(57)【要約】本発明は、新規なラムノリピド化合物、これの光学異性体またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。本発明による新規なラムノリピド化合物、これの光学異性体またはその薬学的に許容可能な塩は、ヒト癌細胞株に対する細胞毒性を示し、癌細胞の成長を阻害することにより、特に前記で述べた癌に対して優れた予防または治療効果を有する。
2021530429.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コアが流動床のアルギン酸塩であり、
シェルがエピガロカテキンガレート二量体で架橋されたアルギン酸塩ハイドロゲルである、コア−シェル構造の表面改質アルギン酸塩微細カプセル。
【請求項２】
前記シェルのエピガロカテキンガレート二量体の一部は、他のエピガロカテキンガレート二量体と酸化によって互いに結合されたものであることを特徴とする請求項１に記載の微細カプセル。
【請求項３】
前記シェルは、アルギン酸塩コーティング層をさらに含むものであることを特徴とする請求項１に記載の微細カプセル。
【請求項４】
前記アルギン酸塩コーティング層は、シェルのエピガロカテキンガレート二量体と共にアミド結合を形成したものであることを特徴とする請求項３に記載の微細カプセル。
【請求項５】
前記シェルは、３次元的に連結された多数個の中空を含むものであることを特徴とする請求項１に記載の微細カプセル。
【請求項６】
前記コアは、液状のアルギン酸または液状のアルギン酸とアルギン酸ハイドロゲルとの混合物であることを特徴とする請求項１に記載の微細カプセル。
【請求項７】
細胞皮膜用であることを特徴とする請求項１に記載の微細カプセル。
【請求項８】
（１）カルシウム−アルギン酸塩微細カプセルを製造するコア製造段階と、
（２）カルシウム−アルギン酸塩微細カプセル及びエピガロカテキンガレート二量体を反応させて前記カルシウム−アルギン酸塩微細カプセルの表面にアルギン酸塩−エピガロカテキンガレート二量体架橋物を形成されるシェルの製造段階と、及び
（３）カルシウム−アルギン酸塩のカルシウムイオンをエピガロカテキンガレート二量体にキレートさせるコア液化段階と、を含み、
前記コアは、流動床のアルギン酸塩であり、シェルがエピガロカテキンガレート二量体で架橋されたアルギン酸塩ハイドロゲルである、表面改質アルギン酸塩微細カプセルの製造方法。
【請求項９】
前記製造されたシェルのエピガロカテキンガレート二量体を、隣接するエピガロカテキンガレート二量体と酸化結合させる段階をさらに含むものであることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記製造されたシェルをアルギン酸塩でコーティングさせる段階と、をさらに含むものであることを特徴とする請求項８に記載の製造方法
【請求項１１】
前記製造された表面改質アルギン酸塩微細カプセルを、カルシウムイオンキレート剤と反応させて中空を形成させる段階をさらに含むものであることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
【請求項１２】
（ａ）細胞をカルシウム−アルギン酸塩ハイドロゲル微細カプセルに皮膜化するコアの製造段階と、
（ｂ）細胞を皮膜化したカルシウム−アルギン酸塩ハイドロゲル微細カプセルをエピガロカテキンガレート二量体と反応させ、カルシウム−アルギン酸塩微細カプセルの表面にアルギン酸塩−エピガロカテキンガレート二量体架橋物を形成させるシェルの製造段階と
、及び
（ｃ）前記カルシウム−アルギン酸塩のカルシウムイオンをエピガロカテキンガレート二量体にキレートさせ、前記細胞周辺のハイドロゲルを液化させる段階と、を含むコア−シェル構造の表面改質アルギン酸塩微細カプセルを用いた細胞皮膜化方法。
【請求項１３】
前記製造されたシェルのエピガロカテキンガレート二量体を、隣接するエピガロカテキンガレート二量体と酸化結合させる段階をさらに含むものであることを特徴とする請求項１２に記載の細胞皮膜化方法。
【請求項１４】
前記製造されたシェルをアルギン酸塩でコーティングさせる段階と、をさらに含むものであることを特徴とする請求項１２に記載の細胞皮膜化方法。
【請求項１５】
前記製造された表面改質アルギン酸塩微細カプセルを、カルシウムイオンキレート剤と反応させて中空を形成させる段階をさらに含むものであることを特徴とする請求項１２に記載の細胞皮膜化方法。
【請求項１６】
前記細胞は、膵島細胞であることを特徴とする請求項１２に記載の細胞皮膜化方法。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか一項によるカプセルの治療学的に有効量をこれを必要とする個体に投与する段階を含む、糖尿病の治療方法。
【請求項１８】
糖尿病の予防または治療に使用するための請求項１〜７のいずれか一項によるカプセルを含む組成物。
【請求項１９】
糖尿病の予防または治療用の薬剤を製造するための請求項１〜７のいずれか一項によるカプセルを含む組成物の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面改質アルギン酸塩微細カプセル、その製造方法及びこれを用いた細胞皮膜化方法に関するものであって、より詳しくは、細胞移植において外部環境から細胞を保護するために、細胞皮膜化に用いられることができ、細胞生存能が改善された表面改質アルギン酸塩微細カプセル、その製造方法及びこれを用いた細胞皮膜化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルギン酸塩は、生体適合性に優れ、生体不活性であるため、組織工学、細胞治療、人工臓器の制作など、様々な分野で生体材料として活用されている。
【０００３】
１型糖尿病の治療において膵島細胞移植（ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）は、効果的な治療法として提示された。しかし、同種移植は、需要に比べて供給が非常に不足しているため、異種移植が求められている。異種移植は、移植対象の免疫反応によって移植された細胞が破壊される可能性があるため、これを抑制することが重要である。移植される異種細胞を保護するために、生体材料を用いた皮膜化に関する研究が進められており、アルギン酸塩は糖尿病治療のための膵島細胞移植（ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）において、膵島が免疫反応に露出されることを防ぐための皮膜化材料として提示された［Ｄｅｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １６．５（２０１７）、３３８］。
【０００４】
膵島皮膜化に用いられる代表的な材料は、アルギン酸塩ハイドロゲルである。アルギン酸塩ハイドロゲルは、アルギン酸ナトリウムをＣａ２＋のような２価陽イオンを用いて架橋させることによって迅速で、且つ、容易に製造することができる。しかし、Ｎａ＋のような１価陽イオンが多量に存在する環境では、１価陽イオンが架橋に用いられた２価陽イオンと交換され、ハイドロゲルを溶液状態でゾル−ゲル相転移（ｓｏｌ−ｇｅｌ  ｐｈａｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）することができる。一方、体内にはＮａ＋が多量に存在する環境である。したがって、体内移植の際、皮膜化に用いられたアルギン酸塩ハイドロゲルは、Ｃａ２＋が体内のＮａ＋と交換される、又は自然に拡散（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）されるため、体内で徐々に融解される問題がある。こうした融解は、微細カプセルの寿命を短縮させ、内部の細胞を外部の免疫システムから保護できない原因となるので、微細カプセル化膵島の商用化において限界として作用する。そればかりでなく、形成されたハイドロゲルは、細胞が完全に生着することを妨げ、細胞に低酸素症（ｈｙｐｏｘｉａ）などを誘発させる。そればかりでなく、カプセルそのものの体積に比べて酸素または栄養素の拡散量が少ないという限界がある。
【０００５】
これらの限界点を克服するために、最近ではＣａ２＋非依存的にハイドロゲルを形成するアルギン酸塩（ａｌｇｉｎａｔｅ）接合体、中空カプセル（ｈｏｌｌｏｗ  ｃａｐｓｕｌｅ）、表面改質細胞（ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｅｌｌ）などの開発に多くの研究が進められている。Ｃａ２＋非依存的にハイドロゲルを形成するアルギン酸塩（ａｌｇｉｎａｔｅ）接合体として、アルギン酸塩−ドーパミン接合体及びヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）−ＥＧＣＧ接合体が開発された。アルギン酸塩−ドーパミン接合体の場合、ドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ）の酸化によって互いに結合させることができるが、結合にはＨ２Ｏ２とＨＲＰ酵素が必要であり、結合が強くなく、抗−増殖効果（ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ）、ラジカル消去能（ｒａｄｉｃａｌ  ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ）のような機能性が多少劣るという限界がある。ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）−ＥＧＣＧ接合体の場合、ヒアルロン酸が体内で自然に分解が起こり得る物質であるため、製造された接合体が生体内で分解される
ことができ、ＥＧＣＧ結合によるハイドロゲル形成反応は速度が遅く、物性が強くないので、微細皮膜化に適用するのは難しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、細胞皮膜化用表面改質アルギン酸塩微細カプセルを提供することにある。
【０００７】
本発明が解決しようとするもう一つの課題は、細胞皮膜化用表面改質アルギン酸塩微細カプセルの製造方法を提供することにある。
【０００８】
本発明が解決しようとするもう一つの課題は、前記表面改質アルギン酸塩微細カプセルを用いた細胞皮膜化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記した課題を解決すべく本発明は、コアが流動床のアルギン酸塩であり、シェルがエピガロカテキンガレート二量体で架橋されたアルギン酸塩ハイドロゲルである、コア−シェル構造の表面改質アルギン酸塩微細カプセルを提供する。
【００１０】
本発明によれば、前記シェルのエピガロカテキンガレート二量体の一部は、他のエピガロカテキンガレート二量体と酸化によって互いに結合されたものであることができる。
【００１１】
本発明によれば、前記シェルは、アルギン酸塩コーティング層をさらに含むものであることができる。
【００１２】
本発明によれば、前記アルギン酸塩コーティング層は、シェルのエピガロカテキンガレート二量体と共にアミド結合を形成したものであってもよい。
【００１３】
本発明によれば、前記シェルは、３次元的に連結された多数個の中空を含むものであることができる。
【００１４】
本発明によれば、前記コアは、液状のアルギン酸塩または液状のアルギン酸塩とアルギン酸塩ハイドロゲルとの混合物であってもよい。
【００１５】
本発明によれば、前記微細カプセルは、細胞皮膜用であってもよく、好ましくは、膵島細胞皮膜化用であってもよい。
【００１６】
また、本発明は、（１）カルシウム−アルギン酸塩微細カプセルを製造するコアの製造段階と、（２）カルシウム−アルギン酸塩微細カプセル及びエピガロカテキンガレート二量体を反応させ、前記カルシウム−アルギン酸塩微細カプセルの表面にアルギン酸塩−エピガロカテキンガレート二量体架橋物を形成させるシェル製造段階と、及び（３）カルシウム−アルギン酸塩のカルシウムイオンをエピガロカテキンガレート二量体にキレートさせるコア液化段階と、を含み、前記コアは、流動床のアルギン酸塩であり、シェルがエピガロカテキンガレート二量体で架橋されたアルギン酸塩ハイドロゲルである、表面改質アルギン酸塩微細カプセルの製造方法を提供する。
【００１７】
本発明によれば、前記製造されたシェルのエピガロカテキンガレート二量体を、隣接するエピガロカテキンガレート二量体と酸化結合させる段階をさらに含むことができる。
本発明によれば、前記製造されたシェルをアルギン酸塩でコーティングさせる段階と、をさらに含むことができる。
【００１８】
本発明によれば、前記製造された表面改質アルギン酸塩微細カプセルを、カルシウムイオンキレート剤と反応させて中空を形成させる段階をさらに含むことができる。
【００１９】
また、本発明は、（ａ）細胞をカルシウム−アルギン酸塩ハイドロゲル微細カプセルで皮膜化するコア製造段階と、（ｂ）細胞を皮膜化したカルシウム−アルギン酸塩ハイドロゲル微細カプセルをエピガロカテキンガレート二量体と反応させ、カルシウム−アルギン酸塩微細カプセルの表面にアルギン酸塩−エピガロカテキンガレート二量体架橋物を形成させるシェル製造段階と、及び（ｃ）前記カルシウム−アルギン酸塩のカルシウムイオンをエピガロカテキンガレート二量体にキレートさせ、前記細胞周辺のハイドロゲルを液化させる段階と、を含むコア−シェル構造の表面改質アルギン酸塩微細カプセルを用いた細胞皮膜化方法を提供する。
【００２０】
本発明によれば、前記製造されたシェルのエピガロカテキンガレート二量体を、隣接するエピガロカテキンガレート二量体と酸化結合させる段階をさらに含むことができる。
【００２１】
本発明によれば、前記製造されたシェルをアルギン酸塩でコーティングさせる段階と、をさらに含むことができる。
【００２２】
本発明によれば、前記製造された表面改質アルギン酸塩微細カプセルを、カルシウムイオンキレート剤と反応させて中空を形成させる段階をさらに含むことができる。
【００２３】
本発明によれば、前記細胞は、生体内に移植のための細胞であってもよく、好ましくは、膵島細胞であってもよい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係るアルギン酸塩微細カプセルは、ＥＧＣＧの酸化によってアルギン酸塩を架橋することができるので、Ｃａ２＋非依存的にハイドロゲルを形成することができる。そればかりでなく、本発明のアルギン酸塩微細カプセルは、ＥＧＣＧがアルギン酸塩ハイドロゲルのＣａ２＋をキレートすることにより、生体内でハイドロゲルが容易に分解される問題を解決し、内部アルギン酸塩コアが部分的に溶解されるため、酸素又は栄養素が拡散され、内部の皮膜化細胞に伝達され易くなるので、細胞生存度を向上させるだけでなく、物性に優れ、生体内で容易に分解される問題を解決した。したがって、外部の物理的刺激から内部細胞を保護する性能が向上され、免疫反応を最小化した。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明により製造されたエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）二量体を高速液体クロマトグラフィーで分析した結果である。
【図２】本発明により製造されたエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）二量体を質量分析計で分析した結果である。
【図３】本発明によりＥＧＣＧ二量体９９ｍｇを使用して製造されたアルギン酸塩−ＥＧＣＧ（ｄｉ）接合体のカルシウムイオン（Ｃａ２＋）非依存性ハイドロゲルが形成されたか否かを時間の流れに沿って確認したものである。
【図４】本発明により製造されたアルギン酸塩−ＥＧＣＧ（ｄｉ）接合体のレオロジー物性測定結果である。
【図５】本発明によりＥＧＣＧ二量体４ｍｇを使用して製造されたアルギン酸塩−ＥＧＣＧ（ｄｉ）接合体のカルシウムイオン（Ｃａ２＋）非依存性ハイドロゲルが形成されたか否かを時間の流れに沿って確認したものである。
【図６】本発明の比較例３に係るアルギン酸塩−ＥＧＣＧ（ｄｉ）微細カプセルの製造結果である。
【図７】本発明の比較例４に係るアルギン酸塩／アルギン酸塩−ＥＧＣＧ（ｄｉ）微細カプセルの製造結果である。
【図８】比較例１及び比較例４に係る微細カプセルを、カルシウムイオンキレート剤で５分間処理し、分解度を評価したものである（ａ：比較例１、ｂ：比較例４）。
【図９】本発明の反応時間による実施例１の微細カプセルの製造結果である。
【図１０】ＨＲＰ処理の有無、様々な反応時間及びＥＧＣＧ二量体の濃度による実施例１の微細カプセルの製造結果である。
【図１１】ＨＲＰ処理の有無による表面改質アルギン酸塩微細カプセルの色の変化を確認した結果である（左：ＨＲＰ添加Ｘ、右：ＨＲＰ添加Ｏ）
【図１２】ＥＧＣＧが結合されたアルギン酸塩ビーズ、アルギン酸塩ビーズ及びアルギン酸塩−ＥＧＣＧビーズを、ＨＲＰを添加したか否か、およびＡＣアルギン酸塩コーティングしたか否かによって区別したものである。
【図１３】比較例１、実施例１、実施例２の微細カプセルの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。
【図１４】ＥＧＣＧが結合されたアルギン酸塩ビーズに、ＨＲＰを添加していない微細カプセル（左）、ＨＲＰを添加した微細カプセル（右）、の光学顕微鏡画像である。
【図１５】膵島を、実施例１または２による表面改質アルギン酸塩微細カプセルに皮膜化する過程を模式化して示したものである。
【図１６】比較例１のカルシウム−アルギン酸塩微細カプセルを、カルシウムイオンキレート剤として知られたＥＤＴＡ（１００ｍＭ）を２０分間処理し、形態変化を確認したものである。
【図１７】実施例１の微細カプセルを、カルシウムイオンキレート剤として知られたＥＤＴＡ（１００ｍＭ）を１０分または２０分間処理し、形態変化を確認したものである。
【図１８】比較例１、比較例３及び実施例１による微細カプセルのレオロジー（Ｒｈｅｏｌｏｇｙ）測定結果である。
【図１９】比較例１、比較例３及び実施例１による微細カプセルの粘弾性測定結果である。（ａ）比較例１、（ｂ）比較例３、（ｃ）実施例１、ＨＲＰ添加Ｏ、（ｄ）実施例１、ＨＲＰ添加Ｘ。
【図２０】実施例１による微細カプセルが製造されてから２週間後の粘弾性測定結果である。（ａ）ＨＲＰ添加Ｏ、（ｂ）ＨＲＰ添加Ｘ。
【図２１】比較例１、比較例３及び実施例１による微細カプセルの粘弾性を測定した結果を示したものである。
【図２２】図２２の上段は、ＨＲＰ未添加の膵島カプセル化表面改質アルギン酸塩微細カプセルの光学顕微鏡画像であり、図２２の下段は、ＨＲＰ添加された膵島カプセル化表面改質アルギン酸塩微細カプセルの光学顕微鏡画像である。
【図２３】ＥＧＣＧ使用量による表面改質微細カプセルの分解抵抗性を濃度別に区別して光学顕微鏡画像で示したものである。
【図２４】ＥＧＣＧ使用量による表面改質微細カプセルの外部ＥＧＣＧ層を形成するか否かを光学顕微鏡で確認したものである。
【図２５】微細カプセル内部の膵島に対するインスリン分泌能をグラフで示したものである。
【図２６】ＥＧＣＧが８４ｍｇ使用されたときの表面改質微細カプセル内の膵島の血中当たりの濃度をグラフで示したものである。
【図２７】アルギン酸塩微細カプセル及び表面改質アルギン酸塩微細カプセルの血中当たりの濃度及び重量をグラフで示したものである。
【図２８】表面改質微細カプセル化膵島及びアルギン酸塩微細カプセル化膵島の形態を光学顕微鏡で示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００２７】
本発明は、コアが流動床のアルギン酸塩であり、シェルがエピガロカテキンガレート二量体で架橋されたアルギン酸塩ハイドロゲルである、コア−シェル構造の表面改質アルギン酸塩微細カプセルを提供する。
【００２８】
本発明によれば、前記コアは、流動床であってもよく、前記流動床は、液状または液状とハイドロゲルとの混合物であってもよい。前記コアが流動床であれば、酸素及び物質を内部の細胞に容易に伝達することができ、細胞生存能を向上させることができるので、好ましい。
【００２９】
本発明によれば、前記エピガロカテキンガレート二量体は、エピガロカテキン単量体の６、８炭素がアルデヒドと反応して形成されたものであってもよい。前記エピガロカテキンガレート二量体は、８−８異性体、６−８異性体（２種類）及び６−６異性体の中から選択される１種以上であることができ、好ましくは、これらの４種の混合物であることができる。
【００３０】
前記エピガロカテキンガレート８−８二量体は、下記化学式１で定義された通りである。
【００３１】
【化１】
2021530429.tif 000003
【００３２】
前記一対のエピガロカテキンガレート６−８二量体、下記化２および３に定義された通りである。
【００３３】
【化２】
2021530429.tif 000004
【００３４】
【化３】
2021530429.tif 000005
【００３５】
前記エピガロカテキンガレート６−６二量体は、下記化４で定義された通りである。
【００３６】
【化４】
2021530429.tif 000006
【００３７】
本発明によれば、前記シェルのエピガロカテキンガレート二量体の一部は、他のエピガ
ロカテキンガレート二量体と酸化によって互いに結合されたものであってもよい。前記エピガロカテキンガレート二量体間の酸化結合は、シェルを厚く形成させるためのものであってもよい。前記エピガロカテキンガレート二量体間の酸化結合は、本発明による微細カプセルの物理的特性を向上させ、被膜化する細胞を物理的な衝撃から保護するのに効果的であることができる。酸化結合されたエピガロカテキンガレート二量体を、下記化５に示した。
【００３８】
【化５】
2021530429.tif 000007
【００３９】
本発明によれば、前記シェルは、アルギン酸塩コーティング層をさらに含むことができ
るものである。
【００４０】
本発明によれば、前記アルギン酸塩コーティング層は、シェルのエピガロカテキンガレート二量体と一緒にアミド結合を形成したものであることができる。
【００４１】
前記化５に示すように、エピガロカテキンガレート二量体は、アミン基を含むので、正電荷を持つ。従来の研究によれば、正電荷を持つ生体材料は、中性または負電荷を持つ生体材料に比べて免疫反応及び炎症がよく誘発され得る。前記アルギン酸塩コーティング層は、エピガロカテキンガレート二量体の前記アミン基とアルギン酸塩の−ＣＯＯＨ基アミド結合を形成しているので、正電荷を持たないようにし、好ましい。
【００４２】
本発明によれば、前記シェルは、３次元的に連結された多数個の中空を含むものであることができる。該中空は、酸素及び物質を内部の細胞に容易に伝達することができるので、好ましい。前記中空は、本発明に係るコア−シェル構造の表面改質アルギン酸塩微細カプセルを、カルシウムイオンキレート剤で処理することにより、容易に形成させることができる。
【００４３】
本発明によれば、前記微細カプセルは、細胞皮膜用であってもよい。前記細胞の種類は制限されることなく、生体内移植のための細胞であってもよく、好ましくは、膵島細胞であってもよい。
【００４４】
本発明において、用語「膵島」とは、ランゲルハンス島（Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｉｓｌｅｔｓ）を意味し、膵島移植は１型糖尿病の改善のための実用的な治療法である。これは膵島がインスリンを分泌するβ細胞が含まれているため、膵島の移植を介してインスリン依存型である１型糖尿病を治療することができるからである。
【００４５】
また、本発明は、（１）カルシウム−アルギン酸塩微細カプセルを製造するコア製造段階と、（２）カルシウム−アルギン酸塩微細カプセル及びエピガロカテキンガレート二量体を反応させ、前記カルシウム−アルギン酸塩微細カプセルの表面にアルギン酸塩−エピガロカテキンガレート二量体架橋物を形成させるシェルの製造段階と、及び（３）カルシウム−アルギン酸塩のカルシウムイオンをエピガロカテキンガレート二量体にキレートさせるコア液化段階と、を含み、前記コアは、流動床のアルギン酸塩であり、シェルがエピガロカテキンガレート二量体で架橋されたアルギン酸塩ハイドロゲルである、表面改質アルギン酸塩微細カプセルの製造方法を提供する。
【００４６】
まず、カルシウム−アルギン酸塩微細カプセルを製造する。
【００４７】
次に、カルシウム−アルギン酸塩微細カプセル及びエピガロカテキンガレート二量体を反応させる。前記反応によりカルシウム−アルギン酸塩ハイドロゲルのアルギン酸塩は、エピガロカテキンガレート二量体によって架橋されながら、外郭（シェル）にハイドロゲルを形成するようになり、内部のカルシウム−アルギン酸のカルシウムイオンの一部または全部は、エピガロカテキンガレート二量体にキレートされる。カルシウムイオンが全部エピガロカテキンガレート二量体にキレートされた場合には、内部はアルギン酸が液状に変わり、カルシウムイオンが一部エピガロカテキンガレート二量体にキレートされた場合には、内部は液状のアルギン酸とカルシウム−アルギン酸塩ハイドロゲルが共存しながら、流動床のスラリーを形成する。
【００４８】
前記微細カプセルは、膵島細胞を含む膵島細胞のカプセルであってもよい。
【００４９】
本発明において、用語「膵島細胞カプセル」とは、膵島細胞を生体適合性高分子で囲み
、カプセルの形を形成することを意味する。このような膵島細胞のカプセルは、免疫細胞の透過を防止し、異種個体から分離された膵島または同種の個体から分離された膵島によって起こる免疫拒否反応を抑制することができるようにする。
【００５０】
本発明によれば、前記製造されたシェルのエピガロカテキンガレート二量体を、隣接するエピガロカテキンガレート二量体と酸化結合させる段階をさらに含むことができる。前記酸化は、エピガロカテキンガレート二量体の酸化に通常、使用される方法であれば特に制限はないが、基質を脱水素化する触媒反応に関与するＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）酵素がより好ましい。
【００５１】
本発明によれば、前記製造されたシェルをアルギン酸塩でコーティングさせる段階と、をさらに含むことができる。前記コーティングは、純粋なアルギン酸塩溶液を添加して反応させることによって行うことができる。
【００５２】
本発明によれば、前記製造された表面改質アルギン酸塩微細カプセルを、カルシウムイオンキレート剤と反応させて中空を形成させる段階をさらに含むことができる。前記カルシウムイオンキレート剤は、例えば、ＥＤＴＡであってもよい。
【００５３】
また、本発明は、（ａ）細胞をカルシウム−アルギン酸塩ハイドロゲル微細カプセルに皮膜化するコア製造段階と、（ｂ）細胞を皮膜化したカルシウム−アルギン酸塩ハイドロゲル微細カプセルをエピガロカテキンガレート二量体と反応させ、カルシウム−アルギン酸塩微細カプセルの表面に、アルギン酸塩−エピガロカテキンガレート二量体架橋物を形成させるシェルの製造段階と、及び（ｃ）前記カルシウム−アルギン酸塩のカルシウムイオンをエピガロカテキンガレート二量体にキレートさせ、前記細胞周辺のハイドロゲルを液化させる段階と、を含むコア−シェル構造の表面改質アルギン酸塩微細カプセルを用いた細胞皮膜化方法を提供する。
【００５４】
本発明によれば、前記製造されたシェルのエピガロカテキンガレート二量体を、隣接するエピガロカテキンガレート二量体と酸化結合させる段階をさらに含むことができる。
【００５５】
本発明によれば、前記製造されたシェルをアルギン酸塩でコーティングさせる段階と、をさらに含むことができる。
【００５６】
本発明によれば、前記製造された表面改質アルギン酸塩微細カプセルを、カルシウムイオンキレート剤と反応させて中空を形成させる段階をさらに含むことができる。
【００５７】
本発明によれば、前記細胞は、生体内移植のための細胞であってもよく、好ましくは、膵島細胞であってもよい。
【００５８】
本発明によれば、前記微細カプセルの製造に使用されるエピガロカテキンガレートの濃度は、アルギン酸塩５ｍｇ当たり、好ましくは４２ｍｇ〜１６７ｍｇであってもよく、より好ましくは６３〜１６７ｍｇであってもよく、さらに好ましくは８４〜１６７ｍｇであってもよい。本発明によれば、最も好ましい一実施例は、アルギン酸塩５ｍｇ当たり、エピガロカテキンガレートの濃度が８４ｍｇである。
【００５９】
本発明の一つの様態として、本発明は、糖尿病の予防または治療に使用するために、前記膵島細胞のカプセルを含む糖尿病の治療用組成物を提供する。
【００６０】
前記糖尿病の治療は、好ましくは前記カプセルを生体に移植して行うことができる。本発明者らは、本発明の膵島細胞のカプセルの生存能が高く、グルコースに反応するインス
リン分泌能が高く、代謝物質は透過させるが、免疫細胞は透過させないことを確認し、免疫抑制剤の投与がなくても、小部位に移植して、インスリンを分泌して、糖尿病を治療することができることを確認した。
【００６１】
本発明において、用語「治療」とは、本発明の膵島細胞カプセルを含む組成物の投与によって、糖尿病の症状が好転したり、有利に変更するすべての行為を意味する。前記糖尿病の治療は、糖尿病が発病する可能性のある任意の哺乳動物に適用することができ、その例として、ヒトと霊長類に加えて、牛、豚、羊、馬、犬および猫などの家畜を制限なく含むが、好ましくは、ヒトであってもよい。
【００６２】
本発明に係る膵島細胞のカプセルは、糖尿病の治療を必要とする患者に移植することができ、移植部位としては、腹腔、皮下、筋肉内、臓器、臓器の動脈／静脈の血管質、脳−脊髄液またはリンパ液などが好ましい。また、本発明による膵島細胞のカプセルは、免疫抑制剤の投与がなくてもよいが、好ましくは、免疫抑制剤または抗炎症剤と組み合わせて糖尿病の治療を必要とする患者に投与することができる。前記免疫抑制剤は、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）、シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）とオルタクロリムス（ｏｒｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）からなる群から選択されることができるが、これに限定されるものでない。
【００６３】
前記抗炎症剤は、アスピリン、イブプロフェン、ステロイド及び非ステロイド性抗炎症剤からなる群から選択されることができるが、これに限定されるものではない。前記免疫抑制剤または抗炎症は、膵島のカプセルの移植後６ヶ月の間、好ましくは、１ヶ月の間に投与するのがよい。
【００６４】
前記組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、担体と共に製剤化することができる。本発明において、用語、「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せずに投与カプセルの生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液に製剤化する組成物において許容される薬剤学的担体としては、滅菌および生体に適したものであり、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など、他の通常の添加剤を添加することができる。また希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形で製剤化することができる。
【００６５】
本発明による膵島細胞のカプセルをレシピエントに移植するためには、移植される膵島のカプセルの量は、マウスの場合、４，０００〜１０，０００  ＩＥＱ／ｋｇ、非ヒト霊長類の場合、１０，０００〜１５，０００  ＩＥＱ／ｋｇが好ましく、ドナーの種類、性別および膵臓の状態、レシピエントの体重、年齢、性別、健康状態、食物、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が様々である。
【００６６】
もう一つの様態として、本発明は、前記組成物を、糖尿病にかかった個体または糖尿病にかかる危険性がある個体に投与する段階を含む、糖尿病治療方法を提供する。
【００６７】
本発明で使用される用語、「投与」は、如何なる適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、組成物の投与経路は、目的組織に到達することができる限り、いかなる一般的な経路を通じて投与することができる。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与することができるが、これに限定されるものではない。また、組成物は、標的部位に移動することができる任意の装置によって投与することができる。
【００６８】
もう一つの様態として、本発明は、糖尿病の予防または治療用薬剤を製造するために、前記微細カプセルを含む組成物の用途を提供する。
【００６９】
以下、好ましい実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれによって限定されないことは、当業界の通常の知識を有する者にとって自明である。
【実施例】
【００７０】
合成例１．エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）二量体の製造
２，２−ジエトキシエチルアミン（２，２−ｄｉｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、ＤＡ）は、酸性環境でアルデヒドとして存在する。メタンスルホン酸（ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ＭＳＡ）下でエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）とＤＡを反応させ、アルデヒド媒介重合反応をさせてＥＧＣＧ二量体を製造した。
【００７１】
具体的には、１０ｍｌバイアルにテトラヒドロフラン３．８ｍｌ及びメタンスルホン酸７μｌを混合した上、暗室条件及び窒素気流下においてＥＧＣＧ  ２．２９ｇ（５ｍｍｏｌ）を添加してから、１〜２時間攪拌した。次に、冷却した１０ｍｌバイアルにテトラヒドロフラン１ｍｌとメタンスルホン酸０．２ｍｌとの混合溶媒に、２，２−ジエトキシエチルアミン１４５μｌを添加し、２０分〜３０分間攪拌して、２，２−ジエトキシエチルアミンのエトキシ基を除去し、アルデヒド基を露出させた。エトキシ基が除去された２，２−ジエトキシエチルアミンの溶液を事前に製造したＥＧＣＧ溶液にゆっくりと滴下（ｄｒｏｐ  ｗｉｓｅ）し、常温の暗室条件で一夜（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）反応させた。反応終了後、反応混合物をフラスコに移してから、減圧して溶媒を除去し、次にフラスコ内部を窒素気流に作成した後、密閉した。暗条件下で、前記密閉した容器にシリンジを利用して、脱イオン水１０ｍｌを添加して攪拌した。反応終了後、暗条件下で反応混合物に酢酸エチルおよび蒸留水を添加し、分別漏斗を使用して有機層と水層に分離した。水層を急速冷凍した後、凍結乾燥して、目的とするＥＧＣＧ二量体を得た。製造されたＥＧＣＧ二量体は、使用する前に、超低温冷凍庫に保管した。
【００７２】
下記反応式１で確認できるように、６、８炭素がアルデヒドと反応して二量体を形成する。このとき、結合態様に応じて製造されたＥＧＣＧ二量体は、８−８異性体、６−８異性体（２種類）と６−６異性体との混合物から得られる。これを確認するために、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および質量分析計（Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を使用して製造されたＥＧＣＧ二量体を分析した。図１は、ＨＰＬＣの結果であり、図２は、質量分析結果である。図１に示すように、４種類のＥＧＣＧ二量体の合成が観察された。一方、ＥＧＣＧ二量体が正常に合成されず、凝集体が形成された際には、６〜６．４分台でピークが現れた。
ＨＲＭＳ−ＥＳＩ：Ｃ４６Ｈ４０ＮＯ２２  ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値９５８．２０３６、実験値９５８．２０６２
【００７３】
【化６】
2021530429.tif 000008
【００７４】
合成例２．アルギン酸塩−ＥＧＣＧ接合体の製造
反応式２の方法でカルボジイミド媒介カップリング反応を利用して、カルボン酸基を有する高分子にＥＧＣＧ二量体を接合させる。アルギン酸塩（Ａｌｇｉｎａｔｅ）をＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）存在下、酸性条件（ｐＨ  ４．７）においてＥＧＣＧ二量体と一晩反応させ、ＥＧＣＧのアミン基とＨＡのカルボン酸がアミド結合させ、アルギン酸塩−ＥＧＣＧ接合体を製造する。
【００７５】
【化７】
2021530429.tif 000009
【００７６】
具体的には、暗室条件では、三口フラスコに０．４Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ  ５．２）２０．２ｍｌとＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２．５ｍｌとの混合溶液にアルギン酸塩２０２ｍｇを添加し、攪拌した。アルギン酸塩が完全に溶解されると、フラスコの内部を窒素雰囲気に交替して密閉した。０．４Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ  ５．２）３ｍｌにＮＨＳ  ８９ｍｇ（０．７８ｍｍｏｌ）を溶解させた後、シリンジを用いて添加した。脱イオン水２．３３ｍｌに、前記合成例１で製造したＥＧＣＧ二量体４ｍｇ（０．０８
２ｍｏｌ）を溶解させた後、シリンジを用いて添加した。次に、０．４Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ  ５．２）３ｍｌにＥＤＣ  ６６ｍｇ（０．７８ｍｍｏｌ）を溶解させた後、シリンジを用いて添加した。すべての反応は、窒素雰囲気下、暗室条件で攪拌させた。
【００７７】
次に、反応混合物をエタノール沈殿法で沈殿させ、未反応物（ＥＤＣ、ＮＨＳ、未反応ＥＧＣＧ二量体）を除去した。具体的には、窒素雰囲気下、脱イオン水１２５ｍｌに反応混合物を溶解させ、５Ｍ塩化ナトリウム水溶液１６．７ｍｌを添加した後、ｐＨを３に調整した。エタノール３１０ｍｌを添加した後、混合物を遠心分離用容器に移し入れ、超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）して沈殿させた。上澄み液を除去し、沈殿物を脱イオン水２５０ｍｌに溶解させ、５Ｍ塩化ナトリウム水溶液３３ｍｌを添加した後、ｐＨを３に調整した。エタノール６２０ｍｌを添加した後、混合物を遠心分離用容器に移し入れ、超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）して沈殿させた。上澄み液を除去し、沈殿物を５００ｍｌに溶解させ、５Ｍ塩化ナトリウム水溶液６７ｍｌを添加した後、ｐＨを３に調整した。エタノール１，２４０ｍｌを添加した後、混合物を遠心分離用容器に移し入れ、超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）して沈殿させた。上澄み液を除去し、沈殿物を脱イオン水３００ｍｌに溶解させた。
【００７８】
得られた溶解物を３５０Ｄａ透析膜を使用して、窒素雰囲気下で２４時間透析した。透析した溶液を急冷させ、凍結乾燥して、目的とするアルギン酸塩−ＥＧＣＧ（ｄｉ）接合体を得た。製造されたアルギン酸塩−ＥＧＣＧ（ｄｉ）接合体は、使用する前に、超低温冷凍庫に保管した。
【００７９】
合成例３．ＥＧＣＧ二量体の酸化
ＥＧＣＧは、大きく二つの方向に変性されることができ、そのうちの一つは、酸化であり、もう一つは、エピマー化である。前記変性は、ＥＧＣＧの濃度、ｐＨ、温度、酸素分圧などの様々な条件に応じて、その態様と速度が変わる。ＥＧＣＧが、マイクロモル濃度レベルで存在する場合には、速く酸化が進み、ミリモル濃度レベルで存在する場合には、それぞれのＥＧＣＧ分子が互いに酸化防止することにより、酸化速度が遅くなる。また、ＥＧＣＧは、ｐＨ  ２〜５．５の弱酸性条件では、酸化が抑制され、エピマー化が進むが、強酸または塩基性条件下では、酸化が速く進み、５０℃以上の温度条件では、ＥＧＣＧのエピマー化が起こるが、それより低い温度では酸化が進む。特に、極低温条件下でＥＧＣＧの変性が非常にゆっくりと進むことが確認された。一方、酸素分圧が低いほどＥＧＣＧの酸化が抑制され、エピマー化が進み、ｐＨまたは濃度の条件が整っていない環境のＥＧＣＧは、空気中に露出された場合に速く酸化が起こり凝集体が形成されることができる。
【００８０】
したがって、凝集体が形成されていないＥＧＣＧ二量体の酸化のためにＥＧＣＧの濃度、ｐＨ、温度、酸素分圧の調整を行った。
【００８１】
アルギン酸塩−ＥＧＣＧ（ｄｉ）接合体の酸化を下記に示した。
【００８２】
【化８】
2021530429.tif 000010
【００８３】
製造例
アルギン酸塩対ＥＧＣＧ二量体の割合の確立
アルギン酸塩−ＥＧＣＧ接合体のハイドロゲル形成の有無を確認
最適化された細胞皮膜用微細カプセルを製造するためには、アルギン酸塩−ＥＧＣＧ接合体が空気中に露出されてもゲル化が進んでいない溶液の状態で存在しなければならない。これを確立するためにアルギン酸塩に接合されるＥＧＣＧの種類と量を変化させながら、アルギン酸塩対比ＥＧＣＧの量を最適化した。
【００８４】
１．ＥＧＣＧ単量体の使用
従来の方法に基づいてＥＧＣＧ単量体２０２ｍｇを使用してアルギン酸塩に接合させた。アルギン酸塩のＥＧＣＧが多量に接合されたが、酵素がない環境でも、空気にさらされ
たときに速くゲル化された。
【００８５】
２．ＥＧＣＧ二量体９〜９９ｍｇ使用
ＥＧＣＧ二量体９９ｍｇを使用して合成例２の方法でアルギン酸−ＥＧＣＧ接合体を製造した。しかし、図３に示すように、接合体は、空気中の酸素にさらされて、すぐにハイドロゲルを形成した。形成されたハイドロゲルのレオロジー物性を測定し、これを図４に示した。形成されたハイドロゲルの物性は、微細カプセルに適用可能なレベルであったが、空気にさらされるとすぐに、ゲル化が起こるので、微細カプセルの工程に適用することは困難であった。したがって、アルギン酸塩に接合されるＥＧＣＧ二量体の量を減らす必要性があった。
【００８６】
３．ＥＧＣＧ二量体４ｍｇを使用
ＥＧＣＧ二量体４ｍｇを使用して合成例２の方法でアルギン酸−ＥＧＣＧ接合体を製造した。製造された接合体は、空気中でゲル化されなかった。これに図５に示した。
【００８７】
微細カプセルの製造
比較例１カルシウム−アルギン酸塩カプセルの製造
公知の製造方法に基づいてカルシウム−アルギン酸塩カプセルを製造した。
【００８８】
比較例２．アルギン酸塩−ＥＧＣＧ（ｍｏｎｏ）微細カプセルの製造
ＥＧＣＧ単量体２０２ｍｇを使用してアルギン酸塩−ＥＧＣＧ（ｍｏｎｏ）微細カプセルを製造した。
【００８９】
比較例３．アルギン酸塩−ＥＧＣＧ（ｄｉ）微細カプセルの製造
ＥＧＣＧ二量体４ｍｇ使用して製造されたアルギン酸塩−ＥＧＣＧ（ｄｉ）接合を用いて微細カプセルを製造した。カプセル製造時のカルシウムイオンの濃度は、１００ｍＭまたは１Ｍであった。
【００９０】
図６に示すように、カプセルが正常に形成されなかった。カプセル化工程のうち、このような形態は、一般的にアルギン酸塩の濃度が適正な範囲を外れたり、またはカルシウムイオンの濃度が低いとき現れる。本発明では、ＥＧＣＧの抗酸化特性がカルシウムイオン媒介されたアルギン酸塩架橋を阻害することを把握した。一般的に、ＥＧＣＧのようなカテキンは、金属陽イオンと結合し、キレートすることができる。反応物内に存在していた少量のカルシウムイオンがＥＧＣＧと結合してＥＧＣＧの構造を変化させ、ＥＧＣＧの抗酸化能を減少させると予測される。
【００９１】
比較例４．アルギン酸塩／アルギン酸塩−ＥＧＣＧ（ｄｉ）微細カプセルの製造
ＥＧＣＧによる架橋阻害の問題を解消すべく純粋なアルギン酸溶液とアルギン酸塩−ＥＧＣＧ（ｄｉ）接合を混合した混合物を使用してカプセル化を行った。反応は、ＥＧＣＧの酸化を防止するために、窒素雰囲気下、暗室条件で実施した。
【００９２】
まず、アルギン酸対アルギン酸−ＥＧＣＧ接合体の混合比の最適化のために、アルギン酸対アルギン酸−ＥＧＣＧ接合体の混合比がそれぞれ１：１、２：１及び３：１重量部である混合物を製造し、カプセル化した。図７に示すように、アルギン酸−ＥＧＣＧ接合体１重量部に対してアルギン酸塩の混合比が２重量部以上である場合に正常に微細カプセルが形成された。
【００９３】
カルシウムイオン依存性及び分解度の評価
比較例１及び比較例４（アルギン酸塩及びアルギン酸塩−ＥＧＣＧ接合体の混合微細カプセル）により製造された微細カプセルのカルシウムイオン依存性及び分解度を評価した
。具体的には、カルシウムイオンキレート剤ＥＤＴＡで処理した後、微細カプセルの形態を確認し、これを図８に示した。
【００９４】
比較例４の微細カプセルは、比較例１の微細カプセルに比べてカルシウムイオンキレート剤に抵抗性を持つことが確認された。しかし、分解度においては大きな差異を示さなかったことが見られ、分解度の改善効果が大きくないことが確認された。一方、ＨＲＰ酵素を処理した場合には、比較例４の微細カプセルは、比較例１の微細カプセルに比べて速く分解されたが、これは残存したＨＲＰのＥＤＴＡ触媒作用によるものと判断された。
【００９５】
実施例１．表面改質アルギン酸塩微細カプセルの製造
カルシウム−アルギン酸塩微細カプセルをＥＧＣＧ二量体で表面改質した。最適化のために、様々な反応時間、ＥＧＣＧ二量体の濃度及び酸化処理の有無の条件で微細カプセルを製造した。
【００９６】
反応時間
ゲル化の傾向を増加させることなく、ＥＧＣＧの接合量を増加させるために、カルシウム−アルギン酸塩カプセルを製造した後、ＥＧＣＧ二量体を接合させた。
【００９７】
公知の方法で、カルシウム−アルギン酸塩カプセルを製造した。製造されたカプセルをＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ  ７．４）で４回洗浄し、次にＭＥＳ緩衝液（ｐＨ  ６．０）で２回洗浄し、ＭＥＳ緩衝液５０ｍｌで洗浄されたカプセルを保管した。暗室条件下で、カプセルが存在するＭＥＳ緩衝液にＭＥＳ緩衝液２ｍｌに溶解させたＮＨＳ  ４０ｍｇ（０．３４７ｍｍｏｌ）を添加して撹拌した。次に、ＥＧＣＧ二量体を複数の濃度（０．３４７ｍｍｏｌと０．１７４ｍｍｏｌ）に添加して撹拌した。次に、ＭＥＳ緩衝液２ｍｌに溶解させたＥＤＣ  ６６ｍｇ（０．０３４７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を時間帯別（１０分、２０分、３０分、及び６０分）に確認して、表面改質の状態をチェックした。すべての反応は暗室条件下で行われた。
【００９８】
また、酸化処理による影響を確認するために、反応時間０分でＨＲＰ  １  Ｕ／ｍｌを添加して３０分間攪拌した。
【００９９】
この時、反応に使用されたＥＤＣ、ＮＨＳの量は、アルギン酸の単量体モル数を基準にモル比がＥＤＣ：ＮＨＳ：アルギン酸塩＝１：１：１となるように処理した。
【０１００】
図９に示すように、反応時間１０分、２０分、３０分、及び６０分ですべてのアルギン酸塩カプセルの表面改質が正常に行われた。反応時間が増加するほどＥＧＣＧの凝集が多く形成されており、微細カプセルの表面に接合されたＥＧＣＧ二量体に他のＥＧＣＧ二量体が結合され、ＥＧＣＧが微細カプセルの内部に浸透された形態を有することが観察された。
【０１０１】
追加実験では、細胞の損傷を最小化するために、反応時間は１０分〜２０分に設定して実施した。
【０１０２】
反応時間、ＥＧＣＧ二量体の濃度及びＨＲＰ処理
微細カプセルをＨＲＰ処理の有無、様々な反応時間及びＥＧＣＧ二量体の濃度で改質し、この画像を図１０に示した。
【０１０３】
ＥＧＣＧの結合度は、反応時間よりは処理されたＥＧＣＧ二量体の濃度に大きく影響されることが確認された。
【０１０４】
また、光学顕微鏡では、酸化するか否かが有意に観測されなかったが、肉眼では色の変化を通じて容易に観測された。図１１及び図１２は、ＨＲＰ処理の有無による表面改質アルギン酸塩微細カプセルの色の変化を確認した結果である。図１１は、左側はＨＲＰ処理が施されておらず、右側はＨＲＰ処理が施されたものである。ＨＲＰによって微細カプセル表面のＥＧＣＧは、酸化されることによってＥＧＣＧは、互いに凝集され、赤色に変わった。
【０１０５】
実施例２．表面改質されたアルギン酸塩カプセルの製造工程及びアルギン酸塩コーティングされた表面改質アルギン酸塩微細カプセルの製造
ＥＧＣＧ二量体は、アミン基を含む。アルギン酸塩と直接接合されたＥＧＣＧ二量体の場合には、アミン基がアルギン酸塩とアミド結合を形成するので、量で荷電されないが、ＥＧＣＧ間の酸化によって結合されたＥＧＣＧ二量体の場合には、アミン基を有しているので正電荷を持つ。従来の研究によると、正電荷を持つ生体材料は、中性または負電荷を持つ生体材料に比べて免疫反応と炎症が多く誘発される。
【０１０６】
不要な免疫反応の発生を防ぐために、実施例１の表面改質アルギン酸塩微細カプセルの外側をアルギン酸でコーティングした。
【０１０７】
公知の方法で、カルシウム−アルギン酸塩カプセルを製造した。製造されたカプセルをＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ  ７．４）で４回洗浄し、次にＭＥＳ緩衝液（ｐＨ  ６．０）で２回洗浄し、ＭＥＳ緩衝液５０ｍｌで洗浄されたカプセルを保管した。暗室条件下で、カプセルが存在するＭＥＳ緩衝液にＭＥＳ緩衝液２ｍｌに溶解させたＮＨＳ  ４０ｍｇ（０．３４７ｍｍｏｌ）を添加して撹拌した。次に、ＥＧＣＧ二量体を複数の濃度（０．３４７ｍｍｏｌ及び０．１７４ｍｍｏｌ）に添加して撹拌した。次に、ＭＥＳ緩衝液２ｍｌに溶解させたＥＤＣ  ６６ｍｇ（０．０３４７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を時間帯別（１０分、２０分、３０分、及び６０分）に確認して、表面改質の状態をチェックした。すべての反応は暗室条件下で行った。
また、酸化処理による影響を確認するために、ＨＲＰ処理／非処理した。
【０１０８】
実施例３．ＥＤＴＡ処理表面改質アルギン酸塩微細カプセルの製造
実施例１及び実施例２の微細カプセルを１００ｍＭ  ＥＤＴＡで処理（１０分及び２０分）して微細カプセルに中空を形成した。
【０１０９】
試験例１．構造分析
表面分析
図１３は、比較例１、実施例１、実施例２の微細カプセルを走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観測したものである。ＳＥＭ画像は、それぞれ×７０、×１０，０００、×５０，０００、×１００，０００の倍率で撮影した。比較例１と比較して、実施例１の微細カプセルは、表面から特異的形態が示されたことが観測された。一方、実施例２の微細カプセル表面では、実施例１で示されたような特異な形態が消えたことが確認された。これにより、ＥＧＣＧ二量体で改質されたアルギン酸塩微小カプセルの表面がアルギン酸塩でコーティングされたことが確認された。
【０１１０】
内部構造の分析
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で実施例１及び実施例２の微細カプセル内部構造を分析し、図１４に示した。
【０１１１】
ＳＥＭ画像からも、コア−シェル構造が形成されたことが確認できる。外膜の厚みの場合、ＨＲＰ処理を施した微細カプセルの方がＨＲＰ未処理の微細カプセルよりもより厚く形成されており、気孔発達に優れていた。
【０１１２】
図１５は、膵島を、実施例１または２による表面改質アルギン酸塩微細カプセルに皮膜化する過程を模式化して示したものである。
【０１１３】
まず、膵島をカルシウム−アルギン酸塩微細カプセルに皮膜化する。次に、カルシウム−アルギン酸塩微細カプセルの表面にＥＧＣＧ二量体を接合させる。アルギン酸塩と結合したＥＧＣＧ二量体は、内部のカルシウムをキレートするため、カルシウム−アルギン酸ハイドロゲルは、溶解される。このような過程を通じて内部アルギン酸塩が一部溶解され、アルギン酸塩コア／アルギン酸塩−ＥＧＣＧ二量体シェル構造の微細カプセルが形成される。この時、前記カルシウム−ハイドロゲルの溶解は、全部または一部のみ起こり得る。
【０１１４】
このような構造は、従来技術による微細カプセルに比べて酸素及び栄養素の拡散が容易なため、カプセル化した膵島の生存度を向上させることができる。
【０１１５】
カルシウムイオン依存性及び分解度の評価
ＥＧＣＧ二量体の使用量、反応時間、およびＨＲＰ処理による比較例１及び実施例１の微細カプセルのカルシウムイオン依存性及び分解度を評価した。比較例１及び実施例１の微細カプセルを、カルシウムイオンキレート剤として知られたＥＤＴＡ（１００ｍＭ）を処理し、形態変化を確認した。
【０１１６】
図１６に開示されたように、比較例１のカルシウム−アルギン酸塩微細カプセルは、１００ｍＭ  ＥＤＴＡで２０分間処理した条件で完全に分解され、溶液の状態に変わった。一方、図１７に示すように、実施例１の微細カプセルは、ＥＤＴＡ処理にも微細カプセルが崩壊されず、形態が維持された。これは、本発明による微細カプセルがＥＤＴＡによるカルシウムイオンキレート作用抵抗性を持つことを意味する。ＥＤＴＡ処理はむしろ、実施例１の微細カプセルに中空（ｈｏｌｌｏｗ）を形成させ、カプセル内部に物質拡散及び酸素供給に利点を供することが確認された。物性（物理的な損傷に対する安定性）は、ＥＤＴＡ非処理の微細カプセルがＥＤＴＡ処理された微細カプセルよりも優れていた。
【０１１７】
一方、微細カプセル製造時に使用されたＥＧＣＧ二量体の量が多ければ多いほど、反応時間が長いほど分解度が増加する傾向を示したが、有意なレベルではなかった。また、ＨＲＰ処理された実施例１の微細カプセルの場合、分解度が増加したが、これは残存するＨＲＰがＥＤＴＡの活性を増加させることに起因したものと思われる。
【０１１８】
したがって、ＥＤＴＡの処理時間及び処理濃度を調節して微細カプセルの形を最適化することにより、皮膜化された膵島の生存をさらに向上させ、物理的な損傷から保護することができる。
【０１１９】
レオロジー特性評価
比較例１、比較例３及び実施例１による微細カプセルの物性を確認するためにレオロジー特性を測定し、これを下記図１８〜図２１に示した。
【０１２０】
図１８は、レオロジー（Ｒｈｅｏｌｏｇｙ）測定結果であり、図１９〜図２１は、粘弾性測定結果である。
【０１２１】
図１９を参考にすれば、比較例１に比べて比較例３の微細カプセルは、低物性を示したが、これはＥＧＣＧのカルシウムイオンキレート作用によるものと推定される。実施例１の微細カプセルは、ＨＲＰの添加の有無とは無関係に、比較例１の微細カプセルよりも高い物性を示した。一方、ＨＲＰ処理された微細カプセルは、ＨＲＰ未処理の微細カプセル
よりも低い物性を示したが、これはＨＲＰ処理により、より厚いＥＧＣＧシェルが形成されたにもかかわらず、ＨＲＰ処理によりＥＧＣＧのカルシウムイオンキレート作用がより活発に行われ、コアの物性が低下したものと予想される。
【０１２２】
実施例１の微細カプセルを製造してから２週間保管した後、粘弾性の変化を確認した（図２１）。ＨＲＰ処理された微細カプセルの場合、粘弾性が減少したが、ＨＲＰ処理された微細カプセルは、粘弾性がほとんど維持された。これは、ＨＲＰ処理された微細カプセルは、コアのアルギン酸の溶解が促進され、物性が一部減少したが、ＨＲＰを介してＥＧＣＧ間、安定した結合が形成されているからである。一方、ＨＲＰ未処理微細カプセルの場合には、製造時点では完全に溶解されなかったコアのアルギン酸による高物性が示されたが、保管中にコアのアルギン酸が溶解され、物性の減少が生じたと推定された。
【０１２３】
実施例４．膵島のカプセル化
実施例１による微細カプセルの製造方法を使用して膵島をカプセル化した。微細カプセル製造時、ＨＲＰ処理の有無による特性を光学顕微鏡で確認し、これを図２２に示した。
【０１２４】
図２２の上段は、ＨＲＰ未添加の膵島のカプセル化表面改質アルギン酸塩微細カプセルの光学顕微鏡画像であり、図２２の下段は、ＨＲＰ添加された膵島のカプセル化表面改質アルギン酸塩微細カプセルの光学顕微鏡画像である。コアのアルギン酸塩は、一部は溶液の形態で溶解され、一部はハイドロゲルの状態を有するスラリーの形態で観測された。物理的な損傷から細胞を保護しながら、生存度を向上させるに適するように膵島の皮膜化がよくなることが確認された。
【０１２５】
実施例５．ＥＧＣＧ量による表面改質微細カプセルの分解抵抗性を確認
ＥＧＣＧ使用量による表面改質微細カプセルの分解抵抗性を確認するために、アルギン酸塩５ｍｌ当たりＥＧＣＧ添加量が１０．５、２１、４２、および８４ｍｇのときの微細カプセルの形態を光学顕微鏡で確認して、図２３に示した。ＥＤＴＡを介したＣａ２＋除去時に発生する分解に対する抵抗性を測定し、ＥＧＣＧの使用量がアルギン酸塩（ａｌｇｉｎａｔｅ）５ｍｌ当たり８４ｍｇ以上の時から抵抗性が現れることを確認した。
【０１２６】
実施例６．ＥＧＣＧ量による表面改質微細カプセルの外部ＥＧＣＧ層形成の有無を確認
ＥＧＣＧ量による表面改質微細カプセルの外部ＥＧＣＧ層が形成されるか否かを確認するために、ＥＧＣＧ添加量が１０．５、２１、４２、および８４ｍｇのときの外部層の形態を共焦点光学顕微鏡で確認して、図２４に示した。分解抵抗性は、コアアルギン酸塩（ａｌｇｉｎａｔｅ）の外部に形成されるＥＧＣＧ層によって示され、ＥＧＣＧ層内部の結合は、Ｃａ２＋とは無関係にＥＧＣＧ自体の自動酸化（ａｕｔｏｏｘｉｄａｔｉｏｎ）によって形成されるので、一般的なアルギン酸塩の溶解過程とは相違した。
【０１２７】
前記実施例からＥＧＣＧ層の形成は、表面改質微細カプセルの製造時に使用されるＥＧＣＧの量がアルギン酸（ａｌｇｉｎａｔｅ）５ｍｌ当たり８４ｍｇ以上の場合、明らかに形成されることを確認した。
【０１２８】
実施例７．微細カプセル内部膵島のグルコース反応性及びインスリン分泌能を確認
一般膵島、アルギン酸塩微細カプセル内部膵島及び表面改質微細カプセル内部膵島のグルコース反応性インスリン分泌能を確認するため、ＧＳＩＳ（Ｇｌｕｃｏｓｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）分析を行った結果を図２５に示した、その結果、微細カプセル内部の膵島は一般膵島に比べてグルコース反応性が低いことを確認した。これは微細カプセル構造によりインスリンの拡散が滞っていることに起因した結果である。しかし、アルギン酸塩、微細カプセルの内部膵島と表面改質微細カプセル内部膵島の場合、グルコース反応性で有意な差を示さなかった。これは、表面改質工程が
内部膵島の機能に影響を及ぼさないことを意味する。
【０１２９】
実施例８．糖尿疾患のマウス動物モデルにおいて、表面改質微細カプセル化膵島の移植を通じた効能、持続期間の評価及び回収された微細カプセルの効能、持続期間および形態の分析
ＥＧＣＧ  ｄｉｍｅｒ  ８４ｍｇを用いて製造した表面改質された微細カプセルの血中当たり濃度を図２６に示し、表面改質された微細カプセル及びアルギン酸塩微細カプセルの効果及び形態を分析するために膵島移植による糖尿病疾患のマウスの血糖濃度及び体重を図２７に示し、移植後６７日目と８５日目に移植された微細カプセルを回収してこれの形態を光学顕微鏡で観察して、図２８に示した。
【０１３０】
まず、血糖調節期間の場合、表面改質微細カプセル及びアルギン酸塩微細カプセルなど統計的非有効性で、約６０日内外で効能が持続された。回収された微細カプセルの形態の場合には、表面改質微細カプセルがアルギン酸塩微細カプセルに比べて、より安定的に維持されたことが確認された。表面改質微細カプセルの場合、表面に細胞吸着が示されたもの以外の免疫反応が発生しないのに対し、アルギン酸塩微細カプセルの場合、内部に組織が形成されたことを確認した。このような結果を総合して見たとき、ＥＧＣＧを通じたアルギン酸塩（ａｌｇｉｎａｔｅ）微細カプセルの表面改質は、微細カプセルの構造安定性を改善する効果的な方法であることを確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年4月30日(2021.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コアが流動床のアルギン酸塩であり、
シェルがエピガロカテキンガレート二量体で架橋されたアルギン酸塩ハイドロゲルである、コア−シェル構造の表面改質アルギン酸塩微細カプセル。
【請求項２】
前記シェルのエピガロカテキンガレート二量体の一部は、他のエピガロカテキンガレート二量体と酸化によって互いに結合されたものであることを特徴とする請求項１に記載の微細カプセル。
【請求項３】
前記シェルは、アルギン酸塩コーティング層をさらに含むものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の微細カプセル。
【請求項４】
前記アルギン酸塩コーティング層は、シェルのエピガロカテキンガレート二量体と共にアミド結合を形成したものであることを特徴とする請求項３に記載の微細カプセル。
【請求項５】
前記シェルは、３次元的に連結された多数個の中空を含むものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の微細カプセル。
【請求項６】
前記コアは、液状のアルギン酸または液状のアルギン酸とアルギン酸ハイドロゲルとの混合物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の微細カプセル。
【請求項７】
細胞皮膜用であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の微細カプセル。
【請求項８】
（１）カルシウム−アルギン酸塩微細カプセルを製造するコア製造段階と、
（２）カルシウム−アルギン酸塩微細カプセル及びエピガロカテキンガレート二量体を反応させて前記カルシウム−アルギン酸塩微細カプセルの表面にアルギン酸塩−エピガロカテキンガレート二量体架橋物を形成されるシェルの製造段階と、及び
（３）カルシウム−アルギン酸塩のカルシウムイオンをエピガロカテキンガレート二量体にキレートさせるコア液化段階と、を含み、
前記コアは、流動床のアルギン酸塩であり、シェルがエピガロカテキンガレート二量体で架橋されたアルギン酸塩ハイドロゲルである、表面改質アルギン酸塩微細カプセルの製
造方法。
【請求項９】
前記製造されたシェルのエピガロカテキンガレート二量体を、隣接するエピガロカテキンガレート二量体と酸化結合させる段階をさらに含むものであることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記製造されたシェルをアルギン酸塩でコーティングさせる段階をさらに含むものであることを特徴とする請求項８又は９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記製造された表面改質アルギン酸塩微細カプセルを、カルシウムイオンキレート剤と反応させて中空を形成させる段階をさらに含むものであることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
（ａ）細胞をカルシウム−アルギン酸塩ハイドロゲル微細カプセルに皮膜化するコアの製造段階と、
（ｂ）細胞を皮膜化したカルシウム−アルギン酸塩ハイドロゲル微細カプセルをエピガロカテキンガレート二量体と反応させ、カルシウム−アルギン酸塩微細カプセルの表面にアルギン酸塩−エピガロカテキンガレート二量体架橋物を形成させるシェルの製造段階と、及び
（ｃ）前記カルシウム−アルギン酸塩のカルシウムイオンをエピガロカテキンガレート二量体にキレートさせ、前記細胞周辺のハイドロゲルを液化させる段階と、を含むコア−シェル構造の表面改質アルギン酸塩微細カプセルを用いた細胞皮膜化方法。
【請求項１３】
前記製造されたシェルのエピガロカテキンガレート二量体を、隣接するエピガロカテキンガレート二量体と酸化結合させる段階をさらに含むものであることを特徴とする請求項１２に記載の細胞皮膜化方法。
【請求項１４】
前記製造されたシェルをアルギン酸塩でコーティングさせる段階をさらに含むものであることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の細胞皮膜化方法。
【請求項１５】
前記製造された表面改質アルギン酸塩微細カプセルを、カルシウムイオンキレート剤と反応させて中空を形成させる段階をさらに含むものであることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の細胞皮膜化方法。
【請求項１６】
前記細胞は、膵島細胞であることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の細胞皮膜化方法。
【請求項１７】
糖尿病の予防または治療に使用するための請求項１〜７のいずれか一項によるカプセルを含む組成物。
【請求項１８】
糖尿病の予防または治療用の薬剤を製造するための請求項１〜７のいずれか一項によるカプセルを含む組成物の使用。
【国際調査報告】
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