(57)【要約】本発明は、クリックケミストリー反応を通じてフィラー又は薬物伝達体として用いるための注射剤型組成物に関し、より詳しくは、本発明は、第１クリックケミストリー作用基が導入された第１生体高分子を含む第１液；及び第２クリックケミストリー作用基が導入された第２生体高分子を含む第２液を含み、前記第１クリックケミストリー作用基及び前記第２クリックケミストリー作用基が化学的に結合可能であることを特徴とする注射剤型組成物；これを用いた注射剤型ヒドロゲルの製造方法；及びこれを用いた医療用充填剤、体内注入型支持体又は薬物伝達体に関する。
2021523896.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１クリックケミストリー作用基が導入された第１生体高分子を含む第１液；及び
第２クリックケミストリー作用基が導入された第２生体高分子を含む第２液を含み、
前記第１クリックケミストリー作用基及び前記第２クリックケミストリー作用基が化学的に結合可能であることを特徴とする、注射剤型組成物。
【請求項２】
前記第１クリックケミストリー作用基は、アルキニル基、エポキシ基、アクリロイル基及びテトラジン基のうち選択される１種以上であり、前記第２クリックケミストリー作用基は、アジド基、チオール基、アミン基及びシクロオクテン基のうち選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の注射剤型組成物。
【請求項３】
前記第１クリックケミストリー作用基及び前記第２クリックケミストリー作用基の組み合わせは、（アルキニル基、アジド基）、（アルキニル基、チオール基）、（エポキシ基、アミン基）、（エポキシ基、チオール基）、（アクリロイル基、アミン基）、（アクリロイル基、チオール基）及び（テトラジン、シクロオクテン）のうち選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の注射剤型組成物。
【請求項４】
前記第１生体高分子及び前記第２生体高分子は、互いに同一であるか、相異なり、それぞれ独立的にヒアルロン酸、小腸粘膜下組織、カルボキシメチルセルロース、アルジネート、キトサン、プルロニック、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）及びβ−グリセロホスフェートのうち選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の注射剤型組成物。
【請求項５】
前記第１液及び前記第２液に薬物をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の注射剤型組成物。
【請求項６】
前記薬物は、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、グリベック（ｇｌｅｅｖｅｃ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）及びゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）のうち選択される１種以上を含む抗癌剤；又はインスリン又はインスリン親和性（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ）ペプチドを含む糖尿病疾患治療剤を含むことを特徴とする、請求項５に記載の注射剤型組成物。
【請求項７】
前記第１生体高分子１モル当たり導入された第１クリックケミストリー作用基の数；又は前記第２生体高分子１モル当たり導入された第２クリックケミストリー作用基の数は、１００個〜２０００個であることを特徴とする、請求項１に記載の注射剤型組成物。
【請求項８】
（ａ）第１生体高分子に第１クリックケミストリー作用基を含む物質を投入して第１液を製造するステップ；
（ｂ）第２生体高分子に第２クリックケミストリー作用基を含む物質を投入して第２液を製造するステップ；及び
（ｃ）前記第１液及び第２液を反応させて第１クリックケミストリー作用基及び前記第２クリックケミストリー作用基を化学的に結合させるステップを含むことを特徴とする、注射剤型ヒドロゲルの製造方法。
【請求項９】
前記ステップ（ａ）で第１クリックケミストリー作用基を含む物質は、アミノ−ＰＥＧ４−アルキニル（ａｍｉｎｏ−ＰＥＧ４−ａｌｋｙｎｅ）、アルキニルＰＥＧ５−酸（ａｌｋｙｎｅ−ＰＥＧ５−ａｃｉｄ）、アルキニルＰＥＧ−アミン（ａｌｋｙｎｅ−ＰＥＧ−ａｍｉｎｅ）、オキシラニルアミン（ｏｘｉｒａｎｙｌａｍｉｎｅ）、２−オキシラニル−エチルアミン（２−ｏｘｉｒａｎｙｌ−ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ)、アクリル酸（ａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、アクリロイルクロリド（ａｃｒｙｌｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メチルテトラジン−アミン（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ａｍｉｎｅ）、メチルテトラジン−ＰＥＧ４−アミン（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ４−ａｍｉｎｅ）、メチルテトラジン−プロピルアミン（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）、テトラジン−ＰＥＧ５−ＮＨＳエステル（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ５−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（ｍｅｔｈｙｌｔｅｌｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン−シルフォ−ＮＨＳエステル（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ｓｉｌｆｏ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン−ＰＥＧ４−酸（ｍｅｔｈｌｙｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ４−ａｃｉｄ）、メチルテトラジン−ＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン−ＮＨＳエステル（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン酸（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ａｃｉｄ）及びテトラジン酸（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ａｃｉｄ）のうち選択される１種以上であり、
前記ステップ（ｂ）で第２クリックケミストリー作用基を含む物質は、アジド−ＰＥＧ４−アミン（ａｚｉｄｅ−ＰＥＧ４−ａｍｉｎｅ）、３−アミノ−１−プロパンチオール（３−ａｍｉｎｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｔｈｉｏｌ）、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、アミノ−メタンチオール（Ａｍｉｎｏ−ｍｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ）、チオールＰＥＧアミン（ｔｈｉｏｌ  ＰＥＧ  ａｍｉｎｅ）、エチレンジアミン（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｎｅ）、ＰＥＧジアミン（ＰＥＧ  ｄｉａｍｉｎｅ）、（Ｓ）−３−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロピオン酸（（Ｓ）−ａｍｉｎｏ−２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アミノ酢酸（ａｍｉｎｏ−ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、トランス−シクロオクテン−アミン（ｔｒａｎｓ−ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ａｍｉｎｅ）、トランス−シクロオクテン−ＮＨＳエステル（ｔｒａｎｓ−ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、トランスシクロオクテン−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル（ｔｒａｎｓ  ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ＰＥＧ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）及びトランスシクロオクテン−ＰＥＧ４−酸（ｔｒａｎｓ  ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ＰＥＧ４−ａｃｉｄ）のうち選択される１種以上であることを特徴とする、請求項８に記載の注射剤型ヒドロゲルの製造方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ａ）又は前記ステップ（ｂ）で縮合剤又は薬物をさらに投入することを特徴とする、請求項８に記載の注射剤型ヒドロゲルの製造方法。
【請求項１１】
前記注射剤型ヒドロゲルの０．１Ｈｚ〜１０Ｈｚの周波数範囲でレオメータを用いて測定された貯蔵弾性率（Ｇ'）は、２．００×１０２Ｐａ〜２．００×１０３Ｐａであることを特徴とする、請求項８に記載の注射剤型ヒドロゲルの製造方法。
【請求項１２】
前記注射剤型ヒドロゲルの２５℃で複合粘度は、３．００×１０１Ｐａ・ｓ〜３．０×１０２Ｐａ・ｓであることを特徴とする、請求項８に記載の注射剤型ヒドロゲルの製造方法。
【請求項１３】
前記注射剤型ヒドロゲルは、多孔形態であることを特徴とする、請求項８に記載の注射剤型ヒドロゲルの製造方法。
【請求項１４】
前記注射剤型ヒドロゲルの水に対する膨潤率（ｓｗｅｌｌｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）は、２，０００％〜１０，０００％であることを特徴とする、請求項８に記載の注射剤型ヒドロゲルの製造方法。
【請求項１５】
請求項８によって製造された注射剤型ヒドロゲルを含むことを特徴とする、医療用充填剤又は体内注入型支持体。
【請求項１６】
請求項８によって製造された注射剤型ヒドロゲル及び薬物を含むことを特徴とする、薬物伝達体。
【請求項１７】
前記薬物は、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、グリベック（ｇｌｅｅｖｅｃ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）及びゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）のうち選択される１種以上を含む抗癌剤；又はインスリン又はインスリン親和性（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ）ペプチドを含む糖尿病疾患治療剤を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の薬物伝達体。
【請求項１８】
前記薬物伝達体は、２８日間５０％〜１００％の累積薬物放出率を有することを特徴とする、請求項１６に記載の薬物伝達体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クリックケミストリー反応を通じてフィラー又は薬物伝達体として用いるための注射剤型組成物に関し、より詳しくは、本発明は、第１クリックケミストリー作用基が導入された第１生体高分子を含む第１液；及び第２クリックケミストリー作用基が導入された第２生体高分子を含む第２液を含み、前記第１クリックケミストリー作用基及び前記第２クリックケミストリー作用基が化学的に結合可能であることを特徴とする注射剤型組成物；これを用いた注射剤型ヒドロゲルの製造方法；及びこれを用いた医療用充填剤、体内注入型支持体又は薬物伝達体に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、ヒアルロン酸注射注入型ヒドロゲルは、医療分野で多くの関心を集めており、医療用充填剤から薬物（生体伝達物質含み）伝達体、三次元構造を用いた器官／組織再生に至るまで幅広く用いられ得ると期待される。このような注射注入型ヒドロゲルは、外科的な手術過程なしに注射器などを用いて簡単に生体内に注入され得るという長所を有している。
【０００３】
一般的に、注射注入型ヒドロゲルの場合、体外では流体のような特性を有しているので、注射器を用いて移植が可能であり、体内に注入した後にはゲル化が起きるようになる。すなわち、移植後には、薬物（生体活性物質）の持続的な放出のための薬物伝達体又は細胞の成長を維持する支持体としての役目を果たすことができる。また、多様な架橋方法を導入してヒドロゲルのゲル化時間、膨潤程度、分解及び機械的物性のような物理化学的特性を調節することができ、このような物理化学的特性の調節可能性は、用途によってヒドロゲルを薬物伝達システムや組織工学に用いるのに大きな利点になる。したがって、適当な架橋程度を調節して所望する物理化学的特性を有するヒドロゲルを製造することが重要である。
【０００４】
注射注入型ヒドロゲルは、非共有結合性（疎水性結合、水素結合など）による可逆的相互作用又は化学的（熱、ＵＶ）反応による非可逆的結合を通じて収得され得る。このうち、可逆的結合反応を通じて製造された注射注入型ヒドロゲルは、光開始剤、交差結合剤のような毒性添加剤を用い、且つ機械的物性が弱いという問題点がある。
【０００５】
さて、上記のような問題点を克服すると共に、生体適合性物質の物理化学的特性を容易に調節できる架橋ヒドロゲルが必要な実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、第１クリックケミストリー作用基が導入された第１生体高分子を含む第１液；及び第２クリックケミストリー作用基が導入された第２生体高分子を含む第２液を含み、前記第１クリックケミストリー作用基及び前記第２クリックケミストリー作用基が化学的に結合可能であることを特徴とする注射剤型組成物などを提供することを目的とする。
【０００７】
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されなかったまた他の課題は、下の記載から当業者に明確に理解されるべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上述した課題を解決するためのものであって、第１クリックケミストリー作用基が導入された第１生体高分子を含む第１液；及び第２クリックケミストリー作用基が導入された第２生体高分子を含む第２液を含み、前記第１クリックケミストリー作用基及び前記第２クリックケミストリー作用基が化学的に結合可能であることを特徴とする注射剤型組成物を提供する。
【０００９】
また、本発明は、（ａ）第１生体高分子に第１クリックケミストリー作用基を含む物質を投入して第１液を製造するステップ；（ｂ）第２生体高分子に第２クリックケミストリー作用基を含む物質を投入して第２液を製造するステップ；及び（ｃ）前記第１液及び第２液を反応させて第１クリックケミストリー作用基及び前記第２クリックケミストリー作用基を化学的に結合させるステップを含むことを特徴とする注射剤型ヒドロゲルの製造方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、前記注射剤型ヒドロゲルを含む医療用充填剤又は体内注入型支持体を提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記注射剤型ヒドロゲル及び薬物を用いた薬物伝達体を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明による注射剤型ヒドロゲルは、注射剤型組成物からクリックケミストリー反応を通じて簡単に製造されるものであって、クリックケミストリー作用基の種類及び数、生体高分子の分子量などを調節することで注射剤型ヒドロゲルの物理化学的特性を容易に調節できるという長所がある。したがって、本発明による注射剤型ヒドロゲルは、医療用充填剤又は体内注入型支持体として適合であり、薬物（生体伝達物質含み）をさらに含むことで徐放型薬物伝達体などでも用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明による第１クリックケミストリー作用基が導入されたヒアルロン酸及び第２クリックケミストリー作用基が導入されたヒアルロン酸のクリックケミストリー反応を通じた特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの作用機序を示した模式図である。
【００１４】
【図２】図２は、本発明の一実施例によって製造された特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの１Ｈ−ＮＭＲ結果である。
【００１５】
【図３】図３は、本発明の一実施例によって製造された特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの有変学的特性を示すグラフである。
【００１６】
【図４】図４は、本発明の一実施例によって製造された特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルを走査電子顕微鏡で観察した写真である。
【００１７】
【図５】図５は、本発明の一実施例によって製造された特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの水に対する膨潤特性を示すグラフである。
【００１８】
【図６】図６は、本発明の一実施例によって製造された特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの生体内ゲル形態維持特性を示す写真である。
【００１９】
【図７】図７は、本発明の一実施例によって製造された特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの生体内維持特性を示す写真である。
【００２０】
【図８】図８は、本発明の一実施例によって製造された抗癌剤（ドキソルビシン）含有特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルから抗癌剤（ドキソルビシン）の累積放出特性を示すグラフである。
【００２１】
【図９】図９は、本発明の一実施例によって製造された抗癌剤（ドキソルビシン）含有特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルによる癌細胞の成長抑制を示すグラフである。
【００２２】
【図１０】図１０は、本発明の一実施例によって製造された抗癌剤（ドキソルビシン）含有特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの注入による動物に形成された癌の成長抑制を示すグラフである。
【００２３】
【図１１】図１１は、本発明の一実施例によって製造された抗癌剤（ドキソルビシン）含有特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル及び本発明の一実施例によって製造された特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの凍結粉砕物に抗癌剤（ドキソルビシン）を含有した組成物の注入による動物に形成された癌の成長抑制を比較するグラフである。
【００２４】
【図１２】図１２は、本発明の一実施例によって製造された抗癌剤（ドキソルビシン）含有特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの注入後に動物の各臓器に抗癌剤（ドキソルビシン）の蛍光が現われることを観察した結果を示す写真である。
【００２５】
【図１３】図１３は、本発明の一実施例によって製造された抗癌剤（ドキソルビシン）含有特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの注入後に動物の各臓器で観察された抗癌剤（ドキソルビシン）の量をＨＰＬＣで定量確認した結果を示すグラフである。
【００２６】
【図１４】図１４は、本発明の一実施例によって製造されたインスリン含有特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの注入後に糖尿誘発動物の血中での血糖濃度の変化を定量確認した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明者らは、フィラー（医療用充填剤又は体内注入型支持体）及び薬物伝達体に対する研究を持続していた中、生体高分子に互いに異なるクリックケミストリー作用基を導入し、クリックケミストリー反応を通じて化学的に架橋結合させることで、製造が簡便で且つ生体持続性に優れたヒドロゲルを製造することができることを確認し、本発明を完成した。
【００２８】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２９】
本発明は、第１クリックケミストリー作用基が導入された第１生体高分子を含む第１液；及び第２クリックケミストリー作用基が導入された第２生体高分子を含む第２液を含み、前記第１クリックケミストリー作用基及び前記第２クリックケミストリー作用基が化学的に結合可能であることを特徴とする注射剤型組成物を提供する。
【００３０】
前記注射剤型組成物は、注射剤型ヒドロゲルを簡単に製造するための組成物であって、前記第１液及び前記第２液がデュアルシリンジなどで互いに分離された状態で存在してから、混合させることができる。混合するとき、前記注射剤型組成物内の第１クリックケミストリー作用基及び第２クリックケミストリー作用基がクリックケミストリー反応を通じて特異的架橋結合を形成することで注射剤型ヒドロゲル形態に製造され得る。前記ヒドロゲルは、水を分散媒にするゲルであって、ゲルは、ゾルが流動性を失って固化された状態で分散相の溶解度が低下されて互いに連結されて網目構造を取り、その中に分散媒が含まれているものである。
【００３１】
前記第１クリックケミストリー作用基は、アルキニル基、エポキシ基、アクリロイル基及びテトラジン基のうち選択される１種以上を含み、前記第２クリックケミストリー作用基は、アジド基、チオール基、アミン基及びシクロオクテン基のうち選択される１種以上を含むことができる。
【００３２】
具体的に、前記第１クリックケミストリー作用基として、アルキニル基は、アミノ−ＰＥＧ４−アルキニル（ａｍｉｎｏ−ＰＥＧ４−ａｌｋｙｎｅ）、アルキニルＰＥＧ５−酸（ａｌｋｙｎｅ−ＰＥＧ５−ａｃｉｄ）、アルキニルＰＥＧ−アミン（ａｌｋｙｎｅ−ＰＥＧ−ａｍｉｎｅ）のうち；エポキシ基は、オキシラニルアミン（ｏｘｉｒａｎｙｌａｍｉｎｅ）、２−オキシラニル−エチルアミン（２−ｏｘｉｒａｎｙｌ−ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）のうち；アクリロイル基は、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、アクリル酸（ａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、アクリロイルクロリド（ａｃｒｙｌｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）のうち；テトラジン基は、メチルテトラジン−アミン（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ａｍｉｎｅ）、メチルテトラジン−ＰＥＧ４−アミン（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ４−ａｍｉｎｅ）、メチルテトラジン−プロピルアミン（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）、テトラジン−ＰＥＧ５−ＮＨＳエステル（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ５−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（ｍｅｔｈｙｌｔｅｌｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン−シルフォ−ＮＨＳエステル（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ｓｉｌｆｏ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン−ＰＥＧ４−酸（ｍｅｔｈｌｙｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ４−ａｃｉｄ）、メチルテトラジン−ＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン−ＮＨＳエステル（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン酸（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ａｃｉｄ）、テトラジン酸（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ａｃｉｄ）のうち選択された第１クリックケミストリー作用基を含む物質に由来したものであってもよい。
【００３３】
本発明の一実施例では、前記第１クリックケミストリー作用基を含む物質として、メチルテトラジン−ＰＥＧ４−アミン（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ４−ａｍｉｎｅ、Ｔｅｔ）を用いた。
【００３４】
また、前記第２クリックケミストリー作用基として、アジド基は、アジド−ＰＥＧ４−アミン（ａｚｉｄｅ−ＰＥＧ４−ａｍｉｎｅ）から；チオール基は、３−アミノ−１−プロパンチオール（３−ａｍｉｎｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｔｈｉｏｌ）、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、アミノ−メタンチオール（Ａｍｉｎｏ−ｍｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ）、チオールＰＥＧアミン（ｔｈｉｏｌ  ＰＥＧ  ａｍｉｎｅ）のうち；アミン基は、エチレンジアミン（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｎｅ）、ＰＥＧジアミン（ＰＥＧ  ｄｉａｍｉｎｅ）、（Ｓ）−３−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロピオン酸（（Ｓ）−ａｍｉｎｏ−２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アミノ酢酸（ａｍｉｎｏ−ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）のうち；シクロオクテン基は、トランス−シクロオクテン−アミン（ｔｒａｎｓ−ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ａｍｉｎｅ）、トランス−シクロオクテン−ＮＨＳエステル（ｔｒａｎｓ−ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、トランスシクロオクテン−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル（ｔｒａｎｓ  ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ＰＥＧ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、トランスシクロオクテン−ＰＥＧ４−酸（ｔｒａｎｓ  ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ＰＥＧ４−ａｃｉｄ）のうち選択された第２クリックケミストリー作用基を含む物質に由来したものであってもよい。
【００３５】
本発明の一実施例では、前記第２クリックケミストリー作用基を含む物質として、トランス−シクロオクテン−アミン（ｔｒａｎｓ−ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ａｍｉｎｅ、ＴＣＯ）を用いた。
【００３６】
前記第１クリックケミストリー作用基及び第２クリックケミストリー作用基は、互いに化学的に架橋結合が可能なものであって、このような化学的結合は、短い時間、特に、数秒以内に行われ得、第１液と第２液が短時間内にゲル化が可能であるという利点を有する。具体的に、前記第１クリックケミストリー作用基及び前記第２クリックケミストリー作用基の組み合わせは、（アルキニル基、アジド基）、（アルキニル基、チオール基）、（エポキシ基、アミン基）、（エポキシ基、チオール基）、（アクリロイル基、アミン基）、（アクリロイル基、チオール基）及び（テトラジン、シクロオクテン）のうち選択される１種以上であってもよい。
【００３７】
本発明の一実施例では、前記第１クリックケミストリー作用基及び第２クリックケミストリー作用基の組み合わせで（テトラジン、シクロオクテン）を用い、これらが互いに反応して特異的架橋結合を形成した。
【００３８】
前記第１生体高分子及び前記第２生体高分子は、互いに同一であるか、相異なっていてもよく、それぞれ独立的にヒアルロン酸、小腸粘膜下組織、カルボキシメチルセルロース、アルジネート、キトサン、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）及びβ−グリセロホスフェートのうち選択される一つ以上を含むことができ、ヒアルロン酸を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００３９】
より具体的に、前記第１生体高分子及び第２生体高分子は、作用基導入前を基準に分子量が互いに同一であるか、相異なっていてもよく、その分子量は、５００，０００Ｄａ〜６，０００，０００Ｄａであることが好ましいが、これに限定されない。生体高分子の分子量が前記範囲未満である場合、物性が過度に低くなる問題点があり、分子量が前記範囲を超過する場合、粘度上昇による使用時の問題点がある。
【００４０】
前記第１生体高分子１モル当たり導入された第１クリックケミストリー作用基の数；又は前記第２生体高分子１モル当たり導入された第２クリックケミストリー作用基の数を調節することで、前記生体高分子ヒドロゲルの架橋度を調節することができ、結果的に、ヒドロゲルの用途によって物性を最適化させ得る。具体的に、前記第１生体高分子１モル当たり導入された第１クリックケミストリー作用基の数；又は前記第２生体高分子１モル当たり導入された第２クリックケミストリー作用基の数は、１００個〜２０００個であってもよく、１００個〜３００個であることが容易な注射注入側面で最も好ましいが、これに限定されない。
【００４１】
具体的に、前記生体高分子ヒドロゲルが低いクリック架橋度を有する場合には、低い強度及び高い膨潤度により各種軟組織に適用ができる。一方、前記生体高分子ヒドロゲルが中間クリック架橋度を有する場合には、軟骨組織に適用されて関節炎、軟骨損傷又は軟骨欠損の予防又は治療用途で用いられ得る。一方、前記生体高分子ヒドロゲルが高いクリック架橋度を有する場合には、高い強度及び低い膨潤度により骨組織に適用されて骨粗鬆症又は骨欠損疾患の予防又は治療用途で用いられ得る。
【００４２】
前記第１液及び前記第２液に薬物をさらに含むことができるが、このとき、薬物は、通常的な薬物だけではなく、生体伝達物質を全て含む広範囲な概念である。前記薬物としては、公知の薬物が使用可能であり、例えば、前記薬物は、化学薬物、タンパク質医薬、ペプチド医薬、遺伝子治療用核酸分子及びナノ粒子などを含むことができる。例えば、前記薬物は、抗癌剤、糖尿病疾患治療剤、抗炎症剤、鎮痛剤、抗関節炎剤、鎮痙剤、抗うつ剤、抗精神病薬物、神経安定剤、抗不安剤、麻薬拮抗剤、抗パーキンソン疾患薬物、コリン性アゴニスト、抗血管新生抑制剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤、抗生剤、食欲抑制剤、鎮痛剤、抗コリン剤、抗ヒスタミン剤、抗片頭痛剤、ホルモン剤、冠血管、脳血管又は末梢血管拡張剤、避姙薬、抗血栓剤、利尿剤、抗高血圧剤、心血管疾患治療剤、美容成分（例えば、しわ改善剤、皮膚老化抑制剤及び皮膚美白剤）などを含むが、これに限定されない。
【００４３】
具体的に、前記薬物は、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、グリベック（ｇｌｅｅｖｅｃ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）及びゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）のうち選択される１種以上を含む抗癌剤；又はインスリン又はインスリン親和性（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ）ペプチドを含む糖尿病疾患治療剤を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００４４】
本発明の一実施例では、前記薬物にドキソルビシン及びインスリンを用いた。
【００４５】
また、本発明は、（ａ）第１生体高分子に第１クリックケミストリー作用基を含む物質を投入して第１液を製造するステップ；（ｂ）第２生体高分子に第２クリックケミストリー作用基を含む物質を投入して第２液を製造するステップ；及び（ｃ）前記第１液及び第２液を反応させて第１クリックケミストリー作用基及び前記第２クリックケミストリー作用基を化学的に結合させるステップを含むことを特徴とする注射剤型ヒドロゲルの製造方法を提供する。
【００４６】
前記ステップ（ａ）で第１クリックケミストリー作用基を含む物質は、アミノ−ＰＥＧ４−アルキニル（ａｍｉｎｏ−ＰＥＧ４−ａｌｋｙｎｅ）、アルキニルＰＥＧ５−酸（ａｌｋｙｎｅ−ＰＥＧ５−ａｃｉｄ）、アルキニルＰＥＧ−アミン（ａｌｋｙｎｅ−ＰＥＧ−ａｍｉｎｅ）、オキシラニルアミン（ｏｘｉｒａｎｙｌａｍｉｎｅ）、２−オキシラニル−エチルアミン（２−ｏｘｉｒａｎｙｌ−ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ)、アクリル酸（ａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、アクリロイルクロリド（ａｃｒｙｌｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メチルテトラジン−アミン（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ａｍｉｎｅ）、メチルテトラジン−ＰＥＧ４−アミン（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ４−ａｍｉｎｅ）、メチルテトラジン−プロピルアミン（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）、テトラジン−ＰＥＧ５−ＮＨＳエステル（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ５−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（ｍｅｔｈｙｌｔｅｌｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン−シルフォ−ＮＨＳエステル（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ｓｉｌｆｏ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン−ＰＥＧ４−酸（ｍｅｔｈｌｙｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ４−ａｃｉｄ）、メチルテトラジン−ＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン−ＮＨＳエステル（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン酸（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ａｃｉｄ）及びテトラジン酸（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ａｃｉｄ）のうち選択される１種以上であってもよい。
【００４７】
前記ステップ（ｂ）で第２クリックケミストリー作用基を含む物質は、アジド−ＰＥＧ４−アミン（ａｚｉｄｅ−ＰＥＧ４−ａｍｉｎｅ）、３−アミノ−１−プロパンチオール（３−ａｍｉｎｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｔｈｉｏｌ）、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、アミノ−メタンチオール（Ａｍｉｎｏ−ｍｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ）、チオールＰＥＧアミン（ｔｈｉｏｌ  ＰＥＧ  ａｍｉｎｅ）、エチレンジアミン（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｎｅ）、ＰＥＧジアミン（ＰＥＧ  ｄｉａｍｉｎｅ）、（Ｓ）−３−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロピオン酸（（Ｓ）−ａｍｉｎｏ−２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アミノ酢酸（ａｍｉｎｏ−ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、トランス−シクロオクテン−アミン（ｔｒａｎｓ−ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ａｍｉｎｅ）、トランス−シクロオクテン−ＮＨＳエステル（ｔｒａｎｓ−ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、トランスシクロオクテン−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル（ｔｒａｎｓ  ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ＰＥＧ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）及びトランスシクロオクテン−ＰＥＧ４−酸（ｔｒａｎｓ  ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ＰＥＧ４−ａｃｉｄ）のうち選択される１種以上であってもよい。
【００４８】
選択的に、前記ステップ（ａ）又は前記ステップ（ｂ）で縮合剤又は薬物をさらに投入することができる。具体的に、前記第１又は第２生体高分子に第１又は第２クリックケミストリー作用基を導入するためには、前記第１又は第２生体高分子溶液に縮合剤をさらに含むことで縮合反応を行うことが好ましいが、これに限定されない。前記縮合剤としては、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（４−（４，６−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）４−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＤＭＴＭＭ）を用いることができ、縮合剤の量は、縮合反応程度を制御するために調節され得る。一方、前記薬物に対しては上述した通りであり、前記薬物の投入により薬物伝達体で適用が可能である。
【００４９】
前記方法によって製造された注射剤型ヒドロゲルは、ゲル形態であると共に注射が可能な剤型であることを特徴とする。
【００５０】
具体的に、前記注射剤型ヒドロゲルは、高い貯蔵弾性率（Ｇ'）を有することを特徴とするが、前記注射剤型ヒドロゲルの０．１Ｈｚ〜１０Ｈｚの周波数範囲でレオメータを用いて測定された貯蔵弾性率（Ｇ'）は、２．００×１０２Ｐａ〜２．００×１０３Ｐａであってもよく、２．００×１０２Ｐａ〜４．００×１０２Ｐａであることが好ましいが、これに限定されない。
【００５１】
また、前記注射剤型ヒドロゲルの２５℃での複合粘度は、３．００×１０１Ｐａ・ｓ〜３．０×１０２Ｐａ・ｓであってもよく、３．００×１０１Ｐａ・ｓ〜６．０×１０１Ｐａ・ｓであることが好ましいが、これに限定されない。
【００５２】
また、前記注射剤型ヒドロゲルは、多孔形態であってもよい。これは架橋結合が行われたことを意味する。
【００５３】
また、前記注射剤型ヒドロゲルの水に対する膨潤率（ｓｗｅｌｌｉｎｇｒａｔｉｏ）は、２，０００％〜１０，０００％であってもよく、７，５００％〜１０，０００％であることが好ましいが、これに限定されない。
【００５４】
また、前記製造された注射剤型ヒドロゲルを含む医療用充填剤又は体内注入型支持体（フィラー）を提供する。
【００５５】
また、前記製造された注射剤型ヒドロゲル及び薬物を含む薬物伝達体を提供する。
【００５６】
前記薬物は、前記ヒドロゲルの内部に存在してもよく、前記ヒドロゲルと混合された形態で存在してもよいが、前記ヒドロゲルの内部に存在することが効果的な薬物伝達側面で好ましいが、これに限定されない。
【００５７】
前記薬物に対しては上述した通りである。
【００５８】
前記薬物伝達体は、徐放型薬物伝達体として用いられ得、２８日間５０％〜１００％の累積薬物放出率を有することができる。具体的に、前記薬物伝達体は、１６日間５０％〜８０％の累積薬物放出率を有することができ、２８日間８０％〜１００％の累積薬物放出率を有することができるので、薬物が長い時間にわたって徐々に放出されて長期間薬効が維持されることを特徴とする。したがって、薬物の一回／繰り返し注入による副作用を全て解消できるという利点を有する。
【００５９】
また、本発明は、前記注射剤型ヒドロゲル又は前記薬物伝達体を癌、糖尿病又は疾患治療に用いるための用途を提供する。
【００６０】
また、本発明は、前記注射剤型ヒドロゲル又は前記薬物伝達体を個体に投与するステップを含む癌又は糖尿病疾患治療方法を提供する。
【００６１】
本発明で「個体」とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒト又は非ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、犬、猫、馬及び牛などの哺乳類を意味する。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。これら実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないと解釈されることは、当業界で通常の知識を有した者において自明である。
【００６３】
実施例１〜３．第１及び第２クリック反応作用基が導入されて特異的に架橋されたヒアルロン酸ヒドロゲルの製造
（１）３次蒸溜水１０ｍＬにヒアルロン酸（ＨＡ）（分子量：１，０００，０００Ｄａ）１００ｍｇを投入した後、２５℃で２４時間の間撹拌してヒアルロン酸溶液を製造し、これをバイアルに５ｍＬずつ分けた。
【００６４】
（２）前記ヒアルロン酸溶液があるバイアルに縮合剤として４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（４−（４，６−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）４−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＤＭＴＭＭ）８．３ｇとメチルテトラジン−ＰＥＧ４−アミン（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ４−ａｍｉｎｅ、Ｔｅｔ）９．９３ｍｇを投入し、２５℃で２４時間の間撹拌して反応させた。次に、７２時間の間透析した後、−８０℃で凍結乾燥させて第１クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−Ｔｅｔを製造した。
【００６５】
下記表１に示したように、Ｆｌａｓｈ  ＥＡ１１１２装置（ＣＥ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｔａｌｙ）の元素分析を通じて第１クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−Ｔｅｔにクリック反応作用基の導入された量を分析した。
【００６６】
（３）上記と同一の方法で化学作用基が導入されたヒアルロン酸を製造するが、Ｔｅｔの代わりにトランス−シクロオクテン−アミン（ｔｒａｎｓ−ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ａｍｉｎｅ、ＴＣＯ）７．７ｍｇを投入して第２クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−ＴＣＯを製造した。
【００６７】
下記表１に示したように、Ｆｌａｓｈ  ＥＡ１１１２装置（ＣＥ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｔａｌｙ）の元素分析を通じて第２クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−ＴＣＯにクリック反応作用基の導入された量を分析した。
【００６８】
（４）上記で製造された第１クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−Ｔｅｔと第２クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−ＴＣＯをそれぞれ２％生理食塩水にとかした後、デュアルシリンジに入れて注射することでＨＡ−ＴｅｔとＨＡ−ＴＣＯを混合してクリックケミストリー反応を誘導し、最終的に、本発明の特異的架橋結合を通じたヒアルロン酸ヒドロゲルを製造した。
【００６９】
（５）上記で製造されたヒアルロン酸ヒドロゲルの架橋度は、ＴＣＯ又はＴｅｔが導入された数に応じて調節される。
【００７０】
【表１】
2021523896.tif 000003
【００７１】
＊数字：ヒアルロン酸（ＨＡ）１モル当たり導入されたＴＣＯ又はＴｅｔの数（２５０、５００、１０００個）
【００７２】
また、１Ｈ−ＮＭＲ分析を通じて第１クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−Ｔｅｔと第２クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−ＴＣＯの作用基の導入を確認した（図２）。
【００７３】
実施例４．近赤外線蛍光イメージングのための蛍光物質が導入された特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの製造
５０ｍＬ丸底フラスコでＩＲ７８３（８０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）及び４−メルカプト安息香酸（４−ｍｅｒｃａｐｔｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ、５１ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解させ、室温で２４時間の間撹拌した。反応させた溶液から未反応物質及び不純物を除去するためにエタノールとジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）の混合溶媒（ｖ／ｖ＝１／１９）３０ｍＬに沈澱させて濾過した。濾過物で得られた緑色固体を真空乾燥してＩＲ７８３−ＣＯＯＨを製造した。
【００７４】
次に、前記実施例１で製造された第１クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−Ｔｅｔ及び第２クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−ＴＣＯをそれぞれ３次蒸溜水１０ｍＬに投入した後に溶液を製造し、それぞれのバイアルに縮合剤として４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（４−（４，６−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）４−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＤＭＴＭＭ）３．３ｍｇを投入した。これをそれぞれＩＲ７８３−ＣＯＯＨ  １０．５ｍｇが含まれた３次蒸溜水５ｍＬにゆっくり滴下しながら、２５℃で２４時間の間撹拌して反応させ、３日間透析した後、−８０℃で凍結乾燥させて、第１クリックケミストリー作用基とＩＲ７８３が導入されたＮＩＲ−ＨＡ−Ｔｅｔ及び第２クリックケミストリー作用基とＩＲ７８３が導入されたＮＩＲ−ＨＡ−ＴＣＯを製造した。
【００７５】
実施例５．抗癌剤が含有された特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの製造
前記実施例１で製造された第１クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−Ｔｅｔ（２ｍｇ）と第２クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−ＴＣＯ（２ｍｇ）をそれぞれ２％生理食塩水にとかして１００μＬ溶液で製造し、それぞれの溶液に抗癌剤０．２ｍｇのドキソルビシン（Ｄｏｘ）を添加した。１時間の間撹拌した後、それぞれ撹拌された混合液をデュアルシリンジを通じて混合して、ドキソルビシン（０．４ｍｇ）が含有された特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル（Ｃｘ−ＨＡ−Ｄｏｘ）を最終的に収得した。
【００７６】
実施例６．糖尿病疾患治療剤が含有された特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの製造
前記実施例１で製造された第１クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−Ｔｅｔ（２ｍｇ）と第２クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−ＴＣＯ（２ｍｇ）をそれぞれ２％生理食塩水にとかして１００μＬ溶液で製造し、それぞれの溶液にインスリン３１．５ＩＵを添加した。１時間の間撹拌した後、それぞれ撹拌された混合液をデュアルシリンジを通じて混合して、インスリン（６３ＩＵ）が含有された特異的架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル（Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｃｘ−ＨＡ）を最終的に収得した。
【００７７】
比較例１．ヒアルロン酸ヒドロゲルの製造
ヒアルロン酸を２％生理食塩水にとかした後、ヒアルロン酸ヒドロゲル（ＨＡ）を最終製造した。
【００７８】
比較例２．蛍光物質が導入されたヒアルロン酸ヒドロゲルの製造
ヒアルロン酸を２％生理食塩水にとかしたバイアルに縮合剤として４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（４−（４，６−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）４−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＤＭＴＭＭ）３．３ｍｇを投入した後、前記実施例４で製造されたＩＲ７８３−ＣＯＯＨ  １０．５ｍｇ含む３次蒸溜水５Ｍｌにゆっくり滴下しながら、２５℃で２４時間の間撹拌して反応させ、３日間透析した後、−８０℃で凍結乾燥させて、ＩＲ７８３が導入されたＮＩＲ−ＨＡを製造した。
【００７９】
比較例３．抗癌剤が含有されたヒアルロン酸ヒドロゲルの製造
比較例１で製造されたヒアルロン酸ヒドロゲル（４ｍｇ）を２％生理食塩水にとかして２００μＬ溶液で製造し、シリンジを通じて抗癌剤ドキソルビシン（０．４ｍｇ）が含有されたヒアルロン酸ヒドロゲル（ＨＡ−Ｄｏｘ）を最終的に収得した。
【００８０】
比較例４．糖尿病疾患治療剤が含有されたヒアルロン酸ヒドロゲルの製造
比較例１で製造されたヒアルロン酸ヒドロゲル（４ｍｇ）を２％生理食塩水にとかして２００μＬ溶液で製造し、シリンジを通じてインスリン（６３ＩＵ）が含有されたヒアルロン酸ヒドロゲル（Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｄｏｘ）を最終的に収得した。
【００８１】
比較例５．第１及び第２クリック反応作用基が導入されて架橋されたヒアルロン酸ヒドロゲルの凍結粉砕物の製造
前記実施例１でクリックケミストリー反応を通じた特異的架橋結合を通じて製造されたヒアルロン酸ヒドロゲルを対象として、凍結粉砕機（６７００、ＳＰＥＸ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて液体窒素内でｐｒｅ−ｃｏｏｌｉｎｇ  ５０秒／ｇｒｉｎｄｉｎｇ（６０Ｈｚ）２４０秒／ｃｏｏｌｉｎｇ  ５０秒で３ｃｙｃｌｅ条件で凍結粉砕した（Ｐｕｌｖｅｒｉｚｅｄ−ＨＡ）。
【００８２】
実験例１．ヒドロゲルの有変学的特性の評価
前記実施例１でクリックケミストリー反応を通じた特異的架橋結合を通じて製造されたヒアルロン酸ヒドロゲル及び比較例１で製造されたヒアルロン酸ヒドロゲルの有変学的特性を評価するために、Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ（ＭＣＲ  １０２、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いてもモジュラス及び粘度を測定した。このとき、用いた平行板（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｐｌａｔｅ）は、直径が２５ｍｍであり、底面との間隔は、０．３ｍｍであり、２５℃でｓｔｒａｉｎ  ２％、１Ｈｚ条件で実行し、その結果は、図３に示した。
【００８３】
製造されたヒドロゲルのモジュラス（ｍｏｄｕｌｕｓ）値と関連して、図３の（ａ）に示したように、実施例１でクリックケミストリー反応を通じた特異的架橋結合を通じて製造されたヒアルロン酸ヒドロゲルは、比較例１で製造されたヒアルロン酸ヒドロゲルとほとんど同等の損失モジュラス（ｌｏｓｓ  ｍｏｄｕｌｕｓ）を有するが、クリックケミストリー反応を通じた特異的架橋結合をすることで貯蔵モジュラス（ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｏｄｕｌｕｓ）が顕著に増加することを確認した。また、貯蔵モジュラスの強度は、クリック架橋度の増加によって非常に大きく増加することが分かった。
【００８４】
また、製造されたヒドロゲルの粘度と関連して、図３の（ｂ）に示したように、実施例１で製造されたヒアルロン酸ヒドロゲルは、比較例１のヒアルロン酸ヒドロゲルより粘度が非常に大きく上昇したことを確認し、また、クリック架橋度の増加によって粘度が顕著に増加することを確認した。
【００８５】
また、製造されたヒドロゲルをＭｏｄｕｌａｒ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ（ＭＣＲ  １０２、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて測定した弾性と関連して、図３の（ｃ）に示したように、実施例１で製造されたヒアルロン酸ヒドロゲルは、比較例１で製造されたヒアルロン酸ヒドロゲルより非常に大きい弾性を示し、また、クリック架橋度の増加によって弾性が顕著に増加することを確認した。
【００８６】
図３の（ｄ）及び（ｅ）に示したように、第１クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−Ｔｅｔと第２クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−ＴＣＯのクリックケミストリー反応を通じた特異的架橋結合されたヒドロゲル（実施例１、Ｃｘ−ＨＡ−２５０）の損失モジュラスと貯蔵モジュラスは、約２秒で逆転されることが観察された。このことから、クリックケミストリー反応を通じた特異的架橋結合は３秒以内に発生することが分かった。
【００８７】
一方、Ｃｘ−ＨＡ−５００（実施例２）及びＣｘ−ＨＡ−１００（実施例３）は、損失モジュラスと貯蔵モジュラスの逆転が測定と同時に観察され、クリック反応が非常に速くて測定できないことが分かった。
【００８８】
また、前記実施例１、２、３で製造された第１クリックケミストリー作用基が導入されたＨＡ−Ｔｅｔ及び第２クリックケミストリー作用基が導入されたＮＩＲ−ＨＡ−ＴＣＯをデュアルシリンジにそれぞれ含んで注射注入をすると、実施例１は、容易に注射器を押して注入できるが、実施例３の場合、注入にもっと大きい力が必要であった。このことから、Ｔｅｔ又はＴＣＯの導入量が増加するほど架橋度が増加してクリック反応が非常に速く進行されることが分かった。
【００８９】
実験例２．ヒドロゲルの粘度特性の評価
前記実施例１（Ｃｘ−ＨＡ−２５０）と比較例２で製造されたヒドロゲルを５ｍｌバイアルに製造し、製造直後と２日、８日、１２日、２８日が経過した後、Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ（ＭＣＲ  １０２、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて各ヒドロゲルの粘度を測定した。
【００９０】
その結果、図３の（ｆ）に示したように、実施例１によるクリックケミストリー反応を通じた特異的架橋結合されたヒドロゲルは、２８日以上粘度を維持するが、比較例２で製造されたプルロニックヒドロゲルは、１日間粘度を維持した後２日から粘度が非常に低くなり、３日以後には粘度が測定されない溶液に変化されることを確認した。
【００９１】
実験例３．ヒドロゲルの架橋度によるヒドロゲル内部の観察
前記実施例２、３及び比較例１で製造されたヒアルロン酸ヒドロゲルの内部架橋度を評価するために、それぞれのヒアルロン酸ヒドロゲルをプラズマスパッタリング装置（Ｐｌａｓｍａ−ｓｐｕｔｔｅｒｉｎｇ  ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｅｍｉｔｅｃｈ、Ｋ５７５、Ｋｅｎｔ、ＵＫ）を用いてコーティングした後、走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ；ＪＳＭ−６７００Ｆ、ＪＥＯＬ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）でヒドロゲル内部の構造を観察した。
【００９２】
その結果、図４に示したように、比較例１は、内部のヒドロゲル構造が固まって多孔性がない構造である一方、実施例２及び３は、一定多孔形態を維持していることを確認することができた。また、Ｔｅｔ及びＴＣＯの数が高くなるほど多孔サイズが小さくなり、ＴｅｔとＴＣＯ間の架橋度が高くなることを確認した。
【００９３】
実験例４．ヒドロゲルの水に対する膨潤観察
【００９４】
前記実施例１、２、３及び比較例１で製造されたヒアルロン酸ヒドロゲルの水に対する膨潤特性を評価するために、それぞれのヒアルロン酸ヒドロゲル２００μＬずつ２０ｍＬバイアルに入れて１０ｍＬ  ＰＢＳを入れた後、３７℃で時間別にヒドロゲルの重さを測定して水に対する膨潤率（ｓｗｅｌｌｉｎｇ  ｒａｔｉｏ)を求めた。水に対する膨潤率は、下記のような式で計算した。
【００９５】
水に対する膨潤率［Ｓｗｅｌｌｉｎｇ  ｒａｔｉｏ（％）］＝［（水を吸収したヒドロゲルの重さ−乾燥されたヒドロゲルの重さ）／（乾燥されたヒドロゲルの重さ）］×１００
【００９６】
その結果、図５に示したように、比較例１のヒアルロン酸ヒドロゲルは、ＰＢＳを加えた後数分以内に溶液化されて水に対する膨潤率を算出することができなかったが、実施例１で製造されたヒアルロン酸ヒドロゲルは、非常に大きい水に対する膨潤率を示し、クリック架橋度の増加によって水に対する膨潤率が顕著に減少することを確認した。
【００９７】
実験例５．ヒドロゲル形成の観察
上記製造されたＨＡ−Ｔｅｔ及びＨＡ−ＴＣＯをデュアルシリンジにそれぞれ入れ、ラットの皮下に１００μｌずつ注入して皮下でヒドロゲルを形成させた。その後、１週間の間隔でラットの皮下からヒドロゲルを摘出して観察した。その結果、図６に示したように、４週間が経過した後にも安定的にゲルを形成していることが分かった。
【００９８】
一方、比較例１で製造されたヒアルロン酸ヒドロゲルを同じラットの皮下に１００μｌずつ注入してヒドロゲルを形成させた後観察しようとしたが、１週間以降からゲルの形成は確認が不可能であった。
【００９９】
実験例６．近赤外線蛍光イメージングを通じたヒドロゲル形成の観察
前記実施例４で製造された第１クリックケミストリー作用基とＩＲ７８３が導入されたＮＩＲ−ＨＡ−Ｔｅｔ及び第２クリックケミストリー作用基とＩＲ７８３が導入されたＮＩＲ−ＨＡ−ＴＣＯをデュアルシリンジにそれぞれ含有してヌードマウス（ｍａｌｅ、８週齢）の皮下に１ｍＬ注射器（２１Ｇ）で０．１５ｍＬ注入した。比較実験のために、比較例３で製造されたＮＩＲ−ＨＡを上記と同一の方法でヌードマウスに注入した後、各時間に応じた蛍光イメージングを観察した。
その結果、図７に示したように、実施例４で製造されたヒアルロン酸ヒドロゲルの蛍光イメージングは、４０日以上維持（図７の（ｂ））される一方、比較例３で製造注入されたヒアルロン酸ヒドロゲルの蛍光イメージングは、１２時間まで維持され、１日が経過した後には、全然観察されないことが分かった（図７の（ｃ））。
【０１００】
実験例７．抗癌剤が含有されたヒドロゲルからの薬物放出效果
前記実施例５及び比較例３で製造された抗癌剤含有ヒドロゲルを０．５ｍＬのＰＢＳにとかした後、２４−ｗｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＳＰＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、０．４μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ）のｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒに注入した後、３７℃、１００ｒｐｍのｓｈａｋｅｒで時間による薬物の放出を確認した。各時間に応じて０．５ｍＬの溶液を採取した後、０．５ｍＬ  ＰＢＳ溶液をさらに注入した。ドキソルビシンの放出は、ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ｓｅｒｉｅｓ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定された。ドキソルビシンの量を測定するために、４７９ｎｍの波長とＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＣＫ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ（５μｍ、４．６×２５０ｍｍ、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いた。移動相は、５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅとａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅを３０：７０（ｖ／ｖ）で混合した混合溶液を用い、カラムは、０．５ｍＬ／ｍｉｎ速度で抽出された。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでドキソルビシンの放出率は、ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅと比較して計算された。
【０１０１】
その結果、図８に示したように、実施例５で製造された抗癌剤含有特異的架橋ヒドロゲル（Ｃｘ−ＨＡ−Ｄｏｘ）は、比較例３で製造された抗癌剤含有ヒドロゲル（ＨＡ−Ｄｏｘ）に比べて、ドキソルビシンの徐放出が行われることが確認され、１６日の間累積ドキソルビシンの放出率が約６０〜７０％程度であると確認される。
【０１０２】
２８日の間放出実験の後、実施例５で製造された抗癌剤含有特異的架橋ヒドロゲル（Ｃｘ−ＨＡ−Ｄｏｘ）内に残っているドキソルビシンの含量を測定した結果、その含量は、約１０．４％であると確認される。それによって、実際累積ドキソルビシンの放出率は、約９０％であると判断される。
【０１０３】
実験例８．抗癌剤が含有されたヒドロゲルの細胞抗癌効果
２×１０４個のＢ１６Ｆ１０  ｍｅｌａｎｏｍａ細胞を２４−ｗｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＳＰＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、０．４μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ）のそれぞれのｌｏｗｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒに入れた後、３７℃、５％  ＣＯ２条件で一日の間インキュベーションした。その後、２４−ｗｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅのｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒにＰＢＳ  ２００μＬ、ドキソルビシン（Ｄｏｘ；０．４ｍｇ  Ｄｏｘ／２００μＬ）、ドキソルビシン繰り返し（Ｄｏｘ  ｒｅｐｅａｔ；０．１ｍｇ  Ｄｏｘ／２００μＬ）、比較例１で製造されたヒドロゲル（ＨＡ；４ｍｇ、ＨＡ／２００μＬ）、比較例３で製造された抗癌剤含有ヒドロゲル（ＨＡ−Ｄｏｘ；４ｍｇ  ＨＡ、０．４ｍｇ  Ｄｏｘ／２００μＬ）、実施例１で製造された特異的架橋ヒドロゲル（Ｃｘ−ＨＡ；２ｍｇ  ＴＥＴ−ＨＡ、２ｍｇ  ＴＣＯ−ＨＡ／２００μＬ）、実施例５で製造された抗癌剤含有特異的架橋ヒドロゲル（Ｃｘ−ＨＡ−Ｄｏｘ；２ｍｇ  ＴＥＴ−ＨＡ、２ｍｇ  ＴＣＯ−ＨＡ、０．４ｍｇ  Ｄｏｘ／２００μＬ）を入れた。Ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒを細胞があるｗｅｌｌで覆って３７℃、５％  ＣＯ２で１２時間、２４時間、４８時間、７２時間の間インキュベーションし、１２時間後、初期に入れた培地を交替した。１２時間、２４時間、４８時間、７２時間以後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢ１６Ｆ１０細胞に対する各剤型の細胞毒性を確認するために、ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）ａｓｓａｙを進行した。ＭＴＴ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（５０μｇ／ｍＬ）を含んでいる１００μＬ  ＰＢＳ溶液を各ｗｅｌｌに入れた後、３７℃で４時間の間インキュベーションした。このとき生成された紫色のｆｏｒｍａｚａｎをとかすために、各ｗｅｌｌ当たり５００μＬ  ＤＭＳＯを注入して３０分間振った後溶液を９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移す。５９０ｎｍの波長で溶液のｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙは、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｅ−ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて測定された。
【０１０４】
その結果、図９に示したように、抗癌剤を含有した場合、細胞抗癌効果が非常に優れることが確認される。しかし、抗癌剤を含まなくても、実施例１で製造された特異的架橋ヒドロゲル（Ｃｘ−ＨＡ）の場合、比較例１で製造されたヒドロゲル（ＨＡ）に比べて細胞抗癌効果が向上されたことが確認される。
【０１０５】
実験例９．抗癌剤が含有されたヒドロゲルの動物適用癌サイズの比較 
癌モデルは、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雄、２０ｇ）の腹部に約２×１０５Ｂ１６Ｆ１０  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓを１００μＬに懸濁させて皮下注射して作られた。癌の体積が１５０−２００ｍｍ３になったときを０ｄにし、癌が誘発された動物は、６個の実験群、（１）対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、（２）ドキソルビシン（Ｄｏｘ；０．４ｍｇ  Ｄｏｘ）、（３）ドキソルビシン繰り返し（Ｄｏｘ  ｒｅｐｅａｔ；０．１ｍｇ  Ｄｏｘ）、（４）比較例３で製造された抗癌剤含有ヒドロゲル（ＨＡ−Ｄｏｘ；０．４ｍｇ  Ｄｏｘ）、（５）実施例５で製造された抗癌剤含有特異的架橋ヒドロゲル（Ｃｘ−ＨＡ−Ｄｏｘ；０．４ｍｇ  Ｄｏｘ）、（６）比較例５で製造された特異的架橋ヒドロゲルの凍結粉砕物に抗癌剤（ドキソルビシン）を含有した組成物（Ｐｕｌｖｅｒｉｚｅｄ−ＨＡ；０．４ｍｇ  Ｄｏｘ）に割り当てられた。癌の体積が１５０〜２００ｍｍ３になったとき、それぞれの溶液は、１ｍＬシリンジと２１−ゲージニードルを用いて癌内部に注入された。このとき、溶液の注入速度は、周辺の組織に溶液が流入されることを阻むために１０μＬ／ｓに維持した。抗腫瘍活性度は、事前に定義された日付にＶｅｒｎｉｅｒ  ｃａｌｉｐｅｒｓで２次元で腫瘍直径を測定して評価した。癌の体積（Ｖ）は、Ｖ＝［ｌｅｎｇｔｈ×（ｗｉｄｔｈ）２］／２を用いて計算された。
【０１０６】
その結果、図１０及び図１１に示したように、抗癌剤を含有した場合、抗腫瘍活性度が顕著に向上されたことが確認される。特に、実施例５で製造された抗癌剤含有特異的架橋ヒドロゲル（Ｃｘ−ＨＡ−Ｄｏｘ）の場合、比較例３で製造された抗癌剤含有ヒドロゲル（ＨＡ−Ｄｏｘ）及び比較例５で製造された抗癌剤含有ヒドロゲル（Ｐｕｌｖｅｒｉｚｅｄ−ＨＡ−Ｄｏｘ）に比べて抗腫瘍活性度が一層向上されることが確認されたので、効果な薬物伝達体として用いられ得ると期待される。
【０１０７】
実験例１０．抗癌剤が含有されたヒドロゲルの動物適用抗癌薬動力学の効果
薬物動力学実験を進行するために、１日、６日、１２日、１８日にマウスを犠牲にさせた。臓器（腫瘍、腸、肺、腎臓、肝、脾臓及び心臓）を直ちに獲得し、また写真で撮影した（図１２）。そして、各臓器に残っているドキソルビシンの量を測定するために、各臓器をＴ  １０  ｂａｓｉｃ  ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（ＩＫＡ−Ｗｅｒｋｅ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．，Ｓｔａｕｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて０．３Ｎ  ＨＣｌ／７０％  ｅｔｈａｎｏｌ溶液で２５，０００−３０，０００ｒｐｍの速度で均一化した後、３７℃で１５分間インキュベーションさせた。均一に混合された各サンプルは、同一の体積の４０％  ＺｎＳＯ４と移動相を混合して３７℃で１５分間またインキュベーションさせた。インキュベーションが完了すれば、各サンプルを２０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した後、上層液に含まれているドキソルビシンの量をｓｔａｎｄａｒｄ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅを参照して計算した。各臓器に含まれているドキソルビシンの量は、ＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒｓ（Ｖ−７７０、ＪＡＳＣＯ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を通じて測定された（図１３）。
【０１０８】
その結果、図１３に示したように、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）の単独注入の場合、癌より各種臓器にはやく抗癌剤が分布される問題点があると確認される。一方、ドキソルビシン繰り返し注入（Ｄｏｘ  ｒｅｐｅａｔ）の場合、癌に多くの量の抗癌剤が存在し、またドキソルビシンの単独注入に比べて各種臓器に多い抗癌剤が残存して影響を及ぼした。それから、抗癌剤の繰り返し注入が癌治療も伴うが、抗癌剤による各種副作用を誘発することが確認される。
【０１０９】
また、比較例３で製造された抗癌剤含有ヒドロゲル（ＨＡ−Ｄｏｘ）注入の場合、抗癌剤が癌の初期時間にのみ存在してはやく他の臓器に分散された。したがって、薬物伝達体としての効能がほとんどないことが確認される。
【０１１０】
それに比べて、実施例５で製造された抗癌剤含有特異的架橋ヒドロゲル（Ｃｘ−ＨＡ−Ｄｏｘ）注入の場合、抗癌剤が癌に存在する量と維持する時間が他の実験群より高く、抗癌剤による各種臓器に対する多くの副作用を誘発しないか副作用が少ないことが確認された。したがって、効果的な薬物伝達体として用いられ得ると期待される。
【０１１１】
実験例１１．糖尿病疾患治療剤が含有されたヒドロゲルの製造
糖尿病疾患モデルは、ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（４０ｍｇ／ｋｇ）をｃｉｒｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．５）に溶解してしっぽを通じて注入し、注入後２日に３８０〜４２０の血糖を確認して糖尿病モデル製造を確認した。前記実施例６及び比較例４で製造された糖尿病疾患治療剤含有ヒドロゲルを皮下に注射で注入し、血中の血を朝（１０時頃）に１８日間採取し、ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｍｅｔｅｒを用いて血中の血糖を測定した。
【０１１２】
その結果、図１４に示したように、実施例６で製造された糖尿病疾患治療剤含有特異的架橋ヒドロゲル（Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｃｘ−ＨＡ）の場合、比較例３で製造された抗癌剤含有ヒドロゲル（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ＨＡ）に比べて血中の血糖が安定的に維持されることが確認された。したがって、効果的な薬物伝達体として用いられ得ると期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年11月25日(2020.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１クリックケミストリー作用基が導入された第１生体高分子を含む第１液；及び
第２クリックケミストリー作用基が導入された第２生体高分子を含む第２液を含み、
前記第１クリックケミストリー作用基及び前記第２クリックケミストリー作用基が化学的に結合可能であることを特徴とする、注射剤型組成物。
【請求項２】
前記第１クリックケミストリー作用基は、アルキニル基、エポキシ基、アクリロイル基及びテトラジン基のうち選択される１種以上であり、前記第２クリックケミストリー作用基は、アジド基、チオール基、アミン基及びシクロオクテン基のうち選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の注射剤型組成物。
【請求項３】
前記第１クリックケミストリー作用基及び前記第２クリックケミストリー作用基の組み合わせは、（アルキニル基、アジド基）、（アルキニル基、チオール基）、（エポキシ基、アミン基）、（エポキシ基、チオール基）、（アクリロイル基、アミン基）、（アクリロイル基、チオール基）及び（テトラジン、シクロオクテン）のうち選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の注射剤型組成物。
【請求項４】
前記第１生体高分子及び前記第２生体高分子は、互いに同一であるか、相異なり、それぞれ独立的にヒアルロン酸、小腸粘膜下組織、カルボキシメチルセルロース、アルジネート、キトサン、プルロニック、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）及びβ−グリセロホスフェートのうち選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の注射剤型組成物。
【請求項５】
前記第１液及び前記第２液に薬物をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の注射剤型組成物。
【請求項６】
前記薬物は、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、グリベック（ｇｌｅｅｖｅｃ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）及びゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）のうち選択される１種以上を含む抗癌剤；又はインスリン又はインスリン親和性（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ）ペプチドを含む糖尿病疾患治療剤を含むことを特徴とする、請求項５に記載の注射剤型組成物。
【請求項７】
前記第１生体高分子１モル当たり導入された第１クリックケミストリー作用基の数；又は前記第２生体高分子１モル当たり導入された第２クリックケミストリー作用基の数は、１００個〜２０００個であることを特徴とする、請求項１に記載の注射剤型組成物。
【請求項８】
（ａ）第１生体高分子に第１クリックケミストリー作用基を含む物質を投入して第１液を製造するステップ；
（ｂ）第２生体高分子に第２クリックケミストリー作用基を含む物質を投入して第２液を製造するステップ；及び
（ｃ）前記第１液及び第２液を反応させて第１クリックケミストリー作用基及び前記第２クリックケミストリー作用基を化学的に結合させるステップを含むことを特徴とする、注射剤型ヒドロゲルの製造方法。
【請求項９】
前記ステップ（ａ）で第１クリックケミストリー作用基を含む物質は、アミノ−ＰＥＧ４−アルキニル（ａｍｉｎｏ−ＰＥＧ４−ａｌｋｙｎｅ）、アルキニルＰＥＧ５−酸（ａｌｋｙｎｅ−ＰＥＧ５−ａｃｉｄ）、アルキニルＰＥＧ−アミン（ａｌｋｙｎｅ−ＰＥＧ−ａｍｉｎｅ）、オキシラニルアミン（ｏｘｉｒａｎｙｌａｍｉｎｅ）、２−オキシラニル−エチルアミン（２−ｏｘｉｒａｎｙｌ−ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ)、アクリル酸（ａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、アクリロイルクロリド（ａｃｒｙｌｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メチルテトラジン−アミン（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ａｍｉｎｅ）、メチルテトラジン−ＰＥＧ４−アミン（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ４−ａｍｉｎｅ）、メチルテトラジン−プロピルアミン（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）、テトラジン−ＰＥＧ５−ＮＨＳエステル（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ５−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（ｍｅｔｈｙｌｔｅｌｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン−シルフォ−ＮＨＳエステル（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ｓｉｌｆｏ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン−ＰＥＧ４−酸（ｍｅｔｈｌｙｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ４−ａｃｉｄ）、メチルテトラジン−ＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン−ＮＨＳエステル（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、メチルテトラジン酸（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ａｃｉｄ）及びテトラジン酸（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ−ａｃｉｄ）のうち選択される１種以上であり、
前記ステップ（ｂ）で第２クリックケミストリー作用基を含む物質は、アジド−ＰＥＧ４−アミン（ａｚｉｄｅ−ＰＥＧ４−ａｍｉｎｅ）、３−アミノ−１−プロパンチオール（３−ａｍｉｎｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｔｈｉｏｌ）、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、アミノ−メタンチオール（Ａｍｉｎｏ−ｍｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ）、チオールＰＥＧアミン（ｔｈｉｏｌ  ＰＥＧ  ａｍｉｎｅ）、エチレンジアミン（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｎｅ）、ＰＥＧジアミン（ＰＥＧ  ｄｉａｍｉｎｅ）、（Ｓ）−３−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロピオン酸（（Ｓ）−ａｍｉｎｏ−２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アミノ酢酸（ａｍｉｎｏ−ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、トランス−シクロオクテン−アミン（ｔｒａｎｓ−ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ａｍｉｎｅ）、トランス−シクロオクテン−ＮＨＳエステル（ｔｒａｎｓ−ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、トランスシクロオクテン−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル（ｔｒａｎｓ  ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ＰＥＧ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）及びトランスシクロオクテン−ＰＥＧ４−酸（ｔｒａｎｓ  ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ−ＰＥＧ４−ａｃｉｄ）のうち選択される１種以上であることを特徴とする、請求項８に記載の注射剤型ヒドロゲルの製造方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ａ）又は前記ステップ（ｂ）で縮合剤又は薬物をさらに投入することを特徴とする、請求項８に記載の注射剤型ヒドロゲルの製造方法。
【請求項１１】
前記注射剤型ヒドロゲルの０．１Ｈｚ〜１０Ｈｚの周波数範囲でレオメータを用いて測定された貯蔵弾性率（Ｇ'）は、２．００×１０２Ｐａ〜２．００×１０３Ｐａであることを特徴とする、請求項８に記載の注射剤型ヒドロゲルの製造方法。
【請求項１２】
前記注射剤型ヒドロゲルの２５℃で複合粘度は、３．００×１０１Ｐａ・ｓ〜３．０×１０２Ｐａ・ｓであることを特徴とする、請求項８に記載の注射剤型ヒドロゲルの製造方法。
【請求項１３】
前記注射剤型ヒドロゲルは、多孔形態であることを特徴とする、請求項８に記載の注射剤型ヒドロゲルの製造方法。
【請求項１４】
前記注射剤型ヒドロゲルの水に対する膨潤率（ｓｗｅｌｌｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）は、２，０００％〜１０，０００％であることを特徴とする、請求項８に記載の注射剤型ヒドロゲルの製造方法。
【請求項１５】
請求項８に記載の製造方法によって製造された注射剤型ヒドロゲルを含むことを特徴とする、医療用充填剤又は体内注入型支持体。
【請求項１６】
請求項８に記載の製造方法によって製造された注射剤型ヒドロゲル及び薬物を含むことを特徴とする、薬物伝達体。
【請求項１７】
前記薬物は、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、グリベック（ｇｌｅｅｖｅｃ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）及びゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）のうち選択される１種以上を含む抗癌剤；又はインスリン又はインスリン親和性（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ）ペプチドを含む糖尿病疾患治療剤を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の薬物伝達体。
【請求項１８】
前記薬物伝達体は、２８日間５０％〜１００％の累積薬物放出率を有することを特徴とする、請求項１６に記載の薬物伝達体。
【国際調査報告】
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