(57)【要約】  本発明は、PSMA抗原に特異的に結合する抗原結合断片を含む新規キメラ抗原受容体(CAR)、ならびにそれを用いたT細胞の形質転換および/または形質導入により高品質CART細胞生成物を製造する方法であって、そのような化学療法、抗体のような医薬医薬、またはタンパク質キナーゼ阻害剤のような小分子薬物との組み合わせで、ウイルスの腫瘍を根絶することを可能にする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
PSMA抗原に特異的に結合する抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体であって、PSMAに対する抗原受容体が単鎖可変断片D7、膜貫通ドメイン、特にCD3ζ細胞質ドメインおよび細胞内シグナルドメイン、特にCD28および/または4-1BB細胞質ドメインから誘導される、キメラ抗原受容体。
【請求項２】
配列番号２、配列番号４および配列番号７から選択される少なくとも3つのCDRs、または
配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号７から選択される少なくとも4つのCDRs、または
配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７から選択される少なくとも5つのCDRs、または
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群から選択される少なくとも6つのCDRs
を含むことを特徴とする請求項1に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３】
前記抗原結合断片がヒト化されていることを特徴とする、請求項1に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４】
単鎖可変断片D7から誘導されることを特徴とする、請求項3に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項５】
アミノ酸配列：を含むことを特徴とする、請求項3または4に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
アミノ酸配列：を含むことを特徴とする、請求項3または4に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項７】
請求項1乃至6のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項1乃至6のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
【請求項８】
請求項1乃至6のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項1乃至6のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体をコードするベクター。
【請求項９】
配列番号10または配列番号11またはそれらと少なくとも95%の程度の同一配列を含むことを特徴とする、請求項8に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項1乃至6のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体を含む、免疫細胞、特に、T細胞を提供するインビトロ方法であって、
免疫細胞を単離すること、特に、白血球アフェレーシスによってドナーからのT細胞を単離する工程； 
キメラ抗原受容体をコードする請求項8に記載のベクターを有する免疫細胞、特にT細胞をトランスフェクション/形質導入する工程； 
トランスフェクトされた/形質導入されたT細胞を単離および増幅する工程を含む、インビトロ方法。
【請求項１１】
請求項1乃至7のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体をコードする遺伝子情報を含むことを特徴とする、免疫細胞、特にT細胞。
【請求項１２】
前立腺癌および/または前立腺由来腫瘍の治療に使用するための請求項1乃至6のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体、または請求項7に記載の核酸あるいは請求項8または9に記載のベクター。
【請求項１３】
抗腫瘍活性を有する薬剤が固体腫瘍に導入される、PSMAを発現する固形腫瘍の治療に使用するための請求項1乃至6のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体、および/または請求項7に記載の核酸および/または請求項8または9に記載のベクター。
【請求項１４】
タキソール誘導体、5-フルオロウラシル、シクロホスファミド、マイタゾロン、ドセタキセルおよび/またはカバジタキセルを含む細胞毒性物質から選択される化学療法剤の投与と併用されることを特徴とする、請求項12乃至13のいずれか1項に記載の使用のためのキメラ抗原受容体。
【請求項１５】
タンパク質、抗体、ワクチン、血液、血液成分、アレルゲン免疫療法薬、組換え治療性タンパク質、遺伝子治療約、体細胞、組織、および細胞治療剤、特にプロテインキナーゼ阻害剤、酵素阻害剤、抗ゲノム治療剤を含む、生物医薬の投与と併用されることを特徴とする、請求項12乃至14のいずれか１項に記載の使用のためのキメラ抗原受容体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体に関し、該抗原は前立腺特異的膜抗原(PSMA)である。キメラ抗原受容体(以下CARという）)は、免疫細胞、特にT細胞、NK細胞、INKTＩ細胞およびCIK細胞に導入され、PSMAを発現する腫瘍細胞と特異的に反応し、腫瘍細胞の除去につながる。本発明の構築物は、2つの主要な部分、即ち、前立腺特異的膜抗原(PSMA)に特異的に結合する抗原結合領域、および他方および免疫細胞のシグナル伝達および活性化に関与する免疫細胞の受容体由来の共刺激ドメインを含む。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、毎年推定された1千100万個の新しい症例を有する男性の中で最も頻繁に診断された第2の癌ある。さらに、307000人の死亡が推定推定され、癌死亡の第5の原因となる。一次腫瘍を良好に治療することができるが、進行ステージのための治療方法はない。したがって、新たな治療オプションが緊急に必要とされる。
【０００３】
前立腺特異的膜抗原(PSMA)は、抗体ベースの診断および治療的介入のための前立腺癌における最良の特徴づけられた抗原である。このタンパク質は、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼII(EC 3.4.17.21)、N-アセチル結合酸性ジペプチダーゼI(NAALADase)、または葉酸加水分解酵素としても知られている。PSMAは、19aaの小さな細胞内ドメイン、24aaの膜貫通ドメイン、および707aaの大きな細胞外ドメインを有する750個のアミノ酸(aa)からなるタイプII膜糖タンパク質である。細胞外ドメインは、3つの別個のドメイン、すなわち、プロテアーゼドメイン(aa 57-116および352-590)、先端ドメイン(aa 117-351)、およびＣ-末端ドメイン(aa 591-750)に折り畳まれる。ヒトトランスフェリン受容体1との高い構造的類似性および同一性を示す。PSMAは、前立腺癌細胞の表面に高度に制限され、全ての腫瘍段階中に癌細胞上に存在し、アンドロゲン非依存性および転移性疾患における増強された発現を示す。PSMAは細胞外空間に分泌されず、PSMA特異的抗体の結合によって増強される構成的なインターナリゼーションを受ける。これらの特性は、進行前立腺癌の標的化された治療のための理想的な候補となる。さらに、PSMAは、正常な血管内皮で発現することなく、実質的にすべての固体腫瘍型の新血管内皮で発現されることも判明した。したがって、それは、独特な抗血管新生ターゲットであると考えられる。
【０００４】
モノクローナル抗体(mAbs)は、細胞標的化のための高度に特異的で汎用的なツールである。この数十年では、それらは医療研究において関心が高まっており、癌を含む様々なヒト疾患を治療するための医薬品の最も急速に拡張しているクラスになってきた。抗体7E11は、最初に公表されたPSMA特異的mAbであり、PSMAの細胞内ドメインのN末端(MWNLLH)に結合することが判明した。7E11のラベル付きフォーム (ProstaScint、Cytogen、Philadelphia、PA)は、軟組織における転移性前立腺癌の検出および画像化について、米国食品医薬品局(FDA)から承認を受けた。しかし、この抗体は細胞内エピトープに結合するので、7E11は生存細胞に結合することができない。ProstaScintを用いたインビボ撮像における正のシグナルは、腫瘍塊内の死んだ細胞または死滅細胞の検出に戻って追跡されなければならない。したがって、生存細胞によって発現されるPSMAの細胞外エピトープに特異的に結合する、新規なクラスの抗PSMA mAbが創出された。
【０００５】
EP1 883 698は、前立腺癌細胞および前立腺組織試料の表面上のPSMAの細胞外部分への強力で特異的な結合を示す、3種の異なるmAbs、3/A12、3/E7、3/F11を開示している。mAb J591(ラジオ免疫療法用の臨床的に有効な抗体(PMID：18552139；PMID：24135437；PMID：25771365；PMID：26175541)との直接的な比較において、mAb3/F11は、C4-2前立腺癌標的細胞を発現するPSMAに対するより高い結合を示した(平均半値飽和濃度(Kd)として、3/F11のKd=9nM;J591のKd=
16nM)。さらに、競合的結合研究は、mAb 3/F11がJ591(PMID：19938014)よりも異なる細胞外PSMAエピトープに結合することを実証した。ヒト正常組織のパネルに対する免疫組織学的研究において、PSMA-陰性組織(副腎、骨髄、小脳、大脳、下垂体、結腸、食道、心臓、腎臓、肝臓、肺、心膜、神経、卵巣、膵臓、骨格筋、皮膚、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃腺、および子宮)への3/F11  mAbの結合が検出されなかった。PSMA(PMID：19938014)を発現することが知られている、唾液腺および十二指腸ブラシ境界細胞への分泌細胞への結合のみが観察された。mAb 3/F11は、全ての試験された正常な前立腺組織の腺房分泌上皮細胞に対して中程度の免疫反応性を示した。腺癌のほとんどすべての上皮細胞およびリンパ節転移において、より強力で広範囲な染色が認められた。乳房試料の凍結切片上での免疫組織学的染色は検出されなかった。これに対して、他の公開されたデータによれば、乳房乳管上皮の染色はmAb J591で検出された。乳房組織におけるPSMA発現はPCRによっても検出されず、またウェスタンブロッティングによっても検出されなかったので、mAb J591は他の抗原と交差反応する可能性が高い。
【０００６】
単鎖可変断片(scFv)D7（EP 1 883 698 B1に公開されている)は、mAb 3/F11からのファージディスプレイ技術によって生成された。抗PSMA scFvの特異性の最も重要な断片は、VLおよびVH部分であり、これは好ましくはポリグリシンリンカーで連結される。D7は、約18nMのKdでPSMA発現C4-2細胞に結合し、親mAb 3/F11とのプレインキュベーションは、結合活性を完全に阻害した。これは、scFv D7が、3/F11と同じPSMAエピトープに結合することを証明した。scFv D7およびそのヒト化バージョンは、PSMA発現前立腺癌細胞に対して高いおよび特異的な細胞毒性を示し、前立腺腫瘍を有するマウスにおけるインビボ抗腫瘍活性を示した、シュードモナス外毒素A(PE)ベースのイムノトキシンの構築に成功裡に使用された。
【０００７】
本発明によれば、D7 scFvは、PSMAを発現する癌細胞を標的化するための免疫細胞での使用のための構築物を提供するためにキメラ抗原受容体(CAR)の構築に使用された。
【０００８】
Maら[The Prostate(2014)(74)、pp286-296]は、CD28共刺激ドメインおよび抗原結合CD3ζシグナルドメイン並びにNorthwest Biophareutics,Inc.から市販されているマウス抗ヒトPSMAモノクローナル抗体3D8からの抗原結合部分を含むPSMAに対する第2世代CARを開示している。
【０００９】
Santoroら[Cancer Immunol.Res(2015),pp68-84]は、PSMA結合部分が抗体J591から誘導される、前立腺特異的膜抗原に対するキメラ抗原受容体を有するT細胞を記載している。
【００１０】
Zhongら[Molecular Therapy(2010),pp413-420]は、PSMA結合断片が抗体J591からも誘導されるキメラ抗原受容体も開示する。J591の配列は当該技術分野で周知である。WO2009/017823は、そのVHドメインおよびVLドメインを開示している。
【００１１】
前記構築物(配列番号9)をコードする相補鎖を含む、抗原結合断片D7(図10；配列番号1)のアミノ酸配列および核酸配列(配列番号8)が提供されている。さらに、抗原結合断片の非常に重要な部分、すなわちCDRｓ：(CDR-H1(配列番号2)、CDR-H2(配列番号3)、CDR-H3(配列番号4)、CDR-L1(配列番号5)、CDR-L2(配列番号6)およびCDR-L3(配列番号7))が、灰色の矢印によって示され、強調されている。
【００１２】
マウス抗体のヒト化は、免疫原性を低下させるために、1つの抗体から別の抗体への有益な特性(例えば、抗原特異的結合、他の抗原との非交差反応性の回避)の転写を含む。ヒト化は、通常、患者が、典型的には、治療の無効、最悪の場合のシナリオでは、生命を脅かす状況をもたらし得る非ヒト抗体に対する免疫反応に応答するので、ヒトの使用に必要である。ヒト化構築物は、図10に示す抗原結合断片の配列から誘導することができる。CDR領域は、パラトープ、すなわち抗原結合断片の抗原との接触部位を構造的に規定する。フレームワーク領域のための配列コードの残りは、パラトープの足場を形成する。ヒト化プロセス(例えば、インシリコモデリングによる)では、フレームワーク配列は、ヒト由来の他の抗原結合配列と最初に比較される。通常、図10に示されたフレームワーク配列と最高の類似性を有するヒト配列(受容体フレームワーク)が選択される。CDR領域は、ヒト受容体フレームワークにグラフトされて、望ましくないヒト抗マウス抗体(HAMA)免疫反応を引き起こす可能性のあるアミノ酸配列を除去する。潜在的に重要な位置(例えば、パラトープまたはVH-VL界面の折り畳みに関与するアミノ酸)の置換は、将来の後方変異について分析される。CDR配列においても、アミノ酸の例外的な修飾が免疫原性を避けるためになされ得、パラトープの正しい折り畳みを確実にし、抗原特異的結合を維持することができる。
【００１３】
抗体のヒト化の過程において、好ましくは、対応するマウス配列と最高の相同性を有するヒト免疫配列の中から、配列が選択される。次いで、CDRの位置が決定される。CDRの決定は当該技術分野で周知であり、決定のための異なる方法が知られており、CDRの位置がある程度異なることが可能であることに留意すべきである。本発明の過程において、KabatによるCDRの決定が用いられ、またIMGT(International Immunogene Ticks)による決定も用いられた。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態では、ヒト化は、いわゆる"CDRグラフト"(CDR-grafting）に従って行われた。機能性CDRは、好ましくはIMGT法に従って決定され、これらのCDRは、最初マウス抗体に対して最も高い配列相同性を有するヒトフレームワーク領域において転写される。次いで、ヒト化抗体およびマウス抗体のフレームワーク領域における単一のアミノ酸に関する相違を、サイズ、極性または電荷のような生化学的特性に関して決定した。第1段階では、類似のアミノ酸が適合され、そして連続的に異なるアミノ酸が、完全なヒトフレームワークで終わるように変更された。
【００１５】
本明細書に開示されたヒト化バージョンは、CDRを完全にまたは非常に大量に維持しているので、ヒト化変異体は、マウス抗体と同じ機能を有するが、親和性は互いに多少異なっていてもよい。
【００１６】
ヒト化実験の結果は、図11に示されている。CDR-H1、CDR-H3およびCDR-L3は、いかなる修正もなく維持されるべきであることが判明した。CDR-L2において、X9として示される1つのアミノ酸は、置換され得る。X9は、脂肪族、非荷電アミノ酸の意味を有することができ、該アミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、リジン、イソリシンおよび/またはプロリンであることができる。
【００１７】
CDR-L1では、2つのアミノ酸を置換することができ、これらをx7およびx(8)と命名することができる。これらのアミノ酸は、親水性であってもよく、セリン、トレオニン、アスパラギンおよび/またはグルタミンのような非荷電アミノ酸であってもよい。
【００１８】
最高の柔軟性は、6個までのアミノ酸が置換され得るCDR-H2を有するように思われる。これらのアミノ酸は、X1、X2、X3、X4、X5およびX6と命名される。ヒト化抗体または抗原結合フラグメントにおける置換に使用されるアミノ酸は、以下の意味を有する。
【００１９】
X1、X4、X6：親水性、非荷電アミノ酸[セリン(S)、トレオニン(T)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)] 
X2、X3：脂肪族、非荷電アミノ酸[グリシン(G)、アラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、プロリン(P) 
X5：塩基性アミノ酸[ヒスチジン(H)、リジン(K)、アルギニン(R)] 
【００２０】
近年、免疫系をリダイレクトして腫瘍細胞を除去することにより、異なる癌を治療するための新規概念として養子免疫細胞治療が導入されている。最も成功した概念の一つは、ヒト白血球抗原(HLA)非依存的に腫瘍抗原または腫瘍関連抗原を結合するキメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞の遺伝子工学に基づくものである。CD19標的化CART細胞は、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)を処置するために成功に使用されており、いくつかの臨床試験において、90%以上の患者が完全寛解になる。この成功に基づいて、多くの臨床試験が、ほとんどの血液学的悪性腫瘍を治療するために開始されてきた。しかしながら、固形腫瘍については、CAR T細胞療法の効力は、むしろ低いと思われる。この障害の主な理由は、腫瘍が存在する細胞環境である腫瘍微小環境(TME)であると思われる。それは、種々の種類の免疫細胞、線維芽細胞、細胞外マトリックス(ECM)ならびに周囲の血管を含む。TMEにおける細胞傷害性T細胞活性の制限を記載する多くのメカニズムが記載されており、これは、PD-1のT細胞免疫チェックポイント阻害の活性化を含む。T細胞チェックポイントアンタゴニストと組み合わせにより、これらの制限を克服することは、TMEにおける抗腫瘍活性を改善するのに役立つであろう。
【００２１】
本発明で使用される腫瘍の根絶は、腫瘍抗原特異的免疫細胞、好ましくはT細胞の適切な生存および腫瘍内活性化を必要とする。これらの要件を満たすために、T細胞は、抗原プライミングおよび刺激の際に適切な活性化シグナルを与えられなければならない。したがって、本発明のキメラ抗原受容体は、T細胞上の受容体の一部として抗原結合フラグメントを結合する。抗原結合フラグメントは、T細胞が結合すべき特異的抗原(ここではPSMA)に結合する。さらに、受容体は、共刺激シグナルドメインとして、それぞれCD28および4-1BBからの配列を含む。CD28配列または他の共刺激シグナルドメインのCD3ζ鎖ベース受容体への付加は、インターロイキン-2の抗原誘導分泌およびインビトロT細胞増幅を増加させることが示されている。本発明の場合、シグナルドメインは、CD3ζドメインと、細胞内CD28または4-1BBドメインのいずれかとからなる。
【００２２】
一般に、CARの設計は変化することができ、また、いくつかの世代のCARが知られている。CARシステムの主要な成分は、T細胞受容体(TCR)複合体、膜貫通ドメイン、ヒンジ領域、および抗原結合部分である。CARの設計において、抗原結合ドメインは、スペーサー領域とも呼ばれるヒンジ領域、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインに連結される。これらの部分は、抗原結合部分の位置、T細胞膜における結合、および細胞内シグナル伝達に関与する。CARデザインにおけるこの構造規則の他に、それらの長さおよび配列などのヒンジ領域の形態学的特徴は、効率的な標的化にとって重要である。細胞内ドメインはシグナル変換器として作用する。CD3ζの細胞質セグメントは、活性化されたT細胞および休止中の細胞における異なる機能のために主要な法則を果たす。しかしながら、この細胞質部分は、休止T細胞のみを活性化することができない。したがって、T細胞の完全な活性化のための少なくとも二次シグナルの必要性がある。本発明では、好ましくは4-1BBまたはCD28共刺激ドメインを使用した。CD27、ICOSおよび0X40から誘導される共刺激ドメインのような他の共刺激ドメインを代替的に使用することができる。
【００２３】
好ましい態様では、突然変異はヒトIgG1 Fcヒンジ領域に導入され、それによってLcK活性化の防止のような副作用または先天性免疫応答の意図しない開始が回避される。これらの突然変異の一つは、LcK結合を回避し、別の突然変異は、構築物へのTreg細胞の結合を阻害し得る。このような突然変異は、構築物の生物学的活性を改善し得る。
【００２４】
ヒト患者の治療のために、T細胞は、個々の患者の末梢血(自己設定)から濃縮されなければならず、またはドナー(同種異系設定)によって提供されなければならない。これは、例えば、白血球アフェレーシスによって行うことができる。次いで、濃縮されたT細胞を、CARの遺伝子情報を含む適切なベクターでex  vivoでトランスフェクトまたは形質導入する。
【００２５】
CARをコードする遺伝子情報は、適切なベクターに挿入される。このようなベクターは、好ましくはレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターである。初代T細胞の形質導入のための金標準は、現在、より単純なレトロウイルスベクターの有効な代替物であると思われるレンチウイルスベクターと考えられている。レンチウイルスベクターのさらなる代替として、情報は、トランスポゾンまたはプラスミドの助けを借りてT細胞に導入することができる。ウイルス性および非ウイルス性の両方の送達の代替物は、CRISPR/Casまたは転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALENs)または亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFNs)などのような他の設計者ヌクレアーゼとして指定された、最近記載された遺伝子編集ツールである。この技術プラットフォームは、標的化された方法で実質的に任意のゲノム部位を標的化する可能性を提供する。CRISPR/Casの場合、編集複合体は、Casヌクレアーゼおよび通常、CRISPR RNA(crRNA)とトランス作用crRNAとからなるガイドRNAを含む。標的配列へのガイドRNAのハイブリダイゼーションの際に、Cas9(または、例えばCpf1/Cas 12aのような他のCasヌクレアーゼ)は、非相同末端結合(NHEJ)によって修復され得る二本鎖破断を生成し、これはゲノム遺伝子座の機能の喪失をもたらす可能性がある事象である。適切なドナーDNAの存在下で、相同性特異的修復(HDR)のメカニズムにより、外因性配列(CAR配列)を標的遺伝子座に導入することができる。これを利用して、内因性遺伝子機能を妨げない所望のゲノム遺伝子座においてCAR発現カセットを送達することができ、したがって、ウイルスベクターを統合することにより経験される遺伝子毒性効果を最小化することができる。さらなる好ましい実施形態では、ゲノム編集は、内在性プロモーターの制御下でCARをコードする配列を配置するために使用される。TRAC遺伝子座のプロモーターのような内在性プロモーターからの発現は、CAR構築物の最適な発現レベルを確実にしてその機能を達成することができる。本発明のCARをコードする核酸配列は、ヒトコドン使用のために最適化されることが好ましい。特に好ましい態様は、CAR28構築物をコードする配列番号10、およびCAR41構築物をコードする配列番号11である。
【００２６】
本発明の別の好ましい実施形態では、CAR構築物をコードするRNAは、T細胞のような標的細胞に導入される。CAR構築物をコードする核酸は、エレクトロポレーションなどの物理的手順によって、または適切な小胞との細胞の膜の融合によって、標的細胞に導入され得る。この態様において、CAR構築物は、T細胞において一過性に発現されることが好ましい。この利点は、一時的な時間だけ治療された患者に存在する形質導入されたT細胞の集団が存在することである。
【００２７】
他の好ましい態様において、CAR構築物は、ナチュラルキラー細胞(NK)、不変のナチュラルキラーt細胞(iNKT)、多様なナチュラルキラー細胞(dNKT)、サイトカイン誘導キラー細胞(CIK)またはγ-δT細胞に導入される。さらに、適切な同種異型細胞を使用してもよい。
【００２８】
さらなる好ましい実施形態では、本明細書に記載のCAR構築物に加えて、免疫系を調節する別の導入遺伝子、例えばサイトカイン、ケモカイン受容体および/またはチェックポイント阻害剤をコードする遺伝子、を免疫細胞に導入することができる。さらなる好ましい実施形態において、ゲノム編集は、サイトカイン、ケモカイン受容体および/またはチェックポイント阻害剤をコードする遺伝子などの免疫系を調節する遺伝子の発現を破壊するために使用される。
【００２９】
別の実施形態では、本発明による構築物およびそのような構築物を含有する免疫細胞は、標的化された腫瘍注入によるフォーカルセラピー（focal  therapy）に使用することができる。本実施形態では、患者の体内の特定の、局所的な腫瘍領域が存在する場所にCAR T細胞を適用する自動化された装置によって、行われることが好ましい。次いで、生検針を用いて、試料を引き抜くことにより、小さな空洞が形成される。この空洞において、形質導入またはトランスフェクトされたT細胞が導入され、次いで、針が引き抜かれる。本実施形態は、通常の方法で処理することが極めて困難である固体腫瘍が存在する場合に特に有利である。
【００３０】
本明細書に開示されるキメラ抗原受容体は、PSMAの発現に関連する疾患の治療に使用することができる。PSMAは、前立腺癌由来の腫瘍細胞において発現される。前立腺癌のいくつかの段階が知られているが、PSMAは前立腺癌の治療に最も適しているマーカーの一つであると思われる。"前立腺癌"という用語は、原発腫瘍または転移腫瘍または循環腫瘍細胞から誘導されたいずれかの形態の前立腺癌細胞を含む。特に好ましい実施形態では、本発明のキメラ抗原受容体で操作された免疫細胞は、PSMAを発現する固形腫瘍の血管新生に対して使用される。
【００３１】
本発明のさらなる実施形態において、本明細書に開示されるキメラ抗原受容体で操作された免疫細胞は、治療薬、特に細胞毒性剤と組み合わせて使用される。前立腺癌の治療に使用される細胞毒性剤が知られている。好ましくは、タキソール誘導体、5-フルオロウラシル、シクロホスファミド、ミトキサントロン、ドセタキセル、カザール及びエトポシドのような物質を含む。以下の薬物は、前立腺癌に対して承認され、好ましくは、アビラテロンアセテート、アパルタミド、ビカルタミド、カバジタキセル、カソデックス（ビカルタミド）、デガレリックス、ドセタキセル、エリガード（ロイプロリドアセテート）、エンザルタミド、エルレアダ（アパルタミド）、フィルマゴン（デガレリックス）、フルタミド、ゴセレリンアセテート、ジェバタナ デポ（酢酸ロイプロリド）、塩酸ミトキサントロン、ニランドロン（ニルタミド）、ニルタミド、プロベンジ（シプルセル-T）、ジ塩化ラジウム223、シプルセル-T、タキソテール（ドセタキセル）、ゾフィゴ（ジ塩化ラジウム223）、キサンジ（エンザルタミド）、ゾラデックス（ゴセレリン酢酸塩）、ザイティガ（アビラテロンアセタート）が用いられる。本発明のキメラ抗原受容体はまた、例えばロイプロリド酢酸塩のような、前立腺癌のホルモン感受性形態を治療するために使用される医薬と組み合わせて使用され得ることが理解される。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態は、図面および本出願の実施例にさらに記載および図示されている。図面又は実施例に開示された全ての態様は、明示的に除外されない限り、本発明に関する。実験部に開示された本発明の単一の特徴は、そのような組合せに対して言及する技術的な理由がない限り、組み合わせることができる。特に、図は、以下のような実験の結果を示す。
【００３３】
図面および実験では、以下の略語を使用した。
2021530974.tif 000002
2021530974.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】CART細胞を標的とするPSMAの生成および品質評価 （A）第二世代抗PSMA CARsを発現する自己不活性化γ-レトロウイルスベクターの略図。  CAR発現はEFSプロモーターによって駆動される。CARは、単鎖可変断片D7(PSMAに対する3F/11マウスモノクローナル抗体から誘導される)、ヒンジ領域(図示せず)、膜貫通ドメイン、4-1BB(CAR41)またはCD28(CAR28)由来の共刺激ドメイン、およびCD3ζ鎖由来の細胞内シグナルドメインからなる。両方のCARに含まれるヒンジ領域は、ヒトIgG由来であり、D7-scFvと膜貫通ドメインとの間に、最適な標的認識のための物理的スペーサーを提供する。(B)CAR発現  レトロウイルス形質導入前に抗CD2/3/28抗体で2-3日間、T細胞を活性化した。ウイルス形質導入後、T細胞を8-9日間増殖させ、細胞を採取し、抗ヒトIgG抗体(CAR)およびCD3で染色し、形質導入効率を評価した。(C)フローサイトメトリー分析による定性的CART細胞表現型特徴付け  T細胞サブセットは、形質導入されていないT細胞(UT)(図示せず)またはCAR+CD3+の両方のタイプのCART細胞(図示せず)について、CAR-CD3+上でプレゲートされたCD62LおよびCD45RAの発現を評価することによって評価された。(D)CART細胞表現型の定性的評価  少なくとも3つの独立した実験からの異なるT細胞サブセットの平均パーセンテージが示されている。PSMA、前立腺特異的膜抗原；scFv、単鎖可変断片；EFS、伸長因子1α短プロモーター；Tn/Tscm、T細胞ナイーブまたはT幹細胞メモリー；Tcm、T細胞中央メモリー；Tem、T細胞エフェクターメモリー；Teff、T細胞エフェクター。  CAR T細胞表現型のこの特徴付けは、選択されたCARデザインが、最小量の末端分化T細胞サブセットを有する高品質のCAR T細胞産物の生成を可能にすることを確認する
【図２】PSMA-CAR T細胞の細胞傷害性およびサイトカイン放出。 (A)PSMA陽性C4-2腫瘍細胞におけるCAR T細胞の細胞傷害性プロフィール  CAR T細胞を異なるエフェクター対標的(E：T)比で48時間共培養し、抗原陽性C4-2腫瘍細胞またはPSMA陰性細胞(DU145)のいずれかを使用した (B)PSMA-陰性DU145腫瘍細胞におけるCAR T細胞の細胞毒性  CAR T細胞は、DU145細胞を有する標的(E：T)比で、異なるエフェクターで48時間共培養された   細胞傷害性は、XTT ELISAベースの比色アッセイ(%細胞毒性=100%生存度)によって測定された。   図(2A)および図(2B)に示す結果を比較すると、本発明のCARでトランスフェクトされたT細胞は、PSMA抗原を発現する細胞株のみにおいて細胞毒性活性を有することが示されている。なぜなら、パネルAでは、PSMA発現細胞株(C4--2)が使用されているからである。細胞株がPSMAを発現しない場合、例えば、細胞株DU145のように、CAR T細胞(図2B)で細胞傷害性は見られない。さらに、本発明のCAR28およびCAR41細胞は、以前に公開されたデータ(PMID16204083、PMID：18026115、PMID：19773745、PMID：25358763、PMID：23242161、PMID：4174378、PMID：2527968)と比較して優れた細胞毒性を示し、PSMA発現細胞の90%までを、1：1の低いE：T比を用いて除去した。1：1の低いE：T比を有する観察された高いインビトロの細胞毒性は独特であり、これまでに利用可能なPSMA-CARのいずれにも記載されておらず、scFv D7に基づくCAR T細胞の優れた性能を示す。(C)抗原刺激時の炎症誘発性サイトカイン放出の定量  CART細胞を、PSMA-陽性C4-2細胞またはPSMA-陰性DU 145細胞のいずれかで48時間刺激した。上清中のサイトカインをフローサイトメトリーに基づくサイトカイン-ビーズアッセイにより定量した。統計学的に有意な差は、***(P<(0.001)、n=3)によって示される。UT；未形質導入T細胞、IFN-g；インターフェロンγ、Gr.A；グラザイムA、Gr.B；グラザイムB。   図２Cから分かるように、pro-炎症性サイトカイン放出は、CAR T細胞がPSMAを発現する細胞株(細胞株：C4-2)と共培養されたときにのみ発生した。CAR28はCAR41細胞よりも高い範囲で活性化された。
【図３】抗原特異的刺激の際のCART細胞表現型および疲弊プロフィールを示す。（A）CAR T細胞表現型  T細胞表現型プロフィールがCD62lおよびCD45RAの発現に基づいて評価される前に、1：1のエフェクター対標的(E：T)比で24時間、PSMA-陽性C4-2腫瘍細胞でCART細胞を刺激した。細胞は、UTコントロール用のCAR-CD3 +（図示せず）または両方のタイプのCAR T細胞用のCAR+CD3+（図示せず）のいずれかでプレゲートされた。 （B）CAR T細胞表現型の定量的評価  3つの独立した実験からの異なるT細胞サブセットの平均パーセンテージを示す。統計的有意差は、***(P<(0.001)または*(P<(0.05)によって示される。 （C）T細胞疲弊プロフィール  CAR T細胞をPSMA陽性腫瘍細胞（C4-2）で24時間刺激した後、CD223（LAG-3）およびCD279（PD-1）の発現を測定することによりT細胞疲弊プロファイルを評価した。細胞は、UTコントロール用のCAR-CD3+（図示せず）または両方のタイプのCAR T細胞用のCAR+CD3+（図示せず）のいずれかでプレゲートされた。 (D)CART細胞疲弊プロフィールの定量的評価  PD-1またはLAG-3陽性細胞の平均パーセンテージが示されている(3つの独立した実験)。***(P<(0.001)によって統計学的に有意な差が示される。NS、有意ではない；UT、形質導入されていないT細胞；Tn/Tscm、T細胞のナイーブまたはT幹細胞メモリー；Tcm、T細胞の中央メモリー；Tem、T細胞エフェクターメモリー；Teff、T細胞エフェクター；LAG-3、リンパ球活性化遺伝子3；PD-1、プログラムされた細胞死タンパク質1。  この一連の実験では、抗原特異的刺激によるCAR41およびCAR28T細胞のT細胞表現型と疲弊プロファイルに取り組んだ。パネル３Aおよび3Bに見られるように、CAR28細胞とは対照的に、高パーセンテージのCAR41細胞は、抗原特異的刺激の際に未分化T細胞表現型を保存した。さらに、CAR41細胞は、抗原特異的分化の際のCAR28T細胞と比較して、疲弊に対する感受性が低かった(図3Cおよび図3D)。
【図４】前立腺癌標的細胞系C4-2luc+のPSMA発現   生体内生物発光撮像のために、PSMA-陽性前立腺癌C4-2細胞を、ホタルルシフェラーゼ、ネオマイシン耐性遺伝子および緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。形質導入された細胞株は、C4-2luc+と命名された。(A) フローサイトメトリーで測定した抗PSMAmAb3 / F11のC4-2luc+細胞への結合 (B) フローサイトメトリーで測定した、25 μg/ml 3/F11の飽和濃度でのC4-2luc+およびPSMA陰性DU 145細胞への結合。   抗PSMA mAb 3/F11、scFv D7の親mAbの結合は、すべてのC4-2luc+前立腺癌標的細胞の表面上のPSMA発現を検証し、DU 145前立腺癌対照細胞はPSMA陰性であることが示された。
【図５】リビングイメージングシステムIVIS200（Xenogen VivoVision）を使用した生物発光イメージング（BLI）によって決定されたC4-2luc+細胞の生物発光   C4-2luc+標的細胞の発光を、ルシフェリンとのインキュベーション後、インビボ撮像システムIVIS 200(Xenogen VivoVision)を用いて試験した。非形質導入C4-2細胞と比較して、C4-2luc+細胞は、細胞数に対して線形である強度(光子/秒/cm2)を有する、生物発光を示した。従って、これらの細胞は、生物発光イメージング(BLI)による腫瘍検出を伴うマウス腫瘍異種移植モデルにおけるそれらの使用に適していた。ROI、関心領域。
【図６】腫瘍内CAR T細胞療法 (A)腫瘍内CAR T細胞治療の略図  腫瘍の生着は、1.5x106個の細胞の皮下注射によって動物で確立された。 成長中の固形C4-2luc+腫瘍の体積が60-80mm3に達したら、治療の1日目にCAR T細胞に5x106 CAR28（n=5）またはCAR41 T細胞（n=5）の単回投与を腫瘍内注射した。対照マウスに同数のUT細胞を注射するか（n=7）、未処理のままにした（対照、n=6）。腫瘍は、22日目の治療が終了するまで生物発光イメージング（BLI）によって視覚化された。i.t、腫瘍内;s.c、皮下。(B)腫瘍内注射後のCAR28およびCAR41T細胞の抗腫瘍活性  皮下に成長する固体C4-2luc+腫瘍(60-80mm3容積)を有する動物を、治療の1日目に5x106 CAR28(n=5)またはCAR41T細胞(n=5)の単回投与で腫瘍内注射した。対照マウスに同じ数のUT細胞(n=7)または未処理(対照、n=6)を注射した。腫瘍は、22日目の治療の終了までBLIによって可視化された 平均±SDとして表される腫瘍容積は、式vol=d2xD/2を用いてBLI画像から計算され、ここで、ｄは小直径であり、Dは腫瘍の大径である。統計的有意差は、***p<(0.001)によって示される。(C)治療終了時（22日目）における腫瘍内注射されたCAR28およびCAR41 T細胞の抗腫瘍活性。  上記のように、BLI画像から腫瘍容積を計算した。腫瘍容積は、平均±SDとして示されている。統計的有意差は*** p<0.001で示される。対照群の1/6マウスは潰瘍化腫瘍を発症したので、このマウスは15日目に安楽死させなければならず、22日目の統計的分析には含まれなかった。(D)非処置動物(対照)またはUT T細胞で処理された動物と比較して、CAR28またはCAR41 T細胞の単回注射による治療の1日目に腫瘍内治療されたマウスの代表的な生物発光画像。各治療群の大きなまたは小さな腫瘍を有する動物を表す2匹のマウスが示されている。  60-80mm3の固体C4-2luc+腫瘍を有するマウスの腫瘍内治療は、治療の1日目に5x106 CAR28 T細胞の1回の注射により、腫瘍増殖の有意な阻害と、15日目までの5/5の完全腫瘍寛解(CR)とに導いた(図6B、C、D)。1つの動物は、22日目に腫瘍の末端体積が0.55mm3である腫瘍の再発を示した(図6D、写真のマウス)。群の全てのマウスについて、0.11±0.22mm3の平均腫瘍体積が22日目に計算された(図6B、C)。CAR41 T細胞で腫瘍内処理されたマウスは、異なる応答を示した。1/5 CRおよび1/5部分的寛解(PR)は、22日目(図6B、C)で397.3±393.6mm3の平均腫瘍端体積を有する腫瘍成長の統計的に有意な阻害をもたらすことに留意されたい。対照的に、UTおよび対照群のすべてのマウスは、それぞれ1469.4±961.5mm3および1289.1±66.8mm3の腫瘍末端容積につながる腫瘍進行を示した(図6B、C)。
【図７】治療終了時の腫瘍内治療マウスの体重の変化(22日目)  動物保護指針によれば、体重の減少は、治療中の毒性の本質的な徴候である。動物は、20%を超える初期体重の臨界的な減少を示さなかった。これは、オフターゲット毒性の明白な徴候なしに、腫瘍内治療が十分に許容されたことを証明する。
【図８】静脈内CAR T細胞治療(A)静脈内CAR T細胞治療の略図。  5x106細胞の皮下注射により、動物において腫瘍移植が確立された。成長する固体C4-2luc+腫瘍が60-80mm3容積に達したとき、治療の1日目に、CAR T細胞を5x106 CAR28(n=5)またはCAR41 T細胞(n=5)の単回用量で静脈内注射した。対照マウスに同じ数のUT細胞(n=7)または未処理(対照、n=6)を注射した。腫瘍は、22日目の治療が終了するまでBLIを介して視覚化された。D、日； i.v、静脈内; s.c、皮下。(B)静脈注射後のCAR28およびCAR41 T細胞の抗腫瘍活性。  皮下に成長する固体C4-2luc+腫瘍(60-80mm3容積)を有する動物に、治療の1日目に5x106 CAR28(n=5)またはCAR41 T細胞(n=5)の単回投与を静脈注射した。対照マウスに、同じ数の未形質導入T細胞(UT細胞)(n=5)または未処理(対照、n=6)を注射した。腫瘍は、22日目の治療の終了まで、生物発光撮像によって可視化された。平均±SDとして表される腫瘍容積は、式Vol=d2xD/2を用いてBLI画像から計算され、ここで、dは細径であり、Dは腫瘍の大径である。（C）治療終了時(22日目)における、静脈注射されたCAR28およびCAR41 T細胞の抗腫瘍活性。  上記のように、BLI画像から腫瘍容積を計算した。腫瘍容積は、平均±SDとして示される。(D)単一用量のCAR28またはCAR41 T細胞を静脈内注射したマウスの代表的な生物発光画像。  各治療群の大きなまたは小さな腫瘍を有する動物を表す2匹のマウスが示されている。  60-80mm3の体積を有する固形腫瘍を有するマウスへのCAR28またはCAR41 T細胞の単回静脈注射後に、腫瘍増殖の阻害は測定できなかった(図8B、C)。図8C+Dに示されているように、すべての治療群の動物は、1469.4±961.4mm3(対照)、1275.7±544.5mm3(UT)、1427.3±448.5mm3(CAR28)、および1529.3±971.0mm3(CAR41)の22日目の腫瘍末端容積につながる匹敵する腫瘍成長を示した。
【図９】組み合わせ治療 (A)静脈内CAR T細胞療法との組み合わせた化学療法の略図  (1.5x106)の細胞を皮下注射することにより、動物において腫瘍移植を確立した。ドセタキセル(DOC、6mg/kg bw)の腹腔内注射による3日間の治療の1日目に化学療法を開始した。最後の化学療法サイクルの48時間後に、マウスを5x106 CAR28(n=3)またはCAR41 T細胞(n=3)の単一用量で静脈内注射した。対象マウスに、ドセタキセル単独(n=3)または未処理(対照、n=4)を注射した。腫瘍は、17日目の治療の終了までBLIを介して可視化された。D、日；i.v、静脈内注射；i.p、腹腔内；s.c、皮下。(B)ドセタキセル化学療法と組み合わせて、CAR28およびCAR41 T細胞の抗腫瘍活性。  C4-2luc+腫瘍を皮下に成長させたマウス(200-250mm3)に、治療の1日目、2日目、3日目に、ドセタキセル(DOC；6mg/kg bw)を腹腔内注射した。48時間後、マウスを5x106 CAR28(n=3)またはCAR41 T細胞(n=3)の単回投与で静脈内注射した。腫瘍成長はBLIによってモニターされた。未処理の対照(n=4)と比較して、DOC処理は腫瘍成長の有意な阻害をもたらし、これはCAR28またはCAR41 T細胞の添加によって増強された。対照群の4/4マウスは、治療中に成長する腫瘍を示し、一方、DOC群2/3マウスはPRを示した。DOC+CAR28群において、1/3動物はPRを示した。DOC+CAR41群において2/3マウスがCRおよび1/3マウスがPRを示した。DOC+CAR28とDOC+CAR41群との間の統計的に有意な差は、この処理スキームにおけるCAR41 T細胞の優れた効果を示した。統計的有意差は、*p<(0.05)によって示される。(C)治療の17日目に、ドセタキセル化学療法と組み合わせて、CAR28およびCAR41T細胞の抗腫瘍活性。  17日目の治療の終了時に、対照群のマウスの平均腫瘍容積を1817.5±165.5mm3で決定した。DOC群およびDOC+CAR28群は、それぞれ338.3±355.6mm3および559.9±317.2mm3の有意に低い容積を示した。DOC+CAR41群の動物は、50.2±71.1mm3の平均腫瘍体積しか有しなかった。統計的有意差は、*p<(0.05)によって示される。(D)DOCで前処理されたマウスの代表的な生物発光画像であって、単一用量のCAR28またはCAR41 T細胞で静脈内注射されたマウス。  各治療群の大きなまたは小さな腫瘍を有する動物を表す2匹のマウスが示されている。  一緒にして、ドセタキセル化学療法による腫瘍の前処理は、静脈内に適用されたCAR41 T細胞の抗腫瘍活性をもたらした。
【図１０】配列  図10は、マウス由来の抗原結合構築物D7のアミノ酸配列を示す。さらに、コード核酸配列およびその相補鎖を提供する。CDRH1-H3およびCDRL1-L3核酸およびアミノ酸配列は、灰色の矢印でマークされる。  D7(配列番号1)のScFvフラグメントのアミノ酸配列は、抗原結合フラグメントのヒト化のための開始配列である限り、本発明にとって必須である。ヒト化配列は配列番号1と少なくとも80%の相同性を有する。より好ましい態様では、配列は配列番号1と少なくとも90%以上、より好ましくは少なくとも95%の相同性を有し、さらに好ましくは、相同性は配列番号1と少なくとも98%である。図に示されるCDR領域は非常に高いレベルに保存されており、Kabat法によって決定されるCDR領域が3個以下、好ましくは1個以下、好ましくはアミノ酸交換を有さないことを意味することに留意すべきである。  本出願に開示される配列は、以下のように要約される。
【００３５】
2021530974.tif 000004
2021530974.tif 000005
【図１１】ヒト化配列における潜在的突然変異   図11では、CDRが示されている。通常、CDR-H1、CDR-H3およびCDR-L3は、いかなる修正も伴わない。しかしながら、CDR-L2中の1つのアミノ酸、CDR-L1中の2つのアミノ酸までおよびCDR-H3中の6個までのアミノ酸を置換することが可能である。置換され得るアミノ酸は、図1の凡例に示される意味を有するX1-X9と命名される。
【図１２】構築体CAR28の配列を示す。  図12a-図12dは、CAR-CD28として示される構築物の配列を示す。
【図１３】構築体CAR41の配列を示す。  構築物CAR-4-1BBの配列は、図13a-13dに示されている。  図10-図13において、配列情報は、配列の関連部分を機能させる情報とともに提供されることに留意すべきである。したがって、当業者は、提供された配列から最良の態様で情報を導出することが理解される。配列10-13は、本発明の好ましい態様を開示する。
【図１４】D7由来のヒト化ScFvの配列(A)CDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の位置がKabatの決定およびIMGTにしたがって示されている、D7の重鎖のマウス配列およびその5個のヒト化変異体が示されている。(B)CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を有する、D7の軽鎖およびその5個のヒト化変異体のマウス配列である。重鎖と軽鎖は互いに結合することができることが理解される。例えば、変異体1(hum D7-VH1)の重鎖配列と変異体5(hum D7-VL5)の軽鎖とを結合させることが可能である。
【図１５】従来技術においてPSMA抗原結合断片が既に記載されている構築物と本発明によるCAR構築物の比較（A）第二世代の抗PSMA CARを発現するための自己不活性化レトロウイルスベクター構築物の略図  CAR発現はEFSプロモーターによって駆動される。抗PSMA CARは、単鎖可変フラグメント(scFv) 3D8またはJ591(両方とも従来技術において記載されている)、またはD7(PSMAに対する3F/11マウスモノクローナル抗体から誘導される)を含み、これはFC IgG1由来ヒンジ領域、膜貫通(tm)ドメイン、CD28由来共刺激ドメイン、及びCD3ζ鎖由来の細胞内シグナルドメインに融合される。ヒンジ領域は、最適な標的認識のためにscFvとtmドメインとの間に物理的なスペーサーを提供する。CD28共刺激ドメインは、LCK結合を防止し、阻害性調節T細胞(Tregs)の存在下で抗腫瘍活性を増強するアミノ酸交換を含有する。すべての生成されたレトロウイルス構築物は、同じ足場を有するが、活性および細胞毒性に関してCAR構築物の並列比較を可能にするscFvフラグメントのみが異なる。(B)Jurkat細胞におけるCAR発現は、3つの異なるPSMA-CARsをコードするレトロウイルス粒子で形質導入された。ウイルス形質導入後、細胞を回収し、抗ヒトIgG抗体(CAR)で染色して形質導入効率およびCAR発現レベルを評価する前に、Jurkat細胞を16日間増殖させた。（C）抗原特異的活性化プロフィール  CAR 発現Jurkat細胞は、PSMA陽性、PD-L1陰性C4-2腫瘍細胞(PSMA+/PDL1-)、またはPSMA陽性、PD-L1陽性LNCaP腫瘍細胞(PSMA+/PDL1+)のいずれかで、1：1のエフェクター対標的比で24時間刺激された。陰性対照として、CAR細胞をPSMA陰性DU145腫瘍細胞(PSMA-)と共培養した。24時間刺激後、細胞を採取し、活性化マーカーCD69に対して陽性である細胞のパーセンテージを評価することにより活性化プロフィールを評価した。  抗原特異的活性化プロフィールは、J591および3D8系のCAR T Jurkat細胞と並んで、D7系CAR T Jurkat細胞において比較された。パネルCに示されるように、D7系のCARおよびJ591系のCARは、細胞の約70%における活性化マーカーCD69のアップレギュレーションによって測定されるように、抗原特異的増感の際にJurkat細胞の大量の活性化を媒介することができた。活性化は阻害性リガンドPD-L1の存在により影響されなかった。一方、3D8系のCAR T細胞は、わずかに活性化された(CD69陽性細胞の20%まで)。(D)初代T細胞におけるCAR表面発現  レトロウイルス形質導入前に抗CD2/CD3/CD28抗体を用いて2-3日間、T細胞を活性化した。6-9日間の増幅後、細胞を採取し、抗ヒトIgG抗体(CAR)およびCD3で染色し、形質導入効率およびCAR発現レベルを評価した。(E-G)CAR T細胞の細胞毒性プロファイルは、抗-CD3/CD28/CD2抗体で3日間活性化した後に初代T細胞を形質導入することによって生成された。8-9日間の増幅後、C4-2(PSMA+/PDL1-)腫瘍細胞(E)、LNCaP(PSMA+/PDL1+)腫瘍細胞(F)またはDU145(PSMA-)腫瘍細胞(G)のいずれか異なるエフェクター対標的(E：T)比で48時間CAR T細胞を共培養することにより、細胞毒性プロフィールを検査した。細胞傷害性は、XTT ELISA系の比色アッセイ(%細胞毒性=100%-%生存度)によって測定された。統計学的に有意な差は、*(P<(0.05)、**(P<(0.01)、または***(P<(0.001)によって示される。UT、形質導入されていない細胞；PSMA、前立腺特異的膜抗原；PD-L1、プログラムされた細胞死リガンド 1。  D7系のCART細胞は、J591系のCAR T細胞と並んで比較された。D7系のCAR T細胞は、両方の腫瘍細胞標的(E)、F)上のJ591系のCAR T細胞と比較して、優れた細胞毒性プロフィールを示した。これは、両方の腫瘍細胞株が、より低いエフェクター対標的比で排除され得るという事実によって証明される。弱い活性化プロフィール(C)およびT細胞(D)における効率的発現の欠如のために、3D8系のCAR T細胞は、比較にさらに含まれなかった。結論として、D7系のCAR T細胞のPSMA抗原特異的活性化と細胞毒性プロファイルの両方が、従来技術のCARに基づくCAR T細胞を上回った。(H、I)使用される前立腺癌細胞株の特徴づけ  PSMA標的抗原発現(H)およびPD-L1(CD274)発現(I)の程度をC4-2、LNCaPおよびDU145前立腺細胞株上で評価した。フローサイトメトリー分析のために、細胞を3/F11抗体(抗PSMA)または抗CD274抗体で染色した。UT、形質導入されていないT細胞；PD-L1、プログラムされた細胞死リガンド 1；PSMA、前立腺特異的膜抗原。  パネルHに示すように、C4-2およびLNCaP腫瘍細胞の両方がPSMA抗原を発現し、DU145はPSMA抗原に対して陰性である。パネルIは、LNCaPおよびDU145細胞の大部分がPD-L1を発現し、C4-2細胞がPD-L1に対して陰性であることを示している。
【００３６】
図面に示された実験の結果は、以下のように解釈することができる。
【００３７】
一般に、CARは、抗原認識scFvを含む細胞外ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通領域、およびT細胞を活性化する1つまたは複数の細胞内シグナルドメインを含み、これらの細胞内シグナルドメインは、CD3ζ鎖を含む。第2世代または第3世代のCARでは、通常、CD28、4-1BB、0X40、CD27および/またはICOSから誘導される共刺激ドメインが含まれる(図1A)。前立腺癌の治療のために、多くの試みが、PSMAエピトープを標的とするCARを利用しており、これらの方法のいくつかは、既に臨床試験に入ってきた（例えば、NCT01140373、NCT01929239)。しかしながら、これらのCARの効力は、インビトロおよびインビボの両方においてかなり低いようである。特に、抗PSMA scFv 3D8またはJ591(Pzlとして知られている)に基づく第1世代のCARに基づく初期の研究は、インビトロで腫瘍細胞を除去するために、100：1までの高エフェクター対標的（E:T）比を使用して、腫瘍細胞を除去する必要があることによって示されるように、得られたCAR T細胞の低効力を示した。D2bまたはJ591由来のscFvsのいずれかに基づく第2または第3世代のCARが使用された場合に、インビトロの効力が改善される。しかしながら、これらのPSMA標的化CAR T細胞が腫瘍成長を抑制することができるのみであり、インビボで腫瘍を除去することができない。このように非常に高いCAR T細胞用量、時には20x106  CAR T細胞、または複数の注入が適用された場合でも(PMID 6204083、PMID：18026115、PMID：19773745、PMID：25358763、PMID：23242161、PMID：4174378、PMID：25279468)、これらのCAR T細胞の効力は、異種移植腫瘍マウスモデルにおいて低い。かなり非効率的なPSMA-CAR T細胞を有するこれらの混合結果を考慮して、scFv D7に基づいて、新規でより効率的なPSMA標的CARを生成し、有効にすることが意図された。CD28(CAR28)または4-1BB(CAR41)由来の共刺激ドメイン(図1)を含む2つの異なる第２世代PSMA-CARｓを設計した。これらの結果は、インビトロおよびインビボの両方において、これらの新しく開発されたD7系のPSMA-標的化CAR T細胞の高い有効性を示す。製造されたCAR T細胞生成物は、例えばナイーブT細胞、T幹細胞メモリーおよび中央メモリーT細胞表現型のような高パーセンテージの未分化T細胞を含有した(図(1D)。これらのD7系CAR T細胞は、低エフェクター対標的比でインビトロでPSMA陽性腫瘍細胞を完全に排除し、特異的抗原刺激の際に予想されるサイトカインを放出した（図２A-C）。
【００３８】
CAR41 T細胞は、CAR28と比較して、抗原特異的刺激の際に、よりナイーブな表現型およびより少ない疲弊プロフィールを維持した（図３）。
【００３９】
重要なことに、D7系のCAR T細胞は、腫瘍内適用中のマウス腫瘍モデルにおいて、固体PSMA陽性腫瘍を排除した(図６)。対照(未処理)および形質導入されていない(UT)T細胞を有する対照は、急速に成長する腫瘍を形成したことがわかる。しかし、本発明の2つの実施形態(CAR28 T細胞およびCAR41 T細胞)は、腫瘍内単回投与後に腫瘍成長を明確に遮断し、PRまたはCRに導かれる。これは、本発明の概念がインビボで働くことを証明する。
【００４０】
本発明のCAR T細胞の静脈内単回注射は、PSMA陽性固形腫瘍の増殖阻害を引き起こさなかった(図8)。しかしながら、ドセタキセルでの化学療法後、静脈注射されたCAR41 T細胞の単回用量は、大きな腫瘍(200-250mm3)の完全寛解をもたらした(図９)。
【００４１】
D7系のCAR T細胞を、J591および3D8系のCAR T細胞と並んで比較した(図15)。抗原特異的活性化プロフィールは、D7、J591および3D8系のCARsをコードする発現ベクターで形質導入されるJurkat細胞において比較された。D7系のCARおよびJ591系のCARは、抗原特異的増感の際にJurkat細胞の大量の活性化を媒介することができたが、3D8-CAR担持細胞は弱く活性化されただけであった。さらに、初代T細胞の形質導入時に、D7系のCAR T細胞は、両方の腫瘍細胞株が低いエフェクター対標的比で除去されたという事実によって証明されるように、2つのPSMA腫瘍細胞株(図15E、15F)上のJ591系のCAR T細胞と比較して、優れた細胞毒性プロフィールを示した。
【００４２】
要約すると、D7系の抗PSMA CAR T細胞は、以前に公開されたPSMA-標的化CAR T細胞よりも優れた予想外の特性、特にそれらの優れたインビトロ細胞毒性および高いインビボ抗腫瘍活性を有することが実証されている。これらは、進歩した前立腺癌の治療のための新規な免疫療法の開発のための有望なツールである。
【００４３】
本発明は、したがって、PSMA抗原に特異的に結合する抗原結合フラグメントを含むT細胞のキメラ抗原受容体に関する。抗原結合断片は、好適なリンカーと連結されたVHおよびVLフラグメントを含むことが好ましい。さらに、キメラ抗原受容体は、好ましくは、スペーサー要素、膜貫通断片、およびCDR3ζ細胞質ドメインを含む。 さらに、キメラ抗原受容体は、CD28(図12)および/または4-1BB(図13)細胞質ドメインからのフラグメントを含むことが好ましい。
【００４４】
本発明のキメラ抗原受容体は、好ましくは、図10に示すようにCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3からなる群から選択される少なくとも３つのCDRsを含む。CDRsは、アミノ酸配列および関連する核酸配列コード化の上の灰色の矢印によって示されている。好ましい態様において、キメラ抗原受容体は、図10および11に示されるように少なくとも3個(CDR-H1、CDR-H3、CDR-L3)、好ましくは4個(CDR-H1、CDR-H3、CDR-L2、CDR-L3)、より好ましくは、少なくとも5個(CDR-H1、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)を含む。
【００４５】
キメラ抗原受容体は、好ましくはヒト化フォーマットで存在する。このようなヒト化フォーマットは、図11に示すように、マウス足場に対して高い相同性を有する適切なヒト抗原結合足場中に、少なくとも3個、好ましくは4個、より好ましくは5個またはもっと好ましくは6個のCDRを挿入することにより得ることができる。
【００４６】
通常、キメラ抗原受容体をコードする遺伝子情報は、適切なベクターを標的免疫細胞(例えばT細胞)に導入することにより導入される。このようなベクターは、好ましくは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはトランスポゾンあるいはプラスミドであってもよい。あるいは、本明細書に記載されるように、CRISPR/Cas技術またはTALEN技術のようなデザイナヌクレアーゼ技術の助けを借りて、標的様式でT細胞のゲノムに遺伝子情報を導入することができる。
【００４７】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体を含むT細胞を提供するインビトロ方法に関する。第1のステップにおいて、T細胞は、好ましくは白血球アフェレーシス法によってドナーから単離される。これにより、細胞の実質的な濃縮がもたらされる。次いで、T細胞は、適当なベクターを用いたトランスフェクションまたはキメラ抗原受容体の遺伝子情報を含むウイルスベクターでの形質導入により遺伝的に改変される。次いで、このような遺伝的に改変されたT細胞を単離し、増幅することにより、所望の遺伝子情報を含まないT細胞を、改変されたT細胞から分離することができ、または少なくとも低減することができる。次いで、トランスフェクトされたT細胞を、治療すべき患者に適用することができる。
【００４８】
実施例1
レトロウイルス粒子をコードするCARの調製 
HEK293T細胞を、10%ウシ胎児血清(Biochrom, Berlin, Gremany)、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100mg/L)および10mM HEPES(Sigma-Aldrich)を補充したDMEM(Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, Germany)中の5% CO2を含む加湿インキュベーター中37℃で培養した。トランスフェクションの1日前に、細胞を5×106細胞/ディッシュの細胞密度で10cmディッシュに播種した。24時間後、ポリエチレンイミン(PEI：0.1mg PEI/ml、Polysicence Inc., USA)を用いて細胞をトランスフェクションした。10cm皿毎に３μgのVSV-Gエンベロープをコードするプラスミド、6μgのgag/polコード化プラスミド、及び10μgのCAR28またはCAR41のいずれかをコードするベクタープラスミドを使用した。48時間及び72時間トランスフェクション後、ウイルスベクターを含む上清を回収し、超遠心分離(WX ultra series；Thermo Scientific：25、000rpm、4℃で2時間)を用いて濃縮した。濃縮したベクターを100μgの冷PBS中に懸濁させ、使用するまで-80℃に保った。ベクター調製物の生物学的力価は、Jurkat T細胞株を形質転換し、続いて、形質導入された細胞を抗ヒトIgGで染色してCAR陽性細胞を決定することにより決定した。
【００４９】
実施例2
PSMA標的化CAR T細胞の生成
CAR T細胞は末梢血単核細胞(PBMCs)から生成された。PBMCsを、製造者の推奨に従って相分離(Ficoll、Sigma-Aldrich)を用いて単離し、使用するまで液体窒素中で凍結させた。CART細胞の生成のために、PBMCsを解凍し、10%ウシ胎児血清(Biochcom、Berlin、Germany)、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100mg/L)および10mM HEPES緩衝液(Sigma-Aldrich)を補充したRPMI完全培地[RPMI 1640培地(Gibco、Invitrogen、karllruhe、Germany)中で24時間回収した。次いで、抗CD2/CD3/CD28抗体(Immunocolt,Stemcell  Technologies)を使用してPBMCsを活性化し、100U/mlのIL-2、25U/mlのIL-7および50U/mlのIL-15(すべてMiltenyi Biotechから)を補充したRPMI完全培地で2-3日間培養した後、50-300のMOIsを有するCAR28またはCAR41のいずれかをコードするγ-レトロウイルス構築物で形質導入する。形質導入された細胞を、5μg/mlのプロタミン硫酸塩(Sigma-Aldrich)および1000U/mlのIL-2、25U/mlのIL-7および50U/mlのIL-15を補充したRPMI完全培地を含有し、poly-D-lysin(PDL、Sigma-aldrich)により被覆されたウェルで培養した。1日後に培地を交換し、100U/mlのIL-2、25U/mlのIL-7および50U/mlのIL-15を補充したRPMI培地中で、さらに8-9日間細胞を増殖させ、さらに使用するまで液体窒素中で凍結させた。
【００５０】
実施例3
CAR T細胞の品質評価 
フローサイトメトリー(FACS Canto IIまたはAccuri,BD Biosciences)によりCARおよびTCRの発現をモニターするために、細胞を抗ヒトIgG-PE(Southern Biotech)およびCD3-APC(Miltenyi Biotec)で染色した。図1Bに示すように、CAR28)またはCAR41の両方について、50%までの形質導入効率が達成された。品質評価のために、CAR T細胞を収穫し、抗ヒトCD62L-Bv421(BD Biosciences)、抗ヒトCD45RA-FITC(Biolegend)、抗ヒトCD3-APC/H7(BD Biosciences)、および抗ヒトIgG-PE(CAR)(Southern Biotec)を用いて増幅終了後染色した(図１C,D)。T細胞表現型は、CD62lおよびCD45RAの発現に基づいて決定された。細胞は、未形質導入(UT)T細胞のCD3+/CAR-または両方のタイプのCAR T細胞のCD3+/CAR+に予めゲートされた(図１C,D)。
形質導入および増幅プロトコルの両方は、T細胞分化を誘発せず、ナイーブT細胞(Tn)、T幹細胞メモリー(Tscm)または中央メモリーT細胞(Tcm)表現型を有する未分化細胞のパーセンテージが高く、末端分化エフェクターT細胞(Teff)の低画分と組み合わせて、高品質CAR T細胞生成物の生成のために許容されるプロトコルが存在することを示す(図1C,D)。
【００５１】
実施例4
製造されたCAR T細胞のインビトロ細胞毒性 
製造されたCART細胞の細胞傷害性は、前述のように、XTTアッセイを用いて細胞の生存性を評価することによって決定された。CAR T細胞をPSMA-陽性C4-2腫瘍細胞または抗原陰性腫瘍制御細胞(DU145)のいずれかを用いて、異なるエフェクター対標的比でサイトカインを含まないRPMI完全培地の200μl/ウェルの最終体積中の96ウェルプレート中に48時間共培養した。代謝活性の関数として細胞の生存度を決定するために、100μl/ウェルの培地を除去し、XTT溶液(Sigma-Aldrich)の100μl/ウェルで置換し、37℃で細胞をインキュベートした。比色変化をELISAリーダー(Infinite F50、Tecan)を用いて450nmで定量した。細胞傷害性は死細胞のパーセンテージとして示され、これは生存細胞の百分率を引いた100%に等しい。式[ODE+T-ODE only]/[ODTonly-ODmedium only](E、エフェクター細胞=CAR T細胞；T、標的細胞=腫瘍細胞)に従って生存率を計算した。図2Aに示すように、CAR28 T細胞は、エフェクター対標的(E：T)比1：4で標的細胞の90%を除去した。一方、CAR41 T細胞は、1：1のE：T比で同等の活性を示した。両方のタイプのCAR T細胞は、PSMA-陰性腫瘍細胞(DU145)と共培養されたときに、いくつかの最小のアロ反応性を明らかにした(図２B)。これらの結果は、D7ベのCAR T細胞の両方のタイプが、高い効率および特異性を有するPSMA陽性標的細胞を排除することを示す。
【００５２】
実施例5
活性化CAR T細胞によるサイトカイン放出 
CAR T細胞をPSMA-陽性C4-2腫瘍細胞または抗原陰性DU145腫瘍細胞のいずれかで、任意のサイトカインを含まないRPMI完全培地の200ml/ウェルの最終容量で1：1のエフェクター対標的比で48時間共培養した。この時間中にCART細胞から放出されたサイトカインを評価するために、上清を収集し、製造者の推奨に従って、多重化ビーズ系イムノアッセイ(cytometric bead array, CBA assay, BD Biosciences)により評価した。3つの検体、インターフェロンγ(IFN-g)、グラザイムA(Gr.A)およびグラザイムB(Gr.B)を決定した(図2C)。
D7系CAR T細胞の両方のタイプは、抗原刺激の際に測定されたプロ炎症性サイトカインを分泌したが、CAR41 T細胞は、CAR28 T細胞よりも有意に低いサイトカインを放出した。
【００５３】
実施例6
細胞分化および抗原刺激時の疲弊
CAR T細胞をPSMA-陽性C4-2腫瘍細胞で、エフェクター対標的比1：1で24時間刺激した。細胞を回収し、T細胞表現型およびプロフィールについて染色した。抗原刺激によるCART細胞表現型の評価は、CAR41細胞が、Tn、scmおよびTcmのような、有意に高い数の未分化T細胞サブタイプの存在によって示されるように、CAR28細胞と比較して、分化しにくいことを明らかにした(図３A,B)。
特定の抗原刺激時にCAR T細胞の疲弊をモニターするために、PSMA陽性腫瘍細胞(C4-2)を24時間刺激したCART細胞を24時間刺激した。細胞を採取し、抗ヒトCD279-FITC(PD-1,BD Biosciences)、抗ヒトCD223-eFuse710(LAG-3、BD
Biosciences)、抗ヒトCD3-APC/H7(BD Biosciences)および抗ヒトIgG-PE(Southern Biotec)で染色した。この枯渇プロフィールは、CD279(PD-1)およびCD223(LAG-3)の発現に基づいてフローサイトメトリー(FACS Canto II)によって決定された。細胞は、について、CD3+/CAR-のUT T細胞またはCD3+/CAR+の両方のタイプのCARのいずれかで予めゲートされた。さらに、CAR41細胞は、CAR28細胞とは異なる表現型を示した。LAG-3陽性CAR T細胞の有意に減少した数は、あまり疲弊しないT細胞発現型の表示である。
【００５４】
実施例7
前立腺癌標的細胞C4-2luc+のPSMA発現 
PSMA発現、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株C4-2を、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100mg/L)および10%ウシ胎児血清(FCS、Ｂiochcom、Berlin、Germany)を補充したRPMI 1640培地(Gibco、Invitrogen、Karllruhe、Germany)中で、5%CO2の加湿雰囲気中37℃で増殖させた。インビボの生物発光撮像のために、C4-2細胞を、ホタルルシフェラーゼ、ネオマイシン耐性遺伝子、および緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。細胞をC4-2luc+細胞と命名し、前記のように2mg/mlのネオマイシンアナログGeneticin(G-418硫酸塩)で選択した。C4-2luc+細胞を、前述したフローサイトメトリーによりPSMA発現について試験した。要約すると、3%  FCSおよび0.1%NaN3を有するPBS中の2×105 C4-2luc+細胞/ウェルは、氷上で1時間、scFv D7の親mAbである抗PSMA mAb 3/F11の異なる濃度でインキュベートした。洗浄後、細胞を25μlヤギ抗マウスIg-RPE(Becton-Dickinson,Mountain View、CA)と共に氷上で40分間インキュベートした。次いで、細胞を繰り返し洗浄し、1μg/mlプロピジウムヨウ化物、3%FCSおよび0.1%NaN3を含有する200μl PBS中に懸濁させた。染色された細胞の分析は、CellQuest PBDソフトウェア(BD Biosciences,Heidelberg,Germany)を有するFACSCaliburフローサイトメーターを用いて行った。
図(4A)に示すように、mAb3/F11は、0.96μg/ml(約6.3nM)の半最大飽和濃度として定義された結合定数(kd)でC4-2luc+細胞に結合している。これは、このセルライン上でのPSMAの高い発現を証明した。C4-2luc+細胞は、飽和濃度でPSMA陽性であることが示されたが、DU145前立腺癌対照細胞はPSMA陰性であることが示された(図４B)。
【００５５】
実施例8
C4-2luc+細胞の生物発光 
C4-2luc+細胞の生物発光を、インビボ撮像システムIVIS200(Xenogen Vivo Vivision)を用いて試験した。このために、細胞を96-ウェルプレート(Nunc Delta Surface,Thermo Fisher Scientific、Roskilde、Denmark)に異なる番号で播種し、40μlルシフェリン/ウェル(BioSynth AG, Staad, Switzerland)を基材としてインキュベートした。発光は、10-30分以内にソフトウェアリビング画像3.0を用いて分析された(Caliper Lifesciences)。
生物発光画像化(BLI)は、C4-2luc+細胞の数と生物発光(関心領域(ROI)として定量化される)との間に直線性があることを示した。形質導入されていないC4-2細胞を用いて発光シグナルを検出することができず、そしてバックグラウンド染色は、max.2.362x106光子/秒/cm2のROIで決定された(図5)。
【００５６】
実施例9
CAR T細胞の腫瘍内注射によるC4-2luc+腫瘍異種移植片の治療 
5-6週齢の雄SCID CB17/lcr-Prkdc scid/Crlマウス(20-25g, Janiver Labs, St Berthevin Cedex,France)の右フランクに50%マトリゲル(Collaborative Biomedical Products,Chicago、IL)と混合したPBS中の5x106 C4-2luc+細胞を注入した。腫瘍成長はBLIによってモニターされた。このため、200μlのルシフェリン(Biosynth AG,Staad,Switzerland)を腹腔内に注入した。生体撮像システムIVIS 200(Xenogen VivoVision)を用いた麻酔下で注射後10-30分間BLIを行った。ソフトウェアリビング画像3.0および式体積=d2xD/2を用いて、BLI画像から腫瘍容積を計算した。ここで、Dは大径であり、dは腫瘍の細径である。腫瘍が約60-80mm3の容積に達した場合、マウスに5x106 CAR28(n=5)またはCAR41 T細胞(n=5)の1回のみを経口で注射した(処理日1回目)(図６A)。対照として、非形質導入T細胞(UT,n=7)または未処理(対照、n=6)をマウスに注射した。治療の1日目、3日目、8日目、15日目および22日目に、BLIによる腫瘍増殖をモニターした。対照群(UTおよび未処理)は、高速腫瘍成長を示した。減少した腫瘍増殖は、CAR41 T細胞を用いて達成された。CAR28 T細胞で処理したマウスでは、著しい腫瘍退縮が認められた(図６B, CおよびD)。22日目の治療の終了まで、対照群の全ての動物は増殖した腫瘍を示した。動物保護指針によれば、15日目の潰瘍化腫瘍のために、未処置群の1匹のマウスを死滅させなければならなかった。
22日目に、1469.4±961.5mm3(未処理対照)および129.1±66.8mm3(UT)の平均腫瘍端体積がそれぞれ達成された。対照的に、CAR28 T細胞で処理した5/5マウスは、8日目から完全腫瘍寛解(CR)を示し、4匹のマウスは、実験の終了まで腫瘍を含まないままであった。残りの動物において、小腫瘍は22日目に検出され、0.55mm3の体積を有する組織学的検査によって検証された。CAR28で処置された全てのマウスについて、0.11±0.22 mm3の平均腫瘍体積は22日目に計算され、これは対照群(*p<(0.05)と比較して統計学的に有意であった(図6Bおよび6D)。CAR41 T細胞で腫瘍内に注射されたマウスは、治療に対して異なる応答を示した。処理された5匹の動物の1匹は、CRを示した(図6B及び6D)。別の動物はPRを示し、一方、他の動物は治療の22日目まで腫瘍進行を有していた。要約すると、この群における平均腫瘍体積は397.7±393.6mm3であると決定された(図6C)。
【００５７】
実施例10
有害な副作用 
動物保護指針によれば、マウスにおける、処置時の毒性の明らかな兆候を観察した(体重減少、食欲低下、発熱、緊張、無呼吸、攻撃、呼吸障害、麻痺、死亡)および終了基準は以下のように定義された：有意に減少した食物摂取量、初期体重の減少>20%、痙攣、麻痺、異常な呼吸障害、無呼吸、重度の疼痛の兆候としての攻撃性、腫瘍直径>20mm、潰瘍化腫瘍。腫瘍の潰瘍のために15日目に死滅させなければならない未処理の対照群の1匹のマウスを除いて、マウスは毒性の明白な兆候を示しておらず、、動物は1以上の判定基準に達しなかった。図7は、動物が、20%を超える初期体重の臨界的な減少を示していないことを示している。一緒にして、すべての動物は、非特異的毒性の明白な兆候を伴わずに、抗PSMACART細胞を用いた腫瘍内治療を許容した。
【００５８】
実施例11
CART細胞の静脈内注射によるC4-2luc+腫瘍異種移植片の治療 
C4-2luc+腫瘍異種移植片を有するマウスに、それぞれ100μlのPBS中の5x106 CAR28(n=5)、CAR41(n=5)、またはUT T細胞(n=5)の1回のみを静脈内注射した(処理日1日目)(図８A)。対照マウス(n=6)は未処理のままであった。上記のように腫瘍の増殖をモニターした。対照(腫瘍末端体積：1469.4±961.1mm3)およびUT群(腫瘍末端体積：1275.7±544.5mm3)と比較すると、CAR28 T細胞を注射したマウスは、22日目の治療終了時に1427.3±448.5mm3の平均腫瘍体積で同様の腫瘍増殖を示した(図8Bおよび8C)。CAR41 T細胞で処置された動物では、1529.3±971.0mm3の平均腫瘍体積が測定された(図8C)。CAR41またはCAR28のいずれかで静脈内処置された動物では、腫瘍増殖は制御されなかった(図8B,CおよびD)。
要約すると、PSMA CAR T細胞、CAR28およびCAR41の両方の腫瘍内適用は、インビボで完全に腫瘍を除去した(図6)。これとは対照的に、CART細胞の静脈内注射はいずれの抗腫瘍活性も生じなかった(図8)。これは、腫瘍内注射がCAR T細胞がTMEをバイパスすることを可能にすることを示唆し、静脈注射の際に、CAR T細胞はTMEによって阻害された可能性が高いことを示唆している。
【００５９】
実施例12
化学療法とCAR T細胞の静脈内注射との組み合わせによるC4-2luc+腫瘍異種移植片の治療 
大きなC4-2luc+腫瘍異種移植片(200-250mm3)を有するマウスに、3日サイクルのドセタキセル(DOC、6mg/kg bw、1日目、2日目、3日目)を腹腔内注射した(図9A)。最後のサイクルの48時間後、マウスに5x106 CAR28(n=3) CAR41 T細胞(n=3)またはPBS(n=3)の1回のみを静脈注射した(図9A)。対照動物(n=4)は完全に未処理のままであった。腫瘍の増殖は、上記のようにBLIによってモニターされた。対照群と比較して、DOC単独およびDOC+CAR28を注射したマウスは、腫瘍成長の阻害を示した(図(9B)。対照群(1817.5±165.5mm3)と比較してDOC単独で処置されたマウスについて338.2±355.6mm3の腫瘍末端容積およびDOC+CAR28で処理されたマウスについて599.9±3178.2mm3の腫瘍末端容積は17日目に到達した(図9C)。対照的に、DOC+CAR41併用療法で処置された2/3動物は、CRを示し、および1/3マウスは、PRを示した(図9B)。平均腫瘍体積は50.2±71.0mm3と測定された(図9C)。
これらの結果は、D7-CAR T細胞が、ドセタキセルのような化学療法剤と組み合わせてCAR T細胞を単回用量投与する際に、大きな腫瘍を排除するのに有効であることを示す。
【００６０】
実施例13
マウス配列のヒト化 
抗原結合断片のマウス部分に対するヒト患者に生じる抗体のような後の潜在的な不利な効果を避けるために、構築物D7由来の抗原結合断片をヒト化した。 
配列をヒト化する過程で、構築物D7由来の抗PSMA結合配列をヒト幹細胞の配列と比較した。非常に高い相同性を有する配列が選択され、CDR結合配列が位置する領域が決定された。CDR配列の決定については、いくつかの方法が知られている。最も好ましい方法は、KabatおよびIMGT法による方法である。 IMGT、国際免疫遺伝子Ticsデータベースは、免疫グロブリン分子に特殊化された高度に認定された統合情報システムである。KabatおよびIMGTによる方法はいくらか異なる結果を提供するので、異なる変異体(hum D7 VH1-5およびhum D7 VL1-5)の配列を図14AおよびBに示す。KabatおよびIMGTによる関連CDR領域を示す。
2つの異なる方法を使用しても、アミノ酸配列ARDGNFPYYAMDSを有するCDRH3 (配列番号11)および配列SQSTHVPT (配列番号12)を有するCDRL3の配列は、両方の決定方法に従って同一であることに留意することが重要である。したがって、これらの二つのCDR、すなわちCDRH3およびCDRL3は、構築物の適切な機能のために重要であると仮定される。図14aおよびbに示されるヒト化配列は、配列番号13-23に対応する。
【００６１】
実施例14
本発明による好ましい構築物の生物学的活性は、PSMA結合断片が抗体J591から誘導される構築物と比較した。さらに、抗原結合構築物が別の抗体(3D8)から誘導された類似の構築物と比較した。
これらから得られた実験および結果は、図15A-151に示されている。
図15Aは、PSMA結合断片を除いて同一である異なる抗PSMA-CAR28構築物の概略図である。構築物CAR28(D7)では、本発明による断片を使用した。CAR28(J591)において、PSMAフラグメントは、抗体J591から誘導され、およびCAR28((3D8)において、PSMAフラグメントは、PSMA結合抗体(3D8)から誘導された。
構築物をJurkat T細胞株に導入し、構築物の発現を測定した。図15B)において、制御は、UT(非変換)として指定されている。図15Bは、フローサイトメトリーで測定されたすべてのCAR構築物が、UT(形質導入されていない)として指定された対照を除いて、Jurkat T細胞株において適切に発現されることを示す。
図15Cにおいて、抗原刺激時の活性化マーカーの発現をモニターすることにより、形質導入されたJURKAT細胞の抗原特異的活性化プロフィールを測定する。D7およびJ591系のCARとは対照的に、3D8系のCARは、PSMA発現腫瘍細胞への増幅時に、形質導入されたJurkat細胞の弱い活性化のみを媒介する。
図15Dは、初代T細胞におけるCAR発現を示す。本発明CAR28 (D7)による構築物は、CAR(J591)(30%)と比較して、より良好に(42%)発現されることがわかる。PSMA結合断片が3D8から誘導される構築物の発現は非常に低い(4%)。初代T細胞において十分な程度に発現されない構築物は、後の治療用途には適していない。
インジケータ細胞上のCAR28 T細胞の細胞毒性プロフィール、すなわちC4-2(PSMA+/PDL1-)；LNCap(PSMA+/PDL1+)およびDU145(PSMA-/PDl1+)が図15E-15Gに示されている。CAR T細胞の細胞傷害性プロフィールを評価するために、エフェクター(CAR28 T細胞)対標的細胞(異なる腫瘍細胞、すなわちC4-2、LNCaPおよびDU145) の異なる比率が決定された。本発明による構築物は、図15Eおよび図15Fから見られるように、構築物J591から誘導された抗原結合断片を有する構築物よりも優れている。低エフェクター対標的比では、本発明による構築物は、比較構築物よりも常に優れている。非常に高エフェクター対標的比を現実に提供することができないので、エフェクター対標的比は、臨床使用のための非常に重要な側面である。エフェクター対標的比が低いほど、構築物がより良好である。
図(15H)および図15Iは、前立腺癌細胞株LNCaP、C4-2およびDU145上のPSMAおよびPD-L-1発現を示す。
【００６２】
実施例15
さらなる実験では、CAR療法と一緒に化学療法の組み合わせが、化学療法単独よりも優れていることが示され得る。
実験は、図16Aおよび図16Bに示されている。図16Aはドセタキセル(DOC)プラスCAR T細胞を用いた、皮下C4-2luc異種移植片を有するマウスの併用療法の概略図である。150-200mm3の腫瘍を有するマウスに、1日目および2日目に6mg/kg bwのDOCを2回注射し、続いて8日目にCAR28またはCAR41 T細胞を静脈内注射した。腫瘍の増殖を、22目日まで触診およびBLIによってモニターした。
実験の結果は、図16Bに示す：皮下C4-2luc異種移植片を有するマウスにおけるDOCと組み合わせたCAR28およびCAR41 T細胞のインビボ抗腫瘍活性。DOC+CAR28処置動物と未処理対照との間の腫瘍体積の統計学的に有意な差異は、治療の15日目、17日目、および22日目で決定された。DOCで処理された、DOC+CAR28で処置した動物とDOCで処理したマウスとの間の腫瘍体積の統計学的に有意な差異は、治療の17日目および22日目に決定された。さらに、DOC+CAR41で処置した動物の腫瘍体積は、22日目の対照群の腫瘍体積よりも有意に小さく、これは、併用治療が化学療法単独よりも優れていることを証明している。対応のないt検定、*p<(0.05.)。
実験から、本発明によるCAR28およびCAR41構築物と化学療法剤との相乗効果があり、これにより、その効果がドセタキセルで例示されていることが明らかに理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ−Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１５Ｃ−Ｄ】
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【図１５Ｅ−Ｉ】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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