(57)【要約】  本開示の態様は、株操作のための、液体に基づくワークフローに関する。株操作では、細胞は、改変プロセスを受けて、細胞の所望の1つ又は複数の変化を獲得する。一部の細胞は1つ又は複数の変化を受容し、一部の細胞は受容しない。1つ又は複数の変化を受容した細胞の集団を選択するための、液体に基づく方法が本明細書において提供される。形質転換した細胞からマーカーを除去するための、液体に基づく方法、及び細胞のクローン的に純粋な集団を単離するための、液体に基づく方法もまた本明細書において提供される。
2021530211.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の混合集団を用意する工程であって、混合集団が、第1の変異細胞及び非変異細胞を含み、第1の変異細胞が、左又は右ホモロジーアームに組み込まれた標的DNA配列、選択マーカー、及び対抗選択マーカーをゲノムに組み込んでおり、選択マーカーが、選択剤に対する耐性をコードし、対抗選択マーカーが、対抗選択条件において細胞死を導く1種又は複数種のタンパク質をコードする、工程、
液体中で、混合集団において非変異細胞に対して第1の変異細胞を濃縮して、第1の変異細胞の同種集団を作製する工程、並びに
液体中で、第1の変異細胞に関して濃縮した集団のうちの一部の細胞から選択マーカー及び対抗選択マーカーを除去する工程
を含む方法。
【請求項２】
固形増殖培地と選択又は対抗選択添加剤とを含有するプレートにおいてクローン集団を生成することなく実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
形質転換プロセスを実施して混合集団を作製する工程を更に含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
形質転換プロセスを実施した後、選択剤を含む液体培地を混合集団に加えて、第1の変異細胞を選択する工程を更に含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
非変異細胞が残存細胞を含み、残存細胞が代謝的に不活性な細胞である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
残存細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程が、凍結保護剤を加える工程、並びに次いで混合集団を凍結及び解凍する工程を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
非変異細胞が、選択剤に対する耐性を自発的に発生するが標的DNA配列を有しない細胞を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
選択剤に対する耐性を自発的に発生するが標的DNA配列を有しない細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程が、混合集団を凍結及び解凍する工程を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
非変異細胞が、選択マーカーを含む、組み込まれていないプラスミドを保有し、選択剤に対して耐性であるが、数を増加させることができない、プラスミドに基づく残存細胞を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
プラスミドに基づく残存細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程が、混合集団細胞を希釈し、更に増殖させる工程を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
混合集団において非変異細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程が、混合集団を凍結及び解凍する工程を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
凍結及び解凍する工程が、形質転換後細胞回収の作業、及び選択剤を含む液体培地を混合集団に加える作業の後に実施される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
混合集団から非変異細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程が、解凍後に混合集団細胞を希釈し、更に増殖させる工程を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
第1の変異細胞に関して濃縮した集団の細胞から選択マーカー及び対抗選択マーカーを除去する工程が、第2の混合集団を作製する工程を含み、第2の混合集団が、第1の変異細胞、選択マーカー及び対抗選択マーカーを含まない標的DNA配列をゲノムに組み込んだ第2の変異細胞、並びに基準株細胞を含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
第2の混合集団の細胞を単離する工程を更に含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
第2の混合集団の細胞を単離する工程が、個々の細胞の光学的同定を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
細胞を単離する工程が、光学的に同定された個々の細胞の単一細胞分注を更に含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
細胞を単離する工程が、生死判定染色、蛍光タンパク質、及びレポーティング試薬からなる群のうちの1つ又は複数を用いて選別する工程を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１９】
濃縮した集団の細胞を限界希釈プロセスを経て単離する工程を更に含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
濃縮した集団の、対抗選択剤を含有する複数のウェルへの限界希釈を、実質的に全てのウェルが対抗選択後も生存する細胞を1つ以下含有するように実施する工程を更に含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞が、細菌細胞及び真菌細胞から選択される、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
細胞がグラム陰性細菌細胞である、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
細胞の混合集団を用意する工程であって、混合集団が、第1の変異細胞及び非変異細胞を含み、第1の変異細胞が、左又は右ホモロジーアームに組み込まれた標的DNA配列、選択マーカー、及び対抗選択マーカーをゲノムに組み込んでおり、選択マーカーが、選択剤に対する耐性をコードする、工程、並びに
液体中で、混合集団において非変異細胞に対して第1の変異細胞を濃縮して、第1の変異細胞の同種集団を作製する工程
を含む方法。
【請求項２４】
固形増殖培地と選択剤とを含有するプレートにおいてクローン集団を生成することなく実施される、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
非変異細胞が、選択マーカーを含む、組み込まれていないプラスミドを保有し、選択剤に対して耐性であるが、数を増加させることができない、プラスミドに基づく残存細胞を含む、請求項23又は24に記載の方法。
【請求項２６】
非変異細胞が、選択剤に対する耐性を自発的に発生するが標的DNA配列を有しない細胞を含む、請求項23から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
選択剤に対する耐性を自発的に発生するが標的DNA配列を有しない細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程が、混合集団を凍結及び解凍する工程を含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
非変異細胞が、選択マーカーを含む、組み込まれていないプラスミドを保有し、選択剤に対して耐性であるが、数を増加させることができない、プラスミドに基づく残存細胞を含む、請求項23から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
プラスミドに基づく残存細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程が、混合集団細胞を希釈し、更に増殖させる工程を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
混合集団において非変異細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程が、混合集団を凍結及び解凍する工程を含む、請求項23から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
凍結及び解凍する工程が、形質転換後細胞回収、及び選択剤を含む液体培地を混合集団に加える工程の直後に実施される、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
非変異細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程が、解凍後に、選択剤を含有する液体培地での混合集団細胞の第1の希釈及び更なる増殖を含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
非変異細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程が、選択剤を含有する液体培地での混合集団細胞の第2の希釈及び更なる増殖を含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
細胞が、細菌細胞及び真菌細胞から選択される、請求項23から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
細胞がグラム陰性細菌細胞である、請求項23から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
液体中で、標的DNA配列及び1つ又は複数の対抗選択マーカーをゲノムに組み込んだ第1の変異細胞の実質的同種集団を受け取る工程であって、1つ又は複数の対抗選択マーカーが、対抗選択条件において細胞死を導く1種又は複数種のタンパク質をコードする、工程、
液体中で、対抗選択条件において第1の変異細胞の実質的同種集団を培養して、対抗選択マーカーを含まない標的DNA配列をゲノムに組み込んだ第2の変異細胞を作製する工程、並びに
液体中で、第2の変異細胞のクローン的に単離された集団を作製する工程
を含む方法。
【請求項３７】
固形増殖培地と対抗選択剤とを含有するプレートにおいてクローン集団を生成することなく実施される、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
第2の混合集団を作製する工程を更に含み、第2の混合集団が、第2の変異細胞及び基準株細胞を含む、請求項36又は37に記載の方法。
【請求項３９】
個々の第2の変異細胞の光学的同定を更に含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
第2の変異細胞のクローン的に単離された集団を作製する工程が、光学的に同定された個々の細胞の単一細胞分注を含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
クローン的に単離された集団を作製する工程が、生死判定染色、蛍光タンパク質、及びレポーティング試薬からなる群のうちの1つ又は複数を用いて選別する工程を含む、請求項36から40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
第1の同種集団の、対抗選択剤を含有する複数のウェルへの限界希釈を、実質的に全てのウェルが対抗選択後も生存する細胞を1つ以下含有するように実施する工程を更に含む、請求項36から40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
細胞が、細菌細胞及び真菌細胞から選択される、請求項36から42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
細胞がグラム陰性細菌細胞である、請求項36から42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
(a)形質転換細胞及び非形質転換細胞を含む細胞の集団を用意する工程であって、形質転換細胞が選択マーカーを含む、工程、
(b)選択マーカーを選択する液体培地中で細胞の集団を培養する工程、並びに
(c)液体中に、細胞のクローン的に純粋な複数の集団をもたらす工程
を含む方法。
【請求項４６】
固形増殖培地と選択添加剤とを含有するプレートにおいてクローン集団を生成することなく実施される、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
(c)が、液体中で、細胞集団の細胞を単離して、複数の単離された単一細胞集団をもたらす工程を含む、請求項45又は46に記載の方法。
【請求項４８】
(c)が、単離された細胞を液体培地中で培養して、細胞のクローン的に純粋な複数の集団をもたらす工程を更に含む、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
細胞を単離する工程が限界希釈プロセスを含む、請求項47又は48に記載の方法。
【請求項５０】
細胞のクローン的に純粋な集団の遺伝子型を決定する工程を更に含む、請求項45から49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
個々の細胞の光学的同定を更に含む、請求項47に記載の方法。
【請求項５２】
複数の単一細胞集団をもたらす工程が、光学的に同定された個々の細胞の単一細胞分注を含む、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
複数の単離された単一細胞集団をもたらす工程が、生死判定染色、蛍光タンパク質、及びレポーティング試薬からなる群のうちの1つ又は複数を用いて選別する工程を含む、請求項47に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
参照による組込み
PCT願書は、本出願の一部として本明細書と同時に提出される。同時に提出されるPCT願書において同定される、本出願がその利益又は優先権を主張する各出願は、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、微生物株操作のためのワークフローに関する。より詳細には、本開示は、固形培地へのプレーティングを低減又は排除する、液体に基づくワークフローに関する。
【背景技術】
【０００３】
微生物株操作は、1つ又は複数の所望の変化を含む細胞と含まない細胞とを含む細胞の混合集団を作製する、形質転換等の細胞編集プロセスを伴う。形質転換又は他の編集プロセス後、細胞は、所望の変化を含まない細胞を死滅させる選択又は対抗選択添加剤を含む、寒天等の凝固剤を含有する固形増殖培地にプレーティングされ得る。細胞を、収集、遺伝子型決定、及び保管することができるように、別個のコロニーが現れるまで増殖し、手動で又はコロニー採取機を使用して採取される。固形培地にプレーティングすること、及び固形培地からサンプリングすることは、場合によってはプレーティングが数時間かかり、コロニー成長が数日かかるため、厄介で時間がかかる。更に、寒天培地は汚染されやすく、プレートに注ぐことを必要とし、手動採取は冗長であり、コロニー採取機は多くの場合、自動化株操作ワークフローにおける短所であり、エラー又は失敗を導入する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許公開第2011/0045563号
【特許文献２】米国特許第7,659,097号
【特許文献３】米国特許公開第2010/0297749号
【特許文献４】米国特許公開第2009/0282545号
【特許文献５】国際特許公開第WO2011/034863号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Berka及びBarnett、Biotechnology Advances、(1989)、7(2):127〜154頁
【非特許文献２】Romanosら、Yeast、(1992)、8(6):423〜488頁
【非特許文献３】Saunders及びWarmbrodt、「Gene Expression in Algae and Fungi, Including Yeast」、(1993)、National Agricultural Library、Beltsville、Md.
【非特許文献４】Lindbergら、Metab. Eng.、(2010) 12(1):70〜79頁
【非特許文献５】Reyratら、1998「Counterselectable Markers: Untapped Tools for Bacterial Genetics and Pathogenesis.」Infect Immun. 66(9): 4011〜4017頁
【非特許文献６】Christie, P. J.及びGordon, J. E.、2014「The Agrobacterium Ti Plasmids」Microbiol SPectr. 2014、2(6)、10.1128
【非特許文献７】Davis, L.、Dibner, M.、Battey, I.、1986「Basic Methods in Molecular Biology」
【非特許文献８】Gietzら、Nucleic Acids Res. 27:69〜74頁(1992)
【非特許文献９】Itoら、J. Bacterol. 153:163〜168頁(1983)
【非特許文献１０】Becker及びGuarente、Methods in Enzymology 194:182〜187頁(1991)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
株操作を実施する時間を減少させることが望ましい。寒天に基づく工程及びコロニー採取を低減又は排除することが更に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、遺伝的に変更された微小生物のクローン的に純粋な試料を液体中で単離するための方法を提示する。方法は、液体培地中での選択及び/又は対抗選択を伴う。方法は、クローン的に純粋な集団の、液体に基づく細胞選択及び単離を伴う。選択、対抗選択、及び単離のうちの1つ又は複数を含むプロセスは、固形培地にプレーティングすることなく実施することができる。
【０００８】
本開示の一態様は、細胞の混合集団を用意する工程であって、混合集団が、第1の変異細胞及び非変異細胞を含み、第1の変異細胞が、左又は右ホモロジーアームに組み込まれた標的DNA配列、選択マーカー、及び対抗選択マーカーをゲノムに組み込んでおり、選択マーカーが、選択剤に対する耐性をコードし、対抗選択マーカーが、対抗選択条件において細胞死を導く1種又は複数種のタンパク質をコードする、工程、液体中で、混合集団において非変異細胞に対して第1の変異細胞を濃縮して、第1の変異細胞の同種集団を作製する工程、並びに液体中で、第1の変異細胞に関して濃縮した集団のうちの一部の細胞から選択マーカー及び対抗選択マーカーを除去する工程を含む方法に関する。
【０００９】
一部の実施形態では、方法は、固形増殖培地と選択又は対抗選択添加剤とを含有するプレートにおいてクローン集団を生成することなく実施される。一部の実施形態では、方法は、形質転換プロセスを実施して混合集団を作製する工程を更に含む。一部のそのような実施形態では、方法は、形質転換プロセスを実施した後、選択剤を含む液体培地を混合集団に加えて、第1の変異細胞を選択する工程を更に含む。
【００１０】
一部の実施形態では、非変異細胞は残存細胞を含み、残存細胞は代謝的に不活性な細胞である。一部のそのような実施形態では、残存細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程は、凍結保護剤を加える工程、並びに次いで混合集団を凍結及び解凍する工程を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、非変異細胞は、選択剤に対する耐性を自発的に発生するが標的DNA配列を有しない細胞を含む。一部のそのような実施形態では、選択剤に対する耐性を自発的に発生するが標的DNA配列を有しない細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程は、混合集団を凍結及び解凍する工程を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、非変異細胞は、選択マーカーを含む、組み込まれていないプラスミドを保有し、選択剤に対して耐性であるが、数を増加させることができない、プラスミドに基づく残存細胞を含む。一部のそのような実施形態では、プラスミドに基づく残存細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程は、混合集団細胞を希釈し、更に増殖させる工程を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、混合集団において非変異細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程は、混合集団を凍結及び解凍する工程を含む。一部のそのような実施形態では、凍結及び解凍する工程は、形質転換後細胞回収の作業、及び選択剤を含む液体培地を混合集団に加える作業の後に実施される。
【００１４】
一部の実施形態では、混合集団から非変異細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程は、解凍後に混合集団細胞を希釈し、更に増殖させる工程を含む。一部の実施形態では、第1の変異細胞に関して濃縮した集団の細胞から選択マーカー及び対抗選択マーカーを除去する工程は、第2の混合集団を作製する工程を含み、第2の混合集団は、第1の変異細胞、選択マーカー及び対抗選択マーカーを含まない標的DNA配列をゲノムに組み込んだ第2の変異細胞、並びに基準株細胞を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、方法は、第2の混合集団の細胞を単離する工程を更に含む。一部のそのような実施形態では、第2の混合集団の細胞を単離する工程は、個々の細胞の光学的同定を含む。一部のそのような実施形態では、細胞を単離する工程は、光学的に同定された個々の細胞の単一細胞分注を更に含む。一部のそのような実施形態では、細胞を単離する工程は、生死判定染色、蛍光タンパク質、及びレポーティング試薬からなる群のうちの1つ又は複数を用いて選別する工程を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、方法は、濃縮した集団の細胞を限界希釈プロセスを経て単離する工程を更に含む。一部の実施形態では、方法は、濃縮した集団の、対抗選択剤を含有する複数のウェルへの限界希釈を、実質的に全てのウェルが対抗選択後も生存する細胞を1つ以下含有するように実施する工程を更に含む。
【００１７】
一部の実施形態では、細胞は、細菌細胞及び真菌細胞から選択される。一部の実施形態では、細胞はグラム陰性細菌細胞である。
【００１８】
本開示の別の態様は、細胞の混合集団を用意する工程であって、混合集団が、第1の変異細胞及び非変異細胞を含み、第1の変異細胞が、左又は右ホモロジーアームに組み込まれた標的DNA配列、選択マーカー、及び対抗選択マーカーをゲノムに組み込んでおり、選択マーカーが、選択剤に対する耐性をコードする、工程、並びに液体中で、混合集団において非変異細胞に対して第1の変異細胞を濃縮して、第1の変異細胞の同種集団を作製する工程を含む方法に関する。
【００１９】
一部の実施形態では、方法は、固形増殖培地と選択剤とを含有するプレートにおいてクローン集団を生成することなく実施される。一部の実施形態では、非変異細胞は、選択マーカーを含む、組み込まれていないプラスミドを保有し、選択剤に対して耐性であるが、数を増加させることができない、プラスミドに基づく残存細胞を含む。一部の実施形態では、非変異細胞は、選択剤に対する耐性を自発的に発生するが標的DNA配列を有しない細胞を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、選択剤に対する耐性を自発的に発生するが標的DNA配列を有しない細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程は、混合集団を凍結及び解凍する工程を含む。一部の実施形態では、非変異細胞は、選択マーカーを含む、組み込まれていないプラスミドを保有し、選択剤に対して耐性であるが、数を増加させることができない、プラスミドに基づく残存細胞を含む。一部の実施形態では、プラスミドに基づく残存細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程は、混合集団細胞を希釈し、更に増殖させる工程を含む。
【００２１】
一部の実施形態では、混合集団において非変異細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程は、混合集団を凍結及び解凍する工程を含む。一部のそのような実施形態では、凍結及び解凍する工程は、形質転換後細胞回収、及び選択剤を含む液体培地を混合集団に加える工程の直後に実施される。
【００２２】
一部の実施形態では、非変異細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程は、解凍後に、選択剤を含有する液体培地での混合集団細胞の第1の希釈及び更なる増殖を含む。一部の実施形態では、非変異細胞に対して第1の変異細胞を濃縮する工程は、選択剤を含有する液体培地での混合集団細胞の第2の希釈及び更なる増殖を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、細胞は、細菌細胞及び真菌細胞から選択される。一部の実施形態では、細胞はグラム陰性細菌細胞である。
【００２４】
本開示の別の態様は、液体中で、標的DNA配列及び1つ又は複数の対抗選択マーカーをゲノムに組み込んだ第1の変異細胞の実質的同種集団を受け取る工程であって、1つ又は複数の対抗選択マーカーが、対抗選択条件において細胞死を導く1種又は複数種のタンパク質をコードする、工程、液体中で、対抗選択条件において第1の変異細胞の実質的同種集団を培養して、対抗選択マーカーを含まない標的DNA配列をゲノムに組み込んだ第2の変異細胞を作製する工程、並びに液体中で、第2の変異細胞のクローン的に単離された集団を作製する工程を含む方法に関する。
【００２５】
一部の実施形態では、方法は、固形増殖培地と対抗選択剤とを含有するプレートにおいてクローン集団を生成することなく実施される。一部の実施形態では、方法は、第2の混合集団を作製する工程を更に含み、第2の混合集団は、第2の変異細胞及び基準株細胞を含む。一部の実施形態では、方法は、個々の第2の変異細胞の光学的同定を更に含む。一部のそのような実施形態では、第2の変異細胞のクローン的に単離された集団を作製する工程は、光学的に同定された個々の細胞の単一細胞分注を含む。
【００２６】
一部の実施形態では、クローン的に単離された集団を作製する工程は、生死判定染色、蛍光タンパク質、及びレポーティング試薬からなる群のうちの1つ又は複数を用いて選別する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、第1の同種集団の、対抗選択剤を含有する複数のウェルへの限界希釈を、実質的に全てのウェルが対抗選択後も生存する細胞を1つ以下含有するように実施する工程を更に含む。
【００２７】
一部の実施形態では、細胞は、細菌細胞及び真菌細胞から選択される。一部の実施形態では、細胞はグラム陰性細菌細胞である。
【００２８】
本開示の別の態様は、(a)形質転換細胞及び非形質転換細胞を含む細胞の集団を用意する工程であって、形質転換細胞が選択マーカーを含む、工程、(b)選択マーカーを選択する液体培地中で細胞の集団を培養する工程、並びに(c)液体中に、細胞のクローン的に純粋な複数の集団をもたらす工程を含む方法に関する。
【００２９】
一部の実施形態では、方法は、固形増殖培地と選択添加剤とを含有するプレートにおいてクローン集団を生成することなく実施される。一部の実施形態では、(c)は、液体中で、細胞集団の細胞を単離して、複数の単離された単一細胞集団をもたらす工程を含む。一部の実施形態では、(c)は、単離された細胞を液体培地中で培養して、細胞のクローン的に純粋な複数の集団をもたらす工程を更に含む。
【００３０】
一部の実施形態では、細胞を単離する工程は限界希釈プロセスを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞のクローン的に純粋な集団の遺伝子型を決定する工程を更に含む。一部の実施形態では、方法は、個々の細胞の光学的同定を更に含む。一部の実施形態では、複数の単一細胞集団をもたらす工程は、光学的に同定された個々の細胞の単一細胞分注を含む。一部の実施形態では、複数の単離された単一細胞集団をもたらす工程は、生死判定染色、蛍光タンパク質、及びレポーティング試薬からなる群のうちの1つ又は複数を用いて選別する工程を含む。
【００３１】
本開示のこれらの及び他の特徴は、関連する図面を参照しつつ以下に提示される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ハイスループット株操作のための概観的なプロセスを示すフローチャートである。
【図２】標的DNA配列を宿主株に組み込むための概観的なプロセスを示すフローチャートである。
【図３】株構築プロセスにおけるプラスミドを用いた宿主細胞の形質転換によって作製された変異細胞の例示的な配列の図である。
【図４】株構築プロセスにおいて宿主細胞から1つ又は複数のマーカーを除去する一例の図である。
【図５】細胞の選択及び対抗選択のための、液体に基づくワークフローを示すフローチャートである。
【図６】液体中での変異細胞の選択のための、液体に基づくワークフローを示すフローチャートである。
【図７】自殺、すなわち非複製プラスミドを用いて形質転換した細胞の、回収後のプレートに基づく選択、及び選択剤を含む液体培地におけるその存在に関する画像を示す図である。
【図８】図6に示す方法に従った液体に基づくワークフローの一例を示す図である。
【図９】最初の増殖及び選択工程後、並びに選択剤を含む液体での希釈及び一晩の増殖後の、変異体のプレートに基づく選択の結果を非選択的増殖と比較して示す図である。
【図１０】液体中での対抗選択的マーカーの除去のための、液体に基づくワークフローの一例を示す図である。
【図１１】限界希釈を使用して、細胞のクローン的に純粋な集団を液体中で単離するための方法を示すフローチャートである。
【図１２】限界希釈法による、ループアウト変異細胞のクローン的に純粋な集団の単離の概略的な一例を例示する図である。
【図１３】細胞選別を使用して、細胞のクローン的に純粋な集団を液体中で単離するための方法を示すフローチャートである。
【図１４】3つのプロセス:A)固形培地へのプレーティングを使用するループイン及びループアウト、B)固形培地へのプレーティングを使用する、液体に基づくループイン及びループアウト、並びにC)液体に基づくループイン及びループアウトの例示的な時間枠の概略図を提供する図である。
【図１５】目的のDNA配列をクローニングするための概観的なプロセスを示すフローチャートである。
【図１６】細胞のクローン的に純粋な集団の選択及び単離のための、液体に基づくワークフローを示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
用語
特許請求の範囲及び本明細書で使用される用語は、別段の指定がない限り、以下に記載するように定義される。
【００３４】
「基準株」という用語は、現在のラウンドの遺伝子変化の挿入前の出発株を指す。
【００３５】
細胞に関する「変異」という用語は、最初の基準株細胞と遺伝的に異なる細胞を指す。
【００３６】
「クローン的に純粋な集団」又は「同質遺伝子集団」という用語は、遺伝的に同一な細胞、又は標的とした遺伝子変化を除いては遺伝的に同一である細胞を含有する細胞集団を指す。
【００３７】
変異細胞に関連する「同種集団」という用語は、生細胞が全て、変異細胞が由来する細胞の集団に対して同じ変異表現型を発現する細胞集団を指す。同種集団の変異細胞における変異表現型の発現は、各細胞のゲノムへの標的DNA配列を有するベクターの組込みに起因し得る。
【００３８】
「ループイン」又は「ループインすること」という用語は、単一組換え事象を介して微生物細胞のゲノムに外来DNAを組み込むプロセス、及びその結果得られる微生物細胞を指す。外来DNAとしては、1つ又は複数の標的DNA配列、1つ又は複数のマーカー、並びに右及び左相同性配列が挙げられ得る。
【００３９】
「ループアウト」又は「ループアウトすること」という用語は、微生物細胞のゲノムにそれ以前に組み込まれた外来DNAの一部を切り出すプロセス、及びその結果得られる微生物細胞を指す。これは第2のDNA組換え工程を介して行われ得る。ループアウト細胞とは、所望の変異を含むが、残りの外来DNA配列、例えば選択及び対抗選択マーカー、又はベクターの他の機能及び構造DNA部分のいずれも含まない変異細胞である。
【００４０】
序論
本開示の態様は、株操作のための、液体のみに基づくワークフローに関する。株操作では、細胞は、改変プロセスを受けて、DNA中に1つ又は複数の所望の変化を獲得する。一部の細胞は1つ又は複数の変化を組み込み、一部の細胞は組み込まない。1つ又は複数の変化を受容した細胞の集団を選択するための、液体に基づく方法は、本明細書において提供され、変化を受容しなかった細胞を排除する。追加の組換え工程を経て、染色体からのマーカーの除去に至った細胞を選択する、液体に基づく方法もまた本明細書において提供される。細胞のクローン的に純粋な集団を単離するための、液体に基づく方法もまた本明細書において提供される。
【００４１】
本開示の態様は、エピソームDNAセグメントを含む細胞を選択及び/又は単離するための、液体に基づくワークフローを含む。一部の実施形態では、DNAセグメントは、所望の標的DNA切片を宿主生物の染色体に、同じ配列を含むDNAを介して挿入することができるベクターである。ベクターには、例えば、標的DNA及びホモロジーアーム(同じDNA配列)、並びに1つ又は複数のマーカーが含まれ得る。液体に基づくワークフローは、宿主株への組込みのためのDNAプラスミド又は他のベクターを生成及びクローニングするプロセス(「DNA構築」と称される)の一部であり得る。液体に基づくワークフローには、液体培地中での選択が含まれてもよく、一部の実装形態では、クローン的に純粋な集団の液体中での単離が更に含まれてもよい。液体に基づくワークフローは、1種又は複数種の選択又は対抗選択剤を含む固形培地にプレーティングすることなく実施することができる。
【００４２】
本開示の態様は、目的の標的DNA配列及び追加のプラスミドDNAをゲノムに組み込んだ変異細胞(ループイン細胞とも称される)を選択し、変異細胞の同種集団を生成するための、液体に基づくワークフローを含む。更なる態様は、変異細胞からマーカー及び追加のプラスミドDNAを切り出し(ループアウトとも称される)、ループアウト細胞のクローン的に純粋な集団を単離するための、液体に基づくワークフローを含む。
【００４３】
一部の実装形態では、方法は、株操作のためのハイスループット法の一部として実装され得る。株操作のためのハイスループット法の一例は図1において規定される。図1において、参照符号100によって表されるフローチャートは、「DNA構築」と称される作業101で始まる。DNA構築では、宿主株に組み込まれるDNAがアセンブルされ、形質転換プラスミド又は他のベクターにクローニングされる。DNA構築の文脈において実装され得る液体に基づくワークフローは、図15及び図16に関連して以下に記載される。
【００４４】
次に、「株構築」と称される作業が作業103において実施される。株構築では、作業101において構築されたDNAが、変異が導入されることになる宿主株のゲノムに移される。一部の実装形態では、これは、任意の形質転換法、例えば、これらに限定されないが、電気穿孔、接合、及びファージ形質導入を利用して、作業101においてアセンブルされたDNAを宿主細胞内に形質転換することを含む。標的DNA配列は宿主細胞ゲノムに組み込まれ、これは「ループイン」とも称される。一部の実装形態では、次いで、1つ又は複数のマーカーが除去される(「ループアウト」)。株構築の文脈において実装され得る液体に基づくワークフローは、図2〜図14に関連して以下に記載される。
【００４５】
次いで、改変されたことが確認された(例えば次世代又はサンガー配列決定によって)細胞は、作業105において評価されてもよい。例えば、改変された株は、所望の化学物質の収率、又は他の関連する測定基準に基づいて評価することができる。試験は、1つ又は複数の株の性能を、マイクロタイタープレート及び発酵槽、又は任意の他の細胞培養環境において評価することを含んでよい。作業105からの情報は、新規に提唱される遺伝子改変を生じ、フローチャート100における作業を繰り返すために使用され得る。ハイスループット株操作では、フローチャート100によって表されるプロセスは、数百回又は数千回、並行して及び/又は逐次実施され得る。本明細書に記載される液体に基づくワークフローは、プロセスの反復ごとにおよそ数日の、著しい時間の節約を実現し得る。
【００４６】
液体に基づくワークフローは、主にハイスループット株操作の文脈において以下に記載されるが、細胞のクローン的に純粋な集団の選択、対抗選択、及び/又は単離が所望されるいかなる用途においても使用され得る。
【００４７】
株構築のための、液体に基づくワークフロー
本明細書に記載される方法の実装形態は、遺伝子編集された微小生物の選択、対抗選択、及び/又は単離に関する。編集された微小生物は、電気穿孔、接合、トランスフェクション、形質導入、又は任意の他の種類のDNA形質転換を含む多様な技法のいずれかによる外来DNAの形質転換後に作製され得る。編集は、これらに限定されないが、単一及び二重組換え、リコンビナーゼ補助組換え、イントロン補助組換え、並びにヌクレアーゼ補助組換えを含む、任意のDNA編集の方法によって達成され得る。本明細書に記載される液体に基づくワークフローは、株操作の多様な文脈において実装され得る。
【００４８】
図2は、標的DNA配列を宿主株に組み込む(「株構築」)ための概観的なプロセスを示すフローチャートである。図2に示すプロセスが本明細書に記載される液体に基づくワークフローが実装され得る方法の一例であるということに留意すべきである。参照符号200によって表されるフローチャートは、外来DNA配列を宿主株内に形質転換する作業201で始まる。一部の実施形態では、形質転換は電気穿孔を含む。
【００４９】
作業201は、細胞の混合集団を作製することができ、混合集団は、外来DNA配列を含む変異細胞及び非変異細胞を含む。変異細胞は、標的DNA配列及び1つ又は複数のマーカーをゲノムに組み込んでいる場合がある。標的DNA配列は、ゲノムの標的とした領域と相同なDNAの領域に挟まれている。これらの相同領域は、DNA組換えを介したゲノム組込みを容易にし、一旦組み込まれると、その後の工程においてベクター骨格DNAをループアウトするために設計されたダイレクトリピート領域を形成する。
【００５０】
図3は、プラスミド301を用いた宿主細胞の形質転換によって作製された変異細胞の配列(303a及び303b)の一例を示す。変異細胞は、示されているように、標的DNA配列及び1つ又は複数のマーカーを含む。303a及び303bにそれぞれ示すように、外因性DNAが、ゲノムDNAの左ホモロジーアーム又は右ホモロジーアームで、非変異細胞の染色体に組み込まれ得るということに留意すべきである。プラスミドは、組み込まれていないプラスミドが宿主において複製しないような自殺(すなわち複製不全)プラスミドである。
【００５１】
一部の実施形態では、1つ又は複数のマーカーとしては、選択剤に対する耐性をコードする選択マーカーが挙げられる。1つの例では、変異細胞は、カナマイシンに対する耐性をコードする選択マーカーを含む。選択マーカーの更なる例は以下に提供される。一部の実施形態では、1つ又は複数のマーカーとしては、対抗選択条件において細胞死を導く、1種若しくは複数種のペプチド、タンパク質、若しくは低分子をコードするか又はDNA若しくはRNA分子である対抗選択マーカーが挙げられる。一部の例では、変異細胞は、スクロースをレバンに変換するタンパク質(酵素)をコードする対抗選択マーカーsacBを含む。これは、レバンの毒性のためにスクロースの存在下において細胞死を導く。対抗選択マーカーの更なる例もまた以下に提供される。
【００５２】
図2に戻り、細胞は回収することが可能であり(203)、次いで選択が、非変異細胞に対して変異細胞を濃縮するために実施される(205)。この作業は、非変異細胞の細胞死を引き起こす選択剤の存在下において混合集団を培養することを伴い得る。以下に更に記載するように、選択は、液体培地中で、細胞増殖のための固形材料と選択剤とを含有するプレートにおいてクローン集団を生成することなく実施される。
【００５３】
次いで、対抗選択条件下における更なる増殖が作業207において実施される。一部の実施形態では、作業207は、1つ又は複数のマーカーを除去することを含む。例えば、スクロース含有培地での更なる増殖は、組換えエピソードのためにsacBマーカーを喪失させた後、それを含まない細胞に関して液体培地を濃縮することができる。図4は、宿主株から1つ又は複数のマーカーを除去する一例を示す。変異配列303の組換えは、挿入したDNA及び宿主ゲノムのダイレクトリピート領域を「ループアウト」させ、マーカーを含まない基準株細胞(配列405)及び変異細胞(配列407)を作製する。以下に更に記載するように、一部の実施形態では、対抗選択は、液体培地中で、固形対抗選択剤を含有するプレートにおいてクローン集団を生成することなく実施される。
【００５４】
図5は、細胞の選択及び対抗選択のための、液体に基づくワークフローを示すフローチャートである。図5に示すワークフローは、ゲノムへの標的DNA及びマーカーの組込み(「ループイン」)から、マーカーを除去すること(「ループアウト」)及び追加のプラスミドDNA配列を除去することまで、コロニーをプレートにおいて生成することもコロニー採取を必要とすることもなく進めるために使用され得る。
【００５５】
参照符号500によって表されるフローチャートは、変異細胞及び非変異細胞を含む細胞の混合集団を用意する作業501で始まる。混合集団は、外来DNAを細胞に導入する任意の適切な方法によって生成することができる。変異細胞は、外来DNAに規定される選択マーカー及び対抗選択マーカーを含む。細胞の混合集団は、一部の実施形態では、ハイスループット電気穿孔システムから受け取られ得る。例えば、細胞の混合集団は、VWR(登録商標)ハイスループット電気穿孔システム、BTX(商標)、Bio-Rad(登録商標)Gene Pulser MXcell(商標)、又は96ウェル、384ウェル、若しくは他のマルチウェルプレートにおいて細胞を形質転換することができる他のマルチウェル電気穿孔システム等のハイスループット電気穿孔システムから受け取られ得る。
【００５６】
次いで、変異細胞は、作業503において変異細胞の同種集団を作成するために非変異細胞に対して濃縮される。液体中で同種集団を作製することは、固形培地にプレーティングすることも、コロニー採取も、細胞を単離することもなく、ループインからループアウトに移行することを可能にする。作業503は、選択剤を含む液体培地中での選択を含む。
【００５７】
液体培地中での選択は、寒天に基づく選択の場合には存在しないか又は軽減される課題を有する。特に、選択プロセスを損なうおそれがある種々の種類の「背景」又は非変異細胞が存在する場合があり、これらとしては、「自然変異体」、「残存細胞」、及び「プラスミドに基づく残存細胞」と称される種類が挙げられる。
【００５８】
自然変異体とは、選択剤に対する耐性を自発的に発生し、外来DNAを含有する場合のように選択的薬剤の存在下において生存するにもかかわらず、外来DNAを含有しない細胞である。残存細胞とは、生存しているが代謝的に不活性であり、したがって選択剤による影響を受けない細胞である。
【００５９】
プラスミドに基づく残存細胞とは、選択マーカーを含む、組み込まれていない非複製プラスミドを保有する細胞である。この細胞は、選択剤に対して耐性であるが、プラスミドを複製することができない。図7は、所与の時間期間の、自殺プラスミドを用いて形質転換した細胞の、回収後の非選択培地中でのプレートに基づく選択と、それに続く選択剤(カナマイシン)を含有する液体培地での更なる増殖とに関する画像を示す。液体におけるカナマイシン等の選択剤の存在下では、プラスミドに基づく残存細胞は自殺プラスミドをエピソームに維持し、このことは、これらの細胞に前記選択剤に対する耐性を付与する。プラスミドに基づく残存細胞の数は、プラスミドを複製する能力がないため、図7における時間経過実験の全体にわたって一定である。左の画像に見られるように、液体培養がKan 50と共に寒天にプレーティングされる場合、コロニー形成単位(CFU)は存在せず、これはプレートにループイン細胞が存在しないことを示す。液体培養が選択剤なしで寒天へプレーティングされる場合、プラスミドに基づく残存細胞は複製し、右の画像に見られるようにCFUを形成することができる。プラスミドに基づく残存細胞は、プレートに基づく選択においては、コロニーを形成することができないため、観察されず、それゆえ検出及び収集されることはないが、一旦最初の選択的薬剤が除去されると出現して真のループアウトを不明瞭にし得るため、それらの存在は変異細胞の液体選択に影響を及ぼす。一部の実施形態では、例えばゲノムへのベクターの組込みが酵素によって援助されない場合、形質転換後集団は、所望の1つ又は複数のゲノム変異を有する変異体よりも数百倍多い、プラスミドに基づく残存細胞を有し得る。一部の実施形態では、プラスミドに基づく残存細胞を液体選択の間に除去するか又は著しく減少させることが重要である。この理由は、選択剤が除去される際(例えば対抗選択培地への移行時)に任意のプラスミドに基づく残存細胞が残留する場合、それらは増殖して集団において優位を占め、真の変異体を検出するプロセスを著しく困難にするおそれがあるためである。
【００６０】
背景細胞を選択の間に除去するために、1つ又は複数の液体に基づく処理作業が採用され得る。一部の実施形態では、細胞の液体懸濁液を凍結及び解凍することは、ある特定の背景細胞を除去する。一部の実施形態では、液体中での更なる増殖と結びついた希釈は、希釈によってある特定の背景細胞を除去する。図6は、液体中での変異細胞の選択のための、液体に基づくワークフローを示すフローチャートである。図6におけるワークフローは、作業503に示す変異細胞の同種集団を作製するために使用され得る。参照符号600によって表されるフローチャートは、選択剤を含む凍結保護剤を、変異細胞及び非変異細胞を含む細胞の集団に加える作業601で始まる。混合集団は、自然変異体、残存細胞、及びプラスミドに基づく残存細胞を含む1つ又は複数の背景細胞の種類を含み得る。一例では、細胞を含む懸濁液は、例えば50ug/mLのカナマイシンと凍結保護剤とを含有する、ブレインハートインフュージョン(BHI)又はカタボライト抑制を伴う超最適ブロス(SOC: Super Optimal broth with Catabolite regression)培地に加えられる。
【００６１】
次いで、細胞は作業603において、凍結され、その後解凍される。これは、作業601の直後に実施してもよく、凍結保護剤が事前に加えられたか又は直前に加えられることになる懸濁液の全て又はアリコートを利用し、それを凍結することを伴う。例示的な凍結条件は-80℃で1時間である。代謝的に不活性な細胞を解凍することがその細胞を選択剤の影響を受けやすい代謝的に活性な状態に移行させるような凍結で足りる。自然変異細胞を凍結及び解凍すること、並びにその後の選択的薬剤への再曝露は、集団からの自然変異細胞の除去を可能にする致死的なストレスを生じる。次いで、残りの細胞は選択剤を含む液体培地で増殖し得る。次いで、細胞は作業605において、選択剤を含有する液体培地で希釈され、増殖する。このことは、選択剤の存在下において倍加し続ける、大部分が変異である細胞の集団を生じる。
【００６２】
プラスミドに基づく残存細胞は、選択培地での懸濁液の増殖と結びついた希釈によって除去することができる。図9は、凍結/解凍工程の、並びに液体での希釈及び一晩の増殖の8DT(倍加時間)後の、液体集団(LB)及びその変異画分(LB Kan25)の総組成物を示す。加えて、図9は、変異体の、液体に基づく選択に加えたプレートに基づく選択の結果(左下の画像)を、部分的な液体選択(左上の画像)と比較して示す。選択剤を含まない場合、細胞/mL単位で200倍の差が存在し、これは、プラスミドに基づく残存細胞の、ループイン細胞に対する差を表す。懸濁液の希釈及び一晩の増殖後、選択培地における増殖(右下の画像)と非選択培地における増殖(右上の画像)との間に統計的な差は存在しない。これは、プラスミドに基づく残存細胞(及び他の非ループイン細胞)の全てが排除されたか又は取るに足らない数まで減少し、集団の全てではないにせよ大多数が変異細胞から構成されていることを示す。
【００６３】
図8は、図6に示す方法に従った液体に基づくワークフローの一例を示す。図8に示されているように、ゲノムに組み込まれた標的DNAを含む変異細胞の同種集団の作製は、大腸菌(E. coli)の場合、24時間の期間で得られる。細胞は、挿入されるDNAと混合され、次いで、DNAを細胞に導入するために電気穿孔される。形質転換後細胞はSOC液体培地中に回収される。回収の直後、グリセロール(凍結保護剤)中のKan50選択剤が加えられる。細胞のアリコートは-80℃で2DT凍結される。これに続いて、Kan50を含有するSOCでの8DTの第1の希釈(1:3)、及び一晩の増殖を伴うKan50を含有するLBでの第2の希釈(1:100)が行われる。次いで、細胞はループアウト可能となる。図8に示す液体に基づくワークフローを実施した後の細胞のコロニーPCRは、一晩(O/N)ループイン液体集団が全てループイン細胞であり、背景及び基準株細胞は存在しないか又は取るに足らない数であることを示した。
【００６４】
所与のシステムに効果的な選択を実施するために、図6における液体に基づくワークフローは、回収時間、液体培地、抗生物質(又は他の選択剤)濃度、インキュベーション時間、希釈因子、及び選択時間のパラメータを適宜調整して使用してもよい。1DT未満〜10DT超の例示的な回収時間が使用されてもよい。培地は合成(例えば最少培地#63)であっても複合(例えば溶原培地)であってもよい。一部の実施形態では、第1の希釈(例えば1:4又は1:8)に続いて第2の希釈(例えば1:50又は1:100)が行われる。
【００６５】
図5に戻り、変異細胞の同種集団が作製された後、1つ又は複数のマーカーが同種集団のうちの一部の細胞から除去される(505)。上に示したように、これは「ループアウト」と称される。図10は、液体中でのマーカーの除去のための、液体に基づくワークフローの一例である。ワークフローは、対抗選択マーカーを含む変異細胞の同種集団の懸濁液を受け取る作業1001で始まる。同種集団は、選択剤を含む液体培地での更なる増殖によって作製され得る。一部の実施形態では、同種集団は、図6〜図8を参照して上に記載したような、非変異細胞を除去する選択剤の存在下において細胞を凍結及び解凍すること、並びに希釈及び更なる増殖のうちの一方又は両方を含む方法によって作製することができる。また、一部の実施形態では、変異細胞は、上に記載したように、選択マーカー及び対抗選択マーカーをゲノムに組み込んでいる。1つ又は複数のマーカーは、図3に関連して上に記載したように、左又は右ホモロジーアームに組み込まれ得る。
【００６６】
変異細胞の実質的同種集団は、第2の変異細胞を作製するために、対抗選択条件下において液体中で培養される(1003)。第2の変異細胞(ループアウト細胞とも称される)は、標的DNA配列を含み得るが、マーカーを含まない。一例は図4の407に示される。
【００６７】
作業1003は、ループアウトプロセスが行われるのに十分長い時間実施することができるが、増殖速度の差(例えば基準株と変異ループアウト細胞との間の)により基準株が集団を引き継ぐことが可能になるほど多くの時間は与えない。例えば、細胞を液体培地で一晩増殖させると、大半が基準株細胞となる場合がある。一部の実装形態では、作業1003は、例えば、少ない場合は2DT、多い場合は100DT実施され得る。作業1003は、第2の変異細胞のクローン的に単離された集団を取得するために限界希釈プロセスを採用している場合は省くことができる。にもかかわらず、ループアウトされた(第2の変異)細胞の更なる増殖は、ごくわずかな数のDTの場合であっても依然として実施され得る。
【００６８】
第2の変異細胞のクローン的に単離された集団は、作業1005において液体中で作製される。一部の実施形態では、変異体のクローン的に単離された集団を作製することは、希釈試料(例えばマルチウェルプレートにおけるウェル)中の細胞の数が希釈液中の細胞の統計的分布のために閾値(例えば1、2等)以下となる限界希釈プロセスを伴う。
【００６９】
図4に例証するように、対抗選択は、ループイン細胞から基準株細胞又はループアウト(変異細胞)を作製することができる。したがって、対抗選択培地中の細胞の集団は、死滅することになる対抗選択マーカーを含む変異細胞(ループイン細胞)、対抗選択マーカーを含まない変異細胞(ループアウト細胞)、及び基準株に復帰する(ループインしたのと同じホモロジーアームにおいてループアウトした)細胞を有することになる。一部の実施形態では、集団のうちの大半はループイン細胞となる。図11は、限界希釈を使用して、細胞のクローン的に純粋な集団を液体中で単離するための方法を示すフローチャートである。参照符号1100によって表されるフローチャートは、多数の細胞を対抗選択剤の存在下の各ウェルに、対抗選択後も生存する可能性が統計的に高い細胞がウェル1つ当たり1つ以下となるように入れる作業1101で始まる。例えば、限界希釈は、4つのウェル当たり1つ又は10のウェル当たり1つのウェルが対抗選択後も生存する細胞を有するように実施され得る。対抗選択の存在下における更なる増殖は、作業1103において行われる。これはループイン細胞の死を導く。対抗選択後も生存する細胞を有するウェルでは、その細胞が集団を引き継ぐことになる。このことは、1つがループアウト細胞のクローン的に純粋な集団を有する4つのウェルの概略的な一例を示す図12に概略的に例証される。変異細胞と基準株細胞の両方が対抗選択後も生存するという、起こる可能性の低い事象では、基準株細胞が集団を引き継ぐ場合があるということに留意すべきである。一部の実施形態では、次いで、細胞は作業1105において遺伝子型を決定され得る。この例では、作業1105は、各ウェル中の細胞(すなわち各同質遺伝子集団)が基準株であるか変異体であるかを決定するために使用され得る。
【００７０】
一部の実施形態では、変異体のクローン的に単離された集団を作製することは、細胞を選別することを伴う。図13は、選別を使用して、細胞のクローン的に純粋な集団を液体使用選別で単離するための方法を示すフローチャートである。参照符号1300によって表されるフローチャートは、目的の細胞を同定する作業1301で始まる。ループアウトの例では、目的の細胞はマーカーもプラスミド骨格も含まない細胞である。一部の実施形態では、作業1301は光学的同定を伴う。例えば、プラスミドには、緑色蛍光タンパク質(GFP)等の蛍光マーカーが含まれ得る。GFPを含まない細胞は、マーカーもプラスミド骨格も有しない(したがって、これらの細胞は、変異細胞かループアウトされた基準株復帰細胞のいずれかである)と同定され、蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して選別される。一部の実施形態では、作業1301は、ループイン細胞を死滅させる対抗選択剤に初めに十分に曝露された細胞に関する生死判定染色を伴う。プラスミドには、蛍光反応色素又は他のマーカーが含まれ得る。次いで、生存している細胞は、ThermoFisher社製のLIVE/DEAD定着性生死判定染色、又は他の適切な生死判定染色若しくは色素を使用して選別され得る。
【００７１】
目的の細胞が同定されると、方法は、作業1303におけるウェルへの単一細胞分注を進めることができる。CellenONE又はFACS等の単一細胞分注装置は、単一細胞を各ウェルに入れるために使用され得る。上で指摘したように、ループインは混合集団において優位を占める場合があり、遺伝子型を決定するために各細胞をウェルに分注することは現実的ではない。しかしながら、単一細胞分注前に細胞を選別することによって、目的の細胞のみがウェルを占有することになる。一部の実施形態では、次いで、細胞は、各ウェル中の細胞(同質遺伝子集団)が基準株であるか変異体であるかを決定する作業1305において遺伝子型を決定され得る。
【００７２】
図14は、大腸菌等の生物を用いた3つのプロセス:A)固形培地へのプレーティングを使用するループイン及びループアウト、B)固形培地へのプレーティングを使用する、液体に基づくループイン及びループアウト、並びにC)液体に基づくループイン及びループアウトの例示的な時間枠の概略図を提供する。プロセス(A)をプロセス(B)と比較することによって見られるように、液体に基づくループインを行うことによって、ループアウトが固形培地における対抗選択を使用して実施される実装形態においてさえ、24時間節約することができる。2日目の朝に、ループイン選択プロセスは完了し、細胞はループアウトに進むことが可能となる。プロセス(B)とプロセス(C)との比較は、液体に基づくループアウトを使用することによる、顕著な更なる時間の節約(例えば24時間対4時間)を示す。大腸菌よりも遅く増殖する生物の場合、更なる時間の節約が実現し得る。
【００７３】
DNA構築のための、液体に基づくワークフロー
図15は、DNAをクローニングするための概観的なプロセス(「DNA構築」)を示すフローチャートである。図15に示すプロセスは、本明細書に記載される液体に基づくワークフローが実装され得る方法の一例である。参照符号1500によって表されるフローチャートは、クローニングされるDNAをベクターに提供する作業1501で始まる。一部の実施形態では、ベクターは、酵母によってアセンブルされ、酵母から単離されたプラスミドである。ベクターは、作業1503において、コンピテント宿主細胞内に形質転換され、エピソームに残留する。次いで、形質転換した細胞は作業1505において選択される。細胞は、ベクターを含まない細胞が死滅する選択剤の存在下において増殖する。形質転換した細胞は、増加して、プラスミドのコピーを創製する。一部の実施形態では、更なる処理の後、プラスミドは、上に記載した株構築のために使用され得る。
【００７４】
図16は、細胞のクローン的に純粋な集団の選択及び単離のための、液体に基づくワークフローを示すフローチャートである。図16に示すワークフローは、図15に示すDNA構築プロセスの一部として実装することができ、細胞懸濁液を固形選択培地上にプレーティングして、その後採取を必要とするコロニーを生成することなく実施することができる。参照符号1600によって表されるフローチャートは、形質転換細胞及び非形質転換細胞を含む細胞の集団を受け取る作業1601で始まる。これらの細胞は、形質転換されたベクターの複製を可能にする。形質転換細胞は、選択マーカーを有するベクターを含む。細胞の集団は、作業1603において、形質転換細胞を選択する選択剤を含む液体培地中で培養される。生存細胞は複製プラスミドを含み、これを娘細胞と共有する。形質転換の直後、形質転換細胞の数は非形質転換体よりもはるかに少ない。液体選択は、形質転換細胞の割合が、選別すること又は限界希釈を実施することが非現実的ではないほど十分に高くなるのに十分な時間(例えば40DT)実施され得る。例えば、液体選択は、形質転換細胞の数が非形質転換細胞とほぼ等しくなるような時間実施され得る。
【００７５】
次いで、形質転換細胞のクローン的に単離された集団は、作業1605において液体中で作製される。一部の実施形態では、変異体のクローン的に単離された集団を作製することは、希釈試料中の細胞の数が希釈液中の細胞の統計的分布のために閾値以下となる限界希釈プロセスを伴う。
【００７６】
一部の実施形態では、形質転換細胞のクローン的に単離された集団を作製することは、細胞を選別することを伴う。図13を参照して記載した方法は、形質転換細胞におけるベクターに組み込まれたマーカー又は他のレポーターと共に採用され得る。例えば、プラスミド又は他のベクターには、GFP又は他の蛍光マーカーが含まれ得る。GFPを含む細胞は、ベクターを含んでいると同定され、FACSを使用して選別される。また、図13を参照して上に記載したように、一部の実施形態では、生死判定染色又は色素は、非形質転換体マーカーに対する選択剤に初めに十分に曝露された細胞に関して使用され得る。次いで、生存している細胞は、適切な生死判定染色又は色素を使用して選別され得る。ベクターを含む細胞が同定されると、方法は、ウェルへの単一細胞分注を進めることができる。一部の実施形態では、次いで、細胞は、例えば品質管理プロセスの一部として遺伝子型を決定され得る。
【００７７】
微生物宿主細胞
本明細書に記載される方法は宿主非依存性であり、導入される遺伝子を発現させるために使用することができる任意の微生物が使用される。一部の実施形態では、微生物は、容易に培養される微生物、例えば、目的の化合物の発酵産生における宿主細胞として有用であることが公知の微生物等である。一部の実施形態では、細胞は、グラム陽性又はグラム陰性細菌を含む細菌細胞である。例としては、大腸菌、C.グルタミクム(C. glutamicum)細胞、枯草菌(Bacillus subtilus)、B.リケニフォルミス(B. licheniformis)、B.レンタス(B. lentus)、B.ブレビス(B. brevis)、B.ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)、B.アルカロフィルス(B. alkalophilus)、B.アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、B.クラウジ(B. clausii)、B.ハロデュランス(B. halodurans)、B.メガテリウム(B. megaterium)、B.コアグランス(B. coagulans)、B.サーキュランス(B. circulans)、B.ラウタス(B. lautus)、B.チューリンゲンシス(B. thuringiensis)、S.アルバス(S. albus)、S.リビダンス(S. lividans)、S.セリカラー(S. coelicolor)、S.グリセウス(S. griseus)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、P.アルカリゲネス(P. alcaligenes)、P.シトレア(P. citrea)、ラクトバチルス属(Lactobacillis spp.)(例えばL.ラクティス(L. lactis)、L.プランタルム(L. plantarum))、L.グレイ(L. grayi)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナラム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)、及び/又はE.フェカリス(E. faecalis)細胞が挙げられる。
【００７８】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される微生物宿主細胞は糸状菌細胞である。(例えば、Berka及びBarnett、Biotechnology Advances、(1989)、7(2):127〜154頁を参照のこと)。例としては、トリコデルマ・ロンギブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)、T.ビリデ(T. viride)、T.コニンギ(T. koningii)、T.ハルジアナム(T. harzianum)、ペニシリウム属(Penicillium sp.)、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、H.ラヌギノサ(H. lanuginosa)、H.グリセア(H. grisea)、クリソスポリウム属(Chrysosporium sp.)、C.ルクノウェンス(C. lucknowense)、グリオクラジウム属(Gliocladium sp.)、アスペルギルス種(Aspergillus sp.)(例えば、A.オリゼー(A. oryzae)、A.ニガー(A. niger)、A.ソーヤ(A. sojae)、A.ジャポニカス(A. japonicus)、A.ニデュランス(A. nidulans)、又はA.アワモリ(A. awamori))、フザリウム属(Fusarium sp.)(例えば、F.ロゼウム(F. roseum)、F.グラミナム(F. graminum)、F.セレアリス(F. cerealis)、F.オキシスポラム(F. oxysporum)、又はF.ベネナタム(F. venenatum))、ニューロスポラ属(Neurospora sp.)(例えば、N.クラッサ(N. crassa)又はヒポクレア属(Hypocrea sp.))、ムコール属(Mucor sp.)(例えばM.ミエヘイ(M. miehei))、リゾプス属(Rhizopus sp.)、及びエメリセラ属(Emericella sp.)細胞が挙げられる。特定の実施形態では、上に記載したように操作される真菌細胞は、A.ニデュランス、A.アワモリ、A.オリゼー、A.アクレアタス(A. aculeatus)、A.ニガー、A.ジャポニカス、T.リーゼイ(T. reesei)、T.ビリデ、F.オキシスポラム、又はF.ソラニ(F. solani)である。そのような宿主との使用のための例証的なプラスミド又はプラスミド成分としては、米国特許公開第2011/0045563号に記載されているものが挙げられる。
【００７９】
酵母もまた、本明細書に記載される方法における微生物宿主細胞として使用することができる。例としては、サッカロミセス属(Saccharomyces sp.)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces sp.)、ピキア属(Pichia sp.)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピキア・スティピティス(Pichia stipitis)、クルイベロミセス・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces spp.)、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、及びカンジダ属(Candida sp.)が挙げられる。一部の実施形態では、サッカロミセス属はS.セレビシエ(S. cerevisiae)である(例えば、Romanosら、Yeast、(1992)、8(6):423〜488頁を参照のこと)。そのような宿主との使用のための例証的なプラスミド又はプラスミド成分としては、米国特許第7,659,097号及び米国特許公開第2011/0045563号に記載されているものが挙げられる。
【００８０】
一部の実施形態では、宿主細胞は、例えば、緑藻、紅藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ユーグレナ藻、クロミスタ、又は渦鞭毛藻に由来する藻類細胞であり得る。(例えば、Saunders及びWarmbrodt、「Gene Expression in Algae and Fungi, Including Yeast」、(1993)、National Agricultural Library、Beltsville、Md.を参照のこと)。藻類細胞における使用のための例証的なプラスミド又はプラスミド成分としては、米国特許公開第2011/0045563号に記載されているものが挙げられる。
【００８１】
他の実施形態では、宿主細胞はシアノバクテリア、例えば形態に基づく以下の群:クロロコックム目(Chlorococcales)、プレウロカプサ目(Pleurocapsales)、ユレモ目(Oscillatoriales)、ネンジュモ目(Nostocales)、シネコシスティス(Synechocystis)又はスチゴネマ目(Stigonematales)のいずれかに分類されるシアノバクテリアである(例えば、Lindbergら、Metab. Eng.、(2010) 12(1):70〜79頁を参照のこと)。シアノバクテリア細胞における使用のための例証的なプラスミド又はプラスミド成分としては、米国特許公開第2010/0297749号及び同第2009/0282545号、並びに国際特許公開第WO2011/034863号に記載されているものが挙げられる。
【００８２】
マーカー
様々な選択マーカー遺伝子は、当技術分野で公知であり、多くの場合、選択圧下において、原核細胞における選択のための抗生物質耐性機能(例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ゼオシン、スペクチノマイシン/ストレプトマイシンに対する)、又は真核細胞における選択のための抗生物質耐性機能(例えば、ジェネティシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン)をコードする。
【００８３】
別のクラスの選択マーカーは、産生細胞を死滅させる毒性遺伝子産物を発現する対抗選択マーカー遺伝子に関する。これらは本明細書の記載において全般に対抗選択マーカーと称される。そのような遺伝子の例としては、sacB、rpsL(strA)、tetAR、pheS、thyA、lacY、gata-1、又はccdBが挙げられる。これらの及び対応する対抗選択添加剤は、(Reyratら、1998「Counterselectable Markers: Untapped Tools for Bacterial Genetics and Pathogenesis.」Infect Immun. 66(9): 4011〜4017頁)に更に記載されている。
【００８４】
他のマーカー系、例えば、X-gal又は成功裏に形質転換した宿主細胞において発現する緑色若しくは赤色蛍光タンパク質等の蛍光レポーターの存在下において、陽性クローンを選択するために細菌中で使用される青/白スクリーニング系は、望まれる又は望まれない細胞のスクリーニング及び同定を可能にする。
【００８５】
宿主細胞の形質転換
一部の実施形態では、ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃、又はTi媒介遺伝子移入を含む多様な技法のいずれかを使用して宿主細胞に導入され得る(Christie, P. J.及びGordon, J. E.、2014「The Agrobacterium Ti Plasmids」Microbiol SPectr. 2014、2(6)、10.1128を参照のこと)。特定の方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、接合、又は電気穿孔が挙げられる(Davis, L.、Dibner, M.、Battey, I.、1986「Basic Methods in Molecular Biology」)。他の形質転換の方法としては、例えば、酢酸リチウム形質転換及び電気穿孔が挙げられる。例えば、Gietzら、Nucleic Acids Res. 27:69〜74頁(1992)、Itoら、J. Bacterol. 153:163〜168頁(1983)、並びにBecker及びGuarente、Methods in Enzymology 194:182〜187頁(1991)を参照のこと。
【００８６】
ハイスループット液体ハンドリング
上に記載した方法及びワークフローは、ハイスループット液体ハンドリングのための装置を使用してもよい。本明細書に記載されるワークフローは全般に96又は384ウェルマイクロタイタープレートの使用を対象とするが、当業者によって理解されるように、任意の数の種々のプレート又は構成が使用されてもよい。加えて、本明細書に記載される作業のいずれか又は全ては自動化されてもよく、したがって、方法は完全に自動化されても部分的に自動化されてもよい。
【００８７】
採用され得る液体ハンドリング分注装置は、Labcyte Echoアコースティック液体ハンドラー及びBioSero Gen 5 ATS液体ハンドラー等のアコースティック液体ハンドラー、Tekmatic BioSpot Nanoliter液体ハンドラー、並びにBioNex NanoDrop液体ハンドラーを備える。Cellenion社のCellenONEシステム等の単一細胞分注システムは、単一細胞分注のために使用され得る。FACSシステムは、上に記載した選別のために使用され得る。
【００８８】
結論
本出願における請求項のいずれも、「ミーンズプラスファンクション」又は「ステッププラスファンクション」形式で提示される限定を含まない。(米国特許法112条(f)を参照のこと)。請求項に関する限定のいずれも、米国特許法112条(f)の下で解釈されるべきでも、それに従って解釈されるべきでもないというのが本出願人の意図である。
【００８９】
本発明は、例証される実施形態に関連して特に記載されたが、様々な変更、改変、及び適合が本開示に基づいて行われてもよく、これらは本発明の範囲内にあることが意図されるということが理解されるだろう。本発明は、開示された実施形態と関連して記載されたが、本発明は開示された実施形態に限定されるのではなく、むしろ特許請求の範囲内に含まれる様々な改変形態及び等価な構成形態を包含することが意図されるということが理解されるべきである。
【符号の説明】
【００９０】
100  フローチャート
101  作業
103  「株構築」と称される作業
105  作業
200  フローチャート
201  作業
203  細胞は回収することが可能である
205  選択が、非変異細胞に対して変異細胞を濃縮するために実施される
207  作業
301  プラスミド
303  変異配列
303a  配列
303b  配列
405  配列
407  配列
500  フローチャート
501  作業
503  作業
505  1つ又は複数のマーカーが同種集団のうちの一部の細胞から除去される
600  フローチャート
601  作業
603  作業
605  作業
1001  作業
1003  変異細胞の実質的同種集団は、第2の変異細胞を作製するために、対抗選択条件下において液体中で培養される、作業
1005  作業
1100  フローチャート
1101  作業
1103  作業
1105  作業
1300  フローチャート
1301  作業
1303  作業
1305  作業
1500  フローチャート
1501  作業
1503  作業
1505  作業
1600  フローチャート
1601  作業
1603  作業
1605  作業
【図１】
2021530211.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021530211.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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