(57)【要約】  本発明は、イヌライム病のワクチンならびに該ワクチン単独もしくは他の防御薬との組み合わせの調製もしくは使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
1つ以上のBorrelia burgdorferi抗原またはその抗原断片をそれぞれ個別にコードする2つ以上のアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む免疫原性組成物であって、
1つのアルファウイルスRNAレプリコン粒子が、1つ以上のBorrelia burgdorferi外表面蛋白質A (OspA)またはその抗原断片をコードし、別のアルファウイルスRNAレプリコン粒子が、1つ以上のBorrelia burgdorferi外表面蛋白質C (OspC)またはその抗原断片をコードする、免疫原性組成物。
【請求項２】
2つ以上のBorrelia burgdorferi抗原をコードするアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む免疫原性組成物であって、少なくとも1つのBorrelia burgdorferi抗原が外表面蛋白質A (OspA)またはその抗原断片であり、少なくとも1つの他のBorrelia burgdorferi抗原が外表面蛋白質C (OspC)またはその抗原断片である、免疫原性組成物。
【請求項３】
OspAまたはその抗原断片およびOspCまたはその抗原断片をそれぞれ個別にコードする第1および第2のアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む請求項2に記載の免疫原性組成物であって、第1のRNAレプリコン粒子が、OspCまたはその抗原断片をコードする核酸配列の上流に位置するOspAまたはその抗原断片をコードする核酸配列を含み、第2のRNAレプリコン粒子が、OspAまたはその抗原断片をコードする核酸配列の上流に位置するOspCまたはその抗原断片をコードする核酸配列を含む、免疫原性組成物。
【請求項４】
アルファウイルスRNAレプリコン粒子の少なくとも1つがベネズエラ馬脳炎ウイルス(VEEV) RNAレプリコン粒子である、請求項1、2または3記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記OspAとは異なるBorrelia burgdorferi株に由来する第2のOspAまたはその抗原断片、前記OspCとは異なるBorrelia burgdorferi株に由来する第2のOspCまたはその抗原断片、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるBorrelia burgdorferi抗原をコードする1以上の追加のアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む、請求項1、2、3または4に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記1つ以上の追加のアルファウイルスRNAレプリコン粒子が、VEEV RNAレプリコン粒子である、請求項5に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
少なくとも1つのOspAがB. burgdorferi株297に由来し、少なくとも1つのOspCがB. burgdorferi株50772に由来する、請求項1、2、3、4、5または6に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
OspAが配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を含むアミノ酸配列を含み、OspCが配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を含むアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
請求項1、2、3、4、5、6、7または8に記載の免疫原性組成物および薬学的に許容される担体を含む、Borrelia burgdorferi感染による疾患の予防を助けるワクチン。
【請求項１０】
1つ以上の抗体が、イヌをワクチンで免疫したときにイヌにおいて誘導され、該1つ以上の抗体が、OspA-ボレリア殺菌抗体、OspC-ボレリア殺菌抗体、またはOspA-ボレリア殺菌抗体とOspC-ボレリア殺菌抗体の両方からなる群から選択される、請求項9記載のワクチン。
【請求項１１】
非ボレリア病原体に対する防御免疫を誘発するための少なくとも1つの非ボレリア免疫原をさらに含む、請求項9または10に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
非ボレリア免疫原由来の少なくとも1つのタンパク質抗原またはその抗原断片をコードするヌクレオチド配列を含むアルファウイルスRNAレプリコン粒子をさらに含む、請求項9、10または11に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
非ボレリア免疫原が、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌコロナウイルス、イヌインフルエンザウイルス、レプトスピラ血清型、リーシュマニア生物、Bordetella bronchiseptica、マイコプラズマ種、狂犬病ウイルス、Ehrlichia canis、Anaplasma種、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される非ボレリア病原体に由来する、請求項11または12に記載のワクチン。
【請求項１４】
非ボレリア免疫原が、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌコロナウイルス、イヌインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、レプトスピラ血清型、リーシュマニア菌、Bordetella bronchiseptica、マイコプラズマ種、狂犬病ウイルス、Ehrlichia canis、Anaplasma種、およびそれらの任意の組合せからなる死滅または弱毒化非ボレリア病原体の群から選択される死滅または弱毒化非ボレリア病原体である、請求項11に記載のワクチン。
【請求項１５】
マイコプラズマ種がMycoplasma cynosを含む、請求項13または14に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記レプトスピラ血清型が、Leptospira kirschneri serovar grippotyphosa、Leptospira interrogans serovar canicola、Leptospira interrogans serovar icterohaemorrhagiae、Leptospira interrogans serovar pomona、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項13、14または15に記載のワクチン。
【請求項１７】
非アジュバントワクチンである請求項9、10、11、12、13、14、15または16のワクチン組成物。
【請求項１８】
病原性ボレリア遺伝子種に対して哺乳動物を免疫する方法であって、請求項9、10、11、12、13、14、15、16または17に記載のワクチンの免疫学的に有効な量を哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１９】
哺乳動物がイヌである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物がウマ科動物である、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物がネコである、請求項18記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、イヌライム病のための新しいワクチンに関する。ワクチンを単独で、または他の防御剤と組み合わせて製造し、使用する方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
背景
イヌライム病は、主として米国におけるB. burgdorferi sensu stricto (ss)および欧州におけるB. burgdorferi ss、B. garinii、およびB. afzeliiを含むボレリア種(spp.)スピロヘータによる感染によって引き起こされる[Barantonら、Int. J. Sys. Bacteriol.42:378-383(1992); Hoviusら、J. Clin. Microbiol.38:2611-2621(2000)]。スピロヘータは血液を接種し、感染したIxodes spp.ダニとして伝播し、感染はイヌにおいて無症候性滑膜炎から急性関節炎および関節痛までの範囲の臨床徴候を引き起こす[Jacobsonら、Semin. Vet. Med. Surg.11:172-182(1996); Summersら、J. Comp. Path.133:1-13(2005)]。重要なことに、イヌライム病症例の発生率は、ヒト症例数の増加と一致して年々増加し続けている[Haninkovaら、Emerg. Infect. Dis.12:604-610(2006)]。さらに、イヌの品種の中には、特にリトリーバーやベルネス山犬など、重度の糸球体腎炎を発症したものもあり[Dambachら、Vet Pathol 34:85-96(1997)]、合併症による死亡例が報告されている[Littmanら、J Vet Intern Med.20:422-434(2006)]。
【０００３】
ボレルア種の感染に応答して産生される抗体は、2つの異なる機能を有する[Schwan, Biochem. Soc. Trans.31:108-112(2003); Tokarzら、Infect. Immun.72:5419-5432(2004)]。最も一般的な体液性免疫応答は、食細胞による摂取のためにスピロヘータを「標識」する非特異的結合/オプソニン化(コーティング)抗体の産生である。したがって、この体液性免疫応答は、外来抗原を殺す補体媒介膜攻撃複合体に結合し誘導する免疫グロブリン(Ig)M抗体の産生につながる。しかし、IgM抗体応答は、典型的には、抗原に結合するが補体媒介殺傷を刺激しないIgG抗体にクラススイッチする。むしろ、IgG抗体は標的抗原に結合し、食細胞による摂取のためにスピロヘータを効果的に「標識」する。
【０００４】
このより典型的なオプソニン化IgG抗体反応は、ワクチン接種後に効果的な防御をもたらさなかった。これは、主に、免疫応答を誘導するタンパク質が他の複数の微生物に一般的であり、また、食細胞との相互作用がより効果的である可能性が高い血流中では、ライム病スピロヘータの存在量がより少ないためである[Caineら、Infect Immun 83:3184-3194(2015)]。実際、オプソニン化抗体は、他の微生物に共通するいくつかのタンパク質(すなわち、細菌の鞭毛を構成する41kDaのタンパク質)によって誘導され、ワクチン接種誘発性の抗体媒介性免疫に対する価値を、せいぜい疑問に思わせる。
【０００５】
一方、少数のボレリア種蛋白質は、IgG抗体に切り替えた後でも補体結合能(殺ボレリア性)を維持する抗体反応を誘導する。より具体的には、殺ボレリア抗体は特定のタンパク質標的に結合し、補体を誘導して、食細胞による捕捉の必要なしに、生体を殺す膜侵襲複合体を形成する。オプソニン化抗体とは対照的に、このボレリア殺菌反応は、最も効果的なイヌライム病バクテリンの基礎を形成している。
【０００６】
最も初期のイヌライム病バクテリンは、B. burgdorferi ss外表面タンパク質(Osp)Aに特異的な殺ボレリア抗体を誘導することによって防御を提供した[Chuら、JAVMA 201:403-411(1992); Maら、Vaccine 14:1366-1374(1996); Wikleら、Intern. J. Appl. Res. Vet. Med.4:23-28(2006);およびStraubingerら、Vaccine 20:181-193(2002)]。このアプローチは効果的であるが、現在ではこの戦略にはワクチン接種を失敗させうる重大な欠点があることが理解されている。例えば、抗体は、OspAを発現しているB. burgdorferi ssスピロヘータのみを認識し[Jobeら、J. Clin. Microbiol.32:618-622(1994); Lovrichら、Infect. Immun.63:2113-2119(1995)]、そしてダニはまた、OspAを発現していないB. burgdorferi ssスピロヘータに一般的に感染される[Fikrigら、Infect. Immun.63:1658-1662(1995); Ohnishiら、Proc. Natl. Acad. Sci.98:670-675(2001)]。また、ダニはライム病の原因ともなるB. afzeliiやB. garinii等の他のボレリア種にも一般的に感染しており[Ornstein et al.、 J. Clin. Microbiol. 39:1294-1298(2001)]、OspA抗体は遺伝子種特異的である[Lovrich et al.、 Infect. Immun. 63:2113-2119(1995)]。さらに、ダニの中腸への付着を媒介するOspAの発現[Palら、J Clin Invest 106:561-569(2000)]は、感染したダニが摂食を開始した直後にオフになるため、防御を提供するための「機会の窓」は短い[Schwanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2909-2913(1995)]。
【０００７】
研究者らは、OspAベースのイヌライム病ワクチンの開発と一致して、B. burgdorferi ss OspC蛋白質も防御的ボレリア殺菌抗体を誘導することを示した[Rousselleら、J. Infect. Dis. 178:733-741(1998); Ikushimaら、FEMS Immunol. Med. Microbiol. 29:15-21(2000)]が、同じ地理的地域から採取したB. burgdorferi ss分離株の中でもOspCは極めて不均一であったことから、この反応は有効なライム病ワクチンには有用ではないと考えられた[Ing-Nangら、Genetics 151:15-30(1999); Bucklesら、Clin.Vacc.Immuno. 13:1162-1165(2006)]。したがって、研究者らは、OspCボレリア殺菌抗体は少数のライム病スピロヘータに対してのみ抗体媒介性免疫をもたらすと推測した。
【０００８】
一貫して、Callisterら、[U.S.6,210,676およびU.S.6,464,985]は、Ospのカルボキシ(C)末端に特異的なOspCの免疫原性ポリペプチド断片を単独またはOspAポリペプチドと組み合わせて使用して、ヒトおよび他の哺乳動物をライム病から保護するためのワクチンに使用することを提案している。具体的には、OspCのカルボキシ(C)末端内の7アミノ酸エピトープに特異的に結合するボレリア殺菌抗体を誘導するという戦略であった[Jobe et al.、 Clin. Diagn. Lab. Immuno. 10:573-578(2003); Lovrich et al.、 Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12:746-751(2005)]。なぜなら、エピトープは現在までに特徴付けられたB. burgdorferi ss株の各々の間で保存されており、（BLAST検索で見出せるような）他の病原性ボレリア種の間でも保存されているからである。したがって、保存されたエピトープに対するOspCボレリア殺菌抗体を誘導するワクチンは、OspC遺伝子の系統的特徴付けにかかわらず、各B. burgdorferi ss「株」に対する防御をもたらし、またB. gariniiまたはB. afzeliiのような他のイヌライム病病原体に対しても防御をもたらすことが期待される。Liveyら[U.S. 6,872,550]はまた、組換えOspA、OspB、およびOspC蛋白質の組合せから調製したライム病に対する免疫化のためのワクチンを提案した。
【０００９】
この戦略に基づき、2009年に、Merck Animal Health, Inc.は、それぞれ外膜表面にOspAまたはOspCのいずれかを発現する2つの別々のB. burgdorferi分離株の混合物からなる全細胞細菌ノビバック（Nobivac）ライムのUSDA承認を受けた[U.S. 8,137,678 B2; U. 8,414,901 S. B2]。最も重要なことは、ノビバックライム・ワクチンにより、メルク・アニマル・ヘルスのアプローチが、イヌライム病に対してより包括的な防御を提供し得ることが十分に検証されていることである。例えば、研究者らは、ワクチンがOspAおよびOspCの両方のボレリア殺菌抗体を誘導することを確認し、また、OspC抗体反応が、C末端で保存されたエピトープに特異的なボレリア殺菌抗体のかなりの割合を含むことを実証した[LaFleurら、Clin Vaccine Immunol 16:253-259(2009)]。さらに、ワクチンはワクチン接種後1年間、レシピエントのイヌを確実に保護することが確認され[LaFleurら、Clin Vacc Immunol 17:870-874(2010)]、また、OspC発現スピロヘータが高いレベルの防御に有意な寄与をもたらすことが示された[LaFleurら、Clin Vacc Immunol 22:836-839(2015)]。しかしながら、このような改善にもかかわらず、特にライム病を引き起こすスピロヘータの遺伝的多様性が拡大し続けるにつれて、より包括的で長期的な防御の必要性が依然として存在している。
【００１０】
さらに最近では、研究者らはOspCの不均一性を克服するためのさらなる戦略を採用し、したがってより包括的な保護を提供した。この戦略は、多数のB. burgdorferi ss分離株からのOspCの系統解析を行い、複数の細菌間で均一である遺伝子配列内の領域を同定することであった[Earnhardtら.、Clin Vaccine Immunol 14:628-634(2007)]。次に、同博士らは、多数の均一領域を含む「人工」遺伝子を設計し、その人工遺伝子を用いてキメラ蛋白質を作製した。キメラ蛋白質は、おそらく、OspCボレリア殺菌抗体を誘導するためのワクチンに使用され、それぞれの取り込まれた領域に結合し、より包括的な防御を提供するであろう[Rhodesら、Vet J 198:doi:10.1016/j.tvjl.2013.07.019(2013)]。その結果、2016年に、OspCの7種類の「タイプ」のエピトープを含む組換え体(r)OspAと人工的に作製されたキメラ蛋白質から成る市販のイヌライム病ワクチン(Vanguard （登録商標） crLyme)がUSDAに承認された[Zoetis技術情報-SAB-00233］。しかしながら、ボレリア殺抗体を誘導し得るOspCサブユニット抗原に基づくワクチンをどのように調製するかは、先行技術からは知られていない。
【００１１】
長年にわたって、アルファウイルス由来レプリコンRNA粒子(RP)を含む多くのベクター戦略が利用され[Frolov ら., PNAS 93: 11371-11377 (1996); Vander Veen, ら. Anim Health Res Rev. 13(1): 1-9. (2012) doi: 10.1017/S1466252312000011; Kamrudら., J Gen Virol.91(Pt 7):1723-1727(2010)]、これらは、ベネズエラ馬脳炎ウイルス(VEE) [Pushko ら.、 Virology 239:389-401(1997)]、Sindbis (SIN) [Bredenbeek ら.、 Journal of Virology 67:6439-6446(1993)]、Semliki Forest virus (SFV) [Liljestrom and Garoff, Biotechnology (NY)9:13561361(1991)]を含む異なったアルファウイルスから開発されたものである。RPワクチンは増殖欠損アルファウイルスRNAレプリコンを宿主細胞に送達し、in vivoで所望の抗原導入遺伝子の発現をもたらす[Pushkoら、Virology 239(2):389-401(1997)]。RPは、一部の従来のワクチン製剤と比較した場合、魅力的な安全性及び有効性プロファイルを有する[Vander Veen,ら. Anim Health Res Rev.13(1):1-9.(2012)]。RPプラットフォームは病原性抗原をコードするために使用されており、いくつかのUSDA認可の豚および家禽用ワクチンの基礎となっている。また、Gipsonら[Vaccine.21(25-26):3875-84.(2003)]は、イヌでは同等の試験が実施されていないと報告されているものの、マウスモデルワクチン接種試験においてRPプラットフォームを用いてOpsA抗原をコード化している。
【００１２】
したがって、ノビバックライムワクチンによってもたらされる有効性の増加および過去の多くの推定される死亡終了および/または失敗にもかかわらず、哺乳動物、特にイヌをこの衰弱性疾患からより良好に保護するであろうさらなる改良されたライム病ワクチンの長期にわたる必要性が残されている。
【００１３】
本明細書中の文献の引用はこれらの文献が本件出願の「従来技術」として利用し得ることを認めたものと見なされるべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】U.S.6,210,676
【特許文献２】U.S.6,464,985
【特許文献３】U.S. 6,872,550
【特許文献４】U.S. 8,137,678 B2
【特許文献５】U. 8,414,901 S. B2
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Barantonら、Int. J. Sys. Bacteriol.42:378-383(1992)
【非特許文献２】Hoviusら、J. Clin. Microbiol.38:2611-2621(2000)
【非特許文献３】Jacobsonら、Semin. Vet. Med. Surg.11:172-182(1996)
【非特許文献４】Summersら、J. Comp. Path.133:1-13(2005)
【非特許文献５】Haninkovaら、Emerg. Infect. Dis.12:604-610(2006)
【非特許文献６】Dambachら、Vet Pathol 34:85-96(1997)]
【非特許文献７】Littmanら、J Vet Intern Med.20:422-434(2006)
【非特許文献８】Schwan, Biochem. Soc. Trans.31:108-112(2003)
【非特許文献９】Tokarzら、Infect. Immun.72:5419-5432(2004)
【非特許文献１０】Caineら、Infect Immun 83:3184-3194(2015)
【非特許文献１１】Chuら、JAVMA 201:403-411(1992)
【非特許文献１２】Maら、Vaccine 14:1366-1374(1996)
【非特許文献１３】Wikleら、Intern. J. Appl. Res. Vet. Med.4:23-28(2006)
【非特許文献１４】Straubingerら、Vaccine 20:181-193(2002)
【非特許文献１５】Jobeら、J. Clin. Microbiol.32:618-622(1994)
【非特許文献１６】Lovrichら、Infect. Immun.63:2113-2119(1995)
【非特許文献１７】Fikrigら、Infect. Immun.63:1658-1662(1995)
【非特許文献１８】Ohnishiら、Proc. Natl. Acad. Sci.98:670-675(2001)]
【非特許文献１９】Ornstein et al.、 J. Clin. Microbiol. 39:1294-1298(2001)
【非特許文献２０】Lovrich et al.、 Infect. Immun. 63:2113-2119(1995)
【非特許文献２１】Palら、J Clin Invest 106:561-569(2000)
【非特許文献２２】Schwanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2909-2913(1995)
【非特許文献２３】Rousselleら、J. Infect. Dis. 178:733-741(1998)
【非特許文献２４】Ikushimaら、FEMS Immunol. Med. Microbiol. 29:15-21(2000)
【非特許文献２５】Ing-Nangら、Genetics 151:15-30(1999)
【非特許文献２６】Bucklesら、Clin.Vacc.Immuno. 13:1162-1165(2006)
【非特許文献２７】Jobe ら、 Clin. Diagn. Lab. Immuno. 10:573-578(2003)
【非特許文献２８】Lovrichら、 Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12:746-751(2005)
【非特許文献２９】LaFleurら、Clin Vaccine Immunol 16:253-259(2009)
【非特許文献３０】LaFleurら、Clin Vacc Immunol 17:870-874(2010)
【非特許文献３１】LaFleurら、Clin Vacc Immunol 22:836-839(2015)
【非特許文献３２】Earnhardtら.、Clin Vaccine Immunol 14:628-634(2007)
【非特許文献３３】Rhodesら、Vet J 198:doi:10.1016/j.tvjl.2013.07.019(2013)
【非特許文献３４】Frolovら, PNAS 93: 11371-11377 (1996)
【非特許文献３５】Vander Veen, ら. Anim Health Res Rev. 13(1): 1-9. (2012)
【非特許文献３６】Kamrudら., J Gen Virol.91(Pt 7):1723-1727(2010)
【非特許文献３７】Pushko ら.、 Virology 239:389-401(1997)
【非特許文献３８】Bredenbeek ら.、 Journal of Virology 67:6439-6446(1993)
【非特許文献３９】Liljestrom and Garoff, Biotechnology (NY)9:13561361(1991)
【非特許文献４０】Pushkoら、Virology 239(2):389-401(1997)
【非特許文献４１】Vander Veen,ら. Anim Health Res Rev.13(1):1-9.(2012)
【非特許文献４２】GipsonらVaccine.21(25-26):3875-84.(2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の要約
したがって、本発明は、1つ以上のBorrelia burgdorferi抗原をコードするベクターを提供する。このようなベクターは、これらのベクターを含む免疫原性組成物において使用することができる。本発明の免疫原性組成物は、ワクチンに使用することができる。本発明の一態様では、ワクチンは、ライム病に対するワクチン接種された被験体(例えば、哺乳動物)の保護を助ける。この型の特定の実施形態では、ワクチン接種対象はイヌである。別の実施形態では、ワクチン接種された被験体は家ネコである。他の家畜哺乳類、ウマ科動物(例えば、ウマ)および/またはウシ等が本発明のワクチンおよび/または方法によって保護され得る。本発明はさらに、ライム病および他の疾患、例えば他のイヌまたはウマの感染症に対する防御免疫を誘発するための組合せワクチンを提供する。本発明の免疫原性組成物およびワクチンを製造し、使用する方法もまた提供される。
【００１７】
具体的な実施形態では、ベクターは、Borrelia burgdorferi抗原をコードする核酸構築物を含むアルファウイルスRNAレプリコン粒子である。より特定の実施形態では、アルファウイルスRNAレプリコン粒子は、ベネズエラ馬脳炎(VEE)アルファウイルスRNAレプリコン粒子である。さらに具体的な実施形態では、VEEアルファウイルスRNAレプリコン粒子は、TC-83 VEEアルファウイルスRNAレプリコン粒子である。他の実施形態では、アルファウイルスRNAレプリコン粒子は、シンドビス(SIN)RNAレプリコン粒子である。さらに他の実施形態では、アルファウイルスRNAレプリコン粒子は、Semliki Forestウイルス(SFV)アルファウイルスRNAレプリコン粒子である。別の実施形態では、裸のDNA発現ベクターが、Borrelia burgdorferi抗原をコードする核酸構築物を含む。さらに別の実施形態では、裸のDNA発現ベクターは、それ自身がBorrelia burgdorferi抗原をコードするアルファウイルスレプリコン配列を含む。本発明は、合成メッセンジャーRNA、RNAレプリコン、ならびに本発明のアルファウイルスRNAレプリコン粒子の全て、裸のDNAベクター、ならびに核酸構築物(例えば、合成メッセンジャーRNA、RNAレプリコン)、アルファウイルスRNAレプリコン粒子、および/または本発明の裸のDNAベクターを含む免疫原性組成物および/またはワクチンを含む、本発明の核酸構築物の全てを含む。
【００１８】
特定の実施形態において、本発明の核酸構築物は、1つ以上のBorrelia burgdorferi抗原をコードする。そのような1つの実施形態において、Borrelia burgdorferi抗原は、外表面蛋白質A (OspA)またはその抗原断片である。別の実施形態では、Borrelia burgdorferi抗原は、外表面蛋白質C (OspC)またはその抗原断片である。さらに他の態様において、核酸構築物は、2〜4個のBorrelia burgdorferi抗原またはその抗原断片をコードする。この型の特定の実施形態では、核酸構築物は、1以上のOspAまたはその1以上の抗原断片、および1以上のOspCまたはその抗原断片をコードする。特に、核酸構築物は、OspAまたはその抗原断片およびOspCまたはその抗原断片をコードし、ここでOspAまたはその抗原断片は、OspCまたはその抗原断片をコードする核酸配列の上流に位置する核酸配列によってコードされる。別の特定の実施形態では、核酸構築物は、OspCまたはその抗原断片およびOspAまたはその抗原断片をコードし、ここでOspCまたはその抗原断片は、OspAまたはその抗原断片をコードする核酸配列の上流に位置する核酸配列によってコードされる。他の実施形態では、核酸構築物は、2つ以上のBorrelia burgdorferi株に由来する、OspAまたはその抗原断片をコードする。さらに他の実施形態では、核酸構築物は、2つ以上のBorrelia burgdorferi株に由来するOspCまたはその抗原断片をコードする。本発明はさらに、これらの核酸構築物のいずれかを含むアルファウイルスRNAレプリコン粒子を提供する。別の実施形態では、ベクターは、これらの核酸構築物の1つ以上を含む裸のDNAである。
【００１９】
特定の実施形態では、免疫原性組成物は、1つ以上のBorrelia burgdorferi抗原またはその抗原断片をコードする核酸構築物を含むアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む。関連する実施形態において、免疫原性組成物は、2〜4個のBorrelia burgdorferi抗原またはその抗原断片をコードする核酸構築物を含むアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む。
【００２０】
具体的な実施形態では、免疫原性組成物は、本発明の核酸構築物を含むアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む。この型の特定の実施形態では、アルファウイルスRNAレプリコン粒子は、OspAをコードする核酸構築物を含む。関連する実施形態では、アルファウイルスRNAレプリコン粒子は、OspAの抗原断片をコードする核酸構築物を含む。さらに他の実施形態では、アルファウイルスRNAレプリコン粒子は、2つ以上の異なるBorrelia burgdorferi株由来のOspAsまたはその抗原断片をコードする核酸構築物を含む。他の実施形態では、アルファウイルスRNAレプリコン粒子は、OspCをコードする核酸構築物を含む。関連する実施形態では、アルファウイルスRNAレプリコン粒子は、OspCの抗原断片をコードする核酸構築物を含む。さらに他の実施形態では、アルファウイルスRNAレプリコン粒子は、2つ以上の異なるBorrelia burgdorferi株由来のOspCまたはその抗原断片をコードする核酸構築物を含む。
【００２１】
さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、以下のBorrelia burgdorferi抗原:1つ以上の株からのOspA、1つ以上の株からのOspC、および/またはこれらのタンパク質のいずれかの抗原性断片、の2つ以上の組合せをコードする核酸構築物を含むアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む。特定の実施形態では、免疫原性組成物は、全てのベネズエラ馬脳炎(VEE)アルファウイルスRNAレプリコン粒子であるアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む。
【００２２】
関連する実施形態では、免疫原性組成物は、2つ以上の組のアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む。このタイプの特定の実施形態では、1セットのアルファウイルスRNAレプリコン粒子は、第1の核酸構築物（コンストラクト）を含むが、他のセットのアルファウイルスRNAレプリコン粒子は、第2の核酸構築物を含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、第１の核酸構築物を含む1セットのアルファウイルスRNAレプリコン粒子、第２の核酸構築物を含む別のセットのアルファウイルスRNAレプリコン粒子、および第３の核酸構築物を含む第３のセットのアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、第1の核酸構築物を含む1セットのアルファウイルスRNAレプリコン粒子、第2の核酸構築物を含む別のセットのアルファウイルスRNAレプリコン粒子、第３の核酸構築物を含む第３のセットのアルファウイルスRNAレプリコン粒子、および第４の核酸構築物を含む第４のセットのアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、第１の核酸構築物を含むアルファウイルスRNAレプリコン粒子のセット、第２の核酸構築物を含む別のセットのアルファウイルスRNAレプリコン粒子、第３の核酸構築物を含む第３のセットのアルファウイルスRNAレプリコン粒子、第４の核酸構築物を含む第４のセットのアルファウイルスRNAレプリコン粒子、および第５の核酸構築物を含む第５のセットのアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む。このような実施形態では、第１の核酸構築物、第２の核酸構築物、第３の核酸構築物、第４の核酸構築物、および第５の核酸構築物のヌクレオチド配列はすべて異なる。
【００２３】
従って、本発明は、各々が1つ以上のBorrelia burgdorferi抗原を個別にコードする2つ以上のアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む免疫原性組成物を提供する。この型の特定の実施形態では、1つのアルファウイルスRNAレプリコン粒子は、Borrelia burgdorferi外表面蛋白質A (OspA)またはその抗原断片をコードする。特定の実施形態において、1つのアルファウイルスRNAレプリコン粒子は、Borrelia burgdorferi外表面蛋白質C (OspC)またはその抗原断片をコードする。さらに別の実施形態では、1つのアルファウイルスRNAレプリコン粒子は、Borrelia burgdorferi OspAまたはその抗原断片をコードし、第2のアルファウイルスRNAレプリコン粒子は、Borrelia burgdorferi OspCまたはその抗原断片をコードする。関連する実施形態では、免疫原性組成物は、さらに、2つ以上のBorrelia burgdorferi抗原またはその抗原断片をコードする核酸構築物を含むアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む。
【００２４】
特に、本発明は、OspAまたはその抗原断片をそれぞれ個別にコードする第1および第2のアルファウイルスRNAレプリコン粒子、ならびにOspCまたはその抗原断片(二重構築物)を含む免疫原性組成物を提供し、第1のRNAレプリコン粒子は、OspAをコードする核酸配列またはその抗原断片の上流に位置するOspAまたはその抗原断片をコードする核酸配列を含み、第2のRNAレプリコン粒子は、OspCをコードする核酸配列またはOspAをコードする核酸配列またはその抗原断片の上流に位置するその抗原断片を含む。
【００２５】
特定の実施形態では、核酸構築物は、B. burgdorferi株297に由来するOspA、またはその抗原断片をコードする。この型の具体的な実施形態では、OspAは、配列番号:2のアミノ酸配列と95%の同一性以上を含むアミノ酸配列を含み、より具体的な実施形態では、OspAは、配列番号:2のアミノ酸配列を含み、さらに具体的な実施形態では、OspAは、配列番号:1のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２６】
関連する実施形態では、核酸構築物は、B. burgdorferi株50772(ATCC No. PTA-439)に由来するOspC、またはその抗原断片をコードする。この型の具体的な実施形態では、OspCは、配列番号:4のアミノ酸配列と95%の同一性以上を含むアミノ酸配列を含み、より具体的な実施形態では、OspCは、配列番号:4のアミノ酸配列を含む。さらに具体的な実施形態では、OspCは、配列番号:3のヌクレオチド配列によってコードされる。さらに他の実施形態では、核酸構築物は、B. burgdorferi株297に由来するOspAおよびB. burgdorferi株50772に由来するOspCをコードする。
【００２７】
本発明は、本発明の免疫原性組成物を含むワクチンを含み、より具体的にはワクチンは非アジュバントワクチンである。特定の実施形態において、ワクチンは、B. burgdorferiによる疾患の予防を助ける。具体的な実施形態では、B. burgdorferiによる疾患はライム病である。より具体的な実施形態では、ライム病はイヌライム病である。特定の態様において、本発明のワクチンは、イヌライム病に対する6〜8週齢の健康なイヌのワクチン接種に有効である。この型の具体的な実施形態では、本発明のワクチンは、イヌライム病に対する7週齢の健康なイヌのワクチン接種に有効である。特定の実施形態では、抗体は、イヌがワクチンで免疫されるときに、イヌにおいて誘導される。特定の実施形態では、抗体はオプソニン化IgGである。他の実施形態では、誘導される抗体はボレリア殺傷性である。さらに他の実施形態では、オプソニン化IgGおよびボレリア殺菌抗体の両方が誘導される。より具体的な実施形態では、誘導されるOspA抗体はボレリア殺傷性およびオプソニン化IgGであり、誘導されるOspC抗体はボレリア殺傷性およびオプソニン化IgGである。
【００２８】
特定の実施形態において、本発明のワクチンは、非ボレリア病原体に対する防御免疫を誘発するための少なくとも1つの非ボレリア免疫原をさらに含む。特定の態様において、本発明のワクチンは、非ボレリア病原体に対する防御免疫を誘発するための非ボレリア免疫原由来の少なくとも1つのタンパク質抗原をコードするアルファウイルスRNAレプリコン粒子をさらに含む。特定の実施形態において、非ボレリア免疫原は、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌコロナウイルス、イヌインフルエンザウイルス、レプトスピラ血清型、リーシュマニア生物、Bordetella bronchiseptica、マイコプラズマ種、狂犬病ウイルス、Ehrlichia canis、Anaplasma生物、および/またはこれらの組合せなどの非ボレリア病原体由来である。
【００２９】
特定の実施形態において、Leptospira血清型由来の非ボレリア免疫原は、Leptospira kirschneri血清型grippotyphosaである。他の実施形態では、Leptospira serovar由来の免疫原は、Leptospira interrogans serovar canicolaである。さらに他の実施形態では、Leptospira血液型由来の免疫原は、Leptospira interrogans血液型icterohaemorrhagiaeである。さらに他の実施形態では、Leptospira serovar由来の免疫原は、Leptospira interrogans serovar pomonaである。さらに他の実施形態では、ワクチンは、複数のLeptospira血清型由来の免疫原を含む。特定の実施形態において、Mycoplasma種由来の非ボレリア免疫原は、Mycoplasma cynosである。
【００３０】
本発明はさらに、本発明のワクチンの免疫学的に有効な量を哺乳動物に投与することを含む病原性ボレリア遺伝子種に対して哺乳動物を免疫する方法を提供する。特定の実施形態では、ワクチンは皮下注射によって投与される。代替の実施形態では、ワクチンは筋肉内注射によって投与される。他の実施形態では、ワクチンは静脈内注射によって投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンは皮内注射によって投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンは経口投与によって投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンは鼻腔内投与によって投与される。具体的な実施形態では、哺乳動物はイヌである。他の実施形態では、哺乳動物はウマ科動物(例えば、ウマ)である。
【００３１】
本発明のワクチンは、プライマーワクチンとして、および/またはブースター（追加）ワクチンとして投与することができる。特定の実施形態では、プライマーワクチンおよびブースターワクチンの両方の投与の場合、プライマーワクチンおよびブースターワクチンを同一の経路で投与することができる。この型の特定の実施形態では、プライマーワクチンおよびブースターワクチンは、いずれも皮下注射によって投与される。代替の実施形態では、プライマーワクチンおよびブースターワクチンの両方の投与の場合、プライマーワクチンの投与は1つの経路により、ブースターワクチンは別の経路により行うことができる。この型の特定の実施形態では、プライマーワクチンは皮下注射により投与することができ、ブースターワクチンは経口投与することができる。
【００３２】
本発明のワクチン組成物は、病原性ボレリア遺伝子種由来の1つ以上の追加株(第2の株として本明細書中で集合的に標識され得る)からの免疫学的に有効な量の不活化された細菌をさらに含むことができる。特定の実施形態において、第2の株は、OspAおよびOspB抗原を示す。適当な第２の株の例としては、以下のものが挙げられる: B. burgdorferi ss S-1-10(ATCC No. PTA-1680)、B. burgdorferi ss B-31(ATCC No. 35210)、B. afzelii(例えば、ATCC No. 51383および51991として入手可能)、B. burgdorferi ss DK7、B. burgdorferi ss ZS7、B. burgdorferi ss IP1、IP2、B. burgdorferi ss HII、B. burgdorferi ss P1F、B. burgdorferi ss Mil、B. burgdorferi ss 20006、B. burgdorferi ss ESP1、B. burgdorferi ss Ne-56、B. burgdorferi ss ia、および/またはこれらの任意の組合せ。
【００３３】
本発明はさらに、病原性ボレリア種.、具体的にはB. burgdorferi ssに対して哺乳動物を免疫する方法であって、上記の本発明のワクチンの免疫学的に有効な量を哺乳動物に注射することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、ワクチンは、例えば、約1×104から約1×1010のRP以上を含むことができる。より特定の実施形態では、ワクチンは、約1×105から約1×109CRPまでを含むことができる。さらに特定の実施形態では、ワクチンは、約1×106から約1×108のRPを含むことができる。特定の実施形態において、ワクチン接種後、免疫化哺乳動物はボレリア殺菌抗体を産生する。特定の実施形態では、哺乳動物はイヌである。他の実施形態では、哺乳動物はウマ科動物(例えば、ウマ)である。
【００３４】
特定の実施形態では、本発明のワクチンは、0.05mL〜3mLの用量で投与される。より特定の実施形態では、投与される用量は0.1mL〜2mLである。さらに特定の実施形態では、投与される用量は0.2mL〜1.5mLである。さらに特定の実施形態では、投与される用量は0.3〜1.0mLである。さらに特定の実施形態では、投与される用量は0.4mL〜0.8mLである。
【００３５】
本発明はさらに、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌコロナウイルス、イヌインフルエンザウイルス、および/またはレプトスピラ血清型、例えば、Leptospira kirschneri serovar grippotyphosa、Leptospira interrogans serovar canicola、Leptospira interrogans serovar haemorhagiae、および/またはLeptospira interrogans serovar pomonaに対する免疫を誘発するための免疫原を含む、他のイヌ病原体からの1以上の免疫原をコードするベクター(例えば、アルファウイルスRNAレプリコン粒子)を提供する。本発明の組合せワクチンに加えることができる追加のイヌ病原体には、リーシュマニア・メジャーおよびリーシュマニア・インファンタムなどのリーシュマニア生物、Bordetella bronchiseptica、マイコプラズマ種(例えば、マイコプラズマ・サイノス)、狂犬病ウイルス、アナプラズマ種、例えば、Anaplasma phagocytophilumおよびAnaplasma platys;ならびにEhrlichia canisが含まれる。特定の実施形態では、本発明のワクチンは、1以上のそのような免疫原からの少なくとも1以上の抗原をコードするアルファウイルスRNAレプリコン粒子をさらに含む。
【００３６】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明を参照することにより、より良く理解されるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明は、免疫学的有効量のBorrelia burgdorferi外表面タンパク質A (OspA)またはその抗原性断片およびBorrelia burgdorferi外表面タンパク質C (OspC)またはその抗原性断片をコードする免疫学的有効量のアルファRNAレプリコン粒子、免疫学的有効量の２以上のベクターと免疫学的有効量のBorrelia burgdorferi外表面タンパク質A (OspA)またはその抗原性断片をコードする少なくとも１つのアルファRNAレプリコン粒子およびBorrelia burgdorferi外表面タンパク質C (OspC)またはその抗原性断片をコードする少なくとも１つの他のアルファRNAレプリコン粒子またはBorrelia burgdorferi外表面タンパク質A (OspA)またはその抗原性断片およびBorrelia burgdorferi外表面タンパク質B (OspB)またはその抗原性断片をコードするアルファウイルスRNAレプリコン粒子とBorrelia burgdorferi外表面タンパク質A (OspA)またはその抗原性断片をコードする少なくとも１つのアルファRNAレプリコン粒子およびBorrelia burgdorferi外表面タンパク質C (OspC)またはその抗原性断片をコードするアルファウイルスRNAレプリコン粒子の組み合わせを含む免疫学的有効量のアルファウイルスRNAレプリコン粒子および/またはワクチンを含む免疫原性組成物および/またはワクチンを提供する。このような免疫原性組成物の全てを、哺乳動物ワクチンに使用することができる。本発明の一態様では、ワクチンは、ライム病に対するワクチン接種された被験体(例えば、哺乳動物)の保護を助ける。この型の特定の実施形態では、ワクチン接種対象はイヌである。したがって、本発明は、(i)バクテリンから無関係の抗原によるワクチン接種を排除することによって有害な副作用の可能性を有意に減少させること、および(ii)依然として包括的な保護を提供することによって、イヌライム病を予防するためのワクチン接種の信頼性を改善する新しい免疫学的組成物を提供する。本発明のライム病ワクチン製剤はまた、効果的な既往記憶反応を誘導することによって、「有効性の窓」を有意に延長すべきである。
【００３８】
本発明をより十分に理解するために、以下の定義を提供する。
【００３９】
記述の便宜上、単数語を使用することは、決してそのように制限されることを意図したものではない。したがって、例えば、「ポリペプチド」を含む組成物への言及は、そのようなポリペプチドの1つ以上への言及を含み、さらに、「微生物」への言及は、特に指定されない限り、複数のそのような微生物への言及を含む。
【００４０】
本明細書中で使用される「およそ」という用語は、「約」という用語と同義に使用され、数値が表示値の50%以内であることを意味する。すなわち、1ミリリットルあたり「およそ」1×108のアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む構成物は、1ミリリットルあたり5×107から1.5×108のアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む。
【００４１】
本明細書中で使用される用語「イヌ」は、特に指定のない限り、全ての家畜イヌ、Canis lupus familiarisまたはCanis familiarisを含む。
【００４２】
用語「遺伝子種」は、まずG. Barantonら、1992, International J. of Systematic Bacteriology 42: 378-383によって使用され定義され、ここでは「種」という用語が非ボレリア生物の分類学を記述する際に用いられるのと同じ方法で用いられる。
【００４３】
用語「非ボレリア」は、生物、病原体、および/または抗原(または免疫原)などの用語を修飾するために使用され、それぞれの生物、病原体、および/または抗原(または免疫原)がボレリア病原体ではなく、ボレリア抗原(または免疫原)ではないこと、および/またはボレリア以外のタンパク質抗原(または免疫原)がボレリア生物に由来しないことを意味する。
【００４４】
用語「由来」、「由来する」および「由来している」は、所定のタンパク質抗原およびそれを自然にコードする病原体またはその病原体の株に関して互換的に使用され、本明細書中で使用されるように、所与のタンパク質抗原の未修飾および/または切断されたアミノ酸配列は、その病原体またはその病原体の株によってコードされることを意味する。病原体に由来するタンパク質抗原に対する本発明の核酸構築物内のコード配列は、それが由来する病原体または病原体株(天然に弱毒化された株を含む)におけるそのタンパク質抗原の対応する配列に対して、発現されたタンパク質抗原のアミノ酸配列の修飾および/または切断をもたらすように、遺伝的に操作されていてもよい。
【００４５】
ボレリアの遺伝種を培養するための「スタンダードな増殖条件」は、BSK (バーボール・ストーンナー・ケリー)培地において、約33oCから約35oCの範囲の温度での増殖を必要とする。本明細書に記載のBSK培地は、Callisterら[Detection of Borreliacidal Antibodies by Flow Cytometry, Sections 11.5.1 - 11.5.12, Current Protocols in Cytometry, John Wiley and Sons, Inc. Supplement 26, (2003)(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)]に従って調製した。(BSK培地は、例えば、Sigma, St. Louis, MOから市販もされている)。
【００４６】
本明細書中で使用される「OspC7」は、Callisterら[U.S.6,210,676 B1およびU.S.6,464,985 B1.]によって開示されているように、既知の病原性ボレリア種の中で保存されているOspCのC末端50アミノ酸内の7アミノ酸領域[Lovrichら、Clin. Diagn. Lab. Immunol.、12:746-751,(2005)]に位置する免疫優性OspCボレリア殺菌抗体エピトープである。この保存性は、Lovrichら[Clin. Diagn. Lab. Immunol.、12:746-751,(2005)]によって記載されている7アミノ酸セグメントをコードするコドンセグメントのBLAST検索によって、容易に確認された。このような検索を2006年10月9日に実施したところ、上記のOspC 7-merエピトープコードセグメントを含む100のボレリア種の結果リストが生成された。特定の実施形態では、アルファウイルスRNAレプリコン粒子は、OspC7を含むOsp Cの抗原断片をコードする。
【００４７】
本明細書中で使用される用語「防御」または「防御免疫を提供する」または「防御免疫を誘発する」および「防御の補助」は、感染のいずれかの徴候からの完全な防御を必要としない。例えば、「防御の補助」は、攻撃後、基礎となる感染の症状が少なくとも軽減される、および/または症状を引き起こす基礎となる細胞性、生理学的、または生化学的な原因または機序の1つ以上が軽減および/または除去されるような、防御が十分であることを意味することができ、この文脈で使用される「軽減」は、単に感染の生理学的状態ではなく、感染の分子状態を含む感染状態との関連を意味すると理解される。
【００４８】
本明細書で使用する「ワクチン」は、動物、例えばイヌ、ネコ、またはウマ(特定の実施形態では、ヒトを含むが、他の実施形態では、ヒトに特異的ではない)への適用に適した組成物であり、典型的には、水を含む液体のような薬学的に許容可能な担体と組み合わせた1以上の抗原を含み、その動物への投与は、野生型微生物による感染から生じる疾患からの防御を最小限に補助するのに十分に強い免疫応答を誘導し、すなわち、疾患の予防を補助し、および/または疾患を予防し、改善し、または治癒させるのに十分に強い免疫応答を誘導する。
【００４９】
本明細書中で使用されるように、多価ワクチンは、2つ以上の異なる抗原を含むワクチンである。この型の特定の実施形態では、多価ワクチンは、2つ以上の異なる病原体に対してレシピエントの免疫系を刺激する。
【００５０】
本明細書中で使用される用語「レプリコン」は、それらが存在する場合、細胞培養物または動物宿主における親ウイルスの増殖を成功させるであろう1つ以上の要素(例えば、構造タンパク質のコード配列)を欠く修飾されたRNAウイルスゲノムを指す。適当な細胞状況において、レプリコンはそれ自身を増幅し、1以上のサブゲノムRNA種を産生し得る。
【００５１】
本明細書中で使用される用語「アルファウイルスRNAレプリコン粒子」、略して「RP」は、構造タンパク質、例えばカプシドおよび糖タンパク質にパッケージされたアルファウイルス由来RNAレプリコンであり、これらもまた、例えばPushkoら[Virology 239(2):389-401(1997)]によって記載されているように、アルファウイルスに由来する。レプリコンはアルファウイルスの構造成分(カプシドや糖タンパク質など)をコードしていないため、RPは細胞培養や動物宿主(ヘルパープラスミドや類似成分を含まない)では増殖できない。OspAおよび/またはOspC、またはその抗原断片をコードするRNA RPにおける異種核酸配列は、アルファウイルスサブゲノム(sg)プロモーター、特に26S sgプロモーター、好ましくはVEEV 26S sgプロモーターの転写制御下にある。
【００５２】
OspAおよびOspCコード配列の二重RP構築物の場合、構築物中のコード配列の各々は、別々のサブゲノムプロモーターの転写制御下にあり得る。このような二重構造（デュアルコンストラクト）では、上流のコード配列は5'プロモーター位置に対応し、下流のコード配列は3'プロモーター位置に対応する(ポジティブセンスRNA;図1および図2)。好ましくは、上流および下流のコード配列は隣接している。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、修飾された名義語が医薬品中での使用に適切であることを意味するために、形容的に使用される。例えば、医薬品ワクチン中の賦形剤を記載するために使用する場合、それは、組成物の他の成分と適合し、意図されたレシピエント動物、例えばイヌに対して不利に有害ではないとして、賦形剤を特徴付ける。
【００５４】
「非経口投与」には、皮下注射、粘膜下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射、および注入が含まれる。
【００５５】
本明細書で使用される、特定のタンパク質(例えば、タンパク質抗原)に関する用語「抗原断片」は、抗原性である、すなわち、免疫グロブリン(抗体)またはT細胞抗原レセプターのような免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用することができる、そのタンパク質の断片(完全長タンパク質からの１アミノ酸が欠けている程度の大きな断片を含む)である。たとえば、外表面タンパク質A (OspA)の抗原断片は、抗原性をもつOspAタンパク質の断片である。好適には、本発明の抗原断片は、抗体および/またはT細胞レセプター認識に対して免疫優性である。特定の態様において、所与のタンパク質抗原に関する抗原断片は、完全長タンパク質の抗原性の少なくとも25%を保持するそのタンパク質の断片である。好ましい態様において、抗原性断片は、全長タンパク質の抗原性の少なくとも50%を保持する。より好ましい態様において、それは、全長タンパク質の抗原性の少なくとも75%を保持する。抗原断片は、7〜20アミノ酸程度の小さなもの(前述参照)もあれば、もう一方の極端なものでは、完全長タンパク質から1アミノ酸程度欠けているような大きな断片であってもよい。特定の態様において、抗原フラグメントは、25〜150アミノ酸残基を含む。他の態様において、抗原フラグメントは、50〜250アミノ酸残基を含む。
【００５６】
「OspC特異的ボレリア殺菌抗体」は、例えばB. burgdorferi ss 50772(ATCC No. PTA-439)をワクチン接種した動物の血清中に見出されるものであり、OspC抗原のいずれかのエピトープに選択的に結合し、スピロヘータを補体依存性又は非依存性に殺傷するものである。「OspC7特異的ボレリア殺菌抗体」は、例えばB. burgdorferi ss 50772(ATCC No. PTA-439)をワクチン接種した動物の血清中に見出されるものであり、Lovrichら[Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12:746-751, (2005)]に記載されているようにOspCの7つのC末端アミノ酸に選択的に結合し、スピロヘータを殺傷するものである。OspCボレリア殺菌抗体の特異性は十分に確立されている。例えば、OspCボレリア殺菌抗体は、ボレリア殺菌抗体検査でB. burgdorferi ss 50772の感受性を測定することにより、ライム病血清中に一般的に検出される。密接に関連した疾患を有するヒト患者由来の血清には、50772株も殺傷する交差反応性抗体が含まれることはごくまれである(2%)[Callister, et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 3(4): 399-4021(1996)によって詳細に記載されている]。さらに、OspC7ボレリア殺菌エピトープを用いるペプチドELISAは、ライム病血清中のボレリア殺菌抗体を正確に捕捉し、他の密接に関連する疾患を有する患者由来の血清は、OspC7ペプチドにも結合する交差反応性抗体を含むことはごくまれである(<2%)。
【００５７】
ワクチンによって誘導された血清中のOspC特異的ボレリア殺菌抗体の「かなりの割合」が、保存されたエピトープOspC7に特異的である場合、それは、OspC7によるその血清の吸収に続いて、血清中のOspC特異的ボレリア殺菌抗体の測定可能な減少が存在することを意味する。B. burgdorferi ss 50772を用いることにより検出される血清のボレリア殺菌抗体価の少なくとも2倍の低下、およびより好ましくはOspC7によるその血清の吸収に続く血清のボレリア殺菌抗体価の2〜4倍またはそれ以上の低下と定義されることが望ましい。
【００５８】
「補体特異的反応」とは、ボレリア属細菌がボレリア殺菌抗体によって殺菌されるために、血清補体が存在することを必要とする抗体反応である。
【００５９】
本明細書中で使用される「不活化」微生物という用語は、「死滅」微生物という用語と同義に使用され、本発明の目的のために、「不活化」Borrelia burgdorferi ss微生物は、動物において免疫応答を誘発することができるが、動物に感染することができない生物である。Borrelia burgdorferi ss分離株は、二元エチレンイミン、ホルマリン、β-プロピオラクトン、チメロサール、または熱からなる群から選択される薬剤によって不活化され得る。特定の実施形態では、Borrelia burgdorferi ss分離株は、二成分エチレンイミンによって不活化される。
【００６０】
本明細書中で使用される「非アジュバントワクチン」は、アジュバントを含まないワクチンまたは多価ワクチンである。
【００６１】
米国6,210,676に記載されているB. burgdorferi ss 50772(ATCC No. PTA-439)及び米国6,316,005に記載されているB. burgdorferi ss S-1-10(ATCC No. PTA-1680)は、それぞれ1999年7月30日及び2000年4月11日にAmerican Type Culture Collection,10801 University Boulevard Manassas (VA)20110に寄託された。
【００６２】
本明細書中で使用される際、両配列のアミノ酸残基が同一である場合、1つのアミノ酸配列は、第2のアミノ酸配列に対して100%「同一」であるか、または100%の「同一」を有しする。したがって、2つのアミノ酸配列のアミノ酸残基の50%が同一である場合、一方のアミノ酸配列は、第2のアミノ酸配列に対して50%の「同一」である。配列比較は、所与のタンパク質、例えばタンパク質、または比較されるポリペプチドの一部によって構成されるアミノ酸残基の連続したブロックにわたって実施される。特定の実施形態では、2つのアミノ酸配列間の対応を他の方法で変化させることができる選択された欠失または挿入が考慮される。
【００６３】
本明細書中で使用されるように、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列パーセントの同一性は、C、MacVector (MacVector, Inc. Cary, NC 27519)、ベクターNTI (Informax, Inc. MD)、Oxford Molecular Group PLC (1996)およびアラインメントの初期パラメータを有するClustal Wアルゴリズム、ならびに同一性のための初期パラメータを用いて決定することができる。これらの市販のプログラムはまた、同一または類似の初期パラメータを用いて配列類似性を決定するために使用することができる。または、例えば、GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin)パイループプログラムを用いて、初期設定のフィルタ条件下でのAdvanced Blast検索を使用することもできる。
【００６４】
また、本発明は、本明細書に開示される特定の構成、プロセス工程、および材料、例えば構成、プロセス工程、および材料に限定されるものではないことも理解されるべきである。また、本発明の範囲は、添付の請求項およびその等価物によってのみ限定されることになるので、本明細書で採用される用語は、特定の実施形態を記述する目的のためにのみ使用され、限定することを意図したものではないことも理解されるべきである。
【００６５】
選択的OspA株
【００６６】
OspA抗原を提供する株は、B. burgdorferi ss B-31(ATCC No. 35210)のような従来の病原性実験室B. burgdorferi ss分離株[Barbourら、J. Clin. Microbiol. 52:478-484(1985)]であり得る。特定の第２の生物は、例示されたB. burgdorferi ss S-1-10株(ATCC No. PTA-1680)である。北米以外の地域に最適化されたワクチン組成物の第2の生物として使用するのに適した追加の菌株には、例えば、菌株: B. burgdorferi ss B-31(ATCC No. 35210)、B. afzelii(例えば、ATCC No. 51567として入手可能)およびB. garinii(例えば、ATCC No. 51383および51991として入手可能)、ならびに以下の表1に列挙されたものが含まれる。
【００６７】
2021505560.tif 000002
【００６８】
ワクチン組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、経口、鼻腔内、皮内、および/または腹腔内ワクチン接種を含む任意の標準経路によって容易に投与される。当業者は、ワクチン組成物が、レシピエント動物の種類および投与経路ごとに適切に製剤化されることが望ましいことを認識するであろう。
【００６９】
したがって、本発明はまた、イヌをB. burgdorferi ssおよび他のボレリア種に対して免疫する方法を提供し、そのような方法の1つは、イヌが適切なOspAおよび/またはOspCを産生するように、免疫学的に有効な量の本発明のワクチンをイヌに注射することを含む。特定の実施形態では、抗体はボレリア殺菌抗体である。
【実施例】
【００７０】
実施例
【００７１】
以下の実施例は、本発明のさらなる評価を提供するのに役立つが、本発明の有効な範囲を制限することを意図するものではない。
【００７２】
実施例１
アルファウイルスRNAレプリコン粒子によって送達されるOspAおよびOspCワクチンの構築
【００７３】
RNAウイルスは、そのゲノムに遺伝子操作されたワクチン抗原を導入するためのベクター-ビヒクルとして用いられてきた。しかしながら、現在までのそれらの使用は、主にRNAウイルスにウイルス抗原を取り込み、次いでレシピエント宿主にウイルスを導入することに限定されてきた。その結果、取り込まれたウイルス抗原に対する防御抗体が誘導される。例えば、アルファウイルスレプリコンベクターは、ボツリヌス菌神経毒HC又は炭疽菌防御抗原のそれぞれの発現を介して、マウスをボツリヌス神経毒及び炭疽から防御するために使用されている[Leeら、Vaccine 24(47-48) 6886-6892(2006)]。アルファウイルスRNAレプリコン粒子は、病原性抗原をコードするために使用されている。このようなアルファウイルスレプリコンプラットフォームは、ベネズエラ馬脳炎ウイルス(VEE) [Pushkoら、Virology 239:389-401(1997)]、Sindbis (SIN) [Bredenbeekら、Journal of Virology 67:6439-6446(1993)、その内容が本明細書に全体に組み込まれている]、およびSemliki Forestウイルス(SFV) [Liljestrom and Garoff, Biotechnology (NY) 9:13561361(1991)］を含むいくつかの異なるアルファウイルスから開発されている。これらの内容は本明細書に全体に組み込まれている。さらに、アルファウイルスRNAレプリコン粒子は、いくつかのUSDAが認可した豚および家禽用ワクチンの基礎となっている。これらには、豚流行性下痢ワクチン、RNA粒子(製品コード19U5.P1)、豚インフルエンザワクチン、RNA (製品コード19A5.D0)、鳥インフルエンザワクチン、RNA (製品コード19O5.D0)、および処方箋製品、RNA粒子(製品コード9PP0.00)が含まれる。以下に開示するように、アルファウイルスRNAレプリコンベクター系がイヌに対してOspA、OspC、およびDbpAに特異的な殺ボレリア抗体を産生する能力を誘導することが検討されている。
【００７４】
OspAまたはOspCのコード配列のアルファウイルスレプリコンへの組み込み
【００７５】
OspA (297株)およびOspC (50772株)のアミノ酸配列を用いて、コドン最適化(Canis lupusコドン使用)ヌクレオチド配列をin silicoで作製した。最適化された配列は市販のベンダー(ATUM、Newark、CA)により合成DNAとして調製された。
【００７６】
OspAまたはOspCを発現するようにデザインされたVEEレプリコンベクターを、前述のように構築し[U.S.9,441,247 B2を参照のこと;その内容は参照により本明細書に組み込まれる]、以下の修飾を加えた。TC-83由来レプリコンベクター「pVEK」[米国9,441,247 B2に開示および記載]を制限酵素AscIおよびPacIで消化した。
【００７７】
5'フランキング配列(5'‐GGCGCGCCGCACC‐3') [配列番号:5]および3'フランキング配列(5'‐TTAATTAA‐3')を有するOspAまたはOspCのコドン最適化オープンリーディングフレーム配列を含むDNAプラスミドを、制限酵素AscIおよびPacIで同様に消化した。次に、合成遺伝子カセットを消化pVEKベクターに連結し、得られたクローンを「pVHV-OspA」および「pVHV-OspC」と再命名した。
【００７８】
TC-83 RNAレプリコン粒子(RP)の製造は、前述の方法[U.S. 9,441,247 B2およびU.S. 8,460,913 B2;その内容を本明細書に参考として取り入れる]に従って行った。簡潔に言えば、pVHVレプリコンDNA及びヘルパーDNA遺伝子をメガスクリットT7 RNAポリマーとキャップアナログ(プロメガ、マディソン、WI)を用いたインビトロ転写前のノートI制限因子に直線化した。重要なことに、製造に使用されるヘルパーRNAは、前述したように、VEEサブゲノムプロモーター配列を欠いている[Kamrudら、J Gen Virol. 91(Pt 7):1723-1727(2010)]。レプリコン成分とヘルパー成分の精製RNAを組み合わせ、ベロ細胞の懸濁液と混合し、4mmキュベットで電気穿孔し、OptiPro SFMOBの名称で販売されているワルタムMAのサーモフィッシャーから得た無血清細胞培養培地に戻した。一晩培養後、ZetaPlus BioCap深度フィルター(3M、Maplewood、MN)を通して懸濁液を通過させ、5%スクロースを含むリン酸緩衝生理食塩水(w/v)で洗浄し、最後に保持したRPを400mM NaCl緩衝液で溶出することにより、アルファウイルスRNAレプリコン粒子を細胞および培地から精製した。溶出RPを最終的な5%スクロース(w/v)に処方し、0.22ミクロンのメンブランフィルターを通過させ、保存のためにアリコートに分注した。機能的RPの力価は、感染Vero細胞単層上の免疫蛍光アッセイにより測定した。RPのバッチは、パッケージングされたレプリコン: RP‐OspAまたはRP‐OspCによってコードされる遺伝子に従って同定された。
【００７９】
実施例2
【００８０】
RP-OspA構築物を有するワクチン
【００８１】
材料および方法
【００８２】
構築物：外表面蛋白質Aの免疫原性エピトープを含む抗原をコードするヌクレオチド配列を用いて、上記のようにRP-OspA構築物を作製した。
【００８３】
動物：5か月齢のビーグル(Marshall Bioresources)を飼育ドッグランで共同飼育し、餌と水を自由摂取させた。
【００８４】
RP-OspAワクチンの調製：OspA RNAをヘルパーRNAとともにVero細胞にエレクトロポレーションした。OspAはRP‐OspAを生成する共エレクトロポレーション過程に続いてRPにパッケージングされた。次に、RP-OspAを安定剤(スクロース、N-Zアミン、ゼラチン)、0.9%生理食塩水、アムホテリシンB、およびゲンタマイシンと混合し、1.0mLの投与量が1.0 x 108レプリコン粒子/mLの標的を含むようにした。その後、ワクチンを凍結乾燥した。
【００８５】
ワクチン接種および血清の採取：イヌにRP-OspAワクチン1mL用量を頸部皮下接種し、21日後にさらに1mL用量で追加接種した。試験7日目、14日目、20日目、29日目、35日目、42日目に頸静脈穿刺により全血を採取した。遠心分離により血清を分離し、試験まで-10-Cまたはより寒冷で保存した。
【００８６】
OspAボレリア殺菌抗体の検出：フローサイトメトリー法およびB. burgdorferi ss S-1-10を用いてOspAボレリア殺菌抗体を検出した[Callisterら、Arch. Intern. Med. 154:1625-1632(1994)]。
【００８７】
OspA IgG抗体の検出:：OspA IgGオプソニン化抗体をELISAで検出した。
【００８８】
結果
【００８９】
RP-OspAワクチンによるワクチン接種は、高いレベルのIgG抗体を確実に誘導し、抗体反応は、追加ワクチン接種後2週間でかなりの量のボレリア殺菌性OspA抗体を含んだ。
【００９０】
2021505560.tif 000003
【００９１】
上記の表2の結果は、RP-OspAを含むワクチンが有意なレベルのOspAボレリア殺菌抗体を誘導する能力を有することを示す。
【００９２】
実施例3
【００９３】
RP-OspC構築物を有するワクチン
【００９４】
材料および方法
【００９５】
構築物:外表面蛋白質Cの免疫原性エピトープを含む抗原をコードするヌクレオチド配列を用いて、上記のようにRP-OspC構築物を作製した。
【００９６】
動物：5か月齢のビーグル(Marshall Bioresources)を飼育ドッグランで共同飼育し、餌と水を自由摂取させた。
【００９７】
RP-OspCワクチンの調製:OspC RNAをヘルパーRNAとともにVero細胞にエレクトロポレーションした。OspCはRP‐OspCを生成する共エレクトロポレーションプロセスに続いてRPにパッケージングされた。次に、RP-OspCを安定剤(スクロース、N-Zアミン、ゼラチン)、0.9%生理食塩水、アムホテリシンB、およびゲンタマイシンと混合し、1.0mLの投与量が1.0 x 108レプリコン粒子/mLの標的を含むようにした。その後、ワクチンを凍結乾燥した。
【００９８】
ワクチン接種および血清の採取：イヌにRP-OspCワクチン1mL用量を頸部皮下接種し、21日後にさらに1mL用量で追加接種した。試験7日目、14日目、20日目、29日目、35日目、42日目に頸静脈穿刺により全血を採取した。遠心分離により血清を分離し、試験まで-10-Cまたはより寒冷で保存した。
【００９９】
OspCボレリア殺菌抗体の検出：フローサイトメトリー法およびB. burgdorferi ss 50772[Callisterら、Arch. Intern. Med. 154:1625-1632(1994)]を用いてOspCボレリア殺菌抗体を検出した。
【０１００】
OspC IgG抗体の検出:：OspC IgG抗体をELISAで検出した。
【０１０１】
結果
【０１０２】
RP-OspCワクチンによるワクチン接種は、高いレベルのIgG抗体を確実に誘導し、抗体反応は、追加ワクチン接種後2週間でかなりの量のボレリア殺菌性OspC抗体を含んだ。
【０１０３】
2021505560.tif 000004
【０１０４】
結果は、RP-OspCを含むワクチンが、有意なレベルのOspCボレリア殺菌抗体を誘導する能力を有することを示す。
【０１０５】
実施例4
【０１０６】
RP-OspAおよびRP-OspCとの併用ワクチン
【０１０７】
材料および方法
【０１０８】
構築物：上記のようにRP-OspAおよびRP-OspC構築物を作製した。
【０１０９】
動物：5か月齢のビーグル(Marshall Bioresources)を飼育イヌランで共同飼育し、餌と水を自由摂取させた。
【０１１０】
RP-OspAおよびRP-OspC併用ワクチンの調製：RP-OspAおよびRP-OspC抗原を、安定剤(ショ糖、N-Zアミン、ゼラチン)、0.9%生理食塩水、アンホテリシンB、およびゲンタマイシンとブレンドし、1.0mL投与量がそれぞれの構築物の1.0×108レプリコン粒子/mLの標的を含むようにした。その後、ワクチンを凍結乾燥した。
【０１１１】
ワクチン接種及び血清の採取：イヌに本配合ワクチン1mLを頸部皮下接種し、21日後に1mLを追加接種した。試験7日目、14日目、20日目、29日目、35日目、42日目に頸静脈穿刺により全血を採取した。遠心分離により血清を分離し、試験まで-10-Cまたはより寒冷で保存した。
【０１１２】
ボレリア殺菌抗体の検出：フローサイトメトリー法およびB. burgdorferi ss S-1-10またはB. burgdorferi ss 50772をそれぞれ用いて、OspAおよびOspCボレリア殺菌抗体を検出した[Callisterら、Arch. Intern. Med. 154:1625-1632(1994)]。
【０１１３】
IgG抗体の検出:：OspAおよびOspC抗体をELISAにより検出した。
【０１１４】
結果
【０１１５】
混合ワクチンによるワクチン接種は、ブースターワクチン接種後2週間で高レベルのIgGおよび殺ボレリア性OspAおよびOspC抗体を確実に誘導した。
【０１１６】
結果は、RP-OspAおよびRP-OspCを含む組合せワクチンが、高レベルのOspAおよびOspCボレリア殺菌抗体を誘導し、高レベルのRP-OspCオプソニン化IgG抗体を誘導する能力を有することを示す。
【０１１７】
実施例5
【０１１８】
RP-OspAおよびRP-OspCとの併用ワクチン
【０１１９】
構築物：上記のようにRP-OspAおよびRP-OspC構築物を作製した。
【０１２０】
動物：3か月齢のビーグル犬(Ridglan Farms)をドッグランで共同飼育し、餌と水を自由摂取させた。
【０１２１】
RP-OspAおよびRP-OspC配合ワクチンの調製：治療グループAは、株S-1-10および株50772のBEI不活性菌の組合せを受けた(5%のEmulsigenアジュバン液-MVPラボラトリーズInc.、米国オマハ社と混合)。RP-OspAおよびRP-OspC抗原を、安定剤(スクロース、N-Zアミン、ゼラチン)、0.9%生理食塩水、アムホテリシンB、およびゲンタマイシンと混合し、その結果、1.0mL用量が、各構築物の5.0 x 107(治療群B)、5.0 x 106(治療群C)、または5.0 x 105(治療群D)レプリコン粒子/mLのいずれかの標的を含むようにした。ワクチンは凍結乾燥した。
【０１２２】
ワクチン接種・注射部位反応：イヌに本配合ワクチン1mLを頸部皮下接種し、その21日後に1mLを追加接種した。
【０１２３】
イヌについては、初回接種後3日目及び4日目、並びに2回目接種後24日目及び25日目に、反応が感じられなくなるまで注射部位反応をモニタリングした(表4)。注射部位反応は、種類と大きさに基づいて評価した。反応は可視、肥厚、軟、硬、圧痛としてスコア化し、反応サイズはS1 = < 1.0cm、S2 = 1.0 - 2.0cm、またはS3 = > 2.0cmとスコア化した。
【０１２４】
結果
【０１２５】
2021505560.tif 000005
【０１２６】
実施例6
【０１２７】
デュアルインサートRP-OspA/C構築物との併用ワクチン
【０１２８】
材料および方法
【０１２９】
OspAとOspCのコード配列のアルファウイルスレプリコンへの組み込み:
【０１３０】
AscI及びPacI消化TC-83由来レプリコンベクター「pVEK」を実施例1に記載したように調製した。5'フランキング配列(5'‐GGCGCGCCGCACC‐3') [SEQ ID NO: 5]および3'フランキング配列(5'‐TTAATTAA‐3')を有するOspAおよびOspCの両方のコドン最適化オープンリーディングフレーム配列を含む2つのDNAプラスミドを、制限酵素AscIおよびPacIで同様に消化した。合成遺伝子カセットのデザインは、オープンリーディングフレーム配列(OspAまたはOspC)の1つ、アルファウイルスサブゲノムプロモーターおよびフランキング配列を含む非コード配列、次いで他の所望のオープンリーディングフレーム(OspAまたはOspC)を組み込む。アルファウイルスサブゲノムプロモーターおよび隣接配列は、5'GAACTGAACTGAACTGATGCTGAACTGAACTGCTGATGAACTAGCTGGAACTAGCTGTCGAACTAGCTGAACTGAGCTGCACCGTGCACC-3'[配列番号:6]であり、アルファウイルスサブゲノムプロモーターおよび隣接配列は、5'GAACTAACTAGTCGCTGACTAGACTAGACTAGTCGCCAAGCTATCACCGGTGGCACC-3'である。このデザインは、3' nsP4オープンリーディングフレームの短い部分、天然のアルファウイルスサブゲノムプロモーター、および天然のサブゲノム配列の5'非翻訳部分を複製する。また、組み込まれているのは、制限酵素認識部位、非コードランダム配列、プライマー結合部位、および第2のオープンリーディングフレームのすぐ5'近位のKozakコンセンサス配列である。次いで、合成遺伝子カセットを消化pVEKベクターに連結し、得られたクローンを、カセット内の相対的5'および3'位置を表す名称の順序で、"pVDG-OspA-OspC"または"pVDG-OspC-OspA"と再命名した。
RPの製造は、実施例1に記載したように実施した。
【０１３１】
動物：7〜8週齢のビーグル犬(Ridglan Farms)をドッグランで共同飼育し、餌と水を自由摂取させた。
【０１３２】
RP-OspA/OspCまたはRP-OspC/OspAワクチンの調製：
【０１３３】
各コンストラクトのレプリコンRNAを、ヘルパーRNA(VEEカプシドヘルパーおよび糖蛋白質配列に由来)と併せてVero細胞にエレクトロポレーションした。各レプリコンは、RP抗原を生成する共エレクトロポレーションプロセスに続いて、RPにパッケージングされた。次いで、得られたRPを0.4M NaClリン酸緩衝液中で収集し、5% (w/v)スクロースで処方し、免疫蛍光アッセイにより定量した。
【０１３４】
安定剤(ショ糖、N-Z Amine、ゼラチン)と0.9%生理食塩水を1mL用量で3種類の別々のワクチンを混合した。治療群Aのワクチンには、それぞれ別々のRP-OspAおよびRP-OspC抗原に対して5.0 x 107の標的用量が含まれていた。治療群Bのワクチンには、RP-OspA/OspCデュアルコンストラクト抗原の標的用量5.0 x 107が含まれていた。治療群Cのワクチンには、RP-OspC/OspAデュアルコンストラクト抗原の標的用量5.0 x 107が含まれていた。ワクチンを凍結乾燥した。
【０１３５】
ワクチン接種と血清の採取：イヌにワクチン1mLを頸部皮下接種し、21日後にさらに1mLを追加接種した。試験第-1、28、35、70、92、119日に頸静脈穿刺により全血を採取した。遠心分離により血清を分離し、試験まで-10-Cまたはより寒冷で保存した。
【０１３６】
OspAおよびOspCボレリア症抗体の検出：
フローサイトメトリー法およびB. burgdorferi ssを用いて、OspAボレリア殺菌抗体を検出した
S-1-10 [Callister et al.、 Arch. Intern. Med. 154:1625-1632(1994)]、フローサイトメトリー法及びB. burgdorferi ss 50772 [Callister et al.、 Arch. Intern. Med. 154:1625-1632(1994)]を用いて、OspCボレリア殺菌抗体が検出された。
【０１３７】
結果
【０１３８】
別々のRP-OspAおよびRP-OspC抗原を含むワクチンは、追加ワクチン接種後1週間で中程度のレベルのボレリア殺菌抗体を誘導した。追加ワクチン接種後1週間で、RP-OspA/OspCデュアルコンストラクト抗原を含むワクチンは、OspCに対する殺ボレリア性抗体を高レベルで誘導したが、OspAに対する殺ボレリア性抗体は比較的低レベルであった。対照的に、RP-OspC/OspAデュアルコンストラクト抗原を含むワクチンは、OspAに対して高レベルのボレリア殺菌抗体を誘導したが、OspCに対しては比較的低レベルのボレリア殺菌抗体を誘導した。データから、OspAまたはOspCに対するより頑健なボレリア殺菌抗体反応は、その遺伝子が構築物の下流位置にある場合に誘導されることが示唆される(表5)。
【０１３９】
2021505560.tif 000006
【０１４０】
B. burgdorferi感染Ixodes scapularisダニによる攻撃感染：
【０１４１】
B. burgdorferi感染ダニによる実験的攻撃は、2回目のワクチン接種から約2週間後に実施した。簡単に説明すると、雌9匹と雄8匹の成ダニを、テープと包帯ラップで所定の位置に保持されたゴムカップの中で、各イヌの剃毛側に置いた。ダニをイヌに7日間吸血させ、除去した。
【０１４２】
攻撃後1、2、3ヵ月で、ダニ付着部位に隣接する部位の各イヌから4mmの穿刺器具を用いて皮膚生検を行い、B. burgdorferiの分離を行った。皮膚バイオプシをBSAに富む培地でインキュベートし、B. burgdorferiの増殖について4週間観察した。肢および/または跛行を示したイヌの左側または肢から、肘、手根、スチフル、およびタースから、組織サンプルを採取し、PCR法によりB. burgdorferiの分離のために処理した(表6)。
【０１４３】
2021505560.tif 000007
【０１４４】
2021505560.tif 000008
【０１４５】
配列
【０１４６】
外表面プロテインA(配列番号1)
atgaaaaagtaccttttgggaatcggactcattctcgccctgatcgcctgcaagcaaaacgtgtcctccctcgacgaaaagaactcagtgtcggtggatctgcccggcgaaatgaaggtgctcgtgtccaaagagaagaacaaggatggaaaatacgacctgattgccaccgtggacaagctggagttgaagggcacctcagacaagaacaacgggtctggagtgctggaaggagtcaaagcggacaagtccaaggtcaagctgactatttcggacgacctgggccagactaccctggaagtgttcaaggaggacggaaagaccctggtgtccaagaaggtcacctccaaggataagtcgagcaccgaagagaagttcaatgagaagggagaagtgtcggagaagatcatcacccgcgccgatggaacccggctggagtacaccgagatcaagtccgatggttcggggaaggctaaggaagtcctgaagggctacgtgcttgagggtactctgactgcggaaaagaccactctggtggtcaaggaaggcaccgtgactctgtcaaagaacatctccaagagcggagaagtcagcgtggaactgaacgacacagattcctccgctgccacgaaaaagaccgccgcctggaacagcgggaccagcactctcaccattaccgtgaacagcaaaaagactaaggacctggtgttcaccaaggagaacacgatcaccgtgcagcagtatgactccaacggtaccaagctcgaagggtccgccgtggagatcactaagctggacgagattaagaatgcactgaagtga
【０１４７】
外表面プロテインA(配列番号2)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTEIKSDGSGKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK*
【０１４８】
外側表面蛋白質C配列ID番号:3
atgaagaagaatactctctccgccattctgatgaccctgttcctgtttatctcctgcaacaactccgggaaggatggcaacacctcggccaactccgccgatgaaagcgtcaagggtcccaacctgactgagatctcgaagaaaatcaccgagtccaacgcggtggtgttggcagtgaaggaggtcgaaactctgctgactagcatcgacgagcttgccaaggccattggaaagaagattaagaacgacgtgtcactggacaacgaagctgaccataacggatctcttatctcgggcgcttacctgatttcgaccctcatcaccaagaagatctccgcgatcaaggacagcggggagctcaaggccgaaattgagaaagcaaagaagtgctccgaagagttcaccgcgaagctcaagggagaacacaccgacctgggaaaggaaggcgtcaccgatgataacgcgaagaaggccatcctcaaaaccaacaacgacaagacaaagggcgccgacgaactggagaagctgttcgagagcgtgaagaatctgtccaaggccgccaaggaaatgttgacgaacagcgtgaaggaactgacctcccctgtggtggccgagtcaccgaaaaagccatga
【０１４９】
外表面プロテインC(配列番号4)
MKKNTLSAILMTLFLFISCNNSGKDGNTSANSADESVKGPNLTEISKKITESNAVVLAVKEVETLLTSIDELAKAIGKKIKNDVSLDNEADHNGSLISGAYLISTLITKKISAIKDSGELKAEIEKAKKCSEEFTAKLKGEHTDLGKEGVTDDNAKKAILKTNNDKTKGADELEKLFESVKNLSKAAKEMLTNSVKELTSPVVAESPKKP*
【０１５０】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施態様に限定されるものではない。実際、本明細書に記載の実施態様に加えて、種々の修飾が、前記の説明から明らかになるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。
【０１５１】
核酸またはポリペプチドについて与えられる場合、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量の値は近似であり、説明のために提供されることが、さらに理解されるべきである。
【配列表】
2021505560000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月3日(2020.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1つ以上のBorrelia burgdorferi抗原またはその抗原断片をそれぞれ個別にコードする2つ以上のアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む免疫原性組成物であって、
1つのアルファウイルスRNAレプリコン粒子が、1つ以上のBorrelia burgdorferi外表面蛋白質A (OspA)またはその抗原断片をコードし、別のアルファウイルスRNAレプリコン粒子が、1つ以上のBorrelia burgdorferi外表面蛋白質C (OspC)またはその抗原断片をコードする、免疫原性組成物。
【請求項２】
2つ以上のBorrelia burgdorferi抗原をコードするアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む免疫原性組成物であって、少なくとも1つのBorrelia burgdorferi抗原が外表面蛋白質A (OspA)またはその抗原断片であり、少なくとも1つの他のBorrelia burgdorferi抗原が外表面蛋白質C (OspC)またはその抗原断片である、免疫原性組成物。
【請求項３】
OspAまたはその抗原断片およびOspCまたはその抗原断片をそれぞれ個別にコードする第1および第2のアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む請求項2に記載の免疫原性組成物であって、第1のRNAレプリコン粒子が、OspCまたはその抗原断片をコードする核酸配列の上流に位置するOspAまたはその抗原断片をコードする核酸配列を含み、第2のRNAレプリコン粒子が、OspAまたはその抗原断片をコードする核酸配列の上流に位置するOspCまたはその抗原断片をコードする核酸配列を含む、免疫原性組成物。
【請求項４】
アルファウイルスRNAレプリコン粒子の少なくとも1つがベネズエラ馬脳炎ウイルス(VEEV) RNAレプリコン粒子である、請求項1、2または3記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記OspAとは異なるBorrelia burgdorferi株に由来する第2のOspAまたはその抗原断片、前記OspCとは異なるBorrelia burgdorferi株に由来する第2のOspCまたはその抗原断片、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるBorrelia burgdorferi抗原をコードする1以上の追加のアルファウイルスRNAレプリコン粒子を含む、請求項1、2、3または4に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記1つ以上の追加のアルファウイルスRNAレプリコン粒子が、VEEV RNAレプリコン粒子である、請求項5に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
少なくとも1つのOspAがB. burgdorferi株297に由来し、少なくとも1つのOspCがB. burgdorferi株50772に由来する、請求項1、2、3、4、5または6に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
OspAが配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を含むアミノ酸配列を含み、OspCが配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を含むアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
請求項1、2、3、4、5、6、7または8に記載の免疫原性組成物および薬学的に許容される担体を含む、Borrelia burgdorferi感染による疾患の予防を助けるワクチンであって、該ワクチンでイヌを免疫した場合に該イヌにおいてOspA-ボレリア殺菌抗体とOspC-ボレリア殺菌抗体の両方が誘導されることを特徴とするワクチン。
【請求項１０】
非ボレリア病原体に対する防御免疫を誘発するための少なくとも1つの非ボレリア免疫原をさらに含む、請求項9に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
非ボレリア免疫原由来の少なくとも1つのタンパク質抗原またはその抗原断片をコードするヌクレオチド配列を含むアルファウイルスRNAレプリコン粒子をさらに含む、請求項9または10に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
非アジュバントワクチンである請求項9、10または11のワクチン組成物。
【請求項１３】
病原性ボレリア遺伝子種に対して哺乳動物を免疫する方法であって、請求項9、10、11または12に記載のワクチンの免疫学的に有効な量を哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１４】
哺乳動物がイヌである、請求項1３記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物がネコである、請求項1４記載の方法。
【国際調査報告】
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