(57)【要約】  本発明は交互の立体化学を有するペプチドに関する。特に、本発明は、最初の4個のアミノ酸残基に交互の立体化学(LDLD)を含むペプチドに関する。本発明は疼痛の処置における、交互の立体化学を有するペプチドの使用を更に想定している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I
【化１】
2021525736.tif 000074
(式中、N-末端から数えて、第1及び第3のアミノ酸残基はL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基はD-アミノ酸残基であり、
R1は、水素、C1〜C3アルキル、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R2は、水素、C1〜C3アルキル、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R1及びR2は一緒になって、1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく、
R3及びR4は、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R5は、水素、-OH、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R6は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、
R7は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、
R8は、-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)、
【化２】
2021525736.tif 000075
、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y1は、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2は、水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
R8が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)前記L-アミノ酸残基は場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端は場合によってアミド化されている)を含む単離ペプチド。
【請求項２】
R6がC1〜C6アルキルであり、R7がC1〜C6アルキルである、請求項1に記載のペプチド。
【請求項３】
R6及びR7が、独立して、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、ノルロイシン、又はイソロイシンの側鎖から選択される、請求項1又は請求項2に記載のペプチド。
【請求項４】
R6及びR7がそれぞれバリン側鎖(-CH(CH3)2)である、請求項1から3のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
R6及びR7がそれぞれスレオニン側鎖である、請求項1に記載のペプチド。
【請求項６】
R3及びR4が-CH3であり、R5が-OHである、請求項1から5のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
R1及びR2がそれぞれ水素である、請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
R1、R2、R3、R4、及びR5がそれぞれ水素である、請求項1から5のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９】
式I
【化３】
2021525736.tif 000076
(式中、N-末端から数えて、第1及び第3のアミノ酸残基はL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基はD-アミノ酸残基であり、
R1は、水素、単結合、又は-C1〜C3アルキルであり、
R2は、水素、単結合、又は-C1〜C3アルキルであり、
R3及びR4は、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R5は、水素、-OH、又は-O(C1〜C3)アルキルであり、
R6は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、
R7は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、
R8は、-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)、
【化４】
2021525736.tif 000077
、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y1は、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2は、水素又は糖部分、好ましくは二糖部分であり、
R8が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)前記L-アミノ酸残基は場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端は場合によってアミド化されており、
R8がリンカーである場合、前記リンカーは糖部分、好ましくは二糖部分、例えば、ラクトースを含み、
R1又はR2のうちの1つが単結合である場合、R1及びR2のうちの1つは水素であり、前記単結合はN-末端で場合によってアルキル化されていてもよい、好ましくは単独にメチル化されていてもよいL-アミノ酸残基へのペプチド結合である)を含む単離ペプチド。
【請求項１０】
R1及びR2のうちの1つが水素及びR1及びR2のうちの1つが-CH3である、請求項9に記載のペプチド。
【請求項１１】
R5が-O(C1〜C3)アルキルであり、好ましくは-OCH3である、請求項9又は請求項10に記載のペプチド。
【請求項１２】
R3及びR4が-CH3である、請求項11に記載のペプチド。
【請求項１３】
R3及びR4が水素である、請求項11に記載のペプチド。
【請求項１４】
R3及びR4が-CH3であり、R5が-OHである、請求項9又は請求項10に記載のペプチド。
【請求項１５】
R6及びR7がそれぞれバリン側鎖(-CH(CH3)2)である、請求項9から14のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１６】
R6及びR7がそれぞれスレオニン側鎖である、請求項9から14のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１７】
R1又はR2のうちの1つが単結合であり、R1及びR2のうちの1つが水素であり、前記単結合がL-アミノ酸残基へのペプチド結合である、請求項9から16のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１８】
前記L-アミノ酸残基が少なくとも1つのN-末端メチル化を有する、請求項17に記載のペプチド。
【請求項１９】
前記L-アミノ酸残基がL-アラニン残基である、請求項17又は請求項18に記載のペプチド。
【請求項２０】
R8がリンカーである、請求項9から19のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２１】
前記リンカーが、アミノ酸ベースリンカー、ペプチドベースリンカー、アミノ酸を含むリンカー、及び/若しくはマレイミドベースリンカー、並びに/又はこれらの組合せを含む、請求項20に記載のペプチド。
【請求項２２】
R8が-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)、
【化５】
2021525736.tif 000078
であり、Y1が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2が、水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、請求項1から19のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２３】
R8が、
【化６】
2021525736.tif 000079
であり、Y1が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2が、水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、請求項22に記載のペプチド。
【請求項２４】
Y1が-NH2である、請求項22又は請求項23に記載のペプチド。
【請求項２５】
Y1が1〜約30個のL-アミノ酸残基である、請求項22又は請求項23に記載のペプチド。
【請求項２６】
Y1が1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基である、請求項25に記載のペプチド。
【請求項２７】
Y1が1〜約11個のL-アミノ酸残基である、請求項26に記載のペプチド。
【請求項２８】
R8が1〜約30個のL-アミノ酸残基である、請求項1から19のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２９】
R8が1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基である、請求項28に記載のペプチド。
【請求項３０】
R8が1〜約11個のL-アミノ酸残基である、請求項29に記載のペプチド。
【請求項３１】
前記1〜約11個のL-アミノ酸残基が、少なくとも1つのグリコシル化されているL-アミノ酸残基を含み、好ましくは少なくとも1つのO-グリコシル化されているL-セリン残基を含む、請求項30に記載のペプチド。
【請求項３２】
R1及びR2が水素であり、R3、R4、及びR5が水素であり、R6及びR7がそれぞれ-CH(CH3)2であり、R8が-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)、
【化７】
2021525736.tif 000080
であり、Y1が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、請求項1に記載のペプチド。
【請求項３３】
R1及びR2が水素であり、R3及びR4が両方とも水素であるか、又は両方とも-CH3であり、R5が-OHであり、R6及びR7がそれぞれ-CH(CH3)2であり、R8が-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)、
【化８】
2021525736.tif 000081
であり、Y1が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、請求項1に記載のペプチド。
【請求項３４】
R8が-NH2、
【化９】
2021525736.tif 000082
であり、Y1が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、請求項32又は請求項33に記載のペプチド。
【請求項３５】
R8が、
【化１０】
2021525736.tif 000083
であり、Y1が-OH又は-NH2であり、
Y2が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、請求項32から34のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３６】
Y1が1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基である、請求項32から34のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３７】
Y1が1〜約11個のL-アミノ酸残基である、請求項36に記載のペプチド。
【請求項３８】
Y2が糖部分であり、好ましくは二糖部分である、請求項1から19、22、23、及び32から35のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３９】
Y2前記二糖部分がラクトース部分又はメリビオース部分である、請求項38に記載のペプチド。
【請求項４０】
Y2前記二糖部分がラクトース部分である、請求項38に記載のペプチド。
【請求項４１】
前記二糖部分がベータ結合を介して付加している、請求項39又は請求項40に記載のペプチド。
【請求項４２】
R8が1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基である、請求項1に記載のペプチド。
【請求項４３】
R8が1〜約11個のL-アミノ酸残基である、請求項42に記載のペプチド。
【請求項４４】
前記L-アミノ酸残基が、N-グリコシル化されている、O-グリコシル化されている、C-グリコシル化されている、S-グリコシル化されている、又はSe-グリコシル化されている少なくとも1個のアミノ酸残基を含む、請求項42又は請求項43に記載のペプチド。
【請求項４５】
前記L-アミノ酸残基が、O-グリコシル化されている少なくとも1個のL-アミノ酸残基を含む、請求項44に記載のペプチド。
【請求項４６】
O-グリコシル化されている前記アミノ酸残基がL-セリン残基である、請求項45に記載のペプチド。
【請求項４７】
R1及びR2が一緒になって、バイオリバーシブル部分を形成する、請求項1から6、22から31、及び38から46のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項４８】
前記バイオリバーシブル部分が、
【化１１】
2021525736.tif 000084
又は=N=N(アジド部分)である、請求項47に記載のペプチド。
【請求項４９】
R1又はR2のうちの1つが水素であり、R1又はR2のうちの1つが-C(=O)OCH2CH3又は-C(=O)OCH2OC(=O)CH3である、請求項1から6、22から31、及び38から46のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５０】
R5がバイオリバーシブル部分である、請求項1から5、7、22から31、及び38から46のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５１】
前記バイオリバーシブル部分が-C(=O)CH3である、請求項50に記載のペプチド。
【請求項５２】
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe(ペプチド1a、Bilaid A);
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド1e);
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe(ペプチド3a、Bilaid C);
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド3b);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド3c; Bilorphin);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(ペプチド3g; Bilactorphin);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(ペプチド4);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Pro-L-Asn-L-Leu-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Ala-L-Leu-L-Lys-L-Ser-L-Leu-NH2(ペプチド11);
N-末端がバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2OC(=O)CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド10);
N-末端がバイオリバーシブル部分
【化１２】
2021525736.tif 000085
で置換されている2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド8);
2,6-ジメチル-L-チロシン上のヒドロキシ基がバイオリバーシブル部分-C(=O)CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド5);
2,6-ジメチル-L-チロシン上のヒドロキシ基がバイオリバーシブル部分-C(=O)CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(ペプチド6);
N-末端がバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド7);及び
N-末端がバイオリバーシブル部分、=N=Nで置換されて、N-末端アジド基を形成する、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド9)
からなる群から選択される、請求項1に記載のペプチド。
【請求項５３】
L-AA-L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-リンカー-糖部分;
L-AA-L-Tyr-D-Thr-L-Thr-D-Phe-リンカー-糖部分;
L-AA-L-Dmt-D-Val-L-Val-D-Phe-リンカー-糖部分;
L-AA-L-Dmt-D-Thr-L-Thr-D-Phe-リンカー-糖部分を含み、
L-AAが、少なくとも1つのN-末端-CH3を場合によって有する任意のL-アミノ酸残基であり、
L-Tyr又はL-Dmtのヒドロキシル基が場合によってアルキル化されており、
前記リンカーが好ましくはL-Ser又はL-Thrである、ペプチド。
【請求項５４】
式II
【化１３】
2021525736.tif 000086
(式中、N-末端から数えて、第1のアミノ酸残基はL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基はD-アミノ酸残基であり、
R9は、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R10は、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R9又はR10のうちの1つが水素であり、R9又はR10のうちの1つがバイオリバーシブル部分である場合、前記バイオリバーシブル部分は好ましくは-C(=O)OCH2CH3又は-C(=O)OCH2OC(=O)CH3であり、
R9及びR10は、一緒になって、1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく、好ましくは、前記バイオリバーシブル部分は、
【化１４】
2021525736.tif 000087
又は=N=N(アジド部分)であり、
R11及びR12は、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R13は、水素、-OH、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R14は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R15は、水素、-OH、又はバイオリバーシブル部分であり、
R16は、-OH、-O(C1〜C3アルキル)、-NH2、
【化１５】
2021525736.tif 000088
、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y3は、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y4は、水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
R16が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)前記L-アミノ酸残基は場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端は場合によってアミド化されている)を含むペプチド。
【請求項５５】
R14がC1〜C6アルキルである、請求項54に記載のペプチド。
【請求項５６】
R14が、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、ノルロイシン、又はイソロイシンの側鎖から選択される、請求項54又は請求項55に記載のペプチド。
【請求項５７】
R14がバリン側鎖(-CH(CH3)2)である、請求項54から56のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５８】
R14がスレオニン側鎖である、請求項54に記載のペプチド。
【請求項５９】
R11及びR12が-CH3であり、R13が-OHである、請求項54から58のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６０】
R9及びR10がそれぞれ水素である、請求項54から59のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６１】
R9、R10、R11、R12、及びR13がそれぞれ水素である、請求項54から58のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６２】
R9、R10、R11、R12、及びR13が水素であり、R14がC1〜C4アルキルであり、R15が-OHである、請求項54から58のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６３】
式II
【化１６】
2021525736.tif 000089
(式中、N-末端から数えて、第1のアミノ酸残基はL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基はD-アミノ酸残基であり、
R9は、水素、単結合、又は-C1〜C3アルキル、好ましくは-CH3であり、
R10は、水素、単結合、又は-C1〜C3アルキル、好ましくは-CH3であり、
R11及びR12は、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R13は、水素、-OH、又は-O(C1〜C3)アルキルであり、
R14は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R15は、水素、-OH、又はバイオリバーシブル部分であり、
R16は、-OH、-O(C1〜C3アルキル)、-NH2、
【化１７】
2021525736.tif 000090
、1〜約30個のL-アミノ酸残基、又はリンカーであり、
Y3は、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y4は、水素又は糖部分、好ましくは二糖部分であり、
R16が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)前記L-アミノ酸残基は場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端は場合によってアミド化されており、
R16がリンカーの場合、前記リンカーは糖部分、好ましくは二糖部分例えば、ラクトースを含み、
R9又はR10のうちの1つが単結合である場合、R9又はR10のうちの1つは水素であり、前記単結合はN-末端で場合によってアルキル化されている、好ましくは単独にメチル化されているL-アミノ酸残基へのペプチド結合である)を含むペプチド。
【請求項６４】
R9及びR10のうちの1つが水素であり、R9及びR10のうちの1つが-CH3である、請求項63に記載のペプチド。
【請求項６５】
R13が-O(C1〜C3)アルキルであり、好ましくは-OCH3である、請求項63又は請求項64に記載のペプチド。
【請求項６６】
R11及びR12が-CH3である、請求項65に記載のペプチド。
【請求項６７】
R11及びR12が水素である、請求項65に記載のペプチド。
【請求項６８】
R11及びR12が-CH3であり、R13が-OHである、請求項63又は請求項64に記載のペプチド。
【請求項６９】
R9又はR10のうちの1つが単結合であり、R9又はR10のうちの1つが水素であり、前記単結合がL-アミノ酸残基へのペプチド結合である、請求項63に記載のペプチド。
【請求項７０】
前記L-アミノ酸残基が少なくとも1つのN-末端メチル化を有する、請求項69に記載のペプチド。
【請求項７１】
前記L-アミノ酸残基がL-アラニン残基である、請求項69又は請求項70に記載のペプチド。
【請求項７２】
R14がバリン側鎖(-CH(CH3)2)である、請求項63から71のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７３】
R14がスレオニン側鎖である、請求項63から71のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７４】
R16が-NH2である、請求項54から73のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７５】
R16が、
【化１８】
2021525736.tif 000091
、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y3が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y4が、水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
R16が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)前記L-アミノ酸残基は場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端は場合によってアミド化されている、請求項54から73のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７６】
R16が1〜約30個のL-アミノ酸である、請求項75に記載のペプチド。
【請求項７７】
R16が、1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基である、請求項76に記載のペプチド。
【請求項７８】
R16が1〜約11個のL-アミノ酸残基である、請求項77に記載のペプチド。
【請求項７９】
前記L-アミノ酸残基が、N-グリコシル化されている、O-グリコシル化されている、C-グリコシル化されている、S-グリコシル化されている、又はSe-グリコシル化されている少なくとも1個のアミノ酸残基を含む、請求項76から78のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８０】
前記L-アミノ酸残基が、O-グリコシル化されている少なくとも1個のアミノ酸残基を含む、請求項79に記載のペプチド。
【請求項８１】
O-グリコシル化されている前記アミノ酸残基がL-セリン残基である、請求項80に記載のペプチド。
【請求項８２】
R16がリンカーである、請求項63から72のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８３】
前記リンカーがアミノ酸ベースリンカー、ペプチドベースリンカー、アミノ酸を含むリンカー、及び/若しくはマレイミドベースリンカー、並びに/又はこれらの組合せを含む、請求項82に記載のペプチド。
【請求項８４】
R16が、
【化１９】
2021525736.tif 000092
であり、Y3が-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y4が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、請求項54に記載のペプチド。
【請求項８５】
R16が、
【化２０】
2021525736.tif 000093
であり、Y3が-OH又は-NH2であり、Y4が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、請求項54から73のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８６】
R9、R10、R11、R12、及びR13が水素であり、R14が-CH(CH3)2であり、R15が-OHであり、R16が、
【化２１】
2021525736.tif 000094
であり、
Y3が-OH又は-NH2であり、Y4が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、請求項54に記載のペプチド。
【請求項８７】
前記糖部分が二糖部分であり、好ましくは前記二糖部分がベータ結合を介して付加している、請求項54から73、75、及び84から86のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８８】
前記二糖部分がラクトース部分又はメリビオース部分であり、好ましくは前記二糖部分がベータ結合を介して付加している、請求項87に記載のペプチド。
【請求項８９】
前記二糖部分がラクトース部分であり、好ましくは前記ラクトース部分がベータ結合を介して付加している、請求項87又は請求項88に記載のペプチド。
【請求項９０】
R9及びR10が、一緒になって、バイオリバーシブル部分を形成する、請求項54から59のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９１】
前記バイオリバーシブル部分が、
【化２２】
2021525736.tif 000095
又は=N=N(アジド部分)である、請求項90に記載のペプチド。
【請求項９２】
R9又はR10のうちの1つが水素であり、R9又はR10のうちの1つが-C(=O)OCH2CH3又は-C(=O)OCH2OC(=O)CH3である、請求項54から59のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９３】
R13がバイオリバーシブル部分である、請求項54から59のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９４】
前記バイオリバーシブル部分が、-C(=O)CH3である、請求項93に記載のペプチド。
【請求項９５】
L-Phe-D-Val-Gly-D-Tyr-NH2である、請求項54に記載のペプチド。
【請求項９６】
式III
X1-X2-X3-X4
(III)
(式中、
X1は、N-末端部分-NR17R18を含むN-末端アミノ酸残基であり、
X4は、-C(=O)OH、-C(=O)O(C1〜C3アルキル)、-C(=O)NH2、
【化２３】
2021525736.tif 000096
から選択されるC-末端部分を含み、Y5は-OH又は-NH2であり、Y6は水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
X1は、L-チロシン、2,6-ジメチル-L-チロシン、又はL-フェニルアラニンから選択されるL-アミノ酸残基であり、X1がL-チロシン又は2,6-ジメチル-L-チロシンの場合、前記残基は、4位において、糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分で場合によってO-置換されており、
X2はD-アミノ酸残基であり、好ましくはD-アラニン、D-バリン、D-ロイシン、又はD-イソロイシンであり、より好ましくは、D-バリンであり、
X3はグリシン又はL-アミノ酸残基であり、X3がL-アミノ酸残基である場合、X3は好ましくはL-アラニン、L-バリン、L-ロイシン、又はL-イソロイシンであり、より好ましくはL-バリンであり、
X4は、D-チロシン又はD-フェニルアラニンから選択されるD-アミノ酸残基であり、X4がD-チロシンの場合、前記残基はバイオリバーシブル部分で場合によってO-置換されており、
R17及びR18は、独立して、水素、若しくは糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分から選択されるか、又はR17及びR18は、一緒になって、糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分を形成する）を含み、
MOPrアゴニストである、単離ペプチド。
【請求項９７】
前記C-末端部分が、-C(=O)OH、
【化２４】
2021525736.tif 000097
であり、Y5が-OHであり、Y6が水素又は糖部分であり、前記ペプチドが、C-末端上に約5個、8個、11個、12個、20個又は26個の追加のL-アミノ酸残基を更に含む、請求項96に記載のペプチド。
【請求項９８】
R17及びR18がそれぞれ水素であり、X2がD-バリン残基であり、X3がグリシン又はL-バリン残基であり、X4が、-C(=O)OH、-C(=O)NH2、
【化２５】
2021525736.tif 000098
から選択されるC-末端部分を含み、Y5が-OH又は-NH2であり、Y6が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、請求項96又は請求項97に記載のペプチド。
【請求項９９】
式III
X1-X2-X3-X4
(III)
(式中、
X1は、N-末端部分-NR17R18を含むN-末端アミノ酸残基であり、
X4は、-C(=O)OH、-C(=O)O(C1〜C3アルキル)、-C(=O)NH2、
【化２６】
2021525736.tif 000099
又はリンカーから選択されるC-末端部分を含み、Y5は-OH又は-NH2であり、Y6は水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
X1は、L-チロシン、2,6-ジメチル-L-チロシン、又はL-フェニルアラニンから選択されるL-アミノ酸残基であり、X1がL-チロシン又は2,6-ジメチル-L-チロシンである場合、前記残基は、4位においてC1〜C3アルキルで場合によってO-置換されており、
X2は、D-アミノ酸残基であり、好ましくはD-スレオニン、D-アラニン、D-バリン、D-ロイシン、又はD-イソロイシンであり、より好ましくは、D-スレオニン又はD-バリンであり、
X3はグリシン又はL-アミノ酸残基であり、X3がL-アミノ酸残基である場合、X3は、好ましくはL-スレオニン、L-アラニン、L-バリン、L-ロイシン、又はL-イソロイシンであり、より好ましくはL-スレオニン又はL-バリンであり、
X4は、D-チロシン又はD-フェニルアラニンから選択されるD-アミノ酸残基であり、X4がD-チロシンの場合、前記残基は、バイオリバーシブル部分で場合によってO-置換されており、
R17及びR18は、独立して、水素、単結合、又は-C1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
X4がリンカーを含む場合、前記リンカーは糖部分、好ましくは二糖部分、例えば、ラクトースを含み、
R17又はR18のうちの1つが単結合である場合、R17又はR18のうちの1つは水素であり、前記単結合はN-末端で場合によってアルキル化されていてもよい、好ましくは単独にメチル化されていてもよいL-アミノ酸残基へのペプチド結合である）を含み、
MOPrアゴニストである、単離ペプチド。
【請求項１００】
前記C-末端部分が-C(=O)OH、
【化２７】
2021525736.tif 000100
であり、Y5が-OHであり、Y6が水素又は糖部分であり、前記ペプチドがC-末端上に、約5個、8個、11個、12個、20個又は26個の追加のL-アミノ酸残基を更に含む、請求項99に記載のペプチド。
【請求項１０１】
X2がD-バリン残基であり、X3がグリシン又はL-バリン残基であり、X4が-C(=O)OH、-C(=O)NH2、
【化２８】
2021525736.tif 000101
から選択されるC-末端部分を含み、Y5が-OH又は-NH2であり、Y6が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、請求項99又は請求項100に記載のペプチド。
【請求項１０２】
X2がD-スレオニン残基であり、X3がグリシン、又は、L-スレオニン残基であり、X4が-C(=O)OH、-C(=O)NH2、
【化２９】
2021525736.tif 000102
から選択されるC-末端部分を含み、Y5が-OH又は-NH2であり、Y6が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、請求項99又は請求項100に記載のペプチド。
【請求項１０３】
R17及びR18のうちの1つが水素であり、R17及びR18のうちの1つが-CH3である、請求項99から102のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０４】
R17又はR18のうちの1つが単結合であり、R17又はR18のうちの1つが水素であり、前記単結合がL-アミノ酸残基へのペプチド結合である、請求項99から102のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０５】
前記L-アミノ酸残基が少なくとも1つのN-末端メチル化を有する、請求項104に記載のペプチド。
【請求項１０６】
前記L-アミノ酸残基がL-アラニン残基である、請求項104又は請求項105に記載のペプチド。
【請求項１０７】
X4がリンカーを含む、請求項99に記載のペプチド。
【請求項１０８】
前記リンカーがアミノ酸ベースリンカー、ペプチドベースリンカー、アミノ酸を含むリンカー、及び/若しくはマレイミドベースリンカー、並びに/又はこれらの組合せを含む、請求項107に記載のペプチド。
【請求項１０９】
X1がL-チロシン又は2,6-ジメチル-L-チロシンであり、前記L-チロシン又は2,6-ジメチル-L-チロシンが4位においてC1〜C3アルキルでO-置換されている、請求項99から108のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１０】
X1が2,6-ジメチル-L-チロシンであり、2,6-ジメチル-L-チロシンが4位においてC1〜C3アルキルでO-置換されている、請求項109に記載のペプチド。
【請求項１１１】
X4が、
【化３０】
2021525736.tif 000103
から選択されるC-末端部分を含み、Y5が-OH又は-NH2であり、Y6が二糖部分であり、好ましくは前記二糖部分がベータ結合を介して付加している、請求項96から106のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１２】
前記二糖部分がラクトース部分であり、好ましくは前記ラクトース部分がベータ結合を介して付加している、請求項111に記載のペプチド。
【請求項１１３】
前記追加のL-アミノ酸が、N-グリコシル化されている、O-グリコシル化されている、C-グリコシル化されている、S-グリコシル化されている、又はSe-グリコシル化されている少なくとも1個のアミノ酸残基を含む、請求項97に記載のペプチド。
【請求項１１４】
R17及びR18が一緒になって、バイオリバーシブル部分を形成する、請求項96、97、及び111から113のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１５】
前記バイオリバーシブル部分が
【化３１】
2021525736.tif 000104
又は=N=N(アジド部分)である、請求項114に記載のペプチド。
【請求項１１６】
R17又はR18のうちの1つが水素であり、R17又はR18のうちの1つが-C(=O)OCH2CH3又は-C(=O)OCH2OC(=O)CH3である、請求項96、97、及び111から113のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１７】
以下からなる群から選択される請求項96に記載のペプチド
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe(ペプチド1a、Bilaid A);
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド1e);
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe(ペプチド3a、Bilaid C);
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド3b);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド3c;Bilorphin);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(ペプチド3g; Bilactorphin);
L-Phe-D-Val-Gly-D-Tyr-NH2(ペプチド2d);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(ペプチド4);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Pro-L-Asn-L-Leu-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Ala-L-Leu-L-Lys-L-Ser-L-Leu-NH2(ペプチド11);
N-末端がバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2OC(=O)CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド10);
N-末端がバイオリバーシブル部分
【化３２】
2021525736.tif 000105
で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド8);
2,6-ジメチル-L-チロシン上のヒドロキシ基がバイオリバーシブル部分-C(=O)CH3で置換されている2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド5);
2,6-ジメチル-L-チロシン上のヒドロキシ基がバイオリバーシブル部分-C(=O)CH3で置換されている2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe--OCH2CH3(ペプチド6);
N-末端がバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2CH3で置換されている2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド7)、及び
N-末端がバイオリバーシブル部分、=N=Nで置換されて、N-末端アジド基を形成する2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド9)。
【請求項１１８】
モルヒネと比較して、
(a)MOPrのC-末端リン酸化対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す、及び/又は
(b)βアレスチン動員対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す、及び/又は
(c)MOPr内在化対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す、請求項1から117のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１９】
モルヒネと比較して、βアレスチン動員対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す、請求項1から117のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２０】
hMOPrを使用するアッセイにおいて、約10μMの濃度で、ビヒクルと比較してcAMP形成の阻害における増加を示す、請求項1から119のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２１】
[3H]DAMGOを使用する競合的結合アッセイにおいて、約5μM未満、約3.5μM未満、約1μM未満、約0.8μM未満、約0.5μM未満、又は約0.3μM未満のKiを示す、請求項1から120のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２２】
約0.5μM未満又は約0.3μM未満のKiを示す、請求項121に記載のペプチド。
【請求項１２３】
血液脳関門を横断する、請求項1から122のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２４】
請求項1から123のいずれか一項に記載のペプチドと、少なくとも1種の医薬賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１２５】
経口投与用に製剤化される、請求項124に記載の医薬組成物。
【請求項１２６】
前記ペプチドがグリコシル化され、前記組成物が経口投与、注射による投与、又は髄腔内投与用に製剤化される、請求項124に記載の医薬組成物。
【請求項１２７】
前記ペプチドがグリコシル化されず、前記組成物が経鼻投与又は髄腔内投与用に製剤化される、請求項124に記載の医薬組成物。
【請求項１２８】
対象に、請求項1から123のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項124から127のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、疼痛を処置する方法。
【請求項１２９】
前記疼痛が、術後疼痛、神経損傷に伴う疼痛、骨折に伴う疼痛、火傷に伴う疼痛、又は外傷に伴う疼痛である、請求項128に記載の方法。
【請求項１３０】
疼痛を処置するための医薬の製造における、請求項1から123のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項124から127のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３１】
前記疼痛が、術後疼痛、神経損傷に伴う疼痛、骨折に伴う疼痛、火傷に伴う疼痛、又は外傷に伴う疼痛である、請求項130に記載の使用。
【請求項１３２】
対象に、請求項1から123のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項124から127のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、鎮痛を届ける方法。
【請求項１３３】
鎮痛を届けるための医薬の製造のための、請求項1から123のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項124から127のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３４】
鎮痛を届ける方法における使用のための、請求項1から123のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項124から127のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３５】
対象に、請求項1から123のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項124から127のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、有害な副作用がより少ない、好ましくはモルヒネと比較してより少ない、疼痛を処置する又は鎮痛を届ける方法。
【請求項１３６】
前記有害な副作用が消化管(GI)阻害及び/又は呼吸抑制である、請求項135に記載の方法。
【請求項１３７】
有害な副作用がより少ない、好ましくはモルヒネと比較してより少ない、疼痛を処置する又は鎮痛を届けるための医薬の製造のための、請求項1から123のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項124から127のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３８】
前記有害な副作用が消化管(GI)阻害及び/又は呼吸抑制である、請求項137に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、「鎮痛剤及び使用のその方法」という表題の、2018年5月31日に出願したオーストラリア仮特許出願第2018901944号の優先権を主張するものである。前述の出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれている。本明細書は28枚の図面を含み、その一部は複数の部分を含む。
【０００２】
本発明は、交互の立体化学を有するペプチドに関する。特に、本発明は、最初の4個のアミノ酸残基に(LDLD)の交互の立体化学を含むペプチドに関する。本発明は、疼痛の処置に使用するための交互の立体化学を有するペプチドの使用を更に想定している。
【背景技術】
【０００３】
本明細書全体にわたる従来技術のいかなる考察も、このような従来技術が広く公知である、また技術分野において共通の一般知識の一部を形成するという許可と考えられるべきものでは決してない。
【０００４】
短い生理活性ペプチド(4〜50残基)は、これらの選択性と新規の薬理学的特性の両方に対して重大な期待を示す。1970年代における比較的非選択的なオピオイドペプチド、エンケファリン及びエンドルフィンの発見以来、関連するκ-オピオイド(KOPr)及びδ-オピオイド(DOPr)サブタイプに対して選択性を有するμ-オピオイド受容体(MOPr)を標的とするテトラペプチドエンドモルフィンを含めて、他の推定上の内因性リガンドが発見されてきた。自然はまた、カエル皮膚から単離したヘプタペプチドである、デルモルフィン及びデルトルフィンIIを届ける発見的役割を果たし、これらはそれぞれMOPr及びDOPrに対する強力な、選択的アゴニストであり、興味深いことに、両方ともD-アラニンを2位に含有する(Kreil, G.、Antimicrobial peptides.、Ciba Foundation Symposium, 186巻、77〜90頁、1994年)。類似の戦略を使用する哺乳動物のオピオイドペプチドへの合成的修飾はまた、生物学的安定性及び受容体選択性の増強をもたらした。例えば、D-アラニンの導入は、タンパク質分解に対してエンケファリンを安定化させ、これらのC-末端付近でのさらなる置換は、極めて安定した選択的MOPrアゴニスト、例えば、DAMGO([D-Ala2、N-MePhe4、Gly5-オール]-エンケファリン)を生成した。オピオイド受容体タイプに対して高親和性及び選択性を有するオピオイドペプチドアゴニスト及び類似体は自然から単離されるか、又は開発されているが、今まで研究したすべての公知の強力な内因性及び合成オピオイドペプチドはほぼ偏向性がない、又はアレスチン偏向性であり、すべてが強力なMOPr内在化を生成する(例えば、Thompson GLら、(2015年)、Molecular Pharmacology、88巻:335〜346頁)。環状ペプチドの1つの例がG偏向性であると最近報告されている(Piekielna-Ciesielska Jら、(2018年) Peptides、101巻:227〜233頁)。
【０００５】
MOPrでのアゴニストは、疼痛の管理のための極めて重要な薬物であるが、これらの使用は多くの場合、呼吸抑制、便秘、及び耐性を含む有害作用をもたらす。MOPrアゴニストの乱用に対する可能性もまた存在する。バイアスアゴニズムは、明確な下流シグナル伝達経路にカップリングするために、GPCRを異なる形でアゴナイズするGタンパク質共役受容体(GPCR)のアゴニストの能力について記載している。Gタンパク質を介して差次的に信号を送る偏向オピオイドと、βアレスチン動員との対比は、βアレスチン動員の不在が副作用プロファイルを改善し得ることから、さらなる関心を集めている。例えば、モルヒネの鎮痛効果は、βアレスチン-2ノックアウトマウスにおいて増強及び延長したのに対して、モルヒネ誘発性呼吸抑制及び急性便秘は減弱した(Raehal, K.ら、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics、314巻、3号(2005年):1195〜1201頁)。同様に、マウス及びラットにおける強力な鎮痛剤である、Gタンパク質偏向性MOPrアゴニスト、オリセリジン(TRV130)は、モルヒネよりも、生じる呼吸抑制及び消化器障害が少ない。(DeWire, S.ら、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics、344巻、3号(2013年):708〜717頁)。オリセリジンの治験は、等鎮痛薬用量に対して、モルヒネと比較して、呼吸器の機能障害の減少を示した(Singla, N.ら、Journal of Pain Research、10巻(2017年):2413頁)。呼吸抑制の減少は、過量の状況において安全性の改善をもたらし、多くの管轄において現在多発しているオピオイド過量の罹患率及び死亡率負荷を潜在的に減少させる。したがって、モルヒネ等の従来のオピオイドに伴う不要な作用が少ない新規鎮痛剤を開発する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kreil, G.、Antimicrobial peptides.、Ciba Foundation Symposium、186巻、77〜90頁、1994年
【非特許文献２】Thompson GLら、(2015年)、Molecular Pharmacology、88巻:335〜346頁
【非特許文献３】Piekielna-Ciesielska Jら、(2018年) Peptides、101巻:227〜233頁
【非特許文献４】Raehal, K.ら、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics、314巻、3号(2005年):1195〜1201頁
【非特許文献５】DeWire, S.ら、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics、344巻、3号(2013年):708〜717頁
【非特許文献６】Singla, N.ら、Journal of Pain Research、10巻(2017年):2413頁
【非特許文献７】Schnolzerら、Int J Pept Prot Res (1992年)、40巻:180〜193頁
【非特許文献８】Alewoodら、Methods in Enzymology(1997年)、289巻:14〜29頁
【非特許文献９】McPherson Jら、(2010年)、Molecular Pharmacology、78巻:756〜766頁
【非特許文献１０】Borgland SLら、(2003年)、J Biol Chem、278巻:18776〜18784頁
【非特許文献１１】Yousuf Aら、(2015年)、Molecular Pharmacology、88巻:825〜835頁
【非特許文献１２】Williamsら、Pharmacol Rev.、(2013年)65巻(1号):223〜54頁
【非特許文献１３】Justら、「Molecular Pharmacology」(2013年) 83巻(3号): 633〜639頁
【非特許文献１４】Wilhelm Iら、Molecular Pharmaceutics (2014年)、11巻(7号):1949〜63頁
【非特許文献１５】Remington's Pharmaceutical Sciences、第22版、University of the Sciences in Philadelphia編、Lippincott、Williams & Wilkins、Philadelphia Pa.、2012年
【非特許文献１６】Koehl、Nature、(2018年) 558巻: 547〜552頁
【非特許文献１７】Manglik、Nature、(2012年)485巻:321〜326頁
【非特許文献１８】Xuら、Journal of Carbohyrate Chemistry、(2012年)、31巻(9号): 711〜720頁
【非特許文献１９】Salvadorら、Tetrahedron、(1995年)、51巻(19号):5643〜5656頁
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【非特許文献５３】Liら、Future Med Chem、(2012年) 4巻(2号): 205〜26頁
【非特許文献５４】Hillら、Br J Pharmacol、(2018年3月26日) epub PMID: 29582414
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来技術の欠点の少なくとも1つを克服若しくは改善する、又は有用な代替を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
オピオイドファミリーは、脊椎動物及び他のいくつかの動物において同定されているが、オピオイド関連ペプチドは低級真核生物において同定されていない。本発明は、オーストラリアの河口のペニシリウム属(Penicillium sp.)の分離株MST-MF667から単離した、テトラペプチド、FvVf-OH(Bilaid Aと命名)、FvVy-OH(Bilaid Bと命名)、及びYvVf-OH(Bilaid Cと命名)に関し、これは、オーストラリア海洋由来のペニシリウム・ビライイ(Penicillium bilaii)、及びこれらペプチドの誘導体として最初に報告された。ペプチドは、4個のアミノ酸残基の交互の立体化学(LDLD)を共有する。
【０００９】
第1の態様では、本発明は、式I
【００１０】
【化１】
2021525736.tif 000002
【００１１】
(式中、N-末端から数えて、第1及び第3のアミノ酸残基はL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基はD-アミノ酸残基であり、
R1は、水素、C1〜C3アルキル、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R2は、水素、C1〜C3アルキル、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R1及びR2は一緒になって、糖部分を場合によって含む1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく、
R3及びR4は、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R5は、水素、-OH、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R6は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R7は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R8は、-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)
【００１２】
【化２】
2021525736.tif 000003
【００１３】
、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y1は、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2は、水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
R8が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)L-アミノ酸残基は場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端は場合によってアミド化されている)を含む単離ペプチドを提供する。
【００１４】
本発明の第1の態様の一実施形態では、
R1は、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R2は、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R1及びR2は一緒になって、糖部分を場合によって含む1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく
R3及びR4は、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R5は、水素、-OH、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R6は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R7は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R8は、-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)、
【００１５】
【化３】
2021525736.tif 000004
【００１６】
、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y1は、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2は、水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
R8が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)L-アミノ酸残基は場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端は場合によってアミド化されている。
【００１７】
場合によってグリコシル化されていてもよいL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。
【００１８】
本発明の第1の態様によるペプチドは、R8が、1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基であるペプチドを含む。
【００１９】
本発明の第1の態様によるペプチドは、Y1が、1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基であるペプチドを含む。
【００２０】
本発明の第1の態様によるペプチドは、R8が1個のL-アミノ酸残基であり、このL-アミノ酸残基が好ましくは場合によってグリコシル化されていてもよい残基であるペプチドを含む。
【００２１】
バイオリバーシブル部分を含む本発明の第1の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は任意の当技術分野で公知のものであってよく、これらに限定されないが、カーボネート、カルバメート、イミン、エーテル、エステル、及びアミド部分を含む。バイオリバーシブル部分を含む本発明の第1の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は糖部分、好ましくは二糖を場合によって含む。
【００２２】
ある特定の実施形態では、本発明の第1の態様によるペプチドにおいて、R1又はR2のうちの1つは、糖部分、好ましくは二糖部分でグリコシル化されているバイオリバーシブル部分である。
【００２３】
ある特定の実施形態では、本発明の第1の態様によるペプチドにおいて、R6はアミノ酸の側鎖であり、及び/又はR7はアミノ酸の側鎖である。ある特定の実施形態では、R6はスレオニンの側鎖であり、及び/又はR7はスレオニンの側鎖である。ある特定の実施形態では、R6又はR7のうちの1つはスレオニンの側鎖であり、R6又はR7のうちの1つはバリンの側鎖である。ある特定の実施形態では、R6とR7の両方ともスレオニンの側鎖である。ある特定の実施形態では、R6はバリンの側鎖であり、及び/又はR7はバリンの側鎖である。ある特定の実施形態では、R6とR7の両方ともバリンの側鎖である。
【００２４】
好ましくは、本発明の第1の態様によるペプチドにおいて、R1及びR2は水素である。
【００２５】
第2の態様では、本発明は、N-末端から数えて、第1及び第3のアミノ酸残基がL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基がD-アミノ酸残基であり、
R1が、水素、C1〜C3アルキル、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R2が、水素、C1〜C3アルキル、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R1及びR2が、一緒になって、糖部分を場合によって含む1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく、
R3及びR4が、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R5が、水素、-OH、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R6が、C1〜C6アルキル、好ましくはC1〜C4アルキル、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R7が、C1〜C6アルキル、好ましくはC1〜C4アルキル、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R8が、-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)、
【００２６】
【化４】
2021525736.tif 000005
【００２７】
、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y1が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2が、水素又は糖部分、好ましくは二糖部分であり、
R8が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)L-アミノ酸残基が場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端が場合によってアミド化されている、式Iを含む単離ペプチドを提供する。
【００２８】
本発明の第2の態様の一実施形態では、
R1は、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R2は、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R1及びR2は一緒になって、糖部分を場合によって含む1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく
R3及びR4は、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R5は、水素、-OH、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R6は、C1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R7は、C1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R8は、-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)
【００２９】
【化５】
2021525736.tif 000006
【００３０】
、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y1は、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2は、水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
R8が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)L-アミノ酸残基は場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端は場合によってアミド化されている。
【００３１】
場合によってグリコシル化されていてもよいL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。
【００３２】
本発明の第2の態様によるペプチドは、R8が、1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基であるペプチドを含む。
【００３３】
本発明の第2の態様によるペプチドは、Y1が1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基であるペプチドを含む。
【００３４】
本発明の第2の態様によるペプチドは、R8が、1個のL-アミノ酸残基であり、このL-アミノ酸残基が好ましくは場合によってグリコシル化されていてもよい残基であるペプチドを含む。
【００３５】
バイオリバーシブル部分を含む本発明の第2の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は任意の当技術分野で公知のものであってよく、これらに限定されないが、カーボネート、カルバメート、イミン、エーテル、エステル、及びアミド部分を含む。バイオリバーシブル部分を含む本発明の第2の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は糖部分、好ましくは二糖を場合によって含む。
【００３６】
ある特定の実施形態では、本発明の第2の態様によるペプチドにおいて、R1又はR2のうちの1つは、糖部分、好ましくは二糖部分でグリコシル化されているバイオリバーシブル部分である。
【００３７】
好ましくは、本発明の第2の態様によるペプチドにおいて、R1及びR2は水素である。
【００３８】
第3の態様では、本発明は、N-末端から数えて、第1及び第3のアミノ酸残基がL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基がD-アミノ酸残基であり、
R1が、水素、C1〜C3アルキル、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R2が、水素、C1〜C3アルキル、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R1及びR2が、一緒になって、糖部分を場合によって含む1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく、
R3及びR4が、独立して、水素又は-CH3から選択され、
R5が、水素、-OH、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R6が、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R7が、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R8が、-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)、
【００３９】
【化６】
2021525736.tif 000007
【００４０】
であり、
Y1が、-OH又は-NH2であり、
Y2が、水素又は糖部分、好ましくは二糖部分である、式Iを含む単離ペプチドを提供する。
【００４１】
本発明の第3の態様の一実施形態では、
R1は、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R2は、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R1及びR2は一緒になって、糖部分を場合によって含む1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく、
R3及びR4は、独立して、水素又は-CH3から選択され、
R5は、水素、-OH、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R6は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R7は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R8は、-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)、
【００４２】
【化７】
2021525736.tif 000008
【００４３】
であり、
Y1は、-OH又は-NH2であり、
Y2は、水素又は糖部分、好ましくは二糖部分である。
【００４４】
本発明の第3の態様によるペプチドは、ペプチドのC-末端に追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、前記追加のL-アミノ酸残基は場合によってグリコシル化されている。好ましくは、本発明の第3の態様のペプチドは、C-末端に、約5個、約8個、約11個、約12個、約20個又は約26個の追加のL-アミノ酸残基を場合によって含む。ペプチドは、場合によってグリコシル化されていてもよい追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、この追加のL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。C-末端は場合によってアミド化されている。
【００４５】
バイオリバーシブル部分を含む本発明の第3の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は任意の当技術分野で公知のものであってよく、これらに限定されないが、カーボネート、カルバメート、イミン、エーテル、エステル、及びアミド部分を含む。バイオリバーシブル部分を含む本発明の第3の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は糖部分、好ましくは二糖を場合によって含む。
【００４６】
ある特定の実施形態では、本発明の第3の態様によるペプチドにおいて、R1又はR2のうちの1つは糖部分、好ましくは二糖部分でグリコシル化されているバイオリバーシブル部分である。
【００４７】
ある特定の実施形態では、本発明の第3の態様によるペプチドにおいて、R6はアミノ酸の側鎖であり、及び/又はR7はアミノ酸の側鎖である。ある特定の実施形態では、R6はスレオニンの側鎖であり、及び/又はR7はスレオニンの側鎖である。ある特定の実施形態では、R6又はR7のうちの1つはスレオニンの側鎖であり、R6又はR7のうちの1つはバリンの側鎖である。ある特定の実施形態では、R6とR7の両方ともスレオニンの側鎖である。ある特定の実施形態では、R6はバリンの側鎖であり、及び/又はR7はバリンの側鎖である。ある特定の実施形態では、R6とR7の両方ともバリンの側鎖である。
【００４８】
好ましくは、本発明の第3の態様によるペプチドにおいて、R1及びR2は水素である。
【００４９】
第4の態様において、本発明は、N-末端から数えて、第1及び第3のアミノ酸残基がL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基がD-アミノ酸残基であり、
R1が、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R2が、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R1及びR2が、一緒になって、糖部分を場合によって含む1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく、
R3及びR4が、独立して、水素又は-CH3から選択され、
R5が、水素、-OH、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R6が、C1〜C4アルキルであり、好ましくは-CH(CH3)2であり、
R7が、C1〜C4アルキルであり、好ましくは-CH(CH3)2であり、
R8が、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)、
【００５０】
【化８】
2021525736.tif 000009
【００５１】
であり、
Y1が、-OH又は-NH2であり、
Y2が、水素又は糖部分、好ましくは二糖部分である、式Iを含むペプチドを提供する。
【００５２】
本発明の第4の態様によるペプチドは、ペプチドのC-末端に追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、前記追加のL-アミノ酸残基は場合によってグリコシル化されている。好ましくは、本発明の第4の態様のペプチドは、C-末端に約5個、約8個、約11個、約12個、約20個又は約26個の追加のL-アミノ酸残基を場合によって含む。ペプチドは、場合によってグリコシル化されていてもよい追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、この追加のL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。C-末端は場合によってアミド化されている。
【００５３】
バイオリバーシブル部分を含む本発明の第4の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は任意の当技術分野で公知のものであってよく、これらに限定されないが、カーボネート、カルバメート、イミン、エーテル、エステル、及びアミド部分を含む。バイオリバーシブル部分を含む本発明の第4の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は糖部分、好ましくは二糖を場合によって含む。
【００５４】
ある特定の実施形態では、本発明の第4の態様によるペプチドにおいて、R1又はR2のうちの1つは、糖部分、好ましくは二糖部分でグリコシル化されているバイオリバーシブル部分である。
【００５５】
好ましくは、本発明の第4の態様によるペプチドにおいて、R1及びR2は水素である。
【００５６】
第5の態様では、本発明は、N-末端から数えて、第1及び第3のアミノ酸残基がL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基がD-アミノ酸残基であり、
R1が、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R2が、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R1又はR2のうちの1つが水素であり、R1又はR2のうちの1つがバイオリバーシブル部分である場合、バイオリバーシブル部分が、好ましくは-C(=O)OZ1又は-C(=O)OCH2OC(=O)Z2であり、
Z1がC1〜C6アルキル又はアリールであり、好ましくはZ1が-CH2CH3であり
Z2がC1〜C6アルキル又はアリールであり、好ましくはZ2が-CH3であり
R1及びR2が、一緒になって、1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく、好ましくは、バイオリバーシブル部分が、
【００５７】
【化９】
2021525736.tif 000010
【００５８】
(イミン部分)、又は=N=N(アジド部分)であり、
R3及びR4が-CH3であり、
R5がOHであり、
R6がC1〜C4アルキルであり、
R7がC1〜C4アルキルであり、
R8が-OH、-NH2、
【００５９】
【化１０】
2021525736.tif 000011
【００６０】
であり、
Y1が-OH又は-NH2であり、
Y2が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、式Iを含むペプチドを提供する。
【００６１】
本発明の第5の態様によるペプチドは、ペプチドのC-末端に追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、前記追加のL-アミノ酸残基は場合によってグリコシル化されている。好ましくは、本発明の第5の態様のペプチドは、C-末端に、約5個、約8個、約11個、約12個、約20個又は約26個の追加のL-アミノ酸残基を場合によって含む。ペプチドは、場合によってグリコシル化されていてもよい追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、この追加のL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステイン等を含む。C-末端は場合によってアミド化されている。
【００６２】
バイオリバーシブル部分を含む本発明の第5の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は任意の当技術分野で公知のものであってよく、これらに限定されないが、カーボネート、カルバメート、イミン、エーテル、エステル、及びアミド部分を含む。バイオリバーシブル部分を含む本発明の第5の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は糖部分、好ましくは二糖を場合によって含む。
【００６３】
ある特定の実施形態では、本発明の第5の態様によるペプチドにおいて、R1又はR2のうちの1つは、糖部分、好ましくは二糖部分でグリコシル化されているバイオリバーシブル部分である。
【００６４】
好ましくは、本発明の第5の態様によるペプチドにおいて、R1及びR2は水素である。
【００６５】
第6の態様では、本発明は、N-末端から数えて、第1及び第3のアミノ酸残基がL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基がD-アミノ酸残基であり、
R1が、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R2が、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R1又はR2のうちの1つが水素であり、R1又はR2のうちの1つがバイオリバーシブル部分である場合、バイオリバーシブル部分が好ましくは-C(=O)OZ1又は-C(=O)OCH2OC(=O)Z2であり、
Z1がC1〜C6アルキル又はアリールであり、好ましくはZ1が-CH2CH3であり、
Z2がC1〜C6アルキル又はアリールであり、好ましくはZ2が-CH3であり、
R1及びR2が、一緒になって、1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく、好ましくは、バイオリバーシブル部分が、
【００６６】
【化１１】
2021525736.tif 000012
【００６７】
(イミン部分)、又は=N=N(アジド部分)であり、
R3及びR4が-CH3であり、
R5がOHであり、
R6が-CH(CH3)2であり、
R7が-CH(CH3)2であり、
R8が-OH、-NH2、
【００６８】
【化１２】
2021525736.tif 000013
【００６９】
であり、
Y1が、-OH又は-NH2であり、
Y2が水素又は糖部分、好ましくは二糖部分である、式Iを含むペプチドを提供する。
【００７０】
本発明の第6の態様によるペプチドは、ペプチドのC-末端に追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、前記追加のL-アミノ酸残基は場合によってグリコシル化されている。好ましくは、本発明の第6の態様のペプチドは、C-末端に、約5個、約8個、約11個、約12個、約20個又は約26個の追加のL-アミノ酸残基を場合によって含む。ペプチドは、場合によってグリコシル化されていてもよい追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、この追加のL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。C-末端は場合によってアミド化されている。
【００７１】
バイオリバーシブル部分を含む本発明の第6の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は任意の当技術分野で公知のものであってよく、これらに限定されないが、カーボネート、カルバメート、イミン、エーテル、エステル、及びアミド部分を含む。バイオリバーシブル部分を含む本発明の第6の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は糖部分、好ましくは二糖を場合によって含む。
【００７２】
ある特定の実施形態では、本発明の第6の態様によるペプチドにおいて、R1又はR2のうちの1つは、糖部分、好ましくは二糖部分でグリコシル化されているバイオリバーシブル部分である。
【００７３】
好ましくは、本発明の第6の態様によるペプチドにおいて、R1及びR2は水素である。
【００７４】
第7の態様において、本発明は、N-末端から数えて、第1及び第3のアミノ酸残基がL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基がD-アミノ酸残基であり、
R1が水素であり、
R2が水素であり、
R3及びR4が-CH3であり、
R5がOHであり、
R6が-CH(CH3)2であり、
R7が-CH(CH3)2であり、
R8が-OH、-NH2、
【００７５】
【化１３】
2021525736.tif 000014
【００７６】
であり、
Y1が、-OH又は-NH2であり、
Y2が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、式Iを含むペプチドを提供する。
【００７７】
本発明の第7の態様によるペプチドは、ペプチドのC-末端に追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、前記追加のL-アミノ酸残基は場合によってグリコシル化されている。好ましくは、本発明の第7の態様のペプチドは、C-末端に、約5個、約8個、約11個、約12個、約20個又は約26個の追加のL-アミノ酸残基を場合によって含む。ペプチドは、場合によってグリコシル化されていてもよい追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、この追加のL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。C-末端は場合によってアミド化した。
【００７８】
第8の態様では、本発明は、
N-末端から数えて、第1及び第3のアミノ酸残基がL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基がD-アミノ酸残基であり、
R1が、水素、単結合、又はC1〜C3アルキル、好ましくは水素又は-CH3であり、
R2が、水素、単結合、又はC1〜C3アルキル、好ましくは水素又は-CH3であり、
R3及びR4が、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R5が、水素、-OH、又は-O(C1〜C4)アルキルであり、
R6が、アミノ酸の側鎖であり、好ましくはバリンの側鎖又はスレオニン残基、又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R7が、アミノ酸の側鎖であり、好ましくはバリンの側鎖又はスレオニン残基、又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R8が、-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)
【００７９】
【化１４】
2021525736.tif 000015
【００８０】
、1〜約30個のL-アミノ酸残基、又はリンカーであり、
Y1が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2が、水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
R8が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)L-アミノ酸残基が場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端が場合によってアミド化されており、
R8がリンカーである場合、リンカーが糖部分、好ましくは二糖部分、例えば、ラクトースを含み、
R1又はR2のうちの1つが単結合である場合、R1及びR2のうちの1つが水素であり、単結合がN-末端で場合によってアルキル化されていてもよい、好ましくは単独にメチル化されていてもよいL-アミノ酸残基へのペプチド結合である、式Iを含む単離ペプチドを提供する。
【００８１】
場合によってグリコシル化されていてもよいL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。
【００８２】
本発明の第8の態様によるペプチドは、R8が1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基であるペプチドを含む。
【００８３】
本発明の第8の態様によるペプチドは、Y1が1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基であるペプチドを含む。
【００８４】
本発明の第8の態様によるペプチドは、R8が1個のL-アミノ酸残基であり、このL-アミノ酸残基が好ましくは場合によってグリコシル化されていてもよい残基であるペプチドを含む。
【００８５】
バイオリバーシブル部分を含む本発明の第8の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は任意の当技術分野で公知のものであってよく、これらに限定されないが、カーボネート、カルバメート、イミン、エーテル、エステル、及びアミド部分を含む。バイオリバーシブル部分を含む本発明の第8の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は糖部分、好ましくは二糖を場合によって含む。
【００８６】
ある特定の実施形態では、本発明の第8の態様によるペプチドにおいて、R1又はR2のうちの1つは、糖部分、好ましくは二糖部分でグリコシル化されているバイオリバーシブル部分である。
【００８７】
ある特定の実施形態では、本発明の第8の態様によるペプチドにおいて、R6はアミノ酸の側鎖であり、及び/又はR7はアミノ酸の側鎖である。ある特定の実施形態では、R6はスレオニンの側鎖であり、及び/又はR7はスレオニンの側鎖である。ある特定の実施形態では、R6又はR7のうちの1つはスレオニンの側鎖であり、R6又はR7のうちの1つはバリンの側鎖である。ある特定の実施形態では、R6とR7の両方ともスレオニンの側鎖である。ある特定の実施形態では、R6はバリンの側鎖であり、及び/又はR7はバリンの側鎖である。ある特定の実施形態では、R6とR7の両方ともバリンの側鎖である。
【００８８】
R8としてリンカーを含む本発明の第8の態様によるペプチドにおいて、リンカーは特に限定されていない。適切なリンカーとして、アミノ酸ベースリンカー、例えば、これらに限定されないが、単一アミノ酸リンカー、例えば、L-システイン、L-リジン、L-セリン、L-スレオニン等を含めたもの、ペプチドベースリンカー、例えば、これらに限定されないが、L-バリン-L-シトルリン、L-Phe-L-Lys、L-グルタミン酸-L-バリン-L-シトルリン等を含めたもの、アミノ酸を含むリンカー、例えば、これらに限定されないが、バリン-シトルリン-p-アミノカルバメート(VC-PABC)等を含めたもの、及びマレイミドベースリンカー、例えば、これらに限定されないが、マレイミドカプロイル、マレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシレート等を含めたもの、並びにこのようなリンカーの組合せ、例えば、マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノカルバメート、並びにアミノ及びカルボキシ基を含有するリンカー、例えば、6-アミノヘキサン酸等が挙げられる。マレイミドベースリンカーは、マレイミドがL-システインの硫黄に結合するようにL-システイン残基を使用してもよいし、又はマレイミドがL-リジンの窒素に結合するようにL-リジン残基を使用してもよいことを当業者であれば認識されよう。マレイミドベースリンカーを含む実施形態では、ペプチドは、マレイミドベースリンカーに結合しているC-末端のL-システイン残基又はL-リジン残基、例えば、マレイミドカプロイル、マレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシレートを更に含んでもよい。
【００８９】
ある特定の実施形態では、本発明の第8の態様によるペプチドにおいて、R1及びR2のうちの1つは-CH3であり、R1及びR2のうちの1つは水素である。
【００９０】
好ましくは、本発明の第8の態様によるペプチドにおいて、R1及びR2は水素である。
【００９１】
第9の態様では、本発明は、式II
【００９２】
【化１５】
2021525736.tif 000016
【００９３】
(式中、N-末端から数えて、第1のアミノ酸残基はL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基はD-アミノ酸残基であり、
R9は、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R10は、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R9又はR10のうちの1つが水素であり、R9又はR10のうちの1つがバイオリバーシブル部分である場合、バイオリバーシブル部分は好ましくは-C(=O)OZ3又は-C(=O)OCH2OC(=O)Z4であり、
Z3はC1〜C6アルキル又はアリールであり、好ましくは、Z1は-CH2CH3であり、
Z4はC1〜C6アルキル又はアリールであり、好ましくは、Z2は-CH3であり、
R9及びR10は、一緒になって、1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく、好ましくは、バイオリバーシブル部分は、
【００９４】
【化１６】
2021525736.tif 000017
【００９５】
(イミン部分)又は=N=N(アジド部分)であり、
R11及びR12は、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R13は、水素、-OH、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R14は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R15は、水素、-OH、又はバイオリバーシブル部分であり、
R16は、-OH、-O(C1〜C3アルキル)、-NH2、
【００９６】
【化１７】
2021525736.tif 000018
【００９７】
、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y3は、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y4は、水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
R16が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)L-アミノ酸残基は場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端は場合によってアミド化されている)を含むペプチドを提供する。
【００９８】
場合によってグリコシル化されていてもよいL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。
【００９９】
本発明の第9の態様によるペプチドは、R16が、1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基であるペプチドを含む。
【０１００】
本発明の第9の態様によるペプチドは、Y3が、1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基であるペプチドを含む。
【０１０１】
本発明の第9の態様によるペプチドは、R16が1個のL-アミノ酸残基であり、このL-アミノ酸残基が好ましくは場合によってグリコシル化されていてもよい残基であるペプチドを含む。
【０１０２】
バイオリバーシブル部分を含む本発明の第9の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は任意の当技術分野で公知のものであってよく、これらに限定されないが、カーボネート、カルバメート、イミン、エーテル、エステル、及びアミド部分を含む。バイオリバーシブル部分を含む本発明の第9の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は糖部分、好ましくは二糖を場合によって含む。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、本発明の第9の態様によるペプチドにおいて、R9又はR10のうちの1つは、糖部分、好ましくは二糖部分でグリコシル化されているバイオリバーシブル部分である。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、本発明の第9の態様によるペプチドにおいて、R14はアミノ酸の側鎖である。ある特定の実施形態では、R14はスレオニンの側鎖である。
【０１０５】
好ましくは、本発明の第9の態様によるペプチドにおいて、R9及びR10は水素である。
【０１０６】
第10の態様では、本発明は、N-末端から数えて、第1のアミノ酸残基がL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基がD-アミノ酸残基であり、
R9が、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R10が、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R9又はR10のうちの1つが水素であり、R9又はR10のうちの1つがバイオリバーシブル部分である場合、バイオリバーシブル部分が好ましくは-C(=O)OZ3又は-C(=O)OCH2OC(=O)Z4であり、
Z3がC1〜C6アルキル又はアリールであり、好ましくはZ1が-CH2CH3であり、
Z4がC1〜C6アルキル又はアリールであり、好ましくはZ2が-CH3であり、
R9及びR10が、一緒になって、1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく、好ましくは、バイオリバーシブル部分が、
【０１０７】
【化１８】
2021525736.tif 000019
【０１０８】
(イミン部分)又は=N=N(アジド部分)であり、
R11及びR12が、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R13が、水素、-OH、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R14が、C1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R15が、水素、-OH、又はバイオリバーシブル部分であり、
R16が、-OH、-O(C1〜C3アルキル)、-NH2、
【０１０９】
【化１９】
2021525736.tif 000020
【０１１０】
、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y3が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y4が、水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
R16が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合。(1)L-アミノ酸残基が場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端が場合によってアミド化されている、式IIを含むペプチドを提供する。
【０１１１】
場合によってグリコシル化されていてもよいL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。
【０１１２】
本発明の第10の態様によるペプチドは、R16が、1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基であるペプチドを含む。
【０１１３】
本発明の第10の態様によるペプチドは、Y3が1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基であるペプチドを含む。
【０１１４】
本発明の第10の態様によるペプチドは、R16が1個のL-アミノ酸残基であり、このL-アミノ酸残基が好ましくは場合によってグリコシル化されていてもよい残基であるペプチドを含む。
【０１１５】
バイオリバーシブル部分を含む本発明の第10の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は任意の当技術分野で公知のものであってよく、これらに限定されないが、カーボネート、カルバメート、イミン、エーテル、エステル、及びアミド部分を含む。バイオリバーシブル部分を含む本発明の第10の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は糖部分、好ましくは二糖を場合によって含む。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、本発明の第10の態様によるペプチドにおいて、R9又はR10のうちの1つは、糖部分、好ましくは二糖部分でグリコシル化されているバイオリバーシブル部分である。
【０１１７】
好ましくは、本発明の第10の態様によるペプチドにおいて、R9及びR10は水素である。
【０１１８】
第11の態様において、本発明は、N-末端から数えて、第1のアミノ酸残基がL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基がD-アミノ酸残基であり、
R9が、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R10が、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R9又はR10のうちの1つが水素であり、R9又はR10のうちの1つがバイオリバーシブル部分である場合、バイオリバーシブル部分が好ましくは-C(=O)OZ3又は-C(=O)OCH2OC(=O)Z4であり、
Z3がC1〜C6アルキル又はアリールであり、好ましくはZ1が-CH2CH3であり、
Z4がC1〜C6アルキル又はアリールであり、好ましくはZ2が-CH3であり、
R9及びR10が、一緒になって、1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく、好ましくは、バイオリバーシブル部分が、
【０１１９】
【化２０】
2021525736.tif 000021
【０１２０】
(イミン部分)又は=N=N(アジド部分)であり、
R11、R12、及びR13が水素であり、
R14がC1〜C4アルキルであり、好ましくは-CH(CH3)2であり、
R15が-OHであり、
R16が、-OH、-O(C1〜C3アルキル)、-NH2、
【０１２１】
【化２１】
2021525736.tif 000022
【０１２２】
であり、
Y3が-OH又は-NH2であり、
Y4が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、式IIを含むペプチドを提供する。
【０１２３】
本発明の第11の態様によるペプチドは、ペプチドのC-末端に追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、前記追加のL-アミノ酸残基は場合によってグリコシル化されている。好ましくは、本発明の第11の態様のペプチドは、C-末端に、約5個、約8個、約11個、約12個、約20個又は約26個の追加のL-アミノ酸残基を場合によって含む。ペプチドは、場合によってグリコシル化されていてもよい追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、この追加のL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。C-末端は場合によってアミド化されている。
【０１２４】
バイオリバーシブル部分を含む本発明の第11の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は任意の当技術分野で公知のものであってよく、これらに限定されないが、カーボネート、カルバメート、イミン、エーテル、エステル、及びアミド部分を含む。バイオリバーシブル部分を含む本発明の第11の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は糖部分、好ましくは二糖を場合によって含む。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、本発明の第11の態様によるペプチドにおいて、R9又はR10のうちの1つは糖部分、好ましくは二糖部分でグリコシル化されているバイオリバーシブル部分である。
【０１２６】
好ましくは、本発明の第11の態様によるペプチドにおいて、R9及びR10は水素である。
【０１２７】
第12の態様では、本発明は、N-末端から数えて、第1のアミノ酸残基がL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基がD-アミノ酸残基であり、
R9が、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R10が、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R9又はR10のうちの1つが水素であり、R9又はR10のうちの1つがバイオリバーシブル部分である場合、バイオリバーシブル部分が好ましくは-C(=O)OZ3又は-C(=O)OCH2OC(=O)Z4であり、
Z3がC1〜C6アルキル又はアリールであり、好ましくはZ1が-CH2CH3であり、
Z4がC1〜C6アルキル又はアリールであり、好ましくはZ2が-CH3であり、
R9及びR10が、一緒になって、1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく、好ましくは、バイオリバーシブル部分が、
【０１２８】
【化２２】
2021525736.tif 000023
【０１２９】
(イミン部分)又は=N=N(アジド部分)であり、
R11、R12、及びR13が水素であり、
R14が-CH(CH3)2であり、
R15が-OHであり、
R16が-OH、-O(C1〜C3アルキル)、-NH2、
【０１３０】
【化２３】
2021525736.tif 000024
【０１３１】
であり、
Y3が-OH又は-NH2であり、
Y4が、水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、式IIを含むペプチドを提供する。
【０１３２】
本発明の第12の態様によるペプチドは、ペプチドのC-末端に追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、前記追加のL-アミノ酸残基は場合によってグリコシル化されている。好ましくは、本発明の第12の態様のペプチドは、C-末端に、約5個、約8個、約11個、約12個、約20個又は約26個の追加のL-アミノ酸残基を場合によって含む。ペプチドは、場合によってグリコシル化されていてもよい追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、この追加のL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。C-末端は場合によってアミド化されている。
【０１３３】
バイオリバーシブル部分を含む本発明の第12の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は任意の当技術分野で公知のものであってよく、これらに限定されないが、カーボネート、カルバメート、イミン、エーテル、エステル、及びアミド部分を含む。バイオリバーシブル部分を含む本発明の第12の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は糖部分、好ましくは二糖を場合によって含む。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、本発明の第12の態様によるペプチドにおいて、R9又はR10のうちの1つは、糖部分、好ましくは二糖部分でグリコシル化されているバイオリバーシブル部分である。
【０１３５】
好ましくは、本発明の第12の態様によるペプチドにおいて、R9及びR10は水素である。
【０１３６】
第13の態様では、本発明は、N-末端から数えて、第1のアミノ酸残基がL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基がD-アミノ酸残基であり、
R9、R10、R11、R12、及びR13が水素であり、
R14がC1〜C4アルキル、好ましくは-CH(CH3)2であり、
R15が-OHであり、
R16が-OH、-O(C1〜C3アルキル)、-NH2、
【０１３７】
【化２４】
2021525736.tif 000025
【０１３８】
であり、
Y3が-OH又は-NH2であり、
Y4が、水素又は糖部分、好ましくは二糖部分である、式IIを含むペプチドを提供する。
【０１３９】
本発明の第13の態様によるペプチドは、ペプチドのC-末端に追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、前記追加のL-アミノ酸残基は場合によってグリコシル化されている。好ましくは、本発明の第13の態様のペプチドは、C-末端に、約5個、約8個、約11個、約12個、約20個又は約26個の追加のL-アミノ酸残基を場合によって含む。ペプチドは、場合によってグリコシル化されていてもよい追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、この追加のL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。C-末端は場合によってアミド化されている。
【０１４０】
第14の態様では、本発明は、N-末端から数えて、第1のアミノ酸残基がL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基がD-アミノ酸残基であり、
R9が、水素、単結合、又は-C1〜C3アルキル、好ましくは-CH3であり、
R10が、水素、単結合、又は-C1〜C3アルキル、好ましくは-CH3であり、
R11及びR12が、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R13が、水素、-OH、又は-O(C1〜C3)アルキルであり、
R14が、アミノ酸の側鎖であり、好ましくはスレオニンの側鎖残基であり、又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R15が、水素、-OH、又はバイオリバーシブル部分であり、
R16が、-OH、-O(C1〜C3アルキル)、-NH2、
【０１４１】
【化２５】
2021525736.tif 000026
【０１４２】
1〜約30個のL-アミノ酸残基、又はリンカーであり、
Y3が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y4が、水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
R16が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)L-アミノ酸残基が場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端が場合によってアミド化されており、
R16がリンカーであり、リンカーが、糖部分、好ましくは二糖部分、例えば、ラクトースを含み、
R9又はR10のうちの1つが単結合である場合、R9又はR10のうちの1つが水素であり、単結合がN-末端で場合によってアルキル化されていてもよい、好ましくは単独にメチル化されていてもよいL-アミノ酸残基へのペプチド結合である、式IIを含むペプチドを提供する。
【０１４３】
場合によってグリコシル化されていてもよいL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。
【０１４４】
本発明の第14の態様によるペプチドは、R16が1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基であるペプチドを含む。
【０１４５】
本発明の第14の態様によるペプチドは、Y3が1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基であるペプチドを含む。
【０１４６】
本発明の第14の態様によるペプチドは、R16が、1個のL-アミノ酸残基であり、このL-アミノ酸残基が好ましくは場合によってグリコシル化されていてもよい残基であるペプチドを含む。
【０１４７】
バイオリバーシブル部分を含む本発明の第14の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は任意の当技術分野で公知のものであってよく、これらに限定されないが、カーボネート、カルバメート、イミン、エーテル、エステル、及びアミド部分を含む。バイオリバーシブル部分を含む本発明の第14の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は糖部分、好ましくは二糖を場合によって含む。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、本発明の第14の態様によるペプチドにおいて、R14はアミノ酸の側鎖、好ましくは、スレオニンの側鎖残基である。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、本発明の第14の態様によるペプチドにおいて、R9及びR10のうちの1つは-CH3である、R9及びR10のうちの1つは水素である。
【０１５０】
R16としてリンカーを含む本発明の第14の態様によるペプチドにおいて、リンカーは特に限定されておらず、任意の当技術分野で公知のものであってよい。適切なリンカーとして、アミノ酸ベースリンカー、例えば、これらに限定されないが、単一アミノ酸リンカー、例えば、L-システイン、L-リジン、L-セリン、L-スレオニン等を含めたもの、ペプチドベースリンカー、例えば、これらに限定されないが、L-バリン-L-シトルリン、L-Phe-L-Lys、L-グルタミン酸-L-バリン-L-シトルリン等を含めたもの、アミノ酸を含むリンカー、例えば、これらに限定されないが、バリン-シトルリン-p-アミノカルバメート(VC-PABC)等を含めたもの、及びマレイミドベースリンカー、例えば、これらに限定されないが、マレイミドカプロイル、マレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシレート等を含めたもの、並びにこのようなリンカーの組合せ、例えば、マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノカルバメート、並びにアミノ及びカルボキシ基を含有するリンカー、例えば、6-アミノヘキサン酸等が挙げられる。マレイミドベースリンカーは、マレイミドがL-システインの硫黄に結合するようにL-システイン残基を使用してもよいし、又はマレイミドがL-リジンの窒素に結合するようにL-リジン残基を使用してもよいことを当業者であれば認識されよう。マレイミドベースリンカーを含む実施形態では、ペプチドは、マレイミドベースリンカーに結合しているC-末端のL-システイン残基又はL-リジン残基、例えば、マレイミドカプロイル、マレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシレートを更に含んでもよい。
【０１５１】
好ましくは、本発明の第14の態様によるペプチドにおいて、R9及びR10は水素である。
【０１５２】
第15の態様では、本発明は、式III
X1-X2-X3-X4
(III)
(式中、
X1は、N-末端部分-NR17R18を含むN-末端アミノ酸残基であり、
X4は、-C(=O)OH、-C(=O)O(C1〜C3アルキル)、-C(=O)NH2、
【０１５３】
【化２６】
2021525736.tif 000027
【０１５４】
から選択されるC-末端部分を含み、
Y5は-OH又は-NH2であり、Y6は水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
X1は、L-チロシン、2,6-ジメチル-L-チロシン、又はL-フェニルアラニンから選択されるL-アミノ酸残基であり、X1がL-チロシン又は2,6-ジメチル-L-チロシンである場合、残基は、4位において、バイオリバーシブル部分で場合によってO-置換されており、
X2はD-アミノ酸残基であり、好ましくはD-アラニン、D-バリン、D-ロイシン、又はD-イソロイシンであり、より好ましくは、D-バリンであり、
X3は、グリシン又はL-アミノ酸残基であり、X3がL-アミノ酸残基である場合、X3は好ましくはL-アラニン、L-バリン、L-ロイシン、又はL-イソロイシンであり、より好ましくはL-バリンであり、
X4は、D-チロシン又はD-フェニルアラニンから選択されるD-アミノ酸残基であり、X4がD-チロシンである場合、残基は、4位においてバイオリバーシブル部分で場合によってO-置換されており、
R17及びR18は、独立して、水素、若しくは糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分から選択されるか、又はR17及びR18は一緒になって、糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分を形成する）を含み、
MOPrアゴニストである、単離ペプチドを提供する。
【０１５５】
本発明の第15の態様によるペプチドは、ペプチドのC-末端に追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、前記追加のL-アミノ酸残基は場合によってグリコシル化されている。好ましくは、本発明の第15の態様のペプチドは、C-末端に、約5個、約8個、約11個、約12個、約20個又は約26個の追加のL-アミノ酸残基を場合によって含む。ペプチドは、場合によってグリコシル化されていてもよい追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、この追加のL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。C-末端は場合によってアミド化されている。
【０１５６】
バイオリバーシブル部分を含む本発明の第15の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は任意の当技術分野で公知のものであってよく、これらに限定されないが、カーボネート、カルバメート、イミン、エーテル、エステル、及びアミド部分を含む。バイオリバーシブル部分を含む本発明の第15の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は糖部分、好ましくは二糖を場合によって含む。ある特定の実施形態では、本発明の第15の態様によるペプチドにおいて、R17又はR18のうちの1つは、糖部分、好ましくは二糖部分でグリコシル化されているバイオリバーシブル部分である。ある特定の実施形態では、本発明の第15の態様によるペプチドにおいて、R17及びR18は、一緒になって、糖部分、好ましくは二糖部分でグリコシル化されているバイオリバーシブル部分を形成する。ある特定の実施形態では、X1がL-チロシン又は2,6-ジメチル-L-チロシンである本発明の第15の態様によるペプチドにおいて、残基は、4位において、バイオリバーシブル部分でO-置換されており、更にバイオリバーシブル部分はグリコシル化されている。
【０１５７】
本発明の第15の態様によるある特定の実施形態では、X2はD-スレオニン残基であり、及び/又はX3はL-スレオニン残基である。ある特定の実施形態では、X2はD-スレオニン残基であり、X3はL-スレオニン残基である。ある特定の実施形態では、X2はD-スレオニン残基であり、X3はL-バリン残基であるか、又はX2はD-バリン残基であり、X3はL-スレオニン残基である。
【０１５８】
好ましくは、本発明の第15の態様によるペプチドにおいて、R17及びR18は水素である。
【０１５９】
第16の態様では、本発明は、
X1が、N-末端部分-NR17R18を含むN-末端アミノ酸残基であり、
R17及びR18がそれぞれ水素であり、
X4が、-C(=O)OH、-C(=O)O(C1〜C3アルキル)、-C(=O)NH2、
【０１６０】
【化２７】
2021525736.tif 000028
【０１６１】
から選択されるC-末端部分を含み、
Y5が-OH又は-NH2であり、Y6が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
X2がD-バリン残基であり、
X3がグリシン残基又はL-バリン残基である、式IIIを含むペプチドを提供する。
【０１６２】
本発明の第16の態様によるペプチドは、ペプチドのC-末端に追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、前記追加のL-アミノ酸残基は場合によってグリコシル化されている。好ましくは、本発明の第16の態様のペプチドは、C-末端に、約5個、約8個、約11個、約12個、約20個又は約26個の追加のL-アミノ酸残基を場合によって含む。ペプチドは、場合によってグリコシル化されていてもよい追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、この追加のL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。C-末端は場合によってアミド化されている。
【０１６３】
第17の態様では、本発明は、
X1が、N-末端部分-NR17R18を含むN-末端アミノ酸残基であり、
X4が、-C(=O)OH、-C(=O)O(C1〜C3アルキル)、-C(=O)NH2、
【０１６４】
【化２８】
2021525736.tif 000029
【０１６５】
又はリンカーから選択されるC-末端部分を含み、Y5が-OH又は-NH2であり、Y6が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり
X1が、L-チロシン、2,6-ジメチル-L-チロシン、又はL-フェニルアラニンから選択されるL-アミノ酸残基であり、X1がL-チロシン又は2,6-ジメチル-L-チロシンである場合、残基が、4位において、C1〜C3アルキルで場合によってO-置換されており、
X2がD-アミノ酸残基であり、好ましくはD-スレオニン、D-アラニン、D-バリン、D-ロイシン、又はD-イソロイシン、より好ましくは、D-スレオニン又はD-バリンであり、
X3がグリシン又はL-アミノ酸残基であり、X3がL-アミノ酸残基である場合、X3は、好ましくは、L-スレオニン、L-アラニン、L-バリン、L-ロイシン、又はL-イソロイシンであり、より好ましくはL-スレオニン、又は、L-バリンであり、
X4がD-チロシン又はD-フェニルアラニンから選択されるD-アミノ酸残基であり、X4がD-チロシンである場合、残基が4位において、バイオリバーシブル部分で場合によってO-置換されており、
R17及びR18が、独立して、水素、単結合、又は-C1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
X4がリンカーを含む場合、リンカーが糖部分、好ましくは、二糖部分、例えば、ラクトースを含み、
R17又はR18のうちの1つが単結合の場合、R17及びR18のうちの1つが水素であり、単結合が、N-末端で場合によってアルキル化されていてもよい、好ましくは単独にメチル化されていてもよいL-アミノ酸残基へのペプチド結合であり、
ペプチドがMOPrアゴニストである、式IIIを含む単離ペプチドを提供する。
【０１６６】
本発明の第17の態様によるペプチドは、ペプチドのC-末端に追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、前記追加のL-アミノ酸残基は場合によってグリコシル化されている。好ましくは、本発明の第17の態様のペプチドは、C-末端に、約5個、約8個、約11個、約12個、約20個又は約26個の追加のL-アミノ酸残基を場合によって含む。ペプチドは、場合によってグリコシル化されていてもよい追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、この追加のL-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン、C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。C-末端は場合によってアミド化されている。
【０１６７】
バイオリバーシブル部分を含む本発明の第17の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は任意の当技術分野で公知のものであってよく、これらに限定されないが、カーボネート、カルバメート、イミン、エーテル、エステル、及びアミド部分を含む。バイオリバーシブル部分を含む本発明の第17の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は、糖部分、好ましくは二糖を場合によって含む。
【０１６８】
本発明の第17の態様によるある特定の実施形態では、X2はD-スレオニン残基であり、及び/又はX3はL-スレオニン残基である。ある特定の実施形態では、X2はD-スレオニン残基であり、X3はL-スレオニン残基である。ある特定の実施形態では、X2はD-スレオニン残基であり、X3はL-バリン残基であるか、又はX2はD-バリン残基であり、X3はL-スレオニン残基である。
【０１６９】
本発明の第17の態様によるペプチドにおいて、X4がリンカーを含む場合、リンカーは特に限定されておらず、任意の当技術分野で公知のものであってよい。適切なリンカーとして、アミノ酸ベースリンカー、例えば、これらに限定されないが、単一アミノ酸リンカー、例えば、L-システイン、L-リジン、L-セリン、L-スレオニン等を含めたもの、ペプチドベースリンカー、例えば、これらに限定されないが、L-バリン-L-シトルリン、L-Phe-L-Lys、L-グルタミン酸-L-バリン-L-シトルリン等を含めたもの、アミノ酸を含むリンカー、例えば、これらに限定されないが、バリン-シトルリン-p-アミノカルバメート(VC-PABC)等を含めたもの、及びマレイミドベースリンカー、例えば、これらに限定されないが、マレイミドカプロイル、マレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシレート等を含めたもの、並びにこのようなリンカーの組合せ、例えば、マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノカルバメート、並びにアミノ及びカルボキシ基を含有するリンカー、例えば、6-アミノヘキサン酸等が挙げられる。マレイミドベースリンカーは、マレイミドがL-システインの硫黄に結合するようにL-システイン残基を使用してもよいし、又はマレイミドがL-リジンの窒素に結合するようにL-リジン残基を使用してもよいことを当業者であれば認識されよう。マレイミドベースリンカーを含む実施形態では、ペプチドは、マレイミドベースリンカーに結合しているC-末端のL-システイン残基又はL-リジン残基、例えば、マレイミドカプロイル、マレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシレートを更に含んでもよい。
【０１７０】
本発明の第17の態様によるある特定の実施形態ではR17及びR18のうちの1つは水素であり、R17及びR18のうちの1つは-CH3である。
【０１７１】
好ましくは、本発明の第17の態様によるペプチドにおいて、R17及びR18は水素である。
【０１７２】
第18の態様では、本発明は、式IV
【０１７３】
【化２９】
2021525736.tif 000030
【０１７４】
(式中、N-末端から数えて、第1及び第3のアミノ酸残基はL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基はD-アミノ酸残基であり、
R19若しくはR20のうちの1つは水素であり、R19若しくはR20のうちの1つは糖部分、好ましくは二糖部分を含むバイオリバーシブル部分であるか、又はR19及びR20は、一緒になって、糖部分、好ましくは二糖部分を含むバイオリバーシブル部分を形成し、
R21及びR22は、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R23は、水素、-OH、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R24は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくはCH(CH3)2であり、
R25は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくはCH(CH3)2であり、
R26は、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R27は、-OH、-O(C1〜C3アルキル)、又は-NH2である)を含むペプチドを提供する。
【０１７５】
第18の態様によるペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分は任意の当技術分野で公知のものであってよく、これらに限定されないが、カーボネート、カルバメート、イミン、エーテル、エステル、及びアミド部分を含む。
【０１７６】
第18の態様によるペプチドにおいて、R19又はR20により構成される糖部分は好ましくは二糖部分である。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、第18の態様によるペプチドにおいて、R19又はR20は、グリコシル化されている追加のN-末端L-アミノ酸残基を含み、この追加のN-末端L-アミノ酸残基は、N-グリコシル化されていてもよい残基(N-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-アスパラギン、Lグルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニン、O-グリコシル化されていてもよい残基(O-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリン、S-グリコシル化されていてもよい残基(S-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-システイン;C-グリコシル化されていてもよい残基(C-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-トリプトファン、並びにSe-グリコシル化されていてもよい残基(Se-結合グリコシル化とも呼ばれる)、例えば、L-セレノシステインを含む。ある特定の実施形態では、R19又はR20のうちの1つは、
【０１７８】
【化３０】
2021525736.tif 000031
【０１７９】
であり、Y7は糖部分、好ましくは二糖部分である。
【０１８０】
本発明の第18の態様によるペプチドは、ペプチドのC-末端に追加のL-アミノ酸残基を場合によって含み、前記追加のL-アミノ酸残基は場合によってグリコシル化されている。好ましくは、本発明の第18の態様のペプチドは、C-末端に、約5個、約8個、約11個、約12個、約20個又は約26個の追加のL-アミノ酸残基を場合によって含む。C-末端は場合によってアミド化されている。
【０１８１】
本発明のペプチドの例として、以下が挙げられる:
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe(ペプチド1a、Bilaid A);
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド1e);
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe(ペプチド3a、Bilaid C);
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド3b);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド3c;Bilorphin);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(ペプチド3g;Bilactorphin);
L-Phe-D-Val-Gly-D-Tyr-NH2(ペプチド2d);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(ペプチド4);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Pro-L-Asn-L-Leu-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Ala-L-Leu-L-Lys-L-Ser-L-Leu-NH2(ペプチド11);
N-末端がバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2OC(=O)CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド10);
N-末端がバイオリバーシブル部分
【０１８２】
【化３１】
2021525736.tif 000032
【０１８３】
で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド8);
2,6-ジメチル-L-チロシン上のヒドロキシ基がバイオリバーシブル部分-C(=O)CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド5);
2,6-ジメチル-L-チロシン上のヒドロキシ基がバイオリバーシブル部分-C(=O)CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(ペプチド6);
N-末端がバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド7);及び
N-末端がバイオリバーシブル部分、=N=Nで置換されて、N-末端アジド基を形成する、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド9)。
【０１８４】
本発明のペプチドのさらなる例として以下が挙げられ、
L-AA-L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-リンカー-糖部分;
L-AA-L-Tyr-D-Thr-L-Thr-D-Phe-リンカー-糖部分;
L-AA-L-Dmt-D-Val-L-Val-D-Phe-リンカー-糖部分;
L-AA-L-Dmt-D-Thr-L-Thr-D-Phe-リンカー-糖部分;
式中、L-AAは、少なくとも1つのN-末端-CH3を場合によって含む任意のL-アミノ酸残基であり、
L-Tyr又はL-Dmtのヒドロキシ基は場合によってアルキル化されており、
リンカーは好ましくはL-Ser又はL-Thrである。
【０１８５】
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe(ペプチド1a、Bilaid A)は、
(1)R1、R2、R3、R4、及びR5が水素であり、R6及びR7が-CH(CH3)2であり、R8が-OHである式Iのペプチド、又は
(2)X1がN-末端アミノ酸であり、X1がL-フェニルアラニン残基であり、X2がD-バリン残基であり、X3がL-バリン残基であり、X4がC-末端-C(=O)OH部分を有するD-フェニルアラニン残基であり、X1がN-末端-NR17R18部分(式中、R17及びR18はそれぞれ水素である)を有する式IIIのペプチドである。
【０１８６】
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド1e)は、
(1)R1、R2、R3、R4、及びR5が水素であり、R6及びR7が-CH(CH3)2であり、R8が-NH2である式Iのペプチド、又は
(2)X1がN-末端アミノ酸であり、X1がL-フェニルアラニン残基であり、X2がD-バリン残基であり、X3がL-バリン残基であり、X4がC-末端-C(=O)NH2部分を有するD-フェニルアラニン残基であり、X1がN-末端-NR17R18部分(式中、R17及びR18はそれぞれ水素を有する)を有する式IIIのペプチドである。
【０１８７】
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe(ペプチド3a、Bilaid C)は、
(1)R1、R2、R3、及びR4が水素であり、R5が-OHであり、R6及びR7が-CH(CH3)2であり、R8が-OHである式Iのペプチド、又は
(2)X1がN-末端アミノ酸であり、X1がL-チロシン残基であり、X2がD-バリン残基であり、X3がL-バリン残基であり、X4がC-末端-C(=O)OH部分を有するD-フェニルアラニン残基であり、X1がN-末端-NR17R18部分(式中、R17及びR18はそれぞれ水素である)を有する式IIIのペプチドである。
【０１８８】
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド3b)は、
(1)R1、R2、R3、及びR4が水素であり、R5が-OHであり、R6及びR7が-CH(CH3)2であり、R8が-NH2である式Iのペプチド、又は
(2)X1がN-末端アミノ酸であり、X1がL-チロシン残基であり、X2がD-バリン残基であり、X3がL-バリン残基であり、X4がC-末端-C(=O)NH2部分を有するD-フェニルアラニン残基であり、X1がN-末端-NR17R18部分(式中、R17及びR18はそれぞれ水素である)を有する式IIIのペプチドである。
【０１８９】
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド3c;Bilorphin)は、
(1)R1及びR2が水素であり、R3及びR4が-CH3であり、R5が-OHであり、R6及びR7が-CH(CH3)2であり、R8が-NH2である式Iのペプチド、又は
(2)X1がN-末端アミノ酸であり、X1が2,6-ジメチル-L-チロシン残基であり、X2がD-バリン残基であり、X3がL-バリン残基であり、X4がC-末端-C(=O)NH2部分を有するD-フェニルアラニン残基であり、X1がN-末端-NR17R18部分(式中、R17及びR18はそれぞれ水素である)を有する式IIIのペプチドである。
【０１９０】
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(ペプチド3g;Bilactorphin)は、
(1)R1及びR2が水素であり、R3及びR4が-CH3であり、R5が-OHであり、R6及びR7が-CH(CH3)2であり、及びR8が、
【０１９１】
【化３２】
2021525736.tif 000033
【０１９２】
であり、Y1が-NH2であり、Y2が、二糖ラクトース部分である糖部分であり、このラクトース部分がベータ結合を介して付加している、式Iのペプチド、又は
(2)X1がN-末端アミノ酸であり、X1が2,6-ジメチル-L-チロシン残基であり、X2がD-バリン残基であり、X3がL-バリン残基であり、X4がD-フェニルアラニン残基であり、X1がN-末端-NR17R18部分(式中、R17及びR18はそれぞれ水素である)を有し、X4がC-末端
【０１９３】
【化３３】
2021525736.tif 000034
【０１９４】
を含み、Y5が-NH2であり、Y6が、二糖ラクトース部分である糖部分であり、このラクトース部分がベータ結合を介して付加している、式IIIのペプチドである。
【０１９５】
L-Phe-D-Val-Gly-D-Tyr-NH2(ペプチド2d)は、
(1)R9、R10、R11、R12、及びR13が水素であり、R14が-CH(CH3)2であり、R15が-OHであり、R16-NH2である式IIのペプチド、又は
(2)X1がN-末端アミノ酸であり、X1がL-フェニルアラニン残基であり、X2がD-バリン残基であり、X3がグリシン残基であり、X4がC-末端-C(=O)NH2部分を有するD-チロシン残基であり、X1がN-末端-NR17R18部分(式中、R17及びR18はそれぞれ水素である)を有する式IIIのペプチドである。
【０１９６】
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(ペプチド4)は、
(1)R1及びR2が水素であり、R3及びR4が-CH3であり、R5が-OHであり、R6及びR7が-CH(CH3)2であり、R8が-O(CH2CH3)である式Iのペプチド、又は
(2)X1がN-末端アミノ酸であり、X1が2,6-ジメチル-L-チロシン残基であり、X2がD-バリン残基であり、X3がL-バリン残基であり、X4がC-末端-C(=O)OCH2CH3部分を有するD-フェニルアラニン残基であり、X1がN-末端-NR17R18部分(式中、R17及びR18はそれぞれ水素である)を有する式IIIのペプチドである。
【０１９７】
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Pro-L-Asn-L-Leu-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Ala-L-Leu-L-Lys-L-Ser-L-Leu-NH2(ペプチド11)は、
(1)R1及びR2が水素であり、R3及びR4が-CH3であり、R5が-OHであり、R6及びR7が-CH(CH3)2であり、R8が11個の追加のL-アミノ酸残基であり、C-末端がアミド化している式Iのペプチド、又は
(2)X1がN-末端アミノ酸であり、X1が2,6-ジメチル-L-チロシン残基であり、X2がD-バリン残基であり、X3がL-バリン残基であり、X4がD-フェニルアラニン残基であり、X1がN-末端-NR17R18部分(式中、R17及びR18はそれぞれ水素である)を有し、ペプチドが11個の追加のL-アミノ酸残基を含有し、C-末端がアミド化されている、式IIIのペプチドである。
【０１９８】
N-末端がバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2OC(=O)CH3で置換されている2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド10)は、
(1)R3及びR4が-CH3であり、R5が-OHであり、R6及びR7が-CH(CH3)2であり、R8が-NH2であり、R1若しくはR2のうちの1つが水素であり、R1若しくはR2のうちの1つがバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2OC(=O)CH3である式Iのペプチド、又は
(2)X1がN-末端アミノ酸であり、X1が2,6-ジメチル-L-チロシン残基であり、X2がD-バリン残基であり、X3がL-バリン残基であり、X4がC-末端-C(=O)NH2部分を有するD-フェニルアラニン残基であり、X1がN-末端-NR17R18部分(式中、R17若しくはR182のうちの1つは水素であり、R17若しくはR18のうちの1つはバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2OC(=O)CH3である)を有する式IIIのペプチドである。
【０１９９】
N-末端がバイオリバーシブル部分
【０２００】
【化３４】
2021525736.tif 000035
【０２０１】
で置換されている2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド8)は、
(1)R3及びR4が-CH3であり、R5が-OHであり、R6及びR7が-CH(CH3)2であり、R8が-NH2であり、R1及びR2が一緒になって、バイオリバーシブル部分
【０２０２】
【化３５】
2021525736.tif 000036
【０２０３】
を形成する式Iのペプチド、又は
(2)X1がN-末端アミノ酸であり、X1が2,6-ジメチル-L-チロシン残基であり、X2がD-バリン残基であり、X3がL-バリン残基であり、X4がC-末端-C(=O)NH2部分を有するD-フェニルアラニン残基であり、X1がN-末端-NR17R18部分(式中、R17及びR18が一緒になって、バイオリバーシブル部分
【０２０４】
【化３６】
2021525736.tif 000037
【０２０５】
を形成する)を有する式IIIのペプチドである。
【０２０６】
2,6-ジメチル-L-チロシン上のヒドロキシ基がバイオリバーシブル部分-C(=O)CH3で置換されている2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド5)は、
(1)R1及びR2が水素であり、R3及びR4が-CH3であり、R5がバイオリバーシブル部分-OC(=O)CH3であり、R6及びR7が-CH(CH3)2であり、R8が-NH2である式Iのペプチド、又は
(2)X1がN-末端アミノ酸であり、X1が2,6-ジメチル-L-チロシン残基(4-ヒドロキシルはバイオリバーシブル部分-C(=O)CH3で置換されている)であり、X2がD-バリン残基であり、X3がL-バリン残基であり、X4がC-末端-C(=O)NH2部分を有するD-フェニルアラニン残基であり、X1がN-末端-NR17R18部分(式中、R17及びR18は水素である)を有する式IIIのペプチドである。
【０２０７】
2,6-ジメチル-L-チロシン上のヒドロキシ基がバイオリバーシブル部分-C(=O)CH3で置換されている2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(ペプチド6)は、
(1)R1及びR2が水素であり、R3及びR4が-CH3であり、R5がバイオリバーシブル部分-OC(=O)CH3であり、R6及びR7が-CH(CH3)2であり、R8が-OCH2CH3である式Iのペプチド、又は
(2)X1がN-末端アミノ酸であり、X1が4-ヒドロキシルがバイオリバーシブル部分-C(=O)CH3で置換されている2,6-ジメチル-L-チロシン残基であり、X2がD-バリン残基であり、X3がL-バリン残基であり、X4がC-末端-OCH2CH3部分を有するD-フェニルアラニン残基であり、X1がN-末端-NR17R18部分(式中R17及びR18は水素である)を有する式IIIのペプチドである。
【０２０８】
N-末端がバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2CH3で置換されている2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド7)は、
(1)R3及びR4が-CH3であり、R5が-OHであり、R6及びR7が-CH(CH3)2であり、R8が-NH2であり、R1若しくはR2のうちの1つが水素であり、R1若しくはR2のうちの1つがバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2CH3である式Iのペプチド、又は
(2)X1がN-末端アミノ酸であり、X1が2,6-ジメチル-L-チロシン残基であり、X2がD-バリン残基であり、X3がL-バリン残基であり、X4がC-末端-NH2部分を有するD-フェニルアラニン残基であり、X1がN-末端-NR17R18部分(式中、R17又はR18のうちの1つは水素であり、R17又はR18のうちの1つはバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2CHである)を有する式IIIのペプチドである。
【０２０９】
N-末端がバイオリバーシブル部分、=N=Nで置換されて、N-末端アジド基を形成する2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド9)は、
(1)R3及びR4が-CH3であり、R5が-OHであり、R6及びR7が-CH(CH3)2であり、R8が-NH2であり、R1及びR2が一緒になって、バイオリバーシブル部分=N=Nを形成して、N-末端アジド基を形成する式Iのペプチド、
(2)X1がN-末端アミノ酸であり、X1が2,6-ジメチル-L-チロシン残基であり、X2がD-バリン残基であり、X3がL-バリン残基であり、X4がC-末端-NH2部分を有するD-フェニルアラニン残基であり、X1がN-末端-NR17R18部分(式中、R17及びR18は一緒になって、バイオリバーシブル部分=N=Nを形成して、N-末端アジド基を形成する)を有する式IIIのペプチドである。
【０２１０】
本発明のペプチドが生成される方法は特に限定されておらず、当技術分野で公知の任意の方法であってよい。本発明のペプチドは、周知の溶液相技術又は固相方法を使用して合成することができる。本発明のペプチドは、アミノ酸残基のN-末端がフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)保護基で保護されるFmoc化学反応を使用して合成することができる。当技術分野で公知の方法として、これらに限定されないが、両方とも参照により組み込まれているSchnolzerら、Int J Pept Prot Res (1992年)、40巻:180〜193頁及びAlewoodら、Methods in Enzymology(1997年)、289巻:14〜29頁に記載されている方法が挙げられる。
【０２１１】
本発明のペプチドは、糖部分、例えば単糖、二糖、又は三糖でグリコシル化されていてもよい。好ましくは、糖部分は二糖である。糖部分を本発明のペプチドに結合するための適切な方法は当技術分野で周知である。好ましくは、糖部分はベータ結合で結合される。糖部分が最初にアミノ酸残基に付加し、次いでこれが本発明のペプチドに組み込まれるかどうか、又はアミノ酸が最初に本発明のペプチドに組み込まれ、次いでこれがグリコシル化されるかどうかは重要ではない。アミノ酸残基をグリコシル化し、次いでそのグリコシル化されたアミノ酸残基をペプチドに組み込むのが通常の慣習である。本発明のペプチドは、N-グリコシル化、O-グリコシル化、S-グリコシル化、C-グリコシル化、又はSe-グリコシル化を有する1つ又は複数のアミノ酸残基を含み得る。N-結合グリコシル化には、アミノ酸残基のグリコシル化、例えば、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-ヒスチジン、及びL-アルギニンが含まれる。O-結合グリコシル化には、アミノ酸残基のグリコシル化、例えば、L-セリン、L-スレオニン、L-チロシン、L-ヒドロキシリジン、及びL-ヒドロキシプロリンが含まれる。S-結合グリコシル化には、アミノ酸残基のグリコシル化、例えば、L-システインが含まれる。C-結合グリコシル化には、アミノ酸残基のグリコシル化、例えば、L-トリプトファンが含まれ、Se-結合グリコシル化には、アミノ酸残基のグリコシル化、例えば、L-セレノシステインが含まれる。好ましくは、本発明のペプチドは、O-結合グリコシル化、好ましくはL-セリン残基のO-結合グリコシル化が含まれる。
【０２１２】
本発明の一実施形態では、本発明のペプチドは単糖部分でグリコシル化されている。本発明のペプチドのグリコシル化に適した単糖としてこれらに限定されないが、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒド、アルドトリオース、エリトルロース、エリトロース、トレオース、リブロース、プシコース、キシロース、グルコース(Glc)、フルクトース、マンノース、ガラクトース、フコース、リボース、タガトース、アラビノース、ラムノース、セドヘプツロース(sedoheptalose)及びノノース、例えば、ノイラミン酸、シアル酸が挙げられる。グルコースは好ましい単糖である。
【０２１３】
本発明の一実施形態では、本発明のペプチドは三糖部分でグリコシル化されている。本発明のペプチドのグリコシル化に適した三糖として、これらに限定されないが、マルトトリオース及びラフィノースが挙げられる。
【０２１４】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは二糖部分でグリコシル化されている。本発明のペプチドのグリコシル化に適した二糖として、これらに限定されないが、スクロース、トレハロース、サッカロース、マルトース、ラクトース(Lac)、セロビオース、ゲンチビオース、イソマルトース、メリビオース、及びプリメベロース(primeveose)が挙げられる。本発明のペプチドのグリコシル化に対して好ましい二糖として、ラクトース及びメリビオースが挙げられる。最も好ましくは、二糖はラクトースである。
【０２１５】
本発明のペプチドはMOPrアゴニストである。ペプチドのMOPrアゴニストは、MOPrに選択的に結合し、活性化するペプチドであり、すなわちMOPrアゴニストは、結合した場合、Gタンパク質又は他のセカンドメッセンジャー活性を刺激する。ペプチドは、ホルスコリン誘発性cAMP形成の阻害についてスクリーニングを行うことにより、MOPrのアゴニストとして特定することができる。ホルスコリン阻害アッセイは、これらに限定されないが、MOPr、好ましくは哺乳動物のMOPr、例えば、ネズミMOPr、より好ましくはヒトMOPr(hMOPr)を発現するHEK細胞を含めた、任意の適切な細胞株内で行うことができる。MOPrアゴニスト活性に対するアッセイの他の方法が当技術分野で公知であり、これには、これらに限定されないが、MOPrを発現する細胞内での35S GTP-γ-S結合のシミュレーション(例えば、McPherson Jら、(2010年)、Molecular Pharmacology、78巻:756〜766頁)、MOPrを発現する細胞内での電位依存性カルシウムチャネル流の阻害(例えば、Borgland SLら、(2003年)、J Biol Chem、278巻:18776〜18784頁)又はMOPrを発現する細胞内でのGIRKタイプカリウム流の活性化(例えば、Yousuf Aら、(2015年)、Molecular Pharmacology、88巻:825〜835頁)が含まれる。すべての参考文献は参照により組み込まれている。好ましくは、本発明のペプチドは、hMOPrを使用するホルスコリン阻害アッセイにおいて、約10μMの濃度で、ビヒクルと比較して、cAMP形成の阻害を増加させ、又はMOPrを発現する細胞内でGIRK流を活性化する能力を示している。
【０２１６】
本発明のペプチドはまた、公知のMOPrアゴニスト、好ましくは[3H]DAMGO([D-Ala2、N-MePhe4、Gly5-ol]-エンケファリン)を使用する競合的結合アッセイにおいて、MOPrアゴニスト活性についてスクリーニングすることもできる。競合性MOPr結合は、HEK-293細胞(ヒト胚性腎臓細胞株)内で発現されるヒト組換えMOPrから調製した膜を、[3H]DAMGO(0.5nM)及び様々な濃度の非標識ペプチドと共に、適切な条件下、例えば、22℃で120分間インキュベートした後、濾過分離、これに続いて液体シンチレーションカウンティング手順を使用して決定することができる。受容体への特異的リガンド結合は、全結合と、過剰の非標識オピオイドリガンド、例えば、ナロキソン(10μM)の存在下で決定される非特異結合との間の差異として定義することができる。結果は、目的の非標識ペプチドの存在下で得た対照の特異結合のパーセント((測定された特異結合/対照の特異結合)×100)として表現することができる。IC50値(対照の特異結合の最大半量の阻害を引き起こす濃度)及びHill係数(nH)は、Hill方程式カーブフィッティング(Y=D+[(A-D)/(1+(C/C50nH)](式中、Y=特異結合、D=最小特異結合、A=最大特異結合、C=化合物濃度、C50=IC50、及びnH=スロープ係数)を使用して、平均反復値で作成した競合曲線の非直線回帰分析により決定することができる。好ましくは、本発明のペプチドは、約5μM未満、約3.5μM未満、又は約1μM未満のMOPrに対するKiを示す。より好ましくは、本発明のペプチドは、約0.8μM未満、約0.5μM未満、又は約0.3μM未満のKiを示す。
【０２１７】
同様に、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞株内で発現されるヒト組換えDOPr(hDOPr)への結合の阻害は、22℃で120分間の[3H]DADLE(0.5nM)中でのインキュベーションを使用して評価することができる。同様に、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞株内で発現されるヒト組換えKOPr(hKOPr)への結合は、[3H]U69593(2nM)中で、22℃で60分間のインキュベーションを使用して実施した。
【０２１８】
本発明のペプチドは、偏向性Gタンパク質シグナル伝達を方向づけるこれらの能力についてスクリーニングすることができる。MOPrのC-末端リン酸化、βアレスチン動員及び内在化は、βアレスチンシグナル伝達を回避するGタンパク質偏向性オピオイドが改善された副作用プロファイルを示すことができるように、オンターゲットオピオイド鎮痛剤副作用に寄与すると考えられる。本発明のペプチドは、モルヒネよりもMOPrのC-末端リン酸化のより低い誘発を示すことが好ましい。本発明のペプチドは、モルヒネよりもβアレスチン動員のより低い誘発を示すことが好ましい。本発明のペプチドはモルヒネよりもMOPr内在化のより低い誘発を示すことが好ましい。より好ましくは、本発明のペプチドは、以下のうちの少なくとも2つを示す:MOPrのC-末端リン酸化の誘発がモルヒネより低い、βアレスチン動員の誘発がモルヒネより低い、及びMOPr内在化の誘発がモルヒネより低い。最も好ましくは、本発明のペプチドは、MOPrのC-末端リン酸化の誘発がモルヒネより低い、βアレスチン動員の誘発がモルヒネより低い、及びMOPr内在化の誘発がモルヒネより低いことを示す。
【０２１９】
MOPrのセリン375(Ser375)のアゴニスト誘発性リン酸化は、βアレスチン動員及び内在化を促進する(Williamsら、Pharmacol Rev.、(2013年)65巻(1号):223〜54頁)。本発明のペプチドによるMOPrのセリン375(Ser375)のリン酸化の誘発を決定するアッセイは特に限定されているわけではなく、当技術分野で公知の任意の方法で決定することができる。例えば、MOPrのセリン375(Ser375)のリン酸化を誘発する本発明のペプチドの能力は、Ser375-ホスホサイト特異的抗体、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Justら、「Molecular Pharmacology」(2013年) 83巻(3号): 633〜639頁に記載されているものを使用するアッセイで評価することができる。モルヒネは、Ser375においてMOPrの弱いリン酸化を誘発することが公知であり、本発明のペプチドにより誘発されるSer375でのMOPrのリン酸化を評価するために比較目的で使用することができる。Met-エンケファリン及びエンドモルフィン2は、モルヒネよりも強くSer375においてMOPrのリン酸化を誘発することが公知であり、それぞれを、本発明のペプチドによりSer375において誘発されるMOPrのリン酸化を評価するために比較目的で独立して使用することができる。オリセリジン(TRV130)は確立した、小分子、Gタンパク質偏向性MOPrアゴニストであり、本発明のペプチドにより誘発される、Ser375におけるMOPrのリン酸化を評価するために比較目的で使用することができる。
【０２２０】
MOPr活性化によるβアレスチン動員に対する本発明のペプチドの作用を決定するためのアッセイは特に限定されているわけではなく、当技術分野で公知の任意の方法で決定することができる。例えば、βアレスチン動員に対する本発明のペプチドの作用は、生体発光共鳴エネルギー移動(BRET)アッセイにおいて、MOPr-ルシフェラーゼ(luciferease)及びβアレスチン2-YFP構造体を使用して評価することができる。βアレスチン動員を判定するための市販のキットを使用してもよい。モルヒネはβアレスチン動員を弱く誘発することが公知であり、本発明のペプチドにより誘発されるβアレスチン動員を評価するために比較目的で使用することができる。Met-エンケファリン及びエンドモルフィン2は、βアレスチン動員を、モルヒネよりも強く誘発することが公知であり、それぞれを、本発明のペプチドで誘発されるβアレスチン動員を評価するために比較目的で独立して使用することができる。オリセリジン(TRV130)は、確立した、小分子、Gタンパク質偏向性MOPrアゴニストであり、本発明のペプチドによるβアレスチン動員を評価するために比較目的で使用することができる。
【０２２１】
MOPr内在化に対する本発明ペプチドの作用を決定するためのアッセイは特に限定されているわけではなく、当技術分野で公知の任意の方法で決定することができる。例えば、MOPr内在化に対する本発明のペプチドの作用は、免疫細胞化学的に評価することができる。例えば、MOPrを発現する細胞は、一次抗体で予備標識し、次いで本発明のペプチドで刺激する。刺激後のMOPrの表面発現の変化を、本発明のペプチドで処置していない対応する対照との比較により決定する。モルヒネは弱いMOPr内在化を誘発することが公知であり、本発明のペプチドで誘発されるMOPr内在化を評価するために比較目的で使用することができる。Met-エンケファリン及びエンドモルフィン2は、MOPr内在化をモルヒネより強く誘発することが公知であり、それぞれを、本発明のペプチドで誘発されるMOPr内在化を評価するために比較目的で独立して使用することができる。オリセリジン(TRV130)は、確立した、小分子、Gタンパク質偏向性MOPrアゴニストであり、本発明のペプチドで誘発されるMOPr内在化を評価するために比較目的で使用することができる。
【０２２２】
本発明のペプチドが中枢神経系を浸透する能力(血液脳関門(BBB)の横断とも呼ばれる)を決定するアッセイは特に限定されているわけではなく、当技術分野で公知の任意の方法で決定することができる。例えば、血液脳関門(BBB)を横断するペプチドの能力を評価する方法は、鎮痛評価のin vivoモデルにおいて本発明のペプチドの末梢(例えば、皮下)及び髄腔内注射を比較することであり、これを使用することができる。血液脳関門(BBB)を横断する能力を評価するin vitro方法は公知であり、これらに限定されないが、単一の脳上皮細胞層及びその他を有する半透過性チャンバーを使用する方法を含む。(Wilhelm Iら、Molecular Pharmaceutics (2014年)、11巻(7号):1949〜63頁、参照により組み込まれている)。一実施形態では、本発明のペプチドは血液脳関門を横断する。
【０２２３】
本発明のペプチドのin vivoでの鎮痛作用の評価は特に限定されているわけではなく、当技術分野で公知の任意の方法で決定することができる。鎮痛作用を評価するための公知の方法として、テール払い落とし試験及びホットプレート試験が挙げられ、これら試験において加熱に対する動物の疼痛反応。
【０２２４】
本発明のペプチドは、本発明のペプチドと、少なくとも1種の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物として製剤化され得る。
【０２２５】
好ましくは、本発明は、本発明のペプチドの薬での使用を対象とする。本発明は、医薬における使用のための本発明のペプチドを含む。
【０２２６】
一実施形態では、本発明は、最も広範な意味での疼痛の減少、改善、又は抑制を含む、疼痛の処置を対象とする。ある特定の実施形態では、本発明は、疼痛を処置する方法であって、対象に、本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疼痛を処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、疼痛を処置するための医薬の製造のための、本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含む医薬組成物の使用を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、疼痛を処置する方法における使用のための、本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【０２２７】
本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含む医薬組成物で処置することができる疼痛は、これらに限定されないが、術後疼痛、神経損傷に伴う疼痛、骨折に伴う疼痛、火傷に伴う疼痛、外傷に伴う疼痛、短期、長期、断続的若しくは持続性の体性痛、内臓痛、又は神経障害性疼痛を含む任意の種類の疼痛であってよい。ある特定の実施形態では、本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含む医薬組成物で処置することができる疼痛は、術後疼痛、神経損傷に伴う疼痛、骨折に伴う疼痛、火傷に伴う疼痛、又は外傷に伴う疼痛であってよい。ある特定の実施形態では、本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含む医薬組成物で処置することができる疼痛は、短期、長期、断続的若しくは持続性の体性痛、内臓痛、又は神経障害性疼痛であってよい。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、本発明のペプチドは、鎮痛を届ける方法を対象とする。ある特定の実施形態では、本発明は、鎮痛を届ける方法であって、対象に、本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、鎮痛を届ける方法であって、治療有効量の本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、鎮痛を届けるための医薬の製造のための、本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含む医薬組成物の使用を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、鎮痛を届ける方法における使用のための、本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【０２２９】
「有害な副作用」とは、化合物又は処置が意図した結果以外の医学的に所望しない結果を指す。ある特定の実施形態では、本発明は、オピオイド処置に伴う有害な副作用がより少ないMOPrアゴニストでの疼痛の処置を対象とする。特に、有害な副作用がより少ないMOPrアゴニストは、本発明のペプチドである。ある特定の実施形態では、本発明は、有害な副作用がより少ない、好ましくはモルヒネと比較してより少ない、疼痛を処置する又は鎮痛を届ける方法であって、対象に、本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、有害な副作用がより少ない、好ましくはモルヒネと比較してより少ない、疼痛を処置する又は鎮痛を届ける方法であって、治療有効量の本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、有害な副作用がより少ない、好ましくはモルヒネと比較してより少ない、疼痛を処置する又は鎮痛を届けるための医薬の製造のための、本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含む医薬組成物の使用を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、有害な副作用がより少ない、好ましくはモルヒネと比較してより少ない、疼痛を処置する又は鎮痛を届ける方法における使用のための、本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含む医薬組成物を提供する。MOPrアゴニストを含むオピオイド処置に伴う有害な副作用として、耐性、消化管(GI)阻害及び便秘、呼吸抑制、運動妨害、オピオイド誘発性痛覚過敏、乱用可能性、並びに/又は依存性が挙げられる。好ましくは、本発明のペプチドは、オピオイド処置に伴う1種又は複数の有害な副作用を減少させる。より好ましくは、本発明のペプチドは、オピオイド処置に伴う消化管(GI)阻害及び/又は呼吸抑制を減少させる。有害な副作用の減少を評価する方法は特に限定されるわけではなく、当技術分野で公知の任意の方法で決定することができる。モルヒネの有害な副作用プロファイルは当技術分野で周知である。オピオイド処置に伴う1種又は複数の有害な副作用の減少は、これらに限定されないが、疼痛処置のin vivo動物モデル、消化管(GI)阻害のin vivo動物モデル及び呼吸抑制のin vivo動物モデルを含めた適切なアッセイにおいて、本発明のペプチドの有害な副作用を、モルヒネと比較することにより決定することができる。
【０２３０】
本発明のペプチドは、任意の適切な投与方法に対して製剤化することができる。本発明のペプチドは、非経口的に、局所的に、直腸に、経鼻的に、口腔内頬側に、経膣により、経皮的に、経粘膜に、又は埋め込みリザーバーを介して経口投与することができる。「非経口」という用語は、本明細書で使用される場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内及び脳内の注射又は点滴技術を含む。ある特定の実施形態では、本発明のペプチドは好ましくは注射用に製剤化される。本発明のペプチドが注射用に製剤化される場合、製剤は、皮下、腹腔内に、静脈内、又は髄腔内投与され得る。ある特定の実施形態では、製剤のペプチドは、経口投与用に製剤化される。
【０２３１】
本発明のグリコシル化ペプチドは好ましくは経口投与、注射による投与、又は髄腔内投与用に製剤化される。本発明の非グリコシル化ペプチドは好ましくは経鼻投与又は髄腔内投与用に製剤化される。
【０２３２】
定義
文脈により他に明確に必要とされない限り、明細書及び特許請求の範囲全体にわたり、「含む」、「含んでいる」等の単語は、独占的な意味とは対照的に包括的又は網羅的な意味、すなわち、「を含むが、これらに限定されない」という意味と解釈されるものとする。
【０２３３】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当技術分野の慣習に従い1以内又はそれより多くの標準偏差を意味することができる。代わりに「約」は20%までの範囲を意味することができる。例えば、1〜約35個のアミノ酸残基を更に含むペプチドは、1〜約33個、34個、35個、又は36個の追加のアミノ酸残基を含むペプチドを含む。
【０２３４】
本明細書で使用される場合、「L-アミノ酸」という用語は、アミノ酸のL異性体を指す。当業者であれば、これはアミノ酸のアルファ-炭素の立体化学を指すと理解している。当業者であれば、L-アラニン(L-Ala)、L-バリン(L-Val)、L-ロイシン(L-Leu)、L-イソロイシン(L-Ile)、L-セリン(L-Ser)、L-スレオニン(L-Thr)、L-フェニルアラニン(L-Phe)、L-チロシン(L-Tyr)、L-アスパラギン(L-Asn)、L-グルタミン(L-Gln)、L-ヒスチジン(L-His)、L-リジン(L-Lys)、L-アルギニン(L-Arg)、L-プロリン(L-Pro)、L-システイン(L-Cys)、L-メチオニン(L-Met)、L-トリプトファン(L-Trp)、L-アスパラギン酸(L-Asp)、L-グルタミン酸(L-Glu)、L-セレノシステイン(L-Sec)、L-ヒドロキシリジン(L-Hyl)及びL-ヒドロキシプロリン(L-Hyp)を含む周知の略語に精通している。本明細書で使用される場合、「L-アミノ酸残基」という用語はペプチドに組み込まれたL-アミノ酸を指す。本明細書で使用される場合「L-Dmt」という用語は2,6-ジメチル-L-チロシンを指す。
【０２３５】
本明細書で使用される場合、「D-アミノ酸」という用語は、アミノ酸のD異性体を指す。当業者であれば、これはアミノ酸のアルファ-炭素の立体化学を指すと理解している。当業者であれば、D-アラニン(D-Ala)、D-バリン(D-Val)、D-ロイシン(D-Leu)、D-イソロイシン(D-Ile)、D-セリン(D-Ser)、D-スレオニン(L-Thr)、D-フェニルアラニン(D-Phe)、D-チロシン(D-Tyr)、D-アスパラギン(D-Asn)、D-グルタミン(D-Gln)、D-ヒスチジン(D-His)、D-リジン(D-Lys)、D-アルギニン(D-Arg)、D-プロリン(D-Pro)、D-システイン(D-Cys)、D-メチオニン(D-Met)、D-トリプトファン(D-Trp)、D-アスパラギン酸(D-Asp)、D-グルタミン酸(D-Glu)、D-セレノシステイン(D-Sec)、D-ヒドロキシリジン(D-Hyl)及びD-ヒドロキシプロリン(D-Hyp)を含む周知の略語に精通している。本明細書で使用される場合、「D-アミノ酸残基」という用語は、ペプチドに組み込まれたD-アミノ酸を指す。
【０２３６】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸残基」という用語は、ペプチド内に含まれるアミノ酸を指す。アミノ酸残基のアミノ及び/又はカルボキシル基はペプチド結合の一部となる。当業者であれば、ペプチドのN-末端又はC-末端は、ペプチドとさらなるアミノ酸との間にペプチド結合を形成することにより、さらなるアミノ酸残基を添加することで延長することができることを理解している。
【０２３７】
本発明のペプチドについて言及すると、ペプチド内に含まれるアミノ酸又はアミノ酸残基は、周知の単一文字のアミノ酸コード又は「L-」又は「D-」指定を有する3文字のアミノ酸コードで言及されている。当業者であれば、アミノ酸グリシンのアルファ炭素は非対称ではないのでグリシンは、3文字コードでGlyと命名されることを理解している。例えば、「L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe」は、L-フェニルアラニン-D-バリン-L-バリン-D-フェニルアラニンからなるテトラペプチドを指す。代わりに、周知の単一文字アミノ酸コードを使用する本発明のペプチドについて言及すると、D又はL立体化学は、L-アミノ酸残基を意味する大文字及びD-アミノ酸残基を意味する小文字を使用することにより区別されている。例えば、FvVfは、L-フェニルアラニン-D-バリン-L-バリン-D-フェニルアラニンからなるテトラペプチドを指す。アミノ酸グリシンは単一文字コード内に非対称アルファ炭素原子を有さないので、これは大文字Gで命名される。C-末端が修飾されていないペプチド、C-末端カルボキシル基(-C(=O)OH部分)を有するペプチドと、C-末端がアミド化で修飾されているペプチドとを区別するため、C-末端アミド基(-C(=O)NH2部分)を有するペプチドは、すなわち、単一アミノ酸コード及び3文字コードの両方においてこのペプチドは、末端-NH2と共に、例えば、FvVf-NH2及びL-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2のように示されて、C-末端がアミド化されていることを示す。対照的に、C-末端が修飾されていない場合、ペプチドは、末端-OHと共に、又は末端-OHなしで、例えば、FvVf-OH若しくはFvVf、又はL-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe若しくはL-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-OHと表すことができる。
【０２３８】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸の側鎖」という用語は、β原子から開始するアミノ酸若しくはアミノ酸残基の一部を指す。当業者であれば、アミノ酸の構造に精通しており、このアミノ酸の構造は、H2N-CαH(Raa)-C(=O)OH(式中、Raaはアミノ酸の側鎖である)と表すことができる。「アミノ酸の側鎖」という用語が「D」又は「L」立体化学を有するアミノ酸残基という言及と共に使用された場合、当業者であれば、アミノ酸グリシンの側鎖は除外される、すなわち、Raaが水素の場合、アミノ酸グリシンは非対称でないのでアミノ酸グリシンの側鎖は除外されることを理解している。本発明のペプチドにおいて、アミノ酸の側鎖は、自然発生の及び非自然発生のアミノ酸の側鎖を含む。好ましくは、側鎖は、これらに限定されないが、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、ノルロイシン、及びイソロイシンの側鎖を含む疎水性アミノ酸の側鎖である。
【０２３９】
本明細書で使用される場合、「単糖」という用語は、塩基性の炭水化物単位を指す。本明細書で使用される場合、「単糖部分」という用語は本発明のペプチドに結合している単糖を指す。本発明のペプチドのグリコシル化に適した単糖として、これらに限定されないが、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒド、アルドトリオース、エリトルロース、エリトロース、トレオース、リブロース、プシコース、キシロース、グルコース(Glc)、フルクトース、マンノース、ガラクトース、フコース、リボース、タガトース、アラビノース、ラムノース、セドヘプツロース及びノノース、例えば、ノイラミン酸、シアル酸が挙げられる。好ましい単糖はグルコースである。
【０２４０】
本明細書で使用される場合、「二糖」という用語は、2個の単糖がグリコシド結合により結合される際に形成される炭水化物を指す。本明細書で使用される場合、「二糖部分」という用語は、本発明のペプチドに結合している二糖を指す。本発明のペプチドのグリコシル化に適した二糖として、これらに限定されないが、スクロース、トレハロース、サッカロース、マルトース、ラクトース(Lac)、セロビオース、ゲンチビオース、イソマルトース、メリビオース、及びプリメベロースが挙げられる。本発明のペプチドのグリコシル化に好ましい二糖として、ラクトース及びメリビオースが挙げられる。ある特定の実施形態では、二糖はラクトースである。
【０２４１】
本明細書で使用される場合、「三糖」という用語は、3個の単糖が2つのグリコシド結合で結合される際に形成される炭水化物を指す。本明細書で使用される場合、「三糖部分」という用語は、本発明のペプチドに結合している三糖を指す。本発明のペプチドのグリコシル化に適した三糖として、これらに限定されないが、マルトトリオース及びラフィノースが挙げられる。
【０２４２】
本明細書で使用される場合、「糖部分」という用語は、本発明のペプチド結合している単糖、二糖、又は三糖を指す。好ましくは、糖部分は、O-結合グリコシル化及びベータ結合により本発明のペプチドに結合している。本明細書で使用される場合、糖部分を含む本発明のペプチドは代わりに、グリコシル化を含むペプチド又はグリコシル化ペプチドと呼ぶこともできる。
【０２４３】
本明細書で使用される場合、「バイオリバーシブル部分」という用語は、本発明のペプチドに付加している部分を指し、この部分は、in vivo投与の際に、例えば、血中加水分解により、細胞内の代謝により、又は脳脊髄液内で、又はこれら経路の併用により、代謝され、さもなければ変換されて、本発明のペプチドの生物学的、薬学的又は治療的に活性形態となる。本発明のペプチドに適したバイオリバーシブル部分として、これらに限定されないが、カーボネート、カルバメート、イミン、エーテル、エステル、及びアミド部分が挙げられる。本発明のペプチドにおいて、ペプチドのN-末端上で置換されているバイオリバーシブル部分として、これらに限定されないが、
【０２４４】
【化３７】
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【０２４５】
(イミン部分)又は=N=N(アジド部分)、-C(=O)OZ(1、3、又は5)又は-C(=O)OCH2OC(=O)Z(2、4、又は6)が挙げられる。ペプチドのN-末端窒素は、基に結合していると理解されている。Z(1、3、又は5)は、C1〜C6アルキル又はアリールの基、好ましくは-CH2CH3である。Z(2、4、又は6)は、C1〜C6アルキル又はアリールの基、好ましくは-CH3基である。本発明のペプチドにおいて、バイオリバーシブル部分はL-チロシン又は2,6-ジメチル-L-チロシンのヒドロキシ上で置換されていてもよく、及び、これらに限定されないが、-C(=O)Z(7)を含む。Z(7)は、C1〜C6アルキル又はアリール、好ましくは-CH3である。
【０２４６】
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、及びシクロアルキル(脂環式)基を含めた飽和脂肪族基の基を指す。ある特定の実施形態では、アルキル部分は、当技術分野で公知の任意の方法で場合によってグリコシル化されている。アルキル部分がグリコシル化されている実施形態では、アルキル部分は、炭化水素骨格の1個又は複数の炭素上で水素を置き換えている置換基を有することにより、グリコシル化を可能にしていることが理解されている。本明細書で使用される場合、「アルキル化」又は「アルキル化された」等の用語は、ペプチドのN-末端及び/又はアミノ酸残基との関連では、1つ又は両方のN-末端水素をアルキル基で置き換えることを指し、-OH基との関連では、水素をアルキル基、例えば、メチル(「メチル化された」「メチル化」)、エチル(「エチレート化された」「エチル化」)等で置き換えることを指す。単独にアルキル化された又は単一アルキル化等は、ペプチド又はアミノ酸残基のN-末端水素のうちの1個をアルキル基で置き換えることを指す。単独にメチル化するとは、N-末端水素の1個を-CH3で置き換えることを指す。
【０２４７】
本明細書で使用される場合、「アリール」という用語は、0〜4個のヘテロ原子を含んでもよい5員、6員及び7員の単環の芳香族基、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン及びピリミジン等を含む。ある特定の実施形態では、アリールは当技術分野で公知の任意の方法で場合によってグリコシル化されている。
【０２４８】
ここで使用されているように、「リンカー」という用語は、当技術分野で公知の任意の適切なリンカーを指す。適切なリンカーとして、アミノ酸ベースリンカー、例えば、これらに限定されないが、単一アミノ酸リンカー、例えば、L-システイン、L-リジン、L-セリン、L-スレオニン等を含めたもの、ペプチドベースリンカー、例えば、これらに限定されないが、L-バリン-L-シトルリン、L-Phe-L-Lys、L-グルタミン酸-L-バリン-L-シトルリン等を含めたもの、アミノ酸を含むリンカー、例えば、これらに限定されないが、バリン-シトルリン-p-アミノカルバメート(VC-PABC)等を含めたもの、及びマレイミドベースリンカー、例えば、これらに限定されないが、マレイミドカプロイル、マレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシレート等を含めたもの、並びにこのようなリンカーの組合せ、例えば、マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノカルバメート、並びにアミノ基及びカルボキシ基を含有するリンカー、例えば、6-アミノヘキサン酸等が挙げられる。マレイミドベースリンカーは、マレイミドがL-システインの硫黄に結合するようにL-システイン残基を使用してもよいし、又はマレイミドがL-リジンの窒素に結合するようにL-リジン残基を使用してもよいことを当業者であれば認識されよう。マレイミドベースリンカーを含む実施形態では、ペプチドは、マレイミドベースリンカーに結合しているC-末端のL-システイン残基又はL-リジン残基、例えば、マレイミドカプロイル、マレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシレートを更に含んでもよい。本明細書に開示されているペプチドにおいて、リンカーは糖部分を更に含む。
【０２４９】
本明細書で使用される場合、「選択的MOPrアゴニスト」という用語は、関連するκ-オピオイド(KOPr)及び/又はδ-オピオイド(DOPr)サブタイプのうちの少なくとも1つよりも、MOPrに対して選択的であるアゴニストを指す。MOPrアゴニストの選択性は、当技術分野で周知の方法により決定することができる。1つの例示的な方法では、MOPr、好ましくはhMOPrに対するペプチドのKiは、[2H]DAMGOとの競合的結合アッセイにおいて、及び(2)DOPr、好ましくはヒトDOPr(hDOPr)に対する同じペプチドのKi(これは[3H]DADLEとの競合的結合アッセイで決定することができる)と比較して、及び/又は(3)KOPr、好ましくはヒトKOPr(hKOPr)に対する同じペプチドのKi(これは[3H]U69593との競合的結合アッセイで決定することができる)と比較して決定することができる。MOPrアゴニストである本発明のペプチドはまた選択的MOPrアゴニストであってもよい。好ましくは、本発明のペプチドは、κ-オピオイド(KOPr)又はδ-オピオイド(DOPr)のうちの少なくとも1つよりもMOPrに対して選択的であるMOPrアゴニストである。より好ましくは、本発明のペプチドは、κ-オピオイド(KOPr)及びδ-オピオイド(DOPr)の両方よりもMOPrに対して選択的であるMOPrアゴニストである。最も好ましくは、本発明のペプチドはKOPrよりもMOPrに対して50倍の選択性及び/又はDOPrよりもMOPrに対して50倍の選択性を示す。
【０２５０】
本明細書で使用される場合、Gタンパク質偏向性MOPrアゴニストという用語は、Gタンパク質共役受容体(GPCR)を差次的にアゴナイズして、異なる下流シグナル伝達経路とカップリングするペプチドを指す。Gタンパク質偏向性MOPrアゴニストペプチドは、Gタンパク質対βアレスチン動員を介したシグナル伝達の増加を示す。偏向性Gタンパク質ペプチドを評価するためのアッセイは当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、Gタンパク質活性化アッセイ、MOPrのC-末端リン酸化、βアレスチン動員、及び/又はMOPr内在化の比較が挙げられる。ペプチドのGタンパク質偏向性は、MOPrのC-末端リン酸化アッセイにおいてモルヒネ(モルヒネはSer375においてMOPrを弱くリン酸化することが知られている)、エンドモルフィン-2(エンドモルフィン-2はSer375においてMOPrを強くリン酸化することが知られている)、及び/又はmet-エンケファリン(met-エンケファリンはSer375においてMOPrを強くリン酸化することが知られている)と比較することができる。ペプチドのGタンパク質偏向性は、βアレスチン動員アッセイにおいてモルヒネ(モルヒネはβアレスチン動員を弱く誘発することが知られている)、エンドモルフィン-2(エンドモルフィン-2はβアレスチン動員を強く誘発することが知られている)、及び/又はmet-エンケファリン(met-エンケファリンはβアレスチン動員を強く誘発することが知られている)と比較することができる。ペプチドのGタンパク質偏向性は、MOPr内在化アッセイにおいて、モルヒネ(モルヒネはMOPr内在化を弱く誘発することが知られている)、エンドモルフィン-2(エンドモルフィン-2はMOPr内在化を強く誘発することが知られている)、及び/又はmet-エンケファリン(met-エンケファリンはMOPr内在化を強く誘発することが知られている)と比較することができる。ペプチドのGタンパク質偏向性は、Gタンパク質活性化アッセイにおいてモルヒネ、エンドモルフィン-2、及び/又はmet-エンケファリン(それぞれ、Gタンパク質を活性化することが知られている)と比較することができる。好ましくは、本発明のペプチドは、モルヒネと比較して、MOPrのC-末端リン酸化対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示し、及び/又はβアレスチン動員対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示し、及び/又はMOPr内在化対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す。
【０２５１】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、任意の担体、賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤、又は医薬組成物における使用に対して当技術分野で周知の他の物質を包含する。組成物に使用するための賦形剤の選択は、組成物に対して意図される投与経路に依存する。これらの物質を含有する薬学的に許容される賦形剤及び組成物の調製は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第22版、University of the Sciences in Philadelphia編、Lippincott、Williams & Wilkins、Philadelphia Pa.、2012年に記載されている。
【０２５２】
本明細書で使用される場合、「対象」又は「それを必要とする対象」という用語は、例えば、飼育動物、例えば、ヒツジ、ブタ、雌ウシ、及びウマ;ペット動物、例えば、イヌ及びネコ;実験動物、例えば、ラット、マウス及びウサギ、並びにヒトを含む哺乳動物を指す。好ましくは、対象はイヌ、ネコ、又はヒトである。より好ましくは、対象はヒトである。
【０２５３】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医学博士又は他の臨床医による探究が行われている、それを必要とする対象の生物学的な又は医学的応答を導き出す本発明のペプチド又は本発明のペプチドを含む医薬組成物の量を意味する。
【０２５４】
本発明の実施形態は、以下の通り添付の図を参照して、例示としてのみここに記載される。
【図面の簡単な説明】
【０２５５】
【図１】競合的結合アッセイを示している。MOPrアゴニスト[3H]DMAGOに対抗するhMOPrへの競合的結合についてペプチド[YvVf-OH(3a)、YvVf-NH2(3b)、[Dmt]-vVf-NH2(3c)]を試験した。DOPrアゴニスト[3H]DADLEに対抗するhDOPrへの競合的結合について、KOPrアゴニスト[3H]U69593に対抗するhKOPrへの競合的結合について、[Dmt]-vVf-NH2(3c)を試験した。図中の記号:hMOPr:YvVf-OH(3a)丸に×;YvVf-NH2(3b)二重丸、[Dmt]-vVf-NH2(3c)大きな丸;DOPr:[Dmt]-vVf-NH2(3c)丸に*;KOPr:[Dmt]-vVf-NH2(3c)丸に+。
【図２】図2A: met-エンケファリン(1μM)、[Dmt]-vVf-NH2(3c、Bilorphin)(1μM)、及びMOPr選択的アンタゴニスト、CTAP((D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr-NH2)(1μM)の同時適用によるその逆転に応答してラットLCニューロンから記録されたGIRK流の例を示している。スケールバー:50pA、5分。図2B:最大脱感作濃度のmet-エンケファリン(10μM、10分;図2Aと同じスケール)で誘起されたGIRK流に対する[Dmt]-vVf-NH2(3c、Bilorphin)(1μM)の部分的アンタゴニスト作用を示している。
【図３】各細胞(1データ点当たりN=4〜13個の細胞)内に、プローブとして適用した1μMmet-エンケファリンに正規化した、LCニューロンにおけるGIRK流の活性化に対する例示的オピオイドと[Dmt]-vVf-NH2(3c、Bilorphin)とのアゴニスト濃度-応答関係を示している。[Dmt]-vVf-NH2(3c、Bilorphin、丸に*)を、met-エンケファリン(丸に×)、モルヒネ(丸に+)、及びエンドモルフィン-2(二重丸)と比較。
【図４】不可逆的MOPrアンタゴニストβ-クロルナルトレキサミン(β-CNA)による一部分の受容体のアルキル化後の、ソマトスタチン(SST)に応答してmMOPrを発現するAtT20細胞におけるGGIRKの例示的な記録と示されるオピオイドの濃度及びバーの期間を示している。スケールバー0.2ns、1分。
【図５】met-エンケファリンへの最大応答を、ソマトスタチン(SST)でもたらされる応答の80%までもたらすように、β-CNA前処理により予備受容体を減少させた後の、AtT20細胞内のオピオイド誘発性GGIRKの濃度-応答曲線を示している。[Dmt]-vVf-NH2(3c、Bilorphin、丸に*(紫))を、met-エンケファリン(丸×)、モルヒネ(丸に+)、エンドモルフィン-2(二重丸)及びオリセリジン(大きな丸)と比較。FLAGタグを付けたマウスMOPr(mMOPr)を安定的に発現するAtT20細胞内のパッチクランプ記録。
【図６】[Dmt]-vVf-NH2(3c、Bilorphin)によるC-末端リン酸化誘発を、ホスホサイト特異的抗体を使用して、met-エンケファリン、モルヒネ、及びエンドモルフィン-2ホスホサイトと比較したものを示している。5分間のインキュベーション後、飽和濃度(30μM)のmet-エンケファリン、エンドモルフィン2、モルヒネ及びbilorphinにより誘発させた、AtT20細胞内のセリン375リン酸化の代表的画像である。提示目的のために色を均一に増強した。
【図７】MOPr-ルシフェラーゼ及びβ-アレスチン2-YFP構造体により決定される、[Dmt]-vVf-NH2(3c、Bilorphin)で誘発させたβアレスチン動員を、met-エンケファリン、モルヒネ、及びエンドモルフィン-2と比較している。リガンド誘発性BRETシグナル(535nm/475nmの光の放射)の時間経過は、アゴニスト曝露(矢印で示す)後のβアレスチン2の動員を示している。バンドは、独立して6回繰り返した実験の標準誤差を表す(各実験は3回行った)。
【図８】MOPr内在化を示している。30μMのアゴニストによる処置から30分後のMOPr内在化の例示的画像である。定量化のために二重染色を利用した(膜受容体を緑色(薄い灰色として現れる)及び内在化した受容体を赤色(濃い灰色として現れる)として、色は提示目的のために均一に増強した)。
【図９】GIRKチャネル活性化、セリン375リン酸化、βアレスチン2動員及び正規化した内在化について、エンドモルフィン2、モルヒネ及びbilorphinの最大効力値をmet-エンケファリンと比較して示している。[Dmt]-vVf-NH2(3c、Bilorphin)は、モルヒネ、及びエンドモルフィン-2、及びmet-エンケファリンと比較して、最前面から後方へと順番に提示した。
【図１０】GRK2-YFPを発現する細胞内でのMOPr内在化を示している。パネルC)の通り、GRK2(黄色(灰色として現れる))とβアレスチン2の両方を過剰発現する細胞内の、オリセリジン、bilorphin及びモルヒネにより生成される増強した内在化(緑色(薄い灰色として現れる)及び赤色(濃い灰色として現れる))の例である。
【図１１Ａ】GRK2とβアレスチン2の両方を一時的にトランスフェクトした(2つの実験からのn=40個の細胞)細胞内での各アゴニストに対する内在化を示している(緑色/[緑色+赤色]チャネルにおける蛍光の比率)。
【図１１Ｂ】bilorphinに対して、met-エンケファリンに対して正規化したGGIRK最高点(図5から)、Met-エンケファリンに対して正規化した内在化(図11Aから)から計算した偏向比は、オリセリジン(olicerideine)及びモルヒネの両方よりも大きなGタンパク質偏向性があることを示している。
【図１１Ｃ】GRK2とβアレスチン2の両方を一時的にトランスフェクトした細胞(緑色/[緑色+赤色]チャネルにおける蛍光比)内での各アゴニストに対する内在化を示している(n=5の実験、それぞれ10個超の細胞)。
【図１１Ｄ】bilorphinに対して、met-エンケファリンに対して正規化したGGIRK最高点(図5から)、及びMet-エンケファリンに対して正規化した内在化(図11Cから)から計算した偏向比は、オリセリジン及びモルヒネの両方よりもより大きなGタンパク質偏向性があることを示している。
【図１２】[Dmt]-vVf-NH2(3c、Bilorphin)の類似体のin vivo鎮痛アッセイにおいて、皮下投与し、ナルトレキソンにより拮抗させた後、[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g、Bilactorphin)は、54℃ホットプレート上でマウスに用量依存性鎮痛をもたらした。μmol/kgでの用量が括弧に示されている(ナルトレキソン[n=4]を除いて1データ点当たりn=7〜12)。ビヒクル(丸と=)、モルヒネ(丸と+)、[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g、Bilactorphin(14μmol/kg、丸と星1個(*);28μmol/kg、丸と星2個(**);56μmol/kg、丸と星3個(***);112μmol/kg、丸と星4個(****));[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g、Bilactorphin)とナルトレキソン(丸と×)。
【図１３】末梢に投与した[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g、Bilactorphin)は、ホットプレート試験(n=5〜12)で、モルヒネと等しい効力を有した。[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g、Bilactorphin、大きな丸(濃い灰色))及びモルヒネ(丸に×(薄い灰色))。
【図１４】[Dmt]-vVf-NH2(3c、Bilorphin)及び[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g、Bilactorphin)及びモルヒネに応答した、MOPrを発現するAtT20細胞内でのGIRK流の時間経過を、1μMソマトスタチンのプローブと比べて示している代表的トレースである。スケールバーは0.2nS及び1分を表す。
【図１５】個々の細胞内にプローブとして適用した1μMソマトスタチンに正規化させた[Dmt]-vVf-NH2(3c、Bilorphin、丸に×)及び[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g、Bilactorphin、大きな丸)で誘発させたカリウムコンダクタンスの濃度応答曲線を示している。
【図１６】GRK2過剰発現後(膜及び正規化したMOPrをそれぞれ緑色(薄い灰色として現れる)及び赤色(濃い灰色として現れる)で、GRK2を黄色で)、30μM[Dmt]-vVf-NH2(3c、Bilorphin)及び[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g、Bilactorphin)で誘発させたMOPr内在化の例示的画像である。
【図１７】met-エンケファリン(アゴニストの30μM曝露)と比較した、モルヒネ(緑色)、[Dmt]-vVf-NH2(3c、Bilorphin、紫)及び[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g、Bilactorphin、濃緑色)の受容体内在化を生じる最大効力値である。各セットに対して、モルヒネは左側、bilprophinは中央、及びbilactorphinは右側である。
【図１８】MDシミュレーションからの[Dmt]-vVf-NH2(3c、Bilorphin)(A及びB)及びエンドモルフィン-2(C及びD)の予測される結合ポーズである。図18A及び18C:bilorphin(濃い灰色)(18A)及びエンドモルフィン-2(薄い灰色)(18C)の予測される結合ポーズ、並びに分子ドッキング及び1μsのMDシミュレーション後に得た、周辺の結合ポケット残基(最も薄い灰色)の位置である。リガンドのプロトン化アミンとAsp1473.32との間の塩の架橋は破線の黒線として印が付けられている。わかりやすくするためにTM7は除去している。図18B及び図18D:bilorphin(濃い灰色)(18B)、及びエンドモルフィン-2(薄い灰色)(18D)の予測される結合ポーズの代替のビューポイント(18A/18C)、並びに分子ドッキング及び1μsのMDシミュレーション後に得た、周辺の結合ポケット残基(最も薄い灰色)の位置である。リガンドのプロトン化アミンとAsp1473.32との間の塩架橋は、破線の黒線として印が付けられている。わかりやすくするために、今回TM4は除去している。
【図１９】[Dmt]-vVf-NH2(3c、Bilorphin)(A)及びエンドモルフィン-2(B)のRMSDプロットである。図19A:最初のドッキングポーズと比較して、bilorphinの重原子についてRMSD計算を実施し(濃い灰色)、MDシミュレーションの最初の枠と比較して、受容体膜貫通ドメインのアルファ炭素についてRMSD計算を実施した(薄い灰色)。図19B:最初のドッキングポーズと比較して、エンドモルフィン-2の重原子についてRMSD計算を実施し(薄い灰色)、MDシミュレーションの最初の枠と比較して、受容体膜貫通ドメインのアルファ炭素についてRMSD計算を実施した(灰色)。差し込み図:Phe4の3つの異なる位置を示す、MDシミュレーション中のエンドモルフィン-2におけるPhe4の変動を示している。
【図２０】図20A:bilorphin-MOPr複合体(濃い灰色)及びエンドモルフィン-2-MOPr複合体(薄い灰色)に対するリガンド-残基相互作用のフィンガープリントを示している。データは、各残基がリガンドの4.5Å内にあるシミュレーション時間のパーセンテージとして表現され、ポイントは0%から100%へと20%ずつ増加させながら外向きに放射状に広がっている。図20B:各シミュレーション時間点において、受容体構造をPC1及びPC2に投影する前に、受容体膜貫通ドメインのアルファ炭素に対して主成分分析を実施した。bilorphin-MOPr複合体は紫色、エンドモルフィン-2-MOPr複合体はオレンジ色であり、黒点はペプチドがドッキングした不活性MOPrモデルの構造を示している。
【図２１】PC1の極限を表す抽出構造は、bilorphin-MOPr複合体(濃い灰色)と、エンドモルフィン-2-MOPr複合体(薄い灰色)との間の立体配座の差異を実証している。ループは、画像から除去して、PCAを実施した受容体の一部のみを表している。白色の矢印は、bilorphin結合からエンドモルフィン-2結合MOPrへと移動するヘリックスの構造変化を示している。
【図２２】CASTpを使用したオルトステリック結合部位の量の計算は、結合ポケットが、エンドモルフィン2-MOPr複合体(薄い灰色)と比較して、bilorphin-MOPr複合体(濃い灰色)に対してより大きいことを示した。各シミュレーションの最終100nsにわたり平均した構造に対してCASTp計算を実施した。
【図２３Ａ−Ｄ】各シグナル伝達におけるアゴニストの最大作用及びGタンパク質活性化に対する偏向性対他の経路の計算:図23A: GIRKの活性化に対する非正規化した最大効力(±S.E.M.)、図23B: Ser375リン酸化、図23C:βアレスチン2動員、及び図23D:内在化。これは、図9に提示されている比率を計算するため、及びEのΔ正規化EMaxの計算のために使用され、又はFの作業用モデルに含まれている。E及びFに表示されたデータは平均値であり、95%信頼区間である。Met-エンケファリンは最も薄い灰色、エンドモルフィン2は濃い灰色、モルヒネは薄い灰色で示され、bilorphin(ペプチド3c、[Dmt]-vVf-NH2)は最も濃い灰色で示されている。
【図２３Ｅ】各シグナル伝達におけるアゴニストの最大作用及びGタンパク質活性化に対する偏向性対他の経路の計算:図23A: GIRKの活性化に対する非正規化した最大効力(±S.E.M.)、図23B: Ser375リン酸化、図23C:βアレスチン2動員、及び図23D:内在化。これは、図9に提示されている比率を計算するため、及びEのΔ正規化EMaxの計算のために使用され、又はFの作業用モデルに含まれている。E及びFに表示されたデータは平均値であり、95%信頼区間である。Met-エンケファリンは最も薄い灰色、エンドモルフィン2は濃い灰色、モルヒネは薄い灰色で示され、bilorphin(ペプチド3c、[Dmt]-vVf-NH2)は最も濃い灰色で示されている。
【図２３Ｆ】各シグナル伝達におけるアゴニストの最大作用及びGタンパク質活性化に対する偏向性対他の経路の計算:図23A: GIRKの活性化に対する非正規化した最大効力(±S.E.M.)、図23B: Ser375リン酸化、図23C:βアレスチン2動員、及び図23D:内在化。これは、図9に提示されている比率を計算するため、及びEのΔ正規化EMaxの計算のために使用され、又はFの作業用モデルに含まれている。E及びFに表示されたデータは平均値であり、95%信頼区間である。Met-エンケファリンは最も薄い灰色、エンドモルフィン2は濃い灰色、モルヒネは薄い灰色で示され、bilorphin(ペプチド3c、[Dmt]-vVf-NH2)は最も濃い灰色で示されている。
【図２４Ａ】経口のbilactorphin及びモルヒネの抗侵害受容性作用である。[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g、Bilactorphin)及びモルヒネの強制経口投与に対する、ホットプレート潜時についての時間-応答(平均値±SEM)を示している。ビヒクル(大きな丸);モルヒネ(丸と+);[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g、Bilactorphin)(100μmol/kg、6、丸と星1個(*);300μmol/kg、6、丸と星2個(**);1000μmol/kg、6、丸と星3個(***))。
【図２４Ｂ】図24Aに示されている強制投与から300分後の、各動物に対する完全な時間-応答データの曲線下面積(AUC)を示している。AUCデータの普通の一元ANOVAは、100μmol/kgを超えるすべての用量のbilactorphinと、モルヒネ90μmol/kgとの間の統計学的に有意な差異を明らかにした。
【図２５】bilaids、bilorphin、及びbilactorphinの構造を以下に示す。L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe(ペプチド1a、Bilaid A);L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド1e);L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe(ペプチド3a、Bilaid C);L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド3b);2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド3c;Bilorphin);及び2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(ペプチド3g;Bilactorphin)。
【図２６−１】図２６。Bilaid Cの類似体は以下のペプチドを含む。2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(ペプチド4);2,6-ジメチル-L-チロシン上のヒドロキシ基がバイオリバーシブル部分-C(=O)CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド5);2,6-ジメチル-L-チロシン上のヒドロキシ基がバイオリバーシブル部分-C(=O)CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(ペプチド6);N-末端がバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド7);N-末端がバイオリバーシブル部分
【化３８】
2021525736.tif 000039
で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド8);
N-末端がバイオリバーシブル部分、=N=Nで置換されて、N-末端アジド基を形成する、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド9);
N-末端がバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2OC(=O)CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド10);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Pro-L-Asn-L-Leu-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Ala-L-Leu-L-Lys-L-Ser-L-Leu-NH2(ペプチド11);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(ペプチド3g;Bilactorphin);及び
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-D-Glc)-NH2(ペプチド3h)。
【図２６−２】図２６の続き。
【図２６−３】図２６の続き。
【図２６−４】図２６の続き。
【図２７】各ペプチド又は生理食塩水の皮下注射から5、10、20、30及び60分間後に測定されたホットプレート応答に対して、1時間にわたる曲線下の積分値(AUC応答(秒)×時間(分))として提示された、標識されたペプチドの抗侵害受容性応答を示している。アスタリスクは、生理食塩水とは有意に異なるAUC応答を示している(フィッシャーのLSDポスト-hoc試験を用いた一元ANOVA)。
【図２８】DAMGOを用いたCryo-EM構造及びMolecular Dynamicsシミュレーション:図28A:MOPr-Gi複合体のcryo-EM構造におけるDAMGOの結合ポーズを示している(Koehl、Nature、(2018年) 558巻: 547〜552頁)。DAMGOは濃い灰色で示されており、周辺の結合ポケット残基及び受容体ヘリックスは薄い灰色で示されている。図28B:BUDEとのドッキング後のDAMGOの予測された結合ポーズ及び不活性MOPr構造から出発する1μsMDシミュレーションを示している(Manglik、Nature、(2012年)485巻:321〜326頁.)DAMGOは中程度の灰色で、周辺の残基及びヘリックスは薄い灰色で示されている。Koehl、Nature、(2018年) 558巻: 547〜552頁は、MDシミュレーションにおいて、DAMGOのC-末端部分の弱い分離及びこの領域の高い柔軟性を報告した。この柔軟性のあるC-末端エタノールアミンを取り除くと、cryo-EM構造内のDAMGOのすべての重原子と、1μsMD後の発明者らによる最終ポーズにおけるDAMGOのすべての重原子との間のRMSDは2.83Åであった。よって、cryo-EM構造及びモデルにおけるDAMGO-MOPr相互作用は実質的には同一であった。
【発明を実施するための形態】
【０２５６】
本発明の実施形態は以下の通りである。
【０２５７】
実施形態1:式I
【０２５８】
【化３９】
2021525736.tif 000040
【０２５９】
(式中、N-末端から数えて、第1及び第3のアミノ酸残基はL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基はD-アミノ酸残基であり、
R1は、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R2は、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R1及びR2は一緒になって、1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく、
R3及びR4は、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R5は、水素、-OH、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R6は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、
R7は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、
R8は、-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)
【０２６０】
【化４０】
2021525736.tif 000041
【０２６１】
、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y1は、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2は水素又は糖部分、好ましくは二糖部分であり、
R8が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)L-アミノ酸残基は場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端は場合によってアミド化されている)を含む単離ペプチド。
【０２６２】
実施形態2:R6がC1〜C6アルキルであり、R7がC1〜C6アルキルである、実施形態1に記載のペプチド。
【０２６３】
実施形態3:R6及びR7が独立して、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、ノルロイシン、又はイソロイシンの側鎖から選択される、実施形態1又は実施形態2に記載のペプチド。
【０２６４】
実施形態4:R6及びR7がそれぞれバリン側鎖(-CH(CH3)2)である、実施形態1から3のいずれか1つに記載のペプチド。
【０２６５】
実施形態5:R6及びR7がそれぞれスレオニン側鎖である、実施形態1に記載のペプチド。
【０２６６】
実施形態6:R3及びR4が-CH3であり、R5が-OHである、実施形態1から5のいずれか1つに記載のペプチド。
【０２６７】
実施形態7:R1及びR2がそれぞれ水素である、実施形態1から6のいずれか1つに記載のペプチド。
【０２６８】
実施形態8:R1、R2、R3、R4、及びR5がそれぞれ水素である、実施形態1から5のいずれか1つに記載のペプチド。
【０２６９】
実施形態9:式I
【０２７０】
【化４１】
2021525736.tif 000042
【０２７１】
(式中、N-末端から数えて、第1及び第3のアミノ酸残基はL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基はD-アミノ酸残基であり、
R1は、水素、単結合、又は-C1〜C3アルキルであり、
R2は、水素、単結合、又は-C1〜C3アルキルであり、
R3及びR4は、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R5は、水素、-OH、又は-O(C1〜C3)アルキルであり、
R6は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、
R7は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、
R8は、-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)、
【０２７２】
【化４２】
2021525736.tif 000043
【０２７３】
、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y1は、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2は、水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
R8が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)L-アミノ酸残基は場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端は場合によってアミド化されており、
R8がリンカーである場合、リンカーは糖部分、好ましくは二糖部分、例えば、ラクトースを含み、
R1又はR2のうちの1つが単結合である場合、R1及びR2のうちの1つは水素であり、単結合はN-末端で場合によってアルキル化されていてもよい、好ましくは単独にメチル化されていてもよいL-アミノ酸残基へのペプチド結合である)を含む単離ペプチド。
【０２７４】
実施形態10:R1及びR2のうちの1つが水素であり、R1及びR2のうちの1つが-CH3である、実施形態9に記載のペプチド。
【０２７５】
実施形態11:R5が-O(C1〜C3)アルキルであり、好ましくは-OCH3である、実施形態9又は実施形態10に記載のペプチド。
【０２７６】
実施形態12:R3及びR4が-CH3である、実施形態11に記載のペプチド。
【０２７７】
実施形態13:R3及びR4が水素である、実施形態11に記載のペプチド。
【０２７８】
実施形態14:R3及びR4が-CH3であり、R5が-OHである、実施形態9又は実施形態10に記載のペプチド。
【０２７９】
実施形態15:R6及びR7がそれぞれバリン側鎖(-CH(CH3)2)である、実施形態9から14のいずれか1つに記載のペプチド。
【０２８０】
実施形態16:R6及びR7がそれぞれスレオニン側鎖である、実施形態9から14のいずれか1つに記載のペプチド。
【０２８１】
実施形態17:R1又はR2のうちの1つが単結合であり、R1及びR2のうちの1つが水素であり、単結合がL-アミノ酸残基へのペプチド結合である、実施形態9から16のいずれか1つに記載のペプチド。
【０２８２】
実施形態18:L-アミノ酸残基が少なくとも1つのN-末端メチル化を有する、実施形態17に記載のペプチド。
【０２８３】
実施形態19:L-アミノ酸残基がL-アラニン残基である、実施形態17又は実施形態18に記載のペプチド。
【０２８４】
実施形態20:R8がリンカーである、実施形態9から19のいずれか1つに記載のペプチド。
【０２８５】
実施形態21:リンカーが、アミノ酸ベースリンカー、ペプチドベースリンカー、アミノ酸を含むリンカー、及び/若しくはマレイミドベースリンカー、並びに/又はこれらの組合せを含む、実施形態20に記載のペプチド。
【０２８６】
実施形態22:R8が、-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)、
【０２８７】
【化４３】
2021525736.tif 000044
【０２８８】
であり、Y1が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、実施形態1から19のいずれか1つに記載のペプチド。
【０２８９】
実施形態23:R8が、
【０２９０】
【化４４】
2021525736.tif 000045
【０２９１】
であり、Y1が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、実施形態22に記載のペプチド。
【０２９２】
実施形態24:Y1が-NH2である、実施形態22又は実施形態23に記載のペプチド。
【０２９３】
実施形態25:Y1が1〜約30個のL-アミノ酸残基である、実施形態22又は実施形態23に記載のペプチド。
【０２９４】
実施形態26:Y1が1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基である、実施形態25に記載のペプチド。
【０２９５】
実施形態27:Y1が1〜約11個のL-アミノ酸残基である、実施形態26に記載のペプチド。
【０２９６】
実施形態28:R8が1〜約30個のL-アミノ酸残基である、実施形態1から19のいずれか1つに記載のペプチド。
【０２９７】
実施形態29:R8が1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基である、実施形態28に記載のペプチド。
【０２９８】
実施形態30:R8が1〜約11個のL-アミノ酸残基である、実施形態29に記載のペプチド。
【０２９９】
実施形態31:1〜約11個のL-アミノ酸残基が、少なくとも1つのグリコシル化されているL-アミノ酸残基を含み、好ましくは少なくとも1つのO-グリコシル化されているL-セリン残基を含む、実施形態30に記載のペプチド。
【０３００】
実施形態32:R1及びR2が水素であり、R3、R4、及びR5が水素であり、R6及びR7がそれぞれ-CH(CH3)2であり、R8が-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)、
【０３０１】
【化４５】
2021525736.tif 000046
【０３０２】
であり、Y1が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、実施形態1に記載のペプチド。
【０３０３】
実施形態33:R1及びR2が水素であり、R3及びR4が両方とも水素であるか、又は両方とも-CH3であり、R5が-OHであり、R6及びR7がそれぞれ-CH(CH3)2であり、R8が-OH、-NH2、-O(C1〜C3アルキル)、
【０３０４】
【化４６】
2021525736.tif 000047
【０３０５】
であり、Y1が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、実施形態1に記載のペプチド。
【０３０６】
実施形態34:R8が-NH2、
【０３０７】
【化４７】
2021525736.tif 000048
【０３０８】
であり、Y1が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y2が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、実施形態32又は実施形態33に記載のペプチド。
【０３０９】
実施形態35:R8が、
【０３１０】
【化４８】
2021525736.tif 000049
【０３１１】
であり、Y1が-OH又は-NH2であり、
Y2が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、実施形態32から34のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３１２】
実施形態36:Y1が1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基である、実施形態32から34のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３１３】
実施形態37: Y1が1〜約11個のL-アミノ酸残基である、実施形態36に記載のペプチド。
【０３１４】
実施形態38:Y2が糖部分であり、好ましくは二糖部分である、実施形態1から19、22、23、及び32から35のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３１５】
実施形態39:Y2二糖部分がラクトース部分又はメリビオース部分である、実施形態38に記載のペプチド。
【０３１６】
実施形態40:Y2二糖部分がラクトース部分である、実施形態38に記載のペプチド。
【０３１７】
実施形態41:二糖部分がベータ結合を介して付加している、実施形態39又は実施形態40に記載のペプチド。
【０３１８】
実施形態42:R8が1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基である、実施形態1に記載のペプチド。
【０３１９】
実施形態43:R8が1〜約11個のL-アミノ酸残基である、実施形態42に記載のペプチド。
【０３２０】
実施形態44:前記L-アミノ酸残基が、N-グリコシル化されている、O-グリコシル化されている、C-グリコシル化されている、S-グリコシル化されている、又はSe-グリコシル化されている少なくとも1個のアミノ酸残基を含む、実施形態42又は実施形態43に記載のペプチド。
【０３２１】
実施形態45:前記L-アミノ酸残基が、O-グリコシル化されている少なくとも1つのL-アミノ酸残基を含む、実施形態44に記載のペプチド。
【０３２２】
実施形態46:O-グリコシル化されている前記アミノ酸残基がL-セリン残基である、実施形態45に記載のペプチド。
【０３２３】
実施形態47:R1及びR2が一緒になって、バイオリバーシブル部分を形成する、実施形態1から6、22から31、及び38から46のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３２４】
実施形態48:前記バイオリバーシブル部分が、
【０３２５】
【化４９】
2021525736.tif 000050
【０３２６】
又は=N=N(アジド部分)である、実施形態47に記載のペプチド。
【０３２７】
実施形態49:R1又はR2のうちの1つが水素であり、R1又はR2のうちの1つが-C(=O)OCH2CH3又は-C(=O)OCH2OC(=O)CH3である、実施形態1から6、22から31、及び38から46のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３２８】
実施形態50:R5がバイオリバーシブル部分である、実施形態1から5、7、22から31、及び38から46のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３２９】
実施形態51:バイオリバーシブル部分が-C(=O)CH3である、実施形態50に記載のペプチド。
【０３３０】
実施形態52:
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe(ペプチド1a、Bilaid A);
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド1e);
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe(ペプチド3a、Bilaid C);
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド3b);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド3c;Bilorphin);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(ペプチド3g;Bilactorphin);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(ペプチド4);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Pro-L-Asn-L-Leu-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Ala-L-Leu-L-Lys-L-Ser-L-Leu-NH2(ペプチド11);
N-末端がバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2OC(=O)CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド10);
N-末端がバイオリバーシブル部分
【０３３１】
【化５０】
2021525736.tif 000051
【０３３２】
で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド8);
2,6-ジメチル-L-チロシン上のヒドロキシ基がバイオリバーシブル部分-C(=O)CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド5);
2,6-ジメチル-L-チロシン上のヒドロキシ基がバイオリバーシブル部分-C(=O)CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(ペプチド6);
N-末端がバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド7);及び
N-末端がバイオリバーシブル部分、=N=Nで置換されて、N-末端アジド基を形成する、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド9)
からなる群から選択される、実施形態1に記載のペプチド。
【０３３３】
実施形態53:
L-AA-L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-リンカー-糖部分;
L-AA-L-Tyr-D-Thr-L-Thr-D-Phe-リンカー-糖部分;
L-AA-L-Dmt-D-Val-L-Val-D-Phe-リンカー-糖部分;
L-AA-L-Dmt-D-Thr-L-Thr-D-Phe-リンカー-糖部分を含み、
L-AAが、少なくとも1つのN-末端-CH3を場合によって有する任意のL-アミノ酸残基であり、
L-Tyr又はL-Dmtのヒドロキシル基が、場合によってアルキル化されており、
リンカーが好ましくはL-Ser又はL-Thrである、ペプチド。
【０３３４】
実施形態54:モルヒネと比較して、
(a)MOPrのC-末端リン酸化対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す、及び/又は
(b)βアレスチン動員対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す、及び/又は
(c)MOPr内在化対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す、
実施形態1から53のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３３５】
実施形態55:モルヒネと比較して、βアレスチン動員対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す、実施形態1から53のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３３６】
実施形態56:hMOPrを使用するアッセイにおいて、約10μMの濃度で、ビヒクルと比較して、cAMP形成の阻害における増加を示す、実施形態1から55のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３３７】
実施形態57:[3H]DAMGOを使用する競合的結合アッセイにおいて、約5μM未満、約3.5μM未満、約1μM未満、約0.8μM未満、約0.5μM未満、又は約0.3μM未満のKiを示す、実施形態1から56のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３３８】
実施形態58:約0.5μM未満又は約0.3μM未満のKiを示す、実施形態57に記載のペプチド。
【０３３９】
実施形態59:血液脳関門を横断する、実施形態1から58いずれか1つに記載のペプチド。
【０３４０】
実施形態60:実施形態1から59のいずれか1つに記載のペプチドと、少なくとも1つの医薬賦形剤とを含む、医薬組成物。
【０３４１】
実施形態61:経口投与用に製剤化される、実施形態60に記載の医薬組成物。
【０３４２】
実施形態62:前記ペプチドがグリコシル化され、前記組成物が経口投与、注射による投与、又は髄腔内投与用に製剤化される、実施形態60に記載の医薬組成物。
【０３４３】
実施形態63:前記ペプチドがグリコシル化されず、前記組成物が経鼻投与又は髄腔内投与用に製剤化される、実施形態60に記載の医薬組成物。
【０３４４】
実施形態64:対象に、実施形態1から59のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態60から63のいずれか1つに記載の医薬組成物を投与することを含む、疼痛を処置する方法。
【０３４５】
実施形態65:疼痛が、術後疼痛、神経損傷に伴う疼痛、骨折に伴う疼痛、火傷に伴う疼痛、又は外傷に伴う疼痛である、実施形態64に記載の方法。
【０３４６】
実施形態66:疼痛を処置するための医薬の製造における、実施形態1から59のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態60から63のいずれか1つに記載の医薬組成物の使用。
【０３４７】
実施形態67:疼痛が、術後疼痛、神経損傷に伴う疼痛、骨折に伴う疼痛、火傷に伴う疼痛、又は外傷に伴う疼痛である、実施形態66に記載の使用。
【０３４８】
実施形態68:疼痛を処置する方法における使用のための、実施形態1から59のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３４９】
実施形態69:疼痛を処置する方法における使用のための、実施形態60から63のいずれか1つに記載の医薬組成物。
【０３５０】
実施形態70:疼痛が、術後疼痛、神経損傷に伴う疼痛、骨折に伴う疼痛、火傷に伴う疼痛、又は外傷に伴う疼痛である、実施形態68に記載の方法における使用のためのペプチド又は実施形態69に記載の方法における使用のための医薬組成物。
【０３５１】
実施形態71:対象に、実施形態1から59のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態60から63のいずれか1つに記載の医薬組成物を投与することを含む、鎮痛を届ける方法。
【０３５２】
実施形態72:鎮痛を届けるための医薬の製造のための、実施形態1から59のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態60から63のいずれか1つに記載の医薬組成物の使用。
【０３５３】
実施形態73:鎮痛を届ける方法における使用のための、実施形態1から59のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態60から63のいずれか1つに記載の医薬組成物。
【０３５４】
実施形態74:対象に、実施形態1から59のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態60から63のいずれか1つに記載の医薬組成物を投与することを含む、有害な副作用がより少ない、好ましくはモルヒネと比較してより少ない、疼痛を処置する又は鎮痛を届ける方法。
【０３５５】
実施形態75:前記有害な副作用が消化管(GI)阻害及び/又は呼吸抑制である、実施形態74に記載の方法。
【０３５６】
実施形態76:有害な副作用がより少ない、好ましくはモルヒネと比較してより少ない、疼痛を処置する又は鎮痛を届けるための医薬の製造のための、実施形態1から59のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態60から63のいずれか1つに記載の医薬組成物の使用。
【０３５７】
実施形態77:前記有害な副作用が消化管(GI)阻害及び/又は呼吸抑制である、実施形態76に記載の使用。
【０３５８】
実施形態78:有害な副作用がより少ない、好ましくはモルヒネと比較してより少ない、疼痛を処置する又は鎮痛を届ける方法における使用のための実施形態1から59のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態60から63のいずれか1つに記載の医薬組成物。
【０３５９】
実施形態79:前記有害な副作用が消化管(GI)阻害及び/又は呼吸抑制である、実施形態78に記載の方法における使用のためのペプチド又は実施形態78に記載の方法における使用のための医薬組成物。
【０３６０】
実施形態80:式II
【０３６１】
【化５１】
2021525736.tif 000052
【０３６２】
(式中、N-末端から数えて、第1のアミノ酸残基はL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基はD-アミノ酸残基であり、
R9は、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R10は、水素又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R9又はR10のうちの1つが水素であり、R9又はR10のうちの1つがバイオリバーシブル部分である場合、バイオリバーシブル部分は好ましくは-C(=O)OCH2CH3又は-C(=O)OCH2OC(=O)CH3であり、
R9及びR10は、一緒になって、1つのバイオリバーシブル部分を形成してもよく、好ましくは、バイオリバーシブル部分は、
【０３６３】
【化５２】
2021525736.tif 000053
【０３６４】
又は=N=N(アジド部分)であり、
R11及びR12は、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R13は、水素、-OH、又は糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分であり、
R14は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R15は、水素、-OH、又はバイオリバーシブル部分であり、
R16は、-OH、-O(C1〜C3アルキル)、-NH2、
【０３６５】
【化５３】
2021525736.tif 000054
【０３６６】
、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y3は、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y4は、水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
R16が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)L-アミノ酸残基は場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端は場合によってアミド化されている)を含むペプチド。
【０３６７】
実施形態81:R14がC1〜C6アルキルである、実施形態80に記載のペプチド。
【０３６８】
実施形態82:R14が、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、ノルロイシン、又はイソロイシンの側鎖から選択される、実施形態80又は実施形態81に記載のペプチド。
【０３６９】
実施形態83:R14がバリン側鎖(-CH(CH3)2)である、実施形態80から82のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３７０】
実施形態84:R14がスレオニン側鎖である、実施形態80に記載のペプチド。
【０３７１】
実施形態85:R11及びR12が-CH3であり、R13が-OHである、実施形態80から84のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３７２】
実施形態86:R9及びR10がそれぞれ水素である、実施形態80から84のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３７３】
実施形態87:R9、R10、R11、R12、及びR13がそれぞれ水素である、実施形態80から84のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３７４】
実施形態88:R9、R10、R11、R12、及びR13が水素であり、R14がC1〜C4アルキルであり、R15が-OHである、実施形態80から84のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３７５】
実施形態89:式II
【０３７６】
【化５４】
2021525736.tif 000055
【０３７７】
(式中、N-末端から数えて、第1のアミノ酸残基はL-アミノ酸残基であり、第2及び第4のアミノ酸残基はD-アミノ酸残基であり、
R9は、水素、単結合、又は-C1〜C3アルキル、好ましくは-CH3であり、
R10は、水素、単結合、又は-C1〜C3アルキル、好ましくは-CH3であり、
R11及びR12は、独立して、水素又はC1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
R13は、水素、-OH、又は-O(C1〜C3)アルキルであり、
R14は、アミノ酸の側鎖又はC1〜C6アルキルであり、好ましくはC1〜C4アルキルであり、より好ましくは-CH(CH3)2であり、
R15は、水素、-OH、又はバイオリバーシブル部分であり、
R16は、-OH、-O(C1〜C3アルキル)、-NH2、
【０３７８】
【化５５】
2021525736.tif 000056
【０３７９】
、1〜約30個のL-アミノ酸残基、又はリンカーであり、
Y3は、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y4は、水素又は糖部分、好ましくは二糖部分であり、
R16が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)L-アミノ酸残基は場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端は場合によってアミド化されており、
R16がリンカーの場合、リンカーは糖部分、好ましくは二糖部分、例えば、ラクトースを含み、
R9又はR10のうちの1つが単結合である場合、R9又はR10のうちの1つは水素であり、単結合はN-末端で場合によってアルキル化されている、好ましくは単独にメチル化されているL-アミノ酸残基へのペプチド結合である)を含むペプチド。
【０３８０】
実施形態90:R9及びR10のうちの1つが水素であり、R9及びR10のうちの1つが-CH3である、実施形態89に記載のペプチド。
【０３８１】
実施形態91:R13が-O(C1〜C3)アルキルであり、好ましくは-OCH3である、実施形態89又は実施形態90に記載のペプチド。
【０３８２】
実施形態92:R11及びR12が-CH3である、実施形態91に記載のペプチド。
【０３８３】
実施形態93:R11及びR12が水素である、実施形態91に記載のペプチド。
【０３８４】
実施形態94:R11及びR12が-CH3であり、R13が-OHである、実施形態89又は実施形態90に記載のペプチド。
【０３８５】
実施形態95:R9又はR10のうちの1つが単結合であり、R9又はR10のうちの1つが水素であり、単結合がL-アミノ酸残基へのペプチド結合である、実施形態89に記載のペプチド。
【０３８６】
実施形態96:L-アミノ酸残基が少なくとも1つのN-末端メチル化を有する、実施形態95に記載のペプチド。
【０３８７】
実施形態97:L-アミノ酸残基がL-アラニン残基である、実施形態95又は実施形態96に記載のペプチド。
【０３８８】
実施形態98:R14がバリン側鎖(-CH(CH3)2)である、実施形態89から97のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３８９】
実施形態99:R14がスレオニン側鎖である、実施形態89から97のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３９０】
実施形態100:R16が-NH2である、実施形態80から99のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３９１】
実施形態101:R16が、
【０３９２】
【化５６】
2021525736.tif 000057
【０３９３】
、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y3が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y4が、水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
R8が1〜約30個のL-アミノ酸残基である場合、(1)L-アミノ酸残基は場合によって糖部分、好ましくは二糖部分で場合によってグリコシル化されていてもよい残基であり、(2)C-末端は場合によってアミド化されている、実施形態80から99のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３９４】
実施形態102:R16が1〜約30個のL-アミノ酸である、実施形態101に記載のペプチド。
【０３９５】
実施形態103:R16が、1〜約25個のL-アミノ酸残基、1〜約20個のL-アミノ酸残基、1〜約15個のL-アミノ酸残基、1〜約11個のL-アミノ酸残基、又は1〜約5個のL-アミノ酸残基である、実施形態102に記載のペプチド。
【０３９６】
実施形態104:R16が1〜約11個のL-アミノ酸残基である、実施形態103に記載のペプチド。
【０３９７】
実施形態105:前記L-アミノ酸残基が、N-グリコシル化されている、O-グリコシル化されている、C-グリコシル化されている、S-グリコシル化されている、又はSe-グリコシル化されている少なくとも1個のアミノ酸残基を含む、実施形態102から104のいずれか1つに記載のペプチド。
【０３９８】
実施形態106:前記L-アミノ酸残基が、O-グリコシル化されている少なくとも1個のアミノ酸残基を含む、実施形態105に記載のペプチド。
【０３９９】
実施形態107:O-グリコシル化されている前記アミノ酸残基がL-セリン残基である、実施形態106に記載のペプチド。
【０４００】
実施形態108:R16がリンカーである、実施形態89から99のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４０１】
実施形態109:リンカーがアミノ酸ベースリンカー、ペプチドベースリンカー、アミノ酸を含むリンカー、及び/若しくはマレイミドベースリンカー、並びに/又はこれらの組合せを含む、実施形態108に記載のペプチド。
【０４０２】
実施形態110:R16が、
【０４０３】
【化５７】
2021525736.tif 000058
【０４０４】
であり、
Y3が、-OH、-NH2、又は1〜約30個のL-アミノ酸残基であり、
Y4が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、実施形態101に記載のペプチド。
【０４０５】
実施形態111:R16が、
【０４０６】
【化５８】
2021525736.tif 000059
【０４０７】
であり、Y3が-OH又は-NH2であり、Y4が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、実施形態80から99のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４０８】
実施形態112:R9、R10、R11、R12、及びR13が水素であり、R14が-CH(CH3)2であり、R15が-OHであり、R16が、
【０４０９】
【化５９】
2021525736.tif 000060
【０４１０】
であり、Y3が-OH又は-NH2であり、Y4が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、実施形態80に記載のペプチド。
【０４１１】
実施形態113:前記糖部分が二糖部分であり、好ましくは二糖部分がベータ結合を介して付加している、実施形態80から99、101、110、111、及び112のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４１２】
実施形態114:前記二糖部分がラクトース部分又はメリビオース部分であり、好ましくは二糖部分がベータ結合を介して付加している、実施形態113に記載のペプチド。
【０４１３】
実施形態115:前記二糖部分がラクトース部分であり、好ましくはラクトース部分がベータ結合を介して付加している、実施形態113又は実施形態114に記載のペプチド。
【０４１４】
実施形態116:R9及びR10が、一緒になって、バイオリバーシブル部分を形成する、実施形態80から85のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４１５】
実施形態117:前記バイオリバーシブル部分が、
【０４１６】
【化６０】
2021525736.tif 000061
【０４１７】
又は=N=N(アジド部分)である、実施形態116に記載のペプチド。
【０４１８】
実施形態118:R9又はR10のうちの1つが水素であり、R9又はR10のうちの1つが-C(=O)OCH2CH3又は-C(=O)OCH2OC(=O)CH3である、実施形態80から85のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４１９】
実施形態119:R13がバイオリバーシブル部分である、実施形態80から85のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４２０】
実施形態120:バイオリバーシブル部分が-C(=O)CH3である、実施形態119に記載のペプチド。
【０４２１】
実施形態121:L-Phe-D-Val-Gly-D-Tyr-NH2である、実施形態80に記載のペプチド。
【０４２２】
実施形態122:モルヒネと比較して、
(a)MOPrのC-末端リン酸化対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す、及び/又は
(b)βアレスチン動員対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す、及び/又は
(c)MOPr内在化対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す、実施形態80から121いずれか1つに記載のペプチド。
【０４２３】
実施形態123:モルヒネと比較して、βアレスチン動員対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す、実施形態80から121のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４２４】
実施形態124:hMOPrを使用するアッセイにおいて、約10μMの濃度で、ビヒクルと比較してcAMP形成の阻害における増加を示す、実施形態80から123のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４２５】
実施形態125:[3H]DAMGOを使用する競合的結合アッセイにおいて、約5μM未満、約3.5μM未満、約1μM未満、約0.8μM未満、約0.5μM未満、又は約0.3μM未満のKiを示す、実施形態80から124のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４２６】
実施形態126:約0.5μM未満又は約0.3μM未満のKiを示す、実施形態125に記載のペプチド。
【０４２７】
実施形態127:血液脳関門を横断する、実施形態80から126のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４２８】
実施形態128:実施形態80から127のいずれか1つに記載のペプチドと、少なくとも1種の医薬賦形剤とを含む、医薬組成物。
【０４２９】
実施形態129:経口投与用に製剤化される、実施形態128に記載の医薬組成物。
【０４３０】
実施形態130:前記ペプチドがグリコシル化され、前記組成物が経口投与、注射による投与、又は髄腔内投与用に製剤化される、実施形態128に記載の医薬組成物。
【０４３１】
実施形態131:前記ペプチドがグリコシル化されず、前記組成物が経鼻投与又は髄腔内投与用に製剤化される、実施形態128に記載の医薬組成物。
【０４３２】
実施形態132:対象に、実施形態80から127のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態128から131のいずれか1つに記載の医薬組成物を投与することを含む、疼痛を処置する方法。
【０４３３】
実施形態133:疼痛が、術後疼痛、神経損傷に伴う疼痛、骨折に伴う疼痛、火傷に伴う疼痛、又は外傷に伴う疼痛である、実施形態132に記載の方法。
【０４３４】
実施形態134:疼痛を処置するための医薬の製造における、実施形態80から127のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態128から131のいずれか1つに記載の医薬組成物の使用。
【０４３５】
実施形態135:疼痛が、術後疼痛、神経損傷に伴う疼痛、骨折に伴う疼痛、火傷に伴う疼痛、又は外傷に伴う疼痛である、実施形態134に記載の使用。
【０４３６】
実施形態136:疼痛を処置する方法における使用のための、実施形態80から127のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４３７】
実施形態137:疼痛を処置する方法における使用のための、実施形態128から131のいずれか1つに記載の医薬組成物。
【０４３８】
実施形態138:疼痛が術後疼痛、神経損傷に伴う疼痛、骨折に伴う疼痛、火傷に伴う疼痛、又は外傷に伴う疼痛である、実施形態136に記載の方法における使用のためのペプチド又は実施形態137に記載の方法における使用のための医薬組成物。
【０４３９】
実施形態139:対象に、実施形態80から127のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態128から131のいずれか1つに記載の医薬組成物を投与することを含む、鎮痛を届ける方法。
【０４４０】
実施形態140:鎮痛を届けるための医薬の製造のための、実施形態80から127のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態128から131のいずれか1つに記載の医薬組成物の使用。
【０４４１】
実施形態141:鎮痛を届ける方法における使用のための、実施形態80から127のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態128から131のいずれか1つに記載の医薬組成物。
【０４４２】
実施形態142:対象に、実施形態80から127のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態128から131のいずれか1つに記載の医薬組成物を投与することを含む、有害な副作用がより少ない、好ましくはモルヒネと比較してより少ない、疼痛を処置する又は鎮痛を届ける方法。
【０４４３】
実施形態143:前記有害な副作用が消化管(GI)阻害及び/又は呼吸抑制である、実施形態142に記載の方法。
【０４４４】
実施形態144:有害な副作用がより少ない、好ましくはモルヒネと比較してより少ない、疼痛を処置する又は鎮痛を届けるための医薬の製造のための、実施形態80から127のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態128から131のいずれか1つに記載の医薬組成物の使用。
【０４４５】
実施形態145:前記有害な副作用が消化管(GI)阻害及び/又は呼吸抑制である、実施形態144に記載の使用。
【０４４６】
実施形態146:有害な副作用がより少ない、好ましくはモルヒネと比較してより少ない、疼痛を処置する又は鎮痛を届ける方法における使用のための、実施形態80から127のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態128から131のいずれか1つに記載の医薬組成物。
【０４４７】
実施形態147:前記有害な副作用が消化管(GI)阻害及び/又は呼吸抑制である、実施形態146に記載の方法における使用のためのペプチド又は実施形態146に記載の方法における使用のための医薬組成物。
【０４４８】
実施形態148:式III
X1-X2-X3-X4
(III)
(式中、
X1は、N-末端部分-NR17R18を含むN-末端アミノ酸残基であり、
X4は、-C(=O)OH、-C(=O)O(C1〜C3アルキル)、-C(=O)NH2、
【０４４９】
【化６１】
2021525736.tif 000062
【０４５０】
から選択されるC-末端部分を含み、Y5は-OH又は-NH2であり、Y6は水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
X1は、L-チロシン、2,6-ジメチル-L-チロシン、又はL-フェニルアラニンから選択されるL-アミノ酸残基であり、X1がL-チロシン又は2,6-ジメチル-L-チロシンの場合、残基は、4位において、糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分で場合によってO-置換されており、
X2はD-アミノ酸残基であり、好ましくはD-アラニン、D-バリン、D-ロイシン、又はD-イソロイシンであり、より好ましくは、D-バリンであり、
X3はグリシン又はL-アミノ酸残基であり、X3がL-アミノ酸残基である場合、X3は好ましくはL-アラニン、L-バリン、L-ロイシン、又はL-イソロイシンであり、より好ましくはL-バリンであり、
X4は、D-チロシン又はD-フェニルアラニンから選択されるD-アミノ酸残基であり、X4がD-チロシンの場合、残基はバイオリバーシブル部分で場合によってO-置換されており、
R17及びR18は、独立して、水素、若しくは糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分から選択されるか、又はR17及びR18は、一緒になって、糖部分を場合によって含むバイオリバーシブル部分を形成する）を含み、
MOPrアゴニストである、単離ペプチド。
【０４５１】
実施形態149:C-末端部分が、-C(=O)OH、
【０４５２】
【化６２】
2021525736.tif 000063
【０４５３】
であり、Y5が-OHであり、Y6が水素又は糖部分であり、ペプチドが、C-末端上に約5個、8個、11個、12個、20個又は26個の追加のL-アミノ酸残基を更に含む、実施形態148に記載のペプチド。
【０４５４】
実施形態150:R17及びR18がそれぞれ水素であり、X2がD-バリン残基であり、X3がグリシン又はL-バリン残基であり、X4が、-C(=O)OH、-C(=O)NH2、
【０４５５】
【化６３】
2021525736.tif 000064
【０４５６】
から選択されるC-末端部分を含み、Y5が-OH又は-NH2であり、Y6が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、実施形態148又は実施形態149に記載のペプチド。
【０４５７】
実施形態151:式III
X1-X2-X3-X4
(III)
(式中、
X1は、N-末端部分-NR17R18を含むN-末端アミノ酸残基であり、
X4は、-C(=O)OH、-C(=O)O(C1〜C3アルキル)、-C(=O)NH2、
【０４５８】
【化６４】
2021525736.tif 000065
【０４５９】
又はリンカーから選択されるC-末端部分を含み、Y5は-OH又は-NH2であり、Y6は水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分であり、
X1は、L-チロシン、2,6-ジメチル-L-チロシン、又はL-フェニルアラニンから選択されるL-アミノ酸残基であり、X1がL-チロシン又は2,6-ジメチル-L-チロシンである場合、残基は、4位においてC1〜C3アルキルで場合によってO-置換されており、
X2は、D-アミノ酸残基であり、好ましくはD-スレオニン、D-アラニン、D-バリン、D-ロイシンであり、又はD-イソロイシンであり、より好ましくは、D-スレオニン又はD-バリンであり、
X3はグリシン又はL-アミノ酸残基であり、X3がL-アミノ酸残基である場合、X3は、好ましくはL-スレオニン、L-アラニン、L-バリン、L-ロイシン、又はL-イソロイシンであり、より好ましくはL-スレオニン又はL-バリンであり、
X4は、D-チロシン又はD-フェニルアラニンから選択されるD-アミノ酸残基であり、X4がD-チロシンの場合、残基は、バイオリバーシブル部分で場合によってO-置換されており、
R17及びR18は、独立して、水素、単結合、又は-C1〜C3アルキルから選択され、好ましくは-CH3であり、
X4がリンカーを含む場合、リンカーは糖部分、好ましくは二糖部分、例えば、ラクトースを含み、
R17又はR18のうちの1つが単結合である場合、R17又はR18のうちの1つは水素であり、単結合はN-末端で場合によってアルキル化されていてもよい、好ましくは単独にメチル化されていてもよいL-アミノ酸残基へのペプチド結合である）を含み、
MOPrアゴニストである、単離ペプチド。
【０４６０】
実施形態152:C-末端部分が、-C(=O)OH、
【０４６１】
【化６５】
2021525736.tif 000066
【０４６２】
であり、Y5が-OHであり、Y6が水素又は糖部分であり、ペプチドがC-末端上に、約5個、8個、11個、12個、20個又は26個の追加のL-アミノ酸残基を更に含む、実施形態151に記載のペプチド。
【０４６３】
実施形態153:X2がD-バリン残基であり、X3がグリシン又はL-バリン残基であり、X4が-C(=O)OH、-C(=O)NH2、
【０４６４】
【化６６】
2021525736.tif 000067
【０４６５】
から選択されるC-末端部分を含み、Y5が-OH又は-NH2であり、Y6が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、実施形態151又は実施形態152に記載のペプチド。
【０４６６】
実施形態154:X2がD-スレオニン残基であり、X3がグリシン、又は、L-スレオニン残基であり、X4が-C(=O)OH、-C(=O)NH2、
【０４６７】
【化６７】
2021525736.tif 000068
【０４６８】
から選択されるC-末端部分を含み、Y5が-OH又は-NH2であり、Y6が水素又は糖部分であり、好ましくは二糖部分である、実施形態151又は実施形態152に記載のペプチド。
【０４６９】
実施形態155:R17及びR18のうちの1つが水素であり、R17及びR18のうちの1つが-CH3である、実施形態151から154のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４７０】
実施形態156:R17又はR18のうちの1つが単結合であり、R17又はR18のうちの1つが水素であり、単結合がL-アミノ酸残基へのペプチド結合である、実施形態151から154のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４７１】
実施形態157:L-アミノ酸残基が少なくとも1つのN-末端メチル化を有する、実施形態156に記載のペプチド。
【０４７２】
実施形態158:L-アミノ酸残基がL-アラニン残基である、実施形態156又は実施形態157に記載のペプチド。
【０４７３】
実施形態159:X4がリンカーを含む、実施形態151に記載のペプチド。
【０４７４】
実施形態160:リンカーがアミノ酸ベースリンカー、ペプチドベースリンカー、アミノ酸を含むリンカー、及び/若しくはマレイミドベースリンカー、並びに/又はこれらの組合せを含む、実施形態154に記載のペプチド。
【０４７５】
実施形態161:X1がL-チロシン又は2,6-ジメチル-L-チロシンであり、L-チロシン又は2,6-ジメチル-L-チロシンが4位においてC1〜C3アルキルでO-置換されている、実施形態151から160のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４７６】
実施形態162:X1が2,6-ジメチル-L-チロシンであり、2,6-ジメチル-L-チロシンが4位においてC1〜C3アルキルでO置換されている、実施形態161に記載のペプチド
【０４７７】
実施形態163:X4が、
【０４７８】
【化６８】
2021525736.tif 000069
【０４７９】
から選択されるC-末端部分を含み、Y5が-OH又は-NH2であり、Y6が二糖部分であり、好ましくは二糖部分がベータ結合を介して付加している、実施形態148から162のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４８０】
実施形態164:二糖部分がラクトース部分であり、好ましくはラクトース部分がベータ結合を介して付加している、実施形態162に記載のペプチド。
【０４８１】
実施形態165:前記追加のL-アミノ酸が、N-グリコシル化されている、O-グリコシル化されている、C-グリコシル化されている、S-グリコシル化されている、又はSe-グリコシル化されている少なくとも1個のアミノ酸残基を含む、実施形態149に記載のペプチド。
【０４８２】
実施形態166:R17及びR18が一緒になって、バイオリバーシブル部分を形成する、実施形態148、149、及び163から165のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４８３】
実施形態167:前記バイオリバーシブル部分が、
【０４８４】
【化６９】
2021525736.tif 000070
【０４８５】
又は=N=N(アジド部分)である、実施形態166に記載のペプチド。
【０４８６】
実施形態168:R17又はR18のうちの1つが水素であり、R17又はR18のうちの1つが-C(=O)OCH2CH3又は-C(=O)OCH2OC(=O)CH3である、実施形態148、149及び163から165のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４８７】
実施形態169:以下からなる群から選択される実施形態148に記載のペプチド
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe(ペプチド1a、Bilaid A);
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド1e);
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe(ペプチド3a、Bilaid C);
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド3b);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド3c;Bilorphin);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(ペプチド3g;Bilactorphin);
L-Phe-D-Val-Gly-D-Tyr-NH2(ペプチド2d);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(ペプチド4);
2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Pro-L-Asn-L-Leu-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Ala-L-Leu-L-Lys-L-Ser-L-Leu-NH2(ペプチド11);
N-末端がバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2OC(=O)CH3で置換されている2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド10);
N-末端がバイオリバーシブル部分
【０４８８】
【化７０】
2021525736.tif 000071
【０４８９】
で置換されている2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド8);
2,6-ジメチル-L-チロシン上のヒドロキシ基がバイオリバーシブル部分-C(=O)CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド5);
2,6-ジメチル-L-チロシン上のヒドロキシ基がバイオリバーシブル部分-C(=O)CH3で置換されている、2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(ペプチド6);
N-末端がバイオリバーシブル部分-C(=O)OCH2CH3で置換されている2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド7)、及び
N-末端がバイオリバーシブル部分、=N=Nで置換されて、N-末端アジド基を形成する2,6-ジメチル-L-チロシン-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(ペプチド9)。
【０４９０】
実施形態170:モルヒネと比較して、
(a)MOPrのC-末端リン酸化対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す、及び/又は
(b)βアレスチン動員対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す、及び/又は
(c)MOPr内在化対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す、実施形態148から169のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４９１】
実施形態171:モルヒネと比較して、βアレスチン動員対Gタンパク質活性化のより低い誘発比率を示す、実施形態148から169のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４９２】
実施形態172:hMOPrを使用するアッセイにおいて、約10μMの濃度で、ビヒクルと比較してcAMP形成の阻害における増加を示す、実施形態148から171のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４９３】
実施形態173:[3H]DAMGOを使用する競合的結合アッセイにおいて、約5μM未満、約3.5μM未満、約1μM未満、約0.8μM未満、約0.5μM未満、又は約0.3μM未満のKiを示す、実施形態148から172のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４９４】
実施形態174:約0.5μM未満又は約0.3μM未満のKiを示す、実施形態173に記載のペプチド。
【０４９５】
実施形態175:血液脳関門を横断する、実施形態148から174のいずれか1つに記載のペプチド。
【０４９６】
実施形態176:実施形態148から175のいずれか1つに記載のペプチドと、少なくとも1種の医薬賦形剤とを含む、医薬組成物。
【０４９７】
実施形態177:経口投与用に製剤化される、実施形態176に記載の医薬組成物。
【０４９８】
実施形態178:前記ペプチドがグリコシル化され、前記組成物が経口投与、注射による投与、又は髄腔内投与用に製剤化される、実施形態176に記載の医薬組成物。
【０４９９】
実施形態179:前記ペプチドがグリコシル化されず、前記組成物が経鼻投与又は髄腔内投与用に製剤化される、実施形態176に記載の医薬組成物。
【０５００】
実施形態180:対象に、実施形態148から175のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態176から179のいずれか1つに記載の医薬組成物を投与することを含む、疼痛を処置する方法。
【０５０１】
実施形態181:疼痛が、術後疼痛、神経損傷に伴う疼痛、骨折に伴う疼痛、火傷に伴う疼痛、又は外傷に伴う疼痛である、実施形態180に記載の方法。
【０５０２】
実施形態182:疼痛を処置するための医薬の製造における、実施形態148から175のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態176から179のいずれか1つに記載の医薬組成物の使用。
【０５０３】
実施形態183:疼痛が、術後疼痛、神経損傷に伴う疼痛、骨折に伴う疼痛、火傷に伴う疼痛、又は外傷に伴う疼痛である、実施形態182に記載の使用。
【０５０４】
実施形態184:疼痛を処置する方法における使用のための、実施形態148から175のいずれか1つに記載のペプチド。
【０５０５】
実施形態185:疼痛を処置する方法における使用のための、実施形態176から179のいずれか1つに記載の医薬組成物。
【０５０６】
実施形態186:疼痛が、術後疼痛、神経損傷に伴う疼痛、骨折に伴う疼痛、火傷に伴う疼痛、又は外傷に伴う疼痛である、実施形態184に記載の方法における使用のためのペプチド又は実施形態185に記載の方法における使用のための医薬組成物。
【０５０７】
実施形態187:対象に、実施形態148から175のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態176から179のいずれか1つに記載の医薬組成物を投与することを含む、鎮痛を届ける方法。
【０５０８】
実施形態188:鎮痛を届けるための医薬の製造のための、実施形態148から175のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態176から179のいずれか1つに記載の医薬組成物の使用。
【０５０９】
実施形態189:鎮痛を届ける方法における使用のための、実施形態148から175のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態176から179のいずれか1つに記載の医薬組成物。
【０５１０】
実施形態190:対象に、実施形態148から175のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態176から179のいずれか1つに記載の医薬組成物を投与することを含む、有害な副作用がより少ない、好ましくはモルヒネと比較してより少ない、疼痛を処置する又は鎮痛を届ける方法。
【０５１１】
実施形態191:前記有害な副作用が消化管(GI)阻害及び/又は呼吸抑制である、実施形態190に記載の方法。
【０５１２】
実施形態192:有害な副作用がより少ない、好ましくはモルヒネと比較してより少ない、疼痛を処置する又は鎮痛を届けるための医薬の製造のための、実施形態148から175のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態176から179のいずれか1つに記載の医薬組成物の使用。
【０５１３】
実施形態193:前記有害な副作用が消化管(GI)阻害及び/又は呼吸抑制である、実施形態192に記載の使用。
【０５１４】
実施形態194:有害な副作用がより少ない、好ましくはモルヒネと比較してより少ない、疼痛を処置する又は鎮痛を届ける方法における使用のための、実施形態148から175のいずれか1つに記載のペプチド又は実施形態176から179のいずれか1つに記載の医薬組成物。
【０５１５】
実施形態195:前記有害な副作用が消化管(GI)阻害及び/又は呼吸抑制である、実施形態194に記載の方法における使用のためのペプチド又は実施形態194に記載の方法における使用のための医薬組成物。
【０５１６】
実施形態196:薬における使用のための、実施形態1から59、80から127、及び148から175のいずれか1つに記載のペプチド。
【０５１７】
本発明の実施形態は、例として添付の図を参照してここに記載される。
【０５１８】
【表１】
2021525736.tif 000072
【実施例１】
【０５１９】
ペプチド合成
Fmoc化学反応を使用してTable 1(表1)のペプチドを合成した。
【０５２０】
新規ペプチド合成:
一般的な合成の詳細:静的混合機、Shimadzu SPD-M10AVP Diode Array Detector及びShimadzu SCL-10AVP System Controllerを備えた2台のShimadzu LC-8A Preparative Liquid Chromatographsからなるシステムで最初のHPLCを実施した。Agilent 1100 Seriesダイオードアレイ及び/又は複数の波長検出器、Polymer Laboratories PL-ELS1000 ELSD及びAgilent 1100 Seriesフラクションコレクターを備えたAgilent 1100シリーズ分離モジュールを使用し、ChemStation(Revisions 9.03A又は10.0A)を作動させて、さらなるHPLCを実施した。XWIN-NMR又はTopspinの制御下でBruker Avance 500又はBruker Avance 600分光器上でDMSO-d6中でNMRスペクトルを取得し、残留する1Hシグナルを参照した。Agilent 1100シリーズLC/MSD質量検出器及びAgilent 1100シリーズダイオードアレイ検出器を備えたAgilent 1100シリーズ分離モジュールを使用してエレクトロスプレーイオン化質量スペクトル(ESIMS)を取得した。Finnigan API IIIソースを備えたFinnigan MAT 900 XL-Trap装置上で、高分解能(HR)ESIMS測定を行った。特に明記しない限り、0.1%TFAの一定レベルをすべてのHPLC分離に使用した。100×2mm細胞内でのカイロオプティカル測定([α]D)をJasco P-1010 Intelligent遠隔モジュール型旋光計で得た。
【０５２１】
Fmoc-L-及びD-アミノ酸はNovabiochem社(Laufelfingen、Switzerland)又はPeptide Institute社(Osaka、Japan)から入手した。2-クロロトリチルクロリド及びRinkamide樹脂はNovabiochem社(Laufelfingen、Switzerland)から購入した。2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)はRichelieu Biotechnologies社(Quebec、Canada)から入手した。トリフルオロ酢酸(TFA)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)及びN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、すべての合成等級のペプチドはAuspep社(Melbourne、Australia)から購入した。
【０５２２】
bilaid A〜Cの特徴付け:
bilaid A(FvVf-OH)(1a)。淡褐色の油状物質;[α]D+9(c0.2、0.1%TFA/MeOH);HRESI(+)MS m/z 533.2745[(M+Na)、C28H38N4O5Naは533.2740を必要とする];1H、13C及び2D NMR(600MHz、DMSO-d6)については図25及びTable 1(表1)を参照されたい。
【０５２３】
bilaid B(FvVy-OH)(2a)。淡褐色の油状物質;HRESI(+)MS m/z 549.2692[(M+Na)+、C28H38N4O6Naは549.2689を必要とする];1H NMR(600MHz、DMSO-d6)については図25及びTable 1(表1)を参照されたい。
【０５２４】
bilaid C(YvVf-OH)(3a)。淡褐色の油状物質;HRESI(+)MS m/z 527.2879[(M+H)+、C28H39N4O6は527.2870を必要とする];1H NMR(600MHz、DMSO-d6)については図25及びTable 1(表1)を参照されたい。
【０５２５】
一般的なペプチド合成手順:すべてのペプチドは段階的な固相ペプチド合成により手作業で組み立てた。2-クロロトリチルクロリド樹脂(0.176g、0.25mmol;ペプチド酸に対して)又はRinkアミド樹脂(0.176g、0.25mmol;ペプチドアミドに対して)をDMF中で2時間膨張させ、排水した。第1のFmoc保護されたアミノ酸(1mmol)をDMF(2mL)に溶解し、DIEA(174μL、1mmol)を加えた。アミノ酸の完全な溶解後、混合物を反応容器に加え、2時間振盪した。樹脂をDMFで1分間流動洗浄した。5%ピペリジン/DMF混合物と共に樹脂を振盪することにより(2×10mL、各サイクル1分間)、Fmoc保護基を除去した。脱保護後、樹脂を再度1分間流動洗浄した。次のアミノ酸(1mmol)を0.5M HBTU溶液(2mL)及びDIEA(174μL、1mmol)で活性化し、反応容器に加えた。混合物を10分間振盪し、ニンヒドリン試験を実施して、カップリング収率を計算した。この試験を各カップリング後に繰り返した。集合体の完成後、末端Fmoc基を上に記載されているように除去し、樹脂をDMFで洗浄し、これに続いてDCMで洗浄し、窒素下で乾燥させた。10mLの切断混合物(TFA:水:95:5)と共に2時間振盪することにより、ペプチドを樹脂から切断した。TN2気体下でFAを蒸発させた。
【０５２６】
固相合成からの合成ペプチド酸の精製:合成ペプチドのための反応生成物を分取HPLC(Zorbax SB-C18カラム、250×21.2mm、7μm、均一濃度45%H2O(0.1%TFA)で精製した:bilaid A(FvVf-OH、35.3mg)(1a)及びfVvF-OH、41.0mg(1b)に対するMeOH; 30% H2O(0.1%TFA): FVvf-OH、25.0mg(1c)及びfvVF-OH、30.8mg(1d)に対するMeOH;40%H2O(0.1%TFA); bilaid B(FvVy-OH、44.8mg)(2a)及びbilaid C(YvVf-OH、45.9mg)(3a)。
【０５２７】
テトラペプチド酸のアミドへの溶液変換:ジ-tert-ブチル-ジカルボネートの1,4-ジオキサン(29.3mg/mL)中溶液に、ピリジン(10.5μL/mL)及び炭酸水素アンモニウム(10.5mg/mL)を加えた。1a、1b、1c及び1dに、300μLのこの溶液を加え、2a及び3aには、4当量と一致させた600μLを加えた。50℃で3日間撹拌後、反応生成物を分取HPLC(Zorbax SB-C8 150×21.2mmカラム;90%H2O(0.1%TFA):MeCN〜MeCNの勾配を15分間)で精製し、純粋な試料を生成した。
【０５２８】
合成ペプチドに対するLC/MS分析:Zorbax SB-C8 150×4.6mm、5μmカラムで実施した(流量1mL/分;勾配10〜100% MeCN/H2O(+均一濃度0.05% HCO2H)を15分間)。
【０５２９】
ペプチドに対するキラルHPLC分析:Astec Chirobiotic Tカラム、150×4.6mm、5μm、0.5mL/分、均一濃度のMeOH(0.1%トリエチルアミン、0.2% AcOH、pH6.23)で実施した。
【０５３０】
Nα-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-3-O-[2,3,6-トリ-O-アセチル-4-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノシル)-β-D-グルコピラノシル]-L-セリン(Fmoc-L-Ser[β-Lac(Ac7)]-OH)
Xuら、Journal of Carbohyrate Chemistry、(2012年)、31巻(9号): 711〜720頁に概説されている手順に従いβ-ラクトース過酢酸を調製した。簡単に説明すると、温度を135℃で維持しながらα-ラクトース一水和物(20.0g)を酢酸ナトリウム(5.0g)の無水酢酸(200mL)中撹拌懸濁液に少しずつ加えた。1時間後、溶液を氷水(1L)の中に注ぎ入れ、終夜撹拌した。生成した沈殿物を濾過によって収集し、CH2Cl2中に再び溶解し、飽和NaHCO3で洗浄し、MgSO4で乾燥させた。減圧下で溶媒を除去した後、これをCH2Cl2/MeOH(16.1g、42%)から結晶化した。ESI-MS(m/z):計算値619.2[M-OAc]+実測値619.3。
【０５３１】
Salvadorら、Tetrahedron、(1995年)、51巻(19号):5643〜5656頁により記載された手順に基づき、Fmoc-L-Ser-OHをO-β-ラクトシル化した。β-ラクトース過酢酸(5.0g)とFmoc-L-Ser-OH(2.9g)の無水CH2Cl2(100mL)中混合物に、BF3・Et2O(2.8mL)を加え、窒素下で20時間撹拌した。溶液を1M HClで洗浄し、次いで水で洗浄し、MgSO4で乾燥させた。シリカゲルクロマトグラフィー(CH2Cl2中1% AcOH/2% MeOH)で精製し、これに続いてRP-HPLC(50%B均一濃度)(1.9g、27%、β-ラクトース過酢酸から得たもの)で精製した。ESI-MS(m/z):計算値946.3[M+H]+実測値946.3。
【０５３２】
H-[2,6-ジメチル-L-チロシル]-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(Bilactorphin、3g)
Fmoc-Rink-アミドポリスチレン樹脂(置換値0.67mmol/g)に対して0.5mmolスケールでのFmoc化学反応を使用してペプチドアセンブリーを実施した。50%ピペリジン/DMFでの処理により(2×1分)、Fmoc脱保護を達成した。樹脂充填量に対して3当量のFmocアミノ酸/HBTU/DIEA(1:1:1)樹脂を使用してカップリングを実施した(30分)。Nα-Fmoc-O-β-ラクトシル-L-セリンをヘプタ-O-アセテート(上に記載の通り調製)として組み込んだ。Nα-Boc-2,6-ジメチル-L-チロシンは側鎖保護なしで使用した。95% TFA/2.5% TIPS/2.5% H2Oで、室温で2時間処理することにより、側鎖保護基の樹脂からの切断及び除去を達成した。窒素流下でTFAを除去し、冷たいジエチルエーテル/n-ヘキサン(1:1)を使用して生成物を沈殿させ、Et2Oで洗浄し、50%アセトニトリル/0.1% TFA/H2O中に再び溶解し、凍結乾燥させた。ESI-MS(m/z):計算値1259.5[M+H]+、実測値1259.7。5%ヒドラジン/30%アセトニトリル/H2Oの溶液で5時間処理することにより、粗生成物を脱アセチル化し、次いでRP-HPLC(10〜50%Bで40分間を超えて)で精製した。(190mg、最初の樹脂充填量から39%)。ESI-MS(m/z):計算値965.5[M+H]+、実測値965.4。
【０５３３】
一般的物質及び方法
RP-HPLC溶媒Aは0.05%TFA/H2Oであり、溶媒Bは0.043%TFA/90%アセトニトリル/H2Oであった。流量0.3mL/分でThermo Hypersil GOLD C182.1×100mmカラムを使用して、Shimadzu LC20ATシステムで分析HPLCを実施した。吸光度を214nmで記録した。流量80mL/分でVydac 208TP 50×250mmカラムを使用して、Waters DeltaPrep 3000システムで分取HPLCを実施した。API 2000三重四重極質量分析計(AB SCIEX社、Framingham、MA、USA)で、陽性イオン化モードにおいて質量スペクトルを記録した。Fmocアミノ酸及びO-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)はIris Biotech社(Marktredwitz、Germany)製のものであり、ジメチルホルムアミド(DMF)及びジイソプロピルエチルアミン(DIEA)はAuspep社(Melbourne、Australia)製のものであった。Boc-2,6-ジメチル-L-チロシンはAstaTech社(Bristol PA、USA)から購入した。すべての他の試薬はSigma Aldrich社から入手した。
【実施例２】
【０５３４】
ホルスコリン誘発性cAMP形成の阻害
Gタンパク質共役受容体(GPCR)によるアデニル酸シクラーゼ活性のモジュレーションにより生成された細胞内cAMPのレベルを測定するための手順。基礎レベルに対して、細胞内のcAMPレベルの変化を測定することにより、オピオイド、及びオピオイド様化合物、及び特異的オピオイドGPCRの間の機能的相互作用を試験するため、アッセイは、細胞を刺激して、細胞内cAMPレベルを増加又は低減させることにより、GPCRに対するアゴニスト及びアンタゴニスト活性を測定することができる。
【０５３５】
物質
cAMPアッセイキットで供給された試薬:Anti-cAMP受容体ビーズ、ストレプトアビジン-コーティングしたドナービーズ、ビオチン化したcAMP、cAMP標準物質、3% Tween-20溶液。追加の試薬:1M HEPES(Muticel)、10% Tween-20(Pierce社)、BSA(Sigma社)、1×PBS(Gibco BRL社)、滅菌蒸留水(Gibco BRL社)、ホルスコリン(Sigma社)、10×HBSS(Hepes緩衝塩溶液、Gibco BRL社)、IBMX溶液(3-イソブチル-1-メチルキサンチン、Sigma社)、DMSO(Sigma社)、95%エタノール(Sigma社)、完全成長培地、Versene(Gibco社)。装置:Envisionマルチラベルプレートリーダー(Perkin Elmer社)、Optiplate-384ウェルプレート(Perkin Elmer社)、TopSeal接着シーリングフィルム(Perkin Elmer社)、96-ウェルプレート(Axigen社、ポリプロピレンVの底部)、ケイ素96-ウェルプレートシーリングマット(Axigen Axigen社)、単一チャネルピペッター、マルチチャネルピペッター、遠心分離、ボルテックス、75cm2ベントした組織培養フラスコ、50mlコニカルチューブ、15mlコニカルチューブ、電子ピペットエイド、使い捨て滅菌トランスファーピペット、血球計算器、顕微鏡。
【０５３６】
方法
アッセイは384-ウェルプレート内で実施し、各データ点は三重反復試験で実施する。試験化合物は同じプレート上で対照及びcAMP標準物質として分析すべきである。活性についてスクリーニングすべき化合物の数により、試薬の量及び各実験に必要とされる細胞を決定する。試験化合物、対照及びcAMP標準物質は、事前に又は細胞を刺激緩衝液と共にインキュベートしている間にプレートに加えることができる。プレートは、蒸発を回避するためにTopSeal接着剤シーリングフィルムで密閉すべきである。
【０５３７】
アッセイバックグランド:cAMPの検出は、細胞内cAMPと、ビオチン化cAMPに連結しているストレプトアビジンコーティングドナービーズとの間での抗cAMPコンジュゲート受容体ビーズに対する競合に基づく。ドナービーズと受容体ビーズとが近接近すると、520〜620nmで放出されたシグナルがEnvisionマルチラベルプレートリーダーを使用して検出される。
【０５３８】
試薬の調製
ストック:
500mM IBMX溶液:100mgのIBMXを900μlのDMSOに溶解して、500mMのストック溶液を得る。等分し、20℃で保存する。
【０５３９】
50mMホルスコリン溶液:5mgのホルスコリンを244μlの95%エタノールに溶解して、50mMストック溶液を得る。20℃で保存し、必要に応じて使用する。
【０５４０】
新鮮な試薬- 50mlのコニカル試験管内に以下の試薬を新しく調製する:
刺激緩衝液(1×HBSS、0.1% BSA、1m MIBMX):50mlに対して、5mlの10×HBSSを50ml試験管に加え、次いで50mlになるように水を加える。50mgのBSAを加え、BSAが溶解するまで37℃に保ち、次いでIBMXが確実に沈殿しないように緩衝液を37℃で保ちながら100μlのIBMXを加える。
【０５４１】
溶解緩衝液(0.3%Tween-20、5mM HEPES、0.1%BSA):40mlに対して、1.2mlの10%Tween-20及び200μlの1M HEPESを50ml試験管に加え、次いで40mlになるように水を加える。50mgのBSAを加え、BSAが溶解するまで37℃に保つ。
【０５４２】
ホルスコリンを有する刺激緩衝液(*刺激緩衝液中200μM):1:250の希釈になるように、50mMストックから、ホルスコリンを必要量の刺激緩衝液に加える。アッセイプレート内の最終濃度は半分になることに注目されたい。*アッセイにおけるホルスコリンの最適な濃度は細胞株に特異的であり、最適化すべきである。
【０５４３】
試験ペプチドの調製:試験ペプチドは通常、最終濃度10μMで試験する。大部分の試験ペプチドは100%DMSOに溶解するので、最大細胞生存度及び応答性を確実にするように、DMSO濃度を細胞刺激中は2%v/vに限定することが推奨される。適当な希釈液中で試験ペプチドの1mM及び100μMストック溶液を調製し、4℃で保存する。ペプチドライブラリーのために、これは、ケイ素シーリングマットで密閉した96ウェルプレート内で実施することができる。試験ペプチドを、ストック溶液から新しく希釈して、ホルスコリンを有する刺激緩衝液中での作用濃度にする。アッセイにおいてペプチドは細胞と共に1:1希釈されるので、作用濃度は最終必要濃度の2倍にすべきであることに注目されたい。実験のばらつきを回避するため、DMSOストック化合物から新たに希釈した化合物にアッセイを実施することが必要となり得る。
【０５４４】
対照化合物:公知の活性を有する化合物を対照として使用する。対照は通常1μMで使用し、-20℃で貯蔵されているストックからホルスコリンを有する刺激緩衝液中で新しく希釈する。アッセイのために、5μlの調製した対照化合物を三重反復試験において1ウェルごとに加える。
【０５４５】
細胞の調製:最も良い結果を得るためには、細胞は70〜90%コンフルエンスで低継代であるべきである。アッセイのための細胞を調製するために、成長培地を除去し、ヴェルセンを加え、次いで37℃でおよそ5分間インキュベートして、細胞を組織培養物プラスチックから分離させる。細胞を収集し、275×gで2分間遠心分離する。上清をデカントし、細胞ペレットを1×PBSに再懸濁させる。血球計算器を使用して細胞濃度を決定する。細胞を275×gで2分間再遠心分離し、上清をデカントする。細胞を刺激緩衝液に再懸濁させて、1ml当たり1〜4×104個の細胞の最終濃度にする。細胞の数はアデニル酸シクラーゼ活性化の前(基本)及び後に広まるcAMPレベルに影響を及ぼすことに注目されたい。cAMPの基本レベルと刺激レベルとの間の差異を最適化するために細胞滴定を実施すべきである。細胞を37℃で20〜30分間刺激緩衝液中でインキュベートしてから、試験及び対照化合物を含有するウェルに5μlを加える。細胞はcAMP標準物質には加えないことに注目されたい。
【０５４６】
cAMP検量線の調製:50μMのcAMP溶液が供給されたキットから基準のcAMP希釈系列を調製する。使用前、最大強度で5秒間ボルテックスする。連続的に希釈して、5μM〜0.5nMの範囲の最終濃度のcAMPを得る(例えば:5μM、0.5μM、50nM、15nM、5nM、1.5nM、及び0.5nM cAMP)。陽性対照(cAMPなし)も含むべきである。アッセイに対して、1ウェル当たり10μlの基準希釈物を三重反復試験で加える。
【０５４７】
受容体及びドナービーズ溶液の調製:抗cAMPコンジュゲート受容体ビーズ及びストレプトアビジンコーティングドナービーズは、光感受性があり、抑制された照明下で又はグリーンフィルターを装着した照明下で取り扱うべきである。ビーズをアッセイプレートに加えたら、インキュベーションが暗所で実施されるようそれをホイルで包むべきである。細胞をインキュベートし、必要時まで暗所で保ちながら、受容体及びドナービーズ溶液を15mlコニカル試験管中に調製する。受容体ビーズ溶液に対しては、溶解緩衝液1ml当たり10μlのビーズ懸濁液を穏やかに混合する。ドナービーズ溶液に対しては、溶解緩衝液1ml当たり10μlビーズ懸濁液及び0.75μl/mlのcAMP-ビオチンを使用し、穏やかに混合する。
【０５４８】
cAMPアッセイ手順
1.標準物質(10μl/ウェル)、対照化合物(5μl/ウェル)及び試験ペプチド(5μl/ウェル)を384-ウェルプレートに加え、Top Seal接着剤シーリングフィルムで密閉する。細胞インキュベーションが完了するまでそのまま室温で置く。
2.刺激緩衝液中でインキュベートした5μlの細胞を、試験ペプチド及び対照化合物を含有するウェルに加えるが、標準物質には加えない。細胞及び化合物を37℃で30分間インキュベートする。
3.1ウェル当たり10μlの溶解緩衝液を加える。
4.抑制された照明下で、5μlの受容体ビーズ溶液を各ウェルに加える。プレートをホイルで覆い、オービタルシェーカー上で60分間穏やかに混合しながら室温でインキュベートする。
5.同様に抑制された照明下で、5μlのドナービーズ溶液を各ウェルに加え、プレートをホイルで覆い、次いでオービタルシェーカー上で穏やかに混合しながら終夜室温でインキュベートする。
6。cAMPレベルをEnvisionマルチラベルプレートリーダーで測定する。
【０５４９】
結果分析:プリズムソフトウエアを使用して結果を分析することで、それぞれ3重のデータ点及びこれらデータ点の標準偏差に対してcAMPの細胞内レベルを計算する。
【０５５０】
上記に記載されている方法に従い、ヒトMOPr(hMOPr)を発現するHEK細胞内でホルスコリン誘発性cAMP形成の阻害に対してペプチドをスクリーニングした。
【０５５１】
Bilaid B(2a)もそのC-末端カルボキサミド類似体(2b)も10μMで活性を示さず、第4のアミノ酸位でのフェニルアラニンがより良好であることを示した。
【０５５２】
Table 1(表1)に示されている通り、bilaid A(ペプチド1a、H-FvVf-OH)及びbilaid C(ペプチド3a、H-YvVf-OH)は10μMで活性を示した。対照的に、DLDL(1b)立体化学又はLLDD(1c)立体化学を有するbilaid Aの類似体は10μMで不活性であり、LLLL立体化学(1h)を有するbilaid Aの類似体は10μMで活性が低く、MOPr活性の維持に対するLDLDモチーフの重要性を強調した。
【実施例３】
【０５５３】
競合的結合アッセイ(MOPr)
MOPrアゴニスト[3H]DAMGOに対抗する、hMOPrに対する競合的結合についてペプチドを試験した。Bilaid A(1a)は中程度の親和性(Ki=3.1μM)を示し、これはC-末端アミド化を介して4倍改善した(1e、Ki=0.75μM)。N-末端チロシンを含有するBilaid C(3a)は、hMOPrにおいてサブマイクロモル結合(Ki=210nM)を示した。C-末端アミド化(3b)は、MOPr親和性(Ki=93nM)を2倍にし、これは1aよりも高い1eへの結合の増加と一致した。N-末端チロシンのジメチル化([Dmt]-vVf-NH2(3c))(Dmt=2,6-ジメチル-L-チロシン)、Zhaoら、J Pharmacol Exp Ther、(2003年)307巻(3号): 947〜54頁を参照されたい)は、1.1nMのKiを生じるためのさらなる増加をもたらした。ペプチド3c(bilorphinと命名)は、hMOPrに対して、hDOPrよりもほぼ200倍の選択性(Ki=190nM)及びhKOPrよりも700倍の選択性(Ki=770nM)で結合した。図1及びTable 1(表1)を参照されたい。
【０５５４】
HEK-293細胞(ヒト胚性腎臓細胞株)内で発現されたヒト組換えMOPrから調製した膜を、[3H]DAMGO(0.5nM)プラス様々な濃度の非標識ペプチドと共に22℃で120分間インキュベートした後、濾過分離し、これに続いて液体シンチレーションカウンティング手順を使用して、競合性MOPr結合を決定した。受容体への特異的なリガンド結合は、過剰の非標識オピオイドリガンド(ナロキソン、10μM)の存在下で決定された全結合と、非特異性結合との間の差異として定義される。結果は、目的の非標識ペプチド存在下で得られた、対照の特異結合のパーセント((測定された特異結合/対照特異結合)×100)として表現される。IC50値(対照の特異結合の最大半量の阻害を引き起こす濃度)及びHill係数(nH)は、Hill方程式カーブフィッティング(Y=D+[(A-D)/(1+(C/C50nH)]、(式中、Y=特異結合、D=最小特異結合、A=最大特異結合、C=化合物濃度、C50=IC50、及びnH=スロープ係数)を使用して、平均反復値を用いて作成された競合曲線の非直線回帰分析により決定した。
【実施例４】
【０５５５】
競合的結合アッセイ(DOPr)
DOPrアゴニスト[3H]DADLEに対抗する、hDOPrに対する競合的結合についてペプチドを試験した。図1及びTable 1(表1)を参照されたい。
【０５５６】
CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞株において発現されるヒト組換えDOPr(hDOPr)への結合の阻害は、[3H]DADLE(0.5nM)中で、22℃で120分間インキュベーションを行ったことを除いて、MOPr結合に対して記載されている通り(実施例3)実施した。
【実施例５】
【０５５７】
競合的結合アッセイ(KOPr)
KOPrアゴニスト[3H]U69593に対抗する、hKOPrに対する競合的結合についてペプチドを試験した。図1及びTable 1(表1)を参照されたい。
【０５５８】
CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞株において発現されるヒト組換えKOPr(hKOPr)への結合の阻害は、[3H]U69593(2nM)中で、22℃で60分間インキュベーションを行ったことを除いて、MOPr結合に対して記載されている通り(実施例3)実施した。
【実施例６】
【０５５９】
活性化したGタンパク質のパッチクランプ記録
bilorphinの機能活性を評価するため、Gタンパク質活性化した、内向き整流性カリウムチャネル(GIRK)流のパッチクランプ記録を、MOPrを天然に発現するが、DOPrもKOPrも発現しないラット青斑核(LC)ニューロンに作製した(Northら、Proc Natl Acad Sci、U S A.(1987年)84巻(15号):5487〜91頁)。Bilorphinは、モルヒネより大きい有効性でアゴニストとして作用した。その作用は極めてMOPr選択的アンタゴニストCTAPにより完全に逆転し(n=9、図2A; Table 1(表1))(Peltonら、J Med Chem (1986年)29巻(11号):2370〜5頁)、LCニューロンにより発現される密接に関連した受容体、例えば、NOPr又はソマトスタチン受容体に作用しないことを確証した(Connorら、Br J Pharmacol (1996年)119巻(8号): 1614〜8頁)。アセチル化N-末端(3d)を有するBilaid C類似体、又はすべてのL-立体異性体(3e及び3f)は、10〜30μMでLCニューロンにおいて不活性であり、MOPr活性を維持することに対する遊離N-末端及び天然のLDLDモチーフの重要性を示している(Table 1(表1))。LCニューロンにおけるbilorphinの最大下の、部分アゴニスト様作用を、met-エンケファリンの完全アゴニスト作用のその部分的アンタゴニズムにより確認した。急性脱感作後に安定した活性化応答を生成させ、並びに機能的予備受容体を減少させたるためにMOPrを10分間脱感作した後、これを試験した(n=12、図2B)。
【０５６０】
脳スライス電気生理:以前に記載されているように、青斑核LCニューロンを含有する脳スライスを雄のSprague Dawleyラット(4〜6週)から調製した(Sadeghi Mら、Br J Pharmacol、(2015年)172巻(2号):460〜8頁、参照により組み込まれている)。簡単に説明すると、ラットをイソフルランの麻酔下に置き、頭部を切除した。脳を分析し、ビブラトームチャンバー(Leica biosystem社、VT100、Wetzlar、Germany)に固定して、水平な脳スライス(280μm)を調製した。スライスを切り、0.01(+)MK801(95%O2 - 5%CO2)を補充した以下(単位:mM)を含有する温かい(34℃)人工の脳脊髄液(ACSF)に貯蔵した:125 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl2、1 MgCl2、1.25 NaH2PO4、25 NaHCO3及び11グルコース。記録前に、スライスを温かい酸素化ACSF内で少なくとも30分間インキュベートした。温かいACSF(34℃)を約2mL/分の速度で表面灌流しながら、スライスを記録チャンバーに移した。-60mVの保持電位でマルチクランプ700B増幅器(Molecular Devices社、CA、USA)を用いてLCニューロンから全細胞の電圧-クランプ記録を取得した。記録ピペット(2〜4MΩ)に以下を含有する(単位mM)内液を充填した:135グルコン酸カリウム、8 NaCl、10 HEPES、0.5 EGTA、2 Mg-ATP及び0.3 Na-GTP;pH7.3、280〜285mOsM。連続流の記録チャートモードに500Hzで収集し、Axograph X(Axograph Scientific社、Sydney、Australia)を使用して20〜50Hzで濾過した。直列抵抗を実験全体にわたりモニターし、<15ΜΩのままにした。さもなければ、データは廃棄した。薬物適用のベースライン流とピーク流との間の差異として外向き流を測定した。
【実施例７】
【０５６１】
相対的有効性及び固有効力の評価
他のシグナル伝達経路におけるbilorphinの相対的有効性及び固有効力(最大応答)もFLAGタグ付きマウスMOPr(mMOPr)を安定的に発現するAtT20細胞内で試験することによって、偏向性の分析を可能にした(図5)。Gタンパク質(GGIRK)を活性化するbilorphinの相対的な固有効力を確実に決定するため、いかなるMOPrアゴニストも天井効果に到達しないことを確実にした。β-クロルナルトレキサミンを使用して、十分な画分の受容体を不可逆的に不活化することによって、met-エンケファリンの最大応答を、同じ細胞内で天然のSST受容体に作用する最大濃度のソマトスタチンにより生成される応答の80%に減少させた(図4、図5)。SST受容体の最大活性化は通常MOPrの最大活性化と同等のGGIRK増加を生成する(Yousufら、Mol Pharmacol、(2015年)88巻(4号): 825〜35頁)。これらの条件下で、bilorphin、モルヒネ及びエンドモルフィン-2はすべて類似の最大応答を示し、これらが類似の固有効力を有することを示している。met-エンケファリンを除いて、すべてのアゴニストは脳スライス及び細胞株において類似の有効性を示した。脳スライスにおけるMet-エンケファリンの有効性の減少はエンケファリナーゼ及び他のペプチダーゼによるその分解から生じることが知られている(Williamsら、J. Pharmac. Exp. Ther.、(1987年) 243巻: 397〜401頁)。脳スライス実験から予想されるように、すべての3種のオピオイドは適度に効果的であったが、Met-エンケファリンほどではなかった(図5、図23A)。対照的に、Gタンパク質偏向性の小分子アゴニストオリセリジンは、モルヒネ又はbilorphinのいずれよりもGGIRKを活性化させる効果が有意に低かった(図5、図23A)。
【０５６２】
AtT20細胞におけるMOPrの発現:
野生型mMOPrをFLAG-タグの付いたpcDNA3.1プラスミド中にクローニングし、Borglandら、J Biol Chem (2003年) 278巻(21号): 18775〜84頁で以前に記載されている通り、AtT20細胞において意図的に低レベルの発現で安定的に発現させた(8pmol/mgタンパク質;2×105受容体/細胞、細胞数測定から予測)。パッチクランプ実験のために、ダルベッコ改変イーグル培地(Gibco社、Life Technologies社、Australia)内に、4.5g/Lグルコース、ペニシリン-ストレプトマイシン(100μl/ml.)、G418(50mg/ml.)(Gibco社、Invitrogen社)及び10%FBSを含有する35-mmポリスチレンペトリ皿(Beckton、Dickinson Biosciences社)にAtT20細胞を播種した。細胞培養物を加湿した5%CO2大気中37℃で保持した。24時間のインキュベーション後の記録に対して、細胞の準備はできた。
【０５６３】
培養細胞電気生理:穿孔パッチクランプ記録法を以前に記載されている通り実施した(Yousufら、Mol Pharmacol.、(2015年) 88巻(4号):825〜35頁)。ピペットをボロシリケートガラス(AM Systems社、Everett、WA、USA)から引き込み、3.5〜4.5MΩの間の入力抵抗を生成し、135mMグルコン酸カリウム、3mM MgCl2、10mM HEPES(KOHでpH7.4に調整)を含有する内液を充填した。記録電極にこの内液を最初に充填し、次いで200μg/mlのアムホテリシンB(0.8%DMSO中)を含有する同じ溶液を充填し直した。IGIRKの測定のため、測定開始前に槽内のKCl濃度を20mMに増加させ(NaClを置換)、Yousufら(2015年)に以前に記載されている通り、実験全体にわたりこれを維持した。液間電位は+16mVであると計算し、各記録の開始前に調整した。Axopatch 200B増幅器及びpCLAMP 9.2ソフトウエアを使用して、完全に密閉した、温度制御された記録チャンバー内で、37℃で流れを記録し、Digidata 1320(Axon Instruments、Molecular Devices社、Sunnyvale、CA、USA)を使用してデジタル化した。流れを100Hzでサンプリングし、50Hzで低域フィルタリングし、後で分析するために、ハードディスクに記録した。2秒ごとに送達される、-60mVの保持電位から-120mVまでの200ms電圧ステップを使用してIGIRKを記録した。薬物は、ValveLink 8.2、加圧したピンチバルブ潅流システム(AutoMate Scientific社、USA)を使用して細胞に直接灌流した。
【０５６４】
データ分析。すべてのデータは平均値±SEMとして示し、GraphPad Prism v7を使用して分析した。すべてのデータ点は、以下の計算を使用してコードGIRKコンダクタンス(GGIRK、nS)としてプロットする:[IGIRK(-60mV)-IGIRK(-120mV)]pA/60mV。
【０５６５】
C-末端リン酸化の誘発の評価
MOPrのC-末端リン酸化、βアレスチン動員及び内在化は、オンターゲットオピオイド鎮痛剤副作用に寄与すると考えられるので、アレスチンシグナル伝達を回避するGタンパク質偏向性オピオイドは改善された副作用プロファイルを示すはずである(Manglikら、Nature、(2016年) 537巻(7619号):185〜190頁; Schmidら、Cell、(2017年) 171巻(5号):1165〜1175頁; DeWireら、J Pharmacol Exp Ther、(2013年) 344巻(3号):708〜17頁)。残基セリン375(Ser375)のアゴニスト誘発性リン酸化はβアレスチン動員及び内在化を促進する(El Kouhenら、J Biol Chem、(2001年) 276巻(16号): 12774〜80頁)。Gタンパク質活性化を決定するために使用した、同じAtT20細胞株において、C-末端リン酸化、βアレスチン動員及びMOPr内在化を誘発するためのbilorphinの活性をアッセイした。bilorphin誘発性Ser375リン酸化の活性を、ホスホサイト特異的抗体を使用して決定した(図6、図9;Dollら、Br J Pharmacol、(2011年) 164巻(2号): 298〜307頁)。驚くことに、他のオピオイドペプチドとは異なり(Thompsonら、Biochem Pharmacol、(2016年) 113巻:70〜87頁)、bilorphinは、飽和濃度で非常に低レベルのpSer375免疫反応性を生じた(30μM、図6、図9、図23B)。bilorphinによる最大リン酸化はモルヒネによるものと類似であり、モルヒネより低い傾向を示すが、モルヒネはSer375においてMOPrを少しだけ弱くリン酸化することが知られている(図23)(McPhersonら、(2010年)、Mol Pharmacol、78巻: 756〜766頁)。
【０５６６】
Ser375リン酸化アッセイ:MOPrを安定的に発現するAtT20細胞をカバーガラス上で約50%コンフルエンスまで成長させた。細胞は少なくとも30分間血清不足の状態に置き、次いで示されたリガンドの不在下で又は存在下、37℃で5〜10分間インキュベートした。-30℃メタノールで細胞を固定させることによりリン酸化を終結し、これに続いて氷上で10分間のインキュベーションを行った。細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、次いでクエン酸ナトリウム緩衝液(10mM、0.05%Tween20、pH.6)中で、95℃で20分間加熱した。細胞をアンチ-ホスホSer375抗体(1:200、細胞シグナル伝達)と共に、室温で終夜インキュベートした。翌日、標識した受容体をAlexa-fluor488抗体(1μg/ml、室温で1時間、Thermo Fisher Scientific社)で着色した。以下に詳述されている通り画像化を実施した。
【０５６７】
画像化:60×油乳剤対物レンズを使用した1024×1024ピクセル解像度でZeiss 510 Metaレーザースキャニング共焦点顕微鏡を使用して、受容体リン酸化及び内在化(実施例10)の画像を取得した。レーザー強度、光電子増倍管(PMT)電圧及びオフセットを含む画像化パラメーターは、各実験に対して一定のままであった。単細胞の外側に定義された領域の平均濃淡値を計算するために、ImageJソフトウエアを使用して平均蛍光強度を測定した。未処理の細胞の平均値を0%として、飽和濃度のMet-enk(30μM)で処理した細胞の平均値を100%として各実験を正規化した。
【０５６８】
βアレスチン2動員の評価
MOPr-ルシフェラーゼ及びβ-アレスチン2-YFP構造体を使用して、受容体へのβアレスチン2動員を決定するためのBRETアッセイを実施した(図7、図9)(Thompsonら、Biochem Pharmacol、(2016年) 113巻:70〜87頁)。Ser375リン酸化と同様に、飽和濃度のbilorphinは、公知のアゴニストと比べて非常に低レベルのBRET効率を誘発させ、これはまた有意にモルヒネより低かった(30μMまで)(図7)。
【０５６９】
アレスチン動員:BRETベースの手法を使用して、βアレスチン2のMOPrへのアゴニスト誘発性動員を試験した。AtT20細胞を10-cmシャーレにプレーティングし、Rluc8(MOPr-RLuc8)、βアレスチン2-YFP及びGRK2(1μg、4μg及び2μg、それぞれ)でC-末端にタグを付けたMOPrと共にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、ウェルを白色の遮光性96-ウェルプレート(Cultur Plate、Perkin Elmer社)に再度プレーティングし、終夜接着させた。細胞をHank's Balanced Salt Solution(HBSS)で洗浄し、HBSS中で、37℃で30分間平衡化してから、実験を行った。LUMIstar Omegaプレートリーダー(BMG LabTech社)での二重蛍光/発光測定の10分前に、セレンテラジンhを最終濃度5μMまで加えた。ベースラインBRETを30秒間測定してから、示されたリガンドを加えた。BRETシグナルを、YFPにより530nmで放出された光の、レニラルシフェラーゼ8(RLuc8)により430nmで放出された光に対する比として計算した。
【０５７０】
MOPr内在化の評価
アゴニスト処理の30分後にMOPr内在化を免疫細胞化学的に評価した(図8、図9)。モルヒネで誘発させた低レベル内在化及びエンドモルフィン-2とmet-エンケファリンの両方で推進される強力な内在化と比較して、Bilorphinは検出可能なMOPrの内在化をほとんど生じなかった(図9)。更に、効果的に内在化するアゴニストとのbilorphin(10μM)のコインキュベーションは、内在化を減少させた(3μM DAMGOをアゴニストとして使用する3つの独立した実験、データは示されていない)。要約すれば、各経路におけるmet-エンケファリンへの最大応答に正規化させた場合、bilorphinは、Ser375リン酸化、βアレスチン動員から内在化までの経路全域での相対的な効力の漸減(図9)と共に、モルヒネと類似した最大Gタンパク質効力を示し、bilorphinがGタンパク質偏向性オピオイドであることを示唆している。
【０５７１】
エンドサイトーシスアッセイ:膜及び内在化した受容体のレシオメトリック染色を使用して、受容体内在化を定量化した。簡単に説明すると、FLAG-タグを付けたMOPrを発現するAtT20細胞を1μg/mlのAlexa594-コンジュゲートM1モノクローナル抗FLAG(スクシンイミジルエステル部分を有するAlexa-fluor594から調製、Molecular Probes社)と共に30分間インキュベートして、膜受容体を標識化した。次いで、細胞を、示されたアゴニストと共に37℃で更に30分間インキュベートした。表面受容体からM1抗FLAG抗体を解放するために、細胞を、Mg2+及びCa2+が欠乏した、0.04%EDTA(pH7.4)を補充した氷冷PBSで3回すばやく洗浄した。細胞を非透過処理条件下で、PBS中4%パラホルムアルデヒドで20分間固定し、次いで抗FLAGポリクローナル抗体(1μg/ml,室温で2時間、Sigma Aldrich社)これに続いてAlexa-fluor488ヤギ抗-ウサギ抗体(1μg/ml、室温で1時間、Thermo Fisher Scientific社)と共にインキュベートした。したがって、表面受容体をAlexa-fluor488で標識する一方で、内在化した受容体をAlexa-fluor594で標識した。内在化した受容体のパーセンテージを、平均594nm蛍光強度の、594nm及び488nmでの全平均蛍光強度に対する比として計算した。
【０５７２】
GRK2-YFP及びβアレスチン2-HAが発現した実験において、Alexa-fluor405ヤギ抗ウサギ(2μg/mL、1h室温で、Abcam社)を二次抗体として、Alexa-fluor488ヤギ抗ウサギの代わりに使用することによって、YFPとの蛍光スペクトルの重複を回避した。405nm蛍光を、代表的な画像のために緑色に偽色した。YFP陽性細胞のみを内在化について分析した。
【実施例８】
【０５７３】
ΔEMAX及びΔlogτの判定
作業用分析、偏向性シグナル伝達を定量化するための事実上の標準物質(Kenakin Curr Protoc Pharmacol.、(2016年) 74巻:2.15.1〜2.15.15頁; Kelly Br、J Pharmacol、(2013年)169巻(7号): 1430〜46頁)は、bilorphinがモルヒネと比べてGタンパク質偏向性があることを示唆し(図23)、アレスチン偏向性エンドモルフィン-2を含む他のアゴニストに対する相対的偏向値は以前に報告されたものと同様であった(Riveroら、Mol Pharmacol、(2012年) 82巻(2号): 178〜88頁)。しかし、作業用分析は、正確なEC50の判定を必要とし、これは非常に低い内在化効力によりbilorphinに対して実行不可能であり、大きな誤差という条件付きの弱い機能的親和性推定値をもたらした(図23)(Kelly Br、J Pharmacol、(2013年)169巻(7号): 1430〜46頁)。各経路における最大応答からのΔEMax比の計算、及びΔlogτは、シグナル伝達アッセイにおける偏向性の相補的推定値を提供し、この場合天井値は存在しない、すなわちすべてのアゴニストは部分アゴニストである(Burguenoら、Sci Rep (2017年) 7巻(1号):15389頁; Kelly Br、J Pharmacol、(2013年)169巻(7号): 1430〜46頁)。高い固有効力のあるアゴニスト、met-エンケファリンに対する最大可能GGIRK応答を最大可能な応答のおよそ80%に減少させている現在のアッセイ条件は、この判定基準を満たす。この手法及び添付のデータ(図18〜図22;Table2(表2))は、モルヒネ、及び強く内在化するペプチドmet-エンケファリン(Thompsonら、Mol Pharmacol (2015年) 88巻(2号): 335〜346頁; McPhersonら、(2010年) Mol Pharmacol 78巻: 756〜766頁)及びエンドモルフィン-2(endomorpin-2)(Figure23)と比べたbilorphinのGタンパク質偏向性を実証した。
【０５７４】
偏向性の計算及び統計:アゴニスト濃度応答曲線を、曲線位置(EC50)及び漸近線(Emax)の推定値を生成するGraphPadプリズム7において、3パラメーター濃度応答曲線、抑制された傾き1を有するロジスティック関数にフィットさせた。すべての経路において基礎活性は差し引かれているので、曲線の底部は0に抑制された
【０５７５】
偏向性シグナル伝達を正確に決定するために、アゴニスト親和性及び効力を定量化するための事実上の標準物質はアゴニズムの作業用モデルである(Black及びLeff、Proc R Soc Lond B Biol Sci、(1983年) 220巻(1219号):141〜62頁、Kenakin、Mol Pharmacol (2015年) 88巻(6号):1055〜61頁)。各経路に対するアゴニスト濃度応答データを作業用モデルにフィットさせた。システムにおける最大作用を、基準の完全アゴニストmet-エンケファリン及び1に抑制したトランスデューサー曲線の傾きにより定義した。試験アゴニストエンドモルフィン2、bilorphin及びモルヒネに対する曲線フィットから効力(τ)及び親和性(KA)推定値を生成した。各アゴニストに対するlog(τ/KA)値を、各経路内の基準アゴニストmet-エンケファリンlog(τ/KA)値の引き算により正規化して、Δlog(τ/KA)を生成した。経路の全域での引き算により、ΔΔlog(τ/KA)、各アゴニストのシグナル伝達偏向性の正規化された予測値を生成した。作業用モデルについての過去の論文は、これらの比較力を増加させるためにプールした分散の適用を主張した(Kenakinら、ACS Chem Neurosci、(2012年) 3巻(3号):193〜203頁)。この手法はここでは適切でない、又は変数曲線フィットの品質を有するいかなる状況でも適切でない。理由は、偏向性アゴニスの非常に低いシグナリング効力は、計算したパラメーターに対してずっと大きな誤差を生じ、プールした分散の想定を無効にするからである(Table 2(表2))。したがって、パラメーターの直線的組合せである標準誤差は、標準的規定下で正確に増加させた(Farrance及びFrenkel、Clin Biochem Rev (2012年) 33巻(2号):49〜75頁、ISO/IEC Guide to Uncertainty in Measurement)。低いシグナリング効力による弱い曲線フィットは、ΔΔlog(τ/KA)手法の力を一般的に減少させ、この手法から偏向性推定値の自信のある解釈を行うことはできなかった(図23)。
【０５７６】
すべての試験アゴニストが、基準アゴニストと比較して部分的である場合、効力を単独で使用して、偏向性を定量化してきた(Burguenoら、Sci Rep、(2017年) 7巻(1号):15389頁)。予備受容体の低い系では、ロジスティック関数の漸近線、Emaxは、強力な、仮定なしの、及び親和性に依存しない効力推定値であり、作業効力の値に接近する。アゴニスト占有と、ここで研究した、シグナル増幅のないβアレスチン経路等の作用との間に直線的な関係のある系では、Emaxは作業効力、「τ」に近似する。
【０５７７】
Emaxは、各経路内で基準アゴニストに対して正規化し、比較経路の全域で差し引いて、偏向性の効力の尺度であるΔ正規化Emaxをもたらす。測定された経路全域にわたる、濃度-応答曲線の位置の観察(ここで提示されたすべての部分アゴニストに対する作業親和性に取り組むものである)は、この場合、偏向性を示し、順位有効性の保存により親和性が促進されるようには見えない。
【０５７８】
met-エンケファリンに正規化する場合、2種の試料サイズのより低い方を最初に保存的に採用することにより自由度を計算した。Δ正規化Emaxの場合、経路の全域での分散は等しいことが想定され、自由度を合計することを可能にする。ΔΔlog(τ/KA)の場合、β-アレスチン経路における低い効力は分散の不均一性を引き起こし、自由度はWelch-Satterwaite方程式(測定における不確実性に対するISO/IECガイド)を使用して近似した。
【０５７９】
Δ正規化Emax及びΔΔlog(τ/KA)計算の両方における各アゴニストの偏向性は、一元t-試験により、基準アゴニストの値0に対して試験した。次いでbilorphinの偏向性を、等しい又は等しくない分散、どちらか適切な方を用いて、2試料t-試験を使用してモルヒネと比較した。すべての比較は、試験した経路の各対の範囲内で、Holm-Sidakランキング法(GraphPad Prism7)を使用して多重度を調整した。
【０５８０】
【表２】
2021525736.tif 000073
【実施例９】
【０５８１】
GRK-YFPを過剰発現する細胞内でのMOPr内在化
bilorphinの偏向性を、確立した、小さな非ペプチド性、Gタンパク質偏向性アゴニスト、オリセリジンと比較するため(両方とも非常にわずかな内在化を生じる)、GRK2-YFP及びB-アレスチン2-HAを過剰発現する細胞内でMOPr内在化を試験したが、この試験は、モルヒネの内在化を増強するために着手したものであった(Zhangら、Proc Natl Acad Sci U S A、(1998年) 95巻(12号):7157〜62頁)。GRK2陽性細胞内で、モルヒネ、オリセリジン及びbilorphinはすべて明らかな内在化シグナルを生成した(図10)。定量化は、更にこれらの増幅条件下で、bilorphinはオリセリジンと類似のMOPr内在化を誘発するが、飽和濃度ではMOPr内在化の誘発はモルヒネより低いことを示している(図10、図11A、図11B)。ΔEmax方法を用いたモルヒネと比べた偏向性の計算はbilorphinがオリセリジンと類似の又はそれより大きなGタンパク質偏向性を示すことを示唆し、bilorphinが新規の、及びまた潜在的により安全なGタンパク質偏向オピオイドであることを確証している(図11B)。図11C及び図11Dもまた参照されたい。
【実施例１０】
【０５８２】
分子ドッキング及び分子動力学
偏向性に対する立体配座ベースが存在するかどうか調べるために、分子ドッキング及び分子動力学(MD)シミュレーション(Sutcliffeら、J Mol Biol、(2017年) 429巻(12号):1840〜1851頁)をmMOPrにおいてbilorphin及びエンドモルフィン-2を用いて実施した。水中での各ペプチドの1ミクロ秒シミュレーションから構造(10,000)を取得した。これらのアンサンブルを(Manglikら、Nature、(2016年) 537巻(7619号): 185〜190頁)、Bristol University Docking Engine(BUDE)(McIntosh-Smithら、Int J High Perform Comput Appl、(2015年) 29巻(2号):119〜134頁)を使用して、不活性MOPr結晶構造のオルトステリック結合ポケットにドッキングさせた。最も低いエネルギー構造を目視により検査し、リガンドのプロトン化アミンと、Asp1473.32(上付き数字はGPCR残基に対するBallesteros-Weinstein付番システムに従う[Ballesteros and Weinstein Methods in Neurosciences、(1995年) 25巻:366〜428頁]との間の3Å未満の距離に従い優先順位を決めた。次いで、選択されたペプチド-MOPr複合体を脂質及びコレステロール二重層に埋め込み、全原子MDシミュレーションを使用して、結合ポーズ、残基相互作用及び受容体構造変化を評価した。異なる初期速度を用いて、8×125nsシミュレーションを実施して、各ペプチドに対して合計1μsの軌道データを得た。エンドモルフィン-2をcis異性体としてモデリングした。これは、この構造がBUDEとのドッキング及び125nsのMDシミュレーション後の最も安定し、最も低いエネルギー結合ポーズを有していたからであった。
【０５８３】
MDシミュレーションから決定されたbilorphinの予測される結合ポーズが図18A及び図18Bに示されている。Bilorphinは、オルトステリック結合部位内で、MOPr細胞内側に向かってDmt-Tyr1と結合することが予測された。テトラペプチド鎖の残りはMOPrの細胞外側に向かって延び、TM2及びTM7の最上部において残基と接触した。エンドモルフィン-2もまたオルトステリック部位(図18C、図18D)において、His2976.52と相互作用しているTyr1のフェノール基と結合することが予測され、ペプチド鎖の残りは、ECL1及びECL2並びにTM2の最上部に向かって延びる。図19AのRMSDプロットは、bilorphinの結合ポーズは、約1.5Åのドッキングしたポーズからの初期のずれの後、1μsのシミュレーション時間にわたり比較的安定していたことを示す。3つの主要ポーズの間で切り替えたPhe4芳香族環の可動性により導入されるRMSDプロットに一部の変動があったが、エンドモルフィン-2の骨格はその結合ポーズにおいて安定していた(図19B)。
【０５８４】
両方のペプチドは、MOPr複合体の主要オピオイド結合残基Asp1473.32とのイオン性相互作用を維持し、全シミュレーション時間にわたり保存された回転異性体トグルスイッチTrp2936.48と相互作用した(図20A)。両方のペプチドはまたHis2976.52とも直接相互作用した。エンドモルフィン-2は直接相互作用し、bilorphinは相互作用と、架橋の水分子を介した水素結合との間でスイッチングしていた(図18Aの差し込み図)。しかし、これらのペプチドがMOPr結合ポケットとどのように相互作用するかについての違いがあった。例えば、bilorphinはTM1内のTyr751.39と相互作用したが、エンドモルフィン-2はしなかった。他方では、エンドモルフィン-2は細胞外ループと相互作用し、全シミュレーション時間にわたりECL1内のW133ECL1と接触し、ECL2のCys217ECL2、Thr218ECL2及びLeu219ECL2とは一時的に相互作用していたが、これらの相互作用はbilorphinに対しては存在しなかった。更に、エンドモルフィン-2は、bilorphinよりもTM3及びTM5とより多くの回数の接触があった。
【０５８５】
主成分分析(PCA)を利用して、受容体膜貫通ヘリックスにおける構造変化を調査した。システムのグローバルローテーション及び翻訳の除去に対するフィッティング後、MOPr膜貫通ドメインのアルファ炭素のみから共分散行列を生成して、分析に極めて動的ループが含まれるのを回避した。各時間点における受容体構造を、主成分(PC)1及び2に投影し、図20Bにおいてプロットした。PC1及びPC2は、分散のそれぞれ28.9%及び10.9%を占めた。両方のペプチド-MOPr複合体はPC2の全域で構造をサンプリングしたが、PC1に基づき異なって凝集した。PC1の擬似軌道を生成し、PC1の極限を示す実際のシミュレーションから構造を抽出することによって、発明者らは主成分に寄与するヘリックス運動を視覚化することができた。
【０５８６】
図21に示されているように、PC1は、オルトステリック結合部位の近くの受容体の細胞外領域における代替の構造、及びそれほどではないが、ヘリックスの細胞内部分における差異を主に記載している。bilorphinが結合した状態では、TM1の中央部分のバルジ及びエンドモルフィン-2結合受容体と比べて、ヘリックス束から外向きのシフトが存在した。またTM2、6及び7の細胞外末端の大幅な運動が存在し、TM4に形成されたねじれにより、このヘリックスの細胞外部分が、エンドモルフィン-2が結合したTM3に向かって移動することを可能にした。エンドモルフィン-2-結合受容体内のTM2へのTM3のより小さな運動(これによりMet1513.36その初期位置から約1.7Åシフトした)は、アゴニストが結合した結晶構造において観察されたTM3の活性のある構造と一致している(Huangら、Nature、(2015年) 524巻(7565号): 315〜21頁)。オルトステリック結合部位周辺でのヘリックスのこれらの代替構造はまた、CASTpを使用したオルトステリック結合部位の量の計算によりbilorphin結合ポケット量がエンドモルフィン-2結合より平均して1.6倍大きいことが明らかとなったように、結合ポケットの量を反映したものであった(Dundasら、Nucleic Acids Res、(2006年) 34巻(Web Server issue):W116〜8)(図22)。
【０５８７】
MOPrの細胞内側で、エンドモルフィン-2結合している状態で、PC1は、bilorphin-結合したMOPrと比較して、TM5、6及び7の内向き運動を記載した(図21)。
【０５８８】
DAMGOに結合したMOPr-Gi複合体の低温電子顕微鏡法の構造が最近解明された(Koehl Nature、(2018年) 558巻: 547〜552頁)。この構造のリリース前、発明者らは、bilorphin及びエンドモルフィン-2に対してここに記載されている方法を使用して、MOPrにおいてDAMGOを用いてMDシミュレーションを実施した(図28)。DAMGOの位置並びにcryo-EM構造及びモデルにおけるリガンド残基の相互作用(図28)はほぼ同一であり、bilorphin及びエンドモルフィン-2に対する発明者らのドッキング及びMD戦略はin vivoで生じるリガンド-MOPr相互作用に関連する可能性が高いという自信が得られた。
【０５８９】
したがって、MDデータの分析は、これら逆方向の偏向性ペプチドに対する異なるリガンド-残基相互作用が、PCAにより記載された代替の受容体構造をもたらし、したがってbilorphin及びエンドモルフィン-2の対向する偏向性プロファイルをもたらし得ることを示唆している。
【０５９０】
分子動力学:ペプチド構造の生成:ペプチド構造の生成:bilorphin及びエンドモルフィン-2(EM2)の3D配座異性体をChimeraで構築した(Pettersonら、J Comput Chem、(2004年) 25巻(13号): 1605〜12頁)。2つのエンドモルフィン-2配座異性体を使用し、Tyr1-Pro2ペプチド結合をcis又はtrans異性体のいずれかとしてモデリングし、MDシミュレーション及びドッキングのための別個のリガンドとして処理した。ペプチドをN-末端チロシンにおいてプロトン化し、Antechamber及び一般的なAmber力場でパラメーター化した(Wangら、J Mol Graph Model、(2006年) 25巻(2号): 247〜60頁、Wangら、J Comput Chem、(2004年) 25巻(9号): 1157〜74頁)。Amber ff14SB力場下、明白な溶媒(0.15M NaCl及びTIP3P水)中で各ペプチドの1μsMDシミュレーションを作動することにより、配座異性体の生成を実施した。これらの軌道データをcpptrajで分析して(Roeら、J Chem Theory Comput、(2013年) 9巻(7号): 3084〜95頁)、分子のドッキングに使用する10000の構造を各ペプチドに対して抽出した。
【０５９１】
MOPrへのペプチドのドッキング:Bristol University Docking Engine(BUDE)を用いて分子ドッキングを実施した(McIntosh-Smithら、Int J High Perform Comput Appl.、(2015年) 29巻(2号): 119〜134頁)。ペプチドを、アンタゴニスト-結合MOPr(PDB:4DKL)のX線結晶構造から得た不活性MOPrモデルにドッキングさせた(Manglikら、Nature、(2012年) 485巻(7398号): 321〜6頁)。タンパク質はInsight II(Accelrys社)で以下の通り調製した;リガンド及びT4リゾチームを除去し、欠損した細胞内ループ3においてモデリングのための同種のループを発見するためにループサーチを実施した。ループを目視検査で選択し、残基を正しいマウスMOPr配列に変えた。3種のペプチド、bilorphin、cis-エンドモルフィン-2及びtrans-エンドモルフィン-2のそれぞれを独立して用いて、このMOPr構造への分子ドッキングを実施した。以下は、1つのペプチドに対するドッキング手順について記載している。ペプチドの10000の構造が独立した分子として処理されるようにマルチ-配座異性体ドッキングを作動させた。オルトステリック結合部位を中心としたサイズ15、15、15Åのボックスをサーチスペースとして指定した。BUDEの遺伝的アルゴリズムを使用して最も良いエネルギーポーズに対して利用可能なポーズスペースをサーチした。合計105,000ポーズを10,000のペプチド配座異性体のそれぞれに対してサンプリングした。ボックス内のx、y、z翻訳に対応させ、すべての軸を10°増加させながら360°回転させたポーズの全可能数は、各配座異性体に対して1.57×108個であった。50の最も低いエネルギーの結合ポーズを目視により検査し、リガンドのプロトン化アミンと、Asp1473.32との間の制約距離3Å未満の対象下においた。選択したペプチド-MOPr複合体を短い(125ns)MDシミュレーションに使用して、結合ポーズの安定性を評価し、その後、完全な1μsの軌道データを以下に記載されている通り収集した。ドッキングデータ及び初期の125nsMDシミュレーションに基づき、cis-エンドモルフィン-2配座異性体をさらなるシミュレーションに対して選択した。
【０５９２】
MDシミュレーション:置換法を使用して、各ペプチド-MOPr複合体を、POPC:POPE:コレステロール脂質二重層に5:5:1の比で埋め込み、CHARMM-GUIソフトウエアを使用して、シミュレーションボックス(初期寸法:90、110、90Å)をTIP3P水及びNaCl(150mM)で溶媒和した(Joら、J Comput Chem、(2008年) 29巻(11号): 1859〜65頁)。Amberパラメータートポロジー及び座標ファイルをLEaPで準備した。構造は10000ステップにわたり最小限に抑え、次いで一定の容量及び圧力下で、脂質を制限しながら、0Kから100Kへと、5psにわたり、次いで100Kから310Kへと100psにわたりシステムを加熱した。10ラウンドの500psの平衡化を一定の圧力下で実施して、周期的なボックス寸法を平衡化した。Amber ff14SB及びLipid14力場下、8×125nsの並行したステップでシミュレーションを作動し(Maierら、J Chem Theory Comput、(2015年) 11巻(8号): 3696〜713頁; Dicksonら、J Chem Theory Comput、(2014年) 10巻(2号): 865〜79頁)、各ペプチド-MOPr複合体に対して1μsのシミュレーションデータを生成した。2fsの時間ステップにより及び100psごとに軌線を書き込みながら、Langevinサーモスタット及び異方性Berendsen barostatを使用して温度及び圧力を制御した。軌線をVMDで視覚化し(Humphreyら、J Mol Graph、(1996年) 14巻(1号): 33〜8頁、27〜8頁)、cpptrajを使用して分析を実施し(Roeら、J Chem Theory Comput、(2013年) 9巻(7号): 3084〜95頁)、画像をChimeraで調製した(Pettersonら、J Comput Chem、(2004年) 25巻(13号): 1605〜12頁)。
【０５９３】
主成分分析:分析における全体的な翻訳及びタンパク質の回転を除去するために、シミュレーション期間中最小の変動を示す一連の「コア残基」に対して、軌線を整列させた。すべての軌線の膜貫通ドメインのアルファ炭素の3D Cartesian座標について主成分分析を実施して、567の固有値を生成した。各シミュレーション時間点における受容体構造を最初の2PCに投影し、約40%の分散があった。
【実施例１１】
【０５９４】
in vivoの評価
bilorphinの作用をin vivoで評価した。Bilorphinは、皮下(100mg/kg、n=4)又は静脈内(50mg/kgn=4)に投与した場合、ビヒクルと対比したホットプレート試験において侵害受容を阻害することができなかった。対照的に、bilorphinは、髄腔内注射後、抗侵害受容性を示し(5nmol/マウス、ピーク作用41±9%MPEn=4、これに対してビヒクル0±1.5%、n=4)、これは、全身性活性の欠如は血液脳関門(BBB)の弱い浸透によると示唆するものであった。いくつかのbilorphin類似体は、C-末端付近のグリコシル化を含めて、BBB浸透率を増強すると考えられる置換を用いて開発された。ジグリコシル化されている類似体、bilactorphin(3g)は、全身投与後強力な鎮痛剤であり(s.c;34μmol/kgのED50、95% CI=28〜40μmol/kg;図12、図13)、モルヒネとほぼ等しい効力を有し(27μmol/kgのED50、95%CI=24-30μmol/kg;図13)、オピオイドアンタゴニスト、ナルトレキソンの共投与により拮抗された(図12)。Bilactorphinもまたi.v後(ピーク作用、88.9±11.8対14.4±1.8% MPE、ビヒクルn=3〜4)又は経口投与後(図24A、図24B)に活性を示し、対照的にモノ-グリコシル化類似体(3h)は全身的に不活性であり、これは単糖修飾オピオイドペプチドと比べて、二糖オピオイドペプチドの全身投与でより大きな鎮痛効果が誘発されることと一致する(Liら、Future Med Chem、(2012年) 4巻(2号): 205〜26頁)。これらの知見は、LDLDオピオイドペプチド骨格が、Gタンパク質偏向オピオイド鎮痛剤のさらなる開発のための実行可能な枠組みであることを確証している。bilorphinのように、bilactorphinはAtT20細胞(MOPrの部分不活化なし)において強力な部分的オピオイドアゴニストであったが、bilorphinと比較して有効性の小さな損失を示した(図14、図15)。しかし、Bilactorphinは確かにbilorphinと比較して中程度の内在化及びβアレスチン動員を示し、これは、親bilorphinのGタンパク質偏向性を破壊しない他の置換の潜在的優位性を示唆するものであった(図16、図17)。
【０５９５】
侵害受容(鎮痛)試験:動物が関与するすべての実験はシドニー大学動物倫理委員会(University of Sydney Animal Ethics Committee)で承認された(AEC.プロトコル番号K00/12-2011/3/5650)。実験は、科学的目的のための動物のケア及び使用に関するオーストラリアの実施規則のガイドラインの下で実施した(National Health and Medical Research Council、Australia、第7版)。これら実験中に罹患する動物を最小限に抑え、使用する動物の数を減少させるために多大なケアがなされた。個々に換気されたケージの中、制御された光(12:12時間、6amに点灯)及び気候(18〜23℃、湿度40〜60%気)の条件下で、成長した雄のC57BL/6マウス(20〜25g)を1ケージ当たり5〜6匹飼育した。食物及び水は自由に摂取させた。マウスは、取り扱う前に少なくとも7日間かけて住居施設に慣らし、試験の4日前に実験者らがこれらを取り扱った。静かな、温度制御された部屋(21±1℃)の中で、8am〜6pmの間実験を行った。実験者は試験したすべての薬物について知らされていなかった。動物は、組織損傷を防ぐための最大20秒のカットオフ時間を設けながら、54℃のホットプレート上で試験した。エンドポイントは後足をなめる、後足をぱたぱたと動かす、又はジャンプすることであった。モルヒネ、bilactorphin又はビヒクル(20%PEG400/生理食塩水v/v)の総量200μLの皮下注射の直前にベースライン潜時を記録した。注射の30、60、90、150、210、330及び450分後、マウスを試験した。最大可能な作用のパーセンテージ(%MPE)を以下の通り計算した:%MPE=(試験潜時-ベースライン潜時)/(カットオフ潜時-ベースライン潜時)×100%。カットオフ潜時は20秒であった。著しい差異を二元ANOVA及びTukeyポストホック多重比較検定を用いて評価した。30〜90分の間の各用量に対する最大応答を使用して、bilactorphin及びモルヒネに対する用量反応曲線を計算した。用量をμmol/kgの対数に変換した。二元ANOVAを使用して、等モル用量でデータを比較した。
【実施例１２】
【０５９６】
in vivoでの評価
図27のペプチドを実施例11で上に記載の通り正確に試験した。実験は、科学的な目的のための動物のケア及び使用に関するオーストラリアの実施規則のガイドラインの下で実施した(National Health and Medical Research Council、Australia、第7版)。これら実験中に罹患する動物を最小限に抑え、使用する動物の数を減少させるために多大なケアがなされた。個々に換気されたケージの中、制御された光(12:12時間、6amに点灯)及び気候(18〜23℃、湿度40〜60%)の条件下で、成長した雄のC57BL/6マウス(20〜25g)を1ケージ当たり5〜6匹飼育した。食物及び水は自由に摂取させた。マウスは、取り扱う前に少なくとも7日かけて住居施設に慣らし、試験の4日前に実験者らがこれらを取り扱った。静かな、温度制御された部屋(21±1℃)の中で、8am〜6pmの間実験を行った。実験者は試験したすべての薬物について知らされていなかった。動物は組織損傷を防ぐための最大20秒のカットオフ時間を設けながら、54℃のホットプレート上で試験した。エンドポイントは後足をなめる、後足をぱたぱたと動かす又はジャンプすることであった。モルヒネ、ペプチド、又はビヒクル(20%PEG400/生理食塩水v/v)の総量200μLの皮下注射直前にベースライン潜時を記録した。注射の30、60、90、150、210、330及び450分後、マウスを試験した。最大可能な作用のパーセンテージ(%MPE)を以下の通り計算した:%MPE=(試験潜時-ベースライン潜時)/(カットオフ潜時-ベースライン潜時)×100%。カットオフ潜時は20秒であった。各薬物又は生理食塩水の皮下注射の5,10、20、30及び60分後に測定されたホットプレート応答に対する1時間にわたるIntegrated Area Under the Curve(曲線下の積分値)(AUC:秒単位での応答×時間(分))は、試験時間(分)を掛けた応答(秒)の三角領域を60分間特定された時間において測定することによって各薬物に対して計算した。フィッシャーのLSDポストホック検定で、一元ANOVAを用いて差異を分析した。
【０５９７】
考察
本発明は、新規ペプチドクラスのGタンパク質偏向性オピオイドの開発に対して有用な新規のペプチド性骨格の同定に関する。生成された結果は、このペプチド性骨格を使用して、Gタンパク質偏向性薬理を有する経口的に活性のあるオピオイドアゴニストを開発することができることを示している。この新規のLDLD構造は真正核細胞からこれまで単離されたことがない。bilorphinが導かれる親天然産物、bilaid C(Table 1(表1)の3a)は比較的弱いオピオイドであり、この河口の酵母に対するオピオイドアゴニスト活性の潜在的な天然の機能は不明である。LDLD構造の予期せぬ生体内安定性及びその新規オピオイド薬理を使用して、より安全なオピオイドを開発することができる。
【０５９８】
Gタンパク質偏向性オピオイドアゴニストは、治療プロファイルを改善するための経路として提案されている。β-アレスチンシグナル伝達に対するわずかな偏向性又は偏向性を有する公知のペプチド作動性オピオイドアゴニストの中でも、bilorphinは他の天然のオピオイドペプチドと比較して変則的にGタンパク質偏向性があるので、bilorphinの薬理学的プロファイルは最も稀なものであるが、ただし最近になって、Gタンパク質偏向性を有する合成オピオイドシクロペプチドが報告された。Bilorphinは第III相薬物候補オリセリジンと同等に偏向性がある。グリコシル化は、皮下投与及び経口投与を介してin vivoで活性のある類似体を生成し、これは、偏向性オピオイドアゴニストさらなる開発のためのプラットフォームとしてのbilorphinテトラペプチド骨格の正当性を立証するものである。このようなGタンパク質偏向性アゴニストの前臨床開発は、呼吸抑制及び便秘の減少と共に著しく良好なプロファイルを示す。治験に到達する最初のこのような化合物、オリセリジン(TRV130)は、抗侵害受容性と、呼吸抑制作用との間のウィンドウを増加させ、等鎮痛薬用量に対するモルヒネよりもヒトにおいて安全のように見えることが報告された。同様に、一連の置換フェンタニル類似体は、Gタンパク質の増加対β-アレスチン2動員に相互関係する呼吸抑制に対する治療ウィンドウの増加をもたらすことが観察された。新規の受容体相互作用を用いたin silicoスクリーニングを介して開発されたPZM21は、モルヒネと比較して、Gタンパク質偏向性アゴニストであるように見える。呼吸抑制を生じなかったことが報告されたが、これは他では再現されていない(Hillら、Br J Pharmacol、(2018年3月26日) epub PMID: 29582414)。
【０５９９】
偏向性が、bilorphinとエンドモルフィン-2とのMOPrに対する異なる相互作用により、又はそれぞれにより開始される異なる受容体構造変化により説明されるかどうか調べるため、MOPrに結合しているbilorphin又はエンドモルフィン-2を用いた分子動力学シミュレーションを行った。両方のペプチドをMOPrのオルトステリック結合部位にドッキングさせると、リガンド-残基相互作用に差異を示し、これがこれらの偏向性プロファイルの差異へと翻訳され得る。とりわけ、エンドモルフィン-2は保存された残基Leu219を含む、ECL2内の残基と一時的に相互作用したが、これは、5HT2A及び5HT2B受容体並びに他のアミン作動性GPCRにおけるアレスチン偏向性及びリガンド滞留時間に対して重要であると提案された。対照的に、bilorphinは細胞外ループに接触しなかった。ペプチドとMOPr結合ポケットとの間の相互作用は、PCAで観察された分岐する構造変化へと翻訳されるようである。具体的には、エンドモルフィン-2が結合している状態で、bilorphinが結合したMOPrと比べてオルトステリック結合ポケットが収縮するように、TMDの細胞外部分は内向きに移動した。受容体の細胞内側で、TM5、6及び7は、結合しているペプチドに応じて、異なる位置、主にエンドモルフィン-2(endormorphin-2)の存在下でのこれらヘリックスの内向きのシフトを採用した。以前に示唆した通り、Gタンパク質又はアレスチンとの相互作用は、完全に活性のある状態を達成するためにMOPrにとって必要となり得るので、受容体及びアゴニスト単独でのこれらのMDシミュレーションにおいて、複合体の細胞内部分がアゴニスト及びナノボディ結合した結晶構造において捕らえられた完全に活性のある構造をサンプリングしなかったことは驚くに当たらない。
【０６００】
Gタンパク質又はアレスチンへの異なるカップリングを有するリガンド-誘発性GPCR構造を結合することは現在では依然として困難ではあるが、リガンド-残基の相互作用及びここで発明者らがモデリングしたMOPrヘリックスの構造の微妙な差異は、逆方向の偏向性ペプチド、bilorphin及びエンドモルフィン-2により誘発される初期変化を示し、これは、これらの異なるシグナル伝達プロファイル及び潜在的に有害な作用の不都合な点につながる。
【０６０１】
しかし、Gタンパク質偏向性それ自体が、オリセリジン(TRV130)等の薬物の改善された安全性に寄与する唯一の特性であるかどうかは依然として不明である(Singlaら、J Pain Res、(2017年) 10巻: 2413〜2424頁)。受容体ノックダウンを使用して、TRV130がモルヒネと比較して非常に低いGタンパク質効力を有することがここに示されている。モルヒネより安全であると主張されている別のオピオイド、PZM21に対して類似の結果が報告されているが(Hillら、Br J Pharmacol、(2018年3月26日) epub PMID: 29582414)、アッセイがモルヒネの比較的に低いGタンパク質効力に非感受性であったため、他の実験において新規の偏向性アゴニストのGタンパク質効力を評価することは困難である(Schmidら、Cell、(2017年) 171巻(5号): 1165〜1175頁; DeWireら、J Pharmacol Exp Ther、(2013年) 344巻(3号): 708〜17頁)。非常に低いGタンパク質効力を有するアゴニスト、例えば、ブプレノルフィンは強い偏向性があるが、極めて効果的なアゴニスト、例えば、モルヒネ及びメサドンよりも、生成する呼吸抑制及び過量死亡が低いことを十分特徴とすることを考慮すると、非常に低いGタンパク質効力は実際に、副作用プロファイルの前臨床及び臨床研究において交絡因子となり得る。bilorphinは強いGタンパク質偏向性があり、モルヒネとほぼ同等のGタンパク質効力を有するので、その類似体は、異なるGタンパク質効力により交絡させられることなく、偏向性の影響の直接的な試験を促す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ−Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２６−４】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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