(57)【要約】本開示は、目的のゲノム領域にハイブリダイズするための１組のガイドＲＮＡを設計するための方法を提供する。本開示は、少なくとも１つの目的のゲノム領域を、少なくとも１組のガイドＲＮＡにより編集する方法をさらに提供する。本開示は、目的の種の全ゲノムにわたるオフターゲット値を決定して、オフターゲットゲノム編集を最小限にし、かつ編集効率を改善する方法を説明する。本開示は、そのようなオリゴヌクレオチドの設計および確証を行うためのソフトウェアおよびハードウェア構成を説明する。
2021523745.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム内の目的のゲノム領域にハイブリダイズ可能な１組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を識別するための方法であって、
１組のｇＲＮＡを設計することであって、前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、前記１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つの他のガイドＲＮＡの、目的の前記ゲノム領域内の複数の標的部位中の異なる標的部位から少なくとも３０塩基離れている、前記複数の標的部位からの標的部位にハイブリダイズ可能である、設計すること
を含む方法。
【請求項２】
前記標的部位が、前記異なる標的部位から多くても１７０塩基離れている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１組のｇＲＮＡ中の少なくとも１つのｇＲＮＡの配列が、目的の前記ゲノム領域に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１組のｇＲＮＡ中の少なくとも１つのｇＲＮＡの配列が、目的の前記ゲノム領域に部分的に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
目的の前記ゲノム領域に部分的に相補的な前記１組のｇＲＮＡ中の前記少なくとも１つのｇＲＮＡの配列が、目的の前記ゲノム領域と比較して１、２、３、４、５個または５個よりも多いミスマッチを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約１７〜約４２塩基の長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約２０塩基の長さである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約２０塩基のガイド配列を含み、約２２〜約８０塩基の長さの定常領域をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡの前記ガイド配列が、目的の前記ゲノム領域に選択的にハイブリダイズする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約１００塩基の長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
目的の前記ゲノム領域が、遺伝子のコード領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
目的の前記ゲノム領域が、前記遺伝子のエクソンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
目的の前記ゲノム領域が、遺伝子のファミリーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
目的の前記ゲノム領域が、遺伝子の前記ファミリーからの１つまたは複数のコード領域を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
目的の前記ゲノム領域が、前記ゲノムの非コード領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記非コード領域が、調節エレメントである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記調節エレメントが、シス調節エレメントまたはトランス調節エレメントである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記シス調節エレメントが、プロモーター、エンハンサーおよびサイレンサーからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
目的の前記ゲノム領域が、５ｋｂ超、１０ｋｂ超、１５ｋｂ超、２０ｋｂ超、５０ｋｂ超、または１００ｋｂ超にわたる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記１組のｇＲＮＡが、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個のｇＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つのｇＲＮＡが、改変を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記改変が、２’−Ｏ−Ｃ１〜４アルキル、例えば、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−デオキシ（２’−Ｈ）、２’−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、例えば、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−アラビノシル（２’−アラビノ）ヌクレオチド、２’−Ｆ−アラビノシル（２’−Ｆ−アラビノ）ヌクレオチド、２’−ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−非ロックド核酸（ＵＬＮＡ）ヌクレオチド、Ｌ形態の糖（Ｌ−糖）および４’−チオリボシルヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記改変が、ホスホロチオエート、ホスホノカルボキシレート、チオホスホノカルボキシレート、アルキルホスホネートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオチド間結合改変である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記改変が、２−チオウラシル（２−チオＵ）、２−チオシトシン（２−チオＣ）、４−チオウラシル（４−チオＵ）、６−チオグアニン（６−チオＧ）、２−アミノアデニン（２−アミノＡ）、２−アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、５−メチルシトシン（５−メチルＣ）、５−メチルウラシル（５−メチルＵ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルウラシル、５，６−デヒドロウラシル、５−プロピニルシトシン、５−プロピニルウラシル、５−エチニルシトシン、５−エチニルウラシル、５−アリルウラシル（５−アリルＵ）、５−アリルシトシン（５−アリルＣ）、５−アミノアリルウラシル（５−アミノアリルＵ）、５−アミノアリル−シトシン（５−アミノアリルＣ）、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ塩基、Ｐ塩基、非構造核酸（ＵＮＡ）、イソグアニン（イソＧ）、イソシトシン（イソＣ）および５−メチル−２−ピリミジンからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数の標的部位の標的部位が、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３およびＣｐｆ１からなる群から選択されるヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヌクレアーゼが、不活性化Ｃａｓ９である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記１組のｇＲＮＡが、細胞において目的の前記ゲノム領域内の遺伝子をノックアウトするように設計される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、ヒト初代細胞、ヒト不死化細胞、ヒト誘導多能性幹細胞、マウス胚性幹細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記設計することが、コンピュータによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
１組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むキットであって、前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法によって設計されている、キット。
【請求項３２】
ゲノム内の目的のゲノム領域にハイブリダイズ可能な１組のｇＲＮＡを含むキットであって、前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、
前記１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つの他のガイドＲＮＡの、目的の前記ゲノム領域内の複数の標的部位中の異なる標的部位から少なくとも３０塩基離れている、前記複数の標的部位からの標的部位にハイブリダイズ可能である、
キット。
【請求項３３】
前記標的部位が、前記異なる標的部位から多くても１７０塩基離れている、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記１組のｇＲＮＡが、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個のｇＲＮＡを含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３およびＣｐｆ１からなる群から選択される１つまたは複数のヌクレアーゼをさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３６】
複数の組のｇＲＮＡをさらに含み、各組のｇＲＮＡが、前記ゲノム内の異なる目的のゲノム領域にハイブリダイズ可能である、請求項３２に記載のキット。
【請求項３７】
前記１つまたは複数のヌクレアーゼが、少なくとも１つのｇＲＮＡにカップリングされている、請求項３５に記載のキット。
【請求項３８】
ある種のゲノムの遺伝子にハイブリダイズするための１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を選択するための方法であって、
前記遺伝子にハイブリダイズする最初の組のガイドＲＮＡの複数のガイドＲＮＡの各々について、前記ゲノム内の潜在的ガイドＲＮＡハイブリダイズ部位に対するミスマッチの数を数え上げることによってオフターゲット値を計算すること
を含む方法。
【請求項３９】
前記複数のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、１００塩基の長さである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記複数のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡの約２０塩基が、目的のゲノム領域内の異なる標的部位にハイブリダイズする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ミスマッチの前記数が、０である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ミスマッチの前記数が、１である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
ミスマッチの前記数が、２である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
ミスマッチの前記数が、３である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記計算することが、前記最初の組のガイドＲＮＡの各ｇＲＮＡについてのミスマッチの前記数の総和を得る、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記計算することが、ミスマッチの前記数をシャードへと組織化する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記オフターゲット値が、参照ゲノムに対して計算される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記参照ゲノムが、ヒト参照ゲノムである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記参照ゲノムが、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ  Ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏおよびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記オフターゲット値が、参照ゲノムの１，０００，０００ｂｐにわたり、または参照ゲノムにわたり決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項５１】
前記オフターゲット値が、ヌクレアーゼの結合部位のデータベースに対して計算される、請求項３８に記載の方法。
【請求項５２】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３およびＣｐｆ１からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記データベースが、前記ヌクレアーゼの１０，０００を超えるか、５０，０００を超えるか、１００，０００を超えるか、１５０，０００を超えるか、２００，０００を超えるか、２５０，０００を超えるか、３００，０００を超えるか、３５０，０００を超えるか、４００，０００を超えるか、４５０，０００を超えるか、５００，０００を超えるか、５５０，０００を超えるか、６００，０００を超えるか、６５０，０００を超えるか、７００，０００を超えるか、７５０，０００を超えるか、８００，０００を超えるか、８５０，０００を超えるか、９００，０００を超えるか、９５０，０００を超えるか、または１，０００，０００を超える結合部位を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
ヌクレアーゼ結合部位の前記データベースが、前記ヌクレアーゼの２５００万を超えるか、５０００万を超えるか、７５００万を超えるか、１億を超えるか、１億２５００万を超えるか、１億５０００万を超えるか、１億７５００万を超えるか、２億を超えるか、２億２５００万を超えるか、２億５０００万を超えるか、２億７５００万を超えるか、または３億を超える結合部位を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
ミスマッチの前記数を数え上げることによって前記オフターゲット値を前記計算することが、コンピュータによって行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項５７】
ある種のゲノムの遺伝子にハイブリダイズするための１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計するための方法であって、
前記遺伝子の複数の転写物から転写物を選択することと、
最初の組のｇＲＮＡを識別することであって、前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、選択された前記転写物の前記遺伝子内の異なる標的部位にハイブリダイズする、識別することと
を含む方法。
【請求項５８】
前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約１７〜約４２塩基の長さである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約２０塩基の長さである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約２０塩基のガイド配列および約２２〜約８０塩基の長さの定常領域を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡの前記ガイド配列が、標的部位に選択的にハイブリダイズする、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約１００塩基の長さである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
選択された前記転写物が、データベース中の前記遺伝子の最も豊富な転写物である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
選択された前記転写物が、前記遺伝子の前記複数の転写物の最も長い転写物である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
選択された前記転写物中に存在する前記遺伝子内のコード領域を選択することをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６６】
選択された前記コード領域が、初期位置エクソンである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記初期位置エクソンが、前記遺伝子の前半に存在する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記初期位置エクソンが、前記遺伝子の第１、第２、第３、第４、第５または第６エクソンである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
選択された前記コード領域が、前記遺伝子の前記複数の転写物の中で最も豊富な転写物の選択されたエクソンである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
選択された前記エクソンが、前記複数の転写物において１つまたは複数の他のエクソンよりも長い、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
選択された前記エクソンが、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも５５ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも６５ｂｐ、少なくとも７０ｂｐまたは少なくとも７５ｂｐである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
選択された前記エクソンが、前記複数の転写物において長さおよび豊富さの両方に基づいて選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記最初の組のｇＲＮＡの各ｇＲＮＡについてのオフターゲット値を決定することをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項７４】
前記オフターゲット値が、前記種の前記ゲノムにわたり決定される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ゲノムが、前記種の参照ゲノムである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記種の前記参照ゲノムが、染色体および位置が決定されていないコンティグを含有する完全な参照アセンブリである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ゲノム内の複数の標的部位と比較して前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡについてのミスマッチの数を数え上げることによって前記オフターゲット値を決定することをさらに含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
前記複数の標的部位が、前記ゲノムにわたる全ての可能なＣａｓヌクレアーゼ結合部位を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記複数の標的部位が、少なくとも１０００個、１０，０００個、１００，０００個、２００，０００個、３００，０００個、４００，０００個、５００，０００個、６００，０００個、７００，０００個、８００，０００個、９００，０００個、１，０００，０００個、２，０００，０００個または３，０００，０００個の標的部位を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記複数の標的部位が、少なくとも１００，０００，０００個、２００，０００，０００個、３００，０００，０００個、４００，０００，０００個、５００，０００，０００個、６００，０００，０００個、７００，０００，０００個、８００，０００，０００個、９００，０００，０００個、１，０００，０００，０００個または１，５００，０００，０００個の標的部位を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記数え上げることが、０、１、２、３または４個のミスマッチの数を有する前記最初の組のガイドＲＮＡの各ｇＲＮＡについてのオフターゲットハイブリダイゼーション領域を決定することを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記異なる標的部位の標的部位が、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３およびＣｐｆ１からなる群から選択されるヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する、請求項５７に記載の方法。
【請求項８３】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＰＡＭ部位が、ＮＧＧである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記ヌクレアーゼが、不活性化Ｃａｓである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
前記種が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ  Ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏおよびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓからなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項８７】
オンターゲット効率閾値およびオフターゲット閾値に基づいて前記最初の組のｇＲＮＡからガイドＲＮＡのサブセットを選択することをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項８８】
前記最初の組のｇＲＮＡの各ガイドＲＮＡについての前記オンターゲット効率閾値が、アジマススコアを計算することによって決定される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記アジマススコアが、０．４を超える、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記識別することが、前記アジマススコアの閾値およびオフターゲットハイブリダイズ値に基づく、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記最初の組のｇＲＮＡが、細胞において前記遺伝子をノックアウトする、請求項５７に記載の方法。
【請求項９２】
前記最初の組のｇＲＮＡが、細胞において前記遺伝子に突然変異をノックインする、請求項５７に記載の方法。
【請求項９３】
前記細胞が、ヒト初代細胞、ヒト不死化細胞、ヒト誘導多能性幹細胞、マウス胚性幹細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞からなる群から選択される、請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記最初の組のガイドＲＮＡ中の少なくとも１つのガイドＲＮＡからの少なくとも１つのヌクレオチドが、改変を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項９５】
前記改変が、２’−Ｏ−Ｃ１〜４アルキル、例えば、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−デオキシ（２’−Ｈ）、２’−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、例えば、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−アラビノシル（２’−アラビノ）ヌクレオチド、２’−Ｆ−アラビノシル（２’−Ｆ−アラビノ）ヌクレオチド、２’−ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−非ロックド核酸（ＵＬＮＡ）ヌクレオチド、Ｌ形態の糖（Ｌ−糖）および４’−チオリボシルヌクレオチドからなる群から選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記改変が、ホスホロチオエート、ホスホノカルボキシレート、チオホスホノカルボキシレート、アルキルホスホネートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオチド間結合改変である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記改変が、２−チオウラシル（２−チオＵ）、２−チオシトシン（２−チオＣ）、４−チオウラシル（４−チオＵ）、６−チオグアニン（６−チオＧ）、２−アミノアデニン（２−アミノＡ）、２−アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、５−メチルシトシン（５−メチルＣ）、５−メチルウラシル（５−メチルＵ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルウラシル、５，６−デヒドロウラシル、５−プロピニルシトシン、５−プロピニルウラシル、５−エチニルシトシン、５−エチニルウラシル、５−アリルウラシル（５−アリルＵ）、５−アリルシトシン（５−アリルＣ）、５−アミノアリルウラシル（５−アミノアリルＵ）、５−アミノアリル−シトシン（５−アミノアリルＣ）、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ塩基、Ｐ塩基、非構造核酸（ＵＮＡ）、イソグアニン（イソＧ）、イソシトシン（イソＣ）および５−メチル−２−ピリミジンからなる群から選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
前記選択することおよび前記識別することが、コンピュータによって行われる、請求項５７に記載の方法。
【請求項９９】
前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、前記最初の組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つの他のガイドＲＮＡの標的部位から少なくとも３０塩基離れている標的部位にハイブリダイズ可能である、請求項５７に記載の方法。
【請求項１００】
１組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むキットであって、前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、請求項５７から９８のいずれか一項に記載の方法によって設計されている、キット。
【請求項１０１】
目的のゲノム領域を編集するための方法であって、目的の前記ゲノム領域を含む細胞の集団を、（ｉ）目的の前記ゲノム領域をターゲティングする少なくとも２つのｇＲＮＡを含む１組のｇＲＮＡ、および（ｉｉ）ヌクレアーゼと接触させることであって、少なくとも２つのｇＲＮＡを含む前記１組のｇＲＮＡの編集効率が、前記少なくとも２つのｇＲＮＡの各々の個々の編集効率よりも高い、接触させることを含む方法。
【請求項１０２】
目的の前記ゲノム領域が、遺伝子のコード領域である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記コード領域が、前記遺伝子のエクソンである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
目的の前記ゲノム領域が、ゲノム内の非コード領域である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記非コード領域が、調節エレメントである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記調節エレメントが、シス調節エレメントまたはトランス調節エレメントである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記シス調節エレメントが、プロモーター、エンハンサーおよびサイレンサーからなる群から選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させることをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ドナーポリヌクレオチドが、前記細胞の野生型遺伝子型と比較して点突然変異、対立遺伝子、タグまたは外因性エクソンを含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記編集効率が、前記接触させることの後の非野生型遺伝子型を含む、細胞の前記集団中の細胞の割合である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１１】
前記非野生型遺伝子型が、遺伝子のノックアウトである、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記非野生型遺伝子型が、野生型遺伝子型と比較した挿入または欠失である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
細胞の前記集団中の前記細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、前記非野生型遺伝子型を含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１４】
前記少なくとも２つのｇＲＮＡの各ｇＲＮＡが、目的の前記ゲノム領域内の異なる標的部位にハイブリダイズする、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記少なくとも２つのｇＲＮＡの各ｇＲＮＡが、前記１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つの他のガイドＲＮＡの標的部位から少なくとも３０塩基離れている標的部位にハイブリダイズ可能である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
複数の目的のゲノム領域をターゲティングする複数の組のｇＲＮＡを導入することをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１７】
前記複数の組のｇＲＮＡの各々が、細胞の前記集団の複数のサブセットの各々と接触される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記複数の組のｇＲＮＡの各々が、前記複数の目的のゲノム領域内の異なる目的のゲノム領域をターゲティングする、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
細胞の前記集団の前記複数のサブセットの少なくとも５０％における細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、非野生型遺伝子型を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
細胞の前記集団の前記複数のサブセットの少なくとも７０％における細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、非野生型遺伝子型を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２１】
細胞の前記集団の前記複数のサブセットの少なくとも９０％における細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、非野生型遺伝子型を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２２】
表現型について細胞の前記集団をスクリーニングすることをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年５月１６日出願の米国仮出願第６２／６７２，４３７号の利益を主張し、この出願は、参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
特定のＤＮＡ配列をターゲティングおよび操作するために設計された操作ヌクレアーゼ技術は、細胞および生物全体の遺伝子操作、ターゲティングされた遺伝子欠失、置換および修復、ならびに外因性配列（導入遺伝子）のゲノムへの挿入を含む、多くの異なる適用のための有用な技術として急速に採用されている。ゲノム編集技術の例には、ジンクフィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ）、およびＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ：クラスター化規則的配置短回分反復配列）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ＣＲＩＳＰＲ関連）（「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」）系が含まれる。
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を、多くの異なる生物において遺伝子編集ツールとして使用して、標的部位において切断部位を生成し、次に遺伝子座において突然変異を導入することができる。２つの主要な成分：Ｃａｓ酵素のようなエンドヌクレアーゼ、および特定のＤＮＡ標的配列を認識するための短鎖ＲＮＡ分子が、遺伝子編集プロセスに必要とされ得る。ＤＮＡ標的毎にヌクレアーゼ酵素を操作する代わりに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、カスタマイズした短鎖ＲＮＡ分子に依拠して、Ｃａｓ酵素を新しいＤＮＡ標的部位に動員することができる。Ｃａｓ酵素の例には、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１が含まれる。
【０００４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ゲノム編集および転写調節のために原核生物系および真核生物系において使用することができる。一部の場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、望ましくないオフターゲットゲノム編集を生じ、また遺伝子標的が異なると編集効率が変動する場合がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子操作のための、各々の標的オリゴヌクレオチド配列を認識する１つまたは複数のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ分子）を設計することに関する技術を説明し、特に、本開示は、目的の種の全ゲノムにわたるオフターゲット値を決定して、オフターゲットゲノム編集を最小限にし、かつ編集効率を改善する方法を説明する。本開示は、そのようなオリゴヌクレオチドの設計および確証を行うためのソフトウェアおよびハードウェア構成を説明する。
【０００６】
ある特定の実施形態では、ゲノム内の目的のゲノム領域にハイブリダイズ可能な１組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を識別するための方法であって、１組のｇＲＮＡを設計することであって、前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、前記１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つの他のガイドＲＮＡの、目的の前記ゲノム領域内の複数の標的部位中の異なる標的部位から少なくとも３０塩基離れている、前記複数の標的部位からの標的部位にハイブリダイズ可能である、設計することを含む方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、前記標的部位が、前記異なる標的部位から多くても１７０塩基離れている。
【０００７】
一部の実施形態では、前記１組のｇＲＮＡ中の少なくとも１つのｇＲＮＡの配列が、目的の前記ゲノム領域に相補的である。一部の実施形態では、前記１組のｇＲＮＡ中の少なくとも１つのｇＲＮＡの配列が、目的の前記ゲノム領域に部分的に相補的である。一部の実施形態では、目的の前記ゲノム領域に部分的に相補的な前記１組のｇＲＮＡ中の前記少なくとも１つのｇＲＮＡの配列が、目的の前記ゲノム領域と比較して１、２、３、４、５個または５個よりも多いミスマッチを含む。一部の実施形態では、前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約１７〜約４２塩基の長さである。一部の実施形態では、前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約２０塩基の長さである。一部の実施形態では、前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約２０塩基のガイド配列を含み、約２２〜約８０塩基の長さの定常領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡの前記ガイド配列が、目的の前記ゲノム領域に選択的にハイブリダイズする。一部の実施形態では、最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約１００塩基の長さである。
【０００８】
一部の実施形態では、目的の前記ゲノム領域が、遺伝子のコード領域を含む。一部の実施形態では、目的の前記ゲノム領域が、前記遺伝子のエクソンを含む。一部の実施形態では、目的の前記ゲノム領域が、遺伝子のファミリーを含む。一部の実施形態では、目的の前記ゲノム領域が、遺伝子の前記ファミリーからの１つまたは複数のコード領域を含む。一部の実施形態では、目的の前記ゲノム領域が、前記ゲノムの非コード領域を含む。一部の実施形態では、前記非コード領域が、調節エレメントである。一部の実施形態では、前記調節エレメントが、シス調節エレメントまたはトランス調節エレメントである。一部の実施形態では、前記シス調節エレメントが、プロモーター、エンハンサーおよびサイレンサーからなる群から選択される。
【０００９】
一部の実施形態では、目的の前記ゲノム領域が、５ｋｂ超、１０ｋｂ超、１５ｋｂ超、２０ｋｂ超、５０ｋｂ超、または１００ｋｂ超にわたる。一部の実施形態では、前記１組のｇＲＮＡが、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個のｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、前記１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つのｇＲＮＡが、改変を含む。一部の実施形態では、前記改変が、２’−Ｏ−Ｃ１〜４アルキル、例えば、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−デオキシ（２’−Ｈ）、２’−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、例えば、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−アラビノシル（２’−アラビノ）ヌクレオチド、２’−Ｆ−アラビノシル（２’−Ｆ−アラビノ）ヌクレオチド、２’−ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−非ロックド核酸（ＵＬＮＡ）ヌクレオチド、ｌ形態の糖（ｌ−糖）および４’−チオリボシルヌクレオチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記改変が、ホスホロチオエート、ホスホノカルボキシレート、チオホスホノカルボキシレート、アルキルホスホネートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオチド間結合改変である。一部の実施形態では、前記改変が、２−チオウラシル（２−チオＵ）、２−チオシトシン（２−チオＣ）、４−チオウラシル（４−チオＵ）、６−チオグアニン（６−チオＧ）、２−アミノアデニン（２−アミノＡ）、２−アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、５−メチルシトシン（５−メチルＣ）、５−メチルウラシル（５−メチルＵ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルウラシル、５，６−デヒドロウラシル、５−プロピニルシトシン、５−プロピニルウラシル、５−エチニルシトシン、５−エチニルウラシル、５−アリルウラシル（５−アリルＵ）、５−アリルシトシン（５−アリルＣ）、５−アミノアリルウラシル（５−アミノアリルＵ）、５−アミノアリル−シトシン（５−アミノアリルＣ）、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ塩基、Ｐ塩基、非構造核酸（ＵＮＡ）、イソグアニン（イソＧ）、イソシトシン（イソＣ）および５−メチル−２−ピリミジンからなる群から選択される。
【００１０】
一部の実施形態では、前記複数の標的部位の標的部位が、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３およびＣｐｆ１からなる群から選択されるヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する。一部の実施形態では、前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、前記ヌクレアーゼが、不活性化Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、前記１組のｇＲＮＡが、細胞において目的の前記ゲノム領域内の遺伝子をノックアウトするように設計される。一部の実施形態では、前記細胞が、ヒト初代細胞、ヒト不死化細胞、ヒト誘導多能性幹細胞、マウス胚性幹細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、前記設計することが、コンピュータによって行われる。一部の実施形態では、１組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むキットであって、前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、本明細書に記載の方法のいずれかによって設計されている、キットが本明細書に記載される。
【００１１】
ある特定の実施形態では、ゲノム内の目的のゲノム領域にハイブリダイズ可能な１組のｇＲＮＡを含むキットであって、前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、前記１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つの他のガイドＲＮＡの、目的の前記ゲノム領域内の複数の標的部位中の異なる標的部位から少なくとも３０塩基離れている、前記複数の標的部位からの標的部位にハイブリダイズ可能である、キットが本明細書に記載される。一部の実施形態では、前記標的部位が、前記異なる標的部位から多くても１７０塩基離れている。一部の実施形態では、前記１組のｇＲＮＡが、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個のｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、前記キットは、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３およびＣｐｆ１からなる群から選択される１つまたは複数のヌクレアーゼをさらに含む。一部の実施形態では、前記キットは、複数の組のｇＲＮＡをさらに含み、各組のｇＲＮＡが、前記ゲノム内の異なる目的のゲノム領域にハイブリダイズ可能である。一部の実施形態では、前記１つまたは複数のヌクレアーゼが、少なくとも１つのｇＲＮＡにカップリングされている。
【００１２】
ある特定の実施形態では、ある種のゲノムの遺伝子にハイブリダイズするための１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を選択するための方法であって、前記遺伝子にハイブリダイズする最初の組のガイドＲＮＡの複数のガイドＲＮＡの各々について、前記ゲノム内の潜在的ガイドＲＮＡハイブリダイズ部位に対するミスマッチの数を数え上げることによってオフターゲット値を計算することを含む方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、前記複数のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、１００塩基の長さである。一部の実施形態では、前記複数のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡの約２０塩基が、目的のゲノム領域内の異なる標的部位にハイブリダイズする。一部の実施形態では、ミスマッチの前記数が、０である。一部の実施形態では、ミスマッチの前記数が、１である。一部の実施形態では、ミスマッチの前記数が、２である。一部の実施形態では、ミスマッチの前記数が、３である。一部の実施形態では、前記計算することが、前記最初の組のガイドＲＮＡの各ｇＲＮＡについてのミスマッチの前記数の総和を得る。一部の実施形態では、前記計算することが、ミスマッチの前記数をシャードへと組織化する。
【００１３】
一部の実施形態では、前記オフターゲット値が、参照ゲノムに対して計算される。一部の実施形態では、前記参照ゲノムが、ヒト参照ゲノムである。一部の実施形態では、前記参照ゲノムが、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ  Ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏおよびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記オフターゲット値が、参照ゲノムの１，０００，０００ｂｐにわたり、または参照ゲノムにわたり決定される。一部の実施形態では、前記オフターゲット値が、ヌクレアーゼの結合部位のデータベースに対して計算される。一部の実施形態では、前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３およびＣｐｆ１からなる群から選択される。一部の実施形態では、前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、前記データベースが、前記ヌクレアーゼの１０，０００を超えるか、５０，０００を超えるか、１００，０００を超えるか、１５０，０００を超えるか、２００，０００を超えるか、２５０，０００を超えるか、３００，０００を超えるか、３５０，０００を超えるか、４００，０００を超えるか、４５０，０００を超えるか、５００，０００を超えるか、５５０，０００を超えるか、６００，０００を超えるか、６５０，０００を超えるか、７００，０００を超えるか、７５０，０００を超えるか、８００，０００を超えるか、８５０，０００を超えるか、９００，０００を超えるか、９５０，０００を超えるか、または１，０００，０００を超える結合部位を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ結合部位の前記データベースが、前記ヌクレアーゼの２５００万を超えるか、５０００万を超えるか、７５００万を超えるか、１億を超えるか、１億２５００万を超えるか、１億５０００万を超えるか、１億７５００万を超えるか、２億を超えるか、２億２５００万を超えるか、２億５０００万を超えるか、２億７５００万を超えるか、または３億を超える結合部位を含む。一部の実施形態では、ミスマッチの前記数を数え上げることによって前記オフターゲット値を前記計算することが、コンピュータによって行われる。
【００１４】
ある特定の実施形態では、ある種のゲノムの遺伝子にハイブリダイズするための１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計するための方法であって、前記遺伝子の複数の転写物から転写物を選択することと、最初の組のｇＲＮＡを識別することであって、前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、選択された前記転写物の前記遺伝子内の異なる標的部位にハイブリダイズする、識別することとを含む方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約１７〜約４２塩基の長さである。一部の実施形態では、前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約２０塩基の長さである。一部の実施形態では、前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約２０塩基のガイド配列および約２２〜約８０塩基の長さの定常領域を含む。一部の実施形態では、前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡの前記ガイド配列が、標的部位に選択的にハイブリダイズする。一部の実施形態では、前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、約１００塩基の長さである。一部の実施形態では、選択された前記転写物が、データベース中の前記遺伝子の最も豊富な転写物である。一部の実施形態では、選択された前記転写物が、前記遺伝子の前記複数の転写物の最も長い転写物である。
【００１５】
一部の実施形態では、前記方法は、選択された前記転写物中に存在する前記遺伝子内のコード領域を選択することをさらに含む。一部の実施形態では、選択された前記コード領域が、初期位置エクソンである。一部の実施形態では、前記初期位置エクソンが、前記遺伝子の前半に存在する。一部の実施形態では、前記初期位置エクソンが、前記遺伝子の第１、第２、第３、第４、第５または第６エクソンである。一部の実施形態では、選択された前記コード領域が、前記遺伝子の前記複数の転写物の中で最も豊富な転写物の選択されたエクソンである。一部の実施形態では、選択された前記エクソンが、前記複数の転写物において１つまたは複数の他のエクソンよりも長い。一部の実施形態では、選択された前記エクソンが、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも５５ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも６５ｂｐ、少なくとも７０ｂｐまたは少なくとも７５ｂｐである。一部の実施形態では、選択された前記エクソンが、前記複数の転写物において長さおよび豊富さの両方に基づいて選択される。
【００１６】
一部の実施形態では、前記方法は、前記最初の組のｇＲＮＡの各ｇＲＮＡについてのオフターゲット値を決定することをさらに含む。一部の実施形態では、前記オフターゲット値が、前記種の前記ゲノムにわたり決定される。一部の実施形態では、前記ゲノムが、前記種の参照ゲノムである。一部の実施形態では、前記種の前記参照ゲノムが、染色体および位置が決定されていないコンティグを含有する完全な参照アセンブリである。一部の実施形態では、前記方法は、前記ゲノム内の複数の標的部位と比較して前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡについてのミスマッチの数を数え上げることによって前記オフターゲット値を決定することをさらに含む。一部の実施形態では、前記複数の標的部位が、前記ゲノムにわたる全ての可能なＣａｓヌクレアーゼ結合部位を含む。一部の実施形態では、前記複数の標的部位が、少なくとも１０００個、１０，０００個、１００，０００個、２００，０００個、３００，０００個、４００，０００個、５００，０００個、６００，０００個、７００，０００個、８００，０００個、９００，０００個、１，０００，０００個、２，０００，０００個または３，０００，０００個の標的部位を含む。一部の実施形態では、前記複数の標的部位が、少なくとも１００，０００，０００個、２００，０００，０００個、３００，０００，０００個、４００，０００，０００個、５００，０００，０００個、６００，０００，０００個、７００，０００，０００個、８００，０００，０００個、９００，０００，０００個、１，０００，０００，０００個または１，５００，０００，０００個の標的部位を含む。前記数え上げることが、０、１、２、３または４個のミスマッチの数を有する前記最初の組のガイドＲＮＡの各ｇＲＮＡについてのオフターゲットハイブリダイゼーション領域を決定することを含む。
【００１７】
一部の実施形態では、前記異なる標的部位の標的部位が、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３およびＣｐｆ１からなる群から選択されるヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する。一部の実施形態では、前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、前記ＰＡＭ部位が、ＮＧＧである。一部の実施形態では、前記ヌクレアーゼが、不活性化Ｃａｓである。一部の実施形態では、前記種が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ  Ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏおよびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓからなる群から選択される。
【００１８】
一部の実施形態では、前記方法は、オンターゲット効率閾値およびオフターゲット閾値に基づいて前記最初の組のｇＲＮＡからガイドＲＮＡのサブセットを選択することをさらに含む。一部の実施形態では、前記最初の組のｇＲＮＡの各ガイドＲＮＡについての前記オンターゲット効率閾値が、アジマススコアを計算することによって決定される。一部の実施形態では、前記アジマススコアが、０．４を超える。一部の実施形態では、前記識別することが、前記アジマススコアの閾値およびオフターゲットハイブリダイズ値に基づく。一部の実施形態では、前記最初の組のｇＲＮＡが、細胞において前記遺伝子をノックアウトする。一部の実施形態では、前記最初の組のｇＲＮＡが、細胞において前記遺伝子に突然変異をノックインする。
【００１９】
一部の実施形態では、前記細胞が、ヒト初代細胞、ヒト不死化細胞、ヒト誘導多能性幹細胞、マウス胚性幹細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、前記最初の組のガイドＲＮＡ中の少なくとも１つのガイドＲＮＡからの少なくとも１つのヌクレオチドが、改変を含む。一部の実施形態では、前記改変が、２’−Ｏ−Ｃ１〜４アルキル、例えば、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−デオキシ（２’−Ｈ）、２’−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、例えば、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−アラビノシル（２’−アラビノ）ヌクレオチド、２’−Ｆ−アラビノシル（２’−Ｆ−アラビノ）ヌクレオチド、２’−ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−非ロックド核酸（ＵＬＮＡ）ヌクレオチド、Ｌ形態の糖（Ｌ−糖）および４’−チオリボシルヌクレオチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記改変が、ホスホロチオエート、ホスホノカルボキシレート、チオホスホノカルボキシレート、アルキルホスホネートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオチド間結合改変である。一部の実施形態では、前記改変が、２−チオウラシル（２−チオＵ）、２−チオシトシン（２−チオＣ）、４−チオウラシル（４−チオＵ）、６−チオグアニン（６−チオＧ）、２−アミノアデニン（２−アミノＡ）、２−アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、５−メチルシトシン（５−メチルＣ）、５−メチルウラシル（５−メチルＵ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルウラシル、５，６−デヒドロウラシル、５−プロピニルシトシン、５−プロピニルウラシル、５−エチニルシトシン、５−エチニルウラシル、５−アリルウラシル（５−アリルＵ）、５−アリルシトシン（５−アリルＣ）、５−アミノアリルウラシル（５−アミノアリルＵ）、５−アミノアリル−シトシン（５−アミノアリルＣ）、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ塩基、Ｐ塩基、非構造核酸（ＵＮＡ）、イソグアニン（イソＧ）、イソシトシン（イソＣ）および５−メチル−２−ピリミジンからなる群から選択される。
【００２０】
一部の実施形態では、前記選択することおよび前記識別することが、コンピュータによって行われる。一部の実施形態では、前記最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、前記最初の組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つの他のガイドＲＮＡの標的部位から少なくとも３０塩基離れている標的部位にハイブリダイズ可能である。一部の実施形態では、１組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むキットであって、前記１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが、本明細書に記載の方法のいずれかによって設計されている、キットが本明細書に記載される。
【００２１】
ある特定の実施形態では、目的のゲノム領域を編集するための方法であって、目的の前記ゲノム領域を含む細胞の集団を、（ｉ）目的の前記ゲノム領域をターゲティングする少なくとも２つのｇＲＮＡを含む１組のｇＲＮＡ、および（ｉｉ）ヌクレアーゼと接触させることであって、少なくとも２つのｇＲＮＡを含む前記１組のｇＲＮＡの編集効率が、前記少なくとも２つのｇＲＮＡの各々の個々の編集効率よりも高い、接触させることを含む方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、目的の前記ゲノム領域が、遺伝子のコード領域である。一部の実施形態では、前記コード領域が、前記遺伝子のエクソンである。一部の実施形態では、目的の前記ゲノム領域が、ゲノム内の非コード領域である。一部の実施形態では、前記非コード領域が、調節エレメントである。一部の実施形態では、前記調節エレメントが、シス調節エレメントまたはトランス調節エレメントである。一部の実施形態では、前記シス調節エレメントが、プロモーター、エンハンサーおよびサイレンサーからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記方法は、前記細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記細胞の野生型遺伝子型と比較して点突然変異、対立遺伝子、タグまたは外因性エクソンを含む。
【００２２】
一部の実施形態では、前記編集効率が、前記接触させることの後の非野生型遺伝子型を含む、細胞の前記集団中の細胞の割合である。一部の実施形態では、前記非野生型遺伝子型が、遺伝子のノックアウトである。一部の実施形態では、前記非野生型遺伝子型が、野生型遺伝子型と比較した挿入または欠失である。一部の実施形態では、細胞の前記集団中の前記細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、前記非野生型遺伝子型を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのｇＲＮＡの各ｇＲＮＡが、目的の前記ゲノム領域内の異なる標的部位にハイブリダイズする。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのｇＲＮＡの各ｇＲＮＡが、前記１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つの他のガイドＲＮＡの標的部位から少なくとも３０塩基離れている標的部位にハイブリダイズ可能である。
【００２３】
一部の実施形態では、前記方法は、複数の目的のゲノム領域をターゲティングする複数の組のｇＲＮＡを導入することをさらに含む。一部の実施形態では、前記複数の組のｇＲＮＡの各々が、細胞の前記集団の複数のサブセットの各々と接触される。一部の実施形態では、前記複数の組のｇＲＮＡの各々が、前記複数の目的のゲノム領域内の異なる目的のゲノム領域をターゲティングする。一部の実施形態では、細胞の前記集団の前記複数のサブセットの少なくとも５０％における細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、非野生型遺伝子型を含む。一部の実施形態では、細胞の前記集団の前記複数のサブセットの少なくとも７０％における細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、非野生型遺伝子型を含む。一部の実施形態では、細胞の前記集団の前記複数のサブセットの少なくとも９０％における細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、非野生型遺伝子型を含む。
【００２４】
一部の実施形態では、前記方法は、表現型について細胞の前記集団をスクリーニングすることをさらに含む。
【００２５】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のコンピュータプロセッサー；および１つまたは複数のコンピュータプロセッサーによって実行された場合、システムが、遺伝子の複数の転写物から転写物を選択し、選択された転写物の遺伝子内の複数の標的部位から、異なる標的部位にハイブリダイズする最初の組のｇＲＮＡを識別することをもたらすように作動可能な命令を含む非一過性コンピュータ可読媒体を含む、ある種のゲノムの遺伝子にハイブリダイズするための１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ：ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）を設計するためのコンピュータシステムが、本明細書で説明される。一部の実施形態では、最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡは、約１７〜約４２塩基の長さである。一部の実施形態では、最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡは、約２０塩基の長さである。一部の実施形態では、最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡは、約２０塩基のガイド配列を含み、約２２〜約８０塩基の長さの定常領域をさらに含む。一部の実施形態では、最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡのガイド配列は、遺伝子に選択的にハイブリダイズする。一部の実施形態では、最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡは、約１００塩基の長さである。一部の実施形態では、選択された転写物は、データベース中の遺伝子の最も豊富な転写物である。一部の実施形態では、選択された転写物は、遺伝子の複数の転写物の最も長い転写物である。
【００２６】
一部の実施形態では、命令は、システムが、選択された転写物に存在する遺伝子内のコード領域を選択し、それによって、選択されたコード領域を選択することをもたらすようにさらに作動可能である。一部の実施形態では、選択されたコード領域は、初期位置エクソン（ｅａｒｌｙ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｅｘｏｎ）である。一部の実施形態では、初期位置エクソンは、遺伝子の前半に存在する。一部の実施形態では、初期位置エクソンは、遺伝子の第１、第２、第３、第４、第５または第６エクソンである。一部の実施形態では、選択されたコード領域は、遺伝子の複数の転写物中で最も豊富な転写物の選択されたエクソンである。一部の実施形態では、選択されたエクソンは、複数の転写物中で１つまたは複数の他のエクソンよりも長い。一部の実施形態では、選択されたエクソンは、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも５５ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも６５ｂｐ、少なくとも７０ｂｐまたは少なくとも７５ｂｐである。一部の実施形態では、選択されたエクソンは、複数の転写物中で長さおよび豊富さの両方に基づいて選択される。一部の実施形態では、命令は、システムが、最初の組のｇＲＮＡの各ｇＲＮＡについてのオフターゲット値を決定することをもたらすようにさらに作動可能である。一部の実施形態では、命令は、システムが、種のゲノムにわたり決定することをもたらすようにさらに作動可能である。
【００２７】
一部の実施形態では、ゲノムは、種の参照ゲノムである。一部の実施形態では、種の参照ゲノムは、染色体および位置が決定されていない（ｕｎｌｏｃａｌｉｚｅｄ）コンティグを含む完全な参照アセンブリである。一部の実施形態では、命令は、システムが、最初の組のｇＲＮＡ中のｇＲＮＡの各々についての、ゲノム内の複数の標的部位と比較したミスマッチの数を数え上げることによってオフターゲット値を決定することをもたらすようにさらに作動可能である。一部の実施形態では、複数の標的部位は、ゲノムにわたる全ての可能なＣａｓヌクレアーゼ結合部位を含む。一部の実施形態では、複数の標的部位は、少なくとも１０００、１０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００または３，０００，０００個の標的部位を含む。一部の実施形態では、複数の標的部位は、少なくとも１００，０００，０００、２００，０００，０００、３００，０００，０００、４００，０００，０００、５００，０００，０００、６００，０００，０００、７００，０００，０００、８００，０００，０００、９００，０００，０００、１，０００，０００，０００または１，５００，０００，０００個の標的部位を含む。一部の実施形態では、数え上げることは、０、１、２、３または４個のミスマッチの数を有する最初の組のガイドＲＮＡの各ｇＲＮＡについてのオフターゲットハイブリダイゼーション領域を決定することを含む。一部の実施形態では、複数の標的部位の標的部位は、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３およびＣｐｆ１からなる群から選択されるヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、ＰＡＭ部位は、ＮＧＧである。一部の実施形態では、種は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ  Ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏおよびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓからなる群から選択される。
【００２８】
一部の実施形態では、命令は、システムが、オンターゲット効率閾値およびオフターゲット閾値に基づいて最初の組のｇＲＮＡからガイドＲＮＡのサブセットを選択することをもたらすようにさらに作動可能である。一部の実施形態では、最初の組のｇＲＮＡの各ガイドＲＮＡについてのオンターゲット効率閾値は、アジマススコア(azimuth score)を計算することによって決定される。一部の実施形態では、アジマススコアは、０．４よりも大きい。一部の実施形態では、命令は、システムが、アジマススコアおよびオフターゲットハイブリダイズ値の閾値に基づいて最初の組のｇＲＮＡを識別することをもたらすようにさらに作動可能である。一部の実施形態では、最初の組のガイドＲＮＡ中の少なくとも１つのガイドＲＮＡからの少なくとも１つのヌクレオチドは、改変を含む。一部の実施形態では、改変は、２’−Ｏ−Ｃ１〜４アルキル、例えば、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−デオキシ（２’−Ｈ）、２’−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、例えば、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−アラビノシル（２’−アラビノ）ヌクレオチド、２’−Ｆ−アラビノシル（２’−Ｆ−アラビノ）ヌクレオチド、２’−ロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）ヌクレオチド、２’−非ロックド核酸（ＵＬＮＡ：ｕｎｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）ヌクレオチド、ｌ形態の糖（ｌ−糖）および４’−チオリボシルヌクレオチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、改変は、ホスホロチオエート、ホスホノカルボキシレート、チオホスホノカルボキシレート、アルキルホスホネートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオチド間結合改変である。一部の実施形態では、改変は、２−チオウラシル（２−チオＵ）、２−チオシトシン（２−チオＣ）、４−チオウラシル（４−チオＵ）、６−チオグアニン（６−チオＧ）、２−アミノアデニン（２−アミノＡ）、２−アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、５−メチルシトシン（５−メチルＣ）、５−メチルウラシル（５−メチルＵ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルウラシル、５，６−デヒドロウラシル、５−プロピニルシトシン、５−プロピニルウラシル、５−エチニルシトシン、５−エチニルウラシル、５−アリルウラシル（５−アリルＵ）、５−アリルシトシン（５−アリルＣ）、５−アミノアリルウラシル（５−アミノアリルＵ）、５−アミノアリル−シトシン（５−アミノアリルＣ）、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ塩基、Ｐ塩基、非構造核酸（ＵＮＡ：Ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、イソグアニン（イソＧ）、イソシトシン（イソＣ）および５−メチル−２−ピリミジンからなる群から選択される。一部の実施形態では、組における各ｇＲＮＡは、目的のゲノム領域内の異なる標的部位にハイブリダイズ可能であり；かつ１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つの他のガイドＲＮＡの標的部位から少なくとも３０塩基離れている標的部位にハイブリダイズ可能である。
【００２９】
ある特定の実施形態では、個体のゲノム領域にハイブリダイズするための１つまたは複数のガイドＲＮＡを設計するための方法であって、個体のゲノムを使用して、ｇＲＮＡ標的部位潜在性を決定することと；ｇＲＮＡ標的部位潜在性の各ｇＲＮＡ標的部位潜在性について、見込みがあるガイドＲＮＡについてのオフターゲット値を決定することと；改善された効用指数を有する１つまたは複数のガイドＲＮＡを識別することとを含む方法が、本明細書で説明される。一部の実施形態では、１つまたは複数のｇＲＮＡの各ｇＲＮＡは、約１００塩基の長さである。一部の実施形態では、１つまたは複数のｇＲＮＡの各ｇＲＮＡの約２０塩基は、ｇＲＮＡ標的部位潜在性の各ｇＲＮＡ標的部位潜在性にハイブリダイズ可能である。一部の実施形態では、効用指数は、治療指数である。一部の実施形態では、治療指数は、オフターゲット結合の低減、オンターゲット効率の増大、ノックアウト効率の増大、ノックイン効率の増大またはＣＲＩＳＰＲ干渉の調節を含む。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、個体は、状態を患っている。一部の実施形態では、個体は、１つまたは複数の状態を患っている集団群の部分である。一部の実施形態では、１つまたは複数の状態は、１つまたは複数の種類のがんを含む。一部の実施形態では、状態は、がんである。
【００３０】
一部の実施形態では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、個体の細胞のゲノム領域内の遺伝子をノックアウトするように設計される。一部の実施形態では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、個体の細胞のゲノム領域において突然変異をノックインするように設計される。一部の実施形態では、方法は、細胞を、改善された効用指数を有する１つまたは複数のガイドＲＮＡで編集することをさらに含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ標的部位潜在性の決定および１つまたは複数のガイドＲＮＡの特定は、コンピュータによって行われる。
【００３１】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ剤の、個体に対するオフターゲット効果を評価するための方法であって、個体のゲノムを使用して、コンピュータシステムによって、個体のゲノム内の潜在的標的部位に対するミスマッチの数を数え上げることによってＣＲＩＳＰＲ剤のオフターゲット値を決定することを含む方法が、本明細書で説明される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ剤は、治療剤である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ剤は、約１００塩基の長さのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的にハイブリダイズ可能な２０塩基を含む。一部の実施形態では、ミスマッチの数は独立して、標的にハイブリダイズ可能な２０塩基の各々について計算される。
【００３２】
一部の実施形態では、数え上げることは、潜在的標的部位からの１、２、３、４または５個のミスマッチの数のうちの少なくとも２つを別々に数え上げることを含む。一部の実施形態では、潜在的標的部位の数は、少なくとも１０００、１０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００または３，０００，０００個である。一部の実施形態では、方法は、個体のゲノム内の潜在的標的部位に対するミスマッチの数を数え上げる報告を出力することをさらに含む。一部の実施形態では、出力することは、スクリーン上に表示される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ剤のオフターゲット効果の評価は、コンパニオン診断として使用される。
【００３３】
ある特定の実施形態では、見込みがあるｇＲＮＡを確証するための方法であって、コンピュータシステム上で、ゲノムまたはゲノムの部分において見込みがあるｇＲＮＡの複数のオフターゲット部位を決定することと；コンピュータシステムを使用して、複数のオフターゲット部位中の各オフターゲット部位についての見込みがあるｇＲＮＡのオフターゲット値を計算することと；コンピュータシステムを使用して、オフターゲット値を使用して見込みがあるｇＲＮＡの活性を予測することとを含む方法が、本明細書で説明される。一部の実施形態では、予測することは、オンターゲットハイブリダイゼーション部位またはオフターゲットハイブリダイゼーション部位の潜在性をリストにする。一部の実施形態では、ゲノムまたはゲノムの部分は、１，０００，０００ｂｐ超である。一部の実施形態では、オフターゲット値は、ｇＲＮＡについての、複数のオフターゲット部位に対するミスマッチの数を計算することによって決定される。一部の実施形態では、ミスマッチの数は、０、１、２、３および／または４個である。一部の実施形態では、複数のオフターゲット部位は、少なくとも１００，０００，０００個のオフターゲット部位を含む。
【００３４】
ある特定の実施形態では、目的の種および目的の種からの目的の遺伝子を選択するように構成されたユーザーインターフェースシステムと；目的の遺伝子のための１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を識別するように構成された、ユーザーインターフェースと統合された設計モジュールと；選択されたｇＲＮＡを表示するように構成された出力システムと；１つまたは複数のｇＲＮＡのＲＮＡシンセサイザーによる合成を開始するように構成されたアクティベーションユニットとを含むコンピュータシステムが、本明細書で説明される。一部の実施形態では、各ｇＲＮＡは、約２０塩基の長さである。一部の実施形態では、ユーザーインターフェースシステムは、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、５００，０００個超の異なる参照ゲノムの選択を含む。一部の実施形態では、設計モジュールは、オフターゲット値およびオンターゲット効率スコアに基づいてｇＲＮＡを選択するように構成される。一部の実施形態では、設計モジュールは、クラウドにおける参照ゲノムにアクセスするように構成される。一部の実施形態では、設計モジュールは、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１１０，０００または１２０，０００個よりも多い参照ゲノムにアクセスするように構成される。一部の実施形態では、ユーザーインターフェースは、個体のゲノムの入力を得るためのゲノムデータ受信モジュールを含む。一部の実施形態では、ゲノムデータ受信モジュールは、サーバーから、またはユーザーによってアップロードされたファイルから個体のゲノムを得るように構成される。
【００３５】
ある特定の実施形態では、ユーザーに１０，０００個よりも多い参照ゲノムへのアクセスを提供するように構成されたインターフェースと；５０，０００個よりも多い参照ゲノムのうちの任意の１つにおける遺伝子について１つまたは複数のガイドＲＮＡを選択するように構成されたソフトウェアと；選択されたガイドＲＮＡを表示するように構成された出力システムとを含むシステムが、本明細書で説明される。一部の実施形態では、システムは、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１１０，０００または１２０，０００個よりも多い参照ゲノムを含む。一部の実施形態では、システムは、少なくとも１つまたは複数のガイドＲＮＡの合成を活性化および開始するように構成されたスクリプトをさらに含む。
【００３６】
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計するための方法であって、コンピュータシステムによって、遺伝子の主要な転写物を識別することと；コンピュータシステムによって、主要な転写物と複数の選択的転写物との間の共通エクソンを識別することと；コンピュータシステムによって、共通エクソン内のヌクレアーゼ標的部位を識別することと；コンピュータシステムによって、ヌクレアーゼについての参照ゲノム配列におけるオフターゲット結合部位の数を計算し、それによって、計算されたヌクレアーゼオフターゲット結合部位の数を得ることと；コンピュータシステムによって、オンターゲット効率スコアを計算し、それによって、計算されたオンターゲット効率スコアを得ることと；コンピュータシステムによって、少なくとも１つのｇＲＮＡ配列を出力することであって、少なくとも１つのｇＲＮＡ配列が、計算されたオンターゲット効率が閾値を超え、計算されたヌクレアーゼオフターゲット結合部位の数が０である配列を含む、出力することとを含む方法が、本明細書で説明される。一部の実施形態では、方法は、標的部位に対して部分的相補性を有する核酸の合成を方向付けることをさらに含む。一部の実施形態では、１組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むキットであって、１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡが本明細書で説明される方法のいずれかによって設計される、キットが、本明細書で説明される。
【００３７】
ある特定の実施形態では、ネットワークを通じてユーザーのデジタルコンピュータと通信するように構成された通信インターフェースと；１つまたは複数の参照ゲノムを保存するように構成された参照ゲノムデータベースと；通信インターフェースおよびデータベースに作動可能に連結された１つまたは複数のコンピュータプロセッサーを含むコンピュータであって、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーが個々に、または集合的に、（ａ）ネットワークを通じて通信インターフェースから、ユーザーのデジタルコンピュータからのバイオポリマー合成リクエストを受信することであって、バイオポリマー合成リクエストが標的ゲノム情報を含む、受信すること、（ｂ）データベースからの１つまたは複数の参照ゲノムに対して標的ゲノム情報を処理して、標的ゲノム情報に対応する標的配列を識別すること、（ｃ）アルゴリズムを実行して、標的配列と少なくとも部分的に相補的な第１の組のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）配列を生成し、第１の組のｇＲＮＡ配列におけるｇＲＮＡ配列の各々についてオフターゲット相補性スコアを計算すること、（ｄ）ユーザーのデジタルコンピュータのグラフィカルユーザーインターフェース上での表示のために第２の組のｇＲＮＡ配列を出力することであって、第２の組のｇＲＮＡ配列の各々が閾値未満の計算されたオフターゲット相補性スコアを有する、出力すること、（ｅ）ユーザーのデジタルコンピュータから、第２の組のｇＲＮＡ配列からの所与のｇＲＮＡ配列の選択を受信することを行うように構成された、コンピュータとを含むネットワークを通じたユーザーからのバイオポリマー合成リクエストを処理するためのシステムが、本明細書で説明される。
【００３８】
一部の実施形態では、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーは個々に、または集合的に、キューの中の所与のｇＲＮＡ配列を、ｇＲＮＡ配列の合成へと方向付けるようにプログラミングされる。一部の実施形態では、参照ゲノムデータベース中の少なくとも１つのゲノムは、個体の個別化ゲノムである。一部の実施形態では、参照ゲノムデータベース中の少なくとも１つのゲノムは、状態を患っている集団の１組の個別化ゲノムである。一部の実施形態では、参照ゲノムは、ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ参照ゲノムである。一部の実施形態では、システムは、予測されたゲノム配列を出力することであって、予測されたゲノム配列が、第２の組のｇＲＮＡ配列からの１つまたは複数のｇＲＮＡで標的ゲノム情報を編集することの予測された出力を表す、出力することをさらに含む。一部の実施形態では、予測されたゲノム配列は、ゲノム欠失を含む。一部の実施形態では、予測されたゲノム配列は、ゲノム挿入を含む。一部の実施形態では、計算することは、アジマススコアを計算する。一部の実施形態では、第２の組のｇＲＮＡ配列は、ある特定の閾値を超える少なくとも２つのｇＲＮＡを表示する。一部の実施形態では、参照ゲノムデータベースは、少なくとも５０，０００個の参照ゲノムを含む。一部の実施形態では、参照ゲノムデータベースは、少なくとも１２０，０００個の参照ゲノムを含む。
【００３９】
ある特定の実施形態では、ネットワークを通じたユーザーからのバイオポリマー合成リクエストを処理するための方法であって、（ａ）コンピュータシステムによって、ネットワークを通じてユーザーのデジタルコンピュータからのバイオポリマー合成リクエストを受信することであって、バイオポリマー合成リクエストが標的ゲノム情報を含む、受信することと；（ｂ）コンピュータシステムによって、参照ゲノムデータベースからの１つまたは複数の参照ゲノムに対して標的ゲノム情報を処理して、標的ゲノム情報に対応する標的配列を識別することと；（ｃ）アルゴリズムを実行するために１つまたは複数のコンピュータプロセッサーを使用して、（ｉ）標的配列と少なくとも部分的に相補的な第１の組のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）配列を生成し、（ｉｉ）ｇＲＮＡ配列の各々について、第１の組のｇＲＮＡ配列におけるｇＲＮＡ配列の各々についてのオフターゲット相補性スコアを計算することと；（ｄ）コンピュータシステムによって、ユーザーのデジタルコンピュータのグラフィカルユーザーインターフェース上での表示のために第２の組のｇＲＮＡ配列を出力することであって、第２の組のｇＲＮＡ配列の各々が閾値未満の計算されたオフターゲット相補性スコアを含む、出力することと；（ｅ）ユーザーのデジタルコンピュータから、第２の組のｇＲＮＡ配列からの所与のｇＲＮＡ配列の合成についてのリクエストを受信することとを含む方法が、本明細書で説明される。
【００４０】
一部の実施形態では、合成についてのリクエストを受信する１つまたは複数のコンピュータプロセッサーは個々に、または集合的に、シンセサイザーにおける第２の組のｇＲＮＡ配列からの所与のｇＲＮＡ配列の合成を方向付けるようにプログラミングされる。一部の実施形態では、参照ゲノムデータベース中の少なくとも１つのゲノムは、個体の個別化ゲノムである。一部の実施形態では、参照ゲノムデータベース中の少なくとも２つのゲノムは、状態を患っている集団の個別化ゲノムである。一部の実施形態では、参照ゲノムは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ参照ゲノムである。一部の実施形態では、方法は、予測されたゲノム配列を出力することであって、予測されたゲノム配列が、第２の組のｇＲＮＡ配列からの１つまたは複数のｇＲＮＡで標的ゲノム情報を編集することの予測された出力を表す、出力することをさらに含む。一部の実施形態では、予測されたゲノム配列は、ゲノム欠失を含む。一部の実施形態では、予測されたゲノム配列は、ゲノム挿入を含む。一部の実施形態では、計算することは、アジマススコアを計算する。一部の実施形態では、第２の組のｇＲＮＡ配列は、ある特定の閾値を超える少なくとも２つのｇＲＮＡを表示する。一部の実施形態では、参照ゲノムデータベースは、少なくとも５０，０００個の参照ゲノムを含む。一部の実施形態では、参照ゲノムデータベースは、少なくとも１２０，０００個の参照ゲノムを含む。
【００４１】
一部の実施形態では、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーによって実行された場合、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーが、本明細書で説明される方法のいずれかを行うことをもたらすように作動可能な命令を含む非一過性コンピュータ可読媒体が、本明細書で説明される。
【００４２】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーによる実行に際して、ネットワークを通じたユーザーからのバイオポリマー合成リクエストを処理するための方法を実現する機械実行可能コードを含む非一過性コンピュータ可読媒体であって、方法が、（ａ）ネットワークを通じてユーザーのデジタルコンピュータからのバイオポリマー合成リクエストを受信することであって、バイオポリマー合成リクエストが標的ゲノム情報を含む、受信することと；（ｂ）参照ゲノムデータベースからの１つまたは複数の参照ゲノムに対して標的ゲノム情報を処理して、標的ゲノム情報に対応する標的配列を識別することと；（ｃ）アルゴリズムを実行して、標的配列と少なくとも部分的に相補的な第１の組のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）配列を生成し、第１の組のｇＲＮＡ配列におけるｇＲＮＡ配列の各々についてのオフターゲット相補性スコアを計算することと；（ｄ）ユーザーのデジタルコンピュータのグラフィカルユーザーインターフェース上での表示のために第２の組のｇＲＮＡ配列を出力することであって、第２の組のｇＲＮＡ配列の各々が閾値未満の計算されたオフターゲット相補性スコアを有する、出力することと；（ｅ）ユーザーのデジタルコンピュータから、第２の組のｇＲＮＡ配列からの所与のｇＲＮＡ配列の選択を受信することとを含む、非一過性コンピュータ可読媒体が、本明細書で説明される。
【００４３】
参照による組込み
本明細書で言及する全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が特に、かつ個々に、参照により組み込まれることが示されているのと同様に参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含有される開示と矛盾する限り、本明細書は、任意のそのような矛盾材料に代わることおよび／または優先することが意図される。
【００４４】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に、詳細に示されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用されている例証的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および付随の図面（本明細書では、「図（Ｆｉｇｕｒｅ）」や「図（ＦＩＧ．）」とも呼ばれる）を参照して、得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ある種のゲノムの遺伝子とハイブリダイズするための１個または複数のガイドを設計する方法のフローチャートの例を示す。
【００４６】
【図２−１】図２は、ある種のゲノムの遺伝子の複数の転写物の表の例を示す。
【図２−２】図２は、ある種のゲノムの遺伝子の複数の転写物の表の例を示す。
【００４７】
【図３−１】図３は、１個または複数のｇＲＮＡによりターゲティングされる転写物の初期コード領域の例を示す。
【図３−２】図３は、１個または複数のｇＲＮＡによりターゲティングされる転写物の初期コード領域の例を示す。
【００４８】
【図４Ａ】図４Ａは、転写物由来の複数のエクソンの相対的存在量およびエクソンの長さのプロットの例を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ガイドならびにそれらのオフターゲットおよびオンターゲット活性分析の例を示す。
【００４９】
【図５】図５は、ゲノムにわたる複数のガイドのオフターゲット値を計算するためのデータ処理アーキテクチャを示す。
【００５０】
【図６】図６は、ある種のゲノムの遺伝子とハイブリダイズするための１個または複数のガイドを確証する方法のフローチャートの例を示す。
【００５１】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｄは、ゲノムの遺伝子をハイブリダイズするための１個または複数のガイドの設計をリクエストするための、目的のゲノムおよび遺伝子を選択するためのグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）のウィンドウの例を示す。図７Ａは、目的のゲノムおよび目的の遺伝子を選択する前のウィンドウを例示する。図７Ｂは、タイプされた入力にマッチするゲノムのリストを示すウィンドウを例示する。図７Ｃは、タイプされた入力にマッチする遺伝子のリストを示すウィンドウを例示する。図７Ｄは、目的のゲノム、目的の遺伝子、およびヌクレアーゼの選択後のウィンドウを例示する。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｄは、ゲノムの遺伝子をハイブリダイズするための１個または複数のガイドの設計をリクエストするための、目的のゲノムおよび遺伝子を選択するためのグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）のウィンドウの例を示す。図７Ａは、目的のゲノムおよび目的の遺伝子を選択する前のウィンドウを例示する。図７Ｂは、タイプされた入力にマッチするゲノムのリストを示すウィンドウを例示する。図７Ｃは、タイプされた入力にマッチする遺伝子のリストを示すウィンドウを例示する。図７Ｄは、目的のゲノム、目的の遺伝子、およびヌクレアーゼの選択後のウィンドウを例示する。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｄは、ゲノムの遺伝子をハイブリダイズするための１個または複数のガイドの設計をリクエストするための、目的のゲノムおよび遺伝子を選択するためのグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）のウィンドウの例を示す。図７Ａは、目的のゲノムおよび目的の遺伝子を選択する前のウィンドウを例示する。図７Ｂは、タイプされた入力にマッチするゲノムのリストを示すウィンドウを例示する。図７Ｃは、タイプされた入力にマッチする遺伝子のリストを示すウィンドウを例示する。図７Ｄは、目的のゲノム、目的の遺伝子、およびヌクレアーゼの選択後のウィンドウを例示する。
【図７Ｄ】図７Ａ〜７Ｄは、ゲノムの遺伝子をハイブリダイズするための１個または複数のガイドの設計をリクエストするための、目的のゲノムおよび遺伝子を選択するためのグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）のウィンドウの例を示す。図７Ａは、目的のゲノムおよび目的の遺伝子を選択する前のウィンドウを例示する。図７Ｂは、タイプされた入力にマッチするゲノムのリストを示すウィンドウを例示する。図７Ｃは、タイプされた入力にマッチする遺伝子のリストを示すウィンドウを例示する。図７Ｄは、目的のゲノム、目的の遺伝子、およびヌクレアーゼの選択後のウィンドウを例示する。
【００５２】
【図８】図８は、目的のゲノムの遺伝子をハイブリダイズするための１個または複数のガイドを設計する過程を表示するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。
【００５３】
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｄは、目的のゲノムの遺伝子をハイブリダイズするように設計されている１個または複数のガイドを表示するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図９Ａは、１個または複数のｇＲＮＡを設計することの概要を示すウィンドウを例示する。図９Ｂは、上位にランク付けされたｇＲＮＡの選択を例示する。図９Ｃは、選択されたｇＲＮＡについての情報を示すウィンドウを例示する。図９Ｄは、目的のゲノムの遺伝子とハイブリダイズするように設計された追加のｇＲＮＡを示すウィンドウを例示する。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｄは、目的のゲノムの遺伝子をハイブリダイズするように設計されている１個または複数のガイドを表示するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図９Ａは、１個または複数のｇＲＮＡを設計することの概要を示すウィンドウを例示する。図９Ｂは、上位にランク付けされたｇＲＮＡの選択を例示する。図９Ｃは、選択されたｇＲＮＡについての情報を示すウィンドウを例示する。図９Ｄは、目的のゲノムの遺伝子とハイブリダイズするように設計された追加のｇＲＮＡを示すウィンドウを例示する。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｄは、目的のゲノムの遺伝子をハイブリダイズするように設計されている１個または複数のガイドを表示するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図９Ａは、１個または複数のｇＲＮＡを設計することの概要を示すウィンドウを例示する。図９Ｂは、上位にランク付けされたｇＲＮＡの選択を例示する。図９Ｃは、選択されたｇＲＮＡについての情報を示すウィンドウを例示する。図９Ｄは、目的のゲノムの遺伝子とハイブリダイズするように設計された追加のｇＲＮＡを示すウィンドウを例示する。
【図９Ｄ−１】図９Ａ〜９Ｄは、目的のゲノムの遺伝子をハイブリダイズするように設計されている１個または複数のガイドを表示するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図９Ａは、１個または複数のｇＲＮＡを設計することの概要を示すウィンドウを例示する。図９Ｂは、上位にランク付けされたｇＲＮＡの選択を例示する。図９Ｃは、選択されたｇＲＮＡについての情報を示すウィンドウを例示する。図９Ｄは、目的のゲノムの遺伝子とハイブリダイズするように設計された追加のｇＲＮＡを示すウィンドウを例示する。
【図９Ｄ−２】図９Ａ〜９Ｄは、目的のゲノムの遺伝子をハイブリダイズするように設計されている１個または複数のガイドを表示するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図９Ａは、１個または複数のｇＲＮＡを設計することの概要を示すウィンドウを例示する。図９Ｂは、上位にランク付けされたｇＲＮＡの選択を例示する。図９Ｃは、選択されたｇＲＮＡについての情報を示すウィンドウを例示する。図９Ｄは、目的のゲノムの遺伝子とハイブリダイズするように設計された追加のｇＲＮＡを示すウィンドウを例示する。
【００５４】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｅは、設計されたガイドについての詳細な情報を表示するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図１０Ａは、選択されたｇＲＮＡのパフォーマンスの概要を例示する。図１０Ｂは、選択されたＲＮＡガイド配列と共に、目的の標的領域と相互作用するＣａｓ−ｇＲＮＡ複合体の概略図を示す。図１０Ｃは、選択されたＰＡＭ領域と共に、目的の標的領域と相互作用するＣａｓ−ｇＲＮＡ複合体の概略図を示す。図１０Ｄは、選択された標的配列と共に、目的の標的領域と相互作用するＣａｓ−ｇＲＮＡ複合体の概略図を示す。図１０Ｅは、選択されたｇＲＮＡのオフターゲット部位のリストを例示する。
【図１０ＢＣＤ】図１０Ａ〜１０Ｅは、設計されたガイドについての詳細な情報を表示するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図１０Ａは、選択されたｇＲＮＡのパフォーマンスの概要を例示する。図１０Ｂは、選択されたＲＮＡガイド配列と共に、目的の標的領域と相互作用するＣａｓ−ｇＲＮＡ複合体の概略図を示す。図１０Ｃは、選択されたＰＡＭ領域と共に、目的の標的領域と相互作用するＣａｓ−ｇＲＮＡ複合体の概略図を示す。図１０Ｄは、選択された標的配列と共に、目的の標的領域と相互作用するＣａｓ−ｇＲＮＡ複合体の概略図を示す。図１０Ｅは、選択されたｇＲＮＡのオフターゲット部位のリストを例示する。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜１０Ｅは、設計されたガイドについての詳細な情報を表示するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図１０Ａは、選択されたｇＲＮＡのパフォーマンスの概要を例示する。図１０Ｂは、選択されたＲＮＡガイド配列と共に、目的の標的領域と相互作用するＣａｓ−ｇＲＮＡ複合体の概略図を示す。図１０Ｃは、選択されたＰＡＭ領域と共に、目的の標的領域と相互作用するＣａｓ−ｇＲＮＡ複合体の概略図を示す。図１０Ｄは、選択された標的配列と共に、目的の標的領域と相互作用するＣａｓ−ｇＲＮＡ複合体の概略図を示す。図１０Ｅは、選択されたｇＲＮＡのオフターゲット部位のリストを例示する。
【００５５】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｂは、目的のゲノムの遺伝子をハイブリダイズするように設計されている１個または複数のガイドのサブセットを選択し、かつ購入するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図１１Ａは、ｇＲＮＡサブセットの選択を示すウィンドウを例示する。図１１Ｂは、修飾型または非修飾型ｇＲＮＡを注文する追加の選択と共に、選択されたｇＲＮＡを示すウィンドウを例示する。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｂは、目的のゲノムの遺伝子をハイブリダイズするように設計されている１個または複数のガイドのサブセットを選択し、かつ購入するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図１１Ａは、ｇＲＮＡサブセットの選択を示すウィンドウを例示する。図１１Ｂは、修飾型または非修飾型ｇＲＮＡを注文する追加の選択と共に、選択されたｇＲＮＡを示すウィンドウを例示する。
【００５６】
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｂは、目的の種のゲノムを選択し、かつ前に生成されたガイド配列を入力して、そのガイドパフォーマンスの確証をリクエストするためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図１２Ａは、目的のゲノムおよびガイド配列を選択する前のウィンドウを例示する。図１２Ｂは、目的のゲノムおよびガイド配列の選択後のウィンドウを例示する。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｂは、目的の種のゲノムを選択し、かつ前に生成されたガイド配列を入力して、そのガイドパフォーマンスの確証をリクエストするためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図１２Ａは、目的のゲノムおよびガイド配列を選択する前のウィンドウを例示する。図１２Ｂは、目的のゲノムおよびガイド配列の選択後のウィンドウを例示する。
【００５７】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｂは、ガイドの確証についての詳細な情報を表示するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図１３Ａは、前に決定されたｇＲＮＡのパフォーマンスの概要を例示する。図１３Ｂは、前に決定されたｇＲＮＡのオフターゲット部位のリストを例示する。
【図１３Ｂ−１】図１３Ａ〜１３Ｂは、ガイドの確証についての詳細な情報を表示するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図１３Ａは、前に決定されたｇＲＮＡのパフォーマンスの概要を例示する。図１３Ｂは、前に決定されたｇＲＮＡのオフターゲット部位のリストを例示する。
【図１３Ｂ−２】図１３Ａ〜１３Ｂは、ガイドの確証についての詳細な情報を表示するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図１３Ａは、前に決定されたｇＲＮＡのパフォーマンスの概要を例示する。図１３Ｂは、前に決定されたｇＲＮＡのオフターゲット部位のリストを例示する。
【００５８】
【図１４】図１４は、本明細書に提供された方法を実現するようにプログラミングされ、または他の方法で構成され得るコンピュータシステムを示す。
【００５９】
【図１５】図１５は、単一のガイドＲＮＡ対多重ガイドＲＮＡの編集効率を例示する。単一のガイドＲＮＡについて、各データ点は、１個のトランスフェクションされたｓｇＲＮＡのパーセント編集効率またはＫＯスコアを表す。多重ガイドについて、各データ点は、３個の同時トランスフェクションされたｓｇＲＮＡについてのＫＯスコアを表す。
【００６０】
【図１６】図１６は、１組の多重ｇＲＮＡにおけるガイドＲＮＡのスペーシングに関するパーセント編集効率を例示する。
【００６１】
【図１７】図１７は、ターゲティングされた各遺伝子ペアについての多重ｇＲＮＡを使用する二重ノックアウトのパーセント編集効率を例示する。
【００６２】
【図１８Ａ】図１８Ａ〜１８Ｂは、多重ガイドノックアウト設計を使用する、アレイ化ライブラリーのスクリーニングを例示する。図１８Ａは、機能の測定についてのライブラリーのスクリーニングを例示する。図１８Ｂは、編集効率についてのライブラリーのスクリーニングを例示する。
【図１８Ｂ】図１８Ａ〜１８Ｂは、多重ガイドノックアウト設計を使用する、アレイ化ライブラリーのスクリーニングを例示する。図１８Ａは、機能の測定についてのライブラリーのスクリーニングを例示する。図１８Ｂは、編集効率についてのライブラリーのスクリーニングを例示する。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
詳細な説明
本発明の様々な実施形態が、本明細書で示され、かつ説明されているが、そのような実施形態は単に例として提供されていることが当業者に明らかである。多くの変形、変化および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者に想起され得る。本明細書で説明する本発明の実施形態の様々な選択肢が使用され得ることが理解されるべきである。
【００６４】
本明細書で使用される用語は、単に特定の場合を説明する目的のためであり、限定であるとは意図されない。以下の用語は、当業者によるこれらの用語の理解に加えて、本明細書で使用される用語の意味を例示するために説明されている。本明細書および付属の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別に規定しない限り、複数の指示物を含む。特許請求の範囲は、任意の必要に応じた要素を除外するように起草され得ることがさらに留意される。よって、本説明は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単独で」、「のみ」等のような排他的用語の使用、または「消極的」限定の使用のための前提の基礎として働くことが意図される。
【００６５】
ある特定の範囲は、本明細書で「約」という用語が先行する数値により示される。「約」という用語は、それが先行する厳密な数字、およびその用語が先行する数字に近いか、またはおよそその数字である数字の文字上の支持を提供するために本明細書で使用される。数字が特に列挙された数字に近いか、またはおよそその数字であるかどうかを決定することにおいて、近いか、または近似する列挙されていない数字は、それが示される文脈において、特に列挙される数字の実質的な等価物を提供する数字であり得る。ある範囲の値が提供される場合、各間にある値であって、その範囲の上限と下限との間の、文脈が明らかに別に規定しない限り下限の単位の１０分の１までの値、およびその言明される範囲内の他の任意の言明される値または間にある値は、本明細書で説明する方法および組成物に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、より小さい範囲に含まれる場合があり、また、本明細書で説明する方法および組成物に包含され、言明される範囲内で任意の特に除外される限界の対象となる。言明される範囲が、限界の１つまたは両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本明細書で説明する方法および組成物に含まれる。
【００６６】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、本明細書で互換的に使用される場合、一般的に、任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドのいずれかのポリマー形態を指す。したがって、これらの用語には、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基もしくは他の天然、化学修飾もしくは生化学修飾、非天然、もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は一般的に、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの約５〜約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指し得る。しかしながら、本開示の目的のためには、オリゴヌクレオチドの長さについて上限はない場合がある。一部の場合、オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」として公知である場合があり、遺伝子から単離しても、当該技術分野で公知の方法によって化学合成してもよい。「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、一本鎖（例えば、センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。
【００６７】
「改変ヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、一般的に、天然の塩基、糖および／またはホスホジエステル結合もしくは骨格部分と比較して、リン酸ヌクレオチドを含む、塩基、糖および／またはホスホジエステル結合もしくは骨格部分のうちの１つまたは複数の化学構造への改変を有するヌクレオチドを指し得る。
【００６８】
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズすること」という用語は、本明細書で使用される場合、一般的に、完全または部分的相補ポリヌクレオチド鎖が好適なハイブリダイゼーション条件下で一体となって、２つの構成成分鎖が水素結合によって接合された二本鎖構造または領域を形成するプロセスを指し得る。一部の場合、改変ヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションを可能にするか、または促進する水素結合を形成し得る。一部の場合、対象ＤＮＡターゲティングＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメントのグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）に相補的であると考えることができ、その逆も同様である。
【００６９】
「切断」または「切断すること」という用語は、本明細書で使用される場合、一般的に、ポリヌクレオチドのリボシルホスホジエステル骨格中の共有ホスホジエステル結合の破壊を指し得る。「切断」または「切断すること」という用語は、一本鎖切断部位および二本鎖切断部位の両方をもたらす切断を包含し得る。一部の場合、切断は、平滑末端または付着末端（または粘着末端）のいずれかの産生をもたらし得る。
【００７０】
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」という用語は、本明細書で使用される場合、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼとを含むリボ核タンパク質複合体を指し得る。「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、クラスター化規則的配置短回分反復配列およびその関連系を指す。ＣＲＩＳＰＲは、細菌および古細菌が外来性核酸（例えば、ウイルスまたはプラスミドからの）を検出および発現抑制することを可能にする適応性防御系として発見されたが、それは、異なる細胞種における使用のために適合して、配列特異的様式でポリヌクレオチド編集を可能にすることができる。一部の場合、ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型  ＣＲＩＳＰＲ系に由来し得る。ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型系では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓと相互作用し、Ｃａｓ酵素のヌクレアーゼ活性を標的領域に方向付けることができる。標的領域は、「プロトスペーサー」および「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ：ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）を含む場合があり、両方のドメインは、Ｃａｓ酵素媒介活性（例えば、切断）のために必要とされ得る。プロトスペーサーは、標的部位（またはゲノム標的部位）と呼ばれ得る。ｇＲＮＡは、プロトスペーサーの逆鎖（結合部位）と対形成（またはハイブリダイズ）して、Ｃａｓ酵素を標的領域に方向付け得る。ＰＡＭ部位は一般的に、Ｃａｓ酵素によって認識され、かつ一部の場合、Ｃａｓ酵素活性に必要とされる短い配列を指す。ＰＡＭ部位のヌクレオチドの配列および数は、Ｃａｓ酵素の種類に依存して異なり得る。
【００７１】
「Ｃａｓ」という用語は、本明細書で使用される場合、一般的に、野生型Ｃａｓタンパク質、その断片、またはその突然変異体もしくはバリアントを指し得る。
【００７２】
Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡによりガイドされるポリヌクレオチド結合活性またはヌクレアーゼ活性であり得るＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型系のタンパク質またはそれに由来するタンパク質を含み得る。好適なＣａｓタンパク質の例には、ＣａｓＸ、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｕ１９６６、そのホモログおよびその改変変形が含まれる。一部の場合、Ｃａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｖ型またはＶＩ型系のタンパク質またはそれに由来するタンパク質、例えば、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、Ｃ２ｃ１（Ｃａｓ１２ｂ）、Ｃ２ｃ２、そのホモログおよびその改変変形を含み得る。一部の場合、Ｃａｓタンパク質は、触媒的に死滅しているか、または不活性Ｃａｓ（ｄＣａｓ）であり得る。
【００７３】
一部の場合、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。一部の場合、Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるＰＡＭ配列は、ＮＧＧである場合があり、ここで、「Ｎ」は、任意のヌクレオチドである。
【００７４】
「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、一般的に、Ｃａｓタンパク質に結合し、かつＣａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）内の特定の場所にターゲティングすることにおいて補助することができるＲＮＡ分子（または集合的にＲＮＡ分子の群）を指し得る。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）セグメントおよびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ）セグメントを含み得る。「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡセグメント」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドターゲティングガイド配列、ステム配列および必要に応じて５’−オーバーハング配列を含むＲＮＡ分子またはその部分を指し得る。「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡセグメント」という用語は、タンパク質結合セグメントを含むＲＮＡ分子またはその部分を指し得る（例えば、タンパク質結合セグメントは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えば、Ｃａｓ９と相互作用することができる）。「ガイドＲＮＡ」という用語は、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ：ｓｉｎｇｌｅ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）を包含する場合があり、ここでは、ｃｒＲＮＡセグメントとｔｒａｃｒＲＮＡセグメントとは、同じＲＮＡ分子内に位置する。また、「ガイドＲＮＡ」という用語は、集合的に、２つまたはそれよりも多いＲＮＡ分子の群を包含する場合があり、ここでは、ｃｒＲＮＡセグメントとｔｒａｃｒＲＮＡセグメントとは、別々のＲＮＡ分子に位置する。
【００７５】
一部の場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性は、部位特異的（ターゲティングされた）様式で核酸を改変することが望ましい任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ適用、例えば、遺伝子療法において使用される、例えば、遺伝子ノックアウト（ＫＯ：ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）、遺伝子ノックイン（ＫＩ：ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）、遺伝子編集、遺伝子タグ付け等において有用であり得る。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。遺伝子療法の例には、疾患を治療すること、または抗ウイルス、抗病原体もしくは抗がん治療として；農業における遺伝子改変生物の産生；治療、診断または研究目的のための細胞によるタンパク質のラージスケール産生；誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣ）の誘導；および病原体の遺伝子の欠失または置換のためのターゲティングが含まれる。一部の場合、Ｃａｓは、触媒的に死滅しているか、または不活性Ｃａｓ（ｄＣａｓ）である場合があり、得られるＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ系は、遺伝子発現の配列特異的抑制（ＣＲＩＳＰＲ干渉）または活性化（ＣＲＩＳＰＲ活性化）に有用であり得る。
【００７６】
「対象」、「個体」または「患者」という用語は、本明細書で使用される場合、一般的に、治療を必要とし得る生物全体もしくはその集合、および／または治療に供され得る生物全体もしくはその集合、例えば、家畜、ペットもしくはヒトまたはそれらの集合を指し得る。一部の場合、「対象」という用語は、その細胞または細胞系であり得る。
【００７７】
「遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、一般的に、機能的遺伝子情報をコードするヌクレオチド配列、例えば、ポリペプチド（例えば、タンパク質）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ：ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ）またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ：ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を指し得る。遺伝子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他のヌクレオチドを含み得る。
オリゴヌクレオチドを設計するための方法
【００７８】
一態様では、本開示は、目的のゲノム領域にハイブリダイズするための１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計するための方法を提供する。目的のゲノム領域は、ある種のゲノムの遺伝子であり得る。方法は、遺伝子の複数の転写物から転写物を選択することを含み得る。方法は、選択された転写物の遺伝子内の異なる標的部位にハイブリダイズする最初の組のｇＲＮＡを識別することを含み得る。遺伝子は、目的の遺伝子であり得る。目的のゲノム領域は、ゲノムの非コード領域であり得る。非コード領域は、調節エレメントであり得る。調節エレメントは、シス調節エレメントまたはトランス調節エレメントであり得る。シス調節エレメントは、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサーであり得る。
【００７９】
種のゲノムおよび／または種の参照ゲノムを含む情報は、複数のデータベースから得ることができる。一部の場合、複数のデータベースは、ＤＮＡからの配列決定データ（ＤＮＡ−ｓｅｑ）および／またはＲＮＡからの配列決定データ（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を含む遺伝子および／またはゲノムデータベースを含み得る。そのようなゲノムデータベースの例には、ＧＥＮＣＯＤＥ、ＮＣＢＩ、Ｅｎｓｅｍｂｌ、｛ＡＰＰＲＩＳ｝およびＮＩＨ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔが含まれる。あるいは、または加えて、個体のゲノム情報は、非限定的に、２３ａｎｄＭｅ、ｄｅＣＯＤＥ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｇｅｎｅ  ｂｙ  Ｇｅｎｅ、Ｇｅｎｅ  Ｐｌａｎｅｔ、ＤＮＡ  Ａｎｃｅｓｔｒｙ、ｕＢｉｏｍｅおよび医療提供者を含む個別化ゲノムデータベースから検索することができる。一部の場合、目的の種のゲノムの少なくとも一部を含む必要な情報は、ユーザーによって（例えば、パーソナルコンピュータ等のユーザーデバイス上のユーザーインターフェースを介して）提供され得る。
【００８０】
種のゲノムは、種（例えば、細胞または生物）に存在する一部または完全な組の遺伝子材料を含み得る。種の例には、哺乳動物（例えば、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｅｃｕｓ、Ｐａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓ）、魚類（例えば、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ、Ａｍｐｈｉｐｒｉｏｎ  ｆｒｅｎａｔｕｓ）、昆虫（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、植物（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、回虫（例えば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）および細菌を含む微生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）が含まれるが、これらに限定されない。一部の場合、細菌は、栄養補助食品（例えば、媒体としてのヨーグルト中の）および／または治療（例えば、状態を抑制または改善するための）として個体により消費される株を含み得る。一部の場合、細菌は、個体の身体に存在する株（例えば、ヒトマイクロバイオーム）を含み得る。
【００８１】
ゲノムの遺伝子材料は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡであり得る。遺伝子材料は、遺伝子および遺伝子間領域における核酸配列を含み得る。一部の場合、遺伝子材料は、染色体の単位として表すことができる。一部の場合、遺伝子材料は、遺伝子から転写された１つまたは複数の転写物として表され得る。遺伝子およびその各々の１つまたは複数の転写物は、１つまたは複数のコード領域（すなわち、エクソン）を含み得る。一部の場合、遺伝子およびその各々の１つまたは複数の転写物は、１つまたは複数の遺伝子内非コード領域（すなわち、イントロン）を含み得る。１つまたは複数の遺伝子内非コード領域は、コード領域間に位置し得る。一部の場合、遺伝子は、１つの転写物をコードし得る。一部の場合、遺伝子は、複数の転写物をコードし、各転写物は、遺伝子からのエクソンおよびイントロンの異なる変形を含む。一例では、ＲｅｌＡ遺伝子は、転写因子ｐ６５をコードし、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのＲＥＬＡ遺伝子は、異なる長さの少なくとも１８個の公知の転写物：ＲＥＬＡ−２０２、ＲＥＬＡ−２０７、ＲＥＬＡ−２２６、ＲＥＬＡ−２０５、ＲＥＬＡ−２０１、ＲＥＬＡ−２０８、ＲＥＬＡ−２２０、ＲＥＬＡ−２０７、ＲＥＬＡ−２１５、ＲＥＬＡ−２０４、ＲＥＬＡ−２２２、ＲＥＬＡ−２１３、ＲＥＬＡ−２２５、ＲＥＬＡ−２１１、ＲＥＬＡ−２１９、ＲＥＬＡ−２２１およびＲＥＬＡ−２１２をコードする。したがって、複数の転写物は、異なる数のヌクレオチド塩基（ポリヌクレオチド長）を有し得る。あるいは、または加えて、複数の転写物は、異なる数のアミノ酸（ポリペプチド長）を有するポリペプチド（例えば、タンパク質）に翻訳され得る。一部の場合、複数の転写物の各々は、１つまたは複数の他の転写物と比較して、報告される異なる発現レベル（豊富さ）を有し得る。
【００８２】
遺伝子にハイブリダイズするための最初の組のｇＲＮＡを識別するために、転写物は、遺伝子の複数の転写物から選択され得る。一部の場合、選択された転写物は、複数の転写物中の１つまたは複数の他の転写物よりも高い、報告される豊富さを有し得る。一部の実施形態では、遺伝子の複数の転写物の豊富さは、データベースから決定される。選択された転写物は、複数の転写物中で、報告される第１、第２、第３、第４または第５番目に高い豊富さを有し得る。一部の場合、選択された転写物は、複数の転写物中の１つまたは複数の他の転写物よりも少なくとも１つの追加のヌクレオチドを有し得る。選択された転写物は、複数の転写物中で、第１、第２、第３、第４または第５番目に多いヌクレオチドを有し得る。一部の場合、選択された転写物から翻訳されたポリペプチド（例えば、タンパク質）は、複数の転写物中の１つまたは複数の他の転写物から翻訳された１つまたは複数のポリペプチドよりも少なくとも１つの追加のアミノ酸を有し得る。選択された転写物から翻訳されたポリペプチドは、複数の転写物中で、第１、第２、第３、第４または第５番目に多いアミノ酸を有し得る。一部の場合、複数の転写物の豊富さは、遺伝子の複数の転写物から選択された転写物を決定するために使用される第１の基準であり得る。
【００８３】
遺伝子にハイブリダイズするための最初の組のｇＲＮＡを識別するために、選択された転写物に存在する遺伝子内のコード領域を選択することができる。遺伝子がＤＮＡである場合、選択されたコード領域は、遺伝子のターミネーター（下流）よりも遺伝子のプロモーター（上流）により近い場合があり得る。遺伝子がＲＮＡである場合、選択されたコード領域は、遺伝子の３’末端よりも遺伝子の５’末端により近い場合があり得る。一部の場合、選択されたコード領域は、選択された転写物内の初期位置エクソンであり得る。初期位置エクソンは、遺伝子の前半内に位置するエクソンであり得る。初期位置エクソンは、遺伝子の第１、第２、第３、第４、第５または第６エクソンであり得る。
【００８４】
一部の場合、選択された転写物の選択されたコード領域は、遺伝子の複数の転写物のうちの１つまたは複数に存在する１つまたは複数の他のエクソンよりも高い出現率を有するエクソンであり得る。一部の場合、選択された転写物の選択されたエクソンは、複数の転写物中の他の転写物の約５０％に含有され（共通し）得る。選択された転写物の選択されたエクソンは、複数の転写物中の他の転写物の少なくとも約４０パーセント（％）、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多くに含有され得る。選択された転写物の選択されたエクソンは、複数の転写物中の他の転写物の約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％以下またはそれ未満に含有され得る。一部の場合、選択された転写物の選択されたエクソンは、選択された転写物中の他のエクソンよりも少なくとも１つの追加のヌクレオチドを有し得る。一部の場合、選択されたエクソンは、少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０個またはそれよりも多いヌクレオチドを有し得る。一部の場合、エクソンのヌクレオチドの出現率および数の両方は、選択された転写物の選択されたエクソンを決定するための基準であり得る。
【００８５】
最初の組のｇＲＮＡは、本明細書で結合部位とも呼ばれる標的領域にハイブリダイズするように設計され得る。標的領域は、種のゲノム内の遺伝子または遺伝子の一部に存在し得る。一部の場合、遺伝子の一部は、遺伝子のエクソンであり得る。エクソンは、遺伝子の各転写物に見出されるエクソンであり得る。エクソンは、遺伝子の複数の転写物の、上記に挙げる基準から選択された転写物の選択されたエクソンであり得る。一部の場合、最初の組のｇＲＮＡ中の１つまたは複数のｇＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。一部の場合、ｓｇＲＮＡは、単一ポリヌクレオチド鎖であり得る。ｓｇＲＮＡは、ハイブリダイズポリヌクレオチド配列および第２のポリヌクレオチド配列を含み得る。
【００８６】
ハイブリダイズポリヌクレオチド配列は、遺伝子の一部（例えば、遺伝子の複数の転写物の選択された転写物の選択されたエクソン）にハイブリダイズし得る。ｓｇＲＮＡのハイブリダイズポリヌクレオチド配列は、１７〜２３個のヌクレオチドに及び得る。ｓｇＲＮＡのハイブリダイズポリヌクレオチド配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３個またはそれよりも多いヌクレオチドであり得る。ｓｇＲＮＡのハイブリダイズポリヌクレオチド配列は、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７個以下またはそれよりも少ないヌクレオチドであり得る。一例では、ｇＲＮＡのハイブリダイズポリヌクレオチド配列は、２０個のヌクレオチドである。ハイブリダイズポリヌクレオチド配列は、標的領域に相補的または部分的に相補的であり得る。標的領域に相補的なハイブリダイズポリヌクレオチド配列は、標的領域の配列に対して１００％の相補性を有する配列を含み得る。標的領域に部分的に相補的なｇＲＮＡは、標的領域に対する１００％の相補性を含む配列と比較して少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５個のミスマッチを有する配列を含み得る。
【００８７】
シングルポリヌクレオチド鎖ｓｇＲＮＡの第２のポリヌクレオチド配列は、Ｃａｓ酵素と相互作用（結合）し得る。第２のポリヌクレオチド配列は、約８０個のヌクレオチドであり得る。第２のポリヌクレオチド配列は、８０個のヌクレオチドであり得る。第２のポリヌクレオチド配列は、少なくとも８０個またはそれよりも多いヌクレオチドであり得る。第２のポリヌクレオチド配列は、８０個以下またはそれよりも少ないヌクレオチドであり得る。
【００８８】
全体として、シングルポリヌクレオチド鎖ｓｇＲＮＡは、９７〜１０３個のヌクレオチドに及び得る。シングルポリヌクレオチド鎖ｓｇＲＮＡは、少なくとも９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３個またはそれよりも多いヌクレオチドであり得る。シングルポリヌクレオチド鎖ｓｇＲＮＡは、１０３、１０２、１０１、１００、９９、９８、９７個以下またはそれよりも少ないヌクレオチドであり得る。一例では、シングルポリヌクレオチド鎖ｓｇＲＮＡは、１００個のヌクレオチドであり得る。
【００８９】
一部の場合、最初の組のｇＲＮＡ中の１つまたは複数のｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）セグメントおよびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）セグメントの複合体（例えば、水素結合を介する）であり得る。ｃｒＲＮＡは、ハイブリダイズポリヌクレオチド配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ結合ポリヌクレオチド配列を含み得る。ハイブリダイズポリヌクレオチド配列は、遺伝子の一部（例えば、遺伝子の複数の転写物の選択された転写物の選択されたエクソン）にハイブリダイズし得る。ｃｒＲＮＡのハイブリダイズポリヌクレオチド配列は、１７〜２３個のヌクレオチドに及び得る。ｃｒＲＮＡのハイブリダイズポリヌクレオチド配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３個またはそれよりも多いヌクレオチドであり得る。ｃｒＲＮＡのハイブリダイズポリヌクレオチド配列は、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７個以下またはそれよりも少ないヌクレオチドであり得る。一例では、ｃｒＲＮＡのハイブリダイズポリヌクレオチド配列は、２０個のヌクレオチドである。ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ結合ポリヌクレオチド配列は、２２個のヌクレオチドであり得る。ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ結合ポリヌクレオチド配列は、少なくとも２２個またはそれよりも多いヌクレオチドであり得る。ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ結合ポリヌクレオチド配列は、２２個以下またはそれよりも少ないヌクレオチドであり得る。全体として、ｃｒＲＮＡは、３９〜４５個のヌクレオチドに及び得る。ｃｒＲＮＡは、少なくとも３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５個またはそれよりも多いヌクレオチドであり得る。ｃｒＲＮＡは、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９個以下またはそれよりも少ないヌクレオチドであり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、６０〜８０個のヌクレオチドに及び得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、少なくとも６０、６１、６２、６３、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０個またはそれよりも多いヌクレオチドであり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、８０、７９、７８、７７、７６、７４、７２、７０、６８、６６、６４、６２、６０個以下またはそれよりも少ないヌクレオチドであり得る。一例では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、７２個のヌクレオチドであり得る。別の例では、ｃｒＲＮＡのハイブリダイズポリヌクレオチド配列は２０個のヌクレオチドであり、ｃｒＲＮＡは４２個のヌクレオチドであり、各々のｔｒａｃｒＲＮＡは７２個のヌクレオチドである。
【００９０】
一部の場合、最初の組のｇＲＮＡは、１つまたは複数のｓｇＲＮＡ、およびｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの１つまたは複数の複合体の両方を含み得る。あるいは、または加えて、最初の組のｇＲＮＡ中の１つまたは複数のｇＲＮＡは、３つまたはそれよりも多いＲＮＡ鎖の複合体であり得る。３つまたはそれよりも多いＲＮＡ鎖の複合体の少なくとも１つのＲＮＡ鎖は、ハイブリダイズポリヌクレオチド配列を含み得る。３つまたはそれよりも多いＲＮＡ鎖の複合体の少なくとも１つのＲＮＡ鎖は、Ｃａｓ酵素結合配列を含み得る。
【００９１】
ｇＲＮＡが、目的のゲノム領域の標的領域にハイブリダイズする場合、目的のゲノム領域のハイブリダイズされる部分は、プロトスペーサー（標的部位）と、Ｃａｓ酵素によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と、プロトスペーサーの逆鎖（結合部位）とを含む標的領域（または標的遺伝子座）であり得る。プロトスペーサーの逆鎖は、ｇＲＮＡハイブリダイズゲノム領域（配列）であり得る。遺伝子内のｇＲＮＡハイブリダイズ配列は、１７〜２３個のヌクレオチドに及び得る。遺伝子内のｇＲＮＡハイブリダイズ配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３個またはそれよりも多いヌクレオチドであり得る。遺伝子内のｇＲＮＡハイブリダイズ配列は、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７個以下またはそれよりも少ないヌクレオチドであり得る。
【００９２】
最初の組のｇＲＮＡ中のｇＲＮＡの各々は、目的のゲノム領域内のその各々の結合部位（例えば、選択されたエクソン内の結合部位）に結合するように設計され得る。しかしながら、一部の場合、また、ｇＲＮＡの各々は、ＰＡＭ部位を含む他のＣａｓ標的領域に結合し、オフターゲットハイブリダイゼーション領域への望ましくないオフターゲット結合をもたらし得る。そのため、最初の組のｇＲＮＡのｇＲＮＡの各々について、オフターゲット値が決定され得る。オフターゲット値は、種のゲノムにわたり決定され得る。一部の場合、オフターゲット値は、種の参照ゲノム（例えば、ヒト参照ゲノム、マイクロバイオームゲノム等）にわたり決定され得る。種の参照ゲノムは、ドナーの収集物からのＤＮＡ（またはＲＮＡ）の配列決定から組み立てた１組の遺伝子であり得る。参照ゲノムは、１つまたは複数の染色体からの遺伝子材料を含み得る。参照ゲノムは、１つまたは複数のコンティグ（例えば、位置が決定されていない配列コンティグ）を含み得る。各コンティグは、ＤＮＡの連続領域を表す１組の重複するポリヌクレオチドクローンであり得る。一例では、各コンティグは、連続ＤＮＡ配列であり得る。オフターゲット値は、ゲノム内の複数の標的部位と比較して最初の組のｇＲＮＡ中のｇＲＮＡの各々についてのミスマッチの数を数え上げることによって決定（例えば、計算）され得る。複数の標的部位は、ゲノムにわたる全ての可能性のあるＣａｓヌクレアーゼ標的領域のプロトスペーサーを含み得る。
【００９３】
一部の場合、複数の標的部位の各々は、ＰＡＭ部位に隣接し得る。一部の場合、複数の標的部位の各々は、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３ｂおよびＣａｓ１３ｃからなる群から選択されるヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接し得る。一例では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）であり、複数の標的部位は、ＳｐＣａｓ９のＰＡＭ部位（「Ｎ」が任意のヌクレオチドであるＮＧＧ）に隣接する全てのヌクレオチド配列を含む。別の例では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからのＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）であり、複数の標的部位は、ＮｍＣａｓ９のＰＡＭ部位（ＧＡＴＴ）に隣接する全てのヌクレオチド配列を含む。そのような標的部位に方向付けるために、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ等）の１つまたは複数は、少なくとも１つのｇＲＮＡにカップリングしてもよい。少なくとも１つのｇＲＮＡは、標的部位（プロトスペーサー）の逆鎖である少なくとも１つの結合部位にハイブリダイズするように設計され得る。
【００９４】
一例では、細菌について報告されている複数の標的部位は、少なくとも１００、１，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００個またはそれよりも多い標的部位を含み得る。別の例では、ヒトについて報告されている複数の標的部位は、少なくとも１０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、２０，０００，０００、３０，０００，０００、４０，０００，０００、５０，０００，０００、６０，０００，０００、７０，０００，０００、８０，０００，０００、９０，０００，０００、１００，０００，０００、２００，０００，０００、３００，０００，０００個またはそれよりも多い標的部位を含み得る。別の例では、植物について報告されている複数の標的部位は、少なくとも１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、１００，０００，０００、２００，０００，０００、３００，０００，０００、４００，０００，０００、５００，０００，０００、６００，０００，０００、７００，０００，０００、８００，０００，０００、９００，０００，０００、１，０００，０００，０００、１，１００，０００，０００、１，２００，０００，０００、１，３００，０００，０００、１，４００，０００，０００、１，５００，０００，０００個またはそれよりも多い標的部位を含み得る。
【００９５】
一部の場合、複数の標的部位と比較したｇＲＮＡの各々についてのミスマッチの数を数え上げることは、０、１、２、３、４、５個またはそれよりも多いミスマッチの数を有するオフターゲットハイブリダイズ領域を決定することを含み得る。これは、ｇＲＮＡが設計されるゲノム全体、またはそのようなゲノムの一部にわたり決定され得る。ゲノムは、参照ゲノムであり得る。一部の場合、ゲノムの一部は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多い染色体であり得る。ミスマッチの数は、標的にハイブリダイズ可能なｇＲＮＡ（例えば、２０塩基のハイブリダイズポリヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡ）の各々について独立して、計算され得る。数え上げられたミスマッチの数は、０であり得る。数え上げられたミスマッチの数は、１であり得る。数え上げられたミスマッチの数は、２であり得る。数え上げられたミスマッチの数は、３であり得る。数え上げられたミスマッチの数は、４であり得る。一部の場合、オフターゲット値を決定すること（例えば、計算すること）は、最初の組のｇＲＮＡの各々についてのミスマッチの数の総和を得ることを含む。一部の場合、数え上げることは、標的部位（潜在的な標的部位）からの０、１、２、３、４または５個のミスマッチの数のうちの少なくとも２つを別々に数え上げることを含み得る。一例では、設計したｇＲＮＡについて、０個のミスマッチを有する（例えば、ｇＲＮＡのどのヌクレオチドも、オフターゲットハイブリダイズ領域の各々のヌクレオチドと集合的に対形成する）１個のオフターゲットハイブリダイズ領域、１個のミスマッチを有する３個のオフターゲットハイブリダイズ領域、２個のミスマッチを有する５個のオフターゲットハイブリダイズ領域、３個のミスマッチを有する７個のオフターゲットハイブリダイズ領域、および４個のミスマッチを有する９個のオフターゲットハイブリダイズ領域が存在し得る。したがって、設計したｇＲＮＡの得られるオフターゲット値は、［１、３、５、７、９］と示され得る。別の例では、別の設計したｇＲＮＡについて、０個のミスマッチを有する（例えば、ｇＲＮＡのどのヌクレオチドも、オフターゲットハイブリダイズ領域の各々のヌクレオチドと集合的に対形成する）０個のオフターゲットハイブリダイズ領域、１個のミスマッチを有する０個のオフターゲットハイブリダイズ領域、２個のミスマッチを有する１５個のオフターゲットハイブリダイズ領域、３個のミスマッチを有する５０個のオフターゲットハイブリダイズ領域、および４個のミスマッチを有する９０個のオフターゲットハイブリダイズ領域が存在し得る。したがって、設計したｇＲＮＡの得られるオフターゲット値は、［０、０、１５、５０、９０］と示され得る。
【００９６】
オフターゲット値は、最初の組のｇＲＮＡからｇＲＮＡのサブセットを選択するための基準として使用することができる。一部の場合、ミスマッチの数のうちの１つは、最初の組のｇＲＮＡからｇＲＮＡのサブセットを生成するための閾値として使用することができる。一例では、ｇＲＮＡのサブセットは、０個のミスマッチを有するいかなるオフターゲットハイブリダイゼーション領域も有してはならない。そのような場合、ｇＲＮＡのサブセットの各々は、「０、＃、＃、＃、＃」のオフターゲット値を有する場合があり、ここで、「＃」は、少なくとも０の任意の整数を示す。別の例では、ｇＲＮＡのサブセットは、０および１個のミスマッチを有するいかなるオフターゲットハイブリダイゼーション領域も有してはならない。そのような場合、ｇＲＮＡのサブセットの各々は、「０、０、＃、＃、＃」のオフターゲット値を有する場合があり、ここで、「＃」は、少なくとも０の任意の整数を示す。理論に束縛されるものではないが、閾値を増大させると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのオフターゲット効果の機会がより低いｇＲＮＡのサブセットが生成され得る。
【００９７】
最初の組のｇＲＮＡの各ｇＲＮＡについてのオンターゲット効率値を決定してもよい。ｇＲＮＡのオフターゲット効率値は、アジマススコアを計算することによって決定することができる。アジマススコアは、Ｄｏｅｎｃｈの「Ｒｕｌｅ  Ｓｅｔ  ２」スコア付けモデルに基づき得る。Ｒｕｌｅ  Ｓｅｔ  ２スコア付けモデルは、１つまたは複数の機械学習アルゴリズムを使用して、各ｇＲＮＡのその各々の標的領域へのオンターゲット活性を計算することができる。１つまたは複数の機械学習アルゴリズムによって使用されるパラメータの例には、単一のヌクレオチドの位置；ジヌクレオチドの位置；単一ヌクレオチドおよびジヌクレオチドの頻度；ｇＲＮＡ中のＧおよびＣ塩基の数；遺伝子内のｇＲＮＡの場所；およびｇＲＮＡの最初の５個、中央の８個および最後の５個のヌクレオチドの融解温度が含まれる。計算後、得られるオンターゲット活性（アジマススコア）は、０〜１に及び得る。
【００９８】
一部の場合、オンターゲット効率値（アジマススコア）は、最初の組のｇＲＮＡからｇＲＮＡのサブセットを選択することにおける基準であり得る。最初の組のｇＲＮＡからのｇＲＮＡのサブセットは、少なくとも約０．２のオンターゲット効率値を有し得る。最初の組のｇＲＮＡからのｇＲＮＡのサブセットは、少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９またはそれよりも多いオンターゲット効率値を有し得る。一例では、最初の組のｇＲＮＡからのｇＲＮＡのサブセットは、０．４よりも大きいオンターゲット効率値を有し得る。
【００９９】
一部の場合、ｇＲＮＡのオンターゲット効率値およびオフターゲット値の両方は、最初の組のｇＲＮＡからｇＲＮＡのサブセットを選択することにおける基準であり得る。一例では、ｇＲＮＡのサブセットを識別することは、オンターゲット効率の閾値（例えば、０．４よりも大きいアジマススコア）およびオフターゲット値の閾値（例えば、０または１個のミスマッチを有するオフターゲットハイブリダイゼーション部位がないこと）に基づき得る。２つの基準に基づいて、最初の組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡを、ランク付けすることができる。最初の組のｇＲＮＡからのｇＲＮＡのサブセットは、上位にランク付けされたｇＲＮＡのうちの１〜１０個を含み得る。最初の組のｇＲＮＡからのｇＲＮＡのサブセットは、上位にランク付けされたｇＲＮＡのうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多くを含み得る。最初の組のｇＲＮＡからのｇＲＮＡのサブセットは、上位にランク付けされたｇＲＮＡのうちの１０、９、８、７、６、５、４、３、２個以下またはそれ未満を含み得る。
【０１００】
最初の組のｇＲＮＡは、各々、種のゲノムの遺伝子の一部にハイブリダイズするように設計され、細胞において遺伝子をノックアウト（ＫＯ）するために使用され得る。ＫＯは、ターゲティングされたＫＯであり得る。あるいは、または加えて、最初の組のｇＲＮＡは、各々、種のゲノムの遺伝子の一部にハイブリダイズするように設計され、細胞において遺伝子に突然変異をノックイン（ＫＩ）するために使用され得る。ＫＩは、ターゲティングされた挿入であり得る。ターゲティングされた挿入は、ドナーポリヌクレオチドの挿入であり得る。一部の場合、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、少なくとも１つの特異的ｇＲＮＡによって標的領域に方向付けられ、標的領域を切断することができる。一部の例では、切断は、挿入および／もしくは欠失（「インデル」）突然変異、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ：ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ）プロセスによるフレームシフトをもたらし、標的遺伝子特異的ＫＯをもたらすことができる。一部の場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、共投与されたドナーポリヌクレオチド（一本鎖または二本鎖）と共に特異的ｇＲＮＡによって標的ゲノム領域に方向付けられ得る。標的領域の切断後、相同組換え修復（ＨＤＲ：ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ）プロセスは、（ａ）切断された標的ヌクレオチド配列の修復および（ｂ）ドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへの遺伝情報の移行のための１つまたは複数の鋳型としてドナーポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数を使用し得る。遺伝情報の性質に依存して、ＨＤＲプロセスは、標的遺伝子特異的ＫＯまたはＫＩを生成しうる。ＨＤＲ媒介遺伝子ＫＩの適用の例には、タンパク質、ｍＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、タグ（例えば、６ｘＨｉｓ）、レポータータンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）および遺伝子の調節配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル）をコードする核酸材料の付加（挿入または置換）が含まれる。
【０１０１】
ＨＤＲプロセスのために、ドナーポリヌクレオチドは、複製されるべき所望の遺伝子編集（配列）、および切断された標的部位のすぐ上流および下流に相同な両方の末端の追加のヌクレオチド配列（ホモロジーアーム）を含有し得る。一部の場合、ＨＤＲプロセスの効率は、遺伝子編集のサイズおよび／またはホモロジーアームのサイズに依存し得る。あるいは、または加えて、ＨＤＲプロセスの効率は、ＰＡＭ部位を含むＣａｓ標的領域の利用可能性に依存し得る。したがって、（ａ）複数の遺伝子および／またはゲノムデータベースからの最初の組のＲＮＡ配列、（ｂ）オンターゲット効率および／または（ｃ）オフターゲット値を決定することを含む方法は、ＨＤＲのための１組のドナーポリヌクレオチドを設計するために利用することができる。
【０１０２】
本開示によるＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系は、異なる細胞において使用することができる。細胞は、任意の原核または真核生細胞、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のためのこれらの生物に由来する細胞系、動物または植物起源の初代細胞であり得る。真核細胞は、真菌、植物、藻類もしくは動物細胞、または以下に列挙する生物に由来し、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のために確立された細胞系を指し得る。真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｃｈｒｙｓｏｐｏｒｉｕｍ属、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属またはＰｉｃｈｉａ属の真菌である場合があり；より好ましくは、真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ種、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ種、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ種、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  Ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ種、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎｅ種、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ種、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ種またはＰｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ種の真菌である。植物は、Ａｒａｂｉｄｏｓｐｉｓ属、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属、Ｓｏｌａｎｕｍ属、ｌａｃｔｕｃａ属、Ｂｒａｓｓｉｃａ属、Ｏｒｙｚａ属、Ａｓｐａｒａｇｕｓ属、Ｐｉｓｕｍ属、Ｍｅｄｉｃａｇｏ属、Ｚｅａ属、Ｈｏｒｄｅｕｍ属、Ｓｅｃａｌｅ属、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属、Ｃｕｃｕｍｉｓ属、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ属、Ｃｉｔｒｕｌｌｉｓ属、Ｃｉｔｒｕｓ属、Ｓｏｒｇｈｕｍ属の植物であり得る。植物は、Ａｒａｂｉｄｏｓｐｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ種、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｃｕｍ種、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ種、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ種、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ種、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｌｉｖａ種、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ種、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ種、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ種、Ｏｒｙｚａ  ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ種、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ種、Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ種、Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ種、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ種、ｚｅａ  ｍａｙｓ種、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ種、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌ種、Ｔｒｉｔｉｃｕｍａ  ｅｓｔｉｖｕｍ種、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｄｕｒｕｍ種、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｓａｔｉｖｕｓ種、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｐｅｐｏ種、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ種、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ種、Ｃｉｔｒｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｆｏｌｉａ種、Ｃｉｔｒｕｓ  ｍａｘｉｍａ種、Ｃｉｔｒｕｓ  ｍｅｄｉｃａ種およびＣｉｔｒｕｓ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ種の植物であり得る。動物細胞は、Ｈｏｍｏ属、Ｒａｔｔｕｓ属、Ｍｕｓ属、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ属、Ｐａｎ属、Ｓｕｓ属、Ｂｏｓ属、Ｄａｎｉｏ属、Ｃａｎｉｓ属、Ｆｅｌｉｓ属、Ｅｑｕｕｓ属、Ｓａｌｍｏ属、Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ���、Ｇａｌｌｕｓ属、Ｍｅｌｅａｇｒｉｓ属、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ属の動物細胞であり得る。動物細胞は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ種、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ種、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ種、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ種、Ｐａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓ種、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ種、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ種、Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ種、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ種、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ種、Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ種、Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ種、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｅｃｕｓ種、Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ種、Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ種、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ種、Ｍｅｌｅａｇｒｉｓ  ｇａｌｌｏｐａｖｏ種、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ種およびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ種の動物細胞であり得る。
【０１０３】
例の細胞系は、ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１）；ＨＥＫ２９３細胞；Ｃａｃｏ２細胞；Ｕ２−ＯＳ細胞；ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞；ＮＳＯ細胞；ＳＰ２細胞；ＤＧ４４細胞；Ｋ−５６２細胞、Ｕ−９３７細胞；ＭＣ５細胞；ＩＭＲ９０細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞；ＨｅｐＧ２細胞；ＨｅＬａ細胞；ＨＴ−１０８０細胞；ＨＣＴ−１１６細胞；Ｈｕ−ｈ７細胞；Ｈｕｖｅｃ細胞；およびＭｏｌｔ  ４細胞からなる群から選択され得る。本開示の範囲に適用可能な他の細胞の例は、幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含み得る。全てのこれらの細胞系および／または細胞は、本発明の方法によって改変されて、目的の遺伝子またはタンパク質を産生、発現、定量、検出および／もしくは研究するため；ならびに／または研究および産生ならびに異なる分野、例えば、非限定的な例としての化学、バイオ燃料、治療薬および農学において目的の生理活性分子をスクリーニングするための細胞系モデルを提供することができる。
【０１０４】
一部の場合、最初の組のガイドＲＮＡ中の少なくとも１つのガイドＲＮＡからの少なくとも１つのヌクレオチドは、改変され得る。少なくとも１つのヌクレオチドの改変の例は、（ａ）５’末端改変または３’末端改変を含む末端改変、（ｂ）塩基の置換または除去を含む核酸塩基（または「塩基」）改変、（ｃ）２’、３’および／または４’位置における改変を含む糖改変、および（ｄ）ホスホジエステル結合の改変または置換を含む骨格改変を含み得る。理論に束縛されるものではないが、少なくとも１つのヌクレオチドの改変は、例えば、（ａ）標的特異性の改善、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の有効濃度の低減、（ｃ）ｇＲＮＡの安定性の改善（例えば、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）および／またはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）に対する耐性）、および（ｄ）免疫原性の減少を提供し得る。一例では、最初の組のガイドＲＮＡ中の少なくとも１つのガイドＲＮＡからの少なくとも１つのヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり得る。そのような改変は、ＲＮアーゼおよび／またはＤＮアーゼによる攻撃についてのｇＲＮＡの安定性を増大させることができる。
【０１０５】
一部の場合、ガイドＲＮＡに組み込まれるヌクレオチド糖改変は、２’−Ｏ−Ｃ１〜４アルキル、例えば、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−デオキシ（２’−Ｈ）、２’−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、例えば、２’−メトキシエチル（「２’−ＭＯＥ」）、２’−フルオロ（「２’−Ｆ」）、２’−アミノ（「２’−ＮＨ２」）、２’−アラビノシル（「２’−アラビノ」）ヌクレオチド、２’−Ｆ−アラビノシル（「２’−Ｆ−アラビノ」）ヌクレオチド、２’−ロックド核酸（「ＬＮＡ」）ヌクレオチド、２’−非ロックド核酸（「ＵＬＮＡ」）ヌクレオチド、Ｌ形態の糖（「Ｌ−糖」）および４’−チオリボシルヌクレオチドからなる群から選択される。一部の場合、ガイドＲＮＡに組み込まれるヌクレオチド間結合改変は、ホスホロチオエート「Ｐ（Ｓ）」（Ｐ（Ｓ））、ホスホノカルボキシレート（Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、例えば、ホスホノアセテート「ＰＡＣＥ」（Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ−））、チオホスホノカルボキシレート（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、例えば、チオホスホノアセテート「チオＰＡＣＥ」（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯ−））、アルキルホスホネート（Ｐ（Ｃ１〜３アルキル）、例えば、メチルホスホネート−Ｐ（ＣＨ３）、ボラノホスホネート（Ｐ（ＢＨ３））およびホスホロジチオエート（Ｐ（Ｓ）２）からなる群から選択される。
【０１０６】
一部の場合、ガイドＲＮＡに組み込まれる核酸塩基（「塩基」）改変は、２−チオウラシル（「２−チオＵ」）、２−チオシトシン（「２−チオＣ」）、４−チオウラシル（「４−チオＵ」）、６−チオグアニン（「６−チオＧ」）、２−アミノアデニン（「２−アミノＡ」）、２−アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、５−メチルシトシン（「５−メチルＣ」）、５−メチルウラシル（「５−メチルＵ」）、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルウラシル、５，６−デヒドロウラシル、５−プロピニルシトシン、５−プロピニルウラシル、５−エチニルシトシン、５−エチニルウラシル、５−アリルウラシル（「５−アリルＵ」）、５−アリルシトシン（「５−アリルＣ」）、５−アミノアリルウラシル（「５−アミノアリルＵ」）、５−アミノアリル−シトシン（「５−アミノアリルＣ」）、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ塩基、Ｐ塩基、非構造核酸（「ＵＮＡ」）、イソグアニン（「イソＧ」）、イソシトシン（「イソＣ」）および５−メチル−２−ピリミジンからなる群から選択される。
【０１０７】
一部の場合、１つまたは複数の同位体改変が、ヌクレオチド糖、核酸塩基、ホスホジエステル結合および／またはリン酸ヌクレオチドに導入される。そのような改変は、１つまたは複数の１５Ｎ、１３Ｃ、１４Ｃ、重水素、３Ｈ、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ原子またはトレーサーとして使用される他の原子もしくは元素を含むヌクレオチドを含む。
【０１０８】
一部の場合、ガイドＲＮＡに組み込まれる「末端」改変は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、炭化水素リンカー（ヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、Ｎ）置換炭化水素スペーサー；ハロ置換炭化水素スペーサー；ケト、カルボキシル、アミド、チオニル、カルバモイル、チオノカルバマオイル（thionocarbamaoyl）含有炭化水素スペーサーを含む）、スペルミンリンカー、リンカーに結合された蛍光色素（例えば、フルオレセイン、ローダミン、シアニン）を含む色素、例えば、６−フルオレセイン−ヘキシル、クエンチャー（例えば、ダブシル、ＢＨＱ）および他の標識（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、アクリジン、ストレプトアビジン、アビジン、ペプチドおよび／またはタンパク質）からなる群から選択される。一部の場合、「末端」改変は、ガイドＲＮＡの、オリゴヌクレオチド（デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む）、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、ビタミンおよび／または他の分子を含む別の分子へのコンジュゲーション（またはライゲーション）を含む。一部の場合、ガイドＲＮＡに組み込まれる「末端」改変は、ホスホジエステル結合として組み込まれ、かつガイドＲＮＡ中の２つのヌクレオチド間のどこかに組み込まれ得るリンカー、例えば、２−（４−ブチルアミドフルオレセイン）プロパン−１，３−ジオールビス（ホスホジエステル）リンカーを介してガイドＲＮＡ配列において内部に位置する。
【０１０９】
一部の場合、コンピュータは、目的のゲノム領域にハイブリダイズするための１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計するための方法を行うために利用することができる。
【０１１０】
図１は、ある種のゲノムの遺伝子にハイブリダイズするための１つまたは複数のガイド（例えば、ｇＲＮＡ）を設計する方法のフローチャート（１００）の一例を示す。本方法は、（ａ）１つまたは複数のデータベースから目的の遺伝子についての詳細を取得すること（１０５）と、（ｂ）標的領域（例えば、遺伝子の複数の転写物の選択された転写物のエクソン）の位置を決定すること（１１０）と、（ｃ）潜在的ガイド（例えば、ハイブリダイズポリヌクレオチド配列を伴う１つまたは複数のｇＲＮＡ）を取得すること（１１５）と、（ｄ）各ガイドについてのオンターゲット値を算出すること（例えば、各ガイドについてのアジマススコアを計算すること）（１２０）と、（ｅ）各ガイドについてのオフターゲットヒットを算出すること（１２５）と、（ｆ）予想されるオフターゲットについてのさらなる詳細を取得すること（例えば、ゲノムにわたる複数の可能性のあるＣａｓ標的領域と比較したｇＲＮＡの各々についてのミスマッチの数を数え上げること）（１３０）と、（ｇ）ランク付けされたガイドのリストを返すこと（１３５）とを含む。（ｇ）では、ガイドは、オンターゲット値および／またはオフターゲット値によってランク付けされ得る。一部の場合、ステップ（ｄ）および（ｅ〜ｆ）の順序は、互換的であり得る。
【０１１１】
図２は、ある種のゲノムの遺伝子の複数の転写物の表（２００）の一例を示す。情報は、１つまたは複数のデータベースから得ることができる。この例では、目的の遺伝子は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（２１０）のＲＥＬＡ（２２０）である。ＲＥＬＡについて複数の転写物（２３０）が公知である。複数のＲＥＬＡ転写物は、異なる数の核酸塩基（２３２）を有し得る。あるいは、または加えて、複数の転写物は、異なる数のアミノ酸（２３４）を有するポリペプチド（例えば、タンパク質）に翻訳され得る。さらに、転写物は、複数の転写物中の１つまたは複数の他の転写物よりも豊富であることが報告されている場合がある（示されていない）。上記に挙げる因子のうちの１つまたは複数に基づいて、主要な転写物（２４０）が選択される。
【０１１２】
図３は、１つまたは複数のｇＲＮＡによってターゲティングされる転写物の初期コード領域の一例を示す。ヒト遺伝子ＲＥＬＡの複数の転写物において、主要な転写物（２４０）を分析して、エクソン（３１０）を含む初期コード領域を選択する。また、エクソン（３１０）は、複数の転写物のうちの他の転写物の５０パーセント（％）超で見出される。次に、エクソン（３１０）にわたる全ての可能性のあるＣａｓ標的領域を特定して、ターゲティングおよびハイブリダイズのための１つまたは複数のｇＲＮＡを設計することができる。
【０１１３】
図４Ａは、転写物からの複数のエクソンの相対的存在量（４１０）およびエクソン長（４２０）のプロットの例を示す。複数のエクソン（位置１〜１１）は、主要な転写物（２４０）からのエクソンである。選択されたエクソン（３１０）は、０．９を超える相対的存在量値を有し、それが同じ遺伝子の他の転写物の９０％超に存在することを示唆する。また、選択されたエクソン（３１０）は、１００個を超えるヌクレオチドの長さである。
【０１１４】
図４Ｂは、ｇＲＮＡ（４５０）、（４５２）、（４５４）および（４６０）の例、ならびにそれらのオフターゲットおよびオンターゲット活性分析を示す。各ｇＲＮＡについての分析は、推奨括弧［Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ］として要約され、ここで、Ａは、ｇＲＮＡが遺伝子の初期コード領域をターゲティングするように設計されるかどうかを示し；Ｂは、遺伝子の意図される標的部位が、遺伝子の複数の転写物において共通である（すなわち、遺伝子の複数の転写物中の他の転写物の５０％超で見出される）かどうかを示し；Ｃは、ｇＲＮＡのオンターゲット活性が閾値を超える（すなわち、０．４よりも大きいアジマススコア）かどうかを示し；Ｄは、ｇＲＮＡのオフターゲット活性が閾値を超える（すなわち、０および１個のミスマッチを有するいかなるオフターゲットハイブリダイズ領域も有しない）かどうかを示す。全ての４つの因子Ａ〜Ｄは、ｇＲＮＡが使用に選択されるためには「真」（「偽」の反対）である必要がある。図４Ｂでは、ｇＲＮＡ（４６０）のみが、全ての４つの因子について真と見なされる。
コンピュータシステム
【０１１５】
本開示の別の態様は、目的のゲノム領域にハイブリダイズするための１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計するための上記に挙げる方法を行うためのコンピュータシステムを提供する。本開示の別の態様は、複数の目的のゲノム領域の各々にハイブリダイズするための１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計するための上記に挙げる方法を行うためのコンピュータシステムを提供する。目的のゲノム領域は、ある種のゲノムの遺伝子であり得る。コンピュータシステムは、遺伝子の複数の転写物から転写物を選択するためのコンピュータ可読媒体を含み得る。コンピュータシステムは、選択された転写物の遺伝子内の異なる標的部位にハイブリダイズする最初の組のｇＲＮＡを識別するためのコンピュータ可読媒体を含み得る。
【０１１６】
コンピュータのコンピュータ可読媒体は、目的の遺伝子および種の入力を受信することができる（例えば、ユーザーデバイス上のユーザーインターフェースを介してユーザーから）。コンピュータ可読媒体は、種のゲノムおよび／または種の参照ゲノムを含む情報を得るために複数のデータベースと通信することができる。一部の場合、コンピュータ可読媒体は、ＤＮＡからの配列決定データ（ＤＮＡ−ｓｅｑ）および／またはＲＮＡからの配列決定データ（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を含む遺伝子および／またはゲノムデータベースを含む複数のデータベースと通信することができる。そのような情報に基づいて、コンピュータ可読媒体は、遺伝子の複数の転写物から転写物を選択することができる。コンピュータ可読媒体は、選択された転写物の遺伝子内の異なる標的部位にハイブリダイズする最初の組のｇＲＮＡを識別することができる。あるいは、または加えて、コンピュータ可読媒体は、種のゲノムの遺伝子にハイブリダイズするための１つまたは複数のｇＲＮＡを設計するための上記に挙げる方法に関する１つまたは複数のタスク（例えば、１つまたは複数のｇＲＮＡについてのオフターゲット値を計算すること）を行うように構成され得る。さらに、また、コンピュータ可読媒体は、設計ツールのユーザーによって選択される自動活性化バイオポリマー（例えば、ＲＮＡ）シンセサイザーのための命令を含み得る。
【０１１７】
図５は、ゲノムにわたり複数のｇＲＮＡのオフターゲット値を計算するためのデータ処理アーキテクチャ（５００）を示す。最初の組のｇＲＮＡ（またはあるいは、各ｇＲＮＡの１組の各々の標的部位配列）（５１０）を、コンピューティングプラットホーム（例えば、サーバレスコンピューティングプラットホーム）の「マスター」クエリー（５２０）に入れる。同時に、ゲノムにわたる全ての可能なＣａｓ標的領域（例えば、プロトスペーサー配列およびＰＡＭ部位を含む各ドメイン）のデータベースを、より小さいサブセット（または「シャード」）（５０５）に分割する。オフターゲット値を得るために、マスタークエリー（５２０）は、追加の「スレーブ」クエリー（５２５）を各シャードにつき１つ呼び出し、各スレーブクエリーを各シャードと比較して（５３０）、各ｇＲＮＡのミスマッチおよび全体的なオフターゲット値を決定する。オフターゲット検索後、スレーブクエリー−シャード比較からの結果を、結果アグリゲータ（５４０）に収集する。一例では、約３億２０００万個のＣａｓ標的領域のデータベースは、１６１個のシャードへと分割される場合があり、各シャードは、約２００万個のＣａｓ標的領域を含む。そのため、マスタークエリーは、オフターゲット検索について１６１個のスレーブクエリーを呼び出し得る。データ処理アーキテクチャ（５００）を使用し、同時に比較を行うことによって、分析の出力時間を低減することができる。
多重ｇＲＮＡ系
【０１１８】
一部の実施形態では、本開示は、目的のゲノム領域をターゲティングする１組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を識別するための方法を提供する。１組のｇＲＮＡは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個または少なくとも２００個のｇＲＮＡを含み得る。１組のｇＲＮＡは、２個のｇＲＮＡからなる場合がある。１組のｇＲＮＡは、３個のｇＲＮＡからなる場合がある。１組のｇＲＮＡは、４個のｇＲＮＡからなる場合がある。本方法は、コンピュータにおいて、１組のｇＲＮＡを設計することを含み得る。１組における各ｇＲＮＡは、目的のゲノム領域（例えば、遺伝子、遺伝子クラスター、エクソン）内の異なる標的部位にハイブリダイズ可能であり得る。
【０１１９】
また、同じ目的のゲノム領域をターゲティングする１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡの標的部位間の距離は、本明細書でガイド間スペーシングと呼ばれ得る。ガイド間スペーシングは、塩基対における、１組のｇＲＮＡ中の第１のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の第１の標的部位の３’末端から第２のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の第２の標的部位の５’末端までの距離であり得る。ガイド間スペーシングは、第１のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位と第２のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位とを含む塩基対を含めない場合がある。ガイド間スペーシングは、参照ゲノムに基づいて決定され得る。ガイド間スペーシングは、目的のゲノム領域内の逐次的標的部位間で決定され得る。一例では、１組のｇＲＮＡ中のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位間の最短距離は、１組のｇＲＮＡからの少なくとも１つの他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から少なくとも３０塩基離れている。別の例では、１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位間の最短距離は、１組のｇＲＮＡからのどの他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位からも少なくとも３０塩基離れている。別の例では、１組のｇＲＮＡ中のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位間の最長距離は、１組のｇＲＮＡからの少なくとも１つの他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から多くても１５０塩基離れている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの複数の組におけるｇＲＮＡの組の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、少なくとも３個のｇＲＮＡを含む。
【０１２０】
編集効率は、目的のゲノム領域において編集された遺伝子型を含む細胞の割合を示し得る。細胞は、少なくとも１組のｇＲＮＡ、ヌクレアーゼおよび必要に応じてドナーポリヌクレオチドと接触させた細胞の集団であり得る。編集された遺伝子型は、任意の非野生型遺伝子型であり得る。編集された遺伝子型は、野生型遺伝子型と比較して挿入または欠失を含み得る。編集された遺伝子型は、標的部位におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体によってもたらされた二本鎖切断部位の修復の結果であり得る。編集された遺伝子型は、目的のゲノム領域のノックアウトをもたらし得る。一部の実施形態では、３０個またはそれよりも多い塩基の、１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的領域間の最短距離を有する１組のｇＲＮＡは、５０％、６０％、７０％または８０％よりも大きい編集効率を産生する。一部の実施形態では、複数の組のｇＲＮＡは、少なくとも５０％、６０％、７０％または８０％の平均編集効率を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの複数の組におけるｇＲＮＡの組の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％は、５０％よりも大きい平均編集効率を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの複数の組におけるｇＲＮＡの組の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％は、７０％よりも大きい平均編集効率を含む。編集効率は、配列決定によって決定することができる。配列決定は、サンガー配列決定であり得る。配列決定は、ハイスループット配列決定であり得る。
【０１２１】
１組における各ｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡからの少なくとも１つの他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から少なくとも１０塩基離れている標的部位にハイブリダイズ可能であり得る。１組における各ｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡからの少なくとも１つの他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から少なくとも３０塩基離れている目的のゲノム領域内の標的部位にハイブリダイズ可能であり得る。１組における各ｇＲＮＡは、１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つの他のガイドＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から多くても１７０塩基離れている目的のゲノム領域内の標的部位にハイブリダイズ可能であり得る。１組における各ｇＲＮＡは、１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つの他のガイドＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から多くても１０００塩基離れている目的のゲノム領域内の標的部位にハイブリダイズ可能であり得る。好ましくは、１組のｇＲＮＡからの各ｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位は、１組における他の任意のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から約１０〜１７０、３０〜１７０、１０〜１５０、３０〜１５０、１０〜１００、３０〜１００または３０〜１０００塩基、分離している。この配置は、ＫＯ特性の改善および異なるＣＲＩＳＰＲ酵素間の相乗的効果をもたらし得る。一部の実施形態では、目的のゲノム領域のノックアウトは、目的のゲノム領域のノックアウトを達成するために個々に必要とされる各ｇＲＮＡの量よりも少ない１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡの量を使用して達成される。目的のゲノム領域のノックアウトを達成するために必要とされる１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡの量は、目的のゲノム領域のノックアウトを達成するために個々に必要とされる各ｇＲＮＡの量の１／３であり得る。目的のゲノム領域のノックアウトを達成するために必要とされる１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡの量は、目的のゲノム領域のノックアウトを達成するために個々に必要とされる各ｇＲＮＡの量の１／２であり得る。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、複数の組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を識別するための方法であって、複数の組のｇＲＮＡ中の各組のｇＲＮＡが、複数の目的のゲノム領域中の異なる目的のゲノム領域をターゲティングする、方法が本明細書でさらに説明される。複数の目的のゲノム領域は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１０個よりも多い目的のゲノム領域を含み得る。本方法は、コンピュータにおいて、複数の目的のゲノム領域のうちの各々について異なる組のｇＲＮＡを設計することを含み得る。１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡは、目的のゲノム領域（例えば、遺伝子、遺伝子クラスター、エクソン）内の異なる標的部位にハイブリダイズ可能であり得る。１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡからの少なくとも１つの他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から少なくとも１０塩基離れている目的のゲノム領域内の標的部位にハイブリダイズ可能であり得る。１組における各ｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡからの少なくとも１つの他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から少なくとも３０塩基離れている目的のゲノム領域内の標的部位にハイブリダイズ可能であり得る。１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡは、１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１つの他のガイドＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から多くても１７０塩基離れている目的のゲノム領域内の標的部位にハイブリダイズ可能であり得る。１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡからの少なくとも１つの他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から多くても１０００塩基離れている目的のゲノム領域内の標的部位にハイブリダイズ可能であり得る。好ましくは、１組のｇＲＮＡからの各ｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位は、１組における他の任意のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から約１０〜１７０、３０〜１７０、１０〜１５０、３０〜１５０、１０〜１００、３０〜１００または３０〜１０００塩基、分離している。この配置は、ＫＯ特性の改善および異なるＣＲＩＳＰＲ酵素間の相乗的効果をもたらし得る。
【０１２３】
コンピュータは、目的のゲノム領域にハイブリダイズするための１つまたは複数のｇＲＮＡを設計するための方法を行うための上記に挙げるコンピュータシステムであり得る。目的のゲノム領域は、ある種のゲノムの遺伝子であり得る。目的のゲノム領域は、ゲノムの非コード領域であり得る。非コード領域は、調節エレメントであり得る。調節エレメントは、シス調節エレメントまたはトランス調節エレメントであり得る。シス調節エレメントは、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサーであり得る。特定された１組のｇＲＮＡは、種のゲノムの遺伝子にハイブリダイズするための１つまたは複数のｇＲＮＡのサブセットであり得る。一部の場合、１組のｇＲＮＡの１つまたは複数のｇＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。一部の場合、１組のｇＲＮＡの１つまたは複数のｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）セグメントとトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）セグメントとの複合体（例えば、水素結合を介する）であり得る。
【０１２４】
１組のｇＲＮＡの各ｇＲＮＡは、目的のゲノム領域内の異なる標的部位にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列（ハイブリダイズポリヌクレオチド配列）を含み得る。ｇＲＮＡのハイブリダイズポリヌクレオチド配列は、１７〜２３個のヌクレオチドに及び得る。ｇＲＮＡのハイブリダイズポリヌクレオチド配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３個またはそれよりも多いヌクレオチドであり得る。ｇＲＮＡのハイブリダイズポリヌクレオチド配列は、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７個以下またはそれよりも少ないヌクレオチドであり得る。一例では、ｇＲＮＡのハイブリダイズポリヌクレオチド配列は、２０個のヌクレオチドである。
【０１２５】
種のゲノムの遺伝子は、１つまたは複数の転写物を有し得る。一例では、遺伝子は、１つまたは複数の転写物に転写され得る。１つまたは複数の転写物は、１つまたは複数のコード領域（すなわち、エクソン）および／または１つまたは複数の遺伝子内非コード領域（すなわち、イントロン）を含み得る。一部の場合、目的のゲノム領域は、遺伝子のコード領域を含み得る。一部の場合、目的のゲノム領域は、遺伝子の非コード領域を含み得る。一部の場合、目的のゲノム領域は、遺伝子のコード領域および遺伝子の非コード領域を含み得る。遺伝子がＤＮＡである場合、遺伝子のコード領域は、遺伝子のターミネーター（下流）よりも遺伝子のプロモーター（上流）に近い場合がある。遺伝子がＲＮＡである場合、遺伝子のコード領域は、遺伝子の３’末端よりも遺伝子の５’末端に近い場合がある。一部の場合、目的のゲノム領域は、遺伝子のエクソンを含み得る。目的のゲノム領域は、遺伝子内の初期位置エクソンであり得る。初期位置エクソンは、遺伝子の前半内に位置するエクソンであり得る。初期位置エクソンは、遺伝子の第１、第２、第３、第４、第５または第６エクソンであり得る。
【０１２６】
種のゲノムの遺伝子は、遺伝子のファミリーの遺伝子である場合があり、１組のｇＲＮＡによってターゲティングされる目的のゲノム領域は、遺伝子のファミリーを含み得る。一例では、遺伝子は、ＲＥＬＡ、ＲＥＬＢ、ＲＥＬ、ＮＦＫＢ１およびＮＦＫＢ２を含むＮＦ−κＢ（Ｒｅｌ）ファミリーの遺伝子であり、目的のゲノム領域は、５つの遺伝子を含むＮＦ−κＢ（Ｒｅｌ）ファミリーの遺伝子であり得る。別の例では、ペルオキシレドキシンファミリーの遺伝子は、ＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ２、ＰＲＤＸ３、ＰＲＤＸ４、ＰＲＤＸ５およびＰＲＤＸ６を含み、目的のゲノム領域は、６個の遺伝子を含むペルオキシレドキシンファミリーの遺伝子であり得る。
【０１２７】
種のゲノムの遺伝子は、偽遺伝子の遺伝子であり得る。偽遺伝子は、プロセシングされた偽遺伝子、プロセシングされていない偽遺伝子、ユニタリー（ｕｎｉｔａｒｙ）偽遺伝子および偽−偽遺伝子であり得る。
【０１２８】
１組のｇＲＮＡによってターゲティングされる目的のゲノム領域は、遺伝子のファミリーからの１つまたは複数のコード領域を含み得る。１つまたは複数のコード領域の各コード領域は、遺伝子のファミリーの０〜１００％によって表され（０〜１００％中に含有され）得る。１つまたは複数のコード領域の各コード領域は、遺伝子のファミリーの少なくとも０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれよりも多くによって表され得る。１つまたは複数のコード領域の各コード領域は、遺伝子のファミリーの１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％以下またはそれ未満によって表され得る。一例では、目的のゲノム領域は、遺伝子のファミリーの全ての遺伝子において表される１つのコード領域を含む。
【０１２９】
一部の場合、ゲノム領域は、遺伝子の連続ポリヌクレオチドセグメントである。目的のゲノム領域は、１０００塩基またはヌクレオチド（１ｋｂ）〜５００ｋｂに及び得る。目的のゲノム領域は、少なくとも１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、５００ｋｂまたはそれよりも多い場合がある。目的のゲノム領域は、５００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、２０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、５ｋｂ、１ｋｂ以下またはそれ未満であり得る。
【０１３０】
目的のゲノム領域をターゲティングする特定された１組のｇＲＮＡは、２〜２００個のｇＲＮＡを含み得る。目的のゲノム領域をターゲティングする特定された１組のｇＲＮＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００個またはそれよりも多くのｇＲＮＡを含み得る。目的のゲノム領域をターゲティングする特定された１組のｇＲＮＡは、少なくとも２個のｇＲＮＡを含み得る。目的のゲノム領域をターゲティングする特定された１組のｇＲＮＡは、少なくとも３個のｇＲＮＡを含み得る。目的のゲノム領域をターゲティングする特定された１組のｇＲＮＡは、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３個以下またはそれよりも少ないｇＲＮＡを含み得る。目的のゲノム領域をターゲティングする特定された１組のｇＲＮＡは、４個以下のｇＲＮＡを含み得る。目的のゲノム領域をターゲティングする特定された１組のｇＲＮＡは、３個以下のｇＲＮＡを含み得る。
【０１３１】
目的のゲノム領域をターゲティングする１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡからの少なくとも１つの他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から約１０〜２００塩基（ヌクレオチド）離れている目的のゲノム領域内の標的部位にハイブリダイズ可能であり得る。目的のゲノム領域をターゲティングする１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡからの少なくとも１つの他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から約３０〜１０００塩基（ヌクレオチド）離れている目的のゲノム領域内の標的部位にハイブリダイズ可能であり得る。目的のゲノム領域をターゲティングする１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡからの少なくとも１つの他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から少なくとも３０塩基（ヌクレオチド）離れている目的のゲノム領域内の標的部位にハイブリダイズ可能であり得る。１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡからの少なくとも１つの他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、２５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００塩基またはそれよりも多い塩基離れている目的のゲノム領域内の標的部位にハイブリダイズ可能であり得る。１組のｇＲＮＡ中の各ｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡからの少なくとも１つの他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域内の標的部位から２０００、１５００、１０００、５００、２００、１８０、１６０、１４０、１２０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０塩基以下またはそれよりも少ない塩基離れている目的のゲノム領域内の標的部位にハイブリダイズ可能であり得る。
【０１３２】
１組のｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡが１組のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を細胞において目的のゲノム領域内の異なる標的部位に方向付けるように設計され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、標的部位における核酸配列に切断部位を作出し得る。切断部位は、二本鎖切断部位であり得る。切断部位は、一本鎖切断部位であり得る。一例では、１組のｇＲＮＡは、１組のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が細胞において目的のゲノム領域内の異なる標的部位のうちの１つまたは複数をノックアウト（ＫＯ）するように方向付けるように設計され得る。ノックアウトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体によってもたらされた切断部位の修復によって導入されたフレームシフト突然変異の結果として起こり得る。ノックアウトは、目的の遺伝子におけるエクソンの欠失の結果として起こり得る。ノックアウトは、目的のゲノム領域における少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１０００または少なくとも１０，０００塩基対の欠失の結果として起こり得る。ノックアウトは、遺伝子の機能を除去し得る。
【０１３３】
別の例では、１組のｇＲＮＡは、１組のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が細胞において目的のゲノム領域内の異なる標的部位において１つまたは複数の突然変異をノックイン（ＫＩ）するように方向付けるように設計され得る。１組のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、ＫＩのための１組のドナーポリヌクレオチドと共に共投与され得る。１つまたは複数のノックイン突然変異は、点突然変異、対立遺伝子、タグまたは外因性エクソンをゲノムに導入し得る。点突然変異、対立遺伝子、タグまたは外因性エクソンは、ドナーポリヌクレオチドに位置してもよい。ドナーポリヌクレオチドは、本明細書で説明する相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用してゲノムに組み込まれ得る。１つまたは複数のノックイン突然変異は、以前に非機能性であった遺伝子の機能を回復し得る。１つまたは複数のノックイン突然変異は、遺伝子の機能を改善し得る。遺伝子の機能の改善は、遺伝子によって産生されるタンパク質の量の増大であり得る。ノックインは、遺伝子の機能をノックアウトする場合がある。
【０１３４】
一部の実施形態では、１つまたは複数のノックイン突然変異は、タグをゲノムに導入し得る。タグは、検出可能なタグであり得る。検出可能なタグは、蛍光タグであり得る。検出可能なタグは、制限断片長多型（ＲＦＬＰ：ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）であり得る。
【０１３５】
一部の実施形態では、１つまたは複数のノックイン突然変異は、点突然変異をゲノムに導入し得る。点突然変異は、目的のゲノム領域における核酸の挿入、欠失または置換であり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数のノックイン突然変異は、対立遺伝子をゲノムに導入し得る。対立遺伝子は、導入遺伝子であり得る。
【０１３６】
一部の実施形態では、１つまたは複数のノックイン突然変異は、外因性エクソンをゲノムに導入し得る。エクソンは、標的遺伝子の内因性エクソンに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であり得る。内因性エクソンは、野生型エクソンであり得る。外因性エクソンは、標的遺伝子の内因性エクソンと比較して少なくとも１つの突然変異を含むエクソンであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数のノックイン突然変異は、内因性エクソンを外因性エクソンで置換し得る。外因性エクソンは、野生型エクソンと比較して少なくとも１つの突然変異を含み得る。外因性エクソンは、ドナーポリヌクレオチドに存在し得る。
【０１３７】
一部の実施形態では、本方法は、複数の最初の組のｇＲＮＡを作出するために少なくとも第２の最初の組のｇＲＮＡを設計することをさらに含む。本方法は、複数の遺伝子をターゲティングする複数の最初の組のｇＲＮＡを識別することであって、複数の最初の組のｇＲＮＡ中の各最初の組のｇＲＮＡが、複数の遺伝子中の遺伝子における異なる標的部位にハイブリダイズする、識別することを含み得る。
多重ｇＲＮＡのキット
【０１３８】
本開示の別の態様は、目的のゲノム領域をターゲティングする１組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を識別するための前述の方法により生成された複数のｇＲＮＡを含むキットを提供する。キットは、１組のｇＲＮＡを含み得る。１組における各ｇＲＮＡは、目的のゲノム領域内の異なる標的部位とハイブリダイズ可能であり得る。１組における各ｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡからの少なくとも１個の他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域における標的部位から少なくとも１０塩基離れている、目的のゲノム領域における標的部位とハイブリダイズ可能であり得る。１組における各ｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡからの少なくとも１個の他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域における標的部位から少なくとも３０塩基離れている、目的のゲノム領域における標的部位とハイブリダイズ可能であり得る。１組における各ｇＲＮＡは、１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１個の他のガイドＲＮＡの目的のゲノム領域における標的部位から多くとも１７０塩基離れている、目的のゲノム領域における標的部位とハイブリダイズ可能であり得る。１組における各ｇＲＮＡは、１組のガイドＲＮＡからのあらゆる他のガイドＲＮＡの目的のゲノム領域における標的部位から３０塩基〜１０００塩基離れている、目的のゲノム領域における標的部位とハイブリダイズ可能であり得る。一部の実施形態では、１組のｇＲＮＡは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０、または少なくとも３０個のｇＲＮＡを含む。
【０１３９】
一部の実施形態では、キットは、目的の複数のゲノム領域の各々についての１組のｇＲＮＡを含む。本明細書に記載されたキットは、目的のゲノム領域または目的の複数のゲノム領域をノックアウトするために使用することができる。本明細書に記載されたキットは、目的のゲノム領域へドナーポリヌクレオチドを導入するために使用することができる。本明細書に記載されたキットは、目的の複数のゲノム領域へ複数のドナーポリヌクレオチドを導入するために使用することができる。
【０１４０】
一部の実施形態では、キットは、少なくとも１個のドナーポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、目的の複数のゲノム領域の各々についての少なくとも１個のドナーポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、ヌクレアーゼを含む。ヌクレアーゼはＣａｓタンパク質であり得る。Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載された任意のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、またはＣｐｆ１であり得る。一部の実施形態では、キットは、緩衝剤などの試薬を含む。緩衝剤は、Ｔｒｉｓ緩衝剤、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝剤、Ｔｒｉｓ／ホウ酸／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝剤、またはＴｒｉｓ−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝剤であり得る。キットは、ＲＮＡアーゼフリーのＨ２Ｏを含み得る。一部の実施形態では、キットは、トランスフェクション試薬を含む。トランスフェクション試薬の例には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）およびＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）が含まれるが、それらに限定されない。
【０１４１】
一部の実施形態では、キットは、バイアル、管などの１つまたは複数の容器を受けるために区切られていて、その容器（単数または複数）が、本明細書に記載された方法に使用される別々の要素の１つを含む、搬器、パッケージ、または容器を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。一部の実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの異なる材料から形成されている。キットは、マルチウェルプレートを含み得る。マルチウェルプレートは、４ウェルプレート、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、または３８４ウェルプレートであり得る。一部の実施形態では、マルチウェルプレートにおける各ウェルは、１個のｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、マルチウェルプレートにおける各ウェルは、目的の単一のゲノム領域をターゲティングする１組のｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、マルチウェルプレートにおける各ウェルは、目的の複数のゲノム領域をターゲティングする複数のｇＲＮＡを含む。
【０１４２】
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載された使用のために商業的なおよびユーザーの観点から望ましい１つまたは複数の異なる材料（例えば、試薬、必要に応じて濃縮された形での試薬、および／またはデバイス）をそれぞれが有する、１つまたは複数の追加の容器を含む。そのような材料の非限定的例には、緩衝剤、プライマー、酵素、希釈剤、フィルター、搬器、パッケージ、容器、バイアル、ならびに／または内容物および／もしくは使用説明書を載せている管ラベル、ならびに使用説明書を含むパッケージインサートが含まれるが、それらに限定されない。場合によっては、１セットの使用説明書が含まれる。場合によっては、ラベルは、容器上にあり、または容器に付随してある。ラベルを形成する文字、数字、または他の記号が、容器自体へ付着され、はめられ、またはエッチングされている場合、ラベルは容器上であり得る。ラベルが、容器も保持する入れ物または搬器内に、例えばパッケージインサートとして、存在する場合、ラベルは、容器と付随し得る。ラベルは、その内容物が特定の治療的適用に使用されるべきであることを示すために使用することができる。ラベルは、本明細書に記載された方法においてなどの、その内容物の使用についての指示を示すことができる。
【０１４３】
本開示の別の態様は、目的のゲノム領域をターゲティングするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を識別するための前述の方法により生成された単一のｇＲＮＡを含むキットを提供する。ｇＲＮＡは、目的のゲノム領域内の標的部位とハイブリダイズ可能であり得る。
【０１４４】
本開示の別の態様は、目的のゲノム領域に改変を含む複数の改変細胞を含むキットを提供する。複数の改変細胞は、目的のゲノム領域をターゲティングする１組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を識別するための前述の方法により生成された１組のｇＲＮＡと、ヌクレアーゼおよび必要に応じてドナーポリヌクレオチドと組み合わせて、複数の細胞を接触させることにより、作製することができる。
コンピュータシステムアルゴリズム
【０１４５】
本開示の別の態様は、目的のゲノム領域をターゲティングする１組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を識別するために前述の方法を実施するためのアルゴリズムを含むコンピュータシステムを提供する。アルゴリズムは、１組のｇＲＮＡを識別するステップを含み得る。アルゴリズムは、目的の複数のゲノム領域の各々について１組のｇＲＮＡを識別するステップを含み得る。１組における各ｇＲＮＡは、目的のゲノム領域内の異なる標的部位とハイブリダイズ可能であり得る。１組における各ｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡからの少なくとも１個の他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域における標的部位から少なくとも１０塩基離れている、目的のゲノム領域における標的部位とハイブリダイズ可能であり得る。１組における各ｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡからの少なくとも１個の他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域における標的部位から少なくとも３０塩基離れている、目的のゲノム領域における標的部位とハイブリダイズ可能であり得る。１組における各ｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡからのいずれの他のｇＲＮＡの目的のゲノム領域における標的部位から少なくとも３０塩基離れている、目的のゲノム領域における標的部位とハイブリダイズ可能であり得る。１組における各ｇＲＮＡは、１組のガイドＲＮＡからの少なくとも１個の他のガイドＲＮＡの目的のゲノム領域における標的部位から多くとも１７０塩基離れている、目的のゲノム領域における標的部位とハイブリダイズ可能であり得る。１組における各ｇＲＮＡは、１組のガイドＲＮＡからのあらゆる他のガイドＲＮＡの目的のゲノム領域における標的部位から３０塩基〜１０００塩基離れている、目的のゲノム領域における標的部位とハイブリダイズ可能であり得る。
オフターゲット効率の計算
【０１４６】
本開示の別の態様は、目的のゲノム領域とハイブリダイズするための少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を選択するための方法を提供する。目的のゲノム領域は、ある種のゲノムの遺伝子であり得る。方法は、遺伝子とハイブリダイズする、最初の組のｇＲＮＡの複数のｇＲＮＡの各々について、ゲノムにおける潜在的ｇＲＮＡハイブリダイズ部位とのミスマッチの数を数え上げることにより、オフターゲット値を計算することを含む。
【０１４７】
方法は、目的のゲノム領域とハイブリダイズするための１個または複数のｇＲＮＡを設計するための方法を実施するためのコンピュータ可読媒体を含む、前述のコンピュータシステムを利用することができる。目的のゲノム領域は、ある種のゲノムの遺伝子であり得る。コンピュータ可読媒体は、ゲノムにおける潜在的ｇＲＮＡハイブリダイズ部位とのミスマッチの数を数え上げることにより、オフターゲット値を計算することができる。
【０１４８】
場合によっては、コンピュータシステムのコンピュータ可読媒体は、オフターゲット値を計算し、ミスマッチの数をシャードへと組織化することができる。最初の組のｇＲＮＡのオフターゲット値を計算する時、そのゲノムおよび／またはその種の参照ゲノムにわたる全ての可能なヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）標的領域を含むデータベースが、その可能なＣａｓヌクレアーゼ標的領域の複数の「シャード」（サブセット）へ区切られ（分割され）得る。最初の組のｇＲＮＡは、シャードの各々と比較して、０個、１個、２個、３個、および／または４個のミスマッチを数え上げることができる。全ての可能なＣａｓヌクレアーゼ標的領域を含む１つのデータベースと最初の組のｇＲＮＡを比較することとは対照的に、可能なＣａｓヌクレアーゼ標的領域のサブセットを含むシャードの各々と最初の組のｇＲＮＡを同時に比較することは、オフターゲット値を計算するスループット、速度、および全体的パフォーマンスを向上させることができる。
【０１４９】
オフターゲット値は、参照ゲノムの、または参照ゲノムにわたる１００，０００塩基対（ｂｐ）もしくはヌクレオチド〜３，０００，０００，０００ｂｐに対して、決定することができる。オフターゲット値は、参照ゲノムの、または参照ゲノムにわたる少なくとも１００，０００ｂｐ、５００，０００ｂｐ、１，０００，０００ｂｐ、５，０００，０００ｂｐ、１０，０００，０００ｂｐ、５０，０００，０００ｂｐ、１００，０００，０００ｂｐ、５００，０００，０００ｂｐ、１，０００，０００，０００ｂｐ、２，０００，０００，０００ｂｐ、３，０００，０００，０００ｂｐ、またはそれより多くに対して決定することができる。オフターゲット値は、参照ゲノムの、または参照ゲノムにわたる多くとも３，０００，０００，０００ｂｐ、２，０００，０００，０００ｂｐ、１，０００，０００，０００ｂｐ、５００，０００，０００ｂｐ、１００，０００，０００ｂｐ、５０，０００，０００ｂｐ、１０，０００，０００ｂｐ、５，０００，０００ｂｐ、１，０００，０００ｂｐ、５００，０００ｂｐ、１００，０００ｂｐ、またはそれ未満に対して決定することができる。ある例において、オフターゲット値は、参照ゲノムの、または参照ゲノムにわたる１，０００，０００ｂｐに対して決定することができる。
【０１５０】
複数のゲノムおよび／または参照ゲノムの可能なヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）標的領域を含むデータベースは、１，０００個から１，０００，０００個までのヌクレアーゼ結合部位を有し得る。データベースは、少なくとも１，０００個、１０，０００個、５０，０００個、１００，０００個、１５０，０００個、２００，０００個、２５０，０００個、３００，０００個、３５０，０００個、４００，０００個、４５０，０００個、５００，０００個、５５０，０００個、６００，０００個、６５０，０００個、７００，０００個、７５０，０００個、８００，０００個、８５０，０００個、９００，０００個、９５０，０００個、１，０００，０００個、またはそれより多くのヌクレアーゼ結合部位を有し得る。データベースは、多くとも１，０００，０００個、９５０，０００個、９００，０００個、８５０，０００個、８００，０００個、７５０，０００個、７００，０００個、６５０，０００個、６００，０００個、５５０，０００個、５００，０００個、４５０，０００個、４００，０００個、３５０，０００個、３００，０００個、２５０，０００個、２００，０００個、１５０，０００個、１００，０００個、５０，０００個、１０，０００個、１，０００個、またはそれ未満のヌクレアーゼ結合部位を有し得る。
【０１５１】
複数のゲノムおよび／または参照ゲノムの可能なヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）標的領域を含むデータベースは、１０００万個から３億個までのヌクレアーゼ結合部位を有し得る。データベースは、少なくとも１０００万個、２５００万個、５０００万個、７５００万個、１億個、１億２５００万個、１億５０００万個、１億７５００万個、２億個、２億２５００万個、２億５０００万個、２億７５００万個、３億個、またはそれより多くのヌクレアーゼ結合部位を有し得る。データベースは、多くとも３億個、２億７５００万個、２億５０００万個、２億２５００万個、２億個、１億７５００万個、１億５０００万個、１億２５００万個、１億個、７５００万個、５０００万個、２５００万個、１０００万個、またはそれ未満のヌクレアーゼ結合部位を有し得る。
個別化治療学
【０１５２】
本開示の別の態様は、個体における目的のゲノム領域とハイブリダイズするための１個または複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計するための方法を提供する。方法は、個体のゲノムを使用して、ｇＲＮＡ標的部位潜在性を決定することを含み得る。方法は、各ｇＲＮＡ標的部位潜在性に関して、見込みがあるガイドＲＮＡについてのオフターゲット値を決定することを含み得る。方法は、効用指数が向上した１個または複数のｇＲＮＡを識別することを含み得る。
【０１５３】
場合によっては、方法は、個体集団のゲノムを使用して、ｇＲＮＡ標的部位潜在性を決定することを含み得る。個体集団の例には、一連の年齢の個体セット（例えば、十代、６５歳以上など）、同じ状態と診断された個体セット（例えば、筋ジストロフィー、パーキンソン病などを有する患者集団）、同じ疾患処置を受ける個体セット（例えば、乳がん、前立腺がんなどと診断され、および／または処置された対象のコホート）などが含まれる。そのような方法は、各個体、個体集団由来の個体のサブセット、および／または個体集団全体についてｇＲＮＡ標的部位潜在性を識別することができる。
【０１５４】
場合によっては、本明細書に記載されたソフトウェアおよび方法は、患者コホートにわたって、および／または特定の患者層において、ＣＲＩＳＰＲ系に使用することができるｇＲＮＡの選択および／または推奨を行うために使用される。例えば、活性化または不活性化エンドヌクレアーゼと共にＣＲＩＳＰＲ系を含む治療剤は、本明細書における方法およびシステムを使用して選択されている対象に投与することができる。ｇＲＮＡが、閾値を超えるオフターゲット結合の数を生じるだろうという決定は、処置についてその患者の選択の欠落、または別の処置の推奨を生じるだろう。ｇＲＮＡが閾値未満のオフターゲット結合の数を生じるだろうという決定は、処置にその患者を選択すること、またはその患者にそのような処置を推奨することを生じるだろう。
【０１５５】
ある場合には、本明細書における方法およびシステムのいずれかが、集団における１つ、いくつか、もしくは全ての対象に存在し、または集団における１つ、いくつか、もしくは全ての対象中の標的部位と結合する能力があり、好ましくはオフターゲット値が低下した、ｇＲＮＡを識別するために使用される。これはまた、集団における全対象にわたる、選択されたｇＲＮＡについてのオフターゲット値の計算も網羅するだろう。
【０１５６】
参照アセンブリから設計されたｇＲＮＡは、本明細書に記載されているような臨床研究に由来した情報を使用して、または複数の個体（例えば、少なくとも１０個、１００個、１，０００個、１０，０００個、または１００，０００個）からのゲノム情報を使用して、評価することができる。例えば、臨床研究は、処置されるべき状態および／または正常である状態を有する対象セットのゲノムをシーケンシングし、かつ上記個体のゲノムにわたる試験ｇＲＮＡについてのオフターゲット値を決定することを含み得る。場合によっては、単一の参照ゲノム（例えば、個体）から設計されたｇＲＮＡが、集団における１つ、いくつか、または全ての対象にわたってそれのオフターゲット活性について評価することができる。これは、例えば、本明細書における方法およびシステムを使用して、参照ゲノムを使用して新しい治療剤を設計し、かつ対象、対象セットにおいて、または個体の集団もしくは層にわたって、それの可能な効率または有効性を評価するために、行うことができる。ｇＲＮＡは、安定性、ｐＫ、送達の増加、オフターゲット値の低下またはオフターゲット効果の低下へさらに改変することができる。
【０１５７】
一例では、臨床研究は、処置されるべき状態および／または正常である状態を有する対象セットにおける少なくとも１つの対象のゲノムをシーケンシングし、少なくとも１つの対象のゲノムに基づいてｇＲＮＡを設計し、対象セットにおける１つ、いくつか、または全ての対象にわたって、設計されたｇＲＮＡについてオフターゲット値を決定することを含み得る。
【０１５８】
個体のゲノム領域をハイブリダイズするための１個または複数のｇＲＮＡを設計するための方法は、目的のゲノム領域とハイブリダイズするための１個または複数のｇＲＮＡを設計するための前述の方法を利用することができる。目的のゲノム領域は、ある種のゲノムの遺伝子であり得る。方法は、個体のゲノムおよび／または個体集団のゲノムを（例えば、ユーザーデバイスにおけるユーザーインターフェースを介してユーザー入力から、またはデータベースから）受信することをさらに含み得る。方法は、プロトスペーサー（標的配列）、１つまたは複数の型のＣａｓ酵素によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、およびプロトスペーサーの逆鎖（結合部位）を含む全ての可能な標的領域（または標的座）をゲノムから識別することをさらに含み得る。方法は、目的のゲノム領域において、特定された標的領域を単離することをさらに含み得る。単離された標的領域は、標的部位潜在性であり得る。ある例では、目的のゲノム領域は、間違ったまたは望ましくない位置における遺伝子挿入のリスクを低下させるために、個体または個体集団の免疫細胞のＴ細胞ゲノム内の特異的部位であり得る。
【０１５９】
方法は、個体または個体集団の標的部位潜在性をハイブリダイズする最初の組のｇＲＮＡを識別することをさらに含み得る。方法は、最初の組のｇＲＮＡの各ｇＲＮＡのオフターゲット値および／またはオンターゲット効率を計算して、各ｇＲＮＡの効用指数を決定することをさらに含み得る。場合によっては、効用指数は治療指数であり得る。場合によっては、治療指数は、オフターゲット値および／またはオンターゲット効率により評価することができるオフターゲット結合の低下を含む。したがって、場合によっては、オフターゲット値およびオープン標的効率の異なる閾値を使用して、効用指数が向上した１個または複数のｇＲＮＡを識別することができる。したがって、方法は、効用指数が向上した１個または複数のｇＲＮＡで細胞を編集することをさらに含み得る。
【０１６０】
場合によっては、治療指数は、個体または個体集団の少なくとも１個の細胞における、オフターゲット結合の低下だけでなく、オンターゲット効率の増加、ノックアウト（ＫＯ）効率の増加、ノックイン（ＫＩ）効率の増加、またはＣＲＩＳＰＲ干渉の調節もまた含む。ある例では、１個または複数のｇＲＮＡは、個体または個体集団の細胞のゲノム領域における遺伝子をＫＯするように設計することができる。別の例では、１個または複数のｇＲＮＡは、個体または個体集団の細胞のゲノム領域において突然変異をＫＩするように設計することができる。
【０１６１】
場合によっては、個体はヒトであり得る。場合によっては、個体は非ヒト（例えば、マウス、ラットなど）であり得る。場合によっては、個体（または個体集団における個体）は、状態に悩まされ得る。その状態は、いくつかの疾患関連遺伝子と関係していることが公知であり得、または予想され得、本開示の１個または複数のｇＲＮＡが、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をいくつかの疾患関連遺伝子へ方向付けることができる。いくつかの疾患関連遺伝子は、非疾患対照の組織または細胞と比較して、疾患罹患組織由来の細胞において異常なレベルでまたは異常な形で転写または翻訳産物を生じている、任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを含み得る。例は、異常に高いレベルで発現している遺伝子であり得る。別の例は、異常に低いレベルで発現している遺伝子であり得、その発現の変化が、疾患の発生および／または進行と相関する。あるいはまたは加えて、いくつかの疾患関連遺伝子は、突然変異を有する任意の遺伝子を含み得る。
【０１６２】
いくつかの疾患関連遺伝子の例には、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発硬化症、脊髄性筋ジストロフィー、筋ジストロフィー、骨髄性細胞に影響を及ぼす疾患、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、悪性腫瘍、黒色腫、嚢胞性線維症、血友病、鎌状赤血球症、ならびに乳房、腸、前立腺、中枢神経系、神経膠芽腫、および肉腫を含む異なる臓器のがんが含まれる。
【０１６３】
ｇＲＮＡ標的部位潜在性の決定方法、および１個または複数のｇＲＮＡの特定は、コンピュータにより実施することができる。コンピュータは、目的のゲノム領域とハイブリダイズするための１個または複数のｇＲＮＡを設計するための方法を実施するための計算可能媒体を含む前述のコンピュータシステムであり得る。
個別化診断学
【０１６４】
本開示の別の態様は、ＣＲＩＳＰＲ剤の個体へのオフターゲット効果を評価するための方法を提供する。方法は、個体のゲノムを使用して、コンピュータにより、個体のゲノムにおける潜在的標的部位とのミスマッチの数を数え上げることにより、ＣＲＩＳＰＲ剤のオフターゲット値を決定することを含む。
【０１６５】
これは、例えば、臨床試験設定において、臨床試験または処置に含まれ得る患者、またはそれから除外され得る患者を選択するのに、有用であり得る。例えば、その個人的ゲノムが閾値（例えば、０、１、２、３など）より多い数のオフターゲット結合部位を有する患者は、臨床試験または処置レジメンから除外され、一方、その個人的ゲノムがより少ないオフターゲット結合部位を有し、またはオフターゲット結合部位を有しない患者は、臨床試験に含まれ、または処置を受ける。
【０１６６】
個体へのＣＲＩＳＰＲ剤のオフターゲット効果を評価するための方法は、目的のゲノム領域とハイブリダイズするための１個または複数のｇＲＮＡを設計するための方法を実施するためのコンピュータ可読媒体を含む前述のコンピュータシステムを利用することができる。目的のゲノム領域は、ある種のゲノムの遺伝子であり得る。方法は、個体のゲノムにおける潜在的標的部位とのミスマッチの数を数え上げる報告を出力することをさらに含み得る。場合によっては、出力は、スクリーン上に（例えば、パーソナルコンピュータなどのユーザーデバイスにおけるユーザーインターフェースを介して）表示され得る。
【０１６７】
ＣＲＩＳＰＲ剤は、治療剤であり得る。治療剤は、その種のゲノムの遺伝子をハイブリダイズするための１個または複数のｇＲＮＡ由来のｇＲＮＡであり得る。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的領域へ方向付けることができる。治療剤は、多様な細胞型において標的領域を改変すること（例えば、欠失させること、挿入すること、転位置させること、不活性化すること、活性化すること）を含む、幅広い種類の有用性を有し得る。したがって、治療剤は、非限定的に遺伝子治療、薬物スクリーニング、疾患診断、および予後を含む広範囲の適用を有し得る。
【０１６８】
個体のゲノムにおける潜在的標的部位の数は、１，０００個から３，０００，０００個までの範囲であり得る。個体のゲノムにおける潜在的標的部位の数は、少なくとも１，０００個、１０，０００個、１００，０００個、２００，０００個、３００，０００個、４００，０００個、５００，０００個、６００，０００個、７００，０００個、８００，０００個、９００，０００個、１，０００，０００個、２，０００，０００個、３，０００，０００個、またはそれより多くであり得る。個体のゲノムにおける潜在的標的部位の数は、多くとも３，０００，０００個、２，０００，０００個、１，０００，０００個、９００，０００個、８００，０００個、７００，０００個、６００，０００個、５００，０００個、４００，０００個、３００，０００個、２００，０００個、１００，０００個、１０，０００個、１，０００個、またはそれ未満であり得る。
編集のための高効率および高精度の方法
【０１６９】
本開示の別の態様は、細胞または細胞集団を、ヌクレアーゼおよび必要に応じてドナーポリヌクレオチドと組み合わせた、１組または複数組のｇＲＮＡと、接触させて、改変細胞の集団を生じさせることを含む、細胞または細胞集団を編集するための方法を提供する。改変細胞の集団は、目的の少なくとも１つのゲノム領域において少なくとも１つの編集を含み得る。１組または複数組のｇＲＮＡは、本明細書に記載された方法のいずれかにより設計することができる。少なくとも１つの編集は、結果として、目的のゲノム領域における遺伝子のノックアウト、または目的のゲノム領域におけるゲノムへの点突然変異、対立遺伝子、タグ、もしくは外因性エクソンのノックインを生じ得る。本開示の別の態様は、少なくとも１組のｇＲＮＡにより生じた、目的の少なくとも１つのゲノム領域における少なくとも１つの編集を含む細胞または改変細胞集団をスクリーニングするための方法を提供する。少なくとも２個のｇＲＮＡを含む１組または複数組のｇＲＮＡの編集効率は、少なくとも２個のｇＲＮＡの各々の個々の編集効率より高いことがある。
【０１７０】
一部の実施形態では、細胞集団における目的の複数のゲノム領域を編集するための方法は、細胞集団を（ｉ）目的の複数のゲノム領域をターゲティングする複数組のｇＲＮＡおよび（ｉｉ）ヌクレアーゼと接触させることであって、接触後、細胞集団における細胞の少なくとも５０％が、目的のゲノム領域の各々において、野生型遺伝子型とは異なる編集された遺伝子型を含む、接触させることを含む。一部の実施形態では、細胞集団における目的の複数のゲノム領域を編集するための方法は、細胞集団のサブセットの各々を以下と接触させることを含む：（ｉ）ｇＲＮＡの複数組からのｇＲＮＡの１組であって、ｇＲＮＡの複数組におけるｇＲＮＡの各組が、目的の複数のゲノム領域由来の、目的の異なるゲノム領域をターゲティングする、ｇＲＮＡの１組、および（ｉｉ）ヌクレアーゼ。一部の実施形態では、接触後、細胞集団のサブセットの少なくとも５０％における細胞の少なくとも８０％が、目的のゲノム領域において野生型遺伝子型とは異なる編集された遺伝子型を含む。一部の実施形態では、接触後、細胞集団のサブセットの各々における細胞の少なくとも７０％が、目的のゲノム領域において野生型遺伝子型とは異なる編集された遺伝子型を含む。ｇＲＮＡの各組は、３個のｇＲＮＡを含み得る。場合によっては、ｇＲＮＡの組の少なくとも５０％、６０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、少なくとも３個のｇＲＮＡを含む。１組のｇＲＮＡにおける各ｇＲＮＡは、少なくとも３０塩基のガイド間スペーシングを含む。１組のｇＲＮＡにおける各ｇＲＮＡは、１組のｇＲＮＡからの全ての他のｇＲＮＡの標的部位から少なくとも３０塩基である、目的のゲノム領域における標的部位とハイブリダイズ可能であり得る。
【０１７１】
方法は、本明細書に記載されているように、目的のゲノム領域とハイブリダイズするための１組または複数組のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計することを含み得る。改変細胞の集団は、少なくとも１個の細胞を含み得る。少なくとも１個の細胞は、哺乳動物細胞、魚細胞、昆虫細胞、植物細胞、または微生物であり得る。微生物は細菌であり得る。少なくとも１個の細胞は、本明細書に記載されているような細胞系における細胞であり得る。少なくとも１個の細胞は、腫瘍細胞であり得る。少なくとも１個の細胞は、個体に由来し得る。
【０１７２】
方法は、細胞または細胞集団を、１組または複数組のｇＲＮＡおよびヌクレアーゼと接触させて、改変細胞または改変細胞集団を生じさせることを含み得る。方法は、細胞または細胞集団をドナーポリヌクレオチドと接触させることをさらに含み得る。接触させることは、１組または複数組のｇＲＮＡ、ヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、またはそれらの組合せを細胞または細胞集団へトランスフェクションすることを含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの１組または複数組における各ｇＲＮＡは、トランスフェクション前にＣａｓタンパク質と複合体化されて、Ｃａｓ−ｇＲＮＡ複合体を生じ、その複合体は、本明細書で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系とも呼ばれる。一部の実施形態では、方法は、細胞または細胞集団へ少なくとも１個のドナーポリヌクレオチドをトランスフェクションすることをさらに含む。トランスフェクションすることは、非ウイルストランスフェクションまたはウイルストランスフェクションであり得る。非ウイルストランスフェクションは、電気穿孔、リポフェクション、またはマイクロインジェクションであり得る。ウイルストランスフェクションは、ウイルスベクターの使用を含み得る。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アルファウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターは、複製可能ウイルスベクターまたは複製不能ウイルスベクターであり得る。
【０１７３】
目的のゲノム領域は遺伝子であり得る。遺伝子は、目的の経路における遺伝子であり得る。方法は、目的の複数のゲノム領域をターゲティングすることを含み得る。目的の複数のゲノム領域は、目的の経路における複数の遺伝子を含み得る。目的の複数のゲノム領域は、目的の複数の経路における複数の遺伝子を含み得る。目的の経路は、代謝経路、シグナル伝達経路、または遺伝子調節経路であり得る。目的の経路は、疾患に関与する経路であり得る。疾患はがんであり得る。目的の経路は、目的の分子の産生に関与する経路であり得る。目的の分子は、薬理学的活性を有する分子であり得る。目的のゲノム領域は、ゲノムの非コード領域であり得る。非コード領域は、調節エレメントであり得る。調節エレメントは、シス調節エレメントまたはトランス調節エレメントであり得る。シス調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、またはサイレンサーであり得る。
【０１７４】
一部の実施形態では、方法は、目的のゲノム領域をターゲティングする１組のｇＲＮＡを、改変細胞集団のサブセットと接触させることを含む。一部の実施形態では、方法は、目的のゲノム領域をターゲティングするｇＲＮＡの複数組の各々を、改変細胞集団の複数のサブセットの各々と接触させることを含む。一例では、改変細胞集団の複数のサブセットは、マルチウェルプレートの各ウェルに置くことができる。マルチウェルプレートは、４ウェルプレート、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、または３８４ウェルプレートであり得る。改変細胞集団のサブセットは、少なくとも１０２個、少なくとも１０３個、少なくとも１０４個、少なくとも１０５個、または少なくとも１０６個の細胞を含み得る。マルチウェルプレートの各ウェルは、目的のゲノム領域をターゲティングする１組のｇＲＮＡをさらに含み得る。マルチウェルプレートの各ウェルにおけるｇＲＮＡの各組は、目的の異なるゲノム領域をターゲティングし得る。ｇＲＮＡの複数組は、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、または少なくとも１００個の、目的の異なるゲノム領域をターゲティングし得る。一部の実施形態では、接触は、マルチウェルプレートの各ウェルで起こる。
【０１７５】
一部の実施形態では、方法は、改変細胞集団または改変細胞集団のサブセットを刺激と接触させることを含む。刺激は、追加の作用物質であり得る。追加の作用物質は、治療剤（例えば、抗生物質、生物製剤、または小分子薬）、または改変細胞において疾患状態を誘導する作用物質であり得る。
【０１７６】
一部の実施形態では、方法は、改変細胞集団または改変細胞集団のサブセットの表現型を検出することを含む。表現型は、細胞生生存率であり得る。表現型は、１組のｇＲＮＡの編集効率であり得る。表現型は、改変細胞集団または改変細胞集団のサブセットにより産生された目的の分子の量であり得る。目的の分子は、タンパク質、またはタンパク質をコードする転写物であり得る。一部の実施形態では、方法は、改変細胞集団または改変細胞集団のサブセットのタグを検出することを含む。
ｇＲＮＡの確証
【０１７７】
本開示の他の態様は、見込みがあるｇＲＮＡを確証するための方法を提供する。方法は、ゲノムまたはゲノムの一部における見込みがあるｇＲＮＡについてのオフターゲットヒット数を決定することを含み得る。方法は、オフターゲットヒット数を使用して、見込みがあるｇＲＮＡについてのオフターゲット値を計算することを含み得る。方法は、オフターゲット値を使用して、見込みがあるｇＲＮＡの活性を予測することを含み得る。
【０１７８】
見込みがあるｇＲＮＡを確証するための方法は、目的のゲノム領域とハイブリダイズするための１個または複数のｇＲＮＡを設計するための前述の方法を利用することができる。目的のゲノム領域は、ある種のゲノムの遺伝子であり得る。あるいはまたは加えて、見込みがあるｇＲＮＡを確証するための方法は、（１）目的のゲノム領域とハイブリダイズするための１個または複数のｇＲＮＡを設計するための方法、（２）目的のゲノム領域をターゲティングする１組のｇＲＮＡを識別するための方法、および（３）目的のゲノム領域とハイブリダイズするための少なくとも１個のｇＲＮＡを選択するための方法を実施するために、コンピュータ可読媒体を含む前述のコンピュータシステムをさらに利用することができる。
【０１７９】
図６は、ある種のゲノムの遺伝子とハイブリダイズするための１個または複数のガイド（例えば、ｇＲＮＡ）を確証する方法のフローチャート６００の例を示す。方法は、（ａ）ガイドが存在することを確認すること（例えば、ユーザーによって提供されたｇＲＮＡの相補配列が、その種のゲノムに存在することを確認すること）６０５；（ｂ）切断情報を見ること（例えば、ゲノムにおけるｇＲＮＡの相補配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位の隣にあることを確認すること）６１０、（ｃ）ｇＲＮＡについてのオンターゲット値を算出すること（例えば、ｇＲＮＡについてアジマススコアを計算すること）６１５；（ｄ）各ガイドについてオフターゲットヒットを算出すること６２０；（ｅ）可能性の高いオフターゲットについてさらなる詳細を得ること（例えば、ゲノムにわたる複数の可能なＣａｓ標的領域と比較した、ｇＲＮＡの各々についてのミスマッチの数を数え上げること）６２５；および（ｆ）ｇＲＮＡ活性の予測を返すこと６３０を含む。場合によっては、ステップ（ｃ）および（ｄ〜ｅ）の順序は交換可能であり得る。
ユーザーインターフェース
【０１８０】
本開示の他の追加の態様は、コンピュータシステムを提供する。コンピュータシステムは、目的の種、および目的の種由来の目的の遺伝子の選択のためのユーザーインターフェースシステムを含み得る。コンピュータシステムは、目的の遺伝子ついての１個または複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を識別するための、ユーザーインターフェースと統合された設計モジュールを含み得る。コンピュータシステムは、選択された低分子ｇＲＮＡ、または低分子ｇＲＮＡを含むｇＲＮＡを表示するための出力システムを含み得る。各低分子ｇＲＮＡは、約２０塩基またはヌクレオチドの各ｇＲＮＡであり得る。コンピュータシステムは、１個または複数の低分子ｇＲＮＡの、ＲＮＡシンセサイザーによる合成を開始するためのアクティベーションユニットを含み得る。
【０１８１】
コンピュータシステムの設計モジュールは、目的のゲノム領域とハイブリダイズするための１個または複数のｇＲＮＡを設計するための前述の方法を利用し得る、見込みがあるｇＲＮＡを確証するために、前述の方法を実施することができる。
【０１８２】
ユーザーインターフェースシステムは、１００個〜５００，０００個の異なる参照ゲノムの選択を含み得る。ユーザーインターフェースシステムは、少なくとも１００個、１，０００個、１０，０００個、１００，０００個、５００，０００個、またはそれより多くの異なる参照ゲノムの選択を含み得る。ユーザーインターフェースシステムは、多くとも５００，０００個、１００，０００個、１０，０００個、１，０００個、１００個、またはそれ未満の異なる参照ゲノムの選択を含み得る。異なる参照ゲノムは、クラウド（例えば、Ａｍａｚｏｎ  Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｃｌｏｕｄにおける１つまたは複数のデータベース）に記憶することができる。コンピュータシステムの設計モジュールは、クラウドにおける参照ゲノムにアクセスできる。
【０１８３】
コンピュータシステムの設計モジュールは、１０，０００個から１２０，０００個の間の参照ゲノムにアクセスできる。コンピュータシステムの設計モジュールは、少なくとも１０，０００個、２０，０００個、３０，０００個、４０，０００個、５０，０００個、６０，０００個、７０，０００個、８０，０００個、９０，０００個、１００，０００個、１１０，０００個、１２０，０００個、またはそれより多くの参照ゲノムにアクセスできる。コンピュータシステムの設計モジュールは、多くとも１２０，０００個、１１０，０００個、１００，０００個、９０，０００個、８０，０００個、７０，０００個、６０，０００個、５０，０００個、４０，０００個、３０，０００個、２０，０００個、１０，０００個、またはそれ未満の参照ゲノムにアクセスできる。
【０１８４】
コンピュータシステムのユーザーインターフェースは、個々のゲノムの入力を得るためのゲノムデータ受信モジュールをさらに含み得る。ゲノムデータ受信モジュールは、サーバー（例えば、パーソナルゲノムサービスのサーバー）から、またはユーザーによりアップロードされたファイルから、個々のゲノムまたはユーザーのゲノムの一部を得ることができる。
【０１８５】
図７Ａ〜Ｄは、目的のある種のゲノムの遺伝子を選択して、遺伝子をハイブリダイズするための１個または複数のｇＲＮＡの設計をリクエストする、グラフィックユーザーインターフェース（ＧＵＩ）のウィンドウの例を示す。１個または複数のｇＲＮＡは、目的の遺伝子のノックアウトのためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を方向付けるように設計することができる。図７Ａは、目的のゲノム７１０および遺伝子７２０の名前または識別番号をユーザーがタイプすることを可能にするノックアウトガイド設計についてのＧＵＩ  ７００のウィンドウを示す。このＧＵＩにおいて、使用のヌクレアーゼ７３０は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）であるように前もって選択される。場合によっては、ユーザーは、目的のＣａｓ酵素を選択することができる。図７Ｂは、ノックアウトガイド設計についてのＧＵＩ  ７００のウィンドウを示す。ユーザーが、目的のゲノムの二名法による名前の一部分（例えば、「Ｈｏｍｏ」）をタイプしたとき、ＧＵＩ  ７００のソフトウェアは、属において（例えば、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、７１２）、または種において（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｏｍｏｈｉｏｃｈｉｉ、７１４）その語「Ｈｏｍｏ」を含む、入手可能なゲノムのリストをユーザーに提案することができる。ＧＵＩ  ７００のソフトウェアはまた、同じゲノムの異なる型（例えば、「Ｇｅｎｅｃｏｄｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２６」由来のＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓゲノム７１２および「Ｇｅｎｅｃｏｄｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２１」由来のＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓゲノム７１６）を提案することができる。その後、ユーザーは、目的の正しい二名法による名前を選択することができる。あるいはまたは加えて、ユーザーは、目的の二名法による名前をフルスペリングでタイプすることができる。図７Ｃは、ノックアウトガイド設計についてのＧＵＩ  ７００のウィンドウを示す。ユーザーが、目的の遺伝子の略語および／またはフルネームの一部分（例えば、「ＲＥ」）をタイプしたとき、ＧＵＩ  ７００のソフトウェアは、タイプされた入力を含む入手可能な遺伝子（例えば、「ＲＥＬＡ」７２２または「ＡＬＹＲＥＦ」７２４）のリストをユーザーに提案することができる。その後、ユーザーは、目的の正しい遺伝子を選択することができる。あるいはまたは加えて、ユーザーは、目的の遺伝子の名前をフルスペリングでタイプすることができる。図７Ｄは、ノックアウトガイド設計についてのＧＵＩ  ７００のウィンドウを示す。いったんゲノム７１０、遺伝子７２０、およびヌクレアーゼ７３０が選択されたならば、ユーザーは、目的の種のゲノムの遺伝子をハイブリダイズするための１個または複数のｇＲＮＡを設計するための方法を開始するようにＧＵＩのソフトウェアに指示するために、検索ボタン７４０をクリックすることができる。
【０１８６】
図８は、目的のゲノムの遺伝子をハイブリダイズするための１個または複数のｇＲＮＡを設計する過程を表示するためのＧＵＩのウィンドウ８００の例を示す。ウィンドウ８００は、１個または複数のｇＲＮＡを設計するための方法のステップのリストを示す。ウィンドウは、使用済みのステップにマークを付け８１０、かつ残りのステップをマークしないでおくこと８２０により、過程を示すことができる。
【０１８７】
図９Ａ〜Ｄは、目的のゲノムの遺伝子をハイブリダイズするように設計されている１個または複数のｇＲＮＡを表示するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図９Ａは、ＧＵＩのウィンドウ９００を示す。ウィンドウ９００は、１個または複数のｇＲＮＡを設計した結果の概要９１０（例えば、目的の遺伝子におけるＣａｓ標的部位の数、遺伝子ノックアウトに使用することができるいくつかの上位にランク付けされたｇＲＮＡなど）を提供する。ウィンドウ９００は、上位にランク付けされたｇＲＮＡ  ９２０の、ハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を提供する。ウィンドウ９００はまた、１個または複数のｇＲＮＡを生成するために使用された遺伝子の選択されたコード領域９３０（例えば、ＲＥＬＡ遺伝子のエクソン３）の概略図、加えて、その遺伝子の選択された領域９３０内で、上位にランク付けされたｇＲＮＡ  ９２０のハイブリダイズする位置９４０を提供する。図９Ｂは、ＧＵＩのウィンドウ９００を示す。ユーザーが、上位にランク付けされたｇＲＮＡ  ９２０からｇＲＮＡ  ９２２を選択したとき、ＧＵＩは、遺伝子の選択されたコード領域９３０における、選択されたｇＲＮＡ  ９２２の各々のハイブリダイズ位置９４２をハイライトする。さらに、図９Ｃに示されているように、ウィンドウ９００はまた、標的ポリヌクレオチド配列、その種のゲノム内のＣａｓ切断部位（開裂部位）、選択されたコード領域位置、オンターゲット値、およびオフターゲット値を含む、選択されたｇＲＮＡ  ９２２についての詳細９４４を示す。図９Ｄは、ＧＵＩのウィンドウ９０５を示す。ウィンドウ９０５は、目的のゲノムの遺伝子をハイブリダイズするように設計されている１個または複数のｇＲＮＡから追加のｇＲＮＡを表示する。ユーザーは、さらなる分析および／または購入のために、追加のｇＲＮＡから少なくとも１個を選択することができる。
【０１８８】
図１０Ａ〜Ｅは、目的のゲノムの遺伝子をハイブリダイズするように設計されたｇＲＮＡについての詳細な情報を表示するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。ユーザーが、設計されたｇＲＮＡ（例えば、図９ＣにおけるｇＲＮＡ  ９２２）を選択したとき、ユーザーは、図１０Ａに示されているように、新しいＧＵＩウィンドウ１０００に導かれる。ウィンドウ１０００は、選択されたｇＲＮＡのパフォーマンス（例えば、ｇＲＮＡの標的遺伝子、ゲノム内の切断部位の位置など）の概要１０１０を提供する。ウィンドウ１０００はまた、分析のために選択された、選択されたｇＲＮＡ配列、ゲノム、遺伝子、およびヌクレアーゼを含む他の詳細１０２０を示す。さらに、ウィンドウ１０００は、目的の遺伝子の標的領域と相互作用するところを描画されたＣａｓ−ｇＲＮＡ複合体の概略図１０３０を示す。ウィンドウ１０００はまた、選択されたｇＲＮＡとオフターゲット部位の各々との間のミスマッチの数、ゲノム内のオフターゲット部位の位置、およびオフターゲット部位を含む遺伝子の名前を含む付随情報と共に、選択されたｇＲＮＡのオフターゲット部位１０４０の例を示す（図１０Ｅに示された、選択されたｇＲＮＡの追加のオフターゲット部位のリスト１０４５）。ユーザーが概略図１０３０の異なる部分を選択したとき、ＧＵＩは、概略図１０３０のどのパートが、ＲＮＡガイド配列（図１０Ｂ、１０３２）、標的部位におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（図１０Ｃ、１０３４）、および標的部位配列（図１０Ｄ、１０３６）を表示しているかの情報をユーザーに与えることができる。
【０１８９】
図１１Ａ〜Ｂは、目的のゲノムの遺伝子をハイブリダイズするように設計されている１個または複数のｇＲＮＡのサブセットを選択し、かつ購入するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。図１１Ａは、ＧＵＩのウィンドウ９００を示す。ユーザーは、上位にランク付けされたｇＲＮＡ  ９２０からｇＲＮＡのサブセット１１１０を選択し、ｇＲＮＡのサブセット１１１０の合成分子を購入するように進むことができる１１２０。図１１Ｂは、ユーザーがｇＲＮＡのサブセット１１１０の合成分子を購入するように進んだ１１２０時点で、ユーザーに表示されるウィンドウ１１００を示す。ウィンドウ１１００は、選択されｔｇＲＮＡの概要１１３０（例えば、選択されたｇＲＮＡの数、ならびにそれらの意図された標的遺伝子およびゲノム）を表示する。ウィンドウ１１００はまた、合成について、修飾型ｇＲＮＡ  １１４０かまたは非修飾型ｇＲＮＡ  １１４５かを選択するようにユーザーにリクエストする。加えて、ウィンドウ１１００は、合成について選択されているｇＲＮＡの最終概要１１５０を表示する。ユーザーは、購入の支払いのために進むことができる。
【０１９０】
図１２Ａ〜Ｂは、目的の種のゲノムを選択し、あらかじめ生成されたｇＲＮＡ配列を入力して、そのガイドパフォーマンスの確証をリクエストするためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。ｇＲＮＡは、遺伝子編集のためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を方向付けるように、あらかじめ設計することができる。図１２Ａは、ｇＲＮＡ確証のためのＧＵＩのウィンドウ１２００を示す。ＧＵＩは、ユーザーが、ゲノム１２１０の名前または識別番号、およびあらかじめ決定されたｇＲＮＡ  １２２０の配列をタイプすることを可能にする。このＧＵＩにおいて、使用のヌクレアーゼ１２３０は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）であるように前もって選択される。場合によっては、ユーザーは、目的のＣａｓ酵素を選択することができる。図１２Ｂに示されているように、ゲノム１２１５、ｇＲＮＡ配列１２２５、およびヌクレアーゼ１２３０が決定されたならば、ユーザーは、そのｇＲＭＡ配列を確証するために進むことができる１２４０。
【０１９１】
図１３Ａ〜Ｂは、目的のゲノムの遺伝子をハイブリダイズするように設計されているｇＲＮＡの確証についての詳細な情報を表示するためのＧＵＩのウィンドウの例を示す。ユーザーが、あらかじめ決定されたｇＲＮＡ（例えば、図１２ＢにおけるｇＲＮＡ配列１２２５）の確証をリクエストしたとき、ユーザーは、図１３Ａに示されているように、新しいＧＵＩウィンドウ１３００に導かれる。ウィンドウ１３００は、あらかじめ決定されたｇＲＮＡのパフォーマンス（例えば、ｇＲＮＡの推定標的遺伝子、ゲノム内の切断部位の位置など）の概要１３１０を提供する。ウィンドウ１３００はまた、分析のために選択された、あらかじめ決定されたｇＲＮＡ配列、ゲノム、およびヌクレアーゼを含む他の詳細１３２０を示す。さらに、ウィンドウ１３００は、推定標的遺伝子の標的領域と相互作用するところを描画されたＣａｓ−ｇＲＮＡ複合体の概略図１３３０を示す。ウィンドウ１３００はまた、図１３Ｂに示されているように、あらかじめ決定されたｇＲＮＡとオフターゲット部位の各々との間のミスマッチの数、ゲノム内のオフターゲット部位の位置、およびオフターゲット部位を含む遺伝子の名前を含む、付随情報と共に、あらかじめ決定されたｇＲＮＡのオフターゲット部位１３４０の例を示す。
システム
【０１９２】
本開示の他の異なる態様は、（１）１０，０００個より多い参照ゲノムへのアクセスをユーザーに提供するインターフェース；（２）５０，０００個より多い参照ゲノムのいずれか１個における遺伝子についての１個または複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の選択のためのソフトウェア；および（３）選択されたガイドＲＮＡを表示する出力システムを含むシステムを提供する。
【０１９３】
システムは、目的のゲノム領域とハイブリダイズするための１個または複数のｇＲＮＡを設計するための方法を実施するためのコンピュータ可読媒体を含む前述のコンピュータシステムを利用することができる。
【０１９４】
システムは、２０，０００個から１２０，０００個までの参照ゲノムを含み得る。システムは、少なくとも２０，０００個、２０，０００個、３０，０００個、４０，０００個、５０，０００個、６０，０００個、７０，０００個、８０，０００個、９０，０００個、１００，０００個、１１０，０００個、１２０，０００個、またはそれより多くの参照ゲノムを含み得る。システムは、多くとも１２０，０００個、１１０，０００個、１００，０００個、９０，０００個、８０，０００個、７０，０００個、６０，０００個、５０，０００個、４０，０００個、３０，０００個、２０，０００個、またはそれ未満の参照ゲノムを含み得る。
【０１９５】
システムは、ポリヌクレオチドを合成する機械（例えば、シンセサイザー）を含み得る。ソフトウェアは、その機械と通信することができる。あるいはまたは加えて、システムは、ポリヌクレオチドを合成する外部機械と通信することができる。場合によっては、システムは、ｇＲＮＡの合成をアクティブにして、開始するスクリプトをさらに含み得る。ｇＲＮＡの合成は、１個または複数のｇＲＮＡのユーザーの選択に基づき得る。
【０１９６】
本開示は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計するための方法をさらに提供する。ｇＲＮＡを設計するための方法は、遺伝子の主要な転写物を識別することを含み得る。ｇＲＮＡを設計するための方法は、主要な転写物と複数の選択的転写物との間の共通エクソンを識別することを含み得る。ｇＲＮＡを設計するための方法は、共通エクソン内にヌクレアーゼ標的部位を識別することを含み得る。ｇＲＮＡを設計するための方法は、参照ゲノム配列に対する、ヌクレアーゼ標的部位についてのオフターゲット結合部位の数を計算し、それにより、計算されたヌクレアーゼオフターゲット結合部位数を得ることを含み得る。ｇＲＮＡを設計するための方法は、オンターゲット効率スコアを計算し、それにより、計算されたオンターゲット効率スコアを生じることを含み得る。ｇＲＮＡを設計するための方法は、計算されたオンターゲット効率が閾値を超えており、かつ計算されたヌクレアーゼオフターゲット結合部位数がゼロである配列をｇＲＮＡが含む、少なくとも１つのｇＲＮＡ配列を出力することを含み得る。
【０１９７】
場合によっては、ｇＲＮＡを設計するための方法は、標的部位と部分的相補性を有する核酸の合成を指示することを含み得る。ｇＲＮＡと標的部位との間の部分的相補性は、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、または１０ヌクレオチドより多いミスマッチを含み得る。
【０１９８】
本開示は、ネットワークを通じて、ユーザーからのバイオポリマー合成リクエストを処理するためのシステムをさらに提供する。システムは、ネットワークを通じて、ユーザーのデジタルコンピュータと通信するように構成されている通信インターフェースを含み得る。システムは、１個または複数の参照ゲノムを記憶する参照ゲノムデータベースを含み得る。システムは、通信インターフェースおよびデータベースと作動可能に連結された１つまたは複数のコンピュータプロセッサーを含むコンピュータを含み得る。１つまたは複数のコンピュータプロセッサーは個々に、または集合的に、（ａ）ネットワークを通じて通信インターフェースから、ユーザーのデジタルコンピュータからのバイオポリマー合成リクエストを受信することであって、バイオポリマー合成リクエストが標的ゲノム情報を含む、バイオポリマー合成リクエストを受信すること；（ｂ）標的ゲノム情報をデータベースからの１個または複数の参照ゲノムに対して処理して、標的ゲノム情報に対応する標的配列を識別すること；（ｃ）アルゴリズムを実行して、標的配列に少なくとも部分的に相補的である第１の組のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）配列を生成し、第１の組のｇＲＮＡ配列におけるｇＲＮＡ配列の各々についてオフターゲット相補性スコアを計算すること；（ｄ）ユーザーのデジタルコンピュータのグラフィカルユーザーインターフェース上での表示のために第２の組のｇＲＮＡ配列を出力することであって、第２の組のｇＲＮＡ配列の各々が、閾値未満の計算されたオフターゲット相補性スコアを有する、出力すること；および（ｅ）第２の組のｇＲＮＡ配列からの所与のｇＲＮＡ配列の選択をユーザーのデジタルコンピュータから受信することを行うようにプログラミングされ得る。
【０１９９】
場合によっては、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーは個々に、または集合的に、キューの中の所与のｇＲＮＡ配列を、ｇＲＮＡ配列の合成へと方向付けるようにプログラミングされ得る。場合によっては、参照ゲノムデータベースにおける少なくとも１個のゲノムが、個体の個別化ゲノムであり得る。場合によっては、参照ゲノムデータベースにおける少なくとも１個のゲノムが、状態に悩まされている集団の１組の個別化ゲノムであり得る。場合によっては、参照ゲノムは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ参照ゲノムであり得る。
【０２００】
場合によっては、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーは個々に、または集合的に、予想されたゲノム配列を出力するようにプログラミングされ得る。予想されたゲノム配列は、第２の組のｇＲＮＡ配列由来の１個または複数のｇＲＮＡで標的ゲノム情報を編集することの予想された出力を表し得る。予想されたゲノム配列は、ゲノム欠失を含み得る。予想されたゲノム配列は、ゲノム挿入を含む。
【０２０１】
場合によっては、オフターゲット相補性スコアを計算することは、アジマススコアを計算することを含む。場合によっては、第２の組のｇＲＮＡ配列は、ある特定の閾値を超える少なくとも２個のｇＲＮＡを表示し得る。
【０２０２】
場合によっては、参照ゲノムデータベースは、少なくとも５万個の参照ゲノムを含み得る。場合によっては、参照ゲノムデータベースは、少なくとも１２万個の参照ゲノムを含み得る。
【０２０３】
本開示は、ネットワークを通じたユーザーからのバイオポリマー合成リクエストを処理するための方法をさらに提供する。方法は、（ａ）ネットワークを通じてユーザーのデジタルコンピュータからのバイオポリマー合成リクエストを受信することであって、バイオポリマー合成リクエストが標的ゲノム情報を含む、受信すること；（ｂ）標的ゲノム情報を参照ゲノムデータベース由来の１個または複数の参照ゲノムに対して処理して、標的ゲノム情報に対応する標的配列を識別すること；（ｃ）アルゴリズムを実行するために１つまたは複数のコンピュータプロセッサーを使用して、（ｉ）標的配列に少なくとも部分的に相補的である第１の組のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）配列を生成し、（ｉｉ）ｇＲＮＡ配列の各々について、第１の組のｇＲＮＡ配列におけるｇＲＮＡ配列の各々についてのオフターゲット相補性スコアを計算すること；（ｄ）ユーザーのデジタルコンピュータのグラフィカルユーザーインターフェース上での表示のために第２の組のｇＲＮＡ配列を出力することであって、第２の組のｇＲＮＡ配列の各々が、閾値未満の計算されたオフターゲット相補性スコアを有する、出力すること；および（ｅ）第２の組のｇＲＮＡ配列由来の所与のｇＲＮＡ配列の合成のリクエストをユーザーのデジタルコンピュータから受信することを含み得る。
【０２０４】
場合によっては、コンピュータプログラム（コンピュータ可読媒体）は、ネットワークを通じたユーザーからのバイオポリマー合成リクエストを処理する方法を実施するようにコンピュータに命令するために構成することができる。
【０２０５】
場合によっては、合成のリクエストを受信する１つまたは複数のコンピュータプロセッサーは個々に、または集合的に、シンセサイザーにおける第２の組のｇＲＮＡ配列由来の所与のｇＲＮＡ配列の合成を指示するようにプログラミングされ得る。場合によっては、参照ゲノムデータベースにおける少なくとも１個のゲノムは、個体の個別化ゲノムであり得る。場合によっては、参照ゲノムデータベースにおける少なくとも２個のゲノムは、状態に悩まされている集団の個別化ゲノムであり得る。場合によっては、参照ゲノムは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ参照ゲノムであり得る。
【０２０６】
場合によっては、方法は、予想されたゲノム配列を出力することをさらに含み得る。予想されたゲノム配列は、第２の組のｇＲＮＡ配列由来の１個または複数のｇＲＮＡで標的ゲノム情報を編集することの予想された出力を表し得る。場合によっては、予想されたゲノム配列は、ゲノム欠失を含み得る。場合によっては、予想されたゲノム配列は、ゲノム挿入を含み得る。場合によっては、計算は、アジマススコアを計算することができる。場合によっては、第２の組のｇＲＮＡ配列は、ある特定の閾値を超える少なくとも２個のｇＲＮＡを表示し得る。場合によっては、参照ゲノムデータベースは、少なくとも５万個の参照ゲノムを含み得る。場合によっては、参照ゲノムデータベースは、少なくとも１２万個の参照ゲノムを含み得る。
【０２０７】
本開示は、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーによる実行に際して、ネットワークを通じたユーザーからのバイオポリマー合成リクエストを処理するための方法を実現する機械実行可能コードを含む非一過性コンピュータ可読媒体をさらに提供する。方法は、ネットワークを通じてユーザーのデジタルコンピュータからのバイオポリマー合成リクエストを受信することであって、バイオポリマー合成リクエストが標的ゲノム情報を含む、受信することを含み得る。方法は、標的ゲノム情報を参照ゲノムデータベース由来の１個または複数の参照ゲノムに対して処理して、標的ゲノム情報に対応する標的配列を識別することを含み得る。方法は、標的配列に少なくとも部分的に相補的である第１の組のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）配列を生成し、第１の組のｇＲＮＡ配列におけるｇＲＮＡ配列の各々についてオフターゲット相補性スコアを計算するアルゴリズムを実行することを含み得る。方法は、ユーザーのデジタルコンピュータのグラフィカルユーザーインターフェース上での表示のために第２の組のｇＲＮＡ配列を出力することであって、第２の組のｇＲＮＡ配列の各々が、閾値未満の計算されたオフターゲット相補性スコアを有する、出力することを含み得る。方法は、第２の組のｇＲＮＡ配列由来の所与のｇＲＮＡ配列の選択をユーザーのデジタルコンピュータから受信することを含み得る。
コンピュータシステム
【０２０８】
本開示は、本開示の方法を実現するようにプログラミングされているコンピュータシステムを提供する。本開示のコンピュータシステムは、目的のゲノム領域とハイブリダイズするための１個または複数のガイドＲＮＡを設計するために使用することができる。目的のゲノム領域は、ある種のゲノムの遺伝子であり得る。本明細書に記載されたコンピュータシステムのいずれかからの情報は、リモートコンピュータへ報告を提供することができる。
【０２０９】
図１４は、本開示のコンピュータシステムの異なる側面と通信し、かつそれらを調節するようにプログラミングされ、または別な方法で構成されているコンピュータシステム１４０１を示す。
【０２１０】
コンピュータシステム１４０１は、本開示の異なる態様、例えば、ある種のゲノムの遺伝子とハイブリダイズするための１個もしくは複数のガイドＲＮＡを設計すること、または目的のゲノムにおける潜在的ガイドＲＮＡハイブリダイズ部位とのミスマッチの数を数え上げることによりオフターゲット値を計算することを調節することができる。コンピュータシステム１４０１は、ユーザーの電子デバイス、または電子デバイスに対して遠隔に設置されているコンピュータシステムであり得る。電子デバイスは、モバイル電子デバイスであり得る。
【０２１１】
コンピュータシステム１４０１は、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサー、または並行処理のための複数のプロセッサーであり得る、中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では、「プロセッサー」や「コンピュータプロセッサー」とも呼ばれている）１４０５を含む。コンピュータシステム１４０１はまた、メモリまたはメモリ場所１４１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置１４１５（例えば、ハードディスク）、１つまたは複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース１４２０（例えば、ネットワークアダプター）、ならびに周辺デバイス１４２５、例えば、キャッシュ、他のメモリ、データ記憶装置、および／または電子ディスプレイアダプターを含む。メモリ１４１０、記憶装置１４１５、インターフェース１４２０、および周辺デバイス１４２５は、マザーボードなどの通信バス（実ライン）を通して、ＣＰＵ１４０５と通信する。記憶装置１４１５は、データを記憶するためのデータ記憶装置（データ保存場所）であり得る。コンピュータシステム１４０１は、通信インターフェース１４２０の助けを借りて、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１４３０と動作可能に連結することができる。ネットワーク１４３０は、インターネット（ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ）、インターネット（ａｎ  ｉｎｔｅｒｎｅｔ）および／もしくはエクストラネット、またはインターネット（ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ）と通信するイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであり得る。場合によっては、ネットワーク１４３０は、遠隔通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク１４３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にし得る、１つまたは複数のコンピュータサーバーを含み得る。場合によっては、ネットワーク１４３０は、コンピュータシステム１４０１の助けを借りて、コンピュータシステム１４０１と連結されたデバイスが、クライアントまたはサーバーとして振る舞うことを可能にし得る、ピアツーピアネットワークを実現することができる。
【０２１２】
ＣＰＵ１４０５は、プログラムまたはソフトウェアにおいて具体化され得る、機械可読命令のシークエンスを実行することができる。命令は、メモリ１４１０などのメモリ場所に記憶することができる。命令は、ＣＰＵ１４０５に指示され得、その後、本開示の方法を実現するようにＣＰＵ１４０５をプログラミングまたは別な方法で構成することができる。ＣＰＵ１４０５により実施されるオペレーションの例には、フェッチ、解読、実行、およびライトバックが含まれ得る。
【０２１３】
ＣＰＵ  １４０５は、集積回路などの回路の一部であり得る。システム１４０１の１つまたは複数の他のコンポーネントは、回路に含まれ得る。場合によっては、回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
【０２１４】
記憶装置１４１５は、ドライバー、ライブラリー、および保存プログラムなどのファイルを記憶することができる。記憶装置１４１５は、ユーザーデータ、例えば、ユーザー選択およびユーザープログラムを記憶することができる。コンピュータシステム１４０１は、場合によっては、例えばイントラネットまたはインターネット（ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ）を通してコンピュータシステム１４０１と通信するリモートサーバーに位置した、コンピュータシステム１４０１にとって外部である１つまたは複数の追加のデータ記憶装置を含み得る。
【０２１５】
コンピュータシステム１４０１は、ネットワーク１４３０を通して１つまたは複数のコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム１４０１は、ユーザーのリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例には、パーソナルコンピュータ（例えば、携帯用ＰＣ）、スレートもしくはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ  Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ使用可能デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、またはパーソナルデジタルアシスタントが含まれる。ユーザーは、ネットワーク１４３０を経由してコンピュータシステム１４０１にアクセスすることができる。
【０２１６】
本明細書に記載された方法は、コンピュータシステム１４０１の電子記憶場所、例えばメモリ１４１０または電子記憶装置１４１５などに記憶された機械（例えば、コンピュータプロセッサー）実行可能コードによって実現することができる。機械実行可能または機械可読コードは、ソフトウェアの形をとって提供され得る。使用中、コードは、プロセッサー１４０５によって実行され得る。場合によっては、コードは、プロセッサー１４０５による敏速なアクセスのために、記憶装置１４１５から読み出されて、メモリ１４１０に記憶され得る。いくつかの状況では、電子記憶装置１４１５を外すことができ、機械実行可能命令はメモリ１４１０に記憶される。
【０２１７】
コードは、プリコンパイルされて、コードを実行するのに適応したプロセッサーを有する機械での使用のために構成され得、またはランタイム中にコンパイルされ得る。コードは、コードをプレコンパイル方式またはアズコンパイル（ａｓ−ｃｏｍｐｉｌｅｄ）方式で実行することを可能にするように選択することができるプログラミング言語で供給され得る。
【０２１８】
コンピュータシステム１４０１などの本明細書に提供されたシステムおよび方法の態様は、プログラミングにおいて具体化することができる。テクノロジーの異なる態様は、典型的には、機械（またはプロセッサー）実行可能コードおよび／またはある型の機械可読媒体で維持または具体化されている関連データの形をとった、「生産物」または「製造品」として考えることができる。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクなどの電子記憶装置に記憶することができる。「記憶」型媒体には、コンピュータ、プロセッサーなどの有形メモリ、またはそれらの関連モジュール、例えば、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどのいずれかまたは全てが含まれ得、それらは、ソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一過性記憶を提供することができる。ソフトウェアの全部または一部分は、時には、インターネット（ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ）または様々な他の遠隔通信ネットワークを通して通信することができる。そのような通信は、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサーから別のコンピュータまたはプロセッサーへ、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへ、のソフトウェアのローディングを可能にすることができる。したがって、ソフトウェア要素を有し得る別の型の媒体には、例えば、ローカルデバイス間の物理インターフェースにわたって、有線および光学地上線ネットワークを通して、ならびに様々なエアリンクにわたって、使用されるような、光波、電波、および電磁波が含まれる。そのような波を運ぶ物理的要素、例えば、有線または無線リンク、光リンクなどもまた、ソフトウェアを有する媒体としてみなすことができる。本明細書で使用される場合、非一過性な有形の「記憶」媒体に制限されない限り、コンピュータ「可読媒体」または機械「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサーへ命令を与えることに関与する任意の媒体を指す。
【０２１９】
したがって、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、多くの形をとることができ、それには、有形の記憶媒体、搬送波媒体、または物理的伝送媒体が含まれるが、それらに限定されない。不揮発性記憶媒体には、例えば、図面に示された、データベースなどを実現するために使用することができるような、任意のコンピュータなどにおける記憶デバイスのいずれかなどの、光学または磁気ディスクが含まれる。揮発性記憶媒体には、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリが含まれる。有形の伝送媒体には、同軸ケーブル；コンピュータシステム内にバスを構成するワイヤを含む、銅線および光ファイバーが含まれる。搬送波媒体は、電子もしくは電磁シグナル、またはラジオ周波数（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）のデータ通信中に発生するものなどの音波もしくは光波の形をとることができる。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形には、例えば、以下が含まれる：フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、もしくはＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を運ぶ搬送波、そのような搬送波を運ぶケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読むことができる任意の他の媒体。これらの形のコンピュータ可読媒体の多くは、実行のためにプロセッサーへ１つまたは複数の命令の１つまたは複数のシークエンスを運ぶことに関与し得る。
【０２２０】
コンピュータシステム１４０１は、使用を提供するための、例えば、目的の種および目的の種由来の目的の遺伝子を選択するのを可能にするためのユーザーインターフェース（ＵＩ）を含む電子ディスプレイ１４３５を含み、または通信することができる。ＵＩの例には、非限定的に、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブベースのユーザーインターフェースが含まれる。
【０２２１】
本開示の方法およびシステムは、１つまたは複数のアルゴリズムによって実現することができる。アルゴリズムは、中央処理装置１４０５による実行に際して、ソフトウェアにより実現することができる。アルゴリズムは、例えば、ある種の目的のゲノム領域とハイブリダイズするための１個または複数のｇＲＮＡを設計し、かつその１個または複数のｇＲＮＡの少なくとも１個の合成をアクティブにして、開始することができる。
【実施例】
【０２２２】
（実施例１）
多重ガイドＲＮＡの使用は、単一のガイドＲＮＡの使用より高い編集効率を達成する
遺伝子あたり３個のガイドＲＮＡを設計して、７６個の遺伝子をハイブリダイズするように、合計２２８個のガイドＲＮＡを設計した。３個のガイドＲＮＡの各組を、ガイド間スペーシングが少なくとも３０ｂｐであるように設計した。９６ウェルプレート上のウェルあたり３５，０００個の細胞で播種されたＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７細胞へ、ガイドＲＮＡを導入した。単一のガイドの編集に使用されたガイドＲＮＡを、４．５μｍｏｌでトランスフェクションし、一方、多重ガイドＲＮＡ使用についてのガイドＲＮＡを、それぞれ２．２５μｍｏｌでトランスフェクションした。全てのガイドＲＮＡを、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎによるリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）としてトランスフェクションした。トランスフェクション前に、０．５μｍｏｌのＣａｓ９をＲＮＰと複合体化した。トランスフェクション後２日目に、細胞の生じた遺伝子型を、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって調べ、全体的な編集効率を、Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｄｉｔｓ（ＩＣＥ）を使用して分析した。ｇＲＮＡが編集するように設計された位置において非野生型遺伝子型を含む細胞のパーセンテージを示すように、パーセント編集効率を使用した。遺伝子あたり単一のｇＲＮＡ、および遺伝子あたり３個のｇＲＮＡの１組の使用について、編集効率を評価した（図１５）。データ点の背後にあるボックスプロットは、中央値、２５／７５パーセンタイル、および５／９５パーセンタイルを示す。これらの結果は、指定されたガイド間スペーシングを有する３個のｇＲＮＡの使用が、標的遺伝子とハイブリダイズする単一のｇＲＮＡの使用より高い編集効率を達成することを示した（ｐ＜１Ｅ−１５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定）。
【０２２３】
多重ガイドＲＮＡを使用する編集結果を、ガイドスペーシングの効果についてさらに分析した。遺伝子あたり３個のｇＲＮＡを設計して、１７９個の遺伝子をハイブリダイズするように、５３７個のｇＲＮＡを設計した。３個のｇＲＮＡを、−２０ｂｐ（すなわち、完全に重複している）〜８０ｂｐのガイド間スペーシングを有するように設計した。多重ガイドについてのガイドＲＮＡを、それぞれ２．２５μｍｏｌでトランスフェクションした。全てのガイドＲＮＡを、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎによるリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）としてトランスフェクションした。トランスフェクション前に、０．５μｍｏｌのＣａｓ９をＲＮＰと複合体化した。トランスフェクション後２日目に、細胞の生じた遺伝子型を、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって調べ、全体的な編集効率を分析した。ガイド間スペーシング（すなわち、ガイドの終端からガイドの開始端までの距離）が３０塩基対（ｂｐ）を超えて増加したとき、全体的な編集効率は、７５％未満の効率が観察されないような向上を示した（図１６）。
【０２２４】
（実施例２）
多重ガイドＲＮＡキットの組合せ
３個のｓｇＲＮＡが、ヒトゲノム内の３つの標的領域：２個の遺伝子、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）とメチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）、およびアデノ随伴ウイルス組込み部位１（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  １）（ＡＡＶＳ１）内の部位の各々をターゲティングするように、９個のｓｇＲＮＡを設計した。ｓｇＲＮＡの各組において、ガイド間スペーシングは、少なくとも３０ｂｐであった。各ペアワイズ組合せにおける各遺伝子についての編集効率を、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって決定した（図１７）。
【０２２５】
９６ウェルプレートにおけるウェルあたり５０００個のＨｅｐ３Ｂ細胞を播種した。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）テクノロジー（Ｌｏｎｚａ）を使用して、これらの細胞に、ペアをターゲティングする多重ＲＮＰをトランスフェクションし、トランスフェクション後２４、４８、および７２において、細胞力価をアッセイした。これらの結果は、１つの組合せが、単回のトランスフェクションにおいて複数のゲノム座に同時に編集を生じ得ることを示している。
【０２２６】
（実施例３）
アレイ化ライブラリースクリーニング
９６ウェルプレートの９２ウェルにおいて、ウェルあたり３５，０００個のＵ２ＯＳ細胞を播種した。９２ウェルの各々は、スクリーニングアッセイによりターゲティングされる合計９２個の異なる遺伝子について、少なくとも３０ｂｐのガイド間スペーシングを有する、１つの遺伝子をターゲティングする２個または３個のｓｇＲＮＡの１組、およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼをさらに含有した。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）テクノロジー（Ｌｏｎｚａ）を使用して、細胞をトランスフェクションした。その後、トランスフェクション後６日目に、細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイを使用してアッセイした（図１８Ａ）。追加として、トランスフェクション後２日目に、これらの細胞の遺伝子型を、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングで同定し、続いて、編集効率を決定するためにＩｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｄｉｔｓ（ＩＣＥ）を使用して分析した（図１８Ｂ）。同じ細胞集団の生じた遺伝子型を評価する能力は、プール化スクリーニングアプローチを凌ぐ、アレイ化スクリーニングアプローチの利点であり得る。
【０２２７】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され、かつ記載されているが、そのような実施形態が、例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。本発明が本明細書内に提供された特定の例によって限定されることは意図されない。本発明が前述の明細書を参照して記載されているが、本明細書における実施形態の説明および実例は、限定する意味に解釈されることを意図するものではない。本発明から逸脱することなく、多数のバリエーション、変化、および置換が、今、当業者の頭に浮かぶであろう。さらに、本発明の全ての態様が、様々な条件および変数に依存する本明細書に示された特定の描写、構成、または相対的割合に限定されないことは理解されているはずである。本明細書に記載された本発明の実施形態の様々な代替物が、本発明を実施するのに用いられ得ることは理解されるべきである。したがって、本発明がまた、いずれのそのような代替物、改変、バリエーション、または均等物も網羅するだろうことが企図される。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、ならびにこれらの特許請求の範囲内の方法と構造およびそれらの均等物がそれらにより網羅されることが、意図される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ−１】
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【図９Ｄ−２】
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【図１０Ａ】
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【図１０ＢＣＤ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ−１】
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【図１３Ｂ−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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