(57)【要約】  本発明は、体細胞クローンのための動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法に関し、より具体的には、イヌ科動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法およびそれによる凍結解凍卵子に関する。従来技術に係るイヌのガラス化凍結卵子の生産技術は、発情周期が異なって同期化し難い状況であるのに対し、本発明に係るイヌ科動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法およびそれによる凍結解凍卵子は、異なる日付の発情が来ても、採取した卵子をガラス化凍結技術によって実験日程を同期化することができるため、高い核移植および受精の効果が現れる。【選択図】なし
2021529505.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌ科動物の成熟卵子を採取する過程（１過程）、
前記採取した卵子に対してガラス化凍結過程（２過程）を行い、
混合液、平衡溶液、ガラス化溶液を準備する過程（２過程−１）、
前記回収した卵子の卵丘細胞を除去する過程（ｄｅｎｕｄｉｎｇ）（２過程−２）、
前記卵丘細胞を除去した成熟卵子を室温に平衡させた混合液に処理する過程（２過程−３）、
前記卵子が含まれている混合液に平衡溶液を追加して処理した後、再び平衡溶液をさらに追加して処理する過程（２過程−４）、
前記処理を経た卵子を再び平衡溶液で処理する過程（２過程−５）、
処理した卵子をガラス化溶液に移して処理する過程（２過程−６）、および
卵子を卵子凍結道具に載せてガラス化溶液の除去後に直ちに液体窒素に浸漬して保管する過程（２過程−７）
を含むことを特徴とする、イヌ科動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法。
【請求項２】
ガラス化凍結卵子に対して融解する過程（３過程）を行い、
解凍溶液、希釈溶液、洗浄溶液、回復培養液を準備する過程（３過程−１）、
解凍溶液（Ｔｈａｗｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をインキュベータで３５〜４０℃に加温させる過程（３過程−２）、
回復培養液（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｍｅｄｉｕｍ）をインキュベータで３５〜４０℃に加温させる過程（３過程−３）、
液体窒素に保管された卵子凍結道具（ＣｒｙｏＴｏｐ）を取り出して加温した解凍溶液に入れ、卵子凍結道具に付着している卵子を分離して処理する過程（３過程−４）、
前記分離した卵子を常温に平衡させた希釈溶液に移して処理する過程（３過程−５）、
前記処理された卵子を常温に平衡させた２個の洗浄溶液に移して順次処理する過程（３過程−６）、および
前記過程後、回復培養をために前記前培養した回復培養液で培養する過程（３過程−７）
を含むことを特徴とする、請求項１に記載のイヌ科動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法により形成された凍結解凍卵子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体細胞クローンのための動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法に関し、より具体的には、イヌ科動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法およびそれによる凍結解凍卵子に関する。
【背景技術】
【０００２】
体細胞クローンとは、卵子の核を除去した後、複製しようとする体細胞の核を移植して体細胞と同一の遺伝情報を有したクローン生物を作り出すことをいう。体細胞クローンは、卵子と精子が結合する受精過程無しにも体細胞核移植を通じて生命体を誕生できる画期的な技術である。現在、体細胞クローン技術は、有用動物の生産、高価な薬剤生産用の形質転換動物の生産、絶滅に瀕した動物種のクローン、ペットのクローンおよび再生医学などに現実的に多様に利用されている。
【０００３】
体細胞クローンは、ドナー卵から核を除去する除核（ｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）過程、体細胞を除核したドナー卵に移植する核移植（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）過程、体細胞とドナー卵の細胞融合（ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ）過程、細胞融合したドナー卵の細胞質活性を誘導する卵活性（ｏｖｕｍ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）過程、および全ての過程が処理された体細胞クローン受精卵の培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）過程など、体外で長時間極微操作装置を用いた精巧な機械的技術と化学的処理が要求される。これには、基本材料として、ドナー卵子と複製しようとする遺伝情報を有した体細胞とが必要である。体細胞クローン動物の生産は、１９９７年に英国のＷｉｌｍｕｔらが羊をもって最初に報告して以来、マウス（Ｗａｋａｙａｍａら、１９９８）、ヤギ（Ｂａｇｕｉｓｉら、１９９９）、豚（Ｐｏｌｅｊａｅｖａら、２０００）、ウサギ（Ｃｈｅｓｎｅら、２００２）、猫（Ｓｈｉｎら、２００２）などのような様々な種での研究結果が報告されており、クローン牛の生産の場合は、１９９８年にＫａｔｏらとＣｉｂｅｌｌｉらによって研究結果が報告されており、韓国でもＩｍら（２００１）とＫｉｍら（２０１０）によって韓牛に対するクローン牛の生産について報告されている。しかし、体細胞クローン動物の生産効率は、５％未満として非常に小さいことが知られている（Ｈｅｙｍａｎら、２００２；Ｙａｎｇら、２００８）。
【０００４】
体細胞クローンのために体細胞を予め凍結保存だけをしておけば、必要時に融解していつでも使用することができ、増殖過程を通じて多数の細胞を得ることができるため、一部損失してもクローンに活用するのに問題がない。体細胞凍結方法は、既に普遍化しており、生存率が高いため、体細胞クローンに使われる細胞数の確保に困難がないためである。
【０００５】
その反面、ドナー卵の卵子は、屠殺時に得る卵巣からのみ回収することができるため、口蹄疫のような突然の自然災害が発生する場合または屠殺が難しくて卵巣の供給を受けることができない場合には、新鮮な卵子を得ることができないため、体細胞クローンに利用できなくなる。したがって、卵子の持続的な供給のために、未受精卵子を凍結保存しておく必要がある。また、環境汚染または自然破壊による、絶滅に瀕した動物または繁殖力が低下している動物を保護し蘇らせようとする努力が全世界的になされているところ、良質の卵子を予め選別し保管しておくのであれば、体細胞クローン研究のみならず、卵子が必要な他の研究にいつでも有用に利用できるという長所がある。
【０００６】
このような凍結保存の核心技術は、細胞内で約９０％を占める水の処理である。水は凍結過程で鋭い氷の結晶を形成し、そのため、細胞膜に傷ができて解凍後に細胞が死ぬことになる。一般体細胞や精子と比較して、哺乳類の卵子は、その大きさが約１２０〜１５０μｍ程度として約５万倍以上であり、他の細胞に比べて細胞内に多くの水を有しているだけでなく、特に成熟卵子の場合、染色体とそれを分離する染色体分裂機構が細胞質内に直接露出しており凍結保存が難しい。したがって、凍結過程を経ても卵子を安全に保護できる技術が求められ、さらに凍結および融解後にも卵子の生存率を高める技術も求められる。
【０００７】
特にイヌ科動物のイヌは、哺乳類とは異なり、未成熟卵子を排卵して卵管で２〜３日後に成熟した後に受精になる特異的な繁殖生理システムを有しており、体内卵子の採取時期が実験の成果を左右する。そのため、同じ時期に発情が来る実験犬を確保できない場合にはガラス化凍結を通じて充分な数量の卵子を確保する技術が必要であるが、現在のところ、このような実験結果および技術に非常に不備がある状況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
イヌ科動物のイヌは、哺乳類とは異なり、未成熟卵子を排卵して卵管で２〜３日後に成熟した後に受精になる特異的な繁殖生理システムを有しており、体内卵子の採取時期が実験の成果を左右する。そのため、同じ時期に発情が来る実験犬を確保できない場合にはガラス化凍結を通じて充分な数量の卵子を確保する技術が必要であるが、現在のところ、このような実験結果および技術に非常に不備がある状況である。
【０００９】
さらに、現在までイヌの未成熟卵子の凍結が試みられたが、未だに体外成熟システムに不備があって成熟卵子のガラス化凍結技術としての活用価値が顕著に落ちた状況であるため、イヌの体細胞クローンの活用性が不十分な実情である。
【００１０】
したがって、本発明は、イヌの成熟卵子を採取してガラス化凍結ができるイヌ科動物のガラス化凍結卵子の生産方法を提供し、また、このような生産方法による凍結卵子を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、前記目的および要求を解決するために、
イヌ科動物の成熟卵子を採取する過程（１過程）、
前記採取した卵子をガラス化凍結過程（２過程）を行い、
混合液、平衡溶液、ガラス化溶液を準備する過程（２過程−１）、
２過程‐１において、前記混合液は１０〜３０％  ＳＳＳ（Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）１００重量部にｍＨＴＦ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＨＴＦ  Ｍｅｄｉｕｍ−ＨＥＰＥＳ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）３００〜１０００重量部を混合したものであり、
前記平衡溶液は６．５〜８．５％（ｖ／ｖ）エチレングリコール（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、６．５〜８．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、１０〜３０％デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）そして２５〜４５μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝溶液から構成され、
前記ガラス化溶液（Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は５〜２５％（ｖ／ｖ）エチレングリコール（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、５〜２５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、１０〜３０％デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、０．３〜０．６Ｍスクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、２５〜４５μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝溶液から構成され、
前記回収した卵子の卵丘細胞の除去過程を経る（ｄｅｎｕｄｉｎｇ）過程（２過程−２）、
前記卵丘細胞を除去した成熟卵子を室温に平衡させた混合液に処理する過程（２過程−３）、
前記卵子が含まれている混合液に平衡溶液を追加して処理した後、再び平衡溶液をさらに追加して処理する過程（２過程−４）、
前記処理を経た卵子を再び平衡溶液で処理する過程（２過程−５）、
処理した卵子をガラス化溶液に移して処理する過程（２過程−６）、および
卵子を卵子凍結道具に載せてガラス化溶液の除去後に直ちに液体窒素に浸漬して保管する過程（２過程−７）、
を含むイヌ科動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、ガラス化凍結卵子に対して融解する過程（３過程）を行い、
解凍溶液、希釈溶液、洗浄溶液、回復培養液を準備する過程を行うが（３過程−１）、
３過程―１において、解凍溶液（Ｔｈａｗｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は０．５〜１．５Ｍスクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、１０〜３０％デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）そして２５〜４５μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝溶液から構成され、
希釈溶液（Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は０．３〜０．７Ｍスクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、１０〜３０％デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）そして２５〜４５μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝溶液から構成され、
回復培養液（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｍｅｄｉｕｍ）はＨＥＰＥＳ緩衝溶液、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ）、硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）を混合したものから構成され、
解凍溶液（Ｔｈａｗｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をインキュベータで３５〜４０℃に加温させる過程（３過程−２）、
回復培養液（ＲｅｃｏｖｅｒｙＭｅｄｉｕｍ）をインキュベータで３５〜４０℃に加温させる過程（３過程−３）、
液体窒素に保管された卵子凍結道具（ＣｒｙｏＴｏｐ）を取り出して加温した解凍溶液に入れ、卵子凍結道具（ＣｒｙｏＴｏｐ）に付着している卵子を分離して処理する過程（３過程−４）、
前記分離した卵子を常温に平衡させた希釈溶液に移して処理する過程（３過程−５）、
前記処理された卵子を常温に平衡させた２個の洗浄溶液に移して順次処理する過程（３過程−６）、および
前記過程後、回復培養のために前記加温した回復培養液で培養する過程（３過程−７）、
を含むことを特徴とするイヌ科動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、上記のようなイヌ科動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法により形成された凍結解凍卵子を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るイヌ科動物の卵子をガラス化凍結する方法は、混合液、平衡溶液、ガラス化溶液の技術的特性およびガラス化凍結方法により、凍結過程中に卵子内の氷結晶の形成が防止され、細胞内の水が相当除去され、また、液体窒素に直ちに入れて凍結させる超急速冷凍法として、氷結晶が防止されて細胞壁と膜が保護され、毒性が顕著に減って生存率が顕著に高くなるという効果がある。
【００１５】
また、本発明に係るイヌ科動物の卵子を解凍する方法は、解凍溶液、希釈溶液、洗浄溶液、回復培養液の技術的特徴および解凍方法の特徴により、凍結解凍卵子の生存性が顕著に高くなるという効果があり、それにより、本発明に係る凍結解凍卵子は高い核移植培養効果が現れる。
【００１６】
なお、従来技術に係るイヌのガラス化凍結卵子の生産技術は、発情周期が異なって同期化し難い状況であるのに対し、本発明に係るイヌ科動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法およびそれによる凍結解凍卵子は、異なる日付の発情が来ても、採取した卵子をガラス化凍結技術によって実験日程を同期化することができるため、高い核移植および受精の効果が現れる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施形態による卵子凍結道具であるＣｒｙｏＴｏｐ（Ｋｉｔａｚａｔｏ、Ｊａｐａｎ）に関するものである。
【図２】イヌの成熟卵子をガラス化凍結し解凍する過程における成熟卵子の状態に関する写真である。
【図３】イヌの成熟卵子をガラス化凍結し解凍する過程における成熟卵子の状態に関する写真である。
【図４】イヌの成熟卵子をガラス化凍結し解凍する過程における成熟卵子の状態に関する写真である。
【図５】イヌの成熟卵子をガラス化凍結し解凍する過程における成熟卵子の状態に関する写真である。
【図６】イヌの成熟卵子をガラス化凍結し解凍する過程における成熟卵子の状態に関する写真である。
【図７】イヌの成熟卵子をガラス化凍結し解凍する過程における成熟卵子の状態に関する写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、イヌ科動物の成熟卵子を採取する過程（１過程）、前記採取した卵子をガラス化凍結過程（２過程）を行い、混合液、平衡溶液、ガラス化溶液を準備する過程（２過程−１）、前記回収した卵子の卵丘細胞を除去する過程（ｄｅｎｕｄｉｎｇ）（２過程−２）、前記卵丘細胞を除去した成熟卵子を室温に平衡させた混合液に処理する過程（２過程−３）、前記卵子が含まれている混合液に平衡溶液を追加して処理した後、再び平衡溶液をさらに追加して処理する過程（２過程−４）、前記処理を経た卵子を再び平衡溶液で処理する過程（２過程−５）、処理した卵子をガラス化溶液に移して処理する過程（２過程−６）、および卵子を卵子凍結道具に載せてガラス化溶液の除去後に直ちに液体窒素に浸漬して保管する過程（２過程−７）を含む、イヌ科動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法に関する。
【００１９】
以下では、本発明について図面を参照して詳しく説明する。
【００２０】
本発明は、イヌ科動物のガラス化凍結卵子の生産方法、およびこのようなガラス化凍結卵子の生産方法によるイヌ科動物の凍結卵子を提供する。
【００２１】
本発明は、先ず、イヌ科動物の成熟卵子を採取する過程を行う（１過程）。
【００２２】
本発明において、イヌ科動物は、キツネ、タヌキ、オオカミ、野犬、畜犬などを意味し、代表的にはイヌを意味する。
【００２３】
本発明は、１〜５年齢の雑種の発情犬から手術的な方法で成熟した卵子を回収する方法を行う。
【００２４】
特に、本発明は、発情が観察された日から毎日採血してＶｅｔｃｈｒｏｍａ（Ａｎｉｖｅｔ、Ｋｏｒｅａ）を用いて血清内プロゲステロン（Ｐ４）を測定した。プロゲステロン濃度が１０ｎｇ／ｍｌ以上になる日を排卵日に取り、その後７２時間後に外科的手術によって体内から成熟したレシピエント卵子を回収（採取）する。
【００２５】
レシピエント卵子を採取する過程は、発情犬を５〜７ｍｇ／ｍｌ、好ましくは６ｍｇ／ｍｌのケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）で麻酔した後、ｌ．５〜２．５％、好ましくは２％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で麻酔を維持しながら手術を進行する。
【００２６】
開腹し子宮を取り出して固定させた後、卵巣を囲むベルサのスリットを通して卵管開始部にフラッシングニードル（ｆｌｕｓｈｉｎｇ  ｎｅｅｄｌｅ）を取り付ける。卵管接合部に隣接した卵管に血管内チューブカテーテル（ＩＶ  ｃａｔｈｅｔｅｒ）を挿入し、フラッシング培地を用いて成熟卵子を回収する。
【００２７】
本発明は、前記採取した卵子に対してガラス化凍結過程を行う（２過程）。
【００２８】
本発明の採取した卵子のガラス化凍結過程は、下記の細部過程により行われる。
【００２９】
本発明の技術的特徴は、下記のガラス化凍結過程に用いられる混合液、平衡溶液、ガラス化溶液の構成にある。
【００３０】
本発明は、前記混合液、平衡溶液、ガラス化溶液に技術的特徴があり、このような混合液、平衡溶液、ガラス化溶液を用いてガラス化した凍結卵子は、凍結過程中に卵子内の氷結晶の形成が防止され、細胞内の水が相当除去され、細胞壁と膜が保護され、毒性が顕著に減って生存率が顕著に高くなるという効果がある。
【００３１】
本発明は、ガラス化凍結過程を行う前に混合液、平衡溶液、ガラス化溶液を準備する過程を行う（２過程−１）。
【００３２】
本発明の混合液は、ＳＳＳ（Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、ｍＨＴＦ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＨＴＦ  Ｍｅｄｉｕｍ−ＨＥＰＥＳ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）を混合して作った液を意味する。
【００３３】
本発明の混合液は、１０〜３０％  ＳＳＳ（Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）１００重量部にｍＨＴＦ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＨＴＦ  Ｍｅｄｉｕｍ−ＨＥＰＥＳ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）３００〜１０００重量部を混合したものが良い。
【００３４】
好ましくは、２０％  ＳＳＳ（Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）にｍＨＴＦ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＨＴＦ  Ｍｅｄｉｕｍ−ＨＥＰＥＳ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）を混合した混合液を準備する。
【００３５】
本発明の平衡溶液（Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、エチレングリコール（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）および硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝溶液を含んで作る。
【００３６】
本発明は、６．５〜８．５％（ｖ／ｖ）エチレングリコール（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、６．５〜８．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、１０〜３０％デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、２５〜４５μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎｓｕｌｆａｔｅ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝溶液を含んで構成された平衡溶液（Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を準備して平衡化させる過程を行う。
【００３７】
本発明において、前記硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝溶液は、ＴＣＭ１９９（商品名）という名称で通用しているものを用いることができる。
【００３８】
本発明は、より好ましくは、７．５％（ｖ／ｖ）エチレングリコール（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、２０％デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、３５μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ＴＣＭ１９９、商品名）から構成された平衡溶液（Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を準備して平衡させる。
【００３９】
本発明は、エチレングリコール（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝溶液を含んで構成されたガラス化溶液（Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を準備して常温に平衡させる過程を行う。
【００４０】
本発明は、５〜２５％（ｖ／ｖ）エチレングリコール（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、５〜２５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、１０〜３０％デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、０．３〜０．６Ｍスクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、２５〜４５μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝溶液を含んで構成されたガラス化溶液（Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を準備して常温に０．５〜２時間平衡させる過程を行う。
【００４１】
好ましくは、１５％（ｖ／ｖ）エチレングリコール（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、１５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、２０％デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、０．５Ｍスクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、３５μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ＴＣＭ１９９）から構成されたガラス化溶液（Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を準備して常温に０．５〜２時間平衡させる過程を行う。
【００４２】
前記平衡させるとは、混合試薬が常温で使用できるように濃度が均一になり常温状態と類似になるように置くことを意味する。
【００４３】
本発明は、前記回収した卵子に対してｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅを用いて卵丘細胞の除去過程（ｄｅｎｕｄｉｎｇ）を経る過程を行う（２過程−２）。
【００４４】
本発明は、前記回収した卵子を０．０１〜０．２％  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅを用いて卵丘細胞の除去過程（ｄｅｎｕｄｉｎｇ）を経る過程を行う。
【００４５】
好ましくは、０．１％  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅを用いて卵丘細胞の除去過程を経る（ｄｅｎｕｄｉｎｇ）過程を行いつつ、卵子の成熟有無を検査して成熟した卵子を使用できるようにする。
【００４６】
本発明は、前記卵丘細胞を除去した成熟卵子を室温に平衡させた混合液１０〜３０μｌ  ｄｒｏｐに０．５〜２分間処理する過程を行う（２過程−３）。
【００４７】
本発明で用いられるドロップ（ｄｒｏｐ）は水滴形態の液滴を意味する。
【００４８】
好ましくは、前記卵丘細胞を除去した成熟卵子を室温に平衡させた混合液（２０％ＳＳＳが含まれたｍＨＴＦ溶液）２０μｌ  ｄｒｏｐに１分間処理する過程を行う。
【００４９】
本発明は、前記卵子が含まれている混合液に平衡溶液１０〜３０μｌ  ｄｒｏｐを追加して１〜３分間処理した後、再び平衡溶液１０〜３０μｌ  ｄｒｏｐを追加して１〜３分間さらに処理する過程を行う（２過程−４）。
【００５０】
好ましくは、卵子が含まれている混合液に平衡溶液２０μｌ  ｄｒｏｐを追加して２分間処理（総４０μｌ）した後、平衡溶液２０μｌ  ｄｒｏｐを追加して２分間処理（総６０μｌ）する過程を行う。
【００５１】
本発明は、前記処理を経た卵子を再び平衡溶液で５〜７分間処理する過程を行う（２過程−５）。
【００５２】
好ましくは、前記処理を経た卵子を平衡溶液２０μｌ  ｄｒｏｐで６分間処理する。
【００５３】
図２は、卵子のガラス化凍結前の写真であり、図３は、平衡溶液で処理した卵子の写真を示す。
【００５４】
本発明は、前記処理した卵子をガラス化溶液に移して０．５〜３分間処理する過程を行う（２過程−６）。
【００５５】
好ましくは、前記処理した卵子をガラス化溶液５０μｌ  ｄｒｏｐに移して１分間処理する。
【００５６】
図４は、ガラス化溶液で処理した卵子の写真を示す。
【００５７】
本発明は、前記過程後に卵子を卵子凍結道具に載せてガラス化溶液を最小限に除去した後に直ちに液体窒素に浸漬して保管する過程を行う（２過程−７）。
【００５８】
本発明において、卵子を卵子凍結道具に載せてガラス化溶液を最小限に除去するとは、卵子周辺のガラス化溶液を適切に除去することを意味する。
【００５９】
前記卵子凍結道具は端部に卵子を載せて液体窒素に浸漬して凍結する道具を意味し、卵子凍結道具としてＣｒｙｏＴｏｐ（Ｋｉｔａｚａｔｏ、Ｊａｐａｎ）を使用することができる。
【００６０】
図１に示すように、ＣｒｙｏＴｏｐ（Ｋｉｔａｚａｔｏ、Ｊａｐａｎ）は、卵子を凍結させるために使用する道具を意味する。
【００６１】
本発明は、上記のような方法で行われたガラス化凍結卵子に対して融解する過程を行う（３過程）。  
【００６２】
本発明において、融解する過程とは解凍する過程を意味する。
【００６３】
本発明は、解凍溶液、希釈溶液、洗浄溶液、回復培養液を準備する過程を行う（３過程−１）。
【００６４】
本発明は、前記解凍溶液、希釈溶液、洗浄溶液、回復培養液に技術的特徴があり、このような解凍溶液、希釈溶液、洗浄溶液、回復培養液を用いて解凍したガラス化凍結卵子（凍結解凍卵子）の生存性が顕著に高くなるという効果があり、それにより、本発明に係る凍結解凍卵子は高い核移植培養効果が現れる。
【００６５】
本発明の解凍溶液（Ｔｈａｗｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝溶液を含んで構成されている。
【００６６】
本発明の解凍溶液（Ｔｈａｗｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、０．５〜１．５Ｍスクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、１０〜３０％デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、２５〜４５μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝溶液を含んで構成されている。
【００６７】
好ましくは、解凍溶液（Ｔｈａｗｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、Ｉ．ＯＭスクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、２０％デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、３５μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝溶液を含んで構成されたものが効果的である。
【００６８】
本発明の希釈溶液（Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝溶液を含んで構成される。
【００６９】
本発明の希釈溶液（Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、０．３〜０．７Ｍスクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、１０〜３０％デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、２５〜４５μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝溶液を含んで構成される。
【００７０】
好ましくは、希釈溶液（Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、０．５Ｍスクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、２０％デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）そして３５μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝溶液を含んで構成されたものが効率的である。
【００７１】
本発明の洗浄溶液（Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝溶液を含んで構成される。
【００７２】
本発明の洗浄溶液（Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、１５〜２５％デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、２５〜４５μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝溶液を含んで構成される。
【００７３】
好ましくは、洗浄溶液（Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、２０％デキストラン血清補充剤（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、３５μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝溶液（商品名ＴＣＭ１９９）を含んで構成されたものが効果的である。
【００７４】
本発明の回復培養液（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｍｅｄｉｕｍ）は、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ）、硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）を混合して作る。
【００７５】
好ましくは、回復培養液（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｍｅｄｉｕｍ）は、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液１００重量部にピルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ）０．５〜２重量部、硫酸ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）０．５〜２重量部、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）２〜１０重量部を混合して製造する。
【００７６】
本発明は、解凍溶液（Ｔｈａｗｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を２５〜４５ｍｍの皿に入れてインキュベータで３５〜４０℃に加温させる過程を行う（３過程−２）。
【００７７】
好ましくは、解凍溶液（Ｔｈａｗｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を３５ｍｍの皿に入れてインキュベータで３７〜３８℃に２〜５ｍｌの量で加温させる過程を行う。
【００７８】
本発明は、回復培養液（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｍｅｄｉｕｍ）をインキュベータで加温させる過程を行う（３過程−３）。
【００７９】
好ましくは、回復培養液（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｍｅｄｉｕｍ）を４ｗｅｌｌ皿に分株してインキュベータで３７〜３８℃に２０〜４０分程度で加温させる。
【００８０】
本発明は、液体窒素に保管された前記卵子凍結道具（ＣｒｙｏＴｏｐ）を取り出して加温した解凍溶液に入れ、卵子凍結道具（ＣｒｙｏＴｏｐ）に付着している卵子を分離し１分間処理する過程を行う（３過程−４）。
【００８１】
好ましくは、液体窒素に保管された卵子凍結道具であるＣｒｙｏＴｏｐを取り出して加温した解凍溶液に入れ、ＣｒｙｏＴｏｐに付着している卵子を分離し１分間処理する。
【００８２】
本発明は、前記分離した卵子を常温に平衡させた希釈溶液３０〜５０μｌ  ｄｒｏｐに移して３〜５分間処理する過程を行う（３過程−５）。
【００８３】
好ましくは、前記分離した卵子を常温に平衡させた希釈溶液４０μｌ  ｄｒｏｐに移して４分間処理する。
【００８４】
本発明は、前記処理された卵子を常温に平衡させた２個の洗浄溶液３０〜５０μｌ  ｄｒｏｐに移して順次３〜５分間ずつ処理する過程を行う（３過程−６）。
【００８５】
好ましくは、処理された卵子を常温に平衡させた２個の洗浄溶液４０μｌ  ｄｒｏｐに移して順次４分間ずつ各々処理する。
【００８６】
本発明は、前記融解過程後、回復培養のために前記加温した回復培養液で１〜３時間培養する過程を行う（３過程−７）。
【００８７】
好ましくは、前記融解過程後に回復培養のために回復培養液で２時間培養することが良い。
【００８８】
図５は、解凍溶液で卵子を処理したものを示す写真である。
【００８９】
図６は、希釈溶液で処理したものを示す写真である。
【００９０】
図７は、洗浄溶液で卵子を処理したものを示す写真である。
【００９１】
本発明は前記過程でイヌ科動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法で処理された凍結解凍卵子に対して生存性検査（凍結解凍卵子の生存性検査）を施し、以下の表１のような結果を得た。
【００９２】
【表１】
2021529505.tif 000003
【００９３】
全体ガラス化凍結卵子における融解後の卵子生存率は９５％程度として非常に高いことが分かり、特に回復培養後の卵子生存率も９０％を超過して生存率が顕著に高い効果を示している。
【００９４】
また、回復培養後、実験が使用可能な９０％程度の成熟卵子（凍結解凍卵子）と新鮮卵子を対比する体細胞核移植実験を通じて表２に示すように効率性を比較した。
【００９５】
【表２】
2021529505.tif 000004
【００９６】
上記したように、本発明に係る凍結解凍卵子は、新鮮卵子を用いた結果と比較した時、実験過程で重大な欠陥は発見されず、新鮮卵子の結果と類似した研究結果を導き出したところ、本発明に係る凍結解凍卵子は、顕著に高い核移植培養効果があることが分かる。
【００９７】
すなわち、胚盤胞ステップにおいて、新鮮卵子と本発明に係る凍結解凍卵子の生存率（％）が類似した研究結果を導き出したところ、本発明に係る凍結解凍卵子は、顕著に高い核移植培養効果があることが分かる。
【００９８】
本発明は、前記機能と効果からなるイヌ科動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法およびそれによる凍結解凍卵子を提供する。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明は、体細胞クローンのための動物の卵子を生産、製造、販売、流通、研究する産業に非常に有用である。
【０１００】
特に、本発明は、体細胞クローンのための動物の卵子をガラス化凍結し解凍する技術と装置に対する生産、製造、販売、流通、研究する産業に非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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