(57)【要約】【課題】ＣＡＲ−ＮＫ細胞に関する。【解決手段】本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを保有するレンチウイルスベクターで遺伝子組換えされたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を作製する分野に関する。本発明は、さらに、該方法を用いて得られたＣＡＲ−ＮＫ細胞、及び医薬における、特にがんを治療する方法における使用を意図したＣＡＲ−ＮＫ細胞の使用に関する。【選択図】図１
2021525066.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で遺伝子組換えされたＮＫ細胞の集団を作製するための方法であって、
（ｉ）ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを保有するＣＤ３４＋細胞を含有する中間細胞集団を、
ａ）骨髄、末梢血、胎盤又は臍帯血からなる群から選択される生物学的出発サンプルを得るステップと、
ｂ）造血幹細胞をかかる生体サンプルから単離するステップと、
ｃ）前記単離された造血幹細胞を培地Ｉの存在下で培養するステップと、
ｄ）培養された幹細胞を、ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを保有するレンチウイルスベクターとともにかかる細胞をインキュベートすることにより形質導入し、それによりＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団を得るステップと、
ｅ）任意選択的には、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する前記中間細胞集団を培地Ｉ中で少なくとも１日間培養するステップと、
に従って生成し、ここで培地Ｉが、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、サイトカインの前記コレクションが、インターロイキン−７、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬＴ−３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）の１つ以上、並びに顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）の２つ以上を含む、第１相
（ｉｉ）前記第１相からのＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する前記中間細胞集団を培地ＩＩ中でさらに拡大し、それによりＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞及びＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞を含有する細胞集団を得て、ここで培地ＩＩが、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、サイトカインの前記コレクションが、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３Ｌ  インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）及びＩＬ−７の２つ以上、並びにＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ６の２つ以上を含む、任意選択的な予備ステップと、
相ＩからのＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する前記中間細胞集団、又は前記任意選択的な予備ステップからのＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞及びＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞を含有する前記細胞集団を、ＣＡＲ−ＮＫ細胞を含有する細胞集団に拡大及び分化させるステップであって、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する、相Ｉからの前記中間細胞集団、又はＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞及びＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞を含有する、前記任意選択的な予備ステップからの前記細胞集団を、培地ＩＩＩ中で培養し、それによりＮＫ細胞を含有する細胞集団を得ることを含み、ここで前記培地ＩＩＩが、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、サイトカインの前記コレクションが、ＳＣＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）の２つ以上、並びにＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ−６の２つ以上を含む、ステップと、
を含み、ここで前記キメラ抗原受容体が、ＣＤ４４ｖ６に特異的である、第２相
を含む方法。
【請求項２】
前記第２相が、前記予備拡大ステップと拡大及び分化の前記ステップの双方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体サンプルが、臍帯血である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
幹細胞が、ＣＤ３４＋免疫磁気選択法を用いて単離される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記形質導入が、培地Ｉ中で実施される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
培地Ｉが、ＳＣＦを４ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌの間の濃度、又はＦｌｔ３−Ｌを４ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌの間の濃度、又はＴＰＯを４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度、又はＩＬ７を４ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度、又はこれらサイトカインの任意の組み合わせを前記特定範囲の濃度で含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記中間細胞集団を生成する前記相が、１回以上の形質導入の実行を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＣＤ３４＋幹細胞が、１０〜２００の間のＭＯＩでのレンチウイルスベクターとともにインキュベートされる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＣＤ３４＋幹細胞が、ＭＯＩ１００でのレンチウイルスベクターとともにインキュベートされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記レンチウイルスベクターが、免疫選択用のマーカーとしての使用を意図した選択可能タンパク質をコードするさらなるポリヌクレオチドを保有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
免疫磁気選択法を用いて、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を選択するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＡＲが、免疫選択用のマーカーとしての使用を意図したスペーサードメインを有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
免疫磁気選択法を用いて、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を選択するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
好ましくは、ＮＫ−ＣＡＲ細胞が、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）について陽性である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によって入手可能な前記ＮＫ−ＣＡＲ細胞を含む組成物。
【請求項１５】
医薬における使用を意図した、好ましくは免疫療法における使用を意図した、より好ましくは腫瘍及び血液学的悪性腫瘍の治療における使用を意図した、請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを保有するレンチウイルスベクターで遺伝子組換えされたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を作製する分野に関する。本発明は、さらに、ＣＡＲ−ＮＫ細胞、及び医薬における、特にがんを治療するためのＣＡＲ−ＮＫ細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明に対する背景
本発明は、ＣＡＲ（ＣＡＲ−ＮＫ細胞）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを保有するレンチウイルスベクターで遺伝子組換えされたナチュラルキラー細胞の作製プロセスの開発に注目する。本発明の作製方法は、ＮＫ細胞の治療効果とＣＡＲの治療効果との間の有効な相乗作用によって特徴づけられる細胞集団を得ることを可能にする。
【０００３】
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、高い抗腫瘍、抗ウイルス及び抗菌活性を有する自然免疫系の細胞である。がんの治療におけるＮＫ細胞の使用は、養子移植の成功後として注目を集めており、がんを有する患者においてインビボでのＮＫ細胞の拡大が報告されている［Ruggeri et al (2005) Curr Opin Immunol 17: 211-7; Ren et al (2007) Cancer Biother Radiopharm 22: 223-34; Koehl et al (2004) Blood Cells Mol Dis 33: 261-6.176 Passweg et al (2004) Leukaemia 18:1835-8］。一般には、ドナーＮＫ細胞注入は、これらの試験におけるＧｖＨＤの誘導における証拠の不在下で、十分な耐容性があった。しかし、がんを有する患者における養子ＮＫ細胞注入について検討する試験は、現在まで数件実施されているに過ぎない。主要な障壁は、相対的少数のＮＫ細胞が定期的な白血球除去産物から単離されうるに過ぎないことである。これは、がんを有するヒトにおけるＮＫ細胞の用量依存性の抗腫瘍応答に対する臨床試験の妨げになる［Klingemann  et al (2004) Cytotherapy 6: 15-22; Passweg et al (2006) Best Pract Res Clin Haematol 19: 811-824; McKenna  et al (2007) Transfusion 47: 520-528; Koehl et al (2005) Klin Padiatr 217: 345-350; Iyengar et al (2003) Cytotherapy 5: 479-484; Meyer-Monard et al (2009) Transfusion 49: 362-371］。したがって、より高いＮＫ細胞用量での臨床試験を可能にする、また複数のＮＫ細胞注入を可能にする、ＮＫ細胞の拡大及び活性化についての生体外プロトコルが検討中である［Carlens et al (2001) Hum Immunol 62: 1092-1098; Barkholt et al (2009) Immunotherapy 1: 753-764; Berg et al (2009) Cytotherapy 11: 341-355; Fujisaki et al (2009) Cancer Res 69: 4010-4017; Siegler et al. (2010) Cytotherapy 12(6):750-63］。しかし、大規模及び多施設試験において、大部分のプロトコルが、ＮＫ細胞産物を生成するという制御上の問題をもたらす可能性がある支持的な支持細胞株を用いることにより技術的不具合に対処する。以前、我々は、ＣＤ３４＋造血幹細胞から高細胞数、高純度及び機能性を有する臨床的に関連するＮＫ細胞産物を生成する能力を有する、代替サイトカインに基づく培養方法について記載している［Spanholtz et al (2010) PLoS One 5: e9221］。我々は、ＣＤ３４＋濃縮をさらに最適化しており、活性化ＣＤ３４＋細胞由来ＮＫ細胞を高収量でもたらすスケーラブルな手順を開発した。
【０００４】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、標的細胞上で発現される特異的なタンパク質又は抗原を認識する組換え受容体である。ＣＡＲは、そこでＣＡＲ−Ｔ細胞と称されるＴリンパ球、又は免疫系の他の細胞において発現されると、それらが結合する抗原を発現するすべての細胞に対する特異的な免疫応答を再び指示することができる。ＣＡＲの最も幅広く探索された臨床適用は、腫瘍抗原に標的化されるＣＡＲを保有する免疫系の細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の注入を本質とするがん免疫療法である。かかる細胞は、ＣＡＲによって標的化される抗原を発現する細胞に対する強力な抗腫瘍応答を生じさせることができる（Sadelain et al., Cancer Discovery. 2013. 3(4):388-98）。
【０００５】
ＣＡＲは、一般に、活性化及び共刺激シグナルをそれらが発現される細胞に伝達する、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、スペーサー領域、膜貫通ドメイン、及びエンドドメインに由来する、抗原認識に関与する外部ドメインからなる組換えキメラタンパク質である。ＣＡＲは、シグナル伝達ドメインの数に応じて、第１世代（１）、第２世代（２）、又は第３世代（３）ＣＡＲに分類される（Dotti et al., Immunol Rev. 2014 Jan; 257(1)）。
【０００６】
「スペーサー」又は「ヒンジ」領域は、外部ドメインと膜貫通ドメインとの間の接続配列である。スペーサーとして用いられる最も一般的な配列は、定常免疫グロブリンＩｇＧ１  ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインである。国際公開第２０１６／０４２４６１号は、ヒト低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）の細胞外ドメインに由来するスペーサー領域を含むＣＡＲを開示している。
【０００７】
いくつかのＣＡＲ−Ｔ細胞候補は、現在は臨床開発段階であり、異なる奏効症例が得られつつある。食品医薬品局（Food and Drug Administration）（ＦＤＡ）は最近、難治性であるか又は２回目若しくは後の再発性であるＢ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）に罹患した２５歳までの患者の治療に適用される最初のＣＡＲ  Ｔ細胞療法であるチサゲンレクルユーセル（Kymriah（登録商標））、及び２系統以上の全身性治療後の再発性又は難治性の大型Ｂ細胞リンパ腫を有する成人患者の治療に適用されるアキシカブタゲンシロロイセル（Yescarta（登録商標））を認可した。
【０００８】
大半のＣＡＲ−Ｔ細胞試験では、同種Ｔ細胞が、同種Ｔ細胞による宿主組織に対する侵襲性を本質とする重篤で潜在的に致死性の有害事象として移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を発生させるような有意なリスクを有することから、自己Ｔ細胞が用いられている。自家ＣＡＲ修飾Ｔ細胞の作製は、患者に特異的であり、いくつかの実用的制限を有する。
【０００９】
ＣＡＲを発現するように遺伝子組換えされたＮＫ細胞（ＣＡＲ−ＮＫ細胞）の発生は、まだより早期の発生段階にある。異なる抗腫瘍剤を標的化するＣＡＲ−ＮＫ細胞を用いて実施された前臨床及び臨床試験は、Martin-Antonio et al. Int J Mol Sci. 2017 Aug 29;18(9)にレビューされている。
【００１０】
ＣＡＲ−ＮＫ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞と比べて、いくつかの利点を有すると予想される。作製については、ＮＫ細胞は、ＧｖＨＤを引き起こさないことから、即時性の臨床用途に利用可能な既製の同種産物を生成するための機会を提供する。さらには、自家及び同種ＮＫ細胞は、サイトカイン放出症候群のような生命を脅かす毒性を生じる可能性を低減する、制限されたインビボ持続性を有する。有効性の観点から、ＮＫ細胞は、一旦ＣＡＲで改変されると、それらの天然受容体を保持することで、抗腫瘍効果がＣＡＲの特異性によって媒介される機構とは別の機構によって媒介され得るはずである（Rezvani et al. Mol. Ther. Aug. 2017; 25 (8)）。
【００１１】
ＮＫ細胞を改変するための異なる方法が、現在開発中である。これまで公表されたＣＡＲ−ＮＫ細胞に関する前臨床及び早期臨床試験の大部分では、ＣＡＲ分子を発現するためのＮＫ細胞株が利用されており（Martin-Antonio et al. Int J Mol Sci. 2017 Aug 29;18(9)、ここでは最も広範に試験されたＮＫ−９２細胞株が用いられる。その作製におけるいくつかの潜在的利点にもかかわらず、ＮＫ−９２細胞は、非ホジキンリンパ腫、複数の細胞遺伝学的異常、及びエプスタイン・バーウイルス（Epstein-Barr virus）（ＥＢＶ）による潜伏感染によって罹患された患者に由来することから、検討されるべき有意な臨床的欠点：潜在的な催腫瘍性を有する。これらの理由のため、ＮＫ−９２は、臨床使用前に照射される。かかる照射は、ＣＡＲ−ＮＫ細胞のインビボでの増殖及び持続性に対して、また決定的には抗腫瘍活性に対して負の影響を有することがある。一部の筆者は、ウイルス形質導入又は他の代替的な非ウイルス性形質導入方法により遺伝子組換えされた、末梢血又は臍帯血に由来する一次ヒトＮＫ細胞から最初に得られたＣＡＲ−ＮＫ細胞を開示した。これらの手法では、異なるドナーの中での異なるＮＫ機能、並びに形質導入方法及び拡大方法の影響に起因して、大きな変動性が認められた（Rezvani et al. Mol. Ther. Aug. 2017; 25 (8)）。
【００１２】
本発明は、ＣＡＲを発現するように遺伝子組換えされ、次にＣＡＲ−ＮＫに分化される、生体サンプルから精製された幹細胞から始まるＣＡＲ−ＮＫ細胞の作製プロセスの開発に注目する。発明者は、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性とＣＡＲの抗腫瘍活性とが相乗的に作用する、ＣＡＲ−ＮＫ細胞を含有する細胞集団を得ることを目的とする、作製プロセスの各ステップを実施するための条件を見出した。
【００１３】
先行技術では、類似的手法に従ういくつかのプロトコルが開示されているが、中間ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞集団の性質及び組成物に対する、並びに最終ＣＡＲ−ＮＫ細胞集団の治療効果に対する形質導入条件の影響について説明している先行論文は皆無である。
【００１４】
例えば、Lowe et al. Met. Mol. Biol. 2016; 1441: 241-2511は、キメラ抗原受容体を発現するように修飾された臍帯血由来ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）から始まるＣＡＲ−ＮＫ細胞の生成についての２つのプロトコルを開示している。両プロトコルでは、レトロネクチンの存在下でＦｌｔ３、ＳＣＦ及びＴＰＯが添加された培地中でＬＶＶ形質導入が実施される。次に、形質導入幹細胞は、マウスＯＰ９−ＤＬ１細胞のフィーダー間質との共培養を用いて（プロトコル１）、又はＳＣＦ、組換えヒトＦｌｔ−３リガンド、ＩＬ−１５及びＩＧＦ−１が添加されたＡＩＭ  Ｖ培地中での培養細胞に基づくフィーダーフリープロトコルを用いて（プロトコル２）、ＮＫ細胞に分化される。該論文は、本発明の作製方法及びＣＡＲ−ＮＫ細胞の最終集団の抗腫瘍効果に対して用いられる条件の影響について開示していない。
【００１５】
Ni et al. Stem Cells. 2014 April; 32(4)は、ＨＩＶ感染の治療に用いられるべきＣＡＲ−ＮＫ細胞の生成用のさらなるプロトコルを開示している。この症例では、ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞は、ＣＡＲを保有するＬＶＶが形質導入され、次に幹細胞因子、血管内皮増殖因子及び骨形成タンパク質４を有するＢＰＥＬ培地中で１１日間培養され、次にＥＬ０８−１Ｄ２間質細胞の存在下でＮＫ細胞に分化される。該論文は、本発明の方法の条件について開示しておらず、興味深いことに、インビトロでＣＡＲ−ＮＫ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞内でＨＩＶ複製を、それらの非修飾対応物よりも効率的に阻害することができる一方で、ＣＡＲ修飾ＮＫ細胞の有効性の非修飾ＮＫ細胞に対しての有意な増強がインビボで認められないことを明示している。したがって、この手法では、ＮＫ細胞とＣＡＲとの間の相乗作用がインビボで認められない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
ＮＫ細胞及びＣＡＲの治療効果間の相乗効果によって特徴づけられる、医学的治療に用いるための十分な量及び質のＣＡＲ−ＮＫ細胞を得ることを可能にする作製方法を開発することが求められる。本発明は、この要求に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の概要
本発明は、ＮＫ細胞及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の治療効果間の有効な相乗作用によって特徴づけられる細胞集団を得ることを可能にする、ＣＡＲ−ＮＫ細胞の作製プロセスの開発に関する。
【００１８】
該作製プロセスは、レンチウイルスベクター形質導入を用いて、ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現するように遺伝子組換えされたＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団を生成することを目的とする第１相、並びに中間細胞集団がＣＡＲ−ＮＫ細胞を含有する細胞集団に拡大及び分化される第２相を含む。先行技術では、生物学的供給源からのＣＤ３４＋幹細胞のウイルス形質導入、それに続くＣＡＲ−ＮＫ細胞への分化のアイデアに基づく、ＣＡＲ−ＮＫ細胞を得るためのいくつかの方法が開示されている。かかる方法の中で、本発明の方法の条件を開示するものはない。さらには、異なるプロトコルを比較することにより、発明者は、意外にも、異なる形質導入及び培養条件が、中間細胞集団、ひいては異なる治療効果をもたらす最終分化ＣＡＲ−ＮＫ細胞集団の性質及び組成物に対する効果を有することを見出した。本発明の作製方法によって入手可能なＣＡＲ−ＮＫ細胞集団は、インビボでより強力な治療効果を有する。
【００１９】
本発明の方法は、次の２相を含む。第１相では、ＣＤ３４＋幹細胞が、生体サンプルから精製され、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを保有するレンチウイルスベクターの形質導入により遺伝子改変される。レンチウイルス形質導入は、サイトカインのコレクションを含む培地の存在下で実施され、そのようにしてＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団が得られ、任意選択的には、サイトカインのコレクションを含む培地中でさらに拡大される。
【００２０】
第２相では、中間細胞集団は、ＣＡＲ−ＮＫ細胞を含有する細胞集団に（さらに）拡大及び分化される。相Ｉから得られるＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞は、好ましくは、前記第１の培地と異なる、サイトカインのコレクションを有する第２の培地中及び第３の培地中で培養され、それにより複数のＣＡＲ−ＮＫ細胞又はＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞又は双方を含有する培養細胞のコレクションが得られる。
【００２１】
意外にも、本発明の方法の性能のために適用される条件により、ＮＫ細胞の内因性抗腫瘍効果とＣＡＲの内因性抗腫瘍効果との間の相乗作用に起因する、より強力な治療効果を有するＣＡＲ−ＮＫ集団を得ることが可能になることが見出された。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＣＤ４４ｖ６結合ドメイン、（４つのＴＮＦＲ−Ｃｙｓドメイン及び全セリントレオニンリッチストークを含む）ＬＮＧＦＲ野生型ロングスペーサー、ＣＤ２８の膜貫通及び共刺激ドメイン、並びにＣＤ３ζ鎖の細胞内ドメインを有するＣＡＲ  ＣＤ４４ｖ６野生型ロング（ＣＤ４４ｖ６−ＮＷＬ）の模式的構造を示す。
【図２】条件Ａ及び条件Ｂにおいて得られたモックＮＫ及びＣＤ４４ｖ６−ＣＡＲ  ＮＫ細胞のインビトロ機能活性であり、同図は、Ｋ５６２、ＭＯＬＴ−４、Ｋ５６２−ＣＤ４４ｖ６又はＭＯＬＴ−４−ＣＤ４４ｖ６細胞で刺激された、条件Ａ（左）又は条件Ｂ（右）の下で得られたモックＮＫ及びＣＡＲ  ＮＫにおけるＣＤ１０７ａ陽性細胞の頻度（パネルＡ；１８時間）又はＴＮＦ−α陽性細胞の頻度（パネルＢ、６時間）を示す。ＣＡＲ  ＮＫ活性の分析は、２つの亜集団、ＬＮＧＦＲ＋細胞及びＬＮＧＦＲ−細胞において実施された。
【図３】十分に確立された疾患モデルにおける条件Ａ及びＢからのモックＮＫ及びＣＤ４４ｖ６  ＣＡＲ−ＮＫ細胞のインビボ抗腫瘍効果である。同図は、各条件における肝臓重量（グラム）を示す。条件Ｂ下で、即ち本発明の方法に従って得られたＣＤ４４ｖ６  ＣＡＲ−ＮＫ細胞は、対照よりも強力な抗腫瘍効果を有するという結果が得られる。
【図４】図４Ａ：ＮＫ細胞の細胞傷害性に対して感受性、中等感受性（intermediate）及び抵抗性を示す、Ｋ５６２、Ｔ９８Ｇ及びＴＨＰ−１腫瘍細胞株の各々に対する条件Ａ及びＢにおけるモックＮＫ（非Ｔ）及びＣＤ４４ｖ６  ＣＡＲ−ＮＫ（Ｔ）細胞からのインビトロ機能性データ（％７ＡＡＤ＋）である。図４Ｂ：再構成後の感受性腫瘍細胞株（Ｋ５６２）に対する条件Ａ及びＢにおけるモックＮＫ（非Ｔ）及びＣＤ４４ｖ６  ＣＡＲ−ＮＫ（Ｔ）細胞からのインビトロ機能性データ（％７ＡＡＤ＋）である。図４Ｃ：再構成後の感受性腫瘍細胞株（Ｋ５６２）に対する条件Ａ及びＢにおけるモックＮＫ（非Ｔ）及びＣＤ４４ｖ６  ＣＡＲ−ＮＫ（Ｔ）細胞の脱顆粒（％ＣＤ１０７ａ＋）である。
【図５】図５Ａ：再構成前の条件ＡからのモックＮＫ（非Ｔ）及びＣＤ４４ｖ６  ＣＡＲ−ＮＫ（Ｔ）細胞の阻害性及び活性化受容体の発現である。図５Ｂ：再構成後の条件Ａ及びＢにおけるモックＮＫ（非Ｔ）及びＣＤ４４ｖ６  ＣＡＲ−ＮＫ（Ｔ）細胞の阻害性及び活性化受容体の発現である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明の様々な好ましい特徴及び実施形態は、ここで非限定的な例示的実施形態により説明されることになる。
【００２４】
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で遺伝子組換えされたＮＫ細胞の集団を作製するための方法を提供する。本発明の方法は、ＮＫ細胞及びＣＡＲの治療効果が相乗的に作用するような細胞集団を得ることを可能にする。発明者は、かかる相乗作用を得るための最適条件を見出した。該プロセスは、ＣＡＲを発現するように遺伝子組換えされた幹細胞を含有する中間細胞集団、即ちＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間集団の生成を目的とした第１相、並びにかかる中間細胞集団がＣＡＲ−ＮＫ細胞を含有する細胞集団に拡大及び分化される第２相という２つの相を含む。
【００２５】
一実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で遺伝子組換えされたＮＫ細胞の集団を作製するための方法であって、
（ｉ）ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを保有するＣＤ３４＋細胞を含有する中間細胞集団を、
ａ）骨髄、末梢血、胎盤又は臍帯血からなる群から選択される生物学的出発サンプルを得るステップと、
ｂ）造血幹細胞をかかる生体サンプルから単離するステップと、
ｃ）単離された造血幹細胞を培地Ｉの存在下で培養するステップと、
ｄ）培養された幹細胞を、ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを保有するレンチウイルスベクターとともにかかる細胞をインキュベートすることにより形質導入し、それによりＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団を得るステップと、
ｅ）任意選択的には、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団を培地Ｉ中で少なくとも１日間培養するステップと、
に従って生成し、ここで培地Ｉが、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、サイトカインの前記コレクションが、インターロイキン−７、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬＴ−３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）の１つ以上、並びに顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）の２つ以上を含む、第１相
（ｉｉ）第１相からのＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団を培地ＩＩ中でさらに拡大し、それによりＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞及びＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞を含有する細胞集団を得て、ここで培地ＩＩが、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、サイトカインの前記コレクションが、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３Ｌ  インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）及びＩＬ−７の２つ以上、並びにＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ６の２つ以上を含む、任意選択的な予備ステップと、
ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する、相Ｉから収集された中間細胞集団、又はＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞及びＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞を含有する、任意選択的な予備ステップから収集された細胞集団を、ＣＡＲ−ＮＫ細胞を含有する細胞集団に拡大及び分化させるステップであって、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する、相Ｉからの中間細胞集団、又はＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞及びＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞を含有する、任意選択的な予備ステップからの細胞集団を、培地ＩＩＩ中で培養し、それによりＮＫ細胞を含有する細胞集団を得ることを含み、ここで培地ＩＩＩが、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、サイトカインの前記コレクションが、ＳＣＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）の２つ以上、並びにＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ−６の２つ以上を含む、ステップと、
を含む第２相
を含む方法が提供される。
【００２６】
培養及び形質導入のため、全部で３つの異なる培地が用いられる：
培地Ｉは、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、ここでサイトカインの前記コレクションは、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬＴ−３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）の１つ以上、並びに顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）の２つ以上を含む。好ましくは、サイトカインのコレクションは、ＩＬ−７及びＳＣＦ、ＦＬＴ−３Ｌ、及びＴＰＯの２つ以上を含み、より好ましくはサイトカインのコレクションは、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３Ｌ、ＴＰＯ及びＩＬ−７を含む。好ましい実施形態では、サイトカインのコレクションは、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ−６を含む。培地ＩがＳＣＦ、ＦＬＴ−３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ−６を含むことは特に好ましい。
【００２７】
培地ＩＩは、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、ここでサイトカインの前記コレクションは、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３Ｌインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）及びＩＬ−７の２つ以上、並びにＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ−６の２つ以上を含む。好ましくは、サイトカインのコレクションは、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３Ｌ、ＩＬ−１５、及びＩＬ−７の３つ以上を含み、より好ましくはサイトカインのコレクションは、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３Ｌ、ＩＬ−１５及びＩＬ−７を含む。好ましい実施形態では、サイトカインのコレクションは、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ−６を含む。培地ＩＩが、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３Ｌ、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ−６を含むことは特に好ましい。
【００２８】
培地ＩＩＩは、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、ここでサイトカインの前記コレクションは、ＳＣＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）の２つ以上、並びにＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ−６の２つ以上を含む。好ましくは、サイトカインのコレクションは、ＳＣＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２の３つ以上を含み、より好ましくはサイトカインのコレクションは、ＳＣＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＩＬ−２を含む。好ましい実施形態では、サイトカインのコレクションは、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ−６を含む。培地ＩＩＩが、ＳＣＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ−６を含むことは特に好ましい。
【００２９】
第１相：  ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間集団の生成
（ｉ）本発明の方法の第１相は、ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを保有するＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団を生成するための条件を提供する。中間細胞集団は、
ａ）骨髄、末梢血、胎盤又は臍帯血からなる群から選択される生物学的出発サンプルを得るステップと、
ｂ）造血幹細胞をかかる生体サンプルから単離するステップと、
ｃ）単離された造血幹細胞を培地Ｉの存在下で培養するステップと、
ｄ）培養された幹細胞を、ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを保有するレンチウイルスベクターとともにかかる細胞をインキュベートすることにより形質導入し、それによりＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団を得るステップと、
ｅ）任意選択的には、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団を培地Ｉ中で少なくとも１日間培養するステップと、
に従って生成し、ここで培地Ｉは、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、サイトカインの前記コレクションが、インターロイキン−７、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬＴ−３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）の１つ以上、並びに顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）の２つ以上を含む。
【００３０】
本発明の方法において用いられるべき出発物質は、体性幹細胞とも称される成体（後胚期）幹細胞を含有する生体サンプルである。本明細書で用いられるとき、生体サンプルという用語は、ヒト由来のサンプルを意味する。好ましい実施形態では、用いられるべき出発物質は、臍帯血である。
【００３１】
本発明の方法によると、ＣＤ３４＋幹細胞は、生体サンプルから単離される。ＣＤ３４＋単離においては様々なプロトコルが当該技術分野で公知であり、例えば免疫磁気選択又は細胞選別に基づく方法が挙げられる。本明細書で用いられるとき、免疫磁気選択は、磁気の使用により抗原構築物の分離を可能にする、磁気粒子に対する抗体のカップリングを指す。
【００３２】
好ましい実施形態では、生体サンプルは、最初に勾配分離又は遠心分離技術を用いて単核球について濃縮され、次に磁気ビーズにコンジュゲートされた特異的な抗ＣＤ３４＋抗体で細胞を標識し、磁気カラムを用いてＣＤ３４＋細胞を精製することにより、免疫磁気選択が施される。さらなる好ましい実施形態では、MidiMACS（商標）Separator、CliniMACS（登録商標）Plus機器又はCliniMACS Prodigy（登録商標）装置を用いて、免疫磁気分離が実施される。
【００３３】
本発明の方法の第１相の間、単離されたＣＤ３４＋幹細胞が、サイトカイン及び増殖因子のカクテルを含む基礎培地の存在下で最初に培養され、次に形質導入される。多数の基礎培地が公知である。選択は以下に示されるが、さらに多くが好適なことがある。基礎培地として、限定はされないが、ＢＥＭ（基本イーグル培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、グラスゴー最少必須培地、Ｍ１９９基本培地、ハムＦ−１０、ハムＦ−１２、イスコフＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、レイボビッツＬ１５、ＭＣＤＢ、マッコイ５Ａ、StemSpan H3000（登録商標）及びStemSpanSFEM（登録商標）、Stemline I（商標）及びStemline II（商標）、Glycostem Basal growth medium（ＧＢＧＭ（商標））；X-Vivo10（商標）、X-Vivo15（商標）及びX-Vivo20（商標）CellGenix（登録商標）幹細胞増殖培地などが挙げられる。これらの基礎培地の組み合わせも用いることができる。好ましくは、無血清製剤、例えば、Stemline I（商標）及びStemline II（商標）、StemSpan H3000（登録商標）、StemSpan SFEM（登録商標）又はX-Vivo10（商標）、ＧＢＧＭ、X-Vivo15（商標）及びX-Vivo20（商標）は、培養の開始時点で、ヒト血清の添加の存在下及び／又は不在下で用いられる。代替的に、又は追加的に、基礎培地は、別の（ヒト）血液誘導体、例えば、血小板ライセート、自家若しくは同種ドナー血清、（血小板リッチ）血漿、アルブミン、又は血清に対する合成代替物、例えば、グロブリン濃縮タンパク質サプリメントなどで補完されてもよい。本明細書に与えられる量は、典型的には培養に適する。該量は、培養が開始される異なる量の細胞にとって適応してもよい。本発明に従う様々な培養ステップにて用いられる培地は、本発明に従う規定された時点で、拡大培地又は分化培地のいずれか、及び／又は代替的には拡大＋分化培地を提供するため、好ましくはサイトカインの異なる組み合わせと一緒に、それらの血清含量が変化し得る。
【００３４】
ＣＤ３４＋幹細胞は、単離時、０．５×１０６〜２×１０６個の細胞／ｍｌの範囲の濃度で、プレート、フラスコ、細胞工場又はバッグなどの容器に播種される。好ましい実施形態では、細胞は、１×１０６個の細胞／ｍｌの濃度で播種される。
【００３５】
一実施形態では、細胞は、フィブロネクチンの断片、例えばＣＨ−２９６（レトロネクチン（登録商標））の断片又は機能的誘導体で予めコーティングされた容器に播種される。レトロネクチン（登録商標）は、細胞容器の表面上にコーティングされるとき、ウイルスベクター媒介遺伝子の哺乳動物細胞への形質導入を有意に増強する。好ましい実施形態では、細胞容器は、レトロネクチン（登録商標）でコーティングされる。
【００３６】
一旦播種されると、幹細胞は、培地Ｉ中で培養される。一実施形態では、培養相は、少なくとも１２〜４８時間、より好ましくは２２＋／−２時間にわたり実施されてもよい。好ましい一実施形態では、培地Ｉは、サイトカインの１つ以上を、２〜１００ｐｇ／ｍｌの間、好ましくは５〜５０ｐｇ／ｍｌの間、最も好ましくは約１０ｐｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、１００〜１０００ｐｇ／ｍｌの間、好ましくは１５０〜５００ｐｇ／ｍｌの間、最も好ましくは約２５０ｐｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ、４ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌの間、最も好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、４ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌの間、最も好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３−Ｌ、４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１０〜５０ｎｇ／ｍｌの間、最も好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、５〜５００ｐｇ／ｍｌの間、好ましくは２５〜１００ｐｇ／ｍｌの間、最も好ましくは約５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６、及び／又は４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１０〜５０ｎｇ／ｍｌの間、最も好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ７といった濃度範囲で含む。本発明のより好ましい態様では、培地Ｉは、約２５ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、約２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３−Ｌ、約２５ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、約２５０ｐｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ、約１０ｐｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、約５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６、及び約２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ７といった濃度でサイトカインを含む。「約」を伴うことは、この文脈では、約２０％、好ましくは１０％、より好ましくは５％、最も好ましくは２％の偏差を意味する。
【００３７】
特定の好ましい一実施形態では、本発明に従う方法が提供され、ここで培地Ｉは、ＳＣＦを４ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、又はＦｌｔ３−Ｌを４ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、又はＴＰＯを４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、又はＩＬ７を４ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、又はこれらサイトカインのいずれかの組み合わせを特定範囲内の濃度で含む。
【００３８】
より好ましい実施形態では、本発明に従う方法が提供され、ここで培地Ｉは、ＧＭ−ＣＳＦを２ｐｇ／ｍｌ〜１００ｐｇ／ｍｌの間の濃度で、又はＧ−ＣＳＦを１００ｐｇ／ｍｌ〜１０００ｐｇ／ｍｌの間の濃度で、又はＩＬ６を５〜５００ｐｇ／ｍｌの間で、又はこれらサイトカインのいずれかの組み合わせを特定範囲内の濃度で含む。
【００３９】
好ましくは、培地Ｉは、４〜１００μｇ／ｍｌの間のヘパリン、好ましくは１０〜４０μｇ／ｍｌの間のヘパリン、より好ましくは約２０μｇ／ｍｌのヘパリンを含む。好ましくは、培地Ｉは、０．５〜２５％の間の血清、より好ましくは１〜２０％の間の血清、最も好ましくは約１０％の血清を含む。好ましくは、血清は、ヒト血清である。別の好ましい実施形態では、培地Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは、互いに独立であり、別の（ヒト）血液誘導体、例えば、血小板ライセート、自家若しくは同種ドナー血清、（血小板リッチ）血漿、アルブミン、又は血清に対する合成代替物、例えば、グロブリン濃縮タンパク質サプリメントなどを含む。血清に対するかかる代替物の最適濃度は、当業者により容易に測定され得る。
【００４０】
培養するステップの後、ＣＤ３４＋幹細胞は、ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現するように遺伝子組換えされる。幹細胞の遺伝子工学を実施するために用いられる技術は、レンチウイルス形質導入である。本明細書で用いられるとき、形質導入又はレンチウイルス形質導入という用語は、レンチウイルスベクターを用いての外来ポリヌクレオチドの細胞のゲノムへの導入を指す。レンチウイルスベクターという用語は、核酸導入を媒介するレンチウイルス粒子を指すために用いられる。
【００４１】
本発明の方法によると、形質導入は、ＣＤ３４＋幹細胞を、培地Ｉの存在下で、ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを保有するレンチウイルスベクターとともにインキュベートすることにより実施される。一実施形態では、インキュベーションは、培地の少なくとも半分を、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを保有するレンチウイルスベクターを含有する新しい培地Ｉと置換することにより実施される。
【００４２】
別の実施形態では、インキュベーションは、ＣＤ３４＋幹細胞を、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを保有するレンチウイルスベクターを含有する新しい培地Ｉに再懸濁することにより実施され、次にかかる再懸濁物は、１×１０６〜１０×１０６個の細胞／ｍｌ、好ましくは２×１０６〜５×１０６個の細胞／ｍｌの範囲、最も好ましくは約２×１０６の濃度で細胞容器内に播種される。
【００４３】
本明細書で用いられるとき、用語「形質導入の実行」は、ＣＤ３４＋幹細胞の新しいレンチウイルスベクターとのインキュベーションの単一サイクルを指す。インキュベーションにおける期間は、レンチウイルスベクターの性質に応じて変化することがある。好ましい実施形態では、形質導入の実行中、ＣＤ３４＋幹細胞は、１０〜２４時間、好ましくは１３〜２０時間、より好ましくは約１５時間の期間にわたり、レンチウイルスベクターとともにインキュベートされてもよい。「約」を伴うことは、この文脈では、約２０％、好ましくは１０％、より好ましくは５％、最も好ましくは２％の偏差を意味する。本発明の方法によると、形質導入は、１つ以上の形質導入の実行を含んでもよい。本発明の別の態様では、細胞容器は、レトロネクチン（登録商標）でコーティングされてもよい。
【００４４】
形質導入は、ポリブレン、プロタミン硫酸塩又はコンドロイチン硫酸塩などの、形質導入の効率を増強するさらなる添加剤の存在下で実施されてもよい。
【００４５】
レンチウイルスベクターは、ベクターの性質に依存する異なる濃度でＣＤ３４＋幹細胞とともにインキュベートされてもよい。好ましくは、形質導入は、１０〜２００の範囲の感染多重度（ＭＯＩ）でのレンチウイルスベクターのインキュベーションにより実施される。ＭＯＩは、規定された空間内に存在する標的細胞の数に対するレンチウイルスベクター粒子の数の比である。好ましい実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１００のＭＯＩでインキュベートされる。
【００４６】
形質導入により、ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを保有するＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団の生成がもたらされる。
【００４７】
そのようにして得られたＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団は、作製方法の第２相に移行する前、新しい培地Ｉの存在下で、少なくともさらに１日間培養されてもよい。
【００４８】
別の実施形態では、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団は、形質導入の終了時、凍結されてもよい。別の実施形態では、中間細胞集団は、新しい培地Ｉの存在下で、少なくともさらに１日間培養されてもよく、次いで凍結されてもよい。
【００４９】
作製の第２相は、形質導入の終了後又は培養から１日以上経てから、又はＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する凍結された中間細胞集団の解凍時、実施され得る。好ましくは、第２相は、培地Ｉ中での全体で少なくとも７培養日後、実施される。
【００５０】
本発明の一実施形態では、本発明の方法の第１相により入手可能なＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団が提供される。
【００５１】
別の実施形態では、本発明の方法の第１相は、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を選択し、ひいてはＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞の純粋な集団を得るステップをさらに含んでもよい。当業者は、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を選択するため、当該技術分野で公知の異なる方法を適用してもよい。一実施形態では、ＣＤ３４＋幹細胞は、ＣＡＲをコードする１つのポリヌクレオチド、及び免疫選択用のマーカーとして用いられるべきＣＤ３４＋細胞によって通常は発現されない選択可能タンパク質をコードするさらなるポリヌクレオチドを保有するレンチウイルスベクターで形質導入されてもよい。
【００５２】
マーカーとしての使用に適した選択可能タンパク質の例が、受容体タンパク質の切断形態、例えばヒト低親和性神経成長因子の細胞外ドメイン（ΔＬＮＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体、ＣＤ１９又はＣＤ２０などである。このように、形質導入されたＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞は、ＣＡＲと選択可能タンパク質とを同時発現することになり、それ故、免疫磁気選択法を用いて、磁気ビーズにコンジュゲートされている抗体など、選択可能マーカーに標的化される特異的抗体で細胞を標識し、磁気カラムを用いてＣＡＲ−ＣＤ３４＋細胞を精製することにより、選択されてもよい。さらなる好ましい実施形態では、免疫磁気分離は、MidiMACS（商標）Separator、CliniMACS（登録商標）Plus機器又はCliniMACS Prodigy（登録商標）装置を用いて実施される。
【００５３】
別の好ましい実施形態では、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞は、抗体がＣＡＲ分子の選択可能領域に標的化される場合の免疫磁気選択法により選択されてもよい。例えば、ＣＤ３４＋幹細胞は、ＣＡＲをコードする１つのポリヌクレオチドを保有するレンチウイルスベクターで形質導入されてもよく、かかるＣＡＲは、免疫選択用のマーカーとしての使用を意図したスペーサードメイン、即ち磁気ビーズにコンジュゲートされた抗体によって特異的に認識可能なスペーサードメインを有し、それ故、磁気カラムを用いてＣＡＲ−ＣＤ３４＋細胞の精製を可能にする。好ましくは、免疫磁気分離は、MidiMACS（商標）Separator、CliniMACS（登録商標）Plus機器又はCliniMACS Prodigy（登録商標）装置を用いて実施される。好ましくは、マーカーとしての使用を意図したスペーサードメインは、ＣＤ３４＋細胞により通常は発現されないタンパク質の細胞外ドメインから誘導される。さらなる好ましい実施形態では、ＣＤ３４＋幹細胞は、ＣＡＲをコードする１つのポリヌクレオチドを保有するレンチウイルスベクターで形質導入されてもよく、ここでＣＡＲは、ヒト低親和性神経成長因子の１つの細胞外ドメイン（ΔＬＮＧＦＲ）によって誘導されるスペーサードメインを有する。
【００５４】
前記の通り、形質導入が生じる（即ち培地Ｉ中で培養する）場合の培養条件、即ち、形質導入前に培養すること、形質導入の実行１及び２中に培養すること、並びに形質導入後に培養することなどは、好ましくは全体で少なくとも７日間継続される。その後、ＮＫ細胞への拡大及び分化を含む第２相が開始される。
【００５５】
第２相：ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団のＣＡＲ−ＮＫ細胞を含有する細胞集団への拡大及び分化
本発明の方法の第２相は、中間細胞集団（又はさらに拡大された細胞集団（下記参照）が、ＣＡＲ−ＮＫ細胞を含有する細胞集団に拡大及び分化されるような条件であって、第１相からのＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間（又はさらに拡大された）細胞集団を培地ＩＩＩ中で培養し、それによりＮＫ細胞を含有する細胞集団を得ることを含む条件を提供し、ここで培地ＩＩＩは、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、サイトカインの前記コレクションは、ＳＣＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）の２つ以上及びＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ−６の２つ以上を含む。中間細胞集団（又はさらに拡大された細胞集団）は、培地ＩＩＩ中で少なくとも７日間培養され、それにより複数のＣＡＲ−ＮＫ細胞又はＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞又は双方を含有する培養細胞のコレクションが得られる。
【００５６】
本発明のさらなる態様では、該方法は、第２相においては、培地ＩＩ中で第１相からのＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団を培養し、それによりＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞及びＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞を含有する細胞集団を得る予備ステップをさらに含み、ここで培地ＩＩは、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、サイトカインの前記コレクションは、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３Ｌインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）及びＩＬ−７の２つ以上、並びにＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ６の２つ以上を含む。
【００５７】
培地ＩＩでの予備培養ステップは、任意選択的であり、さらなるＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞又はＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞を得て、分化を目的とする培地ＩＩＩでの培養ステップに移行することを対象とする。この予備培養ステップでは、相Ｉから収集されたＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団が培地ＩＩ中で少なくとも４日間培養され、それにより、ＮＫ細胞株に深く関与する複数のＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞を含有する、培養されたＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞、ＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞又は双方のコレクションが得られる。
【００５８】
好ましい一実施形態では、培地ＩＩは、サイトカインの１つ以上を、５０ｐｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１５０〜４００ｎｇ／ｍｌの間のＧ−ＣＳＦ、２〜１００ｐｇ／ｍｌの間、好ましくは５〜２５ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、４〜３００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌの間のＳＣＦ、４ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間のＦｌｔ３−Ｌ、４ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間のＩＬ１５、２ｐｇ／ｍｌ〜５００ｐｇ／ｍｌの間、好ましくは２０ｐｇ／ｍｌ〜２００ｐｇ／ｍｌの間のＩＬ−６、及び／又は４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの間のＩＬ７といった濃度範囲で含む。本発明のより好ましい態様では、培地ＩＩは、約１０ｐｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、約２５０ｐｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ、約２５ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、約２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３−Ｌ、約２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５、約５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６、及び約２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ７といった濃度でサイトカインを含む。「約」を伴うことは、この文脈では、約２０％、好ましくは１０％、より好ましくは５％、最も好ましくは２％の偏差を意味する。好ましくは、培地ＩＩは、４〜１００μｇ／ｍｌの間のヘパリン、好ましくは１０〜４０μｇ／ｍｌの間のヘパリン、より好ましくは約２０μｇ／ｍｌのヘパリンを含む。好ましくは、培地ＩＩは、０．５〜２５％の間の血清、より好ましくは１〜２０％の間の血清、最も好ましくは約１０％の血清を含む。好ましくは、血清は、ヒト血清である。
【００５９】
好ましい一実施形態では、培地ＩＩＩは、サイトカインの１つ以上を、５０ｐｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１５０〜４００ｎｇ／ｍｌの間のＧ−ＣＳＦ、２ｐｇ／ｍｌ〜１００ｐｇ／ｍｌの間、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌの間のＧＭ−ＣＳＦ、４ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間のＳＣＦ、２００Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの間、好ましくは５００〜２０００Ｕ／ｍｌの間のＩＬ−２、４ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間のＩＬ１５、２ｐｇ／ｍｌ〜５００ｐｇ／ｍｌの間、好ましくは２０ｐｇ／ｍｌ〜２００ｐｇ／ｍｌの間のＩＬ−６、及び／又は４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの間のＩＬ７といった濃度範囲で含む。本発明のより好ましい態様では、培地ＩＩＩは、約１０ｐｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、約２５０ｐｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ、約２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５、約５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６、約１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、及び約２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ７といった濃度でサイトカインを含む。「約」を伴うことは、この文脈では、約２０％、好ましくは１０％、より好ましくは５％、最も好ましくは２％の偏差を意味する。好ましくは、培地ＩＩＩは、０．５〜１０％の間の血清、より好ましくは１〜５％の間の血清、最も好ましくは約２％の間の血清を含む。好ましくは、血清は、ヒト血清である。
【００６０】
キメラ抗原受容体
本発明の方法で用いられるべきレンチウイルスベクターは、ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを保有する。本発明の方法で用いられるべきＣＡＲは、
（ｉ）抗原特異的標的化ドメイン；
（ｉｉ）スペーサードメイン；
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；
（ｉｖ）任意選択的には少なくとも１つの共刺激ドメイン；及び
（ｖ）細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む組換えキメラ受容体である。
【００６１】
本発明の方法で用いられるべきＣＡＲの細胞外ドメインは、目的の標的抗原に結合する機能を有する抗原特異的標的化ドメインを含む。
【００６２】
抗原特異的標的化ドメインは、標的抗原に特異的に結合する、任意の天然に存在する合成、半合成、若しくは組換え技術により生成される分子、タンパク質、ペプチド又はオリゴペプチドであってもよい。
【００６３】
考えられる抗原特異的標的化ドメインの例として、抗体又は抗体断片若しくは誘導体、標的化受容体の合成若しくは天然に存在するリガンド、例えば分子、受容体の結合若しくは細胞外ドメイン又は結合タンパク質が挙げられる。
【００６４】
好ましい実施形態では、抗原特異的標的化ドメインは、抗体であるか又は抗体から誘導される。抗体は、抗原と結合することができる免疫グロブリンから誘導される、タンパク質、又はポリペプチド配列である。本明細書で用いられるような抗体は、天然又は組換え供給源のいずれかに由来する、ポリクローナル又はモノクローナル、多重又は一本鎖抗体、及び免疫グロブリンを含む。
【００６５】
抗体由来の標的化ドメインは、抗体の断片又は抗体の１つ以上の断片の遺伝子改変産物であり得、ここで断片は、抗原との結合に関与する。例として、可変領域（Ｆｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、Ｆａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）及びラクダ抗体（ＶＨＨ）が挙げられる。
【００６６】
好ましい実施形態では、結合ドメインは、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、マウス、ヒト又はヒト化ｓｃＦｖであってもよい。
【００６７】
好ましい実施形態では、標的抗原は、腫瘍抗原である。
【００６８】
本明細書で用いられるとき、腫瘍抗原という用語は、腫瘍細胞上に発現される抗原、例えば、腫瘍細胞上に見出され、且つ正常組織上に実質的には見出されないか又は発現が失活した正常組織に制限されるバイオマーカー又は細胞表面マーカーを含む。
【００６９】
好ましい実施形態では、本発明の方法で用いられるＣＡＲは、Ｃｄ４４ｖ６腫瘍抗原に標的化される。
【００７０】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法のＣＡＲにおける抗原特異的標的化ドメインは、抗ＣＤ４４ｖ６  ｓｃＦｖである。抗ＣＤ４４ｖ６  ｓｃＦｖは、米国特許第６，９７２，３２４号に開示された抗ＣＤ４４ｖ６抗体から誘導されてもよい。
【００７１】
スペーサードメイン
本発明の方法で用いられるべきＣＡＲは、抗原特異的標的化ドメインを膜貫通ドメインに接続する細胞外スペーサードメインを含む。スペーサーとして用いられる最も一般的な配列は、定常免疫グロブリンＩｇＧ１ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインである。このスペーサーの突然変異体及び／又は変異体は、当該技術分野で開示され、例えば、Hombach et al. 2010 Gene Ther. 17:1206-1213は、Ｆｃ受容体の結合を低減するため、ヒトｌｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３ドメインがｐｖａ／ａ突然変異で修飾されたスペーサーを開示している。
【００７２】
好ましい実施形態では、本発明の方法において用いられるＣＡＲのスペーサーは、国際公開第２０１６／０４２４６１号で開示されるようなヒト低親和性神経成長因子（ＬＮＧＦＲ）の細胞外ドメインから誘導される断片である。この属内に該当する考えられる配列の中で、国際公開第２０１６／０４２４６１号は、４つの特定種：（ｉ）ＬＮＧＦＲの全細胞外ドメイン（即ち：４つのＴＮＦＲ−Ｃｙｓドメイン及びセリントレオニンリッチストークを含む）；（ｉｉ）ＬＮＧＦＲの全細胞外ドメインの突然変異バージョン（かかる突然変異は、３つの特定アミノ酸によって置換された４番目のＴＮＦＲ−Ｃｙｓドメインの断片の欠失からなる）；（ｉｉｉ）ＬＮＧＦＲの細胞外ドメインの４つのＴＮＦＲ−Ｃｙｓドメインのみを含む断片；（ｉｖ）ＬＮＧＦＲの細胞外ドメインの最初から３つのＴＮＦＲ−Ｃｙｓドメイン及び４番目の突然変異バージョンを含む断片（かかる突然変異は、３つの特定アミノ酸によって置換された４番目のＴＮＦＲ−Ｃｙｓドメインの断片の欠失からなる）を開示している。
【００７３】
ＬＮＧＦＲは、ヒト造血細胞の大部分において発現されず、それ故、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された細胞の選択及び免疫蛍光による形質導入遺伝子発現の定量分析を容易にするため、ＬＮＧＦＲに由来するスペーサー単位を用いることができる。本発明のさらなる態様では、作製方法での第１相は、形質導入後に、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞の免疫磁気選択ステップをさらに含んでもよい。例えば、形質導入ステップの終了後、該細胞は、磁気ビーズにコンジュゲートされ、ＬＮＧＦＲ由来スペーサーを認識することができ、それ故、磁気カラムを用いてのＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞の精製を可能にする抗体とともにインキュベートされてもよい。
【００７４】
ＬＮＧＦＲ由来スペーサーの例が以下に報告される。
【００７５】
スペーサーＬＮＧＦＲ野生型ロング（ＮＷＬ）：
タンパク質配列（配列番号１）：
【化１】
2021525066.tif 000003
ヌクレオチド配列（配列番号２）：
【化２】
2021525066.tif 000004
【００７６】
スペーサーＬＮＧＦＲ野生型ショート（ＮＷＳ）：
タンパク質配列（配列番号３）：
【化３】
2021525066.tif 000005
ヌクレオチド配列（配列番号４）：
【化４】
2021525066.tif 000006
【００７７】
スペーサーＬＮＧＦＲ突然変異型ロング（ＮＭＬ）：
タンパク質配列（配列番号５）：
【化５】
2021525066.tif 000007
ヌクレオチド配列（配列番号６）：
【化６】
2021525066.tif 000008
【００７８】
スペーサーＬＮＧＦＲ突然変異型ショート（ＮＭＳ）：
タンパク質配列（配列番号７）：
【化７】
2021525066.tif 000009
ヌクレオチド配列（配列番号８）：
【化８】
2021525066.tif 000010
【００７９】
膜貫通ドメイン
本発明の方法で用いられるべきＣＡＲは、スペーサードメインとシグナル伝達ドメインとの間の膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然供給源又は合成供給源のいずれかから誘導されてもよい。天然供給源から誘導される該ドメインは、Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型膜貫通タンパク質のいずれかを含む任意の膜結合又は膜貫通タンパク質からの膜貫通配列を含んでもよい。ＣＡＲにおいて用いてもよい膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα、β若しくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＡＰ１０又はＤＡＰ１２から誘導されてもよい。合成供給源から誘導されるドメインは、主にロイシン及びバリンなどの残基を含む疎水性配列を含むことになる。
【００８０】
先行技術では、１）ＣＤ２８  ＴＭ領域（Pule et al, Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41; Brentjens et al, CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35; Casucci et al, Blood, 2013, Nov 14;122(20):3461-72.；２）ＯＸ４０  ＴＭ領域（Pule et al, Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41）；３）４１ＢＢ  ＴＭ領域（Brentjens et al, CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35）；４）ＣＤ３ζ  ＴＭ領域（Pule et al, Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41; Savoldo B, Blood, 2009, Jun 18;113(25):6392-402.）；５）ＣＤ８ａ  ＴＭ領域（Maher et al, Nat Biotechnol, 2002, Jan;20(1):70-5.; Imai C, Leukemia, 2004, Apr;18(4):676-84; Brentjens et al, CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35; Milone et al, Mol Ther, 2009, Aug;17(8):1453-64）など、ＣＡＲにおいて使用可能な膜貫通ドメインの例が開示されている。
【００８１】
当業者により、膜貫通ドメインのさらなる例が本発明の方法で用いられるべきＣＡＲに適用されてもよい。
【００８２】
一実施形態では、本発明の方法において用いられるＣＡＲは、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ８ａ、ＣＤ４又はそれらの組み合わせの膜貫通ドメインのいずれか１つ以上から選択される膜貫通ドメインを含む。
【００８３】
好ましくは、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８から誘導される。
【００８４】
より好ましくは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインは、配列ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号９）からなる。
【００８５】
一実施形態では、膜貫通及び細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号９に対する少なくとも８５、９０、９５、９７、９８又は９９％の同一性を含む。
【００８６】
共刺激ドメイン
本発明の方法において用いられるＣＡＲは、細胞質側末端に１つ以上の共刺激ドメインを含んでもよい。かかるドメインは、１つ以上の共刺激タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）の細胞内シグナル伝達ドメインから構成されてもよい。共刺激ドメインの機能は、追加的なシグナルを細胞に提供することにより、細胞拡大、細胞生存及びメモリー細胞の発生を増強することである。
【００８７】
本発明の方法において用いられるＣＡＲは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＤａｐｌＯ、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ−１、ＴＮＦＲ−ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２又はそれらの組み合わせの細胞内ドメインからなる群から選択される１つ以上の共刺激ドメインを含んでもよい。共刺激ドメインのさらなる例が、ＣＡＲにおける当業者により利用されてもよい。
【００８８】
一実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２８の細胞内ドメインから誘導される。好ましい実施形態では、膜貫通及び共刺激ドメインはいずれもＣＤ２８から誘導される。一実施形態では、膜貫通及び細胞内共刺激ドメインは、以下の配列を含む。
【００８９】
ヒトＣＤ２８の膜貫通及び細胞内部分（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ１０７４７、ＣＤ２８＿ＨＵＭＡＮ、１５３〜２２０位）
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号１０）
【００９０】
一実施形態では、膜貫通及び共刺激ドメインは、配列番号１０に対して少なくとも８５、９０、９５、９７、９８又は９９％の同一性を含む。
【００９１】
一実施形態では、ＣＡＲの細胞内共刺激ドメインは、ＣＤ２８の細胞内ドメインから誘導され、配列
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号１１）
を含む。
【００９２】
細胞内シグナル伝達ドメイン
本発明の方法において用いられるＣＡＲはまた、細胞内シグナル伝達ドメインを含んでもよい。このドメインは、細胞質内に存在してもよく、活性化シグナルを伝達し、細胞がその専門化された機能を果たすように指示する。細胞内シグナル伝達ドメインの例として、限定はされないが、Ｔ細胞受容体のζ鎖又はその相同体のいずれか（例えば、η鎖、ＦｃεＲ１γ及びβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖など）、ＣＤ３ポリペプチド（Δ、δ及びε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０など）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎなど）及びＴ細胞シグナル伝達に関与する他の分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ５及びＣＤ２８が挙げられる。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＦｃｙＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、細胞質受容体を有する免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【００９３】
好ましい実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００９４】
一実施形態では、ヒトＣＤ３ζ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインは、以下の配列を含む。
ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ２０９６３、ＣＤ３Ｚ＿ＨＵＭＡＮ、３１〜１４３位
【化９】
2021525066.tif 000011
【００９５】
一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１２に対して少なくとも８５、９０、９５、９７、９８又は９９％の同一性を含む。
【００９６】
さらなる細胞内シグナル伝達ドメインは、当業者にとって明らかと思われ、本発明の代替的な実施形態に関連して用いられてもよい。
【００９７】
ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドという用語は、本明細書で用いられるとき、ＤＮＡ又はＲＮＡ断片を形成するヌクレオチドのポリマーと定義される。当業者は、真核生物の遺伝暗号の６４のコドンが、２０の天然に存在するアミノ酸及び３の停止コドンのみをコードし、アミノ酸残基のコード化に関連して遺伝暗号縮重を与えるという一般的知見を有している。遺伝暗号の縮重の観点では、異なるポリヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードしてもよい。通常の技法を適用することにより、ヌクレオチド置換を有するが、依然として本発明のポリペプチドをコードする異なるポリペプチド配列を精巧に作製することは可能である。ポリヌクレオチドを修飾するための方法は、当該技術分野で公知であり、当業者により、ポリペプチドの活性若しくは安定性を改善するか、又はスプライシング現象を回避するように適用されてもよい。
【００９８】
本発明のポリヌクレオチドは、当該技術分野で利用可能な任意の手段、例えば限定はされないが、通常のクローニング技術、ＰＣＲ（商標）などを用いる、組換え手段、即ち組換えライブラリー又は細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングにより、並びに合成手段により、得てもよい。本発明で用いられるポリヌクレオチドは、コドン最適化されてもよい。コドン最適化は、目的の細胞内でのタンパク質発現を増加又は低下させることを意図した当該技術分野で公知の技術である（国際公開第１９９９／４１３９７号及び国際公開第２００１／７９５１８号）。複数のコドンが同じアミノ酸をコードし得ることが多いが、コドンの優先的使用は各生物において異なる。したがって、各生物では、特定のコドンに対応するｔ−ＲＮＡは、それ以外よりも大量に存在する。宿主細胞内でのタンパク質発現を増加させるため、ポリヌクレオチドは、タンパク質のアミノ酸配列に影響することなく、最も大量の縮重ｔＲＮＡとのコドンマッチングを用いることにより、合成又は修飾されてもよい。
【００９９】
レンチウイルスベクター
好ましい実施形態では、本発明において用いられるべきベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、本明細書で用いられるとき、レトロウイルスベクターのファミリー内の属を指す。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができることから、レトロウイルスベクターの中で固有の特性を有する。レンチウイルスベクターは、インビボで遺伝子導入の有意なレベルを達成するための手段を提供する。
【０１００】
レンチウイルスの詳細なリストが、Coffin et al (“Retroviruses” 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds:  JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763)の中に見出されることがある。要するに、レンチウイルスは、霊長類及び非霊長類グループに分かれ得る。霊長類レンチウイルスの例として、限定はされないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長類レンチウイルスグループは、プロトタイプ「スローウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、並びに関連ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）及びより最近特徴づけられた猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）及びウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）を含む。
【０１０１】
好ましい実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶレンチウイルスから誘導され、より好ましくは、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ−１レンチウイルスから誘導される。
【０１０２】
本発明の方法において用いられるべき例示的なレンチウイルスベクターは、レンチウイルスゲノムの少なくとも以下の部分：ａ）５’ロング末端リピート（ＬＴＲ）；ｂ）パッケージング配列ｐｓｉ；ｃ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）；ｄ）目的の遺伝子に作動可能に連結されるプロモーター；ｅ）３’ロング末端リピート（ＬＴＲ）を含む。好ましい実施形態では、５’ＬＴＲのＵ３領域は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、又はサルウイルス４０（ＳＶ４０）からなる群から選択される異種プロモーターと置換され；それによりレンチウイルス転写がｔａｔ非依存性になる。さらなる好ましい実施形態では、３’ＬＴＲ配列は、Ｕ３領域の欠失を有する（即ち、ベクターは、自己不活性化ベクター又はＳＩＮベクターである）。レンチウイルスベクターは、レンチウイルス中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）及びマーモット肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ））をさらに含んでもよい。
【０１０３】
本発明における使用を意図したさらなる例示的なレンチウイルスベクターは、２つのコード配列を逆方向に発現し、それにより効率的な二重遺伝子導入を可能にするための双方向性プロモーターを含む、Amendola et al, Nat Biotechnol. 2005 Jan;23(1):108-16に記載のベクターである。双方向性プロモーターは、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）又はポリユビキチンＵＢＩ−Ｃ遺伝子から誘導された効率プロモーターに上流で且つ逆方向に連結された、ヒトサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）からの最小のコアプロモーターエレメントによって構成される。１つの単一構築物においてＣＡＲ及び自殺遺伝子を発現するため、双方向性プロモーターを組み込むこのレンチウイルスベクターが用いられてもよい。本発明の好ましい態様では、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、より好ましくは、国際公開第２００５／１２３９１２号に開示のようなＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の非スプライシング変異体である。さらに好ましい実施形態では、自殺遺伝子は、以下のポリヌクレオチド配列によってコードされるＨＳＶ−ＴＫ  Ｍｕｔ２である。
【化１０】
2021525066.tif 000012
本発明の別の態様では、インビボでＮＫ細胞の生存及び増殖を改善することができるＣＡＲ及びサイトカインの発現を可能にする双方向性プロモーターを含むレンチウイルスベクターが提供される。好ましい実施形態では、サイトカインＩＬ１５がそのように用いられてもよい。
【０１０４】
レンチウイルスベクターの作製は、一過性の又は安定なパッケージングシステムを用いて実施されてもよい。一過性システムでは、パッケージング細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３ＴＨＥＫ２９３−ＳＦ、ＴＥ６７１、ＨＴ１０８０又はＨｅＬａ、）は、少なくとも、レンチウイルスＧａｇ／Ｐｏｌをコードするパッケージングプラスミド、目的のエンベロープタンパク質をコードするプラスミド、及び上に開示のような必須のレンチウイルスゲノムエレメントを保有する導入プラスミド、並びに目的の遺伝子が同時トランスフェクトされる。さらなる一過性システムでは、レンチウイルス調節タンパク質Ｒｅｖが、第４の別のプラスミド上で、トランスで発現されてもよい。好適なｅｎｖ遺伝子の例として、限定はされないが、ＶＳＶ−Ｇ  ｅｎｖ、ＭＬＶ４０７０  ｅｎｖ、ＲＤ１１４  ｅｎｖ、ＲＤ１１４〜ＴＲ、ＲＤ１１４ｐｒｏ、バキュロウイルスの５ＧＰ６４  ｅｎｖ、ＧＡＬＶ、又は麻疹ウイルスから誘導されるエンベロープタンパク質が挙げられる。同時トランスフェクションは、当該技術分野で周知の方法を用いて、例えばリン酸カルシウム又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）若しくはリポフェクタミン（商標）２０００ＣＤなどの市販製剤を用いて実施されてもよい。レンチウイルスベクターの作製用の安定なパッケージング細胞株は、例えば、国際公開第２０１２／０２８６８１号、国際公開第２００４／０２２７６１号、Broussau et al. Mol. Ther. 2008; 16 (3), 500-507又はThrom et al. 2009 May 21;113(21):5104-10に開示されている。
【０１０５】
細胞
本発明は、本発明の方法によって得ることができるＣＡＲ−ＮＫ細胞を含む組成物をさらに提供する。意外にも、キメラ抗原受容体を保有するレンチウイルスベクターの幹細胞への形質導入に適用される条件が、拡大相及び分化相に起因し、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団の性質及び組成に対して、並びにＣＡＲ−ＮＫ細胞を含有する最終細胞集団の場合に対して影響を有することが見出された。本発明の方法によって得ることができるＣＡＲ−ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞とＣＡＲとの間での相乗的治療効果を提示する。かかる効果は、異なる作製方法を用いて得られる効果よりも強力となる。したがって、本発明は、医薬における使用を意図した、より好ましくは免疫療法における使用を意図した、特に腫瘍及び血液学的悪性腫瘍の治療を意図した、本発明の方法によって得ることができるＣＡＲ−ＮＫ細胞を含む組成物をさらに提供する。
【０１０６】
用語「免疫療法」は、がんなどの疾患と闘うために個人の免疫系の特定部分を用いる治療を意味する。免疫系の該部分は、疾患を有する個人からだけでなく、例えば本発明における場合、「ドナー」と称される別の個人から得ることができる。本発明に従う使用を意図した組成物は、好ましくは細胞に基づく免疫療法において用いられ、ここでは自家のハプロタイプ不一致ドナーから誘導される免疫エフェクター細胞が、それを必要とするレシピエントに投与される。
【０１０７】
本発明では、好ましくはＴ細胞汚染を有しない、例えば臍帯血（ＵＣＢ）由来のＣＤ３４＋前駆細胞からの免疫エフェクター細胞の大規模バッチの作製用のＧＭＰ適合の培養系を用いて作製される細胞が、好ましくは用いられる。かかる細胞は、例えば制御プロセスをずっと容易にするようなより高い一致を有することから、用いることが有利である。同時に、以前、安全性への懸念故の想定されるレシピエントとの少なくとも部分的な一致に基づいて個別のバッチが作製される必要があったことから、本発明は、免疫エフェクター細胞のかかる大規模バッチの使用を可能にする。しかし、本発明は、本発明で定義のような免疫エフェクター細胞が、ハプロタイプ一致であることを超えてミスマッチであり、免疫療法における使用に対して安全であることと、それらが有効性を示すこととを示す。
【０１０８】
好ましくは、本発明に従う使用を意図した組成物は、少なくとも１つの賦形剤、例えば、注入用の水、生理的塩類溶液（０．９％ＮａＣｌ）、又は好ましくはヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）などのタンパク質成分で置換された生理的塩類溶液からなる細胞緩衝液などをさらに含む。
【０１０９】
本発明の組成物が、例えばハプロタイプ不一致でミスマッチの状況下で用いられるため、本発明に従う使用を意図した組成物が、移植片対宿主病を回避するため、Ｂ細胞数又はＴ細胞数に対して少ないことは好ましい。好ましい実施形態では、本発明に従う使用を意図した組成物は、移植片対宿主病をもたらさない。好ましくは、該組成物は、５％以下のＴ細胞及び５％以下のＢ細胞、より好ましくは２％以下のＴ細胞及び２％以下のＢ細胞、最も好ましくは１％未満のＴ細胞及び１％未満のＢ細胞を含む。
【０１１０】
好ましい実施形態では、本発明に従う使用を意図した組成物が提供され、ここで免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲに対して陽性であることに加えて、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）に対して陽性である。
【０１１１】
神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）は、ニューロン、グリア、骨格筋及びナチュラルキラー細胞の表面上に発現される免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの糖タンパク質である。ＮＣＡＭは、ＣＤ５６とも称され、細胞−細胞接着、神経突起増殖、シナプス可塑性、並びに学習及びメモリーにおける役割を有するものとして関与している。ＮＣＡＭは、好ましくは、本発明に従う使用を意図した、分化した免疫エフェクター細胞の集団を定義するために用いられ、注入されたエフェクター細胞を患者の末梢血中のナチュラルキラー細胞と区別するために用いることができる。好ましくは、本発明に従う使用を意図した組成物は、９０％を超えるＣＤ５６＋細胞、より好ましくは９５％を超えるＣＤ５６＋細胞、最も好ましくは９８％を超えるＣＤ５６＋細胞を含む。
【０１１２】
典型的には、本発明の組成物は、複数の細胞を含む。組成物中のすべての細胞が本発明で定義のような特徴及び効果を有する必要はない。しかし、効率（生成中）及び有効性（クリニック内）について適正なバランスを有するように、本発明に従う使用を意図した組成物中に少なくとも特定の百分率の本発明で定義のような免疫エフェクター細胞を有することは好ましい。好ましい実施形態では、本発明に従う使用を意図した組成物が提供され、ここで組成物は、複数の細胞の３０〜１００％、好ましくは３０〜９０％、より好ましくは３０〜８０％、より好ましくは３０〜７０％、より好ましくは３０〜６０％、より好ましくは３０〜５０％、最も好ましくは３０〜４０％が、本発明で定義のようなＣＡＲ−ＮＫ細胞であるように特徴づけられる、複数の細胞を含む。好ましくは、複数の細胞を含む組成物は、複数の細胞の４０〜１００％、より好ましくは５０〜１００％、より好ましくは６０〜１００％、より好ましくは７０〜１００％、より好ましくは８０〜１００％、最も好ましくは９０〜１００％が、本発明で定義のようなＣＡＲ−ＮＫ細胞であるように特徴づけられる。本発明に従う使用を意図した組成物中の本発明で定義のようなＣＡＲ−ＮＫ細胞のそれ以外の好ましい範囲は、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％、８０〜９０％、４０〜８０％、５０〜８０％、６０〜８０％、４０〜７０％、４０〜６０％、５０〜６０％又は４０〜５０％である。生成効率の場合、本発明で定義のようなＣＡＲ−ＮＫ細胞は、より低い百分率が所望される一方、他方では臨床的有効性や制御上の理由の場合、本発明で定義のようなＣＡＲ−ＮＫ細胞は、より高い百分率が所望される。
【０１１３】
制御上の観点だけでなく効率上の観点から、本発明に従う使用を意図した組成物が単一ドナーから得られることは好ましい。大規模バッチが生成され得、排除又は認可され得、且つ無作為な個体が本発明に従う使用を意図した組成物で治療される必要がある時に既製使用され得るように、単一ドナーが２回以上の治療用量を提供することは、さらにより好ましい。好ましい実施形態では、本発明に従う使用を意図した組成物が提供され、ここで複数の細胞は、単一ドナーから得られる細胞から誘導される。好ましくは、複数の細胞は、ＣＤ３４陽性の幹細胞及び／又は前駆細胞の豊富な供給源であるとして、臍帯血及び骨髄の少なくとも１つから誘導される。
【０１１４】
ＣＡＲ−ＮＫ細胞を含む既製の組成物を使用する可能性が理由で、本発明に従う使用を意図した組成物は、細胞養子療法を、個別ドナーが個別レシピエントにマッチすることを探索することがもはや必要でないことから、個別化された薬からよりジェネリックな薬へステップをさらに変化させる。これはまた、治療のコストに対して有利な影響を有する。
【０１１５】
かかる組成物は、本明細書で用いられるような「既製」を伴うと、必要に応じた直接的使用のために調製され、貯蔵されることを意味する。特に、「既製」使用可能な組成物は、特定の１レシピエントに対して作製されないが、一般に異なる時点で異なるレシピエントに対して使用され得る。本発明で定義のような組成物は、本発明で定義されるように、例えば凍結され得、必要に応じて、解凍及び使用され得る。本発明で定義のような組成物は、任意の無作為なレシピエントに対して必要な際に理論的に数分以内に提供され得る、ＧＭＰで作製された免疫エフェクター細胞の大規模生成を可能にする。
【０１１６】
一実施形態では、本発明は、ＣＡＲ−ＮＫ細胞を含む組成物を提供し、ここで組成物は、生体外で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で遺伝子組換えされたＮＫ細胞の集団を作製するための方法であって、
（ｉ）ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを保有するＣＤ３４＋細胞を含有する中間細胞集団を、
ａ）骨髄、末梢血、胎盤又は臍帯血からなる群から選択される生物学的出発サンプルを得るステップと、
ｂ）造血幹細胞をかかる生体サンプルから単離するステップと、
ｃ）単離された造血幹細胞を培地Ｉの存在下で培養するステップと、
ｄ）培養された幹細胞を、ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを保有するレンチウイルスベクターとともにかかる細胞をインキュベートすることにより形質導入し、それによりＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団を得るステップと、
ｅ）任意選択的には、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団を培地Ｉ中で少なくとも１日間培養するステップと、
に従って生成し、ここで培地Ｉが、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、サイトカインの前記コレクションが、インターロイキン−７、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬＴ−３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）の１つ以上、並びに顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）の２つ以上を含む、第１相
（ｉｉ）第１相からのＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団を培地ＩＩ中でさらに拡大し、それによりＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞及びＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞を含有する細胞集団を得て、ここで培地ＩＩが、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、サイトカインの前記コレクションが、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３Ｌインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）及びＩＬ−７の２つ以上、並びにＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ６の２つ以上を含む、任意選択的な予備ステップと、
ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する相Ｉからの中間細胞集団、又はＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞及びＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞を含有する任意選択的な予備ステップからの細胞集団を、ＣＡＲ−ＮＫ細胞を含有する細胞集団に拡大及び分化させるステップであって、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する相Ｉからの中間細胞集団、又はＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞及びＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞を含有する任意選択的な予備ステップからの細胞集団を、培地ＩＩＩ中で培養し、それによりＮＫ細胞を含有する細胞集団を得ることを含み、ここで培地ＩＩＩが、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、サイトカインの前記コレクションが、ＳＣＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）の２つ以上、並びにＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ−６の２つ以上を含む、ステップと、
を含む第２相
を含む方法で作製される。
【０１１７】
造血幹細胞及び／又は前駆細胞を含むサンプルは、例えば、幹細胞及び／又は前駆細胞を含有する細胞供給源、例えば、細胞培養ステップを用いて胚性幹細胞若しくはその任意の派生物（deviates）から生体外で作製された、又は細胞培養ステップを用いて人工多能性幹細胞若しくはその任意の派生物から生体外で作製された、幹細胞動員剤で処置された個人の骨髄、臍帯血、胎盤材料、末梢血、末梢血を得る又は収集するための任意の可能な方法で得られてもよい。造血幹細胞及び／又は前駆細胞は、親和性精製法を用いて、かかる幹細胞及び／又は前駆細胞を含有する細胞供給源からさらに精製され得る。
【０１１８】
用語「生体外」の場合、実施されるプロセス又は方法が、生きている個体内部で用いられず、例えば細胞を培養可能な装置、好ましくはオープンな又はクローズドな細胞培養装置、例えば、培養フラスコ、ディスポーザブルバッグ又はバイオリアクターで用いられることを意味する。
【０１１９】
用語「ＣＤ３４＋幹細胞」の場合、細胞表面上でＣＤ３４抗原を発現する多能性幹細胞、好ましくは血球のすべての特定タイプを発生可能な幹細胞、及びより好ましくは血液系統の系統特異的前駆細胞を生じ得る細胞を意味する。
【０１２０】
用語「ＣＤ３４＋前駆細胞」の場合、細胞表面上でＣＤ３４抗原を発現する多能性前駆細胞、好ましくは血球の様々なタイプを発生可能な前駆細胞、及びより好ましくは特定の血液系統の系統特異的前駆細胞を生じ得る細胞を意味する。
【０１２１】
用語「親和性精製」の場合、本明細書で用いられるとき、精製対象の細胞が、例えば、分離を目的として目的の特定エピトープを標的化する、例えば分離のための方法による検出に適した薬剤にカップリングされた抗体を用いて、例えば蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）などの精製方法において蛍光色素にカップリングされた抗体を用いて、及び／又は例えば磁気選択法において磁気粒子にカップリングされた抗体を用いて抗原を標的化することにより、標識されることを意味する。親和性精製法は、当該技術分野で公知であり、例えば、抗原と抗体との間、酵素と基質との間、又は受容体とリガンドとの間などの高度に特異的な相互作用に基づいて生化学的混合物を分離する任意の方法であり得る。
【０１２２】
用語「拡大する」の場合、本明細書で用いられるとき、好ましくは、一般に「分化」と称される細胞の表現型を本質的に改変することのない、細胞培養ステップによって引き起こされる細胞分裂事象に起因する細胞の増殖を意味する。語句「細胞の表現型を本質的に改変することのない」の場合、細胞がその機能、その細胞表面マーカー及び／又はその形態を好ましくは改変しないことを意味する。
【０１２３】
用語「分化する」の場合、本明細書で用いられるとき、細胞の表現型を改変することを意味し、それは細胞培養プロセス中に特定の表面分子の発現を改変する、細胞機能を改変する、及び／又は細胞の形態を改変することを意味し、ここで細胞は、好ましくは、細胞培地の添加に起因し、さらに拡大し得る。以前に示した通り、発明者は、本発明で定義のような免疫療法での使用を意図した組成物が腫瘍の治療にとって特に有用であることを示している。好ましい実施形態によると、本発明に従う使用を意図した組成物は、腫瘍の治療を目的とする。腫瘍は、本発明の意味の範囲内で、造血性腫瘍又は固形腫瘍を含む。腫瘍は、悪性又は良性のいずれかであり得る。
【０１２４】
本発明に従う免疫療法における使用を意図した組成物は、腫瘍の治療における、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの造血性腫瘍の治療における異なるステージで用いることができる。例えば、本発明によって例示されるように、該組成物は、好ましくは、骨髄移植を受けるのに適格でないような（高齢）患者における地固め療法として用いることができる。加えて、別の治療を用いる他の患者によって示されるように、本発明に従う免疫エフェクター細胞療法は、好ましくは、導入療法に対して完全寛解に至っていない患者（難治性患者）、又は導入療法後の短い間に再発する患者（再発性患者）に対して用いることができる。免疫エフェクター細胞療法の他の地固め療法への組み込み、例えば同種ＨＳＴＣレジメンにおける本発明で定義のような免疫エフェクター細胞の追加使用もまた、実現可能であり、好ましい。
【０１２５】
好ましい実施形態では、本発明に従う使用を意図した組成物が提供され、ここで１回の治療において投与されるべき組成物は、少なくとも５×１０５個の細胞及び５×１０１１個以下の細胞を含む。
【０１２６】
本発明の組成物は、免疫エフェクター細胞が個体内のそれらの標的に達することができるという条件で、任意の許容できる方法を通じて投与可能である。例えば、本発明の組成物を、静脈内経路を介して、又は限定はされないが、眼内、皮膚、肺、頬側及び鼻腔内経路を含む局所的経路を介して投与することは可能である。局所的経路の場合、本明細書で用いられるとき、例えば骨髄内などの任意の直接的な局所投与だけでなく、例えば固形腫瘍に直接的に注射されることをも意味する。特定の症例では、例えば免疫療法で胃腸管の粘膜層に対する効果が意図される場合、経口経路を用いることができる。
【０１２７】
好ましくは、本発明に従う使用を意図した組成物が提供され、ここで組成物は、静脈内経路により、又は局所的経路により、又は経口経路により、又はそれら３経路の任意の組み合わせにより、投与される。用語「局所的」の場合、本明細書で用いられるとき、免疫エフェクター細胞が、好ましくは、任意の解剖学的部位に限局され得る腫瘍（より詳細には腫瘍は骨髄又は任意の他の臓器に限局され得る）の部位に局所適用されることを意味する。本発明に従う使用を意図した組成物は、１回投与され得るが、必要と見なされれば、組成物は、複数回投与されてもよい。これらは、日あたり、週あたり、又はさらに月あたり複数回であり得る。最初、初回投与、例えば注入の臨床結果を待ち、そして必要と見なされれば、組成物が有効でない場合に２回目の投与を行い、さらに３回目、４回目の投与なども可能である。
【０１２８】
好ましい一実施形態では、腫瘍の治療のための本発明に従う使用を意図した組成物が提供され、ここで腫瘍は造血性若しくはリンパ系腫瘍であるか、又は腫瘍は固形腫瘍である。
【０１２９】
用語「血液学的」、「造血性」又は「リンパ系」腫瘍は、これらが造血及びリンパ組織の腫瘍であることを意味する。造血性及びリンパ系悪性腫瘍は、血液、骨髄、リンパ、及びリンパ系を冒す腫瘍である。
【０１３０】
腫瘍が造血性又はリンパ系腫瘍であるような症例では、本発明に従う使用を意図した組成物が提供され、ここで腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群又は骨髄腫の１つ以上、好ましくは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性Ｔ細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、組織球性リンパ腫、若しくは多発性骨髄腫から選択される白血病、リンパ腫又は骨髄腫、好ましくはＡＭＬである。
【０１３１】
腫瘍が固形腫瘍であるような症例では、本発明に従う使用を意図した組成物が提供され、ここで腫瘍は、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん未分化がん、大細胞がん若しくは小細胞がん、肝細胞がん、肝芽腫、結腸腺がん、腎細胞がん、腎臓細胞腺がん、結腸直腸がん、結腸直腸腺がん、神経膠芽腫、神経膠腫、頭頚部がん、肺がん、乳がん、メルケル細胞がん、横紋筋肉腫、悪性メラノーマ、類表皮がん、肺がん、腎がん、腎臓腺がん、乳がん、乳腺がん、乳管がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、口腔がん、肛門がん、皮膚がん、ユーイング肉腫、胃がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ウィルムス腫瘍、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、膵がん、膵臓腺がん、子宮頸部がん、扁平上皮がん、髄芽腫、前立腺がん、結腸がん、結腸腺がん、移行細胞がん、骨肉腫、腺管がん、大細胞肺がん、小細胞肺がん、卵巣腺がん、卵巣奇形腫、膀胱乳頭腫、神経芽細胞腫、多形神経膠芽腫、神経膠芽腫  星状細胞腫、類上皮がん、メラノーマ、又は網膜芽細胞腫の悪性新生物又は転移誘導性二次腫瘍の１つである。
【０１３２】
好ましい実施形態では、本発明に従う使用を意図した組成物が提供され、ここで固形腫瘍は、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、子宮頸部がん、小細胞がん、及びメラノーマから選択される子宮頸がんの悪性新生物又は転移誘導性二次腫瘍から選択される。別の好ましい実施形態では、本発明に従う使用を意図した組成物が提供され、ここで固形腫瘍は、腺がん、扁平上皮がん、結腸腺がん、結腸直腸がん、結腸直腸腺がん、結腸がん、及びメラノーマから選択される結腸直腸がんの悪性新生物又は転移誘導性二次腫瘍から選択される。
【０１３３】
本発明の組成物は、今日まで知られている治療オプションに関連して、いくつかの利点を有する。本発明の組成物は、ＨＰＶ型、腫瘍組織学、腫瘍ＥＧＦＲ発現及びＫＲＡＳ状態と無関係に有利である。それに加えて、本発明の免疫エフェクター細胞はまた、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ及び（ＩＤＯ）阻害を克服することから、腫瘍に対する、特に子宮頸がん及び結腸直腸がんに対する抗腫瘍効果の増強をもたらす。
【０１３４】
用語「上皮成長因子受容体」又はＥＧＦＲは、一般に記載されるとき、ほぼすべての健常組織内で広く発現される細胞表面タンパク質を指す。ＥＧＦＲタンパク質は、膜貫通糖タンパク質によってコードされ、タンパク質キナーゼファミリーのメンバーである。ＥＧＦＲの過剰発現及びその下流シグナル伝達経路における突然変異は、結腸、肺及び子宮頸部のようないくつかの固形腫瘍における悪い予後に関連している。
【０１３５】
カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子（ＫＲＡＳ）という用語は、ＥＧＦＲ下流シグナル伝達経路の一部としての正常組織シグナル伝達を調節することに活発に関与する遺伝子を指す。しかし、ＫＲＡＳ遺伝子における突然変異が、結腸、直腸及び肺の固形腫瘍内の腫瘍細胞内で報告されている。結腸直腸がん患者の５０％超において生じるこの活性化突然変異は、腫瘍細胞がセツキシマブ及びパニツムマブのようなＥＧＦＲ標的化薬を回避することに役立つ。
【０１３６】
用語「ヒトパピローマウイルス（human papilloma virus）（ＨＰＶ）」は、本明細書で用いられるとき、女性における子宮頸がんを引き起こすウイルスのグループを指す。ＨＰＶウイルスは、口、咽頭、外陰部、子宮頸部及び腟の周囲の皮膚及び湿性膜を冒す。ＨＰＶ感染は、子宮頸部においてがんをもたらす異常細胞変化を引き起こす。
【０１３７】
インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）は、本明細書で用いられるとき、アミノ酸Ｌ−トリプトファンをＮ−ホルミルキヌレニンに分解する場合の触媒として作用する酵素を指す。一般に、前立腺、胃、卵巣、子宮頸部及び結腸の固形腫瘍において報告されたＩＤＯの過剰発現は、腫瘍細胞が細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞による殺滅を回避することを可能にする。
【０１３８】
本発明は、以下の非限定例において、より詳細に説明される。
【実施例】
【０１３９】
実施例
実施例１−ＬＮＧＦＲで隔てられたＣＤ４４ｖ６  ＣＡＲの説明
本実施例で用いるＣＡＲ構築物は、かかる構築物の配列の詳細な説明を含む国際公開第２０１６／０４２４６１号に開示されるＣＤ４４ｖ６−ＮＷＬである。ＣＡＲ  ＣＤ４４ｖ６−ＮＷＬをコードするｃＤＮＡを考案者から購入した。
【０１４０】
ＣＡＲ構築物ＣＤ４４ｖ６−ＮＷＬの構成の模式的なバージョンを図１に示す。
【０１４１】
ＣＡＲ  ＣＤ４４ｖ６−ＮＷＬは、ＣＤ４４ｖ６結合ドメイン、ＬＮＧＦＲ野生型ロングスペーサー（４つのＴＮＦＲ−Ｃｙｓドメイン及び全セリントレオニンリッチストークを含む）、ＣＤ２８の膜貫通及び共刺激ドメイン並びにＣＤ３  ζ鎖の細胞内ドメインからなる。ＣＡＲ  ＣＤ４４ｖ６−ＮＷＬのタンパク質配列を以下に報告する（配列番号Ｎ°１４）：
【化１１】
2021525066.tif 000013
【０１４２】
レジェンド
太字：ＣＤ４４ｖ６に特異的な一本鎖断片
下線のイタリック体：ＬＮＧＦＲスペーサー
下線の太字：ＣＤ２８膜貫通及び共刺激ドメイン
イタリック体：ＣＤ３ζ鎖シグナル伝達ドメイン。
【０１４３】
実施例２−相１での中間ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞集団の生成
本発明の方法の第１相では、ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを保有するＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団を生成するための条件が提供される。幹細胞の改変は、実施例１に開示のＣＡＲ  ＣＤ４４ｖ６−ＮＷＬの構成的発現を駆動するためのヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーターを有する発現カセットを保有するｔａｔ非依存性ＳＩＮレンチウイルスベクターの形質導入により得られる。
【０１４４】
実験の本質は、以下の異なる条件を用いてのＵＣＢから単離されたＣＤ３４＋細胞の形質導入にある。
−条件Ａ：サイトカイン（３００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３−Ｌ及びＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ並びに６０ｎｇ／ｍｌのＩＬ３）を添加した基礎細胞培地（CellGenix（登録商標）ＧＭＰ幹細胞増殖培地、Cellgenix GmbH, Freiburg, Germanyから入手）。条件Ａは、本発明の場合以外の形質導入条件を適用する制御方法である。
−条件Ｂ：１０％ヒト血清、サイトカイン（１０ｐｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、２５０ｐｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ、５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６、２５ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７）及び２０μｇ／ｍｌのヘパリンを添加した基礎細胞培地（Glycostem Basal Growth Medium（ＧＢＧＭ、Glycostem Therapeutics, Oss, The Netherlandsから入手）。条件Ｂは、本発明の方法の相１の代表例である。
【０１４５】
実験の目的は、作製プロセスの第２相においてＣＡＲ−ＮＫ細胞に拡大及び分化される対象のＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団を得るための最も有効な条件の同定である。完全な実験スキームを下記にまとめる。
【０１４６】
【表１】
2021525066.tif 000014
【０１４７】
ＣＤ３４＋形質導入プロセスにおける主なステップを表２中に開示する。
【０１４８】
【表２】
2021525066.tif 000015
【０１４９】
２．２  生物学的出発材料
実験の実行のため、ＣＤ３４＋細胞を、ＮＨＳ献血・臓器移植機関（NHS blood and Transplant）によって提供された３つの臍帯血（ＵＣＢ）から単離した（表３）。
【０１５０】
【表３】
2021525066.tif 000016
【０１５１】
２．３  ＣＤ３４の単離及び特徴づけ
（ＮＨＳ献血・臓器移植機関（NHS blood and Transplant）によって提供された）３つのＵＢＣを独立的に処理し：Lymphoprep（商標）による手動による密度勾配を用い、提供者の標準条件に従い、単核球（ＭＮＣ）を単離した。さらには、ＣＤ３４＋精製を得るため、免疫磁気選択を各サンプルに適用し：最初に細胞を磁気ビーズにコンジュゲートされた抗ＣＤ３４抗体で免疫標識し、次に提供者の該条件に従い、Miltenyi LS MidiMACSカラムに負荷した。
【０１５２】
ＣＤ３４＋細胞％に関してより高い純度を有するサンプルを実験用に選択し、それ以外の細胞を凍結させた。
【０１５３】
ＣＤ３４＋細胞回収に関する細胞数、生存率及び全プロセス収率を表４に報告する。
【０１５４】
【表４】
2021525066.tif 000017
【０１５５】
ＵＣＢ１及びＵＣＢ３から回収されたＣＤ３４＋細胞は、温度速度が制御された冷凍庫で凍結された。
【０１５６】
ＵＣＢサンプルの免疫表現型をＦＡＣＳ分析により評価した。取得は、BD FACSCanto 2で実施し、DIVAソフトウェアを用いてデータを分析した。表５は、０日目のＵＣＢサンプル１、２及び３の予備操作及び陰性画分についての結果を示す。表６は、０日目のＵＣＢサンプル１、２及び３の陽性画分についての結果を示す。
【０１５７】
【表５】
2021525066.tif 000018
【０１５８】
【表６】
2021525066.tif 000019
【０１５９】
２．４  ＣＤ３４＋播種
ＩＦ分析及びクローン原性アッセイのためのサンプリング後、ＵＣＢ２から回収した細胞を、１．０×１０６個の細胞／ｍｌの播種濃度で、予めレトロネクチンでコーティングした非組織培養処理プレートに播種した（表７）。
【０１６０】
２．５  ＣＤ３４＋形質導入
１日目、２２時間４５分のインキュベーション後、細胞懸濁液の半分をプレートから収集し、遠心分離し、ＬＶ  ＣＡＲ−ＣＤ４４ｖ６ベクターＰＤＥ＿Ｂ１７１００を懸濁した（１回目の形質導入実行）。
【０１６１】
インキュベーションの１５時間後、細胞を収集し、計数し、次に遠心分離し、１．０×１０６個の細胞／ｍｌの播種濃度で培地１×サイトカインに懸濁した。
【０１６２】
培養物の成長速度を計算するため、以下の方程式を用いた。
【数１】
2021525066.tif 000020
【０１６３】
【表７】
2021525066.tif 000021
【０１６４】
３日目、細胞を収集し、計数した。
【０１６５】
０日目〜３日目（形質導入の終了）から得られる総成長速度はまた、個別の成長速度を掛けることにより算出した。
【０１６６】
【表８】
2021525066.tif 000022
【０１６７】
形質導入の終了時、条件Ａの細胞を収集し、遠心管に移し；ウェルをCellGenix（登録商標）ＧＭＰ幹細胞増殖培地で１回洗浄後、該細胞を遠心分離し、新しいCellGenix（登録商標）ＧＭＰ幹細胞増殖培地に懸濁し、計数し、採取し、試験に備えた。クライオバイアル内のヒト血清＋１４％ＤＭＳＯを添加したGlycostem基礎培地（１：１）中で残存細胞を凍結させた。
【０１６８】
表６に記載のような試験のため、条件Ｂの細胞を収集し、計数し、採取した。残存細胞を遠心分離し、０．４×１０６個の細胞／ｍｌの播種濃度で培地１×サイトカインに再懸濁した。
【０１６９】
５日目、条件Ｂの細胞を計数し、１体積の新しい培地を添加した。
【０１７０】
【表９】
2021525066.tif 000023
【０１７１】
７日目、条件Ｂの細胞を収集し、遠心管に移し；ウェルをＧｌｙ培地で１回洗浄後、該細胞を遠心分離し、ＤＳの配合のため、（２倍の細胞培養体積を用いる）新しいＧｌｙ培地に再懸濁し、計数し、採取した（表６に記載のような試験用）。クライオバイアル内のヒト血清＋１４％ＤＭＳＯを添加したＧｌｙ培地（１：１）中で残存細胞を凍結させた。
【０１７２】
０日目〜７日目から得られる総成長速度はまた、個別の成長速度を掛けることにより算出した。
【０１７３】
【表１０】
2021525066.tif 000024
【０１７４】
免疫表現型は、ＦＡＣＳ分析により評価した。取得は、BD FACSCanto 2で実施し、DIVAソフトウェアを用いてデータを分析した。細胞は、（条件Ａ及び条件Ｂ）日及び７日目（条件Ｂ）に分析された。
【０１７５】
【表１１】
2021525066.tif 000025
【０１７６】
２．６  ＣＤ３４＋細胞のクローン原性能
Pharmacopeia Monography EP 2.7.28に開示された方法（ヒト造血性前駆細胞用のコロニー形成アッセイ）に従う、造血性前駆細胞のクローン原性能。
【０１７７】
分析は、基礎クローン原性能測定用の細胞解凍時（０日目）と形質導入相の終了時（３日目）とに実施した。
【０１７８】
【表１２】
2021525066.tif 000026
【０１７９】
【表１３】
2021525066.tif 000027
【０１８０】
２．６．１  形質導入効率
ＮＧＦＲマーカーについてのＦＡＣＳ分析により、形質導入効率を評価した。液体培養後、クローン原性アッセイからのコロニープール上で細胞を分析した。
【０１８１】
【表１４】
2021525066.tif 000028
【０１８２】
【表１５】
2021525066.tif 000029
【０１８３】
２．６．２  ＶＣＮアッセイ
形質導入ＣＤ３４＋細胞の１４日間の骨髄培養後に実施した定量ＰＣＲにより、ベクターコピー数を測定した。結果を表１６にまとめる。
【０１８４】
【表１６】
2021525066.tif 000030
【０１８５】
結論
細胞生存率及び成長速度：
細胞は、全プロセス（≧９６％）の間、良好な生存率を維持し、成長速度は２つの条件の間で類似していた。
【０１８６】
免疫表現型：
分析を通じて、条件Ａに従って培養及び形質導入された細胞におけるＣＤ１５マーカーの発現がより高いことを除いて、幹細胞の特徴づけに関する差は生じておらず、細胞集団が骨髄系統により関与することが示される。これらの表現型は、条件Ｂに従って培養及び形質導入された細胞、即ち本発明の方法に従って生成された中間細胞集団において認められない。
【０１８７】
クローン原性能：
３日目のＣＤ３４＋細胞のクローン原性能は類似した。
【０１８８】
形質導入効率及びベクターコピー数：
形質導入効率及びＶＣＮは、条件Ｂよりも条件Ａにおいてより高い。
【０１８９】
実施例３−相２のＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞のＣＡＲ−ＮＫ細胞への細胞の拡大及び分化
３．１  解凍
条件Ａ（３日目）及び条件Ｂ（７日目）からの凍結保存ＣＤ４４ｖ６形質導入及びモック前駆細胞を、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加したヒト血清アルブミン及び０．１３ｍｇ／ｍｌのＮＡｓｅからなる解凍緩衝液で解凍した。ＣＤ３４＋  ＵＣＢ細胞を、新しい拡大培地Ｉ中の組織培養物で処理した６ウェルプレートに、０．９７×１０＾６個の細胞／ｍｌ（条件Ａ）；２．１１×１０＾６個の細胞／ｍｌ（条件Ｂの非Ｔ）及び１．９９×１０＾６個の細胞／ｍｌ（条件ＢのＴ）の細胞濃度で蒔いた。
【０１９０】
表１７に表す通り、凍結−解凍サイクル後十分経過してから回収したＣＤ３４＋  ＵＣＢ細胞は、最初に凍結された全細胞からの生細胞の百分率を示す。
【０１９１】
【表１７】
2021525066.tif 000031
【０１９２】
３．２  拡大相
細胞生存率、ＣＤ３４含量及びＬＮＧＦＲ発現についてのフローサイトメトリーデータは、最適な細胞培養条件を監視し、提供するため、拡大相において測定した。ＣＤ３４＋  ＵＣＢ細胞は、新しい拡大培地Ｉ、即ち、１０％ヒト血清、１０ｐｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、２５０ｐｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ及び５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６；２５ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ−７及び２０μｇ／ｍｌのヘパリン（クリバリン）を含有する低用量のサイトカインカクテルを添加した基礎培地（ＧＢＧＭ）で培養した。条件Ａ及び条件Ｂからの細胞は、９日目まで拡大培地Ｉで培養し、４日目（条件Ａからの細胞を解凍後）及び８日目（条件Ｂからの細胞）から計数した。拡大培地Ｉは、週につき２〜３日ごとに更新した。１０日目、拡大培地ＩＩを添加する、ここでは２５ｍｇ／ｍｌのＴＰＯを２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５と交換することにより、前駆細胞を培養した。
【０１９３】
すべての条件における実際の拡大は、３日目（条件Ａ）又は７日目（条件Ｂ）の解凍日から算出した（拡大を１に設定）ものによると、条件ＢのＴと条件Ｂの非Ｔとの間に差がないことが示されている。条件ＡのＴ及び条件Ａの非Ｔにおいては、Ａの非ＴではＡのＴと比べてより低い拡大が測定された。拡大に対する凍結−解凍効果を除外することにより、理論上の拡大を算出し、すべての条件における最適な拡大が示された。すべての条件の間でのこの比較からの結果によると、条件Ａ、特にＡの非Ｔにおいて、より低い拡大が示された。
【０１９４】
ＬＮＧＦＲ発現からの結果によると、培養中の１０〜２１日目にかけて細胞内での天然ＣＤ２７１の発現が示された。
【０１９５】
３．３  分化相
分化中、ＮＫ細胞のマーカーとして、細胞生存率及びＬＮＧＦＲ発現に並んで、ＣＤ３４含量の代わりに、ＣＤ５６含量を測定した。分化培地は、２％ヒト血清、１０ｐｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、２５０ｐｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ及び５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６；２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、ＩＬ−１５、ＩＬ−７及び１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Proleukin）を含有する低用量のサイトカインカクテルを添加したＧＢＧＭからなる。分化培地は、培養の終了まで週２回更新した。
【０１９６】
ＣＤ４４ｖ６形質導入ＵＣＢ−ＮＫ細胞内でのＬＮＧＦＲの発現は、条件Ａで形質導入されたＮＫ細胞内での高いＮＧＦＲの発現（４１日目で８７％）及び条件Ｂで形質導入されたＮＫ細胞内での中程度の（mediate）ＮＧＦＲの発現（４５日目で３７％）を示した。
【０１９７】
条件ＡのＣＤ４４ｖ６形質導入ＵＣＢ−ＮＫからの形態学的結果は、培養下で、すべての他の条件と比べて拡大された細胞を示した。
【０１９８】
３．４  インビトロ機能性アッセイ
条件Ａ及びＢからのモック及びＣＤ４４ｖ６形質導入ＵＣＢ−ＮＫ細胞との培養の終了時、ＮＫ細胞の細胞傷害性に対して感受性、中等感受性及び抵抗性を示すＫ５６２、Ｔ９８Ｇ及びＴＨＰ−１腫瘍細胞株の各々に対して、インビトロ機能性アッセイを実施した。
【０１９９】
２×１０＾５個の細胞／ｍｌの細胞密度でのＴＨＰ−１ヒト白血病単核球細胞を、２５ｎＭのホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）で４８時間刺激し、ＴＨＰ−１細胞を、ＣＤ４４を発現することが知られるマクロファージに分化させるための新しい培地とともにさらに２４時間インキュベートした（図４Ａ）。１×１０＾７個の細胞／ｍｌの濃度の標的細胞を、３７℃で１０分間、５μＭのパシフィックブルースクシンイミジルエステル（ＰＢＳＥ）で標識した。標的細胞を標的培地で洗浄し、５×１０＾５個の細胞／ｍｌまで濃縮した。同様に、ＮＫ細胞を５×１０＾５個の細胞／ｍｌまで濃縮し、一晩アッセイにおいて標的細胞（１００μｌのエフェクター＋１００μｌの標的）と共培養した。脱顆粒測定においては、インキュベーションの開始時、抗ＣＤ１０７ａを添加し、インキュベーションの終了時、ＮＫ細胞識別用に抗ＣＤ５６を添加した。細胞傷害性を、１：１のエフェクター：標的比についてのアポトーシス７ＡＡＤ生存率マーカーにおけるフローサイトメトリーの読み出しに基づいて算出した。
【０２００】
感受性腫瘍細胞株Ｋ５６２に対し、条件ＡからのＣＤ４４ｖ６形質導入ＵＣＢ−ＮＫ細胞において、他の条件と比べてより低い細胞傷害性が認められる。
【０２０１】
３．５  ＮＫ細胞における受容体発現
培養の終了時の条件Ａからのモック及びＣＤ４４ｖ６形質導入ＵＣＢ−ＮＫ細胞を、（ＮＫＧ２Ａ）を阻害し、ＮＫ細胞による殺滅機構に関与する（ＤＮＡＭ−１、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６）受容体の発現を活性化することについてスクリーニングした（図５Ａ）。
【０２０２】
ＣＤ４４ｖ６形質導入ＵＣＢ−ＮＫ細胞において、モックＵＣＢ−ＮＫ細胞と比べてより低いＤＮＡＭ−１活性化受容体の発現が測定された。
【０２０３】
３．６  MolMedへの輸送
条件Ａ（３１日目）及び条件Ｂ（３５日目）からの新しいモック及びＣＤ４４ｖ６形質導入ＵＣＢ−ＮＫ細胞を、機能活性のさらなる特徴づけ及びＮＳＧマウスでのインビボ試験のため、MolMedに輸送した。モック及びＣＤ４４ｖ６形質導入ＵＣＢ−ＮＫ細胞の、解凍後にそれらの機能的能力が回復する中での回収について検討するため、３４日目（条件Ａ）及び３８日目（条件Ｂ）、残存細胞を、５０％ヒト血清及び最終濃度７％のＤＭＳＯを添加したＧＢＧＭ中で凍結させた。
【０２０４】
３．７  再構成
条件Ａ（３４日目）及び条件Ｂ（３８日目）からの凍結保存したモック及びＣＤ４４ｖ６形質導入ＵＣＢ−ＮＫ細胞を、（３．１に記載の）解凍緩衝液で、３．４に記載のようなインビトロ機能性アッセイにおいて用いられた良好な回収後、解凍した。
【０２０５】
感受性腫瘍細胞株Ｋ５６２に対する、条件Ａ及びＢからのモック及びＣＤ４４ｖ６形質導入ＵＣＢ−ＮＫ細胞を用いたインビトロ機能性アッセイからの結果は、再構成前の機能性データと同等の結果を示す（図４Ｂ）。条件ＡからのＣＤ４４ｖ６形質導入ＵＣＢ−ＮＫ細胞において、Ｋ５６２に対するより低い細胞傷害性がさらに認められる。
【０２０６】
ＣＤ１０７ａ＋百分率によりフローサイトメーターで測定された、モック及びＣＤ４４ｖ６形質導入ＵＣＢ−ＮＫ細胞の脱顆粒を、感受性腫瘍細胞株Ｋ５６２に対して分析した（図４Ｃ）。
【０２０７】
再構成前及び後のＮＫ細胞による殺滅機構に関与する阻害性及び活性化受容体発現を比較するため、再構成後の条件Ａ及びＢからのモック及びＣＤ４４ｖ６形質導入ＵＣＢ−ＮＫ細胞を、同じく重要なＮＫ細胞の活性化及び阻害性受容体についてスクリーニングし、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ３ＤＬ及びＫＩＲ２ＤＬ１阻害性受容体を添加した（図５Ｂ）。再構成後、ＤＮＡＭ−１及びＮＫＧ２Ｄの活性化受容体発現の低下が、条件ＡからのＣＤ４４ｖ６形質導入ＵＣＢ−ＮＫ細胞において測定された。
【０２０８】
実施例４−モックＮＫ及びＣＡＲ−ＮＫ細胞の機能活性のインビトロ特徴づけ
ＣＤ４４ｖ６−ＣＡＲ  ＮＫ細胞の抗原特異的活性を評価するため、ＣＤ４４ｖ６抗原を発現するか又は発現しない標的細胞株で刺激された細胞における脱顆粒及びサイトカイン産生を測定する、フローサイトメトリーに基づく効力アッセイを実施した。
【０２０９】
４．１  実験設計
ＣＤ１０７ａ＋細胞の百分率としての脱顆粒、及びＴＮＦ−α＋細胞の百分率としてのサイトカイン産生を、最終培地変更後３日目、条件Ｂ下（即ち、本発明の方法に従う）及び条件Ａ下（即ち、対照）で生成されたモックＮＫ及びＣＤ４４ｖ６−ＣＡＲ  ＮＫにおいて分析した。標的細胞として、ＣＤ４４ｖ６陰性及び陽性腫瘍細胞は、ＮＫ細胞による細胞溶解に対して感受性（Ｋ５６２、慢性骨髄性白血病）及び抵抗性（ＭＯＬＴ−４、急性リンパ芽球性白血病）の双方であり、１：１のＥ：Ｔ比で利用した。さらには、エフェクター細胞を、未処理のままか、又はホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）及びイオノマイシン（ＩＯＮＯ）で刺激し、基礎細胞の活性化又は非特異的活性化を各々検出した。
【０２１０】
４．２  材料
１００μｌの最終体積で、９６ウェルの丸底プレート内で効力試験を実施した。
【０２１１】
エフェクター細胞のＦＡＣＳ分析を実施し、抗体のパネルを表１８に報告する。
【０２１２】
【表１８】
2021525066.tif 000032
【０２１３】
ＣＤ４４ｖ６陽性Ｋ５６２及びＭＯＬＴ−４細胞株を作製するため、親細胞株へのＣＤ４４ｖ６抗原を発現するレトロウイルスベクターの形質導入を実施した。
【０２１４】
４．３  結果
条件Ａ（対照）及び条件Ｂ（即ち、本発明の方法に従う）にて得られたモックＮＫ及びＣＤ４４ｖ６−ＣＡＲ  ＮＫを、培養の３８日目のインビトロ機能活性（条件Ａ；８２％のＬＮＧＦＲ＋細胞）又は培養の４２日目のインビトロ機能活性（条件Ｂ；３３％のＬＮＧＦＲ＋細胞）について試験した。すべてのエフェクター及び標的細胞を計数し、ヒトＩｇＧを添加したＲＰＭＩ  １６４０に再懸濁し、氷上で２０分間インキュベートした。遠心分離後、エフェクター細胞（０．２×１０６個の細胞／条件）を、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中で、単独で又は１：１のＥ：Ｔ比での異なる標的細胞株とともに培養した。細胞機能性に対する陽性対照としてのＰＭＡ／ＩＯＮＯで細胞を刺激した。ＣＤ１０７ａ  Ａｂ、ブレフェルジン及び／又はモネンシンの存在下での６又は１８時間のインキュベーション後、表１８に報告する通り、ＮＫを、適切な蛍光抗体のパネルを用いて表面抗原について染色した。次に、サンプルを固定し、透過処理し、製造業者の使用説明書に従い、細胞内ＴＮＦ−α染色を行い、フローサイトメトリーにより分析した。（単独でインキュベートした陽性エフェクター細胞の百分率の減算後の）異なる標的で刺激した生存可能陽性エフェクター細胞の百分率を、図２のパネルＡ（１８時間後のＣＤ１０７ａ陽性細胞の百分率）、及びパネルＢ（６時間後のＴＮＦ−α陽性細胞の百分率）に示す。ＬＮＧＦＲ陽性及び陰性細胞の２つの亜集団において、ＣＡＲ  ＮＫ活性化の分析を実施した。モック及び形質導入ＮＫ細胞の双方（条件Ａ及びＢの双方）が、ＮＫ感受性Ｋ５６２細胞株を認識するが（条件ＡからのＣＤ４４ｖ６−ＣＡＲ  ＮＫ細胞がモック−ＮＫに対して機能的低下を示すが）、専らＣＡＲ−ＮＫ  ＬＮＧＦＲ＋細胞は、Ｋ５６２  ＣＤ４４ｖ６細胞での活性化における明らかな特異的増加を示す（いずれもＣＤ１０７及びＴＮＦ−α陽性と考えられる）。
【０２１５】
ＣＤ４４ｖ６抗原によるＣＡＲ  ＮＫのこの特異的活性化は、ＮＫ細胞と抵抗性ＭＯＬＴ−４細胞株との共培養により確認される。（条件Ａ及びＢ双方からの）専らＣＡＲ  ＮＫ  ＬＮＧＦＲ＋細胞内では、ＣＤ４４ｖ６抗原を発現するＭＯＬＴ−４細胞とともにインキュベートするとき、脱顆粒及びＴＮＦ−α産生の双方として検出可能な活性化が生じた。
【０２１６】
実施例５−ＮＫ及びＣＡＲ−ＮＫ細胞のインビボ有効性
５．１  実験設計
ＡＭＬ異種間腫瘍モデルにおいて、ＣＤ４４ｖ６  ＣＡＲ−ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を評価した。実験は、実施例２（条件Ａ下又は条件Ｂ下の臍帯血由来幹細胞の形質導入）及び実施例３（ＣＡＲ−ＮＫ細胞又はＮＫ細胞への拡大及び分化）の下で述べられた条件に従って生成された、ＮＫ細胞のＴＨＰ１白血病細胞（微小残存病変のセッティング）を有するＮＳＧマウスへの注入に相当する。条件Ｂにおける実施例２下での形質導入と、それに続く実施例３下でのＮＫ細胞への拡大及び分化を含む方法は、本発明の方法の代表例である。
【０２１７】
０日目、マウスにＴＨＰ１がん細胞を注入し、３日後、養子免疫療法で処置した。
【０２１８】
実験は、７つの実験群を含む（表１９）。
【０２１９】
【表１９】
2021525066.tif 000033
【０２２０】
実験手順は、表２０に示す通り、詳細にまとめる。
【０２２１】
【表２０】
2021525066.tif 000034
【０２２２】
５．２  材料
ＴＨＰ１腫瘍細胞
インビボ有効性実験においては、急性単球性白血病患者由来のヒト単核球細胞株であるＴＨＰ１細胞株をマウスに注入し、腫瘍生着を可能にした。ＴＨＰ１腫瘍細胞を、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び５０μＭのβメルカプトエタノールの中で１２日間、培養及び拡大した。０日目、全部で１．５Ｅ＋０６個の細胞／マウスを尾静脈に注入した。
【０２２３】
非形質導入及びＣＤ４４ｖ６  ＣＡＲ形質導入ＮＫ細胞（条件Ａ及びＢ）
インビボ有効性実験の実行においては、異なる条件下で培養したＮＫ細胞（表１８）を生成し、２％ヒト血清、１０ｐｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、２５０ｐｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ及び５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６；２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、ＩＬ−１５、ＩＬ−７及び１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Proleukin）を含有する低用量のサイトカインカクテルを添加した基礎培地（ＧＢＧＭ）中、培養下で維持し、以下に示すようにマウスに注入した（表２１）。
【０２２４】
【表２１】
2021525066.tif 000035
【０２２５】
ＮＳＧマウスモデル
８週齢のNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) トランスジェニックマウスは、Charles River Laboratoriesにより準備された。０日目、腫瘍生着のため、マウスに１．５Ｅ＋０６個のＴＨＰ１細胞を注入した。注入の２日後、マウスを２つの異なるマウスコホート（雄／雌）から５群に無作為化し（マウス５匹／群）、異なる細胞調製物で処置した。条件Ａ（雄コホート）及びＢ（雌コホート）からのＮＫ細胞及びＣＡＲ  ＮＫを性別一致コホートに投与した。３日目−６日目−９日目（各々、１回目、２回目及び３回目注入）、ＮＫ細胞を投与した。対照マウス（雄コホート）を非処置で放置した。３−６−９−１２−１５−１８日目、補助として組換えｈＩＬ−１５（ＩＬ１５）を準備した。
【０２２６】
組換えｈＩＬ−１５（ＩＬ１５）
ＩＬ−１５（ImmunoTool）を、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で、滅菌水で再構成し、溶液をアリコートし、−２０℃で凍結させた。
【０２２７】
（ｉ）方法
免疫表現型及び生存率
トリパンブルー染色液を用いて細胞を計数することにより、細胞生存率を評価した。ＦＡＣＳ分析により、細胞をＣＤ４５−ＣＤ３−ＣＤ８−ＣＤ５６−ＣＤ１６−ＣＤ２７１の発現について特徴づけた。７ＡＡＤ陽性細胞を除外することにより、ＣＤ５６＋及びＣＤ５６＋ＣＤ２７１＋細胞の集団について判定した。取得をBD FACSCanto 2で実施し、DIVAソフトウェアを用いてデータを分析した。条件Ａ及びＢからの細胞を、各注入日に分析した。
【０２２８】
インビボでのＴＨＰ１及び治療用細胞の注入
インビボ有効性実験においては、ＴＨＰ１腫瘍細胞、ＮＫ細胞及びＴ細胞を収集し、細胞生存率を意図してトリパンブルー染色液を用いて計数し、３８０ｇで１０分間の遠心分離によりＰＢＳで２回洗浄した。細胞を所望される濃度で０．９％生理食塩水に再懸濁し、マウス尾静脈に注入した。
【０２２９】
ＩＬ１５処置
ＩＬ１５を解凍し、５μｇ／ｍｌの濃度で０．９％生理食塩水に再懸濁した。実験手順（表２０）に示す通り、マウスを０．５μｇのＩＬ１５の腹腔内注射（１００μｌ／マウス）で処置した。
【０２３０】
肝臓切除
３９日目、マウスをＣＯ２チャンバ内で動物実験用倫理ガイドラインに従って安楽死させた。肝臓を切除し、分析天秤で秤量し（weighted）、データを記録し、切除した肝臓の画像を取得した。
【０２３１】
５．４  結果
十分に確立された疾患モデルにおいて、条件Ａ及びＢからのモックＮＫ及びＣＤ４４ｖ６  ＣＡＲ−ＮＫ細胞のインビボ抗腫瘍効果を評価した。図３は、各条件における肝臓重量（グラム）を示す。一元配置分散分析を用いて、統計分析を実施した。条件Ｂ下で、即ち本発明の方法に従って得られたＣＤ４４ｖ６  ＣＡＲ−ＮＫ細胞が、モックＮＫ細胞で得られた場合又は条件Ａ下で得られたＣＤ４４ｖ６  ＣＡＲ−ＮＫ細胞で得られた場合よりも強力な抗腫瘍効果を有するという結果である。
【０２３２】
結論
インビボでの結果によると、本発明の作製方法により、非形質導入ＮＫ細胞及び異なる条件下で実施されたプロセスで得られたＣＡＲ−ＮＫ細胞と比べてより強力な抗腫瘍効果によって特徴づけられる細胞集団を得ることができることが示される。その結果、本発明の方法により、ＮＫ細胞及びＣＡＲの双方の機能的効果によって特徴づけられるＣＡＲ−ＮＫ細胞を含有する細胞集団を得ることができる。
【図１】
2021525066.tif 000036
【図２】
2021525066.tif 000037
【図３】
2021525066.tif 000038
【図４】
2021525066.tif 000039
【図５】
2021525066.tif 000040
【配列表】
2021525066000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月13日(2021.1.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で遺伝子組換えされたＮＫ細胞の集団を作製するための方法であって、
（ｉ）ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを保有するＣＤ３４＋細胞を含有する中間細胞集団を、
ａ）骨髄、末梢血、胎盤又は臍帯血からなる群から選択される生物学的出発サンプルを得るステップと、
ｂ）造血幹細胞をかかる生体サンプルから単離するステップと、
ｃ）前記単離された造血幹細胞を培地Ｉの存在下で培養するステップと、
ｄ）培養された幹細胞を、ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを保有するレンチウイルスベクターとともにかかる細胞をインキュベートすることにより形質導入し、それによりＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する中間細胞集団を得るステップと、
ｅ）任意選択的には、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する前記中間細胞集団を培地Ｉ中で少なくとも１日間培養するステップと、
に従って生成し、ここで培地Ｉが、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、サイトカインの前記コレクションが、インターロイキン−７、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬＴ−３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）の１つ以上、並びに顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）の２つ以上を含む、第１相
（ｉｉ）前記第１相からのＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する前記中間細胞集団を培地ＩＩ中でさらに拡大し、それによりＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞及びＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞を含有する細胞集団を得て、ここで培地ＩＩが、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、サイトカインの前記コレクションが、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３Ｌ  インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）及びＩＬ−７の２つ以上、並びにＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ６の２つ以上を含む、任意選択的な予備ステップと、
相ＩからのＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する前記中間細胞集団、又は前記任意選択的な予備ステップからのＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞及びＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞を含有する前記細胞集団を、ＣＡＲ−ＮＫ細胞を含有する細胞集団に拡大及び分化させるステップであって、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を含有する、相Ｉからの前記中間細胞集団、又はＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞及びＣＡＲ−ＮＫ前駆細胞を含有する、前記任意選択的な予備ステップからの前記細胞集団を、培地ＩＩＩ中で培養し、それによりＮＫ細胞を含有する細胞集団を得ることを含み、ここで前記培地ＩＩＩが、サイトカインのコレクションを含む基礎培地であり、サイトカインの前記コレクションが、ＳＣＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）の２つ以上、並びにＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＬ−６の２つ以上を含む、ステップと、
を含む、第２相
を含む方法。
【請求項２】
前記第２相が、前記予備拡大ステップと拡大及び分化の前記ステップの双方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体サンプルが、臍帯血である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
幹細胞が、ＣＤ３４＋免疫磁気選択法を用いて単離される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記形質導入が、培地Ｉ中で実施される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
培地Ｉが、ＳＣＦを４ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌの間の濃度、又はＦｌｔ３−Ｌを４ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌの間の濃度、又はＴＰＯを４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度、又はＩＬ７を４ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度、又はこれらサイトカインの任意の組み合わせを前記特定範囲の濃度で含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記中間細胞集団を生成する前記相が、１回以上の形質導入の実行を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＣＤ３４＋幹細胞が、１０〜２００の間のＭＯＩでのレンチウイルスベクターとともにインキュベートされる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＣＤ３４＋幹細胞が、ＭＯＩ１００でのレンチウイルスベクターとともにインキュベートされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記レンチウイルスベクターが、免疫選択用のマーカーとしての使用を意図した選択可能タンパク質をコードするさらなるポリヌクレオチドを保有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
免疫磁気選択法を用いて、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を選択するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＡＲが、免疫選択用のマーカーとしての使用を意図したスペーサードメインを有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
免疫磁気選択法を用いて、ＣＡＲ−ＣＤ３４＋幹細胞を選択するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
好ましくは、ＮＫ−ＣＡＲ細胞が、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）について陽性である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によって入手可能な前記ＮＫ−ＣＡＲ細胞を含む組成物。
【請求項１５】
医薬における使用を意図した、好ましくは免疫療法における使用を意図した、より好ましくは腫瘍及び血液学的悪性腫瘍の治療における使用を意図した、請求項１４に記載の組成物。
【国際調査報告】
2021525066.tif 000041
2021525066.tif 000042
2021525066.tif 000043