(57)【要約】  アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）欠損症（ＡＲＧ１−Ｄ）を有する対象を治療し、対象におけるアルギニン及び／又はグアニジノ化合物のうち少なくとも１つのレベルを急速に低下させる方法及び組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるアルギナーゼ１（ＡＲＧ１）欠損症（ＡＲＧ１−Ｄ）を治療する方法であって、アルギナーゼの初回投与後の約２〜約４日以内に、前記対象のアルギニンの血漿レベルを２００μｍｏｌ／Ｌ未満まで低下させるのに充分な量の前記アルギナーゼを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記対象のアルギニンの前記血漿レベルが、前記アルギナーゼの初回投与後、４０μｍｏｌ／Ｌ〜１１５μｍｏｌ／Ｌの範囲内に低下する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルギナーゼが、ＰＥＧ化アルギナーゼ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アルギナーゼが、マンガン金属補因子の代わりにコバルト金属補因子を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記アルギナーゼが、ペグジラルギナーゼ（ｐｅｇｚｉｌａｒｇｉｎａｓｅ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｎ−α−アセチルアルギニン（ＮＡＡｒｇ）、アルギニン酸（ＡｒｇＡ）、α−ケト−δ−グアニジノ吉草酸（ＧＶＡ）、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）、及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルが、前記アルギナーゼの初回投与後７日未満で、前記対象において少なくとも１回は正常レベルまで低下する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の前記血漿レベルが、前記アルギナーゼの初回投与後３日未満で、前記対象において少なくとも１回は前記正常レベルまで低下する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の前記血漿レベルが、前記アルギナーゼの初回投与後２日未満で、前記対象において少なくとも１回は正常レベルまで低下する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の前記血漿レベルが、前記アルギナーゼの初回投与後１日未満で、前記対象において少なくとも１回の投与で正常レベルに達するまで低下する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象のアルギニンの血漿レベルを低下させるのに充分な前記量が、安静時痙縮（ｒｅｓｔｉｎｇ  ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ）、痙縮に関連した下肢痙攣、適応行動、及び患者報告アウトカム測定情報システム（ＰＲＯＭＩＳ）身体機能スコアからなる群から選択される特性を改善する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象におけるグアニジノ酢酸（ＧＡＡ）の前記血漿レベルが、正常レベルに達する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アルギナーゼが、前記対象へ静脈内又は皮下で投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アルギナーゼが、約０．００５〜約１．００ｍｇ／ｋｇ対象体重の用量で、前記対象へ静脈内投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルギナーゼが、約０．００５〜約０．５０ｍｇ／ｋｇ対象体重の用量で、前記対象へ静脈内投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アルギナーゼが、約０．００５〜約０．２０ｍｇ／ｋｇ対象体重の用量で、前記対象へ静脈内投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アルギナーゼが、約０．０１〜約１．５０ｍｇ／ｋｇ対象体重の用量で、前記対象へ皮下で皮下投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記アルギナーゼが、約０．０１５〜約０．７５ｍｇ／ｋｇ対象体重の用量で、前記対象へ皮下で皮下投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルギナーゼが、約０．０１５〜約０．３０ｍｇ／ｋｇ対象体重の用量で、前記対象へ皮下で皮下投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アルギナーゼが、前記対象において、ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルを少なくとも２倍低下させるのに充分な用量で、前記対象に投与され、ここで、前記血漿レベルが、投与後の約２４〜４８時間でアッセイされる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
投与された前記用量が、ＮＡＡｒｇの前記血漿レベルを少なくとも３倍低下させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
投与された前記用量が、ＧＡＡの前記血漿レベルを少なくとも２倍低下させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記アルギナーゼが、毎日、毎週、隔月、又は毎月、前記対象へ投与される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
窒素スカベンジャを前記対象へ投与することを更に含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記アルギナーゼが、前記対象へ送達するためアデノウイルスベクターに操作可能に連結された核酸として投与され、前記対象へ投与されると前記対象中でアルギナーゼを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
アルギニン、Ｎ−α−アセチルアルギニン（ＮＡＡｒｇ）、アルギニン酸（ＡｒｇＡ）、α−ケト−δ−グアニジノ吉草酸（ＧＶＡ）、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）からなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルを、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）欠損症（ＡＲＧ１−Ｄ）を有する対象において正常レベルまで急速に低下させる方法であって、
治療有効量のＰＥＧ化アルギナーゼを含む組成物を前記対象へ投与することを含み、
ここで、前記ＰＥＧ化アルギナーゼは、初回は０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１．００ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、その後は毎週皮下又は静脈内のいずれかで投与される、方法。
【請求項２６】
前記ＰＥＧ化アルギナーゼが、初回は０．００５ｍｇ／ｋｇ〜０．５０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、その後は毎週皮下又は静脈内のいずれかで投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＰＥＧ化アルギナーゼが、初回は０．００５ｍｇ／ｋｇ〜０．２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、その後は毎週皮下又は静脈内のいずれかで投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＥＧ化アルギナーゼが、ペグジラルギナーゼである、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルが、前記ＰＥＧ化アルギナーゼの初回投与後３日未満で、前記対象において正常レベルまで低下する、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルが、前記ＰＥＧ化アルギナーゼの初回投与後２日未満で、前記対象において正常レベルまで低下する、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びアルギニンのうちの少なくとも１つの血漿レベルが、前記ＰＥＧ化アルギナーゼの初回投与後１日未満で、前記対象において正常レベルまで低下する、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象へ投与した前記ＰＥＧ化アルギナーゼの前記用量が、ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びアルギニンから選択される群から少なくとも１つの化合物の血漿レベルを少なくとも２倍低下させるのに充分であり、ここで、前記血漿レベルが、前記ＰＥＧ化アルギナーゼの投与後の約２４〜４８時間でアッセイされる、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
アルギニン、Ｎ−α−アセチルアルギニン（ＮＡＡｒｇ）、アルギニン酸（ＡｒｇＡ）、α−ケト−δ−グアニジノ吉草酸（ＧＶＡ）、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）からなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルを、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）欠損症（ＡＲＧ１−Ｄ）を有する対象において正常レベルまで急速に低下させる方法であって、
治療有効量のＰＥＧ化アルギナーゼを含む組成物を前記対象へ投与することを含み、
ここで、前記ＰＥＧ化アルギナーゼは、初回は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．５０ｍｇ／ｋｇで皮下投与され、その後は毎週皮下又は静脈内のいずれかで投与される、方法。
【請求項３４】
前記ＰＥＧ化アルギナーゼが、初回は０．０１５ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇで皮下投与され、その後は毎週皮下又は静脈内のいずれかで投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＰＥＧ化アルギナーゼが、初回は０．０１５ｍｇ／ｋｇ〜０．３０ｍｇ／ｋｇで皮下投与され、その後は毎週皮下又は静脈内のいずれかで投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＰＥＧ化アルギナーゼが、ペグジラルギナーゼである、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルが、前記ＰＥＧ化アルギナーゼの初回投与後３日未満で、前記対象において正常レベルまで低下する、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルが、前記ＰＥＧ化アルギナーゼの初回投与後２日未満で、前記対象において正常レベルまで低下する、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルが、前記ＰＥＧ化アルギナーゼの初回投与後１日未満で、前記対象において正常レベルまで低下する、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象へ投与した前記ＰＥＧ化アルギナーゼの前記用量が、ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルを少なくとも２倍低下させるのに充分であり、ここで、前記血漿レベルが、前記ＰＥＧ化アルギナーゼの投与後の約２４〜４８時間でアッセイされる、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記対象に、アルギニンの前記血漿レベルを２００μｍｏｌ／Ｌ未満まで低下させる前記量の前記アルギナーゼの少なくとも１回の反復投与を行う、請求項２２に記載の方法。
【請求項４２】
アルギニンの前記血漿レベルが、少なくとも３０週間２００μｍｏｌ／Ｌ未満に低下する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
アルギニンの前記血漿レベルが、少なくとも４０週間２００μｍｏｌ／Ｌ未満に低下する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１回の反復投与のうち８回を受けた後、前記対象が、治療前の前記対象の可動性又は適応行動に対するベースラインと比べて、（ａ）前記可動性又は（ｂ）適応行動のうち少なくとも１つの改善を示す、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＮＡＡｒｇ、ＡｒｇＡ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、又はアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルが、前記対象における前記ベースライン血漿レベルと比べて低下する、請求項２２に記載の方法。
【請求項４６】
前記対象が、治療の９日後に１を超える臨床上意味のある最小変化量（ｍｉｎｉｍａｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）（ＭＣＩＤ）を有する、請求項２５〜４１のいずれか一項に記載に方法。
【請求項４７】
アルギニンの前記血漿レベルが、ＭＣＩＤと相関している、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ペグジラルギナーゼと、医薬的に許容可能な緩衝液とを含む、組成物。
【請求項４９】
約１０％のグリセロールを更に含み、ここで、前記医薬的に許容可能な緩衝液が、リン酸緩衝食塩水である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ペグジラルギナーゼが、赤血球ゴースト中に配合される、請求項４９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１７年１２月５日に出願された米国仮出願第６２／５９４，７４７号、２０１８年８月３１日に出願された米国仮出願第６２／７２５，６１２号、及び２０１８年１０月１２日に出願された米国仮出願第６２／７４５，０００号の優先権を主張するものであり、これらの全ての内容を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
配列表の参照
本出願に関連する配列表はＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子フォーマットで提出され、これによって、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は２１８１０７−００１１−００−ＷＯ＿ＳＴ２５である。テキストファイルのサイズは６，２４７バイトであり、２０１８年１２月４日に作成された。
【技術分野】
【０００３】
背景
本発明は、患者におけるアルギナーゼ１欠損症を治療する方法と、患者におけるアルギナーゼ１欠損症（ＡＲＧ１−Ｄ）を治療するための組成物と、を開示する。
【背景技術】
【０００４】
アルギナーゼ１欠損症（高アルギニン血症又はアルギニン血症としても知られる）は、例えばアルギナーゼ１（ＡＲＧ１）遺伝子の変異に起因する、アルギナーゼ１タンパク質の欠損又は活性の喪失によって引き起こされる。ＡＲＧ１はアルギニンをオルニチンへと変換する尿素サイクル酵素である。ＡＲＧ１−Ｄは稀で進行性の疾患である。３００，０００〜１，０００，０００人に１人の割合で発生するものと推定されている。ＡＲＧ１−Ｄは、アルギニン及び他のグアニジノ化合物（ＧＣ）の毒性蓄積を生じる、常染色体劣性の尿素サイクル異常症である。ＡＲＧ１−Ｄの臨床的特徴は、典型的には幼児期早期に発現するが、一部の患児では出生直後に発現することがある。疾患の症状には、痙縮、発育遅延、脳卒中、タンパク質回避（ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｖｏｉｄａｎｃｅ）、偶発性高アンモニア血症、悪心、及び嘔吐などが挙げられる。疾患が進行した青年期には、患者は可動性を失い、話すこと又は理解することもできず、栄養失調及びビタミンＤ欠乏症に苦しむことがある。疾患及びその関連症状の更なる進行には、トランスアミナーゼの上昇及び肝線維症を根拠とする肝損傷、重度の痙縮及び筋拘縮、精神遅滞及び限られた寿命が挙げられる。残念なことに、食事制限及び窒素スカベンジャは、アルギニン及び他のグアニジノ化合物の慢性的な著しい増加並びに偶発性高アンモニア血症に起因する疾患進行を防止するには不充分である。
【０００５】
ＡＲＧ１−Ｄ患者に低タンパク食を提供する場合、アルギニンレベルは約２６５〜３００μｍｏｌ／Ｌまで低下させることができる（Ｓｃｈｌｕｎｅらによる、「Ｈｙｐｅｒａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ  ｄｕｅ  ｔｏ  ａｒｇｉｎａｓｅ  １  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ，ａｎｄ  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ」、Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ第４７巻、第１７５１〜１７６２頁（２０１５年））。食事によるタンパク質摂取量に影響される新規のアルギニン合成は、血漿アルギニン合成のおよそ５〜１５％を占め、アルギニンの主要源は体組織のターンオーバーである（Ｗｕ，Ｇ．ら、「Ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、第３３６巻（パート１）、第１〜１７頁（１９９８年）。したがって、血漿アルギニンレベルに対する食事性タンパク質制限の影響は限定されており、対象おけるアルギニンの循環レベルは、過剰なアルギニンを分解できないために高いままである。
【０００６】
ＡＲＧ１−Ｄ動物モデルを用いた大部分の治療方法に関する非臨床試験では、血漿アルギニンレベルが低下しても疾患の転帰に実質的な影響を及ぼすとは示されていない。これらのアプローチの大部分が疾患の根本原因、すなわち肝臓におけるＡＲＧ１のサイトゾル欠乏の修正に対処していないことを考慮して、米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ＦＤＡ）は、血漿アルギナーゼレベルの増大が、疾患の病因に寄与し得るアルギニン由来グアニジノ化合物の低下を含む細胞内ＡＲＧ１活性の修正と、同じ全体効果を持ち得るかどうかについて疑問を呈した。食事性アルギニン制限が血漿アルギニンレベルを低下させることができるという文献的証拠があるものの、疾患発現に対する食事性アプローチの有益な影響は、生理的正常範囲と医療指針との両方を充分に超えた血漿アルギニンレベルの慢性的な著しい上昇のために制限される。このことは、食事療法及び血漿アルギニンの低下にもかかわらず、患者の１１人中４人で痙縮の進行が報告された群によって支持されている（Ｐｒａｓａｄら、「Ａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ：ａ  ｔｒｅａｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｐａｓｔｉｃ  ｄｉｐｌｅｇｉａ  ｓｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｐａｌｓｙ−ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ａｎｄ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗ」、Ｊ．Ｃｈｉｌｄ  Ｎｅｕｒｏｌ、第１２巻、第３０１〜３０９頁（１９９７年））。この理論的根拠に沿って、アルギニン酸、グアニジノ酢酸、β−グアニジノプロピオン酸、β−グアニジノブトリ酸（β−ｇｕａｎｉｄｉｎｏｂｕｔｒｙｉｃ  ａｃｉｄ）、及びＮ−α−アセチルアルギニンといった高レベルのアルギニン代謝物が、ＡＲＧ１欠損患者における神経学的後遺症の原因として重要であり得るということを示唆する研究者もいる（Ｄｅｉｇｎａｎら、「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ」、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ、第９３巻、第１７２〜１７８頁（２００８年）、Ｓｅｇａｗａら、「Ａ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ａｒｇｉｎａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ｍｕｌｔｉｃｙｓｔｉｃ  ｗｈｉｔｅ  ｍａｔｔｅｒ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」、Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｖ．、第３３巻、第４５〜４８頁（２０１１年）、Ｗｙｓｅら、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｏｒｔｅｘ  ｏｆ  ｒａｔｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｇｕａｎｉｄｉｎｏ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｙｐｅｒａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ」、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、（２００１年）、第９２３巻、第１〜２号、第５０〜７頁）。ＡＲＧ１−Ｄにおけるグアニジノ化合物の潜在的重要性を考慮して、低アルギニン食がこれらの潜在的神経毒性代謝物を減少させる能力を検討されている（Ｌａｍｂｅｒｔら、「Ｈｙｐｅｒａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ：ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  ａｎｄ  ｍｏｔｏｒ  ｉｍｐｒ���ｖｅｍｅｎｔ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄａｔａ」、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．、（１９９１年）第１１８巻、第３号、第４２０〜４頁）。Ｌａｍｂｅｒｔらは、低アルギニン食が厳密な食事制御後およそ１ヶ月以内に血中アルギニンレベルを低下させることができることを示すことができたが、グアニジノ酢酸及びα−ケト−δ−グアニジノ吉草酸（ＧＶＡ）のレベルは変化せず、これは食事が治療介入としてＧＣレベルを迅速に制御する見込みがないことを意味する、ということを示すことができた。障害とその根底にある複雑な機序とを考えると、この満たされていない医学ニーズに対処するためには、患者における高レベルのアルギニンを迅速に低下させ、制御するための新しい治療が必要である。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書で新たに開示されるものは、患者において好ましくは迅速な応答を得る、ＡＲＧ１−Ｄ患者を治療するための方法、化合物、及び組成物であって、ここで患者は、ヒトであり、かつ成人、小児、又は乳児であり得る。
【０００８】
対象におけるアルギナーゼ１（ＡＲＧ１）欠損症（ＡＲＧ１−Ｄ）を治療する方法であって、アルギナーゼの初回投与後の約２〜約４日以内に、対象のアルギニンの血漿レベルを２００μｍｏｌ／Ｌ未満まで低下させるのに充分な量のアルギナーゼを対象に投与することを含む、方法を提供する。対象のアルギニンの血漿レベルは、アルギナーゼの初回投与後、４０μｍｏｌ／Ｌ〜１１５μｍｏｌ／Ｌの範囲内に低下し得る。対象は、ＡＲＧ１−Ｄを有するヒト成人、ヒト小児、又はヒト乳児（例えば、１２ヶ月未満）であってもよい。
【０００９】
アルギナーゼは、野生型アルギナーゼＩ（例えば、配列番号２）又はアルギナーゼＩＩ（例えば、配列番号１）であってもよい。アルギナーゼは、ＰＥＧ化アルギナーゼ１であってもよく、マンガン金属補因子の代わりにコバルト金属補因子を有し得る。ＰＥＧ化アルギナーゼ１はペグジラルギナーゼ（ｐｅｇｚｉｌａｒｇｉｎａｓｅ）であってもよい。
【００１０】
開示された治療方法は、Ｎ−α−アセチルアルギニン（ＮＡＡｒｇ）、アルギニン酸（ＡｒｇＡ）、ＧＶＡ、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）、及びアルギニンのうち少なくとも１つの血漿レベルが、初回投与後７日未満、３日未満、２日未満、及び／又は１日未満で、対象において少なくとも１回は正常レベルまで低下する投与を更に伴うことができる。アルギナーゼを用いた治療方法は、投与後にＧＡＡの血漿レベルが正常レベルに達するようにすることができる。この方法は、対象のアルギニンの血漿レベルを低下させるのに充分な量が、安静時痙縮（ｒｅｓｔｉｎｇ  ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ）、痙縮に関連した下肢痙攣、適応行動、及び患者報告アウトカム測定情報システム（ＰＲＯＭＩＳ）身体機能スコアなどの１つ以上の特性を改善するようにすることができる。
【００１１】
この治療方法は、約０．００５〜約１．００ｍｇ／ｋｇ／患者体重の静脈内投与を行うことを企図する。静脈内投与のための他の範囲又は使用は、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇ、０．０１５〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、及び０．０１５〜０．０７５ｍｇ／ｋｇを含むことができ、記載された範囲の間での０．００５毎の増分もまた企図される。
【００１２】
この治療方法は、約０．０１〜約１．５０ｍｇ／ｋｇ／患者体重の皮下投与を行うことを企図する。静脈内投与のための他の範囲又は使用は、０．０１５〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０１５〜０．３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１５〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、及び０．０１５〜０．０７５ｍｇ／ｋｇを含むことができ、記載された範囲の間での０．００５毎の増分もまた企図される。
【００１３】
別の方法は、対象において、ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルを少なくとも２倍低下させるのに充分な用量で、アルギナーゼを対象に投与することを企図し、ここで、血漿レベルは、投与後の約２４〜４８時間でアッセイされる。別の方法は、投与された用量が、ＮＡＡｒｇの血漿レベルを少なくとも３倍低下させることを企図する。別の方法は、投与された用量が、ＧＡＡの血漿レベルを少なくとも２倍低下させることを企図する。開示された治療方法のアルギナーゼは、患者へ、静脈内若しくは皮下、又は両方の組合せで投与することができる。アルギナーゼは、毎日、毎週、隔月、又は毎月、対象へ投与することができる。
【００１４】
窒素スカベンジャもまた、対象に投与してもよい。アルギナーゼを有する開示された組成物は、窒素スカベンジャを含むことができる。アルギナーゼを用いた開示された治療方法は、窒素スカベンジャと共に対象へ投与することができ、場合によっては、対象は更に低アルギニン食にすることができる。アルギナーゼで対象を治療する別の方法は、対象へ送達するためアデノウイルスベクターに操作可能に連結された核酸を投与することを含み、アルギナーゼは、対象へ投与されると対象中でアルギナーゼを産生する。アデノウイルスベクター送達によって産生されるアルギナーゼの量は、対象において、ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルを少なくとも２倍低下させるために治療効果があり得、ここで、血漿レベルは、アルギナーゼの投与後の約２４〜４８時間でアッセイされる。
【００１５】
別の方法は、アルギナーゼの初回投与後の神経運動機能の改善を企図する。神経運動機能は、ステップ、歩行、痙縮、及び／又は覚醒のうちの１つ以上であり得るが、これらに限定されない。別の方法は、対象が、アルギナーゼ投与前の痙縮、挙動、及びＰＲＯＭＩＳ−Ｔスコアのうちの少なくとも１つと比較して、アルギナーゼの初回投与後に、安静時痙縮の減少、痙縮に関連する下肢痙攣の減少、適応行動、及びＰＲＯＭＩＳ−Ｔスコアの改善のうちの少なくとも１つを示すことを企図する。この方法は、１つ以上の毒性代謝物（例えば、ＧＡＡ）が正常レベルまで低下する又は除去されるような、アルギナーゼによる治療に対する急性期反応を企図する。
【００１６】
本方法は、対象に、アルギニンの血漿レベルを２００μｍｏｌ／Ｌ未満まで低下させる量のアルギナーゼの少なくとも１回の反復投与を行うことを企図する。アルギニンの血漿レベルは、少なくとも３０週及び／又は少なくとも４０週の間、２００μｍｏｌ／Ｌ未満のレベルまで低下し得る。少なくとも１回の反復投与のうち８回を受けた後、対象は、治療前の対象の可動性又は適応行動に対するベースラインと比べて、（ａ）該可動性又は（ｂ）適応行動のうち少なくとも１つの改善を示し得る。ＮＡＡｒｇ、ＡｒｇＡ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、又はアルギニンのうち少なくとも１つの血漿レベルは、対象におけるベースライン血漿レベルと比べて、低下し得る。別の方法は、対象が、治療の９日後に１を超える臨床上意味のある最小変化量（ｍｉｎｉｍａｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）（ＭＣＩＤ）を有することを企図する。アルギニンの血漿レベルは、ＭＣＩＤと相関している。
【００１７】
ペグジラルギナーゼと、医薬的に許容可能な緩衝液と、を含む組成物もまた企図される。組成物は約１０％のグリセロールを含むことができ、医薬的に許容可能な緩衝液は、所望の量のペグジラルギナーゼ又は他のアルギナーゼに加えて、リン酸緩衝食塩水であり得る。ＡＲＧ１−Ｄを治療するための医薬の製造における、アルギナーゼ（例えば、ペグジラルギナーゼ）又はアルギナーゼをコードする核酸を含む組成物の使用が提供される。
【００１８】
また、例えばペグジラルギナーゼが赤血球ゴースト中に配合されたアルギナーゼなども企図される。
【００１９】
アルギニン、Ｎ−α−アセチルアルギニン（ＮＡＡｒｇ）、アルギニン酸（ＡｒｇＡ）、α−ケト−δ−グアニジノ吉草酸（ＧＶＡ）、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）からなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルを、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）欠損症（ＡＲＧ１−Ｄ）を有する対象において正常レベルまで急速に低下させる方法であって、治療有効量のＰＥＧ化アルギナーゼを含む組成物を対象へ投与することを含み、ここで、ＰＥＧ化アルギナーゼは、対象へ、初回は０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１．００ｍｇ／ｋｇで静脈内投与され、その後は毎週皮下又は静脈内のいずれかで投与される、方法。別の方法は、ＰＥＧ化アルギナーゼを、初回は０．００５ｍｇ／ｋｇ〜０．５０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与することを企図する。別の方法は、ＰＥＧ化アルギナーゼを、初回は０．００５ｍｇ／ｋｇ〜０．２０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与することを企図する。別の方法は、ＰＥＧ化アルギナーゼがペグジラルギナーゼであることを企図する。別の方法は、ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、又はアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルが、ＰＥＧ化アルギナーゼの初回投与後３日未満、２日未満、及び／又は１日未満で、対象において正常レベルまで低下することを企図する。別の方法は、対象へ投与したＰＥＧ化アルギナーゼの用量が、ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びアルギニンから選択される群から少なくとも１つの化合物の血漿レベルを少なくとも２倍低下させるのに充分であり、ここで、血漿レベルが、ＰＥＧ化アルギナーゼの投与後の約２４〜４８時間でアッセイされることを企図する。
【００２０】
アルギニン、Ｎ−α−アセチルアルギニン（ＮＡＡｒｇ）、アルギニン酸（ＡｒｇＡ）、α−ケト−δ−グアニジノ吉草酸（ＧＶＡ）、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）からなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルを、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）欠損症（ＡＲＧ１−Ｄ）を有する対象において正常レベルまで急速に低下させる方法であって、治療有効量のＰＥＧ化アルギナーゼを含む組成物を対象へ投与することを含み、ここで、ＰＥＧ化アルギナーゼは、対象へ、初回は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．５０ｍｇ／ｋｇで皮下投与され、その後は毎週皮下又は静脈内のいずれかで投与される、方法。別の方法は、ＰＥＧ化アルギナーゼを、初回は０．０１５ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇで皮下投与することを企図する。別の方法は、ＰＥＧ化アルギナーゼを、初回は０．０１５ｍｇ／ｋｇ〜０．３０ｍｇ／ｋｇで皮下投与することを企図する。別の方法は、ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、又はアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルが、ＰＥＧ化アルギナーゼの初回投与後３日未満、２日未満、及び／又は１日未満で、対象において正常レベルまで低下する、ことを企図する。別の方法は、対象へ投与したＰＥＧ化アルギナーゼの用量が、ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の血漿レベルを少なくとも２倍低下させるのに充分であり、ここで、血漿レベルが、ＰＥＧ化アルギナーゼの投与後の約２４〜４８時間でアッセイされることを企図する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａは、アルギニンの血漿中濃度である。図１Ｂは、アルギニン酸（ＡｒｇＡ）の血漿中濃度である。
【図１Ｃ−Ｄ】図１Ｃは、ＧＶＡの血漿中濃度である。図１Ｄは、Ｎ−α−アセチルアルギニン（ＮＡＡｒｇ）の血漿中濃度である。アルギニンレベルは、検証された（優良試験所基準、すなわちＧＬＰ（ｇｏｏｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒａｃｔｉｃｅ））アッセイを用いて０．０３ｍｇ／ｋｇのペグジラルギナーゼで治療された、２人のＡＲＧ１−Ｄ患者から得た値の平均である。ＡｒｇＡ、ＧＶＡ、及びＮＡＡｒｇレベルは、０．０３ｍｇ／ｋｇのペグジラルギナーゼで治療した同じ２人のＡＲＧ１−Ｄ患者に由来するプールした試料を用いて、非ＧＬＰアッセイにより分析した。ヒトの正常範囲は「＊」で示す。ヒト血清中のアルギニンの正常範囲は４０μｍｏｌ／Ｌ〜１１５μｍｏｌ／Ｌである。例えば、Ｌｕｅｎｅｂｕｒｇ，Ｎ．ら、「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍａ  Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ：ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒａｔｉｏ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ  Ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ  Ｃｏｈｏｒｔ．」、Ｊ．Ｎｕｔｒ．、第１４１巻、第１２号、第２１８６〜２１９０頁（２０１１）を参照されたい。ＡｒｇＡの正常範囲は０．０２５μｍｏｌ／Ｌ〜０．１００μｍｏｌ／Ｌであり、ＧＶＡの正常範囲は０．０５０未満であり、ＮＡＡｒｇの正常範囲は０．０２５μｍｏｌ／Ｌ未満〜０．２５５μｍｏｌ／Ｌである。例えば、Ｍａｒｅｓｃａｕら、「Ｇｕａｎｉｄｉｎｏ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ  ｈｙｐｅｒａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ：Ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｏｆ  ｇｕａｎｉｄｉｎｏ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ．Ｒｅｓ．、第２７巻、第３号、第２９７〜３０３頁（１９９０年）を参照されたい。
【図２】図２Ａは、アルギニンの血漿中濃度を示す。図２Ｂは、ホモアルギニン（ＨＡｒｇ）を示す。アルギニンレベルは、検証された（ＧＬＰ）アッセイを用いて０．０３ｍｇ／ｋｇのペグジラルギナーゼで治療された、２人のＡＲＧ１−Ｄ患者から得た値の平均である。ＨＡｒｇ値は、０．０３ｍｇ／ｋｇのペグジラルギナーゼで治療した同じ２人のＡＲＧ１−Ｄ患者に由来するプールした試料を用いて、非ＧＬＰアッセイにより得た。「＊」とは、アルギニンに関してはＬｕｎｅｂｕｒｇ、Ｎ．ら（２０１１年）、又はグアニジノ化合物に関してはＭａｒｅｓｃａｕら（１９９０年）に記載されているような、ヒト血清中の正常範囲を指す。ＨＡｒｇの正常範囲は０．５００μｍｏｌ／Ｌ未満〜２．８０μｍｏｌ／Ｌである。
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａは、アルギニンの血漿中濃度である。図３Ｂは、アルギニン酸（ＡｒｇＡ）の血漿中濃度である。
【図３Ｃ−Ｄ】図３Ｃは、ＧＶＡの血漿中濃度である。図３Ｄは、Ｎ−α−アセチルアルギニン（ＮＡＡｒｇ）の血漿中濃度である。アルギニンレベルは、検証された（ＧＬＰ）アッセイを用いて０．０１５ｍｇ／ｋｇのペグジラルギナーゼ（「●」）及び０．０３ｍｇ／ｋｇのペグジラルギナーゼ（「□」）で治療された、２人のＡＲＧ１−Ｄ患者から得た値の平均である。ＡｒｇＡ、ＧＶＡ、及びＮＡＡｒｇレベルは、０．０１５ｍｇ／ｋｇ及び０．０３ｍｇ／ｋｇのペグジラルギナーゼで治療した同じ２人のＡＲＧ１−Ｄ患者に由来するプールした試料を用いて、非ＧＬＰアッセイにより得た。「＊」とは、アルギニンに関してはＬｕｎｅｂｕｒｇ、Ｎ．ら（２０１１年）、又はグアニジノ化合物に関してはＭａｒｅｓｃａｕら（１９９０年）に記載されているような、ヒト血清中の正常範囲を指す。
【図４Ａ】図４Ａは、ペグジラルギナーゼによる治療前（例えば、スクリーニング時）及び治療後の、２人の患者である患者第１２０−１０１号（図４Ａ）及び患者１２０−１０２号（図４Ｂ）におけるＧＡＡのデータを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ペグジラルギナーゼによる治療前（例えば、スクリーニング時）及び治療後の、２人の患者である患者第１２０−１０１号（図４Ａ）及び患者１２０−１０２号（図４Ｂ）におけるＧＡＡのデータを示す。いずれの場合でも、スクリーニング時と、第１部及び第２部の投与中と、におけるＧＡＡレベルに関するデータを示す。「ＦＵＰ」とは経過観察（ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ）を示す。ＧＡＡの正常範囲は０．４００μｍｏｌ／Ｌ〜３．００μｍｏｌ／Ｌである。例えば、Ｍａｒｅｓｃａｕら（１９９０年）を参照されたい。
【図５Ａ】アルギニン及びＧＣの血漿レベルに対するアルギナーゼ治療の影響を、単回投与を用いた臨床試験の第１部にて試験した（ＮＡＡはＮＡＡｒｇを指す）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、アルギニン及びＧＣの血漿レベルに対するアルギナーゼ治療の影響を、反復投与を含む臨床試験の第２部にて試験した。第２部に示したデータには、臨床プロトコルに従って投与された全８回の投与を受けた患者が含まれる。図５Ａと図５Ｂとの両方について、「ａ」とは患者におけるベースラインのアルギニンレベルを示し、「ｂ」とは投与後最低値を示し、「ｃ」とは投与後７日目のレベルを示し、「ｄ」とは投与前のアルギニンレベルを示し、「ｅ」とは全投与後値（ａｌｌ  ｐｏｓｔ−ｄｏｓｅ）を示し、「ｆ」とは、Ｌｕｎｅｂｕｒｇ、Ｎ．ら（２０１１年）に記載されているような４０μｍｏｌ／Ｌ〜１１５μｍｏｌ／Ｌの、健康な患者におけるアルギニンの血漿レベルの正常範囲を示し、「ｎ」とは患者数を表す。投与後最低値は第１部投与後の最低値であり、第２部の「全投与後値」には、次回投与直前の値を除く、全投与後値が含まれる。
【図６】３名の患者である、患者第１号（「ａ」）、患者第２号（「ｂ」）、及び患者第５号（「ｃ」）に対する６分間の歩行試験の結果を、ベースラインで、用量８、用量２０、及び用量３２（用量２０及び３２での患者第５号に対するデータは得られず）で示した。用量８、２０、及び３２は、反復投与開始時より投与する。
【図７】第１／２相試験及び非盲検延長試験（ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の概要を示す。
【図８】第２部及び非盲検延長試験の患者に対する、ペグジラルギナーゼの反復投与による血漿アルギニンの時間依存性改善。「ＢＬ」とはベースラインであり、「Ｆ／Ｕ」とは経過観察であり、「ＯＬＥ」とは非盲検延長試験であり、「ｎ」とは各時点での患者数である。患者血漿中のアルギニンを２００μｍｏｌ／Ｌ以下に維持することが望ましい。第２部を完了した患者の１００％（５／５）が、推奨ガイドライン以下である一貫したアルギニン低下レベルを達成していた。アルギニン低下は血漿ＧＣ（ＧＶＡ、ＡｒｇＡ、ＮＡＡ、ＧＡＡ）の持続的な低下を伴った。
【図９】ペグジラルギナーゼによる治療は、わずか８回の反復投与後にベースラインから臨床転帰を改善した。図９の各点は、１人の患者に対する１つの評価を表す。好ましい評価は黒丸「●」で示し、中立の評価は白丸「○」で示す。
【図１０】図１０は、患者のＭＣＩＤ改善に基づいて、ペグジラルギナーゼ治療に応答した患者（応答者）と、ペグジラルギナーゼ治療に応答しなかった患者（非応答者）と、に関する９週間にわたるアルギニン濃度を示す。医療指針を上回る血漿中アルギニンの範囲は２００μｍｏｌ／Ｌ以上であり、ヒトのアルギニンに対する正常範囲は、Ｌｕｎｅｂｕｒｇ、Ｎ．ら（２０１１年）に記載されているように、４０μｍｏｌ／Ｌ〜１１５μｍｏｌ／Ｌである。ＭＣＩＤは以下に記載のように決定される。応答者」はＭＣＩＤが１を超える個人であり得、非応答者はＭＣＩＤが１未満の個人であり得る。非応答者データ点は黒い菱形で示され、応答者データ点は白い菱形で示される。非応答者データ点の平均は線「ａ」で示され、応答者データ点の平均は線「ｂ」で示される。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下の実施例に開示された研究の承認を求める時点で、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、食事性アルギニン制限による血漿アルギニンレベルの低下とＡＲＧ１−Ｄ患者における疾患進行の客観的な改善との間の明確かつ一貫した関係を、科学文献が支持していないと考えていた。当初ＦＤＡは、ＡＲＧ１−Ｄ患者にペグジラルギナーゼを投与しても、臨床上の直接的な利益は期待できないと主張した。ＦＤＡは、ペグジラルギナーゼ及びそのような薬物が、ＡＲＧ１−Ｄ患者の根本的な酵素欠損に対処できるかどうかについて懸念を表明した。ＦＤＡは、アルギナーゼ含有医薬の末梢循環が、肝内アルギニンレベルの代謝及び関連するアルギニン代謝物の生成に現実的な影響を及ぼすかどうかを疑問視した。その結果、ＦＤＡは当初、成人患者の治療が可能になるまで小児患者での検査を延期したが、その後、小児患者での検査を継続することを許可した。
【００２３】
驚くべきことに発見されたのは、アルギニンのレベルと、グアニジノ化合物（ＮＡＡｒｇ）レベルのうち少なくとも１つとを、３日以内に正常レベル内まで迅速に低下させる、ＡＲＧ１欠損患者の治療方法である（図１）。
【００２４】
定義
本明細書中で使用される場合、用語「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｏ  ｔｒｅａｔ）」、又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、ＡＲＧ１−Ｄに関連する既存の症状、障害、状態、又は疾患の、進行又は重症度を抑制、緩徐化、阻止、低下、改善、又は逆転させることを含む。治療は、予防的又は治療的に適用され得る。
【００２５】
使用される用語「有効量」とは、野生型アルギナーゼ又はペグジラルギナーゼなどのＰＥＧ化アルギナーゼの量を指し、このペグジラルギナーゼは投与されると、アルギニン、アルギニン酸（ＡｒｇＡ）、ＧＶＡ、Ｎ−α−アセチルアルギニン（ＮＡＡｒｇ）、ＧＡＡ、及びホモアルギニン（ＨＡｒｇ）のうち１つ以上の血漿レベルを低下させるといった望ましい効果を持つ。有効量は、患者の体重といった要因によって異なる場合がある。例えば、有効量は、ＰＥＧ化アルギナーゼの静脈内投与について、患者の０．００５〜１．００ｍｇ／ｋｇ／患者体重の範囲であり得る（これらの範囲間にある０．００５毎の値を含む）。ＡＲＧ１−Ｄ患者に対するＰＥＧ化アルギナーゼの皮下（ｓ．ｃ．）投与の有効量としては、０．０１〜１が挙げられる。５０ｍｇ／ｋｇ／患者体重（これらの範囲間にある０．０１毎の値を含む）。１つの例として、ＡＲＧ１欠損症に罹患していない正常なヒトにおける各化合物の正常レベルと同等の範囲のアルギニン、ＡｒｇＡ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及び／又はＮＡＡｒｇを達成するために化合物を投与するこが挙げられる。有効量はまた、筋力、患者の歩行能力（すなわち、走る、歩く、自転車に乗る、支えなしで階段を上る能力）を改善し、かつ認知能力（例えば、ウェクスラー児童知能（Ｗｅｃｈｓｌｅｒ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  Ｓｃａｌｅ  ｆｏｒ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ、ＷＩＳＣ）検査の改善）及び／又は適応行動（例えば、適応行動評価スケール（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｓｃａｌｅ、ＡＢＡＳ）若しくはヴァインランド適応行動スケール（Ｖｉｎｅｌａｎｄ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ｓｃａｌｅ、ＶＡＢＳ）検査の改善）を改善することができる（Ｌｏｐａｔａら、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ＨＦＡＳＤｓ」、Ａｕｔｉｓｍ  Ｒｅｓｅａｒｃ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、第２０１３巻、第１〜１０頁（２０１３年））。グアニジノ化合物の正常レベルを以下の表に示す。アルギニンの正常レベルは、Ｌｕｎｅｂｕｒｇ、Ｎ．ら（２０１１年）に記載されている。
【００２６】
アルギニン及び／又はグアニジノ化合物の血漿レベルは正常範囲又は正常レベルまで低下させてもよく、これは、アルギナーゼの初期用量及び／又は反復用量の投与に続くある時点で、アルギニン及び／又は１つ以上のグアニジノ化合物の血漿レベルが、以下の表に示される範囲内の値又はＬｕｎｅｂｕｒｇ、Ｎ．ら（２０１１年）に記載されるアルギニンについて４０μｍｏｌ／Ｌ〜１１５μｍｏｌ／Ｌを有するということを意味し得る。例えば、アルギニン及び／又は１つ以上のグアニジノ化合物についての患者の血漿レベルは、本明細書に開示されているように、アルギナーゼによる治療中に正常範囲内及び正常範囲外で振動し得る。この患者は、分析されたアルギニン及び／又はグアニジノ化合物の血漿レベルが正常レベル又は正常範囲内まで低下していると考えられる。別の例として、患者は、１以上の用量本明細書に開示されるアルギナーゼを受けた後に、正常範囲内（例えば、以下の表に記載されるように、又はＬｕｎｅｂｕｒｇ、Ｎ．ら（２０１１年）に記載されるアルギニンについて４０〜１１５μｍｏｌ／Ｌ）にあるアルギニン及び／又は１つ以上のグアニジノ化合物の平均量の血漿レベルを有してもよい。したがって、本明細書に開示された組成物及び方法は、アルギニン及び／又はグアニジノ化合物の対象の血漿レベルを、アルギナーゼの初期用量及び／又は反復用量を受けた後に、少なくとも１回、正常レベル又は正常範囲内まで低下させ得る。一部の患者では、アルギニン及び／又はグアニジノ化合物の血漿レベルが、本明細書に開示された方法に従って、平均して正常レベル又は正常範囲内に維持され得るということが観察された。
【００２７】
［表１］ヒト血清、尿、及び脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ、ＣＳＦ）中のグアニジノ化合物の正常範囲
2021505620.tif 000002
【００２８】
野生型アルギナーゼはヒトアルギナーゼＩ又はアルギナーゼＩＩに基づいてもよい。野生型ヒトアルギナーゼＩＩは以下の配列を有する（Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ７８５４０）：
ＭＳＬＲＧＳＬＳＲＬＬＱＴＲＶＨＳＩＬＫＫＳＶＨＳＶＡＶＩＧＡＰＦＳＱＧＱＫＲＫＧＶＥＨＧＰＡＡＩＲＥＡＧＬＭＫＲＬＳＳＬＧＣＨＬＫＤＦＧＤＬＳＦＴＰＶＰＫＤＤＬＹＮＮＬＩＶＮＰＲＳＶＧＬＡＮＱＥＬＡＥＶＶＳＲＡＶＳＤＧＹＳＣＶＴＬＧＧＤＨＳＬＡＩＧＴＩＳＧＨＡＲＨＣＰＤＬＣＶＶＷＶＤＡＨＡＤＩＮＴＰＬＴＴＳＳＧＮＬＨＧＱＰＶＳＦＬＬＲＥＬＱＤＫＶＰＱＬＰＧＦＳＷＩＫＰＣＩＳＳＡＳＩＶＹＩＧＬＲＤＶＤＰＰＥＨＦＩＬＫＮＹＤＩＱＹＦＳＭＲＤＩＤＲＬＧＩＱＫＶＭＥＲＴＦＤＬＬＩＧＫＲＱＲＰＩＨＬＳＦＤＩＤＡＦＤＰＴＬＡＰＡＴＧＴＰＶＶＧＧＬＴＹＲＥＧＭＹＩＡＥＥＩＨＮＴＧＬＬＳＡＬＤＬＶＥＶＮＰＱＬＡＴＳＥＥＥＡＫＴＴＡＮＬＡＶＤＶＩＡＳＳＦＧＱＴＲＥＧＧＨＩＶＹＤＱＬＰＴＰＳＳＰＤＥＳＥＮＱＡＲＶＲＩ（配列番号１）。
【００２９】
野生型ヒトアルギナーゼＩは以下の配列を有する（Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０５０８９）：
ＭＳＡＫＳＲＴＩＧＩＩＧＡＰＦＳＫＧＱＰＲＧＧＶＥＥＧＰＴＶＬＲＫＡＧＬＬＥＫＬＫＥＱＥＣＤＶＫＤＹＧＤＬＰＦＡＤＩＰＮＤＳＰＦＱＩＶＫＮＰＲＳＶＧＫＡＳＥＱＬＡＧＫＶＡＥＶＫＫＮＧＲＩＳＬＶＬＧＧＤＨＳＬＡＩＧＳＩＳＧＨＡＲＶＨＰＤＬＧＶＩＷＶＤＡＨＴＤＩＮＴＰＬＴＴＴＳＧＮＬＨＧＱＰＶＳＦＬＬＫＥＬＫＧＫＩＰＤＶＰＧＦＳＷＶＴＰＣＩＳＡＫＤＩＶＹＩＧＬＲＤＶＤＰＧＥＨＹＩＬＫＴＬＧＩＫＹＦＳＭＴＥＶＤＲＬＧＩＧＫＶＭＥＥＴＬＳＹＬＬＧＲＫＫＲＰＩＨＬＳＦＤＶＤＧＬＤＰＳＦＴＰＡＴＧＴＰＶＶＧＧＬＴＹＲＥＧＬＹＩＴＥＥＩＹＫＴＧＬＬＳＧＬＤＩＭＥＶＮＰＳＬＧＫＴＰＥＥＶＴＲＴＶＮＴＡＶＡＩＴＬＡＣＦＧＬＡＲＥＧＮＨＫＰＩＤＹＬＮＰＰＫ（配列番号２）。
【００３０】
本明細書に開示されるペグジラルギナーゼは、配列番号２のアルギナーゼＩの配列を有し、マンガン金属補因子の代わりにコバルト金属補因子を有する。ペグジラルギナーゼもまた、米国特許第８，４４０，１８４号に記載されているようにＰＥＧ化される。
【００３１】
「投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」とは、化合物、及び開示された該化合物を含有する組成物の治療有効量の注射を意味する。例えば、限定されるものではないが、投与は血管内（ｉ．ｖ．）又は皮下（ｓ．ｃ．）であってもよい。本発明の組成物はまた、筋肉内（ｉ．ｍ．）に投与されてもよい。
【００３２】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変化する。本明細書中で使用される場合、「約」とは、±１０％、±５％、又は±１％の包含することを意味する。
【００３３】
用語「ＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）」とは、その高度な生体適合性及び修飾の容易さを考慮して薬物担体として広く使用されている、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との結合を指す（例えば、Ｈａｒｒｉｓら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．、第４０巻、第７号、第５３９〜５１頁（２００１年）を参照されたい）。ＰＥＧは、鎖の末端のヒドロキシル基を介して、及び他の化学的方法によって、活性剤にカップリング（例えば、共有結合）され得るが、しかしながら、ＰＥＧ自体は、分子当たり最大で２つの活性剤に制限される。異なるアプローチでは、ＰＥＧとアミノ酸とのコポリマーは、ＰＥＧの生体適合特性を保持するが、分子当たり多数の付着点の付加的利点を有する（薬物負荷を増大させる）、新規の生体材料として探求されている。
【００３４】
ＰＥＧ化アルギナーゼ変異体は、医薬的に有用な組成物を調製するために、公知の方法に従って製剤化することができる。ＡＲＧ１−Ｄ患者には、天然にマンガン金属補因子を含有する野生型アルギナーゼタンパク質（アルギナーゼＩ若しくはアルギナーゼＩＩのいずれか）、又はＰＥＧ化されマンガン金属補因子を含有する野生型アルギナーゼタンパク質を投与することができる。別の例では、ＡＲＧ１−Ｄ患者には、天然のマンガン金属補因子の代わりにコバルト金属補因子を有するアルギナーゼを投与することができる。アルギナーゼを含有するコバルト金属補因子は、更にＰＥＧ化することができ、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，４４０，１８４号に記載されているような、Ｃｏ−ＡｒｇＩ−ＰＥＧ（本明細書では、ＡＥＢ１１０２、ペグジラルギナーゼ、又はＣｏ−ｈＡｒｇＩとも称される）が例示的な形態である。ペグジラルギナーゼなどの例示的形態は、ペグジラルギナーゼのタンパク質配列中に存在する１以上のリシンに結合したモノマー当たり、およそ１２の５Ｋ（５０００ダルトン）のＰＥＧ単位を有する。所望の配合は、任意の医薬的に許容可能な担体、保存剤、賦形剤、又は安定剤と共に、適切な希釈剤又は高純度の水溶液で再構成される、安定な凍結乾燥製剤である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ、ペンシルヴァニア州イーストン、１９９５年を参照されたい）。この薬物は、赤血球ゴースト（人工赤血球とも称される）中に送達されるように製剤化することができる。別のアプローチは、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、若しくはｉ．ｖ．を介して、又は記載された赤血球ゴーストを使用して、アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）−ＰＥＧ２０（Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｐｈａｒｍａ）をＡＲＧ１−Ｄ患者に投与することであろう。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「一部（ｐｏｒｔｉｏｎ）とは、タンパク質に関するとき（「所与のタンパク質の一部」のような）、アルギナーゼフラグメントを指し、ここで、フラグメントは尿素サイクル中でアルギナーゼ活性を有する。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」とは、ペプチド結合を介して結合されたアミノ酸を含む化合物を指し、交換可能に使用される。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「融合タンパク質」とは、外因性タンパク質フラグメント（非アルギナーゼタンパク質から成る融合パートナー）に結合された（又は、操作可能に連結された）、目的のタンパク質（すなわち、ヒトアルギナーゼ又はそのバリアント）を含有するキメラタンパク質を指す。融合パートナーは、血清の半減期、溶解性、又はこれら両方を増強し得る。これはまた、宿主細胞若しくは培養上清、又はこれら両方からの組換え融合タンパク質の精製を可能にする親和性タグ（例えば、Ｈｉｓタグ）を提供し得る。
【００３８】
用語「操作可能な組合せで」、「動作可能な順序で」、及び「操作可能に連結される」とは、所与の遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質分子の合成を指示することができる核酸分子が産生されるような様式での、核酸配列の連結を指す。この用語はまた、機能性タンパク質が産生されるような様式でのアミノ酸配列の連結を指す。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｋｍ」とは、酵素のミカエリス・メントン定数（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）を指し、酵素触媒反応において所定の酵素がその最大速度の半分を生じる特定の基質の濃度として定義される。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「ｋｃａｔ」とは、酵素が最大効率で作用している単位時間当たりに各酵素部位が生成物に変換する、ターンオーバー数又は基質分子の数を指す。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｋｃａｔ／Ｋｍ」とは、特異性定数であって、これは、酵素がいかに効率的に基質を生成物へと変換するかの尺度である。
【００４２】
用語「Ｍｎ−ｈＡｒｇＩ」とは、Ｍｎ（ＩＩ）金属補因子を有するヒトアルギナーゼＩを指す。用語「Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ」とは、Ｃｏ（ＩＩ）金属補因子を有するヒトアルギナーゼＩ（突然変異又は天然）を指す。
【００４３】
用語「ＩＣ５０」は、最大半量（５０％）の阻害濃度（ＩＣ）であり、したがって有効性の尺度である。
【００４４】
用語「遺伝子」とは、アルギナーゼ又はその前駆体などのポリペプチドの産生に必要な制御配列及びコード配列を含む、ＤＮＡ配列を指す。アルギニンをオルニチンに還元するアルギナーゼの所望の酵素活性が保持されている限り、ポリペプチドは、全長コード配列によって又はコード配列のあらゆる部分によって、コードされる。
【００４５】
用語「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物などの動物を指す。
【００４６】
用語「野生型」とは、天然に存在する供給源から単離された場合にその遺伝子又は遺伝子産物の特徴を有する、遺伝子又は遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁に観察されるものであり、したがって、遺伝子の「正常」形態又は「野生型」形態と任意に命名される。対照的に、用語「修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」又は「バリアント」若しくは「突然変異体」とは、野生型の遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合に、配列及び／又は機能的特性における修飾（すなわち、特徴の変化）を示す、遺伝子又は遺伝子産物を指す。天然に存在する突然変異体を単離することができることに留意されたい。これらは、野生型の遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合に変化した特徴を有するという事実によって同定される。
【００４７】
以下の略語が本明細書で使用される。
略語
ＡＤＡ  抗薬物抗体
ＡＲＧ又はＡＲＧ  アルギニン
ＡＲＧ１−Ｄ  アルギナーゼ１欠損
Ａｒｇ１−／−マウス  アルギナーゼ欠損マウス
ＡｒｇＡ  アルギニン酸
ＡＵＣ  血漿中濃度−時間曲線下面積（Ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｃｏｎｃｅｒｔａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ  ｃｕｒｖｅ）
ＢＱＬ  定量限界未満
Ｃｏ−ＡｒｇＩ−ＰＥＧ  コバルト置換及びＰＥＧ化アルギナーゼ１
ＥＯＩ  注入終了
Ｆ／Ｕ  経過観察
ＧＣ  グアニジノ化合物
ＧＬＰ  医薬品安全性試験実施基準
ＧＶＡ  α−ケト−δ−グアニジノ吉草酸
ＧＡＡ  グアニジノ酢酸
ＨＡｒｇ  ホモアルギニン
ｉ．ｖ．筋肉内又は筋肉内に（ＩＶ）
Ｋ２ＥＤＴＡ血漿  凝固防止用エチレンジアミン四酢酸二カリウム処理管
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  液体クロマトグラフィータンデム質量分析
ＮＡＡｒｇ  Ｎ−アセチル−アルギニン
ＰＥＧ  ポリエチレングリコール
ｓ．ｃ．皮下、皮下に、又はＳＣ
ＳＯＩ  注入終了
ｗｔ  野生型
【００４８】
大腸菌で生産された組換えヒトアルギナーゼ酵素であるペグジラルギナーゼが、新生仔マウス及び成体マウスＡＲＧ１欠損症モデルにおいて、アルギニンレベルを正常範囲まで低下させ得るかどうかを検討した。ペグジラルギナーゼは安定性及び半減期のためにＰＥＧ化され、マンガン金属補因子の代わりにコバルト金属補因子を有する。コバルト金属補因子は触媒活性を高め、アルギナーゼの安定性を改善する。ペグジラルギナーゼによる治療は血漿アルギニン及び全脳アルギニンを低下させたが、薬物の投与はマウスの高アンモニア血症を治療できなかった。肝組織におけるアルギニンレベル低下の欠如は、おそらく投与された酵素ペグジラルギナーゼが肝臓に入らないためであると理論化された。ＡＲＧ１−Ｄの成体マウスモデルにおいて、ペグジラルギナーゼの投与は動物の生存を改善できなかった。マウスモデルにおけるヒト疾患の最も近いシミュレーションである新生仔アルギナーゼＩ欠損マウス（Ａｒｇ１−／−マウス）において、ペグジルアルギナーゼを試験した（Ｂｕｒｒａｇｅら、「Ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｒｇｉｎａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｒｇｉｎａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ」、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ第２４巻、第２２号、第６４１７〜２７頁（２０１５年））。多回投与試験の結果、血漿及び脳のアルギニンレベルは正常範囲まで低下した。しかしながら、肝臓のアルギニンレベルは有益な影響を受けず、無処置のＡｒｇ１−／−マウスと比較して生存率の改善はみられず、これは予想外であった。
【００４９】
アルギナーゼＩ欠損症のヒト臨床症状とは異なり、Ａｒｇ１−／−マウスは若死の原因と考えられる重度高アンモニア血症を有する（例えば、Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ｄ．Ｒ．ら、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ」、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｕｒｏｌ、第４６巻、第６号、第３６９〜７４頁（２０１２年））。高アンモニア血症は、この障害のヒト患者ではより軽度の合併症である。高アンモニア血症よりも血漿アルギニンの上昇がアルギナーゼＩ欠損症のヒト患者における主要な治療課題であることを考慮すると、Ｃｏ−ＡｒｇＩ−ＰＥＧは治療的有用性を有すると推測されることもあるが、有用性の程度及び反応は合理的に予測できず、たとえ１９９５年に遡って仮定しても、試験又は治療モデルは実施又は開発されていない。例えば、Ｕｃｈｉｎｏ，Ｔ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ」、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第９６巻、第３号、第２５５〜６０頁（１９９５年）を参照されたい。
【００５０】
Ｉ．アルギナーゼ
野生型アルギナーゼはマンガン含有酵素である。これは尿素サイクルの最後の酵素である。アルギナーゼは、体が有害なアンモニアを処理する哺乳類における一連の生物物理的反応である、尿素サイクルの第５番目かつ最終ステップである。具体的には、アルギナーゼは、Ｌ−アルギニンをＬ−オルニチン及び尿素に変換する。
【００５１】
Ｌ−アルギニンは酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）に対する窒素供与基質であり、Ｌ−シトルリン及び酸化窒素（ＮＯ）を産生する。アルギナーゼのＫＭ（２〜５ｍＭ）は、Ｌ−アルギニンに対するＮＯＳのそれ（２〜２０μＭ）よりはるかに高いことが報告されているが、アルギナーゼはＮＯＳ活性の調節にも役割を果たすことができる。ある条件下では、アルギナーゼＩはＣｙｓ−Ｓ−ニトロシル化され、Ｌ−アルギニンに対するより高い親和性及びＮＯＳに対する基質の利用性の低下をもたらす。
【００５２】
アルギナーゼは、いくつかのヘリックスで囲まれた平行な８本鎖βシートのα／βフォールドを有する、ホモ三量体酵素である。この酵素は、Ｌ−アルギニンのグアニジニウム炭素を求核攻撃する水酸化物を生成するのに不可欠な、二核金属クラスターを含有する。アルギナーゼの天然金属補因子はＭｎ２＋である。これらのＭｎ２＋イオンは水を配位し、分子を配向及び安定化し、水を求核試薬として作用させてＬ−アルギニンを攻撃させ、それを加水分解してオルニチン及び尿素にする。
【００５３】
哺乳類は、Ｌ−アルギニンの尿素及びＬ−オルニチンへの加水分解を触媒する、２つのアルギナーゼアイソザイム（ＥＣ３．５．３．１）を有する。アルギナーゼＩ遺伝子は第６染色体（６ｑ２３）上に位置し、肝細胞のサイトゾルで高度に発現し、尿素サイクルの最終ステップとして窒素除去で機能する。アルギナーゼＩＩ遺伝子は第１４染色体（１４ｑ２４．１）に存在する。アルギナーゼＩＩは、腎臓、脳、及び骨格筋などの組織にミトコンドリアに局在し、プロリン及びポリアミン生合成のためのＬ−オルニチンの供給をすると考えられている（Ｌｏｐｅｚら、ＦＥＢＳ  Ｊ．、第２７２巻、第４５４０〜４８頁（２００５年）。
【００５４】
アルギナーゼは細胞外Ｌ−アルギニンを分解する方法として５０年近く研究されてきた（Ｄｉｌｌｏｎら、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｒｇｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．、第８巻、第７号、第ＢＲ２４８〜２５３頁（２００２年）。天然アルギナーゼは数分以内に循環から除去されるが（Ｓａｖｏｃａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ、第７巻、第２６１〜２６８頁（１９８４年）、ラットへのＰＥＧ−アルギナーゼＭＷ５，０００の単回注射は、約３日間の完全に近いアルギニン欠乏を達成するのに充分であった（Ｃｈｅｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、第６７巻、第３０９〜１７頁（２００７年））。
【００５５】
良好な動態及び安定性を示す細菌アルギニン加水分解酵素であるＡＤＩを、インビトロで試験した。残念なことに、ＡＤＩは細菌酵素であり、そのためほとんどの患者で強い免疫反応及び副作用を誘導し、定期的な投与を必要とするＡＲＧ１−Ｄ患者での長期投与には適していない。
【００５６】
ＡＲＧ１−Ｄ患者における臨床使用のためには、アルギナーゼが循環中において長時間（例えば、数日）持続できるように設計することが不可欠である。いかなる修飾も存在しない場合、ヒトアルギナーゼの循環中の半減期はわずか数分であるが、これは主に、その大きさが腎臓でのろ過を避けるほど大きくないためである。修飾されていないヒトアルギナーゼは、血清中で非常に不活性化されやすく、わずか４時間の半減期で分解される。
【００５７】
ＩＩ．アルギナーゼバリアントのＰＥＧ化
本発明のある態様では、ＰＥＧ化アルギナーゼに関連する方法及び組成物が開示される。具体的には、操作されたシステイン残基におけるアルギナーゼのＰＥＧ化（例えば、Ｎ末端の３番目の残基を置換）を用いて、均質なＰＥＧ化アルギナーゼ組成物を産生することができる。重合の一時的な中断に基づくＰＥＧ化アルギナーゼの単離方法もまた開示される。
【００５８】
ＰＥＧ化とは、ＰＥＧポリマー鎖を別の分子である、通常は薬物又は治療用タンパク質に共有結合するプロセスである。「ＰＥＧ化」は、ＰＥＧの反応性誘導体を標的高分子とインキュベーションすることによって達成することができる。薬物又は治療用タンパク質の流体力学的サイズ（溶液中でのサイズ）が増大し、腎クリアランスを低下させることによって循環時間が延長されること。ＰＥＧ化はまた、疎水性薬物及びタンパク質に水溶性を与えることもできる。
【００５９】
ＰＥＧ化における第１ステップは、タンパク質の一方若しくは両方の末端ドメインにおける、又はリジンなどのアミノ酸に対する内部での、ＰＥＧポリマーの好適な官能化であり得る。同じ反応性部分を有する各末端で活性化されるＰＥＧは「ホモ二官能性」として知られているが、存在する官能基が異なる場合、ＰＥＧ誘導体は「ヘテロ二官能性」又は「ヘテロ官能性」と称される。ＰＥＧポリマーの化学的に活性な又は活性化された誘導体は、ＰＥＧを所望の分子に結合させるために調製される。
【００６０】
ＰＥＧ誘導体のための好適な官能基の選択は、ＰＥＧにカップリングされるであろう分子上の利用可能な反応基のタイプに基づく。タンパク質について、典型的な反応性アミノ酸としては、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、及びチロシンが挙げられる。Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボン酸を使用して、ＰＥＧをポリペプチドに結合させることもまたできる。
【００６１】
ＰＥＧ誘導体を形成するために使用される技術は、ＰＥＧポリマーを、ヒドロキシル基、典型的には無水物、酸塩化物、クロロギ酸エステル、及び炭酸塩と反応する基と反応させることを含む。ＰＥＧ化の化学的性質はまた、共役に利用可能なアルデヒド、エステル、アミドなどの官能基を使用することができる。ヘテロ二官能性ＰＥＧは、親水性、柔軟性、及び生体適合性スペーサーが必要とされる２つの実体を連結するのに非常に有用である。ヘテロ二官能性ＰＥＧの好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸、及びＨ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルである。
【００６２】
最も一般的な修飾剤又はリンカーは、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）分子に基づく。これらの活性は、アルコール末端にタンパク質修飾基を付加することに依存している。ポリエチレングリコール（ＰＥＧジオール）を前駆体分子として用いることができる。その後、このジオールの両端が修飾されて、ヘテロ二量体又はホモ二量体のＰＥＧ結合分子が形成される（ＰＥＧビス−ビニルスルホンを用いた例に示す通り）。
【００６３】
タンパク質は一般に、プロトン化されていないチオール（システイニル残基）又はアミノ基のような、求核部位でＰＥＧ化される。システイニル特異的修飾試薬の例として、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヨード酢酸、ＰＥＧチオール、及びＰＥＧビニルスルホンが挙げられる。４つは全て、温和な条件下及び中性〜弱アルカリ性のｐＨ下において強いシステイニル特異性を示すが、それぞれいくつかの欠点がある。マレイミドで形成されたアミドは、アルカリ性条件下では幾分不安定であり得るため、このリンカーを用いた配合オプションにはいくつかの制限があり得る。ヨード−ＰＥＧで形成されるアミド結合はより安定であるが、遊離ヨウ素はいくつかの条件下においてチロシン残基を修飾できる。ＰＥＧチオールはタンパク質チオールとジスルフィド結合を形成するが、この結合もまた、アルカリ条件下で不安定であり得る。ＰＥＧ−ビニルスルホン反応性は、マレイミド及びヨード−ＰＥＧと比べて比較的遅い。しかしながら、形成されるチオエーテル結合は極めて安定である。反応速度が遅いとまた、ＰＥＧ−ビニルスルホン反応の制御も容易になる。
【００６４】
天然のシステイニル残基での部位特異的ＰＥＧ化は、これらの残基が通常ジスルフィド結合の形態であるか、又は生物活性に必要であるため、ほとんど行われない。一方で、部位特異的突然変異誘発法は、チオール特異的リンカーのシステイニルＰＥＧ化部位を取り込むために使用できる。システイン変異は、それがＰＥＧ化試薬に利用可能であり、かつＰＥＧ化後もなお生物学的に活性であるように設計されなければならない。
【００６５】
アミン特異的修飾剤には、ＰＥＧ−ＮＨＳエステル、ＰＥＧトレシレート、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧイソチオシアネート、及びいくつかの他のものが含まれる。これらのアミン特異的薬剤は、一般に温和な条件下で反応し、アミノ基に対して非常に特異的である。
【００６６】
ほとんどのタンパク質には複数のリシン残基があるため、部位特異的なＰＥＧ化は困難となり得る。幸いなことに、これらの試薬はプロトン化されていないアミノ基と反応するので、より低いｐＨで反応を行うことによって、より低いｐＫアミノ基にＰＥＧ化をさせることが可能である。一般に、α−アミノ基のｐＫは、リシン残基のε−アミノ基より１〜２ｐＨ単位低い。ｐＨ７以下で分子をＰＥＧ化することによって、Ｎ末端に対する高い選択性をしばしば達成することができる。しかしながら、これはタンパク質のＮ末端部分が生物活性に必要でない場合にのみ可能である。それでもなお、ＰＥＧ化による薬物動態学的利益はしばしば、インビトロ生物活性の有意な損失を上回るため、結果として、ＰＥＧ化の化学的性質に関わらず、はるかに大きなインビボ生物活性を有する生成物が得られる。
【００６７】
ＩＩＩ．タンパク質及びペプチド
ある実施形態では、本発明は、安定化アルギナーゼ多量体などの少なくとも１つのタンパク質又はペプチドを含む組成物に関する。これらのペプチドは、融合タンパク質中に含まれ得るか、又は作用剤に結合され得る。
【００６８】
Ａ．タンパク質及びペプチド
本明細書中で使用される場合、タンパク質又はペプチドとは、一般に、限定されるものではないが、遺伝子から翻訳された全長配列までの約２００を超えるアミノ酸のタンパク質、約１００以上のアミノ酸のポリペプチド、及び／又は約３〜約１００のアミノ酸のペプチドを指す。便宜上、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」は、本明細書中では交換可能に使用される。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、「アミノ酸残基」とは、あらゆる天然に存在するアミノ酸、あらゆるアミノ酸誘導体、又は当技術分野において公知のあらゆるアミノ酸模倣物を指す。タンパク質又はペプチドの例示的な残基は、アミノ酸残基の配列を中断するいかなる非アミノ酸も伴わず、連続したものである。他の例示的な配列は、１つ以上の非アミノ酸部分を含み得る。例えば、タンパク質又はペプチドの残基の配列は、１つ以上の非アミノ酸部分によって中断され得る。
【００７０】
したがって、用語「タンパク質又はペプチド」は、天然に存在するタンパク質において見出される２０個の一般的なアミノ酸の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を包含し、少なくとも１つの修飾されたアミノ酸又は異常なアミノ酸を含んでもよく、これには以下に示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
2021505620.tif 000003
【００７２】
ＩＶ．核酸及びベクター
目的のアルギナーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、安定化された多量体アルギナーゼであり得る。使用される発現系に応じて、核酸配列は、従来の方法に基づいて選択することができる。例えば、ヒトアルギナーゼＩ及びＩＩは、発現を妨害し得る大腸菌においてまれに利用される複数のコドンを含有する。したがって、それぞれの遺伝子又はそのバリアントは、例えば米国特許第８，４４０，１８４号に記載されているように、大腸菌発現のためにコドンを最適化することができる。融合多量体アルギナーゼ又はシステイン置換アルギナーゼのような種々のベクターを用いて、目的のタンパク質を発現させることもできる。例示的なベクターは、限定されるものではないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾン、ゴースト赤血球細胞、又はリポソームベースのベクターを含む。
【００７３】
Ｖ．宿主細胞
宿主細胞、好ましくは真核細胞を用いて、アルギナーゼ、及びその融合多量体の発現及び分泌を可能にするように形質転換することができる。宿主細胞は、バクテリア、哺乳動物細胞、酵母、又は糸状菌であり得る。種々のバクテリアには、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）が含まれる。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、又はピチア（Ｐｉｃｈｉａ）に属する酵母もまた、宿主細胞として用いることができる。糸状菌の種々の種は、以下の属を含む発現宿主として使用され得る。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、青カビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ワタカビ（Ａｃｈｌｙａ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、エンドチア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、コクリオボルス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、及び＞ピロクラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）。
【００７４】
使用可能なバクテリア宿主生物の例としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１、枯草菌ＢＲＢ１の誘導体、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＳＡＩ１２３、又はストレプトコッカス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）が挙げられる。宿主細胞として使用することができる例示的な酵母としては、例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）が挙げられ、例示的な糸状菌としては、例えば、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、及びトリコデルマ・リーゼイが挙げられる。
【００７５】
一般的に入手可能な哺乳動物宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）第ＣＣＬ６１号）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１、ＡＴＣＣ、第ＣＣＬ８２号）、ＨｅＬａＳ３細胞（ＡＴＣＣ、第ＣＣＬ２．２）、ラット肝癌細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ、ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１５４８号）、ＳＶ４０形質転換サル腎臓細胞（ＣＯＳ−１、ＡＴＣＣ、第ＣＲＬ１６５０号）、及びマウス胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３、ＡＴＣＣ、第ＣＲＬ１６５８号）が挙げられる。上記は、当技術分野で知られている多くの可能な宿主生物を例示するものであるが、限定するものではない。
【００７６】
アルギナーゼ及び／又はそれらの融合多量体を発現する哺乳動物宿主細胞は、典型的には親細胞株を培養するために使用される条件下であり得る。一般に、細胞は、生理学的塩及び栄養素を含有する標準的な哺乳動物細胞培地、例えば、標準的なロズウェルパーク記念研究所培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ、ＲＰＭＩ）、最小必須培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＭＥＭ）、改良最小必須培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＩＭＥＭ）、又はダルベッコ最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）中で培養され、典型的には、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）などの５〜１０％の血清が添加される。培養条件もまた標準的であり、例えば、タンパク質の所望のレベルが達成されるまで、培養物を定置又はローラー培養物中において３７℃でインキュベートする。
【００７７】
ＶＩ．タンパク質精製
目的のタンパク質又はポリペプチドは、特に明記しない限り、部分的又は完全な精製（又は、均一にするための精製）を達成するために、クロマトグラフィー技術及び電気泳動技術を用いて更に精製することができる。純粋なペプチドの調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、及び等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速液体クロマトグラフィー（ｆａｓｔ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＦＰＬＣ）、又は更には、高性能液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）である。
【００７８】
精製されたタンパク質又はペプチドとは、他の成分から単離可能な組成物を指すことを意図し、ここで、タンパク質又はペプチドは、その天然に入手可能な状態に対してあらゆる程度まで精製される。したがって、単離又は精製されたタンパク質又はペプチドはまた、それが天然に存在し得る環境から遊離したタンパク質又はペプチドも指す。一般的に、「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、種々の他の成分を除去するために分画に供され、その発現された生物活性を実質的に保持する、タンパク質又はペプチド組成物を指す。用語「実質的に精製された」が使用される場合、この呼称は、タンパク質又はペプチドが組成物の主要成分を形成する組成物、例えばタンパク質が組成物の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又はより多くを構成する組成物を指す。
【００７９】
例示的なタンパク質精製技術には、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、及び抗体などを使用する、又は熱変性を行った後、遠心分離、イオン交換、ゲルろ過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、及びアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーステップ、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、並びにこれらの技術と他の技術との組合せを行うことが含まれる。
【００８０】
ＶＩＩ．医薬組成物
本明細書に記載のアルギナーゼは、全身的又は局所的に投与することができる。アルギナーゼ及びそれらを含む組成物は、静脈内、クモ膜下、皮下、筋肉内、腫瘍内、及び／若しくは腹腔内、又はこれらの組合せで投与することができる。本明細書に記載される化合物及びそれらを含む組成物は、単独で、又はアルギニンスカベンジャ及び／若しくはアルギニン低減食と組み合わせて、投与することができる。
【００８１】
アルギナーゼ又はその一部を含有する組成物は、生理学的に許容可能な液体、ゲル又は固体の担体、希釈剤、及び賦形剤と共に配合物として提供することができる。このような組成物は、典型的には、液体溶液又は懸濁液として、注射剤として、調製される。好適な希釈剤及び賦形剤とは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、又はグリセロールなど、及びこれらの組合せである。更に、所望であれば、組成物は少量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、安定化剤又はｐＨ緩衝液を含有してもよい。臨床応用が企図される場合には、意図された応用に適切な形態で、医薬組成物（発現ベクター、ウイルスストック、タンパク質、抗体、及び薬物）を調製することが必要であり得る。一般に、本発明の医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体中に溶解又は分散された、有効量である１以上のアルギナーゼバリアント又は更なる薬剤を含む。
【００８２】
語句「医薬的又は薬理学的に許容可能な」とは、ヒトなどの対象に投与された場合に、必要に応じて、有害な、アレルギー性の、又は他の好ましくない反応を生じない分子類及び組成物を指す。本明細書に開示された方法によって単離された安定化多量体アルギナーゼ若しくはＰＥＧ化アルギナーゼなどの少なくとも１つのアルギナーゼバリアント、又は更なる有効成分を含有する医薬組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０年）によって例示されるように、本開示に照らして当業者に公知である。更に、動物（例えば、ヒト）への投与について、製剤は、ＦＤＡ生物学的基準事務局（ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）が要求する無菌性、発熱性、全般的安全性、及び純度の基準を満たすべきであることが理解される。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容可能な担体」には、当業者に知られている、あらゆる及び全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩類、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、染料、例えば材料及びそれらの組合せが含まれる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０年）を参照されたい）。いずれかの従来の担体が有効成分と不適合である場合を除き、医薬組成物におけるその使用が企図される。
【００８４】
アルギナーゼを含有する医薬組成物は、それを固体、液体、又はエアロゾル形態で投与されるべきかどうか、及び注射などの投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて、異なるタイプの担体を含むことができる。本発明は、静脈内、皮内、経皮、クモ膜下、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腫瘍内、局所、注射、注入、連続注入、カテーテルを介して、脂質組成物（例えば、リポソーム）中において、又は当業者に知られている他の方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）若しくは前述のあらゆる組合せによって投与することができる。
【００８５】
アルギナーゼバリアントは、遊離塩基、中性、又は塩の形態で配合して、組成物することができる。医薬的に許容可能な塩には、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成されるもの、又は無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸と形成されるもの、又は有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、若しくはマンデル酸などが含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩類を、無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、若しくは第二鉄の水酸化物、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、若しくはプロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。配合されると、液剤を、その投与配合物と適合する様式において、治療有効量で投与することができる。配合物は、注射剤のような非経口投与のための若しくは肺への送達用のエアロゾルための配合、又は消化管投与用の薬物放出カプセルなどの配合といった種々の投与形態で容易に投与される。
【００８６】
投与用の組成物は、不活性希釈剤を含むか又は含まない医薬的に許容可能な担体中において提供することができる。担体は吸収性でなければならず、液体、半固体、すなわちペースト、又は固体担体を含む。いずれか一般的な媒体、作用剤、希釈剤、又は担体が、レシピエントに対して、又はそれに含有される組成物の療法有効性に対して有害である場合を除いて、本発明の方法を実施する際に使用するための投与可能な組成物中におけるそれの使用は適切である。担体又は希釈剤の例には、脂肪、油、水、生理食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、及び増量剤など、又はその組合せが含まれる。組成物はまた、１以上の成分の酸化を遅らせるための種々の抗酸化剤を含むこともできる。更に、パラベン類（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、又はこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない、種々の抗細菌剤及び抗真菌剤の使用が、医薬組成物の寿命を改善し得る。
【００８７】
いずれか好都合かつ実用的な様式で、すなわち溶解、懸濁、乳化、混合、カプセル封入、及び吸収などにより、組成物を担体と混和することができる。そのような手順は当業者にとってルーティンである。
【００８８】
アルギナーゼバリアントを含む組成物に、医薬脂質ビヒクルを使用することができる。脂質ビヒクル組成物は、１以上の脂質及び水性溶媒を含むことができる。本明細書中で使用される場合、用語「脂質」とは、水に特徴的に不溶性であり、かつ有機溶媒で抽出可能である、広範囲の物質のいずれかを含むように定義される。例えば、長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体を含有する化合物が挙げられる。脂質には天然のもの又は合成のもの（すなわち、人間によって設計されるか又は生産される）があり得る。しかしながら、脂質は通常、生体物質である。生体脂質としては、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リソリピド、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテル結合脂肪酸及びエステル結合脂肪酸を有する脂質、重合性脂質、並びにそれらの組合せが挙げられる。もちろん、脂質として当業者に理解される本明細書で具体的に記載された化合物以外の化合物もまた、本発明の組成物及び方法に含まれる。
【００８９】
本明細書に記載されるアルギナーゼを含む組成物の患者への実際の投与量は、患者の体重、状態の重篤度、治療される疾患のタイプ、以前又は現在の治療介入、突発性疾患、及び投与経路などの物理的並びに生理学的要因によって決定することができる。投与量及び投与経路に応じて、好ましい用量及び／又は有効量の投与回数が、対象によって変化し得る。用量は、患者が、アルギニン、ＨＡｒｇ、ＡｒｇＡ、ＧＶＡ、ＧＡＡ、及びＮＡＡｒｇの少なくとも１つ以上の正常レベルを達成するために必要な量に応じる。これら５つの化合物のうちの１つ以上のＡＲＧ１−Ｄ患者レベルは、一般に、患者の血漿で正常範囲が得られるまで評価される。５つの化合物の組織レベルも評価することができるが、必ずしも必要ではないか、又は血漿レベル試験よりも低い頻度で実施することができる。
【００９０】
ＡＲＧ１−Ｄ患者について、初回投与は、患者１ｋｇ当たり０．００５〜１．００ｍｇ／ｋｇのアルギナーゼの用量、及び０．０２ｍｇ／ｋｇ又は０．０３５ｍｇ／ｋｇのような、０．００５〜１．００ｍｇ／ｋｇ／患者体重の範囲でのあらゆる０．００５量の、静脈内投与であり得る。例示的な静脈内投与量又はアルギナーゼは、毎日、毎週、隔月、又は毎月投与することができる。あるいは、アルギナーゼ組成物は、最初に、又は皮下のみで、又は静脈内投与若しくは皮下投与のあらゆる組合せで、投与することができる。皮下又は筋肉内投与は、０．０１〜１．５０ｍｇ／ｋｇ／患者体重のアルギナーゼの用量、及び０．０８ｍｇ／ｋｇのような、０．０１〜１．５０ｍｇ／ｋｇ／患者体重の範囲の０．０１量であり得る。皮下又は筋肉内投与は、毎日、毎週、隔月、又は毎月であってもよい。
【００９１】
医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態では、活性化合物は、例えば、単位の重量の約２％〜約７５％、又は約２５％〜約６０％、及びそこで誘導可能なあらゆる範囲を含んでもよい。当然ながら、各治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、化合物のあらゆる所与の単位用量において好適な用量が得られるように調製してもよい。溶解性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品の有効期間、及び他の薬理学的理由などの要因は、そのような医薬製剤を調製する当業者によって企図され、そのようなものとして、種々の投与量及び治療レジメンが望ましい場合がある。ペグジラルギナーゼの例示的な配合は、５ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び１．５％のグリセロール（ｗ／ｖ／）を含む緩衝液中で、ｐＨ７．４で配合される。
【００９２】
ＶＩＩＩ．治療方法
アルギナーゼタンパク質をＡＲＧ１−Ｄ患者に投与することに加えて、他の治療方法もまた企図される。例えば、患者は、野生型アルギナーゼを含むアデノウイルスベースの遺伝子送達ベクターといった遺伝子療法ベクターによって治療することができる。野生型タンパク質は、肝臓などの特定の臓器を対象とし得る。例えば、米国特許第８，３９８，９６８号に記載されているように、遺伝子療法によって患者へタンパク質を再導入するための種々のウイルス包装システムが作製されている。
【００９３】
ＡＲＧ１−Ｄ患者を治療する別の方法は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）システムを使用することであり、ここで、染色体上の欠陥遺伝子は、患者が正常量の野生型アルギナーゼを産生できるようにエラーを編集するように操作される。すでに述べたように、編集する必要のある異なる染色体上に位置している、２つのアルギナーゼ遺伝子が存在する。ＣＲＩＳＰＲゲノム編集は、例えば、米国特許出願公開第２０１７０２４０９２２号、同第２０１７０２８３８３０号、同第２０１７０２２４８４３号、及び同第２０１７０１９１０７８号に記載されている。
【００９４】
アルギナーゼを送達する別の方法は、患者に投与することができる、再封された赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ、ＲＢＣ）中にアルギナーゼタンパク質を封入することである。アルギナーゼの封入は、一般に、米国特許出願公開第２０１６００９５８８４号及び同第２０１４０１５４７９７号に記載されている通りに実施することができる。アルギナーゼを含有する赤血球を調製するための溶解／再封プロセスは、球状濃縮物を、ヘマトクリットレベルが６５％以上である等張液中に懸濁させ、１℃〜８℃で冷却することと、同じ球状濃縮物由来の赤血球の試料、好ましくは懸濁液の試料に基づく浸透圧脆弱性を測定することと、ヘマトクリットレベルが６５％以上である赤血球懸濁液及び１℃〜８℃で冷蔵された低張性溶解液を、透析カートリッジ内で循環させることを含む、同一チャンバ内で約１℃〜８℃に維持された温度における有効成分（すなわち、アルギナーゼ）の溶解及び内在化手順と、以前に測定された浸透圧脆弱性に従って調整される溶解パラメータと、高張液を用いて３０℃〜４０℃の温度で第２のチャンバに再封することと、を含む。
【実施例】
【００９５】
非盲検第１／２相試験では、ＡＲＧ１−Ｄと診断された１２人の成人及び小児患者（小児７名及び成人５名）が登録された。第１部では、患者は２週間の間隔で漸増用量のペグジラルギナーゼを受けた。第２部では、患者は８週の間、毎週間隔でペグジラルギナーゼ（ＡＥＢ１１０２）を静脈内（ＩＶ）に投与された。
【００９６】
安全性、薬物動態、薬力学（血漿アルギニン及びＧＣ例えば、ＧＶＡ、ＡｒｇＡ、ＮＡＡ、ＧＡＡ））、及び標準化臨床測定（例えば｝、６分間歩行試験（６−ｍｉｎｕｔｅ  ｗａｌｋ  ｔｅｓｔ、６ＭＷＴ）、バーグ・バランス・スケール（Ｂｅｒｇ  Ｂａｌａｎｃｅ  Ｓｃａｌｅ、ＢＢＳ）、粗大運動能力尺度６６項目（Ｇｒｏｓｓ  Ｍｏｔｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｍｅａｓｕｒｅ  ６６  ｉｔｅｍ、ＧＭＦＭ−６６）、及びＰＲＯＭＩＳ）に対する評価を行った。ＧＭＦＭ−６６は、パートＡ〜パートＥまでの粗大運動能力の様々な側面を評価するツールである。グアニジノ化合物（ＧＣ）をペグジラルギナーゼ投与前と投与後との両方で分析して、患者に対するペグジラルギナーゼの治療効果を評価した。患者から分析のために選んだＧＣには、血漿中における、α−ケト−δ−グアニジノ吉草酸（ＧＶＡ）、アルギニン酸（ＡｒｇＡ）、ホモアルギニン、Ｎ−α−アセチルアルギニン（ＮＡＡｒｇ）、及びＧＡＡが含まれていた。
【００９７】
方法。患者由来のＫ２ＥＤＴＡ血漿からのＧＣ（ＧＡＡ、ＧＶＡ、ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ）を定量するための生化学分析法を開発した。患者由来の血漿タンパク質を１０％のトリクロロ酢酸溶液で沈殿させ、Ｉｍｔａｋｔ  Ｉｎｔｒａｄａ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄの５０×２ｍｍ（商品番号ＷＡＡ２２）カラムを使用して島津Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）で分離した。分析物は、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ５５００（商標）を用いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより検出した。各ＧＣの同位体標識標準を用いて、各血漿試料の定量を可能にした。詳細な方法プロトコルを、この例の最後に示す。
【００９８】
成人女性患者２例の試験結果
２４歳及び２５歳の２人の成人女性患者を、８週間、週１回のペグジラルギナーゼＩＶで治療した。両患者は、痙縮を含む中等度〜重度の神経認知及び神経運動障害を有する。両患者には、ペグジラルギナーゼ投与期間中、プレペグジラルギナーゼ治療標準が続いた。０．０４ｍｇ／ｋｇのペグジラルギナーゼの週１回静脈内（ＩＶ）投与は、良好な耐容性を示した。血漿アルギニンの予想された低下（図１）に加えて、分析したＧＣ（例えば、ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、ＧＶＡ）の濃度の経時的な低下がペグジラルギナーゼ治療後に観察された。ＡｒｇＡ、ＮＡＡｒｇ、及びＧＶＡ血漿レベルの低下は最初の注入から２４時間以内に生じ、各患者が受けた８週間の投与を通してベースラインレベル以下に維持された。
【００９９】
第１相試験（ペグジラルギナーゼ−１０１Ａ）の単一漸増用量部分におけるアルギニン／オルニチン試料分析に最初に使用した両患者由来の血漿試料を、ＧＣ法開発中のアッセイ範囲の設定を支援するためにプールした。次いで、これらのプールされた試料を用いて、方法開発段階が完了した後に、ＧＣを定量した。両患者に、０．０１５ｍｇ／ｋｇ及び０．０３ｍｇ／ｋｇ／患者体重のペグジラルギナーゼを単回投与し、投与期間中に２週間観察した。
【０１００】
以前に報告した非ＧＬＰアッセイ（この例の最後に示した詳細な方法）でこれらのプールした患者試料を用いて、０．０３ｍｇ／ｋｇのペグジラルギナーゼで治療したＡＲＧ１−Ｄ患者由来のＡｒｇＡ（およそ３倍）、ＧＶＡ（およそ４倍）、及びＮＡＡｒｇ（およそ２倍）濃度の経時的低下を観察した。ＧＣレベルの低下は、ＧＬＰアッセイを用いて測定した血漿アルギニンの低下と並行していた（図１Ａ〜図１Ｄ）。
【０１０１】
図３Ａ〜図３Ｄに反映されるように、２人の患者（すなわち、第１２０−１０１号及び第１２０−１０２号）に、０．０１５ｍｇ／ｋｇ／患者体重又は０．０３ｍｇ／ｋｇ／患者体重でペグジラルギナーゼを投与し、血漿中のアルギニン及びグアニジノ化合物レベルを以下のように測定した。
【０１０２】
［表２］２例の患者における０．０１５ｍｇ／ｋｇ／患者の用量のＧＣレベル。
2021505620.tif 000004
＊対象２例の平均、＊＊対象２例由来のプールした試料。表２及び表３に値が記載されていない場合、患者はその時点では検査を受けておらず、理由としては、検査が高価であり、かつ一般的に、血中レベルが急速に変化するとは考えられていなかったからである。
【０１０３】
［表３］２例の患者における０．０３ｍｇ／ｋｇ／患者体重の用量のＧＣレベル。
2021505620.tif 000005
＊対象２例の平均、＊＊対象２例由来のプールした試料。
【０１０４】
［表４］用量及び濃度の試験は以下の通りであった。
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【０１０５】
［表５］ＰＫ濃度（試験の用量漸増部分で利用できる濃度データ）。患者２名のＰＫデータは以下の通りである。
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【０１０６】
［表６］単回ＩＶ注入後の高アルギニン血症患者における、ペグジラルギナーゼの個人及び平均ＰＫパラメータ（用量漸増のみのデータ）。
2021505620.tif 000014
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【０１０７】
データ。血漿アルギニンと、ＡｒｇＡ、ＧＶＡ、及びＮＡＡｒｇ濃度との間で観察された関係は、一般に、Ｍａｒｅｓｃａｕら（１９９０年）により発表されたデータと一致しており、ここではタンパク質制限食を与えられた患者が分析された。Ｍａｒｅｓｃａｕら（１９９０年）の研究では、ＧＣレベルはアルギニンレベルの低下と同時に低下した。
【０１０８】
本明細書に示したデータについて、分析したＡｒｇＡ、ＧＶＡ、及びＮＡＡｒｇレベルだけでなく、ホモアルギニン（ＨＡｒｇ）レベルも示した。ＨＡｒｇがＭａｒｅｓｃａｕら（１９９０年）の研究におけるＡＲＧ１−Ｄ患者の血清で有意に上昇したため、ＨＡｒｇレベルを調べた。ペグジラルギナーゼで治療したＡＲＧ１−Ｄ患者では、ＨＡｒｇレベルは調節されないようであった（図２）。この結果は、タンパク質制限食で維持されている患者において血清ＨＡｒｇレベルが低下しないという、Ｍａｒｅｓｃａｕら（１９９０年）により報告されたデータと一致する。患者の治療によって評価できる更なる条件は、筋力、患者の歩行能力（すなわち、走る、歩く、自転車に乗る、支えなしで階段を上る能力）を改善し、認知能力（例えば、ＷＩＳＣ検査の改善）、又は適応行動（例えば、ＡＢＡＳ若しくはＶＡＢＳ検査）の改善）の改善である。
【０１０９】
ＧＣデータはまた、低用量のペグジラルギナーゼ０．０１５ｍｇ／ｋｇ／患者体重で治療した、２人の成人患者から得たプール血漿試料からも生成した。血漿アルギニン濃度の低下が、ペグジラルギナーゼの低用量投与で観察された。しかしながら、この低下は、０．０３ｍｇ／ｋｇ用量で観察された血漿アルギニンの低下ほど顕著ではなかった。
【０１１０】
上記のこれら２人の患者の所見を考慮すると、ペグジラルギナーゼ０．０４ｍｇ／ｋｇの用量を辛抱強く週１回で患者に静脈内投与した場合、成人ＡＲＧ１−Ｄ患者では耐用性が良好であったと結論した。患者は、アルギニンレベル低下と平行したＧＣの著しい低下を示した。アルギニンレベル及びＧＣレベルに対する効果はこれら２人の成人患者に基づき、厳密な食事アルギニン制限によって歴史的に達成された効果よりも化学的に重要であると考えられる。研究において１人のＡＲＧ１−Ｄ患者が０．２ｍｇ／ｋｇの投与に成功した。固形腫瘍最大耐量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ｄｏｓｅ、ＭＴＤ）を、０．３３ｍｇ／ｋｇ〜最大０．４８ｍｇ／ｋｇまでの用量で確立した。
【０１１１】
もちろん、アルギニンレベルが高い（例えば、６００〜８００μＭのアルギニン）患者は、０．５０ｍｇ／ｋｇより高い用量のペグジラルギナーゼで治療してもよい。アルギニンレベルが高い患者は、０．００５〜１．００ｍｇ／ｋｇ対象体重の範囲でのアルギナーゼ投与を必要とし得る。０．００５ｍｇ／ｋｇ〜０．５０ｍｇ／ｋｇ対象体重の投与範囲、及び／又は０．００５ｍｇ／ｋｇ〜０．２０ｍｇ／ｋｇ対象体重の投与範囲もまた企図される。
【０１１２】
薬物の生物学的利用能は、ＩＶ及び／又は皮下注射から指定された期間にわたって血液中の薬物量を測定することによって、測定できる。計算のため、静脈内投与された薬物の１００％が血流に入ると仮定されるが、皮下投与された薬物の全てが皮下空間から血液に入るわけではない。生物学的利用能は、皮下総容量をＩＶ総容量で除すことで決定できる。皮下投与されたペグジラルギナーゼの生物学的利用能はカニクイザルにおける静脈内投与と皮下投与との比較に基づいて、ＩＶ投与のおよそ６０％と決定された。したがって、アルギニンのレベルが高い患者は、１．５ｍｇ／ｋｇものアルギナーゼで上手く治療することができる。生物学的利用能データに基づいて、ペグジラルギナーゼの皮下投与のための投与範囲は、例えば、０．０１〜約１．５ｍｇ／ｋｇ対象体重であってもよく、０．０１５ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ対象体重及び／又は０．０１５ｍｇ／ｋｇ〜約０．３０ｍｇ／ｋｇ対象体重が使用される。
【０１１３】
図４Ａ及び図４Ｂは、ペグジラルギナーゼによる治療前（例えば、スクリーニング時）及び治療後の、２人の患者である患者第１２０−１０１号（図４Ａ）及び患者１２０−１０２号（図４Ｂ）におけるＧＡＡのデータを示す。いずれの場合でも、スクリーニング時と、第１部及び第２部の投与中と、におけるＧＡＡレベルに関するデータを示す。両患者において、ＧＡＡは０．０１５ｍｇ／ｋｇ／対象体重の投与後に低下し、より高い用量でより大きな効果が観察された。特に、ＧＡＡの急速な低下がペグジラルギナーゼの投与直後に観察された。更に、初期治療によって、投与後２４時間以内に両患者はＧＡＡの血漿レベルの正常範囲になった。例えば、図４Ｂにおいて、１４日目の患者のＧＡＡレベルは４，３５０ｎＭであり、これはアルギナーゼの投与後２４時間以内に１，３５０ｎＭという低いレベルまで低下する。したがって、アルギナーゼによる治療は、ＧＡＡ又はＧＶＡのような有毒代謝物を迅速に除去することができ、急性治療として有用である。ペグジラルギナーゼは、アルギニン低減食のみよりもはるかに速い速度で、示された有毒代謝物を除去する。
【０１１４】
患者特性及び安全性
第１／２相試験の患者に対してベースライン評価を行った。以下の表に示すベースライン評価では、この試験の患者にかなりの疾患負荷が認められた。患者はタンパク質制限食を摂取していた。
【０１１５】
バーグバランスでは、欠損バランスは転倒リスクが中等度又は高度（スコア≦４０）と定義される。６ＭＷＴでは、欠損は、Ｇｅｉｇｅｒら、「Ｓｉｘ−ｍｉｎｕｔｅ  ｗａｌｋ  ｔｅｓｔ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｎｄ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ」、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．、２００７年４月、第１５０巻、第４号、第３９５〜３９９頁、及びＥｎｒｉｇｈｔら、「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｅｑｕａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｉｘ−ｍｉｎｕｔｅ  ｗａｌｋ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９８年１１月、第１５８巻、第５号パート１）第１３８４〜１３８７頁に記載の健常者の年齢調整範囲以下と定義される。ＧＭＦＭパートＥでは、欠損は、Ｏｅｆｆｉｎｇｅｒら、「Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｔｏｏｌｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｐａｌｓｙ：ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ」、Ｄｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｉｌｄ  Ｎｅｕｒｏｌ、２００８年、第５０巻、第１２号、第９１８〜９２５頁に記載の臨床上意味のある最小変化量（ＭＣＩＤ）に基づき６８未満と定義される。複数のベースライン臨床検査評価が利用可能である場合、投与直前の評価が報告される。ＰＲＯＭＩＳの場合、欠損ベースラインはＴスコア４０未満として定義される。
【０１１６】
［表７］第１／２相試験の患者に対してベースライン評価を行った。
2021505620.tif 000016
【０１１７】
主な治療関連有害事象（ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔｓ、ＡＥ）は、以下の表に示す通り軽度であった。治療関連ＡＥが２人以上の患者で認められたのは、過敏症（ｎ＝３、全て中程度）、そう痒症（ｎ＝３、全て軽度）、及び皮膚乾燥（ｎ＝２、どちらも軽度）であった。合計すると、１３０回以上の注入が試験における全患者で行われた。３人の患者（重篤な有害事象（ｓｅｒｉｏｕｓ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔ、ＳＡＥ）と考えられる患者２名）で、４種類の中等度の過敏反応を観察した。これらのＡＥは、注入速度の調整及び抗ヒスタミン薬の投与、並びに一部の症例ではコルチコステロイドにより管理した。高アンモニア血症の１つのＳＡＥは、ペグジラルギナーゼによる治療に関連しないと評価された。
【０１１８】
［表８］有害事象
2021505620.tif 000017
【０１１９】
ペグジラルギナーゼＡＤＡ効果を試験した。Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ電気化学発光法を用いたブリッジングアッセイを、ラット、サル、及びヒト血清中のＡＥＢ１１０２（Ｃｏ‐Ａｒｇ１‐ＰＥＧ）に対する抗体を検出するために検証した。この方法は、抗体を検出するために、ビオチニル化ＡＥＢ１１０２（Ｂ−ＡＥＢ１１０２又はＢ−Ｃｏ−ＡｒｇＩ−ＰＥＧ）を使用して、ＡＤＡ及びルテニウム標識ＡＥＢ１１０２（Ｒｕ−ＡＥＢ１１０２又はＲｕ−Ｃｏ−ＡｒｇＩ−ＰＥＧ）を捕捉した。
【０１２０】
検証中に、Ｂ−Ｃｏ−ＡｒｇＩ−ＰＥＧ及びＲｕ−Ｃｏ−ＡｒｇＩ−ＰＥＧのマスターミックス（Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＭＭ）を、１．０μｇ／ｍＬのＢ−ＡＥＢ１１０２及び１．０μｇ／ｍＬのＲｕ−ＡＥＢ１１０２の最終濃度までアッセイ緩衝液中に調製した。希釈した試料及び対照を、ストレプトアビジンでコートしたプレートのウェル中のマスターミックスに加えた。インキュベーション及び洗浄の後、１５０μＬの２Ｘ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ製）を各ウェルに加えた。試料をＳｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ６０００で読み取った。この方法を、スクリーニング、力価測定、及び確認に使用した。確認アッセイを１５０μｇ／ｍＬのＡＥＢ１１０２（薬物）でプレインキュベートしたことに留意されたい。高、中、低濃度の陽性対照及び陰性対照を各試験に含めた。カットポイント、スクリーニング、及び確認を統計的に割り当て、それぞれおよそ５％及び１％の偽陽性率を得た。陽性対照は、抗Ｃｏ−ＡｒｇＩ−ＰＥＧアフィニティー精製ポリクローナル抗体であり、陰性対照（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＮＣ）は、プールされた正常ラット、カニクイザル、又はヒト血清を等分した。陽性対照及び非特異的結合（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ、ＮＳＢ）対照を、アッセイ成績をモニターするために使用した。
【０１２１】
ＰＥＧに対する抗体を検出するために直接結合アッセイを検証して、ＡＥＢ１１０２の投与後に、すでに存在するか又は治療により発現する可能性のある抗ＰＥＧ抗体の検出を可能にした。
【０１２２】
Ｓｔａｒｗｅｌｌ  Ｃ８  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（９６穴フォーマットプレート）のウェルを、炭酸塩コーティング緩衝液（ＢｉｏＷｏｒｌｄ）中において、１００μＬの２μｇ／ｍＬモノＰＥＧ化ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）（ＢＳＡ−ｍＰＥＧ）５ｋＤａ（Ｌｉｆｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、又は５００ｎｇ／ｍＬヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、若しくは５００ｎｇ／ｍＬヒトＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でコーティングした。希釈緩衝液で５０倍の最小希釈倍率（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ、ＭＲＤ）に希釈した対照及び試料を、二重にプレートへ加えた（１００μＬ／ウェル）。希釈緩衝液は、１倍リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中４％のウシγ−グロブリンを含む。１００μＬの検出抗体を適切なウェルに添加した。１：５，０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてマウス抗ＰＥＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を検出し、希釈緩衝液で１：３０，０００に希釈し、適切なウェルに添加したウサギ抗ヒトＩｇＧ／Ａ／Ｍ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、抗ヒト抗体を検出した。続いて、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＴＭＢ）基質を１ウェル当たり１００μＬ添加した後、ウェル当たり１００μＬの停止液を添加して、およそ１０〜２０分後に反応を停止した。プレートを、Ｓｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダーで４５０（検出）及び６２０（バックグラウンド）にて読み取った。カットポイント、スクリーニング、及び確認を統計的に割り当て、それぞれおよそ５及び１％の偽陽性率を得た。この方法を、スクリーニング、力価測定、及び確認に用いた。力価測定される試料は、陰性プールヒト血清中で少なくとも７回の２倍系列希釈に供した。
【０１２３】
一過性の低力価抗ＰＥＧ  ＡＤＡ（抗薬物抗体）が患者試験の第１部で検出された（以下の表を参照されたい）。反復投与開始時、６／７の患者では検出可能なＡＤＡはなかった。ペグジラルギナーゼへの耐用性は、以下の表９に示すように、予想外に迅速であった。
【０１２４】
［表９］ペグジラルギナーゼ及びＰＥＧについてのＡＤＡ評価。
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【０１２５】
＊治療前に抗ＰＥＧ  ＡＤＡを有する患者１人は、第１部の間に力価が低下し、最後の第１部用量ではＡＤＡが検出できなかった。しかしながら、この患者は、試験とは無関係な理由から、試験の第２部は継続しなかった。この患者はｎ＝７には含まれない。
【０１２６】
図５Ａ及び図５Ｂは、アルギニン及びＧＣの効果を示す。ＧＡＡはＡＲＧ１−Ｄ患者で上昇していた。これらの患者のＧＡＡレベルはペグジラルギナーゼによる治療で低下した。図５Ｂに示す反復投与量グラフは、第２部で８回全て投与された患者を含む。ＧＣの正常上限（ｕｐｐｅｒ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ、ＵＬＮ）は、健常成人におけるＧＣの研究に基づいている。ペグジラルギナーゼは、単回投与及び反復投与においてアルギニンレベルを正常範囲まで低下させるのに、非常に効果的である（図５Ｂ）。ＡＲＧ１−Ｄ患者で上昇するＧＡＡは、ペグジラルギナーゼによる治療でも低下する。ＧＶＡ、ＡｒｇＡ、ＧＡＡ、及びＮＡＡの濃度の経時的低下が、ペグジラルギナーゼによるＩＶ  ＱＷ（毎週）治療後に観察された。ＧＶＡ、ＡｒｇＡ、ＧＡＡ、及びＮＡＡレベルの低下は、最初の注入から２４時間以内に生じ、ベースラインレベルからの低下は、投与の８週中維持した。血清ペグジラルギナーゼレベルは、投与１及び投与８周辺の複数の時点で測定した。
【０１２７】
図６は、３人の患者に対する６分間歩行試験の結果を表す（投与２０及び投与３２では患者５（「ｃ」）のデータが得られず）。神経運動の結果を以下の表に示す。投与８、２０、及び３２は、反復投与（２回目の投与）の開始時より測定する。ＰＲＯＭＩＳは、特に、ＰＲＯＭＩＳの身体機能ドメインである。以下の表に示す６ＭＷＴ（６分間歩行試験）、ＢＢＳ（バーグ・バランス・スケール）、ＧＭＦＭパートＥ、及びＰＲＯＭＩＳのデータは、ベースラインの生データ、及び他の時点でのベースラインからの変化として示されている。６ＭＷＴについて、ＭＣＩＤは、Ｓｃｈｒｏｖｅｒら、「Ｍｉｎｉｍａｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ６−ｍｉｎ  ｗａｌｋ  ｔｅｓｔ：ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｒｑｕｉｏ  Ａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、Ｏｒｐｈａｎｅｔ．Ｊ．Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ．２０１７年４月２６日、第１２巻、第１号、第７８頁の分析から定義され、ＢＢＳの場合、ＭＣＩＤは、Ｄｏｗｎｓら、「Ｔｈｅ  Ｂｅｒｇ  Ｂａｌａｎｃｅ  Ｓｃａｌｅ」Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｔｈｅｒ．」、２０１５年１月、第６１巻、第１号、第４６頁の分析から定義され、ＧＭＦＭの場合、ＭＣＩＤは、Ｏｅｆｆｉｎｇｅｒら（２００８年）の分析から定義され、そしてＰＲＯＭＩＳの場合、ＭＣＩＤは、０．５標準偏差又はＴスコア５点を持つ身体機能に基づいている。以下の表及び図６は、ペグジラルギナーゼ投与後の患者の神経運動機能の改善を示す。神経運動機能は、筋肉又は神経機能を指す場合があり、例えばＰＲＯＭＩＳ、６ＭＷＴ、ＢＢＳ、及びＧＭＦＭを用いて、患者において臨床的に評価することができる。神経運動機能の例としては、限定されるものではないが、登山ステップ、歩行、痙縮、及び覚醒が挙げられる。例えば、罹患した患者は、正常な歩行（かかとから爪先）ではなく爪先立ちで歩くことがある。神経運動機能の改善とは、そのような患者の歩行能力の向上、又は爪先立ちではなく普通に歩くことを意味する場合がある。神経運動機能の改善とは、歩行補助具（例えば、「歩行器」又は杖）の使用をもはや必要としない、又は歩行補助具の使用をより少なくするといった、可動性を高めることであり得る。神経運動機能の改善は、姿勢の改善、及び／又はコミュニケーション／社会化の改善を意味し得る。
【０１２８】
［表１０］神経運動機能評価
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【０１２９】
ＧＡＡは、ＧＡＭＴ（グアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼ）欠損患者における脳卒中と関連している（Ｓｔｏｃｋｌｅｒ−Ｉｐｓｉｒｏｇｌｕら、「Ｇｕａｎｉｄｉｎｏａｃｅｔａｔｅ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＡＭＴ）ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ４８  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ」、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、Ｍｅｔａｂ．、２０１４年、第１１１巻、第１号、第１６〜２５頁）。結果は、ペグジラルギナーゼによる治療が患者のＧＡＡレベルを低下させ、かつ血漿アルギニン及び関連したＧＣを低下させることを示す。ＧＡＡのような１つ以上のグアニジノ化合物のレベル（例えば、図５Ｂを参照されたい）は、アルギナーゼの投与後２４〜４８時間以内に低下又は除去される。したがって、アルギナーゼは、患者における有毒代謝物を減少又は除去するための急性治療として有用である。臨床的改善は、８週後のペグジラルギナーゼの反復投与で観察された。ペグジラルギナーゼは、一般に、患者の耐用性が良好であった。ほとんどの関連ＡＥは軽度であり、標準的測定で管理可能であった。
【０１３０】
ペグジラルギナーゼによる治療は、予想外に、ＡＲＧ１−Ｄ患者における高アルギニン血症の症状を迅速に低下させた。これらの改善は生化学的レベルで明らかになった。１つ以上のアルギニン及びグアニジノ化合物の血漿レベルは、アルギナーゼの初回投与及び／又は反復投与に基づいて、正常レベルまで低下させることができる。更に、アルギナーゼの投与は、ＡＲＧ１−Ｄ患者の適応行動及び／又は神経運動機能を改善した。試験に参加した全患者は、試験期間中に高アルギニン血症の標準的又は従来的治療を受けていた。このような標準的又は従来的治療には、アルギニンレベルを上昇させ得るタンパク質の摂取を制限する食事制限、及び窒素スカベンジャ薬物の使用が含まれる。これらの標準治療にもかかわらず、全ての患者が依然として高アルギニンレベルを示した。アルギナーゼによる治療は、１つ以上のアルギニン及び他のグアニジノ化合物の血漿レベルを迅速かつ持続的に低下させる。アルギナーゼ治療の効果（例えば、ペグジルアルギナーゼ）は予想外に速く、投与後２４〜４８時間以内に生じた。対照的に、高アルギニン血症に対する標準的又は従来的治療では、２年の間いかなる改善も見られないことがある（Ｍａｒｅｓｃａｕら（１９９０年）、Ｍａｒｅｓｃａｕら、「Ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｕｒｅｍｉａ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｕｒｅａ  ａｎｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｏｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ」、１９９２年、第４１巻、第９号、第１０２１〜１０２４頁）。更に、ペグジラルギナーゼで治療された患者は、アルギニンの低下によって、より自由な食事を取ることができるため、より多くのタンパク質を得ることができた。
【０１３１】
アルギニン欠損剤による血漿アルギニン低下後のＡＲＧ１−Ｄ関連疾患症状の改善を示す第２相臨床データ
第１部及び第２部では、上記の非盲検第１／２相試験を継続し、非盲検延長試験を続行した。図７に示すように、第１／２相では、第１部で１６人の患者が、前述のようにペグジラルギナーゼの単回漸増用量を、４〜１０週の間、隔週で静脈内投与された。第２部では、前述したように、ペグジラルギナーゼの反復投与（毎週８投与）を１０週間静脈内投与した。第２部を開始した患者は９人、反復投与を完了した患者は６人であった。非盲検延長試験では、患者３人にペグジラルギナーゼの静脈内投与を開始した。
【０１３２】
以下の表は患者の特徴を示し、試験における患者の疾患負荷、及び非盲検の延長を示す。血漿アルギニン中央値は、各患者の初回投与前の全血漿アルギニン値の平均を計算し、これらの値の中央値を決定することに基づいた。この表は、１６人の患者全員がベースライン時の血漿アルギニンレベルが上昇していたことを示す。患者１０人中７人は、可動性及び適応行動の両方で欠損を示した。血漿アルギニン中央値は、各患者の初回投与前の全血漿アルギニン値の平均に基づいた。他の生化学的パラメータについては、投与直前の評価を用いた。臨床検査評価では、異常値は基準範囲外であると定義される。身長百分位では、欠損はＣＤＣにより提供された正常値の１０％以下と定義された。６ＭＷＴでは、前述のように、バーグバランス、ＧＭＦＭパートＥ、及びＰＲＯＭＩＳが適用される。適応行動評価システム第３版（ＡＢＡＳ）では実践的、社会的、概念的、又は複合的に、欠損を８５未満の標準スコアと定義した。６ＭＷＴについて、ＭＣＩＤは（図９を参照されたい）、ベースラインから９％の変化と定義し、ＧＭＦＭパートＥの場合、個々の患者の粗大運動能力分類システムレベルに応じて１．８〜４．０点の変化として定義し、ＢＢＳの場合、７点の変化として定義し、ＡＢＡＳの場合、７．５点の全般適応合成（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ、ＧＡＣ）標準スコアの変化として定義し、そしてＰＲＯＭＩＳの場合、５点の変化として定義した。
【０１３３】
［表１１］第１／２相試験の患者に対してベースライン評価を行った。
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【０１３４】
図８は、第２部及び非盲検延長試験の患者に対する、反復投与による血漿アルギニンの時間依存性改善を示す。ＢＬとはベースラインであり、Ｆ／Ｕとは経過観察であり、ｎとは各時点での患者数である。全患者のアルギニンレベルの中央値は各時点について示される。Ｈａｅｂｅｒｌｅら、「Ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｕｒｅａ  ｃｙｃｌｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、Ｏｒｐｈａｎｅｔ．Ｊ．Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ．、２０１２年、第７巻、第３２頁に記載されている治療ガイドラインによると、血漿アルギニンレベルは、２００μｍｏｌ／Ｌ以下に維持することが望ましい。図８は、第２部を完了した患者の１００％（６／６）が、推奨ガイドライン以下である一貫したアルギニン低下レベルを達成していたことを示す。アルギニン低下の血漿レベルにおける低下は、ＧＣ（ＧＶＡ、ＡｒｇＡ、ＮＡＡ、ＧＡＡ）の血漿レベルの著しくかつ持続した低下を伴った。
【０１３５】
ペグジラルギナーゼによる治療はまた、図９に図示される通り、８回の反復投与後にベースラインから臨床転帰を改善した。図９の各点は、１人の患者に対する１つの評価を表す。好ましい評価は黒丸「●」で示し、中立の評価は白丸「○」で示す。６７％（４／６）の患者は、ペグジラルギナーゼの反復投与のわずか８週間後に、可動性及び／又は適応行動の試験でＭＣＩＤ以上の改善を示した。これらの検査の基準については、６ＭＷＴ、バーグ・バランス・スケール、ＧＭＦＭパートＥ、ＰＲＯＭＩＳ、及びＡＢＡＳですでに述べた。評価の３３％は好ましくＭＣＩＤを越えたが、ＭＣＩＤを越えた好ましくない評価はなかった。ＡＢＡＳ評価の１／３は好ましくＭＣＩＤを超え、２／３は８週目で改善傾向であった。
【０１３６】
［表１２］評価者による試験での一部の患者の観察を要約する。
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【０１３７】
ペグジラルギナーゼ投与は、一般的に、もしある場合は、軽度のＡＥを生じた。ペグジラルギナーゼの１８０回の注入を全患者に行った。低力価の治療により発現するＡＤＡは、第１部の６／１６の患者で検出された。第２部の全患者が、５回目の投与までにＡＤＡレベルを検出できなかった。治療関連ＡＥが少なくとも中等度の重症度の２人以上の患者には過敏症が含まれていたが（患者３人中４事象、研究者は３人を重篤有害事象（ＳＡＥ）と考えた）、これは注入速度の調節及び抗ヒスタミン薬の投与といった薬物投与、並びに一部の症例ではコルチコステロイドによって管理された。
【０１３８】
図１０は、第２部に参加した患者に対して行われた臨床反応による、平均アルギニン値の分析を示す。患者の平均アルギニンレベルは、神経運動又は適応行動評価で１を超えるＭＣＩＤ改善の臨床応答を示した患者（ｎ＝４）に対して、神経運動又は適応行動評価で１未満のＭＣＩＤを改善した患者（ｎ＝２）より低いことを見出した。
【０１３９】
結論として、この疾患の進行性の性質は、重度の食事タンパク質制限を利用した標準化疾患管理アプローチ及び疾患症状のみに対処するためのアンモニアスカベンジャの使用にも関わらず、現在の標準的な疾患管理で達成可能なレベルを超えてアルギニン量を低下させ、したがってＡＲＧ１−Ｄ患者で観察される神経運動、神経認知、及び／又は適応行動の悪化の進行を遅らせる又は停止する可能性を提供する、薬理学的治療方法に対する重要で満たされていない医学ニーズを強調する。人工ヒトアルギナーゼ１であるペグジラルギナーゼは、一部の患者において神経運動機能及び／又は適応行動の改善を伴う、ＡＲＧ１−Ｄ患者における血漿アルギニン及び関連ＧＣレベルの顕著かつ持続的な低下の直接的証拠をもたらした。
【０１４０】
前述の試験の第１／２相試験で観察されたＡＲＧ１−Ｄ患者に対するペグジラルギナーゼ投与による改善は、非盲検延長試験において持続した。ペグジラルギナーゼは、上昇した血漿アルギニンを持続的に低下させるのに非常に効果的であり、これはＡＲＧ１−Ｄ症状の病理の基礎にあると考えられている。血漿アルギニンの低下は、反復投与のわずか８週間後に可動性及び適応行動の改善を伴った。ペグジラルギナーゼは、患者の耐用性が良好であった。ほとんどの治療関連ＡＥは軽度であった。過敏反応は標準的な方法で管理でき、全ての患者は試験治療を継続した。ＡＲＧ１−Ｄ患者の包括的ベースラインプロファイリングは、９４％（１５／１６）の患者で可動性及び／又は適応行動における定量可能な欠損を示した。
【０１４１】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＫ２ＥＤＴＡヒト血漿中における、α−Ｋ−δ−ＧＶＡ、（Ｒ，Ｓ）−ＡｒｇＡ、ホモアルギニンＨＣｌ、及びＮαアセチル−Ｌ−アルギニンの分析法。
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【０１４２】
使用される市販試薬は以下の通りである：
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【０１４３】
処置ヒト血漿［ＴＨＰ］．２０．０ｍＬのＫ２ＥＤＴＡヒト血漿に、０．０５９ｍＬのＡＥＢ１１０２を加える。ポリプロピレンバイアル（ＰＰＶ）に入れ、およそ−７０℃で保存する。呼気は使用した血漿のものである。
【０１４４】
処置ヒト脂肪血症血漿［ＴＬＰ］．２０．０ｍＬのＫ２ＥＤＴＡ脂肪血症ヒト血漿に、０．０５９ｍＬのペグジラルギナーゼを加える。ＰＰＶに入れ、およそ−７０℃で保存する。呼気は使用した血漿のものである。
【０１４５】
処置ヒト全血［ＴＨＢ］．２０．０ｍＬのＫ２ＥＤＴＡヒト全血に、０．０５９ｍＬのペグジラルギナーゼを加える。ＰＰＶに入れ、およそ４℃で保存する。呼気は使用した血漿のものである。
【０１４６】
１ｍｇ／ｍＬのｎｏｒ−ＮＯＨＡ［ＮＯＨＡ］
ｎｏｒ−ＮＯＨＡの５ｍｇバイアルの全内容物を、５．００ｍＬのＭＱで溶解する。ＰＰＶに入れ、およそ−７０℃で最長１ヶ月保存する。
【０１４７】
１０％マンニトール溶液（ｗ／ｖ）［ＭＴ１］
およそ１．００ｇのマンニトールを量り、１０ｍＬのＭＱで溶解する。溶解するまで撹拌する。室温で最長１ヶ月保存する。
【０１４８】
非酸化マトリクス［ＮＭ１］
２０ｍＬのＫ２ＥＤＴＡヒト血漿を、３５００ｒｃｆで５分間遠心分離する。０．０５９ｍＬのＡＥＢ１１０２を、ピペットを使って血漿に加える。血漿を３７℃でおよそ３時間インキュベートする。０．１８０ｍＬのＮｏｒ−ＮＯＨＡを血漿バイアルへ加える。０．２００ｍＬのＭＴ１を、０．１％（ｖ／ｖ）のマンニトールを達成するために、処置した血漿へ加える（このステップは、血漿を使用する直前に実施することができる）。よく混合する。ＰＰＶに入れ、最長で血漿成分の有効期限までおよそ−７０℃で保存する。
【０１４９】
酸化マトリクス［ＡＭ１］
２０ｍＬのＫ２ＥＤＴＡヒト血漿を、３５００ｒｃｆ（相対遠心力）で５分間遠心分離する。０．０５９ｍＬのＡＥＢ１１０２を、ピペットを使って血漿に加える。血漿を３７℃でおよそ３時間インキュベートする。０．４００ｍＬのＧＬＡを血漿バイアルへ加える。０．１８０ｍＬのＮｏｒ−ＮＯＨＡを血漿バイアルへ加える。０．２００ｍＬのＭＴ１を、０．１％（ｖ／ｖ）のマンニトールを達成するために、処置した血漿へ加える（このステップは、血漿を使用する直前に実施することができる）。よく混合する。ＰＰＶに入れ、最長で血漿成分の有効期限までおよそ−７０℃で保存する。
【０１５０】
１０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ［ＢＡＣ−３５９］．およそ５０ｇのＴＣＡを溶媒瓶に秤量する。５００ｍＬのＭＱを、メスシリンダーを用いて加える。溶解するまで撹拌する。溶液は室温で最長１ヶ月保存することができる。この溶液はタンパク質沈殿溶液として使用する。この溶液は、試料抽出に使う前に氷の上で冷やす。
【０１５１】
ＭＱ中０．１％ＦＡ及び０．０５％ＰＦＨｘ［ＢＡＣ−３６０］．１０００ｍＬのＭＱをメスシリンダーで量り、溶媒貯蔵瓶へ加える。１ｍＬのＦＡと０．５ｍＬのＰＦＨｘとを、ピペットを用いて加える。完全に混合する。溶液は室温で最長１ヶ月保存することができる。この溶液は移動相Ａ（ＭＰＡ）として使用する。この溶液は１Ｌのテフロン容器中で作製しなくてはならない。
【０１５２】
ＡＣＮ中０．１％ＦＡ及び０．０５％ＰＦＨｘ［ＢＡＣ−３６１］．１０００ｍＬのＡＣＮをメスシリンダーで量り、溶媒貯蔵瓶へ加える。１ｍＬのＦＡと０．５ｍＬのＰＦＨｘとを、ピペットを用いて加える。完全に混合する。この溶液は室温で最長１ヶ月保存することができる。この溶液は移動相Ｂ（ＭＰＢ）として使用する。この溶液は１Ｌのテフロン容器中で作製しなくてはならない。
【０１５３】
８０：２０：０．３（ｖ／ｖ／ｖ）のＭｅＯＨ：ＭＱ：ＦＡ［ＢＡＣ−４０９］
８００ｍＬのＭｅＯＨ（メタノール）と２００ｍＬのＭＱとを、メスシリンダーを用いて溶媒貯蔵瓶中で合わせる。３．００ｍＬのＦＡを、ピペットを使って加える。完全に混合する。室温で最長１ヶ月保存する。この溶液は移動相Ａ（ＭＰＡ）として使用することができる。
【０１５４】
ＭＱ中１００ｍＭのギ酸アンモニウム［ＢＡＣ−４０９］
１０００ｍＬのＭＱを、メスシリンダーを用いて量る。およそ６．３０６ｇのギ酸アンモニウムを、風袋重量ボート中に入れる。ギ酸アンモニウムを、ＭＱのリンス液の入った溶媒保存瓶に移す。残りのＭＱを瓶に移す。溶解するまで撹拌する。室温で最長１ヶ月保存する。この溶液を使用して、移動相Ｂ（ＭＰＢ）を調製することができる。
【０１５５】
７０：３０（ｖ／ｖ）の、１００ｍＭのギ酸アンモニウム：ＭｅＯＨ［ＢＡＣ−４１０］
７００ｍＬのＢＡＣ−４０８と３００ｍＬのＭｅＯＨとを、メスシリンダーを用いて溶媒貯蔵瓶中で合わせる。完全に混合する。最長でＢＡＣ−４０８の有効期限まで室温で保存する。この溶液を、移動相Ｂ（ＭＰＢ）として使用することができる。
【０１５６】
１０００：１（ｖ／ｖ）のＭＱ：ＦＡ［ＢＡＣ−００１］．
１０００ｍＬのＭＱを、メスシリンダーを使用して溶媒瓶へ加える。１ｍＬのＦＡを、ピペットを使って加える。完全に混合する。この溶液は室温で最長１ヶ月保存することができる。この溶液はＲ０溶液に使用することができる。
【０１５７】
４０：１０：５０：０．０５（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）のＩＰＡ：アセトン：ＣＡＮ：ＦＡ［ＢＡＣ−０８３］
４００ｍＬのＩＰＡ、１００ｍＬのアセトン、及び５００ｍＬのＡＣＮを、メスシリンダーを使用して合わせ、適切な大きさの溶媒貯蔵瓶中へ移す。撹拌して混合する。ピペットを使って、０．５００ｍＬのＦＡを瓶へと移す。完全に混合する。室温で最長１ヶ月保存する。あるいは、購入した溶液を、調製した溶液の代わりに使用してもよい。購入した溶液を使用する場合、溶液は標準的な手順に従って室温で保存する。この溶液はＲ３溶液に使用することができる。
【０１５８】
５０：２５：２５（ｖ／ｖ／ｖ）のＩＰＡ：ＡＣＮ：ＭｅＯＨ［ＢＡＣ−０１１］．５００ｍＬのＩＰＡ、２５０ｍＬのＡＣＮ、及び２５０ｍＬのＭｅＯＨを、メスシリンダーを用いて溶媒貯蔵瓶中で合わせる。完全に混合する。溶液は室温で最長１ヶ月保存することができる。この溶液はニードルの強力な洗浄に使用することができる。
【０１５９】
貯蔵液の調製．貯蔵液は二重に調製し、使用の前に比べる。均整及び最終濃度が維持され、記録されていれば、調製された量は変更してもよい。
【０１６０】
ＧＶＡ貯蔵液（１０，０００μＭ）［Ｓ０１］．琥珀色のガラスバイアルに補正係数を適用した後に、３ｍｇ等量のＧＶＡ（ＭＷ１７３．１７）を量る。ＭＱで溶解し、１０，０００μＭまで希釈する。完全に混合する。溶液を０．０７５ｍＬのアリコットに分け、ＰＰＶ中にて溶液をおよそ−７０℃で保存する。使用前に、ストックを湿潤氷上で解凍する。
【０１６１】
ＡｒｇＡ貯蔵液（１０，０００μＭ）［Ｓ０２］．琥珀色のガラスバイアルに補正係数を適用した後に、３ｍｇ等量のＡｒｇＡ（ＭＷ１７５．１９）を量る。ＭＱで溶解し、１０，０００μＭまで希釈する。完全に混合する。貯蔵液をおよそ１０分間超音波処理する。溶液を０．０７５ｍＬのアリコットに分け、ＰＰＶ中にて溶液をおよそ−７０℃で保存する。使用前に、ストックを湿潤氷上で解凍する。
【０１６２】
ＨＡｒｇ貯蔵液（４０，０００μＭ）［Ｓ０３］．琥珀色のガラスバイアルに補正係数を適用した後に、１５ｍｇ等量のＨＡｒｇ（ＭＷ２２４．６９）を量る。ＭＱで溶解し、４０，０００μＭまで希釈する。完全に混合する。溶液を０．１００ｍＬのアリコットに分け、ＰＰＶ中にて溶液をおよそ−７０℃で保存する。使用前に、ストックを湿潤氷上で解凍する。
【０１６３】
ＮＡＡｒｇ貯蔵液（２０，０００μＭ）［Ｓ０４］．琥珀色のガラスバイアルに補正係数を適用した後に、６ｍｇ等量のＮＡＡｒｇ（ＭＷ２１６．２４）を量る。ＭＱで溶解し、２０，０００μＭまで希釈する。完全に混合する。溶液を０．０７５ｍＬのアリコットに分け、ＰＰＶ中にて溶液をおよそ−７０℃で保存する。使用前に、ストックを湿潤氷上で解凍する。
【０１６４】
ＧＡＡ貯蔵液（４０，０００μＭ）［Ｓ０５］．
琥珀色のガラスバイアルに補正係数を適用した後に、１４ｍｇ等量のＧＡＡ（ＭＷ１１７．１１）を量る。［ＢＡＣ−００９］で溶解し、４０，０００μＭまで希釈する。完全に混合する。溶液を０．１５０ｍＬのアリコットに分け、ＰＰＶ中で光から保護された溶液をおよそ−７０℃で保存する。使用前に、ストックを湿潤氷上で解凍する。
【０１６５】
内部標準（ＩＳ）溶液の調製．均整及び最終濃度が維持され、記録されていれば、調製された量は変更してもよい。
【０１６６】
ＧＶＡ−１３Ｃ６  ＩＳ貯蔵液（４，１５０μＭ）［Ｉ０１］．琥珀色のガラスバイアルに補正係数を適用した後に、３ｍｇ等量のＧＶＡ−１３Ｃ６（ＭＷ２１５．６５）を量る。ＭＱで溶解し、４１５０μＭまで希釈する。完全に混合する。溶液を０．０５０ｍＬのアリコットに分け、ＰＰＶ中にて溶液をおよそ−７０℃で保存する。使用前に、ストックを湿潤氷上で解凍する。
【０１６７】
ＡｒｇＡ−１３Ｃ６  ＩＳ貯蔵液（５，０００μＭ）［Ｉ０２］．琥珀色のガラスバイアルに補正係数を適用した後に、３ｍｇ等量のＡｒｇＡ−１３Ｃ６（ＭＷ１８１．１４）を量る。ＭＱで溶解し、５，０００μＭまで希釈する。完全に混合する。溶液を０．０５０ｍＬのアリコットに分け、ＰＰＶ中にて溶液をおよそ−７０℃で保存する。使用前に、ストックを湿潤氷上で解凍する。
【０１６８】
ＨＡｒｇ−ｄ４  ＩＳ貯蔵液（５，０００μＭ）［Ｉ０３］．琥珀色のガラスバイアルに補正係数を適用した後に、３ｍｇ等量のＨＡｒｇ−ｄ４（ＭＷ２６５．１７）を量る。ＭＱで溶解し、５０００μＭまで希釈する。完全に混合する。溶液を０．０５０ｍＬのアリコットに分け、ＰＰＶ中にて溶液をおよそ−７０℃で保存する。使用前に、ストックを湿潤氷上で解凍する。
【０１６９】
ＮＡＡｒｇ−１３Ｃ６  ＩＳ貯蔵液（５，０００μＭ）［Ｉ０４］．琥珀色のガラスバイアルに補正係数を適用した後に、３ｍｇ等量のＮＡＡｒｇ−１３Ｃ６（ＭＷ２２２．１９）を量る。ＭＱで溶解し、５，０００μＭまで希釈する。完全に混合する。溶液を０．０５０ｍＬのアリコットに分け、ＰＰＶ中にて溶液をおよそ−７０℃で保存する。使用前に、ストックを湿潤氷上で解凍する。
【０１７０】
ＧＡＡ−１３Ｃ２  ＩＳ貯蔵液（５，０００μＭ）［Ｉ０５］
琥珀色のガラスバイアルに補正係数を適用した後に、３ｍｇ等量のＧＡＡ−１３Ｃ２（ＭＷ１１９．０９）を量る。［ＢＡＣ−００９］で溶解し、５，０００μＭまで希釈する。完全に混合する。溶液を０．０５０ｍＬのアリコットに分け、ＰＰＶ中にて溶液ＰＦＬをおよそ−７０℃で保存する。使用前に、ストックを湿潤氷上で解凍する。
【０１７１】
重ＩＳ使用液（２．０７５μＭのＩ０１、２．５０μＭのＩ０２、Ｉ０４）［ＨＩ０６］
各０．０２０ｍＬの［Ｉ０１］、［Ｉ０２］、及び［Ｉ０４］を、ピペットを使って、ＰＰＶ中にて３９．９４０ｍＬの［１Ｎ  ＨＣｌ］と合わせる。完全に混合する。溶液を湿潤氷の上で調製する。使用後は溶液を処分する。
【０１７２】
ＩＳ使用液（５，０００ｎＭ）［Ｉ０５］．各０．０２０ｍＬの［Ｉ０１］、［Ｉ０２］、［Ｉ０４］、及び［Ｉ０５］と、ＰＰＶ中３９．９２０ｍＬの［１Ｎ  ＨＣｌ］とを、ピペットを使って合わせる。完全に混合する。溶液を湿潤氷の上で調製する。使用後は溶液を処分する。
【０１７３】
貯蔵比較溶液の調製
以下の表に示すように、ピペットを用いて、湿潤氷上でＰＰＶ中の比較溶液を調製する。完全に混合する。冷蔵保存する。安定性を確立するために用いた貯蔵比較溶液は、確立された処理試料安定性ウィンドウ内で評価すること。均整及び最終濃度が維持され、記録されていれば、調製された量は変更してもよい。
2021505620.tif 000025
【０１７４】
ＳＣ６は、短期の貯蔵比較の場合はＳＳＴ、長期の貯蔵比較の場合はＳＬＴと称することができる。ＳＣ６を使用して、Ｉ０５貯蔵液調製物を比較することができる。（＊）１つの濃度のみがリストされている場合、ＧＶＡ−１３Ｃ６濃度は、示される値の０．８３倍である。
【０１７５】
試料抽出．
１．０．０５０ｍＬの各較正試料、品質管理（ＱＣ）試料、空試料、及び実験試料を、湿潤氷上にて９６ウェルプレートへと移す。希釈された試料は、試料処理の前に、適切な希釈係数の１倍ＰＢＳで希釈されなければならない。
２．０．１００ｍＬの［１Ｎ  ＨＣｌ］を、各マトリクス空試料へ加える。
３．０．１００ｍＬの［Ｉ０５］を、各較正試料、ＱＣ試料、ＩＳを伴う空試料、及び実験試料に加える。ＧＱＣ（ＧＡＡ  ＬＬＯＱ（定量下限）（ＱＣ）試料がもし存在する場合、［Ｉ０６］を加えてはいけない。
４．１６００ｒｐｍで５分間、渦流混合する。
５．０．４００ｍＬの氷冷［ＢＡＣ−３５９］を、各試料へ加える。
６．１０００ｒｐｍで５分間、渦流混合する。
７．３５００ｒｃｆで５分間、遠心分離する。
８．０．３００ｍＬの上清を、ＴｏｍＴｅｃ又は多導管ピペットを使用して清潔な９６ウェルプレートに移す。
９．３５００ｒｃｆで５分間、遠心分離する。
１０．分析が終了するまで、処理済みの試料は、ＬＣ装置の試料室又は冷蔵庫中にておよそ４℃で保存する。
【０１７６】
超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）セットアップ．
2021505620.tif 000026
【０１７７】
勾配プログラム：
2021505620.tif 000027
【０１７８】
質量分析装置パラメータ．質量分析装置、インターフェース、及びスキャンモード以外のパラメータは、最適な性能を得るために修正することができる。正確な質量遷移は、四重極質量分析装置の単位分解能のために、装置によってわずかに異なることがある。
2021505620.tif 000028
【０１７９】
2021505620.tif 000029
【０１８０】
ヒト血清中のＰＥＧに対する抗体検出のための直接結合ＥＬＩＳＡ
Ａ．試薬／緩衝液
希釈緩衝液／アッセイ緩衝液（１倍ＰＢＳ中４％ウシγ−グロブリン（ＢＧＧ））
アッセイ希釈液は、４ｇのＢＧＧを１００ｍＬの１倍ＰＢＳに添加することによって調製した。溶液を０．２２μＭのフィルタにかけ、２〜８℃で最長２週間保存した。体積は必要に応じて測った。
【０１８１】
競合緩衝液（アッセイ緩衝液＋１００μｇ／ｍＬのＰＥＧ）
競合緩衝液を、１ｍＬのアッセイ緩衝液当たり１００μｇのＰＥＧを添加することによって調製した。競合緩衝液はアッセイ当日に新しく作製した。体積は必要に応じて測った。
【０１８２】
停止液（１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４）
２１．４ｍＬの８５％（１１．７Ｍ）Ｈ３ＰＯ４を、２２８．６ｍＬのｄＩ（脱イオン）Ｈ２Ｏに加え、よく混合し、酸キャビネット中に最長１年間保存した。体積は必要に応じて測った。
【０１８３】
追加試薬（以下の表を参照されたい）
2021505620.tif 000030
【０１８４】
試薬  供給源  ＣＡＴ番号  バッチ／ロット番号
炭酸塩コーティング緩衝液  ＢｉｏＷｏｒｌｄ  ４０３２００１６−１  Ｌ１６０２０１０９ＪＣ
希釈緩衝液／アッセイ緩衝液（４％  ＢｉｏＡｇｉｌｙｔｉｘ  Ｎ／Ａ  ＲＰ０８Ｊｕｌ１６ＪＨＪ０４、
ＢＧＧ、１倍ＰＢＳ中）ＲＰ１３Ｊｕｌ１６ＭＢ０１、
ＲＰ１１Ｊｕｌ１６ＪＨＪ０２、
ＲＰ１８Ｊｕｌ１６ＪＨＪ０１
ウシγ−グロブリン  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ８２−０４１  １２６９
洗浄緩衝液（１倍ＰＢＳ）ＢｉｏＡｇｉｌｙｔｉｘ  Ｎ／Ａ  ＲＰ１１Ｊｕｌ１６ＪＨＪ０１、
ＲＰ１２Ｊｕｌ１６ＭＢＭ０１、
ＲＰ１３Ｊｕｌ１６ＪＨＪ０１、
ＲＰ１８Ｊｕｌ１６ＪＨＪ０２、
ＲＰ０８Ｊｕｌ１６ＪＨＪ０３
ポリプロピレンプレート  Ｃｏｓｔａｒ  ３３６５  ０９５１６０００
Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｔａｒｗｅｌｌ  Ｃ８  Ｔｈｅｒｍｏ  ４４１６５３  １２５６６３
Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート
ＴＭＢマイクロウェルプロキシダーゼキット  ＫＰＬ  ５０−７６−００  １０１５８８１９
停止液（１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４）ＢｉｏＡｇｉｌｙｔｉｘ  Ｎ／Ａ  ＲＰ０８Ｊｕｌ１６ＭＢＭ０１、
ＲＰ２６Ｍａｙ１６ｋｍｌ０３、
ＲＰ１８Ｊｕｌ１６ＭＢＭ０１
ヒトＩｇＧ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ００９−０００−００３  １２６２５８
Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ
ヒトＩｇＭ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ００９−０００−０１２  １２４５１７
Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ
【０１８５】
Ｂ．スクリーニングアッセイ手順
Ｓｔａｒｗｅｌｌ  Ｃ８  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（９６ウェルフォーマットプレート）のウェルを、炭酸塩コーティング緩衝液中において、プレートマップに従って、１００μＬの、２μｇ／ｍＬのＢＳＡ  ｍＰＥＧ  ５Ｋ（５，０００ダルトン）、又は５００ｎｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ、又は５００ｎｇ／ｍＬ（これらの対照はカットポイント後試験からは除外した）でコーティングした。プレートを密封し、約４５０ｒｐｍで短時間振盪してウェル全体に分配し、３７℃でおよそ１時間インキュベートした。インキュベーション語、ウェルを１倍ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄プログラムは、吸引設定のあるオーバーフロー、及び各分注後１０秒振盪（プログラム２９＿洗浄＿振盪）を含み、スターウェルプレートを確実に完全な洗浄を行った。このプログラムを、この手順における全ての洗浄ステップに使用した。
【０１８６】
洗浄後、プレートを逆さにし、吸収紙上で軽く叩いて乾燥させた。次いで、３００μＬの希釈緩衝液をプレートの全ウェルに加えた。希釈緩衝液は４％ＢＧＧを含有するため、「緩衝液を阻害する」とも考えられる。プレートを覆い、振盪（約４５０ｒｐｍ）しながら室温で、少なくとも１時間だが３時間以下、インキュベートした。
【０１８７】
ブロッキングインキュベーション期間の後、プレートを洗浄し、逆さにし、吸収紙上で軽く叩いて乾燥させた。希釈緩衝液で５０倍の最小希釈倍率（ＭＲＤ）に希釈した対照及び試料を、プレートマップに従って二重にプレートへ加えた（１００μＬ／ウェル）。次いで、プレートを密封し、振盪（約４５０ｒｐｍ）しながら室温でおよそ１時間インキュベートした。
【０１８８】
プレートを洗浄し、逆さにし、吸収紙上で軽く叩いて乾燥させ、１００μＬの検出抗体をプレートマップに従って適切なウェルに加えた。１：５，０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ−ＨＲＰを用いてマウス抗ＰＥＧ抗体を検出し、希釈緩衝液中で１：３０，０００に希釈し、適切なウェルに添加したウサギ抗ヒトＩｇＧ／Ａ／Ｍを用いて、抗ヒト抗体を検出した。プレートを密封し、振盪（約４５０ｒｐｍ）しながら室温でおよそ１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、逆さにし、吸収紙上で軽く叩いて乾燥させた後、１ウェル当たり１００μＬのＴＭＢ基質を加えた。プレートを覆い、振盪（約４５０ｒｐｍ）しながら室温でおよそ１０〜２０分間インキュベートした。反応を、１ウェル当たり１００μＬの停止液を加えることによって停止した。確実にするために、プレートを短時間振盪した。
【０１８９】
Ｃ．確認アッセイ手順
以下のプレートマップに従って、Ｓｔａｒｗｅｌｌ  Ｃ８  Ｍａｘｉｓｏｒｐのウェルを、炭酸塩コーティング緩衝液中において、１００μＬの、２μｇ／ｍＬのＢＳＡ  ｍＰＥＧ  ５Ｋ、又は５００ｎｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ、又は５００ｎｇ／ｍＬ（これらの対照はカットポイント後試験からは除外した）でコーティングした。プレートを密封し、約４５０ｒｐｍで短時間振盪してウェル全体に分配し、３７℃でおよそ１時間インキュベートした。
【０１９０】
インキュベーション後、ウェルを、プログラム２９＿洗浄＿振盪によって（１倍ＰＢＳ）で３回洗浄して、スターウェルプレートを確実に完全な洗浄を行った。このプログラムを、この手順における全ての洗浄ステップに使用した。洗浄後、プレートを逆さにし、吸収紙上で軽く叩いて乾燥させた。次いで、ブロッキングステップとして、３００μＬの希釈緩衝液をプレートの全ウェルに加えた。プレートを覆い、振盪（約４５０ｒｐｍ）しながら室温で、少なくとも１時間だが３時間以下、インキュベートした。
【０１９１】
スターウェルプレートがブロックされている間に、試料及び対照を、ポリプロピレンプレート中１００μｇ／ｍＬでＰＥＧを含有する希釈緩衝液及び競合緩衝液中で、５０倍のＭＲＤに希釈した。希釈した試料及び対照を、振盪（約４５０ｒｐｍ）しながら室温でおよそ１時間インキュベートした。
【０１９２】
ブロッキングインキュベーション期間の後、スターウェルプレートを洗浄し、逆さにし、吸収紙上で軽く叩いて乾燥させた。ＰＥＧ有り及びＰＥＧ無しで予めインキュベートした対照及び試料を、プレートマップに従って、二重にプレートへ加えた（１００μＬ／ウェル）。次いで、プレートを密封し、振盪（約４５０ｒｐｍ）しながら室温でおよそ１時間インキュベートした。
【０１９３】
洗浄後、プレートを逆さにし、吸収紙上で軽く叩いて乾燥させ、１００μＬの検出抗体をプレートマップに従って適切なウェルに加えた。１：５，０００に希釈した（ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ−ＨＲＰ）を用いてマウス抗ＰＥＧ抗体を検出し、希釈緩衝液中で１：３０，０００に希釈し、適切なウェルに添加した（ウサギ抗ヒトＩｇＧ／Ａ／Ｍ）を用いて、抗ヒト抗体を検出した。プレートを密封し、振盪（約４５０ｒｐｍ）しながら室温でおよそ１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、逆さにし、吸収紙上で軽く叩いて乾燥させた後、１ウェル当たり１００μＬのＴＭＢ基質を加えた。プレートを覆い、振盪（約４５０ｒｐｍ）しながら室温でおよそ１０〜２０分間インキュベートした。反応を、１ウェル当たり１００μＬの停止液を加えることによって停止した。プレートを、確実に適切な混合を行うために短時間振盪し、次いで、４５０（検出）６２０（バックグラウンド）でＳｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダーにて読み取った。
【０１９４】
Ｄ．滴定濃度法手順
滴定濃度アッセイは、スクリーニングアッセイと同じ手順に従った。力価測定される試料は、陰性プールヒト血清中で少なくとも７回の２倍系列希釈に供した。正常なヒトのプールを、品質確認の際にスクリーニングし、バックグラウンドが最も低いものを、確認で陰性プールとして使用するために選択した。これらの滴定濃度希釈液を、希釈緩衝液で５０倍の最小希釈倍率に希釈し、プレートマップに従って二重にプレートへ加えた（１００μＬ／ウェル）。
【０１９５】
Ｅ．方法確認
方法の確認としては、特異性、アッセイ感度、選択性／マトリクス干渉、薬剤耐性、プロゾーン（付着）効果、滴定アッセイ直線性、アッセイ内及びアッセイ間精度、短期及び凍結融解安定性、並びにスクリーニング、確認、及び滴定カットポイントの確立が挙げられる。
【０１９６】
２セットの対照をアッセイ確認に用いた。１セットは、アッセイで高（ＨＰＣ−ｍ）シグナル及び低（ＬＰＣ−ｍ）シグナルを生じるためにプールした、正常ヒト血清（ＮＣ）にスパイクしたマウス抗ＰＥＧ代用陽性対照を用いて、調製した。２番目のセットは、スクリーニングアッセイで高い抗ＰＥＧ反応を示し、確認アッセイで高い阻害を示すヒト試料を用いて、調製した。この試料は、予想される既存の抗ＰＥＧ試料と一致するであろう。ヒト抗ＰＥＧ低濃度対照は、同定された高濃度ヒト試料を陰性対照血清中に希釈して、アッセイにおいて低（ＬＰＣ−ｈ）シグナルをもたらす試料を生成することによって調製した。希釈していない高濃度ヒト試料をＨＰＣ−ｈとして用いた。両セットの対照は、該当する場合は各試験に含めた。対照は、レベルに比例したシグナル、すなわち高濃度は低濃度より大きく、低濃度はカットポイントより大きいシグナルを示す必要がある。免疫グロブリン対照（プレート上に被覆されたヒトＩｇＧ及びヒトＩｇＭ）もまた、検出抗体カクテルの性能を検証するために、カットポイント試験に含めた。
【０１９７】
Ｆ．カットポイント分析
マウス抗ＰＥＧスクリーニングカットポイント．マウス抗ＰＥＧ  ＳＰＣを用いるデータ評価のために、スクリーニングカットポイントを、確認の間に生じた全ての陰性対照試料の平均の標準偏差の２倍を用いて設定した（ｎ＝５５プレート）。この計算により、各プレート上のＮＣの平均に加えることで、マウス抗ＰＥＧ  ＳＰＣ試料に特異的なカットポイントを生成する、補正係数０．０１４６７を得た。
【０１９８】
ヒトスクリーニングアッセイカットポイント．スクリーニングアッセイカットポイントは、９８個の正常ヒト血清試料を用いて確立した。６回の測定を、３人の分析者が最低でも７回にわたって、各試料について行った。データは、ＳＡＳ  ＪＭＰ（登録商標）ソフトウェア（バージョン１２以降）を用いて評価し、統計的異常値を除去し、分散を測定し、カットオフポイントを確立した。統計的異常値の決定については、試料の平均シグナルを各プレートの抗ヒトＮＣ試料の平均で割ることにより、応答を正規化した。
【０１９９】
Ｇ．カットポイント決定
ヒト抗ＰＥＧスクリーニングカットポイント．パラメトリック及びノンパラメトリックなスクリーニング浮動カットポイント因子を、正規化値を用いて決定した。最初に、Ｔｕｋｅｙのｂｉｗｅｉｇｈｔ推定法によるパラメトリック法を用いて、外れ値を排除した後の比の平均及び標準偏差（ＳＤ）のロバストな推定値を計算した。次いで、ＳＤ値にｔ分布の第９５の分位数（自由度が比率値の数から１を引いた値に等しい）を乗算し、その積を平均値に加算することによって、５％の偽陽性エラー率におけるパラメトリック浮動カットポイント係数を決定した。ノンパラメトリックな５％のエラー率のカットポイント係数を、比率値の経験上第９５分位数値の計算によって決定した。
【０２００】
ヒト確認的カットポイント．確認的カットポイント値を、Ｓｈａｎｋａｒ  Ｇらが推奨する手順により、１％の偽陽性エラー率で確立した。カットポイント値は、生物学的異常値としてスクリーンカットポイント割り当てから除外した第１４試料を用いて、特異的阻害の下限を割り当てることによって決定した。これらの試料は、陰性としてスクリーニングされる試料よりも一貫して高い％阻害値を有した。スパイクされていない試料からの変化のパーセンテージは、以下の式を用いて各試料について計算した。
2021505620.tif 000031
【０２０１】
パラメトリック確認的カットポイントは、最初に、分析で保持された全ての％阻害値の平均値及びＳＤのＴｕｋｅｙのｂｉｗｅｉｇｈｔ推定値を計算することによって、決定した。次に、ｔ分布の第１の分位数に等しい係数をＳＤ値にそれぞれ乗算し（自由度が抑制値の数から１を引いた値に等しい）、その積を平均値に減算することによって、カットポイント値を計算した。ノンパラメトリックなカットポイントの値もまた、経験上の第１分位数に基づいて決定した。
【０２０２】
Ｇ．特異性
高レベルのヒトＩｇＧの添加は、スパイクされていない試料と比較して、アッセイで生成されたシグナルに影響を与えなかった。
Ｈ．ＰＥＧ耐用性
【０２０３】
アッセイ干渉を、ＨＰＣ−ｍ及びＬＰＣ−ｍに相当する抗ＰＥＧ代用陽性対照の濃度、並びにヒト抗ＰＥＧ  ＨＰＣ−ｈ及びＬＰＣ−ｈの濃度の存在下で、１００μｇ／ｍＬの濃度で開始するＰＥＧの２倍連続希釈を行うことによって評価した。ＰＥＧ無しの各対照からなる０スパイク対照も行った。これは、少なくとも２人の分析者によって少なくとも２回、重複して行われた。ヒト特異的スクリーニングカットポイントを用いて、これらのアッセイの実行における耐用性を決定した。ＨＰＣ−ｍ、ＨＰＣ−ｈ、及びＬＰＣ−ｈは、最大１００μｇ／ｍＬまで試験したＰＥＧの全濃度に耐用性であった。
【０２０４】
Ｉ．ペグジラルギナーゼの薬剤耐性
アッセイ干渉を、ＨＰＣ−ｍ及びＬＰＣ−ｍに相当する抗ＰＥＧ代用陽性対照の濃度、並びにヒト抗ＰＥＧ  ＨＰＣ−ｈ及びＬＰＣ−ｈの濃度の存在下で、１５０μｇ／ｍＬの濃度で開始するペグジラルギナーゼの２倍連続希釈を行うことによって評価した。ＰＥＧ無しの各対照からなる０スパイク対照も行った。薬剤耐性の評価は、抗ヒト特異的カットポイントを用いて行った。１回の評価ではＨＰＣ−ｍは９．３８μｇ／ｍＬまで耐性であり、２回目の評価では最大３７．５μｇ／ｍＬまで耐性であり、平均薬物耐性は２３．４μｇ／ｍＬであった。１回の評価ではＬＰＣ−ｍはＣｏ−Ａｒｇ１ＰＥＧに耐性ではなく、２回目の評価では２．３４μｇ／ｍＬに耐性であった。１回の評価ではＨＰＣ−ｈは９．３８μｇ／ｍＬまで耐性であり、２回目の評価では最大１８．８μｇ／ｍＬまで耐性であり、平均薬物耐性は１４．１μｇ／ｍＬであった。１回の評価ではＬＰＣ−ｈは４．６９μｇ／ｍＬまで耐性であり、２回目の評価では９．３８μｇ／ｍＬまで耐性であり、平均薬物耐性は７．０４μｇ／ｍＬであった。
【０２０５】
神経運動及び神経認知検査法
身体検査は、６ＭＷＴ、ＧＭＦＭ、バーグ・バランス・スケール、アシュワーススケール変法、及びパーデューペグボード試験を含むが、これらに限定されない、神経学的及び神経運動機能の評価により完了する。評価は１日以上行うことができる。評価は、ベースライン時、及びその後の時点で記録してもよい。
【０２０６】
６ＭＷＴは、数多くの疾患状態で心血管、肺、及び神経筋系を全体的に評価するため、臨床試験で広く用いられている。患者が平らな場所を６分間で歩ける距離を測定する。米国胸部学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ＡＴＳ）は、試験実施のための標準化された方法（ＡＴＳ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｉｘ−Ｍｉｎｕｔｅ  Ｗａｌｋ、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、第１６６巻、第１１１〜１１７頁（２００２年））を発表したが、これは耐用性が高く、投与が簡単である。６ＭＷＴではこの手順に従った。試験方法の変更は、試験依頼者の承認を得て、患者の病態や、試験実施場所のロジスティック上の考慮事項を考慮してもよい。歩行不能患者は６ＭＷＴを投与されなかった。６ＭＷＴの結果は、メートル単位の完了した距離、及びベースラインからの変化率として記録される。
【０２０７】
バーグ・バランス・スケールは、特定の機能的課題における能力を評価することにより、バランス機能障害患者のバランスを測定する。座位から立位への移行、移動、回転、及び片足立ちなど、バランスの特定の側面を評価する１４の課題がある。更に、ほとんどの課題では、対象が特定の時間その位置を維持する必要がある。
【０２０８】
ＧＭＦＭは、横たわる、転がる、歩く、走る、及びジャンプするといった一連の活動を観察して、粗大運動能力能の変化を評価するためにデザインされた臨床的尺度である。ＧＭＦＭの各項目には４点のスコアリングシステムが使用され、これは５つの面（Ａ〜Ｅ）を対象に、人がどの程度まで運動を開始し完了できるかが判定される。Ａ：横になる及び転がる、Ｂ：座る、Ｃ：四つん這い及びひざまずく、Ｄ：立つ、並びにＥ：歩く、走る、及びジャンプする。
【０２０９】
アシュワーススケール変法は、中枢神経系（ＣＮＳ）病変を有する患者の痙縮を評価するために開発され、痙縮による関節周囲の受動運動に対する抵抗を測定するために使用される。このスケールは許容し易く、そして実施が容易である。このスケールは痙縮と軟部組織硬直とを区別できない。このスケールでは、以下の表に示すように、０（痙縮なし）〜４（完全に硬直）の６つのスコアリング選択肢があるスコアリングスケールが使用される。
【０２１０】
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【０２１１】
パーデューペグボード試験は、身体の両側を利用した微細運動課題において、操作的器用さ及び両手協調運動能力速度を測定するテストである（Ｔｉｆｆｉｎら（１９４８年））。この検査には、（１）腕、手、及び指の全体的な動き、並びに（２）「指紋」の器用さとも呼ばれる微細運動をする四肢の、２つの異なる能力が含まれる。ペグボード試験の成績不良は、大脳基底核を含む回路によって媒介されると考えられる、複雑な視覚誘導運動又は協調運動における障害の徴候である。
【０２１２】
以下の表は、長期にわたる改善を評価するために、治療を受けている患者に実施できる更なる神経認知、発達、及び生活の質（ＱＯＬ）評価を示す。
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ａＰＲＯＭＩＳ（ＰＲＯＭＩＳ評価を用いて第１／２相試験を開始した患者）又は小児科品質の生活インベントリに対するＰｅｄｓＱＬ測定モデル（ＰＲＯＭＩＳ評価を用いた第１／２相試験ではなかった患者）。
【０２１３】
参考文献一覧
ＡＴＳ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｉｘ−Ｍｉｎｕｔｅ  Ｗａｌｋ、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、第１６６巻、第１１１〜１１７頁（２００２年）
Ｂｕｒｒａｇｅら、「Ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｒｇｉｎａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｒｇｉｎａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ」、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２４巻、第２２号、第６４１７〜２７頁（２０１５年）
Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ｄ．Ｒ．ら、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ」、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｕｒｏｌ、第４６巻、第６号、第３６９〜７４頁（２０１２年）
Ｃｈｅｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、第６７巻、第３０９〜１７頁（２００７年）
Ｄｅｉｇｎａｎら、「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ」、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．、第９３巻、第１７２〜１７８頁（２００８年）
Ｄｉｌｌｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｒｇｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．、第８巻、第７号、第ＢＲ２４８〜２５３頁（２００２年）
Ｄｏｗｎｓら、「Ｔｈｅ  Ｂｅｒｇ  Ｂａｌａｎｃｅ  Ｓｃａｌｅ」、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｔｈｅｒ．」、２０１５年、第６１巻、第１号、第４６頁
Ｅｎｒｉｇｈｔら、「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｅｑｕａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｉｘ−ｍｉｎｕｔｅ  ｗａｌｋ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９８年、第１５８巻、第５号、パート１、第１３８４〜１３８７頁
Ｇｅｉｇｅｒら、「Ｓｉｘ−ｍｉｎｕｔｅ  ｗａｌｋ  ｔｅｓｔ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｎｄ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ」、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．、２００７年、第１５０巻、第４号、第３９５〜３９９頁
Ｈａｂｅｒｌｅら、「Ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｕｒｅａ  ｃｙｃｌｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、Ｏｒｐｈａｎｅｔ．Ｊ．Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ．、２０１２年、第７巻、第３２頁
Ｈａｒｒｉｓら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．、第４０巻、第７号、第５３９〜５１頁（２００１年）
Ｌａｍｂｅｒｔら、「Ｈｙｐｅｒａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ：ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  ａｎｄ  ｍｏｔｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ
ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄａｔａ」、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ、１９９１年、第１１８巻、第３号、第４２０〜４頁
Ｌｏｐｅｚら、ＦＥＢＳ  Ｊ．、第２７２巻、第４５４０〜４８頁（２００５年）
Ｌｕｎｅｂｕｒｇ，Ｎ．ら、「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍａ  Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ：ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒａｔｉｏ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ  Ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ  Ｃｏｈｏｒｔ．」、Ｊ．Ｎｕｔｒ．、第１４１巻、第１２号、第２１８６〜２１９０頁（２０１１年）。
Ｍａｒｅｓｃａｕら、「Ｇｕａｎｉｄｉｎｏ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ
ｈｙｐｅｒａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ：Ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｏｆ  ｇｕａｎｉｄｉｎｏ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ．Ｒｅｓ．
、第２７巻、第３号、第２９７〜３０３頁（１９９０年）
Ｍａｒｅｓｃａｕら、「Ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｕｒｅｍｉａ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａ
ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｕｒｅａ  ａｎｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｏｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ」、１９９２年、第４１巻、第９号、第１０２１〜１０２４頁
Ｏｅｆｆｉｎｇｅｒら、「Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｔｏｏｌｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｐａｌｓｙ：
ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ」、Ｄｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｉｌｅ  Ｎｅｕｒｏｌ．、２００８年、第５０巻、第１２号、第９１８〜９２５頁
Ｐｒａｓａｄら、「Ａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ：ａ  ｔｒｅａｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｐａｓｔｉｃ  ｄｉｐｌｅｇｉａ  ｓｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｐａｌｓｙ−ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ａｎｄ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗ」、Ｊ．Ｃｈｉｌｄ  Ｎｅｕｒｏｌ．、第１２巻、第３０１〜３０９頁（１９９７年）
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ペンシルヴァニア州イーストン（１９９５年）
Ｓａｖｏｃａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ、第７巻、第２６１〜２６８頁（１９８４年）
Ｓｃｈｒｏｖｅｒら、「Ｍｉｎｉｍａｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ６−ｍｉｎ  ｗａｌｋ  ｔｅｓｔ：ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｒｑｕｉｏ  Ａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、Ｏｒｐｈａｎｅｔ．Ｊ．Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ．、２０１７年、第１２巻、第１号、第７８頁
Ｓｃｈｌｕｎｅら、「Ｈｙｐｅｒａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ  ｄｕｅ  ｔｏ  ａｒｇｉｎａｓｅ  １  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ，ａｎｄ  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ」、Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ、第４７巻、第１７５１〜１７６２頁（２０１５年）
Ｓｅｇａｗａら、「Ａ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ａｒｇｉｎａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ｍｕｌｔｉｃｙｓｔｉｃ  ｗｈｉｔｅ  ｍａｔｔｅｒ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」、Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｖ．、第３３巻、第４５〜４８頁（２０１１年）
Ｓｔｏｃｋｌｅｒ−Ｉｐｓｉｒｏｇｌｕら、「Ｇｕａｎｉｄｉｎｏａｃｅｔａｔｅ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＡＭＴ）ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ４８  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ」、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、Ｍｅｔａｂ．、第１１１巻、第１号、第１６〜２５頁（２０１４年）
Ｕｃｈｉｎｏ，Ｔ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ」、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第９６巻、第３号、第２５５〜６０頁（１９９５年）
Ｗｕ，Ｇ．ら、「Ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第３３６巻パート１第１〜１７頁（１９９８年）
Ｗｙｓｅら、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｏｒｔｅｘ  ｏｆ  ｒａｔｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｇｕａｎｉｄｉｎｏ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｙｐｅｒａｒｇｉｎｉｎｅｍｉａ」、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、２００１年、第９２３巻、第１〜２号、第５０〜７頁
並びに、米国特許文献：米国特許出願公開第２０１７０２４０９２２号、米国特許出願公開第２０１７０２８３８３０号、米国特許出願公開第２０１７０２２４８４３号、米国特許出願公開第２０１７０１９１０７８号、米国特許出願公開第２０１６００９５８８４号、米国特許第８，３９８，９６８号、米国特許第８，４４０，１８４号、米国特許出願公開第２０１６００９５８８４号、及び米国特許出願公開第２０１４０１５４７９７号。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ−Ｄ】
2021505620.tif 000036
【図２】
2021505620.tif 000037
【図３Ａ−Ｂ】
2021505620.tif 000038
【図３Ｃ−Ｄ】
2021505620.tif 000039
2021505620.tif 000040
【図４Ａ】
2021505620.tif 000041
【図４Ｂ】
2021505620.tif 000042
【図５Ａ】
2021505620.tif 000043
【図５Ｂ】
2021505620.tif 000044
【図６】
2021505620.tif 000045
【図７】
2021505620.tif 000046
【図８】
2021505620.tif 000047
【図９】
2021505620.tif 000048
【図１０】
2021505620.tif 000049
【配列表】
2021505620000001.app
【国際調査報告】
2021505620.tif 000050
2021505620.tif 000051
2021505620.tif 000052
2021505620.tif 000053