(57)【要約】  本発明は、生物学的流体からの遺伝的に形質転換された細胞の調製に好適な自動化装置であって、操作部と、アフェレーシスからの白血球細胞、骨髄細胞又は培養細胞等の生体試料を自動的に処理して遺伝子操作細胞を製造することができる回転可能な同心状中空処理チャンバとを含む装置に関する。この操作部は、水平軸に関して中心の周りに回転可能であり、処理チャンバは、操作部の回転軸に垂直な中心ロータ軸の周りに回転可能である。上記処理チャンバは、鉛直方向に向けると高速回転で作動して、収容されたサンプルに遠心力を発生させて液体からの固体の分離を可能にし、又はインキュベーション、固体再懸濁及び磁気ビーズ磁気付着のために水平方向に向けると、低速度で、一連の高速の連続的な時計回り及び反時計回りの回転によって作動させることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的流体からの遺伝的に形質転換された細胞の調製に好適な自動化装置であって、
（ｉ）水平軸（１９）に関して中心の周りに回転可能な操作部（８０）と、
（ｉｉ）前記操作部（８０）を保持し、支持及び電力を供給する中心軸シャフト（１６）と
を含み、前記操作部（８０）が、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を備え、前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）が、
丸い部分を上にして、突出孔（３）をまさに頂部に有する半球である頂部部分と、
前記回転可能な同心状処理チャンバ（１）の全体高さの４分の１と中間の間に位置し、前記同心状中空処理チャンバ（１）の底部部分と垂直角を形成する前記半球の底部の縁部（７）であって、前記底部部分は、そのまさに底部に底孔（４）を有する凹状のアーチ状の曲線に従う漏斗形状（６）に狭まる前記半球の底部の縁部（７）と
を有することを特徴とし、前記操作部（８０）が、前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を鉛直位置（１４）から水平位置（１５）にシフトさせ、前記自動化装置に異なる操作を与えるように構成されている自動化装置。
【請求項２】
前記回転可能な同心状処理チャンバ（１）が、前記底孔（４）の上方に環状に配置された１つ以上の側孔（５）をさらに含む請求項１に記載の自動化装置。
【請求項３】
前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）が、その頂部に入口側ステータ（８）と、その底部に出口側ステータ（１０）とを備え、前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の内外に液体をポンプで送り出すことができる請求項１又は請求項２に記載の自動化装置。
【請求項４】
前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の前記底孔（４）に嵌合するように成形された作用可能なプラグ（１３）が、環状に配置された前記１つ以上の側孔（５）をそれぞれ遮断又は遮断解除するように係合（３２）又は係合解除（３４）することができる請求項２又は請求項３に記載の自動化装置。
【請求項５】
前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）が、その底部ステータ（１０）及び頂部ステータ（８）の両方で、使い捨てキット（６６）を形成するようにいくつかの試薬又は産物のパウチに接続されている使い捨て多方向回転セレクタバルブヘッド（５７、６１）に接続された使い捨て蠕動ポンプヘッド（５８、６０）から構成されている２つの独立した組に接続されている請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の自動化装置。
【請求項６】
前記操作部（８０）が六角柱（９６）として成形されており、前記六角柱（９６）が、６つの操作部面（８７、８８、８９、９１、９２、９５）の各々について異なる機能を有し、前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を前記面のうちの１つにあるロータ筐体（９５）内に収容することができる請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の自動化装置。
【請求項７】
前記６つの操作部面（８７、８８、８９、９１、９２、９５）が、
温度制御可能な、液体バッグの格納のために設計されたチャンバである２つの面（８７、８９）、
前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を保持し、作用可能な磁気アレイ（７０）を備えるロータ筐体チャンバである１つの面（９５）、
ユーザインターフェース（８６）並びに蠕動ポンプヘッド（５８）及び多方向回転セレクタバルブヘッド（５７）の取り付け点を含む１つの面（９１）、
蠕動ポンプヘッド（６０）及び多方向回転セレクタバルブヘッド（６１）の取り付け点を含む１つの面（９２）、並びに
データ入力／出力コネクタ、電源コネクタ、及び温度制御のためのベントを含む１つの面（８８）
を含む請求項６に記載の自動化装置。
【請求項８】
前記作用可能な磁気アレイ（７０）が、係合されたときに前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の前記縁部（７）に形状適合するように設計されたアーチ形状からなり、１つ以上の高磁界強度磁石（７３）をさらに含む請求項７に記載の自動化装置。
【請求項９】
生物学的流体の処理方法であって、前記処理方法は、流体を受容することができ、使い捨てキット（６６）の一部に試薬及びバッグの組を備え、
鉛直方向（１４）に向けられる場合、固体から液体を分離するための遠心分離、及び体積調整、
水平方向（１５）に向けられる場合、固体再懸濁、磁気ビーズ磁性付着、溶液インキュベーション及び混合並びに体積調整、
を実行可能である操作部（８０）による、空間内で多方向に操作することができる回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の中での生物学的固体分離、凝集体再懸濁、試薬及び／又は細胞のインキュベーション、目的の細胞の磁気分離並びに細胞培養増殖を含み、生物学的流体の前記処理を実行するための前記一組の操作は、
前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）が鉛直方向（１４）である場合の体積調整及び遠心分離の手順の連鎖組み合わせ及び／又は反復、並びに
前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）が水平方向（１５）である場合、低速回転、高速の連続的な時計回り及び反時計回りの回転、磁気ビーズ磁気付着、溶液インキュベーション及び混合を含むことを特徴とする生物学的流体の処理方法。
【請求項１０】
前記生物学的固体分離のための操作が、
前記操作部（８０）の回転によって前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を鉛直方向（１４）に位置決めし、前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）に生物学的懸濁液（１００）を充填し、次いで、前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）をその軸（１４）に沿って設定された速度で設定された時間回転させて遠心力を生成することによって前記生物学的懸濁液（１００）を遠心分離して、これにより、前記生物学的固体を前記液体から分離し、前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の縁部（７）に凝集（１０２）させることをもたらす工程と、
続いて、前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の回転を徐々に停止し、液相（１０１）が流下し、前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の前記縁部（７）に付着して留まる固相（１０２）を生じる工程と、
得られた前記液相（１０１）が出口側ステータ（１０）でポンプ排出される工程と
によって行われる請求項９に記載の生物学的流体の処理方法。
【請求項１１】
前記凝集体再懸濁のための操作が、
前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を前記操作部（８０）の回転によって水平方向（１５）に位置決めする工程と、
前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）をその水平軸（１５）を中心に設定された時間だけ一連の高速の連続的な時計回り及び反時計回りの回転によって回転させる工程と、
得られた凝集固体（１０２）を分離し、それを液相（１０６）に懸濁させる工程と
によって行われる請求項９に記載の生物学的流体の処理方法。
【請求項１２】
前記試薬及び／又は細胞のインキュベーションのための操作が、
前記操作部（８０）の回転により前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を水平方向（１５）に位置決めし、前記処理チャンバ（１）内の生体懸濁液（１０６）を対象試薬と混合し、前記同心状処理チャンバ（１）を設定された温度で設定された時間低速回転によりその中心軸回りに回転させる工程
によって行われる請求項９に記載の生物学的流体の処理方法。
【請求項１３】
前記目的の細胞の磁気分離のための操作が、
結合磁気選択ビーズ（１０４）と共に生物学的懸濁液（１０３）をインキュベーションし、前記操作部（８０）の回転によって回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を水平位置（１５）に配向させ、磁気アレイ（７０）を前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の縁部（７）に近づけ、前記磁気ビーズ（１０４）の引力を生じさせる工程と、
前記磁気アレイ（７０）が前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の前記縁部（７）と密接した状態を保って、前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を鉛直方向（１４）に位置決めするように前記操作部（８０）を回転させ、これにより、不要な懸濁液（１０３）を前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の底部へ流し、次いで、前記磁気ビーズ（１０４）に付着した目的の細胞が前記縁部（７）で磁気的に静止している間に前記不要な懸濁液（１０３）を廃棄物バッグ（６２）にポンプ排出し、前記磁気アレイ（７０）を後退させて、前記磁気ビーズ（１０４）が自由に流れることを可能にする工程と
によって行われる請求項９に記載の生物学的流体の処理方法。
【請求項１４】
前記細胞培養増殖のための操作が、
十分な時間のインキュベーション操作を行うように低速回転を行う前記操作部（８０）の作用によって水平方向（１５）に向けられた前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の内部の細胞培養培地中に存在する均一な細胞懸濁液（１０６）を有する工程と、
前記十分な時間の後、細胞培養（１０６）状態を評価するために、前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）が前記操作部（８０）の作用により鉛直方向（１４）に向けられ、サンプルポート（６４）を介してサンプリングが行われ、培地更新が必要な場合には、生物学的固体分離操作が、古い培地（１０１）が前記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）から排出され、新しい細胞培養培地が添加され（１０５）て実施される工程と、
前記手順に続いて凝集体再懸濁が行われ、続いて細胞数が十分であるまでさらにインキュベーションされる工程と
によって行われる請求項９に記載の生物学的流体の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的流体からの遺伝子操作細胞の製造のための自動化された装置及びプロセスに関する。特に、この装置は、遺伝子治療関連製品の文脈において、遠心分離、磁気分離及び流体混合などの物理的処理を生物学的流体へ適用することを通して、細胞を遺伝子操作し、流体から細胞を分離し、細胞を洗浄し、濃縮し、希釈することによって、治療溶液の調製及び生物学的流体処理を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞又はキメラ抗原受容体Ｔ細胞の遺伝子工学に基づく遺伝子治療は、現在、患者に使用され、いくつかの形態の癌に対して前例のない結果を提供している。治療用製品は、一般に、以下のように製造される：患者の体液からの白血球の採取が行われる。この採取物から、目的の細胞のサブセットを洗浄し、単離しなければならない。これらの比較的少数の単離細胞は、ウイルスベクターの作用により遺伝子改変されることになる。改変された細胞は、大きな培養物に戻すために増殖されなければならない。これらの治療法の製造は、一般に、クリーンルーム内でヒト技術者によって行われ、厳しい標準操作手順にかけられる。ヒトによる労働は、最終的な治療製品の品質及び再現性に負の影響を及ぼすため、自動化が、適用可能な治療製品を生産するという成功を増加させるために適用されるべきである。
【０００３】
国際公開第２００９／０７２００３Ａ２号パンフレット（ＭＩＬＴＥＮＹＩ  ＢＩＯＴＥＣ  ＧＭＢＨ［ＤＥ］；ＭＩＬＴＥＮＹＩ  ＳＴＥＦＡＮ［ＤＥ］；ＳＣＨＩＭＭＥＬＰＦＥＮＮＩＧ  ＷＩＮＦＲＩＥＤ）は、ａ）少なくとも１つのサンプルチャンバを有する回転容器に連結された入力ポート及び出力ポートを含むサンプル処理ユニットであって、このサンプル処理ユニットは、サンプルに第１の処理工程を提供するか、又は上記チャンバ内に堆積されたサンプルに遠心力を加え、堆積されたサンプルの少なくとも第１の成分及び第２の成分を分離するように、上記容器を回転させるように構成されているサンプル処理ユニットと、ｂ）上記サンプル処理ユニットの出力ポートに連結されたサンプル分離ユニットであって、上記細胞分離ユニットは、分離カラムホルダ、ポンプ、並びに流体回路及び上記ホルダ内に配置された分離カラムを通る流体流を少なくとも部分的に制御するように構成された複数のバルブを含み、この分離カラムは、そのカラムを通って流れるサンプルの標識成分及び非標識成分を分離するように構成されているサンプル分離ユニットとを含むシステムを開示する。
【０００４】
米国特許出願公開第２０１７／２１８３３１Ａ１号号明細書（ＭＩＬＴＥＮＹＩ  ＳＴＥＦＡＮ［ＤＥ］ら）には、遠心分離チャンバを含む細胞改変装置であって、この遠心分離チャンバは、遠心分離チャンバの回転軸に対して１３５〜４５°の角度を有する法線ベクトルを有する少なくとも１つの細胞改変表面を有し、かつ少なくとも１つの入力／出力ポートを含み、改変される細胞は、２〜２０００ｇでの遠心分離チャンバの回転によって上記細胞改変表面に固定される、細胞改変装置が開示されている。さらに、この発明は、細胞を改変するための方法であって、遠心分離チャンバを含む細胞改変装置に細胞を導入する工程であって、この遠心分離チャンバは、遠心分離チャンバの回転軸に対して１３５〜４５°の角度を有する法線ベクトルを有する少なくとも１つの細胞改変表面を有し、かつ少なくとも１つの入力／出力ポートを含む工程と、２〜２０００ｇでの遠心分離チャンバの回転によって上記細胞を上記細胞改変表面上に固定する工程と、上記細胞が改変されるまで遠心分離チャンバの回転の回転を維持する工程とを含む方法に関する。
【０００５】
国際公開第２０１６／１１８７００Ａ１号パンフレット（ＨＵＴＣＨＩＮＳＯＮ  ＦＲＥＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳ［ＵＳ］）には、遺伝子改変細胞のエキソビボ単離、製造、及び製剤化のためのプラットフォームが記載されている。このプラットフォームは、遺伝子治療をより広く利用可能にする、ソフトウェアが有効になっているポイントオブケア機器及び／又は携帯機器を利用する。
【０００６】
米国特許出願公開第２００５／０５４５０６Ａ１号明細書（ＢＲＡＤＬＥＹ  ＢＲＵＣＥ  Ｊ［ＵＳ］）は、微生物を分離するための特定の用途の遠心分離チャンバを記載している。このチャンバは、上方にフレア状の円錐形状を有し、試料採取溝は、その最も広い点にある。サンプルは、チャンバがスピンするにつれてサンプル溝に集められる。停止まで遅くすると、上清はチャンバの底に沈み、サンプルをサンプル溝に残し、そこでサンプルに容易にアクセスすることができる。
【０００７】
国際公開第２０１６／０９７８８９Ａ１号パンフレット（ＢＩＯＳＡＦＥ  ＳＡ［ＣＨ］）は、使い捨てセットの一部である中空円筒形遠心処理チャンバ（３００）中の処理工程による、全血、アフェレーシス血液、骨髄血、臍帯血、軟膜（バフィーコート）又は培養細胞などの不透明生物学的流体及び透明な生物学的流体の連続的処理のためのプロセスを開示する。洗浄、インキュベーション、形質導入、分離、密度勾配分離、希釈及び体積調整から選択される少なくとも３つの異なる手順は、各々、処理チャンバ内の所与の処理プロファイルに従って、１回実施されるか又は複数回繰り返される。各手順は、処理チャンバへの入力、処理チャンバ内の操作、及びピストン（３１０）の変位による処理チャンバからの出力を含む。上記少なくとも３つの異なる手順は次々に連鎖され、処理チャンバ及びその使い捨てセットにおける全体的な連続操作を構成する。第１の用途は、磁気ビーズをヒトの血液細胞又は幹細胞と結合させるためのインキュベーションである。第２の用途は、外来性遺伝物質をウイルスによってヒトの血液細胞又は幹細胞に挿入する形質導入である。第３の用途は、再現可能な濃度及び体積の血液細胞又は幹細胞を達成するために、生物学的流体を再調整することである。
【０００８】
報告されているように、遺伝子操作された細胞の製造を自動化する努力がすでになされている。しかしながら、国際公開第２０１６／０９７８８９Ａ１号パンフレット又は国際公開第２００９／０７２００３Ａ２号パンフレットに例示されているような最新技術は、現在、単一の処理チャンバ内で遺伝子操作細胞製造全体を実施することができない。困難さは、プロセスに沿った培養サイズのばらつきに存在し、及びプロセスの一部分（例えば、それぞれ細胞単離又は最終所望の細胞数への最終細胞増殖、又は細胞単離）は、別の装置において実施されなければならず、これはプロセス複雑性及び最終産物の損傷の可能性を増加させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００９／０７２００３Ａ２号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１７／２１８３３１Ａ１号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１６／１１８７００Ａ１号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／０５４５０６Ａ１号明細書
【特許文献５】国際公開第２０１６／０９７８８９Ａ１号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２０１６／０９７８８９Ａ１号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的の１つは、遺伝的に形質転換された細胞の調製に適した自動化された装置を提供することである。この装置は、細胞処理を行うのに好適な操作部と回転可能な同心状中空処理チャンバで構成されている。操作部は、形状が六角形であり、その中心を通り、回転可能な同心状中空処理チャンバの回転軸に垂直なシャフトの周りに回転することができる。操作部は、上記回転可能な同心状中空処理チャンバを収容し、その回転を介して、処理チャンバを異なる位置に向けることができ、上記処理チャンバに対して異なる可能な操作を与える。操作部は、その６つの面上に異なる機能を有し、１つの面上に、回転可能な同心状中空処理チャンバを保持し、そのチャンバを温めることができ、かつ作用可能な磁気アレイを装備する筐体を有する。最後に、作用可能な磁気アレイは、同心状中空処理チャンバの縁部に密接に形状適合して、チャンバ内に磁場を働かせることができる。回転可能な中空処理チャンバは、鉛直方向に向けられた場合に遠心分離を行うことにより、液体から固体を分離することができ、水平方向に向けられた場合には、固体再懸濁及び溶液インキュベーションを行うことができる。回転可能な同心状中空処理チャンバはその形状が特徴的であり、回転可能な同心状中空処理チャンバは、まさに頂部に穴を有する丸い部分を上に向けた半球である頂部で構成され、底部が、回転可能な同心状処理チャンバの全体高さの４分の１と中間との間の位置で、上記半球の縁部において上記球と垂直角度を形成して始まり、まさに底部に第２の穴を有する凹状のアーチ状の曲線に従う漏斗形状に狭まる。この回転可能な同心状中空処理チャンバは、頂部に入口側ステータ、底部に出口側ステータが取り付けられており、これによりチャンバ内外に液体をポンプで送り込むことができる。さらに、回転可能な同心状中空処理チャンバは、その底部ステータ及び頂部ステータの両方で、１回使用の使い捨てキットを形成するいくつかの試薬又は産物のパウチに接続される使い捨ての多方向回転セレクタバルブヘッドに接続された使い捨ての蠕動ポンプヘッドから構成されている２つの独立した組に接続される。最後に、上記回転可能な同心状中空処理チャンバは、その底部穴に嵌合するように形作られた作用可能なプラグを有する。この作用可能なプラグは、アクチュエータによって係合又は係合解除されることができ、それぞれ処理チャンバ液体出口を遮断及び遮断解除することができる。
【００１１】
本発明の別の目的は、遺伝子操作された細胞の製造プロセスを実施することを可能にする、操作部及び回転可能な同心状中空処理チャンバを介して行われる一組の操作、例えば、処理チャンバを充填すること、処理チャンバを空にすること、液体から固体を分離する遠心分離、凝集体再懸濁、細胞及び／又は試薬のインキュベーション、細胞培養増殖、磁気分離及び体積調整の組として本明細書で定義されるプロセスを提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的及び利点は、以下の例示的な図面及び添付の特許請求の範囲を参照して進められる以下の詳細な説明のレビューから当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
装置及びプロセスは、図面によって説明される。
【００１４】
【図１】図１は、回転可能な同心状中空処理チャンバの断面図を示す。
【図２】図２は、入口側ステータ及び出口側ステータを備えた回転可能な同心状中空処理チャンバの断面図である。
【図３】図３は、入口側ステータの拡大断面図である。
【図４】図４は、出口側ステータ及びその機能モードの拡大断面図である。
【図５】図５は、操作部に装着されたときの、回転可能な同心状中空処理チャンバの回転及び移動の範囲の概略図である。
【図６】図６は、作用可能な磁気アレイの斜視図である。
【図７】図７は、使用される使い捨てキット及びその関連試薬のスキームである。
【図８】図８は、使い捨てキットが取り付けられた操作部の斜視図である。
【図９ａ】図９ａは、生物学的固体分離操作のフロー図である。
【図９ｂ】図９ｂは、操作対象とする細胞の磁気分離のフロー図である。
【図９ｃ】図９ｃは、凝集体再懸濁操作並びに試薬及び／又は細胞のインキュベーション操作のフロー図である。
【図９ｄ】図９ｄは、細胞培養増殖操作のフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料が本発明の実施又は試験に使用できるが、好適な方法及び材料が下記に記載されている。本明細書中で参照されているすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体を援用したものとする。本明細書中で論じられる刊行物及び出願は、本願の出願日前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書中には、本発明が先行発明によってこうした刊行物に先行する権利を有しないことの承認と解釈されるものは含まれていない。加えて、材料、方法及び実施例は説明的なものに過ぎず、限定的なことを意図しない。
【００１６】
矛盾する場合、定義を含めて本明細書が優先する。
【００１７】
特段の記載がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本明細書の主題が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書では、本発明の理解を容易にするために、以下の定義を提供する。
【００１８】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、一般に、包含する意味で、つまり、１つ以上の特徴又は構成要素の存在を許容する意味で使用される。
【００１９】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈と明らかな矛盾がない限り、複数の指示対象を含む。
【００２０】
本明細書で使用する場合、用語「処理チャンバ」は、回転可能な、同心状及び中空という用語の任意の組み合わせを伴わなくても、又はそれが先行する場合でも、同じ対象を指す。
【００２１】
本明細書で使用する場合、用語「プラグ」又は「作用可能なプラグ」は、液体の流れを妨害する目的を有するストッパを指す。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「低速回転」は、２〜１００ｒｐｍの間の回転速度であり、遠心分離は、２０００〜６０００Ｇを発生させる回転速度であり、「高速の連続的な時計回り及び反時計回りの回転」は、１〜１０秒の間の２〜４００ｒｐｍの間の回転である。
【００２３】
本明細書で使用する場合、用語「十分な時間」は、細胞増殖に言及する場合、１２〜２４時間を、固体再懸濁に言及する場合、２〜２０分であり、遠心分離に言及する場合、２〜３０分であり、レンチウイルスインキュベーションに言及する場合、１５分〜８時間である。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、用語「細胞培養標準と適合する温度」は、細胞培養増殖又はインキュベーションに言及する場合、３２〜３８℃である。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「十分な細胞数」は、１０８から１０１０細胞以上の間の多数の細胞を指す。
【００２６】
本発明の１つの目的は、生物学的流体からの遺伝的に形質転換された細胞の調製に好適な又は適合された自動化装置であって、
（ｉ）水平軸（１９）に関して中心の周りに回転可能な操作部（８０）と、
（ｉｉ）上記操作部（８０）を保持し、支持及び電力を供給する中心軸シャフト（１６）と
を含み、操作部（８０）は、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を備え、この回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）は、
丸い部分を上にして、突出孔（３）をまさに頂部に有する半球である頂部部分と、
回転可能な同心状処理チャンバ（１）の全体高さの４分の１と中間の間に位置し、同心状中空処理チャンバ（１）の底部部分と垂直角を形成する半球の底部の縁部（７）であって、上記底部部分は、そのまさに底部に底孔（４）を有する凹状のアーチ状の曲線に従う漏斗形状（６）に狭まる半球の底部の縁部（７）と
を有し、
上記操作部（８０）は、上記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を鉛直位置（１４）から水平位置（１５）にシフトさせ、上記自動化装置に異なる操作を与えるように構成されている装置を提供することである。
【００２７】
好ましくは、回転可能な同心状処理チャンバ（１）は、底孔（４）の上方に環状に配置された１つ又は複数の側孔（５）をさらに備える。
【００２８】
本発明の１つの実施形態では、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）は、その頂部に入口側ステータ（８）と、その底部に出口側ステータ（１０）とを備え、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の内外に液体をポンプで送り出すことができる。
【００２９】
特に、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の底孔（４）に嵌合するように成形された作用可能なプラグ（１３）は、１つ以上の環状に配置された側孔（５）をそれぞれ遮断又は遮断解除するように係合（３２）又は係合解除（３４）することができる。
【００３０】
１つの好ましい実施形態では、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）は、その底部ステータ（１０）及び頂部ステータ（８）の両方で、使い捨てキット（６６）を形成するようにいくつかの試薬又は産物のパウチに接続されている使い捨て多方向回転セレクタバルブヘッド（５７、６１）に接続された使い捨て蠕動ポンプヘッド（５８、６０）から構成されている２つの独立した組に接続されている。
【００３１】
好ましくは、操作部（８０）は六角柱（９６）として成形されており、この六角柱（９６）は、６つの操作部面（８７、８８、８９、９１、９２、９５）の各々について異なる機能を有し、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を上記面のうちの１つにあるロータ筐体（９５）内に収容することができる。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態によれば、操作部（８０）の６つの操作部面（８７、８８、８９、９１、９２、９５）は、
温度制御可能な、液体バッグの格納のために設計されたチャンバである２つの面（８７、８９）、
回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を保持し、作用可能な磁気アレイ（７０）を備えるロータ筐体チャンバである１つの面（９５）、
ユーザインターフェース（８６）並びに蠕動ポンプヘッド（５８）及び多方向回転セレクタバルブヘッド（５７）の取り付け点を含む１つの面（９１）、
蠕動ポンプヘッド（６０）及び多方向回転セレクタバルブヘッド（６１）の取り付け点を含む１つの面（９２）、並びに
データ入力／出力コネクタ、電源コネクタ、及び温度制御のためのベントを含む１つの面（８８）
を含む。
【００３３】
好ましくは、作用可能な磁気アレイ（７０）は、係合されたときに上記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の縁部（７）に形状適合するように設計されたアーチ形状からなり、高磁場強度ネオジム磁石などの１つ以上の高磁場強度磁石（７３）をさらに含む。
【００３４】
特に、本発明は、（ｉ）水平軸に関して中心の周りに（中心を通る水平軸の周りに）回転可能であり、支持及び電力を提供するシャフトによって保持される操作部（図８）、及び（ｉｉ）上記操作部に設置される回転可能な同心状中空処理チャンバ（図１）の２つの主要部分から構成されている装置に関する。本発明は、回転可能な同心状中空処理チャンバに作用するその操作部によって、アフェレーシスからの白血球細胞、骨髄細胞又は培養細胞などの生体試料を自動化様式で処理して、遺伝子操作された細胞を製造することができる。回転可能な同心状中空処理チャンバには、入口側ステータ（図３）及び出口側ステータ（図４）が取り付けられており、操作部の回転軸と垂直なその中心ロータ軸の周りに回転可能である（図５）。上記処理チャンバは、鉛直方向に向けると高速回転で作動して、収容されたサンプルに遠心力を発生させ、インキュベーション及び固体再懸濁のために水平方向に向けると、低速度で、又は一連の高速の連続的な時計回り及び反時計回りの回転によって作動させることができる（図９）。回転可能な同心状中空処理チャンバは、使い捨てキットのいくつかの試薬又は産物のパウチ部分に接続された使い捨て多方向回転セレクタバルブヘッドに接続された使い捨て蠕動ポンプヘッドから構成されている２つの独立した組に、その底部ステータ及び頂部ステータの両方で接続される（図７）。
【００３５】
操作部
操作部（８０）は能動システムであり、基部（９６）で接合された三つの六角柱のような形をしている。中央六角柱は正六角柱であるが、隣接する角柱は、それらの内側底面よりも小さい外側底面を有し、これは、この装置の２つの側面を正六角柱で構成されている中央部分よりも小さくするテーパ効果を形成する。操作部（８０）は、その６つの面（８７、８８、８９、９１、９２、９５）の各々について異なる機能を有し、そして、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を、上記面のうちの１つにあるロータ筐体（９５）内に収容することができる。操作部（８０）は、シャフト（１６）を通る水平軸（１９）を中心としてその操作部（８０）の中心の周りに回転可能である。
【００３６】
操作部（８０）の回転は、中央シャフト（１６）に隣接して操作部（８０）の内側に配置された電気モータ（１７）によって行われる。第２の電気モータ（１８）は、同じく操作部（８０）内に位置し、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の回転を駆動する。両電気モータ（１７、１８）は互いに独立しており、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の回転を空間内で多方向に操作することができるという革新的で有利な特徴を可能にする（図５）。この特徴は、鉛直（垂直）方向位置（１４）において、固体を懸濁液から分離する（図９ａ）ための遠心体として作用するための処理チャンバ（１）の利用を可能にし、水平位置（１５）において、細胞培養増殖のため（図９ｃ２）又は溶液中での固体再懸濁のため（図９ｃ）のインキュベータとして利用することを可能にする。操作部（８０）の向きは、操作部（８０）面の表面に便利に配置されたいくつかのボタン（８３）によって制御することができる。操作部（８０）は、使い捨てキット（６６）の異なる要素を設置することができる場所を６つの面上に備えることによって、使い捨てキット（６６）を収容する。
【００３７】
上部背面（８７）上には、試薬格納（保存）のためのチャンバが存在する。隣接する上部前面（９１）上には、ユーザインターフェース（８６）、並びに入口側多方向回転セレクタバルブヘッド（５７）及び入口側使い捨て蠕動ポンプヘッド（５８）を取り付けるための手段が存在する。隣接する前面には、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）が設置されるためのロータ筐体（９５）が存在する。隣接する底部前面（９２）には、出口側使い捨て蠕動ポンプヘッド（６０）及び出口側多方向回転セレクタバルブヘッド（６１）を取り付けるための手段が設けられている。隣接する底部背面（８９）には、廃棄物（６２）、最終産物（６３）及びサンプルポート（６４）を格納するためのチャンバが存在する。背面（８８）には、入出力データ転送コネクタ、並びに二次的電力接続及び熱交換体通気グリッドが存在する。
【００３８】
回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）は、入口側ステータ（８）及び出口側ステータ（１０）上の取り付け点によってロータ筐体（９５）内に設置される。処理チャンバ（１）の底部出口側ステータ（１０）は、回転ソケット（１２）にクリップ止めして設置されている。回転可能な同心状中空処理チャンバ回転（１）は、電気モータ（１７）によって駆動されるこの回転ソケット（１２）によってその軸（１４、１５）に沿って回転する。処理チャンバ（１）の頂部入口側ステータ（８）は、ロータ筐体（９５）にクリップ止めして設置されている。係合（３２）されたときに処理チャンバ出口（５、１１）を閉じることを可能にする作用可能なプラグ（１３）は、ロータ筐体（９５）内に設置されたリニアアクチュエータによって駆動される。ロータ筐体（９５）の内部には、後部に、アクチュエータによって処理チャンバ縁部（７）に近づけることができる磁気アレイ（７０）が存在し、処理チャンバ（１）の内部に強力な磁界が印加される。この有利な特徴は、処理チャンバ（１）の内部の溶液（１０３）から磁気ビーズを分離すること（図８ｂ）を可能にする。ロータ筐体（９５）は、取り付け点（８２）によって保持された透明な保護スクリーン（８１）で閉じられている。ロータ筐体（９５）空間は、操作部（８０）の背面（８８）に配置された一組の熱交換器によって、細胞培養標準に適合する温度まで加熱又は冷却することができる。
【００３９】
磁気アレイ（７０）は、接触させたときに、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）に、より正確には、処理チャンバの頂部部分と底部部分との間の縁部（７）に、密接に形状適合するように構造的に成形される。磁気アレイ（７０）は、リングセグメント又はアーチとして成形され、ネオジム（これに限定されない）などのいくつかの高磁場強度磁石（７３）を包含し、すべて、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）表面に垂直なそれらの中心軸と共に近接して配置される。近接センサ（７２）は、磁気アレイ（７０）の本体の上部に載置され、処理チャンバ表面（１）に対する磁気アレイの近接性を評価する。磁気アレイは、シャフト（７１）上のリニアアクチュエータの作用を介して直線的に動かすことができる。
【００４０】
上部前面（９１）は、入口側使い捨て蠕動ポンプヘッド（５８）及び入口側使い捨て多方向回転セレクタヘッド（５７）の設置を可能にする。底部前面（９２）は、出口側使い捨て蠕動ポンプヘッド（６０）及び出口側多方向回転セレクタバルブヘッドヘッド（６１）の設置を可能にする。取り付け点は、ナンバリング及びエラープルーフガイドを備えた明確なキット設置用に設計されている。プラスチックチューブ（５６）は、明確かつ整然としたシステム設定のために、内蔵クリップ（８４）によって表面に保持される。ユーザインタフェースクリーン（８６）と、システム及びプロセス状態を表示するスクリーン（９０）とが、上部前面に配置され、四方向パッド（９３）及びキーパッドを介して操作される。操作部（８０）のためのプログラムは、ユーザインターフェース（８６）を介してオペレータによって設定することができ、又はリモート端末を介して設定することができ、使い捨てキット（６６）設置ガイドラインは、プロセス前進パネル（９０）に提供される。
【００４１】
上部背面（８７）及び下部背面（８９）は、試薬バッグ及び溶液を格納するために開閉することができる２つのチャンバである。２つのバッグ格納チャンバは、数個のバッグ及び数リットルの溶液を収容するためにラック形状である。試薬バッグは、ストラップ及び透明プラスチックカバーによってチャンバ内に係止され、これは、目視検査のために実用的である。全てのチューブ（５６）は、チューブを整然とした様式で保持するダクト（８５、９４）を介してチャンバから出ることができ、使い捨てキット（６６）の残りの部分に接続する。これらのチャンバは、操作部（８０）の背面（８８）に配置された一組の熱交換器によって加熱又は冷却することができる。
【００４２】
コネクタ（８８）を含む面は、背面に位置する。このコネクタ（８８）を含む面は、遠隔装置制御及びファームウェアアップグレードのために、ＵＳＢ、ＲＳ２３２及びＲＪ４５（これらに限定されない）などの入出力データコネクタを備えている。熱交換器及びヒーター通気グリッド、並びに二次電源入口がこの面にある。
【００４３】
使い捨てキット
１回使用使い捨て可能キット（６６）は、回転可能な同心状処理チャンバ（１）で構成され、回転可能な同心状処理チャンバ（１）は、その入口側ステータ（８）及び出口側ステータ（１０）の両方で、使い捨て可能な多方向回転セレクタバルブヘッド（５７、６１）に接続された使い捨て蠕動ポンプヘッド（５８、６０）で構成されている２つの独立した組に接続される。多方向回転セレクタバルブは、いくつかの医療グレードの試薬パウチ、採取又はサンプリングのための医療グレードの空のプラスチックパウチ、及び接続チューブに接続することができる。
【００４４】
このキットと共に使用される試薬は、典型的には、アフェレーシスからの白血球細胞、骨髄細胞又は培養細胞等の生体試料；並びに細胞培養適合性の緩衝液、生理食塩水及びイオン性溶液等の緩衝液；細胞培養培地；ウイルス溶液、例えば、レンチウイルスベクター又はＲＮＡベクターの希釈物；活性化ビーズの懸濁液、結合磁気ビーズの懸濁液及び磁気ビーズ分離のための試薬である。
【００４５】
これを例示するために、磁気分離ビーズを、ＣＤ３４＋、ＣＤ２０＋及びＣＤ１９＋細胞型の精製（これらに限定されない）のために使用することができ、次いで、これらの細胞型はキメラ抗原受容体Ｔ細胞又は造血幹細胞ベースの遺伝子治療の製造のためにレンチウイルスベクターによって改変することができる。
【００４６】
１つの実施形態では、使用されるキット試薬は、ビーズ濾過ユニット（５５）に接続された患者生体試料バッグ（５４）、リン酸緩衝液バッグ（５０）、細胞培養増殖培地バッグ（５１）、磁気ビーズの懸濁液を含有するバッグ（５２）、レンチウイルスベクター溶液を含有するバッグ（５３）、及び追加の試薬バッグの追加のための入口ピン（５９）からなる。全ては、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の入口側ステータ（８）に接続された使い捨ての蠕動ポンプヘッド（５８）に接続された医療グレードのチューブ（５６）を介して使い捨ての多方向回転セレクタバルブヘッド（５７）に接続される。液体試薬の総体積よりも多くを収容することができる一般的に大きな廃棄物バッグ（６２）、採取バッグ（６３）、サンプリングポート（６４）及びバッグ接続ポート（６５）が、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の出口側ステータ（１０）に接続された出口側（６０）使い捨て蠕動ポンプヘッドに接続された出口側多方向回転セレクタバルブヘッド（６１）に接続される。
【００４７】
回転可能な同心状中空処理チャンバ
回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の形状は、球形の頂部部分と狭い漏斗形状の底部部分の２つの部分を特徴とする。チャンバの頂部部分は半球で、まさに上部の突出孔（３）が部分球の中心と整列している。部分球の縁部（７）において、同心状処理チャンバの全体高さの４分の１と中間の間の位置で、好ましくは３分の１で、底部部分が始まり、まさに底部に第２の孔（４）を有する凹状のアーチ状の曲線に続く漏斗形状（６）に狭まる。処理チャンバ壁のいくつかの孔（５）は、底孔（４）の上方に密接して位置している。処理チャンバ縁部（７）は、特定の角度を特徴とし、これは、固体が凝集し、遠心分離時に付着するための箇所として働く（図９ａ）。回転可能な同心状処理チャンバのまさに底（３０）は、操作部（８０）に装着されたときに回転ソケット（１２）に嵌合するような形状とされている。回転ソケット（１２）は電気モータ（１７）に接続されている。
【００４８】
処理チャンバ（１）は、細胞の溶液、生体試料又は濁った生物学的懸濁液を受容することができる中空コア（２）を有する。処理チャンバ（１）は、一般に、ポリエチレンテレフタレート又はポリスチレン等（これらに限定されるものではない）の医療グレードのプラスチックで製造され、目的の用途に適した表面改質を有することができる。
【００４９】
処理チャンバの底部（４）は、作用可能なプラグ（１３）がチャンバに嵌合する中央孔と、プラグ（３１）が係合（３２）されたときに覆われ、かつプラグが係合解除（３４）されたときに液体の出口として働くいくつかの側孔（５）とを特徴とし、このチャンバの底部は、出口側ステータ（１０）に嵌合し、取り付けるように設計される。
【００５０】
入口側ステータ（８）は、回転可能な同心状中空処理チャンバの頂部（３）に位置し、その中に部分的に挿入される。入口側ステータ（８）は、処理チャンバ（１）を保持する一方で、それが回転すること及び流体がそれに流入することを可能にするように設計される。上記入口側ステータ（８）は、互いに取り付けられた２つの部品を特徴とする。底部部分（２１）は、頂部部分（２０）に螺合される防水軸受ユニット（２２ａ）及び回転シールユニット（２３ａ）を取り囲む。ステータ（８）の頂部部分（２０）は、チューブ（５６）に接続された螺合式オス継手（２４）に接続された入口タップを特徴とする。ポンプ注入されると、液体はステータ頂部（２０）の注入口（９）を経由して中空の同心状の遠心チャンバ（２）に入る。
【００５１】
出口側ステータ（１０）は、同心状処理チャンバの底部（４）に位置し、処理チャンバ（１）を保持でき、回転でき、流体が流出することができるように設計されている。この出口（１０）は、互いに螺合した２つの部品からなるステータであることを特徴としている。出口側ステータ（１０）は、２つの防水ベアリングユニット（２２ｂ）と、回転シールユニット（２３ｂ）とを取り囲む頂部部分（２５）で構成されており、液体を通過させるロータ底部側孔（５）を取り囲む液体出口チャンバ（２７）を形成する。底部ステータ（１０）の頂部（２５）は、スナップリング（２９）によってロータに保持され、ステータのねじ込み（螺合）式底部部分（２６）によって締め付けられる。底部ステータ（１０）の頂部（２５）は、チューブ（５６）に接続された螺合式オス継手（２８）に接続された出口タップを特徴とする。
【００５２】
底部ステータ（１０）の中心には、作用可能なプラグ（１３）が同心状処理チャンバ（１）に嵌め込まれる。作用可能なプラグ（１３）は、係合され、液体ストッパとして作用し（３２）、係合解除され、液体を流動させることができる（３４）。ポンプ排出されると、液体は、底部ステータ（１０）上の出口（１１）を介して、回転可能な中空同心状処理チャンバ（１）から出る。作用可能なプラグ（１３）は、回転可能な同心状中空処理チャンバの底部（４）に嵌合する生体適合ゴム（３１）の軟らかい部分と、アクチュエータに嵌合する駆動軸（３３）とから構成されている２部要素である。プラグ（１３）は、アクチュエータによって係合（３２）され、又は係合解除（３４）され、処理チャンバ（１）と共に回転する。
【００５３】
回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）は、中心軸（１４、１５）を中心として双方向に回転可能であり、操作部（８０）によって垂直な外部軸（１９）を中心として回転可能である。操作部（８０）は、同心状中空処理チャンバ（１）を鉛直位置（１４）から水平位置（１５）にシフトすることができる。
【００５４】
回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の具体的な形状は、以下の節で示す操作を行うために必要である。凹状のアーチ状漏斗として成形された底部部分は、液体が流体出口（５）に迅速に蓄積され、効率的に排出されることを可能にするために重要である。さらに、出口における角度（６）は、作用可能なプラグ（１３）が係合されるとき（３２）、垂直ではない。角度（６）は、遠心分離の際に、処理チャンバ（１）が鉛直であるとき（１４）、液に対して処理チャンバ縁部（７）で液を変位させる上向きの力を発生させることを可能にする。回転軸（１４）から処理チャンバ縁部（７）までの半径は、技術的に妥当な回転速度での細胞処理と適合する遠心力を得るために十分に大きい。処理チャンバ縁部（７）における角度は、遠心分離が行われる場合に固体が凝集し、付着したままであることを可能にする。水平方向（１５）に配向される場合、上半球は、処理チャンバ（１）内により多くの容積が格納され、処理チャンバ内の液対空気界面が細胞培養標準に対して十分に大きいことを可能にする。
【００５５】
プロセス又は操作
細胞ベースの治療溶液の自動製造は、生物学的流体（生体液）からの目的の細胞の単離及びウイルス形質転換によって行われる。上述の製造プロセスは、処理チャンバを充填し、処理チャンバを空にし、遠心分離による懸濁液からの生物学的固形分の分離、目的の液体又は試薬溶液中の生物学的固形分の懸濁及び混合、生物学的懸濁液との結合磁気ビーズのインキュベーション、磁気アレイを使用する磁気ビーズ分離による生物学的懸濁液からの目的の磁気タグ化細胞の分離、レンチウイルスベクター又はＲＮＡベクターを使用する対象の細胞の形質転換、溶液体積の変更、目的の細胞の培養及び処理チャンバ中での増殖などの連続操作によって行われる。
【００５６】
特に、本発明の別の目的は、生物学的流体の処理方法であって、当該方法は、流体を受容することができ、使い捨てキット（６６）の一部に試薬及びバッグの組を備え、
鉛直方向（１４）に向けられる場合、固体から液体を分離するための遠心分離、及び体積調整、
水平方向（１５）に向けられる場合、固体再懸濁、磁気ビーズ磁性付着、溶液インキュベーション及び混合並びに体積調整
を実行可能である操作部（８０）による、空間内で多方向に操作することができる回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の中での生物学的固体分離、凝集体再懸濁、試薬及び／又は細胞のインキュベーション、目的の細胞の磁気分離（磁選）並びに細胞培養増殖を含み、
生物学的流体の上記処理を実行するための一組の操作は、
回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）が鉛直方向（１４）である場合の体積調整及び遠心分離の手順の連鎖組み合わせ及び／又は反復、並びに
回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）が水平方向（１５）である場合、低速回転、高速の連続的な時計回り及び反時計回りの回転、磁気ビーズ磁気付着、溶液インキュベーション及び混合を含む方法を提供することである。
【００５７】
一実施形態では、本発明は、
操作部（８０）の回転によって回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を鉛直方向（１４）に位置決めし、それに生物学的懸濁液（１００）を充填し、次いで、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）をその軸（１４）に沿って設定された速度で設定された時間回転させて遠心力を生成することによって生物学的懸濁液（１００）を遠心分離して、これにより、生物学的固体を液体から分離し、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の縁部（７）上に凝集（１０２）させることをもたらす工程と、
続いて、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の回転を徐々に停止し、液相（１０１）が流下し、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の縁部（７）に付着して留まる固相（１０２）を生じる工程と、
得られた液相（１０１）が出口側ステータ（１０）でポンプ排出される工程と
によって実施される生物学的固体分離のためのプロセスを提供する。
【００５８】
別の実施形態では、本発明は、
回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を操作部（８０）の回転によって水平方向（１５）に位置決めする工程と、
回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）をその水平軸（１５）を中心に設定された時間だけ一連の高速の連続的な時計回り及び反時計回りの回転によって回転させる工程と、
得られた凝集固体（１０２）を分離し、それを液相（１０６）に懸濁させる工程と
によって実施される凝集体再懸濁のためのプロセスを提供する。
【００５９】
さらに別の実施形態では、本発明は、
操作部（８０）の回転により上記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を水平方向（１５）に位置決めし、処理チャンバ（１）内の生体懸濁液（１０６）を対象試薬と混合し、同心状処理チャンバ（１）を設定された温度で設定された時間低速回転によりその中心軸回りに回転させる工程
によって実施される、試薬及び／又は細胞のインキュベーションのためのプロセスを提供する。
【００６０】
また、本発明の別の目的は、
結合磁気選択ビーズ（１０４）と共に生物学的懸濁液（１０３）をインキュベーションし、操作部（８０）の回転によって上記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を水平位置（１５）に配向させ、磁気アレイ（７０）を回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の縁部（７）に近づけ、磁気ビーズ（１０４）の引力を生じさせる工程と、
磁気アレイ（７０）が回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の縁部（７）と密接した状態を保って、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を鉛直方向（１４）に位置決めするように操作部（８０）を回転させ、これにより、不要な懸濁液（１０３）を回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の底部へ流し、次いで、磁気ビーズ（１０４）に付着した目的の細胞が縁部（７）で磁気的に静止している間に不要な懸濁液（１０３）を廃棄物バッグ（６２）にポンプ排出し、磁気アレイ（７０）を後退させて、磁気ビーズ（１０４）が自由に流れることを可能にする工程と
によって実行される、目的の細胞の磁気分離のためのプロセスを提供することである。
【００６１】
本発明のさらに別の目的は、
十分な時間のインキュベーション操作を行うように低速回転を行う操作部（８０）の作用によって水平方向（１５）に向けられた回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）の内部の細胞培養培地中に存在する均一な細胞懸濁液（１０６）を有する工程と、
上記十分な時間の後、細胞培養（１０６）状態を評価するために、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）が操作部（８０）の作用により鉛直方向（１４）に向けられ、サンプルポート（６４）を介してサンプリングが行われ、培地更新が必要な場合には、生物学的固体分離操作が、古い培地（１０１）が回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）から排出され、新しい細胞培養培地が添加され（１０５）て実施される工程と、
上記手順に続いて凝集体再懸濁が行われ、続いて細胞数が満足できるまでさらにインキュベーションされる工程と
によって実施される、細胞培養増殖のためのプロセスを提供することである。
【００６２】
処理チャンバの充填及び空化
回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）への充填は、様々な方法で行うことができる。
１．処理チャンバ（１）は、入口側ステータ（８）を上向きにして、操作部（８０）によって鉛直方向（１４）に向けられる。作用可能なプラグ（１３）は、係合（３２）され、チャンバ出口孔（５）を遮断する。入口側ステータ（８）に接続された蠕動ポンプヘッド（５８）は、目的の試薬が処理チャンバの内部（２）にポンプで送り出されるために起動される。
２．処理チャンバ（１）は、操作部（８０）によって水平方向（１５）に向けられる。作用可能なプラグ（１３）が係合される（３２）。入口側ステータ（８）に接続された蠕動ポンプヘッド（５８）は、目的の試薬が処理チャンバの内部（２）にポンプ注入されるために起動される。
３．処理チャンバ（１）は、操作部（８０）によって水平方向（１５）に向けられる。作用可能なプラグ（１３）は、係合解除される（３４）。出口側ステータ（１０）に接続された蠕動ポンプヘッド（６０）は、対象とする試薬が処理チャンバの内部（２）にポンプ注入されるために起動される。この場合は、一般に出口側ステータ（１０）と呼ばれる部分が入口側ステータとなるため、特別である。
【００６３】
回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を空にすることは、単一の方法で行うことができる。処理チャンバ（１）は、入口側ステータ（８）を上向きにして、操作部（８０）によって鉛直方向（１４）に向けられる。作用可能なプラグ（１３）は係合解除（３４）され、処理チャンバ出口孔（５）を開放する。出口側ステータ（１０）に接続された蠕動ポンプヘッド（６０）は、処理チャンバの底部（６）に存在する溶液が処理チャンバ（２）からポンプ排出されるために起動される。作用可能なプラグ（１３）は、処理チャンバ（１）が空になると再び係合（３２）される。
【００６４】
生物学的固体分離操作
生物学的固体分離操作（図９ａ）は、典型的には、以下のように行われる。
９ａ  １：回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）は、操作部（８０）の回転により鉛直方向（１４）に位置決めされ、細胞の溶液、生物学的流体又は濁った生物学的懸濁液（１００）が入口（９）を介して処理チャンバ（２）に投入され、底部（６）へと流れる。作用可能なプラグ（１３）は係合（３２）され、液を処理チャンバ（２）内に留めるように強制する。
９ａ  ２：同心状中空処理チャンバ（１）が鉛直（垂直）軸（１４）を中心に高速回転され、設定された時間のあいだ遠心力が発生される。懸濁液は、処理チャンバの頂部部分に向かって流れ、処理チャンバ（１）の最大部分（７）に蓄積する。生物学的固体は、液体から分離し、同心状中空処理チャンバ（１）の縁部（７）で凝集し、透明な液相（１０１）及び固相（１０２）を形成する。
９ａ  ３：同心状中空遠心チャンバ（１）の回転がゆっくりと停止される。透明な液相（１０１）は、中空チャンバ（２）の底部（６）に流下する。固相（１０２）は、最大のロータ部分（７）に付着したままである。
９ａ  ４：作用可能なプラグ（１３）は係合解除（３４）され、透明な液体が出口（１１）を介して同心状中空処理チャンバ（２）からポンプ排出されることが可能になる。処理チャンバ（１）は、さらなる洗浄のために目的の新しい液体を充填されることが可能であるし、又は分離される別の体積の懸濁液で充填されることもできる。
【００６５】
凝集体再懸濁操作
凝集体再懸濁操作（図９ｃ）は、典型的には、以下のように行われる。
９ｃ  １：同心状中空処理チャンバ（１）は、遠心分離された固体（１０２）が遠心分離後に処理チャンバ縁部（７）に付着した状態で、操作部（８０）の回転によって水平位置（１５）に移される。細胞培養培地又は緩衝液であることができる（これらに限定されない）透明な溶液（１０５）が、入口（９）を介して投入され、処理チャンバ側（７）に流れる。処理チャンバ（１）は、一連の高速の連続的な時計回り及び反時計回りの回転に従って回転され、これにより凝集固体（１０２）が分離し、液相（１０５）に浮遊する。
９ｃ  ２：回転が停止され、均一な細胞懸濁液が得られる（１０６）。処理チャンバ（１）は、懸濁液をさらにインキュベーションするために水平方向に（１５）保持することができ、又は操作部（８０）の回転によるさらなる処理のために、鉛直方法に（１４）配向することができる。
【００６６】
試薬及び／又は細胞のインキュベーション操作：
試薬及び／又は細胞のインキュベーション操作（図９ｃ  ２）は、典型的には、以下のように行われる。
９ｃ  ２：回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）は、操作部（８０）の回転によって水平（１５）に位置決めされ、チャンバ内に存在する生物学的懸濁液（１０６）は、目的の試薬、レンチウイルスベクター又は結合磁気ビーズ（これらに限定されない）と混合される。同心状処理チャンバ（１）は、その中心軸（１５）を中心として、設定された時間の間、ゆっくりとした回転により回転される。温度は、インキュベーションのニーズを満たすように調整することができる。
【００６７】
目的の細胞の磁気分離操作
目的の細胞の磁気分離操作（図９ｂ）は、典型的には、以下のように行われる。
９ｂ  １：目的の細胞特徴を認識するための磁気ビーズ（１０４）の懸濁液が、細胞の溶液、生体試料又は濁った生物学的懸濁液（１０３）を含有する同心状中空処理チャンバ（２）の内側へ入口（９）を介して投入され、処理チャンバの底部（６）に流れる。
９ｂ  ２：回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）が、操作部（８０）の回転によって水平位置（１５）に運ばれ、溶液は、設定された温度で設定された時間、処理チャンバ軸（１５）の周りのゆっくりとした回転又はゆっくりとした時計回り及び反時計回りの回転のいずれかによってインキュベーションされる。回転が停止され、磁気ビーズ（１０４）は沈降によって生物学的溶液（１０３）から分離する。
９ｂ  ３：磁気アレイ（７０）が、同心状処理チャンバ側（７）に持ち込まれ、生体溶液（１０３）から磁気ビーズ（１０４）を引き寄せ、さらに分離する。
９ｂ  ４：操作部（８０）が回転され、磁気アレイ（７０）が処理チャンバ縁部（７）と密接した状態を保って、回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）が鉛直方向（１４）に位置決めされる。不要な懸濁液（１０３）は、同心状処理チャンバの底部（６）へ流れる。
９ｂ５：不要な生物学的溶液は、出口（１１）を介して同心状中空遠心チャンバ（２）から排出される。目的の細胞は、依然として、磁気アレイ（７０）によって磁気ビーズ（１０４）に付着されている。作用可能なプラグ（１３）は係合（３２）され、磁気アレイ（７０）は、磁気ビーズを解放するために後退されて（引き込められて）もよく、又は液体が同心状処理チャンバ（２）にポンプ注入されて、付着した細胞（１０４）をさらに洗浄してもよい。
【００６８】
細胞培養増殖操作
細胞培養増殖動作（図９ｄ）は、典型的には、以下のように行われる。
９ｄ  １：増殖させる均一な細胞懸濁液（１０６）が、回転可能な同心状中空処理チャンバ（２）の内部の細胞培養培地中に存在する。
９ｄ  ２：回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）は、操作部（８０）の作用により水平方向（１５）に向けられる。処理チャンバがゆっくり回転され、設定された温度でインキュベーション操作（図９ｃ  ２）が行われる。
９ｄ  ３：設定された時間後、操作部（８０）の作用により上記回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）が鉛直方向に（１４）向けられる。作用可能なプラグ（１３）は、係合解除され（３４）、細胞培養物（１０６）状態を評価するために、サンプリングがサンプルポート（６４）を介して行われる。細胞培養（１０６）培地を更新する必要がない場合、操作部（８０）は、９ｄ  ２に戻る。
９ｄ  ４〜９ｄ  ６：培地の更新が必要である。生物学的固体分離操作が行われる（図９ａ）。古い培養培地（１０１）が処理チャンバ（２）から排出され（図９ｄ  ６）、新しい細胞培養培地が加えられる（１０５）。
９ｄ７：凝集体再懸濁操作が行われ（図９ｃ）、細胞数が十分になるまで細胞培養液（１０６）がインキュベーションされる（図９ｃ  ２）。
【００６９】
当業者は、本明細書で説明した発明に対し、具体的に説明したもの以外の変形及び変更が可能であるということを理解するであろう。本発明は、その趣旨又は本質的特徴から逸脱しない範囲のそのようなすべての変形及び変更を含むということが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において参照され又は示される工程、特徴、組成物及び化合物のすべてを、個々に又は集合的に、並びに上記工程又は特徴の任意の及びすべての組み合わせ又は任意の２つ以上を含む。従って、本開示は、例示されたすべての態様において考慮され、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって示され、均等の意味及び範囲内に入るすべての変更は、本発明の範囲に包含されることが意図される。
【００７０】
種々の参考文献が本明細書全体にわたって引用され、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
上記の説明は、以下の実施例を参照してより完全に理解される。しかしながら、このような実施例は、本発明を実施する方法の例示であり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００７２】
実施例１：１つの応用において、ＣＤ３２＋細胞を、アフェレーシスによって採取した白血球細胞から単離、形質転換及び精製して、ＨＩＶ耐性造血幹細胞を得る。試薬及びキットを以下のように調製する：アフェレーシス産物のバッグ（５００〜８００ｍＬ）、カルシウムもマグネシウムも含まないリン酸緩衝液のバッグ（３００ｍＬ）、ＣＣＲ５遺伝子のノックアウトのために投入するレンチウイルスの溶液（５０〜１００ｍＬ）、ＣＤ３４＋細胞を特異的に標的化する磁気ビーズの溶液（５〜１０ｍＬ）、高グルコース改変イーグル細胞培養増殖培地の溶液（１．５Ｌ）、廃棄物バッグ（２Ｌ）及び最終産物採取バッグ（１００ｍＬ）。操作者は、操作部配向ボタン（８３）を使用して、操作部（８０）を試薬チャンバ（８７）が操作者を向くように向ける。試薬バッグを、試薬面チャンバ（８７）に配置し、ストラップを使用して所定の位置に係止する。チューブを整然とした方法で出口ダクト（８５）に固定し、チャンバを透明なプラスチックカバーで閉じる。操作者は、入口側多方向回転バルブヘッド（５７）と蠕動ポンプヘッド（５８）を取り付けるために、操作部（８０）を、第２の面（９１）が操作者を向くように向ける。操作者は、ロータチャンバ（９５）を自分の前方に向ける前に、チューブが確実にその面にクランプされるようにする（８４）。この回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）は、まず回転ソケット（１２）に出口側ステータ（１０）と作用可能なプラグ（１３）とを嵌合させて配置される。入口側ステータ（８）は、ロータチャンバ（９５）の頂部部分にあるソケットにクリップ留めされている。安全カバーガラス（８１）は回転チャンバ（９５）を閉じるためにロックされている。操作者は、出口側の多方向回転バルブヘッド（６１）及び蠕動ポンプヘッド（６０）を取り付けるために、操作部（８０）を第３の面（９２）が操作者を向くように向ける。操作者は、チューブ（５６）を出力チャンバ入口ダクト（９４）内に整然とした方法で固定し、操作部（８０）を回転させて、廃棄物バッグ（６２）及び最終産物バッグ（６３）をそれらの適切なチャンバ（８９）に配置し、サンプリングチューブ出口（６４）をソケット内に配置する。細胞処理は、ユーザインターフェイス（８６）を介して、又はリモート端末を介して、操作部（８０）上で上記方法を選択することによって開始される。操作者は、最適な進行を確実にするために、半自動化自己チェックに進む。この回転可能な同心状中空処理チャンバ（１）を、操作部（８０）の作用により鉛直位置（１４）に運ぶ。ラインは、患者サンプルを処理チャンバ（２）に投入する前に、リン酸緩衝液で呼び水（プライミング）される。生物学的固形分分離操作（図９ａ）を行い、得られた液体を廃棄物バッグ（６２）にポンプ排出する。リン酸緩衝液を、処理チャンバ（２、５０ｍＬ）にポンプ注入し、生物学的凝集体再懸濁操作（図９ｃ）を実行する。前の２つの操作を２回繰り返し、サンプルを完全に洗浄する。次いで、磁気分離ビーズを用いたインキュベーション操作（図９ｃ２）を行う。磁気分離操作（図９（ｂ））を３回行い、最初の２回はリン酸緩衝液（５０ｍＬ）を、最後は細胞培養増殖培地を処理チャンバ（２、２〜１０ｍＬ）にポンプ注入する。レンチウイルスベクターとのインキュベーション操作（図９ｃ  ２）を行う。再び磁気分離操作（図８ｂ）を３回行い、最初の２回はリン酸緩衝液（５０ｍＬ）で、最後に細胞培養増殖培地（５０ｍＬ）で行う。細胞数が１０９細胞に達するまで細胞培養増殖動作を行う。生物学的固形分分離操作（図９ａ）を行い、得られた液体を廃棄物バッグ（６２）にポンプ排出する。生物学的凝集体再懸濁操作（図９ｃ）を行い、全ての溶液を最終産物バッグ（６３）に採取する。
【００７３】
実施例２：この実施例は、癌治療の場合の移植のための凍結自己幹細胞調製を例示する。選択した患者幹細胞（２０ｍＬ）のバッグを解凍させる。これを、以下の試薬から構成される使い捨てキット（６６からのバリエーション）に接続する：カルシウムもマグネシウムも含まないリン酸緩衝液（３００ｍＬ）のバッグ、高グルコース改変イーグル細胞培養増殖培地の溶液（１．５Ｌ）、廃棄物バッグ（２Ｌ）及び最終産物採取バッグ（１００ｍＬ）。この使い捨てキット（６６からのバリエーション）を設置し、操作部（８０）を、実施例１に提示するプロセスを実施するために準備する。生物学的固形分分離操作（図９ａ）を行い、得られた液体を廃棄物バッグ（６２）にポンプ排出する。リン酸緩衝液を、処理チャンバ（２、５０ｍＬ）にポンプ注入し、生物学的凝集体再懸濁操作（図９ｃ）を実行する。前の２回の操作を２回繰り返し、最後のサンプルを細胞培養増殖培地（５０ｍＬ）で徹底的に洗浄する。細胞数が１０９細胞に達するまで細胞培養増殖動作を行う。生物学的固形分分離操作（図９ａ）を行い、得られた液体を廃棄物バッグ（６２）にポンプ排出する。生物学的凝集体再懸濁操作（図９ｃ）を行い、全ての溶液を最終産物バッグ（６３）に採取する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【国際調査報告】
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