(57)【要約】  マルチモード撮像システム２は、高精細画像を撮像する多光子撮像システムと少なくとも一つの共焦点検知デバイスとを有し、前記多光子撮像システムは、被験体１０からの二次放射光の出射をさせる赤外フェムト秒レーザー放射光からなる励起ビーム２１を発生させる放射光源１２と、光合焦ユニット３０によって放射光源１２からの励起ビーム２１を被験体１０の測定位置に当てることができる光合焦ユニット３０と、を有し、光合焦ユニット３０と放射光源１２のレーザーヘッド１４とは測定ヘッド４の中に配置され、測定ヘッド４は空間中で自在に旋回可能、回転可能かつ柔軟に配置可能であり、前記少なくとも一つの共焦点検知デバイスは、その少なくとも一部が前記測定ヘッド４の中に設けられて測定ヘッド４と一体になり、励起ビーム２１が被験体１０によって反射した信号光を受光する。
2021519438.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体（１０）を非侵襲的に検査するマルチモード撮像システム（２）であって、
前記マルチモード撮像システム（２）は、被験体（１０）の高精細画像を撮像する多光子撮像システムを有し、前記多光子撮像システムは、被験体（１０）からの二次放射光の出射を引き起こさせる赤外フェムト秒レーザー放射光からなる励起ビーム（２１）を発生させる放射光源（１２）と、光合焦ユニット（３０）とを有し、前記光合焦ユニット（３０）によって前記放射光源（１２）からの前記励起ビーム（２１）を被験体（１０）の測定位置に当てることができ、
前記光合焦ユニット（３０）と前記放射光源（１２）のレーザーヘッド（１４）とは測定ヘッド（４）の中に配置され、被験体（１０）の検査を任意の望ましい立体的な角度でおこなうことができるように、前記測定ヘッド（４）は空間中で自在に旋回可能、回転可能かつ柔軟に配置可能であり、、
前記マルチモード撮像システム（２）は、さらに少なくとも一つの共焦点検知デバイスを有し、前記少なくとも一つの共焦点検知デバイスは、その少なくとも一部が前記測定ヘッド（４）の中に設けられて前記測定ヘッド（４）と一体になり、近赤外フェムト秒レーザー放射光からなる励起ビーム（２１）が被験体（１０）によって反射した信号光を受光するマルチモード撮像システム（２）。
【請求項２】
請求項１に記載するマルチモード撮像システム（２）であって、前記撮像システムの検知システムの少なくとも複数の部分は前記測定ヘッドの中に設けられて、前記測定ヘッドと一体になり、特に電池で駆動されるマルチモード撮像システム（２）。
【請求項３】
請求項１または２に記載するマルチモード撮像システム（２）であって、被験体（１０）の全体画像を撮像する少なくとも一つの別システムを有し、前記別システムは少なくともその一部が前記測定ヘッド（４）の中に設けられて前記測定ヘッド（４）と一体になっており、前記別システムはＣＣＤカメラあるいはＣＭＯＳカメラおよび／または光コヒーレンス・トモグラフィ・デバイスを有し、特に前記別システムは照明放射光として近赤外フェムト秒レーザー放射光を用いるマルチモード撮像システム（２）。
【請求項４】
請求項３に記載するマルチモード撮像システム（２）であって、前記ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラが前記測定ヘッド（４）の前部でその側方に、シャインプルーフの原理にしたがって配置され、または前記ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラは撮像素子として前記光合焦ユニット（３０）を用いるマルチモード撮像システム（２）。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載するマルチモード撮像システム（２）であって、中心部の反射光のピークを下げるため、前記共焦点検知デバイスは前記放射光源（１２）の前方にある偏向ミラー（６０）を部分的に透過する信号光を受光するように配置され、
中心部の反射光のピークを下げるため、直線偏光された励起放射光と被験体（１０）から散乱反射して偏光されていない二次信号光とを分離する偏光ビームスプリッタ（２２）を備え、前記共焦点検知デバイスが被験体（１０）から反射して偏光されていない二次放射光を受光するように配置されるマルチモード撮像システム（２）。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載するマルチモード撮像システム（２）であって、前記共焦点検知デバイスは近赤外フェムト秒レーザー放射光からなる前記励起ビーム（２１）の反射信号光を時間分解信号処理する装置を有するマルチモード撮像システム（２）。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載するマルチモード撮像システム（２）であって、自動合焦機能を与える目的で、カバースリップ（１０６）の位置および／または被験体（１０）の位置を測定する装置を有する前記マルチモード撮像システム（２）。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載するマルチモード撮像システム（２）であって、自動合焦機能を与える目的で前記光合焦ユニット（３０）の光軸と同一直線状に合わされたＯＣ測定ビーム光を有し、前記カバースリップ（１０６）の位置および／または前記被験体（１０）の位置を、前記ＯＣ測定ビームを用いて測定可能であるマルチモード撮像システム（２）。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載するマルチモード撮像システム（２）であって、前記被験体（１０）の表面を見つけるため、および／または接触圧力を測定するための圧力センサーを有するマルチモード撮像システム（２）。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれかに記載するマルチモード撮像システム（２）であって、励起ビーム（２１）の照射制御器が測定領域内に被験体（１０）があることを判定するための装置と結合しているマルチモード撮像システム（２）。
【請求項１１】
請求項１乃至９のいずれかに記載するマルチモード撮像システム（２）を用いて被験体（１０）を非侵襲的に検査する方法であって、
前記光合焦ユニット（３０）を測定位置に合わせるステップと、
前記放射光源（１２）からの近赤外フェムト秒レーザー放射光を前記測定位置に当てるステップと、
前記測定位置にある前記被験体（１０）の高精細画像を撮像するために、前記多光子撮像システムおよび前記共焦点検知システムを順に、または同時に用いることにより、前記被験体（１０）から出射される二次放射光を測定するステップと、を有する方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載する方法であって、さらに
前記測定ヘッド（４）を前記被験体（１０）の全体画像領域に合わせるステップと、
前記共焦点検知システム並びに／またはＣＣＤカメラもしくはＣＭＯＳカメラ（６４）および／あるいは光コヒーレンス・トモグラフィ・デバイス（７４）を用いて前記被験体（１０）の全体画像を撮像するステップと、
前記高精細画像を撮像する目的で、前記全体画像中の測定位置を選択するステップと、有する方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載する方法であって、
前記被験体（１０）の軸方向の動きによるアーチファクトは前記光合焦ユニット（３０）と前記被験体（１０）の距離が連続的に機械的に調節されることによる自動合焦機能によって修正される方法。
【請求項１４】
請求項１１乃至１３のいずれかに記載する方法であって、前記被験体（１０）の表面を見つける目的で、特に自動合焦機能を与えるために測定信号光を評価する方法。
【請求項１５】
請求項１１乃至１４のいずれかに記載する方法であって、
ＣＣＤカメラあるいはＣＭＯＳカメラ（６４）および／または光コヒーレンス・トモグラフィ・デバイス（７４）を用いて全体画像を撮像し、並びに、
前記光合焦ユニット（３０）と前記被験体（１０）の距離が、前記被験体（１０）の前記高精細画像を撮像するときよりも、前記被験体（１０）の前記全体画像を撮像するときの方が大きい、および／または、
前記ＣＣＤカメラあるいは前記ＣＭＯＳカメラ（６４）および／または前記光コヒーレンス・トモグラフィ・デバイス（７４）を用いて、前記全体画像は前記光合焦ユニット（３０）の光軸と同一直線方向から見た画像ではなく斜視画像として撮像される方法。
【請求項１６】
被験体（１０）からなる生体を検査するための請求項１乃至１０のいずれかに記載するマルチモード撮像システム（２）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は被験体を非侵襲的に検査するためのマルチモード撮像システムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国特許第５，０３４，６１３号公報、ドイツ実用新案第２０１１７２９４号公報およびドイツ特許出願公開第１０２０１００４７５７８号公報は近赤外領域のパルスレーザー放射光を用いる多光子撮像用の頑丈でしかも柔軟でもあるシステムを開示している。例として述べるが、多光子撮像を用いて一辺の長さが１ｍｍよりはるかに短い高解像度顕微鏡画像野が実現されている。
【０００３】
ドイツ特許出願公開第１０２００９０２９８３１号公報はいわゆるフライング光学系を用いることを提案する。フライング光学系では、励起放射光を合焦させ二次放射光を励起させる光ユニットが静止したままではなく、被験体の複数の異なる部位を励起するために光ユニットを広範囲に続けて素早く動かす。ここで、被験体の局所部位を励起させることは、ミラーを回転させたり、傾けることにより放射光を偏向させることではなく、光ユニット全体を一次元または多次元で動かすことによってなされる。この手法の不利な点は、モーター駆動される光ユニットの応答が遅いことで、その結果、画像撮像速度が低速度であることである。
【０００４】
ドイツ特許出願公開第１０２０１１１１５９４４号公報は被験体を非侵襲的に三次元的に検査するために用いる曲げることができる非直線レーザー走査マイクロスコープを開示している。このレーザー走査マイクロスコープは原子および分子からの二次放射光の出光をもたらす励起ビームを発生させる放射光源を有し、さらに放射光を光合焦ユニットを備える測定ヘッドまで放射光を透過させる曲げることができる光透過ユニットを有し、この光合焦ユニットによって放射光が検査対象の中に入って合焦する。ここで、測定ヘッドを空間中で自在に、旋回可能、回転可能かつ柔軟に配置可能になるように、測定ヘッドは放射光源と接続されている。その結果、検査対象の検査を任意の望ましい立体的な角度で顕微鏡検査ができる。
【０００５】
柔軟に位置を変えることができる測定ヘッドによる人体についての多様な検査を容易にするため、ドイツ特許出願公開第１０２０１１１１５９４４号公報は曲げることができ任意の位置で固定できる支持アームにより機械的に支持された測定ヘッドを提供し、この支持アームは光透過ユニットを携行する可動ベース装置に取り付けられている。パルス励起放射光を発生する放射光源と励起放射光を少なくとも一つの光透過ユニットに位置合わせして測定ヘッドまで伝播させる複数の光ユニットとは、可動ベース装置の中に備えられている。ミラー付きの関節結合されたアームにより、望ましい精度で柔軟にビーム光伝播を行うため、検知器、コントロールユニットおよびモーター駆動鏡によってレーザー放射光の方向が安定化されている。ここで、レーザービームのビーム方向の修正は、測定ヘッド中の対応する目標面内の検知されたずれに基づいてコントロールユニットによって行われる。ドイツ特許出願公開第１０２０１１１１５９４４号公報では、光合焦ユニットの顕微鏡画像野と測定位置とを重ね合わせることには不確実さの問題がある。光合焦ユニットの直径は約３０ｍｍで、光合焦ユニットの被験体からの動作距離は約０．２ｍｍなので、光合焦ユニットによって顕微鏡画像野は完全にカバーされる。。
【０００６】
さらに、光合焦ユニットと被験体の相対的な位置は読亭ヘッドと被験体または被験体と接するアダプタ板との間の機械的な結合の再現性に依存する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一方、本願発明の目的は被験体に対して測定ヘッドを位置合わせすることによりユーザーを支援することであるこの位置合わせの精度は、被験体の望ましい目標位置（ＲＯＩ、対象領域）を高精細画像で表すときの精度であり、特にマルチモード撮像システムの光合焦ユニットの機械的位置合わせ能力の精度に依存する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
被験体を非侵襲的に検査する本願発明にかかるマルチモード撮像システムでは、前記マルチモード撮像システムが、被験体の高精細画像を撮像する撮像システム、具体的には多光子撮像システムを有し、前記多光子撮像システムは、被験体からの二次放射光の出射を引き起こさせる赤外フェムト秒レーザー放射光からなる励起ビームを発生させる放射光源と、光合焦ユニットとを有し、前記光合焦ユニットによって前記放射光源からの前記励起ビームを被験体の測定位置に当てることができ、前記光合焦ユニットと前記放射光源のレーザーヘッドとは測定ヘッドの中に配置され、被験体の検査を任意の望ましい立体的な角度でおこなうことができるように、前記測定ヘッドは空間中で自在に旋回可能、回転可能かつ柔軟に配置可能であり、前記マルチモード撮像システムは、さらに少なくとも一つの共焦点検知デバイスを有し、前記少なくとも一つの共焦点検知デバイスは、その少なくとも一部が前記測定ヘッドの中に設けられて前記測定ヘッドと一体になり、近赤外フェムト秒レーザー放射光からなる励起ビームが被験体によって反射した信号光の一部を受光する。
【０００９】
以下で「マルチモード」とは、少なくとも部分的に互いに統合されて一体となっている２個、３個または４個のシステムをそなえていることを意味すると解される。例えば一つ以上の測定システムまたは撮像システムが同じ放射光源、同じ光透過ユニット、同じ光合焦ユニットまたは同じ検知器システムを用いる場合、これらのシステムは個別の部品を互いに共有することができる。複数のシステムが個別の複数の部品を同時に使用することができる、または続けて使用することができるコンパクトな構成は好都合である。例として述べれば、これらの複数のシステムは複数の異なる撮像モードを続けて、または同時に用いることを容易にすることができる。
【００１０】
特に、光合焦ユニットはそれによって近赤外フェムト秒レーザー放射光を被験体に当てるものであるが、少なくともこの光合焦ユニットと前記共焦点検知デバイスは、前記測定ヘッド中に設けられて、前記測定ヘッドと一体になり、その結果空間中で自在に、旋回可能、回転可能かつ柔軟に配置可能である。さらに、前記放射光源のレーザーヘッドも備えられており、同レーザーヘッドも前記測定ヘッド中に設けられて、前記測定ヘッドと一体になっている。例として述べると、電源およびドライバーは別として、同じ目的で励起ビーム源も前記測定ヘッド中に設けて、前記測定ヘッドと完全に一体にすることができる。好都合なことに、結果としてレーザービームの入力または出力を前記マルチモード撮像システムの関節結合されたアームの中に入射させて同アームと結合させる必要がない。したがって、前記測定ヘッドの位置はレーザービームの透過品質に対する影響がなく、例えばその結果として、システムに誤りが生じる可能性が低減する。
【００１１】
さらに、前記測定ヘッドも最低限の光透過ユニットを有しており、この光透過ユニットは最も簡単な場合には、例えば走査ユニット、走査レンズ、管レンズ、ダイクロイックビームスプリッタおよび光合焦ユニットを有するものでよい。例として述べると、このようなレーザー走査システムにできる画像野は３５０μｍ×３５０μｍとすることができる。また、前記測定ヘッドはさらに位置決め範囲が例えば５ｍｍ×５ｍｍのｘ−ｙ方向移動ステージを有するものでよい。好都合なことに、本願発明は様々な部品が前記測定ヘッドの中に組み入れられて一体となった極めてコンパクトなシステムを提案するものであり、同システムは生物の組織および非生物の組織の高精細撮像を可能にする。このシステムは全体として、従来のシステムよりも小型で人間工学的に優れている。
【００１２】
以下では、「非侵襲的」とは撮像システムが被験体の中に機械的に侵入することがないことを意味すると解される。撮像する目的では、被験体を汚染したり、破壊したりする可能性のリスクを避けるため、侵襲的な方法よりも非侵襲的な方法が通常好まれる。非侵襲的に検査するための本願発明が提案するマルチモード撮像システムによれば、例えば生きている被験体、例えば植物、動物および人間について検査を行うことができ、特に、例えば人間の皮膚または眼の検査を行うことができる。具体的に、表皮および／または真皮の皮膚層からの顕微鏡の解像度の深さ情報が非侵襲的に得ることができ、例えば皮膚がんを検知できる。
【００１３】
ここで、「空間中で自在に、旋回可能、回転可能かつ柔軟に配置可能である」とは、測定ヘッドが、任意の望ましい位置に固定可能な曲げることができる支持アームによって、機械的に支持される形でベース装置に取り付けられることを意味すると解される。ここで、測定ヘッドとベース装置はそれぞれマルチモード撮像システムの部品を支持して移動させる。ベース装置自身は動かすことができる。例として述べるが、放射光源の一部、例えば放射光源の電源は、コンピュータシステム、ユーザーインタフェース、および出光した二次放射光を検知する検知器システムまたは被験体の全体画像を撮像する別のシステムの部品と一緒にこのベース装置の中に備えることができる。
【００１４】
ここで、「高精細画像」とは、本願発明がサブミクロン範囲の水平解像度および数百ミクロンの大きさの３次元の走査領域を有する光学顕微鏡検査および光トモグラフィを容易にすることを意味すると解される。例として述べるが、この高精細画像野の大きさは水平方向が３５０μｍ×３５０μｍで垂直方向が２００μｍである。
【００１５】
以下、被験体の「測定位置」はＲＯＩとも呼ぶ。
【００１６】
具体的に、多光子撮像システムは多光子蛍光顕微鏡としてもよいし、多々光子蛍光顕微鏡としてもよい。多光子撮像システムはレーザー走査顕微鏡のグループの特定の一つの光顕微鏡である。具体的には、出射される二次放射光は、被験体が光子を吸収し、その後別の光子を出射する時に生じる蛍光放射光でよい。吸収された光子は被験体の原子または分子の電子を所定の高いエネルギー準位に引き上げて、一時的に励起光子のエネルギーを保存する。対応する原子または分子に特有の時間の後、この励起電子は低いエネルギー準位に低下して戻り、その時に新しい光子を出射する。従来の単一光子蛍光顕微鏡では電子を励起して所定の高いエネルギー準位に上げる目的で単一の光子が必要であるが、多光子蛍光顕微鏡では複数の光子が必要である。ここで、最も一般的な方法は二光子蛍光顕微鏡（ＴＰＦＭ）であり、この顕微鏡では正確に２つの光子によって電子の励起が行われる。これらの２つの光子のエンルギーを合わせたエネルギーは電子を所定の高いエネルギー準位に上げるのに必要なエネルギーに一致する。通常、電子が励起される中間の安定したエネルギー準位はないので、これらの２つの光子が同時に電子に当たることが励起するための必須条件である。より詳細な情報を得るには、デンク（Denk）らによる記事、「二光子レーザー走査蛍光顕微鏡検査」サイエンス、２４８巻、７３−７６頁．（“Two-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy”, Science, vol. 248, pp. 73-76）を参照する。
【００１７】
ＴＰＦ（二光子蛍光）は別として、多光子撮像システムは励起放射光の二次高調波発生（ＳＨＧ）信号および三次高調波発生（ＴＨＧ）信号も測定できる。そのため、多光子撮像システムはＴＰＦ、ＳＨＧおよびＴＨＧ撮像用の一つ以上の検知器を有するのが好都合であり、そのようにすれば特に生命体中の蛍光物質および非蛍光物質を調べるための柔軟な診断システムが得られる。具体的には、同一の位置からのＴＲＦ、ＳＨＧおよびＴＨＧ信号により同時撮像することも可能になる。
【００１８】
この撮像方法の代わりに、またはこの撮像方法に加えて、多光子撮像システムの検知システムは時間相関単一光子計数（ＴＣＳＰＣ）を行うため、特にこの装置は複数の異なる内因性の蛍光発生化合物及び外因性の蛍光発生化合物の二光子蛍光の固有の寿命を測定するための装置を含むものにできる。
【００１９】
本明細書中で、「フェムト秒レーザー放射光」は、具体的にパルスレーザー放射光であって、ピコ秒パルスおよびアト秒パルスと区別され、そのパルス継続時間が、例えば２〜３百フェムト秒のもの、または、そのパルス持続時間が１００ｆｓより短いものをいう。フェムト秒レーザー放射光という語は、またＣＷ（連続波）レーザー光とも区別される。被験体の測定位置で高光子密度を発生させるため、励起ビームはパルス継続時間がフェムト秒の範囲の超短波パルスレーザー放射光を含む。
【００２０】
例として述べるが、モード結合したレーザー光も一つのレーザー光と考えることができる。特に、このようなレーザー光はポンプ源としてレーザーダイオードを用いることができる。例として述べるが、例えば１５６０ｎｍの波長をもつ励起ビームを発生させ、この励起放射光を周波数逓倍器で波長を半分にして７８０ｎｍにするエルビウムファイバレーザーはレーザー光ユニットと考えられる。この周波数が２倍になった放射光を用いて被験体の原子および分子を励起する。
【００２１】
代わりに、半導体レーザーを備えるものでもよい。モード結合したレーザー光の繰り返し速度は時間分解される蛍光レーザー顕微鏡検査には少し高すぎるが、しかしそのようなレーザー光を用いて単純な光強度測定することが既に考えられている。
【００２２】
適したフェムト秒レーザー放射光を出射するレーザーの別の例は、チタンサファイアレーザーであり、チタンサファイアレーザーはそのレーザーパルス幅が２００ｆｓより短い、または１００ｆｓより短く、その繰り返し周波数が８０ＭＨｚまたは９０ＭＨｚであり、パワーが０〜１．５Ｗであり、さらにその波長範囲は７１０〜９２０ｎｍである。
【００２３】
例として述べるが、多光子撮像システムの光合焦ユニットはレンズシステムを有し、このレンズシステムによって励起ビームを被験体上に合焦させたり、非合焦にしたりすることができる。
【００２４】
例として述べるが、光合焦ユニットの開口数は０．８〜１．４であり、好ましくは１〜１．４であり、特に、例えば１．３の開口数が多光子撮像、特に二光子撮像には好都合である。
【００２５】
前記した共焦点検知デバイスは、少なくともその一部を測定ヘッドの中に入れて一体とすることが好都合であり、そのすべてを完全に測定ヘッドの中に入れて一体とすることが好ましい。さらに前記した共焦点検知デバイスは、近赤外フェムト秒レーザー放射光からなる励起ビームが、例えば被験体内部の焦点部位で反射してくる信号光を受信する。特に、反射した信号を用いて撮像することができる。
【００２６】
強い瞬間的な反射信号光のため、被験体の形態を十分に画像化するのを容易にするために必要な各画素での滞留時間は、自動蛍光に基づく多光子撮像に比べて、顕著に短くなる。共焦点検知デバイスのこの特性は。被験体の「高速」な全体像の撮像に用いるのに好都合である。ここで、全体画像は複数の隣り合う顕微鏡画像野、例えば３５０×３５０μｍ２の複数の隣り合う画像野をチェッカーボード状に継ぎ合わせることによってできる。このような複数の画像は連続して撮像され、継ぎ合わされてチェッカーボード状に一体となって全体画像になる。この目的のため、共焦点検知デバイスの開口数が大きいことが望ましく、例えば開口数が０．８〜１．４、好ましくは１〜１．３であることが望ましい。多光子撮像の画像野の大きさと共焦点検知デバイスの画像野の大きさは実質的に同一である。
【００２７】
したがって、三次元的な方向合わせのため、すなわち、測定ヘッドを被験体に対して位置決めする時にユーザーを支援するためには、複数の比較的小さい画像野を継ぎ合わせて一体とした「大きな」全体画像野によって補完する撮像方法およびシステムを使用することが好都合である。このような全体画像野の座標システムによって、例えば被験体の多光子撮像と被験体の望ましい測定位置とを三次元的に相関させることが可能になる。従来の静的な多光子顕微鏡検査はその設計に柔軟性がないため使用できる用途が限定されているが、本願発明のマルチモード撮像システムは人体の様々な部位の検査により適している。
【００２８】
好ましい実施形態によれば、前記撮像システムの検知システムの少なくとも一部は前記測定ヘッドの中に設けられて前記測定ヘッドと一体である。
【００２９】
測定ヘッドと一体となっている形の検知システムの部品は、例えば光増幅管（ＰＭＴ）、ＣＣＤアレー、ＣＭＯＳアレーまたは被験体から出射した二次放射光を受光して、受光した二次放射光を電気データ信号に変換することができる同様な検知器である。検知システムの部品を測定ヘッドの中に入れて一体とすることによって、極めてコンパクトなシステムを提案するのは好都合である。このシステムは生物の組織または非生物の組織の大きい範囲の全体画像野の撮像および高精細画像の撮像ができる。
【００３０】
一つの好都合な実施形態によれば、前記マルチモード撮像システムは、被験体の全体画像を撮像する少なくとも一つの別システムを有し、前記別システムは少なくともその一部が前記測定ヘッドの中に設けられて前記測定ヘッドと一体になっており、前記別システムはＣＣＤカメラあるいはＣＭＯＳカメラおよび／または光コヒーレンス・トモグラフィ・デバイスを有する。したがって前記別システムは前記測定ヘッドと同様に空間中で旋回可能、回転可能かつ柔軟に配置可能であり、好都合である。
【００３１】
ここで、「全体画像」は、例えば、一辺の長さが数ｍｍの画像を意味すると解される。したがって、前記別システムの全体画像を撮像するための検知領域は、例えば、少なくとも１ｍｍ２、２×２ｍｍ２、５×５ｍｍ２または１０×１０ｍｍ２の大きさで実現される。以下、「全体画像」という語は２次元全体画像および３次元全体画像の両方を意味すると解される。例として述べるが、光コヒーレンス・トモグラフィの場合、大きな画像野を有する３次元画像が可能である。
【００３２】
一実施形態によれば、被験体の全体画像を与える前記別システムはカメラに基づき、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラを有する。
【００３３】
これらのカメラの代わりに、またはこれらのカメラに加えて、前記別システムは光コヒーレンス・トモグラフィ・デバイスを有するものでよい。光コヒーレンス・トモグラフィ（ＯＣＴ）により、高い診断可能性を有する被験体のトポグラフィ情報を含む二次元画像または三次元画像が容易に得られ、好都合である。しかし、光コヒーレンス・トモグラフィ（ＯＣＴ）デバイスは一次元での撮像にも作動させることができる。
【００３４】
多光子撮像用の光合焦ユニットは大きい開口数が必要であるが、他方ＯＣＴ用には小さい開口数が好都合であるため、それぞれの光合焦ユニットの必要条件が異なる。そのため、ＯＣＴに基づく全体画像の撮像を高精細多光子撮像と結合させること難しい。このような必要条件の違いに関して、本願発明は２つの異なる光システムで用いることができる解決策を与える。始めに、ＯＣＴに基づく全体画像の撮像した後に、対応する目標位置（ＲＯＩ）に対する高精細多光子撮像を行う。ＯＣＴ撮像用システムと多光子撮像用システムの両方を共通の測定ヘッドの中に入れて一体にし、被験体をこの測定ヘッドと機械的に非結合状態にすることなく、これらのシステムを連続して用いる。直径が例えば３０ｍｍで作動距離を約０．２ｍｍの多光子撮像用光合焦ユニットの場合、目標位置（ＲＯＩ）がこの光合焦ユニットによって完全にカバーされるが、大きい領域のＯＣＴ撮像ではこの目標位置には、この光合焦ユニットでは光学的にアクセスすることはできないことは明らかである。したがって、多光子光合焦ユニットと被験体の間のｚ方向距離は、リニアアクチュエータによって始めは比較的大きい約１０ｍｍに設定される。ＯＣＴ撮像システムを側方に配置して、約４５°に傾けることによって、ＯＣＴに基づく全体画像の撮像に必要な目標位置に対する光学的なアクセスが可能であり、しかもＯＣＴ撮像システムの画像野が多光子撮像用光合焦ユニットの外形サイズによって縮められることがない。これら２つの撮像システムを機械的に結合し、共通の座標システム内の座標を用いることによって、これら２つの撮像システムを三次元的に関連付けることができる。ここで、ＯＣＴ撮像システムは、走査素子、例えばｘ−ｙ方向ガルバノメータ・スキャナー、小さい開口数の別の光合焦ユニットを有する光システム、干渉計測構造、スペクトロメータ、高波長帯域照明および評価ユニットによって実現できる。ここで、走査素子は光コヒーレンス測定に必要な、測定ビームを二次元で偏向させることを可能にする。
【００３５】
一つの有利な実施形態では、前記別システムは近赤外フェムト秒レーザー放射光を照明放射光として用いる。したがって、全体画像を撮像する時に、具体的にフェムト秒レーザー放射光源によって照明を当てることができる。
【００３６】
一実施形態によれば、前記ＣＣＤカメラあるいはＣＭＯＳカメラが前記測定ヘッドの前部でその側方に、シャインプルーフの原理にしたがって配置される。
【００３７】
カメラ、センサー、撮像レンズおよび対象物の配置は、「シャインプルーフの原理」にしたがって行うのが好都合である。「シャインプルーフの原理」では、対物面、画像面およびレンズ面が共通の交軸を有する。これらの面の間の角度は、すべての対象物の点とそれと対応する画像の点で撮像条件が満たされるように設定される。対物面と画像面が平行でない状態での側方からの撮像により画像野内で撮像倍率に相違が生じる。このような画像のゆがみはコンピュータに基づく斜視矯正によって修正される。
【００３８】
この撮像法の代わりとして、カメラに基づく撮像が可能である。この撮像では、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラが光合焦ユニット、具体的には多光子撮像用光合焦ユニットを撮像素子として用いる。
【００３９】
光合焦ユニットをカメラ構造の撮像構成部品として用いることによって、極めてコンパクトな装置サイズのシステムが実現するのは好都合である。カメラは測定ヘッドの内部に配置できるのは好都合である。ここで、撮像条件は対物距離が光合焦ユニットと被験体の間の作動距離よりも大きい、例えば１０倍、２０倍、３０倍または５０倍以上、特に２０倍と７０倍の間で、例えば５０倍大きいことによって満たされる。最適な対物距離は望ましい対象物の大きさ、すなわち全体画像の辺の長さによって定まる。対物距離が大きくし、および光合焦ユニットの開口数を大きくした結果、直線偏光されたフェムト秒レーザー放射光からなる励起ビームによって組織の大きな領域を照明することができる。約４．１ｍｍの焦点距離の光合焦ユニットの場合、２〜１０ｍｍの対物距離が典型的な対物距離になる。この構造における光合焦ユニットは光学的に補正されず、対応する（モノラル）色収差が考慮されることがわかっている。特に、画像のゆがみがおきるが、コンピュータに基づく斜視矯正によって訂正される。
【００４０】
カメラセンサーに向かわせるため、例えば、逆走査する位置に配置された偏光ビームスプリッタによって撮像ビーム光路を照明ビーム光路と結合させている。組織によって反射し、光合焦ユニットによって受光された偏光されていない励起放射光の一部が逆走査する位置に配置された偏光ビームスプリッタによって反射してレンズシステムを通ってガイドされてカメラセンサーまで伝播する。この点で、色収差は狭い帯域の照明光によって低く抑えられている。ここで、狭い帯域は、例えば５０ｎｍより狭い帯域幅、好ましくは２０ｎｍより狭い帯域幅、さらに好ましくは１０ｎｍより小さい帯域幅を表す。代わりに、偏光ビームスプリッタを強度によって分離するビームスプリッタで置き換えることもできる。
【００４１】
全体画像の撮像を手作業行うカメラを備えてもよい。この目的のため、カメラは始めアダプタ板に結合している。全体画像が撮像された後、カメラを取り除かれて高精細顕微鏡撮像用のデバイスを有する測定ヘッドを取り付ける。
【００４２】
例として述べるが、カメラは別システムとして備えられたものでよく、この場合のカメラは、カメラに基づく撮像用の別の放射光源として可視光または近赤外光を発生する照明ユニットを有する。
【００４３】
もしもこのカメラが逆走査をしない構成とすると、撮像ビーム光路と励起ビーム光路が部分的に重なるが、多光子撮像および共焦点検知デバイスによる撮像が別の放射光源によって損なわれることがないようにするのが都合がよい。そのため、この別の放射光源として、多光子撮像または共焦点検知デバイスによる撮像の検知放射光あるいは励起放射光の波長範囲と重ならない波長範囲を有する別の放射光源を提案する。例として述べるが、この条件は９５０ｎｍより長い波長範囲とビーム光路中にビームスプリッタを配置することにより満たされる。
【００４４】
一つの有利な実施形態では、中心部の反射光のピークを下げるため、前記共焦点検知デバイスによって放射光源の前に配置された偏向ミラーを部分的に透過した信号光を受光するように前記共焦点検知デバイスを配置する。この信号光はさらに第２光ガイド中をガイドされて伝播するように構成するものでよい。
【００４５】
ここで偏向ミラーの反射率は８０％より高く、好ましくは９０％より高く、さらに好ましくは９５％より高くすることができる。アナライザとレンズを通った後、透過してきた信号光は直接測定ヘッド内に配置され上流側にピンホールを有する共焦点検知器に入射するか、またはまず光ガイド中に入射させて同光ガイドと結合させて外部に配置した共焦点検知器に入射するかのいずれかである。ここで、光ガイドはピンホールの機能を果たす。
【００４６】
「中心部の反射光」の形の画像のアーチファクトが照明放射光の様々な光成分の表面反射により共焦点検知デバイスにより生じるが、このようなイメージアーチファクトはアナライザにより直角偏光検知することによって減少するのは好都合である。
【００４７】
中心部の反射のピークを下げるため、代わりに、直線偏光した励起ビームと被験体から反射する偏光されていない二次放射光を分離する偏向偏光ビームスプリッタを設ける。この場合、共焦点検知デバイスが被験体で反射して偏光されていない二次放射光を受光するように共焦点検知デバイスを配置する。この構成では、放射光源からの直線偏光した信号光が偏光ビームスプリッタを通って、光合焦ユニットによって被験体内で合焦する。この放射光は焦点部位で反射し、その一部が戻り方向に伝播して複数の散乱事象の後で光合焦ユニットによって受光される。偏光状態は被験体内の複数の複雑な組織構造部での複数の散乱事象によって乱される。スキャナーを介して戻り方向にガイドされる（逆走査される）信号光の一部は、偏光ビームスプリッタによって分離され、共焦点の形で受光される、すなわち、レンズを通った後、直接測定ヘッド内に配置され上流側にピンホールを有する共焦点検知器に入射するか、またはまず、例えばエアリーディスク（Airy Disk）の径と同じ径のコアを有する光ガイドに入射させて同光ガイドと結合させて外部に配置した共焦点検知器に入射するかのいずれかである。同様な直角偏光による検知によって、表面反射光の一部が抑えられて中心部の反射光のピークが下げられる。
【００４８】
一つの発展した実施形態では、前記共焦点検知デバイスは近赤外フェムト秒レーザー放射光からなる励起ビームの反射した信号光を時間分解信号処理する装置を有する。
【００４９】
中心部の反射光をさらに減じ、理想的には完全に補償することが、共焦点光学系で検知された信号光を時間分解検知することによって可能になる。ここで、蛍光寿命測定を目的とする時間分解信号光子計数（ＴＣＳＰＣ）または単純で低コストのゲート光子計数（ＧＰＣ）のいずれかがこの目的に適している。検知器のＴＴＳ限定された時間分解能は、例えば２００ｐｓであり、この値から空気中の光路の分解能が６０ｍｍになる（ＴＴＳ：遷移時間スプレッド）。時間分解能が２０ｐｓの場合、空気中の光路の分解能が６ｍｍになる。ここで、励起ビーム光路中のほとんどの光ユニットの表面反射光が除ける。
【００５０】
別の発展した実施形態は前記マルチモード撮像システム内の自動合焦ユニットの構成にある。この自動合焦ユニットは測定システム、評価ユニットおよびリニアアクチュエータによって実現される。リニアアクチュエータはｚ方向アクチュエータとも呼び、軸方向に動く被験体に対して光合焦ユニットの位置を決め、またはその位置を調節する機能を有する。
【００５１】
被験体と撮像システムとの結合は、特に自動合焦ユニットによって安定にすることができ、それによって生体組織の検査を実質的に向上させることができる。生体組織を平面方向に固定することは、両面接着テープ、カバースリップおよび磁気アダプタ板の組み合わせによって、十分安定になされることが多い。一方、軸方向においては、本発明の自動合焦ユニットが対物面と焦点位置を安定させる。対物面と焦点位置は、特に被験体の拍動、呼吸または他の相対的な動きの結果として変化する。具体的に、自動合焦ユニットは使用するカバースリップの可撓性によって生じる画像のゆがみを減じる、または防ぐことができる（例として述べるが、厚さが６０〜１８０μｍの複数のカバースリップが用いられ、これらのカバースリップは被験体の接触圧力が上昇すると撓む）。以下、このようして生じる画像のゆがみは「イメージアーチファクト」ともいう。呼吸によるアーチファクトの影響は大きい場合がある。特に動きの大きい組織の場合、例えば肺の皮膚の領域を検査する場合、その影響は大きい。自動合焦による調節をしないと、画像評価にとって重要な深さ情報が失われる。その結果、垂直方向の断層画像、いわゆるｘ−ｚ方向走査、またはｙ−ｚ方向走査はゆがみ、コンピュータに基づく評価および三次元画像の再生が困難になる。特に正面像を重ねて撮像する場合は困難になる。
【００５２】
例として述べるが、ｚ方向アクチュエータはステッピングモーターか、または圧電効果に基づくものにすることができる。圧電アクチュエータにより、迅速な調節が可能であり、下限の周波数を０．１Ｈｚよりも高くすることができる。その結果、圧電アクチュエータは前記した生命体の相対的な動きのほとんどよりも明らかに速い。実施形態にもよるが、圧電アクチュエータにより１００μｍ〜５００μｍの距離を動かすことができる。
【００５３】
一つの発展した実施形態では、自動合焦機能を設けるために、前記マルチモード撮像システムは前記カバースリップの相対的な位置および／または被験体の相対的な位置を測定する装置を有する。
【００５４】
自動合焦ユニットに送られるセンサー信号が、使用する可撓性のあるカバースリップの表面反射光によって与えられるのは好都合である。ここで、この表面反射光を、例えば光コヒーレンス・トモグラフィ用に統合したシステムによって、または別のシステムを用いるレーザー三角測量法によって動的に評価することができる。
【００５５】
一つの有利な実施形態によれば、前記マルチモード撮像システムは前記光合焦ユニットの光軸と同一直線状に合わされたＯＣ測定ビーム光を有し、自動合焦機能を与える目的で、前記カバースリップの位置および／または前記被験体の位置を、前記ＯＣ測定ビームを用いて測定可能である。
【００５６】
光コヒーレンス（ＯＣ）測定は、好都合なことに、撮像はしない自動合焦ユニットの一部として前記マルチモード撮像システムの中に入れられて前記マルチモード撮像システムと一体にすることができる。ここで、ＯＣ測定ビーム光はビームスプリッタによって光合焦ユニットの光軸に重ね合わされる。開口数を効果的に小さくすることを容易にし、その結果ＯＣ測定ビーム光のレイリー長さを長くするために、光合焦ユニットの開口は完全に照明されずに、例えば３０％未満、好ましくは２０％未満、さらに好ましくは１０％未満のみ照明される。ビームスプリッタの光学層によって、例えば７１０ｎｍ〜９５０ｎｍの波長範囲にある多光子撮像および共焦点検知デバイスの照明放射光を透過させることが容易になる。検知される二次信号光は、例えば蛍光およびＳＨＧ信号光であり、これらの信号光の波長範囲は７１０ｎｍ未満であり、これらの信号光とＯＣ測定ビーム光の波長範囲の光は反射する。例として述べるが、統合するためにスーパールミネセントダイオード（ＳＬＤ）を光ファイバ部品および統合スペクトロメータと組み合わせて設けてもよい。スーパールミネセントダイオード（ＳＬＤ）の中心波長は、例えば概ね１０６０ｎｍであり、その帯域は７０ｎｍである。この構成の利点は、本明細書で説明する残りの撮像手段に悪影響を与えないことである。さらに、このユニットの小型の装置サイズと例えば可動台車の筐体内に入ったスーパールミネセントダイオードおよびスペクトロメータからなる外部の構成のオプションは測定ヘッドの重さと組立体積に有益な影響を与える。
【００５７】
一つの有利な実施形態によれば、圧力センサーまたは力センサーを備えて被験体の表面を見つける、および／または接触圧力をモニターする。
【００５８】
対象物の軸方向位置は接触圧力に依存する。そのため、自動合焦ユニットに与えるセンサー信号を、圧力センサーが与えるのは好都合である。圧力センサーは集積された電気圧力センサーであるのが好ましく、例えばひずみゲージ技術に基づくものでもよい。
【００５９】
圧力センサーによって、高精細撮像を始める時に組織の表面を見つけることを簡単にできるのは好都合である。光合焦ユニットを被験体に対して軸方向に変位させるリニアアクチュエータを用いることにより、例えば連続的に光合焦ユニットを変位させて、同時に目標位置でのＲＯＩでの多光子蛍光信号を検知することにより、撮像を開始できる状態にする工程を改良できる。ここで、被験体の表面は低信号光のカバースリップまたは浸漬液体から蛍光を出すサンプルへの遷移から定められる（この点については、図９を参照）。例として述べるが、低信号光から高信号光の領域への転換点が組織の表面であると定める。
【００６０】
圧力センサーを評価することによって、接触圧力を調節し、制限することができる。特に、眼科検査および皮膚科検査の場合には、接触圧力を調節姿勢源することによって、組織への血液供給を制限し、そのため組織の代謝を損なう過大な接触圧力が生じるのを防ぐことができる。
【００６１】
一つの有利な実施形態によれば、励起ビームの照射制御器が測定領域内に被験体があることを判定するための装置と結合している。
【００６２】
例として述べるが、被験体があることを判定する装置は、前記した圧力センサーによって実現できる。そのため、この圧力センサーは患者の安全に役に立つ。もしもこの圧力センサーが被験体を検知すると、励起ビーム光が出射される。
【００６３】
上記の代わりに、または上記に加えて、測定領域に被験体があることは判定するのに役立ち、その結果患者の安全のために用いられる光コヒーレンス・トモグラフィ用の測定ビームを用いることができる。例として述べるが、もしも組織が対物面内にある場合、その組織は光コヒーレンス測定用の測定ビームによって検知され、励起ビームがその後出射される。
【００６４】
例として述べるが、前記マルチモード撮像システムのコンピュータシステムは制御ユニットおよび処理ユニットを有し、これらのユニットは、具体的には既知の信号処理ユニットおよび／または画像処理ユニットである。さらに、前記マルチモード撮像システムは特に、例えばマウス、キーボード、タッチスクリーン等のようなユーザーインタフェースを有する。例として述べるが、全体画像はユーザーインタフェースを用いて表示でき、ユーザーは検査する測定位置を詳細に決めることができる。被験体の精細画像を撮像する時、全体画像を重ねて表示して、全体画像中の精細画像が撮像される位置をユーザーがわかるようにする。測定位置は同じユーザーインタフェース（タッチスクリーン）を用いて、または別のユーザーインタフェース（マウズ、キーボード等）用いて選択することができる。例として述べるが、これらも撮像した画像は保存する、印刷する、および／または他のモジュールに移すことができる。ここで、コンピュータシステムは例えば適切なズーム機能またはスクロール機能によってユーザーを支援することができる。例として述べるが、画像中の距離および大きさを算出する他のツールによって、ユーザーを支援することもできる。
【００６５】
このようなコンピュータシステムおよびスクリーン、入力デバイス、出力デバイス等のようなコンピュータシステムの周辺デバイスは測定ヘッドの外部に設けることにより、測定ヘッドが必要以上に重くなることを避けることができて有利である。
【００６６】
別の有利な実施形態では、前記マルチモード撮像システムは電池駆動である。
【００６７】
この実施形態によれば、電源が有る無しにかかわらず、いかなる周囲の状況でもコンパクトなシステムを一時的に使用することを容易にするので好都合である。好都合なことに、電池駆動システムは電源が無くても、数時間動作する。特に、この実施形態は電池駆動のシステムを可動にし、患者のベッドで、または医療現場で直接、検査することを容易にする。さらに、電力の不具合でデータを失うことに関しての信頼性を高めることは有利である。
【００６８】
前記したマルチモード撮像システムのうちの一つを用いて被験体を非侵襲的に検査するための本願発明にしたがう方法では、
光合焦ユニットを測定位置に合わせるステップと、
放射光源からの近赤外フェムト秒レーザー放射光を測定位置に当てるステップと、
前記測定位置にある被験体の高精細画像を撮像するために、多光子撮像システムおよび共焦点検知システムを順に、または同時に用いることにより、前記被験体から出射される二次放射光を測定するステップと、を行う。
【００６９】
ここで、前記システムに関して説明した特徴はすべて方法の発明に対しても開示されたものと考えるべきであり、その逆もある。
【００７０】
前記測定位置にある前記被験体の高精細画像を撮像するために、前記被験体から出射される二次放射光を測定するステップは、複数のシステムを組み合わせて測定することを含むことが好都合である。特に有利な点は、本願発明が前記多光子撮像と前記共焦点検知システムによる撮像の高速フレーム率とを組み合わせることである。
【００７１】
強い瞬間的な反射信号光のため、被験体の形態を十分に画像化するのを容易にするために必要な各画素での滞留時間は、自動蛍光に基づく多光子撮像に比べて、顕著に短いことは有利な点である。共焦点検知デバイスのこの特性は、被験体の全体像を「高速」で撮像するのに用いるのに有利な点である。ここで、全体画像は複数の隣り合う顕微鏡画像野、例えば３５０×３５０μｍ２の複数の隣り合う画像野をチェッカーボード状に継ぎ合わせることによってできる。このような複数の画像は順に撮像され、継ぎ合わされてチェッカーボード状に一体となって全体画像になる。
【００７２】
このようにして、前記方法の一つの実施形態では、全体画像を測定することができる。ここで、前記方法は、
前記測定ヘッドを前記被験体の全体領域に合わせるステップと、
前記共焦点検知システム並びに／またはＣＣＤカメラもしくはＣＭＯＳカメラおよび／あるいは光コヒーレンス・トモグラフィ・デバイスを用いて前記被験体の全体画像を撮像するステップと、
前記高精細画像を撮像する目的で、前記全体画像中の測定位置を選択するステップと、を含む。
【００７３】
全体画像を撮像する時の照明は、特にフェムト秒レーザー放射光源によってなされる。
【００７４】
前記したように高精細画像の測定は、
前記光合焦ユニットを測定位置に合わせるステップと、
前記放射光源からの近赤外フェムト秒レーザー放射光を前記測定位置に当てるステップと、
前記測定位置にある前記被験体の高精細画像を撮像するために、前記多光子撮像システムおよび／または前記共焦点検知システムを用いることにより、前記被験体から出射される二次放射光を測定するステップと、を行うことによってなされる。
【００７５】
前記方法の発展した手法では、全体画像が始めにカメラによって撮像され、次に共焦点検知デバイスによる撮像が行われ、最後に高精細多光子撮像を用いて測定が行われる。ここでも、照明は常にフェムト秒レーザー放射光源によって行うことができる。
【００７６】
一つの有利な実施形態では、被験体の軸方向の動きによるアーチファクトが光合焦ユニットと被験体の間の距離を連続的に機械的に調節することによる自動合焦機能によって修正することができる。
【００７７】
さらに、被験体の表面を見つける目的で測定信号光を評価する構成にすることができるのは、特に自動合焦機能を行えるので有利である。
【００７８】
一つの有利な実施形態によれば、被験体の精細画像を撮像するときよりも、被験体の全体画像を撮像するときの方が、前記光合焦ユニットと被験体の間の距離が長く設定される。特に、この距離は被験体に対して前記光合焦ユニットを軸方向に変位させるリニアアクチュエータにより設定することができる。
【００７９】
この実施形態の代わりに、前記ＣＣＤカメラあるいは前記ＣＭＯＳカメラおよび／または前記光コヒーレンス・トモグラフィ・デバイスを用いて、前記全体画像は前記光合焦ユニットの光軸と同一直線方向から見た画像ではなく斜視画像として撮像することもできる。
【００８０】
一つに有利な実施形態によれば、測定領域の中に被験体がある場合に、励起ビーム光が出射される。例として述べるが、このことによって患者の安全を担保できる。
【００８１】
高精細撮像システムの対物面に対する組織表面の位置を見つけるために、一つの実施形態では、皮膚の表面中のクレアチンが発する多光子蛍光信号を測定することができる。皮膚表面のもっと正確な位置の特定は、ガラスまたは水浸漬層からなる低信号領域とクレアチンが豊富な皮膚表面の間の変化点を測定することによって確実にできる。
【００８２】
本願発明の別の側面によれば、前記したマルチモード撮像システムの一つを用いて被験体である生命体を検査する。そのため、前記方法は人間、動物または植物の生体検査に特に適している。自由に配置できる曲げることができる測定ヘッドを有する本願発明が提案する構造によって、いかなる方向を向いている対象物の表面の検査も非侵襲的に行うことができる。具体的には、例えば大きい被験体の複数の異なる部分をそれぞれ測定することにより行うことにより、非侵襲的に検査を行うことができる。
【００８３】
特に、例えばＧＦＰのような生物用蛍光マーカーでマークしたサンプルに適用するための構成にすることができる。
【００８４】
通常、組織中のコラーゲン、エラスチン、フレーヴィン、ケラチン、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび／またはメラニンのような代表的な内因性の蛍光色素物質の分布を測定することができ、さらに、測定した分布から、例えば癌のような組織の集まりについての結論を導くことができる。
【００８５】
励起放射光の周波数を二倍にすることによって、例えばコラーゲン繊維またはミオシンを極めてはっきりと見えるようにすることも可能である。
【００８６】
前記システムは、外科医の診断を支援するのに適しており、外科医は、特に人間の皮膚の生体精細画像を受けとり、受けとった画像により支援されて診断を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
添付図面は本願発明として可能な代表的な実施形態を図解する。
【図１】図１は本願発明の一つの実施形態であるマルチモード撮像システムの概略図である。
【図２】図２は本願発明の一つの別の実施形態であるマルチモード撮像システムの概略図である。
【図３】図３は本願発明の一つの実施形態であるマルチモード撮像システムによる検査中の被験体の２つの異なる段階での概略図である。
【図４】図４は本願発明の一つの実施形態であるマルチモード撮像システムによる検査中の被験体の概略図である。
【図５】図５は本願発明の別の実施形態であるマルチモード撮像システムによる検査中の被験体の概略図である。
【図６】図６は本願発明の別の実施形態であるマルチモード撮像システムによる検査中の被験体の概略図である。
【図７】図７は本願発明の別の実施形態であるマルチモード撮像システムの測定ヘッドの一部の概略図である。
【図８】図８は本願発明の一つの実施形態であるマルチモード撮像システムによる検査中の被験体の斜視図である。
【図９】図９は侵入深さに対する信号光強度のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
以下で添付図面を参照して説明する代表的な実施形態は本願発明の主題を限定するものと解釈してはいけない。添付図面は本願発明の主題を概略的にのみ表している。
【００８９】
すべての添付図面中で、同じ、または類似する部品には同じ符号が与えられ、個々のケースにおける説明中で、これらの部品について繰り返し記載することが省かれている。
【００９０】
図１は本願発明の一つの実施形態であるマルチモード撮像システム２の概略図である。
【００９１】
マルチモード撮像システム２は測定ヘッド４を有し、測定ヘッド４は空間中で自在に、旋回可能、回転可能かつ柔軟に配置可能であるため、被験体１０の検査を任意の望ましい立体的な角度で行うことができる。
【００９２】
測定ヘッド４を自在に配置する目的で、測定ヘッド４は間接結合されたアーム８を介して可動ベース装置６に取り付けられている。
【００９３】
マルチモード撮像システム２は照射光源１２を有し、照射光源１２は測定ヘッド４の中にあるレーザーヘッド１４と可動ベース装置６の中にあるレーザー光発生器１６を有する。レーザーヘッド１４とレーザー光発生器１６は第１光ガイド１８、例えば光ファイバによって互いに接続されている。ある実施形態（図示していない）では、第１光ガイド１８を関節結合されたアーム８の中に入れてアーム８と一体にすることができる。
【００９４】
例になるが、レーザー光発生器１６はレーザーダイオードとポンプダイオードの電源を有する。例になるが、レーザーヘッド１４は直線偏光励起ビーム２１を発生させる目的でレーザー光発生器１６が出射する放射光の周波数を二倍にするＳＨＧユニットを有する。
【００９５】
励起ビーム２１はパワー設定ユニット２０および偏光ビームスプリッタ２２を通って伝播し、走査ユニット２４を介して、さらに二枚のレンズ２６、２８を介して光合焦ユニット３０に導かれ、光合焦ユニット３０は励起ビーム２１を被験体１０上で合焦させる。走査ユニット２４は２つの面内で励起照射光の角度を偏向させる。この角度の偏向は光合焦ユニット３０によって励起部位の二次元の移動の動きに変換される。
【００９６】
光合焦ユニット３０のｚ方向位置はリニアアアクチュエータ３２によって調節でき、このことは矢印によって示されている。この目的で、リニアアクチュエータ３２はモーターを有している。図解されている代表的な実施形態では、ｚ方向は光合焦ユニット３０の光軸と一致する。
【００９７】
測定ヘッド４の全体は関節結合されたアーム８によって空間中の任意の望ましい位置に固定される。アダプタ板３６は光合焦ユニット３０と被験体１０の間にあって、被験体１０と接触する部材であり、光合焦ユニット３０と被験体１０の間に配置される。アダプタ板３６は図８を参照してさらに詳細に説明される。ｘ−ｙ方向移動ステージ３４はアダプタ板３６とアダプタ板３６に結合された被験体１０を測定ヘッド４に対して水平方向に動かす。この目的のため、ｃ３４は適切なモーター駆動アクチュエータを複数有する。
【００９８】
励起ビーム２１は被験体１０と相互に作用し合う。励起ビーム２１が当たると、被験体１０は二次放射光を出光する。この二次放射光は、例えば反射放射光、蛍光放射光、特に光合焦ユニット３０が受光するＴＰＦ、ＳＨＧまたはＴＨＧである。図解する代表的な実施形態では、２つのダイクロイックビームスプリッタ３８、４２が第２レンズ２８と光合焦ユニット３０の間に設けられ、これらのダイクロイックビームスプリッタ３８、４２はＴＰＦ、ＳＨＧまたはＴＨＧの信号光を第１検知器４０および第２検知器４４に伝播させる。例として述べるが、第１検知器４０は具体的にはＳＨＧの信号を受光でき、第２検知器４４は具体的にはＴＰＦの信号光を受光できる。ある実施形態（図示なし）では、２つのダイクロイックビームスプリッタ３８、４２のうちの一つのみがレンズ２８と光合焦ユニット３０の間に設けられる。この実施形態では、さらに別のビームスプリッタを用いて結合した第１ビーム光路１５０および第２ビーム光路１５１のうちの一つの中で信号光の波長を分離できる。
【００９９】
図解された代表的な実施形態では、共焦点検知デバイスはマルチモード撮像システム２の中に設けられてマルチモード撮像システム２と一体となっている。この共焦点検知デバイスは、偏光ビームスプリッタ２２、レンズ４６、ピンホール４９および共焦点放射光検知器５２を有する。この共焦点検知デバイスは、被験体１０に当てた励起ビーム２１によって生じた偏光されてない反射放射光の一部を受光する。走査ユニット２４を通った後、この反射放射光は「逆走査」される形でこの共焦点検知デバイスによって受光される。走査ユニット２４を通った後、信号光は偏光ビームスプリッタ２２で反射して、レンズ４６とピンホール４９を通ってガイドされてＣＬＳＭ検知器とも呼ばれる共焦点放射光検知器５２まで伝播する。 図解された代表的な実施形態では、共焦点放射光検知器５２は測定ヘッド４の中に位置する、放射光源１２は共焦点検知器用の照明として働く。
【０１００】
励起ビームと異なる偏光状態を有する信号光を前述したように受光することによって、中心部の反射光のピークを下げることは好都合である。ある実施形態では、さらに減少させたり、完全に補償することが、この目的に合った装置、例えばゲート回路を有する共焦点放射光検知器５２を用いて共焦点信号光を時間分解検知することにより可能である。
【０１０１】
代わりの実施形態（図示なし）では、共焦点光学系で検出された蛍光を受光するために、偏光ビームスプリッタ２２をダイクロイックミラーで置き換え、ダイクロイックビームスプリッタ３８、４２を除き、さらに検出ビーム光路１６０に蛍光バンドパスフィルタを加えることができる。
【０１０２】
レーザー光発生器１６に加えて、可動ベース装置６は多光子およびＣＬＳＭ撮像用の信号光または画像に対応する信号光入力（図示せず）を通常含み、この信号光入力は検出器４０、４４および共焦点放射光検知器によって受光される。
【０１０３】
さらに、可動ベース装置６はコントロールユニット５４を有し、このコントロールユニット５４によって、例えばユーザーの入力が処理され、電源のような個々の部品を制御でき、さらにこのコントロールユニット５４によって、被験体１０の全体画像と微細画像の間の切り替えも処理できる。この処理はユーザーまたはトリガーユニットによって始められる。ユーザー用のインタフェースの一部として、可動ベース装置はディスプレー５６、例えばタッチスクリーンまたはモニターを有する。
【０１０４】
さらに、マルチモード撮像システム２が可動であることを示すために、ホイール５８が示されている。電池ユニット２３がマルチモード撮像システム２用の電源として設けられている。
【０１０５】
図２はマルチモード撮像システム２の代わりの実施形態を示す。図２中に図解されたマルチモード撮像システム２は同じように共焦点検知デバイスを有する。
【０１０６】
放射光源１２が発生する励起ビーム２１は、本実施形態では始めに偏向ミラー６０によって高偏向度で、９０％よりも大きく、または９５％よりも大きく、１００％よりも小さい偏向度で偏向される。励起ビーム２１のその先のビーム光路は図１を参照して説明したものである。被験体１０の近くにある光合焦ユニット３０によって受光される二次信号光は走査ユニット２４によってガイドされ、逆走査信号光として、走査されて光路を戻って伝播する。
【０１０７】
共焦点検知デバイスは偏光ミラー６０を部分的に透過する信号光である二次信号光を受光する。
この目的で、偏光ミラー６０を通過した後、偏光ミラー６０を部分的に透過した信号光はアナライザ６２を通ってガイドされる。アナライザ６２の向きは、励起ビーム２１の偏光状態とアナライザ６２を通過した検知放射光１００の偏光状態とが互いに直角になるような向きになっている（直角偏光）。ここで図解される代表的な実施形態では、透過してきた検知放射光１００はレンズ４６を通って伝播し、入射結合点４８で第２光ガイド５０の中に入射して第２光ガイド５０と結合する。入射結合点４８は測定ヘッド４の中にある。この第２光ガイドの芯部の直径は、例えばエアリーディスク（Ａｉｒｙ  Ｄｉｓｋ）の直径に一致し、前記した伝播する検知放射光は共焦点放射光検知器５２に送られる。図解された代表的な実施形態では、共焦点放射光検知器５２は可動ベース装置６の中にある。直角の偏光の構成で検知するこの代表的な実施形態は、効果的に中央部の反射を抑えることを容易にする。
【０１０８】
図３は本願発明の一つの実施形態であるマルチモード撮像システム２による検査中の２つの異なる段階での被験体１０を示し、この図では測定ヘッド４の一部がそれぞれの段階で図解されており、例えば、図１または図２を参照して説明された撮像が前記した測定ヘッドによって容易になっていることを示す。
【０１０９】
図３の左半分はカメラに基づく全体の撮像を図解する。この目的のため、カメラ６４はアダプタ板３６と結合されている。図解された代表的な実施形態では、カメラ６４は可視放射光（ＶＩＳ）、例えば白色光、を発光するもう一つの放射光源７０とカメラレンズ１５４を有する。
【０１１０】
図２中の右側に図解されているように、全体画像の撮像後、カメラ６４が除かれ、高精細顕微鏡撮像をするデバイスを有する測定ヘッド４が被験体１０に対して配置される。
【０１１１】
図４は多光子撮像を共焦点検知デバイスだけでなくさらにカメラに基づく撮像と結合させたマルチモード撮像システム２からなる代わりの実施形態を示す。
【０１１２】
多光子撮像のビーム光路および共焦点検知デバイスは図２を参照して説明したものとしてよい。カメラ６４は完全に測定ヘッド４の中に入れられて測定ヘッド４と一体となっている。カメラ６４は撮像素子として光合焦ユニット３０を用い、照明として放射光源１２を用いる。カメラに基づく撮影用の撮像条件は光合焦ユニット３０と被験体１０の間に設けられた比較的大きい動作距離によって満たされる。例として述べるが、ここで光合焦ユニット３０を被験体１０から約１０ｍｍの距離の位置に配置するリニアアクチュエータ３２を用いることは好都合である。光合焦ユニット３０の対物距離が大きいことと開口数が大きいため、放射光源１２からの励起ビーム２１によって組織の大きな領域を照明することができる。
【０１１３】
信号光は走査ユニット２４を通って伝播し、ビーム強度スプリッタ１５２で反射する。この目的のため、ビーム強度スプリッタ１５２は非対称な反射／透過比を有し、その反射／透過比は、例えば２０／８０より小さい、好ましくは１０／９０より小さく、例えば５／９５である。ビームブロッカー１５３はビーム強度スプリッタ１５２の戻り方向の反射光をブロックする目的で挿入されている。その結果、信号光は第４レンズ６６および第５レンズ６８を通ってカメラ６４に入射し、カメラセンサーによって検知され測定部位を解像する。この構成では、被験体１０は対物面内にあり、カメラチップは撮像光学システムの撮像面内にある。第４レンズ６６と第５レンズ６８はさらに複雑なレンズシステムを加えて補完することもできる。測定ヘッド４はカメラの画像を可動ベース装置６に送信する適切なインタフェース（図示せず）を有するものでよいことがわかる。
【０１１４】
図５は別の実施形態であるマルチモード撮像システム２を示す。図１および図２を参照して説明した多光子撮像の部品および共焦点検知器に加えて、例えば、マルチモード撮像システム２は測定ヘッド４と一体となって測定ヘッド４の側面に取り付けられた、または測定ヘッド４と一体となって測定ヘッド４内に入れられたカメラ６４を有し、このカメラセンサー６４、撮像レンズ６６および被験体１０の配置は、シャインプルーフの原理にしたがって行われ、この配置により対物面、撮像面およびレンズ面の共通の交軸が存在する。カメラ６４は放射光源１２を照明として用いることができる。この代わりとして、またはこれに加えて、ＶＩＳ光を発生するもう一つの放射光源７０を別体のユニットと側方に設けられ、測定ヘッドと一体にして、測定ヘッドの側方に取り付け、または測定ヘッドの中に組み入れる。
【０１１５】
光合焦ユニット３０のｚ方向位置はリニアアクチュエータ３２によって調整され、図５中では２つの異なるｚ方向位置が示されている。第１の距離の位置では、マルチモード撮像システム２は被験体１０の精細画像を撮像する位置に置かれ、（リニアアクチュエータおよび合焦光ユニットをそれぞれ表すアポストロフィ付きの参照符号３０‘および３２’によって示される）対物距離ｄ１が例えば０．２ｍｍである。例えば約１０ｍｍである（アポストロフィなしの該符号によって示される）第２の距離ｄ２の位置では、マルチモード撮像システム２はカメラに基づく全体画像を撮像する。第２の場合、カメラに基づく撮像システムの対物側の開口角度を光合焦ユニット３０の外形寸法によって減少させることなく、側方かつ傾いた配置によって、カメラに基づく撮像に必要な光を照射することができる。
【０１１６】
別のシステムとして、マルチモード撮像システム２はさらに光コヒーレンス・トモグラフィ・デバイスを有する。この光コヒーレンス・トモグラフィ・デバイスは図５中では光コヒーレンス測定システム７４で示される。光コヒーレンス測定システム７４は干渉測定構造、スペクトロメータ、照明および評価装置を有し、さらにもう一つの合焦光ユニット７６も有する。光コヒーレンス測定を一緒に行うため、中心波長が１０６０ｎｍで帯域が７０ｎｍのスーパールミネッセントダイオードを照明の目的で用いる。光コヒーレンス・トモグラフィ・デバイスの光コヒーレンス測定システム７４、もう一つの光合焦ユニット７６およびＯＣ測定ビーム９２は励起ビーム２１の光軸に対して所定の角度、例えば３０°から６０°、好ましくは４０°から５０°、具体的には好ましくは４２°から４８°、特に例えば４５°に傾けて配置される。この結果、第２の距離ｄ２に設定されたときに、光コヒーレンス・トモグラフィ・デバイスは、例えば、５ｍｍ×５ｍｍ×１ｍｍのオーダーの被験体の全体画像の撮像をすることができる。この側方かつ傾いた配置によって、光コヒーレンス・トモグラフィ・デバイスに必要な光の照射が可能になる。
【０１１７】
２個のガルバノメーター・スキャナー（図示せず）によって、ＯＣ測定ビーム９２を二次元で偏向させることができる。代わりに、例えばたった１個のガルバノメータ・スキャナーを用いて測定ビーム９２を一次元で偏向させることもできる。後者の場合、結果として得られる直線走査をモーター駆動ｘ−ｙ方向移動ステージ３４のＸ軸またはＹ軸の搬送動作と同期させることにより、三次元撮像を行うことができる。
【０１１８】
もちろん、側方に備えられたカメラ６４と一体になったシステムのみを含む実施形態や側方に傾けて配置された光コヒーレンス・トモグラフィ・デバイスのみを含む実施形態でもよい。
【０１１９】
図６は図５を参照して説明した多光子撮像デバイスと光コヒーレンス・トモグラフィ・デバイスを備えるマルチモード撮像システム２の別の構成を示す。第３のシステムとして、この実施形態中のカメラ６４は、側方に配置されているのではなく、完全に測定ヘッドの中に組み入れれて、測定ヘッドと一体になっている。カメラ６４は撮像素子として光合焦ユニット３０を用いる。この構成では、被験体１０は対物面内にあり、カメラチップは撮像光学システムの撮像面内にある。参照符号７８はダイクロイックミラースプリッタを示す。合焦ユニット３０または（図６で示される）移動ステージ３４と結合したもう一つの別体の放射光源７０が照明の目的で用いられる。ここで、励起放射光２１の波長範囲およびもう一つの放射光源７０の波長範囲は互いに異なる。全体画像の撮像用の別体の放射光源７０の照明領域７２がさらに示されている。
【０１２０】
図７は、撮像しないで光コヒーレンスを適用することによって自動合焦ユニットを一体にしたことを示す。この構成で、前記した光コヒーレンス測定システム７４からのＯＣ測定ビーム９２は、第３ダイクロイックミラー９０により励起ビーム２１のビーム光路中に入射させられて励起ビーム２１と結合する。この構成では、ＯＣ測定ビームと光合焦ユニット３０の光軸は同一直線になるように合わされる。例として述べるが、ダイクロイックミラー９０の光学層によって、例えば７１０ｎｍから９５０ｎｍの波長範囲にある励起ビーム２１と照明放射光とを透過させることが容易になっている。７１０ｎｍより短い波長範囲内の検知された二次信号光およびＯＣ測定ビーム９２の波長範囲内の検知された二次信号光が反射する。開口数を効果的に小さくし、その結果としてＯＣ測定ビーム９２のレイリー長を大きくするため、光合焦ユニット３０の出口孔は完全に照明されず、約１０％以下の範囲のみが照明される。
【０１２１】
光コヒーレンス測定を一緒に行うために、中心波長が１０６０ｎｍで帯域が７０ｎｍのスーパールミネッセンスダイオードを、照明の目的で用いる。ここで、干渉メーターは光コヒーレンス測定システム７４の構成部品である。
【０１２２】
図８はアダプタ板３６が付いている測定ヘッド４と被験体１０、この場合人間の皮膚の一部との斜視図である。アダプタ板３６は金属製結合リング１０４、カバースリップ１０６および接着リング１０８をこの順番に含む。光合焦ユニット３０の開口数の値を大きくするため、例えばオイルである第１浸漬液体が測定ヘッド４の光合焦ユニット３０と金属製結合リング１０４の間に入れられる。例えば水である第２浸漬液体１１０が接着リング１０８と被験体１０の間に入れられる。
【０１２３】
図９は被験体１０の表面を見つけるための測定信号光を示す。被験体１０の表面は低信号光のカバースリップまたは浸漬液体から蛍光を出すサンプルへの遷移部として定まる。例として述べるが、低信号光領域から高信号光領域への変化点は組織の表面として定まる。
【符号の説明】
【０１２４】
２      マルチモード撮像システム   
４      測定ヘッド                 
６      可動ベースデバイス         
８      関節結合したアーム         
１０    被験体                            
１２    放射光源                   
１４    レーザーヘッド             
１６    レーザー光発生器           
１８    第１光ガイド
２０    パワー設定ユニット
２１    励起ビーム
２２    偏光ビームスプリッタ
２３    電池ユニット
２４    走査ユニット
２６    第１レンズ
２８    第２レンズ
３０    光合焦ユニット
３２    リニアアクチュエータ
３４    ｘ−ｙ方向移動ステージ
３６    アダプタ板
３８    第１ダイクロイックビームスプリッタ
４０    第１検知器
４２    第２ダイクロイックビームスプリッタ
４４    第２検知器
４６    第３レンズ
４８    結合点
４９    ピンホール
５０    第２光ガイド
５２    共焦点放射光検知器
５４    コントロールユニット
５６    ディスプレー
５８    ホイール
６０    偏向ミラー
６２    アナライザ
６４    カメラ
６８    第５レンズ
７０    もう一つの放射光源
７２    照明領域
７４    光コヒーレンス測定システム
７６    もう一つの光合焦ユニット
７８    第３ダイクロイックビームスプリッタ
９０    第４ダイクロイックビームスプリッタ
９２    ＯＣ測定ビーム
１００  伝播する検知放射光
１０２  第１浸漬液体
１０４  金属製結合リング
１０６  カバースリップ
１０８  接着リング
１１０  第２浸漬液体
１５０  第１ビーム光路
１５１  第２ビーム光路
１５２  ビーム強度スプリッタ
１５３  ビームブロッカー
１５４  カメラレンズ
１６０  検知ビーム
ｄ１    第１対物距離
ｄ２    第２対物距離
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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