(57)【要約】  本発明は、Ｃｙ５．５色素部分で標識され、腫瘍および病理学的部位のガイド手術で用いられる、アザ−ビシクロアルカン系環状ペプチドを特徴とする、近赤外（ＮＩＲ）蛍光プローブの固相での製造方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2021505618.tif 000017
で示されるｃＲＧＤ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、固体支持体上で製造する方法であって、
ａ）式（ＩＩ）
【化２】
2021505618.tif 000018
［式中、Ｐ１およびＰ２は適切な保護基であり、Ｓは固体支持体である。］
で示されるトリペプチドを、固体支持体上で合成すること；
ｂ）固体支持体に結合した式（ＩＩ）のトリペプチドと、式（ＩＩＩ）
【化３】
2021505618.tif 000019
［式中、Ｐ３は、適切な保護基である。］
で示されるアザ−ビシクロアルカンとをカップリングさせて、式（ＩＶ）
【化４】
2021505618.tif 000020
［式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびＳは、上記で定義したとおりである。］
で示される化合物を得ること；
ｃ）化合物（ＩＶ）から保護基Ｐ２およびＰ３を除去して、式（Ｖ）
【化５】
2021505618.tif 000021
［式中、Ｐ１およびＳは、上記で定義したとおりである。］
で示される化合物を得ること；
ｄ）分子内環化を行って、式（ＶＩ）
【化６】
2021505618.tif 000022
［式中、Ｐ１およびＳは、上記で定義したとおりである。］
で示される化合物を得ること；
ｅ）得られた式（ＶＩ）の化合物を還元反応に付して、式（ＶＩＩ）
【化７】
2021505618.tif 000023
［式中、Ｐ１およびＳは、上記で定義したとおりである。］
で示される、対応するアミノ誘導体を得ること；
ｆ）得られた式（ＶＩＩ）の化合物と、式（ＶＩＩＩ）
【化８】
2021505618.tif 000024
で示される化合物とをコンジュゲートして、式（ＩＸ）
【化９】
2021505618.tif 000025
［式中、Ｐ１およびＳは、上記で定義したとおりである。］
で示される化合物を得ること；
ｇ）保護基Ｐ１を除去し、ペプチド様化合物（ＩＸ）を固体支持体Ｓから切断して、上記で定義した式（Ｉ）の化合物を得ること、
を含む、方法。
【請求項２】
ｈ）工程ｇ）で得られた式（Ｉ）の化合物の精製、および、任意に行ってもよい、
ｉ）最終生成物の凍結乾燥、
の工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｐ１が、２，２，４，６，７−ペンタメチル−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、２，３，６−トリメチル−４−メトキシベンゼン−スルホニル（Ｍｔｒ）、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、トリフルオロアセチル、ｏ−ニトロベンゼンスルホニル（ｏＮＢＳ）、２，４−ジニトロベンゼンスルホニル（ｄＮＢＳ）、ベンゾチアゾール−２−スルホニル（Ｂｔｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、２，３，６−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、トリフルオロアセチル、およびｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、から選択される保護基であり；Ｐ２が、アリル、アルキル、ｔ−ブチル、トリチル（Ｔｒｔ）、２，４−ジメトキシベンジル（ＤＭＢ）、ベンジル（Ｂｎ）、９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）、２−クロロトリチル（２−Ｃｌ−Ｔｒｔ）、２−フェニルイソプロピル（２−ＰｈｉＰｒ）、５−フェニル−３，４−エチレンジオキシテニル誘導体（Ｐｈｅｎｙｌ−ＥＤＯＴｎ）、４−（Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル］−アミノ）ベンジル（Ｄｍａｂ）、カルバモイルメチル（Ｃａｍ）、ｐ−ニトロベンジル（ｐＮＢ）、２−トリメチルシリルエチル（ＴＭＳＥ）、（２−フェニル−２−トリメチルシリル）エチル（ＰＴＭＳＥ）、２−（トリメチルシリル）イソプロピル（Ｔｍｓｉ）、２，２，２−トリクロロエチル（Ｔｃｅ）、ｐ−ヒドロキシフェナシル、４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル（Ｄｍｎｂ）、１，１−ジメチルアリル（Ｄｍａ）、ペンタアミンコバルト（ＩＩＩ）、β−メンチル（Ｍｅｎ）、β−３−メチルペンタ−３−イル（Ｍｐｅ）、および４−（３，６，９−トリオキサデシル）オキシベンジル（ＴＥＧＢｚまたはＴＥＧＢｎ）、から選択される保護基であり；および、Ｐ３が、アリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、２−（４−ビフェニル）イソプロピルオキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、３，５−ジメトキシフェニルイソプロピルオキシカルボニル（Ｄｄｚ）、２−（４−ニトロフェニルスルホニル）エトキシカルボニル（Ｎｓｃ）、１，１−ジオキソベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルメチルオキシカルボニル（Ｂｓｍｏｃ）、（１，１−ジオキソナフト［１，２−ｂ］チオフェン−２−イル）メチルオキシカルボニル（α−Ｎｓｍｏｃ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉｖＤｄｅ）、テトラクロロフタロイル（ＴＣＰ）、２−フェニル（メチル）スルホニオ）エチルオキシカルボニルテトラフルオロボレート（Ｐｍｓ）、エタンスルホニルエトキシカルボニル（Ｅｓｃ）、２−（４−スルホフェニルスルホニル）エトキシカルボニル（Ｓｐｓ）、トリクロロエチルオキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル（ｐＮＺ）、プロパルギルオキシカルボニル（Ｐｏｃ）、ｏ−ニトロベンジルオキシカルボニル（ｏＮＺ）、４−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）、（２−ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル（ＮＰＰＯＣ）、アジドメチルオキシカルボニル（Ａｚｏｃ）、およびトリフルオロアセチル、から選択される保護基である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｐ１が、２，２，４，６，７−ペンタメチル−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）であり、Ｐ２が、アリルであり、Ｐ３が、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）、ｄ）、およびｆ）が、カップリング試薬および塩基の存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
カップリング試薬が、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ΗＢＴＵ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ΗＡＴＵ）、Ｏ−（１Ｈ−６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、１−［１−（シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデン−アミノオキシ）−ジメチルアミノ−モルホリノ］−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）、およびフルオロ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＴＦＦＨ）、からなる群から選択され、塩基が、第三級アミンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）において、カップリング試薬が、１−［１−（シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデン−アミノオキシ）−ジメチルアミノ−モルホリノ］−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）であり、塩基が、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程ｄ）において、カップリング試薬が、７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）であり、塩基が、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）であり、式（Ｖ）の中間体、カップリング試薬、および塩基の比が、約１：１．５：３（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
式（ＩＩ）の中間体とカップリング試薬との比が、約１：２（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であり；式（ＩＩＩ）の中間体とカップリング試薬との比が、約１：０．９８（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であり；かつ、式（ＩＩＩ）の中間体とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンとの比が、約１：２（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｃ）が、アルゴン雰囲気下、オルガノシラン化合物および触媒の存在下での３分間の予備活性化が行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
オルガノシランが、フェニルシラン（ＰｈＳｉＨ３）であり、触媒が、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（Ｐｄ（ＰＰＨ３）４）であり、中間体（ＩＶ）とフェニルシランとの比が、約１：２５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｅ）が、有機リン化合物および水の存在下、２０℃〜７０℃で、５〜２０時間、行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｆ）が、式（ＶＩＩＩ）の中間体を、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、および１−［１−（シアノ−２−エトキシ−２）−オキソエチリデン−アミノオキシ）−ジメチルアミノ−モルホリノ］−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）により、予め活性化することにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
式（ＩＩＩ）
【化１０】
2021505618.tif 000026
［式中、Ｐ３は適切な保護基である。］
で示される、中間体化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学イメージングの分野に関する。より詳細には、Ｃｙ５．５色素部分で標識され、腫瘍および病理学的部位のガイド手術で使用される、アザ−ビシクロアルカン系の環状ペプチドを含む、近赤外（ＮＩＲ）蛍光プローブ（「ＤＡ３６４」として知られる）の固相合成の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）は、生理学的および病理学的な病態の両方のイメージング、および手術中の視覚化とガイドのための強力なツールである。実際、ＮＩＲ蛍光は、組織を数センチメートルまで透過し、散乱を減少させ、体外からのＮＩＲ造影剤によって得られるシグナルとバックグラウンドのコントラストを最大にするという利点がある。例えば、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）における腫瘍組織の組成を定量したり、バックグラウンドのコントラストの変化から腫瘍を識別したりするために使用することができる。
【０００３】
これらの理由により、ＮＩＲ部分を含むいくつかの診断剤が、標的含有組織を生体内でイメージ化するために、最近数年、開発されてきている。広く使用されている近赤外色素の中で、約６９５ｎｍで発光するフルオロフォアＣｙ５．５は、いくつかの標的部分とコンジュゲート（複合化）し、ＮＩＲＦによる生体内リアルタイムイメージングのための蛍光プローブとして評価されている（例えば、Ｊｏｓｈｉ  Ｂ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０１６，２７，４８１−４９４参照）。
【０００４】
バイオマーカーへのコンジュゲートは、より特定の結合とより良好な取り込みと保持をもたらす。ＮＩＲＦプローブとのコンジュゲートに適した標的部分の中で、特定の標的に対して特異的な、いくつかの抗体またはペプチド配列が挙げられる。広く使用されている生化学的ツールは、例えば、膜貫通型受容体インテグリンによって選択的に認識される、トリペプチドＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）である。
【０００５】
本発明は、光学イメージングの分野において、インテグリン過剰発現腫瘍を標的とするペプチド模倣体にコンジュゲートした蛍光分子に関する。より詳細には、Ｃｙ５．５色素部分にコンジュゲートしたアザ−ビシクロアルカン系環状ペプチドＲＧＤを含む、ＤＡ３６４（下記の式Ｉを参照）として知られる、近赤外（ＮＩＲ）蛍光プローブの、改良された合成方法に関する。
【化１】
2021505618.tif 000002
【０００６】
手術中のイメージングにおけるＤＡ３６４の使用は、効果的に研究されている。特に、上記の式（Ｉ）の化合物は、腫瘍および病理学的部位のＮＩＲ蛍光イメージングガイド治療手術中に、腫瘍縁部のリアルタイムの検出および識別を提供できることが示されている（例えば、Ｃｏｎｔｉ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｅｄｉａ  Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ２０１３，８，３５０−３６０；Ｌａｎｚａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｅｄｉａ  Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ２０１１，６，４４９−４５８、および、同じ出願人名のＷＯ２０１６／０９７３１７Ａ１参照）。
【０００７】
この特定の化合物は、Ｌａｎｚａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｅｄｉａ  Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ２０１１，６，４４９−４５８、によって、はじめて記載され、その製造条件が開示されている。そこに記載されたＤＡ３６４の合成は、スクシンイミジルエステルＣｙ５．５−ＮＨＳと、対応するアジド化合物の触媒的還元後に得られる環状ペプチド模倣体（ｃＲＧＤ）のアミノ部分との反応が含まれる。
【０００８】
アジド中間体またはその立体異性体の製造は、同じ出願人名の特許出願ＷＯ２００６／０９５２３４Ａ２、および、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａ  ｄｅｇｌｉ  Ｓｔｕｄｉ  Ｍｉｌａｎｏの名前によるＷＯ２００６／０９２７２２Ａ１に、これまでに開示されている。特に、ＷＯ２００６／０９５２３４Ａ２は、インテグリン受容体に選択的に結合することが可能な標的部分として作用する、新規な６，５−アザ−ビシクロアルカン系環状ペプチド類を報告しており、生物学的に活性な部分またはイメージング検出可能な部分とコンジュゲートした６，５−トランス−アザ−ビシクロアルカン−ｃＲＧＤ化合物の製造スキームを示している（図３および５、および明細書の４１〜４８ページ参照）。
【０００９】
アミノ酸の非ペプチドオリゴマーの一部で作製された人工ポリペプチドは、Ｍｕｒｉｅｌ  Ａｍｂｌａｒｄらの名前によるＵＳ２００３／１９１０４９Ａ１に記載されている。
【００１０】
官能化アザビシクロアルカンアミノ酸の製造は、Ｍａｎｚｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００５，７０（１０），４１２４−４１３２、において記載され、一方、Ｍａｎｚｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９，４，６１５−６３２の論文は、アザビシクロアルカンの足場から出発する溶液中での直鎖ペプチド合成を経て、次いでＲＧＤ鎖の環化がなされる、ＲＧＤ含有官能化アザビシクロアルカンペプチドの製造について記載している。
【００１１】
上記の方法は、ＤＡ３６４を製造するため現在用いられている溶液中の手法を表しており、これは、以下のスキーム１および２に要約される。
この手法は、溶液中での直鎖ペプチド合成、それに続く、ＧｌｙとＡｓｐ残基間の環化；メシラートの置換によるアジド部分の形成；アジドの、対応するアミノ官能基への水素化；および、側鎖の脱保護、を含む。その後、ｃＲＧＤ−アザビシクロアルカン−ＮＨ２は、フルオロフォアＣｙ５．５−ＮＨＳエステルとコンジュゲートされる。
【００１２】
スキーム１
【化２】
2021505618.tif 000003
【００１３】
スキーム２
【化３】
2021505618.tif 000004
【００１４】
しかしながら、上記の方法は、収率、時間およびコストの点でいくつかの欠点を有する。実際、ＤＡ３６４の全合成は、数多くの反応工程（通常は少なくとも２０）、長い製造時間（数週間の期間）、および比較的低い全体収率を要する、長いプロセスを表している。
例えば、フルオロフォアのコンジュゲートより前の製造の最初の部分を実施するには少なくとも４週間必要であり、Ｃｙ５．５へのカップリング、および、最終生成物の処理には、さらに数日必要であり、得られる収率は非常に低い。
今回、このような化合物ＤＡ３６４を、適切な固体支持体上での固相合成を用いて簡便に合成できることを見出した。
【発明の概要】
【００１５】
本発明の目的は、上記で定義された式（Ｉ）のｃＲＧＤ−Ｃｙ５．５コンジュゲート（複合体）の製造のための、固相合成アプローチに基づく新規な合成手法であり、これは、驚くべきことに、時間の短縮と収率の著しい向上に有利であることが見出された。
実際、本明細書に記載された新規の方法では、精製と凍結乾燥の工程を含め、最終生成物を短時間（通常は数日）で得ることができ、全体の収率を４５％まで到達することができる（約３ｇのバッチサイズでの合成を考慮）。
【００１６】
具体的には、新規な本方法によって達成できるいくつかの利点の中で、全合成の手法の簡略化（現在の溶液中の合成に対して少ない工程数）；製造および産業目的のスケールアップに結果的に有利になる反応工程の自動化；途中の化学反応の終了後の精製工程の削除；および、合成中の生成物のロスの最小化、について言及する価値がある。実際、上記の合成方法は、自動化がなされると、ヒトの介入を最小限にして、週７日で実施することができる。
【００１７】
現在の合成を超えるこのアプローチの別の利点は、アザ−ビシクロアルカン環状ペプチドＲＧＤの色素へのコンジュゲートが、事前のペプチド切断および追加の精製を必要とすることなく、樹脂上で直接実施されることである。その結果、この新規な方法は、最終収率を大きく向上させ、全体の製造時間を短縮させる。
したがって、本発明によって得られるいくつかの利点によれば、最初のアミノ酸の結合から最終生成物（精製前）までのＤＡ３６４の合成は、現在確立されているプロトコルに対して、著しく短い時間で実施することができる。
さらに、この新規な方法に用いられるリソースと溶媒の量は、精製工程が、合成の最後に実施されるわずか１つへと著しく削減されるため、大きく削減される。
【００１８】
したがって、本発明は、現在の方法の欠点を克服し、ＤＡ３６４の製造を、スケールアップおよび産業用途に適したものにすることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
したがって、本発明の第１の目的は、式（Ｉ）
【化４】
2021505618.tif 000005
で示されるｃＲＧＤ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、固体支持体上で製造する方法であって、
ａ）式（ＩＩ）
【化５】
2021505618.tif 000006
［式中、Ｐ１およびＰ２は適切な保護基であり、Ｓは固体支持体である。］
で示されるトリペプチドを、固体支持体上で合成すること；
ｂ）固体支持体に結合した式（ＩＩ）のトリペプチドと、式（ＩＩＩ）
【化６】
2021505618.tif 000007
［式中、Ｐ３は、適切な保護基である。］
で示されるアザ−ビシクロアルカンとをカップリングさせて、式（ＩＶ）
【化７】
2021505618.tif 000008
［式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびＳは、上記で定義したとおりである。］
で示される化合物を得ること；
ｃ）化合物（ＩＶ）から保護基Ｐ２およびＰ３を除去して、式（Ｖ）
【化８】
2021505618.tif 000009
［式中、Ｐ１およびＳは、上記で定義したとおりである。］
で示される化合物を得ること；
ｄ）分子内環化を行って、式（ＶＩ）
【化９】
2021505618.tif 000010
［式中、Ｐ１およびＳは、上記で定義したとおりである。］
で示される化合物を得ること；
ｅ）得られた式（ＶＩ）の化合物を還元反応に付して、式（ＶＩＩ）
【化１０】
2021505618.tif 000011
［式中、Ｐ１およびＳは、上記で定義したとおりである。］
で示される、対応するアミノ誘導体を得ること；
ｆ）得られた式（ＶＩＩ）の化合物と、式（ＶＩＩＩ）
【化１１】
2021505618.tif 000012
で示される化合物とをコンジュゲートして、式（ＩＸ）
【化１２】
2021505618.tif 000013
［式中、Ｐ１およびＳは、上記で定義したとおりである。］
で示される化合物を得ること；
ｇ）保護基Ｐ１を除去し、ペプチド様化合物（ＩＸ）を固体支持体Ｓから切断して、上記で定義した式（Ｉ）の化合物を得ること、
を含む、方法である。
【００２０】
したがって、本発明の固相合成法は、以下の反応スキーム３および３ａによって要約され得る。
【００２１】
反応スキーム３
【化１３】
2021505618.tif 000014
【００２２】
反応スキーム３ａ
【化１４】
2021505618.tif 000015
【００２３】
スキーム３および３ａにおいて、基Ｓは、アミノ酸が結合する固体支持体（樹脂）を表し、そして、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４は、適切な保護基である。
【００２４】
本発明の別の実施形態では、上記の方法は、次の工程：
ｈ）工程ｇ）で得られた式（Ｉ）の化合物の精製、および、任意に行ってもよい、
ｉ）最終生成物の凍結乾燥、
をさらに含む。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、Ｐ１は、スルホニルまたはカルボニルの保護基である。
好ましくは、Ｐ１は、２，２，４，６，７−ペンタメチル−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、ｏ−ニトロベンゼンスルホニル（ｏＮＢＳ）、２，４−ジニトロベンゼンスルホニル（ｄＮＢＳ）、ベンゾチアゾール−２−スルホニル（Ｂｔｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、２，３，６−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、およびｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、から選択され；特に、２，２，４，６，７−ペンタメチル−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）が好ましい。
【００２６】
本発明の別の好ましい実施形態では、Ｐ２は、ベンジル基またはアルキル基によって表される保護基である。
好ましくは、Ｐ２は、アリル、アルキル、ｔ−ブチル、トリチル（Ｔｒｔ）、２，４−ジメトキシベンジル（ＤＭＢ）、ベンジル（Ｂｎ）、９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）、２−クロロトリチル（２−Ｃｌ−Ｔｒｔ）、２−フェニルイソプロピル（２−ＰｈｉＰｒ）、５−フェニル−３，４−エチレンジオキシテニル誘導体（Ｐｈｅｎｙｌ−ＥＤＯＴｎ）、４−（Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル］−アミノ）ベンジル（Ｄｍａｂ）、カルバモイルメチル（Ｃａｍ）、ｐ−ニトロベンジル（ｐＮＢ）、２−トリメチルシリルエチル（ＴＭＳＥ）、（２−フェニル−２−トリメチルシリル）エチル（ＰＴＭＳＥ）、２−（トリメチルシリル）イソプロピル（Ｔｍｓｉ）、２，２，２−トリクロロエチル（Ｔｃｅ）、ｐ−ヒドロキシフェナシル、４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル（Ｄｍｎｂ）、１，１−ジメチルアリル（Ｄｍａ）、ペンタアミンコバルト（ＩＩＩ）、β−メンチル（Ｍｅｎ）、β−３−メチルペンタ−３−イル（Ｍｐｅ）、４−（３，６，９−トリオキサデシル）オキシベンジル（ＴＥＧＢｚまたはＴＥＧＢｎ）、から選択され；特に、アリルが好ましい。
【００２７】
本発明の別の好ましい実施形態では、Ｐ３は、カルボニル基またはアセチル基によって表される保護基である。
好ましくは、Ｐ３は、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、２−（４−ビフェニル）イソプロピルオキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、３，５−ジメトキシフェニルイソプロピルオキシカルボニル（Ｄｄｚ）、２−（４−ニトロフェニルスルホニル）エトキシカルボニル（Ｎｓｃ）、１，１−ジオキソベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルメチルオキシカルボニル（Ｂｓｍｏｃ）、（１，１−ジオキソナフト［１，２−ｂ］チオフェン−２−イル）メチルオキシカルボニル（α−Ｎｓｍｏｃ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉｖＤｄｅ）、テトラクロロフタロイル（ＴＣＰ）、２−フェニル（メチル）スルホニオ）エチルオキシカルボニルテトラフルオロボレート（Ｐｍｓ）、エタンスルホニルエトキシカルボニル（Ｅｓｃ）、２−（４−スルホフェニルスルホニル）エトキシカルボニル（Ｓｐｓ）、トリクロロエチルオキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル（ｐＮＺ）、プロパルギルオキシカルボニル（Ｐｏｃ）、ｏ−ニトロベンジルオキシカルボニル（ｏＮＺ）、４−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）、（２−ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル（ＮＰＰＯＣ）、アジドメチルオキシカルボニル（Ａｚｏｃ）、トリフルオロアセチル、から選択され；特に、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）が好ましい。
【００２８】
上記で定義される、Ｐ３が適切な保護基である式（ＩＩＩ）の中間体化合物は、本発明のさらなる目的である。
【００２９】
式（ＩＩＩ）の中間体の製造を、スキーム４に記載する：
【００３０】
スキーム４
【化１５】
2021505618.tif 000016
【００３１】
定義
本明細書において、特に断りのない限り、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
【００３２】
「カップリング試薬」との用語は、カルボキシル部分とアミノ部分との間のアミド結合の形成に用いられる試薬を意味する。反応は、２つの連続した工程：カルボキシル部分の活性化、およびアミノ基のアシル化、で構成され得る。カップリング試薬は、例えば、Ａ．Ｅｌ−Ｆａｈａｍ  ａｎｄ  Ｆ．  Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１１，１１１，６５５７−６６０２；Ｅ．Ｖａｌｅｕｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｂｒａｄｌｅｙ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２００９，３８，６０６−６３１、に記載されているように、当技術分野においてよく知られている。本発明のカップリング試薬は、典型的には、ホスホニウム基、アミニウム基、イモニウム基およびイミド基から選択される少なくとも１つの官能基を含み、それぞれカルボキシル基と反応して活性化した中間体を得ることができる。カップリング剤としては、これに限定されるものではないが、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）などの、カルボジイミド；（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）、［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト−Ｏ２］トリ−１−ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＯｘｉｍ）、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ）、および３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）などの、ホスホニウム試薬；および、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ΗＢＴＵ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ΗＡＴＵ）、Ｏ−（１Ｈ−６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、１−［１−（シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデン−アミノオキシ）−ジメチルアミノ−モルホリノ］−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）、およびフルオロ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＴＦＦＨ）などの、アミニウム／ウロニウム−イモニウム試薬、からなる群から選択される。
本発明の好ましいカップリング試薬は、ＰｙＡＯＰ、ＨＡＴＵ、およびＣＯＭＵである。
【００３３】
「保護基」との用語は、それが結合する官能基を保護するために適用される基を意味する。具体的には、保護基は、アミノ基またはカルボキシル基を保護するために用いられる。適切な保護基としては、例えば、当業者に周知であり、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．２００７）などの従来のマニュアルに記載されている、ベンジル基、カルボニル基、アルキル基、スルホニル基、およびアセチル基が、挙げられる。適切な保護基としては、これに限定されるものではないが、例えば、ホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル、９−フルオロメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニル、アリル、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ベンジル、およびトリフェニルメチル、が挙げられる。これらの中で、Ｆｍｏｃは、好ましい保護基である。
【００３４】
アミノ酸側鎖は、２，２，４，６，７−ペンタメチル−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、ｏ−ニトロベンゼンスルホニル（ｏＮＢＳ）、２，４−ジニトロベンゼンスルホニル（ｄＮＢＳ）、ベンゾチアゾール−２−スルホニル（Ｂｔｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、２，３，６−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、およびｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、アリル、アルキル、ｔ−ブチル、トリチル（Ｔｒｔ）、２，４−ジメトキシベンジル（ＤＭＢ）、ベンジル（Ｂｎ）、９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）、２−クロロトリチル（２−Ｃｌ−Ｔｒｔ）、２−フェニルイソプロピル（２−ＰｈｉＰｒ）、５−フェニル−３，４−エチレンジオキシテニル誘導体（Ｐｈｅｎｙｌ−ＥＤＯＴｎ）、４−（Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル］−アミノ）ベンジル（Ｄｍａｂ）、カルバモイルメチル（Ｃａｍ）、ｐ−ニトロベンジル（ｐＮＢ）、２−トリメチルシリルエチル（ＴＭＳＥ）、（２−フェニル−２−トリメチルシリル）エチル（ＰＴＭＳＥ）、２−（トリメチルシリル）イソプロピル（Ｔｍｓｉ）、２，２，２−トリクロロエチル（Ｔｃｅ）、ｐ−ヒドロキシフェナシル、４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル（Ｄｍｎｂ）、１，１−ジメチルアリル（Ｄｍａ）、ペンタアミンコバルト（ＩＩＩ）、β−メンチル（Ｍｅｎ）、β−３−メチルペンタ−３−イル（Ｍｐｅ）、４−（３，６，９−トリオキサデシル）オキシベンジル（ＴＥＧＢｚまたはＴＥＧＢｎ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、２−（４−ビフェニル）イソプロピルオキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、３，５−ジメトキシフェニルイソプロピルオキシカルボニル（Ｄｄｚ）、２−（４−ニトロフェニルスルホニル）エトキシカルボニル（Ｎｓｃ）、１，１−ジオキソベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルメチルオキシカルボニル（Ｂｓｍｏｃ）、（１，１−ジオキソナフト［１，２−ｂ］チオフェン−２−イル）メチルオキシカルボニル（α−Ｎｓｍｏｃ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉｖＤｄｅ）、テトラクロロフタロイル（ＴＣＰ）、２−フェニル（メチル）スルホニオ）エチルオキシカルボニルテトラフルオロボレート（Ｐｍｓ）、エタンスルホニルエトキシカルボニル（Ｅｓｃ）、２−（４−スルホフェニルスルホニル）エトキシカルボニル（Ｓｐｓ）、トリクロロエチルオキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル（ｐＮＺ）、プロパルギルオキシカルボニル（Ｐｏｃ）、ｏ−ニトロベンジルオキシカルボニル（ｏＮＺ）、４−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）、（２−ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル（ＮＰＰＯＣ）、アジドメチルオキシカルボニル（Ａｚｏｃ）、およびトリフルオロアセチル、からなる群から選択される保護基（水素化、酸または塩基での処理、またはその他の条件で除去可能）でブロックすることができる。
【００３５】
「酸／スカベンジャーカクテル」との表現には、その意味において、いくつかの保護基、特に、Ｍｔｒ（２，３，６−トリメチル−４−メトキシベンゼン−スルホニル）、Ｐｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチル−６−クロマン−スルホニル）、ＯｔＢｕ（ｔｅｒｔ−ブチルエステル）、Ｔｒｔ（トリフェニルメチル）、Ｐｂｆ（２，２，４，６，７−ペンタメチル−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−スルホニル）、およびＢＯＣ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、を除去するのに適した、切断酸試薬混合物が含まれる。好ましくは、酸／スカベンジャーカクテルとして、ＴＦＡ、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）、フェノール、水、アニソール、チオアニソール、１−ドデカンチオール、メタンスルホン酸、トリエチルシラン、インドール、ジクロロメタン、ジチオトレイトール、またはそれらの混合物が、挙げられる。
【００３６】
詳細な説明
上記のように、本明細書に記載の方法は、数工程で、式（Ｉ）の最終化合物を迅速かつ効率的に生成するという利点を有する。
実際、溶液相で行われる唯一の製造は、スキーム４に記載された方法に従って得られる、式（ＩＩＩ）のアザ−ビシクロアルカン中間体の合成である。残りの合成は、本明細書で詳細に説明するように、固体支持体上で行われる。
【００３７】
固体支持体上の合成
本発明によれば、固体支持体上で合成を行う選択は、特に保護基の選択に関して、化学および反応の戦略を見直すことが求められる。
スキーム３に記載された合成工程は、通常、合成を開始すると、反応モニタリングのためのコントロールサンプリング以外は、基本的にヒトの介入なしにペプチド合成装置で継続的に実施できる。
試薬および溶媒の移送は、好ましくは、アミノ酸活性化用のカートリッジまたは反応容器へのいずれかにおいて、自動化される。後者を考慮すれば、移送は、固体支持体上で反応を実施可能にするため、または固体支持体を洗浄するためのいずれかで、実施される。さらに、化学反応は、別々の反応容器で異なるバッチに対して行うことができる。
典型的な反応は、保護基の除去、または２つの反応部分のカップリングである。
合成は、好ましくは、空気が除去され、アルゴンまたは窒素などの不活性ガスで置換された、不活性条件下で実施される。しかしながら、ほとんどの反応工程は、大気条件下でも行うことができる。
当技術分野で周知である関連する固相合成技術、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５，２１４９；Ｂａｒａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．１９８７，３０（６），７０５−７３９、および、Ｃｏｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２００７，２，３２４７−３２５６、に記載されたものなどは、本合成のために考慮され、参照により本明細書に組み込まれる。特に、塩基に不安定な９−フルオロメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基をα−アミノ基の保護基として使用する、既知のＦｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）プロトコルが、本発明に好ましく適用される。
【００３８】
樹脂
本発明によれば、ＤＡ３６４の合成のための固体支持体として、さまざまな樹脂を用いることができる。当技術分野で最も頻繁に使用される樹脂としては、これに限定するものではないが、ヒドロキシメチル樹脂、ワング（Ｗａｎｇ）樹脂、２−クロロトリチル樹脂、リンク（Ｒｉｎｋ）アミド樹脂（特にＦｍｏｃ  ＳＰＰＳに）；メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミド（ＭＢＨＡ）樹脂、オキシム樹脂（特にＢｏｃ  ＳＰＰＳに）、を挙げることができる。これらの樹脂は、商業的に入手可能であり、ペプチドの固相合成で広く使用されている。
本発明の好ましい実施形態では、ＤＡ３６４の合成は、遊離カルボキシル基を有するアミノ酸に適した、ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール（ワング）樹脂を使用して行う。より好ましくは、環状ペプチドの合成に特に有用な、市販のＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ワング樹脂）−ＯＡｌｌ樹脂を使用する。樹脂上での環化は、頭部と尾部による環状ペプチドの製造のための最も簡単なアプローチである。合成戦略としては、例えば、Ｄｅｌｆｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６，３，８９−９７；Ｓ．Ａ．Ｋａｔｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９３，３４，１５４９；Ａ．Ｔｒｚｅｃｉａｋ  ＆  Ｗ．Ｂａｎｎｗａｒｔｈ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９２，３３，４５５７；Ｃ．Ｆｌｏｕｚａｔ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９７，３８，１１９１、に記載されているように、側鎖β（ここではアリル基）を介してオルソゴナルなα−カルボキシル保護を有するＡｓｐまたはＧｌｕ残基を固相に固定することが挙げられる。この樹脂は、ワング樹脂に直接結合した、トリペプチドＲＧＤのＣ末端アミノ酸である、保護アミノ酸残基（Ａｓｐ）を有するため、適切に選択することができる。直鎖ペプチドは、Ａｓｐ残基のα−アミノ基上でアセンブルされる。次に、オルソゴナルなカルボキシル保護基（−アリル）を除去し、Ｎ末端アミンとＣ末端カルボキシル基の間にラクタムブリッジを形成してから、所望の環状ペプチドを固相から切り離す。
固体支持体は、自動ペプチド合成装置で使用され、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、メチレンクロライド（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ−メチルモルホリン、コリジンヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、好ましくはＤＭＦ、未使用のもの、などの適切な溶媒で簡単に処理することができる。例えば、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ワング樹脂）−ＯＡｌｌ樹脂は、好ましくは、ＤＭＦでコンディショニング／カバーされ、１分〜４時間で、膨潤する。
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ワング樹脂）−ＯＡｌｌ樹脂の担持容量は、一般に、０〜１０ｍｍｏｌ／ｇである。本発明の好ましい実施形態では、樹脂の担持は、０．２〜４．０ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは、担持は、０．３ｍｍｏｌ／ｇである。
【００３９】
アミノ酸保護基
本発明によれば、ペプチド伸長に用いられるα−アミノ基は、アミノ酸カップリング中、当技術分野において周知の適切な保護基で保護することができる。適切な保護基は、例えば、上記で定義されている。しかしながら、Ｆｍｏｃは、好ましい保護基である。
さらに、化合物が樹脂に結合している限り、個々のアミノ酸のいくつかは、反応中に保護基でブロックされた側鎖を有していてもよい。これらの保護基は、好ましくは、合成の各工程での反応条件下において安定である。実際、最終化合物を樹脂から切断するのと同時にそれらを除去することは、有利であり得る。この点で、それらは、例えば、酸または塩基の処理によって除去可能であるかどうかに応じて、区分することができる。これらの保護基の例は、上記に記載されている。
本発明によれば、アミノ酸アルギニン（Ａｒｇ）は、好ましくは、酸に不安定な保護基で保護することができる。より好ましくは、保護基Ｐｂｆが用いられる。
【００４０】
樹脂上でのアザビシクロアルカン−ｃＲＧＤの合成（工程ａ〜ｅ）
本発明の最初の工程ａ）は、樹脂への結合およびアミノ酸の付加を含み、次の工程：
ｉ−脱保護剤によるα−アミノ保護基の脱保護；
ｉｉ−有機溶媒中でのカップリング試薬によるアミノ酸のカップリング；および、
ｉｉｉ−残存するアミンのキャッピング、
を含む方法により、トリペプチド鎖ＲＧＤ（ＩＩ）を形成する。
脱保護およびカップリングの各工程の後に、適切な洗浄液による洗浄工程が実施される。通常、洗浄液は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、メチレンクロライド（ＤＣＭ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、およびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、または水、または緩衝液、などの極性非プロトン性溶媒である。
本発明によれば、脱保護、カップリングおよび洗浄に用いられる主な溶媒として、これに限定するものではないが、ＤＣＭ、ＤＭＦおよびＴＨＦが挙げられる。
脱保護は、次のアミノ酸のカップリングを可能にするために、α−アミノ保護基、特にＦｍｏｃを除去する作業である。本発明によれば、Ｆｍｏｃ保護基のための脱保護剤は、ピペリジンを２０％含むＤＭＦ溶液であり得る。
α−アミノ基の脱保護の後、それに続くアミノ酸（ＧｌｙおよびＡｒｇ）が、シーケンスに従い加えられ、目的のトリペプチドが生成される。
カップリング工程は、アミノ酸残基間のアミド結合の形成を導き、カップリング試薬、および中間体の反応性を高めるいくつかの添加剤の存在下で、行われる。
本発明によれば、カップリング試薬は、ペプチド結合形成に一般的に使用される試薬から選択することができ、例えば、上記で述べられた群から選択されるものにできる。
本発明の好ましいカップリング試薬は、ＰｙＡＯＰ、ＨＡＴＵ、およびＣＯＭＵである。
いくつかの添加剤は、製造をより速く、よりきれいにするために、カップリング反応において使用することもできる。そのような添加剤の例としては、例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、ＥＤＣ、ＢＯＰ、ＯｘｙｍａＰｕｒｅ、ＤＩＣ、およびＤＣＣが挙げられる。上記の化合物のうち、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、およびＯｘｙｍａＰｕｒｅが好ましい実施形態である。
したがって、本発明の好ましい実施形態では、カップリングは、活性化されたアミノ酸を、カップリング試薬としてのＤＩＣ、および添加剤としてのＯｘｉｍａＰｕｒｅとともに、１〜６時間、好ましくは４時間で、添加することによって行われる。
カップリングの最後に、残存するアミンを閉鎖するために、キャッピング工程が行われる。この工程は、好ましくは、無水酢酸のＤＭＦ溶液を加えることにより行われる。無水酢酸溶液と樹脂の活性容量との比率は、１：１〜１：３００（ｍｏｌ／ｍｏｌ）にすることができ、好ましくは、約１：１５０である。
ＲＧＤ合成の最終段階で、ＡｒｇのＦｍｏｃは除去されるが、キャッピングは行われず、得られた式（ＩＩ）の中間体は、さらに精製することなく、次に使用することができる。
【００４１】
工程ｂ）によれば、固体支持体に結合したＲＧＤペプチド（ＩＩ）は、スキーム４で述べられた手法に従って製造される式（ＩＩＩ）のアザ−ビシクロアルカンと、カップリングされる。中間体（ＩＩＩ）は、（３Ｒ，４Ｒ，６Ｓ，９Ｓ）−３−ベンジルアミノ−１−アザ−２−オキソ−４−ヒドロキシ−メチルビシクロ［４．３．０］ノナン−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルから出発する、４つの工程によって得られ、その合成は、Ｍａｎｚｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００５，７０（１０），４１２４−４１３２（化合物２５）、に記載されている。この化合物（Ｘ）は、まず、アミノ基がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）で保護されることで、化合物（ＸＩ）が得られ、これが、ＭｓＣｌおよびＴＥＡで活性化され、次いで、ＤＭＦ中、ＮａＮ３により置換されて、化合物（ＸＩＩ）が生成される。これが、ＴＦＡによりカルボキシル官能基において脱保護され、その後、適切な保護基Ｐ３と反応することで、式（ＩＩＩ）のアザ−ビシクロアルカンが得られる。
【００４２】
工程ｂ）によるカップリング反応は、上記のものから選択されるカップリング試薬、および塩基の存在下で行われる、アザ−ビシクロアルカン（ＩＩＩ）の活性化が、予め行われる。
好ましくは、カップリング試薬は、アミニウム／ウラニウム−イモニウム試薬の中から選択され、塩基は、第三級アミンである。より好ましくは、カップリング試薬は、ＣＯＭＵであり、塩基は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである。
中間体化合物（ＩＩ）とカップリング試薬との比は、１：１〜１：５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）にすることができる。好ましくは、この比は、１：１．５〜１：３であり、より好ましくは、約１：２（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。
アザ−ビシクロアルカン化合物（ＩＩＩ）とカップリング試薬との比は、１：０．９５〜１：０．９９（ｍｏｌ／ｍｏｌ）にすることができ、好ましくは、約１：０．９８（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。
アザ−ビシクロアルカン化合物（ＩＩＩ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンとの比は、１：２〜１：５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）にすることができ、好ましくは、約１：２（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。
化合物（ＩＩＩ）の活性化は、１〜１０分間、行うことができ、好ましくは３分間行う。その後、式（ＩＶ）のペプチド模倣化合物を得るために、化合物（ＩＩＩ）と化合物（ＩＩ）とのカップリングは、１〜２０時間、行うことができる。
本発明の好ましい実施形態によれば、反応の終わりに、媒質はろ過され、洗浄される（例えば、ＤＭＦにより）。
【００４３】
得られた式（ＩＶ）の化合物は、次いで、工程ｃ）に従って脱保護がなされる。好ましくは、この化合物に使用される保護基は、それぞれ、カルボキシル基においてはアリル基であり、アザ−ビシクロアルカンのアミノ部分においてはアリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）である。アリル／Ａｌｌｏｃ保護基の除去の例は、例えば、Ｇｒｉｅｃｏ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．，２００１，５７，２５０−２５６に記載されている。
式（Ｖ）の中間体を生成するための式（ＩＶ）の中間体のアリルオキシカルボニル基およびアリル基の自動的な脱保護は、アルゴン雰囲気下、フェニルシランなどのオルガノシランを添加して約３分間、予備活性化が行われ、続いて予めアルゴンでパージした、ＤＣＭなどの適切な溶媒に溶解した、パラジウム触媒などの金属触媒を添加することにより行われる。好ましくは、オルガノシランは、ＰｈＳｉＨ３であり、触媒は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（Ｐｄ（ＰＰＨ３）４）である。
中間体（ＩＶ）とフェニルシランの比は、１：１０〜１：５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）にすることができ、好ましくは、約１：２５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。
脱保護は、好ましくは、撹拌下で、３０〜６０分間、好ましくは４０分間、行われる。
【００４４】
工程ｄ）に参照される、中間体（ＶＩ）を生成するための中間体（Ｖ）の分子内環化は、塩基およびカップリング試薬、好ましくは、第三級アミンおよびアミニウム／ウラニウム−イミニウム試薬、より好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびＰｙＡＯＰ、の存在下、１時間〜２０時間、好ましくは１７時間で、行われる。
中間体（Ｖ）とアミニウム／ウラニウム−イミニウム試薬の比は、１：１〜１：５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）にすることができ、好ましくは、約１：１．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。
中間体（Ｖ）と塩基の比は、１：１〜１：５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）にすることができ、好ましくは、約１：３（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。
その後、媒質をろ過し、ＤＭＦなどの適切な溶媒で約５回洗浄する。
【００４５】
工程ｅ）は、アジド誘導体（ＶＩ）の、対応するアミノ誘導体（ＶＩＩ）への還元を含む。このタイプの反応、すなわち、アジドとホスファンの反応に関するシュタウディンガー反応は、例えば、Ｑｕａｎ  Ｔｉａｎ  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００４，６９，４２９９−４３０８、に記載されている。
還元工程は、トリフェニルホスフィンなどの有機リン化合物および水の存在下、５時間〜２０時間、好ましくは１７時間、２０℃〜７０℃、好ましくは６０℃で、行うことができる。
中間体（ＶＩ）とトリフェニルホスフィンの比は、１：１〜１：２０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）にすることができ、好ましくは、約１：１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。
中間体（ＶＩ）と水の比は、１：２０〜１：１００（ｍｏｌ／ｍｏｌ）にすることができ、好ましくは、約１：５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。
反応の終わりに、樹脂は、好ましくは、例えば、Ｅｔ３Ｎを１％含むＤＣＭで３回、およびＥｔ２Ｏで２回、洗浄される。
【００４６】
フルオロフォアのアザビシクロアルカン−ｃＲＧＤ−樹脂へのコンジュゲート
工程ｆ）は、式（ＶＩＩ）のペプチド模倣体と式（ＶＩＩＩ）のフルオロフォアＣｙ５．５とのコンジュゲートを含む。
化合物（ＶＩＩＩ）は、中間体（ＶＩＩ）とカップリングして化合物（ＩＸ）になる前に、例えば、塩基およびカップリング試薬で、１〜１０分間、活性化させることを要する。好ましくは、活性化は、第三級アミンおよびアミニウム／ウロニウム−イモニウム試薬を用いて３分間行い、カップリングの時間は、１〜２４時間にすることができる。より好ましくは、活性化は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびＣＯＭＵを用いて行い、カップリングは、約２０時間行う。
化合物（ＶＩＩＩ）とカップリング試薬の比は、１：０．９５〜１：０．９９（ｍｏｌ／ｍｏｌ）にすることができ、好ましくは、約１：０．９８（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。化合物（ＶＩＩＩ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの比は、１：２〜１：５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）にすることができ、好ましくは、約１：２（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。最後に、樹脂をろ過し、ＤＭＦなどの適切な溶媒で約５回洗浄を行う。
【００４７】
樹脂からの化合物（Ｉ）の切断と脱保護
最終のペプチド模倣化合物（Ｉ）は、工程ｇ）に従って、粗生成物として収集される。
化合物（ＩＸ）のアルギニン残基のグアニジニウム基の脱保護、および、同時に行う、アスパラギン酸残基のカルボキシル基を生じさせる、樹脂からの最終生成物の切断は、周知の技術（例えば、Ｓｏｌｅ，Ｎ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９２，５７，５３９９−５４０３；Ｈｕａｎｇ，Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．１９９９，５３，５４８−５５３；Ｋｉｎｇ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．１９９０，３６，２５５−２６６；Ｂｏｎｎｅｒ，Ａ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．２００１，５７，４８−５８；Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９０，５５，３７３０−３７４３に記載）に従って、例えば、ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／Ｈ２Ｏなどの効率的な酸／スカベンジャーカクテルを用いて、実施することができ、それにより、式（Ｉ）の化合物を得ることができる。ＴＦＡ、ＴＩＳおよび水の比は、８０／１０／１０〜９５／２．５／２．５にすることができ、好ましくは、９５／２．５／２．５である。
脱保護は、撹拌下、室温、暗所で、１時間〜８時間、好ましくは３時間、行うことができる。その後、反応混合物をろ過し、青色の溶液をジエチルエーテルで洗浄することができる。
【００４８】
式（Ｉ）の最終粗化合物の精製
最終粗生成物（Ｉ）は、最終的に沈殿後に収集され、工程ｈ）による分取ＨＰＬＣシステムで精製される。その後、単離された化合物の集められた画分は、任意に、工程ｉ）に従って、凍結乾燥することができる。
分取ＨＰＬＣは、逆相ＨＰＬＣ専用の固定相を有し、目的の化合物を純粋な画分で溶出するための適切な移動相を用いた、分取カラムで行うことができる。ＨＰＬＣは、固体支持体からのペプチド模倣体残基の切断後、粗溶液から高純度の標的化合物を分離および精製するために、用いられる。
例えば、分取逆相ＨＰＬＣは、ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｌｕｎａ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ１８分取カラム（２５０×１０ｍｍ）を有する、ＡＫＴＡ  ＰＵＲＥ  ２５システムで、簡便に行うことができる。精製は、ＴＦＡを０．１％含む０〜９５％のアセトニトリルの直線勾配で溶出することにより、行うことができる。
上記のように、最終段階での純粋な生成物を収集する１工程のみの精製であるため、全体の合成における精製に要する時間は、大きく減少する。
【００４９】
以下、本発明および特定の実施形態を説明するが、これらは、単なる例示であり、本発明を限定するものではなく、これらは、本発明がどのように実行され得るかを示し、本発明の範囲を限定することなく、説明することを意味する。
【実施例】
【００５０】
材料と設備
ＤＡ３６４の合成に使用される、すべての商業的に入手可能な試薬は、さらに精製することなく使用した。
分析逆相ＨＰＬＣは、ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｌｕｎａ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ１８分析カラム（２５０×４．６ｍｍ）を有する、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＦＬＣバイナリ溶媒マネージャー、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＦＬＣコントローラー（ＣＢＭ−２０Ａ）、および、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＨＰＬＣ  ＵＶ−ＶＩＳ検出器（ＳＰＤ−２０Ａ）、で構成される、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＦＬＣシステム、により行った。分析は、Ａ相（ＡｃＯＮＨ４を１０ｍＭ含むＨ２Ｏ）およびＢ相（ＡｃＯＮＨ４を１０ｍＭ含む、９／１のＡＣＮ／Ｈ２Ｏ）の直線勾配、または、Ａ相（ＴＦＡを０．１％含むＨ２Ｏ）およびＢ相（ＴＦＡを０．１％含むＡＣＮ）の直線勾配を用い、１．０ｍＬ／ｍｉｎ、２１４ｎｍでのＵＶ検出で行った。２０μＬを注入し、カラム温度は制御しなかった。
分取逆相ＨＰＬＣは、ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｌｕｎａ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ１８分取カラム（２５０×１０ｍｍ）を有する、ＡＫＴＡ  ＰＵＲＥ  ２５システムにより行った。精製は、ＴＦＡを０．１％含む０〜９５％のアセトニトリルの直線勾配で溶出することにより行った。
質量分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＬＣ／ＭＳＤ装置により行った。
固相合成には、Ｇｙｒｏｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＴＲＩＢＵＴＥペプチドシンセサイザーを使用した。
個々のアミノ酸残基の略語は従来通りであり、ＡｓｐまたはＤは、アスパラギン酸であり、ＧｌｙまたはＧは、グリシンであり、ＡｒｇまたはＲは、アルギニンである。本明細書で述べられるアミノ酸は、特に断りのない限り、Ｌ−異性体の配置であると理解されるべきである。
【００５１】
略語リスト
Ａｌｌｏｃ                アリルオキシカルボニル
ＡＰＩ                    活性医薬成分
ＢＯＰ                    （ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチ
ルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＣＯＭＵ                  （１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミ
ノオキシ）ジメチルアミノモルホリノ−カルベニウムヘキ
サフルオロホスフェート
Ｃｙ５．５                スルホ−シアニン５．５カルボン酸
ＤＣＣ                    Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ                    ジクロロメタン
ＤＥＰＢＴ                ３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１，２，３−ベン
ゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン
ＤＩＣ                    Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ又はＤＩＥＡ    Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡ                    ジメチルアセトアミド
ＤＭＦ                    ジメチルホルムアミド
ＥＤＡＣ                  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド
ＥＤＣ                    １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド
Ｅｑ．                    当量
Ｅｔ３Ｎ                  トリエチルアミン
Ｅｔ２Ｏ                  ジエチルエーテル
Ｆｍｏｃ                  フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＡＴＵ                  （１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，
２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３オキシ
ドヘキサフルオロホスフェート）
ＨＢＴＵ                  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾ
トリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホス
フェート
Ｈ２Ｏ                    水
ＨＯＡｔ                  １−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
ＨＯＢｔ                  ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ                  高速液体クロマトグラフィー
ＮＭＰ                    Ｎ−メチル−２−ピロリドン
ＯＡｌｌ                  アリルエステル
ＯｘｙｍａＰｕｒｅ        エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセテート
Ｐｂｆ                    ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン
−５−スルホニル
Ｐｄ（ＰＰｈ３）４        テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）
ＰｈＳｉＨ３              フェニルシラン
ＰＰｈ３                  トリフェニルホスフィン
ＰｙＡＯＰ                ７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリピロ
リジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＰｙＢＯＰ                ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホ
スホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＰｙＯｘｉｍ              ［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト−Ｏ２］
トリ−１−ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホス
フェート
ＰｙＢｒＯＰ              ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホス
フェート
ＴＢＴＵ                  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（ベンゾトリア
ゾール−１−イル）ウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＦＡ                    トリフルオロ酢酸
ＴＦＦＨ                  フルオロ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホルムアミ
ジニウムヘキサフルオロホスフェート
ＴＨＦ                    テトラヒドロフラン
ＴＩＳ                    トリイソプロピルシラン
【００５２】
実施例１：式（Ｉ）の化合物の合成
式（Ｉ）の化合物の合成は、スキーム３に記載された工程に従って行われる。反応の進行は、それぞれのＦｍｏｃ脱保護の工程の後に除去される、ジベンゾフルベン−ピペリジン付加物の３０１ｎｍでのＵＶモニタリングおよび比色試験（ＴＮＢＳ）を用いて、追跡した。
【００５３】
工程ａ）トリペプチドＲＧＤの合成
ペプチド合成は、固体支持体としてＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ワング樹脂）−ＯＡｌｌ（１０００ｍｇ、担持容量：０．４６９ｍｍｏｌ／ｇ、活性容量：０．４６９ｍｍｏｌ）を用いて、標準のＦｍｏｃ−固相ストラテジーにより、実施した。４０ｍＬの反応器を使用した。樹脂をＤＭＦ１０ｍＬでカバーし、１０分間膨潤させた。この操作をさらに３回繰り返した。既に担持されたアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＡｌｌ）は、ピペリジンを２０％（ｖ／ｖ）含むＤＭＦ１０ｍＬで、３０秒間、Ｆｍｏｃ脱保護を行った。次に、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを、ＤＩＣ／ＯｘｙｍａＰｕｒｅ溶液８ｍＬにより１０分間活性化した後、固体支持体に結合した前記のＦｍｏｃ脱保護アミノ酸に加えた。それぞれのカップリングの後、未反応の遊離アミノ基をブロックするために、８ｍＬの無水酢酸（１５０当量）で５分間、キャッピングを行った。
次に、成長構造に新しく追加されたＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨは、ピペリジンを２０％（ｖ／ｖ）含むＤＭＦ１０ｍＬで、３０秒間、Ｆｍｏｃ脱保護を行った。その後、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨを、ＤＩＣ／ＯｘｙｍａＰｕｒｅ溶液８ｍＬにより１０分間活性化した後、前記のＧｌｙに加えた。そして、８ｍＬの無水酢酸（１５０当量）で５分間、キャッピングを行った。最後の残渣は、ピペリジンを２０％（ｖ／ｖ）含むＤＭＦ１０ｍＬで、３０秒間、Ｆｍｏｃ脱保護を行った。最後に、樹脂上のカップリング生成物を、８ｍＬのＭｅＯＨで、３０秒間、３回洗浄した。そして、得られた中間体（ＩＩ）をさらに精製することなく使用した。
【００５４】
工程ｂ）アザ−ビシクロアルカンとＲＧＤのカップリング
中間体化合物（ＩＩＩ）は、上記スキーム４および実施例２に記載された方法に従って、合成した。
中間体（ＩＩ）をＤＣＭに膨潤させた。次に、別のフラスコにおいて、中間体（ＩＩＩ）（３８．５μｍｏｌ）を、ＨＡＴＵ（３７．７μｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（７７．０μｍｏｌ）で３分間活性化させた後、中間体（ＩＩ）を含む混合物に加え、撹拌した。カップリング反応を２０時間行い、その後、媒質をろ過した。ＤＭＦ（３ｍＬ）を加え、媒質を３０秒間、撹拌した。その後、ＤＭＦをろ過し、洗浄工程をさらに４回繰り返した。こうして得られた中間体（ＩＶ）を、さらに精製することなく使用した。
【００５５】
工程ｃ）アリル−Ａｌｌｏｃの脱保護
反応を行う前に、反応系を窒素ガスで不活性化した。次に、中間体（ＩＶ）をＰｈＳｉＨ３（０．９６３ｍｍｏｌ）を加えて活性化し、３分間反応させた。その後、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１５．４μｍｏｌ）を加え、脱保護を４０分間、行った。反応終了後、樹脂を、ＤＣＭ４ｍＬで３０秒間４回、ジオキサン：水（９：１）の溶液４ｍＬで１分間１回、ＤＭＦ４ｍＬで２分間１回、およびＤＣＭ４ｍＬで２分間２回、洗浄した。脱保護のためのこのプロセス全体を、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４の溶液を新しくして、２回繰り返した。その後、得られた中間体（Ｖ）をさらに精製することなく使用した。
【００５６】
工程ｄ）アザ−ビシクロアルカン−ＲＧＤの環化
中間体（Ｖ）を、ＰｙＡＯＰ（５７．８μｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１１６μｍｏｌ）で活性化させ、反応媒質を１７時間、撹拌した。カップリングの終了後、溶液をろ過し、ＤＭＦ３ｍＬを加え、媒質を３０秒間、撹拌した。その後、ＤＭＦをろ過し、この洗浄工程をさらに４回繰り返した。その後、得られた中間体（ＶＩ）をさらに精製することなく使用した。
【００５７】
工程ｅ）アジドの還元
中間体（ＶＩ）をＴＨＦに膨潤させた。次に、ＴＨＦ中、６０℃で、ＰＰｈ３（３８５μｍｏｌ）およびＨ２Ｏ（１．９２５ｍｍｏｌ）を加え、媒質を１７時間、撹拌することにより、還元を行った。反応終了後、樹脂を、Ｅｔ３Ｎを１％含むＤＣＭ５ｍＬで２分間３回、Ｅｔ２Ｏ５ｍＬで２分間２回、洗浄した。その後、得られた中間体（ＶＩＩ）をさらに精製することなく使用した。
【００５８】
工程ｆ）フルオロフォアＣｙ５．５による標識化
中間体（ＶＩＩＩ）を、ＣＯＭＵ（６．３０ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（１．５当量）で３分間、活性化させた後、ＤＭＦに溶解した中間体（ＶＩＩ）に加えた。カップリング反応を２０時間行った。最後に、樹脂をろ過し、ＤＭＦ３ｍＬを加え、媒質を３０秒間撹拌した。その後、ＤＭＦをろ過し、洗浄工程をさらに４回、繰り返した。
【００５９】
工程ｇ）切断と脱保護
新たに調製したＴＦＡ／スカベンジャーカクテル（トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：水が９５：２．５：２．５の溶液２ｍＬ）を、前記の工程ｆ）で得られた粗生成物に加え、混合物を室温で３時間、撹拌した。その後、反応混合物をろ過し、青色の溶液をジエチルエーテル８ｍＬで３回洗浄した。最終的に、粗製の最終化合物（Ｉ）を得た。
【００６０】
工程ｈ）精製
粗製の最終化合物（Ｉ）は、ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｌｕｎａ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ１８分取カラム（２５０×１０ｍｍ）で、ＴＦＡを０．１％含む０〜９５％のアセトニトリルの直線勾配で溶出することにより、精製した。収集した画分は、分析用ＨＰＬＣ−ＵＶおよび質量分析により分析した。目的の画分を合わせ、アセトニトリルをエバポレートした。
【００６１】
工程ｉ）凍結乾燥
得られた溶液を、−４０℃のイソプロパノール浴で凍結させた。その後、生成物を、１２時間凍結乾燥し、青色の粉末として収集した。
【００６２】
実施例２：Ｐ３がＡｌｌｏｃである式（ＩＩＩ）の化合物の合成
式（ＩＩＩ）の化合物の合成は、スキーム４に記載された工程に従って行われる。
【００６３】
化合物（ＸＩ）の合成
ＢＯＣ２Ｏ（２．３４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、化合物（Ｘ）（１．９ｇ、６．６８ｍｍｏｌ）（Ｍａｎｚｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００５，７０（１０），４１２４−４１３２）のＴＨＦ（２０ｍＬ）の溶液に加えた。混合物を２時間撹拌し、次いで、溶媒をエバポレートして、粗生成物（２．６ｇ）を次の工程に直接使用した。定量の収率。
【００６４】
化合物（ＸＩＩ）の合成
メタンスルホニルクロリド（１．１ｍＬ、１４．２ｍｍｏｌ）を、化合物（ＸＩ）（２．５７ｇ、６．６８ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）の溶液に、０℃でゆっくりと加え、次いで、Ｅｔ３Ｎ（４ｍＬ、２８．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を０℃でさらに１時間撹拌し、室温まで温め、ＮＨ４Ｃｌ（２×５ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し、溶媒を減圧下で除去して、粗メシラートを得て、これを室温でＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解した。ＮａＮ３（５．４ｇ、８３．１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を６０℃で加熱し、３時間撹拌した。ＤＭＦを真空下でエバポレートし、粗生成物を、Ｈ２Ｏ（１５ｍＬ）で洗浄し、ＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）で抽出した。有機相を分離し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ｉＰｒＯＨ＝１３０／０．８）で精製することにより、１．６ｇの化合物（ＸＩＩ）を得た。収率５８％。
【００６５】
化合物（ＩＩＩ）の合成
化合物（ＸＩＩ）（１．６ｇ、３．９ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）の溶液を、室温で１８時間撹拌した。トリフルオロ酢酸をエバポレートし、粗生成物を、窒素雰囲気下で乾燥ＴＨＦ（２５ｍＬ）に溶解した。ジアリルジカーボネート（０．８７ｇ、４．７ｍｍｏｌ）を加え、混合物を５５℃で２４時間、撹拌した。溶媒を除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ３、８／２／０．２→７／３／０．３）で精製することにより、１．０３ｇの化合物（ＩＩＩ）を得た。収率７８％。
【国際調査報告】
2021505618.tif 000027
2021505618.tif 000028
2021505618.tif 000029