(57)【要約】  本開示は、概して、神経学的疾患又は障害の治療に使用され得るポリペプチドに関する。
2021525074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無害なβ-ソレノイド足場ポリペプチド由来のアミノ酸を含むβ-ソレノイド構造化ポリペプチド、及びβ-ソレノイドドメインの外部の位置に突出する又は突出すると予測される露出した側鎖を有する疾患関連ポリペプチド由来の複数のエピトープアミノ酸、を含む又はそれからなる単離された組み換えポリペプチドであって、前記複数のエピトープアミノ酸は、疾患関連ポリペプチド由来のエピトープを規定し、好ましくは前記複数のエピトープアミノ酸は、前記β-ソレノイド足場ポリペプチドのβ鎖において1残基おきである、単離された組み換えポリペプチド。
【請求項２】
前記β-ソレノイド構造化ポリペプチドが、前記疾患関連ポリペプチド由来の複数の前記エピトープアミノ酸を含む1つ又は複数のβ-アークを含む、請求項1に記載の単離された組み換えポリペプチド。
【請求項３】
リンカードメイン及び第2のβ-ソレノイド構造化ポリペプチドを更に含み、前記リンカードメインが、前記β-ソレノイド構造化ポリペプチドと前記第2のβ-ソレノイド構造化ポリペプチドとの間に位置し、前記第2のβ-ソレノイド構造化ポリペプチドが、β-ソレノイド足場ドメイン、及びβ-ソレノイドドメインの外部の位置に突出する又は突出すると予測される露出した側鎖を有する疾患関連ポリペプチド由来の複数のエピトープアミノ酸を含み、前記複数のエピトープアミノ酸が、疾患関連ポリペプチド由来のエピトープを規定する、請求項1又は2に記載の単離された組み換えポリペプチド。
【請求項４】
前記リンカーが10〜16個のアミノ酸を含む、請求項3に記載の単離された組み換えポリペプチド。
【請求項５】
前記β-ソレノイド足場ポリペプチドが、Het-s、Het-2s、ペクチン酸リアーゼ3、Ca2+依存性ベータ-ヘリックス不凍タンパク質、HMW付着因子、ポリ(ベータ-D-マンヌロネート)C5エピメラーゼ4、又はエンドポリガラクツロナーゼ由来のβ-ソレノイド配列を含む又はそれからなる、請求項1から4のいずれか一項に記載の単離された組み換えポリペプチド。
【請求項６】
前記β-ソレノイド足場ポリペプチドが、配列番号1、11、24、26、30、又は32に記載の配列を有するポリペプチドを含む又はそれからなる、請求項1から4のいずれか一項に記載の単離された組み換えポリペプチド。
【請求項７】
前記疾患関連ポリペプチドが、PrPSc、微小管関連タンパク質タウ、α-シヌクレイン、PrP、Aβ、又はβ-2-ミクログロブリンである、請求項1から6のいずれか一項に記載の単離された組み換えポリペプチド。
【請求項８】
前記β-ソレノイドドメインポリペプチドが左巻きである、請求項1から7のいずれか一項に記載の単離された組み換えポリペプチド。
【請求項９】
前記β-ソレノイドドメインポリペプチドが右巻きである、請求項1から7のいずれか一項に記載の単離された組み換えポリペプチド。
【請求項１０】
前記β-ソレノイドドメインポリペプチドが、7段、4段、又は2段のβ-ソレノイドドメインを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の単離された組み換えポリペプチド。
【請求項１１】
精製ドメインを更に含む又はそれからなる、請求項1から10のいずれか一項に記載の単離された組み換えポリペプチド。
【請求項１２】
前記精製ドメインが複数のHisアミノ酸を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の単離された組み換えポリペプチド。
【請求項１３】
アミノ酸配列
【化１】
2021525074.tif 000015
(配列番号33)
を含む又はそれからなる、単離された組み換えポリペプチド。
【請求項１４】
アミノ酸配列
【化２】
2021525074.tif 000016
(配列番号1)
を含む又はそれからなる、単離された組み換えポリペプチド。
【請求項１５】
アミノ酸配列
【化３】
2021525074.tif 000017
(配列番号3)
を含む又はそれからなる、単離された組み換えポリペプチド。
【請求項１６】
アミノ酸配列
【化４】
2021525074.tif 000018
(配列番号34)
を含む又はそれからなる、単離された組み換えポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号3、19、20、21、22、25、27、又は28に記載のアミノ酸配列を含む又はそれからなる、単離された組み換えポリペプチド。
【請求項１８】
請求項1から17のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチドをコードする配列を含む又はそれからなる、ポリヌクレオチド分子。
【請求項１９】
請求項18に記載のポリヌクレオチド分子を含む、ベクター。
【請求項２０】
請求項18に記載のポリヌクレオチド分子を含む、細胞。
【請求項２１】
請求項19に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２２】
哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、細菌細胞、又は真菌細胞である、請求項20又は21に記載の細胞。
【請求項２３】
請求項1から17のいずれか一項に記載の単離された組み換えポリペプチド、及び薬学的に許容される賦形剤、及び任意選択でアジュバントを含む、免疫原性組成物。
【請求項２４】
請求項23に記載の免疫原性組成物を対象に投与する工程を含む、抗体を産生する方法。
【請求項２５】
請求項24に記載の方法によって取得される、抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
プリオン関連疾患若しくは障害、神経変性疾患若しくは障害、又はプロテイノパチーを有する又は有する疑いがある又は発症するリスクがある対象を治療する方法であって、請求項1から17のいずれか一項に記載の単離された組み換えポリペプチド、請求項18に記載のポリヌクレオチド分子、請求項19から22のいずれか一項に記載の細胞、請求項23に記載の免疫原性組成物、又は請求項25に記載の抗体若しくは抗原結合フラグメントを投与する工程を含む、方法。
【請求項２７】
前記プリオン関連疾患若しくは障害、又は前記神経変性疾患若しくは障害、又は前記プロテイノパチーが、ヒトにおけるアルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、レビー小体型認知症(LBD)、多系統萎縮症(MSA)、ハンチントン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、毛細血管拡張性運動失調症、フリードライヒ運動失調症、多発性硬化症(MS)、プリオン病、脊髄小脳失調症(SCA)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、外傷性脳損傷、海綿状脳症(TSE)、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、新変異型CJD、クールー病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、透析関連アミロイドーシス(DRA)、ヒツジ及びヤギにおけるスクレイピー、ウシにおける海綿状脳症、又はシカ科における慢性消耗性疾患(CWD)である、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象がヒト又は動物である、請求項26又は27に記載の方法。
【請求項２９】
プリオン関連疾患若しくは障害、神経変性疾患若しくは障害、又はプロテイノパチーを有する又は有する疑いがある又は発症するリスクがある対象を治療するための、請求項1から17のいずれか一項に記載の単離された組み換えポリペプチド、請求項18に記載のポリヌクレオチド分子、請求項19から22のいずれか一項に記載の細胞、請求項23に記載の免疫原性組成物、又は請求項24に記載の抗体若しくは抗原結合フラグメントの使用。
【請求項３０】
プリオン関連疾患若しくは障害、神経変性疾患若しくは障害、又はプロテイノパチーを有する又は有する疑いがある又は発症するリスクがある対象を治療するための医薬の製造における、請求項1から17のいずれか一項に記載の単離された組み換えポリペプチド、請求項18に記載のポリヌクレオチド分子、請求項18から22のいずれか一項に記載の細胞、請求項23に記載の免疫原性組成物、又は請求項25に記載の抗体若しくは抗原結合フラグメントの使用。
【請求項３１】
前記プリオン関連疾患若しくは障害、又は前記神経変性疾患若しくは障害、又は前記プロテイノパチーが、ヒトにおけるアルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、レビー小体型認知症(LBD)、多系統萎縮症(MSA)、ハンチントン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、毛細血管拡張性運動失調症、フリードライヒ運動失調症、多発性硬化症(MS)、プリオン病、脊髄小脳失調症(SCA)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、外傷性脳損傷、海綿状脳症(TSE)、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、新変異型CJD、クールー病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、透析関連アミロイドーシス(DRA)、ヒツジ及びヤギにおけるスクレイピー、ウシにおける海綿状脳症、又はシカ科における慢性消耗性疾患(CWD)である、請求項29又は30に記載の使用。
【請求項３２】
前記対象がヒト又は動物である、請求項29から31のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全内容が参照により本明細書によって組み込まれている、2018年5月22日に出願した米国特許出願第62/674,916号に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
本開示は、概して、神経学的疾患又は障害の治療に使用され得るポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
慢性消耗性疾患(CWD)、牛海綿状脳症(BSE)、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、アルツハイマー病(AD)、又はパーキンソン病(PD)等のタンパク質ミスフォールディング病に対するワクチン及び特異的抗原を創出しようとする、多数の研究者及び企業による先行する試みは、疾患を引き起こすタンパク質に由来する全長タンパク質又は短いペプチドに依存した。これらの抗原及びワクチンは、インビボで使用される場合の特異的構造を採用する及び維持するようには設計されておらず、特にそれらは、ベータ構造化タンパク質表面(エピトープ)を形成する特異的残基を有する規定のベータ構造を採用するようには設計されていなかった。更には、これらのタンパク質及びペプチド(抗原)のすべては、疾患を引き起こすタンパク質又はペプチドに由来する連続した配列として規定された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願第62/674,916号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
1つの態様において、無害なβ-ソレノイド足場ポリペプチド由来のアミノ酸を含むβ-ソレノイド構造化ポリペプチド、及びβ-ソレノイドドメインの外部の位置に突出する又は突出すると予測される露出した側鎖を有する疾患関連ポリペプチド由来の複数のエピトープアミノ酸、を含む又はそれからなる単離された組み換えポリペプチドであって、複数のエピトープアミノ酸は、疾患関連ポリペプチド由来のエピトープを規定し、好ましくは複数のエピトープアミノ酸は、β-ソレノイド足場ポリペプチドのβ鎖において1残基おきである、単離された組み換えポリペプチドが提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
1つの例において、β-ソレノイド構造化ポリペプチドは、疾患関連ポリペプチド由来の複数のエピトープアミノ酸を含む1つ又は複数のβ-アークを含む。
【０００７】
1つの例において、リンカードメイン及び第2のβ-ソレノイド構造化ポリペプチドを更に含み、前記リンカードメインは、β-ソレノイド構造化ポリペプチドと第2のβ-ソレノイド構造化ポリペプチドとの間に位置し、前記第2のβ-ソレノイド構造化ポリペプチドは、β-ソレノイド足場ドメイン、及びβ-ソレノイドドメインの外部の位置に突出する又は突出すると予測される露出した側鎖を有する疾患関連ポリペプチド由来の複数のエピトープアミノ酸を含み、前記複数のエピトープアミノ酸は、疾患関連ポリペプチド由来のエピトープを規定する。
【０００８】
1つの例において、リンカーは10〜16個のアミノ酸を含む。
【０００９】
1つの例において、β-ソレノイド足場ポリペプチドは、Het-s、Het-2s、ペクチン酸リアーゼ3、Ca2+依存性ベータ-ヘリックス不凍タンパク質、HMW付着因子、ポリ(ベータ-D-マンヌロネート)C5エピメラーゼ4、又はエンドポリガラクツロナーゼ由来のβ-ソレノイド配列を含む又はそれからなる。
【００１０】
1つの例において、β-ソレノイド足場ポリペプチドは、配列番号1、11、24、26、30、又は32に記載の配列を有するポリペプチドを含む又はそれからなる。
【００１１】
1つの例において、疾患関連ポリペプチドは、PrPSc、微小管関連タンパク質タウ、α-シヌクレイン、PrP、Aβ、又はβ-2-ミクログロブリンである。
【００１２】
1つの例において、β-ソレノイドドメインポリペプチドは左巻きである。
【００１３】
1つの例において、β-ソレノイドドメインポリペプチドは右巻きである。
【００１４】
1つの例において、β-ソレノイドドメインポリペプチドは、7段、4段、又は2段のβ-ソレノイドドメインを含む。
【００１５】
1つの例において、精製ドメインを更に含む又はそれからなる。
【００１６】
1つの例において、精製ドメインは複数のHisアミノ酸を含む。
【００１７】
1つの態様において、アミノ酸配列
【化１】
2021525074.tif 000003
(配列番号33)を含む又はそれからなる単離された組み換えポリペプチドが提供される。
【００１８】
1つの態様において、アミノ酸配列
【化２】
2021525074.tif 000004
(配列番号1)を含む又はそれからなる単離された組み換えポリペプチドが提供される。
【００１９】
1つの態様において、アミノ酸配列
【化３】
2021525074.tif 000005
(配列番号3)を含む又はそれからなる単離された組み換えポリペプチドが提供される。
【００２０】
1つの態様において、アミノ酸配列
【化４】
2021525074.tif 000006
(配列番号34)を含む又はそれからなる単離された組み換えポリペプチドが提供される。
【００２１】
1つの態様において、配列番号3、19、20、21、22、25、27、又は28に記載のアミノ酸配列を含む又はそれからなる単離された組み換えポリペプチドが提供される。
【００２２】
1つの態様において、請求項1から17のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチドをコードする配列を含む又はそれからなるポリヌクレオチド分子が提供される。
【００２３】
1つの態様において、請求項18に記載のポリヌクレオチド分子を含むベクターが提供される。
【００２４】
1つの態様において、請求項18に記載のポリヌクレオチド分子を含む細胞が提供される。
【００２５】
1つの態様において、請求項19に記載のベクターを含む細胞が提供される。
【００２６】
1つの例において、細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、細菌細胞、又は真菌細胞である。
【００２７】
1つの態様において、請求項1から17のいずれか一項に記載の単離された組み換えポリペプチド、及び薬学的に許容される賦形剤、及び任意選択でアジュバントを含む免疫原性組成物が提供される。
【００２８】
1つの態様において、請求項23に記載の免疫原性組成物を対象に投与する工程を含む、抗体を産生する方法が提供される。
【００２９】
1つの態様において、請求項24に記載の方法によって取得される抗体又は抗原結合フラグメントが提供される。
【００３０】
1つの態様において、プリオン関連疾患若しくは障害、神経変性疾患若しくは障害、又はプロテイノパチーを有する又は有する疑いがある又は発症するリスクがある対象を治療する方法であって、請求項1から17のいずれか一項に記載の単離された組み換えポリペプチド、請求項18に記載のポリヌクレオチド分子、請求項19から22のいずれか一項に記載の細胞、請求項23に記載の免疫原性組成物、又は請求項25に記載の抗体若しくは抗原結合フラグメントを投与する工程を含む、方法が提供される。
【００３１】
1つの例において、プリオン関連疾患若しくは障害、又は神経変性疾患若しくは障害、又はプロテイノパチーは、ヒトにおけるアルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、レビー小体型認知症(LBD)、多系統萎縮症(MSA)、ハンチントン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、毛細血管拡張性運動失調症、フリードライヒ運動失調症、多発性硬化症(MS)、プリオン病、脊髄小脳失調症(SCA)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、外傷性脳損傷、海綿状脳症(TSE)、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、新変異型CJD、クールー病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、透析関連アミロイドーシス(DRA)、ヒツジ及びヤギにおけるスクレイピー、ウシにおける海綿状脳症、又はシカ科における慢性消耗性疾患(CWD)である。
【００３２】
1つの例において、対象はヒト又は動物である。
【００３３】
1つの態様において、プリオン関連疾患若しくは障害、神経変性疾患若しくは障害、又はプロテイノパチーを有する又は有する疑いがある又は発症するリスクがある対象を治療するための、請求項1から17のいずれか一項に記載の単離された組み換えポリペプチド、請求項18に記載のポリヌクレオチド分子、請求項19から22のいずれか一項に記載の細胞、請求項23に記載の免疫原性組成物、又は請求項24に記載の抗体若しくは抗原結合フラグメントの使用が提供される。
【００３４】
1つの態様において、プリオン関連疾患若しくは障害、神経変性疾患若しくは障害、又はプロテイノパチーを有する又は有する疑いがある又は発症するリスクがある対象を治療するための医薬の製造における、請求項1から17のいずれか一項に記載の単離された組み換えポリペプチド、請求項18に記載のポリヌクレオチド分子、請求項18から22のいずれか一項に記載の細胞、請求項23に記載の免疫原性組成物、又は請求項25に記載の抗体若しくは抗原結合フラグメントの使用が提供される。
【００３５】
1つの例において、プリオン関連疾患若しくは障害、又は神経変性疾患若しくは障害、又はプロテイノパチーは、ヒトにおけるアルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、レビー小体型認知症(LBD)、多系統萎縮症(MSA)、ハンチントン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、毛細血管拡張性運動失調症、フリードライヒ運動失調症、多発性硬化症(MS)、プリオン病、脊髄小脳失調症(SCA)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、外傷性脳損傷、海綿状脳症(TSE)、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、新変異型CJD、クールー病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、透析関連アミロイドーシス(DRA)、ヒツジ及びヤギにおけるスクレイピー、ウシにおける海綿状脳症、又はシカ科における慢性消耗性疾患(CWD)である。
【００３６】
1つの例において、対象はヒト又は動物である。
【００３７】
本開示の実施形態が、添付の図を参照して、単なる例としてここで記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】アルツハイマー病及びパーキンソン病に関与しているミスフォールドしたタンパク質の構造。クライオ電子顕微鏡法及び固体NMR分光法により、アミロイド-ベータペプチド(残基1〜42)によって形成されるアミロイド線維(A)、タウタンパク質のコア(B)、及びアルファ-シヌクレインのコア(C)の構造を解明することが可能となった。3つすべての場合において、ミスフォールドしたタンパク質は、正しい高次構造にある(in-register)並行したクロス-ベータ構造を採用し、あらゆる分子が正確に同じ配向で線維軸に沿ってその先行するものの上に座する。上の図は、ペプチド骨格表示での個々のアミロイド線維の横断面を示しており、一方で下の図は、線維の外部及び内部に向かってそれらの配向において交互に入れ替わる一部の側鎖を含む。(A)アミロイド-ベータペプチド(1〜42)のクライオ電子顕微鏡法構造、PDBアクセスコード:5OQV(Gremerら、2017)。(B)タウタンパク質のコアを含有する対らせん状細線維のクライオ電子顕微鏡法構造、PDBアクセスコード:5O3L(Fitzpatrickら、2017)。(C)アルファ-シヌクレインのコアの固体NMR分光法構造、PDBアクセスコード:2N0A(Tuttleら、2016)。
【図２】構造に基づく抗原/ワクチン候補を開発するために使用された足場タンパク質の構造、及び比較のための感染性プリオンタンパク質のアーキテクチャー。(A)そのアミロイド線維/プリオン状態にある真菌HET-sプリオンタンパク質(残基218〜289)のプリオンドメインの固体NMR分光法構造。PDBアクセスコード:2RNM(Wasmerら、2008)。フォールドの安定性に寄与する外側に面した残基は、スティック図として表示されている(上の行)。(B)ペクチン酸リアーゼのベータ-ソレノイド部分(残基118〜285)の結晶構造。ベータ-ソレノイドフォールドを安定化させるために操縦され得る外側に面した残基は、スティック図として示されている(上の行)。PDBアクセスコード:2PEC(Yoder&Jurnak、1995)。(C)4段のベータ-ソレノイドフォールドを含有する感染性プリオンタンパク質の全体的アーキテクチャーを描写したアニメ。接続ループについての情報はほとんど又は全く入手できないため、予測されるベータ鎖のみが示されている(Willeら、2009;Vazquez-Fernandezら、2016)。
【図３】構造に基づく抗原/ワクチン候補の設計のための(HET-s)に基づく足場の構築。真菌HET-sプリオンタンパク質のプリオンドメイン(残基218〜289)に対するコード配列を重複させることによってHET-2sを構築した(Wasmerら、2008)。重複配列を、所望の4段のベータ-ソレノイド構造にフォールドさせるために、グリシン及びアラニン残基からなる14残基のリンカー配列を付加し、イオン交換クロマトグラフィーによる精製を容易にするためにC末端に6残基のヒスチジンタグを付加した。(A)プリオン状態にある当該タンパク質の4段のベータ-ソレノイドアーキテクチャーを図解したHET-2sの予測される構造。(B)規則的なHET-sのものと区別できないアミロイド線維を形成するその能力を実証した、線維化HET-2sのネガティブ染色電子顕微鏡写真(Mizunoら、2011)。同一の寸法及び特性を有する線維に線維化する能力は、構築物が、予測されるフォールドを採用したことを証明している。(C)HET-s(218〜289)、14残基のリンカー、HET-s(227〜289)、及び6残基のヒスチジンテールからなるHET-2s構築物の一次構造。
【図４】N及びC末端におけるすべてのシグナルペプチドを含む、オジロジカ由来のプリオンタンパク質の一次構造。当該タンパク質のN末端ドメインは一般的にフォールドされておらず、一方でPrPのC末端ドメインは、凝縮したフォールドを採用する(結晶構造に基づき下線を引かれている、PDBアクセスコード4yxh(Baralら、2015))。PrPScの構造においてベータ鎖立体配置を採用すると予測される7つの残基、及び近隣のベータ-ターンを、HET-2s構築物への組み込みのために選定して(より大きな太字フォントで示されている)、第1のワクチン候補を産生した。予測されるβ鎖に関しては、1残基おきの、PrPScベータ-ソレノイドアーキテクチャーの外部に面すると予測されるもののみを選択し、一方で予測されるベータ-ターンは、2つの連続した残基によって表される。
【図５】スティックアンドボール側鎖で強調された、第1のワクチン候補に対して選択された残基を有するオジロジカPrPの構造。フォールドされていないドメインに由来する残基K_N_KH、及びアルファ-ヘリックスの一部を形成するフォールドしたドメイン由来の残基D_EDが黒で示されている。PrPの構造は、リボン図として(左)及び空間充填表示で(右)示されている。PrPの構造は、残基128〜228を網羅したオジロジカPrPの結晶構造に基づき(PDBアクセスコード4yxh(Baralら、2015))、分子動力学シミュレーションにより結晶化され得なかった分子のフォールドされていない部分(残基93〜127及び229〜233)を含むように拡張された。
【図６】オジロジカPrPを起源とする残基で置き換えられた選択アミノ酸を有するHET-2s構築物に基づく、第1のワクチン候補(14R1)の略図。HET-2sの4つのベータ-ソレノイド層が、1文字コードで表された外側に面した残基を有する単純なジグザク線として示されている(上)。PrP由来のそれぞれの残基で置き換えられたアミノ酸は、PrPに基づくアミノ酸番号付けでラベルされている。オジロジカPrPを起源とする残基を有するHET-2sの一次構造が、より背が高いフォントで表示されている(下)。
【図７】非改変HET-2s(左)及びHET-2s 14R1ワクチン候補(右)のネガティブ染色電子顕微鏡写真。両タンパク質を大腸菌(E.coli)において発現させ、C末端ヒスチジンタグを使用して精製し、インビトロで線維化した。HET-2s 14R1が、非改変HET-2sのものと区別できないアミロイド線維を形成するという事実は、HET-2s 14R1構築物が、4段のβ-ソレノイドフォールドを採用した正しい様式でフォールドすることを証明している。両構築物からの線維は、非改変HET-s(218〜289)のものと区別できない(Mizunoら、2011)。インビトロでの線維化は品質管理工程として働き、HET-2s 14R1における改変された残基が、設計されたとおりベータ鎖立体配置を採用することを示す。
【図８】紙の平面上で上から下に伸びる線維軸と垂直に積み重なった3つのHET-s分子の空間充填表現。真ん中のHET-s分子は、黒で表示される14R1アミノ酸改変を有して示されている。上及び下のHET-s分子は変化しておらず、プリオン状態にある天然HET-s(218〜289)プリオンドメインの表面を表す。PDBアクセスコード:2RNM、HET-s(218〜289)構造に対する(Wasmerら、2008)。
【図９】スティックアンドボール側鎖及び黒色として表された、14R1ワクチン候補のアミノ酸変化を有する3つのHET-s分子の構造。HET-sの構造は、リボン図として(左)及び空間充填表示で(右)示されている。HET-s 14R1改変を、プリオン状態にある天然HET-s(218〜289)プリオンドメインの構造にモデル化した。PDBアクセスコード:2RNM、HET-s(218〜289)構造に対する(Wasmerら、2008)。
【図１０】HET-2s 14R1ワクチン候補を抗原投与された指標マウスの免疫応答を定量するために使用された間接的及び競合ELISAのための実験スキーム。間接的ELISAを使用して、HET-2s 14R1抗原投与後の全体的な免疫応答を判定し、一方で競合ELISAにより、プリオンタンパク質の感染性配座異性体に対して標的にされた免疫反応の部分を定量することが可能となった。
【図１１】3回目の免疫付与ブースター後の、HET-2s 14R1ワクチン候補に対する抗原応答血清の力価測定。元の抗原の連続希釈を間接的ELISAにおいて使用して、免疫応答を定量した。
【図１２】非感染対照動物(CWD陰性)からの及びCWD感染動物(CWD陽性)からの種々の量の脳ホモジネートに対する、HET-2s 14R1免疫付与マウスからの固定量の抗血清の力価測定。Prnp-/-動物からの脳ホモジネートを用いて取得された吸光度を差し引くことによって、生データを処理した。CWD陰性サンプルに対する値は、アッセイのバックグラウンドレベルに相当し、一方でCWD陽性サンプルは、強く陽性の用量依存的シグナルを与え、抗血清がプリオンタンパク質の感染性配座異性体を特異的に認識することを示唆している。
【図１３】プリオン感染マウス、トランスジェニックマウス、又はハムスター脳から取得された粗脳ホモジネート、並びに非感染対照脳ホモジネートを試験した、モノクローナル抗体61D8(IgG)を用いて取得された競合ELISA結果。モノクローナル抗体61D8は、標準的ハイブリドーマ技術(Milsteinら、1978)を使用して14R1免疫付与マウスから作出された。一貫して、プリオン感染脳ホモジネートは、非感染対照サンプルと比較して、ELISAシグナルの明確な差(ΔOD 450nmとしてプロットされている)をもたらした。詳細には、61D8は、種々の分離株:ヒツジスクレイピー(RML)、慢性消耗性疾患(CWD)、伝染性ミンク脳症(興奮性&眠気)、及び牛海綿状脳症(BSEの3つすべての分離株:C型、L型、H型)由来のプリオンを認識した。同じ免疫付与実験から作出された他の12種のモノクローナル抗体(IgG&IgM)は、天然PrPScに対する61D8と同じ特異性を有することが見い出された。それらの元のプレート場所に基づき、他のIgGクローンを、63G4、1B1、2A4、7B6.2、及び17A7.9と指名した。同様に、IgMクローンを、M18、16D5、M63、40D4、58E6、M6、及びM63と指名した。
【図１４】患者由来の、プリオン感染した、及び非神経学的対照の脳ホモジネートから取得された粗脳ホモジネートを試験した、モノクローナル抗体61D8(IgG)を用いて取得された競合ELISA結果。一貫して、プリオン感染脳ホモジネートは、非神経学的対照サンプルと比較して、ELISAシグナルの明確な差(ΔOD 450nmとしてプロットされている)をもたらした。詳細には、61D8は、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群(GSS A117V変異)、家族性クロイツフェルト・ヤコブ病(fCJD E200K変異)、致死性家族性不眠症(コドン129MバックグラウンドでのFFI D178N変異)、孤発性クロイツフェルト・ヤコブ病(sCJD)、及び変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD、それはヒトに伝染した牛海綿状脳症である)に基づくヒト分離株由来のプリオンを認識した。
【図１５】61D8発現ハイブリドーマ細胞から調製されたcDNAから決定された、61D8抗体の一次構造。ヌクレオチド配列をそれぞれのタンパク質配列に転換し、相補性決定領域(CDR)を、重鎖及び軽鎖CDRの両方を作り上げる保存された配列に基づいて同定した。別の免疫付与マウスから独立して作出された第2のモノクローナル抗体(63G4)は、同一の一次構造を有することが見い出されたことから、エピトープの隆起、及び14R1抗原を使用した免疫応答の再現性が示された。
【図１６】61D8及び他の14R1由来抗体の精確なエピトープを判定するための、14R1抗原/ワクチン候補の復帰突然変異体。構築物のそれぞれに関して、PrPScの構造を模倣するためにもともと挿入されたアミノ酸のうちの2つを、元のHET-s配列に戻した(Wasmerら、2008)。14R1は、HET-s(218〜289)の重複型に基づくため、復帰突然変異を14R1の両半分に適用した(示されず)。構築物A〜Dを、垂直の列に沿ってアミノ酸を戻した。当分の間、構築物Aは、いかなる成功クローンももたらさず、後続の実験において試験され得なかった。構築物Bにおいて、リジン及びグルタミン酸はHET-sにおけるこれらの位置での天然の残基であるため、残基を非関連アミノ酸に変化させた。
【図１７】61D8及び他の14R1由来抗体の精確なエピトープを判定するための、14R1抗原/ワクチン候補の復帰突然変異体。構築物のそれぞれに関して、PrPScの構造を模倣するためにもともと挿入されたアミノ酸のうちの2つを、元のHET-s配列に戻した。14R1は、HET-s(218〜289)の重複型に基づくため、復帰突然変異を14R1の両半分に適用した(示されず)。構築物E〜Hを、水平の行に沿ってアミノ酸を戻した。構築物E及びFにおいて、他は14R1と元のHET-s(218〜289)との間で同一であることから、1個の残基のみを変化させた。
【図１８】14R1復帰突然変異体B〜Hのネガティブ染色電子顕微鏡写真。すべての構築物は、非改変HET-s線維と形態学的に同一の線維を形成し(Mizunoら、2011)、それは、組み換えにより産生されたタンパク質の適正なβ-ソレノイドフォールドを示すことに留意することが重要である。
【図１９】コア61D8エピトープを形成するアミノ酸を同定するための、14R1復帰突然変異体を使用したエピトープマッピング。ELISA結果は、14R1のほとんどの復帰突然変異体(B、D、F、G、及びH)が、14R1それ自体として61D8抗体によって同じようによく認識されることを示す。対照的に、復帰突然変異体「E」は61D8結合の約30倍の低下を示し、それは61D8の結合にとってのβ-アークにおけるHis残基の重要性を実証している。1段下の同等のβ-アークにおける、Hisの下のAsp残基は、「G」復帰突然変異体によって実証されるように、Gluによって置き換えられ得る。この位置における負電荷の除去(示されず)は、抗体結合を無効にし、61D8 PrPSc特異的抗体エピトープの一部としてのその役割を明らかにしている。
【図２０】61D8エピトープの主要な残基を示した、14R1ワクチン候補のモデル化された構造。3つのHET-s(218〜289)プリオンドメインがアミロイド線維に積み重なって示されており(Wasmerら、2008)、HET-s(218〜289)の重複セットを含有するHET-2s 14R1構築物の1.5分子を表す。61D8のコアエピトープを形成する残基は、黒で表示されている。
【図２１】黒で強調された61D8エピトープ残基を有するPrPScの構造のモデル。61D8エピトープの残基は、PrPSc分子の4段のβ-ソレノイドフォールドにおいて2つの積み重なったβ-ソレノイドコーナー(β-アーク)を占有する。PrPScモデルは、PrPScの構造に関するすべての入手可能な実験データを含むように独立して開発され(Spagnolliら、2018)、14R1ワクチン候補の開発につながる予測に合うことが見い出された。
【図２２】互いの上に積み重なったPrPScの4つの分子、及び黒で強調された61D8エピトープ残基を有するPrPSc線維のモデル。リボン図(左)及び空間充填表示(右)は、PrPSc線維の反復する性質を示す。61D8エピトープの残基は、PrPSc分子の4段のβ-ソレノイドフォールドにおいて2つの積み重なったβ-ソレノイドコーナー(β-アーク)を占有する。PrPScモデルは、PrPScの構造に関するすべての入手可能な実験データを含むように独立して開発され(Spagnolliら、2018)、14R1ワクチン候補の開発につながる予測に合うことが見い出された。
【図２３】HET-s(218〜289)タンパク質足場に基づく、パーキンソン病及び他のシヌクレイノパチーを標的にするワクチン候補のネガティブ染色電子顕微鏡写真。組み換えにより作出されたワクチン候補を精製し、インビトロで線維化し、典型的なHET-sアミロイド線維形態の形成についてネガティブ染色電子顕微鏡法により解析した(Mizunoら、2011)。特徴的なHET-sアミロイド線維の形成は、合理的に設計された抗原構造が予測されたとおりに形成されていることを確保する。
【図２４】それぞれ3回目又は初回の免疫付与ブースター後の、HET-s  α-SC3、α-SC6、α-SC8、及びα-SC9ワクチン候補に対する抗原応答血清の力価測定。抗血清の連続希釈を、元の抗原でコートされたプレートでの間接的ELISAにおいて使用して、免疫応答を定量した。
【図２５】3回目の免疫付与ブースター後の、HET-s AβC4ワクチン候補及び非改変HET-sに対する抗原応答血清の力価測定。抗血清の連続希釈を、元の抗原でコートされたプレートでの間接的ELISAにおいて使用して、免疫応答を定量した。HET-s AβC4抗原に対する免疫応答は、非改変HET-sに対してよりもやや強く、挿入されたAβ表面残基の免疫原的強さを示している。
【図２６】3回目の免疫付与ブースター後の、HET-sタウC4ワクチン候補及び非改変HET-sに対する抗原応答血清の力価測定。抗血清の連続希釈を、元の抗原でコートされたプレートでの間接的ELISAにおいて使用して、免疫応答を定量した。HET-sタウC4抗原に対する免疫応答は、非改変HET-sに対してよりも実質的に強く、挿入されたタウ表面残基の抗原的効率性を示している。
【図２７】ワクチン候補α-SC3及びα-SC6を用いて取得された免疫応答の特異性を試験するための競合ELISA。レビー小体型認知症(LBD)、多系統萎縮症(MSA)、及びパーキンソン病(PD)に罹患した3人の別個の患者からの脳ホモジネートを、α-SC3及びα-SC6を免疫付与されたマウスからの免疫後血清を使用して解析した。α-SC3により誘導された免疫応答は、不均一な応答をもたらし、一部のサンプルは認識され、一方で他はバックグラウンド読み取りのみを与えた。対照的に、α-SC6により誘導された免疫応答は、すべての疾患関連患者由来サンプルを認識し、α-SC6が、より普遍的に見い出されるα-シヌクレインエピトープを標的にすることを示した。α-SC3構築物は、Tuttleら、2016によって報告された構造に基づき、一方でα-SC6は、Guerrero-Ferreiraら、2018によって報告された構造に基づいたため、免疫応答の差は、候補ワクチンの設計及びそれらが基づく構造が非常に重要であることを実証している。
【図２８】ワクチン候補α-SC8及びα-SC9を用いて取得された免疫応答の特異性を試験するための競合ELISA。レビー小体型認知症(LBD)、多系統萎縮症(MSA)、及びパーキンソン病(PD)に罹患した3人の別個の患者からの脳ホモジネートを、α-SC8及びα-SC8を免疫付与されたマウスからの免疫後血清を使用して解析した。両方の場合において、ワクチン候補により誘導された免疫応答は、すべての疾患関連患者由来サンプルを認識し、抗原が、α-シヌクレインエピトープに対する免疫応答を誘導することを示した。
【図２９】円偏光二色性分光法測定は、可溶性ワクチン足場PL3並びに2つのワクチン候補PL3C1及びPL3C2が、β-シートリッチなコンフォメーションを採用することを示している。PrP由来のアミノ酸の挿入は、決して目立った形でタンパク質フォールディングに影響を及ぼさなかった。
【図３０】非感染対照動物からの及びCWD感染動物(CWD)からの種々の量の脳ホモジネートに対する、PL3C1免疫付与マウスからの固定量の抗血清の力価測定。Prnp-/-動物からの脳ホモジネートを用いて取得された吸光度を差し引くことによって、生データを処理した。非感染対照サンプルに対する値は、アッセイのバックグラウンドレベルに相当し、一方でCWD陽性サンプルは、強く陽性の用量依存的シグナルを与え、抗血清がプリオンタンパク質の感染性配座異性体を特異的に認識することを示唆している。
【図３１】β-ソレノイド構造の4段にわたり、インビトロでアミロイド線維に線維化してPrPScの構造を模倣するように設計された、3つの右巻きのβ-ソレノイドワクチン足場(3P4G-Vac;1HG8-Vac;及び2ODL-Vac)のネガティブ染色電子顕微鏡写真。更に、3P4G-Vac足場に基づく第1のワクチン候補(3P4G-C7)を、PrPScコンフォメーションにおいて露出されると予測されるPrP由来のアミノ酸を呈示するように操作した。
【図３２】ワクチン足場タンパク質:HET-2s。真菌プリオンタンパク質HET-sのプリオンドメイン(残基218〜289)を含有する重複構築物。グリシンリッチなリンカー(太字及び下線)は、2つのタンパク質半分を接続する。C末端におけるヒスチジンタグ(太字のみ)は、精製を容易にする。
【図３３】ワクチン足場タンパク質:HET-s。真菌プリオンタンパク質HET-sのプリオンドメイン(残基218〜289)。C末端におけるヒスチジンタグ(太字フォント)は、精製を容易にする。
【図３４】ワクチン候補:14R1(プリオン病)。(上)シカPrP配列:より背が高い太字フォントでのHET-2s_14R1に対する残基。(下)14R1に対する適応HET-2s配列:より背が高い太字フォントでのシカPrP由来の残基。
【図３５】ワクチン候補:AβC3(アルツハイマー病)。(上)Aβ(1〜42)配列:より背が高い太字フォントでのHET-s_AβC3に対する残基。(下)AβC3に対する適応HET-s配列:より背が高い太字フォントでのAβ(1〜42)由来の残基。
【図３６】ワクチン候補:AβC4(アルツハイマー病)。(上)Aβ(1〜42)配列:より背が高い太字フォントでのHET-s_AβC4に対する残基。(下)AβC4に対する適応HET-s配列:より背が高い太字フォントでのAβ(1〜42)由来の残基。
【図３７】ワクチン候補:タウC3(アルツハイマー病&タウオパチー)。(上)部分的タウ配列:より背が高い太字フォントでのHET-s_タウC3に対する残基。(下)タウC3に対する適応HET-s配列:より背が高い太字フォントでのタウ由来の残基。
【図３８】ワクチン候補:タウC4(アルツハイマー病&タウオパチー)。(上)部分的タウ配列:より背が高い太字フォントでのHET-s_タウC4に対する残基。(下)タウC4に対する適応HET-s配列:より背が高い太字フォントでのタウ由来の残基。
【図３９】ワクチン候補:α-SC3(パーキンソン病&シヌクレイノパチー)。(上)アルファ-シヌクレイン配列:より背が高い太字フォントでのHET-s_α-SC3に対する残基。(下)α-SC3に対する適応HET-s配列:より背が高い太字フォントでのアルファ-シヌクレイン由来の残基。
【図４０】ワクチン候補:α-SC6(パーキンソン病&シヌクレイノパチー)。(上)アルファ-シヌクレイン配列:より背が高い太字フォントでのHET-s_α-SC6に対する残基。(下)α-SC6に対する適応HET-s配列:より背が高い太字フォントでのアルファ-シヌクレイン由来の残基。
【図４１】ワクチン候補:α-SC8(パーキンソン病&シヌクレイノパチー)。(上)アルファ-シヌクレイン配列:より背が高い太字フォントでのHET-s_α-SC8に対する残基。(下)α-SC8に対する適応HET-s配列:より背が高い太字フォントでのアルファ-シヌクレイン由来の残基。
【図４２】ワクチン候補:α-SC9(パーキンソン病&シヌクレイノパチー)。(上)アルファ-シヌクレイン配列:より背が高い太字フォントでのHET-s_α-SC9に対する残基。(下)α-SC9に対する適応HET-s配列:より背が高い太字フォントでのアルファ-シヌクレイン由来の残基。
【図４３】ワクチン足場タンパク質:3P4G-Vac。(上)南極細菌マリノモナス・プリモリエンシス(Marinomonas primoryensis)由来の不凍タンパク質(PDB#:3P4G)。(下)3P4G-Vacの配列:4段の右巻きのβ-ソレノイドワクチン足場:設計された様式でタンパク質が線維化するのを可能にするために変化させた残基は、以下のように表示されている:1)精製を容易にするヒスチジンタグ:より背が高い太字フォント;2)TEV切断部位:より背が高い斜字フォント;3)塩橋の形成を通じて線維化を容易にする荷電残基:より背が高い太字の下線が引かれたフォント;4)2つのタンパク質フラグメントを接続する「SGA」ループ:より背が高いフォントのみ。
【図４４】ワクチン候補:3P4G-C7(プリオン病)。(上)シカPrP配列:より背が高い太字フォントでの3P4G-C7に対する残基。(下)3P4G-C7配列:より背が高い太字フォントでのシカPrP由来の残基。
【図４５】ワクチン足場タンパク質:PL3-Vac。ファミリー3からのペクチン酸リアーゼ配列(PDB:4Z05):右巻きのβ-ソレノイドワクチン足場として全長で使用されたタンパク質。タンパク質全体を、アミロイド線維を形成しない可溶性ワクチン足場として使用した。ワクチン候補の構造的完全性を、円偏光二色性分光法により判定した。
【図４６】ワクチン候補:PL3C1(プリオン病)。(上)シカPrP配列:より背が高い太字フォントでのPL3C1に対する残基。(下)PL3C1に対する適応PL3-Vac配列:より背が高い太字フォントでのシカPrP由来の残基。
【図４７】ワクチン候補:PL3C2(プリオン病)。(上)シカPrP配列:より背が高い太字フォントでのPL3C2に対する残基。(下)PL3C2に対する適応PL3-Vac配列:より背が高い太字フォントでのシカPrP由来の残基。
【図４８】ワクチン足場タンパク質:2ODL-Vac。(上)ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)由来のHMW1分泌ドメイン配列(PDB#:2ODL):4段の右巻きのβ-ソレノイドワクチン足場を創出するために選択された残基は、より背が高い太字フォントで示されている。(下)2ODL-Vacの配列:4段の右巻きのβ-ソレノイドワクチン足場。設計された様式でタンパク質が線維化するのを可能にするために変化させた残基は、以下のように表示されている:1)精製を容易にするヒスチジンタグ:より背が高い太字フォント;2)TEV切断部位:より背が高い斜字フォント;3)塩橋の形成を通じて線維化を容易にする荷電残基:より背が高い太字の下線が引かれたフォント;4)線維化を容易にする荷電残基の除去:背が高いフォントのみ。
【図４９】ワクチン足場タンパク質:1HG8-Vac。(上)真菌フザリウム・モニフォルメ(Fusarium moniliforme)由来のエンドポリガラクツロナーゼ配列(PDB#:1HG8):4段の右巻きのβ-ソレノイドワクチン足場を創出するために使用された残基は、より背が高い太字フォントで示されている。(下)1HG8-Vacの配列:4段の右巻きのβ-ソレノイドワクチン足場。設計された様式でタンパク質が線維化するのを可能にするために変化させた残基は、以下のように表示されている:1)精製を容易にするヒスチジンタグ:より背が高い太字フォント;2)TEV切断部位:より背が高い斜字フォント;3)塩橋の形成を通じて線維化を容易にする荷電残基:より背が高い太字の下線が引かれたフォント。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
概して、本開示は、神経学的疾患又は障害の治療に使用され得るポリペプチドを提供する。
【００４０】
多くの神経変性疾患は、特異的タンパク質凝集体の細胞内及び/又は細胞外蓄積に関連付けされ、それはプロテイノパチー誘導性神経変性又はプロテイノパチー誘導性神経変性疾患と称され得る。多くの場合、タンパク質凝集体は、脳に対して毒性効果を発揮し、疾患病態に寄与すると考えられる。
【００４１】
「プロテイノパチー」又は「プロテイノパチーの」という用語は、例えばα-シヌクレイン、β-アミロイド、及び/又はタウタンパク質であるがそれらに限定されない、1つ又は複数のタイプのタンパク質の病原性凝集及び/又は蓄積に伴う疾患、障害、及び/又は状態を指し得る。一部の実施形態において、プロテイノパチーは、タンパク質の産生、フォールディング、凝集、代謝、又は分解(例えば、オートファジー)、輸送若しくはトラフィッキング、分泌等のうちの1つ又は複数における異常によって特徴付けされる。一部の実施形態において、プロテイノパチーは神経変性疾患である。シヌクレイノパチー、タウオパチー、アミロイドパチー、TDP-43プロテイノパチー、及び他のもの等の特異的病態は、プロテイノパチーの例である。プロテイノパチーに関わる例示的なタンパク質には、パーキンソン病、レビー小体病、及び他のシヌクレイノパチーの場合におけるα-シヌクレイン;アルツハイマー病及びある特定の他の神経変性疾患の場合におけるタウ及びβ-アミロイド;筋萎縮性側索硬化症の場合におけるSOD1及びTDP-43;ハンチントン病の場合におけるハンチンチン;網膜色素変性症の場合におけるロドプシン;並びにリソソーム蓄積症に関与するタンパク質が含まれる。
【００４２】
一部の例において、プリオン関連疾患若しくは障害、神経変性疾患若しくは障害、又はプロテイノパチーを有する又は有する疑いがある又は発症するリスクがある対象を治療するための単離された組み換えポリペプチドが提供される。
【００４３】
「神経変性」という用語は、多くの神経変性疾患と関連している、ニューロンの死を含むそれ以下の、ニューロンの個々の又は集合的な構造又は機能の進行性消失を指し得る。例えば、「神経変性疾患」又は「神経変性障害」とは、それらの潜行的発生及び慢性的進行によって臨床的に特徴付けされる医学的状態を指し得る。多くの例において、脳、脊髄、又は末梢神経の特定の部分が機能的に故障し、機能不全領域のニューロンが死滅する。神経解剖学的に位置特定可能な機能障害及び「神経変性」は、識別可能な症候群又は状態と結び付き、それは理想的にははっきりと区別できるが、とはいえ臨床的実践において及び神経病理学的実践においてさえ実質的な重なりが存在する。神経変性疾患は、それらが初めに認知、動作、力、協調、感覚、又は自律神経制御に影響を及ぼすかどうかによってしばしば分類される。
【００４４】
例えば、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、及びプリオン病等の神経変性疾患は、ミスフォールドした凝集タンパク質の神経沈着によって特徴付けされる。
【００４５】
プロテイノパチー誘導性神経変性によって特徴付けされる疾患及び/又は状態の非限定的な例には、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)、アルツハイマー病(AD)、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、毛細血管拡張性運動失調症、フリードライヒ運動失調症、多発性硬化症(MS)、プリオン病、脊髄小脳失調症(SCA)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、外傷性脳損傷が含まれる。
【００４６】
「パーキンソン病」とは、個体が、以下の症状:限定されることなく、安静時振戦、歯車様固縮、動作緩徐、姿勢反射障害、L-ドーパ治療に対する良好な応答、目立った動眼神経麻痺がないこと、小脳若しくは錐体路徴候、筋萎縮、協調運動障害、及び/又は不全失語症のうちの1つ又は複数等、パーキンソン病と関連した1つ又は複数の症状を経験する任意の医学的状態を指す。
【００４７】
「レビー小体型認知症」とは、記憶、思考、動作、及び行動の変化を引き起こす医学的状態を指す。これらの変化は、典型的に、計画を立てること、決定を下すこと、及び視覚情報を理解すること(物体が空間のどこにあるのかを見ること及び解釈すること)における困難を伴う。それらは、パーキンソン病におけるものと類似している動作問題、すなわち振戦、緩慢、硬直、及び歩行/平衡問題も伴い得る。幻視、注意及び覚醒度の変動、並びに行動、人格、及び気分(鬱又は不安)の変化も記載されている。
【００４８】
「多系統萎縮症」とは、平衡障害、動作困難、協調運動不良、膀胱機能不全、睡眠障害、並びに血圧コントロール不良を引き起こす医学的状態である。
【００４９】
「筋萎縮性側索硬化症」又は「ALS」とは、上位運動ニューロン(脳における運動ニューロン)及び/又は下位運動ニューロン(脊髄における運動ニューロン)に影響を及ぼし、運動ニューロンの死をもたらす進行性神経変性疾患を指す。「ALS」という用語は、古典的ALS(下位及び上位運動ニューロンの両方に影響を及ぼす)、原発性側索硬化症(PLS、上位運動ニューロンのみに影響を及ぼす)、進行性球麻痺(PBP又は球麻痺型、嚥下、咀嚼、及び発話困難から始まるALSの型)、進行性筋萎縮症(PMA、下位運動ニューロンのみに影響を及ぼす)、及び家族性ALS(ALSの遺伝型)を含むがそれらに限定されない、当技術分野において公知のALSの分類のすべてを含む。
【００５０】
「アルツハイマー病」とは、進行性の記憶欠損、混乱、行動問題、自分自身の身の回りのことをすることができないこと、漸進的な身体的減衰、及び最終的には死によって臨床的に特徴付けされる変性脳障害を指す。組織学的には、当該疾患は、神経突起斑(主として、連合皮質、辺縁系、及び大脳基底核に見い出される)及び神経原線維変化(neurofibrillary tangle)(病変部全域にわたるニューロンの内側に見い出される)によって特徴付けされる。これらのプラークの主な構成成分は、ベータアミロイド前駆体タンパク質(βAPP又はAPP)の切断産物であるアミロイドベータペプチド(Aβ)である。APPは、大きな異所性N末端ドメイン、膜貫通ドメイン、及び小さな細胞質C末端テールを含有するI型膜貫通糖タンパク質である。もつれは、微小管関連タンパク質タウによって形成され、それは、対らせん状細線維(PHF)と呼ばれるアミロイド線維に細胞内で凝集する。
【００５１】
「ハンチントン病」とは、不随意動作、認知障害又は認知機能の消失、及び広範な行動障害等の症状によって臨床的に特徴付けされる致死性の神経学的障害を指す。ハンチントン病と関連したよく見られる運動症状には、舞踏病(不随意に身をよじる及びけいれん)、ぎこちなさ、並びに歩行する、話す(例えば、ろれつが回らない発語を呈する)、及び飲み込む能力の進行性消失が含まれる。ハンチントン病の他の症状には、知的速度、注意、及び短期記憶の消失等の認知症状、並びに/又は人格の変化、鬱、怒りやすさ、感情の爆発、及び無関心の範囲にわたり得る行動症状が含まれ得る。
【００５２】
「多発性硬化症」とは、ヒト中枢神経系(CNS)の炎症性及び脱髄性の神経変性疾患を指す。
【００５３】
「透析関連アミロイドーシス」とは、慢性腎疾患を有する患者の骨、関節周辺構造、及び内臓における、ベータ2-ミクログロブリンを含有するアミロイド線維の蓄積及び組織沈着によって特徴付けされる疾患である。ベータ2-ミクログロブリンは、通常、腎臓において糸球体濾過によって取り除かれ、その後の近位尿細管における再吸収及び異化を有する。ベータ2-ミクログロブリンのクリアランスは、低下した腎臓機能を有する患者又は透析を受けている患者において衰退し、それは血漿蓄積及び緩徐な組織沈着につながる。
【００５４】
「クロイツフェルト・ヤコブ病」(CJD)とは、変性の、一定不変に致死性の脳障害を指す。疾患の初期段階において、人々は物忘れ、行動変化、協調運動の欠如、及び視覚障害を有し得る。病気が進行するにつれて、精神的減衰が顕著になり、不随意動作、失明、四肢の衰弱、及び昏睡が生じ得る。クロイツフェルト・ヤコブ病は、孤発性、医原性、及び家族性の型、並びにCJDの変異型(vCJD)を有する。
【００５５】
プリオン病及び障害とは、海綿状変性(spongiform change)、神経細胞消失、グリオーシス、及び異常アミロイドポリペプチドの脳蓄積によって神経病理学的に特徴付けされる急速進行性で且つ治療不可能な神経変性症候群の群である。
【００５６】
「プリオン病」とは、急速進行性で、致死性で、且つ治療不可能ないくつかの脳変性障害のうちの1つを指す。これらは、ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、新変異型CJD、クールー病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、ヒツジ及びヤギにおけるスクレイピー、ウシにおける海綿状脳症(「狂牛病」としても知られる)、並びにシカ科における慢性消耗性疾患を含むがそれらに限定されない群である、伝染性海綿状脳症(TSE)であると見なされ得る。
【００５７】
他の種のプリオン病の例には、古典的な牛海綿状脳症(BSE C型)、非定型形態の牛海綿状脳症(BSE L型及びBSE H型)、ヒツジ、ヤギ、及び齧歯類におけるスクレイピー、並びにシカ科の慢性消耗性疾患が含まれる。捕獲及び野生シカ科(シカ、エルク、ムース、トナカイ、及び他の種)の慢性消耗性疾患(CWD)は、別の例又は動物プリオン病を表す。
【００５８】
プリオン病は、宿主の正常な形態のプリオンタンパク質(例えば、PrPC)の、ミスフォールドし、凝集し、感染性で、且つ病原性の形態(例えば、PrPSc)への変換を伴う根本的分子病理学を共有する。
【００５９】
「PrPC」という用語は、哺乳綱(Mammalia)の体内で天然に且つ広く発現する天然プリオンタンパク質分子を指す。その構造は高度に保存されており、疾患状態とは関連しない。
【００６０】
「PrPSc」という用語は、感染性であり、vCJD、CJD、クールー病、致死性不眠症、GSS、スクレイピー、BSE、CWD、並びに捕獲及び実験動物の他の稀なTSEを含めたTSE/プリオン病と関連すると考えられる、PrPC分子のコンフォメーション変更した形態を指す。それは、正常な細胞性PrPCと同じアミノ酸配列を有し、α-ヘリックスの一部をβ-シートに変換しており、疾患状態と関連する。
【００６１】
「PrP」という用語は、一般的にプリオンタンパク質を指す。
【００６２】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸配列」又は「核酸分子」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態にあるDNA又はRNA分子を指す。1つの例において、ポリヌクレオチドは、タンパク質又はタンパク質フラグメントをコードするDNAを含む。
【００６３】
「タンパク質」又は「ポリペプチド」という用語は、互換可能に使用され、作用、サイズ、三次元構造、又は起源を構わず、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。
【００６４】
「変異型」という用語は、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換(すなわち、縮重変異型)を有するアミノ酸配列、又は列挙された配列と60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するペプチドを指す。「保存的に改変された変異型」という用語は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異型とは、アミノ酸配列の同一の又は保存的に改変された変異型をコードするそうした核酸を指す。遺伝子コードの縮重が理由で、多数の機能的に同一の核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、及び3CUはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。故に、アラニンがコドンによって指定されるあらゆる位置において、コードされるポリペプチドを変更することなく、記載される対応するコドンのいずれかにコドンを変更し得る。そのような核酸変形は「サイレント変形」であり、保存的に改変された変形の1つの種を表す。従って、本明細書において記載されるポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変形は、記載される各ポリペプチド配列において黙示的であり、本発明の範囲内にある。
【００６５】
アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コード配列における単一アミノ酸又はごく一部のアミノ酸を変更する、付加する、又は欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列への個々の置換、欠失、又は付加は、変更により、化学的に類似したアミノ酸でのアミノ酸の置換がもたらされる場合、「保存的に改変された変異型」であることを認識するであろう。故に、例えば1、2、3、4、5、7、若しくは10個、又はそれを上回る数の変更がなされ得る。保存的に改変された変異型は、典型的に、それらが由来する非改変ポリペプチド配列と類似した生物学的活性を提供する。例えば、免疫応答の生成、基質特異性、酵素活性、又はリガンド/受容体結合は、一般的に、その天然基質に対する天然タンパク質の少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%である。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。
【００６６】
「配列同一性パーセント」又は「相同性」という用語は、配列をアラインし及び必要な場合にはギャップを導入して配列同一性最大パーセントを達成した後の、参照核酸配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸と同一である、候補配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸のパーセンテージを指す。配列同一性パーセントを判定する目的のためのアラインメントは、当技術分野における技能の範囲内にある様々なやり方で、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2等の公に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成され得る。
【００６７】
本明細書において記載される単離された組み換えポリペプチドは、免疫原性化合物及び/又は組成物として使用され得る。
【００６８】
「免疫原性の」又は「免疫原性」という用語は、免疫応答を刺激する又は引き出す物質の能力に関する。免疫原性は、例えば、物質に特異的な抗体の存在を判定することによって測定される。抗体の存在は、当技術分野において公知の方法によって、例えばELISA又はHAIアッセイを使用して検出される。
【００６９】
本明細書において使用するとき、「免疫原性ポリペプチド」とは、ポリペプチドがMHC分子に結合し、細胞傷害性Tリンパ球(「CTL」)応答、及び/又はB細胞応答(例えば、抗体産生)、及び/又は免疫原性ポリペプチドが由来する抗原に対するTヘルパーリンパ球応答等の免疫応答を誘導するであろうような、アレル特異的モチーフ、エピトープ、又は他の配列を含むポリペプチドを指す。「抗原提示」という用語は、動物の主要組織適合性複合体クラスI若しくはクラスII分子(MHC-I又はMHC-II)と、又はヒトのHLA-I及びHLA-IIと関連した、細胞の表面での抗原の発現を意味する。
【００７０】
「免疫原性組成物」とは、免疫原性ポリペプチドに対して測定可能なCTL応答を誘導する、又は免疫原性ポリペプチドに対して測定可能なB細胞応答(抗体の産生等)を誘導する、免疫原性ポリペプチド又は免疫原性ポリペプチドをコードする核酸分子若しくはベクターを含む組成物を指す。一部の例において、それは、抗原を発現させるために使用され得る(故に、ポリペプチドに対する免疫応答を引き出すために使用される)核酸等、抗原をコードする単離された核酸を指し得る。インビトロ使用のために、免疫原性組成物は、ポリペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含み得る又はそれからなり得る。インビボ使用のために、免疫原性組成物は、典型的に、薬学的に許容される担体中にポリペプチド又はポリヌクレオチド分子を含むと考えられ、アジュバント等の他の作用物質も含み得る。
【００７１】
ポリペプチド又はポリヌクレオチド等の「単離された」生物学的成分は、他の染色体及び染色体外DNA、RNA、及びタンパク質等の、成分が天然に存在する他の生物学的成分等、他の生物学的成分から実質的に分離され得る又は精製され得る。「単離されて」いるタンパク質、ペプチド、及び核酸には、標準的精製法によって精製されたタンパク質が含まれる。当該用語は、宿主細胞における組み換え発現によって調製されたタンパク質又はペプチド、並びに化学的に合成されたタンパク質、ペプチド、及び核酸分子も包含する。単離されたとは、絶対的な純度を要求するわけではなく、少なくとも75%、80%、90%、95%、98%、99%、又は更に99.9%の純度等、少なくとも50%純粋であるタンパク質、ペプチド、又は核酸分子を含み得る。
【００７２】
「抗体」という用語は、分析物(抗原)、その抗原性フラグメント、又は抗原の二量体若しくは多量体に特異的に結合し及び認識する免疫グロブリン、抗原結合フラグメント、又はその誘導体を指す。「抗体」という用語は、本明細書において最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び抗体フラグメントを含むがそれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
【００７３】
抗体の非限定的な例には、抗原に対する結合アフィニティーを保持する、例えば当技術分野において公知の無傷免疫グロブリン並びにその変異型及びフラグメントが含まれる。抗体フラグメントの例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;ダイアボディ;線状抗体;一本鎖抗体分子(例えば、scFv);及び抗体フラグメントから形成された多特異性抗体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。抗体フラグメントには、抗体全体の改変によって産生された抗原結合フラグメント、又は組み換えDNA方法論を使用してデノボで合成されたものが含まれる。
【００７４】
「モノクローナル抗体」という用語は、Bリンパ球の単一クローンによって、又は単一抗体の軽鎖及び重鎖をコードする核酸をトランスフェクトされている細胞若しくはその子孫によって産生された抗体を指す。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって、例えば骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞との融合によりハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって産生される。これらの融合細胞及びそれらの子孫は、「ハイブリドーマ」と称される。一部の例において、モノクローナル抗体は、対象から単離される。モノクローナル抗体は、抗原結合又は他の免疫グロブリン機能に対する影響を実質的に有しない保存的アミノ酸置換を有し得る。
【００７５】
「抗原」という用語は、動物に注射される又は吸収される組成物を含めた、動物における抗体の産生又はT細胞応答を刺激し得る化合物、組成物、又は物質を指す。抗原は、本明細書において開示されるもの等、異種の又は合成された抗原によって誘導されるものを含めた、特異的な液性又は細胞性免疫の産物と反応する。抗原は、1つ又は複数のエピトープを含み得る。
【００７６】
「中和抗体」とは、感染性因子上の特異的抗原に結合することによって、感染性因子の感染力価を低下させる抗体を指す。一部の例において、感染性因子はウイルスである。一部の例において、抗体は、HAに特異的であり、インフルエンザウイルスの感染力価を中和する。「広域中和抗体」とは、抗原の抗原性表面と少なくとも65%、75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を共有する抗原等の関連抗原に結合し及びその機能を阻害する抗体である。ウイルス等の病原体由来の抗原に関して、抗体は、病原体の1つを上回る数のクラス及び/又はサブクラス由来の抗原に結合し得及びその機能を阻害し得る。
【００７７】
「エピトープ」という用語は、抗原決定基を指す。これらは、抗原性である、分子上の特定の化学基又はペプチド配列であり、それによりそれらは特異的免疫応答を引き出し、例えばエピトープは、B及び/又はT細胞が応答する抗原の領域である。
【００７８】
「キメラポリヌクレオチド」又は「組み換えポリヌクレオチド」とは、種において天然には通常見い出されないポリヌクレオチドを指す。
【００７９】
「核酸構築物」又は「ベクター」とは、外因性DNAを宿主細胞に送達するために使用され得るポリヌクレオチド分子を指す。ベクターは、例えば選択可能なマーカー、マルチクローニングサイト等、分子クローニングにおけるそれらの使用を容易にする遺伝要素を更に含み得る。
【００８０】
細胞又は生物の文脈において本明細書において使用される「導入すること」という用語は、核酸分子が細胞の内部にアクセスするような様式で核酸分子を生物及び/又は細胞に提示することを指す。1つを上回る数の核酸分子が導入されるべきである場合、これらの核酸分子は、単一のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物の一部として、又は別個のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物として組み立てられ得、同じ又は異なる核酸構築物に位置付けられ得る。従って、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換事象で又は別個の形質転換事象で細胞に導入され得る。
【００８１】
故に、本明細書において使用される「形質転換」という用語は、細胞内への異種核酸の導入を指す。細胞の形質転換は、安定的又は一過性であり得る。
【００８２】
ポリヌクレオチドの文脈において本明細書において使用される「一過性の形質転換」という用語は、細胞に導入され得、細胞のゲノムに組み入れられないポリヌクレオチドを指す。
【００８３】
細胞に導入されるポリヌクレオチドの文脈において本明細書において使用される「安定に導入すること」又は「安定に導入された」という用語は、細胞のゲノムに安定に組み入れられ得るポリヌクレオチドを指し、故に細胞はポリヌクレオチドで安定に形質転換される。
【００８４】
本明細書において使用するとき、「接触すること」という用語は、例えば化合物を細胞に送達し得る過程を指す。化合物は、細胞内への直接導入(すなわち、細胞内に)、及び/又は空洞、間質空間への、若しくは生物の循環内への細胞外導入を含むがそれらに限定されないいくつかのやり方で投与され得る。
【００８５】
「細胞」又は「宿主細胞」とは、任意の組み換えベクター、単離されたポリヌクレオチド、又はポリペプチドのレシピエントであり得る又はレシピエントになっている個々の細胞又は細胞培養物を指す。宿主細胞には単一宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然の、偶然の、又は故意の変異及び/又は変化に起因して、必ずしも元の親細胞と(形態学において又は全DNA相補体において)完全に同一でなくてもよい。宿主細胞には、本発明の組み換えベクター又はポリヌクレオチドをインビボ又はインビトロでトランスフェクトされた又は感染した細胞が含まれる。本発明の組み換えベクターを含む宿主細胞は、組み換え宿主細胞である。
【００８６】
本明細書において使用される「対象」という用語は、動物を指し、例えば、ネコ、イヌ等の飼い慣らされた動物、家畜(例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等)、実験動物(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット等)、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、霊長類、非ヒト霊長類、齧歯類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び他の任意の動物を含み得る。具体的な例において、対象はヒトである。
【００８７】
本明細書において使用される「治療」、「治療する」、又は「治療すること」という用語は、臨床結果を含めた、有益な又は所望の結果を取得することを指す。有益な又は所望の臨床結果には、検出可能か又は検出不能かどうかにかかわらず、1つ又は複数の症状又は状態の軽減又は改善、疾患の程度の縮小、疾患の安定した(すなわち、悪化していない)状態、疾患の広がりを阻止すること、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、疾患の再発の縮小、及び完解(部分的又は全体的かどうかにかかわらず)が含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。「治療すること」及び「治療」は、治療を受けない場合の予想される生存と比較して、生存を引き延ばすことも意味し得る。
【００８８】
本明細書において使用される「改善」又は「改善する」という用語は、異常又は症状を含めた、状態、疾患、障害、又は表現型の減少、低下、又は排除を指す。
【００８９】
疾患又は障害(例えば、癌)の「症状」という用語は、対象によって経験される、任意の病的現象、又は構造、機能、若しくは感覚における正常からの逸脱であり、疾患を指し示す。
【００９０】
本明細書において使用される「治療レジメン」とは、第2の薬物の付加の有無にかかわらず、投薬量、投与の頻度、又は治療の継続期間の組み合わせを指す。
【００９１】
例えば、癌を有する対象を治療して進行を阻止し得る、或いは完解状態にある対象を、本明細書において記載される化合物又は組成物で治療して再発を阻止し得る。
【００９２】
別の例において、癌を有する対象を治療して、治療の結果により又は結果として、患者の、細胞応答若しくは生物学的応答、完全奏効、部分奏効、安定(stable disease)(進行又は再燃なし)、又は後の再燃を有する奏効を提供し得る。
【００９３】
本明細書において使用するとき、「治療上有効な量」という用語は、疾患又は障害を阻止する、改善する、又は治療するために有効である量を指す。
【００９４】
本明細書において使用するとき、「アジュバント」とは、抗原性を増強するために使用されるビヒクルを意味する。一部の実施形態において、アジュバントには、抗原が吸収される鉱物(ミョウバン、水酸化アルミニウム、又はホスフェート)の懸濁液;又は、例えば抗原溶液が鉱油中に乳化されている(フロイント不完全アジュバント)、抗原性を更に増強する(抗原の分解を阻害し及び/又はマクロファージの流入を引き起こす)ための殺傷マイコバクテリウムの内包を有することもある(フロイント完全アジュバント)、油中水型エマルションが含まれ得る。
【００９５】
本明細書において使用するとき、「投与」という用語は、選定された経路による対象への組成物の導入を指す。投与は局所的又は全身性であり得る。例えば、選定された経路が静脈内である場合、組成物(開示される免疫原を含む組成物等)は、対象の静脈に組成物を導入することによって投与される。例示的な投与の経路には、経口、注射(皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、及び静脈内等)、舌下、直腸、経皮(例えば、局部的)、鼻腔内、膣内、及び吸入経路が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００９６】
化合物又は組成物は、単独で、又は治療される対象となる状態に応じて、同時に又は逐次的に他の治療と組み合わせて投与され得る。
【００９７】
本明細書において開示される化合物及び/又は化合物を含む組成物は、当業者に公知であろうように、付加的な/代替的な治療又は治療レジームと組み合わせて、本明細書において記載される方法において使用され得る。
【００９８】
本発明の方法は、そのような方法において使用される化合物及び/又は組成物をキットの形態で提供することによって、好都合に実践される。そのようなキットは、好ましくは組成物を含有する。そのようなキットは、好ましくはその使用のための取扱説明書を含有する。
【００９９】
本明細書において記載される本発明のよりよい理解を得るために、以下の実施例が示される。これらの実施例は単なる例示目的のためのものであることが理解されるべきである。それ故、それらは本発明の範囲を決して限定しないはずである。
【実施例】
【０１００】
PrPScの構造:
ここで、本発明者らは、PrPSc、そのタンパク質分解により切り取られた変異型(PrP27〜30)、及び関連分子種の構造について知られていることに関する短い概説を提供し、より詳細な情報に関しては(Wille&Requena、2018)を参照されたい。フーリエ変換遠赤外(FTIR)分光法は、N末端を切り取られたPrP27〜30が圧倒的にβ構造を含有するという最初の実験的証拠を提供した(Caugheyら、1991;Panら、1993)。PrP27〜30及び106個の残基のみの操作された変異型PrPSc106の2D結晶に関する電子線結晶学解析は、感染性配座異性体の主要な特質としてのβ-ソレノイドフォールドの存在を示唆した(Willeら、2002;Govaertsら、2004)。その後、X線繊維回析は、アミロイド線維におけるPrP27〜30の分子の高さが、4本のβ鎖の高さに相当する19.2Åであることを決定した(19.2Å=4×4.8Å)(Willeら、2009)。加えて、回析データは、PrP27〜30のコアが、4つの積み重なったβ-ラングからなるβ-ソレノイドフォールドを採用することを裏付けた。19.2Åの反復単位サイズは、PrPSc106アミロイド線維から取得された回析パターンにおいても見い出された(Wanら、2015)。近年、クライオEM及び後続の3次元(3D)再構築は、PrP27〜30アミロイド線維が、2本の絡み合ったプロトフィラメントによって形成され得ることを実証した。更に、クライオEM解析は、PrP27〜30の構造が4段のβ-ソレノイドからなることを確証した(Vazquez-Fernandezら、2016)。
【０１０１】
PrPScは、短いターン及びループによって接続される個々のβ鎖を有して、水がアクセスできないと推測されるβ-シートコアを有し(Smirnovasら、2011)、とはいえ、どの残基が各β鎖にあるのか、及びどれがβ-ソレノイドコアに対して外に又は内に面しているのかは依然として不明である(Silvaら、2015;Wille&Requena、2018)。PrP27〜30から取得されたプロテイナーゼK抵抗性フラグメントの質量分析に基づいて提案されたモデルは、どのアミノ酸がβ鎖又は接続ループに位置付けられ得るかを示唆した(Vazquez-Fernandezら、2012;Silvaら、2015)。実験データと計算技法とを組み合わせることによって、4段のベータ-ソレノイドアーキテクチャーに基づくPrPScの最初の物理的に妥当と思われる原子分解モデルが築かれた(Spagnolliら、2018)。PrPScの構造は、変性及び除染に対する抵抗性を提供する高度の安定性を有するが、この安定性に寄与する因子のすべてが十分に理解されているわけではない。β-シートの上下を走る高度に秩序化された水素結合が、PrPScβ-ソレノイドフォールドの構造及び安定性に必須であることは明らかである(Smirnovasら、2011)。しかしながら、ファンデルワールス力、疎水性相互作用及び静電相互作用、並びに芳香族側鎖の積み重なりもその安定性に寄与している、なぜならそれは、他のアミロイド(Tsemekhmanら、2007)及びβ-ソレノイドタンパク質(Kobe&Kajava、2000)において実証されているためである。
【０１０２】
HET-sプリオンドメインの構造:
HET-sは、糸状真菌ポドスポラ・アンセリナ(Podospora anserina)の公知の機能的プリオンであり、それは、種々の接合型の間のヘテロカリオン不和合性を調節することに関与する(Coustouら、1997;Wickner、1997)。HET-sのプリオンドメイン(HET-s(218〜289))はアミロイド線維を形成し得、それは過程においてプロテアーゼ抵抗性になる(Dos Reisら、2002)。ssNMRによって解明されているその構造は、左巻きの2段のβ-ソレノイドからなる(図1B)(Wasmerら、2008;van Melckebekeら、2010)。β-ソレノイドラングは、15個の残基の柔軟性のあるループによって接続される(Ritterら、2005)。分子あたり8本のβ鎖があり、各β-ソレノイドラングは、短いループによって接続された4本のβ鎖を有する。第1の2本のβ鎖は、短い2残基のβ-アークによって接続され、ペプチド骨格の配向を約90°変化させており;第2及び第3のβ鎖は、3残基のβ-アークによって接続され、配向を約150°変化させており;最後に、第3及び第4のβ鎖は、単一のグリシン残基によって接続される(Wasmerら、2008)。
【０１０３】
HET-s(218〜289)は、各β-ソレノイドラングの第1の3本のβ鎖によって形成される三角形の疎水性コアを有し、それは、2個の埋もれた極性アミノ酸(T233及びS273)、並びにN226/N262及びN243/N279からなる2つのアスパラギンラダーも含む(Wasmerら、2008)。第4のβ鎖は、β-ソレノイドコアから離れて向いており、β-ソレノイド構造の第1及び第2のラングを接続するループの一部を形成する。第2のβ-ソレノイドラングのβ鎖は、第1のラングのβ鎖の上に積み重なり、4本の分子内β-シートを形成する。これらのβ-シートは、分子間水素結合/β-シート接触を通じて、隣のHET-s(218〜289)分子のβ鎖と接続し得る(Wasmerら、2008)。HET-s(218〜289)は、β-ソレノイド構造の表面に露出される極性及び荷電アミノ酸を含有し、そこでは第1のβ-ラング由来の残基K229、E234、及びR236と第2のβ-ラング由来の残基E265、K270、及びE272との間に3つの塩橋が形成される(van Melckebekeら、2010)。HET-s(1〜227)N末端ドメインは、9本のα-ヘリックス及び2本の短いβ鎖からなる(Balguerieら、2003;Greenwaldら、2010)。全体として、HET-s(218〜289)は、Q/Nリッチである酵母プリオンとは非常に異なるアミノ酸組成を有する(Liebman&Chernoff、2012)。
【０１０４】
ssNMRによる特徴付けに加えて、HET-s(218〜289)は、クライオEM(Mizunoら、2011)及びX線繊維回析(Wanら、2012;Wan&Stubbs、2014)によっても解析されている。後者の調査において、約4.8Å及び約9.6Åでの子午線反射は、HET-s(218〜289)が、PrPScの構造との明らかな類似性を有する2段のβ-ソレノイド構造を採用することを裏付けた(Willeら、2009;Wanら、2012)。
【０１０５】
一般的なβ-ソレノイドフォールドの特徴付け:
β-ソレノイドタンパク質は、ほぼ規則的な「ソレノイド巻線」にフォールドするポリペプチド鎖によって特徴付けされ、一方で標準β-ヘリックスタンパク質は、よりストリンジェントなヘリックス形状に従う(Kajava&Steven、2006a)。β-ソレノイドタンパク質は、3個〜100個をはるかに上回るβ-ラングを含有する(Kajava&Steven、2006b)。各β-ラングは2〜4本のβ鎖を含有し、それらは、急なターン、β-アーク(2〜6個の残基)、又はより長いループによって接続される。全体として、β-ラングは、12〜30個のアミノ酸の長さを有する。β-ラングは、隣のβ-ラングが4.8±0.2Åの軸方向上昇から始まる場所までの、アミノ酸骨格の完全なターンに相当する(Kajava&Steven、2006a;Kajavaら、2010)。β-ソレノイド構造を形成するβ-ラングは、水素結合によって上下のβ-ラングに接続され、表面に溶媒に曝露される側鎖を有する疎水性コアを形成する(Kajava&Steven、2006a;Hennetinら、2006)。β-ソレノイドタンパク質の独特の特質は、後続のβ-ラングにおける同じ位置での同一残基の積み重なりである(Jenkins&Pickersgill、2001;Kajava&Steven、2006a)。そのような「ラダー」は、通常、極性残基から構成され、アスパラギンが最も一般的であり、その後にセリン及びトレオニンが続くが、芳香族残基も、芳香族積み重なりによって安定化される別個のラダーを形成し得る(Yoderら、1993;Henrissatら、1995;Kajava&Steven、2006a;Hennetinら、2006)。
【０１０６】
β-ソレノイドタンパク質は、ポリペプチド鎖が軸に巻き付く方向に応じて、右巻き又は左巻きのポリマーに分類され得る(Kobe&Kajava、2000)。加えて、β-ソレノイドタンパク質は、個々のβ-ラング間の角度補正によって決定されるねじれを呈示し得る(Yoderら、1993;Kobe&Kajava、2000)。β-ソレノイド横断面の形は、各β鎖を接続するβ-アークによって規定され、最も頻度の高い形は一般的に三角形、長方形、又は楕円形である(Kajava&Steven、2006a)。個々のβ鎖を接続する短いβ-アークは、主に、非極性及び非荷電極性残基によって形成されるが(Kajavaら、2010)、より長いループも後続のβ-ラングを接続し得、一方でβ-ソレノイドの全体的な形を保持する。最後に、β-ソレノイドタンパク質のN及びC末端は、一般的に、重合を阻害するキャップを有し、それは極性及び荷電アミノ酸を含有し、疎水性コアを溶媒曝露から守る(Bryanら、2011;Kondoら、2012)。
【０１０７】
β-ヘリックス又はβ-ソレノイド構造における個々のβ鎖を接続するβ-アークは(Kajavaら、2010)、より従来的なβ-ターンと構造的に類似しており、それは伝統的に4個のアミノ酸を含有し、ペプチド鎖の180°ターンをもたらす。HET-s(218〜289)プリオンドメイン及び他のβ-ソレノイドタンパク質におけるβ-アークは、1個のみ〜3個のアミノ酸を含有することが多く、ターンを90°〜150°生じさせる(Wasmerら、2008)。これらのターンの構造的制約は極めて詳細に記載されており、結合角及び距離は十分に特徴付けされている(Iengarら、2006;de Brevern、2016)。
【０１０８】
タンパク質フォールディング病に対する、構造に基づく合理的に設計されたワクチン候補:
プリオン病、アルツハイマー病、及びパーキンソン病等の疾患、並びに関連疾患に関与しており、疾患関連コンフォメーションを採用する抗原を要求する、ミスフォールドしたタンパク質コンフォメーションを標的にするワクチン又は抗原(1つの例において、予防的ワクチン)が本明細書において記載される。これまで、調査中のワクチン候補のいずれも、構造に基づく合理的に設計されたエピトープを使用して、疾患を引き起こすタンパク質コンフォメーションに特異的な免疫応答を引き出すようには設計されていなかった。
【０１０９】
慢性消耗性疾患及び他のプリオン病の感染性プリオンタンパク質を標的にするワクチン候補:
慢性消耗性疾患(CWD)プリオンは、経口感染経路によってシカ科の間で広がっており、他のプリオン病も、十分に確立された感染の経路として経口感染を実証している。この末梢感染様態は、ワクチン接種による潜在的介入に対して、CWD、他のプリオン病を開放した(Hedlinら、2012;Mabbott、2015)。CWDワクチンの開発は、PrPの組み換えの又は化学的に合成された形態に依存する多数の調査において試みられている。細胞性プリオンタンパク質(PrPC)は神経系全体にわたって存在するため、この自己抗原に対して良好な免疫応答を取得することは困難であった。更には、これらのワクチン候補は、プリオンタンパク質の短いペプチド又は非感染性形態に基づくため、それらは、せいぜいCWDに対する限定された防御を提供する程度であった(Pilonら、2013;Goniら、2015;Thuermer、2015)。本発明者らがPrPScの構造に関して得た洞察を使用することによって(Wille&Requena、2018)、本発明者らは、本発明者らの知識を、CWDプリオンに対するより良好な防御を提供し得るより特異的なワクチン候補に転換した。
【０１１０】
PrPScの構造はβ-ソレノイド構造に基づくため、本発明者らは、Het-s、不凍タンパク質、HMW付着因子、エンドポリガラクツロナーゼ、及びそれに由来する構築物等、β-ソレノイドフォールドを天然に採用するタンパク質を使用した。選定されたタンパク質は、PrPとの配列相同性又は進化的関係性を有せず、それは、それらが感染性でもなく(β-ソレノイド構造を有するにもかかわらず)、それらが哺乳動物において自己抗原としても作用しないことを意味する。β-ソレノイド構造は左巻き及び右巻きの多様性があり、それはPrPScの構造にも適用される。現在のところ、本発明者らは、PrPScの構造が左巻き又は右巻きのフォールドに基づくかどうか分からない。それ故、本発明者らは、左巻き及び右巻きの足場タンパク質の両方を使用して、本発明者らのワクチン候補を設計した。その有益な特性に基づき、本発明者らは、真菌Het-sタンパク質の左巻きの4段のβ-ソレノイド変異型(「Het-2s」と称される)、及び3つの新たな右巻きの4段のβ-ソレノイド(「3P4G-Vac、2ODL-Vac、1HG8-Vac」と称される)を創出し、組み換え発現及び精製システムを確立し、それをβ-ソレノイド構造にフォールドするそれらの能力を検証した。
【０１１１】
左巻き及び右巻きのβ-ソレノイド構築物の両方に関して、本発明者らは、それらの側鎖をβ-ソレノイドフォールドの内部に突出させる残基を、それらがβ-ソレノイド構造のコアを安定化させるのに必須であるため保持した。それらの側鎖を外部に向けて突出させる残基は、β-ソレノイドフォールドの安定性に対するそれらの効果が限定されているため、より自由に変化され得る(Choiら、2008&2009;Daskalovら、2014;Wan&Stubbs、2014)。偶然にも、これら外部に面する残基は、免疫系によって認識される表面をそれらが構成することから、これらの分子の抗原性プロファイルを決定する残基でもある。それ故、本発明者らは、β-ソレノイドフォールドの1つの表面を構成するβ鎖内の1残基おきのみを標的にした/変異させた。β-ソレノイドフォールドのコーナーは、1〜3個のアミノ酸を含むβ-アーク(Iengarら、2006;Wasmerら、2008;de Brevern、2016)、又は適正なβ鎖を形成し得ない一続きの配列を調整し得るより長いループ(Choiら、2008&2009)として規定される。これらのβ-アーク及びループは、左巻き及び右巻きのβ-ソレノイドフォールドの両方に関して観察されており(Choiら、2008&2009)、PrPScにも拡張されると推測される(Silvaら、2015;Spagnolliら、2018)。それ故、本発明者らは、これらのコーナー(β-アーク)におけるPrPに基づく配列モチーフを標的β鎖に近接してより自由に挿入することができ、標的足場分子において充分に大きなPrPSc特異的エピトープ/表面を創出する可能性が増加した。
【０１１２】
ワクチン候補を創出するために必要な変化は、足場タンパク質の配列への多くの同時変化を要求した。これらの大規模な変化を達成する最も経済的な方法は、遺伝子フラグメントを交換して、個々のβ鎖及び近接するコーナー又はβ-アーク(必要に応じて)を改変することによるものであった。例えばgBlocks(Integrated DNA Technologies社;IDT)又は合成遺伝子(Bio Basic社)を使用することによって、足場タンパク質の配列にそれらの変化を生じさせることが簡潔であった。β-ソレノイドタンパク質のモジュール組み立てにより、本発明者らは、異なるラング設計間での並べ替えを創出することが可能となり、それは、個々のワクチン候補を構築する過程を加速させるであろう。
【０１１３】
これらの構築物のそれぞれに関して、本発明者らは、大腸菌において当該タンパク質を発現させ、N又はC末端に位置するHisタグに基づいて、その変性又は天然状態で組み換えタンパク質を精製した。純粋なタンパク質をインビトロでリフォールドさせ、それは線維形成を誘導した。線維化をネガティブ染色電子顕微鏡法によってチェックし、豊富なアミロイド線維の存在はリフォールディングの成功を示した。インビトロで線維化することができたワクチン候補のみを、Prnp-/-及び野生型マウスにおいてスクリーニングした、なぜならこれらの構築物のみが、設計されたとおりに、それらの指定されるフォールドを採用することができ、新たに創出されたエピトープ/表面模倣体を露出させるためであった。PL3に基づく構築物を、それらの構造が、円偏光二色性によって検出される天然構造を採用した場合に、Prnp-/-及び野生型マウスにおいてスクリーニングした。
【０１１４】
他の神経変性疾患に対する、疾患を引き起こすタンパク質配座異性体を標的にするワクチン候補:
固体NMR分光法(ssNMR)(Tuttleら、2016)及びクライオEM(Waltiら、2016;Fitzpatrickら、2017;Gremerら、2017;Guerrero-Ferreiraら、2018;Liら、2018a;Liら、2018b)によって近年解明されている、アルツハイマー病及びパーキンソン病等の疾患を引き起こすことが知られる病原性アミロイド(例えば、Aβ(1〜42)線維、タウPHF、及びα-シヌクレイン線維)の構造についての近年の洞察により、構造に基づく合理的に設計されたワクチン候補の開発に対して新規な標的が提供される。並行した正しい高次構造にあるこれら高分解能構造は、疾患を引き起こす/疾患関連の配座異性体の特異的表面エピトープを規定するのに役立つ。PrPScを標的にするワクチン候補を開発するために考案された手法(上記を参照されたい)も採用して、これらの他のタンパク質の疾患を引き起こす配座異性体を模倣するワクチン候補を創出した。
【０１１５】
疾患特異的エピトープに対する無害な担体としてのβ-ソレノイド構造化足場タンパク質の合理的設計:
真菌HET-s(218〜289)プリオンドメイン等、アミロイド線維に線維化する天然の傾向を有するタンパク質は、エピトープ担体として使用することが容易である。このタンパク質/タンパク質ドメインは、β-ソレノイド状態にある場合に重合体構造を採用しやすいことから、線維化を誘導するために更なる改変を必要としない。個々の及び不連続のアミノ酸変化を加えて、表面に面した残基を他のタンパク質の疾患特異的状態に対する模倣体に変換し得る。β-ソレノイドフォールドは、全般的な荷電平衡及び立体適合性が維持される限り、多くのアミノ酸置換を許容する。β-ソレノイドフォールドの内部に面する残基に対しては、適正にフォールドした抗原が使用される場合、これらの残基は免疫系には見えないであろうことから、変化は必要でない。更には、天然において圧倒的に疎水性であるこれらの残基は、β-ソレノイドフォールドの安定性を維持するために必要である。適正なβ-ソレノイド構造を維持することは、抗原の構造特異性を達成することへの前提条件である。
【０１１６】
通常の条件下ではアミロイド線維を形成しないβ-ソレノイド構造化タンパク質を、一連の標的アミノ酸変化を通じてこの四次構造に重合するように改変し得る(Peraltaら、2015)。最も容易な手法は、β-ソレノイド構造化タンパク質からいくつかのβ-ソレノイドラングを選択し(最低2つは必要とされる)、個々のタンパク質分子間の指向性引力を誘導する、N及びC末端近くに構造的に標的にされる塩橋を付加することである。個々のタンパク質単量体の向かい合った積み重なりを容易にする完全なβ-ソレノイドラングを選択することが望ましい。次いで、タンパク質分子の直接的積み重なりは、近接するβ鎖間での分子間水素結合形成を可能にし、それによって、線維軸に沿って連続的β-ソレノイド構造を安定化させる(Peraltaら、2015)。例えばネガティブ染色電子顕微鏡法により、アミロイド線維の形成が証明され次第、上で記載されるように、所望の表面残基を導入することが簡潔である。
【０１１７】
材料&方法:
4段の左巻きのβ-ソレノイドワクチン足場の構築-HET-2s:
HET-2sを構築するために使用された基本タンパク質は、糸状真菌ポドスポラ・アンセリナ由来の真菌プリオンタンパク質HET-sである。12個のグリシン及び2個のアラニンからなるリンカー配列を使用して、HET-sのアミノ酸残基218〜289の2つのコピーを接続し、左巻きの4段のβ-ソレノイドタンパク質足場をもたらした。リンカー配列の長さは可変であり得るが、好ましくは長さが10〜16個のアミノ酸であり得る。アミノ酸配列を、組み換え大腸菌(Escherichia coli(E.coli))タンパク質発現のためにコドン最適化し、必要な遺伝子フラグメントをg-Blocksとして注文し(IDT社、Coralville、IA)、NotI/XhoI制限部位を介してpET-17bベクター(EMD Millipore社、Billerica、MA)にクローニングする前に、PCRにより増幅した。結果として生じたDNA配列を、サンガーシーケンシングにより検証した(アルバータ大学、分子生物学サービスユニット(Molecular Biology Service Unit))。足場タンパク質は、分子量が約16.3〜約15.9kDaに及ぶ。
【０１１８】
4段の右巻きのβ-ソレノイドワクチン足場の構築-β-ソレノイドタンパク質:
4段の右巻きのβ-ソレノイドタンパク質足場を創出するためのすべての構築物を、UCSF ChimeraXソフトウェアを使用して設計し、任意の既存のキャッピングモチーフをRaptorXソフトウェアを使用して予測して(Bryanら、2011;Peng及びXu、2011)、凝集体の形成を増強した(Bryanら、2011)。6つの異なるタンパク質の4段のβ-ソレノイド部分を選択した(ペンタペプチドリピートタンパク質AlbG、ペクチン酸リアーゼ3、細胞骨格バクトフィリンBacA、Ca2+依存性ベータ-ヘリックス不凍タンパク質、HMW付着因子、ポリ(ベータ-D-マンヌロネート)C5エピメラーゼ4、及びエンドポリガラクツロナーゼ)。その後、点変異を導入して、塩橋を形成して、タンパク質単量体間の並びに単量体のN及びC末端間の界面を安定化させた。タバコエッチウイルス(TEV)切断部位を6×Hisタグの後に導入して、その除去を容易にし、N及びC末端間での塩橋の形成を可能にした。コード配列を、大腸菌におけるそれらの発現のために最適化し、pET-28b(+)発現ベクター(Novagen社、Germany)へのクローニングのためにBamHI/HindIII制限部位を使用し、pET-21a(+)発現ベクター(Novagen社、Germany)へのクローニングのためにNdeI/BamHI制限部位を使用した。これら6つの選定されたタンパク質のうち、3つはインビトロでアミロイド線維を形成することができ(Ca2+依存性ベータ-ヘリックス不凍タンパク質、HMW付着因子、及びエンドポリガラクツロナーゼ)、故に、3P4G-C7を用いて実証されるように、構造に基づくワクチンを開発する基礎として、3つの異なる4段の右巻きのβ-ソレノイドワクチン足場(3P4G-Vac、2ODL-Vac、及び1HG8-Vac)が本発明者らに提供された。
【０１１９】
β-ソレノイドワクチン足場3P4G-Vac、2ODL-Vac、及び1HG8-Vacの構築
UCSF ChimeraXソフトウェアを使用して、南極細菌マリノモナス・プリモリエンシス由来の不凍タンパク質(PDB#:3P4G)からβ-ソレノイド構造の4つのラングを選択した。伸長したループを除去して、フォールドしたタンパク質をきつく締め、短い3アミノ酸の柔軟性のあるリンカー(SGA)で置き換えた。更に、2個の荷電残基をN末端に挿入し及び別の荷電残基をC末端に挿入して、2つの塩橋を創出して、結果として生じたβ-ソレノイド足場タンパク質の重合を誘導した(Peraltaら、2015)。結果として生じた右巻きのβ-ソレノイドワクチン足場を3P4G-Vacと命名した。
【０１２０】
2つのループ配列を除去して、より締まったタンパク質構造を創出したという点を除いて、ヘモフィルス・インフルエンザ由来のHMW1分泌ドメイン(PDB#:2ODL)に対して同じ手法を使用した。更には、1個の荷電残基をN及びC末端それぞれに挿入して、2つの塩橋を創出した。電荷反発を阻止するために、C末端における1個の荷電残基を非荷電アミノ酸で置き換えた。結果として生じた右巻きのβ-ソレノイドワクチン足場を2ODL-Vacと命名した。
【０１２１】
真菌フザリウム・モニフォルメ由来のエンドポリガラクツロナーゼ(PDB#:1HG8)を同じ手順に供したが、重合能を有するβ-ソレノイドタンパク質を創出するために、1個のみの荷電残基がC末端に付加される必要があった。結果として生じた右巻きのβ-ソレノイドワクチン足場を1HG8-Vacと命名した。
【０１２２】
HET-2sに基づくPrP指向性ワクチン候補14R1の構築:
2つのHET-s(218〜289)プリオンドメインを接続する14アミノ酸リンカー長を有するHET-2sに対して、ワクチン候補を設計し、コドン最適化し、足場タンパク質と同一に構築した。HET-2sを描写し、アニメモデルとして可視化し、β鎖のβ1b及びβ3b上の交互の表面残基を、改変される対象となる標的として選定した。残基配置は、PrPScの構造に関する公開スレッド(Silvaら、2015)、並びに一般的なβ-シートコンフォメーション及び安定性(Jenkins&Pickersgill、2001)に大まかに基づいた。適正なβ-ソレノイド形成を確保するように注意し、塩橋の形成をもたらして、フォールドしたタンパク質の安定性を確保した。現在のワクチン候補は、以前に言及された塩橋構築に起因して、繰り返しの性質を有し、すなわちラングI&IIはそれぞれIII&IVと同一である。選定された残基は、約89〜232に及ぶシカ科PRNP配列に基づいた。
【０１２３】
3P4Gに基づくPrP指向性ワクチン候補3P4G-C7の構築:
PrPに対するワクチン候補3P4G-C7を、マリノモナス・プリモリエンシス由来のCa2+依存性ベータ-ヘリックス不凍タンパク質から取得された新たな4段のβ-ソレノイド足場の1つに基づいて設計した。不凍タンパク質(PDBアクセスコード:3P4G)はいくつかのβ-ソレノイドラングを有し、それから4段のβ-ソレノイド構造を含有する部分を選択し、一部の残基を置き換えて2つの塩橋を形成して、当該タンパク質がアミロイド線維に重合するのを可能にした。アミロイド線維の形成を促す、N及びC末端間の一方の塩橋、並びにフォールドを安定化させる、第1のベータ-ソレノイドラングにおける他方。シカPRNP配列由来の露出残基を種々の領域で選択し、4段の右巻きのβ-ソレノイド足場タンパク質であるこの3P4Gに導入した。残基を変異させ、UCSF ChimeraXソフトウェアを使用して可視化し次第、コード配列を大腸菌発現のために最適化し、合成遺伝子を合成し、NcoI/HindIII制限部位を使用してpET-28a(+)発現ベクター(Novagen社、Germany)にクローニングした。
【０１２４】
PL3に基づくPrP指向性ワクチン候補PL3C1、PL3C2の構築:
PrPに対するワクチン候補PL3C1及びPL3C2を、カルディセルロシルプター・ベシー(Caldicellulosiruptor bescii)由来の多糖リアーゼファミリー3(PL3)に属するペクチン酸リアーゼに基づいて設計した。PL3タンパク質(PDBアクセスコード:4Z05)は、7つの右巻きのβ-ソレノイドラングを有し、それはアミロイド線維を形成しないものの、それは、β-ソレノイドタンパク質の構造アーキテクチャーに基づくPrPScに類似した原子構造を有する。加えて、当該タンパク質は可溶性であり、それは、免疫付与過程にとって、及びPL3に基づく操作された抗原を有する抗体の開発にとって有利であり得た。線維性足場β-ソレノイドタンパク質を用いてワクチン候補を創出する本発明者らの手法と同様に、PrP配列由来の一部の残基を選択し、正規の可溶性PL3に導入した。残基を変異させ、UCSF ChimeraXソフトウェアを使用して可視化し次第、コード配列を大腸菌発現のために最適化し、合成遺伝子を合成し、NcoI/HindIII制限部位を使用してpET-28a(+)発現ベクター(Novagen社、Germany)にクローニングした。
【０１２５】
HET-sに基づくAβ指向性ワクチン候補AβC3、AβC4の構築:
Aβに対するワクチン候補を、ポドスポラ・アンセリナ由来の真菌プリオンタンパク質HET-sのプリオンドメイン(残基218〜289)に基づいて設計した。HET-s構造を、蛋白質構造データバンク(Protein Data Bank)(PDBアクセスコード:2RNM)からダウンロードし、UCSF ChimeraXソフトウェアで可視化し、次いで、クライオEMによって解明されたAβ(1〜42)線維構造(PDBアクセスコード:5OQV)を考慮に入れた(Gremerら、2017)。Aβ(1〜42)の表面露出残基をHET-s構造に入れて、通常5〜8個のアミノ酸であるエピトープを模倣した。HET-sの第1のラングにおいて変異させた残基は、第2のラングにおいて変異させたものと同じであり、これを行って、並行した正しい高次構造にあるフォールドであるAβ(1〜42)線維構造を模倣したことに言及することは重要である。UCSF ChimeraXソフトウェアを使用して残基を変異させ次第、コード配列を大腸菌発現のために最適化し、合成遺伝子を合成し、NdeI/BamHI制限部位によってpET-21a(+)発現ベクター(Novagen社、Germany)にクローニングした。
【０１２６】
HET-sに基づくα-シヌクレイン指向性ワクチン候補α-S3、α-S6、α-S8、及びα-S9の構築:
α-シヌクレイン指向性ワクチン候補も、HET-sプリオンドメイン(残基218〜289)(PDBアクセスコード:2RNM)に基づいて設計した。ssNMR及びX線繊維回析(Tuttleら、2016)によって決定されたα-シヌクレインの高分解能構造(PDBアクセスコード:2N0A、6CU7、及び6CU8)からの表面露出残基を選択し、UCSF ChimeraXソフトウェアを使用してHET-s(218〜289)構築物に入れた。この設計において、第1のラングにおいて変異させた残基は、HET-sの第2のラングにおいて変異させたものと同じであり、これは、並行した正しい高次構造にあるα-シヌクレイン線維構造を模倣するためでもあった。コード配列を大腸菌発現のために最適化し、合成遺伝子を合成し、NdeI/BamHI制限部位によってpET-21a(+)発現ベクター(Novagen社、Germany)にクローニングした。
【０１２７】
HET-sに基づくタウ指向性ワクチン候補タウC3、タウC4の構築:
タウタンパク質を標的にするワクチン候補も、HET-sプリオンドメイン(残基218〜289)(PDBアクセスコード:2RNM)に基づいた。クライオEMによって取得されたタウ対らせん状細線維構造(PDBアクセスコード:5O3L)(Fitzpatrickら、2017)を考慮に入れて、表面露出残基を選択し、UCSF ChimeraXソフトウェアを使用してHET-s(218〜289)構築物に入れ、次いでコード配列を大腸菌発現のために最適化し、合成遺伝子を合成し、制限部位NdeI/BamHIによってpET-21a(+)発現ベクター(Novagen社、Germany)にクローニングした。これらの構築物も、並行した正しい高次構造にあるフォールドとして設計され、それ故、HET-sの両ラングを、ミスフォールドしたタウタンパク質を模倣するように同一に変異させた。
【０１２８】
HET-2s、14R1の発現及び精製:
すべてのHET-sに基づく構築物及びワクチン候補を同一に精製した。精製プロトコールは(Wan、論文、2014)から適応された。配列を検証したプラスミドを、抗生物質選択のためのアンピシリン(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO)(100μg/mL)を使用してBL21(DE3)化学的コンピテントセル(Life Technologies社、Carlsbad、CA)にヒートショック形質転換した。次いで、形質転換された細胞を、2.8Lのフェルンバッハフラスコ中300mLのZYM-5052自己誘導培地(Teknova社、Hollister、CA)中で350rpmにて37℃で大体24時間成長させた。
【０１２９】
成長後、細胞を5000×gで15分間の遠心分離によってペレットにし、次いで、再懸濁バッファー(50mM Tris-HCl pH8.0、100mM NaCl、0.1mM PMSF、5mM EDTA)中に3mL/gの細胞ペレットで再懸濁した。次いで、混合物を、20分間かき混ぜながら、ペレットのグラムあたり10mgの組み換えヒトリゾチーム(Lysobac、InVitria社、Fort Collins、CO)を用いて室温で消化した。次いで、懸濁液を、4℃で80%のアウトプットにて5秒間のオン及び5秒間のオフサイクルでSonifier 250(Branson Ultrasonics社、Danbury、CT)にて10分間超音波処理し、次いで6000×gで遠心分離し、前に記載されるようにペレットにした。次いで、ペレットを洗浄バッファー(50mM Tris-HCl pH8.0、100mM NaCl、0.5% Trition-X100)中に再懸濁し、以前に記載されるように超音波処理した。超音波処理後、MgCl2を10mMの最終濃度になるように添加した。次いで、溶液を、500Uのベンゾナーゼ(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO)とともに、再度リゾチームで消化し、次いでペレットにし、再懸濁バッファー中にあと3回再懸濁した。次いで、封入体溶液をペレットにし、更なる精製まで-20℃で保管した。
【０１３０】
封入体をC末端6×ヒスチジンタグにより精製した。ペレットにした封入体を変性バッファー(20mM Tris-HCl pH8.0、6Mグアニジン塩酸塩)中に3mL/gで再懸濁し、室温で30分間かき混ぜ、次いで50,000×gにて4℃で45分間超遠心分離した。次いで、浄化された溶液を、6×hisテールを有するタンパク質に結合するNi-ニトリロ三酢酸(NTA)カラム(QIAGEN社、Venlo、Netherlands)を使用して精製した。カラムを平衡化し、変性バッファーのそれぞれ1及び3ベッドボリュームで洗浄し、固定されたタンパク質を溶出バッファー(50mMクエン酸pH2.0、6Mグアニジン塩酸塩)で溶出した。溶出されたタンパク質を、Zebaスピン脱塩カラム(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA)を使用して500mM酢酸にバッファー交換した。次いで、脱塩されたサンプルを、3M trisを使用してpHを7.5に増加させることによって線維化し、1mMアジ化ナトリウムを用いて室温で保管した。
【０１３１】
HET-s、AβC3、AβC4、タウC3、タウC4、α-SC3、α-SC6、α-SC8、α-SC9、並びに4段の右巻きのβ-ソレノイド足場タンパク質2ODL-Vac及び1HG8-Vacの形質転換、発現、及び精製:
すべてのワクチン候補構築物及び足場構築物を同一に形質転換し、発現させ、及び精製した。およそ約100ngのプラスミドDNAを、50μLの大腸菌BL21(DE3)化学的コンピテントセル(Life Technologies社、Carlsbad、CA)に添加し、氷上に20分間置き、次いで42℃で30秒間のヒートショックを実施し、直ちに反応物を氷上に2分間置いた。その後、250μLの異化産物抑制を有する超最適ブロス(Super Optimal broth with Catabolite repression)(SOC)培地を添加し、細胞を250rpmでの撹拌下にて37℃で60分間成長させた。40μLの形質転換物を、抗生物質選択として100μg/mLのアンピシリン(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO)を含有する事前に温めたプレート上に広げ、37℃で一晩インキュベートする。
【０１３２】
コロニーを選び、100μg/mLのアンピシリンを含有する5mLのルリア・ベルターニ培地中で37℃、250rpmで一晩培養した。翌日、QIAprep Spin Miniprepキット(QIAGEN社、Venlo、Netherlands)をメーカーの取扱説明書どおりに使用して、各形質転換体コロニーに対してプラスミドDNAを単離した。各プラスミドDNAをサンガーシーケンシングに送り、陽性コロニーを-70℃で20%グリセロールストックに保管した。少量のグリセロールストックをこすり取って、25mLのLB培地中で37℃、250rpmにて一晩前接種し、次いで500mLの2YT培地(1.6%トリプトン、1.0%酵母エキス、及び0.5%NaCl、pH7.0)を含有する2Lフラスコに接種し、600nmで0.6〜0.8の光学密度(OD)に到達するまで37℃及び250rpmでインキュベートした。次いで培養物を25℃に冷まし、次いで、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドを1mMの最終濃度まで添加することによってそれをタンパク質発現のために誘導し、培養物を一晩成長させた。
【０１３３】
誘導後、細胞を11,000rpm、4℃、10分間で収穫し、次いでそれらを少なくとも30分間冷凍し、その後ペレットを、1mg/mLリゾチーム及び1×EDTA不含プロテアーゼ阻害剤タブレットを含有する、20mlのIBバッファー(100mM Tris-HCl、pH8.0、0.5% Triton X-100)中に再懸濁した。ペレットをホモジナイズし、室温で30分間インキュベートし、次いでそれを、50%のデューティサイクルで出力電圧50にて7サイクル(1分間のオン及び1分間のオフ)超音波処理した。その後、元の培養物の各mLあたり3U/mLのベンゾナーゼを添加し、ホモジネートをもう20分間インキュベートし、次いでそれを11,000rpm、4℃で30分間遠心分離した。上清を捨て、その一方でペレットを、1mg/mLリゾチーム及び1×プロテアーゼ阻害剤タブレットを含有するIBバッファー中でホモジナイズし、次いでそれを室温で20分間インキュベートし、ホモジネートを5サイクル超音波処理し、上で記載されるのと同じ条件下で遠心分離した。結果として生じたペレットをIBバッファーで2回洗浄し、11,000rpm、4℃で30分間遠心分離し、100mM Tris-HCl、pH8.0バッファーを使用した最後の洗浄工程を実施した。本発明者らの封入体を含有するペレットを-20℃で保管した。
【０１３４】
封入体を、タンパク質可溶化バッファー(6Mグアニジン塩酸塩、20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、及び10mMイミダゾール、pH8.0)の添加によって可溶化し、室温で45分間かき混ぜ、その後、それを4℃で35分間の45,000rpmでの超遠心分離によって浄化した。次いで、ワクチン候補タンパク質を、4℃の冷蔵庫に入れられたbiologic duoflow(商標)クロマトグラフィーシステム(Bio-Rad Laboratories社、Hercules、USA)を使用することによって以下のとおりに精製した:HisTrap(商標)HPカラム(GE Healthcare Life Sciences社、Piscataway、NJ、USA)を、30mlの平衡バッファー(8M尿素、20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、及び10mMイミダゾール、pH8.0)を使用して、又は280nmでの吸光度が安定なベースライン測定を達成するまで平衡化し、次いで浄化された溶解物をHisTrap(商標)HPカラムにロードし、カラムを25mLの平衡バッファーによって洗浄し、次いで直ちに、平衡バッファーであるが20mMイミダゾールを含有するものを用いて他の洗浄工程を行い、次いで20mM〜500mMのイミダゾール(他の成分は平衡バッファーと同じであった)の線形勾配を開始して、結合している候補ワクチンタンパク質を溶出した。関心対象の候補ワクチンのピークを、吸光度が280nmで0.05を上回る場合に、BioFrac(商標)フラクションコレクター(Bio-Rad Laboratories社、Hercules、USA)により自動的に収集した。本発明者らの純粋なワクチン候補タンパク質を含有する画分を、HiTrap(登録商標)脱塩カラム(GE Healthcare Life Sciences社、Piscataway、NJ、USA)を使用して脱塩し、まずカラムを10mLの175mM酢酸、約pH2.8を使用して平衡化し、次いで画分をHiTrap(登録商標)脱塩カラムにロードし、20mLの175mM酢酸、約pH2.8を通してタンパク質をバッファー交換した。関心対象の候補ワクチンのピークを、上で言及されるように自動的に収集した。サンプルを脱塩し次第、約200μLの3M TrisによってpHを7.5に増加させ、アジ化ナトリウムを1mMの最終濃度まで添加した。それらを室温に置いて、その線維化を促した。
【０１３５】
4段の右巻きのβ-ソレノイドワクチン足場タンパク質3P4G-Vac及びワクチン候補3P4G-VacC7の形質転換、発現、及び精製:
4段の右巻きのβ-ソレノイドワクチン足場3P4G-Vac及びワクチン候補3P4G-C7に対する形質転換及び発現を、100μg/mLのカナマイシンを使用して25℃にて、上で記載されるように行った。
【０１３６】
誘導後、細胞を11,000rpm、4℃、10分間で収穫し、次いでそれらを少なくとも30分間冷凍し、その後ペレットを、0.5% Triton X-100、1mg/mLリゾチーム、及び1×EDTA不含プロテアーゼ阻害剤タブレットを含有する、20mLの再懸濁バッファー(50mM Tris、0.5M NaCl、pH7.5、2%(v/v)グリセロール、2mM CaCl2、及び20mMイミダゾール、pH8.0)中に再懸濁した。ペレットをホモジナイズし、室温で30分間インキュベートし、次いでそれを、50%のデューティサイクルで出力電圧50にて7サイクル(1分間のオン及び1分間のオフ)超音波処理した。その後、元の培養物のmLあたり3U/mLのベンゾナーゼを添加し、ホモジネートをもう20分間インキュベートし、次いでそれを11,000rpm、4℃で30分間遠心分離した。上清を回収し、それを4℃で30分間の45,000rpmでの超遠心分離によって浄化した。次いで、タンパク質を、4℃でbiologic duoflow(商標)クロマトグラフィーシステム(Bio-Rad Laboratories社、Hercules、USA)を使用することによって以下のとおりに精製した:HisTrap(商標)HPカラム(GE Healthcare Life Sciences社、Piscataway、NJ、USA)を、30mlの平衡バッファー(50mM Tris、0.5M NaCl、pH7.5、2%(v/v)グリセロール、2mM CaCl2、及び20mMイミダゾール、pH8.0)を使用して、又は280nmでの吸光度が安定なベースライン測定を達成するまで平衡化し、次いで浄化された溶解物をHisTrap(商標)HPカラムにロードし、カラムを25mLの平衡バッファーによって洗浄し、それに続いて20mM〜500mMのイミダゾール(他の成分は平衡バッファーと同じであった)の線形勾配を開始して、結合している候補ワクチンタンパク質を溶出した。関心タンパク質のピークを、吸光度が280nmで0.05を上回る場合に、BioFrac(商標)フラクションコレクター(Bio-Rad Laboratories社、Hercules、USA)により自動的に収集した。純粋なタンパク質を含有する画分を、3000Daの分子量カットオフを有するAmicon(登録商標)Ultra-4 Centrifugal Filter Unitを使用して濃縮した。
【０１３７】
次いで、本発明者らの純粋なタンパク質である4段の右巻きのβ-ソレノイド足場タンパク質3P4G-Vac及びワクチン候補3P4G-C7を含有する濃縮された画分を、PD10脱塩カラム(GE Healthcare Life Sciences社、Piscataway、NJ、USA)にロードした。まず、カラムを25mLの100mM Tris-HCl、0.5M NaCl、pH7.4を使用して平衡化し、次いで2.5mLの濃縮されたタンパク質を脱塩カラムにロードし、次いで3.5mLの100mM Tris-HCl、0.5M NaClを使用して3P4G-Vac及び3P4G-C7を溶出し、最初の0.5mLを捨て、タンパク質を3mLの総容量で収集した。次いで、アジ化ナトリウムを1mMの最終濃度まで添加し、純粋なタンパク質を室温に置いて、その線維化を促した。
【０１３８】
PL3及びワクチン候補PL3C1、PL3C2の形質転換、発現、及び精製:
足場タンパク質PL3並びにワクチン候補PL3C1及びPL3C2を、大腸菌BL21(DE3)において発現させた。培養物を、250rpmで連続的に振とうしながら、100μg/mLのカナマイシンを補給した0.1%グルコースを含有する500mLの2YT培地中にて25℃で、培養物が0.6〜0.8の600nmでの吸光度に到達するまでインキュベートし、次いでイソプロピル-β-d-チオガラクトシダーゼを1mMの最終濃度を達成するように添加し、培養物を同じ温度及び撹拌条件下で16時間維持した。
【０１３９】
細胞を11,000rpm、4℃、10分間で収穫し、30分間冷凍した。PL3、PL3C1、及びPL3C2のペレットを20mlの再懸濁バッファー(100mM Tris-HCl、0.5M NaCl、pH7.4)中に再懸濁した。次いで、Triton X-100を0.5%最終濃度に到達するように添加し、並びに1mg/mLリゾチーム及び1×EDTA不含プロテアーゼ阻害剤タブレットを添加した。ペレットをホモジナイズし、室温で30分間インキュベートし、次いで50%のデューティサイクルで出力電圧50にて7サイクル(1分間のオン及び1分間のオフ)超音波処理した。その後、元の培養物のmLあたり3U/mLのベンゾナーゼを添加し、ホモジネートをもう20分間インキュベートし、次いでそれを11,000rpm、4℃で30分間遠心分離した。上清を回収し、4℃で30分間の45,000rpmでの超遠心分離によって浄化し、次いでタンパク質を、4℃に入れられたbiologic duoflow(商標)クロマトグラフィーシステム(Bio-Rad Laboratories社、Hercules、USA)を使用することによって以下のとおりに精製した:HisTrap(商標)HPカラム(GE Healthcare Life Sciences社、Piscataway、NJ、USA)を、30mLの平衡バッファー(100mM Tris、0.5M NaCl、pH8.0)を使用して、又は280nmでの吸光度が安定なベースライン測定を達成するまで平衡化し、次いで浄化された溶解物をHisTrap(商標)HPカラムにロードし、次いでカラムを25mLの平衡バッファーによって洗浄し、それに続いて0mM〜500mMのイミダゾール(他の成分は平衡バッファーと同じであった)の線形勾配を使用して、結合しているワクチン候補タンパク質を溶出した。関心タンパク質のピークを、吸光度が280nmで0.05を上回る場合に、BioFrac(商標)フラクションコレクター(Bio-Rad Laboratories社、Hercules、USA)により自動的に収集した。
【０１４０】
純粋なタンパク質を含有する画分を、3000Daの分子量カットオフを有するAmicon(登録商標)Ultra-4 Centrifugal Filter Unitを使用して濃縮した。画分が濃縮され次第、次いでPL3、PL3C1、及びPL3C2を、250mLのサイズ排除バッファー(50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.4)であらかじめ平衡化されたHiLoad Superdex 75 PGカラム(GE Healthcare Life Sciences社、Piscataway、NJ、USA)にロードして、サイズ排除分子クロマトグラフィーを行い、次いでタンパク質を、125mLのサイズ排除クロマトグラフィーバッファーを使用することによって溶出した。純粋なタンパク質を含有する画分を、吸光度が280nmで0.05を上回る場合に、BioFrac(商標)フラクションコレクター(Bio-Rad Laboratories社、Hercules、USA)により自動的に収集した。次いで、アジ化ナトリウムを1mMの最終濃度まで添加し、サンプルを-20℃で保管した。
【０１４１】
品質管理解析(SDS PAGE、ネガティブ染色EM):
精製されたサンプルを、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)及びネガティブ染色透過電子顕微鏡法(TEM)の両方に供して、線維の純度及び存在を保証した。サンプルが不溶性又は可溶性の場合、タンパク質濃度を、それぞれビシンコニン酸タンパク質アッセイ(BCA assay)(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA)又は280nmでの吸光度によって判定した。
【０１４２】
β-メルカプトエタノールを有する5×自家SDSサンプルバッファーをサンプルに添加し、95℃で5分間煮沸した。次いで、サンプルをNuPAGE 12% Bis-Trisタンパク質ゲル(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA)にロードし、200Vで35分間電気泳動した。次いで、ゲルを洗浄し、Bio-safeクマシーステイン(Bio-Rad Laboratories社、Hercules、CA)を用いて染色し及び可視化した。
【０１４３】
線維形成をチェックするために、精製されたサンプルを撮像し、ネガティブ染色TEMにより可視化した。200又は400スクエアメッシュのカーボンコートされた銅グリッド(Electron Microscopy Sciences社、Hatfield、PA)を15mA、0.39mBarで1分間グロー放電した。5μLの約1mg/mLサンプルをグリッド上に30秒間吸収させ、次いで2滴(50μL)の酢酸アンモニウム(100及び10mM)で洗浄し、2滴(50μL)の2%濾過酢酸ウラニル(Electron Microscopy Sciences社、Hatfield、PA)で染色した。次いで、グリッドを濾紙で拭き取り、室温で保管した。グリッドを、底部に取り付けられたEagle 4k×4k電荷結合素子(CCD)カメラ(FEI社、Hillsboro、OR)を使用して200kVで作動するTecnai F20 TEM(FEI社、Hillsboro、OR)によって可視化した。
【０１４４】
可溶性足場タンパク質PL3に基づくワクチン候補に対してだけ円偏光二色性を実施して、変異後にタンパク質二次構造が影響を受けていないかどうかを判定した。室温で1cmセルを使用して、50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.4中0.5mg/mLタンパク質に対して、200nm〜300nmでスペクトルを記録した。Chirascan(商標)円偏光二色性スペクトロメーター機器を使用して、高電圧に比例した走査速度でスペクトルを収集した。
【０１４５】
HET-2s、14R1、AβC3、AβC4、タウC3、タウC4、α-SC3、α-SC6、α-SC8、α-SC9、PL3C1、及びPL3C2による指標マウスの免疫付与:
【０１４６】
動物試験に関して、すべての実験プロトコールは、カナダ動物管理協会(Canadian Council on Animal Care)に従い、アルバータ大学における動物実験委員会(Animal Care and Use Committee)によって承認された(AUP00000424)。
【０１４７】
良好な線維化を示し、それ故適正なβ-ソレノイドフォールドを採用しているワクチン候補を使用して、Prnp-/-及びPrnp+/+(FVB野生型)マウスに免疫付与した。サンプル濃度を以前に記載されるように判定し、PBS pH7.4にバッファー交換した。0日目に、両性別の約8〜12週齢のマウスに、100μLの接種材料の50/50フロイント完全アジュバント(FCA)(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO)中100μgのプライミング用量の超音波処理された免疫原を腹腔内に(IP)接種した。その後の週2回のブースターは、合計3回のブースターでIP注射される、100μLの接種材料の50/50フロイント不完全アジュバント(FIA)(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO)中50μgの免疫原からなった。免疫付与が開始される前(免疫前血清)及び各ブースト後2週間ごとに血液を採取し、最後のブーストの2週間後に免疫後血清を収集した。対照として、本発明者らは、ワクチン候補が疾患を引き起こし得るかどうかを判定するためにFVB野生型マウスに14R1を頭蓋内に(IC)接種し、それは現在進行中である。
【０１４８】
14R1に対する間接的及び競合ELISA:
間接的酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して、免疫後血清の力価を判定し、一方で競合ELISAを使用して、感染性CWD脳ホモジネートに対する免疫後血清の特異性を判定した。別様に指定されていない限り、すべての工程を室温で実施した。高結合性96ウェルUltraCruzマイクロプレートストリップ(Santa Cruz Biotechnology社、Santa Cruz、CA)をPBS中0.5μgの超音波処理された抗原でコートし、一晩回転させながらインキュベートした。次いで、プレートをTBST(0.1% tween 20)中5%スキムミルクで1時間又は4℃で一晩ブロッキングし、TBSTで洗浄した。次いで、免疫後血清をPBS中に連続希釈し、1時間インキュベートした。競合ELISAに関しては、免疫後血清を、非結合性マイクロプレート(Greiner Bio-One社、Kremsmunster、Austria)においてCWD+脳ホモジネートに添加し、1時間インキュベートし、次いで元のプレートに移し戻し、1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、5%スキムミルクTBS中1:5000希釈の二次HRP-ヤギ抗マウスを添加し、30分間インキュベートし、その後に再度洗浄した。3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)基質(SurModics社、Eden Prairie、MN)を添加し、反応を停止させるための2M硫酸の添加前に、暗所で30分間インキュベートする。次いで、450nmでの吸光度を5分以内に記録した。
【０１４９】
AβC3、AβC4、タウC3、タウC4、α-SC3、α-SC6、α-SC8、α-SC9、PL3C1、及びPL3C2に対する間接的ELISA:
間接的ELISAを使用して、操作されたタンパク質抗原を免疫付与されたマウスの免疫前及び免疫後血清の力価を判定した。すべての抗原を5mg/mLの濃度に到達するようにPBS中に希釈し、最小出力電圧で10秒間超音波処理し、一方でPL3C1及びPL3C2を、それらは可溶性タンパク質であるため超音波処理しなかった。高結合性96ウェルUltraCruzマイクロプレートストリップ(Santa Cruz Biotechnology社、Santa Cruz、CA)を、5mg/mLに希釈された100μLの抗原を添加することによって0.5μgの抗原でコートし、プレートを4℃で穏やかな撹拌下にて一晩インキュベートした。次いで、プレートを3% BSAで室温にて1時間ブロッキングし、0.1% tween 20を含有するPBSで3回洗浄し、次いで免疫血清を種々の希釈で1% BSA中に連続希釈した。その後、抗血清希釈物をプレートに添加し、穏やかな撹拌を使用して暗所で2時間インキュベートした。その後、あと3回の洗浄を、以前に記載されるように実施した。次いで、PBS中5%スキムミルク中1:5000希釈の100μLの二次HRP-ヤギ抗マウスを各ウェルに添加し、30分間インキュベートし、プレートを5回洗浄した。100μLの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)基質(SurModics社、Eden Prairie、MN)を発色するまで暗所で添加し、次いで反応を2M硫酸の添加によって停止させた。450nmでの吸光度を記録した。
【０１５０】
α-SC3、α-SC6、α-SC8、α-SC9、PL3C1、及びPL3C2に対する競合ELISA:
競合ELISAを使用して、プリオン感染した脳ホモジネート及びアルファ-シヌクレイノパチー脳ホモジネートの両方に対する、免疫後血清におけるポリクローナル抗体の特異性をそれぞれ判定した。高結合性96ウェルUltraCruzマイクロプレートストリップ(Santa Cruz Biotechnology社、Santa Cruz、CA)をPBS中0.5μgの超音波処理された抗原でコートし、一定に振とうしながら4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを3% BSAで室温にて1時間ブロッキングし、0.1% tween 20を含有するPBSで3回洗浄した。次いで、3つの異なるα-シヌクレイノパチー(レビー小体型認知症、多系統萎縮症、パーキンソン病)又はプリオン病のいずれかからの脳ホモジネートの50ugの総タンパク質を異なるウェルに添加し、穏やかな撹拌を使用して室温で5分間インキュベートした。陰性対照として、健常対照からの脳ホモジネートを異なるウェルに添加した。次いで、1:10,000〜1:500,000希釈の50μLの抗血清を添加し、穏やかな撹拌を使用して室温で暗所にて1時間インキュベートした。その後、プレートを上で記載されるように洗浄し、次いでPBS中5%スキムミルク中1:5,000希釈の100μLの二次HRP-ヤギ抗マウスを添加し、穏やかな撹拌を使用して室温で暗所にて1時間インキュベートした。最後に、プレートを上で言及されるように5回洗浄し、発色させるために3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)基質(SurModics社、Eden Prairie、MN)を添加した。発色し次第、50μLの2M硫酸を添加して、反応を停止させた。450nmでの吸光度を5分以内に記録した。
【０１５１】
配列の表
【表１Ａ】
2021525074.tif 000007
【表１Ｂ】
2021525074.tif 000008
【表１Ｃ】
2021525074.tif 000009
【０１５２】
参考文献:
2021525074.tif 000010
2021525074.tif 000011
2021525074.tif 000012
2021525074.tif 000013
2021525074.tif 000014
【０１５３】
本明細書において記載される実施形態は、単なる例であることを意図される。変更、改変、及び変形が、当業者によって特定の実施形態にもたらされ得る。特許請求の範囲は、本明細書において示される特定の実施形態によって限定されるべきではないが、全体として本明細書と一致した様式で解釈されるべきである。
【０１５４】
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、本発明が関連する技術分野における当業者のレベルを指し示すものであり、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により組み込まれることを具体的に且つ個々に示されるかのようにと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
本発明はこのように記載されているが、それは多くのやり方で様々に異なり得ることは明白であろう。そのような変形は、本発明の精神及び範囲からの逸脱として見なされるべきではなく、当業者に明白であると考えられるようなすべての改変は、以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
2021525074.tif 000019
【図２】
2021525074.tif 000020
【図３】
2021525074.tif 000021
【図４】
2021525074.tif 000022
【図５】
2021525074.tif 000023
【図６】
2021525074.tif 000024
【図７】
2021525074.tif 000025
【図８】
2021525074.tif 000026
【図９】
2021525074.tif 000027
【図１０】
2021525074.tif 000028
【図１１】
2021525074.tif 000029
【図１２】
2021525074.tif 000030
【図１３】
2021525074.tif 000031
【図１４】
2021525074.tif 000032
【図１５】
2021525074.tif 000033
【図１６】
2021525074.tif 000034
【図１７】
2021525074.tif 000035
【図１８】
2021525074.tif 000036
【図１９】
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【図２０】
2021525074.tif 000038
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2021525074.tif 000044
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
2021525074.tif 000051
【図３４】
2021525074.tif 000052
【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
2021525074.tif 000060
【図４３】
2021525074.tif 000061
【図４４】
2021525074.tif 000062
【図４５】
2021525074.tif 000063
【図４６】
2021525074.tif 000064
【図４７】
2021525074.tif 000065
【図４８】
2021525074.tif 000066
【図４９】
2021525074.tif 000067
【配列表】
2021525074000001.app
【国際調査報告】
2021525074.tif 000068
2021525074.tif 000069
2021525074.tif 000070
2021525074.tif 000071