(57)【要約】  双性イオン性ホスファチジルセリン（ＺＰＳ）モノマー、ＺＰＳポリマー、ならびにＺＰＳコポリマー、このようなＺＰＳモノマー、ＺＰＳポリマー、およびＺＰＳコポリマーの作製方法、ＺＰＳポリマーおよびＺＰＳコポリマーを含む組成物および材料、ならびにＺＰＳモノマー、ＺＰＳポリマー、およびＺＰＳコポリマーの使用方法。
2021519275.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロスケールまたはナノスケールの大きさを有する粒子であって、前記粒子に結合した１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーを含む、粒子。
【請求項２】
前記粒子は、マイクロスケールの大きさを有する、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
前記粒子は、ナノスケールの大きさを有する、請求項１に記載の粒子。
【請求項４】
前記粒子は生体分子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項５】
前記生体分子は、タンパク質、核酸、糖タンパク質、脂質、またはプロテオグリカンである、請求項４に記載の粒子。
【請求項６】
前記生体分子は、酵素、シグナル伝達タンパク質、止血もしくは血栓症タンパク質、ワクチン、補体系タンパク質、または、抗体またはその機能的断片もしくは特性部分から選択されるタンパク質である、請求項４に記載の粒子。
【請求項７】
前記生体分子は小分子治療剤である、請求項４に記載の粒子。
【請求項８】
前記粒子は薬物送達ビヒクルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項９】
前記薬物送達ビヒクルは、ミセル、リポソーム、またはポリマーソームである、請求項８に記載の粒子。
【請求項１０】
前記粒子は、細胞、ウイルス、または細菌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項１１】
前記粒子はハイドロゲルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項１２】
前記ハイドロゲルは、ミクロゲルまたはナノゲルである、請求項１１に記載の粒子。
【請求項１３】
前記粒子は、金属、金属酸化物、セラミック、合成ポリマー、天然ポリマー、結晶、半導体材料、グラフェン、酸化グラフェン、酸化鉄、またはシリカ、または量子ドットである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項１４】
前記１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーは、前記粒子からグラフトしている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項１５】
前記１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーは、前記粒子にグラフトしている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項１６】
前記１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーは、下記式：
【化１】
2021519275.tif 000031
式中、
＊は、この繰り返し単位と前記ポリマーもしくはコポリマーにおける他の繰り返し単位との付着箇所、またはポリマーもしくはコポリマーの末端基を示し；
Ｂは、ポリマー骨格であり；
Ｌ２は、式中のｘがそれぞれ１〜２０から独立して選択される整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｘ−から選択されるリンカー基であり；
Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より独立して選択され；
ｍは１〜２０の整数であり；
ｐは１〜２０の整数であり；かつ
ｎは約１０〜約５００の整数である
の繰り返し単位を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項１７】
前記１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーは、下記式：
【化２】
2021519275.tif 000032
式中、
＊は、この繰り返し単位と前記ポリマーもしくはコポリマーにおける他の繰り返し単位との付着箇所、またはポリマーもしくはコポリマーの末端基を示し；
Ｒ１は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より独立して選択され；
Ｒ４およびＲ５は、重合性官能基の重合残基であり；
Ｌは、ＣまたはＳｉであり；
Ｌ２は、式中のｘがそれぞれ１〜２０から独立して選択される整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｘ−から選択されるリンカー基であり；
Ｌ３およびＬ４は、式中のｘがそれぞれ０〜２０から独立して選択される整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｘ−から独立して選択され；
ｍは１〜２０の整数であり；
ｐは１〜２０の整数であり；かつ
ｎは約１０〜約５００の整数である
の繰り返し単位を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項１８】
前記１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーは、下記式：
【化３】
2021519275.tif 000033
式中、
＊は、この繰り返し単位と前記ポリマーもしくはコポリマーにおける他の繰り返し単位との付着箇所、またはポリマーもしくはコポリマーの末端基を示し；
Ｒ１は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルから独立して選択され；
ＸはＯまたはＮＨであり、
ｎは１〜２０の整数であり；
ｍは１〜２０の整数であり；
ｐは１〜２０の整数であり；かつ
ａは約１０〜約５００の整数である
の繰り返し単位を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項１９】
粒子に免疫抑制性を付与するための方法であって、１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーを前記粒子に共有結合させることを含む、方法。
【請求項２０】
１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーが共有結合した基体の表面。
【請求項２１】
マイクロスケールまたはナノスケールの大きさを有する粒子であって、前記粒子に共有結合した１つ以上の中性（非双性イオン性）ホスファチジルセリンポリマーを含む、粒子。
【請求項２２】
粒子に免疫抑制性を付与するための方法であって、１つ以上の中性（非双性イオン性）ホスファチジルセリンポリマーを前記粒子に共有結合させることを含む、方法。
【請求項２３】
１つ以上の中性（非双性イオン性）ホスファチジルセリンポリマーが共有結合した基体の表面。
【請求項２４】
双性イオン性ホスファチジルセリン部位に共有結合した重合性部位を含むＺＰＳモノマー。
【請求項２５】
下記式を有するＺＰＳモノマー：
【化４】
2021519275.tif 000034
式中、
Ｒ１は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より独立して選択され；
Ｒ４およびＲ５は、付加、縮合、またはフリーラジカル重合による重合にとって好適な官能基から独立して選択され；
Ｌは、ＣまたはＳｉであり；
Ｌ２は、式中のｘが１〜２０の整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−から独立して選択され；
Ｌ３およびＬ４は、式中のｘがそれぞれ０〜２０から独立して選択される整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｘ−から独立して選択され；
ｍは１〜２０の整数であり；かつ
ｐは１〜２０の整数である。
【請求項２６】
下記式を有するＺＰＳモノマー：
【化５】
2021519275.tif 000035
式中、
Ｒ１は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルから独立して選択され、
ＸはＯまたはＮＨであり、
ｎは１〜２０の整数であり、
ｍは１〜２０の整数であり、かつ
ｐは１〜２０の整数である。
【請求項２７】
繰り返し単位を有するＺＰＳポリマーまたはコポリマーであって、１つ以上の繰り返し単位は、双性イオン性ホスファチジルセリン部位を含む、ＺＰＳポリマーまたはコポリマー。
【請求項２８】
下記式の繰り返し単位を有するＺＰＳポリマーまたはコポリマー：
【化６】
2021519275.tif 000036
式中、
＊は、この繰り返し単位と前記ポリマーもしくはコポリマーにおける他の繰り返し単位との付着箇所、またはポリマーもしくはコポリマーの末端基を示し；
Ｂは、ポリマー骨格であり；
Ｌ２は、ＺＰＳ部位を前記骨格に繋ぐリンカー基であり、代表的な基は、式中のｘがそれぞれ１〜２０から独立して選択される整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｘ−を含み；
Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より独立して選択され；
ｍは１〜２０の整数であり；
ｐは１〜２０の整数であり；かつ
ｎは約１０〜約５００の整数である。
【請求項２９】
下記式の繰り返し単位を有するＺＰＳポリマーまたはコポリマー：
【化７】
2021519275.tif 000037
式中、
＊は、この繰り返し単位と前記ポリマーもしくはコポリマーにおける他の繰り返し単位との付着箇所、またはポリマーもしくはコポリマーの末端基を示し；
Ｒ１は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より独立して選択され；
Ｒ４およびＲ５は、付加、縮合、またはフリーラジカル重合による重合にとって好適な官能基の重合残基から独立して選択され；
Ｌは、ＣまたはＳｉであり；
Ｌ２は、式中のｘが１〜２０の整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−から独立して選択され；
Ｌ３およびＬ４は、式中のｘがそれぞれ０〜２０から独立して選択される整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｘ−から独立して選択され；
ｍは１〜２０の整数であり；
ｐは１〜２０の整数であり；かつ
ｎは約１０〜約５００の整数である。
【請求項３０】
下記式の繰り返し単位を有するＺＰＳポリマーまたはコポリマー：
【化８】
2021519275.tif 000038
式中、
＊は、この繰り返し単位と前記ポリマーもしくはコポリマーにおける他の繰り返し単位との付着箇所、またはポリマーもしくはコポリマーの末端基を示し；
Ｒ１は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルから独立して選択され；
ＸはＯまたはＮＨであり；
ｎは１〜２０の整数であり；
ｍは１〜２０の整数であり；
ｐは１〜２０の整数であり；かつ
ａは約１０〜約５００の整数である。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願との相互参照
本願は、２０１８年３月２３日提出の米国出願６第６２／６４７，５３４号の利益を主張し、この出願の全体を引用により本明細書に明白に援用する。
【０００２】
政府のライセンス権に関して
本発明は、政府の資金援助を受けて実施された（助成金第ＨＤＴＲＡ１−１３−１−００４４号（アメリカ国防脅威削減局）および助成金第ＤＭＲ−１７０８４３６号（アメリカ国立科学財団））。政府は、本発明について一定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
ｉｎ  ｖｉｖｏ用途を目的とした生体材料を考えるとき、まず最も重要な要件は人体との生体適合性である。不活性な生体材料だけでなく、免疫応答を活発に制御および調節できる機能性生体材料も、ひとつのアプローチである。アポトーシス細胞は、その表面にホスファチジルセリン（ＰＳ）を露出させることによって、マクロファージおよび樹状細胞などの免疫細胞を免疫抑制性の表現型へと指向させ、その結果、炎症活性化領域においてさえ免疫寛容を誘発できることが見いだされている。
【０００４】
有利な非ファウリング特性を有する改善された非ファウリング性ポリマー、ならびにこうしたポリマーを含む組成物および材料の開発が求められている。本発明は、このニーズを満たすことを目的とし、関連するさらなる利点を提供する。
【０００５】
発明の概要
本発明は、双性イオン性ホスファチジルセリン（ＺＰＳ）モノマー、ＺＰＳポリマー、ならびにＺＰＳコポリマー、このようなＺＰＳモノマー、ＺＰＳポリマー、およびＺＰＳコポリマーの作製方法、ＺＰＳポリマーおよびＺＰＳコポリマーを含む組成物および材料、ならびにＺＰＳモノマー、ＺＰＳポリマー、およびＺＰＳコポリマーの使用方法を提供する。
【０００６】
本発明はまた、非双性イオン性（中性）ホスファチジルセリン（ＮＺＰＳ）モノマー、ポリマー、コポリマー、これらを含む組成物および材料、ならびにこれらの作製および使用方法をも提供する。
【０００７】
一態様において、本発明は、１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーを含む粒子であって、当該ポリマーが当該粒子に結合している粒子を提供する。一実施形態において、粒子は、マイクロスケールまたはナノスケールの大きさを有し、当該粒子に結合した１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーを含む。特定の実施形態において、ポリマーは、粒子に共有結合している。他の実施形態において、ポリマーは、粒子に物理的に吸着している。本明細書中において使用される場合、用語「マイクロスケールの大きさ」は、直径約１μｍ以上の粒子を指す。本明細書中において使用される場合、用語「ナノスケールの大きさ」は、直径１μｍ未満の粒子を指す。
【０００８】
特定の実施形態において、粒子は生体分子であり、上記ポリマーを含むように修飾された生体分子はバイオコンジュゲートである。本発明において有用である代表的な生体分子は、タンパク質、核酸、糖タンパク質、脂質、およびプロテオグリカンを含む。代表的なタンパク質は、酵素、シグナル伝達タンパク質（たとえば、ホルモン、サイトカイン、調節性タンパク質、インスリン、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／２阻害剤）、止血もしくは血栓症タンパク質、ワクチン、補体系タンパク質、および抗体またはその機能的断片もしくは特性部分を含む。特定の実施形態において、生体分子は、ＰＥＧ化された生体分子（たとえば、１つ以上のポリ（エチレングリコール）を含むように修飾されたタンパク質）などの、予め修飾された生体分子である。
【０００９】
他の実施形態において、生体分子は、小分子治療剤（分子量が約１０００ｇ／モル未満、好ましくは約８００ｇ／モル未満である炭素系治療剤）である。
【００１０】
さらなる実施形態において、粒子は、薬物送達ビヒクルである。代表的な薬物送達ビヒクルは、ミセル、リポソーム、およびポリマーソーム（たとえば、１つ以上の治療剤および／または診断剤を含有）を含む。
【００１１】
特定の実施形態において、粒子は、細胞、ウイルス、または細菌である。
【００１２】
他の実施形態において、粒子は、ミクロゲルまたはナノゲルなどのハイドロゲルである。
【００１３】
さらなる実施形態において、粒子は、金属、金属酸化物、セラミック、合成ポリマー、天然ポリマー、結晶、半導体材料、グラフェン、酸化グラフェン、酸化鉄、またはシリカ、または量子ドットである。
【００１４】
特定の実施形態において、粒子は、当該粒子からグラフトした１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーを有する。他の実施形態において、粒子は、当該粒子にグラフトした１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーを有する。
【００１５】
特定の実施形態において、粒子は、下記式：
【００１６】
【化１】
2021519275.tif 000003
【００１７】
式中、
＊は、この繰り返し単位と上記ポリマーもしくはコポリマーにおける他の繰り返し単位との付着箇所、またはポリマーもしくはコポリマーの末端基を示し；
Ｂは、ポリマー骨格であり；
Ｌ２は、式中のｘがそれぞれ１〜２０から独立して選択される整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｘ−から選択されるリンカー基であり；
Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より独立して選択され；
ｍは１〜２０の整数であり；
ｐは１〜２０の整数であり；かつ
ｎは約１０〜約５００の整数である
の繰り返し単位を有する１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーを含む。
【００１８】
他の実施形態において、粒子は、下記式：
【００１９】
【化２】
2021519275.tif 000004
【００２０】
式中、
＊は、この繰り返し単位と上記ポリマーもしくはコポリマーにおける他の繰り返し単位との付着箇所、またはポリマーもしくはコポリマーの末端基を示し；
Ｒ１は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より独立して選択される、または、Ｒ２およびＲ３は窒素と一緒に環を形成し；
Ｒ４およびＲ５は、重合性官能基の重合残基であり；
Ｌは、ＣまたはＳｉであり；
Ｌ２は、式中のｘがそれぞれ１〜２０から独立して選択される整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｘ−から選択されるリンカー基であり；
Ｌ３およびＬ４は、式中のｘがそれぞれ０〜２０から独立して選択される整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｘ−から独立して選択され；
ｍは１〜２０の整数であり；
ｐは１〜２０の整数であり；かつ
ｎは約１０〜約５００の整数である
の繰り返し単位を有する１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーを含む。
【００２１】
さらなる実施形態において、粒子は、下記式：
【００２２】
【化３】
2021519275.tif 000005
【００２３】
式中、
＊は、この繰り返し単位と上記ポリマーもしくはコポリマーにおける他の繰り返し単位との付着箇所、またはポリマーもしくはコポリマーの末端基を示し；
Ｒ１は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルから独立して選択される、または、Ｒ２およびＲ３は窒素と一緒に環を形成し；
ＸはＯまたはＮＨであり、
ｎは１〜２０の整数であり；
ｍは１〜２０の整数であり；
ｐは１〜２０の整数であり；かつ
ａは約１０〜約５００の整数である
の繰り返し単位を有する１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーを含む。
【００２４】
別の一態様において、本発明は、粒子に免疫抑制性を付与するための方法を提供する。一実施形態において、当該方法は、１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーを粒子に共有結合させることを含む。
【００２５】
別の一態様において、本発明は、１つ以上の双性イオン性ホスファチジルセリンポリマーが共有結合した基体表面を提供する。
【００２６】
他の態様において、本発明はまた、マイクロスケールまたはナノスケールの大きさを有する粒子であって、当該粒子に共有結合した１つ以上の中性（非双性イオン性）ホスファチジルセリンポリマーを含む粒子と、粒子に免疫抑制性を付与するための方法であって、１つ以上の中性（非双性イオン性）ホスファチジルセリンポリマーを粒子に共有結合させることを含む方法と、１つ以上の中性（非双性イオン性）ホスファチジルセリンポリマーが共有結合した基体表面と、をも提供する。
【００２７】
さらなる一態様において、本発明は、ＺＰＳモノマーを提供する。こうした実施形態において、当該モノマーは、双性イオン性ホスファチジルセリン部位に共有結合した重合性部位を含む。
【００２８】
一実施形態において、ＺＰＳモノマーは、下記式を有する。
【００２９】
【化４】
2021519275.tif 000006
【００３０】
式中、
Ｒ１は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より独立して選択される、または、Ｒ２およびＲ３は窒素と一緒に環を形成し；
Ｒ４およびＲ５は、付加、縮合、またはフリーラジカル重合による重合にとって好適な官能基から独立して選択され；
Ｌは、ＣまたはＳｉであり；
Ｌ２は、式中のｘが１〜２０の整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−から独立して選択され；
Ｌ３およびＬ４は、式中のｘがそれぞれ０〜２０から独立して選択される整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｘ−から独立して選択され；
ｍは１〜２０の整数であり；かつ
ｐは１〜２０の整数である。
【００３１】
別の一実施形態において、ＺＰＳモノマーは、下記式を有する。
【００３２】
【化５】
2021519275.tif 000007
【００３３】
式中、
Ｒ１は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルから独立して選択される、または、Ｒ２およびＲ３は窒素と一緒に環を形成し、
ＸはＯまたはＮＨであり、
ｎは１〜２０の整数であり、
ｍは１〜２０の整数であり、かつ
ｐは１〜２０の整数である。
【００３４】
別の一態様において、本発明は、ＺＰＳポリマーおよびコポリマーを提供する。こうした実施形態において、ＺＰＳポリマーまたはコポリマーは繰り返し単位を有し、１つ以上の繰り返し単位は、双性イオン性ホスファチジルセリン部位を含む。特定の実施形態において、双性イオン性ホスファチジルセリン部位は、ポリマー骨格からペンダント状に伸びている。他の実施形態において、双性イオン性ホスファチジルセリン部位は、ポリマー骨格の構成要素である（たとえば、双性イオン性ホスファチジルセリン部位の一部がポリマー骨格中にある）。
【００３５】
特定の実施形態において、ＺＰＳポリマーまたはコポリマーは、下記式：
【００３６】
【化６】
2021519275.tif 000008
【００３７】
式中、
＊は、この繰り返し単位と上記ポリマーもしくはコポリマーにおける他の繰り返し単位との付着箇所、またはポリマーもしくはコポリマーの末端基を示し；
Ｂは、ポリマー骨格であり；
Ｌ２は、ＺＰＳ部位を上記骨格に繋ぐリンカー基であり、代表的な基は、式中のｘがそれぞれ１〜２０から独立して選択される整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｘ−を含み；
Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より独立して選択される、または、Ｒ２およびＲ３は窒素と一緒に環を形成し；
ｍは１〜２０の整数であり；
ｐは１〜２０の整数であり；かつ
ｎは約１０〜約５００の整数である
の繰り返し単位を含む。
【００３８】
他の実施形態において、ＺＰＳポリマーまたはコポリマーは、下記式：
【００３９】
【化７】
2021519275.tif 000009
【００４０】
式中、
＊は、この繰り返し単位と上記ポリマーもしくはコポリマーにおける他の繰り返し単位との付着箇所、またはポリマーもしくはコポリマーの末端基を示し；
Ｒ１は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より独立して選択される、または、Ｒ２およびＲ３は窒素と一緒に環を形成し；
Ｒ４およびＲ５は、付加、縮合、またはフリーラジカル重合による重合にとって好適な官能基の重合残基から独立して選択され；
Ｌは、ＣまたはＳｉであり；
Ｌ２は、式中のｘが１〜２０の整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−から独立して選択され；
Ｌ３およびＬ４は、式中のｘがそれぞれ０〜２０から独立して選択される整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｘ−から独立して選択され；
ｍは１〜２０の整数であり；
ｐは１〜２０の整数であり；かつ
ｎは約１０〜約５００の整数である
の繰り返し単位を含む。
【００４１】
さらなる実施形態において、ＺＰＳポリマーまたはコポリマーは、下記式：
【００４２】
【化８】
2021519275.tif 000010
【００４３】
式中、
＊は、この繰り返し単位と上記ポリマーもしくはコポリマーにおける他の繰り返し単位との付着箇所、またはポリマーもしくはコポリマーの末端基を示し；
Ｒ１は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルから独立して選択される、または、Ｒ２およびＲ３は窒素と一緒に環を形成し；
ＸはＯまたはＮＨであり；
ｎは１〜２０の整数であり；
ｍは１〜２０の整数であり；
ｐは１〜２０の整数であり；かつ
ａは約１０〜約５００の整数である
の繰り返し単位を含む。
図面の説明
上述される本発明の態様、および本発明の付随的な利点の多くは、下記の詳細な説明と添付の図面とを参照することによって理解が深まるにつれて、より容易に認識される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＭＰＣ、ＮＺＰＳ、およびＺＰＳハイドロゲル表面と、コントロールであるＴＣＰＳとについての、ＥＬＳＩＡにより測定した相対的なフィブリノゲン吸着（％）の比較である。
【図２Ａ】多様な濃度（１０、２５、５０、１００、２００、１０００μｇ／ｍｌ）のＭＰＣ、ＮＺＰＳ、またはＺＰＳナノゲル溶液で１８時間処置し、続いてＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）による刺激を４８時間行なったＲＡＷ２６４．７マクロファージ（１０５個／ウェル）からの、上清中へのＴＮＦ−α分泌のレベルを、ＥＬＩＳＡにより測定したものの比較である。
【図２Ｂ】多様な濃度（０、１０、２５、５０、１００、２００μｇ／ｍｌ）のアネキシンＶ溶液と共に６時間プレインキュベートしておいたＭＰＣ、ＮＺＰＳ、またはＺＰＳナノゲル溶液（１００μｇ／ｍｌ）で１８時間処置し、続いてＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）による刺激を４８時間行なったＲＡＷ２６４．７マクロファージ（１０５個／ウェル）からの、上清中へのＴＮＦ−α分泌のレベルを、ＥＬＩＳＡにより測定したものの比較である。
【図２Ｃ】ＦＩＴＣ−ＢＳＡを封入しているＭＰＣ、ＮＺＰＳ、およびＺＰＳナノゲルと共にＲＡＷ２６４．７マクロファージ（１０５個／ウェル）を３０、６０、１２０、および１８０分間インキュベートし、続いて、当該細胞を洗浄および溶解して、回収した蛍光を検出した際の、回収された蛍光を比較したものである。
【図３Ａ】天然ウリカーゼ、ＭＰＣ−ウリカーゼ、ＮＺＰＳ−ウリカーゼ、およびＺＰＳ−ウリカーゼコンジュゲートと共に７２時間インキュベートしたＤＣ２．４樹状細胞と、ブランクコントロールとを、フローサイトメトリーのために染色したものについての、ＣＤ４０／ＣＤ８０の比較である。  （Ｂ）未成熟（ＣＤ４０−  ＣＤ８０−）である樹状細胞の割合の概要。（Ｃ）上清中へのＴＧＦ−ベータの分泌をＥＬＩＳＡキットで検出した。
【図３Ｂ】図３Ａ中に記載される樹状細胞について、未成熟（ＣＤ４０−  ＣＤ８０−）である樹状細胞の割合の比較である。
【図３Ｃ】図３Ａ中に記載される樹状細胞について、ＥＬＩＳＡにより測定したＴＧＦ−ベータ分泌の比較である。
【図４Ａ】マウスへの１回目（４Ａ）および３回目（４Ｂ）の注射後の天然ウリカーゼ、ＺＰＳ−ウリカーゼ、ＮＺＰＳ−ウリカーゼ、ＭＰＣ−ウリカーゼコンジュゲートの循環時間の比較である。
【図４Ｂ】マウスへの１回目（４Ａ）および３回目（４Ｂ）の注射後の天然ウリカーゼ、ＺＰＳ−ウリカーゼ、ＮＺＰＳ−ウリカーゼ、ＭＰＣ−ウリカーゼコンジュゲートの循環時間の比較である。
【図４Ｃ】ウリカーゼまたはウリカーゼコンジュゲートに特異的なＩｇＭ（４Ｃ）およびＩｇＧ（４Ｄ）の検出を比較している。２１日目にマウスを犠牲死させ、血清を採取して、ウリカーゼまたはウリカーゼコンジュゲートに特異的なＩｇＭおよびＩｇＧをＥＬＩＳＡ試験によって検出した。
【図４Ｄ】ウリカーゼまたはウリカーゼコンジュゲートに特異的なＩｇＭ（４Ｃ）およびＩｇＧ（４Ｄ）の検出を比較している。２１日目にマウスを犠牲死させ、血清を採取して、ウリカーゼまたはウリカーゼコンジュゲートに特異的なＩｇＭおよびＩｇＧをＥＬＩＳＡ試験によって検出した。
【図４Ｅ】天然ウリカーゼ、ＺＰＳ−ウリカーゼ、ＮＺＰＳ−ウリカーゼ、およびＭＰＣ−ウリカーゼコンジュゲートでの７２時間の処置後に染色してフローサイトメトリーに供したマウスＣＤ４＋  ＣＤ２５＋脾細胞に含まれるＴｒｅｇ表現型（Ｆｏｘｐ３＋）細胞を、ブランクコントロールの場合と比較したものである。ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋脾細胞に含まれるＴｒｅｇ表現型（Ｆｏｘｐ３＋）細胞の割合の概要。
【図４Ｆ】図４Ｅ中に記載されるとおりに処置したマウスのＣＤ４＋  ＣＤ２５＋細胞に含まれるＴｒｅｇの割合（％）を比較したものである。
【００４５】
発明の詳細な説明
一態様において、本発明は、双性イオン性ホスファチジルセリン（ＺＰＳ）モノマー、ＺＰＳポリマー、ならびにＺＰＳコポリマー、このようなＺＰＳモノマー、ＺＰＳポリマー、およびＺＰＳコポリマーの作製方法、ＺＰＳポリマーおよびＺＰＳコポリマーを含む組成物および材料、ならびにＺＰＳモノマー、ＺＰＳポリマー、およびＺＰＳコポリマーの使用方法を提供する。
【００４６】
本明細書中において使用される場合、用語「双性イオン性ホスファチジルセリンモノマー」または「ＺＰＳモノマー」は、ホスファチジルセリン部位（ＮＨ２−ＣＨ（−ＣＨ２Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−））−ＣＯ２Ｈおよびそのイオン型）とさらにカチオン中心（たとえば−Ｎ＋（Ｒａ）（Ｒｂ）−、式中、ＲａおよびＲｂは独立してＨまたはＣ１−Ｃ３アルキルである）とを含むホモポリマーまたはコポリマーの重合性モノマーまたはペンダント基を指す。ホモポリマーまたはコポリマーのモノマーまたはペンダント基は、カチオン中心であるＮとアニオン中心であるリン酸とを有しているために、双性イオン性である。
【００４７】
代表的なＺＰＳモノマーは、式（Ｉ）を有する。
【００４８】
【化９】
2021519275.tif 000011
【００４９】
式中、特定の実施形態において、Ｒ１は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル（好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル）、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より選択され、Ｒ２およびＲ３は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルから独立して選択される、または、Ｒ２およびＲ３は窒素と一緒に環を形成し、ＸはＯまたはＮＨであり、ｎは１〜２０の整数（たとえば、１、２、３、４、５、または６）であり、ｍは１〜２０の整数（たとえば、１、２、３、４、５、または６）であり、ｐは１〜２０の整数（たとえば、１、２、３、４、５、または６）である。
【００５０】
用語「双性イオン性ホスファチジルセリンポリマー」または「ＺＰＳポリマー」は、上述されるようにホスファチジルセリン部位とさらにカチオン中心とを含む１つ以上のペンダント基を有するポリマー（すなわち、ホモポリマーまたはコポリマー）を指す。このポリマーは、繰り返し単位ペンダント基においてカチオン中心であるＮとアニオン中心であるリン酸とを有しているために、双性イオン性である。
【００５１】
ＺＰＳホモポリマーポリマーは式（Ｉ）のモノマーの重合によって調製され、ＺＰＳコポリマーは、式（Ｉ）のモノマーとコモノマーとの共重合によって調製される。こうしたＺＰＳポリマー（ホモポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー）は、以下に示されるようなペンダント型の双性イオン性ホスファチジルセリン（ＺＰＳ）部位を有する繰り返し単位を含む。
【００５２】
【化１０】
2021519275.tif 000012
【００５３】
式中、特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ、ｎ、ｍ、およびｐは、式（Ｉ）のモノマーについて上述される通りであり、ａは約１０〜約５００の整数であり、＊は、この繰り返し単位と上記ポリマーもしくはコポリマーにおける他の繰り返し単位との付着箇所、またはポリマーもしくはコポリマーの末端基を示す。
【００５４】
本明細書中に記載されるように、ＺＰＳモノマーは、標準的な重合条件下において容易に重合させて、ＺＰＳポリマーを提供することができる。
【００５５】
ＺＰＳモノマー、ＺＰＳポリマー、およびＺＰＳコポリマー
特定の態様において、本発明は、ＺＰＳモノマー、ならびにＺＰＳモノマーから調製されるＺＰＳポリマーおよびＺＰＳコポリマーを提供する。
【００５６】
本発明に係るモノマーは、（ａ）シリコーン、フッ素化、ペプチド、ウレタン、ウレア、イミド、カーボネート、無水物、ホスファゼン、エポキシ、スルホン、およびスルフィド骨格、ならびにメタクリレートおよびアクリレート骨格以外の分解性骨格から選択される骨格を有するＺＰＳモノマー、または（ｂ）直鎖状のＺＰＳ架橋剤（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒｓ）、分解性および非分解性のＺＰＳ系架橋剤、または（ｃ）ポリマー骨格中にＺＰＳ基を与えるもしくはポリマー側鎖中にＺＰＳ基を与える直鎖状のＺＰＳ系モノマーを含む。
【００５７】
本発明に係るポリマーおよびコポリマーは、ＺＰＳ基を含有する繰り返し単位を含むホモポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、マルチブロックコポリマー、および分枝状またはスターポリマーなどのポリマーおよびコポリマーを含み、これらには、本発明に係る１つ以上のモノマー（たとえば、ＺＰＳモノマー）の重合（または共重合）から調製されるポリマーが含まれる。
【００５８】
ＺＰＳモノマー。一態様において、本発明は、ＺＰＳモノマーを提供する。ＺＰＳモノマーは、ＺＰＳを含有する繰り返し単位を含むＺＰＳポリマーおよびＺＰＳコポリマーを提供する。当該繰り返し単位およびポリマーのＺＰＳ基は、ペンダント型のＺＰＳ基（すなわち、ポリマー側鎖）であってもよい。
【００５９】
特定の実施形態において、ＺＰＳモノマーは、双性イオン性ホスファチジルセリン部位に共有結合した重合性部位を含む。
【００６０】
特定の実施形態において、ＺＰＳモノマーは、ペンダント型のＺＰＳ基（ポリマー側鎖）を有するポリマーまたはコポリマーを提供するモノマーを含む。代表的なＺＰＳモノマーは、上述される式（Ｉ）を有する。他の代表的なＺＰＳモノマーは、式（ＩＩＩ）を有する。
【００６１】
【化１１】
2021519275.tif 000013
【００６２】
式中、
Ｒ１は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ２０アルキル（たとえば、Ｃ１−Ｃ３アルキル）、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より独立して選択される、または、Ｒ２およびＲ３は窒素と一緒に環を形成し；
Ｒ４およびＲ５は、付加、縮合、またはフリーラジカル重合による重合にとって好適な官能基から独立して選択され；
Ｌは、ＣまたはＳｉであり；
Ｌ２は、式中のｘが１〜２０の整数（たとえば、１、２、３、４、５、または６）である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−から独立して選択され；
Ｌ３およびＬ４は、式中のｘがそれぞれ、０〜２０から、好ましくは１〜２０から独立して選択される整数である（特定の実施形態において、Ｌ３および／またはＬ４は存在しない）、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｘ−から独立して選択され；
ｍは１〜２０の整数（たとえば、１、２、３、４、５、または６）であり；かつ
ｐは１〜２０の整数（たとえば、１、２、３、４、５、または６）である。
【００６３】
本発明に係るポリマーおよびコポリマーの作製に有用な代表的なＺＰＳモノマーの調製が、実施例１中に記載される。
【００６４】
本発明に係る表面コーティング、バルク材料、単体材料、ハイドロゲル、およびコンジュゲートの作製に使用される本発明に係るＺＰＳポリマーおよびコポリマーは、式（Ｉ）のメタクリレート／メタアクリルアミドＺＰＳモノマーおよび式（ＩＩＩ）のＺＰＳモノマーを含む本明細書中に記載されるモノマーから調製できることが理解される。
【００６５】
ＺＰＳポリマーおよびコポリマー。他の態様において、本発明は、本明細書中に記載されるようにＺＰＳモノマーから調製されかつＺＰＳ繰り返し単位を含むＺＰＳポリマーを提供する。
【００６６】
特定の実施形態において、ＺＰＳポリマーまたはコポリマーは繰り返し単位を有し、１つ以上の繰り返し単位は双性イオン性ホスファチジルセリン部位を含む。これらの実施形態のうち特定のものにおいて、双性イオン性ホスファチジルセリン部位は、ポリマー骨格からペンダント状に伸びている。これらの実施形態のうちの他のものにおいて、双性イオン性ホスファチジルセリン部位は、ポリマー骨格の構成要素である（たとえば、双性イオン性ホスファチジルセリン部位の一部がポリマー骨格中にある）。
【００６７】
こうしたポリマーおよびコポリマーについての特定の実施形態において、ポリマーおよびコポリマーの骨格は、ポリエステル、ポリペプチド、ポリイミド、ポリホスファゼン、ポリシロキサン、ポリエポキシ、ビニルポリマー、フェノール系ポリマー、ポリウレタン、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリスルホン、またはポリスルフィドのうちの任意の１つであってよい。
【００６８】
本発明に係るＺＰＳポリマーおよびコポリマーは、式（Ｉ）および（ＩＩＩ）のモノマーから調製されるポリマーおよびコポリマーを含む。ポリマーは、（ａ）式（Ｉ）のモノマー、（ｂ）式（ＩＩＩ）のモノマー、または（ｃ）式（Ｉ）および（ＩＩＩ）のコモノマーの重合によって形成できる。コポリマーは、（ａ）式（Ｉ）のモノマーと、式（Ｉ）のモノマーとの共重合にとって好適な第２のコモノマーとの共重合、（ｂ）式（ＩＩＩ）のモノマーと、式（ＩＩ）のモノマーとの共重合にとって好適な第２のコモノマーとの共重合、および（ｃ）式（Ｉ）のモノマーと、式（Ｉ）のモノマーとの共重合にとって好適な式（ＩＩＩ）のモノマーとの共重合によって調製できる。
【００６９】
特定の実施形態において、ＺＰＳモノマーは、ポリマー骨格からペンダント状に伸びている（すなわち、ポリマー側鎖の一部を形成している）ＺＰＳ部位を含むポリマー繰り返し単位を提供する。ポリマー骨格からペンダント状に伸びたＺＰＳ部位を有する代表的なポリマーは、上述される式（ＩＩ）を有する。他の代表的なＺＰＳポリマーは、式（ＩＶ）を有する。
【００７０】
【化１２】
2021519275.tif 000014
【００７１】
式中、
＊は、この繰り返し単位と上記ポリマーもしくはコポリマーにおける他の繰り返し単位との付着箇所、またはポリマーもしくはコポリマーの末端基を示し；
Ｂは、上述されるポリマー骨格であり；
Ｌ２は、ＺＰＳ部位を上記骨格に繋ぐリンカー基であり、代表的な基は、式中のｘがそれぞれ１〜２０から独立して選択される整数である、−（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｘ−を含み；
Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ２０アルキル（たとえば、Ｃ１−Ｃ３アルキル；Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルなどの環状アルキルを含む）、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より独立して選択される、または、Ｒ２およびＲ３は窒素と一緒に環を形成し；
ｍは１〜２０の整数（たとえば、１、２、３、４、５、または６）であり；
ｐは１〜２０の整数（たとえば、１、２、３、４、５、または６）であり；かつ
ｎは約１０〜約５００の整数である。
【００７２】
他の実施形態において、ポリマー骨格からペンダント状に伸びたＺＰＳ部位を有する代表的なポリマーは、式（Ｖ）を有する。
【００７３】
【化１３】
2021519275.tif 000015
【００７４】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｌ、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、ｍ、ｐ、および＊は、式（ＩＩＩ）のモノマーについて上述される通りであり、式（Ｖ）中のＲ４およびＲ５は式（ＩＩＩ）中の官能基Ｒ４およびＲ５のそれぞれの重合残基であることが理解され；かつ、ｎは約１０〜約５００の整数である。
【００７５】
特定の実施形態において、ＺＰＳポリマーの双性イオン性ホスファチジルセリン部位は、少なくとも一部が、ポリマー骨格中に含まれる。
【００７６】
これらの実施形態のうち特定のものにおいて、ＺＰＳポリマーは、下記式を含む繰り返し単位を有する。
【００７７】
【化１４】
2021519275.tif 000016
【００７８】
式中、Ｌ２、ｐ、および＊は、式（ＩＶ）のポリマーについて上述される通りであり、Ｌ２がＢに結合している箇所はＮ＋（Ｒ１）の窒素（すなわち、Ｌ２が共有結合しているＢ中の原子）であることが理解され；かつ、ｎは約１０〜約５００の整数である。
【００７９】
これらの実施形態のうちの他のものにおいて、ＺＰＳポリマーは、下記式を含む繰り返し単位を有する。
【００８０】
【化１５】
2021519275.tif 000017
【００８１】
式中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、ｐ、および＊は、式（ＩＩＩ）のモノマーについて上述される通りであり、式（ＶＡ）中のＲ４およびＲ５は式（ＩＩＩ）中の官能基Ｒ４およびＲ５のそれぞれの重合残基であることが理解され；かつ、ｎは約１０〜約５００の整数である。
【００８２】
特定の実施形態において、本発明は、式（ＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶＡ）、（Ｖ）、または（ＶＡ）のポリマーを含む修飾された表面を提供する。当該修飾された表面は、人工神経系、ニューロン再生プラットフォーム、ニューラルセンサ、細胞培養プラットフォーム；非ファウリング性半導体、電池、有機太陽電池、バイオ燃料電池、プリント電子回路、有機発光ダイオード、アクチュエータ、エレクトロクロミズムデバイス、スーパーキャパシタ、化学センサ、フレキシブル透過型ディスプレイ、電磁シールド、帯電防止コーティング、マイクロ波吸収デバイス、またはレーダー吸収デバイスの表面であってよい。
【００８３】
特定の実施形態において、本発明は、式（ＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶＡ）、（Ｖ）、または（ＶＡ）のポリマーを含むバルク構築物を提供する。代表的な構築物は、医療用、電子、または船舶用デバイスであってよい。これらの実施形態のうち特定のものにおいて、バルク構築物は、人工神経系、ニューロン再生プラットフォーム、ニューラルセンサ、細胞培養プラットフォーム；非ファウリング性半導体、電池、有機太陽電池、バイオ燃料電池、プリント電子回路、有機発光ダイオード、アクチュエータ、エレクトロクロミズムデバイス、スーパーキャパシタ、化学センサ、フレキシブル透過型ディスプレイ、電磁シールド、帯電防止コーティング、マイクロ波吸収デバイス、またはレーダー吸収デバイスである。
【００８４】
ＺＰＳスターポリマーおよびコポリマー。他の態様において、本発明は、ＺＰＳ繰り返し単位を含むＺＰＳスターポリマーおよびＺＰＳコポリマーを提供する。
【００８５】
こうしたポリマーは、コアと、コアに共有結合した複数のＺＰＳ分枝部とを含む。こうしたポリマーのコアは、星形の小分子、オリゴマー、またはポリマーであってよい。特定の実施形態において、こうしたポリマーは、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のＺＰＳ分枝部を含んでよい。これらの実施形態のうち特定のものにおいて、ＺＰＳ分枝部のうち１つ以上は、それ自体がさらに分枝していてもよい。特定の実施形態において、こうしたポリマーは、複数のＺＰＳ分枝部の末端に結合した末端官能基をさらに含んでもよい。代表的な末端官能基は、ＯＨ、ＮＨ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｎ３、ＣＨ＝ＣＨ２、Ｃ≡ＣＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、イミドエステル、ハロアセチル、ヒドラジド、アルコキシアミン、アリールアジド、ジアジリン、マレイミド、カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、チアゾリジン−２−チオン、ピリジルジスルフィド、ジフルオロシクロオクチン（ｄｉｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）、シュタウディンガー試薬（２種で１組）、イソシアネート、イソチオシアネート、チオエーテル、スルフヒドリル、ヒドラジン、ヒドロキシメチルホスフィン、スルホ−ＮＨＳエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、スルホニルアジド、および５Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｆ］アゼピン、ならびにこれらの誘導体から選択される。
【００８６】
ＺＰＳコポリマー：疎水性および親水性の構成単位。さらなる態様において、本発明は、ＺＰＳ繰り返し単位と疎水性および／または親水性の構成単位とを含むＺＰＳコポリマーを提供する。
【００８７】
特定の実施形態において、コポリマーは、ＺＰＳ繰り返し単位を含むランダム、ジブロック、または超分枝コポリマー（たとえば、ポリ（ＺＰＳ））である。
【００８８】
代表的なブロックコポリマーは、少なくとも１つのＺＰＳ構成要素ブロック（Ａ）と少なくとも１つの疎水性ブロック（Ｂ）とを含む。特定の実施形態において、コポリマーは、親水性ブロック（Ｃ）または第２の疎水性ブロック（Ｃ）をさらに含む。本発明に係るブロックコポリマーは、ＡＢジブロックコポリマー、ＡＢＣトリブロックコポリマー、ＡＢＡトリブロックコポリマー、ＢＡＢトリブロックコポリマー、直鎖状またはスター状のマルチブロック（ＡＢ）ｎコポリマー、ミクトアーム（Ｍｉｋｔｏａｒｍ）ブロックコポリマー（ＡＢｎまたはＡｎＢ）、およびこれらの混合物を含む。特定の実施形態において、コポリマーは、中性の親水性繰り返し単位（たとえば、エチレンオキシド繰り返し単位などのアルキレンオキシド繰り返し単位）をさらに含む。
【００８９】
特定の実施形態において、コポリマーは、ＺＰＳモノマー（たとえば、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）を有する本発明に係るＺＰＳモノマー）に由来する繰り返し単位を含むＺＰＳ構成要素と、疎水性モノマーに由来する繰り返し単位を含む疎水性構成要素とを含む。
【００９０】
代表的な疎水性繰り返し単位は、アクリル酸およびエステル、アルキルアクリル酸およびエステル、アクリルアミド、アルキルアクリルアミド、ポリシロキサン繰り返し単位、ポリエステル繰り返し単位、ポリウレタン繰り返し単位、ポリスチレン繰り返し単位、ならびにこれらのフッ化誘導体に由来するものであってよい。
【００９１】
特定の実施形態において、コポリマーは、ＺＰＳモノマー（たとえば、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）を有する本発明に係るＺＰＳモノマー）に由来する繰り返し単位を含むＺＰＳ構成要素と、親水性モノマーに由来する繰り返し単位を含む親水性構成要素と、任意に、親水性モノマーに由来する繰り返し単位を含む疎水性構成要素とを含む。これらの実施形態のうち特定のものにおいて、親水性繰り返し単位はＺＰＳ部位を含む。他の実施形態において、親水性繰り返し単位は、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ＰＨＥＭＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリカルボキシベタイン（ＰＣＢ）、ポリスルホベタイン（ＰＳＢ）、ポリホスホベタイン（ＰＰＢ）、ポリホスホリルコリン（ＰＰＣ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）、ポリ（２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレート）（ＰＤＨＰＭ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリ（アクリル酸）、ポリメタクリレート（ＰＭＡ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、高分子電解質、多糖、ポリアミド、ならびに様々な親水性ポリマー、ペプチド系材料、および２つ以上の親水性モノマーのコポリマーであってよい。
【００９２】
ＺＰＳポリマーでの表面コーティング、バルク材料、および単体材料
他の態様において、本発明は、ＺＰＳポリマーでの表面コーティング、ＺＰＳポリマーのバルク材料、およびＺＰＳポリマーの単体材料を提供する。特定の実施形態において、ＺＰＳポリマーでの表面コーティング、バルク材料、および単体材料は、ＺＰＳモノマー、ならびにＺＰＳモノマーから調製されるポリマーおよびコポリマーから調製される。
【００９３】
ＺＰＳポリマーは、「グラフト法」（ｇｒａｆｔ−ｆｒｏｍ法またはｇｒａｆｔ−ｔｏ法）によって表面（たとえば、医療用デバイス、センサ、膜、船、および船舶用構造物）に付着させて、当該表面に非ファウリング性を付与することできる。また、ＺＰＳポリマーは、バルク材料（たとえば、シリコーン）と共に、またはその中に混合することもできる。表面コーティングは、平坦なまたはナノ／マイクロ粒子の表面に施すことができる。また、ＺＰＳポリマーは、（ｉ）シリコーン、フッ素化、ウレタン、イミド、アミドなどの固有の骨格、および（ｉｉ）複数の水素結合などの強い相互作用、および（ｉｉｉ）相互貫入ネットワークにより、医療および船舶用途のためのスタンドアロン型の低ファウリング性かつ高強度の材料およびデバイスを作製することもできる。
【００９４】
ＺＰＳポリマーでの表面コーティング。本発明は、ＺＰＳポリマーでの表面コーティングを提供する。特定の実施形態において、表面コーティングは、本明細書中に記載される本発明に係るＺＰＳポリマー（オリゴマー）またはＺＰＳコポリマー（たとえば、式（ＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶＡ）、（Ｖ）、または（ＶＡ）のポリマー）を含む。
【００９５】
ＺＰＳポリマーおよびコポリマーでコーティングした表面は、非ファウリング特性を有する。表面の非ファウリング特性は、フィブリノゲン吸着および細胞接着によって評価できる。特定の実施形態において、本発明に係る表面は、フィブリノゲン吸着が約２００ｎｇ／ｃｍ２未満である。他の実施形態において、本発明に係る表面は、フィブリノゲン吸着が約１００ｎｇ／ｃｍ２未満である。さらなる実施形態において、本発明に係る表面は、フィブリノゲン吸着が約５０ｎｇ／ｃｍ２未満である。他の実施形態において、本発明に係る表面は、フィブリノゲン吸着が約３０ｎｇ／ｃｍ２未満である。さらなる実施形態において、本発明に係る表面は、フィブリノゲン吸着が約２０ｎｇ／ｃｍ２未満である。他の実施形態において、本発明に係る表面は、フィブリノゲン吸着が約１０ｎｇ／ｃｍ２未満である。特定の実施形態において、本発明に係る表面は、フィブリノゲン吸着が約５ｎｇ／ｃｍ２未満である。
【００９６】
特定の実施形態において、表面は、ＺＰＳアクリレート、ＺＰＳアクリルアミド、ＺＰＳメタクリレート、ＺＰＳメタアクリルアミド、ＺＰＳビニル化合物、ＺＰＳエポキシド、およびこれらの混合を含むがこれらに限定されない重合性基から選択される１つ以上のＺＰＳモノマーから調製されるＺＰＳポリマーまたはコポリマーでコーティングされている。代表的なＺＰＳモノマーは、式（Ｉ）および（ＩＩＩ）のＺＰＳモノマーを含む、本明細書中に記載されるものを含む。
【００９７】
特定の実施形態において、ＺＰＳポリマーまたはコポリマーは、ポリ（ＺＰＳ）を含むランダム、マルチブロック、または超分枝コポリマーである。他の実施形態において、ＺＰＳポリマーまたはコポリマーは、相互貫入ＺＰＳポリマーネットワークである。
【００９８】
特定の実施形態において、ＺＰＳポリマーまたはコポリマーは、表面接着基（たとえば、ＤＯＰＡ、チオール、シラン、クリックケミストリー、疎水性、親水性、および荷電基）を有する。
【００９９】
ＺＰＳポリマーおよびコポリマーでコーティングした表面は、共有結合性の相互作用により、または、物理的な疎水性同士の、および荷電同士の、およびハイドロゲル結合の相互作用により、またはこうした化学的および物理的な相互作用の組み合わせにより、ＺＰＳポリマーまたはコポリマーを基体表面に付着させることによって調製できる。
【０１００】
ＺＰＳポリマーまたはコポリマーでコーティングした表面は、基体表面からＺＰＳポリマーをグラフトする（「ｇｒａｆｔｅｄ  ｆｒｏｍ」）（たとえば、基体の存在下において好適なモノマーを重合させてポリマーまたはコポリマーを形成することでポリマー表面を調製する）ことによって調製できる、または、ＺＰＳポリマーを基体表面にグラフトする（「ｇｒａｆｔｅｄ  ｔｏ」）（たとえば、予め形成したポリマーまたはコポリマーを基体に結合させることでポリマー表面を調製する）ことによって調製できる。
【０１０１】
特定の実施形態において、ＺＰＳポリマーおよびコポリマーは、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）、または光イニファーター（ｐｈｏｔｏｉｎｆｅｒｔｅｒ）重合などの重合法によって、基体からグラフトする。
【０１０２】
特定の実施形態において、ＺＰＳポリマーおよびコポリマーは、クリックケミストリー、ＤＯＰＡコンジュゲーション化学、またはチオールもしくはシランによる自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）などのコンジュゲーション法によって、基体にグラフトする。
【０１０３】
ＺＰＳポリマーでの表面コーティングは、多様な基体（たとえば、基体表面）に適用され得る。特定の実施形態において、表面は、バイオメディカルデバイスの全体または一部である。代表的なバイオメディカルデバイスは、カテーテル、耳ドレナージ管、栄養管、緑内障ドレナージ管、水頭症（ｈｙｄｒｏｃｅｐｈａｌｏｕｓ）シャント、角膜プロステーシス、神経誘導管（ｎｅｒｖｅ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｔｕｂｅｓ）、組織接着剤、Ｘ線導管、人工関節（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｊｏｉｎｔｓ）、人工心臓弁、人工血管、ペースメーカー、左室補助デバイス（ＬＶＡＤ）、動脈グラフト、血管グラフト、ステント、血管内ステント、心弁、置換用関節（ｊｏｉｎｔ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ）、血管プロステーシス、皮膚修復デバイス、置換用蝸牛（ｃｏｃｈｌｅａｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ）、コンタクトレンズ、人工靱帯および腱、歯科インプラント、ならびに再生組織工学における組織スキャフォールドを含む。特定の実施形態において、デバイスはコンタクトレンズである。
【０１０４】
特定の実施形態において、表面は、粒子の全体または一部である。代表的な粒子は、金属、金属酸化物、セラミック、合成ポリマー、天然ポリマー、二酸化ケイ素、結晶、および半導体材料の粒子を含む。特定の実施形態において、粒子は、タンパク質（たとえば、酵素）または核酸（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）などの生体分子である。他の実施形態において、粒子は細胞である。
【０１０５】
特定の実施形態において、表面は、膜またはバイオ分離膜の全体または一部である。代表的な膜は、タンパク質精製、廃水処理、バイオリアクター、海水淡水化、および水／油精製に使用される膜を含む。
【０１０６】
特定の実施形態において、表面は、遺伝子送達ビヒクル、ＲＮＡ送達ビヒクル、またはタンパク質送達ビヒクルなどの薬物送達ビヒクルの全体に接している、またはこれを形成している。
【０１０７】
特定の実施形態において、表面は、埋め込み型または皮下型センサの全体または一部に接している、またはこれを形成している。
【０１０８】
特定の実施形態において、表面は、組織スキャフォールドの全体または一部に接している、またはこれを形成している。
【０１０９】
ＺＰＳポリマーのバルク材料。本発明は、ＺＰＳポリマーのバルク材料を提供する。特定の実施形態において、バルク材料は、本明細書中に記載される本発明に係るＺＰＳポリマー（オリゴマー）またはＺＰＳコポリマー（たとえば、式（ＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶＡ）、（Ｖ）、または（ＶＡ）のポリマー）を含む。特定の実施形態において、材料は、本明細書中に記載される本発明に係るモノマー（たとえば、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）のモノマー）を使用する重合または共重合プロセスによって調製される。
【０１１０】
特定の実施形態において、バルク材料は、１つ以上のＺＰＳポリマーまたはコポリマーと、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリウレア、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリイミド、ポリエポキシ、芳香族ポリエステル、セルロース誘導体、フルオロポリマー、ポリアクリル、ポリアミド、ポリ酸無水物、ポリエーテル、ビニルポリマー、フェノール誘導体、エラストマー、および他の付加ポリマーなどの１つ以上の他のポリマーとをブレンドすることによって得られる。
【０１１１】
他の実施形態において、バルク材料は、相互貫入ＺＰＳポリマーネットワークと、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリウレア、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリイミド、ポリエポキシ、芳香族ポリエステル、セルロース誘導体、フルオロポリマー、ポリアクリル、ポリアミド、ポリ酸無水物、ポリエーテル、ビニルポリマー、フェノール誘導体、エラストマー、および他の付加ポリマーなどの１つ以上の他のポリマーとを含む。
【０１１２】
ＺＰＳポリマーの単体材料。本発明は、ＺＰＳポリマーの単体材料を提供する。特定の実施形態において、材料は、本明細書中に記載される本発明に係るＺＰＳポリマー（オリゴマー）またはＺＰＳコポリマー（たとえば、式（ＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶＡ）、（Ｖ）、または（ＶＡ）のポリマー）を含む。特定の実施形態において、材料は、本明細書中に記載される本発明に係るモノマー（たとえば、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）のモノマー）を使用する重合または共重合プロセスによって調製される。
【０１１３】
特定の実施形態において、ＺＰＳポリマーの単体材料は非ファウリング性材料であり、高い力学的強度を有する。これらの実施形態のうち特定のものにおいて、単体材料は、タンパク質吸着が約３０ｎｇ／ｃｍ２未満、約５０ｎｇ／ｃｍ２未満、または約１００ｎｇ／ｃｍ２未満であり、引張／圧縮強度が約０．２ＭＰａより大きい、約０．５ＭＰａより大きい、または約１．０ＭＰａより大きい非ファウリング性材料である。
【０１１４】
特定の実施形態において、ＺＰＳポリマーの単体材料は、（ａ）シアノ基（Ｃ≡Ｎ）などの双極子−双極子相互作用と、（ｂ）アミド基（−（ＮＨ）−（Ｃ＝Ｏ）−）、複数のアミド基（（−（ＮＨ）−（Ｃ＝Ｏ）−）ｎ（ｎ＝１〜５））、ウレタン基（−（ＮＨ）−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−）、複数のウレタン基（（−（ＮＨ）−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−）ｎ（ｎ＝１〜５））、ウレア基（−（ＮＨ）−（Ｃ＝Ｏ）−（ＮＨ）−）、複数のウレア基（（−（ＮＨ）−（Ｃ＝Ｏ）−（ＮＨ）−）ｎ（ｎ＝１〜５））、およびこれらの組み合わせなどの水素ドナー／アクセプターとの導入によって強化されたＺＰＳポリマーネットワークである。こうした基は、ＺＰＳモノマーおよびＺＰＳ（ランダムまたはブロック）コポリマーに由来するものであってよい。こうした基は、ポリマー骨格またはポリマーペンダント基の中にあってもよい。
【０１１５】
ＺＰＳポリマーネットワークは、ＺＰＳモノマー、または、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリアミド、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリイソブテン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリウレア、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリイミド、ポリエポキシ、ポリ酸無水物、ポリエーテル、および他の縮合／付加ポリマーなどのＺＰＳポリマー中の骨格で強化されてよい。特定の実施形態において、ＺＰＳポリマーネットワークは、上述されるものの任意の組み合わせによって強化される。
【０１１６】
特定の実施形態において、ＺＰＳポリマーは、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリウレア、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリイミド、ポリエポキシ、芳香族ポリエステル、セルロース誘導体、フルオロポリマー、ポリアクリル、ポリアミド、ポリ酸無水物、ポリエーテル、ビニルポリマー、フェノール誘導体、エラストマー、および他の付加ポリマーなどの他のポリマーまたは複合体と共にコポリマーを形成してよい。これらの材料の力学的特性を増大させるために、繊維、クレイ、ナノチューブ、および他の無機物体を添加してよい。
【０１１７】
本発明に係るＺＰＳ単体材料を、射出成形、ブロー成形、押出成形、カレンダー成形、流延、圧縮成形、プレバリケーション（ｐｒｅｖａｒｉｃａｔｉｏｎ）成形、および３Ｄ印刷などの多様な方法に供することによって、物体を形成してよい。
【０１１８】
本発明に係るＺＰＳ単体材料は、生物医学／生物工学用途、消費者向製品用途、工学／船舶用途、カテーテル、耳ドレナージ管、栄養管、緑内障ドレナージ管、水頭症（ｈｙｄｒｏｃｅｐｈａｌｏｕｓ）シャント、角膜プロステーシス、神経誘導管（ｎｅｒｖｅ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｔｕｂｅｓ）、組織接着剤、Ｘ線導管、人工関節、人工心臓弁、人工血管、ペースメーカー、左室補助デバイス（ＬＶＡＤ）、動脈グラフト、血管グラフト、ステント、血管内ステント、心弁、置換用関節、血管プロステーシス、皮膚修復デバイス、置換用蝸牛、コンタクトレンズ、人工靱帯および腱、歯科インプラント、ならびに再生組織工学における組織スキャフォールドなどの治療／診断用途、薬物送達、遺伝子送達、ＲＮＡ送達、タンパク質送達、船舶用および工学用デバイス／物体（たとえば、膜、チューブ、パイプ、容器、またはプレート）において使用できる。
【０１１９】
特定の実施形態において、単体材料は、船舶体（ｍａｒｉｎｅ  ｖｅｓｓｅｌ  ｈｕｌｌｓ）、船舶用構造物、橋、プロペラ、熱交換器、潜望鏡、センサ、漁網、ケーブル、チューブ／パイプ、容器、膜、および石油ブームなどの船舶用製品において使用できる。
【０１２０】
特定の実施形態において、単体材料は、生体材料にコンジュゲートさせてよい。代表的な生体材料は、核酸（たとえば、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、タンパク質（たとえば、酵素、抗体またはその機能的断片）、ペプチド、脂質、細胞もしくは微生物、固体ナノ粒子（酸化鉄、シリカ、量子ドット、または金ナノ粒子）を含む、または、皮膚を界面活性剤による脱水から保護するために使用される。
【０１２１】
ＺＰＳポリマーのハイドロゲル
本発明は、ＺＰＳポリマーのハイドロゲルを提供する。特定の実施形態において、ハイドロゲルは、本明細書中に記載される本発明に係る架橋ＺＰＳポリマー（オリゴマー）またはＺＰＳコポリマー（たとえば、式（ＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶＡ）、（Ｖ）、または（ＶＡ）のポリマー）を含む。特定の実施形態において、ハイドロゲルは、本明細書中に記載される本発明に係るモノマー（たとえば、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）のモノマー）を使用する重合または共重合プロセスによって調製される。
【０１２２】
ＺＰＳポリマーのハイドロゲルは、ＺＰＳモノマーと、分解性または非分解性のＺＰＳ架橋剤を含む多様な架橋剤とから作製できる。ＺＰＳスターポリマーは、（たとえば、クリックケミストリーにより）ハイドロゲルを形成することによって調製できる。こうしたハイドロゲルは、バルクハイドロゲルまたはペレットハイドロゲルの形態であってよい。こうしたハイドロゲルは、埋め込み型材料およびデバイスとして使用することによってカプセル形成の低減が可能であり、培地として使用することによって、制御された様式での多様な細胞（たとえば、幹細胞、免疫細胞、膵島細胞（ｉｓｌｅｔｓ）、血小板、および心筋細胞）の保護、増殖、保存、および分化が可能である。ペレットおよびスターハイドロゲルは、生物製剤（たとえば、多様な細胞、および腫瘍ワクチンのための腫瘍）と共に注射してもよい。
【０１２３】
特定の実施形態において、ＺＰＳハイドロゲルは、１つ以上の架橋剤を使用して１つ以上のＺＰＳモノマー（たとえば、式（Ｉ）または（ＩＩ）のモノマー）から調製される架橋ハイドロゲルである。
【０１２４】
これらの実施形態のうちの他のものにおいて、架橋剤は、カルボキシベタイン、スルホベタイン、またはホスホベタイン部位を含む多官能双性イオン性架橋剤である。
【０１２５】
これらの実施形態のうちさらなるものにおいて、架橋剤は、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ジアクリレートもしくはジアクリルアミド、またはＰＥＧジメタクリレートもしくはジメタアクリルアミドなどの多官能架橋剤である。
【０１２６】
特定の実施形態において、ハイドロゲルは、二官能性のＺＰＳ架橋剤を使用して調製される。他の実施形態において、ハイドロゲルは、分解性または非分解性の架橋剤を使用して調製される。さらなる実施形態において、ハイドロゲルは、分解性の双性イオン性ジスルフィド架橋剤を使用して調製される。他の実施形態において、ハイドロゲルは、酵素または好適な剤によって分解され得るペプチド系架橋剤を使用して調製される。
【０１２７】
本発明に係るＺＰＳハイドロゲルは、熱重合、光重合、またはレドックス重合などのフリーラジカルが介在する重合技術によって調製できる。
【０１２８】
本発明に係る代表的なＺＰＳハイドロゲルの調製が、実施例４中に記載される。代表的なＺＰＳハイドロゲルへのタンパク質吸着および細胞接着が、実施例４中に記載される。
【０１２９】
本発明に係るＺＰＳハイドロゲルは、バイオセンサおよびバイオメディカルデバイス、血管グラフト、血管内ステント、心弁、置換用関節、細胞保存／増殖／分化、薬物送達プラットフォーム、船体（ｓｈｉｐ  ｈｕｌｌｓ）、船舶用構造物／機器、ならびに、生理的環境と接触する他の材料およびデバイスに使用できる。
【０１３０】
特定の実施形態において、ＺＰＳハイドロゲルはスターハイドロゲルである。スターハイドロゲルは、コアと、コアに共有結合した複数のＺＰＳ系または双性イオン性分枝部とを有するポリマーから調製できる。代表的なコアは、分枝部を３つ、４つ、５つ、またはそれ以上有するスター型の小分子、オリゴマー、またはポリマーのうちの１つを含む。
【０１３１】
特定の実施形態において、ハイドロゲルは、選択的に（すなわち、特定条件下において）分解され得る分解性の架橋剤によって架橋されている。分解性の架橋剤は、ペプチド架橋剤、多糖架橋剤、無水物架橋剤、ジスルフィド架橋剤、およびポリエステル架橋剤から選択されてよい。これらの実施形態のうち特定のものについて、ハイドロゲルは、酵素によって加水分解または消化され得る。
【０１３２】
特定の実施形態において、スターハイドロゲル分枝ポリマーは、その末端官能基が分枝部の末端（たとえば、複数のＺＰＳまたは双性イオン性分枝部の末端）に結合している。代表的な末端官能基は、ＯＨ、ＮＨ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｎ３、ＣＨ＝ＣＨ２、Ｃ≡ＣＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、イミドエステル、ハロアセチル、ヒドラジド、アルコキシアミン、アリールアジド、ジアジリン、マレイミド、カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、チアゾリジン−２−チオン、ピリジルジスルフィド、ジフルオロシクロオクチン、シュタウディンガー試薬（２種で１組）、イソシアネート、イソチオシアネート、チオエーテル、スルフヒドリル、ヒドラジン、ヒドロキシメチルホスフィン、スルホ−ＮＨＳエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、スルホニルアジド、および５Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｆ］アゼピンを含む。
【０１３３】
特定の実施形態において、ハイドロゲルは、第１のポリマー／コポリマー（第１のスターハイドロゲル）に１つ以上の第２のポリマー／コポリマー（第２のスターハイドロゲル）が結合したものを含む。ハイドロゲルは、注射用のハイドロゲルとして使用できる。これらの実施形態のうち特定のものにおいて、第１のポリマーは、末端官能基によって１つ以上の第２のポリマーに結合している。
【０１３４】
スターハイドロゲルは、双性イオン性ハイドロゲルと組み合わされ、特定の鋳型中にてまたは機械的な低減（たとえば、ブレンダー）によって、多様なサイズのペレットに形成され得る。こうしたペレットハイドロゲルは、生物学的な内容物を入れてまたは入れずに、注射用のハイドロゲルとして使用できる。
【０１３５】
本発明に係るＺＰＳスターハイドロゲルは、（ａ）ＡＴＲＰ、ＲＡＦＴ、ＲＯＰ、縮合、マイケル付加、分枝部発生／伸長反応によりＺＰＳまたは双性イオン性分枝部を合成し、（ｂ）このＺＰＳまたは双性イオン性分枝部をコアと反応させてスターポリマーを得ることによって作製され得る。特定の実施形態において、当該方法は、「クリック」反応、チオール交換反応、または還元反応によってＺＰＳまたは双性イオン性分枝部の末端を官能化することをさらに含む。
【０１３６】
特定の実施形態において、ＺＰＳハイドロゲルはミクロゲルである。本発明に係るミクロゲルは、ミクロンサイズで大きさが約１ミクロン（１０−６ｍ）〜１ｍｍ（１０−２ｍ）であり、ＺＰＳ系モノマーから構成されていて、任意の架橋化学によって支持されている、架橋ハイドロゲルである。
【０１３７】
本発明に係るミクロゲルは、官能化されたＺＰＳモノマー、オリゴマー、またはポリマーを使用する多様な方法であって、
（ａ）アジドとアルキン、アジドとアルケン、チオールとマレイミド、チオールとアルケン、チオールとジスルフィド、または任意の他の「クリック」型の対、生体直交型の対、または他の反応対（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐａｉｒ）から選択される反応対の１つが、
（ｂ）ポリマー構造の末端に、または骨格に沿って位置しており、
（ｃ）外科用途、治療用途、創傷治癒用途、薬物送達調製物、細胞の保管および保存、または再生医療の目的で、ペプチド、核酸、タンパク質、抗体、ナノ粒子、マイクロ粒子、ミセル、リポソーム、ポリマーソーム、薬物、薬物前駆体、または他の治療種もしくは薬物送達様式を組み込むことを含む、方法によって調製できる。
【０１３８】
特定の実施形態において、ミクロゲルは、ＺＰＳモノマーもしくはポリマーと他の種類のイオン性もしくは非イオン性の非ファウリング性モノマーもしくはポリマーとの混合物、またはＺＰＳ系ポリマーと他の種類のイオン性もしくは非イオン性のモノマーとのコポリマーを含む。
【０１３９】
当該ミクロゲルについて、架橋は、物理的および／または化学的な機構の任意の組み合わせを用いてなされ、これには、特定の実施形態において、以下が含まれる：
（ａ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、オリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）、もしくは他の構造もしくは基に基づいていて、かつ末端に２つ以上のアクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、マレイミド、もしくは類似する反応性基を有する市販の架橋剤、または、任意の機能性、反応性、もしくは分解性の基が組み込まれたオーダーメイド合成の架橋剤（分解性の基は、任意に、ジスルフィド結合、エステル、無水物、酵素切断可能なペプチド（ＧＰＱＧＩＷＣＧモチーフなど）、または外部刺激応答性の化学種から選択され得る）を含む、任意の構造を有しラジカル介在性反応によりモノマーと共重合する化学的架橋剤、
（ｂ）アジド／アルキン（ＳＰＡＡＣを含む）およびチオール−エン化学種などの、生体直交型の架橋性の化学種および「クリック」化学種（ポリマー主鎖もしくは構造中に官能基として含まれているか、または、別個の架橋性分子として存在する）、
（ｃ）イオン性相互作用、水素結合、疎水性相互作用、生体分子とのまたは天然もしくは合成由来のナノ粒子との相互作用、または任意の他の可逆性もしくは非可逆性の物理的相互作用を含む、任意の型の物理的相互作用、および
（ｄ）上述される架橋機構の任意の組み合わせ。
【０１４０】
特定の実施形態において、ミクロゲルは、１つ以上のＺＰＳ部位が組み込まれた二官能性のＺＰＳの架橋性の分子、オリゴマー、もしくはポリマー、またはこうした分子の混合物を使用して調製される。
【０１４１】
特定の実施形態において、ミクロゲルは、１つ以上の双性イオン性部位が組み込まれた双性イオン性の（カルボキシベタイン、スルホベタイン、またはホスホベタイン）架橋性の分子、オリゴマー、もしくはポリマー、またはこうした分子の混合物を使用して調製される。こうした架橋剤には、ジスルフィド結合、エステル、または刺激応答性の基、または分解性のペプチドなどの分解性の基が組み込まれていてもよい。
【０１４２】
特定の実施形態において、本発明は、上述されるような２つ以上のミクロゲルの集合から形成される材料であって、個々のミクロゲル間における相互作用に起因して固有の特性が付与されたバルク材料を提供する。こうした材料は、小分子薬物、ペプチド、生体分子、ナノ粒子、細胞、または組織などの他の成分を含んでよい。
【０１４３】
特定の実施形態において、上述されるミクロゲルおよび集合体は、重合方法（たとえば、マイクロエマルション重合）に起因して大きさが限定されたミクロゲルから作製される。
【０１４４】
他の実施形態において、ミクロゲルは、上述される（バルク）ハイドロゲルまたは上述されるスターハイドロゲルを、重合後にさらなるサイジングを施して大きさを限定したもの、すなわち、任意の処理工程によりハイドロゲルを粉砕、押出、細断、切断、またはペレット化して個々の単位のサイズを限定したものである。
【０１４５】
上述されるミクロゲルおよび集合体は、保管、運搬、使用、または滅菌の目的で、乾燥または凍結乾燥（フリーズドライ）によって脱水粉末としてもよい。ミクロゲル粉末に、水、生理食塩水、またはイオン性溶液、細胞を含有するもしくは含有しない細胞成長用もしくは保存用の培地、または、治療用薬物、治療用タンパク質、治療用核酸、細胞、ナノ粒子、もしくはマイクロ粒子を含有してよい任意の他の生理学的に妥当な溶液を含む任意の水性流体を用いて、再度含水させてもよい。
【０１４６】
ＺＰＳスターハイドロゲルおよびミクロゲル、ならびにその集合体、ならびに／またはこれらを部分的もしくは完全に乾燥もしくは再度含水させた組成物は、以下の用途を有する：
（ａ）非ニュートン挙動を有する（たとえば、粘弾性、レオペクシー性、チキソトロピー性、剪断増粘性（ダイラタンシー）、剪断減粘性（擬塑性）、および／またはビンガム塑性特性を呈する）材料、
（ｂ）自己治癒材料および／または形状記憶材料、または、類似する種類の、損傷や外部刺激後に損傷修復もしくは特性回復が可能な「スマート」材料、ならびに
（ｃ）たとえば、船舶用途、薬物送達プラットフォーム、バイオセンサおよび他の医療用デバイス、血管グラフト、血管内ステント、心弁、置換用関節、ならびに、生理的環境と接触する他の材料およびデバイスのための、タンパク質または他の生体分子の非特異的吸着の防止を目的とした、抗ファウリング材料または表面コーティング。
【０１４７】
ＺＰＳスターハイドロゲルおよびミクロゲル、ならびにその集合体は、生物医学用途、特に非ニュートン流体特性と高い生体適合性とが要求される用途において、注射用または塗布用材料として使用できる：
（ａ）美容整形または再建手術、血管プロステーシス、皮膚修復デバイス、置換用蝸牛、注射用ガラス質物質、人工軟骨、人工脂肪、コラーゲン模倣物、および他の軟部組織模倣物もしくは補助物において使用されるものなどの、力学的な補助を提供できる注射用または塗布用材料、
（ｂ）特に、非特異的な相互作用が回避されるべき場合、または、非特異的な相互作用と特異的な相互作用との間で望ましいバランスを達成しなくてはならない場合に、表面または組織と所望のまたは特異的な生物学的相互作用をする、注射用または塗布用材料、ならびに
（ｃ）外科用途、治療用途、創傷治癒、および薬物送達調製物において、薬物、生体分子（たとえば、核酸、ペプチド、タンパク質、多糖）、細胞（たとえば、膵島、心血管細胞、幹細胞、Ｔ細胞、血液細胞）、ナノ粒子またはマイクロ粒子（たとえば、ＰＬＧＡ／薬物調製物）、ミセル、リポソーム、ポリマーソーム、または他の治療種もしくは薬物送達様式を送達および／または保護または遮蔽するための、注射用または塗布用キャリア。
【０１４８】
ＺＰＳスターハイドロゲルおよびミクロゲル、ならびにその集合体は、細胞および組織の成長、維持、または増殖のためのスキャフォールド、マトリックス、または基体として使用でき、ここで、当該細胞およびミクロゲル構築物は、任意の型のバイオリアクターを含む任意の培養方法または装置の使用により成長でき、かつ、以下を含む系譜に由来し得る：
（ａ）多能性および多分化能幹および始原細胞であって、以下を含むもの：
（ｉ）臍帯血もしくは骨髄に由来もしくはこれらから精製された、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、組織由来幹細胞（たとえば、皮膚、血液、または眼に由来）、造血性幹および始原細胞（ＨＳＰＣ）、間葉系幹細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、
（ｉｉ）遺伝子改変またはトランスフェクションされた幹および始原細胞、ならびに
（ｉｉｉ）がん幹細胞（ＣＳＣ）；
（ｂ）赤色血液細胞（赤血球）、白色血液細胞（白血球）、および血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔｓ、ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅｓ）を含む、典型的にはヒト血液中を循環している造血細胞；
（ｃ）免疫細胞および始原細胞、またはこれらから分化した系譜であって、以下を含むもの：
（ｉ）特にナイーブ型細胞傷害Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびこれから分化または活性化された系譜（セントラルメモリーＴ細胞を含む）を含む、ＣＤ８表面糖タンパク質発現Ｔ細胞、
（ｉｉ）特にナイーブ型ヘルパーＴリンパ球およびこれから分化または活性化された系譜（ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ９、ＴＨ１７、ＴＦＨ、Ｔｒｅｇ、およびセントラルメモリー（ＴＣＭ）Ｔ細胞を含む）を含む、ＣＤ４表面糖タンパク質発現Ｔ細胞、
（ｉｉｉ）任意の供給源に由来する制御性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）（天然Ｔｒｅｇでも誘導Ｔｒｅｇでもよい）、
（ｉｖ）ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）細胞、
（ｖ）キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）、
（ｖｉ）遺伝子改変Ｔ細胞；
（ｄ）上に具体的に列記されていない、Ｂ細胞、樹状細胞、および他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）または免疫細胞；
（ｅ）糖尿病の処置および管理に有用な、膵島細胞または他のインスリン産生細胞およびβ細胞；
（ｆ）神経系細胞および始原細胞；
（ｇ）心血管系細胞および始原細胞；ならびに
（ｈ）免疫療法、再生医療、血液疾患または悪性腫瘍、またはがんのワクチンもしくは処置の分野において有用な細胞。
【０１４９】
ＺＰＳスターハイドロゲルおよびミクロゲル、ならびにその集合体は、臨床または軍事目的で、細胞もしくは組織（特に、従来の方法での保存が困難な血液細胞（たとえば、血小板および赤色血液細胞）などの細胞型）を、長期にわたり、室温または低温で、全血中または保存溶液中にて、ＤＭＳＯ、グリセリン、グリシンベタイン、または他のオスモライトもしくは凍結保護物質の存在下または非存在下で、保存するための、またはその生物学的機能を保持するための任意の方法において、生体適合性材料、スキャフォールド、調製物構成要素、または接触材料として使用できる。
【０１５０】
ＺＰＳスターハイドロゲルおよびミクロゲル、ならびにその集合体は、埋め込み型バイオセンサなどの物体、デバイス、および部品；創傷ケア用のデバイス、接着剤、およびシーラント（ｓｅｌａｎｔｓ）、コンタクトレンズ；歯科インプラント；人工関節、人工骨、人工靱帯、および人工腱などの整形外科用デバイス；カテーテル、人工弁、人工血管、人工ステント、ＬＶＡＤ、もしくはリズム管理デバイスなどの心血管用デバイス；栄養管、消化管クリップ、胃腸管スリーブ、もしくは胃バルーンなどの胃腸科用デバイス；埋め込み型受胎調節デバイスもしくは膣スリングなどのＯＢ／Ｇｙｎデバイス；吻合部コネクタもしくは真皮下ポートなどの腎臓科用デバイス；神経誘導管（ｎｅｒｖｅ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｔｕｂｅｓ）、脳脊髄液ドレーンもしくはシャントなどの神経系外科手術用デバイス、皮膚修復デバイスなどの皮膚科用デバイス、シャントなどの眼科用デバイス、ステント、蝸牛インプラント、チューブ、シャント、もしくは開大器などの耳鼻咽喉科用デバイス、眼内レンズ；乳房インプラント、鼻インプラント、および頬インプラントなどの審美インプラント；神経刺激デバイス、蝸牛インプラント、および神経導管（ｎｅｒｖｅ  ｃｏｎｄｕｉｔ）などの神経インプラント；血糖センサおよびインスリンポンプなどのホルモン制御インプラント；埋め込んだバイオセンサ；アクセスポートデバイス；および組織スキャフォールド、ＣＯＰＤ管理のための弁もしくは人工肺などの肺動脈弁デバイス；放射線不透過もしくは超音波不透過マーカーなどの放射線科用デバイス；または、カテーテルもしくは人工尿道などの泌尿器科用デバイスに使用できる。
【０１５１】
他の態様において、本発明は、ＺＰＳスターハイドロゲルまたはミクロゲルまたはミクロゲル集合体でコーティングした基体を提供する。代表的な基体は、埋め込み型バイオセンサなどの物体、デバイス、および部品；創傷ケア用のデバイス、接着剤、およびシーラント（ｓｅｌａｎｔｓ）、コンタクトレンズ；歯科インプラント；人工関節、人工骨、人工靱帯、および人工腱などの整形外科用デバイス；カテーテル、人工弁、人工血管、人工ステント、ＬＶＡＤ、もしくは／およびリズム管理デバイスなどの心血管用デバイス；栄養管、消化管クリップ、胃腸管スリーブ、もしくは胃バルーンなどの胃腸科用デバイス；埋め込み型受胎調節デバイスもしくは膣スリングなどのＯＢ／Ｇｙｎデバイス；吻合部コネクタもしくは真皮下ポートなどの腎臓科用デバイス；神経誘導管（ｎｅｒｖｅ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｔｕｂｅｓ）、脳脊髄液ドレーンもしくはシャントなどの神経系外科手術用デバイス、皮膚修復デバイスなどの皮膚科用デバイス、シャントなどの眼科用デバイス、ステント、蝸牛インプラント、チューブ、シャント、もしくは開大器などの耳鼻咽喉科用デバイス、眼内レンズ；乳房インプラント、鼻インプラント、および頬インプラントなどの審美インプラント；神経刺激デバイス、蝸牛インプラント、および神経導管（ｎｅｒｖｅ  ｃｏｎｄｕｉｔ）などの神経インプラント；血糖センサおよびインスリンポンプなどのホルモン制御インプラント；埋め込みまれたバイオセンサ；アクセスポートデバイス；および組織スキャフォールド、ＣＯＰＤ管理のための弁もしくは人工肺などの肺動脈弁デバイス；放射線不透過もしくは超音波不透過マーカーなどの放射線科用デバイス；または、カテーテルもしくは人工尿道などの泌尿器科用デバイスを含む。
【０１５２】
ＺＰＳポリマーのナノ粒子およびマイクロ粒子
別の一態様において、本発明は、本発明に係るＺＰＳポリマーおよびコポリマーを含むナノおよびマイクロ粒子を提供する。本発明に係るＺＰＳポリマーおよびコポリマーは、ナノおよびマイクロ粒子を、ナノおよびミクロゲル、ミセル、リポソーム、およびポリマーソームの形態にて形成するために使用できる。また、治療または診断目的で量子ドット、酸化鉄、シリカ、および金などの固体粒子をコーティングするためにも使用できる。本発明に係るＺＰＳポリマーおよびコポリマーは、共有結合および非共有結合によって、ナノおよびマイクロ粒子と結合させることができる。
【０１５３】
特定の実施形態において、ナノスケールの大きさを有する粒子が提供される。粒子はコアを有し、当該コアの表面に、または当該コアの表面から、複数のＺＰＳポリマーまたはコポリマーがグラフトしている。代表的な粒子コアは、金属、金属酸化物、セラミック、合成ポリマー、天然ポリマー、結晶、半導体材料、グラフェン、酸化グラフェン、酸化鉄、シリカ、量子ドット、ハイドロゲル、リポソーム、ミセル、炭素系材料、または生体分子を含む。
【０１５４】
ＺＰＳポリマーおよびコポリマーコンジュゲート
さらなる一態様において、本発明は、ＺＰＳポリマーおよびコポリマーコンジュゲートを提供する。ＺＰＳポリマーは、グラフト法（ｇｒａｆｔ−ｔｏ法またはｇｒａｆｔ−ｆｒｏｍ法）によって生体分子（たとえば、タンパク質／ペプチド、核酸、および糖）、他の巨大分子、および細胞に付着させて、多様なコンジュゲートを提供することができる。
【０１５５】
特定の実施形態において、ＺＰＳポリマーコンジュゲートまたはコポリマーコンジュゲートは、生体分子に結合した１つ以上のＺＰＳポリマーを含むＺＰＳポリマーバイオコンジュゲートである。好適な生体分子は、タンパク質、核酸、糖タンパク質、プロテオグリカン、および脂質を含む。好適な生体分子は、小分子治療剤（すなわち、分子量約１０００ｇ／モル未満の、好ましくは約８００ｇ／モル未満の炭素系治療剤）を含む。
【０１５６】
代表的なタンパク質は、酵素、シグナル伝達タンパク質、止血および血栓症タンパク質、ワクチン、補体系タンパク質、ならびに抗体、その機能的断片または特性部分を含む。代表的なシグナル伝達タンパク質は、ホルモン、サイトカイン、調節性タンパク質、インスリン、およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／２阻害剤を含む。
【０１５７】
これらの実施形態のうち特定のものにおいて、ＺＰＳポリマーコンジュゲートまたはコポリマーコンジュゲートは、修飾された生体分子（たとえば、ポリマー修飾生体分子）に結合した１つ以上のＺＰＳポリマーまたはコポリマーを含むＺＰＳポリマーまたはコポリマーバイオコンジュゲートである。ポリマー修飾生体分子の例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーで修飾された生体分子を含む（たとえば、こうしたＰＥＧ修飾生体分子のＰＥＧ部位は、ポリマー骨格中にあってよい、またはポリマー骨格からペンダント状に伸びていてもよい）。ポリマー修飾生体分子に１つ以上のＺＰＳポリマーまたはコポリマーを結合することによってさらに修飾したものの代表例が、実施例５中に記載される。
【０１５８】
他の実施形態において、ＺＰＳポリマーコンジュゲートまたはコポリマーコンジュゲートは、細胞、ウイルス、または細菌に結合した１つ以上のＺＰＳポリマーを含むＺＰＳポリマーまたはコポリマーバイオコンジュゲートである。
【０１５９】
ＺＰＳポリマーコンジュゲートまたはコポリマーコンジュゲートは、送達ビヒクルであってよい。代表的な送達ビヒクルは、治療または診断用途のためのミセル、リポソーム、またはポリマーソームを含む。
【０１６０】
特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のＺＰＳポリマーまたはコポリマーを含む本発明に係るコポリマーまたはコンジュゲート脂質が自己集合して形成されたミセル、リポソーム、ポリマーソーム、または粒子を提供する。
【０１６１】
さらなる一実施形態において、本発明は、ＺＰＳポリマーまたはコポリマーコンジュゲートと、製薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、を含む組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明に係るＺＰＳポリマーおよびコポリマーは、組成物のためのキャリアまたは希釈剤として使用できる。
【０１６２】
代表的なＺＰＳポリマータンパク質コンジュゲートの調製および免疫原性が、実施例７中に記載される。
【０１６３】
ＺＰＳポリマーナノゲルおよびナノケージ
別の一態様において、本発明は、ＺＰＳポリマーナノゲルおよびナノケージを提供する。ＺＰＳポリマーは、１つ以上の他の種を化学的に捕捉するナノゲルおよび１つ以上の他の種を物理的に捕捉するナノケージを提供するために使用できる。
【０１６４】
特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のＺＰＳポリマーまたは１つ以上のＺＰＳコポリマーを含む、内容物を化学的に封入するためのナノゲルを提供する。
【０１６５】
他の実施形態において、本発明は、１つ以上のＺＰＳポリマーまたは１つ以上のＺＰＳコポリマーを含む、内容物を物理的に封入するためのナノケージを提供する。
【０１６６】
ナノゲルにより化学的に捕捉されるまたはナノケージにより物理的に捕捉される好適な内容物（たとえば、種）は、タンパク質、脂質、糖タンパク質、細胞、ウイルス、細菌、および小分子（たとえば、分子量約１０００ｇ／モル未満、好ましくは８００ｇ／モルの治療剤）、または本明細書中に記載される他の生体分子などの生体分子を含む。
【０１６７】
特定の実施形態において、ナノゲルまたはナノケージは、ＺＰＳポリマーまたはコポリマーと、１つ以上の治療剤とを含む。
【０１６８】
他の実施形態において、ナノゲルまたはナノケージは、ＺＰＳポリマーまたはコポリマーと、１つ以上の診断剤とを含む。
【０１６９】
さらなる実施形態において、ナノゲルまたはナノケージは、ＺＰＳポリマーまたはコポリマーと、１つ以上の治療剤と、１つ以上の診断剤とを含む。
【０１７０】
非双性イオン性ホスファチジルセリンモノマー、ポリマー、コポリマー、組成物、表面、ならびにこれらの調製および使用方法
中性のホスファチジルセリン（ＮＰＳ）モノマー、ポリマー、およびコポリマー（本明細書中において非双性イオン性ホスファチジルセリン（ＮＺＰＳ）モノマー、ポリマー、およびコポリマーとも称される）も本発明の範囲内であることが理解される。よって、さらなる態様において、本発明は、非双性イオン性ホスファチジルセリン（ＮＺＰＳ）モノマー、ＮＺＰＳポリマー、およびＮＺＰＳコポリマー、ＮＺＰＳモノマー、ＮＺＰＳポリマー、およびＮＺＰＳコポリマーの作製方法、ＮＺＰＳポリマーおよびＮＺＰＳコポリマーを含む組成物および材料、ならびにＮＺＰＳモノマー、ＮＺＰＳポリマー、およびＮＺＰＳコポリマーの使用方法を提供する。
【０１７１】
本明細書中において使用される場合、用語「非双性イオン性ホスファチジルセリンモノマー」または「ＮＺＰＳモノマー」は、ホスファチジルセリン部位（ＮＨ２−ＣＨ（−ＣＨ２Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−））−ＣＯ２Ｈおよびそのイオン型）を含むホモポリマーまたはコポリマーの重合性モノマーまたはペンダント基を指す。
【０１７２】
代表的なＮＺＰＳモノマーは、式（ＶＩ）を有する。
【０１７３】
【化１６】
2021519275.tif 000018
【０１７４】
式中、特定の実施形態において、Ｒ１は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、シアノ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル（好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル）、およびＣ６−Ｃ１２アリールからなる群より選択され、ＸはＯまたはＮＨであり、ｎは１〜２０の整数（たとえば、１、２、３、４、５、または６）であり、ｐは１〜２０の整数（たとえば、１、２、３、４、５、または６）である。
【０１７５】
用語「非双性イオン性ホスファチジルセリンポリマー」または「ＮＺＰＳポリマー」は、上述されるようにホスファチジルセリン部位を含む１つ以上のペンダント基を有するポリマー（すなわち、ホモポリマーまたはコポリマー）を指す。
【０１７６】
ＮＺＰＳポリマーは式（ＶＩ）のモノマーの重合によって調製され、ＮＺＰＳコポリマーは式（ＶＩ）のモノマーとコモノマーとの共重合によって調製される。こうしたＮＺＰＳポリマー（ホモポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー）は、以下に示されるようなペンダント型のホスファチジルセリン（ＰＳ）部位を有する繰り返し単位を含む。
【０１７７】
【化１７】
2021519275.tif 000019
【０１７８】
式中、特定の実施形態において、Ｒ１、Ｘ、ｎ、およびｐは、式（ＶＩ）のモノマーについて上述される通りであり、ａは約１０〜約５００の整数であり、＊は、この繰り返し単位と上記ポリマーもしくはコポリマーにおける他の繰り返し単位との付着箇所、またはポリマーの末端基を示す。
【０１７９】
ＮＺＰＳモノマーは、標準的な重合条件下において容易に重合させて、ＮＺＰＳポリマーを提供することができる。
【０１８０】
したがって、ＺＰＳモノマー、ＺＰＳポリマー、ＺＰＳコポリマー、ＺＰＳポリマーを含む組成物、ＺＰＳポリマーを含む表面、ならびにＺＰＳモノマー、ポリマー、および組成物の使用方法について本明細書中において提供される説明のすべてが、ＮＺＰＳモノマー、ポリマー、組成物、表面、および方法にも等しくあてはまることが理解される。
【０１８１】
実施例２は、本発明に係る代表的なＮＺＰＳの調製および特徴づけについて記載する。
【０１８２】
代表的なＮＺＰＳポリマータンパク質コンジュゲートの調製および免疫原性が、実施例７中に記載される。
【０１８３】
ここに記載されるのは、ＰＳ模倣重合性（ＮＺＰＳ）モノマー、当該モノマーに由来するポリマー、ならびに、生体分子、巨大分子、小分子、粒子、インプラント、デバイス、表面、コーティング、およびハイドロゲルに付着したポリマーである。生体適合性の免疫抑制性の生体材料は、ペプチド、タンパク質、脂質、糖タンパク質、巨大生体分子（たとえば、細胞、ウイルス、細菌など）、ナノ粒子、マイクロ粒子、小分子薬物（これらはいずれも、医療用デバイス、プロステーシス、埋め込んだ材料（歯科用を含む）、臓器移植片との併用を含め、人体への投与に使用できる）と共に使用するための、ＮＺＰＳポリマー、ならびにその誘導体および前駆体を含む。
【０１８４】
一態様において、重合性ＮＺＰＳモノマーおよび誘導体または前駆体は、下記式（ＶＩＩＩ）を有する。
【０１８５】
【化１８】
2021519275.tif 000020
【０１８６】
式中、
Ａ、Ｇ、およびＩは、特定の実施形態においてモノマーに重合性を付与する官能基であり、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、保護されたチオール、ＮＨ２、−ＮＨ−（第２級アミン）、Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、保護されたＮＣＯ、Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、ＣＯＯＨ、活性型エステル、アルデヒド、ＣＯＳＨ、Ｃ（＝Ｓ）ＳＨ、ＯＣＯＯＨ、ＯＣＯＳＨ、ＯＣ（＝Ｓ）ＯＨ、ＳＣ（＝Ｏ）ＳＨ、ＳＣ（＝Ｓ）ＳＨ、Ｎ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ２、Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｎ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ２、δ−バレロラクトン、ε−カプロラクトン、ＣＨ２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、ＣＨ２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、ＣＨ２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、ＣＮ、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、ＯＨ、アジド、アルキン、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、環状基（イソボルニル、シクロヘキシル、シクロペンチル）、フルオロ（パーフルオロブチル、パーフルオロエチル）誘導体、または無し（存在しない）から独立して選択され；
Ｂ、Ｆ、およびＨは、式中のｘが０〜２０の整数である−（ＣＨ２）ｘ−から独立して選択され；
Ｃｃｉｓは、Ｃ、Ｎ、Ｓｉ、または無し（存在しない）から選択され；かつ
Ｄは、式中のｘが１〜２０の整数である、Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｘ、−（ＣＨ２）ｘ−から選択される。
【０１８７】
また、こうしたモノマーの調製方法、こうしたモノマーから調製されるポリマー、ならびに、こうしたポリマーを使用してナノ粒子、表面、コーティング、およびハイドロゲルに又はこれらから付着させる方法、ならびに、こうしたナノ粒子、表面、コーティング、およびハイドロゲルに免疫抑制効果を付与するためのその使用も提供される。
【０１８８】
別の一態様において、ＮＺＰＳポリマーおよびコポリマーが提供される。こうしたポリマーおよびコポリマーは、繰り返し単位を含む。特定の実施形態において、こうしたポリマーおよびコポリマーの繰り返し単位は、下記式（ＩＸ）を有する（Ｒ２およびＲ３は含まない）（繰り返し単位はＲ２およびＲ３を含まないと考えられるが、しかしながら、マクロモノマーはこれを含み得、恐らくはポリマーおよびコポリマーもこれを含み得る）。
【０１８９】
【化１９】
2021519275.tif 000021
【０１９０】
上記式はｎ個の繰り返し単位−Ｍ１−（Ｋ１−Ｚ−Ｋ２）ｊ−Ｍ２−Ｍ１−（Ｋ３−Ｘ−Ｋ４）ｊ−Ｍ２−を有し、これは、ｊ個の繰り返し単位−Ｋ１−Ｚ−Ｋ２−とｊ個の繰り返し単位−Ｋ３−Ｘ−Ｋ４−とを含む。
【０１９１】
上記式中、
Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、およびＫ４は、式中のｘがそれぞれ、０〜２０から独立して選択される整数、これらの組み合わせ、または無し（置換基が存在しない場合）である、−（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ（ＣＮ））ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｘ−から独立して選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、保護されたチオール、ＮＨ２、−ＮＨ−（第２級アミン）、Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、ＣＯＯＨ、ＣＯＳＨ、Ｃ（＝Ｓ）ＳＨ、ＯＣＯＯＨ、ＯＣＯＳＨ、ＯＣ（＝Ｓ）ＯＨ、ＳＣ（＝Ｏ）ＳＨ、ＳＣ（＝Ｓ）ＳＨ、Ｎ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ２、Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｎ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ２、δ−バレロラクトン部位、ε−カプロラクトン部位、ＣＨ２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、ＣＨ２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、ＣＨ２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、ＣＮ、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、または無し（置換基が存在しない場合）から独立して選択され；
ｎは、５〜約１０，０００の整数である。
【０１９２】
ｊはそれぞれ、１〜約１０００の整数である。
【０１９３】
Ｍ１およびＭ２は、式中のｎが１〜２０の整数である、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｓ）−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝ＮＨ）−（ＣＨ２）ｎ−、および−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−；式中のｘがそれぞれ、０〜２０から独立して選択される整数、これらの組み合わせ、または無し（置換基が存在しない場合）である、−（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ（ＣＮ））ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−、および−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｘ−からなる群より独立して選択され；かつ
ＺおよびＸは、下記式からなる群より独立して選択される。
【０１９４】
【化２０】
2021519275.tif 000022
【０１９５】
式中、Ｌは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、保護されたチオール、ＮＨ２、−ＮＨ−（第２級アミン）、Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、保護されたＮＣＯ、Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、ＣＯＯＨ、ＣＯＳＨ、Ｃ（＝Ｓ）ＳＨ、ＯＣＯＯＨ、ＯＣＯＳＨ、ＯＣ（＝Ｓ）ＯＨ、ＳＣ（＝Ｏ）ＳＨ、ＳＣ（＝Ｓ）ＳＨ、Ｎ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ２、Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｎ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ２、δ−バレロラクトン、ε−カプロラクトン、ＣＨ２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、ＣＨ２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、ＣＨ２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、ＣＮ、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、ＯＨ、アジド、アルキン、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、環状基（イソボルニル、シクロヘキシル、シクロペンチル）、フルオロ（パーフルオロブチル、パーフルオロエチル）誘導体、または無しから独立して選択され；
Ｋは、式中のｘが０〜２０の整数である−（ＣＨ２）ｘ−から独立して選択され；
Ｊは、式中のｘが１〜２０の整数である、Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｘ、−（ＣＨ２）ｘ−から選択され；かつ
＊は、中に示されるように、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、およびＫ４との付着箇所である。
【０１９６】
本明細書中において使用される場合、用語「約」は、明示された値の±５パーセントを指す。
【０１９７】
以下の実施例は、本発明を例証する目的で提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１９８】
実施例
実施例１
代表的なＺＰＳモノマーの調製および特徴づけ
本実施例では、代表的な重合性双性イオン性（ＺＰＳ）モノマーの合成および精製が記載される。
【０１９９】
本発明に係る重合性ＺＰＳモノマーの合成プロセスの図解が、以下に示される。
【０２００】
【化２１】
2021519275.tif 000023
【０２０１】
３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−オキソプロピル（２−（（２−（メタクリロイルオキシ）エチル）ジメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（化合物３）の合成。Ｎ−Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−ＯｔＢｕ（１．０ｇｍ、３．８２ｍｍｏｌ）を無水ベンゼン３０ｍｌ中に溶解し、この溶液を０℃に冷却した。次に、トリエチルアミン（０．６２ｍＬ、４．６ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、２−クロロ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン１（０．４２ｍＬ、４．６ｍｍｏｌ）（無水ベンゼン１０ｍＬ中）を３０分かけて滴下し、次いで、当該反応物を室温でさらに３時間撹拌した。反応終了後、ジエチルエーテルを反応混合物中に注ぎ、沈殿したトリメチルアミン塩酸塩をろ過によって除去した。次いで、ろ液を減圧下において濃縮して、化合物２を油として得て、これを、さらなる精製をせずに次の工程で使用した。化合物２を無水アセトニトリル３０ｍＬ中に再溶解して、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（１．４５ｍＬ、８．８ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、反応混合物を５５℃において２４時間撹拌した。次いで、反応生成物を真空下において濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物３を収量４２％にて得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．１８（ｓ，１Ｈ），５．６７（ｓ，１Ｈ），４．６３−４．５４（ｍ，２Ｈ），４．３５−４．１４（ｍ，３Ｈ），４．１０−３．９９（ｍ，２Ｈ），３．８３−３．７６（ｍ，２Ｈ），３．４０−３．２７（ｍ，２Ｈ），２．８２（ｓ，６Ｈ），１．９７（ｓ，３Ｈ），１．４６（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１８Ｈ）。
【０２０２】
代表的なＺＰＳモノマー（化合物４）の合成。化合物３（０．８４ｇｍ、１．６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン５ｍＬ中に溶解して、トリフルオロ酢酸３０ｍＬを添加した。当該反応物を５時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を真空下において濃縮して、粘稠かつ粘性の液体を得た。次いで、この粗生成物をＭｅＯＨ：ジエチルエーテル（１：１５）を用いて結晶化して、所望の化合物４を白色粉末として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ６．０８（ｓ，１Ｈ），５．６９（ｓ，１Ｈ），４．４７−４．４１（ｍ，２Ｈ），４．２６−４．２３（ｍ，２Ｈ），４．０５−４．００（ｍ，１Ｈ），３．８７−３．８４（ｍ，２Ｈ），３．６９−３．６７（ｍ，２Ｈ），３．５０−３．４５（ｍ，２Ｈ），２．８８（ｓ，６Ｈ），１．８４（ｓ，３Ｈ）。
【０２０３】
実施例２
代表的な中性ＰＳモノマーの調製および特徴づけ
本実施例では、代表的な重合性中性ＰＳ（ＮＺＰＳ）モノマーの合成および精製が記載される。このＮＺＰＳモノマーの合成プロセスの図解が以下に示される。
【０２０４】
【化２２】
2021519275.tif 000024
【０２０５】
化合物５の合成。Ｎ−Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−ＯｔＢｕ（１．０ｇｍ、３．８２ｍｍｏｌ）を、無水ベンゼン３０ｍｌ中に溶解し、この溶液を０℃に冷却した。次に、トリエチルアミン（０．６２ｍＬ、４．６ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、２−クロロ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン１（０．４２ｍＬ、４．６ｍｍｏｌ）（無水ベンゼン１０ｍＬ中）を３０分かけて滴下し、次いで、当該反応物を室温でさらに３時間撹拌した。反応終了後、ジエチルエーテルを反応混合物中に注ぎ、沈殿したトリメチルアミン塩酸塩をろ過によって除去した。次いで、ろ液を減圧下において濃縮して、化合物２を油として得て、これを、さらなる精製をせずに次の工程で使用した。化合物２を無水アセトニトリル３０ｍＬ中に再溶解し、ここに、メタクリル酸ナトリウム（０．６２ｇｍ、５．７ｍｍｏｌ）と１８−クラウン−６エーテル（０．１４ｇｍ、０．５３ｍｍｏｌ）とを添加した。次いで、反応混合物を５５℃において７２時間撹拌した。反応後、反応生成物をろ過し、真空下において濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物５を収量７１％にて得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．１５（ｓ，１Ｈ），５．５７（ｓ，１Ｈ），４．４１−４．２７（ｍ，２Ｈ），４．２４−４．０４（ｍ，４Ｈ），３．８６−３．７８（ｍ，１Ｈ），１．９５（ｓ，３Ｈ），１．４６（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１８Ｈ）。
【０２０６】
代表的な中性ＰＳモノマー（化合物６）の合成。化合物５（１．２ｇｍ、２．６５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン５ｍＬ中に溶解して、ここにトリフルオロ酢酸３０ｍＬを添加した。当該反応物を５時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を真空下において濃縮して、粘稠かつ粘性の液体を得た。次いで、この粗生成物をＭｅＯＨ：ジエチルエーテル（１：２０）を用いて結晶化して、所望の化合物６を白色粉末として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ６．１１（ｓ，１Ｈ），５．６６（ｓ，１Ｈ），４．３４−４．１５（ｍ，５Ｈ），４．１０−３．９７（ｍ，２Ｈ），１．８５（ｓ，３Ｈ）。
【０２０７】
実施例３
代表的なＮＺＰＳおよびＺＰＳハイドロゲルの非ファウリング特性
本実施例では、代表的なＮＺＰＳおよびＺＰＳハイドロゲルの非ファウリング特性が記載される。
【０２０８】
ＺＰＳハイドロゲルの調製
ＺＰＳモノマーを含有するハイドロゲル水溶液（０．６７ｇ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、３３０ｍｇ）、架橋剤Ｎ，Ｎ’メチレンビス（アクリルアミド）（１重量％、３．３ｍｇ）、および光重合開始剤２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオフェノン（０．３３ｍｇ）を用いてバルク光重合を行なうことによって、ＺＰＳハイドロゲルを作製した。厚さ０．５ｍｍのポリテトラフルオロエチレンスペーサを挟んで配置した２枚のスライドガラスの間に、このハイドロゲル水溶液を置き、次いで、室温で３０分間、光重合させた。重合後、ハイドロゲルを型から取り出して、ＰＢＳ中に３日間浸漬することにより、未反応の化学物質を除去して、十分に含水したハイドロゲルネットワークを得た。１２時間毎にリン酸緩衝生理食塩水を交換した。同じプロトコールに従って、同じ架橋密度を有するＭＰＣおよびＮＺＰＳハイドロゲルを調製した。
【０２０９】
フィブリノゲン吸着試験
生検パンチを使用して、含水したＭＰＣ、ＮＺＰＳ、およびＺＰＳハイドロゲルを直径５ｍｍのディスク状にパンチした。ハイドロゲルディスクを２４ウェルプレート中に入れ、１ｍｇ／ｍＬフィブリノゲン（ＰＢＳバッファー中）１ｍＬと共に１時間インキュベートし、続いて純粋なＰＢＳバッファーで５回洗浄した。次いで、ハイドロゲルディスクを新しいウェルに移して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗フィブリノゲン（１μｇ／ｍＬ）（ＰＢＳバッファー中）１ｍＬと共に１時間インキュベートした。次いで、純粋なＰＢＳバッファーで５回洗浄した後、すべてのハイドロゲルディスクを新しいウェルに移した。次に、１ｍｇ／ｍＬ  ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（０．１Ｍクエン酸リン酸溶液（ｐＨ５．０）中、過酸化水素０．０３％含有）１ｍＬを添加した。１５分間インキュベートした後、同体積の１Ｍ  ＨＣｌを添加することによって酵素反応を停止させた。同じ手順を、コントロールである、同じ表面積を有する組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）ディスクについても行なった。４９２ｎｍにおける吸光度の値をプレートリーダーを用いて記録し、ＴＣＰＳ試料の値に対して標準化した。３つの検体から得たデータを平均した。
【０２１０】
高濃縮フィブリノゲン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）中で１時間インキュベートした後のＺＰＳハイドロゲルディスクは、ＴＣＰＳディスクの場合よりも吸着フィブリノゲンが８４．４％低く、非常に優れた非ファウリング特性を呈した。一方、ＮＺＰＳハイドロゲルディスクは、ＴＣＰＳディスクの場合と比較した吸着フィブリノゲンの低下分が４１％と小さかった（図１）。
【０２１１】
実施例４
代表的なＮＺＰＳおよびＺＰＳナノゲルの免疫抑制効果
本実施例では、代表的なＮＺＰＳおよびＺＰＳナノゲルの免疫抑制効果が記載される。
【０２１２】
ＭＰＣ、ＮＺＰＳ、およびＺＰＳナノゲルの調製
ＡＯＴ（ビス（２−エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウム、２３７ｍｇ）およびＢｒｉｊ３０（ポリ（エチレングリコール）ドデシルエーテル、４５９ｍｇ）を２０ｍＬのガラスバイアルに添加し、この中に撹拌子を入れた。テフロン（登録商標）で裏打ちしたセプタム付きのキャップでバイアルを密閉し、乾燥窒素を１０分間パージした。次いで、激しく撹拌しながら、バイアル中に、窒素で脱酸素化したヘキサン（１０ｍＬ）を添加した。水相として、モノマー（ＭＰＣ、ＮＺＰＳ、ＺＰＳ）および架橋剤（ＭＢＡ）を、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４、２５０μＬ）中に、モル比９５％：５％にて溶解した。このモノマー溶液に乾燥窒素を２分間通気し、その後、水相を有機連続相にゆっくりと滴下した。バイアルを超音波にかけて、安定なナノエマルションを形成した。次いで、２０％（ｗ／ｖ）過硫酸アンモニウム溶液（脱イオン水中）（１０μＬ）をエマルションに添加した。５分後、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、６μＬ）を添加することによって重合を開始させ、高速磁気撹拌下において４℃で維持した。２時間反応させた後、ロータリーエバポレータによって有機溶媒を除去し、ナノゲルを沈殿させて、ＴＨＦで３回洗浄した。ナノゲルをＰＢＳバッファー中に再懸濁し、分画分子量１００ＫＤａの遠心式フィルターで精製することによって、未反応のモノマーと架橋剤とを除去した。
【０２１３】
ＦＩＴＣ−ＢＳＡを封入しているＭＰＣ、ＮＺＰＳ、およびＺＰＳナノゲルの調製
ＡＯＴ（ビス（２−エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウム、２３７ｍｇ）およびＢｒｉｊ３０（ポリ（エチレングリコール）ドデシルエーテル、４５９ｍｇ）を２０ｍＬのガラスバイアルに添加し、この中に撹拌子を入れた。テフロン（登録商標）で裏打ちしたセプタム付きのキャップでバイアルを密閉し、乾燥窒素を１０分間パージした。次いで、激しく撹拌しながら、バイアル中に、窒素で脱酸素化したヘキサン（１０ｍＬ）を添加した。水相として、ＦＩＴＣ−ＢＳＡ、モノマー（ＭＰＣ、ＮＺＰＳ、ＺＰＳ）、および架橋剤（ＭＢＡ）を、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４、２５０μＬ）中に、モル比９５％：５％にて溶解した。このモノマー溶液に乾燥窒素を２分間通気し、その後、水相を有機連続相にゆっくりと滴下した。バイアルを超音波にかけて、安定なナノエマルションを形成した。次いで、２０％（ｗ／ｖ）過硫酸アンモニウム溶液（脱イオン水中）（１０μＬ）をエマルションに添加した。５分後、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、６μＬ）を添加することによって重合を開始させ、高速磁気撹拌下において４℃で維持した。２時間反応させた後、ロータリーエバポレータによって有機溶媒を除去し、ナノゲルを沈殿させて、ＴＨＦで３回洗浄した。ナノゲルをＰＢＳバッファー中に再懸濁し、分画分子量１００ＫＤａの遠心式フィルターで精製することによって、遊離ＦＩＴＣ−ＢＳＡ、未反応のモノマー、および架橋剤を除去した。
【０２１４】
免疫抑制効果
ＲＡＷ２６４．７細胞（１０５個／ウェル）を、多様な濃度（１０、２５、５０、１００、２００、１０００μｇ／ｍｌ）のＭＰＣ、ＮＺＰＳ、またはＺＰＳナノゲル溶液に１８時間曝露した。次いで、当該細胞をＬＰＳ溶液（１００ｎｇ／ｍＬ）でさらに４８時間刺激した後、細胞を３００ｇで１０分間遠心し、上清の培地を採取して、ＥＬＩＳＡによるサイトカイン（ＴＮＦ−α）分析に供した。図２Ａ中に示すように、ＮＺＰＳおよびＺＰＳがＴＮＦ−αレベルに及ぼす影響はいずれも用量依存的で、ＮＺＰＳのＴＮＦ−αに対する阻害は比較的低濃度で始まっており、このことから、ＺＰＳよりも免疫抑制効果が強いことが示唆される。
【０２１５】
アネキシンＶによる遮断
ＮＺＰＳおよびＺＰＳの免疫抑制効果がこれらのＰＳ頭部に介在されるｅａｔ−ｍｅシグナルに由来するものであることを確認するために、ＭＰＣ、ＮＺＰＳ、またはＺＰＳナノゲル溶液（１００μｇ／ｍｌ）を、多様な濃度（０、１０、２５、５０、１００、２００μｇ／ｍｌ）のアネキシンＶ（当該ＰＳ基に対する親和性が高くｅａｔ−ｍｅシグナルを阻害できるタンパク質）と共に、６時間プレインキュベートした。次いで、これらのナノゲル溶液（１００μｇ／ｍｌ）でＲＡＷ２６４．７マクロファージ（１０５個／ウェル）を１８時間処理し、続いてＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）による刺激を４８時間行なった。上清中へのＴＮＦ−α分泌のレベルを、ＥＬＩＳＡキットで測定した。図２Ｂ中に示すように、アネキシンＶの濃度が増加するにつれて、ＮＺＰＳおよびＺＰＳナノゲルのＴＮＦ−α分泌低減効果が低下し、免疫抑制効果が有効に遮断されていることが分かった。注目されることに、ＺＰＳナノゲルはアネキシンＶの遮断効果に対する感度が比較的低いが、これは恐らく、ＺＰＳの非ファウリング特性によって、ＺＰＳ中のＰＳ官能基とその受容体との親和性がある程度低くなっているためではないかと考えられる。また、これにより、ＺＰＳの免疫抑制効果がＮＺＰＳの場合よりも弱いことの説明がつく。
【０２１６】
細胞取り込み
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ（１０５個／ウェル）を、ＦＩＴＣ−ＢＳＡを封入しているＭＰＣ、ＮＺＰＳ、およびＺＰＳナノゲルと共に、３０、６０、１２０、および１８０分間インキュベートし、その後、細胞を洗浄して溶解し、回収された蛍光を検出した。図２Ｃ中に示すように、ＭＰＣは優れた非ファウリング特性を有しているために細胞取り込みが最も少なく、一方、ＮＺＰＳナノゲルはｅａｔ−ｍｅシグナルが介在するために速やかにマクロファージに取り込まれた。ＮＺＰＳと比較して、ＺＰＳは、非ファウリング特性を有しかつ受容体に対する親和性が低いために、取り込まれるのが遅い。こうした結果から、ＺＰＳは、固有の双性イオン性構造を有するために、有効な免疫抑制と良好な非ファウリング性能とを同時に達成できているのではないかということが示唆される。
【０２１７】
実施例５
代表的なポリ（ＺＰＳ）含有およびポリ（ＮＺＰＳ）含有バイオコンジュゲート
本実施例では、本発明に係る代表的なバイオコンジュゲートが記載される。特定の実施形態において、代表的なバイオコンジュゲートは、ＺＰＳポリマー構成要素を含む。他の実施形態において、代表的なバイオコンジュゲートは、ＮＺＰＳポリマー構成要素を含む。
【０２１８】
本実施例において、バイオコンジュゲートは酵素コンジュゲートである。代表的な酵素はウリカーゼである。ポリマーはこの酵素に、直接、または当該ポリマーと酵素とを繋ぐのに好適なリンカーを介して、共有結合している。
【０２１９】
以下に示される代表的なバイオコンジュゲートにおいて、バイオコンジュゲートはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部位をさらに含む。特定の実施形態において、こうしたバイオコンジュゲートは、酵素とＰＳポリマーとの間に介在するリンカー中にＰＥＧを含む。他の実施形態において、こうしたバイオコンジュゲートは、ポリマー骨格（たとえば、ＰＥＧＭＡの重合に由来）からのペンダント基としてＰＥＧを含む。
【０２２０】
代表的なポリ（ＺＰＳ）−ブロック−ポリ（ＰＥＧＭＡ）ブロックコポリマーを含有するバイオコンジュゲートの調製および特徴づけ
末端チオール基を有するポリ（ＺＰＳ）−ブロック−ポリ（ＰＥＧＭＡ）ブロックコポリマーの合成。可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合によって、当該ブロックコポリマーを調製する。概して、ＺＰＳモノマー（６．７ｇ）の重合を、連鎖移動剤（ＣＴＡ）としての２−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）−２−メチルプロピオン酸（１００ｍｇ）の存在下において、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、１８ｍｇ）によって開始する。１２時間反応させた後、重合を停止させ、得られたポリマーであるポリ（ＺＰＳ）−ＣＴＡを透析によって精製する。次いで、ポリ（ＺＰＳ）−ＣＴＡを巨大分子ＣＴＡとして使用して、ＰＥＧＭＡモノマーの重合を行なう（モル比、ＣＴＡ／ＰＥＧＭＡ＝１／５０）。過剰量のエーテル中で沈殿させた後、ポリ（ＺＰＳ）−ブロック−ポリ（ＰＥＧＭＡ）−ＣＴＡブロックコポリマーを、透析および凍結乾燥によってさらに精製する。次いで、ヘキシルアミンおよびトリエチルアミンの混合溶液を使用して、このブロックコポリマーのＣＴＡ部位をチオール基に変換する。
【０２２１】
ポリ（ＺＰＳ）−ブロック−ポリ（ＰＥＧＭＡ）−ウリカーゼコンジュゲートの調製
まず、ウリカーゼのアミン基を、二官能性架橋剤であるＢＭＰＳ（Ｎ−マレイミドプロピル−オキシスクシンイミドエステル）を使用して、マレイミド基に変換する。次いで、活性化ウリカーゼ（１０ｍｇ）を、末端チオール基を有するポリ（ＺＰＳ）−ブロック−ポリ（ＰＥＧＭＡ）コポリマー（３００ｍｇ）（ＰＢＳ  ４ｍｌ中）と混合する。ポリ（ＺＰＳ）−ブロック−ポリ（ＰＥＧＭＡ）−ウリカーゼコンジュゲートを透析ろ過によって精製することによって、過剰なポリマーおよび未反応のウリカーゼを除去する。
【０２２２】
代表的なポリ（ＺＰＳ）およびポリ（ＰＥＧＭＡ）ポリマーを含有するバイオコンジュゲートの調製および特徴づけ
末端チオール基を有するポリ（ＺＰＳ）の合成。可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合によって、当該ブロックコポリマーを調製する。概して、ＺＰＳモノマー（６．７ｇ）の重合を、ＣＴＡとしての２−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）−２−メチルプロピオン酸（１００ｍｇ）の存在下において、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、１８ｍｇ）によって開始する。１２時間反応させた後、重合を停止させ、得られたポリマーであるポリ（ＺＰＳ）−ＣＴＡを透析によって精製する。次いで、ヘキシルアミンおよびトリエチルアミンの混合溶液を使用して、ポリ（ＺＰＳ）−ＣＴＡのＣＴＡ部位をチオール基に変換する。
【０２２３】
末端チオール基を有するポリ（ＰＥＧＭＡ）の合成。ＰＥＧＭＡ（５ｇ）の重合を、連鎖移動剤（ＣＴＡ）としての２−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）−２−メチルプロピオン酸（１００ｍｇ）の存在下において、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、１８ｍｇ）によって開始する。１２時間反応させた後、重合を停止させ、得られたポリマーであるポリ（ＰＥＧＭＡ）−ＣＴＡを透析によって精製する。次いで、ヘキシルアミンおよびトリエチルアミンの混合溶液を使用して、ポリ（ＰＥＧＭＡ）−ＣＴＡのＣＴＡ部位をチオール基に変換する。
【０２２４】
ポリ（ＺＰＳ）およびポリ（ＰＥＧＭＡ）を含有するバイオコンジュゲートの調製。
まず、ウリカーゼのアミン基を、二官能性架橋剤であるＢＭＰＳ（Ｎ−マレイミドプロピル−オキシスクシンイミドエステル）を使用して、マレイミド基に変換する。次いで、活性化ウリカーゼ（１０ｍｇ）を、末端チオール基を有するポリ（ＺＰＳ）（１００ｍｇ）（ＰＢＳ  ４ｍｌ中）と混合する。ポリ（ＺＰＳ）−ウリカーゼコンジュゲートを透析ろ過によって精製することによって、過剰なポリマーおよび未反応のウリカーゼを除去する。第２のコンジュゲーション工程を、末端チオール基を有するポリ（ＰＥＧＭＡ）とポリ（ＺＰＳ）−ウリカーゼとを混合することによって行なう。ポリ（ＺＰＳ）およびポリ（ＰＥＧＭＡ）修飾ウリカーゼを透析ろ過によって精製することによって、過剰なポリマーを除去する。
【０２２５】
本実施例中に記載される代表的なバイオコンジュゲートは、以下の構造を有する。
【０２２６】
【化２３】
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【０２２７】
【化２４】
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【０２２８】
【化２５】
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【０２２９】
実施例６
代表的な中性ＰＳ−ＰＥＧバイオコンジュゲートの免疫原性
本実施例では、代表的な中性ＰＳ−ＰＥＧバイオコンジュゲートの免疫原性を、代表的なＰＥＧ−ウリカーゼと比較する。
【０２３０】
ＰＥＧ−ウリカーゼおよびＰＳ模倣ポリマー−ＰＥＧ−ウリカーゼを、２５Ｕ／ｋｇ体重の用量にて、ラットの尾静脈中に静脈投与する。ウリカーゼ試料の投与を、免疫化間隔を１週間あけて５回繰り返す。第５週目の終わり（３５日目）に、すべてのラットを安楽死させる。ラットを犠牲死させ、心臓穿刺により採取した血液を直接ＥＬＩＳＡ試験に用いる。ＥＬＩＳＡ試験に際し、抗ウリカーゼ抗体の検出にはコーティングされたウリカーゼを抗原として使用し、抗ＰＥＧ抗体の検出にはＢＳＡ−ＰＥＧコンジュゲートが必要である。
【０２３１】
直接ＥＬＩＳＡ試験の第１の工程として、コーティングバッファー（０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ１０．５）中に溶解して調製した抗原溶液（タンパク質濃度１０μｇ／ｍＬ）１００μＬを使用して、９６ウェルプレートの各ウェルをコーティングする。４℃において一晩コーティングした後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）でプレートを５回洗浄することによって抗原溶液を除去し、次いで、ブロッキングバッファー（０．１Ｍトリスバッファー中の１％ＢＳＡ溶液、ｐＨ８．０）を満たして室温で１時間インキュベートした後、ブロッキングバッファーを除去する。次いで、ＰＢＳバッファーで全ウェルをさらに５回洗浄する。続いて、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳバッファー中にラット血清を段階希釈したものをプレートに添加して（１００μＬ／ウェル）、３７℃において１時間インキュベートし、続いてラット血清を除去し、全ウェルをＰＢＳバッファーで５回洗浄する。次に、二次抗体としてヤギ抗ラットＩｇＭまたはＩｇＧ（ＨＲＰ標識、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各ウェルに添加して、３７℃においてさらに１時間インキュベートする。続いて、全ウェルをＰＢＳバッファーで５回洗浄し、その後、ＨＲＰの基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００μＬ／ウェルにて添加する。プレートを１５分間振とうし、停止溶液（０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）１００μＬを各ウェルに添加する。４５０ｎｍ（シグナル）および５７０ｎｍ（バックグラウンド）における吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて記録する。ウリカーゼ試料を投与していないラットの血清を、すべてのＥＬＩＳＡ検出について、ネガティブコントロールとして使用する。
【０２３２】
ラットの脾臓を採取し、１００μｍのセルストレーナー（ＦｉｓｈｅｒｂｒａｎｄＴＭ）を用いて脾細胞を分離する。各群のラット脾細胞を、抗ラットＭＨＣＩＩおよびＣＤ８６抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて染色し、次いでフローサイトメトリーによって分析する。Ｔ細胞活性化を試験するにあたり、各群のラット脾細胞を１２ウェルプレート（１０６個／ウェル）中で培養し、ＰＥＧ−ウリカーゼおよびＰＳ模倣ポリマー−ＰＥＧ−ウリカーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）のそれぞれを用いて再度刺激する。平行して、各ラットの脾細胞を２つのウェル中で培養する。７２時間後、各ウェルから細胞培地を採取し、ＩＬ−４  Ｒａｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＩＬ−４を定量する。
【０２３３】
実施例７
代表的なＺＰＳ、中性ＰＳ、およびＰＣバイオコンジュゲートの免疫原性
本実施例では、代表的なバイオコンジュゲートの免疫原性が記載される。バイオコンジュゲートはウリカーゼコンジュゲートである。（ａ）双性イオン性ＰＳ（ＺＰＳ）ポリマー、（ｂ）中性の非双性イオン性（ＮＺＰＳ）ポリマー、または（ｃ）ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（ＰＣ）（ＭＰＣ）ポリマーをウリカーゼ表面に共有結合させることによって、ウリカーゼコンジュゲートを調製した。
【０２３４】
簡潔には、ＡＯＴ（１２０ｍｇ）およびＢｒｉｊ３０（２３０ｍｇ）を２０ｍＬのガラスバイアルに添加し、この中に撹拌子を入れた。テフロン（登録商標）で裏打ちしたセプタム付きのキャップでバイアルを密閉し、乾燥窒素を１０分間パージした。次いで、激しく撹拌しながら、バイアル中に、窒素で脱酸素化したヘキサン（５ｍＬ）を添加した。水相として、ウリカーゼ（１ｍｇ）をＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．５、１２５μＬ）中に溶解し、ここに、ＺＰＳモノマー（５０ｍｇ）を添加して溶解した。このモノマー／タンパク質溶液に乾燥窒素を２分間通気し、その後、水相を有機連続相にゆっくりと滴下した。バイアルを超音波にかけて、安定なマイクロエマルションを形成した。次いで、２０％（ｗ／ｖ）ＡＰＳ溶液（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中）（１０μＬ）をエマルションに添加した。５分後、ＴＥＭＥＤ（６μＬ）を添加することによって重合を開始させ、高速磁気撹拌下において４℃で維持した。２時間反応させた後、ロータリーエバポレータによって有機溶媒を除去し、ＺＰＳ−ウリカーゼコンジュゲートを沈殿させて、ＴＨＦで３回洗浄した。ＺＰＳ−ウリカーゼコンジュゲートをＰＢＳバッファー中に再懸濁し、高分解能サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００ＨＲ）で精製することによって、遊離のウリカーゼを除去した。最後に、分画分子量１００ｋＤａの遠心式フィルターを使用して、コンジュゲートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄および濃縮した。
【０２３５】
コンジュゲートの構造が、以下に概略的に示される。
【０２３６】
【化２６】
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【０２３７】
【化２７】
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【０２３８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫原性研究に際し、ＤＣ２．４樹状細胞（１０５個／ウェル）を、ＰＢＳ（ブランクコントロール）、天然ウリカーゼ、ＺＰＳ−ウリカーゼ、ＮＺＰＳ−ウリカーゼ、ＭＰＣ−ウリカーゼコンジュゲート（２ｍＵ／ｍＬ）それぞれと共に、７２時間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、細胞を３００ｇで１０分間遠心し、上清の培地を採取して、ＥＬＩＳＡによるサイトカイン（ＴＧＦ−ベータ）分析に供した。細胞を回収し、氷冷滅菌リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。細胞を抗ＣＤ４０−ＦＩＴＣまたは抗ＣＤ８０−ＰＥで標識して、フローサイトメトリーを使用して分析した。図３Ａおよび図３Ｂ中に示すように、天然ウリカーゼに曝露した結果、共刺激マーカーＣＤ４０およびＣＤ８０の発現が増加し（図３Ａ）、その結果、未成熟の樹状細胞が減少した（図３Ｂ）。一方、ＭＰＣ−ウリカーゼ、ＮＺＰＳ−ウリカーゼ、およびＺＰＳ−ウリカーゼは、樹状細胞活性化を刺激する効果が低減されており、そのなかで、ＮＺＰＳ−ウリカーゼの効果が最も小さく、次にＺＰＳ−ウリカーゼの効果が小さかった。典型的な免疫抑制性サイトカインマーカーであるＴＧＦ−ベータの測定（図３Ｃ）によって、ＭＰＣ−ウリカーゼはＴＧＦ−ベータのレベルに影響を及ぼさず、ＮＺＰＳ−ウリカーゼおよびＺＰＳ−ウリカーゼはいずれも著しいＴＧＦ−ベータ分泌上方調節効果を有することが示唆される。
【０２３９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性研究に際し、ＺＰＳ−ウリカーゼ、ＮＺＰＳ−ウリカーゼ、ＭＰＣ−ウリカーゼコンジュゲートを、２５Ｕ／ｋｇ体重の用量にて、マウスの尾静脈に静脈投与する。ウリカーゼ試料の投与を、投与間隔を１週間あけて３回繰り返す。多様な時点（０、６時間、２４時間、４８時間、７２時間）においてマウスの血液を採取し、ＡｍｐｌｅｘＴＭ尿酸／ウリカーゼキットを用いて酵素活性を測定することによって、血中滞留ウリカーゼ量を推定した。３週間目の終わり（２１日目）に、すべてのマウスを安楽死させる。マウスを犠牲死させ、心臓穿刺により採取した血液を直接ＥＬＩＳＡ試験に用いる。
【０２４０】
直接ＥＬＩＳＡ試験の第１の工程として、コーティングバッファー（０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ１０．５）中に溶解して調製した抗原溶液（タンパク質濃度１０μｇ／ｍＬ）１００μＬを使用して、９６ウェルプレートの各ウェルをコーティングする。４℃において一晩コーティングした後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）でプレートを５回洗浄することによって抗原溶液を除去し、次いで、ブロッキングバッファー（０．１Ｍトリスバッファー中の１％ＢＳＡ溶液、ｐＨ８．０）を満たして室温で１時間インキュベートした後、ブロッキングバッファーを除去する。次いで、ＰＢＳバッファーで全ウェルをさらに５回洗浄する。続いて、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳバッファー中にマウス血清を段階希釈したものをプレートに添加して（１００μＬ／ウェル）、３７℃において１時間インキュベートし、続いてマウス血清を除去し、全ウェルをＰＢＳバッファーで５回洗浄する。次に、二次抗体としてヤギ抗ラットＩｇＭまたはＩｇＧ（ＨＲＰ標識、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各ウェルに添加して、３７℃においてさらに１時間インキュベートする。続いて、全ウェルをＰＢＳバッファーで５回洗浄し、その後、ＨＲＰの基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００μＬ／ウェルにて添加する。プレートを１５分間振とうし、停止溶液（０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）１００μＬを各ウェルに添加する。４５０ｎｍ（シグナル）および５７０ｎｍ（バックグラウンド）における吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて記録する。ウリカーゼ試料を投与していないマウスの血清を、すべてのＥＬＩＳＡ検出について、ネガティブコントロールとして使用する。また、２１日目にマウスの脾臓を採取し、１００μｍセルストレーナー（ＦｉｓｈｅｒｂｒａｎｄＴＭ）を用いて脾細胞を分離した。各群のマウス脾細胞を、天然ウリカーゼ、ＭＰＣ−ウリカーゼ、ＮＺＰＳ−ウリカーゼ、またはＺＰＳ−ウリカーゼの存在下において７２時間培養し、次いで、フローサイトメトリー分析のために、抗ＣＤ４−ＰＥ抗体、抗ＣＤ２５−ＦＩＴＣ抗体、および抗Ｆｏｘｐ３−Ｐｅｒｃｅｐ抗体を用いて染色した。
【０２４１】
図４Ａおよび図４Ｂならびに表１中に示すように、不活性の双性イオン性ポリマーであるＭＰＣとコンジュゲートしたウリカーゼでは、３回の投与後に、血中からの急速なクリアランス（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ：ＡＢＣ）が生じている。
【０２４２】
【表１】
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【０２４３】
抗ウリカーゼ抗体または抗コンジュゲート抗体での展開（図４Ｃおよび図４Ｄ）は、天然ウリカーゼおよびＭＰＣ−ウリカーゼコンジュゲートの場合に生じたＡＢＣ現象を説明できる。一方、双性イオン性ＰＳ（ＺＰＳ）ポリマーおよび非双性イオン性ＰＳ（ＮＺＰＳ）ポリマーはいずれも、免疫原性のタンパク質キャリア（ウリカーゼ）により誘発され得る免疫応答を抑制できる。このような免疫抑制効果のために、抗コンジュゲート抗体がなくなり（図４Ｃおよび図４Ｄ）、その結果として、繰り返し投与後のウリカーゼコンジュゲートの循環時間が維持される（表１）。ＮＺＰＳ−ウリカーゼの循環時間は、ＺＰＳ−ウリカーゼの循環時間よりも大幅に短く、このことから、ＮＺＰＳのＰＳ頭部基の「ｅａｔ−ｍｅ」シグナルにより急速なクリアランスが生じたことが示され、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるタンパク質の滞留時間を引き延ばすためには好ましくない。一方、ＺＰＳ−ウリカーゼの循環時間はＭＰＣ−ウリカーゼの循環時間と同等であり、このことから、ＺＰＳは、他の双性イオン性材料と同じようにタンパク質の循環時間を引き延ばし、その上ＰＳの免疫抑制効果を保持できるため、タンパク質の免疫原性を阻害できることが示される。このように、ＺＰＳは長い循環期間と低い免疫原性とを同時に達成できるという固有の特性を有するために、ナノ粒子（たとえば、タンパク質コンジュゲート、リポソーム、ミセル、ならびに、金、量子ドット、シリカ、および酸化鉄のナノ粒子などの固体ナノ粒子）にとって特に好適である。また、マウス脾細胞の特徴づけによって、ＮＺＰＳ−ウリカーゼおよびＺＰＳ−ウリカーゼコンジュゲートはＴ−ｒｅｇｅ細胞の発現を上方調節し得ることが確認され（図４Ｅおよび図４Ｆ）、これにより、これらが望ましくない免疫応答を回避する現象の説明がつく。
【０２４４】
ここまで、例示的な実施形態を例示および記載したが、これらの実施形態は、本発明の思想および範囲から逸脱することなく様々に変更できるということが理解される。
排他的な特性または権利を主張する本発明の実施形態を以下のように定義する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【国際調査報告】
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