(57)【要約】  本出願は、複数の個体動物から収集されたある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を決定する方法であって、浅い全ゲノムシーケンシング（ＳＷＧＳ）によって、ある体積の乳の試料から抽出されたＤＮＡ中のＤＮＡ配列多型について対立遺伝子サンプリングすることを用いる、方法に関する。本方法は、例えば、ある体積の乳に乳を寄与する動物の乳房炎または潜在性乳房炎を検出するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の個体動物から収集されたある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を決定する方法であって、
ａ）浅い全ゲノムシーケンシング（ＳＷＧＳ）によって、ある体積の乳の試料から抽出されたＤＮＡ中の複数のＤＮＡ配列多型について対立遺伝子サンプリングするステップと；
ｂ）ステップａ）からの前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子サンプリング、および個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子データに基づいて、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップｂ）において、個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子データが、個体動物における前記ＤＮＡ配列多型の遺伝子型もしくは対立遺伝子量、および／または個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についてのＳＷＧＳ対立遺伝子サンプリングデータを含むか、またはそれらからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量に基づいて、個体動物の乳中の体細胞濃度を決定するステップであって、例えば、体細胞の濃度が体細胞スコア（ＳＣＳ）によって表される、ステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）におけるＳＷＧＳによる前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子サンプリングが、低もしくは超低対立遺伝子サンプリングであり、および／またはステップｂ）における個体動物におけるＳＷＧＳ対立遺伝子サンプリングデータが、ＳＷＧＳによる低もしくは超低対立遺伝子サンプリングからのものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）および／またはステップｂ）において、ＳＷＧＳのシーケンシング深度が０．１０〜１０．０、好ましくは０．２５〜５．０であり、例えば、約０．２５、約０．５０、約０．７５、約１．０、約２．０、約３．０、約４．０または約５．０、さらにより好ましくは０．２５から１．０、例えば、好ましくは約０．２５または約１．０のシーケンシング深度である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡ配列多型が一塩基多型（ＳＮＰ）である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型が、遺伝子型判定アレイ、例えばＳＮＰ遺伝子型判定アレイによって、ゲノムシーケンシング、例えばターゲティッドゲノムシーケンシングもしくは全ゲノムシーケンシングによって、またはそれらの任意の組合せによって、少なくとも部分的に決定されており、ならびに／あるいは個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型または対立遺伝子量が少なくとも部分的にインピュテーションされている、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型が、１００，０００以下のＳＮＰ、好ましくは５０，０００以下のＳＮＰ、より好ましくは１０，０００以下のＳＮＰを調べることが可能なＳＮＰ遺伝子型判定アレイによって、少なくとも部分的に決定されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１×１０５、好ましくは少なくとも５×１０５、より好ましくは少なくとも１×１０６、さらにより好ましくは少なくとも５×１０６、または少なくとも８×１０６のＤＮＡ配列多型が分析される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
動物が泌乳家畜である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
動物がウシ科またはウシ科雑種であり；好ましくはウシであり；より好ましくは畜牛、例えば、ボス・タウルス（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、ボス・インディカス（Ｂｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ）もしくは雑種の畜牛；または水牛である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
動物がヒツジまたはヤギである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ある体積の乳がタンク乳である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
所定の閾値を超える個体動物の乳中の体細胞濃度または体細胞スコア（ＳＣＳ）が、前記動物を潜在性乳房炎または臨床型乳房炎を有すると識別する、請求項３から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ある体積の乳に乳を寄与する複数の個体動物から潜在性乳房炎または臨床型乳房炎を有する１頭または複数の動物を識別する方法であって、
ａ’）ＳＷＧＳによって、ある体積の乳の試料から抽出されたＤＮＡ中の複数のＤＮＡ配列多型について対立遺伝子サンプリングする、例えば、低または超低対立遺伝子サンプリングすることを含む方法によって、好ましくは請求項１の方法によって、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を決定するステップと、
ｂ’）ステップａ’）で決定した、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量に基づいて、個体動物の乳中の体細胞濃度を決定するステップと；
ｃ’）ステップｂ’）で決定した、１頭または複数の動物の乳中の体細胞濃度が所定の閾値を超える場合、前記１頭または複数の動物が潜在性乳房炎または臨床型乳房炎を有すると識別するステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広くは畜産および獣医学の分野であり、特に酪農動物の健康管理に関する。本発明は、乳、例えばタンク乳の核酸分析に関する方法であって、とりわけ、その乳に寄与する個体動物の健康状態に関する有益情報を提供することができる方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
乳房炎は、酪農において最も一般的で最も重要な健康問題である。抗生物質治療と乳量および乳質の低下による損失は、オランダ酪農業界では、１年につき雌牛１頭当たり約８０ユーロに達する（Ｈｏｇｅｖｅｅｎら、２０１１）。
【０００３】
罹患した雌牛の乳は、乳中の体細胞濃度の増加、すなわち、免疫細胞が乳房および乳へと移動することを特徴とし、これは「体細胞スコア」（ＳＣＳ）として便宜的に表される。正常（健康）なＳＣＳ値は細胞１００，０００個／乳１ｍＬ未満であるが、臨床型乳房炎に罹患している雌牛では、ＳＣＳは細胞数百万個／ｍＬに達し得る。明らかな病状を示す前に、潜在性乳房炎の雌牛は既に細胞２００，０００個／ｍＬを有する可能性があり、後者のＳＣＳ値は、潜在性乳房炎と正常健康のカットオフ値として一般に使用されている。潜在性乳房炎の雌牛は、典型的には乳量が減少することを示し、タンクに加えられた場合、それらの乳は群れ全体の乳質に有害な影響を及ぼす。したがって、臨床型乳房炎および潜在性乳房炎の雌牛の検出は最重要である。
【０００４】
現在、個体雌牛のＳＣＳをモニタリングする最も一般的な方法は、乳の記録によってである。個体雌牛からの乳試料は、例えば毎月収集され、乳成分、ＳＣＳおよび細菌汚染を分析するため乳の記録センターに送られる。しかし、コスト調整のために、乳の記録を控える、またはその頻度を減らす酪農家の数が増えつつある。高性能の搾乳機は、乳の導電率を測定することにより乳房の健康状態をモニタリングするが、それらは高価であり、多くの農場では手が届かない。したがって、農場での乳房の健康状態をモニタリングするコスト効率の良い代替法が早急に必要とされている。
【０００５】
酪農場には、典型的には、数十頭から数百頭もの雌牛がおり、その乳は、毎日、乳加工工場によって収集されるまでは、大型の容器または「タンク」に保管される。最近、欧州特許出願公開第２５９７１５９号明細書およびＢｌａｒｄら、２０１２は、タンクに乳を寄与した個体搾乳牛のＳＣＳを決定する方法として、そのようなタンク乳のバルク一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子型判定（すなわち、それぞれの動物に対して別々の測定を実施する必要がない）を開示している。この方法は、最初に、農場のすべての搾乳牛にＳＮＰ遺伝子型判定することが必要であった（著者は、搾乳牛を含む動物の選択にゲノム選抜（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（ＧＳ））を使用することが増加しているため、それらのすべての雌牛にＳＮＰ遺伝子型判定する農場の数が急速に増大していたことに注目した）。タンク乳のＳＮＰ遺伝子型判定により、利用したＳＮＰアレイに応じて数万から数十万のマーカーについての「Ｂ対立遺伝子頻度」（Ｂｆｒｅｑ）の推定値が得られた。所与のＳＮＰに関するタンク乳のＢｆｒｅｑは、それぞれの雌牛の既知のＢ対立遺伝子数（ｇｉ；＝０、１、または２）と寄与したＤＮＡの未知の比率（ｐｉ）の積の（すべての雌牛に対する）合計を示した。ｐｉは、最小二乗法または他の方法を使用して、この一次方程式のアンサンブルから推定することができる。個体雌牛が寄与した既知または推定の乳体積とタンク中の既知の全ＳＣＳとを組み合わせると、ｐｉはそれぞれの個体雌牛についてのＳＣＳに変換され得る。タンク乳の遺伝子型判定にＳＮＰアレイを使用する欧州特許出願公開第２５９７１５９号明細書およびＢｌａｒｄら、２０１２の方法を、タンク乳に寄与する個体雌牛についてのＳＮＰアレイ生成遺伝子型と組み合わせて、図１に概略的に示す。適切な精度を達成するのに必要なＳＮＰの数は、農場の雌牛の数によって決まる。数万のＳＮＰは数十頭の雌牛のいる農場では十分であったが、数百頭の雌牛のいる農場では数十万のＳＮＰが必要であった。
【０００６】
雌牛の遺伝子型判定に最も一般に使用されるＳＮＰアレイは、数千のＳＮＰを調べる低密度アレイ、例えば、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ（登録商標）Ｂｏｖｉｎｅ３Ｋ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（２，９００ＳＮＰ）またはＢｏｖｉｎｅＬＤ  ｖ２．０  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｂｅａｄ  Ｃｈｉｐ（７，９３１ＳＮＰ）であり、両方ともＩｌｌｕｍｉｎａによって開発されている。調べたＳＮＰの数がやや少ない場合、特に大規模農場においては、上記のタンク乳遺伝子型判定法の精度に限界がある可能性がある（平均の農場サイズが世界中で大きくなっており、農場で既に飼育されている乳牛群の実質的な割合は、米国、ヨーロッパおよびオーストラリアにおいて２５０頭を超える搾乳牛を数えることに留意されたい）。また著者らは、高密度ＳＮＰアレイ、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａの５０，０００  ＢｏｖｉｎｅＳＮＰ５０    Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（５３，７１４ＳＮＰを特徴とする現行バージョン）またはＢｏｖｉｎｅＨＤ    Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（７７７，９６２ＳＮＰを特徴とする現行バージョン）の使用を提案しているが、このような高密度ＳＮＰアレイの使用は、コストを著しく上昇させ、したがって、農家にとってのこれらの方法への注目度を大きく低下させる可能性がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、乳、特にタンク乳のバルク核酸分析に関係した問題に対処し、および／またはそれの改善を提供する。そのような方法は、とりわけ、潜在性乳房炎もしくは臨床型乳房炎を有する、乳を寄与する雌牛を識別すること、および／または特定の雌牛（複数可）がタンクに乳を寄与したか否かを決定することができる（これは、例えば、雌牛、例えば、治療を受けている雌牛からの乳をタンクに入れないことの遵守をモニタリングするのに有用であり得る）。
【０００８】
ＤＮＡシーケンシングによる遺伝子型判定は、ＳＮＰアレイを使用する遺伝子型判定の代替技術として浮上してきた。しかし、タンク乳をバルク遺伝子型判定するための上述の既存方法におけるＳＮＰアレイ生成遺伝子型を場合によっては置き換えることができる信頼性の高い遺伝子型を生成するためには、シーケンス深度を高める必要があり、また農家は非現実的なコストに直面する可能性がある。
【０００９】
この背景に対して、本発明者らは、浅い全ゲノムシーケンシング（ｓｈａｌｌｏｗ  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＳＷＧＳ）によって示されたほとんどの多型についての対立遺伝子情報の大部分が不完全な、または「曖昧」な性質であるにもかかわらず、ＳＷＧＳは、それでもなお、乳（例えばタンク乳）のＤＮＡ多型についてのバルク対立遺伝子サンプリングに使用して、例えば、乳を寄与する個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子データと組み合わせて、乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を望ましい精度で推定することができることを思いがけず実証した。本発明者らは、乳を寄与する個体動物におけるＤＮＡ配列多型の対立遺伝子データを生成する様々な方法と組み合わせた場合、例えば、特に、未調査のＳＮＰでの遺伝子型のコンピュータでのインピュテーションの有無に関係なくＳＮＰアレイ遺伝子型判定と組み合わせた場合、またはＳＷＧＳ対立遺伝子サンプリングデータと組み合わせた場合、乳のバルクＳＷＧＳ対立遺伝子サンプリングが有益な結果を示すことを実証した。
【００１０】
したがって、ある態様は、複数の個体動物から収集されたある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を決定する方法であって、
ａ）浅い全ゲノムシーケンシング（ＳＷＧＳ）によって、ある体積の乳の試料から抽出されたＤＮＡ中の複数のＤＮＡ配列多型について対立遺伝子サンプリングするステップと；
ｂ）ステップａ）からの前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子サンプリング、および個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子データに基づいて、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を決定するステップと
を含む、方法を提供する。
【００１１】
さらなる態様は、ある体積の乳に乳を寄与する複数の個体動物から潜在性乳房炎または臨床型乳房炎を有する１頭または複数の動物を識別する方法であって、
ａ’）ＳＷＧＳによって、ある体積の乳の試料から抽出されたＤＮＡ中の複数のＤＮＡ配列多型について対立遺伝子サンプリングすることを含む方法によって、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を決定するステップと、
ｂ’）ステップａ’）で決定した、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量に基づいて、個体動物の乳中の体細胞濃度を決定するステップと；
ｃ’）ステップｂ’）で決定した、１頭または複数の動物の乳中の体細胞濃度が所定の閾値を超える場合、前記１頭または複数の動物が潜在性乳房炎または臨床型乳房炎を有すると識別するステップと
を含む、方法を提供する。
【００１２】
本発明のこれらの態様およびさらなる態様、ならびに好ましい実施形態は、以下のセクションおよび添付の特許請求の範囲に記載されている。添付の特許請求の範囲の主題は、これにより、本明細書に詳細に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、乳タンクに乳を寄与した個体搾乳牛における体細胞スコア（ＳＣＳ）の推定および（潜在性）乳房炎の検出に関する欧州特許出願公開第２５９７１５９号明細書およびＢｌａｒｄら、２０１２で提案された方法を概略的に示す。この方法は、タンク乳のＳＮＰアレイによるバルク一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子型判定を、タンク乳に寄与する個体雌牛についてのＳＮＰアレイ生成遺伝子型と組み合わせて使用した。
【図２（Ａ）】図２は、３つの異なるスキームを使用する、タンク乳のバルクＤＮＡ分析による個体雌牛についての体細胞スコア（ＳＣＳ）の推定における精度を示す：（Ａ）タンク乳、およびタンク乳に寄与する個体雌牛の両方におけるＤＮＡ多型を遺伝子型判定するためのＳＮＰアレイ（参照スキーム「Ａ」）。
【図２（Ｂ）】図２は、３つの異なるスキームを使用する、タンク乳のバルクＤＮＡ分析による個体雌牛についての体細胞スコア（ＳＣＳ）の推定における精度を示す：（Ｂ）タンク乳におけるＤＮＡ多型について対立遺伝子サンプリングするためのＳＷＧＳ、およびタンク乳に寄与する個体雌牛におけるＤＮＡ多型について遺伝子型判定するためのＳＮＰアレイ（本発明の原理を具体化するスキーム「Ｂ」）。
【図２（Ｃ）−１】図２は、３つの異なるスキームを使用する、タンク乳のバルクＤＮＡ分析による個体雌牛についての体細胞スコア（ＳＣＳ）の推定における精度を示す：（Ｃ）タンク乳、およびタンク乳に寄与する個体雌牛の両方におけるＤＮＡ多型について対立遺伝子サンプリングするためのＳＷＧＳ（本発明の原理を具体化する、スキーム「Ｃ」）。
【図２（Ｃ）−２】図２は、３つの異なるスキームを使用する、タンク乳のバルクＤＮＡ分析による個体雌牛についての体細胞スコア（ＳＣＳ）の推定における精度を示す：（Ｃ）タンク乳、およびタンク乳に寄与する個体雌牛の両方におけるＤＮＡ多型について対立遺伝子サンプリングするためのＳＷＧＳ（本発明の原理を具体化する、スキーム「Ｃ」）。
【図３】図３は、２つの異なる遺伝子型判定スキームを使用する個体雌牛についての予測ＳＣＳと測定ＳＣＳとの間の相関関係を示す。タンク乳、およびタンク乳に寄与する個体雌牛の両方におけるＤＮＡ多型について遺伝子型判定するためのＳＮＰアレイ（参照スキーム「Ａ」）；タンク乳におけるＤＮＡ多型について対立遺伝子サンプリングするためのＳＷＧＳ、ならびにタンク乳に寄与する個体雌牛におけるＤＮＡ多型について遺伝子型判定するためのＳＮＰアレイおよびコンピュータでのインピュテーション（本発明の原理を具体化するスキーム「Ｂ」）。
【図４】図４は、２つの異なる遺伝子型判定スキームを使用する、個体雌牛についての予測ＳＣＳと測定ＳＣＳとの間の相関を示す：タンク乳、およびタンク乳に寄与する個体雌牛の両方におけるのＤＮＡ多型について遺伝子型判定するためのＳＮＰアレイ（参照スキーム「Ａ」）；タンク乳におけるＤＮＡ多型について対立遺伝子サンプリングするための様々な深度（０．４×、１×、２×、４×）でのＳＷＧＳ、ならびにタンク乳に寄与する個体雌牛におけるＤＮＡ多型について遺伝子型判定するためのＳＮＰアレイおよびコンピュータでのインピュテーション（本発明の原理を具体化するスキーム「Ｂ」）。
【図５】図５は、２つの異なる遺伝子型判定スキームを使用する、選択した閾値を超えるＳＣＳと下回るＳＣＳを有する動物を識別する精度を示す：タンク乳、およびタンク乳に寄与する個体雌牛の両方におけるＤＮＡ多型について遺伝子型判定するためのＳＮＰアレイ（参照スキーム「Ａ」）；タンク乳におけるＤＮＡ多型について対立遺伝子サンプリングするための様々な深度（０．４×、１×、２×、４×）でのＳＷＧＳ、ならびにタンク乳に寄与する個体雌牛におけるＤＮＡ多型について遺伝子型判定するためのＳＮＰアレイおよびコンピュータでのインピュテーション（本発明の原理を具体化するスキーム「Ｂ」）。
【図６（Ａ）】図６（Ａ）は、２１週間にわたる１２０頭の雌牛の乳におけるＳＣＳの推定値を示し（菱形：１２週目に測定されたＳＣＳ；三角形：１２週目のタンク乳のシーケンスによるバルク遺伝子型判定によって予測されたＳＣＳ；大きい円：２１週間にわたる平均予測ＳＣＳ、小さい円ドット：個体の測定値）を示す。
【図６（Ｂ）】図６（Ｂ）は、１２週目の測定ＳＣＳと２１週間にわたる平均予測ＳＣＳとの間の相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明白に他のことを指示しない限り、単数および複数の指示物の両方を含む。
本明細書で使用される場合の用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」とは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義的であり、また包括的もしくはオープンエンドであり、追加の列挙されなかったメンバー、要素もしくは方法のステップを除外しない。またこれらの用語には、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「〜から本質的なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」も包含されるが、これらは、特許用語において確立された意味を享受する。
【００１５】
エンドポイントによる数値範囲の詳説には、それぞれの範囲内に含めたすべての数および分数、ならびに詳説したエンドポイントが含まれる。
本明細書で使用される場合の用語「約」または「およそ」とは、パラメータ、分量、時間的な期間などの測定可能な値を意味する場合、所定値のおよび所定値からの変動、例えば、そのような変動が開示した発明において実施されるのに適切である限り、所定値のおよび所定値からの＋／−１０％以下、好ましくは＋／−５％以下、より好ましくは＋／−１％以下、さらにより好ましくは＋／−０．１％以下の変動を包含することを意味する。修飾句の「約」が意味する値はまた、それ自体、詳細に、および好ましく開示されていることを理解されたい。
【００１６】
用語の「１つまたは複数」または「少なくとも１つ」、例えば、１つもしくは複数のメンバー、またはメンバーの群の少なくとも１つのメンバーとは、それ自体は明白であるが、さらなる例示によって、用語は、とりわけ、前記メンバーの任意の１つ、または前記メンバーの任意の２つ以上、例えば前記メンバーの任意の≧３、≧４、≧５、≧６もしくは≧７など、および前記メンバーの全部以下に言及することを包含する。別の例において、「１つまたは複数」あるいは「少なくとも１つ」とは、１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上を意味し得る。
【００１７】
本明細書における本発明の背景の論旨は、本発明の文脈を説明するために含まれる。これは、言及したいずれかの内容が、特許請求の範囲のいずれかの優先日の時点でいずれかの国において公開されていたか、公知となっていたか、または通常の一般的な知識の一部であったことを承認するものではない。
【００１８】
この開示全体にわたって、様々な出版物、特許、および公開特許明細書は、引用を記載することにより参照される。本明細書において引用されたすべての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特に、本明細書において詳しく参照されたそのような文書の教示またはセクションは、参照により組み込まれる。
【００１９】
別段の定義がない限り、技術用語および科学用語を含む本発明の開示において使用したすべての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。さらなるガイダンスによって、用語定義が、本発明の教示をよりいっそう理解するために含まれる。特定の用語が、本発明の特定の態様または本発明の特定の実施形態に関連して定義される場合、そうした意味合いは、本明細書の全体にわたって、すなわち、特段の定義のない限り、本発明の他の態様または実施形態の文脈においても適用されることを意味する。
【００２０】
以下の節において、本発明の異なる態様または実施形態がより詳細に定義される。そのように定義したそれぞれの態様または実施形態は、反対に明白に示されない限り、任意の他の態様（複数可）または実施形態（複数可）と組み合わせることができる。特に、好ましい、または有利であると示されている任意の特徴は、好ましい、または有利であると示されている任意の他の１つまたは複数の特徴と組み合わせることができる。
【００２１】
本明細書の全体にわたる「一実施形態」、「実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載した特定の特徴、構造、または特性が本発明の少なくとも一実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な箇所における「一実施形態では」または「実施形態では」という語句の出現は、必ずしも同じ実施形態をすべて言及するとは限らないが、その可能性もある。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つまたは複数の実施形態において、当業者には本開示から明白であるように、任意の適切な方法で組み合わせてもよい。さらに、本明細書に記載したいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれる一部の特徴を含むが他の特徴は含まず、異なる実施形態の特徴の組合せは、当業者によって理解されるように、本発明の範囲内にあり、異なる実施形態を形成することを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲においては、特許請求された実施形態のいずれも、任意の組合せで使用することができる。
【００２２】
本発明者らは、浅い全ゲノムシーケンシング（ＳＷＧＳ）を、乳（例えばタンク乳）におけるＤＮＡ多型についてのバルク対立遺伝子サンプリングに使用して、例えば、乳を寄与する個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子データと組み合わせて、乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を望ましい精度および信頼性で推定することができることを思いがけず実証した。
【００２３】
本発明者らの認識を具体化する方法は、有利には、例えば、潜在性乳房炎または臨床性乳房炎を有する、タンク乳に寄与する雌牛を識別すること；および／または特定の雌牛（複数可）がタンクに乳を寄与したか否かを決定することができる（これは、雌牛、例えば治療を受けている雌牛からの乳をタンクに入れないことの遵守をモニタリングするのに有用であり得る）。
【００２４】
したがって、ある態様は、複数の個体動物から収集されたある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を決定する方法であって、
ａ）浅い全ゲノムシーケンシング（ＳＷＧＳ）によって、ある体積の乳の試料から抽出されたＤＮＡ中の複数のＤＮＡ配列多型について対立遺伝子サンプリングするステップと；
ｂ）ステップａ）からの前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子サンプリング、および個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子データに基づいて、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を決定するステップと
を含む、方法を提供する。
【００２５】
さらなる態様は、ある体積の乳に乳を寄与する複数の個体動物から潜在性乳房炎または臨床型乳房炎を有する１頭または複数の動物を識別する方法であって、
ａ’）ＳＷＧＳによって、ある体積の乳の試料から抽出されたＤＮＡ中の複数のＤＮＡ配列多型について対立遺伝子サンプリングすることを含む方法によって、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を決定するステップと、
ｂ’）ステップａ’）で決定した、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量に基づいて、個体動物の乳中の体細胞濃度を決定するステップと；
ｃ’）ステップｂ’）で決定した、１頭または複数の動物の乳中の体細胞濃度が所定の閾値を超える場合、前記１頭または複数の動物が潜在性乳房炎または臨床型乳房炎を有すると識別するステップと
を含む、方法を提供する。
【００２６】
用語の「量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）」、「分量（ａｍｏｕｎｔ）」、および「レベル」は同義語であり、当技術分野においては一般によく理解されている。ある特定の実施形態では、これらの用語は、目的の物体または材料中の分析物の絶対定量または相対定量を意味し得る。定量は、前記の目的の物体もしくは材料の分析を要する場合があり、より典型的には、前記の目的の物体もしくは材料の試料の分析を要する場合がある。目的の物体または材料中の分析物の絶対量は、重量としてもしくはモル量として、またはより一般的には濃度として、例えば、体積当たりの重量もしくは体積当たりのモルとして、適切に示すことができる。目的の物体または材料中の分析物の相対量は、適切な参照変数と比較して有利に示すことができる。非限定的な例においては、目的の物体または材料中の分析物の量は、前記の目的の物体または材料中の第２の分析物の量と比較して示すことができ、また前記分析物間の重量比もしくはモル比によって適切に表すことができる。非限定的な例においては、目的の物体または材料中の分析物の量は、前記の目的の物体または材料中の同じ化学クラスのすべての分析物の合計量と比較して示すことができ、また前記分析物と前記合計との間の重量比またはモル比（割合またはパーセンテージ）によって適切に表すことができる。さらに別の非限定的な例においては、目的の物体または材料中の分析物の量は、目的の別の物体または材料中の同じ分析物の量と比較して示すことができ、また前記量の比によって、または前記の量の間の倍数増加もしくは倍数減少により適切に表すことができる。第１の変数と第２の変数（例えば、第１の量と第２の量）との間の相対比較の実施は、前記の第１の変数および第２の変数の絶対値を決定することを課す場合があるが、必要ではない。例えば、限定するものではないが、定量化法は、個体の分析物の絶対量またはすべてのそのような分析物の絶対総量を決定または計算することを必要とすることなく、同じ化学クラスの２つ以上のそれぞれの分析物の、目的の物体または材料中のすべてのそのような分析物の総量に対する相対寄与（例えば、重量比またはモル比、割合またはパーセンテージ）を決定することを可能にすることができる。
【００２７】
したがって、ある特定の実施形態では、本方法は、乳に個体動物が寄与したＤＮＡの絶対量を決定することを可能にし得るが、これは、乳の体積当たりの所与の動物由来のＤＮＡの重量（ｗ／ｖ）、または乳中の所与の動物由来のＤＮＡ濃度（ｍｏｌ／ｖ）によって適切に表すことができる。
【００２８】
より典型的な実施形態では、本方法は、乳中のＤＮＡに対する（より詳細には、乳中の前記動物からのＤＮＡのプールに対する）個体動物の相対寄与を決定する。乳中のＤＮＡに対する所与の動物の相対寄与は、前記動物に由来するかまたは起因する乳ＤＮＡの比率（割合またはパーセンテージ）によって適切に表すことができる。本方法は、単位のない変数として前記比率を都合よく推定することができる。
【００２９】
したがって、ある特定の好ましい実施形態では、本発明の方法は、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率を決定する。
本明細書で使用される場合の用語「ＤＮＡ」とは、デオキシリボ核酸を意味する。この用語は、細胞中に存在する場合、細胞から放出された場合、ならびにそのような供給源から少なくとも部分的に精製または抽出された場合のＤＮＡを包含する。本方法において、この用語は、特に、個体動物、より詳細には個体動物の体細胞、さらにより詳細には個体動物の有核体細胞からのＤＮＡを意味する。ゲノム（核）ＤＮＡが特に本明細書で意図されている。この用語は、本方法に伴う技術的操作、例えばＳＷＧＳおよびＳＮＰアレイ遺伝子型判定を適切に実施するのに適した任意の形態のＤＮＡを包含する。限定ではない例として、この用語は、二本鎖ＤＮＡ；一本鎖ＤＮＡ、例えば変性ＤＮＡ；無傷ＤＮＡ；断片化ＤＮＡ、例えば、物理的力（例えば、音響的剪断、超音波処理、流体力学的剪断）の適用によって、または酵素的方法（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼもしくは他の制限エンドヌクレアーゼ、非特異的ヌクレアーゼ、トランスポザーゼ）によって断片化されたＤＮＡ；化学的に修飾されたＤＮＡ、例えば標識ＤＮＡ；アダプター配列がライゲーションされた断片化ＤＮＡ；ベクターにライゲーションされた断片化ＤＮＡ；などを包含し得る。
【００３０】
本明細書で使用される場合の用語「動物」とは、任意の乳を生産する動物を包含し、特に、雌の泌乳哺乳動物、好ましくは非ヒト泌乳哺乳動物を意味する。
ある特定の実施形態では、動物は泌乳家畜であり、特に雌の泌乳家畜哺乳動物である。用語の「家畜」または「家畜哺乳動物」は、利益のため、または使用のため、例えば、限定するものではないが、消費、間接的消費（すなわち、乳製品などの食料の生産）、皮革生産、毛皮生産、繁殖、研究のため、または荷物運搬用の動物として、維持され飼育される任意の家畜種の動物または哺乳動物を包含する。
【００３１】
ある特定の実施形態では、動物は、ウシ科またはウシ科の雑種である。ウシ科とは、ウシ科に属する偶蹄の反蹄類哺乳動物である。メンバーとしては、例えば、限定するものではないが、野生および家畜のウシ、バイソン（アメリカ水牛）、アフリカ水牛、水牛、レイヨウ、ガゼル、ヒツジ、ヤギ、ジャコウウシおよびヤクが挙げられる。ウシ科のファミリーの異なる２種のメンバーの雑種には、例えば、アメリカ野牛またはヨーロッパ野牛と家畜牛の雑種、家畜牛／ヤクの雑種、家畜牛／水牛の雑種、野牛／ヤクの雑種などが含まれる。
【００３２】
ある特定の好ましい実施形態では、動物は、特に野生牛および家畜牛、バイソン、アフリカ水牛、水牛、およびヤクを含むウシ（ウシ亜科ファミリー）である。好ましくは、動物は、Ｂｏｓ属に属していてもよい。
【００３３】
ある特定のより好ましい実施形態では、動物は、ウシ、より詳しくは、家畜牛、例えば、任意のウシ繁殖種を含むボス・タウルス（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）種もしくはボス・インディカス（Ｂｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ）種の動物、または雑種牛である。したがって、特に好ましい動物は、搾乳牛を含む。
【００３４】
ある特定のさらに好ましい実施形態では、動物は、水牛、例えばアメリカ水牛またはアフリカ水牛である。
ある特定のさらなる実施形態では、動物はヒツジ、好ましくはオヴィス・アリエス（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ）である。
【００３５】
ある特定のさらなる実施形態では、動物はヤギ、好ましくはカプラ・アエガグルス・ヒルクス（Ｃａｐｒａ  ａｅｇａｇｒｕｓ  ｈｉｒｃｕｓ）である。
語句の「複数の個体動物から収集されたある体積の乳」とは、そのような複数の個体動物から収集された乳の任意のミックスまたはプールを広く意味する。この語句は、乳の分量もしくは体積（Ｌ）、または乳が保管もしくは貯蔵された貯蔵所または容器に関して制限を課さない。例えば、複数の動物から収集されプールされた任意のバルク量の乳が包含される。
【００３６】
本明細書で使用される場合の用語「複数」とは、１より大きい（＞１）というその通常の意味を有する。好ましくは、「複数の個々の動物」という用語は、個体搾乳動物、例えば、ウシ、雑種のウシ、水牛、ヒツジまたはヤギなどの典型的に分類される群または群れを包含するものとする。したがって、ある特定の実施形態では、語句の「複数の個体動物」とは、５頭以上（≧５）、≧１０、≧１５、≧２０、≧２５、≧３０、≧４０、≧５０、≧６０、≧７０、≧８０、≧９０、≧１００、≧１５０、≧２００、≧２５０、≧３００、≧４００、≧５００、≧６００、≧７００、≧８００、≧９００、≧１０００、≧１５００、または≧２０００頭の個体動物を表し得る。ある特定のさらなる実施形態では、語句の「複数の個体動物」とは、５０００以下、例えば、４０００以下、３０００以下、２５００以下、２０００以下、１５００以下、または１０００頭以下の個体動物を表し得る。ある特定のさらなる実施形態では、語句の「複数の個体動物」は、１０〜２５頭の間、または２５〜５０頭の間、または５０〜１００頭の間、または１００〜２５０頭の間、または２５０〜５００頭の間、または５００〜１０００頭の間の個体動物を示し得る。ある特定の実施形態では、本方法は、１つの農場からの複数の個体動物から収集されたある体積の乳（例えばタンク乳）に適用することができる。ある特定の実施形態では、本方法は、２つ以上の農場からの複数の個体動物から収集されたある体積の乳（例えばタンク乳）に適用することができる。ある特定の実施形態では、本方法は、典型的には、相当数の農場から収集された乳を含み得る、搾乳場でのある体積の乳（例えばタンク乳）に適用することもできる。したがって、ある特定の実施形態では、語句の「複数の個体動物」とは、５０００頭を超える個体動物を表すこともできる。本文脈における用語「複数の個体動物」とは、典型的には、排他的ではないが、そのすべてが同じ種の動物を示すことができる。この用語は、さらに、典型的には、排他的ではないが、そのすべてが同じ亜種、または同じ変種、または同じ繁殖種の動物を示すことができる。例示的な例として、この用語は、複数の搾乳牛ボス・タウルスを示し得る。他の例示的な例として、この用語は、複数の搾乳ホルスタイン・フリーシアン牛、または複数の搾乳ノルウェージャンレッド（Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ｒｅｄ）牛、または複数の搾乳コストロマ（Ｋｏｓｔｒｏｍａ）牛、または複数の搾乳ブラウンスイス牛、または複数の搾乳スウェーデンレッド牛、または複数の搾乳エアーシア（Ａｙｒｓｈｉｒｅ）牛、または複数の搾乳アンゲルン（Ａｎｇｅｌｎ）牛、または複数の搾乳ガーンジー牛、または複数の搾乳ショートホーン牛、または複数の搾乳パイ・ルージュ・デス・プレーンズ（Ｐｉｅ  Ｒｏｕｇｅ  ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ）牛を意味し得る。
【００３７】
ある特定の他の実施形態では、用語の「複数の個体動物」とは、そのすべてが同じ種または亜種であるが、同じ変種または繁殖種ではない動物を示し得る。例えば、複数には、２種以上の変種または繁殖種、例えば２〜５種、例えば３または４種の異なる変種または繁殖種の動物を含むことができる。
【００３８】
ある特定の実施形態では、ある体積の乳は、タンク乳、すなわち、農場で搾乳動物から収集され、慣例的に「乳タンク」と呼ばれる容器に保管された乳を意味し得る。市販の乳タンクは、典型的には、乳運搬業者によって毎日収集される前に、収集した乳を冷蔵し混合することができる。乳タンクは、サイズが最小タンクの１００リットル（Ｌ）からサイロタンクの１５０，０００Ｌまで大幅に異なる。乳サイロは、典型的には２５，０００〜１５０，０００Ｌの容量を有し得るが、中間の乳タンクは、典型的には１０００〜１０，０００Ｌの間の容量を有し、小型乳タンクは、典型的には１５０〜３０００Ｌの間の容量を有し得る。
【００３９】
本方法のステップａ）は、浅い全ゲノムシーケンシング（ＳＷＧＳ）により、ある体積の乳の試料から抽出されたＤＮＡ中の複数のＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子サンプリングを含む。
【００４０】
用語「試料」は、従来のように理解される通りであり、また特に、取り出されるか取得された全体（例えば、物体または材料）の質（すなわち、代表的または特徴的な特性）を示す、限定された量、部分または検体を意味する。本文脈において、試料は、ある特定の体積の乳であり得る。当業者は、本方法を実施することができるように適切な量の試料を選択することができる。
【００４１】
ＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡは、当技術分野で公知の方法において、ＤＮＡ含有試料から抽出または単離することができる。組成物または混合物（例えば、乳の試料）の特定の成分（例えばＤＮＡ）に関連する用語の「抽出する」または「単離する」とは、そのような成分が１つまたは複数または（実質的に）すべての他の成分から分離されるプロセスまたは技術を包含する。この用語は、絶対的純度を必要としない。代わりに、成分の単離により、１つまたは複数またはすべての他の成分と比べて、成分の存在量が開始時の組成物または混合物の存在量よりも多い分離環境が生じる。分離環境は、単一の媒体、例えば、単一の溶液、分散液、ゲル、沈殿物などを示し得る。核酸の量は、吸光度Ａ２６０の測定により決定することができる。核酸の純度は、吸光度Ａ２６０／Ａ２８０を測定することにより、またはアガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動および臭化エチジウムまたは同様の染色により決定することができる。ＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡを抽出または単離する従来の技術としては、限定するものではないが、有機（フェノール−クロロホルム）抽出、非有機（プロテイナーゼＫおよび塩析）抽出、イオン交換樹脂抽出、またはシリカ交換樹脂抽出が挙げられる。特に、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１；ならびにＳｈａｒｍａ  １９９３を参照されたい。
【００４２】
用語「ＤＮＡ配列多型」とは、自然個体群における遺伝子座（多型遺伝子座または多型部位）での２つ以上の遺伝的に決定された代替配列または「対立遺伝子」の発生を意味する。本明細書で特に意図されるのは、ゲノム（染色体）ＤＮＡにおける配列多型である。多型遺伝子座または多型部位は、限定するものではないが、自然個体群において、２、３、４、５個またはそれ以上の異なる対立遺伝子を示し得る。典型的には、遺伝子座または遺伝子部位は、前記遺伝子座または遺伝子部位でのマイナー対立遺伝子またはレア対立遺伝子が０．０１（１％）以上の頻度を有する場合に多型である（したがって、遺伝子分析に有用である）と考えることができ、一方、０．０１（１％）未満のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有する多型遺伝子座、例えば、０．００１（０．１％）以上、０．００２（０．２％）以上、または０．００５（０．５％）のＭＡＦもまた、本方法において適用可能である。二倍体生物、特に二倍体生物の体細胞は、所与の多型遺伝子座または多型部位で対立遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。例えば、２つの異なる対立遺伝子（ＡおよびＢ）が自然個体群における多型遺伝子座または多型部位に存在する場合、その個体群からの個体は、Ａ対立遺伝子（遺伝子型ＡＡ）についてはホモ接合体であってもよく、Ｂ対立遺伝子（遺伝子型ＢＢ）についてはホモ接合体であってもよく、またはヘテロ接合体（遺伝子型ＡＢまたはＢＡ）であってもよい。
【００４３】
ＤＮＡ配列多型としては、特に、限定するものではないが、一塩基多型（１つまたは複数のＳＮＰ）；制限断片長多型（ＲＦＬＰ）；「マイクロサテライト」またはショートタンデムリピート（ＳＴＲ）（例えばジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピートもしくはテトラヌクレオチドリピート）および「ミニサテライト」（例えば１０〜１００ｂｐ長のＤＮＡモチーフのリピート）を含む、可変数のタンデムリピート（ＶＮＴＲ）；インデル（複数のヌクレオチドの挿入または欠失）；超可変領域；短鎖散在反復配列（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  （ＳＩＮＥ））、例えばＡｌｕエレメント；およびコピー数多型（ＣＮＶ）が挙げられる。任意のそのようなＤＮＡ配列多型のタイプまたはそれらの任意の組合せを本方法において使用することができる。
【００４４】
ある特定の好ましい実施形態では、ＤＮＡ配列多型は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。ＳＮＰは単一ヌクレオチドによって占められている多型部位で生じ、それは対立遺伝子配列間の変異の部位である。ＳＮＰは、通常、トランジション（プリンの別のプリンによる置き換え、またはピリミジンの別のピリミジンによる置き換え）、およびトランスバージョン（プリンのピリミジンによる置き換え、またはピリミジンのプリンによるによる置き換え）を含む、多型部位での１つのヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換によって生じる。またＳＮＰは、参照対立遺伝子に対するヌクレオチドの欠失（単一ヌクレオチド欠失）またはヌクレオチドの挿入（単一ヌクレオチド挿入）により生じる可能性がある。ＳＮＰは、典型的には、最も豊富なタイプのゲノムＤＮＡ配列多型であり、それらの密度は、数十塩基対当たり１ＳＮＰから数百塩基対当たり１ＳＮＰの範囲であってもよく、例えば、１００塩基対当たり１ＳＮＰである。
【００４５】
現在、多くの動物、より詳しくは搾乳農場動物について報告されている数百万から数千万のＳＮＰが存在し、これらまたはこれらのサブセットは、本発明の方法において有用であり得、例えば、限定するものではないが、
−  ウシ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｓｎｐ＿ｂａｔｃｈＳｅａｒｃｈ．ｃｇｉ？ｏｒｇ＝９９１３＆ｔｙｐｅ＝ＳＮＰ）；
−  ヒツジ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｓｎｐ＿ｂａｔｃｈＳｅａｒｃｈ．ｃｇｉ？ｏｒｇ＝９９４０＆ｔｙｐｅ＝ＳＮＰ）；または、
−  ヤギ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｓｎｐ＿ｂａｔｃｈＳｅａｒｃｈ．ｃｇｉ？ｏｒｇ＝９９２５＆ｔｙｐｅ＝ＳＮＰ）
であり；典型的には全ゲノム研究を可能にするようにそれぞれのゲノムにわたり等間隔に配置されたＳＮＰを含む、低密度および高密度のＳＮＰ遺伝子型判定アレイもまた、そのような動物に関して市販されており、本方法において有用なＳＮＰの好ましいサブセットを表す可能性があり、例えば、限定するものではないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａの
−  ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ（登録商標）ウシ（Ｂｏｖｉｎｅ）３Ｋ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（２，９００ＳＮＰ）；
−  ウシＬＤ  ｖ２．０  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（７，９３１ＳＮＰ）；
−  ウシＳＮＰ５０    Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（５３，７１４ＳＮＰ）；
−  ウシＨＤ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（７７７，９６２ＳＮＰ）；
−  ヒツジ（Ｏｖｉｎｅ）ＳＮＰ５０  ＢｅａｄＣｈｉｐ（５４，２４１ＳＮＰ）；または
−  ヤギ（Ｇｏａｔ）ＳＮＰ５０  ＢｅａｄＣｈｉｐ（＞５０，０００ＳＮＰ）
がある。
【００４６】
本明細書で意図される場合の語句「複数のＤＮＡ配列多型」とは、本方法が目的の結果（例えば、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率もしくは量、または個体動物の乳中の体細胞濃度など）を望ましい精度で決定または推定することを可能にする任意の数の多型を広く意味する。例として、限定するものではないが、そのような精度は、適切な統計的手法（ピアソン、スピアマン、またはケンドールの相関）によって計算される、本方法によって決定または推定された結果と（例えば乳のＤＮＡ量または細胞濃度が個体雌牛について別々に測定される場合の）実際の状況との間の相関（ｒ）として表すことができまる。好ましくは、ｒは、≧０．７５であってもよく、より好ましくは≧０．８０、さらにより好ましくは≧０．８５、さらにより好ましくは≧０．９０、例えば０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９またはさらには１．００であってもよい。別の例として、限定するものではないが、そのような精度は、（Ｔｐ＋ＴＮ）／ｍとして測定されるある特定の閾値（式中、Ｔｐは真陽性の数を表し、ＴＮは真陰性の数を表し、ｍは動物の総数を表す）を下回る場合に対して上回る体細胞スコア（ＳＣＳ）を有する動物を識別する能力として表すことができる。多型の数は、いくつかの変数、例えば、限定するものではないが、必要とされる精度、動物の種、亜種、変種または繁殖種、ある体積の乳に寄与する動物の数、ＳＷＧＳシーケンシングの深度、多型のヘテロ接合性のタイプおよび程度などに依存し得る。
【００４７】
ある特定の実施形態では、本方法は、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００、または少なくとも２５，０００、または少なくとも５０，０００、または少なくとも１００，０００、または少なくとも２５０，０００、または少なくとも５００，０００、または少なくとも７５０，０００、または少なくとも１．０×１０６、または少なくとも２．０×１０６、または少なくとも３．０×１０６、または少なくとも４．０×１０６、または少なくとも５．０×１０６、または少なくとも６．０×１０６、または少なくとも７．０×１０６、または少なくとも８．０×１０６、または少なくとも９．０×１０６、または少なくとも１．０×１０７、または少なくとも１．５×１０７、または少なくとも２．０×１０７個のＤＮＡ配列多型を分析することができる。ある特定の好ましい実施形態では、本方法は、少なくとも１×１０５、好ましくは少なくとも５×１０５、より好ましくは少なくとも１×１０６、さらにより好ましくは少なくとも５×１０６、または少なくとも８×１０６個のＤＮＡ配列多型を分析することができる。ある特定の実施形態では、本方法は、２．０×１０７未満、または１．５×１０７未満、または１．０×１０７個未満のＤＮＡ配列多型、例えば１．０×１０６から１．０×１０７個の間のＤＮＡ配列多型、例えば約１．０×１０６、または約２．０×１０６、または約３．０×１０６、または約４．０×１０６、または約５．０×１０６、または約６．０×１０６、または約７．０×１０６、または約８．０×１０６、または約９．０×１０６、または約１．０×１０７個のＤＮＡ配列多型を分析することができる。
【００４８】
用語の「全ゲノムシーケンシング」（ＷＧＳ）とは、生物体の全ゲノムまたは複数の生物体のゲノム（例えば、特にゲノムＤＮＡ）が、典型的には１回、シーケンシングのワークフローに入れられる方法および方法を広く意味する。したがって、シーケンシングのためにゲノム（複数可）のある特定の部分（複数可）だけを、他の部分の表現を除外または低減しながら、意図的に標的化または選択するステップは含まれていない。この用語は、（各）生物体の全ゲノムが効果的にシーケンシングされることを意味するのではなく、ゲノムＤＮＡのある特定の部分について（例えば、コード配列またはエキソンについて）選択または優先を制御することなく、試料中の全ゲノムＤＮＡが所与の深度にシーケンシングされることを意味する。したがって、例えば、全ゲノムシーケンシングの選択深度は、ゲノム（複数可）のすべてが完全にはシーケンシングされないが、配列が得られない部分は実質的にランダムにまたは普通に分布されているようなものであり得る。また、ゲノム（複数可）のある特定の部分は、シーケンシングに簡単には適応可能でない可能性があり（例えば反復配列）、そのような部分は、非意図的に配列内に少ししか存在しない場合がある。全ゲノムシーケンシングは、実質的にゲノム（複数可）全体または端から端まで多型の、すなわち、限定するものではないが、ゲノム（複数可）のある特定の部分（複数可）における多型の対立遺伝子をシーケンシングすることを可能にする。当業者には公知である様々なシーケンシング方法、特に次世代またはハイスループットシーケンシング（ＮＧＳ）は、現在、ＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡの全ゲノムシーケンシングを可能にする。市販の例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａの色素シーケンシング、パイロシーケンシング（Ｑｉａｇｅｎ）、またはＳＭＲＴシーケンシング（ＰａｃＢｉｏ）が挙げられる。これらの方法は、周知の全ゲノムショットガン方法を使用する。第３世代の方法は、例えば、走査トンネル電子顕微鏡（ＴＥＭ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、単一分子検出、またはナノポアシステムを使用する。例えば、Ｎｉｅｄｒｉｎｇｈａｕｓら、２０１１を参照されたい。
【００４９】
用語の「浅い全ゲノムシーケンシング」は、比較的低いまたは浅いシーケンシングのカバレッジまたは深度を提供するように構成されたＷＧＳを意味するために当技術分野で一般的に使用されている。用語の「シーケンシング深度」、「読み取り深度」、「シーケンシングカバレッジ」または「カバレッジ」は、それらの従来の意味で使用される。一般に、これらの用語は、配列内の所与のヌクレオチドが読み取られたか、またはシーケンシングされた平均回数を示す。したがって、例えば、０．２５、１．０、１０、または３０のシーケンシングカバレッジまたは深度は、平均で、各ヌクレオチドがそれぞれ０．２５、１．０、１０、または３０回シーケンシングされたことを意味する。シーケンシング深度は、シーケンシングされたゲノムの長さ（Ｇ）、読み取り数（Ｎ）、および平均読み取り長（Ｌ）からＮ×Ｌ／Ｇとして便宜的に計算することができる。配列カバレッジは、さらにＳｉｍｓら、２０１４において説明されている。例として、限定するものではないが、ＳＷＧＳのシーケンシング深度は１０以下であってもよい。特に好ましい実施形態では、ＳＷＧＳのシーケンシング深度は５以下、例えば、約５．０、約４．０、約３．０、または約２．０、さらにより好ましくは１．０以下、例えば、約１．０、約０．９５、約０．９０、約０．８５、約０．８０、約０．７５、約０．７０、約０．６５、約０．６０、約０．５５、約０．５０、約０．４５、約０．４０、約０．３５、約０．３０、約０．２５、約０．２０、約０．１５、または約０．１０、または約０．０５であり得る。特に好ましい実施形態では、ＳＷＧＳのシーケンシング深度は、０．１０と１．０との間、例えば０．２５と１．０との間であり得る。約１．０以下のシーケンシング深度は、便宜的に「低」と示すことができるが、約０．２５以下（例えば、０．０５と０．２５との間、または０．１０と０．２５との間）のシーケンス深度は、便宜的に「超低」と示すことができる。
【００５０】
シーケンシング深度は、とりわけ農場の大きさ、すなわち、乳に寄与する動物の数に基づいて選択または最適化することができる。例えば、ある特定の実施形態では、乳のシーケンス深度０．２５は、１００頭以下の動物（例えば雌牛）がいる農場に満足のいく精度を提供するのには十分であり得、２５０頭以下の動物（例えば雌牛）のいる農場にはシーケンス深度０．５であり、５００頭以下の動物のいる農場（例えば雌牛）にはシーケンス深度２．０であり、１０００頭以下の動物のいる農場（例えば雌牛）のシーケンス深度は５．０である。
【００５１】
ある特定の実施形態では、本方法のステップａ）および／またはステップｂ）において、あるいはステップａ’）において、ＳＷＧＳのシーケンシング深度は、０．１０〜１０．０、好ましくは０．２５〜５．０であり、例えば、約０．２５、約０．５０、約０．７５、約１．０、約２．０、約３．０、約４．０、または約５．０のシーケンス深度である。ある特定のさらなる実施形態では、本方法のステップａ）および／またはステップｂ）において、あるいはステップａ’）において、ＳＷＧＳのシーケンス深度は、０．２５〜１．０、好ましくは約０．２５または約１．０である。
【００５２】
ＳＷＧＳによる複数のＤＮＡ配列多型についての「対立遺伝子サンプリング」という語句は、ＳＷＧＳにより、前記複数のＤＮＡ配列多型の少なくともいくつかの対立遺伝子（複数可）に関する少なくともいくつかの情報を生成または収集することを広く意味する。ＳＷＧＳの浅いシーケンシング深度により、対立遺伝子情報は、大部分が不完全かまたは「曖昧な」になる傾向がある。例えば、ＳＮＰの対立遺伝子に関する平均の読み取り数は、ＳＷＧＳのシーケンシング深度に対応すると予想される。したがって、多型遺伝子座の分画は、読み取り無し、１つだけの読み取りによる分画、２つ以上の読み取りによる分画でカバーされ得る。例として、限定するものではないが、平均がシーケンシング深度に等しいポアソン分布に基づいて：
−  シーケンシング深度１．０については、多型遺伝子座の６３％がサンプリングされる（すなわち、少なくとも１回の読み取り）が、多型遺伝子座の３７％がサンプリングされず（すなわち、読み取り無し）、またサンプリングされた遺伝子座のうちただ１つの対立遺伝子（１回の読み取り）は５８％の遺伝子座に対してサンプリングされ、２回以上の読み取りは４２％の遺伝子座に対してサンプリングされ得る；あるいは、
−  シーケンシング深度０．２５については、多型遺伝子座の２２％がサンプリングされる（すなわち、少なくとも１回の読み取り）が、多型遺伝子座の７８％がサンプリングされず（すなわち、読み取りは無し）、サンプリングされた遺伝子座のうちただ１つの対立遺伝子（１回の読み取り）は８８％の遺伝子座に対してサンプリングされ、２回以上の読み取りは１２％の遺伝子座に対してサンプリングされ得る。
【００５３】
したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で意図されるＳＷＧＳによるＤＮＡ配列多型の対立遺伝子サンプリングは、低対立遺伝子サンプリングであってもよく（特に、約１．０以下のＳＷＧＳシーケンシング深度によって得られるか、もしくは得ることができる）、または超低対立遺伝子サンプリングであってもよい（特に、約０．２５以下、例えば０．０５と０．２５との間、もしくは０．１０と０．２５との間のＳＷＧＳシーケンシング深度によって得られるか、もしくは得ることができる）。
【００５４】
例えば、ある特定の実施形態では、約１０％〜約８０％の多型遺伝子座は少なくとも１回の読み取りによってサンプリングされるが、約９０％〜約２０％の多型遺伝子座はサンプリングされない（読み取りは無し）。さらなる実施形態では、多型遺伝子座の約１０％〜約７０％は少なくとも１回の読み取りによってサンプリングされるが、多型遺伝子座の約９０％〜約３０％はサンプリングされない（読み取りは無し）。さらなる実施形態では、約１５％〜約６５％の多型遺伝子座は少なくとも１回の読み取りによってサンプリングされるが、約８５％〜約３５％の多型遺伝子座はサンプリングされない（読み取りは無し）。さらなる実施形態では、約２０％〜約６０％の多型遺伝子座は少なくとも１回の読み取りによってサンプリングされるが、約８０％〜約４０％の多型遺伝子座はサンプリングされない（読み取りは無し）。例えば、ある特定の実施形態では：約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％、または約７０％の多型遺伝子座は少なくとも１回の読み取りでサンプリングされるが、それぞれ、約８５％、または約８０％、または約７５％、または約７０％、または約６５％、または約６０％、または約５５％、または約５０％、または約４５％、または約４０％、または約３５％、または約３０％の多型遺伝子座はサンプリングされない（読み取りは無し）。ある特定の実施形態では、本方法は、後続の分析において、予め選択された数の読み取り（例えば、１回だけの読み取り、または２回以下の読み取り、または３回以下の読み取り）によってサンプリングされた多型のみを含めることを必要とし得る。
【００５５】
ある特定のステップでは、ステップａ）またはステップａ’）におけるＳＷＧＳによる前記ＤＮＡ配列多型の対立遺伝子サンプリングは、低または超低対立遺伝子サンプリングである。
【００５６】
ＳＷＧＳが任意の所与の多型（例えばＳＮＰ）の対立遺伝子情報を全くもたらさないか、または不完全に、もしくは比較的不正確にもたらし得るという事実にもかかわらず、本発明者らは、思いがけず、多数の、例えば数十万から数百万の多型についてのＳＷＧＳによる対立遺伝子サンプリングからのこの「曖昧な」情報の組込みを、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率もしくは量、または個体動物の乳中の体細胞濃度に関する非常に有用であって正確な推定値を得るためになお使用することができることを確認した。
【００５７】
本方法のステップｂ）は、ステップａ）からの前記ＤＮＡ配列多型の対立遺伝子サンプリング、および個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子データに基づいて、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を決定するステップを含む。
【００５８】
この文脈において、用語の「対立遺伝子データ」とは、個体動物における前記多型についての対立遺伝子情報、例えば、別個の遺伝子型（すなわち、多型遺伝子座に存在する両方の対立遺伝子の同一性）、対立遺伝子の構成もしくは量、またはＳＷＧＳからの対立遺伝子サンプリングデータ（すなわち、ＳＷＧＳ対立遺伝子サンプリングデータ）の質および量を広く包含する。
【００５９】
したがって、ある特定の実施形態では、ステップｂ）における個体動物の前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子データは、個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型もしくは対立遺伝子の量、および／または個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についてのＳＷＧＳ対立遺伝子サンプリングデータを含むか、またはそれらからなる。
【００６０】
ある特定の実施形態では、ステップｂ）における個体動物の前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子データは、個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型を含むか、またはそれからなる。
【００６１】
ある特定の実施形態では、ステップｂ）における個体動物の前記ＤＮＡ配列多型の対立遺伝子データは、個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についてのＳＷＧＳ対立遺伝子サンプリングデータを含むか、またはそれからなる。
【００６２】
ある特定の好ましい実施形態では、ステップｂ）における個体動物のＳＷＧＳ対立遺伝子サンプリングデータは、５以下、例えば、約５．０、約４．０、約３．０、または約２．０、さらにより好ましくは１．０以下、例えば、約１．０、約０．９５、約０．９０、約０．８５、約０．８０、約０．７５、約０．７０、約０．６５、約０．６０、約０．５５、約０．５０、約０．４５、約０．４０、約０．３５、約０．３０、約０．２５、約０．２０、約０．１５、または約０．１０、または約０．０５のシーケンシング深度；または特に好ましくは、０．１０から１．０の間、例えば０．２５から１．０の間のシーケンシング深度を有するＳＷＧＳからのものであってもよい。
【００６３】
ある特定の実施形態では、ステップｂ）における個体動物のＳＷＧＳ対立遺伝子サンプリングデータは、本明細書の他の箇所で説明されているように、低（特に１．０以下のＳＷＧＳシーケンシング深度により得られるか、もしくは得ることができる）、またはＳＷＧＳによる超低（特に０．２５以下、例えば０．０５から０．２５の間、もしくは０．１０から０．２５の間のＳＷＧＳシーケンシング深度により得られるか、もしくは得ることができる）対立遺伝子サンプリングからのものである。
【００６４】
ある特定の好ましい実施形態では、ステップｂ）における個体動物のＳＷＧＳ対立遺伝子サンプリングデータは、ステップａ）における対立遺伝子サンプリングに使用されるＳＷＧＳのシーケンシング深度と同じであるか実質的に同じであるシーケンシング深度を有するＳＷＧＳからのものであってもよい。この文脈において、「実質的に同じ」とは、それぞれのシーケンシング深度が０．５０以下、好ましくは０．４０以下、より好ましくは０．３０以下、例えば０．２５以下、０．２０以下、０．１５以下、０．１０以下、または０．０５以下だけ異なることを意味し得る。
【００６５】
本方法は、一般には、個体動物の前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子データの先在を仮定している。そのような対立遺伝子データは、既知の方法で、例えば、遺伝子型判定により、または（本質的には上記のように）ＳＷＧＳによる対立遺伝子サンプリングにより生成することができる。この目的のため、動物から、特に体細胞から抽出されたＤＮＡ、さらに特に体細胞からのゲノムＤＮＡ、例えば、血液検体から抽出されたＤＮＡが使用される。
【００６６】
用語「遺伝子型判定」とは、従来のように、１つまたは複数の多型部位のどの対立遺伝子が分析したＤＮＡ試料中に、例えば、個体動物からのＤＮＡ試料中に存在するかを決定するプロセスを意味する。状況に応じて、遺伝子型判定法は、個々の遺伝子型を識別するか、または対立遺伝子の構成もしくは量、例えば、調べたＤＮＡ配列多型での対立遺伝子の相対量などを提供することができる。好ましくは、遺伝子型判定法は、個々の遺伝子型を識別することができる。
【００６７】
遺伝子型判定技術は、当技術分野において日常的であり、一般的に周知である。例として、限定するものではないが、カスタム遺伝子型判定アレイまたは市販の遺伝子型判定アレイ、例えば、ＳＮＰ遺伝子型判定アレイは、多数のＳＮＰを並行して遺伝子型判定することができる。本発明のある特定の実施形態での実施に有用であるそのようなＳＮＰアレイの非限定的な例としては、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ（登録商標）  Ｂｏｖｉｎｅ３Ｋ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（２，９００ＳＮＰ）、ＢｏｖｉｎｅＬＤ  ｖ２．０  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｂｅａｄ  Ｃｈｉｐ（７，９３１ＳＮＰ）、ＢｏｖｉｎｅＳＮＰ５０  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（５３，７１４ＳＮＰ）、ＢｏｖｉｎｅＨＤ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（７７７，９６２ＳＮＰ）、ＯｖｉｎｅＳＮＰ５０  ＢｅａｄＣｈｉｐ（５４，２４１ＳＮＰ）、またはＧｏａｔ  ＳＮＰ５０  ＢｅａｄＣｈｉｐ（＞５０，０００ＳＮＰ）が挙げられる。さらなる遺伝子型判定法には、シーケンシング、例えばターゲットゲノムシーケンシングまたは全ゲノムシーケンシングなどが含まれる。全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）が好まれ得る。好ましくは、遺伝子型判定の文脈において、ＷＧＳは、実質的に明確な遺伝子型の判定（ｃａｌｌｉｎｇ）を可能にするシーケンシング深度、例えば、１０以上、または２０以上、または３０以上、例えば、約４０、約５０、約６０、約７０または約８０のようなシーケンシング深度（例えば「深い」ＷＧＳ）を用いることができる。
【００６８】
したがって、ある特定の実施形態では、ステップｂ）において使用される個体動物の前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型は、遺伝子型判定アレイ、例えばＳＮＰ遺伝子型判定アレイによって、ゲノムシーケンシング、例えばターゲットゲノムシーケンシングもしくは全ゲノムシーケンシングによって、またはそれらの任意の組合せによって、少なくとも部分的に決定された。
【００６９】
ある特定の好ましい実施形態では、ステップｂ）において使用される個体動物の前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型は、遺伝子型判定アレイによって少なくとも部分的には決定された。ある特定の好ましい実施形態では、ステップｂ）において使用される個体動物の前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型は、ＳＮＰ遺伝子型判定アレイによって少なくとも部分的に決定された。
【００７０】
ある特定の実施形態では、ステップｂ）において使用される個体動物の前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型は、全ゲノム配列決定によって少なくとも部分的に決定された。ある特定の実施形態では、ステップｂ）において使用される個体動物の前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型は、深い全ゲノムシーケンシングによって少なくとも部分的に決定された。
【００７１】
典型的には、このようなＳＮＰ遺伝子型判定アレイは、数千のＳＮＰ（例えば、少なくとも２５００、少なくとも５０００、もしくは少なくとも７５００ＳＮＰ）、数万のＳＮＰ（例えば、少なくとも１０，０００、もしくは少なくとも２５，０００、もしくは少なくとも５０，０００、もしくは少なくとも７０，０００ＳＮＰ）、または数十万のＳＮＰ（例えば、少なくとも１００，０００、もしくは少なくとも２５０，０００、もしくは少なくとも５００，０００、もしくは少なくとも７５０，０００ＳＮＰ）を調べることを可能にし得る。しかし、比較的低い密度のＳＮＰはコストが低いため、農家にとってより受け入れられやすい可能性がある。したがって、ある特定の実施形態では、個体動物の前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型は、１００，０００以下のＳＮＰ、好ましくは５０，０００以下のＳＮＰ、より好ましくは１０，０００以下のＳＮＰを調べることが可能なＳＮＰ遺伝子型判定アレイによって少なくとも部分的に決定された。本発明者らは、本方法のある特定の実施形態において、予測の精度が使用されるＳＮＰアレイのタイプによってわずかに影響されるだけであり得ることを実証した（例えば、図２Ｂに示したデータにおいて、１０Ｋ  ＳＮＰアレイは５０Ｋと同様に実施された）。
【００７２】
個体動物の前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型は、「実際の」遺伝子型（すなわち、実験的に検出された遺伝子型）であってもよく、および／または当技術分野で公知のコンピュータでの遺伝子型インピュテーションのプロセスによって決定される遺伝子型であってもよい（ＭａｒｃｈｉｎｉおよびＨｏｗｉｅ、２０１０を参照されたい）。遺伝子型インピュテーションには、試料（例えば個体動物）で実験的に観察された遺伝子型に基づき、集団（例えば、同じ種、亜種、変種もしくは繁殖種の動物のネイティブ集団）における公知のハプロタイプを使用した、未観察の遺伝子型の統計的推測が含まれる。したがって、遺伝子型インピュテーションは、典型的には、参照集団が高密度ＳＮＰアレイで、または高深度（例えば＞１０）の全ゲノムシーケンシングによって予め遺伝子型判定されていることが必要とされ、この状況は、家畜にとって、特に重要な世界的な繁殖種（例えばホルスタイン−フリージアン、ジャージー、またはブラウンスイス牛の繁殖種）とって次第に一般的になってきているが、参照集団は、他の繁殖種にも同様に容易に遺伝子型判定することができる。遺伝子型インピュテーションを実行するためのソフトウェアパッケージは公的に入手可能であり、例えば、Ｂｅａｇｌｅ（ＢｒｏｗｎｉｎｇおよびＢｒｏｗｎｉｎｇ、２００９）、ＭａＣＨ  （Ｌｉら、２０１０）、またはＩＭＰＵＴＥ２（Ｈｏｗｉｅら、２０１２）である。
【００７３】
したがって、ある特定の実施形態では、ステップｂ）において使用される個体動物の前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型または対立遺伝子の量は、少なくとも部分的にインピュテーションされている。
【００７４】
遺伝子型がインピュテーションされる場合、実際の基礎をなす遺伝子型にいくらかの不確実性が存在する。したがって、インピュテーションされたデータでは、対立遺伝子の量は０、０．５、または１ではないことが多く、これらの値から多少外れる可能性がある。そのような対立遺伝子の量は、最も高い確率を有する遺伝子型を得る遺伝子型に変換することができる。あるいは、インピュテーションされたデータを分析する場合、そのような対立遺伝子の量または遺伝子型を許容することができる方法を使用することができ、それによって、インピュテーションされた対立遺伝子の量がそれぞれの最も可能性の高い遺伝子型の代わりに使用される場合に、ことによってはいくらかの力を獲得する。
【００７５】
遺伝子型インピュテーションは、本方法のステップｂ）において使用することができる個体動物の多型の数を顕著に増加させることができる。ステップａ）におけるＳＷＧＳによる対立遺伝子のサンプリングが非常に多数（例えば、数十万〜数百万）の多型部位についての情報を生成すると考えると、遺伝子型インピュテーションは、個体動物の多型の数を同じ桁まで有利に増やすことができ、より有益な統計分析を可能にする。
【００７６】
したがって、ある特定の実施形態では、ステップｂ）における個体動物の前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子データは、部分的に実験的に検出され、部分的にインピュテーションされる、個体動物の前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型を含むか、またはそれからなる。
【００７７】
ある特定の実施形態では、ステップｂ）において使用される個体動物の前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型は、遺伝子型アレイ、例えばＳＮＰ遺伝子型アレイによって、ゲノムシーケンシング、例えばターゲッティッドゲノムシーケンシングもしくは全ゲノムシーケンシングによって、またはそれらの任意の組合せによって部分的に決定されており、また実験的に決定された遺伝子型に基づいて部分的にインピュテーションされている。
【００７８】
ある特定の好ましい実施形態では、ステップｂ）において使用される個体動物の前記ＤＮＡ配列多型について遺伝子型は、遺伝子型アレイ、例えばＳＮＰ遺伝子型アレイなどによって部分的に決定されており、また実験的に決定された遺伝子型に基づいて部分的にインピュテーションされている。
【００７９】
例として、限定するものではないが、ステップｂ）において使用される個体動物の前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型は、数千のＳＮＰ（例えば、少なくとも２５００、少なくとも５０００、もしくは少なくとも７５００ＳＮＰ）、数万のＳＮＰ（例えば、少なくとも１０，０００、もしくは少なくとも２５，０００、もしくは少なくとも５０，０００、もしくは少なくとも７０，０００ＳＮＰ）、または数十万のＳＮＰ（例えば、少なくとも１００，０００、もしくは少なくとも２５０，０００、もしくは少なくとも５００，０００、もしくは少なくとも７５０，０００ＳＮＰ）でさえも調べることが可能な（ＳＮＰ）遺伝子型アレイによって部分的に決定されていてもよく、遺伝子型インピュテーションを適用して遺伝子型ＤＮＡ多型の総数を少なくとも１．０×１０６、または少なくとも２．０×１０６、または少なくとも３．０×１０６、または少なくとも４．０×１０６、または少なくとも５．０×１０６、または少なくとも６．０×１０６、または少なくとも７．０×１０６、または少なくとも８．０×１０６、または少なくとも９．０×１０６、または少なくとも１．０×１０７、または少なくとも１．５×１０７、または少なくとも２．０×１０７まで増加させる。
【００８０】
ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量は、乳中のＤＮＡ配列多型のバルク対立遺伝子サンプリング、および個体動物における前記ＤＮＡ配列多型の公知の対立遺伝子データに基づいて、本明細書では決定することができる。したがって、乳から抽出されたＤＮＡの構成は、各動物（例えば雌牛）の相対的寄与、すなわち、乳中のＤＮＡのどれだけの比率が１、２、３、．．．ｎ頭の動物によって寄与されているかの点から決定することができる。これは、当技術分野で一般に公知である様々な数学的アプローチ、例えば、最小二乗分析、非負最小二乗分析、加重最小二乗分析、最尤法、ベイズ法を使用して達成することができる。
【００８１】
ある特定の実施形態では、線形モデルを使用することができる。ある特定の実施形態では、所与の動物が寄与した、タンク乳中のＤＮＡの比率に対応する変数を含む一連の一次方程式を定義することができ、前記比率は前記方程式の最小二乗分析によって推定することができる。
【００８２】
例えば、参照（Ｒ）対立遺伝子および代替（Ａ）対立遺伝子をそれぞれ有する２対立遺伝子多型（したがって、可能性のある遺伝子型はＲＲ、ＲＡまたはＡＡ）を想定すると、ｍ一次方程式のセットが次の形式で定義され得る：
【００８３】
【数１】
2021519075.tif 000002
【００８４】
式中、ｆｉは、動物ｉが寄与した乳中のＤＮＡの比率であり、ｄｉｊは、動物ｉと多型ｊの代替対立遺伝子Ａの「量」であり、εｊは、多型ｊの誤差項である。
乳をＳＷＧＳにより対立遺伝子サンプリングした場合、
【００８５】
【数２】
2021519075.tif 000003
【００８６】
は、対応するゲノム位置での読み取りＡの比率に対応する。
実験的に検出された個体動物の遺伝子型については、ｄｉｊは、それぞれ、遺伝子型ＲＲ、ＲＡ、ＡＡに関して０、０．５、または１に対応する。インピュテーションによって得られた個体動物の遺伝子型については、ｄｉｊは、適切なインピュテーションアルゴリズム、例えばＢｅａｇｌｅソフトウェアパッケージによって推定されたＡ対立遺伝子の量である。ＳＷＧＳにより行われた個体動物における対立遺伝子サンプリングについては、ｄｉｊ＝０．５×Ｐ（”ＲＡ”｜ｎｒＲ，ｎｒＡ，ｑｊ）＋Ｐ（”ＡＡ”｜ｎｒＲ，ｎｒＡ，ｑｊ）で実施され、式中、ｎｒＲ（それぞれｎｒＡ）は多型ｊおよび動物ｉに関する数値Ｒ（それぞれ読み取りＡ）であり、ｑｊは多型ｊのＡ対立遺伝子の集団内頻度である。
【００８７】
【数３】
2021519075.tif 000004
【００８８】
次いで、ｆｉは、最小二乗分析によって、すなわち
【００８９】
【数４】
2021519075.tif 000005
【００９０】
の最小化によって推定することができる。乳における対立遺伝子サンプリングがＳＷＧＳにより行われる場合、加重最小二乗分析を実施することができ、すなわち、ｆｉは、
【００９１】
【数５】
2021519075.tif 000006
【００９２】
の最小化によって推定することができ、式中、Ｗｊはカバレッジ（ｎｒＲ＋ｎｒＡ）である。
さらに、動物の体細胞はその乳中の動物ゲノムＤＮＡの主要な供給源であるので、プールされた乳（例えばタンク乳）中のＤＮＡに対する個体動物の相対寄与もまた、応答または反映し、したがって、プールされた乳中の体細胞濃度または体細胞スコア（ＳＣＳ）に対する個体動物の相対寄与に変換することができる。そこから、個体動物の乳中の体細胞の濃度は、プールされた乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率、プールされた乳中の体細胞の実際の濃度（これは、多くの場合、乳の価格決定がこのパラメータによって影響を受けるので、乳を収集する乳業工場によって決定される）、および個体動物のプールされた乳に対する相対寄与（この情報は、一般には、今日の搾乳機が各動物、例えば雌牛から得られた乳の量を自動的に収集する場合、利用可能である）に基づいて、乳の個々の体積に換算して計算または推定することができる。例として、個体動物ｉの体細胞スコア（ＳＣＳｉ）は、上記で説明したｆｉから以下のように計算することができる：
ＳＣＳｉ＝ＳＣＳｔａｎｋ×Ｖｔａｎｋ×ｆｉ／Ｖｉ
式中、Ｖｔａｎｋは、乳の総プール体積（例えばリットル）であり、Ｖｉは、プールされた乳に個体動物ｉが寄与した、同一単位（例えばリットル）の乳の体積である。Ｖｉは、直接測定することができ、またはある動物の推定年間生産量と、泌乳中の、すなわち分娩後の日数の関数としての一日乳量（または体積）の推移を捉えた標準泌乳曲線から推定することもできる。
【００９３】
したがって、ある特定の実施形態では、本方法は、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量に基づいて、個体動物の乳中の体細胞濃度を決定するステップをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、体細胞濃度は、体細胞スコア（ＳＣＳ）によって表すことができる。
【００９４】
乳中の体細胞濃度の増加またはＳＣＳの増加は、乳房炎および潜在性乳房炎の特徴または徴候である。乳房炎は、乳腺の炎症に関わる。これは、任意の哺乳動物、非反芻動物および反芻動物、例えば、雌牛、雌羊およびヤギに影響を及ぼし得る。これは、世界で乳牛に影響を及ぼす最も一般的でコストのかかる疾患である。乳房炎は、典型的には、グラム陽性菌およびグラム陰性菌によって引き起こされる乳房感染に起因する。乳房炎を引き起こす主要な病原体としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ（Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ））およびスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））が挙げられる。他の生物も、一般的ではないが、可能性のある乳房炎病原体として確認されている。ウシ乳房炎を引き起こす他の細菌は、限定するものではないが、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である。これらの生物は、乳牛の臨床型乳房炎に最も一般的に関連している主要な病原体として存在する。これらは乳頭管を通って乳房槽（ｕｄｄｅｒ  ｃｉｓｔｅｒｎ）に感染し、中程度の期間から長期間にわたり乳分泌を阻害し、乳生産組織の炎症を誘発する。瘢痕組織が関与している場合、牛乳生産の永続的減少が生じる。乳房感染は、乳の組成、量、外観および／または質を変える。感染の種類によって、微生物の一般的な原因としては、非衛生的な搾乳器具、搾乳者、他の動物、寝藁、および動物自身の排泄物（糞）が挙げられる。臨床型乳房炎と潜在性乳房炎の感染の区別は、（それぞれの）症状が肉眼で見ることができるか否かについて、例えば、機器または試験を使用することなく農家によって視察されるかどうかによって決まり得る。このような症状には、乳房の腫脹および発赤、ならびに／あるいは生産された乳の質または量の低下または変化が含まれる可能性がある。
【００９５】
したがって、本方法のある特定の実施形態では、所定の閾値を超える個体動物の乳中の体細胞濃度または体細胞スコア（ＳＣＳ）は、前記動物を潜在性乳房炎または臨床型乳房炎を有すると識別する。好ましい実施形態では、所定の閾値を超える個体動物の乳中の体細胞濃度またはＳＣＳは、前記動物を潜在性乳房炎を有すると識別し得る。したがって、本方法は、個体動物における潜在性乳房炎または臨床型乳房炎を検出または診断するのに特に有用であり、適用することができる。
【００９６】
このような有用な閾値は、動物の種、亜種、変種、または繁殖種に依存し得るが、当業者には一般に公知である。例として、健康な雌牛の場合、それらの乳中の体細胞濃度またはＳＣＳは、典型的には１００，０００細胞／乳ｍＬ未満であるが、２００，０００細胞／ｍＬの体細胞濃度またはＳＣＳは、２００，０００細胞／ｍＬ以下の雌牛が潜在性乳房炎または臨床型乳房炎を有するものとして示す使用可能な閾値と考えられ得る。臨床型乳房炎のある雌牛の体細胞濃度またはＳＣＳは、典型的には、数百万細胞／ｍＬに達する可能性があり、その時点までに、その雌牛は搾乳から除外され得る。
【００９７】
ある特定の実施形態では、プールされた乳に個体動物が寄与したＤＮＡの絶対量もまた、プールされた乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率、プールされた乳中のＤＮＡの実際の濃度、およびプールされた乳に対する個体動物の相対寄与に基づいて、乳の個々の体積に換算して推定することができる。
【００９８】
上記の教示を考慮して、本発明の別の態様は、一般に、ある体積の乳に乳を寄与する複数の個体動物から潜在性乳房炎または臨床型乳房炎を有する１頭または複数の動物を識別する方法であって、
ａ’）ＳＷＧＳによって、ある体積の乳の試料から抽出されたＤＮＡ中のゲノムにわたり複数のＤＮＡ配列多型について対立遺伝子サンプリングする、例えば、低または超低対立遺伝子サンプリングすることを含む方法によって、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を決定するステップと、
ｂ’）ステップａ’）で決定した、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量に基づいて、個体動物の乳中の体細胞濃度を決定するステップと；
ｃ’）ステップｂ’）で決定した、１頭または複数の動物の乳中の体細胞濃度が所定の閾値を超える場合、前記１頭または複数の動物が潜在性乳房炎または臨床型乳房炎を有すると識別するステップと
を含む、方法に関する。
【００９９】
また本出願は、以下の記述（ｓｔａｔｅｍｅｎｔ）で示した態様および実施形態も提供する。
記述１．複数の個体動物から収集されたある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を決定する方法であって、
ａ）浅い全ゲノムシーケンシング（ＳＷＧＳ）によって、ある体積の乳の試料から抽出されたＤＮＡ中の複数のＤＮＡ配列多型について対立遺伝子サンプリングするステップと；
ｂ）ステップａ）からの前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子サンプリング、および個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子データに基づいて、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を決定するステップと
を含む、方法。
【０１００】
記述２．ステップｂ）において、個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子データが、個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型もしくは対立遺伝子量、および／または個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についてのＳＷＧＳ対立遺伝子サンプリングデータを含む、またはそれらからなる、記述１に記載の方法。
【０１０１】
記述３．ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率が決定される、記述１または２に記載の方法。
記述４．ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量に基づいて、個体動物の乳中の体細胞濃度を決定するステップであって、例えば、体細胞濃度が体細胞スコア（ＳＣＳ）によって表される、ステップをさらに含む、記述１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【０１０２】
記述５．ステップａ）におけるＳＷＧＳによる前記ＤＮＡ配列多型についての対立遺伝子サンプリングが、低または超低対立遺伝子サンプリングである、記述１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【０１０３】
記述６．ステップｂ）における個体動物のＳＷＧＳ対立遺伝子サンプリングデータが、ＳＷＧＳによる低または超低対立遺伝子サンプリングからのものである、記述２〜４のいずれか一つに記載の方法。
【０１０４】
記述７．ステップａ）および／またはステップｂ）において、ＳＷＧＳのシーケンシング深度が０．１０〜１０．０、好ましくは０．２５〜５．０、例えば、約０．２５、約０．５０、約０．７５、約１．０、約２．０、約３．０、約４．０または約５．０のシーケンシング深度である、記述１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【０１０５】
記述８．ステップａ）および／またはステップｂ）において、ＳＷＧＳのシーケンシング深度が０．２５〜１．０、好ましくは約０．２５または約１．０である、記述１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【０１０６】
記述９．ＤＮＡ配列多型が一塩基多型（ＳＮＰ）である、記述１〜８のいずれか一つに記載の方法。
記述１０．個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型が、遺伝子型判定アレイ、例えばＳＮＰ遺伝子型判定アレイによって、ゲノムシーケンシング、例えばターゲティッドゲノムシーケンシングもしくは全ゲノムシーケンシングによって、またはそれらの任意の組合せによって、少なくとも部分的に決定されている、記述２〜９のいずれか一つに記載の方法。
【０１０７】
記述１１．個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型が、１００，０００以下のＳＮＰ、好ましくは５０，０００以下のＳＮＰ、より好ましくは１０，０００以下のＳＮＰを調べることが可能なＳＮＰ遺伝子型判定アレイによって、少なくとも部分的に決定されている、記述１０に記載の方法。
【０１０８】
記述１２．個体動物における前記ＤＮＡ配列多型についての遺伝子型または対立遺伝子量が少なくとも部分的にインピュテーションされている、記述２〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【０１０９】
記述１３．少なくとも１×１０５、好ましくは少なくとも５×１０５、より好ましくは少なくとも１×１０６、さらにより好ましくは少なくとも５×１０６、または少なくとも８×１０６のＤＮＡ配列多型が分析される、記述１〜１２のいずれか一つに記載の方法。
【０１１０】
記述１４．動物が泌乳家畜である、記述１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
記述１５．動物がウシ科またはウシ科雑種であり；好ましくはウシであり；より好ましくは畜牛、例えば、ボス・タウルス）、ボス・インディカスもしくは雑種の畜牛；または水牛である、記述１〜１４のいずれか一つに記載の方法。
【０１１１】
記述１６．動物がヒツジまたはヤギである、記述１〜１４のいずれか一つに記載の方法。
記述１７．ある体積の乳がタンク乳である、記述１〜１６のいずれか一つに記載の方法。
【０１１２】
記述１８．所定の閾値を超える個体動物の乳中の体細胞濃度または体細胞スコア（ＳＣＳ）が、前記動物を潜在性乳房炎または臨床型乳房炎を有すると識別する、記述４〜１７のいずれか一つに記載の方法。
【０１１３】
記述１９．ある体積の乳に乳を寄与する複数の個体動物から潜在性乳房炎または臨床型乳房炎を有する１頭または複数の動物を識別する方法であって、
ａ’）ＳＷＧＳによって、ある体積の乳の試料から抽出されたＤＮＡ中の複数のＤＮＡ配列多型について対立遺伝子サンプリングする、例えば、低または超低対立遺伝子サンプリングすることを含む方法によって、好ましくは記述１の方法によって、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量を決定するステップと、
ｂ’）ステップａ’）で決定した、ある体積の乳に個体動物が寄与したＤＮＡの比率または量に基づいて、個体動物の乳中の体細胞濃度を決定するステップと；
ｃ’）ステップｂ’）で決定した、１頭または複数の動物の乳中の体細胞濃度が所定の閾値を超える場合、前記１頭または複数の動物が潜在性乳房炎または臨床型乳房炎を有すると識別するステップと
を含む、方法。
【０１１４】
本発明をその特定の実施形態と共に説明してきたが、前述の説明に照らして、多くの代替、改変、および変形が明らかであることは、当業者には明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲の通り、すべての代替、改変、および変形を包含するものとする。本明細書で開示した本発明の態様および実施形態は、以下の非限定的な実施例によってさらにサポートされる。
【実施例】
【０１１５】
材料および方法
シミュレーションデータ
参照スキーム（Ａ）：本発明者らは、タンクに乳を寄与するｎ頭（２５、５０、１００、２５０、５００、および１，０００頭）の雌牛がいる農場をシミュレーションした。雌牛を、ｍ（１０Ｋ、５０Ｋ、または７５０Ｋ）マーカーについてＳＮＰアレイで、エラーなく遺伝子型判定した。マイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）は、一様］０，０．５］分布からサンプリングし、遺伝子型は対応するＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ分布からサンプリングした。体細胞スコア（ＳＣＳ）の個体雌牛のスコア（ＳＣＳｉ）は、スケールパラメータα＝１および形状パラメータβ＝２でＷｅｉｂｕｌｌ分布から値をサンプリングすることによりシミュレートし、その結果の値に２００，０００を乗じた。乳中の個体のＳＮＰの正確なＢ対立遺伝子頻度（ＢＡＦｊ）は、ｎ頭の雌牛の乳に対する細胞寄与とそれらの遺伝子型の組合せに基づいてそれぞれのＳＮＰｊについて決定した。Ｂ対立遺伝子頻度は、正規分布誤差Ｎ（０，０．００２５）（すなわちＳＥ＝０．０５）を用いて推定したところ、ｍ
【０１１６】
【数６】
2021519075.tif 000007
【０１１７】
が得られると推測された。
スキームＢ：参照スキームと同じ設定で、以下を追加した。１０Ｋまたは５０Ｋのアレイで遺伝子型判定した雌牛について、本発明者らは、実際のＭＡＦ依存型インピュテーション精度（ＭＡＦ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ａｃｃｕｒａｃｙ）を模倣した誤差モデルを使用して、データを８００万（Ｍ）遺伝子型まで増大させることによりインピュテーションをシミュレーションした。誤差モデルは、７７７Ｋ  ＳＮＰのＨＤアレイに対して遺伝子型判定した８００頭の無関係なホルスタイン・フリーシアン個体についての実際のデータセットを使用して構築した。このデータセットを、２００個体のセットと６００個体のセットに分割した。２００個体のセットは、最初に７Ｋ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｏｖｉｎｅＬＤｖ２．０により調べた遺伝子型まで減らし、次いで、５０Ｋ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｏｖｉｎｅＳＮＰ５０ｖ３  ＳＮＰアレイにより調べた遺伝子型まで減らした。減らしたＳＮＰセットは、参照集団としての６００個体を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｏｖｉｎｅＨＤ  ７７７Ｋ  ＳＮＰアレイの内容にインピュテーションして戻した。実際の遺伝子型に応じて所与の遺伝子型をインピュテーションする頻度は、ＬＤおよび５０Ｋアレイデータについて、別々に０．０１のＭＡＦ  ｂｉｎに対してスコアリングした。本発明者らは、ＳＷＧＳによるタンク乳における対立遺伝子サンプリングを以下のようにシミュレーションした。８Ｍ  ＳＮＰのそれぞれの位置について、本発明者らは、平均Ｃのポアソン分布から局所読み取り深度（ｒε整数）をサンプリングしたが、ここで、Ｃはゲノム全体の平均カバレッジ（０．２５、０．５、１、２、または５）である。次いで、本発明者らは、それぞれＢ対立遺伝子である確率＝ＢＡＦｊ（上記で計算）で、読み取りｒをサンプリングした。
【０１１８】
スキームＣ：個体のＳＮＰ遺伝子型およびタンクのＢ対立遺伝子頻度（ＢＡＦｊ）を、参照スキーム（８Ｍ  ＳＮＰ位置での遺伝子型）と同様にして得た。タンク乳における対立遺伝子サンプリングはＳＷＧＳによりＣの平均カバレッジ（０．２５、０．５、１、２、または５）で行われ、雌牛における対立遺伝子サンプリングはＳＷＧＳによりＣの平均カバレッジ（０．２５、０．５、または１）で行われたと想定した。個体雌牛における対立遺伝子サンプリングは、（ｉ）８Ｍ  ＳＮＰ位置のそれぞれについて、平均のＣのポアソン分布からの局所読み取り深度（ｒε整数）をサンプリングすることによって、および（ｉｉ）雌牛の遺伝子型（ＲＲ、ＲＡまたはＡＡ）に応じて代替対立遺伝子（Ａ）であるような確率０、０．５、または１で読み取りｒをサンプリングすることによって、シミュレーションした。タンク乳における対立遺伝子サンプリングは、スキームＢと同様にして実施した。
【０１１９】
実際のデータ
データセット１：本発明者らは、フランスの農場から１３３頭の搾乳ホルスタイン・フリーシアン牛から乳タンクの試料を得た。すべてを、１７Ｋ  ＳＮＰを調べるカスタマイズされたＩｌｌｕｍｉｎａ  ＢｏｖｉｎｅＬＤｖ２アレイで遺伝子型判定した。すべての雌牛について、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｏｖｉｎｅＨＤアレイ（７７７Ｋ  ＳＮＰ）で遺伝子型判定した８００頭のホルスタイン・フリーシアン動物の参照集団とＢｅａｇｌｅソフトウェア（ｖ３．３．２）（ＢｒｏｗｎｉｎｇおよびＢｒｏｗｎｉｎｇ  ２００９）を使用して、遺伝子型をＨＤ（７７７Ｋ）密度までインピュテーションした。量およびＳＣＳ（細胞／ｍＬ）を含む個体乳の読み取りを、タンクに乳を寄与したすべての雌牛について得た。ＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＭａｇ（登録商標）Ｂｌｏｏｄキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、カタログ番号：７４４５０１．１）を使用して、１．５ｍｌのタンク乳から単離した。タンク乳のＤＮＡは、最初に、１７Ｋ  ＳＮＰを調べるカスタマイズされたＩｌｌｕｍｉｎａ  ＢｏｖｉｎｅＬＤｖ２を使用して、遺伝子型判定した。次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ適合性ＮＧＳライブラリを、ＫＡＰＡ  ＨｙｐｅｒＰｌｕｓキット（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号：ＫＫ８５１０）を使用して、５０ｎｇのゲノムＤＮＡで調製した。シーケンシングは、ＮｅｘｔＳｅｑ５００装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で実施し、約３．５×のゲノムカバレッジに対応する、２＊７５ｂｐの６，０００万ペアエンド読み取りを得た。参照（Ｒ）対立遺伝子および代替（Ａ）対立遺伝子は、Ｂａｍ−ＲｅａｄＣｏｕｎｔツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｇｅｎｏｍｅ／ｂａｍ−ｒｅａｄｃｏｕｎｔ．ｇｉｔ）を使用して、ＨＤアレイの７７７Ｋ  ＳＮＰ位置でカウントし、その結果、６９９，４０２の位置が平均カバレッジ２．８で少なくとも１回の読み取りでカバーされた。読み取り深度分布は、平均２．８のポアソン分布によく似ており（ｒ＝．９８）、１８％の遺伝子座が１回の読み取りでカバーされ、７０％の遺伝子座が２回以上の読み取りでカバーされた。
【０１２０】
データセット２および３：本発明者らは、それぞれ５２０頭および１２０頭のホルスタイン・フリーシアン雌牛の乳を含む、ベルギーの農場からのタンク乳の試料を得た。タンクに乳を寄与したすべての雌牛についての乳体積およびＳＣＳ（細胞／ｍｌ）を得た。すべての雌牛は、１７Ｋ  ＳＮＰを調べるＩｌｌｕｍｉｎａ  ＢｏｖｉｎｅＬＤｖ２アレイで、標準的な手順を使用して遺伝子型判定し、参照として７４３頭のホルスタイン・フリーシアン動物からの全ゲノムシーケンスデータ（平均深度：１５×；範囲：４×〜４８×）（Ｍ．  Ｇｅｏｒｇｅｓ、非公開）とＢｅａｇｌｅソフトウェア（ｖ５．０）（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、２０１８）を使用して全ゲノムへとインピュテーションし、合計１３００万のＳＮＰの対立遺伝子量を得た。タンク乳試料からのＤＮＡ抽出、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｏｖｉｎｅＬＤｖ２（１７Ｋ）およびＢｏｖｉｎｅＳＮＰ５０ｖ３（５０Ｋ）アレイによる遺伝子型判定、ならびにシーケンシング（カバレッジ４×）は、データセット１の場合と同様に行った。
【０１２１】
データセット４：１２０頭の雌牛がいるベルギーの農場で乳の読み取り（すなわち、細胞カウンターと共に用いて測定したＳＣＳの取得）の日にタンク乳の試料を得ることに加えて、本発明者らは、合計約３か月にわたる期間の前に追加の１１タンク乳試料を、その期間の後に９試料を毎週収集した。対応するＤＮＡ試料は、データセット１の場合と同じ手順を使用してシーケンシングした。
【０１２２】
統計モデル
本発明者らは、次の形式のｍ一次方程式のセットを定義した：
【０１２３】
【数７】
2021519075.tif 000008
【０１２４】
式中、ｆｉは、雌牛ｉが寄与したタンク乳におけるＤＮＡの比率であり、ｄｉｊは、雌牛ｉとマーカーｊの代替対立遺伝子Ａの「量」であり、εｊは、マーカーｊの誤差項である。タンク乳をアレイで遺伝子型判定する場合、
【０１２５】
【数８】
2021519075.tif 000009
【０１２６】
は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｔｕｄｉｏ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって推定されたＢ対立遺伝子頻度に対応する。タンク乳をＳＷＧＳにより対立遺伝子サンプリングする場合、
【０１２７】
【数９】
2021519075.tif 000010
【０１２８】
は対応するゲノム位置での読み取りＡの比率に対応する。アレイで得られた雌牛の遺伝子型については、ｄｉｊは、それぞれ、遺伝子型ＲＲ、ＲＡおよびＡＡに関して０、０．５または１に対応する。インピュテーションによって得られた雌牛遺伝子型については、ｄｉｊは、Ｂｅａｇｌｅ（ｖ３．３．２）によって推定されたＡ対立遺伝子の量である（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  ＆  Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  ２００９）。ＳＷＧＳにより行われた雌牛における対立遺伝子サンプリングについては、ｄｉｊ＝０．５×Ｐ（”ＲＡ”｜ｎｒＲ，ｎｒＡ，ｑｊ）＋Ｐ（”ＡＡ”｜ｎｒＲ，ｎｒＡ，ｑｊ）で実施され、式中、ｎｒＲ（それぞれｎｒＡ）はマーカーｊおよび雌牛ｉについての数値Ｒ（それぞれ読み取りＡ）であり、ｑｊはマーカーｊのＡ対立遺伝子の集団内頻度である。
【０１２９】
【数１０】
2021519075.tif 000011
【０１３０】
雌牛ｉについて使用可能な情報がない（例えば、遺伝子型判定の失敗またはカバーする読み取りがない）ＳＮＰ  ｊの場合、ｄｉｊは
【０１３１】
【数１１】
2021519075.tif 000012
【０１３２】
で設定した。
ｆｉは、最小二乗分析によって、すなわち、
【０１３３】
【数１２】
2021519075.tif 000013
【０１３４】
の最小化によって推定した。タンク乳における対立遺伝子サンプリングがＳＷＧＳにより実施された場合、本発明者らはまた、加重最小二乗分析を実施し、すなわち、本発明者らは、
【０１３５】
【数１３】
2021519075.tif 000014
【０１３６】
の最小化によってｆｉを推定し、式中、Ｗｊはカバレッジ（ｎｒＲ＋ｎｒＡ）である。
ＳＣＳｉは、ｆｉから計算した。
ＳＣＳｉ＝ＳＣＳｔａｎｋ×Ｖｔａｎｋ×ｆｉ／Ｖｉ
式中、ＶｔａｎｋおよびＶｉは、それぞれ、タンク中の乳の体積（例えばリットル）、およびタンクに雌牛ｉが寄与した乳の体積（同一単位、例えばリットル）である。
【０１３７】
Ｖｉは、一部の搾乳機がその情報を記録するので、直接測定することもできる。Ｖｉの実際の値が知られていない場合（例えば、農場で使用されている搾乳機がその情報を提供しないことによる）、Ｖｉは、雌牛の推定年間生産量と、泌乳中の、すなわち、分娩後の日数の関数としての一日乳量（または体積）の推移を表す標準泌乳曲線から推定することができる。
【０１３８】
予測の精度は、（ｉ）実際のＳＣＳｉと推定のＳＣＳｉとの間のピアソンの相関（ｒ）、および／または（ｉｉ）（Ｔｐ＋ＴＮ）／ｍとして測定されるある特定の閾値を上回るＳＣＳと下回るＳＣＳを有する動物を区別する能力によって測定することができ、式中、Ｔｐは真陽性の数を示し、ＴＮは真陰性の数を示し、ｍは雌牛の総数を示す。
【０１３９】
シーケンス深度の精度に対する影響をテストするため、本発明者らは、Ｅ（Ｃ×ｘ）＝Ｄ（式中、Ｄは所望のシーケンス深度である）であるような、確率ｘでＳＮＰ位置をオーバーラップする読み取りをサンプリングした。
【０１４０】
結果
シミュレーションデータ
本発明者らは、最初に、「参照スキーム」（Ａ）の下でのタンク乳のバルク遺伝子型判定によって、すなわち、個体雌牛およびタンク乳を、それぞれ１０Ｋ、５０Ｋ、または７５０ＫのＳＮＰを調べる同一の３つの最も一般的に使用されているウシＳＮＰアレイで遺伝子型判定することを想定することによって、個体雌牛のＳＣＳ数を推定する際の精度を再評価した。図２Ａから明らかなように、１０ＫのＳＮＰで、予測の精度は１００頭以下の雌牛がいる農場にとって満足のいくものであり（ｒ≧０．９）、２５０頭以下の雌牛のいる農場にとっては５０ＫのＳＮＰで、および単一タンクに乳を寄与する１，０００頭以下の雌牛のいる農場にとって７５０ＫのＳＮＰで満足のいくものである。さらに、７５０Ｋアレイはもちろんのこと、５０Ｋで群れ全体を遺伝子型判定することは、現在、法外に高価である。
【０１４１】
したがって、本発明者らは、（ｉ）個体雌牛が１０Ｋ、５０Ｋ、または７５０ＫのいずれかのＳＮＰで遺伝子型判定され、遺伝子型はインピュテーションによって８００万（８Ｍ）ＳＮＰに増大され、一方（ｉｉ）タンク乳における対立遺伝子サンプリングは、０．２５〜５の範囲のシーケンス深度でＳＷＧＳにより行われる、代替スキーム（Ｂ）の第１のセットを調査した。図２Ｂは、最初に、予測の精度が、使用されるＳＮＰアレイのタイプによってごくわずかに影響を受けることを示し、すなわち、１０Ｋ  ＳＮＰアレイは、５０Ｋおよび７５０Ｋアレイと同様に行われる（図示せず）。最も重要なことには、０．２５のシーケンス深度（タンク乳の場合）は、１００頭以下の雌牛のいる農場にとって満足のいく精度を提供するのに十分であり、２５０頭以下の雌牛のいる農場にとっては０．５のシーケンス深度、５００頭以下の雌牛のいる農場にとっては２のシーケンス深度、および１，０００頭以下の雌牛のいる農場にとっては５のシーケンス深度で十分である。
【０１４２】
本発明者らは、さらに、タンク乳および個体雌牛の両方における対立遺伝子サンプリングがＳＷＧＳによって行われる、スキーム（Ｃ）の第３のセットを検討した。図２Ｃから明らかなように、乳および雌牛について０．２５×のシーケンス深度が２５頭の雌牛のいる農場においては十分である。雌牛に関するシーケンス深度を０．２５×に維持した場合、乳に関する深度は、好ましくは、５０頭および１００頭の雌牛のいる農場では、それぞれ１×および５×に増大される。２５０頭の雌牛がいる農場において適用可能であるためには、雌牛に関するシーケンス深度を好ましくは０．５×に、乳に関する深度を５×に増大させる。
【０１４３】
実際のデータ
１３３頭の搾乳牛に関するＳＣＳは、最初に、「参照」シナリオ（Ａ）の下で、すなわち、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＬＤアレイによって調べた１７Ｋ  ＳＮＰの遺伝子型のみを使用して推定した。実際のＳＣＳと推定ＳＣＳの相関は０．９１であった。次いで、本発明者らは、スキームＢの下で、すなわち、雌牛に関する（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨＤアレイによってカバーされた）７７７ＫのＳＮＰ位置でのインピュテーションされた遺伝子型量を使用して計算を繰り返し、また乳に関する対応する位置でのＢ対立遺伝子頻度を、材料および方法に記載されているＳＷＧＳデータ（３．５×カバレッジ）から推定した。予測したＳＣＳの精度は０．９６に上昇した。相関プロットの目視検査では、３００万ＳＳＣ／ｍｌを超える雌牛（すなわち、明らかな乳房炎）が１頭明らかになり、これはｒ値を急増させた。本発明者らはこの異常値を除き、分析を繰り返した。実際のＳＣＳと推定ＳＣＳとの間の相関は、スキームＡの下では、すなわち、ＬＤアレイにより調べた１７Ｋ  ＳＮＰからの情報のみを使用した場合には０．７９であり、スキームＢの下では、すなわち、雌牛のインピュテーションされた遺伝子型および乳のＳＷＧＳからの情報を加えた場合には０．９３まで上昇した（図３）。これは、スキームＢがＡよりも優れていることを明白に示した。
【０１４４】
次いで、本発明者らは、タンクに乳を寄与する雌牛の数を増加させる効果を、データセット２（雌牛５２０頭）を使用してテストした。スキームＡ、すなわち、ＳＮＰアレイで遺伝子型判定した乳および乳牛の下では、シミュレーションによって予測されるように、予測ＳＣＣと測定ＳＣＣとの間の相関は０．４７に低下した（図４）。次いで、本発明者らは、スキームＢを適用し、すなわち、雌牛に１０Ｍを超えるＳＮＰをインピュテーションし、乳に対して全ゲノムシーケンシングを実行した。相関は、すべての利用可能な配列情報を使用した場合、すなわち４×シーケンス深度で、０．９１に上昇した。本発明者らは、シーケンスデータを２×、１×および０．４×の深度にダウンサンプリングした。相関は、０．４×のカバレッジで、０．８６を下回らなかった。
【０１４５】
農家は、典型的には、選択ＳＣＳ閾値を使用し、これを超えると、例えば抗生物質治療を使用する介入を行うことができる。したがって、本発明者らは、選択した閾値を上回るＳＣＳと下回るＳＣＳの動物の識別における本発明者らの方法の精度も評価した。一般的に使用される１００万のＳＣＳ値を閾値として使用する場合、スキームＢの精度は、０．４×の深度で乳をシーケンシングする場合であっても０．９以上の精度を有していた（図５）。まとめると、これらの結果は、非常に大規模な農場であっても潜在性乳房炎の雌牛の検出において提案したスキームＢが有効であることを実証する。実際に、１７Ｋアレイによる雌牛の遺伝子型判定は、全ゲノムへの雌牛の遺伝子型インピュテーションとタンク乳の浅い（例えば０．４×）シーケンシングを組み合わせた場合、好都合なことに、有益でコスト効率の良好な提案である。
【０１４６】
本発明者らは、最終的に、提案した方法を使用して、１週間間隔で３か月の期間にわたり、個体のＳＣＳの推移をモニタリングすることを望んだ。本発明者らは、連続する２１週間の間、１２０頭の雌牛がいる農場からのタンク乳試料を収集した（データセット４）。実際のＳＣＳは、１２週目に個体雌牛で測定した。結果は、１２週目に測定したＳＣＳが、１２週を中心として展開する約３か月間にわたる平均予測ＳＣＳの予測因子が低い（ｒ＝０．５６）ことを示した。実際、１２週目に測定したＳＣＳが高い一部の雌牛は、３か月間にわたり全体的に非常に許容されるＳＣＳを有していたが、１２週目に測定したＳＣＳが低い一部の雌牛は、３か月間にわたり平均して高いＳＣＳから非常に高いＳＣＳを有していた（図６Ａ、Ｂ）。したがって、この分析からは、四半期の乳の記録は、動物の実際のＳＣＳの指標が乳の記録の間隔において相対的に不十分であり、実際の平均ＳＣＳが大幅に過小推定または過大推定されている可能性があることが実証された。さらに、臨床症状がＳＣＳと必ずしも十分に相関するとは限らないように思われる。ＳＣＳが非常に高い雌牛が完全に無症状である可能性があり、それらの乳がタンク乳に加えられ、それによってその質および価値が損なわれ得る。これらの事実は、動物における潜在性乳房炎を検出する本出願が教示した遺伝子分析プロトコルが重要であり、また情報価値を改善するものであることをさらに強調している。
【０１４７】
引用リスト
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【図１】
2021519075.tif 000015
【図２（Ａ）】
2021519075.tif 000016
【図２（Ｂ）】
2021519075.tif 000017
【図２（Ｃ）−１】
2021519075.tif 000018
【図２（Ｃ）−２】
2021519075.tif 000019
【図３】
2021519075.tif 000020
【図４】
2021519075.tif 000021
【図５】
2021519075.tif 000022
【図６（Ａ）】
2021519075.tif 000023
【図６（Ｂ）】
2021519075.tif 000024
【国際調査報告】
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2021519075.tif 000026
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