(57)【要約】  本組成物およびキットは、癌の微細骨転移において遊離される血液中の循環骨芽細胞のバイオマーカーであるオステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）及びＮ−カドヘリン（Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）を検出できるので、早期に骨転移癌を診断することができ、また、本癌の骨転移早期診断のための情報提供方法を用いて骨転移癌患者などの生存率を向上させることができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）を検出する物質を含む
ことを特徴とする癌の骨転移診断用組成物。
【請求項２】
Ｎ−カドヘリン（Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）を検出する物質をさらに含む
請求項１に記載の癌の骨転移診断用組成物。
【請求項３】
前記オステオカルシンを検出する物質は、抗体、アプタマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも一つである
請求項１に記載の癌の骨転移診断用組成物。
【請求項４】
前記オステオカルシンを検出する物質及び前記Ｎ−カドヘリンを検出する物質は、それぞれ独立して、抗体、アプタマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも一つである
請求項２に記載の癌の骨転移診断用組成物。
【請求項５】
前記癌は、肝臓癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、結腸癌、血液癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌（膵臓癌）、脾臓癌、睾丸癌、胸腺癌、脳癌、食道癌、腎臓癌、胆道癌、卵巣癌、腎臓癌、甲状腺癌、または皮膚癌の中から選択される少なくとも一つである
請求項１に記載の癌の骨転移診断用組成物。
【請求項６】
前記癌は、乳癌または甲状腺癌である
請求項１に記載の癌の骨転移診断用組成物。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載の組成物を含む
ことを特徴とする癌の骨転移診断用キット。
【請求項８】
診断対象から分離された試料中のオステオカルシンを検出する段階を含む
ことを特徴とする癌の骨転移診断のための情報提供方法。
【請求項９】
前記試料中のＮ−カドヘリンを検出する段階をさらに含む
請求項８に記載の癌の骨転移診断のための情報提供方法。
【請求項１０】
前記癌は、肝臓癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、結腸癌、血液癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌（膵臓癌）、脾臓癌、睾丸癌、胸腺癌、脳癌、食道癌、腎臓癌、胆道癌、卵巣癌、腎臓癌、甲状腺癌、または皮膚癌の中から選択される少なくとも一つである
請求項８に記載の癌の骨転移診断のための情報提供方法。
【請求項１１】
前記癌は、乳癌または甲状腺癌である
請求項８に記載の癌の骨転移診断のための情報提供方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の骨転移診断用組成物およびこれを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨転移癌は、悪性腫瘍が骨組織を破壊し、癌種に関係なく、一度診断されると、多くの場合、予後は急速に悪化する。こうなる最大の理由は、画像検査による現在の骨転移癌診断が非常に遅いからである。実際、骨転移がよく起こる乳癌では、予防及び早期診断のために、通常、初期治療後５年間はホルモン抑制療法を行い、６〜１２ヶ月間隔で「骨スキャン」を繰り返す。しかし、骨スキャン診断に際して、痛み、骨折、神経圧迫などの症状のない場合でも、骨破壊がすでに進行している場合がほとんどであり、結果として、治療反応が不良である。
【０００３】
一般に、骨転移癌は、休眠期段階、微細骨転移段階、臨床的骨転移段階に進む。
【０００４】
休眠期段階では、癌細胞が骨細胞にのみ存在し、癌細胞と骨細胞間の相互作用が起こらない。しかし、微細骨転移段階では、癌細胞が破骨細胞と相互作用し、細胞の増殖が起こる。臨床的骨転移段階では、癌細胞や破骨細胞によって骨組織が破壊され、痛みや骨折などの症状が現れる。
【０００５】
従来の画像検査による癌の骨転移診断は、このような臨床的骨転移段階でのみ可能であった。この場合、腫瘍がすでに進行しており、効果的な治療が困難であり、骨組織の形態学的変化後に診断することが可能であるという限界があった。このため、微細骨転移段階で骨組織が破壊される前に、早期診断により効果的に治療できる診断用組成物、キットまたは診断のための情報提供方法の必要性が高まっているのが現状である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、癌の骨転移を初期段階で診断できる診断用組成物およびキットを提供することを目的とする。
【０００７】
また、本発明は、癌の骨転移診断のための情報提供方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１．オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）を検出する物質を含む、癌の骨転移診断用組成物。
【０００９】
２．Ｎ−カドヘリン（Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）を検出する物質をさらに含む、前記１に記載の癌の骨転移診断用組成物。
【００１０】
３．前記オステオカルシンを検出する物質は、抗体、アプタマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも一つである、前記１に記載の癌の骨転移診断用組成物。
【００１１】
４．前記オステオカルシンを検出する物質及び前記Ｎ−カドヘリンを検出する物質は、それぞれ独立して、抗体、アプタマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも一つである、前記２に記載の癌の骨転移診断用組成物。
【００１２】
５．前記癌は、肝臓癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、結腸癌、血液癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌（膵臓癌）、脾臓癌、睾丸癌、胸腺癌、脳癌、食道癌、腎臓癌、胆道癌、卵巣癌、腎臓癌、甲状腺癌、または皮膚癌の中から選択される少なくとも一つである、前記１に記載の癌の骨転移診断用組成物。
【００１３】
６．前記癌は、乳癌または甲状腺癌である、前記１に記載の癌の骨転移診断用組成物。
【００１４】
７．前記１乃至６のいずれか一項に記載の組成物を含む、癌の骨転移診断用キット。
【００１５】
８．診断対象から分離された試料中のオステオカルシンを検出する段階を含む、癌の骨転移診断のための情報提供方法。
【００１６】
９．前記試料中のＮ−カドヘリンを検出する段階をさらに含む、前記８に記載の癌の骨転移診断のための情報提供方法。
【００１７】
１０．前記癌は、肝臓癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、結腸癌、血液癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌（膵臓癌）、脾臓癌、睾丸癌、胸腺癌、脳癌、食道癌、腎臓癌、胆道癌、卵巣癌、腎臓癌、甲状腺癌、または皮膚癌の中から選択される少なくとも一つである、前記８に記載の癌の骨転移診断のための情報提供方法。  
【００１８】
１１．前記癌は、乳癌または甲状腺癌である、前記８に記載の癌の骨転移診断のための情報提供方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、骨スキャンよりも簡単な方法で癌の骨転移を診断することができ、骨転移癌の診断時期を大幅に前倒しにして患者の生存率を大幅に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の癌の骨転移の早期診断のための情報提供方法の一例を示す図であり、流細胞分析（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；フローサイトメトリー）を用いて、癌患者の血液中のオステオカルシン＋またはオステオカルシン＋Ｎ−カドヘリン＋循環骨芽細胞を定量化する図である。
【図２】骨転移乳癌マウスモデルの構築及び当該モデルにおける２週目、３週目、５週目の生物発光イメージング（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ；ＢＬＩ）、病理組織検査を示す図である。
【図３】（Ａ）は、ＢＬＩでは５週目から骨転移癌を診断できるが、循環骨芽細胞は２〜３週目から診断できることを示すグラフであり、（Ｂ）は、腫瘍のサイズと循環骨芽細胞の数（％）は比例関係であることを示す図である。
【図４】マウスの左心室に乳癌細胞株を注入して、実際の骨転移乳癌患者に最も類似したマウスモデルを構築し、日付別ＢＬＩ測定及びオステオカルシン＋循環骨芽細胞の流細胞分析を示す図である。
【図５】別のマウス種及びそれらの乳癌細胞株を用いてマウスモデルを構築し、骨転移群と対照群とに分け、オステオカルシン＋循環骨芽細胞の流細胞分析を示す図である。
【図６】転移性乳癌患者のうち骨転移の有無によるオステオカルシン＋循環骨芽細胞数を示す図である。
【図７】病変の進行がないｓｔａｂｌｅ群と病変が持続的に進行するｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ群とにおける、骨転移病変の活動性（ａｃｔｉｖｅ）または非活動性（ｉｎａｃｔｉｖｅ）による循環骨芽細胞の分析を示す図である。
【図８】骨転移病変の進行を予測できる最適なカットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）を決定し、それに応じて骨転移癌患者を二つのグループに分けて無増悪生存率（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ；ＰＦＳ）分析を示す図である。
【図９】（Ａ）は、転移性甲状腺癌患者のｃＯＣ％分析に際して、骨転移病変の活動性の有無により非活動性群（ｉｎａｃｔｉｖｅ）または活動性群（ａｃｔｉｖｅ）に分け、循環骨芽細胞の分析を示す図である。（Ｂ）は、病変の進行がないｓｔａｂｌｅ群と病変が持続的に進行するｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ群とにおける循環骨芽細胞の分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２２】
本出願における用語「診断」は、病理状態の存在または特徴を確認することを意味する。本出願の目的上、診断は、癌の骨転移の有無を確認し、さらに癌の骨転移の進行の有無または深化の有無を確認することを意味し得る。
【００２３】
本出願における用語「診断」は、特定の疾病または疾患に対する一つの客体の感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を判定すること、一つの客体が特定の疾病または疾患を現在持っているか否かを判定すること、特定の疾病または疾患にかかった一つの客体の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）を判定すること、またはテラメトリクス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例えば、治療効能に関する情報を提供するために客体の状態をモニタリングすること）を含み得る。
【００２４】
本発明は、オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）を検出する物質を含む、癌の骨転移診断用組成物に関する。
【００２５】
本発明者らは、癌の骨転移の初期段階である微細骨転移段階において骨芽細胞が血液中に遊離して循環骨芽細胞が形成されることを見出し、これを検出することにより、癌の骨転移を初期段階で診断できることを発見したことに着目して、本発明を完成するに至った。
【００２６】
前記オステオカルシンを検出する物質は、オステオカルシンを検出できる限り限定されないが、例えば、オステオカルシン、オステオカルシンに翻訳されるｍＲＮＡ、前記ｍＲＮＡに転写されるＤＮＡ、またはその相補的な配列を有するＤＮＡを標的とする抗体、アプタマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドなどが挙げられる。
【００２７】
前記組成物の場合、前記オステオカルシンを検出する物質が含まれている場合、癌の骨転移診断用途に適用できるが、癌の骨転移診断用途により明確に適用するためにＮ−カドヘリン（Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）を検出する物質をさらに含んでいてもよい。
【００２８】
前記Ｎ−カドヘリンを検出する物質は、Ｎ−カドヘリンを検出できる限り限定されないが、例えば、Ｎ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンに翻訳されるｍＲＮＡ、前記ｍＲＮＡに転写されるＤＮＡ、またはその相補的な配列を有するＤＮＡを標的とする抗体、アプタマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドなどが挙げられる。
【００２９】
本出願における「抗体」とは、抗原性部位に対して指示される特異的なタンパク質分子を意味する。本出願の目的上、抗体は、前記マーカータンパク質であるオステオカルシンまたはＮ−カドヘリンに対して特異的に結合する抗体を意味し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および組換え抗体をすべて含み得る。
【００３０】
前記モノクローナル抗体は、当該技術分野で周知のハイブリドーマ法またはファージ抗体ライブラリ技術を用いて製造できるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
前記ポリクローナル抗体は、前記のタンパク質抗原を動物に注射し、動物から採血して抗体を含む血清を収得することを含む、当該技術分野で周知の方法によって生産することができる。このようなポリクローナル抗体は、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、サル、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ等の任意の動物種宿主から製造可能であるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
また、本出願の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などの特殊な抗体をも含み得る。
【００３３】
前記「ペプチド」は、標的物質への結合力が高いという利点があり、熱処理／化学処理中でも変性が起こらない。また、分子のサイズが小さいため、他のタンパク質に結合して融合タンパク質として使用することができる。具体的には、高分子タンパク質鎖に結合して使用できるため、診断キットおよびドラッグデリバリー材料として使用できる。
【００３４】
前記「アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）」とは、それ自体で安定した三次構造を有しながら標的分子に高い親和性と特異性で結合できる特徴を持つ特殊な種類の一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは変形核酸）で構成されたポリヌクレオチドの一種を意味する。上述したように、アプタマーは、抗体と同様に抗原性物質に特異的に結合することができながらも、タンパク質よりも安定性が高く、構造が簡単であり、合成が容易なポリヌクレオチドで構成されているので、抗体を代替して使用できる。
【００３５】
また、前記癌は、肝臓癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、結腸癌、血液癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌（膵臓癌）、脾臓癌、睾丸癌、胸腺癌、脳癌、食道癌、腎臓癌、胆道癌、卵巣癌、腎臓癌、甲状腺癌、または皮膚癌の中から選択される少なくとも一つであり得、好ましくは乳癌、甲状腺癌、または前立腺癌の中から選択される少なくとも一つであり得、より好ましくは乳癌または甲状腺癌であり得るが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
また、本発明は、前記組成物を含む癌の骨転移診断用キットに関する。
【００３７】
本出願のキットは、マーカー成分に特異的に結合する抗体、基質との反応によって発色する標識体が接合された二次抗体コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、前記標識体と発色反応する発色基質溶液、洗浄液および酵素反応停止液などを含み得、使われる試薬成分を含む多数の別途パッケージングまたはコンパートメントで製作できるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
本出願のキットは、患者試料中のオステオカルシンまたはＮ−カドヘリンの発現レベルを測定できる製剤だけでなく、発現レベルの分析に適した一種以上の組成物、溶液または装置を含んでいてもよい。例えば、前記キットは、抗体の免疫学的検出のために基質、適切な緩衝液、検出ラベルで標識された二次抗体、および発色基質などを含んでいてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
具体的な一例として、前記キットは、ＥＬＩＳＡキット、サンドイッチＥＬＩＳＡなどの様々なＥＬＩＳＡ方法を実現するために、ＥＬＩＳＡを実行するために必要な必須要素を含むことを特徴とするキットであってもよい。このようなＥＬＩＳＡキットは、前記タンパク質に特異的な抗体を含む。抗体は、オステオカルシンまたはＮ−カドヘリンタンパク質に対して高い特異性および親和性を有し、他のタンパク質に対する交差反応性がほとんどない抗体であり、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または組換え抗体であってもよい。また、ＥＬＩＳＡキットは、対照群タンパク質に特異的な抗体を含んでいてもよい。その他、ＥＬＩＳＡキットは、結合された抗体を検出できる試薬、例えば、標識された二次抗体、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｏｒｅｓ）、酵素およびその基質または抗体と結合できる他の物質などを含んでいてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
この他にも、前記キットは、ウェスタンブロット、免疫沈降法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、補体結合アッセイ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、流細胞分析、またはタンパク質チップなどを実現するためのキットであってもよく、さらに各分析方法に適した追加の構成をさらに含んでいてもよい。この分析方法により、抗原−抗体複合体の形成量を比較することで、癌の骨転移を診断することができる。
【００４１】
また、本発明は、診断対象から分離された試料中のオステオカルシンを検出する段階を含む、癌の骨転移を診断するための情報提供方法に関する。
【００４２】
診断対象は、現在癌を患っているか、または癌の病歴を有する動物であり、前記動物はヒトを含む哺乳類であってもよい。
【００４３】
試料は、診断対象から分離されたものであり、その例としては、組織、細胞、全血、血漿、血清、血液、または脳脊髄液などであってもよいが、これらに限定されるものではない。具体的には、血液、血漿、血清など、より具体的には、末梢血単核球であってもよい。
【００４４】
前記検出は、オステオカルシンを検出することであり、オステオカルシンを検出する物質を含む、癌の骨転移診断用組成物で前記試料を処理して行うことであり得る。
【００４５】
前記方法は、前記試料中のＮ−カドヘリンを検出する段階をさらに含んでいてもよい。この場合、前記検出は、オステオカルシンを検出する物質及びＮ−カドヘリンを検出する物質を含む、癌の骨転移診断用組成物で前記試料を処理して行うことであり得る。
【００４６】
さらに精度を高めるためにオステオカルシン及びＮ−カドヘリンの両方を検出し得るが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
前記オステオカルシンを検出する物質またはＮ−カドヘリンを検出する物質の範囲は、前述した通りである。
【００４８】
前記癌の範囲は、前述した通りである。
【００４９】
本発明は、診断対象から分離された試料中のオステオカルシンを検出し、またはオステオカルシン及びＮ−カドヘリンを検出するために、例えば、オステオカルシンまたはＮ−カドヘリンに特異的な抗体、ペプチド、アプタマーまたはタンパク質を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
その具体的な方法の例として、オステオカルシンまたはＮ−カドヘリンに特異的な抗体を用いて、酵素免疫分析法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、放射免疫分析法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法（Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ、ＷＢ）、免疫沈降法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、免疫組織化学染色法（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）、流細胞分析法（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、ＦＣＭ）、蛍光活性化細胞分類法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）、酵素基質発色法、抗原−抗体凝集法およびタンパク質チップからなる群から選択される方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
追加の方法として、近接した２種類の蛍光物質において、共鳴によりエネルギーが移動して新しい発色が生じる蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）技術を用いて、２つの物質を一つの蛍光波長により検出する手法を採用することができる。また、流細胞分析以外の検査の客観性と再現性を向上させるために、抗体標識後、１０μm以下の細胞をメッシュ（ｍｅｓｈ）でろ過し、スライドに塗抹して、自動スキャンや人工知能による陽性細胞数の定量法を使用することができる。
【００５２】
また、本発明の方法は、オステオカルシンが検出された場合、癌が骨転移したと判断する段階をさらに含んでいてもよい。
【００５３】
診断対象の試料からオステオカルシンが検出された場合、癌が骨転移していると判断でき、検出量が増えるほど、癌の骨転移段階がさらに進んでいると判断できる。
【００５４】
本発明の方法がＮ−カドヘリンを検出する段階をさらに含む場合、Ｎ−カドヘリンドも検出されれば、癌が骨に転移したことをより高い精度で判断することができる。
【００５５】
必要に応じて、本発明の方法は、診断対象から分離された試料をビタミンＫで処理する段階をさらに含んでいてもよい。
【００５６】
前記ビタミンＫは、ビタミンＫ１またはビタミンＫ２であってもよい。
【００５７】
ビタミンＫの処理により、オステオカルシンをγ−カルボキシル化してオステオカルシンの発現を増加および安定化させることができるため、オステオカルシンをより容易に検出することができる。
【００５８】
ビタミンＫの処理濃度は、特に制限されず、例えば、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍであってもよく、具体的には、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２の処理濃度がそれぞれ１０−５Ｍ〜１０−７Ｍであってもよい。前記処理濃度下では、循環骨芽細胞のオステオカルシンの発現効果を極大化することができる。
【００５９】
また、本発明は、診断対象から分離された試料中のオステオカルシンを検出して癌の骨転移を診断する方法に関する。
【００６０】
試料は、前述した範囲内のものであってもよい。
【００６１】
前記検出は、オステオカルシンを検出する物質で試料を処理して行うことができる。
【００６２】
オステオカルシンを検出する物質は、前述した範囲内のものであってもよい。
【００６３】
オステオカルシンが検出された場合、癌が骨に転移したと診断でき、より具体的な例を挙げると、試料中のオステオカルシン発現循環骨芽細胞の数（％）を測定して癌の骨転移を診断することがある。具体的には、骨転移のない癌患者のオステオカルシン発現循環骨芽細胞の数に対して、骨転移のある癌患者のオステオカルシン発現循環骨芽細胞の数を比較して診断することができるが、これに限定されるものではない。
【００６４】
また、本発明の方法は、前記試料中のＮ−カドヘリンを検出する段階をさらに含んでいてもよい。
【００６５】
これは、Ｎ−カドヘリンを検出する物質で試料を処理して行うことができ、その物質は、前述した範囲内のものであってもよい。
【００６６】
Ｎ−カドヘリンが検出された場合は、癌が骨に転移したことをより高い精度で診断することができ、具体的には、試料中のオステオカルシン発現循環骨芽細胞を検出し、順次Ｎ−カドヘリン発現循環骨芽細胞を検出できるが、これに限定されるものではない。
【００６７】
また、本発明は、癌の骨転移診断用組成物およびキットの製造におけるオステオカルシンを検出する物質の用途に関する。
【００６８】
前述したように、本発明の癌の骨転移診断用組成物およびこれを含むキットは、オステオカルシンを検出する物質を含み、試料中のオステオカルシンが検出されると、癌が骨に転移したと診断できるので、前記物質は、癌の骨転移診断用組成物およびキットの製造に使用することができる。
【００６９】
また、前記製造に使用される物質は、Ｎ−カドヘリンを検出する物質をさらに含んでいてもよい。
【００７０】
また、本発明は、骨転移した癌を治療する方法に関する。
【００７１】
本発明の治療方法は、診断対象から分離された試料を、オステオカルシンを検出する物質で処理する段階と；オステオカルシンを検出して癌の骨転移の有無を診断する段階と；癌が骨転移した場合、診断対象に骨転移癌治療剤を投与する段階と；を含む。
【００７２】
試料および前記物質は、前述した範囲内のものであってもよく、前述した範囲内の方法でオステオカルシンを検出することができる。
【００７３】
本発明の方法は、前記試料を、Ｎ−カドヘリンを検出する物質で処理し、Ｎ−カドヘリンを検出して癌の骨転移の有無を診断する段階をさらに含んでいてもよい。
【００７４】
必要に応じて、本発明の方法は、診断対象から分離された試料をビタミンＫで処理する段階をさらに含んでいてもよい。
【００７５】
前記ビタミンＫは、ビタミンＫ１またはビタミンＫ２であってもよい。
【００７６】
ビタミンＫの処理により、オステオカルシンをγ−カルボキシル化し、オステオカルシンの発現を増加および安定化させることができるため、オステオカルシンをより容易に検出することができる。
【００７７】
ビタミンＫの処理濃度は、特に制限されず、例えば、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍであってもよく、具体的には、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２の処理濃度がそれぞれ１０−５Ｍ〜１０−７ Ｍであってもよい。前記処理濃度下では、循環骨芽細胞のオステオカルシンの発現効果を極大化することができる。
【００７８】
前記骨転移癌治療剤を投与する段階は、癌の骨転移を診断し、陽性と判定された場合、骨転移癌治療剤を投与して治療することを含んでいてもよい。
【００７９】
前記投与は、非経口投与または経口投与を含み得、このような投与方法は、当業者に公知である。
【００８０】
前記骨転移癌治療剤としては、当技術分野で公知のものを制限なく使用することができ、ゾレドロン酸（ｚｏｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）、デノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）などが挙げられる。
【００８１】
以下、実施例を挙げて本発明について詳細に説明する。
【００８２】
実施例
１．末梢血単核球の確保及び流細胞分析
（１）実験方法
癌患者の血液サンプルにおける循環骨芽細胞の流細胞分析のために、液体生検によりサンプルを確保し、且つ、当該サンプルから末梢血単核球を確保した。診断対象患者の採取された血液サンプル４ｃｃを、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ、ファルマシア社製、米国）が入れられたヘパリンチューブに入れ、４℃の温度で１８００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、血漿、単核球層、フィコール、ＲＢＣ層に分離された血液層を誘導した。このとき、分離された血漿とフィコールとの間のインタフェース（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）（２番目層）である単核球層のみを注意深く分離し、新しいチューブに移す。その後、ＰＢＳ溶液を加えて単核球細胞を洗浄し、再び４℃の温度で２０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、きれいに洗浄された単核球細胞のみを得た。
【００８３】
洗浄した単核球細胞１０６個を、５００μｌのＦＢＳを含む緩衝液に入れ、抗ＣＤ１５−ＦＩＴＣ（５μｌ）、抗ＣＤ３４−ＰＥ−Ｃｙ７（５μｌ）、抗オステオカルシン−ＡＰＣ（３μｌ）、抗Ｎ−カドヘリン−ＰＥ（５μｌ）抗体を添加し、常温で３０分間放置して染色を行った（使用した抗体情報：ａ−ＣＤ１５  ＦＩＴＣ（＃５５５４０１，ＢＤ），ａ−ＣＤ３４  ＰＥ−Ｃｙ７（＃３４８８１，ＢＤ），ａ−オステオカルシンＡＰＣ（＃ＳＣ−３６５７９７−ＡＦ６４７，サンタクルーズ），ａＮ−カドヘリンＰＥ（＃５６１５５４，ＢＤ）を購入して使用した）。
【００８４】
染色終了後、４ｍｌのＦＢＳを含む緩衝液を加えて、非特異的結合および非結合抗体を洗い流し、４℃の温度で１５００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、抗体を標識した単核球細胞を得た。上記の癌患者の血液サンプルは、本発明の臨床研究のために韓国のソウル大学病院臨床研究センターのＩＲＢ承認の下での規定による経路を介して分譲された。
【００８５】
染色された単核球細胞を流細胞分析器（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）II）で分析した。上記の抗体で染色された単核球細胞を単一細胞レベルで分析し、最初にＣＤ１５−細胞集団に分類し、ここでＣＤ３４−、オステオカルシン＋細胞集団に再分類して、含まれる細胞数を定量し、オステオカルシン＋循環骨芽細胞を分析した。さらに、当該集団中のＮ−カドヘリン＋細胞の数を分析することにより、最終的に骨転移癌特異的ＣＤ１５−／ＣＤ３４−／オステオカルシン＋／Ｎ−カドヘリン＋循環骨芽細胞を下記（数１）のように定量した。乳癌患者９８名、甲状腺癌患者１０名、合計１０８名の癌患者の検体における循環骨芽細胞を分析し、代表的な分析結果を図１に示す。
【００８６】
（数１）
循環骨芽細胞（％）＝｛（ＣＤ１５−／ＣＤ３４−／オステオカルシン＋／Ｎ−カドヘリン＋細胞数）／（ＣＤ１５−細胞数）｝×１００（％）
【００８７】
（２）実験結果
その結果、癌患者の血液サンプルの流細胞分析を行い、合計１，０００，０００個の細胞を分析し、このうち死細胞などを除く９３２，５５９個の細胞を分類した。順次ＣＤ１５−細胞８８１，３０２個を再分類し、ここでオステオカルシン＋でありながらＣＤ３４−である細胞１，２５２個を定量した。さらに１，２５２個のうち、Ｎ−カドヘリン＋である細胞８６９個を定量した結果を示した（図１）。
【００８８】
２．骨転移癌のマウスモデルの構築
（１）実験方法
前臨床研究では、循環骨芽細胞を分析するために、骨転移癌患者の骨髄環境及び循環骨芽細胞分析に容易なマウスモデルを構築した。すべての動物実験は、韓国のソウル大学校の動物実験倫理委員会（ＳＮＵ−１７０６０７−６−２）の承認後、徹底したコンプライアンスの下で実施された。ヒト由来乳癌細胞株を免疫不全マウス（ｂａｌｂ／ｃ  ヌードマウス）の脛骨に直接注射することで、骨転移癌患者と同様の理想的な動物モデルを確保した。具体的には、ヒト由来乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を１×１０５／２０μｌ／マウス量でマウスの体内に注入可能な緩衝液であるＰＢＳで用意し、ヌードマウスの右脛骨内に注射した。癌細胞注射後２週目、３週目、５週目にｉｎ  ｖｉｖｏイメージング（Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ，パーキンエルマー社製）により脛骨内の腫瘍の形成および成長を観察した。各週目の実質的な腫瘍形成を確認するために、マウスの安楽死後、腫瘍が形成された脛骨を分離し、組織学的分析のためのサンプル準備過程を実施した。分離した組織を４％パラホルムアルデヒド溶液で３日間冷蔵保管し、組織を固定した後、骨に付着した筋肉部分を取り除き、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液で約２週間脱カルシウム化（Ｄｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）過程を行った（脱カルシウム化過程においても冷蔵保管し、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液を３日に１回交換した）。この後、パラフィンブロック及びパラフィン切片からスライドを作成し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）組織染色を実施した。Ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング及び組織染色分析の結果を図２に示した。
【００８９】
（２）実験結果
骨転移乳癌マウスモデルを構築し、毎週ＢＬＩ画像を確認した。その結果、５週目になってやっと腫瘍形成および成長部位を診断でき、病理組織検査では、それと同じ結果であることが確認できた。３週目に脛骨内に非常に小さい腫瘍が形成されていることが観察され、５週目には脛骨内の腫瘍が大きく形成されることが確認できた。これは、画像診断では、微細な腫瘍は難しく、５週間以上腫瘍が大きく成長したときの診断可能であることを示唆している結果である（図２）。
【００９０】
３．腫瘍の成長に伴う循環骨芽細胞の変化の分析
（１）実験方法
前記実施例２で構築した骨転移癌マウスモデルにおいて、腫瘍サイズに応じた循環骨芽細胞の変化を分析するために採血を実施した。具体的には、マウスに麻酔をかけ、心臓穿刺により１ｍｌ程度マウスから全血を採取した。採血時の血液凝固を防ぐため、採血前に注射器の内部をヘパリン溶液でコーティングし、採血直後に赤血球溶解溶液（Ｌｙｓｉｓ液）に入れて赤血球溶血処理を行った。室温で１５分放置した後、１５００ｒｐｍにて５分間の遠心分離により上澄み液を除去した。当該過程は、赤血球が完全になくなるまで繰り返し、完全にきれいになった細胞を、ＦＢＳを含む緩衝液に入れた。その後、抗ＣＤ４５−ＰＥ（＃５６１０８７，ＢＤ）および前記実施例１に記載の抗オステオカルシン抗体を用いて染色を行い、流細胞分析によりＣＤ４５＋／オステオカルシン＋循環骨芽細胞を分析した。腫瘍の成長に伴うｉｎ  ｖｉｖｏイメージングの生物発光強度（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ｐｈ／ｓ）とオステオカルシン＋循環骨芽細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ＋ｃｅｌｌ，ｃＯＣ）の数（％）を比較した。その結果を図３に示した。
【００９１】
（２）実験結果
乳癌細胞を用いたマウス骨転移癌モデルでは、画像技術による診断前に循環骨芽細胞（ｃＯＣ）が増加しており、組織病理学的分析で確認すると、腫瘍細胞が骨表面で微細凝集を開始する時期と一致していることがわかった（図２参照）。従来のＢＬＩ検査では、５週目で診断が可能であったが、本発明によれば、２〜３週間ですでに診断が可能であることが確認された（図３（Ａ））。
【００９２】
さらに、乳癌細胞を用いたマウス骨転移癌モデルにおける循環骨芽細胞（ｃＯＣ）は、ゴールドスタンダード（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）と考えられる病理学的分析で測定した腫瘍のサイズとの良好な相関関係を示した（図３（Ｂ））。
【００９３】
４．微細骨転移乳癌マウスモデルの構築及び循環骨芽細胞の分析
（１）実験方法
前記実施例で構築した脛骨注射骨転移マウスモデルの構築とは異なるマウスモデルとして、実際の骨転移乳癌患者に最も同様の環境で臨床研究を行うために、マウスの左心室に乳癌細胞を直接注入したマウスモデルを構築した。ヒト由来乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、免疫不全マウス（Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ）の左心室に直接注射して全身循環を経た後、脛骨又は大腿骨に転移したマウスモデルを確立した。
【００９４】
具体的には、ヒト由来乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を１×１０５／１００μｌ／マウス量でマウス体内に注入可能な緩衝液であるＰＢＳで用意し、ヌードマウスの左心室に直接注射した。癌細胞注射後３日目、７日目、１４日目、２２日目にｉｎ  ｖｉｖｏイメージング（Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ，パーキンエルマー社製）によりマウスの骨に転移した腫瘍の形成および成長を観察した。さらに、関心領域（ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒａｓｔ，ＲＯＩ）を設定及び分析することで、マウスの骨に転移した腫瘍の成長を数値的に分析した。当該日付別マウスを犠牲にして全血を採血し、ＰＢＭＣを分離してオステオカルシン＋循環骨芽細胞を分析した。採血及びＰＢＭＣ分離過程、流細胞分析のための抗体染色は、前記実施例３と同様である。
【００９５】
Ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング及び循環骨芽細胞の分析結果は、図４に示した。
【００９６】
（２）実験結果
微細骨転移乳癌マウスモデルを構築し、骨転移の初期日付別ＢＬＩ画像を確認した。その結果、癌細胞注入後１４日目に骨転移の有無を診断でき、ＲＯＩの数値は、２２日目目になってやっと有意な分析結果が確認できた。一方、オステオカルシン＋循環骨芽細胞は、分析の結果、ＢＬＩ画像では骨転移が確認できない時期である７日目にすでに有意に増加していることが確認された。これは、脛骨直接注射モデルにおける結果と一致しており、画像診断では微細骨転移腫瘍を測定することは困難であるが、オステオカルシン＋循環骨芽細胞の分析では早期診断が可能であることを示唆した結果である（図４）。
【００９７】
５．骨転移の有無による循環骨芽細胞の分析
（１）実験方法
骨転移の有無により循環骨芽細胞を分析するために、前記実施例４と同じ左心室注射微細骨転移乳癌マウスモデルを構築した。当該モデルでは、循環骨芽細胞の量的増加がマウス種特異的または特定の乳癌細胞株の反応ではないことを証明するために、他のマウス種における当該マウス種由来乳癌細胞株を用いた。
具体的には、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来乳癌細胞株である４Ｔ１を１×１０４／１００μｌ／マウス量でマウス体内注入可能な緩衝液であるＰＢＳで用意し、Ｂａｌｂ／ｃマウスの左心室に直接注射した。癌細胞注射後７日目に、ＢＬＩ画像により骨転移群と非骨転移対照群とに分離し、ＲＯＩ分析により骨転移群と対照群との間の発光強度を数値化した。その後、マウスを犠牲にして全血を採血し、前記実施例の方法と同様に準備してオステオカルシン＋循環骨芽細胞を分析した。さらに、ＢＬＩ数値分析結果と循環骨芽細胞の分析結果との相関関係を分析した。
【００９８】
その結果を図５に示した。
【００９９】
（２）実験結果
骨転移群と対照群の循環骨芽細胞を分析した結果、対照群に比べて、骨転移群でのオステオカルシン＋循環骨芽細胞の有意な量的増加が確認できた。また、ＢＬＩ数値分析の結果と循環骨芽細胞の量的増加との相関関係を分析した結果、骨転移の有無による循環骨芽細胞の量的増加が相当な相関関係を有することが証明された。これは、オステオカルシン＋循環骨芽細胞が、微細骨転移乳癌の早期診断の可能性に加えて、骨転移の有無を判断するためのマーカーとしての可能性を検証した結果である（図５）。
【０１００】
６．転移性乳癌患者の臨床研究
（１）実験方法
実際の骨転移癌患者の血液中に存在する循環骨芽細胞を分析して臨床的診断価値があるかを評価するために、骨転移癌を有する乳癌患者９６名を対象に、オステオカルシン＋循環骨芽細胞数（％）を測定した。患者の血液サンプル採取、単核球の分離および細胞染色過程は、前記実施例１の方法と同様に実施し、分析方法もまた同様に行った。その結果を図６に示した。
【０１０１】
追加の臨床的価値を評価するために、様々な分析方法を用いた。ｃＯＣ％分析時及び分析後の継続的な追跡観察により、骨転移病変の活動性群（ａｃｔｉｖｅ）または非活動性群（ｉｎａｃｔｉｖｅ）に分けて分析した。その結果は図７に示した。また、前記分析結果に基づいて、骨転移病変の進行を予測するための最適なカットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）を決定し、これに基づいて、無増悪生存率（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ，ＰＦＳ確率）を分析した。その結果を図８に示した。
【０１０２】
（２）実験結果
１．９６名の転移性乳癌患者のうち、骨転移のある６３名の患者は、骨転移のない３３名の患者よりも有意に高いｃＯＣ％を示した（図６）。
【０１０３】
２．ｃＯＣ％分析時の骨転移病変の活動性の有無に応じて、非活動性群（ｉｎａｃｔｉｖｅ）２６名と活動性群（ａｃｔｉｖｅ）３７名とに分けた場合、ｃＯＣ％に違いはなかった。しかし、１５ヶ月の追跡観察の後、現在骨転移病変の進行がないｓｔａｂｌｅ群と病変の進行が続いているｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ群とに分けられると、非活動性群／活動性群の両方でｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ群の基底ｃＯＣ％が有意に高いことが確認された（図７）。
【０１０４】
３．骨転移病変の進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）を予測するためのｃＯＣ％の最適なカットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）は、０．４５％であった（図８（Ａ））。０．４５％を基準として骨転移癌患者を２つの群に分けると、無増悪生存率（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）に有意差があることが確認された（図８（Ｂ））。
【０１０５】
７．転移性甲状腺癌患者の臨床研究
（１）実験方法
実際、骨転移癌患者の血液中に存在する循環骨芽細胞を分析して、臨床的に診断的価値があるかを評価するために、骨転移癌を持つ甲状腺癌患者１４人を対象に、オステオカルシン＋循環骨芽細胞数（％）を測定した。患者の血液サンプル採取、単核球の分離および細胞染色過程は、前記実施例１の方法と同様に実施し、ｃＯＣ％分析時及び分析後の継続的な追跡観察により、骨転移病変の活動性群（ａｃｔｉｖｅ）または非活動性群（ｉｎａｃｔｉｖｅ）に分けて分析した。その結果は図９に示した。
【０１０６】
（２）実験結果
１．１４名の転移性甲状腺癌の患者のうち骨転移のある１２名を、ｃＯＣ％分析時に骨転移病変の活動性の有無に応じて非活動性群（ｉｎａｃｔｉｖｅ）５名と活動性群（ａｃｔｉｖｅ）７名とに分けると、活動性群のｃＯＣ％が非活動性群よりも有意に高いことが確認された（図９（Ａ））。
【０１０７】
２．６ヶ月の追跡観察の後、現在骨転移病変の進行がないｓｔａｂｌｅ群と病変の進行が続いているｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ群とに分けられた場合、ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ群の基底のｃＯＣ％は高かったが、統計的な差はないことが確認された（図９（Ｂ））。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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