(57)【要約】  本発明は、ＧＭＰレベルの無血清懸濁細胞を用いることによるレンチウイルスの大規模製造方法に関する。当該方法は、以下の工程：(ａ)パッケージング細胞のシード溶液を提供する工程；(ｂ)前記シード溶液を培養容器内の第１培養液に接種する工程；(ｃ)前記パッケージング細胞を継代培養する工程；(ｄ)液体交換トリガ条件が満たされたときに液体交換処理を開始する工程；(ｅ)工程（ｃ）および（ｄ）をｎ回繰り返す工程；(ｆ)トランスフェクショントリガ条件が満たされたときにトランスフェクション処理を開始する工程；(ｈ)前記トランスフェクトされたパッケージング細胞を継代培養する工程；(ｉ)液体交換トリガー条件が満たされたときに採取及び液体交換処理を開始する工程；(ｊ)  工程（ｈ）および（ｉ）をｍ回繰り返す工程；(ｋ)  回収された液体を混合する工程；及び(ｌ)精製処理を行う工程を含む。上記各工程で用いられる培養液は、無血清細胞培養液である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清懸濁細胞からレンチウイルスを製造するための方法であって、以下の工程：
(ａ)  レンチウイルスの産生のためのパッケージング細胞のシード溶液を提供する工程であって、前記パッケージング細胞が、懸濁液中で増殖するパッケージング細胞である、該工程；
(ｂ)   前記シード溶液を培養容器内の第１培養液に接種して、第１培養物を得る工程であって、前記第１培養液が無血清細胞培養液であり、接種濃度が１×１０６〜５×１０６細胞／ｍｌであり、および前記第１培養液の体積が３〜１００Ｌである、該工程；
(ｃ)  前記第１培養物を、温度３０〜３８℃、溶存酸素３５〜５５％、ＣＯ2濃度２〜１０％、ｐＨ６．９〜７．４の条件下で、前記パッケージング細胞を継代培養し；継代培養工程における第１培養物のリアルタイムｐＨ値をモニターし；および、前記リアルタイムｐＨ値に基づいて溶存酸素及び／又はＣＯ2の濃度を制御することにより、ｐＨ値を６．９〜７．４に維持する工程；
(ｄ)   液体交換トリガ条件が満たされたときに液体交換処理を開始する工程であって、前記液体交換トリガ条件が
（ｓ１）リアルタイムｐＨ値が、６．９以下、好ましくは７．０以下、より好ましくは７．０５以下であること；
（ｓ２）酸素、空気、窒素および／またはＣＯ2の濃度を調整することにより、前記リアルタイムｐＨ値は依然として下降傾向を示すこと；および
（ｓ３）継代培養時間が７２時間以上であること；
を含み、
前記液体交換処理が、前記培養容器から培養物中の無細胞上清を排出し、ここで、前記上清の排出前における前記培養物の体積をＶｑ１とし、前記上清の排出後における前記培養物の体積をＶｈ１とした場合に、Ｖｑ１／Ｖｈ１比が３〜１５であり；次いで、前記培養容器に培養液を補充して、パッケージング細胞の培養物を形成することを含む、該工程；
(ｅ)  工程（ｃ）および（ｄ）をｎ回繰り返す工程であって、ｎが１、２または３である、該工程；
(ｆ)  トランスフェクショントリガ条件が満たされたときにトランスフェクション処理を開始する工程であって、前記トランスフェクショントリガ条件が
（ｔ１）総細胞量が０．０５〜２×１０１１細胞であること；
（ｔ２）細胞濃度が０．５〜５×１０６細胞／ｍｌであること；
（ｔ３）細胞の生存率が９０％以上であること；
（ｔ４）総培養時間が７２時間以上であること；
を含み、
前記トランスフェクション処理が、前記レンチウイルスの産生のための産生プラスミドおよびトランスフェクション試薬を混合し、それらを培養容器に添加し、それによって、前記パッケージング細胞を導入し、トランスフェクトされたパッケージング細胞を形成することを含む、該工程；
(ｇ)  場合によって、トランスフェクション後に液体交換を行う工程；
(ｈ)   前記トランスフェクトされたパッケージング細胞を、温度３０〜３７℃、溶存酸素３５〜５５％、ＣＯ2濃度２〜１０％、ｐＨ６．９〜７．４の条件下で継代培養し；継代培養工程における第１培養物のリアルタイムｐＨ値をモニターし；および、前記リアルタイムｐＨ値に基づいて溶存酸素及び／又はＣＯ2の濃度を制御することにより、ｐＨ値を６．９〜７．４に維持する工程；
(ｉ)  液体交換トリガー条件が満たされたときに採取及び液体交換処理を開始する工程であって、前記液体交換トリガー条件は以下を含む：
（ｓ１）リアルタイムｐＨ値が、６．９以下であること；
（ｓ２）酸素、空気、窒素および／またはＣＯ2の濃度を調整することにより、前記リアルタイムｐＨ値は依然として減少を示すこと；および
（ｓ３）継代培養時間が７２時間以上であること；
を含み、
ここで、前記液体交換処理が、前記培養物中の無細胞ウイルス含有供給液を回収することを含み、前記供給液の回収前における培養物の体積をＶｑ２とし、上清の回収後における培養物の体積をＶｈ２とした場合に、Ｖｑ２／Ｖｈ２比が３〜１５である、該工程；
(ｊ)  工程（ｈ）および（ｉ）をｍ回繰り返す工程であって、ｍが１、２または３であり、当該繰り返しの前に、培養液を前記培養容器に補充してトランスフェクション細胞培養物を形成する、該工程；
(ｋ)  回収された液体の各々を混合し、混合ウイルス含有上清を得る工程；
(ｌ)  前記混合ウイルス含有上清を精製し、精製レンチウイルスベクターを得る工程；
を含み、上記各工程で用いられる培養液は、無血清細胞培養液である、該方法。
【請求項２】
工程（ｃ）および／または（ｈ）において、培養が振盪条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）および／または（ｈ）において、ｐＨ値が７．０〜７．３５の範囲に維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｄ）および／または（ｉ）において、Ｖｑ１／Ｖｈ１比が５：１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の合計時間が７２〜２１６時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｆ）において、用いられるマルチプラスミドトランスフェクションが、３プラスミドトランスフェクションおよび４プラスミドトランスフェクションを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記培養容器が使い捨て培養容器である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記混合ウイルス含有上清に含まれるウイルスの総数が、１×１０１２ Ｔｕである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記パッケージング細胞が、ヒト胚性腎上皮細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｌ）において、前記精製が、限外濾過およびクロマトグラフィーを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学の技術分野に関し、特にＧＭＰレベルの無血清懸濁細胞を用いることによるレンチウイルスの大規模製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療とは、外因性の治療遺伝子を標的細胞に導入して、遺伝子の欠陥や異常によって引き起こされる疾患を是正したり、補償したりすること、あるいは外因性遺伝子によって発現される製品を介して疾患標的に作用して治療の目的を達成することをいう。
【０００３】
一般的な組換えレンチウイルスベクターは、ＨＩＶ−１（ヒト免疫不全ウイルス−１：ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ−1）に基づいて開発された遺伝子治療ベクターである。一般的なレトロウイルスベクターとは異なり、組換えレンチウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する能力を有する。組換えレンチウイルスベクターは、インビボおよびインビトロでの高い生物学的力価、低い免疫原性および他の利点のために、ＣＡＲＴ細胞および遺伝子治療のための好ましいトランスジェニックベクターとなっている。
【０００４】
成熟ＨＩＶ−１ウイルスは１００〜１２０ｎｍの直径であり、二十面体対称構造を有し、球形である。均一な密な円錐形のコアが電子顕微鏡下で見られる。ウイルスのＲＮＡ分子と酵素を含む。後者には、逆転写酵素、インテグラーゼおよびプロテアーゼが含まれる。ＨＩＶ−１の最外層はリポ蛋白エンベロープである。エンベロープには、表面タンパク質（ｇｐ１２０）と固有タンパク質（ｇｐ４１）の２つの糖タンパク質が含まれている。ｇｐ１２０はスパイクであり、ｇｐ４１は膜貫通タンパク質である。エンベロープの内側表面はＰ１７からなるマトリックスであり、エンベロープの内側はカプシドタンパク質（Ｐ２４）によって包まれたＲＮＡＯである。
【０００５】
現在の組換えレンチウイルスベクターは、遺伝子改変法を用いて、レンチウイルスゲノム中のパッケージングシグナルおよび標的遺伝子の転写エレメントのみを残し、逆転写酵素、エンベロープ蛋白質ＶＳＶＧ、ｇａｇ／ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｔａｔおよび他の構造的または調節的遺伝子を異なるベクター上に分散させ、一方、組換えレンチウイルスベクターの安全性を確保するために病原性遺伝子を欠失させる。
【０００６】
ＨＥＫ２９３Ｔはヒトの腎性エピリウムに由来する細胞株である。アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子のトランスフェクションによりＨＥＫ ２９３細胞株から得られ、ＳＶ４０のラージＴ抗原、及びＳＶ４０を含む複製起点とプロモーター領域を発現することができる。ＳＶ４０ウイルスを含む複製原産地のユーカリ発表現ベクトルはＨＥＫ ２９３Ｔセルにおける効率的な複製と転写を達成し、それにより外来遺伝子の表現レベルを増加させることができる。したがって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はレンチウイルスパッケージングに広く使用されており、高力価のレンチウイルス供給液を得ることができる。
【０００７】
しかしながら、レンチウィルス作製のための細胞株としてのＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、以下の問題点が依然として存在する。１）大型Ｔ抗原は潜在的な発がん性リスクを有しており、下流工程が効果的に除去できなければ、臨床治療には一定のリスクがあり、大型Ｔ抗原には一定の免疫性があるため、臨床治療の難易度を高めることになる；２)ＨＥＫ２９３Ｔは接着細胞であり、細胞工場やスピナーボトル生産による工業化は困難である；３）壁への付着力が弱く、マイクロキャリア技術を用いた場合、細胞が脱落しやすく、毒素生産効率が著しく低下する。
【０００８】
さらに、懸濁細胞に基づいてレンチウイルスを生成するためのいくつかの技術が開発されているが、既存の産生方法は依然としていくつかの欠点を有する。例えば、それらは大規模生産には適しておらず、ＧＭＰ生産の厳しい要件をほとんど満たすことができず、生産されたウイルスは低い力価を有する。
【０００９】
したがって、この分野において、無血清および懸濁培養下で細胞をパッケージングすることによって、大規模にレンチウイルスを効率的に産生することができる方法を開発する緊急の必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、無血清および懸濁培養下で細胞をパッケージングすることによって、大規模にレンチウイルスを効率的に産生するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様において、無血清懸濁細胞からレンチウイルスを製造するための方法が提供される。当該方法以下の工程を含む：
(ａ)  レンチウイルスの産生のためのパッケージング細胞のシード溶液を提供する工程であって、前記パッケージング細胞が、懸濁液中で増殖するパッケージング細胞である、該工程；
(ｂ)   前記シード溶液を培養容器内の第１培養液に接種して、第１培養物を得る工程であって、前記第１培養液が無血清細胞培養液であり、接種濃度が１×１０６〜５×１０６細胞／ｍｌであり、および前記第１培養液の体積が３〜１００Ｌである、該工程；
(ｃ)  前記第１培養物を、温度３０〜３８℃、溶存酸素３５〜５５％、ＣＯ2濃度２〜１０％、ｐＨ６．９〜７．４の条件下で、前記パッケージング細胞を継代培養し；継代培養工程における第１培養物のリアルタイムｐＨ値をモニターし；および、前記リアルタイムｐＨ値に基づいて溶存酸素及び／又はＣＯ2の濃度を制御することにより、ｐＨ値を６．９〜７．４に維持する工程；
(ｄ)   液体交換トリガ条件が満たされたときに液体交換処理を開始する工程であって、前記液体交換トリガ条件が
（ｓ１）リアルタイムｐＨ値が、６．９以下、好ましくは７．０以下、より好ましくは７．０５以下であること；
（ｓ２）酸素、空気、窒素および／またはＣＯ2の濃度を調整することにより、前記リアルタイムｐＨ値は依然として下降傾向を示すこと；および
（ｓ３）継代培養時間が７２時間以上であること；
を含み、
前記液体交換処理が、前記培養容器から培養物中の無細胞上清を排出し、ここで、前記上清の排出前における前記培養物の体積をＶｑ１とし、前記上清の排出後における前記培養物の体積をＶｈ１とした場合に、Ｖｑ１／Ｖｈ１比が３〜１５であり；次いで、前記培養容器に培養液を補充して、パッケージング細胞の培養物を形成することを含む、該工程；
(ｅ)  工程（ｃ）および（ｄ）をｎ回繰り返す工程であって、ｎが１、２または３である、該工程；
(ｆ)  トランスフェクショントリガ条件が満たされたときにトランスフェクション処理を開始する工程であって、前記トランスフェクショントリガ条件が
（ｔ１）総細胞量が０．０５〜２×１０１１細胞であること；
（ｔ２）細胞濃度が０．５〜５×１０６細胞／ｍｌであること；
（ｔ３）細胞の生存率が９０％以上であること；
（ｔ４）総培養時間が７２時間以上であること；
を含み、
前記トランスフェクション処理が、前記レンチウイルスの産生のための産生プラスミドおよびトランスフェクション試薬を混合し、それらを培養容器に添加し、それによって、前記パッケージング細胞を導入し、トランスフェクトされたパッケージング細胞を形成することを含む、該工程；
(ｇ)   場合によって、トランスフェクション後に液体交換を行う工程；
(ｈ)   前記トランスフェクトされたパッケージング細胞を、温度３０〜３７℃、溶存酸素３５〜５５％、ＣＯ2濃度２〜１０％、ｐＨ６．９〜７．４の条件下で継代培養し；継代培養工程における第１培養物のリアルタイムｐＨ値をモニターし；および、前記リアルタイムｐＨ値に基づいて溶存酸素及び／又はＣＯ2の濃度を制御することにより、ｐＨ値を６．９〜７．４に維持する工程；
(ｉ)  液体交換トリガー条件が満たされたときに採取及び液体交換処理を開始する工程であって、前記液体交換トリガー条件は以下を含む：
（ｓ１）リアルタイムｐＨ値が、６．９以下であること；
（ｓ２）酸素、空気、窒素および／またはＣＯ2の濃度を調整することにより、前記リアルタイムｐＨ値は依然として減少を示すこと；および
（ｓ３）継代培養時間が７２時間以上であること；
を含み、
ここで、前記液体交換処理が、前記培養物中の無細胞ウイルス含有供給液を回収することを含み、前記供給液の回収前における培養物の体積をＶｑ２とし、上清の回収後における培養物の体積をＶｈ２とした場合に、Ｖｑ２／Ｖｈ２比が３〜１５である、該工程；
(ｊ)  工程（ｈ）および（ｉ）をｍ回繰り返す工程であって、ｍが１、２または３であり、当該繰り返しの前に、培養液を前記培養容器に補充してトランスフェクション細胞培養物を形成する、該工程；
(ｋ)  回収された液体の各々を混合し、混合ウイルス含有上清を得る工程；
(ｌ)  前記混合ウイルス含有上清を精製し、精製レンチウイルスベクターを得る工程。
【００１２】
ここで、上記各工程で用いられる培養液は、無血清細胞培養液である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
別の好ましい実施形態では、工程（ｄ）において、パッケージング細胞培養物の体積はＶｂ１であり、Ｖｂ１: Ｖｑ１比は（０．８〜１．２）：１である。
【００１４】
別の好ましい実施形態では、工程（ｊ）において、トランスフェクション細胞培養物の体積はＶｂ２であり、Ｖｂ２: Ｖｑ２比は（０．８〜１．２）：１である。
【００１５】
別の好ましい実施形態において、工程（ｃ）および／または（ｈ）において、培養は、振盪条件下で行われる。
【００１６】
別の好ましい実施形態では、上記振盪条件は、毎分１０〜３０回、前後に揺動させることである。
【００１７】
別の好ましい実施形態では、各揺動の振幅が１〜２０ｃｍ、好ましくは５〜１０ｃｍである。
【００１８】
別の好ましい実施形態において、異なる工程で添加される培養溶液は、同じであり、または異なる培養溶液である。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、工程（ｃ）および／または（ｈ）において、ｐＨ値は７．０〜７．３５の範囲に維持される。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、工程（ｃ）および／または（ｈ）において、溶存酸素は３０％〜５０％の範囲に維持される。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、工程（ｃ）および／または（ｈ）において、ＣＯ2濃度は３％〜５％に維持される。
【００２２】
別の好ましい実施形態では、工程（ｄ）および／または（ｉ）において、Ｖｑ１／Ｖｈ１比は５：１０である。
【００２３】
別の好ましい実施形態において、工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の合計時間は、（トランスフェクション前）７２〜２１６時間である。
【００２４】
別の好ましい実施形態において、工程（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）の合計時間は、（トランスフェクション後）７２〜１２０時間である。
【００２５】
別の好ましい実施形態において、工程（ｆ）において、使用されるマルチプラスミドトランスフェクション（ｍｕｌｔｉ−ｐｌａｓｍｉｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）は、３プラスミドトランスフェクションおよび４プラスミドトランスフェクションを含む。
【００２６】
別の好ましい実施形態において、４プラスミドトランスフェクションは、プラスミドＣＡＲ、ｇａｇ／ｐｏｌ、ｒｅｖおよびＶＳＶＧを使用するトランスフェクションである。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、培養容器は、使い捨て培養容器である。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、培養容器の容積が２０〜１２０Ｌ、好ましくは３０〜１００Ｌ、より好ましくは５０〜８０Ｌである。
【００２９】
別の好ましい実施形態において、混合ウイルス含有上清に含まれるウイルスの総数は、１×１０１２Ｔｕである。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、混合ウイルス含有上清中のウイルス力価は、８×１０７Ｔｕ／ｍｌである。
【００３１】
別の好ましい実施形態において、パッケージング細胞は、ヒト胚性腎上皮細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｒｅｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）である。
【００３２】
別の好ましい実施形態において、パッケージング細胞は、ヒト胚性腎上皮細胞ＨＥＫ２９３Ｆまたはそれに由来する細胞である。
【００３３】
別の好ましい実施形態において、無血清培地がＬＶ−ＭＡＸ（商標）生産培地（Ｇｉｂｃｏ（商標））である。
【００３４】
別の好ましい実施形態では、工程（ｌ）において、精製は限外濾過およびクロマトグラフィーを含む。
【００３５】
本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴および以下に詳細に説明する技術的特徴（例えば、実施形態）を互いに組み合わせて、新しいまたは好ましい技術的解決策を形成することができることを理解されたい。スペースの制約のため、ここでは説明しない。
【００３６】
詳細説明
広範かつ詳細な研究の後、製造プロセスへの探索およびプロセスパラメータのスクリーニングを通して、本発明者らは、大規模なＧＭＰレベルの無血清懸濁細胞からレンチウイルスを製造するための方法を開発した。本発明により提供される方法は、５０リットル以上の大規模生産に適しているだけでなく、極めて効率的な様式で高力価レンチウイルスを調製する。さらに、全プロセスが無血清培養条件を採用するので、この方法は、血清の使用による動物ベースのタンパク質および他の汚染物質の導入の危険性を回避する。さらに、本発明によって提供される方法によって産生されるレンチウイルスのバッチ間の変動は極めて小さく、これは産生品質のためのＧＭＰ産生の高い要件を満たし得る。これにより、本発明が完成する。
【００３７】
用語
本明細書において、「本発明のパッケージング細胞」、「パッケージング細胞ＨＥＫ２９３Ｆ」、および「本発明のパッケージング細胞ＨＥＫ２９３Ｆ」という用語は、それぞれ交換可能に使用されることができ、本発明の第１の態様において記載され、レンチウイルスをパッケージングおよび産生するために使用される細胞を意味する。
【００３８】
パッケージング細胞およびパッケージングシステム
本発明において、使用可能なレンチウイルスパッケージング系は特に限定されないが、好ましくは、３プラスミドおよび４プラスミド系を使用することができる。
【００３９】
特に好ましいパッケージング系は、ＨＩＶ−１に由来するレンチウイルスベクターを使用するものであって、ここで、４プラスミド系が３プラスミド系の代わりに使用され、ｔａｔ調節遺伝子がノックアウトされ、そしてｇａｇ／ｐｏｌおよびｒｅｖキャリアプラスミドが１つから２つに分割され、それによって、複製ウイルスを生成する可能性を減少させ、そしてベクター系の安全性を大幅に増加させる。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、レンチウイルス産生のための４プラスミド系を使用することによって、レンチウイルス製品の安全性および信頼性がさらに保証される。
【００４１】
本発明は、以下の主な利点を有する：
(ａ)本発明の細胞は、自動制御システムを用いることでスケールアップすることができる懸濁培養細胞であり、それにより、組換えレンチウイルスベクター供給液を大規模に生産することができ、生産コストを制御下に置くことができる。
【００４２】
(ｂ)本発明の細胞培養プロセスは、一回培養技術を採用し、無血清および無タンパク質培地を使用するものであり、これによって最終産物における異種タンパク質および狂牛病ウイルスの汚染の危険性を排除し、そして産物の臨床適用の安全性を大幅に改善することができる。そのため、細胞または遺伝子医薬の産生において使用される。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を特定の実施形態に関連してさらに説明する。これらの実施形態は本発明を例示することを意図したものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではないことを理解されたい。以下の実施形態における特定の条件を伴わない実験方法は一般に、従来の条件、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ(Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ,１９８９)等に記載される条件に従うか、または製造業者によって推奨される条件に従う。特に断らない限り、百分率および部は、重量百分率および重量部である。
【００４４】
＜一般的な方法及び材料＞
培地：明確な化学組成を有する無血清および無タンパク質培地
培養条件：ＣＯ2３〜５％；温度３０〜３７℃
(１)トランスフェクション試薬の調製：
ａ) １×ＨＢＳ (ｐＨ７．４）：８．７６ｇのＮａＣｌを９００ｍｌの超純水に溶解し、２０ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳを添加し、ｐＨ値を７．４に調整し、容量を１Ｌに設定し、濾過し（０．２μｍ濾過膜）、後の使用のために４℃で保存した；
ｂ) ＰＥＩ粉末１２５ｍｇを量り、１×ＨＢＳ(ｐＨ７．４）５０ｍｌに溶かし、０．２μｍのろ過膜でろ過し、４℃で保存して使用した。
【００４５】
＜実施例１＞
レンチウイルスの大規模生産方法：
本発明は、ＧＭＰレベルの無血清懸濁細胞を使用することによるレンチウイルスの大規模生産のための方法を提供するものである。
【００４６】
本発明によって提供される方法は、以下の工程を含む：
(ａ) レンチウイルスの産生のためのパッケージング細胞のシード溶液を提供する工程であって、前記パッケージング細胞が、懸濁液中で増殖するパッケージング細胞である、該工程；
(ｂ) 前記シード溶液を培養容器内の第１培養液に接種して、第１培養物を得る工程であって、前記第１培養液が無血清細胞培養液であり、接種濃度が１×１０６〜５×１０６細胞／ｍｌであり、および前記第１培養液の体積が所定の大容量（例えば、３〜１００Ｌ）である、該工程；
(ｃ) 前記第１培養物を、温度３０〜３８℃、溶存酸素３５〜５５％、ＣＯ2濃度２〜１０％、ｐＨ６．９〜７．４の条件下で、前記パッケージング細胞を継代培養する工程；
(ｄ) 液体交換トリガ条件が満たされたときに液体交換処理を開始する工程であって、前記液体交換処理が、前記培養容器から培養物中の無細胞上清を排出すること；次いで、前記培養容器に培養液を補充して、パッケージング細胞の培養物を形成することを含む、該工程；
(ｅ)工程（ｃ）および（ｄ）をｎ回繰り返す工程であって、ｎが１、２または３である、該工程；
(ｆ)トランスフェクショントリガ条件が満たされたときにトランスフェクション処理を開始する工程であって、前記トランスフェクション処理が、前記レンチウイルスの産生のための産生プラスミドおよびトランスフェクション試薬を混合し、それらを培養容器に添加し、それによって、前記パッケージング細胞を導入し、トランスフェクトされたパッケージング細胞を形成することを含む、該工程；
(ｇ) 場合によって、トランスフェクション後に液体交換を行う工程；
(ｈ) 前記トランスフェクトされたパッケージング細胞を、温度３０〜３７℃、溶存酸素３５〜５５％、ＣＯ2濃度２〜１０％、ｐＨ６．９〜７．４の条件下で培養する工程；
(ｉ) 液体交換トリガー条件が満たされたときに採取及び液体交換処理を開始する工程であって、前記液体交換処理が、前記培養物中の無細胞ウイルス含有供給液を回収することを含む、該工程；
(ｊ) 工程（ｈ）および（ｉ）をｍ回繰り返す工程であって、ｍが１、２または３であり、当該繰り返しの前に、培養液を前記培養容器に補充してトランスフェクション細胞培養物を形成する、該工程；
(ｋ) 回収された液体の各々を混合し、混合ウイルス含有上清を得る工程；
(ｌ) 前記混合ウイルス含有上清を精製し、精製レンチウイルスベクターを得る工程；
ここで、上記各工程で用いる培養液は、無血清細胞培養液である。
【００４７】
本発明では、液体交換トリガー条件が最適化され、これにより、各生産バッチの品質変動を低減させることができ、高い力価および高い収率を有する医療グレードのレンチウイルスを得ることができる。典型的には、液体変更トリガ条件は、以下を含む：
（ｓ１）リアルタイムｐＨ値が、６．９以下、好ましくは７．０以下、より好ましくは７．０５以下であること；
（ｓ２）酸素、空気、窒素および／またはＣＯ2の濃度を調整することにより、前記リアルタイムｐＨ値は依然として下降傾向を示すこと；および
（ｓ３）継代培養時間が７２時間以上であること。
【００４８】
本発明において、トランスフェクショントリガー条件は最適化され、これにより、各生産バッチの品質変動を減少させることができ、高い力価および高い収率を有する医療グレードのレンチウイルスを得ることができる。典型的には、トラ（ｔ１）総細胞量が０．０５〜２×１０１１細胞であること；
（ｔ２）細胞濃度が０．５〜５×１０６細胞／ｍｌであること；
（ｔ３）細胞の生存率が９０％以上であること；および
（ｔ４）総培養時間が７２時間以上であること。
【００４９】
典型的には、本発明の特定の実施形態において、上記方法は、以下のステップを含むものとした：
シード溶液の調製；
接種濃度１〜５×１０6細胞／ｍｌの接種（２５Ｌの培養液に接種）；
パッケージング細胞の継代培養を行い（この間、ｐＨおよび溶存酸素を用いて、溶存ＣＯ2、窒素、大気の通気比率、さらに液交換の開始様式が自動的に調整すされる）、ｐＨを６．９〜７．４、好ましくは７．０〜７．３、より好ましくは７．１〜７．２に制御する；
第１の液体変化（ｐＨが６．９以下、好ましくは７．０以下である場合、液体変化を開始することができる）、例えば、２５Ｌ→２〜１０Ｌ（好ましくは３〜７Ｌ）；
無血清培養液を補充し、２４〜９６時間、好ましくは３６〜７２時間、より好ましくは４０〜６０時間培養し続け；３００時間培養した後、細胞数は５×１０１０である；
プラスミドを添加し、パッケージング細胞に複数のプラスミドをトランスフェクトする；
任意選択的な工程：トランスフェクション後、２〜１０時間、好ましくは４〜６時間培養し、再度、液体交換を行う（まず一定量の培養混合液を排出し、次に無血清培養液を添加する）；
汎用工程：トランスフェクション後、培養を続ける；ｐＨが≦６．９、好ましくは≦７．０の場合、トランスフェクション後に第１の液体交換を開始することができ、トランスフェクション後の液体交換中に、排出された液体培養混合物（無細胞ウイルス含有上清）を回収し、回収液Ｒ１として記録し、２〜８℃で保存する；
液体交換の後、培養を続ける；液体交換トリガー条件が満たされた場合、トランスフェクション後にｉ番目の液体交換が行われ（ここで、ｉは２、３、４または５であり）、各回の液体交換の間、排出された液体培養混合物の無細胞ウイルス含有上清が回収され、回収液Ｒｉとして記録される；この工程を１、２または３回繰り返す；
回収した各液体を混合し、混合ウイルス含有上清を得る；
混合ウイルス含有上清を精製して、１×１０8〜１×１０9 Ｔｕ／ｍＬの力価を有する精製レンチウイルスベクターを得る。
【００５０】
比較例１
以下の相違点を除いて、実施例１を繰り返した。初期ｐＨ値は６．９〜７．４であるが、継代培養プロセスにおいて、第１培養物のリアルタイムｐＨ値はリアルタイムでモニターされず、代わりに、継代培養は２４〜９６時間で行った。
【００５１】
結果：３００時間培養した後、細胞の数は４×１０9であった（好ましい実施形態における細胞の数より少ない）。
【００５２】
比較例２
以下の相違点を除いて、実施例１を繰り返した：ＣＯ２含有量は調整しない。
【００５３】
結果：レンチウイルスの生物学的力価は、好ましい実施形態の２０％であった。
【００５４】
本発明において言及される全ての文献は各文献が個々に参照として引用されるかのように、本出願において参照として引用される。さらに、本発明の上記教示内容に基づき、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの等価な形態もまた、本出願の添付の特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることを理解することができる。
【国際調査報告】
2021519108.tif 000002
2021519108.tif 000003
2021519108.tif 000004
2021519108.tif 000005