(57)【要約】本発明は、悪性Ｂ細胞を標的して癌を治療する用途の新規な抗体またはその抗原結合断片、これを含むキメラ抗体受容体及びこれらの用途に関するものである。本発明の抗体は、癌細胞（特に、血液癌）で高発現されるＣＤ１９に特異的に結合する抗体であって、従来のＣＤ１９ターゲット抗体のＣＤＲ序列と比較して相同性が非常に低くて、その序列の独特性があり、従来のＣＤ１９に結合するＦＭＣ６３抗体断片と相異するエピトープに特異的に結合する。本発明の抗−ＣＤ１９抗体または抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体を発現する細胞はＣＤ１９を発現する陽性細胞株に反応して免疫細胞活性を誘導するので、ＣＡＲ−免疫細胞治療剤として有用に使用することができる。
2021505137.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片：
（ａ）次の重鎖ＣＤＲ（Complementarity determining region）アミノ酸序列を含む重鎖可変領域：序列番号１のＣＤＲＨ１及び序列番号２のＣＤＲＨ２；及び
（ｂ）次の軽鎖ＣＤＲアミノ酸序列を含む軽鎖可変領域：序列目録第４序列のＣＤＲＬ１。
【請求項２】
前記重鎖可変領域は、序列番号３、３０乃至３５のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含むＣＤＲＨ３を追加的には含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域は、序列番号５、３６乃至３９のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含むＣＤＲＬ２を追加的に含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記軽鎖可変領域は、序列番号６、４０、及び４１のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含むＣＤＲＬ３を追加的に含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記重鎖可変領域は、序列番号７、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、及び７０のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記軽鎖可変領域は、序列番号８、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、及び７１のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
ＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する抗体または抗原結合断片のＣＤ１９に対する結合を遮断する抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体または抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＬ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基に結合する抗体または抗原結合断片のＣＤ１９に対する結合を遮断することを特徴とする、請求項７に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体または抗原結合断片はＦＭＣ６３抗体が結合するエピトープに結合しないものであることを特徴とする、請求項７に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
請求項１乃至９のうち、いずれか一項の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片をエンコーディングする核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０の核酸分子を含む再組合せベクター。
【請求項１２】
請求項１１の再組合せベクターに形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
以下を含むＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体：
（ａ）請求項１乃至９のうち、いずれか一項の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメイン（Extracellular domain）；
（ｂ）膜横断ドメイン（transmembrane domain）；及び
（ｃ）細胞内信号伝達ドメイン。
【請求項１４】
請求項１３のキメラ抗原受容体を発現する効果器細胞。
【請求項１５】
請求項１４の効果器細胞を含むＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患、自己免疫疾患または炎症疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項１６】
請求項１３のキメラ抗原受容体をエンコーディングする核酸分子。
【請求項１７】
請求項１６の核酸分子を含む再組合せベクター。
【請求項１８】
請求項１７の再組合せベクターに形質転換された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は２０１７年１２月６日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１７−０１６６９６９号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は本明細書に参照として挿入される。
【０００２】
本発明は、悪性Ｂ細胞を標的して癌を治療する用途の新規な抗体またはその抗原結合断片、これを含むキメラ抗体受容体及びこれらの用途に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
悪性Ｂ細胞（B cell malignancy）は私達の体の兔疫系を構成する細胞系列のうち、Ｂ細胞で生じる腫瘍をいう。このような悪性Ｂ細胞は正常な兔疫系を破壊するため、外部から侵入する抗原に対する免疫性を落として患者を死亡に至るようにする。例えば、悪性Ｂ細胞のうちの１つである急性リンパ球性白血病（Acute Lymphocytic Leukemia、ＡＬＬ）はリンパ球系白血球が悪性細胞に変わって骨髄で増殖し、末梢血液に広まって、肝、脾臓、リンパ系、大脳、小脳、脊髄などを侵犯する疾病である。このような急性リンパ球性白血病を治療する方法に、化学療法（chemotherapy）、標的治療法（targeted therapy）、同種幹細胞移植（allogeneic stem cell transplantation）が代表的であり、その治療法が向上して小児患者の生存率は８５％を上回っている。しかしながら、相変らず既存の治療剤に未反応する患者あるいは再発患者が発生しており、小児癌死亡の最も大きい原因となっている。
【０００４】
急性リンパ球性白血病だけでなく、悪性Ｂ細胞から発生する大部分のリンパ腫／白血病（lymphoma/leukemia）は細胞の表面にＣＤ１９抗原を発現するので、これに基づいてＣＤ１９抗原を認識する多様な治療法が試みられている。このようなＣＤ１９標的治療剤分野のうち、ＣＡＲ−Ｔ治療剤は既存治療に不応する急性白血病患者を対象に標的細胞の細胞毒性を活性化させることによって細胞死滅を誘導する機作を通じて血液癌治療に活用されており、これを通じて高い完治率（３０人のうち、２７人完治）の臨床試験結果が報告された。しかしながら、既存のＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ治療剤は高い反応率にもかかわらず、治療剤を投与した患者の１０−２０％で耐性が生じる問題点が報告されている（Maude et al., N Eng J Med、 2014、371:1507; Topp et al., J Clin Oncol、2014、32:4134）。したがって、既存に使われるＣＤ１９標的抗体とは異なる部位に結合する新規な抗体の発掘が必要である。
【０００５】
このような背景下に本発明者らは、悪性Ｂ細胞のうち、ＣＤ１９を発現するＢ細胞を選択的に認識する抗体断片を開発して、開発された抗体が既存に使われているＦＭＣ６３とは異なる部位のＣＤ１９に結合して相異するエピトープを有する抗体であることを確認した。また、開発された抗体断片を発現するキメラ抗原受容体を発現する細胞毒性Ｔ細胞が細胞毒性活性を保有していることを確認した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは既存のＣＤ１９特異的なＣＡＲ−Ｔ治療剤に対して耐性が生じる問題を解決するために、ＣＤ１９の他のエピトープに結合する新規な抗体及びこれを用いたキメラ抗原受容体を開発しようと努力した。その結果、本発明のＣＤ１９＿１２．１８抗体及びこれらの変異体が既存のＦＭＣ６３抗体とは異なるＣＤ１９のエピトープ領域に結合することを確認し、本発明を完成した。
【０００７】
したがって、本発明の目的は新規な抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメイン（extracellular domain）、膜横断ドメイン（transmembrane domain）、及び細胞内信号伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供することにある。
【０００９】
本発明の更に他の目的は、前記キメラ抗原受容体を発現する細胞を提供することにある。
【００１０】
本発明の更に他の目的は、前記キメラ抗原受容体を発現する細胞を含む薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の更に他の目的は、前記抗体、その抗原結合断片、またはキメラ抗原受容体をエンコーディングする核酸分子を提供することにある。
【００１２】
本発明の更に他の目的は、前記抗体、その抗原結合断片、またはキメラ抗原受容体をエンコーディングする核酸分子を含む再組合せベクターを提供することにある。
【００１３】
本発明の更に他の目的は、前記再組合せベクターに形質転換された宿主細胞を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求範囲、及び図面により、さらに明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本明細書では、下記の第１項乃至代４２項の発明が請求される。
【００１６】
１．以下を含む抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片：
（ａ）次の重鎖にＣＤＲ（Complementarity determining region）アミノ酸序列を含む重鎖に可変領域：序列番号１のＣＤＲＨ１及び序列番号２のＣＤＲＨ２；及び
（ｂ）次の軽鎖にＣＤＲアミノ酸序列を含む軽鎖可変領域：序列目録第４序列のＣＤＲＬ１。
【００１７】
２．第１項において、前記重鎖可変領域は序列番号３、３０乃至３５のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含むＣＤＲＨ３を追加的に含むものである、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００１８】
３．第１項において、前記軽鎖可変領域は、序列番号５、３６乃至３９のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含むＣＤＲＬ２を追加的に含むものである、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００１９】
４．第１項において、前記軽鎖可変領域は、序列番号６、４０、及び４１のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含むＣＤＲＬ３を追加的に含むものである、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００２０】
５．第１項乃至第４項のうち、いずれか一項において、前記重鎖可変領域は、序列番号７、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、及び７０のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含むものである、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００２１】
６．第１項乃至第４項のうち、いずれか一項において、前記軽鎖可変領域は、序列番号８、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、及び７１のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含むものである、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００２２】
７．ＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する抗体またはその抗原結合断片のＣＤ１９に対する結合を遮断する抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００２３】
８．第７項において、前記抗体またはその抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも２つ以上のアミノ酸残基に結合する抗体またはその抗原結合断片のＣＤ１９に対する結合を遮断するものである、抗−ＣＤ１９抗体または抗原結合断片。
【００２４】
９．第７項において、前記抗体またはその抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基に結合する抗体またはその抗原結合断片のＣＤ１９に対する結合を遮断するものである、抗−ＣＤ１９抗体または抗原結合断片。
【００２５】
１０．第７項において、前記抗体またはその抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＬ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基に結合する抗体またはその抗原結合断片のＣＤ１９に対する結合を遮断するものである、抗−ＣＤ１９抗体または抗原結合断片。
【００２６】
１１．第７項において、前記抗体またはその抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＬ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも２つ以上のアミノ酸残基に結合する抗体またはその抗原結合断片のＣＤ１９に対する結合を遮断するものである、抗−ＣＤ１９抗体または抗原結合断片。
【００２７】
１２．第７項において、前記抗体またはその抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に結合するものである、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００２８】
１３．第７項において、前記抗体またはその抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも２つ以上のアミノ酸残基に結合するものである、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００２９】
１４．第７項において、前記抗体またはその抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基に結合するものである、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００３０】
１５．第７項において、前記抗体またはその抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＬ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基に結合するものである、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００３１】
１６．第７項において、前記抗体またはその抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＬ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも２つ以上のアミノ酸残基に結合するものである、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００３２】
１７．第７項において、前記抗体またはその抗原結合断片は第１項乃至第６項のうちのいずれか一項の抗体またはその抗原結合断片である、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００３３】
１８．第１項乃至第１７項のうち、いずれか一項において、前記抗体またはその抗原結合断片はＦＭＣ６３抗体が結合するエピトープに結合しないものである、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００３４】
１９．第１８項において、前記抗体またはその抗原結合断片はヒト抗体またはヒト化された抗体である、抗−ＣＤ１９抗体または抗原結合断片。
【００３５】
２０．第１８項において、前記抗体またはその抗原結合断片はｓｃＦｖである、抗−ＣＤ１９抗体または抗原結合断片。
【００３６】
２１．第１項乃至第２０項のうち、いずれか一項の抗体またはその抗原結合断片をエンコーディングする核酸分子。
【００３７】
２２．第２１項の核酸分子を含む再組合せベクター。
【００３８】
２３．第２２項の再組合せベクターに形質転換された宿主細胞。
【００３９】
２４．次を含むＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体：
（ａ）第１項の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメイン（Extracellular domain）；
（ｂ）膜横断ドメイン（transmembrane domain）；及び
（ｃ）細胞内信号伝達ドメイン。
【００４０】
２５．第２４項において、前記膜横断ドメインは、Ｔ−細胞受容体、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、［００１１］ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（ＣＤ８α）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４のアルファ、ベータ、またはゼタ鎖からなる群より選択された蛋白質の膜横断ドメインである、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体。
【００４１】
２６．第２４項において、前記細胞内信号伝達ドメインはＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼタ）鎖から由来したドメインである、キメラ抗原受容体。
【００４２】
２７．第２４項において、前記細胞内信号伝達ドメインは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群より選択された共同刺激分子（costimulatory molecule）を追加的に含むものである、キメラ抗原受容体。
【００４３】
２８．第２４項乃至第２７項のうち、いずれか一項のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
【００４４】
２９．第２８項において、前記細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ＮＫ−細胞、Ｂ−細胞または炎症性Ｔ−リンパ球、細胞毒性Ｔ−リンパ球、調節Ｔ−リンパ球またはヘルパーＴ−リンパ球からなる群より選択された免疫細胞である、キメラ抗原受容体を発現する細胞。
【００４５】
３０．第１項乃至第２０項のうち、いずれか一項の抗体またはその抗原結合断片を含むＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患、自己免疫疾患、または炎症疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【００４６】
３１．第３０項において、前記ＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患は、慢性リンパ球性白血病（chronic lymphocytic leukemia、ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（acute lymphocytic leukemia、ＡＬＬ）、前リンパ球性白血病（pro-lymphocytic leukemia）、毛細胞白血病（hairy cell leukemia）、一般急性リンパ球性白血病（common acute lymphocytic leukemia、ＣＡＬＬＡ）、Null-acute lymphoblastic leukemia、非−ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（diffuse large B cell lymphoma、ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma）、脾臓リンパ腫（splenic lymphoma）、辺縁帯リンパ腫（marginal zone lymphoma）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma）、低危険群Ｂ細胞リンパ腫（indolent B cell lymphoma）、及びホジキンリンパ腫（Hodgkin lymphoma）からなる群より選択されたＢ細胞悪性腫瘍（B cell malignancy）である、薬剤学的組成物。
【００４７】
３２．第３０項において、前記自己免疫疾患または炎症疾患は、多発性硬化症、リューマチ性関節炎、及び全身性紅斑性ループス（systemic lupus erythematosus、ＳＬＥ）からなる群より選択された疾患である、薬剤学的組成物。
【００４８】
３３．第２８項または第２９項の細胞を含むＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患、自己免疫疾患、または炎症疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【００４９】
３４．第３３項において、前記ＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患は、慢性リンパ球性白血病（chronic lymphocytic leukemia、ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（acute lymphocytic leukemia、ＡＬＬ）、前リンパ球性白血病（pro-lymphocytic leukemia）、毛細胞白血病（hairy cell leukemia）、一般急性リンパ球性白血病（common acute lymphocytic leukemia、ＣＡＬＬＡ）、Null-acute lymphoblastic leukemia、非−ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（diffuse large B cell lymphoma、ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma）、脾臓リンパ腫（splenic lymphoma）、辺縁帯リンパ腫（marginal zone lymphoma）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma）、低危険群Ｂ細胞リンパ腫（indolent B cell lymphoma）、及びホジキンリンパ腫（Hodgkin lymphoma）からなる群より選択されたＢ細胞悪性腫瘍（B cell malignancy）である、薬剤学的組成物。
【００５０】
３５．第３３項において、前記自己免疫疾患または炎症疾患は、多発性硬化症、リューマチ性関節炎、及び全身性紅斑性ループス（systemic  lupus  erythematosus、ＳＬＥ）からなる群より選択された疾患である、薬剤学的組成物。
【００５１】
３６．第２４項乃至第２７項のキメラ抗原受容体をエンコーディングする核酸分子。
【００５２】
３７．第３６項の核酸分子を含む再組合せベクター。
【００５３】
３８．第３７項の再組合せベクターに形質転換された宿主細胞。
【００５４】
３９．第３０項乃至３５項のうち、いずれか一項の組成物を治療を必要とする対象体に投与する段階を含むＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患、自己免疫疾患、または炎症疾患の治療方法。
【００５５】
４０． 第３９項において、前記ＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患は、慢性リンパ球性白血病（chronic lymphocytic leukemia、ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（acute lymphocytic leukemia、ＡＬＬ）、前リンパ球性白血病（pro-lymphocytic leukemia）、毛細胞白血病（hairy cell leukemia）、一般急性リンパ球性白血病（commonacute lymphocytic leukemia、ＣＡＬＬＡ）、Null-acute lymphoblastic leukemia、非−ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（diffuse large B cell lymphoma、ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma）、脾臓リンパ腫（splenic lymphoma）、辺縁帯リンパ腫（marginal zone lymphoma）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma）、低危険群Ｂ細胞リンパ腫（indolent B cell lymphoma）、及びホジキンリンパ腫（Hodgkin lymphoma）からなる群より選択されたＢ細胞悪性腫瘍（B cell malignancy）である、治療方法。
【００５６】
４１．第３９項において、前記自己免疫疾患または炎症疾患は、多発性硬化症、リューマチ性関節炎、及び全身性紅斑性ループス（systemic  lupus  erythematosus、ＳＬＥ）からなる群より選択された疾患である、治療方法。
【００５７】
４２．第３９項において、前記対象体は哺乳動物またはヒトである、治療方法。
【００５８】
本発明の一態様によれば、本発明は以下を含む抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を提供する：
（ａ）次の重鎖ＣＤＲ（Complementarity determining region）アミノ酸序列を含む重鎖可変領域：序列番号１のＣＤＲＨ１及び序列番号２のＣＤＲＨ２；及び
（ｂ）次の軽鎖ＣＤＲアミノ酸序列を含む軽鎖可変領域：序列目録第４序列のＣＤＲＬ１。
【００５９】
本発明の一具現例で、前記重鎖可変領域は、序列番号３、３０乃至３５のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含むＣＤＲＨ３を追加的に含む。
【００６０】
本発明の他の具現例で、前記軽鎖可変領域は、序列番号５、３６乃至３９のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含むＣＤＲＬ２を追加的に含む。
【００６１】
本発明の更に他の具現例で、前記軽鎖可変領域は、序列番号６、４０、及び４１のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含むＣＤＲＬ３を追加的に含む。
【００６２】
本発明の具体的な具現例で、前記重鎖可変領域は、序列番号７、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、及び７０のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含む。
【００６３】
本発明の他の具体的な具現例で、前記軽鎖可変領域は、序列番号８、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、及び７１のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含む。
【００６４】
本発明の他の一態様によれば、本発明はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する抗体または抗原結合断片のＣＤ１９に対する結合を遮断する抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を提供する。前記序列番号９２のアミノ酸序列はhuman B lymphocyte antigen CD19のアミノ酸序列で、UniProtKBのID：P15391として公知されている。
【００６５】
本発明の前記抗体または抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも２つ以上のアミノ酸残基に結合する抗体または抗原結合断片のＣＤ１９に対する結合を遮断する。
【００６６】
本発明の前記抗体または抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基に結合する抗体または抗原結合断片のＣＤ１９に対する結合を遮断する。
【００６７】
本発明の前記抗体または抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＬ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基に結合する抗体または抗原結合断片のＣＤ１９に対する結合を遮断する。
【００６８】
本発明の前記抗体または抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＬ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも２つ以上のアミノ酸残基に結合する抗体または抗原結合断片のＣＤ１９に対する結合を遮断する。
【００６９】
本発明の一具現例で、前記抗体または抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する。
【００７０】
本発明の他の一具現例で、前記抗体または抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも２つ以上のアミノ酸残基に結合する。
【００７１】
本発明の更に他の一具現例で、前記抗体または抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基に結合する。
【００７２】
本発明の具体的な具現例で、前記抗体または抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＬ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基に結合する。
【００７３】
本発明の他の具体的な具現例で、前記抗体または抗原結合断片はＣＤ１９に特異的に結合し、序列番号９２のアミノ酸序列のＬ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも２つ以上のアミノ酸残基に結合する。
【００７４】
本発明の一実施例で確認したように、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片（ｅ．ｇ．ＣＤ１９＿１２．１８）は前述した序列番号９２のアミノ酸序列からなるｈＣＤ１９のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３アミノ酸残基を各々変形したｍｔＣＤ１９（Ｔ５１Ｖ）、ｍｔＣＤ１９（Ｓ５３Ｃ）、ｍｔＣＤ１９（Ｅ５５Ｄ）、ｍｔＣＤ１９（Ｌ５８Ｆ）、ｍｔＣＤ１９（Ｋ５９Ｅ）、及びｍｔＣＤ１９（Ｋ６３Ｎ）に対して結合力の減少を示した。前記の結果から本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片は前記６個のアミノ酸残基をＣＤ１９に対する結合において主要なkey residueとして有することを確認した。また、その中でもＬ５８、Ｋ５９、及びＫ６３を変形させたｍｕｔａｎｔ  ｈＣＤ１９に対して結合力が顕著に減少するという点でＬ５８、Ｋ５９、及びＫ６３のアミノ酸残基がＣＤ１９結合に一層重要なkey residueであることを確認した。したがって、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片は序列番号９２のアミノ酸序列からなるｈＣＤ１９のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも１つ、２つ、または３個以上のアミノ酸残基に結合する。より具体的には、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片は序列番号９２のアミノ酸序列からなるｈＣＤ１９のＬ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも１つ、または２つ以上のアミノ酸残基に結合する。その結果、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片は序列番号９２のアミノ酸序列からなるｈＣＤ１９のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される抗体または抗原結合断片の少なくとも１つ、２つ、または３個以上のアミノ酸残基に結合する抗体または抗原結合断片のＣＤ１９に対する結合を遮断する。より詳しくは、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片は序列番号９２のアミノ酸序列からなるｈＣＤ１９のＬ５８、Ｋ５９、及びＫ６３からなる群より選択される少なくとも１つ、または２つ以上のアミノ酸残基に結合する抗体または抗原結合断片のＣＤ１９に対する結合を遮断する。
【００７５】
また、本発明の一具現例において、本発明のＣＤ１９＿１２．１８抗体またはこれらの変異体は従来のキメラ抗原受容体に使われる抗体であるＦＭＣ６３のエピトープと異なるＣＤ１９のエピトープに結合し、互いに同一なエピトープを有するか、または同一なエピトープに対して競争的に結合する。
【００７６】
本発明の実施例で確認したように、序列番号９２のアミノ酸序列からなるｈＣＤ１９のＴ５１、Ｓ５３、Ｅ５５、Ｌ５８、Ｋ５９、及びＫ６３アミノ酸残基を各々変形したｍｔＣＤ１９（Ｔ５１Ｖ）、ｍｔＣＤ１９（Ｓ５３Ｃ）、ｍｔＣＤ１９（Ｅ５５Ｄ）、ｍｔＣＤ１９（Ｌ５８Ｆ）、ｍｔＣＤ１９（Ｋ５９Ｅ）、及びｍｔＣＤ１９（Ｋ６３Ｎ）に対して本発明の抗−ＣＤ１９抗体または抗原結合断片の結合力が格段に低下したが、ＦＭＣ６３抗体の場合、結合力が完全に維持された。また、本発明の抗体またはその抗原結合断片はｍｔＣＤ１９（Ｈ２１８Ｒ／ＫＳＳ）にも正常に結合したが、ＦＭＣ６３抗体は前記ｍｔＣＤ１９（Ｈ２１８Ｒ／ＫＳＳ）に対して結合力が大きく低下した。したがって、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片はＦＭＣ６３抗体が結合するエピトープには結合しない。
【００７７】
本発明の他の実施例によれば、本発明のＣＤ１９＿１２．１８抗体の変異体（ｉ．ｅ．ＣＤ１９＿１２１８．８１抗体をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、ＣＤ１９−ＥＣＤ−ＣｋまたはＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｃｋ及びＣＤ１９＿１２１８抗体を加えてcompetitive ELISAを遂行した結果、ＣＤ１９＿１２１８抗体が存在する場合、ＣＤ１９＿１２１８．８１抗体とＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｃｋに競争的に結合する結果、結合されたＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｃｋの量が低下することを確認した。したがって、本発明の抗−ＣＤ１９抗体及びこれらの変異体は互いに同一なエピトープを有するか、または同一なエピトープに対して競争的に結合する。
本発明で、前記抗体または抗原結合断片はヒト抗体であるか、またはヒト化されたものでありうる。また、本発明で前記抗体または抗原結合断片はｓｃＦｖであろうるが、これに限定されるのではない。
【００７８】
本発明で、前記抗体または抗原結合断片は、ＣＤＲグラフティング（CDR grafting）方法を用いてマウスで開発した既存の抗体の相補性決定部位（complementarity determining regions、ＣＤＲｓ）を既存の抗体のフレームワーク領域（framework region）より安定したフレームワーク領域（framework region）に移植した。“ＣＤＲグラフティング”とは、マウス単一クローン抗体をヒト患者に使用時、免疫反応が引き起こされて 中和（neutralization）される問題点を解決するために開発された方法であって、非−ヒト抗体（non-human antibody）をヒト化（humanization）する最も代表的な方法である。即ち、ＣＤＲグラフティングは動物抗体のＣＤＲ部位をヒト抗体のフレームワーク（framework）に移植するものである。
【００７９】
本明細書で、前記発明の一態様に従う抗体はＣＤ１９＿１２．１８抗体またはその変異体である。具体的に、前記ＣＤ１９＿１２．１８抗体の変異体はｈｚＣＤ１９＿１２１８．８１、ｈｚＣＤ１９＿１２１８．８２、ｈｚＣＤ１９＿１２１８．８１．１２、ｈｚＣＤ１９＿１２１８．８１．１７、ｈｚＣＤ１９＿１２１８．８１．５２、ｈｚＣＤ１９＿１２１８．８１．５５、ｈｚＣＤ１９＿１２１８．８１．６４、またはｈｚＣＤ１９＿１２１８．８１．７９であり、これらのＣＤＲ及び軽鎖可変領域または重鎖可変領域に対するアミノ酸序列及びヌクレオチド序列は本願明細書及び添付の序列目録に記載されている。
【００８０】
本明細書で、“ＦＭＣ６３”抗体はムリン抗−ＣＤ１９単一クローン抗体の一例である（Nicholson et al., Molecular Immunology、34(16-17): 1157-1165 (1997)）。ＦＭＣ６３単一クローン抗体の可変領域は臨床試験で試験されたＣＡＲに使われてきた（例えば、文献［Kochenderfer et al., Nature Review Clinical Oncol., 10(5); 267-276 (2013); Porter et al., New Eng. J. Med., 365(8): 725-733 (2011); Kalos et al., Science Translational Medicine、3(95): 95ra73 (2011); Kochenderfer et al., Blood、116(20): 4099-4102 (2010); and Kochenderfer et al., Blood、119(12): 2709-2720 (2012)］参照）。
【００８１】
本明細書で、用語“抗体（antibody）”はＣＤ１９に対する特異抗体であって、完全な抗体形態だけでなく、抗体分子の抗原結合断片（antigen binding fragment）を含む。
【００８２】
完全な抗体は２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を有する構造であり、各々の軽鎖は重鎖とジスルフィド結合により連結されている。重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、及びエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスにガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）、及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域はカッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。
【００８３】
本明細書で、用語“抗原結合断片（antigen binding fragment）”は抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうち、Ｆａｂ（fragment antigen binding）は軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を有する構造で、１つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（hinge region）を有するという点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体はＦａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体片で、Ｆｖ断片を生成する再組合せ技術は当業界に公知されている。二重鎖Ｆｖ（two-chain Fv）は非共有結合により重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Ｆｖ（single-chin variable fragment、ｓｃＦｖ）は一般的にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合により連結されるか、またはＣ−末端で直ぐに連結されているので、二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造をなすことができる。このような抗体断片は蛋白質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインに制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペブシンに切断すればＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、または遺伝子再組合技術により製作することができる。
【００８４】
したがって、本発明で抗体は具体的に単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、及び抗−イディオタイプ（抗−ＩＤ）抗体、そして前記抗体のエピトープ−結合断片などを含むが、これに限定されるのではない。
【００８５】
本明細書で、用語“重鎖”は、抗原に特異性を与えるための充分の可変領域序列を有するアミノ酸序列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む全長の重鎖及びその断片を全て意味する。また、本明細書で、用語“軽鎖”は抗原に特異性を与えるための充分の可変領域序列を有するアミノ酸序列を含む可変領域ドメインＶＬ及び不変領域ドメインＣＬを含む全長の軽鎖及びその断片を全て意味する。
【００８６】
本明細書で、用語“可変領域（variable region）”または“可変ドメイン（variable domain）”は抗体を抗原に結合させることと関連する抗体重鎖または軽鎖のドメインを意味する。Native抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（各々ＶＨ及びＶＬ）は一般的に類似の構造を有し、各ドメインは４個の保存されたフレームワーク領域（framework regions、ＦＲ）及び３個の超可変領域（hypervariable regions、ＨＶＲ）を含む。（Kindt et al., Kuby Immunology、 第6版、W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)）。
【００８７】
本明細書で、用語“ＣＤＲ（complementarity determining region）”は免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の高可変領域（hypervariable region）のアミノ酸序列を意味する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest、4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services、National Institutes of Health (1987)）。重鎖（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）及び軽鎖（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）には各々３個のＣＤＲｓが含まれている。ＣＤＲは抗体が抗原またはエピトープに結合することに当たって主要な接触残基を提供する。
【００８８】
本明細書で、用語“フレームワーク（Framework）”または“ＦＲ”は超可変領域（hypervariable region、ＨＶＲ）残基の以外の可変ドメイン残基を示す。可変ドメインのＦＲは一般的に４個のＦＲドメインＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ序列は一般的にＶＨで次の順序で表れる：
FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-CDRH1 (complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4;
【００８９】
また、ＨＶＲ及びＦＲ序列は一般的にＶＬ（または、Ｖｋ）で次の順序で表れる：
FRL1(Framework region 1 of Light chain)-CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4.
【００９０】
本明細書で、用語“特異的に結合する”またはこのようなことは、抗体またはその抗原結合断片、またはｓｃＦｖのような異なる構成物が生理的条件下で比較的安定した抗原と複合体を形成するということを意味する。特異的結合は少なくとも約１x１０−６Ｍ以下の平衡解離定数（例えば、これより小さいＫＤはより堅い結合を示す）に特性化できる。２つの分子が特異的に結合するか否かを決定する方法は当業界によく知られており、例えば平衡透析、表面プラスモン共鳴などを含む。
【００９１】
本明細書で、用語“親和度（Affinity）”は分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総合の強度を意味する。異に明示しない限り、“結合親和力（binding affinity）”は結合対（例えば、抗体及び抗原）の構成員間の１：１相互作用を反映する内因性（intrinsic）結合親和力を示す。分子ＸとそのパートナーＹの親和度は一般的に解離定数（Ｋｄ）で示すことができる。親和度は本願に記述されていることを含んで当業界に公知されている通常的な方法により測定できる。
【００９２】
また、本明細書で、用語“ヒト抗体（human antibody）”または“ヒト化抗体（humanized antibody）”はヒトまたはヒト細胞により生成された抗体、またはヒト抗体レパートリー（repertoires）または他のヒト抗体コーディング序列を用いる非ヒト根源から由来した抗体のアミノ酸序列に相応するアミノ酸序列を保有する。
本明細書で、用語、“キメラ（chimeric）抗体”は重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定根源（source）または種（species）から由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが相異する根源または種から由来した抗体を意味する。
【００９３】
本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ１９を特異的に認識することができる範囲内で添付した序列目録に記載されたアミノ酸序列の変異体を含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他の生物学的特性を改善させるために抗体のアミノ酸序列に変化を与えることができる。このような変形は、例えば抗体のアミノ酸序列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。
【００９４】
このようなアミノ酸変異はアミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疏水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体のサイズ、形態、及び種類に対する分析により、アルギニン、リジンとヒスチジンは、全て正電荷を帯びた残基であり；アラニン、グライシンとセリンは類似のサイズを有し；フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは類似の形態を有することが分かる。したがって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リジンとヒスチジン；アラニン、グライシンとセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは生物学的に機能均等物ということができる。
【００９５】
変異の導入に当たって、アミノ酸の疏水性インデックス（hydropathic index）が考慮できる。各々のアミノ酸は疏水性と電荷によって疏水性インデックスが与えられている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスタイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グライシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。
【００９６】
蛋白質の相互的な生物学的機能（interactive biological function）を与えることに当たって、疏水性アミノ酸インデックスは非常に重要である。類似の疏水性インデックスを有するアミノ酸に置換しなければ類似の生物学的活性が保有できないということは公知の事実である。疏水性インデックスを参照して変異を導入させる場合、好ましくは、±２以内、より好ましくは±１以内、より好ましくは±０．５以内の疏水性インデックス差を示すアミノ酸の間で置換を行う。
【００９７】
一方、類似の親水性値（hydrophilicity value）を有するアミノ酸の間の置換が均等な生物学的活性を有する蛋白質をもたらすということもよく知られている。米国特許第４，５５４，１０１号に開示されたように、次の親水性値が各々のアミノ酸残基に与えられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グライシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００９８】
親水性値を参照して変異を導入させる場合、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、より好ましくは±０．５以内の親水性値の差を示すアミノ酸の間で置換を行う。
【００９９】
分子の活性を全体的に変更させない蛋白質でのアミノ酸交換は当該分野に公知されている（H. Neurath、R.L.Hill、The Proteins、Academic Press、New York、 1979）。最も通常的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。
【０１００】
本発明の一具現例によれば、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片は前述した序列番号１乃至３、序列番号３０乃至３５のうちより選択されたアミノ酸序列を含む１以上のＣＤＲを含む重鎖可変領域；及び序列番号４乃至６、序列番号３６乃至４１のうちより選択されたアミノ酸序列を含む１以上のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）、及び抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、そして、前記抗体のエピトープ−結合断片などを含むが、これに限定されるのではない。
【０１０１】
本発明の他の一具現例で、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片は前述した序列番号７、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、及び７０のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１０２】
本発明の更に他の一具現例で、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片は前述した序列番号８、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、及び７１のうち、いずれか１つのアミノ酸序列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１０３】
本発明の他の具現例で本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片は抗−ＣＤ１９ｓｃＦｖである。
【０１０４】
本発明の具体的な具現例で、前記抗体またはその抗原結合断片に含まれる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ２−Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ３−Ｓｅｒ）ｎ、または（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカーにより連結される。ここで、ｎは１乃至６の整数であり、具体的には３乃至４であるが、これに限定されるのではない。前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば次の配向により存在することができる：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域；または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
【０１０５】
一方、本発明の抗体ＣＤＲ序列は従来の抗−ＣＤ１９抗体またはこれらを含むキメラ抗原受容体のＣＤＲ序列と比較して相同性（similarity）が非常に低くて、その序列の独特性がある。例えば、本発明のＣＤ１９＿１２．１８抗体に対してｎｃｂｉウェブサイトでＢＬＡＳＴ検索した結果、相同性が最も高いと出た米国特許第９０７４００２号に開示された抗体（序列目録第２９序列）は、本発明のＣＤ１９＿１２．１８抗体とＣＤＲ序列相同性が８１．７％に過ぎず、さらに米国特許第９０７４００２号に記載された抗体はProtein Tyrosine Phosphatase 1B(PTP1B)に結合する抗体であって、本発明の抗体とそのターゲットが相異する。
【０１０６】
本発明の他の一態様によれば、本発明は上記の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片をエンコーディングする核酸分子を提供する。
【０１０７】
本発明の一具現例によれば、前記核酸分子は抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片をエンコーディングする核酸分子は、序列番号１０乃至１２のヌクレオチド序列からなる群より選択された１以上のＣＤＲをエンコーディングするヌクレオチド序列及び序列番号１３乃至１５のヌクレオチド序列からなる群より選択された１以上のＣＤＲをエンコーディングするヌクレオチド序列を含む。
【０１０８】
本発明の他の一具現例によれば、前記核酸分子は序列番号１６、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、及び７２からなる群より選択されるヌクレオチド序列を含む、重鎖可変領域をエンコーディングするヌクレオチド序列を含む。
【０１０９】
本発明の更に他の一具現例によれば、前記核酸分子は序列番号１７、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、及び７３からなる群より選択されるヌクレオチド序列を含む、重鎖可変領域をエンコーディングするヌクレオチド序列を含む。
【０１１０】
本発明の更に他の一具現例によれば、前記核酸分子は序列目録第１８序列を含む抗体または抗原結合断片をエンコーディングするヌクレオチド序列を含むが、これに限定されるのではない。
【０１１１】
本明細書で、用語“核酸分子”はＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）そしてＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子で基本構成単位であるヌクレオチドは自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体（analogue）も含む（Scheit、Nucleotide Analogs、John Wiley、New York(1980); Uhlman及びPeyman、Chemical Reviews、90:543-584(1990)）。
【０１１２】
本発明の前記抗体またはその抗原結合断片、または前記キメラ抗原受容体ポリペプチドをエンコーディングするヌクレオチド序列は、前記キメラ抗原受容体分子を構成するアミノ酸序列をエンコーディングするヌクレオチド序列であれば足りて、どの特定ヌクレオチド序列に限定されないということは当業者に自明である。
【０１１３】
これは、ヌクレオシド序列の変異が発生しても変異されたヌクレオチド序列を蛋白質に発現すれば蛋白質序列で変化をもたらさない場合もあるためである。これをコドンの縮退星という。したがって、前記ヌクレオチド序列は機能的に均等なコドンまたは同一なアミノ酸をコーディングするコドン（例えば、コドンの縮退星により、アルギニンまたはセリンに対するコドンは６個である）、または生物学的に均等なアミノ酸をコーディングするコドンを含むヌクレオチド序列を含む。
【０１１４】
本発明の具体的な具現例によれば、前記本発明のＣＤ１９に対する抗体またはその抗原結合断片の重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖、または軽鎖をなすポリペプチドをエンコーディングする核酸のヌクレオチド序列は本明細書の添付された序列目録に収録されている。
【０１１５】
抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片をエンコーディングする本発明の核酸分子は、前記したヌクレオチド序列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド序列も含むことと解析される。上記の実質的な同一性は、前記した本発明のヌクレオチド序列と任意の他の序列を最大限対応するようにアラインし、当業界で通常的に用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた序列を分析した場合に、最小８０％の相同性、より好ましくは最小９０％の相同性、最も好ましくは最小９５％の相同性を示すヌクレオチド序列を意味する。
【０１１６】
前述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すれば、本発明の抗体または抗原結合断片；またはキメラ抗原受容体ポリペプチドをエンコーディングする核酸分子は序列目録に記載された序列と実質的な同一性（substantial identity）を示す序列も含むことと解析される。上記の実質的な同一性は、前記した本発明の序列と任意の他の序列を最大限対応するようにアラインし、当業界で通常的に用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた序列を分析した場合に、最小６１％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、より好ましくは８０％の相同性、最も好ましくは９０％の相同性を示す序列を意味する。序列比較のためのアラインメント方法は当業界に公知されている。アラインメントに対する多様な方法及びアルゴリズムは Smith and Waterman、Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch、J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman、Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp、Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp、CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)に開示されている。NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol.215:403-10(1990))は、NBCI(National Center for Biological Information) などで接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘのような序列分析プログラムと連動して用いることができる。ＢＬＡＳＴはｎｃｂｉウェブサイトのＢＬＡＳＴページを通じて接続可能である。このプログラムを用いた序列相同性比較方法はｎｃｂｉウェブサイトのＢＬＡＳＴ  ｈｅｌｐページで確認することができる。
【０１１７】
本発明の更に他の態様によれば、本発明は前記抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片をエンコーディングする核酸分子を含む再組合せベクターを提供する。
【０１１８】
本発明の更に他の一態様によれば、本発明は前記再組合せベクターに形質転換された宿主細胞を含む。
【０１１９】
本発明のベクターを安定し、かつ連続的にクローニング及び発現させることができる宿主細胞は当業界に公知されて、いかなる宿主細胞も用いることができ、例えば、前記ベクターの適合した真核細胞宿主細胞は猿腎臓細胞７（ＣＯＳ７：monkey kidney cells）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Chinese hamster ovary）細胞、Ｗ１３８、幼いハムスター腎臓（ＢＨＫ：baby hamster kidney）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄種細胞株、ＨｕＴ７８細胞及びＨＥＫ−２９３細胞を含むが、これに限定されるのではない。
【０１２０】
本発明の他の態様によれば、本発明は次を含むＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体を提供する：
（ａ）上記の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメイン（Extracellular domain）；
（ｂ）膜横断ドメイン（transmembrane domain）；及び
（ｃ）細胞内信号伝達ドメイン。
【０１２１】
本明細書で、用語“キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）”は、Ｔ−細胞信号伝達またはＴ−細胞活性化ドメインに連結された抗体の抗原結合ドメイン（例えば、単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含有する人工的に製作されたハイブリッド蛋白質またはポリペプチドである。キメラ抗原受容体は単一クローン抗体の抗原−結合性質を用いて非−ＭＨＣ−制限方式で、選択された標的に対するＴ−細胞特異性及び反応性を再誘導する能力を有する。非−ＭＨＣ−制限された抗原認識はＣＡＲを発現するＴ−細胞に抗原処理にかかわらず抗原を認識する能力を提供して、腫瘍逃避の主要メカニズムを回避させる。また、ＣＡＲはＴ−細胞で発現される時、有利には内在性Ｔ−細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖と二量体化されない。
【０１２２】
本発明のキメラ抗原受容体はＢリンパ球抗原として知られたＣＤ１９に対して誘導された抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメインを含む。本発明で、前記ＣＤ１９に対して誘導された抗体またはその抗原結合断片は、前述した抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片である。
【０１２３】
本発明の一具現例によれば、本発明のキメラ抗原受容体は細胞の表面で発現される。したがって、膜横断ドメインを含むことができる。前記膜横断ドメインは当該分野で公知された天然供給源から、または合成供給源から由来できる。前記膜横断ドメインは、例えばＴ−細胞受容体、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（ＣＤ８α）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４のアルファ、ベータまたはゼタ鎖からなる群より選択された蛋白質の膜横断ドメインでありうるが、これに限定されるのではない。
【０１２４】
本発明の具体的な具現例によれば、前記膜横断ドメインは序列目録第２０序列を含むヌクレオチド序列によりエンコーディングされるＣＤ８由来ヒンジ／膜横断ドメインである。
【０１２５】
本明細書で、用語“細胞内信号伝達ドメイン”は２次メッセンジャー（2nd messenger）を生成するか、または前記２次メッセンジャーに反応してエフェクターとして機能することによって、規定された信号伝達経路を通じての細胞活性を調節するために情報を細胞内に伝達することによって作用する蛋白質の機能性部分を意味する。
【０１２６】
本発明の他の具現例によれば、本発明のキメラ抗原受容体は細胞内信号伝達ドメインを含むことができる。前記細胞内信号伝達ドメインは、免疫細胞及び免疫反応の活性化を引き起こすターゲット（例えば、ＣＤ１９）に前記細胞外ドメインを結合させた後、細胞内信号伝達の原因となる。即ち、細胞内信号伝達ドメインは免疫細胞の正常エフェクター（effector）機能のうち、少なくとも１つの活性化の原因となる。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能はサイトカインの分泌を含む細胞毒性活性またはヘルパー活性でありうる。キメラ抗原受容体で使用するための信号変換ドメインの好ましい例は、抗原受容体結合（engagement）後、信号変換を開始するために協力して作用するＴ細胞受容体及び共同−受容体の細胞質序列、だけでなく同一な機能的能力を有する、このような序列の任意誘導体または変形体及び任意合成序列でありうる。
【０１２７】
本発明の具体的な具現例によれば、前記キメラ抗原受容体の細胞内信号伝達ドメインはＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼタ）鎖から由来したドメインである。
【０１２８】
本発明のより具体的な具現例によれば、前記ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼタ）鎖から由来したドメインは序列目録第２２序列を含む塩基序列によりエンコーディングされるＣＤ３ζドメインである。
【０１２９】
本発明の他の具体的な具現例によれば、前記キメラ抗原受容体の細胞内信号伝達ドメインは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群より選択された１以上の共同刺激分子（costimulatory molecule）を追加的に含む。前記細胞内信号伝達ドメインは、前述したドメインの他にも当該分野で公知された他の細胞内信号伝達分子から収得または由来することができ、細胞内信号伝達ドメインが由来する分子の全体またはその断片を含むことができる。
【０１３０】
本発明の具体的な一具現例によれば、前記共同刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、及び／又はＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）からなる群より選択された蛋白質から収得された機能的信号伝達ドメインでありえ、より具体的にはＣＤ２８及び／又はＯＸ４０の機能的信号伝達ドメインでありうる。
【０１３１】
本発明の他の一具現例によれば、前記細胞内信号伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ３ゼタの機能的信号伝達ドメイン、またはこれらの組合せである。前記細胞内信号伝達ドメインは、最も具体的にはＣＤ３ゼタの機能的信号伝達ドメインである。
【０１３２】
本発明のより具体的な具現例によれば、前記ＣＤ１３７を含む共同刺激分子は序列目録第２１序列を含む塩基序列によりエンコーディングされるＣＤ３ζドメインである。
【０１３３】
本発明のキメラ抗原受容体の膜横断ドメイン及び細胞内信号伝達ドメインは、前述した具体的な膜横断ドメイン及び細胞内信号伝達ドメインのうち、１つ以上選択された組合せで含まれることができる。例えば、本発明のキメラ抗原受容体はＣＤ８α膜横断ドメイン及びＣＤ２８及びＣＤ３ζの細胞内信号伝達ドメインを含むことができる。
【０１３４】
本発明の一具現例に従うＣＡＲコンストラクトの構造及びアミノ酸／ヌクレオチド序列は、図９及び序列目録に添付されている。
【０１３５】
本発明の他の一態様によれば、本発明は前述したキメラ抗原受容体をエンコーディングする核酸分子を提供する。
【０１３６】
本明細書で、前述した抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片（ポリペプチド）とこれをエンコーディングする核酸分子、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体及びこれをエンコーディングする核酸分子は単離された状態である。
【０１３７】
本明細書で、用語“単離された”は自然／天然状態から変形または除去されることを意味する。例えば、生きている動物に自然的に存在する核酸またはペプチドは“単離された”ものでないが、それから部分的にまたは完全に分離された同一な核酸またはペプチドは“単離された”ものである。単離された核酸または蛋白質は実質的に精製された形態に存在できるか、または例えば宿主細胞のような非−天然環境に存在することができる。
【０１３８】
本発明の更に他の態様によれば、本発明は前述した核酸分子を含む再組合せベクターを提供する。本明細書で後述する“ベクター”に対しては前述した抗体またはその抗原結合断片、またはキメラ抗原受容体をエンコーディングする核酸分子と関連して共通的に適用される。
【０１３９】
本明細書で、用語“ベクター”は伝達ベクターと発現ベクターを含む。
【０１４０】
本明細書で、用語“伝達ベクター”は単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に伝達することに使われることができる物質の組成を称する。線形ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と連結されたポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスを含むが、これに限定されるのではない。より具体的に、前記伝達ベクターは自己複製性プラスミドまたはウイルスを含む。前記用語は細胞内への核酸の転移を促進させる非−プラスミド及び非−ウイルス性化合物、例えばポリリシン化合物、リポソームなどを追加的に含むことができることと解析されならなければならない。ウイルス性伝達ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含むが、これに限定されるのではない。
【０１４１】
本明細書で、用語“発現ベクター”は宿主細胞で目的遺伝子を発現させるために、発現させるヌクレオシド序列に作動可能に連結された発現制御序列を含む再組合せヌクレオシドを含むベクターを称する。発現ベクターは発現のための充分のシス作用因子（cis-acting element）を含み、発現のための他の要素は宿主細胞または試験官内発現システムにより提供できる。前記発現ベクターは再組合せポリヌクレオチドを含むプラスミドベクター；コスミドベクター；そしてバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルス、レトロウイルスベクター、及びアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。本発明の具体的な具現例によれば、本発明のベクターで前記スイッチ分子をコーディングする核酸分子は前記ベクターのプロモータと作動的に結合（operatively linked）されている。本明細書で、用語“作動的に結合された”は、核酸発現調節序列（例：プロモータ、シグナル序列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸序列との間の機能的な結合を意味し、これにより前記調節序列は前記他の核酸序列の転写及び／又は解読を調節するようになる。
【０１４２】
本発明の再組合せベクターシステムは当業界に公知されている多様な方法により構築されることができ、これに対する具体的な方法は Sambrook et al., Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)に開示されており、この文献は本明細書に参照として挿入される。
【０１４３】
本発明のベクターは遺伝子クローニングのためのベクター、蛋白質の発現のためのベクター、または遺伝子の伝達のためのベクターとして構築できる。また、本発明のベクターは原核細胞または真核細胞を宿主にして構築できる。
【０１４４】
例えば、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主にする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモータ（例：メタロチオニンプロモータ、β−アクチンプロモータ、ヒトヘログロビンプロモータ、及びヒト筋肉クレアチンプロモータ）または哺乳動物ウイルスから由来したプロモータ（例：アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、サイトメガロウイルスプロモータ、ＨＳＶのｔｋプロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ＨＩＶのＬＴＲプロモータ、モロニーウイルスのプロモータ、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモータ、及びラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）のプロモータ）が用いられることができ、これらは一般的に転写終結序列としてポリアデニル化序列を有する。
【０１４５】
本発明の一具現例によれば、前記ベクターが伝達ベクターの場合、“レトロウイルスベクター”でありうる。レトロウイルスは遺伝子伝達システムのための便利なプラットフォームを提供する。遺伝子伝達のために選択された遺伝子はレトロウイルスベクター内に挿入され、レトロウイルス粒子内にパッケージングできる。次に、再組合せされたレトロウイルスはインビボ、またはインビトロで目的とする宿主細胞に伝達できる。多くのレトロウイルスベクターが関連技術分野に知られており、本発明の具体的な具現例で、前記レトロウイルスベクターはＭＬＶ−基盤のレトロウイルスベクターであるｐＭＴレトロウイルスベクターであるが、これに限定されるのではない。
【０１４６】
本発明の他の一具現例によれば、前記ベクターはレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターである。
【０１４７】
本発明のベクターはそれから発現されるポリペプチドまたは蛋白質の精製を容易にするために、他の序列と融合されることもできる。融合される序列は、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Pharmacia、ＵＳＡ）、マルトース結合蛋白質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）及び６ｘ  Ｈｉｓ（hexahistidine；Quiagen、ＵＳＡ）などがある。一方、本発明の発現ベクターは本発明の抗体またはその抗原結合断片、及びこれを含むＣＡＲポリペプチドの発現を評価するための選択標識として選択可能マーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子を含むことができる。選択可能マーカー遺伝子には当業界で通常的に用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えばアンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリ、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン、及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。レポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、または緑色蛍光蛋白質遺伝子を含む。
【０１４８】
本発明の再組合せベクターを細胞内に導入し発現させる方法は、関連技術分野によく知られている。ベクターは当業界に公知されている方法により宿主細胞、例えば哺乳動物、バクテリア、酵母、または昆虫細胞内に容易に導入できる。例えば、ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段により宿主細胞内に伝達できる。前記物理的手段は、燐酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子爆撃（particle  bombardment）、微細注入、電気穿孔などを含む。前記化学的手段は、コロイド分散液システム、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスピア、ビード、及び水中油エマルジョン、マイセル（micelle）、混合されたマイセル、及びリポソームを含む脂質−基盤システムを含む。また、前記生物学的手段は前述したレンチウイルス、レトロウイルスなど、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターの使用を含む。
【０１４９】
本発明の他の一態様によれば、本発明は前述したキメラ抗原受容体を発現する細胞を提供する。
【０１５０】
本発明の一具現例によれば、前記細胞は免疫細胞として先天性及び／又は後天性免疫反応の開示及び／又は実行を担う造血起源の細胞を称する。
【０１５１】
本発明に従う前記免疫細胞は、幹細胞から由来できる。幹細胞は、成体幹細胞、非−ヒト胚芽幹細胞、臍帯血由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、誘導万能幹細胞、または造血幹細胞でありうる。より具体的には、前記免疫細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ＮＫ−細胞、Ｂ−細胞、または炎症性Ｔ−リンパ球、細胞毒性Ｔ−リンパ球、調節Ｔ−リンパ球、またはヘルパーＴ−リンパ球からなる群より選択された免疫細胞でありうるが、これに制限されるのではない。
【０１５２】
本発明で、前記キメラ抗原受容体を発現する細胞は効果器細胞（effector cell）とも称される。前記効果器細胞は自己細胞または同種異型細胞の集団を含む。即ち、前記効果器細胞は本ＣＤ１９に特異的なＣＡＲを発現する自己細胞または同種異型細胞の集団を含む。
【０１５３】
また、本発明の一具現例によれば、前記効果器細胞はＣＤ１９特異的ＣＡＲをコーディングする核酸分子を含むベクターに形質感染または形質導入された細胞の集団を含む。前記形質感染または形質導入は、前述したように、当業界に知られている多様な手段により制限無しでなされることができる。
【０１５４】
したがって、本発明の具体的な具現例によれば、本発明の効果器細胞、例えばＴリンパ球、または自然殺害細胞に伝達され、ＣＤ１９特異的ＣＡＲコーディング核酸分子はｍＲＮＡに転写され、前記ｍＲＮＡからＣＤ１９特異的ＣＡＲポリペプチドが翻訳されて効果器細胞の表面に発現される。
【０１５５】
また、本発明の更に他の一態様によれば、本発明はキメラ抗原受容体を発現する細胞を含む薬剤学的組成物を提供する。
【０１５６】
前記薬剤学的組成物は、前述した本発明のキメラ抗原受容体を発現する細胞及び薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物の形態に提供できる。
【０１５７】
本発明のキメラ抗原受容体を発現する細胞が薬剤学的組成物の形態に投与される場合、前記細胞は投与される対象体（subject）に対して同種動物由来または自己由来細胞でありうる。
【０１５８】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明のキメラ抗原受容体を発現する細胞の集団を含むことができる。
【０１５９】
本発明の薬剤学的組成物は、前述した本発明のキメラ抗原受容体を発現する細胞を有効性分に用いるので、この両者に共通した内容は本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【０１６０】
下記の実施例で立証されたように、本発明のＣＤ１９＿１２．１８抗体断片を含むキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＤ１９＿１２．１８ＣＡＲ−Ｔ ｃｅｌｌ）はＣＤ１９抗原を発現する細胞株（ＲａＪｉ）と同時培養する場合、ＣＤ１９陽性細胞株（ＲａＪｉ）の表面のＣＤ１９抗原を認識することによって、キメラ抗原受容体細胞の活性化を誘導するので、ＣＤ１９抗原と関連した疾患の治療に有用に使用できることと期待される。
【０１６１】
本発明の薬剤学的組成物により予防または治療できる疾患には、ＣＤ１９を発現する細胞と関連したヒト及び哺乳動物の疾患として、慢性リンパ球性白血病（chronic lymphocytic leukemia、ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（acute lymphocytic leukemia、ＡＬＬ）、前リンパ球性白血病（pro−lymphocytic leukemia）、毛細胞白血病（hairy cell leukemia）、一般急性リンパ球性白血病（commonacute lymphocytic leukemia、ＣＡＬＬＡ）、Null-acute lymphoblastic leukemia、非−ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（diffuse large B cell lymphoma、ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma）、脾臓リンパ腫（splenic lymphoma）、辺縁帯リンパ腫（marginal zone lymphoma）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma）、低危険群Ｂ細胞リンパ腫（indolent B cell lymphoma）、ホジキンリンパ腫（Hodgkin lymphoma）からなる群より選択されたＢ細胞悪性腫瘍（B cell malignancy）を含む。
【０１６２】
また、前記疾患は不適切であるか、または増強したＢ細胞数及び／又は活性化と関連した自己免疫疾患及び炎症疾患を含む。前記自己免疫疾患及び炎症疾患の例には、多発性硬化症、リューマチ性関節炎、及び全身性紅斑性ループス（systemic  lupus  erythematosus、ＳＬＥ）を含む。
【０１６３】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、燐酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアル酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるのではない。本発明の薬剤学的組成物は前記成分の以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加で含むことができる。適合した薬剤学的に許容される担体及び製剤は Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)に詳細に記載されている。
【０１６４】
本発明の薬剤学的組成物は経口または非経口で投与することができ、例えば静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、胸骨内注入、腫瘍内注入、局所投与、鼻内投与、肺内投与、及び直腸内投与などにより投与できる。
【０１６５】
本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により多様であり、普通に熟練した医者は希望する治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は０．０００１−１００ｍｇ／ｋｇである。本明細書で、用語“薬剤学的有効量”は前述した疾患を予防または治療することに十分な量を意味する。
【０１６６】
本明細書で、用語“予防”は疾患または疾患状態の防止または保護的な治療を意味する。本明細書で、用語“治療”は疾患状態の減少、抑制、鎮静、または根絶を意味する。
【０１６７】
本発明の薬剤学的組成物は当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量形態に製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造できる。この際、剤形はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液形態、またはエキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤形態でありえ、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。
【０１６８】
また、本発明の薬剤学的組成物は前述したキメラ抗原受容体を発現する細胞の以外に他の薬剤学的活性薬剤または薬物、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどの化学治療剤；ベバシズマブ （bevacizumab）、オラパリブ（olaparib）などの標的治療剤；またはニボルマブ （nivolumab）、ペンブロリズマブ（pembrolizumab）のような免疫関門抑制剤を含むか、またはこれらと共に併用投与できる。
【０１６９】
本発明の更に他の一態様によれば、本発明は前述したＣＤ１９に対する抗体またはその抗原結合断片を含む組成物；または上記のＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体を発現する効果器細胞を含む組成物を治療を必要とする対象体に投与する段階を含むＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患、自己免疫疾患または炎症疾患の治療方法を提供する。
【０１７０】
本発明の治療方法の対象疾病であるＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患、自己免疫疾患または炎症疾患は前記薬学的組成物の治療対象疾病と関連して定義した通りである。
【０１７１】
本発明の一具現例で、前記対象体は哺乳動物またはヒトである。
【０１７２】
本発明の癌または炎症性疾患の治療方法は有効性分として前述した抗体または抗原結合断片；またはキメラ抗原受容体を発現する効果器細胞を共通的に使用する方法であるので、重複する内容に対しては本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【発明の効果】
【０１７３】
本発明の抗体は癌細胞（特に、血液癌）で高発現されるＣＤ１９に特異的に結合する抗体であって、従来のＣＤ１９ターゲット抗体のＣＤＲ序列と比較して相同性が非常に低くて、その序列の独特性があり、従来のＣＤ１９に結合するＦＭＣ６３抗体断片と相異するエピトープに特異的に結合する。本発明の抗−ＣＤ１９抗体または抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体を発現する細胞はＣＤ１９を発現する陽性細胞株に反応して免疫細胞活性を誘導するので、ＣＡＲ−免疫細胞治療剤として有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】ＣＤ１９＿１２．１８抗体断片に対するＣＤ１９−ＥＣＤ蛋白質に対する結合をＥＬＩＳＡで分析した結果を示した図である。
【図２】ＣＤ１９＿１２．１８抗体断片に対するＣＤ１９陽性細胞株であるＲａＪｉ、ＲＳ４；１１細胞株、及びＣＤ１９陰性細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞株に対する結合能を流細胞分析器を通じて分析した結果を示した図である。
【図３】開発された抗体断片のＦＭＣ６３抗体断片とのエピトープを比較した結果を示した図である。ＦＭＣ６３とのエピトープ比較のために、センサーチップにＦＭＣ６３とＣＤ１９−ＥＣＤ蛋白質を固定化した後、本発明のＣＤ１９＿１２．１８抗体断片との結合を分析した結果を示した図である。
【図４】開発された抗体断片の結合部位確認を流細胞分析器を通じて進行した結果である。Ｍｕｔａｎｔ  ＣＤ１９がtransient  transfectionを通じて発現された２９３細胞と開発された抗体断片を用いており、対照群にＦＭＣ６３抗体を使用した。
【図５】ＦＭＣ６３の報告された結合部位にＦＭＣ６３と開発された抗体断片の結合有無を確認した結果である。結合部位確認はＭｕｔａｎｔ  ＣＤ１９がtransient  transfectionを通じて発現された２９３細胞を用いて進行した。
【図６】開発された抗体断片が連結されたキメラ抗原受容体を発現する細胞毒性Ｔ細胞の活性をインターフェロンガンマ分泌量で分析した結果を示した図である。
【図７】親和度の増進及びヒト化を通じて開発された抗体断片の細胞結合能を確認した結果である。ＣＤ１９陽性細胞株であるＲａＪｉ細胞が分析に使われた。［単位：ＭＦＩ（mean fluorescence intensity）］
【図８ａ】親和度が異なる開発された抗体断片を含む細胞毒性Ｔ細胞の活性をインターフェロンガンマの量で確認した結果である。ＣＤ１９陽性細胞株であるＲａＪｉ−Ｌｕｃ細胞と細胞毒性Ｔ細胞を１：５の割合で共同培養した後、培養液のインターフェロンガンマを測定した。
【図８ｂ】ＣＤ１９陽性細胞株であるＲａＪｉ−Ｌｕｃ細胞と細胞毒性Ｔ細胞を共同培養した後、生き残ったＲａＪｉ−Ｌｕｃ細胞のluciferaseを測定して細胞毒性を確認した。
【図９】開発された抗体断片の活性を最適化するために、キメラ抗原受容体を構成するヒンジ領域、膜通過ドメイン及び補助刺激ドメインが変更された７種のコンストラクトを示す図である。
【図１０】変更された７種のキメラ抗原受容体の発現を流細胞分析器を通じて分析した結果である。細胞毒性Ｔ細胞でのキメラ抗原受容体の発現を分析するためにマーカーにＣＤ３を使用した。
【図１１ａ】７種のキメラ抗原受容体が発現される細胞毒性Ｔ細胞の活性をインターフェロンガンマの量で確認した結果である。標的細胞にＣＤ１９陽性細胞であるＲａＪｉとＣＤ１９陰性細胞であるＪｕｒｋａｔを使用しており、細胞毒性Ｔ細胞と１：５の割合で共同培養してインターフェロンガンマを測定した。
【図１１ｂ】ＣＤ１９陽性細胞株であるＲａＪｉ−Ｌｕｃ細胞と細胞毒性Ｔ細胞を共同培養した後、生き残ったＲａＪｉ−Ｌｕｃ細胞のluciferaseを測定して細胞毒性を確認した結果である。
【図１２ａ】ＣＤ１９＿１２１８、ＣＤ１９＿１２１８．８１、ＣＤ１９＿１２１８．８１．７９、及びＣＤ１９＿１２１８．８２抗体がＦＭＣ６３と異なる部位に結合することを確認するためのｏｃｔｅｔ実験の結果である。
【図１２ｂ】ＣＤ１９＿１２１８とＣＤ１９＿１２１８．８１抗体を用いたcompetition ELISA試験の結果である。競争物質がない状態（ＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｃｋ単独）の吸光度を１００％にして相対的な結合を示した。
【発明を実施するための形態】
【０１７５】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は専ら本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨に従って本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないということは当業界で通常の知識を有する者において自明である。
【０１７６】
実施例
実施例１：ＣＤ１９に対する抗体開発
抗体開発のためにヒトＣＤ１９蛋白質の細胞外部ドメイン（extracellular domain、ＥＣＤ）部位を動物細胞を用いて生産した。ＥＣＤのＣ−末端にヒトＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃ部位（ＣＨ２−ＣＨ３）が結合された形態（ＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｆｃ）とＨｉｓ  ｔａｇが結合された形態（ＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｈｉｓ）のＤＮＡをpCEP4 (Invitrogen、Cat. No. V044-50)にＨｉｎｄ−ＩＩＩとＢａｍＨ−Ｉ制限酵素を用いてクローニングした。次に、Freestyle 293F(Invitrogen、Cat. No. R790-07)細胞にポリエチレンイミン（Polyscience Inc., Cat. No. 23966）を用いて前記クローニングされたベクターを一時形質転換（transient transfection）させ、細胞培養液からprotein-A Ceramic HyperD Fレジン(PALL、Cat No. 20078-028)またはNi-NTA Superflow(Qiagen、Cat No. 30410) を用いて精製した。精製された蛋白質をProtein assay dye(Bio-Rad、Cat. No. 500-0006)を用いて定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマシブルー染色を通じて濃度及び純度を確認した。確保したＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｈｉｓ蛋白質を鶏の皮下に注射し、免疫が完了した鶏から脾臓及び滑液嚢を得た。採取した脾臓及び滑液嚢試料からＴＲＩ試薬（Invitrogen、米国）を使用してｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、これからｃＤＮＡを合成した。免疫グロブリンの重鎖可変領域と軽鎖可変領域に特異的な公知のプライマーを用いて抗体断片ライブラリーを製作した（表１、Phage display: a laboratory manual、Carlos Barbas III、et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press参照）。
【０１７７】
【表１】
2021505137.tif 000003
【０１７８】
製作された鶏の免疫ライブラリーとＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｆｃ蛋白質を抗原に用いてファージバイオ−パンニング（bio-panning）を実施した。抗体ライブラリーはＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（helper phage）を用いてファージ形態に収得してパンニングに用いた。パンニングラウンド（panning round）は４ラウンドまで実施しており、親和度の高いファージが選択的によく選別できるパンニング戦略でパンニングラウンド回数が増えるにつれて抗原の量を減らし、洗浄回数は増やす方法を適用した。ターゲット抗原に結合したファージの数はER2537 E. coli(New England Biolabs、Cat. No. 801-N)を用いて下記のように滴定した。バイオ−パンニング各ラウンドで得たバインダーファージ（binder phage）をｐＨ２．２のグライシン緩衝液に溶出した。ＳＢ培養液（super broth medium）で一夜間培養したＥＲ２５３７  Ｅ．ｃｏｌｉを新たなＳＢ培養液を用いて１／２００に希釈して継代した。次に、３時間の間３７℃で追加培養してログファージ（log phage）に到達するようにした。１００μｌの新鮮なＥＲ２５３７  Ｅ．ｃｏｌｉと１０μｌの希釈されたファージを１．５ｍｌチューブで混合した後、３０分間培養した後、アンピシリン（ampicillin）ＬＢプレート（lysogeny broth agar plate）に塗抹した。続いて、３７℃で一夜間培養して生成されたコロニー（colony）数と希釈因子を適用してファージ数を測定した。
【０１７９】
バイオ−パンニング各ラウンドで得たバインダーファージはＥＲ２５３７  Ｅ．ｃｏｌｉに感染させてコロニー形態に維持した状態でＥＬＩＳＡ方法により各抗原に対する結合有無を確認した。ファージを感染させて得たコロニーをＳＢ培養液に接種した後、ＯＤ６００で０．５になるまで培養した。次に、０．５ｍＭのＩＰＴＧを入れて３０℃でシェ―キング（shaking）培養して抗体断片蛋白質が過課発現されるようにした。ＣＤ１９に特異的に結合する抗体はＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｆｃ蛋白質を用いたＥＬＩＳＡとＣＤ１９過発現細胞株であるＲａｊｉ細胞を用いたflow  cytometry方法により選別した。これを通じてヒトＣＤ１９に対する結合能が最も優れる抗体ＣＤ１９＿１２．１８を選別して、選別されたＣＤ１９＿１２．１８抗体の可変部位のアミノ酸序列は表２の通りである。
【０１８０】
【表２】
2021505137.tif 000004
【０１８１】
選別されたＣＤ１９＿１２．１８抗体の結合を定量的に確認するために前記可変部位を含む抗体断片を動物細胞を用いて生産した。抗体断片のＣ−末端にヒトＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃ部位（ＣＨ２−ＣＨ３）が結合された形態のＤＮＡをｐＣＥＰ４ベクター（Invitrogen、Cat. No. V044-50）にクローニングした。次に、ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ２９３Ｆ細胞（Invitrogen、 Cat. No. R790-07）に前記クローニングされたベクターを一時的に形質転換させ、細胞培養液から、Ｆｃ融合蛋白質形態の抗体（Ａｎｔｉ−ＣＤ１９  ｓｃＦｖ−Ｆｃ）を確保した。選別された抗体の結合能を測定するためにＣＤ１９−ＥＣＤカッパ軽鎖融合蛋白質（ＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｃｋ）をコーティング抗原に用いたＥＬＩＳＡを進行した。ＣＤ１９−ＥＣＤ蛋白質がコーティングされたプレートに精製された抗体断片（Ａｎｔｉ−ＣＤ１９  ｓｃＦｖ−Ｆｃ）を濃度依存的に（５０、１２．５、３．１μｇ／ｍＬ）処理して、２次抗体（Anti-human Fc HRP）を処理した後、ＴＭＢで発色反応を発生させてＥＬＩＳＡリーダー器（Victor X3 PerkinElmer）を用いてＯＤ４５０値を測定した（図１）。図１に示すように、本発明のＣＤ１９＿１２．１８抗体はＣＤ１９−ＥＣＤ蛋白質に特異的に結合する抗体であることを確認した。
【０１８２】
また、ＣＤ１９−ＥＣＤ蛋白質に結合するＣＤ１９＿１２．１８に対してＣＤ１９陽性細胞株であるＲａＪｉ、ＲＳ４；１１細胞株とＣＤ１９陰性細胞株であるＪｕｒｋａｔに対する結合能を確認した。精製された抗体断片（Anti-CD19 scFv-Fc）をＣＤ１９陽性細胞株であるＲａｊｉ、ＲＳ４；１１とＣＤ１９陰性細胞株であるＪｕｒｋａｔに処理し、細胞株に結合した抗体断片は抗−ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣを用いて染色した。細胞株に結合した抗体断片に対する分析は流細胞分析器を通じて測定した（図２）。図２に示すように、本発明のＣＤ１９＿１２．１８抗体はＣＤ１９陽性細胞に特異的に結合する抗体であることを確認した。
【０１８３】
実施例２．開発された抗体断片のＦＭＣ６３とのエピトープ比較
開発された抗体がＢ細胞由来血液癌治療のためのキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）に使われるマウス由来ＣＤ１９抗体であるＦＭＣ６３とエピトープが重複するかを確認するためにＯｃｔｅｔ（Pall ForteBio）機器を用いてエピトープビニング（epitope binning）を進行した。ＡＲ２Ｇセンサーチップ（Fortebio、Cat. No. 18-5092(tray)、18-5093(pack)、18-5094(case)）にＦＭＣ６３−Ｆｃを１０μｇ／ｍＬの濃度でＥＤＣ／ＮＨＳを用いたアミンカップリング方法により固定させた。ＦＭＣ６３が固定されたセンサーチップにＣＤ１９−ＥＣＤカッパ軽鎖融合蛋白質（ＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｃｋ）を１０μｇ／ｍＬの濃度で１０分間結合させ、以後、５分間ＦＭＣ６３とＣＤ１９−ＥＣＤとの間の結合を安定化させた。以後、本発明の抗体であるＣＤ１９＿１２．１８またはＦＭＣ６３を１０μｇ／ｍＬの濃度で１０分間結合させ、１０分間抗原と抗体との間の結合を安定化させた。ＦＭＣ６３を固定した以後に、全ての抗体抗原は kinetics buffer (Fortebio、 cat No. 18-1092)を用いて希釈し、安定化させる段階でも同一なbufferを使用した。仮に、２次に結合させた抗体がＦＭＣ６３と結合されたＣＤ１９−ＥＣＤ蛋白質に追加結合すれば、これはＦＭＣ６３とエピトープを共有しない抗体と解析することができる。図３に示すように、ＦＭＣ６３は追加で結合しない一方、本発明者らにより開発された抗体であるＣＤ１９＿１２．１８はＦＭＣ６３に結合されたＣＤ１９−ＥＣＤに追加結合することを確認した。したがって、本発明のＣＤ１９＿１２．１８抗体は既存のＦＭＣ６３抗体と結合するエピトープが相異することが分かった。
【０１８４】
実施例３：開発された抗体断片のエピトープ検証
開発された抗体断片のエピトープを確認するための方法で、多様なｍｕｔａｎｔ  ＣＤ１９を構築した後、開発された抗体断片の結合を流細胞分析器を用いて確認した。より具体的に、ＣＤ１９蛋白質の発現を確認するためにｐＬｅｎｔｉ６−Ｖ５／ＤＥＳＴレンチウイルスベクター（Invitrogen、米国）にＴ２Ａ  ｓｙｓｔｅｍを用いてＧＦＰ蛋白質を同時に発現するbi-cistronic expression system(mutant CD19-T2A-GFP)をＣｌａＩ／ＸｈｏＩに切断及び結紮させた。製造されたコンストラクトは塩基序列分析を通じて確認した。抗体の結合有無は full length CD19 蛋白質をtransient transfectionを通じて発現した２９３細胞に精製された抗体断片（Anti-CD19 scFv-Fc）を結合して流細胞分析器で分析する方法を使用した。
【０１８５】
まず、Recombinant human CD19 (hCD19、UniProtKB: P15391、SEQ ID NO: 92)及びcynomolgus monkey CD19 (cCD19、UniprotKB: G7Q0T7、SEQ ID NO: 93) 蛋白質との結合能を測定して、開発された抗体がＦＭＣ６３と同一にｃＣＤ１９にcross-reactivityが無いことを確認した（図４）。これに基づいて開発された抗体のエピトープを糾明するために特定位置のアミノ酸をcynomolgus monkeyのアミノ酸に変形したｍｕｔａｎｔ  ＣＤ１９（ｍｔＣＤ１９）を開発した。既存に報告されたＦＭＣ６３結合部位の以外の部分のうち、ｈＣＤ１９とｃＣＤ１９との間に差が出る１２個のresidueに対してｃＣＤ１９のアミノ酸を有するｍｕｔａｎｔ  ＣＤ１９を開発し、抗体の結合能力を確認した。GFP-positive細胞に対する結合有無はmean fluorescence intensity（ＭＦＩ）に基づいて分析した。その結果、testされた１２個のｍｕｔａｎｔのうち、６個residue（Ｔ５１Ｖ、Ｓ５３Ｃ、Ｅ５５Ｄ、Ｌ５８Ｆ、Ｋ５９Ｅ、Ｋ６３Ｎ）が開発された抗体であるＣＤ１９＿１２．１８とｈＣＤ１９との間の結合に重要な役割をしており、特に、そのうちの３個のresidue（Ｌ５８Ｆ、Ｋ５９Ｅ、Ｋ６３Ｎ）の場合、ＣＤ１９＿１２．１８の結合を完全に抑制してkey residuesであることを確認した（図４）。これら主要６個ｍｕｔａｎｔ  ｈＣＤ１９にＦＭＣ６３は完全に結合するので、該当ｍｕｔａｎｔがｈＣＤ１９の全体構造に影響を与えてＣＤ１９＿１２．１８が結合しないものでないことを確認することができた。
【０１８６】
追加的に、ＣＤ１９＿１２．１８抗体がＦＭＣ６３の結合に重要な部位が変更されたｍｕｔａｎｔに結合できることを確認するためにＦＭＣ６３結合に重要であると予想される部位に対する５種のｍｕｔａｎｔを製作（Sommermeyer D et al., Leukemia、2017、31(10):2191）して試験を進行した。参考文献の結果と同一に、ＦＭＣ６３は２１８  residueがarginineに変更され、２２４  residueにserineが追加されたｍｕｔａｎｔ（Ｈ２１８Ｒ／ＫＳＳ）のみで結合に影響を受けることを確認することができた。一方、開発された抗体であるＣＤ１９＿１２．１８は変更されたｍｕｔａｎｔでも正常に結合することを確認することによって、ＦＭＣ６３とは相異する部位に結合するという事実を確認することができた（図５）。
【０１８７】
実施例４：開発された抗体断片が連結されたキメラ抗原受容体を含むレンチウイルスの製作
開発された抗体ＣＤ１９＿１２．１８を用いてキメラ抗原受容体を開発した。キメラ抗原受容体はＣＤ８リーダー、ｓｃＦｖ形態のＣＤ１９＿１２．１８、ＣＤ８ヒンジ及び膜横断領域、ＣＤ１３７細胞質領域、及びＣＤ３ゼタの細胞質領域をコドン最適化した後、ｐＬｅｎｔｉ６−Ｖ５／ＤＥＳＴレンチウイルスベクター（Invitrogen、米国）にＳｐｅＩ／ＸｈｏＩに切断及び結紮させた。製造されたコンストラクト（序列目録第２３序列）は塩基序列分析を通じて確認した。
【０１８８】
製造されたレンチウイルスコンストラクトをウイルス外皮蛋白質であるＶＳＶ−Ｇ（vesicular stomatitis Indiana virus Gprotein）をコーディングする核酸とｇａｇ、ｐｏｌ及びｒｅｖ遺伝子を含むプラスミドであるｐＣＭＶ−ｄＲ８．９１と共にＬｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ（Takara Bio Inc., 日本）細胞株に形質導入させた。形質導入はリポフェクタミン２０００（Invitrogen、米国）を使用して製造社のプロトコルの通り遂行した。７２時間後、レンチウイルスが含まれた培養液を遠心分離型フィルター装置（Millipore、米国）を使用して１０倍濃縮して保管した。
【０１８９】
実施例５．開発された抗体断片を含むキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞の製造
実施例３で製造されたレンチウイルスを用いて、ＣＤ１９＿１２．１８抗体断片（ｓｃＦｖ）を含むキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞を製造した。
【０１９０】
まず、ヒトのnaive Ｔ細胞を分離してDynabeadsTM Human T-Activator CD3/CD28(Thermofisher scientific、米国）で２４時間の間刺激し、ポリブレン（Sigma-Aldrich、米国）及び前記レンチウイルスを前記細胞に添加して２４時間の間培養しながら形質導入させた。以後、ＩＬ−２（Gibco、米国）が含まれた培地に交替して５％  ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。その後、ＣＤ１９＿１２．１８断片を含むキメラ抗原受容体の形質導入有無をキメラ抗原受容体を構成するＣＤ３ｚ抗体（ＢＤ、米国）とウエスタンブロット（Western blot）方法を用いて分析した（図４）。
【０１９１】
図４に示すように、本発明の開発されたＣＤ１９＿１２．１８抗体断片を含むキメラ抗原受容体はＴ細胞の表面に発現できることを確認した。前記のように製造されたＣＤ１９＿１２．１８抗体断片を含むキメラ抗原受容体が表面に提示されたＴ細胞（ＣＤ１９＿１２．１８  ＣＡＲ−Ｔ ｃｅｌｌ）は、製造後、２４時間以内に以後の実験に使用した。
【０１９２】
実施例６．開発された抗体断片を含むキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞の活性確認
実施例４で製造したキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ１９＿１２．１８  ＣＡＲ−Ｔ  ｃｅｌｌ）を使用して、前記Ｔ細胞が細胞表面のＣＤ１９を認識することによって、キメラ抗原受容体細胞の活性化を誘導するか否かを確認した。
【０１９３】
具体的に、ＣＤ１９陽性細胞株であるＲａｊｉとＣＤ１９陰性細胞株であるＪｕｒｋａｔ  Ｅ６．１細胞株を１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地に培養して使用した。まず、ＣＤ１９陽性あるいは陰性細胞株を底の丸い形態の９６−ウェルプレートにウェル当たり３x１０４個になるように株分けした。培養上等液を除去した後、ウェル当たり処理比率に合うように製造したキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＤ１９＿１２．１８  ＣＡＲ−Ｔ  ｃｅｌｌ）を添加し、５％  ＣＯ２及び３７℃の条件で２４時間の間培養した。その結果、培地に分泌されたインターフェロンガンマの量をＥＬＩＳＡキットを使用して製造社のプロトコルの通り測定し、その結果を図５に示した。この際、対照群として細胞を培養しないプレートにキメラ抗原受容体Ｔ細胞を添加した群（Effector T cell only）、細胞を培養したプレートになんにも添加しない群（Target cell only）を使用した。
【０１９４】
図５に示すように、本発明のＣＤ１９＿１２．１８抗体断片を含むキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＤ１９＿１２．１８  ＣＡＲ−Ｔ  ｃｅｌｌ）とＣＤ１９陽性細胞株（Ｒａｊｉ）でインターフェロンガンマの分泌が有意的に増加することを確認した。したがって、本発明のＣＤ１９＿１２．１８抗体断片を含むキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ１９＿１２．１８  ＣＡＲ−Ｔ  ｃｅｌｌ）はキメラ抗原受容体を使用してＣＤ１９陽性細胞（Ｒａｊｉ）の表面のＣＤ１９を認識することによって、キメラ抗原受容体細胞の活性化を誘導することを確認した。
【０１９５】
実施例７．開発された抗体断片に対する親和度増進及びヒト化抗体開発
ＣＤ１９に対してＣＤ１９＿１２．１８対比優れる結合力を有する抗体断片を確保するために重鎖と軽鎖ライブラリーを組み合わせて新たなサブライブラリーを製作した。サブライブラリーを生成するために、ＮＮＫ同意コドン（degenerate codons）を含有するオリゴヌクレオチドが使われており、この際、ＣＤ１９＿１２．１８の序列が７０％以上維持されるようにした。ＣＤ１９＿１２．１８抗体断片はtemplate DNAに使われた。ランダムコドンはＰＣＲにより６個のＣＤＲに導入された。増幅された抗体断片は QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN、米国）により精製された。抗体断片及びｐＣｏｍｂ３ＸＳＳベクターはｓｆｉＩ制限酵素に切断されており、ライゲーション後、ＥＲ２５３７に形質注入してファージライブラリーを製作した。製作されたファージライブラリーに基づいて実施例１と同一な方法により抗体を選別した。
【０１９６】
選別された抗体のヒト化抗体をＣＤＲグラフティング方法を用いて開発した。開発された抗体のＣＤＲの移植を受けるヒト抗体はＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴを用いて塩基序列基準類似性の高いヒト生殖腺（germline）抗体遺伝子のＶ及びＪ遺伝子を選別した（Brochet、X. et al., Nucl Acids Res. 36:503-508(2008)）。開発されたヒト化抗体をＦｃ ｔａｇ形態にＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ２９３Ｆ細胞株を用いて生産した。重鎖のＶ遺伝子とＪ遺伝子にＩＧＨＶ３−７４＊０１とＩＧＨＪ＊０１が、軽鎖のＶ遺伝子とＪ遺伝子にＩＧＬＶ１−５１＊０２とＩＧＬＪ２＊０１が使われた。開発された抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸序列は表３及び表４の通りである。
【０１９７】
【表３】
2021505137.tif 000005
【０１９８】
【表４】
2021505137.tif 000006
【０１９９】
親和度増進及びヒト化を通じて選別された抗体に対してＣＤ１９陽性細胞株であるＲａｊｉ細胞株に対する結合能を確認した。精製された抗体断片をＣＤ１９陽性細胞株であるＲａｊｉに濃度依存的に処理し、ＣＤ１９陽性細胞株であるＲａｊｉに結合した抗体断片は抗−ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣを用いて染色した。Ｒａｊｉ細胞株に結合した抗体断片に対する分析は流細胞分析器を通じて測定し（図７）、結合能の分析はGraphpad Prismで遂行した（表５）。これを通じてＣＤ１９＿１２．１８対比結合能が向上した抗体を確保した。
【０２００】
【表５】
2021505137.tif 000007
【０２０１】
実施例８：親和度増進及びヒト化がなされた抗体断片が連結されたキメラ抗原受容体を含むレンチウイルスの製作
開発された抗体のうち、親和度が異なる３種（ｈｚＣＤ１９＿１２１８．８１、ｈｚＣＤ１９＿１２１８．８２、ｈｚＣＤ１９＿１２１８．８１．７９）を用いてキメラ抗原受容体を開発した。キメラ抗原受容体はＣＤ８リーダー、ｓｃＦｖ形態の開発された抗体、ＣＤ８ヒンジ及び膜横断（transmembrane）領域、ＣＤ１３７細胞質領域、及びＣＤ３ゼタの細胞質領域をGeneOptimizer（Invitrogen）アルゴリズムを用いてコドン最適化した後、プロモータがＥＦ−１  ａｌｐｈａに変更されたｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５ＴＯＰＯレンチウイルスベクター（Invitrogen、米国）にＳｐｅＩ／ＰａｃＩに切断及び結紮させた。製造されたコンストラクトは塩基序列分析を通じて確認した。
【０２０２】
製造されたレンチウイルスコンストラクトをウイルス外皮蛋白質であるＶＳＶ−Ｇ（vesicular stomatitis indiana virus Gprotein）をコーディングする核酸とｇａｇ、ｐｏｌ、及びｒｅｖ遺伝子を含むプラスミドであるｐＣＭＶ−ｄＲ８．９１と共にＬｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ（Takara Bio Inc., 日本）細胞株に形質導入させた。形質導入はリポフェクタミン２０００（Invitrogen、米国）を使用して製造社のプロトコルの通り遂行した。レンチウイルスが含まれた培養液をLenti-X concentrator（Takara Bio Inc., 日本）を使用して濃縮して保管した。
【０２０３】
実施例９．親和度増進及びヒト化がなされた抗体断片を含むキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞の製造及び活性確認
実施例８で製造されたレンチウイルスを用いて、ＣＤ１９＿１２．１８抗体断片（ｓｃＦｖ）を含むキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞を実施例５の方法を用いて製造した。これを通じてキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞を使用して、前記Ｔ細胞が細胞表面のＣＤ１９を認識することによって、キメラ抗原受容体細胞の活性化を誘導するか否かを確認した。
【０２０４】
具体的に、ＣＤ１９陽性細胞株であるＲａｊｉにＧＦＰ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅが発現されるレンチウイルスを導入して遺伝子導入細胞株であるＲａｊｉ−Ｌｕｃ細胞株を構築して実験に使用した。まず、Ｒａｊｉ−Ｌｕｃ細胞株を底の丸い形態の９６−ウェルプレートにウェル当たり３x１０４個になるように株分けした。Ｒａｊｉ−Ｌｕｃ細胞株（Ｔ）が株分けされたプレートにウェル当たり処理比率（Ｔ：Ｅ＝１：２、１：５、または１：１０）に合うように製造した細胞毒性Ｔ細胞（Ｅ）を添加し、５％ＣＯ２及び３７℃の条件で２４時間の間培養した。培養後、培地に分泌されたインターフェロンガンマの量をＥＬＩＳＡキットを使用して製造社のプロトコルの通り測定し、細胞毒性Ｔ細胞の毒性効果をluciferase測定（Bio-Glo Luciferase assay system、Promega、米国）を通じて確認した。
【０２０５】
図８ａに示すように、本発明の抗体断片を含む細胞毒性Ｔ細胞（Ｅ）とＲａｊｉ−Ｌｕｃ細胞（Ｔ）が処理された実験群でインターフェロンガンマの分泌が有意的に増加することを確認した。本発明の抗体断片を含むキメラ抗原受容体の細胞毒性効果は、細胞毒性Ｔ細胞とＲａｊｉ−Ｌｕｃの培養後、残っているＲａＪｉ−Ｌｕｃ細胞株を3X Lysis buffer(75mM Tris(pH 8.0)、30% glycerol、3% Triton X100)で破砕して溶出されて出るluciferaseをsubstrateと反応させて確認した。Ｒａｊｉ−Ｌｕｃ細胞のみ培養したwellから出るsignalを１００％にしてlysis比率を決定した。本発明の抗体断片が含まれたキメラ抗原受容体Ｔ細胞では処理比率によって細胞毒性効果が表れることを確認することができ、ＣＤ１９＿１２．１８対比親和度が増進された抗体断片が含まれた細胞毒性Ｔ細胞で細胞毒性効果が優れるに表れることを確認した（図８ｂ）。
【０２０６】
実施例１０：ヒンジ領域、膜通過ドメイン及び補助刺激ドメインの変更を通じてのキメラ抗原受容体の開発
開発された抗体断片を用いたキメラ抗原受容体活性を最適化するためにキメラ抗原受容体を構成するヒンジ領域（ＣＤ８、ＣＤ２８、Ｆｃ）、膜横断ドメイン（ＣＤ８、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）及び補助刺激ドメイン（ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＳ３）の変更を通じて新たなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ２乃至ＣＡＲ７）を開発しており、活性を確認するためにＣＤ１９抗原に結合する抗体断片部位はｈｚＣＤ１９＿１２１８．８１を用いた（図９）。ＣＡＲ１乃至ＣＡＲ７の各々のキメラ抗原受容体は実施例８と同一な方法によりプロモータがＥＦ−１  ａｌｐｈａに変更されたｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５ＴＯＰＯレンチウイルスベクター（Invitrogen、米国）に切断及び結紮させており、製造されたコンストラクトは塩基序列分析を通じて確認した。前記開発されたＣＡＲ１乃至ＣＡＲ７のコンストラクトのアミノ酸及びヌクレオチド序列は序列番号７４乃至８７の序列で序列目録に添付された。開発された各々のコンストラクトは実施例８のプロトコルの通りレンチウイルスを製造及び濃縮して保管した。
【０２０７】
開発されたキメラ抗原受容体の活性を確認するために前記実施例４と同一な方法により細胞毒性Ｔ細胞を確保しており、前記Ｔ細胞がＣＤ１９を発現する細胞に特異的に活性を誘導するかを確認した。
【０２０８】
まず、確保された細胞毒性Ｔ細胞でＣＡＲが発現される様相を確認した。キメラ抗原受容体の発現はＣＤ１９−ＥＣＤを１次結合させた後、２次抗体にanti-human IgG FITC(Invitrogen、A11013)を用いて観察した。この際、確認された細胞がＴ細胞かを確認するためにAnti-human CD3 PE(Biolegend、317308)を同時に結合させて流細胞分析器で分析した。分析結果、ヒンジ領域がＣＤ８からＣＤ２８またはＦｃに変更されたコンストラクト（ＣＡＲ２、ＣＡＲ３）で既存のＣＤ８ヒンジを使ったコンストラクト対比ＣＡＲの発現が大きく低くなることを確認した。また、膜横断ドメイン及び補助刺激ドメインを変更したコンストラクトではＩＣＯＳ膜通過ドメイン及び補助刺激ドメインを使用する場合（ＣＡＲ５）にＣＡＲの発現が相対的に低くなることを確認した（図１０）。
【０２０９】
開発された細胞毒性Ｔ細胞に対する活性は実施例８と同一な方法により進行した。ＣＤ１９陽性であるＲａＪｉ−Ｌｕｃ細胞株とＣＤ１９陰性であるＪｕｒｋａｔ細胞株を製造した細胞毒性Ｔ細胞の２４時間培養液でインターフェロンガンマの量と細胞毒性効果を測定した。図１１ａに示すように、ＣＤ１９陽性であるＲａｊｉ−Ｌｕｃと細胞毒性Ｔ細胞が共に培養された実験群のみでインターフェロンガンマの量が増加することを確認した。また、実験に使われたＣＡＲコンストラクトのうち、発現が最も良かったコンストラクトＣＡＲ１がインターフェロンガンマの分泌を最も多く誘導することが分かった。一方、細胞毒性効果ではインターフェロンガンマ分泌とは異なり、コンストラクトＣＡＲ１、ＣＡＲ４、ＣＡＲ５、ＣＡＲ６がほとんど同等に優れる活性を示した（図１１ｂ）。
【０２１０】
実施例１１．ＣＤ１９＿１２１８及び親和度増進がなされた開発抗体の結合部位分析
本発明で開発されたＣＤ１９＿１２１８抗体及びこれから親和度増進及びヒト化がなされた抗体がＣＤ１９＿１２１８抗体と同一な結合部位を有するかを分析するためにepitope binningとcompetitition ELISAを進行した。実施例２のように、ＦＭＣ６３抗体をimmobilizationsしたsensor chipにＣＤ１９−ＥＣＤ蛋白質を結合させた後、ＦＭＣ６３、ＣＤ１９＿１２１８、ｈｚＣＤ１９＿１２１８．８１、ｈｚＣＤ１９＿１２１８．８１．７９、及びｈｚＣＤ１９＿１２１８．８２抗体を各々追加で結合させた（図１２ａ）。その結果、ＦＭＣ６３抗体は追加結合できなかったが、ＣＤ１９＿１２１８を含んだ４種の抗体は追加で結合することを確認した。Competition ELISAはＣＤ１９＿１２１８．８１−Ｆｃ抗体をELISA plateに２μｇ／ｍＬの濃度でコーティングし、ＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｃｋ（３μｇ／ｍＬ）単独、あるいはＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｃｋ（３μｇ／ｍＬ）とＣＤ１９＿１２１８−Ｆｃ抗体（３００μｇ／ｍＬ）の混合液を加えて結合させた。以後、ＣＤ１９＿１２１８．８１−Ｆｃ抗体に結合したＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｃｋ蛋白質をａｎｔｉ−Ｃｋ−ＨＲＰ抗体を用いて測定した。その結果、ＣＤ１９＿１２１８抗体がある場合にＣＤ１９＿１２１８．８１−ＦｃとＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｃｋ蛋白質の結合が抑制されることを確認した（図１２ｂ）。以上の結果に基づいて開発された抗体がＣＤ１９＿１２１８抗体と同一な結合部位を有することを確認した。
【図１】
2021505137.tif 000008
【図２】
2021505137.tif 000009
【図３】
2021505137.tif 000010
【図４】
2021505137.tif 000011
【図５】
2021505137.tif 000012
【図６】
2021505137.tif 000013
【図７】
2021505137.tif 000014
【図８ａ】
2021505137.tif 000015
【図８ｂ】
2021505137.tif 000016
【図９】
2021505137.tif 000017
【図１０ａ】
2021505137.tif 000018
【図１０ｂ】
2021505137.tif 000019
【図１０ｃ】
2021505137.tif 000020
【図１０ｄ】
2021505137.tif 000021
【図１１ａ】
2021505137.tif 000022
【図１１ｂ】
2021505137.tif 000023
【図１２ａ】
2021505137.tif 000024
【図１２ｂ】
2021505137.tif 000025
【配列表】
2021505137000001.app
【国際調査報告】
2021505137.tif 000026
2021505137.tif 000027
2021505137.tif 000028
2021505137.tif 000029
2021505137.tif 000030
2021505137.tif 000031