(57)【要約】ある実施形態で、ＴＮＦ発現粘液腫ウイルスを使用して、癌を阻害するまたは処置する方法が、本明細書で開示される。ＴＮＦ発現粘液腫ウイルスで処置された、単核末梢血細胞および／または骨髄細胞を使用して、癌を阻害するまたは処置する方法も、本明細書で開示される。いくつかの態様は、本明細書で説明される方法の１以上と共に使用するための、操作された粘液腫ウイルスおよび医薬組成物に関係する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質を発現するように操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）であって、前記ＭＹＸＶが、ウサギ細胞指向性に関連する１以上の遺伝子における、またはそれに隣接する修飾を含む、粘液腫ウイルス。
【請求項２】
前記ＴＮＦタンパク質は、ＴＮＦαタンパク質である、請求項１に記載の粘液腫ウイルス。
【請求項３】
前記ＴＮＦタンパク質は、表面のＴＮＦタンパク質である、請求項２に記載の粘液腫ウイルス。
【請求項４】
前記ＴＮＦタンパク質は、可溶性ＴＮＦタンパク質である、請求項２に記載の粘液腫ウイルス。
【請求項５】
前記ＴＮＦタンパク質は、ヒトＴＮＦタンパク質である、請求項１に記載の粘液腫ウイルス。
【請求項６】
前記ウサギ細胞指向性に関連する１以上の遺伝子は、Ｍ１１Ｌ、Ｍ０６３、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、Ｍ−Ｔ２、Ｍ−Ｔ４、Ｍ−Ｔ５、またはＭ−Ｔ７を含む、請求項１に記載の粘液腫ウイルス。
【請求項７】
前記ＭＹＸＶは、Ｍ１３５Ｒ遺伝子の部分欠失または完全欠失を含む、請求項１に記載の粘液腫ウイルス。
【請求項８】
前記ＭＹＸＶは、Ｍ１３５Ｒ遺伝子の機能を害するＭ１３５Ｒ遺伝子の修飾を含む、請求項１に記載の粘液腫ウイルス。
【請求項９】
前記ＴＮＦタンパク質は、前記ＭＹＸＶゲノム内のＭ１３５Ｒ遺伝子と置き換わる、請求項１に記載の粘液腫ウイルス。
【請求項１０】
前記ＴＮＦタンパク質は、前記ＭＹＸＶゲノム内の、Ｍ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間に挿入される、請求項１に記載の粘液腫ウイルス。
【請求項１１】
前記ＭＹＸＶはさらに、蛍光タンパク質を含む、請求項１に記載の粘液腫ウイルス。
【請求項１２】
前記ＭＹＸＶは、ローザンヌ株である、請求項１に記載の粘液腫ウイルス。
【請求項１３】
前記ＭＹＸＶは、ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ−ｈＴＮＦである、請求項１に記載の粘液腫ウイルス。
【請求項１４】
前記ＭＹＸＶは、ｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−Ｍ１３５−１３６である、請求項１に記載の粘液腫ウイルス。
【請求項１５】
請求項１−１４の粘液腫ウイルス、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
前記医薬組成物は、全身投与のために製剤化される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記医薬組成物は、局所投与のために製剤化される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記医薬組成物は、非経口的投与のために製剤化される、請求項１５−１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質を発現するように操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）によって、エクスビボで処置された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄（ＢＭ）細胞、またはその組み合わせを含む組成物。
【請求項２０】
前記ＭＹＸＶは、請求項１−１４の粘液腫ウイルスである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＭＹＸＶは、ｖＭＹＸ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはその組み合わせは、自己細胞を含む、請求項１９−２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはその組み合わせは、異種ドナーから得られる、請求項１９−２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
被験体の癌を阻害するまたは処置する方法であって、被験体に、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質を発現するように操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）を投与する工程を含む、方法。
【請求項２５】
前記ＭＹＸＶは、請求項１−１４の粘液腫ウイルスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＭＹＸＶは、ｖＭＹＸ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
被験体の癌を阻害するまたは処置する方法であって、被験体に請求項１５−２３の組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２８】
前記ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはその組み合わせの表面上に、前記粘液腫ウイルスをエクスビボで吸着させる工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはその組み合わせの表面上に前記粘液腫ウイルスを吸着させる前記工程は、前記粘液腫ウイルスの、前記ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはその組み合わせの表面への結合が可能な条件下で、前記ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはその組み合わせを、前記粘液腫ウイルスに曝露することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記条件は、約４°Ｃから約３７°Ｃの温度を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記条件は、約２０°Ｃから約３７°Ｃ、約２０°Ｃから約２８°、約２４°Ｃから約２６°Ｃ、約３０°Ｃから約３７°Ｃ、または約３５°Ｃから約３７°Ｃの温度を含む、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記条件は、少なくとも５分、１０分、１５分、２０分、３０分、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、またはそれ以上のインキュベーション時間を含む、請求項２９−３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはその組み合わせは、前記被験体またはＨＬＡ関連ドナーから得られる、請求項２７−３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ウイルス吸着ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞またはその組み合わせは、被験体に全身に投与される、請求項２７−３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記癌は、固形腫瘍である、請求項２４−３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌は、前記被験体の第２の部位へ転移している、請求項２４−３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の部位は、前記被験体の肺、脳、肝臓、および／またはリンパ節を含む、請求項２４−３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌は、骨肉腫、トリプルネガティブ乳癌、または黒色腫を含む、請求項２４−３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記被験体に、追加的治療剤を投与する工程をさらに含む、請求項２４−３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記追加的治療剤は、免疫チェックポイントモジュレータである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記追加的治療剤は、前記ＭＹＸＶまたは前記組成物を投与する前に、前記被験体に投与される、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記追加的治療剤は、前記ＭＹＸＶまたは前記組成物を投与した後に、前記被験体に投与される、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記追加的治療剤は、前記ＭＹＸＶまたは前記組成物との組み合わせとして、前記被験体に投与される、請求項３９−４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記被験体は、ヒトである、請求項２４−４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法は、癌を患っている、または癌を患っていると疑われる被験体を選択する工程をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記粘液腫ウイルスは、欠陥がある先天的抗ウイルス反応を有する細胞に感染することができる、請求項２４−４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記欠陥がある先天的抗ウイルス反応を有する細胞は、癌細胞を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記粘液腫ウイルスに感染した細胞は、ＴＮＦを発現する、請求項２４−４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１−１４の粘液腫ウイルス、請求項１５−１８の医薬組成物、または請求項１９−２３の組成物を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
相互参照本出願は、本明細書で参照によって組み込まれる、２０１８年７月１３日出願の米国仮特許出願第６２／６９７，５８１号の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府後援研究に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって与えられたＰ５０  ＣＡ１８６７８１に従って、政府支援によってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
様々な型の癌を処置するために使用される現行の処置は、癌細胞を毒するまたは死滅させることによって機能する傾向がある。不運にも、癌細胞にとって有毒な処置は通常、正常細胞にとっても有毒である傾向がある。さらに、腫瘍の不均一な特質は、癌の有効な処置が、あてにならないままであることの主要な理由の１つである。化学療法や放射線療法などの、現行の主流療法は、毒性に関して狭い治療域内で使用される傾向がある。これらのタイプの治療法は、腫瘍細胞の型が異なるため、およびこれらの処置を投与し得る域が限定的であるために、適用範囲が限定的である鈍いツールであるとみなされている。
【発明の概要】
【０００４】
ある実施形態で、ＴＮＦタンパク質を発現するように操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）を使用して、癌を阻害するまたは処置する方法が、本明細書で開示される。いくつかの実施形態で、ＴＮＦ発現粘液腫ウイルスで処置された、単核末梢血細胞および／または骨髄細胞を使用して、癌を阻害するまたは処置する方法も、本明細書で説明される。追加的な実施形態で、本明細書で説明される方法の１以上と共に使用するための、操作された粘液腫ウイルスおよび医薬組成物が、本明細書に含まれ説明される。
【０００５】
ある実施形態で、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質を発現するように操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）が開示され、ここでＭＹＸＶは、ウサギ細胞指向性（ｒａｂｂｉｔ  ｃｅｌｌ  ｔｒｏｐｉｓｍ）に関連する１以上の遺伝子における、またはそれに隣接する修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦタンパク質はＴＮＦαタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＴＮＦタンパク質は表面のＴＮＦタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＴＮＦタンパク質は可溶性ＴＮＦタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＴＮＦタンパク質はヒトＴＮＦタンパク質である。いくつかの実施形態では、ウサギ細胞指向性に関連する１以上の遺伝子は、Ｍ１１Ｌ、Ｍ０６３、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、Ｍ−Ｔ２、Ｍ−Ｔ４、Ｍ−Ｔ５、またはＭ−Ｔ７を含む。いくつかの実施形態では、ＭＹＸＶは、Ｍ１３５Ｒ遺伝子の部分欠失または完全欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＭＹＸＶは、Ｍ１３５Ｒ遺伝子の機能を害するＭ１３５Ｒ遺伝子の修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦタンパク質は、ＭＹＸＶゲノム内のＭ１３５Ｒ遺伝子と置き換わる。いくつかの実施形態では、ＴＮＦタンパク質は、ＭＹＸＶゲノム内のＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間に挿入される。いくつかの実施形態では、ＭＹＸＶはさらに、蛍光タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＭＹＸＶは、ローザンヌ株（Ｌａｕｓａｎｎｅ  ｓｔｒａｉｎ）である。いくつかの実施形態では、ＭＹＸＶは、ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ−ｈＴＮＦである。いくつかの実施形態では、ＭＹＸＶは、ｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−Ｍ１３５−１３６である。
【０００６】
ある実施形態で、本明細書に説明される粘液腫ウイルスを含む医薬組成物、および薬学的に許容可能な賦形剤が、本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口適用のために製剤化される。
【０００７】
ある実施形態で、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質を発現するように操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）によって、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で処置された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄（ＢＭ）細胞、またはその組み合わせを含む組成物が、本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、ＭＹＸＶは、本明細書で説明される粘液腫ウイルスである。いくつかの実施形態では、ＭＹＸＶは、ｖＭＹＸ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦである。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ、ＢＭセルまたはその組み合わせは、自己細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ、ＢＭセルまたはその組み合わせは、異種ドナーから得られる。
【０００８】
ある実施形態で、被験体の癌を阻害するまたは処置する方法が、本明細書で開示され、当該方法は、被験体に、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質を発現するように操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＭＹＸＶは、本明細書で説明される粘液腫ウイルスである。いくつかの実施形態では、ＭＹＸＶは、ｖＭＹＸ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦである。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は被験体の第２の部位へ転移している。いくつかの実施形態では、第２の部位は、被験体の肺、脳、肝臓、および／またはリンパ節を含む。いくつかの実施形態では、癌は、骨肉腫、トリプルネガティブ乳癌（ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、または黒色腫を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、被験体に追加的治療剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、追加的治療剤は、免疫チェックポイントモジュレータ（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）である。いくつかの実施形態では、追加的治療剤は、ＭＹＸＶまたは組成物を投与する前に、被験体に投与される。いくつかの実施形態では、追加的治療剤は、ＭＹＸＶまたは組成物を投与した後に、被験体に投与される。いくつかの実施形態では、追加的治療剤は、ＭＹＸＶまたは組成物との組み合わせとして、被験体に投与される。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。いくつかの実施形態では、方法はさらに、癌を患っている、または癌患っていると疑われる被験体を選択する工程を含む。いくつかの実施形態では、粘液腫ウイルスは、欠陥がある先天的抗ウイルス反応を有する細胞に感染することができる。いくつかの実施形態では、欠陥がある先天的抗ウイルス反応を有する細胞は、癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、粘液腫ウイルスに感染した細胞は、ＴＮＦを発現する。
【０００９】
ある実施形態で、被験体の癌を阻害するまたは処置する方法が、本明細書で開示され、当該方法は、被験体に、本明細書で説明される組成物を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはその組み合わせの表面上に、粘液腫ウイルスをエクスビボで吸着させる工程を含む。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、あるいはその組み合わせの表面上に粘液腫ウイルスを吸着させる工程は、粘液腫ウイルスの、ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、あるいはその組み合わせの表面への結合が可能な条件下で、ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、あるいはその組み合わせを、粘液腫ウイルスに曝露することを含む。いくつかの実施形態では、条件として、約４°Ｃから約３７°Ｃの温度が挙げられる。いくつかの実施形態では、条件として、約２０°Ｃから約３７°Ｃ、約２０°Ｃから約２８°、約２４°Ｃから約２６°Ｃ、約３０°Ｃから約３７°Ｃ、または約３５°Ｃから約３７°Ｃの温度が挙げられる。いくつかの実施形態では、条件として、少なくとも５分、１０分、１５分、２０分、３０分、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、またはそれ以上のインキュベーション時間が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはその組み合わせは、被験体またはＨＬＡ関連ドナーから得られる。いくつかの実施形態では、ウイルス吸着ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはその組み合わせは、被験体に全身に投与される。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は被験体の第２の部位へ転移している。いくつかの実施形態では、第２の部位は、被験体の肺、脳、肝臓、および／またはリンパ節を含む。いくつかの実施形態では、癌は、骨肉腫、トリプルネガティブ乳癌、または黒色腫を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、被験体に追加的治療剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、追加的治療剤は、免疫チェックポイントモジュレータである。いくつかの実施形態では、追加的治療剤は、ＭＹＸＶまたは組成物を投与する前に、被験体に投与される。いくつかの実施形態では、追加的治療剤は、ＭＹＸＶまたは組成物を投与した後に、被験体に投与される。いくつかの実施形態では、追加的治療剤は、ＭＹＸＶまたは組成物との組み合わせとして、被験体に投与される。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。いくつかの実施形態では、方法はさらに、癌を患っている、または癌を患っていると疑われる被験体を選択する工程を含む。いくつかの実施形態では、粘液腫ウイルスは、欠陥がある先天的抗ウイルス反応を有する細胞に感染することができる。いくつかの実施形態では、欠陥がある先天的抗ウイルス反応を有する細胞は、癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、粘液腫ウイルスに感染した細胞は、ＴＮＦを発現する。
【００１０】
ある実施形態で、本明細書で説明される粘液腫ウイルス、本明細書で説明される医薬組成物、または本明細書で説明される組成物を含むキットが、本明細書に開示される、
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本発明のある実施形態の新規的特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に明記される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が活用される例示的実施形態を明記する以下の詳述と、添付図面とを参照することによって得られるであろう。
【００１２】
【図１】ｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦ挿入プラスミドの遺伝子マップ、およびウイルスの構成の要旨を示す。このプラスミドは、ｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦウイルスの構成用にｖＭｙｘ−ＬａｃＺウイルスに感染させられる前に、ＲＫ−１３細胞の遺伝子導入のために使用された。
【図２Ａ】図２Ａと図２Ｂは、２つの異なる操作されたＭＹＸＶの遺伝子マップを示す。図２Ａは、ｖＭｙｘ−１３５ＫＯ−ｈＴＮＦ挿入プラスミドの遺伝子マップ、および組み換え粘液腫ウイルスの遺伝子マップの要旨を示す。このウイルスが、ウイルス性Ｍ１３５Ｒ遺伝子ノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）を有することに、注意が必要である。各プラスミドは、ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ−ｈＴＮＦ（図２Ａ）およびｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−（Ｍ１３５−１３６）（図２Ｂ）それぞれの構成のための、親の野生型ｖＭｙｘ−Ｌａｕによる感染前に、ＲＫ−１３細胞のトランスフェクションのために使用された。
【図２Ｂ】図２Ａと図２Ｂは、２つの異なる操作されたＭＹＸＶの遺伝子マップを示す。図２Ｂは、ｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−（Ｍ１３５−１３６）挿入プラスミドの遺伝子マップ、およびこの組み換え粘液腫ウイルスの構成の要旨を示す。このウイルスは、ＴＮＦ導入遺伝子がウイルス性Ｍ１３５ＲとＭ１３６Ｒ遺伝子との間の遺伝子間遺伝子座に挿入されているので、野生型ＭＹＸＶバックボーンを有し、それゆえ、遺伝子ノックアウトを有していないことに、注意が必要である。各プラスミドは、ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ−ｈＴＮＦ（図２Ａ）およびｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−（Ｍ１３５−１３６）（図２Ｂ）それぞれの構成のための、親の野生型ｖＭｙｘ−Ｌａｕによる感染前に、ＲＫ−１３細胞のトランスフェクションのために使用された。
【図３】Ｋ７Ｍ２−Ｌｕｃ腫瘍植え付け後２週間の、Ｂａｌｂ／ｃマウスの画像のセットである。未処置の動物は、肺に進行した腫瘍を示す（左）が、一方でｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦで処置された動物は、著しくより小さな腫瘍を示す（右）。動物は、０日目に、２ｘ１０６Ｋ７Ｍ２−ｌｕｃ細胞を植え付けられ、処置前にｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦに１時間感染させられた４ｘ１０６エクスビボＢＭで処置された。動物はその後、２週目に、ルシフェリンＩＰの接種を受け、ＩＶＩＳ撮像システムを使用して画像撮影された。腫瘍発光が、すべての動物について計算されそして標準化された。
【図４】ｈＴＮＦを発現する粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）が負荷された骨髄が、他のＭＹＸＶ構築物と比較して、優れた腫瘍溶解能力を有することを示すグラフである。カプラン−マイアー生存率曲線は、ｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦが、対照コホートと比較して平均生存率を著しく上げることが試験で確認された、唯一のＭＹＸＶ構築物であることを示す。動物は、０日目に、２ｘ１０６Ｋ７Ｍ２−ｌｕｃ細胞を植え付けられ、処置前にそれぞれのＭＹＸＶ構築物に１時間感染させられたエクスビボ骨髄で処置された。動物はその後、安楽死基準が満たされるまで、疾患の進行についてモニタリングされた。植え付け後８週目に、全ての生存動物は安楽死させられた。
【図５】２週間の間隔をあけて撮影された、未処置の対照群（左画像）とｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦウイルスで処置された動物（右画像）との間の腫瘍の進行の違いを示す、画像の２セットである。動物は、０日目に、２ｘ１０６Ｋ７Ｍ２−ｌｕｃ細胞を植え付けられ、処置前にｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦに１時間感染させられた４ｘ１０６エクスビボＰＢＭＣで処置された。動物はその後、３週目と５週目に、ルシフェリンＩＰの接種を受け、ＩＶＩＳ撮像システムを使用して画像撮影された。腫瘍発光が、すべての動物について計算されそして標準化された。
【図６】エクスビボでｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦが負荷されたＰＢＭＣの用量反応生存率を示すグラフである。ｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦが負荷されたＢａｌｂ／ｃ  ＰＢＭＣの漸次的に増加する用量で処置されたＢａｌｂ／ｃマウスは、未処置の対照群よりも著しく長命である。動物は、０日目に、２ｘ１０６Ｋ７Ｍ２−ｌｕｃ細胞を植え付けられ、処置前にそれぞれのＭＹＸＶ構築物に１時間感染させられたエクスビボＰＢＭＣで処置された。動物はその後、安楽死基準が満たされるまで、疾患の進行についてモニタリングされた。
【図７】ｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦで感染させられた細胞が、４８ｈｐｉで、細胞表面でｈＴＮＦを発現する（灰色と緑色）一方で、対照細胞がｈＴＮＦについては陰性（ピンク色と紫色）であることを示すフローサイトメトリーデータのセットである。細胞は、実験的に、ｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦに４８時間感染させられた。４８ｈｐｉで、細胞は非酵素分離バッファを使用して持ち上げられ、そして数えられた。細胞はその後、マウス抗ヒトｈＴＮＦ  ＰＥコンジュゲート抗体を使用して染色され、そしてフローサイトメーターを使用して分析された。
【図８】ｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦからのＴＮＦ発現が、ｈＴＮＦを発現しない対照ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯウイルスと比較して、Ｋ７Ｍ２−ｌｕｃ骨肉腫細胞株における細胞死の増加を引き起こさないことを確認する、ＳＹＴＯＸオレンジを用いた、細胞死分析のグラフのセットである。細胞は、実験的に、ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯウイルス、またはｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦウイルスに感染させられたか、あるいはＴＮＦで処置された。細胞はその後、感染後および処置後、２４時間および４８時間インキュベートされることが許可された。細胞はその後、ＳＹＴＯＸオレンジで染色され、そして蛍光性細胞のパーセントについて数えられた。各ウェル（ｗｅｌｌ）細胞の平均数も、各時点および処置について数えられた。
【図９】フローサイトメトリーを使用した、感染したヒトＡＭＬ（ＴＨＰ１）細胞の細胞死の定量化を、例示する。ＭＹＸＶ媒介の総ＴＨＰ１細胞の死滅は、生／死染色（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を用いた細胞上のゲーティングによってＡＰＣ／Ｃｙ７＋であったと定義される、細胞の固形群から判定された。重要性（＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１）は、多重比較用のＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ  ｔ検定（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）を使用して判定された。結果は、ＴＨＰ−１細胞のｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦ−ＧＦＰへの感染が、感染後の両時間（２４時間および４８時間）で、３検定による感染の多重性（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（ＭＯＩ＝１０、１、または０．１）で、ゲートされた死細胞の数の全面的な増加を引き起こしたことを示す。
【図１０】フローサイトメトリーを使用して、ウイルス感染したヒトＡＭＬ（ＴＨＰ１）細胞の、ＭＹＸＶ媒介性のＯＮ標的（ＯＮ−Ｔａｒｇｅｔ）死滅の定量化を、例示する。ＴＨＰ１細胞のＭＹＸＶ媒介性の「ＯＮ標的」は、ＧＦＰ陽性のウイルス感染した細胞の固形群からゲートされた、ＡＰＣ／Ｃｙ７＋であった細胞の割合から判定された。重要性（＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１）は、多重比較用のＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ  ｔ検定を使用して判定された。
【図１１】フローサイトメトリーを使用して、ＭＹＸＶ誘導のＯＦＦ標的（ＯＦＦ−Ｔａｒｇｅｔ）が死滅させるウイルス感染していないヒトＡＭＬ（ＴＨＰ１）細胞の定量化を、例示する。ＭＹＸＶ媒介のＯＦＦ標的（ＯＦＦ−Ｔａｒｇｅｔ）が死滅させるＴＨＰ１細胞は、ＧＦＰ陰性の細胞の固形群からゲート化された、ＡＰＣ／Ｃｙ７＋であった細胞の割合から判定された。重要性（＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１）は、多重比較用のＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ  ｔ検定を使用して判定された。
【図１２】フローサイトメトリーを使用した、感染したヒト多発性骨髄腫（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｙｅｌｏｍａ）（Ｕ２６６）細胞の細胞死の定量化を、例示する。ＭＹＸＶ媒介の総Ｕ２６６の死滅は、ＡＰＣ／Ｃｙ７＋だった細胞の固形群から判定された。重要性（＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１）は、多重比較用のＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ  ｔ検定を使用して判定された。
【図１３Ａ】免疫適格のマウスにあらかじめ植え付けられたマウス多発性骨髄腫を除去するために、エクスビボで負荷された同系のマウス骨髄白血球を介して送達されたｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦの、試験を示す。図１３Ａは、耐ボルテゾミブＶＫ＊１２５９８骨髄腫細胞を使用するインビボデータを示し、ここで、細胞はほとんどが骨髄と脾臓に遊走する。生存率曲線は、癌移植後１００日後に作成された（図１３Ｂ）。図１３Ｃは、生存率のパーセントに相当する。
【図１３Ｂ】免疫適格のマウスにあらかじめ植え付けられたマウス多発性骨髄腫を除去するために、エクスビボで負荷された同系のマウス骨髄白血球を介して送達されたｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦの、試験を示す。図１３Ａは、耐ボルテゾミブＶＫ＊１２５９８骨髄腫細胞を使用するインビボデータを示し、ここで、細胞はほとんどが骨髄と脾臓に遊走する。生存率曲線は、癌移植後１００日後に作成された（図１３Ｂ）。図１３Ｃは、生存率のパーセントに相当する。
【図１３Ｃ】免疫適格のマウスにあらかじめ植え付けられたマウス多発性骨髄腫を除去するために、エクスビボで負荷された同系のマウス骨髄白血球を介して送達されたｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦの、試験を示す。図１３Ａは、耐ボルテゾミブＶＫ＊１２５９８骨髄腫細胞を使用するインビボデータを示し、ここで、細胞はほとんどが骨髄と脾臓に遊走する。生存率曲線は、癌移植後１００日後に作成された（図１３Ｂ）。図１３Ｃは、生存率のパーセントに相当する。
【図１４Ａ】ＳＭＡＣ擬態または免疫チェックポイント阻害剤のいずれかと、ＢＭ白血球にエクスビボで事前負荷されたｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−（Ｍ１３５−Ｍ１３６）との併用療法を示す。併用療法は、ＳＭＡＣ擬態化合物ＬＣＬ１６１（５０ｍｇ／ｋｇ）、またはチェックポイント阻害剤の単クローン性抗体（ｍＡｂ）α−ｍｕＰＤ−１で、エクスビボで事前負荷された自己のマウス骨髄白血球を介して送達されたｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−（Ｍ１３５−Ｍ１３６）と組み合わされて、試験された（図１４Ａ）。図１４Ｂは、生存率曲線を含むインビボデータを示す。図１４Ｃは、生存率のパーセントを記載する。
【図１４Ｂ】ＳＭＡＣ擬態または免疫チェックポイント阻害剤のいずれかと、ＢＭ白血球にエクスビボで事前負荷されたｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−（Ｍ１３５−Ｍ１３６）との併用療法を示す。併用療法は、ＳＭＡＣ擬態化合物ＬＣＬ１６１（５０ｍｇ／ｋｇ）、またはチェックポイント阻害剤の単クローン性抗体（ｍＡｂ）α−ｍｕＰＤ−１で、エクスビボで事前負荷された自己のマウス骨髄白血球を介して送達されたｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−（Ｍ１３５−Ｍ１３６）と組み合わされて、試験された（図１４Ａ）。図１４Ｂは、生存率曲線を含むインビボデータを示す。図１４Ｃは、生存率のパーセントを記載する。
【図１４Ｃ】ＳＭＡＣ擬態または免疫チェックポイント阻害剤のいずれかと、ＢＭ白血球にエクスビボで事前負荷されたｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−（Ｍ１３５−Ｍ１３６）との併用療法を示す。併用療法は、ＳＭＡＣ擬態化合物ＬＣＬ１６１（５０ｍｇ／ｋｇ）、またはチェックポイント阻害剤の単クローン性抗体（ｍＡｂ）α−ｍｕＰＤ−１で、エクスビボで事前負荷された自己のマウス骨髄白血球を介して送達されたｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−（Ｍ１３５−Ｍ１３６）と組み合わされて、試験された（図１４Ａ）。図１４Ｂは、生存率曲線を含むインビボデータを示す。図１４Ｃは、生存率のパーセントを記載する。
【図１５】ｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ―（Ｍ１３５−１３６）に感染したヒト細胞からの、ヒトＴＮＦタンパク質発現および部分的分泌を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
特定の術語彙
【００１４】
他に明記がない限り、技術用語は従来の使用法に従って使用される。分子生物学の一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ発刊，  １９９４  （ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．発刊，  １９９４  （ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；および、Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ  （ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  ＶＣＲ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．発刊，  １９９５  （ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）、に見つけら得る。
【００１５】
他に説明が無いかぎり、本明細書に使用される技術的および科学的用語はすべて、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を持つ。本明細書に説明されるものに類似する、または、等価である方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が以下に説明される。加えて、材料、方法および例は例示のみであり、限定的であることを意図されていない。
【００１６】
本明細書における「いくつかの実施形態」、「ある実施形態」、「一実施形態」、または「他の実施形態」の言及は、実施形態に関連して説明される、特定の特徴、構造、または特性が、本発明の、少なくともいくつかの実施形態に含まれるが、必ずしもすべての実施形態に含まれないことを意味する。
【００１７】
本明細書に使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のためのものに過ぎず、記載される主題を限定するものと解釈されてはならない。
【００１８】
以下の用語および方法の説明は、本発明の化合物、組成物および方法をよりよく説明し、そして本開示の実践において当業者を導くために提供される。また、本開示で使用される用語は、特定の実施形態および例を説明することのみを目的としており、限定的であることが意図されていないことも、理解されたい。
【００１９】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでない旨を示さない限り、複数形も含むことが意図されている。
【００２０】
本明細書で使用される場合、範囲および量は、特定の値または範囲の「約（ａｂｏｕｔ）」として表されることが可能である。「約」には丁度の量も含まれる。したがって、「約５μＬ」は、「約５μＬ」と、さらに「５μＬ」を意味する。一般に、「約」という用語には、実験誤差内であると予期される量が含まれる。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」という用語は、関連する列挙された項目の１以上の、任意のおよびすべての可能な組み合わせ、ならびに代替的な（「または」）で解釈される場合の組み合わせの不在を指し、そして包含する。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「１以上（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」または少なくとも１つは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上で任意の数までを意味し得る。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ａ  ｏｒ  Ｂ）」は、Ａ、Ｂ、またはＡとＢを含むことを意味する。
【００２４】
「有効な量」または「治療上有効な量」は、望ましい効果を生み出すのに十分な、本発明の化合物または組成物の量を指し、望ましい効果とは治療的効果および／または有益な効果であり得る。有効な量は、当業者の知識および専門技能の範囲内において、被験体の年齢、常態、処置されている疾患の重症度、投与される特定の薬剤、処置の期間、任意の同時処置の性質、使用される薬学的に許容可能な担体、および同様の要因によって変化するだろう。  必要に応じて、任意の個々の場合における有効な量または治療的に有効な量は、関連するテキストおよび文献を参照することによって、および／または日常の実験を使用することによって、当業者によって決定され得る。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（最新版）を参照）。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」および「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指す。本開示の「非ヒト動物（ｎｏｎｈｕｍａｎ  ａｎｉｍａｌｓ）」という用語は、すべての脊椎動物を含み、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット等）などの、哺乳類と非哺乳類である。好ましくは、被験体はヒトの患者である。特別の実施形態では、この開示の被験体は、ヒト被験体である。
【００２６】
本明細書で使用される「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」という用語は、単一の細胞、ならびに細胞の複数または固形群を含む。薬剤を細胞に投与または曝露する工程は、インビトロ投与とインビボ投与の両方を含み得る。
【００２７】
「それを必要とする被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｉｎ  ｎｅｅｄ  ｔｈｅｒｅｏｆ）」または「必要とする被験体（ａ  ｓｕｂｊｅｃｔ  ｉｎ  ｎｅｅｄ  ｏｆ）」は、固形腫瘍などの癌を有することが知られている、またはその疑いがある被験体である。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、分化の喪失、増殖の速度上昇、周囲組織の浸潤を伴う特徴的な退形成を経て、かつ転移することができる、悪性新生物を指す。
【００２９】
残存癌は、癌を小さくするまたは根絶するために被験体に与えられた任意の形態の処置の後に、被験体に残る癌である。転移性癌は、転移性癌が由来する元の（原発性）癌の起源の部位とは別の、例えば第２の部位である、身体の１以上の部位にある癌である。局所再発は、元の癌と（同じ組織内などの）同じ部位またはその近くでの、癌の再発である。
【００３０】
肉腫と癌などの固形癌の例としては、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、骨原性肉腫および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性疾患、膵臓癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、膀胱癌、およびＣＮＳ腫瘍（神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫など）が挙げられる。
【００３１】
血液の癌の例としては、骨髄腫、リンパ腫、および白血病が挙げられる。いくつかの例では、例示的な血液の癌は、Ｂ細胞またはＴ細胞の血液の癌を含む。いくつかの場合では、例示的な血液の癌は、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）または非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）を含む。
【００３２】
本明細書に使用される場合、「化学療法剤」という用語は、異常な細胞増殖によって特徴付けられる疾患の処置において治療的有用性を有する、任意の化学剤を指す。そのような疾患としては、腫瘍、新生物、および癌、ならびに、乾癬などの肥厚増殖によって特徴付けられる疾患が挙げられる。一実施形態では、化学療法薬剤は、抗新生物剤などの、癌を処置する際に役立つ薬剤である。一実施形態では、化学療法薬剤は、放射性化合物である。当業者は、役立つ化学療法薬剤を容易に特定することができる（例えば、Ｓｌａｐａｋ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ８６  ｉｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｐｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  Ｃｈ．  １７  ｉｎ  Ａｂｅｌｏｆｆ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  ２０００  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，  Ｉｎｃ；Ｂａｌｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｒｋｅｒｙ．  （ｅｄｓ）：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，  １９９５；Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｋｎｏｂｆ，  ａｎｄ  Ｄｕｒｉｖａｇｅ  （ｅｄｓ）：Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  ４ｔｈ  ｅｄ．  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，  １９９３．を参照。）併用化学療法は、癌を処置するための１を超える薬剤の投与である。ＴＮＦを発現する粘液腫ウイルスや、１以上の他の化学療法薬剤などで、同時に、または時間内に任意の順序で投与され得る。
【００３３】
本明細書で使用される場合、癌などの「疾患を阻害するまたは処置する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ａ  ｄｉｓｅａｓｅ）」という用語は、疾患または疾病の完全な発症を阻害することを指す。「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患または病的状態の徴候または症状を、それが発症し始めた後に改善する、治療的介入を指す。疾患または病的状態に関連する「改善すること（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」という用語は、処置に関する、任意の観察可能な有益な効果を指す。有益な効果は、例えば、感受性のある被験体における疾患の臨床症状の発症の遅延、疾患の一部またはすべての臨床症状の重症度の低下、例えば転移などの疾患のより遅い進行、被験体の全体的な健康または健常性の改善、あるいは特定の疾患に特有である当該技術分野で周知の他のパラメータによって、証明され得る。「予防的」処置は、例えば転移性癌などの、病状を発症するリスクを低減する目的で、疾患の兆候を示さない、または初期の兆候のみを示す被験体に投与される処置である。
【００３４】
本明細書で使用される場合、本明細書で開示される治療用化合物と併用して有益である「薬学的に許容可能な担体」は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ｂｙ  Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  １９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９９５）は、治療剤の薬学的送達に適している組成物および製剤を説明する。
【００３５】
一般に、担体の性質は、採用されている投与の特定の様式によって決まるであろう。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容可能な流体を含む、注入可能な流体を含有する。固形組成物（例えば、粉末、ピル、錠剤、またはカプセルの形態）については、従来の無毒の固形担体は、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはマグネシウムステアレートを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与されるべき医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存料、ｐＨ緩衝剤、および、例えばソジウムアセテート（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）またはソルビタンモノラウレート（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）などの同様物などの、少量の非毒性補助物質を含み得る。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「医薬品」および「治療剤」という用語は、被験体または細胞に適切に投与されたときに、望ましい治療的または予防的効果を誘発することができる化合物または組成物を指す。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「腫瘍」という用語は新生物の生成を指し、それは過剰な細胞分裂に起因する組織の異常増殖である。周囲の組織に浸潤する、および／または転移し得る腫瘍は、「悪性」と呼ばれる。新生物は増殖性障害の一例である。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「複製能力のある」という用語は、特定の宿主細胞内で感染および複製することができるウイルスを指す。
【００３９】
序論
肺および他の器官に転移する癌は、基礎的および臨床的な癌研究において、大きな挑戦を意味する。肺転移を処置するこれまでの能力は困難を極めており、骨肉腫、黒色腫、および乳癌などの癌は全て、５年生存率は現行の治療で２５％に満たない。現行の治療パラダイムは、古典的な放射線療法、化学療法、および標的治療の混和であるが、すべての腫瘍に有効な処置は１つも無い。癌処置のための潜在的な「特効薬」として以前に売り込まれた１つの療法は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）である。１世紀以上前のＷｉｌｌｉａｍ  Ｃｏｌｅｙによる最初の発見、および数十年後の分子的特性化以来、ＴＮＦは、興味を引くが、謎に満ちた抗癌試薬および免疫調節因子であることが示されて来た。ＴＮＦの、局所的に処置された腫瘍と遠位に単離された腫瘍の両方における使用、および全身処置としての使用に関する研究は、深刻な毒性と低い抗腫瘍反応率を明らかにした。実際に、いくつかの研究では、ＴＮＦ単独の全身投与が、ある癌では腫瘍の増殖を促進し得ることも分かった。
【００４０】
ＴＮＦ（ＴＮＦα、ｃａｃｈｅｘｉｎまたはカケクチンとも呼ばれる）は、炎症性の免疫反応の不可欠な部分であるサイトカインである（（Ｃｏｌｅｙ，  ＷＢ．  ２０１５  Ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ：  ｗｉｔｈ  ａ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｅｎ  ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｃａｓｅｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  １０５，  ４８７−５１１  （１８９３））。ＴＮＦは主に細胞表面免疫リガンドとして発現するが、可溶性リガンドの切断と放出を促進する変換酵素を発現する細胞、例えば骨髄細胞系列で発現すると、可溶性サイトカインとして分泌され得る。文書に記録されている１つのＴＮＦエフェクター経路は、ＴＮＦ受容体−１（ＴＮＦＲ１）経路による細胞死の誘導であり、具体的な標的細胞内の下流の効果によってアポプトーシスまたはネクロプトーシスにつながる（Ｍｏｒｉｗａｋｉ  Ｋ，  Ｂｅｒｔｉｎ  Ｊ，  Ｇｏｕｇｈ  Ｐ，  Ｏｒｌｏｗｓｋｉ  Ｇ，  Ｃｈａｎ  ＦＫ．  ２０１６．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＲＩＰＫ１  ａｎｄ  ＲＩＰＫ３  ｉｎ  ＴＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．  Ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ＆  ｄｉｓｅａｓｅ  ６：ｅ１６３６）。ＴＮＦはまた、例えば、抗腫瘍のＣＤ８＋Ｔ細胞とＮＫ細胞を活性化させることによって、先天的および適応的免疫反応の活性剤にもなる（Ｋａｓｈｉｉ，  Ｙ，  Ｇｉｏｒｄａ，  Ｒ，  Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ，  Ｒ．  Ｂ．，  Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ，  Ｔ．  Ｌ．  Ｖｕｊａｎｏｖｉｃ，  Ｎ．  Ｌ．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＮＦ  ｆａｍｉｌｙ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３，  ５３５８−５３６６；  Ｐｒｅｖｏｓｔ−Ｂｌｏｎｄｅｌ，  Ａ，  Ｒｏｔｈ，  Ｅ．，  Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，  Ｆ．  Ｐｉｒｃｈｅｒ，  Ｈ．  ２０００  Ｃｒｕｃｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＴＮＦ−α  ｉｎ  ＣＤ８  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ３ＬＬ−Ａ９  Ｌｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４，  ３６４５−３６５１）。ＴＮＦは、もともとは、潜在的な抗腫瘍特効薬として考えられていた。マウス内にＴＮＦを全身注射する予備試験が、この楽観論を裏付けると思われたが、研究室から臨床現場へ移行すると、ＴＮＦは、免疫系の活性化因子であるだけでなく、可溶性リガンドで全身に処置された患者に、深刻な全身性毒性を引き起こし得ることが示された。研究は、この全身性ＴＮＦ処置が、マウスモデルで観察された同等の抗腫瘍効果を患者において引き起こさなかったことをも示した（Ｂａｌｋｗｉｌｌ，  Ｆ．  Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．  ２００９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ９，  ３６１）。
【００４１】
腫瘍可溶性のウイルス療法は、実行可能な処置戦略として再出現した。（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＳＪ，  Ｐｅｎｇ  Ｋ−Ｗ，  Ｂｅｌｌ  ＪＣ．  ２０１２．  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０：６５８−６７０）。癌を処置するために腫瘍溶解性のウイルス療法を利用することは、アイディアとしては１世紀以上前から存在するが、それが、標準治療が効かないヒトの腫瘍の処置のためのより実現可能な手法に徐々になってきたのは、ここ２０年程にすぎない。（Ｋｅｌｌｙ  Ｅ，  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＳＪ．  ２００７．  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓｅｓ：  ｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １５：６５１−６５９）。
【００４２】
腫瘍溶解性ウイルスは、形質転換された癌細胞を、選択的に感染および死滅させるそれらの能力のために、そして  ウイルスだけでなく腫瘍抗原に対する宿主免疫系を活性化するそれらの能力によって、設計および／または選択される哺乳類のウイルスである。（Ｌｉｃｈｔｙ  ＢＤ，  Ｂｒｅｉｔｂａｃｈ  ＣＪ，  Ｓｔｏｊｄｌ  ＤＦ，  Ｂｅｌｌ  ＪＣ．  ２０１４．  Ｇｏｉｎｇ  ｖｉｒａｌ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １４：５５９−５６７）。粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）は、ポックスウイルスファミリーおよびレポリポックスウイルス属のメンバーである。（Ｃｈａｎ  ＷＭ，  Ｒａｈｍａｎ  ＭＭ，  ＭｃＦａｄｄｅｎ  Ｇ．  ２０１３．  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｍｙｘｏｍａ  ｖｉｒｕｓ：  ｔｈｅ  ｐａｔｈ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ３１：４２５２−４２５８；  Ｃｈａｎ  ＷＭ，  ＭｃＦａｄｄｅｎ  Ｇ．  ２０１４．  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ．  Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １：１９１−２１４）。自然界において、ＭＹＸＶはウサギに特異的であり、ヒトまたはマウスに感染または疾患を引き起こさない。しかし、発癌に関連する癌経路の突然変異とうい性質が原因で、マウスおよびヒトからの、すべてでは無いにしてもほとんどの癌細胞は常に、ＭＹＸＶを含む多くのウイルスによる感染に抵抗するという先天的能力の要素を失う。（Ｃｈａｎ  ＷＭ，  ＭｃＦａｄｄｅｎ  Ｇ．  ２０１４．  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ．  Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １：１９１−２１４；  Ｓｙｐｕｌａ  Ｊ，  Ｗａｎｇ  Ｆ，  Ｍａ  Ｙ，  Ｂｅｌｌ  Ｊ，  ＭｃＦａｄｄｅｎ  Ｇ．  ２００４．  Ｍｙｘｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｒｏｐｉｓｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８：１０３−１１４）。この系における生態の別の特徴は、複数の治療用の導入遺伝子による遺伝子操作を可能にする、大きく、かつ遺伝学的に安定したポックスウイルスゲノムである。（Ｎａｙｅｒｏｓｓａｄａｔ  Ｎ，  Ｍａｅｄｅｈ  Ｔ，  Ａｌｉ  ＰＡ．  ２０１２．  Ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １）。本明細書に開示される場合、免疫調節および／または細胞死の異なる形態を調節するＭＹＸＶ遺伝子は、随意に除去され、治療的抗癌導入遺伝子が導入され、免疫原性の増加を誘発し、および／または癌細胞死の好ましい形態を誘発する。
【００４３】
操作された粘液腫ウイルスおよび使用の方法
特定の実施形態では、本明細書に開示されるのは、外因性ＴＮＦタンパク質をコードする操作された粘液腫ウイルスを含む。いくつかの例では、粘液腫ウイルスは、ウサギ細胞指向性に関連する１以上の遺伝子における、またはそれに隣接するする修飾を含む。いくつかの例では、ウサギ細胞指向性に関連する１以上の遺伝子は、Ｍ１１Ｌ、Ｍ０６３、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、Ｍ−Ｔ２、Ｍ−Ｔ４、Ｍ−Ｔ５、またはＭ−Ｔ７を含む。いくつかの例では、ウサギ細胞指向性に関連する１以上の遺伝子は、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、またはその組み合わせを含む。
【００４４】
いくつかの例では、本明細書に開示されるのは、ＴＮＦタンパク質を発現するように操作された、操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）を含み、ここでＭＹＸＶはＭ１３５Ｒ遺伝子の修飾を含む。いくつかの例では、修飾は、Ｍ１３５Ｒ遺伝子によってコードされたタンパク質の機能を害する欠失である。いくつかの場合では、修飾は、Ｍ１３５Ｒ遺伝子の部分欠失（例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の欠失）である。他の場合では、修飾は、Ｍ１３５Ｒ遺伝子の完全欠失である。追加的な場合では、修飾は、Ｍ１３５Ｒ遺伝子のＴＮＦタンパク質による置換である。さらなる場合では、操作されたＭＹＸＶは、ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ−ｈＴＮＦである。別のさらなる場合では、操作されたＭＹＸＶは、図２Ａで示されるようなｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ−ｈＴＮＦである。
【００４５】
いくつかの例では、本明細書に開示されるのは、ＴＮＦタンパク質を発現するように操作された、操作された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）を含み、ここでＴＮＦタンパク質は、ＭＹＸＶゲノム内のＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間に挿入される。いくつかの例では、操作されたＭＹＸＶは、ｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−Ｍ１３５−１３６である。いくつかの例では、操作されたＭＹＸＶは、図２Ｂに示されるような、ｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−Ｍ１３５−１３６である。
【００４６】
いくつかの例では、ＴＮＦタンパク質は、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、例えば９５％と９８％との間、９５％と９９％との間、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を含む、配列の同一性を含み、あるいは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１３７５に示されるような配列を含み、それは２０１９年７月３日（エントリーバージョン２４７）に公表され、そして参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの例では、ＴＮＦタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１３７５の残基７７−２３３と、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、例えば９５％と９８％との間、９５％と９９％との間、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を含む、配列の同一性を含む可溶性ＴＮＦである。いくつかの場合では、可溶性ＴＮＦは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢＰ０１３７５の残基７７−２３３を含む。
【００４７】
いくつかの場合では、ＴＮＦタンパク質を含む操作されたＭＹＸＶは、蛍光タンパク質をさらに含む。例示的な蛍光タンパク質は、ＴａｇＢＦＰ、アジュライト（Ａｚｕｒｉｔｅ）、Ｓｉｒｕｓ、またはサファイア（Ｓａｐｐｈｉｒｅ）などのブルー／ＵＶタンパク質；ＥＣＦＰ、セルリアン（ｃｅｒｕｌｅａｎ）、またはｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅなどのシアンタンパク質；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、エメラルド（Ｅｍｅｒａｌｄ）、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、またはクローバ（Ｃｌｏｖｅｒ）などのグリーンタンパク質；ＥＹＦＰ、レモン色（ｃｉｔｒｉｎｅ）、ビーナス（ｖｅｎｕｓ）、またはＳＹＦＰ２などのイエロータンパク質；ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯ２、またはｍＯｒａｎｇｅなどのオレンジタンパク質；ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙｍ  ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＡｐｐｌｅ、またはｍＲｕｂｙなどのレッドタンパク質；ＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１、またはＰＡＴａｇＲＦＰなどの、光活性可能タンパク質（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；およびＤｒｏｐｎａなどの、光スイッチ可能タンパク質（ｐｈｏｔｏｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、を含む。
【００４８】
ある実施形態では、さらに本明細書に説明されるのは、誘発されたＴＮＦ発現（例えば膜貫通ＴＮＦタンパク質または可溶性ＴＮＦタンパク質）を、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）と組み合わせて使用する癌処置の方法である。上に議論されるように、分泌されたＴＮＦは、抗腫瘍分子であることが示されているが、それは、その小さな治療域と深刻な副作用によって、全身への使用には向かない。さらに、腫瘍溶解性ＭＹＸＶは、幅広い種類の腫瘍型に対して広範な指向性を有する、腫瘍に特異的な抗腫瘍薬剤であることが示されている。  いくつかの場合では、本明細書に開示されるのは、例えばウイルス感染の腫瘍細胞表面で、つまり感染細胞の表面で、または分泌バージョンとして、ｈＴＮＦを発現するように修飾されたＭＹＸＶである。本明細書に開示される結果を達成するために、腫瘍溶解性ＭＹＸＶは、強力なウイルスに特異的なプロモータの下で、ウイルス感染細胞において発現される免疫リガンドとして、組み換えＭＹＸＶ構築物からのヒトＴＮＦ（一般にｖＭｙｘ−ｈＴＮＦと呼ばれる）を発現するように操作されても良い。ＴＮＦのＭＹＸＶベースの発現の利点は、リガンドが、ウイルス感染腫瘍組織でのみ、かつ、可溶性ＴＮＦリガンドの全身送達で観察された深刻な副作用を除去する低量で、発現されることである。
【００４９】
いくつかの例では、粘液腫ウイルスゲノムは、当業者に周知の標準分子生物技術を使用して、１以上の治療用導入遺伝子を発現するように容易に修飾され、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （（２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に説明される。当業者であれば、ウイルスが、例えば複製可能なウイルスを提供するために、生産的な感染を継続できるようにするためには、粘液腫ウイルスゲノムのどの部分を除去したら良いのかを、容易に判定できるであろう。例えば、除去できるウイルスゲノムの非本質的な領域は、公開されているウイルスゲノム配列を、他の十分に特徴付けられたウイルスのゲノムと比較することで、推定することができる。（例えば、Ｃ．  Ｃａｍｅｒｏｎ，  Ｓ．  Ｈｏｔａ−Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  Ｌ．  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．  Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ｊ．−Ｘ．  Ｃａｏ，  Ｃ．  Ｍａｃａｕｌａｙ，  Ｄ．  Ｗｉｌｌｅｒ，  Ｄ．  Ｅｖａｎｓ，  ａｎｄ  Ｇ．  ＭｃＦａｄｄｅｎ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （１９９９）  ２６４：  ２９８−３１８）を参照）。そのため、本開示の態様は、被験体の癌を阻害するおよび／または処置するための方法に関する。ある実施形態では、方法は、ヒト被験体などの被験体に、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（例えば膜貫通ＴＮＦタンパク質または可溶性ＴＮＦタンパク質）を発現させるＭＹＸＶを投与する工程を含み、それによって被験体の癌を処置するおよび／または阻害する。ある実施形態では、ＭＹＸＶは、ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ−ｈＴＮＦを含む。ある実施形態では、ＭＹＸＶは、Ｍｙｘ−ｈＴＮＦ−Ｍ１３５−１３６を含む。ある実施形態では、ＭＹＸＶは、ｖＭＹＸ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦを含む。ある実施形態では、被験体はヒト被験体である。ある実施形態では、方法は、癌を患っている、または癌を患っていると疑われる、ヒト被験体などの、被験体を選択する工程をさらに含む。ある実施形態では、ＭＹＸＶは、全身に投与される。ある実施形態では、ＭＹＸＶは、腫瘍および／または転移の部位で投与される。ＭＹＸＶは、欠陥がある先天的抗ウイルス反応を有する細胞を感染させることが、示されている。本明細書に使用される場合、「欠陥がある先天的抗ウイルス反応」とは、ウイルスに曝露された時、またはウイルスによる侵入を受けた時に、抗ウイルス防御メカニズムを誘発しない細胞を指し、抗ウイルス防御メカニズムとは、ウイルス複製の阻害、インターフェロンの生成、インターフェロン反応経路の誘導、およびアポトーシスを含む。当該用語は、例えば非感染細胞または非癌細胞などの正常細胞と比較して、ウイルスへの曝露、またはウイルスによる感染時に、先天的抗ウイルス反応が少ない、またはそれに欠陥がある、癌細胞などの細胞を含む。これは、インターフェロンに反応しない細胞、および、アポトーシスに関連する反応またはアポトーシス経路の誘導が少ない、またはそれらに欠陥がある細胞を含む。当該欠陥は、感染、遺伝的欠陥、または環境ストレスを含む様々な原因によって引き起こされ得る。しかし、当該欠陥が先在する感染によって引き起こされる場合���は、ＭＹＸＶによる重複感染が除外され得ることが理解され、そして、当業者はそのような例を容易に識別することができる。当業者は、任意の所与の細胞型が、欠陥がある先天的抗ウイルス反応を有し、それゆえにＭＹＸＶに感染しているのか否かを、過度の実験無しに、容易に判定することができる。そのため、方法のある実施形態では、ＭＹＸＶは、欠陥がある先天的抗ウイルス反応を有する細胞を感染させることができる。一実施形態では、細胞は、インターフェロンに反応しない。具体的な実施形態では、細胞は、哺乳類の癌細胞である。一実施形態では、細胞は、ヒトの固形腫瘍細胞を含むヒト癌細胞である。
【００５０】
ＭＹＸＶは、複製能力を有する、ポックスウイルスのレポリポックスウイルス種に属する任意のウイルスであっても良い。ＭＹＸＶは、ＭＹＸＶの野生型株であっても良く、または、ＭＹＸＶの遺伝子的に修飾された株であっても良い。いくつかの例では、ＭＹＸＶは、ローザンヌ株である。いくつかの例では、ＭＹＸＶは、Ｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓにおいて広く知られている、南アメリカＭＹＸＶ株（Ｓｏｕｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＭＹＸＶ  ｓｔｒａｉｎ）である。いくつかの例では、ＭＹＸＶは、Ｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ  ｂａｃｈｍａｎｉにおいて広く知られている、カリフォルニアＭＹＸＶ株（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａｎ  ＭＹＸＶ  ｓｔｒａｉｎ）である。いくつかの例では、ＭＹＸＶは６９１８で、遺伝子Ｍ００９Ｌ、Ｍ０３６Ｌ、Ｍ１３５Ｒ、およびＭ１４８Ｒ中に修飾を含む、減衰されたスペインフィールド株（Ｓｐａｎｉｓｈ  ｆｉｅｌｄ  ｓｔｒａｉｎ）である。（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＵ５５２５３０で、参照によって、２０１９年７月１１日にＧｅｎＢａｎｋによって提供された通りに、本明細書に組込まれる）。いくつかの例では、ＭＹＸＶは、６９１８ＶＰ６０−Ｔ２である。（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＵ５５２５３１で、参照によって、２０１９年７月１１日にＧｅｎＢａｎｋによって提供された通りに、本明細書に組込まれる）。いくつかの例では、ＭＹＸＶは、標準臨床株（ＳＬＳ）と命名された株である。
【００５１】
いくつかの例では、ＭＹＸＶは、Ｃａｍｅｒｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｙｘｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ，”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６４：  ２９８−３１８  （１９９９）（この全体は参照によって本明細書に組み込まれる）に開示される配列と、少なくとも９０％、９５％、または９９％の配列の同一性を含む。いくつかの場合では、ＭＹＸＶは、Ｃａｍｅｒｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｙｘｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ，”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６４：  ２９８−３１８  （１９９９）に開示される配列を含む。
【００５２】
ある実施形態では、欠陥がある先天的抗ウイルス反応を有する細胞は、癌細胞を含む。ある実施形態では、ＭＹＸＶに感染した細胞は、ＴＮＦを発現する。いくつかの例では、ＴＮＦは表面に発現される。いくつかの場合では、ＴＮＦは可溶性ＴＮＦである。本明細書に開示される場合、肺転移に対して実証された有効性の結果は、延長線上で、原発および転移性の両方の、他の固形癌に適用可能である。ＴＮＦは、癌細胞の強力なキラー、および、さらに腫瘍細胞に対する先天的および適応的免疫反応の活性因子の両方であり得る。ウイルスおよびＴＮＦの生態に関して周知のものに基づいて、このウイルスを腫瘍型の広範なスペクトルに適用することは、多様な癌型の処置のための理想的な候補を提供する。癌は、悪性腫瘍の存在を含む、当該技術分野で一般に容認されている基準を使用して診断され得る。
【００５３】
開示される方法によって処置され得る癌の型としては、固形腫瘍、例えば、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、骨原性肉腫、およびその他の肉腫が含まれるがこれらに限定されない、瘍肉腫および癌、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性疾患、膵臓癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、膀胱癌、およびＣＮＳ腫瘍（神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫など）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、癌は固形腫瘍である。ある実施形態では、癌は被験体の第２の部位へ転移している。ある実施形態では、第２の部位は、被験体の肺、脳、肝臓、および／またはリンパ節を含む。ある実施形態では、癌は、骨肉腫、トリプルネガティブ乳癌、または黒色腫を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、癌の型は、ホジキンリンパ腫、または非ホジキンリンパ腫などの血液の癌をさらに含む。
【００５５】
被験体に投与される時、細胞表面で発現されるＴＮＦ、または可溶形性の形態であるなどの、ＴＮＦを発現するＭＹＸＶの有効な量は、服用時および十分な期間の間、ウイルスが、癌などの、疾患の拡張を緩和、改善、軽減、良化、安定、防止する、疾患の進行を遅らせるまたは遅延させる、あるいは疾患を治癒するのに必要な量であり、当該疾患は例えば、肺、脳、肝臓、または他の器官に転移した固形腫瘍である。例えば、癌性細胞または新生物細胞の数を減らすか破壊する、または慢性的にウイルスに感染している細胞の数を減らすか破壊する、またはそのような細胞の増殖および／または拡張を阻害する効果、および／または転移の数および／または部位の減少を達成するのに十分な量であり得る。
【００５６】
被験体に投与される有効な量は、ＭＹＸＶの薬物動態的特性、投与の方法、被験体の年齢、健康、および体重、疾患状態の性質および範囲、処置の頻度、およびもしあれば併用処置のタイプ、そしてウイルスの毒性および滴定濃度によって、変化し得る。
【００５７】
ＭＹＸＶは、被験体の臨床反応によって必要に応じて調節されて良い適切な量で、最初に投与され得る。有効な量のウイルスは経験的に決定され得、また、安全に投与することができるＭＹＸＶの最大量、および望ましい結果をもたらすウイルスの最低量によって決まる。
【００５８】
ＭＹＸＶは、投与の標準方法を使用して被験体に投与され得、一実施形態で、ウイルスは全身に投与される。他の実施形態では、ウイルスは、疾患部位に注射によって投与される、様々な実施形態では、ウイルスは、経口でまたは非経口で、あるいは当該技術分野で周知の任意の標準方法によって投与され得る。
【００５９】
ウイルスを全身に投与する時と同一の臨床結果を、疾患部位におけるウイルスの注射を通じて達成される結果で生み出そうとすると、大幅に多い量のウイルスの投与が必要となり得る。しかし、適切な用量レベルは、望ましい結果を達成する最低量であるべきである。
【００６０】
投与されるウイルスの濃度は、投与されるべきＭＹＸＶの特定の株の毒性、および目標とされている細胞の性質によって変化するだろう。一実施形態では、約３ｘ１０１０フォーカス形成単位（「ｆｆｕ」）（「感染単位」とも呼ばれる）未満の用量が、ヒト被験体に投与され、様々な実施形態では、約１０２から約１０９ｐｆｕの間、約１０２から約１０７ｐｆｕの間、約１０３から約１０６ｐｆｕの間、または約１０４から約１０５ｐｆｕの間が、単一用量で投与され得る。
【００６１】
細胞表面発現ＴＮＦまたは可溶形態などの、ＴＮＦを発現するＭＹＸＶは、単独の治療として投与されても良く、あるいは、化学療法、免疫療法、および／または放射線治療を含む、他の治療との組み合わせで投与されても良い。例えば、ＴＮＦを発現するＭＹＸＶは、原発腫瘍の外科的切除の前または後、あるいは、放射線治療または従来の化学療法薬剤の投与の前に、あるいはそれと同時に、あるいはその後に、投与されて良い。
【００６２】
いくつかの実施形態では、免疫療法は  免疫モジュレータを含む。例示的な免疫チェックポイントモジュレータは、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａからのデュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）（Ｉｍｆｉｎｚｉ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈからのアテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ／Ｐｆｉｚｅｒからのアベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、ＣｙｔｏｍＸ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからのＣＸ−０７２、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＦＡＺ０５３、３Ｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ／ＡｌｐｈａｍａｂからのＫＮ０３５、Ｅｌｉ  ＬｉｌｌｙからのＬＹ３３０００５４、またはＥＭＤ  ＳｅｒｏｎｏからのＭ７８２４（抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ）などの、ＰＤ−Ｌ１阻害剤；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのＡＭＰ−２２４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）およびｒＨＩｇＭ１２Ｂ７などの、ＰＤ−Ｌ２阻害剤；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂからのニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）（Ｏｐｄｉｖｏ）、Ｍｅｒｃｋからのペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、ＡｇｅｎｕｓからのＡＧＥＮ  ２０３４、ＢｅｉＧｅｎｅからのＢＧＢ−Ａ３１７、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＢｌ−７５４０９１、ＣＢＴ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＣＢＴ−５０１（ｇｅｎｏｌｉｍｚｕｍａｂ）、ＩｎｃｙｔｅからのＩＮＣＳＨＲ１２１０、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔからのＪＮＪ−６３７２３２８３、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅからのＭＥＤＩ０６８０、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓからのＭＧＡ  ０１２、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＰＤＲ００１、ＰｆｉｚｅｒからのＰＦ−０６８０１５９１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＳａｎｏｆｉからのＲＥＧＮ２８１０（ＳＡＲ４３９６８４）、またはＴＥＳＡＲＯからのＴＳＲ−０４２などの、ＰＤ−１阻害剤；Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂからのイピリムマブｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）、ＭＤＸ−０１０、ＢＭＳ−７３４０１６、およびＭＤＸ−１０１としても知られる）、Ｐｆｉｚｅｒからのトレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）（ＣＰ−６７５，２０６、チシリムマブ（ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ））、またはＡｇｅｎｕｓからのＡＧＥＮ  １８８４などの、ＣＴＬＡ−４阻害剤；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂからのＢＭＳ−９８６０１６、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＩＭＰ７０１、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＬＡＧ５２５、またはＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＲＥＧＮ３７６７などの、ＬＡＧ３阻害剤；ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓからのエノブリツズマブ（ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）（ＭＧＡ２７１）などの、Ｂ７−Ｈ３阻害剤；Ｉｎｎａｔｅ  ＰｈａｒｍａからのＬｉｒｉｌｕｍａｂ（ＩＰＨ２１０１；ＢＭＳ−９８６０１５）などのＫＩＲ阻害剤；ｕｒｅｌｕｍａｂ（ＢＭＳ−６６３５１３、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＰＦ−０５０８２５６６（ａｎｔｉ−４−１ＢＢ、ＰＦ−２５６６、Ｐｆｉｚｅｒ）、またはＸｍＡｂ−５５９２（Ｘｅｎｃｏｒ）などの、ＣＤ１３７阻害剤；バビツキシマブ（Ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）などの、ＰＳ阻害剤；および、抗体またはそのフラグメント（例えば、単クローン抗体、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体）、ＲＮＡｉ分子、あるいはＴＩＭ３、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＴＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴ、ＤＲ３、ＣＤ２２６、ＣＤ２、またはＳＬＡＭまでの小分子などの、阻害剤、を含むが、それらに限定されない。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＴＮＦを発現するＭＹＸＶは、医薬組成物中の成分として製剤化される。したがって、さらなる実施形態では、ＴＮＦを発現する粘液腫ウイルスを含む医薬組成物、および薬学的に許容可能な賦形剤、または希釈剤が提供される。組成物は、日常的に塩、緩衝剤、保存料、および様々な相溶性のある担体（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）の、薬学的に許容可能な濃度を含み得る。
【００６４】
医薬組成物は、追加的な抗癌剤などの追加的な治療剤を、さらに含み得る。一実施形態では、組成は化学療法薬剤を含む。化学療法薬剤は例えば、被験体の癌細胞、または新生細胞に対する腫瘍溶解効果を示す、実質的に任意の薬剤であって良く、そしてそれは、ＴＮＦを発現するＭＹＸＶの腫瘍死滅効果を阻害、または弱めない。例えば、化学療法薬剤は、アントラサイクリン、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌｍｅｌａｍｉｎｅ）、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸アナログ、プリンアナログ、ピリミジンアナログ、酵素、ポドフィロトキシン（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、プラチナ含有剤、またはサイトカイニンであり得るが、それらに限定されない。好ましくは、化学療法薬剤は、癌または新生物である特定の細胞型に対して、有効であることが知られているものである。
【００６５】
いくつかの場合には、追加的治療剤は、上述されたものなどの、免疫のチェックポイントモジュレータを含む。
【００６６】
薬学的に許容可能な賦形剤、または希釈剤の割合および同一性は、選択される投与ルート、生ウイルスとの適合性、および標準的な薬学的実践によって決定される。一般に、医薬組成物は、ＴＮＦを発現するＭＹＸＶの、生物学的特性を著しく害さない成分と共に製剤化されるであろう。医薬組成物は、被験体への投与に適している薬学的に許容可能な組成の調製のための、既知の方法によって調製することができ、その結果、作用物質（複数可）の有効な量が、混合物中で薬学的に許容可能なビヒクルと組み合わされる。適切なビヒクルは、例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  ＵＳＡ  １９９５）で説明されている。これに基づき、組成物は、これらだけでは無いが、１以上の薬学的に許容可能な賦形剤、ビヒクル、または希釈剤に関連する、ＴＮＦを発現するＭＹＸＶの溶液を含み、そして、適切なｐＨで等浸透圧の、生理液を含む緩衝溶液に含有される。
【００６７】
医薬組成物は、当業者によって理解されるであろう、投与の選択された経路に応じた様々な形態で、被験体に投与され得る。いくつかの例では、医薬組成物は全身に投与される。他の例では、医薬組成物は局所的に投与される。いくつかの場合では、医薬組成物は経口で投与される。追加的な場合では、医薬組成物は非経口で投与される。非経口投与としては、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経上皮、鼻、肺内、くも膜下、鞘内、直腸、および局所での投与モードが挙げられる。非経口的投与は、選択された期間にわたる持続注入によるものであっても良い。
【００６８】
医薬組成物は、例えば不活性の希釈剤または担体で、経口で投与されても良く、あるいは、固いまたは柔らかいシェルゼラチンカプセルに含有されていても良く、あるいは錠剤中に圧縮されていても良い。経口医薬組成物については、ＴＮＦを発現するＭＹＸＶは賦形剤に組み込まれていても良く、また、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、ウエハー、などの形態で使用されても良い。
【００６９】
ＴＮＦを発現するＭＹＸＶの溶液は、生理学上適切なバッファで調製され得る。保存および使用の通常の条件下では、これらの調製は、微生物の増殖を防ぐために保存料を含むが、しかし、それが生体ウイルスを不活性化することはないだろう。当業者であれば、適切な製剤を調製する方法を知っているだろう。適切な製剤の選択および調製のための従来の手順および成分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、および、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  （ＵＳＰ  ２４  ＮＦ１９）１９９９年発刊、に説明される。使用されることになっている医薬組成物の用量は、処置されている特定の疾病、疾病の重症度、年齢、身体状態、サイズ、および体重を含む個々の被験体パラメータ、処置の期間、（該当する場合は）併用療法の性質、具体的な投与経路、および医療関係者の知識と専門技能内における類似の要因によって決まる。ある実施形態では、治療用ウイルスは、室温での保存用に冷凍乾燥されても良い。
【００７０】
ＴＮＦを発現するＭＹＸＶ、またはＴＮＦを発現するＭＹＸＶを含む医薬組成物はまた、癌を処置するためのＴＮＦを発現する粘液腫ウイルスの使用のための指示を含む、キットとしてパッケージ化されていても良い。
【００７１】
ＴＮＦの発現に加えて、ＭＹＸＶは、ＭＹＸＶ処置の抗癌効果を増強するであろう任意の他の遺伝子を運ぶように修飾され得る。そのような遺伝子は、アポトーシスを引き起こすこと、または免疫破壊に関する感染細胞を標的にすることに関与しているかもしれず、例えばインターフェロンに対する反応の不足を修復する、または抗体反応を刺激する細胞表面マーカー、例えば細菌性細胞表面抗原など、の発現をもたらす遺伝子である。ＭＹＸＶはまた、新生物または癌の細胞の拡張と増殖を止めることに関与する遺伝子を発現するように修飾されていても良く、それによって細胞が分裂することを妨げる。また、ウイルスは、化学療法薬剤の合成に関与する遺伝子などの、治療用遺伝子を含むように修飾されても良く、あるいは、阻害または死滅される細胞が由来する、例えばヒト細胞などの、特定の種の細胞における複製レベルが増加するように修飾されても良い。
【００７２】
上に議論されるように、ＭＹＸＶは、欠陥のある先天的抗ウイルス反応を有する細胞を選択的に感染させることが可能で、また、細胞におけるそのような欠陥の指標として使用され得る。そのため、被験体から取り除かれた細胞は、本発明の方法を使用して、先天的抗ウイルス反応における欠陥について分析され得る。そのような判定は、他の指標と組み合わされると、被験体が特定の疾患状態、例えば癌を患っているかもしれない事を示し得る。細胞は、周知の生体組織検査法を使用して、ヒト被験体を含む被験体から取り除かれ得る。生体組織検査法は、試験される細胞の位置および型に依存するだろう。細胞は周知の培養技術に従って培養され、生ＭＹＸＶを培養培地に追加することによって、ＭＹＸＶに曝露される。感染多重度（「ＭＯＩ）は、ＭＹＸＶへの曝露時に感染することが知られている陽性対照細胞培養を使用して、所与の細胞型、密度、および培養技術に最適なＭＯＩを決定するために、変更され得る。
【００７３】
培養細胞に追加されるＭＹＸＶの量は、細胞型、培養方法、およびウイルスの株によって変更され得る。そのようなパラメータは、常法を使用して、最小限の試験で容易に試験および調節することができる。
【００７４】
ＭＹＸＶによる培養細胞の感染力は、細胞死を引き起こすＭＹＸＶの能力を含み、当業者に周知の様々な方法によって判定され得る。方法は、ウイルス発現産物との酵素反応または化学反応を完了するために、細胞培養への試薬の添加をも含み得る。ウイルス発現産物は、ＭＹＸＶゲノムに挿入されたレポーター遺伝子から発現され得る。
【００７５】
一実施形態では、ＭＹＸＶは感染状態の検出をより容易にするように修正され得る。例えば、ＭＹＸＶは、位相差顕微鏡法、螢光顕微鏡検査法、または放射性撮像によって、容易に検出され得るマーカーを発現するように遺伝子修飾されても良い。マーカーは、比色反応または放射性標識反応に含まれ得る、発現された蛍光タンパク質または発現された酵素であり得る。別の実施形態では、マーカーは、試験されている細胞の特定の機能を中断または阻害する、遺伝子産物であり得る。
【００７６】
ＭＹＸＶは、当該技術分野で周知の標準技法を使用して調製され得る。例えば、ウイルスは、培養ウサギ細胞、または不死化許容ヒトまたは霊長類細胞を、使用されるＭＹＸＶ株に感染させることによって調製されて良く、ウイルスが培養細胞内で複製し、そして細胞表面を破壊して、それによって採取のためのウイルス粒子を放出する、当該技術分野で周知の標準的方法によって放出され得るように、感染を進行させる。一旦採取されると、ウイルス力価は、ウサギ細胞のコンフルエントなローン（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ｌａｗｎ）を感染させ、かつプラーク分析を実施することによって判定され得る（Ｍｏｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１５：１７−３０を参照、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。方法
【００７７】
治療用ＭＹＸＶウイルスが、最初にエクスビボで、骨髄または末梢血単核細胞のいずれかからの混合白血球に吸着され、その後に癌患者への再注入などの注入が続く送達戦略が、さらに開示される。この戦略では、ヒトＴＮＦを発現するＭＹＸＶは、エクスビボでウイルスに事前感染した白血球の遊走を介して、転移性癌部位に送達される。この全身送達方法は、ウイルスが患者への注入前に、単離された白血球にまず送達されるので、「エクスビボウイルス療法」、またはＥＶＶ（別名ＥＶ２）と呼ばれることがある。ＭＹＸＶ構築物およびこの新しい送達戦略は、腫瘍量を著しく下げ、かつマウス肺転移モデルにおける生存率を上げる能力を示した（実施例１を参照）。本明細書に開示される通り、細胞表面ヒトＴＮＦを発現する粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）構築物の投与は、ウイルス保有「担体」を介して、ＭＹＸＶウイルスを転移性肺疾患部位へ効果的に送達した。さらに、本明細書に開示される通り、本発明者らは、ＴＮＦ発現ウイルス（一般にｖＭｙｘ−ｈＴＮＦとして指定される）のこの細胞支援送達が、腫瘍量を下げ、肺転移を有するマウスの生存率を上げる能力を有することを実証した（実施例１を参照）。これらの結果は、ＴＮＦ発現ＭＹＸＶの細胞媒介送達が、標的肺転移性腫瘍細胞の直接死滅のレベルを上げるが、（理論に縛られてはいないが）宿主免疫系の活性化因子として作用することを実証し、このことは癌の長期退行を導き得る。このことは、現行の処置では困難であることが証明されている、肺、肝臓、脳、骨、および／またはリンパ節に転移した固形癌の処置の、新しい方法を提供する。そのため、ある実施形態では、方法は、被験体に単核末梢血細胞および／または骨髄細胞を投与する工程を含み、ここで単核末梢血細胞および／または骨髄細胞は、細胞表面腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を発現するＭＹＸＶを含み、それにより、被験体の癌を処置するおよび／または阻害する。併用される「白血球／ｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ」療法は、腫瘍床の細胞死を増加させて抗腫瘍免疫原性を増強するが、ＴＮＦを肺腫瘍組織などのウイルス感染転移性腫瘍組織のインサイチュでのみ産生し、ｏｆｆ標的の全身性の有毒な副作用を制限する。マウス骨肉腫肺転移モデルにおける以下の実施例１に提示された試験の結果は、この戦略が腫瘍量を下げ、生存期間の中央値を上げるのに効果的であることを示す。さらに、白血球／ｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ戦略は、癌組織に限定的な方法で細胞表面ＴＮＦを選択的に発現させることにより、元の腫瘍型に関係なく、たとえば肺に転移するような、すべての固形癌に対する新しい潜在的治療レジメンを意味する。理論に拘束されないが、この白血球／ｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ戦略は、たとえば高頻度で肺に転移する固形癌に対する、他の確立された癌治療と相乗的に機能すると考えられている。ある実施形態では、方法は、ＭＹＸＶを単核末梢血細胞および／または骨髄細胞の表面に、吸着させる工程を含む。単核末梢血細胞および／または骨髄細胞の一部が感染している可能性もある；しかし、このことが本明細書に開示される方法において重要となる可能性は低いだろう。ある実施形態では、単核末梢血細胞および／または骨髄細胞の表面に、粘液腫ウイルスを吸着させる工程は、粘液腫ウイルスの単核末梢血細胞および／または骨髄細胞の表面への結合が可能な条件下で、単核末梢血細胞および／または骨髄細胞を粘液腫ウイルスに曝露することを含む。
【００７８】
本開示の態様は、あらゆる種類の腫瘍溶解性ＭＹＸＶ構築物を、転移性肺疾患に送達するための新しい方法に向けられ、すなわち、上述のように、治療用ＭＹＸＶ構築物を、骨髄（ＢＭ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のいずれかに由来する混合白血球に、事前負荷することによる方法である。そのような方法は、例えば癌細胞などの、欠陥のある先天性抗ウイルス反応を有する細胞の存在によって特徴付けられる任意の疾患状態を処置するために使用され得る。ＭＹＸＶ構築物は、任意の治療用遺伝子、または「治療用導入遺伝子を含むように修飾され得る。本明細書に使用される場合、「治療用遺伝子」または「治療用導入遺伝子」という用語は、発現が、例えば抗癌効果などの望まれる結果をもたらす任意の遺伝子を、広範に説明するものと意図されている。例えば、ウイルスは、ウイルス処置の抗癌効果を増強するであろう遺伝子を運ぶように修飾され得る。そのような遺伝子は、アポトーシスを引き起こすこと、または免疫破壊に関する感染細胞を標的にすることに関与しているかもしれず、例えばインターフェロンに対する反応の不足を修復する、または抗体反応を刺激する、細菌性細胞表面抗原などの細胞表面マーカーの発現をもたらす遺伝子である。ウイルスはまた、新生物または癌の細胞の拡張と増殖を止めることに関与する遺伝子を発現するように修飾されていても良く、それによって細胞が分裂することを妨げる。また、ウイルスは、化学療法薬剤の合成に関与する遺伝子などの、治療用遺伝子を含むように修飾されても良く、あるいは、阻害または死滅される細胞が由来する、例えばヒト細胞などの、特定の種の細胞における複製レベルが増加するように修飾されても良い。し戻す
【００７９】
ある実施形態では、ＢＭまたはＰＢＭＣの細胞は、エクスビボで１時間ＭＹＸＶ構築物と吸着させられ、その後、ＭＹＸＶ負荷の白血球が、レシピエントに注入し戻される。ある実施形態では、単核末梢血細胞および／または骨髄細胞は、例えば自己細胞として、被験体から得られる。他の実施形態では、単核末梢血細胞および／または骨髄細胞は、１以上の異種ドナーから得られる。骨髄細胞および単核末梢血細胞を得る方法は、当該技術分野で周知である。
【００８０】
本開示の態様は、たとえば表面のＴＮＦまたは可溶性ＴＮＦなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を発現するＭＹＸＶ、および同様物を含有するキットに関する。ある実施形態では、ＴＮＦを発現するＭＹＸＶは、ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ−ｈＴＮＦを含む。ある実施形態では、ＴＮＦを発現するＭＹＸＶは、ｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−Ｍ１３５−１３６を含む。ＴＮＦを発現する粘液腫ウイルス、またはＴＮＦを発現するＭＹＸＶを含む医薬組成物はまた、癌を処置するための、欠陥がある免疫反応を有する細胞を阻害するための、ＴＮＦを発現するＭＹＸＶの使用のための指示を含む、キットとしてパッケージ化されていても良い。
【実施例】
【００８１】
これらの例は、説明のみを目的として提供されており、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するものではない。
【００８２】
実施例１
この実施例は、ＴＮＦを発現するＭＹＸＶの構成と試験を説明する。
【００８３】
ウイルスの設計
ｖＭｙｘ−ｈＴＮＦウイルスの第１バージョン（ここではｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦと呼ばれる）は、もともと、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２００８によって設計および説明された（Ｗａｎｇ  Ｆ，  Ｇａｏ  Ｘ，  Ｂａｒｒｅｔｔ  ＪＷ，  Ｓｈａｏ  Ｑ，  Ｂａｒｔｅｅ  Ｅ，  Ｍｏｈａｍｅｄ  ＭＲ，  Ｒａｈｍａｎ  Ｍ，  Ｗｅｒｄｅｎ  Ｓ，  Ｉｒｖｉｎｅ  Ｔ，  Ｃａｏ  Ｊ．  Ｄｅｋａｂａｎ，  ＧＡ，  ＭｃＦａｄｄｅｎ，  Ｇ．  ２００８）。ＲＩＧ−Ｉは、初代ヒトマクロファージにおいて粘液腫ウイルスによって引き出される腫瘍壊死因子およびＩ型インターフェロンの同時誘導を媒介する。ＰＬｏＳ病原体４：ｅ１００００９９であり、これは参照により本明細書に具体的に組み込まれる）。要するに、このウイルスは、腫瘍溶解性ウイルス療法と関係ない目的のために、または癌の任意の処置のために、ＭＹＸＶローザンヌ親株を使用して作られた。挿入ベクターは、ｐブルースクリプトファージミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ｐｈａｇｅｍｉｄ）に基づき、個別の合成ワクシニア前期後期プロモータによって制御されて、ｅＧＦＰとともに１３１Ｒ  ＯＲＦ（ＳＯＤと呼ばれる）にクローン化された（マップ図１を参照）。第２のｈＴＮＦ発現ウイルス（ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ−ｈＴＮＦと呼ばれる）は、ヒトの臨床試験用に開発されている、腫瘍溶解性ＭＹＸＶ構築物のための標準的な減衰された遺伝的背景である、Ｍ１３５Ｒ遺伝子ノックアウトウイルスプラットフォームに基づいて生成された。Ｍ１３５Ｒノックアウト構成のための戦略は、Ｂａｒｔｅｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００９によって完全に説明されている。（Ｂａｒｔｅｅ  Ｅ，  Ｍｏｈａｍｅｄ  ＭＲ，  Ｌｏｐｅｚ  ＭＣ，  Ｂａｋｅｒ  ＨＶ，  ＭｃＦａｄｄｅｎ  Ｇ．  ２００９．Ｔｈｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｌｕｓ  ｂｅｔａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｓｔａｔｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８３：４９８−５１１  および  Ｂａｒｒｅｔｔ  ＪＷ，  Ｓｙｐｕｌａ  Ｊ，  Ｗａｎｇ  Ｆ，  Ａｌｓｔｏｎ  ＬＲ，  Ｓｈａｏ  Ｚ，  Ｇａｏ  Ｘ，  Ｉｒｖｉｎｅ  ＴＳ，  ＭｃＦａｄｄｅｎ  Ｇ．  ２００７  Ｍ１３５Ｒ  Ｉｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  Ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  Ｍｙｘｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ  ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．８１（１）：１０６−１１４，。その両方は、参照によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる。）簡潔に言うと、このｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ−ｈＴＮＦウイルスは、マルチサイトゲートウェイスリーフラグメントクローニング手法（Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ  ｇａｔｅｗａｙ  ｔｈｒｅｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を使用して生成された。要素１は、Ｍ１３４  ＯＲＦの３’フラグメントを、合成前期／後期プロモータによって制御されたｅＧＦＰと共に含む。要素２は、さらに合成前期／後期プロモータの制御下にあった、完全なｈＴＮＦコード配列を含んでいた。最後に、要素３は、５���Ｍ１３６遺伝子のフラグメントを含んでいた。これらの３つフラグメントは、ｅＧＦＰ−ｈＴＮＦのタンデムカセット（ｔａｎｄｅｍ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）を任意のＭＹＸＶゲノムのバックボーンのＭ１３５Ｒ遺伝子座に挿入するために使用された、シングルエントリーのビヒクルプラスミドへ組み合わされた。これはその後、トランスフェクション／感染に使用され、そして、組み換えウイルスは、少なくとも３回のプラーク精製（ｐｌａｑｕｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を使用して精製された（最終プラスミドは、図２Ａに示されるトランスフェクションに使用された）。
【００８４】
動物研究
エクスビボでウイルスが事前負荷された白血球を介して送達されたｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦウイルスの、肺転移性骨肉腫に対する有効性を、免疫適格のＢａｌｂ／ｃマウスで、同系のマウス骨肉腫モデルを使用して確認した。動物には、０日目に、２ｘ１０６Ｋ７Ｍ２−ＦＬｕｃマウス骨肉腫細胞を、外側尾静脈を介して接種した。接種後４日で、対照のＢａｌｂ／ｃマウスから骨髄（ＢＭ）を採取し、数を確認し、１有核細胞あたり２−１０の感染性ウイルスユニット単位のＭＯＩ（感染多重度）でウイルスに感染させた。細胞とウイルスを、３７℃で１時間吸着させた。エクスビボでウイルス負荷したＢＭを、その後、１動物あたり４ｘ１０６細胞で眼窩後方に注射した。その後動物を、腫瘍接種後７日目から毎週、腫瘍量のリアルタイム測定として、ルシフェラーゼ発光のためにＩＶＩＳインビボ撮像システムを使用して画像撮影し、そのほとんどがレシピエントの肺で観察された。動物を、進行性疾患の既定の臨床症状への到達、または感染後８週間のどちらかが最初に生じるまでモニタリングした。結果は、ｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦ構築物の注目すべき例外を除き、試験したすべてのウイルス構築物で処置された動物が、対照と同等の腫瘍量を示したことを明らかにした。単一の長期生存者を誘発したｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯウイルスを除くと、他の試験ウイルスも、対照と統計的に区別可能な平均生存率を示さなかった。対照的に、ｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦ構築物コホートでは、腫瘍細胞からの発光によって測定されるように、腫瘍は、対照および他の構築物の両方よりも、すべての撮像時点で統計的に小さかった（図３）。ｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦも、対照と比較して平均生存時間がほぼ２倍になり（図４）、また、このコホートにおいてのみ、実証できる腫瘍量が明らかに存在しない顕著な数の動物が観察された。
【００８５】
これらの結果の後、ウイルス「キャリア細胞」としてのＢＭ白血球を、治療用ＭＹＸＶ構築物の転移性肺腫瘍部位への送達のためのキャリア細胞としての塊のＰＢＭＣの利用と比較した。ＰＢＭＣが、ほとんどの固形癌に対して、臨床的により適切なキャリア白血球の供給源であることが推論された。動物に、上術のようにＫ７Ｍ２−Ｆｌｕｃ細胞を接種した。腫瘍接種の４日後、対照Ｂａｌｂ／ｃマウスからのＰＢＭＣを採取し、そして上術のようにエクスビボで１時間、ｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦ（ＭＯＩ＝２）に吸着させた。動物をその後、１ｘ１０６、２ｘ１０６、および４ｘ１０６のＰＢＭＣの（それぞれ、入力ウイルスの同一のＭＯＩで事前に吸着されている）３つの用量群に分け、それぞれのＰＢＭＣ／ウイルス用量を注射した。動物はその後、７日目から画像撮影を行った。ルシフェラーゼ撮像の結果は、動物が用量に依存して処置に反応し、１ｘ１０６では最も反応が少なく、４ｘ１０６では対照動物と比較して、腫瘍発光の最も有意な低下を示した（図５および図６）。
【００８６】
ｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦに感染した細胞のＴＮＦ発現の確認
ｖＭｙｘｖ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦ構築物によるｈＴＮＦの発現を確認するために、予防対策されていないＲＫ−１３細胞を、１０のＭＯＩで実験的にウイルスに感染させた。感染は４８時間進行し、その後、膜結合タンパク質の完全性を確保するために、非酵素細胞解離バッファを使用して細胞を回収した。その後、細胞表面に発現する分子のみを染色する非透過条件下で、フローサイトメトリー用のＰＥ蛍光体（ＰＥ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）にコンジュゲートされたマウス抗ヒトＴＮＦ抗体を使用して、細胞を染色した。その後、細胞を、非感染の染色対照および非感染の非染色対照に対して比較（ｒｕｎ）した。この分析の結果では、感染後４８時間で、ｖＭＹＸ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦ感染細胞の表面にＴＮＦが発現し、また非感染対照細胞によるＴＮＦ発現の兆候がないことが確認された（図７）。ウエスタンブロッティングでは分泌ＴＮＦは検出されず（図示せず）、このことは、感染細胞が、理論的にはＴＮＦの分泌形態を生成できるはずの、必要な変換／切断酵素を発現しなかったことを示す。
【００８７】
インビトロでの細胞死分析
白血球／ｖＭｙｘｖ−ｈＴＮＦウイルス療法を受けている担癌動物で観察される、生存率の改善と腫瘍量の低下を引き起こすメカニズムをよりよく理解するために、細胞死分析を実施して、異なる試験ウイルスに対する骨肉腫細胞の反応を測定した。これは、腫瘍量の低下が、ウイルスによって発現されたＴＮＦによって引き起こされた、直接的な腫瘍細胞死の増加によってもたらされたか否かを判断するためであった。フローサイトメトリーを使用して、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２の細胞表面発現について、Ｋ７Ｍ２−ＦＬｕｃ細胞を分析した。これらの細胞は、ＴＮＦＲ１とＴＮＦＲ２の両方の発現に対して陽性であることが示され、つまり、ＴＮＦが腫瘍細胞上の同族受容体と直接的に相互作用し、ＴＮＦ誘導の細胞死を引き起こし得ることが可能であったことを意味した。これらの細胞が直接ＴＮＦによって死滅され得るのか否かを確認するために、ＴＮＦを実験的に増殖させ、ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ、ｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦのいずれかに感染させる、あるいは精製したマウスＴＮＦとインキュベートする、のいずれかを行った。次に、ＳＹＴＯＸオレンジを使用して生存率について細胞を測定し、ＳＹＴＯＸオレンジは、さまざまな形態の細胞死に関連して、細胞膜の完全性が失われた後でのみ、細胞に入り、細胞を染色する。感染／接種後２４時間または４８時間で、細胞をＳＹＴＯＸオレンジで１０分間インキュベートし、トリプシンを使用して持ち上げ、そして、細胞と上清を一体的に組み合わせ、遠心分離で過剰なＳＹＴＯＸを洗浄した。その後、細胞を１００マイクロリットルのＤＭＥＭで再懸濁し、セルカウンターを使用して読み取りを行った。この分析の結果は、４８時間までには、マウスＴＮＦが対照と比較して２０％の細胞死の増加のみを引き起こしたが、しかしＴＮＦ後２４時間では、有意差がなかったことを示した。逆に、ｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦ感染は、対照と比較して２４時間で２０％、４８時間で５０％生存率を低下させた。この細胞生存率の低下は、ｈＴＮＦを発現しない対照ｖＭｙｘ−１３５ＫＯウイルスの感染後に観察されたものと、実質的に同一である。このことは、これらの骨肉腫細胞が、ｈＴＮＦによる死滅に対してさらに敏感であるというわけではなく、動物研究で観察された腫瘍縮小の増加が、ウイルス発現ＴＮＦの、骨肉腫におけるＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２との直接的な相互作用とは別の免疫関連メカニズムによって引き起こされた可能性が高いことを示す（図８）。
【００８８】
実施例２
この例では、エクスビボでウイルスが事前負荷された白血球を介して送達された、ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ−ｈＴＮＦウイルスの、トリプルネガティブ乳癌に対する有効性の判定について説明する。
【００８９】
免疫適格のＢａｌｂ／ｃマウスにおける同系のマウストリプルネガティブ乳癌を使用する。動物には、０日目に、トリプルネガティブ乳癌細胞を、外側尾静脈を介して接種した。接種後、対照Ｂａｌｂ／ｃマウスから骨髄（ＢＭ）を採取し、数を確認し、ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ−ｈＴＮＦおよび／または対照ウイルスに感染させる。細胞とウイルスを、３７℃で１時間吸着させる。その後、エクスビボでウイルスを負荷したＢＭを、眼窩後方に注射する。その後動物を、腫瘍接種後毎週、腫瘍量のリアルタイム測定として、ルシフェラーゼ発光のためにＩＶＩＳインビボ撮像システムを使用して画像撮影し、そのほとんどがレシピエントの肺で観察される。動物を、進行性の疾患の既定の臨床症状に達するまでモニタリングする。
【００９０】
実施例３
この例では、エクスビボでウイルスが事前負荷された白血球を介して送達された、ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ−ｈＴＮＦウイルスの、転移性黒色腫に対する有効性の判定について説明する。
【００９１】
免疫適格のＢａｌｂ／ｃマウスにおける同系のマウストリプルネガティブ乳癌を使用する。動物には、０日目に、転移性黒色腫細胞を、外側尾静脈を介して接種した。接種後、対照Ｂａｌｂ／ｃマウスから骨髄（ＢＭ）を採取し、数を確認し、ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ−ｈＴＮＦおよび／または対照ウイルスに感染させる。細胞とウイルスを、３７℃で１時間吸着させる。その後、エクスビボでウイルスを負荷したＢＭを、眼窩後方に注射する。その後動物を、腫瘍接種後毎週、腫瘍量のリアルタイム測定として、ルシフェラーゼ発光のためにＩＶＩＳインビボ撮像システムを使用して画像撮影し、そのほとんどがレシピエントの肺で観察される。動物を、進行性の疾患の既定の臨床症状に達するまでモニタリングする。
【００９２】
実施例４
図９は、フローサイトメトリーを使用した、感染したヒトＡＭＬ（ＴＨＰ１）細胞の細胞死の定量化を、例示する。ＭＹＸＶ媒介の総ＴＨＰ１細胞の死滅は、生／死染色を用いた細胞上のゲーティングによってＡＰＣ／Ｃｙ７＋でであったと定義される、細胞の固形群から判定された。重要性（＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１）は、多重比較用のＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ  ｔ検定を使用して判定された。結果は、ＴＨＰ−１細胞のｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦ−ＧＦＰへの感染が、感染後の両時間（２４時間および４８時間）で、３検定による感染の多重性（ＭＯＩ＝１０、１、または０．１）で、ゲートされた死細胞の数の全面的な増加を引き起こしたことを示す。
【００９３】
図１０は、フローサイトメトリーを使用して、ＭＹＸＶ媒介のＯＮ標的（ＯＮ−Ｔａｒｇｅｔ）が死滅させるウイルス感染したヒトＡＭＬ（ＴＨＰ１）細胞の定量化を、例示する。ＭＹＸＶ媒介のＯＮ標的が死滅させるＴＨＰ１細胞は、ＧＦＰ陽性のウイルス感染した細胞の固形群からゲートされた、ＡＰＣ／Ｃｙ７＋であった細胞の割合から判定された。重要性（＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１）は、多重比較用のＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ  ｔ検定を使用して判定された。結果は、ＴＨＰ１細胞がいずれかの試験ウイルスに感染した場合、ウイルス感染死細胞の検出は、対照ウイルスまたはＴＮＦ発現構築物のいずれかについて、非常に類似していたことを示す。この結果は、ＭＹＸＶが感染細胞を死滅させる能力が主にウイルスプラットフォームの結果であり、ＴＮＦを含むほとんどの導入遺伝子によっては比較的影響を受けないという、一般的な観察結果と一致する。
【００９４】
図１１は、フローサイトメトリーを使用して、ＭＹＸＶ誘導のＯＦＦ標的（ＯＦＦ−Ｔａｒｇｅｔ）が死滅させるウイルス感染していないヒトＡＭＬ（ＴＨＰ１）細胞の定量化を、例示する。ＭＹＸＶ媒介のＯＦＦ標的（ＯＦＦ−Ｔａｒｇｅｔ）が死滅させるＴＨＰ１細胞は、ＧＦＰ陰性の細胞の固形群からゲートされた、ＡＰＣ／Ｃｙ７＋であった細胞の割合から判定された。重要性（＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１）は、多重比較用のＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ  ｔ検定を使用して判定された。結果は、ｈＴＮＦ導入遺伝子の発現が、非武装型ＭＹＸＶ対照感染と比較して、非感染ＴＨＰ１細胞の相当な死滅を誘発したことを示す。
【００９５】
図１２は、フローサイトメトリーを使用した、感染したヒト多発性骨髄腫（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｙｅｌｏｍａ）（Ｕ２６６）細胞の細胞死の定量化を、例示する。ＭＹＸＶ媒介の総Ｕ２６６死滅は、ＡＰＣ／Ｃｙ７＋だった細胞の固形群から判定された。重要性（＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１）は、多重比較用のＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ  ｔ検定を使用して判定された。結果は、ｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦ−ＧＦＰによるＵ２６６細胞の感染が、感染後の両時点（２４時間および４８時間）で、３つの試験された感染多重度（ＭＯＩ＝１０、１、または０．１）で、ゲートされた死細胞の数の全体的な増加を引き起こしたことを示す。
【００９６】
図１３は、免疫適格のマウスにあらかじめ植え付けられたマウス多発性骨髄腫を除去するために、エクスビボで負荷された同系のマウス骨髄白血球を介して送達されたｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦの、試験を示す。多発性骨髄腫の遺伝子組み換えマウスＶＫ＊ＭＹＣモデルは、非常に攻撃的で薬剤耐性のあるモデルであるため、無癌生存率を改善するために、ＭＹＸＶウイルスによるウイルス療法を、骨髄白血球を用いる自己幹細胞移植（ＡＳＣＴ）と組み合わせて使用した。図１３Ａは、耐ボルテゾミブＶＫ＊１２５９８骨髄腫細胞を使用するインビボデータを示し、ここで、細胞はほとんどが骨髄と脾臓に遊走する。簡潔に言うと、１ｘ１０６のＶＫ＊１２５９８の骨髄腫細胞を、免疫適格のＣ５７ＢＬ／６マウスへ、尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）送達した。癌送達後４日で、マウスを以下のように処置した：骨髄（ＢＭ）移植を受けていない対照；２ｘ１０６ＢＭ細胞のみ；ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯの非武装型粘液腫ウイルス（ＭＯＩ＝１０）でエクスビボで事前処置された２ｘ１０６ＢＭ細胞；眼窩後方（ＲＯ）注射を介してｖＭｙｘ−ＳＯＤＫＯ−ｈＴＮＦ（ＭＯＩ＝１０）でエクスビボで処置された、２ｘ１０６ＢＭ。生存率曲線は、癌移植後１００日後に作成された（図１３Ｂ）。図１３Ｃは、生存率のパーセントに相当する。
【００９７】
図１４は、ＳＭＡＣ擬態または免疫チェックポイント阻害剤のいずれかと、ＢＭ白血球にエクスビボで事前負荷されたｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−（Ｍ１３５−Ｍ１３６）との併用療法を示す。併用療法は、ＳＭＡＣ擬態化合物ＬＣＬ１６１（５０ｍｇ／ｋｇ）、またはチェックポイント阻害剤の単クローン性抗体（ｍＡｂ）α−ｍｕＰＤ−１で、エクスビボで事前負荷された自己のマウス骨髄白血球を介して送達されたｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−（Ｍ１３５−Ｍ１３６）と組み合わされて、試験された。簡潔に言うと、１ｘ１０６のＶＫ＊１２５９８マウス骨髄腫細胞を、免疫適格のＣ５７ＢＬ／６マウスへ、尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）送達した。４週後に、血清蛋白質電気泳動（ＳＰＥＰ）を使用して、血清内の骨髄腫タンパクマーカー（例えばＭ−スパイク）のレベルを定量化した。その後、１、４、８、および１１日目に、ＭＯＩ＝１０でｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−（Ｍ１３５−Ｍ１３６）でエクスビボで事前処置した２ｘ１０６ＢＭ細胞で、マウスを処置する。各自己移植後、２、５、９、１２日目に注射を介して、経口強制栄養補給を介して送達された５０ｍｇ／ＫｇのＬＣＬ１６１による化学療法、または腹腔内（Ｉｐ）１０ｍｇ／ＫｇのｍＡｂα−ｍｕＰＤ−１による免疫療法のいずれかが続いた。図１４Ｂは、生存率曲線を含むインビボデータを示す。図１４Ｃは、生存率のパーセントを記載する。
【００９８】
図１５は、ｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ―（Ｍ１３５−１３６）に感染したヒト細胞からの、ヒトＴＮＦタンパク質発現および部分的分泌を示す。２つのヒト細胞系：ＴＨＰ１（ヒト単球）とＡ５４９（ヒト肺癌）を、３つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）で、ｖＭＹＸ−ｈＴＮＦ−（Ｍ１３５−１３６）と対照ｖＭｙｘ−ＧＦＰに感染させた。感染後４８時間後に、上清を採取し、そしてウイルス感染細胞から分泌された可溶性ヒトＴＮＦのレベルをＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で分析した。
【００９９】
実施例５
ｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−Ｍ１３５−Ｍ１３６ウイルスを、ＭＹＸＶローザンヌ親株を使用して作成した。簡潔に言うと、このｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−Ｍ１３５−Ｍ１３６ウイルスは、マルチサイトゲートウェイスリーフラグメントクローニング手法を使用して生成された。要素１は、Ｍ１３４の一部とＭ１３５Ｒ  ＯＲＦの３’フラグメントを、合成前期／後期プロモータによって制御されたｅＧＦＰと共に含む。要素２は、さらに合成前期／後期プロモータの制御下にあった、完全なｈＴＮＦコード配列を含んでいた。要素３は、５’Ｍ１３６Ｒ遺伝子のフラグメントを含んでいた。これらの３つフラグメントは、ｅＧＦＰ−ｈＴＮＦのタンデムカセットを任意のＭＹＸＶゲノムのバックボーンのＭ１３５ＲとＭ１３６Ｒとの間の遺伝子間の位置に挿入するために使用された、シングルエントリーのビヒクルプラスミドへ組み合わされた。これはその後、トランスフェクション／感染に使用され、そして、組み換えウイルスは、少なくとも３回のプラーク精製を使用して精製された（最終プラスミドは、図２Ｂに示されるトランスフェクションに使用された）。
【０１００】
本明細書に説明される組成物および方法に対応する例示的配列は、表１に示される。
【０１０１】
【表１−１】
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【０１０２】
【表１−２】
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【０１０３】
いくつかの例では、ＭＹＸＶ（ローザンヌ株）は、（２０１９年７月１１日にＧｅｎＢａｎｋによって提供された通りに、参照によって本明細書に組み込まれる）ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ１７０７２６．２で示される通りの配列を含む。
【０１０４】
いくつかの例では、ｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−Ｍ１３５−１３６は、図２Ｂで示される通りに配置される、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−５を含む。いくつかの場合では、ｖＭｙｘ−ｈＴＮＦ−Ｍ１３５−１３６は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ１７０７２６．２によって示される通りの配列を随意に含む、ローザンヌ株バックボーンを含む。
【０１０５】
いくつかの例では、ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ−ｈＴＮＦは、図２Ａで示される通りに配置される、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、２、４、および５を含む。いくつかの場合では、ｖＭｙｘ−Ｍ１３５ＫＯ−ｈＴＮＦは、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ１７０７２６．２によって示される通りの配列を随意に含む、ローザンヌ株バックボーンを含む。
【０１０６】
本発明の好ましい実施形態が本明細書中に示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの例示として提供されているに過ぎないことが当業者には明らかであろう。当業者であれば、多くの変更、変形、および置換が、本発明から逸脱することなく思いつくであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明の実施に際して利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、そして、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法と構造体、およびその同等物が、それによって包含されることが意図されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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