(57)【要約】  細胞または組織内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を調節するための方法および組成物が提供される。
2021533795.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を調節する方法であって、
遺伝子改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を前記細胞に導入するステップを含み、前記ＡＡＶのカプシドが、異種ＶＰ１ポリペプチド配列を含むように遺伝子改変されており、前記異種ＶＰ１ポリペプチド配列が、前記細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要とするまたは形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要としない、方法。
【請求項２】
前記異種ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分が、配列番号１で示される配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記異種ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分が、配列番号２で示される配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記異種ＶＰ１ポリペプチドが、ＡＡＶ５  ＶＰ１タンパク質またはその一部分のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記異種ＶＰ１ポリペプチドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ−Ｂ、８ＢＰＶ２、または７Ｍ８のＶＰ１タンパク質またはその一部分のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記異種ＶＰ１ポリペプチド配列が、形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記異種ＶＰ１ポリペプチド配列が、前記細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要としない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の細胞侵入を改変する方法であって、
ＡＡＶをＧＰＲ１０８非依存性となるように遺伝子操作するステップであって、前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶは、配列ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ１〜１２の各々は任意のアミノ酸である、ステップ、または
ＡＡＶをＧＰＲ１０８依存性となるように遺伝子操作するステップであって、前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶは、配列ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ１〜１２の各々は任意のアミノ酸である、ステップ
を含み、それによって前記ＡＡＶの細胞侵入を改変する、方法。
【請求項９】
前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶが、配列ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ１がＳもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ２がＦもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＤであり、Ｘ５がＷであり、Ｘ６がＬであり、Ｘ７がＥであり、Ｘ８がＥであり、Ｘ９がＧであり、Ｘ１０がＬもしくはＩもしくはＶであり、Ｘ１１がＲであり、かつ／またはＸ１２がＥもしくはＱである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶが、配列ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ１がＳもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ２がＦもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＤであり、Ｘ５がＷであり、Ｘ６がＬであり、Ｘ７がＥであり、Ｘ８がＥであり、Ｘ９がＧであり、Ｘ１０がＬもしくはＩもしくはＶであり、Ｘ１１がＲであり、かつ／またはＸ１２がＥもしくはＱである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶが、ＡＡＶ５  ＶＰ１タンパク質に由来するＶＰ１ポリペプチド配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子操作されたＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ−Ｂ、８ＢＰＶ２、または７Ｍ８のＶＰ１タンパク質に由来するＶＰ１ポリペプチド配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を増大させる方法であって、前記細胞を前記細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を増大させる化合物と接触させるステップを含み、それによって前記細胞内への前記ＡＡＶの形質導入効率を増大させる、方法。
【請求項１４】
前記細胞におけるＧＰＲ１０８の発現を増大させる前記化合物が、ＧＰＲ１０８導入遺伝子を含む発現構築物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ−Ｂ、８ＢＰＶ２、および７Ｍ８からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＡＶが、遺伝子操作されたＡＡＶである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を低下させる方法であって、前記細胞を前記細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を低下させる化合物と接触させるステップを含み、それによって前記細胞内への前記ＡＡＶの形質導入効率を低下させる、方法。
【請求項１８】
前記細胞におけるＧＰＲ１０８の発現を低下させる前記化合物が、干渉ＲＮＡ分子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記干渉ＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡｉからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞がインビボである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、肝細胞、腎臓細胞、心臓細胞、肺細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨髄細胞（造血幹細胞を含む）である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
細胞内への治療作用物質の取り込みを増大させる方法であって、前記細胞をＡＡＶ  ＶＰ１ポリペプチドに連結した前記治療作用物質と接触させるステップを含み、前記ＶＰ１ポリペプチドが、配列ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を含み、配列中、Ｘ１〜１２の各々が任意のアミノ酸である、方法。
【請求項２３】
前記治療作用物質が、タンパク質またはタンパク質複合体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療作用物質が、ＧＰＲ１０８に結合する結合因子にさらに連結している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＧＰＲ１０８に結合する前記結合因子が、抗体、アプタマー、および抗体ドメインからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号１または配列番号２を含むＶＰ１ポリペプチドに連結している治療作用物質を含む組成物。
【請求項２７】
前記治療作用物質が、タンパク質またはタンパク質複合体である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
配列番号１を含む異種ＶＰ１配列を含むＡＡＶカプシド配列。
【請求項２９】
前記異種ＶＰ１配列が配列番号１８を含む、請求項２８に記載のＡＡＶカプシド配列。
【請求項３０】
配列番号２を含む異種ＶＰ１配列を含むＡＡＶカプシド配列。
【請求項３１】
前記異種ＶＰ１配列が配列番号１９を含む、請求項３０に記載のＡＡＶカプシド配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は全体として、改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびこのようなウイルスの形質導入効率を調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでの方法論は、主要なＡＡＶ侵入因子を同定するため、またはサブファミリーワイドの受容体および侵入因子の必要性を特徴付けするためには不十分であった。これまでの研究は、あまり許容状態ではない細胞系においてｃＤＮＡを過剰発現させて、最も多くはＡＡＶ２である（７４、７５、７７）特定の血清型の形質導入を増大させる因子を同定することに主に焦点を置いていた（７６、８０、８１）。これらの研究は、ＡＡＶの形質導入を増大させるいくつかのタンパク質を同定したが、これらのタンパク質が形質導入に影響するためのメカニズムは、過剰発現の際に細胞表面での付着の増大を多くの場合に示すことを除いて、あまり特徴付けされていない（７８）。しかし、データにずれが存在し、これらの因子のノックダウンおよびノックアウト研究はＡＡＶの形質導入において大きな欠陥を示さないことが多いため、これらの因子は、必要な侵入受容体として定義され得ない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が細胞に形質導入するメカニズムに関する。このメカニズムを理解することで、当業者が、細胞内へのＡＡＶの侵入、ひいては形質導入効率を調節することが可能となる。
【０００４】
本明細書において記載されるように、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を調節する方法が提供される。このような方法は、典型的には、遺伝子改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を細胞に導入するステップを含み、ここで、ＡＡＶカプシドは異種ＶＰ１ポリペプチド配列を含むように遺伝子改変されており、また、異種ＶＰ１ポリペプチド配列は、細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要とするまたは形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要としない。
【０００５】
一部の実施形態において、異種ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分は、配列番号１で示される配列を含む。これらの場合において、異種ＶＰ１ポリペプチド配列は、細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要としない。配列番号１で示される配列を含むＶＰ１ポリペプチドの一例は、ＡＡＶ５  ＶＰ１タンパク質またはその一部分のアミノ酸配列である。
【０００６】
一部の実施形態において、異種ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分は、配列番号２で示される配列を含む。これらの場合において、異種ＶＰ１ポリペプチド配列は、形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要とする。配列番号２で示される配列を含むＶＰ１ポリペプチドの例は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ−Ｂ、８ＢＰＶ２、または７Ｍ８のＶＰ１タンパク質またはその一部分のアミノ酸配列である。
【０００７】
同様に本明細書において記載されるように、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の細胞侵入を改変する方法が提供される。このような方法は、ＡＡＶをＧＰＲ１０８非依存性となるように遺伝子操作するステップを典型的には含み、遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶは、配列ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ１〜１２の各々は任意のアミノ酸である。あるいは、このような方法は、ＡＡＶをＧＰＲ１０８依存性とするように遺伝子操作するステップであって、遺伝子操作されたＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶは、配列ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ１〜１２の各々は任意のアミノ酸である、ステップを含み、それによってＡＡＶの細胞指向性を改変する。
【０００８】
典型的な遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶは、配列
ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ１はＳもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ２はＦもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＷであり、Ｘ６はＬであり、Ｘ７はＥであり、Ｘ８はＥであり、Ｘ９はＧであり、Ｘ１０はＬもしくはＩもしくはＶであり、Ｘ１１はＲであり、かつ／またはＸ１２はＥもしくはＱである。一部の実施形態において、遺伝子操作されたＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶは、ＡＡＶ５  ＶＰ１タンパク質に由来するＶＰ１ポリペプチド配列を含む。
【０００９】
同様に、典型的な遺伝子操作されたＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶは、配列
ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）を有するＶＰ１ポリペプチド配列を含み、配列中、Ｘ１はＳもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ２はＦもしくはＡもしくはＴであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＷであり、Ｘ６はＬであり、Ｘ７はＥであり、Ｘ８はＥであり、Ｘ９はＧであり、Ｘ１０はＬもしくはＩもしくはＶであり、Ｘ１１はＲであり、かつ／またはＸ１２はＥもしくはＱである。一部の実施形態において、遺伝子操作されたＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ−Ｂ、８ＢＰＶ２、または７Ｍ８のＶＰ１タンパク質に由来するＶＰ１ポリペプチド配列を含む。
【００１０】
さらに、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を増大させる方法が提供される。このような方法は、細胞を細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を増大させる化合物と接触させるステップを典型的には含み、それによって細胞内へのＡＡＶの形質導入効率を増大させる。
【００１１】
細胞におけるＧＰＲ１０８の発現を増大させるために使用され得る代表的な化合物は、ＧＰＲ１０８導入遺伝子を含む発現構築物である。一部の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ−Ｂ、８ＢＰＶ２、または７Ｍ８である。一部の実施形態において、ＡＡＶは、遺伝子操作されたＡＡＶである。
【００１２】
同様に本明細書において記載されるように、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を低下させる方法が提供される。このような方法は、細胞を細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を低下させる化合物と接触させるステップを典型的には含み、それによって細胞内へのＡＡＶの形質導入効率を低下させる。
【００１３】
細胞におけるＧＰＲ１０８の発現を低下させるために使用され得る代表的な化合物は、干渉ＲＮＡ分子である。一部の実施形態において、干渉ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉである。
【００１４】
本明細書において記載される方法のいずれかにおいて使用される細胞は、インビボであり得る。代表的な細胞としては、肝細胞、腎臓細胞、心臓細胞、肺細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨髄細胞（造血幹細胞を含む）が含まれる。
【００１５】
さらに、細胞内への治療作用物質の取り込みを増大させる方法が提供される。このような方法は、細胞をＡＡＶ  ＶＰ１ポリペプチドに連結した治療作用物質と接触させるステップを典型的には含み、ここで、ＶＰ１ポリペプチドは、配列ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）を含み、配列中、Ｘ１〜１２の各々は任意のアミノ酸である。
【００１６】
代表的な治療作用物質としては、タンパク質またはタンパク質複合体が含まれる。一部の実施形態において、治療作用物質は、ＧＰＲ１０８に結合する結合因子にさらに連結している。ＧＰＲ１０８に結合する代表的な結合因子としては、限定はしないが、抗体、アプタマー、および抗体ドメインが含まれる。
【００１７】
さらに、配列番号１または配列番号２を含むＶＰ１ポリペプチドに連結している治療作用物質を含む組成物が提供される。一部の実施形態において、治療作用物質は、タンパク質またはタンパク質複合体である。
【００１８】
さらに、配列番号１を含む異種ＶＰ１配列を含むＡＡＶカプシド配列が提供される。代表的な異種ＶＰ１配列は、配列番号１８で示される配列を含む。
【００１９】
配列番号２を含む異種ＶＰ１配列を含むＡＡＶカプシド配列もまた提供される。代表的な異種ＶＰ１配列としては、配列番号１９で示される配列が含まれる。
【００２０】
一態様において、本開示は、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を調節する方法を提供する。このような方法は、遺伝子改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を細胞に導入するステップを含み、ここで、ＡＡＶカプシドは、異種ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分を含むように遺伝子改変されており、異種ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分は、ＶＰ１ポリペプチドの配列に応じて、細胞のＧＰＲ１０８依存性またはＧＰＲ１０８非依存性の形質導入に関与している。一部の実施形態において、異種ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分は、ＡＡＶ５のＶＰ１ポリペプチドまたはその部分であり、このケースにおいて、ＡＡＶはＧＰＲ１０８非依存性である。一部の実施形態において、遺伝子改変されたＡＡＶは、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）非依存性のＡＡＶである。
【００２１】
別の態様において、本開示は、細胞内への非ＡＡＶ化合物の取り込みを調節する方法を扱う。このような方法は、細胞をＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶのＶＰ１ポリペプチドまたはその部分に連結した非ＡＡＶ化合物と接触させるステップを含む。一部の実施形態において、非ＡＡＶ化合物は、タンパク質またはタンパク質複合体である。一部の実施形態において、ＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶのＶＰ１ポリペプチドまたはその部分は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ−Ｂ、８ＢＰＶ２、および７Ｍ８に由来する。一部の実施形態において、非ＡＡＶ化合物は、ＧＰＲ１０８を結合する結合因子にさらに連結している。ＧＰＲ１０８を結合する代表的な結合因子としては、限定はしないが、抗体、アプタマー、および抗体ドメインが含まれる。
【００２２】
さらに別の態様において、本開示は、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を増大させる方法を扱う。このような方法は、細胞を細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を増大させる化合物と接触させるステップを含み、それによって細胞内へのＡＡＶの形質導入効率を増大させる。一部の実施形態において、細胞におけるＧＰＲ１０８の発現を増大させる化合物は、ＧＰＲ１０８導入遺伝子を含む発現構築物である。
【００２３】
さらに別の態様において、本開示は、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を低下させる方法を提供する。このような方法は、細胞を細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を低下させる化合物と接触させるステップを含み、それによって細胞内へのＡＡＶの形質導入効率を低下させる。一部の実施形態において、細胞におけるＧＰＲ１０８の発現を低下させる化合物は、干渉ＲＮＡ分子である。代表的な干渉ＲＮＡ分子としては、限定はしないが、ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡｉが含まれる。一部の実施形態において、細胞におけるＧＰＲ１０８の活性を低下させる化合物は、ＧＰＲ１０８に特異的に結合する抗体（すなわち抗ＧＰＲ１０８抗体）である。
【００２４】
本明細書において記載される方法のいずれかにおける細胞は、インビボの細胞であり得る。代表的な細胞としては、限定はしないが、肝細胞、腎臓細胞、心臓細胞、肺細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨髄細胞（造血幹細胞を含む）が含まれる。
【００２５】
本開示は、現在使用されているＡＡＶ血清型にこれまで利用しにくかった新規な組織型または細胞型を標的化するために使用され得る、固有の細胞標的化特性および組織標的化特性を有する新規なカプシドの生成を可能にする。具体的には、本明細書において記載される方法および組成物は、ＡＡＶベクターを、細胞受容体であるＧＰＲ１０８を係合するように、またはＧＰＲ１０８の使用および必要性に対する依存性を失うように変更することを可能にし、これによって、ＡＡＶベクターは、ＧＰＲ１０８発現細胞へのアクセスを獲得するか、または標的細胞型におけるＧＰＲ１０８発現によって制限されないようになる。
【００２６】
本明細書において使用される場合、形質導入効率は、細胞への侵入および感染を獲得し得る複数のウイルスの割合を指す。
【００２７】
本明細書において使用される場合、ＶＰ１ポリペプチド配列の文脈における「由来する」は、ＶＰ１ポリペプチド配列が生じたまたは由来した元である血清型を指す。ＶＰ１ポリペプチドは、任意の様式で発現され得、生成され得、または合成され得る。
【００２８】
遺伝子操作されたウイルスは、核酸配列が変化しているウイルスを指す。ウイルスを遺伝子操作する方法は、当技術分野において知られており、また、本明細書においてさらに論じられる。
【００２９】
「異種」ポリペプチドまたはその部分は、ポリペプチドの残り部分に対してまたは異種ポリペプチドがその中に存在する生物に対してネイティブではない、ポリペプチドまたはその一部を指す。
【００３０】
「ＧＰＲ１０８依存性」ＡＡＶは、細胞内への形質導入のためにＧＰＲ１０８の存在を必要とするＡＡＶを指す。他方、「ＧＰＲ１０８非依存性」ＡＡＶは、細胞内への形質導入のためにＧＰＲ１０８の存在を必要としないＡＡＶを指す。
【００３１】
「ＶＰ１タンパク質」は、典型的には、ＧＰＲ１０８非依存性またはＧＰＲ１０８依存性のいずれかを示す特定のＡＡＶ血清型のＶＰ１タンパク質またはその一部である。「ＶＰ１ポリペプチド」は、ＡＡＶのカプシドに組み込まれてＧＰＲ１０８依存性をＡＡＶに付与するＶＰ１タンパク質またはその一部に由来する分子である。本明細書において記載されるように、ＶＰ１ポリペプチドによってＡＡＶに付与されるＧＰＲ１０８依存性は、通常、そのＡＡＶで通常見られる野生型ＶＰ１タンパク質のＧＰＲ１０８依存性と比較して異なる。代表的なＧＰＲ１０８非依存性配列は、ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１、式中、Ｘ１〜１２の各々は任意のアミノ酸であり得る）であり、一方、代表的なＧＰＲ１０８依存性配列は、ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２、式中、Ｘ１〜１２の各々は任意のアミノ酸であり得る）である。
【００３２】
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、方法および組成物が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書において記載されるものに類似のまたは同等の方法および材料が本方法および本組成物の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。さらに、材料、方法、および例は例示的なものにすぎず、限定することを意図したものではない。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によってその全体が組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】血清型によるＡＡＶ細胞侵入受容体の利用のモデルを示す図である。
【図２−１】図２Ａは、２ベクターレンチウイルスＧｅＣＫＯ系の略図である。
【図２−２】図２Ｂは、Ｈｕｈ７  ＡＡＶＲ  ＫＯ細胞が図２Ａにおいて記載されているベクターを使用したレンチＣＲＩＳＰＲ突然変異誘発を受けていることを実証する略図である。
【図３】図３Ａは、ゲノムスケールのＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリーのＶ２Ａ半分におけるＧＦＰ＋およびＧＦＰ−細胞のＦＡＣＳ選択を示すドットプロットである。  図３Ｂは、ゲノムスケールのＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリーのＶ２Ｂ半分におけるＧＦＰ＋およびＧＦＰ−細胞のＦＡＣＳ選択を示すドットプロットである。  図３Ｃは、増殖され、ＧｅＣＫＯライブラリーのＶ２Ａ半分についての第２ラウンドの高ＭＯＩ形質導入にかけられたＧＦＰ−細胞のＦＡＣＳ選択を示すドットプロットである。  図３Ｄは、増殖され、ＧｅＣＫＯライブラリーのＶ２Ｂ半分についての第２ラウンドの高ＭＯＩ形質導入にかけられたＧＦＰ−細胞のＦＡＣＳ選択を示すドットプロットである。
【図４】図４Ａは、潜在的なＡＡＶ制限因子を示唆する、ＧＦＰを高度に発現する細胞において強化されている遺伝子を同定するためのロバストランク凝集（ＲＲＡ）分析を示す図である。  図４Ｂは、Ｈｕｈ７  ＡＡＶＲ  ＫＯ  Ｃａｓ９細胞に、ｒｈ３２．３３  ＧＦＰ＋細胞集団において同定されている個々の遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡをコードするレンチウイルスで形質導入することによって作成された、ＣＲＩＳＰＲ編集型ポリクローナル細胞集団へのｒｈ３２．３３．ＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡの形質導入の増加倍率を示す棒グラフである。
【図５】図５Ａは、機能性によってグループ化された、第１ラウンドのＧＦＰ形質導入のＲＲＡを示す図である。  図５Ｂは、機能性によってグループ化された、第２ラウンドのＧＦＰ形質導入のＲＲＡを示す図である。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、ｈＡｄ５ヘルパーウイルスの存在下で、ＡＡＶＲ非依存性血清型であるｒｈ３２．３３もしくはＡＡＶ４（６Ａ、６Ｂ）、またはＡＡＶＲ非依存性血清型であるＡＡＶ５、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ９．ＰＨＰ−Ｂ（６Ｃ〜６Ｆ）で形質導入された、ＷＴ（野生型）細胞、ノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）ノックアウト［ＫＯ］細胞、カテプシンＡ（ＣＴＳＡ）ヘテロ接合型（ＨＥＴ）細胞、またはＣＴＳＡノックアウト［ＫＯ］細胞において観察された発光のグラフである。  図６Ｇは、ＣＴＳＡ特異的またはＮＥＵ１特異的なｓｇＲＮＡを有するレンチウイルスで形質導入し、その後、ＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ導入遺伝子を発現する異なるＡＡＶカプシドを形質導入した、Ｃａｓ９を発現する様々なヒト細胞系において観察された、発光のグラフである。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、示された濃度のノイラミニダーゼ阻害剤であるザナミビル（７Ａ）またはＤＡＮＡ（７Ｂ）で前処理され、その後、ルシフェラーゼをコードする導入遺伝子をカプシドで包んでいる示されたカプシド血清型（黒：ＡＡＶＲ依存性の血清型、白：ＡＡＶＲ非依存性の血清型、実線：未知のグリカン付着因子、点線：付着に使用されるシアル酸）を形質導入された、Ｈｕｈ７細胞において観察された、発光のグラフである。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、２ｍＭの示された化合物で前処理され、その後、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）由来のノイラミニダーゼで２時間処理され、その後、ルシフェラーゼをコードする導入遺伝子をカプシドで包んでいるｒｈ３２．３３（８Ａ）、ＡＡＶ４（８Ｂ）、ＡＡＶ５（８Ｃ）、またはＡｎｃ８０（８Ｄ）で形質導入された、Ｈｕｈ７細胞において観察された、発光のグラフである。  図８Ｅは、示された血清型についての、ＷＴ細胞系および突然変異ＭＥＦ細胞系における、細胞に結合したウイルスゲノムの棒グラフである。
【図９】図９Ａは、現存のおよび推定上の進化上中間のＡＡＶ血清型の系統樹である。  図９Ｂは、ＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ（ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ８、ＡＡＶＡｎｃ８２、ＡＡＶ９、ＡＡＶＡｎｃ８１、ＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶ３、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ１、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５）導入遺伝子、またはＣＭＶ．ｅＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ（ＡＡＶＡｎｃ８３、ＡＡＶＡｎｃ１１０、ＡＡＶ２）導入遺伝子で形質導入されたＷＴ細胞またはＧＰＲ１０８  ＫＯ  Ｈｕｈ７細胞において観察された発光のグラフである。  図９Ｃは、ＷＴ  Ｈｕｈ７細胞と比較した、ＡＡＶＲ  ＫＯ細胞、ＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞、またはダブルＫＯ細胞における示された血清型の形質導入レベルのグラフである。
【図１０】図１０Ａは、ＧＰＲ１０８を欠失させ、次いで、ＧＰＲ１０８レンチウイルスで安定的に形質導入し、その後、ルシフェラーゼをコードする導入遺伝子を発現する示された血清型を、ヘルパーウイルスを用いておよび用いずに形質導入した、Ｈ１  ＨｅＬａ細胞において観察された、発光のグラフである。  図１０Ｂは、ｆｌａｇタグ付けされたヒトＧＰＲ１０７またはＧＰＲ１０８をトランスフェクトされ、その後、ルシフェラーゼをコードする導入遺伝子を発現する示された血清型を形質導入された、Ｈｕｈ７  ＷＴ細胞またはＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞において観察された、発光のグラフである。    図１０Ｃは、ｆｌａｇタグ付けされたマウスＧＰＲ１０７またはＧＰＲ１０８をトランスフェクトされ、その後、ルシフェラーゼをコードする導入遺伝子を発現する示された血清型を形質導入された、Ｈｕｈ７  ＷＴ細胞またはＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞において観察された、発光のグラフである。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂは、ｆｌａｇタグ付けされたヒトまたはマウスＧＰＲ１０７またはＧＰＲ１０８をトランスフェクトされ、そしてルシフェラーゼをコードする導入遺伝子を発現するｒｈ３２．３３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５（１１Ａ）、ならびにＡｎｃ８０、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ９．ＰＨＰ−Ｂ（１１Ｂ）で形質導入された、Ｈｅｐａ  ＷＴ細胞またはＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞において観察された、発光のグラフである。
【図１２】図１２Ａは、非機能的なＧＰＲ１０７の膜配向の略図である。  図１２Ｂは、ＧＰＲ１０８の予測される膜配向の略図である。  図１２Ｃは、Ｃ末端にあるｆｌａｇタグによって可視化された、Ｈｕｈ７細胞におけるヒトおよびマウスＧＰＲ１０７構築物およびＧＰＲ１０８構築物の発現を実証する、ウェスタンブロットの画像である。  図１２Ｄは、Ｈｅｐａ細胞におけるヒトおよびマウスＧＰＲ１０７およびＧＰＲ１０８の発現を実証するためのウェスタンブロット（抗ｆｌａｇ抗体でプローブされている）画像である。
【図１３】図１３Ａは、親カプシドＡＡＶ９または表面が露出したペプチド挿入カプシドＡＡＶ９．ＰＨＰ−Ｂで形質導入されたＷＴ細胞またはＧＰＲ１０８  ＫＯ  Ｈｕｈ７細胞またはＨ１  ＨｅＬａ細胞において観察された発光のグラフである。  図１３Ｂは、グリカン結合欠損型ＡＡＶ２ＨＳＰＧ−または親ＡＡＶ２カプシドで形質導入されたＷＴ細胞またはＧＰＲ１０８  ＫＯ  Ｈｕｈ７細胞またはＨ１  ＨｅＬａ細胞において観察された発光のグラフである。  図１３Ｃは、示されているカプシド血清型について評価された、Ｈｕｈ７  ＷＴ細胞、ＡＡＶＲ  ＫＯ細胞、ＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞、またはダブルＫＯ細胞における、細胞に結合したウイルスゲノムについての結合アッセイのグラフである。
【図１４】図１４Ａは、ＧＰＲ１０８利用ドメインを決定するために使用されるキメラカプシドを示す略図である。  図１４Ｂは、ルシフェラーゼをコードする導入遺伝子を発現する、示されているＷＴまたはキメラカプシドで形質導入されているＨｕｈ７  ＷＴ細胞、ＡＡＶＲ  ＫＯ細胞、ＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞、またはダブルＫＯ細胞において観察された発光のグラフである。
【図１５−１】図１５Ａは、ＡＡＶ５およびＡＡＶ２の部分間のキメラスワップの略図である。
【図１５−２】図１５Ｂは、示されているＡＡＶで形質導入されたＨｕｈ７およびＨｕｈ７  ＧＰＲ１０８  ＫＯにおける、形質導入の４８時間後のルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ／ｓ）を示すグラフである。データは、５回の技術的反復の平均±ＳＥＭとして示されている。
【図１６】ＧＰＲ１０８依存性を付与することが分かっている領域（ＡＡＶ５（配列番号８）、ＡＡＶ２（配列番号９）、ＡＡＶ４（配列番号１０）、ＡＡＶｒｈ３２．３３（配列番号１１）、ＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５（配列番号１２）、ＡＡＶ１（配列番号１３）、ＡＡＶ６．２（配列番号１４）、ＡＡＶ８（配列番号１５）、ＡＡＶ３（配列番号１６）、およびＡＡＶ９（配列番号１７））のアラインメントを示す図である。
【図１７−１】図１７Ａは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ５．２、またはＰＢＳ（コントロール）における、１ｅ１１ｇｃ／マウスのバージョン１のｃａｐ２〜５キメラで処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの６週間の追跡の間のインビボでのルシフェラーゼ発現（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）のグラフである。データは、群当たり５頭の動物の平均±ＳＥＭとして示されている。  図１７Ｂは、ルシフェラーゼ導入遺伝子を発現する示されているＡＡＶで形質導入されている野生型ＭＥＦまたはＧＰＲ１０８  ＫＯ  ＭＥＦにおける、形質導入の４８時間後のルシフェラーゼ（ＲＬＵ／ｓ）のグラフである。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭとして示されている。
【図１７−２】図１７Ｃは、ルシフェラーゼを発現する示されているＡＡＶで形質導入されているＨｕｈ７、Ｈｕｈ７  ＡＡＶＲ  ＫＯ、Ｈｕｈ７  ＧＰＲ１０８  ＫＯ、またはＨｕｈ７ダブルＫＯにおける、形質導入の４８時間後のルシフェラーゼ（ＲＬＵ／ｓ）のグラフである。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭとして示されている。
【図１８】図１８Ａは、１ｅ１１ｇｃ／マウスの、ルシフェラーゼ導入遺伝子を有する示されているＡＡＶでのＣ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＧＰＲ１０８  ＫＯ  マウスの処理の後８週間にわたる、インビボでのルシフェラーゼ発現（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）のグラフである。データは、群当たり３頭の動物の平均±ＳＥＭとして示されている。  図１８Ｂは、ベクター投与後１４日目の、群ごとの代表的なマウスの画像である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本開示において記載されている研究は、遺伝子療法ベクターの侵入経路を理解するために使用されているウイルス侵入因子を同定するための高度にストリンジェントなゲノムワイドスクリーニングの最初の過程の１つである。３つの新規な宿主細胞侵入因子が同定され、特徴付けされ、そしてＡＡＶＲ非依存性ＡＡＶ血清型およびＡＡＶＲ依存性ＡＡＶ血清型の両方についての試験結果が記載されている。ＡＡＶＲおよびＧタンパク質結合型受容体１０８（ＧＰＲ１０８）という２つの侵入因子の、高度に保存されている利用は、ほとんどのＡＡＶが同一の侵入経路を共有していると考えられることを実証している。ほとんどのＡＡＶがＡＡＶＲを結合し、適正な輸送のためにＡＡＶＲを必要とし、その後、エンドソーム脱出のためにＧＰＲ１０８を必要とする、新規な多因子侵入メカニズムが提示されている（図１）。
【００３５】
図１は、ＡＡＶ細胞侵入受容体の、本明細書において記載される研究に基づく、モデルの略図である。例えば、ほとんどのＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ−Ｂ、８ＢＰＶ２、および７Ｍ８）は、（例えば、ヒトおよびマウスの両方における）細胞侵入のためにＡＡＶＲおよびＧＰＲ１０８の両方を必要とし、ＡＡＶＲおよびＧＰＲ１０８の両方は、遍在的に発現することが報告されている。その一方で、ＡＡＶ５は、ＡＡＶＲの代替ドメインを独自に使用し、ＧＰＲ１０８は使用せず、同様に、エンドソーム脱出のために、現在知られていない共受容体を使用し、また、ＡＡＶ４およびｒｈ３２．３３は、ノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）およびカテプシンＡ（ＣＴＳＡ）の最小受容体複合体を使用し、同様に、エンドソーム脱出のためにＧＰＲ１０８受容体を使用する。
【００３６】
本明細書において記載されるように、細胞侵入に関与するＡＡＶ配列は、固有の細胞標的化特性および組織標的化特性を有する新規なカプシドを生産するように操作することができ、現在のＡＡＶ血清型にこれまで利用しにくかった特定の組織または細胞型の標的化を可能にする。ＡＡＶは、あらゆるウイルスと同様に、宿主タンパク質ならびに侵入と増殖感染を可能にするいくつかの他のステップとのための他の共因子を係合する。ここで、本発明らは、ＡＡＶベクターをＧＰＲ１０８に依存するように改変することを可能にし、これによって、ＧＰＲ１０８を発現する細胞および組織へのアクセスを可能にする、または逆に、ＡＡＶベクターをＧＰＲ１０８依存性でないようにし、これによって、ベクターを標的細胞におけるＧＰＲ１０８発現の必要性によって制限されないようにする、一般化可能な方法を記載する。さらに、本明細書において記載される侵入のメカニズムに基づいて、細胞内へのＡＡＶの形質導入効率を、多くの異なる方法を使用して調節または変更することができる。例えば、本明細書において記載される方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の細胞侵入を変化させるために使用することができる。
【００３７】
細胞内へのＡＡＶの侵入を少なくとも部分的に操作または制御する能力は、広範囲に及ぶ治療的意義を有する。ＡＡＶは、多くの異なる疾患または欠陥を処置するために治療的に使用され得、また、本明細書において記載される方法は、これらのＡＡＶによる１つまたは複数の細胞の形質導入効率を調節するために使用され得る。例えば、ＡＡＶは、血友病、網膜色素変性症、嚢胞性線維症、レーバー先天性黒内障、リソソーム蓄積症、先天性代謝異常（例えば、フェニルケトン尿症を含む先天性アミノ酸代謝異常、プロピオン酸血症を含む先天性有機酸代謝異常、中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ＭＣＡＤ）を含む先天性脂肪酸代謝異常）、癌、色盲、錐体杆体ジストロフィー、黄斑変性（例えば、加齢性黄斑変性）、リポポリペプチドリパーゼ欠損症、家族性高コレステロール血症、脊髄性筋萎縮症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、アルツハイマー病、パーキンソン病、肥満、炎症性腸障害、糖尿病、鬱血性心不全、高コレステロール血症、難聴、冠動脈性心疾患、家族性腎アミロイドーシス、マルファン症候群、致死性家族性不眠症、クロイツフェルト・ヤコブ病、鎌状赤血球症、ハンチントン病、頭側頭葉変性症、アッシャー症候群、乳糖不耐性、脂質蓄積症（例えば、ニーマン・ピック病、Ｃ型）、バッテン病、先天性脈絡膜欠如、グリコーゲン蓄積症ＩＩ型（ポンペ病）、毛細血管拡張性運動失調症（ルイ・バー症候群）、先天性甲状腺機能低下症、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、および／または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む広範な障害を処置するために、治療法（例えば遺伝子療法）を細胞に送達するために使用することができる。
【００３８】
遺伝子操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
本明細書において記載されるように、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率は、非天然の遺伝子改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を生成することおよび複数の遺伝子改変されたＡＡＶを細胞内に導入することによって、調節または変更され得る。ＶＰ１ポリペプチドまたはその部分は、ＡＡＶ配列内のＶＰ１固有のＮ末端部分を指す。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、オーバーラップしているＣ末端タンパク質であり、これは、ＶＰ１およびＶＰ２のＮ末端にあるＶＰ１２固有のドメイン（「ＶＰ１２ｕ」と呼ばれる）、ならびに固有のＶＰ１ドメイン（「ＶＰ１ｕ」と呼ばれる）を生じさせる。本明細書において実証されているように、ＧＰＲ１０８の係合は、ＶＰ１ｕドメインにマッピングされている。
【００３９】
本明細書において記載されるように、ＡＡＶカプシドタンパク質は、遺伝子操作されていない形態では細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要としないＡＡＶを細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要とするようにする異種ＶＰ１ポリペプチド配列を含むように、遺伝子操作され得る。あるいは、ＡＡＶカプシドタンパク質は、遺伝子操作されていない形態では細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体の存在を必要とするＡＡＶを細胞の形質導入のためにＧＰＲ１０８受容体を必要としないようにする異種ＶＰ１ポリペプチド配列を含むように、遺伝子操作され得る。
【００４０】
例えば、ＡＡＶは、ＡＡＶをＧＰＲ１０８非依存性にする（例えば、ＧＰＲ１０８を必要としないようにする）配列ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１、配列中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）を有するＶＰ１配列を導入するように遺伝子操作され得る。一部の実施形態において、Ｘ１はＳもしくはＡもしくはＴであり得、Ｘ２はＦもしくはＡもしくはＴであり得、Ｘ３はＰであり得、Ｘ４はＤであり得、Ｘ５はＷであり得、Ｘ６はＬであり得、Ｘ７はＥであり得、Ｘ８はＥであり得、Ｘ９はＧであり得、Ｘ１０はＬもしくはＩもしくはＶであり得、Ｘ１１はＲであり得、かつ／またはＸ１２はＥもしくはＱであり得る。
【００４１】
代表的なＧＰＲ１０８非依存性のＶＰ１配列は、
ＭＡＡＶＤＨＰＰＤＷＬＥＥＶＧＥＧＩＲＥＦＬＧＬＥＡ（配列番号１８）
である。
【００４２】
あるいは、ＡＡＶは、ＡＡＶをＧＰＲ１０８依存性にする（例えば、ＧＰＲ１０８の存在を必要とするようにする）配列
ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２、配列中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）
を有するＶＰ１配列を含むように遺伝子操作され得る。一部の実施形態において、Ｘ１はＳもしくはＡもしくはＴであり得、Ｘ２はＦもしくはＡもしくはＴであり得、Ｘ３はＰであり得、Ｘ４はＤであり得、Ｘ５はＷであり得、Ｘ６はＬであり得、Ｘ７はＥであり得、Ｘ８はＥであり得、Ｘ９はＧであり得、Ｘ１０はＬもしくはＩもしくはＶであり得、Ｘ１１はＲであり得、かつ／またはＸ１２はＥもしくはＱであり得る。
【００４３】
代表的なＧＰＲ１０８依存性のＶＰ１配列は、
ＭＳＦＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＬＲＥＷＷＫＬＫＰ（配列番号１９）
である。
【００４４】
他の実施形態において、配列番号８（図１６で示され、ＡＡＶ５のＶＰ１配列の一部分である）は、ＧＰＲ１０８非依存性配列の一例であり、一方、配列番号９〜１７（図１６で示され、それぞれが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ｒｈ３２．３３、ＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ３、およびＡＡＶ９のＶＰ１配列の一部分にそれぞれ対応する）は、ＧＰＲ１０８依存性配列の例であるが、本明細書において示されるもの以外のＶＰ１配列がＧＰＲ１０８非依存性またはＧＰＲ１０８依存性を付与し得ることが理解される。例えば、ＡＡＶ７、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ−Ｂ、８ＢＰＶ２、または７Ｍ８の同種ＶＰ１ポリペプチド（例えば、ＶＰ１タンパク質の対応する部分）もまた、ＧＰＲ１０８依存性を付与し得る。
【００４５】
本明細書において記載されるように、ＶＰ１ポリペプチドは、ＶＰ１ポリペプチドが由来した元であるＡＡＶ血清型のＶＰ１タンパク質に基づいて、細胞のＧＰＲ１０８依存性またはＧＰＲ１０８非依存性の形質導入に関与する。したがって、ＡＡＶは、遺伝子操作されたＡＡＶの細胞侵入および最終形質導入効率を改変するための異種ＶＰ１ポリペプチドを含むように遺伝子操作され得る。
【００４６】
例えば、通常はＧＰＲ１０８依存性であるＡＡＶを、ＡＡＶが細胞内へのＧＰＲ１０８非依存性の形質導入を示すようにする異種ＶＰ１ポリペプチドを含むように遺伝子改変することができるか、または、通常はＧＰＲ１０８非依存性であるＡＡＶを、ＡＡＶが細胞内へのＧＰＲ１０８依存性の形質導入を示すようにする異種ＶＰ１ポリペプチドを含むように遺伝子改変することができる。
【００４７】
一部の場合において、異種ＶＰ１ポリペプチドは、ＡＡＶ５のＶＰ１タンパク質またはその部分に由来する。本明細書において実証されているように、ＡＡＶ５由来のＶＰ１ポリペプチドは、さもなければＧＰＲ１０８依存性であるＡＡＶに、ＧＰＲ１０８非依存性を付与し得る。一部の場合において、異種ＶＰ１ポリペプチドを含むように遺伝子改変されているＡＡＶは、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）非依存性のＡＡＶである。ＡＡＶＲ非依存性のＡＡＶは、当技術分野において知られており、これとしては、例えば、ＡＡＶ４およびｒｈ３２．３３が含まれる。例えば、ＡＡＶＲ非依存性のＡＡＶは、本明細書において記載される方法を使用して、ＧＰＲ１０８非依存性ともなるように遺伝子操作され得る。
【００４８】
ＡＡＶの形質導入効率を調節する方法
本開示によって提供されるＡＡＶの細胞侵入メカニズムの理解に基づいて、一部の場合において、細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を増大させることによって、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を増大させることが望ましい場合がある。同様に、本開示によって提供されるＡＡＶの細胞侵入メカニズムの理解に基づいて、一部の場合において、細胞を細胞におけるＧＰＲ１０８の発現または活性を低下させる化合物を接触させることによって、細胞内へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を低下させることが望ましい場合がある。
【００４９】
細胞におけるタンパク質の発現または活性を増大させる方法は一般に知られており、これとしては、例えば、細胞内への、所望のタンパク質をコードする導入遺伝子（例えばＧＰＲ１０８導入遺伝子）を発現するまたは過剰発現する発現構築物の導入が、典型的には含まれる。同様に、タンパク質の発現または活性を低下させる方法は一般に知られており、これとしては、例えば、細胞において干渉ＲＮＡを発現させることが典型的には含まれる。干渉ＲＮＡは当技術分野において知られており、これとしては、限定はしないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子が含まれる。
【００５０】
ヒトＧＰＲ１０８配列ならびにマウスおよびラットＧＰＲ１０８配列は、当技術分野において知られている。例えば、ＮＭ＿００１０８０４５２（ヒトＧＰＲ１０８転写産物バリアント１）、ＮＭ＿０２０１７１（ヒトＧＰＲ１０８転写産物バリアント２）、ＮＰ＿００１０７３９２１（ヒトＧＰＲ１０８タンパク質アイソフォーム１）、ＡＦ３７６７２６（マウスＧＰＲ１０８転写産物）、およびＢＣ０６１９９６（ラットＧＰＲ１０８転写産物）を参照されたい。このような配列は、ＧＰＲ１０８導入遺伝子を発現させるための発現構築物を生成するために使用され得るか、またはこのような配列は、１つもしくは複数の干渉ＲＮＡを生成するために使用され得る。ＧＰＲ１０８に対する代表的な干渉ＲＮＡ配列は、ＣＧＧ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＣＣＡ  ＵＵＵ  ＧＧＡ  Ａ（配列番号２０）の配列（ワールド・ワイド・ウェブ上のｓｃｈｏｌａｒｂａｎｋ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｈａｎｄｌｅ／１０６３５／１４２８２８で入手可能な、Ｋａｕｒ、２０１８、シンガポール国立大学での博士論文における、指定されたｓｉＲＮＡ３）を有する。
【００５１】
発現構築物は当技術分野において知られており、市販されているかまたは当技術分野において通常の組換えＤＮＡ技術によって生産され得る。発現構築物は、導入遺伝子に作動可能に連結している１つまたは複数の調節エレメントを典型的には含み、選択マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）をコードする配列などの配列をさらに含み得る。核酸を発現するように設計された構築物は、キメラポリペプチドまたは融合ポリペプチド（すなわち、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかで異種ポリペプチドに作動的に連結しているポリペプチド）をコードし得る。代表的な異種ポリペプチドは、コードされるポリペプチドの精製において使用され得るもの（例えば、６×Ｈｉｓタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））である。
【００５２】
調節エレメントとしては、核酸コード配列の発現を指示および調節する核酸配列が含まれる。調節エレメントの一例は、プロモーター配列である。調節エレメントとしてはまた、イントロン、エンハンサー配列、応答エレメント、または核酸（例えば導入遺伝子）の発現を調節する誘導性エレメントも含まれ得る。調節エレメントは、細菌由来、酵母由来、昆虫由来、哺乳動物由来、またはウイルス由来のものであり得、構築物は、異なる由来源から得られる調節エレメントの組み合わせを含有し得る。本明細書において使用される場合、作動可能に連結しているとは、発現のためのエレメントが、コード配列の発現を指示または調節するような様式で、構築物内でコード配列（例えば導入遺伝子）との相対的位置にあることを意味する。一部の場合において、作動可能に連結しているとは、インフレームを意味する。
【００５３】
本明細書において記載される構築物は、宿主細胞に導入され得る。本明細書において使用される場合、「宿主細胞」は、核酸が導入される特定の細胞を指し、またこれとしては、このような細胞の子孫または潜在的子孫が含まれる。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、核酸は、大腸菌（E. coli）などの細菌細胞において、あるいは昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）もしくはＣＯＳ細胞など）において発現させることができる。他の適切な宿主細胞は、当業者に知られている。
【００５４】
本明細書において記載される、（例えば、ＧＰＲ１０８の発現もしくは活性を増大もしくは低下させる化合物と、または遺伝子改変されたＡＡＶと）接触している細胞は、インビトロで培養された細胞、あるいは、例えば動物モデルにおけるまたはヒト対象もしくは動物対象における組織の一部分におけるインビボの細胞であり得る。代表的な細胞型としては、限定はしないが、肝細胞、腎臓細胞、心臓細胞、筋肉細胞、脳細胞、肺細胞、上皮細胞、内皮細胞、および骨髄細胞（造血幹細胞を含む）、または眼もしくは内耳における細胞が含まれる。本明細書において記載される、接触している細胞は、例えば、腫瘍細胞または操作された細胞であり得る。
【００５５】
インビボおよびインビトロの両方の、宿主細胞内に核酸を導入するための多くの方法が当業者に知られており、これとしては、限定はしないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）形質転換、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス介在性の核酸移入が含まれる。
【００５６】
治療作用物質の送達
本明細書において記載される方法および組成物はまた、細胞内への治療作用物質の取り込みを調節するために使用することができる。例えば、タンパク質（例えば抗体、例えばモノクローナル抗体）またはタンパク質複合体などの治療作用物質を、ＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶのＶＰ１ポリペプチドまたはその部分に連結させることができる。この様式で、治療作用物質を、ＡＡＶによって通常使用されるＧＰＲ１０８取り込みメカニズムを利用するように操作することができる。本明細書における開示に基づいて、ＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶのＶＰ１ポリペプチドが、配列番号２で示されるコンセンサス配列を含み得ること、または、ＧＰＲ１０８依存性ＡＡＶのＶＰ１ポリペプチドが、取り込みのためにＧＰＲ１０８を必要とする任意のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、ｒｈ８ｃ、ｒｈ１０、ＰＨＰ−Ｂ、８ＢＰＶ２、もしくは７Ｍ８）のＶＰ１タンパク質もしくはその部分に由来し得ることが理解される。
【００５７】
一部の場合において、さらなる結合因子をＧＰＲ１０８に対する親和性を有する治療作用物質にさらに連結させることが望ましい場合がある。このような結合因子は、限定はしないが、抗体、抗体ドメイン、またはアプタマーを含む、ＧＰＲ１０８に結合する任意の分子または作用物質であり得る。例えば、治療作用物質のＮ末端は、コンセンサス配列を含むＶＰ１ポリペプチド
ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）に連結され得、細胞への治療作用物質の送達が可能となる。
【００５８】
本開示に従って、当技術分野の技術の範囲内である従来の分子生物学、微生物学、生化学、および組換えＤＮＡ技術が利用され得る。このような技術は、文献において全て説明されている。本開示は以下の実施例においてさらに記載され、これらの実施例は、特許請求の範囲において記載されている方法および組成物の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５９】
材料および方法
全ての細胞系は、５％ＣＯ２を有する３７℃の加湿インキュベーター内で、１０％ＦＢＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を添加したダルベッコ改変イーグル最小培地ＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で維持した。全ての細胞系はＪａｎ  Ｃａｒｒｅｔｔｅ  ｌａｂから譲り受け、これまでに公開されている（Pillay et al., 2016, Nature, 530:108-12）。細胞を、標準的なプロトコルを使用して、ＰｏｌｙＪｅｔインビトロＤＮＡトランスフェクション試薬（ＳｉｇｎａＧｅｎ、カタログ番号ＳＬ１００６８８）を使用してトランスフェクトした。
【００６０】
一次細胞ＭＥＦを、１０％ＦＢＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、５５μＭのベータ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１５μｇ／ｍＬの硫酸ゲンタマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、および非必須アミノ酸（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）内で培養した。ＷＴおよびＧＰＲ１０８  ＫＯ  ＭＥＦはＢｒｉａｎ  ＳｅｅｄおよびＧｕｏｌｉｎｇ  Ｚｈｏｕから譲り受け、これまでに記載されている（Dong et al., 2018, Plos One, 13(10):e0205303）。
【００６１】
合成に使用したＮＣＢＩ配列は以下の通りであった：マウスＧＰＲ１０７、ＢＡＣ２６９６１、マウスＧＰＲ１０８、ＮＰ＿０８４３６０、ヒトＧＰＲ１０７、ＡＡＫ５７６９５、ヒトＧＰＲ１０８、ＸＰ＿２９０８５４。カプシドキメラを、（Excoffon et al., 2009, PNAS USA, 106:3865-70）において実証されているＶＰ１ジャンクションでＡＡＶ２およびＡＡＶ５のヌクレオチド配列から生成させた。カプシドキメラはＧｅｎｅｗｉｚによって合成され、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位およびＳｐｅＩ制限部位を使用してｐＡＡＶｅｃｔｏｒ２にサブクローニングした。
【００６２】
高力価ベクターはＭＥＥＩ／ＳＥＲＩ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ（ワールド・ワイド・ウェブ上のｖｅｃｔｏｒ．ｍｅｅｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ）によって生産され、精製され、および滴定された。大規模ベクター調製物を、ｐＨｅｌｐ導入遺伝子、ｐＡＡＶｅｃｔｏｒ２［Ｃａｐ］導入遺伝子、およびｐＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ、ｐＣＭＶ．ｅＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ導入遺伝子またはｐＣＭＶ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ導入遺伝子の２：１：１比でのポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２４７６５−２）トリプルトランスフェクションによって生成した。５２０μｇの全ＤＮＡを、１．３７５：１（ｗ／ｗ）のＰＥＩ  Ｍａｘ：ＤＮＡ比を使用して、１０層のハイパーフラスコ内でトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、ベクターをタンジェンシャルフロー濾過によって濃縮し、以前に記載されているように（Lock et al., 2010, Hum. Gene Ther., 21:1259-71）イオジキサノール勾配超遠心分離によって精製した。
【００６３】
キメラウイルスベクターおよび点突然変異ウイルスベクターを、１０ｃｍの細胞培養物プレート内で、同一のトランスフェクション方法によって、小規模で粗ウイルス調製物として生産した。トランスフェクションの３日後、細胞および上清を回収し、３回の凍結融解サイクルにかけ、次いで、粗ウイルス調製物を、４℃のＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＦＩＢＥＲＬｉｔｅ  Ｆ１５−８ｘ５０ｃｙローター内での１００００ＲＰＭで１０分間の遠心分離によって澄明化した。
【００６４】
全てのルシフェラーゼ形質導入アッセイは、底が黒い９６ウェルプレート内でウェル当たり１００００個の細胞を播種することによって一晩行った。示されている場合、細胞はＤ１０中の２００ｐｆｕ／細胞のＷＴ  ｈＡｄ５（ペンシルベニア大学Ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｒｅ）と２時間プレインキュベートし、次いで、ｈＡｄ５を含有する培地を除去し、その後、形質導入を行った。細胞を、５０μＬの無血清ＤＭＥＭ中の１×１０４ＶＧ／細胞のいずれかのＡＡＶで、３７℃で１時間形質導入し（ＡＡＶＲ回復実験）、次いで、Ｄ１０を２００μＬの全容積まで添加したか、または、ウェル当たり１００μｌの粗ウイルス調製物（キメラカプシド実験および点突然変異カプシド実験）を３７℃で１時間添加し、除去し、次いで、Ｄ１０を添加した。形質導入レベルを、形質導入の４８時間後に、ルシフェラーゼアッセイによって分析した。
【００６５】
形質導入の２日後、細胞培養培地を除去し、細胞をウェル当たり２０μＬの１×レポーター溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号）中に溶解し、次いで、−８０℃で凍結した。解凍した後、ｆｆＬｕｃの発現を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダーで、１００μＬのルシフェリンバッファー［２００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、３００μＭのＡＴＰ、１×ホタルルシフェラーゼシグナルエンハンサー（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号１６１８０）、および１５０μｇ／ｍＬのＤ−ルシフェリン］を使用して、相対発光量／ｓで測定した。
【００６６】
[実施例１]
侵入のスクリーニングおよび分析
レンチウイルスを、レンチウイルス生産のための製造者のプロトコルを使用して、ＰｏｌｙＪｅｔインビトロＤＮＡトランスフェクション試薬（ＳｉｇｎａＧｅｎ、カタログ番号ＳＬ１００６８８）を使用して、一過性トランスフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）から生産した。ＬｅｎｔｉＣａｓ９−ｂｌａｓｔおよび個々のｓｇＲＮＡ含有レンチウイルスを、１０ｃｍのディッシュ当たり４×１０６個細胞で一晩播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞において生産した。トランスフェクションの１時間前に、培地を、新鮮な事前に温めたＤ１０に交換し、その後、ｐｓＰＡＸ２、ｐＬｅｎｔｉＣａｓ９−ＢｌａｓｔまたはＬＶ０４、およびｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇを１０：１０：１比でトランスフェクトした。培地をトランスフェクションの６時間後に新鮮なＤ１０に交換し、上清のウイルスを４８時間後に採取し、Ｓｏｒｖａｌｌ卓上型遠心分離機において２０００ＲＰＭで５分間遠心分離することによって澄明化し、そして、０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過した。大規模なＧｅＣ  ＫＯレンチウイルスを以前に記載されているように生産した（Joung et al., 2017, Nat. Protoc., 12:828-63）。
【００６７】
簡潔に述べると、Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂを、本明細書において記載されるプロトコルの大規模トランスフェクションを使用して、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＨＹＰＥＲｆｌａｓｋ培養管において、個々のレンチウイルスライブラリー調製物として生産した。上清のウイルスを、トランスフェクション後２日目および３日目に回収し、０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過し、そして、ＳＷ−２８ローター内で２４０００ＰＲＭで２時間、４℃で超遠心分離することによって濃縮した。
【００６８】
細胞系を、形質導入の前の晩に、６ウェルプレートのウェル当たり１×１０６個細胞で播種した。細胞を、８μｇ／μＬのポリブレン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＴＲ１００３Ｇ）の存在下で、ウェル当たり１ｍＬの上清レンチウイルスを使用して、卓上型での２５℃および２５００ＲＰＭで３０分間のスピンフェクションによって形質導入した。スピンフェクションの後、培地を新鮮なＤ１０に交換し、翌日、安定的に形質導入された細胞を、５μｇ／μＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ９６２０）を使用して２日間選択した。
【００６９】
Ｃａｓ９細胞に、本明細書において記載される個々の標的化ｓｇＲＮＡを発現するレンチウイルス（ＬＶ０４構築物）で形質導入した。ピューロマイシン選択の少なくとも１週間後、個々の細胞クローンを、９６ウェルプレート内でＤＭＥＭ２０％ＦＢＳプラス非必須アミノ酸およびペニシリン／ストレプトマイシン中で限界希釈することによって平板培養し、細胞の生存を増大させた。平板培養の２〜３週間後、単細胞クローンを増殖させ、ノックアウトについてスクリーニングした。
【００７０】
濃縮されたレンチＣＲＩＳＰＲライブラリーを、ピューロマイシン選択の２日後に、ピューロマイシンの不存在下で、形質導入されていないコントロール細胞と比較した、形質導入された細胞の生存の％を決定することによって、Ｈｕｈ７  ＡＡＶＲ  ＫＯ  Ｃａｓ９細胞について滴定した。
【００７１】
Ｈｕｈ７  ＡＡＶＲ  ＫＯ  Ｃａｓ９細胞に、８μｇ／μＬのポリブレンでの２５℃で３０分間の上記のようなスピンフェクションによって、６ウェルプレート内で、０．３のＭＯＩの濃縮されたＶ２ＡまたはＶ２Ｂレンチウイルスで形質導入し、その後、３７℃および５％ＣＯ２で１．５インキュベートし、その後、新鮮なＤ１０培地を添加した。ピューロマイシンを形質導入の２４時間後に５μｇ／μＬの濃度で添加して、ｓｇＲＮＡ発現細胞を選択した。細胞をピューロマイシンと１週間培養して選択を行い、ＡＡＶでの選択の前に編集を生じさせた。突然変異誘発されたライブラリーの各半分から得た３０００万個の細胞（Ｖ２Ａ細胞およびＶ２Ｂ細胞）に、１０００００ＶＧ／細胞のｒｈ３２．３３ＣＭＶ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥで形質導入した。細胞に、２つの１５ｃｍプレートのそれぞれにおける全容積が１０ｍＬの無血清ＤＭＥＭ中で１時間形質導入し、その後、１０ｍＬのＤＭＥＭ２０％ＦＢＳを添加し、そして翌日、細胞を分けた。
【００７２】
細胞をＦＡＣＳ選別のためにトリプシン処理によって回収し、卓上型遠心分離機で、２０００ＲＰＭで５分間回転させ、次いで、５ｍＭのＥＤＴＡを有するＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを有さない）中に再懸濁した。ＦＡＣＳ選別は、マサチューセッツ総合病院フローサイトメトリーコア（Ｓｉｍｃｈｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ）で、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ機器で行った。細胞を、２０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中に回収した。選択された細胞を増殖させ、ゲノムＤＮＡを、サンプル当たり全部で１０７個の細胞から抽出した。ライブラリーの各半分から得たＧＦＰネガティブ細胞を半分に分け、配列決定したか、または同一の形質導入プロトコルを使用して第２の形質導入およびＦＡＣＳ選別にかけた。
【００７３】
シーケンシングした後、生リードを、ＭａＧＥＣＫ分析パイプラインを使用して、既知のｓｇＲＮＡ配列にマッピングした。ライブラリーの各半分（Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂ）内のコントロール集団に対して正規化した後に、有意値をライブラリー全体について決定し、データは、多重検定補正を行わずに、生のｐ値として報告されている。
【００７４】
これらの遺伝子改変された細胞は、その遺伝子改変がＡＡＶの標的化効率に影響したかどうかについて次に調べた細胞のライブラリーとして機能した。ｓｇＲＮＡのシーケンシングはこうして、ＡＡＶの標的化効率を増大または低下させた遺伝子改変の追跡を可能とした。この相関を次いで、ロバスト性について統計的に調べた。有意なヒットを、ＡＡＶの形質導入におけるそれらの役割についてさらに検証した。さらに、実施例２において記載するように、第２ラウンドの選択をライブラリーに対して行って、所見のロバスト性をさらに増大させた。
【００７５】
[実施例２]
侵入のスクリーニングはｒｈ３２．３３の侵入因子を同定する
ＣＲＩＳＰＲに基づく侵入スクリーニングを、代替ＡＡＶ侵入経路に必要な細胞侵入因子を同定するように設計した。２ベクターレンチウイルスＧｅＣＫＯ系は、単一ベクター内のＣａｓ９を目的の細胞系に導入し、その後、ヒトゲノム全体に広がるｓｇＲＮＡおよびｍｉＲＮＡのライブラリーを導入した（図２Ａ）（Shalem et al., 2014, Science, 343:84-7）。簡潔に述べると、細胞にベクター１［ｌｅｎｔｉＣａｓ９−Ｂｌａｓｔ］で形質導入し、その後、Ｃａｓ９の安定な発現のためにブラストサイジン選択を行った。Ｃａｓ９に、次いで、ヒトゲノム全体を標的化するｓｇＲＮＡを含有するライブラリーフォーマットのベクター２（ｌｅｎｔｉＧｕｉｄｅ−Ｐｕｒｏ）で形質導入して、細胞系ノックアウトライブラリーを生成した。
【００７６】
レンチウイルスプラスミドは、ＡｄｄｇｅｎｅまたはＳｉｇｍａから購入した。ＬｅｎｔｉＣａｓ９−ｂｌａｓｔ（５２９６２）、ｐｓＰＡＸ２（１２２６０）、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（８４５４）、ＧｅＣＫＯ  Ｖ２ＡおよびＧｅＣＫＯ  Ｖ２Ｂ（１０００００００４８および１０００００００４９）は、Ａｄｄｇｅｎｅから購入した。スクリーニングの検証およびノックアウト実験に使用される個々の遺伝子を標的化する個々のｓｇＲＮＡレンチウイルス構築物は、Ｓｉｇｍａ  ＬＶ０４ベクター骨格内のＱｕｉｃｋＰｉｃｋグリセロールストッククローンとしてＳｉｇｍａから購入した。
【００７７】
レンチウイルスを、レンチウイルス生産のための製造者のプロトコルを使用して、ＰｏｌｙＪｅｔインビトロＤＮＡトランスフェクション試薬（ＳｉｇｎａＧｅｎ、カタログ番号ＳＬ１００６８８）を使用して、一過性トランスフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）から生産した。ＬｅｎｔｉＣａｓ９−ｂｌａｓｔおよび個々のｓｇＲＮＡ含有レンチウイルスを、１０ｃｍのディッシュ当たり４×１０６個細胞で一晩播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞において生産した。トランスフェクションの１時間前に、培地を、新鮮な事前に温めたＤ１０に交換し、その後、ｐｓＰＡＸ２、ｐＬｅｎｔｉＣａｓ９−ＢｌａｓｔまたはＬＶ０４、およびｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇを１０：１０：１比でトランスフェクトした。培地をトランスフェクションの６時間後に新鮮なＤ１０に交換し、上清のウイルスを４８時間後に採取し、Ｓｏｒｖａｌｌ卓上型遠心分離機において２０００ＲＰＭで５分間遠心分離することによって澄明化し、そして、０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過した。大規模なＧｅＣ  ＫＯレンチウイルスを以前に記載されているように生産した（Joung et al., 2017, Nat. Protoc., 12:828-63）。
【００７８】
簡潔に述べると、Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂを、上記のプロトコルの大規模トランスフェクションを使用して、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＨＹＰＥＲｆｌａｓｋ培養管において、個々のレンチウイルスライブラリー調製物として生産した。上清のウイルスを、トランスフェクション後２日目および３日目に回収し、０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過し、そして、ＳＷ−２８ローター内で２４０００ＰＲＭで２時間、４℃で超遠心分離することによって濃縮した。濃縮されたｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲライブラリーを、ピューロマイシン選択の２日後に、ピューロマイシンの不存在下で、形質導入されていないコントロール細胞と比較した、形質導入された細胞の生存の％を決定することによって、Ｈｕｈ７  ＡＡＶＲ  ＫＯ  Ｃａｓ９細胞について滴定した。
【００７９】
Ｈｕｈ７  ＡＡＶＲ  ＫＯ細胞を、ＡＡＶＲ依存性の侵入でのいかなる考えられる冗長性もスクリーニングにおける偽陰性を生じさせないことを確実にするために、このスクリーニングに使用した。ｒｈ３２．３３．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥベクターで形質導入されたｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ突然変異誘発細胞の複数ラウンドの形質導入、ならびにＦＡＣＳ選別と、その後のｓｇＲＮＡ普及率のＩｌｌｕｍｉｎａディーブシーケンシングとを使用して、ＡＡＶの制限またはＡＡＶの侵入のいずれかに関与する細胞因子を同定した（図２Ｂ）。
【００８０】
コントロール（選択されていない）細胞または選択された細胞のゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号１３３４３）を使用して抽出した。バーコードの追加およびＩｌｌｕｍｉｎａアダプターの追加を、以前に記載されているように行った（Joung et al., 2017, Nat. Protoc., 12:828-63）。簡潔に述べると、２ステップのＰＣＲを、サンプル特異的なプライマーを使用して行って、ｓｇＲＮＡ配列を特異的に増幅させ、記載されているように、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ機でのマルチプレックスシーケンシングの間にサンプルを区別した（Joung et al., 2017, Nat. Protoc., 12:828-63）。
【００８１】
ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ（ＧｅＣＫＯ）ライブラリー（Ｖ２Ａ細胞およびＶ２Ｂ細胞）の各半分で突然変異誘発された３０００万個の細胞（Sanjana et al., 2014, Nat. Methods, 11:783-4）に、高ＭＯＩのｒｈ３２．３３．ＣＭＶ．ｅＧＰＦ．ＷＰＲＥで形質導入した。最も高い≒１５％の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有する細胞を選択し、ｓｇＲＮＡの普及率をディープシーケンシングして、ＡＡＶの侵入または遺伝子発現を制限し得る細胞因子同定した（図３Ａ、図３Ｂ）。ＧＦＰネガティブであった細胞（図３Ａ、図３Ｂ）を選択し、半分に分け、そして、ディープシーケンシングしたかまたは別のラウンドの形質導入を行った。これらの細胞に同一ＭＯＩで形質導入し、ＧＦＰネガティブ細胞を選別し、そしてｒｈ３２．３３侵入因子がさらに強化されるようにシーケンシングした（図３Ｃ、図３Ｄ）。第２ラウンドの形質導入は、同一のＭＯＩで行ったが、第１ラウンドの形質導入（図３Ａ、図３Ｂ）と比較して、ＧＦＰネガティブなままであった細胞のパーセンテージが高く（図３Ｃ、図３Ｄ）、このことは、選択が、ｒｈ３２．３３の侵入に必要な欠失した遺伝子を強化させたことを示唆している。ゲノムＤＮＡを異なる選択された細胞集団から抽出し、ｓｇＲＮＡを、ディーブシーケンシングのために、サンプル特異的なバーコードおよびＩｌｌｕｍｉｎａアダプターを追加した２ステップのネステッドＰＣＲ戦略によって増幅した（Joung et al., 2017, Nat. Protoc., 12:828-63）。
【００８２】
サンプルをマルチプレックス化し、シーケンシングし、その後、Ｖ２ＡサンプルおよびＶ２Ｂサンプルを組み合わせて、ライブラリー全体におけるｓｇＲＮＡの普及率を分析し、そして、リードを、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ  Ｖ２ライブラリー内の既知の配列に戻しマッピングした。２ステップのネステッドＰＣＲ戦略を使用して、選択されていない（コントロール）細胞集団または第１ラウンドのＧＦＰ＋またはＧＦＰ−細胞集団からのシーケンシングのためにｓｇＲＮＡを増幅し、ＮＧＳアンプリコンにおいて、固有のサンプルバーコードおよびＩｌｌｕｍｉｎａアダプターを追加した。各選択条件は、ｓｇＲＮＡライブラリーの３００倍を超える網羅を維持するために十分な、全部で７００万を超える生リード、および３７０万を超える、既知のインプットｓｇＲＮＡ配列に完全にマッピングされたリードを生じさせた。
【００８３】
遺伝的摂動によってＡＡＶ感染に対して不応性とされた細胞についてのこの第２ラウンドの選択において、このマルチプレックスライブラリーアプローチを介してさらに厳密な選択を行って、どの細胞因子がＡＡＶ感染の低減と関連しているかを同定した。宿主ゲノムにおけるｓｇＲＮＡマーカーのシーケンシングによって同定されたこれらの共因子は、こうして、ＡＡＶの形質導入に関与する潜在的な所要の遺伝子およびタンパク質として見なされる。
【００８４】
[実施例３]
潜在的ＡＡＶ制限因子の同定
ＧＦＰ陽性細胞のロバストランク凝集（ＲＲＡ）分析およびＭＡＧｅＣＫ分析（Li et al., 2014, Genome Biol., 15:554、およびLi et al., 2015, Genome Biol., 16:281）は、平均蛍光強度が高い、細胞において強化されているいくつかの因子を同定した（図４Ａ）：
−  ＡＣＳＬ６：Ａｃｙｌ−ＣｏＡ合成酵素長鎖ファミリーメンバー６は、脂肪酸からのＡｃｙｌ−ＣｏＡの形成を触媒し、脂質代謝において主要な役割を有し得る。
−  ＬＥＴＭＤ１：ＬＥＴＭ１ドメイン含有１は、ｐ５３の調節および腫瘍形成において役割を有することが示唆されている。
−  ＣＡＬＮ１：Ｃａｌｎｅｕｒｏｎ  １は、ゴルジから原形質膜への運搬を負に調節し、その欠失は、核へのＡＡＶの運搬の際に輸送経路を変更する可能性があり得る。
−  ＳＳＨ３：Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔプロテインホスファターゼ３は、ＡＤＦ／コフィリンタンパク質を活性化させることによって、アクチンダイナミクスにおいて役割を有し、これはまた、ＡＡＶ侵入の輸送経路にも影響し得、これを変更し得る。
【００８５】
ＧＦＰ陽性のサブセットにおける最も大きなヒットは、特徴付けされていない膜貫通タンパク質であるＴＭＥＭ１２５であった。ＧＦＰ陽性の選択からのトップヒットのいくつかを標的化する個々のｓｇＲＮＡを、レンチウイルスベクターを使用してＨｕｈ７  ＡＡＶＲ  ＫＯ  Ｃａｓ９細胞に導入し、次いで、ピューロマイシン選択された細胞を、ルシフェラーゼアッセイを使用してｒｈ３２．３３の形質導入レベルについて評価した。
【００８６】
提示されているデータは、親細胞系（Ｈｕｈ７  ＡＡＶＲ  ＫＯ  Ｃａｓ９）と比較した、ＣＲＩＳＰＲ編集されたポリクローナル細胞集団における、１００００ＶＧ／細胞のｒｈ３２．３３．ＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡでの形質導入から生じるＲＬＵの増加倍率である。ポリクローナル細胞系は、Ｈｕｈ７  ＡＡＶＲ  ＫＯ  Ｃａｓ９細胞に、ｒｈ３２．３３  ＧＦＰ＋細胞集団において同定された個々の遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡをコードするレンチウイルスで形質導入することによって生成させた。いくつかのｓｇＲＮＡ形質導入された細胞系は、親細胞系と比較して、最も顕著にはＴＭＥＭ１２５およびＧＭＥＢ２（グルココルチコイド調節エレメント結合タンパク質２）の形質導入の増大を示し、これらはそれぞれ、形質導入のおよそ１００倍の増大を示した（図４Ｂ）。
【００８７】
これらの結果は、ＧｅＣＫＯに基づく侵入スクリーニングが、ＡＡＶｒｈ３２．３３についての潜在的な細胞制限因子を同定し得ることを実証している。
【００８８】
[実施例４]
潜在的なＡＡＶの侵入因子の同定
ＧＦＰ−細胞集団の分析は、本明細書において記載されるように、ＧＦＰ−集団において強化されていた、同定されたいくつかの遺伝子を生産し、これらのうちの最も顕著なものの１つは、ＧＰＲ１０８であった（図５Ａ）。この遺伝子は、ノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）およびカテプシンＡ（ＣＴＳＡ）などの非常に強化されていた他の遺伝子と同様に、第２ラウンドの形質導入の分析においてさらに強化された（図５Ｂ）。Ｘ軸は、機能性によってグループ化されたＧｅＣＫＯライブラリー内の個々の遺伝子を示しており、Ｙ軸は、ＲＲＡ分析に基づく各ヒットの有意性を示している。バブルの直径は、選択されていないコントロールと比較して、選択された集団において強化されている、遺伝子当たりの個々のｓｇＲＮＡの数に対応する。重要なことに、トップヒットの有意性は１０６近くのｐ値まで増大したが、他の遺伝子は、１０３の有意値の辺りで変化しないままであった。このことは、第２ラウンドの形質導入がｒｈ３２．３３の侵入因子を強化するために非常に重要であったことを示唆している。ＧＰＲ１０８が侵入因子として同定されたことで、ＧＰＲ１０８依存性に関与するＶＰ１領域の研究およびマッピングが行われた。
【００８９】
[実施例５]
ＮＥＵ１およびＣＴＳＡは、代替侵入経路血清型ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４の侵入に必要である
ＮＥＵ１およびＣＴＳＡは共に複合体内に存在するため、また、ＮＥＵ１の安定性および立体構造はＣＴＳＡに依存するため（Galijart et al., 1988, Cell, 54:755-64、およびBonten et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:26441-5）、これらのタンパク質を、双方が代替ＡＡＶ侵入経路に重要であるかどうかを決定するために試験した。ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４の２つのＡＡＶＲ非依存性血清型を、ＮＥＵ１  ＷＴマウスもしくはＮＥＵ１  ＫＯマウス、またはＣＴＳＡ  ＷＴマウス、ＣＴＳＡヘテロ接合型（ＨＥＴ）マウス、もしくはＣＴＳＡ  ＫＯマウスに由来する、以前に公開されているマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞系において試験した。ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４の両方は、ＮＥＵ１  ＫＯ細胞およびＣＴＳＡ  ＫＯ細胞における形質導入の欠如を示し、ＣＴＳＡヘテロ接合型細胞における影響はほとんどまたは全く観察されなかった（図６Ａ、図６Ｂ）。
【００９０】
シアル酸を付着因子として使用するＡＡＶ５を含む、いくつかの他のＡＡＶ血清型を試験した。ＮＥＵ１はシアル酸グリカンの生物学に関与するが、いずれのＡＡＶＲ依存性血清型の形質導入においても違いは観察されなかった（図６Ｃ〜図６Ｆ）。このことは、ＮＥＵ１およびＣＴＳＡがＡＡＶＲ非依存性の侵入にとって特異的に必要であること、ならびにｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４が同一の代替侵入経路を使用すると思われることを実証している。ヒト細胞におけるＮＥＵ１の欠如の影響を、ＮＥＵ１特異的またはＣＴＳＡ特異的なｓｇＲＮＡを様々なＣａｓ９細胞系に導入することによって、さらに評価した。完全なＮＥＵ１ノックアウト機能性を有するモノクローナル細胞系は同定されなかったが、細胞をポリクローナル状況下でピューロマイシン選択を行った後に試験した場合、ｒｈ３２．３３形質導入の大きな低下が、複数のＮＥＵ１  ｓｇＲＮＡを形質導入された細胞系において観察されたが、いずれの他の試験された血清型でも、低下は観察されなかった（図６Ｇ）。このことは、ＮＥＵ１がヒト細胞およびマウス細胞の両方においてＡＡＶＲ非依存性の侵入に必要であることを示唆している。
【００９１】
[実施例６]
代替経路侵入に必要なＮＥＵ１の酵素活性
ＮＥＵ１は酵素であるため、侵入スクリーニングにおいて同様に同定されたＣＴＳＡ（図５Ｃ）は、ＮＥＵ１の触媒的に活性な立体構造の維持に必要であり（D’Azzo et al., 1982, PNAS USA, 79:4535-9、およびVinogradova et al., 1998, Biochem. J., 330(Pt 2):641-50）、ＮＥＵ１の酵素活性がその機能にとって必要であるかどうかを、ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４の侵入において試験した。２つの異なるシアル酸類似体ノイラミニダーゼ阻害剤化合物であるザナミビル（von Itzstein et al., 1993, Nature, 363:418-23）およびＤＡＮＡ（Meindl et al., 1974, Virology, 58:457-63）を使用して、Ｈｕｈ７細胞に対する用量応答を行い、異なるＡＡＶＲ依存性血清型およびＡＡＶＲ非依存性血清型の侵入に対する影響を評価した。２つの異なるＡＡＶＲ依存性血清型であるＡＡＶ５およびＡｎｃ８０、ならびに２つのＡＡＶＲ非依存性血清型であるｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４を試験した。重要なことに、ＡＡＶ４およびＡＡＶ５は共にシアル酸を付着因子として使用する（Kaludov et al., 2001, J. Virol., 75:6884-93、およびWalters et al., 2001, J. Biol. Chem., 276:20610-6）がそれらのＡＡＶＲ依存性は異なるため、これらＡＡＶを調べた。
【００９２】
簡潔に述べると、ウェル当たり１００００個の細胞を、阻害剤処理の１日前に、９６ウェルプレート内で平板培養した。細胞を、示されている濃度のザナミビル（Ｓｉｇｍａ  ＳＭＬ０４９２）またはＤＡＮＡ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ２５２９２６）と２４時間インキュベートし、その後、全容積が１００μＬのＤ１０中で形質導入した。示されている場合、コントロール細胞または阻害剤処理された細胞を、無血清ＤＭＥＭ中のコレラ菌（Vibrio cholera）ＩＩＩ型（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｎ７８８５）から得た５０ｍＵ／ｍＬのノイラミニダーゼで処理し、その後、記載されているようにＡＡＶの形質導入を行った。
【００９３】
細胞の、短い１時間の前処理は、形質導入の低下を全く示さなかった。しかし、示された濃度のノイラミニダーゼ阻害剤ザナミビル（図７Ａ）またはＤＡＮＡ（図７Ｂ）での、Ｈｕｈ７細胞の２４時間の前処理と、その後の、１００００ＶＧ／細胞の、ＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ導入遺伝子を包んでいる示されているカプシド血清型の形質導入とは、ｒｈ３２．３３の形質導入をおよそ１０倍、大きく低下させ、また、ＡＡＶ４の侵入をわずかに低下させた（黒：ＡＡＶＲ依存性血清型、緑：ＡＡＶＲ非依存性血清型、実線：未知のグリカン付着因子、点線：付着に使用されたシアル酸）。ＡＡＶＲ非依存性の侵入の低下を示すためにノイラミニダーゼ阻害剤との長時間のプレインキュベーションが必要であることは、ＮＥＵ１活性が侵入に必要な別のタンパク質プロセスまたは細胞プロセスの調節活性であり得るという意味で、侵入の欠陥がＮＥＵ１およびＣＴＳＡの機能の影響を受け得ることを示唆している。ＡＡＶＲ依存性血清型、ＡＡＶ５、またはＡｎｃ８０のいずれも、形質導入の低下を示さず、このことは、ＮＥＵ１の活性がＡＡＶＲ非依存性血清型の侵入に特異的に必要であることを実証している。
【００９４】
ＮＥＵ１およびＣＴＳＡは細胞のグリコシル化状態において役割を有するため、侵入の欠陥が、付着の欠陥をもたらす細胞表面でのグリコシル化の全体的な変更に起因するものではないことを確認することが求められた。これを行うために、細胞をまずザナミビルまたはＤＡＮＡで２４時間前処理し、その後、コレラ菌（Vibrio cholera）から得た組換えノイラミニダーゼで処理して、ＮＥＵ１阻害に起因して細胞表面に蓄積している可能性がある全てのシアル酸を除去した。
【００９５】
示されている事前に冷蔵されたベクターを次いで、氷上の細胞に添加し、１時間インキュベートしてベクターを付着させ、未結合のベクターを、氷冷したＰＢＳを使用して洗い流し、次いで、形質導入を進行させ、ベクターの形質導入を、ルシフェラーゼアッセイを介して、異なる処理条件において、未処理コントロール細胞と比較した増加倍率によって評価した。
【００９６】
図７で使用されているものと同一の４つのベクターを、これらの異なる血清型の付着と侵入に対するＮＥＵ１の機能を解明するために調べた。示されている細胞系を、２４ウェルプレートで、ウェル当たり５×１０４個細胞で一晩平板培養した。細胞を氷上に１０分間置き、次いで、ウェル当たり１０９ＶＧの事前に冷蔵されたベクターをウェル当たり全容積２００μＬで添加した。ベクターを、オービタルシェーカープラットフォーム上で氷上の細胞に１時間結合させた。結合の後、細胞を、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を有する氷冷したＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ウェル当たりいずれかの１００μＬのＰＢＳを添加し、プレートを−８０℃で凍結した。結合アッセイプレートを３回の凍結解凍サイクルにかけ、その後、再懸濁し、ＣＭＶプライマー／プローブを使用して、本明細書において記載されるようにｑＰＣＲによってウイルスゲノム定量を行った。
【００９７】
イオジキサノール精製したベクター調製物のＤＮａｓｅ１耐性ウイルスゲノムを、ＣＭＶプロモーターを検出するプライマーおよびプローブのセットを使用して、ＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４３０４４４９）によって定量した。ベクターの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって評価した。
【００９８】
Ｈｕｈ７細胞を２ｍＭのザナミビルまたはＤＡＮＡで２４時間前処理し、その後、コレラ菌（Vibrio cholera）から得たノイラミニダーゼで２時間処理し、その後、ＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ導入遺伝子を包んでいるｒｈ３２．３３（図８Ａ）、ＡＡＶ４（図８Ｂ）、ＡＡＶ５（図８Ｃ）、またはＡｎｃ８０（図８Ｄ）で形質導入した。図８Ｅは、示された血清型についてのＷＴ細胞系および突然変異ＭＥＦ細胞系での、細胞に結合したウイルスゲノムのｑＰＣＲの結果である。
【００９９】
ザナミビルまたはＤＡＮＡで処理した細胞をノイラミニダーゼ処理した後、侵入阻害の逆転は観察されず（図８Ａ）、このことは、ｒｈ３２．３３の侵入の欠陥が、細胞表面にある変更されたグリカン構造に起因するものではないことを示唆している。逆に、ＡＡＶ４およびＡＡＶ５は共に、それらの好ましいグリカン付着因子である末端シアル酸部分が失われていることから予想されたように、外因性ノイラミニダーゼでの処理の後に形質導入の大きな低下を示した（図８Ｂ、図８Ｃ）。Ａｎｃ８０は付着因子が知られておらず、ＡＡＶＲを使用するため、ＮＥＵ１阻害またはノイラミニダーゼ処理の影響は、予想された通り、Ａｎｃ８０の全ての形質導入で観察されなかった（図８Ｄ）。これらのデータは、ＮＥＵ１およびＣＴＳＡの侵入の欠陥が、細胞表面上のグリカン構造の全体的な摂動に起因するものではない可能性が高いことを示唆している。ベクターの付着を直接的にアッセイするために、ｑＰＣＲに基づく細胞結合アッセイを使用して、ＮＥＵ１およびＣＴＳＡのＷＴ  ＭＥＦ細胞またはＫＯ  ＭＥＦ細胞へのベクターの付着を測定した。
【０１００】
異なるベクターの付着における違いが実証されたが（例えば、ｒｈ３２．３３と比較してＡＡＶ４ではおよそ１００倍の付着の増大（図８Ｅ））、ＷＴ細胞とＮＥＵ１  ＫＯ細胞またはＣＴＳＡ  ＫＯ細胞との主な違いは、試験したベクターのいずれでも観察されなかった。この結合アッセイは、ＮＥＵ１  ＫＯ細胞およびＣＴＳＡ  ＫＯ細胞における形質導入の喪失が、細胞表面でのベクターの付着の欠陥に起因しないこと、およびこれらのタンパク質が、侵入受容体としてまたは多タンパク質侵入受容体複合体の一部として付着後の役割を有する可能性が高いことを実証している。
【０１０１】
[実施例７]
ＧＰＲ１０８は、複数の細胞型におけるＡＡＶＲ依存性血清型およびＡＡＶＲ非依存性血清型の侵入に必要である
このスクリーニングにおいて同定された、最も顕著に強化された遺伝子は、特徴付けされていない７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体様タンパク質であるＧＰＲ１０８であった（図５Ａ、図５Ｂ）。ＧＰＲ１０８は、ＡＡＶ５以外の全ての血清型の侵入に必要であり、ヘルパーウイルスに非依存性である。
【０１０２】
興味深いことに、このタンパク質はまた、ＡＡＶＲを同定した最初のハプロイドスクリーニングにおいて潜在的な侵入因子であると同定された（Pillay et al., 2016, Nature, 530:108-12）。このことは、ＧＰＲ１０８がｒｈ３２．３３の侵入に対してだけではなく、他のＡＡＶ血清型の侵入にも重要であり得ることを示唆した。ＧＰＲ１０８  ＫＯ  Ｈｕｈ７細胞系を生成し、現存の血清型のパネルおよび推定上の祖先中間体カプシドを、ルシフェラーゼアッセイを介して、ＧＰＲ１０８の利用について試験した（図９Ａ）。
【０１０３】
ＷＴ  Ｈｕｈ７細胞またはＧＰＲ１０８  ＫＯ  Ｈｕｈ７細胞における全ての試験した血清型（ＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ（ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ８、ＡＡＶＡｎｃ８２、ＡＡＶ９、ＡＡＶＡｎｃ８１、ＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶ３、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ１、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５）またはＣＭＶ．ｅＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ（ＡＡＶＡｎｃ８３、ＡＡＶＡｎｃ１１０、ＡＡＶ２））への、１００００ＶＧ／細胞での、ＡＡＶ５以外のｈＡｄ５ヘルパーウイルスでの形質導入は、ＷＴ  Ｈｕｈ７細胞と比較して、ＧＲＰ１０８  ＫＯ細胞において、１０〜１００倍以上低下した（図９Ｂ）。
【０１０４】
ＡＡＶＲおよびＧＰＲ１０８の両方が欠失した細胞（すなわち、ヘルパーウイルスの存在下または不存在下における、ＷＴ  Ｈｕｈ７細胞と比較した、ＡＡＶＲ  ＫＯ細胞、ＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞、またはダブルＫＯ細胞）において、細胞がヘルパーウイルスに事前に感染していてもいなくても、全ての血清型の形質導入が完全に喪失していた（図９Ｃ）。
【０１０５】
ＧＰＲ１０８  ＫＯでの形質導入の喪失はまた、Ｈ１  ＨｅＬａ細胞においても観察され（図１０Ａ）、このことは、この細胞侵入因子の必要性が、ＡＡＶで形質導入可能な全ての細胞系において保存されていることを示唆している。
【０１０６】
[実施例８]
ＡＡＶの侵入は、ＧＰＲ１０８の安定なまたは一過性のトランスフェクションによって回復し得る
ＧＰＲ１０８  ＫＯの欠陥がＧＰＲ１０８タンパク質発現の喪失に起因することを確認するために、ＧＲＰ１０８のｃＤＮＡを、レンチウイルスベクターを使用して、Ｈ１  ＨｅＬａ  ＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞に安定的に再導入した。
【０１０７】
ＧＰＲ１０８が欠失したＨ１  ＨｅＬａ細胞を生成し、次いで、ＫＯ細胞にＧＰＲ１０８レンチウイルスを安定的に形質導入し、その後、ヘルパーウイルスを伴っておよび伴わずに、示された血清型を１００００ＶＧ／細胞で形質導入した。安定な再導入によって、全ての試験したＧＰＲ１０８依存性ベクターの形質導入を回復させることができたが、ＫＯおよび回復は、ＧＰＲ１０８非依存性ＡＡＶ５の全体的な形質導入レベルに影響を有さなかった（図１０Ａ）。ＧＰＲ１０８の検出に利用可能な機能的抗体はなく、そのため、ｃ末端の３×アラニン−グリシンリンカーと、その後の、ＧＰＲ１０８タンパク質発現を検出するためのｆｌａｇタグとを含有する構築物を設計した。この構築物およびｆｌａｇタグ付けされたホモログであるＧＰＲ１０７を、ｐｃＤＮＡ３．１（−）にサブクローニングし、ＷＴ  Ｈｕｈ７細胞またはＧＰＲ１０８  ＫＯ  Ｈｕｈ７細胞に一過性トランスフェクトし、その後、様々なＧＰＲ１０８依存性血清型および非依存性血清型を形質導入した。ｆｌａｇタグ付けされた構築物の発現を、マウス抗ｆｌａｇクローンＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｆ１８０４）およびウサギ抗ベータアクチンローディングコントロール（Ａｂｃａｍ  ａｂ８２２７）を使用して、全細胞溶解物のウェスタンブロットによって決定した。隣接するＮｏｔＩ制限部位およびＢａｍＨＩ制限部位を有する、Ｆｌａｇタグ付けされたＧＰＲ１０７構築物およびＧＰＲ１０８構築物は、Ｇｅｎｅｗｉｚによって合成され、その後、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）制限部位を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミドに制限酵素サブクローニングした。
【０１０８】
Ｈｕｈ７  ＷＴ細胞またはＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞に、ｆｌａｇタグ付けされたヒトまたはマウスＧＰＲ１０７またはＧＰＲ１０８をトランスフェクトし、その後、ｈＡｄ５ヘルパーウイルスの存在下で、示された血清型を形質導入した（１００００ＶＧ／細胞のＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ導入遺伝子）。形質導入は野生型レベルまで完全には回復しなかったが、全てのＧＰＲ１０８依存性血清型で、ＧＰＲ１０８のトランスフェクションからは明らかな回復の表現型が見られ、しかし、ＧＰＲ１０７のトランスフェクションから見られなかった（図１０Ｂ、図１０Ｃ）。これらのデータは、ＧＰＲ１０８タンパク質の発現が、進化的に分岐している血清型であるＡＡＶ５以外のほとんどのＡＡＶの侵入経路に必要であることを実証している。
【０１０９】
[実施例９]
ＧＰＲ１０８の利用はマウスにおいて保存されている
ヒトおよびマウスＧＰＲ１０７およびＧＰＲ１０８は非常に類似した配列であるため、本発明者らは、ＧＰＲ１０８がマウス細胞においてＡＡＶの侵入に同様に使用されたかどうかを判定したいと考えた。マウス肝臓癌細胞系であるＨｅｐａ細胞を、ヒトＨｕｈ７細胞に類似のマウスインビトロ系として使用した。ｆｌａｇタグ付けされたヒトまたはマウスＧＰＲ１０７またはＧＰＲ１０８をトランスフェクトされたＨｅｐａ  ＷＴ細胞またはＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞における、ｒｈ３２．３３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、［図１１Ａ］、ならびにＡｎｃ８０、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ９．ＰＨＰ−Ｂ［図１１Ｂ］の形質導入（１００００ＶＧ／細胞のＣＭＶ．ルシフェラーゼ．ＳＶＰＡ導入遺伝子）。興味深いことに、ＡＡＶ５は高レベルまでＨｅｐａ細胞に形質導入し得るが、一方、ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ４などの他の血清型はそうではない（図１１Ａ）。このことは、ＧＰＲ１０８の代わりの、代替因子であるＡＡＶ５の使用が、マウスにおいて高度に保存されている可能性が高いが、しかしマウスＧＰＲ１０８は一部の血清型ではヒトＧＰＲ１０８ほどには高度に機能的ではない可能性があることを示唆している。マウスＧＰＲ１０８に対するｓｇＲＮＡをさらに使用して、Ｈｅｐａ  ＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞系を生成した。Ｈｅｐａ細胞を形質導入された、試験したＧＰＲ１０８依存性血清型のうち、全てが、野生型と比較して、ｈｅｐａ  ＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞において、形質導入の１０〜１００倍の低下を示した（図１１Ｂ）。ＧＰＲ１０８または相同タンパク質ＧＰＲ１０７のＦｌａｇタグ付けされたヒトまたはマウスｃＤＮＡ（Ｅｄｇａｒ、２００７、ＤＮＡ  Ｓｅｑ．、１８：２３５〜４１）をｈｅｐａ  ＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞に再導入し、ＡＡＶの形質導入のわずかな増大が観察された（図１１Ｂ）。
【０１１０】
興味深いことに、ヒト細胞において、マウスＧＰＲ１０８は形質導入をヒトＧＰＲ１０８構築物と類似のレベルまで回復させることができる（図１０Ｂ、図１０Ｃ）。これらのヒトＧＰＲ１０８構築物は、タンパク質発現レベルが低いことに起因して形質導入をうまく回復させることができなかった可能性がある。したがって、これらの構築物の各々の発現を、ヒト細胞およびマウス細胞において、トランスフェクトされた細胞の溶解物からの抗ｆｌａｇウェスタンブロットを使用して評価した。
【０１１１】
ＧＰＲ１０７およびＧＰＲ１０８は共に、７つの膜貫通ドメインを有し、大きな内腔側Ｎ末端および短い細胞質側Ｃ末端を有することが予測される、あまり特徴付けされていないタンパク質である（図１２Ａ、図１２Ｂ）。ＧＰＲ１０７は、その機能に必要な、内腔側Ｎ末端ドメインにおけるジスルフィド結合およびフーリン切断部位の両方を有することが示されており（Tafesse et al., 2014, J. Biol. Chem., 289:24005-18）、アラニン−グリシンリンカーおよびｆｌａｇタグもまた示されている（図１２Ａ）。ＧＰＲ１０８のフーリン切断によって、およそ２８ｋＤａおよび３４ｋＤａの２つのペプチド断片が生じ、このうちの後者は、Ｈｕｈ７細胞において一過性トランスフェクションの後に抗ｆｌａｇウェスタンブロットによって視覚化されている（図１２Ｃ）。ベータアクチンローディングコントロールは（図１２Ｄ）に示されている。これらのデータは、ＧＰＲ１０８およびＧＰＲ１０７が、予想された通り発現し、翻訳後修飾を受けていることを実証している。
【０１１２】
[実施例１０]
ＧＰＲ１０８はＡＡＶの付着を促進しない
ＡＡＶの形質導入に関与する因子についての現在の理解は主に、ＡＡＶの付着に関与する因子の周辺にあり、細胞内のＡＡＶ侵入受容体の存在およびメカニズムについてはほとんど分かっていない。したがって、本発明者らは、ＧＰＲ１０８がＡＡＶの付着または侵入経路のさらに下流において役割を有しているかどうかを試験したいと考えた。指向性または結合特性を変更されている２つの異なるカプシド表面突然変異体を、それらの親ＡＡＶカプシドと共に、Ｈｕｈ７  ＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞およびＨ１  ＨｅＬａ  ＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞において試験した。
【０１１３】
まず、ルシフェラーゼアッセイは、ＷＴ細胞またはＧＰＲ１０８  ＫＯ  Ｈｕｈ７細胞またはＧＰＲ１０８  ＫＯ  Ｈ１  ＨｅＬａ細胞に形質導入された、ＡＡＶ９のペプチド挿入バリアントであるＡＡＶ９．ＰＨＰ−Ｂ（Deverman et al., 2016, Nat. Biotechnol., 34:204-9）が、親カプシドであるＡＡＶ９と同様にＧＰＲ１０８に依存性であったことを実証した（図１３Ａ）。さらに、主要なＡＡＶ２付着因子であるヘパリン硫酸塩に結合し得る、点突然変異を有するＡＡＶ２バリアント（Vandenberghe et al., 2006, Nat. Med., 12:967-71）を試験した。ＨＳＰＧ−バリアント（グリカン結合欠損型ＡＡＶ２ＨＳＰＧ−または親カプシドであるＡＡＶ２）は、試験した全ての細胞系（ＷＴ細胞またはＧＰＲ１０８  ＫＯ  Ｈｕｈ７細胞またはＧＰＲ１０８  ＫＯ  Ｈ１  ＨｅＬａ細胞）において形質導入の全体的な低下を有していたが（図１３Ｂ）、ＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞の形質導入は、それらの野生型対応物と比較して１０〜１００倍低下し、このことは、ＧＰＲ１０８の利用がＡＡＶの付着に依存していないことを示唆している。これらのデータはＧＰＲ１０８が付着を促進しないことを示唆しているが、このことを直接試験することが望まれた。
【０１１４】
したがって、結合アッセイを記載されているように利用して、ＧＰＲ１０８依存性血清型および非依存性血清型の付着を評価した。Ｈｕｈ７  ＷＴ細胞およびＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞を試験し、また、ＡＡＶＲは原形質膜で役割を有することが以前に示唆されていたため（Pillay et al., 2016, Nature, 530:108-12）、ＡＡＶＲ  ＫＯ細胞およびダブルＫＯ細胞も試験した（図１３Ｃ）。試験した全てのベクターで、ノックアウト細胞系のいずれにおいても、細胞当たりの結合したウイルスゲノムの数に違いは見られなかったが、異なる血清型での結合したウイルスゲノムの数の違いは検出され、このことは、ＧＰＲ１０８が付着を促進していないことを実証している。
【０１１５】
[実施例１１]
ＧＰＲ１０８の非依存性は伝わり得、ＡＡＶカプシドのホスホリパーゼ含有ＶＰ１ドメインに依存性である
侵入のためのＧＰＲ１０８の機能、およびいかにしてこれがカプシドを係合するかをさらに理解するために、キメラカプシドを使用して、ＧＰＲ１０８の利用を指示するカプシドドメインを同定した。ＡＡＶ５およびＡＡＶ２はＧＰＲ１０８の利用が異なるため、これら２つ血清型の間で生成されたキメラを使用した。類似の点突然変異を有するおよび有さない相反性キメラのセットを設計して、カプシドのどの領域がＧＰＲ１０８利用を指示するかを決定した（図１４Ａ）。これらのキメラを次いで、示されているＷＴカプシドまたはキメラカプシドで（１００μＬの粗ベクター調製物と、ｈＡｄ５ヘルパーウイルス、ＣＭＶ．ｅＧＰＦ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ導入遺伝子）、Ｈｕｈ７  ＷＴ細胞、ＡＡＶＲ  ＫＯ細胞、ＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞、またはダブルＫＯ細胞において試験した。ＡＡＶ２およびＡＡＶ５は共にＡＡＶＲを必要とするため、形質導入の予想された喪失が、ＡＡＶＲ  ＫＯ細胞系およびダブルＫＯ細胞系において、全ての試験した血清型で観察された（図１４Ｂ）。興味深いことに、ＡＡＶ５のＶＰ１固有の領域を有するキメラの両方が、ＧＰＲ１０８  ＫＯ  Ｈｕｈ７細胞をＷＴ細胞と類似のレベルまで形質導入し得た。残基５８１がＧＰＲ１０８利用において主要な役割を有することは分からなかったが、残基５８１は、全体的な形質導入レベルに対してわずかな影響を有していた。これらの実験は、ＡＡＶのＶＰ１固有の領域がＧＰＲ１０８の利用を指示すること、およびこの細胞機能性が他のＡＡＶ血清型に伝わり得ることを実証している。
【０１１６】
[実施例１２]
ＧＰＲ１０８ドメインのさらに精度の高いマッピング
ドメインスワッピング実験を行って、ＧＰＲ１０８ドメインをマッピングした。具体的には、ＡＡＶ５およびＡＡＶ２のＶＰ１内の示されているドメインを交換して、示されているキメラＡＡＶを生産した（図１５Ａ）。ＧＰＲ１０８依存性を付与すると以前に同定されている配列を、保存領域を破壊点として使用して３つの部分に分割してある、３つの異なるカプシドキメラを合成した。ＡＡＶ５カプシドのＧＰＲ１０８依存性領域をＡＡＶ２カプシドにスワッピングし、ベクターを生産した。
【０１１７】
Ｈｕｈ７細胞に、野生型ＡＡＶ（すなわち、ＡＡＶ２もしくはＡＡＶ５）、または、本明細書において記載され、以下に示される、ＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ導入遺伝子を発現するキメラＡＡＶ（すなわち、ＡＡＶ５−２−２．２（配列番号５）、ＡＡＶ２−５−２．２（配列番号６）、もしくはＡＡＶ２−２−５．２（配列番号７））の等容量の粗ウイルス調製物で形質導入した。形質転換されたＨｕｈ７細胞におけるルシフェラーゼの量（ＲＬＵ／ｓ）を、形質導入の４８時間後に決定し、ＧＰＲ１０８がノックアウトされているＨｕｈ７細胞系（Ｈｕｈ７  ＧＰＲ１０８  ＫＯ）におけるルシフェラーゼ発現と比較した。結果を図１５Ｂに示す（５回の反復の平均±ＳＥＭ）。
【０１１８】
【化１−１】
2021533795.tif 000003
【０１１９】
【化１−２】
2021533795.tif 000004
【０１２０】
【化１−３】
2021533795.tif 000005
【０１２１】
Ｈｕｈ７およびＨｕｈ７  ＧＰＲ１０８  ＫＯにおける形質導入の分析は、新規なカプシドが野生型細胞を類似のレベルで形質導入し得ることを示したが、ＧＰＲ１０８  ＫＯ細胞を形質導入し得た唯一のキメラは、ＡＡＶ５の最初の４１アミノ酸を有するものであった。
【０１２２】
ＡＡＶ２のカプシド配列の関連する領域とＡＡＶ５のカプシド配列の関連する領域との間のアラインメントを作成した。
【０１２３】
【化２】
2021533795.tif 000006
【０１２４】
ＧＰＲ１０８依存性に関与する領域を、ＡＡＶ５ならびにいくつかのＧＰＲ１０８依存性血清型（すなわち、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ３、およびＡＡＶ９）のアミノ酸配列を含む、いくつかの異なるＡＡＶからアラインした（図１６）。図１６に示すように、このＮ末端配列はＧＰＲ１０８依存性血清型の間で高度に保存されており、一方、ＡＡＶ５は、３つの主な領域が異なっている（囲まれている部分）。これらの領域はＧＰＲ１０８に対する依存性に関与している可能性が高く、ＧＰＲ１０８非依存性コンセンサス配列（配列番号１）およびＧＰＲ１０８依存性コンセンサス配列（配列番号２）を生じさせるために使用された。したがって、ＧＰＲ１０８非依存性のＡＡＶは、以下のＶＰ１コンセンサス配列を含み：
ＭＸ１Ｘ２ＶＤＨＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＥＶＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＬＧＬＥＡ（配列番号１）
（式中、Ｘ１〜１２の各々は任意のアミノ酸であり得る）、また
ＧＰＲ１０８依存性のＡＡＶは、以下のＶＰ１コンセンサス配列を含む：
ＭＸ１Ｘ２ＤＧＹＬＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｄ（Ｔ／Ｎ）ＬＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＷ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｌ（Ｋ／Ｑ）Ｐ（配列番号２）
（式中、Ｘ１〜１２の各々は任意のアミノ酸であり得る）。
【０１２５】
[実施例１３]
安定性および性能の実験
ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびこれら２つのキメラの安定性および性能を、インビボおよびインビトロで調べた。
【０１２６】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（群当たり５頭の動物）を、ＣＭＶ−ＥＧＰＦ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ導入遺伝子を有する１ｅ１１ｇｃ／マウスのＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ５．２、またはＰＢＳ（コントロール）で処理した。ルシフェラーゼの発現を、形質転換の後６週間にわたり、マウスにおいて調べた（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）。図１７Ａは、これらの実験の結果を示す（平均±ＳＥＭ）。
【０１２７】
野生型ＭＥＦ細胞（ＷＴ  ＭＥＦ）、またはＧＰＲ１０８  ＫＯマウスに由来するＭＥＦ細胞（ＣＰＲ１０８  ＫＯ  ＭＥＦ）に、ＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ導入遺伝子を有するＡＡＶ２ウイルス、ＡＡＶ５ウイルス、ＡＡＶ２．５ウイルス、またはＡＡＶ５．２ウイルスで形質導入した。細胞を２００ｐｆｕ／細胞のＡｄ５で２時間処理し、その後、ＡＡＶに感染させた（ＭＯＩ＝１ｅ４）。ルシフェラーゼの量（ＲＬＵ／ｓ）を形質導入の４８時間後に調べた。図１７Ｂは、３つの独立した実験の結果を示す（平均±ＳＥＭ）。
【０１２８】
Ｈｕｈ７、Ｈｕｈ７  ＡＡＶＲ  ＫＯ、Ｈｕｈ７  ＧＰＲ１０８  ＫＯ、またはＨｕｈ７ダブルＫＯに、ＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ導入遺伝子を有するＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２．５、またはＡＡＶ５．２ウイルスで形質導入した。細胞のセットを２００ｐｆｕ／細胞のＡｄ５で２時間処理し、その後、ＡＡＶに感染させ（ＭＯＩ＝１ｅ４）、一方、残りは、ＡＡＶで直接処理した。ルシフェラーゼの量（ＲＬＵ／ｓ）を形質導入の４８時間後に測定した。図１７Ｃは、３つの独立した実験の結果を示す（平均±ＳＥＭ）。
【０１２９】
これらの結果は、ＧＰＲ１０８依存性を変更するＶＰ１ポリペプチドを使用して生産されたＡＡＶが、マウスＭＥＦをインビトロでおよびマウス組織をインビボで親野生型ベクターと類似のレベルで形質導入し得る、安定な構造体であることを実証している。
【０１３０】
[実施例１４]
ＧＰＲ１０８のインビボでの必要性
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＧＰＲ１０８  ＫＯマウス（群当たり３頭の動物）を、ＣＭＶ−ルシフェラーゼ導入遺伝子を有する１ｅ１１ｇｃ／マウスのＡＡＶ８ウイルス、ＡＡＶｒｈ３２．３３ウイルス、ＡＡＶ５ウイルス（またはコントロールとしてのＰＢＳ）で形質導入した。ルシフェラーゼの量を、形質導入後８週間の期間にわたり測定した（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ、平均±ＳＥＭ）（図１８Ａ）。各群の代表のマウスを、示されているベクターでの形質導入の１４日後に画像化した（図１８Ｂ）。図１８Ａおよび図１８Ｂで示す結果は、ＧＰＲ１０８がＡＡＶによるインビボでの形質導入に必要な侵入因子であることを実証している。
【０１３１】
他の実施形態
方法および組成物を多くの異なる態様と組み合わせて本明細書において記載してきたが、様々な態様についての先の記載は説明することを意図したものであり、方法および組成物の範囲を限定することを意図したものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０１３２】
本開示は、開示される方法および組成物に使用することができる、開示される方法および組成物と組み合わせて使用することができる、開示される方法および組成物の調製において使用することができる、ならびに開示される方法および組成物の産物である、方法および組成物を特徴付ける。これらのおよび他の材料は本明細書において開示されており、これらの方法および組成物の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されていることが理解される。すなわち、これらの組成物および方法のそれぞれの様々な個々のおよび集合的な組み合わせおよび順列についての具体的な言及は明確に開示されていないかもしれないが、それぞれが具体的に検討され、本明細書において記載される。例えば、特定の組成物または特定の方法が開示され、論じられていれば、別段のことが具体的に示されていない限り、いくつかの組成物または方法が論じられており、組成物および方法の各組み合わせおよび順列が具体的に検討されている。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた具体的に検討され、開示される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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