(57)【要約】本明細書では、所望の、又は所定の、又は予め選択されたレベルの総非フコシル化（ＴＡＦ）グリコフォームを含む抗体組成物を産生する方法が提供される。代表的な実施形態において、本方法は、所望されるＴＡＦグリコフォームのレベルに応じて、本明細書に記載されるとおりの特定の濃度でフコース及び／又はグルコースを含む細胞培養培地中においてグリコシル化適格細胞を維持することを含む。グリコシル化タンパク質及びそのＴＡＦグリコフォームを含む関連組成物も本明細書中で提供される。細胞培養培地もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体組成物を産生する方法であって、前記抗体組成物中の総非フコシル化（ＴＡＦ）グリカンのレベルが、約１０％未満であり、前記方法が、フコースを含む細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持することを含み、フコースが、約０．１７ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、方法。
【請求項２】
抗体組成物を産生する方法であって、前記抗体組成物中の総非フコシル化（ＴＡＦ）グリカンのレベルが、約１０％未満であり、前記方法が、フコースを含む細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持することを含み、フコースが、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在し、且つ前記グリコシル化適格細胞が、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されない、方法。
【請求項３】
抗体組成物を産生する方法であって、フコース及びグルコースを含む細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持することを含み、フコースが、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在し、且つグルコースが、約１０ｇ／Ｌ又はそれ未満の平均グルコース濃度を実現するグルコース供給スケジュールに従って前記細胞培養培地に添加される、方法。
【請求項４】
フコースが、約０．７５ｇ／Ｌ未満の濃度で前記培養培地中に存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
フコースが、約０．６ｇ／Ｌ未満の濃度で前記培養培地中に存在する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
フコースが、約０．２ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記フコースが、前記グリコシル化適格細胞が細胞培養中で維持される全期間において前記培養培地中に存在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
初期の期間に第１の細胞培養培地中で前記グリコシル化適格細胞を維持し、続いて第２の細胞培養培地中で前記グリコシル化適格細胞を維持することを含み、前記第１の細胞培養培地が、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度でフコースを含まず、且つ前記第２の細胞培養培地が、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度でフコースを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記初期の期間が、約２４〜約７２時間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記初期の期間が、約７２時間又は約７２時間超であるが１５６時間未満又は約１５６時間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
フコースが、細胞培養接種後の６日目に前記第１の培養培地に添加されて、前記第２の細胞培養培地が得られる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
フコースの前記濃度が、前記グリコシル化適格細胞がフコースを含む前記細胞培養培地中で維持される期間に約０．２ｇ／Ｌ又はそれ未満変動する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
フコースの前記濃度が、前記グリコシル化適格細胞がフコースを含む前記細胞培養培地中で維持される期間に約０．１ｇ／Ｌ又はそれ未満変動する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞培養培地が、初期の期間中に初期のグルコース濃度を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記初期のグルコース濃度が、約１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記初期のグルコース濃度が、約１２ｇ／Ｌ±１ｇ／Ｌである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
グルコース供給スケジュールに従って前記細胞培養培地にグルコースを添加することをさらに含む、請求項１、２、及び４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記グルコース供給スケジュールが、細胞培養接種後の約４〜約６日目に開始される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記グルコース供給スケジュールが、細胞培養接種後の約６日目に開始される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記グルコース供給スケジュールが、前記細胞培養培地中で約１０ｇ／Ｌ又はそれ未満の平均グルコース濃度を実現する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記グルコース供給スケジュールが、前記細胞培養培地中で約９ｇ／Ｌ又はそれ未満の平均グルコース濃度を実現する、請求項３及び１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記グルコース供給スケジュールが、前記細胞培養培地中で約６ｇ／Ｌ又はそれ未満の平均グルコース濃度を実現する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記グルコース供給スケジュールが、前記細胞培養培地中で約０．５ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌの平均グルコース濃度を実現する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記グルコース供給スケジュールが、前記細胞培養培地中のフコースの前記濃度に基づく平均グルコース濃度を実現する、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記平均グルコース濃度が、式Ｉ：
Ｔ＝３．３５４−１．３８８Ｆ＋０．１１１Ｇ＋［Ｆ−０．４３７５］×［１．９５２７（Ｆ−０．４３７５）］
（式Ｉ）
（式中、Ｔは、前記抗体組成物中の標的の％総非フコシル化（ＴＡＦ）グリカンであり、これは約２．５％〜約６％、約２．７５％〜約５．５％、又は約３％〜約５％であり、Ｆは、前記培地中のフコースの濃度（ｇ／Ｌ）であり、Ｇは、前記培地中の前記平均グルコース濃度（ｇ／Ｌ）である）に基づいて計算される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ｉ）フコースの前記濃度が約０．２±０．１ｇ／Ｌであり、且つ前記平均グルコース濃度が約２〜約４ｇ／Ｌであるか；（ｉｉ）フコースの前記濃度が約０．５±０．１ｇ／Ｌであり、且つ前記平均グルコース濃度が約３〜約６ｇ／Ｌであるか；又は（ｉｉｉ）フコースの前記濃度が約０．７５±０．１ｇ／Ｌであり、且つ前記平均グルコース濃度が約４．５〜約９ｇ／Ｌである、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞培養培地のｐＨが、約６．８５〜約７．０５である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞培養培地のｐＨが、約６．９０〜約７．００である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記グリコシル化適格細胞が、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されない、請求項１及び３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記グリコシル化適格細胞が、ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝的に改変されない、請求項２及び２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体組成物中の総非フコシル化（ＴＡＦ）グリカンのレベルが、約１０％未満である、請求項３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ＴＡＦグリカンのレベルが、約２％〜約６％である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ＴＡＦグリカンのレベルが、約２％〜約５％である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体組成物中のＴＡＦグリカンのレベルが、約２％〜約４％である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体組成物中の高マンノースグリカンのレベルが、約３．５％未満である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体組成物中の高マンノースグリカンのレベルが、約０．７％〜約３．０％である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体組成物中の非フコシル化グリカンのレベルが、約３．５％未満である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体組成物中の非フコシル化グリカンのレベルが、約０．８％〜約２．８％である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記グリコシル化適格細胞が、ＩｇＧ抗体を産生する、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記グリコシル化適格細胞が、ＩｇＧ１抗体を産生する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＩｇＧ１抗体が、腫瘍関連抗原に特異的である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記腫瘍関連抗原が、配列番号３を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記培養培地が、マンノースを含まない、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法によって産生される抗体組成物。
【請求項４５】
請求項４４に記載の抗体組成物及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項４６】
ａ．抗体をコードする外来核酸を含むグリコシル化適格細胞；及び
ｂ．約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌ又は約０．１７ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度でフコースを含む培養培地
を含む細胞培養培地。
【請求項４７】
前記グリコシル化適格細胞が、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されず、必要に応じて、前記グリコシル化適格細胞が、ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝的に改変されない、請求項４６に記載の細胞培養培地。
【請求項４８】
前記培養培地がさらに、約１０ｇ／Ｌ未満、必要に応じて約９ｇ／Ｌ未満の濃度でグルコースを含む、請求項４６又は４７に記載の細胞培養培地。
【請求項４９】
グルコースの前記濃度が、約６ｇ／Ｌ又はそれ未満である、請求項４８に記載の細胞培養培地。
【請求項５０】
グルコースの前記濃度が、約０．５ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌである、請求項４９に記載の細胞培養培地。
【請求項５１】
前記培養培地のｐＨが、約６．８５〜約７．０５である、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項５２】
前記細胞培養培地のｐＨが、約６．９０〜約７．００である、請求項５１に記載の細胞培養培地。
【請求項５３】
前記細胞培養培地が、マンノースを含まない、請求項４６〜５２のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項５４】
前記抗体が、ＩｇＧ抗体である、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項５５】
前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１抗体である、請求項５４に記載の細胞培養培地。
【請求項５６】
前記ＩｇＧ１抗体が、腫瘍関連抗原に特異的である、請求項５５に記載の細胞培養培地。
【請求項５７】
前記腫瘍関連抗原が、配列番号３を含む、請求項５６に記載の細胞培養培地。
【請求項５８】
グリコシル化適格細胞によって産生される抗体組成物のＴＡＦグリカンのレベルを調節する方法であって、（Ａ）ＴＡＦグリカンのレベルを低減するために約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌのフコース濃度を実現するように前記グリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にフコースを添加すること；若しくは（Ｂ）ＴＡＦグリカンのレベルを増大させるために約１０ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を実現するように前記グリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にグルコースを添加すること；又は（Ｃ）（Ａ）及び（Ｂ）の両方を含む、方法。
【請求項５９】
グリコシル化適格細胞によって産生される抗体組成物の非フコシル化グリカンのレベルを調節する方法であって、（Ａ）非フコシル化グリカンのレベルを低減するために約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌのフコース濃度を実現するように前記グリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にフコースを添加すること；若しくは（Ｂ）非フコシル化グリカンのレベルを増大させるために１０ｇ／Ｌ未満又は約１０ｇ／Ｌのグルコース濃度を実現するように前記グリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にグルコースを添加すること；又は（Ｃ）（Ａ）及び（Ｂ）の両方を含む、方法。
【請求項６０】
グリコシル化適格細胞によって産生される抗体組成物の高マンノースグリカンのレベルを調節する方法であって、高マンノースグリカンのレベルを増大させるために１０ｇ／Ｌ未満又は約１０ｇ／Ｌのグルコース濃度を実現するように前記グリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にグルコースを添加することを含む、方法。
【請求項６１】
前記グリコシル化適格細胞が、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されない、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記グリコシル化適格細胞が、ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝的に改変されない、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗体組成物中のＴＡＦグリカンのレベルが、１０％未満又は約１０％である、請求項５８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
ＴＡＦグリカンのレベルが、約２％〜約６％である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ＴＡＦグリカンのレベルが、約２％〜約５％である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記抗体組成物中のＴＡＦグリカンのレベルが、約２％〜約４％である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗体組成物中の高マンノースグリカンのレベルが、３．５％未満又は約３．５％である、請求項５８〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記抗体組成物中の高マンノースグリカンのレベルが、約０．７％〜約３．０％である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記抗体組成物中の非フコシル化グリカンのレベルが、３．５％未満又は約３．５％である、請求項５８〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記抗体組成物中の非フコシル化グリカンのレベルが、約０．８％〜約２．８％である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記フコース濃度が、約０．１７ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌである、請求項５８〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記フコース濃度が、約０．２ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
約１０ｇ／Ｌ、必要に応じて未満の平均グルコース濃度を実現するグルコース供給スケジュールに従ってグルコースを前記細胞培養培地に添加することをさらに含む、請求項５８〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記平均グルコース濃度が、約６．０ｇ／Ｌ未満、必要に応じて、約４．０ｇ／Ｌ未満である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記平均グルコース濃度が、前記細胞培養培地の前記フコース濃度に基づく、請求項７３又は７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記平均グルコース濃度が、式Ｉ：
Ｔ＝３．３５４−１．３８８Ｆ＋０．１１１Ｇ＋［Ｆ−０．４３７５］×［１．９５２７（Ｆ−０．４３７５）］
式Ｉ
（式中、Ｔは、抗体組成物中の標的の％総非フコシル化（ＴＡＦ）グリカンであり、これは約３％〜約５％であり、Ｆは、前記培地中のフコースの濃度（ｇ／Ｌ）であり、Ｇは、前記平均グルコース濃度（ｇ／Ｌ）である）に基づいて計算される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
グリコシル化適格細胞によって産生される抗体組成物の非フコシル化グリカンのレベルを調節する方法であって、抗体組成物の非フコシル化グリカンのレベルを約０．５％〜約２％低減するために前記細胞培養培地のｐＨを約０．０３〜約１．２下げること又は抗体組成物の非フコシル化グリカンのレベルを約０．５％〜約２％増大させるために前記細胞培養培地のｐＨを約０．０３〜約１．２上げることを含む、方法。
【請求項７８】
前記抗体組成物の非フコシル化グリカンのレベルを約１％〜約２％低減するために前記細胞培養培地のｐＨを約０．０５〜約１．２下げること又は前記抗体組成物の非フコシル化グリカンのレベルを約１％〜約２％増大させるために前記細胞培養培地のｐＨを約０．０５〜約１．２上げることを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記抗体組成物の非フコシル化グリカンのレベルを約０．５％〜約１．１％低減するために前記細胞培養培地のｐＨを約０．０３〜約０．０７下げること又は前記抗体組成物の非フコシル化グリカンのレベルを約０．５％〜約１．１％増大させるために前記細胞培養培地のｐＨを約０．０３〜約０．０７上げることを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
グリコシル化適格細胞によって産生される抗体組成物の非フコシル化グリカンのレベルを約１％〜約２％低減する方法であって、前記細胞培養培地のｐＨを約０．０５〜約１．２下げることを含む、方法。
【請求項８１】
約１％の非フコシル化グリカンの減少のために前記ｐＨを約０．０５〜約０．０７下げることを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
約１．５％を超える非フコシル化グリカンの減少のために前記ｐＨを約０．０９〜約１．２下げることを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
約７．１０〜約７．２０、必要に応じて約７．１２〜約７．１９のｐＨで前記細胞を培養することを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
グリコシル化適格細胞によって産生される抗体組成物の非フコシル化グリカンのレベルを約０．５％〜約１．１％低減する方法であって、前記細胞培養培地のｐＨを約０．０３〜約０．０７下げることを含む、方法。
【請求項８５】
約０．８％の非フコシル化グリカンの減少のために前記ｐＨを約０．０３〜約０．０６下げることを含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
約１％の非フコシル化グリカンの減少のために前記ｐＨを約０．０５〜約０．０７下げることを含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
約７．０５より高く且つ７．１５未満又は約７．１５、必要に応じて約７．０７〜約７．１３のｐＨで前記細胞を培養することを含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８８】
グリコシル化適格細胞によって産生される抗体組成物の非フコシル化グリカンのレベルを約１％〜約２％増大させる方法であって、前記細胞培養培地のｐＨを約０．０５〜約１．２上げることを含む、方法。
【請求項８９】
約１％の非フコシル化グリカンの減少のために前記ｐＨを約０．０５〜約０．０７上げることを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
約１．５％を超える非フコシル化グリカンの減少のために前記ｐＨを約０．０９〜約１．２上げることを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
約７．１０〜約７．２０、必要に応じて約７．１２〜約７．１９のｐＨで前記細胞を培養することを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
グリコシル化適格細胞によって産生される抗体組成物の非フコシル化グリカンのレベルを約０．５％〜約１．１％増大させる方法であって、前記細胞培養培地のｐＨを約０．０３〜０．０７上げることを含む、方法。
【請求項９３】
約０．８％の非フコシル化グリカンの減少のために前記ｐＨを約０．０３〜約０．０６上げることを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
約１％の非フコシル化グリカンの減少のために前記ｐＨを約０．０５〜約０．０７上げることを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
７．０５より高く且つ７．１５未満又は約７．１５、必要に応じて約７．０７〜約７．１３のｐＨで前記細胞を培養することを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
前記培養全体にわたる前記細胞培養培地の前記ｐＨが、７．０より高く、必要に応じて７．０５より高く且つ７．２未満である、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記抗体組成物中の非フコシル化グリカンのレベルが、約１０％未満である、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記抗体組成物中の非フコシル化グリカンのレベルが、約６．２％〜約８．４％である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記温度が、前記培養期間中に２℃未満変化する、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記培養の前記温度が、１．５℃以下又は１．０℃以下変化する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記細胞培養培地が、検出可能な量のマンガンもベタインも含まない、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記細胞培養培地が、約０．１０ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌのフコース、必要に応じて、約０．１７〜約１．０ｇ／Ｌのフコースを含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
フコースが、約０．７５ｇ／Ｌ未満、約０．６ｇ／Ｌ未満、又は約０．２ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記グリコシル化適格細胞が、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されない、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
グルコースが、約１０ｇ／Ｌ又はそれ未満の平均グルコース濃度を実現するグルコース供給スケジュールに従って前記細胞培養培地に添加される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
グリコシル化適格細胞によって産生される抗体組成物のＴＡＦグリカンのレベルを調節する方法であって、請求項７７〜７９のいずれか一項に記載の方法に従って前記抗体組成物の非フコシル化グリカンのレベルを調節すること、請求項８０〜８７のいずれか一項の方法に従って前記抗体組成物の非フコシル化グリカンのレベルを低減すること、又は請求項８８〜１０５のいずれか一項の方法に従って前記抗体組成物の非フコシル化グリカンのレベルを増大させることを含む、方法。
【請求項１０７】
抗体組成物を産生する方法であって、前記抗体組成物中の非フコシル化グリカンのレベルが、約６．２％〜約８．４％であって、前記方法が、細胞培養培地中においてグリコシル化適格細胞を７．０５より高く且つ７．２未満のｐＨで維持することを含み、
ここで、
（Ａ）前記細胞培養培地のｐＨが、培養期間中に０．１５未満（必要に応じて０．１０未満）変化するか、又は
（Ｂ）前記細胞培養培地の温度が、２℃以下変化するか、又は
（Ｃ）前記方法が、マンガン又はベタインを含む細胞培養培地中で前記細胞を培養することを含まないか、又は
（Ｄ）（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）のうちの２つ又は３つの組合せを含む、方法。
【請求項１０８】
前記ｐＨが、培養期間中に約７．０７〜約７．１９のｐＨで維持され、必要に応じて、前記ｐＨが、約７．０７又はそれ超且つ７．１０未満、又は約７．１０又はそれ超且つ７．１５未満、又は約７．１５又はそれ超から最大約７．１９で維持される、請求項１０７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／６４８，３０８号に対する優先権を主張する。各出願の内容は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
電子ファイルでの提出物の参照による援用
本明細書と同時に提出されたコンピューター可読のヌクレオチド／アミノ酸配列リストは、その全体が参照によって援用され、当該リストは、以下：２８，５４７バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル、ファイル名「５２２４９Ａ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」、２０１９年３月２６日作成、として識別される。
【背景技術】
【０００３】
グリコシル化は、例えば、タンパク質折り畳み、品質管理、分子輸送及び局在化、並びに細胞表面受容体相互作用を含む複数の細胞機能に関与するため、最も一般的で、また重要な翻訳後修飾の１つである。グリコシル化は、治療用糖タンパク質の生理活性、薬物動態、免疫原性、溶解度、及びインビボクリアランスに影響を与えるため、組換えタンパク質薬の治療効果に影響を及ぼす。Ｆｃグリコフォームプロファイルは、特に、抗体の臨床効果及び薬物動態に直接影響を及ぼすため、組換え抗体に関する重要な製品品質特性である。
【０００４】
高マンノース（ＨＭ）グリコフォーム含量は、ある種の治療用抗体の薬物動態特性に影響を及ぼすことが判明している（Ｇｏｅｔｚｅ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１，９４９−５９；Ｙｕ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）ＭＡｂｓ  ４，４７５−８７）。ＨＭグリコフォームは、抗体の血清クリアランス速度に影響を与えるだけでなく、このようなグリコフォームは、非フコシル化（非フコ）グリコフォームに加えて、抗体エフェクター機能又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）としても知られる抗体介在性の標的細胞死滅にも影響し得る。
【０００５】
多くの要因がグリカン構造、したがってタンパク質（糖タンパク質）の最終的なグリコシル化形態（グリコフォーム）に影響を与える。例えば、抗体を発現する細胞株、細胞培養培地、フィード培地組成、及び細胞培養中の供給のタイミングは、タンパク質のグリコフォームの産生に影響し得る。
研究グループにより、抗体の特定のグリコフォームのレベルに影響を与えるための多くの方法が示唆されている一方で、治療用抗体の組換え産生中に総非フコシル化（ＴＡＦ）グリコフォームのレベルを操作し、調節するための単純且つ効率的な方法が生物学的製剤産業において依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｏｅｔｚｅ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１，９４９−５９
【非特許文献２】Ｙｕ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）ＭＡｂｓ  ４，４７５−８７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
最初に記載されるのは、組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体又は抗体結合タンパク質）を産生する細胞を含む細胞培養培地におけるフコース及び／又はグルコースの濃度が、産生される組換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルに影響を与えることを実証するデータである。組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体又は抗体結合タンパク質）のＴＡＦグリコフォームのレベルにおける比較的大きい変化は、組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体又は抗体結合タンパク質）を産生する細胞を含む細胞培養培地中のフコースの濃度を操作することによって実現され得るが、ＴＡＦグリコフォームレベルにおける比較的小さい変化は、本明細書に記載されるとおりの細胞培養培地中のグルコースの濃度を変化させることによって実現され得る。また、データは、細胞培養培地のグルコース濃度が、高マンノースグリカン及び非フコシル化グリカンのレベルに影響を及ぼす一方で、細胞培養培地のフコース濃度は、非フコシル化グリカンのレベルに影響を及ぼすが、高マンノースグリカンレベルに影響を及ぼさないことを実証している。化学式においてただ１つの酸素原子が異なるこれらの糖の各々がＴＡＦグリコフォームレベルに対して差次的効果をもたらすという発見は、予想されなかった。特定の理論に束縛されることなく、本明細書で教示されるとおりの濃度でフコース及び／又はグルコースを含む細胞培養培地において組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体又は抗体結合タンパク質）を産生する細胞を維持することは、所望の又は既定の又は事前に選択されたレベルのＴＡＦグリコフォーム（例えば、高マンノースグリカン及び非フコシル化グリカン）を有する組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体又は抗体結合タンパク質）組成物の産生を可能にする。したがって、本開示は、所望の又は既定の又は事前に選択されたレベルのＴＡＦグリコフォームを含む組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）を産生する方法に関する。
【０００８】
本開示は、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）を産生する方法を提供する。代表的な実施形態において、本方法は、所望されるＴＡＦグリコフォームのレベルに応じて、本明細書に記載されるとおりの特定の濃度でフコース及び／又はグルコースを含む細胞培養培地中においてグリコシル化適格細胞を維持することを含む。
【０００９】
代表的な実施形態において、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）中のＴＡＦグリコフォームのレベルは、約１０％又はそれ未満であり、代表的な態様において、本方法は、フコースを含む細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持することを含み、フコースは、約０．１７ｇ／Ｌと約１．０ｇ／Ｌの間の濃度で培養培地中に存在する。
【００１０】
代表的な実施形態において、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）中のＴＡＦグリコフォームのレベルは、約１０％又はそれ未満であり、代表的な態様において、本方法は、フコースを含む細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持することを含み、フコースは、約０．１ｇ／Ｌと約１．０ｇ／Ｌの間の濃度で培養培地中に存在し、且つグリコシル化適格細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されない。
【００１１】
本開示はまた、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）を産生する方法であって、フコースが、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する、フコース及びグルコースを含む細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持し、且つ約１０ｇ／Ｌ又はそれ未満の平均グルコース濃度を実現するグルコース供給スケジュールに従って細胞培養培地にグルコースを添加することを含む方法を提供する。
【００１２】
本開示の方法によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）が、本明細書で提供される。さらに、関連する医薬組成物及び細胞培養培地が提供される。代表的な態様において、細胞培養培地は、抗体（例えば、ＩｇＧ抗体）をコードする外来核酸及び約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌ又は約０．１７ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度でフコースを含む培養培地を含む。いくつかの例において、グリコシル化適格細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されない。必要に応じて、グリコシル化適格細胞は、ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝的に改変されない。いくつかの態様において、培養培地はさらに、約１０ｇ／Ｌ未満、必要に応じて、約９ｇ／Ｌ未満又は約６ｇ／Ｌ又はそれ未満（例えば、約０．５ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ）の濃度でグルコースを含む。代表的な例において、培養培地のｐＨは、約６．８５〜約７．０５、例えば、約６．９０〜約７．００である。いくつかの例において、細胞培養培地は、マンノースを含まない。ある種の態様において、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。代表的な態様において、抗体は、配列番号３を含むものなど、腫瘍関連抗原に特異的である。
【００１３】
細胞培養培地中においてグリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）のＴＡＦグリカンのレベルを変えるか又は調節する方法がさらに、本明細書において提供される。代表的な態様において、本方法は、（Ａ）ＴＡＦグリカンのレベルを低減するために約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌのフコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にフコースを添加すること；（Ｂ）ＴＡＦのレベルを増大させるために約１０ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にグルコースを添加すること；又は（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の両方の組合せを含む。
【００１４】
また、グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを調節する方法が提供される。代表的な実施形態において、本方法は、（Ａ）非フコシル化グリカンのレベルを低減するために約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌのフコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にフコースを添加すること；（Ｂ）非フコシル化グリカンのレベルを増大させるために１０ｇ／Ｌ未満又は約１０ｇ／Ｌのグルコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にグルコースを添加すること；又は（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の両方の組合せを含む。
【００１５】
本開示はさらに、グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の高マンノース（ＨＭ）グリカンのレベルを調節する方法を提供する。代表的な実施形態において、本方法は、ＨＭグリカンのレベルを増大させるために約１０ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にグルコースを添加することを含む。
【００１６】
また、本開示によって、グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを調節する方法であって、組成物の非フコシル化グリカンのレベルを約０．５％〜約２％低減するために細胞培養培地のｐＨを約０．０３〜約１．２下げること又は組成物の非フコシル化グリカンのレベルを約０．５％〜約２％増大させるために細胞培養培地のｐＨを約０．０３〜約１．２上げることを含む方法が提供される。
【００１７】
グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを約１％〜約２％低減する方法であって、細胞培養培地のｐＨを約０．０５〜約１．２下げることを含む方法が、本開示において提供される。
【００１８】
さらに、グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを約０．５％〜約１．１％低減する方法であって、細胞培養培地のｐＨを約０．０３〜０．０７下げることを含む方法が提供される。
【００１９】
本開示はさらに、グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを約１％〜約２％増大させる方法であって、細胞培養培地のｐＨを約０．０５〜約１．２上げることを含む方法を提供する。
【００２０】
また、グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを約０．５％〜約１．１％増大させる方法であって、細胞培養培地のｐＨを約０．０３〜０．０７上げることを含む方法も提供される。
【００２１】
本開示はさらに、グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）のＴＡＦグリカンのレベルを調節する方法であって、非フコシル化グリカンのレベルを調節するか、低減するか又は増大させる本明細書で開示される方法に従って組成物の非フコシル化グリカンのレベルを調節するか、低減するか又は増大させることを含む方法を提供する。
【００２２】
本開示は、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）を産生する方法であって、組成物中の非フコシル化グリカンのレベルが、約６．２％〜約８．４％であって、細胞培養培地中においてグリコシル化適格細胞を７．０５より高く且つ７．２未満のｐＨで維持することを含み、（Ａ）細胞培養培地中のｐＨが、培養期間中に０．１５未満（必要に応じて０．１０未満）変化するか又は（Ｂ）細胞培養培地の温度が、２℃以下変化するか又は方法が、マンガン又はベタインを含む細胞培養培地中で細胞を培養することを含まないか又は（Ｄ）（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）のうちの２つ又は３つの組合せである方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】３種類のＮ−グリカン（オリゴマンノース、複合及びハイブリッド）及びこのような糖類に関して一般的に使用される記号の図解である。
【図１Ｂ】代表的なグリカン構造の図解である。
【図２】フコース代謝のサルベージ経路及びデノボ経路の図である。サルベージ経路において、遊離Ｌ−フコースはＧＤＰ−フコースに変換されるが、デノボ経路において、ＧＤＰ−フコースは、ＧＭＤ及びＦＸにより触媒される３つの反応を介して合成される。次に、ＧＤＰ−フコースは、ＧＤＰ−Ｆｕｃトランスフェラーゼによって細胞基質からゴルジ内腔に輸送され、アクセプターオリゴ糖及びタンパク質へ移される。他の反応産物であるＧＤＰは、内腔のヌクレオチドジホスファターゼによって、グアノシン５−一リン酸（ＧＭＰ）及び無機リン酸（Ｐｉ）に変換される。前者は、細胞質基質に排出されるが（ＧＤＰ−フコースの輸送と共役される対向輸送系を介して）、後者は、ゴルジアニオンチャネルであるＧＯＬＡＣを介してゴルジ内腔を離れると想定される。例えば、Ｎｏｒｄｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２００１を参照されたい。
【図３】（Ａ）細胞培養行程の期間にわたる対照培地（白抜きの三角を伴う線）、第１の試験培地（白抜きの丸を伴う線）、及び第２の試験培地（白抜きの六角形を伴う線）を使用する細胞培養物のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）、（Ｂ）細胞培養行程にわたる第２の試験培地（白抜きの四角を伴う線）を使用する細胞培養物のフコース濃度（ｇ／Ｌ）、並びに（Ｃ）細胞培養行程の期間にわたる対照培地（黒塗りの三角を伴う点線）、第１の試験培地（黒塗りの丸を伴う点線）、及び第２の試験培地（黒塗りの六角形を伴う点線）を使用する細胞培養物のＴＡＦグリカンレベル（％）を示すグラフである。
【図４】（Ａ）細胞培養行程の期間にわたる対照培地（白抜きの三角を伴う線）、第１の試験培地（白抜きの丸を伴う線）、及び第２の試験培地（白抜きの六角形を伴う線）を使用する細胞培養物のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）、並びに（Ｂ）細胞培養行程の期間にわたる対照培地（黒塗りの三角を伴う点線）、第１の試験培地（黒塗りの丸を伴う点線）、及び第２の試験培地（黒塗りの六角形を伴う点線）を使用する細胞培養物の高マンノース（ＨＭ）グリカンレベル（％）を示すグラフである。
【図５】（Ａ）細胞培養行程の期間にわたる対照培地（白抜きの三角を伴う線）、第１の試験培地（白抜きの丸を伴う線）、及び第２の試験培地（白抜きの六角形を伴う線）を使用する細胞培養物のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）、並びに（Ｂ）細胞培養行程の期間にわたる対照培地（黒塗りの三角を伴う点線）、第１の試験培地（黒塗りの丸を伴う点線）、及び第２の試験培地（黒塗りの六角形を伴う点線）を使用する細胞培養物の非フコシル化（ａｆｕｃ）グリカンレベル（％）を示すグラフである。
【図６】０×グルコース、１×グルコース又は２×グルコースを含有する細胞培養培地中のフコース濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてのＴＡＦグリカンレベル（％）のグラフである。
【図７】０×グルコース、１×グルコース又は２×グルコースを含有する細胞培養培地中のフコース濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてのＡＤＣＣレベル（同じアミノ酸配列を有する対照抗体に対する％として表される）のグラフである。
【図８】ＴＡＦグリカンレベル（％）に対するグルコース及びフコースの効果のモデルを示すグラフである。ＱＴＰＰに従う最小、最大、及び平均ＴＡＦが示される。グラフの下の式は、グルコース、フコース及びＴＡＦの間の数理的関係を示す。
【図９Ａ】（ｉ）細胞培養培地中のフコース濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてのＴＡＦグリカンレベル（％）（左上の四半分）又は細胞培養培地中のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてのＴＡＦグリカンレベル（％）（右上の四半分）及び（ｉｉ）細胞培養培地中のフコース濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてのＡＤＣＣレベル（同じアミノ酸配列を有する対照抗体に対する％として表される）（左下の四半分）又は細胞培養培地中のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてのＡＤＣＣレベル（右下の四半分）を示す一連のグラフである。ＴＡＦグリカンレベル（％）の範囲は、３．３０６８４〜３．７３０８３であり、ＡＤＣＣレベルの範囲は、７８．３０９２〜９０．４４０８である。０．２ｇ／Ｌフコース及び３．０ｇ／Ｌグルコースにおいて、ＴＡＦグリカンレベル（％）は３．５１８８３６であり、ＡＤＣＣレベル（％）は、８４．３７５０１であった。
【図９Ｂ】（ｉ）細胞培養培地中のフコース濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてのＴＡＦグリカンレベル（％）（左上の四半分）又は細胞培養培地中のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてのＴＡＦグリカンレベル（％）（右上の四半分）及び（ｉｉ）細胞培養培地中のフコース濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてのＡＤＣＣレベル（刷新者又は市販の抗体に対する％として表される）（左下の四半分）又は細胞培養培地中のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてのＡＤＣＣレベル（右下の四半分）を示す一連のグラフである。ＴＡＦグリカンレベル（％）の範囲は、３．５２３０１〜４．０５５９であり、ＡＤＣＣレベルの範囲は、７５．６９１１〜９０．９３８５である。０ｇ／Ｌフコース及び０．５５４ｇ／Ｌグルコースにおいて、ＴＡＦグリカンレベル（％）は３．７８９４５８であり、ＡＤＣＣレベル（％）は、８３．３１４８であった。
【図９Ｃ】（ｉ）細胞培養培地中のフコース濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてのＴＡＦグリカンレベル（％）（左上の四半分）又は細胞培養培地中のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてのＴＡＦグリカンレベル（％）（右上の四半分）及び（ｉｉ）細胞培養培地中のフコース濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてのＡＤＣＣレベル（刷新者又は市販の抗体に対する％として表される）（左下の四半分）又は細胞培養培地中のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてのＡＤＣＣレベル（右下の四半分）を示す一連のグラフである。ＴＡＦグリカンレベル（％）の範囲は、２．９９７５〜３．６８４６８であり、ＡＤＣＣレベルの範囲は、７９．２２１５〜９８．８８３６である。０．４９２ｇ／Ｌフコース及び６．０ｇ／Ｌグルコースにおいて、ＴＡＦグリカンレベル（％）は３．３４１０９２であり、ＡＤＣＣレベル（％）は、８９．０５２５６であった。
【図１０】フコース濃度の関数としてプロットされた浸透圧のグラフである。
【図１１】細胞培養物における時間（継続時間）の関数としてプロットされたフコース濃度のグラフである。
【図１２】それぞれ時間の関数としてプロットされた％ＴＡＦ及びフコースの供給のグラフである。
【図１３】６日目以前から標的範囲においてグルコースを制御することにより、同等のＴＡＦ結果が得られることを実証しているグラフの対である。
【図１４】培養時間の関数としてプロットされた％非フコシル化のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
多くの分泌タンパク質が翻訳後グリコシル化され、この過程により、糖部分（例えば、グリカン、糖類）がタンパク質の特定のアミノ酸に共有結合される。真核細胞において、２種類のグリコシル化反応：（１）グリカンが認識配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ（「Ｘ」はプロリンを除く任意のアミノ酸である）のアスパラギンに連結されるＮ結合型グリコシル化、及び（２）グリカンがセリン又はスレオニンに連結されるＯ結合型グリコシル化が起こる。グリコシル化のタイプ（Ｎ結合型又はＯ結合型）にかかわらず、各部位（Ｏ又はＮ）と結合されるグリカン構造は広範囲にわたるため、タンパク質グリコフォームには微小不均一性がある。
【００２５】
全てのＮ−グリカンは、共通のコア糖配列：Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ａｓｎ）を有し、３つのタイプのうちの１つ：（Ａ）２個のＮ−アセチルグルコサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分及び多数（例えば５、６、７、８又は９個）のマンノース（Ｍａｎ）残基からなる高マンノース（ＨＭ）又はオリゴマンノース（ＯＭ）型、（Ｂ）３個以上のＧｌｃＮＡｃ部分及びあらゆる数の他の糖タイプを含む複合型又は（Ｃ）分枝の一方にＭａｎ残基を、複合枝の基部にＧｌｃＮＡｃを含むハイブリッド型に分類される。図１Ａ（Ｓｔａｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８：Ｎ−Ｇｌｙｃａｎｓ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００９から得た）は、Ｎ−グリカンの３つのタイプを示す。
【００２６】
Ｎ結合型グリカンは、一般的には、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ガラクトサミン（ＧａｌＮ）、グルコース（ＧＬｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＣｌｃＮＡｃ）、グルコサミン（ＧｌｃＮ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）、マンノサミン（ＭａｎＮ）、キシロース（Ｘｙｌ）、Ｎ０アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリコシルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、２−ケト−３−ドキシノノン酸（ｄｏｘｙｎｏｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｋｄｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、グルクロン酸（ＧＬｃＡ）、イズロン酸（ＩｄｏＡ）、ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）、マヌロン酸（ＭａｎＡ）のうち１つ又はそれより多くの単糖類を含む。このような糖類に対して一般的に使用される記号は、図１Ａにおいて示される。代表的なグリカン及びそれらの個々の特性は、図１Ｂにおいて示される。
【００２７】
Ｎ結合型グリコシル化は小胞体（ＥＲ）において開始され、複雑な一連の反応の結果、基本的に２個のＧｌｃＮＡｃ残基及び３個のＭａｎ残基から作られるコアグリカン構造の連結が起こる。ＥＲにおいて形成されるグリカン複合体は、ゴルジ装置において酵素の作用により修飾される。糖類が酵素に比較的接近しにくい場合、これは、一般的には元来のＨＭ形態にとどまる。酵素が糖類に接近し得る場合、Ｍａｎ残基の多くが切り離され、糖類がさらに修飾され、その結果、複合型のＮ−グリカン構造が生じる。例えばｃｉｓ−ゴルジに位置するマンノシダーゼ−１は、ＨＭグリカンを切断又は加水分解し得、一方でメディアル−ゴルジに位置するフコシルトランスフェラーゼＦＵＴ−８はグリカンをフコシル化する（Ｈａｎｒｕｅ  Ｉｍａｉ−Ｎｉｓｈｉｙａ（２００７），ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：８４）。
【００２８】
したがって、グリカン構造の糖組成及び構造立体配置は、とりわけ、ＥＲ及びゴルジ装置におけるグリコシル化機序、その機序の酵素のグリカン構造への到達性、各酵素の作用の順序及びタンパク質がグリコシル化機序から放出される段階に依存して変動する。
【００２９】
本明細書で提供される開示は、所望の、又は所定の、又は予め選択されたレベルのＴＡＦグリコフォームを含む抗体組成物を産生する方法に関する。代表的な実施形態において、本方法は、所望されるＴＡＦグリコフォームのレベルに応じて、本明細書に記載されるとおりの特定の濃度でフコース及び／又はグルコースを含む細胞培養培地中においてグリコシル化適格細胞を維持することを含む。また、本開示は、所望の、又は所定の、又は予め選択されたレベルの非フコシル化グリコフォームを含む抗体組成物を産生する方法であって、例えば、抗体組成物中の非フコシル化グリカンのレベルが、約６．２％〜約８．４％である方法に関する。代表的な実施形態において、本方法は、７．０５より高く且つ７．２未満のｐＨレベルで細胞培養培地中のグリコシル化適格細胞を維持することを含み、（Ａ）細胞培養培地中のｐＨが、培養期間中に０．１５未満（必要に応じて０．１０未満）変化するか又は（Ｂ）細胞培養培地の温度が、２℃以下変化するか又は方法が、マンガン又はベタインを含む細胞培養培地中で細胞を培養することを含まないか又は（Ｄ）（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）のうちの２つ又は３つの組合せである。特定の理論に縛られるものではないが、本開示の方法は、特定の量の所与の抗体の特定のグリコフォームを含むテーラーメイドの組成物に対する手段を提供すると考えられる。
【００３０】
代表的な実施形態において、ＴＡＦグリカンのレベルが調節される。本明細書で使用する場合、「総非フコシル化グリカン」又は「ＴＡＦグリカン」又は「総非フコシル化グリコフォーム」又は「ＴＡＦグリコフォーム」は、高マンノース（ＨＭ）グリカン及び非フコシル化グリカンの合計量を指す。代表的な実施形態において、ＨＭグリカンのレベルが調節される。本明細書で使用する場合、「高マンノースグリカン」又は「ＨＭグリカン」又は「高マンノースグリコフォーム」又は「ＨＭグリコフォーム」又は「ＨＭ」という用語は、それぞれＭａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８、及びＭａｎ９と略称される、５、６、７、８、又は９個のマンノース残基を含むグリカンを包含する。代表的な実施形態において、非フコシル化グリカンのレベルが調節される。本明細書で使用する場合、「非フコシル化グリカン」又は「非フコグリカン」又は「非フコシル化グリコフォーム」又は「非フコ」という用語は、コアフコース、例えば、Ｎ−グリコシル化部位のＡｓｎとともにアミド結合において含まれるＧｌｃＮＡｃ残基上のα１，６−結合型フコースを欠くグリコフォームを指す。非フコシル化グリコフォームとしては、Ａ１Ｇ０、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ、Ａ２Ｇ２及びＡ１Ｇ１Ｍ５が挙げられるが限定されない。さらなる非フコシル化グリカンとしては、例えば、Ａ１Ｇ１ａ、Ｇ０［Ｈ３Ｎ４］、Ｇ０［Ｈ４Ｎ４］、Ｇ０［Ｈ５Ｎ４］、ＦＯ−Ｎ［Ｈ３Ｎ３］が挙げられる。例えば、Ｒｅｕｓｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｊａｄａ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２５（１２）：１３２５−１３３４（２０１５）を参照されたい。代表的な態様において、本明細書において実施例１でさらに記載されるとおり、ＴＡＦのレベル、ＨＭグリコフォーム及び非フコシル化グリコフォームの量は、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を介して決定される。Ｎ−グリカンの酵素切断の後、いくつかのピークがあり、その各ピークが様々なグリコフォームの平均分布（量）に相当するクロマトグラムを得るために、ＨＩＬＩＣを行う。これらの目的に対して、％ピーク面積＝ピーク面積／総ピーク面積×１００％及び％総ピーク面積＝試料総面積／標準の総面積×１００％である。％ＴＡＦを決定する目的のために使用される計算は、次のとおりに行われ得る：
％非フコシル化グリコフォーム＝％Ａ１Ｇ０＋％Ａ２Ｇ０＋％Ａ２Ｇ１ａ＋％Ａ２Ｇ１ｂ＋％Ａ２Ｇ２＋％Ａ１Ｇ１Ｍ５。
【００３１】
％高マンノースグリコフォーム＝％Ｍａｎ５（検出可能な場合）＋％Ｍａｎ６（検出可能な場合）＋％Ｍａｎ７（検出可能な場合）＋％Ｍａｎ８（検出可能な場合）＋％Ｍａｎ９（検出可能な場合）である。
【００３２】
本開示は、組換えグリコシル化タンパク質組成物を産生する方法を提供する。代表的な実施形態において、組換えグリコシル化タンパク質組成物は、抗体組成物である。代表的な実施形態において、本方法は、所望されるＴＡＦグリコフォームのレベルに応じて、本明細書に記載されるとおりの特定の濃度でフコース及び／又はグルコースを含む細胞培養培地中においてグリコシル化適格細胞を維持することを含む。
【００３３】
フコース
本明細書で開示される方法の代表的な実施形態において、フコースは、約０．１ｇ／Ｌ〜約２．０ｇ／Ｌ、必要に応じて、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．７５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌ、又は約０．１ｇ／Ｌ〜約１．２ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する。代表的な例において、フコースは、１．２ｇ／Ｌ未満又は約１．２ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する。代表的な例において、フコースは、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する。代表的な例において、培養培地は、約０．１７ｇ／Ｌ〜約２．０ｇ／Ｌ、約０．１７ｇ／Ｌ〜約１．７５ｇ／Ｌ、約０．１７ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌ、又は約０．１７ｇ／Ｌ〜約１．２ｇ／Ｌの濃度でフコースを含む。代表的な態様において、フコースは、約０．１７ｇ／Ｌ〜約１．２ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する。代表的な例において、フコースは、約０．１７ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する。代表的な例では、培養培地は、約０．２ｇ／Ｌ〜約２．０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ〜約１．７５ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌ、又は約０．２ｇ／Ｌ〜約１．２ｇ／Ｌの濃度でフコースを含む。代表的な例において、フコースは、約０．２ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する。代表的な例において、フコースは、１．０ｇ／Ｌ未満又は約１．０ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する。例えば、いくつかの例では、培養培地のフコース濃度は、約０．１０ｇ／Ｌ、約０．１１ｇ／Ｌ、約０．１２ｇ／Ｌ、約０．１３ｇ／Ｌ、約０．１４ｇ／Ｌ、約０．１５ｇ／Ｌ、約０．１６ｇ／Ｌ、約０．１７ｇ／Ｌ、約０．１８ｇ／Ｌ、約０．１９ｇ／Ｌ、又は約０．２０ｇ／Ｌである。いくつかの例において、培養培地のフコース濃度は、約０．３ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ、約０．６ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ、又は約０．９ｇ／Ｌである。代表的な態様において、フコース濃度は、１．０ｇ／Ｌ以下若しくは約１．０ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ以下若しくは約０．９ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ以下若しくは約０．８ｇ／Ｌ、又は０．７ｇ／Ｌ以下若しくは約０．７ｇ／Ｌである。代表的な例において、フコースは、０．７５ｇ／Ｌ未満若しくは約０．７５ｇ／Ｌ、又は約０．２５ｇ／Ｌ〜約０．７５ｇ／Ｌ、例えば、約０．４ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌ、又は約０．６ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する。代表的な態様において、フコースは、約０．６ｇ／Ｌ未満、例えば、約０．２ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する。
【００３４】
代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）を産生する方法は、２種の異なる細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持することを含む。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）を産生する方法は、初期の期間に第１の細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持し、続いて第２の細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持することを含み、必要に応じて、第１の細胞培養培地は、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度でフコースを含まず、且つ第２の細胞培養培地は、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度でフコースを含み、且つ第２の細胞培養培地は、例えば、上記の濃度の１つでフコースを含む。代表的な例において、初期の期間は、細胞が細胞培養培地、例えば、当該細胞培養培地を含むバイオリアクター中に接種されるときに始まる。いくつかの態様において、初期の期間は、約１日〜約３日、例えば、約２４時間〜約７２時間である。代表的な態様において、初期の期間は、約３日（約７２時間）より長いが、約１０日（約２４０時間）未満又は約１５６時間未満である。代表的な態様において、初期の期間は、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、又は約９日である。代表的な態様において、本方法は、初期の期間後に培養培地にフコースを添加することを含む。いくつかの態様において、フコースを第１の培養培地に添加して、第２の細胞培養培地を得る。例えば、様々な態様において、本方法は、約１日〜約３日後、約３日後であるが約１０日未満、又は約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、又は約９日後にフコースを添加することを含む。代表的な態様において、本方法は、細胞培養接種後６日目、７日目、８日目、又は９日目にフコースを細胞培養培地、例えば、第１の細胞培養培地に添加することを含む。代表的な態様において、フコースは、約０．１ｇ／Ｌを超えるか、約０．１７ｇ／Ｌを超えるか、又は約０．２ｇ／Ｌを超え、且つ約２．０ｇ／Ｌ未満の最終濃度まで添加される。代表的な態様において、第１の細胞培養培地は、フコースを含まない。代表的な態様において、第１の細胞培養培地は、フコースを含むが、検出不能若しくは測定不能な濃度、又は第２の細胞培養培地のフコース濃度を実質的に下回る濃度、例えば、実質的に０．１ｇ／Ｌ未満、約０．１７ｇ／Ｌ未満、又は約０．２ｇ／Ｌ未満である。
【００３５】
代替的な態様において、本方法は、グリコシル化適格細胞が細胞培養物中で維持される期間全体、又は培養期間の大部分にわたって、フコースを（例えば、約０．１ｇ／Ｌを超えるか、約０．１７ｇ／Ｌを超えるか、又は約０．２ｇ／Ｌを超え、且つ約２．０ｇ／Ｌ未満の濃度で）含む細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持することを含む。いくつかの態様において、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）を産生する方法は、フコースを含む細胞培養培地を含むバイオリアクター中でグリコシル化適格細胞を接種すること及び細胞培養の期間全体にわたって実質的に同じに維持されるフコースの濃度で細胞培養培地中において細胞を維持することを含む。
【００３６】
代表的な実施形態において、フコースの濃度は、細胞培養の期間中ほとんど変動しない。代表的な態様において、フコース濃度は、グリコシル化適格細胞がフコースを含む細胞培養培地中で維持される期間に約０．２ｇ／Ｌ又はそれ未満変動する。代表的な態様において、フコースの濃度は、グリコシル化適格細胞がフコースを含む細胞培養培地中で維持される期間に約０．１ｇ／Ｌ又はそれ未満変動する。代表的な態様において、フコースが細胞培養培地に加えられるとき、例えば、初期の細胞培養期間の後、フコースは、細胞培養期間の間１回又は２回以下培地に添加される。
【００３７】
グルコース
本明細書で開示される方法の代表的な実施形態において、グルコースが培養培地中に存在する。代表的な態様において、グルコースは、１０ｇ／Ｌ未満又は約１０ｇ／Ｌ、９．０ｇ／Ｌ未満又は約９．０ｇ／Ｌ、又は６．０ｇ／Ｌ未満又は約６．０ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する。代表的な態様において、グルコースは、約０．５ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する。代表的な態様において、グルコースは、約Ｘｇ／Ｌ〜約Ｙｇ／Ｌの濃度で存在し、Ｘは、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、又は３．９であり、且つＹは、約０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、又は５．０であるが、但し、ＸはＹ未満である。
【００３８】
代表的な態様において、本方法は、細胞培養期間と同じ期間において細胞培養培地中でグルコースの濃度を維持することを含む。代表的な例において、細胞培養培地中のグルコースの濃度を維持することは、定期的に、例えば、１時間毎、２時間毎、３、４、５、又は６時間毎に１回、１日１回、１日２回、１日３回、又は１日４回などで細胞培養培地をサンプリングすること、サンプリングされた細胞培養培地のグルコース濃度を測定すること、及びサンプリングされた細胞培養培地のグルコース濃度が、維持された所望のグルコース濃度未満である場合に細胞培養物にグルコースを添加することを含む。代表的な態様において、細胞培養培地中のグルコースの濃度を維持することは、グルコースセンサーを介して細胞培養培地のグルコース濃度を測定することを含む。代表的な態様において、グルコース濃度は、一定の間隔、例えば、１時間毎、２時間毎、３、４、５、又は６時間毎に１回、１日１回、１日２回、１日３回、又は１日４回などでグルコースセンサーを介して測定され、グルコースは、グルコース濃度が、維持された所望のグルコース濃度未満であるとグルコースセンサーを介して決定される場合に細胞培養物に添加される。代替的な態様において、本方法は、グルコースを含む細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持するが、初期の期間の後においてのみ細胞培養培地中のグルコースの濃度を維持することを含む。代表的な態様において、初期の期間は、約１日〜約３日（約２４時間〜約７２時間）である。いくつかの例において、初期の期間は、６日未満又は約６日であり、必要に応じて、初期の期間は、細胞培養接種後の３日間又は４日間又は５日間である。代替的な態様において、本方法は、グルコースを含む細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持し、且つ接種後６日目及びその後に細胞培養培地中のグルコースの濃度を維持することを含む。代表的な態様において、グルコースの濃度は、初期の期間後の少なくとも約４日間又は約５日間維持されるか、又は必要に応じて、初期の期間後の少なくとも約６日間維持される。
【００３９】
代表的な態様において、細胞培養培地は、初期の期間において初期のグルコース濃度を含む。例えば、様々な態様において、初期のグルコース濃度は、約１．０ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約１．０〜約１２ｇ／Ｌ、又は約１．０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌである。いくつかの態様において、初期のグルコース濃度は、約１．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ、約５．５ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ、約６．５ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ、約７．５ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ、約９．０ｇ／Ｌ、約９．５ｇ／Ｌ、約１０．０ｇ／Ｌ、約１０．５ｇ／Ｌ、約１１．０ｇ／Ｌ、約１１．５ｇ／Ｌ、又は約１２．０ｇ／Ｌである。いくつかの態様において、初期のグルコース濃度は、約１２ｇ／Ｌ±１ｇ／Ｌ又は約９ｇ／Ｌ±１ｇ／Ｌ又は約６ｇ／Ｌ±１ｇ／Ｌである。いくつかの態様において、初期のグルコース濃度は、約５．０ｇ／Ｌ未満又は約４．０ｇ／Ｌ未満である。代表的な態様において、初期のグルコース濃度は、初期の期間中に使用される細胞培養培地のグルコース濃度である。代表的な態様において、初期のグルコース濃度は、初期の期間中に維持される細胞培養培地のグルコース濃度である。
【００４０】
代表的な態様において、初期のグルコース濃度は、初期の期間の後に維持されるグルコース濃度と同じである。代替的な態様において、初期のグルコース濃度は、初期の期間後に維持されるグルコース濃度とは異なる。代表的な態様において、本方法は、初期の期間後に細胞培養培地にグルコースを添加すること及び初期のグルコース濃度に対して異なる濃度でグルコースを維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、初期のグルコース濃度に対して異なる濃度でグルコースを維持するために初期の期間後に細胞培養培地にグルコースを添加することを含み、グルコースを加える工程は、約１０ｇ／Ｌ又はそれ未満（例えば、約９ｇ／Ｌ又はそれ未満、約６ｇ／Ｌ又はそれ未満、約０．５ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ）のグルコース濃度を実現する。
【００４１】
代表的な態様において、本方法は、グルコース供給スケジュールに従って細胞培養培地にグルコースを添加することを含む。いくつかの態様において、グルコース供給スケジュールは、初期の期間後に開始される。例えば、いくつかの態様において、初期の期間は、少なくとも３日又は４日であり、グルコース供給スケジュールは、細胞培養接種の約４〜約６日後、例えば、細胞培養接種の約４日後、約５日後、約６日後に開始される。代表的な例において、グルコース供給スケジュールは、約１０ｇ／Ｌ又はそれ未満（例えば、約９ｇ／Ｌ又はそれ未満、約６ｇ／Ｌ又はそれ未満、約０．５ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ）の平均グルコース濃度を実現する。用語「平均グルコース濃度」は、ある期間（例えば、１〜２日）にわたってグルコースセンサーによって決定されるとおりの細胞培養培地中のグルコースの平均濃度を指す。代表的な例において、グルコース供給スケジュールは、細胞培養培地のフコースの濃度に基づいて平均グルコース濃度を実現する。いくつかの態様において、平均グルコース濃度は、式Ｉに基づいて計算される：
Ｔ＝３．３５４−１．３８８Ｆ＋０．１１１Ｇ＋［Ｆ−０．４３７５］×［１．９５２７（Ｆ−０．４３７５）］
（式Ｉ）
（式中、Ｔは、標的の％総非フコシル化（ＴＡＦ）グリカンであり、これは約２．５％〜約６％、約２．７５％〜約５．５％、又は約３％〜約５％であり、Ｆは、培地中のフコースの濃度（ｇ／Ｌ）であり、Ｇは、平均グルコース濃度（ｇ／Ｌ）である）。
【００４２】
代表的な例において、（ｉ）フコースの濃度は約０．２±０．１ｇ／Ｌであり、且つ平均グルコース濃度は約２〜約４ｇ／Ｌであるか；（ｉｉ）フコースの濃度は約０．５±０．１ｇ／Ｌであり、且つ平均グルコース濃度は約３〜約６ｇ／Ｌであるか；又は（ｉｉｉ）フコースの濃度は約０．７５±０．１ｇ／Ｌであり、且つ平均グルコース濃度は約４．５〜約９ｇ／Ｌである。
【００４３】
ＴＡＦ、ＨＭ、及び非フコシル化グリカンレベル
代表的な実施形態において、本明細書で開示される方法は、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）を産生し、組成物中のＴＡＦグリカンのレベルは、１０％未満又は約１０％である。代表的な態様において、組成物中のＴＡＦグリカンのレベルは、９％未満又は約９％、８％未満又は約８％、７％未満又は約７％、６％未満又は約６％、５％未満又は約５％である。代表的な態様において、組成物中のＴＡＦグリカンのレベルは、４％を超えるか又は約４％、例えば、約４％と約１０％の間である。いくつかの態様において、組成物中のＴＡＦグリカンのレベルは、約２％〜約６％又は約２．５％〜約５％である。いくつかの態様において、ＴＡＦグリカンのレベルは、約２．０％、約２．５％、約３．０％、約３．５％、約４．０％、約４．５％、約５％、約５．５％、又は約６．０％である。代表的な態様において、ＴＡＦグリカンのレベルは、約２％〜約５％又は約２％〜約４％である。
【００４４】
組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）を産生する方法の代表的な態様において、フコースは、約０．１ｇ／Ｌと約１．０ｇ／Ｌの間、又は約０．１７ｇ／Ｌと約１．０ｇ／Ｌの間の濃度で培養培地中に存在し、組成物中のＴＡＦグリカンのレベルは、約１０％未満である。
【００４５】
代表的な実施形態において、本明細書で開示される方法は、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）を産生し、抗体組成物中の高マンノースグリカンのレベルは、３．５％未満又は約３．５％、例えば、３．２５％未満又は約３．２５％、３．０％未満又は約３．０％、２．５％未満又は約２．５％、２．０％未満又は約２．０％である。代表的な態様において、抗体組成物中の高マンノースグリカンのレベルは、約０．７％〜約３．０％、必要に応じて、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、約２．８％、約２．９％、又は約３．０％である。
【００４６】
代表的な実施形態において、本明細書で開示される方法は、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）を産生し、抗体組成物中の非フコシル化グリカンのレベルは、３．５％未満又は約３．５％、例えば、３．２５％未満又は約３．２５％、３．０％未満又は約３．０％、２．５％未満又は約２．５％、２．０％未満又は約２．０％である。代表的な態様において、抗体組成物中の非フコシル化グリカンのレベルは、約０．８％〜約２．８％、必要に応じて、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、又は約２．８％である。
【００４７】
グリコフォーム測定の方法
糖タンパク質含有組成物中に存在するグリコフォームを評価するため、又は糖タンパク質を含む特定の試料のグリコフォームプロファイルを決定するか、検出するか若しくは測定するために、様々な方法が当技術分野で知られている。適切な方法としては、陽イオンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析、陰イオンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析、弱陰イオン交換（ＷＡＸ）クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー（ＮＰ−ＨＰＬＣ）、エキソグリコシダーゼ消化、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−４クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー及び一次元ｎ．ｍ．ｒ．分光法、並びにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｍａｔｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２７３：２２６０−２２７２（１９９８）；Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２９９（Ｐｔ  １）：２６１−２７５（１９９４）；Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ  ２（３）：３２０−３３４（２０１０）Ｗｕｈｒｅｒ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，２００５，Ｖｏｌ．８２５，Ｉｓｓｕｅ  ２，１２４−１３３頁；Ｒｕｈａａｋ  Ｌ．Ｒ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，２０１０，Ｖｏｌ．３９７：３４５７−３４８１及びＧｅｏｆｆｒｅｙ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ．ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６，Ｖｏｌ．２４０，２１０−２２６頁を参照されたい。また、本明細書中で示す例は、糖タンパク質含有組成物中に存在するグリコフォームを評価するための適切な方法を記載する。
【００４８】
本開示に関して、細胞培養は、組換えグリコシル化タンパク質産生に適切な何らかの一連の条件に従い維持され得る。例えば、いくつかの態様において、細胞培養は、特定のｐＨ、温度、細胞密度、培養体積、溶解酸素レベル、圧力、浸透圧などで維持され得る。代表的な態様において、ＣＯ２インキュベーター中、標準的な加湿条件下にて５％ＣＯ２で接種前の細胞培養物を振盪する（例えば７０ｒｐｍ）。代表的な態様において、１．５Ｌ培地中約１０６個細胞／ｍＬの接種密度で細胞培養物が接種される。
【００４９】
代表的な態様において、本開示の方法は、約６．８５〜約７．０５、例えば、様々な態様では、約６．８５、約６．８６、約６．８７、約６．８８、約６．８９、約６．９０、約６．９１、約６．９２、約６．９３、約６．９４、約６．９５、約６．９６、約６．９７、約６．９８、約６．９９、約７．００、約７．０１、約７．０２、約７．０３、約７．０４、又は約７．０５のｐＨで細胞培養培地中においてグリコシル化適格細胞を維持することを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、約６．９〜約７．０のｐＨを有する。
【００５０】
代表的な態様において、本方法は、３０℃と４０℃の間の温度で細胞培養を維持することを含む。代表的な実施形態において、温度は、約３２℃〜約３８℃又は約３５℃〜約３８℃である。
【００５１】
代表的な態様において、本方法は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ又は約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３７５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を維持することを含む。様々な態様において、浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）は、約２００、２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、又は約５００で維持される。
【００５２】
代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、約２０％〜約６０％酸素飽和度で細胞培養の溶解酸素（ＤＯ）レベルを維持することを含む。代表的な例において、本方法は、初期細胞培養期間中、約３０％〜約５０％（例えば約３５％〜約４５％）の酸素飽和度に細胞培養のＤＯレベルを維持することを含む。代表的な例において、本方法は、初期細胞培養期間中、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、又は約６０％酸素飽和度で細胞培養のＤＯレベルを維持することを含む。代表的な態様において、ＤＯレベルは、約３５ｍｍＨｇ〜約８５ｍｍＨｇ又は約４０ｍｍＨｇ〜約８０ｍｍＨｇ又は約４５ｍｍＨｇ〜約７５ｍｍＨｇである。
【００５３】
細胞培養は、任意の１つ又はそれより多くの培養培地中で維持される。代表的な態様において、細胞培養は、細胞増殖に適切な培地中で維持され、且つ／又は任意の適切な供給スケジュールに従って１つ又はそれより多くのフィード培地とともにもたらされる。代表的な態様において、本方法は、グルコース、乳酸塩、アンモニア、グルタミン及び／又はグルタメートを含む培地中で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、１μＭ未満又は約１μＭの濃度でマンガンを含む培地中で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、約０．２５μＭ〜約１μＭマンガンを含む培地中で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、無視できる量のマンガンを含む培地中で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、５０ｐｐｂ未満又は約５０ｐｐｂの濃度で銅を含む培地中で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、４０ｐｐｂ未満又は約４０ｐｐｂの濃度で銅を含む培地中で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、３０ｐｐｂ未満又は約３０ｐｐｂの濃度で銅を含む培地中で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、２０ｐｐｂ未満又は約２０ｐｐｂの濃度で銅を含む培地中で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、培地は、約５ｐｐｂを超えるか若しくは約５ｐｐｂ又は約１０ｐｐｂを超えるか若しくは約１０ｐｐｂの濃度で銅を含む。代表的な態様において、細胞培養培地は、マンノースを含む。代表的な態様において、細胞培養培地は、マンノースを含まない。
【００５４】
代表的な実施形態において、細胞培養のタイプは、流加培養法又は連続灌流培養法である。しかし、本開示の方法は、有利に、いずれの特定のタイプの細胞培養にも限定されない。
【００５５】
細胞
本開示は、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）を産生する方法であって、細胞培養培地中においてグリコシル化適格細胞を維持することを含む方法に関する。代表的な態様において、グリコシル化適格細胞は、酵母細胞、糸状菌細胞、原生生物細胞、藻類細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞を含むが限定されない真核細胞である。このような宿主細胞は、当技術分野で記載されている。例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：２１７（２０１３）を参照されたい。代表的な態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。代表的な態様において、哺乳動物細胞は非ヒト哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びその誘導体（例えばＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ  ｐｒｏ−３）、マウス骨髄腫細胞（例えばＮＳ０、ＧＳ−ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）活性を欠くように操作された細胞（例えばＤＵＫＸ−Ｘ１１、ＤＧ４４）、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞又はその誘導体（例えばＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えばＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞）、ヒト子宮頸癌細胞（例えばＨｅＬａ）、ヒト骨の骨肉腫上皮細胞Ｕ２−ＯＳ、腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞Ａ５４９、ヒト線維肉腫細胞ＨＴ１０８０、マウス脳腫瘍細胞ＣＡＤ、胚性癌腫細胞Ｐ１９、マウス胚性繊維芽細胞ＮＩＨ  ３Ｔ３、マウス繊維芽細胞Ｌ９２９、マウス神経芽腫細胞Ｎ２ａ、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７、網膜芽腫細胞Ｙ７９、ヒト網膜芽腫細胞ＳＯ−Ｒｂ５０、ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ  Ｇ２、マウスＢ骨髄腫細胞Ｊ５５８Ｌ又は新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（Ｇａｉｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｋｈａｎ，Ａｄｖ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ３（２）：２５７−２６３（２０１３））である。
【００５６】
グリコシル化に適格ではない細胞はまた、例えば、グリコシル化に必要な関連酵素をコードする遺伝子をそれらに遺伝子導入することによって、グリコシル化適格細胞に形質転換され得る。代表的な酵素としては、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、グルコシダーゼＩ、グルコシデアーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄｅａｓｅ）ＩＩ、カルネキシン／カルレティキュリン、グリコシルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
代表的な実施形態において、グリコシル化適格細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されない。フコース代謝のこれらの２つの経路は、図２において示される。代表的な実施形態において、グリコシル化適格細胞は、フコシル−トランスフェラーゼ（ＦＵＴ、例えば、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、ＦＵＴ８、ＦＵＴ９）、フコースキナーゼ、ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、及びＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼ（ＦＸ）のいずれか１つ又はそれより多くの活性を変えるように遺伝的に改変されない。代表的な実施形態において、グリコシル化適格細胞は、ＦＸをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝的に改変されない。
【００５８】
代表的な実施形態において、グリコシル化適格細胞は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧＮＴＩＩＩ）又はＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）の活性を変えるように遺伝的に改変されない。代表的な態様において、グリコシル化適格細胞は、ＧＮＴＩＩＩ又はＲＭＤを過剰発現するように遺伝的に改変されない。
【００５９】
組換えグリコシル化タンパク質
代表的な実施形態において、組換えグリコシル化タンパク質は、式：
Ａｓｎ−Ｘａａ１−Ｘａａ２
（式中、Ｘａａ１はＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり、Ｘａａ２はＳｅｒ又はＴｈｒである）の１つ又はそれより多くのＮ−グリコシル化コンセンサス配列を含むアミノ酸配列を含む。
【００６０】
代表的な実施形態において、組換えグリコシル化タンパク質は、結晶性断片（Ｆｃ）ポリペプチドを含む。「Ｆｃポリペプチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドのネイティブ及びムテイン形態を含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含有するこのようなポリペプチドの短縮型も含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（及びそれから形成されるオリゴマー）は、プロテインＡ又はプロテインＧカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製の利点をもたらす。代表的な実施形態において、組換えグリコシル化タンパク質は、ＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧのＦｃを含む。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２のＦｃを含む。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質は、抗体、抗体タンパク質生成物、ペプチボディ、又はＦｃ−融合タンパク質である。
【００６１】
代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質は抗体である。本明細書中で使用される場合、「抗体」という用語は、重及び軽鎖を含み、且つ可変及び定常領域を含む、従来の免疫グロブリン形式を有するタンパク質を指す。例えば、抗体は、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアの「Ｙ型」構造であるＩｇＧであり得、各ペアは、１本の「軽」（一般的には分子量が約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（一般的には分子量が約５０〜７０ｋＤａ）を有する。抗体は可変領域及び定常領域を有する。ＩｇＧ形式で、可変領域は一般に約１００〜１１０又はそれより多くのアミノ酸であり、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、抗原認識に主に関与し、異なる抗原に結合する他の抗体間で実質的に変動する。例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，４ｔｈ  ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（１９９９）を参照されたい。
【００６２】
簡潔に述べると、抗体骨格において、ＣＤＲは、重及び軽鎖可変領域におけるフレームワーク内に埋め込まれ、それらは抗原結合及び認識に大きく関与する領域を構成する。可変領域は、少なくとも３つの重鎖又は軽鎖のＣＤＲを含み（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３）、それらはフレームワーク領域（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１によってフレームワーク領域１〜４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４と呼ばれている；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７、前掲も参照のこと）の中にある。
【００６３】
ヒト軽鎖はカッパ及びラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ又はイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定める。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むが限定されないいくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含むが限定されないサブクラスを有する。本開示の実施形態は、抗体の全てのこのようなクラス又はアイソタイプを含む。軽鎖定常領域は、例えばカッパ又はラムダ型軽鎖定常領域、例えばヒトカッパ又はラムダ型軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えばアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ又はミュー型重鎖定常領域、例えばヒトアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ又はミュー型重鎖定常領域であり得る。したがって、代表的な実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のいずれか１つを含む、アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭの抗体である。
【００６４】
様々な態様において、抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。いくつかの態様において、抗体は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ブタ、ヒトなどにより産生される天然に存在する抗体と実質的に同様である配列を含む。この点において、抗体は、哺乳動物抗体、例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ウマ抗体、ニワトリ抗体、ハムスター抗体、ブタ抗体、ヒト抗体などとみなされ得る。ある種の態様において、組換えグリコシル化タンパク質は、モノクローナルヒト抗体である。ある種の態様において、組換えグリコシル化タンパク質は、キメラ抗体又はヒト化抗体である。「キメラ抗体」という用語は、本明細書中で、ある１つの種由来の定常ドメイン及び第２の種類由来の可変ドメインを含有する、又はより一般には少なくとも２種由来のアミノ酸配列のひと続きを含有する抗体を指すために使用される。「ヒト化」という用語は、抗体に関して使用される場合、元の起源の抗体よりも真のヒト抗体と類似している構造及び免疫学的機能を有するように操作されている非ヒト起源由来の少なくともＣＤＲ領域を有する抗体を指す。例えば、ヒト化は、非ヒト抗体、例えばマウス抗体など由来のＣＤＲをヒト抗体に移植することを含み得る。ヒト化は、非ヒト配列をよりヒト配列に見えるようにするためのアミノ酸置換の選択も含み得る。
【００６５】
抗体は、様々な態様において、例えば、パパイン及びペプシンなどの酵素により切断されて断片になる。パパインは、抗体を切断して２個のＦａｂ断片及び１個のＦｃ断片をもたらす。ペプシンは、抗体を切断してＦ（ａｂ’）２断片及びｐＦｃ’断片をもたらす。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質は、少なくとも１個のグリコシル化部位を保持する抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）２又はｐＦｃ’である。本開示の方法に関して、抗体は、抗体のある種の部分を欠く場合があり、抗体断片であってもよい。様々な態様において、抗体断片は、グリコシル化部位を含む。いくつかの態様において、断片は、真核細胞において翻訳後修飾によりグリコシル化される抗体のＦｃ領域の少なくとも一部を含む「グリコシル化Ｆｃ断片」である。
【００６６】
少なくとも又は約１２〜１５０ｋＤａの分子量範囲及び単量体（ｎ＝１）、二量体（ｎ＝２）及び三量体（ｎ＝３）から四量体（ｎ＝４）及び場合によってはそれより高い結合価（ｎ）範囲に広がる代替的な抗体形式の範囲を増大させるために抗体の構造が利用されており；このような代替的な抗体形式は、本明細書中で「抗体タンパク質生成物」又は「抗体結合タンパク質」と呼ばれる。
【００６７】
抗体タンパク質生成物は、完全な抗原結合能を保持する、抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＶＨＨ／ＶＨに基づく抗原結合形式であってもよい。その完全な抗原結合部位を保持する最小の抗原結合断片はＦｖ断片であり、これは完全に可変（Ｖ）領域からなる。分子の安定性のためにｓｃＦｖ（一本鎖断片可変）断片にＶ領域を連結するために、可溶性の柔軟性のあるアミノ酸ペプチドリンカーを使用するか、又は定常（Ｃ）ドメインをＶ領域に付加してＦａｂ断片［断片、抗原結合］を生成する。ｓｃＦｖ及びＦａｂの両方は、原核宿主において容易に作製され得る広く使用される断片である。他の抗体タンパク質生成物としては、オリゴマー化ドメインに連結されるｓｃＦｖからなる異なる形式を含むダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディ、又はミニボディ（ミニＡｂｓ）のようなジスルフィド結合で安定化されるｓｃＦｖ（ｄｓ−ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、並びに二量体及び多量体抗体形式が挙げられる。最小断片は、ラクダ科動物重鎖ＡｂのＶＨＨ／ＶＨ及び単一ドメインＡｂ（ｓｄＡｂ）である。新規抗体形式を作製するために最も頻繁に使用されるビルディングブロックは一本鎖可変（Ｖ）ドメイン抗体断片（ｓｃＦｖ）であり、これは、約１５アミノ酸残基のペプチドリンカーにより連結される重鎖及び軽鎖由来のＶドメイン（ＶＨ及びＶＬドメイン）を含む。ペプチボディ又はペプチド−Ｆｃ融合は、また別の抗体タンパク質生成物である。ペプチボディの構造は、Ｆｃドメイン上に移植された生物学的に活性のあるペプチドからなる。ペプチボディは、当技術分野で詳細に記載されている。例えば、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ４（５）：５８６−５９１（２０１２）を参照されたい。
【００６８】
他の抗体タンパク質生成物としては、一本鎖抗体（ＳＣＡ）、ダイアボディ；トリアボディ；テトラボディ；二重特異性又は三重特異性抗体などが挙げられる。二重特異性抗体は、５つの主要なクラス：ＢｓＩｇＧ、付加ＩｇＧ、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質及びＢｓＡｂコンジュゲートに分類することができる。例えば、Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７（２）Ｐａｒｔ  Ａ：９７−１０６（２０１５）を参照されたい。
【００６９】
代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質は、これらの抗体タンパク質生成物（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ  ＶＨＨ／ＶＨ、Ｆｖ断片、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、二量体抗体、多量体抗体（例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）、ミニＡｂ、ラクダ科動物の重鎖抗体のペプチボディＶＨＨ／ＶＨ、ｓｄＡｂ、ダイアボディ；トリアボディ；テトラボディ；二重特異性又は三重特異性抗体、ＢｓＩｇＧ、付加ＩｇＧ、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質、及びＢｓＡｂコンジュゲート）のいずれか１つを含み、且つ１つ又はそれより多くのＮ−グリコシル化コンセンサス配列、必要に応じて、１つ又はそれより多くのＦｃポリペプチドを含む。様々な態様において、抗体タンパク質生成物は、グリコシル化部位を含む。代表的な態様において、抗体タンパク質生成物は、抗体結合断片にコンジュゲートされたグリコシル化Ｆｃ断片（「グリコシル化Ｆｃ断片抗体生成物」）であってもよい。
【００７０】
組換えグリコシル化タンパク質は、単量体形態、又は多量体、オリゴマー、若しくは多量体形態の抗体タンパク質生成物であり得る。抗体が２つ又はそれより多くの個別の抗原結合領域断片を含むある種の実施形態において、抗体は、抗体により認識され、結合される個別のエピトープの数に依存して、二重特異性、三重特異性若しくは多重特異性又は二価、三価若しくは多価とみなされる。
【００７１】
有利に、本方法は、抗体の抗原特異性に限定されない。したがって、抗体は、実質的にあらゆる抗原に対する何らかの結合特異性を有する。代表的な態様において、抗体は、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、細胞表面受容体又は何らかのそのリガンドに結合する。代表的な態様において、抗体は、免疫細胞の細胞表面上で発現されるタンパク質に結合する。代表的な態様において、抗体は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ１１Ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１，ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７６、ＣＤ７９α、ＣＤ７９β、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤｗ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１４、ＣＤ  １１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤｗ１２８、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤｗ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤｗ１３６、ＣＤｗ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、及びＣＤ１８２からなる群から選択される表面抗原分類分子に結合する。
【００７２】
代表的な態様において、抗体は、米国特許第７９４７８０９号明細書及び米国特許出願公開第２００９００４１７８４号明細書（グルカゴン受容体）、米国特許第７９３９０７０号明細書、米国特許第７８３３５２７号明細書、米国特許第７７６７２０６号明細書、及び米国特許第７７８６２８４号明細書（ＩＬ−１７受容体Ａ）、米国特許第７８７２１０６号明細書及び米国特許第７５９２４２９号明細書（スクレロスチン）、米国特許第７８７１６１１号明細書、米国特許第７８１５９０７号明細書、米国特許第７０３７４９８号明細書、米国特許第７７００７４２号明細書、及び米国特許出願公開第２０１００２５５５３８号明細書（ＩＧＦ−１受容体）、米国特許第７８６８１４０号明細書（Ｂ７ＲＰ１）、米国特許第７８０７１５９号明細書及び米国特許出願公開第２０１１００９１４５５号明細書（ミオスタチン）、米国特許第７７３６６４４号明細書、米国特許第７６２８９８６号明細書、米国特許第７５２４４９６号明細書、及び米国特許出願公開第２０１００１１１９７９号明細書（上皮増殖因子受容体の欠失変異体）、米国特許第７７２８１１０号明細書（ＳＡＲＳコロナウイルス）、米国特許第７７１８７７６号明細書及び米国特許出願公開第２０１００２０９４３５号明細書（ＯＰＧＬ）、米国特許第７６５８９２４号明細書及び米国特許第７５２１０５３号明細書（アンジオポエチン−２）、米国特許第７６０１８１８号明細書、米国特許第７７９５４１３号明細書、米国特許出願公開第２００９０１５５２７４号明細書、米国特許出願公開第２０１１００４００７６号明細書（ＮＧＦ）、米国特許第７５７９１８６号明細書（ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体）、米国特許第７５４１４３８号明細書（結合組織増殖因子）、米国特許第７４３８９１０号明細書（ＩＬ１−Ｒ１）、米国特許第７４２３１２８号明細書（プロパージン）、米国特許第７４１１０５７号明細書、米国特許第７８２４６７９号明細書、米国特許第７１０９００３号明細書、米国特許第６６８２７３６号明細書、米国特許第７１３２２８１号明細書、及び米国特許第７８０７７９７号明細書（ＣＴＬＡ−４）、米国特許第７０８４２５７号明細書、米国特許第７７９０８５９号明細書、米国特許第７３３５７４３号明細書、米国特許第７０８４２５７号明細書、及び米国特許出願公開第２０１１００４５５３７号明細書（インターフェロン−ガンマ）、米国特許第７９３２３７２号明細書（ＭＡｄＣＡＭ）、米国特許第７９０６６２５号明細書、米国特許出願公開第２００８０２９２６３９号明細書、及び米国特許出願公開第２０１１００４４９８６号明細書（アミロイド）、米国特許第７８１５９０７号明細書及び米国特許第７７００７４２号明細書（インスリン様増殖因子Ｉ）、米国特許第７５６６７７２号明細書及び米国特許第７９６４１９３号明細書（インターロイキン−１β）、米国特許第７５６３４４２号明細書、米国特許第７２８８２５１号明細書、米国特許第７３３８６６０号明細書、米国特許第７６２６０１２号明細書、米国特許第７６１８６３３号明細書、及び米国特許出願公開第２０１０００９８６９４号明細書（ＣＤ４０）、米国特許第７４９８４２０号明細書（ｃ−Ｍｅｔ）、米国特許第７３２６４１４号明細��、米国特許第７５９２４３０号明細書、及び米国特許第７７２８１１３号明細書（Ｍ−ＣＳＦ）、米国特許第６９２４３６０号明細書、米国特許第７０６７１３１号明細書、及び米国特許第７０９０８４４号明細書（ＭＵＣ１８）、米国特許第６２３５８８３号明細書、米国特許第７８０７７９８号明細書、及び米国特許出願公開第２０１００３０５３０７号明細書（上皮増殖因子受容体）、米国特許第６７１６５８７号明細書、米国特許第７８７２１１３号明細書、米国特許第７４６５４５０号明細書、米国特許第７１８６８０９号明細書、米国特許第７３１７０９０号明細書、及び米国特許第７６３８６０６号明細書（インターロイキン−４受容体）、米国特許出願公開第２０１１０１３５６５７号明細書（ベータ−クロトー）、米国特許第７８８７７９９号明細書及び米国特許第７８７９３２３（線維芽細胞増殖因子様ポリペプチド）、米国特許第７８６７４９４号明細書（ＩｇＥ）、米国特許出願公開第２０１００２５４９７５号明細書（アルファ−４ベータ−７）、米国特許出願公開第２０１００１９７００５号明細書及び米国特許第７５３７７６２号明細書（アクチビン受容体様キナーゼ−１）、米国特許第７５８５５００号明細書及び米国特許出願公開第２０１０００４７２５３号明細書（ＩＬ−１３）、米国特許出願公開第２００９０２６３３８３号明細書及び米国特許第７４４９５５５号明細書（ＣＤ１４８）、米国特許出願公開第２００９０２３４１０６（アクチビンＡ）、米国特許出願公開第２００９０２２６４４７号明細書（アンジオポエチン−１及びアンジオポエチン−２）、米国特許出願公開第２００９０１９１２１２号明細書（アンジオポエチン−２）、米国特許出願公開第２００９０１５５１６４号明細書（Ｃ−ＦＭＳ）、米国特許第７５３７７６２号明細書（アクチビン受容体様キナーゼ−１）、米国特許第７３７１３８１号明細書（ガラニン）、米国特許出願公開第２００７０１９６３７６号明細書（インスリン様増殖因子）、米国特許第７２６７９６０号明細書及び米国特許第７７４１１１５号明細書（ＬＤＣＡＭ）、米国特許第７２６５２１２号明細書（ＣＤ４５ＲＢ）、米国特許第７７０９６１１号明細書、米国特許出願公開第２００６０１２７３９３号明細書及び米国特許出願公開第２０１０００４０６１９号明細書（ＤＫＫ１）、米国特許第７８０７７９５号明細書、米国特許出願公開第２００３０１０３９７８号明細書及び米国特許第７９２３００８号明細書（オステオプロテジェリン）、米国特許出願公開第２００９０２０８４８９号明細書（ＯＶ０６４）、米国特許出願公開第２００８０２８６２８４号明細書（ＰＳＭＡ）、米国特許第７８８８４８２号明細書、米国特許出願公開第２０１１０１６５１７１号明細書、及び米国特許出願公開第２０１１００５９０６３号明細書（ＰＡＲ２）、米国特許出願公開第２０１１０１５０８８８号明細書（ヘプシジン）、米国特許第７９３９６４０号明細書（Ｂ７Ｌ−１）、米国特許第７９１５３９１号明細書（ｃ−Ｋｉｔ）、米国特許第７８０７７９６号明細書、米国特許第７１９３０５８号明細書、及び米国特許第７４２７６６９号明細書（ＵＬＢＰ）、米国特許第７７８６２７１号明細書、米国特許第７３０４１４４号明細書��及び米国特許出願公開第２００９０２３８８２３号明細書（ＴＳＬＰ）、米国特許第７７６７７９３号明細書（ＳＩＧＩＲＲ）、米国特許第７７０５１３０号明細書（ＨＥＲ−３）、米国特許第７７０４５０１号明細書（アタキシン−１−様ポリペプチド）、米国特許第７６９５９４８号明細書及び米国特許第７１９９２２４号明細書（ＴＮＦ−α変換酵素）、米国特許出願公開第２００９０２３４１０６号明細書（アクチビンＡ）、米国特許出願公開第２００９０２１４５５９号明細書及び米国特許第７４３８９１０号明細書（ＩＬ１−Ｒ１）、米国特許第７５７９１８６号明細書（ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体）、米国特許第７５６９３８７号明細書（ＴＮＦ受容体様分子）、米国特許第７５４１４３８号明細書、（結合組織増殖因子）、米国特許第７５２１０４８号明細書（ＴＲＡＩＬ受容体−２）、米国特許第６３１９４９９号明細書、米国特許第７０８１５２３号明細書、及び米国特許出願公開第２００８０１８２９７６号明細書（エリスロポエチン受容体）、米国特許出願公開第２００８０１６６３５２号明細書及び米国特許第７４３５７９６号明細書（Ｂ７ＲＰ１）、米国特許第７４２３１２８号明細書（プロパージン）、米国特許第７４２２７４２号明細書及び米国特許第７１４１６５３号明細書（インターロイキン−５）、米国特許第６７４０５２２号明細書及び米国特許第７４１１０５０号明細書（ＲＡＮＫＬ）、米国特許第７３７８０９１号明細書（炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）腫瘍抗原）、米国特許第７３１８９２５号明細書及び米国特許第７２８８２５３号明細書（副甲状腺ホルモン）、米国特許第７２８５２６９号明細書（ＴＮＦ）、米国特許第６６９２７４０号明細書及び米国特許第７２７０８１７号明細書（ＡＣＰＬ）、米国特許第７２０２３４３号明細書（単球走化性タンパク質−１）、米国特許第７１４４７３１号明細書（ＳＣＦ）、米国特許第６３５５７７９号明細書及び米国特許第７１３８５００号明細書（４−１ＢＢ）、米国特許第７１３５１７４号明細書（ＰＤＧＦＤ）、米国特許第６６３０１４３号明細書及び米国特許第７０４５１２８号明細書（Ｆｌｔ−３リガンド）、米国特許第６８４９４５０号明細書（メタロプロテイナーゼ阻害剤）、米国特許第６５９６８５２号明細書（ＬＥＲＫ−５）、米国特許第６２３２４４７号明細書（ＬＥＲＫ−６）、米国特許第６５００４２９号明細書（脳由来神経栄養因子）、米国特許第６１８４３５９号明細書（上皮由来Ｔ細胞因子）、米国特許第６１４３８７４号明細書（神経栄養因子ＮＮＴ−１）、米国特許出願公開第２０１１００２７２８７号明細書（プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（ＰＣＳＫ９））、米国特許出願公開第２０１１００１４２０１号明細書（ＩＬ−１８受容体）、及び米国特許出願公開第２００９０１５５１６４号明細書（Ｃ−ＦＭＳ）において記載されるものの１つである。上記の特許及び公開特許出願は、可変ドメインポリペプチド、可変ドメインをコードする核酸、宿主細胞、ベクター、前記の可変ドメインをコードするポリペプチドを作製する方法、医薬組成物及び可変ドメイン含有抗原結合タンパク質又は抗体の個々の標的に付随する疾患を治療する方法のそれらの開示の目的のために、���れらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
【００７３】
代表的な実施形態において、抗体は、ムロモナブ−ＣＤ３（商品名Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  Ｏｋｔ３（登録商標）で市販される製品）、アブシキシマブ（商品名Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標）で市販される製品）、リツキシマブ（商品名ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）で市販される製品）、バシリキシマブ（商品名Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）で市販される製品）、ダクリズマブ（商品名Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）で市販される製品）、パリビズマブ（商品名Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）で市販される製品）、インフリキシマブ（商品名Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）で市販される製品）、トラスツズマブ（商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）で市販される製品）、アレムツズマブ（商品名ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ（登録商標）で市販される製品）、アダリムマブ（商品名Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）で市販される製品）、トシツモマブ−Ｉ１３１（商品名Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）で市販される製品）、エファリズマブ（商品名Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）で市販される製品）、セツキシマブ（商品名Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）で市販される製品）、イブリツモマブ・チウキセタン（商品名Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）で市販される製品）、オマリズマブ（商品名Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）で市販される製品）、ベバシズマブ（商品名Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）で市販される製品）、ナタリズマブ（商品名Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）で市販される製品）、ラニビズマブ（商品名Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）で市販される製品）、パニツムマブ（商品名Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）で市販される製品）、エクリズマブ（商品名Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）で市販される製品）、セルトリズマブ・ペゴル（商品名Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）で市販される製品）、ゴリムマブ（商品名Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）で市販される製品）、カナキヌマブ（商品名Ｉｌａｒｉｓ（登録商標）で市販される製品）、カツマキソマブ（商品名Ｒｅｍｏｖａｂ（登録商標）で市販される製品）、ウステキヌマブ（商品名Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標）で市販される製品）、トシリズマブ（商品名ＲｏＡｃｔｅｍｒａ（登録商標）、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標）で市販される製品）、オファツムマブ（商品名Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標）で市販される製品）、デノスマブ（商品名Ｐｒｏｌｉａ（登録商標）で市販される製品）、ベリムマブ（商品名Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標）で市販される製品）、ラキシバクマブ、イピリムマブ（商品名Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）で市販される製品）及びペルツズマブ（商品名Ｐｅｒｊｅｔａ（登録商標）で市販される製品）のうち１つである。代表的な実施形態において、抗体は、アダリムマブ、インフリキシマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、及びセルトリズマブ・ペゴルなどの抗ＴＮＦアルファ抗体；カナキヌマブなどの抗ＩＬ１．ベータ抗体；ウステキヌマブ及びブリアキヌマブなどの抗ＩＬ１２／２３（ｐ４０）抗体；並びにダクリズマブなどの抗ＩＬ２Ｒ抗体のうち１つである。代表的な態様において、抗体は、腫瘍関連抗原に結合し、且つ抗癌抗体である。適切な抗癌抗体の例としては、ベリムマブなどの抗ＢＡＦＦ抗体���リツキシマブなどの抗ＣＤ２０抗体；エプラツズマブなどの抗ＣＤ２２抗体；ダクリズマブなどの抗ＣＤ２５抗体；イラツムマブなどの抗ＣＤ３０抗体、ゲムツズマブなどの抗ＣＤ３３抗体、アレムツズマブなどの抗ＣＤ５２抗体；イピリムマブなどの抗ＣＤ１５２抗体；セツキシマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体；トラスツズマブ及びペルツズマブなどの抗ＨＥＲ２抗体；シルツキシマブなどの抗ＩＬ６抗体；並びにベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体；トシリズマブなどの抗ＩＬ６受容体抗体が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な態様において、腫瘍関連抗原はＣＤ２０であり、抗体は抗ＣＤ２０抗体である。代表的な態様において、腫瘍関連抗原は、配列番号３を含む。代表的な例において、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列を含む。代表的な態様において、抗体は、抗ＣＤ２０抗体、例えば、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。代替的な態様において、ＩｇＧ１抗体は、リツキシマブ、又はそのバイオシミラーである。リツキシマブという用語は、ＣＤ２０抗原に結合するＩｇＧ１カッパキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体を指す（ＣＡＳ番号：１７４７２２−３１−７；ＤｒｕｇＢａｎｋ−ＤＢ０００７３；京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）エントリーＤ０２９９４を参照のこと）。代表的な態様において、抗体は、表Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。代表的な態様において、抗体は、表Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖を含む。様々な例において、抗体は、表Ａに列挙されるＶＨ及びＶＬを含むか又はＶＨ−ＩｇＧ１及びＶＬ−ＩｇＧカッパ配列を含む。
【００７４】
【表１】
2021519068.tif 000002
【００７５】
代表的な態様において、抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である。代表的な態様において、抗体は、トラスツズマブ、又はそのバイオシミラーである。トラスツズマブという用語は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に結合するＩｇＧ１カッパヒト化モノクローナル抗体を指す（ＣＡＳ番号：１８０２８８−６９−１；ＤｒｕｇＢａｎｋ−ＤＢ０００７２；京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）エントリーＤ０３２５７を参照のこと）。代表的な態様において、抗体は、表Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。代表的な態様において、抗体は、表Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖を含む。様々な例において、抗体は、表Ｂに列挙されるＶＨ及びＶＬを含むか又はＶＨ−ＩｇＧ１及びＶＬ−ＩｇＧカッパ配列を含む。
【００７６】
【表２】
2021519068.tif 000003
【００７７】
追加の工程
本明細書で開示される方法は、様々な態様において、追加の工程を含む。例えば、いくつかの態様において、本方法は、組換えグリコシル化タンパク質を産生し、精製し、製剤化することに関与する１つ又はそれより多くの上流工程又は下流工程を含む。代表的な実施形態において、本方法は、組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体又は抗体結合タンパク質）を発現する宿主細胞を作製するための工程を含む。宿主細胞は、いくつかの態様において、原核宿主細胞、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であるか、又は宿主細胞は、いくつかの態様において、真核宿主細胞、例えば、酵母細胞、糸状菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）である。このような宿主細胞は、当技術分野で記載されている。例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：２１７（２０１３）及び本明細書の「細胞」の節を参照されたい。例えば、本方法は、いくつかの例において、組換えグリコシル化タンパク質、又はそのポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクターを宿主細胞に導入することを含む。
【００７８】
代表的な実施形態において、本明細書で開示される方法は、培養物から組換えグリコシル化タンパク質（例えば、組換え抗体）を単離及び／又は精製するための工程を含む。代表的な態様において、本方法は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない１つ又はそれより多くのクロマトグラフィー工程を含む。代表的な態様において、本方法は、組換えグリコシル化タンパク質を含む溶液から結晶性生体分子を生成させるための工程を含む。
【００７９】
本開示の方法は、様々な態様において、組成物を作製するための１つ又はそれより多くの工程を含み、いくつかの態様において、精製組換えグリコシル化タンパク質を含む医薬組成物を含む、組成物を作製するための１つ又はそれより多くの工程を含む。そのような組成物は、以下で論じられる。
【００８０】
組成物
本明細書では、組換えグリコシル化タンパク質を含む組成物が提供される。代表的な実施形態において、組成物は、本明細書に記載される組換えグリコシル化タンパク質組成物を産生する本発明の方法によって作製される。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質は抗体である。したがって、抗体組成物が本明細書で提供される。代表的な実施形態において、抗体組成物は、抗体の様々なグリコフォームを含む。代表的な実施形態において、抗体組成物は、ＴＡＦグリコフォーム、ＨＭグリコフォーム、及び／又は抗体の非フコシル化グリコフォームを含む。抗体断片又は抗体タンパク質生成物を含む組成物もまた提供される。様々な態様において、抗体断片、抗体タンパク質生成物、グリコシル化Ｆｃ断片、又はグリコシル化Ｆｃ断片抗体生成物は、グリコシル化部位を含む。代表的な実施形態において、抗体組成物は、フコースを含む細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持することを含む方法であって、フコースが約０．１７ｇ／Ｌと約１．０ｇ／Ｌの間の濃度で培養培地中に存在する方法によって産生される。代表的な実施形態において、抗体組成物は、フコースを含む細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持することを含む方法であって、フコースが、約０．１ｇ／Ｌと約１．０ｇ／Ｌの間の濃度で培養培地中に存在し、且つグリコシル化適格細胞が、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されない方法によって産生される。代表的な実施形態において、抗体組成物は、フコースが、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する、フコース及びグルコースを含む細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持し、且つ約１０ｇ／Ｌ又はそれ未満の平均グルコース濃度を実現するグルコース供給スケジュールに従って細胞培養培地にグルコースを添加することを含む方法によって産生される。代表的な実施形態において、抗体組成物は、グリコシル化適格細胞によって産生される抗体組成物のＴＡＦグリカン、非フコシル化グリカン、又は高マンノースグリカンのレベルを調節する方法の実践に基づいて産生される。代表的な態様において、抗体組成物は、（Ａ）ＴＡＦグリカンのレベルを低減するために約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌのフコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にフコースを添加すること；（Ｂ）ＴＡＦグリカンのレベルを増大させるために約１０ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にグルコースを添加すること；又は（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の両方を含むＴＡＦグリカンのレベルを調節する方法の実践に基づいて産生される。代表的な態様において、抗体組成物は、（Ａ）非フコシル化グリカンのレベルを低減するために約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌのフコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にフコースを添加すること；（Ｂ）非フコシル化グリカンのレベルを増大させるために１０ｇ／Ｌ未満又は約１０ｇ／Ｌのグルコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にグルコースを添加すること；又は（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の両方を含む、グリコシル化適格細胞によって産生される抗体組成物の非フコシル化グリカンのレベルを調節する方法の実践に基づいて産生される。代表的な例において、抗体組成物は、高マンノースグリカンのレベルを増大させるために１０ｇ／Ｌ未満又は約１０ｇ／Ｌのグルコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にグルコースを添加することを含む、グリコシル化適格細胞によって産生される抗体組成物の高マンノースグリカンのレベルを調節する方法の実践に基づいて産生される。
【００８１】
代表的な態様において、組成物中の組換えグリコシル化タンパク質の５０％未満又は約５０％（例えば、４０％未満又は約４０％、３０％未満又は約３０％、２５％未満又は約２５％、２０％未満又は約２５％、１５％未満又は約１５％）が、ＴＡＦグリコフォームである。代表的な態様において、組成物中の組換えグリコシル化タンパク質の約１０％未満（例えば、９％未満又は約９％、８％未満又は約８％、７％未満又は約７％、６％未満又は約６％、５％未満又は約５％、４％未満又は約４％、３％未満又は約３％、２％未満又は約２％）が、ＴＡＦグリコフォームである。代表的な態様において、組成物中の組換えグリコシル化タンパク質の約４％〜約１０％が、ＴＡＦグリコフォームである。代表的な態様において、組成物中の組換えグリコシル化タンパク質の約２％〜約６％が、ＴＡＦグリコフォームである。代表的な態様において、組成物中の組換えグリコシル化タンパク質の約２．５％〜約５％が、ＴＡＦグリコフォームである。代表的な態様において、組成物中の組換えグリコシル化タンパク質の４％未満又は約４％が、ＴＡＦグリコフォームである。さらなる代表的な態様において、組成物中の組換えグリコシル化タンパク質の４％未満又は約４％であり且つ２％を超えるか又は約２％が、ＴＡＦグリコフォームである。
【００８２】
代表的な態様において、本開示の組成物は、５０％未満又は約５０％（例えば、４０％未満又は約４０％、３０％未満又は約３０％、２５％未満又は約２５％、２０％未満又は約２０％、１５％未満又は約１５％）ＴＡＦグリコフォームであるグリコフォームプロファイルを有する。代表的な態様において、本開示の組成物は、１０％未満又は約１０％（例えば、９％未満又は約９％、８％未満又は約８％、７％未満又は約７％、６％未満又は約６％、５％未満又は約５％、４％未満又は約４％、３％未満又は約３％、２％未満又は約２％）ＴＡＦグリコフォームであるグリコフォームプロファイルを有する。代表的な態様において、本開示の組成物は、約４％〜約１０％のＴＡＦグリコフォームを含むグリコフォームプロファイルを有する。代表的な態様において、本開示の組成物は、約２％〜約６％のＴＡＦグリコフォームであるグリコフォームプロファイルを有する。代表的な態様において、本開示の組成物は、約２．５％〜約５％のＴＡＦグリコフォームであるグリコフォームプロファイルを有する。代表的な態様において、本開示の組成物は、４％未満又は約４％のＴＡＦグリコフォームであるグリコフォームプロファイルを有する。代表的な態様において、本開示の組成物は、４％未満又は約４％以下であり且つ２％を超えるか又は約２％のＴＡＦグリコフォームであるグリコフォームプロファイルを有する。
【００８３】
代表的な態様において、組成物中の組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体又は抗体結合タンパク質）の５％未満又は約５％が、非フコシル化グリコフォームである。代表的な態様において、組成物中の組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体又は抗体結合タンパク質）の４％未満又は約４％が、非フコシル化グリコフォームである。代表的な態様において、組成物中の組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体又は抗体結合タンパク質）の３．５％未満又は約３．５％が、非フコシル化グリコフォームである。代表的な態様において、組成物中の組換えグリコシル化タンパク質の約０．８％〜約２．８％が、非フコシル化グリコフォームである。代表的な態様において、抗体組成物中の非フコシル化グリカンのレベルは、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、又は約２．８％である。
【００８４】
代表的な態様において、組成物中の組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体又は抗体結合タンパク質）の５％未満又は約５％が、高マンノースグリコフォームである。代表的な態様において、組成物中の組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体又は抗体結合タンパク質）の４％未満又は約４％が、高マンノースグリコフォームである。代表的な態様において、組成物中の組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体又は抗体結合タンパク質）の３．５％未満又は約３．５％が、高マンノースグリコフォームである。代表的な態様において、組成物中の組換えグリコシル化タンパク質の約０．７％〜約３．０％が、高マンノースグリコフォームである。いくつかの態様において、抗体組成物中の高マンノースグリカンのレベルは、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、約２．８％、約２．９％、又は約３．０％である。
【００８５】
代表的な実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせられる。したがって、本明細書では、本明細書に記載される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水又は水／油エマルションなどのエマルション、及び様々なタイプの湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかを含む。
【００８６】
細胞培養培地
本明細書では、（ａ）抗体をコードする外来ヌクレオチド配列を含むグリコシル化適格細胞；及び（ｂ）約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌ又は約０．１７ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度でフコースを含む培養培地を含む細胞培養培地が提供される。グリコシル化適格細胞は、本明細書に記載されるいずれかの細胞であり得る。代表的な例において、グリコシル化適格細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されず、必要に応じて、グリコシル化適格細胞は、ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝的に改変されない。代表的な実施形態において、培養培地はさらに、グルコースを含む。いくつかの態様において、培養培地は、約１０ｇ／Ｌ未満又は約９ｇ／Ｌ未満、例えば、約６ｇ／Ｌ若しくはそれ未満又は約０．５ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌの濃度でグルコースを含む。いくつかの態様において、培養培地は、フコースを含む。代表的な態様において、培養培地のｐＨは、約６．８５〜約７．０５、必要に応じて、約６．９０〜約７．００である。代表的な例において、グリコシル化適格細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されない。例えば、グリコシル化適格細胞は、ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝的に改変されない。代表的な態様において、抗体は、ＩｇＧ抗体、必要に応じて、ＩｇＧ１抗体である。代表的な態様におけるＩｇＧ１抗体は、腫瘍関連抗原、例えば、ＣＤ２０に特異的である。代表的な態様において、細胞培養培地は、マンノースを含まない。
【００８７】
調節方法
細胞培養培地中においてグリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）のＴＡＦグリカンのレベルを変えるか又は調節する方法がさらに、本明細書において提供される。代表的な態様において、本方法は、（Ａ）ＴＡＦグリカンのレベルを低減するために約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌのフコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にフコースを添加すること；（Ｂ）ＴＡＦグリカンのレベルを増大させるために約１０ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にグルコースを添加すること；又は（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の両方を含む。
【００８８】
本開示はまた、グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを調節する方法を提供する。代表的な態様において、本方法は、（Ａ）非フコシル化グリカンのレベルを低減するために約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌのフコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にフコースを添加すること；（Ｂ）非フコシル化グリカンのレベルを増大させるために約１０ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にグルコースを添加すること；又は（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の両方を含む。
【００８９】
また、グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の高マンノースグリカンのレベルを調節する方法が提供される。代表的な実施形態において、本方法は、ＨＭグリカンのレベルを増大させるために約１０ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にグルコースを添加することを含む。
【００９０】
したがって、いくつかの代表的な実施形態において、本開示の方法は、細胞培養において細胞により産生されるタンパク質、例えば、抗体のＴＡＦ、ＨＭ、又は非フコシル化グリカンのレベルを増大させることに関する。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＨＭグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して増大される。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＭａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８、及び／又はＭａｎ９のうち１つ又はそれより多くのレベルは、対照細胞培養と比較して増大される。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質の非フコシル化グリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して増大される。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＡ１Ｇ０、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ、Ａ２Ｇ２、及びＡ１Ｇ１Ｍ５のうち１つ又はそれより多くのレベルは、対照細胞培養と比較して増大される。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＡ１Ｇ１ａ、Ｇ０［Ｈ３Ｎ４］、Ｇ０［Ｈ４Ｎ４］、Ｇ０［Ｈ５Ｎ４］、及びＦＯ−Ｎ［Ｈ３Ｎ３］のうち１つ又はそれより多くのレベルは、対照細胞培養と比較して増大される。いくつかの態様において、この増大は、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）によって決定される、対照細胞培養に対しての増大である。いくつかの態様において、この増大は、当業者に知られる方法によって決定される、対照細胞培養に対しての増大である。
【００９１】
いくつかの態様において、本開示の方法は、対照細胞培養と比較して任意の程度又はレベルまで、ＴＡＦ、ＨＭ、又は非フコグリコフォームレベルを増大させる。例えば、いくつかの態様において、本開示の方法によりもたらされる増大は、対照細胞培養と比較して、少なくとも又は約１％〜約１０％の増大（例えば、少なくとも又は約１％の増大、少なくとも又は約２％の増大、少なくとも又は約３％上昇、少なくとも又は約４％の増大、少なくとも又は約５％の増大、少なくとも又は約６％の増大、少なくとも又は約７％の増大、少なくとも又は約８％の増大、少なくとも又は約９％の増大、少なくとも又は約９．５％の増大、少なくとも又は約９．８％の増大、少なくとも又は約１０％の増大）である。代表的な実施形態において、本開示の方法によりもたらされる増大は、対照細胞培養と比較して、１００％超、例えば、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、又はさらに１０００％である。代表的な実施形態において、タンパク質のＴＡＦ、ＨＭ、又は非フコグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して、少なくとも約１．５倍増大する。代表的な実施形態において、タンパク質のＴＡＦ、ＨＭ、又は非フコグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して、少なくとも約２倍増大する。代表的な実施形態において、タンパク質のＴＡＦ、ＨＭ、又は非フコグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して、少なくとも約３倍増大する。代表的な実施形態において、タンパク質のＴＡＦ、ＨＭ、又は非フコグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して、少なくとも約４倍又は約５倍増大する。
【００９２】
代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの増大は、フコース及び／又はグルコース濃度が変えられた後の１日目という早期に、観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの増大は、変化後の２日目という早期に、観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの増大は、変化後の３日目という早期に、観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの増大は、変化後の約４日目という早期に、観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの増大は、変化後の約５日目という早期に、観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの増大は、細胞培養から組換えグリコシル化タンパク質が回収される時点で観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。
【００９３】
代表的な態様において、細胞培養の約４日目、５日目、又は６日目より長い間、組換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの増大が観察される。代表的な態様において、細胞培養（接種後）の７、８、９、１０、１１又は１２日間にわたり、又はより長く（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約１か月、約２か月、約３か月、約６か月、又は約１年）、組換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの増大が観察される。代表的な態様において、タンパク質のＴＡＦグリコフォームレベルの増大は、細胞培養からタンパク質が回収される時点で観察される。
【００９４】
他の態様において、本開示の方法は、細胞培養において細胞により産生されるタンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルを低減することに関する。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＨＭグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して低減される。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＭａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８、及び／又はＭａｎ９のうち１つ又はそれより多くのレベルは、対照細胞培養と比較して低減される。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質の非フコシル化グリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して低減される。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＡ１Ｇ０、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ、Ａ２Ｇ２、及びＡ１Ｇ１Ｍ５のうち１つ又はそれより多くのレベルは、対照細胞培養と比較して低減される。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＡ１Ｇ１ａ、Ｇ０［Ｈ３Ｎ４］、Ｇ０［Ｈ４Ｎ４］、Ｇ０［Ｈ５Ｎ４］、及びＦＯ−Ｎ［Ｈ３Ｎ３］のうち１つ又はそれより多くのレベルは、対照細胞培養と比較して低減される。代表的な態様において、本方法は、ＴＡＦグリコフォームのレベルを約１％〜約４％低減する方法であり、且つ本方法は、第１の細胞培養培地細胞中でグリコシル化適格細胞を維持すること及びフコース濃度を約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌまで増大させることを含む。いくつかの態様において、この低減は、ＨＩＬＩＣによって決定される、対照細胞培養に対しての低減である。いくつかの態様において、この低減は、当業者に知られる方法によって決定される、対照細胞培養に対しての低減である。
【００９５】
いくつかの態様において、本開示の方法は、対照細胞培養と比較して任意の程度又はレベルまで、ＴＡＦ、ＨＭ、又は非フコグリコフォームのレベルを低減する。例えば、本開示の方法によりもたらされる低減は、対照細胞培養のレベルと比較して、少なくとも又は約０．１％〜約１％の低減（例えば、少なくとも又は約０．１％の低減、少なくとも又は約０．２％の低減、少なくとも又は約０．３％低減、少なくとも又は約０．４％の低減、少なくとも又は約０．５％の低減、少なくとも又は約０．６％の低減、少なくとも又は約０．７％の低減、少なくとも又は約０．８％の低減、少なくとも又は約０．９％の低減、少なくとも又は約０．９５％の低減、少なくとも又は約０．９８％の低減、少なくとも又は約１．０％の低減）である。代表的な実施形態において、本開示の方法によりもたらされる低減は、対照細胞培養のレベルと比較して、約１００％超、例えば、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、又はさらに約１０００％である。代表的な実施形態において、タンパク質のＴＡＦ、ＨＭ、又は非フコグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して少なくとも約１．５倍低減する。代表的な実施形態において、タンパク質のＴＡＦ、ＨＭ、又は非フコグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して少なくとも約２倍低減する。代表的な実施形態において、タンパク質のＴＡＦ、ＨＭ、又は非フコグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して少なくとも約３倍低減する。代表的な実施形態において、タンパク質のＴＡＦ、ＨＭ、又は非フコグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して、少なくとも約４倍又は少なくとも約５倍低減する。
【００９６】
代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの低減は、接種後の約１日目という早期に、観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの低減は、接種後の約２日目という早期に、観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの低減は、接種後の約３日目という早期に、観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの低減は、接種後の約４日目という早期に、観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの低減は、接種後の約５日目という早期に、観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、組換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの低減は、細胞培養からタンパク質が回収される時点の近傍で観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。
【００９７】
代表的な態様において、細胞培養の約４日目、約５日目、若しくは約６日目よりも長いか、又は初期の細胞培養期間を超えて、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの低減が観察される。代表的な態様において、細胞培養（接種後）の約７、約８、約９、約１０、約１１又は約１２日間にわたり、又はより長く（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約１か月、約２か月、約３か月、約６か月、又は約１年）、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの低減が観察される。代表的な態様において、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルの低減は、タンパク質が細胞培養から回収される時点の近傍で観察される。
【００９８】
本開示の方法に関して、このような方法により影響を受ける調節、増大又は低減は、「対照」又は「対照細胞培養」に対するものである。代表的な態様において、対照は、本発明の方法の工程が行われないときのタンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルである。代表的な態様において、対照は、組換え産生の既知の方法が行われるときのタンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルである。代表的な態様において、対照は、既知のグルコース又はフコース濃度が組換え産生中に維持されるときのＴＡＦグリコフォームのレベルである。本明細書で使用する場合、「対照細胞培養」という用語は、フコース／グルコース濃度を除いて、本発明の方法の工程が行われる細胞培養（例えば、開示される方法の細胞培養）と同じ様式で維持される細胞培養を意味する。代表的な態様において、対照細胞培養は、対照フコース／グルコース濃度を含む、既知の操作又は標準パラメーターで維持される細胞培養である。本明細書で使用する場合、「対照フコース濃度」又は「対照グルコース濃度」という用語は、既知の操作のフコース／グルコース濃度、例えば、第１の時点又は本開示の方法を行う前の時点で維持された細胞培養のフコース／グルコース濃度を指し得る。代表的な態様において、対照フコース／グルコース濃度は、ＴＡＦレベルが既知であるか又は決定されている細胞培養のフコース／グルコース濃度である。
【００９９】
本開示の方法を調節する代表的な態様において、グリコシル化適格細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されない。必要に応じて、グリコシル化適格細胞は、ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝的に改変されない。
【０１００】
代表的な態様において、本開示の方法が行われた後、抗体組成物中のＴＡＦグリカンのレベルは、約１０％未満、例えば、約２％〜約６％、約２％〜約５％、又は約２％〜約４％である。
【０１０１】
代表的な態様において、本開示の方法が行われた後、抗体組成物中の高マンノースグリカンのレベルは、約３．５％未満、必要に応じて、約０．７％〜約３．０％である。
【０１０２】
代表的な態様において、本開示の方法が行われた後、抗体組成物中の非フコシル化グリカンのレベルは、約３．５％未満、必要に応じて、約０．８％〜約２．８％である。
【０１０３】
フコースを添加することを含む本明細書に記載される方法を調節することに関して、細胞培養培地の最終フコース濃度は、様々な態様において、約０．１７ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌ、又は約０．２ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌである。しかしながら、本明細書に記載されるフコース濃度のいずれかが企図される。
【０１０４】
細胞培養培地にグルコースを添加することを含む本明細書に記載される方法を調節することに関して、いくつかの態様において、グルコースは、約１０ｇ／Ｌ又はそれ未満又は約９ｇ／Ｌ又はそれ未満の平均グルコース濃度を実現するグルコース供給スケジュールに従って添加される。いくつかの態様において、平均グルコース濃度は、約６．０ｇ／Ｌ未満、必要に応じて、約４．０ｇ／Ｌ未満である。いくつかの例において、平均グルコース濃度は、細胞培養培地のフコース濃度に基づく。例えば、平均グルコース濃度は、式Ｉに基づいて計算され得る：
Ｔ＝３．３５４−１．３８８Ｆ＋０．１１１Ｇ＋［Ｆ−０．４３７５］×［１．９５２７（Ｆ−０．４３７５）］
式Ｉ
（式中、Ｔは、標的の％ＴＡＦグリカンであり、これは２．５％〜約６％、約２．７５％〜約５．５％、又は約３％〜約５％であり、Ｆは、培地中のフコースの濃度（ｇ／Ｌ）であり、Ｇは、平均グルコース濃度（ｇ／Ｌ）である）。
【０１０５】
本開示はさらに、グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを調節する（低減するか又は増大させる）方法を提供する。代表的な実施形態において、本方法は、細胞培養培地のｐＨを約０．０３〜約１．２（例えば、０．０５〜約１．０）下げて、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを約０．５％〜約２％（例えば、０．５％〜約１．５％、０．５％〜約１．０％、１．０％〜約２％、１．５％〜約２．０％）低減すること又は細胞培養培地のｐＨを約０．０３〜約１．２（例えば、０．０５〜約１．０）上げて、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを約０．５％〜約２％（例えば、０．５％〜約１．５％、０．５％〜約１．０％、１．０％〜約２％、１．５％〜約２．０％）増大させることを含む。代表的な態様において、本方法は、細胞培養培地のｐＨを約０．０５〜約１．２（例えば、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、１．１、１．１１、１．１２、１．１３、１．１４、１．１５、１．１６、１．１７、１．１８、１．１９、１．２０）下げて、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを約１％〜約２％（例えば、１．０％〜１．５％、１．５％〜２．０％）低減すること又は細胞培養培地のｐＨを約０．０５〜約１．２（例えば、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、１．１、１．１１、１．１２、１．１３、１．１４、１．１５、１．１６、１．１７、１．１８、１．１９、１．２０）上げて、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを約１％〜約２％（例えば、１．０％〜１．５％、１．５％〜２．０％）増大させることを含む。様々な例において、本方法は、細胞培養培地のｐＨを約０．０３〜約０．０７（例えば、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７）下げて、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを約０．５％〜約１．１％（例えば、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、１．０％、１．０１％、１．０２％、１．０３％、１．０４％、１．０５％、１．０６％、１．０７％、１．０８％、１．０９％、１．１０％）低減すること又は細胞培養培地のｐＨを約０．０３〜約０．０７（例えば、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７）上げて、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを約０．５％〜約１．１％（例えば、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、１．０％、１．０１％、１．０２％、１．０３％、１．０４％、１．０５％、１．０６％、１．０７％、１．０８％、１．０９％、１．１０％）増大させることを含む。
【０１０６】
グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを約１％〜約２％低減する方法もまた本明細書で提供される。代表的な実施形態において、本方法は、細胞培養培地のｐＨを約０．０５〜約１．２下げることを含む。必要に応じて、本方法は、約１％の非フコシル化グリカンの低減のためにｐＨを約０．０５〜約０．０７下げること又は約１．５％を超える非フコシル化グリカンの低減のためにｐＨを約０．０９〜約１．２下げることを含む。様々な態様において、本方法は、約７．１０〜約７．２０、必要に応じて、約７．１２〜約７．１９のｐＨで細胞を培養することを含む。
【０１０７】
グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを約０．５％〜約１．１％低減する方法もさらに提供される。代表的な実施形態において、本方法は、細胞培養培地のｐＨを約０．０３〜０．０７下げることを含む。様々な態様において、本方法は、約０．８％の非フコシル化グリカンの低減のためにｐＨを約０．０３〜約０．０６下げることを含む。いくつかの態様において、本方法は、約１％の非フコシル化グリカンの低減のためにｐＨを約０．０５〜約０．０７下げることを含む。様々な例において、本方法は、約７．０５〜約７．１５、必要に応じて、約７．０７〜約７．１３のｐＨで細胞を培養することを含む。
【０１０８】
グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを約１％〜約２％増大させる方法が、本開示によって提供される。代表的な実施形態において、本方法は、細胞培養培地のｐＨを約０．０５〜約１．２上げることを含む。必要に応じて、本方法は、約１％の非フコシル化グリカンの低減のためにｐＨを約０．０５〜約０．０７上げること又は約１．５％を超える非フコシル化グリカンの低減のためにｐＨを約０．０９〜約１．２上げることを含む。いくつかの態様において、本方法は、約７．１０〜約７．２０、必要に応じて、約７．１２〜約７．１９のｐＨで細胞を培養することを含む。
【０１０９】
本開示はまた、グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを約０．５％〜約１．１％増大させる方法を提供する。代表的な実施形態において、本方法は、細胞培養培地のｐＨを約０．０３〜０．０７上げること又は約０．８％の非フコシル化グリカンの低減のためにｐＨを約０．０３〜約０．０６上げること若しくは約１％の非フコシル化グリカンの低減のためにｐＨを約０．０５〜約０．０７上げることを含む。様々な例において、本方法は、約７．０５〜約７．１５、必要に応じて、約７．０７〜約７．１３のｐＨで細胞を培養することを含む。
【０１１０】
前述の方法のいずれかにおいて、培養全体にわたる細胞培養培地のｐＨは、７．０より高く、必要に応じて７．０５より高く且つ７．２未満である。いくつかの態様において、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルは、約１０％未満、例えば、約６．２％〜約８．４％である。前述の方法のいずれかにおいて、温度は、培養期間中に２℃未満変化する。例えば、いくつかの態様において、培養の温度は、１．５℃以下又は１．０℃以下変化する。前述の方法のいずれかにおいて、細胞培養培地は、検出可能な量のマンガンもベタインも含まない。いくつかの態様における細胞培養培地は、約０．１０ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌのフコース、必要に応じて、約０．１７〜約１．０ｇ／Ｌのフコースを含む。必要に応じて、フコースは、約０．７５ｇ／Ｌ未満、約０．６ｇ／Ｌ未満、又は約０．２ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する。培養培地中のフコースの添加又は存在は、本明細書で提供される教示のいずれかに従い得る。代表的な態様において、グリコシル化適格細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されない。前述の方法のいずれかにおいて、グルコースは、約１０ｇ／Ｌ又はそれ未満の平均グルコース濃度を実現するグルコース供給スケジュールに従って細胞培養培地に添加される。グルコースは、本明細書で提供される教示のいずれかに従って添加され得る。
【０１１１】
上記のとおり、ＴＡＦグリカンは、ＨＭグリカン及び非フコシル化グリカンの合計である。したがって、非フコシル化グリカンを調節する本開示の方法は、様々な例において、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）のＴＡＦグリカンのレベルを調節することになる。したがって、グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）のＴＡＦグリカンのレベルを調節する方法が、本明細書で提供される。代表的な態様における本方法は、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを、非フコシル化グリカンのレベルを調節する本開示の方法に従って調節することを含む。代表的な実施形態において、ＴＡＦグリカンを調節する方法は、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを、非フコシル化グリカンのレベルを低減する本開示の方法に従って低減すること又は組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを、非フコシル化グリカンを増大させる本開示の方法に従って増大させることを含む。
【０１１２】
抗体組成物中の非フコシル化グリカンのレベルが約６．２％〜約８．４％である抗体組成物を産生する方法がさらに、本開示によって提供される。代表的な実施形態において、本方法は、７．０５より高く且つ７．２未満のｐＨで細胞培養培地中のグリコシル化適格細胞を維持することを含み、
必要に応じて、
（Ａ）細胞培養培地のｐＨは、培養期間中に０．１５未満（必要に応じて０．１０未満）変化するか、又は
（Ｂ）細胞培養培地の温度は、２℃以下変化するか、又は
（Ｃ）本方法は、マンガン又はベタインを含む細胞培養培地中で細胞を培養することを含まないか、又は
（Ｄ）（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）のうちの２つ又は３つの組合せを含む。
【０１１３】
様々な態様において、ｐＨは、培養期間中に約７．０７〜約７．１９（例えば、７．０８、７．０９、７．１０、７．１１、７．１２、７．１３、７．１４、７．１５、７．１６、７．１７、７．１８、又は７．１９）のｐＨで維持され、必要に応じて、ｐＨは、約７．０７若しくはそれ超且つ７．１０未満、又は約７．１０若しくはそれ超且つ７．１５未満、又は約７．１５若しくはそれ超から最大約７．１９で維持される。様々な態様において、抗体組成物中の非フコシル化グリカンのレベルは、約１０％未満、必要に応じて、約６．２％〜約８．４％である。様々な例において、温度は、培養期間中に２℃未満変化し、必要に応じて、培養の温度は、１．５℃以下又は１．０℃以下変化する。様々な態様において、細胞培養培地は、検出可能な量のマンガンもベタインも含まない。代表的な態様において、細胞培養培地は、約０．１０ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌのフコース、必要に応じて、約０．１７ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌのフコースを含み、必要に応じて、フコースは、約０．７５ｇ／Ｌ未満、約０．６ｇ／Ｌ未満、又は約０．２ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する。いくつかの態様において、グリコシル化適格細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されず、且ついくつかの態様において、グルコースは、約１０ｇ／Ｌ又はそれ未満の平均グルコース濃度を実現するグルコース供給スケジュールに従って細胞培養培地に添加される。
【０１１４】
代表的な実施形態
本開示は、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）を産生する方法を提供する。代表的な実施形態において、本方法は、所望されるＴＡＦグリコフォームのレベルに応じて、本明細書に記載されるとおりの特定の濃度でフコース及び／又はグルコースを含む細胞培養培地中においてグリコシル化適格細胞を維持することを含む。代表的な実施形態において、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）中のＴＡＦグリコフォームのレベルは、１０％未満又は約１０％であり、代表的な態様において、本方法は、フコースを含む細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持することを含み、フコースは、約０．１７ｇ／Ｌと約１．０ｇ／Ｌの間の濃度で培養培地中に存在する。代表的な実施形態において、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）中のＴＡＦグリコフォームのレベルは、１０％未満又は約１０％であり、代表的な態様において、本方法は、フコースを含む細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持することを含み、フコースは、約０．１ｇ／Ｌと約１．０ｇ／Ｌの間の濃度で培養培地中に存在し、且つグリコシル化適格細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されない。本開示はまた、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）を産生する方法であって、フコースが、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する、フコース及びグルコースを含む細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持し、且つ約１０ｇ／Ｌ又はそれ未満の平均グルコース濃度を実現するグルコース供給スケジュールに従って細胞培養培地にグルコースを添加することを含む方法を提供する。代表的な態様において、フコースは、約０．７５ｇ／Ｌ未満、必要に応じて、約０．６ｇ／Ｌ未満の濃度で培養培地中に存在する。代表的な例において、フコースは、約０．２ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する。いくつかの態様において、フコースは、グリコシル化適格細胞が細胞培養中で維持される全期間において培養培地中に存在する。代表的な例において、組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）を産生する方法は、初期の期間に第１の細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持し、続いて第２の細胞培養培地中でグリコシル化適格細胞を維持することを含み、第１の細胞培養培地は、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度でフコースを含まず、且つ第２の細胞培養培地は、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度でフコースを含む。いくつかの例において、初期の期間は、約２４〜約７２時間である。代替的な態様において、初期の期間は、約７２時間又は約７２時間超であるが１５６時間未満又は約１５６時間である。いくつかの態様において、フコースが、細胞培養接種後の６日目に第１の培養培地に添加されて、第２の細胞培養培地が得られる。フコースの濃度は、グリコシル化適格細胞がフコースを含む細胞培養培地中で維持される期間中に約０．２ｇ／Ｌ又はそれ未満（例えば、０．１ｇ／Ｌ又はそれ未満）変動する。いくつかの態様において、細胞培養培地は、初期の期間において初期のグルコース濃度を含む。必要に応じて、初期のグルコース濃度は、約１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、例えば、約１２ｇ／Ｌ±１ｇ／Ｌである。代表的な態様において、本方法はさらに、グルコース供給スケジュールに従って細胞培養培地にグルコースを添加することを含む。代表的な態様において、グルコース供給スケジュールは、細胞培養接種後の約４〜約６日目に開始される。例えば、グルコース供給スケジュールは、細胞培養接種後の約６日目に開始され得る。代表的な例において、グルコース供給スケジュールは、約１０ｇ／Ｌ又はそれ未満（例えば、細胞培養培地中において約９ｇ／Ｌ又はそれ未満、約６ｇ／Ｌ又はそれ未満、約０．５ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ）の平均グルコース濃度を実現する。代表的な態様において、グルコース供給スケジュールは、細胞培養培地中のフコースの濃度に基づいて平均グルコース濃度を実現する。代表的な態様において、平均グルコース濃度は、式Ｉに基づいて計算される：
Ｔ＝３．３５４−１．３８８Ｆ＋０．１１１Ｇ＋［Ｆ−０．４３７５］×［１．９５２７（Ｆ−０．４３７５）］
（式Ｉ）
（式中、Ｔは、抗体組成物中の標的の％総非フコシル化（ＴＡＦ）グリカンであり、これは約２．５％〜約６％、約２．７５％〜約５．５％、又は約３％〜約５％であり、Ｆは、培地中のフコースの濃度（ｇ／Ｌ）であり、Ｇは、培地中の平均グルコース濃度（ｇ／Ｌ）である）。代表的な態様において、（ｉ）フコースの濃度は約０．２±０．１ｇ／Ｌであり、且つ平均グルコース濃度は約２〜約４ｇ／Ｌであるか；（ｉｉ）フコースの濃度は約０．５±０．１ｇ／Ｌであり、且つ平均グルコース濃度は約３〜約６ｇ／Ｌであるか；又は（ｉｉｉ）フコースの濃度は約０．７５±０．１ｇ／Ｌであり、且つ平均グルコース濃度は約４．５〜約９ｇ／Ｌである。代表的な態様において、細胞培養培地のｐＨは、約６．８５〜約７．０５（例えば、約６．９０〜約７．００）である。いくつかの態様において、グリコシル化適格細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されない。例えば、グリコシル化適格細胞は、ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝的に改変されない。代表的な例において、抗体組成物中の総非フコシル化（ＴＡＦ）グリカンのレベルは、約１０％未満（例えば、約２％〜約６％、約２％〜約５％、約２％〜約４％）である。代表的な例において、抗体組成物中の高マンノースグリカンのレベルは、約３．５％未満（例えば、約０．７％〜約３．０％）である。代表的な例において、抗体組成物中の非フコシル化グリカンのレベルは、約３．５％未満（例えば、約０．８％〜約２．８％）である。いくつかの態様では、グリコシル化適格細胞は、ＩｇＧ抗体、必要に応じて、ＩｇＧ１抗体を産生する。いくつかの態様において、ＩｇＧ１抗体は、腫瘍関連抗原（例えば、ＣＤ２０）に特異的である。代表的な態様において、培養培地は、マンノースを含まない。
【０１１５】
（ａ）抗体をコードする外来核酸を含むグリコシル化適格細胞；及び（ｂ）約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌ又は約０．１７ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌの濃度でフコースを含む培養培地を含む細胞培養培地。代表的な態様において、グリコシル化適格細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されず、必要に応じて、グリコシル化適格細胞は、ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝的に改変されない。代表的な態様において、培養培地はさらに、約１０ｇ／Ｌ未満、例えば、約９ｇ／Ｌ未満、約６ｇ／Ｌ未満、又は約０．５ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌの濃度でグルコースを含む。代表的な態様において、培養培地のｐＨは、約６．８５〜約７．０５、例えば、約６．９〜約７．０である。いくつかの態様において、細胞培養培地は、マンノースを含まない。代表的な態様において、抗体は、ＩｇＧ抗体、例えば、ＩｇＧ１抗体である。代表的な例において、ＩｇＧ１抗体は、腫瘍関連抗原、例えば、ＣＤ２０に特異的である。
【０１１６】
細胞培養培地中においてグリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）のＴＡＦグリカンのレベルを変えるか又は調節する方法がさらに、本明細書において提供される。代表的な態様において、本方法は、（Ａ）ＴＡＦグリカンのレベルを低減するために約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌのフコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にフコースを添加すること；（Ｂ）ＴＡＦグリカンのレベルを増大させるために約１０ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にグルコースを添加すること；又は（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の両方を含む。また、グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の非フコシル化グリカンのレベルを調節する方法が提供される。代表的な実施形態において、本方法は、（Ａ）非フコシル化グリカンのレベルを低減するために約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌのフコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にフコースを添加すること；（Ｂ）非フコシル化グリカンのレベルを増大させるために１０ｇ／Ｌ未満又は約１０ｇ／Ｌのグルコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にグルコースを添加すること；又は（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の両方を含む。本開示はさらに、グリコシル化適格細胞によって産生される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体結合タンパク質組成物）の高マンノースグリカンのレベルを調節する方法を提供する。代表的な実施形態において、本方法は、ＨＭグリカンのレベルを増大させるために約１０ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を実現するようにグリコシル化適格細胞を含む細胞培養培地にグルコースを添加することを含む。調節する方法の代表的な態様において、グリコシル化適格細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されない。例えば、グリコシル化適格細胞は、いくつかの態様において、ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝的に改変されない。いくつかの態様において、抗体組成物中のＴＡＦグリカンのレベルは、１０％未満又は約１０％（例えば、約２％〜約６％、約２％〜約５％、約２％〜約４％）である。いくつかの態様において、抗体組成物中の高マンノースグリカンのレベルは、３．５％未満又は約３．５％（例えば、約０．７％〜約３．０％）である。いくつかの態様において、抗体組成物中の非フコシル化グリカンのレベルは、３．５％未満又は約３．５％（例えば、約０．８％〜約２．８％）である。代表的な態様において、フコース濃度は、約０．１７ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌ、必要に応じて、約０．２ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌである。いくつかの態様において、本方法はさらに、約１０ｇ／Ｌ（例えば、約９．０ｇ／Ｌ未満、約６．０ｇ／Ｌ未満、約４．０ｇ／Ｌ未満）の平均グルコース濃度を実現するグルコース供給スケジュールに従って細胞培養培地にグルコースを添加することを含む。いくつかの例において、平均グルコース濃度は、細胞培養培地のフコース濃度に基づく。例えば、いくつかの態様において、平均グルコース濃度は、式Ｉに基づいて計算される：
Ｔ＝３．３５４−１．３８８Ｆ＋０．１１１Ｇ＋［Ｆ−０．４３７５］×［１．９５２７（Ｆ−０．４３７５）］
式Ｉ
（式中、Ｔは、抗体組成物中の標的の％総非フコシル化（ＴＡＦ）グリカンであり、これは約２．５％〜約６％、約２．７５％〜約５．５％、又は約３％〜約５％であり、Ｆは、培地中のフコースの濃度（ｇ／Ｌ）であり、Ｇは、平均グルコース濃度（ｇ／Ｌ）である）。
【０１１７】
以下の実施例は、単に本開示を説明するために与えられ、決してその範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１１８】
実施例１
この実施例は、実施される方法及び実施例２の実験において使用される材料を記載する。
【０１１９】
細胞株、細胞培養及び培地
全ての実験は、配列番号１を含む軽鎖及び配列番号２を含む重鎖を含む抗体を発現するクローンを使用して実施された。全ての実験は、２５日間培養された細胞の別々のバイアルを使用して実施された。以下のパラメーターが一定に保たれた：期間（１２日）、溶解酸素（４８ｍｍＨｇ〜７４ｍｍＨｇ）、ｐＨ（６．８５〜７．０５）、撹拌（３５０ＲＰＭ、２０Ｗ／ｍ３）、温度（３６．０℃）。
【０１２０】
親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）グリカンマップ
ＨＩＬＩＣを使用して、酵素的に放出されるＮ結合型グリカンのグリカンマップを決定した。簡潔に述べると、約３７℃で約２時間、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ及びリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を含む溶液とともにグリカンを温置した。次に、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含む標識溶液をＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理したグリカンに添加し、約８０℃で約７５分間、混合物を温置した。温置後、沈殿タンパク質のペレットを得るために、混合物を遠心分離した。上清を回収し、バイアルに入れた。
【０１２１】
グリカンは、蛍光検出器に基づきＨＩＬＩＣによって分離された：グリカンを注入し、高有機条件でカラムに結合させ（移動相Ａ及び移動相Ｂはそれぞれギ酸アンモニウム及びアセトニトリルであった）、続いて水性ギ酸アンモニウム緩衝液の勾配を漸増させて溶出させた。１．７μｍ小粒子カラム方式及び１５０ｍｍカラム長を使用して、高分解能が達成された。カラム再平衡化を含む総運転時間は１５５分間であった。
【０１２２】
実施例２
この実施例は、ＴＡＦ％に対して培養培地中のグルコース及びフコースレベルを増大させる効果を実証する。
【０１２３】
配列番号１の軽鎖及び配列番号２の重鎖を含む抗体を発現する細胞を、３種の培養培地：対照培養培地、第１の試験培養培地、及び第２の試験培養培地の１つを含有するバイオリアクターに添加した。第１の試験培養培地は、２倍量のグルコースを含有したことを除いて対照培養培地と同一であり、且つ第２の試験培養培地は、０．５ｇ／Ｌフコースを含む対照培養培地であった。培養培地の各々は、マンノースを欠いた。細胞培養は、６．８５と７．０５の間のｐＨで１２日間維持された。
【０１２４】
培地試料は、グルコース濃度、ＴＡＦレベル及びＡＤＣＣレベルの測定のために、バイオリアクターから定期的に採取された。ＴＡＦ及び／又は非フコシル化（非フコ）グリカンレベルは、ＨＩＬＩＣ  Ｎ−グリカンマッピング工程により評価され、ＡＤＣＣを刺激する能力は、インビトロアッセイを使用して試験された。結果は、以下の表１において示される。
【０１２５】
【表３】
2021519068.tif 000004
【０１２６】
グルコース濃度は、培養行程全体にわたって決定され、これらの測定値は、時間の関数として及び各細胞培養培地タイプにおいて産生される抗体のＴＡＦレベルに対してプロットされた。結果は、図３において示される。この図において示されるとおり、第１の試験培養において培養される細胞によって産生された抗体は、ＴＡＦの増加を実証し、この増加は、細胞培養中のグルコースレベルの増加と一致した。これらの結果（及び表１の結果）は、グルコースがＴＡＦレベル及びＡＤＣＣに影響を及ぼすことができることを示唆する。
【０１２７】
０．５ｇ／Ｌフコースを含む第２の試験培養培地において培養される細胞によって産生される抗体は、ＴＡＦの約１％の減少を示した（図３）。図３において示されるとおり、フコース濃度は、１２日間の行程にわたって大きく変化しなかったが、これは、細胞によるフコースの取込みが無視できたためであると考えられる。
【０１２８】
各種培養培地の各々において産生される抗体の別々のグリカン種のさらなる分析が行われた。興味深いことに、図４において示されるとおり、細胞が、対照培地と比較して２倍量のグルコースを含有した第１の試験培地において培養されたとき、％高マンノース（ＨＭ）グリカンは増加した。％ＨＭグリカンのこの増加は、フコースを含有する第２の試験培地において培養された細胞によっては実現されなかった。図４において示されるとおり、フコースを含有する第２の試験培地において培養された細胞によって産生された抗体の％ＨＭグリカンは、対照培地において培養された細胞によって産生された抗体の％ＨＭグリカンとほぼ同じであった。
【０１２９】
％非フコシル化グリカンに対する２倍量のグルコースを含有する培地（第１の試験培地）又はフコースを含有する培地（第２の試験培地）において培養する効果は、％ＴＡＦグリカンに対するそれらの効果と同様であった。図５において示されるとおり、高グルコース濃度を含む第１の試験培地において培養された細胞は、非フコシル化グリカンの増加を実証したが、フコースを含む第２の試験培地において培養された細胞は、非フコシル化グリカンの減少を伴う抗体を産生した。
【０１３０】
この実施例は、グルコース及びフコースが、高マンノース及び非フコシル化グリカンレベルを調節し、ＡＤＣＣに影響を及ぼすために使用され得る手段であることを実証した。
【０１３１】
実施例３
この実施例は、ＴＡＦレベル及びＡＤＣＣの調節のための手段としてのグルコース及びフコースを実証する追加の試験を示す。
【０１３２】
追跡多変量要因実験を設計して、（１）フルクトース及びグルコース変量の主効果、相互作用効果及び二次効果を解明し、且つ（２）ＴＡＦグリカン及びＡＤＣＣレベルの変更をもたらすことになるこれらの変量に関する量を見出した。フコースは、０ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ及び１ｇ／Ｌの濃度で培養培地中において評価された。グルコースは、０×、１×（対照）及び２×の比率で供給された。０×は、グルコース原液が培養に添加されないことを意味し、これは、細胞培養の６日目の後の約１ｇ／Ｌの残留グルコース濃度に変換された。グルコースは、１２ｇ／Ｌの糖を含有した培地を介してのみ供給された。１×の供給では、グルコースは、グルコース供給開始後に３±１ｇ／Ｌの平均濃度で維持された。２×の供給において、平均グルコースレベルは、６±１ｇ／Ｌで維持された。結果は、フコース濃度を変えて、ＴＡＦレベル（図６）及びＡＤＣＣレベル（図７）に影響を与えることができることを示す。
【０１３３】
これらの実験において、グルコース濃度は、供給開始後（すなわち、６日後）３±１ｇ／Ｌで制御された。グルコース濃度が４ｇ／Ｌを超えた場合、追加のグルコースは添加されず、細胞は、グルコースレベルが制御範囲内になるまでバイオリアクター中の残留グルコース及び灌流培地を介して入ってくるグルコースに依存することになった。これらの実験に基づいて、ＴＡＦ値は、図８において示されるモデルに従って、様々なフコース及びグルコース濃度について予測された。モデルは、目標製品品質プロファイル（ＱＴＴＰ）が、約０．１ｇ／Ｌ〜約１．０ｇ／Ｌフコース及び／又は約０．５ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌグルコースを含む培養培地中で細胞を培養する際に達成され得ることを実証している。ＴＡＦ値は、このモデルを利用する以下の様々なフコース及びグルコース濃度について予測された：０．２ｇ／Ｌフコース及び３ｇ／Ｌグルコース、０ｇ／Ｌフコース及び０．５５４ｇ／Ｌグルコース；及び０．４９２ｇ／Ｌフコース及び６ｇ／Ｌグルコース。図９Ａ〜９Ｃ。これらの結果は、所望のＴＡＦレベル及びＡＤＣＣレベルに到達するためのいくつかの方法があることを示唆した。
【０１３４】
図９Ａ〜９Ｃの予測を確認するために、追加の実験が行われた。実験の概要は、表２において提供される。
【０１３５】
【表４】
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【０１３６】
この実施例は、グルコース濃度及びフコース濃度の両方が、ＴＡＦ及びＡＤＣＣのレベルを変えるために操作され得る変量であることを実証した。
【０１３７】
実施例４
この実施例は、細胞培養に対するフコースの影響を実証する。
【０１３８】
追加の分析が、上記の細胞培養に対して実施された。例えば、細胞培養の浸透圧が測定され、約１７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３４５ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であった。細胞培養浸透圧とフコース濃度の間の相関の欠如が観察された。図１０を参照されたい。この図において示されるとおり、培養培地へのフコースの添加は、いずれの特定の様式においても浸透圧に影響を及ぼすように見えない。浸透圧が対照条件（フコースを伴わない）において大幅に変動したことは、培養培地中の構成成分（フコース以外）が浸透圧に活発に影響を及ぼすことを示唆する。
【０１３９】
このフコース試験の１つの実験において、細胞は、５つのバイオリアクターのうちの１つに接種され、そのうちの２は、フコースを伴わない培養培地を含有し（ｃｔｒｌ＿ａ及びｃｔｒｌ＿ｂ）、且つそのうちの３つは、０．５ｇ／Ｌのフコースを伴う培養培地を含有した（ｆｕｃ＿ａ、ｆｕｃ＿ｂ、及びｆｕｃ＿ｃ）。５つの細胞培養からの培地試料を、１２日の培養期間全体にわたって、０日目、３日目、５日目、７日目、９日目、及び１２日目に回収した。試料は、フコース濃度について測定された。図１１において示されるとおり、フコースの濃度は、培養期間全体にわたって実質的に変化しなかったが、これは、この培養プロセス中のフコースの少量且つ／又は緩徐な消費を示唆している。
【０１４０】
このフコース試験の別の実験において、細胞は、フコースを含有しない培養培地中で１２日間細胞培養において維持された。この特定の実験において、細胞培養のｐＨは、７．１から変動したが、このことが５日目〜約８日目にＴＡＦ％を約５．５％まで増加させた。ＴＡＦ％は、５日目から毎日測定された。ＴＡＦレベルを調節して４．０％の目標値に戻す試みの中で、フコースは、１日当たり０．９ｇ／Ｌの供給速度で培養の９日目に添加された。図１２において示されるとおり、ＴＡＦ％は、培養培地へのフコースの添加時に約５．５％から減少した。ＴＡＦ％は、１２日目の約３．８％まで減少し続けた。これらのデータは、フコースの添加が、培養期間の後期に起こり、それでもなおＴＡＦ％の調節をもたらす可能性があることを示唆する。
【０１４１】
この実施例は、ＴＡＦのレベルに対する、培養期間中のフコース濃度の影響を実証した。
【０１４２】
実施例５
この実施例は、標的範囲におけるグルコースの維持が、培養期間の後期に起こり得ることを実証する。
【０１４３】
３つの実験を行って、１２日の培養期間中に標的となるグルコース範囲に到達したタイミングをモニターした。各実験に関して、各細胞培養の初期グルコース濃度は、約５．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌの範囲であった。細胞培養培地のグルコース濃度は、毎日モニターされた。図１３において示されるとおり、細胞培養の各々は、培養期間の異なる日に標的となるグルコース濃度（０．５ｇ／Ｌ〜４．０ｇ／Ｌ）に達した。１つの実験において（白抜きの四角を伴う線）、標的となる範囲は２日目に実現された。第２の実験において（白抜きの菱形を伴う点線）、標的となる範囲は４日目に実現されたが、第３の実験において（白抜きの丸を伴う点線）、６日目に標的となる範囲に達した。これらの相違にもかかわらず、各細胞培養は、標的となるＴＡＦ％の範囲（約２．０％〜約４．３％）を実現した（図１３の左のグラフ；白抜きの丸によって表される第３の実験；白抜きの菱形によって表される第２の実験；白抜きの四角によって表される第１の実験）。これらのデータは、培養期間中の早期に維持された培養の同じＴＡＦレベルを実現するために、培養期間の後期にグルコースの維持が起こり得ることを示唆する。
【０１４４】
これらのデータは、グルコース濃度の早期及び後期の制御が、同様のＴＡＦレベルをもたらすことを実証している。
【０１４５】
実施例６
この実施例は、フコースの添加の有り無し両方で、抗体の非フコシル化のレベルに対する細胞培養のｐＨを下げることの効果を実証する。
【０１４６】
細胞培養の試料は、２０００Ｌのバイオリアクターから取り出され、これを使用して対応している３Ｌのバイオリアクターに接種した。２０００Ｌ及び３Ｌのバイオリアクターは、連続した流加培養プロセスを使用して１２日間フィードＡ及びフィードＢを供給された。３Ｌのバイオリアクターのうちの２つは、５日目の１．０ｇ／Ｌの最終濃度までフコースを供給された。非フコシル化レベルは、実施例１において記載されるとおりに測定され、結果は表３において提供される。
【０１４７】
【表５】
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【０１４８】
表３において示されるとおり、フコースの添加がない場合、ｐＨが７．１未満であったとき、平均％非フコシル化は６．３９であったが、ｐＨが７．１０を超えるが７．１５未満であったとき、平均％非フコシル化は、より高かった（％非フコシル化＝７．１８５）。ｐＨが７．１５を超えたとき、平均％非フコシル化はさらに高かった（％非フコシル化＝８．２７６）。したがって、比較的低いｐＨが比較的低い％非フコシル化と関連した。
【０１４９】
フコースが細胞培養に添加されたとき（１．０ｇ／Ｌのフコースの最終濃度を実現するように）、％非フコシル化は、比較的低いｐＨ（７．０７）及び比較的高いｐＨ（７．１８）の両方で実質的に減少した。これらのｐＨレベルの各々に関して、フコースが添加されたとき、％非フコシル化における平均の減少は２．１８％であった。
【０１５０】
これらの結果は、細胞培養培地のｐＨを下げること及び／又は細胞培養培地にフコースを添加することが、非フコシル化のパーセントを下げることを示唆する。ｐＨが下げられ且つフコースが細胞培養培地に添加されたとき、非フコシル化のパーセントのより大幅な減少が観察された。
【０１５１】
実施例７
この実施例はさらに、フコースの添加の有り無し両方で、抗体の非フコシル化のレベルに対する細胞培養のｐＨを下げることの効果を実証する。
【０１５２】
２０００Ｌのバイオリアクターからの細胞培養の試料を使用して、対応している３Ｌのバイオリアクターに接種した。２０００Ｌ及び３Ｌのバイオリアクターは、連続した流加培養プロセスを使用して１２日間フィードＡ及びフィードＢを供給された。バイオリアクター（すなわち、細胞培養）の一部は、５日目の０．２５、０．５又は１ｇ／Ｌの最終濃度までフコースを供給された。非フコシル化レベルは、実施例１において記載されるとおりに測定され、結果は図１４において提供される。
【０１５３】
図１４において示されるとおり、対照３Ｌバイオリアクター（対照ｐＨ７．１）は、元の２０００Ｌのバイオリアクターと同様の非フコシル化のレベルを示した。両方ともに、約６．５％又はそれを超える％非フコシル化を示した。試験されたレベルのいずれかでのフコースの添加は、％非フコシル化（５．５％又はそれ未満）の実質的な減少をもたらした。非フコシル化のパーセントは、０．２５ｇ／Ｌのフコースの添加において最も低かった。
【０１５４】
また、図１４において示されるとおり、培養培地にフコースを添加することなくｐＨを７．１から７．０に下げることもまた、少なくとも約１．０％の非フコシル化の減少をもたらした。
【０１５５】
本明細書中に引用される刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が参照によって援用されるように個別的且つ具体的に指定され、その全体が本明細書に記載されているかのような場合と同程度まで、参照により本明細書に援用される。
【０１５６】
本開示の説明に関する（とりわけ以下の特許請求の範囲に関する）「ある（ａ）」及び「ある（ａｎ）」並びに「その（ｔｈｅ）」という用語、並びに類似の指示対象の使用は、本明細書に別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち「含むが、それに限定されない」を意味する）と解釈されるべきである。
【０１５７】
本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、単に、その範囲及び各端点にある別個の値の各々を個々に指す簡略法の役目をするものに過ぎず、別個の値及び端点の各々は、それが個々に本明細書に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。
【０１５８】
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるあらゆる例又は例示的な語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をさらに明らかにするものであり、別段の主張がない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書におけるいかなる語も、任意の特許請求されていない要素を本開示の実施に必須として示していると解釈されるべきではない。
【０１５９】
本開示を実行するために、本発明者らには既知の最良の形態を含む、本開示の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変形形態は、上述の記載を読めば、当業者には明らかになるであろう。本発明者らは、当業者が必要に応じてこのような変形形態を採用することを期待し、また、本発明者らは、本明細書で具体的に記載されている形態以外で本開示が実施されることを意図している。したがって、本開示は、適用される法により認められるとおり、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙される主題の全ての変更形態及び均等物を含む。さらに、上記の要素の全ての可能な変形形態におけるそれらの要素の任意の組合せが、本明細書に別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、本開示に包含される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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