(57)【要約】  リン脂質およびポリエチレングリコールを含む凍結乾燥粉末組成物であって、前記ポリエチレングリコールは、所定の限度よりも高い折りたたまれたポリマー鎖のパーセンテージを有する。当該組成物は、ガスが充填された微小胞を調製するのに適切である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガスが充填された微小胞の調製のための凍結乾燥粉末組成物であって、
前記組成物は、リン脂質およびポリエチレングリコールを含み、
ここで前記ポリエチレングリコールは、３４％よりも高い折りたたまれたポリマー鎖のパーセンテージを有する、
組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、
折りたたまれた鎖の前記パーセンテージが少なくとも４０％である、
組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、
折りたたまれた鎖の前記パーセンテージが少なくとも４２％である、
組成物。
【請求項４】
請求項１、２または３に記載の組成物であって、
前記ポリエチレングリコールは、少なくとも４０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量（Ｍｎ）を有するＰＥＧ４０００である、
組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物であって、
前記Ｍｎが少なくとも４０２５ｇ／ｍｏｌである、
組成物。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の組成物であって、
前記リン脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＧ−Ｎａまたはそれらの混合物である、
組成物。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の組成物であって、
前記組成物は、脂肪酸をさらに含む、
組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の組成物であって、
前記脂肪酸はパルミチン酸である、
組成物。
【請求項９】
請求項８の組成物であって、
２２〜２８重量部のＰＥＧ４０００、０．１５〜０．２５重量部のＤＳＰＣ、０．１５〜０．２５重量部のＤＰＰＧ−Ｎａおよび０．０２〜０．０６重量部のパルミチン酸を含む、
組成物。
【請求項１０】
請求項９の組成物であって、
２４．５６ｍｇのＰＥＧ４０００、０．１９ｍｇのＤＳＰＣ、０．１９ｍｇのＤＰＰＧ−Ｎａおよび０．０４ｍｇのパルミチン酸を含む、
組成物。
【請求項１１】
生理的に許容できるガスと接触している請求項１から１０のいずれかに記載の凍結乾燥粉末組成物を含む、
密封されたバイアル。
【請求項１２】
請求項１１に記載の密封されたバイアルであって、
前記ガスはフッ素化ガスである、
密封されたバイアル。
【請求項１３】
リン脂質およびポリエチレングリコールを含む凍結乾燥組成物を製造するための方法であって：
ａ．前記リン脂質および前記ポリエチレングリコールを溶媒中に溶解させて、それにより溶液を得るステップ；
ｂ．前記溶液を凍結させるステップ；および
ｃ．前記溶媒を凍結乾燥によって除去するステップ；
を含み、
ここで前記ポリエチレングリコールは、３４％よりも高い折りたたまれたポリマー鎖のパーセンテージを有する、
方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
前記組成物は脂肪酸をさらに含み、
前記ステップａ．は、前記脂肪酸を前記溶媒中にさらに溶解させるステップを含む、
方法。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれかに記載の凍結乾燥粉末組成物を、ガス存在下で、生理的に許容できる液体中に分散させることによって得られる、
ガスが充填された微小胞の懸濁液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超音波コントラストイメージングにおける使用のためのガスが充填された微小胞を調製するための製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年における造影剤の迅速な発展は、ヒトまたは動物の体の臓器および組織の造影イメージングならびにそれらの治療的処置において有用な、多くの異なる組成物および製剤を生産してきた。
【０００３】
造影超音波イメージング（「ＣＥＵＳ」イメージング）に特に有用な造影剤のクラスは、水性媒体中に分散されたナノおよび／またはマイクロメートルサイズの気泡の懸濁液を含む。ガスは典型的に、例えば乳化剤、油類、増粘剤または糖類を含むフィルム層内にトラップまたは封入される。これらの安定化された気泡（適切な生理学的溶液中に分散される）は、典型的にそれらの調製のために用いられる安定化材料に依存して様々な専門用語で当該分野において一般に呼ばれていて；これらの用語は、例えば、「マイクロスフェア」、「微小気泡」、「マイクロカプセル」または「マイクロバルーン」を含み、本明細書において包括的に、「ガスが充填された微小胞」（または「微小胞」）と呼ばれる。
【０００４】
超音波造影剤（「ＵＳＣＡ」）は、様々な製造方法に従って製造される。これらの方法の１つは（例えばＷＯ９４／０９８２９（１）を参照）、フィルム成形成分（例えばリン脂質および／または脂肪酸）の混合物および親水性安定化化合物（例えばポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｅｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ））の、有機溶媒中の溶解を必然的に伴い；得られた混合物は、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））に供せられるバイアル内に充填される。固形の凍結乾燥された固形残渣（「ケーク」）をその底に含んでいるバイアルはそれから、適切なガス（例えばフッ素化ガス）が充填されて、最終的には保管のために密封される。使用前に、適切な液体（例えば生理食塩水）をバイアル中に注入して、バイアルを振って固形残渣を溶解させることにより、微小気泡の水性懸濁液が容易に調製される。
【０００５】
上記の方法に従って製造することのできる市販されるＵＳＣＡは、ＢｒａｃｃｏによるＳｏｎｏＶｕｅ（登録商標）（または米国のＬｕｍａｓｏｎ（登録商標））である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本出願人はここで、凍結乾燥された「ケーク」の調製に用いられるポリエチレングリコールは特徴が変動し得て、それにより、凍結乾燥粉末の再構成の際に得られるガスが充填された微小胞の数に悪影響を及ぼし得ることを観察した。
【０００７】
特に、本出願人は、市販されるＰＥＧ４０００の異なるリリースは（同一製造元でさえも）、ポリマー材料中に異なる量の折りたたまれたポリマー鎖を有し得ることを観察した。本出願人が観察したように、ポリマー材料中の折りたたまれた鎖のパーセンテージが低すぎる場合は、製造バッチにおいて容認性試験に合格しないバイアルの数が多すぎるという結果をもたらし得る。工業規模の下では製造バッチは数千のバイアルを含み得るので、相対的に少ない数の却下される（ｄｉｓｃｈａｒｇｅｄ）バイアルでさえ非常に望ましくないことが十分に理解され得る。
【０００８】
上記の観察に基づき、ガスが充填された微小胞の調製のための凍結乾燥粉末の製剤において用いられるポリエチレングリコールについて、所定の値よりも高い折りたたまれたポリマー鎖のパーセンテージを有するものとすることを本出願人は決定した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様は、ガスが充填された微小胞の調製のための凍結乾燥粉末組成物に関し、前記組成物は、リン脂質およびポリエチレングリコールを含み、ここで前記ポリエチレングリコールは、３４％よりも高い、好ましくは３５％よりも高い、折りたたまれたポリマー鎖のパーセンテージを有する。
【００１０】
折りたたまれた鎖の前記パーセンテージは、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４２％、さらにより好ましくは少なくとも４４％である。特に好ましい実施態様では、折りたたまれた鎖の前記パーセンテージは、少なくとも４８％である。
【００１１】
好ましい実施態様では、前記ポリエチレングリコールは、少なくとも４０００ｇ／ｍｏｌ（またはダルトン、Ｄａ）、より好ましくは少なくとも４０２５ｇ／ｍｏｌ、さらにより好ましくは少なくとも４０５０ｇ／ｍｏｌの平均分子質量（または数平均分子量、Ｍｎ）を有する。
【００１２】
別の好ましい実施態様では、前記リン脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＧ−Ｎａまたは（好ましくは）それらの混合物である。
【００１３】
好ましくは、前記組成物は、脂肪酸、好ましくはパルミチン酸をさらに含む。
【００１４】
別の態様では、本発明は、生理的に許容できるガスと接触している上記に定義される組成物を含む、密封されたバイアルに関する。
【００１５】
好ましくは、前記ガスは、フッ素化ガス、より好ましくは六フッ化硫黄である。
【００１６】
別の態様によれば、本発明は、前記凍結乾燥粉末組成物を、ガス存在下で、生理的に許容できる液体中、好ましくは０．９％  ｗ／ｖ  ＮａＣｌ溶液中に分散させることによって得られる、ガスが充填された微小胞の懸濁液に関する。
【００１７】
さらなる態様によれば、本発明は、リン脂質およびポリエチレングリコールを含んでいて脂肪酸を含んでいてもよい凍結乾燥組成物を製造するための方法に関し、その方法は：
−前記リン脂質（任意選択で前記脂肪酸）、および前記ポリエチレングリコールを、溶媒中に溶解させるステップ；
−溶液を凍結させるステップ；および
−溶媒を凍結乾燥によって除去するステップ；
を含み、
ここで前記ポリエチレングリコールは、４０％以上の折りたたまれたポリマー鎖のパーセンテージを有する。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、超音波イメージングの方法に関し、その方法は：
−上記に定義されたガスが充填された微小胞の懸濁液を有効量で患者に投与するステップ；
−前記患者の体部分に超音波シグナルを送るステップ；
−前記体部分から超音波検査シグナルを回収するステップ、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】「滑らかな」凍結乾燥ケーク（１ａ）および「粗い」凍結乾燥ケーク（１ｂ）の例を示す。
【図２】折りたたまれたポリマー鎖のパーセンテージと、製造バッチあたりの却下される（ｒｅｊｅｃｔｅｄ）バイアルの量の間の関係を説明するプロットである。
【図３】ポリエチレングリコールサンプルの第２の加熱サイクルの例示的なＭＤＳＣサーモグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ＳｏｎｏＶｕｅ（登録商標）（またはＬｕｍａｓｏｎ（登録商標））は、セプタムバイアル内に保管された、滅菌された発熱物質フリーの凍結乾燥粉末として製剤化される。凍結乾燥粉末は、ポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ４０００、２４．５６ｍｇ）、ジステアロイルホスファチジル−コリン（ＤＳＰＣ、０．１９ｍｇ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールナトリウム（ＤＰＰＧ−Ｎａ  ０．１９ｍｇ）およびパルミチン酸（０．０４ｍｇ）を含む。各バイアルのヘッドスペースは六フッ化硫黄（ＳＦ６）が充填されている。５ｍＬの滅菌生理食塩水を用いた再構成の際、ＳｏｎｏＶｕｅ／Ｌｕｍａｓｏｎは、六フッ化硫黄が充填された微小胞（「マイクロスフェア」または「微小気泡」としても特定される）を含む乳白色の均質な懸濁液になる。
【００２１】
凍結乾燥粉末の調製は、上記に引用した特許出願ＷＯ９４／０９８２９に記載の手順に従って達成することができる。典型的に、その工程は、適切な溶媒（例えばジオキサン、シクロヘキサノール、２−メチル−２−ブタノール、テトラクロロジフルオロエチレン（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｉｆｌｕｏｒｅｔｈｙｌｅｎｅ）またはｔｅｒｔ−ブタノール）中に、ＰＥＧ４０００、リン脂質およびパルミチン酸の、最終的な凍結乾燥産物における重量比に実質的に対応するそれぞれの重量比での溶解を必然的に伴う。例えば、溶液は、２２〜２８重量部のポリエチレングリコール、０．１５〜０．２５重量部のＤＳＰＣ、０．１５〜０．２５重量部のＤＰＰＧ−Ｎａおよび０．０２〜０．０６重量部のパルミチン酸を含んでよい。得られた溶液はそれからガラスバイアル内に充填されて、急速に凍結されて（例えば−４５℃）、それから凍結乾燥工程に供せられる。典型的に、工業規模の下では、それぞれの製造バッチは数千のバイアルを含む。凍結乾燥ステップの最後に、凍結乾燥された残渣を固形ケークの形状で含んでいるバイアルの上側空間をＳＦ６ガスで飽和させて、バイアルをゴム栓で密封する。そのようにして得られたバイアルは、少なくとも２年の期間保管され得る。
【００２２】
本出願人が観察したように、製造バッチのバイアル内の凍結乾燥ケークの質は、しかしながら、所定の限度よりも低い量の折りたたまれた鎖を有するＰＥＧの使用により悪影響を受け得る。
【００２３】
例えばＧｉｎｅｓら２によって言及されるように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、固形状態で、非晶質の相と規則正しい結晶性の相を、その合成および熱履歴に応じて異なる比率で含む、半結晶性の親水性ポリマーである。結晶性領域では、ポリマー鎖は、特に、約４０００〜６０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＰＥＧでは、伸張した鎖および折りたたまれた鎖の両方として存在する。Ｇｉｎｅｓらによって観察されたように、ＰＥＧ４０００における折りたたまれた鎖の量は一般に、融解サンプルが室温で放冷された場合、液体窒素内の浸漬によってまたは氷浴内でクエンチングされた同一の融解サンプルと比較して、より高い。
【００２４】
本出願人が観察したように、ガスが充填された微小胞を調製するための製剤において安定化化合物として用いられるＰＥＧ材料（典型的にＰＥＧ４０００）中の折りたたまれた鎖の量は、同一の名目上の分子量（すなわち４０００ｇ／ｍｏｌ）を有する材料に関して、同一製造元でさえも、様々な市販ロット間で実質的に変化し得る。
【００２５】
本出願人はここで、予期せずに、そのような折りたたまれたポリマー鎖のパーセンテージが低すぎるＰＥＧを用いた場合、そのようなＰＥＧを用いて製造されたバッチのバイアル内に含まれる凍結乾燥ケークの質に悪影響を及ぼし得ることを見いだした。特に、ＰＥＧ中の折りたたまれたポリマー鎖のパーセンテージが所定の限度よりも下に落ちると、そのようなバッチにおいて、却下されるバイアルの量（すなわち、所定の仕様を満たさない凍結ケークを有するバイアル）は過度に高くなる。
【００２６】
凍結乾燥ケークの質を決定するための様々な基準のうち、重要なものは、ケークの物理面である。特に、本出願人は、ケークの物理面と、生理的に許容できる液体を用いてそのようなケークを再構成した際に生産されるガスが充填された微小胞の懸濁液の質との間の、相対的に良い相関を決定した。本出願人が観察したように、相対的に滑らかな表面外観を示すケーク（例えば図１ａを参照）は、再構成の際に一般により多い数の微小胞を生じさせ、一方で、相対的に粗い表面外観を示すもの（例えば図１ｂを参照）は、再構成の際に実質的により少ない数の微小胞を生じさせる。さらに、本出願人が観察したように、相対的に滑らかな表面を有するケークは、より高いＭＶＣ（微小気泡体積濃度、すなわち、懸濁液のｍＬあたりの、再構成された微小胞内に含まれるガスの合計量）を有する微小胞懸濁液をもたらす。一般に、上述のより低い質に起因して、粗いケークの再構成によって得られるガスが充填された微小胞の懸濁液は、ＣＥＵＳイメージングの実施に関してより効果的でない。
【００２７】
特に、本出願人が観察したように、折りたたまれた鎖のパーセンテージがポリマー鎖の合計量の３４％以下である場合、却下されるバイアルの量（「粗い」ケークを有する）は、一般に、図２において説明されるように、１６％よりも高い。したがって本出願人は、却下されるバイアルのそのような数を減少させるために、３４％よりも高い、好ましくは３５％よりも高い折りたたまれた鎖のパーセンテージを有するＰＥＧを用いるものとすることを決定した。バイアルの却下の割合をさらに最小限にするために、ＰＥＧ中の折りたたまれた鎖のパーセンテージは、ポリマー鎖の合計量に対して好ましくは少なくとも４０％であるものとする。より好ましくは、折りたたまれたポリマー鎖のパーセンテージは４２％よりも高く、さらにより好ましくは４４％よりも高く、４８％が特に好ましい。原理的には折りたたまれた鎖のパーセンテージに関する上限は存在しないが（典型的に、約６０００ｇ／ｍｏｌの名目上のＭｎを有するＰＥＧは、約１００％までの折りたたまれた鎖のパーセンテージを有し得る）、約４０００の名目上のＭｎ（例えば４６００ｇ／ｍｏｌまで）を有するＰＥＧは、典型的に、８０％よりも低い、典型的には７５％以下の折りたたまれた鎖のパーセンテージを有する。好ましくは、折りたたまれた鎖のパーセンテージは、約７０％以下、より好ましくは約６５％以下、さらにより好ましくは６０％以下である。
【００２８】
折りたたまれた鎖のパーセンテージの決定
ポリマー材料中の折りたたまれた鎖のパーセンテージは、当技術分野で知られている方法に従って、好ましくは示差走査熱量計（ＤＳＣ）によって決定することができる。好ましい方法（以下の実施例においても用いられる）は、例えばＤＳＣ−Ｑ２０００システム（ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ  ＵＳＡ）を用いて行われる変調示差走査熱量法（ＭＤＳＣ）である。
【００２９】
ＭＤＳＣ法の詳細は、実施例に記載される。
手短には、サンプルは、一定の温度速度（例えば２℃／分）で、所定の温度範囲（例えば２０℃〜７０℃）にわたって、温度調節幅（例えば３０秒ごとに０．１６℃）を適用することによって、加熱／冷却／加熱サイクルに供せられる。
【００３０】
折りたたまれた形状で存在するポリマー材料の画分は、第２の加熱サイクル中に特徴付けられ得る。実際に、ポリエチレングリコールは、第２の加熱サイクル中に、２つのピークに分かれる特有の特徴を有し、より低い融解温度を有するピークは折りたたまれた鎖を有するＰＥＧの融解に対応し、一方で、より高い融解温度を有するピークは折りたたまれていない鎖を有するＰＥＧの融解に対応する。図３は、ＰＥＧの典型的なＭＤＳＣサーモグラムを示し、前記第２の加熱サイクル中に得られる前記第１および第２の融解ピークが特定される。特に、図３におけるピークＡ（約５７℃）は、折りたたまれた鎖を有するＰＥＧの融解に相当し、一方で、ピークＢ（約６１℃）は、折りたたまれていない鎖を有するＰＥＧの融解に相当する。それぞれのピークの領域は、折りたたまれた鎖または折りたたまれていない鎖を有するＰＥＧのそれぞれの画分に相当する。ポリマーの折りたたまれた鎖の画分、ｆ（折りたたみ）はしたがって、以下の等式１に従って決定される：
等式１          ｆ（折りたたみ）＝Ａ折りたたみ／Ａ折りたたみ＋Ａ非・折りたたみ
ここで、Ａ折りたたみおよびＡ非・折りたたみは、ＰＥＧサンプルのＭＤＳＣサーモグラムの第２の加熱サイクルのそれぞれのピークの下の領域から計算される、折りたたまれたＰＥＧ形態および折りたたまれていないＰＥＧ形態に関する正規化された熱流積分（サンプルの融解エンタルピー、ジュール／グラム）を表わす。ポリエチレングリコールのサンプル中の折りたたまれたポリマー鎖のパーセンテージは、したがって：ｆ（折りたたみ）×１００である。
【００３１】
実験部分において説明されるように、折りたたまれた鎖のパーセンテージとポリエチレングリコールの平均分子質量との間には特定の相関があるが（一般に、ポリマーの分子質量が高ければ高いほど、折りたたまれた鎖のパーセンテージは高くなる）、そのような相関は、必ずしも直線ではない。この知見は、分子質量は折りたたまれた鎖の量において役割を果たすが、折りたたまれた鎖の量はポリマーサンプルの熱履歴（例えば、サンプルの製造／冷却工程、保管状態または経年劣化のパラメーターを含む）によっても影響を受け得るので、それは必ずしも唯一の決定因子ではないことを示す。それにもかかわらず、出願人は、ポリエチレングリコールは、少なくとも４０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは少なくとも４０２５ｇ／ｍｏｌおよびさらにより好ましくは少なくとも４０５０ｇ／ｍｏｌの平均分子質量（または数平均分子量、Ｍｎ）を好ましく示すことを観察した。特に好ましいものは、４０７５以上、例えば４１００以上のＭｎを有するポリエチレングリコールである。折りたたまれた鎖の量に関するものについて、Ｍｎの上限値（ｈｉｇｈｅｒ  ｖａｌｕｅ）は原理的には存在しないが、ポリマーは、ガスが充填された微小胞の最終的な懸濁液の粘性と適合する分子量を有する。したがって、６２００ｇ／ｍｏｌ以下、より好ましくは５０００ｇ／ｍｏｌ以下、さらにより好ましくは４４００ｇ／ｍｏｌ以下のＭｎが好ましい。
【００３２】
ポリエチレングリコールの分子質量は、従来の方法論に従って、好ましくはヒドロキシル価（ＯＨＶ）の滴定によって、例えばＤＩＮ５３２４０標準に従って、決定することができる。ＰＥＧに関する平均分子質量（または数平均分子量、Ｍｎ）はそれから、ＯＨＶから（例えば以下のように：Ｍｎ＝１１２’２２０／ＯＨＶ）、簡単に計算することができる。
【００３３】
ケーク面の決定
ケークの物理的外観のチェックは、目視検査によってすることができる。好ましくは、目視検査は、適切な電光およびミラーシステムを備える半自動的検査機、例えば、Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ  Ｍ１００６３半自動機を用いて行われる。実施において、ケークは、適切な光システムを用いて上部から照らされるが、ケークの底は下にあるミラー上の透明性によって可視化される。したがって、ミラー上で可視化されるケークの面がオペレーターによってチェックされて、以下の基準に基づいて、許容できるバイアルまたは却下されるバイアルが決定される。容認性試験を通過する凍結乾燥ケークは、ケーク全体を通して複数の結晶様構造を有する均質な表面をした実質的に滑らかな面（「滑らかなケーク」）を有する（図１ａを参照）。一方で、容認性試験で却下されるケークは、割れ目および／またはより大きなスポットがケーク内に現れている実質的に粗い面（「粗いケーク」）を有する（例えば図１ｂを参照）。
【００３４】
この容認性試験によって、出願人は、以下の実施例において詳細に説明されるように、製造バッチ内の却下されるバイアルの量は、様々なバッチの調製に用いられるポリエチレングリコール内の折りたたまれた鎖のパーセンテージと反比例することを決定した。
【００３５】
生理食塩水を用いた再構成の際に試験した場合、滑らかなケークは一般に、懸濁液中のより高い量の微小気泡ならびに微小気泡内に含まれるより高い容量のガスをもたらした。
【００３６】
再構成された懸濁液は、従来のＣＥＵＳ手順における患者への投与のために用いることができ、ここで、患者またはその体部分は超音波照射に供せられて、超音波検査シグナルが回収されて分析される。
以下の実施例は、本発明をさらに説明するのを助ける。
【実施例】
【００３７】
［実施例１］
ＭＤＳＣによる、折りたたまれた鎖のパーセンテージの決定
ａ．システムの準備およびキャリブレーション
全てのＭＤＳＣ実験は、Ｔｚｅｒｏ（商標）技術（熱容量の直接測定を可能にする）およびＭｏｄｕｌａｔｅｄ（登録商標）オプション（伝統的な直線ランプ上に正弦波温度振動を重ねるのを可能にする）を備えたＤＳＣ−Ｑ２０００システム（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ  ＵＳＡ）上で行なわれた。
【００３８】
−９０℃〜５５０℃の温度範囲にわたって好都合に運転するための２段階冷却システムを備えた冷蔵された冷却付属品（ＲＣＳ９０）を用いた。
【００３９】
データの取得および処理は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージの助けにより行なった。
【００４０】
Ｔｚｅｒｏアルミニウムるつぼ（ｒｅｆ  ９０１６８３．９０１）およびＴｚｅｒｏアルミニウム蓋（ｒｅｆ  ９０１６７１．９０１）（全てＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによる）を用いて、測定すべきサンプルを中に入れて、Ｔｚｅｒｏプレス（ｒｅｆ  ９０１６００．９０１）を用いて、るつぼを密封した。
【００４１】
ＤＳＣシステムの温度および熱流を含むキャリブレーションを、インジウム金属を用いて行なった。実際には、およそ５ｍｇのインジウム片を計量して、平らに圧縮して、Ｔｚｅｒｏプレスを用いてＴｚｅｒｏ蓋によって密封されたＴｚｅｒｏるつぼ内に移した。キャリブレーションのスキャンプログラムを１０℃／分の一定温度速度で１００℃と１８０℃の間で走らせた。インジウムの仕様は以下であった：融解エンタルピーおよび融解開始温度は、それぞれ、２８．７１Ｊ／ｇ±０．５Ｊ／ｇおよび１５６．６℃±０．２５℃でなければならない。
【００４２】
ｂ．サンプルの調製およびＭＤＳＣ測定
ＰＥＧ４０００の４つの異なるロットを以下の手順に従って特徴付けた。
各サンプルのＰＥＧ４０００フレークを、乳棒を用いて小さなパーツに押し砕いて、５ｍｇ±０．１ｍｇのサンプル質量を、マイクロバランスＸＰ２６（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ）を用いてＴｚｅｒｏるつぼ内で計量して、それから、Ｔｚｅｒｏプレスを用いてＴｚｅｒｏ蓋で密封した。空のサンプルるつぼと比較して似た重量の空のＴｚｅｒｏるつぼを同様に調製して、参照として用いた。
【００４３】
ＭＤＳＣ測定は、以下の表１に概説されるように２０℃〜７０℃の温度範囲にわたって２℃／分の一定温度速度で加熱／冷却／加熱サイクルを適用することによって、ＰＥＧ４０００サンプルを含んでいる各るつぼに対して行なわれた。加熱のみの調節シグナルを適用した（３０秒の温度調節期間ごとに０．１６℃温度調節幅）。窒素を、５０ｍＬ／分の流速でパージガスとして用いた。
2021529730.tif 000002
【００４４】
以下のパラメーターを、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いてＭＤＳＣサーモグラム上で決定した：
−第１の加熱サイクル中のピーク温度および融解エンタルピー；
−第１の冷却サイクル中のピーク温度および結晶化エンタルピー；
−第２の加熱サイクル中の折りたたまれた鎖および伸長した鎖のピーク温度および融解エンタルピー。
【００４５】
折りたたまれた形態で存在するポリマー材料のパーセンテージは、第２の加熱サイクル中に特徴付けられて、等式１に従って計算された。ＰＥＧ４０００の各ロットに関して、３つの異なるサンプルに対して手順を繰り返した。測定および結果の詳細を以下の表２〜５に提供する。
2021529730.tif 000003
2021529730.tif 000004
2021529730.tif 000005
2021529730.tif 000006
【００４６】
それぞれのＰＥＧロットに関するＭＤＳＣ測定の結果を、以下の表６に、供給者によって提供されるそれぞれの数平均分子量（Ｍｎ）とともに要約する。
2021529730.tif 000007
【００４７】
表２〜６に報告される結果は、ロット１（折りたたまれたポリマー鎖がたった３４％である）は本発明に係る要件を満たさないが、ＰＥＧ４０００のその他の３つのロットはそのような要件を満たすことを示す。さらに、ロット番号１は４０００よりも低いＭｎを有するが、他のロットは全て、４０００ｇ／ｍｏｌよりも高い、特に少なくとも４０５０ｇ／ｍｏｌのＭｎを有することも観察することができる。
【００４８】
［実施例２］
凍結乾燥ケークの調製
凍結乾燥ケークを調製するための手順は、ＷＯ９４／０９８２９の実施例において説明されるものに基本的に従う。手短には、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＧ−ＮａおよびＰＡ（４．７５／４．７５／１の重量比）を、最初に、約５ｇ／Ｌの濃度でヘキサン／エタノール（８／２、ｖ／ｖ）中に溶解させて、真空下で溶媒を蒸発させた。残渣を約０．０１７：１の重量比でＰＥＧ４０００と混合させて、混合物を約６０℃でｔｅｒｔ−ブタノール中に溶解させて、透明溶液を用いてそれぞれのＤＩＮ８Ｒバイアルを満たす（対応する容量は約２５ｍｇの混合物を含む）。バイアルを−４５℃で急速に冷却して、それから、最終の凍結乾燥ステップに供する。凍結乾燥の最後に、凍結乾燥器の周囲を大気圧でＳＦ６を用いて飽和させて、ゴム栓を用いてバイアル（ＳＦ６と接触している固形凍結乾燥ケークを含む）を密封する。
【００４９】
上記の製造手順は、実施例１において特徴付けられた４つのＰＥＧ４０００ロット（ロット１〜４）のそれぞれを用いて適用されて、その結果、それぞれ数千バイアルの４つのバッチ（それぞれバッチ１〜４）を取得し、それぞれのバイアルは、バイアルの底にケークの形態で２５ｍｇの凍結乾燥固形材料を含んでいた。
【００５０】
［実施例３］
バイアル／ケークのチェック
実施例２において説明される調製方法に従って得られたバッチを、以下の手順に従って、許容できない凍結乾燥ケークの存在に関してチェックした。
【００５１】
各バッチのバイアルを検査して、以前に説明した手順に従って、Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ  Ｍ１００６３半自動機を用いて、「許容できるバイアル」、すなわち滑らかなケークを含む（ＳＣＶ、例えば図１ａ）、または、「却下されるバイアル」、すなわち粗いケークを含む（ＲＣＶ、例えば図１ｂ）のいずれかに分類した。
【００５２】
上記の手順に従って行われたチェックの結果を以下の表７に示し、図２に報告する。
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【００５３】
表７に示される結果から推論されるように、製造バッチ番号１（組成物のＰＥＧ４０００はたった３４％の折りたたまれた鎖を有する）における棄却されるバイアルのパーセンテージは、本発明に係る、より高いパーセンテージの折りたたまれた鎖を有するＰＥＧ４０００を用いて製造された他のバッチの却下の量と比較して、より高い。
【００５４】
［実施例４］
再構成されたバイアルからの、ガスが充填された微小胞の懸濁液
「許容できるバイアル」および「却下されるバイアル」（上記の実施例３において定義される）のそれぞれのグループから６個のバイアルをサンプリングして、前記バイアル内に含まれるケークを再構成することによって得られる微小気泡の特徴を調べた。
【００５５】
３０μｍアパーチャーチューブが付いたＣｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ３を用いて、ガスが充填された微小胞懸濁液の様々なパラメーター、例えばＭＶＣ（微小胞体積濃度）および懸濁液中の微小胞の合計数を測定した。手短には、１００μＬの分析容量を用いて、５０μＬの微小気泡懸濁液を１００ｍＬのＮａＣｌ  ０．９％溶液中に希釈した。
【００５６】
測定（バイアルの各グループに関する平均値）の結果を以下の表８に報告する。
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【００５７】
表８に示される結果から推論されるように、滑らかなケークの再構成の際に得られる微小胞は、微小胞内にトラップされるより多い容量の合計ガス（具体的には、２倍）ならびに懸濁液中のより多い数の微小胞（具体的には、０．５×１０８）を示す。
【００５８】
［引用文献］

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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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