(57)【要約】本開示は、センス鎖とアンチセンス鎖を含む、ＨＢＶ遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡを提供する。前記センス鎖は、ヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列２を含み、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２とは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列１と配列番号１に示されるヌクレオチド配列は、長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列２と配列番号２に示されるヌクレオチド配列は、長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位及び前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドは、フルオロ修飾ヌクレオチドである。本開示は、当該ｓｉＲＮＡを含む薬物組成物及び複合体をさらに提供する。本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び複合体は、良好なＨＢＶ遺伝子発現抑制活性を有する。【選択図】図７
2021533800.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を抑制できるｓｉＲＮＡであって、前記ｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖とアンチセンス鎖の各ヌクレオチドはいずれも修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖とアンチセンス鎖はいずれもフルオロ修飾ヌクレオチド及び非フルオロ修飾ヌクレオチドを含み、前記フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、非フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指し、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列２を含み、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２とは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列１と配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列２と配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＺ−３’（配列番号１）、
５’−Ｚ’ＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣ−３’（配列番号２）
ただし、ＺはＵであり、Ｚ’はＡであり、
前記ヌクレオチド配列１に、位置がＺに対応するヌクレオチドＺＡが含まれ、前記ヌクレオチド配列２に、位置がＺ’に対応するヌクレオチドＺ’Ｂが含まれ、前記Ｚ’Ｂは、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、
前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列１とヌクレオチド配列２に位置し、前記ヌクレオチド配列１におけるフルオロ修飾ヌクレオチドが５個以下であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２におけるフルオロ修飾ヌクレオチドが７個以下であり、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであるｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列１と配列番号１に示されるヌクレオチド配列との間に１つ以下のヌクレオチド差異があり、及び／又は前記ヌクレオチド配列２と配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間に１つ以下のヌクレオチド差異がある、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列２と配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ’Ｂの位置での差異を含み、Ｚ’ＢがＵ、Ｃ又はＧから選択される、請求項１又は２に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
ＺＡは、Ｚ’Ｂと相補的なヌクレオチドである、請求項３に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２は、基本的に逆相補的、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記基本的に完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項１又は２に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
前記センス鎖は、ヌクレオチド配列３をさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列４をさらに含み、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがそれぞれ１〜４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列３は、前記ヌクレオチド配列１の５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４は、前記ヌクレオチド配列２の３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さが等しく、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列３の塩基がＧである、或いは、
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列３の塩基が順にＵ及びＧである、或いは、
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列３の塩基が順にＵ、Ｕ及びＧである、或いは、
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列３の塩基が順にＡ、Ｕ、Ｕ及びＧである、請求項６に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項８】
前記ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列５をさらに含み、前記ヌクレオチド配列５は、長さが１〜３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の３’オーバーハング端を構成する、請求項１、６又は７に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列５は、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列５は、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド、連続した２個のウラシルリボヌクレオチド、又は標的ｍＲＮＡと相補的な２つのヌクレオチドである、請求項８に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号３又は配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８に示されるヌクレオチド配列からなる群より選ばれるいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のｓｉＲＮＡ。
５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＵ−３’（配列番号３）
５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＡ−３’（配列番号４）
５’−ＡＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＵＵ−３’（配列番号５）
５’−ＡＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＣＡ−３’（配列番号６）
５’−ＵＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＵＵ−３’（配列番号７）
５’−ＵＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＣＡ−３’（配列番号８）
【請求項１１】
以下のｓｉＰ１〜ｓｉＰ４のいずれか１つである、請求項１０に記載のｓｉＲＮＡ。
ｓｉＰ１
センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＵ−３’（配列番号３）
アンチセンス鎖：５’−ＡＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＵＵ−３’（配列番号５）
ｓｉＰ２
センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＵ−３’（配列番号３）
アンチセンス鎖：５’−ＡＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＣＡ−３’（配列番号６）
ｓｉＰ３
センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＡ−３’（配列番号４）
アンチセンス鎖：５’−ＵＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＵＵ−３’（配列番号７）
ｓｉＰ４
センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＡ−３’（配列番号４）
アンチセンス鎖：５’−ＵＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＣＡ−３’（配列番号８）
【請求項１２】
５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位又は５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位又は２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１３】
各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される１つである、請求項１又は１２に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１４】
ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチドは、２’−アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチドから選択される１つであり、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択される１つである、請求項１３に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１５】
各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドは、リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す、請求項１４に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１６】
前記ｓｉＲＮＡは、表１Ａ内のいずれか１つに示されるｓｉＲＮＡである、請求項１５に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１７】
前記センス鎖と前記アンチセンス鎖において、少なくとも１本の一本鎖のリン酸−糖骨格中のリン酸エステル基の少なくとも１個が、修飾基を有するリン酸エステル基である、請求項１〜２、４、６〜７、９〜１１、１２及び１４〜１６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１８】
前記修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である、請求項１７に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１９】
前記修飾基を有するリン酸エステル基が、式（１）に示される構造を有するチオリン酸エステル基である、請求項１８に記載のｓｉＲＮＡ。
【化１】
2021533800.tif 000118
【請求項２０】
前記ｓｉＲＮＡにおいて、以下のヌクレオチド間の結合からなる群より選ばれる少なくとも１つは、チオリン酸エステル基による結合である、請求項１７に記載のｓｉＲＮＡ：
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間の結合、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間の結合。
【請求項２１】
前記ｓｉＲＮＡは、表１Ｂ内のいずれか１つに示されるｓｉＲＮＡである、請求項２０に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２２】
前記アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである、請求項１〜２、４、６〜７、９〜１１、１２、１４〜１６及び１８〜２０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２３】
前記ｓｉＲＮＡは、表１Ｃ又は表１Ｄ内のいずれか１つに示されるｓｉＲＮＡである、請求項２２に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２４】
前記５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、式（２）〜式（６）の１つに示されるヌクレオチドであり、
【化２】
2021533800.tif 000119
ただし、ＲはＨ、ＯＨ、Ｆ及びメトキシ基からなる群から選択される基を表し、
ＢａｓｅはＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される塩基を表す、請求項２２に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする薬物組成物。
【請求項２６】
前記ｓｉＲＮＡと前記薬学的に許容可能な担体との重量比が１：（１〜５００）である、請求項２５に記載の薬物組成物。
【請求項２７】
前記ｓｉＲＮＡと前記薬学的に許容可能な担体との重量比が１：（１〜５０）である、請求項２６に記載の薬物組成物。
【請求項２８】
前記薬学的に許容可能な担体が、有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質を含み、前記有機アミンが、式（２０１）に示される化合物及び／又はその薬学的に許容できる塩である、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の薬物組成物：
【化３】
2021533800.tif 000120
式中、
Ｘ１０１及びＸ１０２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ−Ａ又はＣ−Ａであり、Ａは水素又はＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖であり、
Ｙ１０１及びＺ１０１はそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨ又はＳＯ２であり、
Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｒ１０６及びＲ１０７はそれぞれ独立して、
水素と、
環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基と、
環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基と、
置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基と、
置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基と、
置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基と、から選択され、
ｘは１〜１０の整数であり、
ｎは１〜３の整数であり、ｍは０〜２０の整数であり、ｐは０又は１であり、ｍ及びｐがいずれも０である場合、Ｒ１０２は水素であり、
ｎ又はｍの少なくとも１つが２である場合、Ｒ１０３と式（２０１）における窒素とが、式（２０２）又は式（２０３）に示される構造を形成し、
【化４】
2021533800.tif 000121
式中、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１〜６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊Ｎは式（２０１）に示される窒素原子を表す。
【請求項２９】
前記有機アミンが、式（２１４）に示される有機アミン及び／又は式（２１５）に示される有機アミンであり、
【化５】
2021533800.tif 000122
前記補助脂質はコレステロール、コレステロールのアナログ及び／又はコレステロールの誘導体であり、かつ、
前記ＰＥＧ化脂質は１，２−ジパルミトアミド−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）］−２０００である、請求項２８に記載の薬物組成物。
【請求項３０】
前記有機アミン、前記補助脂質及び前記ＰＥＧ化脂質のモル比が（１９．７〜８０）：（１９．７〜８０）：（０．３〜５０）である、請求項２８に記載の薬物組成物。
【請求項３１】
前記薬物組成物において、前記有機アミン、前記補助脂質及び前記ＰＥＧ化脂質のモル比が（５０〜７０）：（２０〜４０）：（３〜２０）である、請求項３０に記載の薬物組成物。
【請求項３２】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに複合して結合されるリガンドを含むｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項３３】
前記リガンドが薬学的に許容できる複合基であり、前記複合基が薬学的に許容できる標的基とリンカーを含み、前記ｓｉＲＮＡ、前記リンカー及び前記標的基が順に共有結合的に結合されている、請求項３２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項３４】
前記リンカーが式（３０１）に示される構造を有する、請求項３３に記載のｓｉＲＮＡ複合体：
【化６】
2021533800.tif 000123
式中、ｋは１〜３の整数であり、
ＬＡは、式（３０２）に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記ＬＡは、その両端でそれぞれ１つの前記標的基及び前記ＬＣ部にエーテル結合により結合され、
【化７】
2021533800.tif 000124
ＬＢは、式（３０３）に示される構造を有するＮ−アシルピロリジンを含む鎖状部であり、前記鎖状部は、その一端にカルボニル基を有し、前記ＬＣ部にアミド結合により結合され、他端に酸素原子を有し、前記ｓｉＲＮＡにリン酸エステル結合により結合され、
【化８】
2021533800.tif 000125
ＬＣは、ヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく２〜４価のリンカー基であり、前記ＬＣは、酸素原子を介して各前記ＬＡ部にエーテル結合により結合され、窒素原子を介して前記ＬＢ部にアミド結合により結合される。
【請求項３５】
前記リンカーが前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される、請求項３３又は３４に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項３６】
前記標的基がアシアロ糖タンパク質受容体のリガンドである、請求項３３又は３４に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項３７】
前記標的基がガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンである、請求項３６に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項３８】
式（３０５）に示される構造を有し、
【化９】
2021533800.tif 000126
式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、
前記リンカーは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される、請求項３７に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項３９】
前記リンカーが式（３０６）に示される構造を有し、
【化１０】
2021533800.tif 000127
式中、ｌは０〜３の整数であり、
＊は、前記リンカーにおける、エーテル結合により前記標的基に結合される部位を表し、
＃は、前記リンカーにおける、リン酸エステル結合により前記ｓｉＲＮＡに結合される部位を表す、請求項３３に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４０】
前記リンカーが前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される、請求項３９に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４１】
前記標的基がアシアロ糖タンパク質受容体のリガンドである、請求項３９に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４２】
前記標的基がガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンである、請求項４１に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４３】
式（３０７）に示される構造を有し、
【化１１】
2021533800.tif 000128
式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、
前記リンカーは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される、請求項４２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４４】
式（４０１）に示される構造を有するｓｉＲＮＡ複合体：
【化１２】
2021533800.tif 000129
式中、
ｎ１は、１〜３から選択される整数であり、ｎ３は、０〜４から選択される整数であり、
ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２〜１０から選択される整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立して、Ｈ、メチル基又はエチル基の１つであり、
Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基であり、
【化１３】
2021533800.tif 000130
式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、Ｎｕは請求項１〜２４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡであり、
Ｒ２は、窒素含有骨格上のＮとＡ５９との結合を実現できる任意の基であり、
各Ｌ１は、式Ａ１〜Ａ２６の基から独立して選択される１又は複数の結合の組合せであり、
【化１４】
2021533800.tif 000131
式中、ｊ１は１〜２０の整数であり、ｊ２は１〜２０の整数であり、
Ｒ’はＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
Ｒａは式Ａ２７〜Ａ４５の基から選択される１つであり、
【化１５】
2021533800.tif 000132
ＲｂはＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
2021533800.tif 000133
は、基が共有結合的に結合する部位を表し、
各Ｍ１は、哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を有するリガンドから選択される１つである。
【請求項４５】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１３から選択される１又は複数の結合の組合せである、請求項４４に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４６】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せである、請求項４５に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４７】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ８、Ａ１０から選択される少なくとも２つの結合の組合せである、請求項４６に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４８】
Ｌ１の長さが３〜２５個の原子であり、前記Ｌ１の長さとは、窒素含有骨格のＮ原子に結合される原子からＭ１に結合される原子までの最も長い原子鎖を形成する原子の個数を指す、請求項４４〜４７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４９】
Ｌ１の長さが４〜１５個の原子である、請求項４８に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５０】
ｊ１は２〜１０の整数であり、ｊ２は２〜１０の整数であり、Ｒ’はＣ１−Ｃ４のアルキル基であり、Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１の１つであり、Ｒｂは、Ｃ１−Ｃ５のアルキル基である、請求項４４に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５１】
ｊ１は３〜５の整数であり、ｊ２は３〜５の整数であり、Ｒ’はメチル基、エチル基及びイソプロピル基の１つであり、ＲａはＡ２７又はＡ２８であり、Ｒｂが、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の１つである、請求項５０に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５２】
ｎ１は１〜２の整数であり、ｎ３は０〜１の整数であり、かつ、ｎ１＋ｎ３＝２〜３である、請求項４４に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５３】
ｍ１、ｍ２及びｍ３がそれぞれ独立して２〜５の整数である、請求項４４に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５４】
ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である、請求項５３に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５５】
各Ｍ１が、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブチリルガラクトサミン、Ｎ−イソブチリルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコリル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース、Ｌ−４−チオリボースから独立して選択される１つである、請求項４４に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５６】
各Ｍ１がいずれもＮ−アセチルガラクトサミンである、請求項５５に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５７】
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５がいずれもＨである、請求項４４に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５８】
Ｒ２には、窒素含有骨格中のＮに結合される結合部位及びＲ３におけるＰに結合される結合部位がともに含まれる、請求項４４に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５９】
前記Ｒ２における窒素含有骨格上のＮに結合される部位がＮとアミド結合を形成し、前記Ｒ３におけるＰに結合される部位がＰとリン酸エステル結合を形成する、請求項５８に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６０】
Ｒ２がＢ５、Ｂ６、Ｂ５’又はＢ６’から選択され、
【化１６】
2021533800.tif 000134
式中、
2021533800.tif 000135
は、基が共有結合的に結合する部位を表し、ｑ２は１〜１０の整数である、請求項５９に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６１】
ｑ２が１〜５の整数である、請求項６０に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６２】
式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する、請求項４４〜６１のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【化１７】
2021533800.tif 000136
2021533800.tif 000137
2021533800.tif 000138
2021533800.tif 000139
2021533800.tif 000140
【請求項６３】
式Ａ５９におけるＰが、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の端部に結合されており、前記端部とは、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖においてその一端から前の４個のヌクレオチドを指す、請求項４４〜６２のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６４】
式Ａ５９におけるＰが、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の末端に結合される、請求項６３に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６５】
式Ａ５９におけるＰが、前記センス鎖の３’末端に結合される、請求項６３に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６６】
式Ａ５９におけるＰが、リン酸ジエステル結合を形成することにより前記ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの２’位、３’位又は５’位に結合される、請求項４４〜６５のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６７】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の薬物組成物及び／又は請求項３２〜６６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体の、Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製における使用。
【請求項６８】
前記Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患が、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患又は肝過形成性疾患から選択される、請求項４４に記載の使用。
【請求項６９】
Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防方法であって、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の薬物組成物及び／又は請求項３２〜６６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体の有効量を患者に投与することを含む、方法。
【請求項７０】
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現の抑制方法であって、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の薬物組成物及び／又は請求項３２〜６６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体の有効量を、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した肝炎細胞と接触させることを含む、方法。
【請求項７１】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の薬物組成物及び／又は請求項３２〜６６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ｓｉＲＮＡ、当該ｓｉＲＮＡを含む薬物組成物及び複合体ならびにそれらの使用に関する。具体的には、本開示は、Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）遺伝子の発現を抑制するためのｓｉＲＮＡ、当該ｓｉＲＮＡを活性成分として含む薬物組成物及び複合体、ならびに前記ｓｉＲＮＡ、薬物組成物、複合体の、Ｂ型肝炎の予防及び／又は治療のための薬物の調製における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型ウイルス性肝炎（Ｂ型肝炎とも呼ばれる）は、全世界、特に中国に深刻な脅威を与えている感染症である。現在全世界で公認されているＢ型肝炎予防・治療薬としては、インターフェロンとヌクレオシドアナログの２種類があるが、この２種類の薬物は、使用後薬剤耐性が発生しやすい又は使用に制限がある等の様々な欠点があり、例えば、インターフェロンは、副作用が発生しやすく、ヌクレオシド類薬物は、薬剤耐性及び投薬中止後の再発という問題がある。したがって、遺伝子レベルでウイルスの遺伝子発現をサイレンシングし、ＨＢＶの生成と複製を遮断することにより、根本からウイルスの代謝と肝細胞への感染を低下させることができれば、最も理想的なＢ型肝炎の治療手段となることは疑いない。また、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）という機構に基づき、興味あるいずれかの目的とする遺伝子（例えば、癌等の疾患を誘発する遺伝子）の発現を配列特異的に抑制又は遮断し、疾患を治療する目的を達成することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
低分子ＲＮＡ薬物の開発では、ｓｉＲＮＡの安定化修飾及びその送達系は、２つのキー技術である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、ＨＢＶ遺伝子の４つのオープンリーディングフレームの１つであるＰ遺伝子領域を特異的に標的し、ＨＢＶ遺伝子の発現を著しく抑制することができるｓｉＲＮＡを提供する。
【０００５】
本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、センス鎖とアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、いずれも修飾ヌクレオチドであり、センス鎖とアンチセンス鎖は、いずれもフルオロ修飾ヌクレオチドと非フルオロ修飾ヌクレオチドを含み、前記フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、非フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。前記センス鎖は、ヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列２を含み、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２とは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列１と配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列２と配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＺ−３’（配列番号１）、
５’−Ｚ’ＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣ−３’（配列番号２）
ただし、ＺはＵであり、Ｚ’はＡであり、
前記ヌクレオチド配列１に、位置がＺに対応するヌクレオチドＺＡが含まれ、前記ヌクレオチド配列２に、位置がＺ’に対応するヌクレオチドＺ’Ｂが含まれ、前記Ｚ’Ｂは、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、
前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列１とヌクレオチド配列２に位置し、ヌクレオチド配列１におけるフルオロ修飾ヌクレオチドが５個以下であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２におけるフルオロ修飾ヌクレオチドが７個以下であり、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである。
【０００６】
前記ヌクレオチド配列１と配列番号１に示されるヌクレオチド配列との間に１つ以下のヌクレオチド差異があり、及び／又は前記ヌクレオチド配列２と配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間に１つ以下のヌクレオチド差異がある。
【０００７】
前記ヌクレオチド配列２と配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ’Ｂの位置での差異を含み、Ｚ’ＢがＵ、Ｃ又はＧから選択される。
【０００８】
ＺＡは、Ｚ’Ｂと相補的なヌクレオチドである。
【０００９】
前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２は、基本的に逆相補的、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記基本的に完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す。
【００１０】
前記センス鎖は、ヌクレオチド配列３をさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列４をさらに含み、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがそれぞれ１〜４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列３は、前記ヌクレオチド配列１の５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４は、前記ヌクレオチド配列２の３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さが等しく、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す。
【００１１】
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列３の塩基はＧである、或いは、
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列３の塩基は順にＵ及びＧである、或いは、
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列３の塩基は順にＵ、Ｕ及びＧである、或いは、
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列３の塩基は順にＡ、Ｕ、Ｕ及びＧである。
【００１２】
前記ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列５をさらに含み、前記ヌクレオチド配列５は、長さが１〜３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の３’オーバーハング端を構成する。
【００１３】
前記ヌクレオチド配列５は、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列５は、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド、連続した２個のウラシルリボヌクレオチド、又は標的ｍＲＮＡと相補的な２つのヌクレオチドである。
【００１４】
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号３又は配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８に示されるヌクレオチド配列からなる群より選ばれるいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＵ−３’（配列番号３）、
５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＡ−３’（配列番号４）、
５’−ＡＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＵＵ−３’（配列番号５）、
５’−ＡＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＣＡ−３’（配列番号６）、
５’−ＵＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＵＵ−３’（配列番号７）、
５’−ＵＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＣＡ−３’（配列番号８）。
【００１５】
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、以下のｓｉＰ１〜ｓｉＰ４のいずれか１つである。
ｓｉＰ１
センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＵ−３’（配列番号３）、
アンチセンス鎖：５’−ＡＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＵＵ−３’（配列番号５）
ｓｉＰ２
センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＵ−３’（配列番号３）、
アンチセンス鎖：５’−ＡＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＣＡ−３’（配列番号６）
ｓｉＰ３
センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＡ−３’（配列番号４）、
アンチセンス鎖：５’−ＵＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＵＵ−３’（配列番号７）
ｓｉＰ４
センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＡ−３’（配列番号４）、
アンチセンス鎖：５’−ＵＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＣＡ−３’（配列番号８）。
【００１６】
なお、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである、或いは、
５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列１の第５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである、或いは、
５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列１の第５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
【００１７】
各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される１つである。
【００１８】
ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチドは、２’−アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチドから選択される１つであり、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択される１つである。
【００１９】
各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドは、リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖において、少なくとも１本の一本鎖のリン酸−糖骨格中のリン酸エステル基の少なくとも１個は、修飾基を有するリン酸エステル基である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、前記修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である。いくつかの実施形態において、前記修飾基を有するリン酸エステル基は、式（１）に示される構造を有するチオリン酸エステル基である。
【００２２】
【化１】
2021533800.tif 000003
【００２３】
前記ｓｉＲＮＡにおいて、以下のヌクレオチド間の結合からなる群より選ばれる少なくとも１つは、チオリン酸エステル基による結合である。
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間の結合、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間の結合。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドは、５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’末端のヌクレオチドは、以下の式（２）〜式（６）のいずれか１つに示されるヌクレオチドである。
【００２５】
【化２】
2021533800.tif 000004
ただし、ＲはＨ、ＯＨ、Ｆ及びメトキシ基からなる群から選択される基を表し、ＢａｓｅはＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される塩基を表す。
【００２６】
いくつかの具体的な実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡは、表１Ａ〜１Ｄ内のいずれか１つに示されるｓｉＲＮＡである。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本開示は、活性成分として本開示に記載されたｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。一実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと前記薬学的に許容可能な担体との重量比は１：（１〜５００）であり、例えば、１：（１〜５０）であってもよい。
【００２８】
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容可能な担体は、有機アミン、補助脂質及びポリエチレングリコール化（ＰＥＧ化）脂質を含む。ここで、前記有機アミンは、式（２０１）に示される化合物及び／又はその薬学的に許容できる塩である。
【００２９】
【化３】
2021533800.tif 000005
式中、
Ｘ１０１及びＸ１０２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ−Ａ又はＣ−Ａであり、Ａは水素又はＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖であり、
Ｙ１０１及びＺ１０１はそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨ又はＳＯ２であり、
Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｒ１０６及びＲ１０７はそれぞれ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基であり、
ｘは１〜１０の整数であり、
ｎは１〜３の整数であり、ｍは０〜２０の整数であり、ｐは０又は１であり、ｍ及びｐがいずれも０である場合、Ｒ１０２は水素であり、
ｎ又はｍの少なくとも１つが２である場合、Ｒ１０３と式（２０１）における窒素とが、式（２０２）又は式（２０３）に示される構造を形成する。
【００３０】
【化４】
2021533800.tif 000006
式中、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１〜６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊Ｎは式（２０１）に示される窒素原子を表す。
【００３１】
前記有機アミンは、式（２１４）に示される有機アミン及び／又は式（２１５）に示される有機アミンであり、
【００３２】
【化５】
2021533800.tif 000007
前記補助脂質はコレステロール、コレステロールのアナログ及び／又はコレステロールの誘導体であり、かつ、
前記ＰＥＧ化脂質は１，２−ジパルミトアミド−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）］−２０００（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−［ｍｅｔｈｏｘｙ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）］−２０００）である。
【００３３】
前記有機アミン、前記補助脂質及び前記ＰＥＧ化脂質のモル比は（１９．７〜８０）：（１９．７〜８０）：（０．３〜５０）である。
【００３４】
前記薬物組成物において、前記有機アミン、前記補助脂質及び前記ＰＥＧ化脂質のモル比は（５０〜７０）：（２０〜４０）：（３〜２０）である。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本開示は、活性成分として本開示に記載されたｓｉＲＮＡと、当該ｓｉＲＮＡに複合して結合されるリガンドとを含むｓｉＲＮＡ複合体を提供する。いくつかの実施形態において、前記リガンドは、薬学的に許容できる複合基であり、前記複合基は、薬学的に許容できる標的基及びリンカーを含み、前記ｓｉＲＮＡ、前記リンカー及び前記標的基は順に共有結合的又は非共有結合的に結合されている。
【００３６】
前記リンカーは、式（３０１）に示される構造を有する。
【００３７】
【化６】
2021533800.tif 000008
式中、ｋは１〜３の整数であり、
ＬＡは、式（３０２）に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記ＬＡは、その両端でそれぞれ１つの前記標的基及び前記ＬＣ部にエーテル結合により結合される。
【００３８】
【化７】
2021533800.tif 000009
ＬＢは、式（３０３）に示される構造を有するＮ−アシルピロリジンを含む鎖状部であり、前記鎖状部は、その一端にカルボニル基を有し、前記ＬＣ部にアミド結合により結合され、他端に酸素原子を有し、前記ｓｉＲＮＡにリン酸エステル結合により結合される。
【００３９】
【化８】
2021533800.tif 000010
ＬＣは、ヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく２〜４価のリンカー基であり、前記ＬＣは、酸素原子を介して各前記ＬＡ部にエーテル結合により結合され、窒素原子を介して前記ＬＢ部にアミド結合により結合される。
【００４０】
前記リンカーは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。
【００４１】
前記標的基は、アシアロ糖タンパク質受容体のリガンドである。
【００４２】
前記標的基は、ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンである。
【００４３】
前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０５）に示される構造を有する。
【００４４】
【化９】
2021533800.tif 000011
式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、
前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。
【００４５】
前記リンカーは、式（３０６）に示される構造を有する。
【００４６】
【化１０】
2021533800.tif 000012
式中、ｌは０〜３の整数であり、
＊は、前記リンカーにおける、エーテル結合により前記標的基に結合される部位を表し、
＃は、前記リンカーにおける、リン酸エステル結合により前記ｓｉＲＮＡに結合される部位を表し、
前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。
【００４７】
前記標的基は、アシアロ糖タンパク質受容体のリガンドである。
【００４８】
前記標的基はガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンである。
【００４９】
前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０７）に示される構造を有する。
【００５０】
【化１１】
2021533800.tif 000013
式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、
前記リンカーは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本開示は、式（４０１）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を提供する。
【００５２】
【化１２】
2021533800.tif 000014
式中、
ｎ１は、１〜３から選択される整数であり、ｎ３は、０〜４から選択される整数であり、
ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２〜１０から選択される整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、はそれぞれ独立して、Ｈ、メチル基又はエチル基の１つであり、
Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基である。
【００５３】
【化１３】
2021533800.tif 000015
式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、Ｎｕは本開示により提供される上記ｓｉＲＮＡであり、
Ｒ２は、窒素含有骨格上のＮとＡ５９との結合を実現できる任意の基であり、
各Ｌ１は、式Ａ１〜Ａ２６の基から独立して選択される１又は複数の結合の組合せである。
【００５４】
【化１４】
2021533800.tif 000016
式中、ｊ１は１〜２０の整数であり、ｊ２は１〜２０の整数であり、
Ｒ’はＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
Ｒａは式Ａ２７〜Ａ４５の基から選択される１つである。
【００５５】
【化１５】
2021533800.tif 000017
ＲｂはＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
2021533800.tif 000018
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
【００５６】
各Ｍ１は、哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を有するリガンドから選択される１つである。
【００５７】
いくつかの実施形態において、上述したｓｉＲＮＡ複合体におけるＬ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１３から選択される１又は複数の結合の組合せであり、
或いは、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せであり、
或いは、Ｌ１は、Ａ１、Ａ８、Ａ１０から選択される少なくとも２つの結合の組合せである。
【００５８】
いくつかの実施形態において、上述したｓｉＲＮＡ複合体におけるＬ１の長さは３〜２５個の原子であり、前記Ｌ１の長さとは、窒素含有骨格のＮ原子に結合される原子からＭ１に結合される原子までの最も長い原子鎖を形成する原子の個数を指し、
或いは、Ｌ１の長さは４〜１５個の原子である。
【００５９】
いくつかの実施形態において、上述したｓｉＲＮＡ複合体におけるｊ１は２〜１０の整数であり、ｊ２は２〜１０の整数であり、Ｒ’はＣ１−Ｃ４のアルキル基であり、Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１の１つであり、Ｒｂは、Ｃ１−Ｃ５のアルキル基であり、
或いは、ｊ１は３〜５の整数であり、ｊ２は３〜５の整数であり、Ｒ’はメチル基、エチル基及びイソプロピル基の１つであり、ＲａはＡ２７又はＡ２８であり、Ｒｂは、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の１つである。
【００６０】
いくつかの実施形態において、上述したｓｉＲＮＡ複合体におけるｎ１は１〜２の整数であり、ｎ３は０〜１の整数であり、かつ、ｎ１＋ｎ３＝２〜３である。
【００６１】
いくつかの実施形態において、上述した複合体におけるｍ１、ｍ２及びｍ３がそれぞれ独立して２〜５の整数である。いくつかの実施形態において、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である。
【００６２】
いくつかの実施形態において、上述したｓｉＲＮＡ複合体における各Ｍ１は、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブチリルガラクトサミン、Ｎ−イソブチリルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコリル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース、Ｌ−４−チオリボースから独立して選択される１つである。
【００６３】
いくつかの実施形態において、各Ｍ１はいずれもＮ−アセチルガラクトサミンである。
【００６４】
いくつかの実施形態において、上述したｓｉＲＮＡ複合体におけるＲ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５はいずれもＨである。
【００６５】
いくつかの実施形態において、上述したｓｉＲＮＡ複合体におけるＲ２には、窒素含有骨格上のＮに結合される結合部位及びＲ３におけるＰに結合される結合部位がともに含まれる。
【００６６】
いくつかの実施形態において、Ｒ２における前記窒素含有骨格上のＮに結合される部位は、Ｎとアミド結合を形成し、前記Ｒ３上のＰに結合される部位は、Ｐとリン酸エステル結合を形成する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ５’又はＢ６’から選択されてもよい。
【００６８】
【化１６】
2021533800.tif 000019
ただし、
2021533800.tif 000020
は、基が共有結合的に結合する部位を表し、ｑ２は１〜１０の整数である。いくつかの実施形態において、ｑ２は、１〜５の整数であってもよい。
【００６９】
いくつかの実施形態において、上述したｓｉＲＮＡ複合体は、式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する。
【００７０】
【化１７】
2021533800.tif 000021
2021533800.tif 000022
2021533800.tif 000023
2021533800.tif 000024
2021533800.tif 000025
【００７１】
いくつかの実施形態によれば、上述したｓｉＲＮＡ複合体において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の端部に結合されており、前記端部とは、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖においてその一端から前の４個のヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の末端に結合されており、或いは、式Ａ５９におけるＰは、前記センス鎖の３’末端に結合されている。
【００７２】
いくつかの実施形態によれば、上述したｓｉＲＮＡ複合体において、式Ａ５９におけるＰが、リン酸ジエステル結合を形成することにより前記ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの２’位、３’位又は５’位に結合される。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本開示は、上述のｓｉＲＮＡ、上述の薬物組成物及び／又は上述のｓｉＲＮＡ複合体の、前記Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製における使用を提供する。
【００７４】
いくつかの実施形態において、前記Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患が、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患又は肝過形成性疾患から選択される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本開示は、患者に上述のｓｉＲＮＡ、上述の薬物組成物及び／又は上述のｓｉＲＮＡ複合体の有効量を投与することを含む、Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防方法を提供する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本開示は、上述のｓｉＲＮＡ、上述の薬物組成物及び／又は上述のｓｉＲＮＡ複合体の有効量を、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した肝炎細胞と接触させることを含む、肝炎細胞におけるＨＢＶ遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本開示は、上述のｓｉＲＮＡ、上述の薬物組成物及び／又は上述のｓｉＲＮＡ複合体を含むキットを提供する。
【発明の効果】
【００７８】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、血漿における高い安定性及び良好な抑制活性を有する。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、体外でのヒト血漿中で７２時間分解されずに安定的に存在し、いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、濃度０．１ｎＭで、８０％以上の体外抑制活性を有する。
【００７９】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡを含む複合体は、低いオフターゲット効果、良好なリソソーム安定性及び／又は抑制活性を有する。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡを含む複合体は、肝臓を効果的に標的し、優れたＨＢＶ遺伝子発現抑制特性を示すことができる。即ち、低いオフターゲット効果を有するとともに、１ｍｇ／ｋｇの投与量で単回投与することで、Ｂ型肝炎モデルマウスの肝臓における７７．４％〜８８．３％のＨＢＶ  ｍＲＮＡを抑制することができる。同時に、本開示により提供されるｓｉＲＮＡを含む複合体は、Ｂ型肝炎モデルマウスにおけるＨＢＶ表面抗原の発現を効果的に低下させることもでき、３ｍｇ／ｋｇの投与量で単回投与してからの８４日間、ＨＢＶ表面抗原及びＨＢＶ  ＤＮＡ抑制率はいずれも９０％以上に達することができる。観察の最終日である１５４日目まで、この２つの指標は投与前のレベルに戻ることがなく、ＨＢｓＡｇの抑制率は依然として７７．０％であり、ＨＢＶ  ＤＮＡの抑制率は依然として８０．１％である。このことが示すとおり、本開示により提供されるｓｉＲＮＡを含む複合体は、ｓｉＲＮＡ活性成分を肝臓に効果的に送達し、体内で長期間活性を維持することができ、Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態及び疾患を効果的に治療及び／又は予防することができ、良好な応用の見通しがある。
【００８０】
本開示の他の特徴と利点は、後述の発明を実施するための形態部分において詳述する。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】複合体２とマウス由来のリソソーム溶解液を異なる時間培養した後のＰＡＧＥ電気泳動図である。
【図２】複合体２とヒト由来のリソソーム溶解液を異なる時間培養した後のＰＡＧＥ電気泳動図である。
【図３】単剤３ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇの複合体１を経皮下投与した後、標準化された血清表面抗原レベルの経時的変化図（縦座標が対数座標）である。
【図４】単剤３ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇの複合体１を経皮下投与した後、標準化された血清ｅ抗原レベルの経時的変化図である。
【図５】単剤３ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇの複合体１を経皮下投与した後、標準化された血清ＨＢＶ  ＤＮＡレベルの経時的変化図（縦座標が対数座標）である。
【図６】ｓｉＲＮＡ１〜４のｐｓｉＣＨＥＣＫ系における抑制活性を示す。
【図７】ｓｉＲＮＡ１〜４とヒト血漿を異なる時間培養した後のＰＡＧＥ電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
以下に本開示の発明を実施するための形態を詳しく説明する。また、ここで説明される発明を実施するための形態は、本開示を説明又は解釈するためのものに過ぎず、本開示を制限するためのものではないと理解すべきである。
【００８３】
本開示において、ＨＢＶ遺伝子とは、ＤＮＡ配列がＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＣ＿００３９７７．２に示される遺伝子を指す。これに応じて、標的ｍＲＮＡとは、当該ＨＢＶ遺伝子が転写されたｍＲＮＡを指す。
【００８４】
文脈において、特に説明がない限り、大文字のアルファベットＣ、Ｇ、Ｕ、Ａ、Ｔは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｄは、当該文字ｄの右側に隣接する１つのヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドであることを表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、大文字のアルファベットＰ１は、当該文字Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、アルファベットの組合せＶＰは、当該アルファベットの組合せＶＰの右側に隣接する１つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、アルファベットの組合せＰｓは、当該アルファベットの組合せＰｓの右側に隣接するヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、大文字のアルファベットＰは、当該文字Ｐの右側に隣接するヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチドであることを表す。
【００８５】
本明細書の文脈において、「相補」又は「逆相補」という用語は、互換的に使用されてもよく、当業者に周知の意味、即ち、二本鎖核酸分子において、一方の鎖の塩基と他方の鎖上の塩基とが相補的に対合するという意味を有する。ＤＮＡにおいて、プリン塩基であるアデニン（Ａ）は、常にピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）（又は、ＲＮＡにおいてウラシル（Ｕ）である）と対合し、プリン塩基であるグアニン（Ｃ）は、常にピリミジン塩基であるシトシン（Ｇ）と対合する。各塩基対は、いずれも１つのプリンと１つのピリミジンを含む。一方の鎖上のアデニンが常に他方の鎖上のチミン（又はウラシル）と対合するとともに、グアニンが常にシトシンと対合する場合、両方の鎖同士が相補的である、またその相補鎖の配列から鎖の配列を推知できると考えられる。これに応じて、「ミスマッチ」は、本分野では、二本鎖核酸において、対応する位置での塩基が相補的に対合して存在しないことを意味する。
【００８６】
文脈において、特に説明がない限り、基本的に逆相補的であるとは、関連する２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、基本的に完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に塩基ミスマッチが存在しないことを指す。
【００８７】
文脈において、一方のヌクレオチド配列と他方のヌクレオチド配列にヌクレオチド差異が存在するとは、前者が後者に比べて、同じ位置のヌクレオチドの塩基種類が変化したことを指し、例えば、後者において１つのヌクレオチド塩基がＡであり、このとき、前者の同じ位置での、対応するヌクレオチド塩基がＵ、Ｃ、Ｇ又はＴである場合に、当該位置で２つのヌクレオチド配列間にヌクレオチド差異が存在すると認められている。いくつかの実施形態において、元の位置のヌクレオチドの代わりに無塩基ヌクレオチド又はその等価物を用いる場合、当該位置でヌクレオチド差異が生じたとも考えられる。
【００８８】
文脈において、前記フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、非フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指し、ヌクレオチドアナログとは、核酸においてヌクレオチドに取って代わることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指し、例えば、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＢＮＡと略称される）又は非環式ヌクレオチドがある。前記メトキシ修飾ヌクレオチドとは、リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。
【００８９】
文脈において、前記「修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が他の基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ、或いは、ヌクレオチド上の塩基が修飾された塩基であるヌクレオチドを指す。
【００９０】
文脈において、特に本開示のｓｉＲＮＡ複合体の調製方法を説明する際に、特に説明がない限り、前記ヌクレオシドモノマー（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｍｏｎｏｍｅｒ）とは、調製するｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体におけるヌクレオチドの種類と順序に応じてホスホルアミダイト固相合成に用いられる修飾又は未修飾のヌクレオシドモノマー（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｒ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ。ＲＮＡ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓをＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓということもある）を指す。ホスホルアミダイト固相合成は、当業者に公知のＲＮＡ合成に用いられる方法である。本開示に用いられるヌクレオシドモノマーは、いずれも市販品を購入可能である。
【００９１】
本開示の文脈において、特に説明がない限り、「複合」とは、それぞれ特定の機能を有する２つ以上の化学部分間が共有結合的に互いに結合することを指し、これに応じて、「複合体」とは、当該各化学部分間が共有結合的に結合することにより形成された化合物を指す。さらには、「ｓｉＲＮＡ複合体」は、特定の機能を有する１又は複数の化学部分がｓｉＲＮＡに共有結合的に結合して形成された化合物を表す。以下に、本開示のｓｉＲＮＡ複合体を単に「複合体」ということもある。より具体的には、本開示の文脈において、「複合分子」は、反応させることによりｓｉＲＮＡに複合され、最終的に本開示のｓｉＲＮＡ複合体を形成することができる化合物であると理解すべきである。別に説明がない限り、本開示の具体的な実施形態において、ｓｉＲＮＡ複合体又は複合体は、第１種のｓｉＲＮＡ複合体と第２種のｓｉＲＮＡ複合体（以下、さらに詳述する）の総称である。
【００９２】
＜ｓｉＲＮＡ＞
本開示は、ＨＢＶ遺伝子の発現を選択的かつ効果的に低下させることができるｓｉＲＮＡを提供する。
【００９３】
本開示のｓｉＲＮＡは、基本的な構造単位としてヌクレオチド基を含み、前記ヌクレオチド基がリン酸基、リボース基及び塩基を含むことは、当業者に公知であるので、ここでは説明を省略する。
【００９４】
本開示のｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、センス鎖とアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、いずれも修飾ヌクレオチドであり、センス鎖及びアンチセンス鎖がいずれもフルオロ修飾ヌクレオチド及び非フルオロ修飾ヌクレオチドを含み、前記センス鎖がヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列２を含み、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２とは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列１は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、３つ以下のヌクレオチド差異がある。
５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＺ−３’（配列番号１）、
５’−Ｚ’ＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣ−３’（配列番号２）
ただし、ＺはＵであり、Ｚ’はＡであり、
前記ヌクレオチド配列１に、位置がＺに対応するヌクレオチドＺＡが含まれ、前記ヌクレオチド配列２に、位置がＺ’に対応するヌクレオチドＺ’Ｂが含まれ、前記Ｚ’Ｂは、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
【００９５】
前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列１とヌクレオチド配列２に位置し、ヌクレオチド配列１におけるフルオロ修飾ヌクレオチドが５個以下であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２におけるフルオロ修飾ヌクレオチドが７個以下であり、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである。
【００９６】
文脈において、「位置が対応する」とは、ヌクレオチド配列の同一端から、ヌクレオチド配列において同じ位置にあることを指す。例えば、ヌクレオチド配列１の３’端の１番目のヌクレオチドは、位置が配列番号１の３’端の１番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチドである。
【００９７】
上述した前記ヌクレオチド配列１と配列番号１、及び前記ヌクレオチド配列２と配列番号２のヌクレオチド差異により、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子抑制能力が顕著に低下することはなく、したがって、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。
【００９８】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列１と配列番号１に示されるヌクレオチド配列は、１つ以下のヌクレオチド差異があり、又は差異がなく、及び／又は前記ヌクレオチド配列２と配列番号２に示されるヌクレオチド配列は、１つ以下のヌクレオチド差異があり、又は差異がない。
【００９９】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列２と配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ’Ｂの位置での差異を含み、Ｚ’ＢがＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ’Ｂの位置での差異であり、Ｚ’ＢがＵ、Ｃ又はＧから選択され、ＺＡは、Ｚ’Ｂと相補的なヌクレオチドである。
【０１００】
前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２は、二本鎖構造を安定化させる程度に相補的であればよい。したがって、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２は、一部で逆相補的であってもよい。ｓｉＲＮＡをより安定化させるために、いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２は、基本的に逆相補的、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記基本的に完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列３をさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列４をさらに含み、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがそれぞれ１〜４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列３は、前記ヌクレオチド配列１の５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４は、前記ヌクレオチド配列２の３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さが等しく、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、いくつかの具体的な実施形態において、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、完全に逆相補的である。
【０１０２】
したがって、前記センス鎖又はアンチセンス鎖の長さは、独立して１９〜２３ヌクレオチドであってもよい。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の群から選択されるヌクレオチド配列３とヌクレオチド配列４を有しても良く、ヌクレオチド配列３とヌクレオチド配列４は、完全に相補的である。
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列３の塩基はＧである。このとき、前記二本鎖領域の長さは、２０ヌクレオチドであってもよく、即ち、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が、２０／２０であってもよく、或いは、
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列３の塩基は順にＵ及びＧである。このとき、前記二本鎖領域の長さは、２１ヌクレオチドであってもよく、即ち、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が、２１／２１であってもよく、或いは、
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列３の塩基は順にＵ、Ｕ及びＧである。このとき、前記二本鎖領域の長さは、２２ヌクレオチドであってもよく、即ち、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が、２２／２２であってもよく、或いは、
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列３の塩基は順にＡ、Ｕ、Ｕ及びＧである。このとき、前記二本鎖領域の長さは、２３ヌクレオチドであってもよく、即ち、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が、２３／２３であってもよい。
【０１０４】
１つの具体的な実施形態において、前記ヌクレオチド配列３は、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列３の塩基は順にＵ及びＧである。
【０１０５】
上記各群において、ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さが同じであり、相補的であるので、ヌクレオチド配列３の塩基が与えられると、ヌクレオチド配列４の塩基も決定される。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡには、長さが１〜３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の３’オーバーハング端を構成するヌクレオチド配列５がさらに含まれる。
【０１０７】
このように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比は、１９／１９、１９／２０、１９／２１、１９／２２、２０／２０、２０／２１、２０／２２、２０／２３、２１／２１、２１／２２、２１／２３、２１／２４、２２／２２、２２／２３、２２／２４、２２／２５、２３／２３、２３／２４、２３／２５又は２３／２６であってもよい。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列５は、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列５は、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド、連続した２個のウラシルリボヌクレオチド、又は標的ｍＲＮＡと相補的な２つのヌクレオチドである。
【０１０９】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が１９／２１又は２１／２３であり、このとき、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、より良好なＨＢＶ  ｍＲＮＡサイレンシング活性及び／又は表面抗原ＨＢｓＡｇの発現を効果的に低下させる活性を有する。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列１は、配列番号３又は配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８に示されるヌクレオチド配列からなる群より選ばれるいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＵ−３’（配列番号３）、
５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＡ−３’（配列番号４）、
５’−ＡＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＵＵ−３’（配列番号５）、
５’−ＡＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＣＡ−３’（配列番号６）、
５’−ＵＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＵＵ−３’（配列番号７）、
５’−ＵＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＣＡ−３’（配列番号８）
【０１１１】
いくつかの具体的な実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下のｓｉＰ１〜ｓｉＰ４のいずれか１つである。
ｓｉＰ１
センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＵ−３’（配列番号３）
アンチセンス鎖：５’−ＡＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＵＵ−３’（配列番号５）
ｓｉＰ２
センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＵ−３’（配列番号３）
アンチセンス鎖：５’−ＡＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＣＡ−３’（配列番号６）
ｓｉＰ３
センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＡ−３’（配列番号４）
アンチセンス鎖：５’−ＵＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＵＵ−３’（配列番号７）
ｓｉＰ４
センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＡ−３’（配列番号４）
アンチセンス鎖：５’−ＵＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＣＡ−３’（配列番号８）
【０１１２】
いくつかの実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位又は５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
【０１１３】
文脈において、フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換された、式（１０１）に示されるヌクレオチドを指す。ここで、Ｂａｓｅは、Ｃ、Ｇ、Ａ又はＵから選択される塩基を表す。
【０１１４】
非フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択されるいずれか１つである。
【０１１５】
これらのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチドは、当業者に公知であり、これらのヌクレオチドは、例えば、２’−アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチドから選択される１つであってもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、２’−アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式（１０２）に示される、メトキシ修飾ヌクレオチド（２’−ＯＭｅ）であってもよい。２’−置換アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式（１０３）に示される２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオチド（２’−ＭＯＥ）であってもよい。２’−アミノ修飾ヌクレオチド（２’−ＮＨ２）は式（１０４）に示される。２’−デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）は式（１０５）に示される。
【０１１７】
【化１８】
2021533800.tif 000026
【０１１８】
ヌクレオチドアナログとは、核酸においてヌクレオチドに取って代わることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指す。例えば、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＢＮＡと略称される）又は非環式ヌクレオチドである。
【０１１９】
ＢＮＡとは、拘束された又は近づけないヌクレオチドを指す。ＢＮＡは、五員環、六員環、又は七員環の、「固定された」Ｃ３’−エンド糖パッカリングを有する架橋構造を含んでもよい。通常当該橋を当該リボースの２’−、４’−位に導入して２’，４’−ＢＮＡヌクレオチド、例えば、式（１０６）に示されるＬＮＡ、式（１０７）に示されるＥＮＡ、式（１０８）に示されるｃＥＴ  ＢＮＡ等を提供する。
【０１２０】
【化１９】
2021533800.tif 000027
【０１２１】
非環式ヌクレオチドとは、ヌクレオチドの糖環が開環された「開環」ヌクレオチド、例えば、式（１０９）に示されるアンロックド核酸（ＵＮＡ）、又は式（１１０）に示されるグリセロール核酸（ＧＮＡ）を指す。
【０１２２】
【化２０】
2021533800.tif 000028
【０１２３】
上記式（１０９）及び式（１１０）中、Ｒは、Ｈ、ＯＨ又はアルコキシ（Ｏ−アルキル）から選択される。
【０１２４】
イソヌクレオチドとは、ヌクレオチドにおいて塩基のリボース環における位置が変化した化合物、例えば、式（１１１）又は式（１１２）に示される、塩基がリボース環の１’−位から２’−位又は３’−位に移行した化合物を指す。
【０１２５】
【化２１】
2021533800.tif 000029
【０１２６】
上記式（１１１）〜式（１１２）の化合物において、Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ又はＴ等の塩基を表し、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ又は上述した非フッ素化基から選択される。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択されるいずれか１つである。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、文脈において、前記メトキシ修飾ヌクレオチドは、リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。
【０１２８】
本開示のｓｉＲＮＡは、血中のリボヌクレアーゼによる切断に抵抗することにより、核酸の血液安定性を向上させ、核酸の有するヌクレアーゼ加水分解耐性を高めるとともに、高いＨＢＶ遺伝子抑制活性を維持することができる。
【０１２９】
いくつかの実施形態によれば、本開示に記載されたｓｉＲＮＡは、動物実験において血漿における安定性と遺伝子サイレンシング効率の高度なバランスが取られており、より簡便で、コストがより低いという利点を有するものもある。以下はいくつかの例である。
【０１３０】
いくつかの実施形態によれば、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位又は第５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。
【０１３１】
いくつかの実施形態によれば、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである、或いは、
いくつかの実施形態によれば、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列１の第５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである、或いは、
いくつかの実施形態によれば、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列１の第５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。
【０１３２】
いくつかの具体的な実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、表１Ａ内のいずれか１つに示されるｓｉＲＮＡである。
【０１３３】
【表１Ａ】
2021533800.tif 000030
2021533800.tif 000031
【０１３４】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、他の修飾ヌクレオチド基をさらに含むが、前記修飾ヌクレオチド基により、前記ｓｉＲＮＡがＨＢＶ遺伝子発現を抑制する機能を明らかに弱める又は喪失させることはない。
【０１３５】
現在、本分野では、ｓｉＲＮＡの修飾に使用できる方法が複数あり、上で言及されたリボース基修飾のほか、骨格修飾（例えば、リン酸基修飾）及び塩基修飾等を含む（例えば、Ｗａｔｔｓ，Ｊ．Ｋ．，Ｇ．Ｆ．Ｄｅｌｅａｖｅｙ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ：ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ，２００８．１３（１９−２０）：ｐ．８４２−５５を参照のこと。引用によりその全体を本明細書に組み込む）。本開示に記載されたｓｉＲＮＡのいくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチド基は、リボース基及び任意のリン酸基が修飾されたヌクレオチド基であるが、これに限定されない。
【０１３６】
いくつかの実施形態によれば、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖において、少なくとも１本の一本鎖のリン酸−糖骨格中のリン酸エステル基の少なくとも１個は、修飾基を有するリン酸エステル基である。前記修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基であり、式（１）に示されるチオリン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）構造のように、１つの硫黄原子でリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子を置換することにより、チオリン酸ジエステル結合でリン酸ジエステル結合を置換し、即ち、２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていてもよい。当該修飾により、ｓｉＲＮＡの構造を安定化させ、塩基対合の高い特異性と高い親和力を維持することができる。
【０１３７】
【化２２】
2021533800.tif 000032
【０１３８】
いくつかの実施形態によれば、前記ｓｉＲＮＡにおいて、以下のヌクレオチド間の結合からなる群より選ばれる少なくとも１つは、チオリン酸エステル基による結合である。
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間の結合、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間の結合。
【０１３９】
いくつかの具体的な実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、表１Ｂ内のいずれか１つに示されるｓｉＲＮＡである。
【０１４０】
【表１Ｂ】
2021533800.tif 000033
2021533800.tif 000034
【０１４１】
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖配列の５’末端のヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである。
【０１４２】
５’−リン酸ヌクレオチドが式（２）に示される構造を有することは、当業者によく知られている。
【０１４３】
【化２３】
2021533800.tif 000035
【０１４４】
慣用の前記５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドの種類は、当業者によく知られている。例えば、Ａｎａｓｔａｓｉａ  Ｋｈｖｏｒｏｖａ  ａｎｄ  Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｋ．  Ｗａｔｔｓ，  Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｔｉｌｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２０１７，  ３５（３）：  ２３８−４８には、以下の式（３）〜式（６）の５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドか開示されている。
【０１４５】
【化２４】
2021533800.tif 000036
ただし、ＲはＨ、ＯＨ、Ｆ及びメトキシ基からなる群から選択される基を表し、ＢａｓｅはＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される塩基を表す。
【０１４６】
いくつかの具体的な実施形態において、５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、式（３）に示される、ビニルリン酸エステル（Ｅ−ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ、Ｅ−ＶＰ）を含むヌクレオチドであり、又は、式（５）に示される、チオリン酸エステルを含むヌクレオチドである。
【０１４７】
いくつかの具体的な実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、表１Ｃ又は表１Ｄ内のいずれか１つに示されるｓｉＲＮＡである。
【０１４８】
【表１Ｃ】
2021533800.tif 000037
2021533800.tif 000038
【０１４９】
【表１Ｄ】
2021533800.tif 000039
2021533800.tif 000040
【０１５０】
本開示の発明者は、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ、例えば上記表１Ａ〜１Ｄ内に示されるｓｉＲＮＡが、血漿及びリソソームにおける安定性が顕著に向上するとともに、予想外のＨＢＶ  ｍＲＮＡサイレンシング活性及び優れたＨＢｓＡｇ抑制作用をさらに示すことができることを意外にも見出した。
【０１５１】
当業者であれば明らかに知っているように、本分野における通常のｓｉＲＮＡ調製方法（例えば、固相合成方法及び液相合成方法）により、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ、例えば上記表１Ａ〜１Ｄに示されるｓｉＲＮＡを得ることができる。ここで、固相合成は、既に商用カスタマイズサービスが行われている。対応する修飾を有するヌクレオチドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたｓｉＲＮＡに導入することができ、対応する修飾を有するヌクレオチドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチド基をｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。
【０１５２】
＜薬物組成物＞
本開示は、活性成分として上述したｓｉＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。
【０１５３】
前記薬学的に許容可能な担体は、ｓｉＲＮＡ投与分野で通常用いられる担体であってもよく、例えば、磁性ナノ粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、例えば、Ｆｅ３Ｏ４又はＦｅ２Ｏ３に基づくナノ粒子）、カーボンナノチューブ（ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ）、メソポーラスシリコン（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ  ｓｉｌｉｃｏｎ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）、ポリアミドアミンデンドリマー（ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ  （ＰＡＭＡＭ）  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、ポリリジン（ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）、ＰＬＬ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、ポリＤ−又はＬ−乳酸／グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（Ｄ＆Ｌ−ｌａｃｔｉｃ／ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、ＰＬＧＡ）、ポリ（アミノエチルエチレンリン酸エステル）（ｐｏｌｙ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＰＰＥＥＡ）及びポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ（２−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＤＭＡＥＭＡ）並びにこれらの誘導体の１又は複数があるが、これらに限定されない。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物におけるｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体の含有量に対して特段の要件はないが、いくつかの実施形態においては、ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体との重量比が、１：（１〜５００）であってもよい。いくつかの具体的な実施形態においては、上記重量比が１：（１〜５０）である。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物には、薬学的に許容できる他の添加剤が含まれてもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又は複数種であってもよい。例えば、前記薬学的に許容できる他の添加剤は、ｐＨ緩衝液、保護剤及び浸透圧調節剤の少なくとも１種を含んでもよい。
【０１５６】
前記ｐＨ緩衝液は、ｐＨ７．５〜８．５のトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）  ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｂｕｆｆｅｒ）及び／又はｐＨ５．５〜８．５のリン酸塩緩衝液であってもよく、例えば、ｐＨ５．５〜８．５のリン酸塩緩衝液であってもよい。
【０１５７】
前記保護剤は、イノシトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース及びグルコースの少なくとも１種であってもよい。前記薬物組成物の全重量を基準とし、前記保護剤の含有量は０．０１〜３０重量％であってもよい。
【０１５８】
前記浸透圧調節剤は、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムであってもよい。前記浸透圧調節剤の含有量は、前記薬物組成物の浸透圧が２００〜７００ミリオスモル／キログラムとなるように決定される。所望の浸透圧により、当業者は、前記浸透圧調節剤の含有量を容易に決定することができる。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、注射液等の液体製剤であってもよく、凍結乾燥粉末注射剤として、投与時に液体添加剤と混合し、液体製剤としてもよい。前記液体製剤は、皮下、筋肉又は静脈注射投与に用いることができるが、これらに限定されず、噴霧により肺に投与し、或いは、噴霧により肺を通して他の臓器組織（例えば、肝臓）に投与することもできるが、これらに限定されない。いくつかの具体的な実施形態において、前記薬物組成物は、静脈注射投与に用いられる。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、リポソーム製剤の形式であってもよい。いくつかの実施形態において、前記リポソーム製剤に用いられる薬学的に許容可能な担体は、アミン含有トランスフェクション化合物（以下、有機アミンともいう）、補助脂質及び／又はＰＥＧ化脂質を含む。ここで、前記有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質は、ＣＮ１０３３８０１１３Ａ（引用によりその全体を本明細書に組み込む）に記載されたアミン含有トランスフェクション化合物又はその薬学的に許容できる塩又は誘導体、補助脂質及びＰＥＧ化脂質からそれぞれ選択される１種又は複数種であってもよい。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、ＣＮ１０３３８０１１３Ａに記載された式（２０１）に示される化合物又はその薬学的に許容できる塩であってもよい。
【０１６２】
【化２５】
2021533800.tif 000041
式中、
Ｘ１０１及びＸ１０２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ−Ａ又はＣ−Ａであり、Ａは水素又はＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖であり、
Ｙ１０１及びＺ１０１はそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨ又はＳＯ２であり、
Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｒ１０６及びＲ１０７はそれぞれ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基であり、
ｘは１〜１０の整数であり、
ｎは１〜３の整数であり、ｍが０〜２０の整数であり、ｐが０又は１であり、ここで、ｍ及びｐがいずれも０である場合、Ｒ１０２は水素であり、
ｎ又はｍの少なくとも１つが２である場合、Ｒ１０３と式（２０１）における窒素とは、式（２０２）又は式（２０３）に示される構造を形成する。
【０１６３】
【化２６】
2021533800.tif 000042
式中、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１〜６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊Ｎは式（２０１）に示される窒素原子を表す。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、Ｒ１０３はポリアミンである。他の実施形態において、Ｒ１０３はケタールである。いくつかの実施形態において、式（２０１）におけるＲ１０１及びＲ１０２のそれぞれは、独立して、任意に置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アルキル又はアルケニルであり、前記アルキル又はアルケニルは、３〜約２０個の炭素原子、例えば、８〜約１８個の炭素原子、及び０〜４個の二重結合、例えば、０〜２個の二重結合を有する。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、ｎとｍのそれぞれが独立して１又は３の値である場合、Ｒ１０３は、下記式（２０４）〜式（２１３）のいずれか１つであってもよい。
【０１６６】
【化２７】
2021533800.tif 000043
式（２０４）〜式（２１３）中、各「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊はＲ１０３と式（２０１）における窒素原子との結合可能点を示し、任意の＊位置上の各Ｈは、式（２０１）における窒素原子との結合を実現するために置換されてもよい。
【０１６７】
式（２０１）に示される化合物は、ＣＮ１０３３８０１１３Ａの記載により調製されてもよい。
【０１６８】
いくつかの具体的な実施形態において、前記有機アミンは、式（２１４）に示される有機アミン及び／又は式（２１５）に示される有機アミンである。
【０１６９】
【化２８】
2021533800.tif 000044
前記補助脂質は、コレステロール、コレステロールのアナログ及び／又はコレステロールの誘導体であり、
前記ＰＥＧ化脂質は、１，２−ジパルミトアミド−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）］−２０００である。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物において、前記有機アミン、前記補助脂質及び前記ＰＥＧ化脂質のモル比は（１９．７〜８０）：（１９．７〜８０）：（０．３〜５０）であり、例えば、（５０〜７０）：（２０〜４０）：（３〜２０）であってもよい。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡと上記アミン含有トランスフェクション試薬により形成された薬物組成物粒子は、約３０ｎｍ〜約２００ｎｍの平均径を有し、一般に約４０ｎｍ〜約１３５ｎｍであり、より一般的には、当該リポソーム粒子の平均径は約５０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約９０ｎｍ又は約７０ｎｍ〜約９０ｎｍであり、例えば、当該リポソーム粒子の平均径は、約３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０又は１６０ｎｍである。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡと上記アミン含有トランスフェクション試薬により形成された薬物組成物において、ｓｉＲＮＡと全脂質（例えば有機アミン、補助脂質及び／又はＰＥＧ化脂質）の重量比（重量／重量比）は、約１：１〜約１：５０、約１：１〜約１：３０、約１：３〜約１：２０、約１：４〜約１：１８、約１：５〜約１：１７、約１：５〜約１：１５、約１：５〜約１：１２、約１：６〜約１：１２又は約１：６〜約１：１０の範囲内にあり、例えば、本開示のｓｉＲＮＡと全脂質の重量比は約１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１，１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７又は１：１８である。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、市販時に各成分が独立して存在してもよく、使用時に液体製剤として存在してもよい。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡと上記薬学的に許容可能な担体により形成された薬物組成物は、既知の各種の方法に従い調製されてもよく、従来のｓｉＲＮＡの代わりに本開示により提供されるｓｉＲＮＡを用いればよい。いくつかの具体的な実施形態において、以下の方法に従い調製されてもよい。
【０１７４】
有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質を上記モル比でアルコールに懸濁させ均一に混合して脂質溶液を得る。アルコールの用量は、得られた脂質溶液の総質量濃度が２〜２５ｍｇ／ｍＬ、例えば、８〜１８ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記アルコールは、薬学的に許容できるアルコール、例えば、エタノール、プロピレングリコール、ベンジルアルコール、グリセリン、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００など、室温付近で液体であるアルコールから選択される１種又は複数種であり、例えばエタノールであってもよい。
【０１７５】
本開示により提供されるｓｉＲＮＡを緩衝塩溶液に溶解し、ｓｉＲＮＡ水溶液を得る。緩衝塩溶液の濃度が０．０５〜０．５Ｍであり、例えば、０．１〜０．２Ｍであってもよく、緩衝塩溶液のｐＨを４．０〜５．５に調節し、例えば、５．０〜５．２であってもよく、緩衝塩溶液の用量は、ｓｉＲＮＡの濃度が０．６ｍｇ／ｍＬ以下、例えば、０．２〜０．４ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記緩衝塩は、可溶性酢酸塩、可溶性クエン酸塩から選択される１種又は複数種であり、例えば、酢酸ナトリウム及び／又は酢酸カリウムであってよい。
脂質溶液とｓｉＲＮＡ水溶液を混合した後、得られた生成物を４０〜６０℃で少なくとも２分間、例えば、５〜３０分間培養し、培養したリポソーム製剤を得る。脂質溶液とｓｉＲＮＡ水溶液の体積比は１：（２〜５）、例えば、１：４であってよい。
【０１７６】
培養したリポソーム製剤を濃縮又は希釈し、不純物を除去し、除菌し、本開示により提供される薬物組成物を得る。その物理化学的パラメーターとしては、ｐＨが６．５〜８であり、封入効率が８０％以上であり、粒子径が４０〜２００ｎｍであり、多分散指数が０．３０以下であり、浸透圧が２５０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、例えば、物理化学的パラメーターとしては、ｐＨが７．２〜７．６、封入効率が９０％以上、粒子径が６０〜１００ｎｍ、多分散指数が０．２０以下、浸透圧が３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。
【０１７７】
ここで、濃縮又は希釈は、不純物を除去する前、不純物を除去した後又は同時に行われてもよい。不純物を除去する方法としては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば、タンジェンシャルフロー系、中空糸カラムを用い、１００ＫＤａの条件で限外濾過し、限外濾過交換溶液をｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）としてもよい。除菌方法としては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば、０．２２μｍのフィルターで濾過して除菌してもよい。
【０１７８】
＜第１種のｓｉＲＮＡ複合体＞
一実施形態において、本開示は、本開示により提供される上記ｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに複合して結合されるリガンドを含むｓｉＲＮＡ複合体を提供する。以下の記載においては、これらのｓｉＲＮＡ複合体を第１種のｓｉＲＮＡ複合体ともいう。
【０１７９】
前記リガンドの種類及び結合方式は、当業者に公知であり、その作用として、一般的に標的細胞表面の特異的受容体と結合し、リガンドに結合されるｓｉＲＮＡの標的細胞への送達を媒介する。
【０１８０】
前記ｓｉＲＮＡに複合されるリガンドは、薬学的に許容できる複合基であり、一般的には、前記複合基は、薬学的に許容できる標的分子及び任意のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含む。前記ｓｉＲＮＡ分子は、前記複合基に非共有結合的又は共有結合的に複合されてもよく、例えば、前記複合基に共有結合的に複合されてもよい。ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端又は５’端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよく、ｓｉＲＮＡの内部配列にあってもよい。いくつかの具体的な実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端にある。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、前記複合基は、ヌクレオチドのリン酸基、２’−位のヒドロキシ基又は塩基に結合されてもよく、３’−位のヒドロキシ基に結合されてもよく、この場合、ヌクレオチド間が２’−５’リン酸ジエステル結合により結合されている。複合基は、ｓｉＲＮＡ鎖の末端に結合される場合、通常ヌクレオチドのリン酸基に結合され、ｓｉＲＮＡの内部配列に結合される場合、通常リボース糖環或いは塩基に結合される。具体的結合方法については、文献Ｍｕｔｈｉａｈ  Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ．ａｌ．  ｓｉＲＮＡ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｔｒｉｖａｌｅｎｔ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｅｌｉｃｉｔ  ｒｏｂｕｓｔ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，１０  （５）：１１８１〜７．を参照することができる。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと複合基との間が酸不安定又は還元可能な化学結合により結合されてもよく、細胞エンドソームの酸性環境で、これらの化学結合が分解され、ｓｉＲＮＡが遊離状態になることができる。分解できない複合方法については、複合基は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合され、複合によるｓｉＲＮＡ活性への影響をできるだけ低下させることができる。
【０１８３】
前記薬学的に許容できる標的基は、ｓｉＲＮＡ投与分野で通常用いられる標的分子であってもよく、例えば、コレステロール、胆汁酸、ビタミン（例えば、トコフェロール）、鎖長が異なる脂質分子等の親油性分子、ポリエチレングリコール等の高分子、膜透過性ペプチド等のポリペプチド、アプタマー、抗体、量子ドット、ラクトース、ポリラクトース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等の糖類、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）、又はアシアロ糖タンパク質、アシアロ糖残基、リポタンパク（例えば、高密度リポタンパク、低密度リポタンパク等）、グルカゴン、神経伝達物質（例えば、アドレナリン）、成長因子、トランスフェリン等の肝実質細胞に発現する受容体リガンド等の標的分子又はその誘導体の１種又は複数種を含むが、これらに限定されない。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、アシアロ糖タンパク質、例えば、アシアロオロソムコイド（ａｓｉａｌｏｏｒｏｓｏｍｕｃｏｉｄ、ＡＳＯＲ）、アシアロ糖タンパク質受容体（ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＡＳＧＰＲ）のリガンドから選択される１種又は複数種であってもよい。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、アシアロ糖タンパク質受容体のリガンドであり、前記リガンドは、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブチリルガラクトサミン、Ｎ−イソブチリルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコリル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース又はＬ−４−チオリボースから選択されてもよい。前記リガンドの他の選択肢は、例えば、ＣＮ１０５３７８０８２Ａの記載を参照してもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンであってもよく、ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン分子は、１価、２価、３価、４価であってもよい。ここでいう１価、２価、３価、４価は、それぞれｓｉＲＮＡ分子と、標的基としてのガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン分子を含む複合基から形成された第１種のｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡ分子とガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン分子とのモル比が１：１、１：２、１：３及び１：４であることを指すと理解すべきである。いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基はＮ−アセチルガラクトサミンである。いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡがＮ−アセチルガラクトサミンを含む複合分子と複合する場合、Ｎ−アセチルガラクトサミン分子は３価又は４価である。いくつかの具体的な実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡがＮ−アセチルガラクトサミンを含む複合分子と複合する場合、Ｎ−アセチルガラクトサミン分子は３価である。
【０１８７】
本開示に記載されたｓｉＲＮＡが複合分子と複合する場合、複合分子は、適切なリンカーを介してｓｉＲＮＡ分子に結合されてもよく、当業者は、標的分子の具体的な種類により適切なリンカーを選択することができる。
【０１８８】
例示的な複合基、リンカー、標的分子の種類及びｓｉＲＮＡへの結合方法については、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２の開示内容を参照してもよく、引用によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ−アセチルガラクトサミンである場合、適切なリンカーは、式（３０１）に示される構造であってもよい。
【０１９０】
【化２９】
2021533800.tif 000045
式中、
ｋは１〜３の整数であり、
ＬＡは、式（３０２）に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記ＬＡは、その両端でそれぞれ１つの前記標的基及び前記ＬＣ部にエーテル結合により結合される。
【０１９１】
【化３０】
2021533800.tif 000046
ＬＢは、式（３０３）に示される構造を有するＮ−アシルピロリジンを含む鎖状部であり、前記鎖状部は、その一端にカルボニル基を有し、前記ＬＣ部にアミド結合により結合され、他端に酸素基を有し、前記ｓｉＲＮＡにリン酸エステル結合により結合される。
【０１９２】
【化３１】
2021533800.tif 000047
ＬＣは、ヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく２〜４価のリンカー基であり、前記ＬＣは、酸素原子を介してエーテル結合により各前記ＬＡ部に結合されるとともに、窒素原子を介してアミド結合により前記ＬＢ部に結合される。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、ｎ＝３であり、ＬＣがトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく４価のリンカー基である場合、リンカーとしての−（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン−ＬＢ−によりＮ−アセチルガラクトサミン分子とｓｉＲＮＡ分子を結合して形成されたｓｉＲＮＡ複合体は、その構造が以下の式（３０４）に示される。
【０１９４】
【化３２】
2021533800.tif 000048
式中、二重螺旋構造はｓｉＲＮＡを表す。
【０１９５】
同様に、ｓｉＲＮＡと複合分子との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端又は５’端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよく、ｓｉＲＮＡの内部配列にあってもよい。
【０１９６】
いくつかの具体的な実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端は、リンカー−（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン−ＬＢ−により３個のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）分子に共有結合的に複合され、ｓｉＲＮＡ分子とＧａｌＮＡｃ分子とのモル比が１：３である、構造が以下の式（３０５）に示されるｓｉＲＮＡ複合体（以下、（ＧａｌＮＡｃ）３−ｓｉＲＮＡともいう）を得る。
【０１９７】
【化３３】
2021533800.tif 000049
式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、
前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、前記標的分子がＮ−アセチルガラクトサミンである場合、適切なリンカーは、式（３０６）に示される構造であってもよい。
【０１９９】
【化３４】
2021533800.tif 000050
式中、
ｌは０〜３の整数であり、
＊は、リンカーにおいてエーテル結合により標的基に結合される部位を表し、
＃は、リンカーにおいてリン酸エステル結合によりｓｉＲＮＡに結合される部位を表す。
【０２００】
いくつかの具体的な実施形態において、ｌ＝２である場合、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０７）に示される構造を有する。
【０２０１】
【化３５】
2021533800.tif 000051
式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、
前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。
【０２０２】
上記複合分子は、従来技術において既に詳しく記載された方法により合成してもよい。例えば、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２には、複数種の複合分子の調製が詳しく記載されており、例えば、特に当該開示における実施例１４〜１５及び実施例２１の記載を参照されたい。また、ＷＯ２０１４０２５８０５Ａ１にも、式（３０５）の複合分子の調製方法が記載されており、例えば、当該開示の明細書における反応式１〜反応式８に示される合成方法、特に実施例１〜５の詳しい記載を参照されたい。
【０２０３】
当業者によく知られている方法により、本開示のｓｉＲＮＡを上記複合分子に複合させ、本開示の第１種のｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。
第２種のｓｉＲＮＡ複合体
【０２０４】
いくつかの実施形態において、本開示は、式（４０１）に示される構造を有する別のｓｉＲＮＡ複合体（以下、第２種のｓｉＲＮＡ複合体ともいう。このような表現形式は、上記第１種のｓｉＲＮＡ複合体と区別して説明しやすくするためのものに過ぎず、両者が範囲又は意味において固有の排他的区別があると認める意味ではない）を提供する。
【０２０５】
【化３６】
2021533800.tif 000052
式中、
ｎ１は、１〜３から選択される整数であり、ｎ３は、０〜４から選択される整数であり、
ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２〜１０から選択される整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、はそれぞれ独立して、Ｈ、メチル基又はエチル基の１つであり、
Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基である。
【０２０６】
【化３７】
2021533800.tif 000053
式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、Ｎｕは本開示により提供される上記ｓｉＲＮＡであり、
Ｒ２は、窒素含有骨格上のＮとＡ５９との結合を実現できる任意の基であり、
各Ｌ１は、式Ａ１〜Ａ２６の基から独立して選択される１又は複数の結合の組合せである。
【０２０７】
【化３８】
2021533800.tif 000054
ただし、ｊ１は１〜２０の整数であり、ｊ２は１〜２０の整数であり、
Ｒ’はＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
Ｒａは、式Ａ２７〜Ａ４５の基から選択される１つである。
【０２０８】
【化３９】
2021533800.tif 000055
ＲｂはＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
2021533800.tif 000056
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
【０２０９】
各Ｍ１は、哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）に対して親和力を有するリガンドから独立して選択される１つである。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、ｎ１は、１〜３の整数から選択されてもよく、ｎ３は、０〜４の整数から選択されてもよく、前記複合体におけるＭ１リガンドの個数が少なくとも２であることを確保する。いくつかの実施形態において、ｎ１＋ｎ３≧２であり、これにより、Ｍ１リガンドの個数が少なくとも３であり、Ｍ１リガンドと肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体をより容易に結合させ、さらに前記複合体が細胞内取込み（エンドサイトーシス）作用により細胞に取り込まれることを促進することができる。実験から分かるように、Ｍ１リガンドの個数が３個以上である場合、Ｍ１リガンドと肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合の容易さの向上が明らかではないので、合成の容易さ、構造／プロセスコスト及び送達効率等の多方面を総合的に考慮すると、いくつかの実施形態において、ｎ１は１〜２の整数であり、ｎ３は０〜１の整数であり、かつ、ｎ１＋ｎ３＝２〜３である。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、独立して２〜１０の整数から選択される場合、複数のＭ１リガンド間の空間位置をＭ１リガンドと肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合に適合させることができる。本開示により提供される複合体をより簡略化し、より合成しやすく、及び／又はコストを低下させるために、本開示のいくつかの実施形態によれば、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、はそれぞれ独立して２〜５の整数であり、いくつかの実施形態において、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である。
【０２１２】
当業者に理解され得るように、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５が、それぞれ独立してＨ、メチル基又はエチル基の１つである場合、本開示により提供される複合体の性質を変化させることなく、いずれも本開示の目的を実現することができる。しかし、本開示により提供される化合物を簡略化するため、かつ合成しやすくするために、いくつかの実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、いずれもＨである。
【０２１３】
Ｒ２は、窒素含有骨格上のＮとＡ５９との結合を実現するために選択される。本開示の文脈において、「窒素含有骨格」とは、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５が結合された炭素原子とＮが互いに結合している鎖状構造を指す。したがって、Ｒ２は、適当な方法でＡ５９基を窒素含有骨格上のＮに結合することができる任意のリンカー基であってもよい。いくつかの実施形態において、固相合成プロセスにより本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体を調製する場合に、Ｒ２基には、窒素含有骨格上のＮに結合される結合部位及びＲ３におけるＰに結合される結合部位がともに含まれる必要がある。いくつかの実施形態において、Ｒ２における前記窒素含有骨格中のＮに結合される部位は、Ｎとアミド結合を形成し、前記Ｒ３上のＰに結合される部位は、Ｐとリン酸エステル結合を形成する。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ５’又はＢ６’であってもよい。
【０２１４】
【化４０】
2021533800.tif 000057
ただし、
2021533800.tif 000058
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
【０２１５】
ｑ２の値の範囲は、１〜１０の整数であってもよく、本開示により提供される複合体を簡略化するために、いくつかの実施形態において、ｑ２は１〜５の整数である。
【０２１６】
本開示により提供される第２種のｓｉＲＮＡ複合体において、調製原料の入手しやすさを考慮すると、一実施形態におけるＥ１はＯＨ又はＳＨである。
【０２１７】
Ｌ１は、Ｍ１リガンドと窒素含有骨格上のＮを結合し、本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体に肝標的機能を提供する役割を果たす。Ｌ１は、式Ａ１〜Ａ２６の基から選択される１又は複数の結合の組合せである場合、いずれも上記目的を実現できる。Ｍ１リガンド間の空間位置をＭ１リガンドと肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合にさらに適合させ、コストを節約するために、いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１及びＡ１３から選択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ８、Ａ１０から選択される少なくとも２つの結合の組合せである。
【０２１８】
Ｌ１の上記機能を実現するために、いくつかの実施形態において、Ｌ１の長さは、３〜２５個の原子、３〜２０個の原子、４〜１５個の原子又は５〜１２個の原子であってもよい。別に説明がない限り、本明細書の文脈において、前記Ｌ１の長さとは、Ｌ１における窒素含有骨格のＮ原子に結合される原子からＭ１に結合される原子までの最も長い原子鎖を形成する原子の個数を指す。
【０２１９】
式Ａ１〜Ａ２６においてそれぞれｊ１、ｊ２、Ｒ’、Ｒａ、Ｒｂの範囲を選択することにより、Ｍ１リガンドと窒素含有骨格上のＮとの結合を実現し、Ｍ１リガンド間の空間位置をＭ１リガンドと肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合にさらに適合させる。したがって、本開示のいくつかの実施形態において、ｊ１は２〜１０の整数であり、一実施形態において、ｊ１は３〜５の整数である。ｊ２は２〜１０の整数であり、一実施形態において、ｊ２は３〜５の整数である。Ｒ’はＣ１−Ｃ４のアルキル基であり、一実施形態において、Ｒ’は、メチル基、エチル基及びイソプロピル基の１つである。Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３０の１つであり、一実施形態において、ＲａはＡ２７又はＡ２８である。Ｒｂは、Ｃ１−Ｃ５のアルキル基であり、一実施形態において、Ｒｂは、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の１つである。
【０２２０】
Ｍ１は、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体と結合し、複合体が細胞に取り込まれることを促進する役割を果たしているため、哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）に対して親和力を有するリガンドから選択されるいずれか１つであってもよい。これらのリガンドの種類は、当業者に公知である。例えば、各Ｍ１は、多糖、修飾多糖、単糖又は単糖誘導体から独立して選択されてもよい。いくつかの実施形態において、各Ｍ１は、グルコース及びその誘導体、マンノース及びその誘導体、ガラクトース及びその誘導体、キシロース及びその誘導体、リボース及びその誘導体、フコース及びその誘導体、ラクトース及びその誘導体、マルトース及びその誘導体、アラビノース及びその誘導体、フルクトース及びその誘導体、シアル酸から独立して選択される１つであってもよい。
【０２２１】
いくつかの実施形態において、各Ｍ１は、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブチリルガラクトサミン、Ｎ−イソブチリルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコリル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース、Ｌ−４−チオリボースから独立して選択されてもよい。いくつかの実施形態において、各Ｍ１は、いずれもＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。リガンドの他の選択肢は、例えば、ＣＮ１０５３７８０８２Ａの記載を参照してもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。
【０２２２】
本開示のいくつかの具体的な実施形態によれば、本開示の２番目の複合体は、式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する。
【０２２３】
【化４１】
2021533800.tif 000059
2021533800.tif 000060
2021533800.tif 000061
2021533800.tif 000062
2021533800.tif 000063
【０２２４】
式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡ配列における任意の可能な位置に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合されてもよく、いくつかの実施形態において、Ｐは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の端部に結合されてもよく、いくつかの実施形態において、Ｐは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の端部に結合される。前記端部とは、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖においてその一端から前の４個のヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に結合されてもよく、いくつかの実施形態において、Ｐは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。ｓｉＲＮＡのセンス鎖の上記位置に結合される場合に、本開示により提供される複合体は、細胞に入り込んだ後、巻き戻されるときに、単独のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を放出し、ＨＢＶのｍＲＮＡがタンパク質を翻訳する過程を遮断し、Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）遺伝子発現を抑制することができる。
【０２２５】
式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチド上の任意の可能な位置に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ヌクレオチドの５’位、ヌクレオチドの２’位、ヌクレオチドの３’位又はヌクレオチドの塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、リン酸ジエステル結合を形成することにより前記ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの２’位、３’位又は５’位に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端ヌクレオチドの３’ヒドロキシ基を脱水素した酸素原子に結合され（このとき、当該Ｐ原子及び対応するリン酸エステル基を当該ヌクレオチドに属するＰ原子及びリン酸エステル基とみなしてもよい）、或いは、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖における１つのヌクレオチドの２’−ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合され、或いは、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端のヌクレオチドの５’ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合される。
【０２２６】
本開示の発明者は、本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体、即ち、上記ｓｉＲＮＡ（例えば、上記表１Ａ〜１Ｄ内に示されるｓｉＲＮＡ）を含むｓｉＲＮＡ複合体が、顕著に向上した血漿における安定性を有するとともに、明らかに低下していないＨＢＶ  ｍＲＮＡサイレンシング活性及び優れたＨＢｓＡｇとＨＢＶ  ＤＮＡ発現抑制作用をさらに示すことを意外にも見出した。また、本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体は、さらに低いオフターゲット効果を有する。
【０２２７】
本開示の第１種のｓｉＲＮＡ複合体又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体は、薬学的に許容できる他の添加剤と併用してもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又は複数種であってもよく、詳細は、上述した本開示の薬物組成物に関する記載を参照のこと。
【０２２８】
＜本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体の調製＞
任意の合理的な合成経路により本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体を調製してもよい。
【０２２９】
一実施形態において、本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体は、以下の方法により調製することができる。当該方法は、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、それぞれｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、アニールを行うことを含み、前記ｓｉＲＮＡは、本開示により提供される上記ｓｉＲＮＡである。また、当該方法は、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、ヌクレオシドモノマー又は固相担体に結合されたヌクレオチド配列と接触させ、式（３２１）に示される化合物をカップリング反応させてヌクレオチド配列に結合することをさらに含む。以下に、式（３２１）に示される化合物は、複合分子とも呼ばれる。
【０２３０】
【化４２】
2021533800.tif 000064
式中、
Ｒ４は、反応させてリン酸ジエステル結合によりｓｉＲＮＡの任意の官能基に複合することができる基を含み、
各Ｓ１は、独立してＭ１において全ての活性ヒドロキシ基がＹＣＯＯ−基で置換された基であり、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される１つである。
【０２３１】
ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｍ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０２３２】
Ｒ４は、窒素含有骨格上のＮとの結合を実現し、式（４０１）のｓｉＲＮＡ複合体の合成に適切な反応部位を提供するために選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ４には、Ｒ２リンカー基又は保護されたＲ２リンカー基が含まれており、Ｒ４には、反応させることによりｓｉＲＮＡとＡ５９に示される構造を形成することができる官能基が含まれる。
【０２３３】
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、ｓｉＲＮＡ又はヌクレオシドモノマー上の基と亜リン酸エステルを形成することができる官能基を含む基１を含み、或いは、基１と基２とを含み、基２は、ヒドロキシ基又はアミノ基と反応させて共有結合を形成することができる官能基を含むか、もしくは、前記共有結合により結合された固相担体を含む。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ又はヌクレオシドモノマー上の基と亜リン酸エステルを形成することができる官能基は、ホスホルアミダイト、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基である。当該保護されたヒドロキシ基上の保護基は、除去された後、ヒドロキシ基を形成して反応に関与させる。ヒドロキシ基又はアミノ基と反応させて共有結合を形成することができる官能基は、ホスホルアミダイト、カルボン酸又はカルボン酸塩である。前記共有結合を介して結合される固相担体は、リン酸エステル結合を介して結合される固相担体、カルボン酸エステル結合を介して結合される固相担体、又はアミド結合を介して結合される固相担体である。いくつかの実施形態において、前記固相担体は樹脂である。
【０２３４】
いくつかの実施形態において、前記基１は、ヒドロキシ基、−ＯＲｋ又は式（Ｃ３）に示される基を含み、前記基２は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）、（Ｃ３）、（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を含む。
【０２３５】
【化４３】
2021533800.tif 000065
式中、ｑ１は１〜４の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、Ｒｅｓｉｎは固相担体を表し、
2021533800.tif 000066
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
【０２３６】
いくつかの実施形態において、前記基１は、式（Ｃ３）に示されるように、ホスホルアミダイト官能基を含み、当該ホスホルアミダイト官能基は、ヌクレオチド上の任意位置のヒドロキシ基、例えば、２’位のヒドロキシ基又は３’位のヒドロキシ基とカップリング反応させて亜リン酸エステルを形成し、酸化又は硫化されて式Ａ５９に示されるリン酸ジエステル結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、複合分子をｓｉＲＮＡに複合させることができる。この場合、基２が存在しても存在しなくても、式（４０１）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の取得に影響することはない。この場合に、ホスホルアミダイト固相合成等の方法によりｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得た後、式（３２１）の化合物と、ヌクレオチド配列において末端のヌクレオチド上のヒドロキシ基を反応させ、後の酸化又は硫化過程においてリン酸ジエステル結合による結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、式（３２１）の化合物をｓｉＲＮＡに複合させる。
【０２３７】
いくつかの実施形態において、前記基１は、保護されたヒドロキシ基を含み、前記基２は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）又は（Ｃ３）に示されるように、カルボン酸官能基、カルボン酸塩官能基又はホスホルアミダイト官能基を含む。前記基２がカルボン酸官能基又はカルボン酸塩官能基を含む場合、式（３２１）の化合物と固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基又はアミノ基をエステル化反応又はアミド化反応させ、カルボン酸エステル結合により結合された、又はアミド結合により結合された固相担体を形成する。前記基２がホスホルアミダイト官能基を含む場合、式（３２１）の化合物と汎用の固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基をカップリング反応させ、酸化されてリン酸ジエステル結合により結合された固相担体を形成する。その後、上記固相担体が結合された生成物を出発とし、ホスホルアミダイト固相合成方法に従いヌクレオシドモノマーを順に結合し、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る。ホスホルアミダイト固相合成過程において、前記基１は、脱保護され、その後、カップリング反応条件下でヌクレオシドモノマーにおけるホスホルアミダイト基とカップリングさせる。
【０２３８】
一実施形態において、前記基１は、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基を含み、前記基２は、式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示されるように、カルボン酸エステル結合により結合された固相担体又はアミド結合により結合された固相担体、又はリン酸エステル結合により結合された固相担体を含む。この場合、出発として固相担体の代わりに式（３２１）の化合物を用い、ホスホルアミダイト固相合成方法に従いヌクレオシドモノマーを順に結合し、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る。いくつかの実施形態において、カルボン酸塩官能基は、−ＣＯＯ−Ｍ＋で表されてもよく、ここで、Ｍ＋は、カチオンであり、例えば、金属カチオン、アンモニウムカチオンＮＨ４＋、有機アンモニウムカチオンから選択される１つである。一実施形態において、前記金属イオンは、アルカリ金属イオンから選択される１つであり、例えば、Ｋ＋又はＮａ＋である。溶解性を向上させ、反応をスムーズに行うことを考慮し、いくつかの実施形態において、有機アンモニウムイオンは、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン又は４級アンモニウムカチオン、例えば、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオンである。いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、トリエチルアミンカルボン酸塩又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンカルボン酸塩である。
【０２３９】
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）、（Ｂ１０）、（Ｂ９’）、（Ｂ１０’）、（Ｂ１１）、（Ｂ１２）、（Ｂ１１’）又は（Ｂ１２’）に示される構造を含む。
【０２４０】
【化４４】
2021533800.tif 000067
式中、ｑ１は１〜４の整数であり、ｑ２は１〜１０の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、Ｒｅｓｉｎは固相担体を表し、
2021533800.tif 000068
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。合成しやすさ及びコストを考慮すると、いくつかの実施形態において、ｑ１は１又は２であり、ｑ２は１〜５の整数である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）又は（Ｂ１０）に示される構造を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ１１）又は（Ｂ１２）に示される構造を含む。
【０２４１】
ヒドロキシ保護基Ｒｋは、Ｒ４におけるヒドロキシ基上の水素を置換し、反応活性を有しない基を形成するために選択される。当該保護基Ｒｋは、後の反応過程において除去され、活性ヒドロキシ基を新たに放出して後の反応に関与させることができる。前記保護基の種類は、当業者に公知である。例えば、前記保護基Ｒｋは、例えば、Ｔｒ（トリチル基）、ＭＭＴｒ（４−メトキシトリチル基）、ＤＭＴｒ（４，４’−ビスメトキシトリチル基）、ＴＭＴｒ（４，４’，４’’−トリメトキシトリチル基）の１又は複数である。いくつかの実施形態において、Ｒｋは、ＤＭＴｒ、即ち、４，４’−ビスメトキシトリチル基（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）であってもよい。
【０２４２】
上記記載により、当業者であれば容易に理解できるように、本分野で公知のホスホルアミダイト固相合成方法と比較して、上記基１及び任意の基２により、複合分子がヌクレオチド配列の任意の可能な位置、例えば、ヌクレオチド配列の端部、ヌクレオチド配列の末端に結合された、ｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。これに応じて、特に説明がない限り、以下に複合体の調製に関する記載において、「脱保護」、「カップリング」、「キャッピング」、「酸化」、「硫化」等の反応に言及する場合、本分野で公知のホスホルアミダイト核酸の固相合成方法に係る反応条件と試薬もまた、同様にこれらの反応に適用されると理解すべきである。例示的な反応条件と試薬は、以下に詳細に説明する。
【０２４３】
各Ｓ１は独立して、Ｍ１における全ての活性ヒドロキシ基がＹＣＯＯ−基で置換された基である。式（３２１）の化合物によりｓｉＲＮＡ複合体を調製する場合、前記Ｍ１における活性ヒドロキシ基がＹＣＯＯ−基で保護されており、前記保護基は、後の工程で除去され、Ｍ１リガンドが得られる。
【０２４４】
いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、それぞれ独立して式Ａ４６〜Ａ５４の基の１つである。
【０２４５】
【化４５】
2021533800.tif 000069
【０２４６】
いくつかの実施形態において、Ｓ１は式Ａ４９又はＡ５０である。
【０２４７】
各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される１つであり、本開示の複合分子を簡略化する目的で、一実施形態において、Ｙはメチル基である。
【０２４８】
前述したように、本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、ｓｉＲＮＡの他方の鎖を合成し（例えば、上記工程で、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖を合成した場合、固相合成方法に従いｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を合成することをさらに含み、その逆も同様である）、センス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、かつ、アニールを行う工程をさらに含む。具体的には、単離工程において、ヌクレオチド配列及び／又は複合分子に結合される固相担体が切断されるとともに、必要な保護基が除去され（この場合、式（３２１）の化合物における各Ｓ１基が、対応するＭ１リガンドに変換される）、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖（又はアンチセンス鎖）及び対応するアンチセンス鎖（又はセンス鎖）が得られ、センス鎖とアンチセンス鎖をアニールして二本鎖ＲＮＡ構造を形成し、式（４０１）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得る。
【０２４９】
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖の３’端の１番目のヌクレオシドモノマーと接触させ、式（３２１）に示される化合物を配列における１番目のヌクレオチドに結合させ、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、所望のセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を合成する工程であって、（３２１）の化合物は、Ｒ４に、保護されたヒドロキシ基を含む基１、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を有する基２が含まれる、式（３２１）に示される化合物であり、１番目のヌクレオシドモノマーと結合する前に、式（３２１）の化合物を脱保護し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、複合分子が結合された核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る工程；ホスホルアミダイト固相合成の条件で、アンチセンス鎖又はセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、核酸のアンチセンス鎖又はセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、保護基を除去して固相担体から切断し、単離精製して核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、当該二本鎖ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、センス鎖及びアンチセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、固相担体に結合されたセンス鎖、及び固相担体に結合されたアンチセンス鎖を得る工程；カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、固相担体に結合されたセンス鎖又は固相担体に結合されたアンチセンス鎖と接触させ、Ｒ４にホスホルアミダイト基である基１が含まれる式（３２１）の化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合させ、保護基を除去して固相担体から切断し、それぞれ単離精製し、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。
【０２５１】
いくつかの実施形態において、所望の第２種のｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡ配列により、用いられるヌクレオシドモノマーを選択する。例えば、ｓｉＲＮＡ配列にフルオロ修飾又はメトキシ修飾のヌクレオチドが含まれる場合、ｓｉＲＮＡ合成において、対応するフルオロ修飾又はメトキシ修飾のヌクレオシドモノマーを相応に用いる。前述したように、これらのフルオロ修飾又はメトキシ修飾のヌクレオシドモノマーは、本分野において公知であり、容易に市販品を購入することができる。
【０２５２】
一実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖の３’末端に結合され、本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、
（１）式（３２１）の化合物（式（３２１）の化合物は、Ｒ４に、保護されたヒドロキシ基ＯＲｋを含む基１、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を有する基２が含まれる化合物である）におけるヒドロキシ保護基Ｒｋを除去し、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、脱保護された生成物をヌクレオシドモノマーと接触させ、複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを得ること、
（２）当該複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’−５’の方向に従いホスホルアミダイト固相合成方法によりｓｉＲＮＡのセンス鎖を合成すること、
（３）ホスホルアミダイト固相合成方法により、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を合成すること、
（４）ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離してアニールし、本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体を得ることを含む。
【０２５３】
工程（１）において、式（３２１）の化合物における保護基Ｒｋを除去する方法は、脱保護条件で、式（３２１）の化合物を脱保護試薬と接触させることを含む。脱保護条件としては、温度が０〜５０℃であり、一実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が３０〜３００秒であり、一実施形態において、５０〜１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、一実施形態において、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と式（３２１）の化合物とのモル比が１０：１〜１０００：１であり、一実施形態において、５０：１〜５００：１である。
前記カップリング反応条件とカップリング試薬としては、上記カップリング反応を実現できる任意の条件と試薬を用いてもよい。プロセスの簡略化を考慮すると、採用される固相合成方法におけるカップリング反応と同じ条件と試薬を用いてもよい。
【０２５４】
一般的には、前記カップリング反応の条件としては、反応温度が０〜５０℃であり、一実施形態において、１５〜３５℃である。式（３２１）の化合物とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１〜１：５０であり、一実施形態において、１：２〜１：５であり、式（３２１）の化合物とカップリング試薬とのモル比が１：１〜１：５０であり、一実施形態において、１：３〜１：１０であり、反応時間が２００〜３０００秒であり、一実施形態において、５００〜１５００秒である。カップリング試薬は、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオ１Ｈ−テトラゾール、５−ベンジルチオ１Ｈ−テトラゾールから選択される１種又は複数種であり、一実施形態において、５−エチルチオ１Ｈ−テトラゾールである。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、一実施形態において、無水アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、一実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２５５】
工程（２）において、ホスホルアミダイト核酸固相合成方法により、上記工程で調製された複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’−５’の方向に従いｓｉＲＮＡ複合体のセンス鎖Ｓを合成する。この場合、複合分子は、得られたセンス鎖の３’末端に結合される。
【０２５６】
工程（２）及び（３）における前記固相合成の他の条件としては、ヌクレオシドモノマーの脱保護条件、脱保護試薬の種類と用量、カップリング反応条件、カップリング試薬の種類と用量、キャッピング反応の条件、キャッピング試薬の種類と用量、酸化反応条件、酸化試薬の種類と用量、硫化反応条件、硫化試薬及び用量を含み、本分野で通常用いられる各種の試薬、用量及び条件を採用する。
【０２５７】
例えば、一実施形態において、工程（２）及び（３）において、前記固相合成では、以下の条件を用いてもよい。
【０２５８】
ヌクレオシドモノマーの脱保護条件としては、温度が０〜５０℃であり、一実施形態においては、１５〜３５℃であり、反応時間が３０〜３００秒であり、一実施形態において、５０〜１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、一実施形態においては、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固相担体における４，４’−ジメトキシトリチル保護基とのモル比は、２：１〜１００：１であり、一実施形態において、３：１〜５０：１である。
【０２５９】
カップリング反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、一実施形態において、１５〜３５℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１〜１：５０であり、一実施形態において、１：５〜１：１５であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が１：１〜１：１００であり、一実施形態において、１：５０〜１：８０であり、反応時間とカップリング試薬の選択は、前記と同じである。
【０２６０】
キャッピング反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、一実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が５〜５００秒であり、一実施形態において、１０〜１００秒であり、キャッピング試薬の選択は、前記と同じである。キャッピング試薬の総量と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が１：１００〜１００：１であり、一実施形態において、１：１０〜１０：１である。キャッピング試薬として等モル量の酢酸無水物とＮ−メチルイミダゾールを用いる場合に、酢酸無水物、Ｎ−メチルイミダゾール及び固相担体に結合される核酸配列のモル比が１：１：１０〜１０：１０：１であり、一実施形態において、１：１：２〜２：２：１である。
【０２６１】
酸化反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、一実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が１〜１００秒であり、一実施形態において、５〜５０秒であり、酸化試薬は、一実施形態において、ヨウ素である（一実施形態において、ヨウ素水として提供する）。酸化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が、１：１〜１００：１であり、一実施形態において、５：１〜５０：１である。いくつかの実施形態において、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１〜１：１：３の混合溶剤で行われる。硫化反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、一実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が５０〜２０００秒であり、一実施形態において、１００〜１０００秒であり、硫化試薬は、一実施形態において、キサンタンヒドリドである。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が１０：１〜１０００：１であり、一実施形態において、１０：１〜５００：１である。いくつかの実施形態において、前記硫化反応は、アセトニトリル：ピリジン＝１：３〜３：１の混合溶剤で行われる。
【０２６２】
全てのヌクレオシドモノマーを結合した後、アニールする前、当該方法は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離することをさらに含む。単離方法は、当業者に公知であり、一般的に、合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去し、精製し脱塩することを含む。
【０２６３】
合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去するには、ｓｉＲＮＡ合成において通常の切断と脱保護方法により行われてもよい。例えば、得られた固相担体が結合されたヌクレオチド配列を濃アンモニア水と接触させ、脱保護過程において、Ａ４６〜Ａ５４基の保護基ＹＣＯ−をヒドロキシ基に変換させ、Ｓ１基を対応するＭ１基に変換させ、式（４０１）に示される複合体を生成する。ここで、前記濃アンモニア水は、２５〜３０重量％のアンモニア水を指し、濃アンモニア水の用量は、目的とするｓｉＲＮＡ配列に対して０．２ｍｌ／μｍｏｌ〜０．８ｍｌ／μｍｏｌである。
【０２６４】
合成されたヌクレオチド配列に少なくとも１つの２’−ＴＢＤＭＳ保護がある場合、前記方法は、固相担体が除去されたヌクレオチド配列をトリエチルアミン三フッ化水素酸塩と接触させることにより、当該２’−ＴＢＤＭＳ保護を除去することをさらに含む。この場合、得られた目的とするｓｉＲＮＡ配列には、遊離の２’−ヒドロキシ基の対応するヌクレオシドを有する。純粋なトリエチルアミン三フッ化水素酸塩の用量は、目的とするｓｉＲＮＡ配列に対して０．４ｍｌ／μｍｏｌ〜１．０ｍｌ／μｍｏｌである。このように本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。
【０２６５】
精製及び脱塩する方法は、当業者によく知られている。例えば、分取用イオンクロマトグラフィー精製カラムを用いて、ＮａＢｒ又はＮａＣｌの勾配溶出によって、核酸の精製を完成し、生成物を回収して合わせた後、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩することができる。
【０２６６】
このように得られたｓｉＲＮＡ複合体において、ヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、基本的にナトリウムイオンに結合されており、ｓｉＲＮＡ複合体は、基本的にナトリウム塩として存在する。熟知のイオン交換方法により、水素イオン又は他のカチオンで前記ナトリウムイオンを置換し、他の形式のｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。前記カチオンは、以下に詳細に説明する。
【０２６７】
合成過程において、常に核酸配列の純度と分子量を検出し、合成品質をよりよく制御することができる。検出方法は、当業者に公知である。例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより核酸純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析により分子量を測定することができる。
【０２６８】
アニール方法も、当業者によく知られている。例えば、簡単に合成されたセンス鎖（Ｓ鎖）とアンチセンス鎖（ＡＳ鎖）を等モル比で注射用水に混合して７０〜９５℃に加熱し、その後、室温で冷却し、水素結合により二本鎖構造を形成させることができる。このように本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。
【０２６９】
本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体を得た後、一実施形態において、例えば、液体クロマトグラフィータンデム質量分析等の方法を用いて、分子量検出等により合成されたｓｉＲＮＡ複合体の特徴を明らかにし、合成されたｓｉＲＮＡ複合体が、目的設計のｓｉＲＮＡ複合体であるとともに、合成されたｓｉＲＮＡの配列が、合成しようとするｓｉＲＮＡの配列、例えば上記表１Ａ〜１Ｄに示される配列と一致すると確認することもできる。
【０２７０】
式（３２１）に示される化合物は、有機溶剤において、エステル化反応条件下及び塩基とエステル化触媒の存在下で、式（３１３）に示される化合物を環状酸無水物と接触させ、イオン交換を行い、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む調製方法により得ることができる。
【０２７１】
【化４６】
2021533800.tif 000070
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりであり、
Ｒ６は、式（Ａ６１）に示される構造を有する。
【０２７２】
【化４７】
2021533800.tif 000071
式中、Ｒｉは、窒素含有骨格上のＮとの結合を実現できる、ＲｋＯと結合して１つの遊離ヒドロキシ基が結合されている任意の基であり、Ｒｋはヒドロキシ保護基である。この場合、Ｒ４にヒドロキシ保護基を含む基１と基２が含まれ、基２が式（Ｃ１）又は（Ｃ２）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られる。
【０２７３】
前記エステル化反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が８〜４８時間であり、一実施形態において、前記エステル化反応条件としては、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が２０〜３０時間である。
【０２７４】
前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。一実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種である。一実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。前記式（３１３）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、一実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２７５】
いくつかの実施形態において、前記環状酸無水物は、コハク酸無水物、グルタル酸無水物、アジピン酸無水物又はピメリン酸無水物の１つであり、一実施形態において、コハク酸無水物である。前記環状酸無水物と前記式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１〜１０：１であり、一実施形態において、２：１〜５：１である。
【０２７６】
前記エステル化触媒は、当該エステル化反応を触媒する任意の触媒であってもよく、例えば、当該触媒は、４−ジメチルアミノピリジンであってもよい。前記触媒と式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１〜１０：１であり、一実施形態において、２：１〜５：１である。
【０２７７】
いくつかの実施形態において、前記塩基は、任意の無機塩基、有機塩基又はこれらの組合せであってもよい。溶解性及び生成物の安定性を考慮すると、前記塩基は、例えば、第３級アミン類有機塩基であってもよい。一実施形態において、前記第３級アミン類有機塩基は、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミン類有機塩基と式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１〜２０：１であり、一実施形態において、３：１〜１０：１である。
【０２７８】
前記イオン交換作用は、式（３２１）の化合物を所望のカルボン酸又はカルボン酸塩の形式に変換することであり、イオン交換方法は、当業者に公知であり、適切なイオン交換溶液と交換条件を用い、前述したカチオンがＭ＋である複合分子を得ることができ、ここで詳しい説明を省略する。一実施形態において、前記イオン交換反応は、トリエチルアミンリン酸塩溶液を用いて行われ、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度が０．２〜０．８Ｍであり、一実施形態において、０．４〜０．６Ｍであり、式（３１３）の化合物に対して、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の用量が３〜６Ｌ／ｍｏｌであり、一実施形態において４〜５Ｌ／ｍｏｌである。
【０２７９】
任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３２１）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３２１）の化合物を単離することができ、例えば、順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出する；逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するというクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３２１）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０２８０】
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、縮合反応条件下で、有機溶剤において、縮合剤と第３級アミン類有機塩基の存在下で、上記イオン交換反応により得られた生成物を、さらにアミノ基又はヒドロキシ基を含む固相担体と接触させることをさらに含む。この場合、Ｒ４に基１及び基２が含まれ、基１がヒドロキシ保護基を含み、基２が式（Ｃ１’）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られる。
【０２８１】
前記固相担体は、ｓｉＲＮＡの固相合成に用いられる担体の１つであり、そのうちのいくつかは、当業者に公知である。例えば、前記固相担体は、活性ヒドロキシ基又はアミノ官能基を含む固相担体から選択されてもよく、一実施形態において、アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂である。後に核酸固相合成を行いやすくするために、前記アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂は、一実施形態において、粒子径１００〜４００メッシュ（ｍｅｓｈ）、表面におけるアミノ基又はヒドロキシ基の担持量０．２〜０．５ｍｍｏｌ／ｇというパラメーターを有する。前記式（３２１）に示される化合物と固相担体との用量比は１０〜４００μｍｏｌ／ｇであり、一実施形態において、５０〜２００μｍｏｌ／ｇである。
【０２８２】
前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。一実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種である。一実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が２０〜２００Ｌ／ｍｏｌであり、一実施形態において、５０〜１００Ｌ／ｍｏｌである。
【０２８３】
前記縮合剤は、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン及び／又はＯ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであってもよく、一実施形態において、Ｏ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートである。前記縮合剤と式（３２１）に示される化合物とのモル比が１：１〜２０：１であり、一実施形態において１：１〜５：１である。
【０２８４】
いくつかの実施形態において、前記第３級アミン類有機塩基は、トリエチルアミン及び／又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、一実施形態において、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、前記第３級アミン類有機塩基と式（３２１）に示される化合物とのモル比が１：１〜２０：１であり、一実施形態において、１：１〜５：１である。
【０２８５】
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、得られた縮合生成物をキャッピング反応条件下で、有機溶剤において、キャッピング試薬及びアシル化触媒と接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることをさらに含んでもよい。前記キャッピング反応の作用は、後の反応において不必要な副生成物が生じることを避けるために、まだ完全に反応していないあらゆる活性反応官能基を除去することである。前記キャッピング反応の条件としては、反応温度が０〜５０℃であり、一実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が１〜１０ｈであり、一実施形態において、３〜６ｈである。キャッピング試薬としては、当業者に公知の、ｓｉＲＮＡ固相合成に用いられるキャッピング試薬を用いてもよい。
【０２８６】
いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬は、キャッピング試薬１（ｃａｐ１）及びキャッピング試薬２（ｃａｐ２）からなり、キャッピング試薬１は、Ｎ−メチルイミダゾールであり、一実施形態において、Ｎ−メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液として提供され、ピリジンとアセトニトリルとの体積比は１：１０〜１：１であり、一実施形態において、１：３〜１：１であり、ピリジンとアセトニトリルの総体積とＮ−メチルイミダゾールとの体積は１：１〜１０：１であり、一実施形態において、３：１〜７：１である。前記キャッピング試薬２は、酢酸無水物であり、一実施形態において、酢酸無水物のアセトニトリル溶液として提供され、酢酸無水物とアセトニトリルとの体積が１：１〜１：１０であり、一実施形態において１：２〜１：６である。
【０２８７】
いくつかの実施形態において、前記Ｎ−メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液の体積と式（３２１）の化合物の質量との比が５ｍｌ／ｇ〜５０ｍｌ／ｇであり、一実施形態において、１５ｍｌ／ｇ〜３０ｍｌ／ｇである。前記酢酸無水物のアセトニトリル溶液の体積と式（３２１）の化合物の質量との比は０．５ｍｌ／ｇ〜１０ｍｌ／ｇであり、一実施形態において、１ｍｌ／ｇ〜５ｍｌ／ｇである。
【０２８８】
一実施形態において、キャッピング試薬としては、等モル量の酢酸無水物とＮ−メチルイミダゾールを用いる。前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。一実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が１０〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、一実施形態において、５〜３０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２８９】
前記アシル化触媒は、エステル化縮合又はアミド化縮合に使用できる任意の触媒、例えばアルカリ複素環化合物から選択されてもよい。一実施形態において、前記アシル化触媒は、４−ジメチルアミノピリジンである。前記触媒と式（３２１）に示される化合物との質量比が０．００１：１〜１：１であり、一実施形態において、０．０１：１〜０．１：１である。
【０２９０】
任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３２１）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、有機溶剤で十分に洗浄し、濾過し、未反応の反応物、過剰なキャッピング試薬及び他の不純物を除去することにより、式（３２１）の化合物を得ることができる。前記有機溶剤は、アセトニトリル、ジクロロメタン、メタノールから選択され、一実施形態において、アセトニトリルである。
【０２９１】
いくつかの実施形態において、式（３２１）に示される複合分子の調製方法は、有機溶剤において、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３１３）に示される化合物をホスホルジアミダイトと接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む。この場合、Ｒ４に基１及び基２が含まれ、基１がヒドロキシ保護基を含み、基２が式（Ｃ３）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られる。
【０２９２】
カップリング反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、例えば１５〜３５℃であり、式（３１３）の化合物とホスホルジアミダイトとのモル比が１：１〜１：５０であり、例えば１：５〜１：１５であり、式（３１３）の化合物とカップリング試薬とのモル比が１：１〜１：１００であり、例えば１：５０〜１：８０であり、反応時間が２００〜３０００秒であり、例えば５００〜１５００秒である。前記ホスホルジアミダイトは、例えばビス（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィンを用いてもよく、市販品を購入してもよく、本分野で公知の方法により合成してもよい。カップリング試薬は、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオ１Ｈ−テトラゾール、５−ベンジルチオ１Ｈ−テトラゾールから選択される１種又は複数種であり、例えば、５−エチルチオ１Ｈ−テトラゾールである。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、例えば無水アセトニトリルである。式（３１３）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、例えば、５〜２０Ｌ／ｍｏｌであってもよい。当該カップリング反応を行うことにより、式（３１３）の化合物におけるヒドロキシ基とホスホルジアミダイトを反応させてホスホルアミダイト基を形成する。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３２１）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０２９３】
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、カップリング反応条件下で、有機溶剤において、カップリング試薬の存在下で、単離して得られた生成物を、さらにヒドロキシ基含有固相担体と接触させる工程をさらに含む。その後、キャッピング反応、酸化反応を行い、単離して式（３２１）の化合物を得る。この場合、Ｒ４に基１及び基２が含まれ、基１がヒドロキシ保護基を含み、基２が式（Ｃ３’）に示される構造を有する式（３２１）の化合物が得られる。
【０２９４】
前記固相担体は、本分野で公知の核酸固相合成に使用できる固相担体であり、例えば、脱保護反応された市販の汎用の固相担体（ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ  ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ  ３００  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、構造は式Ｂ８０に示すとおり）であってもよい。
【０２９５】
【化４８】
2021533800.tif 000072
【０２９６】
脱保護反応は、当業者に公知である。一実施形態において、脱保護条件としては、温度が０〜５０℃であり、例えば１５〜３５℃であり、反応時間が３０〜３００秒、例えば５０〜１５０秒である。脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態において、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固定相における−ＤＭＴｒ（４，４’−ジメトキシトリチル）保護基とのモル比が２：１〜１００：１であり、例えば３：１〜５０：１である。前記脱保護を行うことにより、前記固相担体の表面に反応活性を有する遊離ヒドロキシ基が得られ、次のカップリング反応を行いやすくする。
【０２９７】
カップリング反応条件及びカップリング試薬の選択は、上述したとおりである。当該カップリング反応を行うことにより、脱保護反応で形成された遊離ヒドロキシ基とホスホルアミダイト基を反応させて亜リン酸エステル結合を形成する。
【０２９８】
キャッピング反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、例えば１５〜３５℃であり、反応時間が５〜５００秒であり、例えば１０〜１００秒であり、前記キャッピング反応をキャッピング試薬の存在下で行う。キャッピング試薬の選択と用量は、上述したとおりである。
【０２９９】
酸化反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、例えば、１５〜３５℃であってもよく、反応時間が１〜１００秒、例えば、５〜５０秒であってもよく、酸化試薬は、例えば、ヨウ素であってもよい（いくつかの実施形態において、ヨウ素水として提供する）。酸化試薬と亜リン酸エステル基とのモル比が１：１〜１００：１であり、例えば、５：１〜５０：１であってもよい。いくつかの実施形態において、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１〜１：１：３の混合溶剤で行われる。
【０３００】
一実施形態において、Ｒ６は、式Ｂ７又はＢ８の基の１つである。
【０３０１】
【化４９】
2021533800.tif 000073
式中、ｑ２の定義は、前述したとおりである。
【０３０２】
この場合、式（３１３）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応条件下及びアミド化反応縮合剤と第３級アミン類有機塩基の存在下で、式（３１４）に示される化合物を式（Ａ−１）に示される化合物又は式（Ａ−２）の化合物と接触させ、単離する、という調製方法により得ることができる。
【０３０３】
【化５０】
2021533800.tif 000074
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１、ｑ２及びＲｋそれぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０３０４】
前記アミド化反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が１〜４８時間であり、一実施形態において、前記アミド化反応条件としては、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が２〜１６時間である。
【０３０５】
前記有機溶剤は、アルコール類溶剤、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記アルコール類溶剤は、一実施形態において、メタノール、エタノール、プロパノールの１種又は複数種であり、一実施形態において、エタノールである。前記エポキシ類溶剤は、一実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランである。前記エーテル類溶剤は、一実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルである。前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、一実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種である。一実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１４）の化合物に対して、有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、一実施形態において３〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０３０６】
前記アミド化反応縮合剤は、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン、４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（４−（４，６−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）−４−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）又はＯ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、一実施形態において、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オンである。前記アミド化反応縮合剤と式（３１４）に示される化合物とのモル比が１：１〜１０：１であり、一実施形態において、２．５：１〜５：１である。
【０３０７】
前記第３級アミン類有機塩基は、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、一実施形態において、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミン類有機塩基と式（３１４）に示される化合物とのモル比が３：１〜２０：１であり、一実施形態において、５：１〜１０：１である。
【０３０８】
式（Ａ−１）及び式（Ａ−２）の化合物は、任意の適当な方法により調製されてもよい。例えば、ＲｋがＤＭＴｒ基である場合、グリセリン酸カルシウムとＤＭＴｒＣｌを反応させて式（Ａ−１）の化合物を調製することができる。同様に、３−アミノ−１，２−プロパンジオールと環状酸無水物を接触させた後、ＤＭＴｒＣｌと反応させて式（Ａ−２）の化合物を調製することができ、前記環状酸無水物は、炭素原子数４〜１３、一実施形態において４〜８の環状酸無水物であってもよい。当業者であれば容易に理解できるように、前記環状酸無水物の選択は、（Ａ〜２）の化合物におけるｑ２の異なる値に対応しており、例えば、前記環状酸無水物がコハク酸無水物である場合、ｑ２＝１であり、前記環状酸無水物がグルタル酸無水物である場合、ｑ２＝２であり、以下類推すればよい。
【０３０９】
いくつかの変形において、式（３１４）に示される化合物を、前記環状酸無水物、３−アミノ−１，２−プロパンジオール及びＤＭＴｒＣｌと順に反応させることにより、式（３１３）の化合物を調製することもできる。当業者であれば容易に理解できるように、これらの変形は、式（３１３）の化合物の構造と機能に影響を与えることがなく、かつ、当業者が上記方法により容易に実現するものである。
【０３１０】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１３）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１３）の化合物を単離することができ、例えば、順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５〜１：１：１：０．６で勾配溶出する；逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するというクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１３）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０３１１】
式（３１４）に示される化合物は、有機溶剤において、脱保護反応条件下で、式（３１５）に示される化合物をハロ酢酸と接触させ、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０３１２】
【化５１】
2021533800.tif 000075
式中、Ｒ７は、式（３３０）、（３３１）、（３３２）又は（３３３）に示される基から選択され、一実施形態において、Ｒ７の構造は式（３３０）に示すとおりである。
【０３１３】
【化５２】
2021533800.tif 000076
ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０３１４】
前記ハロ酢酸は、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、クロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸から選択される１種又は複数種であり、一実施形態において、ジクロロ酢酸である。
【０３１５】
前記脱保護反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が０．１〜２４時間であり、一実施形態において、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が０．５〜１６時間である。
【０３１６】
前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記エポキシ類溶剤は、一実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、一実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、一実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種であり、一実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１５）の化合物に対して、有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、一実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０３１７】
前記ハロ酢酸と前記式（３１５）に示される化合物とのモル比が５：１〜１００：１であり、一実施形態において、１０：１〜５０：１である。
【０３１８】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１４）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１４）の化合物を単離することができ、例えば、順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出する；逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するというクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１４）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０３１９】
式（３１５）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応縮合剤と第３級アミン類有機塩基の存在下及び縮合反応条件下で、式（３１７）に示される化合物を式（３１６）に示される化合物と接触させ、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０３２０】
【化５３】
2021533800.tif 000077
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０３２１】
式（３１６）の化合物としては、例えば、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２０１４，１３６，１６９５８−１６９６１に開示された化合物を用いてもよく、或いは、式（３１６）の化合物は、当業者が各種の方法により調製することができ、例えば、ＵＳ８１０６０２２Ｂ２の実施例１に開示された方法を参照していくつかの式（３１６）の化合物を調製することができ、引用により上記文献の全ての内容が全体として本明細書に組み込まれる。
【０３２２】
前記縮合反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が０．１〜２４時間であり、一実施形態において、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が０．５〜１６時間である。
【０３２３】
前記式（３１６）に示される化合物と前記式（３１７）に示される化合物とのモル比が２：１〜１０：１であり、一実施形態において、２．５：１〜５：１である。
【０３２４】
前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種であり、前記エポキシ類溶剤は、一実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、一実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、一実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種であり、一実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３１７）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、一実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０３２５】
前記アミド化反応縮合剤は、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート又は４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩であり、一実施形態において、４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩である。前記アミド化反応縮合剤と式（３１７）に示される化合物とのモル比が２：１〜１０：１であり、一実施形態において、２．５：１〜５：１である。
【０３２６】
前記第３級アミン類有機塩基は、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、一実施形態において、Ｎ−メチルモルホリンであり、前記第３級アミン類有機塩基と式（３１７）に示される化合物とのモル比が３：１〜２０：１であり、一実施形態において、５：１〜１０：１である。
【０３２７】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１５）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１５）の化合物を単離することができ、例えば、順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出する；逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するというクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１５）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０３２８】
いくつかの実施形態において、式（３１７）の化合物と十分な量の式（３１６）の化合物を一度反応させるだけで所望の式（３１５）の化合物を生成する。この場合、各Ｓ１−Ｌ１部分同士が同じである。いくつかの実施形態において、必要に応じて、式（３１７）の化合物を、異なる式（３１６）の化合物、即ち、Ｌ１及び／又はＳ１が異なる式（３１６）の化合物とバッチ反応させることにより、生成された式（３１５）の化合物に２種類以上のＳ１及び／又はＬ１を含ませることができる。例えば、１ｅｑの式（３１７）の化合物に対して、それを２ｅｑの第１の式（３１６）の化合物と接触させ、式（３１７）の化合物における２つの末端第一級アミン基に第１のＳ１−Ｌ１部分を結合した後、続いて（ｎ３＋ｎ１−１）ｅｑの第２の式（３１６）の化合物と接触させ、（ｎ３及びｎ１の定義と値の範囲は、前述したとおりである）、式（３１７）の化合物における（ｎ３＋ｎ１−１）個の第二級アミン基に第２のＳ１−Ｌ１部分を結合することができる。
【０３２９】
式（３１７）に示される化合物は、有機溶剤の存在下及び脱保護反応条件下で、式（３１８）に示される化合物をメチルアミン水溶液と接触させ、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０３３０】
【化５４】
2021533800.tif 000078
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０３３１】
前記脱保護反応条件としては、反応温度が０〜１５０℃であり、反応時間が５〜７２時間であり、一実施形態において、反応温度が２０〜８０℃であり、反応時間が１０〜３０時間である。
【０３３２】
前記有機溶剤は、アルコールから選択され、一実施形態において、メタノール、エタノール及びイソプロパノールの１つであり、一実施形態において、メタノールであり、式（３１８）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が１〜２０Ｌ／ｍｏｌであり、一実施形態において、１．５〜１０Ｌ／ｍｏｌである。
【０３３３】
前記メチルアミン水溶液の濃度が３０〜４０質量％であり、メチルアミンと式（３１８）に示される化合物とのモル比が１０：１〜５００：１であり、一実施形態において、５０：１〜２００：１である。
【０３３４】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１７）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１７）の化合物を単離することができ、例えば、順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０５〜１：１：０．２５で勾配溶出する；逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するというクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１７）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０３３５】
式（３１８）に示される化合物は、有機溶剤の存在下及び置換反応条件下で、式（３１９）に示される化合物を、トリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロメタン、一実施形態においてトリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）と接触させ、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０３３６】
【化５５】
2021533800.tif 000079
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０３３７】
前記置換反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が５〜７２時間であり、一実施形態において、反応条件としては、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が１０〜３０時間である。
【０３３８】
トリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロメタンは、市販品を購入することができ、トリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロメタンと式（３１９）に示される化合物とのモル比が１：１〜１０：１であり、一実施形態において、１：１〜３：１である。
【０３３９】
前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記エポキシ類溶剤は、一実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、一実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、一実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種であり、一実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１９）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、一実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０３４０】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１８）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１８）の化合物を単離することができ、例えば、順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、メタノール：ジクロロメタン＝０．０１：１〜０．５：１で、又はメタノール：ジクロロメタン：酢酸エチル：石油エーテル＝０．１：１：１：１〜１：１：１：１で勾配溶出する；逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するというクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１８）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０３４１】
式（３１９）に示される化合物は、有機溶剤において、置換反応条件下で、式（３２０）に示される化合物をトリフルオロ酢酸エチルと接触させ、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０３４２】
【化５６】
2021533800.tif 000080
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０３４３】
前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記エポキシ類溶剤は、一実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、一実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、一実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種であり、一実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２０）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が１〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、一実施形態において、１〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０３４４】
前記置換反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が５〜７２時間であり、一実施形態において、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が１０〜３０時間である。
【０３４５】
式（３２０）の化合物は、市販品を購入して、又は、当業者により既知の方法を用いて得ることができる。例えば、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３＝３、ｎ１＝１、ｎ３＝２であり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５がいずれも１である場合、式（３２０）の化合物は、アルファ・エイサー社から市販品として購入することができる。
【０３４６】
前記トリフルオロ酢酸エチルと式（３２０）に示される化合物とのモル比が２：１〜１０：１であり、一実施形態において、３：１〜５：１である。
【０３４７】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１９）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１９）の化合物を単離することができ、例えば、順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、メタノール：ジクロロメタン＝０．０１：１〜０．５：１で、又はメタノール：ジクロロメタン：酢酸エチル：石油エーテル＝０．１：１：１：１〜１：１：１：１で勾配溶出する；逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するというクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１９）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０３４８】
本開示により提供されるｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡを含む複合体において、各隣接するヌクレオチド間がリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合により結合され、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、負電荷を帯び、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基として存在してもよく、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基における水素イオンは、一部又は全部がカチオンで置換されてもよい。前記カチオンは、任意のカチオン、例えば、金属カチオン、アンモニウムカチオンＮＨ４＋、有機アンモニウムカチオンの１つであってもよい。溶解性の向上を考慮し、一実施形態において、前記カチオンは、アルカリ金属イオン、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン及び４級アンモニウムカチオンから選択される１種又は複数種である。アルカリ金属イオンは、Ｋ＋及び／又はＮａ＋であってもよく、第３級アミンにより形成されたカチオンは、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン、及び／又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオンであってもよい。したがって、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ及び複合体は、少なくとも一部が塩として存在してもよい。１つの態様において、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、少なくとも一部がナトリウムイオンに結合され、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ及び複合体は、ナトリウム塩又は部分ナトリウム塩として存在する。
【０３４９】
当業者であれば明らかに知っているように、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載された複合体のｓｉＲＮＡに導入することができる。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチド基をｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。全ての修飾ヌクレオシドモノマーは、市販品を購入してもよく、既知の方法により調製してもよい。
【０３５０】
＜本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体の使用＞
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の、前記Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製における使用を提供する。
【０３５１】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を患者に投与することを含む、Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療方法を提供する。
【０３５２】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した肝炎細胞と接触させることを含む、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
【０３５３】
前記Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患は、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患及び肝過形成性疾患から選択される。
【０３５４】
本開示のｓｉＲＮＡ及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を、それを必要とする患者に投与することにより、ＲＮＡ干渉機構によりＢ型肝炎を治療及び／又は予防する目的を達成することができる。したがって、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体は、Ｂ型肝炎の予防及び／又は治療に用いられ、又はＢ型肝炎の予防及び／又は治療のための薬物の調製に用いることができる。
【０３５５】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の、任意の遺伝子の過剰発現による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製における使用を提供する。
【０３５６】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を患者に投与することを含む、任意の遺伝子の過剰発現による病理学的状態又は疾患の治療方法を提供する。
【０３５７】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を、遺伝子を発現する細胞と接触させることを含む、前記遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
【０３５８】
前記任意の遺伝子の過剰発現による病理学的状態又は疾患は、各種の慢性疾患、炎症、線維性疾患及び過形成性疾患、例えば、癌から選択される。
【０３５９】
本開示のｓｉＲＮＡ及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を、それを必要とする患者に投与することにより、ＲＮＡ干渉機構により疾患を治療する目的を達成することができる。したがって、本開示のｓｉＲＮＡ及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体は、任意の遺伝子の過剰発現による疾患の予防及び／又は治療に用いられ、又は任意の遺伝子の過剰発現による疾患の予防及び／又は治療のための薬物の調製に用いることができる。
【０３６０】
本明細書で用いられる用語「薬剤投与／投与」とは、ｓｉＲＮＡ又は薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体を少なくとも一部、所望の部位に局在化して所望の効果を生じさせる方法又は経路により、ｓｉＲＮＡ又は薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体を患者の体内に入れることを指す。本開示の方法に適した投与経路は、局所投与と全身投与を含む。一般的には、局所投与により、患者全身よりも多くのｓｉＲＮＡ又は薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体が特定の部位に送達されるが、全身投与により、前記ｓｉＲＮＡ又は薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体が患者のほぼ全身に送達される。本開示がＢ型肝炎の予防及び／又は治療手段の提供を主に意図することを考慮すると、いくつかの具体的な実施形態において、薬物を肝臓に送達する投与方法を用いる。
【０３６１】
本分野で既知の任意の適切な経路で患者に投与することができ、前記経路としては、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気管内投与（エアロゾル）、肺部投与、鼻部投与、直腸投与及び局所投与（口腔内投与と舌下投与を含む）を含む、経口投与又は胃腸管外経路（非経口経路）を含むが、これらのみに限定されない。投与頻度は、１日、１週間、１ヶ月又は１年に１回若しくは複数回であってもよい。
【０３６２】
本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又は薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体の用量は、本分野における通常の用量であってもよく、前記用量は、各種のパラメーター、特に患者の年齢、体重及び性別により決定されてもよい。細胞培養又は実験動物で標準薬学的手順により毒性と治療効果を測定し、例えば、ＬＤ５０（５０％の群体を死亡させる用量）及びＥＤ５０（定量的反応において、５０％の最大反応強度を引き起こすことができる用量を指し、定性的反応において、５０％の実験対象に陽性反応が発生する場合の用量を指す）を測定してもよい。細胞培養分析及び動物研究により得られたデータに基づいてヒト用量の範囲を得ることができる。
【０３６３】
本開示に記載された薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体を投与する場合、例えば、雄性又は雌性、６〜１２週齢、体重１８〜２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対して、前記薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡの量として、（ｉ）ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体により形成された薬物組成物については、そのｓｉＲＮＡ用量が０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、例えば、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０５〜５ｍｇ／ｋｇ体重又は０．１〜３ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、（ｉｉ）ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容できる複合分子により形成されたｓｉＲＮＡ複合体については、そのｓｉＲＮＡ用量が０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、例えば、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重又は０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。本開示に記載されたｓｉＲＮＡを投与する場合、上記用量を参照することができる。
【０３６４】
本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を、慢性ＨＢＶに感染した肝炎細胞に導入することにより、さらにはＲＮＡ干渉機構により、慢性ＨＢＶに感染した肝炎細胞におけるＨＢＶ遺伝子の発現を抑制する目的を達成することもできる。いくつかの実施形態において、前記細胞はＨｅｐＧ２．２．１５細胞である。
【０３６５】
本開示により提供される方法により細胞におけるＨＢＶ遺伝子の発現を抑制する。提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物、ｓｉＲＮＡ複合体のいずれを用いるかにかかわらず、ｓｉＲＮＡ用量は、一般的に、標的遺伝子の発現を低減でき、標的細胞表面では１ｐＭ〜１μＭ、０．０１ｎＭ〜１００ｎＭ、０．０５ｎＭ〜５０ｎＭ、又は０．０５ｎＭ〜約５ｎＭの細胞外濃度となる量である。当該局所濃度を達成するのに必要な量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞又は組織との間の細胞層の数、送達するのが局所か全身か等を含む、各種の因子により変化する。送達部位における濃度は、標的細胞又は組織の表面における濃度よりも顕著に高くてもよい。
【０３６６】
＜キット＞
本開示は、上述のｓｉＲＮＡ、上述の薬物組成物及び／又は上述のｓｉＲＮＡ複合体を含むキットを提供する。
【０３６７】
いくつかの実施形態において、１つの容器でｓｉＲＮＡを提供し、少なくとも別の１つの容器で薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤を提供してもよい。ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤のほか、前記キットには、他の成分、例えば、安定化剤又は防腐剤等がさらに含まれてもよい。前記他の成分は、前記キットに含まれてもよいが、ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤を提供する容器とは別の容器に存在する。これらの実施形態において、前記キットは、ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤又は他の成分を混合するための説明書を含んでもよい。
【０３６８】
いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ複合体を１つの容器に保存してもよく、薬学的に許容できる添加剤を提供する又は提供しない少なくとも別の１つの容器が存在しても存在しなくてもよい。ｓｉＲＮＡ複合体及び薬学的に許容できる任意の添加剤のほか、前記キットには、他の成分、例えば、安定化剤又は防腐剤等がさらに含まれてもよい。前記他の成分は、前記キットに含まれてもよいが、ｓｉＲＮＡ複合体と薬学的に許容できる任意の添加剤を提供する容器とは別の容器に存在する。これらの実施形態において、前記キットは、ｓｉＲＮＡ複合体と薬学的に許容できる添加剤（存在する場合）又は他の成分を混合するための説明書を含んでもよい。
【０３６９】
本開示のキットにおいて、前記ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに、前記ｓｉＲＮＡ複合体及び薬学的に許容できる任意の添加剤は、任意の形式、例えば、液体形式、乾燥形式又は凍結乾燥形式として提供されてもよい。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに、前記ｓｉＲＮＡ複合体及び薬学的に許容できる任意の添加剤は、基本的にクリーン及び／又は無菌である。任意に本開示のキットで無菌水を提供することができる。
【０３７０】
以下に実施例により本開示をさらに説明するが、本開示は、これによって何ら制限されない。
【実施例】
【０３７１】
以下に実施例により本開示を詳しく説明する。特に説明がない限り、以下の実施例で用いられる試薬、培地は、いずれも市販品であり、用いられる核酸電気泳動、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ等の操作は、いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａＢｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載された方法を参照して行われる。
【０３７２】
別に説明がない限り、以下で提供される試薬割合は、いずれも体積比（ｖ／ｖ）として計算される。
【０３７３】
（調製例１）複合体１〜３の調製
本調製例では、複合体１〜２（以下、Ｌ１０−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体及びＬ１０−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＰ複合体ともいう）を合成した。複合体３（以下、Ｌ１０−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＰｓ複合体ともいう）を合成することを意図した。前記複合体は、Ｌ−９複合分子がそれぞれ番号ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ、ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＰ又はｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＰｓのｓｉＲＮＡと複合した後に形成された複合体である。当該複合体に複合されたｓｉＲＮＡの配列は、表３を参照されたい。
【０３７４】
（１−１）Ｌ−１０化合物の合成
以下の方法に従い、Ｌ−１０化合物を合成した。
【０３７５】
【化５７】
2021533800.tif 000081
【０３７６】
（１−１−１）複合末端セグメントＧＡＬ−５の合成
【０３７７】
【化５８】
2021533800.tif 000082
【０３７８】
（１−１−１ａ）ＧＡＬ−２の合成
１００．０ｇのＧＡＬ−１（Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン塩酸塩、ＣＡＳ番号：１７７２−０３−８、寧波弘翔生化公司から購入、４６３．８ｍｍｏｌ）を１０００ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、氷水浴下で５４０ｍｌの酢酸無水物（Ｅｎｏｘ社から購入、５５６５．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌反応した。反応液を１０Ｌの氷水に注入し、減圧吸引濾過し、ケーキを２Ｌの氷水で洗浄した後、完全に溶解するまでアセトニトリル／トルエン混合溶剤（アセトニトリル：トルエンの体積比＝１：１）を加え、溶剤を蒸発乾固し、１３０．０ｇの白色固形製品ＧＡＬ−２を得た。
【０３７９】
（１−１−１ｂ）ＧＡＬ−３の合成
工程（１−１−１ａ）で得られたＧＡＬ−２（３５．１ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）を２１３ｍｌの無水１，２−ジクロロエタンに溶解させ、氷水浴下で、窒素保護条件で、２４．０ｇのＴＭＳＯＴｆ（ＣＡＳ番号：２７６０７−７７−８、マックリン社から購入、１０８．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。
【０３８０】
反応液に４００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、１Ｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、均一に攪拌し、有機相を分離し、水相をジクロロエタンにより１回あたり３００ｍｌで２回抽出し、有機相を合わせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、２６．９ｇの淡黄色の粘稠な水飴状製品ＧＡＬ−３を得た。
【０３８１】
（１−１−１ｃ）ＧＡＬ−４の合成
工程（１−１−１ｂ）で得られたＧＡＬ−３（２６．９ｇ、８１．７ｍｍｏｌ）を１３６ｍｌの無水１，２−ジクロロエタンに溶解させ、乾燥した４Å分子篩粉３０ｇを加え、９．０ｇの５−ヘキセン−１−オール（ＣＡＳ番号：８２１−４１−０、Ａｄａｍａｓ−ｂｅｔａ社から購入、８９．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌し、氷浴下で窒素保護下で９．０８ｇのＴＭＳＯＴｆ（４０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌反応させた。４Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に３００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、５００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて１０分間攪拌し洗浄し、有機相を分離し、水相を３００ｍｌのジクロロエタンで１回抽出し、有機相を合わせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、４１．３ｇの黄色水飴状製品ＧＡＬ−４を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
【０３８２】
（１−１−１ｄ）ＧＡＬ−５の合成
工程（１−１−１ｃ）に記載された方法により得られたＧＡＬ−４（１４．９ｇ、３４．７ｍｍｏｌ）を７７ｍｌのジクロロメタンと７７ｍｌのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ１０３ｍｌの脱イオン水及び２９．７ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（ＣＡＳ番号：７７９０−２８−５、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、１３８．８ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴下で１０分間攪拌し、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（ＣＡＳ番号：１４８９８−６７−０、Ｅｎｅｒｇｙ社から購入、２３８ｍｇ、１．１４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。反応液に３００ｍｌの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨを約７．５に調整し、有機相を分離して捨て、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相を捨てた。水相を固形クエン酸でｐＨを約３に調節し、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、６．８５ｇの白色泡状固形製品ＧＡＬ−５を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １２．０１  （ｂｒ，１Ｈ），７．８３  （ｄ，Ｊ  ＝  ９．２  Ｈｚ，１Ｈ），５．２１  （ｄ，Ｊ  ＝  ３．２  Ｈｚ，１Ｈ），４．９６  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １１．２，３．２  Ｈｚ，１Ｈ），４．４９  （ｄ，Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，１Ｈ），４．０７  −  ３．９５  （ｍ，３Ｈ），３．９２  −  ３．８５  （ｍ，１Ｈ），３．７４  −  ３．６７  （ｍ，１Ｈ），３．４８  −  ３．３９  （ｍ，１Ｈ），２．２０  （ｔ，Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，２Ｈ），２．１１  （ｓ，３Ｈ），２．００  （ｓ，３Ｈ），１．９０  （ｓ，３Ｈ），１．７７  （ｓ，３Ｈ），１．５５  −  １．４５  （ｍ，４Ｈ）．
【０３８３】
（１−１−２）Ｍ−１１−Ｔ３の合成：
【０３８４】
【化５９】
2021533800.tif 000083
Ｊ−０（１．８８３ｇ、１０ｍｍｏｌ、アルファ・エイサー社から購入）を２５ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、トリエチルアミン（４．０４８ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加えて氷水浴で０℃まで冷却し、トリフルオロ酢酸エチル（５．６８３ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２２ｈ反応させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで１８ｈ発泡乾燥させ、５．３４２ｇの固形粗製品Ｍ−１１−Ｔ３を得、さらに精製することなく、そのまま後の反応に用いた。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１５Ｈ２２Ｆ９Ｎ４Ｏ３，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４７７．３５、実測値：４７７．６５。
【０３８５】
（１−１−３）Ｍ−１１−Ｔ３−Ｔｒの合成：
【０３８６】
【化６０】
2021533800.tif 000084
Ｍ−１１−Ｔ３粗製品（５．３４２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、反応液にＴｒＣｌ（３．３４５ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５１８ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０ｈ攪拌反応させ、飽和炭酸水素ナトリウムで反応液を１回あたり２０ｍｌで２回洗浄し、２０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に有機溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、７．７６３ｇの固形粗製品Ｍ−１１−Ｔ３−Ｔｒを得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ３４Ｈ３６Ｆ９Ｎ４Ｏ３，［Ｍ＋Ｎａ］＋、理論値：７４１．２５、実測値：７４１．５３。固形粗製品Ｍ−１１−Ｔ３−Ｔｒは、精製することなく、引き続き次のＭ−１８−Ｔｒの合成に使用した。
【０３８７】
（１−１−４）Ｍ−１８−Ｔｒの合成：
【０３８８】
【化６１】
2021533800.tif 000085
工程（１−１−３）で得られたＭ−１１−Ｔ３−Ｔｒ粗製品（７．７６３ｇ、１０ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのメタノールに溶解させ、１００ｍｌのメチルアミン水溶液（４０質量％）を加え、５０℃で２３ｈ攪拌反応させ、不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固し、２００ｍｌの体積比１：１のジクロロメタン：メタノール混合溶剤を加え、５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水相をジクロロメタン（ＤＣＭ）で１回あたり５０ｍｌで３回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０５〜１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて２．８８７ｇの純粋なＭ−１８−Ｔｒを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ７．４７  −  ７．３９  （ｍ，６Ｈ），７．３２  −７．２４  （ｍ，６Ｈ），７．１９  −  ７．１２  （ｍ，３Ｈ），２．６０  −  ２．４７  （ｍ，４Ｈ），２．４６  −  ２．１９  （ｍ，１３Ｈ），１．７０  −  １．５５  （ｍ，４Ｈ），１．４０  （ｐ、Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，２Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２８Ｈ３９Ｎ４，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４３１．６５、実測値：４３２．６１。
【０３８９】
（１−１−５）Ｌ−５−Ｔｒの合成：
【０３９０】
【化６２】
2021533800.tif 000086
工程（１−１−４）で得られたＭ−１８−Ｔｒ（２．０２ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）と工程（１−１−１）で得られたＧＡＬ−５（６．９３ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）とを混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、Ｎ−メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．９６ｍｍｏｌ）及び４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ攪拌反応させた。２００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、１００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、１００ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して７．４９ｇの純粋なＬ−５−Ｔｒを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ７．８３  −  ７．１０  （ｍ，４Ｈ），７．６７  −  ７．６０  （ｍ，１Ｈ），７．４４  −  ７．３４  （ｍ，６Ｈ），７．３３  −  ７．２４  （ｍ，６Ｈ），７．２０  −  ７．１５  （ｍ，３Ｈ），５．２２  （ｓ，３Ｈ），４．９７  （ｄ，Ｊ  ＝  １１．３  Ｈｚ，３Ｈ），４．４９  （ｄ，Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，３Ｈ），４．０６  −  ３．０７  （ｍ，９Ｈ），３．９５  −  ３．８３  （ｍ，３Ｈ），３．７７  −  ３．６４  （ｍ，３Ｈ），３．４５  −  ３．３５  （ｍ，３Ｈ），３．１２  −  ２．８７  （ｍ，８Ｈ），２．３０  −  ２．１５  （ｍ，３Ｈ），２．１１  −  １．９８  （ｍ，２２Ｈ），１．９５  −  １．８４  （ｍ，１１Ｈ），１．８１  −  １．６１  （ｍ，１４Ｈ），１．５４  −  １．３６  （ｍ，１４Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ８５Ｈ１１９Ｎ７Ｏ３０，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７１８．８１、実測値：１７１８．０３。
【０３９１】
（１−１−６）Ｌ−８の合成：
【０３９２】
【化６３】
2021533800.tif 000087
工程（１−１−５）で得られたＬ−５−Ｔｒ（５．９４ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ反応させ、１００ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しｐＨ＝７〜８になるように調節し、水相をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで６回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。精製には、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して４．２６ｇの純粋なＬ−８を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  ７．８４  （ｄ，Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，３Ｈ），７．２７  −  ７．２３  （ｍ，１Ｈ），７．１３  −  ７．１８  （ｍ，１Ｈ），５．２２  （ｄ，Ｊ  ＝  ３．１  Ｈｚ，３Ｈ），４．９７  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １１．３，３．１  Ｈｚ，３Ｈ），４．４８  （ｄ，Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，３Ｈ），４．０９  −  ３．９８  （ｍ，９Ｈ），３．８８  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １９．３，９．３  Ｈｚ，３Ｈ），３．７５  −  ３．６６  （ｍ，３Ｈ），３．４４  −  ３．３８  （ｍ，３Ｈ），３．１７  −  ３．３０  （ｍ，４Ｈ），３．１０  −  ２．９７  （ｍ，４Ｈ），２．３５  −  ２．２０  （ｍ，６Ｈ），２．１５  −  ２．０８  （ｍ，９Ｈ），２．０７  −  １．９８  （ｍ，１３Ｈ），１．９４  −  １．８７  （ｍ，９Ｈ），１．８１  −  １．７４  （ｍ，９Ｈ），１．６５  −  １．４２  （ｍ，１８Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ８５Ｈ１１９Ｎ７Ｏ３０，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４７７．５９、実測値：１４７７．２３。
【０３９３】
（１−１−７ａ）Ａ−１の合成
【０３９４】
【化６４】
2021533800.tif 000088
ＤＭＴｒＣｌ（４，４’−ビスメトキシトリチルクロリド、３８．１２ｇ、１１２．５ｍｍｏｌ）を４５０ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、ＤＬ−グリセリン酸カルシウム水和物（１２．８８ｇ、４５．０ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で２２ｈ反応させ、反応液を濾過し、ケーキを２００ｍｌのＤＣＭでリンスし、濾液を乾燥させるまで減圧濃縮し、残りを５００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩（ｐＨ＝７〜８）で１回あたり２００ｍｌで２回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．３５〜１：１：１：０．５５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、５００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、２００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で１回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩完全に乾燥するまで吸引濾過し、２０．７ｇの白色固形製品Ａ−１を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．４６  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝  ６．５，２．３，１．１  Ｈｚ，１Ｈ），７．４０  −  ７．２８  （ｍ，７Ｈ），６．８９  −  ６．８１  （ｍ，４Ｈ），４．８４  （ｄ，Ｊ  ＝  ５．０  Ｈｚ，１Ｈ），４．３６  −  ４．２４  （ｍ，１Ｈ），４．２９  （ｓ，６Ｈ），３．９２  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １２．４，７．０  Ｈｚ，１Ｈ），３．６７  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １２．３，７．０  Ｈｚ，１Ｈ），２．５２  （ｑ，Ｊ  ＝  ６．３  Ｈｚ，６Ｈ），１．０３  （ｔ，Ｊ  ＝  ６．３  Ｈｚ，９Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ２３Ｏ６，［Ｍ−Ｈ］−、理論値：４０７．１５、実測値：４０６．９２。
【０３９５】
（１−１−７ｂ）Ｌ−７の合成：
【０３９６】
【化６５】
2021533800.tif 000089
工程（１−１−６）で得られたＬ−８（２．２６２ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）と工程（１−１−７ａ）で得られたＡ−１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）とを混合し、１６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）（１．３７５ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２ｈ攪拌反応させ、１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、４．９００ｇの粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５〜１：１：１：０．６で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して２．３３６ｇの純粋なＬ−７を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ７．９０  −  ７．７８  （ｍ，４Ｈ），７．７５  −  ７．６４  （ｍ，１Ｈ），７．３８  −  ７．１８  （ｍ，９Ｈ），６．９１  −  ６．８３  （ｍ，４Ｈ），５．２５  −  ５．１０  （ｍ，４Ｈ），４．９７  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １１．２，３．２  Ｈｚ，３Ｈ），４．４８  −  ４．３０  （ｍ，４Ｈ），４．０２  （ｓ，９Ｈ），３．９３  −  ３．８４  （ｍ，３Ｈ），３．７６  −  ３．６６  （ｍ，９Ｈ），３．４５  −  ３．３５  （ｍ，３Ｈ），３．２４  −  ２．９８  （ｍ，１０Ｈ），２．３０  −  ２．２０  （ｍ，２Ｈ），２．１１  −  １．８８  （ｍ，３１Ｈ），１．８０  −  １．４０  （ｍ，２８Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ９０Ｈ１２８Ｎ７Ｏ３５，［Ｍ−ＤＭＴｒ］＋、理論値：１５６４．６５、実測値：１５６４．８８。
【０３９７】
（１−１−８）Ｌ−９複合分子の合成：
【０３９８】
【化６６】
2021533800.tif 000090
工程（１−１−７）で得られたＬ−７（２．３００ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．３７８ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．４６２ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）を混合して１３ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、０．８１４ｇ、６．３０ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２４ｈ攪拌し、５ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相を合わせ減圧蒸発乾固して２．７７４ｇの粗製品を得た。カラム精製には、６０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．８７４ｇの純粋なＬ−９複合分子を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  ８．５８  （ｄ，Ｊ  ＝  ４．２  Ｈｚ，１Ｈ），７．９４  −  ７．８２  （ｍ，３Ｈ），７．４１  −  ７．２９  （ｍ，５Ｈ），７．２２  （ｄ，Ｊ  ＝  ８．１  Ｈｚ，５Ｈ），６．８９  （ｄ，Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，４Ｈ），５．４９  −  ５．３７  （ｍ，１Ｈ），５．２１  （ｄ，Ｊ  ＝  ３．０  Ｈｚ，３Ｈ），４．９７  （ｄ，Ｊ  ＝  １１．１  Ｈｚ，３Ｈ），４．４９  （ｄ，Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，３Ｈ），４．０２  （ｓ，９Ｈ），３．８８  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １９．４、９．４  Ｈｚ，３Ｈ），３．７７  −  ３．６５  （ｍ，９Ｈ），３．５０  −  ３．３９  （ｍ，６Ｈ），３．１１  −  ２．９０  （ｍ，５Ｈ），２．６１  −  ２．５４  （ｍ，４Ｈ），２．４７  −  ２．４１  （ｍ，２Ｈ），２．２６  −  ２．１７  （ｍ，２Ｈ），２．１５  −  １．９５  （ｍ，２２Ｈ），１．９２  −  １．８４  （ｍ，９Ｈ），１．８０  −  １．７０  （ｍ，１０Ｈ），１．６５  −  １．３５  （ｍ，１７Ｈ），１．３１  −  １．１９  （ｍ，４Ｈ），０．９６  （ｔ，Ｊ  ＝  ７．１  Ｈｚ，９Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ９４Ｈ１３２Ｎ７Ｏ３８，［Ｍ−ＤＭＴｒ］＋、理論値：１６６４．７２、実測値：１６６５．０３。
【０３９９】
（１−１−９）Ｌ−１０化合物の合成：
【０４００】
【化６７】
2021533800.tif 000091
この工程において、Ｌ−９複合分子を固相担体に結合することにより、Ｌ−１０化合物を調製した。
【０４０１】
工程（１−１−８）で得られたＬ−９複合分子（０．２３３ｇ、０．１１２６ｍｍｏｌ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、０．０６４ｇ、０．１６８９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、０．０２９ｇ、０．２２５２ｍｍｏｌ）を混合し、１９ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、室温で５分間攪拌し、反応液にアミノメチル樹脂（Ｈ２ＮＲｅｓｉｎ、０．９０１ｇ、１００〜２００メッシュ、アミノ基担持量４００μｍｏｌ／ｇ、南開和成社から購入）を加え、２５℃でシェーカーで反応を行い、回転数２２０回転／分間、１５ｈ反応させた後に濾過し、ケーキをＤＣＭで１回あたり３０ｍｌで２回リンスし、アセトニトリルで１回あたり３０ｍｌで３回リンスし、３０ｍｌのエチルエーテルで１回リンスし、真空油ポンプで２ｈ乾燥させ、その後、表２に示す配合割合に従い原料（ＣａｐＡ、ＣａｐＢ、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）及びアセトニトリル）を加えてキャッピング反応を行った。２５℃でシェーカーに放置し、回転数２００回転／分間で５ｈ反応させ、反応液を濾過し、ケーキをアセトニトリルで１回あたり３０ｍｌで３回リンスし、乾燥させるまで吸引濾過し、真空油ポンプで一晩乾燥させ、１．１００ｇ、担持量９０．８μｍｏｌ／ｇのＬ−１０化合物（即ち、固相担体に結合されたＬ−９複合分子）を得た。
【０４０２】
【表２】
2021533800.tif 000092
ここで、ＣａｐＡとＣａｐＢは、キャッピング試薬溶液であり、ＣａｐＡは、２０体積％のＮ−メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液であり、ピリジンとアセトニトリルとの体積比が３：５であり、ＣａｐＢは、２０体積％酢酸無水物のアセトニトリル溶液であった。
【０４０３】
（１−２）複合体１〜３のセンス鎖の合成
複合体１〜３のセンス鎖は、配列が同じであるため、その調製方法も同じである。
【０４０４】
固相ホスホルアミダイト法により、上記工程で調製されたＬ−１０化合物を出発として循環させ、センス鎖のヌクレオチドの並び順に従い３’−５’方向に一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を行った。２個のヌクレオチド間がリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行った。２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、保護、カップリング、キャッピング、硫化の４つの反応を行った。合成条件は、以下のように規定された。
【０４０５】
ヌクレオシドモノマーを０．１Ｍ濃度のアセトニトリル溶液で提供し、各脱保護反応の条件が同じであり、即ち、温度が２５℃であり、反応時間が７０秒であり、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液（３％ｖ／ｖ）であり、ジクロロ酢酸と固相担体における４，４’−ジメトキシトリチル保護基とのモル比が５：１であった。
【０４０６】
各カップリング反応条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１０であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が１：６５であり、反応時間が６００秒であり、カップリング試薬は、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾールの０．５Ｍアセトニトリル溶液であった。
【０４０７】
各キャッピング条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が１５秒であった。キャッピング試薬溶液は、モル比が１：１であるＣａｐＡとＣａｐＢの混合溶液であり、キャッピング試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が、酢酸無水物：Ｎ−メチルイミダゾール：固相担体に結合される核酸配列＝１：１：１であった。
【０４０８】
各酸化反応条件は同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が１５秒であり、酸化試薬が濃度０．０５Ｍのヨウ素水であった。ヨウ素と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が３０：１であった。反応をテトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１の混合溶剤で行った。
【０４０９】
各硫化反応の条件は同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が３００秒であり、硫化試薬がキサンタンヒドリドであった。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が１２０：１であった。反応をアセトニトリル：ピリジン＝１：１の混合溶剤で行った。
【０４１０】
切断と脱保護条件は以下のとおりである。合成された担体が結合されたヌクレオチド配列を、濃度２５ｗｔ％のアンモニア水に加え、アンモニア水の用量が０．５ｍｌ／μｍｏｌであり、５５℃で１６ｈ反応させ、液体を除去し、乾燥させるまで真空濃縮した。
【０４１１】
精製と脱塩：分取用イオンクロマトグラフィー精製カラム（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ）により、ＮａＣｌによる勾配溶出で、核酸の精製を完成した。具体的には、溶出剤Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出剤Ｂ：１．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出勾配：溶出剤Ａ：溶出剤Ｂ＝１００：０〜５０：５０で勾配溶出した。製品溶出液を回収してから合わせ、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件としては、デキストランゲルカラムにより脱塩し、充填剤がデキストランゲルＧ２５であり、脱イオン水で溶出した。
【０４１２】
検出：イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）を用いて純度を検出し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分子量を分析した。
【０４１３】
複合体１のセンス鎖のバッチは、純度９０．４％、分子量の理論値７６２７．５、実測値７６２６．６であった。複合体２のセンス鎖のバッチは、純度９４．１％、分子量の理論値７６２７．５、実測値７６２５．１であった。実測値が理論値と一致しており、合成されたのは３’末端にＬ−９複合分子が複合されたセンス鎖Ｓであることが示された。
【０４１４】
（１−３）複合体１〜３のアンチセンス鎖の合成
（１−３Ａ）複合体１のアンチセンス鎖の調製
固相ホスホルアミダイト法により、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ  ｌｏａｄｅｄ  ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を出発として循環させ、複合体１のアンチセンス鎖ＡＳを合成した。固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩条件は、センス鎖の合成と同じである。
【０４１５】
検出：イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）を用いて純度を検出したところ、９３．１％であった。液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分子量を分析したところ、理論値６９２０．１７、実測値６９１９．９であった。実測値が理論値と一致しており、合成されたのは標的配列を有するアンチセンス鎖ＡＳであることが示された。
【０４１６】
ここで、ビニルリン酸エステルで修飾された２’−メトキシ修飾ウラシルヌクレオシドモノマー（ＶＰ−Ｕｍ）は、以下の方法に従い合成された。
【０４１７】
【化６８】
2021533800.tif 000093
【０４１８】
（１−３−１）ＶＰ−Ｕ−２の合成
以下の方法に従い、ＶＰ−Ｕ−２分子を合成した。
【０４１９】
【化６９】
2021533800.tif 000094
２’−メトキシ修飾ウラシルヌクレオシド（２’−ＯＭｅ−Ｕ、５１．３０ｇ、９１．６ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（ＴＢＤＰＳＣｌ、５０．３５ｇ、１８３．２ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１２．４７ｇ、１８３．２ｍｍｏｌ）を混合して４５０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、室温で２０ｈ攪拌反応させた。ＤＭＦを留去し、６００ｍｌのジクロロメタンで溶解した後、３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムを加えて洗浄し、水相をジクロロメタン（ＤＣＭ）で１回あたり３００ｍｌで３回抽出し、有機相を合わせ、５％シュウ酸で水相をｐＨ＜５になるまで洗浄し、乾燥させるまで溶剤を蒸発させた後、ＶＰ−Ｕ−１粗製品を得、そのまま後のＶＰ−Ｕ−２の合成に用いた。
【０４２０】
ＶＰ−Ｕ−１粗製品を１００ｍｌのジクロロメタンで溶解した後、氷浴を施して１０分間攪拌し、さらに、予め４℃の冷蔵庫で冷蔵された４５０ｍｌの２％ｐ−トルエンスルホン酸溶液（溶剤が、体積比３：７のメタノール−ジクロロメタン混合溶剤である）を加え、１０分間反応させた。さらに２００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムを加えて反応をクエンチングし、有機相に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてｐＨ＝８になるまで洗浄した。水相を合わせ、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相を合わせ、さらに２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させるまで溶剤を蒸発させた。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．０５〜１：１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて計４０．００ｇの純粋なＶＰ−Ｕ−２を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９６  （ｄ，Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，１Ｈ），７．６４  （ｄｔｄ，Ｊ  ＝  ５．１，４．０，２．２  Ｈｚ，４Ｈ），７．４１−７．３０  （ｍ，６Ｈ），６．７９  （ｄ，Ｊ  ＝  ４．７  Ｈｚ，１Ｈ），５．７３  （ｄ，Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，１Ｈ），４．９４  （ｔ，Ｊ  ＝  ７．０  Ｈｚ，１Ｈ），４．１２  （ｔｄ，Ｊ  ＝  ４．６，３．９  Ｈｚ，１Ｈ），４．０５  （ｄｄ，Ｊ  ＝  ４．８、４．０  Ｈｚ，１Ｈ），３．９６  （ｔ，Ｊ  ＝  ４．７  Ｈｚ，１Ｈ），３．６８  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝  １１．８，７．０，４．６  Ｈｚ，１Ｈ），３．５７  −  ３．４６  （ｍ，１Ｈ），３．３９  （ｓ，３Ｈ），１．０５  （ｓ，８Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２６Ｈ３３Ｎ２Ｏ６Ｓｉ，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４９７．２１、実測値：４９７．４５。
【０４２１】
（１−３−２）ＶＰ−Ｕ−４の合成：
【０４２２】
【化７０】
2021533800.tif 000095
ＶＰ−Ｕ−２（１９．８４ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、１６．４８ｇ、８０．０ｍｍｏｌ）、ピリジン（４．２０ｇ、５３．２ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（６．６１ｇ、５３．２ｍｍｏｌ）を混合して２００ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、室温で２０ｈ攪拌反応させた。別に、メチレンジホスホン酸テトラエチル（２１．４４ｇ、７４．４ｍｍｏｌ）を１２０ｍｌのＴＨＦに溶解させ、氷浴で降温させ、氷浴温度でｔ−ＢｕＯＫ（１１．３６ｇ、１０１．２ｍｍｏｌ）を加え、氷浴温度で１０ｍｉｎ反応させた後、室温まで昇温して０．５ｈ反応させ、その後、約１ｈかけて前述した反応液に加え、氷浴温度で１ｈ反応させた後、室温まで昇温して１８ｈ反応させた。水を加えて反応をクエンチングし、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出した。有機相を合わせ、２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄した後乾燥させるまで溶剤を蒸発させた。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル＝１：１〜１：４で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて計１４．００ｇの純粋なＶＰ−Ｕ−４を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９６  （ｄ，Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，１Ｈ），７．６４  （ｄｔｄ，Ｊ  ＝  ５．１，４．０，２．２  Ｈｚ，４Ｈ），７．４１  −  ７．３０  （ｍ，６Ｈ），６．８２  −  ６．７１  （ｍ，２Ｈ），５．９０  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝  ２５．９、１５．０，１．０  Ｈｚ，１Ｈ），５．７３  （ｄ，Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，１Ｈ），４．３６  −  ４．２１  （ｍ，３Ｈ），４．１８  （ｔ，Ｊ  ＝  ４．９  Ｈｚ，１Ｈ），４．０５  （ｄｄｑ，Ｊ  ＝  ９．７，８．５，６．９  Ｈｚ，２Ｈ），３．８７  （ｔ，Ｊ  ＝  ４．８  Ｈｚ，１Ｈ），３．３９  （ｓ，３Ｈ），１．３２  （ｔｄ，Ｊ  ＝  ６．９，０．７  Ｈｚ，６Ｈ），１．０５  （ｓ，８Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ３１Ｈ４２Ｎ２Ｏ８ＰＳｉ，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：６２９．２４、実測値：６２９．５１。
【０４２３】
（１−３−３）ＶＰ−Ｕ−５の合成：
【０４２４】
【化７１】
2021533800.tif 000096
ＶＰ−Ｕ−４（１４．００ｇ、２２．２９ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのテトラヒドロフランに溶解させ、トリエチルアミン三フッ化水素酸（１７．９６ｇ、１１１．４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０ｈ攪拌して完全に反応させた。そのまま乾燥させるまで溶剤を蒸発させ、５０ｍｌのジクロロメタンで溶解した後で蒸発乾固する操作を２回繰り返し、粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．０５〜１：１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて計６．７０ｇの純粋なＶＰ−Ｕ−５を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９６  （ｄ，Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，１Ｈ），６．７７  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １５．０，６．２  Ｈｚ，１Ｈ），５．９９  −  ５．８２  （ｍ，２Ｈ），５．７３  （ｄ，Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，１Ｈ），５．２７  （ｄ，Ｊ  ＝  ５．１  Ｈｚ，１Ｈ），５．１０  （ｄｄ，Ｊ  ＝  ５．３，４．７  Ｈｚ，１Ｈ），４．２９  （ｄｄｑ，Ｊ  ＝  ９．８，８．６，７．０  Ｈｚ，２Ｈ），４．１７  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝  ６．２，５．２，１．０  Ｈｚ，１Ｈ），４．１２  −  ３．９８  （ｍ，３Ｈ），３．３９  （ｓ，２Ｈ），１．３２  （ｔｄ，Ｊ  ＝  ６．９，０．６  Ｈｚ，６Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１５Ｈ２４Ｎ２Ｏ８Ｐ，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：３９１．１３、実測値：３９１．３８。
【０４２５】
（１−３−４）ＶＰ−Ｕ−６の合成：
【０４２６】
【化７２】
2021533800.tif 000097
アルゴン保護条件で１０ｍｌの無水ジクロロメタンにＶＰ−Ｕ−５（３９１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ピリジントリフルオロアセテート（０．２３２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイミダゾール（０．０９９ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ビス（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィン（０．４５２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を留去し、カラムクロマトグラフィーにより精製し（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン：アセトニトリル（０．５ｗｔ％トリエチルアミンを含む）＝３：１〜１：３で勾配溶出した）、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計５０８ｍｇの目的生成物ＶＰ−Ｕ−６を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６１  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １５０．３４，１５０．２９，１７．０７，１５．５０．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ４１Ｎ４Ｏ９Ｐ２，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：５９１．２３、実測値：５９１．５５。ＶＰ−Ｕ−６が目的生成物ＶＰ−Ｕｍであり、ヌクレオシドモノマーとしてＲＮＡ鎖の合成に関与することを示した。
【０４２７】
（１−３Ｂ）複合体２のアンチセンス鎖の調製
複合体２のアンチセンス鎖と複合体１のアンチセンス鎖の区別は、５’−末端の１番目のヌクレオチド修飾が異なることのみにあった。固相ホスホルアミダイト法によりアンチセンス鎖を調製する場合、最後に結合されたヌクレオシドモノマーが２’−メトキシ修飾ウラシルヌクレオシドモノマー（Ｕｍ）であり、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行ってＣＰＲ−Ｉモノマー（蘇州吉瑪、番号Ｃａｔ＃１３−２６０１−ＸＸ）をアンチセンス鎖の５’末端に結合し、５’−リン酸エステル修飾を形成した。
【０４２８】
【化７３】
2021533800.tif 000098
【０４２９】
合成において用いられた汎用の固相担体、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩条件は、センス鎖の合成と同じである。
【０４３０】
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）により純度を検出したところ、９９．０％であった。液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分子量を分析したところ、理論値６９２４．４３、実測値６９２４．０であった。実測値が理論値と一致しており、合成されたのは標的配列を有するアンチセンス鎖ＡＳであることが示された。
【０４３１】
（１−３Ｃ）複合体３のアンチセンス鎖の調製
ＣＰＲ−Ｉモノマーを結合する場合、上記酸化反応条件の代わりに硫化反応条件を用いたこと以外、複合体２のアンチセンス鎖と同じ合成プロセスを採用した。５’−チオリン酸エステル修飾を有する複合体３のアンチセンス鎖を製造できると期待される。
【０４３２】
（１−４）複合体１と複合体２の合成
複合体１に対して、Ｓ鎖とＡＳ鎖をそれぞれ注射用水に溶解させ、４０ｍｇ／ｍＬの溶液を得、等モル比で混合し、５０℃で１５ｍｉｎ加熱し、室温で冷却した後、これらを水素結合により二本鎖構造を形成させた。超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ超純水装置で自作、抵抗率１８．２ＭΩ＊ｃｍ（２５℃））を用いて複合体を濃度が０．２ｍｇ／ｍＬになるまで希釈した後、液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。その結果、理論値Ｓ：７６２７．５、ＡＳ：６９２０．１７、実測値Ｓ：７６２６．９、ＡＳ：６９２０．１であり、実測値が理論値と一致しており、合成された複合体１が、Ｌ−９複合分子を含む目的設計の二本鎖核酸配列であることが示された。
【０４３３】
複合体２について、同じ方法により調製し、分子量を検出した。その結果、理論値Ｓ：７６２７．５、ＡＳ：６９２４．４３、実測値Ｓ：７６２６．５、ＡＳ：６９２３．４であり、実測値が理論値と一致しており、合成された複合体２が、Ｌ−９複合分子を含む目的設計の二本鎖核酸配列であることが示された。
【０４３４】
複合体１と複合体２の構造は、式（４０３）に示すとおりである。
【０４３５】
（調製例２）複合体４〜１２及び比較複合体１の調製
１）前記ｓｉＲＮＡが、それぞれ表３に示される複合体４〜１２及び比較複合体１に対応する配列であり、２）標的配列に未修飾ヌクレオチドが含まれる場合、切断と脱保護条件で、アンモニア水により処理した後、一本鎖核酸の量に対して、０．４ｍｌ／μｍｏｌのＮ−メチルピロリドンにより製品を溶解させた後、０．３ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン及び０．６ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボースにおける２’−ＴＢＤＭＳ保護を除去したこと以外、調製例１と同じ方法により、表題複合体を製造できると期待される。
【０４３６】
表題複合体に複合されたｓｉＲＮＡの配列は、表３に示すとおりである。比較複合体１に含まれるｓｉＲＮＡは、ＨＢＶ遺伝子に対して抑制作用のない陰性対照ｓｉＲＮＡである。
【０４３７】
【表３】
2021533800.tif 000099
2021533800.tif 000100
【０４３８】
（調製例３）Ｐ１０−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体１３）の調製
（３−１）Ｐ−１０化合物の合成
以下の方法に従い、Ｐ−１０化合物を合成した。
【０４３９】
【化７４】
2021533800.tif 000101
【０４４０】
（３−１−１）ＧＡＬ５−Ｃ４−１の合成
４０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに上記（１−１−１）に記載された方法により得られたＧＡＬ−５（１３．４３ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、４−アミノ酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル塩酸塩（５．８７ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１３．６５ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１１．６３ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）を加え、均一に溶解させた後に室温で５時間攪拌反応させた。反応液に３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相を合わせ、２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相を分離し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去して油ポンプで乾燥させるまで吸引濾過し、３０．３ｇの油状物粗製品ＧＡＬ５−Ｃ４−１を得、そのまま次の反応を行った。
【０４４１】
（３−１−２）ＧＡＬ５−Ｃ４−２の合成
工程（３−１−１）で得られたＧＡＬ５−Ｃ４−１粗製品（３０．３ｇ、３０ｍｍｏｌ）を１８０ｍｌギ酸に溶解させ、室温で１６時間攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を蒸発させ、カラムクロマトグラフィーにより精製し（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出した）、反応溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計１４．８４ｇの目的生成物ＧＡＬ５−Ｃ４−２を得た。
【０４４２】
（３−１−３）Ｐ−６の合成：
工程（１−１−４）に記載された方法により得られたＭ−１８−Ｔｒ（２．０２ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）と工程（３−１−２）で得られたＧＡＬ５−Ｃ４−２（８．２４ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ、２バッチの生成物を合わせたもの）を混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにＮ−メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．９６ｍｍｏｌ）を加え、最後に４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ攪拌反応させた。２０ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して計８．２７ｇの純粋なＰ−６を得た。
【０４４３】
（３−１−４）Ｐ−７の合成：
上記（３−１−３）で得られたＰ−６（６．８２ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、さらに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しｐＨ＝７〜８になるように調節し、水相をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで６回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルで精製し、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計４．８２ｇのＰ−７を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ７８Ｈ１２７Ｎ１０Ｏ３３，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７３２．９１、実測値：１７３５．７３。
【０４４４】
（３−１−５）Ｐ−８の合成：
【０４４５】
【化７５】
2021533800.tif 000102
Ｐ−７（２．６５３ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）とＡ−１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を混合して１６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）（１．３７５ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２ｈ攪拌反応させた。１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５〜１：１：１：０．６で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計２．７９３ｇの純粋なＰ−８を得た。
【０４４６】
（３−１−６）Ｐ−９の合成：
Ｐ−８（４９０ｍｇ、０．２３１ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（６９ｍｇ、０．６９３ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、６８ｍｇ、０．５５４ｍｍｏｌ）を混合して２．３ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１４９ｍｇ、１．１５５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２１ｈ攪拌反応させた。５０ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、さらに１００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩を加えて反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、有機相を合わせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、８０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計２００ｍｇの純粋なＰ−９複合分子を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１０６Ｈ１５３Ｎ１０Ｏ４１，［Ｍ−ＤＭＴｒ］＋、理論値：１９２１．０５、実測値：１９２０．９７。
【０４４７】
（３−１−７）Ｐ−１０の合成
Ｌ−９複合分子の代わりにＰ−９複合分子を用い、固相担体に結合されたＰ−９複合分子を得たこと以外、調製例１における工程（１−１−９）と同じ方法により、Ｐ−１０を調製した。
【０４４８】
（３−２）Ｐ１０−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体の合成
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＰ−１０化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）〜（１−４）と同じ方法により、複合体１３を調製した。式（４０４）に示す構造のＰ１０−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると期待される。
【０４４９】
（調製例４）Ｒ５−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体１４）の調製
（４−１）Ｒ−５化合物の合成
以下の方法に従い、Ｒ−５化合物を合成した。
【０４５０】
【化７６】
2021533800.tif 000103
【０４５１】
（４−１−１）ＧＡＬ−Ｃ７−１の合成
工程（１−１−１ｂ）に記載された方法により得られたＧＡＬ−３（２６．４ｇ、８０．２ｍｍｏｌ）を１３４ｍｌの無水１，２−ジクロロエタンに溶解させ、６０ｇの４Å分子篩粉を加え、さらに７−オクテン−１−オール（１１．３ｇ、８８．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間攪拌反応させ、氷浴下で窒素保護下でトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（８．９ｇ、４０．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間攪拌反応させた。４Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に５００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて洗浄し、有機相を分離し、水相を１００ｍｌのジクロロメタンで１回抽出し、有機相を合わせ、２５０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去して油ポンプで乾燥させるまで吸引濾過し、３３．３ｇの黄色水飴状製品ＧＡＬ−Ｃ７−１を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
【０４５２】
（４−１−２）ＧＡＬ−Ｃ７−２の合成
工程（４−１−１）で得られたＧＡＬ−Ｃ７−１（３３．３ｇ、７２．８ｍｍｏｌ）を１６０ｍｌのジクロロメタンと１６０ｍｌのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ２１６ｍｌの水及び固形過ヨウ素酸ナトリウム（６２．３ｇ、２９１．２ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴下で１０分間攪拌し、触媒である塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（４９８ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を加えて自然に室温まで昇温し２３時間攪拌反応させた。反応液に２００ｍｌの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨを７．５に調節し、有機相を分離し、水相をジクロロメタンで３回抽出し、有機相を捨て、水相を固形クエン酸でｐＨを約３に調節し、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後でカラムクロマトグラフィー（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出した）により精製して２２．４ｇの白色泡状固形製品ＧＡＬ−Ｃ７−２を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２１Ｈ３２ＮＯ１１，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４７６．５０、実測値：４７５．９４。
【０４５３】
（４−１−３）Ｒ−１の合成：
工程（１−１−４）に記載された方法により得られたＭ−１８−Ｔｒ（２．０２ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）とＧＡＬ−Ｃ７−２（７．３６ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにＮ−メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．９６ｍｍｏｌ）を加え、最後に４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ攪拌反応させた。２００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、１００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、１００ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して７．８２ｇの純粋なＲ−１を得た。
【０４５４】
（４−１−４）Ｒ−２の合成：
Ｒ−１（６．２３ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しｐＨ＝７〜８になるように調節し、水相をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで６回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して４．４９ｇの純粋なＲ−２を得た。
【０４５５】
（４−１−５）Ｒ−３の合成：
Ｒ−２（２．３９１ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）とＡ−１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を混合して１６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）（１．３７５ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２ｈ攪拌反応させた。１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５〜１：１：１：０．６で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して２．６４２ｇの純粋なＲ−３を得た。
【０４５６】
（４−１−６）Ｒ−４の合成：
Ｒ−３（７９５ｍｇ、０．４０７４ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（８２ｍｇ、０．８１４８ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１００ｍｇ、０．８１４８ｍｍｏｌ）を混合して４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１００ｍｇ、０．８１４８ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１８ｈ攪拌反応させた。５ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相を合わせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、３０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して５０５ｍｇの純粋なＲ−４複合分子を得た。
【０４５７】
（４−１−７）Ｒ−５の合成：
Ｌ−９複合分子の代わりにＲ−４複合分子を用い、固相担体に結合されたＲ−４複合分子を得たこと以外、調製例１における工程（１−１−９）と同じ方法により、Ｒ−５を調製した。
【０４５８】
（４−２）Ｒ５−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体の合成
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＲ−５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）〜（１−４）と同じ方法により、複合体１４を調製した。式（４０７）に示す構造のＲ５−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると期待される。
【０４５９】
（調製例５）ＬＡ５−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体１５）の調製
以下のプロセス経路により、ＬＡ−５化合物を合成できると期待される。
【０４６０】
【化７７】
2021533800.tif 000104
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＬＡ−５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）〜（１−４）と同じ方法により、複合体１５を調製した。式（４１２）に示す構造のＬＡ５−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると期待される。
【０４６１】
（調製例６）ＬＢ５−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体１６）の調製
（６−１）ＬＢ−５化合物の合成
以下の方法に従い、ＬＢ−５化合物を合成した。
【０４６２】
【化７８】
2021533800.tif 000105
【０４６３】
（６−１−１）ＬＢ−１の合成：
工程（１−１−６）に記載された方法により得られたＬ−８（５．０ｇ、３．３８６ｍｍｏｌ）、アジピン酸無水物（８７０ｍｇ、６．７７２ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、８２７ｍｇ、６．７７２ｍｍｏｌ）を混合して１３０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、２．２ｇ、１６．９３１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で４ｈ攪拌反応させた。７０ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで４回抽出し、有機相を合わせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．２〜１：１：１：１で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して４．２６７ｇの純粋なＬＢ−１を得た。
【０４６４】
（６−１−２）ＬＢ−２の合成：
工程（６−１−１）に記載された方法により得られたＬＢ−１（４．６９７ｇ、２．７５３ｍｍｏｌ、２バッチの生成物を合わせたもの）、３−アミノ−１，２−プロパンジオール（３１３ｍｇ、３．４４２ｍｍｏｌ）、４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、９５３ｍｇ、３．４４２ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（７００ｍｇ、６．８８４ｍｍｏｌ）を順に３０ｍｌのアセトニトリルと３ｍｌのメタノールの混合液に加え、室温で一晩攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を蒸発させ、カラムクロマトグラフィー（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルをジクロロメタン：メタノール＝１：０．０７〜１：０．５で勾配溶出した）により精製し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、３．２７ｇの目的生成物ＬＢ−２を得た。
【０４６５】
（６−１−３）ＬＢ−３の合成：
ＬＢ−２（２．２７ｇ、１．３５３ｍｍｏｌ）を１４ｍｌの無水ピリジンで溶解させた。さらに４，４’−ビスメトキシトリチルクロリド（６８８ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩攪拌反応させた。１５０ｍｌのメタノールを加えてクエンチングし、乾燥させるまで溶剤を蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルをジクロロメタン：メタノール＝１：０．０５〜１：０．２で勾配溶出した）により精製し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、１．６４７ｇの目的生成物ＬＢ−３を得た。
【０４６６】
（６−１−４）ＬＢ−４の合成：
ＬＢ−３（８２２ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（８３ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１０２ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を混合して４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにＤＩＰＥＡ（２７０ｍｇ、２．０７５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で一晩攪拌反応させた。０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を３回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり２ｍｌで３回抽出し、有機相を合わせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、５ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、石油エーテルでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：２０で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して７８７ｍｇの純粋なＬＢ−４複合分子を得た。
【０４６７】
（６−１−５）ＬＢ−５の合成：
Ｌ−９複合分子の代わりにＬＢ−４複合分子を用い、固相担体に結合されたＬＢ−４複合分子を得たこと以外、調製例１における工程（１−１−９）と同じ方法により、ＬＢ−５を調製した。
【０４６８】
（６−２）ＬＢ５−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体の合成
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＬＢ−５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）〜（１−４）と同じ方法により、複合体１６を調製した。式（４１３）に示す構造のＬＢ５−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると期待される。
【０４６９】
（調製例７）Ｖ８−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体１７）の合成
以下のプロセス経路により、Ｖ−８化合物を合成できると期待される。
【０４７０】
【化７９】
2021533800.tif 000106
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＶ−８化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）〜（１−４）と同じ方法により、複合体１７を調製した。式（４１４）に示す構造のＶ８−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると期待される。
【０４７１】
（調製例８）Ｗ８−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体１８）の調製
（８−１）Ｗ−８化合物の合成
以下の方法に従い、Ｗ−８化合物を合成した。
【０４７２】
【化８０】
2021533800.tif 000107
【０４７３】
（８−１−１）Ｗ−１の合成：
Ｗ−０（２．０２４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を２５ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにトリエチルアミン（４．０４８ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴で０℃程度まで冷却し、トリフルオロ酢酸エチル（５．６８３ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２２ｈ反応させた。溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで１８ｈ発泡乾燥させ、５．８３５ｇの固形粗製品Ｗ−１を得た。
【０４７４】
（８−１−２）Ｗ−２の合成：
Ｗ−１粗製品（５．８３５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、反応液にＴｒＣｌ（３．３４５ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５１８ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０ｈ攪拌反応させた。２０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで反応液を２回洗浄し、２０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に有機溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、８．０１２ｇの固形粗製品Ｗ−２を得た。処理されることなく、次の脱保護反応を行った。
【０４７５】
（８−１−３）Ｗ−３の合成：
Ｗ−２粗製品（８．０１２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのメタノールに溶解させ、さらに１００ｍｌのメチルアミン水溶液（４０ｗｔ％）を加え、５０℃で２３ｈ攪拌反応させた。不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固し、２００ｍｌの体積比１：１のＤＣＭ−メタノール混合溶剤を加え、５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５０ｍｌで３回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０５〜１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて３．０６２ｇの純粋なＷ−３を得た。
【０４７６】
（８−１−４）Ｗ−４の合成：
Ｗ−３（０．６７５ｇ、１．５１７ｍｍｏｌ）とＧＡＬ−Ｃ７−２（２．６０ｇ、５．４６ｍｍｏｌ）を混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．５７ｇ、１２．１４ｍｍｏｌ）を加え、最後に３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、１．８１６ｇ、６．０４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２．５ｈ攪拌反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、８０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して１．６１０ｇの純粋なＷ−４を得た。
【０４７７】
（８−１−５）Ｗ−５の合成：
Ｗ−４（１．６１ｇ、０．８８６ｍｍｏｌ）を１２５ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジクロロ酢酸（３．５ｍｌ、４２．４３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１ｈ反応させた。１５０ｍｌのピリジンを加えて反応液を中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．２６ｇの純粋なＷ−５を得た。
【０４７８】
（８−１−６）Ｗ−６の合成：
Ｗ−５（１．２５ｇ、０．７９３ｍｍｏｌ）と工程（１−１−７ａ）に記載された方法により得られたＡ−１（１．２１ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を混合して１２ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、０．７１２ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（０．６１５ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３ｈ攪拌反応させた。８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、有機相を合わせ、１０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、１８５ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．１〜１：１：０．７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．５７ｇの純粋なＷ−６を得た。
【０４７９】
（８−１−７）Ｗ−７の合成：
Ｗ−６（１．２３８ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．１８９ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．２３１ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）を混合して７ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにＤＩＥＡ（０．４０７ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２４ｈ攪拌反応させた。５ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相を合わせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、３０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．０３３ｇの純粋なＷ−７複合分子を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１０１Ｈ１４６Ｎ７Ｏ３８，［Ｍ−ＤＭＴｒ］＋、理論値：１７６３．９２、実測値：１７６３．２１。
【０４８０】
（８−１−８）Ｗ−８の合成：
Ｌ−９複合分子の代わりにＷ−７複合分子を用い、固相担体に結合されたＷ−７複合分子を得たこと以外、調製例１における工程（１−１−９）と同じ方法により、Ｗ−８を調製した。
【０４８１】
（８−２）Ｗ８−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体の合成
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＷ−８化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）〜（１−４）と同じ方法により、複合体１８を調製した。式（４１５）に示す構造のＷ８−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると期待される。
【０４８２】
（調製例９）Ｘ８−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体１９）の調製
以下のプロセス経路により、Ｘ−８化合物を合成できると期待される。
【０４８３】
【化８１】
2021533800.tif 000108
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＸ−８化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）〜（１−４）と同じ方法により、複合体１９を調製した。式（４２１）に示す構造のＸ８−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると期待される。
【０４８４】
（調製例１０）Ｚ５−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体２０）の調製
（１０−１）Ｚ−５化合物の合成
以下の方法に従い、Ｚ−５化合物を合成した。
【０４８５】
【化８２】
2021533800.tif 000109
【０４８６】
（１０−１−１）Ｚ−１の合成：
工程（８−１−３）に記載された方法により得られたＷ−３（１．５０ｇ、３．３７ｍｍｏｌ）と工程（３−１−２）に記載された方法により得られたＧＡＬ５−Ｃ４−２（７．１８ｇ、１３．４８ｍｍｏｌ）を混合して３４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（３．４８ｇ、２６．９６ｍｍｏｌ）を加え、最後に３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、４．０４ｇ、１３．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で４．５ｈ攪拌反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、８０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝３０：１〜１５：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して３．９７ｇの純粋なＺ−１を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ９８Ｈ１４３Ｎ１０Ｏ３３，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１９８７．９８、実測値：１９８７．９０。
【０４８７】
（１０−１−２）Ｚ−２の合成：
Ｚ−１（３．９７ｇ、２．００ｍｍｏｌ）を２５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジクロロ酢酸（１０．９４１ｇ、８４．８５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１ｈ反応させた。ピリジンを加えて反応液を中性に中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルをカラムに入れ、１０％ピリジンでシリカゲルの酸性を中和し、１‰ピリジンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１０：１〜２：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して３．４９ｇの純粋なＺ−２を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ７９Ｈ１２９Ｎ１０Ｏ３３，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７４６．９４、実測値：１７４６．９０。
【０４８８】
（１０−１−３）Ｚ−３の合成：
Ｚ−２（３．４９ｇ、２．０ｍｍｏｌ）と工程（１−１−７ａ）に記載された方法により得られたＡ−１（３．０６ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を混合して３０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、１．８０ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．５５ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３ｈ攪拌反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を１回あたり３０ｍｌで２回洗浄し、水相を１０ジクロロメタンで抽出し、有機相を合わせ、５０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を合わせ無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、２００ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝２５：１〜１５：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して２．２ｇの純粋なＺ−３を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１０３Ｈ１５１Ｎ１０Ｏ３８，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：２１３６．０２、実測値：２１３６．２０。
【０４８９】
（１０−１−４）Ｚ−４の合成：
Ｚ−３（２．１０ｇ、０．９８３ｍｍｏｌ）をＤＩＥＡ（０．６３５ｇ、４．９１５ｍｍｏｌ）を含む１４．８ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、２４０ｍｇ、１．９６６ｍｍｏｌ）を加え攪拌して清澄させた後、コハク酸無水物（１９７ｍｇ、１．９６６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１８ｈ攪拌反応させた。５０ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、８０ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５０ｍｌで２回抽出し、有機相を合わせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、１８８ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１０：１〜３：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．９５ｇの純粋なＺ−４複合分子を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１０７Ｈ１５５Ｎ１０Ｏ４１，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１９３５．０７、実測値：１９３５．２９。
【０４９０】
（１０−２）Ｚ−５の合成
Ｌ−９複合分子の代わりにＺ−４複合分子を用い、固相担体に結合されたＺ−４複合分子を得たこと以外、調製例１における工程（１−１−９）と同じ方法により、Ｚ−５を調製した。
【０４９１】
（３−２）Ｚ５−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体の合成
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＺ−５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）〜（１−４）と同じ方法により、複合体２０を調製した。式（４２２）に示す構造のＺ５−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると期待される。
【０４９２】
（調製例１１）Ｋ４−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体（比較複合体２）の調製
（１１−１）Ｋ−４化合物の合成
以下の方法に従い、Ｋ−４化合物を合成した。
【０４９３】
【化８３】
2021533800.tif 000110
【０４９４】
（１１−１−１）Ｋ−１の合成：
６０ｍｌのジクロロメタンに、工程（１−１−７ａ）に記載された方法により得られたＡ−１（３．０ｇ、６．０ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（６．２ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１．６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、３．９ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間攪拌反応させた後、上記溶液をＫ−０（５．６ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）に加え、室温で１時間５０分間反応させた。反応液を３０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液に入れ、水相をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで３回抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後に濾過濃縮した。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製を行い、ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１０：２：０．１〜４：４：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、真空油ポンプで発泡乾燥させ、２．２ｇの白色固形製品Ｋ−１を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８．０２  （ｓ，１Ｈ），７．４３  （ｄ，Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，２Ｈ），７．３４  −  ７．１７  （ｍ，７Ｈ），６．８７  （ｄ，Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ，４Ｈ），４．０５  （ｄ，Ｊ  ＝  ５．２  Ｈｚ，１Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．２０  −  ３．０１  （ｍ，５Ｈ），２．６０  −  ２．３８  （ｍ，１２Ｈ），１．６０  −  １．３９  （ｍ，８Ｈ），１．２４  （ｓ，１Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ３３Ｈ４７Ｎ４Ｏ５、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論：５７９．３５、実測：５７９．２６。
【０４９５】
（１１−１−２）Ｋ−２の合成：
３ｍｌのジクロロメタンに、（１−１−１）に記載された方法により得られたＧＡＬ−５（４８３ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（３５９ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、３１０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した後、Ｋ−１（１７４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間反応させた。反応液を１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液に入れ、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、有機相を合わせ、１０ｍｌの飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後に濾過濃縮した。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製を行い、ジクロロメタン：メタノール＝２０：１で溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、真空油ポンプで乾燥発泡させ、２０５ｍｇの黄色固形製品Ｋ−２を得た。
【０４９６】
（１１−１−３）Ｋ−３の合成：
１．１ｍｌのジクロロメタンに、Ｋ−２（２０５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（２２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、２７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、７１ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌反応させた。反応液を０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩溶液で１回あたり０．５ｍｌで３回洗浄し、洗浄するたびに水相をジクロロメタン０．５ｍｌで１回逆抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を濃縮除去し、真空油ポンプで乾燥発泡させ、２１８ｍｇの薄黄色固形製品Ｋ−３複合分子を得た。
【０４９７】
（１１−１−４）Ｋ−４の合成：
Ｌ−９複合分子の代わりにＫ−３複合分子を用い、固相担体に結合されたＫ−３複合分子を得たこと以外、調製例１における工程（１−１−９）と同じ方法により、Ｋ−４を調製した。
【０４９８】
（１１−２）Ｋ４−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体の合成
Ｌ−１０化合物の代わりにＫ−４化合物を出発としてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）〜（１−４）と同じ方法により、比較複合体２を調製した。式（４２３）に示す構造のＫ４−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると期待される。
【０４９９】
【化８４】
2021533800.tif 000111
ただし、Ｎｕは、Ｋ４−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体におけるｓｉＲＮＡである。
【０５００】
（調製例１２）ｓｉＲＮＡの調製
通常の固相合成方法によって。表４に示した本開示により提供されるｓｉＲＮＡ配列を得て、ＤＥＰＣ水で等モルのセンス鎖とアンチセンス鎖の混合物を溶解させた後、通常のアニールを行ってｓｉＲＮＡ二本鎖を形成した。
【０５０１】
【表４】
2021533800.tif 000112
【０５０２】
表４において、ｓｉＲＮＡ１〜４は、本開示の、ＨＢＶのＰ遺伝子領域を特異的に標的するｓｉＲＮＡであり、ＮＣは、ＨＢＶ遺伝子に対して抑制作用のない陰性対照ｓｉＲＮＡである。
【０５０３】
上記本開示のｓｉＲＮＡ又は複合体の調製を完成した後、標準的な手法により凍結乾燥して固形粉末とし、保存して使用に備えた。使用時には、例えば注射用水、生理食塩水（ＮＳ）、リン酸緩衝液（ＰＢ）又はリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）等で新たに溶解させて所望の濃度の溶液として用いる。
【０５０４】
（実験例１）ｓｉＲＮＡ複合体の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性及びオフターゲット活性
本実験例に用いられるＨＥＫ２９３Ａ細胞は、北京大学分子医学研究所核酸技術実験室により提供され、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び０．２体積％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）で細胞を培養し、３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。
【０５０５】
本実験例では、複合体２の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）及びオフターゲット効果を調べた。
【０５０６】
Ｋｕｍｉｃｏ  Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ．ａｌ．、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ＤＮＡ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ：ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｗｉｔｈ  ａ  ＤＮＡ  ｓｅｅｄ  ａｒｍ  ｉｓ  ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８．３６（７），２１３６−２１５１に記載された方法により、検出プラスミドを構築し、被評価ｓｉＲＮＡ複合体と共にＨＥＫ２９３Ａ細胞にコトランスフェクションさせ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルにより、ｓｉＲＮＡ複合体のオンターゲット活性及びオフターゲット効果を反映した。具体的な工程は以下のとおりである。
【０５０７】
［１］検出プラスミドの構築
ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ−２（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ）プラスミドにより４つの組換えプラスミドを構築した。そのうち、ＧＳＣＭは、オンターゲットプラスミドを表し、ＰＳＣＭ、ＧＳＳＭ、ＰＳＳＭは、オフターゲットプラスミドを表す。
（１）ＧＳＣＭは、複合体２におけるアンチセンス鎖の５’端から２〜１９位のヌクレオチド配列と完全に相補的な標的配列を含む。ＧＳＣＭは、アンチセンス鎖のオンターゲット活性を検出するために用いられる。
（２）ＰＳＣＭは、複合体２におけるセンス鎖の５’端から１〜１８位のヌクレオチド配列と完全に相補的な標的配列を含む。ＰＳＣＭは、センス鎖のオフターゲット活性を検出するために用いられる。
（３）ＧＳＳＭは、複合体２におけるアンチセンス鎖の５’端から２〜８位のヌクレオチド配列と完全に相補的であり、残部が複合体２におけるアンチセンス鎖の５’端から９〜２１位のヌクレオチド配列に対応し、その配列が全く相補的ではない、即ち、複合体２におけるアンチセンス鎖の５’端から９〜２１位のいずれかのヌクレオチドがＧ、Ｃ、Ａ又はＵである場合、標的配列における対応する位置のヌクレオチドがそれぞれＴ、Ａ、Ｃ又はＧである標的配列を含む。ＧＳＳＭは、アンチセンス鎖のシード領域のオフターゲット活性を検出するために用いられる。
（４）ＰＳＳＭは、複合体２におけるセンス鎖の５’端から１〜８位のヌクレオチド配列と完全に相補的であり、残部が複合体２におけるセンス鎖の５’端から９〜１９位のヌクレオチド配列に対応し、その配列が全く相補的ではない、即ち、複合体２におけるセンス鎖の５’端から９〜１９位のいずれかのヌクレオチドがＧ、Ｃ、Ａ又はＵである場合、標的配列における対応する位置のヌクレオチドがそれぞれＴ、Ａ、Ｃ又はＧである標的配列を含む。ＰＳＳＭは、センス鎖のシード領域のオフターゲット活性を検出するために用いられる。
【０５０８】
上記各標的配列は、いずれも蘇州吉瑪でカスタマイズされており、配列情報は表５に示すとおりである。
【０５０９】
【表５】
2021533800.tif 000113
【０５１０】
標的配列をｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ−２プラスミドのＸｈｏ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ部位にクローニングした。
【０５１１】
［２］トランスフェクション
９６ウェルプレートに、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の使用説明書により、それぞれｓｉＲＮＡ複合体と、プラスミドごとに若干群の特定の濃度の複合体２が対応している上記各プラスミドをコトランスフェクションした。プラスミドをウェルあたり１０ｎｇずつトランスフェクションし、０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００を用いた。ＧＳＣＭオンターゲットプラスミドについて、複合体２の最終濃度（ｓｉＲＮＡの濃度として算出）が１ｎＭから、０．０００９７７ｎＭまで１１個の濃度に倍加希釈した。他の３個のオフターゲットプラスミドについて、複合体２の最終濃度が１０ｎＭから、０．００００３８ｎＭまで１０個の濃度に４倍希釈した。各群では、ｓｉＲＮＡ複合体処理なしを対照とした。１群あたり３個の複製ウェルがあった。
【０５１２】
［３］検出
２４時間コトランスフェクションした後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット（Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、ｃａｔ．Ｅ２９４０）を用い、使用明細書によりＨＥＫ２９３Ａ細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。ホタルルシフェラーゼタンパク質レベルに対するウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レベルで標準化した。異なるｓｉＲＮＡ濃度で測定された活性結果から、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ５．０ソフトウェアｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）  ｖｓ．  ｒｅｓｐｏｎｓｅ−Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ機能により用量−効果曲線をフィッティングし、用量−効果曲線から複合体２のＧＳＣＭを標的したＩＣ５０値を算出した。
【０５１３】
【数１】
2021533800.tif 000114
式中、
Ｙは、残存ｍＲＮＡの発現レベルであり、
Ｘは、トランスフェクションｓｉＲＮＡ複合体の濃度の対数値であり、
Ｂｏｔは、定常期の最低のＹ値であり、
Ｔｏｐは、定常期の最高のＹ値であり、
ＬｏｇＩＣ５０は、Ｙが最低と最高との間の半分にある場合のＸ値であり、ＨｉｌｌＳｌｏｐｅは、曲線の傾きである。
【０５１４】
その結果から、ＧＳＣＭに対応して、複合体２のＩＣ５０が０．０５１３ｎＭ（Ｒ２＝０．９９１１）であり、ＰＳＣＭ、ＧＳＳＭ、ＰＳＳＭに対応して、複合体２は、ｓｉＲＮＡの各濃度でいずれも明らかな抑制効果が認められなかったことが示され、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高い活性を有するとともに、さらに低いオフターゲット効果を有することが証明された。
【０５１５】
（実験例２）ｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
本実験例に用いられる陰性対照ｓｉＲＮＡ配列は、以下のとおりである。
センス鎖：５’−ＣｍＣｍＵｍＵｍＧＡＧＧＣｍＡＵｍＡＣｍＵｍＵｍＣｍＡＡＡｄＴｓｄＴ−３’（配列番号  ９）
アンチセンス鎖：５’−ＵｆＵｍＵｆＧＡＡＧＵｆＡＵＧＣＣＵｆＣＡＡＧＧｄＴｓｄＴ−３’（配列番号  １０）
【０５１６】
当該ｓｉＲＮＡは、固相ホスホルアミダイト法により合成された。０．９％塩化ナトリウム水溶液で陰性対照及び複合体２をそれぞれ濃度２０μＭ（ｓｉＲＮＡの濃度として算出）の溶液として調製し、陰性対照及び複合体２と記した。
【０５１７】
１）マウス由来のリソソーム溶解液における安定性の検出
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製：各６μｌの複合体２及び陰性対照（２０μＭ）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、４．０８μＬの脱イオン水及び２．７２μＬのマウス由来のリソソーム溶解液（Ｒａｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒｉｔｏｓｏｍｅｓ、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社、番号Ｒ０６１０．ＬＴ、ロット番号１６１００６９）と均一に混合し、酸性ホスファターゼの最終濃度が０．２ｍＵ／μＬであった。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、１、２、４、６、２４時間でそれぞれ混合液を５μｌ取り出し、１５μＬの９Ｍ尿素溶液に加えて変性させた後、４μｌの６×試料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加え、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。０時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した直後に取り出した時点を表す。
リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：等モル量の複合体２及び陰性対照（２０μＭ）を各１．５μｌとり、それぞれ７．５μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、１μＬの脱イオン水と均一に混合し、３０μＬの９Ｍ尿素溶液を加えて変性させた後、８μＬの６×試料負荷緩衝液を加えて均一に混合し、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。陰性対照の参照サンプルをＭ１と記し、複合体２の参照サンプルをＭ２と記した。
【０５１８】
１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記試験サンプル及び参照サンプルをそれぞれ２０μｌとり、ゲルに負荷し、２０ｍＡの定電流条件で１０ｍｉｎ電気泳動した後、４０ｍＡの定電流条件で３０ｍｉｎ電気泳動し続けた。電気泳動終了後、ゲルをシェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２０３）で１０ｍｉｎ染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図１に示した。
【０５１９】
２）ヒト由来のリソソーム溶解液における安定性の検出
マウス由来のリソソーム溶解液をヒト由来のリソソーム溶解液（Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社、番号Ｈ０６１０．Ｌ、ロット番号１６１０３１６）に変更したこと以外、１）と同じ方法により陰性対照及び複合体２のヒト由来のリソソーム溶解液における安定性を検出した。結果を図２に示した。
【０５２０】
結果から明らかなように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト由来のリソソーム溶解液及びマウス由来のリソソーム溶解液のいずれにおいても、満足できる安定性を示し、少なくとも２４時間分解されずに維持することが可能である。
【０５２１】
（実験例３）ｓｉＲＮＡ複合体のＨＢＶモデルマウスにおけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率
１）本実験例では、複合体１及び複合体２のＨＢＶモデルマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／ＪにおけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を調べた。
【０５２２】
本実験例に用いられるＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊマウスは、北京大学医学部実験動物科学部から購入した。０．９％塩化ナトリウム水溶液で複合体２を濃度０．２ｍｇ／ｍｌ（ｓｉＲＮＡの濃度として算出）の溶液として調製した。０．９％塩化ナトリウム水溶液で複合体１を濃度０．２ｍｇ／ｍｌと０．０６ｍｇ／ｍｌ（ｓｉＲＮＡの濃度として算出）の溶液として調製した。
【０５２３】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原診断キット（酵素結合免疫吸着測定法）（上海科華生物）を用いてマウス血清中のＨＢｓＡｇの含有量を検出し、Ｓ／ＣＯＶ＞１０のマウスを選択し、１群あたり６匹でランダムに２群に分け（いずれも雌性）、それぞれ対照群と試験群と記した。各群の動物は、１日目に各種の薬物を投与体積５ｍＬ／ｋｇで皮下注射した。体重に応じて投与体積を算出した。ここで、対照群には生理食塩水を注射し、試験群の動物には複合体２を、１ｍｇ／ｋｇの投与量で注射した。投与後２８日目に全ての動物を死亡させ、動物に対して肉眼解剖を行い、体内臓器に病変があるか否かを観察し、目視で病変が観察された組織を１０％ホルマリンで保存し、さらに病理学的観察を行い、肝臓を回収し、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
【０５２４】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてその説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いて、蛍光定量的ＰＣＲキット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＨＢＶに対するプライマー及びＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いてそれぞれＨＢＶ及びＧＡＰＤＨを検出した。
【０５２５】
検出プライマーの配列は、表６に示すとおりである。
【０５２６】
【表６】
2021533800.tif 000115
【０５２７】
当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ｓｉＲＮＡ抑制活性は、ＨＢＶ  ｍＲＮＡ抑制率で表され、以下の等式により算出した。
ＨＢＶ  ｍＲＮＡ抑制率＝（１−ＨＢＶ遺伝子発現残量）×１００％
ＨＢＶ遺伝子発現残量＝（試験群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／試験群ＧＡＰＤＨのコピー数）／（対照群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／対照群ＧＡＰＤＨのコピー数）×１００％。
結果を以下の表７に示す。
【０５２８】
同じ方法により、異なる投与量の複合体１の体内（ｎ＝５）でのＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を検出した。結果を以下の表７に示す。
【０５２９】
【表７】
2021533800.tif 000116
【０５３０】
上記結果から分かるように、本開示の各実施例の複合体は、いずれも高いマウス体内ＨＢＶ  ｍＲＮＡ抑制活性を示した。本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、良好な体内送達効率を有することも示された。
【０５３１】
２）１）と同じ方法により、複合体３〜複合体２０の体内でのＨＢＶ  ｍＲＮＡに対する抑制効率を検出した。ｓｉＲＮＡの長さが異なり、修飾方法が類似している複合体３〜複合体１２は、高いｍＲＮＡ抑制活性を有することを期待でき、また、同じｓｉＲＮＡを含み、複合分子が類似している複合体１３〜複合体２０も、高いｍＲＮＡ抑制活性を有することを期待できる。
【０５３２】
（実験例４）ｓｉＲＮＡ複合体のＨＢＶモデルマウスにおける血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡ発現量に対する抑制効率の時間関連性試験
本実験例に用いられるＨＢＶモデルマウスＣ５７Ｂ／６Ｎ−Ｔｇ（１．２８ＨＢＶ）／Ｖｓｔ（遺伝子型Ａ）は、北京維通達生物技術有限公司から購入した。０．９％塩化ナトリウム水溶液で複合体１を濃度０．６ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌ（ｓｉＲＮＡの濃度として算出）の溶液として調製した。
【０５３３】
血清ＨＢｓＡｇの含有量が１０４ＣＯＩより大きいマウス（雌雄半々）を選択し、１群あたり６匹でランダムに３群に分け、それぞれ対照群、高投与量群及び低投与量群と記した。各群の動物は１日目に各種の薬物を投与体積５ｍＬ／ｋｇで皮下注射した。体重に応じて投与体積を算出した。全ての動物はいずれも午前に投与し、採血する必要があれば、採血後に投与した。ここで、対照群には生理食塩水を注射し、試験群の動物については、異なる投与量の複合体１を、高投与量群は３ｍｇ／ｋｇ、低投与量群は１ｍｇ／ｋｇ注射した。薬剤投与前及び薬剤投与後の７、１３、２１、２８、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６、１４０、１５４日目に、マウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡレベルを検出した。
【０５３４】
１回あたり約１００μｌ眼窩採血し、遠心後の血清は２０μｌ以上であり、ＰＢＳで再懸濁して５００μｌとし、北京迪安医学検定センターに送って血清中のＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡの含有量を検出し、それぞれＣＯＩ、ＣＯＩ、ＩＵ／ｍｌで表す。
【０５３５】
被験指標（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡ）の標準化レベルは、以下の等式により算出した。
被験指標の標準化レベル＝投与後の被験指標の残量／投与前の被験指標の含有量×１００％
被験指標の抑制率＝（１−被験指標の標準化レベル）×１００％
【０５３６】
実験データは、いずれも
【数２】
2021533800.tif 000117
で表され、データ分析では、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍ５．０統計分析ソフトウェアを採用した。まずデータに対して正規分布と等分散性検定を行った。正規分布を満たす（ｐ＞０．２０）とともに分散が等しい（ｐ＞０．１０）場合、複数の群間の比較では、一元配置分散分析によるＬＳＤ法により多重比較し、ｐ＜０．０５である場合、統計学的有意であると考えられる。正規分布を満たしていない、又は分散が等しくない場合、複数の群間の比較では、ノンパラメトリック検定であるＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｈ方法を採用し、Ｋｒｕｓｋａｌ−ｗａｌｌｉｓ  Ｈ検定結果が有意（ｐ＜０．０５）である場合、データをランク変換した後、複数の群間の一対比較を行い、ｐ＜０．０５である場合、統計学的有意であると考えられる。
【０５３７】
結果を図３〜５に示す。
【０５３８】
図３から分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、生理食塩水を与えた陰性対照群は、血清表面抗原に対していかなる抑制作用も示さなかったのに対して、２つの投与量での複合体１は、薬剤投与後の異なる時点でＨＢｓＡｇに対して、いずれも優れた抑制効果を示した。高投与量群については、単回投与後１３日で、ＨＢｓＡｇに対する最大抑制率は９９．８％に達し、投与後８４日間の長期間にわたって、ＨＢｓＡｇ抑制率は依然として９０％以上に維持され、観察終了時点でも、ＨＢｓＡｇ抑制効率は、７７．０％と依然として高かった。低投与量群については、投与後１３日でＨＢｓＡｇに対する最大抑制率が９９．０％に達し、１５４日間の観察が終了した時点でも、ＨＢｓＡｇ抑制効率は依然として７９．４％のレベルに達していた。
【０５３９】
図４から分かるように、複合体１は、同様にＨＢｅＡｇの発現を抑制することができ、高投与量群については、投与後７０日で、血清ＨＢｅＡｇに対する発現抑制が５０％程度であり、１５４日間の観察が終了するまで、ＨＢｅＡｇに対する抑制効率は、投与前のレベルに戻らなかった。
【０５４０】
図５から分かるように、複合体１は、さらにＨＢＶ  ＤＮＡの発現を効率よく抑制し、１５４日間の長い観察期間にわたって常に高い抑制率を維持することができた。高投与量群については、単回投与後１３日でＨＢＶ  ＤＮＡに対する最大抑制率が９９．２％に達し、投与後８４日間の長期間にわたって、ＨＢＶ  ＤＮＡに対する抑制率は依然として９０％以上に維持され、観察終了時点でも、ＨＢＶ  ＤＮＡに対する抑制効率は８０．１％と依然として高かった。低投与量群については、投与後１３日でＨＢＶ  ＤＮＡに対する最大抑制率は９５．４％に達し、１５４日間の観察が終了した時点でも、ＨＢＶ  ＤＮＡに対する抑制効率は依然として６０．８％のレベルに達していた。
【０５４１】
上記結果から、本開示の複合体は、ＨＢＶ遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制することができ、特に表面抗原に対する長期間の持続的な抑制については、優れた効果を示すことが明らかになった。
【０５４２】
（実験例５）ｓｉＲＮＡの体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系における抑制活性
本実験例では、調製例１２における各ｓｉＲＮＡの体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系における抑制活性を調べた。
【０５４３】
実験例１における検出プラスミドＧＳＣＭを用いて被評価ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ１〜４及びＮＣ）とともにＨＥＫ２３９Ａ細胞にコトランスフェクションさせ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルにより、ｓｉＲＮＡの抑制活性を反映した。具体的な工程は以下のとおりである。
【０５４４】
９６ウェルプレートに、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の使用説明書により、それぞれｓｉＲＮＡとＧＳＣＭプラスミドをコトランスフェクションした。プラスミドをウェルあたり１０ｎｇずつトランスフェクションし、０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００を用いた。ｓｉＲＮＡの最終濃度は、順に０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ及び０．００１ｎＭであった。各群では、ｓｉＲＮＡ処理なしを対照とした。１群あたり３個の複製ウェルがあった。
【０５４５】
２４時間コトランスフェクションした後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット（Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、ｃａｔ．Ｅ２９４０）を用い、使用明細書によりＨＥＫ２９３Ａ細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。ホタルルシフェラーゼタンパク質レベルに対するウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レベルで標準化した。結果を図６に示す。
【０５４６】
結果から、ｓｉＲＮＡ１〜４は、いずれも良好な体外抑制活性を有し、濃度０．１ｎＭで、各ｓｉＲＮＡの抑制率はいずれも８０％以上であることを示した。
【０５４７】
（実験例６）ｓｉＲＮＡの体外でのヒト血漿における安定性
調製例１２で得られたｓｉＲＮＡ１−４（２０μＭ、１２μｌ）をそれぞれ１０８μＬの９０％ヒト血漿（Ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ、ＰＢＳで希釈）と均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、２、４、６、２４、４８、７２時間で１０μＬの試料を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、−８０℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５倍希釈した後、各サンプルを１０μＬずつとった。同時に、等モル量のｓｉＲＮＡ（２０μＭ、１μｌ）を４９μｌの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と均一に混合し、１０μＬをヒト血漿処理されていない参照サンプルとし、それぞれ「Ｍ１１〜Ｍ１４」と記した。１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記サンプルと４μＬの試料負荷緩衝液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、３６重量％グリセリン、０．０６重量％ブロムフェノールブルー）を混合した後、ゲルに負荷し、２０ｍＡの定電流条件で２０分間電気泳動した後、４０ｍＡの定電流条件で６０分間程度電気泳動し続けた。電気泳動終了後、ゲルをシェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２０３）で１５分間染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、その結果を図７に示す。
【０５４８】
結果から明らかにわかるとおり、本開示のｓｉＲＮＡは、参照サンプルと比較して異なる時点でバンドの輝度にいずれも有意差がなく、バンドは鮮明でテーリングがなかった。各ｓｉＲＮＡは、いずれも分解されておらず、安定性が良好であった。
【０５４９】
以上に本開示の好ましい実施形態を詳しく記載したが、本開示は、上記実施形態の具体的な細部に限定されなく、本開示の技術的思想の範囲で、本開示の技術的解決手段に対して種々の簡単な変形が可能であり、これらの簡単な変形は、いずれも本開示の保護範囲に属する。
【０５５０】
このほかに説明すべきこととして、上記実施形態に記載された各技術的特徴は、矛盾がない場合、任意の適切な方法により組み合わせることができ、不必要な重複を避けるために、本開示では各種の可能な組合せ方法を別途説明しない。
【０５５１】
また、本開示の各種の異なる実施形態は任意に組み合わせることもでき、本開示の精神から逸脱しない限り、その組み合わせも同様に、本開示に開示された内容とみなすべきである。
【図１】
2021533800.tif 000141
【図２】
2021533800.tif 000142
【図３】
2021533800.tif 000143
【図４】
2021533800.tif 000144
【図５】
2021533800.tif 000145
【図６】
2021533800.tif 000146
【図７】
2021533800.tif 000147
【配列表】
2021533800000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月25日(2021.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を抑制できるｓｉＲＮＡであって、前記ｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖とアンチセンス鎖の各ヌクレオチドはいずれも修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖とアンチセンス鎖はいずれもフルオロ修飾ヌクレオチド及び非フルオロ修飾ヌクレオチドを含み、前記フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、非フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指し、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列２を含み、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２とは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列１と配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列２と配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＺ−３’（配列番号１）、
５’−Ｚ’ＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣ−３’（配列番号２）
ただし、ＺはＵであり、Ｚ’はＡであり、
前記ヌクレオチド配列１に、位置がＺに対応するヌクレオチドＺＡが含まれ、前記ヌクレオチド配列２に、位置がＺ’に対応するヌクレオチドＺ’Ｂが含まれ、前記Ｚ’Ｂは、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、
前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列１とヌクレオチド配列２に位置し、前記ヌクレオチド配列１におけるフルオロ修飾ヌクレオチドが５個以下であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２におけるフルオロ修飾ヌクレオチドが７個以下であり、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであるｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
前記センス鎖は、ヌクレオチド配列３をさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列４をさらに含み、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがそれぞれ１〜４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列３は、前記ヌクレオチド配列１の５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４は、前記ヌクレオチド配列２の３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さが等しく、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列３の塩基がＧである、或いは、
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列３の塩基が順にＵ及びＧである、或いは、
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列３の塩基が順にＵ、Ｕ及びＧである、或いは、
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列３の塩基が順にＡ、Ｕ、Ｕ及びＧである、請求項２に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列５をさらに含み、前記ヌクレオチド配列５は、長さが１〜３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の３’オーバーハング端を構成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列５は、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列５は、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド、連続した２個のウラシルリボヌクレオチド、又は標的ｍＲＮＡと相補的な２つのヌクレオチドである、請求項４に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号３又は配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８に示されるヌクレオチド配列からなる群より選ばれるいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載のｓｉＲＮＡ。
５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＵ−３’（配列番号３）
５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＡ−３’（配列番号４）
５’−ＡＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＵＵ−３’（配列番号５）
５’−ＡＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＣＡ−３’（配列番号６）
５’−ＵＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＵＵ−３’（配列番号７）
５’−ＵＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＣＡ−３’（配列番号８）
【請求項７】
以下のｓｉＰ１〜ｓｉＰ４のいずれか１つである、請求項６に記載のｓｉＲＮＡ。
ｓｉＰ１
センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＵ−３’（配列番号３）
アンチセンス鎖：５’−ＡＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＵＵ−３’（配列番号５）
ｓｉＰ２
センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＵ−３’（配列番号３）
アンチセンス鎖：５’−ＡＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＣＡ−３’（配列番号６）
ｓｉＰ３
センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＡ−３’（配列番号４）
アンチセンス鎖：５’−ＵＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＵＵ−３’（配列番号７）
ｓｉＰ４
センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＵＡＵＧＵＣＡＡＣＧＡＡＵＡ−３’（配列番号４）
アンチセンス鎖：５’−ＵＡＵＵＣＧＵＵＧＡＣＡＵＡＣＵＵＵＣＣＡ−３’（配列番号８）
【請求項８】
各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される１つである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項９】
各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドは、リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す、請求項８に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１０】
前記ｓｉＲＮＡは、表１Ａ内のいずれか１つに示されるｓｉＲＮＡである、請求項９に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１１】
前記ｓｉＲＮＡにおいて、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖のうちの少なくとも１本のリン酸−糖骨格中のリン酸エステル基の少なくとも１個がチオリン酸エステル基であり、以下のヌクレオチド間の結合からなる群より選ばれる少なくとも１つが、該チオリン酸エステル基による結合である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ：
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間の結合、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間の結合、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間の結合。
【請求項１２】
前記ｓｉＲＮＡは、表１Ｂ内のいずれか１つに示されるｓｉＲＮＡである、請求項１１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１３】
前記アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１４】
前記ｓｉＲＮＡは、表１Ｃ又は表１Ｄ内のいずれか１つに示されるｓｉＲＮＡである、請求項１３に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１５】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含み、該ｓｉＲＮＡと該薬学的に許容可能な担体との重量比が１：（１〜５００）である、薬物組成物。
【請求項１６】
前記薬学的に許容可能な担体が、有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質を含み、前記有機アミンが、式（２０１）に示される化合物及び／又はその薬学的に許容できる塩である、請求項１５に記載の薬物組成物：
【化１】
2021533800.tif 000148
式中、
Ｘ１０１及びＸ１０２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ−Ａ又はＣ−Ａであり、Ａは水素又はＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖であり、
Ｙ１０１及びＺ１０１はそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨ又はＳＯ２であり、
Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｒ１０６及びＲ１０７はそれぞれ独立して、
水素と、
環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基と、
環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基と、
置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基と、
置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基と、
置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基と、から選択され、
ｘは１〜１０の整数であり、
ｎは１〜３の整数であり、ｍは０〜２０の整数であり、ｐは０又は１であり、ｍ及びｐがいずれも０である場合、Ｒ１０２は水素であり、
ｎ又はｍの少なくとも１つが２である場合、Ｒ１０３と式（２０１）における窒素とが、式（２０２）又は式（２０３）に示される構造を形成し、
【化２】
2021533800.tif 000149
式中、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１〜６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊Ｎは式（２０１）に示される窒素原子を表す。
【請求項１７】
前記有機アミンが、式（２１４）に示される有機アミン及び／又は式（２１５）に示される有機アミンであり、
【化３】
2021533800.tif 000150
前記補助脂質はコレステロール、コレステロールのアナログ及び／又はコレステロールの誘導体であり、かつ、
前記ＰＥＧ化脂質は１，２−ジパルミトアミド−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）］−２０００である、請求項１６に記載の薬物組成物。
【請求項１８】
前記有機アミン、前記補助脂質及び前記ＰＥＧ化脂質のモル比が（１９．７〜８０）：（１９．７〜８０）：（０．３〜５０）である、請求項１６に記載の薬物組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに複合して結合されるリガンドを含むｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２０】
前記リガンドが薬学的に許容できる複合基であり、前記複合基が薬学的に許容できる標的基とリンカーを含み、前記ｓｉＲＮＡ、前記リンカー及び前記標的基が順に共有結合的に結合されており；かつ
前記リンカーが式（３０１）に示される構造を有する
【化４】
2021533800.tif 000151
（式中、ｋは１〜３の整数であり、
ＬＡは、式（３０２）に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記ＬＡは、その両端でそれぞれ１つの前記標的基及び前記ＬＣ部にエーテル結合により結合され、
【化５】
2021533800.tif 000152
ＬＢは、式（３０３）に示される構造を有するＮ−アシルピロリジンを含む鎖状部であり、前記鎖状部は、その一端にカルボニル基を有し、前記ＬＣ部にアミド結合により結合され、他端に酸素原子を有し、前記ｓｉＲＮＡにリン酸エステル結合により結合され、
【化６】
2021533800.tif 000153
ＬＣは、ヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく２〜４価のリンカー基であり、前記ＬＣは、酸素原子を介して各前記ＬＡ部にエーテル結合により結合され、窒素原子を介して前記ＬＢ部にアミド結合により結合される）；又は、
前記リンカーが式（３０６）に示される構造を有する
【化７】
2021533800.tif 000154
（式中、ｌは０〜３の整数であり、
＊は、前記リンカーにおける、エーテル結合により前記標的基に結合される部位を表し、
＃は、前記リンカーにおける、リン酸エステル結合により前記ｓｉＲＮＡに結合される部位を表す）、
請求項１９に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２１】
式（３０５）又は式（３０７）に示される構造を有し、
【化８】
2021533800.tif 000155
【化９】
2021533800.tif 000156
式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、
前記リンカーは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される、請求項２０に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２２】
式（４０１）に示される構造を有するｓｉＲＮＡ複合体：
【化１０】
2021533800.tif 000157
式中、
ｎ１は、１〜３から選択される整数であり、ｎ３は、０〜４から選択される整数であり、
ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２〜１０から選択される整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立して、Ｈ、メチル基又はエチル基の１つであり、
Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基であり、
【化１１】
2021533800.tif 000158
式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、Ｎｕは請求項１に記載のｓｉＲＮＡであり、
Ｒ２は、窒素含有骨格上のＮとＡ５９との結合を実現できる任意の基であり、
各Ｌ１は、式Ａ１〜Ａ２６の基から独立して選択される１又は複数の結合の組合せであり、
【化１２】
2021533800.tif 000159
式中、ｊ１は１〜２０の整数であり、ｊ２は１〜２０の整数であり、
Ｒ’はＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
Ｒａは式Ａ２７〜Ａ４５の基から選択される１つであり、
【化１３】
2021533800.tif 000160
ＲｂはＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
2021533800.tif 000161
は、基が共有結合的に結合する部位を表し、
各Ｍ１は、哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を有するリガンドから選択される１つである。
【請求項２３】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１３から選択される１又は複数の結合の組合せである、又は、
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せである、請求項２２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２４】
Ｌ１の長さが３〜２５個の原子である、又は、Ｌ１の長さが４〜１５個の原子である、請求項２２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２５】
ｍ１、ｍ２及びｍ３がそれぞれ独立して２〜５の整数である、又は、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である、請求項２２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２６】
各Ｍ１が、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブチリルガラクトサミン、Ｎ−イソブチリルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコリル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース、Ｌ−４−チオリボースから独立して選択される１つである、請求項２２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２７】
Ｒ２には、窒素含有骨格中のＮに結合される結合部位及びＲ３におけるＰに結合される結合部位がともに含まれ；かつ
前記Ｒ２における窒素含有骨格上のＮ原子に結合される部位が該Ｎ原子とアミド結合を形成し、前記Ｒ３におけるＰ原子に結合される部位が該Ｐ原子とリン酸エステル結合を形成する、又は
Ｒ２がＢ５、Ｂ６、Ｂ５’又はＢ６’から選択される、
【化１４】
2021533800.tif 000162
（式中、
2021533800.tif 000163
は、基が共有結合的に結合する部位を表し、ｑ２は１〜１０の整数である、
請求項２２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２８】
式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する、請求項２２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【化１５】
2021533800.tif 000164
2021533800.tif 000165
2021533800.tif 000166
2021533800.tif 000167
2021533800.tif 000168
【請求項２９】
式Ａ５９におけるＰが、前記センス鎖の３’末端に結合される、請求項２８に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項３０】
Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のために用いられる、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ、請求項１５に記載の薬物組成物及び／又は請求項１９に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項３１】
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現の抑制のために用いられる、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ、請求項１５に記載の薬物組成物及び／又は請求項１９に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項３２】
前記ＨＢＶ感染による病理学的状態又は疾患が、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患、及び肝過形成性疾患から選択される、請求項３０に記載のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体。
【国際調査報告】
2021533800.tif 000169
2021533800.tif 000170
2021533800.tif 000171
2021533800.tif 000172
2021533800.tif 000173
2021533800.tif 000174
2021533800.tif 000175
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