(57)【要約】  本発明は、持続放出組成物の調製、特にアルギン酸マトリクス内に包埋された精子を含む持続放出組成物の調製に適したキットに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
持続放出組成物を調製するのに適したキットであって、該キットが第１の容器及び第２の容器を備え、前記第１の容器が活性化剤組成物と、第１の拡散バリア又は第２の拡散バリアのいずれかと、を含み、前記第２の容器がイオン架橋性生体適合性ポリマーと、不活性架橋剤と、任意に、放出される材料とを含み、前記第１及び／又は第２の拡散バリアが、前記活性化剤組成物及び前記不活性架橋剤が遅延速度で互いに接触することを可能にすることにより、活性架橋剤の遅延放出及び持続放出を保証し、
ここで、
前記第１の容器及び／又は前記第２の容器は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーが前記第１の容器及び／又は前記第２の容器全体にわたって前記活性架橋剤と接触することを可能にするサイズ及び形態であり、それによって架橋された生体適合性ポリマーが前記第１の容器及び／又は前記第２の容器全体にわたって存在することを保証し、
前記イオン架橋性生体適合性ポリマーは、二価陽イオン架橋性生体適合性ポリマーであり、
「活性架橋剤」という用語は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを指し、
「不活性架橋剤」という用語は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出することができるようになるために、前記活性化剤組成物による活性化を必要とする化合物を指し、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記第１の拡散バリアと混合された前記活性化剤組成物は、前記第１の容器の内表面にコーティングされるか、又は、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記活性化剤組成物及び前記第１の拡散バリアは、前記第１の容器の内表面に別々の層でコーティングされ、それによって内表面層及び中間層を形成し、前記中間層は前記活性化剤組成物を含むか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記活性化剤組成物、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記活性化剤組成物、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料へと押出され、前記第２の拡散バリアは前記第１のポリマー、前記第２のポリマー若しくはそれらの組み合わせであるか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記活性化剤組成物、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記活性化剤組成物、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物と混合されている第３のポリマー材料が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料と共押出しされ、それによって内表面層及び外表面層を形成し、前記内表面層は前記活性化剤組成物を含み、前記第２の拡散バリアは、前記第２のポリマー、前記第３のポリマー又はそれらの組み合わせである、キット。
【請求項２】
持続放出組成物を調製するのに適したキットであって、該キットが第１の容器及び第２の容器を備え、前記第１の容器が不活性架橋剤と、第１の拡散バリア又は第２の拡散バリアのいずれかと、を含み、前記第２の容器がイオン架橋性生体適合性ポリマーと、活性化剤組成物と、任意に、放出される材料とを含み、前記第１及び／又は第２の拡散バリアが、前記活性化剤組成物及び前記不活性架橋剤が遅延速度で互いに接触することを可能にすることにより、活性架橋剤の遅延放出及び持続放出を保証し、
ここで、
前記第１の容器及び／又は前記第２の容器は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーが前記第１の容器及び／又は前記第２の容器全体にわたって前記活性架橋剤と接触することを可能にするサイズ及び形態であり、それによって架橋された生体適合性ポリマーが前記第１の容器及び／又は前記第２の容器全体にわたって存在することを保証し、
前記イオン架橋性生体適合性ポリマーは、二価陽イオン架橋性生体適合性ポリマーであり、
「活性架橋剤」という用語は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを指し、
「不活性架橋剤」という用語は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出することができるようになるために、前記活性化剤組成物による活性化を必要とする化合物を指し、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記第１の拡散バリアと混合された前記不活性架橋剤は、前記第１の容器の内表面にコーティングされるか、又は、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記不活性架橋剤及び前記第１の拡散バリアは、前記第１の容器の内表面に別々の層でコーティングされ、それによって内表面層及び中間層を形成し、前記中間層は前記不活性架橋剤を含むか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記不活性架橋剤、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記不活性架橋剤、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料へと押出され、前記第２の拡散バリアは前記第１のポリマー、前記第２のポリマー若しくはそれらの組み合わせであるか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記不活性架橋剤、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記不活性架橋剤、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物と混合されている第３のポリマー材料が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料と共押出しされ、それによって、内表面層及び外表面層を形成し、前記内表面層が不活性架橋剤を含み、前記第２の拡散バリアが前記第２のポリマー、前記第３のポリマー若しくはそれらの組み合わせである、キット。
【請求項３】
持続放出組成物を調製するのに適したキットであって、該キットが第１の容器及び第２の容器を備え、前記第１の容器が活性架橋剤と、第１の拡散バリア又は第２の拡散バリアのいずれかと、を含み、前記第２の容器がイオン架橋性生体適合性ポリマーと、任意に、放出される材料とを含み、前記第１及び／又は第２の拡散バリアが、活性架橋剤の遅延放出及び持続放出を可能とし、
ここで、
前記第１の容器及び／又は前記第２の容器は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーが前記第１の容器及び／又は前記第２の容器全体にわたって前記活性架橋剤と接触することを可能にするサイズ及び形態であり、それによって架橋された生体適合性ポリマーが前記第１の容器及び／又は前記第２の容器全体にわたって存在することを保証し、
前記イオン架橋性生体適合性ポリマーは、二価陽イオン架橋性生体適合性ポリマーであり、
「活性架橋剤」という用語は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを指し、
「不活性架橋剤」という用語は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出することができるようになるために、前記活性化剤組成物による活性化を必要とする化合物を指し、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記第１の拡散バリアと混合された前記活性架橋剤は、前記第１の容器の内表面にコーティングされるか、又は、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記活性架橋剤及び前記第１の拡散バリアは、前記第１の容器の内表面に別々の層でコーティングされ、それによって内表面層及び中間層を形成し、前記中間層は前記活性架橋剤を含むか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記活性架橋剤、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記活性架橋剤、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料へと押出され、前記第２の拡散バリアは前記第１のポリマー、前記第２のポリマー若しくはそれらの組み合わせであるか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記活性架橋剤、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記活性架橋剤、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物と混合されている第３のポリマー材料が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料と共押出しされ、それによって、内表面層及び外表面層を形成し、前記内表面層が前記活性架橋剤を含み、前記第２の拡散バリアが前記第２のポリマー、前記第３のポリマー若しくはそれらの組み合わせである、キット。
【請求項４】
前記イオン架橋性生体適合性ポリマーがイオン架橋性アルギン酸塩である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５】
前記アルギン酸塩が、マンヌロン酸残基よりも多くのグルロン酸残基を有する、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記放出される材料が、生体材料、治療剤、診断剤又はそれらの任意の混合物からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７】
前記放出される材料が精子である、請求項１又は３に記載のキット。
【請求項８】
前記第１の容器が授精１回用量に対する容器である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９】
前記第１の拡散バリアが、ｉ）天然ポリマー、ｉｉ）合成ポリマー若しくはコポリマー、又はｉｉｉ）それらの任意の混合物からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０】
前記活性化剤組成物と不活性架橋剤との混合物が、活性架橋剤の形成をもたらし、前記活性架橋剤が、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適している、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項１１】
前記不活性架橋剤が水に不溶性の二価陽イオン塩である、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項１２】
前記活性化剤組成物が、前記不活性架橋剤を活性架橋剤へと変換することができる少なくとも１つの化合物を含み、前記活性架橋剤が前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適している、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項１３】
前記活性化剤組成物がプロトン供与体を含み、前記不活性架橋剤が、前記プロトン供与体と接触すると前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出する化合物である、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項１４】
前記活性化剤組成物が、水と接触するとプロトン供与体へと変換される化合物を含む、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項１５】
水と接触するとプロトン供与体へと変換される前記化合物が、無機酸無水物、有機酸無水物及びラクトン、又はそれらの任意の混合物からなる群から選択される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記第１及び第２の拡散バリアは同一又は異なるが、ただし、前記第２の拡散バリアが押出し成形に適合性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
前記イオン架橋性生体適合性ポリマーがイオン架橋性アルギン酸塩であり、前記アルギン酸塩がマンヌロン酸残基よりも多くのグルロン酸残基を有し、
前記放出される材料が精子であり、
前記第１の容器が授精１回用量に対する容器である、請求項１又は３に記載のキット。
【請求項１８】
持続放出組成物を調製するための請求項１〜１７のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項１９】
前記持続放出組成物が、動物の繁殖に使用される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記第１の容器及び／又は第２の容器が、内径１ｃｍ未満のチューブの形状を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２１】
前記第１の容器及び／又は第２の容器が、内径０．１ｃｍ〜１ｃｍの範囲のチューブの形状を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
前記第１の容器及び／又は第２の容器が、内径０．１ｃｍ〜０．５ｃｍの範囲のチューブの形状を有する、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記イオン架橋性生体適合性ポリマーがイオン架橋性アルギン酸塩であり、
前記第１の容器及び／又は第２の容器が、内径１ｃｍ未満のチューブの形状を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
前記イオン架橋性生体適合性ポリマーがイオン架橋性アルギン酸塩であり、
前記第１の容器及び／又は第２の容器が、内径０．１ｃｍ〜１ｃｍの範囲のチューブの形状を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
前記イオン架橋性生体適合性ポリマーがイオン架橋性アルギン酸塩であり、
前記第１の容器及び／又は第２の容器が、内径０．１ｃｍ〜０．５ｃｍの範囲のチューブの形状を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、持続放出組成物の調製、特にアルギン酸マトリクス内に包埋された精子を含む持続放出組成物の調製に適したキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
人工授精（ＡＩ：Artificial Insemination）は、自然な性交ではなく人工的な手段で動物の子宮又は子宮頸部に精子を入れる技術である。この技術は１９４０年代から使用されており、現在では望ましい特性を伝播するための動物の交配方法として及び繁殖において広く利用され、特に、ウシ、ブタ、ヒツジ、家禽及びウマ等の家畜の場合だけでなく、純種のイヌ、水生動物等のペット、及び絶滅危惧種の場合にも利用されている。
【０００３】
人工授精の使用及び精子の保存に関する現代のＡＩの開発及びブリーダーの課題に関する概要が非特許文献１及び非特許文献２に開示されている。
【０００４】
精子は典型的には、収集され、増殖させた後、例えば凍結保存によって保存される。凍結保存技術の使用は、動物の特定の種に由来する精子が、精子の品質、生存能力及び受精能力の過度の劣化をもたらすことなく、かかる処置に耐えることを前提としている。次いで、精子は、典型的には、凍結保存又は新鮮貯蔵のいずれか適した方で保存されて、雌性の場所に運ばれる。精子は、授精時まで、そして授精後に卵細胞（複数の場合もある）が受精場所に到達するまで、雌性動物内で十分な期間生存可能に保たれることが不可欠である。
【０００５】
収集後、授精時点まで、より長期間にわたり精子が受精能力を維持することを保証する貯蔵の方法及び手段の提供を目的とした保存方法、特に、授精後より長期間にわたって精子が受精能力を維持することを保証する方法及び手段の提供を目的とした保存方法に対して数多くの着目及び研究がなされている。
【０００６】
特許文献１は、アルギン酸塩に精子が包埋された保存システムを開示している。この保存システムは、とりわけ、授精後より長い期間精子の受精能力を与えることで利益をもたらすと言われている。
【０００７】
特許文献２は、精子が改良されたアルギン酸マトリクスに包埋されている保存システムを教示する。改良されたアルギン酸マトリクスは、とりわけ、受精の可能性が高い精子を長期間にわたって放出するため、排卵に対する授精時間の重要性を更に低くすることを保証すると言われている。
【０００８】
上記の保存システムによって、排卵に関して最も好ましい授精時点にブリーダーが出くわすことへの依存が少なくなるにもかかわらず、製造には訓練された人員が必要である。そのため、上記の保存システムの製造手順を簡素化する手段が必要とされている。
【０００９】
本発明者らが知る限りでは、かかる保存システムの製造手順を簡素化する手段に焦点を当てた研究は多くない。しかしながら、その他の保存システム及びそれに関連するシステムを製造する手段はこれまで公開されている。
【００１０】
非特許文献３は、少なくとも第１及び第２の容器を備えるキットを開示している。第１の容器はアルギン酸ナトリウム溶液を含み、第２の容器は塩化カルシウム（活性架橋剤）溶液を含む。塩化カルシウムは、アルギン酸ナトリウムの溶液中で解離する。遊離カルシウムイオンはアルギン酸ナトリウムと相互作用することにより、架橋アルギン酸塩を形成する。
【００１１】
特許文献３は、動物の人工授精に使用するのに適したアルギン酸塩−精子系を製造する方法を教示する。アルギン酸塩−精子系は、授精ストローを備える。このストローは、従来、細いチューブ及び細いチューブに挿入されたストッパーによって形成されている。充填状態では、ストッパーは、チューブの第１の端部近くに配置され、液体ベースの物質、特にアルギン酸塩に溶解された精子の用量は、ストロー内でストッパーと管の第２の端部との間に配置される。ストローを満たすため、ストッパーに近いチューブの第１の端部を、真空源と連絡するように置き、一方、第２の端部を、ストローに導入される物質を含む管と連絡するように置く。最初にストッパーと第２の端部との間に含まれる空気は、ストッパーを通って吸引され、その間、物質はストッパーに到達するまでチューブ内を前進するが、ストッパーが液密になるために物質はストッパーを通過することはできない。精子がストッパーに吸収されることを避けるため、ストッパーにカルシウム塩又はバリウム塩を含浸させることが提案される。カルシウム塩及びバリウム塩は水溶性（活性架橋剤）である必要がある。アルギン酸塩溶液がカルシウム又はバリウムの塩と接触すると、アルギン酸塩は直ちにゲルへと変換される。アルギン酸塩プラグは、精子がストッパーに吸収されないことを保証する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００８／００４８９０号
【特許文献２】国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８１１２８号
【特許文献３】国際公開第２０１５／１８１４９６号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】R. H. Foote (2002), American Society of Animal Science (http://www.asas.org/symposia/esupp2/Footehist.pdf)
【非特許文献２】"Reproduction in farm animals", edited by B. Hafez, E.S.E. Hafez.-7th ed., Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2000.-XIII, ISBN 0-683-30577-8 (ib.)
【非特許文献３】"Alginate 3d Cell Culture Kit", 16 December 2012, pages 1-10
【発明の概要】
【００１４】
本発明の第１の態様は、持続放出組成物を調製するのに適したキットであって、該キットが第１の容器及び第２の容器を備え、前記第１の容器が活性化剤組成物と、第１の拡散バリア又は第２の拡散バリアのいずれかと、を含み、前記第２の容器がイオン架橋性生体適合性ポリマーと、不活性架橋剤と、任意に、放出される材料とを含み、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記第１の拡散バリアと混合された前記活性化剤組成物は、前記第１の容器の内表面にコーティングされるか、又は、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記活性化剤組成物及び前記第１の拡散バリアは、前記第１の容器の内表面に別々の層でコーティングされ、それによって内表面層及び中間層を形成し、前記中間層は前記活性化剤組成物を含むか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記活性化剤組成物、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記活性化剤組成物、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料へと押出され、前記第２の拡散バリアは前記第１のポリマー、前記第２のポリマー若しくはそれらの組み合わせであるか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記活性化剤組成物、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記活性化剤組成物、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物と混合されている第３のポリマー材料が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料と共押出しされ、それによって内表面層及び外表面層を形成し、前記内表面層が前記活性化剤組成物を含み、前記第２の拡散バリアは、前記第２のポリマー、前記第３のポリマー又はそれらの組み合わせである、キットに関している。
【００１５】
本発明の第２の態様は、持続放出組成物を調製するのに適したキットであって、該キットが第１の容器及び第２の容器を備え、前記第１の容器が不活性架橋剤と、第１の拡散バリア又は第２の拡散バリアのいずれかと、を含み、前記第２の容器がイオン架橋性生体適合性ポリマーと、活性化剤組成物と、任意に、放出される材料とを含み、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記第１の拡散バリアと混合された前記不活性架橋剤は、前記第１の容器の内表面にコーティングされるか、又は、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記不活性架橋剤及び前記第１の拡散バリアは、前記第１の容器の内表面に別々の層でコーティングされ、それによって内表面層及び中間層を形成し、前記中間層は前記不活性架橋剤を含むか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記不活性架橋剤、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記不活性架橋剤、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料へと押出され、前記第２の拡散バリアは前記第１のポリマー、前記第２のポリマー若しくはそれらの組み合わせであるか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記不活性架橋剤、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記不活性架橋剤、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物と混合されている第３のポリマー材料が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料と共押出しされ、それによって、内表面層及び外表面層を形成し、前記内表面層が前記不活性架橋剤を含み、前記第２の拡散バリアが前記第２のポリマー、前記第３のポリマー若しくはそれらの組み合わせである、キットに関する。
【００１６】
本発明の第３の態様は、持続放出組成物を調製するのに適したキットであって、該キットが第１の容器及び第２の容器を備え、前記第１の容器が活性架橋剤と、第１の拡散バリア又は第２の拡散バリアのいずれかと、を含み、前記第２の容器がイオン架橋性生体適合性ポリマーと、任意に、放出される材料とを含み、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記第１の拡散バリアと混合された前記活性架橋剤は、前記第１の容器の内表面にコーティングされるか、又は、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記活性架橋剤及び前記第１の拡散バリアは、前記第１の容器の内表面に別々の層でコーティングされ、それによって内表面層及び中間層を形成し、前記中間層は前記活性架橋剤を含むか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記活性架橋剤、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記活性架橋剤、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料へと押出され、前記第２の拡散バリアは前記第１のポリマー、前記第２のポリマー若しくはそれらの組み合わせであるか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記活性架橋剤、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記活性架橋剤、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物と混合されている第３のポリマー材料が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料と共押出しされ、それによって、内表面層及び外表面層を形成し、前記内表面層が前記活性架橋剤を含み、前記第２の拡散バリアが前記第２のポリマー、前記第３のポリマー若しくはそれらの組み合わせである、キットに関する。
本発明の第１、第２、及び第３の態様に係る一実施の形態において、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーは、二価陽イオン架橋性生体適合性ポリマーである。
【００１７】
本発明の第１、第２、及び第３の態様に係る他の実施の形態において、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーは、イオン架橋性アルギン酸塩である。前記アルギン酸塩が、マンヌロン酸残基よりも多くのグルロン酸残基を有していることが好ましい。
【００１８】
本発明の第１、第２、及び第３の態様に係る更に他の実施の形態において、前記放出される材料が、細胞、特に幹細胞のような生体材料、治療剤、診断剤又はそれらの任意の混合物からなる群から選択される。特に好ましい実施形態では、前記放出される材料は、精子である。
【００１９】
本発明の第１、第２、及び第３の態様に係る更に別の実施の形態において、前記第１の容器が授精１回用量に対する受精ストロー又は受精チューブのような容器であり、受精ストローであることがより好ましい。受精ストローの一例が図１に示されている。典型的な受精ストローの寸法が実施例４に示されている。
【００２０】
一実施の形態において、前記第１の容器及び／又は第２の容器が  内径が１０ｃｍ未満の、例えば、５ｃｍ未満、３ｃｍ未満、２ｃｍ未満、１ｃｍ未満 、８ｍｍ未満、５ｍｍ未満、又は４ｍｍ未満のチューブの形状を有している。
【００２１】
一実施の形態において、前記第１の容器及び／又は第２の容器が、内径が０．１ｃｍ〜１０ｃｍの範囲の、例えば、０．１〜５ｃｍ 、０．１〜３ｃｍ、０．１〜１ｃｍ、又は、０．１〜０．５ｃｍの範囲のチューブの形状を有している。
【００２２】
本発明の第１、第２、又は第３の態様に係るさらに他の実施の形態において、前記第１の容器は受精ストローであり、当該受精ストローは第１の端部(２)と第２の端部(３)の間に延びガス透過性の液密プラグ(４)を含むチューブ（1）を備え、み、当該プラグは、チューブ内にチューブの第１の端部の近辺に配置され、チューブ(２)の第１の端部に向けられた第１の端部とチューブの第２の端部に向けられた第２の端部との間に延びている。
【００２３】
本発明の第１、第２、又は第３の態様に係る更に他の実施の形態において、前記第１の容器及び／又は第２の容器は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーが前記第１の容器及び／又は前記第２の容器全体にわたって前記活性架橋剤と接触することを可能にするサイズ及び形態をもつことが好ましく、それによって架橋された生体適合性ポリマーが前記第１の容器及び／又は前記第２の容器全体にわたって存在することを保証している。
【００２４】
第１の容器及び／又は第２の容器全体でイオン架橋性生体適合性ポリマーを、妥当な時間内に架橋することができることが好ましい。一実施の形態では、妥当な時間は、４８時間未満、２４時間未満、１２時間未満、６時間未満、４時間未満、２時間未満又は１時間未満である。
【００２５】
本発明の第１、第２又は第３の態様による別の実施の形態では、第１の容器及び／又は第２の容器は、持続放出組成物を調製するのに適している。本発明の第１、第２又は第３の態様による更に別の実施の形態では、第１の容器及び／又は第２の容器は、持続放出組成物を調製するのに適しており、持続放出組成物は、動物の繁殖における使用及び／又はヒト若しくは動物の身体への生体材料の移植に適している。本発明の第１、第２又は第３の態様による別の実施の形態では、第１の容器及び／又は第２の容器は、持続放出組成物を調製するのに適したサイズ及び／又は形態である。持続放出組成物は、動物の繁殖における使用、ヒト若しくは動物の身体への生体材料の移植、細胞の培養、生体材料の保存及び／又は生体材料の凍結保存に適している。
【００２６】
生体材料の保存は、例えば、オルガネラ、細胞、組織、細胞外マトリクス、器官、又は調節されていない化学反応速度論によって引き起こされる損傷を受けやすい任意の他の生体構造物が低温、典型的には０℃以下の温度、−５℃以下の温度等、例えば、−１０℃以下の温度、−２０℃以下の温度、−３０℃以下の温度、−４０℃以下の温度、−５０℃以下の温度、−６０℃以下の温度、又は−７０℃以下の温度まで冷却することによって保存されるプロセスであり得る。
【００２７】
凍結保存又は低温貯蔵（cryo-conservation）は、オルガネラ、細胞、組織、細胞外マトリクス、器官、又は調節されていない化学反応速度論によって引き起こされる損傷を受けやすい任意の他の生体構造物が、非常に低い温度、典型的には、例えば固体の二酸化炭素を使用して−８０℃、又は例えば液体窒素を使用して−１９６℃まで冷却することによって保存されるプロセスである。
【００２８】
本発明の第１、第２又は第３の態様による別の実施の形態では、第１及び／又は第２の拡散バリアは、水和性拡散バリアである。好ましくは、第１のポリマー材料は、水和性拡散バリアではない。
【００２９】
本発明の第１、第２又は第３の態様による更に別の実施の形態では、第１及び／又は第２の拡散バリアは、フィルム形成ポリマーである。好ましくは、第１のポリマー材料はフィルム形成ポリマーではない。
【００３０】
本発明の第１又は第２の態様による更なる実施の形態では、第１及び／又は第２の拡散バリアは、活性化剤組成物及び不活性架橋剤が遅延速度で互いに接触することを可能にし、それによって活性架橋剤の遅延放出及び持続放出を保証する。
【００３１】
本発明の第１、第２又は第３の態様による更なる実施の形態では、第１及び／又は第２の拡散バリアは、活性架橋剤の遅延放出及び持続放出を可能にする。
【００３２】
本発明の第１、第２又は第３の態様による一実施の形態では、第１の拡散バリアは、ｉ）アルギン酸塩等の天然ポリマー、デキストラン、デンプン及びアガロースのような他の多糖、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、メチルセルロース及びエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースとしてのセルロース誘導体、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、シェラックのようなタンパク質、ｉｉ）ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）、水溶性ポリアミド、ポリアクリル酸及びポリアクリル酸無水物、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸無水物、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリ−ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルピロリドンのような合成ポリマー若しくはコポリマー、又はｉｉｉ）それらの任意の混合物からなる群から選択される。第１の拡散バリアは、親水性であることが好ましい。
【００３３】
本発明の第１又は第２の態様による別の実施の形態では、活性化剤組成物と不活性架橋剤との混合物は、活性架橋剤の形成をもたらし、活性架橋剤が、イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適している。
【００３４】
本発明の第３の態様による更に別の実施の形態では、活性架橋剤は、イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適している。
【００３５】
本発明の第１又は第２の態様による更なる実施の形態では、不活性架橋剤は、二価陽イオン炭酸塩、より好ましくはＣａＣＯ３、ＢａＣＯ３又はそれらの任意の混合物等の水に不溶性の二価陽イオン塩である。
【００３６】
本発明の第３の態様による更に別の実施の形態では、活性架橋剤は、二価陽イオン塩化物、二価陽イオン酢酸塩、二価陽イオンクエン酸塩、好ましくはＣａＣｌ２、ＢａＣｌ２、Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、Ｂａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、クエン酸カルシウム、クエン酸バリウム又はそれらの任意の混合物、より好ましくはＣａＣｌ２、Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、クエン酸カルシウム又はそれらの任意の混合物等の水に可溶性の二価陽イオン塩である。
【００３７】
本発明の第１又は第２の態様による更なる実施の形態では、活性化剤組成物は、不活性架橋剤を活性架橋剤へと変換することができる少なくとも１つの化合物を含み、活性架橋剤は、イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適している。
【００３８】
本発明の第１又は第２の態様による別の実施の形態では、活性化剤組成物は、酸等のプロトン供与体を含み、不活性架橋剤は、プロトン供与体と接触するとイオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出する化合物である。好ましい実施の形態では、プロトン供与体は水に可溶性である。別の好ましい実施の形態では、プロトン供与体は、ｉ）アスコルビン酸、クエン酸若しくはそれらの任意の混合物等の有機酸、ｉｉ）リン酸、塩酸若しくはそれらの任意の混合物等の無機酸、又はｉｉｉ）有機酸と無機酸との混合物からなる群から選択される。
【００３９】
本発明の第１又は第２の態様による更に別の実施の形態では、活性化剤組成物は、水と接触すると酸等のプロトン供与体へと変換される化合物を含む。好ましい実施の形態では、水と接触するとプロトン供与体へと変換される化合物は、無機酸無水物、コハク酸無水物等の有機酸無水物、及びグルコノデルタラクトン等のラクトン、又はそれらの任意の混合物、好ましくは有機酸無水物及びグルコノデルタラクトン、より好ましくはグルコノデルタラクトン及び／又はコハク酸無水物からなる群から選択される。
【００４０】
それらの実施の形態では、ｉ）活性化剤組成物がプロトン供与体又は水と接触するとプロトン供与体へと変換される化合物を含み、ｉｉ）第１及び／又は第２の拡散バリアが強酸と相溶性ではなく、プロトン供与体（所与の化合物を水と接触させた場合に形成される任意のプロトン供与体を含む）は、好ましくはｐＫａ＞３を有するプロトン供与体である。アスコルビン酸又はグルクロン酸は、ｐＫａ＞３を有する弱酸の例である。ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、Ｂｅｎｅｃｅｌ  ＭＰ  ８１２  Ｗ（メチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース）、及びＭｅｔｈｏｃｅｌ  Ｋ１００（メチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース−ヒプロメロース）等のセルロース系ポリマーは、塩酸のような強酸との相溶性がない拡散バリアの例である。かかるバリアが強酸と接触すると、強酸がセルロース系ポリマーと反応する場合があり、ポリマーマトリクスの分解及び／又は架橋につながるリスクがある。そのため、一実施の形態では、プロトン供与体はｐＫａ＞３を有する。
【００４１】
本発明の第１又は第２の態様による更に別の実施の形態では、活性化剤組成物は、ヒドロラーゼ又はヒドロラーゼによって加水分解可能な基質のいずれかを含む。活性化剤組成物がヒドロラーゼを含む場合、もともとヒドロラーゼを含まない容器は、ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を更に含む。活性化剤組成物がヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を含む場合、もともとヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を含まない容器は、ヒドロラーゼを更に含む。
【００４２】
本発明の第１又は第２の態様による更なる実施の形態では、第１及び／又は第２の拡散バリアは、活性化剤組成物である。好ましい実施の形態では、第１及び／又は第２の拡散バリアは、酸等のプロトン供与体であるか、又は水と接触するとプロトン供与体へと変換される。より好ましい実施の形態では、第１及び／又は第２の拡散バリアは、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸無水物、ポリメタクリル酸無水物又はそれらの任意の混合物からなる群から選択される。
【００４３】
本発明の第１、第２又は第３の態様による別の実施の形態では、第１のポリマー材料は、ポリプロピレン、好ましくは医療グレードのポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ＡＢＳ（アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン）、ポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、アセタール、アクリル（acrylics）、ポリカーボネート、ＥＶＡ（エチレン−酢酸ビニル）、ポリウレタン、熱可塑性エラストマー、ポリプロピレンとＥＯＣ（エチレンオクテングレード）、ＥＰＲ（エチレンプロピレンゴム）等のポリオレフィンエラストマーとのブレンド、又はかかるポリマーのブレンドからなる群から選択される。
【００４４】
本発明の第１、第２又は第３の態様による更に別の実施の形態では、第２の拡散バリアは、押出し成形に適合性でなくてはならない。
【００４５】
本発明の第１、第２又は第３の態様による更に別の実施の形態では、第１及び第２の拡散バリアは同じ又は異なるが、ただし、第２の拡散バリアは押出し成形に適合性がある。
【００４６】
本発明の第１、第２及び第３の態様による更に別の実施の形態では、第１、第２及び第３のポリマー材料は同じ又は異なってもよいが、ただし、第２及び第３のポリマー材料は押出し成形に適合性である。第１のポリマー材料が押出し成形に供されるそれらの実施の形態の場合、第１のポリマー材料も押出し成形に適合性でなければならないことを理解されたい。
【００４７】
本発明の第４の態様は、持続放出組成物を調製するための本発明の第１、第２又は第３の態様のいずれか１つによるキットの使用に関するものである。
【００４８】
本発明の第４の態様による一実施の形態では、持続放出組成物は動物の繁殖に使用するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】第１の端部２と第２の端部３との間に延びるチューブを備え、ガス透過性の液密プラグ４を備え、該プラグはチューブにおいてその第１の端部の近辺に配置され、チューブの第１の端部２に向かう第１の端部とチューブの第２の端部３に向かう第２の端部との間に延びる、授精ストロー１を示す図である。固体形態のＣａＣＯ３とＧＤＬとの混合物６は、ガス透過性の液密プラグ４の端部の近辺に配置され、チューブの第２の端部３に面する。精子及びアルギン酸塩を含む混合物５をストローに導入し、それによって精子が包埋されたイオン架橋ポリマーを形成する。
【図２】本発明の様々な実施形態を示す図である。上図は、授精ストローの内側のポリマーフィルム、すなわち拡散バリア中の活性化剤組成物を示す。中央の図は、授精ストロー中のポリマー材料へと押出されている活性化剤組成物を示す図であり、ポリマー材料は拡散バリアとして作用する。下の図は、第１の容器の製造中にポリマー２中の活性化剤組成物がポリマー１と共押出しされ、それによって二層構造を形成する状況を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
定義
「活性化剤組成物」という用語は、不活性架橋剤を活性化することができる１つ以上の化合物を含む組成物を指す。不活性架橋剤が活性化されると、イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンが、活性化された架橋剤から放出される。
【００５１】
「活性架橋剤」という用語は、イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適した化合物を指す。言い換えれば、「活性架橋剤」を中性のｐＨでアルギン酸ナトリウム溶液と混合すると、イオン架橋されたアルギン酸塩が形成される。活性架橋剤は典型的には、水と接触するとイオンを放出する化合物であり、イオンはイオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適している。そのため、ＣａＣｌ２及びＢａＣｌ２は、本明細書で規定される定義による活性架橋剤の例であり、一方ＣａＣＯ３及びＢａＣＯ３は不活性架橋剤の例である。
【００５２】
「生体適合性ポリマー」という用語は、害を及ぼすことなく、生きた組織又は生物と共存する能力を有するポリマーを指し、すなわち、宿主に悪影響を及ぼすことなく、好ましくは宿主にいかなる悪影響も及ぼすことなく、宿主に導入され得るポリマーを指す。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「コーティングされた」という用語は、基材の表面、例えば授精ストロー又は授精チューブの内表面に適用される被覆材、例えば拡散バリアを指す。コーティング自体は、基材を完全に覆うオールオーバーコーティングであってもよく、又は基材の一部のみを覆ってもよい。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「共押出し」という用語は、通常、複数の材料の層を同時に押出すことを指す。このタイプの押出し成形は、２つ以上の押出し機を利用して溶融し、異なる粘性プラスチックを一定の体積スループット（volumetric throughput）で所望の形態で押出す単一の押出しヘッド（ダイ）に供給する。層の厚さは、典型的には、材料を供給する個々の押出し機の相対速度及びサイズによって制御される。
【００５５】
「押出し成形に適合性」という用語は、より高い温度に供された後であってもその特性を保持する能力を指す。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「拡散バリア」という用語は、特に水を含む溶液等の液体溶液との接触時に、活性架橋剤、不活性架橋剤及び／又は活性化剤組成物に対して透過性のあるバリアを指す。拡散バリアは上記化合物に透過性があるが、バリアを横切る移動速度は、自由流によって達成され得たであろう速度よりも低く、それによってバリアを横切る移動速度を遅くする。多くの現実世界のシナリオでは、単一のポリマーでは或る用途の全ての要求を満たすことはできない。複合押出しではブレンドされた材料を押出すことができるが、共押出しでは、別々の材料を押出し製品内に異なる層として保持し、酸素透過性、強度、剛性、及び耐摩耗性等の異なる特性を持つ材料を適切に配置することができる。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「包埋された」という用語は、包埋された材料が自然に動く可能性が妨げられていることを意味し、すなわち、カプセルの液体コア等の液体中に保管された場合に、そうでなければ動き得る材料が自然に動き得ることが妨げられていることを意味する。固定化の程度は、例えば機械的強度等のマトリクスの特徴によって変化する。包埋された材料は、例えば、イオン架橋されたアルギン酸塩等のイオン架橋ポリマー内に包埋された精子、第２のポリマー材料内に包埋された活性化剤組成物、第２のポリマー材料内に包埋された活性架橋剤、及び／又は第２のポリマー材料内に包埋された不活性架橋剤であり得る。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「カプセル封入された」という用語は、カプセル封入された材料がその自然に動く可能性を保持すること、すなわち材料がカプセルの液体コアに保管されることを意味する。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「押出し（extruded）」という用語は、典型的には、所望の断面のダイを通して材料を押し出すことにより、固定された断面プロファイル、例えば、授精ストロー又は授精チューブのプロファイルの目的物を作り出すために使用されるプロセスを指す。押出される材料が何らかのポリマー樹脂である場合、典型的には、ポリマー樹脂は加熱要素と押出しスクリューからの剪断加熱との組み合わせによって溶融状態まで加熱される。このスクリュー又は２軸スクリュー押出しの場合の複数のスクリューは、ダイを通して樹脂を押し進めて、樹脂を所望の形状に形成する。押出し物は、ダイ又は水タンクを通して引き出されながら冷却され、凝固する。押出し成形は、連続的（理論的には無限に長い材料を製造する）又は半連続的（多くの小片を製造する）であってもよい。一般的に押出し材料としては、金属、ポリマー、セラミックス、コンクリート、模型用粘土、及び食品が挙げられる。押出し成形の製品は、一般に「押出し物」と呼ばれる。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「ヒドロラーゼ」という用語は、ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質（複数の場合もある）を含む溶液とヒドロラーゼを含む別の溶液とを混合する際にＨ３Ｏ＋を産生することを可能にするヒドロラーゼを包含することを意味する。本発明の一実施形態によれば、ヒドロラーゼはリパーゼである。本発明の更に別の実施形態によれば、リパーゼはアシルヒドロラーゼであり、より好ましくは、例えば酵母カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）から単離されたトリアシルグリセロールリパーゼ等のトリアシルグリセロールリパーゼである。好適なリパーゼは、Sigma-Aldrich Co. LLC（Ｌ１７５４−Ｔｙｐｅ  ＶＩＩ又はＬ３００１  Ｔｙｐｅ  Ｉ、ＣＡＳ番号９００１−６２−１）から入手可能である。
【００６１】
「不活性架橋剤」という用語は、イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出することができるようになるために、活性化剤組成物による活性化を必要とする化合物を指す。不活性架橋剤が活性化剤組成物によって活性化されない場合、不活性架橋剤は、イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出することができない。言い換えれば、「不活性架橋剤」を、例えば、活性化剤組成物の不在下で、中性のｐＨでアルギン酸ナトリウム溶液と混合すると、イオン架橋されたアルギン酸塩は形成されない。しかしながら、「不活性架橋剤」を、例えば、活性化剤組成物の存在下でアルギン酸ナトリウム溶液と混合すると、イオン架橋されたアルギン酸塩が形成される。不活性架橋剤は典型的には、２５℃、ｐＨ＞８の水と接触した場合に、イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出しない化合物である。したがって、ＣａＣｌ２及びＢａＣｌ２は、本明細書で規定されている定義による不活性架橋剤ではなく、一方ＣａＣＯ３及びＢａＣＯ３は不活性架橋剤の例である。
【００６２】
「イオン架橋性生体適合性ポリマー」という用語は、直鎖状又は分岐鎖状の高分子がイオン結合によって相互に連結され、３次元ポリマーネットワークを形成することができるポリマーを指す。イオン架橋性生体適合性ポリマーがイオン結合によって相互に連結されると、このポリマーはイオン架橋された生体適合性ポリマーと称される。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「マトリクス」という用語は、放出される材料が包埋されるマトリクスを指す。マトリクスは移動の可能性を低減し、固定化の程度は、典型的には、例えば機械的強度等のマトリクスの特徴によって変化する。しかしながら、固定化の程度だけでなく、典型的にはマトリクスの溶出速度もマトリクスの特徴によって変化する。典型的には、架橋度が高いマトリクスは、架橋度の低いマトリクスよりも機械的強度が高く、したがって溶出速度は遅くなる。そのため、別々の機械的強度を有する２つのマトリクスを組み合わせることにより、組み合わされたマトリクスは、別々の機械的強度を有する２つのセクションを持つことになる。高い機械的強度は低い溶出速度と関連し、低い機械的強度は高い溶出速度に関連するため、２つのセクションは別々の溶出速度を持つことになる。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「機械的強度」という用語は、実施の形態２に記載する方法に従って測定される。２つのセクションのうち１つの機械的強度が、実施の形態２に記載される方法で測定される他方のセクションの機械的強度と著しく異なる場合、２つのセクションは別々の機械的強度を有すると見なされる。一実施形態では、第１のセクションの機械的強度：第２のセクションの機械的強度の比が１に等しくない場合、２つのセクションは別々の機械的強度を有すると見なされる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「精子」という用語は、精子自体、また精漿（seminal fluid）に含有される精子を含み、すなわち、持続放出組成物を形成する際に精液を直接使用することができる。しかしながら、精漿から単離された精子を、任意に、他の適切な保管溶液に含めて、持続放出組成物を形成するために使用することもできる。
【００６６】
「持続放出」という用語は、制御放出、長期放出、時限放出、徐放（retarded release）、拡張放出及び遅延放出を包含するものとされる。
【００６７】
発明の詳細な説明
本明細書で具体的に定義されない限り、使用される全ての技術用語及び科学用語は、ポリマー工学、生化学、分子生物学及び動物育種の分野の当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を持つ。
【００６８】
本明細書において数値の制限又は範囲が記載されている場合、終点が含まれる。また、数値の制限又は範囲内の全ての値及び部分範囲は、明示的に書き出されているかのように明確に含まれる。
【００６９】
本明細書に記載されるものに類似する又はそれらと同等の方法及び材料はいずれも、本発明の実施又は試験において使用することができ、適切な方法及び材料が本明細書に記載されている。本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許、及びその他の参照は、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。矛盾が発生した場合、定義を含む本明細書が優先される。
【００７０】
アルギン酸マトリクスに精子を包埋することは、授精後より長い期間にわたって精子の受精能力を与えることで利益をもたらすことがこれまで示されている（特許文献１）。包埋によりアルギン酸マトリクス内に精子が固定化され、制限された動きは精子によるエネルギー消費の減少をもたらし、貯蔵寿命及び受精能力に関して有益であると推定されている。
【００７１】
上記に基づいて、固定化の程度が精子によるエネルギー消費、それによる精子の貯蔵寿命及び受精能力に影響を与えると仮定することは合理的と思われる。固定化の程度は、典型的には、例えば機械的強度等のマトリクスの特徴によって変化するため、かかる特徴は貯蔵寿命及び受精能力に直接影響を与えることが予想され得る。
【００７２】
特にイオン架橋されたポリマー、及びイオン架橋されたアルギン酸塩等の架橋度が低い架橋ポリマーは、架橋度が高いイオン架橋されたポリマーに比べ機械的強度が低下する。かかるマトリクスは、マトリクス内の制約がより少なく、より高い移動度を可能とし得るため、上記の観点から、貯蔵寿命及び受精能力に関して好ましくないことが予想され得る。
【００７３】
特許文献２の著者は、驚くべきことに、マトリクスの機械的強度を、包埋された精子の貯蔵寿命及び受精能力に悪影響を及ぼすことなく、著しく低下させ得ることを示した。機械的強度はマトリクスの溶出速度に直接結びついているため、この知見により、包埋された精子の貯蔵寿命及び受精能力に悪影響を及ぼすことなく、マトリクスの溶出プロファイルを調整することが可能となった。
【００７４】
貯蔵寿命及び受精能力に悪影響を及ぼすことなく溶出プロファイルを調整することができることで、授精後、長期間にわたってポリマーマトリクスから精子が持続的に放出されるシステムを設計することができる。ポリマーマトリクス内に包埋されたまま貯蔵寿命及び受精能力が維持されることから、連続放出により、授精後長期間にわたって受精に利用することができる高品質の精子が確保されるため、排卵に関して授精時間はそれほど重要ではなくなる。
【００７５】
しかしながら、上記の保存システムはいずれも、ブリーダーが排卵に関して最も好ましい授精時点に出くわすことへの依存が少ないにもかかわらず、保存システムを調製する手順は複雑であり、多くの場合、望ましい結果を達成するためには訓練された人員を必要とする。そのため、上記の保存システムの製造手順を簡素化する手段が必要とされている。
【００７６】
上記の必要性は、持続放出組成物を調製するのに適したキットを提供することによって解決された。キットは使いやすく、訓練された人員を必要とせず、ポリマーマトリクス、特にアルギン酸塩のゲル化の制御を保証し、精子がポリマーマトリクス全体に均等に分布している、持続放出組成物を提供する。
【００７７】
本発明は、人工授精、すなわち、動物の繁殖に使用されることを意図した持続放出組成物の簡素化された調製のために設計されたが、本発明の概念はまた、他の分野での利用を見出すこともできることが理解されよう。他の分野での利用の例は、治療剤の投与、診断剤の投与、又は細胞等の生体材料、特に幹細胞の投与に使用されることを意図した持続放出組成物の調製の簡素化であり得る。
【００７８】
したがって、本発明の第１の態様は、持続放出組成物を調製するのに適したキットであって、キットが第１の容器及び第２の容器を備え、第１の容器が活性化剤組成物と、第１の拡散バリア又は第２の拡散バリアのいずれかと、を含み、第２の容器がイオン架橋性生体適合性ポリマーと、不活性架橋剤と、任意に、放出される材料とを含み、
ここで、
第１の容器は第１の拡散バリアを含み、第１の拡散バリアと混合された活性化剤組成物は、第１の容器の内表面にコーティングされるか、又は、
第１の容器は第１の拡散バリアを含み、活性化剤組成物及び第１の拡散バリアは、第１の容器の内表面に別々の層でコーティングされ、それによって内表面層及び中間層を形成し、中間層は活性化剤組成物を含むか、又は、
第１の容器は第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）活性化剤組成物、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された活性化剤組成物、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物が、第１の容器の製造中に第１のポリマー材料へと押出され、第２の拡散バリアは第１のポリマー、第２のポリマー若しくはそれらの組み合わせであるか、又は、
第１の容器は第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）活性化剤組成物、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された活性化剤組成物、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物と混合されている第３のポリマー材料が、第１の容器の製造中に第１のポリマー材料と共押出しされ、それによって内表面層及び外表面層を形成し、内表面層は活性化剤組成物を含み、第２の拡散バリアは、第２のポリマー、第３のポリマー又はそれらの組み合わせである、キットに関する。
【００７９】
本発明の第２の態様は、持続放出組成物を調製するのに適したキットであって、キットが第１の容器及び第２の容器を備え、第１の容器が不活性架橋剤と、第１の拡散バリア又は第２の拡散バリアのいずれかと、を含み、第２の容器がイオン架橋性生体適合性ポリマーと、活性化剤組成物と、任意に、放出される材料とを含み、
ここで、
第１の容器は第１の拡散バリアを含み、第１の拡散バリアと混合された不活性架橋剤は、第１の容器の内表面にコーティングされるか、又は、
第１の容器は第１の拡散バリアを含み、不活性架橋剤及び第１の拡散バリアは、第１の容器の内表面に別々の層でコーティングされ、それによって内表面層及び中間層を形成し、中間層は不活性架橋剤を含むか、又は、
第１の容器は第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）不活性架橋剤、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された不活性架橋剤、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物が、第１の容器の製造中に第１のポリマー材料へと押出され、第２の拡散バリアは第１のポリマー、第２のポリマー若しくはそれらの組み合わせであるか、又は、
第１の容器は第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）不活性架橋剤、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された不活性架橋剤、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物と混合されている第３のポリマー材料が、第１の容器の製造中に第１のポリマー材料と共押出しされ、それによって、内表面層及び外表面層を形成し、内表面層が不活性架橋剤を含み、第２の拡散バリアが第２のポリマー、第３のポリマー若しくはそれらの組み合わせである、キットに関する。
【００８０】
本発明の第３の態様は、持続放出組成物を調製するのに適したキットであって、キットが第１の容器及び第２の容器を備え、第１の容器が活性架橋剤と、第１の拡散バリア又は第２の拡散バリアのいずれかと、を含み、第２の容器がイオン架橋性生体適合性ポリマーと、任意に、放出される材料とを含み、
ここで、
第１の容器は第１の拡散バリアを含み、第１の拡散バリアと混合された活性架橋剤は、第１の容器の内表面にコーティングされるか、又は、
第１の容器は第１の拡散バリアを含み、活性架橋剤及び第１の拡散バリアは、第１の容器の内表面に別々の層でコーティングされ、それによって内表面層及び中間層を形成し、中間層は活性架橋剤を含むか、又は、
第１の容器は第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）活性架橋剤、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された活性架橋剤、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物が、第１の容器の製造中に第１のポリマー材料へと押出され、第２の拡散バリアは第１のポリマー、第２のポリマー若しくはそれらの組み合わせであるか、又は、
第１の容器は第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）活性架橋剤、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された活性架橋剤、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物と混合されている第３のポリマー材料が、第１の容器の製造中に第１のポリマー材料と共押出しされ、それによって、内表面層及び外表面層を形成し、内表面層が活性架橋剤を含み、第２の拡散バリアが第２のポリマー、第３のポリマー若しくはそれらの組み合わせである、キットに関する。
【００８１】
上に列挙される態様の主題は、いずれも活性架橋剤の遅延放出及び持続放出を提供するという点で同じ課題に対する代替の解決策となる。この課題は、架橋剤と組み合わせて拡散バリアを有することによって解決され、架橋剤は活性架橋剤又は不活性架橋剤のいずれかである。拡散バリアは、活性架橋剤の遅延放出及び持続放出を保証する。
【００８２】
持続放出組成物
本発明によるキットによって調製され得る持続放出組成物は、典型的には、特定の期間にわたって材料の連続供給を確保すると同時に、放出されていない材料を放出時点までマトリクス内に保持されたままにすることを保証するために、所定の速度で材料を放出するように設計される。
【００８３】
一実施形態では、放出される材料は、授精後少なくとも２時間、例えば、授精後少なくとも４時間、授精後少なくとも８時間、授精後少なくとも１６時間、授精後少なくとも３２時間、又は授精後少なくとも１４４時間の期間にわたって放出される。別の実施形態では、放出される材料は、授精後２時間〜１４４時間の範囲、例えば、授精後４時間〜１２０時間、授精後８時間〜９６時間、授精後１６時間〜７２時間、授精後２４時間〜９６時間、授精後２４時間〜１２０時間、又は授精後２４時間〜１４４時間の期間にわたって放出される。
【００８４】
さらに、持続放出組成物は、イオン架橋されたアルギン酸塩等のイオン架橋された生体適合性ポリマーに包埋されている放出される材料を含む。
【００８５】
一実施形態では、イオン架橋された生体適合性ポリマーは、別々の機械的強度を有する少なくとも第１及び第２のセクションを有する。イオン架橋された生体適合性ポリマーの機械的強度を実施の形態２に記載される方法に従って測定することができる。
【００８６】
イオン架橋された生体適合性ポリマーのセクションが別々の機械的強度を有する場合、イオン架橋された生体適合性ポリマーは、不均質の架橋生体適合性ポリマーであり、すなわち機械的強度に関して不均質であるとされる。
【００８７】
セクション間の機械的強度の差が小さい場合、イオン架橋されたアルギン酸塩は実際にはセクションごとに徐々に溶解する。しかしながら、セクション間の機械的強度の差が大きい場合、イオン架橋されたアルギン酸塩は、典型的には、時差（time-staggered）溶解プロファイルに従う。
【００８８】
持続放出組成物を、所定の数のセクションに分割することができる。各セクションは、持続放出組成物の部分となる。セクションは、同一の又は異なる体積サイズであってもよい。
【００８９】
別々の機械的強度を有する第１及び第２のセクションは、類似又は同一の体積サイズであってもよい。別々の機械的強度を有する第１及び第２のセクションは、持続放出組成物において互いに隣接して配置されてもよく、又は持続放出組成物において互いに隣接して配置されなくてもよい。
【００９０】
さらに、持続放出組成物は、原則として、球、円環、円柱、円錐、立方体、直方体、三角錘、四角錘、三角柱、又はそれらの任意の組み合わせ等の任意の３次元形状を取ることができる。
【００９１】
本発明による別の実施形態では、イオン架橋された生体適合性ポリマーは、類似又は同一の機械的強度を有する少なくとも第１及び第２のセクションを有する。イオン架橋された生体適合性ポリマーの機械的強度を実施例２に記載される方法に従って測定することができる。
【００９２】
イオン架橋された生体適合性ポリマーのセクションが同一の機械的強度を有する場合、イオン架橋された生体適合性ポリマーは、均質な架橋生体適合性ポリマーであり、すなわち機械的強度に関して均質であるとされる。
【００９３】
本発明による一実施形態では、イオン架橋された生体適合性ポリマーは、機械的強度に関して均質である。
【００９４】
本発明による別の実施形態では、イオン架橋された生体適合性ポリマーは、機械的強度に関して不均質である。
【００９５】
本発明によるキットを使用することにより、訓練された人員を必要とすることなく、持続放出組成物をより容易に調製することができる。上記キットは、第１の容器及び第２の容器を備える。
【００９６】
イオン架橋性生体適合性ポリマー
第２の容器は、イオン架橋性アルギン酸塩等のイオン架橋性生体適合性ポリマーを含む。しかしながら、第２の容器は、天然起源又は合成、及びホモポリマー又はコポリマーにかかわらず、更に架橋性生体適合性ポリマーを含み得ることも理解されたい。本発明による一実施形態では、第２の容器は、イオン架橋性アルギン酸塩以外の架橋性生体適合性ポリマーを含まない。
【００９７】
本発明による更なる実施形態では、イオン架橋性生体適合性ポリマーは、二価陽イオン架橋性アルギン酸塩等の二価陽イオン架橋性ポリマーである。
【００９８】
アルギン酸塩は、１，４−結合−β−Ｄ−マンヌロン酸とα−Ｌ−グルロン酸との陰イオンコポリマーである。様々な形態のアルギン酸塩が市販されている。かかる形態は、典型的には、６０％の１，４−結合−β−Ｄ−マンヌロン酸及び４０％のα−Ｌ−グルロン酸、又は３０％の１，４−結合−β−Ｄ−マンヌロン酸及び７０％のα−Ｌ−グルロン酸である。本発明による一実施形態では、イオン架橋されたポリマーは、マンヌロン酸残基よりも多くのグルロン酸残基を有するアルギン酸塩である。特定の実施形態では、イオン架橋されたポリマーは５０％超のグルロン酸残基、例えば６０％超のグルロン酸残基、７０％超のグルロン酸残基、又は８０％超のグルロン酸残基で構成されているアルギン酸塩である。パーセンテージは、アルギン酸塩ポリマー中の残基の総数に基づいて計算される。１００個のグルロン酸残基と４００個のマンヌロン酸残基とを有するイオン架橋されたポリマーは、２０％のグルロン酸残基及び８０％のマンヌロン酸残基で構成されている。
【００９９】
本発明による一実施形態では、アルギン酸塩はマンヌロン酸残基よりも多くのグルロン酸残基を有する。
【０１００】
アルギン酸塩は、例えば安定剤として及び粘度制御のため食品産業で、例えば崩壊剤として医薬品及び化粧品産業で広く使用されている。様々な目的で、それぞれグルロン酸又はマンヌロン酸に富むアルギン酸塩がいずれも利用可能であり（Mancini et al., (1999), Journal of Food Engineering 39, 369-378）、グルロン酸に富むアルギン酸塩を製造するための様々な方法が知られている（国際公開第８６０３７８１号、米国特許第４，９９０，６０１号、米国特許第５，６３９，４６７号を参照されたい）。
【０１０１】
第１の容器
第１の容器は、典型的には、調節されていない化学反応速度論によって引き起こされる損傷を受けやすい生体材料（例えば、精子）を非常に低温（典型的には、固体の二酸化炭素を使用して−８０℃、又は液体窒素を使用して−１９６℃）に冷却することによって保存するプロセスである、生体材料の凍結保存又は低温貯蔵に使用される。十分な低温では、問題の生体材料に損傷を引き起こす可能性がある任意の酵素又は化学的活性は、効果的に停止される。凍結保存法では、凍結中に氷晶の形成によって引き起こされる更なる損傷を引き起こすことなく、低温に到達することが求められる。
【０１０２】
そのため、本発明の第１、第２又は第３の態様による一実施形態では、第１の容器は、−２０℃未満の温度、−８０℃未満の温度又は−１９６℃未満の温度等の非常に低い温度に供されることに適合性のある材料から作られている。かかる温度の例としては、固体の二酸化炭素を使用した−８０℃、又は液体窒素を使用した−１９６℃が挙げられる。材料が非常に低温に供されることに適合性であるためには、材料は、かかる低温での長期保存中に同じ形状、構造及び機能を保持しなければならない。また、第１の容器が第１の容器内に保管される生体材料に反応しないか、又はそうでなければ悪影響を及ぼさないことも重要である。
【０１０３】
第１の容器は、生体材料の凍結保存又は低温貯蔵に使用することができるにもかかわらず、第１の容器はまた、精子の新鮮な調製物に使用することができることも理解されたい。第１の容器が精子の新鮮な調製物に使用され、凍結保存又は低温貯蔵を必要としない場合、第１の容器は非常に低温に供されることに適合性のある材料から作られる必要はないが、第１の容器内に貯蔵される生体材料に反応しないか、又はそうでなければ悪影響を及ぼすことのない任意の材料から作られてもよい。
【０１０４】
本発明による好ましい一実施形態では、第１の容器は、授精ストロー及び授精チューブ等の授精１回用量に対する容器である。授精ストローを図１に示す。これらのストローは、従来、例えば内径１．６ｍｍ又は２．５ｍｍの細いチューブ及び細いチューブ内に挿入されたプラグ４によって形成される。
【０１０５】
充填状態では、プラグはチューブの第１の端部２の近くに配置され、第２の容器内に元々含まれる内容物がストロー内でプラグとチューブの第２の端部３との間に配置される。ストローを充填するため、プラグ４に近いチューブの第１の端部２を、典型的には、真空源と連絡するように置き、一方、第２の端部３を、ストローに導入される物質を含む第２の容器と連絡するように置く。最初にプラグと第２の端部３との間に含まれる空気は、プラグ４を通って吸引され、その間、物質はプラグ４に到達するまでチューブ内を前進するが、プラグ４が液密になるために物質はプラグ４を通過することができない。必要であれば、充填後、ストローをその一方又は両方の端部近くで溶接し、典型的には、−８０℃未満の温度又はより好ましくはおよそ−１９６℃の温度等で冷却して保管する。
【０１０６】
ストローを空にするため、必要に応じて溶接された末端部分を切断し、解凍した後、プラグ４に最も近い端部を経て、プラグ４に重みがかかるまでロッドをチューブに挿入する。このロッドを使用することで、ストロー内に最初に含まれる物質の用量がその端部を通って排出されるように、プラグ４から最も遠い端部に向かってピストンのようにプラグをスライドさせる。
【０１０７】
第２の容器
第２の容器は、生体材料の凍結保存又は低温貯蔵に使用されるとは限らない、すなわち、必ずしも−８０℃又は−１９６℃のような低温に供されないため、第１の容器と同じ又は異なる材料から作られる場合がある。しかしながら、第２の容器はまた、第１の容器に内容物が移される前に、第２の容器内に含まれ得る生体材料と反応しないか、又はそうでなければ悪影響を及ぼさない材料から作られることが重要である。
【０１０８】
放出される材料
本発明による一実施形態では、第２の容器は、放出される材料を更に含む。
【０１０９】
本発明による一実施形態では、放出される材料は、細胞、特に幹細胞のような生体材料、治療剤、診断剤又はそれらの任意の混合物からなる群から選択される。本発明による特に好ましい一実施形態では、放出される材料は精子である。
【０１１０】
拡散バリア（複数の場合もある）
本発明によるキットを使用して持続放出組成物を製造する場合、放出される材料、例えば精子は、典型的には、第２の容器の内容物に添加され、その後、第２の容器の内容物は第１の容器に移される。この手順の結果、第１の容器の１つ以上の拡散バリアが水に曝露され、それによって、水和性拡散バリア（複数の場合もある）が水和拡散バリア（複数の場合もある）へと変換される。水和拡散バリア（複数の場合もある）は、好ましくは活性化剤組成物、不活性架橋剤及び／又は活性架橋剤に透過性である。
【０１１１】
そのため、本発明による一実施形態では、第１及び／又は第２の拡散バリアは、水和性拡散バリアであり、すなわち、拡散バリアは水に接触すると水和される。別の実施形態では、第１及び／又は第２の拡散バリアは、水和性拡散バリアであるが、ただし、第１のポリマー材料は水和性拡散バリアではない。
【０１１２】
本発明による別の実施形態では、第１及び／又は第２の拡散バリアは、フィルム形成ポリマーである。フィルム形成ポリマーは、容器の内表面等の基材上に柔軟で凝集性の連続的な被覆を残す一群の化学物質である。フィルム形成ポリマーの例は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アクリレート、アクリルアミド、及び様々なコポリマーである。
【０１１３】
本発明による別の実施形態では、第１及び／又は第２の拡散バリアはフィルム形成ポリマーであるが、ただし、第１のポリマー材料はフィルム形成ポリマーではない。
【０１１４】
本発明による更なる実施形態では、第１の拡散バリアは、ｉ）アルギン酸塩等の天然ポリマー、デキストラン、デンプン及びアガロースのような他の多糖、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、メチルセルロース及びエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースとしてのセルロース誘導体、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、シェラックのようなタンパク質、ｉｉ）ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）のような合成ポリマー若しくはコポリマー、水溶性ポリアミド、ポリアクリル酸及びポリアクリル酸無水物、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸無水物、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリ−ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、又はｉｉｉ）それらの任意の混合物からなる群から選択される。第１の拡散バリアは、親水性であることが好ましい。
【０１１５】
本発明による一実施形態では、第１の拡散バリアの厚さは５０ｎｍ〜１００μｍの範囲であり、より好ましくは１００ｎｍ〜１０μｍの範囲である。さらに、第１の拡散バリアは、好ましくは均一で可能な限り薄くなければならない。
【０１１６】
良好な結果を達成するため、イオン架橋性生体適合性ポリマーのゲル化を制御することが好ましく、すなわち、ゲルがあまり速く形成されず、放出される材料が持続放出組成物、すなわちイオン架橋された生体適合性ポリマー全体に均一に分布することが好ましい。
【０１１７】
本発明の第１、第２及び第３の態様では、イオン架橋性生体適合性ポリマーの制御されたゲル化は、活性架橋剤の遅延放出及び持続放出によって達成される。
【０１１８】
本発明の第１及び第２の態様では、活性架橋剤の遅延放出及び持続放出は、第２の容器の内容物を第１の容器に移した後、不活性架橋剤が少なくとも１つの拡散バリアによって活性化剤組成物から分離されることを保証することによって達成される。活性化剤組成物が不活性架橋剤に接触すると、不活性架橋剤は活性架橋剤へと変換される。次いで、活性架橋剤は、イオン架橋性生体適合性ポリマーと共にイオン架橋された生体適合性ポリマーを形成する。ゲル化速度は、イオン架橋性生体適合性ポリマーに利用可能な活性架橋剤の量を調節することによって制御することができる。
【０１１９】
本発明の第３の態様では、活性架橋剤の遅延放出及び持続放出は、活性架橋剤が少なくとも１つの拡散バリアによってイオン架橋性生体適合性ポリマーから分離されることを保証することによって達成される。活性架橋剤が拡散バリア（複数の場合もある）を通過し、イオン架橋性生体適合性ポリマーと接触すると、イオン架橋された生体適合性ポリマーが形成される。ゲル化速度は、イオン架橋性生体適合性ポリマーに利用可能な活性架橋剤の量を調節することによって、すなわち、拡散バリア（複数の場合もある）を横切る輸送速度を調節することによって制御することができる。
【０１２０】
本発明の第１及び第２の態様による更に別の実施形態では、第１及び／又は第２の拡散バリアは、活性化剤組成物及び不活性架橋剤が遅延速度で互いに接触することを可能にし、それによって活性架橋剤の遅延放出及び持続放出を保証する。
【０１２１】
本発明の第３の態様による更なる実施形態では、第１及び／又は第２の拡散バリアは、活性架橋剤の遅延放出及び持続放出を可能にする。
【０１２２】
本発明による一実施形態では、活性化剤組成物は、第１及び／又は第２の拡散バリア内に均一に分布される。さらに、乾燥中に相分離が起こらないことが好ましいとされる。
【０１２３】
本発明の第１及び第２の態様による更に別の実施形態では、活性化剤組成物と不活性架橋剤との混合物が、活性架橋剤の形成をもたらし、活性架橋剤は、イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適している。
【０１２４】
活性架橋剤
「活性架橋剤」という用語は、イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適した化合物を指す。活性架橋剤は典型的には、水と接触すると、イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出する化合物である。水と接触するとイオンを放出する化合物は、典型的には水溶性であり、好ましくは１ｇ／Ｌよりも高い、例えば１０ｇ／Ｌより高い、又は１００ｇ／Ｌより高い水（２５℃、ｐＨ＝７）への溶解度を有する化合物である。ＣａＣｌ２及びＢａＣｌ２は、それぞれ、およそ８１１ｇ／Ｌ及び３５８ｇ／Ｌの水（２５℃、ｐＨ＝７）への溶解度を有するため、本発明による活性架橋剤の代表的な例となる。対照的に、ＣａＣＯ３及びＢａＣＯ３は、それぞれおよそ０．０１３ｇ／Ｌ及び０．０２４ｇ／Ｌの水（２５℃、ｐＨ＝７）への溶解度を有するため、本明細書で定義される活性架橋剤ではなく、むしろ不活性架橋剤とされるべきである。
【０１２５】
本発明による一実施形態では、活性架橋剤は、二価陽イオン塩化物、二価陽イオン酢酸塩、二価陽イオンクエン酸塩、好ましくはＣａＣｌ２、ＢａＣｌ２、Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、Ｂａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、クエン酸カルシウム、クエン酸バリウム又はそれらの任意の混合物、より好ましくはＣａＣｌ２、Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、クエン酸カルシウム又はそれらの任意の混合物等の水に可溶性の二価陽イオン塩である。
【０１２６】
本発明による別の実施形態では、第１の容器も第２の容器も、第２の容器の内容物を第１の容器の内容物と混合する前に、いかなる活性架橋剤も含まない。
【０１２７】
不活性架橋剤−活性化剤組成物
「不活性架橋剤」という用語は、イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出することができるようになるために、活性化剤組成物による活性化を必要とする化合物を指す。不活性架橋剤が活性化剤組成物によって活性化されない場合、不活性架橋剤は、イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出することができない。不活性架橋剤は、典型的には２５℃、ｐＨ＞８の水と接触した場合に、イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出しない化合物である。
【０１２８】
本発明による一実施形態では、不活性架橋剤は、１ｇ／Ｌ未満、例えば１０ｇ／Ｌ未満又は１００ｇ／Ｌ未満の水（２５℃、ｐＨ＝７）への溶解度を有する化合物である。ＣａＣｌ２及びＢａＣｌ２は、それぞれ、およそ８１１ｇ／Ｌ及び３５８ｇ／Ｌの水（２５℃、ｐＨ＝７）への溶解度を有するため、本明細書で定義されている不活性架橋剤ではない。しかしながら、ＣａＣＯ３及びＢａＣＯ３は、それぞれおよそ０．０１３ｇ／Ｌ及び０．０２４ｇ／Ｌの水（２５℃、ｐＨ＝７）への溶解度を有するため、本明細書で定義される不活性架橋剤とされるべきである。
【０１２９】
本発明による一実施形態では、不活性架橋剤は、二価陽イオン炭酸塩、より好ましくはＣａＣＯ３、ＢａＣＯ３又はそれらの任意の混合物等の水に不溶性の二価陽イオン塩である。
【０１３０】
ＣａＣＯ３及びＢａＣＯ３のような不活性架橋剤は、イオン架橋性生体適合性ポリマーを酸性ｐＨで架橋するのに適したイオンを放出する。そのため、プロトン供与体として作用し得る任意の化合物は、かかる不活性架橋剤に適した活性化剤組成物となり得る。
【０１３１】
したがって、本発明による一実施形態では、活性化剤組成物は、酸等のプロトン供与体を含み、不活性架橋剤は、プロトン供与体と接触するとイオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出する化合物である。プロトン供与体は水に可溶性であるのが好ましい。
【０１３２】
好ましい実施形態では、プロトン供与体は、ｉ）アスコルビン酸、クエン酸若しくはそれらの任意の混合物等の有機酸、ｉｉ）リン酸、塩酸若しくはそれらの任意の混合物等の無機酸、又はｉｉｉ）有機酸と無機酸との混合物からなる群から選択される。
【０１３３】
本発明による代替の実施形態では、活性化剤組成物は、水と接触すると酸等のプロトン供与体へと変換される化合物を含む。かかる化合物の代表例は、無機酸無水物、有機酸無水物、及びグルコノデルタラクトン等のラクトン、又はそれらの任意の混合物である。より好ましい実施形態では、活性化剤組成物は、有機酸無水物、グルコノデルタラクトン又はそれらの任意の混合物であり、更に好ましくは、活性化剤組成物は、グルコノデルタラクトン（グルコノ−δ−ラクトン）を含む。
【０１３４】
グルコノ−δ−ラクトンは、溶液中でゆっくりと加水分解してグルコン酸を形成する単純な糖である。この加水分解により、例えば、ＣａＣＯ３又はＢａＣＯ３等の二価陽イオン炭酸塩から炭酸が形成され得るポイントまで溶液ｐＨが徐々に低下して、活性イオンを放出してゲル化を誘発する。グルコノ−δ−ラクトンの加水分解速度、したがってゲル化の開始は、例えば溶液の温度変化によって変化する場合がある。活性化された架橋剤−イオン架橋性生体適合性ポリマーの接触面でゲル化が進行すると、架橋されたポリマー高分子の体積が減少し、順次残りのポリマー溶液の有効濃度が低下する。
【０１３５】
活性化剤組成物の別の例は、国際公開第２０１３／０７６２３２号に記載され、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。該文献で開示されている活性化システムは、ヒドロラーゼ及びヒドロラーゼによって加水分解可能な基質の使用を伴う。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「ヒドロラーゼ」という用語は、基質（複数の場合もある）を含む溶液とヒドロラーゼを含む別の溶液とを混合する際にＨ３Ｏ＋を産生することを可能にするヒドロラーゼを包含することを意味する。本発明の一実施形態によれば、ヒドロラーゼはリパーゼである。本発明の更に別の実施形態によれば、リパーゼはアシルヒドロラーゼであり、より好ましくは、例えば酵母カンジダ・ルゴサから単離されたトリアシルグリセロールリパーゼ等のトリアシルグリセロールリパーゼである。好適なリパーゼは、Sigma-Aldrich Co. LLC（Ｌ１７５４−Ｔｙｐｅ  ＶＩＩ又はＬ３００１  Ｔｙｐｅ  Ｉ、ＣＡＳ番号９００１−６２−１）から入手可能である。
【０１３７】
本発明によれば、基質と結合する際にＨ３Ｏ＋の生成が生じる任意のヒドロラーゼを使用することができることが理解される。そのため、使用され得るヒドロラーゼは、カルボン酸エステルヒドロラーゼ、オキサロアセターゼ、グリコシダーゼ、エーテルヒドロラーゼ及びキチンデアセチラーゼ等の鎖状アミド中のペプチド結合以外の炭素−窒素結合に作用するヒドロラーゼからなる群から選択され得る。
【０１３８】
カルボン酸エステルヒドロラーゼの非限定的な例は、カルボキシルエステラーゼ、トリグリセロールリパーゼ、アセチルエステラーゼ、ステロールエステラーゼ、Ｌ−アラビノノラクトナーゼ、グルコノラクトナーゼ、アシルグリセロールリパーゼ、ｇ−アセチルグルコースデアセチラーゼ、リポタンパク質リパーゼ、脂肪アシルエチルエステルシンターゼ、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）デポリメラーゼ、及びジアシルグリセロールアシルヒドロラーゼである。オキサロアセターゼの非限定的な例は、フマリルアセトアセターゼ、アシルピルビン酸ヒドロラーゼ、及びアセチルピルビン酸ヒドロラーゼである。
【０１３９】
グリコシダーゼの非限定的な例は、ａ−グルクロニダーゼである。エーテルヒドロラーゼの非限定的な例は、イソコリスマターゼである。
【０１４０】
ヒドロラーゼの基質は、ヒドロラーゼへの結合によってＨ３Ｏ＋の産生をもたらす基質である。よって、基質は、本発明により使用されるヒドロラーゼの種類に応じて変化し得る。
【０１４１】
本発明による好適な基質は、カルボン酸等の有機酸のエステルである。
【０１４２】
本発明の一実施形態によれば、基質は式Ｉ：
【化１】
2021525607.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、同一又は異なって、直鎖又は分岐鎖、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル鎖、例えば、メタノン、エタノン、アセトン、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノン、ヘプタノン、オクタノン、ノナノン、デカノン、ドデカノン等を表す）の化合物である。一実施形態によれば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれメタノンである。別の実施形態によれば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれエタノンである。更に別の実施形態によれば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はアセトンである。式Ｉの基質は、本発明によるヒドロラーゼとしてトリアシルグリセロールリパーゼを使用する場合に特に有用である。基質への結合により、上記式Ｉのエステルはグリセロールとカルボン酸とに分割され、すなわち、そのようにしてＨ３Ｏ＋を提供する。
【０１４３】
アルキルカルボニル鎖は、分岐鎖であってもよく、又は非分岐鎖であってもよい。さらに、アルキルカルボニル鎖は、置換されていてもよく、又は非置換であってもよい。当業者であれば、本明細書の教示に基づき、式Ｉによって包含される様々な基質を使用することができ、本明細書の教示に基づき、本明細書により使用される適切な基質を選択し得ることを認めるであろう。よって、当業者であれば、アルキル鎖の長さを、基質のグリセロール及びカルボン酸を産生する酵素の能力に影響を及ぼすことなく変化させることができ、そのようにしてＨ３Ｏ＋イオンの放出がもたらされることを認めるであろう。
【０１４４】
本発明の好ましい実施形態によれば、基質は、下記式のトリアセチン、トリプロピオニン及びトリブチリンの群から選択される。
【化２】
2021525607.tif 000003
【０１４５】
よって、一実施形態によれば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はＣ１〜Ｃ４のアルキルカルボニルを表す。
【０１４６】
本発明の更に別の実施形態によれば、存在する基質は、トリプロピオニン及びトリブチリンからなる群から選択される。
【０１４７】
本発明によれば、上記に規定されるヒドロラーゼ及び基質の混合は、Ｈ３Ｏ＋の産生をもたらす。さらに、上記Ｈ３Ｏ＋は、不活性架橋剤からのイオンの放出をもたらす。
【０１４８】
ヒドロラーゼは、不活性架橋剤を直接活性化しないにもかかわらず、ヒドロラーゼが不活性架橋剤の活性化をもたらす一連の事象を開始することから、それでもヒドロラーゼは活性化剤組成物となると考えることができる。そのため、活性化剤組成物は、不活性架橋剤を（例えば、プロトン供与体を用いて）直接活性化してもよく、又は不活性架橋剤を（例えば、ヒドロラーゼ及びその基質を用いて）間接的に活性化してもよい。
【０１４９】
本発明による好ましい実施形態では、活性化剤組成物は、不活性架橋剤の活性化をもたらす一連の事象を開始することにより、不活性架橋剤を間接的に活性化する。かかる活性化剤組成物の一例は、酸が形成され、順次、例えばＣａＣＯ３と相互作用して、該炭酸塩からの遊離カルシウムイオンの放出をもたらす、基質を加水分解するヒドロラーゼである。不活性架橋剤を間接的に活性化する活性化剤組成物の別の例は、不活性架橋剤を活性化することができるようになる前に、酸形態へと加水分解される必要があるグルコノ−δ−ラクトンである。
【０１５０】
本発明による一実施形態では、ヒドロラーゼ及びその基質は、第１の容器の内容物を第２の容器の内容物と混合する前は、別々の容器内に含まれる。本発明による別の実施形態では、ヒドロラーゼ及びその基質は、同じ容器に含まれてもよいが、ただし、２つの化合物は、例えば第１の拡散バリア、第２の拡散バリア又はそれらの任意の混合物等の拡散バリアによって分離される。
【０１５１】
本発明による一実施形態では、活性化剤組成物はヒドロラーゼを含む。ヒドロラーゼがその目的を果たすためには、ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質は第１及び／又は第２の容器のいずれかに存在しなければならないが、ただし、第１の容器の内容物が第２の容器の内容物と混合される前は、基質はヒドロラーゼと接触していない。
【０１５２】
本発明による別の実施形態では、活性化剤組成物は、ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を含む。基質がその目的を果たすためには、ヒドロラーゼは第１及び／又は第２の容器のいずれかに存在しなければならないが、ただし、第１の容器の内容物が第２の容器の内容物と混合される前は、基質はヒドロラーゼと接触していない。
【０１５３】
本発明による更なる実施形態では、第１及び／又は第２の拡散バリアは、拡散バリア及び活性化剤組成物の両方として作用し得る。これは、例えば酸等のプロトン供与体である拡散バリアを選択すること、又は水等の液体に接触するとプロトン供与体へと変換される拡散バリアを選択することによって達成され得る。
【０１５４】
そのため、本発明による一実施形態では、第１及び／又は第２の拡散バリアは活性化剤組成物である。
【０１５５】
本発明による別の実施形態では、第１及び／又は第２の拡散バリアは、酸等のプロトン供与体であるか、又は水と接触するとプロトン供与体へと変換される。この特性を有する拡散バリアは、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸無水物、ポリメタクリル酸無水物又はそれらの任意の混合物からなる群から選択され得る。
【０１５６】
本発明を総合的に説明した上で、実施例を参照することにより、更なる理解を得ることができ、これらの実施例は、本明細書において説明のみを目的として提供され、別段の定めがない限り限定を意図するものではない。
【実施例】
【０１５７】
実施例１：授精ストロー内のアルギン酸ゲルにおけるウシ精子の調製
材料
以下の化学物質を使用した：Sigma-Aldrich（アメリカ、セントルイス）よりトリズマ塩酸塩、ＥＤＴＡ、ＮａＨＣＯ３、ＮａＣｌ、ＮａＯＨ、グリセロール（９９％超）、フルクトース、アスコルビン酸及びクエン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）。Sekisui Specialty Chemicals Europe S.L.（スペイン、タラゴナ）よりポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、Ｓｅｌｖｏｌ  ５２３／Ｓｅｌｖｏｌ  ３２５。Apro（ノルウェー、オスロ）よりグルコース無水物。Brenntag Specialties（アメリカ、サウスプレインフィールド）よりＶｉＣａｌｉｔｙ  ＡｌｂａＦｉｌ炭酸カルシウム、及びNovamatrix A/S（ノルウェー、ドランメン）よりアルギン酸ナトリウム（ＵＰ−ＬＶＧ）。
【０１５８】
精子の供給源
ノルウェー、トロンハイムのハルシュタインガード及びシュタンゲのストーレリーのGeno施設でウシ精子を採取した。
【０１５９】
バッファー溶液
以下のエクステンダー溶液を使用した：
精子の一次希釈用エクステンダー：１．４５ｇ／ｌのトリズマ塩酸塩グルコース、０．４ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム、１ｇ／ｌのフルクトース、及び２００ｍｌ／ｌの卵黄。ＮａＯＨを添加して溶液のｐＨを６．４に調整した。
精子の二次希釈用エクステンダー溶液：１ｇ／ｌのＶｉＣａｌｉｔｙ  Ａｌｂａｆｉｌ炭酸カルシウム、５４ｇ／ｌのフルクトース、１７０ｇ／ｌのグリセロール及び１０ｇ／ｌのＵＰ−ＬＶＧアルギン酸ナトリウム。いずれのエクステンダーもＥＵ  ｄｉｒ  ８８／４０７で要求される最終濃度を少なくとも与える標準抗生物質カクテルを含有する。
【０１６０】
授精ストローのコーティング：
授精ストロー（「ミディアム」タイプ）を、１３．６μｍｏｌ／ｍＬのアスコルビン酸水溶液と水中３％ＰＶＡとの混合物、又は１３．６μｍｏｌ／ｍＬのアスコルビン酸水溶液と水中１．５％ＣＭＣとの混合物でフラッシングすることによってコーティングした。ストローをコーティング溶液でフラッシングした後、室温の真空チャンバー内で乾燥させた。
【０１６１】
ウシ精子の希釈及び固定化
Geno施設でウシ精子を採取した。採取直後に、一次希釈用エクステンダー溶液中１ｍｌ当たり１３３×１０６細胞の濃度まで精子を希釈した。次いで、得られた精子を含有する溶液を４℃まで冷却した。４℃まで冷却した後、溶液を等容量の二次希釈用エクステンダー溶液と混合した。
【０１６２】
次いで、精子を含有する溶液を、上記のとおりアスコルビン酸及びＰＶＡ、又はアスコルビン酸及びＣＭＣのいずれかでコーティングされた授精ストローに移した。授精ストローを４℃に保持し、１時間、３時間、５時間及び２４時間後にゲル化及びｐＨについて内容物を確認した。
【０１６３】
ゲル化及びゲル強度及び精子の運動性の評価
両方のタイプのコーティングについて、ストロー内の液体の粘度の増加を１時間後に観察した。３時間後、ストロー内にゲルが形成され、２４時間後、ストロー内で堅固なゲルが観察された。
【０１６４】
精子の運動性を、顕微鏡的判定を用いて評価した。運動性の測定前に、授精ストローの内容物をエッペンドルフチューブ内の０．９ｍｌの改変ＩＶＴ溶液に加え、チューブをおよそ１０分間チューブタンブラー上で注意深く振盪することにより、アルギン酸ゲルを改変ＩＶＴ溶液（３ｇ／ｌのグルコース、２０ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム、２．１ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３、１．１６ｇ／ｌのＮａＣｌ、３ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３５）中で液化した。運動性の顕微鏡的判定の前に、チューブを３７℃のヒートブロックにおいて最低１５分間予熱した。およそ３μｌの溶液を予熱した顕微鏡スライドに添加し、光学顕微鏡を使用して直ちに検査した。各試料中の運動性精子の数を最近傍５％間隔と推定した。
【０１６５】
両方のタイプのコーティングを有するストローの充填から１時間後に評価した場合におよそ８５％の精子が運動性であり、５時間後にはおよそ７０％の精子が両方のタイプのストローで運動性であった。２４時間後に評価すると、アスコルビン酸及びＰＶＡでコーティングされたストローではおよそ５０％の精子が運動性であったのに対し、アスコルビン酸及びＣＭＣでコーティングされたストローでは６０％の精子が運動性であった。
【０１６６】
実施例２：固定化された精子細胞を用いた異なるアルギン酸ゲルの機械的強度の判定
材料
以下の化学物質を使用した：Sigma-Aldrich（アメリカ、セントルイス）よりトリズマ塩酸塩、ＥＤＴＡ、Ｄ−（＋）−グルコン酸δ−ラクトン、ＮａＨＣＯ３、ＮａＣｌ、グリセロール（９９％超）、フルクトース及びクエン酸ナトリウム。Apro（ノルウェー、オスロ）よりグルコース無水物。KSL staubtechnik gmbh（ドイツ、ラウインゲン）よりＥｓｋａｌ５００炭酸カルシウム、及びNovaMatrix, FMC BioPolymer AS（ノルウェー、サンドビカ）よりアルギン酸ナトリウム（ＵＰ  ＬＶＧ及びＵＰ  ＶＬＶＧ）。標準授精ストロー０．２５ｍｌ（Ｆｒｅｎｃｈ  ｍｉｎｉ  ｓｔｒａｗ（IMV、フランスのレーグル））。
【０１６７】
精子の供給源
ノルウェー、トロンハイムのハルシュタインガード及びシュタンゲのストーレリーのGeno施設でウシ精子を採取した。
【０１６８】
バッファー溶液
以下のエクステンダー溶液を使用した：
精子の一次希釈用エクステンダー：１．４５ｇ／ｌのトリズマ塩酸塩グルコース、０．４ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム、１ｇ／ｌのフルクトース、及び２００ｍｌ／ｌの卵黄。ＮａＯＨを添加して溶液のｐＨを６．４に調整した。
精子の二次希釈用エクステンダー溶液：０．５ｇ／ｌのＥｓｋａｌ５００炭酸カルシウム、５４ｇ／ｌのフルクトース、１７０ｇ／ｌのグリセロール及び１２ｇ／ｌのアルギン酸ナトリウム（ＵＰ  ＬＶＧ及びＵＰ  ＶＬＶＧの混合物）。いずれのエクステンダーもＥＵ  ｄｉｒ  ８８／４０７で要求される最終濃度を少なくとも与える標準抗生物質カクテルを含有する。
【０１６９】
ウシ精子の希釈、固定化及び低温貯蔵
Geno施設でウシ精子を採取した。採取直後に、一次希釈用エクステンダー溶液中１ｍｌ当たり１３３×１０６細胞の濃度まで精子を希釈した。次いで、得られた精子を含有する溶液を４℃まで冷却した。４℃まで冷却した後、溶液を等容量の二次希釈用エクステンダー溶液と混合した。ゲル化を開始するため、混合物にＤ−（＋）−グルコン酸δ−ラクトンを最終濃度５５ｍＭまで加え、精液ストローに満たした。ストローを４℃でおよそ４．５時間保管し、低温貯蔵の標準的な手順に従って液体Ｎ２で凍結させた。様々な機械的強度のアルギン酸ゲルを生成するため、二次希釈用溶液中のＵＰ  ＬＶＧ及びＵＰ  ＶＬＶＧの比を変化させた。
【０１７０】
機械的強度の評価
処理ごとに１０本の冷凍精液ストローを３７℃で１分間解凍し、続いて、密接に接触させて平行に整列させ、金属板の中心に置いた。精液ストローに由来するゲルの機械的強度を定量するため、Ｐ／３５プローブ（３５ｍｍ  ＤＩＡ  ＣＹＬＩＮＤＥＲ  ＡＬＵＭＩＮＩＵＭ）を搭載したテクスチャアナライザＴＡ  ＸＴ  Ｐｌｕｓ（英国、サリー州ゴダルマイニングのStable micro systems）を使用した。測定（テストモード圧縮）を、１ｋｇロードセルを使用して試験速度０．１ｍｍ／秒で８０％歪みに対して行った。機械的強度を、ゲルの変形に対する力の初期線形傾斜（０．０５ｍｍ〜０．１ｍｍ）として定量した。実施例１のように手動評価によって弱い又は軟質と特徴付けられたストローに由来するゲルの機械的強度は、４３ｇ／ｍｍと測定された。手動評価によって強いと特徴付けられたストローに由来するゲルの機械的強度は、９０ｇ／ｍｍと測定された。
【０１７１】
実施例３：コーティングされた授精ストロー
コーティングされた授精ストローの調製
材料：Sekesui Specialty Chemicals Europe S.L.（スペイン、タラゴナ））よりポリビニルアルコールＳｅｌｖｏｌ  ５２３及びＳｅｌｖｏｌ  ３２５、CP Kelcoよりカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）：ＣＥＫＯＬ、セルロースガム、カルボキシメチルセルロースナトリウムＥ４６６、Ashland Wilmington（アメリカ、デラウェア）よりメチルセルロースとヒドロキシプロピルメチルセルロースとの混合物Ｂｅｎｅｃｅｌ  ＭＰ  ８１２Ｗ、Dow Chemical Companyよりメチルセルロースとヒドロキシプロピルメチルセルロースとの混合物、ヒプロメロースＭｅｔｈｏｃｅｌ  Ｋ１００、Sigma Aldrichよりアスコルビン酸、VWRより塩酸ＡｎａｌａＲ  ＮＯＲＭＡＰＵＲ（商標）。
【０１７２】
１）授精ストローを、１３．６μｍｏｌ／ｍＬのアスコルビン酸水溶液と、水中３％ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）又は５％ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）との混合物でフラッシングすることによってコーティングした。
２）授精ストローを、１３．６μｍｏｌ／ｍＬのアスコルビン酸水溶液と水中１．５％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）との混合物（コーティング溶液）でフラッシングすることによってコーティングした。ストローをコーティング溶液でフラッシングした後、室温にて真空で動かしながら（in motion）乾燥させた。
３）授精ストローを、１３．６μｍｏｌ／ｍＬのアスコルビン酸水溶液と水中１．５％Ｂｅｎｅｃｅｌ  ＭＰ  ８１２  Ｗ（メチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース）との混合物、又は１３．６μｍｏｌ／ｍＬのアスコルビン酸水溶液と水中１．５％Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｋ１００（メチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース−ヒプロメロース）との混合物（コーティング溶液）でフラッシングすることによってコーティングした。ストローをコーティング溶液でフラッシングした後、室温にて真空で動かしながら乾燥させた。
４）授精ストローを、３５μｍｏｌ／ｍＬの塩酸水溶液と、水中３％ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）又は水中５％ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）との混合物（コーティング溶液）でフラッシングすることによりコーティングした。ストローをコーティング溶液でフラッシングした後、室温にて真空で動かしながら乾燥させた。
【０１７３】
ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、Ｂｅｎｅｃｅｌ  ＭＰ  ８１２  Ｗ（メチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース）、及びＭｅｔｈｏｃｅｌ  Ｋ１００（メチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース−ヒプロメロース）等のセルロース系ポリマーには、塩酸のような強酸との相溶性がない。このタイプのポリマーでは、アスコルビン酸又はグルクロン酸のようなｐＫａ＞３の弱酸が適している。強酸はセルロース系ポリマーと反応し、ポリマーマトリクスの分解又は架橋につながる。
【０１７４】
精子の供給源
ノルウェー、シュタンゲのストーレリーのGeno施設でウシ精子を採取した。
【０１７５】
バッファー溶液
以下のエクステンダー溶液を使用した：
精子の一次希釈用エクステンダー：１．４５ｇ／ｌのトリズマ塩酸塩グルコース、０．４ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム、１ｇ／ｌのフルクトース、及び２００ｍｌ／ｌの卵黄。ＮａＯＨを添加して溶液のｐＨを６．４に調整した。
精子の二次希釈用エクステンダー溶液：５ｇ／ｌのＶｉＣａｌｉｔｙ  Ｅｘｔｒａ  Ｌｉｇｈｔ炭酸カルシウム（ペンシルベニア州ベスレヘムのSpeciality Minerals inc）、５４ｇ／ｌのフルクトース、１７０ｇ／ｌのグリセロール、及び１０ｇ／ｌのＵＰ−ＬＶＧアルギン酸ナトリウム（ノルウェー、サンドビカのNovaMatrix）。いずれのエクステンダーも、ＥＵ  ｄｉｒ  ８８／４０７で要求される最終濃度を少なくとも与える標準抗生物質カクテルを含有する。
【０１７６】
ウシ精子の希釈及び固定化
Geno施設でウシ精子を採取した。採取直後に、一次希釈用エクステンダー溶液中１ｍｌ当たり１３３×１０６細胞の濃度まで精子を希釈した。次いで、得られた精子を含有する溶液を４℃まで冷却した。４℃まで冷却した後、溶液を等容量の二次希釈用エクステンダー溶液と混合した。
【０１７７】
次いで、精子を含有する溶液を、コーティングされた授精ストローの調製のポイント１〜４のもとで上記のようにコーティングされた授精ストローに移した。授精ストローを、ゲル形成のために４℃で保管した。
【０１７８】
ゲル化及びゲル強度及び精子の運動性の評価
ストローをゲルの形成について調べ、固定化された精子の生存率を４℃で３時間及び２４時間保管した後に評価した。結果を表１に要約する。充填から３時間後、全てのストロー内にゲルが形成された。ストロー内のゲル強度の一部のみ又は軽微な変化が、３時間〜２４時間の間に観察された。
【０１７９】
精子の運動性を、顕微鏡的判定を用いて評価した。運動性の測定前に、授精ストローの内容物をエッペンドルフチューブ内の０．９ｍｌの改変ＩＶＴ溶液に加え、チューブをおよそ１０分間チューブタンブラー上で注意深く振盪することにより、アルギン酸ゲルを改変ＩＶＴ溶液（３ｇ／ｌのグルコース、２０ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム、２．１ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３、１．１６ｇ／ｌのＮａＣｌ、３ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３５）中で液化した。運動性の顕微鏡的判定の前に、チューブを３７℃のヒートブロックにおいて最低１５分間予熱した。およそ３μｌの溶液を予熱した顕微鏡スライドに添加し、光学顕微鏡を使用して直ちに検査した。各試料中の運動性精子の数を最近傍５％間隔と推定した。
【０１８０】
結果を表１に要約する。試験した全ストローを用いて、ストローを充填してから３時間後に評価すると、６０％〜８０％の精子が運動性であった。２４時間後に評価すると、およそ４０％〜６５％の精子が試験したストローで運動性であった。
【０１８１】
【表１】
2021525607.tif 000004
【０１８２】
実施例４：ＰＶＣストローからの活性化剤組成物の放出
コーティングされた授精ストローの調製
材料：スウェーデンのINEOS Compoundsより医療グレードのポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）ドライブレンド（ＮＯＲＶＩＮＹＬ  ＨＡ．９７．００．ＰＪ．１９０２０．１）、及びSigma Aldrichよりコハク酸無水物。
【０１８３】
ラボコンパウンダーＫＥＴＳＥ  ２０／４０  ＥＣ押出し機を使用して、押出しＰＶＣストローを調製した。ストロー製造用のチュービングダイヘッドは、内径２ｍｍ及び外径２．５ｍｍであった。チュービングダイヘッドに接続している押出し機は、６つの加熱ゾーンを有する。バレルの全長は８００ｍｍであるが、ＰＶＣの劣化を防ぐために加工長を４００ｍｍに短縮した。
【０１８４】
コハク酸無水物を、ＰＶＣにそれぞれ１重量％及び１．５重量％の量で添加した。全ての原料を室温であらかじめ混合し、押出し機のフィーダーに供給した。１９０℃でブレンドを溶かし、混合した。押出しストローを冷却し、水浴中で収集した。
【０１８５】
押出しストローを、授精ストローの表面にあったコハク酸無水物を除去するために、追加の水で直ちに洗浄し、使用前に授精ストローを乾燥させた。
【０１８６】
精子の供給源
ノルウェー、シュタンゲのストーレリーのGeno施設でウシ精子を採取した。
【０１８７】
バッファー溶液
以下のエクステンダー溶液を使用した：
精子の一次希釈用エクステンダー：１．４５ｇ／ｌのトリズマ塩酸塩グルコース、０．４ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム、１ｇ／ｌのフルクトース、及び２００ｍｌ／ｌの卵黄。ＮａＯＨを添加して溶液のｐＨを６．４に調整した。
精子の二次希釈用エクステンダー溶液：５ｇ／ｌのＶｉＣａｌｉｔｙ  Ｅｘｔｒａ  Ｌｉｇｈｔ炭酸カルシウム（ペンシルベニア州ベスレヘムのSpeciality Minerals inc）、５４ｇ／ｌのフルクトース、１７０ｇ／ｌのグリセロール、及び１０ｇ／ｌのＵＰ−ＬＶＧアルギン酸ナトリウム（ノルウェー、サンドビカのNovaMatrix）。いずれのエクステンダーも、ＥＵ  ｄｉｒ  ８８／４０７で要求される最終濃度を少なくとも与える標準抗生物質カクテルを含有する。
【０１８８】
ウシ精子の希釈及び固定化
Geno施設でウシ精子を採取した。採取直後に、一次希釈用エクステンダー溶液中１ｍｌ当たり１３３×１０６細胞の濃度まで精子を希釈した。次いで、得られた精子を含有する溶液を４℃まで冷却した。４℃まで冷却した後、溶液を等容量の二次希釈用エクステンダー溶液と混合した。
【０１８９】
次いで、精子を含有する溶液を、それぞれ１重量％及び１．５重量％のコハク酸無水物と共に授精ストローに移した。授精ストローを、ゲル形成のために４℃で保管した。
【０１９０】
ゲル化及びゲル強度及び精子の運動性の評価
ストローをゲルの形成について調べ、固定化された精子の生存率を４℃で３時間及び２４時間保管した後に評価した。結果を表２に要約する。充填から３時間後、試験した両方のタイプのストロー内にゲルが形成された。ストロー内では、４℃で３時間〜２４時間のインキュベーションでゲル強度のわずかな変化のみが観察された。
【０１９１】
精子の運動性を、顕微鏡的判定を用いて評価した。運動性の測定前に、授精ストローの内容物をエッペンドルフチューブ内の０．９ｍｌの改変ＩＶＴ溶液に加え、チューブをおよそ１０分間チューブタンブラー上で注意深く振盪することにより、アルギン酸ゲルを改変ＩＶＴ溶液（３ｇ／ｌのグルコース、２０ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム、２．１ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３、１．１６ｇ／ｌのＮａＣｌ、３ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３５）中で液化した。運動性の顕微鏡的判定の前に、チューブを３７℃のヒートブロックにおいて最低１５分間予熱した。およそ３μｌの溶液を予熱した顕微鏡スライドに添加し、光学顕微鏡を使用して直ちに検査した。各試料中の運動性精子の数を最近傍５％間隔と推定した。
【０１９２】
結果を表２に要約する。試験した全ストローを用いて、ストローを充填してから３時間後に評価すると、６０％〜７０％の精子が運動性であった。２４時間後に評価すると、およそ５０％〜６０％の精子が試験したストローで運動性であった。
【０１９３】
【表２】
2021525607.tif 000005
【図１】
2021525607.tif 000006
【図２】
2021525607.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月5日(2021.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
持続放出組成物を調製するのに適したキットであって、該キットが第１の容器及び第２の容器を備え、前記第１の容器が活性化剤組成物と、第１の拡散バリア又は第２の拡散バリアのいずれかと、を含み、前記第２の容器がイオン架橋性生体適合性ポリマーと、不活性架橋剤と、任意に、放出される材料とを含み、前記第１及び／又は第２の拡散バリアが、前記活性化剤組成物及び前記不活性架橋剤が遅延速度で互いに接触することを可能にすることにより、活性架橋剤の遅延放出及び持続放出を保証し、
ここで、
前記第１の容器及び／又は前記第２の容器は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーが前記第１の容器及び／又は前記第２の容器全体にわたって前記活性架橋剤と接触することを可能にするサイズ及び形態であり、それによって架橋された生体適合性ポリマーが前記第１の容器及び／又は前記第２の容器全体にわたって存在することを保証し、
前記イオン架橋性生体適合性ポリマーは、二価陽イオン架橋性生体適合性ポリマーであり、
「活性架橋剤」という用語は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを指し、
「不活性架橋剤」という用語は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出することができるようになるために、前記活性化剤組成物による活性化を必要とする化合物を指し、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記第１の拡散バリアと混合された前記活性化剤組成物は、前記第１の容器の内表面にコーティングされるか、又は、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記活性化剤組成物及び前記第１の拡散バリアは、前記第１の容器の内表面に別々の層でコーティングされ、それによって内表面層及び中間層を形成し、前記中間層は前記活性化剤組成物を含むか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記活性化剤組成物、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記活性化剤組成物、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料へと押出され、前記第２の拡散バリアは前記第１のポリマー、前記第２のポリマー若しくはそれらの組み合わせであるか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記活性化剤組成物、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記活性化剤組成物、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物と混合されている第３のポリマー材料が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料と共押出しされ、それによって内表面層及び外表面層を形成し、前記内表面層は前記活性化剤組成物を含み、前記第２の拡散バリアは、前記第２のポリマー、前記第３のポリマー又はそれらの組み合わせである、キット。
【請求項２】
持続放出組成物を調製するのに適したキットであって、該キットが第１の容器及び第２の容器を備え、前記第１の容器が不活性架橋剤と、第１の拡散バリア又は第２の拡散バリアのいずれかと、を含み、前記第２の容器がイオン架橋性生体適合性ポリマーと、活性化剤組成物と、任意に、放出される材料とを含み、前記第１及び／又は第２の拡散バリアが、前記活性化剤組成物及び前記不活性架橋剤が遅延速度で互いに接触することを可能にすることにより、活性架橋剤の遅延放出及び持続放出を保証し、
ここで、
前記第１の容器及び／又は前記第２の容器は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーが前記第１の容器及び／又は前記第２の容器全体にわたって前記活性架橋剤と接触することを可能にするサイズ及び形態であり、それによって架橋された生体適合性ポリマーが前記第１の容器及び／又は前記第２の容器全体にわたって存在することを保証し、
前記イオン架橋性生体適合性ポリマーは、二価陽イオン架橋性生体適合性ポリマーであり、
「活性架橋剤」という用語は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを指し、
「不活性架橋剤」という用語は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出することができるようになるために、前記活性化剤組成物による活性化を必要とする化合物を指し、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記第１の拡散バリアと混合された前記不活性架橋剤は、前記第１の容器の内表面にコーティングされるか、又は、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記不活性架橋剤及び前記第１の拡散バリアは、前記第１の容器の内表面に別々の層でコーティングされ、それによって内表面層及び中間層を形成し、前記中間層は前記不活性架橋剤を含むか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記不活性架橋剤、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記不活性架橋剤、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料へと押出され、前記第２の拡散バリアは前記第１のポリマー、前記第２のポリマー若しくはそれらの組み合わせであるか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記不活性架橋剤、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記不活性架橋剤、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物と混合されている第３のポリマー材料が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料と共押出しされ、それによって、内表面層及び外表面層を形成し、前記内表面層が不活性架橋剤を含み、前記第２の拡散バリアが前記第２のポリマー、前記第３のポリマー若しくはそれらの組み合わせである、キット。
【請求項３】
持続放出組成物を調製するのに適したキットであって、該キットが第１の容器及び第２の容器を備え、前記第１の容器が活性架橋剤と、第１の拡散バリア又は第２の拡散バリアのいずれかと、を含み、前記第２の容器がイオン架橋性生体適合性ポリマーと、任意に、放出される材料とを含み、前記第１及び／又は第２の拡散バリアが、活性架橋剤の遅延放出及び持続放出を可能とし、
ここで、
前記第１の容器及び／又は前記第２の容器は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーが前記第１の容器及び／又は前記第２の容器全体にわたって前記活性架橋剤と接触することを可能にするサイズ及び形態であり、それによって架橋された生体適合性ポリマーが前記第１の容器及び／又は前記第２の容器全体にわたって存在することを保証し、
前記イオン架橋性生体適合性ポリマーは、二価陽イオン架橋性生体適合性ポリマーであり、
「活性架橋剤」という用語は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを指し、
「不活性架橋剤」という用語は、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出することができるようになるために、前記活性化剤組成物による活性化を必要とする化合物を指し、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記第１の拡散バリアと混合された前記活性架橋剤は、前記第１の容器の内表面にコーティングされるか、又は、
前記第１の容器は前記第１の拡散バリアを含み、前記活性架橋剤及び前記第１の拡散バリアは、前記第１の容器の内表面に別々の層でコーティングされ、それによって内表面層及び中間層を形成し、前記中間層は前記活性架橋剤を含むか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記活性架橋剤、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記活性架橋剤、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料へと押出され、前記第２の拡散バリアは前記第１のポリマー、前記第２のポリマー若しくはそれらの組み合わせであるか、又は、
前記第１の容器は前記第２の拡散バリアを含み、第１のポリマー材料から作られ、ｉ）前記活性架橋剤、ｉｉ）第２のポリマー材料内に包埋された若しくはカプセル封入された前記活性架橋剤、又はｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との混合物と混合されている第３のポリマー材料が、前記第１の容器の製造中に前記第１のポリマー材料と共押出しされ、それによって、内表面層及び外表面層を形成し、前記内表面層が前記活性架橋剤を含み、前記第２の拡散バリアが前記第２のポリマー、前記第３のポリマー若しくはそれらの組み合わせである、キット。
【請求項４】
前記イオン架橋性生体適合性ポリマーがイオン架橋性アルギン酸塩である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５】
前記アルギン酸塩が、マンヌロン酸残基よりも多くのグルロン酸残基を有する、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記放出される材料が、生体材料、治療剤、診断剤又はそれらの任意の混合物からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７】
前記放出される材料が精子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８】
前記第１の容器が授精１回用量に対する容器である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９】
前記第１の拡散バリアが、ｉ）天然ポリマー、ｉｉ）合成ポリマー若しくはコポリマー、又はｉｉｉ）それらの任意の混合物からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０】
前記活性化剤組成物と不活性架橋剤との混合物が、活性架橋剤の形成をもたらし、前記活性架橋剤が、前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適している、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項１１】
前記不活性架橋剤が水に不溶性の二価陽イオン塩である、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項１２】
前記活性化剤組成物が、前記不活性架橋剤を活性架橋剤へと変換することができる少なくとも１つの化合物を含み、前記活性架橋剤が前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適している、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項１３】
前記活性化剤組成物がプロトン供与体を含み、前記不活性架橋剤が、前記プロトン供与体と接触すると前記イオン架橋性生体適合性ポリマーを架橋するのに適したイオンを放出する化合物である、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項１４】
前記活性化剤組成物が、水と接触するとプロトン供与体へと変換される化合物を含む、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項１５】
水と接触するとプロトン供与体へと変換される前記化合物が、無機酸無水物、有機酸無水物及びラクトン、又はそれらの任意の混合物からなる群から選択される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記第１及び第２の拡散バリアは同一又は異なるが、ただし、前記第２の拡散バリアが押出し成形に適合性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
前記イオン架橋性生体適合性ポリマーがイオン架橋性アルギン酸塩であり、前記アルギン酸塩がマンヌロン酸残基よりも多くのグルロン酸残基を有し、
前記放出される材料が精子であり、
前記第１の容器が授精１回用量に対する容器である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１８】
前記第１の容器及び／又は第２の容器が、内径１ｃｍ未満のチューブの形状を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
持続放出組成物を調製するための請求項１〜１８のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項２０】
前記持続放出組成物が、動物の繁殖に使用される、請求項１９に記載の使用。
【国際調査報告】
2021525607.tif 000008
2021525607.tif 000009
2021525607.tif 000010