(57)【要約】  本発明は、抗原バリアントおよびその使用に関する。抗原バリアントは、水痘・帯状疱疹ウイルスの表面タンパク質（ｇＥ）からのタンパク質で、高い発現レベルおよび高い免疫原性を示し、したがって、ワクチン組成物として使用されるとき、ワクチン組成物は生ウイルスワクチンと比較してより高い安全性を示し、また、抗原バリアントは他の抗原と比較して宿主細胞における発現レベルがより高く、したがって、水痘・帯状疱疹ウイルスによって引き起こされる水痘または帯状疱疹の予防または治療用ワクチンとして有用である。
2021525079.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列で表される水痘・帯状疱疹表面タンパク質（ｇＥ）抗原の５２５番目〜５４３番目のアミノ酸残基からなる群から選択される任意の１つのアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションであるバリエーションを含む、水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアント。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列における４０番目のアミノ酸残基がスレオニンである、請求項１に記載の水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアント。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列における５３６番目のアミノ酸残基がロイシンである、請求項１に記載の水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアント。
【請求項４】
該抗原バリアントが配列番号２〜８および配列番号２１〜２３の任意の１つのアミノ酸配列で表される、請求項１に記載の水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアント。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載される水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントをコードする遺伝子。
【請求項６】
該遺伝子が配列番号９〜１５の任意の１つのヌクレオチド配列で表される、請求項５に記載の遺伝子。
【請求項７】
請求項５に記載される遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載される組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載される水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントを有効成分として含む、水疱または帯状疱疹を予防または治療するためのワクチン組成物。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載される水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントを有効成分として含むワクチン組成物を患者に投与するステップを含む、水疱または帯状疱疹を予防または治療する方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載される水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントを有効成分として含むワクチン組成物の、水疱または帯状疱疹の予防または治療のための使用。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載される水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントを有効成分として含むワクチン組成物の、水疱または帯状疱疹の予防または治療用医薬の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水痘・帯状疱疹ウイルス抗原バリアントおよびその使用、特に、水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質（ｇＥ）抗原バリアントのなかから選択される、発現レベルが高く免疫原性が高い水痘・帯状疱疹ウイルス抗原バリアント、ならびに水痘・帯状疱疹ウイルス抗原バリアントを有効成分として含む、水痘または帯状疱疹を予防または治療するためのワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
水痘・帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）は、主に小児および青年期の子供において水痘を引き起こすウイルスである。一旦感染すると、ＶＺＶは知覚根および脳神経の神経節細胞に何年も休眠状態で留まり、大人になってから免疫が低下した際に再び活性化され、帯状疱疹を引き起こす。水痘は伝染性が高く、一旦感染すると、発熱および倦怠感を伴って全身に水疱用の発疹を引き起こす。正常な子供の多くにおいては、水痘が深刻な状態に進行することは稀であり、最終的には、治療しなくても自然に回復する疾患となる。しかしながら、臓器移植または化学療法を受けた患者においては、水痘が深刻な症状にまで進行する場合が多いことが知られている（Adriana Weinberg et al., J Infectious Diseases, 200(7):1068, 2009; Judith Breuer et al., Expert Review of Vaccines, 2017, DOI:10.1080/14760584.2017.1394843）。
【０００３】
帯状疱疹の初期症状は、身体痛のような全身の痛みおよび疼痛、またはナイフで刺されるような強い痛みを伴う強い痒み、ピリピリ感および灼熱感の感覚である。帯状疱疹は、水疱が数日後に出て、皮膚病変が増すにつれ痛みが増し、痛みは年齢が高いほど強い疾患である。帯状疱疹が治癒した場合でも、後遺症としての神経痛が残りうる。４０歳以下の大人では比較的稀であるが６０歳またはそれ以上の人々においては、神経痛のせいで睡眠が中断され、慢性疲労がもたらされ、軽い接触もしくは摩擦によってさえ強い痛みを感じ、抑うつが生じることすらあることが知られている。
【０００４】
水疱予防ワクチンの例には、１９７０年に開発された弱毒株であるＯｋａ株を用いて開発されたVARIVAX (Merck & Co, Inc.) および VARILRIX (GlaxoSmithKline Biologicals SA) といった製品がある。韓国では、１９８０年に開発されたＭＡＶ／０６株を用いて製造されたSuduvax (Green Cross) といった製品が市販されている。問題の市販生ワクチンは平均８０％の防御効果を示すが、これは、ワクチン接種後も被接種者の２０％において感染が起こることを意味する。ワクチンに含まれる生ウイルスによって水痘および帯状疱疹が発症するといった安全性の問題は常に指摘されている。
【０００５】
帯状疱疹予防ワクチンとして、Ｏｋａ株を用いて製造された弱毒生ワクチンであるZOSTAVAX (Merck & Co, Inc.) が開発された。このワクチンは大量のウイルスを含むことから、５０歳以上の大人に使用すべきであり小児または青年期の子供には使用すべきでないという条件で、米国および韓国において承認され販売されている。最近、５０歳以上に使用することが意図される、ウイルス表面タンパク質（ｇＥ）およびアジュバントを含むワクチンが、GlaxoSmithKline Biologicals SAによって開発され、予防効果を示すことが臨床試験において証明されている（２０１１年１月７日発行の米国特許第７９３９０８４号）。
【０００６】
ワクチン開発の初期には、抗原として主に弱毒生細胞または死細胞が用いられた。しかしながら、安全性の問題、および病原体中に免疫抑制物質が存在することのため、そのような抗原の開発は、疾患防御に不可欠な免疫を確立することのできる、構造および組成の明確なタンパク質抗原の開発へとシフトしつつある。
【０００７】
したがって、本発明者は、水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質（ｇＥ）抗原のなかから、免疫原性を犠牲にすることなく製造性の改善に寄与しうる、宿主細胞における発現レベルの高いタンパク質抗原を開発するため努力を重ねた。結果として、本発明者は、さまざまな長さおよび測定される発現レベルの水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントを作製し、それによって、該抗原バリアントの中から発現レベルの高い特定のアミノ酸配列を特定して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質（ｇＥ）抗原バリアントから選択される、発現レベルが高く免疫原性の高い特定の抗原バリアントを提供することである。
【０００９】
本発明の他の課題は、抗原バリアントをコードする遺伝子、遺伝子を含む組換えベクター、および組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の課題は、抗原バリアントを有効成分として含む、水痘または帯状疱疹を予防または治療するためのワクチン組成物を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる課題は、抗原バリアントを有効成分として含むワクチン組成物を使用する、水痘または帯状疱疹を予防または治療する方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる課題は、抗原バリアントを有効成分として含むワクチン組成物の、水痘または帯状疱疹の予防または治療のための使用を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる課題は、抗原バリアントを有効成分として含むワクチン組成物の、水痘または帯状疱疹の予防または治療用医薬の製造のための使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために、本発明において、配列番号１のアミノ酸配列で表される水痘・帯状疱疹表面タンパク質（ｇＥ）抗原の５２５番目〜５４３番目のアミノ酸残基からなる群から選択される任意の１つのアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションであるバリエーションを含むことによって特徴付けられる、水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントが提供される。
【００１５】
さらに、本発明において、抗原バリアントをコードする遺伝子、遺伝子を含む組換えベクター、および組換えベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。
【００１６】
さらに、本発明において、抗原バリアントを有効成分として含む、水疱または帯状疱疹を予防または治療するためのワクチン組成物が提供される。
【００１７】
さらに、本発明において、抗原バリアントを有効成分として含むワクチン組成物を使用する、水疱または帯状疱疹を予防または治療する方法が提供される。
【００１８】
さらに、本発明において、抗原バリアントを有効成分として含むワクチン組成物の、水疱または帯状疱疹の予防または治療のための使用が提供される。
【００１９】
さらに、本発明において、抗原バリアントを有効成分として含むワクチン組成物の、水疱または帯状疱疹の予防または治療用医薬の製造のための使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明の実験方法を示す図である。
【図２】図２は、さまざまな長さの水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質（ｇＥ）抗原のアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、水痘・帯状疱疹ウイルス抗原であるｇＥ断片の発現レベルを比較するために行ったウエスタンブロットの結果を示す。
【図４】図４は、GlaxoSmithKline Biologicals SA製水痘・帯状疱疹ウイルスワクチンShingrixに含まれる表面タンパク質抗原（ＧＳＫ ｇＥ５４６ａａ）と、本発明者が作製した抗原バリアント（ｍｏｇａｍ ｇＥ５３７ａａ）の発現レベルを比較するために行ったウエスタンブロットの結果を示す。
【図５】図５は、GlaxoSmithKline Biologicals SA製水痘・帯状疱疹ウイルスワクチンShingrixに含まれる表面タンパク質抗原（ＧＳＫ ｇＥ５４６ａａ）と、本発明者が作製した抗原バリアント（ｍｏｇａｍ ｇＥ５３７ａａ）による液性免疫反応を比較するために行った抗ｇＥ特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図６】図６は、GlaxoSmithKline Biologicals SA製水痘・帯状疱疹ウイルスワクチンShingrixに含まれる表面タンパク質抗原（ＧＳＫ ｇＥ５４６ａａ）と、本発明者が作製した抗原バリアント（ｍｏｇａｍ ｇＥ５３７ａａ）による細胞性免疫反応（ＣＭＩ）を比較するために行ったマウスＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図７】図７は、水痘・帯状疱疹ウイルス抗原であるｇＥ断片による液性免疫反応を比較するために行った抗ｇＥ特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図８】図８は、水痘・帯状疱疹ウイルス抗原であるｇＥ断片による液性免疫反応を比較するために抗ｇＥ特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを行い、抗原特異的抗体反応を示した応答体の数をまとめることによって得られた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本書において用いられる技術用語および科学用語はいずれも、異なる定義をしない限り、本発明が関係する分野における専門家に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本書に用いられる命名法は全般に、当分野において知られ一般的に用いられるものである。
【００２２】
本発明において、水痘・帯状疱疹ウイルスタンパク質抗原のなかから、免疫原性を犠牲にすることなく生産性改善に寄与することのできる、宿主細胞における発現レベルの高い抗原を開発するために、さまざまな長さの表面タンパク質（ｇＥ）抗原バリアントを作製し、その発現レベルを測定する実験を行った。結果として、本発明者が作製した水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントのなかで、特定のアミノ酸配列で表される抗原が他の抗原よりも高い発現レベルを示すことが確認された（図３）。
【００２３】
さらに、高い免疫原性を有する抗原バリアントを選択するために、抗体力価測定（図７）および抗原特異的反応体測定（図８）を行った。結果として、ｍｏｇａｍ  ｇＥ５３４ａａ〜ｇＥ５４０ａａが免疫原性が特に高いことが確認された。
【００２４】
したがって、本発明の一側面において、配列番号１のアミノ酸配列で表される水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質（ｇＥ）抗原の５２５番目〜５４３番目のアミノ酸残基からなる群から選択される任意の１つのアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションであるバリエーションを含む水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントが提供される。
【００２５】
特に、本発明において、
ａ）５２５番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｂ）５２６番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｃ）５２７番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｄ）５２８番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｅ）５２９番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｆ）５３０番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｇ）５３１番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｈ）５３２番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｉ）５３３番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｊ）５３４番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｋ）５３５番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｌ）５３６番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｍ）５３７番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｎ）５３８番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｏ）５３９番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｐ）５４０番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｑ）５４１番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｒ）５４２番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
ｓ）５４３番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；
からなる群から選択されるバリエーションを含むことによって特徴付けられる水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントが提供される。
【００２６】
抗原性バリアントは、好ましくは、ｊ）５３４番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；ｋ）５３５番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；ｌ）５３６番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；ｍ）５３７番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；ｎ）５３８番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；ｏ）５３９番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーション；およびｐ）５４０番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションからなる群から選択されるバリエーションを含むことによって特徴付けられうるが、バリエーションはそれに限定されない。
【００２７】
配列番号１: mgtvnkpvvg vlmgfgiitg tlritnpvra svlryddfhX1 dedkldtnsv yepyyhsdha esswvnrges srkaydhnsp yiwprndydg flenahehhg vynqgrgids gerlmqptqm saqedlgddt gihviptlng ddrhkivnvd qrqygdvfkg dlnpkpqgqr lievsveenh pftlrapiqr iygvrytetw sflpsltctg daapaiqhic lkhttcfqdv vvdvdcaent kedqlaeisy rfqgkkeadq pwivvntstl fdeleldppe iepgvlkvlr tekqylgvyi wnmrgsdgts tyatflvtwk gdektrnptp avtpqprgae fhmwnyhshv fsvgdtfsla mhlqykihea pfdlllewly vpidptcqpm rlystclyhp napqclshmn sgctftsphl aqrvastvyq ncehadnyta yclgishmep sfglilhdgg ttlkfvdtpe slsglyvfvv yfnghveava ytvvstvdhf vnaieergfp ptagqppatt kpkeitpvnp   gtsplX2ryaa wtgglaavvl lclviflict akrmrvkayr vdkspynqsm yyaglpvddf edsestdtee efgnaiggsh ggssytvyid ktr (ここで、X1はTまたはIであり、X2はLまたはIである)
【００２８】
本発明において、水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントは、それが、６２３アミノ酸からなる配列番号１のアミノ酸配列で表される水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原から誘導される、５３４〜５４０アミノ酸からなる水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアント、またはいくつかのアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションであるバリエーションであることによって特徴付けられうる。例えば、本書において用いられる「５３４番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションであるバリエーション」なる表現は、アミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシ末端（Ｃ末端）に向かって１番目〜５３４番目のアミノ酸残基が維持され、５３５番目のアミノ酸残基からカルボキシ末端までの連続するアミノ酸残基がトランケートされることを意味する。
【００２９】
本発明の一態様において、配列番号１のアミノ酸配列における４０番目のアミノ酸残基は、スレオニンである。
【００３０】
本発明の一態様において、配列番号１のアミノ酸配列における５３６番目のアミノ酸残基は、ロイシンである。
【００３１】
本発明において、水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントは、下記の配列番号２〜８および配列番号２１〜２３の任意の１つのアミノ酸配列で表されることによって特徴付けられうる：
ａ）５３４番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号２のアミノ酸配列で表される抗原バリアント；
ｂ）５３５番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号３のアミノ酸配列で表される抗原バリアント；
ｃ）５３６番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号４のアミノ酸配列で表される抗原バリアント；
ｄ）５３７番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号５のアミノ酸配列で表される抗原バリアント；
ｅ）５３８番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号６のアミノ酸配列で表される抗原バリアント；
ｆ）５３９番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号７のアミノ酸配列で表される抗原バリアント；
ｇ）５４０番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号８のアミノ酸配列で表される抗原バリアント；
ｈ）５２５番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号２１のアミノ酸配列で表される抗原バリアント；
ｉ）５３０番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号２２のアミノ酸配列で表される抗原バリアント；または
ｊ）５４３番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号２３のアミノ酸配列で表される抗原バリアント。
【００３２】
本発明の表面タンパク質は、クレード１由来の水痘・帯状疱疹ウイルスのエンベロープを構成する糖タンパク質に由来し、カルボキシ末端の一部のトランケーションによって得られる５３４〜５４０アミノ酸からなるペプチド断片（トランケートされたタンパク質）である。
【００３３】
生物学的に等価なアミノ酸バリエーションということであれば、本発明において用いられるアミノ酸配列は、配列番号２〜８および配列番号２１〜２３の配列との実質的同一性を有する配列を包含すると解釈される。前記の実質的同一性とは、前記の本発明の配列と任意の他の配列が最大に対応するようにアラインされ、該アラインされた配列が当分野で一般に用いられるアルゴリズムを用いて解析される場合に、本発明の配列に対して他方の配列が、同じ機能を持ちながら少なくとも７０％の相同性、好ましくは８０％の相同性、より好ましくは９０％の相同性、さらに好ましくは９５％の相同性を有することを意味する。
【００３４】
本発明の一態様において、以下の抗原バリアントが高い免疫原性を有することが確認された：ａ）５３４番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号２のアミノ酸配列で表される抗原バリアント；ｂ）５３５番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号３のアミノ酸配列で表される抗原バリアント；ｃ）５３６番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号４のアミノ酸配列で表される抗原バリアント；ｄ）５３７番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号５のアミノ酸配列で表される抗原バリアント；ｅ）５３８番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号６のアミノ酸配列で表される抗原バリアント；ｆ）５３９番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号７のアミノ酸配列で表される抗原バリアント；ｇ）５４０番目のアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションによって得られる配列番号８のアミノ酸配列で表される抗原バリアント。
【００３５】
ワクチン開発の初期には、抗原として弱毒生細胞または死細胞が主に用いられた。しかしながら、安全性の問題のため、そのような抗原の開発は、構造および組成の明確なタンパク質抗原の開発へとシフトしつつある。しかしながら、タンパク質抗原は一般に、従来のワクチンと比較して免疫原性が低いという問題を有する。安全性および免疫原性のいずれにおいても優れ、宿主細胞において高レベルで発現されるという観点から、本発明の抗原バリアントは、水痘・帯状疱疹ウイルスによって引き起こされる水痘または帯状疱疹を予防または治療するためのワクチンとして、効果的に使用されうる。
【００３６】
本発明の他の一側面において、抗原性バリアントをコードする遺伝子、それを含む組換えベクター、および組換えベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。
【００３７】
本発明において、遺伝子は、配列番号９〜１５の任意の１つのヌクレオチド配列で表されることによって特徴付けられうる。
【００３８】
本書において用いられる用語「ベクター」は、ＤＮＡ配列が、適当な宿主におけるＤＮＡ配列の発現を可能にする適当な調節配列に作動可能に連結されたものを含むＤＮＡコンストラクトをいう。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または単に潜在的ゲノムインサートでありうる。ベクターは適当な宿主に導入されると、宿主のゲノムとは独立に複製および機能しうるか、または場合によってはゲノム自体に一体化されうる。プラスミドは現在最も一般的に用いられる形態のベクターであるので、本明細書において「プラスミド」および「ベクター」はしばしば互換的に用いられる。本発明の目的のために、プラスミドベクターを使用することが好ましい。この目的のために使用することのできる典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞あたり数百のプラスミドベクターが生産されるような効果的な複製を可能にする複製起点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞の選択を可能にする抗生物質耐性遺伝子、および（ｃ）外来ＤＮＡ断片の挿入を可能にする制限酵素切断部位、を含む構造を有する。ベクター中に適当な制限酵素切断部位が存在しない場合でも、従来の方法にしたがって合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用することにより、ベクターと外来ＤＮＡのライゲーションを容易に行うことができる。
【００３９】
本書において用いられる用語「組換えベクター」は、通常、異種ＤＮＡの断片が挿入された組換え担体をいい、組換え担体は一般に、二本鎖ＤＮＡ断片の形態である。ここで、異種ＤＮＡは、宿主細胞において天然には存在しない外来ＤＮＡをいう。組換えベクターは、宿主細胞に導入されると、ベクターおよびそれに挿入された（異種）ＤＮＡの複数コピーが生産されうるように、宿主染色体ＤＮＡとは独立に複製することができる。
【００４０】
ライゲーションの後、遺伝子または組換えベクターによって、宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションがなされる。この「形質転換」または「トランスフェクション」のために、異種核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を原核または真核宿主細胞に導入するのに一般に用いられるいくつかの種類のさまざまな方法を用いうる。その例には、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、およびリポフェクションがある。
【００４１】
当分野において知られるように、宿主細胞における導入された遺伝子の発現レベルを高めるために、関心の遺伝子を、選択された発現宿主において機能を発揮する転写または翻訳発現調節配列に、作動可能に連結すべきである。
【００４２】
本書において、用語「形質転換」とは、ＤＮＡが宿主に、染色体外因子として、または染色体との一体化によって複製されうるように導入されることをいう。当然、本発明の遺伝子配列の発現において、すべてのベクターが等しく機能するわけではないことを理解すべきである。同様に、同じ発現系に関してすべての宿主が等しく機能するわけではない。しかしながら、当業者は、過度の実験を必要とせず本発明の範囲から外れることなく、さまざまなベクター、発現調節配列、および宿主のなかから適当なものを選択することができる。例えば、ベクターは、宿主の中で複製しなければならないから、宿主を考慮して選択されなければならない。これに関して、ベクターのコピー数、そのコピー数制御能力、およびベクターによりコードされる他のタンパク質の発現も考慮しなければならない。
【００４３】
本発明において、形質転換される宿主細胞は、好ましくは、動物細胞、植物細胞、酵母、大腸菌および昆虫細胞からなる群から選択されるが、それに限定されない。
【００４４】
特に、本発明において、形質転換される宿主細胞として用いられる微生物として、それが生体に適用されるとき無毒または弱毒微生物である限り、任意の微生物を使用しうる。その例は、グラム陰性細菌、例えば大腸菌、サルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、ビブリオ・コレレ（Vibrio cholerae）、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）およびシゲラ属；ならびにグラム陽性細菌、例えばバシラス属、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属、スタフィロコッカス属、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）およびストレプトコッカス属を包含しうる。その好ましい例は、可食微生物である乳酸菌を包含しうる。しかしながら、微生物はそれに限定されない。
【００４５】
乳酸菌は、ラクトバシラス属、ストレプトコッカス属、およびビフィドバクテリウム属を包含しうる。ラクトバシラス属の例は、ラクトバシラス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバシラス・デルブリッキィ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバシラス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバシラス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバシラス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）およびラクトバシラス・カゼイ（Lactobacillus casei）を包含しうる。ストレプトコッカス属の例は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophiles）を包含しうる。ビフィドバクテリウム属の例は、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）およびビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）を包含しうる。ラクトバシラス・カゼイがより好ましい。しかしながら、乳酸菌はそれに限定されない。
【００４６】
微生物は、真菌、例えばアスペルギルス属、酵母、例えばピキア酵母、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス属、およびアカパンカビを包含する真核細胞、他の低級真核細胞、および高級真核細胞、例えば昆虫由来の細胞であってもよい。
【００４７】
微生物は、植物または哺乳動物由来でありうる。その好ましい例は、サル腎細胞（ＣＯＳ−７細胞）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｗ１３８、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＭＤＣＫ、ミエローマ細胞株、ＨｕＴ７８細胞、およびＨＥＫ２９３細胞株を包含し得、ＣＨＯ細胞が好ましい。しかしながら、微生物はそれに限定されない。
【００４８】
本発明のさらなる一側面において、宿主細胞を培養するステップを含む、水痘・帯状疱疹ウイルス抗原を生産する方法が提供される。
【００４９】
水痘・帯状疱疹ウイルス抗原を発現することのできる組換えベクターが宿主細胞に導入された場合、宿主細胞を、その中で抗原が発現されるのに十分な期間、またはより好ましくは宿主細胞が培養されている培地中に抗原が分泌されるのに十分な期間培養することによって抗原を生産しうる。
【００５０】
いくつかの場合に、発現された抗原は宿主細胞から単離され均一に精製されうる。抗原の単離または精製は、従来のタンパク質単離および精製方法、例えばクロマトグラフィーによって行いうる。クロマトグラフィーの例は、プロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムを含むアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性クロマトグラフィーを包含しうる。前記クロマトグラフィーに加えて、濾過、限外濾過、塩析、透析等をさらに組み合わせることによって抗原を単離および精製しうる。
【００５１】
本発明の他の一側面において、水痘・帯状疱疹ウイルス抗原バリアントを有効成分として含む、水疱または帯状疱疹を予防または治療するためのワクチン組成物が提供される。
【００５２】
本発明の他の一側面において、水痘・帯状疱疹ウイルス抗原バリアントを有効成分として含むワクチン組成物を用いる、水疱または帯状疱疹を予防または治療する方法が提供される。
【００５３】
本発明の他の一側面において、水疱または帯状疱疹を予防または治療するための、水痘・帯状疱疹ウイルス抗原バリアントを有効成分として含むワクチン組成物の使用が提供される。
【００５４】
本発明の他の一側面において、水疱または帯状疱疹を予防または治療するための医薬の製造のための、抗原バリアントを有効成分として含むワクチン組成物の使用が提供される。
【００５５】
本書において、用語「予防」とは、ある状態または疾患を有すると診断されておらず、そのような状態または疾患を有する可能性のある対象において、該状態または疾患の発症を阻止することを意味する。
【００５６】
本書において、用語「治療」とは、（ａ）状態もしくは疾患またはその症状の進行を抑制すること；（ｂ）状態もしくは疾患またはその症状を軽減すること；または（ｃ）状態もしくは疾患またはその症状を解消することを意味する。本発明の組成物は、水痘・帯状疱疹ウイルス感染によって引き起こされる疾患である水痘または帯状疱疹を患う個体において、水痘・帯状疱疹ウイルスに対する免疫反応を活性化し、それによって該疾患の進行を抑制し、該疾患を解消し、または該疾患の症状を軽減するように機能する。したがって、本発明の組成物は、それ自体水痘または帯状疱疹の処置用の組成物でありうるか、または他の薬理成分との組み合わせとして投与される疾患の補助処置として適用されうる。
【００５７】
したがって、本書において、用語「治療（または処置）」または「治療剤（または処置剤）」は、「補助的治療（または補助的処置）」または「補助的治療剤（または補助的処置剤）」の意味をも含む。
【００５８】
本書において、用語「有効成分」とは、患者において水痘・帯状疱疹ウイルスに対する免疫反応を誘導または増強すること、水痘・帯状疱疹ウイルスに感染したかまたは生水痘・帯状疱疹ウイルスワクチンが投与された患者において該ウイルスの再活性化を阻止、軽減または解消すること、帯状疱疹（ＨＺ）および／または帯状疱疹後神経痛（ＰＨＮ）を抑制すること、およびＨＺおよび／またはＰＨＮの重篤度または期間を縮小すること、を包含するがそれに限定されない所望の効果をもたらすのに十分なワクチン組成物をいう。当業者は、そのような所望の効果のレベルはさまざまでありうることを理解する。
【００５９】
本書において、用語「免疫反応」とは、細胞性（Ｔ細胞）免疫反応および／または抗体（Ｂ細胞）反応をさす。
【００６０】
本発明のワクチン組成物は、健常個体、および造血細胞移植（ＨＣＴ）もしくは固形臓器移植（ＳＯＴ）を受けた免疫低下患者、ＨＩＶ感染患者、自己免疫疾患患者および血液癌個体；広範な固形悪生物のための化学療法を受ける個体；関節リウマチ（ＲＡ）、全身性ループス（ＳＬＥ）、クローン病、乾癬および多発性硬化症を包含する広範な状態のための長期免疫抑制治療を受ける患者を包含するがそれに限定されない免疫正常および免疫低下患者の集団において、水痘および／またはＨＺおよび／またはＰＨＮを予防するため、または水痘および／またはＨＺおよび／またはＰＨＮの重篤度または期間を低減するために有用である。
【００６１】
本発明において、ワクチン組成物は、薬学的に許容しうる担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことによって特徴付けられうる。
【００６２】
本発明のワクチン組成物は、本発明が関係する技術分野の専門家が容易に実施しうる方法にしたがう、薬学的に許容しうる担体および／または賦形剤を用いる製剤化によって、単位用量形態で調製されうるか、または多回用量の容器に入れられた形態で調製されうる。ここで、投与形態は、従来の方法にしたがって、経口製剤、例えば散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤およびエーロゾル剤、外用製剤、坐剤、および無菌注射用溶液剤の形態で調製され、使用されうる。当分野で知られる適当な製剤は、Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PAに記載されるものでありうる。
【００６３】
固体の経口投与用製剤は、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤等を包含し、このような固体製剤は、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトースおよびゼラチンといった賦形剤少なくとも１つとの混合によって調製される。単なる賦形剤に加えて、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクといった滑沢剤も固体製剤に用いられる。
【００６４】
液体の経口投与用製剤は、懸濁剤、経口液剤、乳剤、シロップ剤等を包含し、このような液体製剤は、一般的に用いられる単なる希釈剤である水および流動パラフィンに加えて、湿潤剤、甘味剤、香料および保存剤といったさまざまな添加剤を含有しうる。
【００６５】
非経口投与用製剤は、無菌水溶液剤、非水性溶媒剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤を包含する。坐剤用の基剤としては、ウイテップゾール、マクロゴール、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン、グリセロゼラチン等を使用しうる。
【００６６】
本発明において、ワクチン組成物は、アジュバントをさらに含むことによって特徴付けられうる。一般に免疫反応はタンパク質抗原のみでは強くは誘導されず、したがって、ワクチン組成物の効果はアジュバントとの混合によって増強される。
【００６７】
本書において、用語「アジュバント」とは、免疫細胞の初期活性化プロセスにおいて抗原に対する免疫反応を非特異的に促進する、薬剤、分子等を包含する物質をさし、各物質は宿主に対して免疫原ではなく、免疫系の細胞の活動を高めることによって免疫を増強する（Warren et al., Annu. Rev. Immunol, 4:369, 1986）。本発明において用いられる、免疫反応を増強することのできるアジュバントは、ワクチン組成物と同時に投与しうるか、または時間を置いて順次投与しうる。
【００６８】
本発明のアジュバントは、カルシウムホスフェートヒドロキシド、鉱油、スクワレン、トール様受容体（ＴＬＲ）アンタゴニスト、界面活性剤、リポソーム、サポニン、サイトカイン、およびその組み合わせからなる群から選択されることによっ特徴付けられうるが、それに限定されない。
【００６９】
本発明のさらなる一側面において、処置有効量のワクチン組成物を患者に投与するステップを含む、患者の疾患または障害を治療または予防する方法が提供される。
【００７０】
本発明のワクチン組成物の適当な用量は、対象における適当な免疫反応の観察を伴う標準的な試験によって決定することができる。初回のワクチン接種の後、対象を、適当な間隔を置いた１回または複数回の追加免疫に付しうる。
【００７１】
本発明のワクチン組成物の適当な用量は、調製方法、投与方法、患者の年齢、体重、性別、病理学的状態、食餌、投与時間、投与経路、排出速度、および応答感受性といった因子によって異なり、当業者による上記因子の考慮によって適当に決定されうる。
【００７２】
本発明のワクチン組成物は、医薬の分野において一般的に用いられる経路で投与されうる。非経口投与が好ましく、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経口、心臓内、脊髄内、硬膜内、経皮、腸内、皮下、舌下または局所外用の経路で投与されうる。本発明のワクチン組成物は全般に、有効成分として本発明の水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントを処置有効量で含むことによって特徴付けられうる。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。実施例は、単に説明を目的とするものであって、本発明の範囲が実施例によって制限されると解釈されないことは当業者には明らかであろう。
【実施例１】
【００７４】
実施例１：表面タンパク質（ｇＥ）コンストラクトの作製
表面タンパク質（ｇＥ）コンストラクトを作製するために、ＰＣＲを行って所望のｇＥ断片を得た。次いで、各ｇＥ断片を制限酵素で切断してｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入した。ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入されたｇＥ断片の配列をシーケンシングによって確認した。配列確認したｇＥ断片を含むｐｃＤＮＡ３．１のＤＮＡを、midiprepによって得た。表面タンパク質（ｇＥ）断片のアミノ酸配列を表１に示す。
【００７５】
【表１】
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【実施例２】
【００７６】
実施例２：一過性トランスフェクション
ｇＥ断片の発現レベルを調べるために、２９３細胞への一過性トランスフェクションを、リポフェクタミン３０００を用いて行った。６ウェルプレートの各ウェルに５×１０５の細胞を入れ、培養を行った。翌日に、トランスフェクション用のサンプルを調製した。０．２μｇのＤＮＡおよび０．４μｇのＰ３０００をチューブに入れ、１２５μｌのｏｐｔｉＭＥＭで希釈し、別のチューブに３．７５μｌのリポフェクタミン３０００を入れ、１２５μｌのｏｐｔｉＭＥＭで希釈した。希釈ＤＮＡを、同量の希釈リポフェクタミン３０００の入ったチューブに入れた。次いで、室温で１０分間混合しながらチューブをインキュベートして、ＤＮＡ−リポフェクタミン混合物を調製した。インキュベーションの終了後、ＤＮＡ−リポフェクタミン混合物を、２９３細胞の入った６ウェルプレートに加え、ＣＯ２インキュベーター内で２日間培養を行った。培養の終了後、上清を取り、そこにｂ−メルカプトエタノールを含む４倍のサンプルバッファーを加え、１００℃に５分間加熱した。加熱後、得られたものを、ウエスタンブロットを行うまで凍結保存した。
【実施例３】
【００７７】
実施例３：ウエスタンブロット
ｇＥ断片の発現レベルを比較するために、ウエスタンブロットを行った。各サンプルをＮｕＰＡＧＥ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにかけ、その後ＰＶＤＦ膜に転写した。膜を５％スキムミルクで１時間ブロックし、モノクローナルｇＥ抗体（１μｇ／ｍｌ）と２時間インキュベートし、ＴＢＳＴ（ツイーン０．０５％）で洗った後、５０００倍希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰと共に１時間インキュベートした。インキュベートした膜をＴＢＳＴで洗った後、ＥＣＬ基質を用いて発光させた。Chemidoc装置を用いて検出を行った。ウエスタンブロットを行った結果、図３に示すように、抗原ｇＥ５３４ａａ、ｇＥ５３７ａａおよびｇＥ５４０ａａが特に高い発現レベルを示したことがわかった。
【実施例４】
【００７８】
実施例４：GlaxoSmithKline Biologicals SAの水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原との発現レベル比較
現在市販されているGlaxoSmithKline Biologicals SAの水痘・帯状疱疹ウイルスワクチンであるShingrixに含まれる表面タンパク質抗原（ＧＳＫ ｇＥ５４６ａａ）と本発明者が作製した抗原（ｍｏｇａｍ ｇＥ５３７ａａ）とを発現レベルに関して比較するために、実施例３に記載したのと同じ方法でウエスタンブロットを行った。GlaxoSmithKline Biologicals SAのShingrixに含まれる表面タンパク質抗原（ＧＳＫ ｇＥ５４６ａａ）と本発明者が作製した抗原（ｍｏｇａｍ ｇＥ５３７ａａ）との相異を表２に示す。ウエスタンブロットを行った結果、図４に示すように、本発明者が作製した抗原はGlaxoSmithKline Biologicals SAの表面タンパク質抗原よりも高い発現レベルを示したことがわかった。
【００７９】
【表２】
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【実施例５】
【００８０】
実施例５：GlaxoSmithKline Biologicals SAの水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原との免疫原性比較
現在市販されているGlaxoSmithKline Biologicals SAの水痘・帯状疱疹ウイルスワクチンであるShingrixに含まれる表面タンパク質抗原（ＧＳＫ ｇＥ５４６ａａ）と本発明者が作製した抗原（ｍｏｇａｍ ｇＥ５３７ａａ）とを免疫原性に関して比較するために、動物実験を行った。人類は水痘感染歴を有するという観点から、マウスにおいて水痘感染を模すために、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、弱毒生ワクチン（ＬＡＶ、３０００ｐｆｕ）を１回皮下注射することによる初回免疫（ＬＡＶプライミング）に付した。ＬＡＶプライミング（０日目）から２８日後に、マウスを、アジュバントを用いるかまたは用いずにｍｏｇａｍ ｇＥまたはＧＳＫ ｇＥ抗原組成物を筋肉内注射することによる２回目の免疫に付した。ｇＥに対する液性免疫反応を評価するために、ＬＡＶプライミングから４２日後（４２日目）に血液サンプルを採取し、ｇＥまたはＶＺＶに対する細胞性免疫反応（ＣＭＩ）を評価するために、ＬＡＶプライミングから４２日後（４２日目）に脾臓サンプルから白血球を採取した。免疫日ならびに血液および脾臓サンプル採取日は、ＬＡＶプライミング日を０日目として数えた。動物実験方法の概要を表３に示す。
【００８１】
【表３】
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【００８２】
実施例５−１：液性免疫反応の比較
初回および２回目の免疫を行った後、ｇＥ抗原特異的ＩｇＧ力価を測定するために酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。組換えｇＥタンパク質（１μｇ／ｍｌ）をＥＬＩＳＡプレートに適用し、４℃で一晩インキュベートして、該タンパク質抗原をプレート上にコートした。抗原をコートした各ＥＬＩＳＡプレートを３回洗い、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で１時間ブロックした。ＢＳＡによるブロッキング反応の終了後、ＥＬＩＳＡプレートを洗った。その後、そこに希釈血清サンプルを加え、２時間インキュベートした。そこに、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｃ抗体を加え、１時間インキュベートした。最後のインキュベーションの後、ＥＬＩＳＡプレートを洗い、ＨＲＰ基質である３,３',５,５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、ＫＰＬ製）の添加によりＨＲＰ反応を誘導した。その後、ＴＭＢ停止液を加えてＨＲＰ反応を停止し、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Spectramax 250, Molecular Device）を使用して４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定することにより、産生された抗体の量を調べた。結果として、図５に示すように、本発明者が作製した抗原（ｍｏｇａｍ ｇＥ５３７ａａ）およびアジュバントを含むＧ６が最も高い発光強度を示したことがわかった。この結果から、Ｇ６において最も高い液性免疫反応が誘導されたことがわかった。
【００８３】
実施例５−２：細胞性免疫反応の比較
初回および２回目の免疫を行った後、抗原刺激によってＴ細胞から分泌される代表的なサイトカインであるＩＦＮ−γの分泌量を調べるためにＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡを行った。マウスから採取した白血球をＶＺＶ溶解物で３日間刺激した。次いで、遠心分離を行って上清を取得し、上清をマウスＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。ＩＦＮ−γ捕捉抗体（４μｇ／ｍｌ）をＥＬＩＳＡプレートに適用し、室温で一晩インキュベートしてＩＦＮ−γ捕捉抗体をプレート上にコートした。抗体でコートした各ＥＬＩＳＡプレートを３回洗った後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで１時間ブロックした。ＢＳＡによるブロッキング反応の終了後、ＥＬＩＳＡプレートを洗った。次いでそこに、白血球刺激後に取得した上清を加え、室温で２時間インキュベートした。インキュベーションの終了後、ＥＬＩＳＡプレートを洗い、ビオチン化マウスＩＦＮ−γ検出抗体（４００ｎｇ／ｍｌ）と室温で２時間インキュベートした。洗浄を行った後、ストレプトアビジン−ＨＲＰとのさらに２０分間のインキュベーションを行った。最後にインキュベートしたＥＬＩＳＡプレートを洗い、次いで基質溶液と室温で２０分間反応させた。そこに停止溶液を加えて反応を停止させ、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Spectramax 250, Molecular Device）を用いて４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定することにより、産生されたＩＦＮ−γサイトカインの量を調べた。結果として、図６に示すように、本発明者が作製した抗原（ｍｏｇａｍ ｇＥ５３７ａａ）およびアジュバントを含むＧ６が最も多いＩＦＮ−γサイトカイン量を示したことがわかった。この結果から、Ｇ６において最も高い細胞性免疫反応が誘導されたことがわかった。
【実施例６】
【００８４】
実施例６：ｇＥ抗原断片の抗原特異的免疫原性の確認
実施例６−１：抗原生産のための一過性トランスフェクション
ｇＥ断片を発現させるために、２９３細胞への一過性トランスフェクションを、Expifectamine（商標）293トランスフェクションキットを用いて行った。細胞を２×１０６細胞／ｍｌで１２５ｍｌフラスコに入れ、培養した。翌日に、トランスフェクションを実施した。２９３細胞を２．９×１０６細胞／ｍｌに希釈して全量２５．５ｍｌとし、トランスフェクション用調製物を調製した。３０μｇのＤＮＡを１５ｍｌチューブに入れ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを用いて１．５ｍｌに調節した。このようにして調製物１を調製した。８１μｌのExpiFectamine（商標）293試薬を別の１５ｍｌチューブに入れ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを用いて１．５ｍｌに調節した。このようにして調製物２を調製した。室温で５分間インキュベートした。５分後、調製物２の入ったチューブに調製物１を加え、混合した。その後、チューブを室温で２０分間インキュベートして、ＤＮＡ−脂質調製物を調製した。インキュベーションの終了後、ＤＮＡ−脂質調製物を、２９３細胞の入った１２５ｍｌフラスコに加え、インキュベーター内で培養を行った。２０時間後にエンハンサーによる処理を行った。１５０μｌのExpiFectamine（商標）293トランスフェクションエンハンサー１を１．５ｍｌチューブに入れ、そこにExpiFectamine（商標）293トランスフェクションエンハンサー２を１．５ｍｌまで加えた。その後、得られたものを２９３細胞に加え、インキュベーター内で５日間インキュベートした。５日後、培養物上清を取得し、０．４５μｍフィルターで濾過し、精製を行うまで凍結保存した。
【００８５】
実施例６−２：抗原取得のための精製
凍結保存した培養液を解凍し、培養液に等量のＰＢＳを加えた。０．２２μｍフィルターで濾過し、陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出液に５Ｍ ＮａＣｌを加え、疎水性相互作用クロマトグラフィーを行った。クロマトグラフィーからの溶出液を０．２２μｍフィルターで濾過し、動物実験を行うまで凍結保存した。
【００８６】
実施例６−３：免疫
ｇＥ抗原断片の免疫原性を調べるために動物実験を行った。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにｇＥ抗原断片を２週間の間隔を置いて筋肉内注射し、２回目の免疫の２週間後にマウスから血液サンプルを採取した。採取した血液サンプルから血清を分離し、抗体力価を測定するまで凍結保存した。
【００８７】
実施例６−４：抗原特異的ＩｇＧ力価および応答体の測定
抗原特異的ＩｇＧ力価を測定するために酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。ＶＺＶ表面タンパク質（１μｇ／ｍｌ）をＥＬＩＳＡプレートにコートし、４℃で一晩インキュベートし、各ＥＬＩＳＡプレートを３回洗った。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で１時間ブロックした。ＥＬＩＳＡプレートを洗った。次いでそこに、希釈した血清サンプルを加え、２時間インキュベートした。そこに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を加え、１時間インキュベートした。最後のインキュベーションの後、ＥＬＩＳＡプレートを洗い、基質である３,３',５,５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加えてＨＲＰ反応を誘導した。その後、そこにＥＬＩＳＡ停止溶液を加えてＨＲＰ反応を停止させ、分光計を用いて４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定した。
【００８８】
ｇＥ抗原断片の配列の違いが抗原特異的免疫原性に差をもたらすかを調べるために、実施例６−３に記載した方法で動物を免疫した。前記抗体力価測定方法にしたがって、動物実験において得た血清を用いて抗原特異的抗体力価を測定した。結果として、図７に示すように、ｇＥ５３４ａａまたはｇＥ５４３ａａで免疫した場合のＯＤ値は、ｇＥ５００ａａ、ｇＥ５１０ａａ、ｇＥ５２５ａａまたはｇＥ５４６ａａで免疫した場合のＯＤ値よりも高かった。
【００８９】
抗体力価測定後、ＯＤ値が０．６以上であった個体を応答体とみなし、結果をまとめた。結果として、ｇＥ５００ａａについては抗原特異的応答体は無く、ｇＥ５１０ａａで免疫した場合の応答体数はｇＥ５４６ａａで免疫した場合と同じであった。ｇＥ５２５ａａ、ｇＥ５３４ａａ、ｇＥ５３７ａａまたはｇＥ５４０ａａで免疫した場合の応答体数は、ｇＥ５１０ａａまたはｇＥ５４６ａａで免疫した場合の応答体数よりも多かった。したがって、応答体数はｇＥ５２５ａａ〜ｇＥ５４０ａａついて特に多かったことが確認された（図８）。
【００９０】
結果として、ｇＥ５３４ａａ〜ｇＥ５４０ａａが抗体力価測定において特に高い値を示し、ｇＥ５２５ａａ〜ｇＥ５４３ａａが特に多い抗原特異的応答体数を示した。したがって、上記２つの結果を考え合わせると、ｇＥ５３４ａａ〜ｇＥ５４０ａａが特に高い免疫原性を示すということができる。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明の水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質（ｇＥ）抗原バリアントは、タンパク質抗原である。ワクチン組成物として使用される場合、抗原バリアントは生ウイルスワクチンと比較して、高い安全性、および宿主細胞における高い発現レベルを示す。したがって、そのような抗原バリアントは水痘・帯状疱疹ウイルスによって引き起こされる水痘または帯状疱疹の予防または治療用のワクチンとして有用である。
【００９２】
上記のとおり、本発明の特定の部分を詳細に説明した。しかしながら、そのような特定の記載は単に好ましい態様を説明するものであって、本発明の範囲がそれに限定されるものではないことは、当業者に明らかである。したがって、本発明の実際の範囲は、特許請求の範囲およびその等価物によって限定される。
【００９３】
［配列表フリーテキスト］
添付の電子ファイル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年2月12日(2021.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列で表される水痘・帯状疱疹表面タンパク質（ｇＥ）抗原の５２５番目〜５４３番目のアミノ酸残基からなる群から選択される任意の１つのアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションであるバリエーションを含む、水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアント。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列における４０番目のアミノ酸残基がスレオニンである、請求項１に記載の水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアント。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列における５３６番目のアミノ酸残基がロイシンである、請求項１に記載の水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアント。
【請求項４】
該抗原バリアントが配列番号２〜８および配列番号２１〜２３の任意の１つのアミノ酸配列で表される、請求項１に記載の水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアント。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載される水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントをコードする遺伝子。
【請求項６】
該遺伝子が配列番号９〜１５の任意の１つのヌクレオチド配列で表される、請求項５に記載の遺伝子。
【請求項７】
請求項５に記載される遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載される組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載される水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントを有効成分として含む、水疱または帯状疱疹を予防または治療するためのワクチン組成物。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載される水痘・帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントを有効成分として含むワクチン組成物の、水疱または帯状疱疹の予防または治療用医薬の製造のための使用。
【国際調査報告】
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