(57)【要約】  受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法が記載されている。方法は、特異的遺伝子発現を標的とする標的化ライブラリーを含む操作した細胞の集団を提供し、十分な時間、組換え毒素融合体と細胞の集団を接触させ、細胞の選択プールに含まれる核酸分子のうちの１以上の配列を決定することにより、細胞の選択プール内のタンパク質を同定し、それにより標的遺伝子を同定することを含む。毒素耐性細胞株、毒素生成細胞株、組換え毒素融合体、それらを生成するプローブ及び方法、並びにそれらのキットも提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法であって、
（ａ）標的化ライブラリーを含む操作した細胞の集団であって、
前記集団の個々の操作した細胞が標的化ライブラリーの核酸分子を含有し、前記核酸分子が標的遺伝子に相補的な核酸配列を含む、細胞の集団を提供する工程；
（ｂ）前記細胞の集団を、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて転位ドメインを含む組換え毒素融合体と十分な時間接触させることにより、細胞の選択プールを生成する工程；並びに
（ｃ）前記細胞の選択プールに含まれる核酸分子のうちの１以上の配列を決定して、前記標的遺伝子を同定する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
特異的遺伝子発現を標的とする核酸分子が、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ、好ましくはｇＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓシステムの一部である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓシステムがＣａｓ９を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記標的化ライブラリーが哺乳動物ライブラリー、好ましくは、ヒト又はマウスのライブラリーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記標的化ライブラリーが全ゲノムライブラリーである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的化ライブラリーが、細胞表面受容体、好ましくは、ＧＰＣＲを標的とする核酸分子を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的化ライブラリーが、細胞表面受容体介在経路のタンパク質を標的とする核酸分子を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記標的化ライブラリーが、受容体成熟因子を標的とする核酸分子を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞集団が、哺乳動物細胞株、好ましくは、ヒト又はマウスの細胞株からの細胞を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物細胞株が、Ａ４３１、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、Ｋ５６２、ＨｅＬａ、好ましくは、ＨｅＬａ−京都、又はＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔ、又は一倍体若しくはほぼ一倍体の細胞株、好ましくは、ＨＡＰ１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的化ライブラリーが、レトロウイルスベクター、好ましくは、レンチウイルスベクターで前記細胞に形質導入される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記毒素ドメインが、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α−ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、若しくはリシンの毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記結合ドメインが、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記受容体結合分子が、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記受容体結合分子が、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドが、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記結合ドメインが翻訳後修飾を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記翻訳後修飾が、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記翻訳後修飾が、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記転位ドメインが、ＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記毒素ドメインが、前記組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記結合ドメインが、前記毒素ドメインの反対側の末端にある、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞に投与されたとき、前記組換え毒素融合体が、非操作細胞の少なくとも９９％を死滅させる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記配列決定がハイスループット配列決定を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
毒素耐性細胞株を生成する方法であって、
（ａ）Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程；及び
（ｂ）前記毒素耐性細胞株を生成するのに十分な時間、前記細胞を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも２日間、少なくとも０.１ｎＭの毒素と接触させる工程
を含む、方法。
【請求項２７】
前記毒素が、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、サポリン又はサブチラーゼ細胞毒である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＣａｓがＣａｓ９である、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞株がＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ジフテリア毒素（ＤＴＡ）耐性細胞株を生成する方法であって、
（ａ）Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＨＢＥＧＦ、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程；及び
（ｂ）前記ＤＴＡ耐性細胞株を生成するのに十分な時間、前記細胞をＤＴＡと接触させ、必要に応じて、少なくとも２日間、少なくとも０.１ｎＭのＤＴＡと接触させる工程、
を含む、方法。
【請求項３１】
前記ＣａｓがＣａｓ９である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞株がＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）耐性細胞株を生成する方法であって、
（ａ）Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＦＵＲＩＮ、ＭＥＳＤＣ２、ＬＲＰ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程；及び
（ｂ）前記ＰＥ耐性細胞株を生成するのに十分な時間、ＰＥと前記細胞を接触させ、必要に応じて、少なくとも２日間、少なくとも０.１ｎＭのＰＥと接触させる工程、
を含む、方法。
【請求項３４】
前記ＣａｓがＣａｓ９である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞株がＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
毒素生成細胞株を生成する方法であって、
（ａ）Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程；
（ｂ）十分な時間、前記細胞を毒素と接触させる工程；及び
（ｃ）前記毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を工程（ｂ）の細胞に導入し、発現させる工程、
を含む、方法。
【請求項３７】
前記毒素が、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、サポリン又はサブチラーゼ細胞毒である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記組換え毒素融合体が、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記毒素ドメインが、前記組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記結合ドメインが、前記毒素ドメインの反対側の末端にある、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記結合ドメインが、受容結合分子、ペプチド、抗体又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記毒素ドメインが、ＤＴＡ、ＰＥ、サポリン若しくはサブチラーゼ細胞毒の毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記受容体結合分子が、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記受容体結合分子が、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ペプチドが、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記結合ドメインが翻訳後修飾を含む、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記翻訳後修飾が、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記翻訳後修飾が、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記転位ドメインが、ＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＣａｓがＣａｓ９である、請求項３６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞株がＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである、請求項３６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
毒素を生成する方法であって、
（ａ）Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程；
（ｂ）十分な時間、前記細胞を毒素と接触させる工程；
（ｃ）前記毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を工程（ｂ）の細胞に導入し、発現させる工程；
（ｄ）培地中で前記細胞を成長させる工程；並びに
（ｅ）前記毒素又は前記組換え毒素融合体を含有する前記培地を収集する工程、
を含む、方法。
【請求項５３】
前記毒素が、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、サポリン又はサブチラーゼ細胞毒である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記組換え毒素融合体が、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む、請求項５２又は５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記毒素ドメインが、前記組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記結合ドメインが、前記毒素ドメインの反対側の末端にある、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記結合ドメインが、受容結合分子、ペプチド、抗体、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記毒素ドメインが、ＤＴＡ、ＰＥ、サポリン若しくはサブチラーゼ細胞毒の毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記受容体結合分子が、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記受容体結合分子が、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ペプチドが、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記結合ドメインが翻訳後修飾を含む、請求項５４〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記翻訳後修飾が、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
翻訳後修飾が、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記転位ドメインが、ＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む、請求項５４〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＣａｓがＣａｓ９である、請求項５２〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞株がＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである、請求項５２〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
少なくとも１つの核酸分子を含み、発現させる細胞集団を含む毒素耐性細胞株であって、前記核酸分子が、Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む、毒素耐性細胞株。
【請求項６９】
前記細胞株が、毒素、好ましくは、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）又はシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）に耐性のある細胞の集団を含む、請求項６８に記載の毒素耐性細胞株。
【請求項７０】
前記細胞の集団が１００μＭまでの毒素に対して耐性である、請求項６８又は６９に記載の毒素耐性細胞株。
【請求項７１】
前記ＣａｓがＣａｓ９である、請求項６８〜７０のいずれか一項に記載の毒素耐性細胞株。
【請求項７２】
前記細胞株がＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである、請求項６８〜７１のいずれか一項に記載の毒素耐性細胞株。
【請求項７３】
少なくとも１つの核酸分子を含み、発現させる細胞集団を含むジフテリア毒素（ＤＴＡ）耐性細胞株であって、前記核酸分子が、Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＨＢＥＧＦ、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）耐性細胞株。
【請求項７４】
前記細胞の集団が１００μＭまでのＤＴＡに対して耐性である、請求項７３に記載のＤＴＡ耐性細胞株。
【請求項７５】
前記ＣａｓがＣａｓ９である、請求項７３又は７４に記載のＤＴＡ耐性細胞株。
【請求項７６】
前記細胞株がＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載のＤＴＡ耐性細胞株。
【請求項７７】
Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＦＵＲＩＮ、ＭＥＳＤＣ２、ＬＲＰ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を含み、発現させる細胞集団を含む、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）耐性細胞株。
【請求項７８】
前記細胞の集団が１００μＭまでのＰＥに対して耐性である、請求項７７に記載のＰＥ耐性細胞株。
【請求項７９】
前記ＣａｓがＣａｓ９である、請求項７７又は７８に記載のＰＥ耐性細胞株。
【請求項８０】
前記細胞株がＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである、請求項７７〜７９のいずれか一項に記載のＰＥ耐性細胞株。
【請求項８１】
少なくとも１つの核酸分子を含み、発現させる細胞集団を含む毒素生成細胞株であって、前記核酸分子が、Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列と、毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列とを含む、毒素生成細胞株。
【請求項８２】
前記毒素が、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）又はシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）である、請求項８１に記載の毒素生成細胞株。
【請求項８３】
前記組換え毒素融合体が、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む、請求項８２に記載の毒素生成細胞株。
【請求項８４】
前記毒素ドメインが、前記組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある、請求項８３に記載の毒素生成細胞株。
【請求項８５】
前記結合ドメインが、前記毒素ドメインの反対側の末端にある、請求項８３又は８４に記載の毒素生成細胞株。
【請求項８６】
前記結合ドメインが、受容体結合分子、ペプチド、抗体又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の毒素生成細胞株。
【請求項８７】
前記毒素ドメインが、ＤＴＡ若しくはＰＥ毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む、請求項８３〜８６のいずれか一項に記載の毒素生成細胞株。
【請求項８８】
前記受容体結合分子が、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項８６又は８７に記載の毒素生成細胞株。
【請求項８９】
前記受容体結合分子が、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の毒素生成細胞株。
【請求項９０】
前記ペプチドが、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項８６又は８７に記載の毒素生成細胞株。
【請求項９１】
前記結合ドメインが翻訳後修飾を含む、請求項８１〜９０のいずれか一項に記載の毒素生成細胞株。
【請求項９２】
前記翻訳後修飾が、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む、請求項９１に記載の毒素生成細胞株。
【請求項９３】
前記翻訳後修飾がマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む、請求項９２記載の毒素生成細胞株。
【請求項９４】
前記転位ドメインが、ＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む、請求項８３〜９３のいずれか一項に記載の毒素生成細胞株。
【請求項９５】
前記ＣａｓがＣａｓ９である、請求項８１〜９４のいずれか一項に記載の毒素生成細胞株。
【請求項９６】
前記細胞株がＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである、請求項８１〜９５のいずれか一項に記載の毒素生成細胞株。
【請求項９７】
組換え毒素融合体をコードし、発現させることができる核酸配列を含む核酸分子であって、前記組換え毒素融合体が、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含み、前記毒素ドメインが前記組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、前記結合ドメインが、前記毒素ドメインの反対側の末端にあり、前記結合ドメインが受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含み、必要に応じて、前記核酸がベクター中に含まれる、核酸分子。
【請求項９８】
前記毒素ドメインが、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α−ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、又はリシンの毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む、請求項９７に記載の核酸分子。
【請求項９９】
前記受容体結合分子が、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項９７又は９８に記載の核酸分子。
【請求項１００】
前記受容体結合分子が、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項９７〜９９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０１】
前記ペプチドが、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項９７又は９８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１０２】
前記転位ドメインが、ＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む、請求項９７〜１０１のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１０３】
毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む組換え毒素融合体であって、前記毒素ドメインが、前記組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、前記結合ドメインが、前記毒素ドメインの反対側の末端にあり、前記結合ドメインが、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含み、必要に応じて、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法で使用するための、組換え毒素融合体。
【請求項１０４】
前記毒素ドメインが、ＤＴＡ、ＰＥ、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α−ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、若しくはリシンの毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む、請求項１０３に記載の組換え毒素融合体。
【請求項１０５】
前記受容体結合分子が、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項１０３又は１０４に記載の組換え毒素融合体。
【請求項１０６】
前記受容体結合分子が、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項１０３又は１０４に記載の組換え毒素融合体。
【請求項１０７】
前記ペプチドが、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項１０３又は１０４に記載の組換え毒素融合体。
【請求項１０８】
前記結合ドメインが翻訳後修飾を含む、請求項１０３〜１０７のいずれか一項に記載の組換え毒素融合体。
【請求項１０９】
前記翻訳後修飾が、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む、請求項１０８に記載の組換え毒素融合体。
【請求項１１０】
前記翻訳後修飾が、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む、請求項１０９に記載の組換え毒素融合体。
【請求項１１１】
前記転位ドメインが、ＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む、請求項１０３〜１１０のいずれか一項に記載の組換え毒素融合体。
【請求項１１２】
受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するためのキットであって、
（ａ）第１の細胞株、
（ｂ）組換え毒素融合体をコードし、前記組換え毒素融合体を発現させることができる核酸配列を含む少なくとも１つの核酸分子、並びに
必要に応じて、（ｃ）標的化ライブラリーであって、個々の核酸分子が特異的遺伝子の遺伝子発現を標的とする標的化ライブラリー、
のうちの１以上を含み、
前記第１の細胞株が前記組換え毒素融合体に対して耐性があり、かつ
前記組換え毒素融合体が、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む、キット。
【請求項１１３】
（ｄ）細菌細胞、昆虫細胞又は酵母細胞をさらに含む、請求項１１２に記載のキット。
【請求項１１４】
（ｅ）第２の細胞株をさらに含む、請求項１１２又は１１３に記載のキット。
【請求項１１５】
前記毒素耐性細胞株が、Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードし、発現させることができる核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードし、発現させることができる核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を有する細胞を含む、請求項１１１〜１１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１６】
前記毒素ドメインが、前記組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある、請求項１１１〜１１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１７】
前記結合ドメインが、前記毒素ドメインの反対側の末端にある、請求項１１１〜１１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１８】
前記結合ドメインが、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含む、請求項１１１〜１１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１９】
前記毒素ドメインが、ＤＴＡ、ＰＥ、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α−ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、若しくはリシンの毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む、請求項１１１〜１１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２０】
前記受容体結合分子が、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項１１８又は１１９に記載のキット。
【請求項１２１】
前記受容体結合分子が、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項１１８〜１２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２２】
前記ペプチドが、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項１１８又は１１９に記載のキット。
【請求項１２３】
前記結合ドメインが翻訳後修飾を含む、請求項１１２〜１２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２４】
前記翻訳後修飾が、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む、請求項１２３に記載のキット。
【請求項１２５】
前記翻訳後修飾が、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む、請求項１２４に記載のキット。
【請求項１２６】
前記転位ドメインが、ＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む、請求項１１２〜１２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２７】
前記標的化ライブラリーが、少なくとも１つのレンチウイルスベクターに含まれる、請求項１１２〜１２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２８】
前記タンパク質を同定するための一組の説明書をさらに含む、請求項１１２〜１２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２９】
少なくとも１つの細胞株、前記核酸分子、前記標的化ライブラリー及び前記１組の説明書、必要に応じて、前記細菌細胞又は前記酵母細胞を包装するための容器をさらに含む、請求項１１２〜１２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３０】
組換え毒素融合体をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するためのプローブであって、前記組換え毒素融合体が、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含み、前記毒素ドメインが、前記組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、前記結合ドメインが、前記毒素ドメインの反対側の末端にあり、前記結合ドメインが、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含む、プローブ。
【請求項１３１】
前記毒素ドメインが、ＤＴＡ、ＰＥ、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α−ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、若しくはリシンの毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む、請求項１３０に記載のプローブ。
【請求項１３２】
前記受容体結合分子が、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項１３０又は１３１に記載のプローブ。
【請求項１３３】
前記受容体結合分子が、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項１３０〜１３２のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１３４】
前記ペプチドが、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、請求項１３０又は１３１に記載のプローブ。
【請求項１３５】
前記結合ドメインが翻訳後修飾を含む、請求項１３０〜１３４のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１３６】
前記翻訳後修飾が、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む、請求項１３５に記載のプローブ。
【請求項１３７】
前記翻訳後修飾が、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む、請求項１３６に記載のプローブ。
【請求項１３８】
前記転位ドメインが、ＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む、請求項１３０〜１３７のいずれか一項に記載のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年５月３０日出願の米国仮特許出願第６２／６７７，８７５号の優先権を主張するものである。
【０００２】
分野
本開示は、受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法、プローブ、組換え細胞株、組換え毒素融合体、及びキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
細胞は、セクレトームとして集合的に知られている数千のタンパク質を分泌する。ホルモン、成長因子、及び他の自己分泌／パラ分泌シグナル伝達因子を含むこれらのタンパク質は、発達、成長制御、及び組織恒常性に重要な役割を果たす。細胞間シグナル伝達の破壊は、発達障害、癌、及び免疫障害に因果的に関与している。分泌された又別の方法で放出されたシグナル伝達因子は、標的細胞の表面でそれらの特異的（同族）受容体に結合するとすぐに、特異的シグナル伝達カスケードを開始する。そのため、リガンド／受容体相互作用の同定は、基本的な生物医学研究と治療の両方に広範囲に影響する。例えば、現在、外来診療所の薬物の７０％が細胞表面受容体を標的としており、癌及び炎症性疾患における抗体治療薬の成功により、受容体標的薬剤の非常に高い治療可能性がさらに強調されている。したがって、分泌タンパク質をそれらの同族の細胞表面受容体に結合させることは、細胞間コミュニケーションの根底にある基本的なシグナル伝達機構を理解し、新規の治療薬を開発する際の重要な工程である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、推定３，０００個の分泌タンパク質を２，５００個の細胞表面タンパク質に連結することは、依然として厄介な作業である。現代のタンパク質−タンパク質相互作用アッセイは、可溶性細胞内タンパク質間の相互作用を特徴付けるのに非常に成功しているが、偏りのない方法で受容体／リガンド相互作用を研究するための容易に拡張可能な方法はない。いくつかの既存のハイスループットアッセイ、結合活性に基づく細胞外相互作用スクリーニング（ＡＶＥＸＩＳ）の１つは、多量体化された受容体の細胞外ドメインを利用して、プレート上に固定した推定リガンドについてスクリーニングする。その結果、このアッセイは、複数の膜貫通受容体（ＧＰＣＲなど）又はマルチサブユニット受容体に適合しない。さらに、観察された受容体−リガンド相互作用は、試験されたインビトロ条件に特異的であり、インビボでは当てはまらない可能性がある。最後に、該アッセイは、アッセイで試験された全てのタンパク質のクローニング、発現及び精製に依存し、これは、細胞外タンパク質に対して特に困難である。そのため、リガンド／受容体の対の同定は困難であり、その結果、既知の膜貫通受容体及び可溶性リガンドの実質的な画分は、オーファンのままである。これらの障害物は、細胞外シグナル伝達機構の基本的な理解と治療関連の研究の両方を著しく遅くする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、細胞外タンパク質の受容体を同定する方法を開発した。この方法は、既存のアッセイの１以上の制限を克服する。本明細書に記載の方法及び組成物は、細菌外毒素などの毒素を利用する。細菌外毒素などの毒素は、例えば、分泌タンパク質と融合させた場合、受容体依存的に細胞を中毒にさせることができ、これにより、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９ベースの陽性選択スクリーニングなどのゲノムワイド選択スクリーニングにより同族受容体の同定を容易にする。いくつかの実施形態では、受容体に加えて、本発明の方法は、他の因子、例えば、受容体の新生、成熟、又は輸送に関与する遺伝子などの受容体表面発現及び機能付与に必要な因子、リガンド及び／又は受容体エンドサイトーシスに関与する因子、並びに毒素活性に必要な中毒因子を同定することもできる。
【発明の効果】
【０００６】
したがって、本開示の態様は、受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法であって、
（ａ）標的化ライブラリーを含む操作した細胞の集団であって、
該集団の個々の操作した細胞は標的化ライブラリーの核酸分子を含有し、該核酸分子は標的遺伝子に相補的な核酸配列を含む、細胞の集団を提供する工程；
（ｂ）細胞の集団を、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて転位ドメインを含む組換え毒素融合体と十分な時間接触させることにより、細胞の選択プールを生成する工程；並びに
（ｃ）細胞の選択プールの１以上の細胞に含まれる標的化ライブラリーの核酸分子の１以上の配列を決定し、１以上の細胞中の標的遺伝子であって、受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質をコードする標的遺伝子を同定する工程、
を含む方法を含む。
【０００７】
一実施形態では、標的化ライブラリーを含む操作した細胞の集団を毒素と接触させる。例えば、これを対照として用いることができる。
【０００８】
一実施形態では、標的遺伝子に相補的な核酸配列を含む核酸分子は、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ、好ましくはｇＲＮＡを含むか、又はそれらである。
【０００９】
一実施形態では、ｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの一部である。
【００１０】
別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはＣａｓ９を含む。
【００１１】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｃｐｆ１を含む。
【００１２】
別の実施形態では、標的化ライブラリーは、哺乳動物ライブラリー、好ましくは、ヒト又はマウスのライブラリーである。
【００１３】
別の実施形態では、標的化ライブラリーは、全ゲノムライブラリーである。
【００１４】
別の実施形態では、標的化ライブラリーは、細胞表面受容体、好ましくはＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）を標的とする核酸分子を含む。
【００１５】
別の実施形態では、標的化ライブラリーは、細胞表面受容体介在経路のタンパク質をコードする遺伝子を標的とする核酸分子を含む。
【００１６】
別の実施形態では、標的化ライブラリーは、受容体成熟因子遺伝子を標的とする核酸分子を含む。
【００１７】
別の実施形態では、細胞集団は、哺乳動物細胞株、好ましくは、ヒト又はマウスの細胞株からの細胞を含む。
【００１８】
別の実施形態では、哺乳動物細胞株は、Ａ４３１、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、Ｋ５６２、ＨｅＬａ、好ましくは、ＨｅＬａ−京都、又はＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔ、又は一倍体若しくはほぼ一倍体の細胞株、好ましくは、ＨＡＰ１である。
【００１９】
別の実施形態では、標的化ライブラリーは、少なくとも１つのレトロウイルスベクター、好ましくは、少なくとも１つのレンチウイルスベクターで細胞に形質導入される。
【００２０】
別の実施形態では、毒素又は毒素ドメインは、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α−ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、若しくはリシンの毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む。
【００２１】
別の実施形態では、結合ドメインは、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含む。
【００２２】
別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。
【００２３】
一実施形態では、受容体結合分子は成長因子であるか、又はそれを含む。一実施形態では、成長因子は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、又は線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）である。一実施形態では、受容体結合分子は、サイトカインであるか、又はそれを含む。一実施形態では、サイトカインはケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）である。一実施形態では、受容結合分子は、リソソーム酵素であるか、又はそれを含む。一実施形態では、リソソーム酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（ＧＮＳ）又はＧＭ２ガングリオシド活性化因子（ＧＭ２Ａ）である。別の実施形態では、受容体結合分子は、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。
【００２４】
別の実施形態では、ペプチドは、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。
【００２５】
別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。
【００２６】
別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む。
【００２７】
別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む。
【００２８】
別の実施形態では、転位ドメインは、ＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端にある。他の実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のカルボキシル末端にある。
【００３０】
転位ドメインを含む他の実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にある。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインに融合される。
【００３１】
別の実施形態では、細胞に投与されたときに、組換え毒素融合体は、非操作細胞（例えば、標的化ライブラリーを含まない細胞）の少なくとも９９％を死滅させる。
【００３２】
一実施形態では、配列決定はハイスループット配列決定を含む。
【００３３】
別の態様は、毒素耐性細胞株を生成する方法であって、
（ａ）Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程；及び
（ｂ）毒素耐性細胞株を生成するのに十分な時間、細胞を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも２日間、少なくとも０.１ｎＭの毒素と接触させる工程
を含む方法を含む。
【００３４】
一実施形態では、本方法は、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）耐性細胞株を生成する方法であって、
（ａ）Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＨＢＥＧＦ、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程；並びに
（ｂ）ＤＴＡ耐性細胞株を生成するのに十分な時間、ＤＴＡと細胞を接触させ、必要に応じて、少なくとも２日間、少なくとも０.１ｎＭのＤＴＡと接触させる工程、
を含む。
【００３５】
また、さらに別の態様で提供されるのは、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）耐性細胞株を生成する方法であって、
（ａ）Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＦＵＲＩＮ、ＭＥＳＤＣ２、ＬＲＰ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程；及び
（ｂ）ＰＥ耐性細胞株を生成するのに十分な時間、ＰＥと細胞を接触させ、必要に応じて、少なくとも２日間、少なくとも０.１ｎＭのＰＥと接触させる工程、
を含む方法である。
【００３６】
また別の態様で提供されるのは、毒素生成細胞株を生成する方法であって、
（ａ）Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程；
（ｂ）十分な時間、細胞を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも２日間、少なくとも０.１ｎＭの毒素と接触させる工程；並びに
（ｃ）毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を工程（ｂ）の細胞に導入し、発現させる工程、
を含む方法である。
【００３７】
また別の態様で提供されるのは、毒素を生成する方法であって、
（ａ）Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程；
（ｂ）十分な時間、細胞を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも２日間、少なくとも０.１ｎＭの毒素と接触させる工程；
（ｃ）毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を工程（ｂ）の細胞に導入し、発現させる工程；
（ｄ）培地中で細胞を成長させる工程；並びに
（ｅ）毒素又は組換え毒素融合体を含有する培地を収集し、必要に応じて、毒素又は組換え毒素融合体を単離する工程、
を含む方法である。
【００３８】
また一態様で提供されるのは、毒素耐性細胞株であって、該細胞株の細胞の各々が、Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つ核酸分子を含み、発現させる毒素耐性細胞株である。
【００３９】
一実施形態では、該細胞株は、Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＨＢＥＧＦ、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を含み、発現させる細胞集団を含むジフテリア毒素（ＤＴＡ）耐性細胞株である。
【００４０】
一実施形態では、該細胞株は、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）耐性細胞株であり、該細胞株の細胞の各々が、Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＦＵＲＩＮ、ＭＥＳＤＣ２、ＬＲＰ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を含み、発現させる、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）耐性細胞株である。
【００４１】
また一態様で提供されるのは、毒素生成細胞株であって、該細胞株の細胞の各々が、Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列と、毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を含む、毒素生成細胞株である。
【００４２】
また提供されるのは、組換え毒素融合体をコードし、それを発現することができる核酸配列を含む核酸分子であって、組換え毒素融合体が毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含み、毒素ドメインが組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、該結合ドメインが毒素ドメインの反対側の末端にあり、該結合ドメインが受容体結合分子、ペプチド、抗体、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、核酸分子である。
【００４３】
また提供されるのは、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む組換え毒素融合体であって、該毒素ドメインが組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、該結合ドメインが毒素ドメインの反対側の末端にあり、該結合ドメインが、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含む、組換え毒素融合体である。
【００４４】
また提供されるのは、受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するためのキットであって、
（ａ）第１の細胞株、
（ｂ）組換え毒素融合体をコードし、該組換え毒素融合体又は少なくとも１つの組換え毒素融合体を発現させることができる核酸配列を含む少なくとも１つの核酸分子、並びに
（ｃ）複数の核酸分子を含む標的化ライブラリーであって、個々の核酸分子が特異的遺伝子の遺伝子発現を標的とする標的化ライブラリー、
を含み、
第１の細胞株が該組換え毒素融合体に対して耐性があり、かつ
該組換え毒素融合体が、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む、キットである。
【００４５】
また提供されるのは、受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するためのキットであって、
（ａ）第１の細胞株、
（ｂ）毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む少なくとも１つの組換え毒素融合体、及び
必要に応じて、複数の核酸分子を含む標的化ライブラリーであって、個々の核酸分子が特異的遺伝子の遺伝子発現を標的とする標的化ライブラリー
を含む、キットである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、該キットは、本明細書に記載の方法を実行するための説明書を含み、実行するためのものである。該キットは、本明細書に記載の１以上の構成要素を含むことができる。
【００４７】
また提供されるのは、組換え毒素融合体をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該組換え毒素融合体が毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含み、該毒素ドメインが該組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、該結合ドメインが該毒素ドメインの反対側の末端にあり、該結合ドメインが、受容体結合分子、ペプチド、抗体、若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含み、必要に応じて、該組換え毒素融合体は、さらに多量体化ドメインを含むポリペプチドである。一実施形態では、該組換え毒素融合体は複数の毒素ドメインを含む。一実施形態では、プローブは、受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するためのものである。
【００４８】
本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本開示の実施形態を示す詳細な説明及び特定の実施例は、単なる例示として与えられており、特許請求の範囲は、実施例に記載された実施形態によって限定されるべきではないが、全体としての説明と一致する最も広い解釈が与えられるべきであることを理解すべきである。
【００４９】
本開示の実施形態を、これから図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、ジフテリア毒素が受容体に結合し、エンドサイトーシスを受け、エンドソームから脱出することを表すＡＢ型毒素の概略図を示す。
【図２】図２は、リガンド−受容体相互作用のための操作された外毒素の概略図を示す。
【図３】図３は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）スクリーニングで毒素受容体を同定する概略図を示す。
【図４】図４は、ジフテリア毒素−リガンドの細菌発現用の目的プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＳＨＴ−ＳＵＭＯ−ＤＴＡ−ｃｃｄＢの概略図を示す。
【図５】図５は、リガンド−外毒素Ａの哺乳動物発現用の目的プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＳＰ−ｃｃｄＢ−ＧＳリンカー−ＰＥ４０の概略図を示す。
【図６】図６は、リガンド−外毒素Ａの細菌発現用の目的プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＳＨＴ−ｃｃｄ−ＰＥ４０の概略図を示す。
【図７】図７は、ゲノムワイドｇＲＮＡライブラリーを用いたＣＲＩＳＰＲスクリーニング後に、ジフテリア毒素又はシュードモナス外毒素Ａで処理したＨＡＰ１細胞の代表的な画像を示す。
【図８】図８は、ジフテリア毒素−リガンドの哺乳動物発現用の目的プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＳＰ−ＤＴＡ−ＧＳ−ｃｃｄＢの概略図を示す。
【図９】図９は、ジフタミド生合成のための経路を示す。
【図１０】図１０は、シュードモナス外毒素Ａによる中毒に必要な遺伝子のリストを示す。
【図１１】図１１Ａ〜Ｃは、野生型シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）のモデル（Ａ）、転位を有する組換え毒素ＥＧＦ−ＰＥ３８（ＥＧＦ−ＰＥ）（Ｂ）及びＰＥの毒素ドメイン及びリガンドＥＧＦを含む結合ドメイン、並びに組換え毒素ＥＧＦ−ＰＥ３８の生成及び適用の概略図（Ｃ）を示す。Ｉ：受容体結合分子（結合ドメイン）；ＩＩ：転位ドメイン；ＩＩＩ：毒素ドメイン。（Ｂ）において、結合ドメインはＥＧＦである。
【図１２】図１２は、ＥＧＦ−ＰＥを用いたスクリーニングからのグラフ結果を示す。
【図１３】図１３Ａは、ＰＥの転位ドメイン及び毒素ドメインを含む組換えリガンドコンジュゲート毒素の概略図、及び受容体結合分子であるＣＸＣＬ９又はＰＴＮの結合ドメインを示す。図１３Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するＰＴＮ−ＰＥ及びＣＸＣＬ９−ＰＥの異なる毒性効果を示すグラフを示す。Ｉ．ＣＸＣＬ９又はＰＴＮの結合ドメイン；ＩＩ：ＰＥの転位ドメイン；ＩＩＩ：ＰＥの毒素ドメイン。
【図１４】図１４は、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）の転位ドメイン及び毒素ドメイン並びにＴＡＴペプチドの第３ドメインを含む組換えペプチドコンジュゲート毒素融合体の概略図を示す。Ｉ：ＤＴＡの毒素ドメイン；ＩＩ：ＤＴＡの転位ドメイン；ＩＩＩ：第３ドメインとしてのＴＡＴペプチド。
【図１５】図１５は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が異なるＤＴＡ−ＴＡＴ（ＴＡＴペプチドと融合させたジフテリア毒素）及びＤＴＡ−野生型（ＤＴＡ−ｗｔ）の異なる毒性効果を示すグラフを示す。
【図１６】図１６は、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）の転位ドメイン及び毒素ドメインを含む組換えペプチドコンジュゲート毒素融合体の概略図を示し、結合ドメインはＡβ４０又はＡβ４２ペプチドである。Ｉ：ＤＴＡの毒素ドメイン；ＩＩ：ＤＴＡの転位ドメイン；ＩＩＩ：Ａβ４０又はＡβ４２ペプチドである結合ドメイン。
【図１７】図１７Ａ及びＢは、ＨｅＬａ及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するＤＴＡ−Ａβ４０（Ａ）、並びにＤＴＡ−Ａβ４２（Ｂ）の毒性効果を示す。ＤＴＡ−Ａβ４０：ジフテリア毒素（ＤＴＡ）の転位ドメイン及び毒素ドメイン並びにＡβ４０ペプチドの結合ドメインを含む組換え毒素融合体；ＤＴＡ−Ａβ４２：ジフテリア毒素（ＤＴＡ）の転位ドメイン及び毒素ドメイン、並びにＡβ４２ペプチドである結合ドメインを含む組換え毒素融合体。
【図１８】図１８は、リソソームタンパク質のマンノース−６−リン酸タグに結合する陽イオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＩＧＦ２Ｒ）の概略図を示す。
【図１９】図１９Ａは、サポリンと融合した線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を示す。図１９Ｂは、ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、又はＦＧＦＲ４）に結合するＦＧＦに関与するヘパリン硫酸塩の概略図を示す。
【図２０】図２０は、ＥＧＦ及びサブチラーゼ外毒素（ＳｕｂＡ）を含む組換え毒素融合体の概略図を示す。
【図２１】図２１は、リガンド−外毒素Ａの哺乳動物発現用の目的プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｃｃｄＢ−ＰＥ３８−６×Ｈｉｓの概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
詳細な説明
Ａ．定義
特に示さない限り、この節と他の節に記載される定義及び実施形態は、当業者に理解されるとおり、それらが適すると本明細書に記載される本開示の全ての実施形態及び態様に適用可能であることが意図される。
【００５２】
本開示で使用されるように、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その」は、その内容が特に明確に指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、「化合物」を含む実施形態が、ある種の態様を１種の化合物、又は２種以上のさらなる化合物を用いて提示されることを理解すべきである。
【００５３】
本開示の範囲を理解する際、本明細書で使用する用語「含む」及びその派生語は、記載される特徴、要素、構成要素、グループ、整数、及び／又は工程の存在を特定するオープンエンド用語であることが意図されるが、他の未記載の特徴、要素、構成要素、グループ、整数及び／又は工程の存在を除外するものではない。前述のものはまた、用語「含む」、「有する」及びそれらの派生語などの類似の意味を有する単語に適用される。本明細書で使用する用語「からなる」及びその派生語は、記載される特徴、要素、構成要素、グループ、整数、及び／又は工程の存在を特定するクローズド用語であることが意図されるが、他の未記載の特徴、要素、構成要素、グループ、整数及び／又は工程の存在を除外する。本明細書で使用する用語「から本質的になる」は、記載される特徴、要素、構成要素、グループ、整数、及び／又は工程の存在、並びに特徴、要素、構成要素、グループ、整数、及び／又は工程の基本的で、新規な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないものを特定することが意図される。
【００５４】
本明細書で使用する「実質的に」、「約」及び「およそ」などの程度の用語は、最終結果が著しく変更されないように、修飾される用語の妥当な量の偏差を意味する。この偏差が修飾する単語の意味を否定しない場合、これらの程度の用語は、修飾される用語の少なくとも±５％の偏差を含むものとして解釈されるべきである。
【００５５】
本明細書で使用する用語「核酸分子」又はその派生語は、修飾されていないＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は修飾されたＤＮＡ若しくはＲＮＡを含むことが意図され、かつｃＤＮＡを含む。例えば、核酸分子は、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖のＲＮＡ、並びに一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、より典型的には二本鎖、又は一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子で構成することができる。加えて、核酸分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域で構成することができる。核酸分子はまた、安定性のために、又は他の理由で修飾される１以上の修飾された塩基又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ骨格を含有してもよい。「修飾される」塩基には、例えば、トリチウム化塩基、及び天然に存在する塩基に結合するイノシンなどのまれな塩基が含まれる。ＤＮＡ及びＲＮＡに対して様々な修飾を行うことができる。そのため、「核酸分子」は、化学的、酵素的、又は代謝的に修飾された形態を包含する。用語「ポリヌクレオチド」は、対応する意味を有する。
【００５６】
核酸は、二本鎖又は一本鎖のいずれかであり得、センス鎖又はアンチセンス鎖を表す。用語「核酸」には、相補的な核酸配列及びコドン最適化されるか又は同義のコドン均等物が含まれる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、表現「複数の核酸分子」は、細胞集団に導入される標的化ライブラリーに含まれる核酸分子を指すために使用される。
【００５８】
細胞に言及する時の用語「操作された」は、非天然の核酸分子を含有するように細胞が処理されたことを意味する。非天然の核酸分子は、当業者に公知のいくつかの方法で、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクション、転位、及びエレクトロポレーションにより、細胞内に導入することができる。形質転換は、典型的には、当技術分野で公知の方法、例えば、細菌細胞に熱ショックを与えることによる細菌内への核酸分子の導入を指す。トランスフェクションは、核酸分子を真核細胞に導入する作業であり、例えば、脂質ベースの方法を含んでよい。転位は、トランスポゾン輸送機構によって使用される標的ＤＮＡ配列を含むトランスポゾンの機構を含んでよい。エレクトロポレーション技術は、細胞に電界を印加して、細胞膜の透過性を増加させ、これにより、核酸分子が細胞内に導入されることを可能にする。形質導入は、ウイルス又はウイルスベクターによって核酸分子が細胞に導入される作業である。したがって、細胞内に核酸分子を導入する様々な方法により、「操作された」細胞を誘導することができる。
【００５９】
表現「受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質」は、受容体などのタンパク質及びリガンド自体、並びに細胞表面受容体介在経路及び受容体成熟因子に関与するタンパク質を包含する。例えば、受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質は、受容体の新生、成熟、又は輸送に関与する遺伝子などの受容体の表面発現及び機能付与に必要な因子、並びにリガンド及び／又は受容体エンドサイトーシスに関与する因子を含む。受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質には、例えば、血漿膜、小胞体（ＥＲ）膜及び他の細胞内膜に局在化するタンパク質；エンドサイトーシス及び受容体成熟を調節する輸送因子；並びに細胞表面タンパク質又は任意のタンパク質の発現を調節する転写因子が含まれる。
【００６０】
用語「毒素」は、それらの起源及び生成方法を問わない、植物の、動物の、細菌、ウイルス、真菌、リケッチア若しくは原生動物を含むがこれらに限定されない微生物の、有毒な若しくは毒性の物質又は有毒な若しくは毒性の生成物、又は感染性物質、又は組換え分子若しくは合成分子を指し、バイオ技術の結果として操作され、生物によって生成される得る任意の有毒な物質若しくは生物学的生成物、又は任意の有毒な異性体若しくは生物学的生成物、そのような物質の相同体、若しくは誘導体を含む。毒素は、細胞に毒性を付与する毒素ドメインを有する。毒素は、以下に記載されるように、組換え毒素融合体を含む。本明細書で使用する毒素は、ピコモル効力で細胞を中毒にさせる。当業者なら、毒素が受容体媒介経路を介して成長阻害を引き起こし得る限り、本明細書に記載の受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法で使用できることを認識する。細胞が毒素と共に十分な時間インキュベートされたならば、２５％で、又は１０％ですら、成長阻害は十分であり得る。当業者は、インキュベーション時間と関連する毒性又はその逆を容易に調節することができる。また当業者なら、毒素と細胞をインキュベートするのに「十分な時間」、例えば、毒素とインキュベートされた非操作対照細胞が全て死滅し、ｇＲＮＡ処理細胞集団に生存者が存在する時を容易に認識することができる。
【００６１】
用語「組換え毒素融合体」は、結合ドメイン（例えば、リガンド）、毒素ドメイン、及び必要に応じて、標的結合及び細胞毒を可能にする任意の配向で融合された転位ドメインを有する融合分子を指す。本明細書に記載するように、毒素ドメインは、毒素の毒素ドメイン又はその毒性断片であり得る。本明細書で使用する組換え毒素融合体は、ピコモル効力で細胞を中毒にさせる。同様に、結合ドメインは、抗体、炭水化物、ペプチドなどの、本明細書に記載の特異性を有する細胞表面受容体などの細胞表面分子、又はそれらの結合断片に特異的に結合する分子であり得る。結合ドメインは、セクレトームのメンバー、例えば、受容体などの細胞表面実体に結合することができる分泌タンパク質又は分泌タンパク質の断片に由来し得る。結合ドメインはまた、細胞表面実体に結合することができる限り、膜タンパク質の切断産物又は細胞外ドメインに由来し得る。組換え毒素融合体は、融合体の多量体化を可能にする多量体ドメインをさらに含んでよい。
【００６２】
本明細書で使用する用語「受容体−リガンド相互作用」は、別の分子（例えば、「リガンド」）が特異的に結合することができる任意の細胞表面分子（例えば、「受容体」）を指す。例として、ＥＧＦＲ及びその同族リガンドＥＧＦなどの従来の細胞表面受容体、並びに細胞シグナル伝達に影響を与えるか、かつ／又は細胞に入るように別の分子リガンドによって使用される細胞の細胞表面を包埋するか、そこから延在するか、又は他の方法で細胞表面上に曝される他の部分が含まれる。
【００６３】
本明細書で使用する用語「結合ドメイン」は、宿主細胞表面分子と相互作用し、細胞へのその侵入及び融合された積荷（すなわち、組換え毒素）の侵入を容易にする部分を意味し、例えば、同族受容体に結合するリガンド若しくはその結合断片などの受容体結合分子；受容体又は正に荷電したリン脂質に結合するペプチド若しくはその結合断片；細胞表面タンパク質に結合する抗体若しくはその結合断片；例えば、レクチンに結合する炭水化物；例えば、細胞表面タンパク質と相互作用する小分子；又は細胞表面脂質結合タンパク質と相互作用する脂質であり得る。結合ドメインは、目的の受容体と結合する抗体若しくは結合断片、又は受容体結合分子（例えば、リガンド）であってその受容体が知られていない受容体結合分子（例えば、オーファンリガンド）などの分子であってよい。機能的結合ドメインである受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子又は脂質については、宿主細胞表面分子に結合し、少なくとも１つの細胞型に内部移行する必要がある。受容体結合分子は、成長因子、サイトカイン、又はリソソーム酵素であり得る。成長因子は、細胞成長、増殖、治癒、及び細胞分化を刺激することができる分子を指す。成長因子のいくつかの例には、表皮成長因子（ＥＧＦ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）が含まれる。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子を含む、細胞シグナル伝達において重要である小さなタンパク質、典型的には約５〜２０ｋＤａのタンパク質のカテゴリーを指す。サイトカインは、免疫調節剤としての自己分泌シグナル伝達、パラ分泌シグナル伝達及び内分泌シグナル伝達に関与する。サイトカインの例は、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）である。リソソーム酵素は、分泌、血漿膜修復、細胞シグナル伝達、及びエネルギー代謝を含む細胞プロセスに関与するリソソーム中に見出される酵素である。一実施形態では、受容体結合分子は成長因子であるか、又はそれを含む。例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（ＧＮＳ）又はＧＭ２ガングリオシド活性化因子（ＧＭ２Ａ）はリソソーム酵素である。一実施形態では、受容結合分子は、成長因子、サイトカイン、又はリソソーム酵素を含むか、又はそれらである。一実施形態では、成長因子は、ＥＧＦ、ＰＬＮ又はＦＧＦである。一実施形態では、受容体結合分子はサイトカインであるか、又はそれを含む。一実施形態では、サイトカインはＣＸＣＬ９である。一実施形態では、受容体結合分子は、リソソーム酵素であるか、又はそれを含む。一実施形態では、リソソーム酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（ＧＮＳ）又はＧＭ２ガングリオシド活性化因子（ＧＭ２Ａ）である。宿主細胞表面分子と、受容体結合分子、ペプチド、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子又は脂質を含む前記結合ドメインとの間の一価の解離定数で測定された親和性は、例えば、リガンド結合アッセイによって測定した場合に５０μＭ未満である。細胞に入ることができない受容体結合分子（例えば、リ���ンド）又はその結合断片、ペプチド、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子又は脂質は、結合ドメインとして排除される。本明細書で使用する「小分子」結合ドメインは、９００ダルトン未満、又は１，０００ダルトン未満の低分子量化合物を指す。
【００６４】
結合ドメインは、目的の細胞表面受容体又は未知の細胞表面受容体又は他の細胞表面分子に結合するリガンドなどの分子であり得る。結合ドメイン特異性は、結合ドメインと結合する受容体又はタンパク質のスクリーニングを可能にする。本開示は、膜タンパク質の切断産物又は細胞外ドメインを用いることもできるので、従来の分泌タンパク質に限定されない。
【００６５】
結合ドメインは、天然に存在する毒素の結合ドメイン又はその結合断片であり得る。例えば、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）については、結合ドメインは少なくとも１〜１９３残基（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ５ＰＹ５１＿ＣＯＲＤＰ）を含み、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）については、結合ドメインは少なくとも４０５〜６３８残基（ＴＯＸＡ＿ＰＳＥＡＥ）を含み、サポリンについては、結合ドメインは少なくとも２２〜２７７残基（ＲＩＰ６＿ＳＡＰＯＦ）を含み、ゲロニンについては、結合ドメインは少なくとも４７〜２９７残基（ＲＩＰＧ＿ＳＵＲＭＵ）を含み、パーフリンゴリジンについては、結合ドメインは少なくとも２９〜５００残基（ＴＡＣＹ＿ＣＬＯＰＥ）を含み、リステリオリシンについては、結合ドメインは少なくとも２６〜５２９残基（ＴＡＣＹ＿ＬＩＳＭＯ）を含み、α−ヘモリシンについては、結合ドメインは少なくとも２７〜３１９残基（ＨＬＡ＿ＳＴＡＡＵ）を含み、サブチラーゼ細胞毒については、結合ドメインは少なくとも２２〜３４７残基（ＳＵＢＡ＿ＥＣＯＬＸ）を含み、ボウガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）については、結合ドメインは少なくとも１〜３０５残基（Ｑ８Ｗ４Ｕ４＿９ＣＡＲＹ）を含み、リシンについては、結合ドメインは少なくとも３６〜３０２残基（ＲＩＣＩ＿ＲＩＣＣＯ）を含む。例えば、本明細書に開示される方法でこのような結合ドメインを使用して、特定の毒素ドメインに対する耐性を提供する「バックグラウンド」ヒットを同定することができる。
【００６６】
本明細書で使用する用語「毒素ドメイン」は、細胞に内部移行したときに、毒性を付与する毒素の最小ドメインを意味する。例えば、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）については、毒素ドメインは少なくとも１〜１９３残基（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ５ＰＹ５１＿ＣＯＲＤＰ）を含み、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）については、毒素ドメインは少なくとも４０５〜６３８残基（ＴＯＸＡ＿ＰＳＥＡＥ）を含み、サポリンについては、毒素ドメインは少なくとも２２〜２７７残基（ＲＩＰ６＿ＳＡＰＯＦ）を含み、ゲロニンについては、毒素ドメインは少なくとも４７〜２９７残基（ＲＩＰＧ＿ＳＵＲＭＵ）を含み、パーフリンゴリジンについては、毒素ドメインは少なくとも２９〜５００残基（ＴＡＣＹ＿ＣＬＯＰＥ）を含み、リステリオリシンについては、毒素ドメインは、少なくとも２６〜５２９残基（ＴＡＣＹ＿ＬＩＳＭＯ）を含み、α−ヘモリシンについては、毒素ドメインは少なくとも２７〜３１９残基（ＨＬＡ＿ＳＴＡＡＵ）を含み、サブチラーゼ細胞毒については、毒素ドメインは少なくとも２２〜３４７残基（ＳＵＢＡ＿ＥＣＯＬＸ）を含み、ボウガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）については、毒素ドメインは少なくとも１〜３０５残基（Ｑ８Ｗ４Ｕ４＿９ＣＡＲＹ）を含み、リシンについては、毒素ドメインは少なくとも３６〜３０２残基（ＲＩＣＩ＿ＲＩＣＣＯ）を含む。いくつかの毒素は、毒素ドメインのみを有し（例えば、サポリン）、他は毒素ドメインと結合ドメインを有する（例えば、α−ヘモリシン）。いくつかの他のものは、毒素ドメイン、結合ドメインと転位ドメインを有する（例えば、ジフテリア毒素）。
【００６７】
本明細書で使用する用語「転位ドメイン」は、エンドソームからサイトゾルへの毒素及び任意の融合された積荷の膜貫通経路を提供する毒素又は他の分子の最小ドメインを指す。転位ドメインは、毒素中に天然で存在するか、又は組換え毒素融合体中の別の毒素に由来するか、又はその膜貫通経路形成断片であり得る。ジフテリア毒素（ＤＴＡ）については、転位ドメインは少なくとも２０１〜３８０残基（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ５ＰＹ５１＿ＣＯＲＤＰ）を含み、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）については、転位ドメインは少なくとも２７８〜３８９残基（ＴＯＸＡ＿ＰＳＥＡＥ）を含む。組換え毒素融合体において、エンドソームから細胞質への組換え毒素融合体の転位は、転位ドメインによって促進することができる。一実施形態では、転位ドメインは、ＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。いくつかの毒素は、これらのドメインが単一のドメインに埋め込まれているので、別々の若しくは特異的な転位ドメイン又は受容体結合分子を含有しない。例えば、サポリンは、転移ドメインを有していないリボソーム不活性化毒素である。同様に、サブチラーゼ細胞毒（ＳｕｂＡΒ）は、その標的ＢｉＰシャペロンが小胞体に存在するので、細胞質に転移する必要はない。
【００６８】
本明細書で使用する用語「多量体化ドメイン」は、毒素又は分子の多量体化のための最小ドメインを指す。例えば、組換え毒素融合体の多量体化は、融合体の生物学的活性及び／又は結合活性を増強する。このドメインは、当業者によって容易に認識され、例えば、シンデカン４の細胞質ドメイン、又は例えば、ＧＣＮ４転写因子又は軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）由来のコイルドコイルドメインを含み、二量体、三量体（ｔｉｍｅｒ）、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、及び十量体などを形成してよい。例えば、多量体化は、例えば、細胞外スクリーニングで使用される五量体化ドメインを含む。五量体化ドメインは、複数の毒素融合体を結集させ、受容体に対する結合活性を増加させることができる。
【００６９】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、例えば、前記核酸分子が原核細胞及び／又は真核細胞に導入され、かつ／又はゲノムに組み込まれることを可能にする核酸分子のための任意の中間ビヒクルを含み、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ又はレトロウイルス系ベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを含む。本明細書で使用する用語「プラスミド」は、一般に、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる染色体外遺伝物質、通常は環状ＤＮＡ二重鎖の構築物を指す。
【００７０】
核酸分子又はその断片を用いて、遺伝子の発現を調節してよい。本開示の核酸分子を用いるサイレンシングは、当技術分野で一般的に知られているいくつかの方法で、例えば、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを用いるＲＮＡ干渉技術、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）技術、ｇＲＮＡを用いるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１システム及び標的化突然変異誘発技術を用いて達成してよい。
【００７１】
本明細書で使用する用語「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ」、「ＣＲＩＳＰＲシステム」、又は「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム」は、Ｃａｓ遺伝子をコードする核酸、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、活性部分のｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒの仲間の配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈で「直列反復配列」及びｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分的な直列反復配列を含む）、ガイド配列（ｇＲＮＡ、例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓを誘導するＲＮＡ；ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及びトランス活性化（トレーサー）ＲＮＡ又は単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）又は他の配列及びＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの転写物を含むＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現又は活性の指示に関与する転写物及び他の要素を総称して指す。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは、必要に応じて、クラスＩＩ単量体Ｃａｓタンパク質、例えば、ＩＩ型Ｃａｓ、又はＶ型Ｃａｓである。ＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、化膿性連鎖球菌、フランシセラ・ノビシダ、Ａ．ネスランディ、黄色ブドウ球菌又は髄膜炎菌由来のＣａｓ９などのＣａｓ９タンパク質であってよい。必要に応じて、Ｃａｓ９は、化膿性連鎖球菌由来である。Ｖ型Ｃａｓタンパク質はＲＮＡ処理活性を有してよい。Ｖ型Ｃａｓタンパク質は、ラクノスピラ属細菌（Ｌｂ−Ｃａｓ１２ａ）由来又はアシダミノコッカス種ＢＶ３Ｌ６（Ａｓ−Ｃａｓ１２ａ）由来のＣａｓ１２ａなどのＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られている）Ｃａｓタンパク質であってよい。用語「Ｃｐｆ１」及び「Ｃａｓ１２ａ」は、全体にわたって互換的に使用される。このように、ＣＲＩＳＰＲシステムはまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１システムであり得、このシステムでは、Ｃａｓ９などのＣａｓはＣｐｆ１に置換されている。ＣＲＩＳＰＲシステムは、典型的には、標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素によって特徴付けられる。
【００７２】
本明細書で使用する用語「ｇＲＮＡ」又は「ガイドＲＮＡ」は、特異的ＤＮＡ配列（例えば、ｃｒＲＮＡ）とハイブリダイズし、さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質に結合するタンパク質結合セグメントを含むＲＮＡ分子を指す。ｇＲＮＡは直列反復配列も含むことができる。特異的ＤＮＡ配列とハイブリダイズするガイドＲＮＡの一部を、本明細書では、核酸標的配列、又はｃｒＲＮＡ又はスペーサー配列と呼ぶ。ｇＲＮＡはまた、文脈から理解されるように、ｇＲＮＡをコードする対応するＤＮＡ配列を指すか、又はそれによって表すことができる。標的特異的部分又はｃｒＲＮＡは、異なるｔｒａｃｒＲＮＡと組み合わせることができるので、本明細書に提供されるガイド配列は、最小限ｃｒＲＮＡ配列を含む。
【００７３】
「スペーサー配列」とも呼ばれるか、又はスペーサー配列を含む、本明細書で使用する用語「ｃｒＲＮＡ」は、標的配列とのＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖を形成するか、又は形成することができるｇＲＮＡの部分を指す。該配列は、特異的ＣＲＩＳＰＲ標的配列に相補的であっても、又は対応していてもよい。ｃｒＲＮＡ／スペーサー配列のヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲ標的配列を決定し、所望のＣＲＩＳＰＲ標的部位を標的にするように設計されてよい。ｃｒＲＮＡはまた、文脈から理解されるように、ｃｒＲＮＡをコードする対応するＤＮＡ配列を指すか、又はそれによって表すことができる。
【００７４】
本明細書で使用する用語「ＣＲＩＳＰＲ標的部位」又は「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ標的部位」は、活性化されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質が適切な条件下で結合する核酸を意味する。ＣＲＩＳＰＲ標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）及びＣＲＩＳＰＲ標的配列（すなわち、活性化されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質が結合するｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ／スペーサー配列に対応する）を含む。ＰＡＭの配列及びＣＲＩＳＰＲ標的配列に対するＰＡＭの相対位置は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質の種類に依存する。例えば、Ｃａｓ９などのＩＩ型  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質のＣＲＩＳＰＲ標的部位は、５'から３'に向かって、２０個のヌクレオチドの標的配列、続いて、配列ＮＧＧ（配列番号６）を有する３個のヌクレオチドＰＡＭを含んでよい。したがって、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ標的部位は、配列５’−ｎ１−ｎ２−ｎ３−ｎ４−ｎ５−ｎ６−ｎ７−ｎ８−ｎ９−ｎ１０−ｎ１１−ｎ１２−ｎ１３−ｎ１４−ｎ１５−ｎ１６−ｎ１７−ｎ１８−ｎ１９−ｎ２０−ＮＧＧ−３'（配列番号７）を有してよい。別の例として、Ｃｐｆ１などのＶ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質のＣＲＩＳＰＲ標的部位は、５'から３'に向かって、配列ＴＴＴＶ（配列番号８；ＶはＡ、Ｃ、又はＧである）を有する４個のヌクレオチドＰＡＭ、続いて、２３個のヌクレオチド標的配列を含んでよい。したがって、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ標的部位は、配列５'−ＴＴＴＶ−ｎ１−ｎ２−ｎ３−ｎ４−ｎ５−ｎ６−ｎ７−ｎ８−ｎ９−ｎ１０−ｎ１１−ｎ１２−ｎ１３−ｎ１４−ｎ１５−ｎ１６−ｎ１７−ｎ１８−ｎ１９−ｎ２０−ｎ２１−ｎ２２−ｎ２３−３'（配列番号９）を有してよい。
【００７５】
ＣＲＩＳＰＲ標的部位を結合するために、ＣＲＩＳＰＲ標的部位を含有するＤＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質にアクセス可能であることを当業者なら理解するであろう。したがって、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、例えば、１以上の核局在化シグナル、必要に応じて、核プラスミン核局在化シグナルを含んでよい。
【００７６】
本明細書で使用する用語「ｔｒａｃｒＲＮＡ」、また「トランスにコードされたｃｒＲＮＡ」は、例えば、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡと結合するか、又はその一部を形成し得るＲＮＡである。ｔｒａｃｒＲＮＡは、例えば、化膿レンサ球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡであってよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、例えば、５'−ｇｔｔｔｃａｇａｇｃｔａｔｇｃｔｇｇａａａｃａｇｃａｔａｇｃａａｇｔｔｇａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃ−３'（配列番号１０）の配列を有してよい。他のｔｒａｃｒＲＮＡも使用してよい。ｔｒＲＮＡはまた、文脈から理解されるように、ｔｒＲＮＡをコードする対応するＤＮＡ配列を指すか、又はそれによって表すことができる。
【００７７】
本明細書で使用する用語「直列反復配列」は、ステムループを形成し、例えば、Ｃｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質と相互作用し、ガイドＲＮＡと結合するか、又はその一部を形成し得るＲＮＡを指す。直列反復配列は、例えば、ラクノスピラ属細菌又はアシダミノコッカス種ＢＶ３Ｌ６由来の直列反復配列であってよい。直列反復配列は、例えば、５'−ｔａａｔｔｔｃｔａｃｔｃｔｔｇｔａｇａｔ−３'（Ｌｂ−Ｃｐｆ１用）（配列番号１１）又は５'−ｔａａｔｔｔｃｔａｃｔａａｇｔｇｔａｇａｔ−３'（Ａｓ−Ｃｐｆ１用）（配列番号１２）の配列を有してよい。他の直列反復配列を使用してもよい。直列反復配列はまた、文脈から理解されるように、直列反復配列をコードする対応するＤＮＡ配列を指すか、又はそれによって表すことができる。
【００７８】
本明細書で使用する用語「標的化ライブラリー」は、例えば、目的の表現型に関連する遺伝子を同定（例えば、スクリーニング）するために使用することができる１組の遺伝子の発現を標的とし、下方制御する（例えば、抑制するか、阻害するか、又は低下させる）核酸分子のコレクション又は複数の核酸分子を指す。標的化ライブラリーは、広く基づくか、又はフォーカスすることができる（定義されたライブラリーとも呼ぶことができる）。全ゲノムライブラリーは、全て又はほとんど全ての遺伝子を、例えば、単一の生物のゲノムの少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％標的とする核酸分子を含有する広く基づく標的化ライブラリーである。フォーカスライブラリーは、目的のカテゴリー又は分野に関与する全て又はほぼ全ての経路に関連する複数の遺伝子を標的とする核酸を含むライブラリーであり得る。例えば、標的化ライブラリーは、細胞表面受容体遺伝子などの遺伝子のカテゴリーに関連する全て又はほぼ全ての経路に関連する核酸分子を含有することができ、結合する場合には、例えば、受容体の新生、成熟、又は輸送に関与する遺伝子などの受容体の表面発現及び機能付与に必要な因子、並びにリガンド及び／又は受容体エンドサイトーシスに関与する因子を意味する。フォーカスライブラリーは、例えば、血漿膜、ＥＲ膜及び他の細胞内膜に局在化するタンパク質をコードする標的化遺伝子；エンドサイトーシス及び受容体成熟を調節する輸送因子；細胞表面タンパク質の発現を調節する転写因子、又はそのための任意のタンパク質を含んでよい。
【００７９】
全ゲノムライブラリー中の核酸分子の各々は、生物の特異的遺伝子を標的とする。特異的遺伝子の標的化は、標的化遺伝子発現を指す。標的化がｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを使用する場合、核酸分子は、標的遺伝子の一部に相補的な部分を含む核酸配列を発現する。複数の核酸分子は、同じ遺伝子を標的化することができる。適切な標的化ライブラリーには、Ａｄｄｇｅｎｅ及びＴｏｒｏｎｔｏ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｌｉｂｒａｒｙ（ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ａｎｄ ｔｋｏ.ｃｃｂｒ.ｕｔｏｒｏｎｔｏ．ｃａ）から入手可能なｇＲＮＡ全ゲノムライブラリー及びフォーカスライブラリーが含まれる。実施例に示されるように、ＴＫＯＶ３ライブラリーなどの標的化ライブラリーを使用することができる。
【００８０】
本明細書で使用する語句「標的化ライブラリーを含む操作した細胞の集団」は、ライブラリーの異なる構成要素が集団の異なる細胞に含まれ、そこで発現するように形質導入、エレクトロポレーション、又は他の方法で処理された細胞の集団を意味する。
【００８１】
一実施形態では、標的化ライブラリーは全ゲノムライブラリーである。別の実施形態では、標的化ライブラリーは、細胞表面受容体遺伝子、好ましくは、ＧＰＣＲを標的とする核酸分子を含む。一実施形態では、標的化ライブラリーは、細胞表面受容体介在経路をコードする遺伝子を標的とする核酸分子を含む。一実施形態では、標的化ライブラリーは、エンドサイトーシス及び受容体成熟因子遺伝子を調節する輸送因子の少なくとも１つを標的とする核酸分子を含む。一実施形態では、標的化ライブラリーは、受容体成熟因子遺伝子を標的とする核酸分子を含む。一実施形態では、標的化ライブラリーは、血漿膜、ＥＲ膜及び他の細胞内膜に局在化するタンパク質を標的とする核酸分子を含む。一実施形態では、標的化ライブラリーは、タンパク質の転写因子調節発現、必要に応じて、細胞表面タンパク質の発現を標的とする核酸分子を含む。
【００８２】
Ｂ．方法
本明細書に記載されているように、本発明者らは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの陽性遺伝子スクリーニングなどのゲノムワイド遺伝子スクリーニングのための方法及び構成要素を決定した。本発明者らは、ゲノムワイドｇＲＮＡライブラリーを細胞に感染させ、続いて組換え毒素融合体処理を行うことにより、稀な耐性細胞の同定が可能になることを実証した。耐性細胞からのｇＲＮＡの配列決定は、同族受容体並びに受容体表面発現及び機能付与に必要な因子を同定することができる（図３）。
【００８３】
一態様では、本明細書に記載されるのは、スクリーニングにおける受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法である。
【００８４】
したがって、本開示の態様は、受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法であって、
（ａ）標的化ライブラリーを含む操作した細胞の集団であって、該集団の個々の操作した細胞が標的化ライブラリーの核酸分子を含有し、該核酸分子が標的遺伝子に相補的な核酸配列を含む、細胞の集団を提供する工程；
（ｂ）該細胞集団を、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む組換え毒素融合体と十分な時間接触させることにより、細胞の選択プールを生成する工程；並びに
（ｃ）細胞の選択プールに含まれる核酸分子の１以上の配列を決定することにより、標的遺伝子を同定する工程
を含む方法を提供する。
【００８５】
いくつかの実施形態は、十分な時間、細胞の集団を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも２日間、少なくとも０.１ｎＭの毒素と接触させる対照スクリーニングを含む。いくつかの実施形態は、結合ドメインが毒素ドメインに対応する結合ドメインである（例えば、毒素ドメインと結合ドメインの両方がＤＴ由来である）対照スクリーニングを実行することを含む。例えば、対照スクリーニングにおいて、上記（ｃ）で同定したいくつかの遺伝子は、毒素による中毒に必要な遺伝子であり、これらの遺伝子が結合ドメインの特異性とは無関係に中毒を調節するので（例えば、結合ドメインがオーファンリガンドなどの所望の標的のためのものである場合）、その後のスクリーニングで対照遺伝子として機能することができる。例えば、実施例１に示すように、ＦＵＲＩＮ、ＭＥＳＤＣ２、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、及びＤＮＡＪＣ２４は、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）介在毒性に必要な遺伝子として同定されており、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、及びＤＮＡＪＣ２４は、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）介在毒性に必要な遺伝子として同定されている。したがって、いくつかの実施形態では、毒素による中毒に必要であり、かつ／又は結合ドメインタンパク質が関与する経路に関連しない一般的な毒素耐性遺伝子であり、かつ対照として機能することができる遺伝子を同定するために、対照又はバックグラウンドのスクリーニングが行われる。目的の遺伝子のスクリーニングは、組換え毒素融合体の結合ドメインが目的の遺伝子を同定するための標的化部分に置換されている（例えば、その同族受容体を同定するリガンドに置換されている）という点で、対照スクリーニング中の結合ドメインとは異なる選択された結合ドメインを含む組換え毒素融合体を使用する。目的の遺伝子スクリーニングで同定された遺伝子は、対照遺伝子及び目的の遺伝子を含有してよい。目的の遺伝子を同定するために、対照遺伝子を同定し、目的の遺伝子スクリーニングで組換え毒素融合体によって同定した遺伝子から差し引くことにより比較を行う。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子を同定することは、対照スクリーニングで同定された対照遺伝子と、毒素及び目的の遺伝子スクリーニングで組換え毒素融合体によって同定された遺伝子とを比較することを含み、目的の遺伝子スクリーニングにおける組換え毒素融合体の結合ドメインの結合特異性は、対照スクリーニングにおける毒素の結合ドメインの結合特異性とは異なる。いくつかの実施形態では、対照スクリーニングにおける毒素は、目的の遺伝子スクリーニングにおける組換え毒素融合体とは異なり、対照スクリーニングにおける毒素の結合ドメインは、該組換え毒素融合体に含まれる異なる結合ドメインによって目的の遺伝子スクリーニングで置換される。
【００８６】
標的化ライブラリーは、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを含む核酸分子を有することができる。一実施形態では、特異的遺伝子発現を標的とする核酸分子は、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ、好ましくは、ｇＲＮＡを含む。別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはＣａｓ９を含む。
【００８７】
標的化ライブラリーは、哺乳動物の種における遺伝子のスクリーニングライブラリーである「哺乳動物ライブラリー」を含む目的の種の遺伝子を標的とすることができる。別の実施形態では、標的化ライブラリーは、哺乳動物ライブラリー、好ましくは、ヒト又はマウスのライブラリーである。「標的遺伝子」又はその派生語は、標的遺伝子の一部に相補的な核酸配列を有する核酸分子の細胞への導入により、本明細書に記載の機構により発現が下方制御されている遺伝子を指す。
【００８８】
標的化ライブラリーは、広く基づくか、又はフォーカスさせることができる。一実施形態では、標的化ライブラリーは、全ゲノムライブラリーである。別の実施形態では、標的化ライブラリーは、細胞表面受容体遺伝子、好ましくは、ＧＰＣＲ遺伝子を標的とする核酸分子を含む。一実施形態では、標的化ライブラリーは、細胞表面受容体介在経路のタンパク質をコードする遺伝子を標的とする核酸分子を含む。一実施形態では、標的化ライブラリーは、受容体成熟因子遺伝子を標的とする核酸分子を含む。
【００８９】
一実施形態では、細胞の集団は、哺乳動物細胞株、好ましくは、ヒト又はマウスの細胞株からの細胞を含む。別の実施形態では、哺乳動物細胞株は、Ａ４３１、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、Ｋ５６２、ＨｅＬａ、好ましくは、ＨｅＬａ−京都、又はＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔ、又は一倍体若しくはほぼ一倍体の細胞株、好ましくは、ＨＡＰ１である。当業者なら、受容体−リガンド相互作用関連タンパク質を同定するのに適する代替の細胞株を容易に認識することができる。
【００９０】
標的化ライブラリーは、いくつかの方法によって細胞株の細胞の集団に導入することができる。１つの方法は、レトロウイルス系ベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いた形質導入である。一実施形態では、標的化ライブラリーは、少なくとも１つのレトロウイルスベクター、好ましくは、少なくとも１つのレンチウイルスベクターで細胞に形質導入される。一実施形態では、形質導入細胞は、毒素で処理する前に、２〜１０日間、又は少なくとも２、３、４、５、６、７、若しくは８日間、又は最長で３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０日間維持される。一実施形態では、形質導入細胞を、１〜５日間、又は少なくとも１、２、３、若しくは４日、又は最長で２、３、４、若しくは５日間、毒素と接触させる。
【００９１】
本発明に記載の方法は、細胞のプール中の受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質をスクリーニングするための薬剤として組換え毒素融合体を使用する。組換え毒素融合体は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む。
【００９２】
ジフテリア毒素（ＤＴＡ）及びシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）は、細胞、特に哺乳動物細胞に対してピコモル効力で毒性である細菌外毒素である。これらの毒素の毒素ドメインは、タンパク質の合成を強力に阻害し、急速な細胞死をもたらす。ＤＴＡの場合、毒素ドメインは、Ｃドメインとして知られ、異常なベータ＋アルファ折り畳みを有する触媒ドメインである。Ｃドメインは、ＮＡＤから真核性伸長因子２（ｅＥＦ−２）のジフタミド残基へのＡＤＰリボースの転移によるタンパク質合成を阻止する。ＰＥによるタンパク質合成阻害は同様の機構に従う。一実施形態では、組換え毒素融合体は、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）又はシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）毒素ドメイン、又はその毒性断片を含む。別の実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある。組換え毒素融合体は、２つのａｔｔＲ部位間にクローニングされたリガンドをコードする核酸配列を有するｐｃＤＮＡ３．１−ＳＰ−ＤＴＡ−ＧＳ−ｃｃｄＢ（配列番号１）、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＨＴ−ＳＵＭＯ−ＤＴＡ−ｃｃｄＢ（配列番号２）、ｐｃＤＮＡ３．１−ＳＰ−ｃｏｄＢ−ＧＳリンカー−ＰＥ４０（配列番号３）、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＨＴ−ｃｃｄ−ＰＥ４０（配列番号４）、又はｐｃＤＮＡ３．１−ｃｃｄＢ−ＰＥ３８−６×Ｈｉｓ（配列番号５）から発現させることができる。
【００９３】
組換え毒素融合体では、結合ドメインは、リガンド−受容体相互作用に関連付けられる受容体又はタンパク質をスクリーニングするための「選択性」を提供する。結合ドメインは、リガンド−受容体相互作用に関連付けられる同族の受容体又はタンパク質が同定すべき任意の分子であるか、又はそれを含むことができる。該分子は、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であり得る。一実施形態では、結合ドメインは、所望の分子の受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメイン及び／又は転位ドメインに直接コンジュゲートされる。他の実施形態では、リンカーは、これらのコンジュゲーションのうちの１以上に使用される。任意のリンカーを使用することができる。例えば、グリシン−セリンリッチリンカーは、柔軟性を増大させる。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンリッチリンカーである。好適なリンカーの例は、実施例に提供される。
【００９５】
別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、ＥＧＦ（受託番号ＮＭ＿００１９６３）、ＰＴＮ（受託番号ＮＭ＿００２８２５）、ＣＸＣＬ９（受託番号ＮＭ＿００２４１６）、ＧＮＳ（受託番号Ｐ１５５８６）、ＧＭ２Ａ（受託番号Ｐ１７９００）、ＦＧＦ２（受託番号Ｐ０９０３８）、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。
【００９６】
結合ドメイン又はその結合断片は、受容体への結合に影響を及ぼすことができる翻訳後修飾を受けることができる。結合に影響を及ぼすことができる翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加を含む。リン酸化は、分子へのホスホリル基の結合を指す。分子がタンパク質である場合、リン酸化は、典型的にはセリン、トレオニン及びチロシンで起こる。アセチル化は、分子へのアセチル基の導入を指す。グリコシル化は、例えば、タンパク質又は脂質にグリカンを付着させる酵素的プロセスによって、炭水化物、例えば、グリコシル供与体を分子に付加することを指す。一般的なグリコシル化は、Ｎ結合グリコシル化及びＯ結合グリコシル化を含む。Ｎ結合グリコシル化は、典型的には、ドリコールリン酸を必要とし、アスパラギン又はアルギニンの側鎖の窒素に結合したＮ結合グリカンを含む。Ｏ結合グリコシル化では、グリカンは、セリン、トレオニン、チロシン、ヒドロキシリジン、又はヒドロキシプロリン側鎖のヒドロキシル酸素、又はセラミドなどの脂質上の酸素に結合している。アミド化は、例えば、ペプチドがＣ末端にアミド化を有する分子へのアミドの付加を指す。修飾されるアミノ酸は、典型的には、アミド基を提供するグリシンに続く。例えば、グリシンを酸化して、α−ヒドロキシグリシンを形成すると、酸化されたグリシンは、Ｃ末端アミド化ペプチドとＮ−グリオキシル化ペプチドに分解する。ヒドロキシル化は、分子へのヒドロキシル基の導入を指す酸化過程である。ヒドロキシラーゼは、ヒドロキシル化反応を触媒することができる酵素である。メチル化とは、分子へのメチル基の付加を指す。細胞内で、メチル化は、酵素によって達成され、メチル化の基質がタンパク質である場合、典型的には、タンパク質配列中のアルギニン又はリジンアミノ酸残基上で起こる。ユビキチン化は、分子へのユビキチンの付加である。分子がタンパク質である場合、ユビキチン化は、単一のユビキチンタンパク質（すなわち、モノユビキチン化）又はユビキチンの鎖（すなわち、ポリユビキチン化）であり得る。マンノース−６−リン酸は、リソソームへの輸送に向けられたタンパク質の標的化シグナルである。マンノース−６−リン酸のタンパク質への付加は、典型的には、シス−ゴルジ装置で起こり、通常、タグ付きと呼ばれ、すなわち、修飾タンパク質上のマンノース−６−リン酸は、マンノース−６−リン酸タグと呼ばれる。例えば、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）及びＮ−アセチルグルコサミンを含む反応において、酵素Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼは、マンノース−６−リン酸を用いたアスパラギン残基のＮ結合グリコシル化を触媒する。マンノース−６−リン酸タグ付きタンパク質はトランス−ゴルジに移動し、マンノース−６−リン酸タグは、マンノース−６−リン酸受容体（ＭＰＲ）タンパク質が認識し、結合することができる。一実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又は���れらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む。
【００９７】
別の実施形態では、細胞に投与された場合、組換え毒素融合体は、操作した細胞の少なくとも約９９％、９９.５％、９９.９％又は１００％を死滅させる。別の実施形態では、組換え毒素融合体は、細胞に投与された場合、細胞の成長を、操作した細胞の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.９％又は１００％阻害する。
【００９８】
本発明に記載の方法からの受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質の素性は、細胞の選択プールに含まれる特異的遺伝子発現を標的とする核酸分子のうちの１以上の配列を決定することによって決定される。一実施形態では、配列決定はハイスループット配列決定を含む。いくつかの遺伝子は、毒素の毒性効果を可能にするのに必須であるとして本開示により同定された。例えば、ＤＰＨ１（受託番号ＮＭ＿００１３８３）、ＤＰＨ２（受託番号ＮＭ＿００１３８４）、ＤＰＨ３（受託番号ＮＭ＿２０６８３１）、ＤＰＨ５（受託番号ＮＭ＿００１０７７３９４）、ＤＰＨ７（受託番号ＮＭ＿１３８７７８）、又はＤＮＡＪＣ２４（受託番号ＮＭ＿１８１７０６）の下方制御又は発現抑制は、ＤＴＡ又はＰＥに対してＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を耐性にさせる。
【００９９】
また具体的に提供されるのは、毒素耐性細胞株を生成する方法であって、
（ａ）Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程；かつ
（ｂ）毒素耐性細胞株を生成するのに十分な時間、該細胞を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも２日間、少なくとも０.１ｎＭの毒素と接触させる工程
を含む方法である。
【０１００】
一実施形態では、細胞を約０.１ｎＭ〜１００ｎＭの毒素と接触させた。一実施形態では、細胞を１〜４日間、又は２、３、若しくは４日間、毒素と接触させた。一実施形態では、細胞を少なくとも２、３、４、又は５日間、最長で６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日間、約０.１ｎＭ〜１００ｎＭの毒素と接触させた。
【０１０１】
一実施形態では、本方法は毒素ＤＴＡ又はＰＥを含む。別の実施形態では、本方法のＣａｓはＣａｓ９である。別の実施形態では、本方法の細胞株はＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである。
【０１０２】
ＤＴＡ耐性については、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４の下方制御又は発現抑制に加えて、ＨＢＥＧＦの下方制御又は発現抑制はまた、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をＤＴＡに対して耐性にさせる。
【０１０３】
したがって、また提供されるのは、具体的に、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）耐性細胞株を生成する方法であって、
（ａ）Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＨＢＥＧＦ、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程；かつ
（ｂ）ＤＴＡ耐性細胞株を生成するのに十分な時間、該細胞をＤＴＡと接触させ、必要に応じて、少なくとも２日間、少なくとも０.１ｎＭのＤＴＡと接触させる工程
を含む方法である。
【０１０４】
一実施形態では、ＤＴＡ耐性細胞株の生成方法におけるＣａｓはＣａｓ９である。別の実施形態では、ＤＴＡ耐性細胞株はＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである。一実施形態では、細胞を約０.１ｎＭ〜１００ｎＭのＤＴＡと接触させた。一実施形態では、細胞を１〜４日間、又は２、３、若しくは４日間、ＤＴＡと接触させた。一実施形態では、細胞を少なくとも２、３、４、又は５日間、最長で６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日間、約０.１ｎＭ〜１００ｎＭのＤＴＡと接触させた。
【０１０５】
ＰＥ耐性については、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４の下方制御又は発現抑制に加えて、ＦＵＲＩＮ（受託番号ＮＭ＿００２５６９）、ＭＥＳＤＣ２又はＬＲＰ１（受託番号ＮＭ＿００２３３２）の下方制御又は発現抑制も、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をＰＥに対して耐性にさせる。
【０１０６】
したがって、また提供されるのは、ＰＥ耐性細胞株を生成する方法であって、
（ａ）Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＦＵＲＩＮ、ＭＥＳＤＣ２、ＬＲＰ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程；かつ
（ｂ）ＰＥ耐性細胞株を生成するのに十分な時間、該細胞をＰＥと接触させ、必要に応じて、少なくとも２日間、少なくとも０.１ｎＭのＰＥと接触させる工程
を含む方法である。
【０１０７】
一実施形態では、細胞を約０.１ｎＭ〜１００ｎＭのＰＥと接触させた。一実施形態では、細胞を１２ｎＭのＰＥと接触させた。一実施形態では、細胞を１〜４日間、又は２、３、若しくは４日間、ＰＥと接触させた。一実施形態では、細胞を少なくとも２、３、４、又は５日間、最長で６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日間、約０.１ｎＭ〜１００ｎＭのＰＥと接触させた。一実施形態では、細胞を少なくとも２日間、０.１ｎＭのＰＥと接触させた。具体的な実施形態では、細胞を１２ｎＭのＰＥと２日間接触させた。
【０１０８】
一実施形態では、ＰＥ耐性細胞株の生成方法におけるＣａｓはＣａｓ９である。別の実施形態では、ＰＥ耐性細胞株はＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである。
【０１０９】
サブチラーゼ細胞毒耐性については、ＳＬＣ３５Ａ１（受託番号ＮＭ＿００１１６８３９８及びＮＭ＿００６４１６）、ＳＬＣ３５Ａ２（受託番号ＮＭ＿００１０３２２８９、ＮＭ＿００１０４２４９８、ＮＭ＿００１２８２６４７、ＮＭ＿００１２８２６４８、ＮＭ＿００１２８２６４９、ＮＭ＿００１２８２６５０、ＮＭ＿００１２８２６５１、及びＮＭ＿００５６６０）、ＣＭＡＳ（受託番号ＮＭ＿０１８６８６）、又はＣＯＧ１（受託番号ＮＭ＿０１８７１４）、ＣＯＧ２（受託番号ＮＭ＿００１１４５０３６及びＮＭ＿００７３５７）、ＣＯＧ３（受託番号ＮＭ＿０３１４３１）、ＣＯＧ４（受託番号ＮＭ＿００１１９５１３９、ＮＭ＿００１３６５４２６、及びＮＭ＿０１５３８６）、ＣＯＧ５（受託番号ＮＭ＿００１１６１５２０、ＮＭ＿００６３４８、及びＮＭ＿１８１７３３）、ＣＯＧ６（受託番号ＮＭ＿００１１４５０７９及びＮＭ＿０２０７５１）、ＣＯＧ７（受託番号ＮＭ＿１５３６０３）、ＣＯＧ８（受託番号ＮＭ＿０３２３８２）を含む保存されたオリゴマーゴルジ（ＣＯＧ）複合体の下方制御又は発現抑制により、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をサブチラーゼ細胞毒に耐性にさせる。
【０１１０】
したがって、また提供されるのは、サブチラーゼ細胞毒耐性細胞株を生成する方法であって、
（ａ）Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＳＬＣ３５Ａ１、ＳＬＣ３５Ａ２、ＣＭＡＳ、ＣＯＧ１、ＣＯＧ２、ＣＯＧ３、ＣＯＧ４、ＣＯＧ５、ＣＯＧ６、ＣＯＧ７又はＣＯＧ８１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程；かつ
（ｂ）サブチラーゼ細胞毒耐性細胞株を生成するのに十分な時間、該細胞をサブチラーゼ細胞毒と接触させ、必要に応じて、少なくとも２日間、少なくとも０.１ｎＭのサブチラーゼ細胞毒と接触させる工程
を含む方法である。
【０１１１】
一実施形態では、細胞を約０.１ｎＭ〜１００ｎＭのサブチラーゼ細胞毒と接触させた。一実施形態では、細胞を１〜４日間、又は２、３、若しくは４日間、サブチラーゼ細胞毒と接触させた。一実施形態では、細胞を少なくとも２、３、４、又は５日間、最長で６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日間、約０.１ｎＭ〜１００ｎＭのサブチラーゼ細胞毒と接触させた。
【０１１２】
毒素又は組換え毒素融合体を生成することができる細胞株については、細胞株は、毒素又は組換え毒素融合体に対して耐性であり、毒素又は組換え毒素融合体を生成するための遺伝物質を包含する必要がある。
【０１１３】
したがって、また提供されるのは、毒素生成細胞株を生成する方法であって、
（ａ）Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程；
（ｂ）十分な時間、該細胞を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも２日間、少なくとも０.１ｎＭの毒素と接触させる工程；かつ
（ｃ）毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を工程（ｂ）の細胞に導入し、発現させる工程
を含む方法である。
【０１１４】
一実施形態では、（ｂ）又は（ｃ）の毒素は、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）又はシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）である。別の実施形態では、（ｃ）の組換え毒素融合体は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む。別の実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、毒素ドメインは、ＤＴＡ若しくはＰＥ毒素ドメイン、又はその毒性断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、該ペプチドは、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインはＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ＣａｓはＣａｓ９である。別の実施形態では、細胞株はＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである。
【０１１５】
毒素生成細胞株は、毒素の生成を可能にする。また提供されるのは、毒素を生成する方法であって、
（ａ）Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程；
（ｂ）十分な時間、細胞を毒素と接触させる工程；
（ｃ）毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を工程（ｂ）の細胞に導入し、発現させる工程；
（ｄ）培地中で細胞を成長させる工程；かつ
（ｅ）毒素又は組換え毒素融合体を含有する培地を収集する工程
を含む方法である。
【０１１６】
一実施形態では、毒素を生成する方法は、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）又はシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）を生成する。別の実施形態では、本方法は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む組換え毒素融合体を生成する。別の実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、毒素又は毒素ドメインは、ＤＴＡ若しくはＰＥ毒素ドメイン、又はその毒性断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインはＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ＣａｓはＣａｓ９である。別の実施形態では、細胞株はＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである。
【０１１７】
毒素はまた、細菌、昆虫又は酵母細胞などの細胞によって生成することができる。また提供されるのは、細菌、昆虫又は酵母細胞などの細胞において毒素を生成する方法であって、
（ａ）毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を細胞に導入し、発現させる工程；
（ｂ）培地中で細胞を成長させる工程；かつ
（ｃ）毒素又は組換え毒素融合体を含有する培地を収集する工程
を含む方法である。
【０１１８】
一実施形態では、（ａ）の毒素は、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α−ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、又はリシンである。別の実施形態では、（ａ）の組換え毒素融合体は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む。別の実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、毒素ドメインは、ＤＴＡ、ＰＥ、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α−ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、又はリシンの毒素ドメイン、若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインはＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、細菌細胞は大腸菌である。別の実施形態では、酵母細胞は、出芽酵母又はＰ．パストリスである。
【０１１９】
Ｃ．細胞株及び毒素生成細胞
別の態様では、本開示は、毒素耐性細胞株、特に、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）耐性及びシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）耐性細胞株を提供する。
【０１２０】
したがって、また提供されるのは、少なくとも１つの核酸分子を含み、発現させる細胞集団を含む毒素耐性細胞株であって、該核酸分子が、Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む。一実施形態では、該細胞株は、毒素に対して耐性のある細胞の集団を含む。別の実施形態では、毒素は、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）又はシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）である。別の実施形態では、細胞の集団は、５０、１００、１５０又は２００μＭ、必要に応じて、１００μＭまでの毒素に対して耐性である。別の実施形態では、ＣａｓはＣａｓ９である。別の実施形態では、細胞株はＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである。
【０１２１】
また提供されるのは、具体的には、少なくとも１つの核酸分子を含み、発現させる細胞集団を含むジフテリア毒素（ＤＴＡ）耐性細胞株であって、該核酸分子が、Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＨＢＥＧＦ、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含むジフテリア毒素（ＤＴＡ）耐性細胞株である。一実施形態では、細胞の集団は、５０、１００、１５０又は２００μＭ、必要に応じて、１００μＭまでのＤＴＡに対して耐性である。別の実施形態では、ＣａｓはＣａｓ９である。別の実施形態では、ＤＴＡ耐性細胞株はＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである。
【０１２２】
また提供されるのは、具体的には、少なくとも１つの核酸分子を含み、発現させる細胞集団を含むシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）耐性細胞株であって、該核酸分子が、Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＦＵＲＩＮ、ＭＥＳＤＣ２、ＬＲＰ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含むシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）耐性細胞株である。一実施形態では、細胞の集団は、５０、１００、１５０又は２００μＭ、必要に応じて、１００μＭまでのＰＥに対して耐性である。別の実施形態では、ＣａｓはＣａｓ９である。別の実施形態では、ＰＥ耐性細胞株はＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである。
【０１２３】
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの核酸分子を含み、発現させる細胞集団を含む毒素生成細胞株を提供し、該核酸分子が、Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列と、毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列とを含む。一実施形態では、毒素は、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）又はシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）である。別の実施形態では、組換え毒素融合体は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む。別の実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、受容体結合分子、ペプチド、抗体、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、毒素又は毒素ドメインは、ＤＴＡ若しくはＰＥ毒素ドメイン、又はその毒性断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインはＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ＣａｓはＣａｓ９である。別の実施形態では、毒素生成細胞株はＨＥＫ−２９３、好ましくは、ＨＥＫ−２９３Ｔである。一実施形態では、該核酸分子は、配列番号１と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.１％、９９.２％、９９.３％、９９.４％、９９.５％、９９.６％、９９.７％、９９.８％、９９.９％、９９.９９％、又は９９.９９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一実施形態では、該核酸分子は、配列番号３と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.１％、９９.２％、９９.３％、９９.４％、９９.５％、９９.６％、９９.７％、９９.８％、９９.９％、９９.９９％、又は９９.９９９％の配列同一性を有する���酸配列を含む。一実施形態では、該核酸分子は、配列番号５と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.１％、９９.２％、９９.３％、９９.４％、９９.５％、９９.６％、９９.７％、９９.８％、９９.９％、９９.９９％、又は９９.９９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列を有するＤＰＨ１を標的とするｇＲＮＡは、配列番号１３、１４、１５及び１６のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するＤＰＨ２を標的とするｇＲＮＡは、配列番号１７、１８、１９及び２０のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するｇＲＮＡ標的ＤＰＨ３は、配列番号２１、２２、２３及び２４のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するｇＲＮＡ標的ＤＰＨ５は、配列番号２５、２６、２７、及び２８のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するｇＲＮＡ標的ＤＰＨ７は、配列番号２９、３０、３１、及び３２のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するＤＮＡＪＣ２４を標的とするｇＲＮＡは、配列番号３３、３４、３５、及び３６の少なくとも１つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するＨＢＥＧＦを標的とするｇＲＮＡは、配列番号３７、３８、３９、及び４０のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するＦＵＲＩＮを標的とするｇＲＮＡは、配列番号４１、４２、４３、及び４４のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するＭＥＳＤＣ２を標的とするｇＲＮＡは、配列番号４５、４６、４７、及び４８のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するＬＲＰ１を標的とするｇＲＮＡは、配列番号４９、５０、５１、及び５２のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するｇＲＮＡ標的ＬＲＰ１Ｂは、配列番号５３、５４、５５、及び５６のうちの少なくとも１つを含む。
【０１２４】
別の態様では、本開示は、核酸分子を含む、毒素生成細胞、必要に応じて、細菌、昆虫又は酵母細胞を提供し、該核酸分子は、毒素又は組換え毒素融合体を発現する核酸配列を含む。一実施形態では、毒素生成細胞株は細菌細胞である。一実施形態では、該核酸分子は、配列番号２と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.１％、９９.２％、９９.３％、９９.４％、９９.５％、９９.６％、９９.７％、９９.８％、９９.９％、９９.９９％、又は９９.９９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一実施形態では、該核酸分子は、配列番号４と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.１％、９９.２％、９９.３％、９９.４％、９９.５％、９９.６％、９９.７％、９９.８％、９９.９％、９９.９９％、又は９９.９９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１２５】
一実施形態では、毒素は、ＤＴＡ、ＰＥ、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α−ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、又はリシンである。別の実施形態では、組換え毒素融合体は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む。別の実施形態では、毒素ドメインはＤＴＡ、ＰＥ、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α−ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、又はリシン毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片である。別の実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、受容体結合分子、ペプチド、抗体、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインはＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、細菌細胞は大腸菌である。別の実施形態では、酵母細胞は、出芽酵母又はＰ．パストリスである。
【０１２６】
Ｄ．核酸分子及び組換え毒素融合体
本開示はまた、組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を提供し、該組換え毒素融合体は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含み、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にあり、結合ドメインは、受容体結合分子、ペプチド、抗体、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。一実施形態では、毒素ドメインは、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α−ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、若しくはリシンの毒素ドメイン又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインは、ＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。
【０１２７】
組換え毒素融合体をコードする核酸は、必要に応じて、実施例に記載されるように、プラスミドなどのベクターに含めることができる。プラスミドは、実施例に記載のプラスミドの１以上の配列部分又は構成要素を含んでよい。例えば、ベクターは、必要に応じて、ヒスチジンタグなどのタグを含むＰＥ融合ベクター、必要に応じて、実施例に記載のＰＥ融合ベクター又はそれらの構成要素を含むベクターであり得る。
【０１２８】
また本開示により提供されるのは、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む組換え毒素融合体であって、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にあり、結合ドメインは、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含む。一実施形態では、毒素ドメインは、ＤＴＡ、ＰＥ、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α−ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、若しくはリシンの毒素ドメイン又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインは、ＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。
【０１２９】
Ｅ．キット及びプローブ
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される方法を実行するためのキットを提供する。
【０１３０】
したがって、本開示は、受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するためのキットであって、
（ａ）第１の細胞株、
（ｂ）組換え毒素融合体をコードし、組換え毒素融合体を発現することができ、必要に応じて、ベクター中に含まれる核酸配列を含む少なくとも１つの核酸分子、かつ必要に応じて、
（ｃ）複数の核酸分子を含む標的化ライブラリーで、個々の核酸分子が特異的遺伝子の遺伝子発現を標的とする標的化ライブラリー
のうちの１以上を含み、
該第１の細胞株が該組換え毒素融合体に対して耐性であり、かつ
該組換え毒素融合体が、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む、キットを提供する。
【０１３１】
一実施形態では、第１の細胞株は、ＨＡＰ１、Ａ４３１、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、Ｋ５６２、ＨｅＬａ、好ましくは、ＨｅＬａ−京都、又はＨＥＫ−２９３である。該組換え毒素融合体は、組換え毒素融合体に対して耐性のある第１の細胞株から生成することができる。該組換え毒素融合体はまた、細菌細胞、昆虫細胞又は酵母細胞から生成することができる。一実施形態では、該キットはさらに、（ｄ）細菌細胞、必要に応じて、大腸菌、昆虫細胞、又は酵母細胞、必要に応じて、出芽酵母又はＰ．パストリスを含む。
【０１３２】
該キットはまた、特異的遺伝子の遺伝子発現を標的とする核酸分子を含有する標的化ライブラリーの標的細胞又はレシピエント細胞として使用することができる第２の細胞株を含有することができる。一実施形態では、該キットはさらに、（ｅ）第２の細胞株、必要に応じて、Ａ４３１、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、Ｋ５６２、ＨＡＰ１、ＨｅＬａ−京都又はＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を含む。
【０１３３】
別の実施形態では、毒素耐性細胞株は、Ｃａｓ又はＣｐｆ１をコードする核酸配列と、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、又はＤＮＡＪＣ２４、好ましくは、ＤＮＡＪＣ２４を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む少なくとも１つの核酸分子を有し、発現する細胞を含む。一実施形態では、毒素は、毒素ドメイン及び結合ドメインを含む組換え毒素融合体である。別の実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含む。一実施形態では、毒素ドメインは、ＤＴＡ、ＰＥ、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α−ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、若しくはリシンの毒素ドメイン、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、毒素ドメインは、ＤＴＡ若しくはＰＥ毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインはＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、該標的化ライブラリーは、少なくとも１つのレンチウイルスベクターに含まれる。別の実施形態では、該キットは、タンパク質を同定するための一組の説明書をさらに含む。別の実施形態では、該キットは、少なくとも１つの細胞株、核酸分子、標的化ライブラリー及び一組の説明書、必要に応じて、細菌細胞又は酵母細胞を包装するための容器をさらに含む。
【０１３４】
組換え毒素融合体をコードする核酸は、必要に応じて、実施例に記載されるように、プラスミドなどのベクターに含めることができる。
【０１３５】
また提供されるのは、受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するためのキットであって、
（ａ）第１の細胞株、
（ｂ）少なくとも１つの組換え毒素融合体であって、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む組換え毒素融合体、並びに
必要に応じて、複数の核酸分子を含む標的化ライブラリーであって、個々の核酸分子が特異的遺伝子の遺伝子発現を標的とする標的化ライブラリー
を含む、キットである。
【０１３６】
一実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含む。一実施形態では、毒素ドメインは、ＤＴＡ、ＰＥ、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α−ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、若しくはリシンの毒素ドメイン、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、毒素ドメインは、ＤＴＡ若しくはＰＥ毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。
【０１３７】
また提供されるのは、組換え毒素融合体をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するためのプローブであって、該組換え毒素融合体は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含み、該毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、該結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にあり、該結合ドメインは、受容体結合分子、ペプチド、抗体、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。一実施形態では、毒素ドメインは、ＤＴＡ、ＰＥ、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α−ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、若しくはリシンの毒素ドメイン、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＣＸＣＬ９、ＧＮＳ、ＧＭ２Ａ若しくはＦＧＦ、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、ＴＡＴペプチド、Ａβ４０若しくはＡβ４２、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース−６−リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインは、ＤＴＡ若しくはＰＥ転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。
【０１３８】
本明細書に記載の方法を使用して、細胞外タンパク質／タンパク質相互作用ネットワークのつながりを解読して、新規な薬物標的を同定することができる。再生医薬において、本方法は、例えば、操作し、移植した細胞への宿主組織の応答を調節する受容体及び経路を同定するために使用することができる。さらに、新規な細胞型特異的組換え毒素融合体の同定は、インビトロ分化中に望ましくない細胞型の選択的な減少を可能にする。これらの同定された毒素は、特異的細胞型を死滅させるための複数の細胞型の培養集団に適用することができる。癌治療、免疫学及び免疫腫瘍学において、本明細書に記載の方法は、抗体及び他の生物製剤の標的細胞への結合を調節する因子を同定することができる。例えば、毒素に対するコンジュゲートモノクローナル抗体／生物製剤を用いて、細胞への抗体又は毒素コンジュゲートの侵入を調節する因子をスクリーニングすることができる。当業者は、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）などの膜タンパク質を介して作用する小分子の細胞標的を同定するためのアッセイを容易に改変することができる。
【０１３９】
上記の開示は、本開示を概説する。以下の具体的な実施例を参照することにより、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は、単なる例示の目的で説明されており、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。状況が便宜を示唆又は与える可能性があるので、形態の変形及び均等物の置換は企図される。特定の用語が本明細書で用いられてきたが、そのような用語は、説明の意味で意図されており、限定のためのものではない。
【０１４０】
以下の非限定的な実施例は、本開示の例示である。
【０１４１】
実施例１
細胞外タンパク質の細胞表面受容体の発見方法
受容体−リガンド相互作用プラットフォーム
理論に拘束されるものではないが、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）及びシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）などの細菌外毒素は、三段階機構によってピコモル効力で細胞を中毒にさせる（図１）。第１に、毒素の受容体結合分子は、宿主細胞表面上の特異的受容体又は複数の受容体（例えば、ＤＴＡについてはＨＢＥＧＦ、ＰＥについてはＬＲＰ１及びＬＲＰ１Ｂ（受託番号ＮＭ＿０１８５５７））に結合し、続いてエンドサイトーシスが行われる。第２の工程において、毒素は、その転位ドメインを用いることによりエンドソームから細胞質へと移動する。第３に、毒素ドメインは、細胞死を引き起こすか、又は、例えば、タンパク質合成を強力に阻害することによって成長を阻害し、急速な細胞死をもたらす。異なる毒素は、成長を阻害するか、又は細胞死を引き起こす異なる機構を有する。例えば、ＳｕｂＡは、ＥＲ常駐シャペロンのＢｉＰを切断することにより過剰なＥＲストレスを引き起こし、他の毒素はＲａｓ経路構成要素などを阻害する。特に、毒素の受容結合分子が無関係の分泌タンパク質に置換されている場合、毒素はその効力を保持するが、新たな同族受容体を介して細胞に入る。ＤＴＡ−ＩＬ２融合デニロイキン・ディフティトックス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）（ＯＮＴＡＫ（登録商標））は、ＩＬ２受容体を発現する細胞を標的とするＦＤＡ認可薬物であり、そのような融合毒素の特異性及び効力を強調する。
【０１４２】
重要なことに、本明細書に示すように、中毒は受容体介在エンドサイトーシスを必要とするので、組換え融合体毒素に対する同族受容体を欠く細胞は、毒素に対して完全に耐性である（例えば、ジフテリア毒素Ａに特有の受容体であるＨＢ−ＥＧＦを欠く耐性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示す図２を参照されたい）。本明細書に記載するように、この根拠に基づいて、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベースの陽性遺伝子スクリーニングなどのゲノムワイド遺伝子スクリーニングのための方法及び構成要素が提供される。ゲノムワイドｇＲＮＡライブラリーを細胞に感染させ、続いて組換え毒素融合体処理を行うことにより、稀な耐性細胞の同定が可能になる。耐性細胞からのｇＲＮＡの配列決定により、受容体表面発現及び機能付与に必要な同族受容体並びに因子が同定される（図３）。
【０１４３】
実験の設定
プラスミド
本開示は、以下のプラスミドを提供する。
【０１４４】
プラスミド１：ジフテリア毒素−リガンドの哺乳動物発現用の目的プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＳＰ−ＤＴＡ−ＧＳ−ｃｃｄＢ（図４；配列番号１）。リガンドを、ゲートウェイＬＲクローニングを用いて２つのａｔｔＲ部位間にクローニングした。
【０１４５】
プラスミド２：ジフテリア毒素−リガンドの細菌発現用の目的プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＳＨＴ−ＳＵＭＯ−ＤＴＡ−ｃｃｄＢ（図５、配列番号２）。リガンドを、ゲートウェイＬＲクローニングを用いて２つのａｔｔＲ部位間にクローニングした。
【０１４６】
プラスミド３：リガンド−外来毒素Ａの哺乳動物発現用の目的プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＳＰ−ｃｃｄＢ−ＧＳリンカー−ＰＥ４０（図６；配列番号３）。リガンドを、ゲートウェイＬＲクローニングを用いて２つのａｔｔＲ部位間にクローニングした。
【０１４７】
プラスミド４．リガンド−外来毒素Ａの細菌発現用の目的プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＳＨＴ−ｃｃｄ−ＰＥ４０（図７；配列番号４）。リガンドを、ゲートウェイＬＲクローニングを用いて２つのａｔｔＲ部位間にクローニングした。
【０１４８】
プラスミド５．リガンド−外来毒素Ａの哺乳動物発現用の目的プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｃｃｄＢ−ＰＥ３８−６×Ｈｉｓ（図２１；配列番号５）。リガンドを、ゲートウェイＬＲクローニングを用いて２つのａｔｔＲ部位間にクローニングした。これは、Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを有するＰＥ融合ベクターを提供する。
【０１４９】
プラスミド３とプラスミド５の違いは、プラスミド５中のＰＥ３８が野生型外毒素Ａの１つのループを欠いていることである。
【０１５０】
本明細書に記載の核酸配列は、プラスミドの配列については表１Ａに、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ＰＡＭ配列、標的部位及びｇＲＮＡの配列については表１Ｂに記載されている。
【０１５１】
表１Ａ．プラスミドの配列
【表１】
2021525514.tif 000003
2021525514.tif 000004
2021525514.tif 000005
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2021525514.tif 000015
【０１５２】
表１Ｂ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ＰＡＭ、標的部位及びｇＲＮＡの配列
【表２】
2021525514.tif 000016
2021525514.tif 000017
2021525514.tif 000018
【０１５３】
毒素耐性細胞株の作製
野生型哺乳動物細胞内で毒素を生成することは、生成細胞自体に対して毒性であるので、本発明者らは、まず、ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）及びシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）に耐性のある細胞株を作製した。これを行うために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いて、これらの毒素による中毒に必要な遺伝子のＤＮＡＪＣ２４をノックアウトした。
【０１５４】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、ＤＮＡＪＣ２４を標的とするｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするＰＸ４５９プラスミドで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、ＰＥ（最終１２ｎＭ）で２日間処理した。生存細胞（ＤＮＡＪＣ２４  ＫＯ）をさらに２日間再増殖させ、その後の毒素生成に使用した。
【０１５５】
哺乳動物細胞及び細菌細胞における組換え毒素融合体の生成
ＤＮＡＪＣ２４  ＫＯ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を用いて、分泌される野生型又は組換え型の毒素融合体をコードするプラスミド（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１−ＳＰ−ＤＴＡ−ＧＳ−ｃｃｄＢ及びｐｃＤＮＡ３．１−ＳＰ−ｃｏｄＢ−ＧＳリンカー−ＰＥ４０（図４及び図６を参照されたい））でトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間の時点で、培地を補充し、細胞をさらに２日間培養した。トランスフェクション後７２時間の時点で、分泌毒素を含有する馴化培地を収集し、５分間、１，０００ｒｐｍで遠心分離し、標的細胞に適用した。組換え毒素融合体はまた、適切な宿主細菌細胞をプラスミド、例えば、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＨＴ−ＳＵＭＯ−ＤＴＡ−ｃｃｄＢ（図５）及びｐＥＴ１５ｂ−ＳＨＴ−ｃｃｄＢ−ＰＥ４０（図７）で形質転換することにより細菌内で生成することができる。簡単に説明すると、組換え毒素融合体を、ＢＬ２１（ｐＬｙｓＳ）細胞内で発現させ、１８℃で１６時間、０.５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。Ｎｉ−ＮＴＡビーズを用いて、毒素融合体タンパク質を細菌溶解物から精製し、２５０ｍＭのイミダゾールで溶出した。遠心カラムを用いてタンパク質を濃縮し、緩衝液を１×ＰＢＳに交換した。
【０１５６】
ゲノムワイドノックアウト細胞の作製
ＨＡＰ１、ＨｅＬａ−京都及びＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をそれぞれ、レンチウイルス形質導入のために播種した。ＴＫＯｖ３レンチウイルス（７０，０００ガイド）を０.３のＭＯＩで添加して、１細胞当たりの単一の感染を確実にした。当業者なら、より高いＭＯＩが依然として感染を提供し、感染させるべきより多くの初期細胞が存在する場合には、ＭＯＩを低下させることができることを認識する。形質導入細胞を、２日間、ピューロマイシン（最終１．５μｇ／ｍｌ）で選択した。形質導入細胞を、その後のスクリーニングのために継代するか、又は将来の使用のために凍結した。ＨＡＰ１細胞については、レトロウイルス又はトランスポゾンによる挿入変異誘発も有用である。例えば、ピギーバックシステムを使用するトランスポゾン挿入変異誘発。
【０１５７】
組換え毒素融合体を用いたＣＲＩＳＰＲスクリーニング
６００万個の形質導入細胞を、２枚の１０ｃｍプレートに播種した（Ｔ０でそれぞれ３００万個の細胞を、Ｔ５まですなわち形質導入の５日目まで維持した）。この細胞数は、ＴＫＯｖ３ライブラリーの８５倍のカバレッジを反映する。細胞を、Ｔ６で、０.９：２の比率で毒素を含有する馴化培地（すなわち、４.５ｍｌの馴化培地＋１０ｍｌの培地）で処理した。Ｔ８で、細胞を洗浄し、追加の毒素処理なしで、１００％集密度まで再増殖させた。
【０１５８】
あるいは、ＨＡＰ１及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞について、３４０万個の形質導入細胞を１０ｃｍプレート中に播種して、ＴＫＯｖ３ライブラリーの５０倍のカバレッジを提供することができる。
【０１５９】
次世代配列決定及び分析
毒素耐性細胞を、トリプシン処理及びゲノムＤＮＡ抽出のために遠心分離により収集した。製造業者のプロトコルを用いてＱＩＡａｍｐ  ｂｌｏｏｄ  ｍａｘｉキットを用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡをその後のＰＣＲの鋳型として用いて、ｇＲＮＡコード領域を増幅した。増幅したｇＲＮＡ領域を、次世代配列決定のための特有の配列でさらにバーコード化した。
【０１６０】
分析
次世代配列決定の結果を、Ｌｉら（２０１４）に記載のＭＡＧｅＣＫパッケージを用いて分析した。要約すると、各ｇＲＮＡについての読み取りカウントを取得し、それを毒素未処理対照集団と比較することによって正規化した。ＭＡＧｅＣＫを、まず、富化スコアに基づいて個々のｇＲＮＡを計算し、著しく富化された遺伝子をランク付けする。最も富化された遺伝子の中でスクリーニング特異的な血漿膜タンパク質を探すと、所与のリガンドの受容体が同定される。以下で報告するＱ値は、調整したｐ値とも呼ばれる。
【０１６１】
結果
本発明者らは、ゲノムワイドレンチウイルスｇＲＮＡライブラリーを使用して、ヒト一倍体ＨＡＰ１細胞における天然ＰＥ及びＤＴＡに対する耐性を付与する因子についてゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９スクリーニングを行った（図８）。これらのスクリーニングは、３種類のヒットを明らかにした。第１に、本発明者らは、スクリーニングにおけるトップヒットのうち、ＤＴＡ受容体のＨＢＥＧＦ及びＰＥ受容体のＬＲＰ１を同定し、本開示の手法の主要原理を確認した（図９；表２及び表３）。
【表３】
2021525514.tif 000019
表２．ＣＲＩＳＰＲスクリーニングからのジフテリア毒素に対する耐性を与える遺伝子のリスト。ＨＢＥＧＦはＤＴＡ受容体である。ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、及びＤＮＡＪＣ２４は、ジフタミド生合成に関与する。
【０１６２】
【表４】
2021525514.tif 000020
表３．ＣＲＩＳＰＲスクリーニングからのシュードモナス外毒素Ａに対する耐性を与える遺伝子のリスト。ＦＵＲＩＮは、外毒素Ａ切断に関与する。ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ５、ＤＰＨ６、ＤＰＨ７、及びＤＮＡＪＣ２４は、ジフタミド生合成に関与する。ＭＥＳＤＣ２は受容体シャペロンである。ＬＲＰ１は、シュードモナス外毒素の受容体である。ＧＩ１００は、細胞成長の完全な阻害である。
【０１６３】
第２に、ＰＥスクリーニングはまた、血漿膜へのＬＲＰファミリー受容体の輸送に特異的に必要なＥＲシャペロンＭＥＳＤＣ２を同定した（表３）。これは、本開示の方法が、受容体シグナル伝達経路の重要な構成要素を同定することを実証する。最後に、本発明者らは、ＰＥ及びＤＴＡ中毒に必要な一般的な因子を同定した。これらのヒットは、図１０に示すＤＴＡによる中毒に必要な遺伝子と共に、標的化部分とは独立して中毒を調節するので、全てのスクリーニングにおいて陽性対照として機能する。
【０１６４】
本開示の方法が、受容体結合分子、例えば、外毒素に融合された分泌タンパク質などのリガンドを含む組換え毒素融合体のための受容体を同定することができることを実証するために、ＥＧＦ−ＰＥ（ＰＥ転位ドメイン及び毒素ドメインに融合したリガンド表皮成長因子（ＥＧＦ）；図１１）を有するＨｅＬａ細胞において、ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングを行った。スクリーニングにおける第２の最高ヒットは、ＥＧＦの既知の同族受容体であるＥＧＦＲであり、本開示のプラットフォームを確証した（表４）。
【０１６５】
【表５】
2021525514.tif 000021
表４．ＨｅＬａ細胞におけるＣＲＩＳＰＲスクリーニングからのＥＧＦ−ＰＥ３８に対する耐性を与える遺伝子のリスト。ＥＧＦＲはＥＧＦ受容体である。ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ５、及びＤＮＡＪＣ２４は、ジフタミド生合成に関与する。
【０１６６】
さらに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＣＸＣＬ９−ＰＥ（外毒素Ａの転位ドメインと毒素ドメイン、及び受容体結合分子ＣＸＣＬ９を含む組換えリガンドコンジュゲート毒素融合体）並びにＰＴＮ−ＰＥ（外毒素Ａの転位ドメインと毒素ドメイン、及び受容体結合分子ＰＴＮを含む組換えリガンドコンジュゲート毒素融合体）を用いると、異なる毒性効果が示される（図１３）。加えて、ジフテリア毒素の転位ドメインと毒素ドメイン及びＴＡＴペプチドの結合ドメインを含む組換え毒素融合体（図１４）は、野生型ジフテリア毒素よりもＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して異なる毒性効果を有することが示される（図１５）。さらに、ジフテリア毒素の転位ドメインと毒素ドメイン、及びＡβ４０又はＡβ４２ペプチドである結合ドメインを含む組換え毒素融合体（図１６）は、ＨｅＬａ及びＨＥＫ２９３Ｔに対して異なる毒性効果を有することが示される（図１７）。理論に拘束されるものではないが、これらの結果は、毒素が受容体介在エンドサイトーシスを介して細胞に入ることを示唆する。これらの結果は、組換え外毒素を、代替の受容体又は機構を介して（例えば、ＴＡＴの場合には適応翻訳を介して）細胞に入るように操作することができることを示す。
【０１６７】
考察
これらのデータから、本開示の手法が分泌タンパク質などのリガンドの細胞表面受容体（及びそれらの品質管理因子）の発見のための強力なプラットフォームであることが実証される。例えば、本方法は、基本研究において、細胞外タンパク質／タンパク質相互作用ネットワークのつながりを解読するために使用することができ、新規な生物学的洞察及び薬物標的をもたらす。再生医療において、本方法は、例えば、操作され、移植された細胞に対する宿主組織の応答を調節する受容体及び経路を同定するために使用することができる。さらに、新規な細胞型特異的組換え毒素融合体の同定は、インビトロ分化中に望ましくない細胞型の選択的な減少を可能にする。癌治療、免疫学及び免疫腫瘍学において、それは、抗体及び他の生物製剤の標的細胞への結合を調節する因子を同定することができる。最後に、当業者なら、ＧＰＣＲなどの膜タンパク質を介して作用する小分子の細胞標的を同定するためのアッセイを容易に改変することができる。
【０１６８】
実施例２
マンノース−６−リン酸修飾に依存する細胞外相互作用の同定
本実施例では、マンノース−６−リン酸修飾に依存する細胞外相互作用を同定した。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（ＧＮＳ）及びガングリオシドＧＭ２活性化因子（ＧＭ２Ａ）などのリソソームタンパク質のリソソームへの輸送は、翻訳後のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）修飾によって調節される。陽イオンに依存しないマンノース−６−リン酸受容体（ＩＧＦ２Ｒ、ＣＩ−ＭＰＲとしても知られている）は、細胞表面又はリソソーム表面上に局在化し、Ｍ６Ｐタグに結合する（図１８）。実施例１の工程に続いて、ＧＮＳ−ＰＥ３８（外毒素Ａ（ＰＥ３８）のＣ末端断片に融合したＧＮＳ）と、ＧＭ２Ａ−ＰＥ３８（ＰＥ３８に融合したＧＭ２Ａ）を用いて、ＨＡＰ１細胞においてゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングを行った。両方の場合において、ＩＧＦ２Ｒが、それぞれのスクリーニングで最も富化された第２の遺伝子であり、スクリーニングプラットフォームが分泌タンパク質に関する翻訳後修飾に依存する相互作用を同定できることを実証した（表５及び表６）。ＧＮＳ−ＰＥ３８の場合に、スクリーニングは、タンパク質輸送に関与するＶＰＳ３７Ａ、ＰＴＰＮ２３、ＨＧＳ及びＵＢＡＰ１と、ジフタミド生合成に関与するＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７及びＤＮＡＪＣ２４も同定した（表５Ａ及びＢ）。ＧＭ２Ａ−ＰＥ３８の場合に、スクリーニングは、タンパク質輸送に関与するＫＤＥＬＲ１、ＫＤＥＬＲ２、ＤＮＡＪＣ１３、ＡＲＬ５Ｂ、及びＡＲＦＲＰ１と、ジフタミド生合成に関与するＤＰＨ２及びＤＰＨ７も同定した（表６Ａ及びＢ）。
【０１６９】
【表６】
2021525514.tif 000022
表５Ａ．ＨＡＰ１細胞におけるＣＲＩＳＰＲスクリーニングからのＧＮＳ−ＰＥ３８に対する耐性を与え、ｐ値によってランク付けした遺伝子のリスト。ＶＰＳ３７Ａ、ＰＴＰＮ２３、ＨＧＳ及びＵＢＡＰ１は、輸送に関与する。ＩＧＦ２Ｒはマンノース−６−リン酸の受容体である。ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７、及びＤＮＡＪＣ２４はジフタミド生合成に関与する。
【０１７０】
【表７】
2021525514.tif 000023
表５Ｂ．ＨＡＰ１細胞におけるＣＲＩＳＰＲスクリーニングからのＧＮＳ−ＰＥ３８に対する耐性を与え、ｑ値によってランク付けした遺伝子のリスト。ＶＰＳ３７Ａ、ＰＴＰＮ２３、ＨＧＳ及びＵＢＡＰ１は、タンパク質輸送に関与する。ＩＧＦ２Ｒはマンノース−６−リン酸の受容体である。ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ５、ＤＰＨ７及びＤＮＡＪＣ２４は、ジフタミド生合成に関与する。
【０１７１】
【表８】
2021525514.tif 000024
表６Ａ．ＨＡＰ１細胞におけるＣＲＩＳＰＲスクリーニングからのＧＭ２Ａ−ＰＥ３８に対する耐性を与え、ｐ値によってランク付けした遺伝子のリスト。ＫＤＥＬＲ１、ＫＤＥＬＲ２、ＤＮＡＪＣ１３、ＡＲＬ５Ｂ、及びＡＲＦＲＰ１は、タンパク質の輸送に関与する。ＩＧＦ２Ｒはマンノース−６−リン酸の受容体である。ＤＰＨ２及びＤＰＨ７はジフタミド生合成に関与する。
【０１７２】
【表９】
2021525514.tif 000025
表６Ｂ．ＨＡＰ１細胞におけるＣＲＩＳＰＲスクリーニングからのＧＭ２Ａ−ＰＥ３８に対する耐性を与え、ｑ値によってランク付けした遺伝子のリスト。ＫＤＥＬＲ１、ＫＤＥＬＲ２、ＤＮＡＪＣ１３、ＡＲＬ５Ｂ、及びＡＲＦＲＰ１は、タンパク質輸送に関与する。ＩＧＦ２Ｒはマンノース−６−リン酸の受容体である。ＤＰＨ２及びＤＰＨ７はジフタミド生合成に関与する。
【０１７３】
実施例３
グリコサミノグリカンに依存する細胞外相互作用の同定
グリコサミノグリカンに依存する細胞外相互作用をこの実施例で同定した。ＦＧＦ２などの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、決定的なヘパリン硫酸への結合特性を有する細胞シグナルタンパク質であり、可変的に硫酸化した反復二糖単位からなる炭水化物のグリコサミノグリカンファミリーのメンバーである。実施例１の工程に続いて、６．５ｎＭのＦＧＦ２−サポリン（ＦＧＦ２−サポリンをＡｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した、製品番号ＩＴ−３８；サポリンに融合したＦＧＦ２（図１９Ａ））を用いて、ＨｅＬａ細胞においてゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングを行った。表７に示すように、耐性を付与する最も富化された遺伝子は、グリコサミノグリカン生合成経路に関与し、ＦＧＦ／ＦＧＦＲ相互作用におけるヘパラン硫酸の確立された役割と一致し（図１９Ｂ）、これにより、ヘパリン硫酸が、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３又はＦＧＦＲ４とのＦＧＦ相互作用に必要である。また、結果から、一般的なサボンソウ（ｓｏａｐｗｏｒｔ）由来の植物毒素であるサポリンが、スクリーニングプラットフォームにおいて中毒因子として使用できることが示される。
【０１７４】
【表１０】
2021525514.tif 000026
表７．ＨｅＬａ細胞におけるＣＲＩＳＰＲスクリーニングからのＦＧＦ２−サポリンに対する耐性を与える遺伝子のリスト。ＥＸＴ２、ＥＸＴ１、ＴＭＥＭ１６５、ＧＵＳＢ、ＳＬＣ３５Ｂ２、Ｂ３ＧＡＴ３、及びＥＸＴＬ３は、グリコサミノグリカン新生に関与する。
【０１７５】
実施例４
サブチラーゼ外毒素を利用するスクリーニングプラットフォーム
本開示は、異なる毒素に適合するスクリーニングプラットフォームを提供する。スクリーニング用プローブの一部としてのサブチラーゼ外毒素の使用をこの実施例に示した。実施例１の工程の後に、ＳｉｂＴｅｃｈ社（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、ＵＳＡ；カタログ番号ＳＢＴ０７７−０１２）（図２０）から得た２０ｎＭのＥＧＦ−ＳｕｂＡを用いて、ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングをＡ５４９細胞において行った。ＳｕｂＡは、サブチラーゼ外毒素の毒素ドメインである。表８に示すように、生存細胞集団中の最も富化された遺伝子は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）であった。これらの結果から、上記の実施例１に示した結果を考慮して、本明細書に開示したスクリーニングプラットフォームは、同じリガンド（例えば、ＥＧＦ）に融合した異なる毒素（例えば、ＳｕｂＡ及びＰＥ）と適合性があることが実証された。
【０１７６】
【表１１】
2021525514.tif 000027
表８は、Ａ５４９細胞におけるＣＲＩＳＰＲスクリーニングからのＥＧＦ−サブチラーゼ細胞毒（ＳｕｂＡ）に対する耐性を与える遺伝子のリスト。ＫＤＥＬＲ１、ＫＤＥＬＲ２、及びＴＡＰＴ１は、タンパク質の輸送に関与する。ＥＧＦＲはＥＧＦの受容体である。
【０１７７】
本開示を、現在好ましい実施例であると考えられるものを参照して説明してきたが、本開示は開示した実施例に限定されないことが理解されるべきである。逆に、本開示は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれる様々な変更並びに等価な構成を網羅することが意図される。
【０１７８】
全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許又は特許出願が、その全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示される場合と同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。具体的には、例えば、表又は他の場所に提供される受託番号及び／又はバイオマーカー配列（例えば、タンパク質及び／又は核酸）を含む本明細書に提供される各受託番号に関連付けられる配列は、その全体が参照により組み込まれる。
【０１７９】
特許請求の範囲は、好ましい実施形態及び実施例によって限定されるべきではないが、全体としての説明と一致する最も広い解釈が与えられるべきである。
【０１８０】
参考文献
REFERENCES
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WO2011006145A2
【図１】
2021525514.tif 000028
【図２】
2021525514.tif 000029
【図３】
2021525514.tif 000030
【図４】
2021525514.tif 000031
【図５】
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【図６】
2021525514.tif 000033
【図７】
2021525514.tif 000034
【図８】
2021525514.tif 000035
【図９】
2021525514.tif 000036
【図１０】
2021525514.tif 000037
【図１１】
2021525514.tif 000038
【図１２】
2021525514.tif 000039
【図１３】
2021525514.tif 000040
【図１４】
2021525514.tif 000041
【図１５】
2021525514.tif 000042
【図１６】
2021525514.tif 000043
【図１７】
2021525514.tif 000044
【図１８】
2021525514.tif 000045
【図１９】
2021525514.tif 000046
【図２０】
2021525514.tif 000047
【図２１】
2021525514.tif 000048
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月15日(2021.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021525514000001.app
【国際調査報告】
2021525514.tif 000049
2021525514.tif 000050
2021525514.tif 000051
2021525514.tif 000052
2021525514.tif 000053