(57)【要約】本技術は、一般に、免疫学分野に関し、Ｔ細胞及び他の細胞を活性化し、標的抗原に対する免疫応答をもたらすための組成物及び方法に部分的に関する。本技術はまた、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の細胞毒性効果を低減しつつ、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞を増強及び維持するための組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、改変Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含み、キメラ抗原受容体は、膜貫通領域、Ｔ細胞活性化分子、及び抗原認識部分を含み、改変細胞集団中のＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、３：２以上である、改変細胞集団が提供される。
2021505139.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、
前記改変Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含み、前記キメラ抗原受容体が、
（ｉ）膜貫通領域、
（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び
（ｉｉｉ）抗原認識部分
を含み、前記改変細胞集団中のＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、３：２以上である、改変細胞集団。
【請求項２】
前記キメラ抗原受容体が、
（ｉ）膜貫通領域、
（ｉｉ）共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８
ポリペプチド領域、ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及び共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及びＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、並びに
（ｉｖ）抗原認識部分を含む、請求項１に記載の改変細胞集団。
【請求項３】
前記改変Ｔ細胞が、誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載の改変細胞集団。
【請求項４】
前記改変Ｔ細胞が、キメラシグナル伝達ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含み、前記キメラシグナル伝達ポリペプチドが、
（ｉ）共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、
（ｉｉ）ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、
（ｉｉｉ）ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及び
共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、又は
（ｉｖ）ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及びＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、請求項１に記載の改変細胞集団。
【請求項５】
前記キメラシグナル伝達ポリペプチドが、膜標的化領域を含む、請求項４に記載の改変細胞集団。
【請求項６】
共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域が、ＭｙＤ８８、ＣＤ４０、及び／又はＭｙＤ８８−ＣＤ４０融合キメラポリペプチドによって活性化されるシグナル伝達経路を活性化するシグナル伝達領域である、請求項４に記載の改変細胞集団。
【請求項７】
前記改変Ｔ細胞が、
（ｉ）前記キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）キメラシグナル伝達ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含む核酸を含み、前記キメラシグナル伝達ポリペプチドが、
ａ．共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、
ｂ．ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、
ｃ．ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及び共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、又は
ｄ．ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及びＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、請求項１に記載の改変細胞集団。
【請求項８】
前記核酸が、５’から３’の順序で、前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドを含む、請求項７に記載の改変細胞集団。
【請求項９】
前記第１のポリヌクレオチドが、５’から３’の順序で、抗原認識部分、膜貫通領域、及びＴ細胞活性化分子をコードし、前記第２のポリヌクレオチドが、前記Ｔ細胞活性化分子をコードするポリヌクレオチド配列の３’である、請求項７又は８に記載の改変細胞集団。
【請求項１０】
前記核酸が、前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の改変細胞集団。
【請求項１１】
前記リンカーポリペプチドが、２Ａポリペプチドを含む、請求項１０に記載の改変細胞集団。
【請求項１２】
前記核酸が、誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第４のポリヌクレオチドを含む、請求項１０又は１１に記載の改変細胞集団。
【請求項１３】
前記共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０からなる群から選択されるか、又はＭｙＤ８８、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化するシグナル伝達領域である、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の改変細胞集団。
【請求項１４】
前記キメラ抗原受容体が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及び
ＤＡＰ１０からなる群から選択される２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、若しくはＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化するシグナル伝達領域、又はＭｙＤ８８、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化するシグナル伝達領域を含む、請求項２又は３に記載の改変細胞集団。
【請求項１５】
前記キメラシグナル伝達ポリペプチドが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０からなる群から選択される２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、又はＭｙＤ８８、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化するシグナル伝達領域を含む、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の改変細胞集団。
【請求項１６】
前記改変細胞の８０％以上が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の改変細胞集団。
【請求項１７】
対象における標的細胞又は組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の改変細胞集団を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
標的抗原の発現の上昇に関連する疾患又は状態を有する対象を処置するための方法であって、有効量の請求項１〜１６のいずれか一項に記載の改変細胞集団を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
対象における腫瘍サイズを減少させるための方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の改変細胞集団を前記対象に投与することを含み、前記抗原認識部分が、前記腫瘍上の抗原に結合する、方法。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の改変細胞集団を調製するための方法であって、前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を有するＴ細胞を、前記核酸が前記細胞に組み込まれる条件下で、細胞集団と接触させることと、前記Ｔ細胞を濃縮して改変細胞集団を得ることと、を含み、前記細胞集団中のＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、３：２以上である、方法。
【請求項２１】
前記改変細胞集団を対象に投与する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
サイトカイン中和剤を投与することを更に含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記中和剤が、抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２４】
前記中和剤が、抗ＴＮＦα抗体である、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  ＣＡＲ−Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ」と題するＡａｒｏｎ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｆｏｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｐｅｎｃｅｒによって２０１７年１２月８日に出願された米国仮特許出願公開第６２／５９６，７４４号に対する優先権を主張し、当該米国仮特許出願公開は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本技術は、一般に、免疫学分野に関し、Ｔ細胞及び他の細胞を活性化し、標的抗原に対する免疫応答をもたらすための組成物及び方法に部分的に関する。本技術はまた、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の細胞毒性効果を低減しつつ、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞を増強及び維持するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｔ細胞活性化は、病原性微生物（例えば、ウイルス、細菌、及び寄生体）、外因性タンパク質、及び環境中の有害な化学物質に対する保護免疫において、また、癌及び他の過剰増殖性疾患に対する免疫として重要な工程である。Ｔ細胞は、細胞表面上に提示される抗原を認識する受容体（すなわち、Ｔ細胞受容体）をその表面上に発現する。正常な免疫応答の際、ＭＨＣ抗原提示との関連において、Ｔ細胞受容体にこれらの抗原が結合することにより、細胞内変化が開始され、Ｔ細胞活性化が生じる。
【０００４】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＭＨＣ抗原提示を必要とすることなく、Ｔ細胞に抗原特異性を伝達するように設計された人工の受容体である。キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞は、癌療法を含む様々な療法において使用され得る。例えば、ＣＡＲを発現するＴ細胞の養子移入（adoptive  transfer）は、特定の血液悪性疾患の処置に有効な療法である。これらの患者では、抗腫瘍活性は、注入後の堅牢な（robust）ＣＡＲ−Ｔ細胞増殖に関連し、これは、しばしば、毒性（すなわち、重症のサイトカイン放出症候群及び神経毒性）に関連するが、ＣＡＲ−Ｔ増殖及び持続性が少ない患者は、低い割合の長期寛解を示す。したがって、養子ＣＡＲ−Ｔ細胞療法がうまくいくには、ＣＡＲ−Ｔの効力と安全性とのバランスをとりながら、注入後におけるＣＡＲ−Ｔの増殖及び長期持続性が必要となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の細胞毒性効果を低減しつつ、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞を増強及び維持するための改変細胞集団及び方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、改変Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含み、キメラ抗原受容体は、膜貫通領域、Ｔ細胞活性化分子、及び抗原認識部分を含み、改変細胞集団中のＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、３：２以上である、改変細胞集団が提供される。本出願のいくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、膜貫通領域、共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及び共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及びＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、Ｔ細胞活性化分子、並びに抗原認識部分を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞は、誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞は、キメラシグナル伝達ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含み、キメラシグナル伝達ポリペプチドは、共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及び共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及びＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラシグナル伝達ポリペプチドは、膜標的化領域を含む。いくつかの実施形態では、共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域は、ＭｙＤ８８、ＣＤ４０、及び／又はＭｙＤ８８−ＣＤ４０融合キメラポリペプチドによって活性化されるシグナル伝達経路を活性化するシグナル伝達領域である。
【０００６】
いくつかの実施形態では、改変細胞集団は、キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチド及びキメラシグナル伝達ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含む核酸を含む改変Ｔ細胞を含み、キメラシグナル伝達ポリペプチドは、共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及び共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及びＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、５’から３’の順序で、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、５’から３’の順序で、抗原認識部分、膜貫通領域、及びＴ細胞活性化分子をコードし、第２のポリヌクレオチドは、Ｔ細胞活性化分子をコードするポリヌクレオチド配列の３’である。いくつかの実施形態では、核酸は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードする第３ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第４のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０からなる群から選択されるか、又はＭｙＤ８８、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化するシグナル伝達領域ある。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０からなる群から選択される２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含み、若しくはＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化するシグナル伝達領域、又はＭｙＤ８８、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化するシグナル伝達領域を活性化するシグナル伝達領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラシグナル伝達ポリペプチドは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０からなる群から選択される２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、又はＭｙＤ８８、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化するシグナル伝達領域を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、改変細胞の８０％以上がＣＤ８＋Ｔ細胞である、本出願の改変細胞集団が提供される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、対象における標的細胞又は組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、本出願の改変細胞集団を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、標的抗原の発現の上昇に関連する疾患又は状態を有する対象を処置するための方法であって、有効量の、本出願の改変細胞集団を対象に投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象における腫瘍サイズを低減するための方法であって、本出願の改変細胞集団を対象に投与することを含み、抗原認識部分が腫瘍における抗原に結合する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、本出願の改変細胞集団を調製するための方法であって、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を有するＴ細胞を、核酸が細胞に組み込まれる条件下で、細胞集団と接触させることと、Ｔ細胞を濃縮して改変細胞集団を得ることと、を含み、細胞集団中のＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、３：２以上である、方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、改変細胞集団を対象に投与する工程を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明は、サイトカイン又はケモカイン中和剤、例えば中和抗体と共に、本明細書に記載の改変細胞集団を含む、併用療法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＮＦα中和剤、例えば抗ＴＮＦα抗体と共に、本明細書に記載の改変細胞集団を含む、併用療法を提供する。
【００１０】
特定の実施形態を以下の説明、実施例、特許請求の範囲、及び図面において更に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
図面は、技術の実施形態を例示し、限定するものではない。図示の明確性及び容易性のために、図面は縮尺どおりに作製されてなく、いつくかの場合では、特定の実施形態の理解を容易にするために、強調又は拡大された様々な態様が示され得る。
【図１Ａ】従来の第１世代のＣＡＲと、ＣＤ３ζ細胞内ドメインとシスで発現されるＭＣからのシグナル伝達ドメインを含む増強されたＣＡＲと、を比較する概略図を提供する。これらのバイシストロニックベクターはまた、レトロウイルスベクターの第１の位置におけるｉＣ９を発現する。
【図１Ｂ】従来の第１世代のＣＡＲと、ＣＤ３ζ細胞内ドメインとシスで発現されるＭＣからのシグナル伝達ドメインを含む増強されたＣＡＲと、を比較する概略図を提供する。これらのバイシストロニックベクターはまた、レトロウイルスベクターの第１の位置におけるｉＣ９を発現する。
【図１Ｃ】フローサイトメトリーを用い、ＣＤ３＋ＣＤ３４＋発現を使用して、形質導入効率及びＣＡＲ平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。
【図１Ｄ】フローサイトメトリーを用い、ＣＤ３＋ＣＤ３４＋発現を使用して、形質導入効率及びＣＡＲ平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。
【図１Ｅ】非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞又はｉＣ９−ＣＤ１９．ζ若しくはｉＣ９−ＣＤ１９．ＭＣ．ζのいずれかで改変したＴ細胞の効力を、１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でのＣＤ１９＋Ｒａｊｉ−ＥＧＰＦｌｕｃ腫瘍細胞を用いた７日間の共培養アッセイにおいて評価した。腫瘍及びＴ細胞存在比率（frequency）（％）をフローサイトメトリーによって分析し、共培養開始の４８時間後に、ＩＬ−２産生をＥＬＩＳＡによって評価した。
【図１Ｆ】免疫不全ＮＳＧマウスに、尾静脈注射を介して０日目にＣＤ１９＋Ｒａｊｉ−ＥＧＦＰｌｕｃ腫瘍細胞を移植し、続いて、腫瘍注射後４日目に、ＮＴ、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ、又はｉＣ９−ＣＤ１９．ＭＣ．ζで処置した。腫瘍増殖及びＣＡＲ−Ｔ細胞活性を決定するために、約週１回の生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって、マウスを評価した。
【図１Ｇ】免疫不全ＮＳＧマウスに、尾静脈注射を介して０日目にＣＤ１９＋Ｒａｊｉ−ＥＧＦＰｌｕｃ腫瘍細胞を移植し、続いて、腫瘍注射後４日目に、ＮＴ、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ、又はｉＣ９−ＣＤ１９．ＭＣ．ζで処置した。腫瘍増殖及びＣＡＲ−Ｔ細胞活性を決定するために、約週１回の生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって、マウスを評価した。
【図１Ｈ】Ｔ細胞注射後１４日目に、腫瘍ＢＬＩの分析を評価した。＊＊は、Ｐ値＜０．０１を表す。＊＊＊は、Ｐ値＜０．００５を表す。
【図２Ａ】ＣＤ１９、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ共刺激分子、及び誘導性キメラｉカスパーゼ−９安全スイッチポリペプチドを発現するキメラ抗原受容体を発現するために使用され得る構築物の例の概略図を提供する。
【図２Ｂ】フローサイトメトリーデータを提供し、これは、形質導入効率には影響を及ぼさなかったが、ＭＹＤ８８シグナル伝達ドメインを含むことによって、ＣＡＲレベルが低下したことを実証している。
【図２Ｃ】ＣＤ３＋ＣＤ３４＋細胞の割合のグラフを提供する。
【図２Ｄ】図２Ａに示すベクターで形質導入された細胞のＣＤ３４ＭＦＩのグラフを提供する。＊＊＊Ｐ値＜０．００５を表す
【図３Ａ】ＣＤ１９、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ共刺激分子、及び誘導性キメラｉカスパーゼ−９安全スイッチポリペプチドを標的とするキメラ抗原受容体を発現するために使用され得る構築物の例の概略図を提供する。
【図３Ｂ】非形質導入（ＮＴ）及びそれぞれのベクターで形質導入されたＴ細胞を、形質導入効率及びＣＡＲ  ＭＦＩについて比較した。「ＣＤ３（ＭＦＩ）」と標識された点線は、ＮＴ細胞及びｉＣ９−ＣＤ１９．ζＴ細胞上のＣＤ３発現のおよその下限を示す。
【図３Ｃ】４８時間後に、ＮＴ及びｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞を基礎サイトカイン産生について評価した。
【図３Ｄ】抗ＭｙＤ８８、抗カスパーゼ−９、及びｂ−アクチン抗体を使用し、ＮＴ、ｉＭＣ−ＣＤ１９．ζ、及びｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣについてウエスタンブロット分析を行い、ＣＡＲ−ＭＣの融合及び高レベルのｉＣａｓｐ−９発現を実証する。
【図３Ｅ】外因性サイトカイン支持体（１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２）を用いた又は用いない、ＣＡＲ−Ｔ生存及び増殖に対する基礎活性化の寄与を評価するための長期培養を樹立し、これは、ＣＡＲ−ＭＣ基礎活性が、ＩＬ−２の存在下でＴ細胞増殖を駆動するのに十分であることを示している。
【図３Ｆ】リミヅシドによる改変Ｔ細胞の処置前及び処置後のＣＤ３＋ＣＤ３４＋の割合のグラフを提供する。（左：リミヅシドなし（正方形）；右：１０ｎＭリミヅシドあり（円形））。
【図３Ｇ】キメラＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子を発現する改変細胞及び対照細胞におけるＩＬ−２産生のグラフを提供する。（左から右へ、非形質導入細胞（正方形）、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ  １４日目（三角形）、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ  １４日目（逆三角形）、ｉＣ９−ＣＤ１９ζ−ＭＣ  １００日目（円形）。
【図３Ｈ】キメラＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子を発現する改変細胞及び対照細胞におけるＰＤ−１発現のグラフを提供する。（左から右へ：ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ８日目（正方形）、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ８日目（三角形）、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ１００日目（円形）。
【図４Ａ】ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ−ＥＧＦＰｌｕｃ腫瘍細胞を移植したＮＳＧマウスを、７日後に静脈内注射を介して、５×１０６個の非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞又は１．２５×１０６若しくは５×１０６個のｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞で処置した。
【図４Ｂ】腫瘍負荷後７０日間、週１回、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって、腫瘍増殖を評価した。
【図４Ｃ】対照（ＮＴ）及びＣＡＲ−Ｔ処置動物の体重を測定して、ＣＡＲ関連毒性を評価した。５×１０６及び１×１０６個のｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞をそれぞれ享受した後の６日目及び１３日目に、マウスは２０％超の体量減少を示した。この時点で、５ｍｇ／ｋｇのリミヅシドの単回注射を腹腔内投与して、迅速に毒性を解消した。
【図４Ｄ】リミヅシドの投与前及び投与の２４時間後に、ナイーブ（未処置）、ＮＴ、及びＣＡＲ処理における血清サイトカインレベルを評価し、薬剤投与に先んじてより高レベルのｈｌＦＮ−ｙ及びｈｌＬ−６を示し、ｉＣ９安全スイッチの活性化後にバックグラウンドレベルに戻った。
【図４Ｅ】続いて、ナイーブマウス並びにＣＡＲ−Ｔ細胞及びリミヅシドを享受したマウスをＲａｊｉ−ＥＧＦＰｌｕｃ腫瘍細胞で再負荷し、残存のｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変が、腫瘍増殖を効果的に制御することができたことを実証している。
【図４Ｆ】続いて、ナイーブマウス並びにＣＡＲ−Ｔ細胞及びリミヅシドを享受したマウスをＲａｊｉ−ＥＧＦＰｌｕｃ腫瘍細胞で再負荷し、残存のｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変が、腫瘍増殖を効果的に制御することができたことを実証している。
【図４Ｇ】腫瘍再負荷後２５日目に、マウスを犠牲死させ、フローサイトメトリーによってＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ３４＋）の存在について脾細胞を分析し、存在比率について元の産物と比較した。
【図４Ｈ】ＣＡＲ発現（平均蛍光強度；ＭＦＩ）。図４Ｈにおいて、「注入前」は、プリリミヅシドの投与前を示す。＊＊＊は、Ｐ値＜０．００５を表す
【図５Ａ】ＮＳＧマウスにＣＤ１２３＋ＴＨＰ−１−ＥＧＦＰＩｕｃ腫瘍細胞を移植し、続いて、２．５×１０６個の非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞又はｉＣ９−ＣＤ１２３．ζ−ＭＣ−改変Ｔ細胞で処置した。ＢＬＩ測定値（５Ｂ）を用いて週１回腫瘍増殖を評価し、１００日後の生存を評価し（５Ｃ）、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ改変Ｔ細胞と比較して、構成的に活性なＭＣを発現するＴ細胞の堅牢かつ長期の抗腫瘍活性が示された。
【図５Ｂ】ＮＳＧマウスにＣＤ１２３＋ＴＨＰ−１−ＥＧＦＰＩｕｃ腫瘍細胞を移植し、続いて、２．５×１０６個の非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞又はｉＣ９−ＣＤ１２３．ζ−ＭＣ−改変Ｔ細胞で処置した。ＢＬＩ測定値（５Ｂ）を用いて週１回腫瘍増殖を評価し、１００日後の生存を評価し（５Ｃ）、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ改変Ｔ細胞と比較して、構成的に活性なＭＣを発現するＴ細胞の堅牢かつ長期の抗腫瘍活性が示された。
【図５Ｃ】ＮＳＧマウスにＣＤ１２３＋ＴＨＰ−１−ＥＧＦＰＩｕｃ腫瘍細胞を移植し、続いて、２．５×１０６個の非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞又はｉＣ９−ＣＤ１２３．ζ−ＭＣ−改変Ｔ細胞で処置した。ＢＬＩ測定値（５Ｂ）を用いて週１回腫瘍増殖を評価し、１００日後の生存を評価し（５Ｃ）、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ改変Ｔ細胞と比較して、構成的に活性なＭＣを発現するＴ細胞の堅牢かつ長期の抗腫瘍活性が示された。
【図５Ｄ】ＮＳＧマウスにＣＤ１２３＋ＴＨＰ−１−ＥＧＦＰＩｕｃ腫瘍細胞を移植し、続いて、２．５×１０６個の非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞又はｉＣ９−ＣＤ１２３．ζ−ＭＣ−改変Ｔ細胞で処置した。ＢＬＩ測定値（５Ｂ）を用いて週１回腫瘍増殖を評価し、１００日後の生存を評価し（５Ｃ）、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ改変Ｔ細胞と比較して、構成的に活性なＭＣを発現するＴ細胞の堅牢かつ長期の抗腫瘍活性が示された。ＣＤ１９標的化ＭＣ増強ＣＡＲと同様、ｉＣ９−ＣＤ１２３．ζ−ＭＣ発現Ｔ細胞は、ＮＳＧ動物で同様の毒性を示したが、リミヅシドの投与によって、抗腫瘍活性に影響を及ぼすことなく、体重減少を解消することができた。
【図６Ａ】ＮＳＧマウスに非改変ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ腫瘍細胞を移植し、続いて、腫瘍注射後７日目に、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ及びＥＧＦＰｌｕｃレトロウイルスベクターで形質導入された５×１０６個のＴ細胞でＮＳＧマウスを処置した。ＣＡＲ−Ｔ細胞レベルを、リミヅシド（０．００００５、０．０００５、０．００５、０．０５、０．５、及び５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射の前並びに２４時間及び４８時間後にＢＬＩよって評価した。ＣＡＲ−Ｔ細胞ＢＬＩ（６Ｂ）及びリミヅシド処置の２４時間後のＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、及びＴＮＦ−αの血清サイトカインレベル（６Ｃ）を測定した。＊＊、＊＊＊、及び＊＊＊＊は、それぞれ、Ｐ値＜０．０１、０．００５、及び０．００１を表す。
【図６Ｂ】ＮＳＧマウスに非改変ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ腫瘍細胞を移植し、続いて、腫瘍注射後７日目に、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ及びＥＧＦＰｌｕｃレトロウイルスベクターで形質導入された５×１０６個のＴ細胞でＮＳＧマウスを処置した。ＣＡＲ−Ｔ細胞レベルを、リミヅシド（０．００００５、０．０００５、０．００５、０．０５、０．５、及び５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射の前並びに２４時間及び４８時間後にＢＬＩよって評価した。ＣＡＲ−Ｔ細胞ＢＬＩ（６Ｂ）及びリミヅシド処置の２４時間後のＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、及びＴＮＦ−αの血清サイトカインレベル（６Ｃ）を測定した。＊＊、＊＊＊、及び＊＊＊＊は、それぞれ、Ｐ値＜０．０１、０．００５、及び０．００１を表す。
【図６Ｃ】ＮＳＧマウスに非改変ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ腫瘍細胞を移植し、続いて、腫瘍注射後７日目に、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ及びＥＧＦＰｌｕｃレトロウイルスベクターで形質導入された５×１０６個のＴ細胞でＮＳＧマウスを処置した。ＣＡＲ−Ｔ細胞レベルを、リミヅシド（０．００００５、０．０００５、０．００５、０．０５、０．５、及び５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射の前並びに２４時間及び４８時間後にＢＬＩよって評価した。ＣＡＲ−Ｔ細胞ＢＬＩ（６Ｂ）及びリミヅシド処置の２４時間後のＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、及びＴＮＦ−αの血清サイトカインレベル（６Ｃ）を測定した。＊＊、＊＊＊、及び＊＊＊＊は、それぞれ、Ｐ値＜０．０１、０．００５、及び０．００１を表す。
【図７Ａ】動物モデルでの抗腫瘍活性及びサイトカイン関連毒性に対するＣＡＲ−ＭＣ基礎効果の寄与をより良く理解するように、追加のベクターを設計した。ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ（ｉ）及びｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ（ｉｉ）を、高効率２Ａ切断ペプチドを有する構築物（ＧＳＧ−２Ａ）（ｉｉｉ）又はＣＡＲ−ＭＣ融合対形成を排除するためにＭＣを第１の位置に移動させた構築物（ｉｉｉｉ）と比較した。更に、シグナル伝達ドメインを細胞膜に係留する（tethering）ことによって基礎活性を増強するために、ミリストイル化ＭＣドメインを有するベクターを構築した（ｉｖ）。
【図７Ｂ】ＣＡＲ改変Ｔ細胞の基礎活性を、抗原の非存在下でＩＦＮ−γ及びＩＬ−６を測定することによって評価した。
【図７Ｃ】ＣＡＲ−Ｔ増殖を測定するために、Ｔ細胞をＣＡＲベクター及びＥＧＦＰｌｕｃで共形質導入し、続いてＣＤ１９＋Ｒａｊｉ−ｂｅａｒｉｎｇマウスに投与した。
【図７Ｄ】ＣＡＲ−Ｔ増殖を、０日目（Ｔ細胞注射後）、１２日目、及び１９日目に測定した。
【図７Ｅ】ＣＡＲ−Ｔ増殖を、０日目（Ｔ細胞注射後）、１２日目、及び１９日目に測定した。
【図７Ｆ】体量減少を測定することによって、ＭＣに基づくＣＡＲ−Ｔ細胞の毒性を評価した。１０％超の体量減少を示す群を、０．５ｍｇ／ｋｇのリミヅシドの単一注射で処置した。
【図７Ｇ】サイトカイン及びケモカインの血清レベルを、ＣＡＲ−Ｔ細胞注射後７日目に評価した。サイトカイン／ケモカインレベルの変化は、ＣＡＲ−Ｔ注入前試料からの倍率変化として表される。
【図８Ａ】ＣＤ２８及び４−１ＢＢエンドドメインを使用して、ｉＣ９を含む追加のＣＤ１９特異的ＣＡＲ構築物を開発した。マウスにＣＤ１９＋Ｒａｊｉ−ＥＧＦＰｌｕｃ腫瘍細胞を移植し、続いて、腫瘍移植後７日目に、非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞又はＣＡＲ改変Ｔ細胞で処置した。
【図８Ｂ】生物発光イメージングによって腫瘍増殖を毎週測定した。
【図８Ｃ】生物発光イメージングによって腫瘍増殖を毎週測定した。
【図８Ｄ】ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞で処置したマウスを、１２日目に５ｍｇ／ｋｇのリミヅシドで処置して（赤色矢印）、急性のＣＡＲ関連体重減少を解消した。
【図９Ａ】ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ−ＥＧＦＰｌｕｃ腫瘍細胞を移植したＮＳＧマウスを、５×１０６個の非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞又はｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞で処置した。続いて、ＣＡＲ−Ｔ細胞を享受したマウスを、１５％超の体量減少が観察された後に（１５日目）、ｈｌＦＮ−ｙ、ｈｌＬ−６、若しくはｈＴＮＦ−αに対する中和抗体又は対照非特異的アイソタイプ抗体で週２回の腹腔内注射により処置した。対照として、１つの群に、５ｍｇ／ｋｇのリミヅシドを与えて毒性を解消した。
【図９Ｂ】生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって腫瘍増殖を測定し、体量減少を測定することによってＣＡＲ依存性毒性を測定した。
【図９Ｃ】中和抗体サイクルの投与後の−７日目、７日目、及び１４日目に、ｈＴＮＦ−αの血清濃度を測定した。
【図１０Ａ】ＣＤ４＋（高サイトカイン産生細胞）及びＣＤ８＋（低サイトカイン産生）の両方を含むバルク集団を形成する形質導入Ｔ細胞を、ＭＡＣＳカラムを使用して、ＣＤ４又はＣＤ８発現のいずれかについて精製した。
【図１０Ｂ】非形質導入（ＮＴ）、非選択、又はＣＤ４及びＣＤ８選択ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲ発現。
【図１０Ｃ】非選択及び選択ＣＡＲ−Ｔ細胞の純度。
【図１１Ａ】非形質導入（ＮＴ）、非選択（ＣＤ３＋）、ＣＤ４及びＣＤ８選択ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞をＣＤ１９＋Ｒａｊｉ腫瘍細胞と共に培養し、４８時間後にＩＬ−６及びＴＮＦ−α分泌について測定した。
【図１１Ｂ】ＮＴ、非選択、ＣＤ４及びＣＤ８選択ＣＡＲ−Ｔ細胞をＣＤ１９＋Ｒａｊｉ−ＥＧＦＰｌｕｃ細胞に注入し、生物発光イメージングによって腫瘍増殖を測定した。ＣＡＲ−Ｔ注入後に重度の毒性を示すマウスを犠牲死させた。ｉＣ９を活性化するためのリミヅシドを任意の動物に投与しなかった。
【図１１Ｃ】ＮＴ、非選択、ＣＤ４及びＣＤ８選択ＣＡＲ−Ｔ細胞をＣＤ１９＋Ｒａｊｉ−ＥＧＦＰｌｕｃ細胞に注入し、生物発光イメージングによって腫瘍増殖を測定した。ＣＡＲ−Ｔ注入後に重度の毒性を示すマウスを犠牲死させた。ｉＣ９を活性化するためのリミヅシドを任意の動物に投与しなかった。
【図１１Ｄ】４日目に、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ−ＥＧＦＰｌｕｃ腫瘍を有するマウスを６．３×１０５、１．３×１０６、２．５×１０６、又は５×１０６個のＣＤ８選択ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞で処置し、ＢＬＩ及び体量減少について測定した。いずれの群も、ＣＡＲ関連毒性を制御するためのリミヅシドを享受しなかった。
【図１１Ｅ】５×１０６個のＣＤ８選択ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞を享受したマウスの代表的な生物発光画像である。矢印は、頭蓋内腫瘍の後期解像度を示す。＊＊及び＊＊＊＊は、それぞれ、Ｐ値＜０．０１及び０．００１を表す。
【図１２】形質導入細胞及びｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ形質導入細胞における基礎サイトカイン産生のグラフを提供する。各サイトカインについて、左から右に、バーは、非形質導入ＣＤ３＋細胞、非形質導入ＣＤ４＋細胞、非形質導入ＣＤ８＋細胞、ＣＤ３＋形質導入細胞、ＣＤ４＋形質導入細胞、及びＣＤ８＋形質導入細胞を表す。
【図１３Ａ】非形質導入（ＮＴ）細胞及び形質導入細胞のＩＬ−６濃度のグラフである。
【図１３Ｂ】非形質導入（ＮＴ）細胞及び形質導入細胞のＩＬ−１３濃度のグラフである。
【図１３Ｃ】非形質導入（ＮＴ）細胞及び形質導入細胞のＴＮＦ−α濃度のグラフである。
【図１４Ａ】非形質導入又は増加する用量の形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞（グラフの右側の線、上から下に：ＮＴ、０．６２５、１．２５、２．５、及び５×１０６個の形質導入細胞）の投与後における、腫瘍を有するマウスの生物発光のグラフを提供する。
【図１４Ｂ】非形質導入又は増加する用量の形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞（グラフの右側の線、上から下に：０．６２５、２．５又は５、１．２５×１０６個の形質導入細胞；１５日目、上から下に：ＮＴ、１．２５、２．５、０．６２５、及び５×１０６個の形質導入細胞）の投与後のマウス体重のグラフを提供する。
【図１５Ａ】非形質導入Ｔ細胞のＦＡＣｓ分析を提供する。
【図１５Ｂ】ＣＤ３４エピトープを使用してＣＡＲ発現を測定するための、形質導入の５日後における形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞のＦＡＣｓ分析を提供する。
【図１６Ａ】ＣＤ４選択ｉＣ９−Ｈｅｒ２．ζ−ＭＣ形質導入Ｔ細胞のＦＡＣｓ分析を提供する。
【図１６Ｂ】ＣＤ８選択ｉＣ９−Ｈｅｒ２．ζ−ＭＣ形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞のＦＡＣｓ分析を提供する。
【図１７Ａ】非形質導入Ｔ細胞の投与後の腫瘍を有するマウスにおける、カリパスによって測定された腫瘍サイズのグラフを提供する。
【図１７Ｂ】形質導入非選択ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与後の腫瘍サイズのグラフを示す。
【図１７Ｃ】形質導入ＣＤ４選択ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与後の腫瘍サイズのグラフを示す。
【図１７Ｄ】形質導入ＣＤ８選択ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与後の腫瘍サイズのグラフを提供する。
【図１８Ａ】非形質導入Ｔ細胞の投与後の腫瘍を有するマウスにおける、生物発光によって測定された腫瘍サイズのグラフを提供する。
【図１８Ｂ】形質導入非選択ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与後の腫瘍サイズのグラフを示す。
【図１８Ｃ】形質導入ＣＤ４選択ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与後の腫瘍サイズのグラフを示す。
【図１８Ｄ】形質導入ＣＤ８選択ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与後の腫瘍サイズのグラフを提供する。
【図１９Ａ】非形質導入Ｔ細胞の投与後の腫瘍を有するマウスの体重変化のグラフを示す。
【図１９Ｂ】形質導入非選択ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与後の体重変化のグラフを示す。
【図１９Ｃ】形質導入ＣＤ４選択ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与後の体重変化のグラフを示す。
【図１９Ｄ】形質導入ＣＤ８選択ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与後の体重変化のグラフを提供する。
【図２０】非形質導入Ｔ細胞又は形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与後のマウス生存のグラフを提供する（グラフの右側、上から下までの線：非選択、ＣＤ８選択、ＣＤ４選択）。２０日目にｘ軸に接触する線はＮＴである。
【図２１Ａ】非形質導入、非選択形質導入、ＣＤ４選択形質導入、及びＣＤ８選択形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のグラフを提供する。
【図２１Ｂ】非形質導入、非選択形質導入、ＣＤ４選択形質導入、及びＣＤ８選択形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＤ４純度のグラフを提供する。
【図２１Ｃ】非形質導入、非選択形質導入、ＣＤ４選択形質導入、及びＣＤ８選択形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＤ８純度のグラフを提供する。
【図２２Ａ】非形質導入、非選択形質導入、ＣＤ４選択形質導入、及びＣＤ８選択形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与後の腫瘍を有するマウスにおける生物発光の写真を提供する。
【図２２Ｂ】処置マウスの生存率（左から右へのｙ軸に平行な線：ＣＤ４選択、非選択、非形質導入、ＣＤ８選択）のグラフを提供する。
【図２３Ａ】非形質導入細胞を腫瘍を有するマウスに投与した後の体重変化のグラフである。
【図２３Ｂ】非選択形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍を有するマウスに投与した後の体重変化のグラフである。
【図２３Ｃ】ＣＤ４選択ＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍を有するマウスに投与した後の体重変化のグラフである。
【図２３Ｄ】ＣＤ８選択ＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍を有するマウスに投与した後の体重変化のグラフである。
【図２４Ａ】非形質導入細胞を腫瘍を有するマウスに投与した後の腫瘍サイズのグラフである。
【図２４Ｂ】非選択形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍を有するマウスに投与した後の腫瘍サイズのグラフである。
【図２４Ｃ】ＣＤ４選択ＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍を有するマウスに投与した後の腫瘍サイズのグラフである。
【図２４Ｄ】ＣＤ８選択ＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍を有するマウスに投与した後の腫瘍サイズのグラフである。
【図２５】Ａは長期培養後のｉＣ９−ＣＤ１９．ζ及びｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ−改変Ｔ細胞のＦＡＣｓ選別結果を提供する。Ｂは長期培養後のｉＣ９−ＣＤ１９．ζ及びｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ−改変Ｔ細胞サブセット分布のグラフを提供する。
【図２６Ａ】誘導性Ｃａｓｐ−９ポリペプチドと共発現される構成的ＭＣ−ＣＡＲポリペプチドと、第１世代のＣＡＲポリペプチドと共発現される誘導性ＭＣポリペプチドと、を比較した概略図を提供する。
【図２６Ｂ】誘導性Ｃａｓｐ−９ポリペプチドと共発現される構成的ＭＣ−ＣＡＲポリペプチドと、第１世代のＣＡＲポリペプチドと共発現される誘導性ＭＣポリペプチドと、を比較した概略図を提供する。
【図２６Ｃ】ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ腫瘍モデルを使用し、図２６Ａ及び２６Ｂのポリペプチドを発現する改変Ｔ細胞を投与した結果を比較したアッセイの概要及びグラフを提供する。
【図２６Ｄ】ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ腫瘍モデルを使用し、図２６Ａ及び２６Ｂのポリペプチドを発現する改変Ｔ細胞を投与した結果を比較したアッセイの概要及びグラフを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
癌を処置するための免疫療法戦略は、患者の免疫系を増強して、腫瘍細胞を攻撃及び死滅させることを含む。免疫療法のうちの１種は、対象の免疫細胞が収集され、改変されたエクスビボで改変されて、改変細胞が体内に戻された時に特異的かつ標的化された腫瘍細胞死滅を提供する。特定の養子細胞移入は、ＣＡＲ改変Ｔ細胞を使用し、様々な悪性疾患の処置にかなり有望である。この療法では、Ｔ細胞を患者の血液から抽出し、細胞表面上でキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作される。
【００１３】
上記のように、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性は、毒性（すなわち、重症のサイトカイン放出症候群及び神経毒性）に関連する、注入後の堅牢なＣＡＲ−Ｔ細胞増殖に関連するが、ＣＡＲ−Ｔ増殖及び持続性に乏しい患者は、低い長期寛解の割合を示す。本明細書に提示される実施例では、共刺激分子、例えば、ＭｙＤ８８及びＣＤ４０（ＭＣ）からのシグナル伝達は、ＣＡＲ−Ｔ生存、増殖能力、及び抗腫瘍活性を増強することができることが実証されている。重要なことに、実施例の項目でも示されているように、これらの高度に活性なＣＡＲ−Ｔ細胞からのサイトカイン関連毒性は、腫瘍の死滅を安全に最大限にするために誘導性カスパーゼ−９（ｉＣ９）を使用して制御することができる。
【００１４】
いかなる理論にも限定されるものではないが、実施例に記載される研究は、高レベルのサイトカイン（すなわち、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−６）を産生するＣＡＲ−Ｔ細胞の毒性をリミヅシドを使用することによって解消することができることを示している。更に、ＣＡＲ−Ｔ細胞を「部分的に」排除して長期の抗腫瘍効力を維持するように、リミヅシドの用量設定をすることができた。更に、ＣＡＲ−Ｔ分泌されたサイトカインが悪液質の原因であることを見出した際、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の選択は、ＣＤ４＋ヘルパーに依存しない様式で抗腫瘍効果を増加させると共に、より低いレベルの毒性をもたらした。この結果は、異なる抗原標的を有するＣＡＲ−Ｔ細胞を使用した実験にわたって一致した。
【００１５】
一態様では、本明細書に記載される本発明は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の細胞毒性効果を低減しつつ、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞を増強及び維持するための組成物及び方法に関する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＡＲ−Ｔ細胞集団を含む組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞集団は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５、又は９９％の、例えば、特定のマーカー、受容体、又は細胞表面糖タンパク質、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３４などを発現する細胞種を含むように選択され、濃縮され、又は精製される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、共刺激ポリペプチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞集団を含む組成物及び方法を提供する。共刺激ポリペプチドは、誘導性であるか又は構成的に活性化され得る。共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＭｙＤ８８、又はＣＤ４０などの１つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＭｙＤ８８、又はＣＤ４０によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化する１つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。いくつかの実施形態では、共刺激ポリペプチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞集団は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５、又は９９％の、例えば、特定のマーカー、受容体、又は細胞表面糖タンパク質、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３４などを発現する細胞種を含むように選択され、濃縮され、又は精製される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＭｙＤ８８及び／若しくはＣＤ４０を含む共刺激ポリペプチド、又はＭｙＤ８８及び／若しくはＣＤ４０シグナル伝達経路を活性化する任意の好適な細胞質シグナル伝達領域を含むＣＡＲ−Ｔ細胞集団を含む組成物及び方法を提供する。共刺激ポリペプチドは、誘導性であるか又は構成的に活性化され得る。いくつかの実施形態では、共刺激ポリペプチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞集団は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５、又は９９％の、例えば、特定のマーカー、受容体、又は細胞表面糖タンパク質、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３４などを発現する細胞種を含むように選択され、濃縮され、又は精製される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本発明は、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞集団を含む組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、アポトーシス促進ポリペプチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞集団は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５、又は９９％の、例えば、特定のマーカー、受容体、又は細胞表面糖タンパク質、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３４などを発現する細胞種を含むように選択され、濃縮され、又は精製される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本発明は、共刺激ポリペプチド及び誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞集団を含む組成物及び方法を提供する。共刺激ポリペプチドは、誘導性であるか又は構成的に活性化され得る。いくつかの実施形態では、アポトーシス促進ポリペプチド及び共刺激ポリペプチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞集団は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５、又は９９％の、例えば、特定のマーカー、受容体、又は細胞表面糖タンパク質、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３４などを発現する細胞種を含むように選択され、濃縮され、又は精製される。
【００２１】
Ｔ細胞
Ｔ細胞（Ｔリンパ球とも称する）は、リンパ球と称する白血球の群に属する。リンパ球は、細胞媒介性免疫に関与する。「Ｔ細胞」における「Ｔ」は、胸腺に由来するか、又は胸腺によってその成熟が影響される細胞を指す。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体として知られる細胞表面タンパク質の存在により、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの他のリンパ球型と区別することができる。本明細書で使用する場合、「活性化Ｔ細胞」という用語は、例えばクラスＩＩ主要組織適合性（ＭＨＣ）マーカーとの関連で提示されるような抗原決定因子の認識によって免疫応答（例えば、活性化Ｔ細胞のクローン増殖）を生成するよう刺激されたＴ細胞を指す。Ｔ細胞は、抗原決定因子、サイトカイン及び／又はリンホカイン、並びに分化細胞表面タンパク質群（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８など、及びこれらの組み合わせ）の存在によって活性化される。異なるタンパク質群を発現する細胞は、しばしば、Ｔ細胞表面上でのそのタンパク質発現について「陽性である」という（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、又はＣＤ８発現について陽性である細胞をＣＤ３＋、ＣＤ４＋、又はＣＤ８＋と称する）。ＣＤ３及びＣＤ４タンパク質は、Ｔ細胞におけるシグナル伝達に直接及び／又は間接的に関与し得る細胞表面受容体又は共受容体である。
【００２２】
Ｔ細胞は、細胞表面上に提示される抗原を認識する受容体（すなわち、Ｔ細胞受容体）をその表面上に発現する。正常な免疫応答の際、ＭＨＣ抗原提示との関連において、Ｔ細胞受容体にこれらの抗原が結合することにより、細胞内変化が開始され、Ｔ細胞活性化が生じる。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＭＨＣ抗原提示を必要とすることなく、Ｔ細胞に抗原特異性を伝達するように設計された人工の受容体である。これらは、抗原特異的成分、膜貫通構成成分、及びＴ細胞を活性化して、特異的免疫を提供するように選択された細胞内成分を含む。キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞は、癌療法を含む様々な療法において使用され得る。
【００２３】
「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」とは、例えば、Ｔ細胞を活性化して、特異的免疫を提供するように選択された、膜貫通ポリペプチド及び細胞内ドメインポリペプチドに連結された標的抗原（抗原認識ドメイン、抗原認識領域、抗原認識部分、又は抗原結合領域）を認識するポリペプチド配列を含むキメラポリペプチドを意味する。抗原認識ドメインは、抗原に結合する、例えば抗体断片可変ドメインなどの、天然由来又は合成のいずれかの任意のポリペプチド又はその断片であってもよい。抗原認識部分の例には、抗体由来のポリペプチド、例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；Ｔ細胞受容体由来のポリペプチド、例えば、ＴＣＲ可変ドメインなど；パターン認識受容体に由来するポリペプチド、及び細胞外同族タンパク質に結合する任意のリガンド又は受容体断片が含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
「Ｔ細胞活性化分子」とは、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞に組み込まれた時に、Ｔ細胞の活性化を増強するポリペプチドを意味する。例には、ＩＴＡＭを含有するシグナル１を与える分子（ITAM-containing,  Signal  1  conferring  molecule）、例えば、ＣＤ３ζポリペプチド、及びＦｃ受容体γ、例えば、Ｆｃε受容体γ（ＦｃｓＲＩｙ）サブユニット（Ｈａｙｎｅｓ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１８２−７（２００１））．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）が含まれるが、これらに限定されない。細胞内ドメインは、例えば、限定するものではないがＣＤ３ζなどのＴ細胞の活性化を引き起こす少なくとも１つのポリペプチドを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の基本成分は、以下を含む：腫瘍特異的モノクローナル抗体の可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）鎖が、Ｔ細胞受容体複合体由来のＣＤ３ζ鎖（ζ）とインフレームで（in-frame）融合される。ＶＨ及びＶＬは、一般に、フレキシブルなグリシン−セリンリンカーを使用して一緒に接続され、次いで、スペーサー（例えば、ＣＤ８ａストーク（stalk）又はＣＨ２ＣＨ３）によって膜貫通ドメインに結合されて、ｓｃＦｖを細胞表面から離れる方向に延在させて、腫瘍抗原と相互作用することができる。
【００２６】
「キメラ抗原受容体」という用語はまた、抗体由来ではなく、キメラＴ細胞受容体であるキメラ受容体を指し得る。これらのキメラＴ細胞受容体は、標的抗原を認識するポリペプチド配列を含んでもよく、認識配列は、例えば、Ｔ細胞受容体又はｓｃＦｖに由来する認識配列であってもよいが、これらに限定されない。細胞内ドメインポリペプチドは、Ｔ細胞を活性化するように作用するものである。キメラＴ細胞受容体は、例えば、Ｇｒｏｓｓ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｅｓｈｈａｒ，Ｚ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：３３７０−３３７８（１９９２）、及びＺｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ６：１−１３（２０１０）で説明されている。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＡＲ−Ｔ細胞集団を含む組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞集団は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５、又は９９％の、例えば、特定のマーカー、受容体、又は細胞表面糖タンパク質、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３４などを発現する細胞種を含むように選択され、濃縮され、又は精製される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞集団には、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞集団は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５、又は９９％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含むように濃縮される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞集団は、少なくとも８０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含むように濃縮される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞集団は、少なくとも９０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含むように濃縮される。したがって、いくつかの実施形態では、組成物中には、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞が多く、すなわち、ＣＤ８＋細胞に対するＣＤ４＋細胞の比が、１未満、例えば、０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、又は０．５．未満である。
【００２９】
共刺激
いくつかの実施形態では、本発明は、共刺激ポリペプチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞集団を含む組成物及び方法を提供する。
【００３０】
ＣＡＲは、「第１世代ＣＡＲ」としても知られる、単一シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ζを有するものが最初設計されたが（例えば、Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ５８：９１１−９２１；Ｇｏｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６０：９２９−９３９；Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２４−１００２８；Ｋｕｗａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ１４９：９６０−９６８を参照のこと）、ＣＡＲ免疫療法の実行可能性を評価する臨床試験により、臨床的利益が限定的であることが示された（例えば、Ｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ１９：３０４０−３０５０；Ｐｕｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４：１２６４−１２７０；Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １６：１２４５−１２５６；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５：８２５−８３３を参照のこと）。臨床的利益の限定は、主に、腫瘍認識後のＴ細胞の不十分な活性化に起因しており、これは、インビボでの細胞の持続及び増殖の制限をもたらす（例えば、Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １１：８５５−８７３を参照のこと）。
【００３１】
この欠点に対処するために、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ及びＤＡＰ１０を含むＴ細胞共刺激分子の細胞質部分にしばしば由来する別の刺激ドメインを含むように工学的に改変され（例えば、Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６：３３６０−３３６５；Ｆｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１：２７９１−２７９７；Ｈｏｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７：６１２３−６１３１；Ｍａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：７０−７５；Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １８：６７６−６８４；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １８：７１２−７２５；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３：５５６３−５５７４；Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １７：１４５３−１４６４；Ｙｖｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：５８５２−５８６０を参照のこと）、これにより、ＣＡＲ−Ｔ細胞が、標的抗原の結合時に適切な共刺激を受け取ることが可能となる。最も一般的に使用される共刺激分子には、ＣＤ２８及び４−１ＢＢが含まれ、これらは、腫瘍認識後に、ＮＦ−ｋＢ活性化をもたらすシグナルカスケードを開始することができ、これにより、Ｔ細胞増殖及び細胞生存の両方が促進される。難治性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の処置のためのＣＤ２８又は４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを有する抗ＣＤ１９  ＣＡＲを用いて行われた臨床試験により、養子移入後の有意なＴ細胞の持続、増殖、及び連続的な腫瘍死滅が実証された（Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３：９５ｒａ７３；Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５：７２５−７３３；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ５：１７７ｒａ３８）。第３世代ＣＡＲ−Ｔ細胞では、ＯＸ４０及び４−１ＢＢなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリータンパク質由来の追加のシグナル伝達分子を有するＣＤ２８改変ＣＡＲが加わる（Ｆｉｎｎｅｙ  ＨＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：１０４−１３，２００４；Ｇｕｅｄａｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１４）。
【００３２】
いくつかの第２世代及び第３世代のＣＡＲ−Ｔ細胞は、高度に活性化されたＴ細胞によって引き起こされるサイトカインストーム及び腫瘍溶解症候群が原因となって、患者の死亡に関与している。一態様では、本明細書に記載される本発明は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の細胞毒性効果を低減しながら、キメラ抗原受容性Ｔ細胞を増強及び維持するための共刺激ポリペプチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物及び方法に関する。
【００３３】
本発明の共刺激ポリペプチドは、誘導性であるか又は構成的に活性化され得る。共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＭｙＤ８８、又はＣＤ４０、又は例えばこれらの細胞質領域などの１つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＭｙＤ８８、又はＣＤ４０によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化する１つ以上の好適な共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激ポリペプチドには、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーメンバー（すなわち、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ）及びＣＤ２８ファミリーメンバー（ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）のＮＦ−ｋＢ経路、Ａｋｔ経路、及び／又はｐ３８経路を活性化する任意の分子又はポリペプチドが含まれる。２つ以上の共刺激ポリペプチド又は共刺激ポリペプチド細胞質領域が、本明細書に記載の改変Ｔ細胞で発現され得る。
【００３４】
いくつかの実施形態では、共刺激ポリペプチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞集団は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５、又は９９％の、例えば、特定のマーカー、受容体、又は細胞表面糖タンパク質、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３４などを発現する細胞種を含むように選択され、濃縮され、又は精製される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、共刺激ポリペプチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞集団には、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、共刺激ポリペプチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞集団は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５、又は９９％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含むように濃縮される。いくつかの実施形態では、共刺激ポリペプチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞集団は、少なくとも８０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含むように濃縮される。いくつかの実施形態では、共刺激ポリペプチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞集団は、少なくとも９０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含むように濃縮される。したがって、いくつかの実施形態では、組成物中には、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞が多く、すなわち、ＣＤ８＋細胞に対するＣＤ４＋細胞の比が、１未満、例えば、０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、又は０．５．未満である。
【００３６】
ＭｙＤ８８及びＣＤ４０によって提供される共刺激
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞集団は、共刺激ポリペプチドを含む。共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＭｙＤ８８、又はＣＤ４０によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化する１つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。
【００３７】
第２世代ＣＡＲの主な機能の１つは、ＩＬ−２を産生する能力であり、これは、ＣＤ２８又は４−１ＢＢ．３２による、ＣＤ３ζ（シグナル１）及びＮＦ−ｋＢ（シグナル２）による活性化Ｔ細胞転写因子の核因子（ＮＦＡＴ）の活性化を介してＴ細胞の生存及び増殖を支持する。ＮＦ−ｋＢを同様に活性化する他の分子も、ＣＡＲ分子内のＣＤ３ζ鎖と対形成してもよい。１つのアプローチは、樹状細胞（ＤＣ）ワクチンのアジュバントとして最初に開発されたＴ細胞共刺激分子を用いることである（Ｎａｒａｙａｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２１：１５２４−１５３４；Ｋｅｍｎａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０（７）：１４６２−１４７１）。ＤＣの十分な活性化又は許諾（ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ）には、通常、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達が関与する。ＴＬＲシグナル伝達では、ＴＬＲの細胞質ＴＬＲ／ＩＬ−１ドメイン（ＴＩＲドメインと称する）が二量体化し、これにより、細胞質アダプタータンパク質、例えば、骨髄分化一次応答タンパク質（ＭｙＤ８８；完全長のアミノ酸配列については配列番号３５又は配列番号８３を参照のこと、及びこれをコードするヌクレオチド配列については配列番号３６又は配列番号８４を参照のこと）の動員及び会合が生じる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞集団は、ＭｙＤ８８、ＣＤ４０、及び／又はＭｙＤ８８−ＣＤ４０融合キメラポリペプチドによって活性化されるシグナル伝達経路を活性化する１つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含む共刺激ポリペプチドを含む。
【００３９】
ＭｙＤ８８は、ＴＬＲのための汎用性アダプター分子であり、先天性免疫系の重要なシグナル伝達成分であり、外来侵入者に対する警戒を誘発し、免疫細胞の動員及び活性化をプライミングする。ＭｙＤ８８は、先天性及び適応性免疫応答において中心的な役割を果たす細胞質アダプタータンパク質である。このタンパク質は、インターロイキン−１及びＴｏｌｌ様受容体シグナル伝達経路における必須のシグナル変換器として機能する。これらの経路は、多くの炎症性遺伝子の活性化を調節する。コードタンパク質は、Ｎ末端デスドメイン及びＣ末端Ｔｏｌｌ−インターロイキン１受容体ドメインからなる。ＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインは、ＴＬＲとヘテロ二量体化し、他のＭｙＤ８８タンパク質とホモ二量体化することができる。これは、ＭｙＤ８８及びＩＲＡＫキナーゼのアミノ末端におけるデスドメイン（ＤＤ）の相互作用を介してＩＲＡＫファミリーキナーゼの動員及び活性化をもたらし、それにより、ＪＮＫ、ｐ３８  ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）、並びにサイトカイン及びケモカインをコードする遺伝子（並びに他の遺伝子）の発現を誘導する転写因子であるＮＦ−ｋＢの活性化を生じさせるシグナル伝達経路が開始される。ＭｙＤ８８は、ＩＲＡＫＩ、ＩＲＡＫ２、ＩＲＦ７、及びＴＲＡＦ６を介して作用し、ＮＦ−κ−Ｂ活性化、サイトカイン分泌、及び炎症性応答を生じさせる。ＭｙＤ８８はまた、ＩＲＦ１を活性化し、これにより、核への急速な移行をもたらし、ＩＦＮ−β、ＮＯＳ２／ＩＮＯＳ、及びＩＬ１２Ａ遺伝子の効率的な誘導を媒介する。腸上皮細胞におけるＭｙＤ８８媒介シグナル伝達は、腸ホメオスタシスの維持に重要であり、小腸における抗菌性レクチンＲＥＧ３Ｇの発現を制御する。ＴＬＲシグナル伝達はまた、抗原でプライミングされたＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４又はＣＤ４０Ｌ）と相互作用する、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーであるＣＤ４０の発現をアップレギュレートする。
【００４０】
ＣＤ４０は、適応免疫応答の重要な部分であり、その同族ＣＤ４０Ｌとの結合を介してＡＰＣを活性化することを補助し、それにより、より強いＣＴＬ応答を偏在させる。ＣＤ４０／ＣＤ１５４シグナル伝達系は、Ｔ細胞機能及びＢ細胞−Ｔ細胞相互作用における重要な成分である。ＣＤ４０シグナル伝達は、ＴＲＡＦがＣＤ４０の細胞質ドメインに動員されることによって行われるＣＤ４０ホモ二量体の形成及びＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）との相互作用を介して進行し、これにより、ＮＦ−ｋＢ、ＪＮＫ、及びＡＫＴ経路などのいくつかの二次シグナルを伴うＴ細胞活性化が引き起こされる。
【００４１】
生存及び増殖の利点とは別に、ＭｙＤ８８又はＭｙＤ８８−ＣＤ４０融合キメラポリペプチドに基づく共刺激はまた、追加の機能をＣＡＲ改変Ｔ細胞に提供し得る。ＭｙＤ８８シグナル伝達は、Ｔｈ１及びＴｈ１７応答の両方に重要であり、ＩＬ−１を介して作用し、ＣＤ４＋Ｔを調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）駆動阻害に対して耐性にさせる（例えば、Ｓｃｈｅｎｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ４０：７８−９０を参照のこと）。更に、Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、及びプロテインキナーゼＣを介したＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達は、細胞傷害性メディエーターグランザイム及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇ細胞を溶解するパーフォリンのＮＦ−ＫＢ依存性の誘導をもたらす（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８４：５５１０−５５１８）。したがって、ＭｙＤ８８及びＣＤ４０共活性化は、Ｔｒｅｇ細胞の免疫抑制効果に耐性を有するＣＡＲ−Ｔ細胞、固形腫瘍及び他の種類の癌の処置において批判的に重要であり得る機能を与えることができる。
【００４２】
Ｔ細胞を含む免疫細胞中で一緒のＭｙＤ８８及びＣＤ４０は、炎症誘発性サイトカインであるＩ型ＩＦＮをアップレギュレートし、増殖及び生存を促進するために、転写因子に下流で作用することができる。ＣＡＲのＣＤ３ζからのシグナル伝達入力と共に、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０は、強力で多面的な共刺激分子を生じさせる。いくつかの実施形態では、本発明は、ＭｙＤ８８、ＣＤ４０、及び／又はＭｙＤ８８−ＣＤ４０融合キメラポリペプチドによって活性化されるシグナル伝達経路を活性化する１つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含む共刺激ポリペプチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞を提供する。好適な共刺激シグナル伝達領域の例には、ＩＲＡＫ−４、ＩＲＡＫ−１、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、Ａｃｔ、ＪＡＫ３、又はこれらの任意の機能性断片が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の共刺激の１つのアプローチは、ＭｙＤ８８のシグナル伝達要素の融合タンパク質（ＭＣと称される）を発現することである。そのような細胞の生存及び増殖は、キメラ抗原受容体（シグナル１）の一部であるＣＤ３ζによるＮＦＡＴ転写因子（シグナル１）、及びＭｙＤ８８及びＣＤ４０によるＮＦ−ｋＢ（シグナル２）の活性化を介して増強することができる。ＭＣを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化は、膜標的化領域を欠失した細胞質ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ融合タンパク質、並びにＭｙＤ８８／ＣＤ４０を含むキメラ融合タンパク質及び膜標的化領域、例えばミリスチン化領域などで観察される。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、多量体リガンド結合領域、例えばＦＫＢＰ１２ｖ３６、及びＭｙＤ８８ポリペプチド若しくは切断型ＭｙＤ８ポリペプチド、又はＭｙＤ８８−ＣＤ４０若しくは切断型ＭｙＤ８８−ＣＤ４０ポリペプチド（ｉＭＣ）などを含む、誘導性キメラシグナル伝達ポリペプチドを共発現し得る。ＩＭＣ及び第１世代ＣＡＲの両方を発現する細胞は、ｉＭＣ及びＣＡＲを介した腫瘍認識の両方を必要とする完全なＴ細胞活性化を可能にし、これにより、ＩＬ−２産生、ＣＤ２５受容体のアップレユレーション、及びＴ細胞増殖をもたらし、治療効力をＡＰ１９０３によってインビボで制御した。いくつかの実施形態では、誘導性キメラシグナル伝達ポリペプチドは、２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、例えば、４−１ＢＢ及びＣＤ２８など、あるいはＭｙＤ８８、切断型ＭｙＤ８８、ＭｙＤ８８−ＣＤ４０、又は切断型ＭｙＤ８８−ＣＤ４０ポリペプチドではなく、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０からなる群から選択される１つ若しくは２つ以上の共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、誘導性キメラシグナル伝達ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及びＣＡＲをコードする第２のポリヌクレオチドをコードする、核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの５’に位置する。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの３’に位置する。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドをコードする第３ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間に位置する。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、翻訳中又は翻訳後に第１及び第２のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを分離し得る、２Ａポリペプチドである。
【００４４】
ＭｙＤ８８又はＭｙＤ８８ポリペプチドとは、例えば、ｎｃｂｉ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ４６１５として引用されるヒト形態が含まれるがこれに限定されない、骨髄分化一次応答遺伝子８８のポリペプチド産物を意味する。ＭｙＤ８８ポリペプチドの一例は、配列番号８３として示される。ＭｙＤ８８ポリペプチドの別の例は、配列番号３５として示される。「切断型」とは、タンパク質が完全長ではなく、例えばドメインを欠いていてもよいことを意味する。例えば、切断型ＭｙＤ８８は完全長ではなく、例えばＴＩＲドメインを欠いていてもよい。いくつかの実施形態では、切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８の核酸配列によりコードされ、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。「切断型ＭｙＤ８８」をコードする核酸配列とは、切断型ＭｙＤ８８ペプチドをコードする核酸配列を意味し、この用語はまた、リンカーによってコードされた任意のアミノ酸を含む、クローニングのアーチファクトとして添加される任意のアミノ酸をコードする部分を含む核酸配列を指し得る。方法又は構築物が切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを指す場合、方法を使用してもよいし、又は完全長ＭｙＤ８８ポリペプチドなどの別のＭｙＤ８８ポリペプチドを指すように設計された構築物を使用してもよいことが理解される。方法又は構築物が全長ＭｙＤ８８ポリペプチドを指す場合、方法を使用してもよいし、又は切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを指すように設計された構築物を使用してもよい。ＭｙＤ８８ポリペプチドの「機能的に同等である」又は「機能的断片」とは、例えば、ＮＦｋＢ経路を活性化させることにより、細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はＮＫ−Ｔ細胞で発現された時に細胞媒介性腫瘍死滅応答、例えば、Ｔ細胞媒介性応答、ＮＫ細胞媒介性応答、又はＮＫ−Ｔ細胞媒介応答などを増幅することができる、ＴＩＲドメインを欠くかどうかに関わらない切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを指す。切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、例えば、全長ＭｙＤ８８アミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１７２、例えば、配列番号３５又は配列番号８３の残基１〜１７２を含み得る。いくつかの実施形態では、切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、例えば、全長ＭｙＤ８８アミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１５１又は１〜１５５、例えば、配列番号３５又は配列番号８３の残基１〜１５１又は１〜１５５を含み得る。いくつかの実施形態では、切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、例えば、全長ＭｙＤ８８アミノ酸配列のアミノ酸残基１−１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、又は１７１を含み得る。全長ＭｙＤ８８アミノ酸配列の例は、配列番号３５又は配列番号８３として提供される。いくつかの実施形態では、切断型ＭｙＤ８８アミノ酸配列は、全長ＭｙＤ８８アミノ酸配列の連続するアミノ酸残基１７３〜２９６を含まない。いくつかの実施形態では、切断型ＭｙＤ８８アミノ酸配列は、全長ＭｙＤ８８アミノ酸配列の連続するアミノ酸残基１５２〜２９６を含まない。いくつかの実施形態では、切断型ＭｙＤ８８アミノ酸配列は、全長ＭｙＤ８８アミノ酸配列の連続するアミノ酸残基１５６〜２９６を含まない。いくつかの実施形態では、切断型ＭｙＤ８８アミノ酸配列は、全長ＭｙＤ８８アミノ酸配列の連続するアミノ酸残基１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、又は１７２〜２９６を含まない。「全長ＭｙＤ８８アミノ酸配列」とは、例えば配列番号３５又は配列番号８３に対応する全長ＭｙＤ８８アミノ酸配列を意味する。本明細書で提供される実施形態では、細胞外ドメインを欠失した細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、ＭｙＤ８８又は切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド部分の上流又は下流のいずれかに位置し得る。
【００４５】
「キメラシグナル伝達ポリペプチド」という用語は、「キメラ共刺激分子」、「キメラ共刺激ポリペプチド」と互換可能である。
【００４６】
更に、キメラ共刺激分子であるＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ＭＣ）は、多量体リガンド結合領域の非存在下で、バイシストロニック（ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、及びＭＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む）の一部として提供される場合、及びトリシストロニック（ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ＭＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む）の一部として提供される場合、ＣＡＲ−Ｔ細胞の共刺激を提供する。この共刺激は、構成的ＭＣポリペプチドが、ＣＡＲコードポリヌクレオチドの３’、例えば、ＣＤ３ζ領域をコードするＣＡＲヌクレオチド部分の３’に位置する場合に検出された。この共刺激は、ＣＤ３ζコードポリヌクレオチド配列とＭＣコード化ポリヌクレオチド配列との間に２Ａ配列をコードするポリヌクレオチドを含む又は含まない発現ベクターで形質移入又は形質導入されたＣＡＲ−Ｔ細胞で検出された。
【００４７】
「キメラ」、「融合体」、及び「キメラ融合体」という用語は、キメラポリペプチドを作製するために結合された２つ以上のタンパク質（又は２つ以上のタンパク質のうちの１つ以上の部分）を含むポリペプチドを参照して、本明細書において互換的に使用される。２つ以上のタンパク質（又はその一部）は、互いに直接結合されてもよく、ここで、１つのタンパク質（又はその一部）の末端アミノ酸残基が、別のタンパク質（又はその一部）の末端アミノ酸残基に直接結合され、あるいは１つ以上の介在要素（例えば、リンカー若しくはアダプターなどのタンパク質のいずれかの一部ではない１つ以上のアミノ酸、又は非アミノ酸ポリマー）を介して結合されてもよい。例えば、多量体化タンパク質（又はその一部）及び別のタンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質、転写活性化タンパク質、アポトーシス促進タンパク質、又は免疫細胞活性化経路のタンパク質成分）の融合体をコードする核酸から産生されるポリペプチドは、キメラ、融合体、又はキメラ融合ポリペプチドと称し得る。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞集団は、構成的に活性な治療を提供するように設計されたＣＡＲ−Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする第１のポリヌクレオチド及びキメラシグナル伝達ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの５’に位置する。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの３’に位置する。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドをコードする第３ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間に位置する。第３ポリヌクレオチドが第１のポリヌクレオチドの３’及び第２のポリヌクレオチドの５’に位置する場合、リンカーポリペプチドは、翻訳後に無傷のままであってもよく、又は翻訳中若しくは翻訳後に、第１及び第２のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを分離してもよい。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、翻訳中又は翻訳後に第１及び第２のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを分離し得る、２Ａポリペプチドである。高レベルの共刺激は、漏れ（leaky）２Ａ共転写配列、例えばブタテシオウイルス−１（Ｐ２Ａ）に由来するものを使用して、キメラシグナル伝達ポリペプチドからＣＡＲを分離する、代替の作用機構を介して構成的に提供される。例えば漏れ２Ａ配列からの、２Ａの分離が十分でない場合、発現されたキメラシグナル伝達ポリペプチド分子のほとんどは、キメラ抗原受容体ポリペプチドから分離され、細胞質のままであり得、一部の部分又はキメラシグナル伝達ポリペプチド分子は、ＣＡＲに結合又は連結されたままである。
【００４９】
「構成的に活性な」とは、本明細書に示されるように、キメラ刺激分子のＴ細胞活性化活性が、誘導因子の非存在下で活性であることを意味する。本出願における構成的に活性なキメラ刺激分子は、多量体リガンド結合領域又は機能性多量体リガンド結合領域を含まず、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、又は他のＣＩＤによって誘導されない。
【００５０】
いくつかの実施形態では、キメラシグナル伝達ポリペプチドは、切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、及び細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０ポリペプチド、又は２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラシグナル伝達ポリペプチドは、２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、例えば、４−１ＢＢ及びＣＤ２８など、又はＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０からなる群から選択される１つ若しくは２つ以上の共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラシグナル伝達ポリペプチドは、ＭｙＤ８８ポリペプチド又は切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、及びＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４−１  ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、必要な場合に治療のレベルを停止又は低減するための誘導性安全スイッチを含む細胞集団も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞などの免疫細胞は、キメラ抗原受容体、並びに例えば、切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、及び細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０ポリペプチド、又は２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む、キメラシグナル伝達ポリペプチドを発現する。
【００５２】
ＭｙＤ８８及びＣＤ４０ポリペプチドによる、並びに共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含むキメラシグナル伝達ポリペプチドによる、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞における共刺激は、「Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｂｙ  ＭｙＤ８８  ａｎｄ  ＣＤ４０  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」と題する、２０１５年９月１日に出願され、２０１６年３月３日に米国特許出願公開第２０１６／００５８８５７（Ａ１）号として公開された米国特許出願公開第１４／８４２，７１０号、及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  Ａｕｇｍｅｎｔ  ｏｒ  Ａｌｔｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ」と題する、２０１７年５月９日に出願された米国仮特許出願公開第６２／５０３，５６５号で論じられている。
【００５３】
細胞活性化を誘導するのに有用なキメラポリペプチドの非限定的な例、並びに、例えば、発現構築物、ベクターを構築するための方法、及び活性又は機能のアッセイを含む、ＣＡＲ−Ｔ細胞活性化を誘導するための関連する方法もまた、以下の特許及び特許出願に見出すことができ、これらの各々は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＩＮＧ  Ｔ  ＣＥＬＬ  ＰＲＯＬＩＦＥＲＡＴＩＯＮ」と題する、２０１４年３月１３日に出願され、米国特許出願公開第２０１４／０２８６９８７（Ａ１）号として２０１４年９月２５日に公開された米国特許出願公開第１４／２１０，０３４号、２０１４年３月１３日に出願され、２０１４年９月２５日に国際公開第２０１４／１５１９６０号として公開された、Ｓｐｅｎｃｅｒらによる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２６７３４号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＡＣＴＩＶＡＴＩＮＧ  Ｔ  ＣＥＬＬＳ  ＵＳＩＮＧ  ＡＮ  ＩＮＤＵＣＩＢＬＥ  ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥ」と題する、２０１４年２月１３日に出願され、２０１６年２月１８日に米国特許出願公開第２０１６／００４６７００（Ａ１）号として公開された米国特許出願公開第１４／６２２，０１８号、２０１５年２月１３日に出願され、２０１５年８月２０日に国際公開第２０１５／１２３５２７号として公開された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１５８２９号、「ＩＮＤＵＣＥＤ  ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＤＥＮＤＲＩＴＩＣ  ＣＥＬＬＳ」と題する、２００４年２月１８日に出願され、２００４年１０月２１日に米国特許出願公開第２００４／  ０２０９８３６（Ａ１）号として公開され、２００８年６月２９日に米国特許第７，４０４，９５０号として登録された、Ｓｐｅｎｃｅｒらによる米国特許出願公開第１０／７８１，３８４号、２００４年２月１８日に出願され、２００５年３月２４日に国際公開第２００４／０７３６４１  （Ａ３）号として公開された、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００４７５７号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ  ＡＮ  ＩＭＭＵＮＥ  ＲＥＳＰＯＮＳＥ  ＢＹ  ＩＮＤＵＣＩＮＧ  ＣＤ４０  ＡＮＤ  ＰＡＴＴＥＲＮ  ＲＥＣＯＧＮＩＴＩＯＮ  ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ  ＡＮＤ  ＡＤＡＰＴＯＲＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ」と題する、２０１０年１０月２６日に出願され、２０１１年２月１０日に米国特許出願公開第２０１１−００３３３８８（Ａ１）号として公開され、２０１４年４月８日に米国特許第８，６９１，２１０号として登録され、Ｓｐｅｎｃｅｒらによる米国特許出願第１２／４４５，９３９号、２００７年１０月１９日に出願され、２００８年４月２４日に国際公開第２００８／０４９１１３号として公開された、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８１９６３号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ  ＡＮ  ＩＭＭＵＮＥ  ＲＥＳＰＯＮＳＥ  ＢＹ  ＩＮＤＵＣＩＮＧ  ＣＤ４０  ＡＮＤ  ＰＡＴＴＥＲＮ  ＲＥＣＯＧＮＩＴＩＯＮ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＡＤＡＰＴＥＲＳ」と題する、２０１３年２月８日に出願され、２０１４年３月２７日に米国特許出願公開第２０１４／００８７���６８（Ａ１）号として公開され、２０１６年４月１９日に米国特許第９，３１５，５５９号として登録された、Ｓｐｅｎｃｅｒらによる米国特許出願公開第１３／７６３，５９１号、２００９年９月２１日に出願され、２０１０年３月２５日に国際公開第２０１０３３９４９号として公開された、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５７７３８号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＳＯＬＩＤ  ＴＵＭＯＲＳ」と題する、２０１１年４月１４日に出願され、２０１１年１１月２４に米国特許出願公開第２０１１／０２８７０３８（Ａ１）号として公開された、Ｓｌａｗｉｎらによる米国特許出願公開第１３／０８７，３２９号、２０１１年４月１４日に出願され、２０１１年１０月２０日に国際公開第２０１１／１３０５６６号として公開された、Ｓｌａｗｉｎらによる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２５７２号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ  ＯＲ  ＥＬＩＭＩＮＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＣＥＬＬＳ」と題する、２０１５年１２月１４日に出願され、２０１６年６月２３日に米国特許出願公開第２０１６／０１７５３５９（Ａ１）号として公開された、Ｓｐｅｎｃｅｒらによる米国特許出願公開第１４／９６８，８５３号、「ＣＯＳＴＩＭＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＡＮＴＩＧＥＮ  ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ  ＢＹ  ＭＹＤ８８  ＡＮＤ  ＣＤ４０  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ」と題する、２０１６年３月１０日に国際公開第２０１６／０３６７４６号として公開された、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４７９５７号、２０１５年１２月１４日に出願され、２０１６年９月１５日に国際公開第２０１６／１００２４１号として公開された、Ｓｐｅｎｃｅｒらによる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５６４６号、「ＤＵＡＬ  ＣＯＮＴＲＯＬＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＣＥＬＬ  ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ  ＯＲ  ＥＬＩＭＩＮＡＴＩＯＮ」と題する、２０１６年１２月１３日に出願され、２０１７年６月１５日に米国特許出願公開第２０１７／０１６６８７７（Ａ１）号として公開された、Ｂａｙｌｅらによる米国特許出願公開第１５／３７７，７７６号、２０１６年１２月１３日に出願され、２０１７年６月２２日に国際公開第２０１７／１０６１８５号として公開された、Ｂａｙｌｅらによる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６６３７１号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＴＯ  ＡＵＧＭＥＮＴ  ＯＲ  ＡＬＴＥＲ  ＳＩＧＮＡＬ  ＴＲＡＮＳＤＵＣＴＩＯＮ」と題する、２０１８年５月８日に出願され、２０１８年１１月１５日に国際公開第２０１８／２０８８４９号として公開された、Ｂａｙｌｅらによる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３１６８９号、これらの各々は、全ての文章、表、及び図面を含むその全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
安全スイッチ
本発明の遺伝子改変Ｔ細胞は、誘導性自殺遺伝子又は自殺スイッチとしても知られる安全スイッチを表してもよく、これらは、所望する場合、例えば、ＧＶＨＤが発症する場合、インビボでＴ細胞を根絶するために使用することができる。いくつかの例では、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞は、オフターゲット毒性などの有害事象を誘発する患者に提供される。いくつかの治療例では、患者は、キメラ抗原受容体改変細胞を使用した治療中に、陰性症状を経験し得る。いくつかの場合では、これらの治療により、健康な組織に対する非特異的攻撃に一部起因する副作用が生じている。いくつかの例では、治療用Ｔ細胞はもはや必要とされ得ず、又は治療は、特定の時間に対して意図され、例えば、治療用Ｔ細胞は、腫瘍細胞又は腫瘍サイズを減少させるように機能し得、もはや必要とされ得ない。したがって、いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞がまた、誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する、核酸、細胞、及び方法が提供される。例えば、キメラ抗原受容体改変Ｔ細胞の数を減少させる必要がある場合、誘導性リガンドを患者に投与し、それにより、改変Ｔ細胞のアポトーシスを誘導し得る。
【００５５】
これらのスイッチは、Ｔ細胞を根絶することが所望される場合に供給され、細胞死を生じさせる（例えば、壊死又はアポトーシスを誘発することにより）、薬剤などの誘発物に応答する。これらの薬剤は、毒性遺伝子産物の発現を生じさせることができるが、遺伝子改変Ｔ細胞が、薬剤に応答して毒性形態へと変わるタンパク質を既に発現している場合には、より迅速な応答が得られる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、安全スイッチは、二量体化の化学誘導因子を対象に投与することによって誘発することができるアポトーシス促進タンパク質に基づく。アポトーシス促進タンパク質が、二量体化の化学誘導因子に結合するポリペプチド配列に融合される場合、この化学誘導因子の送達により、２つのアポトーシス促進タンパク質が近接することができ、それにより、アポトーシスを誘発する。例えば、カスパーゼ−９は、薬剤リミヅシド（ＡＰ１９０３）に応答して二量体化するように誘導することができる改変ヒトＦＫ結合タンパク質に融合させることができる。ヒトアポトーシス促進タンパク質、例えば、カスパーゼ−９などに基づく安全スイッチの使用により、スイッチを発現する細胞がヒト対象の免疫系によって異物として認識されるリスクが最小限に抑えられる。したがって、対象へのリミヅシドの送達は、カスパーゼ−９スイッチを発現するＴ細胞のアポトーシスを誘発することができる。
【００５７】
カスパーゼ９スイッチは、上記のＤｉ  Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）に記載されている。Ｙａｇｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２３（９）：１４７５−８５、Ｒｏｓｓｉｇｌｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４１７−  ０１８−００３４−１、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｐｈａｒ．２０１４．００２５４、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃａｓｐａｓｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆと題する、２０１６年９月１６日に登録された、米国特許第９，４３４，９３５号、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｓｐａｓｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓと題する、２０１８年３月１３日に登録された、米国特許第９，９１３，８８２号、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓと題する、２０１６年７月１９日に登録された米国特許第９，３９３，２９２号、及びＣａｓｐａｓｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆと題する、２０１５年１１月１９日に公開された特許出願公開第２０１５／０３２８２９２号も参照のこと。自殺スイッチはまた、Ｆａｓ又はＨＳＶチミジンキナーゼに基づいてもよい。
【００５８】
スイッチのリガンド誘導因子の例には、例えば、Ｋｏｐｙｔｅｋ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：３１３−３２１（２０００）ａｎｄ  ｉｎ  Ｇｅｓｔｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍ．＆  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １０：６６７−６７５（２００７）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔ（２００６）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  ６７：４４０−２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，２００７）で論じられているものが含まれる。
【００５９】
安全スイッチに組み込まれるリガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６改変ＦＫＢＰ１２ポリペプチド、若しくはＡＰ１９０３に結合するバリアントポリペプチドを含む他の好適なＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド、又は他の合成ホモ二量体、例えば、ＡＰ２０１８７若しくはＡＰ２０１５などを含んでもよい。バリアントには、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、及びアラニンからなる群から選択されるアミノ酸置換を３６位に有するＦＫＢＰ領域（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９８，９５：１０４３７−１０４４２）が含まれてもよい。リミヅシドとしても知られるＡＰ１９０３（ＣＡＳ索引名：２−ピペリジンカルボン酸，１−［（２Ｓ）−１−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブチル］−，１，２−エタンジイルビス［イミノ（２−オキソ−２，１−エタンジイル）オキシ−３，１−フェニレン［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エステル，［２Ｓ−［１（Ｒ＊），２Ｒ＊［Ｓ＊［Ｓ＊［１（Ｒ＊），２Ｒ＊］］］］］−（９ＣＩ）ＣＡＳ登録番号：１９５５１４−６３−７；分子式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０、分子量：１４１１．６５）は、健康なボランティアで安全であることが証明されている合成分子である（ｌｕｌｉｕｃｃｉ  ＪＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１，４１：８７０−８７９）。
【００６０】
いくつかの実施形態では、安全スイッチ、例えば、上記のＤｉ  Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）で論じられている安全スイッチなどが提供され、これは、内因性カスパーゼ活性化ドメイン及び動員ドメインを欠失した改変ヒトカスパーゼ９（ＣＡＳＰ９）にＳＧＧＧＳリンカーを介して連結された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨ００２  ８１８）の配列からなる。Ｆ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体ＡＰ２０１８７及びＡＰ１９０３（リミヅシド）に対するＦＫＢＰ１２の結合親和性を増加させる。
【００６１】
安全スイッチは、改変された活性、例えば、ホモ二量体リガンドの非存在下における基礎活性の低減などを有する改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含んでもよい。改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、例えば、上記の米国特許第９，９１３，８８２号及び米国特許出願公開第２０１５／０３２８２９２号で論じられ、例えば３３０位のアミノ酸置換（例えば、Ｄ３３０Ｅ若しくはＤ３３０！）、又は例えば４５０位のアミノ酸置換（例えば、Ｎ４０５Ｑ）、並びに、例えばＤ３３０Ｅ−Ｎ４０５Ｑ及びＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑを含む、これらの組み合わせを含んでもよい。
【００６２】
本明細書に提示される二量体化リガンド又は多量体化リガンドなどの医薬組成物の有効量は、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９７％超、又は処置細胞の８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、若しくは１０％未満の治療細胞が死滅するような、カスパーゼ−９発現細胞Ｔ細胞においてアポトーシスを誘導するこの選択された結果を達成する量であろう。この用語はまた、「十分な量」と同義である。死滅した治療細胞の割合を決定するために、任意の適切なアッセイを使用してもよい。アッセイは、二量体化リガンド又は多量体化リガンドの投与前に対象から第１の試料を得る工程と、二量体化リガンド又は多合体化リガンドの投与後に対象から第２の試料を得る工程と、第１及び第２の試料中の治療細胞の数又は濃度を比較して、死滅した治療細胞の割合を決定することと、を含む。本明細書に提供される有効量の特定の組成物は、過度の実験を必要とすることなく、経験的に決定することができる。
【００６３】
細胞死又はアポトーシスを誘導するのに有用なキメラポリペプチドの非限定的な例、及び発現構築物、ベクターを構築するための方法、活性若しくは機能のアッセイを含む、細胞死又はアポトーシスを誘導すること、誘導性キメラポリペプチドを発現する細胞を、エクスビボ若しくはインビボの両方でキメラポリペプチドの多体化領域に結合する多量体化合物又はその薬学的に許容される塩と接触させることによる、キメラポリペプチドを多量体化すること、本明細書に記載の発現ベクター、細胞、若しくは多量体化合物又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること、並びに本明細書に記載の多量体化合物の投与又はその薬学的に許容される塩を誘導性キメラポリペプチドを発現する細胞を投与した対象者に投与することについての関連する方法は、以下の特許及び特許出願にも見出すことができ、それらの各々は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＮＤＵＣＩＮＧ  ＳＥＬＥＣＴＩＶＥ  ＡＰＯＰＴＯＳＩＳと題する、２０１１年５月２０日に出願され、２０１１年１１月２４日に米国特許出願公開第２０１１／０２８６９８０（Ａ１）号として公開され、２０１５年７月２８日に米国特許第９，０８９，５２０号として登録された、米国特許出願公開第１３／１１２，７３９号、ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＣＡＳＰＡＳＥ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦと題する、２０１３年３月１０日に出願され、２０１４年９月１１日に米国特許出願公開第２０１４／０２５５３６０（Ａ１）号として公開され、２０１６年９月６日に米国特許第９，４３４，９３５号として登録された、Ｓｐｅｎｃｅｒらによる米国特許出願公開第１３／７９２，１３５号、２０１４年３月７日に出願され、２０１４年１０月９日に国際公開第２０１４／１６４３８号として公開された、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２２００４号、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＮＤＵＣＩＮＧ  ＰＡＲＴＩＡＬ  ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ  ＵＳＩＮＧ  ＣＡＳＰＡＳＥ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳと題する、２０１４年６月４日に出願され、２０１６年６月２日に米国特許出願公開第２０１６／０１５１４６５（Ａ１）号として公開され、Ｓｌａｗｉｎらによる米国特許出願公開第１４／２９６，４０４号、２０１４年６月４日に出願され、２０１５年２月５日に国際公開第２０１４／１９７６３８号として公開された、Ｓｌａｗｉｎらによる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４０９６４号、ＣＡＳＰＡＳＥ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＨＡＶＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦと題する、２０１５年３月６日に出願され、２０１５年１１月１９日に米国特許出願公開第２０１５／０３２８２９２（Ａ１）号として公開された、米国特許出願公開第１４／６４０，５５３号、２０１５年３月６日に出願され、２０１５年９月１１日に国際公開第２０１５／１３４８７７号として公開された、Ｓｐｅｎｃｅｒらによる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１９１８６号、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＥＬＩＭＩＮＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＣＥＬＬＳと題する、２０１５年１２月１４日に出願され、��０１６年６月１６日に米国特許出願公開第２０１６／０１６６６１３（Ａ１）号として公開された、Ｓｐｅｎｃｅｒらによる米国特許出願公開第１４／９６８，７３７号、２０１５年１２月１４日に出願され、２０１６年６月２３日に国際公開第２０１６／１００２３６号として公開された、Ｓｐｅｎｃｅｒらによる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５６２９号、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ  ＯＲ  ＥＬＩＭＩＮＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＣＥＬＬＳと題する、２０１５年１２月１４日に出願され、２０１６年６月２３日に米国特許出願公開第２０１６／０１７５３５９（Ａ１）号として公開された、Ｓｐｅｎｃｅｒらによる米国特許出願公開第１４／９６８，８５３号、２０１５年１２月１４日に出願され、２０１６年９月１５日に国際公開第２０１６／１００２４１号として公開された、Ｓｐｅｎｃｅｒらによる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５６４６号、ＤＵＡＬ  ＣＯＮＴＲＯＬＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＣＥＬＬ  ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ  ＯＲ  ＥＬＩＭＩＮＡＴＩＯＮと題する、２０１６年１２月１３日に出願され、２０１７年６月１５日に米国特許出願公開第２０１７／０１６６８７７（Ａ１）号として公開された、Ｂａｙｌｅらによる米国特許出願公開第１５／３７７，７７６号、及び２０１６年１２月１３日に出願され、２０１７年６月２２日に国際公開第２０１７／１０６１８５号として公開された、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６６３７１号、これらの各々は、全ての文章、表、及び図面を含むその全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の多量体化合物又はその薬学的に許容される塩は、本質的に、これらの刊行物に提供される例及び本明細書に提供される他の実施例に記載されるように使用され得る。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「薬学的又は薬理学的に許容される」という用語は、動物又はヒトに投与される時、有害、アレルギー、又は他の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」には、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が本明細書で提示されるベクター又は細胞と不適合であることを除いて、治療組成物におけるその使用が企図される。補助活性成分もまた、組成物中に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。
【００６６】
死滅細胞の割合などにおける「死滅する（kill）」又は「死滅（killing）」とは、アポトーシスを測定するための既知の任意の方法を使用して測定される、アポトーシスによる細胞死を意味する。この用語はまた、細胞剥離を指し得る。
【００６７】
濃縮Ｔ細胞集団
いくつかの実施形態では、濃縮細胞集団が提供され、濃縮細胞集団は、特定の比又は割合の１種以上の細胞種を含むように選択されたものである。「細胞集団」又は「改変細胞集団」とは、３つ以上の細胞などの細胞群を意味する。細胞集団は、同じ種類の細胞を含むか若しくは各々が同じマーカーを含む、均質であってもよいし、又は不均質であってもよい。いくつかの例では、細胞集団は、対象から得られた試料に由来し、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、又は任意の組織から調製された細胞を含む。いくつかの例では、細胞集団は、核酸と接触し、核酸は、異種ポリヌクレオチド、例えば、キメラ抗原受容体、誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチド、又は共刺激ポリペプチド、例えば、キメラＭｙＤ８８若しくは切断型ＭｙＤ８８及びＣＤ４０ポリペプチドなどの共刺激ポリペプチドなどをコードするポリヌクレオチドを含む。細胞集団及び改変細胞集団という用語はまた、異種ポリヌクレオチドを含む核酸と接触した元の細胞の子孫を指す。細胞集団は、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５、又は９９％の、特定のマーカー、受容体、又は細胞表面糖タンパク質、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３４などを発現する細胞種を含むように選択され、濃縮され、又は精製されてもよい。いかなる理論にも制限されることを意図するものではないが、いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との増加した比を得るためにＴ細胞集団を濃縮することにより、ＣＡＲ−Ｔ細胞関連サイトカイン放出症候群及び神経毒性のレベルを軽減し得る。
【００６８】
キメラ抗原受容体改変Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）の効力は、養子移入後のインビボでの増殖に依存する。ＣＡＲ−Ｔ増殖を改善するための追加の遺伝的増強は、治療効力を改善するが、ＣＡＲ−Ｔ毒性を増加させるリスクを高め得る。ＣＡＲ−Ｔ細胞、共刺激ポリペプチドを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞、及びＭｙＤ８８又はＭｙＤ８８−ＣＤ４０キメラタンパク質を構成的に若しくは誘導性多量体化領域の制御下のいずれかで発現するＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍を排除するのに有効であるが、急性サイトカイン関連毒性を誘発し得る。細胞毒性の可能性は、対象に投与され得るＣＡＲ−Ｔ細胞の投与量を低減し得る。実施例の項目は、投与前にＣＡＲ−Ｔ細胞を濃縮することによって毒性を回避又は低減させて、増加した濃度のＣＤ８＋Ｔ細胞を有する改変細胞集団を提供し得ることを示す。
【００６９】
Ｔ細胞は、任意の健康なドナーから得ることができる。ドナーは、一般には成人（少なくとも１８歳）であるが、小児は、Ｔ細胞ドナーとしても好適である（（例えば、Ｓｔｙｃｚｙｎｓｋｉ  ２０１８，Ｔｒａｎｓｆｕｓ  Ａｐｈｅｒ  Ｓｃｉ  ５７（３）：３２３−３３０を参照のこと）。ドナーからＴ細胞を得るための好適なプロセスの例は、Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５：１６７３−８３に記載されている。一般的な用語では、Ｔ細胞は、遺伝的改変及び選択を受けたドナーから得られ、次いでレシピエント対象に投与することができる。Ｔ細胞の有用な供給源は、ドナーの末梢血である。末梢血試料は、一般に、白血球が濃縮された試料を提供するために白血球分離（leukapheresis）に供される。この濃縮試料（ロイコパック（leukopak）としても知られる）は、単球、リンパ球、血小板、血漿、及び赤血球を含む様々な血液細胞から構成され得る。白血球は、典型的には、静脈穿刺又はバフィーコート製品と比較して、より高い濃度の細胞を含む。
【００７０】
ＣＤ８＋濃縮Ｔ細胞集団
改変細胞集団における細胞種の選択、濃縮、又は精製は、任意の好適な方法によって達成され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の割合は、フローサイトメトリーによって決定され得る。いくつかの実施例では、ＭＡＣｓカラムが使用され得る。いくつかの実施例では、改変細胞集団は、対象への投与前に凍結及び解凍され、対象への投与前に特定の細胞種の割合又は比率について生存細胞を試験する。形質導入又は形質移入後に、Ｔ細胞を、磁気選択（ＭＡＣＳカラム）によって精製ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に分離した。
【００７１】
組成物は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含み得、理想的には、組成物内の遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団は、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞を含む。白血球中のＣＤ８＋細胞に対するＣＤ４＋細胞の比は、典型的には２超であるが、いくつかの実施形態では、本発明の組成物中の遺伝子改変ＣＤ８＋細胞に対する遺伝子改変ＣＤ４＋細胞の比は、２未満、例えば１．５未満である。いくつかの実施形態では、組成物中には、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞が多く、すなわち、ＣＤ８＋細胞に対するＣＤ４＋細胞の比が、１未満、例えば、０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、又は０．５．未満である。したがって、ドナー細胞から開始し、遺伝子改変Ｔ細胞を産生する全体的な手順は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対してＣＤ８＋細胞Ｔ細胞を濃縮するように設計される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞のうちの６０％以上がＣＤ８＋Ｔ細胞であり、いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞のうちの６５％以上がＣＤ８＋Ｔ細胞である。遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団内では、いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントは、５５〜７５％、例えば、６３〜７３％、６０〜７０％、又は６５〜７１％である。いくつかの実施形態では、例えば、１つの細胞種と別の細胞種との比、例えば、３：２，７：３，４：１，９：１，１９：１、若しくは３９：１、又はそれ以上のＣＤ８＋  Ｔ細胞とＣＤ４＋  Ｔ細胞との比などを含むように選択され、又は濃縮され、又は精製された細胞集団が提供される。いくつかの実施形態では、改変細胞集団は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５、９６、９７、９８、又は９９％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含むように選択され、又は濃縮され、又は精製される。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比は、４対１又は９：１以上である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の共刺激ポリペプチドを含む遺伝子改変ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団について、ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントは、５５〜７５％、例えば、６３〜７３％、６０〜７０％、又は６５〜７１％である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比は、３：２、７：３、４：１、９：１、１９：１、又は３９：１以上である。いくつかの実施形態では、改変細胞集団は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５、９６、９７、９８、又は９９％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含むように選択され、又は濃縮され、又は精製される。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比は、４対１又は９：１以上である。共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＭｙＤ８８、又はＣＤ４０などの１つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含み得る。共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４−１  ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＭｙＤ８８、又はＣＤ４０によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化する１つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＭｙＤ８８及び／若しくはＣＤ４０を含む共刺激ポリペプチド、又はＭｙＤ８８及び／若しくはＣＤ４０シグナル伝達経路を活性化する任意の好適な細胞質シグナル伝達領域を含み、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５、９６、９７、９８、又は９９％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、ＣＡＲ−Ｔ細胞集団を含む組成物及び方法を提供する。共刺激ポリペプチドは、誘導性であるか又は構成的に活性化され得る。いくつかの実施形態では、改変細胞集団は、少なくとも８０％のＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、改変細胞集団は、少なくとも９０％のＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本発明は、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含み、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５、９６、９７、９８、又は９９％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、ＣＡＲ−Ｔ細胞集団を含む組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、改変細胞集団は、少なくとも８０％のＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、改変細胞集団は、少なくとも９０％のＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明は、共刺激ポリペプチド及び誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含み、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５、９６、９７、９８、又は９９％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、ＣＡＲ−Ｔ細胞集団を含む組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、改変細胞集団は、少なくとも８０％のＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、改変細胞集団は、少なくとも９０％のＣＤ８＋Ｔ細胞である。共刺激ポリペプチドは、誘導性であるか又は構成的に活性化され得る。いくつかの実施形態では、共刺激ポリペプチドは、ＭｙＤ８８及び／若しくはＣＤ４０、又はＭｙＤ８８及び／若しくはＣＤ４０シグナル伝達経路を活性化する任意の好適な細胞質シグナル伝達領域を含む。
【００７６】
工学的発現構築物
本明細書では、本発明のキメラ抗原受容体、キメラシグナル伝達ポリペプチド、及び誘導性安全スイッチを発現する発現構築物が提供される。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「ｃＤＮＡ」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を鋳型として使用して調製されたＤＮＡを指すことが意図される。ゲノムＤＮＡ又はゲノム、非加工、若しくは部分的に加工されたＲＮＡ鋳型から重合されるＤＮＡとは対照的に、ｃＤＮＡを使用する利点は、ｃＤＮＡが、対応するタンパク質のコード配列を主に含むことである。非コード領域が最適な発現のために必要とされる場合、又はイントロンなどの非コード領域がアンチセンス戦略で標的化される場合など、完全又は部分的なゲノム配列が使用される場合がある。
【００７８】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、定義された配列を通常有するアミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書で使用する場合、ポリペプチドという用語は、「タンパク質」という用語と交換可能であってもよい。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「発現構築物」又は「導入遺伝子」という用語は、核酸コード配列の一部又は全てを転写することが可能である遺伝子産物をコードする核酸を含み、ベクター中に挿入することができる、任意の種類の遺伝子構築物として定義される。転写物はタンパク質に翻訳されるが、そうである必要はない。特定の実施形態では、発現は、遺伝子の転写及び遺伝子産物へのｍＲＮＡの翻訳の両方を含む。他の実施形態では、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写のみを含む。「治療用構築物」という用語はまた、発現構築物又は導入遺伝子を指すために使用され得る。発現構築物又は導入遺伝子は、例えば、癌などの過剰増殖性疾患又は障害を処置するための治療として使用され得、したがって、発現構築物又は導入遺伝子は、治療用構築物又は予防用構築物である。疾患、障害、又は状態を参照して本明細書で使用する場合、「処置（treatment）」、「処置する（treat）」、「処置される（treated）」、又は「処置する（treating）」という用語は、予防及び／又は治療を指す。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「発現ベクター」という用語は、転写され得る遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターを指す。いくつかの場合では、ＲＮＡ分子は、次いでタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。他の場合には、これらの配列は、例えばアンチセンス分子又はリボザイムの産生において翻訳されない。発現ベクターは、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の転写及び可能性として翻訳に必要な核酸配列を指す、様々な制御配列を含むことができる。転写及び翻訳を調節する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、他の機能も果たす核酸配列を含み得、以下に説明される。
【００８１】
特定の例では、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドは、第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同じベクター、例えば、ウイルス又はプラスミドベクターに含まれる。この第２のポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるようなキメラシグナル伝達ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又はマーカーポリペプチドであってもよい。これらの例では、構築物は、２Ａポリペプチドにより連結された２つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸に作動可能に連結された１つのプロモータを用いて設計され得る。この例では、第１及び第２のポリペプチドは、翻訳中に分離され、２つのポリペプチド、又は漏れ２Ａ、１つ若しくは２つのいずれかのポリペプチドを含む例をもたらす。他の例では、２つのポリペプチドは、同じベクターから別々に発現されてもよく、各核酸は、ポリペプチドのうちの１つをコードするポリヌクレオチドを含むそれぞれの核酸は、別々のプロモータに作動可能に連結される。更に他の例では、１つのプロモータは、２つの別々のＲＮＡ転写物の産生、したがって２つのポリペプチドを指向して、２つのポリヌクレオチドに作動可能に連結されてもよい。一例では、プロモータは双方向性であってもよく、コード領域は、反対方向５’−３’であってもよい。したがって、本明細書に記載の発現構築物は、少なくとも１つ又は少なくとも２つのプロモータを含んでもよい。
【００８２】
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、ウイルスベクター内に含まれる。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、細胞をエクスビボでウイルスベクターと接触させ、いくつかの実施形態では、細胞をインビボでウイルスベクターと接触させることが理解される。したがって、発現構築物は、ベクター、例えば、ウイルスベクター又はプラスミドに挿入させてもよい。提供される方法の工程は、任意の好適な方法を使用して実施され得る。これらの方法には、本明細書に記載される核酸を細胞に形質導入する、形質転換する、又はその他では提供する方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、機能性タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドコード単位として定義される。理解されるように、この機能的用語は、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、及び／又は変異体を発現するか、又は発現するように適合された、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、及びより小さい工学的遺伝子セグメントを含む。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。更に、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。したがって、核酸及びポリヌクレオチドは、本明細書で使用する場合、互換可能である。核酸は、単量体「ヌクレオチド」に加水分解することができるポリヌクレオチドである。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解することができる。本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドには、組み換え手段、すなわち、通常のクローニング技術及びＰＣＲ（商標）などを使用した組み換えライブラリ又は細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、並びに合成手段を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で利用される任意の手段によって得られる全ての核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。更に、ポリヌクレオチドには、ポリヌクレオチドの変異が含まれ、当該技術分野において周知の方法によってヌクレオチド又はヌクレオシドの変異が含まれるが、これらに限定されない。核酸は、１つ以上のポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００８５】
「機能保存的バリアント」は、アミノ酸を極性若しくは非極性特性、サイズ、形状、及び変化を含む同様の性質を有するアミノ酸に置き変えることを含むがこれらに限定されない、タンパク質又は酵素の全体的なコンフォメーショ及び機能を変化させることなく所与のアミノ酸残基が変化したタンパク質又は酵素である。一般に知られている非遺伝的コード（non-genetically  encoded）アミノ酸の多くについての保存的アミノ酸置換は、当該技術分野で周知である。他の非コードアミノ酸ついての保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸の特性と比較した際のそれらの物理的特性に基づいて決定することができる。
【００８６】
保存されているとして示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、同様の機能の任意の２つのタンパク質間のタンパク質又はアミノ酸配列類似性のパーセントが変化してもよく、例えば、アラインメントスキームに従って決定した際に少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、及び少なくとも９５％であり得るように、タンパク質又は酵素において異なっていてもよい。本明細書で言及する時、「配列類似性」とは、ヌクレオチド又はタンパク質配列が関連する程度を意味する。２つの配列間の類似性の程度は、配列同一性及び／又は保存性のパーセントに基づくことができる。本明細書における「配列同一性」とは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列が不変である程度を意味する。「配列アラインメント」とは、類似性の程度を評価する目的で、最大レベルの同一性（及びアミノ酸配列の場合、保存）を達成するために２つ以上の配列を整列させるプロセスを意味する。配列をアラインメントし、類似性／同一性を評価するための多くの方法が、当該技術分野で知られており、例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ法、並びにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、及びＦＡＳＴＡなどである。これらのプログラムのいずれかを使用する場合、設定は、最も高い配列類似性をもたらすように選択されてもよい。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「プロモータ」という用語は、遺伝子の特定の転写を開始するために必要な、細胞の合成機械又は導入合成機械によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。いくつかの実施形態では、プロモータは、発生的に（developmentally）調節されるプロモータである。本明細書で使用する場合、「転写制御下」、「作動可能に連結された」、又は「作動可能に連結された」という用語は、プロモータが、ＲＮＡポリメラーゼの開始及び遺伝子の発現を制御するために核酸に対して正しい位置及び向きにあることとして定義される。いくつかの実施例では、１つ以上のポリペプチドは、「作動可能に連結される」と言われる。一般に、「作動可能に連結された」という用語は、プロモータ配列が第２の配列に機能的に連結されていることを示すことを意味し、プロモータ配列は、第２の配列に対応するＤＮＡの転写を開始及び媒介する。
【００８８】
目的のポリヌクレオチド配列の発現を制御するために使用される特定のプロモータは、標的化細胞中でポリヌクレオチドの発現を指示することができる限り、重要であるとは考えられない。したがって、ヒト細胞が標的化される場合、ポリヌクレオチド配列コード領域は、例えば、ヒト細胞において発現することができるプロモータに隣接し、かつその制御下に配置され得る。一般的に言えば、このようなプロモータは、ヒト又はウイルスプロモータのいずれかを含み得る。本明細書で提供されるＣＡＲ及び他のポリペプチドを発現するために使用されるベクターに適したプロモータが選択され得る。
【００８９】
例えば、発現ベクターがレトロウイルスである様々な実施形態では、適切なプロモータの例は、モロニーマウス白血病ウイルスプロモータである。他の実施形態では、プロモータは、例えば、（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復、Ｂ−アクチン、ラットインスリンプロモータであってもよく、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼは、目的のコード配列の高レベル発現を得るために使用することができる。目的のコード配列の発現を達成するための当該技術分野で周知の他のウイルス若しくは哺乳動物細胞又は細菌ファージプロモータの使用は、発現レベルが所与の目的に十分であるという条件で同様に企図される。周知の特性を有するプロモータを用いることにより、形質移入又は形質転換後における目的のタンパク質の発現レベル及びパターンを最適化することができる。
【００９０】
プロモータ及び他の調節エレメントは、それらが所望の細胞又は組織において機能的であるように選択される。更に、このプロモータの列挙は、網羅的又は限定的であると解釈されるべきではない。本明細書に開示されるプロモータ及び方法と共に使用される他のプロモータ。
【００９１】
本明細書に記載の核酸は、１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドの「５’」若しくは「３’」に位置するか、若しくは別のポリヌクレオチドの「５’」若しくは「３’」で「ある」か、又は「５’」から「３’」の順序で位置しているとして記載され得る。これらの関連における参照の５’から３’は、核酸中のポリヌクレオチドのコード領域の方向を指すものと理解され、例えば、第１のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドの５’に位置し、非切断可能なリンカーポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドと接続されている場合、翻訳産物は、第１、第３、及び第２のポリヌクレオチドの翻訳産物を含む、より大きなポリペプチドのアミノ末端に位置する第１のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドをもたらすであろう。
【００９２】
更に他の例では、２つのポリペプチド、例えば、キメラ刺激分子又はＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原受容体ポリペプチド及び第２のポリペプチドなどは、２つの別々のベクターを使用して細胞中で発現され得る。細胞は、ベクターを用いて共形質移入又は共形質転換されてもよいし、又はベクターは、異なる時間に細胞に導入されてもよい。
【００９３】
ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の順序で変動し得る。例えば、キメラ刺激分子において、ＭｙＤ８８ポリペプチド、ＣＤ４０ポリペプチド、及び任意の追加のポリペプチドの順序は変動し得る。キメラ抗原受容体において、ＭｙＤ８８ポリペプチド、ＣＤ４０ポリペプチド、及び任意の追加のポリペプチド、例えば、ＣＤ３ζポリペプチドなどの順序は変動し得る。様々なドメインの順序は、最適な発現及び活性を得るための例えば本明細書で論じられるものなどの方法を使用して分析し得る。
【００９４】
いくつかの実施形態では、発現構築物がＭｙＤ８８ポリペプチドをコードする場合、ポリペプチドは、全長ＭｙＤ８８ポリペプチドの一部であってもよい。ＭｙＤ８８又はＭｙＤ８８ポリペプチドは、例えばＮＣＢＩＧｅｎｅＩＤ  ４６１５として引用されるヒト形態が含まれるがこれらに限定されない、骨髄分化一次応答遺伝子８８のポリペプチド産物を意味する。いくつかの実施形態では、発現構築物は、ＴＩＲドメインを欠失したＭｙＤ８８ポリペプチドの一部をコードする。いくつかの実施形態では、発現構築物は、ＤＤ（デスドメイン）又はＤＤ及び中間ドメインを含むＭｙＤ８８ポリペプチドの一部をコードする。「切断型」とは、タンパク質が完全長ではなく、例えばドメインを欠いていてもよいことを意味する。例えば、切断型ＭｙＤ８８は完全長ではなく、例えばＴＩＲドメインを欠いていてもよい。いくつかの実施形態では、切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列又はその機能的に等価な断片を有する。いくつかの実施形態では、切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８のヌクレオチド配列又はその機能的に等価な断片によってコードされる。ＭｙＤ８８ポリペプチドの機能的に等価な部分は、配列番号２７のポリペプチドと実質的に同じ細胞内シグナル伝達を刺激する能力を有し、配列番号２７のポリペプチドの活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％を有する。いくつかの実施形態では、発現構築物は、ｐＭ００６、ｐＭ００７、又はｐＭ００９のＭｙＤ８８ポリペプチドコードヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドなどのＴＩＲドメインを欠失したＭｙＤ８８ポリペプチドの一部をコードする。「切断型ＭｙＤ８８」をコードする核酸配列とは、切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドをコードする核酸配列を意味し、この用語は、リンカーによってコードされた任意のアミノ酸を含む、クローニングのアーチファクトとして添加される任意のアミノ酸をコードする部分を含む核酸配列を指し得る。
【００９５】
方法又は構築物が切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを指す場合、方法を使用してもよいし、又は完全長ＭｙＤ８８ポリペプチドなどの別のＭｙＤ８８ポリペプチドを指すように設計された構築物を使用してもよいことが理解される。方法又は構築物が全長ＭｙＤ８８ポリペプチドを指す場合、方法を使用してもよいし、又は切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを指すように設計された構築物を使用してもよい。キメラポリペプチドが、ＭｙＤ８８ポリペプチド（又はその一部）及びＣＤ４０ポリペプチド（又はその一部）を含む本明細書の方法において、キメラポリペプチドのＭｙＤ８８ポリペプチドは、ＣＤ４０ポリペプチドの上流又は下流のいずれかに位置し得る。特定の実施形態では、ＭｙＤ８８ポリペプチド（又はその一部）は、ＣＤ４０ポリペプチド（又はその一部）の上流に位置する。本明細書で使用する場合、「機能的に等価な」という用語は、例えば、これがＭｙＤ８８又はその一部に関連する場合には、細胞シグナル伝達応答を刺激するＭｙＤ８８ポリペプチド、又はそのようなＭｙＤ８８ポリペプチドをコードする核酸を指す。「機能的に等価な」とは、例えば、ＴＩＲドメインを欠失したが細胞シグナル伝達応答を刺激することができるＭｙＤ８８ポリペプチドを指す。
【００９６】
特定の実施形態では、改変細胞集団は、キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ刺激分子が、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、及び（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、キメラ刺激分子は、膜標的化領域を含まない、第１のポリヌクレオチド、及び
ｂ）Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体ベースのキメラ抗原受容体、又はキメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチド、並びに
ｃ）多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第３ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含む核酸分子を含む。ポリヌクレオチドの順序は、変動し得、任意の特定の方法のための構築物の好適性を決定するために試験し得、したがって、核酸は、様々な順序でポリヌクレオチドを含み得、第１のポリヌクレオチドにおけるＭｙＤ８８ポリペプチド又は切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドコード配列及びＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域コード配列の順序の変動も考慮に入れることが理解される。したがって、第１のポリヌクレオチドは、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０、切断型ＭｙＤ８８／ＣＤ４０、ＣＤ４０／ＭｙＤ８８、又はＣＤ４０／切断型ＭｙＤ８８の順序を有するポリペプチドをコードし得る。また、核酸は、以下の順序のいずれかで第１〜第３のポリヌクレオチドを含み得、１、２、３は、５’から３’方向での核酸中のポリヌクレオチドの第１、第２、又は第３の順序を示す。例えば、２Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの他のポリヌクレオチドが、３つの列挙されたポリヌクレオチドの間に存在し得ることが理解される。この表は、第１〜第３ポリヌクレオチドの順序を指定することを意味する。
【００９７】
【表１】
2021505139.tif 000003
【００９８】
同様に、核酸は、上記の表に提供される２つのポリペプチドをコードする、２つのポリヌクレオチドのみを含み得る。いくつかの例では、細胞は、上記の表１に含まれる３つのポリヌクレオチドを含む核酸で形質移入又は形質導入される。他の例では、細胞は、例えば表２に提供される、２つのポリペプチドをコードする２つのポリヌクレオチドをコードする核酸で形質移入又は形質導入される。
【００９９】
【表２】
2021505139.tif 000004
【０１００】
いくつかの実施形態では、細胞は、２つのポリヌクレオチドをコードする核酸で形質移入又は形質導入され、細胞はまた、第３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む。例えば、細胞は、第１及び第２のポリヌクレオチドを含む核酸を含み得、細胞はまた、キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み得る。細胞はまた、第１及び第３のポリヌクレオチドを含む核酸を含み得、細胞はまた、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体ベースのキメラ抗原受容体、又はキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み得る。
【０１０１】
提供される方法の工程は、任意の好適な方法を使用して実施され得る。これらの方法には、本明細書で提供される、核酸を細胞に形質導入する、形質転換する、又はその他では提供する方法が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、切断型ＭｙＤ８８ペプチドは、配列番号２８のヌクレオチド配列によりコードされる（ＤＮＡリンカーを有する若しくは有しない、又は配列番号２７のアミノ酸配列を有する）。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域は、配列番号３０のポリヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１０２】
ベクター
本明細書で提供されるベクターは、領域の位置又は順序を変えて１つの領域を別のものに置換するために、当該技術分野で既知の方法を使用して改変され得ることが理解される。例えば、切断型ＭＣを含むキメラシグナル伝達ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、１つ又は２つ以上の共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０からなる群から選択されるものなどを含む、キメラシグナル伝達ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで置換されてもよい。ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドはまた、ｓｃＦｖ領域が同じ又は異なる標的特異性を有するもので置換され得るように改変されてもよく、膜貫通領域は、異なる膜貫通領域で置換されてもよく、ストークポリペプチドが付加されてもよい。マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つのポリペプチドに含まれるか、又はこれとは別々であってもよく、安全スイッチをコードする追加のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが付加されてもよく、リンカーポリペプチド若しくは非コードポリヌクレオチド又はスペーサーをコードするポリヌクレオチドが付加されてもよく、又はポリヌクレオチド５’から３’の順序は変更されてもよい。
【０１０３】
本出願で提供されるベクターは、例えば、キメラ抗原受容体の領域、例えば、ＣＤ１９特異的ｓｃＦＶ、又は他の標的抗原、例えば、ＣＤ３３、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、及びＥＧＦＲｖｌｌｌなどに対するｓｃＦｖと共に提供される他のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを置換するために、本明細書に説明されるように改変されてもよい。ベクターはまた、本明細書で論じられる各ポリペプチド領域の適切な置換により改変されてもよい。ベクターは、誘導性カスパーゼ−９安全スイッチ（１）を除去して、誘導性カスパーゼ−９安全スイッチをＭｙＤ８８−ＣＤ４０ポリペプチドの３’の位置（＊＊）に位置させるか、誘導性カスパーゼ−９安全スイッチを異なる誘導性カスパーゼポリペプチドベースのスイッチで置換するか、又は誘導性カスパーゼ−９安全スイッチを異なるポリペプチド安全スイッチで置換するように改変されてもよい。
【０１０４】
本明細書で提供されるベクターは、ＭｙＤ８８−ＣＤ４０（ＭＣ）部分を、１つ又は２つ以上の共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０からなる群から選択されるものなどで置換するために改変されてもよい。共刺激ポリペプチドは、本明細書で提供されるアミノ酸配列を含んでもよく、欠失又は切断を含む機能保存的変異を含んでもよく、本明細書で提供されるアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。
【０１０５】
本明細書で提供されるベクターは、リンカー配列をコードするポリヌクレオチドを置換するために改変されてもよく、リンカーポリペプチドは、ＣＡＲポリペプチドとＭＣポリペプチド又は他の共刺激ポリペプチドとの間で２Ａポリペプチドではない。例えば、本明細書で提供される核酸は、ＭＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はＣＡＲのＣＤ３ζ部分をコードするポリヌクレオチドの共刺激ポリペプチドシグナル伝達領域３’を含んでもよく、２つのポリヌクレオチドは、２Ａリンカーをコードするポリヌクレオチドによって分離されているか、又は２つのポリヌクレオチドは、２Ａリンカーをコードするポリヌクレオチドによって分離されていない。いくつかの実施形態では、２つのポリヌクレオチドは、例えば、約５〜２０個のアミノ酸又は例えば、約６〜１０個のアミノ酸を有するリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって分離されてもよく、リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチド配列を含まない。
【０１０６】
選択マーカー
特定の実施形態では、発現構築物は、発現構築物内にマーカーを含ませることによって、発現がインビトロ又はインビボで同定される核酸構築物を含む。このようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を付与し、発現構築物を含む細胞を容易に同定することを可能にする。通常、薬物選択マーカーを含むことは、クローニング及び形質転換体の選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、及びヒスチジンに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。あるいは、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）などの酵素が使用される。細胞外非シグナル伝達ドメイン又は様々なタンパク質（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＬＮＧＦＲ）を含む免疫学的表面マーカーを使用することができ、磁気又は蛍光抗体媒介選別のための直接的な方法を可能にする。使用される選択マーカーは、遺伝子産物をコードしている核酸と同時に発現することができる限り、重要であるとは考えられない。選択マーカーの更なる例には、例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β−ｇａｌ、又はクロラムフェニコールアセチルトランスェラーゼ（ＣＡＴ）などのレポーターが含まれる。特定の実施形態では、例えばＣＤ１９などのマーカータンパク質は、例えば免疫磁性選択などの輸血のための細胞の選択に使用される。本明細書で論じるように、ＣＤ１９マーカーは、抗ＣＤ１９抗体、又は例えば、ｓｃＦｖ、ＴＣＲ、若しくはＣＤ１９に結合する他の抗原認識部分と区別される。
【０１０７】
特定の実施形態では、マーカーポリペプチドは、誘導性キメラ刺激分子に連結される。例えば、マーカーポリペプチドは、例えば切断可能な２Ａ様配列などのポリペプチド配列を介して誘導性キメラ刺激分子に連結されてもよい。
【０１０８】
本明細書で提供されるＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現する発現ベクター上に存在する、又はいくつかの実施形態では、例えば、ＣＡＲと共発現されるＣａｓｐ９などのアポトーシス促進ポリペプチド安全スイッチなどのＣＡＲ以外のタンパク質をコードする発現ベクター上に存在する、細胞表面導入遺伝子マーカーを発現してもよい。
【０１０９】
一実施形態では、細胞表面導入遺伝子マーカーは、細胞質内ドメインの大部分を除去するためにアミノ酸３３３で切断されたヒトＣＤ１９を含む、上記の切断型ＣＤ１９（ΔＣＤ１９）ポリペプチド（Ｄｉ  Ｓｔａｓｉｅｔ  ａｌ．（２０１１）である。細胞外ＣＤ１９ドメインは、（例えば、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、又はＭＡＣＳで）依然として認識することができるが、細胞内シグナル伝達を誘発する可能性は最小となる。ＣＤ１９は、通常、Ｔ細胞ではなくＢ細胞によって発現され、したがって、ＣＤ１９＋Ｔ細胞の選択により、遺伝子改変Ｔ細胞が未改変ドナーＴ細胞から分離されることが可能となる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、例えば、細胞の選別を補助するために発現ベクターによってコードされるＣＡＲに含まれてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキメラ抗原受容体又はキメラ刺激分子を発現するために使用される発現ベクターは、１６個のアミノ酸のＣＤ３４最小エピトープをコードするポリヌクレオチドを更に含む。本明細書の実施例で提供される特定の実施形態などのいくつかの実施形態では、ＣＤ３４最小エピトープは、ＣＤ８ストークのアミノ末端位置に組み込まれる。
【０１１１】
リンカーポリペプチド
リンカーポリペプチドには、例えば、切断可能及び切断不可能なリンカーポリペプチドが含まれる。切断不可能なポリペプチドには、例えば、ＭｙＤ８８−ＣＤ４０キメラポリペプチド、ＭｙＤ８８ポリペプチド、ＣＤ４０ポリペプチド、又は共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域とキメラ抗原受容体のＣＤ３ζ部分との間に作動可能に連結されてもよい任意のポリペプチドが含まれてもよい。リンカーポリペプチドには、例えば、約２〜約３０個のアミノ酸（例えば、フリン切断部位（ＧＧＧＧＳ）ｎ）からなるものが含まれる。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、約１８〜２２個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、２０個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーには、集団中の改変細胞に対して外因性の酵素により、例えば、形質移入又は形質導入によって細胞に導入されるポリヌクレオチドによってコードされる酵素により、リンカーをコードするポリヌクレオチドと同時に又は異なる時のいずれかで切断されるリンカーが含まれる。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーには、例えば、細胞内で天然に発現される酵素、及び例えばリゾチームなどの細胞にネイティブなポリヌクレオチドによってコードされる酵素を含む、集団中の改変細胞に対して内因性の酵素により切断されるリンカーが含まれる。
【０１１２】
２Ａペプチド結合−スキッピング配列
２Ａ様配列又は「ペプチド結合−スキッピング」２Ａ配列は、例えば、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ由来を含む多くの異なるウイルスに由来する。これらの配列は、時には「ペプチドスキッピング配列」としても既知である。この種の配列が、分離されることが意図される２つのポリペプチド間のシストロン内に配置されると、リボソームは、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ配列の場合には、ペプチド結合をスキッピングする（skip）ようである。カルボキシ末端におけるＧｌｙ及びＰｒｏアミノ酸との結合「Ｐ−Ｇ−Ｐ」は省略される。これは、２〜３つのポリペプチド、例えば、誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチド及びキメラ抗原受容体、又は例えばマーカーポリペプチド及び誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドを放出し得る。この配列が使用される場合、２Ａ配列の５’でコードされているポリペプチドは、Ｇｌｙ残基及び２Ａ配列中の任意の上流残基を含む、カルボキシ末端における追加のアミノ酸で終結してもよい。２Ａ配列の３’でコードされているペプチドは、Ｐｒｏ残基及び２Ａ配列に続く任意の下流残基を含む、アミノ末端における追加のアミノ酸で終結してもよい。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、ブタテシオウイルス−１（Ｐ２Ａ）由来の２Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態では、２Ａ共翻訳配列は、２Ａ様配列である。いくつかの実施形態では、２Ａ共翻訳配列は、Ｔ２Ａ（thosea  asignaウイルス２Ａ）、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）、Ｐ２Ａ（ブタテシオウイルス−１  ２Ａ）、ＢｍＣＰＶ  ２Ａ（多角体病（cytoplasmic  polyhedrosis）ウイルス２Ａ）、ＢｍＩＦＶ  ２Ａ（Ｂ  ｍｏｒｉ  ２Ａの軟化病（flacherie）ウイルス）、又はＥ２Ａ（ウマ鼻炎（equine  rhinitis）ウイルス２Ａ）である。いくつかの実施形態では、２Ａ共翻訳配列は、Ｔ２Ａ−ＧＳＧ、Ｆ２Ａ−ＧＳＧ、Ｐ２Ａ−ＧＳＧ、又はＥ２Ａ−ＧＳＧである。いくつかの実施形態では、２Ａ共翻訳配列は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される。「切断可能なリンカー」とは、リンカーが、例えば、ペプチドスキッピングなどの非酵素的手段又は酵素手段を含む任意の手段によって切断されることを意味する。（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ＭＬ  ２００１，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０１３−２５）。
【０１１３】
２Ａ様配列は、ポリペプチドの一部が翻訳中に分離されず、その代わりに、翻訳後に１つの長いポリペプチドとして残存するという点で、「漏れる（leaky）」場合がある。漏れリンカーの原因に関する１つの理論は、短い２Ａ配列が、リボソームスキッピング（「２Ａ折り畳み」）を促進するのに必要な構造に折り畳まれなくてもよいことである。これらの場合では、リボソームは、プロリンペプチド結合を見逃すことはなく、次いでこれにより融合タンパク質がもたらされる。漏れのレベルを低下させ、したがって、形成する融合タンパク質の数を減少させるために、ＧＳＧ（又は類似の）リンカーは、２Ａポリペプチドのアミノ末端側に添加されてもよい。ＧＳＧリンカーは、新たに翻訳されたポリペプチドの二次構造が、「２Ａの折り畳み」を自発的に折り畳むこと及び壊すことを阻止する。
【０１１４】
特定の実施形態では、２Ａリンカーは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、２Ａリンカーに、ポリペプチドのアミノ末端においてＧＳＧアミノ酸配列を更に含み、他の実施形態では、２Ａリンカーは、ポリペプチドのアミノ末端においてＧＳＧＰＲアミノ酸配列を含む。したがって、「２Ａ」配列の用語は、本明細書に記載される例において２Ａ配列を指してもよいし、又はリンカーのアミノ末端においてＧＳＧ又はＧＳＧＰＲ配列を更に含む本明細書に列挙される２Ａ配列を指してもよい。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、リンカー、例えば、２Ａリンカーは、キメラ抗原受容体の約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は９９％で切断され、すなわち、キメラ抗原受容体部分は、キメラＭｙＤ８８及びＣＤ４０、ＭｙＤ８８ポリペプチド、ＣＤ４０ポリペプチド、又は共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、例えばＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢなどから分離される。他の実施形態では、２Ａリンカーは、キメラ抗原受容体の約７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は９９％で切断される。いくつかの実施形態では、２Ａリンカーは、キメラ抗原受容体の約８０〜９９％で切断される。いくつかの実施形態では、２Ａリンカーは、キメラ抗原受容体の約９０％で切断される。いくつかの実施形態では、構成的活性キメラ抗原受容体ポリペプチドは、改変細胞中に存在し、２Ａリンカーは切断されず、すなわち、キメラ抗原受容体部分は、キメラＭｙＤ８８及びＣＤ４０に連結され、ＭｙＤ８８ポリペプチド、ＣＤ４０ポリペプチド、又はＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢなどの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域は、キメラ抗原受容体ポリペプチドの約１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％を表す。他の実施形態では、２Ａリンカーは、キメラ抗原受容体の約５、１０、１５、２０、又は２５％で切断されない。いくつかの実施形態では、２Ａリンカーは、キメラ抗原受容体の約５〜２０％で切断されない。いくつかの実施形態では、２Ａリンカーは、キメラ抗原受容体の約１０％で切断されない。
【０１１６】
膜標的化
膜標的化配列は、細胞表面膜へのキメラタンパク質の輸送を提供し、同じ又は他の配列は、細胞表面膜へのキメラタンパク質の結合をコードすることができる。細胞膜に関連する分子は、膜会合を促進する特定の領域を含み、そのような領域は、キメラタンパク質分子に組み込まれて膜標的分子を生成することができる。例えば、いくつかのタンパク質は、アシル化されたＮ末端又はＣ末端に配列を含み、これらのアシル部分は膜会合を促進する。このような配列は、アシルトランスェラーゼによって認識され、しばしば、特定の配列モチーフに従う。特定のアシル化モチーフは、単一アシル部分で改変する（続いて、しばしば、いくつかの正に荷電した残基（例えば、ヒトｃ−Ｓｒｃ：Ｍ−Ｇ−Ｓ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ）により改変されて、アニオン性脂質頭基との会合を改善する）ことが可能であり、その他は、複数のアシル部分で改変することができる。例えば、タンパク質チロシンキナーゼＳｒｃのＮ末端配列は、単一のミリストイル部分を含むことができる。二重アシル化領域は、特定のタンパク質キナーゼ、例えば、Ｓｒｃファミリーメンバーのサブセット（例えば、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ）及びＧタンパク質αサブユニットのＮ末端領域内に位置する。このような二重アシル化領域は、しばしば、そのようなタンパク質の第１の１８個のアミノ酸内に位置し、配列モチーフＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓに従い、ここで、Ｍｅｔは切断され、ＧｌｙはＮ−アシル化され、Ｃｙｓ残基のうちの１つは、Ｓ−アシル化される。Ｇｌｙは、しばしばミリスチン化され、Ｃｙｓは、パルミトイル化され得る。Ｇタンパク質γサブユニット及び他のタンパク質（例えば、ワールドワイドウェブアドレスｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ＤｉｓｐｌａｙｌｐｒｏＥｎｔｒｙ？ａｃ＝ＩＰＲ００１２３０）のＣ末端由来のＣ１５又はＣ１０イソプレニル部分で改変することができる、配列モチーフＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ（いわゆる「ＣＡＡＸボックス」と称する）とに従うアシル化領域も利用することができる。これら及び他のアシル化モチーフは、例えば、Ｇａｕｔｈｉｅｒ−Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  １５：２２０５−２２１７（２００４）；Ｇｌａｂａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：６９７−７００（１９９４）及びＺｌａｋｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１０：６７３−６７９（１９９７）に論じられており、キメラ分子中に組み込まれて膜局在化を誘導することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含むキメラポリペプチドは、膜標的化領域、及び任意選択で、多量体リガンド結合領域を含み、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキメラＭｙＤ８８、キメラ切断型ＭｙＤ８８、キメラＭｙＤ８８−ＣＤ４０、又はキメラ切断型ＭｙＤ８８−ＣＤ４０ポリペプチドは、膜標的化領域、及び任意選択で、多量体リガンド結合領域を含む。いくつかの実施形態では、膜標的化領域は、ミリスチン化領域を含む。いくつかの実施形態では、膜標的化領域は、ミリスチン化標的化配列、パルミトイル化標的化配列、プレニル化配列（すなわち、ファルネシル化、ゲラニル−ゲラニル化、ＣＡＡＸボックス）、タンパク質−タンパク質相互作用モチーフ、又は膜貫通配列（シグナルペプチドを利用する）からなる群から選択される。例には、例えば、ｔｅｎ  Ｋｌｏｏｓｔｅｒ  ＪＰ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（２００７）９９，１−１２，Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１：９３６−４０，１０９８（２００３）に論じられているものが含まれる。
【０１１７】
ポリペプチドが膜標的化領域を含まないか、又は本明細書で提供される特定のキメラポリペプチドなどの膜標的化領域を欠失している場合、ポリペプチドは、細胞膜へのキメラタンパク質の輸送を提供する領域を含まない。ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドを細胞表面膜に輸送する配列を含まなくてもよく、又はポリペプチドは、例えば、ポリペプチドを細胞表面膜に輸送しない機能不全膜標的化領域、例えば、ミリスチン化標的化領域の機能を破壊するプロリンを含むミリスチン化領域（例えば、Ｒｅｓｈ，Ｍ．Ｄ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４５１：１−１６（１９９９）を参照のこと）を含んでもよい。膜に輸送されないポリペプチドは、細胞質ポリペプチドであるとみなされる。
【０１１８】
キメラ抗原受容体
抗原認識部位
「抗原認識部分」は、抗原に結合する天然由来又は合成のいずれかの任意のポリペプチド又はその断片、例えば、抗体断片可変ドメインなどであってもよい。抗原認識部分の例には、抗体由来のポリペプチド、例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；Ｔ細胞受容体由来のポリペプチド、例えば、ＴＣＲ可変ドメインなど；シグナル伝達ドメイン（例えば、ジトカイン（zytokine）、及び細胞外同族タンパク質に結合する任意のリガンド又は受容体断片（例えば、ＣＤ２７、ＮＫＧ２Ｄ）に人工的に融合することができる分泌因子が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍関連標的に対して高い親和性で結合するペプチドを同定するために、コンビナトリアルライブラリを使用することもできる。更に、「汎用性」ＣＡＲは、ビオチン化腫瘍標的化抗体（Ｕｒｂａｎｓｋａ（１２）Ｃａ  Ｒｅｓ）と組み合わせて、アビデンをシグナル伝達領域に融合することによって、又はＩｇＧ標的化腫瘍（Ｋｕｄｏ  Ｋ（１３）Ｃａ  Ｒｅｓ）に結合するためにＦｃγ受容体／ＣＤ１６を使用することによって作成することができる。
【０１１９】
膜貫通領域
本明細書のキメラタンパク質は、（例えば、キメラタンパク質のＮ末端又はＣ末端において）一回又は複数回膜貫通配列を含んでもよい。一回膜貫通領域は、特定のＣＤ分子、チロシンキナーゼ受容体、セリン／スレオニンキナーゼ受容体、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、アクチビン、及びホスファターゼに見出される。一回膜貫通領域は、しばしば、シグナルペプチド領域及び約２０〜約２５個のアミノ酸の膜貫通領域を含み、その多くは疎水性アミノ酸であり、αヘリックスを形成することができる。正に荷電したアミノ酸の短い繋がりは、しばしば、膜中のタンパク質を固定するための膜貫通スパンの後にくる。複数回貫通タンパク質は、イオンポンプ、イオンチャネル、及び輸送体を含み、膜に複数回広がる２つ以上の螺旋を含む。全て又は実質的に全ての複数回貫通タンパク質が、キメラタンパク質に組み込まれる場合がある。一回及び複数回膜貫通領域の配列は既知であり、キメラタンパク質分子に組み込むために選択することができる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合される。一実施形態では、ＣＡＲ内のドメインのうちの１つに天然で会合している膜貫通ドメインが使用される。他の実施形態では、ＣＡＲ内のドメインのうちの１つと天然で会合していない膜貫通ドメインが使用される。いくつかの場合では、膜貫通ドメインは、そのようなドメインが同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することを回避して受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、アミノ酸置換（例えば、典型的には疎水性残基に荷電される）によって選択又は改変することができる。
【０１２１】
膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のα、β、又はζ鎖、ＣＤ３−ε、ＣＤ３ζＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、又はＣＤ１５４に由来してもよい。又は、いくつかの例では、膜貫通ドメインは、デノボで合成されてもよく、ほぼ疎水性の残基、例えばロイシン及びバリンなどを含む。特定の実施形態では、短いポリペプチドリンカーは、膜貫通ドメインとキメラ抗原受容体の細胞内ドメインとの間の結合を形成してもよい。キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間に、アミノ酸の細胞外領域であるストークを更に含んでもよい。例えば、ストークは、選択された膜貫通ドメインと天然で会合しているアミノ酸配列であってもよい。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＣＤ８膜貫通ドメインを含み、特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＣＤ８α膜貫通ドメイン及び膜貫通ドメインの細胞外部分上の追加のアミノ酸を含み、特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＣＤ８α膜貫通ドメイン及びＣＤ８ストークを含む。キメラ抗原受容体は、膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間に、膜貫通ドメインが由来するポリペプチドと天然で会合しているアミノ酸の領域を更に含んでもよい。
【０１２２】
標的抗原
キメラ抗原受容体は、標的抗原に結合する。インビトロ又はエクスビボでＴ細胞活性化をアッセイする時に、標的抗原は、様々な供給源から取得又は単離され得る。本明細書で使用する場合、標的抗原は、哺乳動物における疾患の病原又は疾患状態の免疫認識及び根本的排除又は制御において重要な抗原又は抗原上の免疫エピトープである。免疫認識は、細胞及び／又は体液であってもよい。細胞内病原体及び癌の場合、免疫認識は、例えば、Ｔリンパ球応答であってもよい。
【０１２３】
標的抗原は、例えば、ＨＩＶ（Ｋｏｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ  ＨＩＶ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎ．Ｍｅｘ．１９７７）、インフルエンザ、単純ヘルペス、ヒトパピローマウイルス（米国特許第５，７１９，０５４号）、Ｂ型肝炎（米国特許第５，７８０，０３６号）、Ｃ型肝炎（米国特許第５，７０９，９９５号）、ＥＢＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などを含むウイルスなどの病原性微生物に由来するか又はこれから単離されてもよい。標的抗原は、病原性細菌、例えば、クラミジア（米国特許第５，８６９，６０８号）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓインフルエンザ（米国特許第５，９５５，５９６号）などに由来するか又はこれらから単離されてもよい。標的抗原は、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、侵襲性カンジダ（米国特許第５，６４５，９９２号）、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａなどを含む病原性酵母に由来するか又はこれらから単離されてもよい。標的抗原は、例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ（米国特許第５，９６５，２４２号）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（米国特許第５，５８９，３４３号）、及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉを含むがこれらに限定されない、病原性原虫及び病原性寄生体に由来するか又はこれらから単離されてもよい。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、「抗原」という用語は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生若しくは特定の免疫学的に競合する細胞の活性化のいずれか、又はその両方を含んでもよい。抗原は、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、死滅した若しくは不活性化された全細胞又は溶解物に由来してもよい。したがって、実質的に全てのタンパク質又はペプチドを含む任意の巨大分子は、抗原として機能することができる。更に、抗原は、例えば、病原ゲノムのヌクレオチド配列若しくは部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡ、又は免疫応答を誘発するタンパク質の遺伝子若しくは遺伝子断片を含む任意のＤＮＡを含む、組み換え又はゲノムＤＮＡに由来し得、抗原の合成をもたらす。
【０１２５】
標的抗原には、前新生物性又は過形成性状態に関連する抗原が含まれる。標的抗原はまた、癌に関連するか又は癌の原因であってもよい。このような標的抗原は、例えば、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、又は組織特異的抗原、それらのエピトープ、及びそれらのエピトープアゴニストであってもよい。このような標的抗原には、癌胎児抗原（ＣＥＡ）及びそれらのエピトープ、例えば、ＣＡＰ−１、ＣＡＰ−１−６Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２９５４０）、ＭＡＲＴ−１（Ｋａｗａｋａｒｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７−３５２，１９９４）、ＭＡＧＥ−１（米国特許第５，７５０，３９５号）、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ（米国特許第５，６４８，２２６号）、ＧＰ−１００（Ｋａｗａｋａｒｎｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：６４５８−６４６２，１９９２）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、点点突然変異ｒａｓ癌遺伝子、正常及び点突然変異ｐ５３癌遺伝子（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：３５５１−３５５５，１９９４）、ＰＳＭＡ（Ｉｓｒａｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２２７−２３０，１９９３）、チロシナーゼ（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ＰＮＡＳ  ８４：７４７３−７４７７，１９８７）、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１８：２８０７−２８０８，１９９０；米国特許第５，８４０，８３９号）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ＰＮＡＳ  ９４：１９１４−１９１８，１９９７）、ＴＲＰ−２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ＥＭＢＯＪ，１１：５２７−５３５，１９９２）、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＣＡ−１２５、ＣＤ−１２３、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２（米国特許第５，５５０，２１４号）、ＢＲＣ−Ｉ、ＢＲＣ−ＩＩ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、ＴＡＡ及び組織特異的抗原の改変、ＴＡＡのスプライスバリアント、エピトープアゴニストなどが含まれるが、これらに限定されない。他のＴＡＡは、米国特許第４，５１４，５０６号に開示されているものなどの当該技術分野において既知の方法によって同定、単離、及びクローン化することができる。標的抗原はまた、それぞれの１つ以上の増殖因子及びスプライスバリアントを含んでもよい。腫瘍抗原は、例えば、腫瘍に対して宿主での免疫応答を誘発するペプチド又はポリペプチドなどの任意の抗原である。腫瘍抗原は、新生物腫瘍細胞と関連する腫瘍関連抗原であってもよい。
【０１２６】
Ｔ細胞の遺伝子移入／遺伝子改変の方法
細胞における導入遺伝子発現の効力を仲介するために、発現構築物を細胞に移入することが必要となる。このような移入は、ウイルス又は非ウイルス遺伝子移入方法を使用してもよい。本項目は、遺伝子移入の方法及び組成物の考察を提供する。
【０１２７】
発現ベクターを含む形質転換細胞は、発現ベクターを細胞に導入することによって生成される。本方法で使用される細胞小器官、細胞、組織、又は生物の形質転換のための好適なポリヌクレオチド送達方法には、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）を細胞小器官、細胞、組織、又は生物に導入することができる任意の方法が含まれる。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」という用語は、互換的に使用されてもよい。これらの全ての用語には、任意かつ全ての後続世代であるそれらの子孫も含まれる。全ての子孫は、意図的又は不慮の突然変異に起因して同一でなくてもよいことが理解される。本明細書で使用する場合、「エクスビボ」という用語は、身体の「外側」を指す。「エクスビボ」及び「インビトロ」という用語は、本明細書において互換的に使用することができる。
【０１２９】
「形質移入」及び「形質導入」という用語は、互換可能であり、外因性の核酸配列が真核生物宿主細胞に導入されるプロセスを指す。形質移入（又は形質導入）は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃送達、レトロウイルス感染、リポフェクション、スーパーフェクション（superfection）などを含む多くの手段のうちのいずれか１つによって達成することができる。
【０１３０】
任意の適切な方法を使用して、細胞、例えばＴ細胞を形質移入若しくは形質転換するか、又は本発明方法のヌクレオチド配列若しくは組成物を投与してもよい。特定の非限定的な例が本明細書に提示される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、Ｔｅｙｅｔａｉ．（２００７）Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌ  １３：９１３−２４及びＤｉ  Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｉ．．（２０１１）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５：１６７３−８３（２０１１）で論じられるようなＳＦＧに基づくウイルスベクターである。
【０１３１】
本明細書に開示される遺伝子改変Ｔ細胞は、ドナーリンパ球投与から利益を得ることができる対象への投与に有用である。これらの対象は、典型的にはヒトであるため、したがって、本発明は、典型的にはヒトＴ細胞を使用して実施される。
【０１３２】
改変細胞は、ドナーから得てもよいし、又は患者から得られた細胞であってもよく、例えば、細胞は、自家、同系、又は同種異系であってもよい。細胞は、例えば疾患細胞の機能を置き換えるために再生に使用されてもよい。細胞はまた、生物学的薬剤が、例えば、病変した骨髄又は転移性沈着物などの特定の微小環境に送達され得るように、異種遺伝子を発現するように改変されてもよい。「治療用細胞」とは、細胞療法に使用される細胞、すなわち、状態又は疾患を処置又は予防するために対象に投与される細胞を意味する。
【０１３３】
例えば、「得られる又は調製された」とは、細胞の場合、細胞又は細胞培養物が供給源から単離、精製、又は部分的に精製され、供給源は、例えば、臍帯血、骨髄、又は末梢血であってもよいことを意味する。この用語はまた、元の供給源又は細胞培養物が培養されて、細胞が複製される場合に適用してもよく、子孫細胞は元の供給源に由来する。
【０１３４】
末梢血：「末梢血」という用語は、本明細書で使用する場合、血液の循環プールから得られるか又は調製され、リンパ系、脾臓、肝臓、又は骨髄内に隔離されていない、血液（例えば、赤血球、白血球、及び血小板）の細胞成分を指す。
【０１３５】
臍帯血：臍帯血は、リンパ系、脾臓、肝臓、又は骨髄内に隔離された末梢血及び血液とは異なる。「臍帯血（umbilical  cord  blood）」、「臍帯血（umbilical  blood）」、又は「臍帯血（cord  blood）」という用語は、互換的に使用することができ、胎盤中及び子の出生後の繋がった臍帯中に残存する血液を指す。臍帯血は、しばしば、血液造血細胞を含む幹細胞を含む。
【０１３６】
「同種異系」という用語は、本明細書で使用する場合、宿主細胞とドナー細胞との間で抗原的に区別されるＨＬＡ又はＭＨＣ座（loci）を指す。したがって、同種から移入された細胞又は組織は、抗原的に区別することができる。同系マウスは、１つ以上の座（類遺伝子）において異なり得、同種異系マウスは、同じバックグランドを有し得る。「自家」という用語は、後に投与される同じ個体に由来する細胞、核酸、タンパク質、ポリペプチドなどを意味する。本方法の改変細胞は、例えば、自家Ｔ細胞などの自家細胞であってもよい。
【０１３７】
ドナーＴ細胞は、一般的に、遺伝子改変される前に、（通常、例えば、任意選択でＩＬ−２と共に、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体を使用して、活性培養条件下で）培養される。この工程は、改変プロセスの終了時に、Ｔ細胞のより高い収率を提供する。
【０１３８】
試料は、いくつかの実施形態では、アロ枯渇（allodepletion）に供されてもよいし、又はアロ枯渇に供されなくてもよい。本明細書で提供される例では、試料は、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｂｌｏｏｄ  １２５：４１０３−１３で論じられているように、アロ枯渇に供されず、したがってアロレプリート（alloreplete）である。これらの集団は、ドナー細胞の治療的利点を提供するために、より堅牢なＴ細胞レパートリーを提供する。
【０１３９】
Ｔ細胞は、本出願のポリヌクレオチドをコードするウイルスベクターを使用して形質導入することができる。好適な形質導入技術には、フィブロネクチン断片ＣＨ−２９６が含まれてもよい。ウイルスベクターを使用した形質導入の代替として、例えば、目的の自殺スイッチをコードするＤＮＡ及び目的の細胞表面導入遺伝子マーカーを、例えば、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー（ＰＥＩなど）、磁気ビーズ、エレクトロポレーション、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）及びＦｕｇｅｎｅ（商標）などの市販の脂質ベースの試薬を使用して、当該技術分野において既知の任意の好適な方法を用いて、細胞に形質移入することができる。形質導入／形質移入工程の１つの結果は、様々なドナーＴ細胞が、目的の自殺スイッチを発現することができる遺伝子改変Ｔ細胞となることである。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、形質導入に使用されるウイルスベクターは、上記のＴｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌ１３：９１３−２４及びＤｉ  Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）により開示されるレトロウイルスベクターである。このベクターは、ｉＣａｓｐ９自殺スイッチ及びΔＣＤ１９細胞表面導入遺伝子マーカーをコードするＧｉｂｂｏｎ  ａｐｅ白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）偽型レトロウイルスに基づく（以下は更に参照のこと）。上記のＴｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）が論じるように、これは、ＰＧ１３パッケージング細胞株中で生成することができる。所望のタンパク質をコードする他のウイルスベクターも使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞当たりの高コピー数のプロウイルス組み込みを提供することができるレトロウイルスベクターが、形質導入に使用される。
【０１４１】
形質導入／形質移入後、細胞を形質導入／形質移入材料から分離し、再び培養して、遺伝子改変Ｔ細胞を増殖させることができる。Ｔ細胞は、所望の最小数の遺伝子改変Ｔ細胞が達成されるように増殖させることができる。
【０１４２】
次いで、遺伝子改変Ｔ細胞を、得られた細胞集団から選択することができる。自殺スイッチは、通常、所望のＴ細胞の正の選択に好適ではなく、したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、目的の細胞表面導入遺伝子マーカーを発現するであろう。この表面マーカーを発現する細胞は、例えば、免疫磁気技術を使用して選択することができる。例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから入手可能）を使用して、例えば、目的の細胞表面導入遺伝子マーカーを認識するモノクローナル抗体に結合させた常磁性ビーズを使用することができる。
【０１４３】
代替的な手順では、形質導入工程後に遺伝子改変Ｔ細胞が選択され、次いで培養され、次いで供給される。したがって、形質導入、供給、及び選択の順序を変更することができる。
【０１４４】
これらの手順の結果は、遺伝子改変され、したがって、例えば、目的の共刺激ポリペプチド及び／又は自殺スイッチ（及び典型的には、目的の細胞表面導入遺伝子マーカー）を発現することができる、ドナーＴ細胞を含む組成物である。これらの遺伝子改変Ｔ細胞は、レシピエントに投与することができるが、通常、投与前に、（任意選択で、更なる増殖後に）凍結保存される。
【０１４５】
処置方法
「患者」又は「対象」という用語は互換可能であり、本明細書で使用する場合、生物又は動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ、又は他の非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリ又はダック）又は魚などの非哺乳動物の脊椎動物、及び非哺乳動物の脊椎動物を含む非哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。対象は、例えば、ヒト、例えば、感染症に罹患している患者、及び／又は免疫不全であるか若しくは過剰増殖性疾患に罹患している対象であってもよい。
【０１４６】
本明細書で提供される改変細胞集団は、処置を必要とするヒト対象を処置するための方法で使用することができ、そのような対象を処置するための医薬を調製するために使用されてもよい。細胞は、通常、注入によってレシピエント対象に送達される。対象のためのＴ細胞の典型的な投与量は、１０５〜１０７細胞／ｋｇである。小児患者は、一般に、約１０６細胞／ｋｇの用量を享受する一方、成人患者は、例えば、３×１０６細胞／ｋｇの高用量を享受する。
【０１４７】
レシピエントは、遺伝子改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団を享受する前に、骨髄破壊的前処置を受けてもよい。したがって、レシピエントのａ／ｐ  Ｔ細胞（及びＢ細胞）は、遺伝子改変Ｔ細胞を享受する前に枯渇させることができる。同様に、レシピエントに投与される造血（幹）細胞は、ａ／ｐ細胞について枯渇させてもよい。対照的に、レシピエントに投与される遺伝子改変ドナーＴ細胞は、一般に、ａ／ｐ細胞について枯渇させない。
【０１４８】
レシピエントは、小児、例えば、０〜１６歳の小児又は０〜１０歳の小児であり得る。いくつかの実施形態では、レシピエントは成人である。
【０１４９】
遺伝子改変Ｔ細胞を享受する対象はまた、同種異系ドナーから他の組織を享受してもよく、例えば、造血細胞及び／又は造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を享受することができる。この同種移植組織及び遺伝子改変Ｔ細胞は、理想的には、それらが電的に適合するように同じドナーに由来する。いくつかの実施形態では、ドナー及びレシピエントは、適合非血縁ドナー又は好適なファミリーメンバーである。例えば、ドナーは、レシピエントの親又は子であってもよい。対象が遺伝子改変Ｔ細胞を必要としていると同定された場合、好適なドナーをＴ細胞ドナーとして同定することができる。
【０１５０】
本明細書で提供される改変細胞集団、例えば、改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団が、造血細胞及び／又は造血幹細胞と共に使用される場合、改変細胞集団は、いくつかの例では、後の時点で、例えば、２０〜１００日後に投与されてもよい。
【０１５１】
レシピエントが、遺伝子改変Ｔ細胞を享受した後に合併症を起こした（例えば、ＧＶＨＤを発症した）場合、例えば、リミヅシドをレシピエントに投与することによって、自殺スイッチを誘発することができる。改変細胞を除去するために必要な誘導性リガンド（例えば、リミヅシド）の最小用量は、改変細胞が誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドを含む場合、レシピエントに存在する遺伝子改変Ｔ細胞の数に依存する。この最小値を超える用量を投与することができるが、通常の医薬品の原則に従って、過剰な投与を避けるべきである。いくつかの実施形態では、自殺スイッチは、リミヅシドで誘発することができ、例えば０．４ｍｇ／ｋｇの用量により、１．５×１０７細胞／ｋｇの用量で注入された細胞を排除することができる。一般的には、０．１〜５ｍｇ／ｋｇのリミヅシド用量が投与され、通常は、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ又は０．１〜１ｍｇ／ｋｇで十分であり、いくつかの実施形態では、用量は０．４ｍｇ／ｋｇである。例えば、第１の用量が全ての遺伝子改変Ｔ細胞を排除せず、次いで第２の用量を投与することができることが見出された場合などに、一連の複数回用量のリミヅシドを投与することができる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、最も感受性の高い細胞を死滅させる第１の用量の誘導リガンド（例えば、リミヅシド）が投与され、次いで、感受性がより低い細胞を死滅させる第２の用量（第１の用量よりも高い）が投与される。必要に応じて、追加用量（必要に応じて増大する）を投与することができる。
【０１５３】
本発明方法はまた、病原性微生物によって引き起こされる疾患及び／又は過剰増殖性疾患の処置又は予防の方法も包含する。
【０１５４】
処置又は予防され得る疾患には、ウイルス、細菌、酵母、寄生体、原虫、癌細胞などによって引き起こされる疾患が含まれる。医薬組成物（形質導入Ｔ細胞、発現ベクター、発現構築物など）は、全身性免疫増強剤（Ｔ細胞活性化組成物又は系）として使用してもよく、したがって、疾患の処置に有用である。処置及び／又は予防され得る例示的な疾患には、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バール、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、パピローマウイルスなどのウイルス性病因の感染、又は肺炎、結核、梅毒などの細菌性病因の感染、又はマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ赤痢などの寄生虫病因の感染が含まれる、これらに限定されない。
【０１５５】
医薬組成物（形質導入Ｔ細胞、発現ベクター、発現構築物など）を使用して処置又は予防され得る新生物性又は過形成性状態には、結腸ポリープ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乳房病変などの新生物性又は過形成性状態が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５６】
医薬組成物を使用して処置され得る固形腫瘍を含む癌には、原発性又は転移性黒色腫、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌、多発性骨髄腫、神経芽腫、ＮＰＣ、膀胱癌、子宮頸癌などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５７】
例えば、肺、骨、肝臓、前立腺、又は脳内に存在する固形腫瘍、並びに、例えば、胸、卵巣、腸、精巣、結腸、膵臓、腎臓、膀胱、神経内分泌系、軟組織、骨塊、及びリンパ系内に存在する固形腫瘍を含む、任意の組織又は器官由来の固形腫瘍が、本発明方法を使用して処置され得る。処置され得る他の固形腫瘍には、例えば、膠芽腫及び悪性骨髄腫が含まれる。
【０１５８】
レシピエントは、血液癌（処置難治性血液癌など）又は遺伝性血液障害を有してもよい。例えば、レシピエントは、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡ）、ファンコニ貧血、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、又は多発性骨髄腫を有してもよい。
【０１５９】
「癌」という用語は、本明細書で使用する場合、固有の特性−正常な制御を失うことにより、増殖の不制御、分化の欠如、局所的な組織浸潤、及び転移をもたらす、細胞の過剰増殖として定義される。例には、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺癌、肝細胞癌、白血病、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、膠芽腫、歯肉（gum）、舌癌、神経芽腫、頭部癌、頸部癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、骨癌、精巣癌、卵巣癌、中皮腫、子宮頸癌、消化管癌、リンパ腫、脳癌、結腸癌、肉腫又は膀胱癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６０】
「過剰増殖性疾患」という用語は、細胞の過剰増殖から生じる疾患として定義される。本明細書に提示されるＴ細胞及び他の治療用細胞活性化システムを使用して処置され得る固形腫瘍を含む他の過剰増殖性疾患には、関節リウマチ、炎症性腸疾患、変形性関節症、平滑筋腫、腺腫、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、前癌病変（例えば、腺腫状過形成及び前立腺上皮内腫瘍など）、上皮内癌、口腔毛状白板症、又は乾癬が含まれる。
【０１６１】
本明細書で使用する場合、「処置（treatment）」、「処置する（treat）」、「処置される（treated）」、又は「処置する（treating）」という用語は、予防及び／又は処置を指す。癌性固形腫瘍などの固形腫瘍に関して使用される場合、例えば、この用語は、固形腫瘍又は癌に対する対象の抵抗を増加させる予防的処置による予防を指す。いくつかの例では、対象は、癌を予防するために処置されてもよく、癌は家族性であるか、又は遺伝的に関連している。感染症に関して使用される場合、例えば、この用語は、病原体による感染に対する対象の抵抗を増加させる、換言すれば、対象が病原体に感染するか又は感染に起因する病気の兆候を示す可能性を減少させる、予防的処置、及び感染と戦う、例えば、感染を軽減若しくは排除するか又は感染を悪化させることを防止するために、対象が感染症に罹患した後の処置を指す。
【０１６２】
本明細書で提供される方法は、例えば、腫瘍抗原の発現が増加している疾患、障害、又は状態を処置するために使用されてもよい。
【０１６３】
医薬組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、形質導入細胞、及び活性化Ｔ細胞、形質導入Ｔ細胞及び負荷（loaded）Ｔ細胞）の投与は、「予防」又は「治療」目的のいずれでもよい。医薬組成物は、予防的に提供される場合、任意の症状に先立って提供される。改変細胞集団の予防的投与は、任意の後続の感染又は疾患を予防又は改善する役割を果たす。改変細胞集団は、治療的に提供される場合、感染又は疾患の症状の発症時又は発症後に提供される。したがって、本明細書に提示される組成物は、疾患の病原若しくは疾患状態への予想される曝露の前、又は感染若しくは疾患の開始後のいずれかで提供されてもよい。したがって、癌に見出されるものなどの固形腫瘍又は例えば限定するものではないが前立腺癌の、本明細書で論じる改変細胞集団を使用した予防的処置のための方法が、本明細書で提供される。例えば、本明細書に記載の改変細胞集団を投与し、それにより、改変細胞集団が、対象における腫瘍サイズを防止又は減少させるための有効な量で投与されることを含む、対象における腫瘍サイズを予防的に防止又は減少させる方法が提供される。
【０１６４】
医薬組成物の有効量は、免疫応答を増強するこの選択された結果を達成する量であり、そのような量を決定することができる。例えば、免疫系不全を処置するのに有効な量は、免疫系の活性化を引き起こすのに必要な量であり得、抗原への曝露時に抗原特異的免疫応答の発現をもたらす。この用語はまた、「十分な量」と同義である。他の例では、有効量は、腫瘍サイズ若しくは数を低減するか、又は腫瘍の成長速度若しくは腫瘍の増殖速度を低下するのに必要な量であり得る。他の実施例では、有効量は、本明細書で提供される改変細胞集団の投与前、投与中、及び／又は投与後に得られた試料中の標的抗原の量又は濃度を比較することによって測定される、対象における標的抗原の量又は濃度を減少させるのに必要な量であり得る。
【０１６５】
任意の特定の用途のための有効量は、処置される疾患若しくは状態、投与される特定の組成物、対象のサイズ、及び／又は疾患若しくは状態の重症度などの要因に応じて変動し得る。本明細書に提供される有効量の特定の組成物は、過度の実験を必要とすることなく、経験的に決定することができる。したがって、例えば、一実施形態では、形質導入Ｔ細胞又は他の細胞は、例えば免疫応答を誘導するか、又は例えば腫瘍サイズを減少させる若しくは腫瘍血管系の量を減少させるのに有効な量で対象に投与される。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、複数用量の改変細胞が、複数回用量間で投与量レベルを増加させて対象に投与される。いくつかの実施形態では、投与量レベルの増加は、ＣＡＲ−Ｔ細胞活性のレベルを増加させ、したがって、例えば腫瘍細胞などの標的細胞の量又は濃度の減少などの治療効果を増加させる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、個別化処置が提供され、疾患又は状態のステージ又はレベルが、改変細胞の投与前、追加用量の改変細胞の投与前、又は改変細胞の投与に関与する方法及び投与量を決定する際に決定される。これらの方法は、本出願の方法のいずれかで使用され得る。改変細胞を投与する前に患者を評価するこれらの方法が、例えば、固形腫瘍を有する対象の処置の関連で考察される場合、これらの方法は、他の状態及び疾患の処置に同様に適用され得ることが理解される。したがって、例えば、本出願のいくつかの実施形態では、本方法は、本出願の改変細胞を対象に投与することを含み、腫瘍サイズの有効なレベルの減少を達成するために、改変細胞の適切な用量を決定することを更に含む。細胞の量は、例えば、対象の臨床状態、体重、及び／若しくは性別、又は他の関連する身体特性に基づいて決定されてもよい。対象に投与される改変細胞の量を制御することによって、例えばサイトカインストームなどの有害事象の可能性を低減させてもよい。
【０１６８】
「投与量」という用語は、投与量及び例えば次の用量のタイミングなど投与頻度の両方を含むことを意味する。「投与量」という用語は、対象の体重に関連して投与される改変細胞集団の量を指す。
【０１６９】
いくつかの例では、投与量という用語は、リガンド誘導因子の投与量を指してもよい。例えば、キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを誘導するために、「投与量」という用語は、対象の体重に関連して投与される多量体リガンドの量を指す。したがって、投与量レベルの増加は、対象の体重に対して投与されるリガンドの量を増加させることを意味する。更に、例えば、多量体リガンドが連続注入ポンプを使用して投与される場合などに投与される用量の濃度を増加させることは、１分又は１秒当たりに投与される濃度（したがって投与される量）が増加することを意味する。
【０１７０】
本明細書に提示される方法は、有効量の改変細胞集団、核酸又はこれをコードする発現構築物の送達が含まれるが、これらに限定されない。改変細胞集団、核酸、又は発現構築物の「有効量」は、一般に、検出可能かつ繰り返しで所望の結果を達成する、例えば、疾患又はその症状の程度を改善する、軽減させる、最小限にする、又は制限するのに十分な量として定義される。疾患の排除、根絶、又は治癒を含む、他のより厳密な定義が適用されてもよい。いくつかの実施形態では、処置の有効性を評価し、毒性を制御するために、バイオマーカー、又は腫瘍サイズ若しくは腫瘍抗原発現などの他の疾患症状を監視する工程があってもよい。
【０１７１】
必要に応じて、本方法は、処置に使用されるより多くの細胞を得るために追加の白血球除去療法を更に含んでもよい。
【０１７２】
最適化及び個別化治療処置
改変細胞の投与量及び投与スケジュールは、処置される疾患又は状態のレベルを決定することによって最適化されてもよい。例えば、任意の残存の固形腫瘍サイズ、又は患者に残存する標的細胞、例えば、腫瘍細胞若しくはＣＤ１９発現Ｂ細胞などのレベルを決定してもよい。
【０１７３】
いくつかの例では、対象の体重１ｋｇあたり、約１×１０４、５×１０４、１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、又は１×１０９個の改変細胞又は改変細胞集団由来の細胞が対象に投与される。いくつかの実施形態では、投与量は、全細胞の所望の固定用量及び所望の比に基づき、並びに／又は個々のサブタイプ若しくはサブ集団の１つ以上、例えば、その各々の所望の固定用量に基づく。したがって、いくつかの実施形態では、投与量は、Ｔ細胞の所望の固定若しくは最小用量及びＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞との所望の比に基づき、並びに／又はＣＤ４＋及び／若しくはＣＤ８＋細胞の所望の固定又は最小用量に基づく。したがって、いくつかの実施形態では、対象の体重１ｋｇあたり、約１×１０４、５×１０４、１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、又は１×１０９個の改変細胞又は改変細胞集団由来の細胞が対象に投与され、改変細胞集団は、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５、９６、９７、９８、又は９９％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞とに対する比は、３：２、４〜１、又は９：１以上である。
【０１７４】
例えば、患者が、最初の治療後に、臨床的に関連するレベルの腫瘍細胞又は固形腫瘍を有することの決定は、改変細胞集団を投与する必要があり得るという指標を臨床医に提供する。別の例では、患者が、改変細胞集団による処置後に、腫瘍細胞レベルの減少又は腫瘍サイズの減少を有することの決定は、追加用量の改変細胞が必要でないことを臨床医に示し得る。同様に、改変細胞で処置した後、患者が疾患若しくは状態の症状を示すことが続くか、又は症状の再発を患うことの決定は、少なくとも１回の追加用量の改変細胞を投与することが必要であり得ることを臨床医に示し得る。
【０１７５】
したがって、例えば、特定の実施形態では、本方法は、第１の用量若しくは以前の用量の改変細胞の投与後の腫瘍サイズ及び／又は腫瘍細胞数に対する、患者における腫瘍サイズの増加及び／又は腫瘍細胞数の増加の存在の有無を決定することと、並びに腫瘍サイズの増加及び／又は腫瘍細胞数の増加の存在が決定された場合には、追加用量の改変細胞酸を対象に投与することを含む。本方法はまた、例えば、第１の用量若しくは以前の用量の改変細胞集団の投与後のＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルに対する、対象における非固形腫瘍細胞、例えばＣＤ１９発現Ｂ細胞などの増加の有無を決定すること、並びに対象においてＣＤ１９発現Ｂ細胞の増加の存在が決定された場合には、追加用量の改変細胞を対象に投与することを含む。これらの実施形態では、例えば、患者は、本明細書で提供される方法に従い、治療用細胞で最初に処置される。最初の処置後に、腫瘍サイズ、腫瘍細胞数、又はＣＤ１９発現Ｂ細胞数は、最初の処置前の時に対して減少し得る。この最初の処置後の特定の時点で、患者を再び試験するか、又は疾患症状について患者を継続的に監視してもよい。例えば、腫瘍サイズ、腫瘍細胞数、又はＣＤ１９発現Ｂ細胞数が、最初の処置直後の時に対して増加していると決定された場合、追加用量の改変細胞集団を投与してもよい。
【０１７６】
固形腫瘍の「腫瘍サイズを減少させる」又は「腫瘍増殖を阻害する」とは、標準的ガイドライン、例えば、固形腫瘍効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）による基準などに従った、疾患の処置又は安定化に対する応答を意味する。例えば、これには、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％の固形腫瘍直径の減少、又は５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％の腫瘍数、循環腫瘍細胞数、又は腫瘍マーカー数の減少が含まれてもよい。腫瘍サイズは、例えば、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、例えば、ＣＴ−ＭＲＩ、胸部Ｘ線（肺の腫瘍）、又は分子イメージング、例えば、ＰＥＴスキャン、例えば、ヨウ素１２３標識ＰＳＡの投与後のＰＥＴスキャンなど、例えば、ＰＥＴスキャン、例えば、ＰＳＭＡリガンド、例えば、この場合、阻害剤がＴＲＯＦＥＸ（商標）／ＭＩＰ−１０７２／１０９５であるものなど、又は分子イメージング、例えば、ＳＰＥＣＴ、若しくはＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡ抗体、例えば、カプロマブペンデチド（Prostascint）、１１１−イリジウム標識ＰＳＭＡ抗体などを使用するＰＥＴスキャン含む任意の方法によって分析してもよい。
【０１７７】
「腫瘍血管新生の減少、遅延、又は阻害」とは、処置前の腫瘍血管新生の量と比較した時に、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の腫瘍血管新生の減少、又は約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の新たな血管新生の出現の減少を意味する。減少は、１つの腫瘍を指してもよく、又は２つ以上の腫瘍における血管新生の合計若しくは平均であってもよい。腫瘍血管新生を測定する方法には、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩ、例えば、ＣＴ−ＭＲＩ、又は分子イメージング、例えば、ＳＰＥＣＴ、若しくはＰＥＴスキャン、例えば、ヨウ素１２３標識ＰＳＡの投与後のＰＥＴスキャンなど、例えば、ＰＳＭＡリガンド、例えば、この場合、阻害剤がＴＲＯＦＥＸ（商標）／ＭＩＰ−１０７２／１０９５であるものなど、又はＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡ抗体、例えば、カプロマブペンデチド（Prostascint）、１１１−イリジウム標識ＰＳＭＡ抗体などを使用するＰＥＴスキャンが含まれる。
【０１７８】
腫瘍は、例えば腫瘍が前立腺腺に存在する場合には、前立腺癌腫瘍などの器官の一部として分類若しくは命名されるか、又は前立腺腺における腫瘍に由来するか、若しくは腫瘍から転移し、あるいはＰＳＡを生成する。例えば、腫瘍が、対象の前立腺腺における腫瘍と同じ又は同様の染色体破壊点を有すると決定される場合には、腫瘍は、前立腺における腫瘍から転移している。
【０１７９】
他の実施形態では、改変細胞数又はインビボ改変細胞数を減少させる必要がある場合、改変細胞集団の投与後に（ここで、改変細胞は、誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチド、例えば、誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドなどを発現する）、多量体リガンドが患者に投与されてもよい。これらの実施形態では、本方法は、陰性症状若しくは状態、例えば、サイトカインストーム、神経毒性、細胞毒性、移植片対宿主病、又はオフターゲット毒性の存在の有無を決定することと、多量体リガンド用量を投与することと、を含む。本方法は、症状又は状態を監視することと、症状又は症状が続く場合には追加用量の多量体リガンドを投与することと、を更に含んでもよい。この監視及び処置スケジュールは、キメラ抗原受容体又はキメラ刺激分子を発現する治療用細胞が患者に残存している間は継続してもよい。いくつかの実施形態では、キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変細胞の数は、多量体リガンドを対象に投与した後、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は９９％以上減少する。
【０１８０】
例えば、後続の薬物用量、例えば、後続の改変細胞若しくは核酸投与など、及び／又は後続の薬物投与量を調整若しくは維持する用量は、任意の好都合な様式で提供することができる。いくつかの実施形態では、指示は、表形式（例えば物理媒体又は電子媒体）で提供されてもよい。例えば、腫瘍細胞サイズ又は試料中の腫瘍細胞の数若しくはレベルは、表で提供されてもよく、臨床医は、症状を疾患ステージのリスト又は表と比較してもよい。次いで、臨床医は、後続の薬物用量の指示を表から識別することができる。特定の実施形態では、指示は、症状がコンピュータに提供された（例えば、コンピュータ上のメモリに入力された）後に、コンピュータによって提示することができる（例えば、示すことができる）。例えば、この情報は、コンピュータに提供することができ（例えば、ユーザによってコンピュータメモリに入力されるか、又はコンピュータネットワークでの遠隔装置を介してコンピュータに送信される）、コンピュータ中のソフトウェアは、後続の薬物用量を調整若しくは維持するための指示を作成し、及び／又は後続の薬物用量を提供することができる。
【０１８１】
後続の用量が指示に基づいて決定されると、臨床医は、後続の用量を投与してもよく、又は別の人若しくは存在者への用量を調整する指示を提供してもよい。「臨床医」という用語は、本明細書で使用する場合、決定者を指し、臨床医は、特定の実施形態では、医療専門家である。決定者は、いくつかの実施形態では、コンピュータ又は表示されたコンピュータプログラム出力であってもよく、健康サービスプロバイダは、コンピュータによって示される指示又は後続の薬物用量に従って行動してもよい。決定者は、後続の用量を直接投与してもよいし（例えば、後続の用量を対象に注入する）、又は遠隔で投与してもよい（例えば、ポンプ（pump）パラメータは、決定者によって遠隔で変更されてもよい）。
【０１８２】
例えば、前立腺癌を含む固形腫瘍癌の処置は、処置過程中に腫瘍に関連するバイオマーカーの濃度を決定することによって最適化されてもよい。患者は処置過程に対して異なる応答を有し得るため、処置に対する応答は、様々な体液又は組織中のバイオマーカー濃度又はレベルに従うことによって監視されてもよい。バイオマーカーポリペプチドの濃度、レベル、又は量の決定は、全長ポリペプチド又はそれらの断片若しくはバリアントの検出を含んでもよい。断片又はバリアントは、例えば、免疫学的方法、質量分析、核酸ハイブリダイゼーションなどによって十分に検出され得る。個々の患者のための処置を最適化することは、過剰投与の結果としての副作用を回避するのに役立ち得、処置が無効になる時を決定し、処置の過程を変更することに役立ち得、若しくは用量を増加し得る時を決定するのに役立ち得、又は処置のタイミングを決定するのに役立ち得る。
【０１８３】
例えば、特定のバイオマーカーの量又は濃度が固形腫瘍の処置過程中に変化することが決定される。そのようなバイオマーカー又はバイオマーカー閾値の所定の標的レベルが健康な対象において同定されてもよく、これにより、臨床医が、固形腫瘍、例えば、前立腺腫瘍などを有する対象などの薬物投与を必要とする対象に投与される薬物の後続の用量を増加し、減少し、又は維持してもよいかどうかを決定することが可能になる。特定の実施形態では、臨床医は、バイオマーカーの存在の有無又は量が、バイオマーカー閾値を下回る、上回る、又はそれとほぼ同じであるかどうかにそれぞれ基づいて、そのような決定を行うことができる。
【０１８４】
サイトカインは、多様な起源の細胞によって身体全体にわたって広く産生されるポリペプチド調節因子の広範かつ多様なファミリーである。サイトカインの存在又はレベルは、バイオマーカーとして使用されてもよい。「サイトカイン」という用語は、タンパク質及び糖タンパク質の広範なファミリーの一般的な記載である。他の名称には、リンホカイン（リンパ球によって産生されるサイトカイン）、モノカイン（単球によって産生されるサイトカイン）、ケモカイン（走化活性を有するサイトカイン）、及びインターロイキン（ある白血球によって産生され、他の白血球に作用するサイトカイン）が含まれる。サイトカインは、サイトカインを分泌する細胞（オートクリン作用）、近くの細胞（パラクリン作用）、又はいくつかの場合では遠くの細胞（内分泌作用）に作用し得る。本出願の改変細胞集団による対象の処置、又は任意選択で、薬物、例えばリミヅシドなどの後続の投与を行って、アポトーシスを誘導し、細胞を排除することを、対象における毒性に関連するサイトカインのレベルを検出することによって監視してもよい。サイトカインの例には、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなど）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βなど）、リンホカイン、モノカイン、及びケモカイン、増殖因子（例えば、増殖因子（例えば、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βなど）を形質転換すること）、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）など）などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８５】
検出は、質量分析（例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳ−ＭＳ））、電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、核酸親和性（例えば、ハイブリダイゼーション）、増幅及び検出（例えば、リアルタイム又は逆転転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））、並びに抗体アッセイ（例えば、抗体アレイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））を含むがこれらに限定されない、任意の好適な方法を使用して行ってもよい。
【０１８６】
試料は、改変細胞集団又は薬物が対象に送達された後、任意の好適な収集時に対象から得ることができる。例えば、試料は、薬物が対象に送達された後約１時間以内（例えば、薬物送達の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５５、又は６０分以内）、薬剤が対象に送達された後約１日以内（例えば、薬物送達の約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４時間以内）、又は薬剤が対象に送達された後約２週間以内（例えば、薬剤の送達の約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日以内）に収集してもよい。収集は、例えば、毎時間、毎日、週２回、週１回、隔週、毎月、隔月、四半期毎、及び毎年などを含む特定のスケジュールで行ってもよい。薬物がある期間にわたって連続的に投与される（例えば、注入される）場合、遅延は、薬剤が投与された第１の時点から、薬剤投与を停止した時点から、又は中間の時点（例えば、投与時間フレームの中点又は他の点）から決定されてもよい。対象への改変細胞集団の投与は、改変細胞又は例えば改変Ｔ細胞の投与の語句と交換可能であると理解される。すなわち、改変細胞の投与又は調製を論じる際に、複数の改変細胞の群は、改変細胞集団も指すことが理解される。
【０１８７】
患者への投与のための製剤及び飲料
臨床用途を企図する場合、医薬組成物−発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、形質導入細胞、活性化Ｔ細胞、形質導入及び負荷Ｔ細胞を意図される用途に適切な形態で調製することが必要であろう。一般的には、これは、本質的に発熱性物質及びヒト又は動物に有害であり得る他の不純物を含まない組成物を調製することを伴う。
【０１８８】
多量体リガンド、例えば、ＡＰ１９０３（リミヅシド）などは、例えば、約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．２〜４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．３〜３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．３〜２ｍｇ／ｋｇ体重、又は約０．３〜１ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、若しくは１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、１用量当たり０．４ｍｇ／ｋｇ、例えば、５ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される。例えば、１バイアル当たり、約０．２５ｍＬ〜約１０ｍＬ、例えば、約０．２５、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、又は１０ｍＬ、例えば約２ｍＬの体積でリガンドを含むバイアル又は他の容器が提供されてもよい。誘導性カスパーゼ−９安全スイッチを活性化するための好適なプロセスは、例えば、Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５：１６７３−８３、及び２０１１年５月２０日に出願され、２０１１年１１月２４日に米国特許出願公開第２０１１／０２８６９８０号として公開され、２０１５年７月２８日に米国特許第９，０８９，５２０号として登録された、米国特許出願公開第１３／１１２，７３９号に記載されている。
【０１８９】
組み合わせ療法
本明細書に提示される発現ベクターの有効性を高めるために、これらの組成物及び方法を疾患の処置に有効な薬剤と組み合わせることが望ましいものとなり得る。
【０１９０】
特定の実施形態では、抗癌剤は、本発明方法と組み合わせて使用されてもよい。「抗癌」剤は、例えば、１つ以上の癌細胞を死滅させ、１つ以上の癌細胞においてアポトーシスを誘導し、１つ以上の癌細胞の増殖速度を低下させ、転移の発生率若しくは数を減少し、腫瘍サイズを減少させ、腫瘍増殖を阻害し、腫瘍若しくは１つ以上の癌細胞への血液供給を低減し、１つ以上の癌細胞若しくは腫瘍に対する免疫応答を促進し、癌の進行を予防若しくは阻害し、又は癌を有する対象の寿命を増加させることによって、対象における癌に負の影響を与えることができる。抗癌剤には、例えば、化学療法剤（化学療法）、放射線療法剤（放射線療法）、外科手術（手術）、免疫療法剤（免疫療法）、遺伝子療法剤（遺伝子療法）、ホルモン療法、他の生物学的薬剤（生物学的療法）、及び／又は代替療法が含まれる。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、抗生物質は、感染性疾患を処置及び／又は予防するために、医薬組成物と組み合わせて使用することができる。このような抗生物質には、アミカシン、アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン）、アモキシシリン、アンホテリシンＢ、アンピシリン、アンチモン剤、アトバコンスチボグルコン酸ナトリウム、アジスロマイシン、カプレオマイシン、セホタキシム、セホキシチン、セフトリアキソン、クロラムフェニコール、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロファジミン、シクロセリン、ダプソン、ドキシサイクリン、エタンブトール、エチオナミド、フルコナゾール、フルオロキノロン、イソニアジド、イトラコナゾール、カナマイシン、ケトコナゾール、ミノサイクリン、オフロキサシン）、パラ−アミノサリチル酸、ペンタミジン、ポリミキシンディフェンシン、プロチオナミド、ピラジンアミド、ピリメタミンスルファジアジン、キノロン（例えば、シプロフロキサシン）、リファブチン、リファンピン、スパルフロキサシン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、チアセタゾン、トリメトプリムースルファメトキサゾール、ビオマイシン、又はこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９２】
より一般的には、そのような薬剤は、癌細胞及び／又は微生物の増殖を死滅又は阻害するのに有効な発現ベクターと組み合わせた量で提供されるであろう。このプロセスは、細胞を同時に又はある期間内に薬剤及び医薬組成物と接触させることを含んでもよく、医薬組成物及び薬剤を細胞、組織、又は生物に別々に投与されることによって、所望の処置効果をもたらす。これは、細胞、組織、又は生物を、医薬組成物及び１つ以上の薬剤の両方を含む単一の組成物若しくは薬理製剤と接触させることによって、又は細胞を２種以上の別個の組成物若しくは製剤（ここで、１つの組成物は医薬組成物を含み、他方は１つ以上の薬剤を含む）と接触させることによって達成されてもよい。
【０１９３】
「接触した」及び「曝露される」という用語は、細胞、組織、又は生物に適用される場合、本明細書では、医薬組成物及び／若しくは別の薬剤、例えば化学療法剤若しくは放射線療法剤が標的細胞、組織、若しくは生物に送達されるか、又は標的細胞、組織、若しくは生物と直接並列して配置されるプロセスを説明するために使用される。細胞の死滅又は静止を達成するために、医薬組成物及び／又は追加の薬剤は、細胞を死滅させるか又は細胞が分裂するのを防ぐのに有効な組み合わせた量で１つ以上の細胞に送達される。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、カルボプラチン、リン酸エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ）、及びサリドマイドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、化学療法剤はタキサンである。タキサンは、例えば、ドセタキセル（Taxotere）、パクリタキセル、及びカバジタキセルからなる群から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、タキサンは、ドセタキセルである。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、改変細胞又は核酸の投与と同時に又は投与後１週間以内に投与される。他の実施形態では、化学療法剤は、改変細胞又は核酸の投与後１〜４週間、若しくは１週間〜１ヶ月間、１週間〜２ヶ月間、１週間〜３ヶ月間、１週間〜６ヶ月間、１週間〜９ヶ月間、又は１週間〜１２ヶ月間投与される。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、細胞又は核酸を投与する前の少なくとも１ヶ月間投与される。
【０１９４】
医薬組成物の投与は、数分〜数週間の範囲の間隔で、他の薬剤に先行して、それと同時、及び／又はその後であってもよい。医薬組成物及び他の薬剤が細胞、組織、又は生物に別々に適用される実施形態では、医薬組成物及び薬剤が、細胞、組織、又は生物に対する有利に組み合わされた効果を依然として発揮することができるように、有意な期間が、各送達時の間に終了しないことを一般的に確保する。例えば、そのような場合では、２つ、３つ、４つ以上の様相を有する細胞、組織、又は生物を、実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）医薬組成物と接触させてもよいことが企図される。他の態様では、１つ以上の薬剤は、発現ベクターの投与前及び／又は投与と実質的に同時から、その投与後の約１分以内、約２４時間以内、約７日以内、約１週間以内、約８週間以上以内、及びそれらの中の任意の範囲内で投与され得る。更に、本明細書に提示される医薬組成物及び１つ以上の薬剤の様々な組み合わせレジメンを用いてもよい。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、リンパ球枯渇化学療法であってもよい。他の例では、化学療法剤は、タキソテレ（ドセタキセル）、又は別のタキサン、例えばカバジタキセルなどであってもよい。化学療法は、細胞及び誘導因子で処置する前、処置中、又は処置後に投与されてもよい。例えば、化学療法は、第１の用量の活性化核酸を投与する前に、約１年間、１１、１０、９、８、７、６、５、若しくは４ヶ月間、又は１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２週間、若しくは１週間投与されてもよい。あるいは、例えば、化学療法は、第１の用量の細胞又は誘導因子を投与した後、約１週間、若しくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、若しくは１８週間、又は４、５、６、７、８、９、１０、若しくは１１ヶ月間、又は１年間投与されてもよい。
【０１９６】
化学療法剤の投与は、２つ以上の化学療法剤の投与を含んでもよい。例えば、シスプラチンが、タキソテレ又は他のタキサン、例えばカバジタキセルなどに追加して投与されてもよい。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本発明は、サイトカイン又はケモカイン中和剤、例えば中和抗体と共に、本明細書に記載の改変細胞集団を含む、併用療法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＮＦα中和剤、例えば抗ＴＮＦα抗体と共に、本明細書に記載の改変細胞集団を含む、併用療法を提供する。
【実施例】
【０１９８】
実施例１：ＭｙＤ８８／ＣＤ４０増強ＣＡＲ−Ｔ細胞は、誘導性カスパーゼ−９を使用したサイトカイン関連毒性の解消後の治療効力を維持する。
要約
血液悪性疾患に対する成功した養子キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、注入後のＣＡＲ−Ｔ増殖及び長期持続性を必要とする。重症のサイトカイン放出症候群（ｓＣＲＳ）及び神経毒性を含む、ＣＡＲ−Ｔ効力の増加と安全性とのバランスを取ることは、インビボＣＡＲ−Ｔ活性を制御するための安全機構が含まれることを保証する。ここで、ＣＡＲ−Ｔの生存、増殖、並びにＣＤ１９＋及びＣＤ１２３＋血液癌に対する抗腫瘍活性を駆動する構成的シグナルを提供する、意図的に非効率的な２Ａリンカーシステムを介してＣＡＲ分子に係留された、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アダプター分子ＭｙＤ８８及び腫瘍壊死因子ファミリーメンバーＣＤ４０（ＭＣ）の発現を利用する新規なＣＡＲ−Ｔ細胞プラットフォームを説明する。ＭＣ増強ＣＡＲ−Ｔ細胞の堅牢な活性を、高レベルのヒトサイトカイン産生に対応する動物モデルにおける悪液質と関連付けた。しかしながら、誘導性カスパーゼ−９（ｉＣ９）を使用して血清サイトカインを減少させることによって、ＴＮＦ−αに対する中和抗体を投与することによって、又は抗腫瘍活性を失わずにサイトカイン産生が「低い」ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択することによって、毒性を緩和することができた。興味深いことに、インビボＣＡＲ−Ｔ増殖には高い基礎活性が必須であった。本研究は、新規なシグナル伝達要素（すなわち、ＭｙＤ８８及びＣＤ４０）の共選択及び特有のＣＡＲ−Ｔアーキテクチャの開発により、インビボでのＴ細胞増殖が駆動されて、ＣＡＲ−Ｔ療法を増強することができることを示している。
【０１９９】
発現構築物
プラスミド構築
ＰＢ００１トラシストロニックＳＦＧ系レトロウイルスベクターは、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体、構成的に活性なＭｙＤ８８−ＣＤ４０キメラポリペプチド、及びｉＣ９安全スイッチを発現する、改変ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞集団を調製するためにいくつかの実施例で使用されたベクターの一例である。
【０２００】
プラスミドｐＢ００１は、５’から３’方向で以下をコードする核酸を含む：
（１）ＭＬＥＭＬＥリンカー（配列番号３２によりコードされる配列番号３１）、変異ヒトＦＫＢＰ１２タンパク質（ＦＫＢＰ１２ｖ３６、Ｆｖｓｅ、ＦＫＢＰＶ、若しくはＦｖとしても既知であるＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）、配列番号２によりコードされる配列番号１）、ここで、アミノ酸３６位（又はタンパク質の最初のメチオニンが計数される場合は３７位）のフェニルアラニンが、８個のアミノ酸のリンカー（配列番号４によりコードされる配列番号３）を介して、ヒトカスパーゼ９ポリペプチドの一部（カスパーゼ９のアミノ酸１３５〜４１６を含むΔカスパーゼ９、配列番号６によりコードされる配列番号５）に融合されたバリンによって置換されている（融合タンパク質全体はｉＣ９と称する）、
（２）Ｔ２Ａポリペプチド（配列番号８によってコードされる配列番号７）、
（３）ヒトＣＤ３ζの一部（ＣＤ３ζアイソフォームＸ２のアミノ酸８３〜１９４、配列番号２４によりコードされる配列番号２３）に融合された、ヒトＣＤ８αの膜貫通ドメイン（ＣＤ８のアミノ酸１８３〜２１９、配列番号２２によりコードされる配列番号２１）に融合された、ヒトＣＤ８αのαストーク領域（ＣＤ８のアミノ酸１４１〜１８２、配列番号２０によりコードされる配列番号１９）に融合された、ヒトＣＤ３４エピトープポリペプチド（ＣＤ３４のアミノ酸３０〜４５、配列番号１８によりコードされる配列番号１７）に融合された、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＦＭＣ６３（鎖の間に、介在する８個のアミノ酸のフレキシブルなグリシン−セリンリンカー、すなわち、フレキシブルなペプチド（配列番号１４によりコードされる配列番号１３）を有する）の軽鎖（配列番号１２によりコードされる配列番号１１）及び重鎖（配列番号１６によりコードされる配列番号１５）可変領域に融合された、膜シグナルペプチド（配列番号１０によりコードされる配列番号９）、
（４）Ｐ２Ａポリペプチド（配列番号２６によりコードされる配列番号２５）、
（５）ヒトＣＤ４０ポリペプチドの一部（カルボキシ末端の６２個のアミノ酸、すなわち、ＣＤ４０のアミノ酸２１６〜２７７、配列番号３０によりコードされる配列番号２９）に融合された、切断型ヒトＭｙＤ８８ポリペプチド（ＤＤドメイン及び中間ドメインを含むＭｙＤ８８のアミノ末端の１７２個のアミノ酸、配列番号２８によりコードされる配列番号２７）を含む、融合タンパク質（融合タンパク質全体はＭＣと称する）。
【０２０１】
ＰＢ００２トラシストロニックＳＦＧ系レトロウイルスベクターは、Ｈｅｒ２特異的キメラ抗原受容体、構成的に活性なＭｙＤ８８−ＣＤ４０キメラポリペプチド、及びｉＣ９安全スイッチを発現する、改変Ｈｅｒ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞集団を調製するためにいくつかの実施例で使用されたベクターの一例である。
【０２０２】
プラスミドｐＢ００２は、５’から３’方向で以下の核酸をコードしている：
（１）ＭＬＥリンカー（配列番号４４によりコードされる配列番号４３）、変異ヒトＦＫＢＰ１２タンパク質（ＦＫＢＰ１２ｖ３６、Ｆｖｓｅ、ＦＫＢＰＶ、若しくはＦｖとしても既知であるＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）、配列番号２によりコードされる配列番号１）、アミノ酸３６位（又はタンパク質の最初のメチオニンが計数される場合は３７位）のフェニルアラニンが、８個のアミノ酸のリンカー（配列番号４によりコードされる配列番号３）を介して、ヒトカスパーゼ９ポリペプチドの一部（カスパーゼ９のアミノ酸１３５〜４１６を含むΔカスパーゼ９、配列番号６によりコードされる配列番号５、配列番号５の末端プロリンを有さないか又は配列番号６のプロリンをコードする末端コドンを有さない）に融合されたバリンによって置換されている（融合タンパク質全体はｉＣ９と称する）、
（２）Ｔ２Ａポリペプチド（配列番号８によってコードされる配列番号７）、
（３）ヒトＣＤ３ζの一部（ＣＤ３ζアイソフォームＸ２のアミノ酸８３〜１９４、配列番号２４によりコードされる配列番号２３）に融合された、ヒトＣＤ８αの膜貫通ドメイン（ＣＤ８のアミノ酸１８３〜２１９、配列番号２２によりコードされる配列番号２１）に融合された、ヒトＣＤ８αのαストーク領域（ＣＤ８のアミノ酸１４１〜１８２、配列番号２０によりコードされる配列番号１９）に融合された、ヒトＣＤ３４エピトープポリペプチド（ＣＤ３４のアミノ酸３０〜４５、配列番号１８によりコードされる配列番号１７）に融合された、抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体ＦＲＰ５（鎖の間に、介在する８個のアミノ酸のフレキシブルなグリシン−セリンリンカー、すなわち、フレキシブルなペプチド（配列番号５０によりコードされる配列番号４９）を有する）の軽鎖（配列番号４６によりコードされる配列番号４５）及び重鎖（配列番号４８によりコードされる配列番号４７）可変領域に融合された、膜シグナルペプチド（配列番号１０によりコードされる配列番号９）、
（４）Ｐ２Ａポリペプチド（配列番号２６によりコードされる配列番号２５）、
（５）ヒトＣＤ４０ポリペプチドの一部（カルボキシ末端の６２個のアミノ酸、すなわち、ＣＤ４０のアミノ酸２１６〜２７７、配列番号３０によりコードされる配列番号２９）に融合された、ミリストイル化ドメイン（配列番号５２によりコードされる配列番号５１）、切断型ヒトＭｙＤ８８ポリペプチド（ＤＤドメイン及び中間ドメインを含むＭｙＤ８８のアミノ末端の１７２個のアミノ酸、配列番号２８によりコードされる配列番号２７）を含む、融合タンパク質（融合タンパク質全体はＭＣと称する）。
【０２０３】
ＰＢ００３トリシストロンＳＦＧ系レトロウイルスベクターは、一部の実施例で使用され、ＰＳＣＡ特異的キメラ抗原受容体、構成活性ＭｙＤ８８−ＣＤ４０キメラポリペプチド、及びｉＣ９安全スイッチを発現する、改変ＰＳＣＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞集団を調製するために使用されたベクターの例である。
【０２０４】
プラスミドｐＢ００３は、５’から３’方向で核酸をコードしている：
（１）ＭＬＥリンカー（配列番号４４によりコードされる配列番号４３）、変異ヒトＦＫＢＰ１２タンパク質（ＦＫＢＰ１２ｖ３６、Ｆｖｓｅ、ＦＫＢＰＶ、若しくはＦｖとしても既知であるＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）、配列番号２によりコードされる配列番号１）、アミノ酸３６位（又はタンパク質の最初のメチオニンが計数される場合は３７位）のフェニルアラニンが、８個のアミノ酸のリンカー（配列番号４によりコードされる配列番号３）を介して、ヒトカスパーゼ９ポリペプチドの一部（カスパーゼ９のアミノ酸１３５〜４１６を含むΔカスパーゼ９、配列番号６によりコードされる配列番号５、配列番号５の末端プロリンを有さないか又は配列番号６のプロリンをコードする末端コドンを有さない）に融合されたバリンによって置換されている（融合タンパク質全体はｉＣ９と称する）、
（２）Ｔ２Ａポリペプチド（配列番号８によってコードされる配列番号７）、
（３）ヒトＣＤ３ζの一部（ＣＤ３ζアイソフォームＸ２のアミノ酸８３〜１９４、配列番号２４によりコードされる配列番号２３）に融合された、ヒトＣＤ８αの膜貫通ドメイン（ＣＤ８のアミノ酸１８３〜２１９、配列番号２２によりコードされる配列番号２１）に融合された、ヒトＣＤ８αのαストーク領域（ＣＤ８のアミノ酸１４１〜１８２、配列番号２０によりコードされる配列番号１９）に融合された、ヒトＣＤ３４エピトープポリペプチド（ＣＤ３４のアミノ酸３０〜４５、配列番号１８によりコードされる配列番号１７）に融合された、抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体Ａ１１（鎖の間に、介在する８個のアミノ酸のフレキシブルなグリシン−セリンリンカー、すなわち、フレキシブルなペプチド（配列番号１４によりコードされる配列番号１３）を有する）の軽鎖（配列番号５４によりコードされる配列番号５３）及び重鎖（配列番号５６によりコードされる配列番号５５）可変領域に融合された、膜シグナルペプチド（配列番号１０によりコードされる配列番号９）、
（４）Ｐ２Ａポリペプチド（配列番号２６によりコードされる配列番号２５）、
（５）ヒトＣＤ４０ポリペプチドの一部（カルボキシ末端の６２個のアミノ酸、すなわち、ＣＤ４０のアミノ酸２１６〜２７７、配列番号３０によりコードされる配列番号２９）に融合された、ミリストイル化ドメイン（配列番号５２によりコードされる配列番号５１）、切断型ヒトＭｙＤ８８ポリペプチド（ＤＤドメイン及び中間ドメインを含むＭｙＤ８８のアミノ末端の１７２個のアミノ酸、配列番号２８によりコードされる配列番号２７）を含む、融合タンパク質（融合タンパク質全体はＭＣと称する）。
【０２０５】
材料及び方法
マウス。ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ｌｌ２ｒｇｔｍ１ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスをＪａｃｋｓｏｎラボラトリ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。
【０２０６】
細胞株、培地、及び試薬。２９３Ｔ（ＨＥＫ  ２９３Ｔ／１７）、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、及びＴＨＰ−１細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び２ｍＭ  ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中、３７℃、５％  ＣＯ２で維持した。別段で注記しない限り末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から生成されたＴ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔ細胞培地、ＴＣＭ）、及び１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した、４５％  ＲＰＭＩ  １６４０、４５％  Ｃｌｉｃｋ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。臨床グレードのリミヅシドを、エタノールに希釈してインビトロアッセイのための１００ｍＭの作業溶液とし、又は動物試験のために０．９％生理食塩水に希釈した。
【０２０７】
レトロウイルス及びプラスミド構築物。ＦＭＣ６３単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＣＤ８ａストーク、及び膜貫通ドメイン、並びにＣＤ３ζ鎖細胞質ドメイン（ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ）を含む第１世代の抗ＣＤ１９ＣＡＲと共にｉＣ９をコードする、最初のバイシストロニックＳＦＧ系レトロウイルスベクターを生成した。遺伝子改変Ｔ細胞上のＣＡＲ発現を検出するために、全てのＣＡＲベクター中に、ＣＤ３４  Ｑｂｅｎｄ−１０最小エピトープ（１０）をＣＤ８ａストークに含めた。ＣＤ８ａ膜貫通領域（ｉＣ９−ＣＤ１９．ＭＣ．ζ）の近くにＭＣ共刺激タンパク質を含む第３世代のＣＡＲを構築した。更に、ＭｙＤ８８（Ｍ）又はＣＤ４０（Ｃ）のみを有するベクターを、両方の第３世代（それぞれ、ｉＣ９−ＣＤ１９．Ｍ．ζ又はｉＣ９−ＣＤ１９．Ｃ．ζ）について構築した。構成的に発現されるＭＣキメラタンパク質（ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ）を有するトリストロニックｉＣ９実施可能な（iC9-enabled）ＣＤ１９及びＣＤ１２３（３３１２９２  ｓｃＦｖ（１１、１２））ＣＡＲ構築物を構築した。ＣＤ２８及び４−１ＢＢエンドドメインをコードするｉＣ９発現ＣＤ１９ベクターをまた、前述のようにして合成した（１３、１４）。リボソームスキッピング効率（１５）及び上記の導入伝子の代替的な配向を改善するためにＧＳＧリンカーを含む、増強された２Ａ配列を有する更なるベクターを合成した。共培養アッセイ及びインビボ研究のために、腫瘍細胞株をＥＧＦＰルシフェラーゼ（ＥＧＦＰｌｕｓ）をコードするレトロウイルスベクターで改変した。
【０２０８】
遺伝子改変Ｔ細胞の生成。ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）形質移入試薬を使用して、ＳＦＧベクタープラスミド、ＭｏＭＬＶ  ｇａｇ−ｐｏｌの配列を含むＥＱ−ＰＡＭ３（−Ｅ）プラスミド、及びＲＤ１１４エンベロープコードプラスミドを用いた２９３Ｔ細胞の一過性共形質移入によって、レトロウイルス上清を生成した。Ｇｕｌｆ  Ｃｏａｓｔ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から入手し、上記で記載したように（５）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体を使用して活性化された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から活性化Ｔ細胞を作製した。３日間の活性化後、続いてＴ細胞をレトロネクチンコーティングプレート（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）上で形質導入し、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２で増殖させ、１０〜１４日間増殖させた。２つの形質導入について、プロトコルは、ウェルが等量の各レトロウイルス上清でコーティングされたことを除いて、上記と同一であった。
【０２０９】
免疫表現型。ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５及びＣＤ３４−ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用し、フローサイトメトリーにより、形質導入の１０〜１４日後の導入遺伝子発現について、遺伝子改変Ｔ細胞を分析した。ＣＡＲ−Ｔ細胞サブセット（すなわち、ＣＤ４及びＣＤ８）の細胞選択評価実験を、ＣＤ４及びＣＤ８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、純度について試験した。ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌ（Ｔ細胞記憶表現型）及びＰＤ−１（Ｔ細胞枯渇）のための抗体を使用して、追加の表現型分析を行った。全てのフローサイトメトリーをＧａｌｌｉｏｓフローサイトメーターを使用して行い、データをＫａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用して分析した。
【０２１０】
共培養アッセイ。非形質導入及び遺伝子改変Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ−ＥＧＦＰｌｕｃ腫瘍細胞と共に、１：１のエフェクター対標的の比（２４ウェルプレート中にそれぞれ５×１０５個の細胞）で培養し、外因性ＩＬ−２の非存在下で７日間培養した。次いで、細胞を採取し、計数し、フローサイトメトリーによってＴ細胞（ＣＤ３＋）又は腫瘍細胞（ＥＧＦＰＩｕｃ＋）の存在比率について分析した。いくつかのアッセイでは、非形質導入及び遺伝子改変Ｔ細胞を、標的細胞なしで培養した（２４ウェルプレート中にそれぞれ５×１０５個の細胞）。共培養の開始から４８時間後に、培養上清をサイトカインレベルについて分析した。
【０２１１】
動物モデル。ＣＤ１９標的化ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を評価するために、ＮＳＧマウスに、５×１０５個のＣＤ１９＋Ｒａｊｉ又はＲａｊｉ−ＥＧＦＰｌｕｃ腫瘍細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射によって移植した。４日後、可変用量の非形質導入及び遺伝子改変Ｔ細胞を、静脈内（尾部）注射により投与した。いくつかの実験では、マウスは、上記のＲａｊｉ−ＥＧＦＰｌｕｃ  Ｔ細胞で再負荷した。ＣＤ１２３特異的ＣＡＲ−Ｔ活性を試験するために、１×１０６個のＣＤ１２３＋  ＴＨＰ−１−ＥＧＦＰＩｕｃを静脈内注射により移植し、続いて、腫瘍移植の７日後に２．５×１０６個の未改変又はＣＡＲ−Ｔ細胞の注入を行った。Ｒａｊｉ腫瘍保有マウスを５×１０６個のｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ−改変Ｔ細胞で処置し、続いて、Ｔ細胞注射の７日後に、リミヅシドを０．００００５、０．０００５、０．００５、０．０５、０．５、及び５ｍｇ／ｋｇで注射することによって、ｉＣ９用量設定実験を行った。サイトカイン関連毒性を評価するために、ｈｌＬ−６、ｈｌＦＮ−ｙ、及びＴＮＦ−αに対する中和抗体又はアイソタイプ対照抗体（ＢｉｏｘＣｅｌｌ，Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）を、１００μｇで週２回、腹腔内注射により投与した。正に選択されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞を使用し、ＣＤ４又はＣＤ８マイクロビーズ及びＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、追加の実験を行った。インビボ腫瘍増殖及びＴ細胞増殖を、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）の腹腔内注射により、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって測定し、Ｉ  ＶＩＳイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して画像化した。全身の関心領域（ＲＯＩ）及び平均放射輝度（光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン）として測定される信号により、光子放出を分析した。
【０２１２】
ウエスタンブロット分析。非形質導入及び遺伝子改変Ｔ細胞を採取し、溶解し、溶解物をタンパク質含有量について定量化した。タンパク質溶解物を、１０％ナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、β−アクチン（１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ）、カスパーゼ−９（１：４００、Ｔｈｅｒｍｏ）、及びＭｙＤ８８（１：２００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に対する一次抗体を用いて免疫ブロットした。使用した二次抗体は、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ又はマウスＩｇＧ抗体（１：５００、Ｔｈｅｒｍｏ）であった。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ，３４０９６）を使用して膜を発色させ、ＧｅｌＬｏｇｉｃ６０００  Ｐｒｏカメラ及びＣａｒｅＳｔｒｅａｍ  Ｍｌソフトウェア（ｖ．５．３．１．１６３６９）を使用して画像化した。
【０２１３】
インビトロ及びインビボサイトカイン産生の分析。ｉＭＣ又は対照ベクターで改変したＴ細胞によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＩＬ−６のサイトカイン産生を、推奨されるように、ＥＬＩＳＡ又はサイトメトリックビーズアレイ（cytometric  bead  array）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ又はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）によって分析した。いくつかの実験では、サイトカインを、多重アレイシステム（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ＭＡＧＰＩＸ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ又はＭｉｌｌｉ−Ｐｌｅｘ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ））を使用して分析した。
【０２１４】
統計値。データは平均値±ＳＥＭとして表される。マン・ホイットニー統計比較を用いてデータを分析し、群間の有意差を決定した。一元配置分散分析、続いてボンフェローニの多重比較検定を使用して、複数の処置群を比較した。二元配置分散分析、続いてボンフェローニの検定を使用して、異なる時点での複数の処置群の間の腫瘍増殖における差異の統計的有意性を評価した。生存率をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフによって記録し、有意性をログ・ランク検定によって決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してデータを分析した。
【０２１５】
結果
ＣＡＲアーキテクチャ内にＭｙＤ８８／ＣＤ４０エンドドメインを含めることにより、共刺激がもたらされるが、インビボでのＣＡＲ活性が低下する。
リミヅシド活性化ｉＣ９安全スイッチを使用する能力を保持しながら、ＭＣ共補刺激を有するＣＡＲ−Ｔ細胞を提供するために、ｉＣ９をコードするバイシストロニックレトロウイルスベクターを構築し、続いて、ＣＤ３ζシグナル伝達要素の上流の切断型ＭｙＤ８８（ＴＩＲドメインを欠失）及びＣＤ４０（細胞外ドメインを欠失）をコードするＣＤ１９特異的ＣＡＲを構築し、それを第１世代のｉＣ９発現ＣＤ１９ＣＡＲと比較した（図１Ａ及び１Ｂ）。「ＣＡＲ．ｚ」及び「ＣＡＲ．ζ」は両方とも、ＣＤ３ζポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を指し、「ＣＡＲ．ゼータ」と互換可能である。初代Ｔ細胞の形質導入は、ＣＤ１９．ζ及びＣＤ１９．ＭＣ．ζ構築物の等価なＣＡＲ形質導入効率（それぞれ７１±１０％対７２±８％）を示したが、ＣＡＲ表面発現（ＭＦＩ）は、ＭＣの添加により有意に減少した（ＭＦＩ８５１３±１５８７対２８２４±４５５、ｐ＜０．００５）（図１Ｃ及び図１Ｄ）。ＭＣ又はＭｙＤ８８若しくはＣＤ４０のみを発現する追加のベクターの構築は、ＭｙＤ８８がＣＡＲ発現レベルを低下させたが、形質導入効率を低下させなかったことを明らかとなり、このことは、ＣＡＲ内で発現されたＭｙＤ８８が膜中でＣＡＲの不安定性を引き起こしていることを示唆した（図２）。ＣＡＲ細胞表面レベルを低下させるにもかかわらず、ＭＣ細胞伝達シルナルドメインは、ＣＤ１９．ζのみで改変されたＴ細胞よりもＣＡＲ−Ｔ増殖及びＩＬ−２サイトカイン産生を増加させることにより、ＣＤ１９発現Ｒａｊｉ腫瘍細胞に対するＣＡＲ活性を増強した（２３倍増加、ｐ＜０．０００１）（図１Ｅ）。続いて、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ腫瘍を移植したＮＳＧマウスを使用して、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ活性を評価した。ここで、５×１０６個のｉＣ９−ＣＤ１９．ζ又はｉＣ９−ＣＤ１９．ＭＣ．ζ−改変Ｔ細胞の静脈内注射により、非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞よりも有意な抗腫瘍制御が示されたが（＊＊＊ｐ＜０．０００１、１４日目）、長期の応答は生じなかった（図１Ｆ及び１Ｇ）。重要なことに、ＭＣの添加は、第１世代の構築物と比較して抗腫瘍活性を改善しなかった。これらのデータは、ＭｙＤ８８が、ＣＡＲアーキテクチャ内の共刺激ドメインとして正常な発現と適合しないことを示唆する。
【０２１６】
ＣＡＲ−Ｔ分子の外側のＭＣの構成的発現は、ＣＡＲ発現を維持しながら、堅牢な共刺激を提供する。
Ｔ細胞増殖を駆動するための構成的に発現された共刺激モジュールとしてＭＣを使用することができるかどうかを決定するために、追加の２Ａ配列を使用したトリシストロニック遺伝子発現アプローチを使用して、ＣＡＲ分子の外側にＭＣを発現させた（図３Ａ）。ＣＡＲからＭＣを除去し、それを別々のポリペプチド（ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ）として発現させることにより、遺伝子改変Ｔ細胞上のＣＡＲ発現レベルが向上し（図３Ｂ）、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）レベルがダウンレギュレートされ、Ｔ細胞活性化と一致する（図３Ｂ）。実際に、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞は、抗原刺激の非存在下で、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、及びＴＮＦ−αを含む炎症誘発性サイトカインを分泌し、このことは、ＭＣの発現が、構成的Ｔ細胞活性化シグナルを提供したことを示唆している（図３Ｃ）。重要なことに、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣは、ＣＡＲ−Ｔ係合の非存在下でＩＬ−２分泌を誘発しなかった。非形質導入、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変、及び誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０ＣＤ１９ＣＡＲベクター（ｉＭＣ−ＣＤ１９．ζ）で形質導入したＴ細胞でのウエスタンブロット分析を用いて、ＭｙＤ８８発現を探査することにより、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ形質導入Ｔ細胞中の速く移動する断片（約３０ｋＤａ）及びわずかに遅く移動する断片（約９０ｋＤａ）の両方を検出することができ、このことは、おそらく、非効率的な２Ａリボソームスキッピングに起因して、この関連で発現されるＣＡＲ．ζ分子からＭＣの分離が不完全であったことを示唆している（図３Ｄ）（１５）。ＭＣ介在構成的Ｔ細胞活性化が自律的なＣＡＲ−Ｔ増殖をもたらすかどうかを理解するために、外因性ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ）の存在下又は非存在下で、非形質導入、ｉＣ９−ＣＤ１９ζ、又はｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞を培養した。ＩＬ−２の存在下では、このＭＣ  ＣＡＲの係留は、６０日間の培養後にＣＡＲ−Ｔ細胞の持続的で広範な増殖（１０８個超）を誘導することができ、更に、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ発現ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＩＬ−２の非存在下では生存せず、自律増殖のリスクが低減した（図３Ｅ）。長期間培養した（１００日間）ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ形質導入Ｔ細胞は、リミヅシドに曝露された時に、ｉＣ９誘導性アポトーシスに対して感受性を維持し（図３Ｆ）、細胞毒性活性を保持し、より短い期間（１４日間）培養したＴ細胞のようなＣＤ１９＋標的細胞との共培養アッセイにおいてＩＬ−２を産生した（図３Ｇ）。興味深いことに、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞は、第１世代のＣＡＲと比較してＰＤ−１発現の低下を示し、このことは、構成的ＭＣ活性が、腫瘍微小環境においてＰＤ−Ｌ１発現に対するｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣＴ細胞の感度を低下させ得ることを示唆している。更に、ＰＤ−１発現の低減は、Ｔ細胞枯渇を遅延又は妨げ得る（図３Ｈ）。更に、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞の長期培養は、これらの細胞が、第１世代のＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＴＮ、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋ＴＣＭ、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−ＴＥＭ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ−ＴＥＭＲＡ��と同様のＴ細胞サブセット分布を呈したことを示す。しかしながら、培養中で１００日後、ＴＥＭ（ＣＤ３＋ＣＤ４５−ＣＤ６２Ｌ−）細胞は、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣＴ細胞培養物中に存在する主要なサブタイプであった（図２５）。したがって、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣは、抗原刺激又は外因性ＩＬ−２の存在下で持続的な増殖能力を有する構成的に活性なＣＡＲ構築物であるが、ｉＣ９安全スイッチを介した制御された排除に応答する。
【０２１７】
構成的ＭＣ  ＣＡＲ−Ｔは、動物におけるＣＤ１９＋リンパ腫に対する堅牢な抗腫瘍活性を示した。
インビボ生物発光イメージングを可能にするために、ＥＧＦＰｌｕｃ導入遺伝子（Ｒａｊｉ−ＥＧＦＰ／ｉ／ｃ）で改変したＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞株を移植した免疫不全ＮＳＧマウスを使用して、構成的ＭＣを発現するＣＤ１９標的化ＣＡＲ−Ｔ細胞をインビボでの効力について評価した。Ｒａｊｉ腫瘍細胞は、５×１０６個の非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞で処置したマウスで急速に増殖し、後肢の麻痺に起因して２１日目までに犠牲死の必要があった（図４Ａ）。１×１０６又は５×１０６個のｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ−改変Ｔ細胞で処置したマウスは、早期の腫瘍制御を示し、これは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の用量依存的な様式で急性体重減少に対応した（図４Ａ及び４Ｃ）。しかしながら、マウスが体重が（最初の測定から）１０％超減少した時に５ｍｇ／ｋｇのリミヅシド（ｉ．ｐ．）を投与することによって、ＣＡＲ関連毒性の解消がうまくいった（図４Ｃ）。
【０２１８】
リミヅシド投与後、生存する改変ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍治療効果が観察された。図４Ｂ：ＮＳＧマウス（１群当たりｎ＝５）にＲａｊｉ−ｌｕｃ腫瘍細胞を移植し、次いで、３日目に非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞又はｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣＣＡＲ改変Ｔ細胞で処置した。腫瘍増殖をＩＶＩＳイメージングにより測定し、全身ＢＬＩにより計算した。図４Ｃ：
マウスの体重を、ＣＡＲ−Ｔ関連サイトカイン毒性を評価するために測定した。−２０％の体重減少後、マウスをリミヅシドで処置して、ＣＡＲ−Ｔ細胞を排除した（図４Ｃ）。
【０２１９】
リミヅシド処置前及び処置後に採取した血清試料は、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−６を含むヒトサイトカインの高いリミヅシド前レベルを示し、これは、リミヅシド曝露後２４時間までに基準レベルに戻った（図４Ｄ）。長期の腫瘍制御は、ｉＣ９安全スイッチの活性化によって損なわれず、全てのＣＡＲ−Ｔ処置マウスは、７０日目までに腫瘍を含まないままであった（ＢＬＩによる）（図４Ａ及び４Ｂ）。ＣＡＲ−Ｔ活性を低下させるためのｉＣ９に基づく以前の研究で観察されたように（１６）、動物は、残存Ｔ細胞が低下したレベルのｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣを発現することに起因して、ナイーブマウスと比較して後続の腫瘍負荷に対して抵抗性であり（図４Ｅ及び４Ｆ）、残存ＣＡＲ−Ｔ細胞をリミヅシド処置動物の脾臓で検出することができた（図４Ｇ及び４Ｈ）。第１世代（ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ）及び第２世代（ｉＣ９−ＣＤ１９．２８．ζ及びｉＣ９−ＣＤ１９．ＢＢ．ζ）のＣＡＲ構築物との比較により、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞で処置された動物における毒性を制御するためにリミヅシドと共にｉＣ９を配備する必要があるにもかかわらず、この動物モデルにおいて、これらの代替のＣＤ１９ＣＡＲと比較して抗腫瘍活性が損なわれなかったことが示された（図１５Ａ〜１５Ｄ）。
【０２２０】
Ｃｄ１２３＋骨髄細胞株＋骨髄細胞株を標的とする構成的ＭＣＣＡＲ−Ｔプラットフォーム（ＴＨＰ−１−ＥＧＦＰ／ｕｃ）をインビボで評価し、非形質導入及びｉＣ９実施可能な第１世代ＣＡＲ（ｉＣ９−ＣＤ１２３ζ）で改変されたＴ細胞と比較した（図５Ａ）。ＴＨＰ−１−ＥＧＦＰ／ｕｃは、対照Ｔ細胞で処置したマウスにおいて急速な過剰増殖を示し、これは３５日目に終了した一方、ｉＣ９−ＣＤ１２３ζ改変Ｔ細胞は、穏やかな抗腫瘍活性を示し、腫瘍増殖を２週間遅延させた（図５Ａ及び５Ｂ）。しかしながら、構築物へのＭＣの付加は、長期の抗腫瘍応答（Ｔ細胞注射後１００日超）を提供した（図５Ａ〜Ｃ）。ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ発現Ｔ細胞で観察されたように、マウスの３／５（６０％）は、Ｔ細胞処置後１４日目までに悪液質の形態で急性毒性を経験し、毒性は、腫瘍制御に影響を及ぼすことなく、リミヅシド投与によって解消することができた（図５Ｄ）。したがって、複数の腫瘍モデルにおいて、構成的に活性なＭＣ駆動ＣＡＲ−Ｔ細胞は、堅牢な抗腫瘍効果を示したが、その高い基礎活性に起因してマウスにおいて悪液質を引き起こし、ｉＣ９媒介性の毒性緩和を必要とした。
【０２２１】
リミヅシドの用量設定により、構成的ＣＡＲ−Ｔ活性の部分的な剥奪を可能にし、全身性サイトカインレベルを調節する。
ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞は、その抗腫瘍活性に関連する高い基礎活性化状態を示した。高用量のリミヅシド（５ｍｇ／ｋｇ）の投与により、低レベルのＣＡＲ−Ｔ細胞の持続が可能となったが、リミヅシドの用量設定は、サイトカイン関連毒性を緩和しながら、より多くの遺伝子改変Ｔ細胞の保持を可能にし得る。Ｔ細胞をｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ及びＥＧＦＰｌｕｃで共形質導入し、Ｒａｊｉ保有マウスに投与した。悪液質の発症（＞１０％の体重減少）に続いて、リミヅシド（５〜５×１０−５ｍｇ／ｋｇ）のｌｏｇ用量設定を単一の腹腔内注射として投与した（図６Ａ）。以前に観察されたように（１６）、ＣＡＲ−Ｔ  ＢＬＩは、リミヅシド用量依存的な様式で減少した（図６Ｂ）。ＣＡＲ−Ｔの減少は、血清サイトカインレベル（すなわち、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−α）の減少に対応した（図６Ｃ）。この高度に活性な構築物では、リミヅシド用量設定を選択的に調節して、治療効力を最大限にしながら、過度の活性を最小限にすることができた。
【０２２２】
インビボでのＣＡＲ−Ｔ増殖には、ＭＣ基礎活性が必要とされる。
図３Ｄに示すように、非効率的な２Ａ切断は、いくつかのＣＡＲ分子とのＭＣ会合をもたらすようであった。ＣＡＲからＭＣをより効率的に分離するために、ＧＳＧ連結２Ａ配列（ＧＳＧリンカー）（１５、１７）を使用した追加の構築物、及びＣＤ３ζ鎖への細胞内付加の可能性を除去するために、ＭＣをＣＡＲの５’である第１位置に配置した構築物を分析した（図７Ａ）。更に、膜へのＭＣの並置から得られる基礎シグナル伝達を、内側膜会合を増加させるためにミリスチン化標的化ドメインを含ませることによってアッセイした（１８）。形質導入Ｔ細胞からの基礎サイトカイン産生をアッセイした。サイトカイン分析により、改善されたＧＳＧ結合２Ａ切断及び５’位置へのＭＣの移動が、基礎ＩＦＮ−γ及びＩＬ−６産生を劇的に低下させたが、部分的なＣＡＲ付着（ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ）及び膜会合ＭＣ（Ｍｙｒ  ＭＣ）により、高レベルのサイトカイン分泌が明らかとなったことを示した（図７Ｂ）。興味深いことに、インビボでのＴ細胞レベルを測定するためにＥＧＦＰ／ｉ／ｃで共改変されたＣＡＲ−Ｔ細胞を使用した場合、高トニックシグナル伝達は、ＣＡＲ−Ｔ注射後１２日目（約４倍、ｐ＜０．００５）及び１９日目（約８倍；ｐ＜０．００１）での急速な増殖に関連した（図７Ｃ及び図７Ｅ）。高い基礎活性は、ＣＡＲ−Ｔの膨張を増強した一方、これはまた、ｉＣ９を活性化するためにリミヅシド注入を必要とする悪液質にも関連していた（図７Ｆ）。これらの動物におけるＣＡＲ−Ｔ産生ヒトサイトカインのプロファイルは、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ及びＭｙｒＭＣ−ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ改変Ｔ細胞が、低い基礎ＣＡＲ活性を有する構築物と比較して、高レベルの多数の炎症誘発性サイトカインを産生したことを示した（図７Ｇ）。更に、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ腫瘍モデルを使用した誘導性ＭＣ系（すなわち、ｉＭＣ［Ｆｏｓｔｅｒ  ２０１７；Ｍａｔａ  ２０１７］）との比較により、長期の抗腫瘍効力のためには高い基礎活性が必要であることが示された（図２６）。これらのデータは、基礎活性化は、インビボでのＣＡＲ−Ｔ増殖及び抗腫瘍活性を増強することができるが、急速増殖Ｔ細胞からのサイトカイン産生は、望ましくない副作用を引き起こし得ることを示唆している。
【０２２３】
ＣＡＲ改変Ｔ細胞の選択は、細胞毒性を低減する
臨床前研究により、様々な抗原（例えば、ＣＤ１９、Ｈｅｒ２、及びＰＳＣＡ）を標的化するＳＦＧ−ｉＣ９−ＣＡＲ．ζ−ＭＣで形質導入されたＴ細胞は、より高いレベルのＣＡＲ−Ｔ増殖及び腫瘍細胞株の死滅を示すことが実証された。更に、ｉＣ９−ＣＡＲ．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞はまた、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αを含む、より高いレベルのサイトカインを産生した。動物モデルでは、ｉＣ９−ＣＡＲ．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞は、血液学的及び固形腫瘍細胞株の両方に対する効力を示した。しかしながら、これらの高度に活性なＣＡＲ−Ｔ細胞は、急性の体重減少を特徴とする、マウスにおける毒性も引き起こした。この毒性は、長期腫瘍制御に影響を及ぼすことなく、リミヅシドの注射（０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射）によって抑制され得る。悪液質の可能性は、腫瘍保有マウスへの細胞の投与前に、高い割合又は比率のＣＤ８＋Ｔ細胞を得るための改変細胞集団の濃縮によって低減させた。ＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の濃縮は、抗腫瘍効力を維持しながらサイトカイン関連毒性を低減させた。
【０２２４】
ＩＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞のＣＤ８選択は、サイトカイン産生を低減することによって毒性を抑制する。
ｉＣ９−ＣＡＲ．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞の投与に関連する悪液質を更に研究するために、ＣＤ１９再指向性（redirected）構築物をＣＤ１９＋Ｄａｕｄｉ腫瘍に対してインビボでアッセイし、ヒトＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αを標的化する中和抗体に対してアッセイし、全てがマウスサイトカイン受容体と交差反応性であるヒトＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αを標的とする中和抗体を投与し、続いてマウスの体重減少を監視した。ここで、腫瘍保有マウスを、５×１０６個のｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ形質導入Ｔ細胞で処置し、１０％超の体量減少後、リミヅシド（０．５ｍｇ／ｋｇ）若しくはビヒクル単回腹腔内投与、又はマウスあたり１００ｕｇの抗ｈｌＦＮ−ｙ、ｈｌＬ−６、若しくはｈＴＮＦ−αの週２回の注射のいずれかによる介入を開始した（図９Ａ）。興味深いことに、抗ｈＴＮＦ−α処置のみが、ｉＣ９安全スイッチを活性化したのと同じ保護レベルに、更なる健康悪化からマウスを保護することができた（図９Ｂ）。５×１０６個のｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞をＤａｕｄｉ保有ＮＳＧマウスに注射し、次いで、１０％超の体重減少後に０．５ｍｇ／ｋｇのリミヅシドで処置するか、若しくはアイソタイプ抗体（対照）で１週間あたり２回の１００ｍｇの腹腔内注射で処置するか、又はヒトＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＦＮ−γに対する中和抗体で処置した。体重の回復を２８日目まで監視した。更なる体重減少からの抗ｈＴＮＦ−α処置による保護は、抗体結合ｈＴＮＦ−α除去を媒介するのではなく、リガンド−受容体相互作用の遮断に合致する血清ｈＴＮＦ−αレベルの穏やかな非有意の低下に関連した（図９Ｃ）。対照的に、リミヅシドによるｉＣ９の活性化は、ｈＴＮＦ−αの血清濃度を有意に低下させた。ｉＣ９の使用と同様に、抗ｈＴＮＦ−αによる毒性の制御は、ＣＡＲ−Ｔ療法の抗腫瘍活性に影響を及ぼさなかった（図９Ｃ）。したがって、サイトカインの遮断は、この強力なアプローチの毒性を解消するための第２の効果的な作用機序を提供する。
【０２２５】
Ｔ細胞サブセットが異なる特性を有することができるので、サブセットの精製が、毒性を制御するための第３の道筋を提供し得ることが推測された。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原認識後の活性化後において、高レベルの炎症誘発性サイトカインを産生することが知られている。我々の研究により、ＣＤ４＋Ｔ細胞が高レベルのＩＦＮ−ｇ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、及びＴＮＦ−ａ（ＴＮＦ−α）を分泌したことも示された（図１２）。異なる細胞集団において、基礎サイトカイン分泌レベルを決定した。
【０２２６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞又は非選択ＣＡＲ−Ｔ細胞よりも高いレベルのＩＦＮ−ｇ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、及びＴＮＦ−ａ（ＴＮＦ−α）を分泌した（図１２）。共培養アッセイでは、ＣＤ１９特異的（ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ）ＣＤ４＋は、ＣＤ８選択ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞と比較して高レベルのＩＬ−６、ＩＬ−１３、及びＴＮＦ−ａを産生した（図１４）。ＣＤ８選択ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞は、低レベルのＴＮＦ−αを産生したが、ＣＤ１９＋腫瘍細胞に対する細胞毒性活性を保持した（図１４）。これらのデータにより、ＣＤ８＋ｉＣ９−ＣＡＲ．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞を選択することは、ＣＡＲ−Ｔ細胞によって産生されるサイトカインによって引き起こされる毒性を回避しつつ、抗腫瘍効能を維持し得ることが示唆された。
【０２２７】
ＴＮＦ−α及び可能性として他のサイトカインが、ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞の静脈内注射後に悪液質の一因となったので、抗腫瘍活性を維持しながら毒性を弱めることができるかを決定するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞の選択（又はＣＤ４＋細胞の枯渇）を試験した。ここで、非形質導入及びＣＡＲ改変Ｔ細胞を、磁気ビーズ選択を用いて、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に精製した（図１０Ａ）。
【０２２８】
非選択及び選択Ｔ細胞を、純度及び形質導入効率について試験した。非選択ＣＡＲ−Ｔ細胞は、１：２のＣＤ４：ＣＤ８の比を有していたが、選択後において、それらは、ＣＤ４及びＣＤ８選択Ｔ細胞についてそれぞれ９９％及び９０％であった（図１０Ｂ）。ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ形質導入は、選択及び非選択遺伝子改変Ｔ細胞（−６２％ＣＤ３＋ＣＤ３４＋）の両方において等価であった（図１０Ｂ）。Ｒａｊｉ腫瘍細胞に対する共培養アッセイを行い、ＩＬ−６及びＴＮＦ−α産生を４８時間で測定した。ＣＤ４選択ＣＡＲ−Ｔ細胞は、非選択ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αを７１％及び７６％高く産生したのに対し、ＣＤ８選択ＣＡＲ−Ｔ細胞は、これらの分子をそれぞれ９９％及び９１％低く産生した（図１１Ａ）。この改変が悪液質を軽減することができるかどうかを試験するために、非形質導入、非選択、ＣＤ４又はＣＤ８濃縮ｉＣ９−ＣＤ１９ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞をＲａｊｉ−ＥＧＦＰＩｕｃ保有ＮＳＧマウスに投与した。結果により、非選択及びＣＤ４濃縮ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＮＴＴ細胞よりも改善された腫瘍制御を示したが（図１１Ｂ）、これらのマウスは、ＣＡＲ−Ｔ注射後７日目までに急速に悪液質を発現したことが示された（図１１Ｃ）。対照的に、ＣＤ８選択ＣＡＲ−Ｔ細胞は、最小限の体重減少を同時に伴って優れた腫瘍制御を示した（図１１Ｂ及び図１１Ｃ）。同じ動物モデルを使用して、ＣＤ８濃縮ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞で用量設定を行った。ここで、高用量（２．５×１０６個超の細胞）は、腫瘍増殖を急速に制御した（図１１Ｄ）。これらの動物は悪液質のいくつかの証拠を示したが、リミヅシドによるｉＣ９活性化は必要ではなく、全ての動物は、ＣＡＲ−Ｔ注射の約２〜３週間後に回復した（図１１Ｄ）。より低い用量のＣＤ８濃縮ＣＡＲ−Ｔ細胞による処置はまた、腫瘍の排除動態がより遅いにもかかわらず、腫瘍制御を示した（図１１Ｄ）。重要なことに、６．３×１０５個のＣＤ８細胞が、長期効能を伴って高レベルの腫瘍負荷を制御した（図１１Ｅ）。これらの実験は、ＣＤ８濃縮ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞が、低減したサイトカイン関連毒性を伴って強力な抗腫瘍効力を有し、ヘルパーＴ細胞に依存しななくてもよいことを示唆している。
【０２２９】
議論
本実施例は、Ｔ細胞増殖及び侵攻性ＣＤ１９＋及びＣＤ１２３＋リンパ腫及び白血病細胞株に対する抗腫瘍活性を駆動するために、高い基礎ＣＡＲシグナル伝達及び共刺激（すなわち、「常に」ＣＡＲに対して）を利用する経験的に発見されたＣＡＲアーキテクチャを記載する。しかしながら、構成的に活性なＭＣを使用したＣＡＲ−Ｔ細胞は、高レベルのサイトカイン（すなわち、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−６）を産生し、これは、動物モデルにおいて毒性を解消するためにリミヅシドの使用を必要とし、リミヅシドは、「部分的に」ＣＡＲ−Ｔ細胞を排除して、長期の抗腫瘍効力を保持するために用量設定することができる。更に、ＣＡＲ−Ｔ分泌サイトカインが悪液質の原因であることを認識すると、ＣＤ４＋ヘルパーには依存しない様式で、増加した抗腫瘍効果を伴って毒性のレベルの低下をもたらす、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の選択に焦点を当てた。
【０２３０】
最初に、ＣＤ２８及び４−１ＢＢなどの従来の共刺激ドメインを使用して、ＣＡＲと類似したＣＤ３ζを用いてシスでＭＣを発現することを試みた。しかしながら、ＭｙＤ８８は、ＣＡＲを不安定化させ、表面発現を低下させ、インビボ抗腫瘍活性を減少させるようであった（図１）。続いて、本発明者らは、連続的な共刺激をＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞に提供するために、構成的タンパク質としてＭＣを発現させた。これは、改変Ｔ細胞上でのＣＡＲ表面発現の回復及び腫瘍活性の改善をもたらした（図３）。ウエスタンブロット分析により、可能性としてＣＡＲ．ζとＭＣ分子との間の非効率的な２Ａスキッピングによって引き起こされる融合タンパク質の形成を示す、追加のＭＣ種が明らかになった。ＣＡＲ分子の分画にＭＣを連結することが、基礎活性の原因であるがＣＡＲの効力の原因でもあるシグナル伝達カスケードを誘導すると仮定した。実際に、導入遺伝子タンパク質分離を増加させるためにＧＳＧリンカーを２Ａに付加することにより、基礎サイトカイン分泌が抑制するが、インビボでのＣＡＲ−Ｔ増殖もなくなった（図７）。ＣＤ３ζに係留されたＭｙＤ８８／ＣＤ４０は、他のシグナル伝達タンパク質（例えば、インターロイキン−１受容体関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）ファミリー）をＭｙＤＤｏｓｏｍｅ複合体として動員して、基礎シグナル伝達を誘導するための足場として作用し得る（１９〜２２）。あるいは、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０により増幅されたｓｃＦｖからのトニックシグナル伝達は、構成的刺激をもたらし得る（２３）。
【０２３１】
構成的ＣＡＲシグナル伝達の有害な効果の以前の報告とは異なり、ＭＣ共刺激は、ＣＡＲ−Ｔ疲弊を誘導するようではなかった（２３、２４）。実際に、ＭＣ実施可能なＣＡＲ−Ｔ細胞は、細胞毒性機能、ＩＬ−２産生、及び重要なことにはｉＣ９媒介アポトーシスに対する応答を失うことなく、３ヶ月超増殖することができた。Ｌｏｎｇ及び同僚は、４−１ＢＢなどのいくつかのＣＡＲ共刺激ドメインが、トニックシグナル伝達に由来する細胞枯渇に対して保護することを示した（２３）。しかしながら、他者は、４−１ＢＢがトニックＣＡＲ条件下でＦＡＳ依存性細胞死の一因となり得ることを示した（２５）。対照的に、ＭＣは、広範かつ固有のシグナル伝達経路のセットをリン酸化するようであった。ＮＦ−ＫＢを介したシグナル伝達に加えて（５、６）、ＭＣはＡｋｔを活性化し、これは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の生存及び増殖を増強することが示されている（２６）。追加のシグナル伝達ノード（node）（例えば、ＡＰ−１、ＭＡＰＫ、及びＩＲＦ）もまた、機能の増強の一因となり得る。我々（図８及び図５）及び他の観察（６）は、ＭＣがＣＤ２８又は４−１ＢＢよりもＣＡＲ−Ｔ活性の強力な駆動物であり得ることを示唆している。ＭｙＤ８８／ＣＤ４０が、構成的に活性なＣＡＲを発現するＴ細胞における従来の共刺激分子の制限を克服するかどうかは、更なる調査を必要とする。
【０２３２】
高活性Ｔ細胞療法は、サイトカイン関連毒性のリスクがあり、これは、高腫瘍負荷を有する患者において更に増幅され得る（２７）。本研究では、ＣＡＲ−Ｔ細胞における構成的ＭＣシグナル伝達は、注入後に急性の悪液質をもたらし、これは、ＣＡＲ標的（すなわち、ＣＤ１９又はＣＤ１２３）に特異的ではなく、異種移植片対宿主病で典型的に見られる時間枠でも特異的でもなかった。しかしながら、毒性は、リミヅシドの単回注射後のｉＣ９の活性化によって軽減することができた。以前に実証されたように、リミヅシドの用量設定は、抗腫瘍活性を失わずに、ＭＣ実施可能なＣＡＲ−Ｔ細胞の部分的な排除をもたらした（１６）。中和ブロッキング抗体の使用により、ＴＮＦ−αがＣＡＲ関連毒性を減少させることが明らかとなり、このことは、高レベルの炎症誘発性サイトカイン（すなわち、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞）を産生する細胞サブセットの枯渇が、構成的ＭＣ実施可能なＣＡＲ−Ｔ細胞療法を使用するための治療用ウィンドウを改善することができることが示唆された。実際に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の精製は、最小限のサイトカイン関連毒性を伴って効能の改善をもたらし、動物を救済するためにリミヅシドを使用する必要はなかった。興味深いことに、ＭＣは、ＣＤ４＋ヘルパーに依存しない様式でＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を支持するようであり、このことは、臨床的用途において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の精製が、推定の調節ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むことなく、サイトカイン放出症候群を減少させ得ることを示唆している（２８）。使用された動物モデルはヒト由来骨髄細胞を含まなかったため、サイトカイン放出症候群の最近記載された前臨床モデルを使用したｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣＣＡＲ−Ｔ細胞の更なる調査は、患者における潜在的な毒性を軽減するためにこの戦略の有用性への追加の洞察をもたらす（２９、３０）。概して、我々は、より有効なＣＡＲ−Ｔプラットフォームを特定した。この改善された効力に関連する毒性リスクの増加が予想されるが、その毒性の軽減、Ｔ細胞サブセットの精製、炎症誘発性サイトカインの中和、及びｉＣ９安全スイッチの使用に対する３つのアプローチも同定した。
【０２３３】
要約すると、構成的ＭＣ共刺激は、リンパ腫及び骨髄性白血病の動物モデルにおいて、長期の増殖能力及び高い抗腫瘍効力を有するＣＤ１９又はＣＤ１２３を標的とするＣＡＲを提供する。ＭＣ実施可能なＣＡＲ−Ｔ細胞は、実質的な基礎活性を示し、免疫不全マウスにおけるサイトカイン関連毒性に関連するが、これは、リミヅシドと共にｉＣ９安全スイッチを配備することによって、又はより低いサイトカイン分泌性向を有するＴ細胞サブセットを選択することによって管理することができる。
【０２３４】
以下の刊行物は、本実施例で引用され、又は支持資料を提供し得る。
（１）Ｊｕｎｅ  ＣＨ，Ｓａｄｅｌａｉｎ  Ｍ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１８；３７９：６４−７３．（２）Ｐａｒｋ  ＪＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１８；３７８：４４９−５９．（３）Ｍａｕｄｅ  ＳＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１８；３７８：４３９−４８．（４）Ｎｅｅｌａｐｕ  ＳＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１７；３７７：２５３１−４．（５）Ｆｏｓｔｅｒ  ＡＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１７；２５：２１７６−８８．（６）Ｍａｔａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１７；７：１３０６−１９．（７）Ｎａｒａｙａｎａｎ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１１；１２１：１５２４−３４．（８）Ｓｔｒａａｔｈｏｆ  ＫＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０５：４２４７−５４．（９）Ｚｈｏｕ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５：４１０３−１３．（１０）Ｐｈｉｌｉｐ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２４：１２７７−８７．（１１）Ｄｕ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００７；３０：６０７−１３．（１２）Ｍａｒｄｉｒｏｓ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２：３１３８−４８．（１３）Ｍｉｌｏｎｅ  ＭＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９；１７：１４５３−６４．（１４）Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ＪＮ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１０；１１６：４０９９−１０２）。（１５）Ｃｈｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．ＭＡｂｓ．２０１５；７：４０３−１２．（１６）Ｄｉａｃｏｎｕ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１７；２５：５８０−９２．（１７）Ｈｏｆａｃｒｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１８；２９：４３７−５１．（１８）Ｈａｎｋｓ  ＢＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００５；１１：１３０−７．（１９）Ｍｏｔｓｈｗｅｎｅ  ＰＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００９；２８４：２５４０４−１１．（２０）Ｌｉｎ  Ｓ−Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１０；４６５：８８５−９０．（２１）Ｗａｎｇ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１７；１１４：１３５０７−１２．（２２）Ｄｅ  Ｎａｒｄｏ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２９３：１５１９５  ｅｔ  ｓｅｑ．，２０１８．（２３）Ｌｏｎｇ  ＡＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１５；２１：５８１−９０．（２４）Ｆｒｉｇａｕｌｔ  ＭＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１５；３：３５６−６７．（２５）Ｇｏｍｅｓ−Ｓｉｌｖａ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１７；２１：１７−２６．（２６）Ｓｕｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０；１８：２００６−１７．（２７）Ｎｅｅｌａｐｕ  ＳＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１８；１５：４７−６２．（２８）Ｌｅｅ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１１；７１：２８７１−８１．（２９）Ｎｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１８；２４：７３９−４８．（３０）Ｇｉａｖｒｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１８；２４：７３１−３８
【０２３５】
実施例２：改変Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ指向性ＣＡＲ−Ｔ細胞
ｉＣ９−ＣＡＲ．ζ−ＭＣ発現Ｔ細胞の改変細胞集団を産生するためのＣＤ８選択が、固形腫瘍抗原を標的化する他のＣＡＲに適用することができるかどうかを決定するために、Ｈｅｒ２特異的ＣＡＲ構築物を用いた動物研究を行った。
【０２３６】
Ｔ細胞をＳＦＧ−ｉＣ９−Ｈｅｒ２．ζ−ＭＣベクターで形質導入し、５日後に、ＣＤ３４エピトープを使用してＣＡＲ発現について測定した。結果は、ＣＡＲ分子の７０％超の発現を伴って、ｉＣ９−Ｈｅｒ２．ζ−ＭＣでＴ細胞を効率的に形質導入することができたことを示している（図１５）。図１５Ａに見ることができるように、ＮＴはＣＡＲ分子を発現せず、図１５Ｂは、ＳＦＧ−ｉＣ９−Ｈｅｒ２．ζ−ＭＣで形質導入されたＴ細胞が７０．３％陽性であることを示している。
【０２３７】
次いで、ＣＡＲ改変Ｔ細胞をＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットについて選択し、高度に精製されたｉＣ９−Ｈｅｒ２．ζ−ＭＣ−改変Ｔ細胞を生成した（図１６）。ｉＣ９−Ｈｅｒ２．ζ−ＭＣ形質導入Ｔ細胞を、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞存在比率について測定した。続いて、磁気ビーズ及びＭＡＣＳカラムを使用して、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかについて、遺伝子改変Ｔ細胞を選択した。４日後、ＣＤ４選択（図１６Ａ）及びＣＤ８選択（図１６Ｂ）Ｔ細胞を、それぞれの集団の純度について蛍光活性化細胞選別により測定し、ＮＳＧマウスに皮下注射によりＨｅｒ２＋ＨＰＡＣ−ＥＧＦＰｌｕｃ腫瘍細胞を移植した。７日後、マウスを、５×１０６個のＮＴ、非選択、ＣＤ４選択、又はＣＤ８選択ｉＣ９−Ｈｅｒ２．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞の静脈内注射で処置した。Ｔ細胞注射から４１日後にカリパスによって（図１７）、又はＴ細胞注射の４１日後に基質Ｄ−ルシフェリンの注射によるインビボ生物発光イメージング（ＩＶＩＳ）によって（図１８）、腫瘍サイズを測定した。ＨＰＡＣ腫瘍細胞は、全てのＣＡＲ−Ｔ改変細胞型によって効率的に制御された（図１７及び１８）。しかしながら、ＣＤ１９研究で観察されるように、ＣＤ４選択ｉＣ９−Ｈｅｒ２．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞は、より高い割合の悪液質を示し、２／５のマウスの死をもたらした（図１９及び２０）。
【０２３８】
図２０は、選択された改変ＣＡＲ−Ｔ細胞による処置後のマウスの生存率を示す。生存率グラフ化し、ここで、ＮＴＴ細胞で処置した全てのマウスが腫瘍増殖に起因して死亡し、ＣＤ４選択群中の２匹のマウスが体重減少／悪液質に起因して死亡した。
【０２３９】
実施例３：改変ＰＳＣＡ指向性ＣＡＲ−Ｔ細胞
ｉＣ９−ＣＡＲ．ζ−ＭＣ発現Ｔ細胞の改変細胞集団を産生するためのＣＤ８選択が、固形腫瘍抗原を標的化する他のＣＡＲに適用することができるかどうかを決定するために、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）特異的ＣＡＲ構築物を使用して動物研究を行った。
【０２４０】
Ｔ細胞を、ＰＳＣＡ指向性ＣＡＲ（ｉＣ９−ＰＳＣＡ．ζ−ＭＣ）で効率的に形質導入し、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞について精製することができる（図２１）。高レベルのＰＳＣＡも発現するＨＰＡＣ−ＥＧＦＰｌｕｃ腫瘍モデルを使用し、ＮＴで処置したマウスは腫瘍を制御できなかったが、非選択及びＣＤ４選択ｉＣ９−ＰＳＣＡ．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞は、ＮＳＧ腫瘍保有動物において悪質液及び死を急速に誘発した（図２１〜２４）。しかしながら、ＣＤ８選択ｉＣ９−ＰＳＣＡ．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞は、体重減少及びマウスの健康に対する影響を最小限としながら、腫瘍を排除することができた。
【０２４１】
累積的に、ＣＤ１９、Ｈｅｒ２、及びＰＳＣＡベクターを使用して得られたデータは、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットが、ｉＣ９−ＣＡＲ．ζ−ＭＣ改変Ｔ細胞で観察される高いサイトカイン産生の原因であり、ＴＮＦ−αなどのサイトカインが、ＮＳＧ腫瘍モデルにおいて観察される毒性の原因であることを示唆している。ＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の精製は、サイトカイン関連毒性を最小限にしながら、ＣＤ１９、Ｈｅｒ２、及びＰＳＣＡ陽性細胞株に対する抗腫瘍効果を維持する。
【０２４２】
実施例４：核酸及びアミノ酸配列
【０２４３】
【表３−１】
2021505139.tif 000005
【０２４４】
【表３−２】
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【０２４５】
【表３−３】
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【０２４６】
【表３−４】
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【０２４７】
【表４−１】
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【０２４８】
【表４−２】
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【０２４９】
【表４−３】
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【０２５０】
【表４−４】
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【０２５１】
【表４−５】
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【０２５２】
【表４−６】
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【０２５３】
実施例５：代表的な実施形態
以下に、本技術の特定の実施形態の例を提供する。
【０２５４】
Ａ１．改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、
改変Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含み、キメラ抗原受容体が、
（ｉ）膜貫通領域、
（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び
（ｉｉｉ）抗原認識部分
を含み、改変細胞集団中のＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、３：２以上である、改変細胞集団。
【０２５５】
Ａ２．キメラ抗原受容体が、
（ｉ）膜貫通領域、
（ｉｉ）共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及び共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及びＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び
（ｉｖ）抗原認識部分を含む、実施形態Ａ１に記載の改変細胞集団。
【０２５６】
Ａ２．１．共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０からなる群から選択される、実施形態Ａ１〜Ａ２のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２５７】
Ａ２．２．キメラ抗原受容体が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０からなる群から選択される２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２．１のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２５８】
Ａ３．キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む改変細胞集団であって、
キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｖ）抗原認識部分を含み、
改変細胞の少なくとも８０％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、改変細胞集団。
【０２５９】
Ａ４．改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、
改変Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含み、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｖ）抗原認識部分を含み、
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、４：１以上である、改変細胞集団。
【０２６０】
Ａ５．改変Ｔ細胞が、誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１〜Ａ４のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２６１】
Ａ６．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、
キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｖ）抗原認識部分を含む、第１のポリヌクレオチド、並びに
多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１〜Ａ５のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２６２】
Ａ７．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、核酸を含み、核酸が、
キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｖ）抗原認識部分を含む、第１のポリヌクレオチド、並びに
多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１〜Ａ５のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２６３】
Ａ８．キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む改変細胞集団であって、
キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含み、
改変細胞の少なくとも８０％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、改変細胞集団。
【０２６４】
Ａ９．改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、
改変Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含み、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域と、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子と、（ｉｖ）抗原認識部分と、を含み、
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、４：１以上である、改変細胞集団。
【０２６５】
Ａ１０．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、
キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含む、第１のポリヌクレオチド、並びに
多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１〜Ａ９のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２６６】
Ａ１１．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、核酸を含み、核酸が、
キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含む、第１のポリヌクレオチド、並びに
多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１０のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２６７】
Ａ１２．キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む改変細胞集団であって、
キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含み、
改変細胞の少なくとも８０％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、改変細胞集団。
【０２６８】
Ａ１３．改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、
改変Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含み、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含み、
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、４：１以上である、改変細胞集団。
【０２６９】
Ａ１４．
改変細胞又は改変Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含む、第１のポリヌクレオチド、並びに
多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１３のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２７０】
Ａ１５．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、核酸を含み、核酸が、
キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含む、第１のポリヌクレオチド、並びに
多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１４に記載の改変細胞集団。
【０２７１】
Ａ１６．キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む改変細胞集団であって、
キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（Ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含み、
改変細胞の少なくとも８０％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、改変細胞集団。
【０２７２】
Ａ１７．改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、
改変Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含み、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（Ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含み、
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、４：１以上である、改変細胞集団。
【０２７３】
Ａ１８．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、
キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含む、第１のポリヌクレオチド、並びに
多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１７のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２７４】
Ａ１９．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、核酸を含み、核酸が、
キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分含む、第１のポリヌクレオチド、並びに
多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１８に記載の改変細胞集団。
【０２７５】
Ａ２０．キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む改変細胞集団であって、
キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（Ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、及びＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含み、
改変細胞の少なくとも８０％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、改変細胞集団。
【０２７６】
Ａ２１．改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、
改変Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含み、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、及びＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含み、
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、４：１以上である、改変細胞集団。
【０２７７】
Ａ２２．
改変細胞又は改変Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、及びＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含む、第１のポリヌクレオチド、並びに
多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２２のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２７８】
Ａ２３．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、核酸を含み、核酸が、
キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、及びＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域と、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含む、第１のポリヌクレオチド、並びに
多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ２２に記載の改変細胞集団。
【０２７９】
Ａ２４．キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む改変細胞集団であって、
キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０ポリペプチド、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含み、
改変細胞の少なくとも８０％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、改変細胞集団。
【０２８０】
Ａ２５．改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、
改変Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含み、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０ポリペプチド、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含み、
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、４：１以上である、改変細胞集団。
【０２８１】
Ａ２６．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、
キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０ポリペプチド、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含む、第１のポリヌクレオチド、並びに
多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２５のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２８２】
Ａ２７．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、核酸を含み、核酸が、
キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０ポリペプチド、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含む、第１のポリヌクレオチド、並びに
多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ２６に記載の改変細胞集団。
【０２８３】
Ａ２８．キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む改変細胞集団であって、
キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０ポリペプチド及び共刺激ポリペプチド細胞質、
ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択されるシグナル伝達領域、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含み、
改変細胞の少なくとも８０％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、改変細胞集団。
【０２８４】
Ａ２９．改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、
改変Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含み、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０ポリペプチド、及びＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含み、
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、４：１以上である、改変細胞集団。
【０２８５】
Ａ３０．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、
キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０ポリペプチド、及びＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含む、第１のポリヌクレオチド、並びに
多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２９のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２８６】
Ａ３１．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、核酸を含み、核酸が、
キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０ポリペプチド、及びＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｉｖ）抗原認識部分を含む、第１のポリヌクレオチド、並びに
多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、
実施形態Ａ３０に記載の改変細胞集団。
【０２８７】
Ａ３２．キメラ抗原受容体が、ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端への（ｖ）、（ｉ）、（ｉｖ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の順序で、領域（ｉ）〜（ｖ）を含むポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ａ３１のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２８８】
Ａ３３．キメラ抗原受容体が、ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端への（ｖ）、（ｉ）、（ｉｖ）、（ｉｉｉ）、（ｉｉ）の順序で、領域（ｉ）〜（ｖ）を含むポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ａ３１のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２８９】
Ａ３４．キメラ抗原受容体が、ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端への（ｖ）、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）の順序で、領域（ｉ）〜（ｖ）を含むポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ａ３１のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２９０】
Ａ３５．キメラ抗原受容体が、ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端への（ｖ）、（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）の順序で、領域（ｉ）〜（ｖ）を含むポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ａ３１のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２９１】
Ａ３６．キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが、領域（ｉｖ）と（ｉｉ）との間にリンカーポリペプチドをコードする、実施形態Ａ３２に記載の改変細胞集団。
【０２９２】
Ａ３７．キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが、領域（ｉｖ）と（ｉｉｉ）との間にリンカーポリペプチドをコードする、実施形態Ａ３３に記載の改変細胞集団。
【０２９３】
Ａ３８．キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが、領域（ｉｉｉ）と（ｉｖ）との間にリンカーポリペプチドをコードする、実施形態Ａ３４に記載の改変細胞集団。
【０２９４】
Ａ３９．キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが、領域（ｉｉ）と（ｉｖ）との間にリンカーポリペプチドをコードする、実施形態Ａ３５に記載の改変細胞集団。
【０２９５】
Ａ４０．リンカーが、切断不可能なリンカーである、実施形態Ａ３６〜Ａ３９のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２９６】
Ａ４１．リンカーが、切断可能なリンカーである、実施形態Ａ３６〜Ａ３９のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０２９７】
Ａ４２．リンカーが、集団中の改変細胞に対して内因性の酵素により切断される、実施形態Ａ４１に記載の改変細胞集団。
【０２９８】
Ａ４３．リンカーが、集団中の改変細胞に対して外因性の酵素により切断される、実施形態Ａ４１に記載の改変細胞集団。
【０２９９】
Ａ４４．リンカーポリペプチドが、ペプチド結合スキッピング配列を含む、実施形態Ａ３６〜Ａ３９のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３００】
Ａ４５．リンカーポリペプチドが、２Ａポリペプチドを含む、実施形態Ａ３６〜Ａ３９のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３０１】
Ａ４６．抗原認識部分が、標的細胞上の抗原に結合する、実施形態Ａ１〜Ａ４５のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３０２】
Ｂ１．改変Ｔ細胞が、キメラシグナル伝達ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含み、キメラシグナル伝達ポリペプチドが、
（ｉ）共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、
（ｉｉ）ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、
（ｉｉｉ）ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、及び
共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、又は
（ｉｖ）ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、及びＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、実施形態Ａ１に記載の改変細胞集団。
【０３０３】
Ｂ２．キメラシグナル伝達ポリペプチドが、膜標的化領域を含む、実施形態Ｂ１に記載の改変細胞集団。
【０３０４】
Ｂ３．キメラシグナル伝達ポリペプチドが、膜標的化領域を含まない、実施形態Ｂ１に記載の改変細胞集団。
【０３０５】
Ｂ４．改変Ｔ細胞が、
（ｉ）キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）キメラシグナル伝達ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含む核酸を含み、キメラシグナル伝達ポリペプチドが、
ａ．共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、
ｂ．ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、
ｃ．ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及び共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、又は
ｄ．ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及びＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、実施形態Ｂ１に記載の改変細胞集団。
【０３０６】
Ｂ５．核酸が、５’から３’の順序で、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ４に記載の改変細胞集団。
【０３０７】
Ｂ６．第１のポリヌクレオチドが、５’から３’の順序で、抗原認識部分、膜貫通領域、及びＴ細胞活性化分子をコードし、第２のポリヌクレオチドが、Ｔ細胞活性化分子をコードするポリヌクレオチド配列の３’である、実施形態Ｂ４又はＢ５に記載の改変細胞集団。
【０３０８】
Ｂ７．核酸が、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードする第３ポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ４〜Ｂ６のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３０９】
Ｂ８．リンカーポリペプチドが、２Ａポリペプチドを含む、実施形態Ｂ７に記載の改変細胞集団。
【０３１０】
Ｂ９．核酸が、誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第４のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ７又はＢ８に記載の改変細胞集団。
【０３１１】
Ｂ１０．改変細胞の８０％以上が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３１２】
Ｂ１０．１．キメラシグナル伝達ポリペプチドが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０からなる群から選択される２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１０のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３１３】
Ｂ１１．核酸を含む改変細胞集団であって、
核酸が、細胞質キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドであって、細胞質キメラ刺激分子が、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、及び（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、第１のポリヌクレオチド、並びにキメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含み、
改変細胞の少なくとも８０％が、ＣＤ８＋細胞である、改変細胞集団。
【０３１４】
Ｂ１２．改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、
改変Ｔ細胞が、核酸を含み、核酸が、
細胞質キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドであって、細胞質キメラ刺激分子が、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、及び（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、第１のポリヌクレオチド、並びにキメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含み、
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、４：１以上である、改変細胞集団。
【０３１５】
Ｂ１３．キメラ抗原受容体が、抗原認識部分、膜貫通領域、及びＴ細胞活性化分子を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１２のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３１６】
Ｂ１４．核酸が、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１３のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３１７】
Ｂ１５．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１４のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３１８】
Ｂ１６．核酸が、多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１４のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３１９】
Ｂ１７．リンカーが、切断不可能なリンカーである、実施形態Ｂ１４〜Ｂ１６のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３２０】
Ｂ１８．リンカーが、切断可能なリンカーである、実施形態Ｂ１４〜Ｂ１６のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３２１】
Ｂ１９．リンカーが、集団中の改変細胞に対して内因性の酵素により切断される、実施形態Ｂ１８に記載の改変細胞集団。
【０３２２】
Ｂ２０．リンカーが、集団中の改変細胞に対して外因性の酵素により切断される、実施形態Ｂ１８に記載の改変細胞集団。
【０３２３】
Ｂ２１．リンカーポリペプチドが、ペプチド結合スキッピング配列を含む、実施形態Ｂ１４〜Ｂ１６のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３２４】
Ｂ２２．リンカーポリペプチドが、２Ａポリペプチドを含む、実施形態Ｂ１４〜Ｂ１６のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３２５】
Ｂ２３．キメラシグナル伝達ポリペプチド又は細胞質キメラ刺激分子が、膜標的化領域を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２２のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３２６】
Ｂ２４．キメラシグナル伝達ポリペプチド又は細胞質キメラ刺激分子が、膜標的化領域を含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ２２のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３２７】
Ｂ２５．抗原認識部分が、標的細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｂ１〜Ｂ２４のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３２８】
Ｂ２６．核酸を含む改変細胞集団であって、
核酸が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域をコードする第１のポリヌクレオチド、
並びにキメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含み、
改変細胞の少なくとも８０％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、改変細胞集団。
【０３２９】
Ｂ２６．改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、
改変Ｔ細胞が、核酸を含み、核酸が、
ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域をコードする第１のポリヌクレオチド、並びにキメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含み、
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、４：１以上である、改変細胞集団。
【０３３０】
Ｂ２．１．核酸を含む改変細胞集団であって、
核酸が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域をコードする第１のポリヌクレオチド、並びにキメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含み、
改変細胞の少なくとも８０％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、改変細胞集団。
【０３３１】
Ｂ２７．改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、
改変Ｔ細胞が、核酸を含み、核酸が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域をコードする第１のポリヌクレオチド、並びにキメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含み、
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、４：１以上である、改変細胞集団。
【０３３２】
Ｂ２８．核酸を含む改変細胞集団であって、
核酸が、ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び
キメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含み、
改変細胞の少なくとも８０％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、改変細胞集団。
【０３３３】
Ｂ２９．改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、
改変Ｔ細胞が核酸を含み、核酸が、ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、並びにキメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含み、
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、４：１以上である、改変細胞集団。
【０３３４】
Ｂ３０．核酸を含む改変細胞集団であって、
核酸が、ＭｙＤ８８ポリペプチド、又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、及びＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域をコードする第１のポリヌクレオチド、並びにキメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含み、
改変細胞の少なくとも８０％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、改変細胞集団。
【０３３５】
Ｂ３１．改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、
改変Ｔ細胞が核酸を含み、核酸が、ＭｙＤ８８ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、及びＣＤ２７からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域をコードする第１のポリヌクレオチド、並びにＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０、並びにキメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含み、
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、４：１以上である、改変細胞集団。
【０３３６】
Ｂ３２．核酸を含む改変細胞集団であって、
核酸が、細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、並びにキメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含み、
改変細胞の少なくとも８０％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、改変細胞集団。
【０３３７】
Ｂ３３．改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、
改変Ｔ細胞が、核酸を含み、核酸が、細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、並びにキメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含み、
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、４：１以上である、改変細胞集団。
【０３３８】
Ｂ３４．核酸を含む改変細胞集団であって、
核酸が、細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０ポリペプチド、及びＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域をコードする第１のポリヌクレオチド、
並びにキメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含み、
改変細胞の少なくとも８０％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、改変細胞集団。
【０３３９】
Ｂ３５．改変Ｔ細胞を含む改変細胞集団であって、
核酸が、細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０ポリペプチド、及びＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、及びＯＸ４０からなる群から選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域をコードする第１のポリヌクレオチド、並びにキメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含み、
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、４：１以上である、改変細胞集団。
【０３４０】
Ｂ３６．キメラ抗原受容体が、抗原認識部分、膜貫通領域、及びＴ細胞活性化分子を含む、実施形態Ｂ２６〜Ｂ３５のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３４１】
Ｂ３７．核酸が、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ２６〜Ｂ３６のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３４２】
Ｂ３８．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ２６〜Ｂ３７のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３４３】
Ｂ３９．核酸が、多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ２６〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３４４】
Ｂ４０．リンカーが、切断不可能なリンカーである、実施形態Ｂ３７〜Ｂ３９のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３４５】
Ｂ４１．リンカーが、切断可能なリンカーである、実施形態Ｂ３７〜Ｂ３９のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３４６】
Ｂ４２．リンカーが、集団中の改変細胞に対して内因性の酵素により切断される、実施形態Ｂ４１に記載の改変細胞集団。
【０３４７】
Ｂ４３．リンカーが、集団中の改変細胞に対して外因性の酵素により切断される、実施形態Ｂ４１に記載の改変細胞集団。
【０３４８】
Ｂ４４．リンカーポリペプチドが、ペプチド結合スキッピング配列を含む、実施形態Ｂ３７〜Ｂ３９のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３４９】
Ｂ４５．リンカーポリペプチドが、２Ａポリペプチドを含む、実施形態Ｂ３７〜Ｂ３９のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３５０】
Ｂ４６．キメラシグナル伝達ポリペプチド又は細胞質キメラ刺激分子が、膜標的化領域を含む、実施形態Ｂ２６〜Ｂ４５のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３５１】
Ｂ４７．キメラシグナル伝達ポリペプチド又は細胞質キメラ刺激分子が、膜標的化領域を含まない、実施形態Ｂ２６〜Ｂ４５のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３５２】
Ｂ４８．抗原認識部分が、標的細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｂ２６〜Ｂ４７のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３５３】
Ｃ１．キメラ抗原受容体が、ストークポリペプチドを含む、実施形態Ａ１〜Ｂ４８のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３５４】
Ｃ２．Ｔ細胞活性化分子が、ＩＴＡＭを含有するシグナル１を与える分子である、実施形態Ａ１〜Ｃ１のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３５５】
Ｃ３．Ｔ細胞活性化分子が、ＣＤ３ζポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ｃ１のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３５６】
Ｃ４．Ｔ細胞活性化分子が、Ｆｃε受容体γ（ＦｃｓＲＩｙ）サブユニットポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ｃ１のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３５７】
Ｃ５．リンカーポリペプチドが、翻訳中又は翻訳後に第１及び第２のポリヌクレオチドの翻訳産物を分離する、実施形態Ａ１〜Ｃ４のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３５８】
Ｃ５．１．リンカーポリペプチドが、第１及び第２のポリヌクレオチドの翻訳中又は翻訳後に切断される、実施形態Ｃ５に記載の改変細胞集団。
【０３５９】
Ｃ５．２．キメラ抗原受容体が、ＭｙＤ８８又はＣＤ４０ポリペプチドに連結された膜標的化領域を含む、実施形態Ａ１〜Ｃ５．１のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３６０】
Ｃ５．３．ＭｙＤ８８及びＣＤ４０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ＭｙＤ８８又はＣＤ４０ポリペプチドに連結された膜標的化領域をコードする、実施形態Ａ１〜Ｃ５．１のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３６１】
Ｃ５．４．膜標的化領域がミリスチル化領域である、実施形態Ｃ５．２又はＣ５．３に記載の改変細胞集団。
【０３６２】
Ｃ５．５．キメラ抗原受容体が、共刺激分子細胞質シグナル伝達領域のうちの１つに連結された膜標的化領域を含む、実施形態Ａ１〜Ｃ５．４のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３６３】
Ｃ５．６．共刺激細胞質シグナル伝達領域をコードするポリヌクレオチドが、膜標的化領域をコードする、実施形態Ａ１〜Ｃ５．５のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３６４】
Ｃ６．リンカーポリペプチドが、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドの翻訳中に切断されず、改変細胞が、ＭｙＤ８８及びＣＤ４０ポリペプチドに連結されたキメラ抗原受容体を発現する、実施形態Ａ１〜Ｃ５．６のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３６５】
Ｃ６．１．リンカーポリペプチドが、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドの翻訳中に切断されない、実施形態Ａ１〜Ｃ６のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３６６】
Ｃ６．２．リンカーポリペプチドが、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドの翻訳中又は翻訳後に切断される、実施形態Ａ１〜Ｃ６のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３６７】
Ｃ７．リンカーポリペプチドが、２Ａポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ｃ６のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３６８】
Ｃ８．膜貫通領域が、ＣＤ８膜貫通領域である、実施形態Ａ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３６９】
Ｃ９．ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号３５若しくは配列番号８３のアミノ酸配列又はそれらの機能性断片を有する、実施形態Ａ１〜Ｃ８のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３７０】
Ｃ１０．切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号２７のアミノ酸配列又はその機能性断片を有する、実施形態Ａ１〜Ｃ８のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３７１】
Ｃ１１．切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、ＴＩＲドメイン欠失した配列番号３５若しくは配列番号８３のアミノ酸配列
又はその機能性断片を含む、実施形態Ａ１〜Ｃ１０のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３７２】
Ｃ１１．１．切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、全長ＭｙＤ８８ポリペプチドの１５６からＣ末端までの連続するアミノ酸残基を含まない、実施形態Ａ１〜Ｃ１０のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３７３】
Ｃ１１．２．切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、全長ＭｙＤ８８ポリペプチドの１５２からＣ末端までの連続するアミノ酸残基を含まない、実施形態Ａ１〜Ｃ１０のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３７４】
Ｃ１１．３．切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、全長ＭｙＤ８８ポリペプチドの１７３からＣ末端までの連続するアミノ酸残基を含まない、実施形態Ａ１〜Ｃ１０のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３７５】
Ｃ１１．４．全長ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号３５又は配列番号８３のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ｃ８のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３７６】
Ｃ１１．５．切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号３５若しくは配列番号８３のアミノ酸配列又はそれらの機能性断片からなる、実施形態Ａ１〜Ｃ１０のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３７７】
Ｃ１２．細胞質ＣＤ４０ポリペプチドが、配列番号２９のアミノ酸配列又はその機能性断片を含む、実施形態Ａ１〜Ｃ１１．５のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３７８】
Ｃ１３．細胞質ＣＤ４０ポリペプチドが、配列番号２９のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる、実施形態Ａ１〜Ｃ１１．５のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３７９】
Ｃ１４．ＣＤ３ζポリペプチドが、配列番号２３のアミノ酸配列又はその機能性断片を含む、実施形態Ａ１〜Ｃ１３のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３８０】
Ｃ１５．膜貫通領域ポリペプチドが、配列番号２１のアミノ酸配列又はその機能性断片を含む、実施形態Ａ１〜Ｃ１４のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３８１】
Ｃ１６．抗原認識部分が、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ａ１〜Ｃ１５のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３８２】
Ｃ１７．抗原認識部分が、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実施形態Ａ１〜Ｃ１６のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３８３】
Ｃ１８．抗原認識部分が、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、メソセリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６、及びＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群から選択される抗原に結合する、実施形態Ａ１〜Ｃ１７のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３８４】
Ｃ１９．抗原認識部分が、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する、実施形態Ａ１〜Ｃ１８のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３８５】
Ｃ２０．抗原認識部分が、ＣＤ１９に結合する、実施形態Ａ１〜Ｃ１８のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３８６】
Ｃ２１．抗原認識部分が、ウイルス又は細菌抗原に結合する、実施形態Ａ１〜Ｃ１８のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３８７】
Ｃ２２．抗原認識部分が、単鎖可変断片である、実施形態Ａ１〜Ｃ２１のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３８８】
Ｃ２３．多量体リガンド結合領域が、二量体ＦＫ５０６又は二量体ＦＫ５０６様類似体に結合する、実施形態Ａ４〜Ｃ２２のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３８９】
Ｃ２３．１．多量体リガンド結合領域が、リミヅシド又はＡＰ２０１８７に結合する、実施形態Ａ４〜Ｃ２２のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３９０】
Ｃ２３．２．多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチドを含む、実施形態Ａ４〜Ｃ２３．１のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３９１】
Ｃ２３．３．ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチドが、野生型ＦＫＢＰ１２ポリペプチドよりも高い親和性で多量体リガンドに結合する、実施形態Ｃ２３．２に記載の改変細胞集団。
【０３９２】
Ｃ２３．４．ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチドが、野生型ＦＫＢＰ１２ポリペプチドよりも高い親和性で多量体リガンドに結合する、３６位のアミノ酸置換を含む、実施形態Ｃ２３．２又はＣ２３．３に記載の改変細胞集団。
【０３９３】
Ｃ２３．５．３６位のアミノ酸置換が、バリン、イソロイシン、ロイシン、及びアラニンからなる群から選択される、実施形態Ｃ２３．４に記載の改変細胞集団。
【０３９４】
Ｃ２３．６．多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｃ２３．５に記載の改変細胞集団。
【０３９５】
Ｃ２４．ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、９：１以上である、実施形態Ａ１〜Ｃ２３．６のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３９６】
Ｃ２５．改変細胞の少なくとも９０％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、実施形態Ａ１〜Ｃ２３．６のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３９７】
Ｃ２６．改変細胞の少なくとも９５％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、実施形態Ａ１〜Ｃ２３．６のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３９８】
Ｃ２７．誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ４〜Ｃ２６のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０３９９】
Ｃ２７．１．カスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、及びＮ４０５Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む改変カスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ａ４〜Ｃ２６のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０４００】
Ｃ２８．キメラ抗原受容体又は核酸をコードするポリヌクレオチドが、ウイルスベクター内に含まれる、実施形態Ａ１〜Ｃ２７．１のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０４０１】
Ｃ２９．ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｃ２８に記載の改変細胞集団。
【０４０２】
Ｃ３０．レトロウイルスベクターが、マウス白血病ウイルスベクターである、実施形態Ｃ２９に記載の改変細胞集団。
【０４０３】
Ｃ３１．レトロウイルスベクターが、ＳＦＧベクターである、実施形態Ｃ２９に記載の改変細胞集団。
【０４０４】
Ｃ３２．ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、実施形態Ｃ２６に記載の改変細胞集団。
【０４０５】
Ｃ３３．ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｃ２６に記載の改変細胞集団。
【０４０６】
Ｃ３４．ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される、実施形態Ｃ２６に記載の改変細胞集団。
【０４０７】
Ｃ３５．キメラ抗原受容体又は核酸をコードするポリヌクレオチドが、エレクトロポレーション、ソノポレーション、若しくはバイオリスティック用に設計されたベクター中に調製されるか、又は化学脂質、ポリマー、無機ナノ粒子、若しくはポリプレックスに結合若しくは組み込まれる、実施形態Ａ１〜Ｃ３４のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０４０８】
Ｃ３６．キメラ抗原受容体又は核酸をコードするポリヌクレオチドが、プラスミド内に含まれる、実施形態Ａ１〜Ｃ３４のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０４０９】
Ｃ３７．リザーブする。
【０４１０】
Ｃ３８．細胞が、骨髄から取得又は調製される、実施形態Ａ１〜Ｃ３７のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０４１１】
Ｃ３９．細胞が、臍帯血から取得又は調製される、実施形態Ａ１〜Ｃ３７のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０４１２】
Ｃ４０．細胞が、末梢血から取得又は調製される、実施形態Ａ１〜Ｃ３７のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０４１３】
Ｃ４１．細胞が、末梢血単核球から取得又は調製される、実施形態Ａ１〜Ｃ３７のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０４１４】
Ｃ４２．改変細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ａ１〜Ｃ４１のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０４１５】
Ｃ４３．改変細胞が、自家Ｔ細胞である、実施形態Ａ１〜Ｃ４１のいずれか１つに記載の方法。
【０４１６】
Ｃ４４．改変細胞が、同種Ｔ細胞である、実施形態Ａ１〜Ｃ４１のいずれか１つに記載の方法。
【０４１７】
Ｃ４５．細胞が、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子を用いた遺伝子銃）、リポトランスフェクション、ポリマー形質移入、ナノ粒子、又はポリプレックスからなる群から選択される方法を用いて、核酸ベクターで形質移入又は形質導入される、実施形態Ａ１〜Ｃ４４のいずれか１つに記載の改変細胞集団。
【０４１８】
Ｃ４６〜Ｃ４８。
【０４１９】
Ｄ１．対象における標的細胞又は組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、実施形態Ａ１〜Ｃ４８のいずれか１つに記載の改変細胞集団を対象に投与することを含む、方法。
【０４２０】
Ｄ１．１．標的抗原の発現の上昇に関連する疾患又は状態を有する対象を処置するための方法であって、有効量の実施形態Ａ１〜Ｃ４８のいずれか１つに記載の改変細胞集団を投与することを含む、方法。
【０４２１】
Ｄ１．２．対象における腫瘍サイズを減少させるための方法であって、実施形態Ａ１〜Ｃ４８のいずれか１つに記載の改変細胞集団を対象に投与することを含み、抗原認識部分が、腫瘍上の抗原に結合する、方法。
【０４２２】
Ｄ２．標的細胞が、腫瘍細胞である、実施形態Ｄ１〜Ｄ１．２のいずれか１つに記載の方法。
【０４２３】
Ｄ３．対象における標的細胞の数又は濃度が、改変細胞集団の投与後に低減される、実施形態Ｄ１又はＤ２に記載の方法。
【０４２４】
Ｄ４．改変細胞集団の投与前に対象から得られた第１の試料中の標的細胞の数又は濃度を測定することを含み、改変細胞集団の投与後に対象から得られた第２の試料中の標的細胞の数濃度を測定することと、第１の試料中の標的細胞の数又は濃度と比較して、第２の試料中の標的細胞の数又は濃度の増加又は減少を決定することと、を含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ３のいずれか１つに記載の方法。
【０４２５】
Ｄ４．第２の試料中の標的細胞の濃度が、第１の試料中の標的細胞の濃度と比較して低下する、実施形態Ｄ４に記載の方法。
【０４２６】
Ｄ５．第２の試料中の標的細胞の濃度が、第１の試料中の標的細胞の濃度と比較して増加する、実施形態Ｄ４に記載の方法。
【０４２７】
Ｄ６．追加用量の改変細胞が、対象に投与される、実施形態Ｄ１〜Ｄ５のいずれか１つに記載の方法。
【０４２８】
Ｄ７．対象に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、有効量の実施形態Ａ１〜Ｃ４８のいずれか１つに記載の改変細胞集団を投与することを含む、方法。
【０４２９】
Ｄ８．標的抗原の発現の上昇に関連する疾患又は状態を有する対象を処置するための方法であって、有効量の実施形態Ａ１〜Ｃ４８のいずれか１つに記載の改変細胞集団を投与することを含む、方法。
【０４３０】
Ｄ９．標的抗原が、腫瘍抗原である、実施形態Ｄ８に記載の方法。
【０４３１】
Ｄ１０．対象における腫瘍サイズを減少させるための方法であって、実施形態Ａ１〜Ｃ４８のいずれか１つに記載の改変細胞集団を対象に投与することを含み、抗原認識部分が、腫瘍上の抗原に結合する、方法。
【０４３２】
Ｄ１１．対象が、腫瘍を有すると診断されている、実施形態Ｄ１〜Ｄ１０のいずれか１つに記載の方法。
【０４３３】
Ｄ１２．対象が、癌を有する、実施形態Ｄ１〜Ｄ１１のいずれか１つに記載の方法。
【０４３４】
Ｄ１３．対象が、固形腫瘍を有する、実施形態Ｄ１〜Ｄ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０４３５】
Ｄ１４．改変細胞集団が、静脈内投与される、実施形態Ｄ１〜Ｄ１３のいずれか１つに記載の方法。
【０４３６】
Ｄ１５．改変細胞集団が、腫瘍床に送達される、実施形態Ｄ１〜Ｄ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０４３７】
Ｄ１６．癌が、対象の血液又は骨髄中に存在する、実施形態Ｄ１２に記載の方法。
【０４３８】
Ｄ１７．対象が、血液又は骨髄疾患を有する、実施形態Ｄ１〜Ｄ１６のいずれか１つに記載の方法。
【０４３９】
Ｄ１８．対象が、幹細胞移植によって緩和することができる任意の状態を有すると診断されている、実施形態Ｄ１〜Ｄ１７のいずれか１つに記載の方法。
【０４４０】
Ｄ１９．対象が、鎌状赤血球症又は異染性白質ジストロフィーを有すると診断されている、実施形態Ｄ１〜Ｄ１８のいずれか１つに記載の方法。
【０４４１】
Ｄ２０．患者が、原発性免疫不全状態、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）、又は他の血球貪食性状態、遺伝性骨髄不全状態、ヘモグロビン症、代謝状態、及び破骨細胞状態からなる群から選択される状態を有すると診断されている、実施形態Ｄ１〜Ｄ１８のいずれか１つに記載の方法。
【０４４２】
Ｄ２１．疾患又は状態が、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠乏性、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多内分泌腺腫症、腸疾患、Ｘ連鎖）、又はＩＰＥＸ様、ウィスコット・アルドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠乏症、白血球粘着欠乏症、ＤＯＣＡ  ８欠乏症、ＩＬ−１０欠乏症／ＩＬ−１０受容体欠乏症、ＧＡＴＡ  ２欠乏症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化不全症、ファンコニ貧血先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、及び大理石骨病からなる群から選択される、実施形態Ｄ１〜Ｄ１８のいずれか１つに記載の方法。
【０４４３】
Ｄ２２．追加用量の改変細胞を対象に投与することを含み、疾患又は状態症状が、症状の軽減後に残存するか又は検出される、実施形態Ｄ１〜Ｄ２１のいずれか１つに記載の方法。
【０４４４】
Ｄ２３．
対象における状態又は疾患の存在、不存在、又はステージを特定することと、
実施形態Ａ１〜Ｃ４８のいずれか１つに記載の改変細胞集団を投与するための指示を送信することと、対象において同定された状態又は疾患の存在、不存在、又はステージに基づいて、改変細胞集団の後続の投与量を維持するか、又は患者に投与される改変細胞集団の後続の投与量を調節することと、を含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ２２のいずれか１つに記載の方法。
【０４４５】
Ｄ２４．状態が、白血病である、実施形態Ｄ１〜Ｄ２３のいずれか１つに記載の方法。
【０４４６】
Ｄ２５．ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バール、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水疱瘡、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルプウイルス６、Ｉ）、及びパピローマウイルスからなる群から選択されるウイルス病因の感染を有すると診断されているか、又は肺炎、結核症、及び梅毒からなる群から選択される細菌病因の感染を有すると診断されているか、あるいはマラリア、トリパノソーマ、レッシュマン、リーシュマニア症、及びアメーバ赤痢からなる群から選択される寄生虫病因の感染を有すると診断されている、実施形態Ｄ１〜Ｄ２３のいずれか１つに記載の方法。
【０４４７】
Ｄ２６．対象に実施形態Ａ１〜Ｃ４８のいずれか１つに記載の改変細胞集団が投与され、改変細胞集団が、多量体リガンド結合領域を含む誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、改変細胞集団を対象に投与した後に、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドが、対象に投与されることを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ２５のいずれか１つに記載の方法。
【０４４８】
Ｄ２７．多量体リガンドの投与後に、誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドを含む改変細胞の数が減少する、実施形態Ｄ２６に記載の方法。
【０４４９】
Ｄ２８．誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドを含む改変細胞の数が、９０％減少する、実施形態Ｄ２６又はＤ２７に記載の方法。
【０４５０】
Ｄ２８．１．誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドを含む改変細胞の数が、７０％減少する、実施形態Ｄ２６又はＤ２７に記載の方法。
【０４５１】
Ｄ２８．２．誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドを含む改変細胞の数が、５０％減少する、実施形態Ｄ２６又はＤ２７に記載の方法。
【０４５２】
Ｄ２８．３．誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドを含む改変細胞の数が、３０％％減少する、実施形態Ｄ２６又はＤ２７に記載の方法。
【０４５３】
Ｄ２８．４．誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドを含む改変細胞の数が、２０％％減少する、実施形態Ｄ２６又はＤ２７に記載の方法。
【０４５４】
Ｄ２８．５．誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドが、誘導性キメラカスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ｄ２６〜Ｄ２８．４のいずれか１つに記載の方法。
【０４５５】
Ｄ２９．対象への改変細胞集団の投与後に、対象が、陰性症状を経験していると決定することと、陰性症状を軽減又は緩和するためにリガンドを投与すること、を含む、実施形態Ｄ２６〜Ｄ２８．４のいずれか１つに記載の方法。
【０４５６】
Ｄ３０．対象におけるサイトカイン毒性を検出する工程と、
多量体リガンド結合領域に結合する十分な用量の多量体リガンドを投与して、対象におけるサイトカイン毒性のレベルを低下させる工程と、を含む、実施形態Ｄ２６〜Ｄ２９のいずれか１つに記載の方法。
【０４５７】
Ｄ３１．サイトカイン毒性が、対象における物理的症状を観察することによって検出される、実施形態Ｄ３０に記載の方法。
【０４５８】
Ｄ３２．サイトカイン毒性が、対象における体重減少を測定することによって検出される、実施形態Ｄ３１に記載の方法。
【０４５９】
Ｄ３３．対象が、改変細胞集団の投与後に悪液質と診断される、実施形態Ｄ２６〜Ｄ３３のいずれか１つに記載の方法。
【０４６０】
Ｄ３４．サイトカイン関連毒性に関連する少なくとも１つのサイトカインのレベルが、改変細胞集団の投与後及び多量体リガンドの投与前の対象から得られた試料中で上昇する、実施形態Ｄ２６〜Ｄ３３のいずれか１つに記載の方法。
【０４６１】
Ｄ３５．多量体リガンドの投与前の対象から得られた試料中の少なくとも１つのサイトカインのレベルと比較して、多量体リガンドの投与後の対象から得られた試料中の少なくとも１つのサイトカインのレベルが低下する、実施形態Ｄ３４に記載の方法。
【０４６２】
Ｄ３６．多量体リガンドが、リミヅシド又はＡＰ２０１８７である、実施形態Ｄ２６〜Ｄ３５のいずれか１つに記載の方法。
【０４６３】
Ｄ３７．改変細胞集団を対象に投与する前に、改変細胞集団を濃縮してＣＤ８＋Ｔ細胞が濃縮された細胞集団を得る工程を含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ３６のいずれか１つに記載の方法。
【０４６４】
Ｄ３８．改変細胞集団を対象に投与する前に、改変細胞集団を濃縮して少なくとも８０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞集団を得ることを含む、実施形態Ｄ３７に記載の方法。
【０４６５】
Ｄ３９．改変細胞集団を対象に投与する前に、ＣＤ８＋Ｔ細胞を精製する工程を含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ３６のいずれか１つに記載の方法。
【０４６６】
Ｄ４０．ＣＤ８＋Ｔ細胞が、磁気活性化細胞選別を使用して濃縮される、実施形態Ｄ３７〜Ｄ３９のいずれか１つに記載の方法。
【０４６７】
Ｄ４１．ＣＤ８＋Ｔ細胞が、磁気活性化細胞選別を使用して精製される、実施形態Ｄ３９に記載の方法。
【０４６８】
Ｅ１．実施形態Ａ１〜Ｃ４８のいずれか１つに記載の改変細胞集団を調製するための方法であって、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を有する細胞集団を、核酸が細胞に組み込まれる条件下で、細胞集団と接触させることを含み、それにより、細胞が、組み込まれた核酸からキメラ抗原受容体を発現する、方法。
【０４６９】
Ｅ２．実施形態Ｂ１〜Ｃ４８のいずれか１つに記載の改変細胞集団を調製するための方法であって、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を有する細胞集団を、核酸が細胞に組み込まれる条件下で、細胞集団と接触させることを含み、それにより、細胞が、組み込まれた核酸からキメラ抗原受容体を発現する、方法。
【０４７０】
Ｅ３．実施形態Ａ１〜Ｃ４８のいずれか１つに記載の改変細胞集団を調製するための方法であって、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を有するＴ細胞を、核酸が細胞に組み込まれる条件下で、細胞集団と接触させることと、Ｔ細胞を濃縮して改変細胞集団を得ることと、を含み、細胞集団中のＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、３：２以上である、方法。
【０４７１】
Ｅ３．細胞集団の細胞が、核酸で形質移入又は形質導入される、実施形態Ｅ１〜Ｅ２のいずれか１つに記載の方法。
【０４７２】
Ｅ４．核酸が、ウイルスベクターに含まれる、実施形態Ｅ１〜Ｅ３のいずれか１つに記載の方法。
【０４７３】
Ｅ５．核酸が、プラスミドベクターに含まれる、実施形態Ｅ１〜Ｅ３のいずれか１つに記載の方法。
【０４７４】
Ｅ６．実施形態Ａ１〜Ｃ４８のいずれか１つに記載の改変細胞集団を調製するための方法であって、改変Ｔ細胞集団を濃縮して、３：２以上のＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比を得ることを含み、改変Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含み、キメラ抗原受容体が、
（ｉ）膜貫通領域、
（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び
（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、方法。
【０４７５】
Ｅ７．キメラ抗原受容体が、
（ｉ）膜貫通領域、
（ｉｉ）共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及び共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及びＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、及び
（ｉｖ）抗原認識部分を含む、実施形態Ｅ６に記載の方法。
【０４７６】
Ｅ８．改変Ｔ細胞が、誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ６又はＥ７に記載の方法。
【０４７７】
Ｅ９．改変Ｔ細胞が、キメラシグナル伝達ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含み、キメラシグナル伝達ポリペプチドが、
（ｉ）共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、
（ｉｉ）ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、
（ｉｉｉ）ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、及び
共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、又は
（ｉｖ）ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、及びＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、実施形態Ｅ６に記載の方法。
【０４７８】
Ｅ１０．キメラシグナル伝達ポリペプチドが、膜標的化領域を含む、実施形態Ｅ９に記載の方法。
【０４７９】
Ｅ１１．キメラシグナル伝達ポリペプチドが、膜標的化領域を含まない、実施形態Ｅ９に記載の方法。
【０４８０】
Ｅ１２．改変Ｔ細胞が、
（ｉ）キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）キメラシグナル伝達ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含む核酸を含み、キメラシグナル伝達ポリペプチドが、
ａ．共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、
ｂ．ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、
ｃ．ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及び共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、又は
ｄ．ＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域及びＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、実施形態Ｅ６に記載の方法。
【０４８１】
Ｅ１３．核酸が、５’から３’順序で、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ１２に記載の方法。
【０４８２】
Ｅ１４．第１のポリヌクレオチドが、５’から３’の順序で、抗原認識部分、膜貫通領域、及びＴ細胞活性化分子をコードし、第２のポリヌクレオチドが、Ｔ細胞活性化分子をコードするポリヌクレオチド配列の３’である、実施形態Ｅ１２又はＥ１３に記載の方法。
【０４８３】
Ｅ１５．核酸が、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードする第３ポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ１２〜Ｅ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０４８４】
Ｅ１６．リンカーポリペプチドが、２Ａポリペプチドを含む、実施形態Ｅ１５に記載の方法。
【０４８５】
Ｅ１７．核酸が、誘導性キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第４のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ１５又はＥ１６に記載の方法。
【０４８６】
Ｅ１８．共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０からなる群から選択される、実施形態Ｅ７〜Ｅ１７のいずれか１つに記載の方法。
【０４８７】
Ｅ１９．キメラ抗原受容体が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０からなる群から選択される２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む、実施形態Ｅ７又はＥ８に記載の方法。
【０４８８】
Ｅ２０．キメラシグナル伝達ポリペプチドが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、及びＤＡＰ１０からなる群から選択される２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む、実施形態Ｅ９〜Ｅ１７のいずれか１つに記載の方法。
【０４８９】
Ｅ２１．改変細胞集団が、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）に供される、実施形態Ｅ１〜Ｅ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０４９０】
Ｅ２２．改変細胞集団が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞画分を含むように選択される、実施形態Ｅ１〜Ｅ２１のいずれか１つに記載の方法。
【０４９１】
Ｅ２３．改変細胞集団が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を決定するために試験される、実施形態Ｅ１〜Ｅ２２のいずれか１つに記載の方法。
【０４９２】
Ｅ２４．改変細胞集団を対象に投与する工程を含む、実施形態Ｅ２３に記載の方法。
【０４９３】
Ｆ１．ＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮改変細胞集団を調製するための方法であって、改変細胞集団を濃縮して、少なくとも８０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む改変細胞集団を得ることを含み、改変細胞が、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含み、
キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｖ）抗原認識部分を含む、方法。
【０４９４】
Ｆ１．１．実施形態Ａ１〜Ｃ４８のいずれか１つに記載のＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮細胞集団を調製するための方法であって、改変細胞集団を濃縮して、少なくとも８０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む改変細胞集団を得ることを含む、方法。
【０４９５】
Ｆ２．ＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮改変細胞集団を調製するための方法であって、改変細胞集団を濃縮して、改変細胞集団を得ることを含む、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が４：１以上である改変細胞集団を得ることを含み、改変細胞集団が、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む改変Ｔ細胞を含み、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｖ）抗原認識部分含む、方法。
【０４９６】
Ｆ３．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、
キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（Ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｖ）抗原認識部分、並びに
多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ１又はＦ２に記載の方法。
【０４９７】
Ｆ４．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、核酸を含み、
核酸が、キメラ抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、キメラ抗原受容体が、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、及び（ｖ）抗原認識部分を含む、第１のポリヌクレオチド、並びに
多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ３に記載の方法。
【０４９８】
Ｆ５．キメラ抗原受容体が、ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端への（ｖ）、（ｉ）、（ｉｖ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の順序で、領域（ｉ）〜（ｖ）を含むポリペプチドである、実施形態Ｆ１〜Ｆ４のいずれか１つに記載の方法。
【０４９９】
Ｆ６．キメラ抗原受容体が、ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端への（ｖ）、（ｉ）、（ｉｖ）、（ｉｉｉ）、（ｉｉ）の順序で、領域（ｉ）〜（ｖ）を含むポリペプチドである、実施形態Ｆ１〜Ｆ４のいずれか１つに記載の方法。
【０５００】
Ｆ７．キメラ抗原受容体が、ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端への（ｖ）、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）の順序で、領域（ｉ）〜（ｖ）を含むポリペプチドである、実施形態Ｆ１〜Ｆ４のいずれか１つに記載の方法。
【０５０１】
Ｆ８．キメラ抗原受容体が、ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端への（ｖ）、（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）の順序で、領域（ｉ）〜（ｖ）を含むポリペプチドである、実施形態Ｆ１〜Ｆ４のいずれか１つに記載の方法。
【０５０２】
Ｆ９．キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが、領域（ｉｖ）と（ｉｉ）との間にリンカーポリペプチドをコードする、実施形態Ｆ５に記載の方法。
【０５０３】
Ｆ１０．キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが、領域（ｉｖ）と（ｉｉｉ）との間にリンカーポリペプチドをコードする、実施形態Ｆ６に記載の方法。
【０５０４】
Ｆ１１．キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが、領域（ｉｉｉ）と（ｉｖ）との間にリンカーポリペプチドをコードする、実施形態Ｆ７に記載の方法。
【０５０５】
Ｆ１２．キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが、領域（ｉｉ）と（ｉｖ）との間にリンカーポリペプチドをコードする、実施形態Ｆ８に記載の方法。
【０５０６】
Ｆ１３．リンカーが、切断不可能なリンカーである、実施形態Ｆ９〜Ｆ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０５０７】
Ｆ１４．リンカーが、切断可能なリンカーである、実施形態Ｆ９〜Ｆ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０５０８】
Ｆ１５．リンカーが、集団中の改変細胞に対して内因性の酵素により切断される、実施形態Ｆ１４に記載の方法。
【０５０９】
Ｆ１６．リンカーが、集団中の改変細胞に対して外因性の酵素により切断される、実施形態Ｆ１４に記載の方法。
【０５１０】
Ｆ１７．抗原認識部分が、標的細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｆ１〜Ｆ１６のいずれか１つに記載の方法。
【０５１１】
Ｇ１．ＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮改変細胞集団を調製するための方法であって、改変細胞集団を濃縮して、少なくとも８０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む改変細胞集団を得ることを含み、改変細胞が核酸を含み、
核酸が、細胞質キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドであって、細胞質キメラ刺激分子が、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、及び（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、第１のポリヌクレオチド、並びにキメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含む、方法。
【０５１２】
Ｇ１．１．実施形態Ａ１〜Ｃ４８のいずれか１つに記載のＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮改変細胞集団を調製するための方法。
【０５１３】
Ｇ２．ＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮改変細胞集団を調製するための方法であって、改変細胞集団を濃縮して、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、４：１以上である改変細胞集団を得ることを含み、改変細胞集団が、核酸を含む改変Ｔ細胞を含み、核酸が、
細胞質キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドであって、細胞質キメラ刺激分子が、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴＩＲドメインを欠失した切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、及び（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠失したＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、第１のポリヌクレオチド、並びにキメラ抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含む、方法。
【０５１４】
Ｇ３．キメラ抗原受容体が、抗原認識部分、膜貫通領域、及びＴ細胞活性化分子を含む、実施形態Ｇ１又はＧ２に記載の方法。
【０５１５】
Ｇ４．核酸が、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ３のいずれか１つに記載の方法。
【０５１６】
Ｇ５．改変細胞又は改変Ｔ細胞が、多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ４のいずれか１つに記載の方法。
【０５１７】
Ｇ６．核酸が、多量体リガンド結合領域及びカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ４のいずれか１つに記載の方法。
【０５１８】
Ｇ７．リンカーが、切断不可能なリンカーである、実施形態Ｇ４〜Ｇ６のいずれか１つに記載の方法。
【０５１９】
Ｇ８．リンカーが、切断可能なリンカーである、実施形態Ｇ４〜Ｇ６のいずれか１つに記載の方法。
【０５２０】
Ｇ９．リンカーが、集団中の改変細胞に対して内因性の酵素により切断される、実施形態Ｇ８に記載の方法。
【０５２１】
Ｇ１０．リンカーが、集団中の改変細胞に対して外因性の酵素により切断される、実施形態Ｇ８に記載の方法。
【０５２２】
Ｇ１１．抗原認識部分が、標的細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｇ１〜Ｇ１０のいずれか１つに記載の方法。
【０５２３】
Ｇ１２．ＣＤ８＋Ｔ細胞を精製する工程を含む、実施形態Ｅ１〜Ｇ１１のいずれか１つに記載の方法。
【０５２４】
Ｇ１３．ＣＤ８＋Ｔ細胞が、磁気活性化細胞選別を使用して濃縮される、実施形態Ｅ１〜Ｇ１１のいずれか１つに記載の方法。
【０５２５】
Ｇ１４．ＣＤ８＋Ｔ細胞が、磁気活性化細胞選別を使用して精製される、実施形態Ｇ１２に記載の方法。
【０５２６】
Ｈ１．キメラ抗原受容体が、ストークポリペプチドを含む、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７又はＧ１〜Ｇ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０５２７】
Ｈ２．Ｔ細胞活性化分子が、ＩＴＡＭを含有するシグナル１を与える分子である、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１のいずれか１つに記載の方法。
【０５２８】
Ｈ３．Ｔ細胞活性化分子が、ＣＤ３ζポリペプチドである、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１に記載の方法。
【０５２９】
Ｈ４．Ｔ細胞活性化分子が、Ｆｃε受容体γ（ＦｃｓＲＩｙ）サブユニットポリペプチドである、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１に記載の方法。
【０５３０】
Ｈ５．リンカーポリペプチドが、翻訳中又は翻訳後に第１及び第２のポリヌクレオチドの翻訳産物を分離する、実施形態Ｇ４〜Ｇ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０５３１】
Ｈ５．１．リンカーポリペプチドが、第１及び第２のポリヌクレオチドの翻訳中又は翻訳後に切断される、実施形態Ｈ５に記載の方法。
【０５３２】
Ｈ６．リンカーポリペプチドが、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドの翻訳中に切断されず、改変細胞が、ＭｙＤ８８及びＣＤ４０ポリペプチドに連結されたキメラ抗原受容体を発現する、実施形態Ｆ９〜Ｆ１７又はＧ４〜Ｇ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０５３３】
Ｈ６．１．リンカーポリペプチドが、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドの翻訳中又は翻訳後に切断される、実施形態Ｆ９〜Ｆ１７又はＧ４〜Ｇ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０５３４】
Ｈ７．リンカーポリペプチドが、２Ａポリペプチドである、実施形態Ｆ９〜Ｆ１７、Ｇ４〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ６のいずれか１つに記載の方法。
【０５３５】
Ｈ８．膜貫通領域が、ＣＤ８膜貫通領域である、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ７のいずれか１つに記載の方法。
【０５３６】
Ｈ９．ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号３５若しくは配列番号８３のアミノ酸配列又はそれらの機能性断片を有する、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ８のいずれか１つに記載の方法。
【０５３７】
Ｈ１０．切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号２７のアミノ酸配列又はその機能性断片を有する、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ８のいずれか１つに記載の方法。
【０５３８】
Ｈ１１．切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、ＴＩＲドメインを欠失した配列番号３５若しくは配列番号８３のアミノ酸配列又はそれらの機能性断片を含む、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ１０のいずれか１つに記載の方法。
【０５３９】
Ｈ１１．１．切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、全長ＭｙＤ８８ポリペプチドの１５６からＣ末端までの連続するアミノ酸残基を含まない、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ１０のいずれか１つに記載の方法。
【０５４０】
Ｈ１１．２．切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、全長ＭｙＤ８８ポリペプチドの１５２からＣ末端までの連続するアミノ酸残基を含まない、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ１０のいずれか１つに記載の方法。
【０５４１】
Ｈ１１．３．切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、全長ＭｙＤ８８ポリペプチドの１７３からＣ末端までの連続するアミノ酸残基を含まない、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ１０のいずれか１つに記載の方法。
【０５４２】
Ｈ１１．４．全長ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号３５又は配列番号８３のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ８のいずれか１つに記載の方法。
【０５４３】
Ｈ１１．５．切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号２７のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ１０のいずれか１つに記載の方法。
【０５４４】
Ｈ１２．細胞質ＣＤ４０ポリペプチドが、配列番号２９のアミノ酸配列又はその機能性断片を含む、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ１１のいずれか１つに記載の方法。
【０５４５】
Ｈ１３．細胞質ＣＤ４０ポリペプチドが、配列番号２９のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ１１のいずれか１つに記載の方法。
【０５４６】
Ｈ１４．ＣＤ３ζポリペプチドが、配列番号２３のアミノ酸配列又はその機能性断片を含む、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ１３のいずれか１つに記載の方法。
【０５４７】
Ｈ１５．膜貫通領域ポリペプチドが、配列番号２１のアミノ酸配列又はその機能性断片を含む、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０５４８】
Ｈ１６．標的細胞が、腫瘍細胞である、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ１５のいずれか１つに記載の方法。
【０５４９】
Ｈ１７．標的細胞が、過剰増殖性疾患に関与する細胞である、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ１６のいずれか１つに記載の方法。
【０５５０】
Ｈ１８．抗原認識部分が、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、メソセリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６、及びＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群から選択される抗原に結合する、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ１７のいずれか１つに記載の方法。
【０５５１】
Ｈ１９．抗原認識部分が、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ１８のいずれか１つに記載の方法。
【０５５２】
Ｈ２０．抗原認識部分が、ＣＤ１９に結合する、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ１８のいずれか１つに記載の方法。
【０５５３】
Ｈ２１．抗原認識部分が、ウイルス又は細菌抗原に結合する、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ１８のいずれか１つに記載の方法。
【０５５４】
Ｈ２２．抗原認識部分が、単鎖可変断片である、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ２１のいずれか１つに記載の方法。
【０５５５】
Ｈ２３．多量体リガンド結合領域が、二量体ＦＫ５０６又は二量体ＦＫ５０６様類似体に結合する、実施形態Ｆ４〜Ｆ１７、Ｇ５〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ２２のいずれか１つに記載の方法。
【０５５６】
Ｈ２３．１．多量体リガンド結合領域が、リミヅシド又はＡＰ２０１８７に結合する、実施形態Ｆ４〜Ｆ１７、Ｇ５〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ２２のいずれか１つに記載の方法。
【０５５７】
Ｈ２３．２．多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチドを含む、実施形態Ｆ４〜Ｆ１７、Ｇ５〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ２３．１のいずれか１つに記載の方法。
【０５５８】
Ｈ２３．３．ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチドが、野生型ＦＫＢＰ１２ポリペプチドよりも高い親和性で多量体リガンドに結合する、実施形態Ｈ２３．２に記載の方法。
【０５５９】
Ｈ２３．４．ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチドが、野生型ＦＫＢＰ１２ポリペプチドよりも高い親和性で結合する、３６位のアミノ酸置換を含む、実施形態Ｈ２３．２又はＨ２３．３に記載の方法。
【０５６０】
Ｈ２３．５．３６位のアミノ酸置換が、バリン、イソロイシン、ロイシン、及びアラニンからなる群から選択される、実施形態Ｈ２３．４に記載の方法。
【０５６１】
Ｈ２３．６．多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｈ２３．５に記載の方法。
【０５６２】
Ｈ２４．ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との比が、９：１以上である、実施形態Ｆ１〜Ｈ２３．６のいずれか１つに記載の方法。
【０５６３】
Ｈ２５．改変細胞の少なくとも９０％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、実施形態Ｆ１〜Ｈ２３．６のいずれか１つに記載の方法。
【０５６４】
Ｈ２６．改変細胞の少なくとも９５％が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、実施形態Ｆ１〜Ｈ２３．６のいずれか１つに記載の方法。
【０５６５】
Ｈ２７．誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ４〜Ｆ１７、Ｇ５〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ２６のいずれか１つに記載の方法。
【０５６６】
Ｈ２７．１．カスパーゼ−９ポリペプチドが、カスパーゼバリアントＤ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、及びＮ４０５Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む改変カスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ｆ４〜Ｆ１７、Ｇ５〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ２６のいずれか１つに記載の方法。
【０５６７】
Ｈ２８．キメラ抗原受容体又は核酸をコードするポリヌクレオチドが、ウイルスベクター内に含まれる、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ２７．１のいずれか１つに記載の方法。
【０５６８】
Ｈ２９．ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｈ２８に記載の方法。
【０５６９】
Ｈ３０．レトロウイルスベクターが、マウス白血病ウイルスベクターである、実施形態Ｈ２９に記載の方法。
【０５７０】
Ｈ３１．レトロウイルスベクターが、ＳＦＧベクターである、実施形態Ｈ２９に記載の方法。
【０５７１】
Ｈ３２．ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、実施形態Ｈ２６に記載の方法。
【０５７２】
Ｈ３３．ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｈ２６に記載の方法。
【０５７３】
Ｈ３４．ウイルスベクターが、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される、実施形態Ｈ２６に記載の方法。
【０５７４】
Ｈ３５．キメラ抗原受容体又は核酸をコードするポリヌクレオチドが、エレクトロポレーション、ソノポレーション、若しくはバイオリスティック用に設計されたベクター中に調製されるか、又は化学脂質、ポリマー、無機ナノ粒子、若しくはポリプレックスに結合若しくは組み込まれる、実施形態Ｅ１〜Ｆ１７、Ｇ１〜Ｇ１４、又はＨ１〜Ｈ３４のいずれか１つに記載の方法。
【０５７５】
Ｈ３６．キメラ抗原受容体又は核酸をコードするポリヌクレオチドが、プラスミド内に含まれる、実施形態Ｅ１〜Ｆ２５のいずれか１つに記載の方法。
【０５７６】
Ｈ３７．保留。
【０５７７】
Ｈ３８．細胞が、骨髄から取得又は調製される、実施形態Ｅ１〜Ｈ３７のいずれか１つに記載の改変細胞。
【０５７８】
Ｈ３９．細胞が、臍帯血から取得又は調製される、実施形態Ｅ１〜Ｈ３７のいずれか１つに記載の改変細胞。
【０５７９】
Ｈ４０．細胞が、末梢血から取得又は調製される、実施形態Ｅ１〜Ｈ３７のいずれか１つに記載の改変細胞。
【０５８０】
Ｈ４１．細胞が、末梢血単核球から取得又は調製される、実施形態Ｅ１〜Ｈ３７のいずれか１つに記載の改変細胞。
【０５８１】
Ｈ４２．改変細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ｅ１〜Ｈ４１のいずれか１つに記載の改変細胞。
【０５８２】
Ｈ４３．改変細胞が、自家Ｔ細胞である、実施形態Ｅ１〜Ｈ４１のいずれか１つに記載の方法。
【０５８３】
Ｈ４４．改変細胞が、同種Ｔ細胞である、実施形態Ｅ１〜Ｈ４１のいずれか１つに記載の方法。
【０５８４】
Ｈ４５．細胞が、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子を用いた遺伝子銃）、リポトランスフェクション、ポリマー形質移入、ナノ粒子、又はポリプレックスからなる群から選択される方法を用いて、核酸ベクターにより形質移入又は形質導入される、実施形態Ｅ１〜Ｈ４４のいずれか１つに記載の方法。
【０５８５】
Ｈ４６−Ｈ４８。保留。
【０５８６】
ｌ１．ＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮改変細胞集団を対象に投与する工程を含む、実施形態Ｊ１〜Ｈ４８のいずれか１つに記載の方法。
【０５８７】
Ｉ２．抗原認識部分が、腫瘍上の抗原に結合する、実施形態１１に記載の方法。
【０５８８】
ｌ３−ｌ１０。保留。
【０５８９】
ｌ１１．対象が、腫瘍を有すると診断されている、実施形態ｌ１〜ｌ１０のいずれか１つに記載の方法。
【０５９０】
ｌ１２．対象が、癌を有する、実施形態ｌ１〜ｌ１１のいずれか１つに記載の方法。
【０５９１】
ｌ１３．対象が、固形腫瘍を有する、実施形態ｌ１〜ｌ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０５９２】
ｌ１４．改変細胞集団が、静脈内投与される、実施形態ｌ１〜ｌ１３のいずれか１つに記載の方法。
【０５９３】
ｌ１５．改変細胞集団が、腫瘍床に送達される、実施形態ｌ１〜ｌ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０５９４】
ｌ１６．癌が、対象の血液又は骨髄中に存在する、実施形態ｌ１２に記載の方法。
【０５９５】
ｌ１７．対象が、血液又は骨髄疾患を有する、実施形態ｌ１〜ｌ１６のいずれか１つに記載の方法。
【０５９６】
ｌ１８．対象が、幹細胞移植によって緩和することができる任意の状態を有すると診断されている、実施形態ｌ１〜ｌ１７のいずれか１つに記載の方法。
【０５９７】
ｌ１９．対象が、鎌状赤血球症又は異染性白質ジストロフィーを有すると診断されている、実施形態ｌ１〜ｌ１８のいずれか１つに記載の方法。
【０５９８】
Ｉ２０．患者が、原発性免疫不全状態、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）、又は他の血球貪食性状態、遺伝性骨髄不全状態、ヘモグロビン症、代謝状態、及び破骨細胞状態からなる群から選択される状態を有すると診断されている、実施形態ｌ１〜ｌ１８のいずれか１つに記載の方法。
【０５９９】
ｌ２１．疾患又は状態が、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、
複合免疫不全（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠乏性、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多内分泌腺腫症、腸疾患、Ｘ連鎖）、又はＩＰＥＸ様、ウィスコット・アルドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠乏症、白血球粘着欠乏症、ＤＯＣＡ  ８欠乏症、ＩＬ−１０欠乏症／ＩＬ−１０受容体欠乏症、ＧＡＴＡ２欠乏症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化不全症、ファンコニ貧血先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、及び大理石骨病からなる群から選択される、実施形態ｌ１〜ｌ１８のいずれか１つに記載の方法。
【０６００】
Ｉ２２．追加用量の改変細胞を対象に投与することを含み、疾患又は状態症状が、症状の軽減後に残存するか又は検出される、実施形態ｌ１〜ｌ２１のいずれか１つに記載の方法。
【０６０１】
Ｉ２３．
対象における状態又は疾患の存在、不存在、又はステージを特定することと、
実施形態Ｅ１〜Ｅ４５のいずれか１つに記載の改変細胞集団を投与するための指示を送信することと、対象において同定された状態又は疾患の存在、不存在、又はステージに基づいて、改変細胞集団の後続の投与量を維持するか、又は患者に投与される改変細胞集団の後続の投与量を調節することと、を含む、実施形態ｌ１〜ｌ２２のいずれか１つに記載の方法。
【０６０２】
Ｉ２４．状態が、白血病である、実施形態Ｉ２３に記載の方法。
【０６０３】
Ｉ２５．対象が、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バール、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水疱瘡、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルプウイルス６、Ｉ）、及びパピローマウイルスからなる群から選択されるウイルス病因の感染を有すると診断されているか、又は肺炎、結核症、及び梅毒からなる群から選択される細菌病因の感染を有すると診断されているか、あるいはマラリア、トリパノソーマ、レッシュマン、リーシュマニア症、及びアメーバ赤痢からなる群から選択される寄生虫病因の感染を有すると診断されている、実施形態ｌ１〜ｌ２２のいずれか１つに記載の方法。
【０６０４】
本明細書で参照される各特許、特許出願、刊行物、及び文書の全体は、参照により組み込まれる。上記特許、特許出願、刊行物、及び文書の引用は、前述のいずれかが、適切な先行技術であることを容認するものではなく、これらの刊行物又は文書の内容物又は日付に関するいかなる容認も構成しない。
【０６０５】
技術の基本的な態様から逸脱することなく、前述に対して修正がなされてもよい。技術は、１つ以上の特定の実施形態を参照してかなり詳細に説明しているが、当業者は、本出願に具体的に開示された実施形態に変更をなし得、更に、これらの修正及び改善は、技術の範囲及び真意内であることを認識するであろう。
【０６０６】
本明細書で例示的に説明される技術は、本明細書で具体的に開示されていない任意の要素の非存在下で実施してもよい。したがって、例えば、本明細書の各例において、「含む（comprising）」、「から本質的になる（consisting  essentially  of）」及び「からなる（consisting  of）」という用語はいずれも、他の２つの用語のうちのいずれかと置き換えられてもよい。使用した用語及び表現は、説明の観点から使用され、限定するものではなく、そのような用語及び表現の使用は、示され記載された特徴又はその部分のいかなる等価物も除外するものではなく、特許請求の範囲に記載される技術の範囲内で様々な修正が可能である。「ａ」又は「ａｎ」という用語は、要素のうちの１つ又は要素のうちの２つ以上のいずれか文脈上明らかにしない限り、それが修飾する要素のうちの１つ又は複数を指すことができる（例えば、「試薬」は、１つ以上の試薬を意味し得る）。本明細書で使用する場合、「ａ」又は「ａｎ」という語の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において「含む」という用語と共に使用される場合には「１つ」を意味し得るが、それはまた、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つ又は２つ以上」の意味と一致する。更に、「有する（having）」、「含む（including）」、「含む（containing）」、及び「含む（comprising）」という用語は互換可能であり、当業者は、これらの用語がオープンエンド用語であると認識する。本明細書で使用する場合、「約」という用語は、基礎となるパラメータの１０％以内の値（すなわち、プラス又はマイナス１０％）を指し、一連の値の開始時における「約」の使用は、それぞれの値を修飾する（すなわち、「約１、２、及び３」は、約１、約２、及び約３を指す）。例えば、「約１００グラム」の重量は、９０グラム〜１１０グラムの重量を含むことができる。更に、値の列挙が本明細書に記載される場合（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、又は８６％）、列挙は、その全ての中間及び分数（例えば、５４％、８５．４％）を含む。したがって、本発明技術は、代表的な実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に記載される概念の修正及び変形は、当業者によって用いられてもよく、そのような修正及び変形は、本技術の範囲内であるとみなすことを理解されたい。
【０６０７】
本技術の特定の実施形態は、以下の請求項に記載されている。
【図１Ａ】
2021505139.tif 000015
【図１Ｂ】
2021505139.tif 000016
【図１Ｃ】
2021505139.tif 000017
【図１Ｄ】
2021505139.tif 000018
【図１Ｅ】
2021505139.tif 000019
【図１Ｆ】
2021505139.tif 000020
【図１Ｇ】
2021505139.tif 000021
【図１Ｈ】
2021505139.tif 000022
【図２Ａ】
2021505139.tif 000023
【図２Ｂ】
2021505139.tif 000024
【図２Ｃ】
2021505139.tif 000025
【図２Ｄ】
2021505139.tif 000026
【図３Ａ】
2021505139.tif 000027
【図３Ｂ】
2021505139.tif 000028
【図３Ｃ】
2021505139.tif 000029
【図３Ｄ】
2021505139.tif 000030
【図３Ｅ】
2021505139.tif 000031
【図３Ｆ】
2021505139.tif 000032
【図３Ｇ】
2021505139.tif 000033
【図３Ｈ】
2021505139.tif 000034
【図４Ａ】
2021505139.tif 000035
【図４Ｂ】
2021505139.tif 000036
【図４Ｃ】
2021505139.tif 000037
【図４Ｄ】
2021505139.tif 000038
【図４Ｅ】
2021505139.tif 000039
【図４Ｆ】
2021505139.tif 000040
【図４Ｇ】
2021505139.tif 000041
【図４Ｈ】
2021505139.tif 000042
【図５Ａ】
2021505139.tif 000043
【図５Ｂ】
2021505139.tif 000044
【図５Ｃ】
2021505139.tif 000045
【図５Ｄ】
2021505139.tif 000046
【図６Ａ】
2021505139.tif 000047
【図６Ｂ】
2021505139.tif 000048
【図６Ｃ】
2021505139.tif 000049
【図７Ａ】
2021505139.tif 000050
【図７Ｂ】
2021505139.tif 000051
【図７Ｃ】
2021505139.tif 000052
【図７Ｄ】
2021505139.tif 000053
【図７Ｅ】
2021505139.tif 000054
【図７Ｆ】
2021505139.tif 000055
【図７Ｇ】
2021505139.tif 000056
【図８Ａ】
2021505139.tif 000057
【図８Ｂ】
2021505139.tif 000058
【図８Ｃ】
2021505139.tif 000059
【図８Ｄ】
2021505139.tif 000060
【図９Ａ】
2021505139.tif 000061
【図９Ｂ】
2021505139.tif 000062
【図９Ｃ】
2021505139.tif 000063
【図１０Ａ】
2021505139.tif 000064
【図１０Ｂ】
2021505139.tif 000065
【図１０Ｃ】
2021505139.tif 000066
【図１１Ａ】
2021505139.tif 000067
【図１１Ｂ】
2021505139.tif 000068
【図１１Ｃ】
2021505139.tif 000069
【図１１Ｄ】
2021505139.tif 000070
【図１１Ｅ】
2021505139.tif 000071
【図１２】
2021505139.tif 000072
【図１３Ａ】
2021505139.tif 000073
【図１３Ｂ】
2021505139.tif 000074
【図１３Ｃ】
2021505139.tif 000075
【図１４Ａ】
2021505139.tif 000076
【図１４Ｂ】
2021505139.tif 000077
【図１５Ａ】
2021505139.tif 000078
【図１５Ｂ】
2021505139.tif 000079
【図１６Ａ】
2021505139.tif 000080
【図１６Ｂ】
2021505139.tif 000081
【図１７Ａ】
2021505139.tif 000082
【図１７Ｂ】
2021505139.tif 000083
【図１７Ｃ】
2021505139.tif 000084
【図１７Ｄ】
2021505139.tif 000085
【図１８Ａ】
2021505139.tif 000086
【図１８Ｂ】
2021505139.tif 000087
【図１８Ｃ】
2021505139.tif 000088
【図１８Ｄ】
2021505139.tif 000089
【図１９Ａ】
2021505139.tif 000090
【図１９Ｂ】
2021505139.tif 000091
【図１９Ｃ】
2021505139.tif 000092
【図１９Ｄ】
2021505139.tif 000093
【図２０】
2021505139.tif 000094
【図２１Ａ】
2021505139.tif 000095
【図２１Ｂ】
2021505139.tif 000096
【図２１Ｃ】
2021505139.tif 000097
【図２２Ａ】
2021505139.tif 000098
【図２２Ｂ】
2021505139.tif 000099
【図２３Ａ】
2021505139.tif 000100
【図２３Ｂ】
2021505139.tif 000101
【図２３Ｃ】
2021505139.tif 000102
【図２３Ｄ】
2021505139.tif 000103
【図２４Ａ】
2021505139.tif 000104
【図２４Ｂ】
2021505139.tif 000105
【図２４Ｃ】
2021505139.tif 000106
【図２４Ｄ】
2021505139.tif 000107
【図２５】
2021505139.tif 000108
【図２６Ａ】
2021505139.tif 000109
【図２６Ｂ】
2021505139.tif 000110
【図２６Ｃ】
2021505139.tif 000111
【図２６Ｄ】
2021505139.tif 000112
【配列表】
2021505139000001.app
【国際調査報告】
2021505139.tif 000113
2021505139.tif 000114
2021505139.tif 000115