(57)【要約】  本明細書の開示の実施形態は、心筋細胞の成熟を誘導するための方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、インビトロで幹細胞に由来する。いくつかの実施形態では、組成物及び方法は、心筋細胞におけるLet7iマイクロRNA（miRNA）の過剰発現、miR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及び/又はmiR-200aの発現低下を誘導することにより、成熟を誘導する。他の実施形態では、本明細書の開示は、脂肪酸酸化障害などのミトコンドリア機能障害によって特徴付けられる状態を治療するための方法に関する。他の実施形態では、本明細書の開示は、心筋機能に影響を与える化合物をスクリーニングする方法に関する。さらに他の実施形態では、本明細書の開示は、細胞のカルジオリピンプロファイルを検出又はモニタリングすることにより、細胞内のミトコンドリア機能障害を検出又はモニタリングする方法に関する。【選択図】図3A
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋細胞の成熟を誘導する方法であって、未成熟な心筋細胞にLet7iマイクロRNA（miRNA）の過剰発現、miR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下のうちの2つ以上を誘導する工程を含む、方法。
【請求項２】
未成熟な心筋細胞に、Let7iのmiRNAの過剰発現、miR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下のうちの3つ以上を誘導する工程を含む、請求項1の方法。
【請求項３】
未成熟な心筋細胞にLet7i miRNAの過剰発現、miR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下を誘導する工程を含む、請求項2の方法。
【請求項４】
過剰発現を誘導する工程は、未成熟な心筋細胞と、過剰発現させるmiRNAをコードする核酸を含むベクターとを接触させる工程を含む、請求項1〜3の1項に記載の方法。
【請求項５】
前記ベクターが、過剰発現させるmiRNAをコードする核酸の一過性の発現を促進するように構成されている、請求項4の方法。
【請求項６】
前記ベクターが、過剰発現させるmiRNAをコードする核酸が未成熟な心筋細胞のゲノムに組み込まれるように構成されたウィルスベクターである、請求項4の方法。
【請求項７】
前記ウィルスベクターがレンチウィルスベクター又はアデノ随伴ウィルスベクターである、請求項6の方法。
【請求項８】
miRNAの発現低下を誘導する工程は、未成熟な心筋細胞と、発現低下の標的のmiRNAにハイブリダイズする核酸断片、又は発現低下の標的のmiRNAにハイブリダイズする転写物をコードする核酸を含むベクターとを接触させる工程を含む、請求項1〜3の1項に記載の方法。
【請求項９】
発現低下を誘導する工程が、前記miRNAをコードする遺伝子のノックアウトを実施する工程を含む、請求項1の方法。
【請求項１０】
前記発現低下を誘導する工程が、ヌクレアーゼ酵素、及び前記ヌクレアーゼ酵素による発現低下の標的となるmiRNAをコードする核酸の特異的切断を促す配列を有するガイド核酸、を有する前記未成熟な心筋細胞を提供する工程を含む、請求項1〜3の1項に記載の方法。
【請求項１１】
ヌクレアーゼ酵素を有する前記未成熟な心筋細胞を提供する工程は、前記未成熟な心筋細胞と、前記ヌクレアーゼ酵素又は前記ヌクレアーゼ酵素をコードするベクターとを接触させる工程を含み、ここで、前記ベクターは、前記心筋細胞における前記酵素の発現を促進するように構成される、請求項10の方法。
【請求項１２】
ガイド核酸を有する前記未成熟な心筋細胞を提供する工程は、前記未成熟な心筋細胞と、前記ガイド核酸又は前記ガイド核酸をコードするベクターとを接触させる工程を含み、ここで、前記ベクターは、前記心筋細胞における前記ガイド核酸の発現を促進するように構成される、請求項10の方法。
【請求項１３】
前記ヌクレアーゼ酵素が、Cas9又はTALENSのようなエンドヌクレアーゼである、請求項10の方法。
【請求項１４】
前記ベクターがウィルスベクターである、請求項8、11、又は12の1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウィルスベクターがレンチウィルスベクター又はアデノ随伴ウィルスベクターである請求項14の方法。
【請求項１６】
前記未成熟な心筋細胞が幹細胞に由来する、請求項1の方法。
【請求項１７】
前記未成熟な心筋細胞がインビトロで幹細胞に由来する請求項14の方法。
【請求項１８】
前記幹細胞が胚性幹細胞、多能性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞である、請求項16又は17の方法。
【請求項１９】
前記未成熟な心筋細胞と、パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸から選択される2種以上の長鎖脂肪酸とを接触させる工程をさらに含む、請求項1〜18の1項の方法。
【請求項２０】
1種以上の前記長鎖脂肪酸がパルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸を含む、請求項19の方法。
【請求項２１】
前記心筋細胞が遺伝子異常を有する、請求項1〜20の1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子異常が、前記心臓の代謝又は病理学的疾患状態に関連している、請求項21の方法。
【請求項２３】
前記遺伝子異常が脂肪酸酸化（FAO）障害と関連している、請求項22の方法。
【請求項２４】
前記心筋細胞が、HADHA、FATP1、FACS1、OCTN2、L-CPTI、M-CPT I、CAT、CPTII、VLCAD、LCAD、MCAD、SCAD、LCHAD、SHYD、M/SCHAD、SKAT、MKAT、HS、HL、ETF、及びETFQOの1つをコードする遺伝子の変異を含む、請求項22の方法。
【請求項２５】
請求項1〜24の1項に記載の任意の方法により生産された心筋細胞。
【請求項２６】
前記心筋細胞が遺伝子異常を有する、請求項25の心筋細胞。
【請求項２７】
前記遺伝子異常が脂肪酸酸化（FAO）障害と関連している、請求項26の心筋細胞。
【請求項２８】
前記遺伝子異常が、HADHAをコードする遺伝子の変異である、請求項27の心筋細胞。
【請求項２９】
成熟したカルジオリピンプロファイルを有する心筋細胞の投与によって治療可能な状態を有する対象の治療方法であって、請求項25に記載の心筋細胞の有効量を対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３０】
前記対象は、損傷した心臓組織又は細胞を有する、請求項29の方法。
【請求項３１】
前記対象が糖尿病、先天性心疾患、虚血、ミオパチー、ミトコンドリア疾患を有する、及び/又は梗塞に罹患している、請求項29の方法。
【請求項３２】
前記ミトコンドリア疾患が脂肪酸酸化（FAO）障害である、請求項29の方法。
【請求項３３】
前記対象が、HADHAをコードする遺伝子の変異を有する、請求項29の方法。
【請求項３４】
前記対象が不整脈を経験する、請求項29の方法。
【請求項３５】
前記対象は乳幼児突然死症候群（SIDS）のリスクが高い、請求項29の方法。
【請求項３６】
心臓機能の調節のための化合物をスクリーニングする方法であって、
請求項25〜28の1項に記載の1つ以上の心筋細胞と候補薬剤とを接触させる工程、及び
前記1つ以上の心筋細胞における心臓機能パラメータを測定する工程、
前記心臓機能パラメータの変化が、前記候補薬剤が心臓機能を調節することを示す、方法。
【請求項３７】
前記成熟した心筋細胞が遺伝子異常を有する、請求項36の方法。
【請求項３８】
前記遺伝子異常が脂肪酸酸化（FAO）障害と関連している、請求項37の方法。
【請求項３９】
前記遺伝子異常が、HADHAをコードする遺伝子の変異である、請求項38の方法。
【請求項４０】
前記心臓機能パラメータが、脂質プロファイル、カルジオリピンプロファイル、代謝プロファイル、酸素消費率、ミトコンドリアプロトン勾配、収縮力、カルシウム輸送、伝導速度、グルコースストレス、及び細胞死を含む、請求項36の方法。
【請求項４１】
対象におけるミトコンドリア脂肪酸酸化（FAO）障害の治療方法であって、対象のミトコンドリアのカルジオリピンプロファイルを安定化する、又は成熟したカルジオリピンリモデリングを促進する組成物の有効量を投与する工程を含む、方法。
【請求項４２】
前記FAO障害が、糖尿病、心不全、神経変性、高齢化、先天性心疾患、虚血、ミオパシー、及び/又は梗塞のインスタンスと関連している、請求項41の方法。
【請求項４３】
前記FAO障害が脂肪酸（FA）β酸化障害である請求項41の方法。
【請求項４４】
前記ミトコンドリア機能障害の表現型が、乳幼児突然死症候群のリスクの増加と関連している、請求項41の方法。
【請求項４５】
カルジオリピンプロファイルを安定化する工程が、カルジオリピンの酸化を防止する工程を含む、請求項41の方法。
【請求項４６】
組成物がエラミプレチドであるか、又は含む、請求項41〜45の方法。
【請求項４７】
培養心筋細胞の病理学的状態を検出する方法であって、心筋細胞におけるカルジオリピンプロファイルを測定する工程を含み、ここで、炭素数18超のアシル鎖を有するカルジオリピンの相対的な増加、及び炭素数18未満のアシル鎖を有するカルジオリピンの相対的な減少は、心筋細胞の病理学的状態の低下を示す、方法。
【請求項４８】
前記カルジオリピンの増加又は減少は、野生型の未成熟な心筋細胞に対して相対的なものである、請求項47の方法。
【請求項４９】
前記培養心筋細胞がインビトロで幹細胞に由来する、請求項47の方法。 
【請求項５０】
前記幹細胞が胚性幹細胞、多能性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞である、請求項49の方法。
【請求項５１】
前記病理状態がミトコンドリア機能障害と関連している、請求項47の方法。
【請求項５２】
前記ミトコンドリア機能障害がミトコンドリア三機能蛋白質欠損症である、請求項51の方法。
【請求項５３】
前記培養心筋細胞と、前記培養心筋細胞の病理学的状態を低下させるための候補薬剤とを接触させる工程をさらに含む、請求項47の方法。
【請求項５４】
前記培養心筋細胞の病理学的状態に関する前記候補薬剤の効果を確認するために、前記培養心筋細胞と候補薬剤とを接触させる工程の前、途中、及び/又は後に、前記培養心筋細胞のカルジオリピンプロファイルを複数回測定する工程を含む、請求項53の方法。
【請求項５５】
培養心筋細胞の成熟を誘導するための組成物であって、Let7iマイクロRNAをコードする核酸コンストラクト、miR-452をコードする核酸コンストラクト、miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクト、及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクトのうちの2つ以上を含む、組成物。
【請求項５６】
Let7iマイクロRNAをコードする核酸コンストラクト、miR-452をコードする核酸コンストラクト、miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクト、及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクトのうちの3つ以上を含む、請求項55の組成物。
【請求項５７】
Let7iマイクロRNAをコードする核酸コンストラクト、miR-452をコードする核酸コンストラクト、miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクト、及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクトを含む、請求項55の組成物。
【請求項５８】
前記マイクロRNAをコードする及び/又はオリゴマーをコードする核酸コンストラクトが、それぞれ1つ以上のプロモーター配列に作動可能に連結している、請求項55〜57の1項の組成物。
【請求項５９】
1以上の前記コンストラクトが、細胞への送達のために構成された1以上のベクターに組み込まれている、請求項55〜57の1項の組成物。
【請求項６０】
前記1種以上のベクターがウィルスベクターである、請求項59の組成物。
【請求項６１】
少なくとも1つのウィルスベクターがレンチウィルスベクター又はAAVベクターである、請求項60の組成物。
【請求項６２】
前記miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマー及び前記miR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーは、それぞれ、miR-122及びmiR-200aを切断するための遺伝子編集酵素を誘導するように構成されたガイドRNA分子である、請求項55〜61の1項に記載の組成物。
【請求項６３】
前記遺伝子編集酵素がヌクレアーゼである請求項62の組成物。
【請求項６４】
ヌクレアーゼをさらに含む、請求項55〜63の1項の組成物。
【請求項６５】
前記ヌクレアーゼがCas9である、請求項63又は請求項64の組成物。
【請求項６６】
さらに1種以上の長鎖脂肪酸を含む、請求項55〜65の1項の組成物。
【請求項６７】
前記1種以上の長鎖脂肪酸が、パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸のうちの2種以上を含む、請求項66の組成物。
【請求項６８】
前記1種以上の長鎖脂肪酸が、パルミチン酸、オレイン酸、及びリノール酸を含む、請求項67の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
この出願は、2017年12月8日出願の米国仮特許出願第62/596,438号、及び2018年5月22日出願の米国仮特許出願第62/674,978号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関するステイトメント
本願に添付の配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、ここに参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、67910_Sequence_Listing_Final_2018-12-07.txtである。このテキストファイルは11KBで2018年12月7日に作成されたものであり、明細書の提出とともにEFS-Web経由で提出されている。
【０００３】
政府ライセンス権に関するステイトメント
本発明は、国立衛生研究所から授与された助成金番号P01 GM081619、及びR01 GM083867、及びR01 GM097372、及びR01 HL135143、及びU01 HL099993、及びU01 HL099997の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明について一定の権利を有している。
【背景技術】
【０００４】
ミトコンドリア三機能性蛋白質（MTP/TFP）欠損症は、ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ/3-ケトアシル-CoAチオラーゼ/エノイル-CoAヒドラターゼサブユニットA（HADHA/LCHAD）又はサブユニットB（HADHB）の変異に起因する正常な機能が損なわれた脂肪酸酸化（FAO）の結果であると考えられている。MTP欠損新生児の主要な表現型は、出生後に発現する乳幼児突然死症候群（SIDS）であり、出産後に子供が脂質が豊富な母乳で授乳を開始すると現れる。FAOの欠損は、不整脈を誘発する心臓環境を促進する役割を有するが、その作用機序は正確には解明されておらず、現在のところ治療法は存在していない。
【０００５】
多能性幹細胞由来心筋細胞（hPSC-CM）は、インビトロでヒトの疾患を研究する手段を提供するが、成人心筋細胞（ACM）ではなく胎児心筋細胞（FCM）を代表するものであるため、その未成熟さゆえに限界がある。コミットされた心筋細胞が未成熟なFCMから成熟したACMにどのように移行するかについての知識が不足しているため、出生後に発症する多くの心疾患の特徴付けが不十分であった。心形成の間、FCMは発生状態を経て、心筋細胞のコミットメントを過ぎると、細胞周期の終了、自発的な拍動の停止、乳酸の利用、そしてその後の主要なエネルギー源としての脂肪酸の出生後の段階での利用とカルジオリピンの成熟を示す。未成熟なhPSC-CMsはエネルギー源としてFAOを介して脂肪酸を利用することができないので、モデルFAO障害への使用が制限される。
【０００６】
ACMに向けた成熟hPSC-CMsへの現在のアプローチは、電気的又は機械的刺激、又は細胞の配向を指示するための2D表面パターンの合図で細胞を物理的に刺激する長期培養に焦点を当てている。
【０００７】
心形成及びミトコンドリア三機能性蛋白質（MTP/TFP）の研究の進歩にもかかわらず、出生後に発症した心疾患を研究するためのモデル作製を容易にするために、成人心筋細胞を開発するニーズが依然として存在する。本明細書の開示は、このニーズ及び関連するニーズに対処するものである。
【発明の概要】
【０００８】
本概要は、以下の詳細な説明にさらに記載されている概念の一部を簡略化した形で紹介するために提供される。本概要は、請求された主題の主要な特徴を特定することを意図したものではなく、また、請求された主題の範囲を決定するための補助として使用することを意図したものでもない。
【０００９】
一態様において、本明細書の開示は、心筋細胞の成熟を誘導する方法を提供する。この方法は、未成熟な心筋細胞において、以下のうちの2つ以上を誘導する工程を含む。Let7iマイクロRNA（miRNA）の過剰発現、miR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下。一実施形態では、この方法は、未成熟な心筋細胞にLet7iマイクロRNA（miRNA）の過剰発現、miR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下を誘導する工程を含む。
【００１０】
別の態様において、本明細書の開示は、本明細書に記載の任意の方法によって生産される心筋細胞を提供する。
【００１１】
別の態様において、本明細書の開示は、成熟したカルジオリピンプロファイルを有する心筋細胞の投与によって治療可能な状態の対象の治療方法を提供する。この方法は、本明細書に記載される有効量の心筋細胞を対象に投与する工程を含む。
【００１２】
別の態様において、本明細書の開示は、心機能の調節のための化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、本明細書に記載されている1つ以上の心筋細胞と候補薬剤とを接触させる工程、及び1つ以上の心筋細胞における心機能パラメータを測定する工程、を含み、ここで、心機能パラメータの変化は、候補薬剤が心機能を調節することを示す。
【００１３】
別の態様において、本明細書の開示は、対象のミトコンドリア脂肪酸酸化（FAO）障害の治療方法を提供する。この方法は、対象のカルジオリピンプロファイルを安定化する、又はミトコンドリアにおける成熟したカルジオリピンリモデリングを促進する組成物の有効量を投与する工程を含む。
【００１４】
別の態様において、本明細書の開示は、培養心筋細胞の病理学的状態を検出する方法を提供する。この方法は、心筋細胞におけるカルジオリピンプロファイルを測定する工程を含み、ここで、炭素数18超のアシル鎖を有するカルジオリピンの相対的な増加、及び炭素数18未満のアシル鎖を有するカルジオリピンの相対的な減少は、心筋細胞の病理学的状態の低下を示す。
【００１５】
さらに別の態様において、本明細書の開示は、培養心筋細胞の成熟を誘導するための組成物、又は組成物のキットを提供する。組成物又はキットは、以下のうちの2つ以上からなる。Let7iマイクロRNAをコードする核酸コンストラクト、miR-452をコードする核酸コンストラクト、miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクト、及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクトである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の前述の態様及び付随する利点の多くは、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することにより、それらがよりよく理解されるにつれて、より容易に理解されるであろう。
【００１７】
【図１Ａ−１Ｆ】図1A-1Fは、HADHA変異型（Mut）及びノックアウト（KO）幹細胞由来の心筋細胞の生成を示す。図1A）4つの酵素ステップを記述した脂肪酸β酸化の模式図。図1B）早期の停止コドンをもたらす22bp欠失を示すWTC iPSC株からのHADHA KO DNA及び蛋白質配列の概略図。図示されたHADHAWT DNA断片配列は配列番号1として示され、対応するHADHAWT蛋白質断片配列は配列番号2として示される。図示されたHADHAKO DNA断片配列は配列番号3として示され、対応するHADHAKO蛋白質断片配列は配列番号4として示される。エクソン、イントロン、及びIn/Delドメインを示す。図1C）第一の対立遺伝子上の2bp欠失及び9bp挿入、及び第二の対立遺伝子上の2bp欠失を示すWTC iPSC株からのHADHA Mut DNA及び蛋白質配列の概略図である。図示されたHADHAWT DNA断片配列は、配列番号5として示される。図示されたHADHAMut DNA断片配列は、配列番号7及び9として示される。RNA配列解析リードカウントは、HADHA Mutがエクソン4-20を発現しており、その結果、蛋白質切断が生じていることを示している。図1D）WTC iPSCsにおけるHADHA発現とハウスキーピング蛋白質β-アクチンのウェスタン分析。図1E）心臓マーカーαアクチニン（左）とHADHA（右）のためのWT、HADHA Mut及びHADHA KO hiPSC-CMsの共焦点顕微鏡分析。図1F）WT、HADHA Mut及びHADHA KO hiPSC-CMsの脂肪酸酸化能のシーホース分析トレース。
【図２Ａ−２Ｆ】図2A-2Fは、心筋細胞成熟マイクロRNAスクリーニングの態様を示す。図2A）心筋細胞成熟のスクリーニングのための候補マイクロRNAを決定するために実行されるワークフローの概略図。図2B）マイクロRNAを導入した幹細胞由来の心筋細胞を生成するために実行されたワークフローの概略図。図2C）マイクロRNAで処理したhiPSC-CMsの細胞エリア解析。マイクロRNA-208b OEは細胞エリアの有意な増加をもたらしたが、miR-205 KOは有意な減少をもたらした。細胞をαアクチニン、ファロイジン、及びDAPIで染色し、共焦点顕微鏡でイメージングした。図2D）マイクロRNAで処理したhiPSC-CMsのマイクロ電極アレイ解析による補正されたフィールドポテンシャル持続時間（cFPD）。MiR-452 OEはより長いcFPDをもたらした。図2E）マイクロポストアッセイを用いたシングルセルのトゥイッチ力の解析。MiR-200a KOはhiPSC-CMsのトゥイッチ力を有意に増加させた。図2F）マイクロRNAで処理したhiPSC-CMsのオリゴマイシン処理後のFCCPによる酸素消費率（OCR）の最大変化のシーホース分析。MiR-122 KOは最大OCRの有意な増加をもたらしたが、miR-208b OE、-378e OE及び-200a KOは最大OCRの有意な減少をもたらした。
【図３Ａ−３Ｏ】図3A-3Oは、MiMaCがhiPSC-CMの成熟を促進することを示す。図3A）MiMaCを生成するために組み合わされた4つのマイクロRNAの概略図。図3B）マイクロポスト上のシングルセル収縮力アッセイは、MiMaC処理されたhiPSC-CMsがトゥイッチ力の有意な増加をもたらしたことを示した。図3C）EV（対照）とMiMaC処理hiPSC-CMの代表的なトレース。図3D）マイクロポスト上のシングルセル収縮力アッセイは、MiMaC処理hiPSC-CMsがパワーの有意な増加をもたらしたことを示した。図3E）細胞サイズの分析は、MiMaC処理したhiPSC-CMsがエリアの有意な増加をもたらしたことを示した。図3F）EVとMiMaC処理hiPSC-CMsの代表的な共焦点顕微鏡画像。αアクチニン（緑）、ファロイジン（赤）及びDAPIを示す。図3G）脂肪酸酸化能力のシーホース分析は、対照細胞がパルミテートを利用することができなかったのに対し、MiMaC処理hiPSC-CMsはATP生成のためにパルミテートを酸化することができるポイントまで成熟したことを示した。MiMaC処理したhiPSC-CMsは、パルミテートの添加によりOCRが有意に増加した。図3H）KOマイクロRNAの予測標的のベンダイアグラムと心筋細胞の成熟のためにスクリーニングされた全てのKO miR間の共通の予測標的としてのHOPXの同定。図3I）心筋細胞成熟期のRNA配列解析データからのHOPX発現のプロット。HOPX発現はD30及び1年のhESC-CMsで有意に高く、1年のhESC-CMsはD30のhESC-CMsと比較して統計的に有意に高いHOPXを有する。*はD20との有意性を示す。#はD30との有意性を示す。図3J）成人ヒト心室組織におけるHOPXの発現は、胎児ヒト心室組織よりも有意に高い。RNA配列解析データを用いてプロットした。図3K）HOPX発現のRT-qPCRは、D30でMiMaC処理されたhiPSC-CMsが、EV対照のD30のhiPSC-CMsと比較して統計的に有意に高いレベルのHOPXを有していたことを示した。図3L）マイクロRNAで処理したhPSC-CMsの非バイアスクラスタリングのシングルセルRNA-SeqのtSNEプロット。図3M）各クラスターでどの処理群が濃縮されているかを詳細に示すクラスタープロット。図3N）MiMaCクラスターに基づく成熟カテゴリーのヒートマップ。図3O）成熟に伴ってアップレギュレーションされるin vivoヒト成熟マーカーのヒートマップ（黄色）。
【図４Ａ−４Ｌ】図4A-4Lは、脂肪酸処理したHADHA Mut CMsが細胞質カルシウムレベルの上昇を示し、拍動速度の不規則性の増加もたらしたことを示す。図4A）オリゴマイシン及びFCCP添加後の最大酸素消費率を分析するためのシーホースマイトストレスアッセイ。MiMaC処理したCMsは、対照EV CMsと比較して最大OCRの有意な増加を示した。図4B）マイトストレスアッセイの代表的なトレース。図4C）脂肪酸酸化能のシーホース分析は、対照細胞がパルミテートを利用できなかったのに対し、MiMaC処理したhiPSC-CMsは、ATP生成のためにパルミテートを酸化することができるポイントまで成熟したことを示した。MiMaC処理したhiPSC-CMsではパルミテートの添加によりOCRが有意に増加した。MiMaC処理したMutとKOの両方のHiPSC-CMsはパルミテートを酸化することができなかった。図4D）カルシウムトランシエント解析中の蛍光変化の代表的なトレース。図4E）カルシウムトランシエント解析中の蛍光の最大変化の定量化。Glc+FA培地処理12D後のWT CMsと比較して、Mut CMsはカルシウムの変化が統計的に有意に低かった。図4F）タウ崩壊定数の定量。Glc+FA培地処理12D後のWT CMsと比較して、Mut CMsはより高いタウ崩壊定数を有していた。図4G）Fluovolt、活動電位、分析中の蛍光変化の代表的なトレース。図4H）活動電位中の蛍光の最大変化の定量化。図4I）Glc+FA培地処理12D後にWT CMsと比較して、Mut CMsでは波の持続時間50%が有意に長い。図4J）Glc又はGlc+FA培地でのMut CMsの代表的なビートレートトレース。図4K）ビートインターバルの変化（ΔBI）の定量化。Glc培地中のMut CMsと比較して、Glc+FA培地中のMut CMsは、統計的に有意に高いΔBIを有していた。図4L）各グループの95％信頼区間を持つ楕円を示すポアンカレプロット。Mut Glc+FA条件の楕円がより丸いことは、細胞がMut Glc CMsと比較して、より大きなビートトゥビートの不安定性を有していたことを示している。
【図５Ａ−５Ｊ】図5A-5Jは、scRNA-Seqが脂肪酸処理したHADHA Mut CMsの複数の疾患状態を明らかにしたことを示している。図5A）HADHA Mut CMsと比較したWTのシングルセルRNA配列解析tSNEプロットは、これらの2つのグループの間の明確な区別を示している。D30のCMsの4つの条件：FA処理したMiMaC WT CMsの6日間、FA及びSS-31処理したMiMaC WT CMsの6日間、FA処理したMiMaC HADHA Mut CMsの6日間、及びFA及びSS-31処理したMiMaC HADHA Mut CMsの6日間。図5B）非バイアスクラスタリングにより、6つのユニークなグループが明らかになった。図5C）各クラスター内の条件の濃縮（enrichment）を詳細に示すヒートマップ。図5D）MiMaCクラスターに基づく成熟カテゴリーのヒートマップ。図5E）成熟に伴ってアップレギュレーションされるin vivoマウス成熟マーカーのヒートマップ。図5F）HADHA Mut CMsはWT CMsよりも多くの核を有することを示す共焦点顕微鏡分析。青色-DAPI、緑色-ATP合成酵素βサブユニット、及びピンク色-チチン。インセットは、灰色のスケールで示されている核を示す。図5G）1、2、3又は4以上の核のいずれかを有する細胞の頻度のヒストグラム。HADHA変異型CMsは、3つ以上の核を持つ細胞の数が有意に多い。図5H）クラスター0（非複製HADHA CMs）における、クラスター3（WT CMs）と比較した場合のダウンレギュレーションされた代謝経路。図5I）クラスター2（エンドレプリケートHADHA CMs）における、クラスター3（WT CMs）と比較した場合のダウンレギュレーションされた代謝経路。図5J）クラスター2（エンドレプリケートHADHA CMs）における、クラスター3（WT CMs）と比較した場合のアップレギュレーションされた代謝経路。代謝バブルプロットの円の大きさは、統計的有意性に比例する。p値が小さいほど円が大きくなる。カットオフとして調整したp値0.01を使用。
【図６Ａ−６Ｈ】図6A-6Hは、脂肪酸処理したHADHA Mut CMsが、重度のミトコンドリア機能障害を伴う膨張したミトコンドリアを示したことを示している。図6A）Glc+FA培地の12DにおけるWT及びMut CMsの代表的な共焦点画像。図6B）ミトトラッカー及びATP合成酵素βの共局在及び強度の定量化。図6C）サルコメア及びミトコンドリア構造を示す、Glc+FA培地の12D後のWT及びMut CMsの透過型電子顕微鏡像。図6D）Glc+FA培地の12日後のWTとHADHA Mut CMsのミトコンドリア真円度インデックスのヒストグラムは、HADHA Mut CMsのミトコンドリアが丸みを帯びていることを示した。図6E）Glc+FA培地の12日後のWT及びHADHA Muts CMsのミトコンドリアエリアのヒストグラムは、HADHA Muts CMsのミトコンドリアが小さくなっていることを示した。図6F）マイトストレスアッセイによる最大OCRの定量。Mut及びKO CMsはWT CMsと比較して、Glc+FA培地の12D後の最大OCRが有意に低かった。図6G）ベースラインOCRとオリゴマイシン後のOCRの間の差として計算されたマイトストレスアッセイからのATP生産の定量化。Mut及びKO CMsはWT CMsと比較して、Glc+FA培地の12D後のATP生産が有意に低かった。図6H）オリゴマイシン後のOCRとアンチマイシン及びロテノン後のOCRの差として計算されたマイトストレスアッセイからのプロトンリークの定量化。Mut及びKO CMsはWT CMsと比較して、Glc+FA 培地の12D後のプロトンリークが有意に高かった。Glc+FAの12D後のSS-31処理したMut CMsは、有意に低いプロトンリークを有していた。
【図７Ａ−７Ｋ】図7A-7Kは、脂肪酸処理したHADHA KO及びMut CMsが、脂肪酸の上昇及び異常なカルジオリピンプロファイルを有することを示す。図7A）HADHA損失による長鎖FAOのファーストステップ後の長鎖FA中間体蓄積のモデル。図7B）WT、Mut及びKOのFA処理したhPSC-CMsにおける全ての長鎖アシル-カルニチンの合計。図7C）WT、Mut及びKOのFA処理したhPSC-CMsにおけるフリー脂肪酸状態におけるフィセテリックアシッドの量。図7D）WT、Mut及びKOのFA処理したhPSC- CMsのフリー脂肪酸状態におけるパルミトオレイン酸の量。図7E）WT、Mut及びKOのFA処理したhPSC- CMsのフリー脂肪酸状態におけるオレイン酸の量。図7F）Glc又はGlc+FAのいずれかで処理したWT及びHADHA KO CMsにおけるテトラ[18:2]-CLの相対量。図7G）Glc又はGlc+FAのいずれかで処理したWT及びHADHA KO CMsに関する、標的リピドミクスから生成されたカルジオリピンプロファイル。図7H）WT CMs 12D Glc+FA、HADHA Muts CM 6D及び12D Glc+FA及びHADHA KO CMs 12D Glc+FAに関する、グローバルリピドミクスから生成されたカルジオリピンプロファイル。図7I）WT、HADHA Mut及びHADHA KO CMのFA処理されたhPSC-CMsにおける、側鎖にミリスチン酸（14:0）を有する全てのCLsの合計。図7J）WT、HADHA Mut及びHADHA KO CMのFA処理したhPSC-CMsにおける、側鎖にパルミチン酸（16:0）を有する全てのCLsの合計。図7K）CLをリモデリングするためにHADHAがTAZと直列に連携する方法の概略図。
【図８】図8は、CMにおけるカルジオリピンの成熟を図示したものである。WT iPSC由来CMsは、成熟していないiPSC由来CMsと比較して、[14:0]、[14:1][16:1]又は[16:0]のCLsが減少し、中間体[18:1][18:2][18:2][20:2]を含む炭素数18超のアシル鎖を有するCLsが増加することにより、成熟中にCLプロファイルがシフトしている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書の開示は、本発明者らによるミトコンドリア三機能性蛋白質欠損症の解析に基づいている。以下に詳細に記載するように、本発明者らは、HADHA欠損ヒト誘導多能性幹細胞（hiPSCs）から新規な幹細胞由来の心筋細胞を生成することにより、現在の細胞モデルにおける主要な欠損に対処した。本発明者らは、エピジェネティックレギュレーターであるホメオボックス蛋白質（HOPX）をアップレギュレートする遺伝子組換えマイクロRNA成熟カクテルを用いて、心筋細胞の成熟を促進する方法を開発した。脂肪酸（FA）処理したHADHA変異型心筋細胞は、異常なカルシウムのハンドリング、再分極の遅れ、不規則な拍動を示し、不整脈状態を示唆していた。この病理学的な心臓の症状は、プロトン勾配の損失とミトコンドリアの正常なクリステの欠如に起因するミトコンドリア機能障害として提示される、内在するミトコンドリア病理の結果であった。この病理学的ミトコンドリア状態の根底にあるメカニズムは、HADHAノックアウトによるカルジオリピンのホメオスタシスの調節障害と、その結果としてのテトラ[18:2]カルジオリピン種の減少であることが明らかになった。これらのデータは、心臓のホメオスタシスのためのカルジオリピンリモデリングでの、脂肪酸ベータ酸化における、及びアシルトランスフェラーゼとしてのHADHAの本質的な二重の役割を明らかにした。
【００１９】
この研究は、治療、実験的モデリング、又は薬物スクリーニングアプリケーションのための心筋細胞の成熟を促進するための新しいアプローチを提供する。さらに、CLモデリングの根本的な観察結果は、細胞の健康状態や成熟度を推測するための、CLのリモデリング状態を検出し、モニタリングする方法を提供する。
【００２０】
上述に従って、一態様において、本明細書の開示は、心筋細胞の成熟を誘導する方法を提供する。この方法は、未成熟な心筋細胞において、以下のうちの2つ、3つ、又はすべてを誘導する工程を含む。Let7マイクロRNA（miRNA）の過剰発現、miR-208bの過剰発現、miR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下。調節されたmiRNAの発現を誘導する薬剤は、本明細書において、一緒にマイクロRNA成熟化カクテル（MiMaC）と称される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、方法は、未成熟な心筋細胞において、少なくともLet7 miRNAの過剰発現及びmiR-452の過剰発現を誘導する工程を含む。別の実施形態では、方法は、未成熟な心筋細胞に少なくともLet7 miRNAの過剰発現及びmiR-122の発現低下を誘導する工程を含む。別の実施形態では、方法は、未成熟な心筋細胞において、少なくともLet7 miRNAの過剰発現及びmiR-200aの発現低下を誘導する工程を含む。別の実施形態では、方法は、未成熟な心筋細胞において、少なくともmiR-452の過剰発現及びmiR-122の発現低下を誘導する工程を含む。別の実施形態では、方法は、未成熟な心筋細胞に少なくともmiR-452の過剰発現及びmiR-200aの発現低下を誘導する工程を含む。別の実施形態では、方法は、未成熟な心筋細胞において、少なくともmiR-122の発現低下及びmiR-200aの発現低下を誘導する工程を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、方法は、未成熟な心筋細胞において、少なくともLet7 miRNAの過剰発現、miR-452の過剰発現、及びmiR-122の発現低下を誘導する工程を含む。別の実施形態では、方法は、未成熟な心筋細胞において、少なくともLet7 miRNAの過剰発現、miR-452の過剰発現、及びmiR-200aの発現低下を誘導する工程を含む。別の実施形態では、方法は、未成熟な心筋細胞において、少なくともLet7 miRNAの過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下を誘導する工程を含む。別の実施形態では、本方法は、未成熟な心筋細胞において、少なくともmiR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下を誘導する工程を含む。
【００２３】
Let7、miR-452、miR-208b、miR-122、及びmiR-200aは、心筋細胞（CM）における全てのマイクロRNA'sであり、本明細書では、SMの場合、成熟の側面に影響を及ぼすことが示されている（以下の実験の考察を参照）。本明細書に記載されているように、これらのmiRNAsの操作は、CMにおけるより高度な成熟及びカルジオリピンリモデリングにつながるシグナル伝達パスウェイに影響を及ぼすことが示されている。培養された（例えば、幹細胞由来の）CMにおいて実施される場合、これらのmiRNA操作は、より密接に成人心筋細胞（ACM）に類似したCMをもたらす。
【００２４】
Let7は、Kuppusamy, K.T., et al., Let-7 family of microRNA is required for maturation and adult-like metabolism in stem cell-derived cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015、及びUS 9,624,471（それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）にさらに詳細に記載されているmiRNAファミリーである。Let-7 miRNAは、Let7a-1、Let7a-2、Let7b、Let7c、Let7e、Let7f-1、Let7f-2、Let7g、及びLet7iから選択され得る。いくつかの実施形態では、Let7 miRNAはLet7iである。Let7i miRNAをコードする代表的なDNA配列は、配列番号11として示される配列に含まれ、この配列は、Let7i miRNAの発現を促進するための発現ベクターに挿入されたヒトゲノムテンプレートから生産されたアンプリコンの配列である。所望のLet7 miRNAをコードする核酸分子は、任意の従来のアプローチによって得ることができる。いくつかの実施形態では、核酸は、特定のプライマーを用いてコード化ゲノムから配列を増幅することによって得ることができる。例えば、以下でより詳細に記載されるように、この増幅プロセスは、細胞内での過剰発現のための発現ベクターに組み込むことができるように、Let7iのコード配列（さらに上流及び下流の追加の配列）を増幅して得るために使用された。Let7iを含むこのような領域を増幅するための例示的なフォワードプライマー及びリバースプライマーは、それぞれ配列番号12及び13に示されている。
【００２５】
miR-452をコードする代表的な配列は、配列番号14として記載される配列に含まれ、この配列は、mi-452 miRNAの発現を促進するために発現ベクターに挿入されたヒトゲノムテンプレートから生産されたアンプリコンの配列である。ヒトmiR-452を含む領域を増幅するための例示的なフォワードプライマー及びリバースプライマーは、それぞれ配列番号41及び42に示されている。
【００２６】
miR-208bは、例えば、Callis, T.E., et al., MicroRNA-208a is a regulator of cardiac hypertrophy and conduction in mice. J Clin Invest, 2009. 119(9): p. 2772-86（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ヒトmiR-452を含む領域を増幅するための例示的なフォワードプライマー及びリバースプライマーは、それぞれ配列番号39及び40に示されている。
【００２７】
miR-122をコードする代表的な配列は、配列番号46として示される配列に含まれる。miR-200aをコードする代表的な配列は、配列番号45として示される配列に含まれる。これらの配列の各々は、上流及び下流の付加的な配列に加えて、所望のmiRNAをコードする領域を含むヒトゲノム配列のアンプリコンを表す。全体のアンプリコンの配列は、全体のmiRNAをトランスジェニックに発現させるために使用できる。当業者であれば、この配列を容易に使用して、コード配列にハイブリダイズするガイドRNAを生成するか、又はmiRNAの一部にハイブリダイズする一本鎖核酸断片を生成して、目的のmiRNAの機能的発現を低下させることができる（下記でより詳細に議論する）。
【００２８】
Let7i、miR-452、及びmiR-208bに関して、「過剰発現を誘導する」という用語及びその文法的変種は、細胞内のmiRNAの任意の追加的なレベルを包含する。いくつかの実施形態では、標的miRNAの発現レベルは、少なくとも約1%、5%、25%、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、又はそれより増加する。過剰発現は、そのコード領域から細胞自身の内因性発現活性を増強することによって、又は追加の転写活性のために細胞に追加の外来コード領域を提供することによって誘導できる。いくつかの実施形態では、「過剰発現を誘導する」ことは、単に細胞にmiRNA自体の追加のコピーを提供することを伴う。
【００２９】
いくつかの実施形態では、miRNA（例えば、Let7i、miR-452、及びmiR-208bの1つ以上）の過剰発現の誘導は、未成熟なCMと、過剰発現させるmiRNAをコードする核酸を含むベクターとを接触させる工程を含み得る。ベクターは、細胞内でのmiRNAの一過性又は恒常的発現を促進するように構成できる。この点において、核酸は、細胞内のmiRNAをコードする領域の転写を駆動することができるプロモーター配列に作動的に連結している。プロモーター領域は、所望の発現のタイプに対応するように、当業者によって選択できる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ベクターは、過剰発現させるmiRNAをコードする核酸の組み込みを促進するように構成されている（例えば、Let7i、miR-452、及びmiR-208bのうちの1つ以上を同一又は別のベクターで含む）。例えば、ベクターは、過剰発現させるmiRNAをコードする核酸を含むウィルスベクターであってもよい。そのようなコードする核酸のゲノム組み込みのための任意の適切なウィルスベクターが、本明細書において企図される。この目的のための非限定的で例示的なウィルスベクターは、レンチウィルスベクター及びアデノ随伴ウィルスベクター（AAV）である。レンチウィルスの実施形態の使用は、説明のために以下でさらに詳細に記載される。
【００３１】
miR-122及びmiR-200aに関して、「発現の減少」という用語は、細胞内の機能的miRNAの発現レベルの任意の減少を包含する。いくつかの実施形態では、標的miRNAの発現レベルの低下は、「スポンジ」アプローチを包含し、ここで、miRNAの少なくとも一部（即ち、miR-122又はmiR-200a）にハイブリダイズする一本鎖核酸で、そのゲノム標的の転写に影響を与えるmiRNAの能力を妨害する。上記のように、miR-122及びmi-200aをコードする配列は、それぞれ配列番号46及び35に記載のアンプリコン配列に含まれる。この意味で、添加された核酸は、未成熟な心筋細胞から標的miRNA'sの「吸収」を行い、細胞内の転写調節因子の環境からそれらを除去する。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションは、RNA干渉のようなmiRNAの分解をもたらす。一本鎖核酸は、直接投与できる。他の実施形態では、未成熟な心筋細胞は、一本鎖核酸の一過性又は恒常的発現を促進するように構成されたベクターを用いて、一本鎖核酸をコードする配列で形質転換できる。この目的のために有用なベクタープラットフォームの非限定的な例としては、レンチウィルスベクター及びAAVベクターが挙げられる。適用可能なベクターに関する上記の議論を参照（これは本文脈においても適用可能である）。
【００３２】
他のアプローチでは、発現の減少を標的とするmiRNA（即ち、miR-122及び/又はmiR-200a）は、細胞内の機能的標的miRNAの発現を恒久的に減少又はノックアウトする、未成熟な心筋細胞内のゲノム変化を標的とする。一実施形態では、未成熟な心筋細胞は、ガイドRNA及びヌクレアーゼを提供する。ガイドRNAは、標的miRNAをコードするゲノム配列の領域にハイブリダイズすることを可能にする配列を有する。ハイブリダイゼーションの際、ガイドRNAはヌクレアーゼによるゲノム領域の特異的切断を促進する。未成熟な心筋細胞には内因性のDNA修復酵素が存在しており、この酵素は定期的に修復ミスを導入し、その結果、コードされている配列内での置換、挿入、欠失が生じ、miRNAの機能的ノックアウトを引き起こす。修復プロセスが最初のラウンドで正確であったとしても、最終的には、ガイドRNA/ヌクレアーゼ/修復の組み合わせは、誤った修復をもたらし、従って機能的ノックアウトをもたらす。miR-122及びmiR-200aのための例示的なガイドRNAは、実施例において以下のとおり論じられ、配列番号17及び18（miR-200aのため）及び配列番号19及び20（miR-122のため）として表1に示されている。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼ活性を有する。例示的な非限定的ヌクレアーゼには、Cas9及びTALENSを含む。ガイドRNAに基づいてDNAを特異的に編集又は切断することができる他のそのようなヌクレアーゼが知られており、本明細書に包含される。
【００３４】
ガイドRNAは、未成熟な心筋細胞に直接、又は未成熟な心筋細胞中でガイドRNAをトランスジェニックに発現させることにより提供できる。ガイドRNAとは別に、ヌクレアーゼは、未成熟な心筋細胞に直接、又は未成熟な心筋細胞中でヌクレアーゼをトランスジェニックに発現させることにより提供できる。
【００３５】
一実施形態では、標的miRNAをコードするゲノム配列の領域にハイブリダイズするガイドRNAを未成熟な心筋細胞に直接投与して、ヌクレアーゼによるゲノム領域の特異的切断を促進する。他の実施形態では、ガイドRNAは、ガイドRNAをコードする核酸コンストラクトで細胞を形質転換することにより、未成熟な心筋細胞において一過性又は恒常的にトランスジェニックに発現される。所望の発現に適したベクターを選択できる。例えば、ガイドRNAをコードする配列を未成熟な心筋細胞ゲノムに組み込むのに有用なベクタープラットフォームの非限定的な例としては、レンチウィルスベクター及びAAVベクターが挙げられる。適用可能なベクターに関する上記の議論を参照（これは本文脈においても適用可能である）。
【００３６】
上記のように、ヌクレアーゼは、未成熟な心筋細胞に直接提供されるか、又は未成熟な心筋細胞内で一過性又は恒常的にトランスジェニックに発現され得る。未成熟な心筋細胞内でヌクレアーゼの発現を誘導するために、一本鎖核酸の一過性又は恒常的発現を促進するように構成されたベクターを用いて、ヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクトで細胞を形質転換できる。例えば、未成熟な心筋細胞ゲノム中にヌクレアーゼをコードする配列を組み込むのに有用なベクタープラットフォームの非限定的な例としては、レンチウィルス及びAAVベクターが挙げられる。適用可能なベクターに関する上記の議論を参照（これは本文脈においても適用可能である）。
【００３７】
前述の観点から、心筋細胞の成熟を誘導するための特定の実施形態の説明に役立つ例が記載されている。
【００３８】
一実施形態では、方法は、未成熟な心筋細胞において、miR-122及びmiR-200aの一方又は両方の発現を低下させる工程を含む。対応するガイドRNA及びヌクレアーゼ（例えば、Cas9）を未成熟な心筋細胞でトランスジェニックに発現させる。ガイドRNA（又は両方のmiRNA'sが標的とされている場合はガイドRNAs）をコードするDNA、及びヌクレアーゼをコードするDNAは、同一又は別のベクターに組み込むことができる。各コードDNA領域は、未成熟な心筋細胞での転写を駆動するように構成されたそれ自身のプロモーター配列に作動的に連結する。ガイドRNAをコードする配列は、転写されたガイドRNAがRNAコンストラクトのままであることを確実にするために、典型的には、RNAプロモーターに作動的に連結している。いくつかの実施形態では、miR-122及びmiR-200aのガイドRNAsをコードするDNAは、同一のベクターに組み込まれる。他の実施形態では、miR-122及びmiR-200aのためのガイドRNAsをコードするDNAは、異なるベクターに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードするDNAは、一方又は両方のガイドRNAsをコードするDNAと同じベクターに組み込まれる。他の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするDNAは、一方又は両方のガイドRNAsをコードするDNAと異なるベクターに組み込まれる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、未成熟な心筋細胞の細胞株は、ヌクレアーゼをコードする遺伝子を細胞ゲノムに組み込むようにトランスジェニックに改変される。この実施形態では、改変は、未成熟な心筋細胞又はその幹細胞前駆体で実施できる。例えば、細胞を、プロモーターに作動的に連結されたヌクレアーゼ（例えば、Cas9）をコードするDNAを含むベクター（例えば、レンチウィルスベクター）と接触させる。ここで、レンチウィルスベクターは、ヌクレアーゼ遺伝子及びプロモーターを有する発現カセットを細胞のゲノムに恒久的に組み込む。プロモーターは、ヌクレアーゼの条件的又は恒常的発現を促進するように構成できる。そのような遺伝的背景により、未成熟な心筋細胞を、標的miRNA（例えば、miR-122又はmiR-200a）をコードするDNAの特異的切断を促進する上記の1つ以上のガイドRNA'sと接触させることができる。ガイドRNA'sは、以前の典型的な方法（例えば、細菌における組換え発現等）を使用して生成できる。これにより、所望の標的miRNA（例えば、miR-122及び/又はmiR-200a）のノックアウトを有する心筋細胞の細胞培養の効率的な生産が可能になる。又は、未成熟な心筋細胞を、標的miRNAをコードするDNA（例えば、miR-122又はmiR-200a）の特異的切断を促進する、上記のガイドRNA'sをコードする配列を組み込んだ1つ以上のプラスミド又は他のベクターと接触させることもできる。異なるガイドRNAsをコードするDNAは、同じ又は異なるプラスミド又は他のベクターに組み込むことができる。ゲノムへの組み込みは不要であり、ガイドRNA'sの一過性の発現は細胞をノックアウトするのに十分である。
【００４０】
さらに別の実施形態では、ヌクレアーゼ（例えば、Cas9）及びガイドRNA（例えば、miR-122又はmiR-200aをコードするDNAに向けられる）は、未成熟な心筋細胞自身におけるトランスジェニック発現に依存することなく、外因的に生産され、未成熟な心筋細胞に直接投与され得る。
【００４１】
標的miRNAsの過剰発現及び他の標的miRNAsの発現低下の両方が求められる他の実施形態では、それぞれの標的miRNAの過剰発現又は発現低下を駆動する核酸コンストラクトは、同一のベクターコンストラクトに組み込まれ得る。例示的な実施形態では、細胞を、複数の核酸発現コンストラクトを有する発現カセットを含むベクターと接触させる。この実施形態では、細胞は、未成熟な心筋細胞又はその幹細胞前駆体であり得る。発現カセットは、ベクターに特異的なインデューサーを用いて、そこにコードされた転写物の誘導性発現を促進できる。発現カセットは、上述のコードコンストラクトの任意の組み合わせを含むことができる。例示として、一実施形態では、発現カセットは、過剰発現を標的とする1つ以上のmiRNA（例えば、Let7、miR-452、及びmiR-208bの1つ以上）のそれぞれをコードするDNA配列と、発現低下を標的とする1つ以上のmiRNAs（例えば、miR-122及びmiR-200aの1つ又は両方）とハイブリダイズする一本鎖核酸をコードするDNA配列とを含む。本実施形態に適用可能な例示的なベクターは、pAC150-PBLHL-4xHS-EF1a-DEST（Addgene、#48234）であり、このベクターは、発現カセット内の発現コンストラクトがサイレンシングされないことを確実にするために、発現カセットに隣接するインシュレーター配列を有する。このような誘導性ベクターは、例えば、ドキシサイクリンによって誘導され得、そこに含まれるMiMaCのメンバーの発現を促進する。
【００４２】
上述のように、未成熟な心筋細胞は、幹細胞に由来し得る。いくつかの実施形態では、実施例にさらに詳細に記載されているように、細胞は、幹細胞の未成熟幹細胞への分化を促進することにより、インビトロで幹細胞に由来する。このプロセスはまた、例えば、Palpant, N.J., et al., Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nat Protoc, 2017. 12(1): p. 15-31; Burridge, P.W., et al., Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods, 2014. 11(8): p. 855-60; 及びTohyama, S., et al., Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell, 2013. 12(1): p. 127-37（それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）により詳細が記載されている。幹細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞であり得る。
【００４３】
いくつかの実施形態では、方法はさらに、未成熟な心筋細胞と有効量の長鎖脂肪酸とを接触させる工程を含む。本明細書で使用される「有効量」という用語は、心筋細胞の成熟及び/又は細胞内のカルジオリピンリモデリングをより成熟した状態に促進するのに十分な量を指す。いくつかの実施形態では、方法はさらに、未成熟な心筋細胞と少なくとも2種の長鎖脂肪酸とを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、未成熟な心筋細胞と少なくとも3種の長鎖脂肪酸種とを接触させる工程を含む。長鎖脂肪酸種は、パルミチン酸、オレイン酸、及びリノール酸から選択され得る。典型的には、パルミチン酸は、それ自体が細胞に対して細胞毒性を有する可能性があるため、オレイン酸又はリノール酸のいずれかと一緒に使用される。
【００４４】
長鎖脂肪酸は、その取り込み及び安定性を補助することができるBSAなどのキャリアに結合された形態で未成熟な心筋細胞に接触させることができる。細胞培養培地中の例示的なオレイン酸/BSA複合体濃度又は範囲は、以下を含む。約10-14μg/mL、約11-13μg/mL、約12-13μg/mL、例えば、約11μg/mL、約11.5μg/mL、約12μg/mL、約12.5μg/mL、約12.7μg/mL、約13μg/mL、及び約13.25μg/mL。細胞培養培地中の例示的なリノール酸/BSA複合体の濃度又は範囲は、以下を含む。約5.5-8.5μg/mL、約6.5-8μg/mL、約6.75-8.0μg/mL、例えば、約6μg/mL、約6.5μg/mL、約7μg/mL、約7.05、μg/mL、約7.5μg/mL、約8μg/mL、及び約8.25μg/mL。細胞培養培地中の例示的なパルミチン酸(パルミチン酸ナトリウムの形態で)/BSA複合体の濃度又は範囲は、以下を含む。約40-60μM、約45-55μM、約50-55μM、例えば、約45μg/mL、約48μM、約50μM、約52.5μM、約55μM、約58μM、及び約60μM。一例示的な実施形態では、実施例に記載されているように、脂肪酸メディアは、BSA（シグマO3008）に結合したオレイン酸は12.7 μg/mL、BSA（シグマL9530）に結合したリノール酸は7.05 μg/mL、BSA（シグマA8806）に結合したパルミチン酸ナトリウム（シグマP9767）は52.5μMの濃度を利用した。
【００４５】
さらなる実施形態では、方法はさらに、未成熟な心筋細胞と、約100-150μM、例えば、約110-140 μM、約115-135μM、及び約120-130μMの濃度のカルニチンとを接触させる工程を含む。例示的な濃度は、約100μg/mL、110μg/mL、約120μM、約125μM、約130μM、約135μM、約140μM、及び約150μMを含む。カルニチンは、ミトコンドリアへ投与された長鎖脂肪酸の輸送を補助する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、未成熟な心筋細胞は、遺伝子異常を有する。遺伝子異常は、心臓の代謝又は病理学的疾患状態と関連し得る。例えば、遺伝子異常は、脂肪酸酸化（FAO）障害と関連している。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、HADHA、FATP1、FACS1、OCTN2、L-CPTI、M-CPT I、CAT、CPTII、VLCAD、LCAD、MCAD、SCAD、LCHAD、SHYD、M/SCHAD、SKAT、MKAT、HS、HL、ETF、及びETFQOの1つをコードする遺伝子の変異を含み、脂肪酸障害をもたらす。誘導された成熟を伴う心筋細胞に遺伝子異常を実施することにより、得られた心筋細胞は、所望の異常を有するACMの疾患モデルを提供する。
【００４７】
別の態様において、本明細書の開示は、上記の方法によって生産される心筋細胞を提供する。示されるように、心筋細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞等の幹細胞に由来できる。いくつかの実施形態では、幹細胞はヒト由来である。
【００４８】
さらに詳細に記載されているように、細胞は、脂肪酸酸化（FAO）障害に関連する異常などの遺伝子異常を含み得る。例示的な遺伝子異常を含む標的遺伝子は、上記に記載されている。一実施形態では、遺伝子異常は、HADHAをコードする遺伝子における変異である。
【００４９】
心筋細胞における成熟を誘導するためにMiMaCを適用する方法を考えると、細胞は、過剰発現させるmiRNA（即ち、Let7、miR-452、及び/又はmiR-208b）であるか、又はそれをコードする外来核酸を含み得る。代替又は追加的に、細胞は、発現を低下させる標的miRNA（即ち、miR-122及び/又はmiR-200a）にハイブリダイズすることができる一本鎖核酸であるか、又はそれをコードする外来核酸を含み得る。代替又は追加的に、細胞は、発現を低下させる標的miRNA（即ち、miR-122及び/又はmiR-200a）をコードするゲノム配列にハイブリダイズすることができるガイドRNAsであるか、又はそれをコードする外来核酸を含むことができる。標的miRNAの発現低下のためのガイドRNAsを含むいくつかの実施形態では、細胞はまた、ヌクレアーゼ（例えば、Cas9又はTALENS）又はヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクトを含む。一実施形態では、細胞は、Let7 miRNAをコードする第一の核酸、miR-452をコードする第二の核酸、miR-122の少なくとも一部にハイブリダイズする一本鎖核酸をコードする第三の核酸、及びmiR-200aの少なくとも一部にハイブリダイズする一本鎖核酸をコードする第4の核酸を有する発現カセットを含む。これらの核酸配列は、1つ以上のプロモーターに作動可能に連結している。さらなる実施形態では、核酸配列の発現は、ドキシシリンの適用から誘導され得る。
【００５０】
別の態様において、本明細書の開示は、成熟したカルジオリピンプロファイルを有する心筋細胞の投与によって治療可能な状態の対象の治療方法を提供する。方法は、培養中の成熟を促進するための本明細書に記載された方法によって生産された有効量の心筋細胞を、対象に投与する工程を含む。例えば、方法は、対象から得られた誘導幹細胞を培養し、未成熟な心筋細胞に分化させる工程、その細胞に本明細書に記載された任意の様式でMiMaCを投与する工程、及びその細胞が成人心筋細胞に向かって成熟を進行させることを可能にする工程を含むことができる。次に、この細胞を必要とする対象に投与できる。他の実施形態では、幹細胞は、同じ種の異なる対象からのものであり得る。上述のように、幹細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞であり得る。
【００５１】
対象は、任意の哺乳類であり得る。いくつかの実施形態では、対象はげっ歯類又は霊長類である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びウサギ等である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、対象は、心臓組織の損傷した心臓細胞を有する。これは、対象が糖尿病、先天性心疾患、虚血、ミオパチー、ミトコンドリア疾患を有する、及び/又は梗塞イベントに罹患しているシナリオを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア疾患は、脂肪酸酸化（FAO）障害である。いくつかの実施形態では、対象は、ミトコンドリア三機能性蛋白質（MTP/TFP）欠損症を有する。いくつかの実施形態では、対象は、HADHAをコードする遺伝子の変異を有する。他の実施形態では、対象者は、FATP1、FACS1、OCTN2、L-CPTI、M-CPT I、CAT、CPTII、VLCAD、LCAD、MCAD、SCAD、LCHAD、SHYD、M/SCHAD、SKAT、MKAT、HS、HL、ETF、及びETFQOのうちの少なくとも1つをコードする遺伝子における変異を有する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、状態又は機能障害は、不整脈を経験することで顕在化し得る。対象は、例えば、ミトコンドリア三機能性蛋白質（MTP/TFP）欠損症を有する場合のような、乳幼児突然死症候群（SIDS）のリスクが高い新生児又は乳児であり得る。
【００５４】
細胞は、当技術分野で理解されている技術に従って、損傷を受けた心臓組織への投与のために容易に製剤化できる。
【００５５】
別の態様において、本明細書の開示は、対象のミトコンドリアの脂肪酸酸化（FAO）障害の治療方法を提供する。この方法は、対象のミトコンドリアにおけるカルジオリピンプロファイルを安定化する、又は成熟したカルジオリピンリモデリングを促進する組成物の有効量を投与する工程を含む。
【００５６】
対象は、ヒト等の任意の哺乳類であり得る。
【００５７】
ミトコンドリア機能障害は、糖尿病、心不全、神経変性、高齢化、先天性心疾患、虚血、ミオパチー、及び/又は梗塞のインスタンスに関連し得る。いくつかの実施形態では、FAO障害は、脂肪酸β酸化障害である。FAO障害は、上記で示された遺伝子のいずれかの変異と関連し得る。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア機能障害は、不整脈及び/又は乳幼児突然死症候群のリスクの増加と関連している。
【００５８】
いくつかの実施形態では、カルジオリピンプロファイルを安定化する工程は、カルジオリピンの酸化を防止する工程を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、毒性活性酸素の生産を減少させ、カルジオリピンを安定化させることが知られている小ミトコンドリア標的化テトラペプチドであるエラミプレチド（SS-31とも呼ばれる）（Stealth BioTherapeutics Inc, Newton, MA）であるか、又はそれを含む。一実施形態では、有効量のエラミプレチドを、ミトコンドリア三機能性蛋白質欠損症を有する対象に投与する。
【００５９】
別の態様において、本明細書の開示は、潜在的な心臓機能の調節のための候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。この点において、本明細書に記載の方法及び組成物は、成人心筋細胞をより正確に反映するように成熟が進行するように培養心筋細胞を生産することを可能にしている。従って、そのような細胞は、候補薬剤/化合物のスクリーニングプロセスを提供するために、インビトロで容易に生産できる。
【００６０】
方法は、本明細書に記載の方法によって生産された1つ以上の心筋細胞と候補薬剤とを接触させる工程、及び1つ以上の心筋細胞における心臓機能パラメータを測定する工程、を含む。心臓機能パラメータの変化は、候補薬剤が心機能を調節していることを示す。好ましい機能パラメータを促進し、及び/又は負の機能パラメータを減少させる候補薬剤は、治療又は継続的な研究のための強力な候補剤又は化合物として選択され得る。
【００６１】
心臓機能パラメータは、心臓組織機能に関連した測定可能な任意のパラメータを含むことができる。非限定的に、例示的な心臓機能パラメータには、定義された状況下での脂質プロファイル、カルジオリピンプロファイル、代謝プロファイル、酸素消費率、ミトコンドリアプロトン勾配、収縮力、カルシウム輸送、伝導速度、グルコースストレス、及び細胞死を含む。さらに、潜在的な毒性及び投与濃度は、開示された細胞において試験できる。
【００６２】
方法は、健康な成人心筋細胞のモデルに対する効果について候補薬剤をスクリーニングすることに加えて、より成熟した心筋細胞の状態を有する疾患モデルの効果について候補化合物をスクリーニングする実施形態を含む。従って、いくつかの実施形態では、スクリーニングに使用される成熟した心筋細胞は、本明細書の他の箇所に記載されているような遺伝子異常を含み得る。この異常は、例えば、脂肪酸酸化（FAO）障害と関連し得る。例示として、以下の実験の説明は、HADHA蛋白質における遺伝子変異を有する細胞に向けられている。細胞は、ミトコンドリア三機能性蛋白質（MTP/TFP）欠損症を有する成人心筋細胞のモデルを提供するために、より成熟した状態に進行するように誘導された。これにより、機能障害に対抗する化合物の試験が可能となった。
【００６３】
別の態様において、本明細書の開示は、培養された心筋細胞の病理学的状態を検出する方法を提供する。この方法は、心筋細胞のカルジオリピンプロファイルを測定する工程を含む。炭素数18を超えるアシル鎖を有するカルジオリピンの相対的な増加、及び/又は炭素数18未満のアシル鎖を有するカルジオリピンの相対的な減少は、心筋細胞の病理学的状態が低下していることを示す。
【００６４】
カルジオリピンプロファイルを測定するための例示的なリピドミクス方法は、下記実施例においてさらに詳細に記載されている。
【００６５】
カルジオリピンの相対的な増加又は減少は、心筋細胞の参照スタンダード（例えば、正常又は許容可能なミトコンドリア機能を示す、又は認められた正常又は成熟したカルジオリピンプロファイルを有することが認められた、野生型成人心筋細胞又は培養心筋細胞に由来する）と比較できる。他の実施形態では、カルジオリピンの相対的な増加又は減少は、正常又は許容可能なミトコンドリア機能を示す、又は認められた正常又は成熟したカルジオリピンプロファイルを有することが認められた、野生型未成熟心筋細胞又は培養心筋細胞と比較できる。以下の実験の開示は、成熟過程における培養ヒト心筋細胞におけるカルジオリピンのプロファイリングを記載する。
【００６６】
培養心筋細胞は、上述したように、胚性幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞等のインビトロの幹細胞に由来し得る。
【００６７】
病理学的状態は、上記でより詳細に説明したように、ミトコンドリア機能障害に関連した状態であり得る。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア機能障害は、ミトコンドリア三機能蛋白質欠損症である。
【００６８】
方法は、目的を果たすために、培養細胞が十分に成熟しているかどうか、即ちカルジオリピンリモデリングが十分に行われているかどうかを確認するために実施できる。さらに、方法は、心臓の恒常性又は他のミトコンドリア機能への影響を確認するために、候補薬剤化合物のインビトロスクリーニング中に1回以上実施できる。このように、方法は、培養心筋細胞の病理学的状態を低下させるために、培養心筋細胞と候補薬剤とを接触させることをさらに含むことができる。検出工程のタイミングは、特定のスクリーニング又は治療のために適切に設計できる。測定工程は、培養心筋細胞の病理学的状態に関する候補薬剤の効果を確認するために、例えば、培養心筋細胞と候補薬剤とを接触させる工程の前、途中、及び/又は後に、複数回行うことができる。
【００６９】
測定方法は、心筋細胞の病理学的状態を診断するために、対象から得られた細胞に対して実行されるように拡張することもできることが理解されるであろう。
【００７０】
この点で、ミトコンドリア三機能性蛋白質欠損症は、しばしば、心臓（心筋細胞）、肝臓（肝細胞）、及び網膜からの細胞において協調的に見られる。従って、これらの組織（典型的には肝臓）のいずれかから1つ以上の細胞を得ることができ、カルジオリピンプロファイルを確認できる。本明細書に記載されているように、18（又はそれを超える）の炭素鎖を有するカルジオリピンの相対的なレベルが低いことは、未成熟な状態から成熟した状態にカルジオリピンを完全にリモデリングするために細胞が破綻していることを示す。カルジオリピンのリモデリングの破綻は、細胞が主要なエネルギー源として脂肪酸を効率的に利用することができないことを示す。この破綻は、対象の心筋細胞と並行して経験される可能性が高く、不整脈やSIDSなどの病態のリスクの増加につながる。
【００７１】
別の態様において、本明細書の開示は、培養心筋細胞の成熟を誘導するための組成物、又は組成物のキットを提供する。組成物は、未成熟な心筋細胞の成熟を促進するための、上述の方法において有用である。組成物は、MiMaC製剤に向けられ、以下のうちの2つ以上を含む。Let7iマイクロRNAをコードする核酸コンストラクト、miR-452をコードする核酸コンストラクト、miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズする核酸フラグメントである、又はそれをコードする核酸コンストラクト、及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズする核酸フラグメントである、又はそれをコードする核酸コンストラクト。
【００７２】
一実施形態では、組成物は、以下の3つ以上を含む。Let7iマイクロRNAをコードする核酸コンストラクト、miR-452をコードする核酸コンストラクト、miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズする核酸フラグメントである、又はそれをコードする核酸コンストラクト、及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズする核酸フラグメントである、又はそれをコードする核酸コンストラクト。さらなる実施形態では、組成物は、Let7iマイクロRNAをコードする核酸コンストラクト、miR-452をコードする核酸コンストラクト、miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズする核酸フラグメントである、又はそれをコードする核酸コンストラクト、及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズする核酸断片である、又はそれをコードする核酸コンストラクトを含む。
【００７３】
標的miRNAsは、上記でより詳細に記載されている。また、標的miRNAをコードする配列の一部にハイブリダイズして機能性を阻害し、発現の機能的低下をもたらすような核酸断片も記載されている。
【００７４】
マイクロRNAをコードする、及び/又は核酸断片をコードする核酸コンストラクトは、それぞれ、1つ以上のプロモーター配列に作動的に連結している。
【００７５】
1つ以上のコンストラクトは、細胞への送達のために構成された1つ以上のベクターに組み込むことができる。1つ以上のベクターは、レンチウィルス又はAAVベクター等のウィルスベクターであり得る。
【００７６】
いくつかの実施形態では、各核酸コンストラクトは、個々にベクターに組み込まれ、従って、組成物は、複数のベクター（異なる組み込まれた発現コンストラクトを有する）を含み、混合される。別の実施形態では、各核酸コンストラクトは、同一のベクターに組み込まれる。例えば、複数の核酸コンストラクトは、単一のベクターに組み込まれた同一の発現カセットに組み込まれ得る。ベクターは、発現カセット内の全てのコンストラクトの発現を、恒常的に又は一過性に（例えば、誘導によって）促進するように構成できる。ベクターは、細胞への送達後の不活性化を防止するためのインシュレーター配列を提供できる。本実施形態に適用可能な例示的なベクターは、pAC150-PBLHL-4xHS-EF1a-DEST（Addgene、#48234）である。
【００７７】
miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズする核酸断片及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズする核酸断片は、それぞれ、miR-122及びmiR-200aを切断する遺伝子編集酵素を誘導するように構成されたガイドRNA分子である。遺伝子編集酵素は、上述したように、ヌクレアーゼであってもよく、及び/又はエンドヌクレアーゼ機能を有していてもよい。例としては、Cas9及びTALENSが挙げられるが、他のものが知られており、本明細書の開示に包含される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のキット又は組成物は、ヌクレアーゼをさらに含む。他の実施形態では、キット又は組成物は、ヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクトをさらに含む。ヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクトは、標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を促進するプロモーター配列に作動的に連結している。
【００７９】
いくつかの実施形態では、キット又は組成物は、上記でより詳細に記載されている1種以上の長鎖脂肪酸をさらに含む。1種以上の長鎖脂肪酸は、パルミチン酸、オレイン酸、及び/又はリノール酸を含む。いくつかの実施形態では、キット又は組成物は、パルミチン酸、オレイン酸、及びリノール酸の組み合わせを含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のキットは、幹細胞由来の心筋細胞からの成熟培養心筋細胞の調製を促進するための細胞培養培地及びインストラクションをさらに含むことができる。
【００８１】
別の実施形態では、本明細書に開示のキットは、代謝的に活性化又は凍結され得る、幹細胞由来の心筋細胞をさらに含むことができる。別の実施形態では、キット及び/又はその構成要素のいずれかは、周囲温度又は室温で、又は例えば、4℃で輸送及び/又は保存できる。幹細胞由来の心筋細胞は、最終的に、疾患又は障害（例えば、本明細書に記載されるようなミトコンドリア機能障害）を有する対象に由来することができ、又は、例えば、心疾患又は障害を含む疾患又は障害を模倣するように遺伝的に改変されている。
【００８２】
本明細書で具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての用語は、本発明の当業者にとっては同じ意味を有する。専門家は、特に技術の定義と用語のためにSambrook J., et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (2001); Ausubel, F.M., et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (2010); Coligan, J.E., et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York (2010); Mirzaei, H. and Carrasco, M. (eds.), Modern Proteomics - Sample Preparation, Analysis and Practical Applications in Advances in Experimental Medicine and Biology, Springer International Publishing, 2016; 及びComai, L, et al., (eds.), Proteomic: Methods and Protocols in Methods in Molecular Biology, Springer International Publishing, 2017を対象にする。
【００８３】
便宜上、本明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲で採用されている特定の用語をここに提供する。定義は、特定の実施形態を説明するのに役立つように提供されており、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため、請求された発明を限定することを意図していない。
【００８４】
特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替物のみを参照することを明示的に示さない限り、又は代替物が相互に排他的である場合を除き、「及び/又は」を意味するために使用されるが、本明細書の開示は、代替物と「及び/又は」のみを指す定義をサポートする。
【００８５】
長年の特許法に従って、特許請求の範囲又は明細書中で「含む」という言葉と一緒に使用される場合、「a」及び「an」という言葉は、特に明記されていない限り、1つ以上のものを意味する。
【００８６】
文脈から明らかに別の意味を要求されない限り、本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、「含む（comprise）」、「含む（comprising）」等の語は、排他的又は徹底的な意味とは対照的に、包括的な意味で解釈される。つまり、「含むが、これに限定されない」という意味である。単数又は複数形の数を使用する単語は、それぞれ、複数形及び単数形の数を含む。さらに、「ここ」、「上」、「下」、及び同様の意味の単語は、本願で使用される場合、本願全体を指し、本願のいかなる特定の部分を指すものではない。「約」という語は、記載された参照数値の上又は下にある微小変化の範囲内の数値を示す。例えば、「約」は、記載された参照数値の上又は下の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、又は1%の範囲内の数字を指すことができる。
【００８７】
開示されている方法及び組成物のために使用することができ、一緒に使用することができ、調製のために使用することができ、又は開示されている方法及び組成物の生産物である、材料、組成物、及び成分が開示されている。これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループ等が開示されている場合、これらの化合物の各単一の組み合わせ及び順列への具体的な言及は明示的に開示されていなくても、様々な個々の組み合わせ及び集合的な組み合わせのそれぞれが具体的に企図されることが理解される。この概念は、本明細書の開示の全ての態様に適用され、記載された方法の工程を含むが、それに限定されない。従って、任意の前述の実施形態の特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせたり、置換したりできる。例えば、実行可能な様々な追加工程がある場合、これらの追加工程の各々は、開示された方法の任意の特定の方法工程又は方法工程の組み合わせで実行可能であり、そのような組み合わせ又は組み合わせのサブセットの各々は、具体的に企図されており、開示されているとみなされるべきであることが理解される。さらに、本明細書に記載された実施形態は、本明細書の他の場所に記載されたような、又は当技術分野で知られているような、任意の適切な材料を使用して実施できることが理解される。
【００８８】
ここで引用された刊行物及び主題は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【００８９】
乳幼児突然死症候群（SIDS）の原因となるミトコンドリア三機能性蛋白質（MTP）欠損症の病因についての研究について以下説明する。この研究では、関連する疾患状態を反映した心筋細胞（CMs）のモデルを生成するために、誘導多能性幹細胞からCMsの成熟を促進するための新しいアプローチを開発した。
【００９０】
アブストラクト
ミトコンドリア三機能性蛋白質欠損症は、ヒドラターゼサブユニットA（HADHA）の変異に起因する。この疾患の病因を明らかにするために、HADHA欠損hiPSCから幹細胞由来の心筋細胞を作製し、エピジェネティックレギュレーターであるHOPXをアップレギュレートする新規の人工マイクロRNA成熟カクテル（「MiMaC」）を用いて成熟を促進させた。脂肪酸処理したMiMaC処理HADHA変異体心筋細胞で、この病気の表現型（不整脈状態を引き起す欠損したカルシウムダイナミクスと再分極キネティクス）が明らかになった。シングルセルRNA-seqにより、代謝遺伝子の発現に基づく新規な心筋細胞の発生中間体が明らかになった。この中間体により、対照細胞では成熟様の心筋細胞が発生したが、変異体細胞では脂肪酸β酸化（FAO）の減少、ミトコンドリアのプロトン勾配の低下、クリステ構造の破壊、カルジオリピンリモデリングの欠損などの病理学的状態に移行した。本研究は、ヒト心筋細胞の機能的ミトコンドリアに不可欠なFAOとカルジオリピンリモデリングには、MLCL-AT様酵素であるTFPa/HADHAが必要であることを明らかにした。
【００９１】
結果
ミトコンドリア三機能性蛋白質欠損心筋細胞の生成
ミトコンドリア三機能性蛋白質欠損症の心臓病理をインビトロで細胞レベルで再現するために、CRISPR/Cas9システムを用いてヒトiPSCのHADHA遺伝子の変異を生成した。我々の同質遺伝子対照となる野生型（WT）hiPSC株から、HADHAのエクソン1を標的とする2つの異なるガイドを用いて複数のHADHA変異hiPSC株を生成し、ウエスタンブロット（図示せず）によりクローンに対してHADHA変異を確認した。gRNA1を用いて作製したノックアウト（KO）HADHA（HADHAKO）及び複合ヘテロ接合体（HADHAMut）hiPSC株を、さらなる研究のために使用した。
【００９２】
HADHAKO株のDNA配列を調べたところ、ホモ接合性の22bp欠失が認められ、これはエクソン1の早期停止コドンをもたらした（図1B）。HADHAMut株は、第1対立遺伝子上に2bp欠失及び9bp挿入を有し、第2対立遺伝子上に2bp挿入を有していた（図1C）。両方の株は、上位3つの予測された部位でのオフターゲット変異を示さなかった（図示せず）。HADHAMut系統で見つかった変異は、両方の対立遺伝子上の予測された早期停止コドンをもたらした。（図1Cに示された野生型配列に対応する代表的なHADHAWT蛋白質断片配列は、配列番号6として示される。図1Cに示された2つのHADHAMut変異体対立遺伝子に対応するHADHAMut蛋白質断片配列は、それぞれ配列番号8及び10として示される。）但し、各株の蛋白質を調べたところ、HADHAは、WT hiPSC株では発現され、HADHAKO株では発現されず、HADHAMut株では低い程度ではあるが依然として発現されていることが観察された（図1D）。次に、WT及びHADHAMut株で発現したHADHAの転写物を調べた。WT株はエクソン1〜20からの全長HADHA転写物を発現しているのに対し、HADHAMut株はエクソン1〜3をスキップし、HADHAエクソン4〜20を発現していることがわかった（図1C）。エクソン4〜20からのHADHAの転写物が知られていないことから、イントロン-エクソン接合部で発生した突然変異が、代替スプライシング事象を誘発し、新しい転写物を発現させた可能性がある。HADHA変異体分子量の減少が観察されたこと（図1D）は、この仮説を支持する。発現されたHADHAMut蛋白質は、エクソン1〜3、60アミノ酸の発現をスキップし、切断されたClpP/クロトナーゼドメインを生成する。これは、おそらくFAO中にエノレートアニオン中間体を安定化することができないことに起因するミトコンドリア局在化及び酵素ポケットの蛋白質フォールディングを損なう。
【００９３】
単層直接分化プロトコル（Palpant, N.J., et al., Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nat Protoc, 2017. 12(1): p. 15-31）を用いて、ヒト誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞（hiPSC-CMs）を3つの株から生成した。HADHAの減少又は喪失は、心筋細胞を生成する能力を妨げないことが判明した（図1Eの画像を参照）。MTP欠損心筋細胞の機能的表現型を評価するために、長鎖FAであるパルミテートの存在による酸素消費量の増加を測定するために、シーホースアッセイを行った。MTP欠損CMsはWT CMsと比較して長鎖FAを利用する能力が低下していることが予想された。しかし、それは対照CMsであっても、全てのCMsにおいて長鎖FAを利用することができないことがわかった（図1F）。hiPSC-CMsはACMではなくFCMを代表する未成熟な細胞であるため、ATP生産のための基質としてFAを利用することができない。従って、MTP欠損CMsの機能的表現型のより良い評価を可能にするFAを利用できるようにhiPSC-CMsを成熟させる戦略が必要となった。
【００９４】
hPSC-CM成熟のためのマイクロRNA（miRs）のスクリーニング
ヒトの心臓成熟期に起こる生物学的変化をよりよく理解するために、本発明者らは以前にmiRスクリーニングを実施したが、そこでは、多くの有意に調節されたmiRが、20日（D20）hPSC-CMsと1年成熟hPSC-CMsとの間のインビトロ移行期に観察された（Kuppusamy, K.T., et al., Let-7 family of microRNA is required for maturation and adult-like metabolism in stem cell-derived cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U.S.A., 2015）。このリストは、ヒト胎児心室から成人心室心筋のin vivo miR配列解析データと相互参照された（Akat, K.M., et al., Comparative RNA-sequencing analysis of myocardial and circulating small RNAs in human heart failure and their utility as biomarkers. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014. 111(30): p. 11151-6; Yang, K.C., et al., Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation, 2014. 129(9): p. 1009-21）。本発明者らは、以前に、不完全ではあるが強固な成熟応答を駆動するために、最もアップレギュレーションされたmiRsファミリーであるLet-7がhESC-CMsにおいて過剰発現され得ることを発見した（Kuppusamy, K.T., et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A., 2015）。本研究では、追加のmiRsをLet-7と組み合わせて、より完全な成人様トランスクリプトームを促進することにより、hPSC-CMsを急速に成熟させた。アップ及びダウンレギュレーションされたmiRsの上位15個をスクリーンから選択し、各miRsについて上位200個の予測標的（TargetScanHuman）を同定した。各miR'sの予測標的を用い、GeneAnalyticsソフトウェアを用いてパスウェイ解析を行い、どのmiRが心筋細胞の成熟に関連するパスウェイに影響を与えているかを決定した。このパスウェイには、グルコース及び/又は脂肪酸代謝、細胞増殖及び肥大、細胞周期が含まれていた。多くのダウンレギュレーションされたmiRは多能性状態の維持に関連しており、心筋細胞の成熟をスクリーニングするためには選択されなかった。最終的には、パスウェイ解析に基づいて、CM成熟能を評価するための6つのmiRsがさらなる解析のために選択された（3つのアップレギュレーションされたmiRs（miR-452、-208b及び-378e）及び3つのダウンレギュレーションされたmiRs（miR-122、-200a及び-205）である）（図2A）。
【００９５】
具体的には、miR-378e（Nagalingam, R.S., et al., A cardiac-enriched microRNA, miR-378, blocks cardiac hypertrophy by targeting Ras signaling. The Journal of biological chemistry, 2013. 288(16): p. 11216-32）、-208b（Callis, T.E., et al., MicroRNA-208a is a regulator of cardiac hypertrophy and conduction in mice. J Clin Invest, 2009. 119(9): p. 2772-86）、及び-452の3つの高発現miRを選択した。成熟CMsにおける高い発現レベル及び心臓肥大への関与に基づいて、378個のmiRsのファミリーを選択した。MiR-378e及び-378fは同じシード領域を共有しており、miR-378eを378ファミリーの代表的なmiRとして選択した。miR-208bは、代謝及び心肥大パスウェイの両方に関与することが予測されるために選択した。さらに、miR-208bは、ミオシンβ重鎖（MYH7）遺伝子のイントロニックmiRであり、マウスの心臓における速筋繊維遺伝子プログラムを抑制しながら、遅筋繊維を特定する役割を持つことが報告されている（van Rooij, E., et al., A family of microRNAs encoded by myosin genes governs myosin expression and muscle performance. Dev Cell, 2009. 17(5): p. 662-73）。MiR-452は、Let-7に次いで2番目にアップレギュレーションされたmiRであり、代謝に関連する標的であることが予測された。
【００９６】
高度にダウンレギュレーションされた3つのmiRs候補は、miR-200a、-122及び-205であった。miR-141と-200aは同じシード領域を共有しており、肥大と代謝の両方のパスウェイに関与している。miR-200aは研究のための代表的なmiRとして選択した。他の2つの高度にダウンレギュレーションされたmiRs、miR-205とmiR-122は最も大きなダウンレギュレーションを示した。
【００９７】
候補マイクロRNA（miRs）の機能解析
上記で示された6つのmiRsについて、hPSC-CMの成熟度を測定するための4つの機能テストを用いて評価した（細胞エリア、収縮力、代謝能力及び電気生理学）。WT D15 hiPSC-CMsに、CRISPR/Cas9を用いてOE miR又はKO miRのいずれかをレンチウィルスで導入した。次に、細胞に、心筋細胞集団を濃縮するために選択された乳酸塩、及びウィルスベクターを含む集団を濃縮するために選択されたピューロマイシンを用いた。機能評価をmiR摂動の2週間後のD30に実施した（図2B）。
【００９８】
心筋細胞の成熟の重要な特徴は、細胞サイズの増加である。試験したmiRsのうち、miR-208b OEだけが細胞エリアの有意な増加を誘導することがわかった（EV: 2891μm2, 208b: 5802μm2, P<0.05）（図2C）。未成熟なhPSC- CMsは、細胞外微小電極で実験すると、高い速度で自発的に拍動し、短いフィールドポテンシャル持続時間を有する。微小電極アレイを用いて、OE miRが生理的に適切な長さまでフィールドポテンシャル持続時間を増加させるかどうかを評価した。試験したmiRsのうち、miR-452 OEのみが補正されたフィールドポテンシャル持続時間（cFPD）をより成人様の持続時間（(cFPD, EV: 296ms, 452: 380ms）に増加させた（図2D）。心筋細胞の成熟の特徴の一つは、細胞によって生成される収縮力の増加である。シングルセル収縮力解析をマイクロポストプラットフォーム（Kuppusamy, K.T., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2015;Rodriguez, M.L., et al., Measuring the contractile forces of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with arrays of microposts. J Biomech Eng, 2014. 136(5): p. 051005; Beussman, K.M., et al., Micropost arrays for measuring stem cell-derived cardiomyocyte contractility. Methods, 2016. 94: p. 43-50）を用いて実施した。試験miRsのうち、miR-200aのKOのみが収縮力の有意な増加をもたらした（EV: 30.8nN, miR-200a: 51.7nN, P<0.05）（図2E）。最後に、miRで処理したhPSC-CMsの代謝能力を評価した。心筋細胞はATP合成のための高い能力を持つミトコンドリアを必要とする代謝要求性の細胞型である。試験したmiRsのうち、miR-122のKOのみが最大酸素消費率（OCR）を有意に増加させ、より活性なミトコンドリアを示した（miR-122 KO: EVと比較した倍率変化1.35, P<0.001）（図2F）。
【００９９】
候補マイクロRNA（miRs）のバイオインフォマティクス解析
hPSC-CMsにおけるグローバルな転写影響を評価するために、いくつかのmiRs（miR-378e OE、-208b OE、-452 OE、-122 KO又は-205 KO）の変化後にRNA配列解析を行った。各miRがグローバルな転写産物レベルで異なる効果を生じさせることができるかどうかを決定するために、サンプルを主成分分析（PCA）で分析した。各サンプルにおいて、約11,000個の蛋白質コード遺伝子が発現しており、全サンプルにわたって少なくとも3つのFPKMの凝集した発現を有するものをPCAに使用した。PCAは、各miRがそれぞれの対照から有意な変化をもたらすことを示した（図示せず）。miR-452 OEはPC1で最大の分離を示したのに対し、miR-122 KOはPC2で最大の分離を示した。このことは、これら2つのmiRがそれぞれhPSC-CMの転写プロファイルにしっかりと影響を与えていることを示唆している。さらに、いずれのmiRも互いにクラスター化していないことから、それぞれのmiRは独自の発現シグネチャを誘導することが可能であった。
【０１００】
次に、心臓成熟に不可欠なパスウェイを具体的に調べることで、各miR'sの機能をよりターゲットを絞った方法で解析した。各miRが心筋細胞の成熟の特徴として選ばれた7つの異なるパスウェイ（心肥大、心臓同一性、細胞周期、電気生理学、脂肪酸代謝、グルコース代謝、及び細胞骨格として特徴づけられた。図示せず。）にどのように影響を与えているかを示すパスウェイ濃縮ヒートマップを作製した。MiR-122 KOは細胞周期及び脂肪酸代謝遺伝子のアップレギュレーションを示した。MiR-452 OEは心肥大、電気生理学、及び細胞骨格のアップレギュレーションを示した。MiR-208b OEは、細胞周期及び電気生理学遺伝子に加えて、心臓同一性の強いアップレギュレーションを示した。最後に、miR-378e OEは電気生理学遺伝子のアップレギュレーションを示したが、miR-205 KOは心臓成熟関連パスウェイのアップレギュレーションが低かった。このヒートマップは、各miRが異なるセットのパスウェイ濃縮をもたらしたため、各miRが心筋細胞の成熟に独自の影響を与えることを補強する。さらに、ヒートマップのデータによると、miR-205 KOは心筋細胞の成熟をもたらす能力が低いのに対し、miRs-122 KO、-452 OE、及び-208b OEはすべて心筋細胞の成熟の特徴的なパスウェイに影響を与える強い能力を示した。
【０１０１】
これらのデータから、Let7i OE、miR-452 OE、miR-122 KO、及びmiR-200a KOのコンストラクトを含むマイクロRNA Maturation Cocktail（MiMaCと称する）を作製した。心筋細胞の成熟をもたらすためのmiRの有効性を示す本発明者らの最初の研究のためにLet7iを選択した（Kuppusamy, K.T., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2015）。機能的アッセイのそれぞれから、最小数のmiRからなるカクテルを生成するために、成熟の有意な増加をもたらすmiRを選択した。 
【０１０２】
MiMaCの機能評価
MiMaC処理したhPSC-CMの成熟を評価するために、収縮力、細胞エリア、代謝アッセイを行った（図3A）。MiMaC処理したhPSC-CMs（平均力：36 nN、P = 0.002）は、対照細胞（平均力：24 nN）と比較して、トゥイッチ力が統計的に有意に増加した（図3B）。MiMaC処理したhPSC-CMs（平均パワー: 38 fW, P = 0.016）はまた、対照細胞（平均パワー：22 fW）と比較して、生成されたパワーが統計的に有意に増加した（図3D）。
【０１０３】
MiMaC処理したhPSC-CMsは、細胞エリアが統計的に有意に増加した。hiPSC-CMsを使用した、MiMaC処理したCMsは、2389 μm2の平均エリアを有する対照細胞と比較して、3022 μm2（P < 0.001）の平均エリアを有していた（図3E及び3F）。hiPSC-CMsに対するMiMaCの効果に加えて、MiMaCは処置したhESC-CMsの細胞エリアを有意に増加させた（図示せず）。
【０１０４】
心筋細胞の成熟の特徴の一つは、ATPを生成するためにFAを利用する能力を得ていることである。未成熟なhPSC-CMsは、β酸化を介したATP生産のために長鎖FAを利用することができない。MiMaC処理したhPSC-CMsが長鎖FAを酸化することができるかどうかを評価するために、細胞をパルミテートで急性処理し、OCRの増加があったかどうかを測定した。MiMaC処理したhESC-CMsとhiPSC-CMsの両方が対照CMsよりも有意に大きくパルミテートを利用することができた（hiPSC-CMsは図3Gを参照。hESC-CMsの同様の結果は図示せず。）。
【０１０５】
MiMaCの転写評価
MiMaCがhiPSC-CMsのトランスクリプトームにどのように影響を与えているかをよりよく理解するために、D30のEV対照CMsとD30のMiMaC処理したCMsを比較してRNA配列解析を行った。特徴的な遺伝子セットを用いたパスウェイ濃縮解析の結果、多くの細胞の成熟と筋のプロセスがアップレギュレーションされていることが示された（例えば、筋発生及び上皮間葉転換[34]）。上位のダウンレギュレーションされたパスウェイは、心筋細胞の成熟の重要な特徴である細胞周期に関連していた。STRING解析を用いて、2つのパスウェイ（筋発生と上皮間葉転換）に関連する有意にアップレギュレーションされ、相互連結した遺伝子のネットワークを決定した。また、STRING解析を用いて、抑制された細胞周期に関連する有意にダウンレギュレーションされ、相互連結した遺伝子は、有糸分裂紡錘体及びG2Mチェックポイントであることを示した。これらの知見は、MiMaCツールがhiPSC-CMsにおけるより成熟したトランスクリプトームを促進することを示している。
【０１０６】
HOPXはCMの成熟を制御する新規な制御因子である
心臓成熟に重要な分子機構をよりよく理解するために、選択された6つのmiRsの重複する予測標的を決定した。予測標的の一つであるHOPX（図3H）は心筋芽細胞の分化に重要であるが（Jain, R., et al., HEART DEVELOPMENT. Integration of Bmp and Wnt signaling by Hopx specifies commitment of cardiomyoblasts. Science, 2015. 348(6242): p. aaa6071）、この転写調節因子に関する研究は、後のプロセスであるヒトの心筋細胞の成熟には至っていない。本研究では、HOPX発現がインビトロ（図3I）、in vivo（図3J）、及びMiMaCで処理したhiPSC-CMs（図3K）でアップレギュレートされていることが見られた。選択されたMiMaC miRsがどのように成熟期にHOPX発現を個別に制御しているかを分析するために、HOPXレベルをmiR-122 KO及びLet7i OE hiPSC-CMsで分析した。その結果、D30のmiR-122 KO hiPSC-CMsではHOPXの発現が6.8倍に増加していたが、Let7i OEで成熟したhiPSC-CMs はHOPXの発現に影響はなかった（図示せず）。このデータは、Let7i OE成熟はHOPX心臓成熟パスウェイを支配していないことを示している。このことは、hPSC-CMsにおけるしっかりとした成熟効果を生成するために複数のmiRsを一緒に組み合わせる必要性を強調しており、HOPXはコミット後の心筋細胞の成熟のための強力な候補であるように思われる。
【０１０７】
miR処理したCM成熟のscRNA配列解析
シングルセルRNA-配列解析（scRNA-Seq）を使用し、心筋細胞の成熟のメカニズムを解明し、MiMaCを構成する各miRがCMの成熟においてどのように振る舞うのかをよりよく理解するために、MiMaCツールを利用した。5つのグループのmiR処理したCMsを対象にscRNA-Seqを行った（EV, Let7i & miR-452 OE, miR-122 & -200a KO, MiMaC及びMiMaC + FA）。非バイアスクラスタリングを行い、miR摂動がCMをどのように変化させたかを調べた。5つのサブグループが発見され（図3L）、カイ二乗検定を使用して、miR摂動がこれら5つのクラスターの濃縮をもたらしたかどうかを評価した（図3M）。クラスター0と3ではEV群が、クラスター0と1ではLet7iとmiR-452 OE群が、クラスター0と3ではmiR-122と-200a KO群が、クラスター1と2ではMiMaCとMiMaC + FA群がそれぞれ濃縮されていた。クラスター4は主にリードカウントの悪い細胞で構成されており、それ以上の解析は行わなかった。各サブグループにおける細胞の運命を特徴づけると、細胞の大部分は心筋細胞であり、クラスター1の細胞のごく小さなサブセットは線維芽細胞（ENC1、DCN、THY1）と心外膜マーカー（WT1、TBX18）を示した（図示せず）。これらのデータは、乳酸濃縮プロトコルが、高度に濃縮された心筋細胞集団の生成に成功したことを示している。
【０１０８】
どのクラスターが心筋細胞の成熟度が高いかをランク付けするために、scRNA Seqクラスターを2つの異なる方法で評価した。まず、MiMaC濃縮されたクラスターであるクラスター2で高度にアップレギュレーションされた遺伝子とダウンレギュレーションされた遺伝子を心臓マーカーと酸化的リン酸化遺伝子とともに評価した（図3N）。次に、同定されたクラスター内のin vivoヒト心臓成熟マーカーを調べた（図3O）。クラスター2では、筋原線維構造蛋白質に関連する遺伝子が高度にアップレギュレーションされ、リボソーム及びECM接着遺伝子がダウンレギュレーションされていることが判明した（図3N）。生体内成熟マーカー遺伝子の平均発現レベルは、他のクラスターと比較して、クラスター2で有意に高かった（図3O：P< 2x10-16、線形混合効果モデルを使用)同様の分析は、実験群に基づいても行った。また、MiMaC処理した細胞は一連のtSNEプロット及びヒートマップ（図示せず）で示されるように、最も成熟した細胞であることが判明した。これらの知見に基づいて、各クラスターを、最も成熟していないものから最も成熟しているものまでをクラスターとしてランク付けした（0<1<3<2）。MiMaCで処理したCMsに富む最も成熟したCMクラスターであるクラスター2は、成熟期にアップレギュレートされ、MiMaCでダウンレギュレートされたmiRsの予測標的である遺伝子であるHOPXの最も高い発現を示した（図示せず）。重要なことに、これらのデータは、観察された転写成熟が正常なin vivo心筋細胞の成熟を反映していることを示している（図3O）。
【０１０９】
最後に、MiMaC製剤への脂肪酸の添加を、心筋細胞の成熟を増加させるために評価した。パルミテート、リノール酸及びオレイン酸の3種の長鎖脂肪酸を、使用した基本心臓培地に添加した。MiMaC + FA細胞はクラスター2で濃縮されていることがわかった。いくつかの研究では、特定のFAとの脂質毒性を示しているが、慎重に最適化されたFA処理手順の分析は、このアッセイで最小限の脂質毒性を示し、アポトーシスを示す転写物の増加を示さなかった（図示せず）。これらのデータは、HiPSC-CMsのしっかりした転写成熟をもたらすためにMiMaCが不可欠であり、しっかりした成熟応答をもたらすためには、4つのマイクロRNAすべてを一緒に組み込む必要があることを示す。
【０１１０】
scRNA-Seqは心筋細胞の成熟期の中間体を明らかにする
miRで処理したCMsの非バイアス解析を行った結果、各miRの組み合わせによって異なる状態のCM成熟の濃縮がもたらされることが明らかになった。興味深いことに、Let7iとmiR-452 OEに富む心筋細胞クラスター1は、OXPHOSとMyc標的遺伝子のしっかりしたアップレギュレーションを示したが、ほとんどの心筋細胞成熟マーカーでは有意に増加していなかった（図3N及び3O）。従って、Let7iとmiR-452 OEで処理すると、代謝成熟を主導する力のある中間体成熟CMが形成された。これらのデータは、生じ得る中間体段階が、胎児様CMからより成熟したCMへの必要な移行段階であることを示唆しており、これにはOXPHOS遺伝子の一過性のアップレギュレーションが必要である。
【０１１１】
MTP/HADHA欠損CMsはミトコンドリア機能の低下を示す
MiMaCツールの作製によって、HADHA CM病因の研究が可能になった。未成熟なhPSC-CMsは脂肪酸酸化ができなかったため、WT CMsにおいて脂肪酸酸化を引き起こすMiMaCでHADHA Mut及びKO CMsを成熟させる必要があった。最初に、WT、HADHA Mut及びKO CMsの最大OCRを評価した。MiMaCで処理したWT CMsは、対照細胞と比較して、最大OCR（2.2倍の変化）が統計的に有意に増加した（図4A及び4B）。興味深いことに、HADHA KO CMsの最大OCRは落ち込んでいたのに対し、対照及びMiMaC処理したHADHA Mut CMsは、対照WT-CMsと同様の最大OCRを有していた。これらのデータは、Mut CMsとKO CMsにおけるHADHAのミトコンドリア活性の欠損を示唆している。
【０１１２】
次に、MiMaC処理したHADHA Mut及びKO CMsが脂肪酸パルミテートをATP生産に利用できるかどうかを評価した。MiMaC処理したWT CMsのみが、パルミテート添加による酸素消費量の統計的に有意な増加を示した（図4C）。WT対照CMs、対照、MiMaC処理されたHADHA Mut及びKO CMsは、FAを利用できなかった。これらのデータは、MiMaC処理されたCMsが長鎖FAを利用する能力を有することを示す。しかし、MiMaC処理したHADHA Mut及びKO CMsはそれを行うことができない。MiMaCは、HADHA Mut及びKO CMsのFAO制限を評価するために不可欠であった。
【０１１３】
HADHA Mut CMsの異常なカルシウムハンドリング
MTP欠損症の乳児は、出生後に原因不明の突然死を呈することがある。母乳中に含まれるATP生産の主な基質である脂質のストレスが、MTP欠損症による乳児の早期死亡を促進するのではないかと提案されている。この仮説に対処するために、グルコースを含む基本心臓培地（Glc+FA培地）に3種の長鎖脂肪酸の組み合わせ、パルミテート、オレイン酸、リノール酸（これらのFAは、母乳で育てられたヒトの乳児の血清中に最も豊富であるため）を添加した（Glc+FA培地）。パルミテートは、脂肪酸基質として、全ての長鎖遊離脂肪酸の36％を表す、新生児期に循環する最も豊富な脂肪酸の一つである。CMsをFAで処理すると脂質毒性を引き起こす可能性があるが、脂質毒性を引き起こさない3つの脂肪酸の濃度と組み合わせを慎重に開発した（図3L）。
【０１１４】
MTP欠損CMsがSIDSにつながる不整脈状態を促進する可能性をよりよく理解するために、WT及びHADHA Mut CMsでカルシウムトランシエントを測定した（例えば、図4Dを参照）。循環しているカルシウムの倍数変化は、カルシウム上昇速度（図示せず）に変化のないHADHA Mut CMsと比較してWT CMsで有意に高いことがわかった（WT CM: 2.03, Mut CM: 1.55, P<0.001）。このことから、カルシウムはHADHA Mut CMsにおいて細胞質から循環し、異常な方法で保存されていることが示唆された。タウ崩壊定数を調べたところ、HADHA Mut CMsの方が平均値が高かった（WT CM: 0.63 s, Mut CM: 0.76 s）（図4F）。これは、カルシウムがサルコ/小胞体に戻される速度がHADHA Mut CMsでは遅いことを示唆している。
【０１１５】
HADHA Mut CMsにおける再分極遅延と拍動数異常
Glc+FA培地で培養したHADHA Mut CMsがカルシウムサイクリングに異常を示したため、このCMsが電気生理学的に異常を示しているかどうかを評価した。電圧感受性蛍光色素Fluovoltを用いて膜電位の変化を測定した。HADHA Mut CMsは、電圧振幅の最大変化、最大脱分極に達するまでの時間、又は脱分極の速度に変化がなかったが（図4G及び4H）、再分極速度を調べるときに有意な差が観察された。波の持続時間（WD）50％（WD50）及び90％（WD90）は、HADHA Mut CMsにおいて、WT CMsと比較して有意に長かった（WD50については図4Iを参照。WD90についても同様の結果が観察された。図示せず）。これらのデータは、HAHDA Mut CMsにおいて再分極が障害されていたことを示している。この表現型は、カルシウムの筋小胞体への還流サイクルの障害に基づいた、観察された異常なカルシウム動態によって引き起こされ得る。
【０１１６】
HADHA Mut CMsはカルシウムハンドリング及び電気生理学的欠陥を示したので、これらのCMsが拍動数異常を示しているかどうかを評価した。HADHA Mut CMsの自発拍動を拍動数異常を定量化するためにFAの存在下で追跡した。HADHA Mut CMsは、拍動間の時間が均等ではなく、異常な拍動数変動を示した（例えば、図4J参照）。これらの所見を定量化すると、HADHA Mut CMsは、有意に高い拍動間隔（図示せず）及び有意に高いビートトゥビート間隔変化（ΔBI）を有していたことが判明した（図4K）。これらのデータは、HADHA Mut CMsが平均的に遅く拍動し、拍動間の時間がより可変的であったことを示している。さらに、250ms以上であったΔBIの割合を定量化し、Glc+FA培地の12D後のHADHA Mut CMsは、Glc培地中のMut CMs（〜10％）と比較して、潜在的に不整脈性のΔBIの高い割合（〜30％）を平均的に有していた。250ms以上のΔBIを持つ細胞数の定量化は、不規則に拍動する細胞を示唆している。最後に、各グループの拍動間隔データの周りにフィットした楕円（95％信頼区間）でポアンカレプロットを作製した（図4L）。狭くて細長い楕円は一様な拍間隔を示唆し、より丸みを帯びた楕円は拍動数の異常を示唆した。各楕円の長軸と短軸の比を取ると、HADHA Mut Glc+FA条件は3.12の比率を持っていたが、HADHA Mut Glc条件は4.36の比率を持っていた。このことは、HADHA Mut Glc+FA条件がこれらのCMsにおいてより多くのビートトゥビートの変動を意味するより丸みを帯びた楕円を持っていたことを示す。
【０１１７】
シングルセルRNA配列解析によりHADHA Mut CMサブポピュレーションを同定する
シングルセルRNA配列解析を、FAで処理したときにHADHA変異CM集団がどのように振る舞うかをよりよく理解するために行った。配列解析された細胞群のそれぞれを詳述するtSNEプロットは、WT及びHADHA Mut CMs間の明確な差異と、小さいが有意な重複を示した（図5A）。非バイアスクラスタリングを行うと、6つのクラスターが見出された（0はHADHA Mut CMs非複製、1はWT及びMut CMsの中間体成熟集団、2はHADHA Mut CMs複製、3は健康なCM、4は線維芽細胞様集団、5は上皮細胞様集団）（図5B及び5C）。
【０１１８】
成熟と疾患状態の程度を評価するために、各クラスターを上記の主要なカテゴリーに基づいて分類した（図3N）。クラスター3のアップレギュレーションされた遺伝子は筋原線維の集合と横紋筋細胞の発達に関連しており、一方でクラスター3ダウンレギュレーションされた遺伝子はリボソーム蛋白質とECM関連蛋白質に関連していた。興味深いことに、WT及びHADHA Mut CMsの両方のサブセットは、上述のように、中間体CM成熟クラスターであるクラスター1で同定された（図3L及び5D）。この心臓の集団は、OXPHOS、及びFABP3、COX6C、ATP5E、UQZRQ、NDUFA1、及びCOX7BなどのMyc標的遺伝子の高いアップレギュレーションを有していた。この中間体状態からさらに発達したWT細胞は、より成熟したCM状態であるクラスター3で同定された。しかしながら、HADHA Mut細胞は、2つの異なる病理学的状態に入った。最初に、HADHA Mut細胞は、クラスター0で見られるように、細胞周期阻害因子CDKN1Aとともに、多くの高度に発現し、抑制された心臓マーカーを失うと推測された（補足図5C）。最後に、クラスター2の強疾患性のHADHA Mut CMsは、成熟CMsで高度に抑制されるべき遺伝子をアップレギュレートし、細胞周期遺伝子を活性化する（図5D）。例えば、tSNEプロットは、HADHA Mut CMsが細胞周期リプレッサーCDKN1Aを失い、HADHA Mut CMsのサブセットが増殖のためのマーカー（MKI67及びRRM2）を獲得することを示した（図示せず）。これらの成熟及び疾患進行の段階を、in vivoマウス及びヒトの成熟マーカーに対して評価したところ、成熟、疾患進行、及び心臓同一性の喪失に関して同様の傾向が見られた（図5E）。
【０１１９】
HADHA Mut CMクラスターとWT CMクラスターの間で顕著に変化した特徴的なパスウェイを調べたところ、OXHPOS、心機能、筋形成が変異体細胞では抑制されていることがわかった。さらに、WT CMsは細胞周期リプレッサーCDKN1Aの強い発現を示すのに対し、両HADHA Mut CM集団はこの発現を失っていた。クラスター2の複製HADHA Mut CMsは、DNA複製、G2Mチェックポイント、及び有糸分裂紡錘体遺伝子のアップレギュレーションを有していた。さらに、MKI67やRRM2のような複製及び/又はエンドサイクリング細胞で発現する遺伝子は、クラスター2のHADHA Mut CMsでのみ発現していた。異常な細胞周期マーカーの増加の潜在的な病理学的アウトカムに対処するために、HADHA変異体CMにおける細胞当たりの核数を解析した。重要なことに、HADHA Mut CMsにおいて、WT CMsと比較して細胞あたりの核数の有意な増加が観察された（カイ二乗検定P<0.001）（図5F及び5G）。WT CMsの大部分は単核又は二核であり、これはCMsの核数として生体内で見られる健全な状態である。しかし、単核のHADHA Mut CMsの数は著しく減少し、一方で二核及び多核のHADHA Mut CMsの数は増加しており、このことは、HADHA Mut CMsの病理学的状態を示唆している。これらのデータは、HADHA Mut CMsのサブポピュレーション（クラスター2）で示された驚くほど高い細胞周期転写産物の発現を支持する。これらのデータは、HADHA変異体CMsにおける疾患状態の複数のステージを示唆している。
【０１２０】
細胞周期が全てのクラスター間の根本的な違いではないことを確認するために、各クラスタの細胞周期遺伝子を検査した。クラスターの違いに課せられるバイアスが細胞の細胞周期の状態によって決まることがわかった以前の研究とは異なり、クラスター2（図5B）のみが細胞周期遺伝子のアップレギュレートを示した。また、クラスタリングデータは細胞周期遺伝子を除去して再処理すると、元のクラスター2、高細胞周期HADHA Mut CMsを除いて、全てのクラスターが残った。これらの知見は、細胞周期がクラスター2の根本的な理由であり、残りの細胞集団についてはそうではないことを示唆している（図5A及び5B）。
【０１２１】
このデータに基づいて、FA処理したHADHA Mut CMsでは、3つの異なる病理状態が仮定される（中間体状態、非複製CM状態、複製CM状態）。クラスター1は、OXPHOS及びMyc標的遺伝子の上昇によって特徴付けられるCM成熟の中間体状態を示した。重要なことに、WT及びHADHA CMsの両方がクラスター1に見られることから、HADHA CMsは、ヒトの発生において見られるのと同様の成熟過程の間に、発生の後期に野生型細胞から分離する病理学的表現型のみを発現することが示唆される。しかし、クラスター0はHADHA変異体CMsのみを含み、代謝及び心臓構造遺伝子の低下とともに細胞周期リプレッサーが低下した病理学的状態を示した。最後に、クラスター2は代謝及び心臓構造遺伝子の抑制と細胞周期遺伝子のアップレギュレーションを有する最も病理学的状態であった。
【０１２２】
68の代謝パスウェイをスクリーニングし、非バイアス代謝パスウェイ解析を行ったところ、HADHA Mut CMクラスター0及び2は、WT CMクラスター3と比較して代謝パスウェイ遺伝子発現の低下を示した（図5Hと5I）。具体的には、コレステロール代謝、脂肪酸酸化に続いて、OXPHOSが最も発現が低下したパスウェイの一つであった。興味深いことに、クラスター2では、2つの高度にアップレギュレーションされた代謝パスウェイがあった（ヌクレオチド相互変換と葉酸代謝（DNA合成に関与する2つの重要な代謝プロセスである））（図5J）。HADHA Mut CMsは脂肪酸及びOXPHOS遺伝子を含む多くの代謝パスウェイのダウンレギュレーションを示したので、次に、これらの細胞のミトコンドリア及び筋原線維を調べた。
【０１２３】
HADHA Mut及びKO CMsのサルコメア分解と異常なミトコンドリア活性
HADHA Mut及びKO CMsをグルコース培地のみで培養した場合、HADHA Mut及びKOではWT CMsと比較して明らかな欠損は見られなかった（図示せず。D24及びD30のWT、HADHA Mut及びHADHA KO hiPSC-CMsをグルコース培地で培養し共焦点画像を撮影し、αアクチニン及びアクチン（ファロイジン）の筋原線維染色を行ったところ、異常は認められなかった。ATP合成酵素βサブユニットによるミトコンドリア染色、ミトトラッカー染色により示されるミトコンドリア電位勾配はミトコンドリア異常を示さなかった）。しかしながら、FA培地中で6〜12日間培養すると、WT CMsは正常に見えたが、HADHA Mut及びKO CMsでは、サルコメア及びミトコンドリアの欠陥が顕在化した（図6A。図示せず。グルコース及び脂肪酸培地処理の6D後、HADHA Mut及びKO hiPSC-CMsは、あまり明確でないαアクチニン染色で見られるサルコメア破壊の兆候を示し、変異体のミトトラッカー染色で見られるミトコンドリアプロトン勾配の損失の開始を示した。ATP合成酵素βサブユニットはWTとHADHA Mut hiPSC-CMsの両方で正常なミトコンドリアネットワークを示したが、HADHA KO hiPSC-CMsではミトコンドリアネットワークの損失の開始があった。)12DのGlc+FA培地処理後、WT CMsは健全な筋原線維を有していたが、HADHA Mut CMsはα-アクチニン染色が点状になり、アクチンフィラメントの検出が困難になるなど、サルコメアの分解が見られた（図6A）。HADHA Mut及びKO CMsは長鎖FAを処理することができなかったとして、ミトコンドリアの健康を次に評価した。ミトコンドリアは、ミトコンドリアネットワークの存在を評価するためにATP合成酵素βサブユニットを用いて染色した。KO CMsは、6DのFAで、小さな、より円形のミトコンドリアへミトコンドリアネットワークを失っていたが、WTとHADHA Mut CMsの両方が多くの接続されたミトコンドリアを有していた。これらのミトコンドリアの機能性を評価するために、ミトコンドリアのプロトン勾配は、マイトトラッカーオレンジ染色を介して分析した。Glc+FAリッチメディアの12日間の後、HADHA Mut CMsは、ミトコンドリア膜プロトン勾配が高度に低下していた（図6A及び6B）。
【０１２４】
サルコメア及びミトコンドリア疾患の表現型をより良く評価するために、透過型電子顕微鏡（TEM）でGlc+FAに12D曝露したWT及びHADHA Mut CMsを観察した（図6C）。WT CMにおいて、豊富な筋原線維、明らかなZバンドは見られたが、AバンドとIバンドは不明瞭であり、M株は見られず、CM筋原線維形成の正常な段階である中間体が示された。さらに、WT CMsは良好なクリステを有する健康なミトコンドリアを示した。対照的に、HADHA Mut CMは、点状のZ体に置き換えられたZディスク構造の破壊を伴う脆弱な筋原線維を示し、細胞質内の筋フィラメントを分解した。興味深いことに、HADHA Mut CMのミトコンドリアは小さく膨張しており、非常に基本的なクリステの形態をしていた（図6C）。WT及びHADHA Mut CMミトコンドリアを定量すると、HADHA MutミトコンドリアはWTミトコンドリアに比べてエリアが小さく、より丸みを帯びていることが明らかになった（図6D及び6E）。最後に、複合体I-V蛋白質を調べたウエスタンブロット分析は、HADHA Mut CMsがGlc+FA条件下で複合体I-IV蛋白質の発現を低下させたことを示した（図示せず）。これらのデータは、HADHA CMsは、FAに曝露されたときにサルコメア構造及びミトコンドリア膜電位及び形態を失うことを示している。
【０１２５】
SS-31は慢性的にFAに曝されたHADHA Mut CMsの異常なプロトンリークをレスキューする
慢性的にFAに曝されたHADHA Mut及びKO CMsの病理学的状態をよりよく理解するために、それらのミトコンドリアを機能的に評価した。Glc+FA処理したHADHA Mut及びKO CMsの最大OCRは、WT細胞に比べて有意に低下した（Mut CM：190pmoles/分/細胞、KO CM：125pmoles/分/細胞、WT CM：359pmoles/分/細胞、P<0.05）（図6F）。さらに、HADHA Mut CMsは、酸素依存性ATP生産の減少を示し（Mut CM：51pmoles/分/細胞、KO CM：43pmoles/分/細胞、WT CM：93 pmoles/分/細胞, P<0.05）（図6G）、HADHA Mut CMは、解糖能の減少を示した（Mut CM：14 mpH/分/細胞、KO CM：18 mpH/分/細胞、WT CM：23 mpH/分/細胞、Mut Vs WT P<0.05）（図示せず。マイトストレスアッセイを介して観察され、オリゴマイシンと2-デオキシ-D-グルコース後の細胞外酸性化率の差として計算された）。FAへの暴露がミトコンドリア膜電位の低下とATP生産の減少につながったので、増加したプロトンリークに部分的に起因する可能性があることが推測された。ATP合成酵素を抑制する場合（オリゴマイシン処理）と電子輸送鎖を抑制する場合（アンチマイシン、ロテノン）のOCRの違いを試験することで、HADHA Mut及びKO CMsはWT CMsに比べて有意に高いプロトンリークを示すことが示された（Mut CM：7.66pmoles/分/細胞、KO CM：10.52pmoles/分/細胞、WT CM：3.64pmoles/分/細胞、P<0.05）。これまでの研究では、ミトコンドリア標的ペプチドであるエラミプレチド（SS-31）が、ミトコンドリアの脱分極及びプロトンリークを防止できることが示されている。興味深いことに、HADHA Mut心筋細胞をエラミプレチド（SS-31）で1nM処理すると、Glc+FAを用いたMut CMsにおいて増加したプロトンリークがレスキューされた（図6H）。これらのデータは、FAに曝されたHADHA Mut及びKO CMsは、プロトンリークの増加に一部起因するミトコンドリア能の低下をもたらしたことを示唆している。
【０１２６】
HADHA機能の喪失は長鎖脂肪酸の蓄積を導く
脂肪酸β酸化の第一段階の間に、アシル-CoAデヒドロゲナーゼは、α炭素とβ炭素の間に二重結合を生成する。従って、HADHAの破壊は、第一段階後にFA中間体の増大をもたらすはずである（図7A）。HADHA Mut及びKO CMsにおける長鎖脂肪酸酸化の破壊を評価するために、非標的リピドミック分析を行い、グローバルなリピドミック変化の特徴付けを行った。
【０１２７】
HADHA Mut及びKO CMsでは、WT CMsと比較して長鎖アシルカルニチンの増加が見られたが、中鎖アシルカルニチンレベルには有意な変化は見られなかった（図7B。中鎖アシルカルニチンレベルの結果は示さず）。このデータは、HADHAの変異が、HADHAの非存在下でのミトコンドリアにおける長鎖脂肪酸の蓄積につながったことを示唆している。長鎖FAOの第一段階の間に、飽和脂肪酸は、例えば、単一の二重結合を有する脂肪酸へ処理され（14:0→14:1、16:0→16:1、及び18:0→18:1）、ここで、カルボキシル末端の不飽和脂肪酸は、FAOの第一段階を通過し、別の二重結合を得る（例えば、18:1→18:2、及び18:2→18:3）。従って、最小の変動が飽和脂肪酸の14:0、16:0及び18:0のレベルで見られ（図示せず）、HADHA Mut及びKO CMsにおける豊富な14:1、16:1、18:1の大きな増加とHADHA KO CMsにおける18:2及び18:3のわずかな増加が見られた（図7C-7E。HADHA KO CMsにおける18:2及び18:3の結果は図示せず。)。これらのデータは、HADHAの破壊及びKOは、特定の長鎖FA中間体の蓄積を導くことを示す。但し、観察された印象的な表現型の1つは、丸みを帯びた崩壊したミトコンドリアであり、潜在的な脂肪酸過負荷のためにミトコンドリアが破裂していなかった。従って、次の段階は、ミトコンドリアの構造を制御する別のリン脂質カテゴリー、カルジオリピンを調べることであった。
【０１２８】
HADHA及びTAZが直列に作用して成熟したカルジオリピンリモデリングをもたらす
カルジオリピン（CL）は、他のミトコンドリア機能とともに電子輸送鎖機能を維持するために、最適なミトコンドリア機能とホメオスタシスに不可欠なリン脂質である。CLはミトコンドリア内膜の主要なリン脂質で、ミトコンドリアで合成され、生後発育や疾患時にダイナミックにリモデリングされる（例えば、Kiebish, M.A., et al., Myocardial regulation of lipidomic flux by cardiolipin synthase: setting the beat for bioenergetic efficiency. J Biol Chem, 2012. 287(30): p. 25086-97、及びHe, Q. and X. Han, Cardiolipin remodeling in diabetic heart. Chem Phys Lipids, 2014. 179: p. 75-81参照）。ヒトの心臓に最も多い種類のCLはテトラリノイル-CL（テトラ[18:2]-CL）である。糖尿病、虚血／再灌流、心不全などの心疾患、又はカルジオリピンリモデリング酵素タファジン（TAZ：バルト症候群を引き起こす）の特異的変異により、テトラ[18:2]-CL値が異常になる。特異的なカルジオリピンの成熟は、出生後早期のマウス心臓において観察される。本発明者らは、成熟パラダイムを用いて、脂肪酸をエネルギー源として利用可能なiPSC由来の心筋細胞（CM）の成熟段階に到達させた。様々な成熟パラダイムは、FAO段階だけでなく、カルジオリピン（CL）早期出生後リモデリングプロセスを模倣することができることが確認された（図8）。標的質量分析リピドミック解析を用いて、野生型（WT）CMの成熟は、以前に観察されたin vivo心筋細胞出生後成熟期の所見と同様に、テトラ[18:2]-CLの有意な増加をもたらすことが示された。これらのデータは、心筋細胞におけるCLの成熟がインビトロで誘導できることを示している。さらに、生後初期のin vivoの発達において示されるように、WT CMは[14:0]、[14:1]、[16:1]、及び[16:0]を有するほとんどのCLを減少させ（図8）、中間体[18:1][18:2][18:2][20:2]を含む炭素数18超のアシル鎖を有するCLを増加させることにより（図8）、そのCLプロファイルをシフトさせた。このCL成熟は成人のCLリモデリング段階には達していないが、観察された出生後の成熟は、正常及び病理学的変異体12-21の状況において、最終的にCMのCL成熟の第一段階を理解し、操作することを目的とした有益なアッセイとして機能する。標的リピドミクスを用いて、FAを添加した場合と添加していない場合のWT CMsを解析した。FA処理したWT CMsは、in vivoの心筋細胞の出生後成熟期において以前に観察された所見と同様に（Kiebish, M.A., et al., J Biol Chem, 2012. 287(30): p. 25086-97、及びHe, Q. and X. Han, Chem Phys Lipids, 2014. 179: p. 75-81, supra参照）、テトラ[18:2]-CLの有意な増加をもたらした（図7F）。これらのデータは、心筋細胞におけるCL成熟がインビトロで誘導され得ることを示している。しかしながら、FA処理後のHADHA KO CMsは、WT FA処理CMsと比較して、テトラ[18:2]-CLの量を増加させることができなかった。さらに、出生後のin vivoの発達において示されるように、WT CMは、[16:1]を有するCLの有意な減少を示し、中間体[18:1][18:2][18:2][20:2]を含む18超の炭素を有するCLの増加を示す、より成熟したCLプロファイルにシフトする（Kiebish, M.A., et al., J Biol Chem, 2012. 287(30): p. 25086-97参照）。しかしながら、HADHA KO CMsは、WT CMsと同様に効率的にCLプロファイルをリモデリングすることができなかった（図7G）。これらのデータは、驚くべきことに、長鎖FAOにおけるその役割に加えて、HADHAが心筋細胞のCLリモデリングプロセスにも必要であることを示している。
【０１２９】
HADHA KO CMsがCLリモデリング欠損を示したため、次に、フルリピドミクスを用いてWT、HADHA Mut及びKO CMsのカルジオリピン種をより詳細に解析した。標的リピドミクスの結果を強化すると、FA処理したHADHA Mut及びKO CMsが、軽鎖CLの存在量の増加と重鎖CLの枯渇を示すことがわかった（図7H）。3つのCL種、テトラ[18:1]、[18:1][18:1][18:1][18:2]及び[18:1][18:1][18:2][18:2]は、HADHA Mut及びKO CMsにおいて有意に濃縮された（図7H）。興味深いことに、[18:1][18:1][18:2][18:2]CLは、TAZ変異を有するバルト症候群患者において特異的に枯渇している。
【０１３０】
HADHA蛋白質は、モノリスカルジオリピンアシル転移酵素（MLCL AT）と類似の酵素機能を有することが以前に示されている。MLCL ATは主に不飽和脂肪酸アシル鎖をリソ-CLに移行させる。従って、HADHAは心筋細胞で成熟テトラ[18:2]-CL種を生産するためのカルジオリピンのリモデリングに直接的な役割を果たしていると考えられる。もしTAZ及びHADHAがリモデリングされたCLを生産するために並行して作用しているならば、両者は同じようにMLCLプールを枯渇させているはずである。TAZがKOされた場合、MLCLの劇的な増加があり、このことは成熟したCLを生成するためにTAZがMLCLを直接利用していることを示す。しかし、本実験では、HADHAをKOすると、MLCLプールに変化がないことが観察された（図示せず）。このことは、HADHAがMLCLをリモデリングするのではなく、CLをリモデリングしていることを示唆している。TAZとHADHAが並行して作用している場合、それぞれのKOは、特定のCL中間体に対する逆の蓄積関係をもたらすべきではない。例えば、TAZのKOは[18:1][18:1][18:2][18:2]CLの減少をもたらす。しかし、ここでのHADHA KOでは同種の蓄積が観察されている。従って、TAZはまずMLCLを[18:1][18:1][18:2][18:2]のようなCLの中間体にリモデリングし、その後HADHAはCL種をテトラ[18:2]-CLにリモデリングすることが提案される。
【０１３１】
HADHA機能の喪失はALCAT1機能を増強しない
HADHAを欠くことによりカルジオリピンのプロファイルがどのように変化しているかをよりよく理解するために、HADHA Mut及びKO CMsにおいてどのような新しいCL種が濃縮したかを調べた。14:0及び16:0などの飽和脂肪酸のアシル鎖を持つCL種は、HADHA Mut及びKO CMにおいて濃縮されていた（図7I, J）。18:0を有するCLのアシル鎖は確認されなかった。典型的には、複数飽和脂肪酸アシル鎖（CLSat）を有する新生CLは、カルジオリピン合成酵素（CLS）から合成されている（例えば、図7Kを参照）。CLSatのリモデリングプロセスの間に、飽和脂肪酸アシル鎖は不飽和脂肪酸アシル鎖に置換される。これらのデータは、HADHA変異体における新生CLSatの蓄積を示唆する。
【０１３２】
次に、HADHA Mut及びKO CMsにおけるCLリモデリングに利用する手段としてALCAT1を検討した。ALCAT1は、脂肪-アシル基質に対する嗜好性を有しないので、存在するいずれかの脂肪-アシル-CoA基質を利用する必要がある。ALCAT1活性の特徴は、CLに組み込まれている多価不飽和脂肪酸アシル鎖の増加である。しかし、炭素長20以上の脂肪酸を有するアシル鎖を有するCL種を調べたところ、HADHA Mut及びKO CMsの大部分は、実際にはWT CMsと比較して少ないCL種を有していた（図7H）。さらに、炭素長20以上の脂肪酸を有するアシル鎖を複数有するCLの種の増加は、どのグループにおいても見られなかった。従って、これらのデータは、HADHAの損失を補うために、ALCAT1がHADHA Mut及びKO CMsに関与していないことを示唆している。
【０１３３】
ディスカッション
本研究では、MiMaC成熟hiPSC-CMsを用いた初のヒトMTP欠損心臓モデルをインビトロで開発し、長鎖FAO及びCLリモデリングにおけるTFPα/HADHA欠損が前不整脈状態を示唆する不規則な拍動のような疾患を引き起こすことを発見した。さらに、その作用機序を明らかにした（HADHAの変異は、アシル-CoAトランスフェラーゼ活性により、主要なリン脂質であるカルジオリピンの組成に異常をきたした）。CL組成の異常は、ミトコンドリアクリステの欠陥とミトコンドリアのプロトン勾配の大きな低下をもたらす。このミトコンドリアの欠陥は、サルコメアの分解、カルシウムハンドリング欠陥、及び電気生理学として現れた。カルシウムの保存と再分極の遅れは、心筋細胞の不均一な拍動パターンに寄与し、その結果、SIDSのMTP欠損新生児に見られる組織レベルの不整脈を誘発し得る。
【０１３４】
多能性幹細胞由来の心筋細胞を用いたMTP欠損の研究では、迅速かつ効率的にインビトロで心筋細胞を出生後の心臓FAO疾患を発現する段階まで成熟させるツールの作製が必要であった。電気的及び/又は機械的刺激、細胞の微小環境及び培養時間を含む、多くのツールがhPSC-CMsを成熟させるために生成されている。しかし、これらの方法のいずれも、FA代謝の分析を可能にする成熟の側面に直接影響を与えるものではない。本発明者らは、hPSC-CMの成熟におけるLet-7の役割を研究した予備的な研究を基に、hPSC-CMのサイズ、収縮力及び代謝を成熟させることができるマイクロRNA成熟カクテル（MiMaC）を開発した。MiMaCは、hPSC-CMのMTP欠損の研究を容易にし、FAO障害の研究のためにhPSC-CMを成熟させることができる強力なツールである。さらに、MiMaCシステムは、後期発生、成熟過程をよりよく理解するために使用された。重要なことに、共通のマイクロRNAターゲットであるHOPXは、心筋細胞の成熟の新規の重要な制御因子として発見された。
【０１３５】
これまでの研究では、心筋細胞が胎児期から成人期に発達すると、代謝遺伝子の発現が増加することが代謝リモデリングにより示されている。OXPHOS遺伝子発現の増加は、ミトコンドリアのコピー数の増加、もしくはより成熟したミトコンドリアの生合成、又はその両方を示唆していると考えられる。このscRNA-seq研究により、OXHPOS及びMycターゲットの代謝遺伝子発現が高い、新規の中間体心筋細胞サブグループが発見された。このデータは、胎児様CMからより成熟したCMへの中間段階の可能性を示唆しており、OXPHOS遺伝子の一過性のアップレギュレーションを必要とする。Parkinはこの段階でもアップレギュレーションされていることから、このデータは、MiMaCによって誘導された心筋細胞の成熟において、胎児期のミトコンドリアの品質管理型マイトファジー及び成熟ミトコンドリアの生合成が行われているという仮説を支持する。これは、以前に示されたマウスの周産期の心臓発生中のParkinを介したマイトファジー媒介応答に類似している。重要なことは、この成熟の中間段階は、病理学的状態になる前のMTP/HADHA変異体心筋細胞でも観察されたことである。この段階をさらに詳しく調べることで、正常状態と疾患状態の両方において、このプロセスの制御のメカニズムを理解することができるようになるだろう。
【０１３６】
我々は多能性幹細胞由来の心筋細胞を用いて、MTP欠乏症を引き起こすHADHA変異を有する患者で観察される不整脈の病因を探索した。重要なことは、hiPSC由来のHADHA変異体心筋細胞は、患者で観察された不整脈の表現型を再現していたことであり、ヒト疾患のモデリングのためのhiPSC-CMsの有用性を強調している。不整脈の原因をよりよく理解するために、脂肪酸を処理したHADHA心筋細胞を用いて表現型を評価し、疾患進行の手がかりとなる可能性のあるカルジオリピンを同定した。HADHA変異体表現型の一部をレスキューした1つの新規治療的介入はSS-31であった。SS-31はミトコンドリア標的ペプチドであり、カルジオリピンと結合し、過酸化などのストレス下でのカルジオリピンのコンフォメーション変化を防ぐことが示されている（Birk, A.V., et al., The mitochondrial-targeted compound SS-31 re-energizes ischemic mitochondria by interacting with cardiolipin. J Am Soc Nephrol, 2013. 24(8): p. 1250-61）。SS-31は、心筋細胞や膵島のミトコンドリアの脱分極と膨張を阻害し、心筋細胞のカルジオリピン欠損を救済することが示されている。本研究において、SS-31がミトコンドリア病理の一側面、即ちプロトンリークの増加をレスキューすることが明らかになったこと、及びHADHA Mut CMsで異常なCL種が観察されたことから、カルジオリピンの欠陥が観察されたミトコンドリア機能障害を引き起こすことが提案される。
【０１３７】
カルジオリピンはミトコンドリア内膜の重要な構成要素である。CLは、グリセロール部位で連結された4本（2本ではなく）のアシル鎖からなる非定型リン脂質である。この非定型構造のカルジオリピンは、ミトコンドリア内膜の構造と機能に重要と考えられる円錐形状を生じる。特に、カルジオリピンは電子輸送鎖（ETC）活性に重要なETC高次構造の組織化において機能すること、及び内側ミトコンドリア膜の外側リーフレット上でプロトントラップとして機能することが示されている。従って、CLの成熟形態の低下は、プロトン勾配損失、ATP生産の低下をもたらすETCの低下、ミトコンドリアのアーキテクチャの異常などのミトコンドリアの異常をもたらす。
【０１３８】
CLの病理学的リモデリングは、糖尿病、心不全、神経変性、老化などで観察されるミトコンドリア機能障害に関係している。しかし、HADHA Mut及びKO CMsの場合の異常なCL種のパターンと組成は、心不全や糖尿病で以前に見られたものよりも特異的であり、HADHAがCLプロセシングに直接関与している可能性が示唆された。興味深いことに、HeLa細胞を用いた以前の研究では、カルジオリピンへのリモデリングのために、HADHAはMLCLにおいてアシル-CoAトランスフェラーゼ活性を示すことが示唆されている。このように、このデータは、HADHAの欠陥が、成熟したカルジオリピンのアシル鎖組成を生成することができず、おそらく維持することができない結果として、カルジオリピンのリモデリングの障害を直接引き起こすことを示唆している。しかし、このアシル基転移酵素が生理的なCLリモデリングにどのように寄与しているのかは不明であった。今回、FA処理されたヒトHADHA Mut及びKO心筋細胞では、成熟したテトラ[18:2]-CLが減少し、ミトコンドリア活性が損なわれたことがここで報告されている。これは、以前に見られた、X連鎖性心臓及び骨格ミトコンドリアミオパシーであるバルト症候群を引き起こすTAZ変異体での所見と類似している。このデータは、ヒト心筋細胞における生理的CLリモデリングに対するHADHAアシルトランスフェラーゼの正確な寄与を初めて明らかにした。
【０１３９】
TAZは、MLCLの成熟カルジオリピンへのリモデリングに不可欠なトランスアシルラーゼである。HADHAとTAZはともに成熟カルジオリピンの生成に重要な役割を果たしており、両方は心室性不整脈による原因不明の突然死を含む類似の病理学的表現型を有している。TAZ変異体において特異的に減少しているカルジオリピン種[18:1][18:1][18:2][18:2]は、HAHDA Mut及びKO CMsにおいて増加していた。さらに、TAZに変異がある場合に典型的に起こるMLCLの蓄積は、HADHA Mut及びKO CMsにおいて見られなかった。これらのデータは、CLリモデリングが、ヒト心筋細胞において最初にTAZによってプロセシングされ、次にHADHAによってテトラ[18:2]-CLを生成する結果であることを示唆している(図7K)。
【０１４０】
HADHAの変異は、CMが大量のテトラ[18:2]-CLを生成できないことを明確に導いた。また、一旦テトラ[18:2]-CL種が枯渇し始めると、CMsはミトコンドリアディスアレイの病理学的状態に陥ることも文献から明らかである。今回の知見で興味深いのは、HADHA Mut及びKO CMsがFAで処理されていない限り、それらはテトラ[18:2]-CLが少ないにもかかわらず、病気の状態に入らないということである。HADHA Mut及びKO CMsへのFAの添加は、長鎖FAの蓄積につながることもここで実証されている。しかし、このFAの蓄積は、ミトコンドリアの膨張と最終的な破裂につながるものではない。その代わり、HADHA変異体ではミトコンドリアの崩壊が丸くなっていることがわかった。これらのデータは、FAO表現型だけでは、HADHA Mut及びKO CMsで観察される欠陥を説明できない可能性があり、さらに、CLリモデリングはCM成熟過程において特に重要であることを示唆している。
【０１４１】
CMにおけるCL種のフルパネルを検討したところ、HADHA Mut及びKO CMsは、CM成熟時にCL側鎖を[18:2]に適切にリモデリングすることによる成熟したCLプロファイルを達成できないことが明らかになった。さらに、20以上の長い炭素基は、CLに積極的に複数回組み込まれておらず、このことはALCAT1が補完されていなかったことを示唆している。明らかになったのは、CL中の飽和FA側鎖、14:0及び16:0の存在であった。飽和側鎖を有するHADHA Mut及びKOにおけるCL種の蓄積は、ミトコンドリア構造の崩壊及びそれに続く心筋病理をもたらした可能性がある。従って、これらのデータは、CMの成熟過程におけるHADHA酵素の変異は、未成熟なCL飽和種の過剰な蓄積をもたらし、それがミトコンドリアの欠陥及びHADHA CMsで見られる病理の原因である可能性があることを示唆している（図7K）。
【０１４２】
ここでは、出生後及び成人のCMsでエネルギーとリン脂質を生成するために使用される通常の基質である長鎖脂肪酸がCMsのMTP欠損病理を引き起こし、異常なカルジオリピンパターンを導き、その結果、重度のミトコンドリア欠陥、及びHADHA Mut CMsの不規則な拍動をCMsに生じやすくさせるカルシウム異常をもたらすことが示される。SS-31は、FA処理したHADHA Mut CMsのプロトンリーク表現型をレスキューするための新規治療法として同定された。これは、SS-31、又は他のカルジオリピンに影響を与える化合物は、MTP欠損症におけるミトコンドリア機能障害の側面を緩和するための潜在的な治療法として役立ち得ることを示している。
【実施例】
【０１４３】
以下の方法は、当業者に開示された技術革新の実施形態の製造方法及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために記載されており、本発明者らが発明とみなす範囲を限定することを意図したものではなく、また、以下の実験がすべて又は実行された唯一の実験であることを表すことを意図したものでもない。
【０１４４】
方法
hESC及びhiPSC並びに心臓分化
コンクリンラボラトリーで以前に得られたhESC株RUES2（NIHhESC-09-0013）及びhiPSC株WTC＃11（Kreitzer, F.R., et al., A robust method to derive functional neural crest cells from human pluripotent stem cells. Am J Stem Cells, 2013. 2(2): p. 119-31）を、mTeSR培地（StemCelll Techellogencess）中のMatrigel成長因子還元基底膜マトリックス（Corning）上で培養した。以前に行ったように、単層ベースの直接分化プロトコールを用いて、hESC-CMsとhiPSC-CMsを生成した（Palpant, N.J., et al., Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nat Protoc, 2017. 12(1): p. 15-31）。以前に行ったように、hiPSC-CMカルジオリピンアッセイを、低分子単層ベースの直接分化プロトコールで行った（Burridge, P.W., et al., Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods, 2014. 11(8): p. 855-60）。分化後15日目に、乳酸選択プロセスを用いてhPSC-CMを心筋細胞集団に濃縮した（Tohyama, S., et al., Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell, 2013. 12(1): p. 127-37）。心筋細胞集団を40〜60％の範囲で生成し、これを乳酸濃縮の4日後に75〜80％の心筋細胞に濃縮した。
【０１４５】
HADHA株作製
LentiCrisprV2プラスミド（Sanjana, N.E., O. Shalem, and F. Zhang, Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods, 2014. 11(8): p. 783-4）（Addgeneプラスミド# 52961）を用いて、HADHAのエクソン1を標的とする2つの異なるgRNAを、CRISPRScanを用いて設計した（Moreno-Mateos, M.A., et al., CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nat Methods, 2015. 12(10): p. 982-8）。gRNAの配列は表1に記載されている。gRNA及びCas9発現プラスミドをGeneJuice（EMD Millipore）を用いてWTC株に一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後、WTCを2日間ピュロマイシン選択し、クローナリーエクスパンドした。クローンのDNAを単離し、ターゲティングガイドの周囲の領域をPCR増幅し（表1のガイドを参照）、配列決定を行い、HADHAのエクソン1におけるCRISPR-Cas9システムによって生成された挿入及び欠失エラーを測定した。ウエスタン分析を行い、HADHA変異体中のHADHA蛋白質のレベルを測定した。gRNA1実験から31クローンを配列決定のために送り、6クローン（19%）には変異がなかったが、25クローン（81%）には変異が見られた。gRNA2では、24クローンを配列決定のために送り、1クローンには突然変異がなかった（4％）が、23クローン（96％）には突然変異が見られた。変異株のうち2株を本研究でさらに分析した。
【０１４６】
【表１】
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【０１４７】
CRISPRオフターゲット
HADHA gRNAの潜在的なオフターゲットを Crispr-RGENのCas-OFFinderツール（Bae, S., J. Park, and J.S. Kim, Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics, 2014. 30(10): p. 1473-5）を用いて同定した。次に、トップ予測されたオフターゲットをGoTaq PCRで増幅し、配列決定した。オフターゲットプライマーは、表2に記載されている。
【０１４８】
【表２】
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【０１４９】
RNA抽出とqPCR分析
Trizolを用いてRNAを細胞から抽出し、7300リアルタイムPCRシステム（Appplied Biosystems）を用いてSYBRグリーンqPCRで分析した。使用したプライマーを表3に示す。全てのqPCR実験の線形発現値は、デルタ-デルタCt法を用いて計算した。
【０１５０】
【表３】
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【０１５１】
蛋白質抽出及びウエスタンブロット分析
細胞を、20mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、15%グリセロール、1% Triton X-100、1Mβ-グリセロールフォスフェイト、0.5M NaF、0.1Mピロリン酸ナトリウム、オルトバナデート、PMSF及び2% SDSを含む溶解バッファーを用いてプレート上で直接溶解した（Moody, J.D., et al., First critical repressive H3K27me3 marks in embryonic stem cells identified using designed protein inhibitor. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017）。25Uのベンゾナーゼヌクレアーゼ（EMD Chemicals, Gibbstown, NJ）を使用直前の溶解バッファーに添加した。蛋白質は、BSA（ウシ血清アルブミン）を標準として、EnWallac Visionを用いて、ブラッドフォードアッセイ（Bio-Rad）により定量した。蛋白質サンプルを4×Laemmliサンプルバッファーと混合し、加熱（95℃、5分）し、SDS-PAGE（プロテアンTGXプレキャスト4％-20％グラジエントゲル、Bio-Rad）に供し、セミドライトランスファー（Bio-Rad）によりニトロセルロースメンブレン（Bio-Rad）に転写した。メンブレンを5％ミルクで1時間ブロッキングし、一次抗体を4℃で一晩インキュベートした。次に、膜を二次抗体（1:10000、ヤギ抗ウサギ又はヤギ抗マウスIgG HRP複合体（Bio-Rad））で1hrインキュベートし、イモビロン-ルミノール試薬アッセイ（EMD Millipore）を用いて検出を行った。一次抗体は以下の通りである。アルファチューブリン抗体 セルシグナリングテクノロジーズ(2144) 1:2000、ベータチューブリン プロメガ(G7121)抗マウス1:4000、ベータアクチン セルシグナリングテクノロジーズ(4970) 1:4000、HADHAアブキャム(ab54477抗ウサギ1: 1000、UCP3アブキャム(ab3477)抗ウサギ1:200、SLC25A4 (ANT1) シグマ(SAB2105530)抗ウサギ1:1000、OXPHOS MitoSciences (MS604/G2830)抗マウス1:1000、抗GFPインビトロジェン(A-11122)抗ウサギ1:1000。
【０１５２】
マイクロRNAの過剰発現とノックアウト
LentiCrisprV2プラスミド（Addgene 52961）を用いて、マイクロRNA-141、-200a、-205及び-122をノックアウト（KO）した。プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）NGGカットサイトが隣接しているか、成熟マイクロRNAのシード領域にあるかのいずれかを有する各miRのためのgRNAを試験のために選択した。各miRのグローバルな減少は、各miRの成熟形態に対して特異的なプローブを用いたTaqMan RT-qPCRを介して評価した。
【０１５３】
マイクロRNAを過剰発現（OE）させるために、pLKO.1 TRCベクター（pLKO.1-TRCクローニングベクター（Addgeneプラスミド#10878））を用いた（Moffat, J., et al., A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell, 2006. 124(6): p. 1283-98）。成熟マイクロRNAの上下200bpのゲノム配列を増幅して精製した。各マイクロRNAのプライマーは表4に記載されている。アンプリコンを、ヒトU6プロモーターの下で、pLKO.1 TRCベクターのAgeIとEcoRI部位の間にクローニングした。
【０１５４】
【表４】
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【０１５５】
ウィルス生産
HEK 293FT細胞をトランスフェクションの1日前にプレーティングした。トランスフェクションの日に、選択したOE又はKOプラスミドを、1μgのDNAあたり1μg/μLのポリエチレニミン（PEI）の存在下で、パッケージングベクターpsPAX2（psPAX2はDidier Trono Addgeneプラスミド＃12260由来）及びpMD2.G（pMD2.GはDidier Trono Addgeneプラスミド＃12259由来）と混合した。培地を24時間後に変更し、トランスフェクションの48時間後及び72時間後にレンチウィルスを収集した。ウィルス粒子をPEG-it（System Biosciences, Inc）を用いて濃縮した。
【０１５６】
hiPSC-CMの形質導入と選択
hiPSC-CMをヘキサジメトリンブロマイド（Polybrene, 6μg/ml）の存在下での誘導後14日目に形質導入した。レンチウィルスを17〜24時間アプライし、その後除去した。細胞をさらに2週間培養した。心筋細胞の濃縮された集団を得るために乳酸選択を採用した（Tohyama, S., et al., Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell, 2013. 12(1): p. 127-37）。ベクターをポジティブに組み込んだ細胞を選択するためにプロマイシン選抜を行った。2週間の培養後、エンドポイント分析のために細胞を収集した。MiMaC群のために、hiPSC-CMを低用量の4種類の異なるレンチウィルスを同時に形質導入した一方で、対照を両方の対照ベクター（pLKO.1及びLentiCRISPRv2エンプティベクター）で形質導入した。
【０１５７】
免疫細胞化学と形態解析
細胞を4%(vol/vol)パラホルムアルデヒドで固定し、5%(vol/vol)正常ヤギ血清(NGS)で1時間ブロッキングし、1%NGS中の一次抗体とともに一晩インキュベートした後、NGS中で二次抗体染色を行った。CMエリアの測定はイメージJソフトウェアを用いて行った。ミトトラッカー強度の定量化は、イメージJソフトウェアを用いて、共局在化の定量化に関する以前に公表された方法に従って行った（Li, Q., et al., A syntaxin 1, Galpha(o), and N-type calcium channel complex at a presynaptic nerve terminal: analysis by quantitative immunocolocalization. J Neurosci, 2004. 24(16): p. 4070-81）。解析は、ライカTCS-SPE共焦点顕微鏡で、40x又は63xオブジェクティブとライカソフトウェアを用いて行った。使用した一次抗体は以下のとおりである。αアクチニン1:250シグマA7811抗マウス、HADHA 1:250アブキャムab54477抗ウサギ、ATPシンターゼβ 1:250アブキャムab14730抗マウス、チチン1:300ミオメディックスTTN-9 (cTerm)抗ウサギ、GFP 1:300インビトロジェンA-11122抗ウサギ。使用した二次抗体及びその他の試薬は以下の通りである。0.02μg/mlの濃度のDAPI、ファロイジンアレキサフルオロ568 1:250、アレキサフルオロ488又は647結合ヤギ抗マウス及び抗ウサギ二次抗体1:500（Molecular Probes）。B27＋インスリンサプリメントを添加したRPMI中で300nMの最終濃度で使用したMitotrackerCMTMRos Life technologies（M7510）を、固定化の前に45分間細胞とインキュベートした。
【０１５８】
マイクロ電極アレイ
自発的に拍動している心筋細胞の電気生理学的記録を、AxISソフトウェア（Axion Biosystems）を用いて2分間収集した。生データ収集後、シグナルをバターワースバンドパスフィルタと90μVスパイク検出閾値を用いてフィルタリングした。フィールド電位持続時間は、ポリノミアルフィットT波検出アルゴリズムを用いて自動的に決定した。
【０１５９】
マイクロポスト（収縮力と拍動数）
ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロポストのアレイを以前に記載されたように作製した（Beussman, K.M., et al., Micropost arrays for measuring stem cell-derived cardiomyocyte contractility. Methods, 2016. 94: p. 43-50）。マイクロポストの先端をマウスラミニン（Life Technologies）でコーティングし、B27サプリメント及び10％ウシ胎児血清を添加したRPMI培地中で約75,000/cm2の密度でAttofluor(R)ビューイングチャンバー（Life Technologies）中のマイクロポスト上に細胞を播種した。次の日、培地の除去し、1日おきに血清フリーRPMI培地と交換した。細胞の拍動が再開したら（典型的には、播種後3〜5日）、個々の細胞の収縮を、60倍の水浸漬オブジェクティブを使用した、ニコンエクリプスTi正立顕微鏡に装着した浜松ORCA-Flash2.8サイエンティフィックCMOSカメラを用いて（70 FPSの最小値で）イメージングした。イメージングの前に、細胞培養培地を1.8 mMのCa2+を含むTyrodeバッファーに交換し、ライブセルチャンバーをイメージングプロセスを通して37℃で細胞を維持するために使用した。個々のセル下の各ポストiの偏向Δiを追跡するために、カスタム記述されたmatlabコードを使用し、合計のトゥイッチ力を計算した（
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ここで、
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でポスト間の間隔は6μmであった）。
【０１６０】
シーホースアッセイ
シーホースXF96細胞外フラックス分析装置を、以前に記載されたようにミトコンドリア機能を評価するために使用した（Kuppusamy, K.T., et al., Let-7 family of microRNA is required for maturation and adult-like metabolism in stem cell-derived cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U.S.A., 2015）。プレートを1:60希釈したマトリゲル還元成長因子（Corning）で前処理した。分化後約28日目に、心筋細胞を、XF96ウェルあたり50,000細胞の密度でプレート上に播種した。シーホースアッセイを、XF96ウェルプレートへの播種から3日後に実施した。アッセイの1時間前に、培地をベース培地（緩衝化されていないDMEM）に交換した。アッセイの1時間前に、培地を、ピルビン酸ナトリウム（ギブコ／インビトロジェン、1mM）、及び25mMグルコース（MitoStressアッセイ用）、パルミテートアッセイ用の0.5mMカルニチンを含む25mMグルコースを添加したベース培地（非緩衝化DMEM；シーホースXFアッセイ培地）で交換した。基質及び阻害剤の注入を、1μMの4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン（FCCP; Seahorse Biosciences）、MitoStressアッセイ（パルミテートアッセイのための200mMパルミテート又は33μMBSA、及び50μMエトモキシル(ETO)）のためのオリゴマイシン（2.5μM）、アンチマイシン（2.5μM）、及びロテノン（2.5μM）の最終濃度を達成するために、測定中に行った。OCR値は、さらに、355nm励起及び460nm発光における蛍光を用いた測定で、Hoechst染色（Hoechst 33342；シグマ-アルドリッチ）によって定量化し、各ウェル中に存在する細胞の数に正規化した。最大OCRは、オリゴマイシン添加後のOCRと比較したFCCPへの応答におけるOCRの変化として定義される。ATP生産は、基礎呼吸とオリゴマイシン添加後の呼吸との差で計算した。プロトンリークは、オリゴマイシン添加後とアンチマイシン及びロテノン添加後の呼吸の差で計算した。パルミテートをエネルギー源として利用するための細胞容量は、2回目のパルミテート添加後の平均OCRと2回目のパルミテート添加前の最終呼吸値との間の差で計算した。試薬は、特に示されていない限り、シグマ製であった。
【０１６１】
RNA配列解析
30日目のhiPSC-CMをRNA調製及びゲノムワイドRNA-seq（>2000万リード）のために収集した。RNA-seqサンプルは、Tophatバージョン2.0.13を使用してhg19にアラインメントした（Trapnell, C., L. Pachter, and S.L. Salzberg, TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics, 2009. 25(9): p. 1105-11）。ゲノムレベルリード数は、Ensembl GRCh37遺伝子アノテーションを用いたhtseq-count（Anders, S., P.T. Pyl, and W. Huber, HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics, 2015. 31(2): p. 166-9）を用いて定量した。各二値比較におけるRNA-seqサンプル全体の正規化リードカウント1以上の総発現を有する遺伝子をDESeqを用いた差分解析のために保持した（Anders, S. and W. Huber, Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol, 2010. 11(10): p. R106）。主成分分析にはRのPrincomp関数を使用した。Gene Ontology濃縮分析にはTopGO Rパッケージ（Alexa, A., J. Rahnenfuhrer, and T. Lengauer, Improved scoring of functional groups from gene expression data by decorrelating GO graph structure. Bioinformatics, 2006. 22(13): p. 1600-7）を使用した。miR摂動による心臓成熟経路への影響を評価するために、各条件をエンプティベクター（EV）と比較し、アップレギュレーション遺伝子（>1.5倍変化）とダウンレギュレーション遺伝子（<-1.5倍変化）を同定した。アップレギュレート遺伝子とダウンレギュレート遺伝子を別々に、心臓の成熟に有益なパスウェイのキュレーションされたセットに対する濃縮のためにハイパージオメトリック検定を実行した結果、m×nのマトリクスが得られた。ここで、mは経路の数（m=7）、nは条件の数（n=6、EVを含む）である。アップレギュレーション遺伝子とダウンレギュレーション遺伝子の濃縮p値の間の比の負のlog10を計算して、治療の全体的な「利益」を表した。正の値が大きい（>0）場合は、治療の結果、心臓成熟経路の遺伝子のダウンレギュレーションよりもアップレギュレーションの方が多いことを意味し、負の値が大きいほど、心臓成熟経路における遺伝子のダウンレギュレーションが多いことを意味する。
【０１６２】
シングルセルRNA配列解析
シングルセルRNA-seq生データを10X GenomicsのCellRangerパイプラインを介して処理する。CellRangerパイプラインのアウトプットをSeurat Rパッケージを使用してさらに解析した（Satija, R., et al., Spatial reconstruction of single-cell gene expression data. Nat Biotechnol, 2015. 33(5): p. 495-502）。リードの40％超がミトコンドリア遺伝子にマップされている細胞、検出された遺伝子が200個未満、又はユニーク分子識別子（UMI）が2000個未満の細胞は除去した。残りの細胞をUMIの数とミトコンドリア遺伝子にマップされた％によってスケーリングした。成熟シングルセルRNA-seqデータのtSNE解析のパラメータは、2905上位可変遺伝子、上位10主成分、分解能0.5であった。HADHA変異体単細胞RNA-seqデータのtSNE解析のためのパラメータは、3375上位変数遺伝子、上位10主成分、及び分解能0.4であった。クラスタリングにおける細胞周期の影響を評価するために、Kowalczyk et al（Kowalczyk, M.S., et al., Single-cell RNA-seq reveals changes in cell cycle and differentiation programs upon aging of hematopoietic stem cells. Genome Res, 2015. 25(12): p. 1860-72）の細胞周期遺伝子とSeuratパッケージのCellCycleScoring機能を使用した。いずれかのクラスタ内の細胞の少なくとも25%で検出され、偽発見率<0.1を有する遺伝子を、差異的に発現していると定義する。発現値は、ヒートマップにプロットされた全細胞にわたる各遺伝子について正規化されている（即ち、Zスコア）。ヒトのin vivo成熟化マーカーは、ロードマップエピゲノミクスプロジェクト（Roadmap Epigenomics, C., et al., Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature, 2015. 518(7539): p. 317-30）の胎児心臓と比較して成人心臓でアップレギュレーションされた遺伝子に基づいている。マウスのin vivo成熟化マーカーは、DeLaughter et al（DeLaughter, D.M., et al., Single-Cell Resolution of Temporal Gene Expression during Heart Development. Dev Cell, 2016. 39(4): p. 480-490）によるin vivo心筋細胞シングルセルRNA-seqデータでアップレギュレートされた遺伝子に基づいている。胎児に比べて成人心臓で有意に高い遺伝子をDESeqを用いて選択した（成人では2倍高い、FDR <0.05）。その後、これらの遺伝子を各scRNA-seqクラスタの中で最も高発現の上位30遺伝子と交差させ、図3Oのヒートマップ用の最終的な遺伝子リストを得た。Gene Ontology濃縮はTopGOパッケージ（Alexa, A., J. Rahnenfuhrer, and T. Lengauer, Improved scoring of functional groups from gene expression data by decorrelating GO graph structure. Bioinformatics, 2006. 22(13): p. 1600-7）を用いて行った。
【０１６３】
カルシウムトランシエント解析法
心筋細胞をマトリゲルコーティングされた丸いガラスカバースリップ上にプレーティングした。心筋細胞をチロードバッファー（1.8mM CaCl2、1mM MgCl2、5.4mM KCl、140mM NaCl、0.33mM NaH2PO4、10mM HEPES、5mMグルコース、pH to 7.4）中の1mM Fluo-4 AM（ライフテクノロジーズ、F14201）とともに37℃で25分間インキュベートした。その後、基材をイメージングのための事前に温められたチロードバッファーで新鮮な60ミリメートルペトリディッシュに移した。サンプルは、ニコンエクリプスTi正立顕微鏡に装着した浜松ORCA-Flash2.8サイエンティフィックCMOSカメラを使用してイメージングした。ビデオは40x水浸漬オブジェクティブを用いて、少なくとも20フレーム/秒のフレームレートで撮影した。蛍光パワーはブリーチせずに偏光解消中の蛍光変化を十分に捕捉できるように調整し、全ての実験で同じ蛍光パワーを使用した。心筋細胞を0.5Hz又は1Hzのいずれかの炭素電極（Ladd Research、30250）を用いて5V/cmで二相的に刺激し、少なくとも5つの拍動を分析のために各ビデオ間でキャプチャした。
【０１６４】
ビデオをカスタムMATLABコードを使用して分析した。カルシウムトランシエントは、各ビデオフレームについて、細胞の境界を見つけ、境界内の蛍光を平均化して得た。バックグラウンドの蛍光は、各ビデオフレームごとに自動的に決定され、カルシウムトランシエントから差し引いた。次に、カルシウムトランシエントを分析して、ピーク蛍光（F）、ベースライン蛍光（F0）、ピークまでの時間（Tpeak）、及び50％及び90％緩和までの時間（T50R、T90R）を求めた。ピーク、50％及び90％緩和までのレート（Rpeak、R50R、R90R）は、それぞれの蛍光変化をそれぞれの時間で割って算出した。指数関数的減衰（e-t/τ）を10%及び90%緩和の間の緩和にあてはめ、緩和係数τを決定した。これらの測定値はすべて、各ビデオの少なくとも4つの拍動について得、比較のために平均化した。
【０１６５】
TEM
細胞をカコジル酸ナトリウムバッファー中の4％グルタルアルデヒドで固定し、オスミウムテトロキシドでポスト固定し、1％酢酸ウラニルでエンブロック染色し、一連のエタノールで脱水し、エポンアラルダイトに包埋しだ。70nmセクションをライカEM UC7ウルトラマイクロトームで切断し、JEOL 1230 TEMで観察した。
【０１６６】
グルコース及び脂肪酸培地
ベース培地（グルコース培地と称する）はインスリンを添加したB27を添加したRPMI培地である。脂肪酸培地はBSAに結合したオレイン酸（シグマO3008）12.7μg/ml、BSAに結合したリノール酸（シグマL9530）7.05μg/ml、BSAに結合したパルミテートナトリウム（シグマP9767）52.5μM、L-カルニチン125μMを有するグルコース培地である。
【０１６７】
エラミプレタイド（SS-31）
SS-31をStealth BioTherapeuticsから入手し、PBSに溶解した。1nMの最終濃度を実験に使用した。
【０１６８】
ボックスプロット
各ボックスプロットの'x'は平均値を示し、横棒は中央値を示し、外れ値は示されていない。*はP<0.05を示す。
【０１６９】
棒グラフ
棒グラフは平均±SEMを示す。SEMを示さない棒グラフは、1サンプル又は2サンプルのRNA配列解析データから生成されたものである。
【０１７０】
STRING分析
蛋白質アソシエーションマップをSTRINGバージョン10.5を使用して生成した。各図では、互いに接続された遺伝子は、互いに関連性を有する。作用効果は3つある。矢印->正、--| -負、及び最後に丸をつけた線-不特定。また、8種類の作用があり、それを線の色で表す。緑-活性、青-結合、シアン-表現型、黒-反応、赤-抑制、紫-触媒作用、ピンク-翻訳後修飾、及び黄色-転写調節。筋構造の発達と細胞外マトリックスの組織化について、MiMaCによって有意に変化した遺伝子を同定するためにKmeansクラスタリングを使用した。マルコフクラスタリングアルゴニズム（MCL）を細胞分裂を制御するためにMiMaCがダウンレギュレーションした遺伝子を同定するために使用した。
【０１７１】
統計解析
統計解析をNが3以上の実験で行った。P値はスチューデントのt検定又はワンウェイANOVAを用いて計算した。スチューデントのt検定はシャピロ-ウィルク正規性検定を実施した。ワンウェイANOVAはコルモゴロフ-スミルノフ正規性検定を実施した。多重比較のために、ホルム-シダック法を使用した。正規性検定に失敗したワンウェイANOVA分析のために、順位に基づく分散分析のクラスカル-ウォリスワンウェイANOVAが実行された。多重比較はダンの手法を使用した。全ての統計検定はα=0.05を使用した。
【０１７２】
LC-MS/MSを用いた標的カルジオリピン分析
12D Glc+FA培地で処理した野生型（WT）hiPSC-CMs並びに6D及び12D Glc+FA培地で処理したHADHA Mut hiPSC-CMsを使用した。抽出の直前に、各細胞ペレットを40μLのDMSOに溶解し、超音波処理により膜を破壊した。細胞は、20秒オン、10秒オフで構成される3つのサイクルを使用して超音波処理にかけた。超音波処理の間、細胞を氷上に保つように注意した。振とう後、懸濁液を2mLのガラス製LCバイアルに移した。
【０１７３】
カルジオリピンの抽出のために、20mLのクロロホルム/メタノール混合液（2:1 v/v）と30μLの内部標準液(5mg PC(18:0/18:1(9Z)) (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL)からなる抽出混合液を調製した。次に、抽出混合物の600μLをサンプルに添加し、次いでボルテックスし、-20℃で20分間インキュベートした。次に、サンプルを氷浴中で15分間超音波処理した。精製水（100μL）を加え、サンプルを室温で30分間振盪した。12,000×gで4℃で10分間遠心分離した後、底相を新しいガラスLCバイアルに移し、真空下で乾燥させた。次に、残渣を150μLアセトニトリル/イソプロパノール/H2O（65:30:5、v/v/v）を加えて再構成し、20,000×gで4℃で10分間遠心した。上清を、MS分析のために個々のガラスバイアルに移した。全てのサンプルはn=3であった。
【０１７４】
標的カルジオリピン測定のために、調製した各サンプル2μLを6410 Agilent Triple Quad LC-MS/MSシステムに注入し、エレクトロスプレーイオン化源及び負イオン化モードを使用して分析した。クロマトグラフィー分離は、Agilent 300 SB-C8 RRHDカラム (1.8μm、2.1×50mm）で行った。移動相Aはアセトニトリル/H2O (6:4, v/v)中の10mM酢酸アンモニウム、移動相Bはイソプロピルアルコール/アセトニトリル/H2O (90:10:1, v/v/v)中の10mM酢酸アンモニウムであった。移動相成分は、12分間の分離の間に60%Aから1%Aへと変化し、その後60%Aへの急激な増加と平衡化を経て、次の注入に備えた。各注入の合計実験時間は20分であった。流量は0.26mL/min、オートサンプラー温度は4℃、カラムコンパートメント温度は55℃とした。標的MS/MSデータは、多重反応モニタリング(MRM)モードを使用して取得した。抽出したMRMピークの統合には、MassHunter Workstation Software Quantitative Analysis for QQQ B.07.00 (Agilent)を使用した。
【０１７５】
非標的リピドミック分析
100万個の細胞を、-20°CでPE(17:0/17:0)、PG(17:0/17:0)、PC(17:0/0:0)、C17 スフィンゴシン、セラミド(d18:1/17:0)、SM (d18:0/17:0)、パルミチン酸-d3、PC (12:0/13:0)、コレステロール-d7、TG (17:0/17:1/17:0)-d5、DG (12:0/12:0/0:0)、DG (18:1/2:0/0:0)、MG (17:0/0:0/0:0)、PE (17:1/0:0)、LPC (17:0)、LPE (17:1)の内部標準液を含む225μlメタノール、及び-20°Cで内部標準コレステロールエステル22:1を含む750μl MTBE（メチルターシャリーブチルエーテル）（シグマアルドリッチ）で抽出した。細胞を20秒間ボルテックスし、5分間超音波処理し、オービタルミキシングチリング/ヒーティングプレート（Torrey Pines Scientific Instruments）を用いて4℃で6分間振盪した。次に、188μlのLC-MSグレードの水（Fisher）を加えた。サンプルをボルテックスし、14,000 rcf（エッペンドルフ5415D）で遠心分離した。上部（非極性、有機）相を2個の350μLアリコートに集め、蒸発させて乾燥させた。1つの有機相アリコートを、50 ng/mlのCUDA（(12-[[(シクロヘキシルアミノ)カルボニル]アミノ]-ドデカン酸）（Cayman Chemical）を含む100μLのメタノール：トルエン（9:1、v/v）混合物に再懸濁した。次に、サンプルをボルテックスし、5分間超音波処理し、16,000 rcfで遠心分離し、リピドミック分析のために調製した。方法ブランク及びプールされたヒト血漿（BioreclamationIVT）を品質管理サンプルとして含めた。6テクニカルレプリケートでWT FA CM, HADHA Mut 12D FAはn=2、HADHA KO CMはn=3、及びHADHA Mut 6D FAはn=2であった。
【０１７６】
リピドミックRPLC-QTOF分析のためのクロマトグラフィー及び質量分析条件
再懸濁したサンプルを、ESIのポジティブモードとネガティブモードについて、それぞれ3μLと5μLでWaters Acquity UPLC CSH C18（長さ100mm×内径2.1 mm、粒径1.7μm）に注入し、さらにWaters Acquity VanGuard CSH C18プレカラム（5mm×内径2.1 mm、粒径1.7μm）を65℃に維持した状態でVanquish UHPLCシステムに接続した。脂質カバレッジを向上させるために、ポジティブモード及びネガティブモード分析に異なる移動相修飾剤を使用した（Cajka, T. and O. Fiehn, Increasing lipidomic coverage by selecting optimal mobile-phase modifiers in LC-MS of blood plasma. Metabolomics, 2016. 12(2): p. 34）。ポジティブモードには10mMギ酸アンモニウムと0.1%ギ酸を、ネガティブモードには10mM酢酸アンモニウム（シグマ-アルドリッチ）を使用した。ポジティブモード及びネガティブモードともに、(A) 60:40 v/v アセトニトリル：水（LC-MSグレード）、及び(B) 90:10 v/vイソプロパノール：アセトニトリルの同じ移動相成分を使用した。0分15%(B)、0-2分30%(B)、2-2.5分48%(B)、2.5-11分82%(B)、11-11.5分99%(B)、11.5-12分99%(B)、12-12.1分15%(B)、及び12.1-15分15%(B)でグラジエントを開始した。流速は0.6 mL/minを使用した。データ収集にはQ-Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap質量分析計を以下のパラメータで使用した。質量範囲m/z 100-1200、MS1分解能60,000、データ依存MS2分解能15,000、NCE 20、30、40、標的/MS1スキャン、ガス温度369℃、シースガス流量（窒素）60単位、補助ガス流量25単位、スウィープガス流量2単位、スプレー電圧3.59kV。
【０１７７】
MS-DIAL及び統計を用いたLC-MSデータ処理
デコンボリューション、ピークピッキング、アラインメント、及び同定のために、MS-DIAL（Tsugawa, H., et al., MS-DIAL: data-independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis. Nat Methods, 2015. 12(6): p. 523-6）を使用して非標的リピドミックデータ処理を行った。mspフォーマットのMS/MSスペクトルデータベース（Kind, T., et al., LipidBlast in silico tandem mass spectrometry database for lipid identification. Nat Methods, 2013. 10(8): p. 755-8）に加えて、インハウスm/z及び保持時間ライブラリを使用した。各群のサンプルの少なくとも50％に存在する場合に特徴が報告された。統計分析は、既知の合計を使用してデータを正規化するか、各サンプルをスケーリングするためのmTIC正規化によって最初に行われた。正規化されたピーク高さは、統計解析のためにRに提出された。ANOVA分析は、FDR補正及びポストホックテストを用いて実施した。
【０１７８】
例示的な実施形態
説明の目的のためだけに、本明細書の開示によって包含される例示的な実施形態の非限定的なリストは、以下を含む。
A1.  心筋細胞の成熟を誘導する方法であって、未成熟な心筋細胞にLet7iマイクロRNA（miRNA）の過剰発現、miR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下のうちの2つ以上を誘導する工程を含む、方法。
A2.  未成熟な心筋細胞に、Let7iのmiRNAの過剰発現、miR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下のうちの3つ以上を誘導する工程を含む、実施形態A1の方法。
A3.  未成熟な心筋細胞にLet7i miRNAの過剰発現、miR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下を誘導する工程を含む、実施形態A1又はA2の方法。
A4.  過剰発現を誘導する工程は、未成熟な心筋細胞と、過剰発現させるmiRNAをコードする核酸を含むベクターを接触させる工程を含む、実施形態A1〜A3の1項に記載の方法。
A5.  前記ベクターが、過剰発現させるmiRNAをコードする核酸の一過性の発現を促進するように構成されている、実施形態A4の方法。
A6.  前記ベクターが、過剰発現させるmiRNAをコードする核酸が未成熟な心筋細胞のゲノムに組み込まれるように構成されたウィルスベクターである、実施形態A4又はA5の方法。
A7.  前記ウィルスベクターがレンチウィルスベクター又はアデノ随伴ウィルスベクターである、実施形態A4〜A6の方法。
A8.  miRNAの発現低下を誘導する工程は、未成熟な心筋細胞と、発現低下の標的のmiRNAにハイブリダイズする核酸断片、又は発現低下の標的のmiRNAにハイブリダイズする転写物をコードする核酸を含むベクターを接触させる工程を含む、実施形態A1〜A7の1項に記載の方法。
A9.  発現低下を誘導する工程が、前記miRNAをコードする遺伝子のノックアウトを実施する工程を含む、実施形態A1〜A8の1項の方法。
A10.  前記発現低下を誘導する工程が、ヌクレアーゼ酵素、及び前記ヌクレアーゼ酵素による発現低下の標的となるmiRNAをコードする核酸の特異的切断を促す配列を有するガイド核酸、を有する前記未成熟な心筋細胞を提供する工程を含む、実施形態A1〜A9の1項に記載の方法。
A11.  ヌクレアーゼ酵素を揺する前記未成熟な心筋細胞を提供する工程は、前記未成熟な心筋細胞と、前記ヌクレアーゼ酵素又は前記ヌクレアーゼ酵素をコードするベクターを接触させる工程を含み、ここで、前記ベクターは、前記心筋細胞における前記酵素の発現を促進するように構成される、実施形態A1〜A10の1項の方法。
A12.  ガイド核酸を有する前記未成熟な心筋細胞を提供する工程は、前記未成熟な心筋細胞と、前記ガイド核酸又は前記ガイド核酸をコードするベクターを接触させる工程を含み、ここで、前記ベクターは、前記心筋細胞における前記ガイド核酸の発現を促進するように構成される、実施形態A10の方法。
A13.  前記ヌクレアーゼ酵素が、Cas9又はTALENSのようなエンドヌクレアーゼである、実施形態A10又はA11の方法。
A14.  前記ベクターがウィルスベクターである、実施形態A8〜A12の1項に記載の方法。
A15.  前記ウィルスベクターがレンチウィルスベクター又はアデノ随伴ウィルスベクターである実施形態A14の方法。
A16.  前記未成熟な心筋細胞が幹細胞に由来する、実施形態A1〜A15の1項の方法。
A17.  前記未成熟な心筋細胞がインビトロで幹細胞に由来する実施形態A1〜A16の1項の方法。
A18.  前記幹細胞が胚性幹細胞、多能性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞である、実施形態A16又はA17の方法。
A19.  前記未成熟な心筋細胞と、パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸から選択される2種以上の長鎖脂肪酸とを接触させる工程をさらに含む、実施形態A1〜A18の1項の方法。
A20.  1種以上の前記長鎖脂肪酸がパルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸を含む、実施形態A19の方法。
A21.  前記心筋細胞が遺伝子異常を有する、実施形態A1〜A20の1項に記載の方法。
A22.  前記遺伝子異常が、前記心臓の代謝又は病理学的疾患状態に関連している、実施形態A21の方法。
A23.  前記遺伝子異常が脂肪酸酸化（FAO）障害と関連している、実施形態A22の方法。
A24.  前記心筋細胞が、HADHA、FATP1、FACS1、OCTN2、L-CPTI、M-CPT I、CAT、CPTII、VLCAD、LCAD、MCAD、SCAD、LCHAD、SHYD、M/SCHAD、SKAT、MKAT、HS、HL、ETF、及びETFQOの1つをコードする遺伝子の変異を含む、実施形態A22の方法。
B1.  実施形態A1〜A24の1項に記載の任意の方法により生産された心筋細胞。
B2.  前記心筋細胞が遺伝子異常を有する、実施形態B1の心筋細胞。
B3.  前記遺伝子異常が脂肪酸酸化（FAO）障害と関連している、実施形態B2の心筋細胞。
B4.  前記遺伝子異常が、HADHAをコードする遺伝子の変異である、実施形態B3の心筋細胞。
C1.  成熟したカルジオリピンプロファイルを有する心筋細胞の投与によって治療可能な状態を有する対象の治療方法であって、実施形態B1に記載の心筋細胞の有効量を対象に投与する工程を含む、方法。
C1.  前記対象は、損傷した心臓組織又は細胞を有する、実施形態C1の方法。
C2.  前記対象が糖尿病、先天性心疾患、虚血、ミオパチー、ミトコンドリア疾患を有する、及び/又は梗塞に罹患している、実施形態C1又はC2の方法。
C3.  前記ミトコンドリア疾患が脂肪酸酸化（FAO）障害である、実施形態C1〜C3の1項の方法。
C4.  前記対象が、HADHAをコードする遺伝子の変異を有する、実施形態C1〜C4の1項の方法。
C5.  前記対象が不整脈を経験する、実施形態C1〜C5の1項の方法。
C6.  前記対象は乳幼児突然死症候群（SIDS）のリスクが高い、実施形態C1〜C6の1項の方法。
D1.  心臓機能の調節のための化合物をスクリーニングする方法であって、
実施形態B1〜B4の1項に記載の1つ以上の心筋細胞を候補薬剤と接触させる工程、及び
前記1つ以上の心筋細胞における心臓機能パラメータを測定する工程、
前記心臓機能パラメータの変化が、前記候補薬剤が心臓機能を調節することを示す、方法。
D2.  前記成熟した心筋細胞が遺伝子異常を有する、実施形態D1の方法。
D3.  前記遺伝子異常が脂肪酸酸化（FAO）障害と関連している、実施形態D1又はD2の方法。
D4.  前記遺伝子異常が、HADHAをコードする遺伝子の変異である、実施形態D1〜D3の1項の方法。
D5.  前記心臓機能パラメータが、脂質プロファイル、カルジオリピンプロファイル、代謝プロファイル、酸素消費率、ミトコンドリアプロトン勾配、収縮力、カルシウム輸送、伝導速度、グルコースストレス、及び細胞死を含む、実施形態D1〜D4の1項の方法。
E1.  対象におけるミトコンドリア脂肪酸酸化（FAO）障害の治療方法であって、対象のミトコンドリアのカルジオリピンプロファイルを安定化する、又は成熟したカルジオリピンリモデリングを促進する組成物の有効量を投与する工程を含む。
E2.  前記FAO障害が、糖尿病、心不全、神経変性、高齢化、先天性心疾患、虚血、ミオパシー、及び/又は梗塞のインスタンスと関連している、実施形態E1の方法。
E3.  前記FAO障害が脂肪酸（FA）β酸化障害である実施形態E1又はE2の方法。
E4.  前記ミトコンドリア障害の表現型が、乳幼児突然死症候群のリスクの増加と関連している、実施形態E1〜E3の1項の方法。
E5.  カルジオリピンプロファイルを安定化する工程が、カルジオリピンの酸化を防止する工程を含む、実施形態E1〜E4の1項の方法。
E6.  組成物がエラミプレチドであるか、又は含む、実施形態E1〜E4の1項の方法。
F1.  培養心筋細胞の病理学的状態を検出する方法であって、心筋細胞におけるカルジオリピンプロファイルを測定する工程を含み、ここで、炭素数18超のアシル鎖を有するカルジオリピンの相対的な増加、及び炭素数18未満のアシル鎖を有するカルジオリピンの相対的な減少は、心筋細胞の病理学的状態の低下を示す、方法。
F2.  前記カルジオリピンの増加又は減少は、野生型の未成熟な心筋細胞に対して相対的なものである、実施形態F1の方法。
F3.  前記培養心筋細胞がインビトロで幹細胞に由来する、実施形態F1又はF2の方法。 
F4.  前記幹細胞が胚性幹細胞、多能性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞である、実施形態F3の方法。
F5.  前記病理状態がミトコンドリア機能障害と関連している、実施形態F1〜F4の1項の方法。
F6.  前記ミトコンドリア機能障害がミトコンドリア三機能蛋白質欠損症である、実施形態F5の方法。
F7.  前記培養心筋細胞と、前記培養心筋細胞の病理学的状態を低下させるための候補薬剤とを接触させる工程をさらに含む、実施形態F1〜F6の1項の方法。
F8.  前記培養心筋細胞の病理学的状態に関する前記候補薬剤の効果を確認するために、前記培養心筋細胞と候補薬剤とを接触させる工程の前、途中、及び/又は後に、前記培養心筋細胞のカルジオリピンプロファイルを複数回測定する工程を含む、実施形態F7の方法。
G1.  培養心筋細胞の成熟を誘導するための組成物であって、Let7iマイクロRNAをコードする核酸コンストラクト、miR-452をコードする核酸コンストラクト、miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクト、及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクトのうちの2つ以上を含む、組成物。
G2.  Let7iマイクロRNAをコードする核酸コンストラクト、miR-452をコードする核酸コンストラクト、miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクト、及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクトのうちの3つ以上を含む、実施形態G1の組成物。
G3.  Let7iマイクロRNAをコードする核酸コンストラクト、miR-452をコードする核酸コンストラクト、miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクト、及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクトを含む、実施形態G1又はG2の組成物。
G4.  前記マイクロRNAをコードする及び/又はオリゴマーをコードする核酸コンストラクトが、それぞれ1つ以上のプロモーター配列に作動可能に連結している、実施形態G1〜G3の1項の組成物。
G5.  1以上の前記コンストラクトが、細胞への送達のために構成された1以上のベクターに組み込まれている、実施形態G1〜G4の1項の組成物。
G6.  前記1種以上のベクターがウィルスベクターである、実施形態G5の組成物。
G7.  少なくとも1つのウィルスベクターがレンチウィルスベクター又はAAVベクターである、実施形態G5又はG660の組成物。
G8.  前記miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマー及び前記miR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーは、それぞれ、miR-122及びmiR-200aを切断するための遺伝子編集酵素を誘導するように構成されたガイドRNA分子である、実施形態G1〜G7の1項に記載の組成物。
G9.  前記遺伝子編集酵素がヌクレアーゼである実施形態G8の組成物。
G10.  ヌクレアーゼをさらに含む、実施形態G1〜G9の1項の組成物。
G11.  前記ヌクレアーゼがCas9である、実施形態G9又はG10の組成物。
G12.   G1.  さらに1種以上の長鎖脂肪酸を含む、実施形態G1〜G11項の組成物。
G13.  前記1種以上の長鎖脂肪酸が、パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸のうちの2種以上を含む、実施形態G12の組成物。
G14.  前記1種以上の長鎖脂肪酸が、パルミチン酸、オレイン酸、及びリノール酸を含む、実施形態G12又はG13の組成物。
H1.  実施形態G1〜G14の組成物（composition）又は組成物（compositions）を含む、キット。
H2.  細胞培地及び/又は1以上の未成熟な心筋細胞をさらに含む、実施形態H1のキット。
【図１Ａ】
2021505176.tif 000009
【図１Ｂ】
2021505176.tif 000010
【図１Ｃ】
2021505176.tif 000011
【図１Ｄ】
2021505176.tif 000012
【図１Ｅ】
2021505176.tif 000013
【図１Ｆ】
2021505176.tif 000014
【図２Ａ】
2021505176.tif 000015
【図２Ｂ】
2021505176.tif 000016
【図２Ｃ】
2021505176.tif 000017
【図２Ｄ】
2021505176.tif 000018
【図２Ｅ】
2021505176.tif 000019
【図２Ｆ】
2021505176.tif 000020
【図３Ａ】
2021505176.tif 000021
【図３Ｂ】
2021505176.tif 000022
【図３Ｃ】
2021505176.tif 000023
【図３Ｄ】
2021505176.tif 000024
【図３Ｅ】
2021505176.tif 000025
【図３Ｆ】
2021505176.tif 000026
【図３Ｇ】
2021505176.tif 000027
【図３Ｈ】
2021505176.tif 000028
【図３Ｉ】
2021505176.tif 000029
【図３Ｊ】
2021505176.tif 000030
【図３Ｋ】
2021505176.tif 000031
【図３Ｌ】
2021505176.tif 000032
【図３Ｍ】
2021505176.tif 000033
【図３Ｎ】
2021505176.tif 000034
【図３Ｏ】
2021505176.tif 000035
【図４Ａ】
2021505176.tif 000036
【図４Ｂ】
2021505176.tif 000037
【図４Ｃ】
2021505176.tif 000038
【図４Ｄ】
2021505176.tif 000039
【図４Ｅ】
2021505176.tif 000040
【図４Ｆ】
2021505176.tif 000041
【図４Ｇ】
2021505176.tif 000042
【図４Ｈ】
2021505176.tif 000043
【図４Ｉ】
2021505176.tif 000044
【図４Ｊ】
2021505176.tif 000045
【図４Ｋ】
2021505176.tif 000046
【図４Ｌ】
2021505176.tif 000047
【図５Ａ】
2021505176.tif 000048
【図５Ｂ】
2021505176.tif 000049
【図５Ｃ】
2021505176.tif 000050
【図５Ｄ】
2021505176.tif 000051
【図５Ｅ】
2021505176.tif 000052
【図５Ｆ】
2021505176.tif 000053
【図５Ｇ】
2021505176.tif 000054
【図５Ｈ】
2021505176.tif 000055
【図５Ｉ】
2021505176.tif 000056
【図５Ｊ】
2021505176.tif 000057
【図６Ａ】
2021505176.tif 000058
【図６Ｂ】
2021505176.tif 000059
【図６Ｃ】
2021505176.tif 000060
【図６Ｄ】
2021505176.tif 000061
【図６Ｅ】
2021505176.tif 000062
【図６Ｆ】
2021505176.tif 000063
【図６Ｇ】
2021505176.tif 000064
【図６Ｈ】
2021505176.tif 000065
【図７Ａ】
2021505176.tif 000066
【図７Ｂ】
2021505176.tif 000067
【図７Ｃ】
2021505176.tif 000068
【図７Ｄ】
2021505176.tif 000069
【図７Ｅ】
2021505176.tif 000070
【図７Ｆ】
2021505176.tif 000071
【図７Ｇ】
2021505176.tif 000072
【図７Ｈ】
2021505176.tif 000073
【図７Ｉ】
2021505176.tif 000074
【図７Ｊ】
2021505176.tif 000075
【図７Ｋ】
2021505176.tif 000076
【図８】
2021505176.tif 000077
【配列表】
2021505176000001.app
【国際調査報告】
2021505176.tif 000078
2021505176.tif 000079
2021505176.tif 000080