(57)【要約】本発明は、病理学的筋細胞膜過興奮性によって引き起こされる状態、および／または正常な筋細胞膜興奮性の回復が治療上の利益または改善をもたらすことができる任意の他の状態の治療に使用するためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩に関し、前記状態は、好ましくは筋緊張性障害である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋緊張性障害の治療における使用のためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記筋緊張性障害が、メキシレチン抵抗性（ｍｅｘｉｌｅｔｉｎｅ−ｒｅｓｉｓｔｅｎｔ）である、請求項１に記載の使用のためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
前記筋緊張性障害が、非ジストロフィー性筋緊張症である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の使用のためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
前記非ジストロフィー性筋緊張症が先天性筋緊張症である、請求項３に記載の使用のためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
前記非ジストロフィー性筋緊張症が、ナトリウムまたは塩素チャネル筋緊張症である、請求項３に記載の使用のためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
前記ナトリウムチャネルが、ｈＮａｖ１．４である、請求項５に記載の使用のためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
先天性筋緊張症が、トムセン先天性筋緊張症またはベッカー先天性筋緊張症である、請求項４に記載の使用のためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
前記ナトリウムチャネル筋緊張症が、先天性異常筋緊張症（ｐａｒａｍｙｏｔｏｎｉａ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａ）である、請求項４〜５のいずれか１項に記載の使用のためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項９】
前記筋緊張性障害が筋緊張性ジストロフィーである、請求項１〜２のいずれか１項に記載の使用のためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項１０】
前記筋緊張性ジストロフィーが筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）または筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）である、請求項９に記載の使用のためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項１１】
筋緊張性障害に関連する筋緊張性症状の１つ以上を緩和することにおける、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
筋緊張性症状が、骨格筋のこわばり、痙攣および疼痛を含む群から選択される、請求項１１に記載の使用のためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項１３】
サフィナミドが、そのメタンスルホネート（メシレート）塩の形成である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項１４】
サフィナミドまたはその薬学的に許容される塩が、薬学的担体、ビヒクルおよび／または賦形剤と組み合わせて医薬組成物中に含まれる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用のためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項１５】
筋緊張性障害に使用するための薬学的担体および／または賦形剤と組み合わせて、サフィナミドまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物。
【請求項１６】
経口または非経口投与のための、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
メキシレチン耐性筋緊張性障害における使用のための、請求項１５〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
筋緊張性障害の治療またはその症状の緩和のための医薬の調製のためのサフィナミドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋緊張症の治療に使用するためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩に関する。特に、本発明は、筋緊張症が望ましくない態様である疾患または状態の治療に使用するための、サフィナミドまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
筋緊張症は、活性化後の骨格筋収縮の不随意持続と定義することができ、これは硬直と疼痛を引き起こす。
筋緊張症は筋線維膜の異常（病理学的筋細胞膜の過剰興奮）に起因し、筋肉が収縮後に弛緩するまでに、遅延の延長を齎し、そして、痛みを伴い、日常の運動活動および生活の質を著しく妨げる可能性がある。筋肉は合図で収縮を開始するが、神経信号が終わった後も電気的活動が続き、筋肉のこわばりや“ロッキングアップ”を引き起こす。
【０００３】
筋緊張性障害患者が経験する消耗性の、遅い筋弛緩は、活動電位（ＡＰ）の不随意発火によって引き起こされる。生理的条件では、静止筋膜コンダクタンスの７０〜８０％を占める塩素電流（塩素チャネルＣＩＣ−１を介する）が、筋Ｔ細管におけるＫ＋蓄積の脱分極作用を相殺し（ＡｄｒｉａｎおよびＢｒｙａｎｔ、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９７４；２４０：５０５−５１５）、電位依存性Ｎａ＋チャネルの開口を妨げるため、筋緊張症で観察される不随意ＡＰや反復放電が回避される。
骨格筋の塩素（ＣＬＣＮ１）及び／又はナトリウムチャネル（ＳＣＮ４Ａ）をコードする遺伝子の変異により、チャネルゲートの複数の欠陥が齎され、筋の過剰興奮及び筋緊張性放出が導かれる（ＢｕｒｇｅおよびＨａｎｎａ、Ｃｕｒｒ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２０１２；１２：６２−６９）。
【０００４】
筋緊張症は、非ジストロフィー性筋緊張症や筋緊張性ジストロフィーなどの筋緊張性障害に分類できる様々な遺伝的および後天性疾患の特有の症状である。
【０００５】
非ジストロフィー性筋緊張症（ＮＤＭ）は、心臓や消化管の筋肉に関与のない純粋な骨格筋疾患である。障害の型および重症度に応じて、筋緊張症は、脚、顔、手、尻、肩、足、まぶたから、人がはっきりと話す能力までのあらゆるものに影響を及ぼすことがある。感情的な驚き、寒さ、カリウムまたは運動は、筋緊張症の潜在的な誘因である。
【０００６】
より重度の症例では、ＮＤＭは疼痛および筋硬直のために慢性的に衰弱する可能性がある。重度新生児発作性弛緩性痙攣ＳＮＥＬ（Ｓｅｖｅｒｅ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｅｐｉｓｏｄｉｃ  Ｌａｒｙｎｇｏｓｐａｓｍｓ）と呼ばれる重症筋緊張状態の不幸な合併症として、周産期死亡（ｐｅｒｉｎａｔａｌ  ｄｅａｔｈ）が非常に少数例報告されている（Ｇａｙら、  Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ａ  ２００８；１４６：３８０−３８３、Ｌｉｏｎ−Ｆｒａｎｃｏｉｓら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２０１０；７５（７）：６４１−６４５）。Ｐｏｒｔａｒｏら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ２０１６；１３７（４）；Ｌｅｈｍａｎｎ−Ｈｏｒｎら、Ａｃｔａ  Ｍｙｏｌｏｇｉｃａ  ２０１７；ＸＸＸＶＩ：１２５−１３４）。ごく最近、ナトリウムチャネルにおける筋緊張性突然変異は、ＳＩＤＳの危険因子として特定されている（Ｓｕｄｄｅｎ  Ｉｎｆａｎｔ  Ｄｅａｔｈ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（Ｍａｎｎｉｋｋｏら、Ｌａｎｃｅｔ  ２０１８；３９１（１０１２９）：１４８３−１４９２）。
【０００７】
ＮＤＭは、骨格筋において排他的に発現する塩素またはナトリウムチャネル遺伝子における従来の点突然変異または欠失によって引き起こされるイオンチャネル障害に分類できる。ＮＤＭは、骨格筋ＮａＶ１．４ナトリウムチャネル（先天性異常筋緊張症およびナトリウムチャネル筋緊張症）をコードするＳＣＮ４Ａ遺伝子の機能獲得突然変異、または骨格筋ＣｌＣ−１塩化物チャネル（先天性筋緊張症）をコードするＣＬＣＮ１遺伝子の機能喪失突然変異によって引き起こされることが知られている。
【０００８】
突然変異した塩素チャネルの活性低下または突然変異したナトリウムチャネルの活性の増加が、高頻度活動電位放出の発生を伴う病理学的筋細胞膜の過剰興奮性を決定する。その結果、筋弛緩が困難になることが、筋緊張筋の特徴的な硬さの原因となる。
ＮＤＭには、例えば、トムセン先天性筋緊張症およびベッカー先天性筋緊張症のような、塩化物チャネル障害；および、例えば、高カリウム血性周期性麻痺を伴う／伴わない先天性異常筋緊張症およびナトリウムチャネル筋緊張症（ＳＣＭ）のようなナトリウムチャネル障害が含まれ、これらには、例えば、変動性筋緊張症、持続性筋緊張症およびアセタゾラミド応答性筋緊張症、Ｋ＋増悪筋緊張症、および重度新生児発作性弛緩性痙攣（ｓｅｖｅｒｅ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｅｐｉｓｏｄｉｃ  ｌａｒｉｎｇｏｓｐａｓｍ）（ＳＮＥＬ）が含まれる。すべての型の先天性筋緊張症は、骨格筋膜にのみ発現する塩素イオンチャネルＣｌＣ−１の機能喪失をもたらす突然変異によって引き起こされる。
【０００９】
上記に列挙したＮＤＭについての以下の臨床的記載および潜在的な治療選択肢は、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  Ｉｎｄｉａ、Ｊｕｌｙ−Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００８、Ｖｏｌ．５６、Ｉｓｓｕｅ  ３に発表されたＲｅｖｉｅｗ  Ａｒｔｉｃｌｅ  Ｍｙｏｔｏｎｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  Ａｍｉ  Ｍａｎｋｏｄｉから得られた。
【００１０】
トムセン先天性筋緊張症
トムセン先天性筋緊張症という名前は、デンマークの医師自身および常染色体優性遺伝パターンを有する彼の家族により、１８７０年代の疾患の最初の記述に由来する。症状は乳児期または小児期に始まる。患者は安静後の筋肉活性化で無痛性の筋硬直を報告する。筋緊張は、反復する筋肉の努力、いわゆるウォームアップ現象で低下することがある。感情的な驚き、寒さ、妊娠は筋緊張症を悪化させることがある。身体検査では、四肢の筋肥大や顔面筋の肥大を伴う運動器の外観を示すことがある。握力筋緊張症や眼瞼筋緊張症を呈する。患者は、四肢の傍脊柱筋および近位筋の筋緊張を反映して、数分間仰臥位になった後、すぐに立ち上がるのが困難になることがある。筋力は正常である。
【００１１】
ほとんどの患者で予後は良好である。身体障害性筋緊張の患者には、メキシレチン１５０ｍｇを１日２回経口投与し、最大用量３００ｍｇまで漸増し、１日３回経口投与することで便益が得られることがある。
【００１２】
ベッカー先天性筋緊張症
ベッカー筋緊張症は、常染色体劣性塩素チャネル筋緊張症（ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｍｙｏｔｏｎｉａ）である。この名前は、１９７０年代にこの状態を記述した研究者に由来する。臨床像には、一般化筋緊張症およびＴｈｏｍｓｅｎの筋緊張症に類似した筋肥大がある。しかしながら、重要な相違点がある：発症は潜行性で、小児期の後期に起こる；症状はしばしば発症時に、下肢（ｌｏｗｅｒ  ｅｘｔｒｅｍｉｔｉｅｓ）に起こる（いわゆる先天性上行性筋緊張症（ａｓｃｅｎｄｉｎｇ  ｍｙｏｔｏｎｉａ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａ）；一部の患者では緩徐に進行する筋力低下；数秒または数分間持続する近位筋の一過性の筋力低下で、数分間、仰臥位で安静にした（ｓｕｐｉｎｅ  ｒｅｓｔ）後、患者に素早く起きるように依頼することによって誘発されることがある；および下肢の筋肉のより顕著な肥大である。寒冷、長期の筋緊張、妊娠、月経、情緒的緊張（ｅｍｏｔｉｏｎａｌ  ｔｅｎｓｉｏｎ）への暴露は、筋緊張症を悪化させうる。身体診察では、特に下肢および肩周囲の筋肉を含む、筋肥大を伴う運動器の外観が明らかになる。一部の患者は、前腕、手および前頸部の筋萎縮を示すことがある。筋緊張症は、握力筋緊張症や眼瞼ラグ（ｅｙｅｌｉｄ  ｌａｇ）に加え、そしゃく筋、舌・頚筋を含む多くの筋群で容易に認められる。最も特徴的な所見は、仰臥位から起き上がることおよび階段を上昇することから生じる著しい困難性であり、これは、暖機現象に続けて、数段階上る後に徐々に改善する。これは、筋緊張症と筋力低下が組み合わさったためと考えられている。ほとんどの患者は、安静期間の後、活動時に筋力低下に気づく。一部の患者では、下肢の筋力低下が持続することがあり、日常生活動作に障害を来すことがある。下肢では筋伸張反射が低下することがある。クレアチンキナーゼ（ＣＫ）値が上昇することがある。反復神経刺激と短時間運動試験は、複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）振幅（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  （ＣＭＡＰ）  ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）の低下を示すことがある。長時間運動試験はわずかな減少を明らかにすることがあり、これは、トムセン筋緊張症の特徴ではない。ほとんどの患者は良好な生活の質を享受する。症状はゆっくりと進行するだけで、患者が３０年後に安定することがある。治療は、活動修飾（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）、筋緊張および筋力低下の誘因の回避に向けられる。身体障害性筋緊張症の患者において、メキシレチン、トカイニドまたはアセタゾラミドを含む薬理学的治療が有益である場合もある。
【００１３】
先天性異常筋緊張症（ＰＭＣ）（Ｐａｒａｍｙｏｔｏｎｉａ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａ（ＰＭＣ））
先天性異常筋緊張症とは、特に寒冷時に運動により悪化する筋緊張症をいう。症状は、乳児期または小児期に始まる。典型的な症状は、乳幼児期に泣いたり、または、冷水で顔を洗ったりした後の長期の眼の閉鎖、およびアイスクリームを食べた後の「冷凍舌」を含む。一部の患者は、低温で運動した後に弛緩性脱力（ｆｌａｃｃｉｄ  ｗｅａｋｎｅｓｓ）を報告することがある。カリウムの摂取、安静、その後の運動および長時間の絶食も、異常筋緊張症を悪化させることがある。身体診察では、眼瞼異常筋緊張（ｅｙｅｌｉｄ  ｐａｒａｍｙｏｔｏｎｉａ）が顕著であり、持続的な閉眼または長期の上方注視後の持続的な眼瞼後退（ｌｉｄ  ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ）の後に眼を開けられないこととして現れる。まぶたにアイスパックを置くと、異常筋緊張症を悪化させることがある。ハンドグリップ運動の前に氷冷水に１０〜１５分間手を浸すと、異常筋緊張症およびその後の脱力が引き起こされることがある。運動および感覚神経伝導検査は正常である。５Ｈｚでの反復神経刺激は、ＣＭＡＰ振幅の減少をもたらし得る。同様に、寒冷暴露後の短い運動試験もまた、応答の減少をもたらし得る。筋電図（ＥＭＧ）では多くの筋に、筋緊張が認められる。細動電位および陽性の鋭い波は、寒さへの暴露後に明らかになることがある。極度の寒冷暴露では、無痛性の筋拘縮が起こることがある。単一ファイバのＥＭＧは、ジッタ（ｊｉｔｔｅｒ）の増加および時にはブロッキングを示すことがある。診断には筋生検の適応はない。ほとんどの患者では、運動や寒冷暴露などの誘因を避けることは良好な生活の質を維持するのに十分である。メキシレチンは、障害性異常筋緊張症に使用できる。
【００１４】
カリウム感受性筋緊張症
ナトリウムチャネル筋緊張性障害には３つの異なるものがあり、それらにおいて、筋緊張症は、カリウム摂取により筋緊張症が悪化する。寒冷暴露は、先天性異常筋緊張症のように、筋緊張症を悪化させないのが一般的である。脱力は顕著な症状ではない。
変動性筋緊張症（Myotonia fluctuans）は、カリウム摂取または運動によって誘発される一般的な筋緊張を特徴とする。異常筋緊張症とは対照的に、患者は、最初の運動後にウォームアップ効果を示すことがあるが、筋緊張症は、約２０〜４０分の安静期間に続く２回目の運動後に、筋緊張症がより顕著になる。患者は、数時間から数日間続く明らかな筋緊張症状のない期間を有する筋緊張症の重症度の変動を報告する。筋肉のバルクと筋力は正常である。ＣＫレベルは、２〜３倍上昇し得る。筋電図（EMG）は筋緊張および細動電位を明らかにすることがある。神経伝導検査は正常である。筋生検では、内部核の増加、線維サイズのばらつきおよび筋細胞膜下空胞（sub-sarcolemma vacuoles）などの軽度の異常が明らかになることがある。ほとんどの患者は投薬を必要としない。カリウムに富む食品の単純な回避で十分であり得る。メキシレチンは、身体障害を来す筋緊張性硬直を緩和するのに有用となりうる。
【００１５】
持続性筋緊張症（Ｍｙｏｔｏｎｉａ  ｐｅｒｍａｎｅｎｓ）は、非ジストロフィー性筋緊張症のまれで重度の型である。臨床像には、１０歳前の発症、重度の一般化筋緊張症、および筋肥大がある。筋力低下は顕著ではない。肋間筋を含む重度の筋緊張症は、低酸素血症およびアシドーシスを伴う呼吸障害をもたらすことがある。カリウムの摂取と運動は、筋緊張の通常の誘因である。筋電図（ＥＭＧ）は、正常な運動単位電位を有する一般的な筋緊張症を明らかにする。メキシレチンは筋緊張性硬直を部分的に緩和することがある。アセタゾラミドは、運動による筋肉のこわばりやけいれんを和らげるのに役立つ。
【００１６】
アセタゾラミド−応答性筋緊張症は、カリウム摂取、寒冷および絶食により悪化する一般的な筋緊張と、アセタゾラミドによる優れた回復を特徴とする。患者は小児期に進行性の一般的な筋緊張症を呈するが、これは臨床検査および筋電図（ＥＭＧ）により容易に明らかになる。眼瞼異常筋緊張症が一部の患者でみられることがある。筋緊張性硬直は痛みを伴うことがある。運動は一般に、筋緊張に有意な影響を及ぼさない。治療にはアセタゾラミドを用い、開始用量は１日１２５ｍｇとし、必要であれば１日３回２５０ｍｇまで漸増する。副作用には、腎結石形成、感覚異常、悪心、錯乱、気分過敏性、うつ病、発疹および肝機能異常などがある。全血球数および肝機能を定期的にモニタリングすることが推奨される。メキシレチンも、筋緊張を軽減できる。
【００１７】
ＮＤＭは進行性の筋力低下と全身性の特徴がないため、筋緊張性ジストロフィーとは異なる。
筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）は、進行性ミオパチー、筋緊張、多臓器病変を特徴とする疾患である。
筋緊張症の存在は、ＤＭの最も身体障害をもたらす態様ではないが、病態の認識されている特徴であり、筋ジストロフィーの他の病型と区別する疾患の態様である。
現在までに、同様の突然変異によって引き起こされる２つの異なる形態が同定されている：筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）と筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）である。
特に、ＤＭ１及びＤＭ２は、それぞれ１９番及び３番染色体のヌクレオチドリピートの伸長による遺伝性のヒト疾患である（Ｍｅｏｌａ、Ａｃｔａ  Ｍｙｏｌ、２０１３；３２（３）：１５４−１６５）。このような変化は、毒性ＲＮＡの核への蓄積につながり、多くの細胞種で正常なタンパク質のプロセシングに影響を及ぼす。したがって、ＤＭ１およびＤＭ２は例えば、ＣＮＳ、心臓、および骨格筋を冒す多臓器性疾患である。後者において、ＣｌＣ−１チャネルは、この毒性プロセスの標的である。ＣｌＣ−１タンパク質の減少およびそのスプライシングの改変はＤＭ１およびＤＭ２患者における筋緊張症の主な原因である（Ｃｈａｒｌｅｔ−Ｂら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００２；１０（１）：４５−５３；Ｍａｎｋｏｄｉら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ）。２００２；１０（１）：３５−４４；およびＣｈｅｎら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００７；３６８（１）：８-１７）．
【００１８】
現在、筋緊張症治療薬は、病理学的な筋細胞膜の過剰興奮性を低下させることを目的としている。これらの投薬はメキシレチンを含む（Ｌｏｇｉｇｉａｎら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２０１０；７４（１８）：１４４１−１４４８）。
【００１９】
発明の概要
本発明者らは、病理学的筋細胞膜の過剰興奮の減少を介して作用する抗筋緊張性薬物を探索し、サルフィナミドが、単離した筋緊張性筋線維における筋細胞膜の興奮を回復させ、筋緊張症の薬物学的に誘発されたラットモデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで筋緊張症状を軽減することができることを見出した。したがって、本発明は、この知見に依拠し、それを必要とする筋緊張性障害を有する患者を治療するための抗筋緊張性薬物としてのサフィナミドに言及する。
本発明はまた、筋緊張性障害における使用のための、適切な賦形剤、ビヒクルまたは担体と組み合わせて、サフィナミドまたはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、９−アントラセンカルボン酸（９−ＡＣ）により誘発された、筋緊張症様状態におけるラット骨格筋線維興奮に対するサフィナミドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗筋緊張作用を示したものである。骨格筋線維興奮（スパイクの最大数、Ｎスパイク）を、投与前（対照、ｃｔｒｌ）、５０μＭの９−ＡＣ単独投与後、および６つの異なる濃度（０．１〜３０μＭ）でのサフィナミドの同時投与後に測定した。抗筋緊張効果は、サフィナミドのウォッシュアウト（５０μＭ  ９−ＡＣ、右端のカラム）で可逆的であった。結果は、平均±標準誤差；Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ９−ＡＣ単独、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｔ検定で表した。
【００２１】
【図２】図２は、先天性筋緊張症の薬理学的誘発ラットモデルにおけるサフィナミドのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗筋緊張についての用量−反応効果を示す。０．３、１、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ（それぞれ：黒三角、灰色円、白丸、黒丸、灰色三角；ビヒクル単独：白四角）で経口投与したサフィナミドは、ラットにおける筋緊張の徴候として、９−アントラセンカルボン酸（９−ＡＣ、３０ｍｇ／ｋｇ）誘発時間正向反射（ＴＲＲ）延長を打ち消すことができた。結果は、平均±標準誤差、ｎ＝５〜７のラット；ビヒクルに対してＰ＜０．０５、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｔ検定で表した。
【００２２】
発明の詳細な説明
したがって、本発明は、病理学的筋細胞膜過興奮によって引き起こされる状態、および／または正常な筋細胞膜興奮の回復が治療上の利益または改善をもたらし得る任意の他の状態（このような状態は筋緊張性障害である）の処置における使用のためのサフィナミドまたは薬学的に許容されるその塩に関する。
実際、筋緊張性障害を有する患者の３０％までが、メキシレチン（筋緊張性障害における参照薬物）が無効であることを見出す（Ｄｅｓａｐｈｙら、２０１３；Ｓｕｅｔｔｅｒｌｉｎら、ＪＡＭＡ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０１５  Ｄｅｃ；７２（１２）：１５３１−３；Ｐｏｒｔａｒｏら、２０１６）。
本発明の目的のために、メキシレチンが無効である筋緊張性障害は、メキシレチン耐性と定義されており、本発明のさらなる実施形態は、メキシレチン耐性筋緊張性障害の治療におけるサフィナミドの使用に関する。
さらに、本発明は、筋緊張性障害の治療における使用のためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩に関し、ここで、筋緊張性障害は、好ましくは非ジストロフィー性筋緊張症（ＮＤＭ）である。
【００２３】
さらに好ましくは、サフィナミドが有益であると思われるＮＤＭ患者が、ＳＣＮ４Ａ遺伝子にミスセンス突然変異を有する。実際、いかなる特定の理論にも束縛されることなく、実験の部でより詳細に説明されるように、静止膜電位で、および反復脱分極パルス後に、ＩＣ５０値として測定されるサフィナミド力価は、ｈＮａｖ１．４チャネルにおけるミスセンス突然変異でトランスフェクトされた細胞において、野生型と比較して減少しないことが見出された（Ｄｅｓａｐｈｙら、２００１、２００３および２０１６）。使用依存性および頻度依存性の方法で、ナトリウムチャネルを遮断することができる化合物は、異常な発火を減少させるが、正常な筋線維活性に影響を与えないままにすることが予想される。
反対に、ｈＮａｖ１．４の点突然変異をトランスフェクトした細胞では、メキシレチンの効力が有意に低下した。
【００２４】
さらなる実施形態では、本発明がＮＤＭの治療に使用するためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩に関し、そのようなＮＤＭは、好ましくは、先天性筋緊張症、例えば、トムセン先天性筋緊張症またはベッカー先天性筋緊張症、先天性異常筋緊張症またはナトリウムまたは塩素チャネル筋緊張症であり；より好ましくは、前記ナトリウムチャネル筋緊張症が、ｈＮａｖ１．４ｖチャネル障害であり、それを必要とする患者は、ｈＮａｖ１．４チャネルをコードするＳＣＮ４Ａ遺伝子における突然変異のキャリアである。
【００２５】
さらなる実施形態では、本発明が、先天性筋緊張症の治療に使用するためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩に関し、このような先天性筋緊張症は、Ｔｈｏｍｓｅｎ先天性筋緊張症またはＢｅｃｋｅｒ先天性筋緊張症である。
【００２６】
好ましい実施形態において、本発明は、先天性異常筋緊張症の治療における使用のためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩に関する。
さらに、本発明は、ナトリウムチャネル筋緊張症の治療に使用するためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩に関し、そのようなナトリウムチャネル筋緊張症は、変動型筋緊張症（ｍｙｏｔｏｎｉａ  ｆｌｕｃｔｕａｎｓ）、持続型筋緊張症（ｍｙｏｔｏｎｉａ  ｐｅｒｍａｎｅｎｓ）またはアセタゾラミド応答性筋緊張症である。
【００２７】
さらに、本発明は、筋緊張性障害の治療に使用するためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩に関し、このような筋緊張性障害は、好ましくはＤＭである。
よりさらに、本発明は、ＤＭの治療に使用するためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩に関し、このようなＤＭは、好ましくはＤＭ１およびＤＭ２から選択される。
好ましい態様において、本発明は、先天性筋緊張症の治療に使用するためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩に関する。
別の態様において、本発明は上記で定義される状態に関連する筋緊張症状の１つ以上を緩和する際に使用するためのサフィナミドまたはその薬学的に許容される塩に関し、筋緊張症状は骨格筋のこわばり、痙攣、および疼痛を含む。本発明によれば、サフィナミドは、次式の（２Ｓ）−２−［［［４−［（３−フルオロフェニル）メトキシ］フェニル］メチルアミノ］プロパンアミドである：
【００２８】
2021525716.tif 000003
サフィナミドは、好ましくは薬学的に許容される塩の形成である。サフィナミドの薬学的に許容される塩には、無機酸、例えば硝酸、塩酸、硫酸、過塩素酸およびリン酸との付加塩、または有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸およびサリチル酸との付加塩が含まれ、サフィナミドメタンスルホネート（メシレート）が好ましい塩である。
【００２９】
本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」および「ａｎ」は冠詞の文法的目的の１つまたは２つ以上（例えば、少なくとも１つ）を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「疾患」、「障害」または「状態」は、交換可能に使用される。
本明細書中で使用される場合、用語「治療する」または「治療」は、このような用語が適用される障害もしくは状態、またはこのような障害もしくは状態の１つ以上の症状の逆転、軽減、進行の阻害、または予防を含む、所望の薬理学的効果を得ることをいう。
【００３０】
サフィナミドまたはその薬学的に許容される塩は、典型的には医薬組成物に含まれる。
上記で定義され、本発明による筋緊張性障害の治療のための医薬組成物は、サフィナミドまたはその薬学的に許容される塩を、所望の治療効果または筋緊張性障害の症状の軽減のいずれかを提供するのに十分な有効量で含む。医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【００３１】
本発明による医薬組成物は全身的／末梢的または局所的（すなわち、所望の作用部位）にかかわらず、任意の簡便な投与経路によって対象／患者に投与され得る。
本発明による医薬組成物は、経口投与、局所投与、経皮投与、非経口投与およびそれらの組み合わせのために製剤化することができる。好ましい組成物は、経口または非経口投与用である。経口投与のための適切な形態としては、錠剤、圧縮されたまたはコーティングされた丸剤、サシェ、トローチ、顆粒、硬質または軟質ゼラチンカプセル、舌下錠、シロップ、溶液、および懸濁液が挙げられ；非経口投与のためには本発明が水性または非水性溶液またはエマルジョンを含むアンプルまたはバイアルを提供し；直腸投与のためには親水性または疎水性ビヒクルを有する座薬が提供され；そして軟膏および経皮送達としての局所適用のためには当該分野で公知の適切な送達システムが提供される。
本発明による医薬組成物はそれ自体公知であり、当業者によく知られている方法によって調製することができる。
【００３２】
サフィナミドまたはその薬学的に許容される塩および／またはそれを含有する医薬組成物の投与方法は、被験者の型、年齢、体重、性別および医学的状態、前記状態に関連する状態および／または筋緊張性症状の重症度、ならびに投与経路を含む様々な因子に基づく。
したがって、投与法は大きく異なる可能性がある。サフィナミドまたはその薬学的に許容される塩の約５〜約５００ｍｇ／日の用量レベル（単回または分割用量で投与される）は、上記の状態の治療に有用である。一実施形態では、全１日用量が典型的には約１０〜約２５０ｍｇである。別の実施形態では、全１日用量が典型的には約５０〜約１００ｍｇである。
【００３３】
サフィナミドメタンスルホネートのフィルムコーティング口腔用錠剤は、５０ｍｇおよび１００ｍｇの投与量で、現在、トレードネームＸａｄａｇｏ(R)で市販されている。
本発明によれば、サフィナミドの抗筋緊張活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（筋緊張性骨格筋線維における筋細胞膜過剰興奮性）及びｉｎ  ｖｉｖｏ（塩化物コンダクタンスの遺伝的損失が筋弛緩及び筋硬直の障害を引き起こす、ヒトの病理学的条件を模倣した先天性筋緊張症の薬理学的誘発ラットモデル）の両方で筋緊張条件を模倣した実験プロトコールを用いることによって評価されている；Ｄｅｓａｐｈｙら、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２０１３，６５：２１−７；及びＤｅｓａｐｈｙら、Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２０１４；２５５：９６−１０２）。
【００３４】
以下の実施例およびそれらに付随する図１および図２は、本発明の範囲を限定することなく、本発明を例示する。
【００３５】
実験部
実施例１．ラット骨格筋線維におけるサフィナミドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗筋緊張活性
サフィナミドの抗筋緊張活性は、２微小電極電流クランプ法を用いて、単離した長指伸筋（Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  Ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ  Ｌｏｎｇｕｓ）（ＥＤＬ）の単一筋線維における筋細胞膜興奮を記録することにより評価した。先天性筋緊張症のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、９−アントラセンカルボン酸（９−ＡＣ）とラットＥＤＬ筋肉をインキュベートすることにより得られた（Ｃｏｎｔｅ  Ｃａｍｅｒｉｎｏら、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ．１９８９；１２（１１）：８９８−９０４）。Ａｌｔａｍｕｒａら、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１８；１７５（１０）：１７７０−１７８０）。骨格筋ＣｌＣ‐１塩素チャネルの遮断を介した９‐ＡＣにより引き起こされる筋細胞膜興奮の増加は、先天性筋緊張症に罹患した患者で観察された異常な活動電位発火を模倣した。
【００３６】
ＥＤＬ筋を、深麻酔下（８０ｍｇ／ｋｇのｉｐケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇのｉｐキシラジン投与）で、雄Ｗｉｓｔａｒラットから切開した。筋肉を、３０℃に維持した２５ｍＬの筋肉浴槽に入れ、生理食塩水（９５％  Ｏ２および５％  ＣＯ２のガスを通した；ｐＨ＝７．２〜７．３）で潅流した。標準的な２細胞内‐微小電極技術の手段により、筋線維の静止膜電位および興奮性特性（スパイク数）を電流クランプモードで測定した。サンプリングされた繊維の興奮性特性は、方形波定常（１００ｍｓ）電流パルスに対する細胞内膜電位応答を記録することによって決定された。各ファイバにおいて、膜電位は脱分極パルスを通過させる前に、定常保持電流を−８０ｍＶに設定された。パルスの振幅を増加させることによって、我々は第１の単一活動電位を誘発することができ、同じファイバにおいて電流強度をさらに増加させることによって、誘発可能なスパイク（Ｎスパイク）の最大数を測定した（Ｐｉｅｒｎｏら、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６；１４９（７）：９０９−１９）。
【００３７】
ダントロレンナトリウム（２ｍｇ／Ｌ）で、不当な筋収縮が妨げられた。細胞興奮性パラメーター（Ｎスパイク）を、投与前（対照）、９−ＡＣ単独の５０μＭ後、および６つの種々の濃度（０．１〜３０μＭ）のサフィナミドの同時投与後に測定した。これらの実験条件において、サフィナミドメタンスルホネートを使用し、蒸留水中のストック溶液（１０ｍＭ）として溶解し、次いで、筋肉浴溶液中で最終濃度に希釈した。１匹の動物を用いて、２つの濃度のサフィナミドを試験した：各ＥＤＬ筋肉において１つの濃度。
【００３８】
図１に示すように、９−ＡＣは、Ｎスパイクを６０％増加させることによって、筋緊張様状態を誘導した。１、５、１０および３０μＭのサフィナミドは、Ｎスパイクを、それぞれ、２２±６％、３５±５％、４２±５％および６０±６％有意に減少させ（Ｐ＜０．０５  対９‐ＡＣ単独、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉのｔ検定）、したがって、筋細胞膜性興奮（ｓａｒｃｏｌｅｍｍａ  ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ）を回復させた。ＩＣ５０（９−ＡＣの効果を、５０％減少させることができる濃度で、濃度−応答曲線への当て嵌め（ｆｉｔ）から計算したもの）は、１３．４±２．４μＭ（当て嵌めに±標準誤差）であった。抗筋緊張効果は、サフィナミドのウォッシュアウト（９−ＡＣ、５０μＭ）で可逆的であった。
注目すべきことに、同じ試験において、メキシレチンのＩＣ５０は、３倍を超えて高く、より低い力価を示した。
【００３９】
実施例２．先天性筋緊張症ラットモデルにおけるサファナミドのｉｎ−ｖｉｖｏ抗筋緊張活性に関する研究
筋緊張症は、骨格筋ＣｌＣ−１塩素チャネルの公知のブロッカーである、９−ＡＣの腹腔内注射によってラットにおいて誘導された（Ｃｏｎｔｅ  Ｃａｍｅｒｉｎｏら、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ．１９８９；１２（１１）：８９８−９０４）。Ａｌｔａｍｕｒａら、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１８；１７５（１０）：１７７０−１７８０）．
【００４０】
雄Ｗｉｓｔａｒラット（２５０〜３００ｇ）を使用した。実験は、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓにしたがって、かつ、Ｉｔａｌｉａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔの承認ｎ．１９４／２０１８−ＰＲを得て行なわれた。実験者には治療法について盲検化された。
【００４１】
この動物モデルでは、９‐ＡＣは、ＣｌＣ‐１チャネルをコードするＣＬＣＮ１遺伝子の機能喪失変異によるヒト疾患である、iｎ  ｖｉｖｏ先天性筋緊張症を模倣する。９‐ＡＣ注射後、ラットは、特に後肢で明らかな筋硬直、および移動困難性を示した。それにもかかわらず、動物は完全に意識し、警戒したままであった。呼吸は正常であった。予想外の騒音を聞くと、動物は,その場でのジャンプによって反応したが、筋肉のこわばりのために離れるのが非常に困難であった。筋緊張は、正向反射の時間（ＴＲＲ、仰臥位に置かれたラットがその４つの足を元に戻すのに必要な時間）を測定することにより評価した。ラットでは、９−ＡＣ注射の前に、ＴＲＲは０．５秒未満であった。ＴＲＲは、９−ＡＣ後１０分で約２秒まで劇的に延長され、９−ＡＣ後３０分で約４秒までさらに増加した。その後、ＴＲＲは時間とともに徐々に減少し、９‐ＡＣ後３時間で１秒に近かった。抗筋緊張薬物は、９‐ＡＣ誘導ＴＲＲ延長に対抗することが期待される。
【００４２】
ＴＲＲを、９−ＡＣの約１０分前（時間０）および９−ＡＣの１０、３７、６７、１２７および１８７分後（３０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ）に評価した。各時点で測定されたＴＲＲは、（ウォームアップ効果を限定するために）１分間隔での７回の測定の平均であった。サフィナミドメタンスルホネート（遊離塩基として、１０および３０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを、９−ＡＣ注射の１７分後に、ラットに強制経口投与した。９−ＡＣおよびサフィナミドメタンスルホネートを、それぞれ重炭酸塩および０．９％ＮａＣｌ溶液に溶解した。ラット間の比較を可能にするために、各時点で測定されたＴＲＲを、同じラットにおける９−ＡＣ注射の１０分後に測定されたＴＲＲの関数として正規化した。次いで、各用量について平均データを、平均値±標準誤差として計算した。統計処理は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）後にａｄ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｔ検定を用いて行った。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とみなした。
【００４３】
図２に示すように、ビヒクル処置ラットでは、９−ＡＣ注射の３７、６７および１２７分後にＴＲＲの有意な増加が観察された。ピーク効果（３７分と６７分）で、サフィナミドとの同時処理は、９‐ＡＣ誘導ＴＲＲ延長を、用量依存的かつ有意に打ち消し、その効果は１２０分まで持続したことから、ｉｎ  ｖｉｖｏのサフィナミドが、先天性筋緊張症のラットモデルにおいて抗筋緊張活性を有することが実証された。
【００４４】
このｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、漸増用量（遊離塩基として０．３、１、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ）でのサフィナミドメタンスルホネートの用量応答曲線も研究した。ラット間の比較を可能にするために、各時点で測定されたＴＲＲを、同じラットにおける９−ＡＣ注射の１０分後に測定されたＴＲＲの関数として正規化した。その後、各薬物／用量の平均データを平均値±標準誤差として算出した。統計解析は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）後にａｄ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｔ検定を用いて行う。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とみなした。
【００４５】
結果を図２に示し、これは、ビヒクル処置ラットにおいて、ＴＲＲの有意な増加が９−ＡＣ注射の３７、６７および１２７分後に観察されたことを示す。サフィナミドによる治療は、９‐ＡＣ誘導ＴＲＲ延長を、用量依存的かつ有意に打ち消した。実際、経口によるサフィナミドは、ラットの筋緊張症の兆候として、９−アントラセンカルボン酸（９−ＡＣ）により誘発された正向反射の時間（ＴＲＲ）の長期化に対抗することができた。
【００４６】
特に、３７分で、ＴＲＲの減少は、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇサフィナミドで有意であった。６７分（９−ＡＣピーク効果）で、ＴＲＲ阻害は、１ｍｇ／ｋｇサフィナミドのより低い用量でも有意であった。１２７分では、１０および３０ｍｇ／ｋｇのみが有意な阻害を生じた。６７分後の用量応答曲線の分析は、１．２ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０（ＴＲＲ延長における、５０％阻害の有効用量）および１０〜３０ｍｇ／ｋｇの用量で得られた６６％の最大効果、ｉｎ  ｖｉｖｏのサフィナミドが先天性筋緊張症のラットモデルにおいて有意な抗筋緊張活性を与えることを実証することを明らかにした。
注目すべきは、同じ試験で、筋緊張症の参照薬であるメキシレチンは、効力が約６倍低かったことである。
【００４７】
実施例３．トランスフェクトされた細胞株における、選択されたヒトＮａｖ  １．４筋緊張症突然変異に対するサフィナミドのインビトロの効果
ｈＮａｖ１．４の４０を超える異なる突然変異が、いくつかの表現型が異なるヒト常染色体優性遺伝性骨格筋障害に関連付けられている（Ｃｕｍｍｉｎｓ  ＆  Ｂｅｎｄａｈｈｏｕ、２００９；Ｊｕｒｋａｔ−Ｒｏｔｔら．２０１０）。
【００４８】
Ｎａｖ１．４チャネルは、主に骨格筋に発現しており、そして、筋肉の、より小さいβ−サブユニットと結合した、２６０ｋＤａのα−サブユニットから構成されている。α−サブユニットは、４つの相同ドメイン（Ｉ〜ＩＶ）からなり、そして、各ドメインは６つの膜貫通セグメント（Ｓ１〜Ｓ６）を有する（Ｎｏｄａら、１９８４）。周期性麻痺または非ジストロフィー性筋緊張症に至る、Ｎａｖ１．４チャネル突然変異は、このチャネルの各ドメインおよびセグメントに亘って認められており、そして、チャネルの動態または機能を変化させることにより、筋の過剰興奮性または興奮不能の原因であり、それによりチャネルのミクローまたはマクロ−な生物物理学的特性において、変化をもたらす可能性がある。筋緊張症に関連する、いくつかのＮａｖ１．４チャネル突然変異は、速い不活性化を遅くすること、速い不活性化からの回復速度を増加させること、不活性化を遅くすること、または活性化の電圧依存性をより負の電位にシフトさせることによって、チャネル機能を変化させることが記載されている（Ｃｕｍｍｉｎｓ  ＆  Ｂｅｎｄａｈｈｏｕ、２００９）。
【００４９】
サフィナミドの効果を、不活性化部位に位置するいくつかのｈＮａｖ１．４点突然変異に対して評価した。
ｐ．Ｐ１１５８Ｌ：この突然変異は、アルジェリアの若い女児に見出され、重度の持続型筋緊張症（ｙｏｔｏｎｉａ  ｐｅｒｍａｎｅｎｓ）に関連している（Ｄｅｓａｐｈｙら、２０１６）。
ｐ．Ｖ１２９３Ｉ：Ｖ１２９３Ｉ突然変異は、ナトリウムチャネル筋緊張症から、先天性異常筋緊張症＋低カリウム血性周期性四肢麻痺に至るまで、様々な表現型に関連している（Ｋｏｃｈら、１９９５）。
ｐ．Ｆ１２９８Ｃ：この突然変異は、３５歳の女性に認められ、主に、収縮後の、顔面、上下肢筋肉のこわばりで、３２歳時に発症した（Ｆａｒｉｎａｔｏら、２０１９）。症状は、寒冷とともに悪化し、筋緊張症は痛みを伴うと報告された。患者は運動による筋緊張症の軽度改善に気付いた。
ｐ．Ｉ１３１０Ｎ：この突然変異は、フランスの近親者５名に見出されており、ナトリウムチャネル筋緊張症に関連している（Ｆａｒｉｎａｔｏら、２０１９）。
野生型または筋緊張性突然変異体である、電位依存性Ｎａ＋チャネル（ｈＮａｖ１．４）のヒト骨格筋サブタイプを、リン酸カルシウム共沈法を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトした。細胞全体のナトリウム電流（ＩＮａ）を、Ａｘｏｎコンベンショナル  パッチ−クランプハードウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて、室温（２０〜２２℃）で記録した。電圧クランププロトコルおよびデータ取得は、ｐＣＬＡＭＰソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて行った。浴液は（ｍＭ）１５０  ＮａＣｌ，４  ＫＣｌ，２  ＣａＣｌ２，１  ＭｇＣｌ２，５  ＮａＨＥＰＥＳ，および、５  グルコース（ｐＨ７．４）を含んでいた。ピペット溶液は（ｍＭで）１２０  ＣｓＦ、１０  ＣｓＣｌ、１０  ＮａＣｌ、５  ＥＧＴＡ、および、５  Ｃｓ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を含有した。Ｃｏｒｎｉｎｇ  ７０５２ガラス（Ｋｉｎｇ  ｇｌａｓｓ、ＵＳＡ）で作製されたパッチピペットは、１〜３ＭΩの範囲の抵抗を有した。静電容量電流は、増幅回路を用いて部分的に補填した。５ｍＶ未満の直列抵抗誤差を示す細胞から得られたデータのみを分析のために考慮した。パッチ膜を破壊した後、−１２０ｍＶの保持電位（ｈｐ）から、−２０ｍＶまでの２５ｍｓの長さの試験パルスを、ＩＮａ振幅および動力学の安定化が達成されるまで（典型的には５分）、低頻度で細胞に印加した。サフィナミドを、０．２％のＤＭＳＯを補充した浴溶液中で最終濃度で可溶化した。パッチした細胞を、対照または薬物補充浴溶液の連続流に暴露した。最大２つの薬物濃度を各細胞で試験し、ナトリウム電流流出による可能なバイアスを最小化した。全細胞実験中の電圧依存性の既知の自発的シフトのために、細胞間の比較を可能にするために、一定のシークエンスに関して種々のプロトコールを実施するために多くの注意が払われた。
【００５０】
サフィナミドによるｈＮａｖ１．４チャネルの阻害を、０．１および１０Ｈｚの周波数刺激で、−１２０から−３０ｍＶの保持電位（ＨＰ）から誘発されるＩＮａの減少を測定することによって評価した。サフィナミドの濃度−応答曲線は、薬物（ＩＤＲＵＧ）の存在下で測定し、薬物適用前に同じ細胞で測定されたピーク電流振幅（ＩＣＴＲＬ）に対して正規化した、ピーク電流振幅を得ることによって、薬物濃度［（ＤＲＵＧ）］の関数として、作製した。濃度−応答曲線を、一次結合関数に適合させた：
ＩＤＲＵＧ／ＩＣＴＲＬ＝１／｛１＋（［ＤＲＵＧ］／ＩＣ５０）ｎＨ｝
ここで、ＩＣ５０は半最大阻害濃度であり、ｎＨは勾配係数である。ＩＣ５０値は、静止膜電位（持続性ブロック：０．１Ｈｚで−１２０ｍＶ）および１０Ｈｚで−２０ｍＶまで反復脱分極パルス後（使用依存性および頻度依存性ブロック）に、決定した。使用依存性および頻度依存性ブロックの方法でナトリウムチャネルを遮断することができる化合物は、異常な発火を減少させるが、正常な筋線維活性に影響を与えないことが予想される。
表１は、トランスフェクトされた細胞株におけるヒトＮａｖ１．４ナトリウムチャネル筋緊張症突然変異体に対するサフィナミドのインビトロ効果を示す。結果は、ＩＣ５０値±当てはめの標準誤差（ＳＥ）（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｅｒｒｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｔ）で表された。
【００５１】
2021525716.tif 000004
【００５２】
表１に示される結果は、ＩＣ５０値が野生型と同じ大きさのオーダーであったので、選択された変異が両方の頻度（０．１Ｈｚおよび１０Ｈｚ）でサフィナミドの活性（ＩＣ５０）に有意な影響を及ぼさなかったことを実証する。ｈＮａｖ１．４チャネルの突然変異のキャリアは、現在使用されている薬物よりも、サフィナミドでより多くの利益を得る可能性がある。
これらの結果は、筋緊張性障害の突然変異主導療法の道を開く。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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