(57)【要約】本発明は、5'→3'方向に5'UTR、エフェクター分子をコードするコード領域、および3'UTRを含む、組換え核酸コンストラクトであって、該5'UTRが、MCP-1、RPL12s.c.、Ang-2、HSP70、H3.3.、ガレクチン-9、GADD34、EDN1、HSP70m5、E-セレクチン、ICAM-1、IL-6、およびvWFからなる群より選択される遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択される、該組換え核酸コンストラクトに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
5'→3'方向に
・5'UTR、
・エフェクター分子をコードするコード領域、および
・3'UTR
を含む、組換え核酸コンストラクトであって、
該5'UTRが、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、Ang-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、H3.3.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ガレクチン-9をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、GADD34をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、EDN1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70m5をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、E-セレクチンをコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ICAM-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、IL-6をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびvWFをコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択され、
3'UTRが、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、MCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、H3.3.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、GADD34をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、EDN1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびIL-6をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択され、
該エフェクター分子が、細胞の細胞機能を回復させるのに有効であるか、または細胞内もしくは細胞上で治療効果を発揮するのに有効であり、かつ
該組換え核酸コンストラクトが、該エフェクター分子をコードする野生型mRNAとは異なる、
該組換え核酸コンストラクト。
【請求項２】
a）前記5'UTRが、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ前記3'UTRが、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、あるいは
b）前記5'UTRが、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ前記3'UTRが、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、あるいは
c）前記5'UTRが、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ前記3'UTRが、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、あるいは
d）前記5'UTRが、ANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ前記3'UTRが、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択される、
請求項1記載の組換え核酸コンストラクト。
【請求項３】
a）3'UTRが、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ前記5'UTRが、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、あるいは
b）3'UTRが、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ前記5'UTRが、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、あるいは
c）3'UTRが、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ前記5'UTRが、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、あるいは
d）3'UTRが、MCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ前記5'UTRが、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択される、
請求項1記載の組換え核酸コンストラクト。
【請求項４】
前記組換えコンストラクトの前記5'UTRと前記3'UTRが、異なる起源であり、好ましくは、異なる内在性遺伝子または内在性種に由来する、請求項1〜3のいずれか一項記載の組換え核酸コンストラクト。
【請求項５】
前記組換えコンストラクトの前記5'UTRと前記3'UTRが、同じ起源であり、好ましくは、同じ内在性遺伝子または内在性種に由来する、請求項1〜3のいずれか一項記載の組換え核酸コンストラクト。
【請求項６】
5'UTRが、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、MCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、ANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、H3.3.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、H3.3.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、および
5'UTRが、ガレクチン9をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、ガレクチン9をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト
を含む群から選択されるものであり、
好ましくは、
5'UTRが、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、あるいは
5'UTRが、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト
である、
請求項1〜5のいずれか一項記載の組換え核酸コンストラクト。
【請求項７】
好ましくは前記組換え核酸コンストラクトの3'末端に、ポリAテールを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の組換え核酸コンストラクト。
【請求項８】
好ましくは前記組換え核酸コンストラクトの5'末端に、キャップ構造を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の組換え核酸コンストラクト。
【請求項９】
好ましくは前記組換え核酸コンストラクトの5'末端に、IRES（配列内リボソーム進入部位）配列を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の組換え核酸コンストラクト。
【請求項１０】
前記コンストラクトが、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含み、好ましくは該シグナルペプチドが、1つのシグナルペプチドをコードする核酸配列とインフレームであり、かつ、前記5'UTRとエフェクター分子をコードする前記コード領域との間に配置されている、請求項1〜9のいずれか一項記載の組換え核酸コンストラクト。
【請求項１１】
前記シグナルペプチドが前記エフェクター分子の分泌を可能にする、請求項10記載の組換え核酸コンストラクト。
【請求項１２】
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が、MCP-1のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列または少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、IL-6のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列または少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、Ang-2のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列または少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびAng-1のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列または少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択される、請求項10または11記載の使用するための組換え核酸コンストラクト。
【請求項１３】
細胞の細胞機能が回復される細胞および/または細胞内もしくは細胞上で治療効果が発揮される細胞が、内皮細胞、好ましくは血管内皮細胞であり、より好ましくは該血管内皮細胞が微小血管内皮細胞である、請求項1〜12のいずれか一項記載の組換え核酸コンストラクト。
【請求項１４】
前記細胞機能が、内皮細胞の抗透過性効果、抗血管漏出効果、内皮細胞の抗アポトーシス効果、または内皮細胞の抗炎症効果、または抗ストレス応答効果を有するエフェクター分子によって回復されうるものであり、好ましくは該効果が、TIE-2シグナリング経路、VEGF受容体経路、NOTCHシグナリング経路、PI3-キナーゼ経路、eNOSシグナリング経路、サーチュイン依存的代謝経路およびエネルギーホメオスタシス経路、酸化ストレス経路、ずり応力応答経路、ET-1シグナル伝達経路、NO媒介シグナル伝達経路、ならびにメカノケミカル伝達経路に関係または関連している、請求項1〜13のいずれか一項記載の組換え核酸コンストラクト。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか一項記載の核酸コンストラクトを含む、ベクター。
【請求項１６】
請求項1〜14のいずれか一項記載の核酸コンストラクトおよび/または請求項15記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１７】
カチオン性脂質送達粒子であり、好ましくは該粒子がナノ粒子であり、より好ましくは該ナノ粒子の平均サイズが、約30nm〜約200nm、好ましくは約30nm〜約140nm、より好ましくは約30nm〜約60nmである、請求項1〜14のいずれか一項記載の核酸コンストラクトを含む送達ビヒクル。
【請求項１８】
請求項1〜14のいずれか一項記載の核酸コンストラクト、請求項15記載のベクター、請求項16記載の細胞、および/または請求項17記載の送達ビヒクルと、薬学的に許容される希釈剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
疾患の処置および/または予防のための方法において使用するための、請求項1〜14のいずれか一項記載の組換え核酸コンストラクト。
【請求項２０】
細胞の細胞機能を回復させるための方法において使用するための、請求項1〜14のいずれか一項記載の組換え核酸コンストラクト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え核酸コンストラクト、組換え核酸コンストラクトを含むベクター、好ましくは発現ベクター、組換え核酸コンストラクトおよび/または該ベクターを含む細胞、組換え核酸コンストラクトを含む送達ビヒクル、組換え核酸コンストラクトを含む薬学的組成物、疾患の処置および/または予防のための方法において使用するための組換え核酸コンストラクト、細胞の細胞機能を回復させるための方法において使用するための組換え核酸コンストラクト、疾患の処置および/または予防のための方法、ならびに細胞の細胞機能を回復させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分子は生物系においてさまざまな目的に役立つ。いくつかの目的のうちの1つは遺伝情報を格納することであり、もう一つは、デオキシリボ核酸からリボソームへと遺伝情報を伝達することでありここでそのような遺伝情報がそこでアミノ酸配列へと翻訳される。後者の工程はメッセンジャーリボ核酸（mRNA）の使用を伴う。
【０００３】
mRNAは、真核細胞では極めて基本的なデザインを示し、典型的には、5'→3'方向に、キャップ構造、5'非翻訳領域（untranslated region）（5'UTR）、典型的にはコード配列（CDS）に結合されたAUGコドンで始まり停止コドンで終わるコード配列、3'非翻訳領域（3'UTR）、およびポリAテールを含む。
【０００４】
mRNAに基づく治療は、バイオテクノロジーの初期から、治療法として提案されてきた。原則的に、投与されたmRNA配列は細胞にタンパク質を生成させることができ、次に、そのタンパク質は、疾患を直接的に処置しうるか、またはワクチンとして機能しうる。また、より間接的には、そのタンパク質が、ある経路の要素と、その経路が阻害されるか刺激されるような形で干渉することにより、疾患を処置または改善しうる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の根底にある課題は、組換え核酸コンストラクトのコード配列の高発現を可能にする組換え核酸コンストラクト、好ましくはmRNAの提供である。
【０００６】
本発明の根底にある別の課題は、内皮細胞における組換え核酸コンストラクトのコード配列の発現を可能にする組換え核酸コンストラクト、好ましくはmRNAの提供である。
【０００７】
本発明の根底にあるこれらのおよび他の課題は、添付の独立請求項の主題によって解決され、好ましい実施形態は添付の従属請求項から理解されうる。
【０００８】
加えて、より具体的には、本発明の根底にある課題は、第1局面の第1態様でもある第1局面において、5'→3'方向に
・5'UTR、
・エフェクター分子をコードするコード領域、および
・3'UTR
を含む、組換え核酸コンストラクトによって解決され、
ここで、5'UTRは、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、Ang-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、H3.3.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ガレクチン-9をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、GADD34をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、EDN1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70m5をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、E-セレクチンをコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ICAM-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、IL-6をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびvWFをコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択され、
3'UTRは、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、MCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、H3.3.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、GADD34をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、EDN1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびIL-6をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択され、
エフェクター分子は、細胞の細胞機能を回復させるのに有効であるか、または細胞内もしくは細胞上で治療効果を発揮するのに有効であり、かつ
組換え核酸コンストラクトは、エフェクター分子をコードする野生型mRNAとは異なる。
【０００９】
第1局面の第1態様の一態様でもある第1局面の第2態様において、組換えコンストラクトの5'UTRと3'UTRは、異なる起源であり、好ましくは、異なる内在性種に由来する。
【００１０】
第1局面の第1態様および第2態様の一態様でもある第1局面の第3態様において、組換えコンストラクトの5'UTRと3'UTRは、同じ起源であり、好ましくは、同じ内在性遺伝子種に由来する。
【００１１】
第1局面の第1態様、第2態様、および第3態様の一態様でもある第1局面の第4態様において、
a）5'UTRは、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRは、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、
b）5'UTRは、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRは、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、
c）5'UTRは、ANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRは、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、あるいは
d）5'UTRは、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRは、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択される。
【００１２】
第1局面の第1態様、第2態様、および第3態様の一態様でもある第1局面の第5態様において、
a）3'UTRは、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ5'UTRは、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、
b）3'UTRは、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ5'UTRは、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、
c）3'UTRは、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ5'UTRは、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、
あるいは
d）3'UTRは、MCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ5'UTRは、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択される。
【００１３】
第1局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、および第5態様の一態様でもある第1局面の第6態様において、コンストラクトは、
5'UTRが、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、MCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、ANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、H3.3.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、H3.3.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、および
5'UTRが、ガレクチン9をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、ガレクチン9をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト
を含む群から選択されるものである。
【００１４】
第1局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、および第6態様の一態様でもある第1局面の第7態様において、コンストラクトはポリAテールを、好ましくは組換え核酸コンストラクトの3'末端に含む。
【００１５】
第1局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、および第7態様の一態様でもある第1局面の第8態様において、コンストラクトはキャップ構造を、好ましくは組換え核酸コンストラクトの5'末端に含む。
【００１６】
第1局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、および第8態様の一態様でもある第1局面の第9態様において、コンストラクトはIRES（配列内リボソーム進入部位）配列を、好ましくは組換え核酸コンストラクトの5'末端に含む。
【００１７】
第1局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、および第9態様の一態様でもある第1局面の第10態様において、コンストラクトは、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含み、好ましくはシグナルペプチドは、1つのシグナルペプチドをコードする核酸配列とインフレームであり、かつ、5'UTRとエフェクター分子をコードするコード領域との間に配置されている。
【００１８】
第1局面の第10態様の一態様でもある第1局面の第11態様において、シグナルペプチドはエフェクター分子の分泌を可能にする。
【００１９】
第1局面の第10態様および第11態様の一態様でもある第1局面の第12態様において、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、MCP-1のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列または少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、IL-6のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列または少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、Ang-2のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列または少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびAng-1のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列または少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択される。
【００２０】
第1局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、および第12態様の一態様でもある第1局面の第13態様において、細胞の細胞機能が回復される細胞および/または細胞内もしくは細胞上で治療効果が発揮される細胞は、内皮細胞、好ましくは血管内皮細胞であり、より好ましくは血管内皮細胞は微小血管内皮細胞である。
【００２１】
第1局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、および第13態様の一態様でもある第1局面の第14態様において、細胞機能は、内皮細胞の抗透過性効果、抗血管漏出効果、内皮細胞の抗アポトーシス効果、または内皮細胞の抗炎症効果、または抗ストレス応答効果を有するエフェクター分子によって回復されうるものであり、好ましくは効果は、Tie-2シグナリング経路、VEGF受容体経路、NOTCHシグナリング経路、PI3-キナーゼ経路、eNOSシグナリング経路、サーチュイン依存的代謝経路およびエネルギーホメオスタシス経路、酸化ストレス経路、ずり応力応答経路、ET-1シグナル伝達経路、NO媒介シグナル伝達経路、ならびにメカノケミカル伝達経路に関係または関連している。
【００２２】
より具体的には、本発明の根底にある課題は、第2局面の第1態様でもある第2局面において、5'→3'方向に
・5'非翻訳領域（non-translated region）、
・エフェクター分子をコードするコード領域、および
・3'非翻訳領域、
を含み、エフェクター分子が細胞の細胞機能を回復させるのに有効である、疾患の処置および/または予防のための方法において使用するための組換え核酸コンストラクトによって、解決され、ここでエフェクター分子は内皮細胞によって発現される。一態様において、および好ましくは本明細書において使用される場合に、細胞機能の回復には、細胞を殺すこと、より好ましくは腫瘍内皮細胞および/または腫瘍細胞を殺すことが含まれ、かつ、それぞれそれらが包含される。また、別の一態様において、および好ましくは本明細書において使用される場合に、細胞機能の回復には、新血管新生、より好ましくは血管疾患の場合における新血管新生が含まれ、かつ、それぞれそれらが包含される。
【００２３】
第2局面の第1態様の一態様でもある第2局面の第2態様において、疾患の処置および/または予防は細胞の細胞機能の回復を伴う。
【００２４】
より具体的には、本発明の根底にある課題は、第3局面の第1態様でもある第3局面において、5'→3'方向に
・5'非翻訳領域、
・エフェクター分子をコードするコード領域、および
・3'非翻訳領域、
を含み、エフェクター分子が細胞の細胞機能を回復させるのに有効である、細胞の細胞機能を回復させるための方法において使用するための組換え核酸コンストラクトによって、解決され、ここでエフェクター分子は内皮細胞によって発現される。
【００２５】
より具体的には、本発明の根底にある課題は、第4局面の第1態様でもある第4局面において、5'→3'方向に
・5'非翻訳領域、
・エフェクター分子をコードするコード領域、および
・3'非翻訳領域、
を含み、エフェクター分子が細胞内または細胞上で治療効果を発揮するのに有効である、疾患の処置および/または予防のための方法において使用するための組換え核酸コンストラクトによって解決され、ここでエフェクター分子は内皮細胞によって発現される。
【００２６】
第4局面の第1態様の一態様でもある第4局面の第2態様において、疾患の処置および/または予防は、細胞の細胞機能の回復を伴う。
【００２７】
より具体的には、本発明の根底にある課題は、第5局面の第1態様でもある第5局面において、5'→3'方向に
・5'非翻訳領域、
・エフェクター分子をコードするコード領域、および
・3'非翻訳領域、
を含み、エフェクター分子が細胞内または細胞上で治療効果を発揮するのに有効である、細胞の細胞機能を回復させるための方法において使用するための組換え核酸コンストラクトによって、解決され、ここでエフェクター分子は内皮細胞によって発現される。
【００２８】
第2局面の第1態様および第2態様の一態様でもある第2局面の第3態様において、第3局面の第1態様の一態様でもある第3局面の第2態様において、第4局面の第1態様および第2態様の一態様でもある第4局面の第3態様において、ならびに第5局面の第1態様の一態様でもある第5局面の第2態様において、前記方法では、エフェクター分子が内皮細胞によって発現される。
【００２９】
第2局面の第1態様、第2態様、および第3態様の一態様でもある第2局面の第4態様において、第3局面の第1態様および第2態様の一態様でもある第3局面の第3態様において、第4局面の第1態様、第2態様、および第3態様の一態様でもある第4局面の第4態様において、ならびに第5局面の第1態様および第2態様の一態様でもある第5局面の第3態様において、内皮細胞は血管内皮細胞であり、好ましくは血管内皮細胞は微小血管内皮細胞である。
【００３０】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、および第4態様の一態様でもある第2局面の第5態様において、第3局面の第1態様、第2態様、および第3態様の一態様でもある第3局面の第4態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、および第4態様の一態様でもある第4局面の第5態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、および第3態様の一態様でもある第5局面の第4態様において、内皮細胞は非分裂性内皮細胞、非増殖性内皮細胞または休止内皮細胞である。その一態様において、および好ましくは本明細書において使用される場合に、内皮細胞は、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、内皮幹細胞（ESC）または内皮前駆細胞（EPC）である。
【００３１】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、および第5態様の一態様でもある第2局面の第6態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様および第4態様の一態様でもある第3局面の第5態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、および第5態様の一態様でもある第4局面の第6態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、および第4態様の一態様でもある第5局面の第5態様において、内皮細胞は老化内皮細胞である。
【００３２】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、および第6態様の一態様でもある第2局面の第7態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、および第5態様の一態様でもある第3局面の第6態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、および第6態様の一態様でもある第4局面の第7態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様および第5態様の一態様でもある第5局面の第6態様において、内皮細胞は加齢による障害がありかつ/またはストレス関連欠陥（stress-related defect）を示している。
【００３３】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、および第7態様の一態様でもある第2局面の第8態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、および第6態様の一態様でもある第3局面の第7態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、および第7態様の一態様でもある第4局面の第8態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、および第6態様の一態様でもある第5局面の第7態様において、組換え核酸コンストラクトは、キャップ構造、IRES配列、さらなる開始コドン提供配列、シグナルペプチドをコードする核酸配列およびポリAテールを含む群から選択される1つの要素を、さらに含む。
【００３４】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、および第8態様の一態様でもある第2局面の第9態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、および第7態様の一態様でもある第3局面の第8態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、および第8態様の一態様でもある第4局面の第9態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、および第7態様の一態様でもある第5局面の第8態様において、
組換え核酸コンストラクトは、5'→3'方向に
a）・5'非翻訳領域、
・エフェクター分子をコードするコード領域、
・3'非翻訳領域、および
・ポリAテール;
b）・5'非翻訳領域、
・さらなる開始コドン提供配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、
・3'非翻訳領域、および
・ポリAテール;
c）・キャップ構造、
・5'非翻訳領域、
・エフェクター分子をコードするコード領域、および
・3'非翻訳領域;
d）・キャップ構造、
・5'非翻訳領域、
・さらなる開始コドン提供配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、および
・3'非翻訳領域;
e）・IRES配列、
・5'非翻訳領域、
・エフェクター分子をコードするコード領域、および
・3'非翻訳領域;
f）・IRES配列、
・5'非翻訳領域、
・さらなる開始コドン提供配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、および
・3'非翻訳領域;
g）・キャップ構造、
・5'非翻訳領域、
・エフェクター分子をコードするコード領域、
・3'非翻訳領域、および
・ポリAテール;
h）・キャップ構造、
・5'非翻訳領域、
・さらなる開始コドン提供配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、
・3'非翻訳領域、および
・ポリAテール;
i）・IRES配列、
・5'非翻訳領域、
・エフェクター分子をコードするコード領域、
・3'非翻訳領域、および
・ポリAテール;
j）・IRES配列、
・5'非翻訳領域、
・さらなる開始コドン提供配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、
・3'非翻訳領域、および
・ポリAテール;
k）・5'非翻訳領域、
・シグナルペプチドをコードする核酸配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、
・3'非翻訳領域、および
・ポリAテール;
l）・5'非翻訳領域、
・さらなる開始コドン提供配列、
・シグナルペプチドをコードする核酸配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、
・3'非翻訳領域、および
・ポリAテール;
m）・キャップ構造、
・5'非翻訳領域、
・シグナルペプチドをコードする核酸配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、および
・3'非翻訳領域;
・キャップ構造、
・5'非翻訳領域、
・さらなる開始コドン提供配列、
・シグナルペプチドをコードする核酸配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、および
・3'非翻訳領域;
o）・IRES配列、
・5'非翻訳領域、
・シグナルペプチドをコードする核酸配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、および
・3'非翻訳領域;
p）・IRES配列、
・5'非翻訳領域、
・さらなる開始コドン提供配列、
・シグナルペプチドをコードする核酸配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、および
・3'非翻訳領域;
q）・キャップ構造、
・5'非翻訳領域、
・シグナルペプチドをコードする核酸配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、
・3'非翻訳領域、および
・ポリAテール;
r）・キャップ構造、
・5'非翻訳領域、
・さらなる開始コドン提供配列、
・シグナルペプチドをコードする核酸配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、
・3'非翻訳領域、および
・ポリAテール;
s）・IRES配列、
・5'非翻訳領域、
・シグナルペプチドをコードする核酸配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、
・3'非翻訳領域、および
・ポリAテール;ならびに
t）・IRES配列、
・5'非翻訳領域、
・さらなる開始コドン提供配列、
・シグナルペプチドをコードする核酸配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、
・3'非翻訳領域、および
・ポリAテール
を含む群から選択されるものである。
【００３５】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、および第9態様の一態様でもある第2局面の第10態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、および第8態様の一態様でもある第3局面の第9態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、および第9態様の一態様でもある第4局面の第10態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、および第8態様の一態様でもある第5局面の第9態様において、組換え核酸は、5'→3'方向に
・キャップ構造、
・5'非翻訳領域、
・シグナルペプチドをコードする核酸配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、
・3'非翻訳領域、および
・ポリAテール
を含む。
【００３６】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様および第10態様の一態様でもある第2局面の第11態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様および第9態様の一態様でもある第3局面の第10態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様および第10態様の一態様でもある第4局面の第11態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、および第9態様の一態様でもある第5局面の第10態様において、組換え核酸は、5'→3'方向に
・IRES配列、
・5'非翻訳領域、
・シグナルペプチドをコードする核酸配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、
・3'非翻訳領域、および
・ポリAテール
を含む。
【００３７】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、および第11態様の一態様でもある第2局面の第12態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、および第10態様の一態様でもある第3局面の第11態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、および第11態様の一態様でもある第4局面の第12態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、および第10態様の一態様でもある第5局面の第11態様において、組換え核酸は、5'→3'方向に
・キャップ構造、
・5'非翻訳領域、
・さらなる開始コドン提供配列、
・シグナルペプチドをコードする核酸配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、
・3'非翻訳領域、および
・ポリAテール
を含む。
【００３８】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、および第12態様の一態様でもある第2局面の第13態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、および第11態様の一態様でもある第3局面の第12態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、および第12態様の一態様でもある第4局面の第13態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、および第11態様の一態様でもある第5局面の第12態様において、組換え核酸は、5'→3'方向に
・IRES配列、
・5'非翻訳領域、
・さらなる開始コドン提供配列、
・シグナルペプチドをコードする核酸配列、
・エフェクター分子をコードするコード領域、
・3'非翻訳領域、および
・ポリAテール
を含む。
【００３９】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、および第13態様の一態様でもある第2局面の第14態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、および第12態様の一態様でもある第3局面の第13態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、および第13態様の一態様でもある第4局面の第14態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、および第12態様の一態様でもある第5局面の第13態様において、さらなる開始コドン提供配列はエフェクター分子をコードするコード領域とインフレームである。
【００４０】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、および第14態様の一態様でもある第2局面の第15態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様および第13態様の一態様でもある第3局面の第14態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、および第14態様の一態様でもある第4局面の第15態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、および第13態様の一態様でもある第5局面の第14態様において、5'非翻訳領域は5'UTRである。
【００４１】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、および第15態様の一態様でもある第2局面の第16態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、および第14態様の一態様でもある第3局面の第15態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、および第15態様の一態様でもある第4局面の第16態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、および第14態様の一態様でもある第5局面の第15態様において、5'非翻訳領域は、真核生物、好ましくは哺乳類生物、より好ましくはヒト、非ヒト霊長類、例えばカニクイザル、チンパンジー、アカゲザル、ラット、およびマウスを含む群から選択される哺乳類生物に由来する。代替的一態様において、5'非翻訳領域はウイルス遺伝子に由来し、好ましくはウイルスは真核生物に感染する能力を有するウイルスである。
【００４２】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、および第16態様の一態様でもある第2局面の第17態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、および第15態様の一態様でもある第3局面の第16態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、および第16態様の一態様でもある第4局面の第17態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、および第15態様の一態様でもある第5局面の第16態様において、5'UTRは、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、Ang-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、H3.3.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびガレクチン-9をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択される。
【００４３】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、および第17態様の一態様でもある第2局面の第18態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、および第16態様の一態様でもある第3局面の第17態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、および第17態様の一態様でもある第4局面の第18態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、および第15態様、第16態様の一態様でもある第5局面の第17態様において、3'非翻訳領域は3'-UTRである。
【００４４】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、および第18態様の一態様でもある第2局面の第19態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、および第17態様の一態様でもある第3局面の第18態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、および第18態様の一態様でもある第4局面の第19態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、および第15態様、第16態様、第17態様の一態様でもある第5局面の第18態様において、3'非翻訳領域は、真核生物、好ましくは哺乳類生物、より好ましくはヒト、非ヒト霊長類、例えばカニクイザル、チンパンジー、アカゲザル、ラットおよびマウスを含む群から選択される哺乳類生物に由来する。代替的一態様において、5'非翻訳領域はウイルス遺伝子に由来し、好ましくはウイルスは真核生物に感染する能力を有するウイルスである。
【００４５】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、および第19態様の一態様でもある第2局面の第20態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、および第18態様の一態様でもある第3局面の第19態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、および第19態様の一態様でもある第4局面の第20態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、および第18態様の一態様でもある第5局面の第19態様において、3'UTRは、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、MCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびH3.3.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択される。
【００４６】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、および第20態様の一態様でもある第2局面の第21態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、および第19態様の一態様でもある第3局面の第20態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、および第20態様の一態様でもある第4局面の第21態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、および第19態様の一態様でもある第5局面の第20態様において、組換え核酸コンストラクトの5'UTRと3'UTRは、異なる起源であり、好ましくは、異なる種に由来する。
【００４７】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、および第21態様の一態様でもある第2局面の第22態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、および第20態様の一態様でもある第3局面の第21態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、および第21態様の一態様でもある第4局面の第22態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、および第20態様の一態様でもある第5局面の第21態様において、組換え核酸コンストラクトの5'UTRと3'UTRは、同じ起源であり、好ましくは、同じ種に由来する。
【００４８】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、および第22態様の一態様でもある第2局面の第23態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、および第21態様の一態様でもある第3局面の第22態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様および第20態様、第21態様、および第22態様の一態様でもある第4局面の第23態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、および第21態様の一態様でもある第5局面の第22態様において、
a）5'UTRは、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRは、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、
b）5'UTRは、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRは、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、
c）5'UTRは、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRは、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、あるいは
d）5'UTRは、ANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRは、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択される。
【００４９】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、および第23態様の一態様でもある第2局面の第24態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、および第22態様の一態様でもある第3局面の第23態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、および第23態様の一態様でもある第4局面の第24態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、および第22態様の一態様でもある第5局面の第23態様において、
a）3'UTRは、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ5'UTRは、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択され、かつ
b）3'UTRは、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ5'UTRは、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、
c）3'UTRは、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ5'UTRは、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択されるか、
あるいは
d）3'UTRは、MCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ5'UTRは、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、ANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびMCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択される。
【００５０】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、および第24態様の一態様でもある第2局面の第25態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、および第23態様の一態様でもある第3局面の第24態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、および第24態様の一態様でもある第4局面の第25態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、および第23態様の一態様でもある第5局面の第24態様において、コンストラクトは、
5'UTRが、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、MCP-1をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、ANG-2をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、vWFをコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTR、または少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、
5'UTRが、H3.3.をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、H3.3.をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト、あるいは
5'UTRが、ガレクチン9をコードする遺伝子の5'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体であり、かつ3'UTRが、ガレクチン9をコードする遺伝子の3'UTRまたは少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体である、コンストラクト
を含む群から選択されるものである。
【００５１】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、および第25態様の一態様でもある第2局面の第26態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、および第24態様の一態様でもある第3局面の第25態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、および第23態様、第24態様および第25態様の一態様でもある第4局面の第26態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、および第24態様の一態様でもある第5局面の第25態様において、コンストラクトはポリAテールを含む。
【００５２】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、第25態様、および第26態様の一態様でもある第2局面の第27態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、および第25態様の一態様でもある第3局面の第26態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、第25態様、および第26態様の一態様でもある第4局面の第27態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、および第25態様の一態様でもある第5局面の第26態様において、コンストラクトはキャップ構造を含む。
【００５３】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様および第23態様、第24態様、第25態様、第26態様および第27態様の一態様でもある第2局面の第28態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、第25態様、および第26態様の一態様でもある第3局面の第27態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、第25態様、第26態様、および第27態様の一態様でもある第4局面の第28態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、第25態様、および第26態様の一態様でもある第5局面の第27態様において、コンストラクトは1つまたは複数のIRES（配列内リボソーム進入部位）配列を含む。好ましい一態様では、IRES配列がキャップ構造に取って代わっていた。
【００５４】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様および第23態様、第24態様、第25態様、第26態様、第27態様および第28態様の一態様でもある第2局面の第29態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、第25態様、第26態様、および第27態様の一態様でもある第3局面の第28態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、第25態様、第26態様、第27態様、および第28態様の一態様でもある第4局面の第29態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、第25態様、第26態様、および第27態様の一態様でもある第5局面の第28態様において、コンストラクトはシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００５５】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、および第23態様、第24態様、第25態様、第26態様、第27態様、第28態様、および第29態様の一態様でもある第2局面の第30態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、第25態様、第26態様、第27態様、および第28態様の一態様でもある第3局面の第29態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、第25態様、第26態様、第27態様、第28態様、および第29態様の一態様でもある第4局面の第30態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、第25態様、第26態様、第27態様、および第28態様の一態様でもある第5局面の第29態様において、シグナルペプチドはエフェクター分子の分泌を可能にする。
【００５６】
第2局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様および第23態様、第24態様、第25態様、第26態様、第27態様、第28態様、第29態様および第30態様の一態様でもある第2局面の第31態様において、第3局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、第25態様、第26態様、第27態様、第28態様、および第29態様の一態様でもある第3局面の第30態様において、第4局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、第25態様、第26態様、第27態様、第28態様、第29態様、および第30態様の一態様でもある第4局面の第31態様において、ならびに第5局面の第1態様、第2態様、第3態様、第4態様、第5態様、第6態様、第7態様、第8態様、第9態様、第10態様、第11態様、第12態様、第13態様、第14態様、第15態様、第16態様、第17態様、第18態様、第19態様、第20態様、第21態様、第22態様、第23態様、第24態様、第25態様、第26態様、第27態様、第28態様、および第29態様の一態様でもある第5局面の第30態様において、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、MCP-1のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列または少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、IL-6のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列または少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、Ang-2のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列または少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体、およびAng-1のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列または少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有するその誘導体を含む群から選択される。
【００５７】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、細胞の細胞機能が回復される細胞および/または細胞内もしくは細胞上で治療効果が発揮される細胞は、内皮細胞、好ましくは血管内皮細胞であり、より好ましくは血管内皮細胞は微小血管内皮細胞である。
【００５８】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、内皮細胞は非分裂内皮細胞、非増殖性内皮細胞、または休止内皮細胞である。
【００５９】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、内皮細胞は炎症性刺激によって刺激された内皮細胞である。
【００６０】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、内皮細胞は老化内皮細胞である。
【００６１】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、内皮細胞は加齢による障害がありかつ/またはストレス関連欠陥を示している。
【００６２】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、細胞機能は、内皮細胞の抗透過性効果、抗血管漏出効果、内皮細胞の抗アポトーシス効果、または内皮細胞の抗炎症効果、または抗ストレス応答効果を有するエフェクター分子によって回復されうるものである。その一態様において、エフェクター分子は、血管の生存を刺激するか、退縮を阻害するか、アポトーシスを阻害するか、遊走を刺激するか、リモデリングを刺激するか、血管新生を刺激するか、管腔形成/侵入を刺激するか、増殖を刺激するか、白血球接着を阻害するか、接着分子発現を阻害するか、組織因子発現を阻害するか、NFκB活性を阻害するか、または単層の完全性を増進する。
【００６３】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、効果は、Tie-2シグナリング経路、VEGF受容体経路、NOTCHシグナリング経路、PI3-キナーゼ経路、eNOSシグナリング経路、サーチュイン依存的代謝経路およびエネルギーホメオスタシス経路、酸化ストレス経路、ずり応力応答経路、ET-1シグナル伝達経路、NO媒介シグナル伝達経路、ならびにメカノケミカル伝達経路に関係または関連し、好ましくは経路は、Ang/Tie-2シグナリング経路、VEGF/VEGF受容体経路およびNotch/Notchリガンド経路を含む群から選択される。
【００６４】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、エフェクター分子は、Tie-2シグナリング経路、VEGF受容体経路、NOTCHシグナリング経路、PI3-キナーゼ経路、eNOSシグナリング経路、サーチュイン依存的代謝経路およびエネルギーホメオスタシス経路、酸化ストレス経路、ずり応力応答経路、ET-1シグナル伝達経路、NO媒介シグナル伝達経路、ならびにメカノケミカル伝達経路を含む群から選択される経路の一要素である。
【００６５】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、エフェクター分子は、Ang-1、Ang-4、COMP-Ang-1、hCOMP-Ang-1、COMP-Ang-1、COMP-ANG-2、Tie-2受容体、Tie-1受容体、PI3-キナーゼ、好ましくは構成的活性型PI3-キナーゼ、高活性型Tie-2受容体（例えばR849W）、VE-カドヘリン、GRB2、GRB7、GRB14、GRB7、IQGAP1、RAC1、RAP1、DOK2、ABIN1およびABIN2、KLF2（Krueppel様因子2）、α5β1インテグリン、CD73、Akt1、Akt2、ならびにAkt3を含む群から選択される。
【００６６】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、細胞機能は血管漏出であり、好ましくは経路はTie-2経路である。
【００６７】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、エフェクター分子は、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、PDGF、bFGF、サーチュイン、eNOS、RAS、およびc-MYCを含む群から選択される。
【００６８】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、エフェクター分子は、血管再生を回復させるか、または血管再生を、好ましくは血管内皮血管再生を提供する。
【００６９】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、細胞の細胞機能が回復される細胞および/または細胞内もしくは細胞上で治療効果が発揮される細胞は、非内皮細胞である。
【００７０】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、非内皮細胞は、上皮細胞、肺胞マクロファージ、I型肺胞細胞、II型肺胞細胞、肺胞マクロファージ、肺細胞、肺上皮細胞、造血細胞、骨髄細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン細胞、アストロサイト、末梢神経系の細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、β細胞、下垂体細胞、滑膜表層細胞、卵巣細胞、精巣細胞、B細胞、T細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、マクロファージ、好中球、抗原提示細胞（樹状細胞）、線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞、およびそれらの組合せを含む群から選択される。
【００７１】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、エフェクター分子は、腫瘍デスリガンド、造血および凝血に関与する因子、幹細胞因子、増殖因子、ならびにサイトカインを含む群から選択される。
【００７２】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、腫瘍デスリガンドは、IL-12、デスリガンドタンパク質のTNF遺伝子スーパーファミリーのメンバー、例えばApo2L/TRAIL、IL-13、IL-10、IL-8、IL-2、インターフェロンβ、分泌型frizzled関連タンパク質（SFRP）1、SFRP2、SFRP3、SFRP4、およびSFRP5を含む群から選択される。
【００７３】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、造血および凝血に関与する因子は、エリスロポエチン、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、およびヘパラン-N-スルファターゼを含む群から選択される。
【００７４】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、幹細胞因子はOct4、Sox2、Klf4、およびc-Mycを含む群から選択される。
【００７５】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、増殖因子およびサイトカインは、アドレノメデュリン、アンジオポエチンファミリー、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質、毛様体神経栄養因子（CNTF）、白血病抑制因子（LIF）、インターロイキン-6（IL-6）、マクロファージコロニー刺激因子（m-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、上皮増殖因子（EGF）、エフリン、エリスロポエチン（EPO）、線維芽細胞増殖因子ファミリー（FGF1〜23）、ソマトトロピン、GDNFリガンドファミリー（例えばグリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）、ニュールツリン、パーセフィンおよびアルテミン）、増殖分化因子-9（GDF9）、肝細胞増殖因子（HGF）、肝癌由来増殖因子（HDGF）、インスリン、インスリン様成長因子-1およびインスリン様成長因子-2（IGF-1、IGF-2）、ケラチノサイト増殖因子（KGF）、遊走刺激因子（MSF）、肝細胞増殖因子様タンパク質（HGFLP）とも呼ばれるマクロファージ刺激タンパク質（MSP）、ミオスタチン（GDF-8）、ニューレグリン1〜4（NRG1〜4）、ニューロトロフィン（脳由来神経栄養因子（BDNF）、神経増殖因子（NGF）、ニューロトロフィン-3（NT-3）、ニューロトロフィン-4（NT-4））、胎盤増殖因子（PGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、レナラーゼ（RNLS）-抗アポトーシス生存因子、T細胞増殖因子（TCGF）、トロンボポエチン（TPO）、トランスフォーミング増殖因子α（TGF-α）、トランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、血管内皮増殖因子ファミリー（VEGF）、Wntシグナリング経路シグナリング糖タンパク質（WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターロイキン2（IL-2）、インターロイキン11（IL-11）、インターフェロン-γ、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-35、およびIL-36を含む群から選択される。
【００７６】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、疾患は、血管漏出、好ましくは血管内皮細胞の漏出、より好ましくは微小血管内皮細胞の漏出を特徴とするか、またはそれらを原因とする。
【００７７】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、疾患を患っている対象は肺に炎症を示す。
【００７８】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、疾患は、肺炎、敗血症、および外傷を含む群から選択される。
【００７９】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、疾患を患っている対象は急性呼吸窮迫症候群（ARDS）を示す。
【００８０】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、疾患は肺炎、好ましくは重症市中感染性肺炎（sCAP）、市中肺炎（CAP）、院内肺炎（HAP）を含む群から選択される肺炎である。
【００８１】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、疾患は肺損傷を特徴とするか、または肺損傷を示す。
【００８２】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、肺損傷は直接的肺損傷（immediate lung damage）である。
【００８３】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、直接的肺損傷は、有毒ガスの吸引、中毒性肺水腫、ウイルスまたは細菌の肺感染、胃内容物の吸引、淡水の吸引、塩水の吸引、肺挫傷、脂肪塞栓、羊水塞栓、および高圧酸素の吸入に起因する。
【００８４】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、肺損傷は間接的肺損傷である。
【００８５】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、間接的肺損傷は、敗血症、菌血症、エンドトキシン血症、重症外傷、ショックを含む多発性外傷、熱傷、膵炎、熱帯熱マラリア、薬物および免疫抑制、慢性アルコール乱用、慢性肺疾患、血清の低pHに起因する。
【００８６】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、疾患または効果は、血管の再生または寿命延長であり、この場合、好ましくはエフェクター分子は、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、PDGF、bFGF、サーチュイン（Sirt1）、PPAR-γ、AMPK、eNOS、RAS、c-MYC、FOXO3、PI3キナーゼ＊、Akt、Akt＊（＊は、キナーゼの高活性型および構成的活性型の誘導体を生成させるための融合物または切断型を示す）、アデノシンA1受容体、アデノシンA2A受容体、アデノシンA2B受容体、テロメラーゼ、山中因子（すなわちOct4、sox2、klf4、c-My）を含む群から選択される。
【００８７】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、エフェクター分子は抗アポトーシス因子、好ましくは正常な内皮、すなわち非疾患内皮を保護する抗アポトーシス因子であり、抗アポトーシス因子は、好ましくは、PTEN、サバイビン、IAP、cIAP2およびXIAP、ニューログロビン（シトクロムcに結合する）、生存促進性タンパク質Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、mcl-1 A1、NR-13、BHRF1、LMW5-HL、ORF16、KS-Bcl-2、E1b-19K、ならびにP53を含む群から選択される。
【００８８】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、エフェクター分子はアポトーシス因子、好ましくは腫瘍内皮を標的とするアポトーシス因子であり、アポトーシス因子は、好ましくは、PTEN、サバイビン、IAP、cIAP2およびXIAP、ニューログロビン（シトクロムcに結合する）、生存促進性タンパク質Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、mcl-1 A1、NR-13、BHRF1、LMW5-HL、ORF16、KS-BCl-2、E1b-19K、P53を含む群から選択される。
【００８９】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、エフェクター分子は腫瘍デスリガンドであり、好ましくは腫瘍デスリガンドはアポトーシス促進性または抗血管新生性であり、より好ましくは腫瘍デスリガンドは、デスリガンドタンパク質のTNF遺伝子スーパーファミリーのメンバー、例えばTNF-α、Fas-L、Apo2L/TRAIL、IL-12、IL-13、IL-10、IL-8、IL-2、分泌型frizzled関連タンパク質（SFRP）ファミリー（SFRP1、2、3、4、5）、ELTD1、TGF-β、TNF-a、IL-6、PTEN、p53およびアポトーシス促進機能を持つ他の腫瘍抑制遺伝子、トロンボスポンジンC、TIMP-1、TIMP-2、インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、Ang-1およびTie-2アゴニスト機能を持つ誘導体、シトクロムc、BH3-onlyタンパク質、アポトーシス促進性Bcl-2タンパク質Bad、Bid、Bax、BakおよびBim、Apaf1、プロカスパーゼ-8、プロカスパーゼ-9、プロカスパーゼ-10、カスパーゼ2、カスパーゼ3、カスパーゼ6、カスパーゼ7、カスパーゼ8、カスパーゼ9、およびカスパーゼ10を含む群から選択される。
【００９０】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、エフェクター分子は抗炎症性であり、好ましくはエフェクター分子は、IκBおよび変異したリン酸化部位を持つ誘導体、PI3キナーゼおよびAktキナーゼならびに高活性型を含む群から選択される。
【００９１】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、エフェクター分子は血液凝固および/または造血において活性であり、好ましくはエフェクター分子は、エリスロポエチン、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、およびヘパラン-N-スルファターゼを含む群から選択される。
【００９２】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、エフェクター分子はCas9などの遺伝子編集ヌクレアーゼである。
【００９３】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、エフェクター分子は治療用抗体またはデコイをコードしている。
【００９４】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、エフェクター分子は腫瘍ワクチンとして有効であり、好ましくはエフェクター分子は腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発する抗原である。
【００９５】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、エフェクター分子は分泌タンパク質である。
【００９６】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、エフェクター分子はオートクリン因子として有効である。
【００９７】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、エフェクター分子はパラクリン因子として有効である。
【００９８】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、組換え核酸コンストラクトはリボヌクレオチドからなる。
【００９９】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、組換え核酸コンストラクトはデオキシリボヌクレオチドからなる。
【０１００】
第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、組換え核酸コンストラクトはリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドからなる。
【０１０１】
より具体的には、本発明の根底にある課題は、第6局面の第1態様でもある第6局面において、第1局面（その任意の態様を含む）の組換え核酸コンストラクト、ならびに/またはあらゆる局面に関連して記載された、例えばその任意の態様、好ましくは第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面の任意の態様に関連して記載された、組換え核酸コンストラクトを含むベクターによって解決される。
【０１０２】
第6局面の第1態様の一態様でもある第6局面の第2態様において、ベクターは発現ベクターである。
【０１０３】
第6局面の第2態様の一態様でもある第6局面の第3態様において、ベクターは細胞、好ましくは内皮細胞における組換え核酸コンストラクトの発現を可能にし、より好ましくはベクターはプラスミドまたはウイルスである。
【０１０４】
より具体的には、本発明の根底にある課題は、第7局面の第1態様でもある第7局面において、第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の組換え核酸コンストラクトおよび/または第7局面（その任意の態様を含む）のベクターを含む細胞によって解決される。
【０１０５】
第7局面の第1態様の一態様でもある第7局面の第2態様において、細胞は内皮細胞または間葉系幹細胞である。
【０１０６】
第7局面の第1態様および第2態様の一態様でもある第7局面の第3態様において、細胞は組換え細胞である。
【０１０７】
第7局面の第1態様、第2態様および第3態様の一態様でもある第7局面の第4態様において、細胞は単離された細胞である。
【０１０８】
より具体的には、本発明の根底にある課題は、第8局面の第1態様でもある第8局面において、第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の組換え核酸コンストラクトを含む、カチオン性脂質送達粒子である送達ビヒクルによって解決される。
【０１０９】
第8局面の第1態様の一態様でもある第8局面の第2態様において、粒子はナノ粒子である。
【０１１０】
第8局面の第1態様および第2態様の一態様でもある第8局面の第3態様において、ナノ粒子の平均サイズは、約30nm〜約200nm、好ましくは約30nm〜約140nm、より好ましくは約30nm〜約60nmである。
【０１１１】
より具体的には、本発明の根底にある課題は、第9局面の第1態様でもある第9局面において、第1局面、第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）の組換え核酸コンストラクトを含む組成物、第6局面（その任意の態様を含む）のベクター、第7局面（その任意の態様を含む）の細胞および/または第8局面（その任意の態様を含む）の送達ビヒクルによって解決される。好ましい一態様において、組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物である。
【０１１２】
より具体的には、本発明の根底にある課題は、第10局面において、第1局面、第2局面、第3局面、第4局面および第5局面（それらの任意の態様を含む）の組換え核酸コンストラクト、第6局面（その任意の態様を含む）のベクター、第7局面（その任意の態様を含む）の細胞、第7局面（その任意の態様を含む）の細胞、および/または第8局面（その任意の態様を含む）の送達ビヒクルの、医薬の製造における使用によっても解決される。その一態様において、医薬は、疾患の処置用、好ましくは第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）に関連して本明細書に記載した疾患の処置用である。
【０１１３】
より具体的には、本発明の根底にある課題は、第11局面において、対象、好ましくはヒト対象を処置するための方法によっても解決され、該方法は、治療有効量の第1局面、第2局面、第3局面、第4局面および第5局面（それらの任意の態様を含む）の組換え核酸コンストラクト、第6局面（その任意の態様を含む）のベクター、第7局面（その任意の態様を含む）の細胞、第8局面（その任意の態様を含む）の送達ビヒクルおよび/または第9局面（その任意の態様を含む）の組成物を対象に投与する工程を含む。その一態様において、本方法は、疾患の処置のための方法、好ましくは第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）に関連して本明細書に記載した疾患の処置ための方法である。
【０１１４】
より具体的には、本発明の根底にある課題は、第12局面において、対象に、好ましくはヒト対象に、予防接種するための方法によっても解決され、該方法は、対象において免疫応答を、好ましくは所望の免疫応答を、誘発するのに有効な量の、第1局面、第2局面、第3局面、第4局面および第5局面（それらの任意の態様を含む）の組換え核酸コンストラクト、第6局面（その任意の態様を含む）のベクター、第7局面（その任意の態様を含む）の細胞、第8局面（その任意の態様を含む）の送達ビヒクルおよび/または第9局面（その任意の態様を含む）の組成物を対象に投与する工程を含む。その一態様において、本方法は、疾患の処置のための方法、好ましくは第2局面、第3局面、第4局面、および第5局面（それらの任意の態様を含む）に関連して本明細書に記載した疾患の処置のための方法である。好ましい一態様において、エフェクター分子は、そのような免疫応答を誘発する能力を有するものまたはそのような免疫応答を誘発するのに適したものである。
【０１１５】
一態様において、および好ましくは本明細書において使用される場合に、異種コンストラクトまたは異種組換えコンストラクトとは、それ自体は、ウイルス、細胞、組織、器官または生物などといった野生型の生物系には存在しないコンストラクトである。より好ましくは、異種コンストラクトまたは組換えコンストラクトは、そのコンストラクトに含有されている、5'非翻訳領域、3'非翻訳領域、キャップ構造、シグナル配列、およびポリAテールからなる群より選択される少なくとも1つの要素が、エフェクターのコード領域とは組み合わされていないものである。好ましくは、5'非翻訳領域は5'UTRであり、3'非翻訳領域は3'UTRである。
【０１１６】
一態様において、および好ましくは本明細書において使用される場合に、治療方法または疾患の処置および/または予防のための方法とは、治療である。
【０１１７】
本発明のあらゆる局面の一態様において、エフェクター分子をコードするコード領域は、内皮細胞によって発現される。その好ましい一態様において、エフェクター分子を発現する内皮細胞は、機能が損なわれている内皮細胞である。これに代わる好ましい一態様において、エフェクター分子を発現する内皮細胞は、機能が損なわれていない内皮細胞であり、そのような場合、エフェクター分子はエフェクター分子産生内皮細胞によって輸出または分泌され、機能が損なわれている他の任意の細胞に対して、典型的には、機能が損なわれている他の任意の内皮細胞に対して、その効果を発揮する。好ましい一態様において、細胞の損なわれた機能は、本発明のさまざまな局面に従って回復される細胞の機能である。
【０１１８】
好ましくは本明細書において使用される場合に、配列の誘導体は親配列と同じ機能を呈し、好ましくは、親配列は野生型配列である。好ましい一態様において、誘導体の配列と親の場合の配列は、少なくとも50％、少なくとも51％、少なくとも52％、少なくとも53％、少なくとも54％、少なくとも55％、少なくとも56％、少なくとも57％、少なくとも58％、少なくとも59％、少なくとも60％、少なくとも61％、少なくとも62％、少なくとも63％、少なくとも64％、少なくとも65％、少なくとも66％、少なくとも67％、少なくとも68％、少なくとも69％、少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％の同一性を有する。誘導体が親配列の切断型であることは、本発明の範囲内である。そのような切断は、5'端に存在するか、3'端に存在するか、または5'端と3'端の両方に存在しうる。同一性に関して親配列に言及する場合、そのような同一性は、好ましくは、誘導体と親配列の両方が共有している後続のヌクレオチドのストレッチを指し、親配列の配列がリファレンス配列として機能する。
【０１１９】
一態様において、および好ましくは本明細書において使用される場合に、エフェクター分子をコードするコード領域は、該エフェクター分子をコードする核酸配列を含むかまたは該核酸配列からなる。
【０１２０】
一態様において、および好ましくは本明細書において使用される場合に、5'非翻訳領域は5'非翻訳配列である。
【０１２１】
一態様において、および好ましくは本明細書において使用される場合に、3'非翻訳領域は5'非翻訳配列である。
【０１２２】
一態様において、および好ましくは本明細書において使用される場合に、本発明の組換え核酸コンストラクトに含有される要素のいずれか1つの任意の供給源の表示は、ヌクレオチド配列の代替的説明の代用と理解されるものとする。そのようなヌクレオチド配列は、好ましくは、それぞれの野生型配列のもの、より好ましくはそれぞれのヒト野生型配列のものである。人間以外の種がそのような野生型配列を提供しうることも、当業者には理解されると考えられる。そして、本発明の一態様では、そのような人間以外の種のそのような野生型配列を、本発明の実施において使用しうる。そのような野生型配列がGenBankなどの公開データベースから入手しうることは、当業者には理解されると考えられる。野生型配列は、典型的にはシーケンシングエラーを修正するために、時がたつにつれて変更されうる。本発明の一態様において、配列は、本願の出願日時点でGenBankなどの該公開データベースに記載されているものである。さまざまなそれぞれの野生型配列が存在する限り、そのようなあらゆる野生型配列は、本発明に包含されるものとする。別の一態様において、2種類以上の野生型配列が存在し、それら2種類以上の野生型配列が、異なる人的グループによって、例えば地理的に定義された異なる人的グループおよび/または遺伝学的に定義された異なる人的グループによって、与えられる場合は、該異なる人的グループのうち、最も広い範囲にわたるグループにおいて優勢な野生型配列を、野生型配列とみなしうる。
【０１２３】
本発明の一態様において、および好ましくは本明細書において使用される場合に、ある遺伝子の5'UTRの誘導体に対して、その誘導体が少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有することを示す言及がなされた場合、同一性とは、その遺伝子の5'UTRを参照した同一性またはその遺伝子の5'UTRを基準とする同一性である。
【０１２４】
本発明の一態様において、および好ましくは本明細書において使用される場合に、ある遺伝子の3'UTRの誘導体に対して、その誘導体が少なくとも85％のヌクレオチド同一性を有することを示す言及がなされた場合、同一性とは、その遺伝子の3'UTRを参照した同一性またはその遺伝子の3'UTRを基準とする同一性である。
【０１２５】
一態様において、および好ましくは本明細書において使用される場合に、シグナルペプチドとは、そのシグナルペプチドに融合されたまたは取り付けられたポリペプチドまたはタンパク質の細胞外間隙への移送または分泌を直接的または間接的に媒介するペプチドであり、その後、好ましくは、シグナル配列は、それぞれポリペプチドおよびタンパク質から除去される。
【０１２６】
本発明の一態様において、組換え核酸コンストラクトは図に開示する組換え核酸コンストラクト、より具体的には、図40（PAN29）、図90（PAN58）、図86（PAN54）、図67（PAN50）、図45（PAN34）、図44（PAN33）、図39（PAN28）、図37（PAN12）、図88（PAN56）に開示する組換え核酸コンストラクトである。
【０１２７】
本発明の一態様において、および好ましくは本明細書において使用される場合に、デコイとは、リガンドに結合してシグナリング活性を中和する、mRNAによってコードされるタンパク質である。
【０１２８】
一態様において、および好ましくは本明細書において使用される場合に、ポリAテールとは、互いに共有結合された多数のAを含むヌクレオチド配列または互いに共有結合された多数のAからなるヌクレオチド配列であり、このような共有結合は好ましくはホスホジエステル結合である。その一態様において、ポリAテールは、約20個〜約240個のA（すなわちアデノシンリン酸）ヌクレオチド、好ましくは約60個〜120個のA、より好ましくは約100個〜約140個のA、最も好ましくは約120個のAを含む。
【０１２９】
ポリAテールは、天然メッセンジャーおよび合成センスRNAを安定化すると考えられる。それゆえに、一態様では、長いポリAテールをmRNA分子に付加することで、そのRNAをより安定にすることができる。ポリAテールは当技術分野において認識されている種々の技法を使って付加することができる。例えば、ポリAポリメラーゼを使って、長いポリAテールを合成RNAまたはインビトロ転写RNAに付加することができる（Yokoe,et al.Nature Biotechnology.1996;14:1252-1256）。転写ベクターが長いポリAテールをコードすることもできる。加えて、PCR産物から直接的に、転写によってポリAテールを付加することもできる。RNAリガーゼを使って、センスRNAの3'端にポリAをライゲーションしてもよい（例えばMolecular Cloning A Laboratory Manual,第2版,Sambrook,Fritsch and Maniatis編（Cold Spring Harbor Laboratory Press:1991年版）参照）。一態様において、ポリAテールの長さは、少なくとも約90、200、300、400ヌクレオチド、または少なくとも500ヌクレオチドである。一態様において、ポリAテールの長さは、本発明の修飾センスmRNAの安定性を、したがって、タンパク質の転写を、制御するために調節される。例えば、ポリAテールの長さはセンスmRNA分子の半減期に影響を及ぼしうるので、ヌクレアーゼに対するmRNAの耐性のレベルを変更し、それによって細胞におけるタンパク質発現の時間経過を制御するために、ポリAテールの長さを調節することができる。一態様において、安定化された核酸分子は、インビボでの（例えばヌクレアーゼによる）分解に対して十分に耐性であるため、それらを導入ビヒクルなしで標的細胞に送達しうる。さらに別の一態様において、二本鎖RNA夾雑物を除去し、よって自然免疫系の活性化を低減するために、HPLCを使って核酸分子を精製することができる（例えばKariko et al.,Nucleic Acids Res.2011 Nov;39（21）:e142参照）。
【０１３０】
一態様において、および好ましくは本明細書において使用される場合に、キャップ構造とは、当業者に公知のキャップ構造を形成するヌクレオチド配列である。真核細胞において、キャップ構造はm7G（5'）ppp（5'）G5'-5'-三リン酸結合構造からなる。mRNAの5'端にある最初の2つのリボース糖は2'位でメチル化されうる。これは、CAP-1（2つのリボース糖のうちの最初のリボース糖がメチル化される場合）およびCAP-2構造（2つのリボース糖のうちの2番目のリボース糖がメチル化される場合）として知られている。キャップ構造は、mRNA転写中に組み込まれうるか、またはキャッピング酵素および2'-O-メチルトランスフェラーゼ酵素とメチル供与体としてのS-アデノシルメチオニン（SAM）とを使って転写後に組み込まれうる。加えて、免疫刺激性5'リン酸基を除去するために、ホスファターゼ処理を使用することもできる。
【０１３１】
あらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の組換え核酸コンストラクトの好ましい一態様において、組換え核酸コンストラクトはmRNAである。
【０１３２】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、MCP-1をコードする遺伝子の5'UTRは、SEQ ID NO:20のヌクレオチド配列を含む。
【０１３３】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、MCP-1をコードする遺伝子の3'UTRは、SEQ ID NO:23のヌクレオチド配列を含む。
【０１３４】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、RPL12s.c.をコードする遺伝子の5'UTRは、SEQ ID NO:24のヌクレオチド配列を含む。
【０１３５】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、RPL12s.c.をコードする遺伝子の3'UTRは、SEQ ID NO:25のヌクレオチド配列を含む。
【０１３６】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、Ang-2をコードする遺伝子の5'UTRは、SEQ ID NO:26のヌクレオチド配列を含む。
【０１３７】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、Ang-2をコードする遺伝子の3'UTRは、SEQ ID NO:29のヌクレオチド配列を含む。
【０１３８】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、HSP70をコードする遺伝子の5'UTRは、SEQ ID NO:38またはSEQ ID NO:40のヌクレオチド配列を含む。
【０１３９】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、HSP70をコードする遺伝子の3'UTRは、SEQ ID NO:39またはSEQ ID NO:43のヌクレオチド配列を含む。
【０１４０】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、H3.3.をコードする遺伝子の5'UTRは、SEQ ID NO:44のヌクレオチド配列を含む。
【０１４１】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、H3.3.をコードする遺伝子の3'UTRは、SEQ ID NO:45のヌクレオチド配列を含む。
【０１４２】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、ガレクチン-9をコードする遺伝子（LHALS9）の5'UTRは、SEQ ID NO:46のヌクレオチド配列を含む。
【０１４３】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、ガレクチン-9をコードする遺伝子（LHALS9）の3'UTRは、SEQ ID NO:47のヌクレオチド配列を含む。
【０１４４】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、IL-6をコードする遺伝子の5'UTRは、SEQ ID NO:30のヌクレオチド配列を含む。
【０１４５】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、IL-6をコードする遺伝子の3'UTRは、SEQ ID NO:33のヌクレオチド配列を含む。
【０１４６】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、vWFをコードする遺伝子の5'UTRは、SEQ ID NO:34のヌクレオチド配列を含む。
【０１４７】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、vWFをコードする遺伝子の3'UTRは、SEQ ID NO:37のヌクレオチド配列を含む。
【０１４８】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、Ang-1をコードする遺伝子の5'UTRは、SEQ ID NO:83のヌクレオチド配列を含む。
【０１４９】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、Ang-1をコードする遺伝子の3'UTRは、SEQ ID NO:88のヌクレオチド配列を含む。
【０１５０】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、Ang-4をコードする遺伝子の5'UTRは、SEQ ID NO:89のヌクレオチド配列を含む。
【０１５１】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、Ang-4をコードする遺伝子の3'UTRは、SEQ ID NO:94のヌクレオチド配列を含む。
【０１５２】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、コンストラクトPAN57の5'UTRは、SEQ ID NO:120のヌクレオチド配列を含む。
【０１５３】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、コンストラクトPAN57の3'UTRは、SEQ ID NO:121のヌクレオチド配列を含む。
【０１５４】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、本明細書に開示されるあらゆる具体的コンストラクトにおいて実現される5'UTRと3'UTRのさまざまな組合せは、他のどの構成成分とも無関係に、特に本発明の組換え核酸コンストラクトに含有されるエフェクター分子をコードするどのコード配列とも無関係に、組換え核酸コンストラクトにおいて実現されうる5'UTRと3'UTRの組合せである。
【０１５５】
本発明のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の一態様において、および好ましくは本明細書において使用される場合に、内在性遺伝子とは、本明細書に記載される任意の細胞に含有される遺伝子である。したがって、5'UTRと3'UTRとが異なる内在性遺伝子に由来する組換え核酸コンストラクトは、ある細胞の第1遺伝子に由来する5'UTRと、ある細胞の第2遺伝子に由来する3'UTRとを含み、例えば5'UTRはMCP-1またはAng-2をコードする遺伝子に由来し、3'UTRはvWFをコードする遺伝子に由来する。該細胞は同じ細胞であっても異なる細胞であってもよく、かつ/または該細胞は同じ種類の細胞であっても異なる種類の細胞であってもよい。好ましくは、細胞はヒト起源の細胞である。
【０１５６】
あらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の組換え核酸コンストラクトの好ましい一態様において、組換え核酸コンストラクトは組換え核酸分子である。
【０１５７】
組換え核酸分子を形成するヌクレオチドを修飾しうることは、あらゆる局面（それらの任意の態様を含む）によって定義される本発明の範囲内である。適切な修飾には、同じアミノ酸をコードするが、野生型バージョンの核酸に見出されるコドンよりも安定なコドンになるように、コドンの1つまたは複数のヌクレオチドを変化させることが含まれる。例えば、RNAの安定性とシチジン（C）残基および/またはウリジン（U）残基の数の多さとの間には逆の関係が実証されており、C残基およびU残基を欠くRNAは大半のRNaseに対して安定であることが見出されている（Heidenreich,et al.J Biol Chem 269,2131-8（1994））。いくつかの態様では、mRNA配列中のC残基および/またはU残基の数を低減させる。別の一態様では、特定のアミノ酸をコードするコドンを、同じアミノ酸または関連するアミノ酸をコードする別のコドンの代わりに使用することによって、C残基および/またはU残基の数を低減させる。本発明のmRNA核酸への修飾として考えられるものには、シュードウリジン、N1-メチル-シュードウリジン、5-メトキシウリジン、および5'-メチルシチジンの組込みも含まれる。組換え核酸コンストラクトへの、好ましくは本発明のmRNAへの、そのような修飾ヌクレオチドの組込みは、安定性および翻訳能を高めると共に、インビボでの免疫原性を減少させうる。（例えばKariko,K.,et al.,Molecular Therapy 16（11）:1833-1840（2008）参照）。本発明の組換え核酸コンストラクトへの置換および修飾、特に組換え核酸コンストラクトの個々のヌクレオチドのレベルでの置換および修飾は、当業者にはすぐにわかる方法によって行われうる。
【０１５８】
配列中のC残基およびU残基の数を低減することに対する制約は、非翻訳領域と比べてmRNAのコード領域内の方がおそらく大きいと考えられる（すなわち、所望のアミノ酸配列をコードするメッセージの能力を依然として保ちながら、メッセージ中に存在するC残基およびU残基のすべてを除去することはおそらく可能ではないと考えられる）。しかし遺伝暗号の縮重により、同じコード能を維持しつつ、配列中に存在するC残基および/またはU残基の数を低減させうるチャンスはある（すなわち、あるコドンがどのアミノ酸をコードしているかに依存して、RNA配列の改変にはいくつかの異なる可能性が考えられると考えられる）。例えばGlyのコドンはGGUまたはGGCの代わりにGGAまたはGGGに変化させることができる。
【０１５９】
修飾という用語は、例えば本発明の核酸配列への非ヌクレオチド結合または修飾ヌクレオチドの組込み（例えば機能的なタンパク質または酵素をコードするmRNA分子の3'端および5'端の一方または両方の修飾）も包含する。そのような修飾としては、核酸配列への塩基の付加（例えばポリAテールまたはより長いポリAテールの組み入れ）、3'UTRまたは5'UTRの改変、核酸と作用物質（例えばタンパク質または相補的核酸分子）との複合体形成、および核酸分子の構造を変化させる要素（例えば二次構造を形成する要素）の組み入れが挙げられる。
【０１６０】
第8局面の送達ビヒクルは、好ましくは、本発明の組換え核酸コンストラクトと組み合わされて全体としてカチオン性の脂質-核酸粒子（cationic-lipid-nucleic acid particle）（cLNP）をもたらす1種類または複数種類の適切な脂質の組成物（例えばリポソーム）に基づく。そのようなcLNPは、核酸、特にmRNAを、哺乳動物の脈管構造の内皮細胞中に機能的に導入するために使用することができる。
【０１６１】
本発明の組換え核酸コンストラクトなどの核酸が、双性イオン性リン脂質、コレステロール、およびPEG化脂質などの他の脂質成分と組み合わされたカチオン性脂質と複合体形成することによって形成される、脂質-核酸ナノ粒子（LNP）は、血漿におけるRNAの分解を阻止し、RNAの機能的な細胞取り込みを容易にするために、既に使用されている。
【０１６２】
しかし、治療との関連においては、特に非経口的治療応用を考えると、ζ電位によって特徴づけられる脂質-核酸ナノ粒子の全体的電荷（overall charge）は、ナノ粒子の臓器分布を指示する上で、極めて重要である。全体として中性に荷電したLNPが、ほとんど排他的に、網内系の器官によって、特に肝臓および脾臓によって、取り込まれることは、当業者には理解されると考えられる。一方、全体として正に荷電した脂質ナノ粒子が、薬学的ペイロードを哺乳動物の脈管構造の細胞中に機能的に送達するのにとりわけ有用であることも、当業者には公知である。
【０１６３】
遊離の核酸、特にmRNAが、静脈内に適用された場合には、免疫刺激性であることも、当業者には理解されると考えられる。
【０１６４】
したがって、非経口的治療応用を考えると、脂質ナノ粒子内部での核酸の完全で安定な複合体形成は、望ましくない免疫原性副反応を防止するために、不可欠であると考えられる。さらにまた、脂質-核酸ナノ粒子のサイズが、粒子の網内系クリアランスを抑制する上で、極めて重要であることも、当業者には公知である。
【０１６５】
スタッガードヘリンボーンマイクロミキサー（staggered herringbone micromixer:SHM）デバイスに基づくマイクロ流体混合プロセスを使って、極めて強力な限界サイズのsiRNA LNP（平均粒径約30nm）を調製できることが、最近記載された（Belliveau et al.;Molecular Therapy-Nucleic Acids（2012）1（8））。
【０１６６】
ナノリットルスケールでの脂質と本発明の組換え核酸コンストラクトなどの核酸のミリ秒混合ゆえに、結果として生じる粒子は、密集した固形粒子コア内部での核酸の極めて密な充填を特徴とする。これに対して、T型コネクタを使ったマクロ流体混合プロセスが、一般に、より不均一な多重膜の形態を持つ、より大きなナノ粒子をもたらすことは、当業者には理解されると考えられる。
【０１６７】
一態様において、本発明は、哺乳動物の脈管構造の細胞中に、特に肺脈管構造の内皮細胞中に、本発明の組換え核酸コンストラクト、特にmRNAを、機能的に送達するための、本発明の組換え核酸コンストラクトなどの核酸を含む新規正荷電脂質-核酸ナノ粒子を提供する。
【０１６８】
本発明のさまざまな局面（それらの任意の態様を含む）の一態様では、β-（L-アルギニル）-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、L-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミド、DOTAP（N-［1-（2,3-ジオレオイルオキシ）プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチル塩化物）、DOTMA（1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（塩化物塩））、またはDC-コレステロールを含む群から選択されるカチオン性脂質が、中性脂質およびポリエチレングリコール（PEG）修飾を持つさらなる遮蔽脂質（shielding lipid）成分と組み合わされる。中性脂質は、ジフィタノイル-PE（1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DOPE（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DLPE（1,2-ラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DMPE、POPE、DSPEを含む群から選択される双性イオン性リン脂質であるか、またはコレステロールおよびスチグマステロールを含む群から選択される非荷電ステロール脂質であることができる。PEG化脂質成分は、メトキシPEG-DSPE、メトキシPEG-DLG、メトキシPEG-DMG、メトキシPEG-DPG、メトキシPEG-DSG、メトキシPEG-c-DMA、メトキシPEG-C8-セラミド、メトキシPEG-C16-セラミドを含む群から選択される。特定の一態様において、PEG鎖の鎖長は750Da〜5000Daの範囲の分子量、好ましくは1500Da〜3000Daの範囲の分子量に対応する。
【０１６９】
本発明の別の一態様において、脂質混合物中の脂質のモル比は、20〜80モル％カチオン性脂質、10〜70モル％中性脂質、および1〜10モル％PEG化脂質の範囲、好ましくは35〜65モル％カチオン性脂質、35〜65モル％中性脂質、および1〜5モル％PEG化脂質の範囲にある（総脂質含量を100％とする）。
【０１７０】
好ましい一態様において、カチオン性脂質は、β-（L-アルギニル）-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミドまたはL-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミドであり、中性脂質はリン脂質ジフィタノイル-PEであり、PEG化脂質はメトキシPEG2000-DSPEである。モル比は、50モル％カチオン性脂質、49モル％ジフィタノイル-PE、および1モル％mPEG2000-DSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000］（ナトリウム塩））である。
【０１７１】
さらに別の一態様において、上述した脂質の混合物は、エタノール、アセトン、1-ブタノール、2-ブタノール、tert.-ブタノール、3-メチル-1-ブタノール、2-メチル-1-プロパノール、1-プロパノール、2-プロパノール、ジメチルスルホキシドを含む群、好ましくはエタノール、tert.-ブタノール、および1-ブタノールを含む群から選択される水混和性溶媒に溶解される。
【０１７２】
溶解された脂質混合物が、次に、水性溶媒中の核酸、例えば本発明の組換え核酸コンストラクトの溶解物と素早く混合されると、脂質-核酸ナノ粒子（LNP）の形成が起こる。本発明の好ましい一態様において、混合は、マイクロ流体混合デバイスを使って、特にスタッガードヘリンボーン型混合チャンバ、例えばNanoAssemblr（商標）（Precision NanoSystems Inc.、カナダ・バンクーバー）デバイスを使って、行われる。
【０１７３】
さらに別の一態様において、本発明の組換え核酸コンストラクトなどの核酸の核酸に対する総脂質の質量比は、5〜60の範囲、好ましくは15〜40の範囲にあり、核酸水性溶液対総脂質有機溶液の体積混合比は、1:1〜6:1の範囲、好ましくは2:1〜4:1の範囲にある。溶液の混合流速は5ml/分〜25ml/分の範囲、好ましくは10ml/分〜20ml/分の範囲にある。
【０１７４】
本発明のある特定の態様において、結果として得られる混合物の有機溶媒は、混合工程後に、透析によって、または限外濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過によって、除去され、ここに、限外濾過膜は中空糸膜または平面膜（flat-screen membrane）のどちらかであることができる。限外濾過膜の孔径は、1500Da〜500.000Daの範囲、好ましくは1500Da〜100.000Daの範囲、さらに好ましくは1500Da〜30.000Daの範囲の分子量カットオフに対応する。タンジェンシャルフロー濾過工程内で、LNPを所望の濃度に濃縮することも可能である。
【０１７５】
結果として生じるLNPの平均粒径は、動的光散乱（DLS）技術を使って測定することができ、好ましくは15nm〜400nmの範囲、より好ましくは25nm〜200nmの範囲にあり、さらに好ましくは粒子は25nm〜100nmの範囲のサイズを有する。LNPの全体としての粒子電荷（overall particle charge）は正であり、粒子のζ電位は、好ましくは＋5mV〜＋60mVの範囲、より好ましくは＋25mV〜＋60mVの範囲にある。
【０１７６】
ある特定の態様において、本発明の送達ビヒクルは、リポソーム導入ビヒクル、例えば脂質ナノ粒子またはリピドイドナノ粒子である。一態様において、導入ビヒクルは、標的細胞への本発明の組換え核酸コンストラクトの送達が最適化されるように選択されかつ/または調製されうる。例えば、標的細胞が内皮細胞である場合、導入ビヒクルの性質（例えばサイズ、電荷および/またはpH）は、そのような導入ビヒクルを標的細胞へと効果的に送達し、免疫クリアランスを低減し、かつ/または標的細胞における保持を増進するように最適化されうる。あるいは、標的細胞が中枢神経系にある場合（例えば神経変性疾患の処置のために投与される本発明の組換え核酸コンストラクトなどのmRNAが脳または脊髄の組織を特異的に標的としうる場合）、導入ビヒクルの選択と調製には、血液脳関門の透過および血液脳関門内での保持ならびに/またはそのような標的細胞にそのような導入ビヒクルを直接送達する代替的手段の使用を考慮しなければならない。一態様において、本発明の組成物を、外因性mRNAの移入を容易にする作用物質（例えば、血液脳関門の透過性を撹乱または改良することによって標的細胞への外因性mRNAの移入を強化する作用物質）と組み合わせてもよい。
【０１７７】
リポソーム（例えばリポソーム脂質ナノ粒子）は、診断化合物または治療化合物の導入ビヒクルとしてのインビボでのそれらの使用にとりわけ適していることが公知であり（Lasic,Trends Biotechnol,16:307-321,1998、Drummond et al,Pharmacol.Rev.,51:691-743,1999）、通常は、1つまたは複数の二重層の膜によって外側の媒質から隔離された内部水性空間を有する微視的ベシクルを特徴とする。リポソームの二重層膜は、典型的には、両親媒性分子、例えば空間的に分離された親水性ドメインと疎水性ドメインとを含む合成起源または天然起源の脂質によって形成される（Lasic,Trends Biotechnol,16:307-321,1998）。リポソームの二重層膜は、両親媒性ポリマーおよび界面活性剤によっても形成されうる（例えばポリメロソーム（polymerosome）、ニオソームなど）。そのようなリポソームは、本発明の組換え核酸コンストラクトを含む本発明の送達ビヒクルにおける脂質部分としても使用しうる。
【０１７８】
本発明の特定の一局面に関連して開示される組換え核酸コンストラクトに関する任意の特徴は、同様に、本発明の他のあらゆる局面（それらの任意の態様を含む）の組換え核酸コンストラクトの一態様でもあると認められるべきである。より具体的には、第1局面に関連して開示される組換え核酸コンストラクトの任意の態様は、第2局面、第3局面、および第4局面の組換え核酸コンストラクトの一態様でもある。同様に、第2局面、第3局面、および第4局面に関連して開示される組換え核酸コンストラクトの任意の態様は、第1局面の組換え核酸コンストラクトの一態様でもある。
【０１７９】
コード領域に隣接するUTRがコード領域と干渉しないこと、より具体的にはUTRが、原則的に、コード領域の発現と干渉することなく交換されうることは、当技術分野において一般に認められている（例えばWO 2017/100551 A1、Trepotec et al.;Tissue Engineering Part A,Vol 0 Nr ja（Apr.2018）（https://doi.org/10.1089/ten.TEA.2017.0485）参照）。
【０１８０】
以下に図面および実施例を挙げて本発明をさらに例示する。これらの図面および実施例からは、本発明のさらなる特徴、態様、および利点を理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】通常のmRNA分子構造の概略図である。
【図２−１】オープンリーディングフレームがナノ-ルシフェラーゼ（Nano-luciferase）のものであるコード配列を持つmRNAコンストラクトに関する選択された実施例、すなわちPAN02、PAN05、PAN07、PAN08、およびPAN09、の概略図である。
【図２−２】オープンリーディングフレームがナノ-ルシフェラーゼのものであるコード配列を持つmRNAコンストラクトに関する選択された実施例、すなわちPAN10、PAN11、PAN12、13、およびPAN28の概略図である。
【図２−３】オープンリーディングフレームがナノ-ルシフェラーゼのものであるコード配列を持つmRNAコンストラクトに関する選択された実施例、すなわちPAN29、PAN30、PAN31、PAN32、PAN33、PAN34、PAN35、PAN36、およびPAN37の概略図である。
【図２−４】オープンリーディングフレームがナノ-ルシフェラーゼのものであるコード配列を持つmRNAコンストラクトに関する選択された実施例、すなわちPAN38、PAN39、PAN40、PAN41、PAN42、PAN43、およびPAN44の概略図である。
【図２−５】オープンリーディングフレームがナノ-ルシフェラーゼのものであるコード配列を持つmRNAコンストラクトに関する選択された実施例、すなわちPAN45、PAN46、PAN47、PAN48、およびPAN49の概略図である。
【図３】コンストラクトPAN11を含有するプラスミドpcDNA3.1（-）の制限地図である。
【図４】図3のプラスミドpdDNA3.1（-）の制限消化地図（restriction digest map）である。
【図５】コンストラクトPAN28（「28」）、PAN13（「13」）、PAN12（「12」）、PAN11（「11」）、PAN10（「10」）、PAN09（「09」）、PAN08（「08」）、PAN07（「07」）、およびPAN05（「05」）を含有するpcDNA3.1（-）プラスミドの非線状化物（未切断、スーパーコイルド、右レーン）およびBamHI制限消化後の線状化産物（左レーン）を示す、EtBr染色した1％アガロースゲルである。
【図６】120ntのポリAテールを付加するためのポリAテーリングPCR（Poly-A tailing PCR）のPCR産物を示す、EtBr染色した1％アガロースゲルを表す。
【図７Ａ】表示した遺伝子の5'UTRのために使用した5'プライマーを表す:1列目は、そのプライマーがどのコンストラクトに関連して使用されるかを示し、2列目は5'UTRの起源を示し、3列目はプライマーがヌクレオチド配列にハイブリダイズする位置を示す。
【図７Ｂ】表示した遺伝子の3'UTRのために使用した3'プライマーを表す:1列目は、そのプライマーがどのコンストラクトに関連して使用されるかを示し、2列目は3'UTRの起源を示し、3列目はプライマーがヌクレオチド配列にハイブリダイズする位置を示す。
【図８】さまざまなコンストラクトのインビトロmRNA転写産物を表すEtBr染色後の非変性アガロースゲルの画像である。
【図９】0.5μg（左）および0.1μg（右）の市販の高感度緑色蛍光タンパク質mRNA（enhanced mRNA version of the producing green fluorescent protein）（TriLINK Biotechnology）をトランスフェクトしたHeLa細胞のトランスフェクション24時間後の蛍光顕微鏡観察の写真である。
【図１０】トランスフェクションの2時間後（左カラム）、6時間後（中央カラム）および24時間後（右カラム）における、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPMEC中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、培地中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。
【図１１】トランスフェクションの6時間後（左カラム）および24時間後（右カラム）における、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPMEC中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、HPMECの全細胞溶解物中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。
【図１２】トランスフェクションの2時間後（左カラム）、6時間後（中央カラム）および24時間後（右カラム）における、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HUVEC中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、培地中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。
【図１３】トランスフェクションの2時間後（左カラム）、6時間後（中央カラム）および24時間後（右カラム）における、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HUVECの溶解後の表示の組換え核酸コンストラクトによる、HUVECの全細胞溶解物中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。
【図１４】トランスフェクションの2時間後（左カラム）、6時間後（中央カラム）および24時間後（右カラム）における、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HeLa細胞中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、培地中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。
【図１５Ａ】ヒト（homo sapiens）C-Cモチーフケモカインリガンド2（CCL2）とも呼ばれるヒトMCP-1（GenBankエントリーNM＿002982.3）のmRNAの5'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図１５Ｂ】ヒトMCP-1のシグナルペプチド配列のヌクレオチド配列とアミノ酸配列との両方を表す。
【図１５Ｃ】ヒトMCP-1のmRNAの3'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図１６Ａ】RPL12s.c.とも呼ばれるホウレンソウ（Spinacia oleracea）の50Sリボソームタンパク質L12,クロロプラスト（LOC110782793）（GenBankエントリーXM＿021987044.1）のmRNAの5'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図１６Ｂ】ホウレンソウの50Sリボソームタンパク質L12,クロロプラスト（LOC110782793）のmRNAに由来する3'UTRを表す。
【図１７Ａ】ANGPT2またはAng-2とも呼ばれるヒトアンジオポエチン2の転写産物バリアント1（GenBankエントリーNM＿001147.2）のmRNAの5'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図１７Ｂ】ヒトAng-2のmRNAのシグナル配列のヌクレオチド配列とアミノ酸配列との両方を表す。
【図１７Ｃ−１】ヒトAng-2のmRNAの3'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図１７Ｃ−２】ヒトAng-2のmRNAの3'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図１８Ａ】ヒトインターロイキン6（IL-6）転写産物バリアント1（GenBankエントリーNM＿000600.4）のmRNAの5'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図１８Ｂ】ヒトIL-6のmRNAのシグナル配列のヌクレオチド配列とアミノ酸配列との両方を表す。
【図１８Ｃ】ヒトIL-6のmRNAの3'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図１９Ａ】ヒト ヴォン・ヴィレブランド（von Willebrand）因子（vWF）（GenBankエントリーNM＿000552.4）のmRNAの5'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図１９Ｂ】ヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）のmRNAのシグナル配列のヌクレオチド配列とアミノ酸配列との両方を表す。
【図１９Ｃ】ヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）のmRNAの3'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図２０】図20Aは、HSPA1Aとも呼ばれるヒト熱ショックタンパク質ファミリーA（Hsp70）メンバー1A（GenBankエントリーNM＿005345.5）のmRNAの5'UTRヌクレオチド配列を表す。図20Bは、ヒトHSPA1AのmRNAの3'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図２１Ａ】HSPA5とも呼ばれるヒト熱ショックタンパク質ファミリーA（Hsp70）メンバー5（GenBankエントリーNM＿005347.4）のmRNAの5'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図２１Ｂ】ヒトHSPA5のmRNAのシグナル配列のヌクレオチド配列とアミノ酸配列との両方を表す。図21Bは、ヒトHSPA5のmRNAのシグナル配列のヌクレオチド配列とアミノ酸配列との両方を表す。
【図２１Ｃ】ヒトHSPA1AのmRNAの3'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図２２】図22Aは、H3.3.とも呼ばれるヒトH3ヒストンファミリーメンバー3A（H3F3A）（GenBankエントリーNM＿002107.4）のmRNAの5'UTRヌクレオチド配列を表す。図22Bは、ヒトH3.3のmRNAの3'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図２３】図23Aは、ヒトガレクチン-9（LGALS9）転写産物バリアント1（GenBankエントリーNM＿009587.2）のmRNAの5'UTRヌクレオチド配列を表す。図23Bは、ヒトガレクチン-9のmRNAの3'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図２４−１】組換え核酸コンストラクトPAN01の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図２４−２】組換え核酸コンストラクトPAN01の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図２４−３】組換え核酸コンストラクトPAN01の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図２５−１】組換え核酸コンストラクトPAN03の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図２５−２】組換え核酸コンストラクトPAN03の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図２６】組換え核酸コンストラクトPAN04の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図２７】組換え核酸コンストラクトPAN06の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図２８−１】組換え核酸コンストラクトPAN36の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図２８−２】組換え核酸コンストラクトPAN36の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図２９】組換え核酸コンストラクトPAN37の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図３０−１】組換え核酸コンストラクトPAN02の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図３０−２】組換え核酸コンストラクトPAN02の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図３１】組換え核酸コンストラクトPAN05の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図３２】組換え核酸コンストラクトPAN07の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図３３】組換え核酸コンストラクトPAN08の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図３４】組換え核酸コンストラクトPAN09の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図３５】組換え核酸コンストラクトPAN10の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図３６】組換え核酸コンストラクトPAN11の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図３７】組換え核酸コンストラクトPAN12の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図３８】組換え核酸コンストラクトPAN13の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図３９】組換え核酸コンストラクトPAN28の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図４０】組換え核酸コンストラクトPAN29の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図４１】組換え核酸コンストラクトPAN30の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図４２】組換え核酸コンストラクトPAN31の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図４３】組換え核酸コンストラクトPAN32の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図４４】組換え核酸コンストラクトPAN33の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図４５】組換え核酸コンストラクトPAN34の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図４６】組換え核酸コンストラクトPAN35の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図４７】組換え核酸コンストラクトPAN38の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図４８】組換え核酸コンストラクトPAN39の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図４９】組換え核酸コンストラクトPAN40の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図５０】組換え核酸コンストラクトPAN41の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図５１】組換え核酸コンストラクトPAN42の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図５２】組換え核酸コンストラクトPAN43の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図５３】組換え核酸コンストラクトPAN44の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図５４】組換え核酸コンストラクトPAN45の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図５５】組換え核酸コンストラクトPAN46の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図５６】組換え核酸コンストラクトPAN47の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図５７】組換え核酸コンストラクトPAN48の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図５８】組換え核酸コンストラクトPAN49の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図５９Ａ】ANGPT1またはAng-1とも呼ばれるヒトアンジオポエチン1転写産物バリアント1,GenBankエントリーNM＿001146.4のmRNAのヌクレオチド配列を表す。
【図５９Ｂ】ヒトAng-1のmRNAのヌクレオチド配列とアミノ酸配列との両方を表す。
【図５９Ｃ】ヒトAng-1のmRNAの成熟ペプチドのコード配列（CDS）を表す。
【図５９Ｄ】ヒトAng-1のmRNAの3'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図６０Ａ】ANGPT4またはAng-4とも呼ばれるヒトアンジオポエチン4転写産物バリアント1,GenBankエントリーNM＿015985.3のmRNAのヌクレオチド配列を表す。
【図６０Ｂ】ヒトAng-4のmRNAのヌクレオチド配列とアミノ酸配列との両方を表す。
【図６０Ｃ】ヒトAng-4のmRNAの成熟ペプチドのコード配列（CDS）を表す。
【図６０Ｄ−１】ヒトAng-4のmRNAの3'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図６０Ｄ−２】ヒトAng-4のmRNAの3'UTRヌクレオチド配列を表す。
【図６１】合成コンストラクトであるCOMP-Ang1をコードするヌクレオチド配列を表す。
【図６２】合成コンストラクトであるhCOMP-Ang1をコードするヌクレオチド配列を表す。
【図６３】合成コンストラクトであるCMP-Ang1をコードするヌクレオチド配列を表す。
【図６４】合成コンストラクトであるCOMP-Ang2をコードするヌクレオチド配列を表す。
【図６５−１】Tie-2とも呼ばれるヒトTEK受容体チロシンキナーゼ（TEK）転写産物バリアント1,GenBankエントリーのmRNAのコードヌクレオチド配列を表す。
【図６５−２】Tie-2とも呼ばれるヒトTEK受容体チロシンキナーゼ（TEK）転写産物バリアント1,GenBankエントリーのmRNAのコードヌクレオチド配列を表す。
【図６６−１】R849W変異を有するTIE＊とも呼ばれるヒト変異型TEK受容体チロシンキナーゼ（TEK）のmRNAのコードヌクレオチド配列を表す。
【図６６−２】R849W変異を有するTIE＊とも呼ばれるヒト変異型TEK受容体チロシンキナーゼ（TEK）のmRNAのコードヌクレオチド配列を表す。
【図６７】組換え核酸コンストラクトPAN50の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図６８】組換え核酸コンストラクトPAN51の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図６９】組換え核酸コンストラクトPAN52の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図７０】組換え核酸コンストラクトPAN53の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図７１】図71Aは、さまざまなコンストラクトのテール-PCR（tail-PCR）産物を表すEtBr染色後の非変性アガロースゲルの画像である。図71Bは、さまざまなコンストラクトのインビトロmRNA転写産物を表すEtBr染色後の非変性アガロースゲルの画像である。
【図７２】トランスフェクションの2時間後（左カラム）、6時間後（中央カラム）および24時間後（右カラム）における、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPMEC中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、培地中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。
【図７３】トランスフェクションの6時間後（左カラム）および24時間後（右カラム）における、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPMEC中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、HPMECの全細胞溶解物中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。
【図７４】図74A（左）は、トランスフェクションの2時間後（左カラム）、6時間後（中央カラム）および24時間後（右カラム）における、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPMEC（GFP mRNA、PAN12 mRNAおよびPAN12＊ mRNAがトランスフェクトされたもの）中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、培地中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。PAN12＊では、100％のウリジンヌクレオチドおよび100％のシチジンヌクレオチドが、それぞれシュード-ウリジンおよび5-メチル-シチジンで置き換えられている。図74B（右）は、トランスフェクションの6時間後（左カラム）および24時間後（右カラム）における、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPMEC（GFP mRNA、PAN12 mRNAおよびPAN12＊ mRNAがトランスフェクトされたもの）中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、細胞溶解物中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。PAN12＊では、100％のウリジンヌクレオチドおよび100％のシチジンヌクレオチドが、それぞれシュード-ウリジンおよび5-メチル-シチジンで置き換えられている。
【図７５】トランスフェクションの1時間後、2時間後、4時間後および24時間後における（左から右に向かって、1時間後の結果が左端に示され、24時間後の結果が右端に示されている）、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPMEC中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、培地中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。
【図７６】トランスフェクションの1時間後、2時間後、4時間後および24時間後における（左から右に向かって、1時間後の結果が左端に示され、24時間後の結果が右端に示されている）、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPMEC中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、HPMECの全細胞溶解物中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。
【図７７】図77A（左）は、トランスフェクションの1時間後、2時間後、4時間後および24時間後における（左から右に向かって、1時間後の結果が左端に示され、24時間後の結果が右端に示されている）、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPMEC（GFP mRNA、PAN12 mRNA、およびPAN12＊ mRNAがトランスフェクトされたもの）中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、培地中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。PAN12＊では、100％のウリジンヌクレオチドおよび100％のシチジンヌクレオチドが、それぞれシュード-ウリジンおよび5-メチル-シチジンで置き換えられている。図77B（右）は、トランスフェクションの1時間後、2時間後、4時間後および24時間後における（左から右に向かって、1時間後の結果が左端に示され、24時間後の結果が右端に示されている）、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPMEC（GFP mRNA、PAN12 mRNA、およびPAN12＊ mRNAがトランスフェクトされたもの）中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、細胞溶解物中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。PAN12＊では、100％のウリジンヌクレオチドおよび100％のシチジンヌクレオチドが、それぞれシュード-ウリジンおよび5-メチル-シチジンで置き換えられている。
【図７８】トランスフェクションの1時間後、2時間後、4時間後および24時間後における（左から右に向かって、1時間後の結果が左端に示され、24時間後の結果が右端に示されている）、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPAEC中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、培地中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。
【図７９】トランスフェクションの1時間後、2時間後、4時間後および24時間後における（左から右に向かって、1時間後の結果が左端に示され、24時間後の結果が右端に示されている）、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPAEC中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、HPAECの全細胞溶解物中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。
【図８０】トランスフェクションの1時間後、2時間後、4時間後および24時間後における（左から右に向かって、1時間後の結果が左端に示され、24時間後の結果が右端に示されている）、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HeLa細胞中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、培地中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。
【図８１】トランスフェクションの1時間後、2時間後、4時間後および24時間後における（左から右に向かって、1時間後の結果が左端に示され、24時間後の結果が右端に示されている）、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HeLa細胞中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、HeLA細胞の全細胞溶解物中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。
【図８２】トランスフェクションの2時間後、4時間後、6時間後および24時間後における（左から右に向かって、1時間後の結果が左端に示され、24時間後の結果が右端に示されている）、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPMEC中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、培地中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。コンストラクトPAN12＊、PAN28＊、PAN29＊、PAN34＊、PAN50＊およびPAN51＊では、100％のウリジンヌクレオチドおよび100％のシチジンヌクレオチドが、それぞれシュードウリジンおよび5-メチル-シチジンで置き換えられている。
【図８３】トランスフェクションの2時間後、4時間後、6時間後および24時間後における（左から右に向かって、1時間後の結果が左端に示され、24時間後の結果が右端に示されている）、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPMEC中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、HPMECの全細胞溶解物中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。コンストラクトPAN12＊、PAN28＊、PAN29＊、PAN34＊、PAN50＊およびPAN51＊では、100％のウリジンヌクレオチドおよび100％のシチジンヌクレオチドが、それぞれシュードウリジンおよび5-メチル-シチジンで置き換えられている。
【図８４】トランスフェクションの2時間後（左カラム）、4時間後（中央カラム）および6時間後（右カラム）における、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPMEC中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、培地中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。コンストラクトPAN02＊では、100％のウリジンヌクレオチドおよび100％のシチジンヌクレオチドが、それぞれシュードウリジンおよび5-メチル-シチジンで置き換えられ、キャップなしのコンストラクトPAN51では、mRNA配列はコンストラクトPAN51のものであるが、5'-キャッピング構造を何も持たない。
【図８５】トランスフェクションの2時間後（左カラム）、4時間後（中央カラム）および6時間後（右カラム）における、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPMEC中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、HPMECの全細胞溶解物中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。コンストラクトPAN02＊では、100％のウリジンヌクレオチドおよび100％のシチジンヌクレオチドが、それぞれシュードウリジンおよび5-メチル-シチジンで置き換えられ、キャップなしのコンストラクトPAN51では、mRNA配列はコンストラクトPAN51のものであるが、5'-キャッピング構造を何も持たない。
【図８６】組換え核酸コンストラクトPAN54の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図８７】組換え核酸コンストラクトPAN55の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図８８】組換え核酸コンストラクトPAN56の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図８９】組換え核酸コンストラクトPAN57の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図９０】組換え核酸コンストラクトPAN58の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図９１】組換え核酸コンストラクトPAN59の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図９２】4時間後（左カラム）の、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HPMEC中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、培地中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。トランスフェクションの24時間後（中央カラム）および48時間後（右カラム）に、細胞を洗浄し細胞に新鮮培地を補充してから、さらなる4時間ルシフェラーゼ活性値が評価される。
【図９３】3時間後（左カラム）の、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HEK293細胞中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、培地中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。トランスフェクションの24時間後（右カラム）に、細胞を洗浄し細胞に新鮮培地を補充してから、さらなる3時間ルシフェラーゼ活性値が評価される。ヒト胎児腎臓293細胞株（HEK293）は、EMEM（EBSS）＋2mMグルタミン＋1％非必須アミノ酸（NEAA）＋10％FCS培養培地中で増殖させる。継代培養ルーチンは、サブコンフルエント培養物（70〜80％）を1:2〜1:6に分割すること、すなわち、0.25％トリプシンまたはトリプシン/EDTA、5％CO2、37℃を使って、2〜5×10,000細胞/cm2で播種することである。mRNAトランスフェクションは、Lipofectamine（商標）MessengerMAX（商標）トランスフェクション試薬（Invitrogen（商標））で、製造者のプロトコールに従って行われる。
【図９４】3時間後（左カラム）の、ルシフェラーゼがエフェクター分子として使用された、HeLa細胞中の表示の組換え核酸コンストラクトによる、培地中のルシフェラーゼのRLU（相対発光量）で示された、ルシフェラーゼの発現を表す棒グラフである。トランスフェクションの24時間後（右カラム）に、細胞を洗浄し細胞に新鮮培地を補充してから、さらなる3時間ルシフェラーゼ活性値が評価される。
【図９５−１】組換え核酸コンストラクトPAN60の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図９５−２】組換え核酸コンストラクトPAN60の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図９６−１】組換え核酸コンストラクトPAN61の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図９６−２】組換え核酸コンストラクトPAN61の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図９７−１】組換え核酸コンストラクトPAN66の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図９７−２】組換え核酸コンストラクトPAN66の基本構造とヌクレオチド配列を表す。
【図９８】表示のPAN mRNAコンストラクトをトランスフェクトしたHPMEC細胞からのタンパク質溶解物のウェスタンブロット解析を表す。細胞に1μgのmRNAをトランスフェクトし、6時間後に収穫した。総細胞溶解物をSDS-PAGEによって分離し、抗Ang1抗体を用いたイムノブロットによって解析した。M、マーカー;UT、無処理細胞;rec.Ang1、組換えhAng1。
【図９９】インビトロ転写後のmRNAのアガロースゲルを表す。2μgの表示のmRNAをアガロースゲル電気泳動によって分離し、臭化エチジウム染色およびUV照射によって可視化した。
【図１００】a）PAN57の5'UTR、b）PAN57の3'UTR、c）PAN57用の5'PCRプライマー、d）PAN57用の3'PCRプライマー、およびe）PAN55、PAN56用の5'PCRプライマーの配列を表す。
【発明を実施するための形態】
【０１８２】
図1は通常のmRNA分子構造の概略図である。哺乳動物mRNAを含む真核生物は、キャップ領域、5'非翻訳領域（UTR）、最適な翻訳開始のためのコンセンサスコザック配列で始まり分泌タンパク質の場合はシグナルペプチドリーダー配列がそれに続くオープンリーディングフレーム（ORF）を持つコード配列（CDS）、3'UTR、および3'端のポリA-テール（＞120nt）からなる。
【０１８３】
図2は、オープンリーディングフレームがナノ-ルシフェラーゼのものであるコード配列を持つmRNAコンストラクトに関する、選択された例の概略図である。表示のmRNAコンストラクトのいずれについても、ナノ-ルシフェラーゼのためのオープンリーディングフレームを持つ配列を含むコード領域を、エフェクター分子をコードする配列を含むコード領域で、特に本明細書に開示するエフェクター分子をコードする配列を含むコード領域で、置き換えうることは、本発明の範囲内であり、その好ましい一態様において、エフェクター分子はAng1またはCOMP-Ang1である。本発明によれば、組換え核酸コンストラクトは以下のように設計される。
【０１８４】
組換え核酸コンストラクトPAN02は、5'非翻訳領域としてAng1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてAng1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼ（Nano luciferase）をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてAng1の3'UTRを含む。
【０１８５】
組換え核酸コンストラクトPAN05は、5'非翻訳領域としてAng2の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてAng2のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む。
【０１８６】
組換え核酸コンストラクトPAN07は、5'非翻訳領域としてガレクチン-9の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてAng2のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む。
【０１８７】
組換え核酸コンストラクトPAN08は、5'非翻訳領域としてHsp70の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてAng2のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてHSP70の3'UTRを含む。
【０１８８】
組換え核酸コンストラクトPAN09は、5'非翻訳領域としてH3.3の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてAng2のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてH3.3の3'UTRを含む。
【０１８９】
組換え核酸コンストラクトPAN10は、5'非翻訳領域としてRPL12s.c.の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてAng2のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてRPL12s.c.の3'UTRを含む。このコンストラクトは、ナノ-ルシフェラーゼのコード領域の開始コドンの前に、別の開始コドンをインフレームで、さらに含む。
【０１９０】
組換え核酸コンストラクトPAN11は、5'非翻訳領域としてGADD34の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてAng2のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてGADD34の3'UTRを含む。
【０１９１】
組換え核酸コンストラクトPAN12は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてMCP-1の3'UTRを含む。
【０１９２】
組換え核酸コンストラクトPAN13は、5'非翻訳領域としてEDN1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてEDN1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてEDN1の3'UTRを含む。
【０１９３】
組換え核酸コンストラクトPAN28は、5'非翻訳領域としてAng2の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてIL-6のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてvWFの3'UTRを含む。
【０１９４】
組換え核酸コンストラクトPAN29は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む。
【０１９５】
組換え核酸コンストラクトPAN30は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてHSP70の3'UTRを含む。
【０１９６】
組換え核酸コンストラクトPAN31は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてIL-6のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてMCP-1の3'UTRを含む。
【０１９７】
組換え核酸コンストラクトPAN32は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてAng2のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてMCP-1の3'UTRを含む。
【０１９８】
組換え核酸コンストラクトPAN33は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTRを含み、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含まず、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてMCP-1の3'UTRを含む。
【０１９９】
組換え核酸コンストラクトPAN34は、5'非翻訳領域としてHsp70の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてMCP-1の3'UTRを含む。
【０２００】
組換え核酸コンストラクトPAN35は、5'非翻訳領域としてRPL12s.c.（ホウレンソウのクロロプラスト）の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてMCP-1の3'UTRを含む。
【０２０１】
組換え核酸コンストラクトPAN36は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてAng1をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてMCP-1の3'UTRを含む。
【０２０２】
組換え核酸コンストラクトPAN37は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてhCOMP-Ang1をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてMCP-1の3'UTRを含む。
【０２０３】
組換え核酸コンストラクトPAN38は、5'非翻訳領域としてAng2の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む。
【０２０４】
組換え核酸コンストラクトPAN39は、5'非翻訳領域としてAng2＊の5'UTR（上流のATGが欠失しているAng2 5'-UTR）、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてIL-6のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む。
【０２０５】
組換え核酸コンストラクトPAN40は、5'非翻訳領域としてAng2の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼのシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む。
【０２０６】
組換え核酸コンストラクトPAN41は、5'非翻訳領域としてRPL12s.c.の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列として、翻訳開始のためのATGが上流に追加されたMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてRPL12s.c.の3'UTRを含む。このコンストラクトは、ナノ-ルシフェラーゼのコード領域の開始コドンの前に、別の開始コドンをインフレームで、さらに含む。
【０２０７】
組換え核酸コンストラクトPAN42は、5'非翻訳領域としてRPL12s.c.の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてRPL12s.c.の3'UTRを含む。
【０２０８】
組換え核酸コンストラクトPAN43は、5'非翻訳領域としてRPL12s.c.の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてAng2のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてRPL12s.c.の3'UTRを含む。
【０２０９】
組換え核酸コンストラクトPAN44は、5'非翻訳領域としてHsp70の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてHsp70の3'UTRを含む。
【０２１０】
組換え核酸コンストラクトPAN45は、5'非翻訳領域としてHsp70m5の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む。
【０２１１】
組換え核酸コンストラクトPAN46は、5'非翻訳領域としてE-セレクチンの5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてIL-6のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む。
【０２１２】
組換え核酸コンストラクトPAN47は、5'非翻訳領域としてICAM1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてIL-6のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む。
【０２１３】
組換え核酸コンストラクトPAN48は、5'非翻訳領域としてIL-6の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてIL-6のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてIL-6の3'UTRを含む。
【０２１４】
組換え核酸コンストラクトPAN49は、5'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む。
【０２１５】
図3に、本発明の例示的組換え核酸コンストラクトを発現させるためのプラスミドに関する具体例として使用されるプラスミドpcDNA3.1（-）の制限地図を示す。ここでの例示的組換え核酸コンストラクトはコンストラクトPAN11であり、制限部位XhoI/HindIIIが示されている。
【０２１６】
図4に、図3のPAN11発現pcDNA3.1-プラスミドの制限消化地図（restriction digestion map）を示す。インサートは、工学的に操作された5'UTRおよび3'UTR、シグナル配列、ならびにナノ-ルシフェラーゼをコードするコード領域を持つ、PAN11配列を表す。
【０２１７】
図5は、コンストラクトPAN28（「28」）、PAN13（「13」）、PAN12（「12」）、PAN11（「11」）、PAN10（「10」）、PAN09（「09」）、PAN08（「08」）、PAN07（「07」）およびPAN05（「05」）のpcDNA3.1（-）プラスミドの非線状化物（未切断、スーパーコイルド、右レーン）およびBamHI制限消化後の線状化産物（左レーン）を示す、EtBr染色した1％アガロースゲルである。
【０２１８】
図6は、さまざまな組換え核酸コンストラクトに隣接する120nt長のポリ-T 3'プライマーによって120ntのポリAテールを付加するためのポリAテーリングPCRのPCR産物を示す、EtBr染色された1％アガロースゲルを表す。上部に、表示の組換え核酸コンストラクトについて、最適化されたPCR条件を示す。例えばPan02の場合、条件は次のとおりである:94℃で2分間の変性、96℃で30秒、55℃で15秒および72℃で4分を33サイクル、72℃で8分間の最終伸長。
【０２１９】
図8は、コンストラクトPAN28（「28」）、PAN13（「13」）、PAN12（「12」）、PAN11（「11」）、PAN10（「10」）、PAN09（「09」）、PAN08（「08」）、PAN07（「07」）およびPAN05（「05」）のインビトロ転写されたmRNAを示す、EtBr染色した1％非変性アガロースゲルの画像である。M:は高レンジRiboRuler RNAラダーのレーンである。この図8から、転写されたmRNAは無傷であった、より具体的には分解されていなかったと理解しうる。
【０２２０】
図24は、組換え核酸コンストラクトPAN01の基本構造とヌクレオチド配列を表す。PAN1は、5'非翻訳領域としてAng1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてAng1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてAng1をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてAng1の3'UTRを含む、本発明の一態様である。
【０２２１】
図25は、組換え核酸コンストラクトPAN03の基本構造とヌクレオチド配列を表す。PAN03は、5'非翻訳領域としてAng1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてAng1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてCOMP-Ang1をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてAng1の3'UTRを含む、本発明の一態様である。
【０２２２】
図26は、組換え核酸コンストラクトPAN04の基本構造とヌクレオチド配列を表す。PAN04は、5'非翻訳領域としてAng2の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてAng2のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてAng1をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む、本発明の一態様である。
【０２２３】
図27は、組換え核酸コンストラクトPAN06の基本構造とヌクレオチド配列を表す。PAN06は、5'非翻訳領域としてAng2の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてAng2のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてCOMP-Ang1をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む、本発明の一態様である。
【０２２４】
図28は、組換え核酸コンストラクトPAN36の基本構造とヌクレオチド配列を表す。PAN36は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてAng1をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてMCP-1の3'UTRを含む、本発明の一態様である。
【０２２５】
図67は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてIL-6のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む、本発明のmRNAの別の一態様である組換え核酸コンストラクトPAN50を表す。
【０２２６】
図68は、5'非翻訳領域としてHSP70の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてIL-6のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼ（NLuc）をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む、本発明のmRNAの別の一態様である組換え核酸コンストラクトPAN51を表す。
【０２２７】
図69は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてAng1をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む、本発明のmRNAの別の一態様である組換え核酸コンストラクトPAN52を表す。
【０２２８】
図70は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてhCOMP-Ang1をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む、本発明のmRNAの別の一態様である組換え核酸コンストラクトPAN53を表す。
【０２２９】
図71Aは、コンストラクトPAN35（「35」）、PA34（「34」）、PAN33（「33」）、PAN32（「32」）、PAN31（「31」）、PAN30（「30」）、PAN29（「29」）、およびPAN12（「12」）のテール-PCR産物を示す、EtBr染色した1％非変性アガロースゲル画像である。M:は高レンジRiboRuler RNAラダーのレーンである。この図71Aから、転写されたmRNAは無傷であった、より具体的には分解されていなかったと理解しうる。
【０２３０】
図71Bは、コンストラクトPAN35（「35」）、PA34（「34」）、PAN33（「33」）、PAN32（「32」）、PAN31（「31」）、PAN30（「30」）、PAN29（「29」）、およびPAN12（「12」）のインビトロmRNA転写産物を示す、EtBr染色した1％非変性アガロースゲルの画像である。M:は高レンジRiboRuler RNAラダーのレーンである。この図71Bから、転写されたmRNAは無傷であった、より具体的には分解されていなかったと理解しうる。
【０２３１】
図86は、5'非翻訳領域としてRPL12s.c.の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノ-ルシフェラーゼ（NLuc）をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む、本発明のmRNAの別の一態様である組換え核酸コンストラクトPAN54を表す。
【０２３２】
図87は、5'非翻訳領域としてvWFの5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼ（NLuc）をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む、本発明のmRNAの別の一態様である組換え核酸コンストラクトPAN55を表す。
【０２３３】
図88は、5'非翻訳領域としてvWFの5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてvWFのシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼ（NLuc）をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む、本発明のmRNAの別の一態様である組換え核酸コンストラクトPAN56を表す。
【０２３４】
図89は、5'非翻訳領域としてJiang,Lei et al.（2018）.Systemic messenger RNA as an etiological treatment for acute intermittent porphyria.Nature Medicine.24,1899-2909（2018）に記載の合成核酸配列、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼ（NLuc）をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてJiang,Lei et al.（2018）.Systemic messenger RNA as an etiological treatment for acute intermittent porphyria.Nature Medicine.24;1899-1909（2018）に記載の核酸配列の3'UTRを含む、本発明のmRNAの別の一態様である組換え核酸コンストラクトPAN57を表す。5'配列および3'配列を下線および太字で示す。
【０２３５】
図90は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてナノルシフェラーゼ（NLuc）をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む、本発明のmRNAの別の一態様である組換え核酸コンストラクトPAN58を表す。加えて、PAN58は、開始AUGの6塩基上流にコンセンサスコザック配列（GCCACC）を含む。
【０２３６】
図91は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTR、シグナルペプチドをコードする核酸配列としてMCP-1のシグナルペプチドをコードする核酸配列、エフェクター分子をコードするコード領域としてCMP-Ang1をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む、本発明のmRNAの別の一態様である組換え核酸コンストラクトPAN59を表す。
【０２３７】
図95は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTR、エフェクター分子をコードするコード領域として野生型（wt）Tie2をコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む、本発明のmRNAの別の一態様である組換え核酸コンストラクトPAN60を表す。
【０２３８】
図96は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTR、エフェクター分子をコードするコード領域としてTie2変異型R849Wをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む、本発明のmRNAの別の一態様である組換え核酸コンストラクトPAN61を表す。
【０２３９】
図97は、5'非翻訳領域としてMCP-1の5'UTR、エフェクター分子をコードするコード領域として、GenBankによればヒトホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸3-キナーゼ触媒サブユニットα（PIK3CA）であり、それぞれのリファレンス番号が006218.4である、野生型PIK3CAをコードするコード領域、および3'非翻訳領域としてヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）の3'UTRを含む、本発明のmRNAの別の一態様である組換え核酸コンストラクトPAN66を表す。
【０２４０】
配列表のSEQ ID NO:は、表1に要約するとおり、本開示に関連する。
【０２４１】
【表１】
2021533821.tif 000002
2021533821.tif 000003
2021533821.tif 000004
【実施例】
【０２４２】
実施例1: 材料および方法
遺伝子合成および遺伝子クローニングによるプラスミドテンプレートの生成
さまざまな異種5'UTRおよび異種3'UTRが隣接する、さまざまなシグナルペプチドを持つ、Nlucレポータータンパク質、Ang-1タンパク質およびその誘導体（例えばCOMP-Ang-1、CMP-Ang-1）をコードする配列を設計した。それらは、BioCat（ハイデルベルク）により、遺伝子合成によって作製され、pcDNA3.1-（Thermo Fisher）にクローニング（Xho1-BamHI）された。
【０２４３】
さまざまな異種5'UTRおよび異種3'UTRが隣接する、wt Tie-2をコードする配列および指定されたTie-2変異をコード領域中に持つ配列を設計した（図95および96参照）。それらは、BioCat（ハイデルベルク）により、遺伝子合成によって作製され、pcDNA3.1-（Thermo Fisher）にクローニング（Xho1-BamHI）された。
【０２４４】
ポリアデニル化されたmRNAを生成させるためのPCR産物からのインビトロ転写
インビトロ転写は、対応するプロモーター配列（T7、T3、SP6）と転写される遺伝子とを含有する線状DNAテンプレートからの、RNAポリメラーゼによるRNA転写産物の合成である。典型的転写反応は、テンプレートDNA、RNAポリメラーゼ、リボヌクレオチド三リン酸、RNase阻害剤およびMg2＋イオンを含有する緩衝液からなる。線状化されたプラスミドDNA、PCR産物および合成DNAオリゴヌクレオチドは、それらが、転写される遺伝子の上流にT7プロモーター配列を有する限り、転写のためのテンプレートとして使用することができる。ポリ（A）テールを持つDNAテンプレートを生成させるために、T7 RNAポリメラーゼ配列を含有する5'プライマーと120ntのポリT配列を持つ3'プライマーとを用いるテール-PCRを、合成し、精製した（BioSpring、フランクフルト）。
【０２４５】
インビトロ転写用の線状DNAテンプレートは、線状化したプラスミドからPCRによって生成させた。プラスミドを、ベクターバックボーン中の3末端を1箇所切断するBamHIで消化することで、ポリ（A）テールPCR（poly-（A）tail PCR）用のテンプレートとして使用することができる線状化ベクターを作製した。5μgのプラスミドを50μl中に5UのBamHI制限酵素と1×HF緩衝液とを使って37℃で2時間消化する。消化された混合物のごく一部をゲル電気泳動で解析することで、プラスミドの完全な消化についてチェックする（例えばコンストラクトPAN28（「28」）、PAN13（「13」）、PAN12（「12」）、PAN11（「11」）、PAN10（「10」）、PAN09（「09」）、PAN08（「08」）、PAN07（「07」）およびPAN05（「05」）については図5参照）。80℃で20分間のインキュベーションによって制限酵素を熱失活させ、消化されたプラスミドをPCR精製カラムにより、製造者のプロトコール（NucleoSpin Gel and PCR clean-up、Macherey-Nagel）に従って精製する。線状化されたプラスミドは-20℃で数ヶ月にわたって保存することができ、PCRテンプレートの生成に使用することができる。直線化の目的は、IVT反応中にランオン転写産物を潜在的に生成しうる環状テンプレートを排除することであった。
【０２４６】
PCRによるポリ（A）テールの付加は、Hot StarHiFidelityポリメラーゼ（Qiagen）またはTaq DNAポリメラーゼ（Roche）を使用し、製造者のプロトコールに従って行った。この目的のために、T7プロモーター配列を含有するアダプタープライマーと3'ポリAテール配列（120nt）を含有するアダプタープライマーとを使って、線状DNAテンプレートを増幅した。各アダプタープライマーは、翻訳と転写に必要な調節配列を関心対象の遺伝子に融合するオーバーラップ配列を有した（例えば図7aおよび7b参照）。典型的な50μlのPCR反応は、最終濃度で200μM（の各）dNTP、各プライマーについて0.5μM、50ngの線状化プラスミドDNA、1×PCR反応緩衝液（1.5mM MgCl2）および1反応あたり1.25UのTaq DNA  ポリメラーゼ（5U/μlで0.25μl）を含有した。具体的なPCRサイクルプログラムまたは温度プロファイルは、プライマーペアのTmに従って、またPCR産物の予想される長さに従って、また使用するサーマルサイクラーに従って、調節した。一部をゲル電気泳動で解析することによってPCR産物の品質をチェックした。反応は市販のPCR精製キット（NucleoSpin Gel and PCR clean-up、Macherey-Nagel）によって精製される。
【０２４７】
インビトロ転写反応
真核生物においてRNAへの5'端キャップ構造の付加は重要なプロセスである。これは、RNAの安定性、効率のよい翻訳、核輸送およびスプライシングにとって不可欠である。このプロセスはRNAの5'三リン酸端における7-メチルグアノシンキャップの付加を伴っていた。RNAキャッピングは、キャッピング酵素を使って転写後に実行するか、ARCA（Jena Bioscience）またはCleanCap（Trilink Biotechnologies）またはEZ-Cap（ApexBio）などのキャップアナログを使って同時転写的に実行することができる。酵素法では、ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素（NEB）を使用し、製造者のプロトコールに従って、mRNAをキャッピングしうる。この酵素は、供与体としてのGTPとS-アデノシルメチオニンを使って、RNAの5'端に7-メチルグアノシンキャップを付加する（キャップ-0構造）。どちらの方法も、トランスフェクションまたは他の応用に適した機能的に活性なキャッピングされたRNAを与える。加えて、2'-O-メチルトランスフェラーゼを使って、キャップ-1構造およびキャップ-2構造を導入することもできる。
【０２４８】
以下に記載する例では、キャッピングされたRNA転写産物（PAN 01-XX）をキャップアナログを使って同時転写的に合成するために、T7 High Yield Transcription Kit（Thermo Scientific）を使用した。
【０２４９】
転写反応用のDNAテンプレートは線状化プラスミドまたはPCR産物とした。キャッピングされたRNAの場合は、室温での反応を以下の順序でセットアップした。
2021533821.tif 000005
【０２５０】
1μgのDNAを加え、ヌクレアーゼフリー水を加えることによって総反応体積を20μlにした。加えるべき水の量は、テンプレートDNAの濃度に基づいて変動する。反応をボルテックスにかけてよく混合し、乾燥空気インキュベーター（dry air incubator）中、37℃で2時間インキュベートした。精製を進める前に、DNAテンプレートを除去するために、以下のように転写反応をDNaseIで処理した。
1. 70μlのヌクレアーゼフリー水を転写反応に加え、次に10μlのDNase I反応緩衝液を加えた。
2. 2μlのDNase Iを反応に加えた。
3. 反応を37℃で15分間インキュベートした。
【０２５１】
キャッピングされたmRNAのカラム精製
1. MEGAclearKitを使用し、製造者の説明書に従って、キャッピングされたRNAを精製した（スピンカラムに基づく任意のRNA精製キットを使用しうる）。
2. NanoDrop分光測光器を使ってRNAを定量した。
3. 製造者の説明書に従い、Agilent RNA 6000 Nano KitとAgilent 2100 Bioanalyzerとを使って、または非変性1％アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウム染色とによって、RNA試料の品質を評価した（図8参照）。
【０２５２】
HeLa細胞、HEK293細胞、HPMEC細胞、HPAEC細胞、およびHUVEC細胞のmRNAトランスフェクション
HeLa細胞はDMEM完全培地中で増殖させた。ヒト胎児腎臓293細胞株（HEK293）は、EMEM（EBSS）＋2mMグルタミン＋1％非必須アミノ酸（NEAA）＋10％FCS培養培地中で増殖させる。
【０２５３】
ヒト胎児腎臓293細胞株（HEK293）は、EMEM（EBSS）＋2mMグルタミン＋1％非必須アミノ酸（NEAA）＋10％FCS培養培地中で増殖させる。継代培養ルーチンは、サブコンフルエント培養物（70〜80％）を1:2〜1:6に分割すること、すなわち、0.25％トリプシンまたはトリプシン/EDTA、5％CO2、37℃を使って、2〜5×10,000細胞/cm2で播種することである。mRNAトランスフェクションは、Lipofectamine（商標）MessengerMAX（商標）トランスフェクション試薬（Invitrogen（商標））で、製造者のプロトコールに従って行われる。
【０２５４】
初代ヒト肺微小血管内皮細胞（HPMEC）および初代ヒト肺動脈内皮細胞（HPAEC）は、ヒト肺動脈から単離され、ヒト肺疾患の研究には最も適しており、単一ドナーの肺から単離される。肺組織は毛細血管および毛細リンパ管を含んでいるので、HPMECは微小血管および微小リンパ管内皮細胞を含む。
【０２５５】
HPMECの細胞タイプは免疫蛍光染色によって特徴づけられる。それらはCD31およびヴォン・ヴィレブランド因子について陽性に染色され、平滑筋α-アクチンについて陰性に染色される。
【０２５６】
HUVEC、HPAEC、およびHPMEC細胞は、PromoCell（ドイツ・ハイデルベルク）から推奨されているとおり、それぞれ内皮細胞増殖培地中で増殖させた。内皮細胞増殖培地は、ウシ胎児血清（0.05ml/ml）、内皮細胞増殖サプリメント（Endothelial Cell Growth Supplement）（ウシ視床下部抽出物;0.004ml ml）、ヘパリン90μg/mlおよびヒドロコルチゾン1μg/mlを補充した基礎培地である。HUVEC、HPAEC、およびHPMEC細胞を使用する実験は、継代数8未満の細胞で行われる。
【０２５７】
Lipofectamin MessengerMAX（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド;Thermo Fisher Scientific）を使って、RNAトランスフェクション、さらにはmRNAトランスフェクションを実行した。24ウェルプレートフォーマットでのmRNAトランスフェクションの場合は、トランスフェクション直前に70〜90コンフルエンスに到達するように、トランスフェクションの24時間前に1×105細胞/ウェルを播種した。単一のウェルで、1.5μlのLipofectamine MessengerMAX試薬を25μlのOptMEM（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド;Thermo Fisher Scientific）に加え、ボルテックスし、室温で10分間インキュベートした。別の1つのウェルでは、500ngまたは1μgのmRNAを25μlのOptiMEMに加え、ボルテックスした。インキュベーション後に、希釈mRNAを希釈Lipofectaminに加え、よく混合し、室温で5分間インキュベートし、HelaおよびHEK293については、0.5mlの完全培地の存在下で細胞に滴下した。HUVEC、HPAECおよびHPMECの場合は、内皮細胞増殖培地を置き換え、細胞をOptiMEMで洗浄した後、Lipofectamin MessengerMAxX mRNA複合体溶液を、37℃に予熱しておいた0.5mlのOptiMEMが入っているウェルに加えた。細胞を37℃で2時間インキュベートし、OptiMEM培地を完全内皮細胞増殖培地（PromoCell、ドイツ・ハイデルベルク）で置き換えた。
【０２５８】
トランスフェクト細胞からの細胞溶解物または漿液を表示の時点で分析した。あるいは、中性補助脂質（co-lipid）およびPEG化補助脂質と組み合わされたカチオン性脂質L-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミドまたはβ-（L-アルギニル）-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミドに基づくmRNA-LNPを、インビトロトランスフェクションに使用した。補助脂質はジフィタノイル-PEであった。PEG化脂質はメトキシPEG2000-DSPEである。
【０２５９】
宿主細胞へのmRNAの導入の成功は、さまざまな公知の方法を使って、例えば蛍光マーカー、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）、例えばレポーター酵素（例えばルシフェラーゼ誘導体）を使って、モニターした。あるいは、標的ポリペプチドのタンパク質発現レベルを、例えばウェスタンブロッティングまたは免疫細胞化学またはELISAで測定することによって、修飾されたmRNAのトランスフェクションを判定することもできると考えられる。
【０２６０】
5-メチルシチジンおよび/またはシュードウリジン（または5-メトキシウリジンもしくはN1-メチルシュードウリジン）で完全に修飾されたmRNAは、Lipofectamin MessengerMAX（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド;Thermo Fisher Scientific）を使って、HUVECまたはHPMEC（ヒト肺微小血管内皮細胞、PromoCell、ハイデルベルク）にトランスフェクトされる。タンパク質発現を判定するために、トランスフェクション後のさまざまな時点（30”、1時間、2時間、4時間、6時間）で、細胞溶解物を収穫し、ELISAまたはイムノブロットアッセイ（ウェスタン）にかける。
【０２６１】
Nano-Lucルシフェラーゼ活性レポーター測定
Nano-Glo-ルシフェラーゼ発現（Promega）の時間依存的定量検出は、分泌型について、組織培養上清からの試料を、Nano-Glo Luciferase Assay System（Promega）のレポーターアッセイ技術マニュアル（reporter assay technical manual）に従って分析することによって行った。簡単に述べると、5〜20μlの漿液または溶解物を最終体積100μlのH2Oに希釈し、等体積の再構成したNano-Gloルシフェラーゼアッセイ試薬を、96ウェルGloMax 96マイクロプレートで混合した。室温で少なくとも3分間のインキュベーション後に、適切なルミノメーターでルミネセンスを測定した。
【０２６２】
Tie-2および誘導体のイムノブロット検出
Tie-2および誘導体のイムノブロット検出のために、1.5mm調製済み（ready-to-use）ビス-トリスゲルおよび4-12％アクリルアミド勾配を使用し、MOPS緩衝液を泳動助剤（running aid）として、NuPage SDS-PAGEシステム（チャンバおよび電源）（いずれもLife Technologies、ニューヨーク州グランドアイランド）に、タンパク質溶解物をローディングする。各溶解物試料を最終体積40μlに調製する。この試料は、さまざまな体積中のタンパク質溶解物25μg、体積を26μlにする量のRIPA緩衝液、4μlの10×還元剤および10μlの4×SDSローディング緩衝液（どちらもLife Technologies製、ニューヨーク州グランドアイランド）を含有する。試料を95℃で5分間加熱し、ゲルにローディングする。標準設定は製造者によって選ばれ、200V、120mA、および最大25Wである。泳動時間は60分であるが、泳動色素（running dye）がゲルの下端に到達するまでとする。
【０２６３】
泳動が終了してから、プラスチックケースを割り、入っているゲルを、調製済みニトロセルロースメンブレンキットおよび電源（iBLOT;LifeTechnologies、ニューヨーク州グランドアイランド）に移す。デフォルト設定を使って、タンパク質溶解物を高電流（high Ampere electricity）によってゲルからメンブレンに転写する。
【０２６４】
転写後に、メンブレンをIX TBS中5％BSA中で15分間インキュベートし、次に、IX TBS中5％BSA＋0.1％Tween中の5％BSAにおいてさらに15分間インキュベートする。ヒトTie-2タンパク質に対する一次抗体またはホスホ特異的抗体（P-Tie-2、P-Akt、下記参照）を、3mlのIX TBS溶液中5％BSA中、1:500〜1:2000希釈で、室温において、オービタルシェーカーで穏やかに振とうしながら、3時間適用する。メンブレンをIX TBS/0.1％Tweenで3回、穏やかに振とうしながら1回につき5分間、洗浄する。二次抗体（ヤギ抗ウサギHRPコンジュゲート;Abeam、マサチューセッツ州ケンブリッジ）はセイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされており、一次抗体の抗体に結合する。二次抗体を、IX TBS中5％BSAで1:1000〜1:5000希釈し、室温で3時間インキュベートする。インキュベーション時間が終了したら、メンブレンをIX TBS/0.1％Tweenで3回、穏やかに振とうしながら1回につき5分間、洗浄する。5mlのPierce WestPico化学発光基質（Thermo Fisher、イリノイ州ロックフォード）中で、指示どおりに、メンブレンを発色させる。
【０２６５】
実施例2: HPMEC、HUVEC、HPAEC、およびHeLa細胞におけるルシフェラーゼ、Ang-1、またはAng-1誘導体を発現する組換え核酸コンストラクトの発現
HeLa、HUVEC、HPAEC、およびHPMEC細胞のmRNAトランスフェクション
初代ヒト肺微小血管内皮細胞（HPMEC）はヒト肺疾患の研究には最も適しており、単一ドナーの肺から単離される。肺組織は毛細血管および毛細リンパ管を含んでいるので、HPMECは微小血管および微小リンパ管内皮細胞を含む。細胞を常法により免疫蛍光染色で解析した。それらはCD31およびヴォン・ヴィレブランド因子について陽性に染色され、平滑筋α-アクチンについて陰性に染色される。HeLa細胞、HUVEC、HPMECおよびHPAEC（ヒト肺動脈内皮細胞）細胞は、それぞれ、DMEM完全培地または内皮細胞増殖培地（PromoCell、ドイツ・ハイデルベルク、カタログ番号C-22020）で、それぞれ増殖させた。内皮細胞増殖培地は、ウシ胎児血清（0.05ml/ml）、内皮細胞増殖サプリメント（Endothelial Cell Growth Supplement）（ウシ視床下部抽出物;0.004ml ml）、ヘパリン90μg/mlおよびヒドロコルチゾン1μg/mlを補充した基礎培地であった。HUVECおよびHPMEC細胞を使用する実験は、継代数8未満の細胞で行った。
【０２６６】
mRNAトランスフェクションは、Lipofectamin MessengerMAX（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド;Thermo Fisher Scientific）を使って実行した。24ウェルプレートフォーマットでのmRNAトランスフェクションの場合は、トランスフェクション直前に70〜90コンフルエンスに到達するように、トランスフェクションの24時間前に1×105細胞/ウェルを播種した。単一のウェルで、1.5μlのLipofectamine MessengerMAX試薬を25μlのOptiMEMに加え、ボルテックスし、室温で10分間インキュベートした。別の1つのウェルでは、500ngまたは1μgのmRNAを25μlのOptiMEMに加え、ボルテックスした。インキュベーション後に、希釈mRNAを希釈Lipofectaminに加え、よく混合し、室温で5分間インキュベートし、HeLaについては、0.5mlのDMEM完全培地の存在下で細胞に滴下した。HUVEC、HPMEC、およびHPAECの場合は、内皮細胞増殖培地を置き換え、細胞をOptiMEMで洗浄した後、Lipofectamin MessengerMAX mRNA複合体溶液を、37℃に予熱しておいた0.5mlのOptiMEMが入っているウェルに加えた。細胞を37℃で2時間インキュベートし、OptiMEM培地を完全内皮細胞増殖培地（PromoCell、ドイツ・ハイデルベルク）で置き換え、トランスフェクト細胞または漿液を表示の時点で分析した。あるいは、インビトロトランスフェクションには、中性補助脂質およびPEG化補助脂質と組み合わされたカチオン性脂質L-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミドまたはβ-（L-アルギニル）-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミドに基づくmRNA-LNPを、使用することができる。
【０２６７】
宿主細胞へのmRNAの導入の成功は、さまざまな公知の方法を使って、例えば蛍光マーカー、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）、例えばレポーター酵素（例えばルシフェラーゼ誘導体）を使って、モニターすることができるか、または、修飾されたmRNAのトランスフェクションは、標的ポリペプチドのタンパク質発現レベルを、例えばウェスタンブロッティングまたは免疫細胞化学またはELISAで測定することによって、判定することもできる。
【０２６８】
Nano-Lucルシフェラーゼ活性レポーター測定
Nano-Glo-ルシフェラーゼ発現（Promega）の時間依存的定量検出は、分泌型について、組織培養上清からの試料を、Nano-Glo Luciferase Assay System（Promega）のレポーターアッセイ技術マニュアルに従って分析することによって行った。簡単に述べると、5〜20μlの漿液または溶解物を最終体積100μlのH2Oに希釈し、等体積の再構成したNano-Gloルシフェラーゼアッセイ試薬を、96ウェルGloMax 96マイクロプレートで混合した。室温で少なくとも3分間のインキュベーション後に、適切なルミノメーターでルミネセンスを測定することができた。
【０２６９】
細胞溶解物中および細胞上清中のAng-1、COM-Ang-1、CMP-Ang-1タンパク質の検出
分泌Ang-1発現および分泌COMP-Ang-1または分泌COMP-Ang-2発現の時間依存的定量検出は、組織培養上清からの試料を技術マニュアルに従ってELISA（ヒトアンジオポエチン-1 Quantikine ELISAキット（DANG10、R＆D systems））またはウェスタンブロットで分析することによって行われる。
【０２７０】
配列には示されていないおよそ120ヌクレオチドのポリAテールおよび5'キャップを有し、5-メチルシチジンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている（COMP-Ang-1,5mC/pU）か、5-メチルシチジンおよびNl-メチル-シュードウリジンで完全に修飾されている（COMP-Ang-1,5mC/NlmpU）か、または無修飾の（COMP-Ang-、unmod）、500ngのCOMP-Ang-1（SEQ ID NO:PAN05に示すmRNA配列）を、Lipofectamin MessengerMAX（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド;Thermo Fisher Scientific）を使って、HUVECまたはHPMEC（ヒト肺微小血管内皮細胞、PromoCell、ハイデルベルク）にトランスフェクトする。タンパク質発現およびサイトカイン誘導を決定するために、トランスフェクションの4時間後に上清を収穫し、ELISAにかける。
【０２７１】
Ang-1および誘導体のイムノブロット検出のために、1.5mm調製済みビス-トリスゲルおよび4-12％アクリルアミド勾配を使用し、MOPS緩衝液を泳動助剤として、NuPage SDS-PAGEシステム（チャンバおよび電源）（いずれもLife Technologies、ニューヨーク州グランドアイランド）に、タンパク質溶解物をローディングした。各溶解物試料を最終体積40ulに調製した。この試料は、さまざまな体積中のタンパク質溶解物25ug、体積を26μlにする量のRIPA緩衝液、4μlの10×還元剤および10μlの4×SDSローディング緩衝液（どちらもLife Technologies製、ニューヨーク州グランドアイランド）を含有した。試料を95℃で5分間加熱し、ゲルにローディングした。標準設定は製造者によって選ばれ、200V、120mA、および最大25Wであった。泳動時間は60分であるが、泳動色素がゲルの下端に到達するまでとした。
【０２７２】
泳動が終了してから、プラスチックケースを割り、入っているゲルを、調製済みニトロセルロースメンブレンキットおよび電源（iBLOT;LifeTechnologies、ニューヨーク州グランドアイランド）に移す。デフォルト設定を使って、タンパク質溶解物を高電流によってゲルからメンブレンに転写する。
【０２７３】
転写後に、メンブレンをIX TBS中5％BSA中で15分間インキュベートし、次に、IX TBS＋0.1％Tween中の5％BSAにおいてさらに15分間インキュベートした。ヒトAng-1タンパク質に対する一次抗体（Ang-1 ab183701 Abcam、英国ケンブリッジ）を、3mlのIX TBS溶液中5％BSA中、1:5000希釈で、4℃において、オービタルシェーカーで穏やかに振とうしながら、一晩適用する。メンブレンをIX TBS/0.1％Tweenで3回、穏やかに振とうしながら1回につき5分間、洗浄する。二次抗体（ヤギ抗ウサギHRPコンジュゲート;Abeam、マサチューセッツ州ケンブリッジ）はセイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされており、一次抗体に結合する。二次抗体を、IX TBS中5％BSAで1:10000希釈し、室温で1時間インキュベートする。インキュベーション時間が終了したら、メンブレンをIX TBS/0.1％Tweenで3回、穏やかに振とうしながら1回につき5分間、洗浄する。5mlのPierce WestPico化学発光基質（Thermo Fisher、イリノイ州ロックフォード）中で、指示どおりに、メンブレンを発色させる。ウェスタンブロットにより、ヒトAng-1については70kdの、またCOMP-Ang-1およびCMP-Ang1については37kDaの予想サイズ近辺に、タンパク質が検出される。参照用に、組換えヒトAng-1タンパク質をR＆D Systems（biotechne）から購入した。
【０２７４】
結果
図10〜14、72〜85、および92〜94に提示するタンパク質発現データは、コード領域に隣接するさまざまな調節ヌクレオチド配列の組合せがタンパク質発現レベルを有意に変化させうることを、明確にしている。そのような変化は、100％のウリジンヌクレオチドおよび100％のシチジンヌクレオチドをシュードウリジンおよび5-メチル-シチジンで置き換えることによって例示されるような（図74および図77〜85において「＊」で印をしたコンストラクト）、コンストラクトを形成するヌクレオチドの修飾によって、さらに左右される。変化は、特定の細胞タイプに観察されるだけでなく、異なる細胞タイプ間でも観察される。例えばPAN02（野生型Ang-1 mRNA）は、どの細胞株でも、最も低いルシフェラーゼ活性を示す（図10〜14）。他のコンストラクトはいずれも、すべての細胞タイプにわたって、強化されたタンパク質発現を示す。したがって、異なる遺伝子からの調節配列を使用するアプローチは、タンパク質発現活性を増加させることができる。この目的のために、内在性Ang-1配列を置き換えると、レポーターのタンパク質発現に対する優れた効果が示された。
【０２７５】
注目すべきことに、同じ調節配列であっても、異なる細胞タイプでは異なるタンパク質発現活性を示した（図75〜81。これらのデータは、特別な調節配列の使用により、背景特異的な（context-specific）、すなわち細胞タイプ特異的な、細胞環境において、タンパク質発現の活性に影響を及ぼすことができるという本発明者らのアプローチを、さらに裏付けている。
【０２７６】
さらにまた本発明者らは、本発明者らのデータが異なる局面、すなわち分泌にも関係していることを明らかにした。例えば、コンストラクトPAN12に使用されている調節配列は、全細胞溶解物だけでなく培地（上清）においても、細胞タイプ特異的（HPMEC）発現を示す（図10〜14）。これにより、これらの配列は、タンパク質発現（翻訳）にとって最適なだけでなく、分泌にとっても最適であることが示された。対照的に、コンストラクトPAN28は、すべての細胞タイプにおいて、ある程度同等な発現を示す。コンストラクトPAN29（およびPAN58）に使用されている調節配列、すなわちMCP-1の5'-UTR配列およびシグナルペプチド配列とvWFの3'-UTRとの組合せは、ヒト（微小血管）肺内皮細胞における高効率タンパク質発現にとって特に有用であることがわかった（例えば図72および図75参照）。コンストラクトPAN54に使用されている調節配列、すなわちホウレンソウのクロロプラストRPL12の5'-UTR、MCP-1のシグナルペプチド配列およびvWFの3'-UTRは、図92に示されるように、タンパク質の発現と分泌とに等しく効率的であることがわかった。図98に示されるように、PAN29の調節配列は、3つの異なるORF、すなわちPAN52におけるwt Ang-1、PAN53におけるhCOMP-Ang-1およびPAN59におけるCMP-Ang-1を使っても、初代ヒト肺微小内皮細胞（microendothelial cell）（HPMEC）における発現の指示において機能的である。対照的に、ヒトAng-1の内在性5'-UTRおよび内在性3'-UTRを含有するmRNAコンストラクト（PAN01）は翻訳されない（図98）。図99は、4種類のmRNAコンストラクトのすべてが、同等の品質（完全性および純度）を呈することを示している。
【０２７７】
実施例3: 野生型Tie-2をコードする修飾されたmRNA（PAN60）または活性化Tie-2変異（例えばR849W）をコードする修飾されたmRNA（PAN61）をトランスフェクトした後のTie-2経路の活性化
異種5'UTRおよび異種3'UTRを含有する修飾されたmRNAを、上記実施例1で既に述べたように、PCRテンプレートのインビトロ転写によって生成させる。Lipofectamin MessengerMAX（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド;Thermo Fisher Scientific.）を使って、野生型Tie-2をコードするmRNAの他に、活性化Tie-2変異（例えばR849W）をコードするこのmRNAを、さまざまな濃度で、さまざまな細胞株（HeLa、HUVECまたはHPMECまたはHPAECなどの初代内皮細胞）にトランスフェクトする。定量的ウェスタンブロットのために、mRNAのトランスフェクション後のさまざまな時点（1〜24時間）における細胞溶解物を、抗ホスホチロシン抗体（R＆D systems）でプローブすることで、Tie-2リン酸化（pTyr、140kD）を評価する。ブロットをストリッピングし、抗Tie-2抗体（R＆D systems）で再プローブすることで、総Tie-2を検出する。定量的測定のために、2種類の異なるELISAを行って、ヒトTie-2 DuoSet ELISAキットまたはヒト-ホスホ-Tie-2 DuoSet IC ELISAを使用して製造者（例えばどちらもR＆D systems製のELISAキット）のプロトコールに従ってヒトTie-2またはホスホ-Tie-2を測定する。
【０２７８】
Tie-2変異（PAN61、R849W）をコードするmRNAのトランスフェクションは、野生型Tie-2 mRNAをコードするmRNAがトランスフェクトされた細胞に由来する細胞溶解物と比較して、または非トランスフェクト細胞と比較して、ホスホ-Tie-2の存在を増加させる。Tie-2リン酸化のこの増加は、組換えヒトAng-1リガンドによる共刺激の存在下または非存在下で観察され、異なる細胞株において観察することできる。Tie-2シグナリング経路の活性化を確認し、Tie-2（R849W）誘導体を発現させることによる生物学的に関連する機能的な下流シグナル伝達を実証するために、Aktのリン酸化を、経時的実験で実証する。これらの実験は、Tie-2活性化変異（R849W）をコードするmRNAが機能的であり、Tie-2シグナリング経路の活性化に関してwt Tie-2をコードするmRNAよりも強力であることを示す。この経路のこれらの高活性化は、ヒトの内皮細胞および/または非内皮細胞において、Tie-2リガンド（例えばAng-1）の非存在下または存在下で実証されうる。
【０２７９】
実施例4:静脈内投与によるインビボ適用のためのカチオン性LNP中のmRNA製剤
インビボ実験のために、β-（L-アルギニル）-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミドをカチオン性脂質とする製剤プロセスで、mRNA-LNPを調製する。あるいは、カチオン性脂質L-アルギニル-β-アラニン-N-パルミチル-N-オレイル-アミドを、同じ手順で使用することで、mRNA-LNPを調製することもできる。
【０２８０】
mRNA-LNP製剤は、siRNAについて記載された方法の変法を使って調製される（Chen,S.,Tam,Y.Y.,Lin,P.J.,Sung,M.M.,Tam,Y.K.,and Cullis,P.R.（2016）,Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA.J.Control.Release 235,236-244および（ii）特許出願公開US20170121712）。
【０２８１】
簡単に述べると、脂質を、適切なモル比（例えば50:49:1のβ-（L-アルギニル）-L-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミド:DPyPE:mPEG2000-DSPE）で、エタノールに溶解する。マイクロ流体ミキサー（NanoAssemblr（登録商標）;Precision Nanosystems、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）を使用し、18ml/分の流速で、脂質混合物をmRNAの等張スクロース溶液と、2:1（水相:エタノール）の体積比で混合する。同様に、クエン酸緩衝または酢酸緩衝mRNA溶液（pH3〜4）と、わずかに異なる3:1（v/v;水相:エタノール）の混合比と、12ml/分の流速とを使って、LNP製剤を得ることもできる。
【０２８２】
混合プロセス後に、3.5K MWCO Slide-A-Lyzer透析カセット（Thermo Fisher Scientific）を使って、製剤を、10mM HEPES緩衝またはTRIS緩衝等張スクロース溶液に対して、4℃で少なくとも18時間は透析する。スクロースの代わりにトレハロースまたはグルコースのような他の糖類も同等に製剤プロセス内で使用することができる。
【０２８３】
次に製剤を、粒径（Zetasizer Nano ZS計器（Malvern Instruments Ltd、英国マルバーン）、RNA封入（Quant-iT RiboGreen RNAアッセイキット、製造者（Thermo Fisher Scientific）のプロトコールに従う）、およびエンドトキシンについて検査すると、サイズが30〜100nmで、＞25mVのζ電位を持ち、90％超のmRNA封入と＜1EU/mlのエンドトキシンを呈することがわかる。
【０２８４】
mRNA-LNP製剤は、約0.3μg/μlのRNA濃度および約0.03〜0.05のRNA対総脂質比で、さらなるインビトロ使用またはインビボ使用まで、-80℃で保存される。
【０２８５】
本明細書、特許請求の範囲、および/または図面に開示される本発明の特徴は、別々におよびそれらの任意の組合せの両方で、本発明をそのさまざまな形態で実現するために重要でありうる。
【図１】
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【図２−１】
2021533821.tif 000007
【図２−２】
2021533821.tif 000008
【図２−３】
2021533821.tif 000009
【図２−４】
2021533821.tif 000010
【図２−５】
2021533821.tif 000011
【図３】
2021533821.tif 000012
【図４】
2021533821.tif 000013
【図５】
2021533821.tif 000014
【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
2021533821.tif 000019
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
2021533821.tif 000030
【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ−１】
2021533821.tif 000032
【図１７Ｃ−２】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図５９Ｃ】
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【図５９Ｄ】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６０Ｃ】
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【図６０Ｄ−１】
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【図６０Ｄ−２】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５−１】
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【図６５−２】
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【図６６−１】
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【図６６−２】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５−１】
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【図９５−２】
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【図９６−１】
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【図９６−２】
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【図９７−１】
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【図９７−２】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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