(57)【要約】【課題】本発明は、Ｌ−アスパラギナーゼを用いた疾患の治療法に関する。【解決手段】実質的なＬ−アスパラギンアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との複合体を有効量で投与することを含む、患者におけるＬ−アスパラギン枯渇により治療可能な疾患の治療法であって、ポリエチレングリコールが、分子量が約５０００Ｄａ以下であり、タンパク質が、Ｅｒｗｉｎｉａ属由来のＬ−アスパラギナーゼである、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的なＬ−アスパラギンアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との複合体を有効量で投与することを含む、患者におけるＬ−アスパラギン枯渇により治療可能な疾患の治療法であって、前記ポリエチレングリコールは、分子量が約５０００Ｄａ以下であり、前記タンパク質は、Ｅｒｗｉｎｉａ属由来のＬ−アスパラギナーゼである、前記方法。
【請求項２】
前記Ｌ−アスパラギナーゼは、配列番号１のアミノ酸に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複合体は、配列番号１のアミノ酸に対して１００％配列同一性を有するＥｒｗｉｎｉａ属由来のＬ−アスパラギナーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＥＧは、分子量が約５０００Ｄａ、４０００Ｄａ、３０００Ｄａ、２５００Ｄａ、または２０００Ｄａである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記複合体は、ＰＥＧと複合体形成していない場合の前記Ｌ−アスパラギナーゼと比較して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記複合体は、ＰＥＧと複合体形成していない場合の前記Ｌ−アスパラギナーゼよりも少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍強力なＬ−アスパラギン枯渇活性を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記複合体は、少なくとも約１２、２４、４８、９６、１０８、または１２０時間、血漿Ｌ−アスパラギンレベルを検出不能レベルまで激減させる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記複合体は、ＰＥＧと複合体形成していない場合の前記Ｌ−アスパラギナーゼよりも長いｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記複合体は、等価なタンパク質用量で投与されたペグアスパラガーゼよりも長いｔ１／２を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複合体は、マウスでｉｖ投与後に、タンパク質含有量基準で約５０μｇ／ｋｇの用量で少なくとも約５８〜約６５時間のｔ１／２、及びタンパク質含有量基準で約１０μｇ／ｋｇの用量で少なくとも約３４〜約４０時間のｔ１／２を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記複合体は、約１０，０００〜約１５，０００ＩＵ／ｍ２（約２０〜３０ｍｇタンパク質／ｍ２）の範囲の用量で少なくとも約１００〜約２００時間のｔ１／２を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複合体は、ＰＥＧと複合体形成していない場合の前記Ｌ−アスパラギナーゼよりも大きい曲線下面積（ＡＵＣ）を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記複合体は、等価なタンパク質用量で、ペグアスパラガーゼより少なくとも約３倍大きい平均ＡＵＣを有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＥＧは、前記Ｌ−アスパラギナーゼの１つまたは複数のアミノ基と共有結合している、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＥＧは、アミド結合により前記１つまたは複数のアミノ基と共有結合している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＥＧは、接近可能なアミノ基のうち少なくとも約４０％〜約１００％、または全アミノ基のうち少なくとも約４０％〜約９０％と共有結合している、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記複合体は、以下の式：
Ａｓｐ−［ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ］ｎ
式中、Ａｓｐは、前記Ｌ−アスパラギナーゼであり、ＮＨは、前記Ａｓｐのリシン残基及び／またはＮ末端のＮＨ基のうちの１つまたは複数であり、ＰＥＧは、ポリエチレングリコール部分であり、ｎは、前記Ａｓｐの接近可能なアミノ基のうち少なくとも約４０％〜約１００％を表す数字であり、ならびにｘは、約１〜約８の範囲の整数である、
を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＥＧは、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
疾患は、がんである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記がんは、リンパ腫、大細胞型免疫芽球性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＮＫリンパ腫、ホジキン病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性Ｔ細胞白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、二重表現型Ｂ細胞骨髄単球性白血病、及び慢性リンパ性白血病からなる群より選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
疾患は、腎細胞癌、腎細胞腺癌、多形性膠芽腫及び星細胞腫を含む神経膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、横紋筋肉腫、悪性黒色腫、類表皮癌、扁平上皮癌、肺大細胞癌及び小細胞肺癌を含む肺癌、子宮内膜癌、卵巣腺癌、卵巣奇形癌、子宮頸部腺癌、乳癌、乳腺癌、乳管癌、膵臓腺癌、膵管癌、結腸癌、結腸腺癌、結腸直腸腺癌、膀胱移行上皮癌、膀胱乳頭腫、前立腺癌、骨肉腫、骨の類上皮癌、前立腺癌、及び甲状腺癌からなる群より選択される、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記複合体は、約５Ｕ／ｋｇ体重〜約５０Ｕ／ｋｇ体重の量で投与される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記複合体は、約１０，０００〜約１５，０００ＩＵ／ｍ２の範囲の用量で投与される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記投与は、静脈内または筋肉内投与であり、及び週に１回、週に２回、または週に３回である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記複合体は、単剤療法として投与される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記複合体は、併用療法の一部として投与される、請求項１２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記複合体は、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）、ダウノルビシン、シタラビン、Ｖｙｘｅｏｓ（登録商標）、ＡＢＴ−７３７、ベネトクラクス、ダクトリシブ、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ビンクリスチン、プレドニゾロン、エベロリムス、及び／またはＣＢ−８３９を用いる併用療法の一部として投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
治療を受ける前記患者は、Ｅ．ｃｏｌｉ種アスパラギナーゼまたはそのＰＥＧ化体あるいはＥｒｗｉｎｉａ属アスパラギナーゼに対して以前に過敏症を発症したことがある、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
治療を受ける前記患者は、疾患再発、特に、Ｅ．ｃｏｌｉ種アスパラギナーゼまたはそのＰＥＧ化体を用いた治療後に再発を起こしたことがある、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、実質的なＬ−アスパラギンアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質とポリエチレングリコールとの複合体、詳細には、ポリエチレングリコールは分子量が約５０００Ｄａ以下であり、詳細には、タンパク質はＥｒｗｉｎｉａ属由来のＬ−アスパラギナーゼである複合体、及び治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アスパラギンアミノヒドロラーゼ活性を持つタンパク質は、一般に、Ｌ−アスパラギナーゼとして知られるが、これらは、長年にわたり小児での急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療に使用されており、成功を収めている。ＡＬＬは、最も一般的な小児悪性腫瘍である（Ａｖｒａｍｉｓ  ａｎｄ  Ｐａｎｏｓｙａｎ，  （２００５）  ４４：３６７−３９３）。
【０００３】
Ｌ−アスパラギナーゼは、ホジキン病、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ肉腫、細網肉腫、及び黒色肉腫の治療にも使用されてきた（Ｋｏｔｚｉａ  （２００７）  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２７，  ６５７−６６９）。Ｌ−アスパラギナーゼの抗腫瘍活性は、ある種の悪性細胞ではＬ−アスパラギン合成能力が無いまたは低いことによると思われる（Ｋｏｔｚｉａ  （２００７）  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２７，  ６５７−６６９）。こうした悪性細胞は、Ｌ−アスパラギンの細胞外からの供給に依存する。しかしながら、Ｌ−アスパラギナーゼ酵素は、Ｌ−アスパラギンをアスパラギン酸及びアンモニアへと加水分解する反応を触媒し、それによりＬ−アスパラギンの循環プールを枯渇させて、Ｌ−アスパラギンなしではタンパク質合成を行うことができない腫瘍細胞を殺傷する（Ｋｏｔｚｉａ  （２００７）  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２７，  ６５７−６６９）。
【０００４】
Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＬ−アスパラギナーゼは、ＡＬＬ治療に使用された初めての酵素薬であり、米国ではＥｌｓｐａｒ（登録商標）として、欧州ではＫｉｄｒｏｌａｓｅ（登録商標）及びＬ−アスパラギナーゼＭｅｄａｃ（登録商標）として販売されている。Ｌ−アスパラギナーゼは、他の微生物からも単離されており、例えば、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のＬ−アスパラギナーゼタンパク質は、クリサンタスパーゼと名付けられ、Ｅｒｗｉｎａｓｅ（登録商標）として市販されている（Ｗｒｉｓｔｏｎ  （１９８５）  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １１３，  ６０８−６１８；Ｇｏｗａｒｄ  （１９９２）  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ２，  ３３５−３４１）。Ｅｒｗｉｎｉａ属の他の種由来のＬ−アスパラギナーゼも同定されており、例えば、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ  ３９３７（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＳ６７０２８）、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ  ＮＣＰＰＢ  １１２５（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＣＡＡ３１２３９）、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＰ９２６６６）、及びＥｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｓｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＳ６７０２７）が挙げられる。こうしたＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ種Ｌ−アスパラギナーゼは、互いに約９１〜９８％のアミノ酸配列同一性を有するが、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ種Ｌ−アスパラギナーゼが、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ種Ｌ−アスパラギナーゼに対して有するアミノ酸配列同一性は、約７５〜７７％である（Ｋｏｔｚｉａ  （２００７）  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２７  ６５７−６６９）。
【０００５】
現在利用可能なＬ−アスパラギナーゼ製剤は、特にＡＬＬの治療に関して、高い触媒活性ならびに大幅に改善された薬理及び薬物動態特性、ならびに低下した免疫原性を特徴とする代替療法も補完療法も提供しない。
【０００６】
１つの態様において、本発明が解決しようとする課題は、以下を備えたＬ−アスパラギナーゼ製剤を提供することである：高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ生理活性、安定したＰＥＧ−タンパク質結合、長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、大幅に低下した免疫原性、これは、例えば、繰り返し投与後のＬ−アスパラギナーゼ製剤に対する抗体反応の低減または排除により裏付けられる、及び第一選択治療、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｌ−アスパラギナーゼを使用する治療に対して感受性を発現してしまった患者のための第二選択治療としての有用性。
【０００７】
この課題は、修飾Ｌ−アスパラギナーゼ製剤との間に顕著な交差反応性を有する（Ｗａｎｇ  （２００３）  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７，  １５８３−１５８８、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される）、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性が大幅に低下している（Ｋｕｃｈｕｍｏｖａ  （２００７）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｍｏｓｃｏｗ）  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ：  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １，  ２３０−２３２、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される）のいずれかである既知のＬ−アスパラギナーゼ複合体では解決されていない。この課題は、Ｅｒｗｉｎｉａ属Ｌ−アスパラギナーゼと親水性重合体、より詳細には、分子量５０００Ｄａ以下のポリエチレングリコールとの複合体、そのような複合体の調製法、及びその複合体の使用を提供することにより、本発明に従って解決される。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、患者においてＬ−アスパラギン枯渇により治療可能な疾患を治療する方法を包含し、本方法は、実質的なＬ−アスパラギンアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との複合体を有効量で投与することを含み、ポリエチレングリコールは、分子量が約５０００Ｄａ以下であり、タンパク質はＥｒｗｉｎｉａ属由来のＬ−アスパラギナーゼである。実施形態によっては、Ｌ−アスパラギナーゼは、配列番号１のアミノ酸に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を有する。実施形態によっては、複合体は、配列番号１のアミノ酸に対して１００％配列同一性を有する、Ｅｒｗｉｎｉａ属由来のＬ−アスパラギナーゼを含む。実施形態によっては、ＰＥＧは、分子量が、約５０００Ｄａ、４０００Ｄａ、３０００Ｄａ、２５００Ｄａ、または２０００Ｄａである。実施形態によっては、複合体は、ＰＥＧと複合体形成していないＬ−アスパラギナーゼと比較して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を有する。実施形態によっては、複合体は、ＰＥＧと複合体形成していないＬ−アスパラギナーゼより、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍強力な、Ｌ−アスパラギン枯渇活性を有する。実施形態によっては、複合体は、少なくとも約１２、２４、４８、９６、１０８、または１２０時間、Ｌ−アスパラギンの血漿レベルを検出不能レベルまで激減させる。実施形態によっては、複合体は、ＰＥＧと複合体形成していないＬ−アスパラギナーゼよりも長いｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期を有する。実施形態によっては、複合体は、等価なタンパク質用量で投与されたペグアスパラガーゼよりも長いｔ１／２を有する。実施形態によっては、複合体は、マウスにｉｖ投与後、タンパク質含有量基準で約５０μｇ／ｋｇの用量で、少なくとも約５８〜約６５時間のｔ１／２を有し、タンパク質含有量基準で約１０μｇ／ｋｇの用量で、少なくとも約３４〜約４０時間のｔ１／２を有する。実施形態によっては、複合体は、約１０，０００〜約１５，０００ＩＵ／ｍ２（約２０〜３０ｍｇのタンパク質／ｍ２）の範囲の用量で、少なくとも約１００〜約２００時間のｔ１／２を有する。実施形態によっては、複合体は、ＰＥＧと複合体形成していないＬ−アスパラギナーゼよりも大きい曲線下面積（ＡＵＣ）を有する。実施形態によっては、複合体は、平均ＡＵＣが、等価なタンパク質用量でのペグアスパラガーゼより少なくとも約３倍大きい。実施形態によっては、ＰＥＧは、Ｌ−アスパラギナーゼの１つまたは複数のアミノ基と共有結合している。実施形態によっては、ＰＥＧは、アミド結合により１つまたは複数のアミノ基と共有結合している。実施形態によっては、ＰＥＧは、接近可能なアミノ基の少なくとも約４０％〜約１００％または全アミノ基の少なくとも���４０％〜約９０％と共有結合している。
【０００９】
本発明の方法は、以下の式を有する複合体の使用を包含し：
Ａｓｐ−［ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ］ｎ
式中、Ａｓｐは、Ｌ−アスパラギナーゼであり、ＮＨは、Ａｓｐのリシン残基及び／またはＮ末端のＮＨ基のうちの１つまたは複数であり、ＰＥＧは、ポリエチレングリコール部分であり、ｎは、Ａｓｐの接近可能なアミノ基のうち少なくとも約４０％〜約１００％を表す数字であり、ｘは、約１〜約８、より詳細には、約２〜約５の範囲の整数である。特定の実施形態において、ＰＥＧは、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
【００１０】
本発明の方法は、１つまたは複数のペプチド（複数可）を含むＬ−アスパラギナーゼ複合体の使用を包含し、各ペプチドは、独立して、ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣであり、式中、（Ｐ／Ａ）は、プロリン及びアラニンアミノ酸残基のみからなるアミノ酸配列であり、式中、ＲＮは、アミノ酸配列のＮ末端アミノ基に結合した保護基であり、式中、ＲＣは、自身のアミノ基を介してアミノ酸配列のＣ末端カルボキシ基に結合したアミノ酸残基であり、各ペプチドは、ペプチドのＣ末端アミノ酸残基ＲＣのカルボキシ基とＬ−アスパラギナーゼの遊離アミノ基から形成されたアミド結合を介してＬ−アスパラギナーゼと複合体形成しており、ならびに式中、ペプチドが結合している遊離アミノ基の少なくとも１つは、Ｌ−アスパラギナーゼのＮ末端α−アミノ基ではない。
【００１１】
本発明の方法は、がん治療のための複合体の使用を包含する。実施形態によっては、がんは、リンパ腫、大細胞型免疫芽球性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＮＫリンパ腫、ホジキン病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性Ｔ細胞白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、二重表現型Ｂ細胞骨髄単球性白血病（ｂｉｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、及び慢性リンパ性白血病からなる群より選択される。
【００１２】
実施形態によっては、疾患は、腎細胞癌、腎細胞腺癌、多形性膠芽腫及び星細胞腫を含む神経膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、横紋筋肉腫、悪性黒色腫、類表皮癌、扁平上皮癌、肺大細胞癌及び小細胞肺癌を含む肺癌、子宮内膜癌、卵巣腺癌、卵巣奇形癌、子宮頸部腺癌、乳癌、乳腺癌、乳管癌、膵臓腺癌、膵管癌、結腸癌、結腸腺癌、結腸直腸腺癌、膀胱移行上皮癌、膀胱乳頭腫、前立腺癌、骨肉腫、骨の類上皮癌、前立腺癌、及び甲状腺癌からなる群より選択される。実施形態によっては、複合体は、約５Ｕ／ｋｇ体重〜約５０Ｕ／ｋｇ体重の量で投与される。
【００１３】
実施形態によっては、複合体は、約１００〜約１５，０００ＩＵ／ｍ２の範囲の用量で投与される。実施形態によっては、投与は、静脈内または筋肉内投与であり、週に１回、週に２回、または週に３回である。実施形態によっては、複合体は、単剤療法として投与される。実施形態によっては、複合体は、併用療法の一部として投与される。実施形態によっては、複合体は、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）、ダウノルビシン、シタラビン、Ｖｙｘｅｏｓ（登録商標）、ＡＢＴ−７３７、ベネトクラクス、ダクトリシブ、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ビンクリスチン、プレドニゾロン、エベロリムス、及び／またはＣＢ−８３９を用いる併用療法の一部として投与される。実施形態によっては、治療を受ける患者は、Ｅ．ｃｏｌｉ種アスパラギナーゼまたはそのＰＥＧ化体に対して、あるいはＥｒｗｉｎｉａ種アスパラギナーゼに対して、以前に過敏症を発症したことがある。実施形態によっては、治療を受ける患者は、疾患再発、特に、Ｅ．ｃｏｌｉ種アスパラギナーゼまたはそのＰＥＧ化体を用いた治療後に再発を起こしたことがある。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｐｅｇクリサンタスパーゼを他の化合物と併用した場合のｉｎ  ｖｉｖｏ実験データを示す。
【図２】ｐｅｇクリサンタスパーゼを他の化合物と併用した場合のｉｎ  ｖｉｖｏ実験データを示す。
【図３】単剤例での用量反応曲線を示す。
【図４】不活性作用剤との混合物例での用量反応曲線を示す。
【図５】単剤例と混合物例との比較データを示す。
【図６】どの薬物併用が相乗的であるかを示す用量中心プロットを示す。
【図７】ＣＮＳ細胞株データを示す。
【図８】ｐｅｇクリサンタスパーゼのＩＣ５０効果を示す。
【図９】ｐｅｇクリサンタスパーゼのＩＣ５０効果を示す。
【図１０】白血病細胞株及びリンパ腫細胞株におけるｐｅｇクリサンタスパーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏ感受性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
細菌起源のＬ−アスパラギナーゼは、高い免疫原性及び抗原性の可能性を有しており、感作された患者において軽度のアレルギー反応からアナフィラキシーショックにまで及ぶ範囲の有害反応を頻繁に誘発する（Ｗａｎｇ  （２００３）  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７，  １５８３−１５８８）。Ｅ．ｃｏｌｉ種Ｌ−アスパラギナーゼは、特に免疫原性が高く、ｉ．ｖ．またはｉ．ｍ．投与後のＥ．ｃｏｌｉ種Ｌ−アスパラギナーゼに対する抗アスパラギナーゼ抗体の存在は、成人で７８％及び小児で７０％もの高さに達することが報告されている（Ｗａｎｇ  （２００３）  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７，  １５８３−１５８８）。
【００１６】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のＬ−アスパラギナーゼとＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のＬ−アスパラギナーゼは、薬物動態特性が異なっており、それぞれ独自の免疫原性プロファイルを有する（Ｋｌｕｇ  Ａｌｂｅｒｔｓｅｎ  （２００１）  Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  １１５，  ９８３−９９０）。そのうえさらに、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＬ−アスパラギナーゼを用いた治療後に発生する抗体は、Ｅｒｗｉｎｉａ属由来のＬ−アスパラギナーゼと交差反応しないことが示されている（Ｗａｎｇ  （２００３）  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７，  １５８３−１５８８）。そのため、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｒｉｓａｎｔａｓｐａｓｅ由来のＬ−アスパラギナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ種Ｌ−アスパラギナーゼに反応する患者におけるＡＬＬの第二選択治療として使用されてきた（Ｄｕｖａｌ  （２００２）  Ｂｌｏｏｄ  １５，  ２７３４−２７３９；Ａｖｒａｍｉｓ  （２００５）  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．  ４４，  ３６７−３９３）。
【００１７】
微生物Ｌ−アスパラギナーゼの投与に関連した免疫原性を低下させる別の試みでは、メトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）で修飾されたＥ．ｃｏｌｉ種Ｌ−アスパラギナーゼが開発されてきた。この方法は、一般的に「ＰＥＧ化」として知られており、タンパク質の免疫原性特性を改変することが示されている（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  （１９７７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２，  ３５７８−３５８１）。このいわゆるｍＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、すなわちペグアスパラガーゼは、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）として販売されているが、米国で１９９４年に第二選択治療として初めて認可され、２００６年から小児及び成人のＡＬＬの第一選択治療として認可されている。Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）は、長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期及び低下した免疫原性／抗原性を有する。
【００１８】
Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）は、複数のリシン残基において５ｋＤａのｍＰＥＧ−スクシンイミジル＝スクシナート（ＳＳ−ＰＥＧ）を用いて修飾されたＥ．ｃｏｌｉ種Ｌ−アスパラギナーゼである（米国特許第４，１７９，３３７号）。ＳＳ−ＰＥＧは、酵素による加水分解または弱アルカリｐＨ値に対して敏感な不安定エステル結合を有する第一世代のＰＥＧ試薬である（米国特許第４，６７０，４１７号）。これらの性質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ両方での安定性を低下させており、薬物安全性を損なう可能性がある。
【００１９】
そのうえさらに、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＬ−アスパラギナーゼに対して発生した抗体は、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）と交差反応する可能性があることが実証された（Ｗａｎｇ  （２００３）  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７，  １５８３−１５８８）。たとえこれらの抗体が中和抗体でなかったとしても、この知見は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの交差過敏症または交差不活性化の高い可能性を明白に実証した。実際、１つの報告では、ペグアスパラガーゼを投与された小児の３０〜４１％でアレルギー反応が起こった（Ｗａｎｇ  （２００３）  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７，  １５８３−１５８８）。
【００２０】
表面化したアレルギー反応の他に、患者が、過敏症反応の臨床エビデンスをまったく示さないまま抗アスパラギナーゼ抗体を発生させる「無症候性過敏症」の問題が、最近報告された（Ｗａｎｇ  （２００３）  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７，  １５８３−１５８８）。この反応は、Ｅ．ｃｏｌｉ種Ｌ−アスパラギナーゼ及びペグアスパラガーゼに対する中和抗体の形成をもたらす可能性がある。しかしながら、これらの患者では、表面化した過敏症兆候がないため、Ｅｒｗｉｎｉａ属Ｌ−アスパラギナーゼへの切り替えが行われず、その結果、これらの患者が受ける有効治療期間は短くなる（Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ  （２００４）  Ｐｅｄｉａｔｒ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２６，  ２７３−２７４）。
【００２１】
Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ種Ｌ−アスパラギナーゼ治療は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｌ−アスパラギナーゼに対する過敏症の事象において使用される場合が多い。しかしながら、Ｅｒｗｉｎｉａ属Ｌ−アスパラギナーゼを投与された患者は、そのうちの３０〜５０％という多さで、抗体陽性になることが観察されている（Ａｖｒａｍｉｓ  （２００５）  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．  ４４，  ３６７−３９３）。そのうえ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ種Ｌ−アスパラギナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ種Ｌ−アスパラギナーゼよりも大幅に短い消失半減期を有するため、より高頻度に投与しなければならない（Ａｖｒａｍｉｓ  （２００５）  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．  ４４，  ３６７−３９３）。Ａｖｒａｍｉｓによる研究では、Ｅｒｗｉｎｉａ属アスパラギナーゼは、薬物動態プロファイルが劣っていた（Ａｖｒａｍｉｓ  （２００７）  Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２９，  ２３９−２４７）。そのため、Ｅ．ｃｏｌｉ種Ｌ−アスパラギナーゼ及びペグアスパラガーゼは、Ｅｒｗｉｎｉａ属Ｌ−アスパラギナーゼよりも優先されるＡＬＬの第一選択治療となっていた。
【００２２】
長年にわたり、多数の生物製剤で、ＰＥＧ化及び製品化が成功している。ＰＥＧとタンパク質をカップリングさせるためには、ＰＥＧをそのＯＨ末端で活性化させなければならない。活性化基は、ＰＥＧ化しようとするタンパク質の利用可能な反応性基に基づいて選択される。タンパク質の場合、最も重要なアミノ酸は、リシン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、Ｃ末端カルボン酸、及びＮ末端アミノ基である。タンパク質における反応性基の広範さを考慮すると、ほぼ全てのペプチド化学反応が、ＰＥＧ部分の活性化に応用されてきている。この活性化ＰＥＧ試薬の例としては、活性化炭酸エステル、例えば、炭酸ｐ−ニトロフェニル、炭酸スクシンイミジルなど、活性エステル、例えば、スクシンイミジルエステルなどがあり、また、部位特異的カップリングのため、アルデヒド及びマレイミドが開発されてきた（Ｈａｒｒｉｓ  （２００２）  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．  ５４，  ４５９−４７６）。ＰＥＧ修飾のために多様な化学手法を利用可能であることは、ＰＥＧ化タンパク質の新規開発それぞれが、事例に応じた研究になることを示す。化学反応だけでなく、タンパク質に結合させるＰＥＧの分子量も、ＰＥＧ化タンパク質の医薬的特性に大きな影響を及ぼす。ほとんどの場合、ＰＥＧの分子量が大きくなるほど、医薬的特性がより良く改善されることが予想される（Ｓｈｅｒｍａｎ  （２００８）  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．  ６０，  ５９−６８；Ｈｏｌｔｓｂｅｒｇ  （２００２）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ８０，  ２５９−２７１）。例えば、Ｈｏｌｔｓｂｅｒｇらは、ＰＥＧを、微生物原料から単離された別のアミノ酸分解酵素であるアルギニンデアミナーゼと複合体形成させた場合、酵素の薬物動態的及び薬力学的機能は、結合したＰＥＧの分子量が５０００Ｄａから２０，０００Ｄａへと増大するに従って、上昇したことを見出した（Ｈｏｌｔｓｂｅｒｇ  （２００２）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ８０，  ２５９−２７１）。
【００２３】
しかしながら、多くの場合、ＰＥＧ化した生物製剤は、未修飾生物製剤と比較して大幅に低下した活性を示す（Ｆｉｓｈｂｕｒｎ  （２００８）  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．、１−１７）。Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ由来のＬ−アスパラギナーゼの場合、ＰＥＧ化によりそのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性は約５７％に低下することが観察された（Ｋｕｃｈｕｍｏｖａ  （２００７）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｍｏｓｃｏｗ）  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ：  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １，  ２３０−２３２）。Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ由来のＬ−アスパラギナーゼは、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ種Ｌ−アスパラギナーゼ（クリサンタスパーゼ）と約７５％の相同性しか有していない。Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）については、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性は、未修飾Ｅ．ｃｏｌｉ種Ｌ−アスパラギナーゼと比較して、約５０％であることも知られている。
【００２４】
本明細書中記載されるのは、未修飾Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質と比較した場合に、ならびにＥ．ｃｏｌｉ由来のペグアスパラガーゼ製剤と比較した場合に改善された薬理学的特性を持つ、Ｅｒｗｉｎｉａ属由来ＰＥＧ化Ｌ−アスパラギナーゼである。本明細書中記載されるＰＥＧ化Ｌ−アスパラギナーゼ複合体、例えば、分子量５０００ＤａのＰＥＧでＰＥＧ化したＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ種Ｌ−アスパラギナーゼは、特に、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＬ−アスパラギナーゼもしくはＰＥＧ化Ｌ−アスパラギナーゼまたはＥｒｗｉｎｉａ属由来未修飾Ｌ−アスパラギナーゼでの治療に過敏症（例えば、アレルギー反応または無症候性過敏症）を示す患者での使用において、治療薬として働く。本明細書中記載されるＰＥＧ化Ｌ−アスパラギナーゼ複合体は、疾患再発、例えば、ＡＬＬが再発した患者、及び以前に別の形態のアスパラギナーゼで、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＬ−アスパラギナーゼまたはＰＥＧ化Ｌ−アスパラギナーゼで治療されたことがある患者で使用する治療薬としても有用である。
【００２５】
本明細書中詳細に記載するとおり、本発明の複合体は、予想外に、ペグアスパラガーゼなど既知のＬ−アスパラギナーゼ製剤と比べて優れた特性を示す。例えば、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来の未修飾Ｌ−アスパラギナーゼ（クリサンタスパーゼ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の未修飾Ｌ−アスパラギナーゼよりも大幅に短い半減期を有する（Ａｖｒａｍｉｓ  （２００５）  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．  ４４，  ３６７−３９３、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される）。本発明のＰＥＧ化複合体は、等価なタンパク質用量で、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＰＥＧ化Ｌ−アスパラギナーゼよりも長い半減期を有する。
【００２６】
定義
特に明示して定義されない限り、本明細書中使用される用語は、当該分野でそれらが通常意味するところに従って理解されることになる。
【００２７】
本明細書中使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含むが、それらに限定されない」を意味し、単数形で使用される用語は、文脈から特に否定されない限り、複数形を含み、その逆もまたしかりである。
【００２８】
本明細書中使用される場合、「アスパラギン枯渇により治療可能な疾患」という用語は、症状または障害に関与するあるいはその一因である細胞が、Ｌ−アスパラギン合成能力の欠如または低下いずれかを示す、症状または障害を示す。Ｌ−アスパラギンの枯渇または喪失は、部分的であっても実質的に完全（例えば、当該分野で既知である方法及び装置を用いて検出不能なレベルにある）であってもよい。
【００２９】
本明細書中使用される場合、「治療上有効量」という用語は、所望の治療効果をもたらすために必要な、タンパク質（例えば、アスパラギナーゼまたはその複合体）の量を示す。
【００３０】
本明細書中使用される場合、「配列同一性」という用語は、「相同性」と同義で使用され、そうであるので、適宜、同じ意味を有することができる。
【００３１】
「同時投与」、「同時投与する」、「〜と併用で投与される」、「〜と併用で投与する」、「同時に」、及び「同時発生で」という用語は、本明細書中使用される場合、２種以上の活性医薬成分を、両方の活性医薬成分及び／またはそれらの代謝産物が同時点でヒト対象中に存在するように、ヒト対象に投与することを包含する。同時投与は、別々の組成物での同時投与、別々の組成物での異なる時点での投与、または２種以上の活性医薬成分が存在する１つの組成物での投与を含む。別々の組成物での同時投与及び両方の作用剤が存在する１つの組成物での投与は、本発明の方法にも包含される。
【００３２】
Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質
本発明によるタンパク質は、Ｌ−アスパラギンアミノヒドロラーゼ活性を持つ酵素、いわゆるＬ−アスパラギナーゼである。
【００３３】
多くのＬ−アスパラギナーゼタンパク質が、当該分野で同定され、微生物から既知の方法により単離されている。（例えば、Ｓａｖｉｔｒｉ  （２００３）  Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２，  １８４−１９４を参照、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される）。最も広く使用されている市販のＬ−アスパラギナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来またはＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のものであり、これらは互いに５０％以下の構造相同性しか有さない。Ｅｒｗｉｎｉａ種の中では、典型的には、７５〜７７％の配列同一性が、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来酵素とＥｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖｏｒａ由来酵素の間で報告されており、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉの異なる亜種の間で約９０％配列同一性が見つかった（Ｋｏｔｚｉａ  Ｇ  Ａ，  Ｌａｂｒｏｕ  Ｅ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （２００７）  １２７：６５７−６６９、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される）。いくつかの代表的なＥｒｗｉｎｉａ属Ｌ−アスパラギナーゼとして、例えば、表１に提示するものが挙げられる：
【表１】
2021505661.tif 000002
【００３４】
表１のＥｒｗｉｎｉａ属Ｌ−アスパラギナーゼの配列及びＧｅｎＢａｎｋ登録は、本明細書中参照として援用される。治療で使用するのに好適なＬ−アスパラギナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＥｒｗｉｎｉａ属、詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉから単離されたＬ−アスパラギナーゼである。
【００３５】
Ｌ−アスパラギナーゼは、微生物から単離された天然酵素が可能である。Ｌ−アスパラギナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの産生微生物において組換え酵素技法により産生させることも可能である。例として、本発明の複合体に使用されるタンパク質は、組換えＥ．ｃｏｌｉ産生株で産生された、Ｅｒｗｉｎｉａ種、詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のタンパク質を産生する組換えＥ．ｃｏｌｉ株で産生されたＥ．ｃｏｌｉによるタンパク質であることが可能である。
【００３６】
酵素は、それらの特異的活性により同定可能である。すなわち、この定義は、定義された特異的活性を有し、他の生物、より詳細には他の微生物中にも存在する全てのポリペプチドを包含する。同様な活性を持つ酵素は、ＰＦＡＭまたはＣＯＧとして定義されるある種のファミリーにそれらをグループ化することにより特定できる場合が多い。ＰＦＡＭ（配列比較及び隠れマルコフモデルによるタンパク質ファミリーデータベース；ｐｆａｍ．ｓａｎｆｆｅｒａｃ．ｕｋｌ）は、タンパク質配列比較の巨大なコレクションを表す。各ＰＦＡＭは、複数の配列比較の視覚化、タンパク質ドメインの表示、生物間での分布の評価、他のデータベースへのアクセス、及び既知タンパク質構造の視覚化を可能にする。ＣＯＧ（タンパク質の相同分子種群のクラスター；ｖｖ−ｗｗ．ｎｅｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＣＯＧ／）は、３０種の主要な系統学的系列を代表する４３の完全配列決定ゲノムからタンパク質配列を比較することにより得られるものである。各ＣＯＧは、少なくとも３種の系列から定義されており、これにより、先に保存されたドメインの同定が可能になる。
【００３７】
相同性配列の同定及びそれらの相同性または配列同一性パーセンテージ同定の手段は、当業者に周知であり、そのような手段として、詳細には、ＢＬＡＳＴプログラムが挙げられる。ＢＬＡＳＴプログラムは、以下のウェブサイト、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｏｌｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉから使用することが可能であり、そのウェブサイト上で初期パラメーターが示されている。次いで、得られる配列を、例えば、以下のプログラム、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）またはＭＵＬＴＡＬＩＮ（ｂｉｏｉｎｆｏ．ｇｅｎｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｍｕｌｔａｌｉｎ／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｈｔｍｌ）に、それらのウェブサイト上で示されている初期パラメーターを用いて、活用する（例えば、整列させる）ことができる。既知の遺伝子についてＧｅｎＢａｎｋに提示される参照を用いて、当業者は、他の生物、細菌株、酵母菌、真菌、哺乳類、植物など中の等価な遺伝子を特定することができる。この常用手段は、コンセンサス配列を用いて有利に行われ、そのようなコンセンサス配列は、他の微生物由来の遺伝子との配列比較を行い、別の生物中の相当する遺伝子をクローン化する変性プローブを設計することにより、特定することが可能である。分子生物学のこうした常用方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  （２０１２）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ４ｔｈ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。
【００３８】
実際、当業者なら、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を実質的に保持する相同タンパク質をどのように選択及び設計するかわかるだろう。典型的には、Ｍａｓｈｂｕｒｎ及びＷｒｉｓｔｏｎにより記載される方法に従って、Ｌ−アスパラギナーゼ活性の測定にネスラーアッセイを用いる（Ｍａｓｈｂｕｒｎ  （１９６３）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １２，  ５０、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される）。
【００３９】
本発明の複合体の特定の実施形態において、Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質は、配列番号１の配列を含むタンパク質に対して、少なくとも約８０％の相同性または配列同一性、より具体的には、配列番号１の配列を含むタンパク質に対して、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、２０９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相同性または配列同一性を有する。配列番号１は、以下のとおりである：
ＡＤＫＬＰＮＩＶＩＬＡＴＧＧＴＩＡＧＳＡＡＴＧＴＱＴＴＧＹＫＡＧＡＬＧＶＤＴＬＩＮＡＶＰＥＶＫＫＬＡＮＶＫＧＥＱＦＳＮＭＡＳＥＮＭＴＧＤＶＶＬＫＬＳＱＲＶＮＥＬＬＡＲＤＤＶＤＧＶＶＩＴＨＧＴＤＴＶＥＥＳＡＹＦＬＨＬＴＶＫＳＤＫＰＶＶＦＶＡＡＭＲＰＡＴＡＩＳＡＤＧＰＭＮＬＬＥＡＶＲＶＡＧＤＫＱＳＲＧＲＧＶＭＶＶＬＮＤＲＩＧＳＡＲＹＩＴＫＴＮＡＳＴＬＤＴＦＫＡＮＥＥＧＹＬＧＶＩＩＧＮＲＩＹＹＱＮＲＩＤＫＬＨＴＴＲＳＶＦＤＶＲＧＬＴＳＬＰＫＶＤＩＬＹＧＹＱＤＤＰＥＹＬＹＤＡＡＩＱＨＧＶＫＧＩＶＹＡＧＭＧＡＧＳＶＳＶＲＧＩＡＧＭＲＫＡＭＥＫＧＶＶＶＩＲＳＴＲＴＧＮＧＩＶＰＰＤＥＥＬＰＧＬＶＳＤＳＬＮＰＡＨＡＲＩＬＬＭＬＡＬＴＲＴＳＤＰＫＶＩＱＥＹＦＨＴＹ
【００４０】
「配列番号１の配列を含む」という用語は、タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１に厳密に限定されることはなく、追加のアミノ酸を有していてもよいことを意味する。
【００４１】
特定の実施形態において、タンパク質は、配列番号１の配列を有する、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＬ−アスパラギナーゼである。別の実施形態において、Ｌ−アスパラギナーゼは、シグナルペプチド及び／またはリーダー配列の有無に関わらず、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ  ＮＣＰＰＢ１０６６（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＣＡＡ３２８８４、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される）に由来する。
【００４２】
配列番号１のタンパク質の断片も、本発明の複合体に使用されるタンパク質の定義に包含される。「配列番号１の断片」という用語は、そのポリペプチドの配列が、配列番号１より少ないアミノ酸を有していてもよいが、依然としてＬ−アミノヒドロラーゼ活性を付与するのに十分なアミノ酸を有していることを意味する。
【００４３】
ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、削除、及び／または付加により、その酵素活性を保持したまま修飾可能であることが当該分野で周知である。例えば、所定の位置で、１つのアミノ酸を、タンパク質の機能特性に影響しない化学的に等価なアミノ酸により置換することは一般的である。置換は、以下の群の１つの群内での交換と定義することができる：
小型脂肪族、無極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、
極性、負に荷電した残基及びそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、
極性、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、
大型脂肪族、無極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、
大型芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００４４】
すなわち、１つの負に荷電した残基から別の残基（例えば、グルタミン酸からアスパラギン酸へ）または１つの正に荷電した残基から別の残基（リシンからアルギニンへ）への置換となる交換は、機能的に等価な生成物をもたらすと予想できる。
【００４５】
アミノ酸配列中のアミノ酸の修飾位置及び修飾対象となるアミノ酸の個数は、特に限定されない。当業者なら、タンパク質の活性に影響を及ぼさずに導入することが可能な修飾がわかる。例えば、タンパク質のＮまたはＣ末端部分での修飾は、ある特定の条件下では、タンパク質の活性を変更させないと予想することができる。特に、アスパラギナーゼに関しては、十分な特性分析が、特に配列、構造、及び活性触媒部位を形成する残基に関して、行われてきている。これにより、酵素の活性に影響を及ぼすことなく修飾可能な残基に関する指針が得られる。全ての既知の細菌原料由来Ｌ−アスパラギナーゼは、共通する構造特性を有する。全て、ホモ四量体であり、２つの隣接する単量体のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインの間に４つの活性部位を持つということである（Ａｇｈａｉｐｏｕｒ  （２００１）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０，  ５６５５−５６６４、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される）。これらは全て、その三次構造及び四次構造において高度の類似性を有する（Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕ  （２００８）  ＦＥＢＳＪ．  ２７５，  ４３０６−４３１６、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される）。Ｌ−アスパラギナーゼの触媒部位の配列は、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、及びＥ．ｃｏｌｉ種Ｌ−アスパラギナーゼＩＩの間で高度に保存されている（Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕ  （２００８）  ＦＥＢＳＪ．  ２７５，  ４３０６−４３１６）。活性部位のフレキシブルループは、１４−３３番アミノ酸残基を含み、構造分析から、Ｔｈｒ１５、Ｔｈｒ９５、Ｓｅｒ６２、Ｇｌｕ６３、Ａｓｐ９６、及びＡｌａ１２０がリガンドと接触することが示されている（Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕ  （２００８）  ＦＥＢＳＪ．  ２７５，  ４３０６−４３１６）。Ａｇｈａｉｐｏｕｒらは、基質と複合した酵素の高解像度結晶構造解析により、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ種Ｌ−アスパラギナーゼの４つの活性部位の詳細分析を行った（Ａｇｈａｉｐｏｕｒ  （２００１）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０，  ５６５５−５６６４）。Ｋｏｔｚｉａらは、Ｅｒｗｉｎｉａ属の複数の種及び亜種由来のＬ−アスパラギナーゼの配列決定を行い、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉとＥｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａの間でそれらのタンパク質が約７５〜７７％の同一性しかないにも関わらず、それらが依然としてＬ−アスパラギナーゼ活性を有することを報告している（Ｋｏｔｚｉａ  （２００７）  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２７，  ６５７−６６９、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される）。Ｍｏｏｌａらが、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ  ３９３７種Ｌ−アスパラギナーゼのエピトープマッピング試験を行ったところ、アスパラギナーゼの免疫原性を低下させるために様々な抗原性配列を変異させた後でさえ、このＬ−アスパラギナーゼは、酵素活性を保持することができた（Ｍｏｏｌａ  （１９９４）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３０２，  ９２１−９２７、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される）。上記文献はそれぞれ、そのまま全体が本明細���中参照として援用される。Ｌ−アスパラギナーゼで行われてきた広範囲の特性分析を考慮することで、当業者は、酵素活性を保持したままで、どのように断片の作製及び／または配列置換を行うかを決定することができる。
【００４６】
複合体に使用される重合体
重合体は、無毒水溶性重合体、例えば、多糖類、例えばヒドロキシエチルデンプン、ポリアミノ酸、例えばポリリシン、ポリエステル、例えば、ポリ乳酸、及びポリアルキレンオキシド、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の群から選択される。
【００４７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはモノ−メトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）は、当該分野で周知であり、直鎖及び分岐鎖重合体を含む。いくつかの重合体、詳細にはＰＥＧの例は、以下に提供され、これらはそれぞれ、そのまま全体が本明細書中参照として援用される：米国特許第５，６７２，６６２号、同第４，１７９，３３７号、同第５，２５２，７１４号、米国特許出願公開番号第２００３／０１１４６４７号、米国特許第６，１１３，９０６号、同第７，４１９，６００号、同第９，９２０，３１１号、及びＰＣＴ公開番号第ＷＯ２００４／０８３２５８号。
【００４８】
そのような重合体の品質は、多分散指数（ＰＤＩ）により特性決定される。ＰＤＩは、所定の重合体試料中の分子量の分布を反映し、重量平均分子量を数平均分子量で除算することにより計算される。ＰＤＩは、重合体のバッチ中の個々の分子量の分布を示す。ＰＤＩは、常に１より大きい数値を有するが、ポリマー鎖が理想ガウス分布（＝単分散）に近くにつれて、ＰＤＩも１に近く。
【００４９】
ポリエチレングリコールは、有利には、約５００Ｄａ〜約９，０００Ｄａの範囲内の分子量を有する。より詳細には、ポリエチレングリコール（例えば、ｍＰＥＧ）は、２０００Ｄａ、２５００Ｄａ、３０００Ｄａ、３５００Ｄａ、４０００Ｄａ、４５００Ｄａ、及び５０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選択される分子量を有する。特定の実施形態において、ポリエチレングリコール（例えば、ｍＰＥＧ）は、分子量が５０００Ｄａである。
【００５０】
複合体の調製法
続いて重合体をＬ−アスパラギンアミノヒドロラーゼ活性を持つタンパク質とカップリングさせるために、重合体部分は、タンパク質中のアミノ基と好適に反応する活性化官能基を有する。１つの態様において、本発明は、複合体の作製法に関し、本方法は、緩衝溶液中、ＰＥＧとＬ−アスパラギナーゼが共有結合するのに十分な長さの時間、ある量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とある量のＬ−アスパラギナーゼを混合することを含む。特定の実施形態において、Ｌ−アスパラギナーゼは、Ｅｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来であり、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼである。１つの実施形態において、ＰＥＧは、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
【００５１】
１つの実施形態において、ポリエチレングリコールとＬ−アスパラギナーゼとの反応は、緩衝溶液中で行われる。特定の実施形態のいくつかにおいて、緩衝溶液のｐＨ値は、約７．０〜約９．０の範囲である。最適なｐＨ値は、約７．５〜約８．５の範囲にあり、例えば、ｐＨ値約７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、または１５８．５である。特定の実施形態において、Ｌ−アスパラギナーゼは、Ｅｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来であり、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼである。
【００５２】
そのうえさらに、Ｌ−アスパラギナーゼのＰＥＧ化は、タンパク質濃度が約０．５〜約２５ｍｇ／ｍＬ、より詳細には、約２〜約２０ｍｇ／ｍＬ、特に詳細には、約３〜約１５ｍｇ／ｍＬで行われる。例えば、タンパク質濃度は、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｍｇ／ｍＬである。特定の実施形態において、これらのタンパク質濃度でのＬ−アスパラギナーゼのＰＥＧ化は、Ｅｒｗｉｎｉａ種のものについて、より詳細にはＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのものについてであり、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼについてである。
【００５３】
２ｍｇ／ｍＬを超える高いタンパク質濃度では、ＰＥＧ化反応は、２時間未満で、迅速に進行する。そのうえさらに、Ｌ−アスパラギナーゼのアミノ基に対する重合体のモル過剰比は、約２０：１未満が適用される。例えば、モル過剰比は、約２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７．５：１、７：１、６．５：１、６：１、５．５：１、５：１、４．５：１、４：１、３．５：１、３：１、２．５：１、２：１、１．５：１、または１：１未満である。特定の実施形態において、モル過剰比は約１０：１未満であり、より詳細な実施形態において、モル過剰比は約８：１未満である。特定の実施形態において、Ｌ−アスパラギナーゼは、Ｅｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来であり、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼである。
【００５４】
タンパク質とカップリングすることが可能なＰＥＧ部分の数は、遊離アミノ基の数に、さらには、ＰＥＧ化反応で接近可能なアミノ基の数に依存する。特定の実施形態において、ＰＥＧ化の度合い（すなわち、Ｌ−アスパラギナーゼのアミノ基とカップリングしたＰＥＧ部分の数）は、遊離及び／または接近可能なアミノ基の約１０％〜約１００％の範囲内にある（例えば、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％）。接近可能なアミノ基（例えば、タンパク質のリシン残基及び／またはＮ末端）の１００％ＰＥＧ化は、本明細書中、「最大ＰＥＧ化」とも称する。ｍＰＥＧ−ｒ−クリサンタスパーゼ複合体中の修飾アミノ基を特定する（ＰＥＧ化の度合い）１つの方法は、Ｈａｂｅｅｂにより記載される方法である（Ａ．  Ｆ．  Ｓ．  Ａ．  Ｈａｂｅｅｂ，  ‘‘Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ’’，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １４  （１９６６），  ｐ．  ３２８、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される）。１つの実施形態において、ＰＥＧ部分は、Ｌ−アスパラギナーゼの１つまたは複数のアミノ基とカップリングしている（アミノ基は、リシン残基及び／またはＮ末端を含む）。特定の実施形態において、ＰＥＧ化の度合いは、全アミノ基または接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の約１０％〜約１００％の範囲内にあり、例えば、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％である。特定の実施形態において、全アミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、ＰＥＧ部分とカップリングする。別の特定の実施形態において、接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の約４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、７０％、７１％、７２％、７％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、ＰＥＧ部分とカップリングする。特定の実施形態において、接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の４０〜５５％または１００％が、ＰＥＧ部分とカップリングする。実施形態によっては、ＰＥＧ部分は、共有結合により、Ｌ−アスパラギナーゼとカップリングする。特定の実施形態において、Ｌ−アスパラギナーゼは、Ｅｒ��ｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来であり、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼである。
【００５５】
１つの実施形態において、本発明の複合体は、以下の式により表すことができ
Ａｓｐ−［ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ］ｎ
式中、Ａｓｐは、Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質であり、ＮＨは、リシン残基及び／またはタンパク質鎖のＮ末端のＮＨ基であり、ＰＥＧは、ポリエチレングリコール部分であり、ｎは、タンパク質中の接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の少なくとも４０％〜約１００％の数字であり、これらは全て、上記及び下記の実施例で定義されており、ｘは、１〜８の範囲の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８）、好ましくは２〜５（例えば、２、３、４、５）である。特定の実施形態において、Ｌ−アスパラギナーゼは、Ｅｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来であり、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼである。
【００５６】
本発明の複合体を形成するのに使用可能な他のＰＥＧ化方法は、例えば、米国特許第４，１７９，３３７号、同第５，７６６，８９７号、米国特許出願公開第２００２／００６５３９７Ａ１号、及び米国特許出願公開第２００９／００５４５９０Ａ１号に提示されており、これらはそれぞれ、そのまま全体が本明細書中参照として援用される。
【００５７】
具体的な実施形態は、実質的なＬ−アスパラギンアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質及びポリエチレングリコールを含み、それらは、以下の複合体の群から選択される：
（Ａ）タンパク質は、配列番号１に開示されるとおりのＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来Ｌ−アスパラギナーゼと少なくとも９０％相同性がある構造を有し、ポリエチレングリコールは、分子量が約５０００Ｄａあり、タンパク質とポリエチレングリコール部分は、アミド結合によりタンパク質と共有結合しており、接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の約１００％、または全アミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の約８０〜９０％、詳細には、約８４％が、ポリエチレングリコール部分と結合している。
（Ｂ）タンパク質は、配列番号１に開示されるとおりのＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来Ｌ−アスパラギナーゼと少なくとも９０％相同性がある構造を有し、ポリエチレングリコールは、分子量が約５０００Ｄａあり、タンパク質とポリエチレングリコール部分は、アミド結合によりタンパク質と共有結合しており、接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の約４０％〜約４５％、より詳細には約４３％、または全アミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の約３６％が、ポリエチレングリコール部分と結合している。
（Ｃ）タンパク質は、配列番号１に開示されるとおりのＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来Ｌ−アスパラギナーゼと少なくとも９０％相同性がある構造を有し、ポリエチレングリコールは、分子量が約２０００Ｄａあり、タンパク質とポリエチレングリコール部分は、アミド結合によりタンパク質と共有結合しており、接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の約１００％、または全アミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の約８０〜９０％、詳細には、約８４％が、ポリエチレングリコール部分と結合している。
（Ｄ）タンパク質は、配列番号１に開示されるとおりのＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来Ｌ−アスパラギナーゼと少なくとも９０％相同性がある構造を有し、ポリエチレングリコールは、分子量が約２０００Ｄａあり、タンパク質とポリエチレングリコール部分は、アミド結合によりタンパク質と共有結合しており、接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の［００９２］約５０％〜約６０％、より詳細には約５５％、または全アミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の約４７％が、ポリエチレングリコール部分と結合している。
【００５８】
Ｌ−アスパラギナーゼ−ＰＥＧ複合体
本発明の複合体は、未修飾Ｌ−アスパラギナーゼと比較して、詳細には未修飾Ｅｒｗｉｎｉａ属Ｌ−アスパラギナーゼと比較して、より詳細にはＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来の未修飾Ｌ−アスパラギナーゼと比較して、より詳細には配列番号１の配列を有する未修飾Ｌ−アスパラギナーゼと比較して、ある特定の利点及び予期せぬ特性を有する。
【００５９】
実施形態によっては、本発明の方法は、５Ｕ／ｋｇ体重（ｂｗ）または１０μｇ／ｋｇ（タンパク質含有量基準）の用量で投与した場合、少なくとも約１２、２４、４８、７２、９６、または１２０時間の期間の間、血漿Ｌ−アスパラギン及びグルタミンレベルを低下させる複合体を包含する。他の実施形態において、本発明の複合体は、２５Ｕ／ｋｇｂｗまたは５０μｇ／ｋｇ（タンパク質含有量基準）の用量で投与した場合、少なくとも約１２、２４、４８、７２、９６、１２０、または１４４時間の期間の間、血漿Ｌ−アスパラギンレベルを、検出不能レベルまで低下させる。他の実施形態において、本発明の複合体は、５０Ｕ／ｋｇｂｗまたは１００μｇ／ｋｇ（タンパク質含有量基準）の用量で投与した場合、少なくとも約１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、または２４０時間の期間の間、血漿Ｌ−アスパラギンレベルを低下させる。別の実施形態において、本発明の複合体は、約１００〜約１５，０００ＩＵ／ｍ２（約１〜３０ｍｇタンパク質／ｍ２）の範囲の用量で投与した場合、少なくとも約１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、または２４０時間の期間の間、血漿Ｌ−アスパラギンレベルを、検出不能レベルまで低下させる。特定の実施形態において、複合体は、Ｅｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のＬ−アスパラギナーゼを含み、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼを含む。詳細な実施形態において、複合体は、分子量が約５０００Ｄａ以下のＰＥＧ（例えば、ｍＰＥＧ）を含む。より詳細な実施形態において、接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の少なくとも約４０％〜約１００％がＰＥＧ化される。
【００６０】
１つの実施形態において、複合体は、ｍｏｌＰＥＧ／ｍｏｌ単量体の比が約４．５〜約８．５、詳細には約６．５であり、比活性が約４５０〜約５５０Ｕ／ｍｇ、詳細には約５０１Ｕ／ｍｇであり、及び相当する未修飾Ｌ−アスパラギナーゼと比較して相対活性が約７５％〜約８５％、詳細には約８１％である。特定の実施形態において、これらの性質を持つ複合体は、Ｅｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のＬ−アスパラギナーゼ、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼを含み、接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の約４０〜５５％が５０００ＤａのｍＰＥＧによりＰＥＧ化されている。
【００６１】
１つの実施形態において、複合体は、ｍｏｌＰＥＧ／ｍｏｌ単量体の比が約１２．０〜約１８．０、詳細には約１５．１であり、比活性が約４５０〜約５５０Ｕ／ｍｇ、詳細には約４８３Ｕ／ｍｇであり、及び相当する未修飾Ｌ−アスパラギナーゼと比較して相対活性が約７５％〜約８５％、詳細には約７８％である。特定の実施形態において、これらの性質を持つ複合体は、Ｅｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のＬ−アスパラギナーゼ、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼを含み、接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の約１００％が５０００ＤａのｍＰＥＧによりＰＥＧ化されている。
【００６２】
１つの実施形態において、複合体は、ｍｏｌＰＥＧ／ｍｏｌ単量体の比が約５．０〜約９．０、詳細には約７．０であり、比活性が約４５０〜約５５０Ｕ／ｍｇ、詳細には約５０１Ｕ／ｍｇであり、及び相当する未修飾Ｌ−アスパラギナーゼと比較して相対活性が約８０〜約９０％、詳細には約８７％である。特定の実施形態において、これらの性質を持つ複合体は、Ｅｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のＬ−アスパラギナーゼ、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼを含み、接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の約４０〜５５％が１０，０００ＤａのｍＰＥＧによりＰＥＧ化されている。
【００６３】
１つの実施形態において、複合体は、ｍｏｌＰＥＧ／ｍｏｌ単量体の比が約１１．０〜約１７．０、詳細には約１４．１であり、比活性が約４５０〜約５５０Ｕ／ｍｇ、詳細には約５４１Ｕ／ｍｇであり、及び相当する未修飾Ｌ−アスパラギナーゼと比較して相対活性が約８０〜約９０％、詳細には約８７％である。特定の実施形態において、これらの性質を持つ複合体は、Ｅｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のＬ−アスパラギナーゼ、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼを含み、接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の約１００％が１０，０００ＤａのｍＰＥＧによりＰＥＧ化されている。
【００６４】
１つの実施形態において、複合体は、ｍｏｌＰＥＧ／ｍｏｌ単量体の比が約６．５〜約１０．５、詳細には約８．５であり、比活性が約４５０〜約５５０Ｕ／ｍｇ、詳細には約５２４Ｕ／ｍｇであり、及び相当する未修飾Ｌ−アスパラギナーゼと比較して相対活性が約８０〜約９０％、詳細には約８４％である。特定の実施形態において、これらの性質を持つ複合体は、Ｅｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のＬ−アスパラギナーゼ、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼを含み、接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の約４０〜５５％が２，０００ＤａのｍＰＥＧによりＰＥＧ化されている。
【００６５】
１つの実施形態において、複合体は、ｍｏｌＰＥＧ／ｍｏｌ単量体の比が約１２．５〜約１８．５、詳細には約１５．５であり、比活性が約４５０〜約５５０Ｕ／ｍｇ、詳細には約５１５Ｕ／ｍｇであり、及び相当する未修飾Ｌ−アスパラギナーゼと比較して相対活性が約８０〜約９０％、詳細には約８３％である。特定の実施形態において、これらの性質を持つ複合体は、Ｅｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のＬ−アスパラギナーゼ、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼを含み、接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の約１００％が２，０００ＤａのｍＰＥＧによりＰＥＧ化されている。
【００６６】
他の実施形態において、本発明の複合体は、相当する未修飾Ｌ−アスパラギナーゼと比較して、単回注射後の効力が少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍上昇している。特定の実施形態において、これらの性質を持つ複合体は、Ｅｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のＬ−アスパラギナーゼ、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼを含む。特定の実施形態において、複合体は、分子量が約５０００Ｄａ以下のＰＥＧ（例えば、ｍＰＥＧ）を含む。より特定の実施形態において、接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の少なくとも約４０％〜約１００％が、ＰＥＧ化されている。
【００６７】
１つの実施形態において、本発明の複合体は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１００３８８６号に記載のとおり測定した場合、以下のとおりの単回用量薬物動態プロファイルを有し、詳細には、複合体は、分子量２０００Ｄａ以下のｍＰＥＧ、及びＥｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のＬ−アスパラギナーゼ、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼを含む：
Ａｍａｘ：約１５０Ｕ／Ｌ〜約２５０Ｕ／Ｌ、
ＴＡｍａｘ：約４時間〜約８時間、詳細には約６時間、
ｄＡｍａｘ：約２２０時間〜約２５０時間、詳細には、約２３８．５時間（０超、約９０分〜約２４０時間）、
ＡＵＣ：約１２０００〜約３００００、及び
ｔ１／２：約５０時間〜約９０時間。
１つの実施形態において、本発明の複合体は、以下のとおりの単回用量薬物動態プロファイルを有し、詳細には、複合体は、分子量５０００Ｄａ以下のｍＰＥＧ、及びＥｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のＬ−アスパラギナーゼ、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼを含む：
Ａｍａｘ：約１８Ｕ／Ｌ〜約２５０Ｕ／Ｌ、
ＴＡｍａｘ：約１時間〜約５０時間、
ｄＡｍａｘ：約９０時間〜約２５０時間、詳細には、約２３８．５時間（０超、約９０分〜約２４０時間）、
ＡＵＣ：約５００〜約３５０００、及び
ｔ１／２：約３０時間〜約１２０時間。
１つの実施形態において、本発明の複合体は、タンパク質の量が等価なペグアスパラガーゼと比較して、単回用量後に、一定時間にわたり（例えば、２４、４８、または７２時間）、同様なレベルのＬ−アスパラギン枯渇をもたらす。特定の実施形態において、複合体は、Ｅｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のＬ−アスパラギナーゼ、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼを含む。特定の実施形態において、複合体は、分子量５０００Ｄａ以下のＰＥＧ（例えば、ｍＰＥＧ）を含む。より特定の実施形態において、接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の少なくとも約４０％〜約１００％、より詳細には約４０〜５５％または１００％が、ＰＥＧ化されている。
【００６８】
１つの実施形態において、本発明の複合体は、等価なタンパク質用量で投与されたペグアスパラガーゼよりも長いｔ１／２を有する。特定の実施形態において、複合体は、約５０μｇ／ｋｇ（タンパク質含有量基準）の用量で、少なくとも約５０、５２、５４、５６、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、または６５時間のｔ１／２を有する。別の特定の実施形態において、複合体は、約１０μｇ／ｋｇ（タンパク質含有量基準）の用量で、少なくとも約３０、３２、３４、３６、３７、３８、３９、または４０時間のｔ１／２を有する。別の特定の実施形態において、複合体は、約１００〜約１５，０００ＩＵ／ｍ２（約１〜３０ｍｇタンパク質／ｍ２）の範囲の用量で、少なくとも約１００〜約２００時間のｔ１／２を有する。
【００６９】
１つの実施形態において、本発明の複合体は、平均ＡＵＣが、等価なタンパク質用量でのペグアスパラガーゼより少なくとも約２、３、４、または５倍大きい。
【００７０】
１つの実施形態において、本発明の複合体は、単回用量の投与後、ある特定の期間の間、例えば、約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間超などの間、どのような顕著な抗体反応も生じさせない。特定の実施形態において、本発明の複合体は、少なくとも８週間、どのような顕著な抗体反応も生じさせない。１つの例において、「どのような顕著な抗体反応も生じさせない」は、複合体を投与される対象が、当該分野で認められたパラメーター範囲内において抗体陰性と同定されることを意味する。抗体レベルは、当該分野で既知である方法、例えば、ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ−Ｂｉａｃｏｒｅ）アッセイなどにより測定可能である（Ｚａｌｅｗｓｋａ−Ｓｚｅｗｃｚｙｋ  （２００９）  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ９，  １１３−１１６；Ａｖｒａｍｉｓ  （２００９）  ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９，  ２９９−３０２、これらはそれぞれ、そのまま全体が本明細書中参照として援用される）。本発明の複合体は、これらの性質を任意の組み合わせで有することができる。
【００７１】
ＰＡＳ化Ｌ−アスパラギナーゼ
実施形態によっては、本発明の方法は、１つまたは複数のペプチド（複数可）を含むＬ−アスパラギナーゼ複合体を包含し、各ペプチドは、独立して、ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣであり、式中、（Ｐ／Ａ）は、プロリン及びアラニンアミノ酸残基のみからなるアミノ酸配列であり、式中、ＲＮは、アミノ酸配列のＮ末端アミノ基に結合した保護基であり、式中、ＲＣは、自身のアミノ基を介してアミノ酸配列のＣ末端カルボキシ基に結合したアミノ酸残基であり、各ペプチドは、ペプチドのＣ末端アミノ酸残基ＲＣのカルボキシ基とＬ−アスパラギナーゼの遊離アミノ基から形成されたアミド結合を介してＬ−アスパラギナーゼと複合体形成しており、ならびに、ペプチドが結合している遊離アミノ基の少なくとも１つは、Ｌ−アスパラギナーゼのＮ末端α−アミノ基ではない。これらの分子は、Ｌ−アスパラギナーゼのＰＡＳ化体としても知られ、本明細書中、複合体とも称する。
【００７２】
修飾Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質の単量体は、修飾後に約３５０、４００、４５０、５００のアミノ酸〜約５５０、６００、６５０、７００、または７５０のアミノ酸を有する。追加の態様において、修飾Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質は、約３５０〜約７５０のアミノ酸、または約５００〜約７５０のアミノ酸を有する。
【００７３】
本明細書中記載されるとおりの修飾Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質に含まれる各ペプチドは、独立して、ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣである。したがって、本明細書中記載されるとおりの修飾Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質に含まれる各ペプチドに関して、Ｎ末端保護基ＲＮ、アミノ酸配列（Ｐ／Ａ）、及びＣ末端アミノ酸残基ＲＣはそれぞれ、独立して、それらの各自意味するところから選択される。したがって、修飾Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質に含まれる２つ以上のペプチドは、同じである場合もあれば、互いに異なっている場合もある。１つの態様において、修飾Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質に含まれる全てのペプチドは、同じである。
【００７４】
化学結合した修飾Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質中の部分（Ｐ／Ａ）は、ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣに含まれているが、この部分は、合計で１０〜１００またはそれ以上のプロリン及びアラニンアミノ酸残基、合計で１５〜６０のプロリン及びアラニンアミノ酸残基、合計で１５〜４５のプロリン及びアラニンアミノ酸残基、例えば、合計で２０〜約４０のプロリン及びアラニンアミノ酸残基、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５のプロリン及びアラニンアミノ酸残基からなることが可能なアミノ酸配列である。好適な態様において、上記アミノ酸配列は、約２０のプロリン及びアラニンアミノ酸残基からなる。別の好適な態様において、上記アミノ酸配列は、約４０のプロリン及びアラニンアミノ酸残基からなる。ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣにおいて、部分（Ｐ／Ａ）に含まれるアミノ酸残基の数に対する（Ｐ／Ａ）に含まれるプロリン残基の数の比は、好ましくは≧１０％及び≦７０％、より好ましくは≧２０％及び≦５０％、さらにより好ましくは≧２５％及び≦４０％である。したがって、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の合計数のうち１０％〜７０％はプロリン残基であることが好ましく、より好ましくは、（Ｐ／Ａ）に含まれるアミノ酸残基の合計数のうち２０％〜５０％がプロリン残基であり、さらにより好ましくは、（Ｐ／Ａ）に含まれるアミノ酸残基の合計数のうち２５％〜４０％（例えば、２５％、３０％、３５％、または４０％）がプロリン残基である。そのうえ、（Ｐ／Ａ）は、連続するプロリン残基をまったく含まない（すなわち、（Ｐ／Ａ）は部分配列ＰＰをまったく含まない）ことが好ましい。好適な態様において、（Ｐ／Ａ）は、アミノ酸配列ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号２）である。別の好適な態様において、（Ｐ／Ａ）は、アミノ酸配列ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号３）である。
【００７５】
ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣの基ＲＮは、アミノ酸配列（Ｐ／Ａ）のＮ末端アミノ基、詳細にはＮ末端α−アミノ基に結合した保護基の場合がある。ＲＮは、ピログルタモイルまたはアセチルであることが好ましい。
【００７６】
ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣの基ＲＣは、自身のアミノ基を介して（Ｐ／Ａ）のＣ末端カルボキシ基に結合したアミノ酸残基であり、この基は、自身のアミノ基と自身のカルボキシ基の間に少なくとも２個の炭素原子を有する。当然のことながら、ＲＣのアミノ基とカルボキシ基の間の少なくとも２個の炭素原子は、ＲＣのアミノ基とカルボキシ基の間に少なくとも２個の炭素原子分の間隔を提供することができる（これは、例えば、ＲＣがω−アミノ−Ｃ３−１５アルカン酸、例えば、ε−アミノヘキサン酸の場合にそうなる）。ＲＣは、ε−アミノヘキサン酸であることが好ましい。
【００７７】
［０００１］１つの実施形態において、ペプチドは、Ｐｇａ−ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ−Ａｈｘ−ＣＯＯＨ（配列番号４）またはＰｇａ−ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ−Ａｈｘ−ＣＯＯＨ（配列番号５）である。「Ｐｇａ」という用語は、「ピログルタモイル」または「ピログルタミン酸」の略号である。「Ａｈｘ」という用語は、「ε−アミノヘキサン酸」の略号である。
【００７８】
本明細書中記載されるとおりの修飾Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質において、各ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣは、ペプチドのＣ末端アミノ酸残基ＲＣのカルボキシ基とＬ−アスパラギナーゼの遊離アミノ基から形成されたアミド結合を介してＬ−アスパラギナーゼと複合体形成することができる。Ｌ−アスパラギナーゼの遊離アミノ基は、例えば、Ｌ−アスパラギナーゼのＮ末端α−アミノ基または側鎖アミノ基が可能である（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼに含まれるリシン残基のε−アミノ基）。Ｌ−アスパラギナーゼが、複数のサブユニットで構成される場合、例えば、Ｌ−アスパラギナーゼが四量体である場合、複数のＮ末端α−アミノ基が存在する場合がある（すなわち、各サブユニットに１つ）。１つの態様において、９〜１３の本明細書中定義されるとおりのペプチド（例えば９、１１、１２、または１３のペプチド）を、Ｌ−アスパラギナーゼと（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼの各サブユニット／単量体と）化学結合させることができる。
【００７９】
上記に従い、１つの態様において、ペプチドが化学結合する遊離アミノ基のうち少なくとも１つは、Ｌ−アスパラギナーゼのＮ末端α−アミノ基ではない（すなわち、Ｎ末端α−アミノ基とは異なる）。したがって、ペプチドが結合する遊離アミノ基のうち少なくとも１つは、Ｌ−アスパラギナーゼの側鎖アミノ基であることが好ましく、ペプチドが結合する遊離アミノ基のうち少なくとも１つは、Ｌ−アスパラギナーゼのリシン残基のε−アミノ基であることが特に好ましい。
【００８０】
そのうえ、ペプチドが結合する遊離アミノ基は、Ｌ−アスパラギナーゼのいずれかのリシン残基（複数可）のε−アミノ基（複数可）、Ｌ−アスパラギナーゼのまたはＬ−アスパラギナーゼのいずれかのサブユニット（複数可）のＮ末端α−アミノ基（複数可）、及びそれらの任意の組み合わせから選択されることが好ましい。ペプチドが結合する遊離アミノ基のうちの１つは、Ｎ末端α−アミノ基であり、ペプチドが結合する遊離アミノ基のうちのそのほかの１つ（複数可）は、それぞれ、Ｌ−アスパラギナーゼのリシン残基のε−アミノ基であることが、特に好ましい。あるいは、ペプチドが結合する遊離アミノ基はそれぞれ、Ｌ−アスパラギナーゼのリシン残基のε−アミノ基であることが好ましい。
【００８１】
本明細書中記載されるとおりの修飾Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質は、Ｌ−アスパラギナーゼ及び１つまたは複数の本明細書中定義されるとおりのペプチドで構成される。相当する修飾Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質は、例えば、１つのＬ−アスパラギナーゼと、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５（またはそれ以上）のペプチドとからなることができ、ペプチドはそれぞれＬ−アスパラギナーゼと結合している。Ｌ−アスパラギナーゼは、例えば、単量体タンパク質の場合も、複数のサブユニットで構成されたタンパク質、例えば、四量体の場合もある。Ｌ−アスパラギナーゼが単量体タンパク質である場合、相当する修飾Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質は、例えば、１つの単量体Ｌ−アスパラギナーゼと、９〜１３（またはそれ以上）、（例えば、８、９、１０、１１、１２、または１３）のペプチドとからなることができ、ペプチドはそれぞれ、単量体Ｌ−アスパラギナーゼと結合している。単量体Ｌ−アスパラギナーゼのアミノ酸配列の例を、配列番号１に示す。Ｌ−アスパラギナーゼが、複数のサブユニット、例えば４つのサブユニットで構成されたタンパク質である場合（すなわち、上記Ｌ−アスパラギナーゼが四量体である場合）、相当する修飾Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質は、例えば、４つのＬ−アスパラギナーゼサブユニットと、９〜１３（またはそれ以上）、（例えば、９、１０、１１、１２、または１３）の上記で定義されるとおりのペプチドとからなることができ、ペプチドはそれぞれ、Ｌ−アスパラギナーゼの各サブユニットと結合している。Ｌ−アスパラギナーゼのサブユニットのアミノ酸配列の例を、配列番号１に示す。同様に、Ｌ−アスパラギナーゼが、複数のサブユニット、例えば４つのサブユニットで構成されたタンパク質である場合（すなわち、上記Ｌ−アスパラギナーゼが四量体である場合）、相当する修飾Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質は、例えば、４つのＬ−アスパラギナーゼサブユニットと、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５（またはそれ以上）のペプチドとからなることができ、ペプチドはそれぞれ、Ｌ−アスパラギナーゼ四量体と結合している。１つの態様において、本発明は、Ｌ−アスパラギナーゼ及び複数の化学結合したペプチド配列を有する修飾Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質に関する。さらなる態様において、ペプチド配列の長さは、約１０〜約１００、約１５〜約６０、または約２０〜約４０である。
【００８２】
プロリン及びアラニンアミノ酸残基のみからなるペプチドは、上記Ｌ−アスパラギナーゼの１つまたは複数のアミノ酸、例えば、リシン残基及び／またはＮ末端残基と共有結合することができ、及び／またはプロリン及びアラニンアミノ酸残基のみからなるペプチドは、Ｌ−アスパラギナーゼ表面のリシン残基及び／またはＮ末端残基のアミノ基を含む接近可能なアミノ基のうち少なくとも約４０、５０、６０、７０、８０、または９０％〜約６０、７０、８０、９０、または１００％と共有結合している場合がある。例えば、接近可能なリシン残基は、１つのＬ−アスパラギナーゼあたり約１１〜１２存在し、約８〜１２のリシンが、プロリン及びアラニンアミノ酸残基のみからなるペプチドと結合する可能性がある。さらなる態様において、プロリン及びアラニンアミノ酸残基のみからなるペプチドは、上記Ｌ−アスパラギナーゼの全リシン残基のうち約２０、３０、４０、５０、または６０％〜約３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％と共有結合している。さらなる実施形態において、プロリン及びアラニンアミノ酸残基のみからなるペプチドは、リンカーを介してＬ−アスパラギナーゼと共有結合している。リンカーの例として、米国特許出願第２０１５／００３７３５９号に開示されるリンカーが挙げられ、この出願はそのまま全体が本明細書中参照として援用される。
【００８３】
１つの態様において、複合体は、Ｌ−アスパラギナーゼと、長さが約２００〜約４００のプロリン及びアラニンアミノ酸残基のプロリン及びアラニンアミノ酸残基のみからなるポリペプチドとを含む融合タンパク質である。言い換えると、ポリペプチドは、約２００〜約４００のプロリン及びアラニンアミノ酸残基からなる場合がある。１つの態様において、ポリペプチドは、合計で約２００（例えば２０１）のプロリン及びアラニンアミノ酸残基からなる（すなわち、約２００（例えば２０１）のプロリン及びアラニンアミノ酸残基の長さを有する）、またはポリペプチドは、合計で約４００（例えば４０１）のプロリン及びアラニンアミノ酸残基からなる（すなわち、約４００（例えば４０１）のプロリン及びアラニンアミノ酸残基の長さを有する）。好適な実施形態のいくつかにおいて、ポリペプチドは、配列番号６または７に示すとおりのアミノ酸配列を含む、またはそのアミノ酸配列からなる。態様によっては、融合タンパク質の各単量体は、単量体及びＰ／Ａアミノ酸配列を含めて、約３５０、４００、４５０、５００のアミノ酸〜約５５０、６００、６５０、７００、７５０、または１，０００のアミノ酸を有する。さらなる態様において、修飾タンパク質は、約３５０〜約８００のアミノ酸または約５００〜約７５０のアミノ酸を有する。例えば、ポリペプチドは、米国特許第９，２２１，８８２号で調製されたペプチドを含む。態様によっては、Ｌ−アスパラギナーゼは、Ｅｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来であり、より詳細には本明細書中記載されるとおりの配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼである。
【００８４】
さらなる態様において、本明細書中開示されるＬ−アスパラギナーゼは、Ｌ−アスパラギナーゼ及びポリペプチドを含む修飾Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む（組換え）ベクターを用いて産生させることができ、このポリペプチドはプロリン及びアラニンアミノ酸残基のみからなり、好ましくは修飾タンパク質は、本明細書中記載されるとおりの融合タンパク質であり、ベクターは、修飾タンパク質（例えば融合タンパク質）を発現することができる。さらなる態様において、本発明は、本明細書中記載される（組換え）ベクターを含む宿主にも関する。宿主として、酵母菌、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰｉｃｈｉａ  Ｐｉｓｔｏｒｉｓなど、細菌、放線菌、真菌、藻類、及び他の微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなど、ならびに以下の属、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの細菌宿主が可能である。他の宿主も、当業者に既知であり、そのような宿主として、グルタミナーゼ活性を欠いたアスパラギナーゼ変異体を発現するＮｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ａｌｂａ、及びＳａｖｉｔｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２，  １８４−１９４に開示されるものが挙げられ、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される。
【００８５】
治療法及び使用法
本発明の複合体は、アスパラギン及び／またはグルタミンの枯渇により治療可能な疾患の治療に使用することができる。例えば、複合体は、成人及び小児両方での急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ならびにアスパラギン及び／またはグルタミンの枯渇が有用な効果を有すると予想される他の症状の治療あるいはその治療用の医薬の製造に有用である。そのような症状として、以下が挙げられるが、それらに限定されない：悪性腫瘍またはがん、例えば、血液悪性腫瘍、リンパ腫、大細胞型免疫芽球性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＮＫリンパ腫、ホジキン病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性Ｔ細胞白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、二重表現型Ｂ細胞骨髄単球性白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ肉腫、細網肉腫、及び黒色肉腫であるが、これらに限定されない。実施形態によっては、疾患は、急性骨髄性白血病またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の場合がある。悪性腫瘍またはがんとして、腎細胞癌、腎細胞腺癌、多形性膠芽腫及び星細胞腫を含む神経膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、横紋筋肉腫、悪性黒色腫、類表皮癌、扁平上皮癌、肺大細胞癌及び小細胞肺癌を含む肺癌、子宮内膜癌、卵巣腺癌、卵巣奇形癌、子宮頸部腺癌、乳癌、乳腺癌、乳管癌、膵臓腺癌、膵管癌、結腸癌、結腸腺癌、結腸直腸腺癌、膀胱移行上皮癌、膀胱乳頭腫、前立腺癌、骨肉腫、骨の類上皮癌、前立腺癌、ならびに甲状腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
アスパラギン及び／またはグルタミン枯渇に反応する代表的な非悪性血液疾患として、免疫系介在型血液疾患、例えば、ＨＩＶ感染（すなわち、ＡＩＤＳ）により引き起こされるものなどの感染症が挙げられる。アスパラギン及び／またはグルタミン依存と関連した非血液疾患として、自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、膠原血管病などが挙げられる。他の自己免疫疾患として、変形性関節症、アイザックス症候群、乾癬、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、硬化性全脳炎、リウマチ熱、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病）、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、及びグレーブス病が挙げられる。疾患を引き起こすことが疑われる細胞を、任意の適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで、例えば、増殖培地がアスパラギン及び／またはグルタミンを含まないｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで、アスパラギン及び／またはグルタミン依存について検査することができる。すなわち、１つの態様において、本発明は、患者において治療可能な疾患を治療する方法に関し、本方法は、患者に、本発明の複合体を有効量で投与することを含む。別の態様において、発明の複合体は、別の活性医薬成分と同時投与される。実施形態によっては、発明の複合体は、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）、ダウノルビシン、シタラビン、Ｖｙｘｅｏｓ（登録商標）、ＡＢＴ−７３７、ベネトクラクス、ダクトリシブ、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ビンクリスチン、プレドニゾロン、エベロリムス、及び／またはＣＢ−８３９と同時投与される。特定の実施形態において、疾患は、ＡＬＬである。特定の実施形態において、アスパラギン及び／またはグルタミン枯渇により治療可能な疾患の治療に使用される複合体は、Ｅｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のＬ−アスパラギナーゼ、より詳細には本明細書中記載されるとおりの配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼを含む。
【００８７】
１つの実施形態において、発明の複合体を用いた治療は、第一選択治療として実施されることになる。別の実施形態において、発明の複合体を用いた治療は、他のアスパラギナーゼ製剤に対して、特に未変性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ−ｃｏｌｉ由来Ｌ−アスパラギナーゼまたはそのＰＥＧ化変異体（ペグアスパラガーゼ）に対して、アレルギーまたは「無症候性過敏症」を含む過敏症の客観的兆候が発生した患者、詳細にはＡＬＬの患者における第二選択治療として実施されることになる。アレルギーまたは過敏症の客観的兆候の非限定的な例として、アスパラギナーゼ酵素に関する検査で「抗体陽性」であることが挙げられる。特定の実施形態において、発明の複合体は、ペグアスパラガーゼを用いた治療後の第二選択治療で使用される。より具体的な実施形態において、第二選択治療で使用される複合体は、Ｅｒｗｉｎｉａ種由来、より詳細には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のＬ−アスパラギナーゼ、より詳細には配列番号１の配列を含むＬ−アスパラギナーゼを含む。より具体的な実施形態において、複合体は、さらに、分子量が約５０００Ｄａ以下、より詳細には約５０００ＤａのＰＥＧ（例えば、ｍＰＥＧ）を含む。さらにより具体的な実施形態において、接近可能なアミノ基（例えば、リシン残基及び／またはＮ末端）の少なくとも約４０％〜約１００％、より詳細には約４０〜５５％または１００％がＰＥＧ化されている。
【００８８】
別の態様において、本発明は、急性リンパ芽球性白血病の治療法に関し、本方法は、治療を必要としている患者に、治療上有効量の本発明の複合体を投与することを含む。別の態様において、本発明は、急性骨髄性白血病の治療法に関し、本方法は、治療を必要としている患者に、治療上有効量の本発明の複合体を、ダウノルビシン、シタラビン、Ｖｙｘｅｏｓ（登録商標）、ＡＢＴ−７３７、ベネトクラクス、ダクトリシブ、ボルテゾミブ、及び／またはカルフィルゾミブと併用して投与することを含む。別の態様において、本発明は、急性骨髄性白血病の治療法に関し、本方法は、治療を必要としている患者に、治療上有効量の本発明の複合体を、ベネトクラクスと併用して投与することを含む。別の態様において、本発明は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の治療法に関し、本方法は、治療を必要としている患者に、治療上有効量の本発明の複合体を、ＡＢＴ−７３７、ベネトクラクス、カルフィルゾミブ、ビンクリスチン、及び／またはプレドニゾロンと併用して投与することを含む。別の態様において、本発明は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の治療法に関し、本方法は、治療を必要としている患者に、治療上有効量の本発明の複合体を、ビンクリスチンと併用して投与することを含む。
【００８９】
別の態様において、本明細書中記載される複合体は、約１５００ＩＵ／ｍ２〜約１５，０００ＩＵ／ｍ２、典型的には約１０，０００〜約１５，０００ＩＵ／ｍ２（約２０〜３０ｍｇタンパク質／ｍ２）の範囲の用量で、約週に２回〜約１ヶ月に１回、典型的には、週に１回または１週おきに１回の範囲のスケジュールで、単剤として（例えば、単剤療法）または化学療法薬の組み合わせの一部として投与されることになり、化学療法薬としては、糖質コルチコイド、コルチコステロイド、抗癌化合物、または他の作用剤、例えばメトトレキサート、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、及びアントラサイクリンなどが挙げられるがこれらに限定されない。例として、ＡＬＬの患者は、導入療法、地固めまたは強化療法、及び維持療法を含む化学療法期間中、多剤化学療法の一成分として本発明の複合体を投与されることになる。具体例において、複合体は、アスパラギンシンセターゼ阻害剤（例えば、米国特許第９，９２０，３１１号に記載されるものなど、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される）とともには投与されない。別の具体例において、複合体は、アスパラギンシンセターゼ阻害剤とともには投与されないが、他の化学療法薬とともに投与される。複合体は、多剤化学療法レジメンの一部として、他の化合物の前、後、または同時に投与することができる。
【００９０】
特定の実施形態において、本方法は、本発明の複合体を、約１Ｕ／ｋｇ〜約２５Ｕ／ｋｇ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５Ｕ／ｋｇ）またはそれらと等価な量２０（例えば、タンパク質含有量基準）で投与することを含む。より具体的な実施形態において、複合体は、約５、約１０、及び約２５Ｕ／ｋｇからなる群より選択される量で投与される。別の具体的な実施形態において、複合体は、約１，０００ＩＵ／ｍ２〜約２０，０００ＩＵ／ｍ２（例えば、１，０００ＩＵ／ｍ２、２，０００ＩＵ／ｍ２、３，０００ＩＵ／ｍ２、４，０００ＩＵ／ｍ２、５，０００ＩＵ／ｍ２、６，０００ＩＵ／ｍ２、７，０００ＩＵ／ｍ２、８，０００ＩＵ／ｍ２、９，０００ＩＵ／ｍ２、１０，０００ＩＵ／ｍ２、１１，０００ＩＵ／ｍ２、１２，０００ＩＵ／ｍ２、１３，０００ＩＵ／ｍ２、１４，０００ＩＵ／ｍ２、１５，０００ＩＵ／ｍ２、１６，０００ＩＵ／ｍ２、１７，０００ＩＵ／ｍ２、１８，０００ＩＵ／ｍ２、１９，０００ＩＵ／ｍ２、または２０，０００ＩＵ／ｍ２）の範囲の用量で投与される。別の具体的な実施形態において、複合体は、単回用量の場合、約３日間〜約１０日間（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間）の期間、Ｌ−アスパラギン及び／またはグルタミンを、当該分野で既知である方法及び装置を用いて検出不能なレベルまで激減させる用量で投与される。
【００９１】
別の実施形態において、本方法は、非複合Ｌ−アスパラギナーゼよりも低い免疫原性反応を患者に誘発する本発明の複合体を投与することを含む。別の実施形態において、本方法は、非複合Ｌ−アスパラギナーゼよりも長い単回用量後ｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期を有する本発明の複合体を投与することを含む。１つの実施形態において、本方法は、等価なタンパク質用量で投与されたペグアスパラガーゼよりも長いｔ１／２を有する複合体を投与することを含む。特定の実施形態において、本方法は、約５０μｇ／ｋｇ（タンパク質含有量基準）の用量で少なくとも約５０、５２、５４、５６、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、または６５時間のｔ１／２を有する複合体を投与することを含む。別の具体的な実施形態において、本方法は、約１０μｇ／ｋｇ（タンパク質含有量基準）の用量で少なくとも約３０、３２、３４、３６、３７、３７、３９、または４０時間のｔ１／２を有する複合体を投与することを含む。別の具体的な実施形態において、本方法は、約１０，０００〜約１５，０００ＩＵ／ＩＵ／ｍ２（約２０〜３０ｍｇタンパク質／ＩＵ／ｍ２）の範囲の用量で少なくとも約１００〜約２００時間のｔ１／２を有する複合体を投与することを含む。１つの実施形態において、本方法は、等価なタンパク質用量で投与されたペグアスパラガーゼに比べて少なくとも約２、３、４、または５倍大きい平均ＡＵＣを有する複合体を投与することを含む。
【００９２】
Ｌ−アスパラギナーゼを用いた治療後にＡＬＬ患者で再発が起こる頻度は依然として高く、小児ＡＬＬ患者の約１０〜２５％で、早期再発が起こる（例えば、場合によっては、導入から３０〜３６ヶ月後の維持期間中）（Ａｖｒａｍｉｓ  （２００５）  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．  ４４，  ３６７−３９３）。Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｌ−アスパラギナーゼで治療された患者で再発が起きた場合、Ｅ．ｃｏｌｉ製剤を用いたその後の治療は、「ワクチン接種」効果を招く可能性があり、これにより、Ｅ．ｃｏｌｉ製剤は、その後の投与中の免疫原性が高くなる。１つの実施形態において、本発明の複合体は、他のアスパラギナーゼ製剤で以前に治療された、詳細には、Ｅ．ｃｏｌｉ由来アスパラギナーゼで以前に治療された、再発性ＡＬＬの患者の治療法に使用することができる。
【００９３】
実施形態によっては、本発明の治療の使用及び方法は、本明細書中上記（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼＰＥＧ複合体またはＰＡＳ化Ｌ−アスパラギナーゼと題した章において）に、または本明細書中以下に記載される性質または性質の組み合わせを有するＬ−アスパラギナーゼ複合体を投与することを含む。
【００９４】
組成物、配合物、及び投与経路
本発明は、本発明の複合体を含む医薬組成物も含む。特定の実施形態において、医薬組成物は、現在入手可能な天然Ｌ−アスパラギナーゼなど、その製造に使用された細菌原料が何かに関わらず、溶媒で再構築することを予定した凍結乾燥粉末としてバイアルに収容されている（Ｋｉｄｒｏｌａｓｅ（登録商標）、Ｅｌｓｐａｒ（登録商標）、Ｅｒｗｉｎａｓｅ（登録商標））。別の実施形態において、医薬組成物は、さらに、「すぐに使用可能な」液剤として、ペグアスパラガーゼなどを含む場合があり（Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標））、これにより、適切に取り扱い、例えば、筋肉内、静脈内（点滴及び／またはボーラス）、脳室内（ｉｃｖ）、皮下経路を通じて投与することがさらに可能になる。さらなる実施形態において、医薬組成物は、本発明の複合体を、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）、ダウノルビシン、シタラビン、ＡＢＴ−７３７、ベネトクラクス、ダクトリシブ、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ビンクリスチン、プレドニゾロン、エベロリムス、及び／またはＣＢ−８３９と組み合わせて含む。
【００９５】
本発明の複合体は、本発明の複合体を含む組成物（例えば、医薬組成物）も含めて、標準技法を用いて患者に投与することができる。技法及び処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （２０１３）  ２２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇで見つけることができ、これは本明細書中参照として援用される。
【００９６】
適切な剤形は、部分的には、使い方または導入経路、例えば、経口、経皮、経粘膜、または注射による（非経口）などに依存する。そのような剤形は、治療薬が標的細胞に到達するか、いずれにしろ所望の治療効果を有することを許容するものでなければならない。例えば、血流に注射される医薬組成物は、好ましくは、溶解性である。
【００９７】
本発明による複合体及び／または医薬組成物は、その薬学上許容される塩及び錯体として配合することができる。薬学上許容される塩とは、それらが投与される量及び濃度において無毒で存在する塩である。そのような塩の製剤は、化合物がその生理的効果を発揮することを防ぐことなく、その化合物の物性を改変することにより、医療での使用を促進することができる。物性の有用な改変として、融点の低下による経粘膜投与の促進、及び溶解性の上昇による薬物濃度を上昇させての投与の促進が挙げられる。アスパラギナーゼの薬学上許容される塩は、当該分野で認められるとおり、錯体として存在することもできる。
【００９８】
薬学上許容される塩として、酸付加塩、例えば、硫酸イオン、塩酸イオン、フマル酸イオン、マレイン酸イオン、リン酸イオン、スルファミン酸イオン、酢酸イオン、クエン酸イオン、乳酸イオン、酒石酸イオン、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、シクロヘキシルスルファミン酸イオン、及びキナ酸イオンを含むものが挙げられる。薬学上許容される塩は、酸から得ることができ、酸として、塩酸、マレイン酸、硫酸、リン酸、スルファミン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、フマル酸、及びキナ酸が挙げられる。
【００９９】
酸性官能基、例えば、カルボン酸またはフェノールが存在する場合には、薬学上許容される塩として、塩基付加塩、例えば、ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、プロカイン、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、アンモニウム、アルキルアミン、及び亜鉛を含むものも挙げられる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（既出）を参照。そのような塩は、適切な該当する塩基を用いて調製することができる。
【０１００】
薬学上許容されるキャリア及び／または賦形剤も、本発明による医薬組成物に組み込んで、特定アスパラギナーゼの投与を促進することができる。本発明を実施する上で使用するのに適したキャリアの例として、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類、例えば、ラクトース、グルコース、またはスクロースなど、または各種デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、及び生理学的に適合性の溶媒が挙げられる。生理学的に適合性の溶媒の例として、注射用水（ＷＦＩ）、生理食塩水、及びブドウ糖の滅菌溶液が挙げられる。
【０１０１】
本発明による医薬組成物は、様々な経路で投与することができ、そのような経路として、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経口、外用（経皮）、または経粘膜投与が挙げられる。全身投与の場合、経口投与が好ましい。経口投与の場合、例えば、化合物は、従来の経口剤形、例えば、カプセル剤、錠剤、及び液状製剤、例えば、シロップ剤、エリキシル剤、及び濃縮ドロップなどに配合することができる。
【０１０２】
あるいは、注射（非経口投与）、例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内、及び皮下注射が、用いられる場合がある。注射の場合、医薬組成物は、液状剤、好ましくは、生理学的に適合性の緩衝液または溶液、例えば生理食塩水、ハンクス液、またはリンガー液に配合される。また、化合物は、固形で配合し、使用直前に再溶解または懸濁させることができる。例えば、凍結乾燥形の複合体を製造することができる。具体的な実施形態において、複合体は、筋肉内投与される。別の具体的な実施形態において、複合体は、静脈内投与される。
【０１０３】
全身投与は、経粘膜または経皮手段によっても達成することができる。経粘膜または経皮投与の場合、透過させるバリアに適切な浸透剤を配合物に使用する。そのような浸透剤は、当該分野で周知であり、そのようなものとして、例えば、経粘膜投与の場合、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。また、浸透を促進するために界面活性剤を使用する場合がある。経粘膜投与は、例えば、鼻スプレー、インヘラー（肺に送達するため）、直腸坐剤、または膣坐剤を通じたものが可能である。外用投与の場合、化合物は、当該分野で周知であるとおり、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに配合することができる。
【０１０４】
送達される複合体の量は、多くの要因、例えば、ＩＣ５０、ＥＣ５０、化合物の生物学的半減期、患者の年齢、寸法、体重、及び体調、ならびに治療しようとする疾患または障害などに依存することになる。考慮すべきこれら及び他の要因の重要性は、当業者に周知である。概して、投与される複合体の量は、患者の身体の表面積１平方メートルあたり約１０国際単位（ＩＵ／ｍ２）〜５０，０００ＩＵ／ｍ２の範囲になり、投薬量範囲は、約１，０００ＩＵ／ｍ２〜約１５，０００ＩＵ／ｍ２が好適であり、約６，０００ＩＵ／ｍ２〜約１５，０００ＩＵ／ｍ２の範囲がより好適であり、約１０，０００〜約１５，０００ＩＵ／ｍ２（約２０〜３０ｍｇタンパク質／ｍ２）の範囲が、悪性血液疾患、例えば、白血病を治療するのに特に好適である。典型的には、これらの投薬量は、治療過程中、週に３回から１ヶ月に約１回、典型的には週に１回または１週おきに１回の間隔で、筋肉内または静脈内注射を介して投与される。当然ながら、担当医により決定されるとおり、他の投薬量及び／または治療レジメンが採用可能である。
【０１０５】
本発明は、以下の追加の例によりさらに例示されるが、それらは制限するものとみなされるべきではない。当業者なら、本開示に照らして、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態に多くの変更を加えることができ、それでもなお類似のまたは同様な結果を得ることができることがわかるはずである。
【実施例】
【０１０６】
米国特許第９，９２０，３１１号の発明対象は、ＰＥＧ化アスパラギナーゼの製造法及び試験法を開示する実施例も含めて、本明細書中参照として援用される。以下の実施例で使用されるｍＰＥＧ−ｒ−クリサンタスパーゼ複合体は、米国特許第９，９２０，３１１号に記載のとおりの調製した。
【０１０７】
実施例１
ｍＰＥＧ−ｒ−クリサンタスパーゼ複合体（Ｐｅｇクリサンタスパーゼ）を、以下に示すとおり２段階で、様々な細胞株に対して試験した。
【０１０８】
細胞調製。全ての細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ（ＵＳ）からライセンス化された。ＡＴＣＣ推奨プロトコル（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）に従って、ＡＴＣＣ推奨培地中で継代培養し、凍結させることにより、マスター細胞バンク及び作業細胞バンク（ＭＣＢ及びＷＣＢ）を調製した。
【０１０９】
化合物調製。試験化合物を、適宜ＤＭＳＯまたは水性緩衝液を用いて、原液として調製し、系列希釈して、希釈系列を得た。
【０１１０】
細胞増殖アッセイ。市販の蛍光アッセイを用い、終点にＡＴＰを使用して、細胞増殖を評価した。
【０１１１】
対照。ｔ＝０のシグナル。平行プレートに、細胞４５μｌを分注し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。２４時間後、ＤＭＳＯ含有Ｈｅｐｅｓ緩衝液５μｌ及びＡＴＰｌｉｔｅ  １Ｓｔｅｐ（商標）溶液２５μｌを混合し、１０分インキュベーション後に蛍光を測定した（＝蛍光ｔ＝０）。
【０１１２】
参照化合物。参照化合物ドキソルビシンのＩＣ５０を、別個のプレートで測定する。ＩＣ５０には、傾向がある。ＩＣ５０が仕様から外れる場合（過去の平均から０．３２〜３．１６倍の逸脱）、そのアッセイは、無効である。
【０１１３】
細胞増殖対照。全ての細胞株の細胞倍加時間を、未処置の細胞のｔ＝０時間及びｔ＝ｅｎｄの増殖シグナルから計算する。倍加時間が仕様から外れる場合（過去の平均から０．５〜２．０倍の逸脱）、そのアッセイは、無効である。
【０１１４】
最大シグナル。各細胞株について、０．４％ＤＭＳＯ存在下、化合物なしで、インキュベーション後、ｔ＝ｅｎｄまでで、最大蛍光を記録した（＝蛍光未処置，ｔ＝ｅｎｄ）。
【０１１５】
薬物感受性。細胞株の「改変型」群と「野生型」群の間での１０ｌｏｇＩＣ５０の差を、３通りのやり方で分析した。１つ目は、頻度の高い遺伝子変化上位１８種について、個々の細胞株の薬物感受性を、ウォーターフォールプロットで視覚化した。２つ目は、最も一般的に生じ一番理解されているがん遺伝子のより大きなサブセット（合計で３８）を、統計プログラムＲのＴｙｐｅ  ＩＩ  Ａｎｏｖａ分析で分析した。結果は、ボルケーノプロットで表示する。３つ目は、１１４のがん遺伝子からなる完全セットを、Ｒの両側等分散ｔ検定により分析した。Ａｎｏｖａ及びｔ検定によるＰ値を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ多重比較検定補正法に供した。偽発見率が２０％未満の遺伝子関連性のみを、有意性があるとみなす。３８のがん遺伝子に対するＴｙｐｅ  ＩＩ  Ａｎｏｖａ分析は、１１４のがん遺伝子に対する等分散ｔ検定とは異なる検定であり、このことは、関連性の有意性が異なる可能性があることを意味する。Ｏｎｃｏｌｉｎｅｓ（商標）法についてのさらなる情報は、以下を参照：ｗｗｗ．ｎｔｒｃ．ｎｌ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｏｎｃｏｌｉｎｅｓｔｍ。
【０１１６】
ＩＣ５０は、ＩＤＢＳ  ＸＬｆｉｔを用いて非線形回帰により計算した。インキュベーション後、ｔ＝ｅｎｄまでの増殖パーセンテージ（％−ｇｒｏｗｔｈ）を、以下の通り計算した：１００％×（蛍光ｔ＝ｅｎｄ／蛍光未処置，ｔ＝ｅｎｄ）。これを、４係数ロジスティック曲線により、１０ｌｏｇ化合物濃度（ｃｏｎｃ）に当てはめた：％−ｇｒｏｗｔｈ＝最小値＋（最大値−最小値）／（１＋１０（ｌｏｇＩＣ５０−ｃｏｎｃ）＊ｈｉｌｌ））、式中、ｈｉｌｌは、ヒル係数であり、最小値及び最大値は、そのアッセイで化合物が許容する漸近最小及び最大細胞増殖値である。
【表２】
2021505661.tif 000003
【０１１７】
ＮＣＩ６０パラメーター。ＬＤ５０、すなわち細胞の５０％が死滅する濃度は、蛍光ｔ＝ｅｎｄ＝１／２×蛍光ｔ＝０ｈとなる濃度である。ＧＩ５０、すなわち増殖が５０％阻害される濃度は、細胞増殖が最大半量となる濃度である。これは以下のシグナルに関連した濃度である：（（蛍光未処置，ｔ＝ｅｎｄ−蛍光ｔ＝０）／２）＋蛍光ｔ＝０。
【０１１８】
曲線当てはめ。ソフトウェアにより自動計算された曲線を、以下のプロトコルに従って手動で調整した：計算された曲線が、０より低い最小値を有した場合には、曲線の最小値を０％に固定した。ソフトウェアが計算で−６より低い値を出した場合には、勾配を−６に固定した。当てはめの品質に関するＦ検定値が＞１．５だった場合、または化合物が不活性であった場合（最大効果が＜２０％）、曲線は無効とし、それらの場合の曲線は、グラフから削除した。曲線が二相性の特徴を有した場合、その曲線は最も強力なＩＣ５０で当てはめを行なった。偶然にも、技術的な過失らしい場合には、濃度点を除外した。これは、常に、用量依存グラフに示される。用量反応曲線が８５％超について完全に特定された場合には、最大効果（Ｍａｘ  ｅｆｆｅｃｔ）を、１００％（未処置細胞のシグナル）−曲線の最小値、として計算した。用量反応曲線は、最高濃度でのデータ点が曲線の最小値に到達する場合に、１００％完全であるとみなされる。完全性が８５％未満であった場合、Ｍａｘ  ｅｆｆｅｃｔは、１００％−最小シグナルの平均、として計算した。曲線の最小値が０％に固定された場合、最大効果は、常に、１００％−最高濃度での増殖阻害、として計算した。
【０１１９】
ボルケーノプロット。図８のボルケーノプロットは、３８の重要遺伝子において、遺伝子形質転換が、化合物感受性のシフトとどのように統計的に関連しているかを示す（１０ｌｏｇＩＣ５０により測定したとして）。Ｐ値（ボルケーノプロットのｙ軸）は、ＩＣ５０シフトを伴う特定遺伝子における変異の遺伝子関連性についての信頼レベルを示す。ＩＣ５０シフトの係数は、ｘ軸に示す。円の面積は、細胞パネル中の変異数に比例する（各変異は、少なくとも３倍存在する）。有意性を計算するため、Ｐ値をＢｅｎｊａｍｉｎ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ多重比較検定補正法に供し、偽発見率が２０％未満の遺伝子関連性のみを、灰色で示す。関連するカットオフＰ値（０．０５９）は、水平線で示す。有意な関連性がない場合、灰色の円も水平線も描画されない。
【０１２０】
Ｔ検定の結果。９８の検証されたがんドライバー遺伝子については、それらの変異体も患者に発生するので、細胞株中の遺伝子の「野生型」及び「変異型」体の存在が、試験化合物の有意なＩＣ５０シフトと関連するかどうかを試験した。「ＩＣ５０シフト」の欄は、１０ｌｏｇＩＣ５０の差を示す。負のＩＣ５０シフトは、化合物が、「変異型」遺伝子を保有する細胞株においてより強力であることを示す。「ｐ値」の欄は、両側ｔ検定の結果を示す。有意性を計算するため、ｐ値をＢｅｎｊａｍｉｎ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ多重比較検定補正法に供した。偽発見率が２０％未満の遺伝子関連性のみに、ハイライトを付してある（「調整ｐ値」の欄）。有意な関連性がない場合、以下の表には、灰色のセルが存在しない。
【表３】
2021505661.tif 000004
【０１２１】
図９の特別なボルケーノプロットは、がんのホットスポット変異の存在に対する化合物感受性に関連する（１０ｌｏｇＩＣ５０により測定したとして）。これは、先の分析との比較において臨床上関連するがんドライバー変異に対してより高い注目を提供する。ホットスポット変異は、別々の研究を通じて患者における変異の反復パターン及びコピー数変化を統計分析することに由来するものであった。軸及び統計分析は、図８のボルケートプロットと同一である。有意性のカットオフｐレベルは０．３２である。
【０１２２】
実施例３：ＰｅｇクリサンタスパーゼとＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）の相乗活性。Ｅｆｆｅｃｔ２０ＳｙｎｅｒｇｙＳｃｒｅｅｎ（商標）実験で、他の抗がん剤の活性に対する本化合物の効果を特定するため、細胞増殖が２０％阻害される濃度に相当する、低く固定された濃度を用いる。この濃度は、単独化合物の用量反応曲線を用いて決定する。濃度は、ｘ軸上の値であり、ｙ軸の未処置での８０％生存率に相当する。
【表４】
2021505661.tif 000005
【０１２３】
ｍＰＥＧ−ｒ−クリサンタスパーゼ複合体（Ｐｅｇクリサンタスパーゼ、以下の最初の表を参照）またはＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（以下の第二の表を参照）を、ＡＭＬまたはＤＬＢＣＬの標準治療（ＳＯＣ）に典型的に使用される他の作用剤とともに試験した。ダウノルビシン、シタラビン、ＡＢＴ−７３７、ベネトクラクス、ダクトリシブ、ボルテゾミブ、及びカルフィルゾミブと併用した場合、ＡＭＬで効果の上昇が見られた。さらに、ビンクリスチン、プレドニゾロン、ＡＢＴ−７３７、ベネトクラクス、エベロリムス、ダクトリシブ、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、及びＣＢ−８３９と併用した場合、ＤＬＢＣＬで効果の上昇が見られた。以下の表を参照。灰色着色は、相乗活性を示す。淡灰色着色は、１つの実験を、濃灰色着色は、２つの実験を示す。
【表５】
2021505661.tif 000006
【０１２４】
実施例３：ｍＰＥＧ−ｒ−クリサンタスパーゼ複合体（Ｐｅｇクリサンタスパーゼ）を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、シタラビン及びダウノルビシンとともに試験した。５匹のマウスからなる群に、それぞれ、ｍＰＥＧ−ｒ−クリサンタスパーゼ（ＰｅｇＣ）を単剤として投与（５＆５０ＩＵ／ｋｇ）、ならびにＳＯＣ薬剤であるシタラビン（５０ｍｇ／ｋｇを１日１回で５日間、続いて２日間の休みというサイクルを２回）及びダウノルビシン（２週間、１ｍｇ／ｋｇを毎週投与）との併用投与を行なった。これらの用量は十分に忍容性があった。図１を参照。群１は、ＰＢＳ対照群、群３はＰｅｇＣ群、群１１はダウノルビシン＋ＰｅｇＣ群、群１３はダウノルビシン群である。相対体重平均の約１０％の低下は、ダウノルビシンによるものであった。
【０１２５】
実施例４：この実施例は、実施例１と同様な様式で行なったが、ただしｍＰＥＧ−ｒ−クリサンタスパーゼ複合体（Ｐｅｇクリサンタスパーゼ）を、他の化合物と併用して試験した。図２は、Ｐｅｇクリサンタスパーゼが、シタラビン、ベネトクラクス、及びＡＢＴ−７３７の効果を増強することを示し、相乗作用を示す。
【０１２６】
実施例５：ＨＬ−６０細胞株に対して、ｍＰＥＧ−ｒ−クリサンタスパーゼ複合体（Ｐｅｇクリサンタスパーゼ）を、ＡＢＴ−７３７と併用して試験した。
【０１２７】
プレート調製。混合物及び単剤の原液を、ＤＭＳＯまたは０．９％塩化ナトリウムに希釈して、７点用量反応希釈系列を生成させた。２０ｍＭ滅菌Ｈｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．４（参照化合物）または媒体（ｐｅｇクリサンタスパーゼ）でさらに３１．６倍希釈した後、ｐｅｇクリサンタスパーゼ溶液５μｌ、及び参照化合物５μｌを、３８４ウェルアッセイプレートにあらかじめ播種しておいた細胞４０μｌに２つ組で加えた。インキュベーション中の最終ＤＭＳＯ濃度は、全てのウェルで０．４％であった。最終アッセイ濃度は、単剤について、それらのＩＣ５０の１０〜０．０１倍（ＩＣ５０の１０倍及び０．０１倍当量）の範囲であった。
【０１２８】
細胞増殖アッセイ。アッセイ用貯蔵細胞を、適切な倍地中で解凍及び希釈し、３８４ウェルプレートに分注した。濃度は、使用する細胞株に応じて、１ウェルあたり培地４５μｌ中８００〜３２００の細胞濃度であった：すなわち、ＤＢ：１ウェルあたり細胞８００個；ＲＬ：１ウェルあたり細胞１０００個；ＭＶ−４−１１：１ウェルあたり細胞１６００個ｌ；ＫＧ−１、ＨＬ−６０、及びＨＴは、１ウェルあたり細胞３２００個。使用した細胞株それぞれについて、細胞密度をあらかじめ最適化した。プレートのマージンには、リン酸緩衝食塩水を充填した。播種した細胞を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。２４時間後、ｐｅｇクリサンタスパーゼ溶液５μｌ、及び参照化合物５μｌを加え、プレートをさらに、追加で７２時間インキュベートした。７２時間後、プレートを３０分で室温まで冷却し、各ウェルに、ＡＴＰｌｉｔｅ  １Ｓｔｅｐ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）溶液２５μｌを加え、続いて２分間振盪撹拌した。暗中室温で５分間インキュベーション後、蛍光をＥｎｖｉｓｉｏｎマルチモードリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で記録した。
【０１２９】
対照：ｔ＝０のシグナル。平行プレートに、細胞４０μｌを４つ組で分注し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。２４時間後、プレートを３０分で室温まで冷却した。ＤＭＳＯ含有Ｈｅｐｅｓ緩衝液５μｌ、０．９％塩化ナトリウム含有培地５μｌ、及びＡＴＰｌｉｔｅ  １Ｓｔｅｐ（商標）溶液２５μｌを加え、続いて２分間混合した。１０分インキュベーション後、暗中で蛍光を測定した（＝蛍光ｔ＝０）。
【０１３０】
細胞増殖対照。全ての細胞株の細胞倍加時間を、未処置細胞のｔ＝０時間及びｔ＝ｅｎｄ増殖シグナルから計算する。倍加時間が仕様から外れる場合（過去の平均から０．５〜２．０倍の偏位）、アッセイは無効とする。
【０１３１】
最大シグナル。各３８４ウェルプレートで、０．４％ＤＭＳＯの存在下、化合物なしで、７２時間インキュベーション後に最大蛍光を記録した。全ての等価なウェル（通常は１４）を平均した。この平均は、以下のとおり定義される：蛍光未処置，ｔ＝７２ｈ。
用量反応曲線。併用分析のためには正確な単剤ＩＣ５０が必要である。各単剤について、その用量反応シグナルに、ＸＬ−ｆｉｔ  ５（ＩＤＢＳソフトウェア）を用いて、４係数ロジスティック曲線による当てはめを行なった：
蛍光＝最小値＋（最大値−最小値）／（１＋１０（ｌｏｇＩＣ５０−ｌｏｇ［ｃｐｄ］）・ｈｉｌｌ））
［ｃｐｄ］は、試験した化合物濃度である。ｈｉｌｌは、ヒル係数である。最小値及び最大値は、曲線の漸近最小及び最大である。
併用指数（ＣＩ）の特定。ＣＩは、相乗作用の定量的表示に最も広く使用されているものの１つである。ＣＩは、固定された効果を達成するために必要な濃度を評価する。１未満のＣＩは、相乗作用を示す。０．３未満のＣＩは、強い相乗作用を示す。例えば、０．１のＣＩは、その併用が、同じ効果レベルを達成するために、単剤データから予想される濃度より１／１０倍低い濃度しか必要としないことを示す。例えば、強力な化合物と、それほど強力じゃない化合物が、０．１のＣＩで組み合わせられる場合、強力化合物の有効濃度は、それほど強力じゃない化合物により１０倍改善される。
【０１３２】
ＣＩは、ある特定の細胞生存度パーセンテージ（Ｖ）に関して定義され、Ｖは、非曝露対照に関するシグナルである：Ｖ＝１００％×蛍光処置，ｔ＝７２ｈ／蛍光未処置，ｔ＝７２ｈ。次いで、２種の化合物、ｃｐｄ１及びｃｐｄ２の、併用においてある特定の細胞生存度パーセンテージＶに達するために必要な濃度を、単剤の場合に必要な濃度と比較する：
ＣＩ（１００−Ｖ）＝［ｃｐｄ１］Ｖ／ＩＣ（１００−Ｖ），ｃｐｄ１＋［ｃｐｄ２］Ｖ／ＩＣ（１００−Ｖ），ｃｐｄ２
例えば、［ｃｐｄ１］５０は、５０％生存率を与える、混合物中のＣＰＤ１濃度を表す。ＩＣ５０，ｃｐｄ１は、ｃｐｄ１単独のＩＣ５０を表す。ＣＩは、慣例に従って、％−効果により標識されるので、ＣＩ７５は、２５％生存率でのＣＩを表す。
曲線のシフト分析。この分析は、相乗作用の視覚による確認を提供する１。化合物１及び２（ｃｐｄ１及びｃｐｄ２）の混合物、ならびに単剤の濃度を、ＩＣ５０当量換算で（ＩＣ５０「単位」で）表した：
［ｍｉｘ］＝［ｃｐｄ１］／ＩＣ５０，ｃｐｄ１＋［ｃｐｄ２］／ＩＣ５０，ｃｐｄ２
用量反応シグナルに、ＸＬ−ｆｉｔ  ５（ＩＤＢＳソフトウェア）を用いて、４係数ロジスティック曲線による当てはめを行なった：
蛍光＝最小値＋（最大値−最小値）／（１＋１０（ｌｏｇＸ−ｌｏｇ［ｍｉｘ］）・ｈｉｌｌ））
式中、ｈｉｌｌは、ヒル係数であり、Ｘは曲線の変曲点である。最小値及び最大値は、曲線の漸近最小及び最大である。［ｍｉｘ］はＩＣ５０当量換算で表されているため、単剤の曲線は重なることになり、それらの変曲点は、値が１のところに来る。計算に使用されるＩＣ５０値は、単剤について平行して測定されたものである。
【０１３３】
相乗作用が存在しない混合物では、曲線は、単剤のものと重なることになる。相乗作用が存在する混合物では、曲線は、ＩＣ５０当量が低い方に向かって左にシフトすることになる：混合物は、個々の構成要素に基づいて予想されるよりも強力になるように見える。これは、相乗作用の良い指標である。
【０１３４】
アイソボログラム。アイソボログラムは、薬物の併用が相乗的であるかどうかを明らかにする用量中心プロットである。これは、ある特定の効果レベル、通常は７５％で、定義される。単剤曲線がこの有効性レベルに達しない場合、アイソボログラムレベルは、５０％、３０％、２５％、または２０％に設定される。単剤が２０％有効に達しない場合、アイソボログラムは描画されない。軸には、あらかじめ設定された増殖効果を与える単独化合物の計算された用量がプロットされる。両点を直線で結ぶ（相加作用ライン）。薬物併用について、どの希釈物があらかじめ設定された増殖効果を与えるかを計算し、その点での個々の成分の濃度をアイソボログラムにプロットする。相加的薬物効果の場合、薬物併用は、相加作用ラインに近い場所に来る。相乗または拮抗作用の場合、点はそれぞれ、相加作用ラインの下または上に来る。
【０１３５】
不活性作用剤を用いた実験。ある特定の合意例において、相乗作用実験を、「不活性」作用剤の存在下で行う。「不活性」作用剤とは、試験した濃度で、単剤として用量反応曲線を与えない化合物である。実験は、上記の説明のとおりに実行されるが、ただし「不活性」作用剤が、実験の各ウェルに固定濃度で加えられる。単独の「不活性」作用剤は効果を示さないため、ＣＩに対するその寄与は、取るに足りないものである。そのため、ＣＩ値は、活性作用剤の反応に基づいている。混合物の曲線シフトは、他の、活性作用剤との比較で特定される。アイソボログラムは計算しない。単剤での用量反応曲線を、図３に示す。ＡＢＴ−７３７は、ＩＣ５０が８３５ｎＭ、及び最大有効性が６７％であるが、ｐｅｇクリサンタスパーゼは、ＩＣ５０が０．１５ｎＭ、及び最大有効性が８８％であった。
【０１３６】
曲線シフト分析：単剤曲線（灰色及び濃灰色）及び混合物曲線（赤色、橙色、及び桃色）のｘ軸を、単剤のＩＣ５０に基づいて、ＩＣ５０当量に変換した。そして変換したものを、図４に示すとおりの混合物の用量反応曲線と比較する。
【０１３７】
ＩＣ５０基準での混合物の用量反応曲線について、全ての曲線を重ね合わせ、シフトを記録した。単剤曲線（灰色及び濃灰色）に比べて左方向にシフトした混合物曲線は、相乗作用を示し、右方向へのシフトは拮抗作用を示す（図５及び以下の表を参照）。
単剤と比較した混合物のＩＣ５０シフト
【表６】
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【０１３８】
ｐｅｇクリサンタスパーゼとＡＢＴ−７３７の併用を用いた結果を、以下に示す。混合物データから計算したＣＩ値、ＥＤ７５は、２５％生存率に相当する。代表的な値は、３種の混合物について５０％生存率での平均ＣＩであり、これを要約に示す。
【表７−１】
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【表７−２】
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【０１３９】
併用データを用いて、図６に示すとおりのアイソボログラムを作成した。アイソボログラムは、薬物の併用が相乗的であるかどうかを明らかにする用量中心プロットである。相乗作用の場合、併用の点は、相加作用ラインの直線の下に来る。ｐｅｇクリサンタスパーゼの濃度は、ＩＵ／ｍＬで示す。相加作用ライン（濃灰色）は、理論的相加作用を与えると思われる濃度の併用を示す。薬物の併用は、赤色、桃色、及び橙色の点でプロットする。まとめると、以下に示すとおり、ＨＬ−６０細胞株においてｐｅｇクリサンタスパーゼとＡＢＴ−７３７の間に強力な相乗作用が見られた。
【表８】
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【０１４０】
実施例６：この実施例は、実施例５と同様な様式で行なったが、ただし、以下に示すとおり、異なる細胞型で追加の抗がん剤との相乗作用を試験した。
【表９】
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【０１４１】
実施例７：この実施例は、実施例１と同様な様式で行なったが、ただし、ｍＰＥＧ−ｒ−クリサンタスパーゼ複合体を、ＣＮＳ細胞株に対する活性について試験した。ＣＮＳ細胞株には、例えば、神経膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、多形性膠芽腫、及び星細胞腫が含まれていた。結果を図７に示す。異なる細胞株を用いた追加実験を行なった。結果を、図１０に示す。
【０１４２】
実施例８：実施例１に記載の方法に従って、ｍＰＥＧ−ｒ−クリサンタスパーゼ複合体（Ｐｅｇクリサンタスパーゼ）を追加の化合物と併用して、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）及びＤＬＢＣＬ（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）細胞株に対して試験した。結果を以下に示す。ＫＧ−１、ＨＬ−６０、及びＭＶ４−１１は、ＡＭＬ細胞株であり、ＤＢ、ＨＴ、及びＲＬは、ＤＬＢＣＬ細胞株である。ｐｅｇクリサンタスパーゼとベネトクラクスの併用のデータは、ＡＭＬ細胞株において強力な相乗作用を示した。
【表１０】
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【０１４３】
実施例９
実施例１に記載の方法に従い、複数の細胞株において、クリサンタスパーゼのＰａｓ化複合体を、クリサンタスパーゼのＰＥＧ化体（ＰＥＧ−クリサンタスパーゼ）及び非ＰＥＧ化体（Ｅｒｗｉｎａｓｅ）と対比させて、Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｏｎｃａｓｐａｒ）も合わせて、試験した。ＰＡ−２０及びＰＡ−４０は、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ発現系で産生されたｐａｓ化クリサンタスパーゼ複合体であり、ＰＡ−２００は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ発現系で産生されたｐａｓ化融合タンパク質である。ＰＡ−２０、ＰＡ−４０、ＰＡ−２００、及びＰＡ−４００構造体は、配列番号２、３、６、及び７のものである。結果を以下に示す。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ−４、及びＲＳ４：１１は、全てＡＭＬ細胞株であり、Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６−１は、急性Ｔ細胞白血病細胞株、ＨＬ−６０は、急性前骨髄球性白血病細胞株、ＭＶ４−１１は、二重表現型Ｂ細胞骨髄単球性白血病細胞株、ＴＨＰ−１は、ＡＭＬ細胞株、ＲＬは、非ホジキンリンパ腫細胞株、Ｈ９は、リンパ腫細胞株である。
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１１−４】
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【表１１−５】
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【０１４４】
当業者なら、本明細書中記載される本発明の具体的な実施形態の多くの等価物がわかるだろう、または常用実験にすぎないものを用いて確認することができるだろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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