(57)【要約】本発明は、心臓病の治療又は予防の方法で使用するための、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ２７ｂ−５ｐを対象とするオリゴ核酸剤に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓病の治療又は予防の方法で使用するためのマイクロＲＮＡであるｍｉＲ２７ｂ−５ｐを対象としてそれを特異的に阻害及び／又は分解することができるオリゴ核酸剤。
【請求項２】
前記オリゴ核酸剤は、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ２７ｂ−５ｐとハイブリッドを形成することができるヌクレオチドのハイブリダイズ配列を含む、又は本質的にそれからなる、請求項１に記載の心臓病の治療又は予防の方法で使用するためのオリゴ核酸剤。
【請求項３】
前記オリゴ核酸剤は、配列ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＡＧＣ  Ｔ（配列番号００１）を含む、又は本質的にそれからなる、請求項１又は２に記載の心臓病の治療又は予防の方法で使用するためのオリゴ核酸剤。
【請求項４】
前記オリゴ核酸剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防の方法で使用するためのオリゴ核酸剤。
【請求項５】
前記オリゴ核酸剤は、ロック（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）部分及び／又はペプチド核酸（ＰＮＡ）部分のうちの１つ若しくは複数を含む、又は本質的にそれからなる、特に前記オリゴ核酸剤は、ロック核酸（ＬＮＡ）部分から本質的になる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防の方法で使用するためのオリゴ核酸剤。
【請求項６】
前記ＬＮＡ部分は、チオリン酸結合によって接続される、請求項５に記載の心臓病の治療又は予防の方法で使用するためのオリゴ核酸剤。
【請求項７】
前記オリゴ核酸剤は、１２〜２０個のヌクレオチド、特に１４〜１６個のヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防の方法で使用するためのオリゴ核酸剤。
【請求項８】
前記オリゴ核酸剤は、２’−Ｏ修飾リボヌクレオチド又はＰＮＡオリゴマーがいずれかの側に隣接する５〜１０個のデオキシリボヌクレオチドの中央ブロック、より特にＬＮＡヌクレオシド類似体が隣接する５〜１０個のデオキシリボヌクレオシドの中央ブロックを含む、又は本質的にそれからなり、さらにより特に、前記ＬＮＡヌクレオシド類似体は、ホスホチオエート部分によって結合される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防の方法で使用するためのオリゴ核酸剤。
【請求項９】
前記オリゴ核酸剤は、配列ＡＣＣＡ−ａｔｃａｇｃｔａ−ＡＧＣＴ（配列番号００５）を含む、又は本質的にそれからなり、前記配列において、
−  大文字は、ヌクレオシド類似体、特にＬＮＡ、より特にホスホチオエートエステルによって結合されるＬＮＡを意味する、かつ
−  小文字は、リン酸エステルによって結合されるＤＮＡヌクレオシドを意味する、かつ
−  ヌクレオシド類似体とＤＮＡヌクレオシドの間の結合は、リン酸エステル及びチオリン酸塩から選択される、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防の方法で使用するためのオリゴ核酸剤。
【請求項１０】
前記オリゴ核酸剤は、ナノ粒子に結合される、又はウイルス若しくは脂質複合体にカプセル化される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防の方法で使用するためのオリゴ核酸剤。
【請求項１１】
前記心臓病は、心筋症、肥大型心筋症、大動脈弁狭窄症、高血圧症及び心不全から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防の方法で使用するためのオリゴ核酸剤。
【請求項１２】
前記心臓病は、ミトコンドリア複合体Ｖ（ＡＴＰシンターゼ）活性の低下又は欠如に関連する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防の方法で使用するためのオリゴ核酸剤。
【請求項１３】
心臓病の予防又は治療のための方法であって、それを必要とする患者に、請求項１〜１２のいずれか一項で特定されるとおりのオリゴ核酸剤を投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロＲＮＡの活性又は発現を調節するオリゴ核酸剤を投与することによる心臓病の治療及び予防に関する。より特に、本発明は、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ２７ｂ−５ｐの発現及び／又は活性を阻害することにより、心臓病を治療又は予防する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ストレスシグナルが、核内倍加を促進し、したがって細胞周期のＳ期に、その後の有糸分裂及び／又は細胞質分裂を完了することなく、ＤＮＡの複製を促進して細胞サイズの閾値を上昇させるメカニズムは未知である。細胞周期制御、成長シグナル伝達経路、並びに転写及び翻訳ネットワークの解析により、上流の制御ネットワークについての知見は得られているが、前述の制御因子が機能することが可能な根底に流れるエネルギーのより根本的な問題はほとんど解決されていない。細胞のエネルギー状態は、倍数性（これは定義上、細胞内の染色体のセット数である）だけでなく、細胞のサイズ及び機能も決定して、特異的な成長又は機能の終点を実行するシグナル伝達カスケード及び転写調節因子によって選出される特異的なアウトプットを許容する環境を確立する。新たな証拠は、調節解除ＡＤＰ：ＡＴＰホメオスタシスをヒト肥大型心筋症（ｈｕｍａｎ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）（ＨＣＭ）及び大動脈弁狭窄症（ａｏｒｔｉｃ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）（ＡＳ）の発症に関連付けている。ＨＣＭ及びＡＳは心臓の過成長の表現型の典型であり、核内倍加によって特徴づけられ、その結果、多倍数性と多核細胞化（２つ以上の核を持つ細胞）、及びミトコンドリアのＡＴＰ合成が低下した環境下での病理学的な心筋細胞の成長をもたらす。エネルギーが不足している心筋細胞（ミトコンドリアの酸化を介してエネルギー及び補因子を生成する能力の低下を表示する）は、同化プロセスを作動することができ心筋細胞の肥大を支持するというのは逆説的である。よって、ミトコンドリアミオパチーは主に心臓の過成長を特徴とする。
【０００３】
心肥大がミトコンドリアＡＴＰ合成の低下によって代謝的に特徴づけられることを考えると、本発明者らは、ヒトＨＣＭ及びＡＳの患者の生検におけるＡＴＰシンターゼ複合体のすべてのサブユニットの発現を体系的にプロファイリングすることから始めた。本発明者らは、ＡＴＰ５Ａ１（中央の軸（ｓｔａｌｋ）が回転してＡＤＰ及び無機リン酸からＡＴＰを再生することを介する触媒ドメインであるβサブユニットとともに形成される、ＡＴＰシンターゼ触媒Ｆ１複合体のαサブユニットをコードする）を、ＨＣＭ及びＡＳの生検においてダウンレギュレーションされているとして同定した。ＡＴＰ５Ａ１の抑制は、ストレス依存的制御性低酸素誘導因子（ＨＩＦ）１αがＭＩＲ２７Ｂの誘導を作動することによって媒介されていることを機構論的に実証した。ＡＴＰ５Ａ１の阻害は、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ活性を抑制して、チャネル化されてかつギ酸及びプリン生合成を調節する１−炭素経路のミトコンドリア局在律速制限酵素のための補因子であるＭＴＨＦＤ１Ｌとして機能するミトコンドリアＡＤＰの蓄積をもたらす。心筋細胞におけるＡＤＰによるＭＴＨＦＤ１Ｌの活性化は、ｄｅ  ｎｏｖｏヌクレオチド合成を加速させ、かつＡＭＰＫ作動型Ｅ２Ｆの並行活性化を介して心筋細胞の核内倍加及び細胞肥大を作動させる。結果として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びマウスでのＭＩＲ２７Ｂの不活性化は、手術媒介大動脈弁狭窄症（経大動脈狭窄（ＴＡＣ））に応答して既存の心不全を軽減するが、一方で心臓特異的なＭＩＲ２７Ｂの発現は自発的な心臓の過成長を引き起こす。マウスにおいて下流成分であるＡＴＰ５Ａ１及びＭＴＨＦＤ１Ｌの分析は、心臓の多倍数化及び細胞サイズの制御におけるＨＩＦ１α−ＭＩＲ２７Ｂ−ＡＴＰ５Ａ１−ＭＴＨＦＤ１Ｌ軸の中心的な役割をさらにサポートする。したがって、この軸の活性化は、ヒトの病理学的心肥大と相関している。これらの発見は、調節解除されたミトコンドリアＡＴＰホメオスタシスを心筋細胞における病態生理学的核内倍加と結びつけ、多核化及び形態学的成長をもたらすストレス依存性経路を明らかにしている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐの過剰発現を介してエネルギー的に欠損した心筋における病理学的成長の進行を指示するこれまで未知であるメカニズムとしての心臓代謝核内倍加を特定できた。このため、核内倍加及びｄｅ  ｎｏｖｏヌクレオチド生合成を介する病理学的成長の予防のためにｍｉＲ２７ｂ−５ｐの発現を阻害できる治療方法が当技術分野で必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の最新技術に基づいて、本発明の目的は、心臓病、特に心筋症（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）を治療する手段及び方法を提供することである。この目的は、本明細書の特許請求の範囲の主題によって達成される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１ＡＢ】図１Ａ〜Ｂは、病理学的増殖における核内倍加及び多核形成に対するＦ１Ｆ０ＡＴＰシンターゼの制御を示す。肥大型心筋症（ＨＣＭ）及び大動脈弁狭窄症（ＡＳ）の患者からの左心室生検と健康対照者、及び大動脈縮窄術（ＴＡＣ）を受けたマウスからと、偽（ｓｈａｍ）手術動物からの心室生検におけるＡＴＰシンターゼサブユニットをコードする遺伝子、及び心肥大及び機能不全のマーカー（ＮＰＰＡ及びＮＰＰＢ）の発現。心エコー検査で得られた心臓拡張期の心室中隔径（ＩＶＳＤ；ｄ）と左心室後壁径（ＬＶＰＷＤ；ｄ）の測定、及びＴＡＣ又はｓｈａｍ動物の短縮率（％ＦＳ）と駆出率（％ＥＦ）を示す。
【図１ＣＤ】図１Ｃ〜Ｄは、免疫ブロッティングによって示されたタンパク質発現について評価した、ＨＣＭ及び大動脈弁狭窄症の患者並びに健康な対照（ｃ）又はｓｈａｍ及びＴＡＣ手術のマウス（ｄ）からの左心室の生検を示す。
【図１ＥＦ】図１Ｅ〜Ｆは、ＨＣＭ及び大動脈弁狭窄症患者と、健康な対照からの心室生検（ｅ）、及びＴＡＣに供したマウスとｓｈａｍ手術動物の心室生検（ｆ）のＡＤＰ／ＡＴＰ比を示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、ＤＡＰＩ（青）、ラミニン（緑）及びαアクチニン（赤）について染色され、共焦点顕微鏡で画像化した大動脈弁狭窄症（ＡＳ）（ｎ＝３）及び肥大型心筋症（ＨＣＭ）（ｎ＝３）の患者と、健康対照者（ｎ＝３）からの左心室縦断面を示す。
【図１Ｈ】図１Ｈは、図１Ｇと同様に染色され、単核、二核、又は多核の心筋細胞の割合を評価した心臓断面を示す。
【図１Ｉ】図１Ｉは、ＤＡＰＩ（青）、ラミニン（緑）及びαアクチニン（赤）について染色され、共焦点顕微鏡によって画像化された、ｓｈａｍ（ｎ＝３）及びＴＡＣ手術（ｎ＝３）されたマウスからの左心室縦断面を示す。
【図１Ｊ】図１Ｊは、（ｉ）のように染色された心臓断面が、単核心筋細胞と多核心筋細胞の比率について評価されたことを示す（２つの断面／心臓は定量化に使用される２つのフィールド／断面で分析した。合計で、群ごとに３つの心臓を分析した）。
【図１Ｋ】図１Ｋは、Ｃｒｅ媒介組換え前後のＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１ウイルス（左パネル）と実験タイムライン（右パネル）の模式図を示す。
【図１Ｌ】図１Ｌは、指定されたタンパク質に対する抗体を使用してＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１で形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスからの心室溶解物のイムノブロットを示す。
【図１Ｍ】図１Ｍは、ＡＡＶ９注射の１１週間後にＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１を形質導入したＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスの左心室試料で測定されたＡＤＰ／ＡＴＰ比を示す。
【図１Ｎ】図１Ｎは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１を形質導入したＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋（ｎ＝３）及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−（ｎ＝３）のマウスの左心室縦断面をＤＡＰＩ（青）、ラミニン（緑）及びαアクチニン（赤）について染色し、及び共焦点顕微鏡によって画像化したことを示す。
【図１Ｏ】図１Ｏは、単核、二核、又は多核の心筋細胞の比率について評価された、図１Ｎのように染色された心臓断面を示す。
【図１Ｐ】図１Ｐは、ＡＡＶ９注射の１１週間後にＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１で形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスの左心室の代表的な画像を示す。
【図１Ｑ】図１Ｑは、ＡＡＶ９注射の１１週間後にＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１で形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスのＨ＆Ｅ染色された組織断面の代表的な画像を示す。
【図１ＲＳ】図１Ｒ〜Ｓは、ＡＡＶ９注射の１１週間後にＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１で形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスの左心室重量／体重（ＬＶＷ／ＢＷ）（Ｒ）及び駆出率（Ｓ）を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、肥大型心筋症（ＨＣＭ）又は大動脈弁狭窄症（ＡＳ）の患者におけるＭＩＲ２７Ｂの発現を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂで形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅマウスの実験的タイムラインの概略図を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂウイルスを注射したＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスの左心室の代表的な画像を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂウイルスで形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスのＨ＆Ｅ染色された組織断面の代表的な画像を示す。
【図２ＥＦ】図２Ｅ〜Ｆは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂウイルスを注射したＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスのＬＶＷ／ＢＷ（ｅ）及び駆出率（ｆ）を示す。
【図２Ｇ】図２Ｇは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂウイルスを注射したＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスにおける成熟ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ及びｍｉＲ２７ｂ−３ｐの相対的発現を示す。
【図２Ｈ】図２Ｈは、図２Ｃ〜Ｇのように、示されたタンパク質に対する抗体を用いて形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスからの心室溶解物のイムノブロットを示す。
【図２Ｉ】図２Ｉは、ＤＡＰＩ（青）、ラミニン（緑）及びαアクチニン（赤）について染色され、共焦点顕微鏡によって画像化されたＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂで形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋（ｎ＝３）及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−（ｎ＝３）のマウスの左心室縦断面を示す。
【図２Ｊ】図２Ｊは、図２Ｉのように染色され、及び単核心筋細胞と多核心筋細胞の比率について評価された心臓断面を示す。
【図２Ｋ】図２Ｋは、ｓｈａｍ及びＴＡＣ手術のマウスにおけるアンタゴミール研究の概略図を示す。ベースライン心エコー測定は、日付が−５日に行われ、日付が０日にｓｈａｍ又はＴＡＣ手術が行われ、手術後４９〜５２日にｓｃｒＬＮＡ及びｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡが腹腔内（ｉ．ｐ）送達され、示された時点で心エコー検査によってモニターした。
【図２ＬＭ】図２Ｌ〜Ｍは、左心室（図２Ｌ）及びＨ＆Ｅ染色（図２Ｍ）の組織学的断面の代表的な画像を示す。
【図２ＮＯＰ】図２Ｎ〜Ｐは、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術に供され、スクランブル（ｓｃｒＬＮＡ）又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐＬＮＡのいずれかで治療されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの、ＬＶＷ／ＢＷ（図２Ｎ）、収縮末期における左心室内径（ＬＶＩＤ；ｓ）（図２Ｏ）、及び駆出率（図２Ｐ）の縦方向モニタリングを示す。
【図２ＱＲＳＴ】図２Ｑ〜Ｔは、ｑＰＣＲによる、ｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡで治療され、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のいずれかに供されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける成熟ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ（図２Ｑ）、ｍｉＲ２７ｂ−３ｐ（図２Ｒ）、Ｎｐｐａ及びＮｐｐｂ（図２Ｓ）並びにＡｔｐ５ａ１  ｍＲＮＡ（図２Ｔ）の相対的発現を示す。
【図２Ｕ】図２Ｕは、示されたタンパク質に対する抗体を使用して、ｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡのいずれかで治療されたｓｈａｍ及びＴＡＣ手術されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスからの心室溶解物のイムノブロットを示す。
【図２Ｖ】図２Ｖは、ＤＡＰＩ（青）、ラミニン（緑）及びαアクチニン（赤）について染色され、共焦点顕微鏡によって画像化された、ｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡのいずれかで治療されたｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のマウスからの左心室縦断面を示す。
【図２Ｗ】図２Ｗは、（Ｖ）のように染色された心臓断面が、単核心筋細胞と多核心筋細胞の比率について評価されたことを示す。
【図２Ｘ】図２Ｘは、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術に供され、ｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡで治療されたマウス間の死亡率を比較するカプランマイヤー生存曲線を示す。ｓｈａｍ手術動物では死亡は観察されなかった。
【図３Ａ】図３Ａは、解糖及び１−炭素代謝の寄与を示すｄｅ  ｎｏｖｏのプリン生合成経路の概略図を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、示されているとおり形質導入及び治療されたＮＲＣにおけるギ酸塩の相対量を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、示されているとおり形質導入及び治療されたＮＲＣにおける相対的なミトコンドリアＡＤＰ／ＡＴＰ比を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、示されるとおり形質導入及び治療されたＮＲＣにおける相対的な代謝産物の存在量のヒートマップを示す。示されているのは、対照治療と比較してｌｏｇ２（倍数変化）が＞０．５であり、対応する対照と比較して少なくとも１つの治療群で調整されたｐ値が＜０．０１の代謝物である（群あたりｎ＝４の生物学的複製）。
【図３Ｅ】図３Ｅは、示されるとおり形質導入及び治療されたＮＲＣの核酸に取り込まれた［１４Ｃ］グルコース、［１４Ｃ］セリン及び［１４Ｃ］グリシンに由来する［１４Ｃ］炭素の相対量を示す。
【図４ＡＢＣＤＥＦ】図４Ａ〜Ｆは、示されているとおり形質導入及び治療されたＮＲＣが、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）について染色され、画像化（ａ、ｃ、ｅ）と、画像から定量化される多核形成（ｂ、ｄ、ｆ）とを組み合わせるフローサイトメトリーによる倍数性についての評価を行ったことを示す。
【図４ＧＨＩ】図４Ｇ〜Ｉは、示されるとおり形質導入及び治療されたＮＲＣにおける［３Ｈ］ロイシン取り込みの評価を示す。データは、対照ＮＲＣ（１．０として設定）と比較して組み込まれた放射能として表される。
【図５Ａ】図５Ａは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌで形質導入され、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術を受けたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅのマウスの実験タイムラインの概略図を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌウイルスを注射したｓｈａｍ又はＴＡＣ手術されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスの左心室縦断面をＤＡＰＩ（青）、ラミニン（緑）及びα−アクチニン（赤）について染色し、共焦点顕微鏡で画像化した（３つの断面／心臓が２〜４つのフィールド／断面で分析され、代表的なｚスタックフィールドを有する。合計で、群ごとに３つの心臓を分析した）。矢印は心筋細胞の核生成を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、（ｂ）のように染色された心臓断面が、単核心筋細胞と多核心筋細胞の比率について評価されたことを示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈ  Ｍｔｈｆｄ１ｌウイルスを注射された、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスの左心室の代表的な画像を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈ  Ｍｔｈｆｄ１ｌウイルスを注射されたｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスのＨ＆Ｅ染色された組織学的断面の代表的な画像を示す。
【図５ＦＧ】図５Ｆ〜Ｇは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈ  Ｍｔｈｆｄ１ｌウイルスを注射したｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスのＬＶＷ／ＢＷ（ｆ）及び駆出率（ｇ）を示す。
【図５Ｈ】図５Ｈは、指定されたタンパク質に対する抗体を使用して（ｂ〜ｇ）のように形質導入されたｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスからの心室溶解物のイムノブロットを示す。
【図５Ｉ】図５Ｉは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１及びＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌで同時形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅのマウスの実験的タイムラインの概略図を示す。
【図５Ｊ】図５Ｊは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１及びＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌで同時形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋（ｎ＝３）及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−（ｎ＝３）のマウスの左心室縦断面をＤＡＰＩ（青）、ラミニン（緑）、αアクチニン（赤）で染色され、共焦点顕微鏡で画像化したものを示す。
【図５Ｋ】図５Ｋは、（ｊ）のように染色された心臓断面が、単核心筋細胞と多核心筋細胞の比率について評価されたことを示す。
【図５Ｌ】図５Ｌは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１及びＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌで同時形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスの左心室の代表的な画像を示す。
【図５Ｍ】図５Ｍは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１及びＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌで同時形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスのＨ＆Ｅ染色された組織断面の代表的な画像を示す。
【図５ＮＯ】図５Ｎ〜Ｏは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１及びＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌで同時形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスのＬＶＷ／ＢＷ（ｎ）及び駆出率（ｏ）を示す。
【図５Ｐ】図５Ｐは、示されたタンパク質に対する抗体を使用して、ｊ〜ｐのように形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスの心室溶解物のイムノブロットを示す。。
【図６Ａ】図６Ａは、示されたタンパク質に対する抗体を使用して、構成的に活性な形態のＡＭＰＫα１を異所的に発現するＮＲＣのイムノブロットを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、構成的に活性な形態のＡＭＰＫα１を異所的に発現するＮＲＣからの抗ＡＭＲＫα抗体又は対照ＩｇＧのいずれかによる免疫沈降（ＩＰ）を示す。ＩＰをｐ−ＡＭＰＫα抗体及びｐ−Ｒｂ抗体を使用してブロットした。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＨＩＦ１αΔＯＤＤを異所的に発現し、示されたタンパク質に対する抗体を使用してＤＭＳＯ又はＡＭＰＫ阻害剤化合物Ｃ（ＣＣ）のいずれかで治療されたＮＲＣのイムノブロットを示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＨＩＦ１αΔＯＤＤを異所的に発現し、ＤＭＳＯ又はＡＭＰＫ阻害剤ＣＣのいずれかで治療されたＮＲＣからの対照ＩｇＧ抗体又は抗ＡＭＲＫα抗体のいずれかによる免疫沈降を示す。ＩＰをｐ−ＡＭＲＫα抗体及びｐ−Ｒｂ抗体を使用してブロットした。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ｐ−Ｒｂ及び総Ｒｂに対する抗体を使用して、ｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡのいずれかで治療されたｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のマウスからの心室溶解物のイムノブロットを示す。
【図６Ｆ】図６Ｆは、ｐ−Ｒｂ及び総Ｒｂに対する抗体を使用して、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂウイルスを注射したＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスの心室溶解物のイムノブロットを示す。
【図６Ｇ】６Ｇは、ｐ−Ｒｂ及び総Ｒｂに対する抗体を使用して、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１ウイルスを注射したＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスの心室溶解物のイムノブロットを示す。
【図６Ｈ】図６Ｈは、ｐ−Ｒｂ及び総Ｒｂに対する抗体を使用して、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌウイルスを注射したｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスからの心室溶解物のイムノブロットを示す。
【図６Ｉ】図６Ｉは、ｐ−Ｒｂ及び総Ｒｂに対する抗体を使用して、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１及びＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌで同時形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスからの心室溶解物のイムノブロットを示す。
【図６Ｊ】図６Ｊは、ｐ−Ｒｂ及び総Ｒｂに対する抗体を使用するＨＣＭ及び大動脈弁狭窄症患者、並びに健康な対照からの心室溶解物のイムノブロットを示す。
【図６Ｋ】図６Ｋは、ｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡのいずれかで治療したｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のマウスからの心室溶解物中の示された遺伝子の相対的発現のヒートマップを示す。
【図６Ｌ】図６Ｌは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂのいずれかを注射したＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスの心室溶解物における指定遺伝子の相対的発現のヒートマップを示す。
【図６Ｍ】図６Ｍは、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術を受け、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌウイルスを注射されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスの心室溶解物における指定の遺伝子の相対的発現のヒートマップを示す。
【図６Ｎ】図６Ｎは、ＨＣＭ及び大動脈弁狭窄症患者並びに健康な対照からの心室溶解物における指定の遺伝子の相対的発現のヒートマップを示す。
【図６Ｏ】図６Ｏは、示されるように感染及び治療されたＮＲＣにおけるＥ２Ｆルシフェラーゼレポーターのトランスフェクションを示す。データは、感染した対照ＮＲＣに正規化される（１．０として設定）。
【図６Ｐ】図６Ｐは、示されるように感染したＮＲＣにおけるＥ２Ｆルシフェラーゼレポーターのトランスフェクションを示す。データは、感染した対照ＮＲＣに正規化される（１．０として設定）。
【図６Ｑ】図６Ｑは、心臓の倍数性と成長制御におけるＦ１Ｆ０ＡＴＰシンターゼ機能の提案されるメカニズムを示す。病理学的ストレスは、解糖系遺伝子及びマイクロＲＮＡであるＭＩＲ２７ＢのＨＩＦ１α及びＨＩＦ１αの依存性誘導の安定化及び蓄積をもたらし、次に、ＭＩＲ２７Ｂは、Ｆ１Ｆ０ＡＴＰシンターゼのアルファサブユニット（ＡＴＰ５Ａ１）の３’ＵＴＲに結合し、それにより、それを分解の標的にする。Ｆ１Ｆ０ＡＴＰシンターゼ阻害の結果として、ＡＤＰ／ＡＴＰ比はミトコンドリアマトリックス内で上昇し、一方ではエネルギーセンサーＡＭＰＫを活性化する。次に、ｐＡＭＰＫはＲｂを高リン酸化し、転写因子Ｅ２Ｆの放出と、サイクリン及びＣＤＫの発現の誘導をもたらす。一方、蓄積するミトコンドリアＡＤＰは、ＣＨＯ−ＴＨＦからギ酸塩への変換を触媒するためにＡＤＰを補因子として使用する、ミトコンドリアの１−炭素代謝に関与する酵素であるＭＴＨＦＤ１Ｌへ再チャネル化される。特にセリンに由来するギ酸塩は、プリンのｄｅ  ｎｏｖｏ合成のための１−炭素ドナーとして機能する。核酸合成の基質としてのプリンのｄｅ  ｎｏｖｏ形成の増加、及びサイクリン及びＣＤＫの誘導は、ＤＮＡ複製、多核形成、及び心臓の成長を促進する。ＣＨＯ−ＴＨＦはホルミルテトラヒドロ葉酸塩を示し、ＣＨ２−ＴＨＦはメチレンテトラヒドロ葉酸塩を示し、３−ＰＧは３−ホスホグリセリン酸塩を示す。
【図７ａ】図７ａは、ＮＰＰＢの発現に対する図１ａ（左パネル）に提示されたＡＴＰシンターゼサブユニット遺伝子のピアソンの相関係数を示す（健康な対照の場合はｎ＝４、ＡＳの場合はｎ＝１０、ＨＣＭの場合はｎ＝１１）。
【図７ｂ】図７ｂは、ｓｈａｍ及びＴＡＣ手術の動物の心室溶解物からのＡＴＰレベルの定量化を示す（ｓｈａｍの場合はｎ＝５、ＴＡＣ手術の場合はｎ＝６、示されているのは平均±ＳＥＭ、＊＊＊ｐ＜０．００１、対応のない両側ｔ検定）。
【図７ｃ】図７ｃでは、ＨＣＭ（ｎ＝３）及び大動脈弁狭窄症（ｎ＝３）患者及び健康対照（ｎ＝３）の左心室断面をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、光学顕微鏡で画像化した（２つの断面／心臓（２つのフィールド／断面を有する）を示される代表的なフィールドで調査した）。スケールバーは２００μｍである。
【図７ｄ】図７ｄでは、ｓｈａｍ（ｎ＝３）及びＴＡＣ（ｎ＝３）手術のマウスの左心室断面をＨ＆Ｅで染色し、光学顕微鏡で画像化した（３つの断面／心臓（３〜５つのフィールド／断面を持つ）を、示される代表的なフィールドで調査した）。スケールバーは２００μｍである。
【図７ｅ】図７ｅでは、心筋細胞を、ｓｈａｍ及びＴＡＣ手術のマウスから単離し、ＤＡＰＩ及びαアクチニンについて染色した。細胞は共焦点顕微鏡で画像化され、群あたり３匹のマウスからの代表的なｚスタック画像を示す。スケールバーは２０μｍである。
【図７ｆ】図７ｆでは、（ｅ）のとおり染色された成体心筋細胞を、多核心筋細胞に対する単核心筋細胞の比率について評価した（群あたりｎ＝３のマウスから、少なくとも１３０個の細胞を定量化した）。
【図７ｇ】図７ｇでは、ｓｈａｍ及びＴＡＣ手術のマウスにおけるＨＷ／ＢＷを示す（ｓｈａｍの場合はｎ＝５、ＴＡＣ手術の場合はｎ＝６、＊ｐ＜０．０５、対応のない両側ｔ検定）。
【図７ｈｉ】図７ｈ、ｉでは、ｓｈａｍ及びＴＡＣ手術のマウスのＨ＆Ｅ（ｈ）及びピクロシリウスレッド（ｉ）染色された組織断面の代表的な画像を示す。スケールバーは５００μｍである。
【図７ｊ】図７ｊでは、ｓｈａｍ及びＴＡＣ手術のマウスの左心室溶解物におけるＣｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１及びＴＧＦｂ１  ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは、ｓｈａｍの手術動物に対して正規化されている（１．０に設定）（ｓｈａｍの場合はｎ＝５、ＴＡＣ手術の場合はｎ＝６。示されている結果は平均±ＳＥＭであり、＊ｐ＜０．０５、対応のない両側ｔ検定）
【図８ａ】図８ａでは、ＡＡＶ９注射の１１週間後にＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１で形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスにおけるＡｔｐ５ａ１  ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１で形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスに正規化されている（１．０に設定）（Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−の場合はｎ＝８、Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋の場合はｎ＝９。示されているのは平均±ＳＥＭであり、＊＊＊ｐ＜０．００１；対応のない両側ｔ検定）。
【図８ｂ】図８ｂでは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１で形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスの心室溶解物からのＡＴＰレベルの定量化を示す（Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−の場合はｎ＝８、Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋の場合はｎ＝９；示されているのは平均±ＳＥＭであり、＊ｐ＜０．０５；対応のない両側ｔ検定）。
【図８ｃ】図８ｃでは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１ウイルスを注射したＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋（ｎ＝３）及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−（ｎ＝３）のマウスの左心室断面をＨ＆Ｅ染色し、光学顕微鏡で画像化した（３つの断面／心臓（３〜５つのフィールド／断面を有する）が調査され、代表的なフィールドが示される）。スケールバーは２００μｍである。
【図８ｄ】図８ｄでは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１ウイルスを注射したＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスから心筋細胞を単離し、ＤＡＰＩ及びα−アクチニンについて染色した。細胞は共焦点顕微鏡で画像化され、群あたり３匹のマウスからの代表的なｚスタック画像を示す。スケールバーは２０μｍである。
【図８ｅ】図８ｅでは、（ｄ）のように染色された成体心筋細胞を、多核心筋細胞に対する単核心筋細胞の比率について評価した（群あたりｎ＝３のマウスから、少なくとも１５０個の細胞を定量化した）。
【図８ｆ】図８ｆでは、ＡＡＶ９注射の１１週間後にＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１で形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスにおけるＮｐｐａ及びＮｐｐｂのｍＲＮＡの相対的発現を示す。データはＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１で形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスに正規化される（１．０に設定）（Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−の場合はｎ＝８、Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋の場合はｎ＝９。示されているのは平均±ＳＥＭであり、＊ｐ＜０．０５；対応のない両側ｔ検定）。
【図８ｇ】図８ｇでは、ＡＡＶ９注射の１１週間後にＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１で形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスにおけるＬＶＩＤを示す（Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−の場合はｎ＝８、Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋の場合はｎ＝９。示されているのは平均±ＳＥＭであり、＊＊ｐ＜０．０１；対応のない両側ｔ検定）。
【図８ｈ】図８ｈ、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１ウイルスで形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスのピクロシリウスレッド染色組織断面の代表的な画像を示す。スケールバーは５００μｍである。
【図８ｉ】図８ｉでは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１ウイルスを形質導入したＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスの左心室溶解物におけるＣｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１及びＴＧＦｂ１ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データはＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスに正規化されている（１．０に設定）（Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスの場合はｎ＝８、Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋マウスの場合はｎ＝９、示されている結果は平均±ＳＥＭであり、＊ｐ＜０．０５、対応のない両側ｔ検定）。
【図８ｊ】図８ｊでは、ＡＴＰ５Ａ１に対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＡＴＰ５Ａ１）又は非サイレンシングｓｈＲＮＡ（ｎｓＲＮＡ）を発現するレンチウイルスで形質導入されたｉＰＳＣ由来ヒト心筋細胞（ｉＰＳＣ−ｈＣＭ）におけるＡＴＰ５Ａ１ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは、ｎｓＲＮＡを発現する対照ＮＲＣに正規化される（１．０として設定）（群あたりｎ＝３の生物学的複製、示されている結果は平均±ＳＤであり；＊＊＊ｐ＜０．００１；対応のない両側ｔ検定）。
【図８ｋ】図８ｋでは、ｎｓＲＮＡ又はｓｈＡＴＰ５Ａ１を発現するレンチウイルスで形質導入されたｉＰＳＣ−ｈＣＭにおけるＡＤＰ／ＡＴＰ比を示す（群あたりｎ＝３の生物学的複製；示されているのは平均±ＳＤ；＊＊ｐ＜０．０１；対応のない両側ｔ検定）。
【図８ｌｍ】図８ｌ、ｍでは、ｎｓＲＮＡ又はｓｈＡＴＰ５Ａ１を発現するレンチウイルスで形質導入されたｉＰＳＣ−ｈＣＭからのＡＤＰ（ｌ）及びＡＴＰ（ｍ）レベルの定量化を示す（両方の群についてｎ＝３、示されているのは平均±ＳＤ、＊＊ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定）。
【図８ｎ】図８ｎでは、ｎｓＲＮＡ又はｓｈＡＴＰ５Ａ１を発現するレンチウイルスで形質導入されたｉＰＳＣ−ｈＣＭをＤＡＰＩ及びファロイジンについて染色し、共焦点顕微鏡で画像化した。３つの生物学的複製からの代表的なフィールドを示す。スケールバーは２０μｍである。
【図８ｏ】図８ｏ、（ｎ）のように治療されたｉＰＳＣ−ｈＣＭの多核細胞のパーセンテージの定量化を示す（実験及び条件ごとに分析された約１００個の細胞でのｎ＝３の生物学的複製；示されているのは平均±ＳＤ；＊ｐ＜０．０５；対応のない両側ｔ検定）。
【図８ｐ】図８ｐでは、（ｎ）のように治療されたｉＰＳＣ−ｈＣＭは、ＩｍａｇｅＪを使用して細胞サイズについて評価した（実験及び条件ごとに分析された約１００個の細胞でのｎ＝３の独立した実験、示されているのは平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、対応のない両側ｔ検定）。
【図８ｑ】図８ｑでは、ｎｓＲＮＡ又はｓｈＡｔｐ５ａ１を発現するレンチウイルスで形質導入されたＮＲＣにおけるＡｔｐ５ａ１ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは、ｎｓＲＮＡを発現する対照ＮＲＣに正規化される（１．０として設定）（群あたりｎ＝３の生物学的複製、示されている結果は平均±ＳＤであり；＊＊＊ｐ＜０．００１；対応のない両側ｔ検定）。
【図８ｒ】図８ｒでは、ｎｓＲＮＡ又はｓｈＡｔｐ５ａ１で形質導入されたＮＲＣを、イムノブロッティングによってＡｔｐ５ａ１タンパク質レベルについて評価した。ローディングは心臓アクチンに対して正規化されている。
【図８ｓ】図８ｓでは、示されているように、ｎｓＲＮＡ又はＡｔｐ５ａ１ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスで形質導入されたＮＲＣにおけるＡＤＰ／ＡＴＰ比を示す（群あたりｎ＝３の生物学的複製；示されているのは平均±ＳＤ；＊＊ｐ＜０．０１；対応のない両側ｔ検定）。
【図８ｔｕ】図８ｔ、ｕでは、ｎｓＲＮＡ又はＡｔｐ５ａ１  ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスで形質導入されたＮＲＣからのＡＤＰ（ｔ）及びＡＴＰ（ｕ）レベルの定量化を示す（両方の群についてｎ＝３、示されているのは平均±ＳＤ、＊＊ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定）。
【図８ｖ】図８ｖでは、ｎｓＲＮＡ又はＡｔｐ５ａ１  ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスで形質導入されたＮＲＣをファロイジン及びＤＡＰＩについて染色し、共焦点顕微鏡で画像化した。ｎ＝３の生物学的複製からの代表的なフィールドを示す。スケールバーは２０μｍである。
【図８ｗ】図８ｗ、（ｖ）のように治療されたＮＲＣの多核細胞のパーセンテージの定量化を示し（実験及び条件ごとに分析された約１００個の細胞でのｎ＝３の生物学的複製；示されているのは平均±ＳＤ；＊ｐ＜０．０５；対応のない両側ｔ検定）。
【図８ｘ】図８ｘ、（ｖ）のように治療されたＮＲＣを、ＩｍａｇｅＪを使用して細胞サイズについて評価した（実験及び条件ごとに分析された約１００個の細胞でのｎ＝３の独立した実験、示されているのは平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、対応のない両側ｔ検定）。
【図８ｙ】図８ｙでは、ｎｓＲＮＡ又はＡｔｐ５ａ１ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスで形質導入されたＮＲＣにおける［３Ｈ］ロイシン取り込みの評価を示す。データは、ｎｓＲＮＡを発現する対照ＮＲＣ（１．０に設定）に対する組み込まれた放射能として表される（群あたりｎ＝４の生物学的複製、示されている結果は平均±ＳＥＭであり；＊ｐ＜０．０５；対応のない両側ｔ検定）。
【図９ａｂ】図９ａ、ｂでは、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術を受けた対照（Ｈｉｆ１αｆｌ／ｆｌ）及びＨｉｆ１αｃＫＯのマウス（ａ）、又は対照（Ｖｈｌ  ｆｌ／ｆｌ）及びＶｈｌｃＫＯのマウス（ｂ）の心室におけるＡｔｐ５ａ１ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは対照に対して正規化される（１．０として設定）（（ａ）及び（ｂ）の群あたりｎ＝５のマウス；示されているのは平均±ＳＥＭ；＊、％ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；（ａ）について１元配置分散分析及びボンフェローニ補正、及び（ｂ）について対応のない両側ｔ検定）。
【図９ｃ】図９ｃでは、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術の対照（Ｈｉｆ１αｆｌ／ｆｌ）及びＨｉｆ１αｃＫＯのマウス（左パネル）、又は対照（Ｖｈｌ  ｆｌ／ｆｌ）及びＶｈｌ  ｃＫＯのマウス（右パネル）の心室溶解物を、Ｈｉｆ１α及びＡｔｐ５ａ１に対する抗体を用いたイムノブロッティングの処理を行った。ローディングは心臓アクチンに対して正規化されている。
【図９ｄｅ】図９ｄ、ｅでは、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術（ｄ）を受けた対照（Ｈｉｆ１αｆｌ／ｆｌ）及び心室特異的Ｈｉｆ１α条件付きノックアウト（Ｈｉｆ１αｃＫＯ）のマウスからの左心室生検におけるＡＴＰ量（ｄ）及び駆出率（ｅ）の定量化を示す（（ｄ）及び（ｅ）の群あたりｎ＝５のマウス；示されているのは平均±ＳＥＭ；＊、％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析及びボンフェローニ補正）。
【図９ｆｇ】図９ｆ、ｇでは、心室特異的Ｖｈｌ条件付きノックアウト（Ｖｈｌ  ｃＫＯ）及びそれぞれの対照（Ｖｈｌ  ｆｌ／ｆｌ）のマウス（ｇ）の左心室生検（ｆ）及び駆出率（ｇ）におけるＡＴＰ量の定量化を示す（（ｆ）及び（ｇ）の１群あたりｎ＝５のマウス；示されているのは平均±ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；対応のない両側ｔ検定）。
【図９ｈ】図９ｈでは、ＴＡＣ手術を受けたＨｉｆ１αｃＫＯマウスに対しＴＡＣ手術を受けた対照動物、又はＶｈｌｃＫＯマウスに対し対照動物からの心室溶解物からの（技術的に４乗間のｐ＜０．０００１、及び平均シグナル強度がバックグラウンドの１倍の生物学的３乗のｐ＜０．０５）、プロモーターにおいて推定ＨＲＥを含有するｍｉＲＮＡの発現を示す。
【図９ｉ】図９ｉ、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術を受けた対照（Ｈｉｆ１αｆｌ／ｆｌ）及びＨｉｆ１αｃＫＯのマウスの心室におけるｍｉｒ２７ｂ、Ｖｅｇｆａ及びＬｄｈａのｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは、ｓｈａｍの対照に対して正規化されている（１．０に設定）（群あたりｎ＝５のマウス；示されているのは平均±ＳＥＭ；＊，％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析及びボンフェローニ補正）。
【図９ｊ】図９ｊ、対照（Ｖｈｌ  ｆｌ／ｆｌ）及びＶｈｌｃＫＯのマウスの心室におけるｍｉｒ２７ｂ  ＲＮＡの相対的発現を示す。データは対照に対して正規化される（１．０として設定）（群あたりｎ＝５のマウス；示されているのは平均±ＳＥＭ；＊＊＊ｐ＜０．００１；対応のない両側ｔ検定）。
【図９ｋｌｍ】図９ｋ〜ｍでは、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術を受けた野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの心室溶解物からのＡｍｐＯ（ｋ）、成熟ｍｉＲ２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ２３ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ２４−３ｐ（ｌ）、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ２３ｂ−５ｐ、及びｍｉＲ２４−５ｐ（ｍ）の相対発現レベルを示す。データは、ｓｈａｍ手術された対照マウスに対して正規化されている（１．０として設定）（ｓｈａｍの場合はｎ＝５、ＴＡＣの場合はｎ＝８、示されているデータは平均±ＳＥＭであり、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；対応のない両側ｔ検定）。
【図９ｎｏｐ】図９ｎ〜ｐでは、空の対照ベクター又はＨＩＦ１αΔＯＤＤを異所性発現するＮＲＣにおけるＡｍｐＯ（ｎ）、成熟ｍｉＲ２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ２４−３ｐ（ｏ）、及びｍｉＲ２７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ２３ｂ−５ｐ、ｍｉＲ２４−５ｐ（ｐ）の相対的発現を示す。データは、空の対照ベクターで形質導入されたＮＲＣに正規化される（１．０に設定）（群あたりｎ＝５の生物学的複製；示されているのは平均±ＳＥＭ；＊＊ｐ＜０．０１；対応のない両側ｔ検定）。
【図９ｑ】図９ｑでは、Ｔ３又はＰＢＳ（モック）で治療したＮＲＣにおける［３Ｈ］ロイシン取り込みの評価を示す。データは、モック治療ＮＲＣ（１．０として設定）と比較して組み込まれた放射能として表される（群あたりｎ＝４の生物学的複製、示されている結果は平均±ＳＥＭであり；＊＊＊ｐ＜０．００１；対応のない両側ｔ検定）。
【図９ｒｓｔ】図９ｒ〜ｔでは、ＰＢＳ（モック）又はＴ３で治療したＮＲＣにおけるＡｍｐＯ（ｒ）、成熟ｍｉＲ２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ２３ｂ−３ｐ及びｍｉＲ２４−３ｐ（ｓ）、及びｍｉＲ２７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ２３ｂ−５ｐ及びｍｉＲ２４−５ｐ（ｔ）の相対的な発現を示す。データはモック治療されたＮＲＣに正規化されている（１．０と設定）（群あたりｎ＝５の生物学的複製；示されているのは平均±ＳＥＭ；＊＊＊ｐ＜０．００１；対応のない両側ｔ検定）。
【図９ｕ】図９ｕでは、Ｔ３で刺激され、かつ非サイレンシング対照ｓｈＲＮＡ（ｎｓＲＮＡ）又はＨｉｆ１αに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨｉｆ１α）で形質導入されたＮＲＣにおけるＨｉｆ１α、ｍｉｒ２７ｂ、Ｇｌｕｔ１及びＶｅｇｆａのｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは、ｎｓＲＮＡに感染した対照ＮＲＣに正規化される（１．０に設定）（群あたりｎ＝３の生物学的複製；示されているのは平均±ＳＤ；＊，
【数１】
2021529202.tif 000002
，％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析及びボンフェローニ補正）。
【図９ｖ】図９ｖでは、前駆体ｍｉｒ２７ｂ転写開始部位の１６２ｂｐ上流に位置する保存されたＨＲＥを保有するヒト、サル、フクロネズミ、ラット及びマウスのｍｉｒ２７ｂのプロモーター配列を示す。ＨＲＥは赤で表示され、コアＨＲＥモチーフが大文字になっている。
【図９ｗ】図９ｗでは、空の対照ベクター又はＨＩＦ１αΔＯＤＤのいずれかの異なる用量での、ルシフェラーゼに融合される野生型（ｗｔ）又はＨＲＥ変異（ｍｕｔ）ｍｉｒ２７ｂプロモーターの同時トランスフェクションを示す。データは、空の対照ベクターでトランスフェクトされた野生型プロモーターに対して正規化される（１．０に設定）（群あたりｎ＝４の生物学的複製、示されているデータは平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５、一元配置分散分析、続いてダネットの事後検定）。
【図９ｘ】図９ｘでは、空のベクター対照又はＨＩＦ１αΔＯＤＤのいずれかの異なる用量でのルシフェラーゼに融合されるｍｉｒ２３ｂ及びｍｉｒ２４−１のプロモーターの同時トランスフェクションを示す。データは、空の対照ベクターでトランスフェクトされたルシフェラーゼベクターに正規化されている（１．０に設定）（群あたりｎ＝４の生物学的複製、示されているデータは平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５、一元配置分散分析、続いてダネットの事後検定）。
【図９ｙ】図９ｙでは、ＮＲＣはＶｈｌ（ｓｈＶｈｌ）に対してｎｓＲＮＡ又はｓｈＲＮＡのいずれかを発現するレンチウイルスで形質導入され、そしてＨＩＦ１α特異的抗体（ＩＰ：ＨＩＦ１α）で、又は対照アイソタイプ一致抗体（ＩｇＧ対照）でクロマチン免疫沈降の処理を行った。Ｈｉｆ１αプロモーターの結合をｑＰＣＲで分析した。示されているデータは、ｎｓＲＮＡを発現するＮＲＣからの核溶解物に対するＩｇ対照抗体を用いたクロマチン免疫沈降に関して示す（１．０に設定）（群あたりｎ＝３の生物学的複製；示されているデータは平均±ＳＤ；＊＊＊ｐ＜０．００１；対応のない両側ｔ検定）。
【図９ｚ】図９ｚでは、ｎｓＲＮＡ又はｓｈＶｈｌで形質導入されたＮＲＣをイムノブロッティングによりＨｉｆ１α及びＶｈｌのタンパク質レベルについて評価した。ローディングは心臓アクチンに対して正規化されている。
【図１０ａ】図１０ａでは、ヒト及びマウスのＡｔｐ５ａＪの３’ＵＴＲにおける標的遺伝子認識モチーフを示す、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐシード配列及びＡｔｐ５ａ１上の対応する標的領域はアラインメントにより示されている。
【図１０ｂ】図１０ｂでは、異なる用量の対照、ｍｉＲ２７ｂ−３ｐ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐのミミックでルシフェラーゼに融合される野生型（ｗｔ）又はｍｉｒ２７ｂの結合部位変異（ｍｕｔ）Ａｔｐ５ａ１  ３’ＵＴＲの同時トランスフェクションを示す。データは、対照ミミックでトランスフェクトされた野生型プロモーターに対して正規化されている（１．０に設定）（群あたりｎ＝４の生物学的複製；示されているデータは平均±ＳＥＭ；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；一元配置分散分析、その後のダネットの事後検定）。
【図１０ｃ】図１０ｃ、空の対照ベクター又は異所性ｍｉｒ２７ｂで形質導入されたＮＲＣをイムノブロッティングによるＡｔｐ５ａ１タンパク質レベルについて評価した。ローディングは心臓アクチンに対して正規化されている。
【図１０ｄｅ】図１０ｄ、ｅでは、空の対照ベクター又はｍｉｒ２７ｂを異所的に発現するＮＲＣにおけるｍｉｒ２７ｂ前駆体（ｄ）及び成熟ｍｉＲ２７ｂ−３ｐ及びｍｉＲ２７ｂ−５ｐ（ｅ）の相対的発現を示す。データは、空の対照ベクターで形質導入されたＮＲＣに正規化される（１．０に設定）（群あたりｎ＝３の生物学的複製；示されているのは平均±ＳＤ；＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１；対応のない両側ｔ検定）。
【図１０ｆ】図１０ｆでは、異なる濃度の対照、ｍｉＲ２７ｂ−３ｐ及びｍｉＲ２７ｂ−５ｐのミミックでトランスフェクトされたＮＲＣからのＡｔｐ５ａ１  ｍＲＮＡの相対的発現レベルを示す。データは対照ミミックに対して正規化される（１．０として設定）（群あたりｎ＝３の生物学的複製；示されているデータは平均±ＳＤ；＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１；一元配置分散分析、その後のダネットの事後検定）。
【図１０ｇｈ】図１０ｇ、ｈでは、空のベクター対照又はＨＩＦ１αΔＯＤＤで形質導入され、ｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡのいずれかで治療されたＮＲＣにおける成熟ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ（ｇ）及びｍｉＲ２７ｂ−３ｐ（ｈ）の相対的発現を示す。データは、空の対照ベクターで形質導入されたＮＲＣに正規化される（１．０に設定）（群あたりｎ＝５の生物学的複製；示されているのは平均±ＳＥＭ；＊，
【数２】
2021529202.tif 000003
，％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析及びボンフェローニ補正）。
【図１０ｉ】図１０ｉでは、空の対照ベクター又はＨＩＦ１αΔＯＤＤを発現するレンチウイルスで形質導入され、スクランブル対照（ｓｃｒＬＮＡ）又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡのいずれかで治療されたＮＲＣにおけるＨｉｆ１α及びＡｔｐ５ａ１発現のイムノブロットを示す。ローディングは心臓アクチンに対して正規化されている。
【図１０ｊｋ】図１０ｊ、ｋでは、ｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡの存在下でＰＢＳ（モック）又はＴ３で治療されたＮＲＣにおける成熟ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ（ｊ）及びｍｉＲ２７ｂ−３ｐ（ｋ）の相対的発現を示す。データはモック治療された細胞に正規化されている（１．０と設定）（群あたりｎ＝５の生物学的複製；示されているのは平均±ＳＥＭ；＊，
【数４】
2021529202.tif 000004
，％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析及びボンフェローニ補正）。
【図１０ｌ】図１０ｌでは、ｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡの存在下でＰＢＳ（モック）又はＴ３で治療されたＮＲＣを、Ｈｉｆ１α、ｍｉｒ２７ｂ及びＡｔｐ５ａ１のＲＮＡレベルについて評価した。データは、ｓｃｒＬＮＡで治療されたＮＲＣに正規化されている（１．０として設定）（群あたりｎ＝４の生物学的複製；示されているのは平均±ＳＥＭ；＊，
【数３】
2021529202.tif 000005
，％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析及びボンフェローニ補正）。
【図１０ｍ】図１０ｍでは、（ｌ）のように治療されたＮＲＣを、イムノブロッティングによってＡｔｐ５ａ１のタンパク質レベルについて評価した。ローディングは心臓アクチンに対して正規化されている。
【図１０ｎｏ】図１０ｎ、ｏでは、示されるように形質導入及び治療されたＮＲＣにおけるＡＴＰシンターゼ酵素活性を示す。データは対照のセットに対して正規化される（１．０として設定）（群あたりのｎ＝５生物学的複製；示されている結果は平均±ＳＥＭ；＊、％ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；対応のない両側ｔ検定（ｎ）又は一元配置分散分析、その後のボンフェローニ補正（ｏ））。
【図１０ｐ】図１０ｐでは、空の対照ベクター又は異所性ＡＴＰ５Ａ１で形質導入されたＮＲＣを、イムノブロッティングによってＡｔｐ５ａ１のタンパク質レベルについて評価した。ローディングは心臓アクチンに対して正規化されている。
【図１１ａ】図１１ａでは、ＡＡＶ９注射の１１週間後にＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂで形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスにおけるＮｐｐａ及びＮｐｐｂのｍＲＮＡの相対的発現を示す。データはＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂで形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスに正規化される（１．０に設定）（Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−の場合はｎ＝６、Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋の場合はｎ＝８。示されているのは平均±ＳＥＭであり、＊ｐ＜０．０５；対応のない両側ｔ検定）。
【図１１ｂ】図１１ｂでは、ＡＡＶ９注射の１１週間後にＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂで形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスにおけるＬＶＩＤ；ｓを示す（Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−の場合はｎ＝６、Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋の場合はｎ＝８。示されているのは平均±ＳＥＭであり、＊ｐ＜０．０５；対応のない両側ｔ検定）。
【図１１ｃ】図１１ｃでは、ｑＰＣＲによる、ＡＡＶ９注射の１１週間後にＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂで形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスにおけるＡｔｐ５ａ１ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂで形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスに正規化されている（１．０に設定）（Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−の場合はｎ＝６、Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋の場合はｎ＝８。示されているのは平均±ＳＥＭであり、＊＊＊ｐ＜０．００１；対応のない両側ｔ検定）。
【図１１ｄ】図１１ｄでは、ＡＡＶ９注射から１１週間後に、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂで形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスの左心室断面をＨ＆Ｅで染色し、光顕微鏡で画像化したものを示す（３つの断面／心臓（３〜５つのフィールド／断面を有する）が調査され、代表的なフィールドが示される。合計で、群ごとに３つの心臓を分析した）。スケールバーは２００μｍである。
【図１１ｅ】図１１ｅでは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂウイルスを注射したＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスから心筋細胞を単離し、ＤＡＰＩ及びα−アクチニンについて染色した。細胞は共焦点顕微鏡で画像化され、群あたり３匹のマウスからの代表的なｚスタック画像を示す。スケールバーは２０μｍである。
【図１１ｆ】図１１ｆでは、（ｅ）のとおり染色された成体心筋細胞を、多核心筋細胞に対する単核心筋細胞の比率について評価した（群あたりｎ＝３のマウスから、少なくとも１６０個の細胞を分析した）。
【図１１ｇ】図１１ｇでは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂウイルスで形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスのピクロシリウスレッド染色組織断面の代表的な画像を示す。スケールバーは５００μｍである。
【図１１ｈ】図１１ｈでは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂウイルスを注射したＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスの左心室溶解物におけるＣｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１及びＴＧＦｂ１のｍＲＮＡの相対的発現を示す。データはＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスに正規化されている（１．０に設定）（Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスの場合はｎ＝６、Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋マウスの場合はｎ＝８、示されている結果は平均±ＳＥＭであり、＊ｐ＜０．０５、対応のない両側ｔ検定）。
【図１１ｉ】図１１ｉでは、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術を受け、スクランブル（ｓｃｒＬＮＡ）又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐのＬＮＡのいずれかで治療されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの大動脈速度の縦断的モニタリングを示す。パネルの矢印はＬＮＡ注射を示している（ｓｈａｍのｓｃｒＬＮＡの場合はｎ＝５、ｓｈａｍのｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡの場合はｎ＝５、ＴＡＣのｓｃｒＬＮＡの場合はｎ＝７、ＴＡＣのｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡの場合はｎ＝８、示されているのは平均±ＳＥＭである）。
【図１１ｊ】図１１ｊでは、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術を受け、かつｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐのＬＮＡのいずれかで治療されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスからの左心室断面をＨ＆Ｅで染色し、光学顕微鏡で画像化した（３つの断面／心臓（２〜４つのフィールド／断面を有する）が調査され、代表的なフィールドが示される。合計で、群ごとに３つの心臓を分析した）。スケールバーは２００μｍである。
【図１１ｋ】図１１ｋでは、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術を受けたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから心筋細胞を単離し、ｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐのＬＮＡのいずれかで治療し、ＤＡＰＩ及びαアクチニンについて染色した。細胞は共焦点顕微鏡で画像化され、群あたり３匹のマウスからの代表的なｚスタック画像を示す。スケールバーは２０μｍである。
【図１１ｌ】図１１ｌでは、（ｋ）のように染色された成体心筋細胞を、単核心筋細胞と多核心筋細胞の比率について評価した（群あたりｎ＝３のマウスから、少なくとも１５０個の細胞を分析した）。
【図１１ｍ】図１１ｍでは、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術を受け、かつｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐのＬＮＡのいずれかで治療されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのピクロシリウスレッド染色組織断面の代表的な画像を示す。スケールバーは５００μｍである。
【図１１ｎ】図１１ｎでは、ｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐのＬＮＡで治療され、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のいずれかを受けたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの左心室溶解物におけるＣｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１及びＴＧＦｂ１  ｍＲＮＡのｑＰＣＲによる相対的発現を示す。データは、ｓｃｒＬＮＡで治療されたｓｈａｍ手術マウスに対して正規化されている（１．０に設定）（ｓｈａｍのｓｃｒＬＮＡの場合はｎ＝５、ｓｈａｍのｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡの場合はｎ＝５、ＴＡＣ手術のｓｃｒＬＮＡの場合はｎ＝７、ＴＡＣ手術のｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡの場合はｎ＝８。示されているのは平均±ＳＥＭであり；＊、％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析及びボンフェローニ補正）。
【図１２ａ】図１２ａでは、空の対照ベクター又は異所性ＭＴＨＦＤ１Ｌを発現するＮＲＣにおけるＭｔｈｆｄ１１  ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは、空の対照ベクターを発現するＮＲＣに正規化されている（１．０に設定）（群あたりｎ＝３の生物学的複製、示されている結果は平均±ＳＤであり；＊＊＊ｐ＜０．０５；対応のない両側ｔ検定）。
【図１２ｂ】図１２ｂでは、Ｍｔｈｆｄ１ｌに対する抗体を使用して、空の対照ベクター又はＭＴＨＦＤ１Ｌを発現するレンチウイルスで形質導入されたＮＲＣのイムノブロットを示す。ローディングは心臓アクチンに対して正規化されている。
【図１２ｃｄｅｆｇｈ】図１２ｃ〜ｈでは、示されているように形質導入及び治療されたＮＲＣにおけるＡＴＰ（ｃ、ｅ、ｇ）及びＡＤＰ（ｄ、ｅ、ｈ）のレベルの定量化を示す（群あたりｎ＝４の生物学的複製；示されている結果は平均±ＳＤ；＊、％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析、それに続くボンフェローニ補正）。
【図１３ａ】図１３ａでは、Ｔ３で刺激され、かつｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡで治療されたＮＲＣにおける［３Ｈ］ロイシン取り込みの評価を示す。データは、ｓｃｒＬＮＡで治療された対照（モック）ＮＲＣ（１．０に設定）と比較した組み込み放射能として表される（群あたりｎ＝４の生物学的複製；示されている結果は平均±ＳＥＭ；＊、％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析、それに続くボンフェローニ補正）。
【図１３ｂ】図１３ｂでは、Ｔ３で刺激され、かつｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡで治療されたＮＲＣ中のギ酸塩の相対量を示す（群あたりｎ＝５の生物学的複製；示されている結果は平均±ＳＥＭ；＊、％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析、それに続くボンフェローニ補正）。
【図１３ｃ】図１３ｃでは、Ｔ３で刺激され、かつｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡで治療されたＮＲＣの相対ＡＤＰ／ＡＴＰ比を示す（群あたりｎ＝５の生物学的複製；示されている結果は平均±ＳＥＭ；＊、％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析、それに続くボンフェローニ補正）。
【図１３ｄ】図１３ｄでは、Ｔ３で刺激され、かつｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡで治療されたＮＲＣにおける相対代謝物存在量のヒートマップを示す。対応する対照と比較して、少なくとも１つの治療群でｌｏｇ２（倍数変化）＞０．４及び調整されたｐ値＜０．０１の代謝物が示される（群あたりｎ＝４の生物学的複製）。
【図１３ｅ】図１３ｅでは、Ｔ３で刺激され、かつｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡで治療されたＮＲＣの核酸に組み込まれた［１４Ｃ］グルコース、［１４Ｃ］セリン及び［１４Ｃ］グリシンに由来する［１４Ｃ］炭素の相対量を示す（群あたりｎ＝５の生物学的複製；示されている結果は平均±ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５；一元配置分散分析、それに続くボンフェローニ補正）。
【図１４ａ】図１４ａでは、ｓｃｒＬＮＡ又はｍｉｒ２７ｂ−５ｐＬＣ５７ＢＬ／６ＪマウスＮＡを注射したｓｈａｍ又はＴＡＣ手術Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの左心室における代謝産物の差次的分析を示し、円の大きさは、−ｌｏｇ１０（調整されたｐ値）を反映し、円の色は、示された対照と比較したｌｏｇ２倍率変化を反映している（群あたりｎ＝６の生物学的複製）。
【図１４ｂ】図１４ｂでは、重複して測定された示される試料中の代謝物の階層的クラスター分析を示す（群あたりｎ＝６の生物学的複製）。
【図１５ａ】図１５ａでは、示されるコホートの主成分分析（ＰＣＡ）を示す。
【図１５ｂｃ】図１５ｂ、ｃでは、活性（スクランブル、ｂ）又はＬＮＡ媒介抑制性ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ（ｃ）を有するｓｈａｍ治療又はＴＡＣ治療されたマウスの左心室試料に対して個別に実行された主成分分析が示される。矢印は、ＰＣ１が包含する分散の１５％を説明するために一致する脂質種を表す（Ｗｉｌｃｏｘｏｎノンパラメトリック符号順位検定；群あたりｎ＝５）。
【図１５ｄ】図１５ｄでは、示された４つのコホートにおける飽和プロファイルのバープロット（平均＋／−ＳＤ）を示す。脂質は二重結合（ｄｂ）の数に従ってグループ化され、６つのｄｂを超えるすべての種が単一の群（６＋）に集められる。分析される脂質には、次の１９個の脂質クラスである、コレステリルエステル（ＣＥ）、セラミド（Ｃｅｒ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、カルジオリピン（ＣＬ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、リゾホスファチド（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルハノールアミン（ＬＰＥ）、エーテル結合ＬＰＥ（ＬＰＥ−Ｏ−）、リゾホスファチジルリノシトール（ＬＰＩ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、エーテル結合ＰＣ（ＰＣ−Ｏ−）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、エーテル結合ＰＥ（ＰＥ−Ｏ−）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルリノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）及びトリアシルグリセロールを含む（調整ｐ値＜０．００１＊＊＊、調整ｐ値＜０．０１＊＊、調整ｐ値＜０．１＊；Ｗｉｌｃｏｘｏｎノンパラメトリック符号順位検定；ｎ＝群あたり５つの生物学的試料）
【図１５ｅ】図１５ｅでは、示された４つのコホートにおける全長プロファイルのバープロットを示す（平均＋／−ＳＤ）。脂質（ｄでの分析のとおり）は、アシル鎖の全長、つまり炭素原子の数に従ってグループ化した。有意な比較はアスタリスクで示される（調整ｐ値＜０．００１＊＊＊、調整ｐ値＜０．０１＊＊、調整ｐ値＜０．１＊；Ｗｉｌｃｏｘｏｎノンパラメトリック符号順位検定；ｎ＝５生物学的群ごとの試料）。
【図１５ｆ】図１５ｆでは、ｓｃｒＬＮＡ治療のＴＡＣ手術マウスの左心室生検における脂質種の平均モル％存在量から、ｓｈａｍ対照における脂質種の平均モル％存在量を差し引いたものを示す。
【図１５ｇ】図１５ｇでは、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡを注射されたＴＡＣ手術マウスにおける脂質種の平均モル％存在量から、抑制された（ＬＮＡ）ｍｉＲ２７ｂ−５ｐを有するｓｈａｍ対照における脂質種の平均モル％存在量を差し引いたものを示す。
【図１５ｈ】図１５ｈでは、ｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡで治療され、かつｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のいずれかを受けたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける示されたｍＲＮＡのｑＰＣＲによる相対的発現を示す。データは、ｓｃｒＬＮＡで治療されたｓｈａｍ手術マウスに対して正規化されている（１．０に設定）（ｓｈａｍのｓｃｒＬＮＡの場合はｎ＝５、ｓｈａｍのｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡの場合はｎ＝５、ＴＡＣ手術のｓｃｒＬＮＡの場合はｎ＝７、ＴＡＣ手術のｍｉＲ２７ｂ−５ｐＬＮＡの場合はｎ＝８。示されているのは平均±ＳＥＭであり；＊、％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析及びボンフェローニ補正）。
【図１５ｉ】図１５ｉでは、［１−１４Ｃ］−パルミチン酸の１４ＣＯ２への酸化は、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術を受け、かつｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡのいずれかで治療されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの左心室生検で測定した。すべての値はタンパク質含有量に対して正規化した（ｓｈａｍのｓｃｒＬＮＡの場合はｎ＝５、ｓｈａｍのｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡの場合はｎ＝５、ＴＡＣ手術のｓｃｒＬＮＡの場合はｎ＝６、ＴＡＣ手術のｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡの場合はｎ＝６。示されているのは平均±ＳＤであり；＊、％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析及びボンフェローニ補正）。
【図１６ａｂ】図１６ａ、ｂでは、ＰＢＳ又は１０μＭのＡＤＰで３日間治療したＮＲＣにおけるＡＤＰ（ａ）及びＡＴＰ（ｂ）のレベルの定量化を示す（群あたりｎ＝４の生物学的複製；示されている結果は平均±ＳＤ；＊、％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析、それに続くボンフェローニ補正）。
【図１６ｃｄ】図１６ｃ、ｄでは、ＰＢＳ又は２０ｎＭのオリゴマイシンで治療されたＮＲＣにおけるＡＤＰ（ｃ）及びＡＴＰ（ｄ）のレベルの定量化を示す（群あたりｎ＝３の生物学的複製；示されている結果は平均±ＳＤ；＊、％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析、それに続くボンフェローニ補正）。
【図１６ｅ】図１６ｅでは、ＰＢＳ又は１０μＭのＡＤＰで３日間治療したＮＲＣをＤＡＰＩ及びαアクチニンについて染色し、共焦点顕微鏡で画像化した。３つの独立した実験の代表的なフィールドが示される。スケールバーは５μｍである。
【図１６ｆ】図１６ｆでは、ＰＢＳ又はオリゴマイシンで治療されたＮＲＣは、ＤＡＰＩ及びαアクチニンについて染色し、共焦点顕微鏡によって画像化した。条件及び実験ごとに平均４つのフィールドが画像化され、３つの独立した実験の代表的なフィールドが示される。スケールバーは５０μｍである。
【図１６ｇｈ】図１６ｇ、ｈでは、（ｅ、ｆ）のように治療及び画像化されたＮＲＣを多核化について評価した（ｎ＝３の独立した実験からの試料ごとに少なくとも１１０個の細胞を定量化した；示されているのは平均±ＳＤ；＊＊ｐ＜０．０１；対応のない両側ｔ検定）。
【図１６ｉｊ】図１６ｉ、ｊでは、（ｅ、ｆ）のように治療及び画像化されたＮＲＣを、ＩｍａｇｅＪを使用して細胞表面積について評価した（ｎ＝３の独立した実験からの試料ごとに少なくとも１１０個の細胞を定量化した；示されているのは平均±ＳＤ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；対応のない両側ｔ検定）。
【図１７ａｃ】図１７ａ〜ｄでは、示されたレンチウイルスで形質導入されたＮＲＣは、細胞有糸分裂の評価のために心臓特異的マーカーα−アクチニン、ＤＡＰＩ及びホスホ−ヒストンＨ３（ｐ−ヒストンＨ３）について染色し、共焦点顕微鏡によって画像化した。ｐ−ヒストンＨ３陽性心筋細胞を定量化した。３〜４フィールド／複製の３つの生物学的複製を条件ごとに分析し、代表的なフィールドを示した。スケールバーは１００μｍである。
【図１７ｂｄ】図１７ａ〜ｄでは、示されたレンチウイルスで形質導入されたＮＲＣは、細胞有糸分裂の評価のために心臓特異的マーカーα−アクチニン、ＤＡＰＩ及びホスホ−ヒストンＨ３（ｐ−ヒストンＨ３）について染色し、共焦点顕微鏡によって画像化した。ｐ−ヒストンＨ３陽性心筋細胞を定量化した。３〜４フィールド／複製の３つの生物学的複製を条件ごとに分析し、代表的なフィールドを示した。スケールバーは１００μｍである。
【図１７ｅ】図１７ｅでは、ｎｓＲＮＡ又はｓｈＭｔｈｆｄ１ｌを発現するＮＲＣにおけるＭｔｈｆｄ１ｌ  ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは、ｎｓＲＮＡを発現するＮＲＣに正規化される（１．０として設定）（群あたりｎ＝３の生物学的複製、示されている結果は平均±ＳＤであり；＊＊＊ｐ＜０．０５；対応のない両側ｔ検定）。
【図１７ｆ】図１７ｆでは、Ｍｔｈｆｄ１ｌに対する抗体を用いて、ｎｓＲＮＡ又はｓｈＭｔｈｆｄ１ｌを発現するレンチウイルスで形質導入されたＮＲＣのイムノブロットを示す。ローディングは心臓アクチンに正規化されている。
【図１７ｇｈ】図１７ｇ〜ｈでは、示されたレンチウイルスで形質導入されたＮＲＣは、細胞有糸分裂の評価のために心臓特異的マーカーα−アクチニン、ＤＡＰＩ及びホスホ−ヒストンＨ３（ｐ−ヒストンＨ３）について染色し、共焦点顕微鏡によって画像化した。ｐ−ヒストンＨ３陽性心筋細胞を定量化した。３〜４フィールド／複製の３つの生物学的複製を条件ごとに分析し、代表的なフィールドを示した。スケールバーは１００μｍである。
【図１８ａ】図１８ａでは、ＡＡＶ９注射の１１週間後に、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈ  Ｍｔｈｆｄ１ｌで形質導入されたｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスの左心室断面をＨ＆Ｅで染色し、光学顕微鏡で画像化した（３つの断面／心臓（２〜４つのフィールド／断面を有する）が調査され、代表的なフィールドが示される。合計で、群ごとに３つの心臓を分析した）。スケールバーは２００μｍである。
【図１８ｂ】図１８ｂでは、ＡＡＶ９注射の１１週間後にＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌで形質導入されたｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスの収縮期の左心室内部寸法（ＬＶＩＤ；ｓ）を示す（ｓｈａｍのＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−の場合はｎ＝４、ｓｈａｍのＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋の場合はｎ＝５、ＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−の場合はｎ＝８、ＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋のマウスの場合はｎ＝７。表示は平均±ＳＥＭであり、＊、％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析、その後のボンフェローニ補正）。
【図１８ｃｄ】図１８ｃ、ｄでは、ＡＡＶ９注射の１１週間後にＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈ  Ｍｔｈｆｄ１ｌで形質導入されたｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスから得られた心室溶解物からのＮｐｐａ及びＮｐｐｂ（ｃ）及びＭｔｈｆｄ１ｌ  ｍＲＮＡ（ｄ）の相対的発現を示す。データは、ｓｈａｍ手術されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスに正規化されている（１．０に設定）（ｓｈａｍのＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−の場合はｎ＝４、ｓｈａｍのＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋の場合はｎ＝５、ＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−の場合はｎ＝８、ＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋のマウスの場合はｎ＝７。表示は平均±ＳＥＭであり、＊、％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析、その後のボンフェローニ補正）。
【図１８ｅ】図１８ｅでは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌで形質導入され、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスから心筋細胞を単離し、ＤＡＰＩ及びαアクチニンについて染色した。細胞は共焦点顕微鏡で画像化され、群あたり３匹のマウスからの代表的なｚスタック画像を示す。スケールバーは２０μｍである。
【図１８ｆ】図１８ｆでは、（ｅ）のとおり染色された成体心筋細胞を、多核心筋細胞に対する単核心筋細胞の比率について評価した（群あたりｎ＝３のマウスから、少なくとも１５０個の細胞を分析した）。
【図１８ｇ】図１８ｇでは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌで形質導入されたｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスのピクロシリウスレッドで染色された組織断面の代表的な画像を示す。スケールバーは５００μｍである。
【図１８ｈ】図１８ｈでは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌウイルスを注射したｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスにおけるＣ５７ＢＬ／６Ｊの左心室溶解物におけるＣｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１及びＴＧＦｂ１  ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは、ｓｈａｍ手術されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスに正規化されている（１．０に設定）（ｓｈａｍのＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−の場合はｎ＝４、ｓｈａｍのＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋の場合はｎ＝５、ＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−の場合はｎ＝８、ＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋のマウスの場合はｎ＝７。表示は平均±ＳＥＭであり、＊、％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析、その後のボンフェローニ補正）。
【図１８ｉ】図１８ｉでは、ＡＡＶ９注射の１１週後に、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１及びＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌで同時形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスの左心室断面をＨ＆Ｅで染色し、光学顕微鏡で画像化した（３つの断面／心臓（３〜５つのフィールド／断面を有する）が調査され、代表的なフィールドが示される。合計で、群ごとに３つの心臓を分析した）。スケールバーは２００μｍである。
【図１８ｊ】図１８ｊでは、心筋細胞は、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１及びＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌウイルスで同時形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスから単離され、ＤＡＰＩ及びαアクチニンについて染色した。細胞は共焦点顕微鏡で画像化され、群あたり３匹のマウスからの代表的なｚスタック画像を示す。スケールバーは２０μｍである。
【図１８ｋ】図１８ｋでは、（ｎ）のとおり染色された成体心筋細胞を、多核心筋細胞に対する単核心筋細胞の比率について評価した（群あたりｎ＝３のマウスから、少なくとも１５０個の細胞を分析した）。
【図１８ｌ】図１８ｌでは、ＡＡＶ９注射の１１週間後に、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１及びＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌで同時形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスのＬＶＩＤ；ｓを示す（群あたりｎ＝６のマウスであり；示されているのは平均±ＳＥＭである）。
【図１８ｍｎｏ】図１８ｍ〜ｏでは、ＡＡＶ９注射の１１週間後に、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１及びＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌで同時形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスから得られた心室溶解物からのＮｐｐａ及びＮｐｐｂ（ｍ）、Ａｔｐ５ａ１（ｎ）、及びＭｔｈｆｄ１ｌ  ｍＲＮＡ（ｏ）の相対発現を示す。データはＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスに正規化されている（１．０に設定）（群あたりｎ＝６のマウス；示されているのは平均±ＳＥＭ；＊＊＊ｐ＜０．００１；対応のない両側ｔ検定）。
【図１８ｐ】図１８ｐでは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１及びＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌウイルスを同時形質導入したＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスのピクロシリウス赤染色組織断面の代表的な画像を示す。スケールバーは５００μｍである。
【図１８ｑ】図１８ｑでは、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１及びＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌのウイルスで同時形質導入されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−のマウスから得られた左心室溶解物のＣｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１及びＴＧＦｂ１  ｍＲＮＡの相対発現を示す。データはＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスに正規化されている（１．０に設定）（群あたりｎ＝６のマウス；示されているのは平均±ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５；対応のない両側ｔ検定）。
【図１９ａｂ】図１９ａ、ｂでは、示されているように治療されたＮＲＣにおけるＣｃｎｄ１（ａ）及びＣｃｎｅ１（ｂ）のｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは、非サイレンシングｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた対照感染細胞に正規化されている（１．０に設定）（群あたりｎ＝３の生物学的複製；示されているのは平均±ＳＤ；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；一元配置分散分析及びボンフェローニ補正）。
【図１９ｃ】図１９ｃでは、空のベクター対照又はＨＩＦ１αΔＯＤＤを発現するレンチウイルスで形質導入され、示されるとおりトランスフェクトされたＮＲＣを、ＤＡＰＩ、Ｋｉ６７及びαアクチニンについて染色し、共焦点顕微鏡によって画像化した。条件及び実験ごとに平均４つのフィールドが画像化され、３つの独立した実験の代表的なフィールドが示される。スケールバーは５０μｍである。
【図１９ｄｅ】図１９ｄ、ｅでは、（ｃ）のように治療されたＮＲＣからの多核細胞（ｄ）及びＫｉ６７陽性（ｅ）の細胞のパーセンテージの定量化を示す（実験及び条件ごとに少なくとも１００個の細胞を分析したｎ＝３の独立した実験；示されているのは平均±ＳＤ；＊、％ｐ＜０．０５；一元配置分散分析及びボンフェローニ補正）。
【図１９ｆ】図１９ｆでは、（ｃ）のように治療されたＮＲＣを、ＩｍａｇｅＪを使用して細胞サイズについて評価した（実験及び条件ごとに少なくとも１００個の細胞を分析したｎ＝３の独立した実験；示されているのは平均±ＳＤ；＊、％ｐ＜０．０５、一元配置分散分析及びボンフェローニ補正）。
【図１９ｇ】図１９ｇでは、示されるように治療されたＮＲＣにおけるＣｄｋｎ１ｂ  ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは、非サイレンシングｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞に正規化されている（１．０に設定）（群あたりｎ＝３の生物学的複製；示されているのは平均±ＳＤ；＊＊ｐ＜０．０１；対応のない両側ｔ検定）。
【図１９ｈ】図１９ｈでは、非サイレンシング又はＣｄｋｎ１ｂのｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＮＲＣをＤＡＰＩ、Ｋｉ６７及びα−アクチニンについて染色し、共焦点顕微鏡で画像化した。条件及び実験ごとに平均４つのフィールドが画像化され、３つの独立した実験の代表的なフィールドが示される。スケールバーは５０μｍである。
【図１９ｉｊ】図１９ｉ、ｊでは、（ｈ）のように治療されたＮＲＣからの多核細胞（ｉ）及びＫｉ６７陽性（ｊ）の細胞のパーセンテージの定量化を示す（実験及び条件ごとに少なくとも１００個の細胞を分析したｎ＝３の独立した実験；示されているのは平均±ＳＤ；＊ｐ＜０．０５；対応のない両側ｔ検定）。
【図１９ｋ】図１９ｋでは、（ｈ）のように治療されたＮＲＣを、ＩｍａｇｅＪを使用して細胞サイズについて評価した（実験及び条件ごとに分析された少なくとも１００個の細胞でのｎ＝３の独立した実験、示されているのは平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、対応のない両側ｔ検定）。
【図２０ａ】図２０ａでは、ｑＰＣＲによるｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のいずれかを受けたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの左心室生検におけるＡｌｄｈ１ｌ１  ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは、Ｈｐｒｔ１に関して２＾−ｄＣｔとして示されている（ｓｈａｍの場合はｎ＝５、ＴＡＣ手術ではｎ＝７；示されているのは平均±ＳＥＭ；＊＊ｐ＜０．０１；対応のない両側ｔ検定）。
【図２０ｂ】図２０ｂでは、肥大型心筋症（ＨＣＭ）及び大動脈弁狭窄症（ＡＳ）の患者と、健康対照者の左心室生検におけるＡＬＤＨ１Ｌ１  ｍＲＮＡの相対的発現を示す。データは、ＨＰＲＴ１に関して２＾−ｄＣｔとして示されている（健康対照の場合はｎ＝４、ＡＳの場合はｎ＝１０、ＨＣＭの場合はｎ＝１１、示されているのは平均±ＳＥＭである）。
【図２０ｃ】図２０ｃでは、示されるとおり治療されたＮＲＣにおけるＮＡＤＰＨの定量化を示す。すべての値はタンパク質含有量に正規化した（群あたりｎ＝３の生物学的複製；示されるのは平均±ＳＤである）。
【図２０ｄ】図２０ｄでは、メチル化リジン抗体を使用したＨＣＭ及び大動脈弁狭窄症の患者及び健康対照者からの左心室溶解物のイムノブロットを示す。ローディングは心臓アクチンに正規化されている。
【図２０ｅｆｇｈｉｊ】図２０ｅ〜ｊでは、メチル化リジン抗体を使用して、示されるとおり治療されたマウスからの左心室溶解物のイムノブロットを示す。ローディングは心臓アクチンに正規化されている。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、オリゴ核酸剤（配列番号００１）の投与を介して、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ２７ｂ−５ｐの阻害が、ミトコンドリアＡＤＰ構築、及びそのメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ１Ｌ（ＭＴＨＦＤ１Ｌ）への再配向化、及びｄｅ  ｎｏｖｏヌクレオチド生合成を誘導するＡＴＰシンターゼなどの調節因子を介した心筋の病理学的成長の改変を可能にするという発見に基づく。
【０００８】
本発明の文脈におけるｍｉＲＮＡという用語は、プリ、プレ、及び成熟ｍｉＲＮＡに関する。
【０００９】
ｍｉＲＮＡ２７ｂのステムループ配列の２つの成熟した亜種には、ｍｉＲＮＡ２７ｂ−３ｐとｍｉＲＮＡ２７ｂ−５ｐとがある。
【００１０】
本発明の文脈における「ハイブリッドを形成することができる」とは、哺乳動物細胞のサイトゾル内に存在する条件下で、それらの標的配列に選択的に結合することができる配列に関する。そのようなハイブリダイズする配列は、標的配列に対して連続的に逆相補的であり得る、又はギャップ、ミスマッチ又はさらなる不一致のヌクレオチドを含み得る。ハイブリッドを形成することができる配列の最小の長さは、その組成に依存し、Ｃ又はＧのヌクレオチドは、Ａ又はＴ／Ｕのヌクレオチドよりも結合エネルギーに寄与し、主鎖の化学的性質に寄与する。
【００１１】
本明細書の文脈における「オリゴ核酸剤」という用語は、特異的に結合し、かつｍｉＲ２７ｂ−５ｐの生理学的役割の有意な減少を導くことが可能なオリゴヌクレオチドを指す。本発明のオリゴ核酸剤の例は、ＤＮＡからなるアンチセンスオリゴマー、骨格にホスホロチオエート修飾結合を有するＤＮＡ、リボヌクレオチドオリゴマー、特にリボース環が２’−Ｏ及び４’−Ｃ原子の間のメチレン架橋によって接続されている架橋又はロックされたヌクレオチドを含むＲＮＡ、骨格にホスホロチオエート修飾結合を有するＲＮＡ、又はオリゴマーとしてのデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの塩基の任意の混合物である。
【００１２】
本明細書の文脈におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド剤という用語は、特異的に結合し、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐの生理学的役割の有意な減少を導くことができる任意のオリゴヌクレオチドを指す。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、ＤＮＡからなるアンチセンスオリゴマー、骨格にホスホロチオエート修飾結合を有するＤＮＡ、リボヌクレオチドオリゴマー、特にリボース環が２’−Ｏ及び４’−Ｃ原子の間のメチレン架橋によって接続されている架橋又はロックされたヌクレオチドを含むＲＮＡ、骨格にホスホロチオエート修飾結合を有するＲＮＡ、又はオリゴマーとしてのデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの塩基の任意の混合物である。
【００１３】
オリゴヌクレオチド剤及びアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチド剤という用語は、本明細書において交換可能に使用される。
【００１４】
特定の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホチオエート、２’Ｏ−メチルホスホチオエート、ペプチド核酸（ＰＮＡ；ペプチド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシンユニット（グリシンのアルファ炭素に結合した核酸塩基を有する））、又はロック（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ；２’Ｏ，４’Ｃメチレン架橋ＲＮＡビルディングブロック）などの核酸の類似体を含む。アンチセンス配列は、核酸の上記の類似体のいずれかで部分的に構成され得、残りのヌクレオチドは、自然界に存在する「天然の」リボヌクレオチドである、又は異なる類似体の混合物である、又は完全に１種類の類似体で構成され得る。
【００１５】
ギャップマーという用語は、分子生物学の分野で知られている意味で使用され、短いリボヌクレオチドオリゴマーが隣接するデオキシリボヌクレオチドオリゴマーの中央ブロックを含む、その標的配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。隣接するリボヌクレオチドオリゴマーは、ヌクレアーゼ及びプロテアーゼ耐性リボヌクレオチドからなる。特定の実施形態において、ヌクレアーゼ及びプロテアーゼ耐性リボヌクレオチドは、２’−Ｏ修飾リボヌクレオチド、特に、リボース部分の２’−Ｏと４’−Ｃとの間に架橋を有する架橋核酸を含む。
【００１６】
本発明の文脈における「ヌクレオチド」は、核酸又は核酸類似体ビルディングブロックであり、そのうちオリゴマーは、塩基対形成に基づいてｍｉＲＮＡオリゴマーと選択的ハイブリッドを形成することができる。この文脈におけるヌクレオチドという用語は、古典的なリボヌクレオチドビルディングブロックであるアデノシン、グアノシン、ウリジン（及びリボシルチミン）、シチジン、古典的なデオキシリボヌクレオチドであるデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン及びデオキシシチジンを含む。この文脈におけるヌクレオチドという用語は、ホスホチオエート、２’Ｏ−メチルホスホチオエート、ペプチド核酸（ＰＮＡ；ペプチド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシンユニット（グリシンのアルファ炭素に結合した核酸塩基を有する））、又はロック核酸（ＬＮＡ；２’Ｏ、４’Ｃメチレン架橋ＲＮＡビルディングブロック）などの核酸の類似体をさらに含む。ハイブリダイズ配列は、上記ヌクレオチドのいずれか、又はそれらの混合物から構成されていてもよい。
【００１７】
本明細書の文脈において、配列同一性及び配列同一性の割合という用語は、２つのアラインメントされた配列を比較することによって決定される値を指す。比較のための配列をアラインメントする方法は、当技術分野でよく知られている。比較のための配列のアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のグローバルアラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）の類似性法の検索によって、又はこれらに限定されないが、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡを含む、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装によって、実施され得る。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開されている。
【００１８】
アミノ酸配列の比較の一例として、デフォルト設定：期待閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリ範囲での最大一致数０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１、拡張１；組成の調整：条件付き構成スコアマトリックス調整、を使用するＢＬＡＳＴＰアルゴリズムがある。アミノ酸配列の比較の一例として、デフォルト設定：期待閾値：１０；ワードサイズ：２８；クエリ範囲での最大一致数：０；一致／不一致スコア：１．−２；ギャップコスト：線形、を使用するＢＬＡＳＴＮアルゴリズムがある。特に明記しない限り、本明細書で提供される配列同一性値は、それぞれタンパク質及び核酸の比較のための上記で特定されるデフォルトパラメーターを使用して、ＢＬＡＳＴプログラムスイート（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））を使用して得られた値を指す。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は、心臓病の治療又は予防の方法で使用するための、ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｉＲ２７ｂ−５ｐを対象とするオリゴ核酸剤を提供する。
【００２０】
すなわち、本発明のオリゴ核酸剤は、ｍｉＲＮＡ  ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ（配列番号００２）を対象とする、又はそれとハイブリッドを形成することが可能である。
【００２１】
特定の実施形態では、オリゴ核酸剤は、成熟形態のｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ｍｉＲＮＡを対象とする。
【００２２】
特定の実施形態では、オリゴ核酸剤は、オリゴ核酸剤が哺乳動物細胞に導入される場合に、細胞内のｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ｍｉＲＮＡレベルを、少なくとも１０〜２０％、少なくとも３０〜４０％、少なくとも５０〜６０％、少なくとも７０〜８０％、少なくとも９０〜９８％、又は少なくとも９９％の量（パーセンテージで表される）で減少させることが可能である。
【００２３】
特定の実施形態では、心臓病の治療又は予防の方法で使用するためのオリゴ核酸剤は、配列ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＡＧＣ  Ｔ（配列番号００１）を含む、又は本質的にそれからなる。
【００２４】
本発明のオリゴ核酸剤は、その配列によって定義されるが、１つ又は２つの位置を交換することによって、特にヌクレオチド類似体の導入を通してｍＲＮＡへの結合を増加させる一方で、本発明の効果を達成するために結合の十分な特異性が達成され得ることが当業者には理解される。
【００２５】
特定の実施形態では、オリゴ核酸剤は、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐにハイブリダイズする配列を含む。この薬剤の配列は、配列番号００１と少なくとも９５％同一、特に９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。特定の実施形態では、ハイブリダイズする配列は、デオキシヌクレオチド、ホスホチオエートデオキシヌクレオチド、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡヌクレオチド、又はそれらの混合物を含む。
【００２６】
ヌクレオシド類似体の一部又は全部から構成されるアンチセンス
特定の実施形態では、オリゴ核酸剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２７】
特定の実施形態では、オリゴ核酸剤は、ＬＮＡ部分を含む、又はＬＮＡ部分から本質的に構成され、約２０又はそれ以下のヌクレオチドを含む。
【００２８】
特定の実施形態では、オリゴ核酸剤は、ＬＮＡ部分から本質的に構成され、配列ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＡＧＣ  Ｔ（配列番号００８）によって記載される。特定の実施形態では、配列番号００８のヌクレオシド類似体は、リン酸エステルによって連結されている。特定の実施形態では、配列番号００８のヌクレオシド類似体は、ホスホチオエートエステルによって連結されている。
【００２９】
特定の実施形態では、心臓病の治療又は予防の方法で使用するためのオリゴ核酸剤は、１つ又は複数のペプチド核酸（ＰＮＡ）部分を含む、又はそれから本質的になる。
【００３０】
特定の実施形態において、本発明は、ｍｉＲＮＡ  ｍｉＲ２７ｂ−５ｐを対象とするオリゴ核酸剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における心臓病を治療又は予防する方法を含む。
【００３１】
ｍｉＲＮＡ  ｍｉＲ２７ｂ−５ｐの阻害は、配列特異的化学修飾オリゴヌクレオチドによって作用され得る。特定の実施形態において、本発明のオリゴ核酸剤は、核酸のリボース部分が２’酸素及び４’炭素を接続する追加の架橋で修飾されるロック核酸（ＬＮＡ）を含むことができ、これは３’−エンド立体配座のリボースをロックする。同様に、本発明のオリゴ核酸剤は、ＰＮＡ部分を含み得る。ＬＮＡ及びＰＮＡは、塩基が一致するＤＮＡ又はＲＮＡへの結合エネルギーがより高いため、結合が強くなる。このような結合は、相補的なｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ｍｉＲＮＡ標的のアンチセンスベースの阻害に付加され得る。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明のオリゴ核酸剤は、ホスホネート、ホスホロチオエート、又はホスフェートエステルのホスフェート骨格修飾を含むことができる。
【００３３】
特定の実施形態では、本発明のオリゴ核酸剤は、リボヌクレオチドを含み得る。任意に、本発明のオリゴ核酸剤は、デオキシリボヌクレオチドを含み得る。
【００３４】
特定の実施形態において、オリゴ核酸剤のハイブリダイズ配列は、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ホスホチオエートデオキシヌクレオチド、ホスホチオエートリボヌクレオチド及び／又は２’−Ｏ−メチル修飾ホスホチオエートリボヌクレオチドを含む。
【００３５】
特定の実施形態では、オリゴ核酸剤は、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド、特に修飾リボヌクレオチド及び修飾デオキシリボヌクレオチドを含む。デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの修飾の非限定的な例は、オリゴヌクレオチド骨格におけるホスホロチオエート修飾結合である。リボヌクレオチドの修飾の非限定的な例は、２’−Ｏから４’−Ｃへの架橋である。
【００３６】
特定の実施形態では、２’−Ｏ／４’−Ｃ架橋は、五員、六員又は七員の架橋構造である。
【００３７】
アンチセンスギャップマー
特定の実施形態において、オリゴ核酸剤は、その配列がｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ｍｉＲＮＡに相補的であり、そしてｍｉＲ２７ｂ−５ｐｍｉＲＮＡにも相補的なヌクレアーゼ耐性ＬＮＡ配列が両側（５’及び３’）に隣接する中央ＤＮＡブロックを特徴とするギャップマーである。この中央ＤＮＡブロックには、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性化ドメインを含有し、つまり、標的ＤＮＡを加水分解する部分である。特定の実施形態では、隣接するＬＮＡは完全にホスホロチオエート化されている。
【００３８】
特定の実施形態において、オリゴ核酸剤は、１２〜２０個のヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、オリゴ核酸剤は、１４〜１６個のヌクレオチドを含む。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明に従ったオリゴ核酸剤のハイブリダイズ配列は、１４、１５又は１６個のヌクレオチドを含む。
【００４０】
特定の実施形態では、ギャップマーの中央デオキシリボヌクレオチドオリゴマーブロックは、少なくとも５つのデオキシリボヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ギャップマーの中央デオキシリボヌクレオチドオリゴマーブロックは、リン酸エステル結合又はチオリン酸エステル結合によって連結された５から１０個のデオキシリボヌクレオシドを含む。
【００４１】
特定の実施形態において、ギャップマーの中央デオキシリボヌクレオチドオリゴマーブロックは、デオキシリボヌクレオシド間のリン酸骨格を含む。
【００４２】
特定の実施形態において、オリゴ核酸剤は、２’−Ｏ修飾リボヌクレオチド又はＰＮＡオリゴマーがいずれかの側に隣接するリン酸エステル結合によって連結された５から１０個のデオキシリボヌクレオチドの中央ブロックを含む、又は本質的にそれからなる。特定の実施形態において、オリゴ核酸剤は、ＬＮＡヌクレオシド類似体が隣接する５から１０個のデオキシリボヌクレオシドの中央ブロックを含む、又は本質的にそれからなる。特に特定の実施形態において、前記ＬＮＡヌクレオシド類似体は、ホスホチオエート部分が連結している。
【００４３】
特定の実施形態において、本発明のオリゴ核酸剤は、配列ＡＣＣＡ−ａｔｃａｇｃｔａ−ＡＧＣＴ（配列番号００５）を含む、又は本質的にそれからなり、ここで大文字は、ヌクレオシド類似体、特にＬＮＡ、より特にホスホチオエートエステルが連結するＬＮＡを意味し、小文字はリン酸エステルが結合するＤＮＡヌクレオシドを意味し、ヌクレオシド類似体とＤＮＡヌクレオシドの間の結合はリン酸エステル及びチオリン酸塩から選択される。
【００４４】
ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ
特定の実施形態では、オリゴ核酸剤は、リボ核酸剤、特にｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである。
【００４５】
本明細書の文脈におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤とは、そのエンハンサーＲＮＡ（ｅＲＮＡ）標的配列の分解を引き起こすリボヌクレオチドオリゴマーを指す。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、
−  標的エンハンサーＲＮＡ分子に相補的な配列トラクトを含む、一本鎖又は二本鎖の干渉リボ核酸オリゴマー又はその前駆体；又は
−  標的エンハンサーＲＮＡ分子に相補的な配列トラクトを含む、一本鎖又は二本鎖のアンチセンスリボ核酸又はデオキシリボ核酸、
を含む、又はそれからなる。
【００４７】
特定の実施形態において、標的エンハンサーＲＮＡ分子に相補的な配列トラクトは、長さが７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２個のヌクレオチドの隣接する配列トラクトである。
【００４８】
特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤には、これらに限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ及び非コーディングＲＮＡなどを含み、モルフォリノ（ホスホジアミデートモルフォリノオリゴマー）及びダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ、ＤｓｉＲＮＡはＲＮＡｓｅ  ＩＩＩクラスエンドリボヌクレアーゼダイサーによって、２−塩基３’−オーバーハングを持つ２１〜２３塩基の二本鎖に切断される）、ＵｓｉＲＮＡ（ＵｓｉＲＮＡは非ヌクレオチド非環式モノマーで修飾された二本鎖ｓｉＲＮＡであり、アンロック核酸塩基と類似体（ＵＮＡ）と呼ばれ、リボースの２つの隣接する炭素原子間の結合が除去される）、ｒｘＲＮＡ（商標）（ＲＸｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ウェストボロー、マサチューセッツ州、米国）を含む自己送達ＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ）を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、ホスホチオエート、２’Ｏ−メチルホスホチオエート、ペプチド核酸（ＰＮＡ；ペプチド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシンユニット（グリシンのアルファ炭素に結合した核酸塩基を有する））、又はロック核酸（ＬＮＡ；２’Ｏ、４’Ｃメチレン架橋ＲＮＡビルディングブロック）などの核酸の類似体を含む。ハイブリダイズ配列は、いずれかの上記の核酸から部分的に構成され得、残りのヌクレオチドは、自然界に存在する「天然の」リボヌクレオチドであり得る、又は異なる類似体の混合物であり得る、又は１種類の類似体から完全に構成され得る。
【００５０】
特定の実施形態では、オリゴ核酸剤は、ナノ粒子、ウイルス及び脂質複合体にコンジュゲートされている、又はカプセル化されている。
【００５１】
特定の実施形態では、オリゴ核酸剤は、（５’及び３’）側のいずれか一方にヌクレアーゼ耐性リボヌクレオチド類似体が隣接する中央のデオキシリボヌクレオチドオリゴマーブロックを含むギャップマーである。
【００５２】
本発明の範囲内に、それを必要とする患者において、本発明によるオリゴ核酸剤を患者に投与することを含む、心臓病を治療又は予防するための方法である。
【００５３】
同様に、本発明によるオリゴ核酸剤を含む、心臓病の予防用又は治療用の投与形態が提供される。
【００５４】
投与形態は、経鼻、口腔内、直腸、経皮又は経口投与などの経腸投与用、又は吸入形態又は坐剤としてであり得る。あるいは、皮下、静脈内、肝内又は筋肉内の注射形態などの非経口投与を使用することができる。任意に、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤が存在し得る。
【００５５】
特定の実施形態において、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ｍｉＲＮＡの発現を減少させるのに十分なオリゴ核酸剤の量は、細胞の環境において１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、及び１ピコモル以下である。
【００５６】
配列
配列番号００１（ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ標的配列；５’−３’、及びヌクレオチド化学）：
ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＡＧＣ  Ｔ
【００５７】
配列番号００２（ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ）
ＧＣＡＧＡＡＣＵＵＡＧＣＣＡＣＵＧＵＧＡＡ
【００５８】
配列番号００３（ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１Ｉ；センス）：
ＴＧＡＡＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＧＡＡＴＴＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡＣＣＡＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣ
【００５９】
配列番号００４（ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌ；アンチセンス）：
ＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＧＡＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＡＡＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡＣＣＡＴＴＣＡ
【００６０】
配列番号００５  ＡＣＣＡ−ａｔｃａｇｃｔａ−ＡＧＣＴ（大文字の場合：ヌクレオシド類似体、特にチオリン酸で連結されたＬＮＡ、小文字の場合：ＤＮＡ；境界：リン酸塩又はチオリン酸塩）
【００６１】
配列番号００６（プライマー配列フォワード；ｍｉｒ２７ｂ）：
ＧＣＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＧＴＧＡＣＴＴＧＡＧ−３’
【００６２】
配列番号００７（プライマー配列リバース；ｍｉｒ２７ｂ）：
５’−ＣＣＴＣＴＧＴＴＣＴＣＣＡＡＡＣＴＧＣＡＧ−３’
【００６３】
配列番号００８：（ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ標的配列；５’−３’、ＬＮＡ）：
ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＡＧＣ  Ｔ
【００６４】
単一の分離可能な特徴のための代替が「実施形態」として本明細書に記載されている場合はどこでも、そのような代替は、本明細書に開示された本発明の別々の実施形態を形成するために自由に組み合わせることができることが理解されよう。
【００６５】
本発明は、以下の実施例及び図によってさらに例示され、そこからさらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を例示するためのものであり、その範囲を限定するものではない。
【００６６】
【表１】
2021529202.tif 000006
【００６７】
ＩＶＳ，拡張期（ｄ）及び収縮期（ｓ）での心室中隔の厚さ；ＬＶＩＤ，拡張期（ｄ）及び収縮期（ｓ）での左心室内径；ＬＶＰＷ，拡張期（ｄ）及び収縮期（ｓ）での左心室後壁の厚さ；ＦＳ，短縮率；ＥＦ，駆出率；ＬＶＷ／ＢＷ，左心室重量／体重；ＨＷ／ＢＷ，心臓重量／体重。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；対応のない両側ｔ検定。
【００６８】
【表２】
2021529202.tif 000007
【００６９】
ＩＶＳ，拡張期（ｄ）及び収縮期（ｓ）での心室中隔の厚さ；ＬＶＩＤ，拡張期（ｄ）及び収縮期（ｓ）での左心室内径；ＬＶＰＷ，拡張期（ｄ）及び収縮期（ｓ）での左心室後壁の厚さ；ＦＳ，短縮率；ＥＦ，駆出率；ＬＶＷ／ＢＷ，左心室重量／体重；ＨＷ／ＢＷ，心臓重量／体重。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；対応のない両側ｔ検定。
【００７０】
【表３】
2021529202.tif 000008
【００７１】
ＬＶＩＤ，拡張期（ｄ）及び収縮期（ｓ）での左心室内径；ＬＶＰＷ，拡張期（ｄ）及び収縮期（ｓ）での左心室後壁の厚さ；ＦＳ，短縮率；ＥＦ，駆出率；ＬＶＷ／ＢＷ，左心室重量／体重；ＨＷ／ＢＷ，心臓重量／体重。示されている値は平均±ｓ．ｅ．ｍである；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；ＴＡＣのｓｃｒＬＮＡと、ｓｈａｍのｓｃｒＬＮＡ；ｓｈａｍのｍｉＲ２７ｂ−５ｐＬＮＡと、ＴＡＣのｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡ；対応のない両側ｔ検定。
【００７２】
【表４】
2021529202.tif 000009
【００７３】
ＩＶＳ，拡張期（ｄ）及び収縮期（ｓ）での心室中隔の厚さ；ＬＶＩＤ，拡張期（ｄ）及び収縮期（ｓ）での左心室内径；ＬＶＰＷ，拡張期（ｄ）及び収縮期（ｓ）での左心室後壁の厚さ；ＥＦ，駆出率；ＬＶＷ／ＢＷ，左心室重量／体重；ＨＷ／ＢＷ，心臓重量／体重。値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．を示す；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１  ＴＡＣのＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−と、ＴＡＣのＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋；対応のない両側ｔ検定。
【００７４】
【表５】
2021529202.tif 000010
【００７５】
ＩＶＳ，拡張期（ｄ）及び収縮期（ｓ）での心室中隔の厚さ；ＬＶＩＤ，拡張期（ｄ）及び収縮期（ｓ）での左心室内径；ＬＶＰＷ，拡張期（ｄ）及び収縮期（ｓ）での左心室後壁の厚さ；ＦＳ，短縮率；ＥＦ，駆出率；ＬＶＷ／ＢＷ，左心室重量／体重；ＨＷ／ＢＷ，心臓重量／体重。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；対応のない両側ｔ検定。
【実施例】
【００７６】
Ｆ１Ｆ０ＡＴＰシンターゼの抑制は、心臓代謝の核内倍加及び病理学的成長を作動する
ヒト及びマウスの病理学的心肥大におけるＡＴＰ枯渇のメディエーターを特定するために、ヒトＨＣＭ及びＡＳの患者の生検、及びＴＡＣに供されたマウスにおけるＡＴＰシンターゼ複合体のすべてのサブユニットのｍＲＮＡレベルをプロファイルした（図１ａ、ｂ及び図７ａ）。プロファイルされたサブユニットの中で、ＡＴＰ５Ａ１のｍＲＮＡ及びタンパク質は、ヒトとマウスの両方の心肥大で一貫して減少し、この肥大マーカーであるナトリウム利尿ペプチドＡ（ＮＰＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチドＢ（ＮＰＰＢ）、及び心エコーで測定される心臓形態及び機能の疾患指標のアップレギュレーションと有意に相関した（図１ａ〜ｄ及び図７ａ）。ＡＴＰ５Ａ１レベルのこれらの変化は、ヒトとマウスの両方の疾患の心筋におけるＴｈｒ１７２でのリン酸化の増加を介するＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化と相関し、その直接標的であるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）のリン酸化及び下流の不活性化をもたらす（図１ｃ、ｄ）。重要なことに、歴史的にＡＭＰ活性化キナーゼと呼ばれるが、ＡＭＰＫは実際にはＡＤＰによって、より感度が高く主に活性化される。抑制されたＡＴＰ５Ａ１発現及びＡＭＰＫ活性化と一致して、ＡＤＰ：ＡＴＰ比は罹患したヒト及びマウスの左心室生検で上昇した（図１ｅ、ｆ及び図７ｂ）。さらに、多核形成を示す心筋細胞の割合の増加が、ヒトの左心室のＡＳ及びＨＣＭの生検で観察された（図１ｇ、ｈ及び図７ｃ）。マウスでは、多核細胞の割合の増加もＴＡＣ手術後に観察された（図１ｉ、ｊ及び図７ｄ〜ｆ）。ＴＡＣプロトコルは、マウス大動脈の外科的狭窄を介してヒト大動脈弁狭窄症を模倣し、心室への血流速度を増加させて圧力過負荷ストレスを課し、ヒト大動脈弁狭窄症で見られるようなピクロシリウスレッド染色の増加によって示され、線維性マーカー遺伝子であるコラーゲンＩ型アルファ１（Ｃｏｌ１ａ１）、コラーゲンＩ型アルファ３（Ｃｏｌ３ａ１）及び形質転換成長因子ベータ１（ＴＧＦ１ｂ）の発現によって示される病理学的な心臓の成長及び線維症を引き起こす（Ｂａｒｒｉｃｋ，Ｃ．Ｊ．ら、２００７、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２９２、２１１９−２１３０）（図７ｇ〜ｊ）。
【００７７】
ＡＴＰ５Ａ１枯渇の生理学的意味を理解するために、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの心室特異的遺伝子導入に新規のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９に基づくシステムを利用した（Ｍｉｒｔｓｃｈｉｎｋ，Ｐ．ら、２０１５、Ｎａｔｕｒｅ、５２２、４４４−４４９）。簡潔には、ＴＡＴＡ−ｌｏｘ隣接遺伝子又はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有するＡＡＶの送達は、Ｃｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）依存性を付与し、これは組織特異的Ｃｒｅトランスジェニックマウスへの送達時に組織特異的異所性遺伝子又はｓｈＲＮＡの発現をもたらす（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．ら、１９８８、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８５、５１６６−５１７０）。Ａｔｐ５ａ１（ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１）を標的とするｓｈＲＮＡを保有するＡＡＶ９を、心室の心筋で特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現するＭｌｃ２ｖ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスに送達した（Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら、１９９８、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２５，１９４３−１９４９）（図１ｋ）。ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１の送達により、Ａｔｐ５ａ１のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現の抑制がもたらされ（図１ｌ及び図８ａ）、Ａｍｐｋの付随活性化及びその下流の標的Ａｃｃのリン酸化の増強（図１ｌ）に伴い、ＡＤＰ：ＡＴＰレベルの増加（図１ｍ及び図８ｂ）、有意な低下する心臓の収縮性及び線維症と組み合わされる心筋細胞の多核形成及び過成長をもたらした（図１ｎ〜ｓ、図８ｃ〜ｉ及び表１）。次に、本発明者らは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）誘導ヒト心筋細胞及び初代新生児ラット心筋細胞（ＮＲＣ）でこれらの所見を確認した。ヒト及びラットの心筋細胞をＤＡＰＩで染色して核を可視化し、ファロイジンで染色して糸状アクチンを標識し、細胞表面の輪郭を描写した。図８ｊ〜ｙに記載されるとおり、ヒト及びラットの心臓の細胞におけるｓｈＲＮＡによるＡＴＰ５Ａ１のノックダウンは、ＡＴＰ枯渇及びＡＤＰのレベルの上昇（図８ｔ、ｕ）によって確認されるＡＤＰ：ＡＴＰ比の増加（図８ｋ〜ｍ、ｓ〜ｕ）、及び心筋細胞の多核形成をもたらし、２次元細胞サイズ分析及び成長の間接的な指標としてのタンパク質合成の読み出しであるロイシン取り込みによって定量化されるとおり細胞の過成長を付随する（図８ｎ〜ｐ、ｖ〜ｙ）（Ｆｕｋｕｚａｗａ，Ｊ．ら、２０００、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、３５、１１９１−１１９６）。したがって、ＡＴＰ５Ａ１の枯渇は、核内倍加及び多核形成を誘発して病理学的な心臓の成長を誘導し、心機能を損なうのに十分である。
【００７８】
ＨＩＦ１αはｍｉｒ２７ｂ−５ｐを介してＦ１Ｆ０ＡＴＰシンターゼ活性を調節する
本発明者らは、ＴＡＣを受けた心室特異的Ｈｉｆ１α条件付きノックアウト（ｃＫＯ）マウス、及び心室心筋のフォンヒッペルリンドウタンパク質（Ｖｈｌ）を欠損したマウスにおいて、Ａｔｐ５ａ１のｍＲＮＡ及びタンパク質発現を用いる心臓のＨｉｆ１αの活性化の逆共調節を検出した。これは酸素依存性サブユニットを介してＨＩＦ１αの分解が阻害されるため、心筋のＨｉｆ１αの蓄積をもたらす（図９ａ〜ｃ）。ＨＩＦ１α蓄積とＡＴＰ５Ａ１抑制の間の逆の関係の結果として、心室特異的Ｈｉｆ１α  ｃＫＯマウスは、ＴＡＣを受けた対照のＨｉｆ１αｆｌ／ｆｌ同腹仔において観察されたＡＴＰ欠乏及び収縮機能障害から守られ（図９ｄ、ｅ）、一方でＶｉｈ／ｃＫＯマウスは、収縮機能の低下に関連する低い心室ＡＴＰレベルを示した（図９ｆ、ｇ）。しかし、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ及び発現研究では、Ａｔｐ５ａ１  ｍＲＮＡ及びＡＴＰレベルで観察された効果を媒介できる直接的なＨｉｆ１α標的遺伝子を特定することに繰り返し失敗していた（データは示さず）。これにより、これらの効果の媒介におけるＨｉｆ１α調節ｍｉＲＮＡの役割を探求することになった。本発明者らは、ＴＡＣを受けた心室特異的Ｈｉｆ１αｃＫＯマウス及び対照、及び心室特異的ＶｈｌｃＫＯマウスの左心室からのｍｉＲＮＡの発現プロファイリングを実施した。それぞれの群内の発現データを比較し、かつ種間保存低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）モチーフを含有するｍｉＲＮＡをフィルタリングすることにより、いくつかの潜在的なＨｉｆ１α調節ｍｉＲＮＡを同定した（図９ｈ）。これらのｍｉＲＮＡのサブセットは、以前から低酸素及び／又はＨｉｆ１α依存に関連付けられている。これらのｍｉＲＮＡのうち、ｍｉｒ２７ｂは、確立されたＨＩＦ１α標的遺伝子の発現パターンと一致してＴＡＣを受けたＨｉｆ１αｃＫＯマウスにおいて（同腹仔の対照Ｈｉｆ１αｆｌ／ｆｌのＴＡＣマウスと比較して）抑制すること、及び心室特異的ＶｈｌｃＫＯマウス（図９ｉ、ｊ）でのアップレギュレーションすることにおいて固有であり、これはＨｉｆ１αによる潜在的な調節を示唆している。
【００７９】
ｍｉｒ２７ｂは、ヒト及びマウスのアミノペプチダーゼＯ（ＡｍｐＯ）遺伝子のイントロン１５のｍｉｒ２３ｂ−２７ｂ−２４のクラスター内に含有される（Ｚｈｏｕ，Ｑ．ら、２０１１、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０８、８２８７−８２９２）。ｍｉｒ２７ｂ転写のストレス及びＨｉｆ１αの依存性を決定するために、ＴＡＣを受けたマウスにおいて、及び酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）を欠く構成的に活性なＨｉｆ１α変異体（ＨＩＦ１αΔＯＤＤと呼ばれる）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現の応答において、又は肥大誘発性β−アドレナリン受容体アゴニストであるトリヨードチロニン（Ｔ３）による刺激によって、クラスター内に含有されるＡｍｐＯ及びすべてのｍｉＲＮＡの発現をアッセイした（図９ｋ〜ｔ）。マウスにＴＡＣを適用すると、ＡｍｐＯがわずかに誘導され、成熟ｍｉＲ２３ｂ−３ｐ／５ｐ及びｍｉＲ２４−３ｐ／５ｐの発現はほとんど変化せず、ｍｉＲ２７ｂ−３ｐ／５ｐが約２．５倍誘導された（図９ｋ〜ｍ）。
【００８０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの異所性ＨＩＦ１αΔＯＤＤ発現は、ＡｍｐＯのダウンレギュレーション及びｍｉＲ２３ｂ−３ｐ／５ｐ及びｍｉＲ２４−３ｐ／５ｐのレベルの不変をもたらし（図９ｎ〜ｐ）、一方でＴ３刺激はＡｍｐＯ発現を誘導したが、ｍｉＲ２３ｂ−３ｐ／５ｐ又はｍｉＲ２４−３ｐ／５ｐの発現は誘導しなかった（図９ｒ〜ｔ）。対照的に、成熟ｍｉＲ２７ｂ−３ｐ／５ｐは、両方のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルで一貫してアップレギュレートした（図９ｐ、ｔ）。これらの結果は、ｍｉＲ２７ｂ−３ｐ／５ｐが、ストレス及びＨｉｆ１αに応答して、その宿主遺伝子ＡｍｐＯ及びその隣接ｍｉＲＮＡとは独立して調節されていることを示唆している。ＭＩＲ２７Ｂを直接のＨＩＦ１α標的と確認するために、本発明者らは、対照の非サイレンシング（ｎｓ）及びｓｈＨｉｆ１αの導入ＮＲＣをＴ３で刺激し、対照として確立されたＨｉｆ１α標的遺伝子及びｍｉｒ２７ｂの発現を解析した（図９ｕ）。プレｍｉｒ２７ｂ転写開始部位（ＴＳＳ）の−１ｋｂ上流に対応するｍｉｒ２７ｂのプロモーターの種間保存ＨＲＥのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析により、ヒト及びマウスのＴＳＳに隣接する保存ＨＲＥモチーフが明らかになった（図９ｖ）。このＨＲＥの機能を評価するために、野生型及びＨＲＥ変異プロモーターを用いたｍｉｒ２７ｂプロモーター−ルシフェラーゼアッセイを実施した。Ｈｉｆ１αは、野生型プロモーターのみのルシフェラーゼレポーター発現を増加させたが、ＨＲＥ変異プロモーター又は対照細胞ではそれぞれ増加させなかった（図９ｗ）。隣接するｍｉＲＮＡであるｍｉｒ２３ｂ及びｍｉｒ２４のプロモーターは、ＨＩＦ１αΔＯＤＤの異所性発現の存在においてプロモーター活性の増加を示さなかった（図９ｘ）。さらに、核抽出物からのＨｉｆ１αクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）によって明らかにされるとおり、Ｈｉｆ１αはｓｈＶｈｌで形質導入したＮＲＣの天然クロマチンのｍｉｒ２７ｂプロモーターと特異的に関連する（図９ｙ）。ｓｈＶｈｌによるｐＶｈｌ枯渇及びその結果としてのＨｉｆ１α蓄積の効率は、免疫ブロッティングによって確認された（図９ｚ）。これらのデータを総合すると、ＭＩＲ２７Ｂは本物のＨＩＦ１α標的ｍｉＲＮＡであることが明らかになった。
【００８１】
Ａｔｐ５ａ１は、ヒトとマウスの間で保存されるｍｉＲ２７ｂ結合部位を３’ＵＴＲに保有しており（図１０ａ）、これは部位直接的変異誘発により切断される場合、ｍｉｒ２７ｂ媒介阻害の抑制解除をもたらす（図１０ｂ）。一致して、ＮＲＣにおける異所性ｍｉｒ２７ｂ発現は、Ａｔｐ５ａ１のｍＲＮＡ及びタンパク質の顕著な抑制をもたらした（図１０ｃ〜ｅ）。ｍｉＲ２７ｂ−３ｐとｍｉＲ２７ｂ−５ｐのＲＮＡの両方がＨＩＦ１αによってアップレギュレートされているにもかかわらず、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐは、野生型Ａｔｐ５ａ１のＵＴＲレポーターの発現を阻害する能力において固有であった（図１０ｂ）。ｍｉＲ２７ｂ−５ｐミミック（ｍｉｍｉｃ）による心筋細胞の治療はＡｔｐ５ａ１  ｍＲＮＡの用量依存的なダウンレギュレーションをもたらしたが、ｍｉＲ２７ｂ−３ｐミミックはもたらさなかった（図１０ｆ）。これらの観察結果は、異所性ＨＩＦ１αΔＯＤＤを発現する心筋細胞において、ロック核酸（ＬＮＡ）媒介ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ阻害により再確認された（図１０ｇ〜ｉ）。ｍｉＲ２７ｂ−５ｐを特異的に標的とするＬＮＡは、ＨＩＦ１αΔＯＤＤ誘導Ａｔｐ５ａ１のダウンレギュレーションを抑制解除することにつながった（図１０ｇ〜ｉ）。同様の結果は、Ｔ３刺激でも観察され、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡで同時に治療することでＡｔｐ５ａ１の抑制が救済された（図１０ｊ〜ｍ）。このように、Ａｔｐ５ａ１のｍｉＲ２７ｂ阻害は、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ種によって特異的に媒介される。
【００８２】
これらの設定下でのＡｔｐ５ａ１のダウンレギュレーションがＡＴＰシンターゼ活性に影響を与えるかどうかを判断するために、ｍｉｒ２７ｂ又はｓｈＡｔｐ５ａ１を異所的に発現する、又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐＬＮＡと組み合わせた異所性ＨＩＦ１αΔＯＤＤ発現時のラット心筋細胞から単離された免疫沈降ＡＴＰシンターゼのＡＴＰ再生能力を測定した（図１０ｎ、ｏ）。前述のように、異所性のｍｉｒ２７ｂ及びＨＩＦ１αΔＯＤＤの発現は、ＡＴＰシンターゼ活性の有意な抑制をもたらし、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡによる並行治療時に活性が救済された（図１０ｎ、ｏ）。Ａｔｐ５ａ１の不活性化はまた、異所性ｍｉｒ２７ｂ発現の作用も模倣したが、一方でフラグタグ付きコンストラクト有する付随するＡＴＰ５Ａ１の過剰発現（図１０ｐ）は、異所性ＨＩＦ１αΔＯＤＤ発現時のＡＴＰシンターゼ活性の低下を救済した（図１０ｏ）。したがって、ＡＴＰシンターゼの活性はＡｔｐ５ａ１の発現レベルに大きく依存する。
【００８３】
ｍｉＲ２７ｂ−５ｐの阻害は重度の心肥大及び機能障害を軽減する
ＭＩＲ２７Ｂの発現がヒトの心臓病理と相関しているかどうかを評価するために、本発明者らは、健康なヒト及び疾患を持つヒトの心臓生検においてＭＩＲ２７Ｂの発現をプロファイリングした。図２ａに記載されるとおり、ＨＣＭ及びＡＳの患者の左室生検では、健康な対象と比較してＭＩＲ２７Ｂ発現が上昇しており、ＡＴＰ５Ａ１発現と逆相関していた（図１ａ）。本発明者らは、心室心筋に特異的に異所性ｍｉｒ２７ｂを発現させるために、Ｍｌｃ２ｖ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスへのプレｍｉｒ２７ｂを運ぶＡＡＶ９（ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｍｉｒ２７ｂ）の送達を介して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍｉｒ２７ｂとＡｔｐ５ａ１との因果関係を調べた。記載のとおり、異所性ｍｉｒ２７ｂの発現は、形質導入後１１週間で、心臓の過成長、収縮機能障害、及びＡｔｐ５ａ１のｍＲＮＡ及びタンパク質の抑制を十分に誘導した（図２ｂ〜ｈ）。さらに、Ｍｌｃ２ｖ−Ｃｒｅ＋マウスの左心室では、Ｃｒｅ−の同腹仔と比較して、核内倍加の上昇のリードアウトとしての多核心筋細胞の割合の増加が観察され（図２ｉ、ｊ及び図１１ｄ〜ｆ）、ＴＡＣ手術時に観察された範囲に匹敵する（図１ｉ、ｊ）。心筋線維化も同様に上昇した（図１１ｇ、ｈ）。これらの観察及びＡｔｐ５ａ１発現の主要な調節因子としてのｍｉＲ２７ｂ−５ｐの同定（図１０ｂ、ｆ〜ｐ）により、本発明者らは、重度の心不全（ＡＴＰシンターゼ抑制及びＡＴＰ枯渇に一般的に関連する病状）を示すマウスにおけるｍｉＲ２７ｂ−５ｐ機能を調べることになった。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを無作為に２つの群に割り当て、これらの群はｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のいずれかを受け、さらにスクランブルＬＮＡ（ｓｃｒＬＮＡ）又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡによる治療群に細分した（図２ｋ）。後期のヒト心不全を模倣するために、ＴＡＣ手術を実施し、心エコー検査によって重度の心機能障害が検出されるまで肥大を進行させた。それぞれの図のパネルに示されているとおり、その時点でＬＮＡ治療が開始され、心エコー検査を実施して疾患の進行を監視した（図２ｋ〜ｐ）。ＴＡＣ手術は、心筋に適用される過負荷の程度についての管理要素である大動脈流速の増加をもたらしたが、ｓｈａｍ治療のマウスは、正常な大動脈流を示した（図１１ｉ）。心室重量：体重比の増加及び心室拡張によって示されるとおり、重度の心肥大に付随して、収縮期の心機能障害は、術後４２日のＴＡＣマウスにおける劇的な駆出率（ＥＦ）の減少（図２ｌ−ｐ及び表３）により明らかになった。この観察に続いて、それぞれの群からのマウスを、ｓｃｒＬＮＡ又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡの療法について細分した。心エコー検査による疾患の進行の縦断的モニタリングにより、ｓｈａｍのマウスに病状がないことが明らかになった。ｓｃｒＬＮＡで治療されたＴＡＣ手術マウスは、顕著な肥大の発生、心室拡張、及び心臓駆出率の低下によって証明されるとおり、心機能及び心不全のさらなる低下を示した（図２ｌ〜ｐ及び表３）。対照的に、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡで治療されたＴＡＣマウスは、心機能の改善及び肥大成長の部分的な回復を示した（図２ｌ〜ｐ及び表３）。ｍｉＲ２７ｂ−３ｐ及びｍｉＲ２７ｂ−５ｐの発現の分析により、ｍｉＲ２���ｂ−５ｐ種の特異的不活性化が確認され（図２ｑ、ｒ）、これはｓｈａｍ治療マウスの発現レベルを模倣する、スクランブルＬＮＡ治療ＴＡＣ手術マウスと比較して肥大マーカー遺伝子の発現の減少（図２ｓ）及びＡｔｐ５ａ１のｍＲＮＡ及びタンパク質発現の増加と相関する（図２ｔ、ｕ）。驚くことに、スクランブルＬＮＡを注射したＴＡＣ手術マウスの左心室断面の免疫蛍光染色によって検出されるストレス誘発性の多核形成の増加は、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡを投与されたＴＡＣ手術マウスで著しく減少した（図２ｖ、ｗ及び図１１ｊ〜１）。同様に、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡ療法は、スクランブルＬＮＡを注射したマウスと比較して、ＴＡＣ手術を受けたマウスの心筋線維化及び死亡率を有意に低下させた（図２ｘ及び図１１ｍ、ｎ）。したがって、病理学的なストレス誘発性ＭＩＲ２７Ｂ−５ｐの発現及びＡＴＰ５Ａ１の抑制は、ヒト及びマウスの病理学的な心臓の成長の主要な側面を保持するために必要である。
【００８４】
ミトコンドリアＡＤＰはプリン生合成を誘導する
ＡＴＰシンターゼの不活性化がミトコンドリア内ＡＤＰレベルを上昇させると仮定して、ＡＴＰシンターゼとの基質競合がないＡＤＰが、細胞で生成されるギ酸の７０〜９９％を占める１−炭素経路のミトコンドリア内律速酵素であるＭＴＨＦＤ１Ｌに再チャネル化されることが可能かどうかを調査した。ＭＴＨＦＤ１Ｌは、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸塩（ＣＨＯ−ＴＨＦ）をギ酸塩に加水分解するための律速補因子としてＡＤＰを利用する（図３ａ）。これを試験するために、遺伝子のＨｉｆ１α、ｍｉＲ２７ｂ、Ａｔｐ５ａ１、及びＭｔｈｆｄ１ｌの機能獲得及び機能喪失の設定においてギ酸塩及びミトコンドリアのＡＴＰ及びＡＤＰのレベルを測定した（図３ｂ、ｃ、図１２ａ〜ｈ）。ギ酸塩生成及びＡＤＰ：ＡＴＰ比の増加は、異所性Ｈｉｆ１α又はｍｉＲ２７ｂの発現、及びｓｈＲＮＡ媒介Ａｔｐ５ａ１ノックダウンと直接相関した（図３ｂ、ｃ）。次に、ＨＩＦ１α−ＭＩＲ２７Ｂ−ＡＴＰ５Ａ１軸の活性化と多核形成及び心筋細胞成長のレベルの上昇との間の代謝的な関連を調査するために、上記と同様の設定でメタボロミクスを実行した（図３ｄ）。驚くことに、異所性Ｈｉｆ１α、ｍｉＲ２７ｂ、又はｓｈＡｔｐ５ａ１の発現により、グルコース及び解糖中間体（ジヒドロキシアセトンリン酸、３−ホスホグリセリン酸）のレベルが上昇し、グルコースの取り込み及び解糖が増加したことを示している。さらに、高レベルのセリン及びグリシン、プリン生合成経路の中間体（リボース−５−リン酸、ＦＧＡＲ）、並びにプリン及びピリミジンの誘導体（イノシン、キサンチン、ｄＵＴＰ、ＧＴＰ、ウリジン）が観察された。対照的に、付随するｍｉＲ２７ｂ−５ｐの不活性化、Ｍｔｈｆｄ１ｌの枯渇、又は異所性ＡＴＰ５Ａ１の発現は、これらの効果を部分的に逆転させた（図３ｄ）。さらに、ＭＴＨＦＤ１Ｌの異所性発現だけでは、ｄｅ  ｎｏｖｏプリン生合成経路を誘導するのに十分ではなく、これはミトコンドリアＡＤＰがＡＴＰシンターゼの基質として機能し、そしてミトコンドリアのギ酸生合成の誘導がＡＴＰ５Ａ１の抑制に大きく依存しているという見解を支持している（図３ｄ）。同様の結果がＴ３でも観察され、高いｍｉＲ２７ｂ依存性の成長（図１３ａ）、ギ酸塩産生（図１３ｂ）、及びＡＤＰ／ＡＴＰの増加（図１３ｃ）がもたらされた。メタボロームのＬＣ−ＭＳに基づく分析により、ｍｉＲ２７ｂ発現の機能としてのプリン及びピリミジンの誘導体の産生の増加が明らかになった（図１３ｄ）。
【００８５】
したがって、ＡＤＰの再チャネリングは、エネルギーの低下（ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）をストレス誘発性の生合成経路に結び付ける。
【００８６】
プリンは、核酸合成、核内倍加、及び細胞成長に不可欠である。そのｄｅ  ｎｏｖｏ合成では、グルコースが細胞に入り解糖を受けて３−ホスホグリセリン酸（３−ＰＧ）を形成し、さらにセリン生合成経路を介して代謝されてセリン及び（間接的に）グリシンを生成し、次いでそれらはその炭素をプリン環に組み込むことによる重要な１−炭素供与体として機能するまでトレースすることができる（図３ａ）。プリン環に組み込まれた炭素原子は本質的にグルコース炭素にまでさかのぼるので、グルコース、セリン、及びグリシンをそれぞれ標識することにより、核酸のプリン環への炭素の流入をトレースした（図３ｅ）。示されるとおり、グルコース、セリン、及びグリシンに由来する炭素原子の取り込みの増加が、ＨＩＦ１αΔＯＤＤ、ｍｉＲ２７ｂ、又はｓｈＡｔｐ５ａ１を異所的に発現する細胞の核酸画分で観察されたが（図３ｅ）、得られたメタボロームプロファイルと一致して、同時異所性ＭＴＨＦＤ１Ｌの発現は標識炭素の寄与を感知できるほど増加されなかった（図３ｄ）。同様の効果が、Ｔ３誘導性細胞成長及びｍｉＲ２７ｂ−５ｐ不活性化の条件で観察された（図１３ｅ）。これらのデータは、上流ネットワーク全体が、病理誘発性ｄｅ  ｎｏｖｏ核酸合成の調節においてＡＴＰ５Ａ１とＭＴＨＦＤ１Ｌの間のクロストークに影響を与えることを示唆している。
【００８７】
最後に、代謝物分布の同様の変化が、スクランブルＬＮＡ（ｓｃｒＬＮＡ）又はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡ治療を伴うｓｈａｍ又はＴＡＣ手術を受けたマウスの左心室生検で検出できるかどうかを判断した（図２ｋ〜ｐ）。図１４ａに示されるとおり、心臓の左心室で観察された代謝物の変化は、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡで治療されたＴＡＣ手術動物、又はｓｈａｍを受けたｓｃｒＬＮＡ治療マウスと比較して、ｓｃｒＬＮＡ治療のＴＡＣマウスにおいてＮ−ホルミルグリシンアミドリボヌクレオチド（ＦＧＡＲ）及び５−ホルムアミドイミダゾール−４−カルボキサミドリボチド（ＦＡＩＣＡＲ）などのプリン前駆体の上昇を含む上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察された変化と密接に類似した。さらに、プリンであるキサンチン及びイノシンは、ｓｃｒＬＮＡで治療されたＴＡＣ手術マウスと比較して、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐで治療されたＴＡＣマウスで有意に低かった（図１４ａ）。階層的クラスタリングにより、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡを注射したＴＡＣ治療マウスの左心室生検の代謝痕跡は、ｓｃｒＬＮＡ注射のＴＡＣマウスと比較して変化したが、ｓｈａｍ手術のｓｃｒＬＮＡ及びｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡ治療マウスと同等であることが明らかになった（図１４ｂ）。特に、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡを注射したマウスのＴＡＣ手術の左心室生検では、ＴＡＣ  ｓｃｒＬＮＡ対照と比較して遊離脂肪酸及びその他の脂質種のレベルが低いことが明らかになった（図１４ａ）。したがって、本発明者らは、さらに、上記のｉｎ  ｖｉｖｏ試料中のリピドームを調査した（図１５ａ〜ｇ）。主成分分析（ＰＣＡ）では、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡ注射のマウスに対して、ＴＡＣ手術のｓｃｒＬＮＡの左心室において特有のリピドーム痕跡を示した（図１５ａ）。ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術のｓｃｒＬＮＡ治療の心臓のリピドームは部分的に重複するが、第１の主成分（ＰＣ１）に沿って有意に分離し、一方でｍｉＲ２７ｂ−５ｐ発現レベルが低下したｓｈａｍ又はＴＡＣ治療の心臓のリピドームは第２の主成分（ＰＣ２）に沿って有意に分離している（図１５ｂ、ｃ）。脂質組成を詳しく調べると、ＴＡＣ手術／ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡ注射のマウスの左心室生検では、６つの二重結合（ｄｂ）を含有する脂質が実際に最も多量に示されるのに対し、ＴＡＣのｓｃｒＬＮＡ試料は２つのｄｂ、４つのｄｂが著しく際立っており、脂質では３４及び３６個の炭素原子を有する（図１５ｄ、ｅ）。
【００８８】
ＴＡＣ手術マウスの個々の脂質種の存在量から対応する対照の脂質種の平均ｍｏｌ％の存在量を差し引いたものを分析すると、ＴＡＣ試料中のアラキドン酸（２０：４）及びリノール酸（１８：２）の富化が明らかになった（図１５ｆ）。驚くべきことに、ドコサヘキサエン酸（２２：６）を含む脂質は、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐの発現が抑制されたＴＡＣ手術マウスの左心室に蓄積する（図１５ｇ）。この結果と一致して、遊離ドコサヘキサン酸もまた非標的代謝分析で増加した（図１４ａ）。心臓のリピドームの包括的な分析をまとめると、圧力過負荷への応答での左心室成長の防止と、高度不飽和脂質、特に心臓保護作用があることが示されているドコサヘキサン酸を含有する脂質の富化との相関関係が明らかになった。一方、肥大の増加は、３４及び３６個の炭素を有する脂肪酸を含有する脂質の有意なアップレギュレーションと関連しており、これは脂肪酸酸化の減少を示している。ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡで治療されたＴＡＣマウスに由来する心臓のより大きな酸化表現型と一致して（ＴＡＣを受け、かつｓｃｒＬＮＡで治療されたマウスと比較）（図１４ａ）、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡで治療のＴＡＣ心臓と比較して、ＴＡＣ手術及びｓｃｒＬＮＡ治療の心臓において長鎖脂肪酸の富化により証明されるとおり、脂質異化はｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡ治療のマウスで著しく上昇した（図１５ａ〜ｇ）。さらに、脂質異化メディエーターの発現の増加が、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡで治療されたＴＡＣ心臓で観察され（ＴＡＣを受け、ｓｃｒＬＮＡで治療されたマウスと比較）、これはｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡで治療されたＴＡＣ心臓のパルミチン酸酸化能力の増加に対応している（図１５ｈ、ｉ）。要約すると、これらの分析により、心臓保護的なドコサヘキサン酸を有する脂質の有意なアップレギュレーション及び脂肪酸酸化能力の増加を特徴とする、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡ治療ＴＡＣ心臓の特有の脂質の痕跡を明らかにした。
【００８９】
ＡＴＰシンターゼは心筋細胞の核内倍加及び病理学的成長を制御する
心筋細胞の核内倍加は、病理学的な心臓の過成長に先行する（Ａｈｕｊａ，Ｐ．ら、２００７、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ、８７，５２１−５４４）。同定された軸が実際にＡＤＰを介して心筋細胞の多核形成及び成長に寄与するかどうかを理解するために、本発明者らは、初代心筋細胞をオリゴマイシン（Ｆ０サブユニットＡＴＰシンターゼ阻害剤（Ｓｈｃｈｅｐｉｎａ，ＬＡ．ら、２００２、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２１、８１４９−８１５７）で治療することにより、ｍｉＲ２７ｂ媒介ＡＴＰ５Ａ１抑制を模倣した、又は初代心筋細胞をＡＤＰで刺激した（Ｈｕ，Ｊ．ら、２０１４、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ、５、１４２４）。図１６ａ〜ｄに記載されるとおり、ＡＤＰレベルはオリゴマイシン又はＡＤＰで治療された細胞において実際に上昇した。次に、本発明者らは、多核細胞の割合、及び細胞サイズ定量化による心筋細胞肥大を定量化するためにＤＡＰＩ及び骨格α−アクチニンを用いた免疫蛍光染色（図１６ｅ〜ｈ）によって視覚化されるとおり、オリゴマイシン又はＡＤＰが核内倍加及び多核形成を誘導するのに十分であることを評価した（図１６ｉ、ｊ）。
【００９０】
根底にあるメカニズムをよりよく定義するために、本発明者らは、Ｈｉｆ１α、ｍｉＲ２７ｂ、Ａｔｐ５ａ１及びＭｔｈｆｄ１ｌの獲得及び喪失の機能設定における心筋細胞の倍数性及び細胞サイズを分析した（図４ａ〜ｉ及び図１７ａ〜ｈ）。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色ＤＮＡのフローサイトメトリーとフローサイトメトリーの組み合わせを画像化することで示されるとおり、異所性ＨＩＦ１α、ｍｉｒ２７ｂ、又はｓｈＡｔｐ５ａ１の発現は、多核倍数体細胞の集団を十分に増加し（図４ａ〜ｆ）、同時のｍｉＲ２７ｂ−５ｐ  ＬＮＡ媒介不活化（図４ａ、ｂ）、異所性ＡＴＰ５Ａ１発現（図４ｃ、ｄ）、又はｓｈＭｔｈｆｄ１ｌ発現レンチウイルスの同時形質導入によるＭｔｈｆｄ１ｌの枯渇（４ｅ、ｆ）の場合に作用が回復した。核内倍加の多核細胞を直接的に視覚化するために、心筋細胞をセリン１０で、リン酸化ヒストン３（ｐ−ヒストンＨ３）について染色し、共焦点顕微鏡で画像化した（図１７ａ〜ｈ）。リン酸化ヒストンＨ３は、核運動細胞の特徴である凝縮した染色体をマークする。フローサイトメトリーデータと一致して、異所性ＨＩＦ１αΔＯＤＤ発現は、リン酸化ヒストンＨ３染色核（ＬＮＡでの並行するｍｉＲ２７ｂ−５ｐ阻害時に救済された）の増加をもたらした（図１７ａ、ｂ）。さらに、ｍｉｒ２７ｂの過剰発現又はＡｔｐ５ａ１阻害は、対応する対照と比較して、同様に核運動細胞の数の増加をもたらした（図１７ｃ、ｄ）。ｓｈＲＮＡ媒介Ｍｔｈｆｄ１ｌ阻害は、そのｍＲＮＡ及びタンパク質の効率的な枯渇をもたらし（図１７ｅ、ｆ）、対照細胞と同等のリン酸化ヒストンＨ３染色をもたらした（図１７ｇ、ｈ）。注目すべきことに、異所性ＡＴＰ５Ａ１及びｍｉｒ２７ｂの同時発現、又はＮＲＣのｓｈＭｔｈｆｄ１ｌ及びｓｈＡｔｐ５ａ１レンチウイルスの同時形質導入は、ｍｉｒ２７ｂ又はｓｈＡｔｐ５ａ１単独の異所性発現で観察されるように、同様にリン酸ヒストンＨ３染色の広範なパターンを減少させた（図１７ｃ〜ｈ）。ｄｅ  ｎｏｖｏプリン生合成及び多核形成の増加が細胞成長に直接関連していることを確認するために、本発明者らは、同一の治療条件下でロイシン取り込みアッセイを実施した。図４ｇ〜ｉに示すとおり、異所性ＨＩＦ１αΔＯＤＤ、ｍｉｒ２７ｂの発現、又はＡｔｐ５ａ１ノックダウンにより、ロイシン取り込みが増加し（タンパク質合成及び細胞成長の増加を示す）、これはｍｉＲ２７ｂ−５ｐの同時不活性化により（図４ｇ）、又はＡＴＰ５Ａ１の異所性発現により（図４ｈ）無効化した。プリン生合成におけるＭＴＨＦＤ１Ｌの重要な要件に沿って、多核細胞の割合は、病理学的細胞成長（図４ｉ）と同様に、ＭＴＨＦＤ１Ｌ及びＡＴＰ５Ａ１の同時枯渇時に減少した（図４ｅ、ｆ）。したがって、本発明者らのデータは、代謝環境の再プログラムが心筋細胞の核内倍加を誘導し、その結果、多核形成及び細胞成長を十分にもたらすという見解を支持している。
【００９１】
ＭＴＨＦＤ１Ｌは病理学的な心臓の成長の重要な調節因子である
ＭＴＨＦＤ１Ｌが心臓の病理学的肥大に影響を与えることを確認するために、本発明者らは、ｓｈａｍ又はＴＡＣ手術を受けたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−及びｃｒｅ＋のマウスに、Ｍｔｈｆｄ１ｌを標的とするショートヘアピンＲＮＡを保有するＡＡＶ９（ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌ）を注射した（図５ａ）。以前のＴＡＣデータ（図１ｉ、ｊ）と一致して、免疫蛍光染色から定量化されたとおり、多核形成はＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスで有意に増加した（図５ｂ、ｃ及び図１８ａ）。ストレス誘発性核内倍加に不随して、Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスは、ＴＡＣ手術後に病理学的な心肥大及び収縮機能障害を発症し、これは、ｓｈａｍ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−マウスと比較して、左心室重量：体量の比率の増加、拡張期の左心室内径の増加（ＬＶＩｄ）、及び肥大マーカー遺伝子の上昇、及び駆出率の低下により明らかになった（図５ｄ〜ｇ、図１８ｂ〜ｄ、及び表４）。驚くべきことに、多核細胞の割合は、ＴＡＣ手術のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋マウスにおいて、同様に治療されたＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−同腹仔と比較して有意に低かった（図５ｂ、ｃ及び図１８ａ、ｅ、ｆ）。よって、心肥大、線維症及び収縮機能障害は有意に減少した（図５ｄ〜ｇ、図１８ｂ、ｇ、ｈ及び表４）。Ｍｔｈｆｄ１ｌ発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析及びイムノブロッティングにより、ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈ  Ｍｔｈｆｄ１ｌ形質導入によって、ＴＡＣ誘発性心臓過成長及び収縮機能障害に対する耐性と同時に、ＲＮＡ及びタンパク質レベル（図５ｈ及び図１８ｄ）の両方でＭｔｈｆ１ｌを十分に抑制することが明らかになった。
【００９２】
ＴＡＣ治療のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋の心臓におけるＨＩＦ１αの蓄積に沿って、Ａｔｐ５ａ１の発現が抑制され、その結果、Ｔｈｒ１７２でのＡＭＰＫリン酸化及びＡＣＣの過剰リン酸化がもたらされた（図５ｈ）。Ｍｔｈｆｄ１ｌ抑制は、ＴＡＣ媒介圧力過負荷によって誘導される心臓代謝核内倍加に応答して多核形成の増加を十分に防ぐという事実に沿って、Ａｔｐ５ａ１のダウンレギュレーションによって誘発される多核形成、過成長、線維症、及び機能不全（図１ｋ〜ｓ及び図８ａ〜ｉ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭｔｈｆｄ１１の並行する不活性化によって同様に予防された（図５ｉ〜ｏ、図１８ｉ〜ｑ及び表５）。ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＡｔｐ５ａ１及びＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌを同時注射したＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋マウスは、Ａｔｐ５ａ１の効果的な阻害にもかかわらず（図５ｐ及び図１８ｎ）、多核細胞（図５ｊ、ｋ及び図１８ｉ〜ｋ）、正常な心室サイズ（図５ｌ、ｍ及び図１８ｌ）、左心室重量：体重比（図５ｎ）、肥大マーカー遺伝子発現（図１８ｍ）及び収縮期左心室機能（図５ｏ及び表５）において増加を示さず、Ｍｔｈｆｄ１ｌが同時に阻害された場合（図１８ｏ）、Ｍｔｈｆｄ１ｌがＡｔｐ５ａ１の下流に機能することを示している。心筋線維化のレベルは、群の間で同様に同等であった（図１８ｐ、ｑ）。したがって、ＡＴＰ５Ａ１抑制及びその結果としてのＡＤＰのＭＴＨＦＤ１Ｌへの再チャネリング、及びその後のプリン生合成の増加は、心臓代謝の核内倍加及び多核形成を誘導して病理学的な心臓の成長を強制する。
【００９３】
ＡＴＰ５Ａ１は、代謝及び成長のシグナル伝達を統合して病理学的な成長を誘導する
ＡＭＰＫの活性化は、Ｓｅｒ８０４でのリン酸化を介して腫瘍抑制因子網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）の阻害を誘導することが示されている。Ｒｂは、二量体Ｅ２Ｆタンパク質及び二量体化パートナー（ＤＰ）タンパク質（Ｅ２Ｆ−ＤＰ）で構成されるＥ２Ｆ転写因子の隔離及び阻害を通じて、ＤＮＡ複製及びＧ１からＳへの細胞周期の進行を制限する。Ｒｂリン酸化は、結果としてＥ２Ｆ−ＤＰ複合体からのＥ２Ｆ転写因子の放出及び抑制解除をもたらし、Ｅ２Ｆ標的遺伝子の誘導及び細胞周期の再突入に至る。ＨＩＦ１α−ｍｉＲ２７ｂ−ＡＴＰ５Ａ１−ＭＴＨＦＤ１Ｌの軸が、有糸分裂後の成体心筋細胞における細胞周期の再突入及び核内有糸分裂を許容する代謝コンテキストを生成することを考え、本発明者らは、心臓病理学的肥大における代謝及び成長因子シグナル伝達の可能な協調について調査した。
【００９４】
第１に、発明者らは、ＡＭＰＫ及びＲｂの共免疫沈降を介して、発明者らの設定におけるＡＭＰＫとＲｂとの直接の相互作用を確認した。そのために、ＡＭＰＫαサブユニットを心筋細胞で異所的に発現し、その後免疫沈降した。プルダウン生成物は、ＡＭＰＫαとリン酸化Ｒｂの共沈降を明らかにした（図６ａ、ｂ）。本発明者らは、異所性ＨＩＦ１αΔＯＤＤを発現する細胞における内因性ＡＭＰＫのプルダウンを介してこの相互作用を確認した。前述のとおり、ＡＭＰＫは、ＨＩＦ１αΔＯＤＤを異所的に発現する心筋細胞においてリン酸化Ｒｂと免疫沈降したが、強力なＡＭＰＫ阻害剤である化合物Ｃ（ＣＣ）とのＡＭＰＫの同時阻害の場合は免疫沈降しなかった（図６ｃ、ｄ）。
【００９５】
ＡＭＰＫとリン酸Ｒｂの間の直接的な相互作用を確認した後、発明者らは次に、Ｒｂがヒト生検及びさまざまなマウスモデルにおいて過剰リン酸化されているかどうかを評価した（図６ｅ〜ｊ）。実際、Ｒｂの過剰リン酸化は、ｓｃｒＬＮＡを注射したＴＡＣ手術マウスの左心室生検の溶解物（図６ｅ）、異所性ｍｉｒ２７ｂ発現（図６ｆ）、及びＡｔｐ５ａ１の枯渇（図６ｇ）において、前に実施したとおりのこれらの条件下でＴｈｒ１７２でのＡＭＰＫのリン酸化と一致して検出された（図１１及び図２ｈ、ｕ）。ｍｉＲ２７ｂ−５ｐを標的とするＬＮＡを注射したマウス（図６ｅ）、又はＭｔｈｆｄ１ｌ単独又はＭｔｈｆｄ１ｌとＡｔｐ５ａ１に対するｓｈＲＮＡを保有するＡＡＶ９を同時形質導入したマウスの左心室は、ＴＡＣ手術後のｐＲｂ誘導から保護された（図６ｈ、ｉ）。マウスでの実験及び観察されたＡＭＰＫのＴｈｒ１７２リン酸化との一致により（図１ｃ）、ＡＳ及びＨＣＭの患者の心室生検の溶解物の免疫ブロッティングは、同様にリン酸Ｒｂの発現の増加を明らかにした（図６ｊ）。まとめると、ｐＲｂは、ＨＩＦ１α−ＭＩＲ２７Ｂ−ＡＴＰ５Ａ１軸を誘導する心臓代謝核内倍加の存在下でのリン酸化ＡＭＰＫの下流標的である。
【００９６】
Ｒｂの過剰リン酸化によるＥ２Ｆ１の予測される放出が、Ｅ２Ｆ１の転写活性の増加につながるかどうかを調べるために、本発明者らはｑＲＴ−ＰＣＲを実行して、Ｅ２Ｆ１標的遺伝子（サイクリンＡ１、Ａ２、Ｄ１、Ｅ１（Ｃｃｎａｌ、Ｃｃｎａ２、Ｃｃｎｄ１、Ｃｃｎｅ１）及びサイクリン依存性キナーゼ１（Ｃｄｋ１））のＲＮＡレベルの変化を、上記の条件で治療されたマウスの左心室試料及びヒト心臓生検において検出した（図６ｋ〜ｎ）。これらの遺伝子発現分析では、マウス並びにＡＳ及びＨＣＭの患者におけるリン酸ＡＭＰＫ媒介Ｒｂ阻害の下流でのｉｎ  ｖｉｖｏでのＥ２Ｆ経路の活性化を確認することができた（図６ｋ〜ｎ）。ＮＲＣで行ったＥ２Ｆルシフェラーゼレポーターアッセイは、ＨＩＦ１αΔＯＤＤ、ｍｉｒ２７ｂ又はＡｔｐ５ａ１枯渇の異所性発現下でのＥ２Ｆ転写活性をさらに確認した（図６ｏ，ｐ）。最後に、心筋細胞の核内有糸分裂及び多核形成に対する細胞周期調節因子の影響を機能的に評価するために、本発明者らは、異所性ＨＩＦ１αΔＯＤＤを発現する心筋細胞におけるＲｂ活性化の２つの重要な下流成分であるＣｃｎｄ１（サイクリンＤ１）及びＣｃｎｅ１（サイクリンＥ１）を不活性化した。証明されるとおり、Ｃｃｎｄ１及びＣｃｎｅ１の不活性化は、ＨＩＦ１α媒介核内有糸分裂、多核形成及び肥大を阻害した（図１９ａ〜ｆ）。対照的に、細胞周期阻害剤Ｃｄｋｎ１ｂ（ｐ２７／Ｋｉｐ１）の不活性化は、心筋細胞の核内有糸分裂、多核形成、及び病理学的成長を十分に誘導した（図１９ｇ〜ｋ）。まとめると、本発明者らは、心臓の核内倍加及び多核形成が、Ｅ２Ｆ１による細胞周期の活性化と同様に、（同定されたＨＩＦ１α−ＭＩＲ２７Ｂ−ＡＴＰ５Ａ１−ＭＴＨＦＤ１Ｌ軸によって促進されるとおりの）ｄｅ  ｎｏｖｏのプリン生合成の同時活性化を必要とすることを実証した。これは、Ａｔｐ５ａ１阻害と組み合わせたＭｔｈｆｄ１ｌの枯渇がＡＭＰＫ活性化及びＥ２Ｆ転写を十分に誘導したが（図６ｈ、ｉ、ｌ、ｍ）、心臓代謝核内倍加を誘導できなかった（図５ｂ、ｃ、ｊ、ｋ）という事実に反映される。
【００９７】
材料及び方法
動物の繁殖及び維持
Ｈｉｆ１α  ｆｌ／ｆｌマウスはＲａｎｄａｌｌ  Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ（カリフォルニア大学、サンディエゴ、米国）から入手し、Ｖｈｌ  ｆｌ／ｆｌマウスはＲｕｄｏｌｆ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ（マサチューセッツ工科大学、米国）から提供してもらった。ミオシン軽鎖（Ｍｌｃ）２ｖ−Ｃｒｅ（Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら、１９９８、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５、１９４３−１９４９）株は、Ｊｕ  Ｃｈｅｎ（カリフォルニア大学、サンディエゴ、米国）からであった。本明細書に記載されているそれぞれの心室特異的マウス系統は、ｌｏｘＰ隣接Ｈｉｆ１α（Ｈｉｆ１α  ｆｌ／ｆｌ）（Ｒｙａｎ，Ｈ．Ｅ．ら、２０００、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６０、４０１０−４０１５）又はＶｈｌ（Ｖｈｌ  ｆｌ／ｆｌ）（Ｈａａｓｅ，ＶＨ．ら、２００１、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９８、１５８３−１５８８）マウスを、ミオシン軽鎖Ｍｌｃ２ｖ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスと交配することによって生成した。提示されたデータは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの背景をもつ３〜２０週齢の雄のマウスを用いた研究を示す。３〜２０週間まで、発明者らは、動物実験の全期間を参照した。ＡＡＶ９ウイルスを３週齢のマウスに投与した。ＡＡＶ９ベクターは最大発現に達するまで約６〜１０週間の遅滞期があるため、図１ｋ、図２ｂ、ｋ及び図５ａ、ｉの実験概要に示すとおり、ＡＡＶ９投与後少なくとも９〜１１週にて手術を行い、１１週にて心臓を回収した。ＴＡＣ実験では、実験開始時のマウスは１０〜１２週齢であった。同様の年齢（＋／−１週間）のマウスのみを対応する実験で使用した。Ｍｌｃ２ｖ−ｃｒｅマウスを用いた実験では、同腹仔及び同様の週齢（＋／−１週間）のマウスを使用した。ベースライン心エコー検査マウスを無作為に群に割り当てた後、ＡＡＶ注射、ＬＮＡ送達、及び心エコー検査を盲検で実施した。ＴＡＣ手術を含む実験では、手術までベースライン心エコー検査に対して盲検で実験を維持した。すべてのマウスは、ＭＲＣクリニカルサイエンスセンター（インペリアルカレッジ  ロンドン）、分子健康科学研究所（ＥＴＨ  チューリッヒ）、及び／又はローザンヌ大学医学部、心臓血管評価施設（ＣＡＦ）にて、特異的な病原体のない施設で維持した。維持管理及び動物実験は、スイス連邦獣医局（ＢＶＥＴ）のガイドラインに従った。
【００９８】
ヒト及びマウスの心室生検
ヒト心臓の生検及び臨床データは、Ｓａｍｕｅｌ  Ｓｏｓｓａｌｌａ（ゲオルク・アウグスト大学ゲッティンゲン、及びＤＺＨＫ、ゲッティンゲン、ドイツ）及びＳｅｂａｓｔｉａｎ  Ｓｔｅｈｒ（ライプツィヒの大学病院、ドイツ）から惜しみなく提供された。ヒトＨＣＭ及び大動脈弁狭窄症の生検は、地域の倫理委員会に従って実施され、参加する前にすべての対象から書面によるインフォームドコンセントが得られた。心筋試料は、大動脈弁置換術及び肥大した左心室中隔からのモロー切除を受けている重度の大動脈弁狭窄症の患者から得られた。有意な大動脈弁逆流がなく、収縮機能が維持されている患者のみが含まれた。ＨＣＭ患者のヒト左心室生検は、外植心臓の左心室乳頭筋から得られた。心筋試料は、手術中に手術室で直接採取し、すぐに予冷された心筋保護液（１１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１６ｍＭ  ＫＣｌ、１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１１ｍＭ  グルコース）で洗浄した後、液体窒素中で素早く急速凍結した。健康な心臓試料は、ドナー心臓の左心室から得た。試料の重量は約２０〜１５０ｍｇであった。これらの主題に関する臨床データは、以前の出版物に示されている。
【００９９】
経大動脈バンディング
９〜１４週齢のマウスを、記載されるとおり（Ｋａｓｓｉｒｉ，Ｚ．ら、２００５、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、９７、３８０〜３９０）、下行大動脈の狭窄を介する経大動脈バンディング（ＴＡＣ）に供した。マウスは手術後９週間までモニターされ、心臓の寸法及び機能は心エコー検査によって測定した。図２ｋに記載されるとおり、ｉｎ  ｖｉｖｏのｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ  Ｐｏｗｅｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを、術後４９日にて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに１０ｍｇ／ｋｇの用量で４日間連続して腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。以下のｉｎ  ｖｉｖｏのｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ  Ｐｏｗｅｒ  ＩｎｈｉｂｉｔｏｒはＥｘｉｑｏｎから購入した：ｉ−ｍｍｕ−ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ（１９９９００）。ｉ−Ｃｅｌ−ｃｏｎｔｒｏｌ＿ｉｎｈ（１９９９００）をスクランブル対照ＬＮＡとして使用した。
【０１００】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの経胸腔超音波画像化
経胸壁心エコー検査は、Ｖｅｖｏ２１００カラードップラー超音波装置（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ）のＭＳ４００（１８〜３８ＭＨｚ）プローブを使用して実施した。マウスを１〜１．５％のイソフルランで軽く麻酔し、心拍数を毎分４００〜５５０拍に維持した。マウスは、体温を維持するために、加熱された３７℃のプラットフォーム上の臥位背側に置かれた。局所除毛剤を使用して毛を除去し、超音波ゲルをトランスデューサーと皮膚の間の結合媒体として使用した。心臓は、胸骨傍の長軸ビューで、２Ｄモードで画像化した。このビューから、Ｍモードカーソルを、乳頭筋のレベルで、左心室中隔及び心室の後壁に垂直に配置した。拡張期及び収縮期の心室中隔の直径（ＩＶＳ；ｄ及びＩＶＳ；ｓ）、拡張期及び収縮期の左心室後壁の直径（ＬＶＰＷ；ｄ及びＬＶＰＷ；ｓ）、及び左心室の内部拡張末期及び収縮末期のチャンバー（ＬＶＩＤ；ｄ及びＬＶＩＤ；ｓ）の寸法を測定した。測定は、３つの別々のＭモード画像で行われ、平均化した。左心室短縮率（％ＦＳ）及び駆出率（％ＥＦ）も計算した。短縮率を、左心室の拡張末期及び収縮末期の直径の変化率に基づいて、Ｍモードから評価した。％ＥＦは、（ＬＶ体積；ｄ−ＬＶ体積；ｓ）／ＬＶ体積；ｄ×１００の式から導出される。実験の期間の終了時に、動物を殺処理し、心臓重量と体重の比率を測定した。
【０１０１】
初代新生児ラット心筋細胞の単離及び維持
初代新生児ラット心筋細胞（ＮＲＣ）の分離は、新生児心臓解離キット（１３０−０９８−３７３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して製造元の推奨に従って実行した。単離された細胞は、線維芽細胞を枯渇させるために１．５時間、プレーティング培地（６５％のＤＭＥＭ、１６％のＭ１９９、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、５％のウマ血清（ＨＳ）、２％のグルタミン及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ））を使用して前プレーティングした。ＮＲＣは、プレーティング培地におけるＩ型コラーゲンコーティング（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ）３ｃｍディッシュ（Ｎｕｎｃ）にプレーティングした。ＮＲＣの単離の２４時間後に、このプレーティング培地を維持培地（８８％のＤＭＥＭ、９％のＭ１９９、１％のＨＳ、２％のグルタミン、及び１％のＰ／Ｓ）に交換した。心筋細胞を３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニン（Ｔ３、Ｔ５５１６、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で１５ｎＭの濃度で６日間治療した。ＮＲＣを、１０μＭの濃度にて外因性ＡＤＰ（Ａ２７５４、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で３日間刺激した。オリゴマイシンＡ（７５３５１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＡＭＰＫ阻害剤化合物Ｃ（ＣＣ；１７１２６０、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、それぞれ２０ｎＭの濃度で２日間にて、及び５μＭの濃度で２４時間にて適用した。ＮＲＣは、単離の翌日に治療のために無作為に選択した。
【０１０２】
成体マウスの心筋細胞の単離
成体マウスの心臓の左心室を１ｍｍ３に切断し、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳで２時間固定化した。この生検は、回転させながら、ＨＢＳＳ中の１０００ＵのコラゲナーゼＩＩ型（１７１０１−０１５、Ｇｉｂｃｏ）で３７℃にて約４２時間消化させた。適切な濃度の単離された成体心筋細胞を、サイトスピン（ＳＣＡ−００３０、Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）を使用して、ゼラチンコーティングされた顕微鏡スライド上で、６００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０１０３】
ヒト心筋細胞の培養
ヒト人工多能性幹細胞由来のヒト心筋細胞（ｉＰＳＣ−ＣＭ）は、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＣＭＣ−１００−０１０−００１）から購入し、製造元の推奨に従って培養した。これらの細胞は、線条により明らかであるとおり、明確なサルコメア組織を示している。さらに、この細胞は増殖せず、そして継代できないために、最終的に分化する。遺伝子発現解析により、ｉＰＳＣ−ＣＭは２００を超える心臓遺伝子を発現し、その中でαアクチニン及び心臓トロポニンＴが発現し、その発現プロファイルは成体心臓組織に類似していることが示された。細胞は解凍後２４〜４８時間後に自発的に拍動し始め、同期して拍動する電気的に接続された合胞体層を形成した。細胞が同期して拍動する合胞体を形成した場合、細胞は研究に適していると見なした。培養の６〜７日後にレンチウイルスによる形質導入のために細胞を無作為に選択し、１０日に実験を行った。
【０１０４】
ミトコンドリアの単離
ミトコンドリアは、培養細胞用ミトコンドリア単離キット（ａｂ１１０１７１、Ａｂｅａｍ）を使用して単離した。簡潔には、６ｃｍディッシュごとに１．２×１０６個のＮＲＣを播種し、細胞をこすり取って収集した。細胞膜を弱めるための凍結解凍のステップの後に、この細胞を試薬Ａに５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。この細胞をＤｏｕｎｃｅホモジナイザーで、３０ストロークで均質化し、１０００ｇで１０分間４℃にて遠心分離した。ペレットを試薬Ａに使用したのと同じ量の試薬Ｂに再懸濁し、破裂と遠心分離とを繰り返した。２回の遠心分離ステップ後の上清を合わせ、１２０００ｇで１５分間４℃にて遠心分離した。ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を添加した８０μＬの試薬Ｃに再懸濁し、−８０℃で保存した。ミトコンドリアＡＤＰ：ＡＴＰの定量化は、ＥｎｚｙＬｉｇｈｔ  ＡＤＰ／ＡＴＰ比率アッセイキット（ＥＬＤＴ−１００、Ｂｉｏアッセイシステムｓ）を使用して製造元の推奨に従って実施した。
【０１０５】
レンチウイルスの生産及び感染
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション試薬で８０〜９０％のコンフルエンスにてトランスフェクトした。１０μｇの導入遺伝子、７．５μｇのｐＭＤ２．Ｇ及び６．５μｇのｐｓＰＡＸ２を、１０ｃｍディッシュあたり２ｍｌの無血清ＤＭＥＭ及び４５μｇのＰＥＩと混合した。室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートした後、０．５％のＦＣＳ及びＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭにて培養した細胞にＤＮＡ／ＰＥＩ複合体をゆっくりと加えた。トランスフェクションの４時間後に培地をＮＲＣ維持培地に交換した。トランスフェクションの４８時間後にレンチウイルスを回収し、−８０℃で保存した。ＮＲＣは、単離の２０時間後に感染させ、３７℃／５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。
【０１０６】
ＡＡＶ９コンストラクト
アデノ随伴ウイルスコンストラクトを生成するために、Ｍｔｈｆｄ１ｌを標的とするｓｈＲＮＡを、Ｕ６プロモーター誘導型ｓｈＲＮＡ発現をＣｒｅ依存様式に制御するｐＳｉｃｏベクターにクローニングした。Ｍｔｈｆｄ１ｌを標的とするｓｈＲＮＡは、オンラインソフトウェアｐＳｉｃｏ  Ｏｌｉｇｏｍａｋｅｒ（ＭＩＴ、バージョン１．５）を使用して設計した。以下のｓｈＲＮＡ配列を用いた：ＡＡＶ９−ｆｌ／ｆｌ−ｓｈＭｔｈｆｄ１ｌ，
センス（配列番号００３）：
ＴＧＡＡＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＧＡＡＴＴＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡＣＣＡＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣ
アンチセンス（配列番号００４）：
ＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＧＡＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＡＡＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡＣＣＡＴＴＣＡ
【０１０７】
Ｃｒｅ媒介組換え及びｓｈＭｔｈｆｄ１ｌ発現の活性化を誘導するＡｄｅｎｏ−Ｃｒｅ（カタログ番号ＡＤＶ−００５、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）発現を使用してｓｈＲＮＡのノックダウン効率をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検証した後、ｐＳｉｃｏコンストラクトのＵ６プロモーター、ｓｈＲＮＡ、ＴＡＴＡ−ｌｏｘ部位を有する領域を増幅し、Ｎｈｅｌ／Ｘｈｏｌ線形ＡＡＶ−ｂＧＨ（＋）ベクターにライゲーションした。他のすべてのウイルスは、標的化遺伝子導入によって設計及び遺伝子操作した。ＡＡＶ９ウイルスを、３週齢のＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ−及びＭｌｃ２ｖ−ｃｒｅ＋のマウスの尾静脈に、体重１ｋｇあたり１．２×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）の濃度で注射した。
【０１０８】
ロック核酸（ＬＮＡ）、ｍｉＲＮＡミミック及びｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ投与
ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ  Ｐｏｗｅｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを、最終濃度５０ｎＭで細胞培養培地に直接添加し、新しいＬＮＡを２日おきに添加した。以下のｍｉＲＣＵＲＹＬＮＡ  Ｐｏｗｅｒ  ＩｎｈｉｂｉｔｏｒをＥｘｉｑｏｎから購入した：ｉ−ｍｍｕ−ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ（４１０１７１２−１０１）。陰性対照Ａ（１９９００６−１０１）を非標的化ＬＮＡとして使用した。
【０１０９】
ｍｉＲＩＤＩＡＮ  マイクロＲＮＡミミックは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＮＲＣにトランスフェクトした。９６ウェルプレートのウェルごとに、０．４μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を２５μＬのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。室温で５分のインキュベートの後、混合物を５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭに６．２５ｎＭ又は１２．５ｎＭのｍｉＲＮＡミミックを含有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに加え、室温で２０分間インキュベートして複合体を形成した。抗生物質を含まない１００μＬの培地で培養した細胞に５０μＬのこの複合体を加えた。トランスフェクションの４時間後に培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収した。以下のｍｉＲＩＤＩＡＮマイクロＲＮＡミミックをＤｈａｒｍａｃｏｎから購入した：ｍｍｕ−ｍｉＲ２７ｂ−３ｐ（Ｃ−３１０３８０−０５−０００５）、ｍｍｕ−ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ（Ｃ−３１０８１０−０１−０００５）。ｍｉＲＩＤＩＡＮマイクロＲＮＡミミック陰性対照＃１（ＣＮ−００１０００−０１）を陰性対照として使用した。
【０１１０】
ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、製造元が推奨するとおり、ｓｉＲＮＡを最終濃度５０ｎＭでＮＲＣにトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に遺伝子発現を分析した。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製の以下のＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡを使用した：Ｃｃｎｄ１（Ｌ−０８９２８５−０２−０００５）、Ｃｃｎｅ１（Ｌ−１０１５７５−０２−０００５）及びＣｄｋｎ１ｂ（Ｌ−０９０９３８−０２−０００５）。非標的化ｓｉＲＮＡプール（Ｄ−００１８１０−１０−０５）を対照として使用した。
【０１１１】
一過性トランスフェクション
ｐＣＭＶ６  ＭＴＨＦＤ１Ｌ（ＲＣ２２３０３４、Ｏｒｉｇｅｎｅ）又はｐＥＢＧ−ＡＭＰＫ１−３１２（＃２７６３２、ａｄｄｇｅｎｅ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造元の指示に従って、単離の２日後に初代新生児ラット心筋細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収して分析した。
【０１１２】
プラスミド構築
ｐＬｅｎｔｉ−ＨＩＦ１αΔＯＤＤピューロレンチウイルス発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ−ＨＩＦ１αΔＯＤＤ（４０１−６０３）プラスミド（Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９５、７９８７−７９９２）からのＨＩＦ１αΔＯＤＤ断片を以前に記載されているとおり、ｐＬｅｎｔｉ−ｐｇｋピューロベクターにサブクローニングすることによって生成した（Ｔｒｏｉｌｏ，Ａ．ら、２０１４、ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ、１５、７７−８５）。対応する対照として、ｐＬｅｎｔｉ−ｐｇｋピューロ空ベクターを使用した。ｍｉＲ２７ｂ過剰発現コンストラクトは、マウスゲノムＤＮＡからのｍｉｒ２７ｂ前駆体転写産物のいずれかの末端から１５８ｂｐの隣接配列及び前駆体ｍｉｒ２７ｂ配列の増幅によって生成した。この配列を、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌｌ制限部位を使用して、Ａ．Ｉｔｔｎｅｒ（ＥＴＨ  チューリッヒ）によって提供されたｐＬＫＯ．１ＣＭＶピューロコンストラクトにクローニングした。対照ベクターとして、空のｐＬＫＯ．１ＣＭＶピューロコンストラクトを使用した。
【０１１３】
ｍｉＲＮＡプロモーター−ルシフェラーゼコンストラクトの生成
ｍｉｒ２３ｂ、ｍｉｒ２４−１、及びｍｉｒ２７ｂのプロモーターの１．０キロバイト（ｋｂ）断片を、マウスゲノムＤＮＡから増幅し、Ｘｈｏｌ制限部位とＨｉｎｄｌｌｌ制限部位の間のｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。ｍｉｒ２７ｂプロモーターのＨＲＥの変異を、組換えＰＣＲによって生成した（Ｅｌｉｏｎ，Ｅ．Ａ．ら、２００７、ＣｕｒｒＰｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｐｔｅｒ３、Ｕｎｉｔ３  １７）。センス及びアンチセンスのプライマーは、ＨＲＥ変異を有するように設計され、それぞれｍｉｒ２７ｂプロモーターの変異体５’領域及び３’領域を増幅するために使用した。その後、それぞれのＰＣＲ反応から生成された５’産物及び３’産物を１：１の比率で混合し、プロモーターの５’末端及び３’末端を標的とするプライマーを使用して断片全体を増幅した。ｍｉｒ２７ｂプロモーターのＨＲＥの変異、及び野生型コンストラクトは、ＤＮＡシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ）によって確認した。
【０１１４】
Ａｔｐ５ａ１の３’ＵＴＲルシフェラーゼコンストラクトの生成
Ａｔｐ５ａ１の３’ＵＴＲは、マウスのｃＤＮＡから増幅され、ｐｍｉｒＧＬＯ  Ｄｕａｌ−ルシフェラーゼｍｉＲＮＡ標的発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。Ａｔｐ５ａ１の３’ＵＴＲ上のｍｉｒ２７ｂ結合部位の変異は、組換えＰＣＲによって生成した。センス及びアンチセンスのプライマーは、ｍｉｒ２７ｂ結合部位の変異を有して生成され、それぞれ３’ＵＴＲの変異体５’領域及び３’領域を増幅するために使用した。その後、それぞれのＰＣＲ反応から生成された５’産物及び３’産物を１：１の比率で混合し、Ａｔｐ５ａ１の３’ＵＴＲの５’末端及び３’末端を標的とするプライマーを使用して配列全体を増幅した。Ａｔｐ５ａ１の３’ＵＴＲのｍｉｒ２７ｂ結合部位の変異は、シーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ）によって確認した。
【０１１５】
Ｍｔｈｆｄ１ｌのｓｈＲＮＡノックダウン
Ｍｔｈｆｄ１ｌを標的とするｓｈＲＮＡは、オンラインソフトウェアＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉデザイナー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して設計され、ＢＬＡＳＴを使用してラットゲノムと比較した。ｓｈＲＮＡをｐＬＫＯ．１ベクターにクローニングした。センス及びアンチセンスのオリゴマーをアニーリング緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．４）に２０μＭの濃度で再懸濁した。５μＬのセンス及びアンチセンスのオリゴマーを混合し、沸騰水を入れたビーカー内でそれをインキュベートし、室温まで冷却することによりアニーリングした。アニーリングしたオリゴマーを、Ａｇｅｌ制限部位とＥｃｏＲＩ制限部位の間にｐＬＫＯ．１ベクターにライゲーションした。５０ｎｇのベクター、２００ｎｇのアニーリングしたオリゴマー、１μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼを１μＬの１０×ライゲーション緩衝液と混合し、ＰＣＲグレードの水で最終容量を１０μＬにした。ライゲーション反応物を１６℃で一晩インキュベートし、２μＬのライゲーション反応物を熱ショック形質転換によって適格性のあるＳｔｂｌ３細菌へ形質転換した。コロニーを、Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨＩを使用する制限消化によってｓｈＲＮＡの挿入についてスクリーニングし、陽性クローンをＤＮＡシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ）によって確認した。
【０１１６】
レンチウイルス及び発現コンストラクト
レンチウイルスｓｈＲＮＡによるノックダウンには、以下のＴＲＣ  ｐＬＫＯ．１ｓｈＲＮＡベクターを使用した：Ａｔｐ５ａ１（ｓｈＡｔｐ５ａ１、ＴＲＣＮ０００００７６２３９）、Ｈｉｆ１α（ｓｈＨｉｆ１α、ＴＲＣＮ００００２３２２２０）及びＶｈｌ（ｓｈＶｈｌ、ＴＲＣＮ００００４３６０５２）。非サイレンシングｓｈＲＮＡ（ｎｓＲＮＡ；ＳＨＣ００２、Ｓｉｇｍａ）を含有するｐＬＫＯ．１ベクターを対照として使用した。ｐＬｅｎｔｉ  ＡＴＰ５Ａ１（ＲＣ２１４８４０Ｌ１）及びｐＣＭＶ６  ＭＴＨＦＤ１Ｌ（ＲＣ２２３０３４）のプラスミドはＯｒｉｇｅｎｅからであった。ｐＥＢＧ−ＡＭＰＫα１（１−３１２）はＲｅｕｂｅｎ  Ｓｈａｗから贈与された（Ａｄｄｇｅｎｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＃２７６３２）。
【０１１７】
ＲＮＡ単離、逆転写、及びｑＲＴ−ＰＣＲ
試料をＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において回収し、製造元の推奨に従って全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡ  ＥｃｏＤｒｙ  Ｐｒｅｍｉｘ（ランダムヘキサマー）キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３９５４５）を製造元の指示に従って使用して、７５０ｎｇのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）反応は、ｉＴａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１７２５１２１）を使用して製造元の推奨に従って設定し、ＰｉｋｏＲｅａｌリアルタイムＰＣＲ装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で実行した。Ｃｔ値は、ハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔ１に対して正規化した。ｑＲＴ−ＰＣＲプライマー配列を表６に示す。
【０１１８】
成熟ｍｉＲＮＡレベルを評価するために、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キット（４３６６５９６、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して製造元の推奨に従って１０ｎｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡに転写した。ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ２×ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（４３０４４３７、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を製造元の指示に従って使用し、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で実行した。Ｃｔ値は、ハウスキーピング遺伝子ｓｎｏＲＮＡ（ラット）又はｓｎｏＲＮＡ２０２（マウス）に対して正規化した。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製の以下のプライマーを使用した：ｍｉＲ２３ｂ−３ｐ（ＩＤ０００４００）、ｍｉＲ２３ｂ−５ｐ（ＩＤ２４３６８０＿ｍａｔ）ｍｉＲ２４−３ｐ（ＩＤ０００４０２）、ｍｉＲ２４−５ｐ（ＩＤ０００４８８）、ｍｉＲ２７ｂ−３ｐ（ＩＤ０００４０９）、ｍｉＲ２７ｂ−５ｐ（ＩＤ００２１７４）、ｓｎｏＲＮＡ（ＩＤ００１７１８）及びｓｎｏＲＮＡ２０２（ＩＤ００１２３２）。
【０１１９】
ＰＣＲ
ＢＬ／６Ｎ及びＢＬ／６ＪのマウスにおけるＮｎｔ転写物の完全性を評価するために、前述のとおり心臓のｃＤＮＡを使用してＰＣＲを実施した（Ｈｕａｎｇ，Ｔ．Ｔ．ら、２００６、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、１５、１１８７−１１９４）。
【０１２０】
クロマチン免疫沈降
ＣｈＩＰアッセイは、ＮＲＣからの成分で実行し、アッセイはＣｈＩＰ−ＩＴキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）を使用して製造元の指示に従って実行し、ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＣｈＩＰは、Ｈｉｆ１αに対するＣｈＩＰグレードの抗体（マウス、ａｂ１、Ａｂｅａｍ）を使用して実行した。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのプロモーターの分析及びアライメントは、Ｍａｔｌｎｓｐｅｃｔｏｒ及びＤｉＡｌｉｇｎＴＦ（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ）を使用して実行した。ＣｈＩＰのｍｉｒ２７ｂについて使用されたプライマー配列は、５’−ＧＣＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＧＴＧＡＣＴＴＧＡＧ−３’（配列番号００６）及び５’−ＣＣＴＣＴＧＴＴＣＴＣＣＡＡＡＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号００７）であった。
【０１２１】
マイクロＲＮＡマイクロアレイ
マイクロＲＮＡマイクロアレイは、それぞれ、Ｖｈｌ  ｃＫＯマウスの３つの生物学的複製及び３つの対照マウス（Ｖｈｌ  ｆｌ／ｆｌ）、並びにＴＡＣを受けたＨｉｆ１α  ｃＫＯマウスの３つの生物学的複製及びＴＡＣ手術を受けた３つの対照（ＴＡＣ  Ｈｉｆ１αｆｌ／ｆｌ）で実行した。心臓の寸法及び機能は、心エコー検査によってすべてのマウスで確認した。全ＲＮＡを左心室から単離し、ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｐｏｗｅｒ標識キット（Ｅｘｉｑｏｎ）を使用してｍｉＲＮＡを標識化し、成熟ｍｉＲＮＡの逆相補配列を持つ１１９４のＤＮＡオリゴヌクレオチドをもつｍｉＲＮＡアレイ（ｍｉＲＸｐｌｏｒｅ）にハイブリダイズした。これらのアレイは、７２８のヒトｍｉＲＮＡ、５８４のマウスｍｉＲＮＡ、４２６のラットｍｉＲＮＡ、及び１２２のウイルスｍｉＲＮＡをカバーし、４組でアレイ上にそれぞれスポットされる。Ｃｙ５標識化ｍｉＲＮＡは、Ｃｙ３で同時に標識化されるｍｉＲＮＡの参照プールに対して正規化した。すべてのデータは、罹患動物と対照動物の間の対数値の比率として表され、ＧＳＥ６２４１８の下に蓄積される。
【０１２２】
ＮＡＤＰＨの定量化
３ｃｍディッシュのウェルごとに４×１０５個のＮＲＣを播種し、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ定量キット（ＭＡＫ０３８、Ｓｉｇｍａ）を使用してアッセイを実施した。データは、ブラッドフォードアッセイによって細胞溶解物中のタンパク質量に対して正規化した。
【０１２３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＴＰの定量化
ＡＴＰを、陰イオン交換カラム（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ４０００−７ＰＥＩ、５０／４、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社製）上で、２つの独立したＵＶ−可視分光計（島津製作所）を備えたＨＰＬＣシステムを使用して線形勾配（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中０〜１．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ８．０）で分離及び定量した。試料の溶出は２５９ｎｍ及び２２０ｎｍでモニターした。２２０ｎｍの波長を使用して、汚染物質の痕跡を検出した。
【０１２４】
ＡＤＰ及びＡＴＰアッセイ
ＡＤＰ／ＡＴＰ比率の分析について、３ｃｍディッシュのウェルごとに４×１０５個のＮＲＣを播種し、ＥｎｚｙＬｉｇｈｔ  ＡＤＰ／ＡＴＰ比率アッセイキット（ＥＬＤＴ−１００、Ｂｉｏアッセイシステムｓ）を使用して製造元の推奨に従ってアッセイを実施した。ＡＤＰ及びＡＴＰの定量化には、ＥｎｚｙＬｉｇｈｔ（商標）ＡＤＰアッセイキット（ＥＡＤＰ−１００、Ｂｉｏアッセイシステムｓ）及びＥｎｚｙＬｉｇｈｔＡＴＰアッセイキット（ＥＡＴＰ−１００、Ｂｉｏアッセイシステムｓ）を製造元の推奨に従ってそれぞれ使用した。シグナルはＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａプレートリーダー（ＢＭＧ）で測定した。ヒト及びマウスの心臓組織におけるＡＤＰ／ＡＴＰの定量化のために、ＡＤＰ／ＡＴＰ比率アッセイキット（ａｂ６５３１３、Ａｂｅａｍ）を使用して、わずかな変更を加えて製造元が推奨するとおりアッセイを実行した。簡潔には、採取直後に心臓組織を凍結し、液体窒素で保存した。この組織を乳鉢で粉末化し、溶解緩衝液（１０μｌ／ｍｇの組織粉末）に室温で５分間懸濁した。１００００ｇで１分間遠心分離した後、上清をアッセイに使用した。データは、ブラッドフォードアッセイによって上清中のタンパク質量に対して正規化した。
【０１２５】
ＡＴＰシンターゼの酵素活性アッセイ
３ｃｍディッシュあたりに４×１０５個の細胞を播種した。トリプシン処理、続いて１．２ｋｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞を回収した。ペレットをＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１回洗浄し、１．２ｋｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットを１００μｌのＰＢＳに再懸濁し、−８０℃で凍結し、製造元の推奨に従ってＡＴＰシンターゼ酵素活性アッセイキット（ａｂ１０９７１４、Ａｂｅａｍ）を使用して試料の調製を継続した。ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、３４０ｎｍ及び３０℃で、１分間隔で３時間、吸光度を測定した。ＡＴＰシンターゼ活性はタンパク質濃度に対して正規化した。
【０１２６】
ルシフェラーゼアッセイ
４×１０４個のＮＲＣを白色９６ウェルプレートにプレーティングし、３日間培養した。４０ｎｇの野生型又は変異型ｐｍｉｒＧＬＯ  Ａｔｐ５ａ１  ３’ＵＴＲコンストラクトを、製造元の推奨に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、６．２５、１２．５、又は２５ｎＭの対照又はｍｉＲ２７ｂミミックで同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの２４時間後に、ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）で製造元の推奨のとおりＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。
【０１２７】
プロモーター活性を評価するために、２０ｎｇのｐＧＬ３ベクターに１．２５ｎｇのＲｅｎｉｌｌａ及び０〜２６０ｎｇのＨＩＦ１αΔＯＤＤを同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの３６時間後に、製造元が推奨するとおりＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。Ｅ２Ｆトランス活性の活性は、Ｃｉｇｎａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒアッセイキット（ＣＣＳ−００３Ｌ、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して製造元の指示に従って測定した。
【０１２８】
イムノブロッティング
心臓組織をブルーワンダー試料緩衝液（３．７Ｍ  尿素、１３４．６ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ６．８、５．４％（ｖ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２．３％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０、４．４５％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール、４％（ｖ／ｖ）グリセロール、６０ｍｇ／Ｌ  ブロムフェノールブルー）に溶解し、そしてタンパク質はＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ１０組織ホモジナイザー（ＩＫＡ）を使用して均質化した後、９５℃で５分間変性した。ＮＲＣを氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ブルーワンダー試料緩衝液において回収した。Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ５５１０超音波ウォーターバス（Ｂｒａｎｓｏｎ）を使用して試料を超音波処理して粘度を下げ、５分間煮沸した。短時間の遠心分離後、タンパク質溶解物を８％又は１０％のポリアクリルアミドミニゲル（Ｂｉｏｒａｄ）に充填し、ウェット転写によってニトロセルロースメンブレン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。メンブレンをＴＢＳＴ中の５％（ｗ／ｖ）粉乳（Ｂｉｏｒａｄ）にてブロックした後、ＴＢＳＴ中の５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にて希釈した一次抗体と室温で２時間、又は４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴ中の５％（ｗ／ｖ）乳粉で３回洗浄した後、メンブレンを１：５０００の希釈にて適切なＨＲＰ結合二次抗体（抗ヤギＩｇＧ  ＨＲＰ、６１−１６２０；抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ、６２−６５２０；抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ、６５−６１２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、１〜２時間インキュベートした。次いで、メンブレンを、ＴＢＳＴで３回洗浄し、その後化学発光を検出するためにＸ線ＲＸ  ＮＩＦフィルム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で検出した。シグナル強度は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（バージョン１．４７）を使用した濃度測定によって定量化した（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ａ．ら、２０１２、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、９、６７１−６７５）。以下の抗体をイムノブロッティングに使用した：抗αアクチン（Ａ７８１１、Ｓｉｇｍａ）、抗ＡＣＣ（３６７６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗リン酸化ＡＣＣ  Ｓｅｒ７９（１１８１８、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＡＭＰＫα（５８３２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗リン酸化ＡＭＲＫα  Ｔｈｒ１７２（２５３５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗Ａｔｐ５ａ１（ａｂ１４７４８、Ａｂｅａｍ）、抗心臓アクチン（６１０７５、Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ）、抗Ｈｉｆ１α（ＮＢ１００−４７９、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、メチル化リジン（ジメチル）（ａｂ２３３６６、Ａｂｅａｍ）、抗Ｍｔｈｆｄ１ｌ（ａｂ１１６６１５、Ａｂｅａｍ）、抗Ｒｂ（９３０９、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗リン酸化Ｒｂ  Ｓｅｒ８０７／８１１（８５１６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗Ｖｈｌ（２７３８、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及びＩｇＧアイソタイプ対照抗体（ａｂ１７１８７０）。
【０１２９】
共免疫沈降
条件ごとに０．５×１０７トランスフェクト（ｐＥＢＧ−ＡＭＰＫ１−３１２）又は形質導入（ＨＩＦ１αΔＯＤＤ−レンチウイルス）のＮＲＣをＴＮＮ細胞溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥｄＴＡ、０．５％  ＮＰ−４０、５０ｍＭ  ＮａＦ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭＤＴＴ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）に３０分間溶解した。磁気ダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を抗ＡＭＰＫα抗体又はＩｇＧ対照抗体（ａｂ１７１８７０）と室温で１０分間インキュベートした。次いで、ＡＭＰＫを４℃で３時間のインキュベーションにより細胞溶解物から免疫沈降させた（ＩｇＧ対照抗体（ａｂ１７１８７０））。最後に、６×レムリ緩衝液でビーズを５分間煮沸することにより反応を停止させた。試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、リン酸ＲｂＳｅｒ８００／８０４（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びリン酸ＡＭＰＫαＴｈｒ１７２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用してウエスタンブロット分析を実施した。
【０１３０】
免疫蛍光染色
以前に記載されるとおり免疫蛍光染色を行った（Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｊ．ら、２００９、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ、９、５１２−５２４）。４％のＰＦＡ／ＰＢＳでＮＲＣを固定化した後、２％（ｖ／ｖ）ＨＳで希釈した一次抗体とともに室温で１時間、細胞を透過処理及びインキュベートした。ＰＢＳで５分間、３回洗浄した後、細胞を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｄ１３０６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、０．１μｇ／ｍｌ）、ファロイジン５５５（Ａ３４０５５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗マウス（Ａ−１１００１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗マウス（Ａ−２１２３５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）二次抗体を用いて室温で１時間インキュベートした。成体心筋細胞については、スライドを一次抗体及び二次抗体とともに加湿チャンバー内で４℃で一晩インキュベートした。スライド及びディッシュは、ＰｒｏＬｏｎｇ褪色防止剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をスライドガラス（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に一滴垂らして装着した。このスライド／ディッシュを透明なマニキュアで固定し、乾燥させた。以下の一次抗体を使用した：サルコメアαアクチニン（Ａ７８１１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｋｉ６７（ａｂ１５５８０、Ａｂｃａｍ）及びリン酸化ヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）（０５−８１７、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）。蛍光画像は、ＳＰ５共焦点顕微鏡（ライカ）で２０倍の倍率を使用して取得した。細胞サイズは、ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｊ（バージョン１．４７）を使用して盲検で定量化した。
【０１３１】
免疫組織化学
心臓を最適切断温度（ＯＣＴ）化合物に包埋し、１０μｍで断面化した。断面を４％のＰＦＡ／ＰＢＳで１０分間固定化し、ＰＢＳで２分間、２回洗浄した後、２％のＨＳ／ＰＢＳで１時間、室温でブロックした。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで１０分間透過処理した後、断面をＰＢＳで５分間、３回洗浄し、４℃にて加湿チャンバーにおいて一晩２％（ｖ／ｖ）ＨＳで希釈したサルコメアαアクチニンに対する一次抗体（Ａ７８１１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、１：８００）及びラミニンに対する一次抗体（ａｂ１１５７５、Ａｂｃａｍ、１：３００）とインキュベートした。ＰＢＳで１０分間３回洗浄した後、断面を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｄ１３０６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、０．１μｇ／ｍｌ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５抗マウス（Ａ−２１４２２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１：５００）及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８抗ウサギ（Ａ−１１０３４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１：５００）二次抗体とともに室温で２時間インキュベートした。断面をＰｒｏＬｏｎｇ褪色防止剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を一滴垂らして装着し、透明なマニキュアで固定し、乾燥させた。蛍光画像は、ＳＰ８共焦点顕微鏡（ライカ）で２０倍の倍率を使用して取得した。ｚ軸全体が画像化され、ｚスタック画像が約０．２μｍステップにより生成された。筋細胞あたりの核の数を決定するために、本発明者らは、それらの縦軸に沿って切断された筋細胞のみを含めた。細胞外マトリックス染色のラミニンに囲まれた核は分析から除外した。核の定量化は盲検で行われた。
【０１３２】
低温切開片は、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）又はピクロシリウスレッド（Ｓｉｇｍａ）で染色した。スライドは、Ｍｏｔｉｃａｍ３又はＡｘｉｏｓｃａｎ．Ｚ１スライドスキャナー（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を備えたＭｏｔｉｃ  ＡＥ２０００を使用して視覚化した。
【０１３３】
［３Ｈ］ロイシン取り込みアッセイ
［３Ｈ］ロイシン取り込みアッセイは、細胞成長の間接的な読み出しとしてｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質合成を測定するために使用した（Ｆｕｋｕｚａｗａ，Ｊ．ら、２０００、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、３５、１１９１−１１９６）。３ｃｍディッシュあたりに４×１０５個の細胞を播種した。３日後、細胞を一晩、血清飢餓状態にした。翌日、細胞を、ロイシンを含まない培地で４時間培養した後、標識化Ｌ−［４，５−３Ｈ（Ｎ）］イソロイシン（比放射能３０〜６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＡＲＴ０２３３、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含有する維持培地で、０．５μＣｉ／ｍＬの濃度で２０時間培養した。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、液体シンチレーションアナライザーＴｒｉ−Ｃａｒｂ２８００ＴＲ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で５分間放射能を測定した。トリプシン処理後、細胞をノイバウアーチャンバーで盲検化して計測し、シンチレーションカウントを絶対細胞数に正規化した。
【０１３４】
核酸取り込みアッセイ
３ｃｍディッシュあたりに４×１０５個の細胞を播種した。４日後、細胞は１．５時間のグルコース、かつ３時間のセリン又はグリシンの飢餓状態にした。放射性標識グルコース取り込みについて、細胞を、１μＣｉ／ｍＬの均一に標識化された［Ｕ−１４Ｃ］グルコース（比放射能２５０〜３６０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＣ０４２Ｖ２５０ＵＣ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を含有するグルコースなしＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で４時間インキュベートした。放射性標識セリンの取り込みについて、心筋細胞を、ＭＥＭビタミン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充され、そして０．６μＣｉ／ｍＬの炭素３での放射性標識セリン（［３−１４Ｃ］セリン、比放射能５０〜６２ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＣ８２７０５０ＵＣ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を含有するＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において一晩インキュベートした。放射性標識グリシン取り込みについては、細胞を１μＣｉ／ｍＬの均一に放射性標識グリシン（［１４Ｃ（Ｕ）］グリシン（比放射能＞１００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＣ２７６Ｅ２５０ＵＣ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を含有するＢＭＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、細胞をＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において回収し、製造元の推奨に従って核酸を単離した。単離した核酸を、４ｍＬの液体シンチレーションカクテルＵｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を含有するシンチレーションバイアルに移し、液体シンチレーションアナライザーＴｒｉ−Ｃａｒｂ２８００ＴＲ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で５分間放射能を測定した。シンチレーションカウントは、絶対核酸量に正規化した。
【０１３５】
脂肪酸の酸化
［１−１４Ｃ］−パルミチン酸（ＮＥＣ０７５Ｈ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用する動物組織の脂肪酸酸化速度は、反応ごとに０．７％ＢＳＡ／５００μＭパルミチン酸／２μＣｉ１４Ｃ−パルミチン酸を使用したことを除いて以前に記載されるとおり決定した（Ｈｕｙｎｈ，Ｆ．Ｋ．ら、２０１４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、５４２，３９１−４０５）。液体シンチレーションアナライザーＴｒｉ−Ｃａｒｂ２８００ＴＲ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において５分間放射能を測定した。シンチレーションカウントはタンパク質量に対して正規化した。
【０１３６】
フローサイトメトリー
１×１０６個のＮＲＣを６ｃｍディッシュ（Ｎｕｎｃ）にプレーティングし、４〜６日後にトリプシン処理によって細胞を回収した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、８０ｇで５分間遠心分離した。細胞を５００μＬのＰＢＳに再懸濁し、５ｍＬの７０％（ｖ／ｖ）冷エタノール（−２０℃にて保存）を直ちに添加した。固定化した細胞を４℃で１週間まで保存した。フローサイトメトリー分析の前に、細胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄した。８０ｇで５分間遠心分離した後、細胞を４０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅを含有する５００μＬのヨウ化プロピジウム溶液（３８ｍＭ  クエン酸ナトリウム中の６９μＭ  ヨウ化プロピジウム、ｐＨ  ７．４）に再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。試料を、フローサイトメトリーデータの代表的な画像を取得するために、蛍光画像取得と組み合わせたフローサイトメーターであるＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（Ａｍｎｉｓ）で実行した。多核化は、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ画像から定量化した。
【０１３７】
ギ酸塩アッセイ
４×１０５個の細胞を３ｃｍディッシュあたりに播種し、ギ酸塩アッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を用いてアッセイを行った。細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、細胞をこすり取ることで２５μＬのギ酸塩アッセイ緩衝液中に回収した。１５０００ｇ、４℃で５分間遠心分離した後、２０μＬの溶解物を５μＬのギ酸塩アッセイ緩衝液と混合し、９６ウェルプレートに添加した。２３μＬのギ酸アッセイ緩衝液、１μＬのギ酸酵素ミックス及び１μＬのギ酸基質ミックスからなる２５μＬの反応ミックスを、溶解物を含有するプレートに加えた。試料を３７℃で１時間インキュベートし（光から保護して）、ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）で４５０ｎｍにて吸光度を測定した。データはタンパク質濃度に正規化した。
【０１３８】
メタボロミクス
３ｃｍディッシュあたり４×１０５個のＮＲＣを培養した。細胞を酢酸でｐＨ７．４に調整した７５ｍＭの炭酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ）で洗浄した後、全細胞培養プレートを液体窒素で急速凍結した。代謝物は、アセトニトリル：メタノール：水を４０：４０：２０の比率で含有する冷抽出緩衝液（−２０℃）で抽出した。以前に記載されたとおりフローインジェクション飛行時間型質量分析による代謝物の非標的分析を行った（Ｆｕｈｒｅｒ，Ｔ．ら、２０１１、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、８３，７０７４−７０８０）。データはＭａｔｌａｂで処理及び分析した。メタボロンにより行われたメタボロミクス解析（図１２ｄ）は、以前に記載されたとおり行った（Ｃｉｍｅｎ，Ｉ．ら、２０１６、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、８、３５８ｒａ１２６）。
【０１３９】
リピドミクス
マウスの心臓試料を、ウルトラツラックスホモジナイザーを使用して、氷上で重炭酸アンモニウム緩衝液（１５０ｍＭの重炭酸アンモニウム、ｐＨ  ７）中で均質化した。タンパク質含有量は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して評価した。質量分析のために、２０μｇのタンパク質の等価重量を採取した。質量分析に基づく脂質分析は、記載のとおりＬｉｐｏｔｙｐｅ  ＧｍｂＨ（ドレスデン、ドイツ）によって実施した（Ｓａｍｐａｉｏ，Ｊ．Ｌ．ら、２０１１、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０８、１９０３−１９０７）。脂質は、２段階のクロロホルム／メタノール手順を使用して抽出した（Ｅｊｓｉｎｇ，Ｃ．Ｓ．ら、２００９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０６、２１３６−２１４１）。試料に、以下を含む内部脂質標準混合物を添加した：カルジオリピン１６：１／１５：０／１５：０／１５：０（ＣＬ）、セラミド１８：１；２／１７：０（Ｃｅｒ）、ヘキソシルセラミド１８：１；２／１２：０（ＨｅｘＣｅｒ）、リゾホスファチジン酸塩１７：０（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルコリン１２：０（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルエタノールアミン１７：１（ＬＰＥ）、リゾホスファチジルグリセロール１７：１（ＬＰＧ）、リゾホスファチジルイノシトール１７：１（ＬＰＩ）、リゾホスファチジルセリン１７：１（ＬＰＳ）、ホスファチジン酸塩１７：０／１７：０（ＰＡ）、ホスファチジルコリン１７：０／１７：０（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン１７：０／１７：０（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール１７：０／１７：０（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール１６：０／１６：０（ＰＩ）、ホスファチジルセリン１７：０／１７：０（ＰＳ）、コレステロールエステル２０：０（ＣＥ）、スフィンゴミエリン１８：１；２／１２：０；０（ＳＭ）、コレステロールＤ６（Ｃｈｏｌ）（すべてＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、トリアシルグリセロール１７：０／１７：０／１７：０（ＴＡＧ）及びジアシルグリセロール１７：０／１７：０（ＤＡＧ）（両方ともＬａｒｏｄａｎ  ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）。抽出後、有機相を注入プレートに移し、高速真空濃縮器において乾燥させた。第１段階の乾燥抽出物をクロロホルム／メタノール／プロパノール（１：２：４、Ｖ：Ｖ：Ｖ）中の７．５ｍＭの酢酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ）に、第２段階の乾燥抽出物をクロロホルム／メタノール（０．００３：５：１；Ｖ：Ｖ：Ｖ）中のメチルアミンの３３％エタノール溶液中に再懸濁した（すべての液体はＶＷＲから入手したＬＣグレードであった）。すべての液体処理ステップは、有機溶媒ピペッティング用の飛沫防止制御機能を備えたハミルトンロボティクスＳＴＡＲｌｅｔロボットプラットフォームを使用して実行した。
【０１４０】
試料は、ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅイオン源（Ａｄｖｉｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＱＥｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に直接注入して分析した。試料は、ＭＳについてＲｍ／ｚ＝２００＝２８００００、ＭＳＭＳ実験についてＲｍ／ｚ＝２００＝１７５００の分解能で、正イオンモードと負イオンモードの両方で１回の取得で分析した。ＭＳＭＳは、１Ｄａ刻みでスキャンされた対応するＭＳ質量範囲を包含する包含リストによって始動させた。ＭＳとＭＳＭＳの両方のデータを組み合わせて、ＣＥ、ＤＡＧ、及びＴＡＧのイオンをアンモニウム付加物として；ＰＣ、ＰＣ  Ｏ−を酢酸付加物として；かつＣＬ、ＰＡ、ＰＥ、ＰＥ  Ｏ−、ＰＧ、ＰＩ及びＰＳを脱プロトン化された陰イオンとしてモニターした。ＭＳのみは、ＬＰＡ、ＬＰＥ、ＬＰＥ  Ｏ−、ＬＰＩ、及びＬＰＳを脱プロトン化陰イオンとして；Ｃｅｒ、ＨｅｘＣｅｒ、ＳＭ、ＬＰＣ及びＬＰＣＯ−を酢酸付加物として、及びコレステロールをアセチル化誘導体のアンモニウム付加物としてモニターした。
【０１４１】
ＬｉｐｉｄＸｐｌｏｒｅｒに基づく脂質同定ソフトウェア（Ｈｅｒｚｏｇ，Ｒ．ら、２０１２、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、７、ｅ２９８５１）（Ｈｅｒｚｏｇ，Ｒ．ら、２０１１、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ、１２、Ｒ８）を使用してデータを分析した。データの後処理及び正規化は、社内で開発されたデータ管理システムを使用して実行した。さらなるデータ分析のために、対応するブランク試料よりもシグナル対ノイズ比が＞５、かつシグナル強度が５倍高い脂質同定のみを考慮した。
【０１４２】
すべての下流分析は、生データ（ｐｉｃｏｍｏｌ）をｍｏｌ％に変換した後のｍｏｌ％変換データセット上のＲ１２３において実行した（各量をそれぞれの試料で検出された脂質の合計で割って１００をかける）。主成分分析（ＰＣＡ）は、特異値分解関数を使用して計算した。総炭素鎖長及び飽和のプロットは、同じ数の炭素原子（全長）又は同じ数の二重結合（飽和）を示すすべての脂質を共にグループ化し、試料の各コホートでの平均及び標準偏差を計算した結果である。平均間の差は、治療試料の平均から対照の平均を差し引くことによって各種について計算したが（参照を差し引いた治療）、｜０．３｜を超えるデルタを持つ脂質のみ補足成分において示される。有意性は、ノンパラメトリック検定Ｗｉｌｃｏｘｏｎを使用して計算し、多重比較の場合は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正後にｐ値を調整した。有意性はｐ＜０．０５に設定した。Ｒベース関数に加えて、以下のパッケージを使用した：ｆａｃｔｏｅｘｔｒａ（Ｋａｓｓａｍｂａｒａ，Ａ及びＭｕｎｄｔ，Ｆ．、２０１７、ｆａｃｔｏｅｘｔｒａ：Ｅｘｔｒａｃｔ  ａｎｄ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｅｓ）、ｒｅｓｈａｐｅ２（Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｈ．、２０１７、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、２１，１−２０）、及びｇｇｐｌｏｔ２（Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｈ．、２００９、ｇｇｐｌｏｔ２：Ｅｌｅｇａｎｔ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）。
【０１４３】
バイオインフォマティクス解析
Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏのプロモーター分析は、Ｍａｔｌｎｓｐｅｃｔｏｒ（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ）を使用して実行した。配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴアラインメント（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）を使用して実行した。ｓｈＲＮＡは、所有のアルゴリズム（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）によって設計した、又はｐＳｉｃｏ  Ｏｌｉｇｏｍａｋｅｒ（ＭＩＴ、バージョン１．５）、ＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して計算により予測した。ｍｉＲ２７ｂ標的を予測するために、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ｍｉＲａｎｄａ、及びＲＮＡ２２などの多くのデータベースを含むｍｉＲＷａｌｋ２．０データベース（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｗａｌｋ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ）を使用した（Ｄｗｅｅｐら、２０１１、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｉｎｆｏｒｍ、４４、８３９−８４７）。共焦点画像は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（バージョン１．４７）（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ａ．ら、２０１２、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９、６７１−６７５）を使用して定量化した。
【図１ＡＢ】
2021529202.tif 000011
【図１ＣＤ】
2021529202.tif 000012
【図１ＥＦ】
2021529202.tif 000013
【図１Ｇ】
2021529202.tif 000014
【図１Ｈ】
2021529202.tif 000015
【図１Ｉ】
2021529202.tif 000016
【図１Ｊ】
2021529202.tif 000017
【図１Ｋ】
2021529202.tif 000018
【図１Ｌ】
2021529202.tif 000019
【図１Ｍ】
2021529202.tif 000020
【図１Ｎ】
2021529202.tif 000021
【図１Ｏ】
2021529202.tif 000022
【図１Ｐ】
2021529202.tif 000023
【図１Ｑ】
2021529202.tif 000024
【図１ＲＳ】
2021529202.tif 000025
【図２Ａ】
2021529202.tif 000026
【図２Ｂ】
2021529202.tif 000027
【図２Ｃ】
2021529202.tif 000028
【図２Ｄ】
2021529202.tif 000029
【図２ＥＦ】
2021529202.tif 000030
【図２Ｇ】
2021529202.tif 000031
【図２Ｈ】
2021529202.tif 000032
【図２Ｉ】
2021529202.tif 000033
【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２ＬＭ】
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【図２ＮＯＰ】
2021529202.tif 000037
【図２ＱＲＳＴ】
2021529202.tif 000038
【図２Ｕ】
2021529202.tif 000039
【図２Ｖ】
2021529202.tif 000040
【図２Ｗ】
2021529202.tif 000041
【図２Ｘ】
2021529202.tif 000042
【図３Ａ】
2021529202.tif 000043
【図３Ｂ】
2021529202.tif 000044
【図３Ｃ】
2021529202.tif 000045
【図３Ｄ】
2021529202.tif 000046
【図３Ｅ】
2021529202.tif 000047
【図４ＡＢＣＤＥＦ】
2021529202.tif 000048
【図４ＧＨＩ】
2021529202.tif 000049
【図５Ａ】
2021529202.tif 000050
【図５Ｂ】
2021529202.tif 000051
【図５Ｃ】
2021529202.tif 000052
【図５Ｄ】
2021529202.tif 000053
【図５Ｅ】
2021529202.tif 000054
【図５ＦＧ】
2021529202.tif 000055
【図５Ｈ】
2021529202.tif 000056
【図５Ｉ】
2021529202.tif 000057
【図５Ｊ】
2021529202.tif 000058
【図５Ｋ】
2021529202.tif 000059
【図５Ｌ】
2021529202.tif 000060
【図５Ｍ】
2021529202.tif 000061
【図５ＮＯ】
2021529202.tif 000062
【図５Ｐ】
2021529202.tif 000063
【図６Ａ】
2021529202.tif 000064
【図６Ｂ】
2021529202.tif 000065
【図６Ｃ】
2021529202.tif 000066
【図６Ｄ】
2021529202.tif 000067
【図６Ｅ】
2021529202.tif 000068
【図６Ｆ】
2021529202.tif 000069
【図６Ｇ】
2021529202.tif 000070
【図６Ｈ】
2021529202.tif 000071
【図６Ｉ】
2021529202.tif 000072
【図６Ｊ】
2021529202.tif 000073
【図６Ｋ】
2021529202.tif 000074
【図６Ｌ】
2021529202.tif 000075
【図６Ｍ】
2021529202.tif 000076
【図６Ｎ】
2021529202.tif 000077
【図６Ｏ】
2021529202.tif 000078
【図６Ｐ】
2021529202.tif 000079
【図６Ｑ】
2021529202.tif 000080
【図７ａ】
2021529202.tif 000081
【図７ｂ】
2021529202.tif 000082
【図７ｃ】
2021529202.tif 000083
【図７ｄ】
2021529202.tif 000084
【図７ｅ】
2021529202.tif 000085
【図７ｆ】
2021529202.tif 000086
【図７ｇ】
2021529202.tif 000087
【図７ｈｉ】
2021529202.tif 000088
【図７ｊ】
2021529202.tif 000089
【図８ａ】
2021529202.tif 000090
【図８ｂ】
2021529202.tif 000091
【図８ｃ】
2021529202.tif 000092
【図８ｄ】
2021529202.tif 000093
【図８ｅ】
2021529202.tif 000094
【図８ｆ】
2021529202.tif 000095
【図８ｇ】
2021529202.tif 000096
【図８ｈ】
2021529202.tif 000097
【図８ｉ】
2021529202.tif 000098
【図８ｊ】
2021529202.tif 000099
【図８ｋ】
2021529202.tif 000100
【図８ｌｍ】
2021529202.tif 000101
【図８ｎ】
2021529202.tif 000102
【図８ｏ】
2021529202.tif 000103
【図８ｐ】
2021529202.tif 000104
【図８ｑ】
2021529202.tif 000105
【図８ｒ】
2021529202.tif 000106
【図８ｓ】
2021529202.tif 000107
【図８ｔｕ】
2021529202.tif 000108
【図８ｖ】
2021529202.tif 000109
【図８ｗ】
2021529202.tif 000110
【図８ｘ】
2021529202.tif 000111
【図８ｙ】
2021529202.tif 000112
【図９ａｂ】
2021529202.tif 000113
【図９ｃ】
2021529202.tif 000114
【図９ｄｅ】
2021529202.tif 000115
【図９ｆｇ】
2021529202.tif 000116
【図９ｈ】
2021529202.tif 000117
【図９ｉ】
2021529202.tif 000118
【図９ｊ】
2021529202.tif 000119
【図９ｋｌｍ】
2021529202.tif 000120
【図９ｎｏｐ】
2021529202.tif 000121
【図９ｑ】
2021529202.tif 000122
【図９ｒｓｔ】
2021529202.tif 000123
【図９ｕ】
2021529202.tif 000124
【図９ｖ】
2021529202.tif 000125
【図９ｗ】
2021529202.tif 000126
【図９ｘ】
2021529202.tif 000127
【図９ｙ】
2021529202.tif 000128
【図９ｚ】
2021529202.tif 000129
【図１０ａ】
2021529202.tif 000130
【図１０ｂ】
2021529202.tif 000131
【図１０ｃ】
2021529202.tif 000132
【図１０ｄｅ】
2021529202.tif 000133
【図１０ｆ】
2021529202.tif 000134
【図１０ｇｈ】
2021529202.tif 000135
【図１０ｉ】
2021529202.tif 000136
【図１０ｊｋ】
2021529202.tif 000137
【図１０ｌ】
2021529202.tif 000138
【図１０ｍ】
2021529202.tif 000139
【図１０ｎｏ】
2021529202.tif 000140
【図１０ｐ】
2021529202.tif 000141
【図１１ａ】
2021529202.tif 000142
【図１１ｂ】
2021529202.tif 000143
【図１１ｃ】
2021529202.tif 000144
【図１１ｄ】
2021529202.tif 000145
【図１１ｅ】
2021529202.tif 000146
【図１１ｆ】
2021529202.tif 000147
【図１１ｇ】
2021529202.tif 000148
【図１１ｈ】
2021529202.tif 000149
【図１１ｉ】
2021529202.tif 000150
【図１１ｊ】
2021529202.tif 000151
【図１１ｋ】
2021529202.tif 000152
【図１１ｌ】
2021529202.tif 000153
【図１１ｍ】
2021529202.tif 000154
【図１１ｎ】
2021529202.tif 000155
【図１２ａ】
2021529202.tif 000156
【図１２ｂ】
2021529202.tif 000157
【図１２ｃｄｅｆｇｈ】
2021529202.tif 000158
【図１３ａ】
2021529202.tif 000159
【図１３ｂ】
2021529202.tif 000160
【図１３ｃ】
2021529202.tif 000161
【図１３ｄ】
2021529202.tif 000162
【図１３ｅ】
2021529202.tif 000163
【図１４ａ】
2021529202.tif 000164
【図１４ｂ】
2021529202.tif 000165
【図１５ａ】
2021529202.tif 000166
【図１５ｂｃ】
2021529202.tif 000167
【図１５ｄ】
2021529202.tif 000168
【図１５ｅ】
2021529202.tif 000169
【図１５ｆ】
2021529202.tif 000170
【図１５ｇ】
2021529202.tif 000171
【図１５ｈ】
2021529202.tif 000172
【図１５ｉ】
2021529202.tif 000173
【図１６ａｂ】
2021529202.tif 000174
【図１６ｃｄ】
2021529202.tif 000175
【図１６ｅ】
2021529202.tif 000176
【図１６ｆ】
2021529202.tif 000177
【図１６ｇｈ】
2021529202.tif 000178
【図１６ｉｊ】
2021529202.tif 000179
【図１７ａｃ】
2021529202.tif 000180
【図１７ｂｄ】
2021529202.tif 000181
【図１７ｅ】
2021529202.tif 000182
【図１７ｆ】
2021529202.tif 000183
【図１７ｇｈ】
2021529202.tif 000184
【図１８ａ】
2021529202.tif 000185
【図１８ｂ】
2021529202.tif 000186
【図１８ｃｄ】
2021529202.tif 000187
【図１８ｅ】
2021529202.tif 000188
【図１８ｆ】
2021529202.tif 000189
【図１８ｇ】
2021529202.tif 000190
【図１８ｈ】
2021529202.tif 000191
【図１８ｉ】
2021529202.tif 000192
【図１８ｊ】
2021529202.tif 000193
【図１８ｋ】
2021529202.tif 000194
【図１８ｌ】
2021529202.tif 000195
【図１８ｍｎｏ】
2021529202.tif 000196
【図１８ｐ】
2021529202.tif 000197
【図１８ｑ】
2021529202.tif 000198
【図１９ａｂ】
2021529202.tif 000199
【図１９ｃ】
2021529202.tif 000200
【図１９ｄｅ】
2021529202.tif 000201
【図１９ｆ】
2021529202.tif 000202
【図１９ｇ】
2021529202.tif 000203
【図１９ｈ】
2021529202.tif 000204
【図１９ｉｊ】
2021529202.tif 000205
【図１９ｋ】
2021529202.tif 000206
【図２０ａ】
2021529202.tif 000207
【図２０ｂ】
2021529202.tif 000208
【図２０ｃ】
2021529202.tif 000209
【図２０ｄ】
2021529202.tif 000210
【図２０ｅｆｇｈｉｊ】
2021529202.tif 000211
【配列表】
2021529202000001.app
【国際調査報告】
2021529202.tif 000212
2021529202.tif 000213
2021529202.tif 000214
2021529202.tif 000215