(57)【要約】  本開示は、目的の生成物、例えば組み換えタンパク質を製造するための方法、細胞、及び組成物に関する。特に、本開示は、目的の生成物を発現する改善された哺乳動物細胞であって、細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）が、制御されたラクトジェニック活性を有する、哺乳動物細胞を提供する。本開示はまた、哺乳動物細胞における、ピルビン酸キナーゼ筋（ＰＫＭ）発現（例えば、ＰＫＭ−１発現）を制御することにより、細胞のラクトジェニック活性を低下させる又は除去するための方法及び組成物、並びに、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞を含む組成物、並びにこれらの使用方法にも関する。
2021519073.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトジェニック活性が低下した又は除去された哺乳動物細胞であって、ピルビン酸キナーゼ筋（ＰＫＭ）ポリペプチドアイソフォームの発現がノックダウン又はノックアウトされており、前記ＰＫＭポリペプチドアイソフォームがＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォームを含む、哺乳動物細胞。
【請求項２】
ＰＫＭ−２ポリペプチドアイソフォームの発現がノックダウン又はノックアウトされている、請求項２に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１又は２に記載の哺乳動物細胞。
【請求項４】
目的の生成物をコードする核酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項５】
前記目的の生成物がタンパク質を含む、請求項４に記載の哺乳動物細胞。
【請求項６】
前記目的の生成物が組み換えタンパク質を含む、請求項４又は５に記載の哺乳動物細胞。
【請求項７】
前記目的の生成物が抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項８】
前記抗体が多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、請求項７に記載の哺乳動物細胞。
【請求項９】
前記抗体が、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、請求項７に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１０】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１１】
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１２】
前記核酸配列が、標的化された位置において前記哺乳動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれている、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１３】
前記哺乳動物細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれた前記目的の生成物をコードする核酸を更に含む、請求項１２に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１４】
前記哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が参照細胞のラクトジェニック活性の約５０％未満である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１５】
前記哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が参照細胞のラクトジェニック活性の約２０％未満である、請求項１４に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１６】
前記参照細胞が、ＰＫＭ遺伝子の野生型対立遺伝子を含む細胞である、請求項１４又は１５に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１７】
前記哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、産生期の１４日目又は１５日目に測定される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１８】
前記哺乳動物細胞が、産生期の間に約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを産生する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１９】
前記哺乳動物細胞が、産生期の間に振盪フラスコ内で約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを産生する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２０】
前記哺乳動物細胞が、産生期の間にバイオリアクター内で約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを産生する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２１】
配列番号３９〜４１からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は、配列番号３７及び３８に記載のヌクレオチド配列を含むＰＫＭ遺伝子の対立遺伝子を含む哺乳動物細胞。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞を含む組成物。
【請求項２３】
ピルビン酸キナーゼ筋（ＰＫＭ）ポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトすることを含む、細胞におけるラクトジェニック活性を低下させる又は除去する方法。
【請求項２４】
細胞におけるラクトジェニック活性を低下させる又は除去する方法であって、前記細胞に遺伝子組み換えシステムを投与することを含み、前記遺伝子組み換えシステムがピルビン酸キナーゼ筋（ＰＫＭ）ポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトする、方法。
【請求項２５】
前記遺伝子組み換えシステムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記遺伝子組み換えシステムがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが
（ａ）Ｃａｓ９分子、及び
（ｂ）ＰＫＭ遺伝子内の標的配列に対して相補的な標的化配列を含む、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的配列が、前記ＰＫＭ遺伝子の一部、前記ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する５’イントロン領域、前記ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する３’イントロン領域、前記ＰＫＭ遺伝子のエクソン１０に隣接する３’イントロン領域、前記ＰＫＭ遺伝子のエクソン１内の領域、前記ＰＫＭ遺伝子のエクソン２内の領域、前記ＰＫＭ遺伝子のエクソン１２内の領域、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記１つ以上のｇＲＮＡが
（ｉ）（１）前記ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する５’イントロン領域に対して相補的な標的配列を含む第１のｇＲＮＡ；及び（２）前記ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する３’イントロン領域に対して相補的な標的ドメインを含む第２のｇＲＮＡ、又は
（ｉｉ）（１）前記ＰＫＭ遺伝子のエクソン２内の領域に対して相補的な標的配列を含む第１のｇＲＮＡ；及び（２）前記ＰＫＭ遺伝子のエクソン１２内の領域に対して相補的な標的ドメインを含む第２のｇＲＮＡ
を含む、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記１つ以上のｇＲＮＡが、配列番号３３〜３４及び４２〜４３からなる群から選択される配列、並びにこれらの組み合わせを含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＰＫＭポリペプチドアイソフォームの発現がノックアウトされ、前記細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性と比較して除去されている、又は低下している、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＰＫＭポリペプチドアイソフォームの発現がノックダウンされ、前記細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性と比較して低下している、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞のラクトジェニック活性が、前記参照細胞のラクトジェニック活性の約５０％未満である、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞のラクトジェニック活性が、前記参照細胞のラクトジェニック活性の約２０％未満である、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞のラクトジェニック活性が、産生期の１４日目又は１５日目に測定される、請求項２３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が、産生期の間に約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを生成する、請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が、産生期の間に振盪フラスコ内で約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを生成する、請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が、産生期の間にバイオリアクター内で約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを生成する、請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記参照細胞が、前記ＰＫＭ遺伝子の野生型対立遺伝子を含む細胞である、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＰＫＭポリペプチドアイソフォームがＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォームである、請求項２３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＰＫＭポリペプチドアイソフォームがＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォーム及びＰＫＭ−２ポリペプチドアイソフォームである、請求項２３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記遺伝子組み換えシステムが、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡを含み、前記ＲＮＡが、前記ＰＫＭ遺伝子により発現するｍＲＮＡの一部に対して相補的である、請求項２４に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＰＫＭ遺伝子により発現される前記ｍＲＮＡが、ＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォームをコードする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォームの発現がノックアウト又はノックダウンされ、前記細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性と比較して低下している、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記遺伝子組み換えシステムが、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡ  ｍｉＲＮＡからなる群から選択される第２のＲＮＡを更に含み、前記第２のＲＮＡが、ＰＫＭ−２ポリペプチドアイソフォームをコードする前記ＰＫＭ遺伝子により発現するｍＲＮＡの一部に対して相補的である、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２ポリペプチドアイソフォームの発現がノックアウト又はノックダウンされ、前記細胞のラクトジェニック活性が低下した、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記遺伝子組み換えシステムが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムである、請求項２４に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が目的の生成物を発現する、請求項２３〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞により発現した前記目的の生成物が核酸配列によりコードされる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記核酸配列が、標的化された位置において前記細胞の細胞ゲノムに組み込まれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞により発現した前記目的の生成物が、前記哺乳動物細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれた核酸配列により更にコードされる、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記目的の生成物がタンパク質を含む、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記目的の生成物が組み換えタンパク質を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記目的の生成物が抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項５０〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗体が多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体が、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
目的の生成物の作製方法であって、前記目的の生成物を発現する哺乳動物細胞を培養することを含み、前記哺乳動物細胞が前記目的の生成物を発現し、低下した又は除去されたラクトジェニック活性を有する、方法。
【請求項６２】
目的の生成物を発現する哺乳動物細胞の集団の培養方法であって、前記哺乳動物細胞が、低下した又は除去されたラクトジェニック活性を有する、方法。
【請求項６３】
前記ラクトジェニック活性の低下又は除去が、前記哺乳動物細胞におけるピルビン酸キナーゼ筋（ＰＫＭ）ポリペプチドアイソフォームの発現のノックアウト又はノックダウンにより生じる、請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＰＫＭポリペプチドアイソフォームがＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォームである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＰＫＭポリペプチドアイソフォームがＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォーム又はＰＫＭ−２ポリペプチドアイソフォームである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性の約５０％未満である、請求項６１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性の約２０％未満である、請求項６１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、産生期の１４日目又は１５日目に測定される、請求項６１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記哺乳動物細胞が、産生期の間に約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを産生する、請求項６１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記哺乳動物細胞が、産生期の間に振盪フラスコ内で約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを産生する、請求項６１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記哺乳動物細胞が、産生期の間にバイオリアクター内で約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを産生する、請求項６１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記参照細胞が、ＰＫＭ遺伝子の少なくとも１つ又は両方の野生型対立遺伝子を含む細胞である、請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項６１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記哺乳動物細胞により発現した前記目的の生成物が核酸配列によりコードされる、請求項６１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記核酸配列が、標的化された位置において前記哺乳動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれている、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞により発現した前記目的の生成物が、前記哺乳動物細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれた核酸配列により更にコードされる、請求項６１〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記目的の生成物がタンパク質を含む、請求項６１〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記目的の生成物が組み換えタンパク質を含む、請求項６１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記目的の生成物が抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項６１〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
抗体が多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記抗体が、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項７９〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記目的の生成物を回収することを更に含む、請求項６１〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月２９日に出願された米国特許出願第６２／６４９，９６３号に対する優先権を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
配列表
本出願には、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットにて提出された配列表が含まれ、その全体が参照により本明細書に援用される。２０１９年３月２８日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、００Ｂ２０６＿０７８５＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、４４４，５１１バイトのサイズである。
【０００３】
１．発明の分野
本開示は、目的の生成物、例えば組み換えタンパク質を製造するための方法及び組成物に関する。特に、本開示は、目的の生成物を発現する哺乳動物細胞であって、細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）が、制御されたラクトジェニック（ｌａｃｔｏｇｅｎｉｃ）活性を有する、哺乳動物細胞に関する。本開示はまた、哺乳動物細胞でピルビン酸キナーゼ筋（ＰＫＭ）発現（例えば、ＰＫＭ−１発現）を制御して、細胞におけるラクトジェニック活性を低下又は除去するための方法及び組成物、並びに、ラクトジェニック活性が低下又は除去された１つ以上の細胞を有する組成物、及びその使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
２．背景
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、その、適切なタンパク質の折りたたみ、集合、及び翻訳後用途に対する能力故に、臨床用途のための治療用タンパク質の製造において、幅広く使用されている。通常、他の不死化細胞株と同様に、ＣＨＯ細胞は、Ｗａｒｂｕｒｇ効果（Ｗａｒｂｕｒｇ，１９５６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２３（３１９１）：３０９−１４）として知られるプロセスである、好気的解糖により、グルコースを消費してラクテートを生成する傾向にある。生成培地におけるラクテートの蓄積は、細胞増殖、生存能、及び産生能に逆効果を及ぼし得る。このような、製造工程中におけるＣＨＯ細胞のラクトジェニック挙動（即ち、ラクテート生成挙動）により、生存能及び産生能の低下が引き起こされ得、生成される治療用タンパク質の質が変化する可能性がある。
【０００５】
処理条件を標的にするいくつかのアプローチが、ラクトジェニックＣＨＯ細胞株におけるラクテートの生成を緩和するために開発されてきた。例えば、銅の量を最適化することが、いくつかのＣＨＯ細胞株において、ラクトジェニック挙動を防止するのに効果的であることが示されている（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０９（１）：１４６−５６；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔ．Ｅｎｇ．３９（１１）：１６８９−７０２）。培地中のｐＨを上昇させることにより引き起こされる、栄養素供給制御を伴う別のアプローチ（ハイエンドｐＨ制御グルコース送達、又はＨＩＰＤＯＧ）が、大規模なＣＨＯ培地中でのラクテート蓄積を低下させる、又は除去するのに効果的であることが、示されている（Ｇａｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０８（６）：１３２８−３７）。しかし、前者のアプローチは、全てのラクトジェニックＣＨＯ細胞株に適用できず、後者では、大規模な製造プロセスが複雑化する可能性があるため、これらのアプローチには制限がある。更に、これらのアプローチは、ＣＨＯ細胞における、ラクトジェニック挙動の根底的なメカニズムを標的にしない。
【０００６】
したがって、細胞培養におけるラクテート生成を低下させるための技術が、当該技術分野において求められている。
【発明の概要】
【０００７】
３．概要
本開示は、目的の生成物、例えば組み換えタンパク質を製造するための方法、細胞、及び組成物に関する。特に、本明細書で記載した方法、細胞、及び組成物は、目的の生成物を発現する、細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）が、制御されたラクトジェニック活性を有する改善された哺乳動物細胞を含む。本明細書に記載する方法及び組成物は、哺乳動物細胞のラクトジェニック活性を制御するために、ラクトジェニック活性と関連する、根底的な影響、例えば哺乳動物細胞の生存能及び産生能の低下、並びに、生成される目的の生成物の質の変化を低下させる、又は除去する。
【０００８】
本開示は更に、哺乳動物細胞でピルビン酸キナーゼ筋（ＰＫＭ）発現（例えば、ＰＫＭ−１発現）を制御することによって、細胞におけるラクトジェニック活性を低下させる、又は除去するための方法及び組成物、並びに、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞、及びその使用方法に関する。
【０００９】
一態様において、本開示は、ピルビン酸キナーゼ筋（ＰＫＭ）ポリペプチドの１つ又は複数のアイソフォームの発現がノックダウン又はノックアウトされている、ラクトジェニック活性が低下した、又は除去された哺乳動物細胞に関する。特定の実施形態において、ノックアウト又はノックダウンされたＰＫＭポリペプチドアイソフォームは、ＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォームである。特定の実施形態において、ノックアウト又はノックダウンされたＰＫＭポリペプチドアイソフォームは、ＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォーム、及びＰＫＭ−２ポリペプチドアイソフォームの両方である。特定の実施形態において、哺乳動物細胞のラクトジェニック活性は、参照細胞のラクトジェニック活性の約５０％未満、例えば約２０％未満である。特定の実施形態において、参照細胞は、ＰＫＭ遺伝子の１つ以上の野生型対立遺伝子を含む細胞である。例えば、ＰＫＭ遺伝子の両方の対立遺伝子が野生型であるか、又は未改変である。特定の実施形態において、哺乳動物細胞のラクトジェニック活性は、産生期の１４日目又は１５日目に測定される。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、産生期の間に、約１．０ｇ／Ｌ未満、又は約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを生成する、例えば、産生期の間に、振盪フラスコ内で約１．０ｇ／Ｌ未満、又は約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを産生する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、産生期中にバイオリアクター中で、約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを産生する。本開示は、配列番号３９〜４１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、又は、配列番号３７及び３８に記載のヌクレオチド配列を含むＰＫＭ遺伝子の対立遺伝子を含む哺乳動物細胞を提供する。本開示は、本明細書にて開示した１つ以上の細胞、例えば哺乳動物細胞を含む組成物を更に提供する。
【００１０】
特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、目的の生成物をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態において、核酸配列は、標的化された位置における哺乳動物細胞の細胞ゲノムにて組み込まれる。あるいは、及び／又は更に、目的の生成物をコードする核酸は無作為に、哺乳動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれる。特定の実施形態において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。
【００１１】
特定の実施形態において、目的の生成物はタンパク質、例えば組み換えタンパク質を含む。特定の実施形態において、目的の生成物は、抗体又はその抗原結合断片を含む。例えば、限定されるものではないが、抗体は多重特異性抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施形態において、抗体は、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる。特定の実施形態において、抗体はキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体、及び／又はモノクローナル抗体である。
【００１２】
別の態様においては、本開示は、細胞におけるラクトジェニック活性の低下又は除去方法に関する。特定の実施形態において、方法は、ピルビン酸キナーゼ筋（ＰＫＭ）ポリペプチドアイソフォームの発現の、ノックダウン又はノックアウトを含む。特定の実施形態において、方法は、細胞に、ピルビン酸キナーゼ筋（ＰＫＭ）ポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトする遺伝子組み換えシステムを投与することを含む。特定の実施形態において、遺伝子組み換えシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態において、方法により、参照細胞のラクトジェニック活性の約５０％未満、例えば約２０％未満であるラクトジェニック活性を有する細胞がもたらされる。特定の実施形態において、参照細胞は、ＰＫＭ遺伝子の１つ以上の野生型対立遺伝子を含む細胞である。例えば、ＰＫＭ遺伝子の両方の対立遺伝子が野生型であるか、又は未改変である。特定の実施形態において、細胞のラクトジェニック活性は、産生期の１４日目又は１５日目に測定される。特定の実施形態において、細胞は、産生期の間に、約１．０ｇ／Ｌ未満、又は約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを生成する、例えば、産生期の間に、振盪フラスコ内で約１．０ｇ／Ｌ未満、又は約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを産生する。特定の実施形態において、細胞は、産生期中にバイオリアクター内で約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを産生する。
【００１３】
特定の非限定的実施形態において、本開示にて使用するための遺伝子組み換えシステムは、Ｃａｓ９分子、及び、ＰＫＭ遺伝子の標的配列に対して相補的な標的化ドメインを含む、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。特定の実施形態において、標的配列は、ＰＫＭ遺伝子の一部、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する５’イントロン領域、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する３’イントロン領域、ＰＫＭ遺伝子のエクソン１０に隣接する３’イントロン領域、ＰＫＭ遺伝子のエクソン１内の領域、ＰＫＭ遺伝子のエクソン２内の領域、ＰＫＭ遺伝子のエクソン１２内の領域、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態において、１つ以上のｇＲＮＡは、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する５’イントロン領域に対して相補的な標的配列を含む第１のｇＲＮＡ、及び、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する３’イントロン領域に対して相補的な標的ドメインを含む第２のｇＲＮＡを含む。特定の実施形態において、１つ以上のｇＲＮＡは、ＰＫＭ遺伝子のエクソン２内の領域に対して相補的な標的配列を含む第１のｇＲＮＡ、ＰＫＭ遺伝子のエクソン１２内の領域に対して相補的な標的ドメインを含む第２のｇＲＮＡを含む。例えば、限定されるものではないが、１つ以上のｇＲＮＡは、配列番号３３〜３４及び４２〜４３からなる群から選択される配列、並びにこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態において、ＰＫＭポリペプチドアイソフォームの発現がノックアウト又はノックダウンされており、細胞のラクトジェニック活性が除去されている。特定の実施形態において、ＰＫＭポリペプチドアイソフォームは、ＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォーム、又はＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２ポリペプチドアイソフォームの組み合わせである。
【００１４】
特定の実施形態において、本開示にて使用するための遺伝子組み換えシステムは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムである。特定の非限定的実施形態において、遺伝子組み換えシステムは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡを含み、ＲＮＡは、ＰＫＭ遺伝子により発現されるｍＲＮＡに相補的である。特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子により発現されるｍＲＮＡは、ＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォームをコードする。特定の実施形態において、ＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォームの発現がノックダウンされ、細胞のラクトジェニック活性が低下している。特定の実施形態において、遺伝子組み換えシステムは、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡ  ｍｉＲＮＡからなる群から選択される第２のＲＮＡを更に含み、第２のＲＮＡは、ＰＫＭ−２ポリペプチドアイソフォームをコードするＰＫＭ遺伝子により発現されるｍＲＮＡの一部に相補的である。特定の実施形態において、ＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２ポリペプチドアイソフォームの発現がノックアウト又はノックダウンされており、細胞のラクトジェニック活性が低下している。
【００１５】
更なる態様において、本開示は、例えば、本明細書にて開示した細胞からの、目的の生成物の製造方法を提供する。例えば、目的の生成物の製造方法は、ラクトジェニック活性が低下した、又は除去された哺乳動物細胞を培養して目的の生成物を生成することを含む。特定の実施形態において、本開示は、目的の生成物を発現する哺乳動物細胞の集団の培養方法であって、哺乳動物細胞が、低下した、又は除去されたラクトジェニック活性を有する、方法を提供する。特定の実施形態において、ラクトジェニック活性の低下又は除去は、哺乳動物細胞でピルビン酸キナーゼ筋（ＰＫＭ）ポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトすることによりもたらされる。特定の実施形態において、ＰＫＭポリペプチドアイソフォームはＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォームである。特定の実施形態において、ＰＫＭ−２ポリペプチドアイソフォームの発現もまたノックダウン又はノックアウトされている。特定の実施形態において、方法は、細胞培養液から目的の生成物を単離することもまた含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ−１Ｆ】ｍＡｂ−１細胞株のラクテート量は、ＰＫＭ−１の量と直接相関する。低ラクテート及び高ラクテートプロセス下でのｍＡｂ−１細胞株における、細胞生存率（図１Ａ）、１４日目の力価（図１Ｂ）、及びラクテート量（図１Ｃ）。（図１Ｄ）低ラクテート及び高ラクテートプロセス下での製造中における、異なる日での、ｍＡｂ−１細胞可溶化物の、ＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２ウェスタンブロット分析。アクチンをローディング対照として使用した。アクチンに対して正規化した、相対的なＰＫＭ−１（図１Ｅ）及びＰＫＭ−２（図１Ｆ）量の定量化。
【図２Ａ−２Ｆ】ｍＡｂ−２細胞株のラクテート量は、ＰＫＭ−１の量と直接相関する。低ラクテート及び高ラクテートプロセス下でのｍＡｂ−２細胞株における、細胞生存率（図２Ａ）、１４日目の力価（図２Ｂ）、及びラクテート量（図２Ｃ）。（図２Ｄ）低ラクテート及び高ラクテートプロセス下での製造中における、異なる日での、ｍＡｂ−２細胞可溶化物の、ＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２ウェスタンブロット分析。アクチンをローディング対照として使用した。アクチンに対して正規化した、相対的なＰＫＭ−１（図２Ｅ）及びＰＫＭ−２（図２Ｆ）量の定量化。
【図３Ａ−３Ｅ】ＣＨＯ細胞はＰＫＬ／Ｒ酵素を発現しないが、これらの酵素の量は、生成培養物中でのラクテート量と相関しない。（図３Ａ）２つの異なるＣＨＯ宿主細胞株（Ｋ１及びＤＨＦＲ−／−）、並びにヒト２９３細胞における、ＰＫＬ／Ｒタンパク質の細胞内発現の、ウェスタンブロット分析。アクチンをローディング対照として使用する。（図３Ｂ及び３Ｃ）ｍＡｂ−１（図３Ｂ）及びｍＡｂ−２（図３Ｃ）細胞株の、高ラクテート及び低ラクテート製造プロセス中での、異なる日数における、ＰＫＬ／Ｒの細胞内タンパク質量。（図３Ｄ及び３Ｅ）ｍＡｂ−１（図３Ｄ）及びｍＡｂ−２（図３Ｅ）細胞株中でアクチンに対して正規化した、ＰＫＬ／Ｒの相対量の定量化。
【図４Ａ−４Ｃ】ＰＫＭ−１を生成することにより、細胞株がノックアウトされる。（図４Ａ）ｍＡｂ−２細胞株でのエクソン−９の欠損を評価するために使用した、ＰＫＭ遺伝子及びｇＲＮＡ及びスクリーニングプライマーの、エクソン８〜１０の概略図。ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する２つのｇＲＮＡを、Ｃａｓ９導入遺伝子と同時にトランスフェクションして、エクソン９の欠損を誘発した。トランスフェクト細胞は、クローニングした単一細胞であった。欠損領域に隣接するＰＣＲプライマーを使用して、ＰＫＭ対立遺伝子にてエクソン−９の欠損に成功した細胞株のスクリーニングを行った。（図４Ｂ）野生型（ＷＴ）ｍＡｂ−２細胞、並びに、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９導入遺伝子を介してエクソン−９の欠損が標的化された細胞株を、ＰＣＲプライマーをスクリーニングすることで分析した。上のバンドはＷＴ  ＰＫＭ対立遺伝子を表す一方で、下のバンドは、エクソン９が欠損したＰＫＭ対立遺伝子を表す。ＫＯ：ノックアウト細胞株、ＨＥＴ：ヘテロ接合細胞株。（図４Ｃ）標的化細胞株における、エクソン−９  ＫＯ対立遺伝子と対比した、ＰＫＭ  ＷＴ対立遺伝子の配列比較。ＫＯ−１５細胞株は、標的化ＰＫＭ対立遺伝子中のエクソン−９の５’領域に、意図した（１２２ｂｐまでの）欠損よりも大きい欠損を有することに注意されたい。
【図５Ａ−５Ｈ】ＰＫＭ−１の発現を停止する、又は低下させることにより、高ラクテートプロセス下においても、ｍＡｂ−２細胞株におけるラクトジェニック挙動が防がれた。ＡＭＢＲ１５バイオリアクターを使用する、１４日間のバッチ供給生成アッセイの間の、ＷＴ、並びにＰＫＭ−１  ＨＥＴ及びＫＯ  ｍＡｂ−２細胞株の、生残細胞計数（図５Ａ）、細胞生存率（図５Ｂ）、１４日目の力価（図５Ｃ）、１４日目の特異的な産生能（図５Ｄ）、及びラクテート量（図５Ｅ）。プロセス制御は、図２における高ラクテートプロセスと同じであった。（図５Ｆ）ＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２タンパク質に対する、示した細胞株の細胞可溶化物のウェスタンブロットアッセイ。アクチンをローディング対照として使用する。（図５Ｇ及び５Ｈ）示した細胞株からのｍＡｂ−２の、凝集率（図５Ｇ）及び荷電バリアントの割合（図５Ｈ）を含む、抗体生成物の質。
【図６Ａ−６Ｇ】細胞の年齢又は解凍後に関係なく、高ラクテートプロセスを使用することで、ラクトジェニック挙動は、ＰＫＭ−１  ＫＯ又はＨＥＴ  ｍＡｂ−２細胞株にて防がれる、又は低減される。ＡＭＢＲ１５バイオリアクターを使用する、１４日間のバッチ供給生成アッセイにおける、若い細胞年齢での、示した細胞株の生残細胞計数（図６Ａ）、細胞生存率（図６Ｂ）、１４日目の力価（図６Ｃ）、１４日目の特異的な産生能（図６Ｄ）、及びラクテート量（図６Ｅ）。（図６Ｆ及び６Ｇ）示した細胞株からのｍＡｂ−２の、凝集率（図６Ｆ）及び荷電バリアントの割合（図６Ｇ）を含む、抗体生成物の質。プロセス制御は、図５におけるものと同じであった。エラーバーは、４つの個別実験の標準誤差を表す。
【図７】ＰＫＭ及びＰＫＭ−１  ＫＯ宿主細胞株に由来する、ＭＡｂ−３産生プールは、（振盪フラスコ産生において）相当する、又は高いＱｐ及び力価を有したが、低い増殖を有した。
【図８Ａ−８Ｂ】ＰＫＭ及びＰＫＭ−１  ＫＯ宿主細胞株に由来する、ＭＡｂ−３産生プールは、振盪フラスコ産生において、少ないラクテートを生成した（図８Ａ）が、より多くのグルコースを消費した（図８Ｂ）。
【図９Ａ】ＰＫＭ及びＰＫＭ−１  ＫＯ宿主細胞株に由来する、ＭＡｂ−３産生プールは、振盪フラスコ産生において、異なるアミノ酸合成／消費速度を示した。
【図９Ｂ】長方形で囲まれる棒及び経路は、ＰＫＭ  ＫＯ宿主細胞株が３−ホスホグリセリン酸を蓄積したことを示す。
【図９Ｃ】長方形で囲まれる棒及び経路は、ＷＴ宿主細胞株がピルベートを蓄積したことを示す。
【図９Ｄ】長方形で囲まれる棒及び経路は、ＰＫＭ−１  ＫＯ宿主細胞株が、ＴＣＡサイクル生成物であるα−ケトグルタレート（ａ−ＫＧ）を蓄積したことを示す。
【図９Ｅ】長方形で囲まれる棒及び経路は、ＰＫＭ−１  ＫＯ宿主細胞株が、ＴＣＡサイクル生成物であるオキザロ酢酸を蓄積したことを示す。
【図１０】グルコース、ラクテート、及びアミノ酸の、宿主細胞の消費率又は生成率。
【図１１】ＰＫＭ及びＰＫＭ−１  ＫＯ宿主細胞株に由来する、ＭＡｂ−３産生プールは、振盪フラスコ産生において、異なるグリコシル化プロファイルを示した。ＰＫＭ  ＫＯ宿主ではガラクトシル化が低下し、ＰＫＭ  ＫＯ及びＰＫＭ−１  ＫＯ宿主細胞株では、フコシル化がわずかに低下した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
５．  詳細な説明
限定を行うものではなく、明確化のために、本明細書にて開示する主題の詳細の説明を、以下の小節に分ける：
５．１  定義；
５．２  ＰＫＭ発現の制御；
５．３  ラクトジェニック活性が低下した、又は除去された細胞；
５．４  細胞培養法；
５．５  生成物；及び
５．６  例示的実施形態。
【００１８】
５．１  定義
本明細書中で使用される用語は一般に、本開示の文脈内で、かつ、各用語が使用される具体的な文脈においての、当該技術分野における通常の意味を有する。特定の用語を以下で、又は、本明細書の他の箇所にて論じ、本開示の組成物及び方法、並びに、それらの作製及び使用方法について記載する、実践者向けの追加の案内を示す。
【００１９】
本明細書で使用する場合、特許請求の範囲、及び／又は明細書内で、用語「を含む」と共に用いられる場合、語句「ａ」又は「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味し得るが、これは「１つ以上の」、「少なくとも１つの」、及び「１つ又は２つ以上」の意味とも一致する。
【００２０】
本明細書で使用する場合、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）／ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「を有する（ｈａｖｉｎｇ／ｈａｓ）」、「することができる」、「を含有する」、及びこれらの変形は、追加の作用又は構造物の可能性を排除しない、オープンエンドの移行句、用語、又は単語であることが意図される。本開示はまた、明示的に記載されているかいないかに関わらず、本明細書にて提示される実施形態又は要素「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」他の実施形態を想到する。
【００２１】
本明細書で使用する場合、用語「ラクトジェニック挙動」又は「ラクトジェニック活性」とは、例えば、好気的解糖により、グルコースを消費してラクテートを生成することによる、細胞のラクテート生成活性を意味する。特定の実施形態において、細胞のラクトジェニック活性は、細胞培養培地中に蓄積したラクテートの量により測定することができる。
【００２２】
用語「約」又は「およそ」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、即ち、測定システムの制限事項にある程度依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野での１回の実施当たり３つ又は３つよりも多くの標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の、最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、そしてより好ましくは更に、最大１％の範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的系又はプロセスに関して、この用語は、ある値の１桁以内、好ましくは５倍以内、及びより好ましくは２倍以内を意味することができる。
用語「細胞培養培地」及び「培地」とは、典型的には、以下のカテゴリーのうちの１つ以上からの、少なくとも１つの構成成分を提供する、哺乳動物細胞を増殖させるのに使用される栄養素溶液を意味する：
１）  通常、グルコースなどの炭水化物の形態でのエネルギー供給源；
２）  全ての必須アミノ酸、及び通常、２０個のアミノ酸＋システインの、塩基性のまとまり；
３）  低濃度で必要とされるビタミン及び／又は他の有機化合物；
４）  遊離脂肪酸；並びに
５）  微量元素（微量元素は、非常に低濃度、通常マイクロモル範囲で典型的には必要とされる、無機化合物又は天然に存在する元素として定義される）。
【００２３】
栄養素溶液は任意に、以下のカテゴリーのいずれかに由来する１つ以上の構成成分が補充されていることができる：
１）  例えばインスリン、トランスフェリン、及び上皮成長因子などの、ホルモン及び他の成長因子；
２）  例えばカルシウム、マグネシウム、及びホスフェートなどの、塩類及び緩衝液；
３）  例えばアデノシン、チミジン、及びヒポキサンチンなどの、ヌクレオシド及び塩基；並びに
４）  タンパク質及び組織加水分解物。
【００２４】
細胞を「培養すること」とは、細胞を、細胞の生残及び／又は成長及び／又は増殖に好適な条件下にて、細胞培養培地と接触させることを意味する。
【００２５】
「バッチ培養液」とは、培養プロセスの開始時に、細胞培養のための全ての構成成分（細胞、及び全ての培養栄養素を含む）が、培養バイオリアクターに供給されている培養液を意味する。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「流加培養細胞培養液」とは、細胞と培地が培養バイオリアクターに最初に供給され、追加の培養栄養素が、培養プロセス中に培養液に連続して、又は個別に増加して供給され、培養終了前に、周期的に細胞及び／又は生成物が回収される、又はされない、バッチ培養液を意味する。
【００２７】
場合によっては連続培養液と呼ばれる「還流培養液」とは、細胞が、例えば濾過、封入、マイクロ担体へのアンカリングなどにより培養液中に保持され、培地が連続して、段階的に、又は断続的に（又はこれらの任意の組み合わせで）導入され、培養バイオリアクターから取り除かれる培養液である。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「細胞」とは、動物細胞、哺乳動物細胞、培養細胞、宿主細胞、組み換え細胞、及び組み換え宿主細胞を意味する。このような細胞は一般に、適切な栄養素及び／又は成長因子を含有する培地に配置されたときに、増殖及び生残可能な哺乳動物組織から入手される、又はその組織に由来する細胞株である。
【００２９】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」は同じ意味で用いられ、外因性核酸が導入された細胞を意味し、そのような細胞の後代を含む。宿主細胞としては、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び継代の数に関わらず宿主細胞に由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞の核酸含有量と完全に同一である必要はないが、変異を含むことができる。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか、又は選択されるのと同じ機能若しくは生体活性を有する変異体子孫が本発明に含まれる。
【００３０】
用語「哺乳動物宿主細胞」又は「哺乳動物細胞」とは、適切な栄養素及び成長因子を含有する培地内の、単一層培養液又は懸濁培養液のいずれかに配置したときに、増殖及び生残可能な哺乳動物に由来する細胞株を意味する。特定の細胞株に必要な成長因子は、例えばＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１９８４）、及びＢａｒｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓａｔｏ，（１９８０）Ｃｅｌｌ，２２：６４９に記載されているように、過度な実験をすることなく、実験により速やかに決定される。典型的には、細胞は、目的の、多量の特定のタンパク質、例えば糖タンパク質を、培地にて発現して分泌させることができる。本開示の文脈内で好適な哺乳動物宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６  １９８０）；ｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（１９８９年３月１５日に出版された欧州特許第３０７，２４７号）；ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−６１）；ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児腎臓株（２９３細胞、又は、懸濁培養液中での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９  １９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１  １９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザルサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファロー系ラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８  １９８２）；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）を挙げることができる。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６  １９８０）；ｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（１９８９年３月１５日に公開された欧州特許第３０７，２４７号）を含む。
【００３１】
本開示の文脈内での用語「ペプトン」とは、本質的に加水分解された動物性タンパク質である、培地補充物を指すことを意味する。このタンパク質の源は、屠殺したウマ由来の動物性副生成物、精製ゼラチン、又は植物物質であることができる。タンパク質は典型的に、酸、熱、又は様々な酵素調製物を用いて、加水分解される。
【００３２】
細胞培養物の「増殖期」とは、細胞が一般に、急速に分裂する、指数的に細胞が増殖する期間（対数期）を意味する。増殖期にて、細胞が維持される時間の長さは、例えば細胞の種類、細胞の増殖速度、及び／又は培地の状態に基づいて変化することができる。特定の実施形態において、この期の間に、細胞は一定期間（通常１〜４日間）、細胞増殖が最大化されるような条件下において培養される。宿主細胞の増殖サイクルの決定は、過度な実験をすることなく想到される、特定の宿主細胞に対して決定される。「細胞増殖が最大化されるような期間及び条件下」などは、特定の細胞株に対して、細胞増殖及び分裂が最適であると測定される培養条件を意味する。特定の実施形態において、増殖期の間に、細胞は、特定の細胞株に対しての最適な増殖が達成されるように、一般に約３０〜４０℃の加湿・制御大気下にて、必要な添加剤を含有する栄養素培地にて培養される。特定の実施形態において、細胞は、約１〜４日間、通常は２〜３日間の期間、増殖期で維持される。
【００３３】
細胞培養の「移行期」とは、産生期の培養条件が関与する期間を意味する。移行期の間、細胞培養液の温度、培地浸透圧などの環境因子は、増殖条件から産生条件へと移動する。
【００３４】
細胞培養の「産生期」とは、細胞増殖が停滞する／停滞を続ける期間を意味する。対数的な細胞増殖は典型的には、この期の前、又は間に低下し、タンパク質産生に引き継がれる。産生期の間、対数的な細胞増殖は終わり、タンパク質産生が主となる。この期間の間、培地は一般に、タンパク質の連続した産生を支え、所望の糖タンパク質生成物を得るために補充される。流加培養及び／又は還流細胞培養プロセスは、この期の間に細胞培養培地を補充し、又は新鮮な培地を供給して、所望の細胞密度、生存能、及び／又は組み換えタンパク質生成物の力価を達成する、及び／又は維持する。産生期は大規模に実施することができる。
【００３５】
用語「発現」又は「発現する」は、本明細書において、宿主細胞内で生じる転写及び翻訳を意味するように用いられる。宿主細胞内での産生遺伝子の発現度合いは、細胞内に存在する、対応するｍＲＮＡの量、又は、細胞により産生される産生遺伝子によりコードされるタンパク質の量のいずれかに基づいて測定することができる。例えば、産生遺伝子から転写されるｍＲＮＡは、ノーザンハイブリダイゼーションにより定量化されるのが望ましい。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｐｐ．７．３−７．５７（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。産生遺伝子によりコードされるタンパク質は、タンパク質の生物活性をアッセイすること、又は、そのような活性とは無関係な、タンパク質と反応可能な抗体を使用するウェスタンブロット若しくはラジオイムノアッセイなどのアッセイを用いることのいずれかにより定量化することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｐｐ．１８．１−１８．８８（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」とは一般に、約１０個を超えるアミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を意味する。ポリペプチドは、宿主細胞に相同であることができる、又は好ましくは、外因性であることができる。後者は、利用される宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞により産生されるヒトタンパク質、又は、哺乳動物細胞により産生される酵母ポリペプチドに対して異種である、即ち、外部のものである、ということを意味する。特定の実施形態において、哺乳動物ポリペプチド（元々、哺乳動物生命体に由来したポリペプチド）、より好ましくは、培地に直接分泌するポリペプチドを使用する。
【００３７】
用語「タンパク質」とは、鎖長が、より高度の三級及び／又は四級構造を産生するのに十分であるアミノ酸の配列を指すことを意味する。これは、「ペプチド」、又は、このような構造を有しない他の低分子量薬剤から、区別するためのものである。典型的には、本明細書のタンパク質は、少なくとも約１５〜２０ｋＤ、好ましくは少なくとも約２０ｋＤの分子量を有する。本明細書の定義に包含されるタンパク質の例としては、全ての哺乳動物タンパク質、特に、治療用及び診断用抗体などの治療用及び診断用タンパク質、並びに、１つ以上の鎖間及び／又は鎖内ジスルフィド結合を含む多鎖ポリペプチドを含む、１つ以上のジスルフィド結合を含有する一般的なタンパク質が挙げられる。
【００３８】
用語「抗体」は、本明細書で最も広い意味で用いられ、所望の抗原結合活性を示すのであれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体（例えば、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列からなる抗体（このような対の多量体を含む））、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体断片を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
【００３９】
本明細書で使用する場合、抗体の「抗体断片」、「抗原結合部」（若しくは単に「抗体部」）、又は、抗体の「抗原結合断片」とは、抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を意味する。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ）；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）；並びに、抗体断片から形成した多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体フラグメントの総説としては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１１２６−１１３６（２００５）を参照のこと。
【００４０】
用語「キメラ」抗体とは、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の源又は種に由来する一方で、重鎖及び／又は軽鎖の残部が異なる源又は種に由来する抗体を意味する。
【００４１】
抗体の「クラス」とは、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。特定の実施形態において、抗体はＩｇＧ１アイソタイプである。特定の実施形態において、抗体はＩｇＧ２アイソタイプである。異なる免疫グロブリンのクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの種類のうちの１つに割り当てられることができる。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「力価」とは、所与の量の培地体積で分けられた細胞培養液により産生された、組み換えにより発現した抗体の総量を意味する。力価は典型的には、１ミリリットル又は１リットルの培地当たりの、抗体のミリグラムの単位（ｍｇ／ｍＬ又はｍｇ／Ｌ）にて表される。特定の実施形態において、力価は、１リットルの培地当たりの抗体のグラム（ｇ／Ｌ）で表される。力価は、異なる培地条件下でタンパク質産生物を得ることと比較しての、力価の増加割合といった、相対的な測定値の観点から表現又は評価することができる。
【００４３】
「核酸」、「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」との用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（即ち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（即ち、デオキシリボース又はリボース）、及びホスフェート基で構成される。多くの場合、核酸分子は塩基配列によって記述され、ここで、上記塩基は、核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。ここで、核酸分子との用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線形又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子との用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。更に、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含んでいてもよい。誘導体化された糖又はホスフェート骨格結合又は化学修飾された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例としては、改変されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、例えば、宿主又は患者において、インビトロ及び／又はインビボで本開示の抗体を直接的に発現するためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。このようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、改変されていなくてもよく、又は改変されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、インビボで抗体を産生するために対象にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を高めるように化学修飾されてもよい（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１７、２０１７年６月１２日にオンラインで公開、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又は欧州特許第２  １０１  ８２３  Ｂ１号を参照のこと）。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」とは、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。
【００４５】
用語「ハイブリドーマ」とは、免疫原の不死化細胞株と、抗体産生細胞との融合により産生される、ハイブリッド細胞株を意味する。この用語は、ヒト細胞とマウス骨髄腫細胞株とを融合した後、トリオーマ細胞株として一般に知られる形質細胞と融合した結果である、ヘテロハイブリッド骨髄腫融合物の後代を包含する。更に、この用語は、抗体を産生する、あらゆる不死化ハイブリッド細胞株、例えばクアドローマなどを含むことを意味する。例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５３７：３０５３（１９８３）を参照のこと。
【００４６】
「ヒト抗体」とは、ヒト若しくはヒト細胞により作製した、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード化配列を利用した、非ヒト源由来の抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、詳細には非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【００４７】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を意味する。特定の態様において、ヒト化抗体は、非ヒト抗体の可変ドメインに対応する全て又はほぼ全てのＣＤＲ、及びヒト抗体の可変ドメインに対応する全て又はほぼ全てのＦＲにおける、ほぼ全ての少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を受けた抗体を意味する。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、配列内で超可変可能であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを意味する。
一般的に、抗体は、６個のＣＤＲを含み、ＶＨに３個（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）、ＶＬに３個（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３）含む。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、
（ａ）  アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；
（ｂ）  アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））；及び
（ｃ）  アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）及び９３−１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））；が挙げられる。
【００４９】
特に指示がない限り、ＣＤＲは、上記のＫａｂａｔらに従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の、科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。
【００５０】
「免疫抱合体」とは、細胞傷害性剤を含むが、これに限定されない１つ以上の異種分子に抱合される抗体である。
【００５１】
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の母集団から得られる抗体を意味する。即ち、母集団を含む個々の抗体が、可能性のあるバリアント抗体（例えば、天然に存在する変異を含有する、又はモノクローナル抗体の調製中に生じ、このような変異が通常少量存在する）を除いて同一である、及び／又は同一のエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対して異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体の調製と比べて、モノクローナル抗体の調製における各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。したがって修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の母集団から得られる抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本開示の主題に従ったモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない様々な技法によって作製することができ、そのような方法及び他の例示のモノクローナル抗体の作製方法は、本明細書に記載されている。
【００５２】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般的に、同様の構造を有し、それぞれのドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照のこと。抗原結合特異性を与えるには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを使用して相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリをそれぞれスクリーニングして、単離されてもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照のこと。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「細胞密度」とは、所与の体積の培地中での、細胞の数を意味する。特定の実施形態において、より高いタンパク質産生能をもたらすという点で、高い細胞密度が望ましい。細胞密度は、培地からサンプルを抽出し、顕微鏡の下で細胞を分析すること、市販されている細胞計数装置を使用すること、又は、バイオリアクターそのもの（若しくは培地及び懸濁細胞が通過して、バイオリアクターに戻るループ）に導入した、市販されている好適なプローブを使用することを含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の任意の技術により監視することができる。
【００５４】
本明細書で使用する場合、用語「シーディング」とは、産生期の開始時に、培地に増殖細胞を添加又は播種することを意味する。更に、本明細書で使用する場合、用語「シードトレイン」とは、細胞株を維持するために、約２０Ｌ以下の体積の培地で、細胞を継続して継代することを意味する。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「組み換え細胞」とは、由来する元の親細胞に対して、いくらかの遺伝子組み換えを有する細胞を意味する。このような遺伝子組み換えは、遺伝子産物、例えば組み換えタンパク質を発現させるために異種遺伝子を導入した結果であることができる。
【００５６】
本明細書で使用する場合、用語「組み換えタンパク質」とは一般に、抗体を含む、ペプチド及びタンパク質を意味する。このような組み換えタンパク質は「異種」、即ち、利用される宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞により産生した抗体に対して外来である。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「ＰＫＭポリペプチド」とは、ＰＫＭ遺伝子によりコードされたポリペプチドを意味する。ＰＫＭポリペプチドは、ＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォーム及び／又はＰＫＭ−２ポリペプチドアイソフォームを含む。
【００５８】
５．２  ＰＫＭ発現の制御
解糖は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞による、エネルギーを生み出すために使用されるグルコース代謝のプロセスである。解糖は高流動状態又は低流動状態にて生じることができる。グルコース量に対する細胞応答、及び、これらの流動状態間での切り替えは、細胞株、並びに、解糖経路に存在するアイソザイムの量及び組み合わせに応じて変化する可能性がある（Ｍｕｌｕｋｕｔｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９（６）：ｅ９８７５６）。通常の培養条件下にて、他の不死化細胞株と同様に、ＣＨＯ細胞は、Ｗａｒｂｕｒｇ効果（Ｗａｒｂｕｒｇ，１９５６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２３（３１９１）：３０９−１４）として知られるプロセスである、好気的解糖により、グルコースを消費してラクテートを生成する傾向にある。産生培地中でラクテートが蓄積することにより、細胞増殖、生存能、及び産生能に悪影響を及ぼし得る。したがって、細胞エネルギー流動及び代謝の制御をてこ入れして、細胞培養産生期中のラクテートの蓄積により引き起こされる、望ましくない結果を回避することができる（Ｍｕｌｕｋｕｔｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（９）：４７６−８４；Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０９（１）：１４６−５６；Ａｈｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｏｎｉｅｗｉｃｚ，２０１２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．７（１）：６１−７４）。
【００５９】
解糖プロセスの最終工程では、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）酵素により媒介される、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）の、ピルベートへの転換が伴う。４つの異なるＰＫのアイソフォーム：ＰＫ肝臓（ＰＫＬ）、ＰＫ赤血球（ＰＫＲ）、ＰＫ筋１（ＰＫＭ−１）、及びＰＫ筋２（ＰＫＭ−２）が識別されている。ＰＫ酵素は、２つの異なる遺伝子：ＰＫＬＲ及びＰＫＭにより発現する。選択的エクソンスプライシングにより、異なるＰＫアイソフォームが生じる。ＰＫＬＲ遺伝子からのｍＲＮＡ転写物に、エクソン１及び２が共に存在することにより、ＰＫＲタンパク質の発現がもたらされる一方、エクソン２で開始するｍＲＮＡ転写物では、ＰＫＬタンパク質の発現が生じる。ＰＫＭ遺伝子転写物でのエクソン９又は１０の選択的スプライシングにより、それぞれＰＫＭ−１又はＰＫＭ−２が生じる。具体的には、ＰＫＭ−１は、ＰＡＭ遺伝子のエクソン９を含みエクソン１０を除外し、ＰＫＭ−２は、ＰＫＭ遺伝子のエクソン１０を含み、エクソン９を除外する。組織特異性プロモーター、転写因子、及び選択的スプライシングは、異なる組織及び細胞株での、これらのアイソフォームの発現を制御する（Ｃｈａｎｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，２０１２，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．３７（８）：３０９−１６；Ｉｓｒａｅｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎ，２０１５，Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ４３：４３−５１；Ｍａｚｕｒｅｋ，２０１１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４３（７）：９６９−８０；Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．５２４（２）：３２７−３９；Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（２９）：１３８０７−１２；Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（２９）：１４３６６−７１）。
【００６０】
ＰＫＭ−２は、多量のグルコース消費及びラクテート産生を特徴とする、癌細胞代謝及び腫瘍増殖におけるその中心的な役割が故に、大規模に研究されてきた。ＰＫＭ−１酵素は恒常的活性型である一方で、ＰＫＭ−２活性はオリゴマー化、基質結合、及び翻訳後修飾により制御される（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ  ４５２（７１８４）：２３０−３；Ｃｈａｎｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，２０１２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．３７（８）：３０９−１６；Ｉｓｒａｅｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎ，２０１５，Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ  ４３：４３−５１）。例えば、フルクトース１，６−ビスホスフェート（ＦＢＰ）は、ＰＫＭ−２に可逆的に結合し、ＰＫＭ−２の四量体化、及びそれ故の活性化を促進する（Ａｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（２５）：１６８４２−６；Ｄｏｍｂｒａｕｃｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４（２７）：９４１７−２９）。チロシン１０５におけるＰＫＭ−２のリン酸化、又は、その他のホスホチロシンタンパク質へのＰＫＭ−２の結合は、ＦＢＰ結合を遮断し、ＰＫＭ−２の四量体化を防止することにより、ＰＫＭ−２を不活性化する（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ  ４５２（７１８４）：１８１−６；Ｈｉｔｏｓｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌ  ２（９７）：ｒａ７３）。しかし、解糖の度合いが増加することにより、代謝フィードバックループの一部としての、リジン３０５におけるＰＫＭ−２のアセチル化が促進され、シャペロン媒介自食作用により、分解に対してＰＫＭ−２を標的化する（Ｌｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ４２（６）：７１９−３０）（Ｍａｃｉｎｔｙｒｅ  ａｎｄ  Ｒａｔｈｍｅｌｌ，２０１１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ４２（６）：７１３−４）。更に、ＰＫＭ−２二量体は、ＰＥＰをホスフェートドナーとして利用して、プロテインキナーゼとして作用する細胞核に局在化し、ＳＴＡＴ３のリン酸化、及びＭＥＫ５の活性化により、細胞増殖を促進することが示されている（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ４５（５）：５９８−６０９）。
【００６１】
一態様に従うと、本開示は、細胞におけるＰＫＭ発現、例えばＰＫＭポリペプチド発現を制御することによる、哺乳動物細胞のラクトジェニック活性の制御方法に関する。例えば、哺乳動物細胞のラクトジェニック活性の制御方法としては、細胞内でのＰＫＭポリペプチド発現をノックアウト又はノックダウンすることが挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態において、ＰＫＭ−１の発現はノックダウン又はノックアウトされる。特定の実施形態において、ＰＫＭ−２の発現はノックダウン又はノックアウトされる。特定の実施形態において、ＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２の両方の発現がノックダウン又はノックアウトされる。本明細書で使用する場合、ノックアウトされた発現とは、参照細胞と比較したときに、細胞内において、ＰＫＭポリペプチド、例えばＰＫＭ−１ポリペプチド及び／又はＰＫＭ−２ポリペプチドの発現を取り除くことを意味する。本明細書で使用する場合、ノックダウンされた発現とは、参照細胞と比較したときに、細胞内において、ＰＫＭポリペプチド、例えばＰＫＭ−１ポリペプチド及び／又はＰＫＭ−２ポリペプチドの発現を低減することを意味する。
【００６２】
特定の実施形態において、参照細胞は、ＰＫＭポリペプチド、例えばＰＫＭ−１及び／又はＰＫＭ−２の発現が制御されていない、例えば、低減されていない細胞である。特定の実施形態において、参照細胞は、ＰＫＭ遺伝子の少なくとも１つ、又は両方の野生型対立遺伝子を含む細胞である。例えば、参照細胞は、両方の野生型ＰＫＭ対立遺伝子を有する細胞であるが、これに限定されない。特定の実施形態において、参照細胞はＷＴ  ＣＨＯ細胞である。
【００６３】
特定の実施形態において、ＰＫＭポリペプチドの発現をノックダウンするように改変された細胞におけるＰＫＭポリペプチド、例えばＰＫＭ−１及び／又はＰＫＭ−２の発現は、参照細胞、例えばＷＴ  ＣＨＯ細胞のＰＫＭポリペプチド発現の、約９０％未満、約８０％未満、約７０％未満、約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。特定の実施形態において、ＰＫＭ−１ポリペプチドの発現をノックダウンするように改変された細胞におけるＰＫＭ−１ポリペプチドの発現は、参照細胞、例えばＷＴ  ＣＨＯ細胞のＰＫＭ−１ポリペプチド発現の、約９０％未満、約８０％未満、約７０％未満、約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。
【００６４】
特定の実施形態において、ＰＫＭポリペプチドの発現をノックダウンするように改変された細胞におけるＰＫＭポリペプチド、例えばＰＫＭ−１及び／又はＰＫＭ−２の発現は、参照細胞、例えばＷＴ  ＣＨＯ細胞のＰＫＭポリペプチド発現の少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、少なくとも約１０％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％、又は少なくとも約１％である。特定の実施形態において、ＰＫＭ−１ポリペプチドの発現をノックダウンするように改変された細胞におけるＰＫＭ−１ポリペプチドの発現は、参照細胞、例えばＷＴ  ＣＨＯ細胞のＰＫＭ−１ポリペプチド発現の少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、少なくとも約１０％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％、又は少なくとも約１％である。
【００６５】
特定の実施形態において、ＰＫＭポリペプチドの発現をノックダウンするように改変された細胞におけるＰＫＭポリペプチド、例えばＰＫＭ−１及び／又はＰＫＭ−２の発現は、参照細胞、例えばＷＴ  ＣＨＯ細胞のＰＫＭポリペプチド発現の約９０％以下、約８０％以下、約７０％以下、約６０％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下である。特定の実施形態において、ＰＫＭポリペプチドの発現をノックダウンするように改変された細胞におけるＰＫＭポリペプチド、例えばＰＫＭ−１及び／又はＰＫＭ−２の発現は、参照細胞、例えばＷＴ  ＣＨＯ細胞のＰＫＭポリペプチド発現の約４０％以下である。特定の実施形態において、ＰＫＭ−１ポリペプチドの発現をノックダウンするようにされた細胞におけるＰＫＭ−１ポリペプチドの発現は、参照細胞、例えばＷＴ  ＣＨＯ細胞のＰＫＭ−１ポリペプチド発現の約９０％以下、約８０％以下、約７０％以下、約６０％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下である。
【００６６】
特定の実施形態において、ＰＫＭポリペプチドの発現をノックダウンするように改変された細胞におけるＰＫＭポリペプチド、例えばＰＫＭ−１及び／又はＰＫＭ−２の発現は、参照細胞、例えばＷＴ  ＣＨＯ細胞のＰＫＭ−１ポリペプチド発現の約１％〜約９０％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約９０％、約２５％〜約９０％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％、約８５％〜約９０％、約１％〜約８０％、約１０％〜約８０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約８０％、約４０％〜約８０％、約５０％〜約８０％、約６０％〜約８０％、約７０％〜約８０％、約７５％〜約８０％、約１％〜約７０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約７０％、約３０％〜約７０％、約４０％〜約７０％、約５０％〜約７０％、約６０％〜約７０％、約６５％〜約７０％、約１％〜約６０％、約１０％〜約６０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、約４０％〜約６０％、約５０％〜約６０％、約５５％〜約６０％、約１％〜約５０％、約１０％〜約５０％、約２０％〜約５０％、約３０％〜約５０％、約４０％〜約５０％、約４５％〜約５０％、約１％〜約４０％、約１０％〜約４０％、約２０％〜約４０％、約３０％〜約４０％、約３５％〜約４０％、約１％〜約３０％、約１０％〜約３０％、約２０％〜約３０％、約２５％〜約３０％、約１％〜約２０％、約５％〜約２０％、約１０％〜約２０％、約１５％〜約２０％、約１％〜約１０％、約５％〜約１０％、約５％〜約２０％、約５％〜約３０％、約５％〜約４０％である。特定の実施形態において、ＰＫＭ−１ポリペプチドの発現をノックダウンするようにされた細胞におけるＰＫＭ−１ポリペプチドの発現は、参照細胞、例えばＷＴ  ＣＨＯ細胞のＰＫＭ−１ポリペプチド発現の約１％〜約９０％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約９０％、約２５％〜約９０％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％、約８５％〜約９０％、約１％〜約８０％、約１０％〜約８０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約８０％、約４０％〜約８０％、約５０％〜約８０％、約６０％〜約８０％、約７０％〜約８０％、約７５％〜約８０％、約１％〜約７０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約７０％、約３０％〜約７０％、約４０％〜約７０％、約５０％〜約７０％、約６０％〜約７０％、約６５％〜約７０％、約１％〜約６０％、約１０％〜約６０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、約４０％〜約６０％、約５０％〜約６０％、約５５％〜約６０％、約１％〜約５０％、約１０％〜約５０％、約２０％〜約５０％、約３０％〜約５０％、約４０％〜約５０％、約４５％〜約５０％、約１％〜約４０％、約１０％〜約４０％、約２０％〜約４０％、約３０％〜約４０％、約３５％〜約４０％、約１％〜約３０％、約１０％〜約３０％、約２０％〜約３０％、約２５％〜約３０％、約１％〜約２０％、約５％〜約２０％、約１０％〜約２０％、約１５％〜約２０％、約１％〜約１０％、約５％〜約１０％、約５％〜約２０％、約５％〜約３０％、約５％〜約４０％である。
【００６７】
特定の実施形態において、ＰＫＭポリペプチドの発現をノックダウンするように改変された細胞におけるＰＫＭポリペプチド、例えばＰＫＭ−１及び／又はＰＫＭ−２の発現は、参照細胞、例えばＷＴ  ＣＨＯ細胞のＰＫＭポリペプチド発現の約５％〜約４０％である。特定の実施形態において、ＰＫＭ−１ポリペプチドの発現をノックダウンするようにされた細胞におけるＰＫＭ−１ポリペプチドの発現は、参照細胞、例えばＷＴ  ＣＨＯ細胞のＰＫＭ−１ポリペプチド発現の約５％〜約４０％である。異なる参照細胞（例えば、ＰＫＭ遺伝子の少なくとも１つ又は両方の野生型対立遺伝子を含む細胞）における、ＰＫＭポリペプチド、例えばＰＫＭ−１及び／又はＰＫＭ−２の発現レベルは、変化する可能性がある。例えば、シードトレイン細胞、又は低ラクテート産生細胞は、少量のＰＫＭ−１を産生し得る一方で、高ラクテート産生細胞は、多量のＰＫＭ−１を産生し得る。
【００６８】
ＰＫＭ遺伝子転写物でのエクソン９又は１０の選択的スプライシングにより、それぞれＰＫＭ−１又はＰＫＭ−２が生じる。ノックダウン又はノックアウトされたＰＫＭ遺伝子は、ヒト由来のＰＫＭ遺伝子であることができる。特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子は、非ヒト、例えばアカゲザル、イヌ、ミドリザル、ニワトリ、ウシ、ブタ、マウス、チャイニーズハムスター、ラット、又はウサギに由来することができる。
【００６９】
特定の実施形態において、ノックダウン又はノックアウトされたＰＫＭ遺伝子は、チャイニーズハムスターＰＫＭ遺伝子であることができる。特定の実施形態において、チャイニーズハムスターＰＫＭ遺伝子配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＩＤ  ＮＷ＿００３６１３７０９．１（範囲：２００６０２．．２２３５６１）（配列番号４４）を有する。特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子配列は、ＮＷ＿００３６１３７０９．１配列とは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又はそれ以上のヌクレオチドが異なる。特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子配列は、配列番号４４に記載の配列とは１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、又はそれ以上異なる。
【００７０】
ＰＫＭ遺伝子の更なる非限定例としては、ヒトＰＫＭ遺伝子（例えばＮＣ＿００００１５．１０（範囲７２１９９０２９．．７２２３１６２４）（配列番号４５））、アカゲザルＰＫＭ遺伝子（例えばＮＣ＿０２７８９９．１（範囲４９２１１７６６．．４９２４５９８３）（配列番号４６））、ミドリザルＰＫＭ遺伝子（例えばＮＣ＿０２３６６７．１（範囲１１２２４３３２．．１１２５５５３８）（配列番号４７））、イヌＰＫＭ遺伝子（例えばＮＣ＿００６６１２．３（範囲３５７１２８５３．．３５７３７６４３）（配列番号４８））、マウスＰＫＭ遺伝子（例えばＮＣ＿００００７５．６（範囲５９６５６３６８．．５９６７９３７５）（配列番号４９））、ラットＰＫＭ遺伝子（例えばＮＣ＿００５１０７．４（範囲６４４８０９６３．．６４５０２９５７）（配列番号５０））、ウサギＰＫＭ遺伝子（例えばＮＣ＿０１３６８５．１（範囲３０４０９６．．３１７８４３）（配列番号５１））、ニワトリＰＫＭ遺伝子（例えば、ＮＣ＿００６０９７．４（範囲１５０６４２８．．１５２３６８４）（配列番号５２））、ブタＰＫＭ遺伝子（例えばＮＣ＿０１０４４９．５（範囲６０９７１８０７．．６１０３２７８０）（配列番号５３））、及びウシＰＫＭ遺伝子（例えばＡＣ＿０００１６７．１（範囲１８９６５９８１．．１８９９２６４４）（配列番号５４））が挙げられる。特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子配列は、配列番号４５〜５４に記載の配列のいずれか１つとは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又はそれ以上のヌクレオチドが異なる。特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子配列は、配列番号４５〜５４に記載の配列のいずれか１つとは１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、又はそれ以上異なる。
【００７１】
当業者は、異なる哺乳動物細胞は、同一種に由来するもの、例えば２つの異なるＣＨＯ宿主細胞株であっても、同じＰＫＭ遺伝子配列を共有し得ないことを知っているであろう。ＰＫＭ遺伝子の配列における小さな差、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のヌクレオチドの違いが、同一種に由来する２つの哺乳動物細胞に存在し得る。
【００７２】
５．２．１  ＰＫＭ発現の制御方法
特定の実施形態において、遺伝子組み換えシステムを使用して、ＰＫＭポリペプチドの発現（例えばＰＫＭ−１発現）を制御（例えば、ノックダウン又はノックアウト）する。当該技術分野において公知の様々な遺伝子組み換えシステムを、本明細書で開示される方法のために使用することができる。このようなシステムの非限定例としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、並びに、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの、遺伝子サイレンシングによるタンパク質ノックダウンのための、他のツールの使用が挙げられる。従来の、改善された、又は修正されたＣａｓシステム、及び、Ｃｐｆ−１などの、その他の細菌ベースのゲノム切除ツールを含む、当該技術分野において公知の任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを、本明細書で開示される方法と共に使用することができる。
【００７３】
当該技術分野において公知の任意のＰＫＭ阻害剤を、本明細書で開示される方法と共に使用してＰＫＭ活性を制御することができ、故に、本明細書にて開示した細胞のラクトジェニック活性を制御することができる。ＰＫＭ阻害剤の非限定例としては、モノフルオロリン酸ナトリウム、Ｌ−フェニルアラニン、クレアチンリン酸、Ｃａ２＋、フルオロホスフェート、及びピリドキサル５’−ホスフェートが挙げられる。
【００７４】
特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子の一部を欠失して、ＰＫＭポリペプチドの発現を制御、例えばノックダウン又はノックアウトする。特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子の少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％が欠失される。特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子の約２％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約６５％以下、約７０％以下、約７５％以下、約８０％以下、約８５％以下、又は約９０％以下が欠失される。特定の実施形態において、約２％〜約９０％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約９０％、約２５％〜約９０％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％、約８５％〜約９０％、約２％〜約８０％、約１０％〜約８０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約８０％、約４０％〜約８０％、約５０％〜約８０％、約６０％〜約８０％、約７０％〜約８０％、約７５％〜約８０％、約２％〜約７０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約７０％、約３０％〜約７０％、約４０％〜約７０％、約５０％〜約７０％、約６０％〜約７０％、約６５％〜約７０％、約２％〜約６０％、約１０％〜約６０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、約４０％〜約６０％、約５０％〜約６０％、約５５％〜約６０％、約２％〜約５０％、約１０％〜約５０％、約２０％〜約５０％、約３０％〜約５０％、約４０％〜約５０％、約４５％〜約５０％、約２％〜約４０％、約１０％〜約４０％、約２０％〜約４０％、約３０％〜約４０％、約３５％〜約４０％、約２％〜約３０％、約１０％〜約３０％、約２０％〜約３０％、約２５％〜約３０％、約２％〜約２０％、約５％〜約２０％、約１０％〜約２０％、約１５％〜約２０％、約２％〜約１０％、約５％〜約１０％、又は約２％〜約５％のＰＫＭ遺伝子が欠失される。
【００７５】
特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子の少なくとも１つのエクソンが、少なくとも部分的に欠失されている。本明細書で使用する場合、「部分的に欠失された」とは、例えば、エクソンの領域の少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、約２％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約６５％以下、約７０％以下、約７５％以下、約８０％以下、約８５％以下、約９０％以下、約９５％以下、約２％〜約９０％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約９０％、約２５％〜約９０％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％、約８５％〜約９０％、約２％〜約８０％、約１０％〜約８０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約８０％、約４０％〜約８０％、約５０％〜約８０％、約６０％〜約８０％、約７０％〜約８０％、約７５％〜約８０％、約２％〜約７０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約７０％、約３０％〜約７０％、約４０％〜約７０％、約５０％〜約７０％、約６０％〜約７０％、約６５％〜約７０％、約２％〜約６０％、約１０％〜約６０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、約４０％〜約６０％、約５０％〜約６０％、約５５％〜約６０％、約２％〜約５０％、約１０％〜約５０％、約２０％〜約５０％、約３０％〜約５０％、約４０％〜約５０％、約４５％〜約５０％、約２％〜約４０％、約１０％〜約４０％、約２０％〜約４０％、約３０％〜約４０％、約３５％〜約４０％、約２％〜約３０％、約１０％〜約３０％、約２０％〜約３０％、約２５％〜約３０％、約２％〜約２０％、約５％〜約２０％、約１０％〜約２０％、約１５％〜約２０％、約２％〜約１０％、約５％〜約１０％、又は約２％〜約５％が欠失されていることを意味する。例えば、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９は、少なくとも部分的に欠損している、又は完全に欠損していることができるが、これに限定されない。特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子のエクソン１０は、少なくとも部分的に欠損している、又は完全に欠損していることができる。特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９及び１０は、少なくとも部分的に欠損している、又は完全に欠損していることができる。特定の実施形態において、エクソン１〜１２を包含する領域は、少なくとも部分的に欠損している、又は完全に欠損している。
【００７６】
特定の非限定的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、ＰＫＭポリペプチドの発現を制御する。クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、原核細胞にて発見されたゲノム編集ツールである。ゲノム編集に利用する場合、システムは、Ｃａｓ９（ｃｒＲＮＡをガイドとして利用してＤＮＡを改変可能なタンパク質）、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９により使用され、Ｃａｓ９と活性の複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ（一般にヘアピンループ形態である）に結合する領域と共に、宿主ＤＮＡの正しい部分にｃｒＲＮＡをガイドするためのＲＮＡを含有する）、及び、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡに結合し、Ｃａｓ９との活性の複合体を形成する）を含む。用語「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」とは、ＲＮＡによりガイドされる、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼの、細胞内のゲノム又はエピソーム配列などの標的配列への特異的会合（即ち「標的化」）を促進する、任意の核酸を意味する。ｇＲＮＡは、単分子（一本鎖ＲＮＡ分子を含み、代替的にキメラと呼ばれる）、又は、モジュラー式（通常、二本鎖化により互いに会合する、例えば２つ以上、典型的には２つの、個別のＲＮＡ分子、例えばｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む）であることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法では、哺乳動物細胞をトランスフェクションするためのベクターを使用することができる。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、Ｃａｓ９を使用して、細胞内の標的ＤＮＡを識別して、直接結合するための配列であるため、各用途に対して設計することができる。複数のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを合わせてパッケージ化して、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成することができる。細胞内にトランスフェクションするために、ｓｇＲＮＡをＣａｓ９遺伝子と共に結合させ、ベクター内に組み入れることができる。
【００７７】
特定の実施形態において、１つ以上のＰＫＭポリペプチドの発現を制御するために使用するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９分子、及び、ＰＫＭ遺伝子の標的配列に相補的である標的化ドメインを含む、１つ以上のｇＲＮＡを含む。特定の実施形態において、標的遺伝子はＰＫＭ遺伝子の領域である。標的配列は、ＰＫＭ遺伝子内の任意のエクソン又はイントロン領域であることができる。例えば、その標的は、ＰＫＭ１及び／又はＰＫＭ２ポリペプチドの発現を取り除く、又は低減することである。特定の実施形態において、標的配列は、ＰＫＭ遺伝子のエクソン１に隣接する５’領域、エクソン１内の領域、エクソン２に隣接する５’領域、エクソン２内の領域、エクソン９に隣接する５’領域、エクソン９に隣接する３’領域、エクソン１０に隣接する３’領域、エクソン１２内の領域、及び／又は、エクソン１２に隣接する３’領域であることができる。例えば、標的配列は、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する５’イントロン領域、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する３’イントロン領域、ＰＫＭ遺伝子のエクソン１０に隣接する３’イントロン領域、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるが、これらに限定されない。
【００７８】
特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する５’イントロン領域、及びＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する３’イントロン領域の両方を、本明細書にて開示したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して標的化する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ＰＫＭ−１がノックダウン又はノックアウトされた細胞を生成するための、Ｃａｓ９分子、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する５’イントロン領域を標的化するｇＲＮＡ、及び、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する３’イントロン領域を標的化するｇＲＮＡを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する５’イントロン領域を標的化するｇＲＮＡは、配列番号３３に記載の配列を含む。特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する３’イントロン領域を標的化するｇＲＮＡは、配列番号３４に記載の配列を含む。
【００７９】
特定の実施形態において、標的配列は、エクソン１に隣接する５’領域、エクソン１内の領域、エクソン２に隣接する５’領域、エクソン２内の領域、エクソン１２内の領域、エクソン１２に隣接する３’領域、又はこれらの組み合わせであることができる。例えば、限定されるものではないが、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、例えば、ＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２の両方がノックダウン又はノックアウトされた細胞を生成するための、Ｃａｓ９分子、ＰＫＭ遺伝子のエクソン１内の領域を標的化するｇＲＮＡ、ＰＫＭ遺伝子のエクソン１２内の領域を標的化するｇＲＮＡを含むことができる。特定の実施形態において、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、例えば、ＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２の両方がノックダウン又はノックアウトされた細胞を生成するための、Ｃａｓ９分子、ＰＫＭ遺伝子のエクソン２内の領域を標的化するｇＲＮＡ、ＰＫＭ遺伝子のエクソン１２内の領域を標的化するｇＲＮＡを含むことができる。特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子のエクソン２内の領域を標的化するｇＲＮＡは、配列番号４２に記載の配列を含む。特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子のエクソン１２内の領域を標的化するｇＲＮＡは、配列番号４３に記載の配列を含む。
【００８０】
特定の実施形態において、ｇＲＮＡは単一のベクターで細胞に投与され、Ｃａｓ９分子は第２のベクターで細胞に投与される。特定の実施形態において、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９分子は、単一のベクターで細胞に投与される。あるいは、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９分子のそれぞれが、別のベクターにより投与されることができる。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、１つ以上のｇＲＮＡと複合体化したＣａｓ９タンパク質を含む、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として細胞に送達することができる、例えば、電気穿孔法により送達することができる（例えば、細胞にＲＮＰを送達する更なる方法については、ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２１−１２２：９−１５（２０１７）を参照のこと）。特定の実施形態において、細胞にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを投与することにより、ＰＫＭ−１ポリペプチドの発現のノックアウト又はノックダウンがもたらされる。特定の実施形態において、細胞にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを投与することにより、ＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２ポリペプチドの両方の発現のノックアウト又はノックダウンがもたらされる。
【００８１】
特定の実施形態において、遺伝子組み換えシステムは、哺乳動物細胞内でのＰＫＭポリペプチドの発現を制御するための、ＺＦＮシステムである。ＺＦＮは制限酵素として作用することができ、これは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを、ＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることにより作製される。ジンクフィンガードメインを改変して、特異的なＤＮＡ配列を標的化することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼが、ゲノム内で所望の配列を標的化することが可能になる。個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは典型的には、複数の、個別のジンクフィンガー反復を含有し、それぞれが複数の塩基対を認識することができる。新しいジンクフィンガードメインを生成するための、最も一般的な方法は、既知の特異性を有する小さいジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。最も一般的な、ＺＦＮの切断ドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩ由来の、非特異的切断ドメインである。ＺＦＮは、標的ＤＮＡ配列内で二本鎖の切断（ＤＳＢ）を行うことにより、タンパク質の発現を調節し、これは、相同テンプレートの不存在下にて、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復される。このような修復により、塩基対の欠失又は挿入をもたらすことができ、フレームシフトを生み出して、有害なタンパク質の産生を防止する（Ｄｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．；３３（１８）：５９７８−９０（２００５））。複数のＺＦＮ対もまた使用して、ゲノム配列の、全体の大きなセグメントを完全に除去することができる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．；２０（１）：８１−９（２０１０））。特定の実施形態において、標的遺伝子はＰＫＭ遺伝子の一部である。特定の実施形態において、標的配列はＰＫＭ遺伝子のエクソン９である。特定の実施形態において、標的配列はＰＫＭ遺伝子のエクソン９及びエクソン１０である。
【００８２】
特定の実施形態において、遺伝子組み換えシステムは、哺乳動物細胞内でのＰＫＭポリペプチドの発現を制御するための、ＴＡＬＥＮシステムである。ＴＡＬＥＮは、改変してＤＮＡの特異的な配列を切断することができる制限酵素である。ＴＡＬＥＮシステムは、ＺＦＮに類似した原理で作動する。ＴＡＬＥＮは、転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメインを、ＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることにより生成される。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、特異的なヌクレオチドを強力に認識する２つの位置を備える、３３〜３４個のアミノ酸反復モチーフで構成される。これらのＴＡＬＥのアレイを組み立てることで、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを改変して、所望のＤＮＡ配列に結合することができ、これにより、ヌクレアーゼを、ゲノムの特定の場所で切断するようにガイドする（Ｂｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；２９（２）：１３５−６（２０１１））。特定の実施形態において、標的遺伝子はＰＫＭ遺伝子の一部である。特定の実施形態において、標的配列はＰＫＭ遺伝子のエクソン９である。特定の実施形態において、標的配列はＰＫＭ遺伝子のエクソン９及びエクソン１０である。
【００８３】
特定の実施形態において、ＰＫＭポリペプチドの発現は、ＰＫＭ核酸に対する相補配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＫＭ  ｍＲＮＡ、ＰＫＭ−１  ｍＲＮＡ、又はＰＫＭ−２  ｍＲＮＡ）を使用してノックダウンすることができる。このようなオリゴヌクレオチドの非限定例としては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。特定の実施形態において、このようなオリゴヌクレオチドは、ＰＫＭ核酸配列、例えばＰＫＭ、ＰＫＭ−１、又はＰＫＭ−２核酸配列の少なくとも一部に対して相同であることができ、ＰＫＭ核酸配列に対するその部分の相同性は、少なくとも約７５、又は少なくとも約８０、又は少なくとも約８５、又は少なくとも約９０、又は少なくとも約９５、又は少なくとも約９８％である。特定の非限定的な実施形態において、相補部分は、少なくとも１０個のヌクレオチド、又は少なくとも１５個のヌクレオチド、又は少なくとも２０個のヌクレオチド、又は少なくとも２５個のヌクレオチド、又は少なくとも３０個のヌクレオチドを構成することができ、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ分子は、最大１５、又は最大２０、又は最大２５、又は最大３０、又は最大３５、又は最大４０、又は最大４５、又は最大５０、又は最大７５、又は最大１００ヌクレオチド長であることができる。アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ分子は、ＤＮＡ、又は非定型若しくは天然に存在しない残基、例えば、これに限定されないがホスホロチオエート残基を含むことができる。
【００８４】
本明細書にて開示した遺伝子組み換えシステムは、ウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターなどのレトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターを使用して哺乳動物細胞に送達することができる。キャプシドタンパク質が、ヒト細胞を感染させるのに機能的である場合、レトロウイルスベクターと、適切なパッケージング株の組み合わせが好適である。ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１−４３７）；ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５−２９０２）；及びＣＲＩＰ（Ｄａｎｏｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４）を含むが、これらに限定されない、様々なアンホトロピックウイルス産生細胞株が知られている。非アンホトロピック粒子、例えば、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４、又はＧＡＬＶエンベロープ、及び当該技術分野において公知の任意の他のものによる偽型化粒子もまた、好適である。可能な形質導入方法としては、例えば、Ｂｒｅｇｎｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｌｏｏｄ  ８０：１４１８−１４２２の方法による、細胞を、プロデューサー細胞と直接同時培養するもの、又は、例えば、Ｘｕ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．２２：２２３−２３０；及びＨｕｇｈｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１８１７の方法による、ウイルス上清のみでの、又は、適切な成長因子及びポリカチオンを有する、若しくは有しない、濃縮ベクター原液による培養もまた挙げられる。
【００８５】
他の形質導入ウイルスベクターを使用して、本明細書にて開示した哺乳動物細胞を改変することができる。特定の実施形態において、選択したベクターは、高効率の感染、並びに安定した組み込み及び発現を示す（例えば、Ｃａｙｏｕｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：４２３−４３０，１９９７；Ｋｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：８３３−８４４，１９９６；Ｂｌｏｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：６６４１−６６４９，１９９７；Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３  ２６７，１９９６；及びＭｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１０３１９，１９９７を参照のこと）。使用可能な他のウイルスベクターとしては例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、及びアデナ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、又はヘルペスウイルス、例えばエプスタイン・バールウイルスが挙げられる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １５−１４，１９９０；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２７５−１２８１，１９８９；Ｅｇｌｉｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８−６１４，１９８８；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：５５−６１，１９９０；Ｓｈａｒｐ，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３３７：１２７７−１２７８，１９９１；Ｃｏｍｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３６：３１１−３２２，１９８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６：４０１−４０９，１９８４；Ｍｏｅｎ，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  １７：４０７−４１６，１９９１；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９８０−９９０，１９８９；ＬｅＧａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０，１９９３；及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｈｅｓｔ  １０７：７７Ｓ−８３Ｓ，１９９５のベクターも参照のこと）。レトロウイルスベクターが特に開発されており、臨床設定にて用いられている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３２３：３７０，１９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，３９９，３４６号）。
【００８６】
非ウイルスアプローチもまた、本明細書にて開示した哺乳動物細胞の遺伝子組み換えに使用することができる。例えば、リポフェクションの存在下における核酸の投与（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３，１９８７；Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７：２５９，１９９０；Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８，１９８９；Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：５１２，１９８３）、アシアロオロソムコイド−ポリリシンコンジュゲーション（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６３：１４６２１，１９８８；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６４：１６９８５，１９８９）、又は、外科的条件下におけるマイクロ注射（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５，１９９０）により、核酸分子を哺乳動物細胞内に導入することができる。遺伝子導入のための、他の非ウイルス方法としては、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法、及び原形質融合を用いる、インビトロでのトランスフェクションが挙げられる。リポソームもまた、核酸分子を細胞内に送達するのに、潜在的に有益である可能性がある。通常の遺伝子を、対象の感染組織に移植することもまた、通常の核酸を、エクスビボ培養が可能な細胞種（例えば、自己由来又は異種一次細胞又はそれらの後代）に移し、その後、細胞（又はその子孫）を、標的組織に注入する、又は全身注入することにより実行することができる。
【００８７】
５．３  ラクトジェニック活性が低下した、又は除去された細胞
一態様において、本開示は、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された１つ以上の細胞、例えば哺乳動物細胞を含む細胞又は組成物、及びその使用方法に関する。ＰＫＭポリペプチドの発現（例えば、ＰＫＭ−１の発現）は細胞内でノックダウン又はノックアウトされており、これにより、細胞のラクトジェニック活性の低下又は除去がもたらされる。細胞の非限定例としては、ＣＨＯ細胞（例えば、ＤＨＦＲ  ＣＨＯ細胞）、ｄｐ１２．ＣＨＯ細胞のＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−６１）、ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１（例えば、ＣＯＳ−７  ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）、ヒト胎児腎臓株（例えば、懸濁培養液中で増殖のためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頚癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝臓細胞（例えば、ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）、マウス乳癌（例えば、ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ  ５細胞、ＦＳ４細胞、ヒト肝癌株（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、骨髄腫細胞株（例えば、Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０）が挙げられる。特定の実施形態において、細胞はＣＨＯ細胞である。ＣＨＯ宿主細胞の、更なる非限定例としては、ＣＨＯ  Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ  ＤＵＫＸＢ−１１細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞、及びＣＨＯ  ＫＩＭ細胞が挙げられる。特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子の１つの対立遺伝子のみが、本開示の細胞内で改変される。特定の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子の両方の対立遺伝子が改変される。特定の実施形態において、本開示の細胞は、配列番号３９〜４１からなる群から選択される配列を含むＰＫＭ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子を含む、又は、配列番号３７及び３８に記載のヌクレオチド配列を含む（図４Ｃを参照のこと）。例えば、本開示の細胞は、配列番号３９〜４１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＰＫＭ遺伝子の対立遺伝子を含む、又は、配列番号３７及び３８に記載のヌクレオチド配列を含むが、これに限定されない。特定の実施形態において、本開示の細胞は、配列番号３９〜４１からなる群から選択される配列を含むＰＫＭ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子を含む。特定の実施形態において、細胞はＣＨＯ細胞である。ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞の非限定例としては、本明細書にて開示するＨＥＴ−３、ＨＥＴ−１８、ＫＯ−２、及びＫＯ−１５が挙げられる。
【００８８】
特定の実施形態において、ＰＫＭポリペプチド（例えばＰＫＭ−１及び／又はＰＫＭ−２）の発現はノックアウトされ、参照細胞と比較して、細胞のラクトジェニック活性の除去がもたらされる。特定の実施形態において、ＰＫＭポリペプチドの発現は細胞内でノックアウトされ、参照細胞と比較して、細胞のラクトジェニック活性の低下がもたらされる。特定の実施形態において、参照細胞は、ＰＫＭポリペプチドの発現が制御されていない細胞である。特定の実施形態において、参照細胞は、少なくとも１つの野生型ＰＫＭ対立遺伝子を有する細胞である。特定の実施形態において、参照細胞は、両方の野生型ＰＫＭ対立遺伝子を有する細胞である。特定の実施形態において、参照細胞はＷＴ  ＣＨＯ細胞である。
【００８９】
特定の実施形態において、細胞のラクトジェニック活性は、細胞の培養期間の間の、細胞培養培地中のラクテート濃度により示される。特定の実施形態において、細胞のラクトジェニック活性は、培養期間の、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目、２０日目、２５日目、３０日目、３５日目、４０日目、４５日目、５０日目、５５日目、６０日目、６５日目、７０日目、又は８０日目における、細胞培養培地中のラクテート濃度により示される。特定の実施形態において、細胞のラクトジェニック活性は、培養を開始してから８０日を超えた後の、細胞培養培地中のラクテート濃度により示される。特定の実施形態において、本明細書にて開示する細胞のラクトジェニック活性は、産生期中、例えば、細胞培養プロセスの産生期の２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目、又は２０日目の、細胞培養培地中のラクテート濃度により示される。特定の実施形態において、ラクテート濃度は産生期の６日目、７日目、１０日目、１１日目、１４日目、及び／又は１５日目に測定される。特定の実施形態において、ラクテート濃度は産生期の７日目、１０日目、及び／又は１４日目に測定される。
【００９０】
細胞のラクトジェニック活性を測定する、及び／又は、培地での細胞によるラクテート産生を測定する、任意の当該技術分野において既知の方法を、本明細書にて開示した主題と共に使用することができる。非限定的な例示の方法としては、ＴｅＳｌａａ  ａｎｄ  Ｔｅｉｔｅｌｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（２０１４）５４２：９１−１１４、及びＬｅｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ（１９９１）２３（８）：９３５−８に開示されているものが挙げられ、これら全体が本明細書に、参照により組み込まれている。例えば、限定されるものではないが、このような技術としては、商用の細胞外ラクテートキットを使用すること、細胞外バイオアナライザーの使用、細胞外での酸性化速度（ＥＣＡＲ）を、例えばＳｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ分析器を使用して測定すること、速度制限解糖酵素の活性を測定すること、及び、トレーサを使用してラクテートの産生を測定することが挙げられる。
【００９１】
特定の実施形態において、（例えば、細胞内のＰＫＭ遺伝子を制御して、ＰＫＭポリペプチドをノックダウン又はノックアウトさせたことにより）ラクトジェニック活性が低下した細胞のラクトジェニック活性は、参照細胞のラクトジェニック活性の約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、又は約１％である。特定の実施形態において、（例えば、細胞内のＰＫＭ遺伝子を制御して、ＰＫＭポリペプチドをノックダウン又はノックアウトさせたことにより）ラクトジェニック活性が低下した細胞のラクトジェニック活性は、参照細胞のラクトジェニック活性の約８０％未満、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、又は約１％である。特定の実施形態において、細胞のラクトジェニック活性は、例えば細胞培養の産生期の１４日目又は１５日目に観察すると、参照細胞のラクトジェニック活性の約５０％未満である。特定の実施形態において、細胞のラクトジェニック活性は、例えば細胞培養の産生期の１４日目又は１５日目に観察すると、参照細胞のラクトジェニック活性の約２０％未満である。特定の実施形態において、細胞のラクトジェニック活性は、例えば細胞培養の産生期の１４日目又は１５日目に観察すると、参照細胞のラクトジェニック活性の約１０％未満である。特定の実施形態において、参照細胞は、ＰＫＭ遺伝子の少なくとも１つ、又は両方の野生型対立遺伝子を含む細胞である。
【００９２】
特定の実施形態において、本開示の細胞により作製される細胞培養培地中でのラクテート濃度は、例えば、細胞培養の産生期にて（例えば、産生期の２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目、又は２０日目において）、約１５ｇ／Ｌ未満、約１４ｇ／Ｌ未満、約１３ｇ／Ｌ未満、約１２ｇ／Ｌ未満、約１０１ｇ／Ｌ未満、約１０ｇ／Ｌ未満、約９ｇ／Ｌ未満、約８ｇ／Ｌ未満、約７ｇ／Ｌ未満、約６ｇ／Ｌ未満、約５ｇ／Ｌ未満、約４ｇ／Ｌ未満、約３ｇ／Ｌ未満、約２ｇ／Ｌ未満、約１ｇ／Ｌ未満、又は約０．５ｇ／Ｌ未満である。特定の実施形態において、本開示の細胞により作製される細胞培養培地中でのラクテート濃度は、約５ｇ／Ｌ未満、約２ｇ／Ｌ未満、又は約１ｇ／Ｌ未満である。特定の実施形態において、本開示の細胞により作製される細胞培養培地中でのラクテート濃度は、細胞培養の産生期の７日目、１０日目、１４日目、又は１５日目において約５ｇ／Ｌ未満、約２ｇ／Ｌ未満、又は約１ｇ／Ｌ未満である。特定の実施形態において、本開示の細胞により作製される細胞培養培地中でのラクテート濃度は、振盪フラスコ培養の産生期の間において、約１ｇ／Ｌ未満、又は約２ｇ／Ｌ未満である。特定の実施形態において、本開示の細胞により作製される細胞培養培地中でのラクテート濃度は、バイオリアクター内での細胞培養の産生期の間において、約２ｇ／Ｌ未満である。
【００９３】
特定の実施形態において、本明細書で開示する、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞（例えば、ＰＫＭポリペプチドの発現をノックアウト又はノックダウンすることにより生成した細胞）は、通常のラクトジェニック活性を有する細胞（例えば、野生型細胞）に匹敵する力価、及び／又は特異的な産生能を有する。特定の実施形態において、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞と、通常のラクトジェニック活性を有する細胞との、力価及び／又は特異的な産生能の差は、通常のラクトジェニック活性を有する細胞（例えば参照細胞）の約１％未満、約５％未満、約１０％未満、約１５％未満、約２０％未満、約２５％未満、又は約３０％未満である。特定の実施形態において、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞は、通常のラクトジェニック活性を有する細胞よりも、高い力価及び／又は特異的な産生能を有する。特定の実施形態において、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞の力価は、通常のラクトジェニック活性を有する細胞の力価より約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、又は約５０％高い。特定の実施形態において、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞の力価は、通常のラクトジェニック活性を有する細胞の力価よりも約５０％を超えて大きい。特定の実施形態において、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞の特異的な産生能（Ｑｐ）は、通常のラクトジェニック活性を有する細胞の特異的な産生能より、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、又は約９０％高い。特定の実施形態において、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞の特異的な産生能は、通常のラクトジェニック活性を有する細胞の特異的な産生能よりも、約９０％を超えて大きい。
【００９４】
細胞培養培地中のラクテート濃度は、化学分析器又はラクテートアッセイキットにより測定することができる。化学分析器の非限定例としては、Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ  ４００（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）、Ｐｉｃｃｏｌｏ  Ｘｐｒｅｓｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｅｘｃｅｌ−Ｓｅｍｉ−ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｉｎｄｉｋｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ及びＳｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、並びにＡＣＥ  Ａｘｃｅｌ（登録商標）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍが挙げられる。ラクテートアッセイキットの非限定例としては、Ｌ−Ｌａｃｔａｔｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）（ａｂ６５３３１、Ａｂｅａｍ）、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｌａｃｔａｔｅ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ／Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、ＰｉｃｏＰｒｏｂｅ（商標）Ｌａｃｔａｔｅ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｌａｃｔａｔｅ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＩＩ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｌａｃｔａｔｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔｓが挙げられる。
【００９５】
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞は目的の生成物を発現する。特定の実施形態において、目的の生成物は組み換えタンパク質である。特定の実施形態において、目的の生成物はモノクローナル抗体である。目的の生成物の更なる非限定例は、セクション５．５に記載する。特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞を、商業的に有用な量の目的の生成物を作製するために使用することができる。
【００９６】
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞は、目的の生成物をコードする核酸を含むことができる。特定の実施形態において、核酸は１つ以上のベクター、例えば発現ベクターに存在することができる。１つの種類のベクターは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得る。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。宿主細胞内に導入する際に、他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）を宿主細胞のゲノム内に導入することにより、宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクター、発現ベクターは、それらが作用可能に結合する遺伝子の発現を指示することが可能である。一般に、組み換えＤＮＡ技法における利用される発現ベクターは、プラスミド（ベクター）の形態である場合が多い。本開示で使用するための発現ベクターの更なる非限定例としては、等価な機能的役割を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。
【００９７】
特定の実施形態において、目的の生成物をコードする核酸を、本明細書にて開示する宿主細胞に導入することができる。特定の実施形態において、核酸の細胞への導入は、トランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、核酸配列含有ウイルス又はバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、マイクロセル媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などにより実施することができる。特定の実施形態において、宿主細胞は真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
【００９８】
特定の実施形態において、目的の生成物をコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに無作為に組み込むことができる（「無作為的組み込み」又は「ＲＩ」）。例えば、限定されるものではないが、目的の生成物をコードする核酸は、ＰＫＭポリペプチド（例えばＰＫＭ−１）の発現をノックダウン又はノックアウトするように制御された細胞のゲノムに無作為に組み込むことができる。
【００９９】
特定の実施形態において、目的の生成物をコードする核酸は、標的化する方式で宿主細胞ゲノムに組み込むことができる（「標的組み込み」又は「ＴＩ」）。例えば、限定されるものではないが、目的の生成物をコードする核酸は、標的化する方式で、ＰＫＭポリペプチド（例えばＰＫＭ−１）の発現をノックダウン又はノックアウトするように制御された細胞のゲノムに組み込むことができる。「組み込み部位」は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される、宿主細胞ゲノム内の配列を含む。特定の実施形態において、組み込み部位は、宿主細胞ゲノムの２つの隣接するヌクレオチドの間にある。特定の実施形態において、組み込み部位はヌクレオチド配列の伸展を含む。特定の実施形態において、組み込み部位はＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座の中に位置する。特定の実施形態において、組み込み部位はＴＩ宿主細胞の内因性遺伝子の中にある。当該技術分野において公知の任意の組み込み部位を、本明細書にて開示した主題を用いて制御及び使用することができる。標的組み込みは、当該技術分野において公知の方法及びシステムにより媒介することができる。例えば、限定されるものではないが、２０１８年１２月２１日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／０６７０７０号（その内容全体が本明細書に組み込まれている）に開示されている方法及びシステムを、標的組み込みのために使用することができる。
【０１００】
特定の実施形態において、目的の生成物をコードする核酸を、トランスポーゼース型組み込みを使用して宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。トランスポーゼース型組み込みは例えば、Ｔｒｕｂｉｔｓｙｎａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４５（１０）：ｅ８９（２０１７）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １１０（２５）：Ｅ２２７９−Ｅ２２８７（２０１３）、及び国際公開第２００４／００９７９２号（これら全体が、本明細書に参考として組み込まれる）に開示されている。
【０１０１】
特定の実施形態において、目的の生成物をコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに無作為に組み込むことができる（「無作為的組み込み」又は「ＲＩ」）。特定の実施形態において、無作為組み込みは当該技術分野において公知の任意の方法又はシステムにより媒介されることができる。特定の実施形態において、無作為組み込みは、ＭａｘＣｙｔｅ  ＳＴＸ（登録商標）電気穿孔システムにより媒介される。
【０１０２】
特定の実施形態において、標的組み込みは無作為組み込みと組み合わせることができる。特定の実施形態において、標的組み込みは無作為組み込みの後に続けることができる。特定の実施形態において、無作為組み込みは標的組み込みの後に続けることができる。例えば、限定されるものではないが、目的の生成物をコードする核酸は、ＰＫＭポリペプチド、例えばＰＫＭ−１の発現をノックダウン又はノックアウトするように制御された細胞のゲノムに無作為に組み込むことができ、目的の同じ生成物をコードする核酸を、標的化する方式で細胞のゲノムに組み込むことができる。
【０１０３】
特定の実施形態において、宿主細胞はＲＩ宿主細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞はＴＩ宿主細胞である。
【０１０４】
５．４  細胞培養法
一態様では、本開示は、本明細書にて開示した細胞を培養することを含む、目的の生成物の作製方法を提供する。当該技術分野において公知の、哺乳動物細胞に対して好適な培養条件は、本明細書に記載の細胞の培養に使用することができる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８３）５６：２２１−２３４）、又は、当事者により容易に測定することができる（例えば、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄｓ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照のこと）。
【０１０５】
哺乳動物細胞は、培養されている特定の細胞に好適な培地にて準備することができる。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、例示的な栄養素溶液である。更に、Ｈａｍ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，５８：４４；Ｂａｒｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓａｔｏ，（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２：２５５；米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第５，１２２，４６９号、又は同第４，５６０，６５５号；国際公開第９０／０３４３０号；及び同第８７／００１９５号に開示されている培地のいずれか（それらの開示全てが、参照により本明細書に組み込まれている）を、培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれかは、必要に応じてホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ／ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ））、微量元素（通常、終濃度にてマイクロモル範囲で存在する無機化合物として定義される）、脂質類（リノレン酸又は他の脂肪酸）及びそれらの好適な単体、並びにグルコース、又は等価なエネルギー供給源を補充することができる。任意の他の必要な補充物も、当業者に既知であろう適切な濃度で含まれ得る。
【０１０６】
特定の実施形態において、ＰＫＭポリペプチドの発現を低下させる、及び／又は除去するように改変された哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。任意の好適な培地を使用して、ＣＨＯ細胞を培養することができる。特定の実施形態において、ＣＨＯ細胞を培養するのに好適な培地は、任意にグリシン、ヒポキサンチン、及びチミジンを含有する、アミノ酸、塩類、糖、及びビタミン；組み換えヒトインスリン、Ｐｒｉｍａｔｏｎｅ  ＨＳ若しくはＰｒｉｍａｔｏｎｅ  ＲＬ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）などの加水分解ペプトン、又は等価物；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８又は等価なプルロニックポリオールなどの、細胞保護剤；ゲンタマイシン；及び微量元素などの、いくつかの構成成分の濃度が変更された、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ−１２系配合物などの、基礎培地構成成分（ＤＭＥＭ及びＨＡＭ  Ｆ１２培地の組成物に関しては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８８、３４６−３４９頁を参照のこと）（米国特許第５，１２２，４６９号に記載の培地の配合物が、特に適切である）を含有することができる。
【０１０７】
特定の実施形態において、ＰＫＭポリペプチドの発現を低下させる、及び／又は除去するように改変された哺乳動物細胞は、組み換えタンパク質を発現する細胞である。組み換えタンパク質は、様々な細胞培養条件下にて、目的の生成物を発現する細胞を成長させることにより産生することができる。例えば、タンパク質の大規模又は小規模産生のための、細胞培養手順は、本開示の文脈にて、潜在的に有用である。流動床バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル培養、振盪フラスコ培養、又は撹拌槽バイオリアクターシステムが挙げられるがこれらに限定されない手順を使用することができ（後者の２つのシステムでは、マイクロ担体と共に、又は無しで）、代替的にバッチ式、流加培養式、又は連続モードで操作することができる。
【０１０８】
特定の実施形態において、本開示の細胞培養は、撹拌槽バイオリアクターシステムで実施され、流加培養手順を用いる。流加培養培養液において、哺乳動物宿主細胞及び培地  を、まず培養容器に供給し、追加の培養栄養素が、培養中に培養液に連続して、又は個別に増加して供給され、培養終了前に、周期的に細胞及び／又は生成物が回収される、又はされない。流加培養培養液としては、例えば、周期的に全ての培養液（細胞と培地を含む）が取り除かれ、新鮮な培地で交換される、半連続式流加培養培養液を挙げることができる。流加培養培養液は、細胞培養のための全ての構成成分（細胞、及び全ての培養栄養素を含む）が、培養プロセスの開始時に培養容器に供給される、単純なバッチ培養液とは区別される。流加培養培養液は更に、上清がプロセス中に培養容器から取り除かれない限りにおいて、還流培養とは区別することができる（還流培養では、細胞は例えば、濾過、封入、マイクロ担体へのアンカリングにより、培養液中に保持される。そして培地が連続して、又は断続的に導入され、培養容器から取り除かれる）。
【０１０９】
特定の実施形態において、想到される特定の宿主細胞及び特定の産生に好適であることができる、任意のスキーム又はルーティンに従い、培養液の細胞を、増殖させることができる。したがって、本開示は、単一工程又は複数工程の培養手順を想到する。単一工程培養において、宿主細胞を培養液環境に播種し、本開示のプロセスを、細胞培養の１回の産生期の間に用いる。あるいは、複数段階培養を想到する。複数段階培養において、細胞は多数の工程又は段階で培養することができる。例えば、細胞を、第１工程又は増殖期培養液中で成長させることができる。この段階において、場合により貯蔵庫から取り除かれた細胞が、成長及び高生存能を促進するのに好適な培地に播種される。新鮮な培地を宿主細胞培養液に添加することにより、細胞を好適な期間、増殖期で維持することができる。
【０１１０】
特定の実施形態において、流培養又は連続細胞培養条件を考案して、細胞培養液の増殖期における哺乳動物細胞の成長を増強する。増殖期において、細胞は、増殖のために最大化された条件下、及び期間、増殖する。培養条件、例えば温度、ｐＨ、溶存酸素（ｄＯ２）などは、特定の宿主で用いられるものであり、当業者には明らかであろう。一般に、酸（例えばＣＯ２）又は塩基（例えば、Ｎａ２ＣＯ３若しくはＮａＯＨ）のいずれかを使用して、ｐＨは、約６．５〜７．５のレベルに調節する。ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞を培養するのに好適な温度範囲は、約３０〜３８℃であり、好適なｄＯ２は、空気飽和度の５〜９０％である。
【０１１１】
特定の段階において、細胞を使用して、細胞培養の産生期又は産生工程を播種することができる。あるいは、上述のとおり、産生期又は工程を、播種又は増殖期又は工程と連続させることができる。
【０１１２】
特定の実施形態において、本開示に記載される培養方法は、例えば、細胞培養の産生期に、細胞培養液から生成物を回収することを更に含むことができる。特定の実施形態において、本開示の細胞培養方法により作成した生成物を、第３のバイオリアクター、例えば製造バイオリアクターから回収することができる。例えば、限定されるものではないが、開示した方法は、細胞培養の産生期の完了時に、生成物を回収することを含むことができる。あるいは、又は更に、生成物は、産生期の完了前に回収することができる。特定の実施形態において、生成物は、特定の細胞密度が達成されたら、細胞培養液から回収することができる。例えば、限定されるものではないが、細胞密度は、回収前に、約２．０×１０７細胞／ｍＬ〜約５．０×１０７細胞／ｍＬであることができる。
【０１１３】
特定の実施形態において、細胞培養液から生成物を回収することは、遠心分離、濾過、音波分離、凝集及び細胞除去技術のうちの１つ以上を含むことができる。
【０１１４】
特定の実施形態において、目的の生成物を宿主細胞から分泌させることができる、又は、目的の生成物は、膜結合、サイトゾル、若しくは核タンパク質であることができる。特定の実施形態において、ポリペプチドの可溶形態を、細胞培養培地から精製することができ、発現する細胞から全ての膜画分を調製し、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）などの非イオン性洗剤を用いて膜を抽出することにより、ポリペプチドの膜結合形態を精製することができる。特定の実施形態において、宿主細胞を（例えば、機械的な力、音波処理、及び／又は洗剤により）溶解させ、遠心分離により細胞膜画分を取り除き、上清を保持することにより、サイトゾル又は核タンパク質を調製することができる。
【０１１５】
５．５  生成物
本開示の細胞及び／又は方法を使用して、本明細書にて開示した細胞により発現可能な、目的の任意の生成物を作製することができる。特定の実施形態において、本開示の細胞及び／又は方法をポリペプチド、例えば哺乳動物ポリペプチドの作製に使用することができる。このようなポリペプチドの非限定例としては、ホルモン、受容体、融合タンパク質、制御因子、成長因子、補体系因子、酵素、凝固因子、抗凝固因子、キナーゼ、サイトカイン、ＣＤタンパク質、インターロイキン、治療用タンパク質、診断用タンパク質、及び抗体が挙げられる。本開示の細胞及び／又は方法は分子、例えば、作製される抗体に対して、特異的ではない。
【０１１６】
特定の実施形態において、本開示の方法を、治療用及び診断用抗体、又はその抗原結合断片を含む抗体の作製に、使用することができる。特定の実施形態において、本開示の細胞及び方法により作製される抗体は、単一特異性抗体（例えば、一本鎖重鎖配列及び一本鎖軽鎖配列からなる、このような対の多量体を含む抗体）、多重特異性抗体及びその抗原結合断片であることができるが、これらに限定されない。例えば、限定されるものではないが、多重特異性抗体は、二重特異性抗体、二重エピトープ抗体、Ｔ細胞依存性二重特異性抗体（ＴＤＢ）、二重作用ＦＡｂ（ＤＡＦ）、又はこれらの抗原結合断片であることができる。
【０１１７】
５．５．１  多重特異性抗体
特定の態様において、本明細書において提供する細胞及び方法により作製される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。「多重特異性抗体」とは、少なくとも２つの異なる部分、即ち異なる抗原の異なるエピトープ（即ち、二重特異的）、又は、同じ抗原の異なるエピトープ（即ち、二重エピトープ）に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様において、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。多重特異性抗体は、本明細書に記載した完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１１８】
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の、組み換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３）を参照のこと）、及び、「ノブ・イン・ホール」組み換え（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、及びＡｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６（１９９７）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の改変（国際公開第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体若しくは断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照のこと）；ロイシンジッパーを使用した二重特異的抗体の産生（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）、及び国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照のこと）；軽鎖のミスペアリング問題を回避するための、一般的な軽鎖技術の使用（例えば国際公開第９８／５０４３１号を参照のこと）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと）；及び、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照）；及び、例えばＴｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されている三重特異的抗体の調製により作製することができる。
【０１１９】
３つ以上の抗原結合部位を有する、例えば「オクトパス抗体」、又はＤＶＤ−Ｉｇなどの改変抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号、及び同第２００８／０２４７１５号を参照のこと）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の別の非限定例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、同第２０１０／１１２１９３号、同第２０１０／１３６１７２号、同第２０１０／１４５７９２号、及び同第２０１３／０２６８３１号に見出すことができる。三重特異性抗体又はその抗原結合断片は、「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」もまた含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号及び国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照のこと）。
【０１２０】
多重特異性抗体は、同じ抗原特異性を有する１つ以上の結合アームにおいて、ドメインクロスオーバを有する非対称形態でも、即ち、ＶＨ／ＶＬドメインを交換する（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号及び同第２０１５／１５０４４７号を参照のこと）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５３号を参照のこと）、又は、完全なＦａｂアームを交換する（例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、同第２０１６／０１６２９９号を参照のこと、また、Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１８７−１１９１，ａｎｄ  Ｋｌｅｉｎ  ａｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ  ８（２０１６）１０１０−２０）も参照のこと）ことにより、提供されることができる。特定の実施形態において、多重特異性抗体はクロスＦａｂ断片を含む。「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」との用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域１（ＣＨ１）とで構成されるポリペプチド鎖、及び重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるポリペプチド鎖を含む。非対称Ｆａｂアームは、荷電又は非荷電アミノ酸変異をドメインインターフェースに導入して正しいＦａｂペアリングを指示することによって操作することもできる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照のこと。
【０１２１】
多重特異性抗体の様々な、更なる分子フォーマットが当技術分野において既知であり、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）９５−１０６を参照のこと）。
【０１２２】
特定の実施形態において、本明細書にも含まれる、特定の種類の多重特異性抗体は、標的細胞、例えば腫瘍細胞上で、表面抗原、及びＴ細胞を再標的化するための、ＣＤ３などの、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の、活性化された不変の構成成分に同時に結合し、標的細胞を殺傷するように設計された二重特異性抗体である。
【０１２３】
本目的に有用であることができる二重特異性抗体フォーマットの更なる非限定例としては、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーにより融合された、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、同第２００５／０６１５４７号、同第２００７／０４２２６１号、及び同第２００８／１１９５６７号、Ｎａｇｏｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３１７，１２５５−１２６０（２０１１）を参照のこと）；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９，２９９−３０５（１９９６））及びその誘導体、例えばタンデム二重特異性抗体（「ＴａｎｄＡｂ」；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３，４１−５６（１９９９））；ダイアボディフォーマットに基づくが、更なる安定化のための、Ｃ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９９，４３６−４４９（２０１０））、及び、全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子である、いわゆるトリオマブ（Ｓｅｉｍｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．３６，４５８−４６７（２０１０）で確認される）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に含まれる、具体的なＴ細胞二重特異性抗体フォーマットは、国際公開第２０１３／０２６８３３号、同第２０１３／０２６８３９号、同第２０１６／０２０３０９号；Ｂａｃａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５（８）（２０１６）ｅｌ２０３４９８に記載されている。
【０１２４】
５．５．２  抗体断片
特定の態様において、本明細書において提供する細胞及び方法により作製される抗体は、抗体断片である。例えば、限定されるものではないが、抗体断片はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、又はＦ（ａｂ’）２断片、特にＦａｂ断片である。インタクトな抗体をパパイン分解することにより、２つの同一の抗原結合断片、いわゆる、それぞれが、重鎖及び軽鎖可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）、並びに、軽鎖（ＣＬ）の定常ドメイン、及び重鎖（ＣＨ１）の第１の定常ドメインを含有する「Ｆａｂ」断片が作製される。用語「Ｆａｂ断片」はそれ故、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖断片と、を含む抗体断片を意味する。「Ｆａｂ’断片」は、抗体ヒンジ領域から１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にて、残基を添加することによって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基がチオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）、及びＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２の議論には、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【０１２５】
特定の実施形態において、抗体断片はダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディである。「ダイアボディ」は、二価又は二重特異性であってよい、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許出願公開第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．９，１２９−１３４（２００３）及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディについては、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）にもまた記載されている。
【０１２６】
更なる態様において、抗体断片は一本鎖Ｆａｂ断片である。「一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、及びリンカーからなるポリペプチドであり、上記抗体ドメイン及び上記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有する。特に、上記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２〜５０個のアミノ酸のポリペプチドである。上記一本鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。更に、これらの一本鎖Ｆａｂ断片は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによれば、可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるであろう。
【０１２７】
別の態様では、抗体断片は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、リンカーにより接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの融合タンパク質である。特に、リンカーは、１０〜２５個のアミノ酸の短いポリペプチドであり、通常、柔軟性のためにグリシンが、かつ、溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と、又はこの逆のいずれかで、接続させることができる。このタンパク質は、定常領域が取り除かれ、リンカーが導入されているにもかかわらず、元の抗体の特異性を保持することができる。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。また、国際公開第９３／１６１８５号、並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照のこと。
【０１２８】
別の態様では、抗体断片は単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。特定の態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照のこと）。
【０１２９】
抗体断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解が挙げられるがこれに限定されない、様々な技術により作製することができる。
【０１３０】
５．５．３  キメラ抗体及びヒト化抗体
特定の態様において、本明細書において提供する細胞及び方法により作製される抗体は、キメラ抗体である。ある種のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）に開示されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類に由来の可変領域）、及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のそれらから変更している「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
【０１３１】
特定の態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。一般的に、非ヒト抗体をヒト化すると、ヒトに対する免疫原性は低下するが、親非ヒト抗体の特異性及び親和性は維持される。通常、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来する１つ以上の可変ドメインを含み、ＦＲ（又はその一部）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は所望により、ヒト定常領域の少なくとも一部もまた含む。特定の実施形態では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を復元又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０１３２】
ヒト化抗体及びその作成方法は例えば、Ａｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）で確認され、更に、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフトに関する記述）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「表面再構成」の記述）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲ再構成」の記述）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲ構築のための「誘導選択」アプローチの記述）に詳しく記載されている。
【０１３３】
ヒト化に用いるヒトフレームワーク領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を用いて選択したフレームワーク領域（例えばＳｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）；重鎖又は軽鎖可変領域の特定の亜型のヒト抗体コンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照）；並びにＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照）。
【０１３４】
５．５．４  ヒト抗体
特定の態様において、本明細書において提供する細胞及び方法により作製される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において既知である様々な技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は通常、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ及びｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。
【０１３５】
抗原投与に対して応答するヒト可変領域を有する完全なヒト抗体又は完全な抗体を産生するために修飾したトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより、ヒト抗体を調製することができる。そのような動物は通常、内在性イムノグロブリン遺伝子座を置き換える、又は染色体外に存在する、若しくは動物の染色体中に無作為に導入したヒトイムノグロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有する。そのようなトランスジェニックマウスでは、内在性免疫グロブリン遺伝子座は通常不活性である。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照のこと。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術について記載した米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術について記載した米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載した米国特許第７，０４１，８７０号；並びにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載した米国特許出願公開第２００７／００６１９００号もまた参照のこと。そのような動物により産生された完全な抗体のヒト可変領域を、例えば異なるヒト定常領域を組み合わせることにより、更に修飾することができる。
【０１３６】
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が説明されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照のこと。）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はまた、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２，２００６にも記載されている。更なる方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生について記載）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマについて記載）に記載されるものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）にも記載されている。
【０１３７】
５．５．５  標的分子
本明細書にて開示した細胞及び方法により作製した抗体により標的化されることができる分子の非限定例としては、可溶性血清タンパク質及びそれらの受容体、並びに、他の膜結合タンパク質（例えば付着因子）が挙げられる。特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞及び方法により作製した抗体は、８ＭＰＩ、８ＭＰ２、８ＭＰ３８（ＧＤＦＩＯ）、８ＭＰ４、８ＭＰ６、８ＭＰ８、ＣＳＦＩ（Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦ１（αＦＧＦ）、ＦＧＦ２（βＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮ８１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷＩ、ＦＥＬ１、ＦＥＬ１（ＥＰＳＥＬＯＮ）、ＦＥＬ１（ＺＥＴＡ）、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢｂ３、ＬＴＡ（ＴＮＦ−β）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−α）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ  １１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦ１、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、及びＴＨＰＯ．ｋからなる群から選択される、１つ、２つ又はそれ以上のサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、及びサイトカイン受容体に結合することができる。
【０１３８】
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞及び方法により作製される抗体は、ＣＣＬＩ（１−３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−Ｉα）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−Ｉβ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−Ｉδ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＤＰ−３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３α）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス−２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬＩ（ＧＲＯＩ）、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）、ＣＸＣＬ１１（１−ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦＩ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）、ＳＣＹＥＩ、ＸＣＬＩ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ−Ｉβ）、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲＩ（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ＩＲＢ  ＩＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／Ｓ  ＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩＩ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ−Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒα）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒβ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＤＦ１、ＨＤＦ１α、ＤＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、及びＶＨＬからなる群から選択されるケモカイン、ケモカイン受容体、又はケモカイン関連タンパク質に結合することができる。
【０１３９】
特定の実施形態において、本明細書にて開示した方法により作製した抗体（例えば、二重特異性抗体などの多重特異性抗体）は、以下から選択される１つ以上の標的分子に結合することができる：０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６）（即ち、卵巣癌抗原）、ＡＢＣＦ１；ＡＣＶＲ１；ＡＣＶＲ１Ｂ；ＡＣＶＲ２；ＡＣＶＲ２Ｂ；ＡＣＶＲＬ１；ＡＤＯＲＡ２Ａ；アグリカン；ＡＧＲ２；ＡＩＣＤＡ；ＡＩＦ１；ＡＩＧ１；ＡＫＡＰ１；ＡＫＡＰ２；ＡＭＨ；ＡＭＨＲ２；アミロイドβ；ＡＮＧＰＴＬ；ＡＮＧＰＴ２；ＡＮＧＰＴＬ３；ＡＮＧＰＴＬ４；ＡＮＰＥＰ；ＡＰＣ；ＡＰＯＣ１；ＡＲ；ＡＳＬＧ６５９；ＡＳＰＨＤ１（アスパルテートβ−ヒドロキシラーゼドメイン含有１；ＬＯＣ２５３９８２）；ＡＺＧＰ１（亜鉛−ａ−糖タンパク質）；Ｂ７．１；Ｂ７．２；ＢＡＤ；ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３；ＢＡＧ１；ＢＡＩ１；ＢＣＬ２；ＢＣＬ６；ＢＤＮＦ；ＢＬＮＫ；ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）；ＢＭＰ１；ＢＭＰ２；ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦ１０）；ＢＭＰ４；ＢＭＰ６；ＢＭＰ８；ＢＭＰＲ１Ａ；ＢＭＰＲ１Ｂ（ＩＢ型骨形成タンパク質受容体）；ＢＭＰＲ２；ＢＰＡＧ１（プレクチン）；ＢＲＣＡ１；Ｂｒｅｖｉｃａｎ；Ｃ１９ｏｒｆ１０（ＩＬ２７ｗ）；Ｃ３；Ｃ４Ａ；Ｃ５；Ｃ５Ｒ１；ＣＡＮＴ１；ＣＡＳＰ１；ＣＡＳＰ４；ＣＡＶ１；ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）；ＣＣＬ１（１−３０９）；ＣＣＬ１１（エオタキシン）；ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）；ＣＣＬ１５（ＭＩＰ１δ）；ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）；ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）；ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）；ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３β）；ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）；ＭＣＡＦ；ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３α）；ＣＣＬ２１（ＭＴＰ−２）；ＳＬＣ；ｅｘｏｄｕｓ−２；ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−１）；ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−１）；ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）；ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）；ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）；ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）；ＣＣＬ２８；ＣＣＬ３（ＭＴＰ−Ｉα）；ＣＣＬ４（ＭＤＰ−Ｉβ）；ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）；ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）；ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）；ＣＣＮＡ１；ＣＣＮＡ２；ＣＣＮＤ１；ＣＣＮＥ１；ＣＣＮＥ２；ＣＣＲ１（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）；ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ＩＲβ／ＲＡ）；ＣＣＲ３（ＣＫＲ／ＣＭＫＢＲ３）；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）；ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）；ＣＣＲ７（ＣＫＢＲ７／ＥＢＩ１）；ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ−Ｌ１）；ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）；ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）；ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）；ＣＤ１６４；ＣＤ１９；ＣＤ１Ｃ；ＣＤ２０；ＣＤ２００；ＣＤ２２（Ｂ−細胞受容体ＣＤ２２−Ｂアイソフォーム）；ＣＤ２４；ＣＤ２８；ＣＤ３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ３Ｅ；ＣＤ３Ｇ；ＣＤ３Ｚ；ＣＤ４；ＣＤ４０；ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ４４；ＣＤ４５ＲＢ；ＣＤ５２；ＣＤ６９；ＣＤ７２；ＣＤ７４；ＣＤ７９Ａ（ＣＤ７９α、免疫グロブリン−関連α、Ｂ細胞特異的タンパク質）；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤＳ；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８３；ＣＤ８６；ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリン）���ＣＤＨ１０；ＣＤＨ１２；ＣＤＨ１３；ＣＤＨ１８；ＣＤＨ１９；ＣＤＨ２０；ＣＤＨ５；ＣＤＨ７；ＣＤＨ８；ＣＤＨ９；ＣＤＫ２；ＣＤＫ３；ＣＤＫ４；ＣＤＫ５；ＣＤＫ６；ＣＤＫ７；ＣＤＫ９；ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７／Ｋｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｃ；ＣＤＫＮ２Ａ（Ｐ１６ＩＮＫ４ａ）；ＣＤＫＮ２Ｂ；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＤＫＮ３；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＲ１；ＣＨＧＡ；ＣＨＧＢ；キチナーゼ；ＣＨＳＴ１０；ＣＫＬＦＳＦ２；ＣＫＬＦＳＦ３；ＣＫＬＦＳＦ４；ＣＫＬＦＳＦ５；ＣＫＬＦＳＦ６；ＣＫＬＦＳＦ７；ＣＫＬＦＳＦ８；ＣＬＤＮ３；ＣＬＤＮ７（クローディン−７）；ＣＬＬ−１（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＭＩＣＬ、及びＤＣＡＬ２）；ＣＬＮ３；ＣＬＵ（クラステリン）；ＣＭＫＬＲ１；ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）；ＣＮＲ１；ＣＯＬ１８Ａ１；ＣＯＬ１Ａ１；ＣＯＬ４Ａ３；ＣＯＬ６Ａ１；補体因子Ｄ；ＣＲ２；ＣＲＰ；ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌由来の増殖因子）；ＣＳＦＩ（Ｍ−ＣＳＦ）；ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）；ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）；ＣＴＬＡ４；ＣＴＮＮＢ１（ｂ−カテニン）；ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）；ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）；ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）；ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）；ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）；ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ／ＩＰ−９）；ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）；ＣＸＣＬ１３；ＣＸＣＬ１４；ＣＸＣＬ１６；ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）；ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）；ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ）；ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）；ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）；ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、Ｇタンパク質結合受容体）；ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）；ＣＹＢ５；ＣＹＣ１；ＣＹＳＬＴＲ１；ＤＡＢ２ＩＰ；ＤＥＳ；ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８；ＤＮＣＬＩ；ＤＰＰ４；Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）；Ｅ２Ｆ１；ＥＣＧＦ１；ＥＤＧ１；ＥＦＮＡ１；ＥＦＮＡ３；ＥＦＮＢ２；ＥＧＦ；ＥＧＦＲ；ＥＬＡＣ２；ＥＮＧ；ＥＮＯ１；ＥＮＯ２；ＥＮＯ３；ＥＰＨＢ４；ＥｐｈＢ２Ｒ；ＥＰＯ；ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ−２）；ＥＲＥＧ；ＥＲＫ８；ＥＳＲ１；ＥＳＲ２；ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）；Ｆ３（ＴＦ）；ＦＡＤＤ；ＦａｓＬ；ＦＡＳＮ；ＦＣＥＲ１Ａ；ＦＣＥＲ２；ＦＣＧＲ３Ａ；ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１）；ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）；ＦＧＦ；ＦＧＦ１（αＦＧＦ）；ＦＧＦ１０；ＦＧＦ１１；ＦＧＦ１２；ＦＧＦ１２Ｂ；ＦＧＦ１３；ＦＧＦ１４；ＦＧＦ１６；ＦＧＦ１７；ＦＧＦ１８；ＦＧＦ１９；ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）；ＦＧＦ２０；ＦＧＦ２１；ＦＧＦ２２；ＦＧＦ２３；ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）；ＦＧＦ４（ＨＳＴ）；ＦＧＦ５；ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）；ＦＧＦ７（ＫＧＦ）；ＦＧＦ８；ＦＧＦ９；ＦＧＦＲ；ＦＧＦＲ３；ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）；ＦＥＬ１（ＥＰＳＩＬＯＮ）；ＦＩＬ１（ＺＥＴＡ）；ＦＬＪ１２５８４；ＦＬＪ２５５３０；ＦＬＲＴＩ（フィブロネクチン）；ＦＬＴ１；��ＯＳ；ＦＯＳＬ１（ＦＲＡ−１）；ＦＹ（ＤＡＲＣ）；ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）；ＧＡＧＥＢ１；ＧＡＧＥＣ１；ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ−６ＳＴ；ＧＡＴＡ３；ＧＤＦ５；ＧＤＮＦ−Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体α１；ＧＦＲＡ１；ＧＤＮＦＲ；ＧＤＮＦＲＡ；ＲＥＴＬ１；ＴＲＮＲ１；ＲＥＴ１Ｌ；ＧＤＮＦＲ−α１；ＧＦＲ−ＡＬＰＨＡ−１）；ＧＥＤＡ；ＧＦＩ１；ＧＧＴ１；ＧＭ−ＣＳＦ；ＧＮＡＳＩ；ＧＮＲＨＩ；ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）；ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質結合受容体１９；Ｍｍ．４７８７）；ＧＰＲ３１；ＧＰＲ４４；ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体；ＫＩＳＳ１Ｒ；ＧＰＲ５４；ＨＯＴ７Ｔ１７５；ＡＸＯＲ１２）；ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）；ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質結合受容体１７２Ａ；ＧＰＣＲ４１；ＦＬＪ１１８５６；Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）；ＧＲＣＣＩＯ（ＣＩＯ）；ＧＲＰ；ＧＳＮ（Ｇｅｌｓｏｌｉｎ）；ＧＳＴＰ１；ＨＡＶＣＲ２；ＨＤＡＣ４；ＨＤＡＣ５；ＨＤＡＣ７Ａ；ＨＤＡＣ９；ＨＧＦ；ＨＩＦ１Ａ；ＨＯＰ１；ヒスタミン及びヒスタミン受容体；ＨＬＡ−Ａ；ＨＬＡ−ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ  分子のβサブユニット（Ｉａ抗原）；ＨＬＡ−ＤＲＡ；ＨＭ７４；ＨＭＯＸＩ；ＨＵＭＣＹＴ２Ａ；ＩＣＥＢＥＲＧ；ＩＣＯＳＬ；１Ｄ２；ＩＦＮ−ａ；ＩＦＮＡ１；ＩＦＮＡ２；ＩＦＮＡ４；ＩＦＮＡ５；ＩＦＮＡ６；ＩＦＮＡ７；ＩＦＮＢ１；ＩＦＮγ；ＤＦＮＷ１；ＩＧＢＰ１；ＩＧＦ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＧＦ２；ＩＧＦＢＰ２；ＩＧＦＢＰ３；ＩＧＦＢＰ６；ＩＬ−１；ＩＬ１０；ＩＬ１０ＲＡ；ＩＬ１０ＲＢ；ＩＬ１１；ＩＬ１１ＲＡ；ＩＬ−１２；ＩＬ１２Ａ；ＩＬ１２Ｂ；ＩＬ１２ＲＢ１；ＩＬ１２ＲＢ２；ＩＬ１３；ＩＬ１３ＲＡ１；ＩＬ１３ＲＡ２；ＩＬ１４；ＩＬ１５；ＩＬ１５ＲＡ；ＩＬ１６；ＩＬ１７；ＩＬ１７Ｂ；ＩＬ１７Ｃ；ＩＬ１７Ｒ；ＩＬ１８；ＩＬ１８ＢＰ；ＩＬ１８Ｒ１；ＩＬ１８ＲＡＰ；ＩＬ１９；ＩＬＩＡ；ＩＬ１Ｂ；ＩＬＩＦ１０；ＩＬ１Ｆ５；ＩＬ１Ｆ６；ＩＬ１Ｆ７；ＩＬ１Ｆ８；ＩＬ１Ｆ９；ＩＬ１ＨＹ１；ＩＬ１Ｒ１；ＩＬ１Ｒ２；ＩＬ１ＲＡＰ；ＩＬ１ＲＡＰＬ１；ＩＬ１ＲＡＰＬ２；ＩＬ１ＲＬ１；ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬＩＲＮ；ＩＬ２；ＩＬ２０；ＩＬ２０Ｒα；ＩＬ２１Ｒ；ＩＬ２２；ＩＬ−２２ｃ；ＩＬ２２Ｒ；ＩＬ２２ＲＡ２；ＩＬ２３；ＩＬ２４；ＩＬ２５；ＩＬ２６；ＩＬ２７；ＩＬ２８Ａ；ＩＬ２８Ｂ；ＩＬ２９；ＩＬ２ＲＡ；ＩＬ２ＲＢ；ＩＬ２ＲＧ；ＩＬ３；ＩＬ３０；ＩＬ３ＲＡ；ＩＬ４；ＩＬ４Ｒ；ＩＬ５；ＩＬ５ＲＡ；ＩＬ６；ＩＬ６Ｒ；ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）；インフルエンザＡ；インフルエンザＢ；ＥＬ７；ＥＬ７Ｒ；ＥＬ８；ＩＬ８ＲＡ；ＤＬ８ＲＢ；ＩＬ８ＲＢ；ＤＬ９；ＤＬ９Ｒ；ＤＬＫ；ＩＮＨＡ；ＩＮＨＢＡ；ＩＮＳＬ３；ＩＮＳＬ４；ＩＲＡＫＩ；ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２）；ＥＲＡＫ２；ＩＴＧＡ１；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ３；ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）；ＩＴＧＡＶ；ＩＴＧＢ３；ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）；α４β７及びαＥβ７インテグリンヘテロ二量体；ＪＡＧ１；ＪＡＫ１；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；Ｋ６ＨＦ；ＫＡＩ１；ＫＤＲ；ＫＩＴＬＧ；ＫＬＦ５（ＧＣ  Ｂｏｘ  ＢＰ）；ＫＬＦ６；ＫＬ��ＩＯ；ＫＬＫ１２；ＫＬＫ１３；ＫＬＫ１４；ＫＬＫ１５；ＫＬＫ３；ＫＬＫ４；ＫＬＫ５；ＫＬＫ６；ＫＬＫ９；ＫＲＴ１；ＫＲＴ１９（ケラチン１９）；ＫＲＴ２Ａ；ＫＨＴＨＢ６（毛髪特異性Ｈ型ケラチン）；ＬＡＭＡＳ；ＬＥＰ（レプチン）；ＬＧＲ５（ロイシン豊富な反復含有Ｇタンパク質結合受容体５；ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）；Ｌｉｎｇｏ−ｐ７５；Ｌｉｎｇｏ−Ｔｒｏｙ；ＬＰＳ；ＬＴＡ（ＴＮＦ−ｂ）；ＬＴＢ；ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）；ＬＴＢ４Ｒ２；ＬＴＢＲ；ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシン豊富な反復（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）；Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、座位Ｅ；Ｌｙ６７、ＲＩＧ−Ｅ、ＳＣＡ−２、ＴＳＡ−ｌ）；Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、座位Ｇ６Ｄ；Ｌｙ６−Ｄ、ＭＥＧＴ１）；ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ；ＬＹ６Ｋ；ＨＳＪ００１３４８；ＦＬＪ３５２２６）；ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ；ＭＡＧ又はＯＭｇｐ；ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ−Ｊｕｎ）；ＭＤＫ；ＭＤＰ；ＭＩＢ１；ミドカイン；ＭＥＦ；ＭＩＰ−２；ＭＫＩ６７；（Ｋｉ−６７）；ＭＭＰ２；ＭＭＰ９；ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソセリン）；ＭＳ４Ａ１；ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、
仮想的タンパク質ＦＬＪ２０３１５）；ＭＳＭＢ；ＭＴ３（メタロチオネクチン−１１１）；ＭＴＳＳ１；ＭＵＣ１（ムチン）；ＭＹＣ；ＭＹ０８８；Ｎａｐｉ３ｂ（ＮａＰｉ２ｂとしても知られている）（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質キャリアファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性ホスフェートトランスポーター３ｂ）；ＮＣＡ；ＮＣＫ２；ニューロカン；ＮＦＫＢ１；ＮＦＫＢ２；ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）；ＮＧＦＲ；ＮｇＲ−Ｌｉｎｇｏ；ＮｇＲ−Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）；ＮｇＲ−ｐ７５；ＮｇＲ−Ｔｒｏｙ；ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）；ＮＯＸ５；ＮＰＰＢ；ＮＲ０Ｂ１；ＮＲ０Ｂ２；ＮＲ１Ｄ１；ＮＲ１Ｄ２；ＮＲ１Ｈ２；ＮＲ１Ｈ３；ＮＲ１Ｈ４；ＮＲ１１２；ＮＲ１１３；ＮＲ２Ｃ１；ＮＲ２Ｃ２；ＮＲ２Ｅ１；ＮＲ２Ｅ３；ＮＲ２Ｆ１；ＮＲ２Ｆ２；ＮＲ２Ｆ６；ＮＲ３Ｃ１；ＮＲ３Ｃ２；ＮＲ４Ａ１；ＮＲ４Ａ２；ＮＲ４Ａ３；ＮＲ５Ａ１；ＮＲ５Ａ２；ＮＲ６Ａ１；ＮＲＰ１；ＮＲＰ２；ＮＴ５Ｅ；ＮＴＮ４；ＯＤＺＩ；ＯＰＲＤ１；０Ｘ４０；Ｐ２ＲＸ７；Ｐ２Ｘ５（プリン作動性受容体Ｐ２Ｘリガンドゲートイオンチャネル５）；ＰＡＰ；ＰＡＲＴＩ；ＰＡＴＥ；ＰＡＷＲ；ＰＣ  Ａ３；ＰＣＮＡ；ＰＤ−Ｌ１；ＰＤ−Ｌ２；ＰＤ−１；ＰＯＧＦＡ；ＰＯＧＦＢ；ＰＥＣ  ＡＭＩ；ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）；ＰＧＦ；ＰＧＲ；ホスファカン；ＰＩＡＳ２；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）；ＰＬＧ；ＰＬＸＤＣ１；ＰＭＥＬ１７（銀ホモログ；ＳＩＬＶ；Ｄ１２Ｓ５３Ｅ；ＰＭＥＬ１７；ＳＩ；ＳＩＬ）；ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）；ＰＰＩＤ；ＰＲＩ；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＫＤＩ；ＰＲＬ；ＰＲＯＣ；ＰＲＯＫ２；ＰＳＡＰ；ＰＳＣＡ  ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８０１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）；ＰＴＡＦＲ；ＰＴＥＮ；ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）；ＰＴＮ；ＲＡＣ２（ｐ２１  Ｒａｃ２）；ＲＡＲＢ；ＲＥＴ（ｒｅｔ原型癌遺伝子；ＭＥＮ２Ａ；ＨＳＣＲ１；ＭＥＮ２Ｂ；ＭＴＣ１；ＰＴＣ；ＣＤＨＦ１２；Ｈｓ．１６８１１４；ＲＥＴ５１；ＲＥＴ−ＥＬＥ１）；ＲＧＳＩ；ＲＧＳ１３；ＲＧＳ３；ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）；ＲＯＢＯ２；Ｓ１００Ａ２；ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）；ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）；ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）；ＳＣＹＥＩ（内皮単核細胞活性化サイトカイン）；ＳＤＦ２；Ｓｅｒｎａ  ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ  Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７つのトロンボスポンジン反復（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び短い細胞質ドメイン（セマフォリン）５Ｂ）；ＳＥＲＰＩＮＡ１；ＳＥＲＰＩＮＡ３；ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン）；ＳＥＲＰＩＮＥｌ（ＰＡＩ−ｌ）；ＳＥＲＰＤＭＦ１；ＳＨＢＧ；ＳＬＡ２；ＳＬＣ２Ａ２；ＳＬＣ３３Ａ１；ＳＬＣ４３Ａ１；ＳＬＩＴ２；ＳＰＰＩ；ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒｌ）；ＳＴ６ＧＡＬ１；ＳＴＡＢＩ；ＳＴＡＴ６；ＳＴＥＡＰ（６つの、前立腺の膜貫通上皮抗原）；ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−１���ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、６つの、前立腺の膜貫通上皮抗原２、６つの膜貫通前立腺タンパク質）；ＴＢ４Ｒ２；ＴＢＸ２１；ＴＣＰＩＯ；ＴＯＧＦＩ；ＴＥＫ；ＴＥＮＢ２（推定の膜貫通プロテオグリカン）；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢ１ＩＩ；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢ３；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＲＩ；ＴＧＦＢＲ２；ＴＧＦＢＲ３；ＴＨＩＬ；ＴＨＢＳＩ（トロンボスポンジン−１）；ＴＨＢＳ２；ＴＨＢＳ４；ＴＨＰＯ；ＴＩＥ（Ｔｉｅ−１）；ＴＭＰ３；組織因子；ＴＬＲ１；ＴＬＲ２；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＴＬＲ５；ＴＬＲ６；ＴＬＲ７；ＴＬＲ８；ＴＬＲ９；ＴＬＲ１０；ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様及びフォリスタチン様ドメイン１を有する膜貫通タンパク質；トモレグリン−１）；ＴＭＥＭ４６（シーサホモログ２）；ＴＮＦ；ＴＮＦ−ａ；ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４）；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦＩＩＡ；ＴＮＦＲＳＦ１Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ５；ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）；ＴＮＦＲＳＦ７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）；ＴＮＦＳＦ１８；ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）；ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）；ＴＮＦＳＦＳ（ＣＤ３０リガンド）；ＴＮＦＳＦ９（４−１  ＢＢリガンド）；ＴＯＬＬＩＰ；Ｔｏｌｌ−様受容体；ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＥａ）；ＴＰ５３；ＴＰＭ１；ＴＰＭ２；ＴＲＡＤＤ；ＴＭＥＭ１１８（ＲＩＮＧフィンガータンパク質、膜貫通２；ＲＮＦＴ２；ＦＬＪ１４６２７）；ＴＲＡＦ１；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＲＡＦ４；ＴＲＡＦ５；ＴＲＡＦ６；ＴＲＥＭ１；ＴＲＥＭ２；ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性の受容体潜在性カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）；ＴＲＰＣ６；ＴＳＬＰ；ＴＷＥＡＫ；チロシナーゼ（ＴＹＲ；ＯＣＡＩＡ；ＯＣＡ１Ａ；チロシナーゼ；ＳＨＥＰ３）；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＢ；ＶＥＧＦＣ；バーシカン；ＶＨＬ  Ｃ５；ＶＬＡ−４；ＸＣＬ１（リンホタクチン）；ＸＣＬ２（ＳＣＭ−１ｂ）；ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／  ＣＣＸＣＲＩ）；ＹＹ１；及びＺＦＰＭ２。
【０１４０】
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞及び方法により作製される抗体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）又はＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタインバーウイルス受容体）、又はＨｓ．７３７９２）；ＣＤ３３；ＣＤ３４；ＣＤ６４；ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２）；ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９Ｐ、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連β）、Ｂ２９）；ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４受容体などの、ＥｒｂＢ受容体ファミリーのＣＤ２００メンバー；ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐｌ５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、α４／β７インテグリン、及び、αｖ／β３インテグリン（これらのα又はβサブユニットのいずれかを含む）などの細胞接着分子（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）；ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ；組織因子（ＴＦ）；αインターフェロン（αＩＦＮ）などの成長因子；ＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７ＡＦ、ＩＬ−１Ｓ、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ１３Ｒα２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩｇＥなどの、インターロイキンであるＴＮＦα；血液群抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、プロテインＣなどのＣＤタンパク質に結合することができる。
【０１４１】
特定の実施形態において、本明細書において提供する細胞及び方法を使用して、補体プロテインＣ５に特異的に結合する抗体（二重特異性抗体などの多重特異性抗体）（例えば、ヒトＣ５に特異的に結合する抗Ｃ５アゴニスト抗体）を産生することができる。特定の実施形態において、抗Ｃ５抗体は、（ａ）ＳＳＹＹＭＡ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＡＩＦＴＧＳＧＡＥＹＫＡＥＷＡＫＧ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）ＤＡＧＹＤＹＰＴＨＡＭＨＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）ＲＡＳＱＧＩＳＳＳＬＡ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）ＧＡＳＥＴＥＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び、（ｆ）ＱＮＴＫＶＧＳＳＹＧＮＴ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含む。例えば、特定の実施形態において、抗０５抗体は、（ａ）ＳＳＹＹＭＡ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＡＩＦＴＧＳＧＡＥＹＫＡＥＷＡＫＧ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）ＤＡＧＹＤＹＰＴＨＡＭＨＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；から選択される１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、並びに／又は、（ｄ）ＲＡＳＱＧＩＳＳＳＬＡ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）ＧＡＳＥＴＥＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び、（ｆ）ＱＮＴＫＶＧＳＳＹＧＮＴ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。上記重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列は、米国特許出願公開第２０１６／０１７６９５４号にそれぞれ、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、及び配列番号１２５として開示されている。（米国特許出願公開第２０１６／０１７６９５４号の表７及び８を参照のこと。）
【０１４２】
特定の実施形態において抗Ｃ５抗体は、それぞれ、ＶＨ及びＶＬ配列ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＶＨ  ＳＳＹＹＭＡＷＶＲＱ  ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧ  ＡＩＦＴＧＳＧＡＥＹ  ＫＡＥＷＡＫＧＲＶＴ  ＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶ  ＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶ  ＤＴＡＴＹＹＣＡＳＤ  ＡＧＹＤＹＰＴＨＡＭ  ＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴ  ＶＳＳ（配列番号３１）、
及び
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ  ＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳ  ＳＳＬＡＷＹＱＱＫＰ  ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧ  ＡＳＥＴＥＳＧＶＰＳ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ  ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ  ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＮ  ＴＫＶＧＳＳＹＧＮＴ  ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３２）を含む（これらの配列の翻訳後修飾を含む）。上記ＶＨ及びＶＬ配列は、米国特許出願公開第２０１６／０１７６９５４号にそれぞれ、配列番号１０６及び配列番号１１１として開示されている。（米国特許出願公開第２０１６／０１７６９５４号の表７及び８を参照のこと。）特定の実施形態において、抗Ｃ５抗体は３０５Ｌ０１５である（米国特許出願公開第２０１６／０１７６９５４号を参照のこと）。
【０１４３】
特定の実施形態において、本明細書にて開示した方法により作製した抗体は、ＯＸ４０に結合することができる（例えば、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する抗ＯＸ４０アゴニスト抗体）。特定の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、（ａ）ＤＳＹＭＳ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＤＭＹＰＤＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＲＥ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）ＡＰＲＷＹＦＳＶ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号５）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）ＹＴＳＲＬＲＳ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び、（ｆ）ＱＱＧＨＴＬＰＰＴ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含む。例えば、特定の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、（ａ）ＤＳＹＭＳ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＤＭＹＰＤＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＲＥ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；及び（ｃ）ＡＰＲＷＹＦＳＶ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；から選択される１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、並びに／又は、（ａ）ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号５）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＹＴＳＲＬＲＳ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び、（ｃ）ＱＱＧＨＴＬＰＰＴ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。特定の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、それぞれ、ＶＨ及びＶＬ配列ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥ  ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ  ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ  ＤＳＹＭＳＷＶＲＱＡ  ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤ  ＭＹＰＤＮＧＤＳＳＹ  ＮＱＫＦＲＥＲＶＴＩ  ＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹ  ＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＶＬＡＰ  ＲＷＹＦＳＶＷＧＱＧ  ＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８）
及び
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ  ＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳ  ＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰ  ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹ  ＴＳＲＬＲＳＧＶＰＳ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ  ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ  ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ  ＧＨＴＬＰＰＴＦＧＱ  ＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号９）を含む（これらの配列の翻訳後修飾を含む）。
【０１４４】
特定の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、（ａ）ＮＹＬＩＥ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＶＩＮＰＧＳＧＤＴＹＹＳＥＫＦＫＧ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）ＤＲＬＤＹ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）ＨＡＳＱＤＩＳＳＹＩＶ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）ＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び、（ｆ）ＶＨＹＡＱＦＰＹＴ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１、２、３、４、５、又は６個のＣＤＲを含む。例えば、特定の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、（ａ）ＮＹＬＩＥ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＶＩＮＰＧＳＧＤＴＹＹＳＥＫＦＫＧ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；及び（ｃ）ＤＲＬＤＹ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１、２、又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、並びに／又は、（ａ）ＨＡＳＱＤＩＳＳＹＩＶ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；及び、（ｃ）ＶＨＹＡＱＦＰＹＴ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１、２、又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。特定の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、それぞれ、ＶＨ及びＶＬ配列ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥ  ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ  ＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴ  ＮＹＬＩＥＷＶＲＱＡ  ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶ  ＩＮＰＧＳＧＤＴＹＹ  ＳＥＫＦＫＧＲＶＴＩ  ＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹ  ＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲ  ＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶ  ＴＶＳＳ（配列番号１６）
及び
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ  ＩＴＣＨＡＳＱＤＩＳ  ＳＹＩＶＷＹＱＱＫＰ  ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨ  ＧＴＮＬＥＤＧＶＰＳ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ  ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ  ＥＤＦＡＴＹＹＣＶＨ  ＹＡＱＦＰＹＴＦＧＱ  ＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１７）を含む（これらの配列の翻訳後修飾を含む）。
【０１４５】
抗ＯＸ４０抗体に関する更なる詳細が、国際公開第２０１５／１５３５１３号で開示されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。
【０１４６】
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞及び方法により作製した抗体は、インフルエンザウイルスＢヘマグルチニン、即ち「ｆｌｕＢ」に結合することができる（例えば、インビトロ及び／又はインビボでインフルエンザＢウイルスのＹａｍａｇａｔａリネージ由来のヘマグルチニンに結合する、インフルエンザＢウイルスのＶｉｃｔｏｒｉａリネージ由来のヘマグルチニンに結合する、インフルエンザＢウイルスの祖先リネージ由来のヘマグルチニンに結合する、又は、インフルエンザＢウイルスのＹａｍａｇａｔａリネージ、Ｖｉｃｔｏｒｉａリネージ、及び祖先リネージ由来のヘマグルチニンに結合する抗体）。抗ＦｌｕＢ抗体に関する更なる詳細は国際公開第２０１５／１４８８０６号で開示されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。
【０１４７】
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞及び方法により作製した抗体は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）−１又はＬＲＰ−８又はトランスフェリン受容体、並びに、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１又はＢＡＣＥ２）、α−セクレターゼ、γ−セクレターゼ、タウセクレターゼ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイドβペプチド、α−シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ｐ７５  ＮＴＲ、ＣＤ４０、及びカスパーゼ−６からなる群から選択される少なくとも１個の標的に結合することができる。
【０１４８】
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞及び方法により作製した抗体は、ＣＤ４０に対するヒトＩｇＧ２抗体である。特定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体はＲＧ７８７６である。
【０１４９】
特定の実施形態において、本開示の細胞及び方法を使用して、ポリペプチドを作製することができる。例えば、限定されるものではないが、ポリペプチドは標的化された免疫サイトカインである。特定の実施形態において、標的化された免疫サイトカインはＣＥＡ−ＩＬ２ｖ免疫サイトカインである。特定の実施形態において、ＣＥＡ−ＩＬ２ｖ免疫サイトカインはＲＧ７８１３である。特定の実施形態において、標的化された免疫サイトカインはＦＡＰ−ＩＬ２ｖ免疫サイトカインである。特定の実施形態において、ＦＡＰ−ＩＬ２ｖ免疫サイトカインはＲＧ７４６１である。
【０１５０】
特定の実施形態において、本明細書において提供する細胞又は方法により作製した多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＣＥＡ、及び、少なくとも１つの追加の標的分子に結合することができる。特定の実施形態において、本明細書において提供する方法に従い作製した多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、腫瘍標的化サイトカイン、及び少なくとも１つの追加の標的分子に結合することができる。特定の実施形態において、本明細書において提供する方法に従い作製した多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＩＬ２ｖ（即ち、インターロイキン２バリアント）に融合され、ＩＬ−１系免疫サイトカイン、及び少なくとも１つの追加の標的分子に結合する。特定の実施形態において、本明細書において提供する方法に従い作製した多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、Ｔ細胞二重特異性抗体（即ち、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー又はＢｉＴＥ）である。
【０１５１】
特定の実施形態において、本明細書において提供する方法に従い作製した多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＩＬ−１α及びＩＬ−１β、ＩＬ−１２及びＩＬ−１Ｓ；ＩＬ−１３及びＩＬ−９；ＩＬ−１３及びＩＬ−４；ＩＬ−１３及びＩＬ−５；ＩＬ−５及びＩＬ−４；ＩＬ−１３及びＩＬ−１β；ＩＬ−１３及びＩＬ−２５；ＩＬ−１３及びＴＡＲＣ；ＩＬ−１３及びＭＤＣ；ＩＬ−１３及びＭＥＦ；ＩＬ−１３及びＴＧＦ−〜；ＩＬ−１３及びＬＨＲアゴニスト；ＩＬ−１２及びＴＷＥＡＫ、ＩＬ−１３及びＣＬ２５；ＩＬ−１３及びＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ−１３及びＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ−１３及びＡＤＡＭＳ、ＩＬ−１３及びＰＥＤ２、ＩＬ１７Ａ及びＩＬ１７Ｆ、ＣＥＡ及びＣＤ３、ＣＤ３及びＣＤ１９、ＣＤ１３８及びＣＤ２０；ＣＤ  １３８及びＣＤ４０；ＣＤ１９及びＣＤ２０；ＣＤ２０及びＣＤ３；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ１３Ｓ；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ２０；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ４０；ＣＤ４０及びＣＤ２０；ＣＤ−Ｓ及びＩＬ−６；ＣＤ２０及びＢＲ３、ＴＮＦα及びＴＧＦ−β、ＴＮＦα及びＩＬ−１β；ＴＮＦα及びＩＬ−２、ＴＮＦα及びＩＬ−３、ＴＮＦα及びＩＬ−４、ＴＮＦα及びＩＬ−５、ＴＮＦα及びＩＬ６、ＴＮＦα及びＩＬ８、ＴＮＦα及びＩＬ−９、ＴＮＦα及びＩＬ−１０、ＴＮＦα及びＩＬ−１１、ＴＮＦα及びＩＬ−１２、ＴＮＦα及びＩＬ−１３、ＴＮＦα及びＩＬ−１４、ＴＮＦα及びＩＬ−１５、ＴＮＦα及びＩＬ−１６、ＴＮＦα及びＩＬ−１７、ＴＮＦα及びＩＬ−１８、ＴＮＦα及びＩＬ−１９、ＴＮＦα及びＩＬ−２０、ＴＮＦα及びＩＬ−２３、ＴＮＦα及びＩＦＮα、ＴＮＦα及びＣＤ４、ＴＮＦα及びＶＥＧＦ、ＴＮＦα及びＭＩＦ、ＴＮＦα及びＩＣＡＭ−１、ＴＮＦα及びＰＧＥ４、ＴＮＦα及びＰＥＧ２、ＴＮＦα及びＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦα及びＴｅ３８、ＴＮＦα及びＢＡＦＦ、ＴＮＦα及びＣＤ２２、ＴＮＦα及びＣＴＬＡ−４、ＴＮＦα及びＧＰ１３０、ＴＮＦ  ａ及びＩＬ−１２ｐ４０、ＶＥＧＦ及びアンジオポエチン、ＶＥＧＦ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−Ａ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦ、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦＡ及びＡＮＧ２、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄ、ＨＥＲ２及びＤＲ５、ＶＥＧＦ及びＩＬ−８、ＶＥＧＦ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＭＥＴ受容体、ＥＧＦＲ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＣＤ６４、ＨＥＲ２及びＣＤ３、ＨＥＲ２及びＣＤ１６、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３；ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）及びＨＥＲ２、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４、ＩＬ−１４及びＩＬ−１３、ＩＬ−１３及びＣＤ４０Ｌ、ＪＬ４及びＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ−１Ｒ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ−６Ｒ及びＴＮＦＲ１及びＩＬ−１８Ｒ、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３、ＭＡＰＧ及びＣＤ２８、ＥＧＦＲ及びＣＤ６４、ＣＳＰＧｓ及びＲＧＭ  Ａ；ＣＴＬＡ−４及びＢＴＮ０２；ＩＧＦ１及びＩＧＦ２；ＩＧＦ  １／２及びＥｒｂ２Ｂ；ＭＡＧ及びＲＧＭ  Ａ；ＮｇＲ及びＲＧＭ  Ａ；ＮｏｇｏＡ及びＲＧＭ  Ａ；ＯＭＧｐ及びＲＧＭ  Ａ；ＰＯＬ−１及びＣＴＬＡ−４；及びＲＧＭ  Ａ及びＲＧＭ  Ｂから選択される少なくとも２つの標的分子に結合することができる。
【０１５２】
特定の実施形態において、本明細書において提供する方法に従い作製した多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。特定の実施形態において抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体はＲＧ７８０２である。特定の実施形態において、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、以下に示す配列番号１８〜２１に記載のアミノ酸配列を含む：
2021519073.tif 000003
2021519073.tif 000004
2021519073.tif 000005
2021519073.tif 000006
【０１５３】
抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体に関する更なる詳細は、国際公開第２０１４／１２１７１２号に提供されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。
【０１５４】
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞及び方法により作製した多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体である。特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体二重特異性抗体はＣｒｏｓｓｍａｂである。特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体はＲＧ７７１６である。特定の実施形態において、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、以下に示す配列番号２２〜２５に記載のアミノ酸配列を含む：
2021519073.tif 000007
2021519073.tif 000008
2021519073.tif 000009
2021519073.tif 000010
【０１５５】
特定の実施形態において、本明細書にて開示した方法により作製した多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体である。特定の実施形態において、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体はＲＧ７２２１である。特定の実施形態において、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体はＣＡＳ番号１４４８２２１−０５−３である。
【０１５６】
他の分子に任意でコンジュゲートされる可溶性抗原又はその断片は、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。受容体などの膜貫通分子の場合、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）が免疫原として使用され得る。代替的に、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として使用され得る。そのような細胞は、天然源（例えば、癌細胞株）に由来し得るか、又は膜貫通分子を発現するように組み換え技法によって形質転換された細胞であり得る。抗体の調製に有用な他の抗原及びその形態は、当業者には明らかであろう。
【０１５７】
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞及び方法により作製したポリペプチド（例えば抗体）は、結合により、染料又は細胞毒性剤、例えば化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素（例えば、微生物、菌類、植物若しくは動物由来の酵素活性毒素、又はこれらの断片）、又は放射性同位体（即ち放射性抱合体）などの化学分子に更にコンジュゲートすることが可能となることができる。本明細書に記載の方法を使用して作製した抗体又は二重特異性抗体を含む免疫抱合体は、１つだけの重鎖、又は１つだけの軽鎖の定常領域にコンジュゲートした細胞毒性剤を含有することができる。
【０１５８】
５．５．６  抗体バリアント
特定の態様において、本明細書において提供する抗体、例えば、セクション５．５．５に示す抗体のアミノ酸配列バリアントを想到する。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的性質を変化させることが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、適切な改変を、抗体をコードするヌクレオチド配列に組み込むことで、又はペプチド合成により調製することができる。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入、及び／又は置換を含む。最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換を任意に組み合わせることができるが、但し、その最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を保有することを条件とする。
【０１５９】
５．５．６．１  置換、挿入、及び欠失バリアント
特定の態様において、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換による変異誘発に関して目的とする部位には、ＣＤＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、表１において、「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化は、表１において、「例示的な置換」の見出しの下に提供され、またアミノ酸側鎖クラスを参照して以下に更に記載されるとおりである。目的とする抗体中にアミノ酸置換を導入し、その産物を、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、低下した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについてスクリーニングすることができる。
【表１】
2021519073.tif 000011
【０１６０】
アミノ酸は、共通の側鎖の性質に従い分類分けすることができる：
（１）  疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）  中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）  酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）  塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）  鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）  芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１６１】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを伴うことになる。
【０１６２】
ある種類の置換型バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる研究のために選択される、得られた変異体は、親抗体と比較して、ある特定の生物学的性質における修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）を有し、及び／又は実質的に保持された親抗体のある特定の生物学的性質を有することになる。例示的な置換バリアントは、例えば、本明細書に記載されるものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して好都合に生成することができる、親和性成熟抗体である。要するに、１つ以上ＣＤＲ残基が変異され、バリアント抗体がファージにディスプレイされ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１６３】
改変（例えば置換）を、ＣＤＲに加えて、例えば、抗体の親和性を改善することができる。そのような改変は、ＣＤＲ「ホットスポット」、即ち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照のこと）、及び／又は抗原と接触する残基内で行われ得、結果として得られる多様体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築し、それから再選択することによる親和性成熟が、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの態様では、多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択される可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリが創出される。次いで、このライブラリは、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を特定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、一度に４〜６個の残基）をランダム化する、ＣＤＲ指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して、具体的に特定することができる。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、しばしば標的化される。
【０１６４】
特定の態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗体の抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＣＤＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的改変（例えば、本明細書に提供されるような保存的置換）が、ＣＤＲ中で行われることができる。そのような改変は、例えば、ＣＤＲ内の抗原接触残基の外側であっててもよい。上述の特定のバリアントＶＨ及びＶＬ配列において、各ＣＤＲは、改変されていないか、又は１つ、２つ、又は３つ以下のアミノ酸置換を有するかのいずれかである。
【０１６５】
変異を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャニング突然変異生成」と呼ばれる。この方法では、一残基又は一群の標的残基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）が特定され、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられて、抗体の抗原との相互作用が影響を受けたかどうかが決定される。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。代替的に、又は追加的に、抗原−抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との間の接触点を特定することができる。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は除去されてもよい。バリアントは、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。
【０１６６】
アミノ酸配列挿入として、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに１個又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ（抗体指向性酵素プロドラッグ治療法のための）又はポリペプチドへの抗体のＮ末端若しくはＣ末端の融合が挙げられ、これは抗体の血清半減期を増大させる。
【０１６７】
５．５．６．２  グリコシル化バリアント
特定の態様において、本明細書において提供する抗体を変えて、抗体のグリコシル化の程度を増減させる。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作り出されるか、又は除去されるようにアミノ酸配列を改変させることにより好都合に達成され得る。
【０１６８】
抗体がＦｃ領域を含む場合、Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照のこと。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの態様では、特定の改善された性質を有する抗体バリアントを作製するために、本開示の抗体中のオリゴ糖に修飾を加えることができる。
【０１６９】
一態様では、非フコシル化オリゴ糖、即ち、Ｆｃ領域へのフコース結合（直接又は間接）が欠落した、オリゴ糖構造を有する抗体多様体を提供する。このような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる）は特に、二分枝オリゴ糖構造の幹に第１のＧｌｃＮＡｃが結合したフコース残基を欠く、Ｎ結合オリゴ糖である。一態様では、内在性又は親抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した抗体バリアントを提供する。例えば、非フコシル化オリゴ糖の比率が、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は更に約１００％（即ち、フコシル化オリゴ糖が存在しない）であることができる。非フコシル化オリゴ糖の割合は、例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号に記載のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により測定した、Ａｓｎ２９７に結合した全てのオリゴ糖の合計（例えば、複合体、ハイブリッド、及びハイマンノース構造）に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域のほぼ位置２９７（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）に位置するアスパラギン残基を意味するが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体の軽度の配列変異により、アミノ酸の位置２９７の上流又は下流約±３、即ち、位置２９４〜３００に位置することができる。Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した、このような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合、及び／又は改善されたエフェクター機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；同第２００４／００９３６２１号を参照のこと。
【０１７０】
フコシル化が低下した抗体を産生可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化で欠失したＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号特に実施例１１）、及び、ノックアウト細胞株、例えばα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えばＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４−６２２（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照のこと）、又は、ＧＤＰ−フコース合成若しくはトランスポータータンパク質の活性が低下した、又は消滅した細胞（例えば、米国特許出願公開第２００４２５９１５０号、同第２００５０３１６１３号、同第２００４１３２１４０号、同第２００４１１０２８２号を参照のこと）が挙げられる。
【０１７１】
更なる態様において、抗体バリアントは、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分枝オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されているバイセクトオリゴ糖と共に提供される。そのような抗体バリアントは、上述のとおり、低下したフコシル化、及び／又は改善されたＡＤＣＣを有することができる。そのような抗体バリアントの例は、例えば、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７，１７６−１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９３，８５１−８６１（２００６）；国際公開第９９／５４３４２号；同第２００４／０６５５４０号、同第２００３／０１１８７８号に記載されている。
【０１７２】
Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内の少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントもまた提供する。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有することができる。そのような抗体バリアントは、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号、同第１９９８／５８９６４号、及び同第１９９９／２２７６４号に記載されている。
【０１７３】
５．５．６．３  Ｆｃ領域バリアント
特定の態様では、１つ以上のアミノ酸改変は、本明細書で提示される抗体のＦｃ領域に導入されてもよく、それにより、Ｆｃ領域バリアントを作成する。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含んでよい。
【０１７４】
特定の態様において、本開示は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を有することで、抗体のインビボ半減期が重要でありながら、特定のエフェクター機能（例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ））が不必要、又は有害である用途に対して望ましい候補となる、抗体バリアントを想到する。インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低減／欠乏を確認してもよい。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（故にＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にし得る。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介するための初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩを発現し、造血細胞内でのＦｃγＲＩＩＩ  ＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁、表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するインビトロアッセイの非限定例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用ＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照のこと）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、又は更に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているように、動物モデルにおいてインビボで評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができないためにＣＤＣ活性を欠くことを確認することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び同第２００５／１００４０２号に記載されているＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期測定もまた、当該技術分野において既知の方法を使用して実施することができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９Ａ１号を参照のこと）。
【０１７５】
エフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ以上の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうち２つ以上での置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０１７６】
ＦｃＲへの結合が向上又は低下した特定の抗体バリアントについて記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号，及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照のこと。）
【０１７７】
特定の態様において、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／又は３３４位（ＥＵ付番の残基）での置換を有するＦｃ領域を含む。
【０１７８】
特定の態様において、抗体バリアントは、ＦｃγＲ結合を減少さあせる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２３４及び２３５（ＥＵ付番の残基）を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。特定の態様において、抗体バリアントは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域に、Ｄ２６５Ａ及び／又はＰ３２９Ｇを更に含む。一態様において、置換は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域における、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ−ＰＧ）である。（例えば、国際公開第２０１２／１３０８３１号を参照のこと。）別の態様において、置換は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域における、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ａ（ＬＡＬＡ−ＤＡ）である。
【０１７９】
いくつかの態様において、例えば米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されているように、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の変化（即ち、向上若しくは低下のいずれか）をもたらすＦｃ領域内で変化が起こる。
【０１８０】
半減期が増大し、胎生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が向上した、母体ＩｇＧを胎児に移行する役割を果たす抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を向上する１つ以上の置換基を有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃバリアントとしては、Ｆｃ領域残基：２３８、２５２、２５４、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、又は４３４の１つ以上において置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものが挙げられる（例えば、米国特許第７，３７１，８２６号；Ｄａｌｌ’  Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（２００６）２３５１４−２３５２４を参照のこと）。
【０１８１】
マウスＦｃマウスＦｃＲｎ相互作用に決定的なＦｃ領域残基は、部位特異的突然変異誘発により識別されている（例えば、Ｄａｌｌ’  Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９（２００２）５１７１−５１８０を参照のこと）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｎ４３４、及びＨ４３５（ＥＵインデックス付番）が、相互作用に関与する（Ｍｅｄｅｓａｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１９９６）２５３３；Ｆｉｒａｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１）９９３；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）５４２）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、及びＨ４３５が、ヒトＦｃとマウスＦｃＲｎの相互作用に決定的であることが発見された（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２８１９）。ヒトＦｃ−ヒトＦｃＲｎ複合体の研究により、残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５、及びＹ４３６が相互作用に決定的であることが示されている（Ｆｉｒａｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１）９９３；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１−６６０４）。Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２（２００９）７６６７−７６７１）において、残基２４８〜２５９、及び３０１〜３１７、及び３７６〜３８２、及び４２４〜４３７の様々な変異が報告され、調査されている。
【０１８２】
ＦｃＲｎ結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃの領域位置２５３、及び／又は３１０、及び／又は４３５（ＥＵ付番の残基）における変異を有するＦｃ領域を含む。特定の態様において、抗体バリアントは、位置２５３、３１０、及び４３５におけるアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様において、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域における、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａである。例えば、Ｇｒｅｖｙｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９４（２０１５）５４９７−５５０８を参照のこと。
【０１８３】
ＦｃＲｎ結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置３１０、及び／又は４３３、及び／又は４３６（ＥＵ付番の残基）における変異を有するＦｃ領域を含む。特定の態様において、抗体バリアントは、位置３１０、４３３、及び４３６におけるアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様において、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域における、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａである。（例えば、国際公開第２０１４／１７７４６０Ａ１号を参照のこと。）
【０１８４】
ＦｃＲｎ結合を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃの領域位置２５２、及び／又は２５４、及び／又は２５６（ＥＵ付番の残基）における変異を有するＦｃ領域を含む。特定の態様において、抗体バリアントは、位置２５２、２５４、及び２５６におけるアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様において、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域におけるＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅである。Ｆｃ領域バリアントのその他の例に関係するＤｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）米国特許第５，６４８，２６０号；同第５，６２４，８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０１８５】
本明細書に報告されるような抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であってもよい。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基のうち１つ又は２つが除去された、短くなったＣ末端であってもよい。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終わる短くなったＣ末端である。本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、Ｃ末端グリシン−リシンジペプチドを含む（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＥＵインデックス付番のアミノ酸位置）。本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、Ｃ末端グリシン残基を含む（Ｇ４４６、ＥＵインデックス付番のアミノ酸位置）。
【０１８６】
５．５．６．４  システイン改変抗体バリアント
特定の態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換された、システイン改変抗体、例えばＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を作製するのが望ましい場合がある。特定の態様において、置換された残基は、抗体の利用しやすい部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体の接触可能部位に配置され、抗体を他の部位、例えば薬物部位、又はリンカー／薬物部位と結合させ、本明細書で更に記載する免疫抱合体を作製するのに用いることができる。システイン改変抗体は、例えば米国特許第７，５２１，５４１号、同第８，３０，９３０号、同第７，８５５，２７５号、同第９，０００，１３０号、又は国際公開２０１６０４０８５６号に記載されているとおりに作製することができる。
【０１８７】
５．５．６．５  抗体誘導体
特定の態様において、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に好適な部分としては、限定するものではないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは任意の分子量であることができ、かつ分枝又は非分枝であることができる。抗体に結合したポリマーの数は異なってもよく、２つ以上のポリマーが結合している場合、それらは同じ分子であっても、異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下である療法に使用されるかなどを含むが、これらに限定されない、考慮すべき事項に基づいて決定され得る。
【０１８８】
５．５．７  免疫抱合体
本開示はまた、１つ以上の治療薬、例えば細胞毒性剤、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、微生物、菌類、植物若しくは動物由来の酵素活性毒素、又はこれらの断片）、又は放射性同位元素にコンジュゲートした（化学結合した）、本明細書にて開示した抗体を含む免疫免疫抱合体を提供する。
【０１８９】
一態様において、免疫抱合体は、抗体が、前述の治療薬の１つ以上に抱合した、抗体薬物抱合体（ＡＤＣ）である。抗体は典型的には、リンカーを使用して、治療薬の１つ以上に接続される。治療薬及び薬剤及びリンカーの例を含む、ＡＤＣ技術の概観は、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ６８：３−１９（２０１６）に記載されている。
【０１９０】
別の態様において、免疫抱合体は、本明細書に記載されるように、酵素活性毒素又はこれらの断片に結合する抗体を含む。これらは以下に限定されるわけではないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌からのもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリのタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウのタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、並びにトリコテセンを含む。
【０１９１】
別の態様において、免疫抱合体は、放射性原子にコンジュゲートされ、放射性抱合体を形成する、本明細書に記載される抗体を含む。放射性抱合体の作製のために、種々の放射性同位元素が利用可能である。例としてはＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位元素が挙げられる。放射性抱合体を検出のために使用する場合、それは、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍ若しくはＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（別名、磁気共鳴画像法、ＭＲＩ）のためのスピン標識、例えば、再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、若しくは鉄を含むことができる。
【０１９２】
抗体及び細胞傷害性剤の抱合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素−１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合体化のための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞内において細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であることができる。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
【０１９３】
本明細書の免疫抱合体又はＡＤＣは、市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（サクシニミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸塩）（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａ製）を含むが、これらに限定されない架橋剤試薬で調製されるそのような抱合体を明示的に企図するが、これらに限定されない。
【０１９４】
５．６  例示的な実施形態
Ａ．  特定の非限定的な実施形態において、本明細書にて開示する主題は、ピルビン酸キナーゼ筋（ＰＫＭ）ポリペプチドアイソフォームの発現がノックダウン又はノックアウトされ、ＰＫＭポリペプチドアイソフォームがＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォームを含む、ラクトジェニック活性が低下した、又は除去された哺乳動物細胞を提供する。
【０１９５】
Ａ１．  ＰＫＭ−２ポリペプチドアイソフォームの発現がノックダウン又はノックアウトされた、Ａに記載の前述の哺乳動物細胞。
【０１９６】
Ａ２．  細胞がＣＨＯ細胞である、Ａ又はＡ１に記載の前述の哺乳動物細胞。
【０１９７】
Ａ３．  目的の生成物をコードする核酸配列を含む、Ａ〜Ａ２のいずれか１つに記載の前述の哺乳動物細胞。
【０１９８】
Ａ４．  目的の生成物がタンパク質を含む、Ａ３に記載の前述の哺乳動物細胞。
【０１９９】
Ａ５．  目的の生成物が組み換えタンパク質を含む、Ａ３又はＡ４に記載の前述の哺乳動物細胞。
【０２００】
Ａ６．  目的の生成物が抗体又はその抗原結合断片を含む、Ａ３〜Ａ５のいずれか１つに記載の前述の哺乳動物細胞。
【０２０１】
Ａ７．  抗体が多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、Ａ６に記載の前述の哺乳動物細胞。
【０２０２】
Ａ８．  抗体が、単一の重鎖配列、及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、Ａ６に記載の前述の哺乳動物細胞。
【０２０３】
Ａ９．  抗体がキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含む、Ａ６〜Ａ８のいずれか１つに記載の前述の哺乳動物細胞。
【０２０４】
Ａ１０．  抗体がモノクローナル抗体を含む、Ａ６〜Ａ９のいずれか１つに記載の前述の哺乳動物細胞。
【０２０５】
Ａ１１．  核酸配列が、標的化された位置にて、哺乳動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれている、Ａ３〜Ａ１０のいずれか１つに記載の前述の哺乳動物細胞。
【０２０６】
Ａ１２．  哺乳動物細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれた目的の生成物をコードする核酸を更に含む、Ａ１１に記載の前述の哺乳動物細胞。
【０２０７】
Ａ１３．  哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性の約５０％未満である、Ａ〜Ａ１２のいずれか１つに記載の前述の哺乳動物細胞。
【０２０８】
Ａ１４．  哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性の約２０％未満である、Ａ１３に記載の前述の哺乳動物細胞。
【０２０９】
Ａ１５．  参照細胞が、ＰＫＭ遺伝子の野生型対立遺伝子を含む細胞である、Ａ１３又はＡ１４に記載の前述の哺乳動物細胞。
【０２１０】
Ａ１６．  哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、産生期の１４日目又は１５日目に測定される、Ａ〜Ａ１５のいずれか１つに記載の前述の哺乳動物細胞。
【０２１１】
Ａ１７．  哺乳動物細胞が、産生期の間に約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを生成する、Ａ〜Ａ１６のいずれか１つに記載の前述の哺乳動物細胞。
【０２１２】
Ａ１８．  哺乳動物細胞が、産生期の間に、振盪フラスコ内で約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを生成する、Ａ〜Ａ１６のいずれか１つに記載の前述の哺乳動物細胞。
【０２１３】
Ａ１９．  哺乳動物細胞が、産生期の間に、バイオリアクター内で約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを生成する、Ａ〜Ａ１６のいずれか１つに記載の前述の哺乳動物細胞。
【０２１４】
Ｂ．  特定の非限定的な実施形態において、本明細書にて開示する主題は、配列番号３９〜４１からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は、配列番号３７及び３８に記載のヌクレオチド配列を含むＰＫＭ遺伝子の対立遺伝子を含む哺乳動物細胞を提供する。
【０２１５】
Ｃ．  特定の非限定的な実施形態において、本明細書にて開示する主題は、Ａ〜Ａ１９に記載の前述の哺乳動物細胞のいずれかの哺乳動物細胞を含む組成物を提供する。
【０２１６】
Ｄ．  特定の非限定的な実施形態において、本明細書にて開示する主題は、ピルビン酸キナーゼ筋（ＰＫＭ）ポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトすることを含む、細胞におけるラクトジェニック活性を低下させる、又は除去する方法を提供する。
【０２１７】
Ｅ．  特定の非限定的な実施形態において、本明細書にて開示する主題は、細胞におけるラクトジェニック活性を低下させる又は除去する方法であって、当該細胞に遺伝子組み換えシステムを投与することを含み、当該遺伝子組み換えシステムがピルビン酸キナーゼ筋（ＰＫＭ）ポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトする方法を提供する。
【０２１８】
Ｅ１．  遺伝子組み換えシステムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、Ｅに記載の前述の方法。
【０２１９】
Ｅ２．  遺伝子組み換えシステムがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、Ｅ又はＥ１に記載の前述の方法。
【０２２０】
Ｅ３．  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが
（ａ）  Ｃａｓ９分子、及び
（ｂ）  ＰＫＭ遺伝子内の標的配列に対して相補的な標的化配列を含む、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含む、Ｅ２に記載の前述の方法。
【０２２１】
Ｅ４．  標的配列が、ＰＫＭ遺伝子の一部、エクソン１内の領域、エクソン２に隣接する５’領域、エクソン２内の領域、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する５’イントロン領域、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する３’イントロン領域、ＰＫＭ遺伝子のエクソン１０に隣接する３’イントロン領域、ＰＫＭ遺伝子のエクソン１内の領域、ＰＫＭ遺伝子のエクソン１２内の領域、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、Ｅ３に記載の前述の方法。
【０２２２】
Ｅ５．  １つ以上のｇＲＮＡが、配列番号３３〜３４、及び４２〜４３からなる群から選択される配列、並びにこれらの組み合わせを含む、Ｅ３〜Ｅ４のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２２３】
Ｅ６．  １つ以上のｇＲＮＡが、（１）ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する５’イントロン領域に対して相補的な標的配列を含む第１のｇＲＮＡ；及び（２）ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する３’イントロン領域に対して相補的な標的ドメインを含む第２のｇＲＮＡを含む、Ｅ３又はＥ４に記載の前述の方法。
【０２２４】
Ｅ７．  １つ以上のｇＲＮＡが、配列番号３３〜３４からなる群から選択される配列、及びこれらの組み合わせを含む、Ｅ３〜Ｅ６のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２２５】
Ｅ８．  １つ以上のｇＲＮＡが、（１）ＰＫＭ遺伝子のエクソン２内の領域に対して相補的な標的配列を含む第１のｇＲＮＡ；及び（２）ＰＫＭ遺伝子のエクソン１２内の領域に対して相補的な標的ドメインを含む第２のｇＲＮＡを含む、Ｅ３又はＥ４に記載の前述の方法。
【０２２６】
Ｅ９．  １つ以上のｇＲＮＡが、配列番号４２〜４３からなる群から選択される配列、及びこれらの組み合わせを含む、Ｅ３〜Ｅ５、及びＥ８のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２２７】
Ｅ１０．  ＰＫＭポリペプチドアイソフォームの発現がノックアウトされ、細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性と比較して除去されている、又は低下している、Ｄ及びＥ〜Ｅ９のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２２８】
Ｅ１１．  ＰＫＭポリペプチドアイソフォームの発現がノックダウンされ、細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性と比較して低下している、Ｄ及びＥ〜Ｅ９のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２２９】
Ｅ１２．  細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性の約５０％未満である、Ｅ１０又はＥ１１に記載の前述の方法。
【０２３０】
Ｅ１３．  細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性の約２０％未満である、Ｅ１０又はＥ１１に記載の前述の方法。
【０２３１】
Ｅ１４．  細胞のラクトジェニック活性が、産生期の１４日目又は１５日目に測定される、Ｄ及びＥ〜Ｅ１３のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２３２】
Ｅ１５．  細胞が、産生期の間に約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを生成する、Ｄ及びＥ〜Ｅ１４のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２３３】
Ｅ１６．  細胞が、産生期の間に振盪フラスコ内で約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを生成する、Ｄ及びＥ〜Ｅ１４のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２３４】
Ｅ１７．  細胞が、産生期の間にバイオリアクター内で約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを生成する、Ｄ及びＥ〜Ｅ１４のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２３５】
Ｅ１８．  参照細胞が、ＰＫＭ遺伝子の野生型対立遺伝子を含む細胞である、Ｅ１１〜Ｅ１７のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２３６】
Ｅ１９．  ＰＫＭポリペプチドアイソフォームがＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォームである、Ｄ及びＥ〜Ｅ１８のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２３７】
Ｅ２０．  ＰＫＭポリペプチドアイソフォームが、ＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォーム及びＰＫＭ−２ポリペプチドアイソフォームである、Ｄ及びＥ〜Ｅ１９のいずれか１つに記載の方法。
【０２３８】
Ｅ２１．  遺伝子組み換えシステムが、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡを含み、ＲＮＡは、ＰＫＭ遺伝子により発現するｍＲＮＡの一部に対して相補的である、Ｅに記載の前述の方法。
【０２３９】
Ｅ２２．  ＰＫＭ遺伝子により発現するｍＲＮＡがＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォームをコードする、Ｅ２１に記載の前述の方法。
【０２４０】
Ｅ２３．  ＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォームの発現がノックアウト又はノックダウンされ、細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性と比較して低下している、Ｅ２２に記載の前述の方法。
【０２４１】
Ｅ２４．  遺伝子組み換えシステムが、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡ  ｍｉＲＮＡからなる群から選択される第２のＲＮＡを更に含み、第２のＲＮＡは、ＰＫＭ−２ポリペプチドアイソフォームをコードするＰＫＭ遺伝子により発現するｍＲＮＡの一部に対して相補的である、Ｅ２１〜Ｅ２３のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２４２】
Ｅ２５．  ＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２ポリペプチドアイソフォームの発現がノックアウト又はノックダウンされ、細胞のラクトジェニック活性が低下した、Ｅ２４に記載の前述の方法。
【０２４３】
Ｅ２６．  遺伝子組み換えシステムが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムである、Ｅに記載の前述の方法。
【０２４４】
Ｅ２７．  細胞が哺乳動物細胞である、Ｄ及びＥ〜Ｅ２６に記載の前述の方法。
【０２４５】
Ｅ２８．  哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、Ｅ２７に記載の前述の方法。
【０２４６】
Ｅ２９．  細胞が目的の生成物を発現する、Ｄ及びＥ〜Ｅ２８に記載の前述の方法。
【０２４７】
Ｅ３０．  細胞により発現した目的の生成物が核酸配列によりコードされる、Ｅ２９に記載の前述の方法。
【０２４８】
Ｅ３１．  核酸配列が、標的化された位置において細胞の細胞ゲノムに組み込まれる、Ｅ３０に記載の前述の方法。
【０２４９】
Ｅ３２．  細胞により発現した目的の生成物が、哺乳動物細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれた核酸配列により更にコードされる、Ｅ２６〜Ｅ３１のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２５０】
Ｅ３３．  目的の生成物がタンパク質を含む、Ｅ２６〜Ｅ３１に記載の前述の方法。
【０２５１】
Ｅ３４．  目的の生成物が組み換えタンパク質を含む、Ｅ３３に記載の前述の方法。
【０２５２】
Ｅ３５．  目的の生成物が抗体又はその抗原結合断片を含む、Ｅ２６〜Ｅ３３のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２５３】
Ｅ３６．  抗体が多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、Ｅ３５に記載の前述の方法。
【０２５４】
Ｅ３７．  抗体が、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、Ｅ３５に記載の前述の方法。
【０２５５】
Ｅ３８．  抗体がキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である、Ｅ３５〜Ｅ３７のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２５６】
Ｅ３９．  抗体がモノクローナル抗体である、Ｅ３５〜Ｅ３８のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２５７】
Ｆ．  特定の非限定的な実施形態において、本明細書にて開示する主題は、目的の生成物の作製方法であって、目的の生成物を発現する哺乳動物細胞を培養することを含み、哺乳動物細胞が目的の生成物を発現し、低下した、又は除去されたラクトジェニック活性を有する、方法を提供する。
【０２５８】
Ｇ．  特定の非限定的な実施形態において、本明細書にて開示する主題は、目的の生成物を発現する哺乳動物細胞の集団の培養方法であって、哺乳動物細胞が、低下した、又は除去されたラクトジェニック活性を有する、方法を提供する。
【０２５９】
Ｇ１．  ラクトジェニック活性の低下又は除去が、哺乳動物細胞におけるピルビン酸キナーゼ筋（ＰＫＭ）ポリペプチドアイソフォームの発現のノックアウト又はノックダウンにより生じる、Ｆ又はＧに記載の前述の方法。
【０２６０】
Ｇ２．  ＰＫＭポリペプチドアイソフォームがＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォームである、Ｇ１に記載の前述の方法。
【０２６１】
Ｇ３．  ＰＫＭポリペプチドアイソフォームが、ＰＫＭ−１ポリペプチドアイソフォーム又はＰＫＭ−２ポリペプチドアイソフォームである、Ｇ１に記載の前述の方法。
【０２６２】
Ｇ４．  哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性の約５０％未満である、Ｆ及びＧ〜Ｇ３のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２６３】
Ｇ５．  哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性の約２０％未満である、Ｆ及びＧ〜Ｇ３のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２６４】
Ｇ６．  哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、産生期の１４日目又は１５日目に測定される、Ｆ及びＧ〜Ｇ５のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２６５】
Ｇ７．  哺乳動物細胞が、産生期の間に約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを生成する、Ｆ及びＧ〜Ｇ６のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２６６】
Ｇ８．  哺乳動物細胞が、産生期の間に浸透フラスコ内で約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを生成する、Ｆ及びＧ〜Ｇ６のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２６７】
Ｇ９．  哺乳動物細胞が、産生期の間にバイオリアクター内で約２．０ｇ／Ｌ未満のラクテートを生成する、Ｆ及びＧ〜Ｇ６のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２６８】
Ｇ１０．  参照細胞が、ＰＫＭ遺伝子の少なくとも１つ又は両方の野生型対立遺伝子を含む細胞である、Ｆ及びＧ〜Ｇ９のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２６９】
Ｇ１１．  哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、Ｆ及びＧ〜１０のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２７０】
Ｇ１２．  哺乳動物細胞により発現した目的の生成物が核酸配列によりコードされる、Ｆ及びＧ〜Ｇ１１のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２７１】
Ｇ１３．  核酸配列が、標的化された位置において哺乳動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれる、Ｇ１２に記載の前述の方法。
【０２７２】
Ｇ１４．  細胞により発現した目的の生成物が、哺乳動物細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれた核酸配列により更にコードされる、Ｆ及びＧ〜Ｇ１３のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２７３】
Ｇ１５．  目的の生成物がタンパク質を含む、Ｆ及びＧ〜Ｇ１４のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２７４】
Ｇ１６．  目的の生成物が組み換えタンパク質を含む、Ｆ及びＧ〜Ｇ１５のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２７５】
Ｇ１７．  目的の生成物が抗体又はその抗原結合断片を含む、Ｆ及びＧ〜Ｇ１６のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２７６】
Ｇ１８．  抗体が多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、Ｇ１７に記載の前述の方法。
【０２７７】
Ｇ１９．  抗体が、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、Ｇ１７に記載の前述の方法。
【０２７８】
Ｇ２０．  抗体がキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である、Ｇ１７〜Ｇ１９のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２７９】
Ｇ２１．  抗体がモノクローナル抗体である、Ｇ１７〜Ｇ２０のいずれか１つに記載の前述の方法。
【０２８０】
Ｇ２２．  目的の生成物を回収することを更に含む、Ｆ及びＧ〜Ｇ２１のいずれか１つに記載の前述の方法。
【実施例】
【０２８１】
以下の実施例は、本明細書にて開示する主題を単に示すものであり、いかなる方法においても、限定とみなされるべきではない。
【０２８２】
実施例１：ＰＫＭ−１発現は、ＣＨＯ細胞株におけるラクトジェニック挙動を駆動し、低い生存能及び産生能を引き起こす
細胞株開発（ＣＬＤ）のプロセスにおいて、異なる抗体分子を発現する、２つのラクトジェニック細胞株を同定した。これらの細胞株のラクトジェニック挙動は、細胞株に応じて、栄養素の供給又は培養ｐＨの最適化を通して、異なるように軽減することができる。解糖経路に関与する様々なタンパク質を分析することにより、ピルビン酸キナーゼ筋−１（ＰＫＭ−１）アイソフォームと、ラクトジェニック挙動との直接相関が明らかになった。
【０２８３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を、エクソン−９の標的欠損のために使用して、ＰＫＭ−１発現をノックアウトした。ＰＫＭ−１発現をノックアウトすることにより、選択した２つの細胞株におけるラクトジェニック挙動が完全に消失し、軽減方法の必要性を無くした。１つの細胞株を同定すると、ＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２遺伝子の両方の発現が、成長及び生存能へのいかなる悪影響も伴わず、完全に消滅した。親及びＣＨＯ細胞株を更に分析することにより、これらは全て、ＰＫＬ及びＰＫＲ版のピルビン酸キナーゼを発現して、これにより、理論に束縛されるものではないが、ＰＫＭ発現の完全な欠如に対して細胞が耐性を有することができるようになることが明らかとなった。これらの細胞株のラクトジェニック挙動を制御するために使用した、独自の軽減方法により、代謝経路を移動させ、ＰＫＭ−１転写及び発現のパターンを変更して、ラクトジェニック挙動を防止した、又は遅延させた。培養液中、及びバイオリアクター内で、得られた細胞株の挙動を分析するために、ＰＫＭ遺伝子を完全にノックアウトする。
【０２８４】
まとめると、本開示は、産生培養液中での、ラクトジェニック挙動と多くのＰＫＭ−１量との直接相関を描写する。更に、ＰＫＭ−１発現を除去することにより、選択したＣＨＯ細胞株におけるラクトジェニック挙動が許容され、逆転した。したがって、ＣＨＯ細胞における、この問題に関するＰＫＭ−１、又は全ＰＫＭ遺伝子の永続的な欠損は、バイオリアクター内での産生中にラクトジェニック挙動が生じることを低減するのに、有益であることができる。
【０２８５】
材料及び方法
細胞株
組み換えモノクローナル抗体ｍＡｂ−１又はｍＡｂ−２を分泌する細胞株を、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）選択マーカーを利用して、ＣＨＯ−Ｋ１宿主から抽出した。シードトレインを、選択剤としてメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を含有する、専売のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地に、浸透速度：１５０ｒｐｍ、３７℃、及び５％  ＣＯ２にて維持した。細胞を、３又は４日毎に継代した。
【０２８６】
２Ｌバイオリアクターの製造
Ｆｉｎｅｓｓｅコントローラ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）付きのガラス撹拌タンクバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）にて、２Ｌバイオリアクターの製造を実施した。全ての産生培地では、バイオリアクター内で３日間、１回の播種トレイン段階（Ｎ−１）を利用し、その後、１４日続く産生段階（Ｎ）を播種した。Ｎ−１播種培地を、０．１７％の目標のパック細胞体積（ＰＣＶ）に対して、１．５〜１．７Ｌの操作体積で播種した。これらを３７℃、７．０のｐＨ設定値、３０％の溶存酸素（ＤＯ）設定値、及び２７５ｒｐｍでの撹拌で操作した。３日後、細胞を移して、０．２５％の目標ＰＣＶにて１．４〜１．７Ｌの体積で、産生（Ｎ）バイオリアクターに播種した。全てのバイオリアクターを３７℃で、７２時間で３５℃への温度移動をさせて操作した。酸対照としてＣＯ２、及び塩基対照として１Ｍ炭酸ナトリウムを使用して、０．０３のデッドバンド、ｐＨ７．００にて、培養液を操作した。このｐＨ操作の唯一の例外は、０．０３の同じデッドバンド、６．８０の一定のｐＨにて操作した、ｍＡｂ−２のｐＨレベルであった。空気と酸素ガス流の組み合わせを利用してＤＯを一定に維持し、全ての培養液を３５０ｒｐｍ及び３０％のＤＯにて操作するように設定した。ｍＡｂ−１の対照プロセス培養に関しては、供給は産生の３日目（７２時間）にて生じ、その時点の、培養液の全体積は２０％であった。向上した供給プロセスに関しては、各供給に対して、培養液の全体積の１５％にて、供給は３日目（７２時間）及び６日目（１４４時間）にて生じた。
【０２８７】
ＡＭＢＲ１５操作
ＡＭＢＲ１５（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）システム内での産生培養液を、３７℃の温度、３０％のＤＯ、ｐＨ７．０、及び１４００ｒｐｍの撹拌速度の設定値にて操作した。Ｎ−１播種トレインを４日間実施し、次に、産生（Ｎ）段階を、３７℃の温度、３０％のＤＯ、ｐＨ７．０、及び１４００ｒｐｍの撹拌速度で、１３ｍＬの全体積、１００万細胞／ｍＬにて播種した。これらの培養液に関して、２Ｌバイオリアクターのスケールダウンプロセスを実施した。
【０２８８】
オフラインでのサンプル分析
上清及び細胞ペレットサンプルを、アッセイ又はウェスタンブロッティング分析に通すために収集した。生残細胞濃度（ＶＣＣ）及び生存能に関して、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、及び、ｐＯ２、ｐＨ、ｐＣＯ２、Ｎａ＋、グルコース、及びラクテートに関して、Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ  ４００（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用して、サンプルを分析した。２Ｌ及びＡＭＢＲバイオリアクターの全てのサンプルを、サンプリングにより気体発生を最小限に抑えた後、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ  ４００で数分間分析した。同じＶｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲ，ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ  ４００及び浸透圧計（Ｍｏｄｅｌ  ２０２０，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を全てのサンプルに使用し、機器間での変動性を取り除いた。プロテインＡカラムを備える高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、抗体力価を測定した。ＰｈｙＴｉｐ（ＰｈｙＮｅｘｕｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）プロテインＡカラムにより精製した、細胞培養上清サンプルを使用して、抗体産生物の品質アッセイを実施した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、抗体分子サイズ分布を分析した。画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）を使用して、タンパク質電荷の不均質性を測定し、全ての電荷不均質サンプルを、カルボキシペプチダーゼＢで前処理した。全てのタンパク質生成物の品質アッセイをインハウスで開発し、詳細の手順を公開した（Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２５（５）：１４２７−３２）。
【０２８９】
免疫ブロッティング
細胞ペレットを細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．５％  ＮＰ４０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、プロテアーゼ阻害剤含有）に溶解させ、氷上で２０分間インキュベートした。次に、サンプルを１３，０００ｒｐｍにて１０分間遠心沈殿させ、２８０ｎｍにおける吸光度を用いるＮａｎｏｄｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ  ＤＥ）を使用して、上清を新しい管に移し、タンパク質濃度を測定した。１５μＬの溶解物を、５μＬの４ｘランニング緩衝液（４００μＬの２ｘ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎローディングバッファー＋４００μＬの５０％グリセロール＋２００μＬの２０％  ＳＤＳ＋１００μＬのβ−メルカプトエタノール）と組み合わせ、９０℃にて５分間加熱した。次に、等量のタンパク質を１２ウェルの４〜２０％  Ｔｒｉｓ−グリシンゲルにロードし、ＳＤＳランニング緩衝液を使用して、１５０Ｖにて１．５時間動かした。その後、タンパク質を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ製ｉＢｌｏｔ２を使用して、ニトロセルロース膜に移した。１ｘＴＢＳＴ緩衝液で洗浄した後、５％の乳溶液にてブロットを最低１時間ブロックし、その後、一次抗体で一晩インキュベートした。次にブロットを洗浄し、最低１時間、二次抗体内でインキュベートし、再びＴＢＳＴ緩衝液で洗浄した。ＥＣＬ試薬を使用し、続けてＢｉｏ−Ｒａｄイメージング機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、ブロットをイメージングした。
【０２９０】
ＰＫＭ−１ノックアウト
ＰＫＭ−１をノックアウトするために、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９に隣接する、５’及び３’イントロン領域の両方を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ製のｇＲＮＡ発現ベクターにクローニングした。この構築物を、Ｃａｓ９発現プラスミドと共に、ｍＡｂ−２発現細胞に同時にトランスフェクションした。トランスフェクト細胞は、クローニングした単一細胞であり、エクソン９の欠損はゲノムＤＮＡ  ＰＣＲにより確認した。以下のｇＲＮＡオリゴが、エクソン−９（ＰＫＭ−１）の欠損には最も有効であり、これらのオリゴにより標的化したプールを使用して、ＰＫＭ−１ノックアウトｍＡｂ−２細胞株を単離した：
５’ｇＲＮＡ：ＧＴＣＣＴＴＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号３３）
３’ｇＲＮＡ：ＧＡＣＣＡＧＡＧＴＡＣＴＣＣＣＴＣＧＴ（配列番号３４）
ゲノムＤＮＡ  ＰＣＲプライマーの配列：
５’−プライマー：ＣＣＡＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＴ（配列番号３５）
３’−プライマー：ＡＧＣＴＧＴＧＴＴＧＴＧＡＧＧＣＡＴＴＧ（配列番号３６）
【０２９１】
結果
産生中のＰＫＭ−１量の増加は、ＣＨＯ細胞のラクトジェニック挙動と相関する
ｍＡｂ−１を発現する細胞株の、培養シードトレインを使用して、標準的又は増強した供給法を用い、バイオリアクター内に産生培養液を準備した。標準的な供給により、ｍＡｂ−１細胞株でラクトジェニック挙動が引き起こされた一方で、増強した供給法では、ラクトジェニック挙動が軽減された。高ラクテート条件では、産生培養液中で１０日後に細胞生存能の低下が引き起こされ（図１Ａ）、低ラクテート条件と比較して、１４日目の力価が低下した（図１Ｂ）。両方の培養条件が、７日目まで相当量のラクテートを有するものの、高ラクテート条件は、産生培養液中にて、７日目からラクテートの蓄積が著しく増加することを示し、１４日目には上方の１５ｇ／Ｌに到達した。低ラクテート条件に関しては、ラクテートの量が高くなる傾向が出る（１２日目〜１４日目）前に、３〜４日の遅延が見られ、１４日目までに、８ｇ／Ｌに到達するのみであった（図１Ｃ）。
【０２９２】
観察されたラクトジェニック挙動と相関し得る酵素を同定するために、細胞増殖シグナル伝達及び解糖通路に関与する様々なタンパク質に、ウェスタンブロット分析を実施した。高ラクテート条件においては、細胞生存能が１０日後に急激に低下したため、このセットの、０、２、７、及び１０日目のサンプルを、低ラクテート条件の０、７、１０、及び１４日目のサンプルと比較した（図１Ｄ〜１Ｆ）。分析した全ての異なるタンパク質の中で（データは図示せず）、ＰＫＭ−１量のみが、ｍＡｂ−１発現細胞株のラクトジェニック挙動との直接相関を示した。図１Ｄ〜１Ｆは、細胞ペレットにおけるＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２タンパク質の量を示した。高ラクテートサンプルにおけるＰＫＭ−１の発現量は、低ラクテートサンプルと比較して、産生培養中にて、７日後に発散的に増加し始めた。興味深いことに、低ラクテート条件下においても、産生培養の終わりに向かってのＰＫＭ−１量の増加（図１Ｅ、１０日目〜１４日目）は、培養中の高ラクテート量と共に傾向が見られた（図１Ｃ）ため、ＰＫＭ−１量の増加は、ラクテートの蓄積と密接な傾向が見られた。しかし、ＰＫＭ−２の量は、ｍＡｂ−１発現細胞株におけるラクトジェニック挙動とは逆相関した（図１Ｆ）。
【０２９３】
同様のバイオリアクター実験を、ｍＡｂ−２発現細胞株に対して実施した。このような細胞株を、ラクトジェニック又は非ラクトジェニック挙動を促進する条件を有する産生培地にて培養した。産生培養の１３及び１４日目まで、高ラクテート条件と低ラクテート条件との間で、ｍＡｂ−２細胞株の細胞生存能は同等であった（図２Ａ）。これにより、低ラクテート条件に対して、高ラクテート条件では約２５％の力価の低下がもたらされた（図２Ｂ）。産生プロセスを通して、培地でのラクテートの蓄積は、ｍＡｂ−２細胞株実験の低ラクテート対照群で低かった。しかし、高ラクテート条件下において、ラクテートの量は７日目から発散し始め、産生培養の１４日目までに、上方の１５ｇ／Ｌに到達した（図２Ｃ）。ウェスタンブロット分析により、ＰＫＭ−１タンパク質の量は、産生のおよそ７日目に、低ラクテートサンプルと比較して、高ラクテートサンプルにて増加し始め、産生培養の終わりまで線形増加したことが明らかとなった（図２Ｄ及び２Ｅ）。ＰＫＭ−１量のこの増加は、蓄積したラクテートの増加と密接に相関した（図２Ｃ及び２Ｅ）。ｍＡｂ−１と同様に、低ラクテートｍＡｂ−２サンプルにおけるＰＫＭ−２の全体の量は、図２Ｄ（下面）及び図２Ｆに示すように、高ラクテートサンプルの量よりも多かった。これらを合わせると、これらのデータは、これらの細胞にて、ｍＡｂ−１及びｍＡｂ−２を発現する細胞におけるラクトジェニック挙動と、ＰＫＭ−１量との直接相関を示唆している。
【０２９４】
ＰＫＬ／Ｒタンパク質は、ＣＨＯ細胞にて発現するが、ラクトジェニック挙動とは相関しない。
ＰＫの他の形態（ＰＫＭ以外）が、専売のＣＨＯ宿主細胞にて発現しているか否かを評価するために、２つの異なるＣＨＯ宿主細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１及びＤＨＦＲ−／−）、並びにヒト（ＨＥＫ２９３）細胞株の、ＰＫＬ及びＰＫＲ（ＰＫＬ／Ｒ）タンパク質の発現を分析した。両方のＣＨＯ細胞株、及び対照のＨＥＫ２９３細胞株は、ＰＫＬ／Ｒ酵素の発現を示し（図３Ａ）、ＰＫ遺伝子の全てのアイソフォーム（ＰＫＭ−１、ＰＫＭ−２、及びＰＫＬ／Ｒを含む）が、選択したＣＨＯ宿主にて発現することを示している。ｍＡｂ−１及び／又はｍＡｂ−２発現細胞における、高／低ラクテート条件を比較する際に、ＰＫＬ／Ｒの発現が異なって制御されたか否かを、次に評価した。ＰＫＬ／Ｒの発現量は、ｍＡｂ−１及びｍＡｂ−２細胞株の両方において、高／低ラクテート条件にて同等であり（タンパク質の量を、内部対照としてのアクチンに対して正規化すると）、このことは、これらの細胞株において、ラクトジェニック挙動との相関がないことを示している（図３Ｂ〜３Ｄ）。図３Ｃにおける、７及び１０日目における、ｍＡｂ−２高ラクテートサンプルにおける少量のＰＫＬ／Ｒは、同じレーンでの低量のアクチン（ローディング対照として）により反映された、全体のタンパク質ローディングが低いことが原因であった。ＰＫアイソフォームの他に、細胞増殖シグナル伝達及び解糖経路に関与するいくつかの異なるタンパク質の発現もまた、分析した。しかし、タンパク質の発現と、ｍＡｂ−１又はｍＡｂ−２発現細胞株にて観察されたラクトジェニック挙動との間に、明確な相関はないことが観察された（データは図示せず）。異なるＰＫアイソフォームが、選択したＣＨＯ宿主細胞にて発現したという事実は、これらの細胞株が、ＰＫの１つ以上のアイソフォームの標的欠損を許容することができる場合がある、ということを示唆した。産生期中に観察された、ｍＡｂ−１及びｍＡｂ−２細胞株のラクトジェニック挙動と、ＰＫＭ−１量との直接相関により、この酵素は、標的欠損の良好な候補となった。
【０２９５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が媒介する、ＰＫＭ遺伝子におけるエクソン−９の標的欠損
ＰＫＭ遺伝子は、ＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２酵素の両方の発現を担い、これらは、それぞれエクソン９又はエクソン１０を代替的に含むことだけが異なる。選択したＣＨＯ細胞株は、配列決定されていない、又は注釈を付けられていないため、ＰＫＭ対立遺伝子型、遺伝子コピー数、又は配列に関する情報を入手することはできなかった。それ故、ＰＫＭ−１遺伝子の発現をなくすため、公開されているデータベースにて利用可能なＣＨＯ配列を使用して、エクソン９に隣接するイントロン領域を標的化するガイドＲＮＡ構築物を設計した（Ｋｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２（６）：９９６−１００６）。５’スクリーニングＰＣＲプライマーを、エクソン８と９の間のイントロン領域に一致するように設計し、３’スクリーニングＰＣＲプライマーを、一致したエクソン１０に対して設計した（図４Ａ）。選択したＣＨＯ宿主のｍＲＮＡ由来のＰＫＭ  ｃＤＮＡの増幅及び配列決定に基づき、エクソンの配列情報を入手した。ｍＡｂ−２発現細胞株にＣａｓ９、及び様々なｇＲＮＡ構築物をトランスフェクションした。最初のスクリーニングの後、最も効率的なエクソン９の標的化を示すプールを、単一細胞クローニングに通した。このプールの２０個の細胞株を、エクソン−９の標的欠損のためにスクリーニングし、２つのヘテロ接合（ＨＥＴ−３及びＨＥＴ−１８）、並びに２つのノックアウト（ＫＯ−２及びＫＯ−１５）細胞株を、標的化した対立遺伝子の欠損が、ＰＣＲ及び配列決定により完全に確認されたものについて同定した（図４Ｂ及び４Ｃ）。これらの細胞株の培養液を次に、バイオリアクターでの更なる評価のために拡大した。標的化した対立遺伝子の配列決定により、選択した全ての細胞株における、エクソン９の欠損が確認された（図４Ｃ）。３つの細胞株（ＫＯ−２、ＨＥＴ−３、及びＨＥＴ−１８）は、５’及び３’ｇＲＮＡ標的化部位にて、正確なエクソン９の欠損を有した（図４Ｃ）。ＫＯ−１５細胞株に関しては、標的化対立遺伝子のＰＣＲサイズは、他の細胞株で観察されたものより小さかった（図４Ｂ）。配列決定分析により、５’ｇＲＮＡの上流の１２２塩基対（ｂｐ）が、ＫＯ−１５細胞株にて欠損し、部分的に、無関係の挿入で置換されたが確認された（図４Ｃ、及びデータは図示せず）。この領域における欠損は、エクソン８と９の間のイントロンの一体性に影響を及ぼし得る。これに関係なく、配列決定分析によると、エクソン９は選択した全ての細胞株にて完全に欠損していた。
【０２９６】
ＰＫＭ−１発現をブロックする、又は低下させることにより、それぞれ、ｍＡｂ−２細胞株におけるラクトジェニック挙動が回避された、又は低下した。
いくつかの（ＨＥＴ）、又は全ての（ＫＯ）対立遺伝子、及びＷＴ  ｍＡｂ−２株における、エクソン−９の欠損を有する４つのｍＡｂ−２細胞株を全て源にし、ＡＭＢＲバイオリアクターにおける、１４日間の産生培養をセットアップした。ＰＫＭ−１  ＫＯ、ＨＥＴ及びＷＴ細胞株の増殖及び生存能を、図５Ａ及び５Ｂに示す。ＰＫＭ−１  ＨＥＴ又はｍＡｂ−２株は、ＷＴ  ｍＡｂ−２細胞株の力価及び特異的産生能と、比較的同じ力価及び特異的産生能を有した（図５Ｃ及び５Ｄ）。ＰＫＭ−１  ＫＯ（ＫＯ−２及びＫＯ−１５）、並びに、ＨＥＴ  ｍＡｂ−２細胞株の１つ（ＨＥＴ−３）は、対照（ラクトジェニック）条件にて培養した際に、ＷＴ  ｍＡｂ−２細胞株（図５Ｅ）と比較して、非常に少ないラクテート量を有した。一方で、ＨＥＴ−１８株は、１０日目まで、ＷＴ  ｍＡｂ−２と比較して、同様のラクトジェニック挙動を示した。１０日後、ＷＴ  ｍＡｂ−２株におけるラクテートの蓄積速度は増加し、１４日目までに、ＨＥＴ−１８株と比較しておよそ２倍になった（図５Ｅ）。
【０２９７】
これらの細胞株をウェスタンブロット分析することにより、ＫＯ−２及びＫＯ−１５株は、ＰＫＭ−１の発現を完全に損なっており、ＨＥＴ−３細胞株は、ＨＥＴ−１８細胞株と比較して低いＰＫＭ−１発現を有したことが示された（図５Ｆ）。ＰＫＭ−１  ＨＥＴ及びＫＯ細胞株のラクトジェニック挙動が、いくつかの細胞株においてＰＫＭ−１タンパク質発現と直接相関したという事実は、ラクトジェニック挙動にて観察された変化が、他のクローンの違いによるもののみではないことを示唆した。完全長ＷＴ対立遺伝子に対応するバンドは、ＨＥＴ細胞株のゲノムＤＮＡから増幅されたものである可能性がある（図４Ｂ）ため、これらの観察に関する、可能性のある説明としては、異なるＣＨＯ  ＰＫＭ対立遺伝子由来のＰＫＭ−１の、異なる発現；適切なエクソンスプライシングの破壊をもたらす、１つだけのｇＲＮＡ構築物による、ＷＴ  ＰＫＭ対立遺伝子の標的化；ｇＲＮＡ標的化領域の反転、又は、対立遺伝子の組み換えにより媒介される４均質化が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９８】
ＰＫＭ−２の量は、ＷＴ  ｍＡｂ−２細胞株に関しては少なかった（相対差は、アクチンローディング対照が本サンプルでも低かったという警告と共に考慮した）が、ＨＥＴ−３、ＨＥＴ−１８、及びＫＯ−２細胞株では多かった（図５Ｆ）。興味深いことに、ＫＯ−１５  ｍＡｂ−２細胞株は、ＰＫＭ−１に加えて、ＰＫＭ−２の発現も完全に欠いていた（図５Ｆ）。これは、ＰＫＭ対立遺伝子の５’ｇＲＮＡ標的化領域の上流で観察される、より大きな欠損による可能性が高く、恐らく、エクソン８と９の間におけるイントロン領域の機能性に影響を及ぼしている（図４Ｃ）。このことは、選択したＣＨＯ細胞は、恐らく、ＰＫＬ／Ｒ酵素を発現する能力によって、ＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２酵素の両方の完全な欠落に対して耐性を有し得ることを示唆した（図３Ａ）。
【０２９９】
ＷＴ及びＰＫＭ−１  ＫＯ及びＨＥＴ  ｍＡｂ２発現細胞株の間での、大きい分子量（アグリゲート）及び電荷バリアント種などの、生成物の品質属性を調査した。ＷＴ及びＰＫＭ−１  ＫＯ及びＨＥＴ細胞株の間で、生成物の凝集度に有意差は観察されなかった（図５Ｇ）ものの、いくらかの変化が、ｍＡｂ−２生成物電荷バリアント（図５Ｈ）プロファイルにて観察された。ラクテートの量と、生成物の品質属性との間には、明確な傾向又は相関関係がなかった（図５Ｇ及び５Ｈ）ため、観察された差は、細胞株誘導の間に生じ得る、通常の変化によるものである可能性がある。更に、これらの実験で使用した培地及びフィードを、ＰＫＭ−１  ＫＯ又はＨＥＴ細胞株ではなく、ＷＴ  ｍＡｂ−２細胞株に対して最適化した。ＰＫＭの量を変更することにより、これらの細胞株の代謝プロファイル全体に影響が及ぶ可能性があるため、細部調整をした培地及びフィードが、生成物の品質属性における完全な効果及び影響を調査するために、必要となる可能性がある。
【０３００】
細胞貯蔵及び解凍後の、あらゆる細胞株の挙動を分析することが重要であるため、ＰＫＭ−１  ＫＯ及びＨＥＴ  ｍＡｂ−２細胞株を貯蔵した後解凍し、培地に２．５週間、対照としてのＷＴ細胞株と共に保持した。次に、これらの細胞を源にして、解凍後の性能を評価するために、各細胞株に対して４組の産生培地をセットアップした。ＰＫＭ−１  ＫＯ及びＨＥＴ細胞株の増殖、生存能、力価、特異的産生能、及びラクトジェニックプロファイルは、細胞貯蔵の前後で同等であったことを、データは示した（図５Ａ〜５Ｄ、及び６Ａ〜６Ｄ）。以前に観察されたように（データは図示せず）、新鮮な、解凍されたＷＴ  ｍＡｂ−２細胞は、古い細胞（１５ｇ／Ｌ、図５Ｅ）に対して、ラクトジェニック性が低かった（１０ｇ／Ｌ、図６Ｅ）。しかし、細胞年齢が、ｍＡｂ−２  ＰＫＭ−１  ＫＯ及びＨＥＴ細胞株のラクトジェニック挙動に有意な影響を有しなかった（図５Ｅ及び６Ｅ）ため、この挙動は、ＷＴ  ｍＡｂ−２細胞株に独自のものであった。全ての細胞株に関して、培地にて、産生培養の７日目までにラクテートが少しずつ蓄積したことが観察され、その後、ＰＫＭ−１  ＫＯ及びＨＥＴ−３細胞株がラクテートを消費した一方で、ラクテート消失プロファイルが、ＷＴ及びＨＥＴ−１８細胞株の両方で観察された（図６Ｅ）ことに注意されたい。若い細胞株（解凍後）は全て、年齢の高い細胞株（図５Ｇ）と比較して、比較的低い酸性ピーク率を有し（図６Ｇ）、これは細胞年齢に恐らく関係ある特徴であるものの、ラクトジェニック（ＷＴ又はＰＫＭ−１  ＨＥＴ−１８）及び非ラクトジェニック（ＰＫＭ−１  ＫＯ又はＨＥＴ−３）細胞株との間に、生成物の品質に関する大きな差は存在しなかった（図６Ｆ〜６Ｇ）。
【０３０１】
考察
ＣＨＯ細胞培養液におけるラクトジェニック挙動は、塩基を添加して、培養液のｐＨ、負に影響を及ぼす生存能、ＶＣＣ、及び最終的な産生力価を調節することの結果として、培養液の酸性化、及び高い浸透圧モル濃度を引き起こす可能性がある（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＭＡｂｓ  ２（５）：４６６−７９）。ラクテートの生成は、Ｗａｒｂｕｒｇ効果として一般に知られる挙動である好気的解糖により生じ（Ｗａｒｂｕｒｇ，１９５６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２３（３１９１）：３０９−１４）、多くの培養細胞、及び癌細胞にて観察される。これらの細胞は、解糖プロセスを利用してエネルギーを産生し、様々なエネルギー、及び代謝フラックスに応じて、このプロセスを制御する（Ｍｕｌｕｋｕｔｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９（６）：ｅ９８７５６；Ｍｕｌｕｋｕｔｌａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（９）：４７６−８４；Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０９（１）：１４６−５６；Ａｈｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｏｎｉｅｗｉｃｚ，２０１２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．７（ｌ）：６１−７４）。いくつかのラクトジェニック挙動は、プロセス改変により制御することができる（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０９（１）：１４６−５６；Ｇａｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０８（６）：１３２８−３７）ものの、これらのアプローチは、観察された挙動の根本的原因を明らかにはしなかった。ＣＨＯ宿主におけるラクトジェニック挙動をよりよく理解するために、供給法又は培養液のｐＨのいずれかを変更することによりラクトジェニック挙動を調整可能である、ｍＡｂ−１又はｍＡｂ−２を発現する２つのラクトジェニック細胞株を同定した。ラクトジェニック挙動との可能性のある相関を描写するために、これらの独立して誘導した細胞株を、細胞増殖シグナル伝達又は解糖経路に関与するタンパク質及び酵素のパネルを分析する際のツールとして利用した。これらの知見により、ｍＡｂ−１及びｍＡｂ−２細胞株の両方における、ＰＫＭ−１発現とラクトジェニック挙動との直接相関が明らかとなった（図１Ｄ〜１Ｆ、及び２Ｄ〜２Ｆ）。
【０３０２】
ｍＡｂ−１及びｍＡｂ−２産生培養液の両方における、検出されたＰＫＭ−１の量は、産生中の初期の時点では低く、培養液中でのラクテートの量の増加に相関する形で、増加した。ＰＫＭ−２の量は、これらの細胞株におけるラクトジェニック挙動とは逆相関した（図１Ｄ〜１Ｆ、及び２Ｄ〜２Ｆ）。これは、ＰＫＭ遺伝子からのＰＫＭ−１又はＰＫＭ−２転写物の選択的スプライシングに関与するタンパク質の機能に依るものである可能性がある（Ｃｈａｎｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，２０１２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．３７（８）：３０９−１６；Ｉｓｒａｅｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎ，２０１５，Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４３：４３−５１；Ｍａｚｕｒｅｋ，２０１１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４３（７）：９６９−８０；Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．５２４（２）：３２７−３９；Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（２９）：１３８０７−１２；Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（２９）：１４３６６−７１）。ＰＫＭ遺伝子の２つのアイソフォームのうち、ＰＫＭ−２は、代謝経路を変更するための中央スイッチとして機能し、癌細胞が、腫瘍環境内などの、生理学的に好ましくない条件下で生残し、増殖することができることが報告されている（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ  ４５２（７１８４）：２３０−３；Ｃｈａｎｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，２０１２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．３７（８）：３０９−１６；Ｉｓｒａｅｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎ，２０１５，Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４３：４３−５１）。一方で、ＰＫＭ−１アイソフォームは、発現したら恒常的に活性型となる。理論に束縛されるものではないが、産生培養液中での、ＰＫＭ−１量とラクトジェニック挙動速度との相関は、この酵素による、ＰＥＰのピルベートへの制御不可能な転換、そしてその後に続く、ＬＤＨが媒介する、ピルベートのラクテートへの転換に依るものである可能性がある。
【０３０３】
ＣＲＩＳＰＲは、エクソン−９の欠損を媒介し、それ故、ｍＡｂ−２発現細胞内のＰＫＭ−１は、ＷＴ  ｍＡｂ−２発現細胞がラクトジェニック挙動を示す条件下において、ＰＫＭ−１  ＫＯ細胞のラクトジェニック挙動の完全な逆転をもたらした（図５Ｅ）。２つのＰＫＭ−１  ＨＥＴ  ｍＡｂ−２細胞株は、異なる挙動を示した。ＨＥＴ−３  ＫＯ細胞株はごくわずかなラクテート（ＰＫＭ−１  ＫＯ細胞株よりも少しだけ多く）を生成した一方で、ＨＥＴ−１８細胞株はラクトジェニック性であり、ＷＴ  ｍＡｂ−２細胞のラクテートの、約２／３を生成した（図５Ｅ）。これらのＰＫＭ−１  ＨＥＴ細胞株のラクトジェニック挙動と、これらの細胞におけるより多量のＰＫＭ−１との直接相関もまた、観察された（図５Ｆ）。ＨＥＴ−３細胞株と比較しての、ＨＥＴ−１８にて観察されるＰＫＭ−１量の差は、異なるＰＫＭ対立遺伝子からの、ＰＫＭ−１の異なる発現、又は、ＨＥＴ−３細胞株における、ｇＲＮＡ構築物によるＰＫＭ対立遺伝子の部分標的化、又は、標的化したＰＫＭ対立遺伝子内の標的化領域の反転に依るものである可能性がある。
【０３０４】
ＰＫＭ−２タンパク質を発現できないＰＫＭ−１ノックアウト細胞株（ＫＯ−１５）（図５Ｆ）が同定された。細胞株は、５’ｇＲＮＡ標的化領域の上流のイントロンにて、無作為な塩基の１２２ｂｐの欠失、及び挿入を有する（図３Ｃ）。ＫＯ−１５細胞株は、ＣＨＯ細胞株がＰＫＬ／Ｒもまた発現する（図３Ａ）ために、ＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２酵素の両方の喪失にも耐性を有することができ、これにより、ＰＫＭ発現の欠如を補うことができる。ＷＴ、並びに全てのＰＫＭ−１  ＨＥＴ及びＫＯ細胞株における、ＰＫＬ／Ｒタンパク質の発現を、ウェスタンブロット分析により確認した（データは図示せず）。それにもかかわらず、ＰＫＭ−１発現の欠如又は低下により、全てのＰＫＭ−１  ＫＯ又はＨＥＴ細胞株において、それぞれ、力価又は特異的産生能に影響を与えることなく、より低いラクテートの生成がもたらされた（図５Ｃ〜５Ｄ、及び６Ｃ〜６Ｄ）。これらの細胞株において、ラクトジェニック挙動が存在しないこと、又は弱化することは再現可能であり、解凍後の若い細胞年齢、及び全ての複製物の間で一致した（図５Ａ〜５Ｅ、及び６Ａ〜６Ｅ）。
【０３０５】
産生培養中にラクトジェニック挙動を制御することは、製造の実施から最適な力価及び生成物の品質を得るために重要である。それ故、宿主からのＰＫＭ−１発現をノックアウトすることは、ＣＨＯ細胞のラクトジェニック挙動を取り扱う上で有利となり得る。ＰＫＬ／Ｒ酵素はＰＫＭの消失を補うことができるため、欠損のために、ＰＫＭ−１又はＰＫＭ遺伝子全体を標的化する前に、ＣＨＯ細胞における、他のＰＫ酵素の発現を確認して監視することが重要である。ＰＫＭ遺伝子全体をノックアウトすることは、ＣＨＯ宿主にて許容されることができ、ＰＫＭ  ＫＯ  ＣＨＯ宿主は、ＷＴ宿主の力価及び生成物の品質に相当する力価及び生成物の品質を有する、対象の抗体又は生成物を発現することができる。これらのＰＫＭ  ＫＯ宿主は、ＫＯ−２及びＫＯ−１５細胞株で観察されるように、ラクトジェニック挙動を低下させ、ＷＴ宿主よりも良好な増殖プロファイルを有することができる（図５Ａ及び６Ａ）。
【０３０６】
実施例２：ＰＫＭノックアウト及びＰＫＭ−１ノックアウトＣＨＯ細胞株における、ｍＡｂ−３の産生
ＰＫＭ遺伝子又はＰＫＭ−１遺伝子をＣＨＯ−Ｋ１Ｍ細胞株にてノックアウトし、１つのＰＫＭ  ＫＯ宿主細胞株、及び４つのＰＫＭ−１  ＫＯ宿主細胞株を作製した。標的組み込みにより、ｍＡｂ−３をコードする導入遺伝子をＷＴ  ＣＨＯ−Ｋ１Ｍ、ＰＫＭ  ＫＯ、及びＰＫＭ−１  ＫＯ宿主細胞株に導入し、同じ宿主細胞株からｍＡｂ−３を発現する３つのＷＴプール、同じ宿主細胞株からｍＡｂ−３を発現する３つのＰＫＭ  ＫＯプール、及び、４つの異なる宿主細胞株からｍＡｂ−３を発現する４つのＰＫＭ−１  ＫＯプールを作製した。
【０３０７】
ＰＫＭ  ＫＯ宿主を作製するためのｇＲＮＡが異なり、以下に示すとおりであることを除いて、実施例１に開示したとおりに以下の実験を実施した。ＰＫＭ−１  ＫＯ宿主細胞を作製するために使用したｇＲＮＡは、実施例１で使用したものと同じである。
ＰＫＭ  ＫＯ宿主細胞を作製するためのｇＲＮＡは、以下の配列を有した：
５’−ｇＲＮＡ：ＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＣＣＣＧＣＡＡＣＡＣ（配列番号４２、ＰＫＭ遺伝子のエクソン２内の領域を標的化）
３’−ｇＲＮＡ：ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＣＧＧＧＧＧＡＴＧ（配列番号４３、ＰＫＭ遺伝子のエクソン１２内の領域を標的化）
【０３０８】
振盪フラスコ産生において、ＰＫＭ及びＰＫＭ−１  ＫＯ宿主細胞株に由来するＭＡｂ−３産生プールは、ＷＴプールに相当する、又はそれより高いＱｐ及び力価を有したが、低い増殖を有した（積算生残細胞濃度（ＩＶＣＣ）により表される）（図７）。振盪フラスコ産生において、ＰＫＭ及びＰＫＭ１  ＫＯ宿主細胞株に由来するＭＡｂ−３産生プールもまた、ＷＴ宿主細胞株よりも少ないラクテートを生成した（図８Ａ）が、より多くのグルコースを消費した（図８Ｂ）。図８Ａに示すように、ＷＴ宿主細胞は、振盪フラスコでの産生の１５日目までに、約１．０ｇ／Ｌのラクテートを産生した。振盪フラスコ産生の間、１〜２．５ｇ／Ｌのラクテート濃度は、高いものと考えられる。対照的に、１５日目までに、ＰＫＭ−１  ＫＯ宿主細胞はごくわずかのラクテートを産生し、ＰＫＭ  ＫＯ宿主細胞は０．２ｇ／Ｌ未満のラクテートを産生し、ＰＫＭ−１、又はＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２の両方がノックアウトしたときに、８０％を超えるラクテートの産生の低下をもたらした。
【０３０９】
振盪フラスコ産生において、ＰＫＭ／ＰＫＭ−１  ＫＯ宿主細胞株に由来するＭＡｂ−３産生プールは、異なるアミノ酸合成／消費速度を有した（図９Ａ及び図１０）。例えば、ＰＫＭ  ＫＯ宿主細胞株は３−ホスホグリセリン酸を蓄積し、ＷＴ及びＰＫＭ−１宿主細胞と比較して、セリン及びグリシンの産生の増加をもたらした（図９Ｂ）。ＷＴ宿主細胞株は、ＰＫＭ  ＫＯ及びＰＫＭ−１宿主細胞と比較して、ピルベートを蓄積した（図９Ｃ）。特定の理論に限定されるものではないが、ＷＴ宿主細胞におけるピルベートの蓄積は、ラクテートの蓄積、及びアラニンの産生の増加をもたらす可能性がある（図１０）。ＰＫＭ−１  ＫＯ宿主細胞株は、オキザロ酢酸（アスパラギン酸及びアスパラギンの蓄積をもたらす（図９Ｄ））、並びにα−ケトグルタレート（ａ−ＫＧ）（グルタミン酸、アルギニン、及びグルタミンの蓄積をもたらす（図９Ｅ））などのＴＣＡサイクル生成物を蓄積した。特定の理論に限定されるものではないが、これらの結果は、ＰＫＭ−１及びＰＫＭ−２が、ピルベートが優先的にＴＣＡサイクルに入るように、ピルベート生成物の量を制御するように機能することができることを示唆している。上記知見をまとめたものを、図１０に示す。これらのデータに基づくと、ＰＫＭ−１及びＰＫＭ  ＫＯ細胞を培養するために使用した細胞培養培地及び条件を調節して、消費されるグルコースの量、及び／又は、消費若しくは合成されるアミノ酸の量を補うことができる。
【０３１０】
ＰＫＭ／ＰＫＭ１  ＫＯ宿主細胞株に由来するＭＡｂ−３産生プールは、振盪フラスコ産生において、異なるグリコシル化プロファイルを有した。ＰＫＭ  ＫＯ宿主ではガラクトシル化が低下し、ＰＫＭ  ＫＯ及びＰＫＭ−１  ＫＯ宿主細胞株では、フコシル化がわずかに低下した（図１１）。特定の理論に限定されるものではないが、グリコシル化におけるこれらの変化は、作製した抗体の活性に影響を及ぼさない可能性が高い。
【０３１１】
本出願を通して引用される、全ての図面及び全ての参考文献、特許及び公開された特許出願、並びに寄託番号の内容物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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