になり、ここで、ＦａｂまたはｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、重鎖のＣ末端においてアンカー型膜貫通ドメインのＮ末端に、ペプチドリンカーを介して融合され、アンカー型膜貫通ドメインは、Ｃ末端において補助刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合され、補助刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端において刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合される。
【０１７７】
抗原結合部分、アンカー型膜貫通ドメイン、ならびに刺激シグナル伝達ドメインおよび／または補助刺激シグナル伝達ドメインは、直接、または１つ以上のアミノ酸、典型的には約２−２０アミノ酸を含む１以上のペプチドリンカーを介して互いに融合していてもよい。ペプチドリンカーは当技術分野において既知であり、本明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎまたはＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれ、ここで「ｎ」は通常、１から１０の間、典型的には２から４の間の数である。抗原結合部分とアンカー型膜貫通部分とを接続するのに好ましいペプチドリンカーは、配列番号２０によるＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）である。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）を接続するのに適した例示的なペプチドリンカーは、配列番号１９によるＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）４である。
【０１７８】
加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含むことができる。抗原結合部分は、特にアンカー型膜貫通ドメインのＮ末端に融合している場合には、追加のペプチドリンカーの有無に関わらず、免疫グロブリンヒンジ領域またはその一部を介して融合することができる。
【０１７９】
本明細書中に記載されるように、本発明に従って提供され使用されるＣＡＲは、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む。単一の抗原結合部分を有するＣＡＲは、特にＣＡＲの高発現が必要な場合に有用であり、好適である。このような場合、複数の抗原結合部分の存在は、ＣＡＲの発現効率を制限する可能性がある。しかしながら、他の場合には、例えば標的部位への標的化を最適化するため、または標的細胞抗原の架橋を可能にするために、２つ以上の抗原結合部分を含むＣＡＲを有することが有利であろう。
【０１８０】
本発明による方法の文脈では、表面に標的抗原を含む標的細胞（例えば腫瘍細胞）と結合する標的抗原結合部分を含む標的抗原結合分子とレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞を接触させることが、本明細書に記載のレポーター遺伝子の発現をもたらす。したがって、一実施態様において、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達および／または補助シグナル伝達ドメインの活性化は、本明細書に記載の応答エレメントの活性化をもたらす。好ましい実施態様では、応答エレメントはレポーター遺伝子の発現を制御する。好ましい実施態様では、応答エレメントの活性化は、レポーター遺伝子の発現をもたらす。したがって、レポーター細胞（例えばレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞）中のレポーター遺伝子は、標的抗原結合部分が標的に結合すると発現される。一実施態様では、レポーター遺伝子の発現は、標的抗原結合部分の標的抗原への結合の指標となる。この文脈において、ＣＡＲのその標的への結合は、直接、または細胞シグナル伝達のカスケードを介して、応答エレメントの活性の調節につながる細胞応答を誘発する。応答エレメントは、転写因子等によってサイレンシングまたは活性化される得るＤＮＡエレメントである。応答エレメントは当技術分野で既知であり、例えばレポーターベクター中のものなど、一般に入手可能である。通常、応答エレメントは、ＤＮＡ反復エレメントを含み、転写因子結合時にレポーター遺伝子の発現を促進する最小限プロモーターの上流に位置するシス作用性エンハンサーエレメントである。
【０１８１】
認識ドメイン、例えば修飾されたＦｃドメインまたはＦａｂ断片へのＣＡＲの結合は、応答エレメントを活性化する。一実施態様では、応答エレメントは、細胞の核内に位置する核応答エレメントである。別の実施態様では、前記応答エレメントは、レポーター細胞内のプラスミド上に位置する。一実施態様では、アッセイは、応答エレメントの制御下で、レポーター遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを用いてレポーター細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞をトランスフェクションするという予備ステップを含む。さらに、レポーター細胞は、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを用いてトランスフェクトすることができる。レポーター細胞は、シグナル伝達カスケードの全エレメントを含む発現ベクターを用いて、または異なる構成要素を個別に発現する異なるベクターをも用いて、トランスフェクトすることができる。一実施態様では、レポーター細胞は、レポーター遺伝子をコードする応答エレメントの制御下のＤＮＡ配列と、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列とを含む。
【０１８２】
したがって、本明細書に記載のように、ＣＡＲは、応答エレメントに機能的に結合されている。一実施態様では、応答エレメントはレポーター遺伝子の発現を制御する。一実施態様では、応答エレメントは、ＮＦＡＴ経路、ＮＦ−κＢ経路またはＡＰ−１経路、好ましくはＮＦＡＴ経路の一部である。
【０１８３】
一実施態様では、レポーター遺伝子は、発光タンパク質をコードする遺伝子または触媒活性を検出することができる酵素をコードする遺伝子から選択される。一実施態様では、レポーター遺伝子は、発光タンパク質をコードする遺伝子であるさらなる実施態様では、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｈｅｉｍら  １９９４，１９９６）、ＣＦＰとしても知られるシアン蛍光変異体（Ｈｅｉｍら  １９９６；Ｔｓｉｅｎ  １９９８）；ＹＦＰとしても知られる黄色蛍光変異体（Ｏｒｍｏら  １９９６；Ｗａｃｈｔｅｒら  １９９８）；サファイアとして知られている紫色興奮性緑色蛍光変異体（Ｔｓｉｅｎ  １９９８；Ｚａｐａｔａ−Ｈｏｍｍｅｒら  ２００３）；および高感度緑色蛍光タンパク質またはＥＧＦＰとして知られているシアン興奮性緑色蛍光変異体（Ｙａｎｇら  １９９６）からなる群から選択され、例えば生細胞画像化（例、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ）または蛍光分光測光法によって測定することができる。一実施態様では、触媒活性が検出され得る酵素は、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群から選択される。一実施態様では、レポーター遺伝子は、ＧＦＰをコードする。好ましい実施態様では、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼをコードする。ルシフェラーゼの活性は、市販のアッセイ、例えばルシフェラーゼ１０００アッセイシステムまたはＯＮＥ−ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイシステム（両方ともＰｒｏｍｅｇａ）によって検出することができる。ルシフェラーゼ１０００アッセイシステムは、基質としてルシフェリンに加えて補酵素Ａ（ＣｏＡ）を含み、少なくとも１分間続く強い光強度をもたらす。細胞内ルシフェラーゼをアッセイするには、検出前に細胞を溶解する必要がある。反応の副産物として生成される光は、可視スペクトル全体からルミノメーターによって収集される。本明細書に示された例では、シグナルは産生されたルシフェラーゼの量に比例し、したがってＮＦＡＴプロモーターの活性化の強さに比例していた。別の実施態様では、ルシフェラーゼが細胞から分泌されるルシフェラーゼアッセイが使用される。したがって、アッセイは、細胞を溶解することなく行うことができる。
【０１８４】
本明細書に記載されているように、レポーター遺伝子の発現は、標的抗原結合部位が標的細胞上の標的抗原に結合し、その結果としてレポーター細胞、例えばＪｕｒｋａｔ細胞が活性化されることと直接相関させることができる。例えば、ルシフェラーゼをコードする遺伝子をレポーター遺伝子として使用する場合、細胞から検出される光の量は、標的抗原結合と直接相関し、適切な対照の状況と比較した場合、標的抗原結合の指標となる。一実施態様では、標的抗原結合部位を含む抗原結合分子を異なる濃度で適用し、レポーター遺伝子活性化の半数効果濃度（ＥＣ５０）を決定する。ＥＣ５０とは、抗原結合分子（例えば抗体）またはリガンドの濃度であって、抗原結合分子が、ベースラインと指定された曝露時間後の最大値との中間に、レポーター遺伝子を活性化または阻害するときの濃度を指す。したがって、用量応答曲線のＥＣ５０は、標的抗原に対する最大活性化または阻害効果の５０％が観察される標的抗原結合部分の濃度を表す。
【０１８５】
一実施態様では、標的抗原結合部分は、腫瘍細胞の表面上の腫瘍標的抗原に特異的に結合することができる。一実施態様では、腫瘍標的抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ２、ＬｅＹ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＹＲＰ１およびＷＴ１、またはこれらの断片からなる群から選択される。しかしながら、標的抗原は、主にまたは排他的に細胞表面に位置するタンパク質に限定されず、一時的または恒久的に細胞内に位置するポリペプチドまたはタンパク質に由来する場合もある。このような場合、細胞内ポリペプチドまたはタンパク質に由来する標的抗原は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の１または複数の分子によって（腫瘍）細胞表面に提示され得る。一実施態様では、腫瘍標的抗原は、ＭＨＣの分子に結合したペプチドである。一実施態様では、ＭＨＣはヒトＭＨＣである。一実施態様では、ＭＨＣの分子に結合したペプチドは、全長が８から１００の間、好ましくは８から３０の間、より好ましくは８から１６の間のアミノ酸である。一実施態様では、腫瘍標的抗原は、腫瘍組織において排他的または主に発現されるタンパク質に由来する。一実施態様では、タンパク質は細胞内タンパク質であり、ペプチドは、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ経路によって生成され、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ複合体によって提示される。一実施態様では、ペプチドは、ＭＨＣ−Ｉ経路によって生成され、ＭＨＣクラスＩ複合体によって提示される。一実施態様において、標的抗原結合部分はＴ細胞受容体様（ＴＣＲＬ）抗原結合部分である。ＴＣＲＬ抗原結合部分は、腫瘍組織において排他的または主に発現されるペプチド抗原に特異的に結合することができ、ペプチド抗原は、標的細胞、特にがん細胞の表面に位置するＭＨＣの分子に結合する。この文脈において、本発明の方法は、確立されたまたは新規のＴＣＲＬ標的抗原結合部分を使用して、標的細胞の表面上の特定のペプチド／ＭＨＣ複合体の存在に基づいて、標的細胞、例えば腫瘍細胞の存在を検出するのに特に適している。実際、現在利用可能な診断アッセイフォーマットは、腫瘍特異的なペプチド／ＭＨＣ複合体を特異的に検出する能力が制限されている。本発明は、ＴＣＲＬ抗原結合部分によるペプチド／ＭＨＣ複合体の特異的検出を伴う、ペプチド／ＭＨＣ複合体の特異的かつ高感度のアッセイフォーマットを提供する。本発明のそのような実施態様では、少なくとも１つのＴＣＲＬ抗原結合部分は、認識ドメイン（例えば修飾または変異Ｆｃドメイン）を含む抗原結合分子に含まれる。
【０１８６】
標的抗原結合部分を含む抗原結合分子の標的抗原への結合は、定性的または定性的（ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｌｙ  ｏｒ  ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｌｙ）に、すなわちレポーター遺伝子の発現の有無によって判定することができ、蛍光または発光がない場合は、結合していないことを示す。結合と活性化を定量的に測定するために、レポーター遺伝子活性化の量を基準と比較することができる。したがって、本明細書に記載の診断アッセイは、レポーター遺伝子の発現レベルを基準と比較するステップをさらに含み得る。適切な基準は通常、アッセイまたは方法の１または複数の必須構成要素を省略した、基準となるアッセイと実質的に同一である陰性対照を含む。本発明の方法の場合、省略される構成要素は、例えば、抗原結合分子の付加を省略したり、標的細胞を省略したりすることであり得る。あるいは、抗原結合分子の標的細胞および／または認識ドメインに結合することができないレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞を使用することもできる。一実施態様では、基準は、抗原結合分子の非存在下でのレポーター遺伝子の発現である。別の実施態様において、基準は、標的細胞の非存在下、特に腫瘍細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の発現である。特定の実施態様では、レポーター遺伝子の発現は、基準の存在下でのレポーター遺伝子の発現の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、または１００００倍である。
【０１８７】
あるいは、レポーター遺伝子発現の非存在は、特定の閾値によって、すなわちバックグラウンドシグナルを差し引いた後に、定義され得る。バックグラウンドシグナルは通常、全ての試薬を使用してアッセイを行うが、抗原結合分子を使用せずに、または標的細胞が存在しない状態でアッセイを行うことによって決定される。標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の発現に対する標的細胞の存在下でのレポーター遺伝子の発現のレベルが予め定められた閾値よりも高い場合に、本発明による診断アッセイからの陽性シグナルが与えられる。特定の実施態様では、閾値は、２、３、４、５、１０、１００、１０００、または１０００００である。
【０１８８】
本明細書に記載の新規の診断アッセイは、堅牢で、ハイスループットフォーマットでの使用に適しており、アッセイを達成するために必要なハンズオン時間の点で効率的である。さらに、本発明の診断アッセイは、分析される試料中の死細胞の存在を許容する。これは、抗原結合分子の結合および機能性が細胞生存率または細胞死を測定することによって判定される細胞アッセイとは対照的である。
【０１８９】
本明細書に記載の新規診断アッセイのさらなる利点の１つは、洗浄ステップが不要なことである。試験されるレポーター細胞および／または抗原結合分子は、標的細胞、例えば腫瘍細胞に、いずれかの順序で、または同時に添加することができる。一実施態様では、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞と腫瘍試料は、適当な細胞培養フォーマットで、例えば、２４ウェルプレートのウェル内または９６ウェルプレートのウェルに、希釈した抗原結合分子を含有し得る細胞培養培地に添加される。好ましくは、試験培地は、細胞が最大４８時間生存するための条件を提供する培地である。一実施態様において、診断アッセイは、マイクロタイタープレートで実施される。一実施態様において、マイクロタイタープレートは、ハイスループットスクリーニングに適している。本発明の診断アッセイは、複数の反応の迅速な調製、処理および分析を可能にする任意のフォーマットで行うことができる。これは、例えば、マルチウェルアッセイプレート（例えば、２４ウェル、９６ウェルまたは３８４ウェル）において行うことができる。様々な薬剤のための原液は手動またはロボットで作ることができ、その後のピペッティング、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベーション、試料の読み取り、データ収集および分析は全て、蛍光および／または発光シグナルを検出することが可能な市販の分析ソフトウェア、ロボット、および検出機器を使用して、ロボット制御で行うことができる。
【０１９０】
一実施態様において、ステップｃ）では、２４ウェルプレートの１ウェル当たり約１０００００から約１００００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が提供される。一実施態様において、ステップｃ）では、２４ウェルプレートの１ウェル当たり約３０００００から約７０００００、または約４０００００から約６０００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が提供される。一実施態様において、ステップｃ）では、２４ウェルプレートの１ウェル当たり約５０００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が提供される。一実施態様において、ステップｃ）では、９６ウェルプレートの１ウェル当たり約１００００から約１０００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が提供される。好ましい実施態様において、ステップｃ）では、９６ウェルプレートの１ウェル当たり約３００００から約７００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞、または約４００００から約６００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が提供される。一実施態様において、ステップｃ）では、９６ウェルプレートの１ウェル当たり約５００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が提供される。一実施態様において、ステップｃ）では、３８４ウェルプレートの１ウェル当たり約３０００から約３００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が提供される。一実施態様において、ステップｃ）では、３８４ウェルプレートの１ウェル当たり約５０００から約１５０００、または約８０００から約１２０００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が提供される。一実施態様において、ステップｃ）では、３８４ウェルプレートの１ウェル当たり約１００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が提供される。一実施態様において、ステップｃ）では、細胞培地１ｍｌ当たり約２０００００から約２００００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が提供される。好ましい実施態様において、ステップｃ）では、細胞培地１ｍｌ当たり約８０００００から約１２０００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が提供される。一実施態様において、ステップｃ）では、細胞培地１ｍｌ当たり約１００００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が提供される。
【０１９１】
一実施態様では、抗原結合分子は、約０．１ｆｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌの最終濃度になるように、ステップｂ）で提供される。さらなる実施態様では、抗原結合分子は、約１ｆｇ／ｍｌから約１μｇ／ｍｌ、または約１ｐｇ／ｍｌから約１μｇ／ｍｌの最終濃度になるように、ステップｂ）で提供される。さらなる実施態様では、抗原結合分子は、約０．１ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように、ステップｂ）で提供される。一実施態様では、抗原結合分子は、約１ｎＭから約１００ｎＭの最終濃度になるように、ステップｂ）で提供される。さらなる実施態様では、抗原結合分子は、約５ｎＭから約２００ｎＭ、または約１０ｎＭから約１００ｎＭの最終濃度になるように、ステップｂ）で提供される。さらなる実施態様では、抗原結合分子は、約５０ｎＭの最終濃度になるように、ステップｂ）で提供される。抗原結合分子は、細胞培地で希釈することができる。本明細書に記載の最終濃度に希釈された抗原結合分子は、レポーター細胞を添加する前または後に標的細胞に添加される。一実施態様では、本明細書に記載の最終濃度に希釈された抗原結合分子は、レポーター細胞を添加する前に標的細胞に添加される。
【０１９２】
さらに提供されるのは、本明細書に記載のＣＡＲを発現することが可能な形質導入されたＴ細胞、すなわちレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（例えばＪｕｒｋａｔ細胞）、および本発明による診断アッセイにおけるそれらの使用である。ＣＡＲは、Ｔ細胞内および／またはその表面に天然には含まれず、かつ、正常な（形質導入されていない）Ｔ細胞内またはＴ細胞上に（内因的に）発現しない分子をいう。したがって、Ｔ細胞内でおよび／またはＴ細胞上で使用される本明細書におけるＣＡＲは、人工的にＴ細胞に導入される。人工的に導入され、前記Ｔ細胞（例えばレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞）内および／またはその表面上にその後提示されるＣＡＲ分子は、抗原および／または（Ｉｇ由来の）免疫グロブリン、好ましくは抗体、例えば本発明に従って使用される抗原結合分子のＦｃドメインまたはＦａｂフラグメントに（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで）アクセス可能な１つ以上の抗原結合部分を含むドメインを含む。この文脈において、これらの人工的に導入された分子は、以下に記載の形質導入の後、前記Ｔ細胞内および／またはその表面上に提示される。したがって、形質導入後、本開示によるＴ細胞は、標的抗原および／または免疫グロブリンによって活性化され得る。
【０１９３】
本明細書において提供されるのはまた、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸分子（複数可）によってコードされるＣＡＲを発現する形質導入されたＴ細胞である。したがって、本発明の文脈において、形質導入された細胞は、本明細書で提供および使用されるＣＡＲをコードする核酸分子を含み得る。
【０１９４】
本発明の文脈において、「形質導入されたＴ細胞」という用語は、遺伝子改変Ｔ細胞（すなわち、核酸分子が意図的に導入されたＴ細胞）をいう。特に、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸分子は、レトロウイルスまたはレンチウイルスの形質導入を用いることにより、Ｔ細胞のゲノムに安定して組み込まれ得る。ＣＡＲの細胞外ドメインは、本明細書に記載の抗原結合部分の完全な細胞外ドメイン含んでもよいが、その一部を含んでもよい。必要とされる最小サイズは、ＣＡＲの抗原結合部分の抗原結合部位である。ＣＡＲの細胞外部分（すなわち、抗原結合部分を含む細胞外ドメイン）は細胞表面上で検出することができ、細胞内部分（すなわち、補助刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）および刺激シグナル伝達ドメイン）は細胞表面上で検出することができない。ＣＡＲの細胞外ドメインの検出は、この細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を用いて、または細胞外ドメインが結合可能な認識ドメイン、例えば修飾免疫グロブリンドメインによって、行うことができる。細胞外ドメインは、これらの抗体、抗原または認識ドメインを用いて、フローサイトメトリーまたは顕微鏡法により検出することができる。
【０１９５】
形質導入された細胞は、任意の免疫細胞であってよい。これらには、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、γδＴ細胞、自然リンパ球、マクロファージ、単球、樹状細胞、または好中球および不死化細胞株が含まれるが、これらに限定されない。優先的には、上記免疫細胞は、リンパ球、優先的にはＮＫもしくはＴ細胞またはこれらに由来する不死化細胞株であろう。上記Ｔ細胞には、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞が含まれる。白血球表面でのＣＡＲのトリガリングにより、上記細胞は、その起源となる系列に関係なく、細胞標的細胞に対して反応するようになる。活性化は、ＣＡＲに対して選択された刺激シグナル伝達ドメインまたは補助刺激シグナル伝達ドメインに関係なく起こり、追加のサイトカインの外因性供給には依存しない。
【０１９６】
形質導入された細胞は、さらなる核酸分子、例えば、本明細書に記載の応答エレメントをコードする核酸分子と同時形質導入されてもよい。
【０１９７】
形質導入された細胞は、好ましくは、それらの自然環境の外で、制御された条件下で増殖される。特に、「培養する」という用語は、細胞（例えば形質導入された細胞）がｉｎ  ｖｉｔｒｏであることを意味する。細胞を培養することは、元の組織源から分離された細胞を生きたまま維持するための実験技術である。本明細書において、本発明に従って用いられる形質導入細胞は、導入された遺伝子の上記形質導入細胞内または上記形質導入細胞上での発現を可能にする条件下で培養される。導入遺伝子の発現を可能にする条件は、当技術分野で一般的に知られている。
【０１９８】
本明細書でさらに提供されるのは、本発明に従って使用される１または複数のＣＡＲをコードする核酸およびベクターである。核酸分子は、調節エレメントの制御下にあってもよい。例えば、プロモーター、転写エンハンサー、および／またはＣＡＲの誘導発現を可能にする配列を使用することができる。本発明の文脈において、核酸分子は、構成的または誘導性プロモーターの制御下で発現される。適切なプロモーターは、例えば、ＣＭＶプロモーター（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＵＢＣプロモーター（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＰＧＫ（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＥＦ１Ａプロモーター（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＣＡＧＧプロモーター（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＳＶ４０プロモーター（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＣＯＰＩＡプロモーター（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＡＣＴ５Ｃプロモーター（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＴＲＥプロモーター（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、Ｏｃｔ３／４プロモーター（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９（２００４），Ｓ３６７-Ｓ３６７（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２００４．０６．９０４））、またはＮａｎｏｇプロモーター（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１５（５）（２００５），３１７−２４）である。本明細書において、ベクターという用語は、それが導入された細胞（すなわち、形質導入細胞）において自律的に複製することができる環状または直鎖状の核酸分子をいう。多くの適切なベクターが分子生物学の当業者に知られており、その選択は、所望の機能に依存し、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、および遺伝子工学で従来から使用されている他のベクターを含む。様々なプラスミドおよびベクターを構築するために、当業者に周知の方法を使用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ｌｏｃ  ｃｉｔ．）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），（１９９４）に記載されている技術を参照されたい。あるいは、ポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞への送達のためにリポソームに再構成することができる。関連する配列は、特定のポリペプチドの発現が必要とされる発現ベクターに移すことができる。典型的なクローニングベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＡ１８およびｐＧＢＴ９が含まれる。典型的な発現ベクターには、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが含まれる���ベクターは、ポリシストロニックであり得る。そのような調節エレメント（制御エレメント）は当業者に知られており、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、およびベクター（複数可）にインサートを導入するための翻訳および挿入部位を含み得る。本発明の文脈において、上記核酸分子（複数可）は、真核細胞または原核細胞での発現を可能にする上記発現制御配列に作動可能に結合している。上記ベクター（複数可）は、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸分子を含む発現ベクターであることが想定される。作動可能に結合しているとは、そのように記載されている構成要素が意図されたように機能することを可能にする関係にある並置を指す。コード配列に作動可能に結合した制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。制御配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸が好ましく使用されることは当業者にとって明らかである。
【０１９９】
本発明の文脈において、記載のベクター（複数可）は、発現ベクターである。発現ベクターは、選択された細胞を形質転換するために使用することができるコンストラクトであって、選択された細胞におけるコード配列の発現を提供するコンストラクトである。発現ベクター（複数可）は、例えば、クローニングベクター（複数可）、バイナリーベクター（複数可）、または組み込みベクター（複数可）であり得る。発現は、好ましくは核酸分子を翻訳可能なｍＲＮＡに転写することを含む。原核生物および／または真核細胞における発現を確実にする調節エレメントは、当業者によく知られている。真核細胞の場合、それらは通常、転写の開始を確実にするプロモーターと、転写の終了および転写物の安定化を確実にする任意選択のポリＡシグナルとを含む。原核生物宿主細胞での発現を可能にする、考えらえる調節エレメントとしては例えば、大腸菌のＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターが含まれ、真核生物宿主細胞での発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母のＡＯＸ１もしくはＧＡＬ１プロモーター、または哺乳類および他の動物細胞のＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサーもしくはグロビンイントロンである。
【０２００】
このような調節エレメントは、転写の開始に関与するエレメントの他に、ポリヌクレオチドの下流に、ＳＶ４０−ポリ−Ａ部位またはｔｋ−ポリ−Ａ部位などの転写終止シグナルを含んでいてもよい。さらに、使用される発現系によっては、ポリペプチドを細胞区画に誘導するか、または培地中に分泌することができるシグナルペプチドをコードするリーダー配列が、引用された核酸配列のコード配列に付加されてもよく、当技術分野でもよく知られている。例えば、別記の実施例も参照されたい。
【０２０１】
リーダー配列（複数可）は、翻訳、開始および終止配列と適切な段階で組み合わされ、好ましくは、翻訳されたタンパク質またはその一部を細胞周辺腔または細胞外培地に分泌するように指示することができるリーダー配列である。任意選択的に、異種配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製を与えるＮ末端同定ペプチドを含むＣＡＲをコードすることができる。この文脈において、適切な発現ベクターは、当技術分野で知られており、例えば、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ、ｐＥＦ−ＡＤＡまたはｐＥＦ−ｎｅｏ（Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001), 141-150）またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）である。
【０２０２】
Ｔ細胞またはその前駆細胞に導入される記載の核酸分子（複数可）またはベクター（複数可）は、細胞のゲノムに組み込まれるか、または染色体外に維持され得る。
【０２０３】
例示的な実施態様
１．試料中の腫瘍細胞の存在を判定するための診断アッセイであって、以下のステップ：
ａ）試料を、抗原結合ドメインと認識ドメインとを含む抗原結合分子と接触させるステップであって、抗原結合ドメインが、腫瘍細胞に特異的に結合可能な標的抗原結合部分を含む、接触させるステップ；
ｂ）試料を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞と接触させるステップであって、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が、
ｉ．応答エレメントに作動可能に結合されており、認識ドメインに特異的に結合可能なＣＡＲ；
ｉｉ．応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子；
を含む、接触させるステップ：および
ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定して腫瘍細胞の存在を確認することにより、Ｔ細胞の活性化を判定するステップ
を含む診断アッセイである。
２．ＣＡＲが、認識ドメインに特異的に結合可能な抗原結合部分を含む、実施態様１の診断アッセイ。
３．抗原結合分子が抗原結合ドメインと認識ドメインとを含み、抗原結合ドメインが標的抗原結合部分を含み、ＣＡＲが、認識ドメインに特異的に結合することができる、実施態様１または２の診断アッセイ。
４．抗原結合ドメインおよび認識ドメインが免疫グロブリンドメインまたはその断片である、実施態様１から３のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
５．抗原結合ドメインおよび認識ドメインが、抗体、Ｆｃドメイン、Ｆａｂ断片、クロスオーバーＦａｂ断片、単鎖Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、単一ドメイン抗体、ＶＨ、またはこれらの断片からなる群から個別に選択される、実施態様１から４のいずれか１つの診断アッセイ。
６．抗原結合ドメインがＦａｂ断片であり、認識ドメインがＦｃドメインである、実施態様１から５のいずれか１つの診断アッセイ。
７．抗原結合分子が、ＩｇＧクラス抗体、特にＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプ抗体である、実施態様１から６のいずれか１つの診断アッセイ。
８．認識ドメインが変異Ｆｃドメインであり、変異Ｆｃドメインが、非変異親Ｆｃドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ＣＡＲが、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することはできるが、非変異親Ｆｃドメインには特異的に結合することができない、実施態様１から７のいずれか１つの診断アッセイ。
９．変異Ｆｃドメインが、ＥＵ番号付けによるＬ２３４、Ｌ２３５、Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｐ３３１、Ｐ３２９およびＨ４３５からなる群から選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、特にアミノ酸変異がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３３１Ｇおよび／またはＨ４３５Ａである、実施態様８の診断アッセイ。
１０．変異体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基１１７、１１８、１３６、１８０、１９３、２１２、２１４および３１８からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を含み、特に、変異体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基１１７にロイシンからアラニン、残基１１８にロイシンからアラニン、位置１３６にイソロイシンからアラニン、残基１８０にアスパラギンからアラニン、残基１９３にヒスチジンからアラニン、残基２１２にプロリンからグリシン、残基２１４にプロリンからグリシン、および／または残基３１８にヒスチジンからアラニンへのアミノ酸置換を含む、実施態様８または９の診断アッセイ。
１１．変異体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基２１２の位置にアミノ酸置換を含み、特に、変異体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基２１２にプロリンからグリシンへのアミノ酸置換を含む、実施態様８から１０のいずれか１つの診断アッセイ。
１２．変異Ｆｃドメインが、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む、実施態様８から１１のいずれか１つの診断アッセイ。
１３．抗原結合ドメインと認識ドメインが同じドメイン、特にＦａｂ断片である、実施態様１から５のいずれか１つの診断アッセイ。
１４．認識ドメインがタグを含む、実施態様１から１３のいずれか１つの診断アッセイ。
１５．ＣＡＲが、タグを含む認識ドメインに特異的に結合することはできるが、タグを含まない認識ドメインには特異的に結合することができない、実施態様１４の診断アッセイ。
１６．タグがハプテン分子である、実施態様１４または１５の診断アッセイ。
１７．ハプテン分子が認識ドメインに結合されている、実施態様１６の診断アッセイ。
１８．ハプテン分子が認識ドメインに共有結合的に結合されている、実施態様１６の診断アッセイ。
１９．ハプテン分子が認識ドメインに非共有結合的に結合されている、実施態様１６の診断アッセイ。
２０．ハプテン分子が、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）およびフルオレセイン（ＦＩＴＣ）からなる群から選択される、実施態様１６の診断アッセイ。
２１．タグがポリペプチドタグである、実施態様１４または１５の診断アッセイ。
２２．ポリペプチドタグは、１‐３０アミノ酸、１‐２５アミノ酸、１‐２０アミノ酸、１‐１５アミノ酸または１‐１０アミノ酸の長さを有する、実施態様２１の診断アッセイ。  
２３．ポリペプチドタグが、Ｃ末端において認識ドメインのＮ末端に、場合によりペプチドリンカーを介して、接続されている、実施態様２１または２２の診断アッセイ。
２４．ポリペプチドタグが、Ｎ末端において認識ドメインのＣ末端に、場合によりペプチドリンカーを介して、接続されている、実施態様２１または２２の診断アッセイ。
２５．ポリペプチドタグは、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ａｖｉタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＧＣＮ４タグおよびＮＥタグからなる群から選択される、実施態様２２から２４のいずれか１つの診断アッセイ。
２６．ＣＡＲが、少なくとも１つの細胞内刺激シグナル伝達および／または補助刺激シグナル伝達ドメインを含む、実施態様１から２５のいずれか１つの診断アッセイ。
２７．標的抗原結合部分の標的抗原への結合および抗原結合部分の認識ドメインへの結合が、細胞内シグナル伝達および／または補助シグナル伝達ドメインの活性化をもたらす、実施態様２６の診断アッセイ。
２８．細胞内シグナル伝達および／または補助シグナル伝達ドメインの活性化が応答エレメントの活性化をもたらす、実施態様２６または２７の診断アッセイ。
２９．応答エレメントがレポーター遺伝子の発現を制御する、実施態様１から２８のいずれか１つの診断アッセイ。
３０．応答エレメントの活性化がレポーター遺伝子の発現をもたらす、実施態様１から２９のいずれか１つの診断アッセイ。
３１．応答エレメントがＮＦＡＴ経路、ＮＦ−κＢ経路またはＡＰ−１経路の一部である、実施態様１から３０のいずれか１つの診断アッセイ。
３２．レポーター遺伝子が発光タンパク質をコードしている、実施態様１から３１のいずれか１つの診断アッセイ。
３３．レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼをコードしている、実施態様１から３２のいずれか１つの診断アッセイ。
３４．標的抗原結合部分が、腫瘍細胞の表面上の腫瘍標的抗原に特異的に結合することができる、実施態様１から３３のいずれか１つの診断アッセイ。
３５．腫瘍標的抗原が細胞表面抗原および／または細胞表面受容体である、実施態様３４の診断アッセイ。
３６．腫瘍標的抗原が、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ２、ＬｅＹ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＹＲＰ１およびＷＴ１、またはこれらの断片からなる群から選択される、実施態様３４または３５の診断アッセイ。
３７．腫瘍標的抗原が、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の分子に結合したペプチドである、実施態様３４から３６のいずれか１つの診断アッセイ。
３８．標的抗原結合部分がＴ細胞受容体様（ＴＣＲＬ）抗原結合部分である、実施態様３７の診断アッセイ。
３９．試料が、疾患に罹患している個体に由来する患者試料であり、特に疾患ががんである、実施態様１から３８のいずれか１つの診断アッセイ。
４０．以下のステップ：
ｃ）レポーター遺伝子の発現を基準と比較するステップ
をさらに含む、実施態様１から３９のいずれか１つの診断アッセイ。
４１．基準が基準試料の存在下でのレポーター遺伝子の発現であり、基準試料が腫瘍細胞を含まない、実施態様４０の診断アッセイ。
４２．レポーター遺伝子の発現は、基準試料の存在下でのレポーター遺伝子の発現の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、または１００００倍である、実施態様４１の診断アッセイ。
４３．試料が患者試料である、実施態様１から４２のいずれか１つの診断アッセイ。
４４．以下のステップ：
ｄ）基準の存在下でのレポーター遺伝子の発現に対する患者試料の存在下でのレポーター遺伝子の発現が予め定められた閾値よりも高い場合に、腫瘍細胞の存在を確認するステップ
をさらに含む、実施態様４３の診断アッセイ。
４５．基準が基準試料の存在下でのレポーター遺伝子の発現であり、基準試料が腫瘍細胞を含まない、実施態様４４の診断アッセイ。
４６．閾値が２、３、４、５、１０、１００、１０００または１０００００である、実施態様４４または４５の診断アッセイ。
４７．患者が哺乳動物であり、特に患者がヒトである、実施態様１から４６のいずれか１つの診断アッセイ。
４８．
（ａ）腫瘍細胞に特異的に結合可能な抗原結合分子；および
（ｂ）（ｉ）抗原結合分子に特異的に結合可能なＣＡＲと（ｉｉ）応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子とを含む形質導入Ｔ細胞であって、ＣＡＲが応答エレメントに作動的に結合されている、形質導入Ｔ細胞
を含む診断キット。
４９．抗原結合分子が、腫瘍細胞の表面上の腫瘍標的抗原に特異的に結合可能な標的抗原結合部分を含む、実施態様４８の診断キット。
５０．腫瘍標的抗原が細胞表面抗原および／または細胞表面受容体である、実施態様４９の診断キット。
５１．腫瘍標的抗原が、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ２、ＬｅＹ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＹＲＰ１およびＷＴ１、またはこれらの断片からなる群から選択される、実施態様４９または５０の診断キット。
５２．腫瘍標的抗原が、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の分子に結合したペプチドである、実施態様４９から５１のいずれか１つの診断キット。
５３．標的抗原結合部分がＴ細胞受容体様（ＴＣＲＬ）抗原結合部分である、実施態様５２の診断キット。
５４．抗原結合分子が、ＩｇＧクラス抗体、特にＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４アイソタイプ抗体またはその断片である、実施態様４８から５３のいずれか１つの診断キット。
５５．抗原結合分子が変異Ｆｃドメインを含み、変異Ｆｃドメインが、非変異親Ｆｃドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ＣＡＲが、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することはできるが、非変異親Ｆｃドメインには特異的に結合することができない、実施態様４８から５４のいずれか１つの診断キット。
５６．変異Ｆｃドメインが、ＥＵ番号付けによるＬ２３４、Ｌ２３５、Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｐ３３１、Ｐ３２９およびＨ４３５からなる群から選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、特にアミノ酸変異がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３３１Ｇおよび／またはＨ４３５Ａである、実施態様５５の診断キット。
５７．変異体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基１１７、１１８、１３６、１８０、１９３、２１２、２１４および３１８からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を含み、特に、変異体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基１１７にロイシンからアラニン、残基１１８にロイシンからアラニン、位置１３６にイソロイシンからアラニン、残基１８０にアスパラギンからアラニン、残基１９３にヒスチジンからアラニン、残基２１２にプロリンからグリシン、残基２１４にプロリンからグリシン、および／または残基３１８にヒスチジンからアラニンへのアミノ酸置換を含む、実施態様５５または５６の診断キット。
５８．変異体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基２１２の位置にアミノ酸置換を含み、特に、変異体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１３２）の残基２１２にプロリンからグリシンへのアミノ酸置換を含む、実施態様５５から５７のいずれか１つの診断キット。
５９．変異Ｆｃドメインが、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む、実施態様５５から５８のいずれか１つの診断キット。
６０．抗原結合分子がタグを含み、ＣＡＲが、タグを含む抗原結合分子に特異的に結合することはできるが、タグを含まない抗原結合分子には特異的に結合することができない、実施態様４８から５４のいずれか１つの診断キット。
６１．タグがハプテン分子である、実施態様６０の診断キット。
６２．ハプテン分子が、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）およびフルオレセイン（ＦＩＴＣ）からなる群から選択される、実施態様６１の診断キット。
６３．タグがポリぺプチドタグである、実施態様６２の診断キット。
６４．ポリペプチドタグが、１‐３０アミノ酸、１‐２５アミノ酸、１‐２０アミノ酸、１‐１５アミノ酸または１‐１０アミノ酸の長さを有する、実施態様６３の診断キット。
６５．ポリペプチドタグが、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ａｖｉタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＧＣＮ４タグおよびＮＥタグからなる群から選択される、実施態様６３または６４の診断キット。
６６．がんの診断における使用のための、実施態様４８から６５のいずれか１つの診断キット。
６７．抗腫瘍治療の有効性をモニタリングするための方法であって、抗腫瘍治療を受けた対象から試料を提供することと、実施態様１から４７のいずれか１つの診断アッセイまたは実施態様４８から６６のいずれか１つの診断キットを用いて腫瘍細胞の存在を判定することとを含む、方法。
６８．腫瘍に罹患している患者へのＴ細胞活性化抗原結合分子の投与による抗腫瘍治療の有効性を予測するための方法であって、対象から試料を提供することと、実施態様１から４７のいずれか１つの診断アッセイまたは実施態様４８から６６のいずれか１つの診断キットを用いてレポーター遺伝子の発現を判定することとを含む方法であって、Ｔ細胞活性化抗原結合分子がアッセイまたはキットにおいて抗原結合分子として使用され、レポーター遺伝子の発現が抗腫瘍治療の有効性を予測するための指標となる、方法。
６９．実施例のいずれかまたは添付の図面のいずれか１つを参照して前述した本明細書の診断アッセイおよび方法。
【実施例】
【０２０４】
以下は本発明の方法および組成物の例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２０５】
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を製造者の指示書に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ９１−３２４２に示されている。
【０２０６】
ＤＮＡシークエンシング
ＤＮＡ配列は、二本鎖シークエンシングにより決定された。
【０２０７】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを用いるＰＣＲによって生成されたか、または遺伝子自動合成による合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物からＧｅｎｅａｒｔ社（ドイツ、レーゲンスブルク）によって合成された。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／シークエンシングベクターにクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
【０２０８】
タンパク質の精製
標準的なプロトコールを参照して、ろ過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、抗体を、プロテインＡ−セファロースカラム（ＧＥヘルスケア）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出はｐＨ２．８で達成され、その直後に試料を中和した。凝集したタンパク質を、ＰＢＳ中または２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００，ＧＥヘルスケア）により、単量体抗体から分離させた。単量体抗体画分をプールし、（必要な場合）例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し、−２０℃または−８０℃で凍結保存した。これらの試料の一部が、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるその後のタンパク質解析および分析的特徴付けのために提供された。
【０２０９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示書に従って使用した。特に、１０％もしくは４−１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤ランニングバッファー添加剤を含む）またはＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
【０２１０】
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集およびオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって実施した。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システムでの３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）のＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムに、またはＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ−システムでの２ｘＰＢＳのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケア）に適用した。ＵＶ吸光度とピーク面積の積分により、溶出したタンパク質を定量化した。バイオ・ラッドのゲルろ過スタンダード１５１-１９０１が標準としての役割を果たした。
【０２１１】
抗体産生
それぞれの抗体は、ポリエチレンイミンを使用して、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターでコトランスフェクトすることによって産生され
た。細胞に、重鎖と軽鎖に１：１の割合で対応する発現ベクターをトランスフェクトした。
【０２１２】
Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴＣＡＲ−Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
レンチウイルスベクターを作製するために、構成的に活性なヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）下で、ＣＡＲの正確なアセンブリのためのそれぞれのＤＮＡ配列を、インフレームでレンチウイルスポリヌクレオチドベクターにクローニングした。レトロウイルスベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、中心ポリプリン路（ｃＰＰＴ）エレメント、ｐＵＣ複製起点、および細菌における増殖と選択を促進する抗生物質耐性をコードする遺伝子を含んでいた。
【０２１３】
機能性ウイルス粒子を作製するために、６０−７０％のコンフルエントなＨｅｋ２９３Ｔセル（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ３２１６）、ならびにＣＡＲを含むベクターおよびｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ：ｐＲＳＶ−ＲＥＶ：ｐＣｇｐＶ転写ベクターを３：１：１：１の割合で用いて、リポフェクタミンＬＴＸＴＭベースのトランスフェクションを行った。４８時間後に上清を採取し、２５０ｇで５分間遠心分離して細胞破片を除去し、０．４５μｍまたは０．２２μｍのポリエーテルスルホンフィルターを通してろ過した。Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ細胞（Ｓｉｇｎｏｓｉｓ）の形質導入には濃縮ウイルス粒子（Ｌｅｎｔｉ−ｘＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ，Ｔａｋａｒａ）を用いた。陽性形質導入細胞を、ＦＡＣＳ−ＡＲＩＡソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてプールまたは単一クローンとしてソートした。適切な密度まで細胞を増殖させた後、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞を実験に用いた。
【０２１４】
実施例１
抗ＣＤ２０抗体ＧＡ１０１をジゴキシゲニル化し、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）分子組み込みをウエスタンブロット解析で検証した。抗体とジゴキシゲニンのカップリング反応のために、２０ｍＭ  Ｈｉｓ  １４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６）に溶解した抗体をまず脱塩し、ＺｅｂａＴＭスピン脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  カタログ＃８９８８９）を用いてバッファーを０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８）バッファーに交換した。抗体とジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ＃１１３３３０５４００１）の等モル以上（１：３の割合）の量を、シェーカーで室温で１時間、３００ｒｐｍでインキュベートした。抗体−ジゴキシゲニンコンジュゲートを再び脱塩し、バッファーを２０ｍＭ  Ｈｉｓ  １４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６）に交換した。非コンジュゲートＤｉｇ‐ＮＨＳを同じステップで除去した（カットオフ７ｋＤａ）。
【０２１５】
ジゴキシゲニニル化を、ウエスタンブロットにおいて抗ジゴキシゲニン‐ＡＰ  Ｆａｂ断片（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ＃１１０９３２７４９１０）により検出した。それぞれの（非）コンジュゲート抗体１μｇを総量２０μｌのＮｕＰＡＧＥＴＭＬＤＳサンプルバッファー（４Ｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  カタログ＃ＮＰ０００７）と混合し、９５℃で５分間煮沸した。１０μｌをＮｕＰＡＧＥＴＭ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓタンパク質ゲル１．０ｍｍ、１０ウェル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  カタログ＃ＮＰ０３２１）にロードし、１ｘＮｕＰＡＧＥＴＭＭＥＳ  ＳＤＳランニングバッファー（カタログ＃ＮＰ０００２）中で１７０Ｖで１時間泳動させた。その後、トランスブロット（登録商標）ＴｕｒｂｏＴＭ転写システム（バイオ・ラッド，カタログ＃１７０４１５０、混合分子量標準プロトコール）を用いて、０，２μｍ  ＰＶＤＦ膜（トランスブロット（登録商標）ＴｕｒｂｏＴＭパック，バイオ・ラッド  カタログ＃１７０４１５６）上にゲルをブロットした。１ｘＴＢＳ−Ｔバッファー中５％ミルクで膜を室温で１時間、オービタルシェーカーでブロックした。抗ジゴキシゲニン−ＡＰ  Ｆａｂ断片を５％ミルク／ＴＢＳ−Ｔに１：２０００で希釈し、オービタルシェーカーで室温で１時間インキュベートした。膜を１ｘＴＢＳ−Ｔで各１０分間３回洗浄した。その後、ＢＣＩＰ（登録商標）／ＮＢＴ−Ｂｌｕｅ膜用液体基質システム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ＃Ｂ３８０４）２ｍｌ中で膜を１分間インキュベートした。再蒸留水で３回洗浄した後、膜を乾燥させ、記録した（図７）。
【０２１６】
実施例２
Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ‐Ｔ細胞における抗ジゴキシゲニン‐ｄｓ‐ｓｃＦｖ‐ＣＤ２８ＡＴＤ‐ＣＤ２８ＤＣＤ３ｚＳＳＤの発現とジゴキシゲニン‐Ｃｙ５のＣＡＲへの結合をＦＡＣＳにより確認した。抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＤＣＤ３ｚＳＳＤ導入Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞を３００ｇで３分間室温でペレット化し、新鮮なＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に適量再懸濁させた。その後、３ｘ１０５個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、一度３００ｇで５分間スピンダウンし、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中の１００μｌに再懸濁させた。Ｄｉｇ‐Ｃｙ５を最終濃度２０ｎＭになるまで加え、氷上で４５分間インキュベートした。その後、細胞をペレット化し、氷冷ＰＢＳに再懸濁させた。洗浄ステップをさらに２回繰り返した。その後、フローサイトメトリーにより細胞のＣｙ５シグナル（ＡＰＣチャネル）を解析した（図８）。陰性対照として、非形質導入Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ細胞を同様に処理し、解析した。
【０２１７】
実施例３
ここに記載されているのは、ＣＤ２０を発現するＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を標的細胞として、および抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済みのプールをレポーター細胞として用いる、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイである（図９）。ジゴキシゲニル化（Ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎｙｌａｔｅｄ）ＧＡ１０１ＩｇＧ（抗体：Ｄｉｇ−ＮＨＳ比１：１０）をＩｇＧとして使用したが、これは、一方では腫瘍抗原を認識し、他方では形質導入されたＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される。陽性対照として、９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌｓｔａｒ  Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ＃６５５１８５）に、ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）から）を１０μｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を一晩４℃で、または３７℃で少なくとも１時間コーティングした。ＣＤ３でコーティングされたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最後の洗浄ステップの後、ＰＢＳを完全に除去した。レポーター細胞またはＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型細胞を計数し、Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓを用いてその生存率をチェックした。細胞数は、１ｘ１０６生細胞／ｍｌに調整した。したがって、細胞懸濁液の適切なアリコートを２１０ｇで５分間、室温（ＲＴ）でペレット化し、新鮮なＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に再懸濁させた。目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、それらの生存率についてもチェックした。細胞数は、増殖培地中、１ｘ１０６生細胞／ｍｌに調整した。標的細胞とレポーター（エフェクター）細胞を、９６ウェル懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ  ｏｎｅ）に、Ｅ（エフェクター細胞）：Ｔ（標的細胞）比５：１で３連で蒔いた（ウェル当たり合計１１０．０００細胞）。次のステップとして、目的の抗原を標的とするジゴキシゲニニル化ＧＡ１０１抗体の段階希釈液を、２ｍｌのディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を用いて増殖培地で調製した。ウェル当たり２００μｌの最終体積で１μｇ／ｍｌ‐０．０１ｐｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得るために、５０μｌアリコートの異なる希釈物をそれぞれのウェルにピペットで移した。９６ウェルプレートを１９０ｇおよび室温で２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封し、湿度雰囲気中、３７℃および５％ＣＯ２でプレートをインキュベートした。２０時間のインキュベーション後、マルチチャンネルピペットを用いて１０回上下にピペッティングすることより、各ウェルの内容物を混合した。１００μｌ細胞懸濁液を新しい白色フラットクリアボトム９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ‐ｂｉｏ‐ｏｎｅ）に移し、１００μｌのＯＮＥ‐ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。ロータリーシェーカーで３００ｒｐｍ、室温暗所で１５分インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを用いてウェル当たり１秒の検出時間で発光を測定した。標的細胞とレポーター細胞を５：１の比率で２０時間共培養すると（灰色の丸）、ジゴキシゲニル化ＧＡ１０１  ＩｇＧを抗体として用いた場合、グラフは抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の用量依存的な活性化を示す（図９）。ジゴキシゲニニル化を伴わないＧＡ１０１  ＩｇＧを用いた場合（図９、灰色の四角形で描画）、形質導入されたＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化は検出できなかった。１μｇ／ｍｌのジゴキシゲニニル化ＧＡ１０１とインキュベートしたが標的細胞なしでインキュベートしたさらなるＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型細胞は、いかなる活性化も示さなかった（図９黒い四角形）。対照的に、抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞を、標的細胞なしで、１μｇ／ｍｌのジゴキシゲニニル化ＧＡ１０１  ＩｇＧとインキュベートしたところ、活性化を示した（図９黒い三角）。
【０２１８】
ポイントは各々、３反復の技術的反復実験（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｓ）の平均値を表す。値は全て、ベースライン補正したものとして描いている。標準偏差はエラーバーで表示している。
【０２１９】
実施例４
ここに記載されているのは、ＣＤ２０を発現するＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を標的細胞として、および抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済みのプール（図１１Ａ）または抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のプール（図１１Ｂ）をレポーター細胞として用いる、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイである。Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＧＡ１０１ＩｇＧをＩｇＧとして使用したが、これは、一方では腫瘍抗原を認識し、他方では形質導入されたＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される。陽性対照として、９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌｓｔａｒ  Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ＃６５５１８５）に、ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）から）１０μｇ／ｍｌを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を一晩４℃で、または３７℃で少なくとも１時間コーティングした。ＣＤ３でコーティングされたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最後の洗浄ステップの後、ＰＢＳを完全に除去した。レポーター細胞またはＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型細胞を計数し、Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓを用いてその生存率をチェックした。細胞数は、１ｘ１０６生細胞／ｍｌに調整した。したがって、細胞懸濁液の適切なアリコートを２１０ｇで５分間、室温（ＲＴ）でペレット化し、新鮮なＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に再懸濁させた。目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、それらの生存率についてもチェックした。細胞数は、レポーター細胞について記載したのと同様に、増殖培地中、１ｘ１０６生細胞／ｍｌに調整した。標的細胞とレポーター細胞を、９６ウェル懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ  ｏｎｅ）に、Ｅ：Ｔ比５：１または１：１のおのおので３連ずつ蒔いた（ウェル当たり合計１１０．０００細胞）。次のステップとして、目的の抗原を標的とするＰ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＧＡ１０１の段階希釈液を、２ｍｌのディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を用いて増殖培地で調製した。ウェル当たり２００μｌの最終体積で１μｇ／ｍｌ‐０．０００１μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得るために、５０μｌアリコートの異なる希釈物をそれぞれのウェルにピペットで移した。９６ウェルプレートを１９０ｇおよび室温で２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封し、湿度雰囲気中、３７℃および５％ＣＯ２でプレートをインキュベートした。２０時間のインキュベーション後、マルチチャンネルピペットを用いて各ウェルの内容物を１０回上下にピペッティングすることより混合した。１００μｌ細胞懸濁液を新しい白色フラットクリアボトム９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ‐ｂｉｏ‐ｏｎｅ）に移し、１００μｌのＯＮＥ‐ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。ロータリーシェーカーで３００ｒｐｍ、室温暗所で１５分インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを用い��ウェル当たり１秒の検出時間で発光を測定した。
【０２２０】
標的細胞とレポーター細胞を５：１（丸）または１：１（四角形）の比で２０時間共培養すると、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＧＡ１０１  ＩｇＧを抗体として使用した場合（図１１ＡおよびＢ、黒で描画）、グラフは、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞および抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の用量依存的な活性化を示す。Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴わないＧＡ１０１  ＩｇＧ（図１１ＡおよびＢ、灰色で描画）を用いた場合、形質導入されたＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化は検出できなかった。ポイントは各々、各２反復の技術的反復実験として実施された、２反復の生物学的反復実験（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）の平均値を表す。値は全て、ベースライン補正したものとして描いている。標準偏差はエラーバーで表示している。
【０２２１】
実施例５
ここに記載されているのは、ＣＤ２０を発現するＳＵＤＨＤＬ４（図１２Ｃおよび１２Ｄ）またはＷＳＵＤＬＣＬ２（図１２Ａおよび１２Ｂ）腫瘍細胞を標的細胞として、および抗Ｐ３２９Ｇ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現する単一クローンＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ細胞をレポーター細胞として用いる、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイである。Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＧＡ１０１ＩｇＧをＩｇＧとして使用したが、これは、一方では腫瘍抗原を認識し、他方ではＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される。レポーター細胞またはＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型細胞を計数し、Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓを用いてその生存率をチェックした。細胞数は、１ｘ１０６生細胞／ｍｌに調整した。したがって、細胞懸濁液の適切なアリコートを２１０ｇで５分間、室温（ＲＴ）でペレット化し、新鮮なＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に再懸濁させた。目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、それらの生存率についてもチェックした。細胞数は、レポーター細胞について記載したのと同様に、増殖培地中、１ｘ１０６生細胞／ｍｌに調整した。標的細胞とレポーター細胞を、９６ウェル懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ  ｏｎｅ）にＥ：Ｔ比１０：１、５：１または１：１のいずれかで３連ずつ蒔いた（ウェル当たり合計１１０．０００細胞）。次のステップとして、目的の抗原を標的とするＰ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＧＡ１０１の段階希釈液を、２ｍｌのディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を用いて増殖培地で調製した。ウェル当たり２００μｌの最終体積で１μｇ／ｍｌ‐０．０００１μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得るために、５０μｌアリコートの異なる希釈物をそれぞれのウェルにピペットで移した。９６ウェルプレートを１９０ｇおよび室温で２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封し、湿度雰囲気中、３７℃および５％ＣＯ２でプレートをインキュベートした。２０時間のインキュベーション後、マルチチャンネルピペットを用いて各ウェルの内容物を１０回上下にピペッティングすることより混合した。１００μｌ細胞懸濁液を新しい白色フラットクリアボトム９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ‐ｂｉｏ‐ｏｎｅ）に移し、１００μｌのＯＮＥ‐ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。ロータリーシェーカーで３００ｒｐｍ、室温暗所で１５分インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを用いてウェル当たり１秒の検出時間で発光を測定した。
【０２２２】
１０：１（丸）、５：１（四角形）または１：１（三角形）の割合で標的細胞とレポーター細胞を２０時間共培養すると、グラフは、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡを伴うＧＡ１０１  ＩｇＧ（図１２Ａ−Ｄ、黒で描画）用量依存的な活性化を示す。Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴わないＧＡ１０１  ＩｇＧが使用された場合（図１２Ａ−Ｄ、灰色で描画）、形質導入されＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のわずかな活性化のみが、１μｇ／ｍｌの最も高い抗体濃度で検出された。ポイントは各々、２反復の技術的反復実験の平均値を表す。値は全て、ベースライン補正したものとして描いている。標準偏差はエラーバーで表示している。
【０２２３】
実施例６
ここに記載されているのは、接着性ＦＡＰを発現するＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ  ｃｌ  １９腫瘍細胞を標的細胞として用いて実施した、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイである。レポーター細胞として、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（図１３Ａ）または抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（図１３Ｃ）のソート済みのプールを使用した。Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＦＡＰ  ４Ｂ９  ＩｇＧをＩｇＧとして使用したが、これは、一方では腫瘍抗原を認識し、他方ではＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される。アイソタイプ対照として、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＩｇＧ  ＤＰ４７／ｖｋ３を含めた。陽性対照として、９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌｓｔａｒ  Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ＃６５５１８５）のウェルに、ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）から）１０μｇ／ｍｌを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を３７℃で少なくとも１時間コーティングした。ＣＤ３でコーティングされたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最後の洗浄ステップの後、ＰＢＳを完全に除去した。接着性ＮＩＨ／３Ｔ３‐ｈｕＦＡＰ  ｃｌ  １９標的細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシンで剥離させた。剥離した細胞をＤＭＥＭ＋４．５ｇ  ＬＤ−グルコース＋Ｌ−グルタミン＋２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋１０％ＦＣＳおよび１％Ｇｌｕｔａｍａｘに再懸濁させた。レポーター細胞またはＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型細胞を計数し、Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓを用いてその生存率をチェックした。細胞数は、１ｘ１０６生細胞／ｍｌに調整した。したがって、細胞懸濁液の適切なアリコートを２１０ｇで５分間、室温（ＲＴ）でペレット化し、新鮮なＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に再懸濁させた。目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、それらの生存率についてもチェックした。細胞数は、レポーター細胞について記載したのと同様に、増殖培地中、１ｘ１０６生細胞／ｍｌに調整した。標的細胞とレポーター細胞を、９６ウェル懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ  ｏｎｅ）にＥ：Ｔ比５：１で３連で蒔いた（ウェル当たり合計１１０．０００細胞）。次のステップとして、目的の抗原を標的とするＰ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＧＡ１０１の段階希釈液を、２ｍｌのディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を用いて増殖培地で調製した。ウェル当たり２００μｌの最終体積で１μｇ／ｍｌ‐０．０００１μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得るために、５０μｌアリコートの異なる希釈物をそれぞれのウェルにピペットで移した。９６ウェルプレートを１９０ｇおよび室温で２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封し、湿度雰囲気中、３７℃および５％ＣＯ２でプレートをインキュベートした。２０時間のインキュベーション後、マルチチャンネルピペットを用いて各ウェルの内容物を１０回上下にピペッティングすることより混合した。１００μｌ��胞懸濁液を新しい白色フラットクリアボトム９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ‐ｂｉｏ‐ｏｎｅ）に移し、１００μｌのＯＮＥ‐ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。ロータリーシェーカーで３００ｒｐｍ、室温暗所で１５分インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを用いてウェル当たり１秒の検出時間で発光を測定した。
【０２２４】
図１３Ｂおよび１３Ｄは、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（図１３Ｄ）または抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（図１３Ｂ）のいずれも標的細胞および１μｇ／ｍｌのＦＡＰ  ４Ｂ９抗体と共培養し、様々な対照条件と比較したデータを示す。
【０２２５】
Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（図１３Ｂおよび１３Ｄ黒い三角形）および標的細胞のみ（図１３Ｂおよび１３Ｄ黒い逆三角形）は、１μｇ／ｍｌのＦＡＰ  ４Ｂ９  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡとインキュベートすると、検出可能な発光信号を示さない。
【０２２６】
また、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞は、標的細胞と１μｇ／ｍｌのＦＡＰ  ４Ｂ９抗体との共培養で発光シグナルを示さない（図１３Ｂおよび図１３Ｄ黒い菱形）。一方、標的細胞および１μｇ／ｍｌのＦＡＰ  ４Ｂ９抗体と共培養されたＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ細胞のＣＤ３依存性活性化は、検出可能な発光シグナルによりその機能性を証明している（白丸（ｗｉｔｈｅ  ｄｏｔｓ））。
【０２２７】
いずれも標的細胞および１μｇ／ｍｌのＦＡＰ  ４Ｂ９抗体と共培養した、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＤ３依存性活性化（図１３Ｂ  白い四角形）および抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化（図１３Ｄ  白い四角形で描画）は、ＣＡＲが媒介する活性化とＣＤ３が媒介する活性化との組み合わせであることから、全ての中で最も高い発光シグナルを示す。ＣＡＲを標的細胞および１μｇ／ｍｌのＤＰ４７／ｖｋ３抗体とインキュベートすると、ＣＤ３媒介発光シグナルも見える（図１３Ｂおよび図１３Ｄ、白い逆三角形）。ポイントは各々、３反復の技術的反復実験の平均値を表す。値は全て、ベースライン補正したものとして描いている。標準偏差はエラーバーで表示している。
【０２２８】
実施例７
ここに記載されているのは、接着性ＣＥＡを発現するＭＫＮ４５腫瘍細胞を標的細胞として用いるＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイである。レポーター細胞として、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（図１４Ａ）または抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（図１４Ｃ）のソート済みのプールを使用した。Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＣＥＡ  Ａ５Ｂ７  ＩｇＧまたはＰ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＣＥＡ  Ｔ８４  ＬＣＨＡ  ＩｇＧのいずれかが使用された。さらに、アイソタイプ対照として、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＩｇＧ  ＤＰ４７／ｖｋ３を含めた。
【０２２９】
陽性対照として、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ＃６５５１８５）のウェルに、ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）から）１０μｇ／ｍｌを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を３７℃で１時間コーティングした。ＣＤ３でコーティングされたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最後の洗浄ステップの後、ＰＢＳを完全に除去した。
【０２３０】
接着性ＭＫＮ４５標的細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシンで剥離させた。剥離した細胞をＤＭＥＭ＋４．５ｇＬＤ−グルコース＋Ｌ−グルタミン＋２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋１０％ＦＣＳおよび１％Ｇｌｕｔａｍａｘに再懸濁させた。
【０２３１】
レポーター細胞またはＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型細胞を計数し、Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓを用いてその生存率をチェックした。細胞数は、１ｘ１０６生細胞／ｍｌに調整した。したがって、細胞懸濁液の適切なアリコートを２１０ｇで５分間、室温（ＲＴ）でペレット化し、新鮮なＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に再懸濁させた。
【０２３２】
目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、それらの生存率についてもチェックした。細胞数は、レポーター細胞について記載したのと同様に、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ中、１ｘ１０６生細胞／ｍｌに調整した。
【０２３３】
標的細胞とレポーター細胞を、９６ウェル懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ  ｏｎｅ）にＥ：Ｔ比５：１で３連で蒔いた（ウェル当たり合計１１０．０００細胞）。
【０２３４】
次のステップとして、目的の抗原を標的とするＰ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴う抗体の段階希釈液を、２ｍｌのディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を用いて増殖培地で調製した。ウェル当たり２００μｌの最終体積で１μｇ／ｍｌ‐０．０００１μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得るために、５０μｌアリコートの異なる希釈物をそれぞれのウェルにピペットで移した。９６ウェルプレートを１９０ｇおよび室温で２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封し、湿度雰囲気中、３７℃および５％ＣＯ２でプレートをインキュベートした。
【０２３５】
２０時間のインキュベーション後、マルチチャンネルピペットを用いて各ウェルの内容物を１０回上下にピペッティングすることより混合した。１００μｌ細胞懸濁液を新しい白色フラットクリアボトム９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ‐ｂｉｏ‐ｏｎｅ）に移し、１００μｌのＯＮＥ‐ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。ロータリーシェーカーで３００ｒｐｍ、室温暗所で１５分インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを用いてウェル当たり１秒の検出時間で発光を測定した。
【０２３６】
標的細胞とレポーター細胞を５：１の比で２０時間共培養すると（図１４Ａおよび１４Ｃ、丸）、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴う  ＣＥＡ  Ａ５Ｂ７を抗体として使用した場合（図１４Ａおよび１４Ｃ、灰色の丸）、グラフは、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞および抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の用量依存的な活性化を示す。Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ変異を伴うＣＥＡＴ８４  ＬＣＨＡの使用は、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞に対してのみ用量依存的な活性化を示した（図１４Ａ黒い丸）。一方、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を持つ抗体を使用した場合、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化は、１μｇ／ｍｌの最も高い抗体濃度でのみ検出された。
【０２３７】
Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴う対照抗体ＤＰ４７／ｖｋ３  ＩｇＧ（図１４Ａおよび１４Ｃ、黒い三角形）を使用した場合、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤＪｕｒｋａｔ    ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞または抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化は検出できなかった。ポイントは各々、３反復の技術的反復実験の平均値を表す。標準偏差はエラーバーで表示している。
【０２３８】
図１４Ｂおよび１４Ｄは、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（図１４Ｂ）または抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（図１４Ｄ）のいずれも標的細胞および１μｇ／ｍｌのＣＥＡ  Ｔ８  ＬＣＨＡ  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡもしくはＣＥＡ  Ａ５Ｂ７  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体と共培養し、様々な対照条件と比較したデータを示す。
【０２３９】
Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ  Ｔ細胞のみ（図１４Ｂおよび１４Ｄ  黒い菱形）および標的細胞のみ（図１４Ｂおよび１４Ｄ  白い丸）は、１μｇ／ｍｌのＣＥＡ  Ｔ８  ＬＣＨＡ  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡとインキュベートすると、検出可能な発光信号を示さない。
【０２４０】
また、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞は、標的細胞と１μｇ／ｍｌのＩｇＧとの共培養で発光シグナルを示さない（図１４Ｂおよび図１４Ｄ  白い四角形および白い菱形）。一方、標的細胞および１μｇ／ｍｌのＩｇＧと共培養されたＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＤ３依存性活性化は、検出可能な発光シグナルによりその機能性を証明している（図１４ＢおよびＤ  灰色の十字形）。
【０２４１】
いずれも標的細胞および１μｇ／ｍｌのＩｇＧと共培養した、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＤ３依存性活性化（図１４Ｂ  黒い星形と灰色の星形）および抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＮＦＡＴ  Ｔ細胞の活性化（図１４Ｄ  黒い星形と灰色の星形）は、ＣＡＲが媒介する活性化とＣＤ３が媒介する活性化との組み合わせであることから、全ての中で最も高い発光シグナルを示す。ＣＡＲを標的細胞および１μｇ／ｍｌのＤＰ４７／ｖｋ３抗体とインキュベートすると、ＣＤ３媒介発光シグナルも見える（図１４Ｂおよび図１４Ｄ、灰色のプラス）。ポイントは各々、３反復の技術的反復実験の平均値を表す。標準偏差はエラーバーで表示している。
【０２４２】
実施例８
ここに記載されているのは、接着性ＴＮＣを発現するＣＴ２６ＴＮＣ  ｃｌ  １９腫瘍細胞を標的細胞として用いるＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイである。レポーター細胞として、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（図１５Ｃ）または抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（図１５Ａ））のソート済みのプールを使用した。ＩｇＧとして、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＴＮＣＡ２Ｂ１０を使用した。さらに、アイソタイプ対照として、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＩｇＧ  ＤＰ４７／ｖｋ３を含めた。
【０２４３】
陽性対照として、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ＃６５５１８５）のウェルに、ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）から）１０μｇ／ｍｌを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を３７℃で１時間コーティングした。ＣＤ３でコーティングされたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最後の洗浄ステップの後、ＰＢＳを完全に除去した。
【０２４４】
接着性ＣＴ２６ＴＮＣ  ｃｌ  １９標的細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシンで剥離させた。剥離した細胞をＲＰＭＩ−１６３０＋１０％ＦＣＳおよび１％Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１５μｇ／ｍｌピューロマイシンに再懸濁させた。
【０２４５】
レポーター細胞またはＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型細胞を計数し、Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓを用いてその生存率をチェックした。細胞数は、１ｘ１０６生細胞／ｍｌに調整した。したがって、細胞懸濁液の適切なアリコートを２１０ｇで５分間、室温（ＲＴ）でペレット化し、新鮮なＲＰＭＩ−１６０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に再懸濁させた。
【０２４６】
目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、それらの生存率についてもチェックした。細胞数は、レポーター細胞について記載したのと同様に、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ中、１ｘ１０６生細胞／ｍｌに調整した。
【０２４７】
標的細胞とレポーター細胞を、９６ウェル懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ  ｏｎｅ）に３連で、Ｅ：Ｔ比５：１で蒔いた（ウェル当たり合計１１０．０００細胞）。
【０２４８】
次のステップとして、目的の抗原を標的とするＰ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴う抗体の段階希釈液を、２ｍｌのディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を用いて増殖培地で調製した。ウェル当たり２００μｌの最終体積で１μｇ／ｍｌ‐０．０００１μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得るために、５０μｌアリコートの異なる希釈物をそれぞれのウェルにピペットで移した。９６ウェルプレートを１９０ｇおよび室温で２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封し、湿度雰囲気中、３７℃および５％ＣＯ２でプレートをインキュベートした。
【０２４９】
２０時間のインキュベーション後、マルチチャンネルピペットを用いて各ウェルの内容物を１０回上下にピペッティングすることより混合した。１００μｌ細胞懸濁液を新しい白色フラットクリアボトム９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ‐ｂｉｏ‐ｏｎｅ）に移し、１００μｌのＯＮＥ‐ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。ロータリーシェーカーで３００ｒｐｍ、室温暗所で１５分インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを用いてウェル当たり１秒の検出時間で発光を測定した。
【０２５０】
標的細胞とレポーター細胞を５：１の比で２０時間共培養すると（図１５Ａおよび１６Ｃ、黒い丸）、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＴＮＣ  Ａ２Ｂ１０を抗体として使用した場合、グラフは、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞および抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の用量依存的な活性化を示す。Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴う対照抗体ＤＰ４７／ｖｋ３  ＩｇＧを使用した場合（図１５Ａおよび１５Ｃ、黒い丸）、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞または抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化は、いずれも検出できなかった。ポイントは各々、３反復の技術的反復実験の平均値を表す。値は全て、ベースライン補正したものとして描いている。標準偏差はエラーバーで表示している。
【０２５１】
図１５Ｂおよび１５Ｄは、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（図１５Ｄ）または抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（図１５Ｂ）のいずれも標的細胞および１μｇ／ｍｌのＴＮＣ  Ａ２Ｂ１０と共培養し、様々な対照条件と比較したデータを示す。
【０２５２】
Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞は、標的細胞と１μｇ／ｍｌのＩｇＧとの共培養では検出可能な発光シグナルを全く示さない（図１５Ｂおよび図１５Ｄ  白い三角形）。一方、標的細胞および１μｇ／ｍｌのＩｇＧと共培養されたＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ細胞のＣＤ３依存性活性化は、検出可能な発光シグナルによりその機能性を証明している（図１５ＢおよびＤ  白色の四角形）。
【０２５３】
いずれも標的細胞および１μｇ／ｍｌのＩｇＧと共培養した、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＤ３依存性活性化（図１５Ｂ  白い丸）および抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（図１５Ｄ  白い丸）の活性化は、ＣＡＲが媒介する活性化とＣＤ３が媒介する活性化との組み合わせであることから、最も高い発光シグナルを示す。ＣＡＲを標的細胞および１μｇ／ｍｌのＤＰ４７／ｖｋ３抗体とインキュベートすると、ＣＤ３媒介発光シグナルも見える（図１５Ｂおよび図１５Ｄ、黒色の菱形）。ポイントは各々、３反復の技術的反復実験の平均値を表す。標準偏差はエラーバーで表示している。
【０２５４】
実施例９
ここに記載されているのは、接着性ＴＮＣを発現するＣＴ２６ＴＮＣ  ｃｌ  １９腫瘍細胞を標的細胞として用いるＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイである。レポーター細胞として、抗Ｐ３２９Ｇ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済みのプール（図１６Ａ）を使用した。ＩｇＧとして、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＴＮＣＡ２Ｂ１０を使用した。さらに、アイソタイプ対照として、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＩｇＧ  ＤＰ４７／ｖｋ３を含めた。
【０２５５】
陽性対照として、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ＃６５５１８５）のウェルに、ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）から）１０μｇ／ｍｌを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を３７℃で１時間コーティングした。ＣＤ３でコーティングされたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最後の洗浄ステップの後、ＰＢＳを完全に除去した。
【０２５６】
接着性ＣＴ２６ＴＮＣ  ｃｌ  １９標的細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシンで剥離させた。剥離した細胞をＲＰＭＩ−１６３０＋１０％ＦＣＳおよび１％Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１５μｇ／ｍｌピューロマイシンに再懸濁させた。
【０２５７】
レポーター細胞またはＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型細胞を計数し、Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓを用いてその生存率をチェックした。細胞数は、１ｘ１０６生細胞／ｍｌに調整した。したがって、細胞懸濁液の適切なアリコートを２１０ｇで５分間、室温（ＲＴ）でペレット化し、新鮮なＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に再懸濁させた。
【０２５８】
目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、それらの生存率についてもチェックした。細胞数は、レポーター細胞について記載したのと同様に、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ中、１ｘ１０６生細胞／ｍｌに調整した。
【０２５９】
標的細胞とレポーター細胞を、９６ウェル懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ  ｏｎｅ）に３連で、Ｅ：Ｔ比５：１で蒔いた（ウェル当たり合計１１０．０００細胞）。
【０２６０】
次のステップとして、目的の抗原を標的とするＰ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＧＡ１０１の段階希釈液を、２ｍｌのディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を用いて増殖培地で調製した。ウェル当たり２００μｌの最終体積で１μｇ／ｍｌ‐０．０００１μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得るために、５０μｌアリコートの異なる希釈物をそれぞれのウェルにピペットで移した。９６ウェルプレートを１９０ｇおよび室温で２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封し、湿度雰囲気中、３７℃および５％ＣＯ２でプレートをインキュベートした。
【０２６１】
２０時間のインキュベーション後、マルチチャンネルピペットを用いて各ウェルの内容物を１０回上下にピペッティングすることより混合した。１００μｌ細胞懸濁液を新しい白色フラットクリアボトム９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ‐ｂｉｏ‐ｏｎｅ）に移し、１００μｌのＯＮＥ‐ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。ロータリーシェーカーで３００ｒｐｍ、室温暗所で１５分インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを用いてウェル当たり１秒の検出時間で発光を測定した。
【０２６２】
標的細胞とレポーター細胞を５：１の比率で２０時間共培養すると（図１６Ａ  黒い丸）、グラフは、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＴＮＣ  Ａ２Ｂ１０  ０．０１μｇ／ｍｌで始まる、抗Ｐ３２９Ｇ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の用量依存的な活性化を示す。Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴う対照抗体ＤＰ４７／ｖｋ３  ＩｇＧを使用した場合（図１６Ａおよび１７Ｃ、灰色の丸）、抗Ｐ３２９Ｇ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化は検出できなかった。ポイントは各々、３反復の技術的反復実験の平均値を表す。値は全て、ベースライン補正したものとして描いている。標準偏差はエラーバーで表示している。
【０２６３】
図１６Ｂは、抗Ｐ３２９Ｇ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞を、標的細胞および１μｇ／ｍｌのＴＮＣ  Ａ２Ｂ１０抗体と共培養し、様々な対照条件と比較したデータを示す。
【０２６４】
標的細胞とインキュべートしたが標的細胞とはしていない抗Ｐ３２９Ｇ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（図１６Ｂ  黒い四角形、ならびに標的細胞および１μｇ／ｍｌのＴＮＣ  Ａ２Ｂ１０抗体とインキュベートしたＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ細胞（図１６Ｂ  白い丸）は、検出可能な発光シグナルを示さなかった。一方、ＣＤ３でコーティングされたウェルに播種し標的細胞および１μｇ／ｍｌのＴＮＣ  Ａ２Ｂ１０と共培養したＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ細胞は、明確な発光シグナルを示した。
【０２６５】
さらに、ＣＤ３でコーティングされたウェル中で、標的細胞と１μｇ／ｍｌのＴＮＣ  Ａ２Ｂ１０抗体または１μｇ／ｍｌのＤＰ４７／ｖｋ３抗体のいずれかとインキュベートした、抗Ｐ３２９Ｇ−−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ  Ｆａｂを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞は、高い発光シグナルを示す。ポイントは各々、３反復の技術的反復実験の平均値を表す。標準偏差はエラーバーで表示している。
【０２６６】
実施例１０
ここに記載されるのは、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１−ペプチドバインダー３３Ｆ０５（配列番号１３９および１４０）、１１Ｄ０６（配列番号１４１および１４２）、３３Ｈ０９（配列番号１４３および１４４）および５Ｅ１１（配列番号１４５および１４６）の特異性を評価するために、ペプチドパルスＴ２細胞を標的細胞として使用したＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイである。レポーター細胞として、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の選別プールを使用した。ＩｇＧとして、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１−ペプチドバインダーを用いた。ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１−ペプチド結合抗体およびレポーター細胞とのインキュベーションの前に、Ｔ２細胞を、それぞれ１０−５Ｍのペプチドを３７℃で２時間パルスするか、またはパルスせずに放置した。標的細胞とレポーター細胞を、５：１のＥ：Ｔ比（ウェル当たり２０００標的細胞当たり１０．０００エフェクター細胞）で、３８４ウェル白色フラットクリアボトムプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ  ｏｎｅ）に蒔いた。次のステップとして、問題のＩｇＧの段階希釈液を増殖培地で調製した。レポーター細胞、Ｔ２細胞およびＩｇＧを３７℃で１６時間インキュベートした後、ウェル当たり６μｌのＯＮＥ−ＧｌｏＴＭルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、ＴＥＣＡＮ社製インフィニットＭ１０００Ｐｒｏプレートリーダーを使用して発光を直接測定した。
【０２６７】
結果として得られたグラフ（図１８Ａから図１８Ｄ）は、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の用量依存的な活性化を示す。重要なことに、この活性化は、バインダー１１Ｄ０６および３３Ｈ０９についてＲＭＦ−ペプチドパルスＴ２細胞（ＲＭＦ−ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄ  Ｔ２  ｃｅｌｌ）上にのみ選択的に現れるが、バインダー３３Ｆ０５および５Ｅ１１についてはＲＭＦ−ペプチドパルスＴ２細胞上とＶＬＤ−ペプチドパルスＴ２細胞上に非特異的に現れ、これら後者の２つの抗体についてのＴ細胞活性化の非選択的な性質を示す。
【０２６８】
実施例１１
ここに記載されるのは、レポーター細胞として抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済みのプールを用いたＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイである。レポーター細胞は、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴うＩｇＧフォーマットのＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１−ペプチドバインダーに結合し、これにより、試験したＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ペプチド（それぞれＲＭＦまたはＶＬＤ）を異なる程度に認識する。
【０２６９】
問題の４つの異なる抗体（３３Ｆ０５（配列番号１３９および１４０）、１１Ｄ０６（配列番号１４１および１４２）、３３Ｈ０９（配列番号１４３および１４４）および５Ｅ１１（配列番号１４５および１４６））はそれぞれ、１０ｎＭで存在した。Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター細胞およびＩｇＧとの共インキュベーションの前に、Ｔ２細胞は、実施例１０に記載されるように、それぞれＲＭＦ−ペプチドもしくはＶＬＤ−ペプチドでパルスされたか、またはペプチドなしで放置された。Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター細胞および標的細胞を、３８４ウェルプレート（白色フラットクリアボトム３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ））のウェルあたり２０μｌ、ＩｇＧ濃度１０ｎＭで１００００から２０００個の細胞と３７℃で６時間、Ｅ：Ｔ比５：１で共インキュベートした後、続いてＯＮＥ−ＧｌｏＴＭルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルあたり６μｌ添加し、ＴＥＣＡＮ社製インフィニートＭ１０００Ｐｒｏプレートリーダーを使用して発光を直接測定した。それぞれの実験設定の３回の測定からのＣＡＲ−ＮＦＡＴシグナル伝達の活性化を、標準偏差を示すエラーバー付きの棒グラフ（図１９）として表す。ＲＭＦ−ペプチド（標的）上のシグナルとＶＬＤ−ペプチド上のシグナル（オフターゲット）上のシグナルの比較は、それぞれのバインダーの活性化の特異性を評価するのに役立つ。ペプチドを含まないＴ２細胞のシグナル強度は、候補バインダー３５Ｆ０５および０５Ｅ１１に対する非特異的結合を示す。候補バインダー３３Ｈ０９および１１Ｄ０６は、オフターゲットペプチドＶＬＤのシグナルが、特に評価したバックグラウンド（「ペプチドなしＴ２」、「Ｔ２なし」エフェクター細胞、ならびに「ＩｇＧの添加なし」のエフェクターおよび標的細胞の共インキュベーション）に対して低いため、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１−ペプチドＲＭＦに対してのみ特異的かつ選択的であることを証明する。
【０２７０】
実施例１２
ここに記載されるのは、ＲＭＦ−ペプチドまたはＶＬＤ−ペプチドでパルスされたＴ２細胞を用いたフローサイトメトリーによるＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１−ペプチドバインダー５Ｅ１１（配列番号１０２および１０３）および３３Ｈ０９（配列番号１００および１０１）の特異性の評価である。ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１−ペプチド結合抗体とのインキュベーションの前に、Ｔ２細胞を、それぞれの１０−５Ｍのペプチドを３７℃で２時間パルスするか、またはパルスせずに放置した。問題の抗体の異なる濃度の１０００００細胞の細胞アリコートへのそれぞれのＩｇＧの結合を氷上で１時間行い、続いてＰＢＳで２回洗浄し、Ｆｏｒｔｅｓｓｓａアナライザー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのフローサイトメトリーで９０ｎＭの濃度で抗ｈｕＦｃ検出（Ｊａｃｋｏｎｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｉｃａｔｉｏｎからの抗ヒトＦ（ａｂ）２＿ＡＦ６４７）によって評価した。バインダー５Ｅ１１および３３Ｈ０９の両方とも、ＲＭＦ−ペプチドパルスＴ２細胞上には明確な濃度依存性結合シグナルを与えるが、ＶＬＤ−ペプチドパルスＴ２細胞上には与えない（図２０Ａおよび図２０Ｂ）。このフローサイトメトリーに基づく評価によれば、両抗体候補は、ＲＭＦ−ペプチドパルスＴ２細胞には特異的に結合するが、ＶＬＤ−ペプチドパルスＴ２細胞には結合しないようである。
【０２７１】
実施例１３
ここに記載されるのは、患者由来の腫瘍の一次試料（結腸癌の肺転移）を使用するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイである。腫瘍試料を、ＣＥＡおよびＦＡＰ抗原レベルの発現を示す蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって特徴付けた。ＦＡＣＳ分析は、ＣＤ４５陽性細胞の約８０％がＣＥＡを発現し、約１６％が表面にＦＡＰを発現することを示した（図２２Ａ）。レポーター細胞として、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済みのプール（図２２Ｂ）または抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済みのプール（図２２Ｃ）を使用した。Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ変異を伴う、ヒトＩｇＧ１抗ＣＥＡ  Ｔ８４  ＬＣＨＡまたは抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗体をＩｇＧとして使用した。腫瘍細胞とレポーター細胞を、５：１のＥ：Ｔ比（ウェル当たり２００．０００標的細胞当たり２０．０００エフェクター細胞）で、９６ウェル白色フラットクリアボトムプレートに２連で蒔いた。次のステップとして、問題のＩｇＧの段階希釈液１μｇ／ｍｌを増殖培地で調製した。レポーター細胞、標的細胞およびＩｇＧを３７℃で８時間インキュベートした後、ウェル当たり５０μｌのＯＮＥ−ＧｌｏＴＭルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、ＴＥＣＡＮ社製インフィニットＭ１０００Ｐｒｏプレートリーダーを使用して発光を直接測定した。
【０２７２】
結果として得られたグラフ（図２２Ｂと図２２Ｃ）はそれぞれ、抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤまたはｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の抗原依存的な活性化を示す。重要なことに、この活性化は、提供された試料に存在する腫瘍抗原を認識するそれぞれの抗体の存在下でのみ現れる。
【０２７３】
例示的配列
表２：抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−ｓｃＦｖアミノ酸配列：
2021519588.tif 000004
2021519588.tif 000005
【０２７４】
表３：抗Ｐ３２９Ｇ−ｄｓ−  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ配列：
2021519588.tif 000006
2021519588.tif 000007
2021519588.tif 000008
2021519588.tif 000009
2021519588.tif 000010
2021519588.tif 000011
【０２７５】
表４  ８：抗Ｐ３２９Ｇ−Ｆａｂアミノ酸配列：
2021519588.tif 000012
2021519588.tif 000013
【０２７６】
表５  ９：抗Ｐ３２９Ｇ−Ｆａｂ  ＤＮＡ配列：
2021519588.tif 000014
2021519588.tif 000015
2021519588.tif 000016
2021519588.tif 000017
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【０２７７】
表６  １０：抗ＡＡＡ−ｓｃＦｖ  アミノ酸配列
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【０２７８】
表７  １１：抗ＡＡＡ−Ｆａｂアミノ酸配列
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【０２７９】
表８  ８：抗ＤＩＧ−ｄｓ−ｓｃＦｖアミノ酸配列：
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【０２８０】
表９  ９：抗ＤＩＧ−Ｆａｂアミノ酸配列：
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【０２８１】
表１０  １０：抗ＦＩＴＣ−ｓｃＦｖアミノ酸配列
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【０２８２】
表１１  １１：抗ＨＡ−ｓｃＦアミノ酸配列
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【０２８３】
表１２  １２：抗ｍｙｃ−Ｆａｂアミノ酸配列
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【０２８４】
表１３  １３：ポリペプチドタグ配列
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【０２８５】
表  １４  １４
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ−Ｃ】
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【図２Ｄ−Ｆ】
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【図３Ａ−Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１２Ａ−Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ−Ｄ】
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【図１９】
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【図２０Ａ−Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【配列表】
2021519588000001.app
【国際調査報告】
2021519588.tif 000079
2021519588.tif 000080