(57)【要約】  本発明は、異種ターゲティング構築物を含有する遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、遺伝子改変自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）を提供するが、この異種ターゲティング構築物は、その構築物が発現されているリンパ球を活性化することができる細胞内シグナル伝達ドメインを欠くものである。さらに、遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞）の組成物、および遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞、例えば、養子Ｔ細胞療法の一部）を使用する方法も提供される。【選択図】図１
2021519063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種ターゲティング構築物を含む遺伝子改変ガンマデルタ（γδ）T細胞であって、異種ターゲティング構築物が、細胞外抗原結合ドメインと、抗原結合ドメインに機能的に連結された膜貫通ドメインとを含み、異種ターゲティング構築物が、遺伝子改変γδ T細胞を活性化できる細胞内ドメインを欠いている、遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項２】
抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとを機能的に連結するストークドメインをさらに含む、請求項1に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項３】
異種ターゲティング構築物を含む遺伝子改変γδ T細胞であって、異種ターゲティング構築物が抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとを含み、膜貫通ドメインが、遺伝子改変γδ T細胞のシグナル1活性化を伝達しない末端膜貫通ドメインである、前記遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項４】
抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとを機能的に連結するストークドメインをさらに含む、請求項3に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項５】
異種ターゲティング構築物を含む遺伝子改変γδ T細胞であって、異種ターゲティング構築物が、抗原結合ドメイン、抗原結合ドメインと機能的に連結されたストークドメイン、およびストークドメインと機能的に連結された膜貫通ドメインからなり、異種ターゲティング構築物が遺伝子改変γδ T細胞のシグナル1活性化を伝達しない、遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項６】
膜貫通ドメインが遺伝子改変γδ T細胞を活性化しない、請求項3〜5のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項７】
遺伝子改変γδ T細胞がVδ2ネガティブである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項８】
Vδ2ネガティブγδ T細胞がVδ1ポジティブである、請求項6に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項９】
抗原結合ドメインが、一本鎖抗体（single chain variable fragment (scFv)）、モノクローナル抗体、Fabフラグメント、B細胞受容体、T細胞受容体、抗体スキャフォールド、受容体特異的リガンド、またはリガンド特異的受容体を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項１０】
ストークドメインが、CD8ストーク、IgG1ヒンジ、IgG1ヒンジ-CH2ドメイン、IgG1ヒンジ-CH3ドメイン、IgG1ヒンジ-CH2-CH3ドメイン、(G4S)3ヒンジ、CD7ストーク、IgDヒンジ、IgDヒンジ-CH2ドメイン、IgDヒンジ-CH2-CH3ドメイン、IgDヒンジ-CH3ドメイン、IgG4ヒンジ、IgG4ヒンジ-CH2ドメイン、IgG4ヒンジ-CH2-CH3ドメイン、IgG4ヒンジ-CH3ドメイン、またはFcεRIストークからなる群から選択される１以上のドメインを含む、請求項2または請求項4〜9のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項１１】
膜貫通ドメインが、CD8膜貫通ドメイン、CD4膜貫通ドメイン、CD3ζ膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD45膜貫通ドメイン、CD5膜貫通ドメイン、CD8膜貫通ドメイン、CD9膜貫通ドメイン、CD16膜貫通ドメイン、CD22膜貫通ドメイン、CD33膜貫通ドメイン、CD37膜貫通ドメイン、CD64膜貫通ドメイン、CD80膜貫通ドメイン、CD86膜貫通ドメイン、CD134膜貫通ドメイン、CD137膜貫通ドメイン、CD154膜貫通ドメイン、CD7膜貫通ドメイン、CD71膜貫通ドメイン、CD18膜貫通ドメイン、CD29膜貫通ドメイン、CD11a膜貫通ドメイン、CD11b膜貫通ドメイン、CD11c膜貫通ドメイン、CD11d膜貫通ドメイン、CD94膜貫通ドメイン、FcγR膜貫通ドメイン、またはNKG2D膜貫通ドメインを含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項１２】
C末端膜貫通ドメインのアミノ酸のうち50％以下が細胞内に存在する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項１３】
抗原結合ドメインの標的抗原への結合に伴う異種ターゲティング構築物のクラスター形成が、遺伝子改変γδ T細胞においてTCR経路を実質的に活性化しない、請求項1〜12のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項１４】
抗原結合ドメインが腫瘍関連抗原と結合する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項１５】
腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞の表面上に発現するタンパク質またはペプチド抗原である、請求項14に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項１６】
腫瘍関連抗原がCD19である、請求項15に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項１７】
腫瘍関連抗原が腫瘍細胞の表面上に発現する炭水化物である、請求項16に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項１８】
腫瘍関連抗原が腫瘍細胞の表面上に発現するガングリオシドである、請求項14に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項１９】
ガングリオシドがGD2である、請求項18に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項２０】
腫瘍関連抗原が免疫抑制抗原である、請求項14〜19のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項２１】
抗原結合ドメインが、固形腫瘍細胞によって発現する標的抗原と結合する、請求項1〜20のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項２２】
健康な細胞上に発現する標的抗原に対する抗原結合ドメインの結合が、機能的な細胞内ドメインを有する対照細胞と比較して、遺伝子改変γδ T細胞によって、実質的により少ない細胞溶解を引き起こす、請求項1〜21のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項２３】
健康な細胞上に発現する標的抗原に対する抗原結合ドメインの結合が、遺伝子改変γδ T細胞による細胞溶解を実質的に引き起こさない、請求項22に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項２４】
抗原結合ドメインを腫瘍細胞または感染細胞上に発現した標的抗原に結合させることが、実質的に遺伝子改変γδ T細胞による細胞溶解を引き起こす、請求項1〜23のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項２５】
細胞溶解が、遺伝子改変γδ T細胞によるNKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、またはDNAM1の内因性発現に依存している、請求項22に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項２６】
細胞溶解が、CD107脱顆粒、グランザイム放出、パーフォリン放出、グラニュライシン放出、標的細胞死滅、γδ T細胞の増幅、およびサイトカイン産生からなる一群から選択される応答のうち1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つすべての応答を特徴とする、請求項24または25に記載の遺伝子改変γδ T細胞。
【請求項２７】
異種ターゲティング構築物を含む遺伝子改変NK細胞またはNK様T細胞であって、異種ターゲティング構築物が、細胞外抗原結合ドメインと、抗原結合ドメインに機能的に連結された膜貫通ドメインとを含み、異種ターゲティング構築物が、遺伝子改変NK細胞またはNK様T細胞を活性化できる細胞内ドメインを欠いている、遺伝子改変NK細胞またはNK様T細胞。
【請求項２８】
異種ターゲティング構築物を含む遺伝子改変自然リンパ球系細胞であって、異種ターゲティング構築物が、細胞外抗原結合ドメインと、抗原結合ドメインに機能的に連結された膜貫通ドメインとを含み、異種ターゲティング構築物が、遺伝子改変自然リンパ球系細胞を活性化できる細胞内ドメインを欠いている、遺伝子改変自然リンパ球系細胞。
【請求項２９】
異種ターゲティング構築物を含有する遺伝子改変粘膜関連インバリアントT（MAIT）細胞であって、異種ターゲティング構築物が、細胞外抗原結合ドメインと、抗原結合ドメインに機能的に連結された膜貫通ドメインとを含み、異種ターゲティング構築物が、遺伝子改変粘膜関連インバリアントT細胞を活性化できる細胞内ドメインを欠いている、遺伝子改変粘膜関連インバリアントT（MAIT）細胞。
【請求項３０】
単離された細胞集団であって、少なくとも10個の、請求項1〜26のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞、請求項27に記載の遺伝子改変NK細胞もしくはNK様T細胞、請求項28に記載の遺伝子改変自然リンパ球系細胞、または請求項29に記載の遺伝子改変MAIT細胞を含む、単離された細胞集団。
【請求項３１】
遺伝子改変γδ T細胞、遺伝子改変NK細胞もしくはNK様T細胞、遺伝子改変自然リンパ球系細胞、または遺伝子改変MAIT細胞が、単離された細胞集団中の細胞総数の2％より多くを占める、請求項30に記載の単離された細胞集団。
【請求項３２】
単離された細胞集団であって、請求項1〜26のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞の集団、請求項27に記載の遺伝子改変NK細胞もしくはNK様T細胞の集団、請求項28に記載の遺伝子改変自然リンパ球系細胞の集団、または請求項29に記載の遺伝子改変MAIT細胞の集団を含み、この集団が、単離された細胞集団中の細胞の総数の2％より多くを占める、単離された細胞集団。
【請求項３３】
少なくとも10個の、請求項1〜26のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞、および／または、少なくとも10個の、請求項27に記載のNK細胞もしくはNK様T細胞、および／または、少なくとも10個の、請求項28に記載の自然リンパ球系細胞、および／または、少なくとも10個の、請求項29に記載のMAIT細胞を含む、請求項31または32に記載の単離された細胞集団。
【請求項３４】
異種ポリヌクレオチドを含有するγδ T細胞であって、そのポリヌクレオチドは異種ターゲティング構築物をコードしており、異種ターゲティング構築物が、細胞外抗原結合ドメインと、抗原結合ドメインに機能的に連結された膜貫通ドメインとを含み、異種ターゲティング構築物が、遺伝子改変γδ T細胞を活性化できる細胞内ドメインを欠いている、γδ T細胞。
【請求項３５】
異種ポリヌクレオチドを含有するγδ T細胞であって、そのポリヌクレオチドはターゲティング構築物をコードしており、異種ターゲティング構築物が、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとを含み、膜貫通ドメインが、遺伝子改変γδ T細胞のシグナル1活性化に関与しない末端膜貫通ドメインである、γδ T細胞。
【請求項３６】
請求項1〜26のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞、請求項27に記載の遺伝子改変NK細胞もしくはNK様T細胞、請求項28に記載の遺伝子改変自然リンパ球系細胞、請求項29に記載の遺伝子改変MAIT細胞、請求項30〜33のいずれか1項に記載の単離された細胞集団、または請求項34もしくは35に記載の異種ポリヌクレオチドを含有するγδ T細胞であって、治療に有効な量の、請求項1〜24のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞、請求項25に記載の遺伝子改変NK細胞もしくはNK様T細胞、請求項26に記載の遺伝子改変自然リンパ球系細胞、請求項27に記載の遺伝子改変MAIT細胞、請求項28〜31のいずれか1項に記載の単離された細胞集団、または請求項32もしくは33に記載の異種ポリヌクレオチドを含有するγδ T細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、養子T細胞療法によって対象を治療する方法に使用するための、請求項1〜26のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞、請求項27に記載の遺伝子改変NK細胞もしくはNK様T細胞、請求項28に記載の遺伝子改変自然リンパ球系細胞、請求項29に記載の遺伝子改変MAIT細胞、請求項30〜33のいずれか1項に記載の単離された細胞集団、または請求項34もしくは35に記載の異種ポリヌクレオチドを含有するγδ T細胞。
【請求項３７】
対象がヒトである、請求項36にしたがって使用するための、遺伝子改変γδ T細胞、遺伝子改変NK細胞もしくはNK様T細胞、遺伝子改変自然リンパ球系細胞、遺伝子改変MAIT細胞、単離された細胞集団、または異種ポリヌクレオチドを含有するγδ T細胞。
【請求項３８】
ヒトがヒト癌患者である、請求項37にしたがって使用するための、遺伝子改変γδ T細胞、遺伝子改変NK細胞もしくはNK様T細胞、遺伝子改変自然リンパ球系細胞、遺伝子改変MAIT細胞、単離された細胞集団、または異種ポリヌクレオチドを含有するγδ T細胞。
【請求項３９】
ヒト癌患者が固形腫瘍の治療を受けている、請求項38にしたがって使用するための、遺伝子改変γδ T細胞、遺伝子改変NK細胞もしくはNK様T細胞、遺伝子改変自然リンパ球系細胞、遺伝子改変MAIT細胞、単離された細胞集団、または異種ポリヌクレオチドを含有するγδ T細胞。
【請求項４０】
ヒトが、ウイルス感染の治療を受けているヒト患者である、請求項37にしたがって使用するための、遺伝子改変γδ T細胞、遺伝子改変NK細胞もしくはNK様T細胞、遺伝子改変自然リンパ球系細胞、遺伝子改変MAIT細胞、単離された細胞集団、または異種ポリヌクレオチドを含有するγδ T細胞。
【請求項４１】
養子T細胞療法によって対象を治療する方法であって、その方法が、治療に有効な量の、請求項1〜26のいずれか1項に記載の遺伝子改変γδ T細胞、請求項27に記載の遺伝子改変NK細胞もしくはNK様T細胞、請求項28に記載の遺伝子改変自然リンパ球系細胞、請求項29に記載の遺伝子改変MAIT細胞、請求項30〜33のいずれか1項に記載の単離された細胞集団、または請求項34もしくは35に記載の異種ポリヌクレオチドを含有するγδ T細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項４２】
対象がヒトである、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
ヒトがヒト癌患者である、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
ヒト癌患者が固形腫瘍の治療を受けている、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
ヒトが、ウイルス感染の治療を受けているヒト患者である、請求項42に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
癌は、体の他の部位に転移する可能性のある、細胞の異常増幅を伴う疾患群である。癌の種類が多様であることはよく知られており、多くの種類の癌は、患者間でその遺伝子構成が大きく異なることがある。こうした差異は、特定の癌を標的とするための効果的な治療戦略を見極める上で重い負担をもたらす。具体的には、所与のいかなる癌標的に対しても個別化された治療戦略の策定が必要とされている。その結果、異質細胞もしくは病因細胞を認識して破壊するために免疫系の細胞を利用することができるとの認定に基づいて、T細胞免疫療法へのより高い関心が浮上している。これまで、T細胞免疫療法には、キメラ抗原受容体（CAR）を発現させるために、αβ T細胞を遺伝子操作することが必要であった。このようなCAR T細胞は、キメラ抗原受容体によって認識される標的抗原（例えば、腫瘍関連抗原）の発現に基づいて、癌の標的を識別することができる。その標的抗原に結合すると、CARの１以上の細胞内ドメインは、シグナル1活性化および／またはシグナル2活性化（共刺激）を伝達して、CAR T細胞を活性化し、それによって標的細胞の脱顆粒および溶解を引き起こす。しかしながら、このようなCAR T細胞アプローチには、一部の問題が残っている。例えば、標的抗原が健康な細胞によってある程度発現されているため、CAR T細胞が標的外の細胞傷害性を与える恐れがある。したがって、この分野において、治療の安全性および有効性を高めながら、これらの免疫系の強力な構成要素を遺伝子改変するための改良された方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００２】
本発明は、CAR T細胞に対する、また別のアプローチを提供する。具体的には、本明細書において特徴とされるのは異種ターゲティング構築物であって、その構築物は、それが発現している細胞を活性化できる機能的な細胞内ドメインを欠いた構築物である。γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、および遺伝子改変粘膜関連インバリアントT（MAIT）細胞等の、自然免疫型エフェクター機能を有するリンパ球および／またはMHC制限されていないリンパ球で発現する場合、遺伝子改変リンパ球は、健康な細胞上の低レベルの標的抗原に結合した際の異常なTCR活性化を回避することによって、病変細胞に対する高度な特異性を示すことができる。
【０００３】
第1の態様において、本発明は、異種ターゲティング構築物を含む、遺伝子改変癌マ-デルタ（γδ）T細胞を特徴とするものであって、この異種ターゲティング構築物は、細胞外抗原結合ドメイン、およびその抗原結合ドメインに機能しうるように連結された膜貫通ドメインを含むが、遺伝子改変γδ T細胞を活性化することができる細胞内ドメインを欠いている（例えば、細胞内ドメインは、もしそれが存在するとすれば、シグナル1活性化を伝達せず、シグナル2共刺激を伝達しない）。一部の実施形態において、異種ターゲティング構築物はさらに、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに機能しうるように連結するストークドメインを含む。
【０００４】
別の態様において、本発明は、異種ターゲティング構築物を含む遺伝子改変γδ T細胞を提供するが、この異種ターゲティング構築物は、抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインを含んでおり、この膜貫通ドメインは、末端膜貫通ドメイン（すなわち、連結されていない末端を有する膜貫通ドメイン、例えば、ペプチドまたはタンパク質に連結されていないC末端を有する膜貫通ドメイン）である。したがって、末端膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメイン等の細胞内ドメインに連結されていない。膜貫通ドメインは、シグナル1活性化を伝達しない。一部の実施形態において、末端膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達経路（例えば、TCR経路、例えば、シグナル2共刺激等のT細胞シグナル伝達経路）に関与しない。他の実施形態において、膜貫通ドメインは、内因性分子と関連していてもよく、それによってシグナル2共刺激を伝達する。一部の実施形態において、異種ターゲティング構築物はさらに、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに機能しうるように連結するストークドメインを含む。
【０００５】
本発明の任意の態様に関する一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、遺伝子改変γδ T細胞を活性化しない。
【０００６】
別の態様において、本発明は、抗原結合ドメイン、その抗原結合ドメインに機能しうるように連結されたストークドメイン、およびそのストークドメインに機能しうるように連結された膜貫通ドメインからなる異種ターゲティング構築物を含む、遺伝子改変γδ T細胞を特徴とする。
【０００７】
本発明の任意の態様に関する一部の実施形態において、遺伝子改変γδ T細胞は、Vδ2ネガティブである（例えば、Vδ2ネガティブγδ T細胞は、Vδ1ポジティブまたはダブルネガティブである）。本発明の任意の態様に関する別の実施形態において、遺伝子改変γδ T細胞はVδ2ポジティブとすることができる。
【０００８】
抗原結合ドメインとしては、一本鎖抗体（single chain variable fragment (scFv)）、モノクローナル抗体、Fabフラグメント、B細胞受容体、T細胞受容体、抗体スキャフォールド、受容体特異的リガンド、またはリガンド特異的受容体（例えば、表面発現リガンドに特異的な受容体）が挙げられる。一部の実施形態において、ストークドメインとしては、CD8ストーク、IgG1ヒンジ−CH2ドメイン、IgG1ヒンジ−CH3ドメイン、IgG1ヒンジ−CH2−CH3ドメイン、(G4S)3ヒンジ、IgG1ヒンジ、CD7ストーク、IgDヒンジ、IgDヒンジ−CH2ドメイン、IgDヒンジ−CH3ドメイン、IgDヒンジ−CH2−CH3ドメイン、IgG4ヒンジ、IgG4ヒンジ-CH2ドメイン、IgG4ヒンジ−CH3ドメイン、IgG4ヒンジ−CH2−CH3ドメイン、またはFcεRIストークドメインからなる一群から選択される１以上のドメインが挙げられる。
【０００９】
本発明の任意の態様に関する一部の実施形態において、膜貫通ドメインとしては、CD8膜貫通ドメイン、CD4膜貫通ドメイン、CD3ε膜貫通ドメイン、CD3ζ膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD45膜貫通ドメイン、CD5膜貫通ドメイン、CD8膜貫通ドメイン、CD9膜貫通ドメイン、CD16膜貫通ドメイン、CD22膜貫通ドメイン、CD33膜貫通ドメイン、CD37膜貫通ドメイン、CD64膜貫通ドメイン、CD80膜貫通ドメイン、CD86膜貫通ドメイン、CD134膜貫通ドメイン、CD137膜貫通ドメイン、CD154膜貫通ドメイン、CD7膜貫通ドメイン、CD71膜貫通ドメイン、CD18膜貫通ドメイン、CD29膜貫通ドメイン、CD11a膜貫通ドメイン、CD11b膜貫通ドメイン、CD11c膜貫通ドメイン、CD11d膜貫通ドメイン、CD94膜貫通ドメイン、FcγR膜貫通ドメイン、またはNKG2D膜貫通ドメインが挙げられる。一部の実施形態において、末端膜貫通ドメインのアミノ酸のうち50％以下（例えば、末端膜貫通ドメイン（例えば、C末端膜貫通ドメイン）のアミノ酸のうち45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、または5％以下）が細胞内に存在する。
【００１０】
本発明の任意の態様に関する一部の実施形態において、標的抗原への抗原結合ドメインの結合に伴う異種ターゲティング構築物のクラスター形成は、遺伝子改変γδ T細胞においてTCR経路を実質的に活性化しない。
【００１１】
本発明の任意の態様に関する一部の実施形態において、抗原結合ドメインは腫瘍関連抗原と結合する。例えば、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の表面上に発現するタンパク質抗原またはペプチド抗原とすることができる（例えば、CD19）。あるいはまた、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の表面上に発現する炭水化物であってもよい。一部の実施形態において、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の表面上に発現するガングリオシドである（例えば、GD2）。一部の実施形態において、腫瘍関連抗原は、免疫抑制抗原である。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、固形腫瘍細胞によって発現する標的抗原と結合する。
【００１２】
先行する実施形態のうち任意のいくつかにおいて、遺伝子改変γδ T細胞によって、健康な細胞上に発現する標的抗原に対する抗原結合ドメインの結合が引き起こす細胞溶解は、機能的な細胞内ドメインを有する参照される細胞と比較して、実質的により少ない（例えば、少なくとも5％少ない、少なくとも10％少ない、少なくとも20％少ない、少なくとも30％少ない、少なくとも40％少ない、少なくとも50％少ない、少なくとも60％少ない、少なくとも70％少ない、少なくとも80％少ない、少なくとも90％少ない、または少なくとも95％少ない細胞溶解）（例えば、その結合は遺伝子改変γδ T細胞による細胞溶解を実質的に引き起こさない）。一部の実施形態において、抗原結合ドメインを腫瘍細胞または感染細胞上に発現した標的抗原に結合させることは、実質的に遺伝子改変γδ T細胞による細胞溶解を引き起こす。細胞溶解は、遺伝子改変γδ T細胞によるNKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、またはDNAM1の内因性発現に依存している可能性がある。一部の実施形態において、細胞溶解は、CD107脱顆粒、グランザイム放出、パーフォリン放出、グラニュライシン放出、標的細胞死滅、γδ T細胞の増幅、およびサイトカイン産生からなる一群から選択される応答のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つすべての応答を特徴とする。
【００１３】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載された実施形態のいずれかの異種ターゲティング構築物を有する遺伝子改変NK細胞またはNK様T細胞を特徴とする。一部の実施形態において、異種ターゲティング構築物は、細胞外抗原結合ドメイン、および抗原結合ドメインに機能しうるように連結された膜貫通ドメインを含む。異種ターゲティング構築物は、遺伝子改変NK細胞またはNK様T細胞を活性化することができる細胞内ドメインを欠いている。
【００１４】
別の態様において、本発明は、遺伝子改変自然リンパ球系細胞（ILC）を特徴とする。遺伝子改変ILCは、本明細書に記載された実施形態のいずれかの異種ターゲティング構築物を含む。一部の実施形態において、異種ターゲティング構築物は、細胞外抗原結合ドメイン、および抗原結合ドメインに機能しうるように連結された膜貫通ドメインを含む。異種ターゲティング構築物は、遺伝子改変自然リンパ球系細胞を活性化することができる細胞内ドメインを欠いている。
【００１５】
別の態様において、本発明は、遺伝子改変MAIT細胞を特徴とする。この遺伝子改変MAIT細胞は、本明細書に記載の実施形態のいずれかの異種ターゲティング構築物を含む。一部の実施形態において、異種ターゲティング構築物は、細胞外抗原結合ドメイン、および抗原結合ドメインに機能しうるように連結された膜貫通ドメインを含む。異種ターゲティング構築物は、遺伝子改変MAIT細胞を活性化することができる細胞内ドメインを欠いている。
【００１６】
別の態様において、本発明は、先行する実施形態のいずれかに記載の、少なくとも10個の遺伝子改変γδ T細胞、遺伝子改変NK細胞もしくはNK様T細胞、遺伝子改変自然リンパ球系細胞、または遺伝子改変MAIT細胞を含む、単離された細胞集団を特徴とする。一部の実施形態において、遺伝子改変γδ T細胞、遺伝子改変NK細胞もしくはNK様T細胞、遺伝子改変自然リンパ球系細胞、または遺伝子改変MAIT細胞は、単離された細胞集団中の細胞の総数の2％より多くを占める（例えば、2％から100％の間、10％から95％の間、20％から90％の間、30％から80％の間、40％から70％の間、例えば、5％より多く、10％より多く、15％より多く、20％より多く、30％より多く、40％より多く、50％より多く、60％より多く、70％より多く、80％より多く、90％より多く、95％より多く、96％より多く、97％より多く、98％より多く、または99％より多くを占める）。
【００１７】
別の態様において、本発明は、先行する実施形態のいずれか１つに記載の、複数の遺伝子改変γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞を含む、単離された細胞集団を特徴とする。遺伝子改変γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞の集団は、単離された細胞集団中の細胞の総数の2％より多くを占める（例えば、2％から100％の間、10％から95％の間、20％から90％の間、30％から80％の間、40％から70％の間、例えば、5％より多く、10％より多く、15％より多く、20％より多く、30％より多く、40％より多く、50％より多く、60％より多く、70％より多く、80％より多く、90％より多く、95％より多く、96％より多く、97％より多く、98％より多く、または99％より多くを占める）。一部の実施形態において、単離された細胞集団は、前記実施形態のいずれか1つに記載の、少なくとも10個の遺伝子改変γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞を含む。
【００１８】
別の態様において、本発明は、異種ポリヌクレオチドを含むγδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞を含む。異種ポリヌクレオチドは、細胞外抗原結合ドメイン、および抗原結合ドメインに機能しうるように連結された膜貫通ドメインを含む、異種ターゲティング構築物をコードしていてもよく、この異種ターゲティング構築物は、遺伝子改変γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞またはMAIT細胞を直接活性化しない。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、抗原結合ドメインおよび末端膜貫通ドメインを含むターゲティング構築物をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞を特徴とする。
【００２０】
遺伝子改変γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、もしくはMAIT細胞；単離された遺伝子改変γδ T細胞集団、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、もしくはMAIT細胞集団；または前記実施形態のいずれかの異種ポリヌクレオチドを含む、γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、もしくはMAIT細胞を、養子細胞療法によって対象を治療する方法に使用することができる（例えば、養子細胞療法によって対象を治療する方法に使用するために）。
【００２１】
別の態様において、本発明は、養子細胞療法（例えば、養子T細胞療法）によって対象を治療する方法を特徴とし、その方法は、治療に有効な量の、前記実施形態のいずれかの遺伝子改変細胞、単離された細胞集団、または細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００２２】
別の態様において、本発明は、養子細胞療法（例えば、養子T細胞療法）によって対象を治療する方法に使用するための、前記実施形態のいずれかの遺伝子改変細胞、単離された細胞集団、または細胞を提供するが、この方法は、治療に有効な量の、前記実施形態のいずれかの遺伝子改変細胞、単離された細胞集団、または細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００２３】
前記態様のいずれかの、一部の実施形態において、対象はヒトである。例えば、対象は、ヒトの癌患者（例えば、固形腫瘍の治療を受けているヒトの癌患者）とすることができる。あるいはまた、ヒト患者は、ウイルス感染症の治療を受けているヒト患者であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図1は、古典的なキメラ抗原受容体（CAR）と、細胞内ドメインを含まない異種ターゲティング構築物の一実施形態を示す概略図である。
【図２】図2A〜2Cは、異種ターゲティング構築物が、所望の標的に合わせたさまざまな細胞外ドメインによってどのように改変され得るかを示す、一連の概略図である。図2Aは、例えば、B細胞受容体、抗体スキャフォールドもしくはミメティック、scFv、mAb、Fab、またはT細胞受容体とすることができる一般化された細胞外ドメインを示す。図2Bは、リガンド特異的受容体である細胞外ドメインを示す。図2Cは、受容体特異的リガンドである細胞外ドメインを示す。
【図３】図3Aおよび3Bはフローサイトメトリーヒストグラムである。 図3Aは、細胞内ドメインを持たない抗CD19ターゲティング構築物（「シグナル伝達なし、すなわちnsCAR」）および全長抗CD19 CARの、形質導入Vδ1細胞上での発現を示す。図3Bは、形質導入されていない（UTD；上段）、シグナル伝達なしのCD19 CARにより形質導入された（中段）、およびCD19 CARにより形質導入された（下段）Vδ1細胞上での、NCR（Natural Cytotoxicity Receptor）、NKp30（左列）、NKp44（中列）、およびNKG2D（右列）の発現を示す。
【図４】図4A〜4Cは、Nalm-6およびB細胞におけるCD19の発現（図4A）、およびエフェクター対標的比1:1における16時間死滅アッセイからの結果（図4Bおよび4C）を示すグラフである。図4Bは、CD19＋Nalm-6細胞の死滅を示し、図4Cは、初代B-ALL細胞の死滅を示す。2つの独立したドナーおよび実験における結果を示す。
【図５】図5Aおよび5Bは、Vδ1細胞上での抗GD2非シグナル伝達CAR発現（図5A）、およびKelly細胞株増殖の、単独またはVδ1細胞存在下での60時間経時変化（図5B）を示すグラフである。データは、時間ゼロの画像あたりの緑色オブジェクトカウントに対して正規化された、画像あたりの緑色オブジェクトカウントの変化として表される。各データポイントは、3連のウェルを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
本明細書で提供されるのは、異種ターゲティング構築物を発現する遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、リンパ球系細胞、または粘膜関連インバリアントT細胞等の、自然免疫型エフェクター機能を有するリンパ球）の組成物である。異種ターゲティング構築物は、細胞外抗原結合ドメイン、および抗原結合ドメインに機能しうるように連結された膜貫通ドメイン（例えば、直接連結されているか、またはストークドメインを介して連結されている）を含む。このような遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞）は、癌またはウイルス感染症等の疾患の治療に使用することができる。本発明の異種構築物は、T細胞活性化を伝達することができる機能的な細胞内ドメインを欠いているため、αβ T細胞に欠落しているγδ T細胞に特徴的な内因性MHC非依存性活性化経路に依存している。したがって、本明細書に記載の異種構築物は、リンパ球、例えば、γδ T細胞（例えば、Vδ1細胞、Vδ2細胞、Vδ3細胞、Vδ5細胞、およびVδ8細胞）の表面上で発現するように設計される。
【００２６】
定義
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、「含む（comprising）」、「なる（consisting）」および「〜から本質的になる（consisting essentially of）」態様および実施形態を含む。本明細書で使用される場合、「a」「an」および「the」の単数形は、特に別途の指示がない限り、複数形への適用も含む。
【００２７】
本明細書で使用される用語「約（about）」は、この技術分野の当業者に容易に知られる、各値における通常の誤差範囲を指す。本明細書で、「約」の値またはパラメータに言及する場合、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（および開示する）。一部の例では、「約」は、指定値から+20％、一部の例では+10％、一部の例では+5％、一部の例では+1％、または、一部の例では指定値から+0.1％の変動を含み、このような変動は、開示された方法を実行するために適している。
【００２８】
本明細書に使用される場合、用語「実質的な（substantial）」および「実施的に（substantially）」は、関心のある特徴または特性の、全体またはほぼ全体の範囲または程度を示す定性的な条件を指す。生物学分野の当業者は、生物学的および化学的な現象は、完成すること、および/もしくは、完成に向かって進むこと、または、絶対的な結果を達成もしくは回避することは、稀有であることを理解するであろう。したがって、本明細書では、「substantially」という用語は、多くの生物学的および化学的な現象における、潜在的に内在する完全性の欠如を捉えるために使用される。受容体／リガンドの相互作用、または、細胞間の接触等の物理的なシナリオについて説明するとき、方法の実施者に利用可能な従来の手段で、その機能的な結果を検出可能であれば、前記のシナリオは実質的（substantial）である。例えば、「実質的なTCRの活性化」とは、細胞の集合の中で、TCRの活性化が検出可能なレベルであること（例えば、統計的に有意な程度のTCRの活性化）を指す。一部の実施形態では、TCRは、各細胞集団上で、EC50の0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、または40％までのTCR経路アゴニスト（例えば、抗体、例えば、抗CD3、またはレクチン）に曝されることで、実質的に活性化される。
【００２９】
本明細書で使用される「異種ターゲティング構築物」は、宿主細胞（すなわち、遺伝子改変細胞）上に存在し、別の細胞上に存在する標的分子と結合するタンパク質、または一連のタンパク質（例えば、機能的な四次構造のタンパク質を形成するために二量体化する、2つ以上のタンパク質）を指し、そのタンパク質は、そのタンパク質が存在する細胞によって自然には発現されないものである。異種ターゲティング構築物は、遺伝子改変細胞内で発現するポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００３０】
本明細書で使用される、T細胞を「活性化する」とは、シグナル1活性化またはシグナル2活性化を伝達することにより、T細胞受容体（TCR）経路を開始または増幅することを意味する。例えば、機能的なシグナル1のT細胞活性化ドメイン（例えば、CD3ζ）または共刺激ドメイン（例えば、CD28、4-1BB等）を有するキメラ抗原受容体は、抗原結合に応答してクラスター形成することにより、その宿主T細胞を「活性化」することができる。機能的な細胞内ドメインを欠いた異種ターゲティング構築物は、シグナル1活性化またはシグナル2活性化を伝達する手段を持たず、したがってTCR経路を活性化することができない。機能的な細胞内ドメインを欠いた異種ターゲティング構築物は、その膜貫通ドメインが共刺激を伝達する場合、例えば、NKG2D膜貫通ドメインが内因性DAP10またはDAP12と結びついている場合、それが発現されているT細胞を「活性化」することができる可能性がある。また別の実施形態において、本発明は、機能的でない膜貫通ドメインを有する異種ターゲティング構築物を特徴とし、その異種ターゲティングドメインは、それが発現されているT細胞を活性化しない。
【００３１】
「T細胞受容体（TCR）経路」の活性化とは、TCRシグナル伝達を介したT細胞の、増幅の誘導、または他の活性化の帰結を意味する。TCRシグナル伝達経路は、シグナル1活性化、例えば、Src関連タンパク質チロシンキナーゼ（PTK）、LckおよびFyn、ならびに70 kDAのゼータ鎖（TCR）関連プロテインキナーゼ（ZAP70）の逐次活性化を含む。これらのPTKは、T細胞のリンカーアクチベーター（LAT）を含むポリペプチドのリン酸化を引き起こし、それは、細胞外シグナル制御キナーゼ（ERK）、c-Jun N末端キナーゼ（JNK）、および活性化されたT細胞の核内転写因子（NFAT）を介した下流の刺激につながる。例えばCD28、CD45、DAP10またはDAP12を介したシグナル2（すなわち、共刺激）は、リン酸化を増強し、TCR活性化を高めることができる。したがって、TCRまたは共刺激経路の一部を標的とする任意の分子は、T細胞シグナル伝達を直接活性化することができる。T細胞を単に標的細胞と接触させるだけの表面結合分子は、他の分子（例えば、異種ターゲティング構築物）がT細胞活性化を直接引き起こすことを促進しうるが、これらのターゲティング分子は、TCR経路を直接活性化しない。
【００３２】
TCR経路アゴニストには、抗体（例えば、モノクローナル抗体、例えば、抗TCRVδ1、抗TCRδTCS-1、抗TCR PANγδ、および抗CD3）、レクチン（例えば、植物レクチン、例えば、コンカナバリンA、Phaseolus vulgaris (PHA-P)、Phytolacca Americana、Triticum vulgaris、Lens culinaris、Glycine max、Maackia amurensis、Pisum sativumおよびSambucus nigra由来のレクチン）、合成リン酸化抗原（例、BrHPP（ブロモヒドリンピロリン酸）、2M3B1PP（2-メチル-3 -ブテニル-1-ピロリン酸）、HMBPP（（E）-4-ヒドロキシ-3-メチル-ブタ-2-エニルピロリン酸）、またはIPP（イソペンテニルピロリン酸））、およびN-ビスホスホネート（例、ゾレドロネート）が含まれる。TCR経路アゴニストには、共受容体アゴニストが含まれ、抗体（例えば、モノクローナル抗体、例えば、抗CD2、抗CD6、抗CD9、抗CD28、抗CD43、抗CD94、抗CD160、抗SLAM、 抗NKG2D、抗2B4、抗HLA-A、抗HLA-b、抗HLA-C、および抗ICAM-3）およびタンパク質（例えば、組み換えタンパク質、例えば組み換えヒトタンパク質、例えばCD7L 、CD26、CD27L、CD30L、CD40L、OX40L、4-1BBL、ICAM-1、フィブロネクチン、ヒドロコルチゾン、およびその変異体、例えばFc融合タンパク質、例えばCD27L-Fc）が含まれる。TCR経路アゴニストは、可溶性または膜結合性であってもよく、例えば、MHCまたはHLA複合体の場合と同様に、人工抗原提示細胞（aAPC）等の細胞上に提示され得る。T細胞シグナル伝達の活性化に適したaAPCは、当技術分野で既知である。TCR経路アゴニストを外因的に加えることにより、T細胞を活性化する適切な方法は、当技術分野で周知であり、Denigerらの図1に要約されている（Deniger et al., Frontiers in Immunology, 2014. 5（636）：1-10）。
【００３３】
「外因性TCR経路アゴニスト」は、非造血組織またはそのドナーに由来しない（すなわち、外因的に添加される）、TCR経路アゴニストを指す。したがって、本発明の一部の実施形態では、培養物中に非造血組織からの残留物質として、TCR経路アゴニスト（例えば、可溶性フィブロネクチンまたは細胞結合ICAM-1）が存在し得ることが理解されよう。一部の実施形態では、残留するTCR経路アゴニストは無視できる濃度であり、実質的にT細胞を活性化するものではない。
【００３４】
異種ターゲティング構築物のようなタンパク質のドメインが本明細書中で別のドメインに「機能的に連結される」ことは、他のドメインと直接隣接するか、または1以上のアミノ酸もしくはドメインによって分離されるかのいずれかで、他のドメインと同じタンパク質上に存在することを意味する。例えば、N末端抗原結合ドメイン、中間のストークドメイン、およびC末端膜貫通ドメインを有する異種ターゲティング構築物において、抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインは、機能的に連結されるといえる。C末端膜貫通ドメインに直ちに隣接するN末端抗原結合ドメインを有する異種ターゲティング構築物では抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとは機能的に結合しているともいえるが、より具体的には直接結合しているともいえる。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体スキャフォールド」は、非天然の抗原結合タンパク質、ペプチド、または抗体フラグメントをいう。抗体スキャフォールドとしては、アドネクチン（adnectin）、アフィボディ（affibody）、アフィリン（affilin）、アンチカリン（anticalin）、アトリマー（atrimer）、アビマー（avimer）、二環式ペプチド、センチリン（centyrin）、シスチンノット（cys-knot）、DARPin、フィノマー（fynomer）、Kunitzドメイン、Obody、およびTn3が含まれる。抗体スキャフォールドは当技術分野で公知であり、その全体が参照により本明細書に組みいれられる（例えば、Vazquz-Lombardi, et al., Drug Discovery Today, 2015, 20(10): 1271-83に記載されている）。
【００３６】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を奏する限り、特に、モノクローナル抗体（全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片をカバーする。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞傷害性」は、免疫細胞（例えば、γδ T細胞）が他の細胞（例えば、標的細胞）を殺傷する能力を指す。細胞傷害機能を有する免疫細胞は、周囲の細胞を殺傷することができる毒性タンパク質（例えば、パーフォリンおよびグランザイム）を放出する。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「脱顆粒」は、抗細菌性分子および細胞傷害性分子を含む分子が顆粒と呼ばれる細胞内分泌小胞から放出される細胞プロセスをいう。脱顆粒は、細胞傷害性T細胞等の免疫細胞による病原体や侵入微生物に対する免疫応答の一部である。脱顆粒の際に放出される分子は細胞の種類によって異なり、侵入してくる病原体や微生物を殺傷したり、炎症等の免疫応答を促進したりするように設計された分子が含まれ得る。
【００３９】
本明細書中で使用される、用語「自然リンパ系細胞」は、T細胞およびB細胞によって発現される、再編成された抗原レセプターを欠く自然様リンパ球を指す。自然リンパ系細胞には、NK細胞、1型自然リンパ系細胞（ILC1）、ILC1内細胞、2型自然リンパ系細胞（ILC2）、3型自然リンパ系細胞（ILC3）等がある。
【００４０】
本明細書中で使用される用語「粘膜関連インバリアントT細胞」および「MAIT細胞」は、インバリアントT細胞受容体α（TCRα）鎖および多様なTCRβ鎖を発現し、進化的に保存された主要組織適合性複合体関連分子1（MR1）との関連において、異なる分子セットを認識することができる自然発生様T細胞を指す。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「NK細胞」は、ナチュラルキラー細胞、TCRまたはCD3を発現せず、そしてCD56およびCD161の発現が陽性である自然様リンパ球をいう。NK細胞はまた、NKp44およびNKp46のような天然の細胞毒性受容体を発現することができる。
【００４２】
本明細書中で使用される用語「NK様T細胞」はナチュラルキラー様T細胞、またはナチュラルキラーT細胞（NKT細胞）を指し、T細胞およびNK細胞の両方と機能的および構造的特徴を共有する、すなわち、それらがTCR(例えば、αβ TCR）、CD3、およびCD56を発現する、自然様リンパ球である。NK様T細胞はMHCクラスI様糖タンパク質、CD1dとの関連で糖脂質を認識して反応し、活性化によりIFN−γとIL−4を産生することができる。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「非造血細胞」は、ストロマ細胞および上皮細胞を含む。ストロマ細胞は、あらゆる臓器の非造血性結合組織細胞であり、その器官の実質細胞の機能を支持する。ストロマ細胞の例としては、線維芽細胞、周皮細胞、間葉細胞、ケラチノサイト（keratinocyte）、内皮細胞、および非血液学的腫瘍細胞が挙げられる。上皮細胞は、体全体の血管や臓器の空洞や表面を覆う非造血細胞である。それらは、通常は、扁平、円柱、または直方体の形状をとっており、単層の細胞層、または2つ以上の細胞層として配置され得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「非造血組織常在性γδ T細胞」、「非造血組織由来」および「生来型の（native）非造血組織γδ T細胞」は、組織が取り出された時点の非造血組織に存在したγδ T細胞を指す。非造血組織常在性γδ T細胞は、ヒトまたは非ヒト動物のあらゆる適切な非造血組織から得ることができる。非造血組織は、血液または骨髄とは異なる組織である。一部の実施形態において、γδ T細胞は、血液または滑液等の、特定の種類の生体液のサンプルから得られたものではない。ヒトまたは非ヒト動物の非造血組織の適切な例としては、皮膚またはその一部（例えば、真皮または表皮）、消化管（例えば、消化管上皮、結腸、小腸、胃、虫垂、盲腸、または直腸）、乳腺組織、肺（気管支肺胞洗浄によって得られた組織でないことが好ましい）、前立腺、肝臓、および膵臓が挙げられる。一部の実施形態において、非造血組織常在性γδ T細胞は、胸腺、脾臓、または扁桃等のリンパ組織に由来し得る。γδ T細胞は、例えば、乳房および前立腺等のヒト癌組織に常在してもよい。一部の実施形態において、γδ T細胞は、ヒト癌組織からは取得されない。非造血組織のサンプルは、例えば、外植（例えば、生検）等の標準的な技術により取得され得る。非造血組織常在性γδ T細胞は、例えば、Vδ1 T細胞、ダブルネガティブ（DN）T細胞、Vδ3T細胞およびVδ5T細胞のような、非Vδ2 T細胞を含む。
【００４５】
上記の因子のいずれか1以上は、本発明の異種ターゲティング構築物をコードする核酸でトランスフェクトされ得るリンパ球（例えば、γδ T細胞）の増幅された集団を生成するのに有効な量で、増幅のプロトコルに組み入れられ得る。本明細書で使用される場合、「に有効な量で（in an amount effective to）」という語句は、検出可能な結果を誘導する量を指す（例えば、開始時の集団と比較して、統計的に有意に増加した細胞の数、例えば、p <0.05）。複数の因子が一度に存在する場合、有効量とは、すべての因子の複合的効果（例えば、IL-2とIL-15の複合的効果、または、IL-2もしくはIL-9、IL-4、IL-15およびIL-21の複合的効果）を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「増幅されたγδ細胞の集団」は、γδ細胞の増幅、すなわちγδ細胞数の増加を誘発する条件で、かつ継続して培養されたγδ T細胞を含む造血または非造血細胞の集団を指す。同様に、本明細書で使用される「増幅されたVδ1 T細胞の集団」は、Vδ1 T細胞の増幅、すなわちVδ1細胞数の増加を誘発する条件で、継続して培養されたVδ1 T細胞を含む造血または非造血細胞の集団を指す。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「支持細胞」は、非造血組織由来細胞に細胞間の表面接触を提供するために、培養物に加えられる外因性細胞を示す。支持細胞は、プライマリ細胞（例えば、組織由来）であっても、細胞株由来の細胞であってもよい。支持細胞は、生細胞でも照射された細胞でもよく、腫瘍細胞、線維芽細胞、B細胞、およびその他の抗原提示細胞を含む。
【００４８】
本明細書において、用語「マーカー」は、DNA、RNA、タンパク質、炭水化物、糖脂質、または細胞ベースの分子マーカーを示し、患者サンプルにおけるその発現または存在は、標準的な方法（または本明細書に開示される方法）によって検出することができる。
【００４９】
目的のマーカーを「発現させる（express）」単一の細胞または細胞の集団は、タンパク質をコードするmRNA、またはその断片を含むタンパク質自体が、前記の細胞または集団に存在することが決定づけられたものである。マーカーの発現は、多様な手法で検出され得る。例えば、一部の実施形態において、マーカーの発現は、細胞上のマーカーの表面密度で示される。例えば、フローサイトメトリーの読み出しとして使用される平均蛍光強度（MFI）は、集団細胞上のマーカーの密度を表す。当業者は、MFIの値が染色パラメータ（例えば、濃度、持続時間、および温度）および蛍光色素の組成に依存することを理解するであろう。ただし、MFIは、適切なコントロールを有する状況で検討すると、定量的となり得る。例えば、マーカーに対する抗体のMFIが、同等の条件下で染色された同じ細胞の集団上の適切なアイソタイプコントロール抗体のMFIよりも有意に高い場合、細胞の集団は、マーカーを発現させていると言える。これに加えて、またはこれに代えて、細胞の集団は、従来のフローサイトメトリー分析法に従って正および負のゲートを使用して（例えば、アイソタイプまたは「蛍光マイナス1」（FMO）コントロールに関するゲートをセットして）、細胞ごとにマーカーの発現を検出できる。この測定基準により、マーカーについて陽性であると検出された細胞の数がバックグラウンドよりも有意に多い場合（例えば、アイソタイプコントロールでゲーティングすることにより）、集団はマーカーを「発現させる」と言うことができる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、集団の発現は陽性細胞の割合として記載され、その割合が参照集団の陽性細胞の対応する割合と比較される場合、割合（パーセンテージ）の差は、それぞれの集団の親集団の割合を示す。例えば、マーカーが集団Aの10％の細胞に発現し、同じマーカーが集団Bの1％の細胞に発現する場合、集団Aは9％高い頻度でマーカー陽性細胞を有すると言える（例えば、10％-1％、10％÷1％ではない）。頻度に親集団の細胞数を掛けると、細胞の絶対数の差が計算される。上記の例において、集団Aには100細胞があり、集団Bには10細胞があるとすれば、集団Aは集団Bと比較して100倍の数の細胞が存在する；例えば、（10％×100）÷（1％×10）。
【００５１】
発現レベルは、核酸発現レベル（例えば、DNA発現レベルまたはRNA発現レベル、例えばmRNA発現レベル）であってもよい。いずれの適切な核酸発現測定方法を用いてもよい。一部の実施形態において、核酸発現レベルは、qPCR、rtPCR、RNA-seq、マルチプレックスqPCRもしくはRT-qPCR、マイクロアレイ解析、遺伝子発現の連続解析（serial analysis of gene expression （SAGE））、 MassARRAY技術、in situハイブリダイゼーション（例えば、FISH）またはこれらの組み合わせを用いて測定される。
【００５２】
本明細書で使用される場合、細胞の「参照となる集団」は、対象となる細胞に対応する細胞の集団であり、対象となる細胞の表現型に対して測定される。例えば、非造血組織由来のγδ細胞の分離された集団上のマーカーの発現レベルは、造血組織由来のγδ T細胞（例えば、血液常在性γδ細胞、例えば、同じドナーまたは他のドナー由来の血液常在性γδ細胞）、または、異なる条件下（例えば、実質的なTCRの活性化のある条件下、外因性TCR活性化剤（例えば、抗CD3）の存在下、または、実質的にストロマ細胞（例えば、フィブロブラスト）との接触のある条件下）で増幅された非造血組織由来のγδ T細胞の発現レベルと比較される。同じ集団のより早期の状態とも比較され得る。例えば、参照となる集団は、増幅前の分離された細胞の集団であってもよい。この場合、増幅された集団は、増幅ステップの前の同集団の組成物と比較される；つまり、この場合、過去の組成物が参照となる集団となる。
【００５３】
「癌」とは、悪性癌細胞の異常増幅を示し、造血器癌（例えば、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性好酸球性白血病（CEL）、骨髄異形成症候群（MDS）、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、および慢性リンパ球性白血病（CLL）等の白血病、ならびに、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（NHL）および多発性骨髄腫（MM）等のリンパ腫、等の血液悪性腫瘍）、ならびに、肉腫（例えば、軟部肉腫、子宮肉腫等）、皮膚癌、黒色腫（例えば、悪性黒色腫）、膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌（例えば、大腸腺癌）、子宮頸癌、肝臓癌（いわゆる肝癌）、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、食道癌、膵臓癌、腎癌（例えば、腎細胞癌）、副腎癌、胃癌、胃癌（例えば、胃腺癌）、精巣癌、胆嚢癌および胆道癌、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌、脳癌、胆道癌、膀胱癌、骨・軟部組織癌、脳腫瘍、子宮頸癌、結腸癌、デスモイド腫瘍、胎児性癌、子宮内膜癌、食道癌、胃腺癌、多形性膠芽腫、婦人科腫瘍、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、膵管腺癌、原発性悪性星細胞腫、原発性甲状腺癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、精巣胚細胞腫瘍、尿路上皮癌、および子宮癌等の固形癌が含まれる。癌患者中の癌細胞は、個体の正常な体細胞とは、免疫学的に区別され得る（例えば、癌性腫瘍は免疫原性の場合がある）。例えば、癌細胞は、癌患者の体内で、癌細胞によって発現する1以上の抗原に対する全身性の免疫応答を誘発し得る。免疫応答を誘発し得る抗原は、腫瘍抗原である場合も、正常細胞と共有される場合もある。癌を有する患者は、技術分野で知られている臨床的な基準に従って癌の診断を行うのに十分な、少なくとも1つの認識可能な兆候、症状、または検査所見を示し得る。このような臨床的な基準の例は、Harrison's Principles of Internal Medicine（Longo DL, Fauci AS, Kasper DL, Hauser SL, Jameson J, Loscalzo J. eds. 18e. New York, NY: McGraw-Hill; 2012）等の医学書を参照できる。例えば、個体の癌の診断は、個体から取得された体液または組織のサンプル中の特徴的な細胞型（例えば、癌細胞）の認識を含み得る。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「固形癌」は、血液、骨髄またはリンパ系以外のあらゆる体組織の癌である。固形癌は、さらに上皮細胞由来の癌と非上皮細胞由来の癌に分けることができる。上皮細胞の固形腫瘍の例としては、消化管、結腸、乳房、前立腺、肺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、頭頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、陰唇、鼻咽頭、皮膚、子宮、男性生殖器、泌尿器、膀胱、および皮膚の腫瘍が挙げられる。非上皮細胞の固形腫瘍の例としては、肉腫、脳腫瘍、骨腫瘍が挙げられる。
【００５５】
上記の治療に適した患者、対象、または個体は、げっ歯類（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科（例えば、マウス）、イヌ科（例えば、イヌ）、ネコ科（例えば、ネコ）、ウマ科（ 例えば、ウマ）、霊長類、サル（simian）（例えば、小型サル（monkey）または類人猿（ape））、小型サル（monkey）（例えば、マーモセットまたはヒヒ）、類人猿（ape）（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータンまたはテナガザル）、またはヒト等の哺乳動物であり得る。
【００５６】
一部の実施形態において、前記の患者、対象または個体はヒトである。他の好適な実施形態においては、非ヒト哺乳動物、特にヒトでの治療効果を実証するモデルとして従来使用されている哺乳動物を使用できる。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「治療」（および、「治療する」または「治療すること」等、文法的な変形）は、ヒトまたは動物（例えば、獣医学への適用）への、例えば、病状の進行の抑制または遅延といった、所望の治療的効果が奏される臨床的な介入を示し、進行速度の低下、進行速度の停止、病状の改善、病状の治癒または寛解（部分的もしくは全体的）、状態の1以上の症状および/もしくは兆候の予防、遅延、軽減または停止、または治療のない条件下で予想される以上の対象または患者の生存期間の延長を含む。
【００５８】
予防処置としての治療（例えば、予防）も含まれる。例えば、癌の発症もしくは再発が起こりやすい、またはそのリスクのある患者、対象、または個体は、本明細書に記載されるように治療され得る。このような治療は、患者、対象、または個体における癌の発症または再発を抑制、または遅延し得る。
【００５９】
特に、治療は、癌の完全寛解および／または癌転移の抑制を含む、癌の成長の抑制を含む。癌の成長は、一般的に、癌内部のより発達した形態への変化を示す、一部の指標のうちのいずれか1つを示す。したがって、癌の成長の抑制を測定する指標は、癌細胞の生存率の低下、腫瘍サイズまたは形態の減少（例えば、コンピューター断層撮影（CT）、超音波検査、または他のイメージング法を使用して決定される）、腫瘍の成長の遅延、腫瘍血管の破壊、遅延型過敏症皮膚試験の性能の向上、細胞傷害性Tリンパ球の活性亢進、および腫瘍特異的抗原のレベルの低下が含まれる。個体の癌性腫瘍中の免疫抑制を低減することは、癌の成長、特に、既に対象に存在する癌の成長に抵抗する、および/または、個体の癌の成長傾向を減少するための個体の能力を改善し得る。
【００６０】
一部の実施形態において、増幅されたγδ T細胞（例えば、非造血組織由来のγδ T細胞、例えば、非造血組織由来のVδ1 T細胞）は、病気の発達を遅らせる、または病気もしくは障害の進行を遅くするために投与される。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「投与」は、患者に対して、一容量の療法（例えば、非造血組織由来のγδ T細胞等を含む、養子T細胞療法）または組成物（例えば、医薬組成物、例えば、非造血細胞由来のγδ T細胞を含む医薬組成物）を与えることを意味する。本明細書に記載される方法で利用される組成物は、例えば、筋肉内、静脈内、皮内、経皮的、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸腔内、気管内、くも膜下、鼻腔内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、腹膜、皮下、結膜下、膀胱内、粘膜、心膜内、臍内、眼内、眼窩内、硝子体内（例えば、硝子体内注射による）、点眼、経口、局所、経皮、吸入、注射、移植、注入、標的細胞を直接浸す局所灌流、標的細胞を直接浸す局所灌流、カテーテル、洗浄、クリーム、または脂質組成物によって投与することができる。本明細書に記載される方法に利用される組成物の投与は、全身投与であっても、局所投与であってもよい。投与方法は、多様な要因（例えば、投与する治療剤または組成物、および治療すべき病状、病気または障害の深刻さ）によって変更されてもよい。
【００６２】
「治療に有効な量」は、哺乳動物の病気または障害を治療または抑制するための治療剤の量を示す。癌の場合、治療剤（例えば、非造血組織由来のγδ T）の治療に有効な量は、癌細胞の数を減らす、原発性腫瘍のサイズを縮小する、末梢組織への癌細胞の浸潤を抑制する（すなわち、ある程度遅らせ、好適には停止させる）、腫瘍の転移を抑制する（すなわち、ある程度遅らせ、好適には停止させる）、ある程度の期間腫瘍の成長を抑制する、および/または、障害に関連する1以上の症状をある程度緩和し得る。薬物が癌細胞の成長を妨げる、および/または、既存の癌細胞を殺すことができる範囲で、それは細胞増殖抑制性および/または細胞毒性である可能性がある。癌治療の場合、in vivoでの有効性は、例えば、生存期間、疾患進行の時間（TTP）、反応率（例えば、完全奏効（CR）および部分奏効（PR））、奏効期間および/または生活の質を評価することで測ることができる。
【００６３】
用語「同時に」は、本明細書においては、少なくとも部分的に投与時間が重複する、2以上の治療剤の投与を示す。したがって、同時投与は、1以上の他の薬剤の投与を中止した後、1以上の薬剤の投与が継続する場合の投与計画を含む。例えば、一部の実施形態において、非造血組織由来のγδ T細胞とIL-2は同時に投与され得る。
【００６４】
用語「医薬組成物」は、含まれる1以上の活性成分の生物学的活性を有効にする形態をとり、かつ、その製剤を投与される患者にとって受忍できない毒性を有する追加の成分を含まない、製剤を示す。
【００６５】
本明細書で使用される「末端膜貫通ドメイン」は、連結されていない末端（例えば、ペプチドまたはタンパク質に連結されていないC末端）を有する膜貫通ドメインを指す。したがって、末端膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメイン等の細胞内ドメインに連結されていない。一部の実施形態において、末端膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達経路（例えば、シグナル1活性化またはシグナル2共刺激等のT細胞シグナル伝達経路）に関与しない。
【００６６】
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」あるいはまた「CAR」という用語は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに細胞を活性化する活性化シグナルを伝達する細胞内ドメインを含む、組換えポリペプチド構築物を指す。一部の実施形態において、CARは、CAR融合タンパク質のN末端に任意のリーダー配列を含む。
【００６７】
本明細書に記載された定義と、参照により本明細書に組み込まれた参考文献のいずれかにおいて提供された定義との間に不一致もしくは矛盾がある場合、本明細書に記載の定義を優先するものとする。
【００６８】
異種ターゲティング構築物を発現するγδ T細胞および他の自然免疫型リンパ球
γδ T細胞および他の自然免疫型リンパ球（例えば、NK細胞およびNK様T細胞、ならびに粘膜関連インバリアントT（MAIT）細胞等の自然リンパ球系細胞）は、癌細胞および感染細胞等の病因細胞を認識する自然免疫型の能力を保持しながら、異種ターゲティング構築物により形質導入することができるので、本明細書に記載の異種ターゲティング構築物のための魅力的な担体となる。形質導入は、エレクトロポレーション、遺伝子編集（例えば、クラスター化され規則的に間隔をおいて配置された短い回文配列リピート（CRISPR）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）トランスフェクション）、トランスポゾン送達等のような、当技術分野で知られているか、または本明細書に記載されている任意の適切な方法を使用して実施することができる。さらに、例えばγδ T細胞による、MHC依存性抗原認識の欠如は、移植片対宿主病の可能性を減少させ、そうした細胞が低レベルのMHCを発現している腫瘍を標的にすることを可能にする。同様に、γδ T細胞が従来のシグナル2共刺激に依存しないことは、例えばCD28の関与を介して、低レベルの、共刺激受容体に対するリガンドを発現している腫瘍の標的化を促進する。
【００６９】
ある態様において、本発明は、異種ターゲティング構築物をその表面に発現するγδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、およびMAIT細胞、ならびにそれらの細胞集団を提供する。このような、異種ターゲティング構築物を発現させるよう操作されたγδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、およびMAIT細胞は、異種構築物上の抗原結合ドメインを介して所望の抗原をターゲティングするために利用することができる。γδ T細胞は、外来病原体に応答するためにMHC受容体に依存しないので、異種ターゲティング構築物は、従来の（例えば、αβ）T細胞養子免疫療法レジメンの一環として使用される、従来のキメラ抗原受容体（CAR）システムとは対照的に、細胞溶解または細胞傷害性を誘導するための細胞内ドメインを必要としない。その代わりに、γδ T細胞は、内因性の標的特異的細胞溶解を引き起こすが、この応答は、異種構築物を使用することにより、標的細胞（例えば、腫瘍、例えば固形腫瘍）との接触時間を改善し、増加させることで、さらに強化することができる。異種構築物を用いて操作されたγδ T細胞は、腫瘍関連抗原等の標的抗原と結合し、細胞傷害性および／または細胞溶解を誘導することができる。この細胞傷害性は、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、および／またはDNAM1等の活性化受容体の内因性発現を介して媒介され得る。
【００７０】
異種ターゲティング構築物は、細胞外抗原結合ドメイン、および抗原結合ドメインに機能的に連結された膜貫通ドメインを特徴とすると考えられる。ストークドメインは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するために、異種ターゲティング構築物の一部としてさらに含まれていてもよい。一部の実施形態において、本明細書で提供される異種ターゲティング構築物は、細胞内ドメイン（図１）を欠いており、また、（例えば、シグナル1の活性化および／またはシグナル2の活性化（すなわち、共刺激）を介して）TCRシグナル伝達を活性化する能力を欠いている。
【００７１】
一部の実施形態において、細胞溶解は、γδ T細胞の脱顆粒（例えば、CD107脱顆粒）、γδ T細胞によるグランザイム放出、パーフォリン放出γδ T細胞、標的細胞の死滅、γδ T細胞の増幅、またはγδ T細胞によるサイトカイン産生によって特徴付けられる。当業者であれば、これらの特性または活性を測定するさまざまなアッセイを用いて、例えば、癌の治療における遺伝子改変T細胞の有効性を評価することができることを認識するであろう。
【００７２】
一般に、脱顆粒は、細胞溶解の必要条件である。脱顆粒細胞は、例えば、LAMP-1（リソソーム関連膜タンパク質1、CD107としても知られている）の表面発現によって識別することができる。CD107は、表面上で一過性に発現され、脱顆粒後、速やかに内部移行する。非活性化状態では、CD107aは、細胞質内の細胞溶解性顆粒膜に存在する。アップレギュレーションは、抗体標識された内部移行CD107a含有小胞の酸性化を防ぐために、モネンシンの存在下でCD107を染色することによって（例えば、FACSによって）測定することができる。
【００７３】
パーフォリンおよびグランザイムアッセイは、当技術分野で知られている方法に従って、FACSにより測定することもできる。細胞傷害性γδ T細胞は、顆粒または受容体を介したメカニズムによってその標的を死滅させる。細胞傷害性顆粒は、細胞質においてあらかじめ形成された分泌型リソソームであって、溶解性タンパク質（パーフォリンおよびグランザイム）を含有する。標的細胞を認識すると、溶解性タンパク質がエキソサイトーシスによって分泌される。したがって、標的細胞が認識されると、細胞内のグランザイムおよび／またはパーフォリンのレベルの低下をFACSで測定することができる。
【００７４】
細胞死滅アッセイを用いて、異種ターゲティング構築物を発現するγδ T細胞の効果をモニターすることができる。動態学的な標的細胞溶解アッセイを用いて、さまざまなエフェクター対標的比において経時的に死滅の割合を追跡することができる。エンドポイント標的細胞溶解アッセイ（例えば、ルシフェラーゼアッセイ）を用いて、さまざまなエフェクター対標的比において特定のエンドポイント時間での死滅の割合を追跡することができる。免疫学的シナプス形成（例えば、ライブセルイメージングによって観察される）は、結合動態、標的認識（例えば、エフェクター細胞におけるCaフラックス）、致死ヒット（例えば、標的細胞におけるヨウ化プロピジウム染色（赤色）によって測定されるような）、または標的細胞の円形化を測定するために使用することができる。
【００７５】
一部の実施形態において、健康な細胞上に発現されている標的抗原への抗原結合ドメインの結合は、遺伝子改変γδ T細胞の細胞溶解を実質的に引き起こさない。一部の実施形態において、腫瘍細胞または感染細胞上に発現されている標的抗原に抗原結合ドメインを結合させると、遺伝子改変γδ T細胞の細胞溶解が実質的に引き起こされる。
【００７６】
ある態様において、本発明は、異種ターゲティング構築物を発現するように改変された細胞（例えば、γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）を提供するが、この遺伝子改変細胞は抗腫瘍特性を示す。ある態様において、細胞は、（例えば、ヌクレオフェクション（nucleofection）、エレクトロポレーション等によって）異種ターゲティング構築物でトランスフェクトされ、異種ターゲティング構築物は細胞表面上で発現する。一部の実施形態において、細胞（例えば、γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）は、異種ターゲティング構築物をコードするウイルスベクターによって形質導入される。一部の実施形態において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。一部のそのような実施形態において、細胞は、異種ターゲティング構築物を安定して発現することができる。別の実施形態において、細胞（例えば、γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）は、（例えば、ヌクレオフェクション（nucleofection）、エレクトロポレーション等によって）異種ターゲティング構築物をコードする核酸、例えばmRNA、cDNA、DNAでトランスフェクトされる。一部の実施形態において、細胞は、異種ターゲティング構築物を一過性に発現することもある。
【００７７】
ある態様において、本発明は、細胞集団のうち少なくとも10％（例えば、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、または実質的にすべて）が異種ターゲティング構築物を発現する遺伝子改変γδ T細胞からなる、遺伝子改変γδ T細胞（例えば、少なくとも10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、または1013個の細胞）の細胞集団（例えば、単離された細胞集団）を特徴とする。
【００７８】
あるいはまた、本発明は、細胞集団のうち少なくとも10％（例えば、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、または実質的にすべて）が異種ターゲティング構築物を発現するように操作されている、遺伝子改変NK細胞もしくはNK様T細胞（例えば、少なくとも10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、または1013個のNK細胞もしくはNK様T細胞）の細胞集団（例えば、単離された細胞集団）を特徴とする。
【００７９】
あるいはまた、本発明は、細胞集団のうち少なくとも10％（例えば、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、または実質的にすべて）が異種ターゲティング構築物を発現するように操作されている、遺伝子改変自然リンパ球系細胞（例えば、少なくとも10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、または1013個のNK細胞もしくはNK様T細胞）の細胞集団（例えば、単離された細胞集団）を特徴とする。あるいはまた、本発明は、細胞集団のうち少なくとも10％（例えば、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、または実質的にすべて）が異種ターゲティング構築物を発現するように操作されている、遺伝子改変MAIT細胞（例えば、少なくとも10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、または1013個のNK細胞もしくはNK様T細胞）の細胞集団（例えば、単離された細胞集団）を特徴とする。
【００８０】
異種ターゲティング構築物
さまざまなタイプのγδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞を、異種ターゲティング構築物を含むように改変して、遺伝子改変γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞を生成することができる。異種ターゲティング構築物は、細胞外抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。例えば、異種ターゲティング構築物は、1〜1,000個のアミノ酸残基（例えば、1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜100、100〜250、250〜500、または500〜1,000個のアミノ酸残基）によって膜貫通ドメインに機能的に連結された細胞外抗原結合ドメインを含んでいてもよい。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ストークドメインによって膜貫通ドメインに連結されている。一部の実施形態において、細胞外抗原結合ドメイン、ストークドメイン、および膜貫通ドメインは、N末端からC末端への方向（例えば、N-抗原結合ドメイン-ストークドメイン-膜貫通ドメイン-C）で、機能しうるように連結されている。一部の実施形態において、細胞外抗原結合ドメイン、ストークドメイン、および膜貫通ドメインは、N末端からC末端に向かって直接連結されている。
【００８１】
一般に、本明細書に記載の異種ターゲティング構築物は、細胞内シグナル伝達ドメインを持たない特異的抗体の抗原結合ドメインを含む。機能的な細胞内ドメインなしでは有効でない遺伝子改変αβ T細胞（例えば、CAR T細胞）（Ghosh et al., Nat. Med., 23: 242-251, 2017; Whilding et al. Mol. Ther., 25: 259-273, 2017; およびWilkie et al. J. Biol. Chem., 285: 25538-25544, 2010）とは対照的に、γδ T細胞等の自然免疫型リンパ球の活性化は、機能的な細胞内ドメインなしで異種ターゲティング構築物によって媒介され得る。当業者は、ポリペプチドが、例えば膜貫通ドメインの延長として、遺伝子改変T細胞を直接活性化しない、非機能性の細胞内アミノ酸残基を含有しうることを理解するであろう。例えば、一部の態様において、膜貫通ドメインは、構造、安定性、および／または発現目的のための余分な残基を含んでいてもよく、非機能性の細胞内ドメインを有していてもよい。一部の実施形態において、C末端膜貫通ドメインの残基の50％以下（例えば、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、または5％以下）が細胞内に存在する。
【００８２】
抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、標的に特異的に結合するように設計された抗体または抗体フラグメントとすることができる。抗原結合ドメインは、さまざまな構造の形態をとることができるが、例えば、B細胞受容体、抗体スキャフォールドもしくはミメティック（例えば、アフィボディ（affibody）、アフィリン（affilin）、アンチカリン（anticalin）、アプタマー、アトリマー（atrimer）、DARPin、FN3スキャフォールド、フィノマー（Fynomer）、Kunitzドメイン、プロネクチン（Pronectin）、Obody、二環式ペプチド、シスチンノット等）、一本鎖抗体（scFv）、モノクローナル抗体（mAb）、抗原結合フラグメント（Fab）、またはT細胞受容体（TCR）等の形をとることができる（図2A）。抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原（TAA；例えば、固形腫瘍上に発現するTAA）等の標的に結合することができる。TAAは、例えば、腫瘍細胞の表面上に発現するタンパク質抗原またはペプチド抗原であってもよい。あるいはまた、TAAは、腫瘍細胞の表面上に発現する炭水化物またはガングリオシドを含む。一部の実施形態において、TAAは免疫抑制性抗原である。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、図2Bに示されるように、リガンド特異的受容体である。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、図2Cに示されるように、受容体特異的リガンドである。
【００８３】
ある態様において、異種ターゲティング構築物の標的結合部分は、scFvである。ある態様において、そのような抗体フラグメントは、同等な結合親和性を保持するという点で機能的であり、例えば、その起源であるIgG抗体と同じような有効性を持って同じ抗原と結合する。あるいはまた、それらは、必要に応じて、例えば、標的抗原の発現密度に基づいて、最適な結合速度（例えば、アビディティ）を達成するために、結合親和性を高め、または結合親和性を弱めるように操作することができる。ある態様において、そのような抗体フラグメントは、当業者であれば理解されるように、免疫応答の活性化、その標的抗原からのシグナル伝達開始の阻害、キナーゼ活性の阻害等を含めることができるが、これらに限定されない、生物学的応答を提供するという点で、機能的である。
【００８４】
ある態様において、異種ターゲティング構築物の抗原結合ドメインは、マウスscFv抗体フラグメントである。別の態様において、異種ターゲティング構築物の抗原結合ドメインは、その起源であるscFvのマウス配列と比べてヒト化されたscFv抗体フラグメントである。マウスscFvのヒト化は、マウス特異的残基が、遺伝子改変T細胞治療を受ける患者においてヒト抗マウス抗原（HAMA）応答を誘導する可能性のある臨床現場にとって、望ましいといえる。
【００８５】
ある態様において、異種ターゲティング構築物の抗原結合ドメイン部分は、哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化された配列を有する導入遺伝子によってコードされる。ある態様において、本発明の異種ターゲティング構築物全体は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された配列を有する導入遺伝子によってコードされる。コドン最適化とは、コーディングDNAにおける同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）の出現頻度が、異なる種において偏っているという知見を意味する。このようなコドン縮退により、同一のポリペプチドを様々なヌクレオチド配列でコードすることが可能になる。さまざまなコドン最適化方法が当技術分野で知られており、例えば、米国特許第5,786,464号および第6,114,148号に開示されている方法があるが、これら2つはいずれもその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００８６】
ある態様において、本発明の異種ターゲティング構築物は、標的特異的結合エレメント抗原結合ドメインを含む。部位の選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドの種類および数によって決まる。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択されてもよい。本発明の異種ターゲティング構築物における抗原結合ドメインのリガンドとして作用しうる細胞表面マーカーの例としては、癌に関連するもの、ならびにウイルス、細菌、寄生虫感染症に関連するものが挙げられる。
【００８７】
ある態様において、異種ターゲティング構築物を介したT細胞応答は、望ましい抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインを異種ターゲティング構築物に工学的に組み込むことによって、目的の抗原に向かわせることができる。抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびそれらの機能性フラグメントを含むがそれに限定されない、抗原に結合する任意のドメインとすることができ、このドメインは、重鎖可変ドメイン（VH）、軽鎖可変ドメイン（VL）、およびラクダ科動物由来ナノボディの可変ドメイン等の単一ドメイン抗体、ならびに組換えフィブロネクチンドメイン等の抗原結合ドメインとして機能する当技術分野で公知の代替スキャフォールドを含むが、これらに限定されない。一部の例において、抗原結合ドメインが、異種ターゲティング構築物が最終的に使用されるのと同じ種に由来することが有利である。例えば、ヒトでの使用のために、異種ターゲティング構築物の抗原結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインのためのヒト残基またはヒト化残基を含むことが有利となりうる。
【００８８】
本発明の任意の態様の一部の実施形態において、異種ターゲティング構築物は、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントである、抗原結合ドメインを特徴とし、それを含む。ヒト化抗体は、当技術分野で知られているさまざまな技術によって生成することが可能であって、その技術には、CDRグラフティング（例えば、欧州特許EP 239,400；PCT公開WO 91/09967；および米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、および第5,585,089号を参照されたい。これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、ベニアリング（veneering）もしくはリサーフェシング（resurfacing）（例えば、欧州特許EP 592,106およびEP 519,596を参照されたい。それぞれは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、チェーンシャッフリング（chain shuffling）（例えば、米国特許第5,565,332号を参照されたい。これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、ならびに、例えば米国特許出願公開第2005/0042664号、米国特許出願公開第2005/0048617号、米国特許第6,407,213号および第5,766,886号、ならびに国際公開WO 93/17105に開示されている技術であって、そのそれぞれが参照によりそのまま本明細書に組み入れられる前記技術、を含むがこれらに限定されない。フレームワーク領域のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させる、例えば改善するために、CDRドナー抗体からの対応する残基で置換されることが多い。これらのフレームワーク置換は、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRとフレームワーク残基との相互作用のモデル化、ならびに特定の位置における普通でないフレームワーク残基を同定するための配列比較によって、当技術分野でよく知られている方法で確認される。例えば、米国特許第5,585,089号を参照されたい。これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８９】
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、その中に残存する、非ヒト起源に由来する１以上のアミノ酸残基を有している。これらの非ヒト由来のアミノ酸残基は、典型的には「インポート」可変ドメインから得られる「インポート」残基と呼ばれることが多い。本明細書で提供されるヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒト免疫グロブリン分子に由来する１以上のCDR、および、フレームワークを含むアミノ酸残基が完全にまたは主にヒト生殖細胞系列に由来するフレームワーク領域を含む。抗体または抗体フラグメントをヒト化するための複数の技術が当技術分野でよく知られているが、基本的には、Jones et al., Nature, 1986, 321:522-525; Riechmann et al., Nature, 1988, 332:323-327; およびVerhoeyen et al., Science, 1988, 239:1534-1536（これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる）の方法にしたがって、げっ歯類のCDRまたはCDR配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより、すなわちCDRグラフティングによって、行うことができる。このようなヒト化抗体およびその抗原結合フラグメントにおいて、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ない量が、ヒト以外の種に由来する対応する配列によって置換されている。ヒト化抗体は、一部のCDR残基および、おそらく、一部のフレームワーク（FR）残基が、げっ歯類抗体の類似部位からの残基で置換されている、ヒト抗体である場合が多い。
【００９０】
一部の態様において、抗体フラグメントを含む、本発明の異種ターゲティング構築物の部分は、標的抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持しながらヒト化されている。本発明のある態様によれば、ヒト化された抗体および抗体フラグメントは、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列およびさまざまな概念上のヒト化産物を解析するプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補の免疫グロブリン配列の、可能性のある三次元コンフォメーション構造を図示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を精査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の、可能性の高い役割の分析、例えば、候補免疫グロブリンが標的抗原と結合する能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大等の、望ましい抗体または抗体フラグメント特性が達成されるように、FR残基を、レシピエント配列およびインポート配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、CDR残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに、直接的かつ最も実質的に関与する。
【００９１】
場合によって、scFvは、当技術分野で知られている方法に従って調製することができる（例えば、Bird et al., Science, 1988, 242:423-426 およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85:5879-5883を参照されたいが、それらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。scFv分子は、フレキシブルなポリペプチドリンカーを用いてVHおよびVL領域を一緒に連結することにより生成することができる。scFv分子は、最適化された長さ、および／またはアミノ酸組成を有するリンカー（例えば、Ser-Glyリンカー）を含む。リンカーの長さは、scFvの可変領域がどのように折り畳まれ、相互作用するかに大きく影響しうる。実際、短いポリペプチドリンカーが採用される場合（例えば、5〜10アミノ酸の間）、鎖間フォールディングは妨げられる。鎖間フォールディングはまた、機能的エピトープ結合部位を形成するために2つの可変領域を1つに結び付けるために必要である。リンカーの配向およびサイズの例については、例えば、Hollinger et al. Proc Natl Acad. Sci. USA, 1993, 90:6444-6448、米国公開番号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794、および国際特許公開番号WO 2006/020258およびWO 2007/024715を参照されたいが、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
【００９２】
scFvは、そのVL領域とVH領域の間に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50個、またはそれ以上のアミノ酸残基のリンカーを含むことができる。リンカー配列は、任意の天然に存在するアミノ酸を含むことができる。一部の実施形態において、リンカー配列は、アミノ酸グリシンおよびセリンを含む。別の実施形態において、リンカー配列は、（GGGGS）nのようなグリシンおよびセリンの繰り返しのセットを含み、このnは、1に等しいかまたは2以上の正の整数（例えば、1、2、3、4、5個またはそれ以上）である。リンカーの長さの変化は、活性を保持することも、活性を高めることもあり、結合および活性において優れた有効性を生じさせることができる。
【００９３】
本発明の遺伝子改変γδ T細胞による標的細胞の細胞溶解の動態は、部分的には、抗原結合ドメインの結合親和性によって決定される。本明細書で提供される抗原結合ドメインはいずれも、必要に応じて、特定の標的に対する結合親和性を増強または低減するために、既知の方法に従って改変することができる。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、その抗原に対する結合親和性または解離定数（KD）が10-4 Mから10-10 Mである（例えば、標準的な生理学的温度および圧力の下で、例えば、表面プラズモン共鳴、例えばBIAcoreによって測定された定数が、10-4 Mから10-5 M、10-5 Mから10-6 M、10-6 Mから10-7 M、10-7 Mから10-8 M、10-8 Mから10-9 M、10-9 Mから10-10 M、例えば、10-5 Mから10-9 M、10-5 Mから10-8 M、10-5 Mから10-7 M、10-5 Mから10-6 M、10-6 Mから10-10 M、10-6 Mから10-9 M、10-6 Mから10-8 M、10-6 Mから10-7 M、10-7 Mから10-10 M、10-7 Mから10-9 M、10-7 Mから10-8 M、10-8 Mから10-10 M、10-8 Mから10-9 M、または10-9 Mから10-10 Mである）。
【００９４】
遺伝子改変γδ T細胞の抗原結合ドメインの、標的細胞に対する結合親和性に加えて、アビディティ相互作用もまた、標的細胞の効果的な結合およびその後の溶解に役割を果たしている。アビディティは、（a）抗原結合ドメインの結合親和性、および（b）T細胞と標的との間の所定の境界面に沿った抗原結合ドメインと抗原との間の相互作用の数によって決定される。一部の実施形態において、遺伝子改変γδ T細胞は、その表面上に、102 から106 の抗原結合ドメイン（例えば、102 から103、103 から104、104 から105、105 から106、102 から104、102 から105、103 から104、103 から105、103 から106、104 から105、104 から106、または105 から106の抗原結合ドメイン）を含む。
【００９５】
ストークドメイン
本発明の異種ターゲティング構築物は、膜貫通ドメインと細胞外抗原結合ドメインとの間に位置するストークドメインを含むことができる。一部の実施形態において、ストークドメインは、CD8ストーク、IgGヒンジ-重鎖定常（CH）ドメイン（例えばIgG1ヒンジ-CH2ドメイン、IgG1ヒンジ-CH3ドメイン、またはIgG1ヒンジ-CH2-CH3ドメイン）、(G4S)3ヒンジ、IgG1ヒンジ、CD7ストーク、IgDヒンジ-CH2ドメイン、IgDヒンジ-CH3ドメイン、IgDヒンジ-CH2-CH3ドメイン、IgG4ヒンジ-CH2ドメイン、IgG4ヒンジ-CH3ドメイン、IgG4ヒンジ-CH2-CH3ドメイン、またはFcεRIストークからなる一群から選択される１つまたは複数のドメインを含む。ストークは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間にフレキシビリティを提供し、標的認識を助けることができる。当業者には当然のことであるが、ストークドメインは、細胞外領域または膜貫通領域に隣接する１以上のアミノ酸、例えば、ストークが由来するタンパク質の細胞外領域または膜貫通領域に関連する１以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域または膜貫通領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15個のアミノ酸）をさらに含んでいてもよい。ストークは、必要に応じて、(GGGGS)nまたはGGGGSGGGGS（配列番号1）等の１以上のリンカーを含んでいてもよい。
【００９６】
膜貫通ドメイン
本発明の任意の態様のさまざまな実施形態において、異種ターゲティング構築物は、細胞外ドメイン（1つもしくは複数）に結合された膜貫通ドメインを含むように設計することができる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１以上の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通領域が由来するタンパク質の細胞外領域に関連する１以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15個のアミノ酸）および／または膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域に関連する１以上の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個から15個までのアミノ酸）を含有することができる。ある態様において、膜貫通ドメインは、異種ターゲティング構築物の他のドメインのうちの1つに関連するものである。場合によって、膜貫通ドメインは、同じ、または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対するそのようなドメインの結合を回避するように（例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするように）、選択され、またはアミノ酸置換によって改変され得る。したがって、場合によっては、膜貫通ドメインは、シグナル1活性化および／またはシグナル2活性化（共刺激）を実質的に伝達しない。
【００９７】
あるいはまた、膜貫通ドメインは、他のタンパク質（例えば、内因性タンパク質、例えば、膜貫通タンパク質等の内因性膜結合タンパク質）との結合能力、クラスター形成誘導能力、活性化能力、リン酸化能力、脱リン酸化能力、またはそのほかに相互作用能力のために、選択することができる。例えば、一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、共刺激性タンパク質と結合してもよく、それによって、シグナル2共刺激シグナルを伝達することにより、間接的に細胞（例えば、γδ T細胞）を活性化する。特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、NKG2Dの膜貫通部分に由来し、これは、内因性に発現したDAP10と結合して、宿主細胞のシグナル2活性化（共刺激）を伝達することができる。このような場合、異種ターゲティング構築物は、細胞を活性化することができる機能的な細胞内ドメインを有していない。例えば、異種ターゲティング構築物は、細胞内ドメインを欠いていてもよく、シグナル1またはシグナル2活性化を伝達しない不活性な細胞内ドメインを含んでいてもよい。例えば、内因性の共刺激分子をリクルートするか、または内因性の共刺激分子と結合することによってシグナル2を伝達することができる膜貫通ドメインは、末端膜貫通ドメインであってもよい（例えば、その末端の一方に追加のドメインが結合していない）。
【００９８】
ある態様において、膜貫通ドメインは、γδ T細胞表面上の別の異種ターゲティング構築物とともにヘテロまたはホモ二量化することが可能である。別の態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じ遺伝子改変T細胞内に存在するネイティブな結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小にするように、改変または置換されていてもよい。
【００９９】
膜貫通ドメインは、天然または組換え起源に由来するものとすることができる。起源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来するものとすることがきる。本発明において個々に使用される膜貫通ドメインは、少なくとも、例えば、T細胞受容体のα、βもしくはζ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD18、CD22、CD29、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD94、CD134、CD137、CD154、CD7、CD3ゼータ、CD71、Fcガンマ受容体（FcγR）、またはNKG2Dの、１以上の膜貫通領域を含むことができる。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、例えば、CD8膜貫通ドメイン、CD4膜貫通ドメイン、CD3ζ膜貫通ドメイン、またはCD28膜貫通ドメインを含むことができる。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、末端膜貫通ドメインである（例えば、その末端の一方に追加のドメインが結合していない）。
【０１００】
場合によって、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えばヒトタンパク質由来のヒンジを介して、異種ターゲティング構築物の細胞外領域、例えば、異種ターゲティング構築物の抗原結合ドメインに、結合され得る。例えば、ある実施形態において、ヒンジは、ヒトIg（免疫グロブリン）ヒンジ、例えば、IgG1ヒンジ、IgG4ヒンジ、IgDヒンジ、またはCD8αヒンジとすることができる。
【０１０１】
ある実施形態において、膜貫通ドメインは組換え型であり、その場合、ロイシンおよびバリンのようなほとんど疎水性の残基を含むことになる。ある態様において、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンの3つ組が、組換え膜貫通ドメインの両端に存在しうる。
【０１０２】
必要に応じて、短いポリペプチドリンカー、例えば、長さが2〜10アミノ酸のポリペプチドリンカーが、異種ターゲティング構築物の膜貫通ドメインと細胞質領域との間の連結を形成してもよい。好適なリンカーの例として、グリシン-セリンの2つの組み合わせが挙げられる。例えば、ある態様において、リンカーは、(GGGGS)nまたはGGGSSSGGGS（配列番号1）のアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
γδ T細胞を採取して増幅させる方法
本発明の遺伝子改変γδ T細胞は、任意の適切な自家γδ T細胞もしくは同種γδ T細胞、またはその集団から得ることができる。一部の実施形態において、ここに記載されている遺伝子改変γδ T細胞の供給源として使用するのに適したγδ T細胞としては、Vδ1細胞、Vδ2細胞、Vδ3細胞、Vδ5細胞、およびVδ8細胞がある。一部の実施形態において、遺伝子改変γδ T細胞の集団は、Vδ1細胞、Vδ3細胞、Vδ5細胞、またはVδ8細胞の集団に由来する。
【０１０４】
例えば、本明細書で提供されるのは、皮膚または腸等の非造血組織からVδ1細胞を分離して増幅させるための方法である。例えば、Vδ1細胞は、U.S. 2018/0312808に記載のように、ヒト皮膚生検材料から単離することが可能であって、前記はその全体が参照により本明細書に組み込まれるが、具体的には、組織からVδ1細胞を単離する方法に関するものである。
【０１０５】
他の実施形態において、好適なγδ T細胞は、血液（例えば、末梢血）由来とすることができる。血液からVδ1細胞を単離して増幅させる方法には、例えば、米国特許第9,499,788号および国際特許公開WO 2016/198480に記載の方法等があるが、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。一部の実施形態において、好適なγδ T細胞は、腫瘍組織に由来していてもよい（例えば、腫瘍浸潤γδ T細胞）。あるいはまた、異種ターゲティング構築物を発現するように操作することができる好適なγδ T細胞は、下記の方法に従って、非造血組織から得ることができる。
【０１０６】
血液からのγδ T細胞の単離および増幅
一部の実施形態において、本発明の遺伝子改変γδ T細胞は、対象の血液（例えば、末梢血）に由来する。例えば、遺伝子改変γδ T細胞は、血液由来のVδ2細胞または血液由来のVδ1細胞に由来してもよい。
【０１０７】
一部の実施形態において、末梢血単核細胞（PBMC）は、当技術分野で知られている任意の適切な方法に従って、対象から得ることができる。PBMCは、アミノビスホスホネート（例えば、ゾレドロン酸）、合成ホスホ抗原（phosphoantigen）（例えば、ブロモヒドリンピロリン酸塩；BrHPP）、2M3B1PP、または2-メチル-3-ブテニル-1-ピロリン酸の存在下で、IL-2の存在のもと1〜2週間培養して、Vδ2細胞の富化された集団を生成することができる。あるいはまた、固定化された抗TCRγδ（例えば、汎TCRγδ）は、例えば約14日間、IL-2の存在下で、PBMCの集団からVδ2細胞の優先的な増幅を誘導することができる。一部の実施形態において、PBMCからのVδ2細胞の優先的な増幅は、IL-2およびIL-4の存在下での固定化抗CD3抗体（例えば、OKT3）の培養で達成することができる。一部の実施形態において、前記培養は、可溶性抗CD3、IL-2、およびIL-4の存在下での継代培養に先立って約７日間維持される。あるいはまた、人工抗原提示細胞を用いて、Vδ2細胞等のγδ T細胞の優先的な増幅を促進することができる。例えば、照射されたaAPC、IL-2、および／またはIL-21の存在下で培養されたPBMC由来γδ T細胞は、Vδ2細胞を高い割合で、Vδ1細胞を中程度の割合で含み、さらにダブルネガティブ細胞を一部含む、γδ T細胞の集団を生成するように増幅させることができる。前記方法の一部の実施形態において、PBMCは、事前に富化させるか、または後で富化させる（例えば、TCRγδ特異的薬剤による陽性選択またはTCRαβ特異的薬剤の陰性選択を介して）ことができる。Vδ2細胞等のγδ T細胞を増幅させるための上記方法および他の好適な方法は、Deniger et al., Frontiers in Immunology 2014, 5, 636: 1-10により詳細に記載されており、それは参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
【０１０８】
一部の実施形態において、Vδ1 T細胞は、異種ターゲティング構築物を発現するように操作することができる。Vδ1 T細胞の集団を得るための任意の適切な方法を使用することができる。例えば、Almeida et al. (Clinical Cancer Research 2016, 22, 23; 5795-5805)は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるが、本明細書に記載の異種ターゲティング構築物を発現するように操作することができるVδ1 T細胞の集団を得るための適切な方法を提供する。例えば、一部の実施形態において、PBMCは、磁気ビーズソーティングを用いて予め富化されており、これによって90％を超えるγδ T細胞が得られる。これらの細胞は、ガス透過性バイオリアクターバッグの中で、１以上の因子（例えば、TCRアゴニスト、コレセプターアゴニスト、および／またはサイトカイン、例えば、IL-4、IL-5、および／またはIFN-γ）の存在下で、最大21日間またはそれ以上の期間培養することができる。この方法の変形形態、およびVδ1 T細胞を得る他の方法は、本発明の一部として適している。例えば、血液由来のVδ1 T細胞は、代わりに、例えば、米国特許第9,499,788号および国際特許公開WO 2016/198480に記載の方法、ならびにWO2017197347およびWO2016081518（米国公開第20160175338号）に記載の方法を用いて、得ることが可能であって、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０９】
非造血組織からの非造血組織常在性γδ T細胞の分離および増幅
下記のように得られた非造血組織常在性γδ T細胞は、すぐれた腫瘍浸潤能力および貯留能力を示しうるので、本明細書に記載の異種ターゲティング構築物のための適切な媒体（ヒビクル）である可能性が高い。非造血組織常在性γδ T細胞の単離および増幅のためのより詳細な方法は、例えば、GB出願第1707048.3号（WO2018/202808）および国際特許公開WO 2017/072367（米国公開第20180312808号）に記載されており、それらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１１０】
非造血組織常在性γδ T細胞（例えば、皮膚由来のγδ T細胞および/または非Vδ2 T細胞、例えばVδ1 T細胞および/またはDN T細胞）は、ヒトまたは非ヒト動物の非造血組織から単離され、本発明の方法による遺伝子改変に適した細胞として取得される。一部の実施形態において、γδ T細胞が取り出され、増幅される元となる非造血組織は皮膚（例えば、ヒトの皮膚）であり、当技術分野で知られる方法により取得される。一部の実施形態において、皮膚はパンチ生検により取得される。あるいは、本明細書で提供される、γδ T細胞を単離および増幅する方法は、消化管（例えば、結腸）、乳腺、肺、前立腺、肝臓、脾臓、膵臓に適用することができる。γδ T細胞は、ヒト癌組織、例えば、乳房または前立腺の腫瘍に常在するものでもよい。一部の実施形態において、γδ T細胞は、ヒト癌組織（例えば、固形腫瘍組織）由来であってもよい。他の実施形態において、γδ T細胞は、ヒト癌組織以外の非造血組織（例えば、実質的な数の腫瘍細胞を有しない組織）由来であってもよい。例えば、γδ T細胞は、癌の周辺または癌の隣接部位から離間した、皮膚領域（例えば、健康な皮膚）由来であってもよい。
【０１１１】
血液中のγδ T細胞の大部分を占めるγδ T細胞は、主にVδ2 T細胞であるが、非造血組織のγδ T細胞の大部分を占めるのは、主にVδ1 T細胞であり、Vδ1 T細胞は非造血組織常在性のγδ T細胞の集団の70-80％を含む。しかしながら、一部のVδ2 T細胞は非造血組織、例えば消化管にも見られ、消化管では、γδ T細胞の10-20％を含む（図６）。非造血組織に常在するγδ T細胞の一部は、Vδ1もVδ2 TCRも発現しない。このような細胞を、本明細書ではダブルネガティブ（DN）と名付ける。DN γδ T細胞は、多数がVδ3発現T細胞であり、少数がVδ5発現T細胞である。したがって、非造血組織に常在し、本発明の方法によって増幅されるγδ T細胞は、好適にはVδ2 T細胞ではなく、例えば、少量のDNγδ T細胞を含むVδ1 T細胞である。
【０１１２】
一部の実施形態において、重要なステップは、例えば、培養数日または数週間後の、非造血組織常在性T細胞（例えば、αβ細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、B細胞およびγδ2T細胞、および非γδ2T細胞等を含む混合リンパ球の集団の内部）を、T細胞を取得した組織の非造血細胞（例えば、ストロマ細胞、特に線維芽細胞）から、目的に沿って分離することである。これにより、非造血組織由来のVδ1 T細胞およびDN γδ T細胞の数日および数週間の優先的かつ迅速な増幅が可能になる。
【０１１３】
一般に、非造血組織常在性γδ T細胞は、ストロマ細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）との物理的な接触を除去すれば、自発的に増幅可能である。したがって、上記のスキャフォールドをベースとした培養方法を使用して、このような分離を誘導し、γδ T細胞の抑制を解除して、増幅を引き起こすことができる。したがって、一部の実施形態においては、増幅ステップにおいて、実質的にTCR経路の活性化は存在しない（例えば、外因性TCR経路活性化剤は、培養液中に含まれない）。さらに、本発明は、非造血由来常在性γδ TCR細胞を増幅する方法であって、支持細胞、腫瘍細胞および/または抗原提示細胞との接触を含まない方法を提供する。
【０１１４】
増幅プロトコルは、非造血組織常在性γδ T細胞を、γδ T細胞の効率的な増幅を支持するために効果的な生物学的因子のカクテルの存在下で培養することを含む。ある実施形態において、γδ T細胞を増幅する方法は、非造血組織より得られたγδ T細胞の集団（例えば、分離された非造血組織由来のγδ T細胞の集団、例えば、本明細書に記載された方法で分離された非造血組織由来のγδ T細胞の集団）を提供することを含み、前記γδ T細胞を、IL-2、IL-4、IL-15および/またはIL-21の存在下で培養することを含む。これらのサイトカインまたはその類似物（アナログ）は、ある期間（例えば、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも21日間、少なくとも28日間 またはより長く、例えば5日間〜40日間、7日間〜35日間、14日間〜28日間、または約21日間）、増幅されたγδ T細胞の集団を生成するために有効な量で、細胞とともに培養され得る。
【０１１５】
増幅されたγδ T細胞の集団
増幅されたγδ T細胞の集団は、増幅ステップ前の分離されたγδ T細胞の集団よりも数が大きい（例えば、増幅ステップ前の分離されたγδ T細胞の集団と比較して、少なくとも2倍の数、少なくとも3倍の数、少なくとも4倍の数、少なくとも5倍の数、少なくとも6倍の数、少なくとも7倍の数、少なくとも8倍の数、少なくとも9倍の数、少なくとも10倍の数、少なくとも15倍の数、少なくとも20倍の数、少なくとも25倍の数、少なくとも30倍の数、少なくとも35倍の数、少なくとも40倍の数、少なくとも50倍の数、少なくとも60倍の数、少なくとも70倍の数、少なくとも80倍の数、少なくとも90倍の数、少なくとも100倍の数、少なくとも200倍の数、少なくとも300倍の数、少なくとも400倍の数、少なくとも500倍の数、少なくとも600倍の数、少なくとも700倍の数、少なくとも800倍の数、少なくとも900倍の数、少なくとも1,000倍の数、少なくとも5,000倍の数、少なくとも10,000倍の数、またはより多く）。したがって、γδ T細胞（例えば、皮膚由来のγδ T細胞および/または非Vδ2 T細胞、例えば、Vδ1 T細胞および/またはDN T細胞）の大きな集団を、高い効率で（例えば、ストロマ細胞の接触および/またTCR刺激の除外による、または有効な量の因子の存在下での培養による）増幅することができる。一部の実施形態において、本明細書における増幅ステップは、短い集団倍増時間でγδ T細胞を増幅し、倍増時間は下記式で得られる：
［数１］
倍増時間＝期間  ×  log（2）/（log（最終濃度）−  log（初期濃度））
本明細書の情報によって、当業者は、本発明が、5日間未満（例えば、4.5日未満、4.0日未満、3.9日未満、3.8日未満、3.7日未満、3.6日未満、3.5日未満、3.4日未満、3.3日未満、3.2日未満、3.1日未満、3.0日未満、2.9日未満、2.8日未満、2.7日未満、2.6日未満、2.5日未満、2.4日未満、2.3日未満、2.2日未満、2.1日未満、2.0日未満、46時間未満、42時間未満、38時間未満、35時間未満、32時間未満）の集団倍増時間にてγδ T細胞（例えば、遺伝子改変γδ T細胞、または異種ターゲット構築物を発現する遺伝子改変のために増幅および／もしくは選別されたγδ T細胞）を増幅する方法を提供することを認識するであろう。
【０１１６】
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法で単離及び増幅されたγδ T細胞（例えば、遺伝子改変γδ T細胞、または異種ターゲット構築物を発現する遺伝子改変のために増幅および／もしくは選別されたγδ T細胞）は、抗腫瘍能に適した表現型を有することができる。一部の実施形態において、増幅されたγδ T細胞（例えば、皮膚由来のVδ1 T細胞）の集団は、参照となる集団（例えば、増幅ステップ前の分離されたγδ T細胞の集団）よりも高いCD27平均発現量を示す。一部の実施形態において、増幅されたγδ T細胞の集団のCD27平均発現量は、分離されたγδ T細胞の集団と比較して、少なくとも2倍である（例えば、分離されたγδ T細胞の集団と比較して、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも 25倍、少なくとも 30倍、少なくとも 40倍、少なくとも50倍、少なくとも 60倍、少なくとも 70倍、少なくとも 80倍、少なくとも90倍、少なくとも 100倍、少なくとも150倍、少なくとも200倍、少なくとも300倍、少なくとも400倍、少なくとも 500倍、少なくとも 600倍、少なくとも700倍、少なくとも 800倍、少なくとも 900倍、少なくとも 1,000倍、少なくとも5,000倍、少なくとも10,000倍、少なくとも20,000倍、またはより多く）。
【０１１７】
増幅されたγδ T細胞（例えば、遺伝子改変γδ T細胞、または異種ターゲット構築物を発現する遺伝子改変のために増幅および／もしくは選別されたγδ T細胞）の集団の区別可能な部分は、CD27量がアップレギュレートされているが、他の部分はCD27が低値か、CD27-であり得る。この場合、分離されたγδ T細胞の集団と比較して、増幅された集団のCD27+細胞の頻度が高くなり得る。例えば、増幅されたγδ T細胞の集団は、増幅前の分離されたγδ T細胞の集団と比較して、CD27+細胞を少なくとも5％高い頻度で有し得る（例えば、増幅前の分離されたγδ T細胞の集団と比較して、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または最大で100%、CD27+細胞の頻度が高い）。一部の実施形態において、分離されたγδ T細胞の集団と比較した、増幅された集団中のCD27+細胞の数は、増大していてもよい。例えば、増幅されたγδ T細胞の集団は、増幅前の分離されたγδ T細胞の集団と比較して、少なくとも2倍の数のCD27+細胞を有し得る（例えば、増幅前の分離されたγδ T細胞の集団と比較して、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または最大で100%、CD27+細胞の頻度が高い）。
【０１１８】
本明細書で提供される増幅方法は、一部の実施形態において、参照となる集団（例えば、増幅ステップ前の分離されたγδ T細胞の集団）と比較して、TIGIT発現が低い、γδ T細胞（例えば、遺伝子改変γδ T細胞、または異種ターゲット構築物を発現する遺伝子改変のために増幅および／もしくは選別されたγδ T細胞）の集団をもたらす。一部の実施形態において、増幅されたγδ T細胞の集団は、参照となる集団（例えば、増幅ステップ前の分離されたγδ T細胞の集団）よりも低いTIGIT平均発現量を示す。一部の実施形態において、増幅されたγδ T細胞の集団は、分離されたγδ T細胞の集団と比較して、少なくとも10％低いTIGIT平均発現量を示す（例えば、分離されたγδ T細胞の集団と比較して、少なくとも20%低い、少なくとも30%低い、少なくとも40%低い、少なくとも50%低い、少なくとも60%低い、少なくとも70%低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、または最大で100％低い）。
【０１１９】
増幅されたγδ T細胞（例えば、遺伝子改変γδ T細胞、または異種ターゲット構築物を発現する遺伝子改変のために増幅および／もしくは選別されたγδ T細胞）の集団の区別可能な部分はTIGIT、例えば、高レベルのTIGITを発現するが、他の部分においては、低いレベルのTIGITか、TIGIT-である、ことがあり得る。この場合、分離されたγδ T細胞の集団と比較して、増幅された集団におけるTIGIT+細胞の頻度は、低くなり得る。例えば、増幅されたγδ T細胞の集団は、増幅前の分離されたγδ T細胞の集団と比較してTIGIT+細胞の頻度が、少なくとも5％低くなり得る（例えば、増幅前の分離されたγδ T細胞の集団と比較して、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%,、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または最大で100% TIGIT+細胞の頻度が低い）。一部の実施形態において、増幅前の分離されたγδ T細胞の集団と比較した、増幅された集団のTIGIT+細胞の数は、少ないことがある。例えば、増幅前の分離されたγδ T細胞の集団におけるTIGIT+細胞の数と比較して、増幅されたγδ T細胞の集団のTIGIT+細胞の数は、少なくとも10％少ない（例えば、増幅前の分離されたγδ T細胞の集団のTIGIT+細胞の数と比較して、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または最大で100% TIGIT+細胞の数が少ない）。
【０１２０】
一部の実施形態において、増幅されたγδ T細胞の集団（例えば、遺伝子改変γδ T細胞、または異種ターゲット構築物を発現する遺伝子改変のために増幅および／もしくは選別されたγδ T細胞）は、CD27+細胞の数または頻度が高く、TIGIT+細胞の頻度が低い。一部の実施形態において、増幅されたγδ T細胞の集団は、参照となる集団と比較して（例えば、増幅前のγδ T細胞の分離された集団と比較して）、CD27+TIGIT-細胞の頻度が高い。例えば、増幅されたγδ T細胞の集団は、増幅前のγδ T細胞の分離された集団と比較して、CD27+TIGIT-細胞の頻度が少なくとも5％高い（例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または最大100％、CD27+ TIGIT-細胞の頻度が、増幅前のγδ T細胞の分離された集団のそれと比較して高い）。一部の実施形態において、分離されたγδ T細胞の集団と比較して、増幅された集団において、CD27+ TIGIT-細胞の数を増加させることができる。例えば、増幅されたγδ T細胞の集団は、増幅前の分離されたγδ T細胞の集団と比較して、少なくとも2倍の数のCD27+TIGIT-細胞（例えば、増幅前のγδ T細胞の分離された集団と比較して、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または最大100％高い頻度のCD27+TIGIT-細胞）を有していてもよい。
【０１２１】
場合によっては、γδ T細胞（例えば、遺伝子改変γδ T細胞、または異種ターゲット構築物を発現する遺伝子改変のために増幅および／もしくは選別されたγδ T細胞）の増幅された集団における、CD27+γδ T細胞の集団でのTIGITの平均発現は、参照となる集団と比較して低い。一部の実施形態において、増幅されたCD27+γδ T細胞の集団は、TIGITの平均発現が、参照となる集団（例えば、増幅ステップの前の、CD27+γδ T細胞の分離された集団）よりも低い。一部の実施形態において、増幅されたCD27+γδ T細胞の集団は、分離されたCD27+γδ T細胞の集団よりも、TIGITの平均発現が、少なくとも10％少ない（例えば、分離されたCD27+γδ T細胞の集団よりも、少なくとも20％少ない、少なくとも30％少ない、少なくとも40％少ない、少なくとも50％少ない、少なくとも60％少ない、少なくとも70％少ない、少なくとも80％少ない、少なくとも90％少ない、または最大100％少ない）。
【０１２２】
それに加えて、またはその代わりに、γδ T細胞（例えば、遺伝子改変γδ T細胞、または異種ターゲット構築物を発現する遺伝子改変のために増幅および／もしくは選別されたγδ T細胞）の増幅された集団における、TIGIT-γδ T細胞の集団でのCD27の発現中央値は、参照となる集団と比較して高い。例えば、増幅されたTIGIT-γδ T細胞の集団は、増幅前のTIGIT-γδ T細胞の分離された集団と比較して、CD27+細胞の頻度が少なくとも5％高い（例えば、増幅前のTIGIT-γδ T細胞の分離された集団と比較して、CD27+細胞の頻度が、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または最大100％高い）可能性がある。一部の実施形態において、TIGIT-γδ T細胞の分離された集団と比較して、増幅させた集団のCD27+細胞数は増加していることがある。例えば、増幅されたTIGIT-γδ T細胞の集団は、増幅前の分離されたTIGIT-γδ T細胞の集団と比較して、CD27+細胞の数が、少なくとも2倍である（例えば、増幅前の分離されたTIGIT-γδ T細胞の集団と比較して、CD27+細胞の頻度が、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または最大100％高い）可能性がある。
【０１２３】
CD124、CD215、CD360、CTLA4、CD1b、BTLA、CD39、CD45RA、Fasリガンド、CD25、ICAM-1、CD31、KLRG1、CD30、CD2、NKp44、NKp46、ICAM-2、CD70、CD28、CD103、NKp30、LAG3、CCR4、CD69、PD-1およびCD64を含めた、他のマーカーの発現の増加または減少は、1以上の増幅されたγδ T細胞（例えば、遺伝子改変γδ T細胞、または異種ターゲット構築物を発現する遺伝子改変のために増幅および／もしくは選別されたγδ T細胞）の集団を特徴づけるために、追加で、または代替的に使用され得る。一部の例において、増幅されたγδ T細胞の集団は、例えば、増幅前の分離されたγδ T細胞の集団と比較して、CD124、CD215、CD360、CTLA4、CD1b、BTLA、CD39、CD45RA、Fasリガンド、CD25、ICAM-1、CD31、KLRG1、CD30およびCD2からなる群から選択される1以上のマーカーの平均発現量が高い、同等である、または低い。これに加えて、または、これに代えて、増幅されたγδ T細胞の集団は、分離されたγδ T細胞の集団と比較して、CD124、CD215、CD360、CTLA4、CD1b、BTLA、CD39、CD45RA、Fasリガンド、CD25、ICAM-1、CD31、KLRG1、CD30およびCD2からなる群から選択される1以上のマーカーを発現する細胞の頻度が高い、同等である、または低い。一部の実施形態において、増幅されたγδ T細胞の集団は、分離されたγδ T細胞の集団と比較して、NKp44、NKp46、ICAM-2、CD70、CD28、CD103、NKp30、LAG3、CCR4、CD69、PD-1およびCD64からなる群より選択される1以上のマーカーの平均発現量が高い、同等である、または低い。同様に、参照となる分離されたγδ T細胞の集団と比較して、増幅された集団は、NKp44、NKp46、ICAM-2、CD70、CD28、CD103、NKp30、LAG3、CCR4、CD69、PD-1およびCD64からなる群より選択される1以上のマーカーを発現する細胞の数が多い、同等である、または少ない。
【０１２４】
γδ T細胞の増幅への使用に適した多数の基礎培地、特にAIM-V、Iscoves培地、RPMI-1640（Life Technologies社）等の完全培地が入手可能である。前記培地には、血清、血清タンパク質および抗生物質等の選択剤等、他の培地成分を追加してもよい。例えば、一部の実施形態では、2 mMグルタミン、10％FBS、10 mM HEPES、pH 7.2、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム（1 mM；Life Technologies社）、非必須アミノ酸（例えば、100μMのGly、Ala、Asn、Asp、Glu、Pro、およびSer、1×MEM非必須アミノ酸、Life Technologies社）、および10μL/L β-メルカプトエタノールを含むRPMI-1640培地。 便宜上、細胞は、適切な培地、5％CO2を含む加湿雰囲気下、37℃で培養される。
【０１２５】
γδ T細胞は、攪拌タンク発酵槽、エアリフト発酵槽、ローラーボトル、培養バッグまたは培養ディッシュ、および他のバイオリアクター、特に中空繊維バイオリアクター、を含む任意の適切なシステムで本明細書に記載のように培養することができる。このようなシステムの使用は、当技術分野で周知である。リンパ球の培養のための一般的な方法および技術は、当技術分野で周知である。
【０１２６】
本明細書に記載の方法は、複数の選択ステップ、例えば複数の枯渇ステップを含むことができる。負の選択によるT細胞集団の富化は、例えば、負の選択をされる細胞に特有の表面マーカーに対する抗体を組み合わせることで達成することができる。ある方法では、負の選択をされる細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用して、負の磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによって、細胞の選別および/または選択を行う。
【０１２７】
V. 医薬組成物および治療方法
本明細書に記載の遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）（例えば、異種ターゲティング構築物を有する遺伝子改変細胞（例えば、γδ T細胞））は、薬剤として、例えば、養子T細胞療法として、使用することができる。そのような使用は、本発明の方法によって得られたリンパ球（例えば、γδ T細胞）を患者に移植することを含む。この治療は、自家移植であってもよく、すなわち、リンパ球（例えば、γδ T細胞）は、それを採取した同じ患者に戻して移植してもよいが、その治療は同種移植であってもよく、すなわち、ある個人からのリンパ球（例えば、γδ T細胞）を、別の患者に移植してもよい。同種移植を伴う例において、リンパ球（例えば、γδ T細胞）は、実質的にαβ T細胞を含まないものとすることができる。例えば、αβ T細胞は、当技術分野で知られている任意の適切な手段を用いて（例えば、磁気ビーズを用いて、ネガティブ選択によって）、例えば、増幅後に、リンパ球（例えば、γδ T細胞）集団から枯渇させることができる。
【０１２８】
γδ T細胞が異種ターゲティング構築物を発現するように操作される一部の実施形態において、γδ T細胞は、Vδ1細胞、Vδ2細胞、Vδ3細胞、Vδ5細胞、またはVδ8細胞である。治療方法は、患者由来の内因性γδ T細胞サンプルを提供すること；異種ターゲティング構築物をコードするポリヌクレオチドを保有するベクターの存在下で、そのサンプルからγδ T細胞を培養して、異種ターゲティング構築物を発現する遺伝子改変γδ T細胞の集団（例えば、異種ターゲティング構築物を発現する増幅された遺伝子改変γδ T細胞集団）を生成すること；および、そのγδ T細胞集団をレシピエント患者に投与することを含むことができる。一部の実施形態において、異種ターゲティング構築物をコードするポリヌクレオチドは、エレクトロポレーション、または当技術分野で既知の、もしくは本明細書に記載の、任意の他の適当なトランスフェクションの方法を介して、内因性γδ T細胞に送達される。
【０１２９】
治療を受ける患者または対象は、ヒト癌患者（例えば、固形腫瘍の治療を受けているヒト癌患者）またはウイルス感染患者（例えば、CMV感染患者またはHIV感染患者）とすることができる。場合によっては、患者は、固形腫瘍を有しており、および／または固形腫瘍の治療を受けている。
【０１３０】
γδ T細胞はMHC非拘束性であるため、移植された宿主を異物として認識しないが、それは、移植片対宿主病を引き起こす可能性が低いことを意味する。これは、γδ T細胞が「既製品」として使用され、任意のレシピエントに移植され得ることを意味し、例えば、同種養子Ｔ細胞療法のために移植され得ることを意味している。
【０１３１】
一部の実施形態において、本発明のγδ T細胞は、NKG2Dを発現し、悪性腫瘍と強い関連性のあるNKG2Dリガンド（例えば、MICA）に応答する。また、それらは、活性化されていない状態で細胞傷害特性を発現し、したがって、腫瘍細胞を死滅させるのに有効である可能性が高い。例えば、本明細書の記載のように得られた遺伝子改変γδ T細胞は、活性化されていない状態でも、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、CCL４、IL-13、グラニュライシン、グランザイムAおよびB、ならびにパーフォリンのうちの１つもしくは2つ以上、好ましくはすべてを発現することができる。IL-17Aは発現されないこともある。
【０１３２】
医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞）を、１以上の製薬上または生理学上許容される基剤、賦形剤、または添加剤と組み合わせて含有することができる。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロースもしくはデキストラン、マンニトール等の炭水化物；タンパク質；ポリペプチドもしくはアミノ酸、例えばグリシン等；抗酸化剤；EDTAもしくはグルタチオン等のキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含有することができる。本発明の医薬組成物に使用することができる凍結保存溶液には、例えば、DMSOが挙げられる。組成物は、例えば、静脈内投与用に調剤することができる。
【０１３３】
ある実施形態において、医薬組成物は、実質的に、例えば、エンドトキシンまたはマイコプラズマ等の夾雑物がなく、検出可能なレベルの夾雑物は存在しない。
【０１３４】
一部の例において、上記のいずれかの方法によって得られた遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）の治療に有効な量を、対象に（例えば、癌の治療のために、例えば、固形腫瘍の治療のために）治療に有効な量で投与することができる。場合によって、遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞（例えば、遺伝子改変γδ T細胞、血液由来T細胞、例えば、Vδ1 T細胞、Vδ2 T細胞、および／またはDN T細胞）、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）の治療に有効な量は、1回の投与量あたり10×1012細胞未満（例えば、1回の投与量あたり9×1012細胞未満、1回の投与量あたり8×1012細胞未満、1回の投与量あたり7×1012細胞未満、1回の投与量あたり6×1012細胞未満、1回の投与量あたり5×1012細胞未満、1回の投与量あたり4×1012細胞未満、1回の投与量あたり3×1012細胞未満、1回の投与量あたり2×1012細胞未満、1回の投与量あたり1×1012細胞未満、1回の投与量あたり9×1011細胞未満、1回の投与量あたり8×1011細胞未満、1回の投与量あたり7×1011細胞未満、1回の投与量あたり6×1011細胞未満、1回の投与量あたり5×1011細胞未満、1回の投与量あたり4×1011細胞未満、1回の投与量あたり3×1011細胞未満、1回の投与量あたり2×1011細胞未満、1回の投与量あたり1×1011細胞未満、1回の投与量あたり9×1010細胞未満、1回の投与量あたり7.5×1010細胞未満、1回の投与量あたり5×1010細胞未満、1回の投与量あたり2.5×1010細胞未満、1回の投与量あたり1×1010細胞未満、1回の投与量あたり7.5×109細胞未満、1回の投与量あたり5×109細胞未満、1回の投与量あたり2.5×109細胞未満、1回の投与量あたり1×109細胞未満、1回の投与量あたり7.5×108細胞未満、1回の投与量あたり5×108細胞未満、1回の投与量あたり2.5×108細胞未満、1回の投与量あたり1×108細胞未満、1回の投与量あたり7.5×107細胞未満、1回の投与量あたり5×107細胞未満、1回の投与量あたり2.5×107細胞未満、1回の投与量あたり1×107細胞未満、1回の投与量あたり7.5×106細胞未満、1回の投与量あたり5×106細胞未満、1回の投与量あたり2.5×106細胞未満、1回の投与量あたり1×106細胞未満、1回の投与量あたり7.5×105細胞未満、1回の投与量あたり5×105細胞未満、1回の投与量あたり2.5×105細胞未満、または1回の投与量あたり1×105細胞未満）である。
【０１３５】
一部の実施形態において、遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞（例えば、遺伝子改変皮膚由来γδ T細胞、遺伝子改変血液由来γδ T細胞、例えば、Vδ1 T細胞、および／またはDN T細胞）、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）の治療に有効な量は、治療期間にわたって10×1012細胞未満（例えば、治療期間にわたって9×1012細胞未満、8×1012細胞未満、7×1012細胞未満、6×1012細胞未満、5×1012細胞未満、4×1012細胞未満、3×1012細胞未満、2×1012細胞未満、1×1012細胞未満、9×1011細胞未満、8×1011細胞未満、7×1011細胞未満、6×1011細胞未満、5×1011細胞未満、4×1011細胞未満、3×1011細胞未満、2×1011細胞未満、1×1011細胞未満、9×1010細胞未満、7.5×1010細胞未満、5×1010細胞未満、2.5×1010細胞未満、1×1010細胞未満、7.5×109細胞未満、5×109細胞未満、2.5×109細胞未満、1×109細胞未満、7.5×108細胞未満、5×108細胞未満、2.5×108細胞未満、1×108細胞未満、7.5×107細胞未満、5×107細胞未満、2.5×107細胞未満、1×107細胞未満、7.5×106細胞未満、5×106細胞未満、2.5×106細胞未満、1×106細胞未満、7.5×105細胞未満、5×105細胞未満、2.5×105細胞未満、または1×105細胞未満）である。
【０１３６】
一部の実施形態において、本明細書に記載の遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）の投与量は、約1×106、1.1×106、2×106、3.6×106、5×106、1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108、または5×108細胞／kg等である。一部の実施形態において、遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞（例えば、皮膚由来γδ T細胞、血液由来γδ T細胞、例えば、Vδ1 T細胞、および／またはDN T細胞）、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）の投与量は、少なくとも約1×106、1.1×106、2×106、3.6×106、5×106、1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108、または5×108細胞／kg等である。一部の実施形態において、遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞（例えば、皮膚由来γδ T細胞、血液由来γδ T細胞、例えば、Vδ1 T細胞、および／またはDN T細胞）、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）の投与量は、最大約1×106、1.1×106、2×106、3.6×106、5×106、1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108、または5×108細胞／kg等である。一部の実施形態において、遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞（例えば、皮膚由来γδ T細胞、血液由来γδ T細胞、例えば、Vδ1 T細胞、および／またはDN T細胞）、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）の投与量は、約1.1×106〜1.8×107細胞／kgを含む。一部の実施形態において、遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞（例えば、皮膚由来γδ T細胞、血液由来γδ T細胞、例えば、Vδ1 T細胞、および／またはDN T細胞）、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）の投与量は、約1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、または5×109細胞等である。一部の実施形態において、遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞（例えば、皮膚由来γδ T細胞、血液由来γδ T細胞、例えば、Vδ1 T細胞、および／またはDN T細胞）、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）の投与量は、少なくとも約1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、または5×109細胞等である。一部の実施形態において、遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞（例えば、皮膚由来γδ T細胞、血液由来γδ T細胞、例えば、Vδ1 T細胞、および／またはDN T細胞）、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）の投与量は、最大約1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、または5×109細胞等である。
【０１３７】
ある実施形態において、対象は、対象の体重kgあたり104 〜106個の遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞（例えば、皮膚由来γδ T細胞、血液由来γδ T細胞、例えば、Vδ1 T細胞、および／またはDN T細胞）、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）の投与を受ける。ある実施形態において、対象は、遺伝子改変リンパ球の集団の初回投与（例えば、γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞（例えば、対象の体重kgあたり104 〜106 γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞、例えば対象の体重kgあたり104 〜105 γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞の初回投与））、ならびに遺伝子改変リンパ球の1回以上（例えば、1、2、3、4、もしくは5回）のそれに続く投与（例えば、γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞（例えば、対象の体重kgあたり104 〜106 遺伝子改変γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞、例えば対象の体重kgあたり104 〜105 遺伝子改変γδ T細胞の1回もしくは複数回のその後の投与））を受ける。ある実施形態において、1回以上のその後の投与は、前回投与後15日未満で、例えば、前回投与後14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、または2日後に、例えば、前回投与後4、3または2日未満で、投与される。ある実施形態において、対象は、γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞の集団の少なくとも3回の投与期間にわたって、対象の体重kgあたり総計約106 γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞を受けるが、例えば、対象は、1×105 γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞の初回投与量、3×105 γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞の第2回投与量、および6×105 γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞の第3回投与量を受け、例えば各回の投与は前回の投与後4、3または2日未満で投与される。
【０１３８】
一部の実施形態において、1以上の追加の治療剤を対象に投与することができる。追加の治療剤は、免疫療法剤、細胞傷害剤、成長阻害剤、放射線治療剤、血管新生阻害剤またはこれらの2以上の組み合わせからなる群から選択できる。追加の治療剤は、遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）の投与と同時に、前に、または後に投与され得る。追加の治療剤は、対象の体内（例えば、対象自身の免疫系）の標的、および/または、移植されたγδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞に作用する、免疫療法剤であってもよい。
【０１３９】
組成物の投与は、任意の便利な方法で実行され得る。本明細書に記載の組成物は、経動脈的、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内注射、または腹腔内、例えば皮内もしくは皮下注射により患者に投与することができる。遺伝子改変リンパ球（例えば、γδ T細胞、NK細胞、NK様T細胞、自然リンパ球系細胞、またはMAIT細胞）の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染箇所に直接注射されてもよい。
【実施例】
【０１４０】
以下の実施例は、異種ターゲティング構築物を発現するようにγδ T細胞を遺伝子改変するための非限定的方法、遺伝子改変γδ T細胞の機能的スクリーニング、および遺伝子改変γδ T細胞を用いた治療法を提供する。
【０１４１】
実施例１：異種ターゲティング構築物を発現する遺伝子改変γδ T細胞の機能的特性評価
異種ターゲティング受容体を有する遺伝子改変Vδ1T細胞は、標的細胞（例えば、癌細胞、例えば、腫瘍細胞株の細胞）とともに共培養することにより、in vitroで機能的に特徴付けられる。遺伝子改変Vδ1T細胞は、3つの対照細胞型：(1)形質導入されていないVδ1T細胞；(2)異種GFPを発現するmock形質導入Vδ1T細胞；および(3)機能的な細胞内シグナル伝達ドメインを有する従来のキメラ抗原受容体(CAR)形質導入Vδ1T細胞、と比較される。各群は、少なくとも2群の標的腫瘍細胞：（A）規定レベルの腫瘍関連抗原（TAA）を発現する健康な細胞群、および（B）高レベルのTAAを発現する腫瘍細胞群、とともに共培養される。さまざまなエフェクター対標的比（γδ T細胞対標的細胞比）を検討する。異種ターゲティング受容体によってもたらされる効果を確認するために、対照として、未形質導入またはmock形質導入Vδ1細胞を使用し、シグナル1および／またはシグナル2刺激を伝達するように構成された機能的な細胞内ドメインの欠如の効果を確認するために、対照としてCAR T細胞を使用する。以下のアッセイを実施する：
【０１４２】
1. 標準的なCFSE希釈プロトコルに従って増幅アッセイを実施し、遺伝子改変γδ T細胞と標的細胞との間の相互作用が遺伝子改変γδ T細胞の増幅に及ぼす影響を定量する。これは標的細胞に対する活性化を示すものである。異種ターゲティング構築物を発現するγδ T細胞は、健康な細胞と比較して、癌細胞に反応してより高度に増幅する。
【０１４３】
2. CD107脱顆粒アッセイは、リソソーム膜タンパク質1（LAMP-1；すなわち、CD107）の発現を定量することによって行われるが、それは、脱顆粒時にγδ T細胞の表面上に一過性に発現する。脱顆粒の動態をモニターするために、さまざまな時点で細胞を染色する。異種ターゲティング構築物を発現するγδ T細胞は、健康な細胞と比較して、癌細胞に反応して優先的に脱顆粒を示す。
【０１４４】
3. パーフォリン/グランザイムアッセイは、FACSを用いてパーフォリンおよびグランザイムを染色することにより行われる。異種ターゲティング構築物を発現するγδ T細胞は、健康な細胞と比較して、癌細胞に反応してパーフォリンおよび／またはグランザイムを優先的に発現する。
【０１４５】
4. 細胞溶解アッセイは、標的細胞溶解（すなわち、細胞溶解）の程度を定量するために実施される。細胞溶解の速度は、Incucyteアッセイまたはルシフェラーゼアッセイを用いて、経時的死滅のパーセントとして測定され、エンドポイント細胞溶解は、ルシフェラーゼアッセイを用いて、所定の時点での死滅パーセントとして測定される。異種ターゲティング構築物を発現するγδ T細胞は、健康な細胞と比較して優先的に癌細胞を溶解する。
【０１４６】
5. 免疫シナプス形成をライブセルイメージングでモニターする。γδ T細胞と標的細胞との間の免疫シナプスの観察から、結合動態をモニターする。さらに、γδ T細胞のカルシウム流（認識を示す）および標的細胞のPI染色（赤色）（致死ヒットを識別する）が観察される。標的細胞の円形化も観察される。癌細胞とともに共培養された場合、健康な細胞と比較して、異種ターゲティング構築物を発現するγδ T細胞では、結合速度とカルシウム流が優先的に増強される。
【０１４７】
実施例２：異種ターゲティング構築物を発現する末梢血由来の遺伝子改変γδ T細胞
従来のαβ T細胞と比較したVδ1 γδ T細胞のユニークな特性の一つは、健康な組織を温存しながら悪性化した細胞を選択的に死滅させることであり、このプロセスは天然の細胞傷害性受容体の作用を介して媒介され得る。本研究の結果は、細胞内シグナル伝達ドメインを欠いた異種ターゲティング構築物を用いて、Vδ1細胞の腫瘍細胞根絶能力をさらに高めることができることを示している。このような構築物を有する遺伝子改変Vδ1細胞は、健康な細胞を温存しながら、悪性化した細胞に対する細胞傷害性を維持し、増加させることすらあった。このアプローチは、CD19を標的とするキメラ抗原受容体（CAR）治療後のB細胞枯渇といった、従来のCAR免疫療法アプローチで観察されたon-target off-tumour効果を克服する。
【０１４８】
材料および方法
末梢血γδ T細胞の単離および増幅
血液由来Vδ1細胞は、特に血液からVδ1細胞を単離する方法について、米国第2018/0169147号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に既述のように、健康なドナーの末梢血からもたらされた。簡潔に言えば、MACS枯渇αβ T細胞を、自己血漿を添加した無血清培地（CTS OpTmizer）中に再懸濁し、IL-4、IFN-γ、IL-21、IL-1β、IL-15、および可溶性OKT3の存在下で増幅させた。細胞は、下記の構築物をコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。基本的に、完全長CAR構築物は、腫瘍抗原CD19またはGD2を標的とするscFvバインダー領域、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメイン（従来のCAR構築物デザインによる）を含んでいた。非シグナル伝達または "nsCAR"構築物は、細胞内ドメインを欠いていた。
【０１４９】
血液からVδ1細胞を得るための他の手段は、例えば、US 9499788、WO2017197347、WO2016081518等のように、当技術分野でよく知られている。あるいはまた、Vδ1細胞は、U.S.2018/0312808（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）において、特に組織からVδ1細胞を単離する方法について記載されているように、ヒト皮膚生検材料から単離される。皮膚由来Vδ1細胞は、上記のように形質導入される。
【０１５０】
フローサイトメトリー分析
イムノフェノタイピングは、BD FACS Lyricフローサイトメーターを用いて実施した。細胞は、PerCP-Vio700抗TCR a/b（Miltenyi）、APC抗TCR g/d（Miltenyi）、VioBlue抗TCR Vδ1（Miltenyi）、PE抗NKp30（BioLegend）、APC抗NKp44（BioLegend）、PerCP.Cy5.5抗NKG2D（BioLegend）を用いて、表面マーカーの発現について分析した。従来のCD19 CARおよび非シグナル伝達CD19 CAR構築物の発現は、FITC抗STREPタグ抗体(LSBio)を用いて検出した。非シグナル伝達GD2 CAR発現は、PE抗FC抗体（BioLegend）を用いてモニターした。
【０１５１】
細胞毒性試験
Nalm-6（ATCC、CRL-1567）および初代B細胞をCTVまたはCFSEで標識し、エフェクターと標的の比を1:1としてT細胞と組み合わせた。培養物は、37℃で16時間インキュベートした。インキュベーション後、SytoxAADvanced（Invitrogen）および絶対計数ビーズをウェルに添加し、フローサイトメトリーのデータ取得を行った。細胞傷害性は以下のように計算した：
100−（サンプルカウント数/最大カウント数）×100
ここで、最大カウントは、エフェクター細胞が存在しない場合の標的細胞の数である。
【０１５２】
ライブセルイメージング
ヒトGD2発現神経芽細胞腫細胞株Kelly（DSMZ ACC-355）を、自動細胞計数を可能にするために、レンチウイルスベクターをコードするNucLight Green（Essen BioScience）によって安定的に形質導入した。細胞増殖を、1時間間隔で60時間、Incucyte Zoom Live-Cell Imaging System（Essen Bioscience）を用いてモニターした。データは、時間ゼロの時点での画像あたりの緑色のオブジェクトカウントの数を基準として、所定の時点での画像あたりの緑色のオブジェクトカウント数の比率の変化として表された。各データポイントは、3連のウェルを表す。
【０１５３】
αβ T細胞CARとの比較
γδ細胞は、上記のように全長または非シグナル伝達CAR構築物により遺伝子改変された。同様に、血液または組織からのαβ由来T細胞もまた、全長または非シグナル伝達CAR構築物により遺伝子改変する。遺伝子改変された細胞は、標的抗原を発現する健康な細胞および悪性細胞に対する細胞溶解活性を測定し、各集団のon-target off-tumour細胞傷害性を実証する。
【０１５４】
結果
全長（CAR19）または非シグナル伝達抗CD19ターゲティング構築物をコードするレンチウイルスベクター用いた血液由来Vδ1細胞の形質導入は、90％を上回る導入効率をもたらした（図3A）。CAR分子の表面発現には有意差はなかった。免疫表現型も、形質導入細胞の増幅能力も、レンチウイルスによる形質導入によって変化しなかった。未形質導入（UTD）および形質導入Vδ1細胞のFACS分析では、主要な天然細胞傷害性受容体（natural cytotoxicity receptor（NCR））分子の表面発現に有意な差は認められなかった（NKp30、NKp44、およびNKG2D；図3B）。
【０１５５】
Vδ1細胞は、CD19を発現する急性リンパ性白血病細胞株NALM-6の細胞を認識し、死滅させた。Vδ1細胞上での全長または非シグナル伝達CD19 CARの発現は、標的細胞の死滅に2倍の増加をもたらした（図4Aおよび4B；エフェクターと標的の比が1:1の場合、ドナー1およびドナー2について、それぞれ、死滅率21.4％（UTD）対46％（nsCAR19）対58％（CAR19）および42.8％（UTD）対83％（nsCAR19）対88％（CAR19））。重要なことに、非シグナル伝達抗CD19 CARを発現するVδ1細胞は、健康なヒトB細胞を死滅させなかった（図4C）。
【０１５６】
非シグナル伝達CARアプローチの一般的な適用可能性をさらに証明するために、Vδ1細胞を、GD2抗原を発現する腫瘍細胞に再度向かわせた。GD2特異的nsCAR分子を用いた血液由来Vδ1細胞の形質導入は、FACSによる測定で54％の形質導入効率をもたらした（図5A）。未形質導入およびnsCAR導入Vδ1細胞を、GD2発現神経芽細胞腫細胞株（Kelly）と1:1のエフェクター対標的比で共培養した。標的細胞の死滅は、ライブセルイメージング（Incucyte、Essen Bioscience）を用いて測定した。nsCAR発現Vδ1細胞とKelly細胞の共培養は、未形質導入Vδ1細胞の存在下で培養された標的細胞と比較して、標的細胞の総数を40％減少させる結果となった（図5B）。
【０１５７】
実施例３：異種ターゲティング構築物により遺伝子改変されたγδ T細胞による癌治療
異種ターゲティング構築物は、当技術分野で知られているクローニングおよびPCR法を用いて合成される。腫瘍関連抗原（TAA）を標的とするscFvをコードするタンパク質断片を、CD8膜貫通ドメインのN末端に融合されたストークドメインのN末端に融合させる。異種ターゲティング構築物は、次にレンチウイルスベクターにクローニングされる。
【０１５８】
血液サンプルを採取して、赤血球が枯渇している状態で、患者は白血球除去輸血を受ける。αβ T細胞は、標準的な磁気分離プロトコルを用いて枯渇させる。γδ T細胞を含む残りの集団は、当技術分野で知られているか、または本明細書に記載されている、γδ T細胞増幅の任意の適切な方法を用いて、増幅させる。増幅中、細胞は、異種ターゲティング構築物をコードするポリヌクレオチドを含有するレンチウイルスベクターとともにインキュベートされ、そのポリヌクレオチドは、逆転写によってγδ T細胞のゲノムに組み込まれる。レンチウイルスベクターによって形質導入された細胞は、異種ターゲティング構築物を表面に発現することになる。異種ターゲティング構築物を発現する形質導入細胞は、その後、非形質導入細胞から分離され、自己または同種療法として注入するために収集される。
【０１５９】
細胞を2時間かけて患者に静脈内投与する。静脈内投与は1週間に1回を12週間繰り返し、癌の症状をモニターする。
【０１６０】
他の実施形態
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの独立した刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、参照により組み込まれる。
【０１６１】
本発明は、その特定の実施形態に関連して説明したが、さらなる修正が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、本発明のあらゆる変形、使用、または適応を網羅し、本発明が関連し、特許請求の範囲に記載された本質的な特徴に適用され得る、当該技術分野内の公知または慣例の範囲内にある本開示からの逸脱を含むことは、理解されるであろう。
【０１６２】
他の実施形態は特許請求の範囲内にある。
【図１】
2021519063.tif 000003
【図２】
2021519063.tif 000004
【図３】
2021519063.tif 000005
【図４】
2021519063.tif 000006
【図５】
2021519063.tif 000007
【国際調査報告】
2021519063.tif 000008
2021519063.tif 000009
2021519063.tif 000010
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