(57)【要約】本発明は、がんを治療または予防するための組成物および方法を含む。態様は、がんを治療または予防するために内因性遺伝子の産物を増大させる遺伝子発現活性化システムを利用する細胞ベースおよびウイルスベクターベースのワクチンを含む。2021522188.tif 000235
2021522188.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの内因性遺伝子の発現を増大させるCRISPR活性化（CRISPRa）システムを含む組成物に細胞を接触させて、改変細胞を生じさせる工程と、
該改変細胞を含む組成物の治療有効量を対象に投与し、それにより、該対象におけるがんに対してワクチン接種する工程と
を含む、対象におけるがんに対してワクチン接種する方法。
【請求項２】
以下の工程を含む、その必要がある対象におけるがんを治療する方法：
少なくとも1つの内因性遺伝子の発現を増大させるCRISPRaシステムを含む組成物に細胞を接触させて、改変細胞を生じさせる工程、および
該改変細胞を含む組成物の治療有効量を該対象に投与し、それにより、該対象におけるがんを治療する工程。
【請求項３】
CRISPRaシステムがsgRNAライブラリーを含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
sgRNAライブラリーが、細胞中の少なくとも1つの内因性遺伝子を標的とする少なくとも1つのsgRNAを含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
CRISPRaシステムが、dCas9-VP64をコードする核酸と、MS2-p65-HSF1およびゲノムスケールレンチウイルスSAM CRISPRa sgRNAライブラリーをコードする核酸とを含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項６】
CRISPRaシステムが、dCas9-VP64をコードする核酸と、MS2-p65-HSF1をコードする核酸と、ゲノムスケールレンチウイルスSAM CRISPRa sgRNAライブラリーをコードする核酸とを含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項７】
細胞が、がん細胞株由来である、請求項1または2記載の方法。
【請求項８】
細胞が対象由来である、請求項1または2記載の方法。
【請求項９】
対象由来の細胞が、がん細胞である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
対象が哺乳動物である、請求項1または2記載の方法。
【請求項１１】
対象がヒトである、請求項1または2記載の方法。
【請求項１２】
組成物の治療有効量の投与が、単回用量、二回用量、三回用量、四回用量または複数回用量の処置を含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項１３】
対象への投与の前に、細胞において老化を誘導する物質に細胞を接触させる工程をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項１４】
細胞において老化を誘導する物質がマイトマイシンである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
がんが、乳がん、肺がん、膵臓がん、黒色腫、神経膠腫、肝細胞腫、結腸がん、膵臓がんおよび脳がんからなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項１６】
さらなる処置を施す工程をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項１７】
さらなる処置が、化学療法、放射線、外科手術、免疫チェックポイント阻害剤および免疫チェックポイント阻害（ICB）抗体からなる群より選択される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
免疫チェックポイント阻害剤がCTLA-4またはPD1を阻害する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
免疫チェックポイント阻害剤が、抗CTLA4抗体および抗PD1抗体からなる群より選択されるモノクローナル抗体である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
CRISPRaシステムが、AAVベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター中にある、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
AAVベクターが、AAV2、AAV8、AAV9、AAV-DJまたは他のAAV血清型である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
以下の工程を含む、その必要がある対象におけるがんに対してワクチン接種する方法：
該対象における少なくとも1つの内因性遺伝子の発現を増大させるCRISPRaシステムを含むベクターを含む組成物の治療有効量を該対象に投与し、それにより、該対象におけるがんに対してワクチン接種する工程。
【請求項２３】
以下の工程を含む、その必要がある対象におけるがんを治療する方法：
該対象における少なくとも1つの内因性遺伝子の発現を増大させるCRISPRaシステムを含むベクターを含む組成物の治療有効量を該対象に投与し、それにより、該対象におけるがんを治療する工程。
【請求項２４】
CRISPRaシステムが、AAVベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター中にある、請求項22または23記載の方法。
【請求項２５】
AAVベクターが、AAV2、AAV8、AAV9、AAV-DJまたは他のAAV血清型である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
CRISPRaシステムがsgRNAライブラリーを含む、請求項22または23記載の方法。
【請求項２７】
sgRNAライブラリーが、細胞中の複数の内因性遺伝子を標的とする複数のsgRNAを含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
CRISPRaシステムが、dCas9-VP64をコードする核酸と、MS2-p65-HSF1をコードする核酸と、ゲノムスケールレンチウイルスSAM CRISPRa sgRNAライブラリーとを含む、請求項22または23記載の方法。
【請求項２９】
CRISPRaシステムが、dCas9-VP64をコードする核酸と、MS2-p65-HSF1をコードする核酸と、ゲノムスケールレンチウイルスSAM CRISPRa sgRNAライブラリーをコードする核酸とを含む、請求項22または23記載の方法。
【請求項３０】
対象が哺乳動物である、請求項22記載の方法。
【請求項３１】
対象がヒトである、請求項22記載の方法。
【請求項３２】
組成物の治療有効量の投与が、単回用量、二回用量、三回用量、四回用量または複数回用量の処置を含む、請求項22または23記載の方法。
【請求項３３】
対象への投与の前に、細胞において老化を誘導する物質に細胞を接触させる工程をさらに含む、請求項22または23記載の方法。
【請求項３４】
細胞において老化を誘導する物質がマイトマイシンである、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
がんが、乳がん、肺がん、膵臓がん、黒色腫、神経膠腫、肝細胞腫、結腸がん、膵臓がんおよび脳がんからなる群より選択される、請求項23記載の方法。
【請求項３６】
さらなる処置を施す工程をさらに含む、請求項22または23記載の方法。
【請求項３７】
さらなる処置が、化学療法、放射線、外科手術、免疫チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント阻害（ICB）抗体からなる群より選択される、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
免疫チェックポイント阻害剤がCTLA-4もしくはPD1または他の免疫チェックポイント標的を阻害する、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
免疫チェックポイント阻害剤が、抗CTLA4抗体および抗PD1抗体からなる群より選択されるモノクローナル抗体である、請求項37記載の方法。
【請求項４０】
組成物の投与が腫瘍微小環境を変化させる、請求項23記載の方法。
【請求項４１】
組成物の投与が、定着した腫瘍に対する宿主免疫反応を増強する、請求項23記載の方法。
【請求項４２】
組成物が腫瘍内投与される、請求項23記載の方法。
【請求項４３】
以下の工程を含む、その必要がある対象におけるがんに対してワクチン接種する方法：
該対象からがん細胞を得、少なくとも1つの変異した内因性遺伝子を決定する工程、
該少なくとも1つの変異した内因性遺伝子に特異的なsgRNAライブラリーを含むCRISPRaシステムを設計する工程、
該CRISPRaシステムを含む組成物の治療有効量を該対象に投与し、それにより、該対象におけるがんに対してワクチン接種する工程。
【請求項４４】
以下の工程を含む、その必要がある対象におけるがんに対してワクチン接種する方法：
該対象からがん細胞を得、少なくとも1つの変異した内因性遺伝子を決定する工程、
該少なくとも1つの変異した内因性遺伝子に特異的なsgRNAライブラリーを含むCRISPRaシステムを設計する工程、
該少なくとも1つの変異した内因性遺伝子の発現を増大させるCRISPRaシステムを含む組成物に細胞を接触させて、改変細胞を生じさせる工程、
該改変細胞を含む組成物の治療有効量を該対象に投与し、それにより、該対象におけるがんに対してワクチン接種する工程。
【請求項４５】
以下の工程を含む、その必要がある対象におけるがんを治療する方法：
該対象からがん細胞を得、少なくとも1つの変異した内因性遺伝子を決定する工程、
該少なくとも1つの変異した内因性遺伝子に特異的なsgRNAライブラリーを含むCRISPRaシステムを設計する工程、
該CRISPRaシステムを含む組成物の治療有効量を該対象に投与し、それにより、該対象におけるがんを治療する工程。
【請求項４６】
以下の工程を含む、その必要がある対象におけるがんを治療する方法：
該対象からがん細胞を得、少なくとも1つの変異した内因性遺伝子を決定する工程、
該少なくとも1つの変異した内因性遺伝子に特異的なsgRNAライブラリーを含むCRISPRaシステムを設計する工程、
該少なくとも1つの変異した内因性遺伝子の発現を増大させる該CRISPRaシステムを含む組成物に細胞を接触させて、改変細胞を生じさせる工程、
該改変細胞を含む組成物の治療有効量を該対象に投与し、それにより、該対象における該がんを治療する工程。
【請求項４７】
前記細胞が、複数の変異した内因性遺伝子を含み、前記活性化システムが、該複数の変異した内因性遺伝子に特異的なsgRNAライブラリーを含み、かつ、該複数の変異した内因性遺伝子の発現を増大させる、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
対象特異的な変異した1つまたは複数の内因性遺伝子を決定する工程が、
がん細胞の全エクソームシーケンシングと、
対象由来の非がん細胞の全エクソームシーケンシングと、
該がん細胞からのシーケンシングデータを該非がん細胞からのシーケンシングデータと比較し、少なくとも1つの変異を決定し、それにより、該対象特異的な変異した1つまたは複数の内因性遺伝子を決定することと
を含む、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
変異が、一塩基多型（SNP）、挿入、欠失、フレームシフトおよび再編成からなる群より選択される、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
組成物がベクターを含む、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
CRISPRaシステムが、AAVベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター中にある、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
AAVベクターが、AAV2、AAV8、AAV9、AAV-DJまたは他のAAV血清型である、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
内因性遺伝子が、検出された体細胞変異を含む、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
sgRNAがカスタマイズされている、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
CRISPRaシステムが、dCas9-VP64をコードする核酸と、MS2-p65-HSF1およびゲノムスケールレンチウイルスCRISPRa sgRNAライブラリーをコードする核酸とを含む、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
CRISPRaシステムが、dCas9-VP64をコードする核酸と、MS2-p65-HSF1をコードする核酸と、ゲノムスケールレンチウイルスCRISPRa sgRNAライブラリーをコードする核酸とを含む、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
対象が哺乳動物である、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
対象がヒトである、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
組成物の治療有効量の投与が、単回用量、二回用量、三回用量、四回用量または複数回用量の処置を含む、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
対象への投与の前に、細胞において老化を誘導する物質に細胞を接触させる工程をさらに含む、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
細胞において老化を誘導する物質がマイトマイシンである、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
がんが、乳がん、肺がん、膵臓がん、黒色腫、神経膠腫、肝細胞腫、結腸がん、膵臓がんおよび脳がんからなる群より選択される、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項６３】
さらなる処置を施す工程をさらに含む、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項６４】
さらなる処置が、化学療法、放射線、外科手術、免疫チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント阻害（ICB）抗体および免疫療法からなる群より選択される、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
免疫チェックポイント阻害剤がCTLA-4もしくはPD1または他の免疫チェックポイント標的を阻害する、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
免疫チェックポイント阻害剤が、抗CTLA4抗体、抗PD1抗体および他の免疫チェックポイント標的からなる群より選択されるモノクローナル抗体である、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
組成物の投与が腫瘍微小環境を変化させる、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項６８】
組成物の投与が、定着した腫瘍に対する宿主免疫反応を増強する、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項６９】
複数の内因性遺伝子の発現を増大させるCRISPRaシステムを含む組成物に細胞を接触させて、改変細胞を生じさせる工程と、
該改変細胞を含む組成物の治療有効量を対象に投与し、それにより、抗腫瘍反応を生じさせる工程と
を含む、対象において抗腫瘍反応を生じさせる方法。
【請求項７０】
複数の内因性遺伝子の発現を増大させることができるCRISPRaシステムを含む改変細胞を含む、がんワクチンを含む組成物。
【請求項７１】
複数の内因性遺伝子の発現を増大させることができるCRISPRaシステムを含むAAVベクターを含む、組成物。
【請求項７２】
CRISPRaシステムがsgRNAライブラリーを含み、該sgRNAライブラリーが、SEQ ID NO: 1〜37からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、請求項70または71記載の組成物。
【請求項７３】
CRISPRaシステム中に2つのsgRNAカセットを含み、単一遺伝子フォーマットまたはプールフォーマットのいずれかで、第一のsgRNAカセットが、抗原提示機構の活性化のために使用され、第二のsgRNAカセットが、患者特異的な変異した内因性遺伝子の活性化のために使用される、ベクター。
【請求項７４】
SEQ ID NO: 38の核酸を含む、請求項73記載のベクター。
【請求項７５】
以下の工程を含む、その必要がある対象におけるがんを治療する方法：
該対象において少なくとも1つの抗原提示遺伝子の発現を増大させるCRISPRaシステムを含むベクターを含む組成物の治療有効量を該対象に投与し、それにより、該対象におけるがんを治療する工程。
【請求項７６】
CRISPRaシステムが、AAVベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター中にある、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
AAVベクターが、AAV2、AAV8、AAV9、AAV-DJまたは他のAAV血清型である、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
CRISPRaシステムがsgRNAライブラリーを含む、請求項75〜77のいずれか一項記載の方法。
【請求項７９】
sgRNAライブラリーが、細胞中の複数の抗原提示遺伝子を標的とする複数のsgRNAを含む、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
sgRNAの少なくとも1つが、SEQ ID NO: 23,886〜24,104からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項79記載の方法。
【請求項８１】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 23,886〜24,104からなるヌクレオチド配列を含む、請求項79記載の方法。
【請求項８２】
がんが、乳がん、肺がん、膵臓がん、黒色腫、神経膠腫、肝細胞腫、結腸がん、膵臓がんおよび脳がんからなる群より選択される、請求項75〜81のいずれか一項記載の方法。
【請求項８３】
さらなる処置を施す工程をさらに含む、請求項75〜82のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
さらなる処置が、化学療法、放射線、外科手術、免疫チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント阻害（ICB）抗体および免疫療法からなる群より選択される、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
免疫チェックポイント阻害剤がCTLA-4もしくはPD1または他の免疫チェックポイント標的を阻害する、請求項84記載の方法。
【請求項８６】
免疫チェックポイント阻害剤が、抗CTLA4抗体および抗PD1抗体からなる群より選択されるモノクローナル抗体である、請求項85記載の方法。
【請求項８７】
組成物の投与が腫瘍微小環境を変化させる、請求項75〜86のいずれか一項記載の方法。
【請求項８８】
組成物の投与が、定着した腫瘍に対する宿主免疫反応を増強する、請求項75〜87のいずれか一項記載の方法。
【請求項８９】
細胞中の複数の遺伝子を標的とする複数のsgRNAを含むsgRNAライブラリーを含む、組成物。
【請求項９０】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 23,886〜24,104からなる群より選択される少なくとも1つのsgRNAを含む、請求項89記載の組成物。
【請求項９１】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 23,886〜24,104からなるヌクレオチド配列を含む、請求項89記載の組成物。
【請求項９２】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 51〜259からなる群より選択される少なくとも1つのsgRNAを含む、請求項89記載の組成物。
【請求項９３】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 51〜259からなるヌクレオチド配列を含む、請求項89記載の組成物。
【請求項９４】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 260〜348からなる群より選択される少なくとも1つのsgRNAを含む、請求項89記載の組成物。
【請求項９５】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 260〜348からなるヌクレオチド配列を含む、請求項89記載の組成物。
【請求項９６】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 349〜4,187からなる群より選択される少なくとも1つのsgRNAを含む、請求項89記載の組成物。
【請求項９７】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 349〜4,187からなるヌクレオチド配列を含む、請求項89記載の組成物。
【請求項９８】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 4,188〜7,980からなる群より選択される少なくとも1つのsgRNAを含む、請求項89記載の組成物。
【請求項９９】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 4,188〜7,980からなるヌクレオチド配列を含む、請求項89記載の組成物。
【請求項１００】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 7,981〜11,808からなる群より選択される少なくとも1つのsgRNAを含む、請求項89記載の組成物。
【請求項１０１】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 7,981〜11,808からなるヌクレオチド配列を含む、請求項89記載の組成物。
【請求項１０２】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 11,809〜23,776からなる群より選択される少なくとも1つのsgRNAを含む、請求項89記載の組成物。
【請求項１０３】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 11,809〜23,776からなるヌクレオチド配列を含む、請求項89記載の組成物。
【請求項１０４】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 23,779〜23,885からなる群より選択される少なくとも1つのsgRNAを含む、請求項89記載の組成物。
【請求項１０５】
複数のsgRNAが、SEQ ID NO: 23,779〜23,885からなるヌクレオチド配列を含む、請求項89記載の組成物。
【請求項１０６】
sgRNAライブラリーがAAVベクター中にクローニングされかつパッケージングされる、請求項89〜105のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０７】
SEQ ID：NO 24,105の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項１０８】
SEQ ID NO: 24,106の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項１０９】
以下の工程を含む、その必要がある対象におけるがんを治療する方法：
CRISPRaシステムを含む第一のAAVベクターおよびdCas9を含む第二のAAVベクターに細胞を接触させる工程であって、
該CRISPRaシステムは、少なくとも1つの内因性遺伝子の発現を増大させて、改変細胞を生じさせる、
工程、ならびに
該改変細胞を含む組成物の治療有効量を該対象に投与し、それにより、該対象におけるがんを治療する工程。
【請求項１１０】
CRISPRaシステムが、複数のsgRNAを含むsgRNAライブラリーを含む、請求項109記載の方法。
【請求項１１１】
sgRNAライブラリーが、SEQ ID NO: 1〜37からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、請求項109記載の方法。
【請求項１１２】
sgRNAライブラリーが、SEQ ID NO: 51〜259からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、請求項109記載の方法。
【請求項１１３】
sgRNAライブラリーが、SEQ ID NO: 260〜348からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、請求項109記載の方法。
【請求項１１４】
sgRNAライブラリーが、SEQ ID NO: 349〜4,187からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、請求項109記載の方法。
【請求項１１５】
sgRNAライブラリーが、SEQ ID NO: 4,188〜7,980からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、請求項109記載の方法。
【請求項１１６】
sgRNAライブラリーが、SEQ ID NO: 7,981〜11,808からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、請求項109記載の方法。
【請求項１１７】
sgRNAライブラリーが、SEQ ID NO: 11,809〜23,776からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、請求項109記載の方法。
【請求項１１８】
sgRNAライブラリーが、SEQ ID NO: 23,779〜23,885からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、請求項109記載の方法。
【請求項１１９】
sgRNAライブラリーが、SEQ ID NO: 23,886〜24,104からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、請求項109記載の方法。
【請求項１２０】
sgRNAライブラリーが、SEQ ID NO: 23,886〜24,104からなるヌクレオチド配列を含む、請求項109記載の方法。
【請求項１２１】
第一のAAVベクターがSEQ ID NO: 38またはSEQ ID NO: 49の核酸配列を含む、請求項109記載の方法。
【請求項１２２】
第二のAAVベクターがSEQ ID NO: 24,105またはSEQ ID NO: 24,106の核酸配列を含む、請求項96記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C.§119(e）の下、全体として参照により本明細書に組み入れられる、2018年4月18日に出願された米国特許仮出願第62/659,543号および2018年10月10日に出願された米国特許仮出願第62/743,990号への優先権を有する。
【０００２】
連邦政府資金援助を受けた研究開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって付与されたCA238295、CA231112およびCA209992ならびにUnited States Army Medical Research and Material Commandによって付与されたW81XWH-17-1-0235の下、政府支援を受けて成されたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
免疫療法は、腫瘍に対する患者自身の免疫系を強化し、それにより、患者のサブセットにとって以前は致命的であったいくつかのがんを対処可能な疾患に変えることにより、がん治療を変革した。免疫療法の主なタイプとしては、チェックポイント阻害、養子細胞移入、ヒト組換えサイトカインおよびがんワクチンがある。抗原認識が抗腫瘍免疫反応における重要なプロセスであるが、過去数十年にわたり、クリニックにおけるがんワクチンを使用した成功例は限られている。従来のがんワクチンは、多くの場合、Sipuleucel-Tなどの樹状細胞ベースのワクチンである。ペプチドベースおよびRNAベースのワクチンの最近の進歩が、複数の変異したネオアンチゲンの標的指向型送達が強力な抗腫瘍効果を生み出して、後期黒色腫に対する効果的ながんワクチンの直接的な臨床エビデンスを提供することができることを示した。腫瘍細胞は、免疫原性である、変異した、部分的にトランケートされた、または増幅された遺伝子をコードすることが多い数多くの変異を宿している。しかし、これらの変異の多くは、効果的なT細胞媒介反応を誘発するのに十分なレベルでは発現しないおそれがある。これらのペプチドまたは転写物の合成は並行的なタンパク質合成またはRNA合成によって可能であるが、この手法のコストは、同定される変異の数に比例する。
【０００４】
効力、融通性および費用有効性を維持しながら、がん抗原に対する強力かつ耐久性の高い特異的な免疫反応を誘発することができる新たなタイプのがんワクチンの必要性がある。本発明はこの必要性を満足させる。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書に記載されるように、本発明は、CRISPRaシステムによる内因性遺伝子の多重活性化によってがんに対して治療またはワクチン接種するための組成物および方法に関する。
【０００６】
1つの局面において、本発明は、対象におけるがんに対してワクチン接種する方法を含む。方法は、少なくとも1つの内因性遺伝子の発現を増大させるCRISPR活性化（CRISPRa）システムを含む組成物に細胞を接触させて、改変細胞を生じさせる工程を含む。改変細胞を含む組成物の治療有効量を対象に投与し、それにより、対象におけるがんに対してワクチン接種する。
【０００７】
別の局面において、本発明は、その必要がある対象におけるがんを治療する方法を含む。方法は、少なくとも1つの内因性遺伝子の発現を増大させるCRISPRaシステムを含む組成物に細胞を接触させて、改変細胞を生じさせる工程を含む。改変細胞を含む組成物の治療有効量を対象に投与し、それにより、対象におけるがんを治療する。
【０００８】
さらに別の局面において、本発明は、その必要がある対象におけるがんに対してワクチン接種する方法を含む。方法は、CRISPRaシステムを含むベクターを含む組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含む。CRISPRaシステムは、対象における少なくとも1つの内因性遺伝子の発現を増大させ、それにより、対象におけるがんに対してワクチン接種する。
【０００９】
さらに別の局面において、本発明は、その必要がある対象におけるがんを治療する方法を含む。方法は、CRISPRaシステムを含むベクターを含む組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含む。CRISPRaシステムは、対象における少なくとも1つの内因性遺伝子の発現を増大させ、それにより、対象におけるがんを治療する。
【００１０】
本発明の別の局面は、その必要がある対象におけるがんに対してワクチン接種する方法を含む。方法は、対象からがん細胞を得る工程と、少なくとも1つの変異した内因性遺伝子を決定する工程と、少なくとも1つの変異した内因性遺伝子に特異的なsgRNAライブラリーを含むCRISPRaシステムを設計する工程とを含む。CRISPRaシステムを含む組成物の治療有効量を対象に投与し、それにより、対象におけるがんに対してワクチン接種する。
【００１１】
本発明のさらに別の局面は、その必要がある対象におけるがんに対してワクチン接種する方法を含む。方法は、対象からがん細胞を得る工程と、少なくとも1つの変異した内因性遺伝子を決定する工程と、少なくとも1つの変異した内因性遺伝子に特異的なsgRNAライブラリーを含むCRISPRaシステムを設計する工程とを含む。少なくとも1つの変異した内因性遺伝子の発現を増大させるCRISPRaシステムを含む組成物に細胞を接触させて、改変細胞を生じさせる。改変細胞を含む組成物の治療有効量を対象に投与し、それにより、対象におけるがんに対してワクチン接種する。
【００１２】
本発明のさらに別の局面は、その必要がある対象におけるがんを治療する方法を含む。方法は、対象からがん細胞を得る工程と、少なくとも1つの変異した内因性遺伝子を決定する工程と、少なくとも1つの変異した内因性遺伝子に特異的なsgRNAライブラリーを含むCRISPRaシステムを設計する工程とを含む。CRISPRaシステムを含む組成物の治療有効量を対象に投与し、それにより、対象におけるがんを治療する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、その必要がある対象におけるがんを治療する方法を含む。方法は、対象からがん細胞を得る工程と、少なくとも1つの変異した内因性遺伝子を決定する工程と、少なくとも1つの変異した内因性遺伝子に特異的なsgRNAライブラリーを含むCRISPRaシステムを設計する工程とを含む。CRISPRaシステムを含む組成物に細胞を接触させる。CRISPRaシステムは、少なくとも1つの内因性遺伝子の発現を増大させて、改変細胞を生じさせる。改変細胞を含む組成物の治療有効量を対象に投与し、それにより、対象におけるがんを治療する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、対象において抗腫瘍反応を生じさせる方法を含む。方法は、CRISPRaシステムを含む組成物に細胞を接触させる工程を含む。CRISPRaシステムは、複数の内因性遺伝子の発現を増大させて、改変細胞を生じさせる。改変細胞を含む組成物の治療有効量を対象に投与し、それにより、抗腫瘍反応を生じさせる。
【００１５】
さらに別の局面において、本発明は、複数の内因性遺伝子の発現を増大させることができるCRISPRaシステムを含む改変細胞を含む、がんワクチンを含む組成物を含む。
【００１６】
さらに別の局面において、本発明は、複数の内因性遺伝子の発現を増大させることができるCRISPRaシステムを含むAAVベクターを含む組成物を含む。
【００１７】
本発明の別の局面は、CRISPRaシステム中に2つのsgRNAカセットを含むベクターであって、単一遺伝子フォーマットまたはプールフォーマットのいずれかで、第一のsgRNAカセットが、抗原提示機構の活性化のために使用され、第二のsgRNAカセットが、患者特異的な変異した内因性遺伝子の活性化のために使用される、ベクターを含む。
【００１８】
本発明のさらに別の局面は、その必要がある対象におけるがんを治療する方法を含む。方法は、CRISPRaシステムを含むベクターを含む組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含む。CRISPRaシステムは、対象において少なくとも1つの抗原提示遺伝子の発現を増大させ、それにより、対象におけるがんを治療する。
【００１９】
本発明のさらに別の局面は、細胞中の複数の遺伝子を標的とする複数のsgRNAを含むsgRNAライブラリーを含む組成物を含む。
【００２０】
別の局面において、本発明は、SEQ ID NO: 24,105の核酸配列を含むベクターを含む。
【００２１】
さらに別の局面において、本発明は、SEQ ID NO: 24,106の核酸配列を含むベクターを含む。
【００２２】
さらに別の局面において、本発明は、その必要がある対象におけるがんを治療する方法を含む。方法は、CRISPRaシステムを含む第一のAAVベクターおよびdCas9を含む第二のAAVベクターに細胞を接触させる工程を含む。CRISPRaシステムは、少なくとも1つの内因性遺伝子の発現を増大させて、改変細胞を生じさせる。改変細胞を含む組成物の治療有効量を対象に投与し、それにより、対象におけるがんを治療する。
【００２３】
本明細書に詳述される発明の上記局面または任意の他の局面の様々な態様において、CRISPRaシステムはsgRNAライブラリーを含む。特定の態様において、CRISPRaシステムは、複数のsgRNAを含むsgRNAライブラリーを含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、細胞中の少なくとも1つの内因性遺伝子を標的とする少なくとも1つのsgRNAを含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、細胞中の複数の内因性遺伝子を標的とする複数のsgRNAを含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、細胞中の複数の抗原提示遺伝子を標的とする複数のsgRNAを含む。特定の態様において、sgRNAはカスタマイズされている。
【００２４】
特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 1〜37からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAの少なくとも1つは、SEQ ID NO: 23,886〜24,104からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、複数のsgRNAは、SEQ ID NO: 23,886〜24,104からなる群より選択される少なくとも1つのsgRNAを含む。特定の態様において、複数のsgRNAは、SEQ ID NO: 23,886〜24,104からなるヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、複数のsgRNAは、SEQ ID NO: 51〜259からなる群より選択される少なくとも1つのsgRNAを含む。特定の態様において、複数のsgRNAは、SEQ ID NO: 51〜259からなるヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、複数のsgRNAは、SEQ ID NO: 260〜348からなる群より選択される少なくとも1つのsgRNAを含む。特定の態様において、複数のsgRNAは、SEQ ID NO: 260〜348からなるヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、複数のsgRNAは、SEQ ID NO: 349〜4,187からなる群より選択される少なくとも1つのsgRNAを含む。特定の態様において、複数のsgRNAは、SEQ ID NO: 349〜4,187からなるヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、複数のsgRNAは、SEQ ID NO: 4,188〜7,980からなる群より選択される少なくとも1つのsgRNAを含む。特定の態様において、複数のsgRNAは、SEQ ID NO: 4,188〜7,980からなるヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、複数のsgRNAは、SEQ ID NO: 7,981〜11,808からなる群より選択される少なくとも1つのsgRNAを含む。特定の態様において、複数のsgRNAは、SEQ ID NO: 7,981〜11,808からなるヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、複数のsgRNAは、SEQ ID NO: 11,809〜23,776からなる群より選択される少なくとも1つのsgRNAを含む。特定の態様において、複数のsgRNAは、SEQ ID NO: 11,809〜23,776からなるヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、複数のsgRNAは、SEQ ID NO: 23,779〜23,885からなる群より選択される少なくとも1つのsgRNAを含む。特定の態様において、複数のsgRNAは、SEQ ID NO: 23,779〜23,885からなるヌクレオチド配列を含む。
【００２５】
特定の態様において、CRISPRaシステムは、dCas9-VP64をコードする核酸と、MS2-p65-HSF1およびゲノムスケールレンチウイルスSAM CRISPRa sgRNAライブラリーをコードする核酸とを含む。特定の態様において、CRISPRaシステムは、dCas9-VP64をコードする核酸と、MS2-p65-HSF1をコードする核酸と、ゲノムスケールレンチウイルスSAM CRISPRa sgRNAライブラリーをコードする核酸とを含む。
【００２６】
特定の態様において、細胞はがん細胞株由来である。特定の態様において、細胞は対象由来である。特定の態様において、対象由来の細胞はがん細胞である。
【００２７】
特定の態様において、対象は哺乳動物である。特定の態様において、対象はヒトである。
【００２８】
特定の態様において、組成物の治療有効量の投与は、単回用量、二回用量、三回用量、四回用量または複数回用量の処置を含む。
【００２９】
特定の態様において、方法はさらに、対象への投与の前に、細胞において老化を誘導する物質に細胞を接触させる工程を含む。特定の態様において、細胞において老化を誘導する物質はマイトマイシンである。
【００３０】
特定の態様において、がんは、乳がん、肺がん、膵臓がん、黒色腫、神経膠腫、肝細胞腫、結腸がん、膵臓がんおよび脳がんからなる群より選択される。
【００３１】
特定の態様において、方法はさらに、さらなる処置を施す工程を含む。特定の態様において、さらなる処置は、化学療法、放射線、外科手術、免疫チェックポイント阻害剤および免疫チェックポイント阻害（ICB）抗体からなる群より選択される。特定の態様において、免疫チェックポイント阻害剤はCTLA-4もしくはPD1または他の免疫チェックポイント標的を阻害する。特定の態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA4抗体および抗PD1抗体からなる群より選択されるモノクローナル抗体である。
【００３２】
特定の態様において、組成物の投与は腫瘍微小環境を変化させる。特定の態様において、組成物の投与は、定着した腫瘍に対する宿主免疫反応を増強する。
【００３３】
特定の態様において、組成物は腫瘍内投与される。
【００３４】
特定の態様において、組成物はベクターを含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、AAVベクター中にクローニングされかつパッケージングされる。
【００３５】
特定の態様において、CRISPRaシステムは、AAVベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター中にある。特定の態様において、AAVベクターは、AAV2、AAV8、AAV9、AAV-DJまたは他のAAV血清型である。
【００３６】
特定の態様において、細胞は、複数の変異した内因性遺伝子を含み、活性化システムは、複数の変異した内因性遺伝子に特異的なsgRNAライブラリーを含み、かつ、複数の変異した内因性遺伝子の発現を増大させる。
【００３７】
特定の態様において、対象特異的な変異した1つまたは複数の内因性遺伝子を決定する工程は、対象由来のがん細胞の全エクソームシーケンシングと、対象由来の非がん細胞の全エクソームシーケンシングとを含む。がん細胞からのシーケンシングデータを非がん細胞からのシーケンシングデータと比較し、少なくとも1つの変異を決定する。それにより、対象特異的な変異した1つまたは複数の内因性遺伝子を決定する。
【００３８】
特定の態様において、変異は、一塩基多型（SNP）、挿入、欠失、フレームシフトおよび再編成からなる群より選択される。
【００３９】
特定の態様において、内因性遺伝子は、検出された体細胞変異を含む。
【００４０】
特定の態様において、ベクターはSEQ ID NO: 38の核酸配列を含む。特定の態様において、第一のAAVベクターはSEQ ID NO: 38またはSEQ ID NO: 49の核酸配列を含む。特定の態様において、第二のAAVベクターはSEQ ID NO: 24,105またはSEQ ID NO: 24,106の核酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
本発明の具体的な態様の以下の詳細な説明は、添付図面と併せて読まれると、より良く理解されよう。本発明を説明するために、例示的な態様が図面に示されている。しかし、本発明は、図面に示す態様のとおりの編成および手段に限定されないということが理解されるべきである。
【００４２】
【図１−１】図1A〜1Kは、予防および治療ワクチンとしてのCRISPRaベースの内因性遺伝子活性化を示す。図1Aは、この研究に使用された細胞ベースの内因性遺伝子腫瘍ワクチン接種のための実験設計の概念図である。CRISPRa機構およびゲノムスケールCRISPR活性化sgRNAライブラリーを担持するレンチウイルスベクターをE0771細胞に形質導入したのち、細胞をマイトマイシンで処理することにより、CRISPR活性化ベースのワクチンのE0771バージョン（E0771-CAVacまたは略してCAVac）を作製した。予防ワクチン接種の場合、C57BL/6Jマウスに細胞ベースのCAVacを事前接種したのち、同一の起源細胞を有するシンジェニック腫瘍または異なる起源細胞を有する腫瘍を移植することによってチャレンジした。治療ワクチン接種の場合、C57BL/6JマウスへのE0771細胞の乳房内移植によってシンジェニック同所性乳房腫瘍を定着させた。移植後、担腫瘍マウスを表記の時間にPBSまたはE0771-CAVacで処置した。治療効果を評価するために、腫瘍サイズを経時的に計測して治療効果を評価した。図1Bは、同一の起源細胞を有するシンジェニック腫瘍に対するE0771-CAVacの予防効力を示す。PBSまたはE0771-CAVacを事前接種されたC57BL/6Jマウスに同所性移植されたE0771腫瘍の成長曲線（PBS処置マウス、n＝7；腫瘍誘導の前に表記の日にE0771-CAVacで処置されたマウス。CAVac@-d14、dpi＝−14でCAVac処置（n＝5）；CAVac@-d7、dpi＝−7（n＝6）；CAVac@-d3、dpi＝−3（n＝6））。以下の比較の場合の、実験終点（dpi＝23）での、Sidak多重比較検定を使用した二元配置分散分析：CAVac@-d14 vs. PBS、p＜0.0001；CAVac@-d7 vs. PBS、p＜0.0001；CAVac@-d3 vs. PBS、p＜0.0001。以下の比較の場合の、全曲線の両側コルモゴロフ・スミルノフ（KS）検定：CAVac@-d14 vs. PBS、p＜2.2e-16；CAVac@-d7 vs. PBS、p＜2.2e-16；CAVac@-d3 vs. PBS、p＝9.62e-11。図1Cは、定着した同所性腫瘍に対するE0771-CAVacの治療効力を示す。2×106個のE0771細胞をシンジェニックC57BL/6Jマウスの乳房脂肪体中に移植した。担腫瘍マウスを表記の時間（矢印）にPBSまたはE0771-CAVacで処置し、それらの処置後に腫瘍サイズを計測した（PBS処置マウス、n＝11；E0771-CAVac、n＝8）。以下の比較の場合の、最後2つの時点（dpi＝24および28）での、Sidak多重比較検定を使用した二元配置分散分析：CAVac vs. PBS、p＝それぞれ0.0009および0.0488。CAVac vs. PBSの後期段階曲線（13dpi以後）の両側KS検定、p＝0.016。図1Dは、PBSおよびE0771-CAVacで処置されたマウスからの代表的な終点腫瘍切片のヘマトキシリン・エオジン（H＆E）染色を示す。矢印が、リンパ球浸潤を伴う炎症を起こした腫瘍領域を示す。図1Eは、PBSおよびE0771-CAVacで処置されたマウスからの代表的な終点腫瘍切片のCD8免疫組織化学（IHC）染色を示す。矢印が、CD8+細胞を有する炎症を起こした腫瘍領域を示す。図1F〜1Gは、CAVacに関するELISPOT実験の結果を示す。マイトマイシン処置した腫瘍細胞を刺激物質として使用して腫瘍刺激IFNγ産生脾細胞の比をELISPOTアッセイで計測することにより、異なる処置群中の担腫瘍C57BL/6Jマウスにおける腫瘍特異的免疫反応を評価した。CTL Immunospot Analyzerを使用してスポットをカウントした。図1Fは、処置群ごとにマウス3匹を使用して1匹あたり3つ得られたスポットの代表的な画像を示す。図1Gは、PBS（n＝4）、細胞ライセート（n＝4）またはCAVac（n＝5）のELISPOT実験の定量化を示す。以下の比較の場合の、対応のない両側t検定：PBS vs.細胞ライセート、非有意；CAVac vs. PBS、p＝0.0159；CAVac vs.細胞ライセート、p＝0.0317。2回の独立した実験の平均からの結果が示されている。図1Hは、CAVac＋免疫チェックポイント阻害またはCD4+T細胞枯渇の併用処置効果を試験するための実験の概念図である。図1Iは、定着したE0771乳房腫瘍に対するCAVac＋抗CTLA4または抗CD4の併用処置効力を示す。また、図1Iの実験はデータのより良い可視化および統計のために、抗CTLA4（図1J）および抗CD4（図1IK）の場合で別々にプロットされている（PBS処置マウス、n＝8；E0771-CAVac処置マウス、n＝8；抗CTLA4処置マウス、n＝6；CAVac＋抗CTLA4併用処置マウス、n＝4；抗CD4処置マウス、n＝3；CAVac＋抗CD4併用処置マウス、n＝6）。図1Jは、定着したE0771乳房腫瘍に対するCAVac＋抗CTLA4の併用処置効力を示す。図1Hに示すスキームでPBS、E0771-CAVac、抗CLTA4または併用によって処置されたシンジェニックC57BL6Jマウスにおける腫瘍成長曲線。以下の比較の場合の、全曲線の両側KS検定：CAVac vs. PBS、p＝0.5899；抗-CTLA4 vs. PBS、p＝0.00537；併用vs. PBS、p＝1.068e-08；併用vs.抗CTLA4、＝3.437e-05；併用vs. CAVac、＝1.375e-08。以下の比較の場合の、最終時点（dpi＝27）での、Tukey多重比較検定を使用した二元配置分散分析：E0771-CAVac vs. PBS、p＜0.0001；抗CTLA4 vs. PBS、p＜0.0001；併用vs. PBS、p＜0.0001；併用vs.抗CTLA4、p＝0.016；併用vs. CAVac、p＜0.0001。図1Kは、定着したシンジェニック腫瘍に対するCAVac＋抗CD4の併用処置効力を示す。表記のように投与されたPBS、E0771-CAVac、抗CD4または併用によって処置されたC57BL/6Jマウスにおける腫瘍成長曲線。以下の比較の場合の、全曲線の両側KS検定：抗CD4 vs. PBS、p＝2.02e-5；併用vs. PBS、p＝6.89e-6；併用vs.抗CD4、＝0.81；併用vs. CAVac、＝1.49e-05。以下の比較の場合の、最終時点（dpi＝27）での、Tukey多重比較検定を使用した二元配置分散分析：E0771-CAVac vs. PBS、p＜0.0001；抗CD4 vs. PBS、p＜0.0001；併用vs. PBS p＜0.0001；併用vs.抗CD4、p＝0.05；併用vs. CAVac、p＜0.0001。エラーバー：この図におけるすべてのデータ点は平均±標準誤差として提示されている。星印：* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001。
【図１−２】図1-1の説明を参照のこと。
【図１−３】図1-1の説明を参照のこと。
【図１−４】図1-1の説明を参照のこと。
【図１−５】図1-1の説明を参照のこと。
【図１−６】図1-1の説明を参照のこと。
【図２Ａ】図2A〜2Gは、定着した腫瘍に対する治療物質としてのAAV担持CRISPR活性化システム（AAV-CAVac）を例示する。図2Aは、この研究に使用された実験設計の概念図を示す。ゲノムスケール活性化sgRNAライブラリーmSAMをAAV-CRISPRaベクター中にクローニングしたのち、プールされたウイルスをAAV9中にパッケージングすることにより、AAV-CAVacを作製した。定着した腫瘍を有するC57BL/6JマウスをAAV-CAVacで処置した。図2Bは、定着した同所性シンジェニックE0771腫瘍に対する、腫瘍内投与によるAAV-CAVacの治療効力を示す。表記の時間（矢印）にPBS、AAV-ベクターおよびAAV-CAVacで処置されたC57BL/6Jマウスに同所性移植されたE0771腫瘍の成長曲線（PBS処置マウス、n＝8；AAV-ベクター処置マウス、n＝6；AAV-CAVac処置マウス、n＝6）。以下の比較の場合の、最終時点（dpi＝31）での、Tukey多重比較検定を使用した二元配置分散分析：AAV-CAVac vs. PBS、p＜0.0001；AAV-CAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.0224。以下の比較の場合の、全曲線の両側KS検定：PBS vs. AAV-ベクター、p＝0.26；AAV-CAVac vs. PBS、p＝0.00014；AAV-CAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.0048。図2Cは、定着した同所性シンジェニックB16F10腫瘍に対する、腫瘍内投与によるAAV-CAVacの治療効力を示す。表記の時間（矢印）にPBSおよびAAV-CAVacで処置されたC57BL/6Jマウスに同所性移植されたB16F10腫瘍の成長曲線（PBS処置マウス、n＝8；AAV-ベクター処置マウス、n＝4；AAV-CAVac処置マウス、n＝4）。以下の比較の場合の、最後2つの時点（dpi＝21および25）での、Tukey多重比較検定を使用した二元配置分散分析：AAV-CAVac vs. PBS、両時点ともp＜0.0001；AAV-CAVac vs. AAV-ベクター、dpi＝21でp＝0.0008。図2Dは、PBS、AAV-ベクターおよびAAV-CAVacで処置されたマウスからの代表的な終点E0771シンジェニック腫瘍切片のH＆E染色を示す。矢印が、リンパ球浸潤を伴う炎症を起こした腫瘍領域を示す。図2Eは、PBS、AAV-ベクターおよびAAV-CAVacで処置されたマウスからの代表的な終点E0771シンジェニック腫瘍切片のCD8 IHC染色を示す。矢印が、CD8+細胞を有する炎症を起こした腫瘍領域を示す。図2F〜2Gは、AAV-CAVacに関するELISPOT実験の結果を示す。マイトマイシン処置した腫瘍細胞を刺激物質として使用して腫瘍刺激IFNγ産生脾細胞の比をELISpotアッセイで計測することにより、異なる処置群中の担腫瘍C57BL/6Jマウスにおける腫瘍特異的免疫反応を評価した。CTL Immunospot Analyzerを使用してスポットをカウントした。図2Fは、処置群（PBS、AAV-ベクターおよびAAV-CAVac）ごとにマウス4匹を使用して1匹あたり3つ得られたスポットの代表的な画像を示す。図2Gは、PBS（n＝4）、AAV-ベクター（n＝7）およびAAV-CAVac（n＝9）のELISPOT実験の定量化を示す。図2Fからのすべてのマウスのデータ点が示されている。両側マン・ホイットニー検定、AAV-CAVac vs. PBS、p＝0.0028；AAV-CAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.005。2回の独立した実験の合計からの結果が示されている。エラーバー：この図におけるすべてのデータ点は平均±標準誤差として提示されている。星印：* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001。
【図２Ｂ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｃ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｄ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｅ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｆ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｇ】図2Aの説明を参照のこと。
【図３Ａ】図3A〜3Eは、シングルセルRNA-seqを使用して、治療CAVac処置時の免疫細胞集団、レパートリーシフトおよび遺伝子発現変化をインタロゲートした結果を示す。図3Aは実験設計の概念図である。シンジェニック同所性E0771担腫瘍マウスをPBSまたはAAV-CAVacで処置した。腫瘍微小環境内の免疫集団全体を、FACSによる抗CD45濃縮によって精製し（CD45+腫瘍浸潤免疫細胞、TII）、シングルセルRNA-seqに付した。図3Bは、シーケンシングされたすべてのTIIからの免疫細胞集団のクラスター化パターンを示すt-SNEベースの次元削減プロットを示す。クラスター0〜10はそれぞれ1,256、1,215、1,213、964、901、870、302、266、181、180および101個の細胞を有する。図3Cは、PBS（n＝細胞5,383個）またはAAV-CAVac（n＝細胞2,075個）で処置されたマウスからのTII scRNAseqデータに基づく免疫細胞集団のクラスター化パターンを示すt-SNEベースの次元削減プロットを示す。図3Dは、それぞれPBSおよびAAV-CAVacで処置されたマウスからのCD45+免疫細胞全体の11のクラスターそれぞれにおける細胞の比率を示す棒グラフである。クラスター特異的な比の差をフィッシャーの両側正確確率検定によって評価した（***、p＜0.0001）。図3Eは、scRNA-seqから同定されたクラスター特異的マーカのヒートマップである。注目すべきことに、クラスター0はMHC-II分子によってマークされ、クラスター1はIfitファミリー遺伝子によってマークされ、クラスター9は、Cd3d、Cd3gおよびGzmbを含むT細胞特異的マーカによってマークされている。
【図３Ｂ】図3Aの説明を参照のこと。
【図３Ｃ】図3Aの説明を参照のこと。
【図３Ｄ】図3Aの説明を参照のこと。
【図３Ｅ】図3Aの説明を参照のこと。
【図４Ａ】図4A〜4Qは、定着した腫瘍に対する精密多重腫瘍ワクチン接種（AAV-PCAVacまたはp-MAEGI、本明細書においては互換的に使用される）としてのエクソームガイドAAV-CRISPRaベースの変異遺伝子セット活性化を示す。図4Aは実験設計の概念図である。がん細胞および正常組織のゲノムDNAを抽出し、精製し、全エクソームシーケンシングに付した。がん細胞中の体細胞SNPおよびインデルを、マッチした正常組織との比較によって同定し、これらの変異体を標的とするCRISPRa sgRNAを設計した。変異遺伝子セットのカスタマイズされたsgRNAライブラリーを合成し、AAV-CRISPRaベクター中にプールクローニングし、それをAAV9中にパッケージングしてAAV-PCAVacを作製した。図4Bは、マウスゲノム中のそれらの位置上に示すように、全エクソームシーケンシングがE0771細胞中のトップゲノム変異を同定したこと示す。SNPおよび／またはインデルの有無によって遺伝子を着色した。図4Cは、遺伝子1個あたりのSNPまたはインデルとして変異の数を示す散布図である。遺伝子を、野生型乳房脂肪体と比較して、E0771細胞中の全変異の最小数によってフィルタリングした。もっとも高度に変異した遺伝子の例は、Tekt2、Hmmr、Acer2、G3bp1、Rscla1、Slu7およびSkint3である。合計1,116の遺伝子を、カスタマイズされたライブラリー設計に使用した。図4Dは、E0771シンジェニック腫瘍モデルにおけるPBSおよびAAV-PCAVac群からのマウスの処置終点時の代表的な画像を示す。図4Eは、定着したE0771シンジェニック腫瘍に対する、表記の時間（矢印）での、腫瘍内投与によるAAV-PCAVacの治療効力を示す。PBS処置マウス、n＝20；AAV-ベクター処置マウス、n＝15；AAV-PCAVac（AAV-p-MAEGI）処置マウス、n＝20。PBS、AAV-ベクターまたはAAV-PCAVacによって処置されたマウスにおけるE0771シンジェニック腫瘍の腫瘍成長曲線。二元配置分散分析：AAV-ベクターvs. PBS、p＜0 0001；AAV-p-MAEGI vs. PBS、p＜0.0001；AAV-PCAVac（AAV-p-MAEGI） vs. AAV-ベクター、p＜0.0001。図4Fは、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-PCAVac（AAV-p-MAEGI）によって処置されたE0771シンジェニック腫瘍の腫瘍成長曲線のスパイダープロットである。AAV-PCAVac（AAV-p-MAEGI）によって腫瘍が完全な反応を見せたマウス（n＝9）を腫瘍再チャレンジ（矢印）に付した。再チャレンジで成長した腫瘍はなく、AAV-p-MAEGIがマウスにおいて長期的抗腫瘍効果を誘導することを示した。処置日が矢印によって示されている。図4Gは、処置群（PBS、AAV-ベクターおよびAAV-CAVac）ごとにマウス5匹を用いて1匹あたり4つ得られたスポットの代表的な画像を示す。図4Hは、PBS（n＝7）、AAV-ベクター（n＝6）およびAAV-CAVac（n＝9）のELISPOT実験の定量化を示す。両側マン・ホイットニー検定、AAV-CAVac vs. PBS、p＝0.002；AAV-CAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.002。2回の独立した実験の合計からの結果が示されている。エラーバー：この図におけるすべてのデータ点は平均±標準誤差として提示されている。星印：* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001。図4Iは、PBSまたはAAV-PCAVacで処置された担腫瘍マウスの脾臓（脾臓細胞）におけるCD45+、CD3+、CD4+およびCD8+T細胞集団の代表的なフローサイトメトリープロットおよびゲーティングを示す。図4Jは、PBSまたはAAV-PCAVacで処置された担腫瘍マウスの脾細胞からのCD4+およびCD8+T細胞集団の定量化を示す。左から右へ、以下の比較の場合の、対応のない両側のt検定によるバー・ドットプロッ���：脾臓中の全細胞中のCD4+T細胞の分画（絶対分画）；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.0046。脾臓中の全CD45+免疫細胞中のCD4+T細胞の分画（相対分画）；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.0017。脾臓中の全細胞中のCD8+T細胞の分画（絶対分画）；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.0059。脾臓中の全CD45+免疫細胞中のCD8+T細胞の分画（相対分画）；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.0007。図4Kは、PBSまたはAAV-PCAVacで処置された担腫瘍マウスからの腫瘍（TIL）中のCD45+、CD3+、CD4+およびCD8+T細胞集団の代表的なフローサイトメトリープロットおよびゲーティングを示す。図4Lは、PBSまたはAAV-PCAVacで処置された担腫瘍マウスのTILからのCD4+およびCD8+T細胞集団の定量化を示す。左から右へ、以下の比較の場合の、対応のない両側のt検定によるバー・ドットプロット：腫瘍中の全細胞中のCD4+T細胞の分画（絶対分画）；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.025。腫瘍中の全CD45+免疫細胞中のCD4+T細胞の分画（相対分画）；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.0035。腫瘍中の全細胞中のCD8+T細胞の分画（絶対分画）；AAV-PCAVac vs. PBS、p p＝0.039。腫瘍中の全CD45+免疫細胞中のCD8+T細胞の分画（相対分画）；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.019。エラーバー：この図におけるすべてのデータ点は平均±標準誤差として提示されている。星印：* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001。図4Mは、ほぼ完全もしくは完全奏効（nCR/CR）、部分奏効（PR）または安定／進行（SD/PD）によって分類した、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-PCAVac（AAV-p-MAEGI）処置の場合の反応率を示す。図4Nは、PBS（n＝6）、AAV-ベクター（n＝5）またはAAV-PCAVac（AAV-p-MAEGI）（n＝6）によって処置されたRag1-/-マウスにおけるE0771シンジェニック腫瘍の成長曲線を示す。AAV-PCAVac（AAV-p-MAEGI）は、表記の時間（矢印）での腫瘍内投与により、免疫不全Rag1-/-マウス中の定着したE0771腫瘍に対して無効であった。二元配置分散分析：AAV-ベクターvs. PBS、p＝0.0653；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.6982；AAV-p-MAEGI vs. AAV-ベクター、p＝0.0634。図4Oは、AAV-p-MAEGIによる全身性抗腫瘍免疫の誘導を評価するための実験設計の概念図である。局所および遠隔腫瘍をモデル化するために、2×106個または0.25×106個のE0771腫瘍細胞をC57BL/6Jマウスの左または右脇腹にそれぞれ移植した。表記の時間（矢印）にAAV-p-MAEGIを局所腫瘍のみに投与した。図4P〜4Qは、AAV-ベクター（n＝18）またはAAV-PCAVac（AAV-p-MAEGI）（n＝18）によって処置されたマウスにおけるE0771局所（図4P）および遠隔（図4Q）腫瘍の成長曲線である。挿入画、処置ごとの反応率を詳述する円グラフ。（図4P）二元配置分散分析：AAV-p-MAEGI vs. AAV-ベクター、p＜0.0001。（図4Q）二元配置分散分析：AAV-p-MAEGI vs. AAV-ベクター、p＝0.0003。エラーバー：この図におけるすべてのデータ点は平均±標準誤差として提示されている。星印：* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001。
【図４Ｂ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｃ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｄ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｅ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｆ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｇ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｈ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｉ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｊ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｋ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｌ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｍ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｎ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｏ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｐ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｑ】図4Aの説明を参照のこと。
【図５Ａ】図5A〜5Dは、マウスCRISPRaライブラリーを形質導入されたE0771細胞のライブラリー表現を示す。図5Aは、2つの独立した実験からの6つの感染レプリケートからのゲノムスケールCRISPRaライブラリー（マウスSAM）を形質導入されたE0771細胞のライブラリー表現を示す。ライブラリー中の66,749のsgRNAのうち、6つのレプリケートが全sgRNAの99.44％〜99.69％をカバーする。図5Bは、2つの独立した実験からの6つの感染レプリケートの間での、mSAMを形質導入されたE0771細胞のライブラリー表現のペアワイズスピアマン相関のヒートマップである。ペアワイズ相関係数は感染レプリケートの間で0.88〜0.93の範囲であり、高い再現精度を示す。図5Cは、抗Cas9モノクローナル抗体を使用するウェスタンブロットによって確認された、dCas9-VP64を形質導入された細胞株E0771-dCas9およびE0771-dCas9-MPH中のdCas9タンパク質の発現を示す。抗GAPDHを内部コントロールとして使用した。図5Dは、Cd70、Cd80、Cd86、Ifnα4、Ifnβ1およびIfnγを含む遺伝子に関する、qPCRアッセイに基づくmRNAレベルでのCRISPRaによる遺伝子活性化の定量化を示す。以下の比較の場合の、対応のない両側t検定、各遺伝子vs.ベクター：Cd70、p＜0.0001；Cd80、p＜0.001；Cd86、p＜0.05；Ifnα4、p＜0.001；Ifnβ1、p＜0 001；Ifnγ、p＜0.0001。
【図５Ｂ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｃ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｄ】図5Aの説明を参照のこと。
【図６−１】図6A〜6Hは、内因性遺伝子のゲノムスケール活性化がシンジェニック腫瘍の強い免疫拒絶を招くという発見を示す。図6Aは、SAM活性化E0771細胞誘導シンジェニック同所性腫瘍の成長曲線を示す。ベクターを形質導入された細胞（n＝8）と比べて、SAM形質導入E0771細胞（n＝50）生成腫瘍は、多くの場合、C57BL/6J宿主によって速やかに拒絶された。ベクターを形質導入された細胞（n＝8）と比べて、SAMを形質導入されたE0771細胞（n＝50）生成腫瘍は、多くの場合、C57BL/6J宿主によって速やかに拒絶された。両側KS検定、p＜2.2e-16。図6Bは、SAM活性化（n＝50）E0771細胞誘導シンジェニック同所性腫瘍のスパイダープロット成長曲線を示す。SAM E0771腫瘍の大部分（42/50、84％）がC57BL/6Jマウスによって拒絶され；ベクターE0771腫瘍はいずれも拒絶されなかった（0/8）。図6Cは、シンジェニック免疫適格マウス（C57BL/6J、n＝5）および2つの免疫不全マウス株（Nu/Nu、n＝4；Rag1-/-、n＝5）におけるSAM活性化E0771細胞誘導同所性腫瘍の成長曲線を示す。全曲線の以下の比較の場合の、両側KS検定：C57BL6/J vs. Nu/Nu、p＝3.2e-06；C57BL6/J vs. Rag1-/-、p＝1.97e-07；Nu/Nu vs. Rag1-/-、p＝0.22；以下の後期段階曲線（14dpi以後）の比較のための両側KS検定：C57BL6/J vs. Nu/Nu、p＝3.2e-06；C57BL6/J vs. Rag1-/-、p＝6.1e-07；Nu/Nu vs. Rag1-/-、p＝0.022；以下の比較の場合の、最終時点（20dpi）での、Tukey多重比較検定を使用した二元配置分散分析：C57BL6/J vs. Nu/Nu、p＜0.0001；C57BL6/J vs. Rag1-/-、p＜0.0001；Nu/Nu vs. Rag1-/-、p＜0.0001。図6D〜6Fは、SAM活性化（n＝50）E0771細胞誘導シンジェニック同所性腫瘍のスパイダープロット成長曲線を示す。SAM E0771腫瘍の大部分（4/5、80％）がC57BL/6Jマウスによって拒絶され（図6D）；SAM E0771腫瘍はいずれもNu/Nu（図6E）（0/4）またはRag1-/-マウス（図6F）（0/5）によって拒絶されなかった（0/9）。図6Gは、T細胞枯渇下でのSAM活性化E0771細胞誘導シンジェニック同所性腫瘍の成長曲線を示す。マウスが処置されないならば、SAM形質導入E0771細胞（n＝11）生成腫瘍はC57BL/6J宿主によって速やかに拒絶された。マウスを抗CD4および抗CD8両方（n＝4）で処置することによってT細胞を枯渇させると、腫瘍はC57BL/6J宿主中で速やかに成長することができるようになった。両側KS検定、非処置vs抗CD4＋抗CD8処置、p＜7.9e-10。図6Hは、T細胞枯渇下でのSAM活性化E0771細胞誘導シンジェニック同所性腫瘍のスパイダープロット成長曲線を示す。SAM E0771腫瘍のすべて（11/11、100％）が非処置C57BL/6Jマウスによって拒絶され；ベクターE0771腫瘍はいずれも、抗CD4および抗CD8の両方で処置されたC57BL/6Jマウスによって拒絶されなかった（0/4）。エラーバー：この図におけるすべてのデータ点は平均±標準誤差として提示されている。星印：* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001。
【図６−２】図6-1の説明を参照のこと。
【図７】図7A〜7Dは、内因性遺伝子のゲノムスケール活性化を有するE0771からの腫瘍がチェックポイント阻害に感受性であるという発見を示す。図7Aは、非処置（n＝13）またはチェックポイント阻害抗体、抗PD1（n＝11）もしくは抗CTLA4（n＝11）によって処置されたC57BL/6JマウスにおけるE0771-SAMエスケーパ腫瘍の成長曲線を示す。抗PD1（n＝11）または抗CTLA4（n＝11）のいずれかで処置されたとき、すべてのE0771-SAM移植C57BL/6Jマウスは腫瘍を拒絶した。これらの比較のための両側KS検定：抗PD1 vs.非処置、p＝6.008e-06；抗CTLA4 vs.非処置、p＝2.853e-06。図7B〜7Dは、非処置（図7B）（n＝13）またはチェックポイント阻害抗体、抗PD1（図7C）（n＝11）もしくは抗CTLA4（図7D）（n＝11）によって処置されたC57BL/6JマウスにおけるE0771-SAM腫瘍のスパイダープロット成長曲線を示す。実験期間（28dpi）中、非処置群中の13匹のE0771-SAM移植マウスのうち、5/13が腫瘍を完全に拒絶し、8/13がより大きく成長した、またはかなりの大きさの腫瘍に留まった。すべての抗PD1（11/11）および抗CTLA4（11/11）処置マウスはE0771-SAM腫瘍を完全に拒絶した。エラーバー：この図におけるすべてのデータ点は平均±標準誤差として提示されている。星印：* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001。
【図８−１】図8A〜8Gは、細胞ベースのCAVacおよび併用処置の成長曲線のさらなるスパイダープロットを示す。図8A〜8Fは、図1A〜1Fに示す実験の腫瘍成長曲線のスパイダープロットである。図8A〜8Bは、C57BL/6Jマウスにおけるシンジェニック同所性E0771腫瘍に対するCAVacの治療効果を示す。図8AはPBS処置E0771腫瘍の成長曲線を示す。図8BはCAVac処置E0771腫瘍の成長曲線を示す。図8C〜8Fは、C57BL/6Jマウスにおけるシンジェニック同所性E0771腫瘍に対するCAVacおよびCTLA4阻害またはCD4+T細胞枯渇の相乗効果試験の成長曲線を示す。図8Cは、PBS処置E0771腫瘍の腫瘍成長曲線のスパイダープロットである。図8Dは、CAVac処置E0771腫瘍の腫瘍成長曲線のスパイダープロットである。図8Eは、抗CTLA4および抗CTLA4＋CAVac処置E0771腫瘍の腫瘍成長曲線のスパイダープロットである。図8Fは、抗CD4および抗CD4＋CAVac処置E0771腫瘍の腫瘍成長曲線のスパイダープロットである。図8Gは、腫瘍拒絶後の長期間点のデータを含む抗CTLA4＋CAVac処置E0771腫瘍のスパイダープロットである。図8CのPBS処置腫瘍からのデータをコントロールとして使用した。矢じりが、90日後、これらのマウスにおいて腫瘍再発が認められなかったことを指摘し、CAVacと抗CTLA4とを併用することによって誘導される抗腫瘍反応が長期に及ぶことを示す。
【図８−２】図8-1の説明を参照のこと。
【図９】図9A〜9Dは、細胞ベースのCAVacのさらなる試験からの結果を示す。図9Aは、定着したシンジェニック同所性E0771腫瘍に対する非形質導入E0771ライセートの効果を試験した結果を示す。担腫瘍マウスを表記の時間（矢印）にPBSまたはE0771ライセートで処置した（PBS処置マウス、n＝6；E0771ライセート、n＝10）。E0771ライセートvs. PBSの両側KS検定、p＝0.77。図9Bは、定着したシンジェニック同所性E0771腫瘍に対する活性CAVacおよび不活性CAVacの効果を試験した結果を示す（PBS処置マウス、n＝4；CAVac、n＝3；CAVacライセート、n＝3）。担腫瘍マウスを表記の時間（矢印）にPBS、CAVacまたはCAVacライセートで処置した。以下の比較の場合の、後期段階曲線（17dpi以後）の両側KS検定：CAVac vs. PBS、p＝0.004；CAVacライセートvs. PBS、p＝0.97。以下の比較の場合の、腫瘍誘導後の最終時点（24dpi）での、Tukey多重比較検定を使用した二元配置分散分析：CAVac vs. PBS、p＝0.0004；CAVacライセートvs. PBS、p＝0.2115。図9Cは、定着したシンジェニック同所性E0771腫瘍に対するCAVacの単回用量効果を示す。担腫瘍マウスを＋3dpi（矢印）にPBSまたはCAVacで処置した（PBS処置マウス、n＝6；CAVac@d3（CAVac、＋3dpiで）、n＝5）。以下の比較の場合の、腫瘍誘導後の最後2つの時点（dpi＝24または28）での、Sidak多重比較検定を使用した二元配置分散分析：CAVac@d3 vs. PBS、それぞれp＝0.013およびp＝0.003。CAVac vs. PBSの後期段階曲線（17dpi以後）の両側KS検定、p＝0.0078。図9Dは、CD8+T細胞枯渇が、定着したシンジェニック同所性E0771腫瘍に対するCAVacの効果を消失させたことを示す。担腫瘍マウスを表記の日（CAVacの場合は上向き矢印、抗CD8の場合は下向き矢印）にPBS（n＝5）またはCAVac＋抗CD8（n＝3）で処置した。注目すべきことに、ここでのPBS処置マウスのデータは、図1I〜Kにおいて使用した5匹のPBS処置マウス（実験2）と同じであった（これらの処置はいっしょに実施されたため）。CAVac＋抗CD8 vs. PBSの両側KS検定、p＝0.78。エラーバー：この図におけるすべてのデータ点は平均±標準誤差として提示されている。星印：* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001。
【図１０−１】図10A〜10Gは、AAV-CAVacおよび併用処置のさらなるスパイダープロット成長曲線を示す。図10Aは、Cd70、Cd80、Cd86を含むミニプール中の遺伝子に関する、qPCRアッセイに基づくmRNAレベルでのAAV-CRISPRa媒介遺伝子活性化の定量化を示す。以下の比較の場合の、対応のない両側t検定、各遺伝子vs.ベクター：Cd70、p＜0.0001；Cd80、p＜0.001；Cd86、p＝0.0054。図10Bは、PBS処置E0771腫瘍の腫瘍成長曲線のスパイダープロットである。図10Cは、AAV-ベクター処置E0771腫瘍の腫瘍成長曲線のスパイダープロットである。図10Dは、AAV-CAVac処置E0771腫瘍の腫瘍成長曲線のスパイダープロットである。図10Eは、PBS処置B16F10腫瘍の腫瘍成長曲線のスパイダープロットである。図10Fは、AAV-ベクター処置B16F10腫瘍の腫瘍成長曲線のスパイダープロットである。図10Gは、AAV-CAVac処置B16F10腫瘍の腫瘍成長曲線のスパイダープロットである。
【図１０−２】図10-1の説明を参照のこと。
【図１１】図11A〜11Cは、AAV-CAVac処置マウスとPBS処置マウスとの間でのTILのscRNA-seqにおける代表的なクラスター特異的な発現変動遺伝子の一連のバイオリン図である。図11Aは、AAV-CAVac処置マウスとPBS処置マウスとの間での代表的なクラスター＃0特異的な発現変動遺伝子の一連のバイオリン図である。AAV-CAVac処置マウス中ではCcl8およびCcl7がより高度に発現し（調整済みp＝1.6e-33およびp＝2.73e-10）、PBS処置マウス中ではPkmおよびAldoaがより高度に発現した（調整済みp＝8.57e-22およびp＝4.85e-19）。図11Bは、AAV-CAVac処置マウスとPBS処置マウスとの間での代表的なクラスター＃1特異的な発現変動遺伝子の一連のバイオリン図である。AAV-CAVac処置マウス中ではCcl8がより高度に発現し（調整済みp＝6.65e-20）、PBS処置マウス中ではPkmがより高度に発現した（調整済みp＝3.03e-14）。図11Cは、AAV-CAVac処置マウスとPBS処置マウスとの間での代表的なクラスター＃9特異的な発現変動遺伝子の一連のバイオリン図である。AAV-CAVac処置マウス中ではCcl8およびGm26917がより高度に発現し（調整済みp＝1.73e-12およびp＝1.46e-6）、PBS処置マウス中ではmt-Nd2およびHmox1がより高度に発現した（調整済みp＝5.97e-6およびp＝9.79e-5）。
【図１２Ａ】図12A〜12Eは、TCRシーケンシングを使用する、CAVacまたはAAV-CAVac処置マウスにおけるT細胞レパートリーのインタロゲーションを示す。図12AはTCR-seq実験設計の概念図である。マウスをPBS、CAVacまたはAAV-CAVacで処置した。ゲノムDNA抽出のために、脾臓および腫瘍を含む試料をマウスから採取し、RTベースのTCRa/TCRb捕捉に付したのち、Illuminaシーケンシングを実施した。図12Bは、腫瘍または脾臓中のT細胞集団からのTCRseqデータのクローンサイズパターンを示す大域占有クローンホメオスタシスプロットである。過剰に拡大したクローンが黒で示されている。図12Cは、トップNのクローンの相対頻度を示す大域クローン比率プロットである。図12Dは、CAVacおよびAAV-CAVac処置マウスからのすべてのTIL試料のTCRレパートリーの、終点腫瘍サイズとクローン分布のジニ・シンプソン指数との間の正の相関関係を示す散布図である。スピアマン相関係数R＝0.5433、p＝0.03632。図12Eは、CAVacおよびAAV-CAVac処置マウスからの3つの例示的なTIL試料からの主要な（トップ3つの）クローンからのCDR3アミノ酸配列を示す。
【図１２Ｂ】図12Aの説明を参照のこと。
【図１２Ｃ】図12Aの説明を参照のこと。
【図１２Ｄ】図12Aの説明を参照のこと。
【図１２Ｅ】図12Aの説明を参照のこと。
【図１３Ａ】図13A〜13Bは、代表的な脾臓および腫瘍試料のFACSゲーティングを示す。脾臓（上）または腫瘍（下）中、試料からの単個細胞浮遊液をFSC、SSCおよび次いでのCD45+、CD3+、CD4+およびCD8+T細胞集団によってゲーティングした。
【図１３Ｂ】図13Aの説明を参照のこと。
【図１４】多重内因性遺伝子活性化によるワクチン接種のための簡略化された作用モデルを示す。左、非ワクチン接種腫瘍微小環境。低いネオアンチゲン発現の状況で、CD8+T細胞が、腫瘍細胞によってMHC-I上に提示された希少な変異体ペプチドを検出し、弱い腫瘍殺滅を開始する。右、ワクチン接種された腫瘍微小環境。CRISPRaを使用すると、腫瘍細胞中の変異した遺伝子が過剰に発現し、CD8+T細胞へのネオアンチゲンの増幅された産生および提示を招く。TCRエンゲージメントの増強により、CD8+T細胞は、ワクチン接種された微小環境中でより強力な殺滅を開始する。
【図１５Ａ】図15A〜15Dは、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-PCAVacで処置されたマウスの脾臓および腫瘍中のCD4+およびCD8+T細胞を示す。図15Aは、PBSまたはAAV-PCAVacで処置された担腫瘍マウスからの脾臓（脾臓細胞）中のCD45+、CD3+、CD4+およびCD8+T細胞集団の代表的なフローサイトメトリー画像およびゲーティングを示す。図15Bは、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-PCAVacで処置された担腫瘍マウスの脾臓細胞からのCD4+およびCD8+T細胞集団の定量化を示す。左から右へ、以下の比較の場合の、マン・ホイットニー検定を用いたバー・ドットプロット：脾臓中の全細胞中のCD4+T細胞の分画（絶対分画）；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.0003；AAV-PCAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.0028。脾臓中の全CD45+免疫細胞中のCD4+T細胞の分画（相対分画）；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.0007；AAV-PCAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.0048。脾臓中の全細胞中のCD8+T細胞の分画（絶対分画）；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.0032；AAV-PCAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.0016。脾臓中の全CD45+免疫細胞中のCD8+T細胞の分画（相対分画）；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.0012；AAV-PCAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.0016。図15Cは、PBSまたはAAV-PCAVacで処置された担腫瘍マウスからの腫瘍中のCD45+、CD3+、CD4+およびCD8+T細胞集団の代表的なフローサイトメトリー画像およびゲーティングを示す。図15Dは、PBSまたはAAV-PCAVacで処置されたマウスからの腫瘍のCD4+およびCD8+T細胞集団の定量化を示す。左から右へ、以下の比較の場合の、マン・ホイットニー検定を用いたバー・ドットプロット：腫瘍中の全細胞中のCD4+T細胞の分画（絶対分画）；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.0007；AAV-PCAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.0256。腫瘍中の全CD45+免疫細胞中のCD4+T細胞の分画（相対分画）；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.0115；AAV-PCAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.0256。腫瘍中の全細胞中のCD8+T細胞の分画（絶対分画）；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.0047；AAV-PCAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.0332。腫瘍中の全CD45+免疫細胞中のCD8+T細胞の分画（相対分画）；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.0161；AAV-PCAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.0248。エラーバー：この図におけるすべてのデータ点は平均±標準誤差として提示されている。星印：* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001。
【図１５Ｂ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｃ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｄ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１６−１】図16A〜16Gは、CRISPRaによる、腫瘍細胞中の単一遺伝子または小さな遺伝子セットの発現レベルのブーストがマウスにおける腫瘍拒絶を生じさせたことを示す。図16Aは、Arhgap30またはNolc1活性化E0771細胞誘導シンジェニック同所性腫瘍の成長曲線を示す。ベクター形質導入細胞と比較して、sg-Arhgap30またはsg-Nolc1形質導入E0771細胞は、よりゆっくりと成長する、多くの場合、C57B1/6J宿主によって拒絶される腫瘍を生成した。以下の比較の場合の、Tukey多重比較検定を使用した二元配置分散分析：sg-Arhgap30 vs.ベクター、dpi20および23の場合でそれぞれp＝0.0003およびp＜0.0001；sg-Nolc1 vs.ベクター、dpi20および23の場合でそれぞれp＝0.0123およびp＝0.0002。以下の比較の場合の、両側コルモゴロフ・スミルノフ（KS）検定：sg-Arhgap30 vs.ベクター、p＝0.003；sg-Nolc1 vs.ベクター、p＝0.02。図16B〜16Dは、ベクター（n＝7）（図16B）、sg-Arhgap30（n＝3）（図16C）およびsg-Nolc1（n＝3）（図16D）の場合のArhgap30またはNolc1活性化E0771細胞誘導シンジェニック同所性腫瘍のスパイダープロット成長曲線を示す。sg-Arhgap30 E0771腫瘍のすべて（3/3）がC57BL/6Jマウスによって拒絶され；sg-Nolc1 E0771腫瘍の2/3が拒絶され；ベクターE0771腫瘍はいずれも拒絶されなかった（0/7）。図16Eは、Cd70、Cd80、Cd86、Ifnα4、Ifnβ1およびIfnγを含む、ミニプール実験に使用した遺伝子に関する、qPCRアッセイに基づくmRNAレベルでのCRISPRaによる遺伝子活性化の定量化を示す。以下の比較の場合の、対応のない両側t検定、各遺伝子vs.ベクター：Cd70、p＜0.0001；Cd80、p＜0.001；Cd86、p＜0.05；Ifnα4、p＜0.001；Ifnβ1、p＜0.001；Ifnγ、p＜0.0001。図16Fは、ミニプール（sg-Cd70、sg-Cd80、sg-Cd86、sg-Ifnα4、sg-Ifnβ1およびsg-Ifnγ）活性化E0771細胞誘導シンジェニック同所性腫瘍の成長曲線を示す。ベクター形質導入細胞と比べて、ミニプール形質導入E0771細胞生成腫瘍はすべてC57BL/6J宿主によって速やかに拒絶された。両側KS検定、p＝3.51e-8。図16Gは、ミニプール活性化（n＝5）およびベクターコントロール（n＝5）E0771細胞誘導シンジェニック同所性腫瘍のスパイダープロット成長曲線を示す。ミニプールE0771腫瘍のすべて（5/5）がC57BL/6Jマウスによって拒絶され；ベクターE0771腫瘍はいずれも拒絶されなかった（0/5）。エラーバー：この図におけるすべてのデータ点は平均±標準誤差として提示されている。星印：* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001。
【図１６−２】図16-1の説明を参照のこと。
【図１７】図17A〜17Cは、CRISPRaシステムを使用する内因性遺伝子活性化を伴う多重ワクチン接種の2つのモードの概念を示す。図17Aは、非ワクチン接種腫瘍微小環境における変異抗原提示およびT細胞認識を示す概念図である。図17Bは、がん細胞中の変異した内因性遺伝子のCRISPRa増幅による免疫反応の増強を示す概念図である。図17Cは、がん細胞中の抗原提示機構をコードする遺伝子のCRISPRa増幅による免疫反応の増強を示す概念図である。
【図１８】三重陰性乳がん（TNBC）に対する治療ワクチンとしての精密（「個別化」）AAV-PCAVacシステムを示す。AAV-PCAVac多重内因性遺伝子活性化の効力がC57BL/6J宿主中のシンジェニック同所性モデルにおいて実証されている。図示されているものは、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-PCAVacライブラリー（雌C57BL/6Jマウスの正常な乳房脂肪体と比べ、E0771細胞中のもっとも高度に変異した遺伝子のセットを標的とする）で処置された雌C57BL/6Jマウスの乳房脂肪体中に移植されたE0771 TNBCの生存率曲線である。効力はAAV-ベクターとAAV-PCAVacの両方において見られ、AAV-PCAVacがより強い抗腫瘍効果を有する。生存率曲線の比較のためにログ・ランク検定p値が示されている。
【図１９】C57BL/6J宿主中のE0771 TNBCシンジェニック同所性モデルにおけるPBS、AAV-ベクターおよびAAV-PCAVacの処置反応の概要を示す表である。
【図２０】C57BL/6J宿主中の両側腫瘍誘導E0771 TNBCシンジェニック同所性モデルにおけるPBS、AAV-ベクターおよびAAV-PCAVacの処置反応の概要を示す表である。
【図２１】C57BL/6J宿主中のシンジェニック同所性TNBCモデルにおいてAAV処置を受けた最初のE0771腫瘍の完全退縮後のE0771腫瘍再チャレンジの概要を示す表である。
【図２２】TNBCに対する治療ワクチンとしての精密（「個別化」）AAV-PCAVacシステムを示す。AAV-PCAVac多重内因性遺伝子活性化の効力がC57BL/6J宿主中のシンジェニック同所性モデルにおいて実証されている。PBS、AAV-ベクター、AAV-Emut11ライブラリーまたはAAV-PCAVacライブラリーで処置された雌C57BL/6Jマウスの乳房脂肪体中に移植されたE0771 TNBCの生存率曲線。Emut11ライブラリーは、E0771細胞中のトップ11の変異遺伝子のセットを標的とする。効力はAAV-ベクター、AAV-Emut11およびAAV-PCAVacにおいて見られ、AAV-PCAVacがもっとも強い抗腫瘍効果を有する。PBS群との腫瘍成長曲線の比較のためにログ・ランク検定p値が示されている。* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001。
【図２３】治療ワクチンとしての既製型（off-the-shelf）AAV-APCMシステムを示す。AAV-APCM多重内因性遺伝子活性化の効力がC57BL/6J宿主中のシンジェニック同所性モデルにおいて実証されている。図示されているものは、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-Apcmライブラリー（免疫反応を誘発するように選択された遺伝子の小さなセット（36の遺伝子、107のsgRNA）を標的とする）で処置された雌C57BL/6Jマウスの乳房脂肪体中に移植されたE0771 TNBCの腫瘍成長曲線である。効力はAAV-ベクターとAAV-Apcmの両方において見られ、AAV-Apcmがより強い抗腫瘍効果を有する。ログ・ランク検定、* p＜0.05；** p＜0.01。
【図２４】黒色腫に対する治療ワクチンとしての既製型全ゲノムAAV-CAVacシステムを示す。定着した同所性シンジェニックB16F10腫瘍に対する、腫瘍内投与による全ゲノム遺伝子活性化AAV-CAVac（すなわちAAV-SAM）の治療効力が実証されている。表記の時間（矢印）にPBSおよびAAV-CAVacで処置されたC57BL/6Jマウスに同所性移植されたB16F10腫瘍の成長曲線が示されている。ログ・ランク検定、* p＜0.05；** p＜0.01。
【図２５】膵臓がんに対する治療ワクチンとしての既製型全ゲノムAAV-CAVacシステムを示す。定着した同所性シンジェニックPan02腫瘍に対する、腫瘍内投与による全ゲノム遺伝子活性化AAV-CAVac（AAV-g-MAEGIとも呼ばれる）の治療効力が実証されている。表記の時間（矢印）にPBS、AAV-ベクターおよびAAV-CAVac（AAV-g-MAEGI）で処置されたC57BL/6Jマウスに皮下移植されたPan02腫瘍の成長曲線が示されている（PBS処置マウス、n＝4；AAV-ベクター処置マウス、n＝5；AAV-g-MAEGI処置マウス、n＝5）。二元配置分散分析：AAV-ベクターvs. PBS、p＜0.0001；AAV-g-MAEGI vs. PBS、p＜0.0001；AAV-g-MAEGI vs. AAV-ベクター、p＜0.0001。星印：* p＜0.05；** p＜0.01, *** p＜0.001。
【図２６】予防ワクチンとしての既製型AAV-SingleCAVacシステムを示す。C57BL/6J宿主中のシンジェニック同所性モデルにおけるAAV-SingleCAVac内因性遺伝子活性化の効力が実証されている。図示されているものは、Arhgap30またはNolc1活性化E0771細胞誘導シンジェニック同所性腫瘍の成長曲線である。ベクター形質導入細胞と比べて、sg-Arhgap30またはsg-Nolc1形質導入E0771細胞は、よりゆっくりと成長する、多くの場合、C57B1/6J宿主によって拒絶される腫瘍を生成した。以下の比較の場合の、Tukey多重比較検定を使用した二元配置分散分析：sg-Arhgap30 vs.ベクター、dpi20および23の場合でそれぞれp＝0.0003およびp＜0.0001；sg-Nolc1 vs.ベクター、dpi20および23の場合でそれぞれp＝0.0123およびp＝0.0002。以下の比較の場合の、両側コルモゴロフ・スミルノフ（KS）検定：sg-Arhgap30 vs.ベクター、p＝0.003；sg-Nolc1 vs.ベクター、p＝0.02。* p＜0.05；** p＜0.01。
【図２７】AAV-Apcmライブラリー（SEQ ID NO: 23,779〜23,885）のsgRNA配列を示す表である。
【図２８Ａ】図28A〜28Bは、AAV-Apchライブラリー（SEQ ID NO: 23,886〜24,104）のsgRNA配列を示す表のセットである。
【図２８Ｂ】図28Aの説明を参照のこと。
【図２９】図29A〜29Dは、細胞製剤中の免疫療法としての内因性遺伝子の多重活性化（MAEGI）を示す。図29Aは、ゲノムスケールCRISPR活性化（SAM）sgRNAライブラリー形質導入細胞の生成および腫瘍形成能の分析のための概念図を示す。図29Bは、ベクターまたはSAM形質導入E0771-dCas9-VP64-MPH細胞（E0771-ベクターまたはE0771-SAM）の腫瘍成長曲線を示す。ベクター形質導入細胞（n＝8）と比べて、E0771-SAM細胞（n＝50）からの同所性腫瘍はC57BL/6J宿主によって強く拒絶された。二元配置分散分析：p＜0.0001。図29Cは、シンジェニック免疫適格マウス（C57BL/6J、n＝5）および2つの免疫不全マウス株（Nu/Nu、n＝4；Rag1-/-、n＝5）におけるE0771-SAM細胞の腫瘍成長曲線を示す。二元配置分散分析：C57BL/6J vs. Nu/Nu、p＜0.0001；C57BL/6J vs. Rag1-/-、p＜0.0001；Nu/Nu vs. Rag1-/-、p＜0.0001。図29Dは、T細胞枯渇下でのE0771-SAM細胞の腫瘍成長曲線を示す。E0771-SAM細胞（n＝11）からの腫瘍はC57BL/6Jマウスにおいて速やかに拒絶されたが、α-CD4およびα-CD8（n＝4）によるT細胞の枯渇は速やかな腫瘍成長を可能にした。二元配置分散分析検定、非処置vs. α-CD4＋α-CD8処置、p＜0.0001。
【図３０−１】図30A〜30Gは、CRISPRaシステムを形質導入された細胞の特性評価を示し、CRISPRaライブラリー形質導入細胞によって形成されたエスケーパ腫瘍はチェックポイント抗体に感受性である。図30Aは、抗Cas9モノクローナル抗体を使用するウェスタンブロットによって確認された、E0771-dCas9-VP64およびE0771-dCas9-VP64-MPH細胞株中のdCas9タンパク質の発現を示す。抗GAPDHを内部コントロールとして使用した。図30Bは、親E0771細胞の腫瘍成長曲線を、dCas9-VP64を発現するように形質導入されたE0771細胞と比べて示す。二元配置分散分析：p＝0.0023。図30Cは、2つの独立した実験からの6つの感染レプリケートからのゲノムスケールマウスCRISPRa（SAM）ライブラリー形質導入E0771細胞のライブラリー表現を示す。ライブラリー中の66,749のsgRNAのうち、6つのレプリケートが全sgRNAの99.44％〜99.69％をカバーする。図30Dは、PBS（n＝13）またはチェックポイント阻害抗体α-PD1（n＝11）もしくはα-CTLA4（n＝11）によって処置されたC57BL/6JマウスにおけるE0771-SAMエスケーパ腫瘍の成長曲線を示す。矢印が処置の時点を示す。α-PD1（n＝11）またはα-CTLA4（n＝11）のいずれかで処置されたとき、すべてのE0771-SAM移植C57BL/6Jマウスは腫瘍を拒絶した。二元配置分散分析：PBS vs. α-PD1またはα-CTLA4の場合、p＝0.0003。図30E〜30G（図30Dに関連）は、PBS（図30E）（n＝13）またはチェックポイント阻害抗体α-PD1（図30F）（n＝11）もしくはα-CTLA4（図30G）（n＝11）によって処置されたC57BL/6JマウスにおけるE0771-SAMエスケーパ腫瘍のスパイダープロット成長曲線を示す。矢印が処置の時点を示す。実験期間（28dpi）にわたり、5/13のE0771-SAMエスケーパ腫瘍がPBS処置マウスによって最終的に拒絶され、8/13がより大きく成長した、またはかなりの大きさの腫瘍に留まった。すべてのα-PD1（11/11）およびα-CTLA4（11/11）処置マウスはE0771-SAM腫瘍を完全に拒絶した。エラーバー：この図におけるすべてのデータ点は平均±標準誤差として提示されている。星印：* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001。
【図３０−２】図30-1の説明を参照のこと。
【図３１−１】図31A〜31Gは、熱誘導細胞溶解またはCD8+T細胞枯渇がc-MAEGIの治療効果を消失させることを示す。図31Aは、定着したシンジェニック同所性E0771腫瘍に対する非形質導入E0771からの熱誘導細胞ライセートの治療効果を試験した結果を示す。担腫瘍マウスを表記の時間（矢印）にPBSまたはE0771ライセートで処置した（PBS処置マウス、n＝6；E0771ライセート、n＝10）。二元配置分散分析：p＝0.8916。図31Bは、定着したシンジェニック同所性E0771腫瘍に対するc-MAEGIの治療効果とc-MAEGIの熱誘導ライセートの治療効果との比較を示す。担腫瘍マウスを表記の時間（矢印）にPBS、c-MAEGIまたはc-MAEGIライセートで処置した（PBS処置マウス、n＝4；c-MAEGI、n＝3；c-MAEGIライセート、n＝3）。二元配置分散分析：PBS vs. c-MAEGI、p＝0.0004；PBS vs. c-MAEGIライセート、p＝0.8856；c-MAEGIライセートvs. c-MAEGI、p＝0.0007。図31Cは、PBS、α-CD8またはc-MAEGI＋α-CD8で処置されたE0771ベクター誘導腫瘍の腫瘍成長曲線を示す。濃いグレーの矢印：c-MAEGI処置；淡いグレーの矢印：α-CD8処置。CD8+T細胞枯渇が、定着したシンジェニックE0771腫瘍に対するc-MAEGIの効果を消失させた。二元配置分散分析：PBS vs. α-CD8、p＝0.9744；PBS vs. c-MAEGI＋α-CD8、p＝0.6037；α-CD8 vs. c-MAEGI＋α-CD8、p＝0.705。図31Dは、CD45+CD3+細胞に対してゲーティングした、PBSまたはα-CD8処置後のCD8+T細胞の代表的な末梢血フローサイトメトリー分析を示す。上の行、PBS処置；下の行、α-CD8処置。左の列、DPI＝14；右の列、DPI＝21。散布図のX軸、CD4；散布図のY軸、CD8a。各四分区間中に％値が記されている。試料ごとに50,000個を超えるPBMCを分析した。図31Eは、PBSまたはα-CD8処置から14日後、CD45+PBMC中のCD8+T細胞の％を詳述する棒グラフである。対応のない両側t検定：PBS vs. α-CD8、p＜0.0001。図31Fは、PBSまたはα-CD8処置から21日後、CD45+PBMC中のCD8+T細胞の％を詳述する棒グラフである。対応のない両側t検定：PBS vs. α-CD8、p＜0.0001。図31Gは、c-MAEGIとCTLA4阻害との併用を長期フォローアップおよび腫瘍再チャレンジで評価した、C57BL/6Jマウスにおけるシンジェニック同所性E0771腫瘍の腫瘍成長曲線のスパイダープロットである。矢じりが腫瘍再チャレンジの時点を示し、c-MAEGIとα-CTLA4とを併用することによって誘導される抗腫瘍反応が長期に及ぶことを示す。エラーバー：この図におけるすべてのデータは平均±標準誤差として提示され、個々のデータ点が示されている。星印：* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001。
【図３１−２】図31-1の説明を参照のこと。
【図３１−３】図31-1の説明を参照のこと。
【図３２】図32A〜32Cは、AAV-CRISPRaシステムが遺伝子発現および抗原の細胞表面提示を特異的に増強するという発見を示す。図32Aは、プールされたやり方での複数の内因性遺伝子のAAV-CRISPRa活性化を示す。E0771-dCas9-VP64細胞にAAV-ベクターまたはAAV-sgRNA-miniLibを形質導入したのち、Cd70、Cd80、Cd86の転写レベルをqRT-PCRによって定量化した。sgRNAs vs.ベクターの対応のない両側t検定：Cd70、p＜0.0001；Cd80、p＝0.0005；Cd86、p＜0.0001。図32B〜32Cは、AAV-CRISPRaがペプチド−MHC-I複合体の形態でモデル抗原の細胞表面提示を特異的に増強することを示す。PGKプロモータ下でオボアルブミン（Ova）を発現するようにレンチウイルスを形質導入された細胞において、PGKプロモータを標的とするようにされたAAV-CRISPRaは、細胞表面上のOva誘導SIINFEKL-MHC-I複合体の提示を増強する。図32Bは、AAV-ベクターまたはAAV-sgRNAで処置された細胞上のSIINFEKL-H-2Kb複合体の表面染色の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図32Cは、4つの独立した実験からのデータにより、AAV-ベクターまたはAAV-sgRNAで処置された細胞上のPE-SIINFEKL-H-2Kbの平均蛍光強度（MFI）の定量分析を示す。両側マン・ホイットニー検定：AAV-ベクター中のSIINFEKL-H-2Kb染色vs.アイソタイプ、p＝0.0146；AAV-sgRNA中のSIINFEKL-H-2Kb染色vs.アイソタイプ、p＝0.0006；AAV-sgRNA vs. AAV-ベクター中のSIINFEKL-H-2Kb染色、p＝0.0484。
【図３３Ａ】図33A〜33Dは、AAV-MAEGIのさらなる特性評価を示す。図33A〜33Bは、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-g-MAEGIで処置されたマウス中のE0771腫瘍のH&E（図33A）またはCD8（図33B）染色を示す（腫瘍採取dpi＝31）。ズームアウト画像および挿入画のスケールバー＝200μm。図33C〜33Dは、GFP発現AAVの腫瘍内送達およびフローサイトメトリー分析によって評価されたAAV感染効率を示す。図33Cは、PBS（n＝3）またはAAV-GFP（n＝12）の腫瘍内注射から4日後のマウスからの腫瘍内のGFP+細胞の％値をCD45+およびCD45-細胞に分けて示す。バックグラウンドGFP蛍光を、破線によって示すPBS試料中の最大％GFP陽性として設定した。AAV条件を超える分画は、表記細胞集団中のバックグラウンドよりも高い％GFP陽性の試料の数を示す。図33Dは、AAV-GFPの腫瘍内注射後の様々な臓器中のGFP+細胞の％値を示す（n＝6）。エラーバー：この図におけるすべてのデータは平均±標準誤差として提示され、個々のデータ点が示されている。星印：* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001。
【図３３Ｂ】図33Aの説明を参照のこと。
【図３３Ｃ】図33Aの説明を参照のこと。
【図３３Ｄ】図33Aの説明を参照のこと。
【図３４Ａ】図34A〜34Dは、AAV-p-MAEGIで処置されたE0771腫瘍の組織学的特性評価を示す。図34A〜34Cは、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-p-MAEGIで処置されたマウスから採取されたE0771腫瘍のH&E（図34A）、CD8（図34B）またはKi67（図34C）染色を示す（腫瘍採取dpi＝36）。図34Dは、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-p-MAEGIで処置されたマウスから採取されたE0771腫瘍における％Ki67陽性率の定量化を示す。ズームアウト画像および挿入画のスケールバー＝200μm。
【図３４Ｂ】図34Aの説明を参照のこと。
【図３４Ｃ】図34Aの説明を参照のこと。
【図３４Ｄ】図34Aの説明を参照のこと。
【図３５−１】図35A〜35Cは、主要な腫瘍浸潤T細胞クローンからの代表的なフローサイトメトリーゲーティングおよびCDR3アミノ酸配列を示す。図35Aは、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-p-MAEGIで処置されたマウスからの腫瘍内のCD45+、CD3+、CD4+およびCD8+細胞集団の代表的なフローサイトメトリーゲーティングを示す。図35Bは、腫瘍誘導から19日後、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-p-MAEGIで処置されたマウスからの腫瘍中の単球、好中球、MHCII+細胞、樹状細胞およびマクロファージの代表的なフローサイトメトリーゲーティングを示す。図35Cは、PBS、AAV-ベクター、AAV-g-MAEGIおよびAAV-p-MAEGI処置マウスからの3つの例示的なTIL試料中の主要な（トップ3つの）クローンからのCDR3アミノ酸配列を示す。
【図３５−２】図35-1の説明を参照のこと。
【図３６−１】図36A〜36Nは、AAV-p-MAEGI処置が腫瘍反応性免疫集団の浸潤を促進するという発見を示す。図36Aは、AAV-p-MAEGI処置が腫瘍微小環境中のCD4+T細胞存在度の増大と関連していることを示す。PBS、AAV-ベクターまたはAAV-p-MAEGIで処置されたマウスからの全腫瘍細胞の中のCD4+T細胞のフローサイトメトリー経時的定量化。両側マン・ホイットニー検定：AAV-p-MAEGI vs. PBS、p＝0.6857（dpi9）、p＝0.0047（dpi19）、p＝0.0048（dpi29）、p＝0.0015（dpi36）；AAV-p-MAEGI vs. AAV-ベクター、p＝0.2000（dpi9）、p＝0.2569（dpi19）、p＝0.0159（dpi29）、p＝0.0422（dpi36）。図36Bは、AAV-p-MAEGI処置が腫瘍微小環境中のCD8+T細胞存在度の増大と関連していることを示す。PBS、AAV-ベクターまたはAAV-p-MAEGIで処置されたマウスから全腫瘍細胞の中のCD8+T細胞のフローサイトメトリー経時的定量化。両側マン・ホイットニー検定：AAV-p-MAEGI vs. PBS、p＝0.6857（dpi9）、p＝0.0047（dpi19）、p＝0.0005（dpi29）、p＝0.0014（dpi36）；AAV-p-MAEGI vs. AAV-ベクター、p＝0.4857（dpi9）、p＝0.2569（dpi19）、p＝0.0064（dpi29）、p＝0.0200（dpi36）。図36Cは、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-PCAVacで処置されたマウスからの腫瘍中のCD45+MHC-II+抗原提示細胞の％値を示す。両側マン・ホイットニー検定：AAV-ベクターvs. PBS、p＝0.0225；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.0001；AAV-PCAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.0147。図36Dは、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-PCAVacで処置されたマウスからの腫瘍中の樹状細胞の％値を示す。両側マン・ホイットニー検定：AAV-ベクターvs. PBS、p＝0.0075；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.0008；AAV-PCAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.0692。図36Eは、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-PCAVacで処置されたマウスからの腫瘍中のマクロファージの％値を示す。両側マン・ホイットニー検定：AAV-ベクターvs. PBS、p＝0.6353；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.5532；AAV-PCAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.9229。図36Fは、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-PCAVacで処置されたマウスからの腫瘍中の単球の％値を示す。両側マン・ホイットニー検定：AAV-ベクターvs. PBS、p＝0.1471；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.5533；AAV-PCAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.0426。図36Gは、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-PCAVacで処置されたマウスからの腫瘍中の好中球の％値を示す。両側マン・ホイットニー検定：AAV-ベクターvs. PBS、p＝0.0559；AAV-PCAVac vs. PBS、p＝0.6165；AAV-PCAVac vs. AAV-ベクター、p＝0.4176。図36Hは、AAV-p-MAEGIによって誘発される免疫反応の抗腫瘍特異性を評価するための実験設計の概念図である。図36Iは、処置群（PBS、AAV-ベクターおよびAAV-p-MAEGI）ごとに5匹の担E0771腫瘍マウスから得た脾臓細胞におけるIFNγ ELISPOTの代表的な画像を示す。図36Jは、E0771腫瘍を担持するPBS（n＝7）、AAV-ベクター（n＝6）およびAAV-g-MAEGI（n＝9）処置マウスからの脾臓細胞におけるIFNγ ELISPOTの定量化を示す。対応のない両側t検定：AAV-ベクターvs. PBS、p＝0.1499；AAV-g-MAEGI vs. PBS、p＝0.0006；AAV-g-MAEGI vs. AAV-ベクター、p＝0.0011。示される結果は、2つの独立した実験の集成からの結果である。図36Kは、野生型C57BL/6J脂肪体組織（正常）からの正常な初代細胞またはE0771細胞（がん）で刺激された、E0771腫瘍を担持するAAV-ベクターまたはAAV-p-MAEGI処置マウスからの脾臓細胞におけるIFNγ ELISPOTの代表的な画像を示す。図36Lは、初代C57BL/6J正常細胞またはがん細胞で刺激された、E0771腫瘍を担持するAAV-ベクター（n＝9）またはAAV-p-MAEGI（n＝9）処置マウスからの脾臓細胞におけるIFNγ ELISPOTの定量化��示す。対応のない両側t検定：正常細胞によって刺激されたAAV-p-MAEGI vs. AAV-ベクター、p＝0.1667；E0771がん細胞によって刺激されたAAV-p-MAEGI vs. AAV-ベクター、p＝0.0057；AAV-ベクター群内でのがんvs.正常細胞刺激、p＝0.0004；AAV-p-MAEGI群内でのがんvs.正常細胞刺激、p＝0.0002。示される結果は、2つの独立した実験から集成されたものである。図36Mは、野生型C57BL/6J脂肪体組織（正常）からの初代細胞またはE0771細胞（がん）で刺激された、E0771腫瘍を担持するAAV-ベクターまたはAAV-p-MAEGI処置マウスからの腫瘍浸潤免疫細胞（TIIC）におけるIFNγ ELISPOTの代表的な画像を示す。図36Nは、初代C57BL/6J正常細胞またはがん細胞で刺激された、E0771腫瘍を担持するAAV-ベクター（n＝6）またはAAV-p-MAEGI（n＝6）処置マウスからのTIICのIFNγ ELISPOTの定量化を示す。対応のない両側t検定：正常細胞で刺激されたAAV-p-MAEGI vs. AAV-ベクター、p＝0.0577；がん細胞で刺激されたAAV-p-MAEGI vs. AAV-ベクター、p＜0.0001；AAV-ベクター群の場合のがんvs.正常細胞刺激、p＝0.0175；AAV-p-MAEGI群の場合のがんvs.正常細胞刺激、p＜0.0001。エラーバー：この図におけるすべてのデータ点は平均±標準誤差として提示されている。星印：* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001。
【図３６−２】図36-1の説明を参照のこと。
【図３６−３】図36-1の説明を参照のこと。
【図３７−１】図37A〜37Fは、TCRシーケンシングによるMAEGI処置マウス中のT細胞レパートリーのインタロゲーションを示す。図37AはTCR-seq実験設計の概念図である。担E0771腫瘍マウスをPBS、AAV-ベクター、AAV-g-MAEGI（ゲノムワイド）またはAAV-p-MAEGI（エクソームガイド）で処置した。ゲノムDNA抽出のためにマウスから脾臓および腫瘍を採取し、RTベースのTCRα/TCRβ捕捉、次いでIlluminaシーケンシングに付した。図37Bは、トップNのクローンの相対頻度を示す大域クローン比率プロットである。図37Cは、試料ごとのChao1指数（TCR多様性）の箱ひげ図である。対応のない両側マン・ホイットニー検定によって統計的有意性を評価した。図37Dは、試料ごとのジニ・シンプソン指数（TCR均一性）の箱ひげ図である。対応のない両側マン・ホイットニー検定によって統計的有意性を評価した。図37E〜37Fは、各脾臓試料（図37E）またはTIL試料（図37F）中で同定されたユニークなクローン型の数（TCRリッチネス）を処置条件間で比較したドットプロットである。対応のない両側t検定によって統計的有意性を評価した。
【図３７−２】図37-1の説明を参照のこと。
【図３７−３】図37-1の説明を参照のこと。
【図３８−１】図38A〜38Fは、腫瘍微小環境中の免疫集団のシングルセルRNAseqプロファイリングを示す。図38Aは、AAV-ベクター処置マウス（n＝3）またはAAV-p-MAEGI処置マウス（n＝3）中の免疫集団のシングルセルRNAseq（scRNAseq）解析の実験設計の概念図である。scRNAseqライブラリー調製のためにレプリケートマウスからの細胞をいっしょにプールした。図38Bは、細胞をk平均クラスターによって着色したt-SNE次元削減の分散図である。各クラスターと対応する推定細胞型が図上にアノテーションされている。クラスター7（k7）はCD45-細胞で構成されており、さらなる解析からは除外した（図39A〜39Fを参照）。各クラスター中の細胞の数が右に記されている。図38Cは、図38Bにおけるようなt-SNE次元削減の分散図であるが、処置群ごとに着色されている。前処理後のscRNAseq細胞数：AAV-p-MAEGI、n＝4,065個；AAV-ベクター、n＝2,799個。図38Dは、scRNAseqからのT細胞集団の同定を示す。左、細胞をCd3e発現によって着色したt-SNE次元削減。右、Cd8a発現（上）またはCd4発現（下）によって着色したクラスターk6およびk9の拡大図。三角形がAAV-p-MAEGIからの細胞に対応し、円がAAV-ベクターからの細胞に対応する。図38Eは、k6およびk9中のT細胞集団の定量化を示す。AAV-p-MAEGIマウスは、全TIIC中、より高いCD3+T細胞、CD8+T細胞およびCD4+T細胞の比率を有する。両側フィッシャーの正確確率検定。AAV-p-MAEGI vs. AAV-ベクター：CD3e+T細胞、CD8+T細胞およびCD4+T細胞の場合、p＜0.0001。図38Fは、k6およびk9中のCD4+T細胞部分集団の定量化を示す。AAV-p-MAEGIマウスは、全CD4+T細胞中、より高いTbx21+細胞、Ifng+細胞およびTbx21+Ifng+細胞の比率を有する。両側フィッシャーの正確確率検定、AAV-p-MAEGI vs. AAV-ベクター：Tbx21+細胞の場合、p＜0.0001、Ifng+細胞の場合、p＝0.0111、Tbx21+Ifng+細胞の場合、p＝0.0109。エラーバー：この図におけるすべてのデータ点は平均±標準誤差として提示されている。星印：* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001。
【図３８−２】図38-1の説明を参照のこと。
【図３９−１】図39A〜39Fは、CD45-細胞を除外するためのscRNAseqデータの処理および各scRNAseqクラスターの特徴的なマーカを示す。図39Aは、k平均クラスタリングによって着色した、フィルタ基準をパスする全単一細胞のt-SNEを示す。図39Bは、k平均クラスターによって分類した、Ptprc（CD45をコードする）発現のバイオリン図を示す。クラスター7の場合、Ptprc発現はほぼ見られない。図39Cは、様々なT細胞を画定する、Cd3e、Cd4、CD8a、Il7rおよびGzmb発現のバイオリン図を示す。図39Dは、様々なB細胞を画定する、Cd19、Cd20、Pax5、JchainおよびLy6d発現のバイオリン図を示す。図39Eは、様々な樹状細胞を画定する、Ly75、Batf3、Clec10aおよびCD209a発現のバイオリン図を示す。図39Fは、マクロファージおよび単球を画定する、Cd14、Fcgr1およびAdgre1（F4/80をコードする）発現のバイオリン図を示す。
【図３９−２】図39-1の説明を参照のこと。
【図３９−３】図39-1の説明を参照のこと。
【図４０−１】図40A〜40Dは、AAV-p-MAEGI処置が腫瘍浸潤T細胞における転写変化と関連するという発見を示す。図40A〜40Cは、上パネルに、AAV-p-MAEGIをAAV-ベクターと比較する、k6中のCD8+T細胞（図40A）、k9中のCD8+T細胞（図40B）ならびにk6およびk9中のCD4+T細胞（図40C）のボルケーノプロットを示す。下パネルは、AAV-p-MAEGIマウスからのT細胞中のアップレギュレートされた遺伝子の遺伝子オントロジーエンリッチメント解析を示す。図40Dは、免疫療法としての内因性遺伝子の多重活性化（MAEGI）のための動作の簡略化モデルを示す。左パネル：非処置腫瘍微小環境。低いネオアンチゲン発現の状況において、CD8+T細胞が、腫瘍細胞によってMHC-I上に提示される希少な変異体ペプチドを検出し、弱い腫瘍殺滅を開始する。右パネル：MAEGI処置腫瘍微小環境。CRISPRaを使用すると、腫瘍細胞中の変異した遺伝子が内在遺伝子座から過剰に発現して、CD8+T細胞へのネオアンチゲンの増幅された産生および提示を招き、それにより、強力な抗腫瘍反応を生じさせる。
【図４０−２】図40-1の説明を参照のこと。
【図４１】AAV-MAEGIは非常に効果的であるが（左パネル）、予想されたトップ20の変異体ミニORFのAAVによる腫瘍内送達（AAV-20MutORF）はAAV-ベクター単独の場合よりも効果が低い（左、図4Eと同じ）ことを示す。右パネル：E0771中の変異プロファイルに基づいてトップ20の予想されるもっとも抗原性のネオアンチゲンを選択し、ORFとして連結してAAV中で導入遺伝子として発現させた、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-20MutORFによるC57BL/6マウスにおけるE0771腫瘍の処置。
【図４２】B16F10細胞中の変異プロファイルのランキングに基づいて15の遺伝子を選択した、PBS、AAV-ベクター、AAV-g-MAEGI（ゲノムワイドライブラリー）またはAAV-ミニMAEGIによるC57BL/6マウス上のB16F10腫瘍の処置からのデータを示す。
【図４３】1,116の変異体遺伝子を標的とするsgRNAライブラリーを担持するE0771-p-MAEGIの場合の強い効力と比べ、Emut11の場合の効力の低下を示す。左パネル：図4Mと同じ。右パネル：E0771細胞中の変異プロファイルのランキングに基づいてトップ11の遺伝子を選択し、それらの遺伝子のプロモータを標的とする小さなsgRNAライブラリーによってそれらの活性化を駆動した、PBS、AAV-ベクターまたはAAV-Emut11によるC57BL/6マウス上のE0771腫瘍の処置。
【図４４】図44A〜44Bは、いずれもAAV9中にパッケージングされたAAV-dCas9およびAAV-sgRNAを使用する、E0771細胞中の内因性遺伝子の活性化のためのデュアルAAV送達を示す。図44AはデュアルAAV送達の概念図である。図44BはPmeIのデュアルAAV活性化を示す。
【図４５】いずれもAAV-DJ中にパッケージングされたAAV-dCas9（PZB2（SEQ ID NO: X）またはpGW011bベクター）およびAAV-sgRNAを使用する、E0771細胞中の内因性遺伝子の活性化のためのデュアルAAV送達を示す。
【図４６】完全非改変親E0771細胞中への個別化ライブラリーのデュアルAAV送達（AAV-PCAVac、すなわちAAV-p-MAEGI）がC57BL/6マウスにおいてインビボで抗腫瘍活性を媒介することができることを示す。上パネル：完全非改変親E0771細胞中への個別化ライブラリーのデュアルAAV送達（AAV-PCAVac、すなわちAAV-p-MAEGI）の概念図。下パネル：C57BL/6マウスにおけるインビボでのベクターまたはMAEGI媒介抗腫瘍活性を示す腫瘍成長曲線。二元配置分散分析による、**、p＜0.01、***、p＜0.001。
【図４７】完全非改変親E0771細胞中へのAPCMライブラリーのデュアルAAV送達がC57BL/6マウスにおいてインビボで抗腫瘍活性を媒介することを示す腫瘍成長曲線を示す。pGW011b＋5APCM群（APCM処置マウス）vs. pGW011b＋pGW05群（ベクター処置マウス）、二元配置分散分析、p＝0.003。
【図４８】GFP発現AAVの腫瘍内送達およびフローサイトメトリー分析によって評価された、血清型の間でのAAV感染効率を示す。CD45+およびCD45-によって分類した、PBS（n＝3）またはAAV-GFP（n＝12）の腫瘍内注射から4日後のマウスからの腫瘍内のGFP+細胞の％値。バックグラウンドGFP蛍光を、破線によって示すPBS試料中の最大％GFP陽性として設定した。AAV条件を超える分画は、表記の細胞集団中のバックグラウンドよりも高い％GFP陽性の試料の数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
詳細な説明
定義
別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似する、または等価である任意の方法および材料を本発明の試験のための実施において使用することができるが、好ましい材料および方法が本明細書に記載される。本発明を詳細に説明し、特許請求する際、以下の用語が使用される。
【００４４】
また、本明細書において使用される用語は、具体的な態様を説明するためだけのものであり、限定的であることを意図したものではないことが理解されよう。
【００４５】
本明細書において、単数形不定冠詞は、その冠詞の文法的対象の1つまたは2つ以上（すなわち、少なくとも1つ）を指すために使用される。実例として、「ある要素」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
【００４６】
量、期間などの計測可能な値を参照するとき本明細書において使用される「約」は、±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらに好ましくは±1％、なおさらに好ましくは±0.1％の変動を包含することを意図する。
【００４７】
本明細書において使用される語「自己」とは、同じ個体に由来し、その後、その個体に再導入される任意の物質を指すことを意味する。
【００４８】
「同種異系」とは、同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。
【００４９】
本明細書において使用される語「bp」とは塩基対を指す。
【００５０】
語「相補性」とは、2本の核酸鎖の間のアンチパラレルアラインメントの程度を指す。完全相補性は、各ヌクレオチドがその反対物の向かい側にあることを要求する。各ヌクレオチドがその反対物の向かい側にないことを要求する相補性はない。相補性の程度が、配列がいっしょになる、またはアニール／ハイブリダイズする場合の安定性を決定する。さらには、様々なDNA修復機能および調節機能が塩基対の相補性に基づく。
【００５１】
語「CRISPR/Cas」または「クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し」または「CRISPR」とは、塩基配列の短い反復、次に、ウイルスまたはプラスミドへの事前の曝露からのスペーサーDNAの短いセグメントを含有するDNA遺伝子座を指す。細菌および古細菌は、短いRNAを使用して外来核酸の分解を指示する、CRISPR/CRISPR関連（Cas）システムと呼ばれる適応免疫防御を進化させた。細菌において、CRISPRシステムは、RNA誘導DNA切断により、侵入する外来DNAに対する獲得免疫を提供する。
【００５２】
「CRISPR/Cas9」システムまたは「CRISPR/Cas9媒介遺伝子編集」とは、ゲノム編集／エンジニアリングのために改変されたタイプII CRISPR/Casシステムを指す。これは通常、「ガイド」RNA（gRNA）および非特異的CRISPR関連エンドヌクレアーゼ（Cas9）で構成されている。「ガイドRNA（gRNA）」は、本明細書においては「短いガイドRNA（sgRNA）」または「シングルガイドRNA（sgRNA）」と交換可能に使用される。sgRNAは、Cas9結合に必要な「足場」配列と、改変されるゲノム標的を決定するユーザ決定の約20ヌクレオチドの「スペーサー」または「ターゲティング」配列とで構成された短い合成RNAである。Cas9のゲノム標的は、sgRNAに存在するターゲティング配列を変更することによって変更することができる。
【００５３】
「CRISPRa」システムとは、遺伝子発現を活性化または増大させるように機能するCRISPR-Cas9システムの改変体を指す。特定の態様において、CRISPRaシステムは、触媒的に死んだRNA/DNA誘導エンドヌクレアーゼ、たとえばdCas9、dCas12a/dCpf1、dCas12b/dC2c1、dCas12c/dC2c3、dCas12d/dCasY、dCas12e/dCasX、dCas13a/dC2c2、dCas13b、dCas13c、死んだCascade複合体またはその他；少なくとも1つの転写活性化因子；および少なくとも1つの関心対象の遺伝子の発現を増大させるように機能する少なくとも1つのsgRNAで構成される。本明細書において使用される語「活性化」とは、1つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現の増大を指す。
【００５４】
本明細書において使用される「dCas9」とは、エンドヌクレアーゼ活性を欠く触媒的に死んだCas9タンパク質を指す。「疾患」とは、動物が恒常性を維持することができないところの健康状態であって、改善されない場合、その動物の健康状態が悪化し続ける健康状態である。対照的に、動物の「障害」とは、動物が恒常性を維持することができるところの健康状態であるが、障害の非存在におけるよりも好ましくない健康状態である。障害は、治療されずに放置されても、必ずしも、動物の健康状態をさらに悪化させるわけではない。
【００５５】
本明細書において使用される語「ダウンレギュレーション」とは、1つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現の減少または消失を指す。
【００５６】
「有効量」または「治療有効量」は、本明細書においては互換的に使用され、特定の生物学的結果を達成する、または治療的もしくは予防的ベネフィットを提供するのに有効な、本明細書に記載される化合物、製剤、物質または組成物の量を指す。そのような結果は、当技術分野における適当な任意の手段によって決定される抗腫瘍活性を含み得るが、これに限定されない。
【００５７】
「コードする」とは、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列、たとえば遺伝子、cDNAまたはmRNAが、生物学的プロセス中で、所定のヌクレオチド配列（すなわちrRNA、tRNAおよびmRNA）または所定のアミノ酸配列のいずれかおよびそれらから生じる生物学的性質を有する他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として働くための固有の性質を指す。たとえば、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞または他の生物学的システム中でタンパク質を産生するならば、そのタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列が、mRNA配列と同一であり、通常は配列リスト中に提供されているコード鎖と、遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードするとされることができる。
【００５８】
本明細書において使用される「内因性」とは、生物、細胞、組織もしくはシステムに由来する、またはそれらの内部で生成される任意の物質を指す。
【００５９】
本明細書において使用される語「外因性」とは、生物、細胞、組織もしくはシステムから導入された、またはそれらの外部で生成された任意の物質を指す。
【００６０】
本明細書において使用される語「発現」は、そのプロモータによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳と定義される。
【００６１】
「発現ベクター」とは、発現させるヌクレオチド配列に機能的に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含む。発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現システムにおいて、供給されることができる。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（たとえば、裸の、またはリポソームに含まれた）およびウイルス（たとえばセンダイウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）など、当技術分野において公知のすべてを含む。
【００６２】
本明細書において使用される「相同」とは、2つのポリマー分子の間、たとえば2つの核酸分子、たとえば2つのDNA分子もしくは2つのRNA分子の間または2つのポリペプチド分子の間のサブユニット配列同一性を指す。2つの分子両方の中のサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占有されている場合、たとえば、2つのDNA分子それぞれの中の位置がアデニンによって占有されている場合、それらはその位置において相同である。2つの配列間の相同性は、マッチする位置または相同位置の数の一次関数である。たとえば、2つの配列中の位置の半分（たとえば、長さ10サブユニットのポリマー中の5つの位置）が相同であるならば、2つの配列は50％相同であり；位置の90％（たとえば10のうち9つ）がマッチする、または相同であるならば、2つの配列は90％相同である。
【００６３】
本明細書において使用される「同一性」とは、2つのポリマー分子の間、特に2つのアミノ酸分子、たとえば2つのポリペプチド分子の間のサブユニット配列同一性を指す。2つのアミノ酸分子が同じ位置に同じ残基を有する場合、たとえば、2つのポリペプチド分子それぞれの中の位置がアルギニンによって占有されている場合、それらはその位置において同一である。同一性または2つのアミノ酸配列がアラインメント中の同じ位置に同じ残基を有する程度は、多くの場合、％値によって表される。2つのアミノ酸配列の間の同一性は、マッチする位置または同一位置の数の一次関数である。たとえば、2つの配列中の位置の半分（たとえば、長さ10アミノ酸のポリマー中の5つの位置）が同一であるならば、2つの配列は50％同一であり；位置の90％（たとえば10のうち9つ）がマッチする、または同一であるならば、2つのアミノ酸配列は90％同一である。
【００６４】
本明細書において使用される「取り扱い指示資料」は、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために使用されることができる刊行物、記録物、図または任意の他の表現媒体を含む。本発明のキットの取り扱い指示資料は、たとえば、本発明の核酸、ペプチドおよび／または組成物を収容する容器に貼り付けられてもよいし、核酸、ペプチドおよび／または組成物を収容する容器といっしょに出荷されてもよい。あるいはまた、取り扱い指示資料は、取り扱い指示資料と化合物が受取人によって協同的に使用されるという意図をもって、容器とは別個に出荷されてもよい。
【００６５】
「単離された」とは、自然な状態から変更されている、または取り出されていることを意味する。たとえば、生きた動物の中に自然に存在する核酸またはペプチドは「単離」されていないが、その自然の状態で共存する物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離」されている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することもできるし、非天然環境、たとえば宿主細胞の中で存在することもできる。
【００６６】
本明細書において使用される語「ノックダウン」とは、1つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現における低下を指す。
【００６７】
本明細書において使用される語「ノックアウト」とは、1つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現の消失を指す。
【００６８】
本明細書において使用される「レンチウイルス」とは、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという点で、レトロウイルスの中でもユニークである。レンチウイルスは、宿主細胞のDNA中に有意な量の遺伝情報を送達することができるため、遺伝子送達のためのもっとも効率的なベクターの1つである。HIV、SIVおよびFIVはすべてレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボで有意なレベルの遺伝子導入を達成するための手段を提供する。
【００６９】
本明細書において使用される語「改変された」とは、本発明の分子または細胞の変化した状態または構造を意味する。分子は、化学的、構造的および機能的を含む多くの方法で改変され得る。細胞は、核酸の導入を通して改変されることもある。
【００７０】
本明細書において使用される語「変調する」とは、治療または化合物の非存在下での対象における反応レベルと比べて、および／または、処置されていないが他の点では同一である対象の反応レベルと比べて、対象における反応レベルの検出可能な増大または減少を媒介することを意味する。この語は、本来のシグナルまたは反応を乱し、および／またはそれに影響を及ぼし、それにより、対象、好ましくはヒトにおいて有益な治療反応を媒介することを包含する。
【００７１】
本明細書において使用される「変異」とは、所与の参照配列（たとえば、同じ対象から以前に採取されたDNA試料であり得る）からの変化を生じさせるDNA配列の変化である。変異は、少なくとも1つのデオキシリボ核酸塩基、たとえばプリン（アデニンおよび／またはチミン）および／またはピリミジン（グアニンおよび／またはシトシン）の欠失および／または挿入および／または重複および／または置換を含むことができる。変異は、生物（対象）の観察可能な特性（表現型）において認めうる変化を生じさせる場合もあるし、生じさせない場合もある。
【００７２】
「核酸」とは任意の核酸を意味し、それが、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドで構成されているのか、また、ホスホジエステル結合または改変された結合、たとえばホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルホン結合およびそのような結合の組み合わせで構成されているのかを問わない。語「核酸」はまた、とりわけ、生物学的に存在する5つの塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基で構成された核酸をも含む。本発明に関連して、普通に存在する核酸塩基の場合には以下の略語が使用される。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
【００７３】
別段の指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり、かつ同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。また、語句「タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンにおいてイントロンを含み得る程度までイントロンを含み得る。
【００７４】
語「オリゴヌクレオチド」とは通常、短いポリヌクレオチド、一般的には約60ヌクレオチド以下のポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド配列がDNA配列（すなわちA、T、G、C）によって表される場合、この語は、「U」が「T」に代わるRNA配列（すなわちA、U、G、C）をも含むということが理解されよう。
【００７５】
本明細書において使用される語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は交換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基で構成された化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも2つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いにつながれた2つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書において使用されるこの語は、当技術分野において一般にたとえばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる短鎖と、当技術分野において一般にタンパク質（多くのタイプがある）と呼ばれる、より長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」は、たとえば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然のペプチド、組換えペプチド、合成ペプチドまたはそれらの組み合わせを含む。
【００７６】
免疫原性組成物の「非経口」投与は、たとえば、皮下（s.c.）、静脈内（i.v.）、筋肉内（i.m.）または胸骨内注射または注入技術を含む。
【００７７】
本明細書において使用される語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は交換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基で構成された化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも2つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いにつながれた2つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書において使用されるこの語は、当技術分野において一般にたとえばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる短鎖と、当技術分野において一般にタンパク質（多くのタイプがある）と呼ばれる、より長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」は、たとえば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然のペプチド、組換えペプチド、合成ペプチドまたはそれらの組み合わせを含む。
【００７８】
本明細書において使用される語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖と定義される。さらに、核酸はヌクレオチドの重合体である。したがって、本明細書において使用される核酸とポリヌクレオチドとは互換可能である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、それを単量体「ヌクレオチド」へと加水分解することができるという一般的な知識を有する。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドへと加水分解することができる。本明細書において使用されるポリヌクレオチドは、当技術分野において利用可能な任意の手段、たとえば、非限定的に、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およびPCR（商標）などを使用する、組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングによって得られる、または合成手段によって得られるすべての核酸配列を含むが、これらに限定されない。本明細書においては、ポリヌクレオチド配列を記載するために従来の表記法が使用される。一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端が5'末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向が5'方向と呼ばれる。
【００７９】
本明細書において使用される「試料」または「生物学的試料」とは、対象由来の生物学的物質、たとえば、非限定的に、臓器、組織、エクソソーム、血液、血漿、唾液、尿および他の体液を意味する。試料は、対象から得られる物質の任意の供給源であることができる。
【００８０】
語「対象」とは、免疫反応を誘発することができるところの生きた生物（たとえば哺乳動物）を含むことを意図する。本明細書において使用される「対象」または「患者」はヒトまたは非ヒト哺乳動物であり得る。非ヒト哺乳動物は、たとえば、家畜およびペット、たとえばヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコおよびネズミを含む。好ましくは、対象はヒトである。
【００８１】
本明細書において使用される「実質的に精製された」細胞とは、他の細胞型を本質的に含まない細胞である。実質的に精製された細胞はまた、自然に存在する状態でそれが通常は会合している他の細胞型から分離されている細胞を指す。いくつかの例において、実質的に精製された細胞の集団とは、均一な細胞集団を指す。他の例において、この語は、単に、自然な状態でそれらが自然に会合している細胞から分離されている細胞を指す。いくつかの態様において、細胞はインビトロで培養される。他の態様において、細胞はインビトロでは培養されない。
【００８２】
「標的部位」または「標的配列」とは、結合が起こるのに十分な条件下で結合分子が特異的に結合し得る核酸の部分を画定するゲノム核酸配列を指す。
【００８３】
本明細書において使用される語「治療」とは、治療および／または予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解または根絶によって得られる。
【００８４】
本明細書において使用される語「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」とは、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入された細胞である。細胞は初代対象細胞およびその子孫を含む。
【００８５】
本明細書において使用される、疾患を「治療する」とは、対象が経験する疾患または障害の少なくとも1つの徴候または症状の頻度または重症度を低下させることを意味する。
【００８６】
本明細書において使用される「ワクチン接種」とは、疾患に対する免疫反応を誘発する物質を対象に投与することを意味する。
【００８７】
「ベクター」とは、単離された核酸を含み、かつ単離された核酸を細胞内部に送達するために使用されることができる組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスをはじめとする数多くのベクターが当技術分野において公知である。したがって、語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この語はまた、細胞への核酸の導入を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物、たとえばポリリジン化合物、リポソームなどをも含むものと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例は、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。
【００８８】
範囲：本開示を通して、本発明の様々な局面は範囲形式で提示されることがある。範囲形式の記載は単に簡便さおよび簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する不変的限定と解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、すべての可能な部分的範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。たとえば、1〜6などの範囲の記載は、部分的範囲、たとえば1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6など、およびその範囲内の個々の数値、たとえば1、2、2.7、3、4、5、5.3および6を具体的に開示したものとみなされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず当てはまる。
【００８９】
詳細な説明
本発明は、がんを治療または予防するための組成物および方法を含む。特定の態様において、本発明は、内因性遺伝子を活性化するためにCRISPR活性化（CRISPRa）システムを利用する細胞ベースまたはAAVベースの組成物を使用してがんを治療または予防する方法を含む。
【００９０】
本明細書において、内因性遺伝子の直接的な活性化が、腫瘍関連抗原を増幅して抗腫瘍免疫反応を増強するための効果的な手段であることが見いだされた。高度に多重化され、カスタマイズ可能な内因性ネオアンチゲンの活性化は、本開示よりも前には実証されていない。本発明は、CRISPR技術をRNAガイド型の正確な遺伝子操作とともに使用する実現可能性を実証する。ヌクレアーゼ活性を有しない死んだCas9（dCas9）に基づくCRISPR活性化（CRISPRa）システム（Qi et al. (20131) Cell 152, 1173-1183）が、dCas9と転写活性化ドメインとの融合（Gilbert et al. (2013) Cell 154, 442-451）による遺伝子発現の簡単かつフレキシブルな調節を可能にし、それが、相乗的活性化メディエータ（SAM）の動員によってさらに強化される（Konermann, et al. (2015) Nature 517, 583-588；Chavez, et al. (2015) Nat Methods 12, 326-328；Tanenbaum, et al. (2014) Cell 159, 635-646）。本明細書においては、抗腫瘍免疫反応を拡大するために、CRISPRaシステムを利用して内因性遺伝子発現を操作した。この手法を多重腫瘍ワクチン接種方略へと発展させた。
【００９１】
本発明の別の局面は、既製型およびカスタマイズ可能な内因性遺伝子ワクチン接種がんワクチンの組成物および方法を含む。既製型バージョンは決められた成分を有し、それらは、単一成分または多成分ワクチンを含む複数の形態を有することができる。カスタマイズ可能なバージョンは可変形態を有し、それらは一般に、成分が、がんの中の変異遺伝子、特に患者の変異遺伝子に基づくところの多成分ワクチンである。これらの形態のがんワクチンの組成物およびそれらの前臨床効力は、これらが、予防および治療物質の効果的な手段になり得ることを示した。
【００９２】
CRISPR活性化（CRISPRa）システム
CRISPR活性化（CRISPRa）システムは、触媒的に不活性のRNAガイド型エンドヌクレアーゼまたは他のエンドヌクレアーゼ、たとえば、非限定的に、dCas9、dCas12a/dCpf1、dCas12b/dC2c1、dCas12c/dC2c3、dCas12d/dCasY、dCas12e/dCasX、dCas13a/dC2c2、dCas13b、dCas13c、死んだCascade複合体などで構成されている。CRISPRaシステムはまた、少なくとも1つの転写活性化因子と、少なくとも1つの関心対象の遺伝子の発現を増大させるように機能する少なくとも1つのsgRNAとを含む。標準的なCRISPR-Cas9システムと同様に、CRISPRaシステムは、sgRNAに依存してCas9を所期の標的に誘導する。しかし、標準的なCRISPR-Cas9システムは、Cas9のエンドヌクレアーゼ活性によってDNA中に切れ目を形成したのち、遺伝子編集のためにDNA修復機構を操作するが、CRISPRaシステムは、転写活性化因子を使用して関心対象の遺伝子の発現を増大させるように改変されている。
【００９３】
「dCas9」とは、エンドヌクレアーゼ活性を欠く触媒的に死んだCas9タンパク質を指す。これは、Cas9をコードする遺伝子の2つの触媒残基（D10AおよびH840A）中に点変異を導入することによって達成することができる。そうすることにより、dCas9は、dsDNAを切断することはできなくなるが、DNAを標的とし、それに結合する能力を保持する。転写因子およびRNAポリメラーゼがDNAにアクセスすることを防ぐやり方でgRNAがdCas9を配置する場合、これだけで、標的とされる遺伝子の転写を完全には阻害しないとしても、減衰させるには十分であることがよくある。しかし、dCas9は、転写活性化因子を付けるために使用することができる改変可能な領域（通常はタンパク質のNおよびC末端）を有するため、このDNA結合能力を活性化に利用することができる。
【００９４】
ターゲティング特異性は、ゲノム遺伝子座への小さなガイドRNA（sgRNA）の相補的塩基対合によって決まる。sgRNAは、3つの領域：塩基対合配列、dCas9結合ヘアピンおよびターミネータに細分することができるキメラ非コードRNAである。合成sgRNAを設計する場合、塩基対合配列だけが改変される。また、二次的な変数：オフ標的効果（そのために、塩基対合配列の簡単なBLASTランが要求される）、dCas9結合ヘアピン構造の維持および改変されたsgRNA中に制限部位が存在しないという確認、を考慮しなければならない。理由は、下流のクローニング工程で問題を引き起こすおそれがあるからである。sgRNA設計の簡単さのため、この技術はゲノムワイドなスケーリングに適している。dCas9は、たとえば、S. pyogenes、S. aureus、N. meningiditis、S. thermopilus、F. novicida、C. jejuni、B. laterosporusまたは他の種に由来することができる。
【００９５】
転写活性化因子とは、dCas9またはsgRNAに結合し、システムによって標的とされる遺伝子の転写のために重要な補因子およびRNAポリメラーゼの動員を支援することができるタンパク質ドメインまたはタンパク質全体である。転写活性化因子は、DNA結合ドメインと、転写の活性化のためのドメインとを有する。活性化ドメインは、一般的な転写因子またはRNAポリメラーゼを遺伝子配列に動員することができる。活性化ドメインはまた、失速したRNAポリメラーゼによる転写を促進することによって機能することができ、真核生物においては、ヌクレオソームをDNA上に移動させる、またはヒストンを改変して遺伝子発現を増大させることができる。これらの活性化因子は、dCas9またはsgRNAへの付着によってシステムに導入することができる。転写活性化因子は、活性化因子機能を有する哺乳動物細胞内因性タンパク質、ウイルス、微生物もしくは植物などの他の種からの活性化因子、それらの部分的もしくは変異体バリアント、操作された活性化因子または遺伝子発現を増大させることができる他の形態の活性化因子であることができる。適用可能なウイルス活性化因子のリストは、VP16、VP32、VP64、VP160、HBx、NSタンパク質およびVMW65を含むが、これらに限定されない。適用可能な微生物活性化因子のリストは、ラクトースオペロンおよびGAL4を含むが、これらに限定されない。適用可能な哺乳類細胞転写活性化因子のリストは、
2021522188.tif 000003
2021522188.tif 000004
2021522188.tif 000005
を含むが、これらに限定されない。
【００９６】
哺乳類種において転写を活性化し得ることが実証されている適用可能なCRISPRaシステムとしては、VP64-p65-Rta（VPR）、相乗的活性化メディエータ（SAM）、Suntag、p300およびVP160があるが、これらに限定されない。
【００９７】
転写活性化因子（またはトランス活性化因子ドメイン）の一例がVP64である。VP64は、VP16（転写活性化に使用される、16アミノ酸のウイルスタンパク質配列）の4つのコピーでできている。本発明の態様は、様々な形態のVP64、たとえば、dCas9および／またはVP64を含む核酸またはdCas9および／またはVP64遺伝子をコードするプラスミドもしくはベクターを含む。1つの非限定的な例がpcDNA-dCas9-VP64（AddgeneのPlasmid＃47107）を含む。たとえば、2Aいもち病抵抗性マーカをさらにコードするレンチベクターEF1a-NLS-dCas9（N863）-VP64-2A-Blast-WPRE（AddgeneのPlasmid＃61425）におけるように、dCas9および／またはVP64をコードする核酸中にさらなるエレメントが存在することができる。別の非限定的な例は、VP64およびGFPの2つのコピーに融合したヒト最適化S. pyogenes dCas9を共発現するプラスミドpLV hUbC-VP64 dCas9 VP64-T2A-GFP（Addgeneのプラスミド＃59791）を含む。
【００９８】
本発明の特定の態様は、VP64転写活性化因子がdCas9のC末端につながれているVP64-p65-Rta、すなわちVPRを利用する。dCas9-VPRタンパク質においては、転写因子p65およびRtaがdCas9-VP64のC末端に付加されている。したがって、3つの転写因子はすべて同じ遺伝子を標的とする。VP64だけを使用するのとは反対に、3つの転写因子を使用する結果、標的とされた遺伝子の発現が増大する。dCas9-VPRを使用すると、複数のsgRNAを同じ細胞に入れることにより、同じ細胞内の複数の遺伝子の発現を増大させることができる。
【００９９】
特定の態様において、本発明は相乗的活性化メディエータ（SAM）システムを利用する。SAMは、VP64を利用するだけでなく、さらに多くのエフェクタに融合したウイルスタンパク質（p65-hsf1）を動員するための配列を含むsgRNA2.0をも利用する。1つの態様において、SAM複合体はdCas9-VP64、sgRNA、MS2-p65HSF-1を含む。1つの態様において、CRISPRaシステムは、dCas9-VP64をコードする核酸と、MS2-p65-HSF1をコードする核酸と、ゲノムスケールレンチウイルスSAM CRISPRa sgRNAライブラリーとを含む。このタイプのCRISPRaシステムを複数の細胞に投与する結果、sgRNAライブラリー全体を包含する非常に多様な細胞集団が得られる。
【０１００】
本発明は、任意の代替活性化因子、たとえばVP16、VP160、p65AD、p300または任意の他の転写活性化因子とでも機能すると解釈されるべきである。
【０１０１】
本発明はまた、任意のdCas9/CRISPRaシステムまたは当技術分野において公知の任意の他のアダプタシステム、たとえば、非限定的に、以下とともに機能すると解釈されるべきである。1）同じくsgRNA 2.0を利用し、VP64に融合した3つのウイルスタンパク質を動員するRNA足場。2）VP64に融合した抗体の取り巻きによって認識される10のペプチドエピトープの突出する鎖を発生させるSuntag。3）活性化H3K27acを付着させるエピゲノムエディタp300。4）CRISPR-onとも知られ、VP16の10倍のVPを有するVP160。5）たいていは軽視されるN末端を利用するVP64-dCas9-BFP-VP64。
【０１０２】
治療方法
A. 細胞ベース
本発明は、CRISPR活性化（CRISPRa）システムによって改変された細胞を対象に投与して内因性遺伝子の発現を誘導する工程を含む、対象におけるがんを治療または予防する方法を含む。このタイプの細胞ベースのワクチン／組成物は、予防処置、治療処置、個別化された対象特異的処置および／または「冷たい」腫瘍を「熱い」腫瘍に変え、それにより、腫瘍をより免疫療法感受性にする方法として利用されることができる。
【０１０３】
1つの局面において、本発明は、複数の内因性遺伝子の発現を増大させるCRISPR活性化（CRISPRa）システムを含む組成物に細胞を接触させる工程を含む、対象におけるがんを予防する方法を含む。細胞を含む組成物の治療有効量を対象に投与し、それにより、対象におけるがんを予防する。この方法は、ある種の予防的がん処置またはがんの発症から対象を保護する方法または対象におけるがんの発症を予防する方法または対象において抗腫瘍反応を生じさせる方法とみなされる。
【０１０４】
別の局面において、本発明は、その必要がある対象におけるがんを治療する方法を含む。方法は、複数の内因性遺伝子の発現を増大させるCRISPRaシステムを含む組成物に細胞を接触させる工程と、細胞を含む組成物の治療有効量を対象に投与し、それにより、対象におけるがんを治療する工程とを含む。
【０１０５】
本発明の別の局面は、その必要がある対象におけるがんを治療する方法を含む。方法は、対象から第一のがん細胞を得る工程と、少なくとも1つの変異した内因性遺伝子を決定する工程と、次いで、変異した内因性遺伝子に特異的なsgRNAライブラリーを含むCRISPRaシステムを設計する工程とを含む。次いで、対象からの第二の細胞を、CRISPRaシステムを含む組成物と接触させると、CRISPRaシステムが、変異した内在性遺伝子の発現を増大させる。その細胞を含む組成物の治療有効量を対象に投与し、それにより、対象におけるがんを治療する。特定の態様において、細胞は、複数の変異した内因性遺伝子を含み、活性化システムは、複数の変異した内因性遺伝子に特異的なsgRNAライブラリーを含み、複数の変異した内因性遺伝子の発現を増大させる。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 1〜37からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 51〜259からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 260〜348からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 349〜4,187からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 4,188〜7,980からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 7,981〜11,808からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 11,809〜23,776からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 23,779〜23,885からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 23,886〜24,104からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。
【０１０６】
本明細書に開示される任意およびすべてのsgRNAライブラリーに関して、ライブラリーが少なくとも1つのsgRNAを含むと述べられる場合、それは、そのライブラリーが、1つまたは複数のsgRNA、ライブラリー中のすべてのsgRNAならびにすべての整数値およびそれらの間の数値範囲のsgRNAを含むことができると解釈されるべきであることが当業者によって理解されるべきである。たとえば、合計219のsgRNA（たとえばSEQ ID NO: 23,886〜24,104）を含むsgRNAライブラリーは、1つのsgRNA、219すべてのsgRNAまたは1〜219までの任意およびすべての整数値のsgRNAを含むことができる。換言するならば、ライブラリーは、1、10、20、50、100、150、200または219のsgRNAならびにそれらの間の任意およびすべての数値のsgRNAを含むことができる。
【０１０７】
B. ベクターベース
本発明はまた、がんを治療または予防するのに有用なベクターベースのワクチン／組成物を含む。ベクターは、内因性遺伝子の発現を誘導するために使用されるCRISPR活性化（CRISPRa）システムを含み、ベクターは、対象への投与のための送達担体を提供する。このタイプのベクターベースのワクチン／組成物は、予防処置、治療処置、個別化された対象特異的処置および「冷たい」腫瘍を「熱い」腫瘍に変え、それにより、腫瘍をより免疫療法感受性にする方法として利用されることができる。
【０１０８】
本発明の1つの局面は、以下の工程を含む、その必要がある対象におけるがんを治療する方法を含む：少なくとも1つの内因性遺伝子の発現を増大させるCRISPRaシステムを含むベクターを含む組成物の治療有効量を対象に投与し、それにより、対象におけるがんを治療する工程。
【０１０９】
ベクターは、標準的なウイルスベクター、キメラウイルスベクター、他のウイルスベクター、細菌ベクター、酵母ベクター、DNAベクター、mRNA、タンパク質担体、ナノ材料または他の送達担体をはじめとする、遺伝子を運ぶことができる任意のベクターであることができる。送達に適用可能な標準的なウイルスベクターとしては、以下のタイプのウイルスからのベクターがある：dsDNAウイルス（たとえばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）、ssDNAウイルス（＋鎖または「センス」）DNA（たとえばパルボウイルス）、dsRNAウイルス（たとえばレオウイルス）、（+）ssRNAウイルス（＋鎖またはセンス）RNA（たとえばピコマウイルス、トガウイルス）、（-）ssRNAウイルス（−鎖またはアンチセンス）RNA（たとえばオルトミクソウイルス、ラブドウイルス）、生活環中のDNA中間体を有するssRNA-RTウイルス（＋鎖またはセンス）RNA（たとえばレトロウイルス）および生活環中のRNA中間体を有するdsDNA-RTウイルスDNA（たとえばヘパドナウイルス）。
【０１１０】
本発明の特定の態様において、細胞はAAVベクター中にパッケージングされる。適用可能なAAV血清型としては、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、人工バリアント、たとえばAAV.rh1O、AAV.rh32/33、AAV.rh43、AAV.rh64R1、rAAV2-retro、AAV-DJ、AAV-PHP.B、AAV-PHP.S、AAV-PHP.eBまたはAAVの他の改変バージョンがあるが、これらに限定されない。1つの態様において、AAVベクターはAAV9である。1つの態様において、CRISPRaシステムはAAVベクター中にクローンニングされる。
【０１１１】
本発明の特定の態様において、CRISPRaシステムはsgRNAライブラリーを含み、sgRNAライブラリーは、細胞中の内因性遺伝子を標的とする複数のsgRNAを含む。特定の態様において、CRISPRaシステムは、dCas9-VP64をコードする核酸と、MS2-p65-HSF1をコードする核酸と、ゲノムスケールレンチウイルスSAM CRISPRa sgRNAライブラリーとを含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 1〜37からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 51〜259からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 260〜348からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 349〜4,187からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 4,188〜7,980からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 7,981〜11,808からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 11,809〜23,776からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 23,779〜23,885からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。特定の態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 23,886〜24,104からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。
【０１１２】
本発明に利用される細胞は、当業者には公知の任意の供給源に由来することができる。本発明の細胞は、処置を受ける対象に対して自己、同種異系または異種であり得る。いくつかの態様において、細胞はがん細胞株由来である。いくつかの態様において、細胞は対象由来である。いくつかの態様において、対象由来の細胞はがん細胞である。さらなる態様において、がん細胞は腫瘍由来である。いくつかの態様において、対象は哺乳動物である。さらなる態様において、対象はヒトである。
【０１１３】
本発明の細胞またはベクターは、治療または予防する疾患に適切なやり方で投与され得る。投与の量および頻度は、患者の状態ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度などの要因によって決まるが、適切な投与量は治験によって決定され得る。本発明の細胞またはベクターは、適切な前臨床および臨床実験および治験において決定される投与量および経路およびタイミングで投与することができる。細胞およびベクター組成物は、様々な投与量で複数回投与されてもよい。本発明の細胞またはベクターの投与が、当業者によって決定されるような、所望の疾患または病気を治療するのに有用な他の方法と併用されてもよい。1つの態様において、組成物の治療有効量の投与は、単回用量、二回用量、三回用量、四回用量または複数回用量の処置を含む。本発明の改変細胞またはベクターの投与は、当業者に公知の任意の好都合なやり方で実施され得る。1つの態様において、細胞は腫瘍内投与される。
【０１１４】
本発明の特定の態様はさらに、対象への投与の前に、細胞において老化を誘導する物質に細胞を接触させる工程を含む。1つの態様において、細胞において老化を誘導する物質はマイトマイシンである。
【０１１５】
本発明は、がんを治療するための組成物および方法を含む。治療することができるがんのタイプは、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、副腎皮質癌、AIDS関連がん、カポジ肉腫、AIDS関連リンパ腫、原発性CNSリンパ腫、肛門がん、虫垂がん（消化管カルチノイド腫瘍）、星状細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、脳がん、皮膚の基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん（ユーイング肉腫および骨肉腫および悪性線維性組織球腫を含む）、脳腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発不明の癌、心臓腫瘍、胚性腫瘍、生殖細胞腫瘍、原発性CNSリンパ腫、頸部がん、胆管癌、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性骨髄増殖性腫瘍、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚T細胞リンパ腫（菌状息肉症およびセザリー症候群）、非浸潤性乳管癌（DCIS）、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼がん、眼内黒色腫、ファロピウス管がん、骨原発線維性組織球腫、骨肉腫、胆嚢がん、胃がん、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（GIST）、中枢神経胚細胞腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、精巣がん、妊娠性絨毛疾患、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓腫瘍、肝細胞（肝臓）がん、組織球症（ランゲルハンス細胞）、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、膵臓神経内分泌腫瘍、腎臓がん、腎細胞がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、唇および口腔がん、肝がん、肺がん（非小細胞および小細胞）、リンパ腫、男性乳がん、骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌（皮膚がん）、悪性中皮腫、転移性がん、オカルト原発の転移性扁平上皮頸部がん、NUT遺伝子変化を伴う正中線管癌、口がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉症（リンパ腫）、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非小細胞肺がん、口腔がんおよび口腔咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽細胞腫、原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫、原発性腹膜がん、前立腺がん、直腸がん再発がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、血管腫瘍、子宮肉腫、セザリー症候群（リンパ腫）、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃がん（胃癌）、喉がん、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、原発不明癌、尿管および腎盂、移行上皮がん、尿道がん、子宮がん、膣がん、外陰がん、ウィルムス腫瘍およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０１１６】
本発明の特定の態様はさらに、さらなる処置を対象に施すことを含む。本発明の特定の態様は、本発明の組成物とさらなる処置との併用によって対象を処置することを含む。さらなる処置の例は、化学療法、放射線、外科手術、投薬、免疫チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント阻害（ICB）抗体、CTLA-4またはPD1を阻害する免疫チェックポイント阻害剤、抗CTLA4モノクローナル抗体、抗PD1モノクローナル抗体、抗PD-L1モノクローナル抗体、養子細胞移入、ヒト組換えサイトカイン、がんワクチン、免疫療法、標的療法、ホルモン療法、幹細胞移植、精密医療、非特異的免疫療法（たとえばサイトカインおよびケモカイン、たとえばEL-2、IFNa、IFNb、IFNg）、腫瘍溶解性ウイルス療法、T細胞療法（たとえば、TIL、TCR-T、CAR-Tの養子移入）、がんワクチン（たとえば従来のDCワクチン）、イピリムマブ（ヤーボイ）、ニボルマブ（オプジーボ）、ペンブロリズマブ（キイトルーダ）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ（バベンシオ）、デュルバルマブ（イミフィンジ）、抗LAG-3、抗TIM1、抗TIM3、抗CSF-R、IDO阻害剤、OX-40アゴニスト、GITRアゴニスト、CD80アゴニスト、CD86アゴニスト、ICOSアゴニスト、ICOSLGアゴニスト、CD276アゴニスト、VTCN1アゴニスト、TNFSF14アゴニスト、TNFSF9アゴニスト、TNFSF4アゴニスト、CD70アゴニスト、CD40アゴニスト、LGALS9アゴニスト、CD80阻害剤、CD86阻害剤、ICOS阻害剤、ICOSLG阻害剤、CD276阻害剤、VTCN1阻害剤、TNFSF14阻害剤、TNFSF9阻害剤、TNFSF4阻害剤、CD70阻害剤、CD40阻害剤、LGALS9阻害剤、TLR9アゴニスト、CD20抗体、CD80抗体、TIGIT抗体、B7-H1抗体、B7-H2抗体、B7-H3抗体、B7-H4抗体、CD28抗体、CD47抗体、抗BTLA、抗Galectin9、抗IL15R、抗GD2を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、モノクローナル抗体は完全ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。
【０１１７】
特定の態様において、本発明の組成物の投与は腫瘍微小環境を変化させる。特定の態様において、組成物の投与は、定着した腫瘍に対する宿主免疫反応を増強する。
【０１１８】
本発明の特定の局面は、対象の遺伝子中の対象特異的または個別化変異を決定することを含む。この決定は、当業者に公知の任意の手段によって実施することができる。たとえば、全ゲノムシーケンシング（WGS）および／または分子反転プローブシーケンシング（MIPS）（Chow et al. 2018）が、対象特異的な変異した内在性遺伝子を決定する他の非限定的な方法を提供する。1つの態様において、対象特異的な変異した内在性遺伝子の決定は、対象からのがん細胞の全エクソームシーケンシングおよび対象からの非がん細胞の全エクソームシーケンシングを含む。がん細胞からのシーケンシングデータと非がん細胞からのシーケンシングデータとを比較して、少なくとも1つの変異を決定する。これにより、対象特異的な変異した内因性遺伝子が決定される。一塩基多型（SNP）、挿入、欠失、フレームシフトおよび再編成をはじめとする任意のタイプの変異を決定することができる。
【０１１９】
本発明の特定の局面は、内因性遺伝子、たとえば、非限定的に、抗原提示などの免疫細胞機能を増強するもののサブセットの発現を活性化または増大させることを含む。特定の態様において、sgRNAは、前述の内在性遺伝子またはそれらの遺伝子のサブセットに対して設計されている。特定の態様において、sgRNAは、6つの選択されたヒト抗原提示遺伝子のミニプールから選択され、1遺伝子あたり複数のsgRNAが選択される。1つの態様において、sgRNAは、SEQ ID NO: 1〜37からなる群より選択される。1つの態様において、sgRNAは、SEQ ID NO: 51〜259からなる群より選択される。特定の態様において、sgRNAは、抗原提示に関連する29の選択された免疫機能遺伝子のミニプールから選択される。特定の態様において、sgRNAは、SEQ ID NO: 260〜348からなる群より選択される。特定の態様において、sgRNAは、SEQ ID NO: 23,779〜23,885からなる群より選択される。特定の態様において、sgRNAは、SEQ ID NO: 23,886〜24,104からなる群より選択される。特定の態様において、sgRNAは、多様ながん（たとえば黒色腫、神経膠腫、肝細胞腫、結腸がんおよび膵臓がん）中に存在する内因性変異体遺伝子を標的とするように設計されている。特定の態様において、sgRNAは、SEQ ID NO: 11,809〜23,776からなる群より選択される。これらの「既製型」sgRNAプールおよびミニプールは、本発明の組成物および方法と併せて対象に投与することができ、個別化された腫瘍をシーケンシングする必要はない。
【０１２０】
あるいはまた、対象の腫瘍がシーケンシングされ、sgRNAがその対象のがんタイプ／変異に特異的に設計されている個別化sgRNAミニプールを設計することもできる。本明細書に記載される個別化sgRNAミニプールの例は、E0771（TNBC)エクソームベースPCAVac sgRNA（SEQ ID NO: 349〜4,187）、GL261（GBM）エクソームベースPCAVac sgRNA（SEQ ID NO: 7,981〜11,808）およびLewis（肺）エクソームベースPCAVac sgRNA（SEQ ID NO: 4,188〜7,980）を含む。
【０１２１】
（表１）ヒト抗原提示遺伝子のミニプールから選択されたsgRNA
2021522188.tif 000006
【０１２２】
合成されたライブラリーを以下の中へクローニングするためのさらなる配列：
サブプール増幅（SPA）プライマー
2021522188.tif 000007
【０１２３】
（表２）免疫機能遺伝子のミニプールから選択されたsgRNA
2021522188.tif 000008
2021522188.tif 000009
2021522188.tif 000010
【０１２４】
（表３）抗原提示に関連する29個の選択された免疫機能遺伝子のミニプールから選択されたsgRNA
2021522188.tif 000011
【０１２５】
組成物
本発明の特定の局面は、本発明の細胞またはベクターを含む組成物を含む。本発明の1つの局面は、複数の内因性遺伝子の発現を増大させることができるCRISPRaシステムを含む改変細胞を含む、がんワクチンを含む組成物を含む。特定の態様において、細胞はAAVベクター中にパッケージングされる。特定の態様において、CRISPRシステムはsgRNAライブラリーを含む。
【０１２６】
特定の態様において、組成物はsgRNAライブラリーを含む。1つの態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 1〜37からなる群より選択される配列を含む。1つの態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 51〜259からなる群より選択される配列を含む。1つの態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 260〜348からなる群より選択される配列を含む。1つの態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 349〜4,187からなる群より選択される配列を含む。1つの態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 4,188〜7,980からなる群より選択される配列を含む。1つの態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 7,981〜11,808からなる群より選択される配列を含む。1つの態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 11,809〜23,776からなる群より選択される配列を含む。1つの態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 23,779〜23,885からなる群より選択される配列を含む。1つの態様において、sgRNAライブラリーは、SEQ ID NO: 23,886〜24,104からなる群より選択される配列を含む。
【０１２７】
1つの態様において、本発明は、U6-sgRNAおよびEFS-MPH（活性化因子）を含むベクターを含む。1つの態様において、本発明は、CRISPRaシステム中に2つのsgRNAカセットを含むベクターであって、単一遺伝子またはプールフォーマットのいずれかで、第一のsgRNAカセットが、抗原提示機構の活性化のために使用され、第二のsgRNAカセットが、患者特異的な変異した内因性遺伝子の活性化のために使用される、ベクターを含む。1つの態様において、ベクターはSEQ ID NO: 49を含む。1つの態様において、ベクターはSEQ ID NO: 50を含む。
【０１２８】
1つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 24,105を含むベクターを含む。1つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 24,106を含むベクターを含む。
【０１２９】
いずれか1つのベクターの許容可能なバリエーションは当業者に知られるであろう。たとえば、いくつかの態様において、ベクターは、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 24,105またはSEQ ID NO: 24,106に記載された核酸配列とで少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１３０】
CRISPRa AAVベクター：
2021522188.tif 000012
2021522188.tif 000013
2021522188.tif 000014
2021522188.tif 000015
2021522188.tif 000016
2021522188.tif 000017
2021522188.tif 000018
2021522188.tif 000019
2021522188.tif 000020
2021522188.tif 000021
【０１３１】
1つの局面において、本発明は精密CAVacを提供する。精密CAVacまたは個別化CAVacとは、個人の腫瘍の遺伝子組成、たとえば、患者の切除された腫瘍または生検材料のゲノムプロファイリングから同定されたものに基づいてカスタマイズされているCAVacの派生物である。
【０１３２】
1つの局面において、本発明は、患者の腫瘍の遺伝的同一性にかかわらず遺伝子の小さなセットを標的とする内因性遺伝子活性化の手法である既製型APCMを提供する。
【０１３３】
1つの局面において、本発明は、中にクローニングされたsgRNAまたはsgRNAプールを有する本明細書に記載されるベクターのいずれか1つの送達と、第二のベクター（たとえばAAV-dCas9ベクター、たとえばpZB2_EFS-LTR-dCas9_addgene-plasmid-106430またはpGW011b_pAAV-EFS-dCAS9-spA）の送達とを含むデュアルAAV送達の方法を提供する。また、前記デュアルAAV送達システムを含む組成物および前記デュアル送達システムシステムを使用してがんを治療する方法が本発明によって提供される。
【０１３４】
AAV-PCAVacの作製：
I. 患者腫瘍シーケンシング
個別化ワクチンのために、各患者の腫瘍生検材料から、ゲノムDNAと、マッチした正常な試料、たとえば末梢血とを抽出する。gDNAを全エクソームシーケンシング（WES）および／または全ゲノムシーケンシング（WGS）に付す。腫瘍試料のWESから変異を同定し、マッチした正常試料からそれを差し引いてバックグラウンドおよび生殖細胞系変異体を除外し、アノテーションされた遺伝子に関連づけした。これが、個別化された遺伝子の腫瘍変異パネル（Patient-mutation-geneset）を生成する。
【０１３５】
II. 遺伝子セット選択
この遺伝子セットを1つまたは複数のフィルタリング基準によってさらにフィルタリングすることができる。
1. PVACseqなどのツールをはじめとする免疫原性スコアの予測により、免疫原性に関して選択する。
2. 既知のがん遺伝子および／またはTCGA、COSMIC、TARGET、cBioPortalをはじめとするがんゲノミクスデータセット／データベース中の任意のタイプのがんにおいて増幅される遺伝子を除外することにより、発がん性に照らして選択する。
3. コード遺伝子のみまたはコード遺伝子と非コード遺伝子の両方を選択することにより、コード能力を考慮する。
【０１３６】
フィルタリングされた遺伝子セット（Patient-mutation-geneset-filt）またはフィルタリングされていない遺伝子セット（Patient-mutation-geneset）をライブラリー設計の対象にする。遺伝子セットは1〜20,000の範囲であることができる。
【０１３７】
III. SgRNA設計およびライブラリー作製
1. SgRNAを、これらの遺伝子のための既定の配列リストから選択する、または、既存の、もしくはカスタマイズされたコードを使用して最初から設計する。
2. プールされたオリゴ合成を使用して、Yale/Keck ISP、IDT、Thermofisher、Customarray、Agilentをはじめとする個人または販売業者を使用して、患者ごとにsgRNAライブラリーを合成する。
3. 他のエフェクタ、アダプタ、Cas酵素を同じ目的に使用して、合成されたsgRNAライブラリーをAAV-CRISPRaベクターまたは派生物または類似のベクター中にプールクローニングする。
4. クローンニングされたライブラリーを、本明細書に記載されるカスタムメソッドおよびプライマーを使用するサンガーおよび／またはイルミナシーケンシングを使用してシーケンス検証する。
5. ウイルスパッケージングのためにプラスミドライブラリーを増幅に付す。
【０１３８】
IV. AAV-PCAVacの作製
1. 本明細書に記載されるものを含む様々なウイルスパッケージングシステムを使用してプラスミドライブラリーをウイルス粒子中にパッケージングすることにより、AAVライブラリーを作製する。
2. 本明細書に記載されるものを含む方法を使用してAAVライブラリーを精製する。
3. qPCRなど、本明細書に記載されるものを含む方法を使用してAAVライブラリーを力価測定する。
4. AAV生産のさらなるGLP、GMPおよび／またはcGMP法を採用してもよい。
【０１３９】
ワクチンまたは個別化ワクチンの担体は、自然変異体AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、人工変異体、たとえばAAV.rhlO、AAV.rh32/33、AAV.rh43、AAV.rh64R1、rAAV2-retro、AAV-DJ、AAV-PHP.B、AAV-PHP.S、AAV-PHP.eBまたはAAVの他の改変バージョン、他の新規なAAV変異体またはそれらの任意の組み合わせをはじめとする、様々な組織特異性／向性に対する様々な血清型のAAVであることができる。
【０１４０】
本発明は、当業者に公知の任意のタイプのウイルスベクターを包含するものと解釈されるべきである。たとえば、ワクチンまたは個別化ワクチンの担体は、AAV（本明細書に記載）であることができるが、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ハイブリッドウイルスベクター、またはそれらの任意の組み合わせをはじめとする他のウイルスベクターであることもできる。
【０１４１】
核酸の導入
特定の態様において、関心対象の細胞へのgRNAおよび(d)Cas9タンパク質の導入のために発現システムが使用される。通常、用いられる選択肢は、プラスミドおよびウイルスベクター、たとえばアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
【０１４２】
核酸を細胞に導入する方法としては、物理的、生物学的および化学的方法がある。RNAなどのポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、パーティクルボンバードメント、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどがある。RNAは、エレクトロポレーション（Amaxa Nucleofector-II（Amaxa Biosystems, Cologne, Germany））、ECM 830（BTX）（Harvard Instruments, Boston, Mass.）またはGene Pulser II（BioRad, Denver, Colo.）、Multiporator（Eppendort, Hamburg Germany）を含む市販の方法を使用して標的細胞に導入することができる。RNAはまた、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、ポリマーカプセル封入、ペプチド媒介トランスフェクションまたはBiolistic Particle Deliveryシステム、たとえば「遺伝子銃」を使用して、細胞に導入することもできる（たとえば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照）。
【０１４３】
関心対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法としては、DNAおよびRNAベクターの使用がある。ウイルスベクターは、哺乳動物、たとえばヒトの細胞に遺伝子を導入するためにもっとも広く使用される方法になった。他のウイルスベクターとしては上記のものを挙げることができる。たとえば、米国特許第5,350,674号および第5,585,362号を参照すること。
【０１４４】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、コロイド分散システ、たとえば高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズならびに脂質ベースのシステム、たとえば水中油型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームがある。インビトロおよびインビボで送達担体として使用するための例示的なコロイドシステムがリポソーム（たとえば人工膜小胞）である。
【０１４５】
使用に適した脂質は販売業者から得ることができる。たとえば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC」）はSigma（St. Louis, MO）から得ることができ；ジセチルホスフェート（「DCP」）はK & K Laboratories（Plainview, NY）から得ることができ；コレステロール（「Choi」）はCalbiochem-Behringから得ることができ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）および他の脂質はAvanti Polar Lipids, Inc.（Birmingham, AL）から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質の原液は約−20℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりも蒸発しやすいため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」とは、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される多様な単一および多重ラメラ脂質担体を包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部水性媒体とを有する小胞構造を有するものとして特徴づけられることができる。多重ラメラリポソームは、水性媒体によって切り離された複数の脂質層を有する。多重ラメラリポソームは、リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁されると自然発生的に形成する。脂質成分は、閉じた構造を形成する前に自己再編成を起こし、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に閉じ込める（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10）。しかし、通常の小胞構造とは異なる構造を溶液中に有する組成物もまた、包含される。たとえば、脂質は、ミセル構造をとってもよいし、単に脂質分子の不均一な凝集体として存在してもよい。また、リポフェクタミン−核酸複合体が考慮される。
【０１４６】
外因性核酸を宿主細胞に導入する、または他のやり方で細胞を本発明の阻害物質に曝露するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞中の核酸の存在を確認するために、多様なアッセイを実施し得る。そのようなアッセイとしては、たとえば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、たとえばサザンおよびノーザンブロッティング、RT-PCRおよびPCR；特定のペプチドの有無をたとえば免疫学的手段（ELISAおよびウエスタンブロット）によって、または本発明の範囲内に入る、作用物質を同定するための本明細書に記載されるアッセイによって検出するなどの「生化学的」アッセイがある。
【０１４７】
そのうえ、核酸は、細胞への形質導入、細胞へのトランスフェクションおよび細胞へのエレクトロポレーションなどの任意の手段によって導入されてもよい。ある核酸がある方法によって細胞に導入され、別の核酸が異なる方法によって細胞に導入されてもよい。
【０１４８】
RNA
1つの態様において、細胞に導入される核酸はRNAである。別の態様において、RNAは、インビトロ転写されたRNAまたは合成RNAを含むmRNAである。RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で生成された鋳型を使用するインビトロ転写によって生成される。任意の供給源からの関心対象のDNAを、PCRにより、適切なプライマーおよびRNAポリメラーゼを使用して、インビトロmRNA合成のための鋳型へと直接変換することができる。DNAの供給源は、たとえば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列または任意の他の適切なDNA供給源であることができる。
【０１４９】
PCRを使用して、mRNAのインビトロ転写のための鋳型を生成したのち、それを細胞に導入することができる。PCRを実施する方法は当技術分野において周知である。PCRに使用するためのプライマーは、PCRのための鋳型として使用されるDNAの領域に実質的に相補的である領域を有するように設計されている。本明細書において使用される「実質的に相補的」とは、プライマー配列中の塩基の大部分またはすべてが相補的である、または1つまたは複数の塩基が非相補的またはミスマッチであるところのヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、PCRに使用されるアニーリング条件下で所期のDNA標的とアニールまたはハイブリダイズすることができる。プライマーは、DNA鋳型の任意の部分に実質的に相補的であるように設計されることができる。たとえば、プライマーは、5'および3'UTRを含む、通常は細胞中に転写される遺伝子の部分（オープンリーディングフレーム）を増幅するように設計されることができる。プライマーはまた、関心対象の特定のドメインをコードする遺伝子の一部分を増幅するように設計されることもできる。1つの態様において、プライマーは、5'および3'UTRの全部または一部を含むヒトcDNAのコード領域を増幅するように設計されている。PCRに有用なプライマーは一般に、当技術分野において周知である合成方法によって生成される。「フォワードプライマー」とは、増幅されるDNA配列の上流にあるDNA鋳型上のヌクレオチドに実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「上流」は、本明細書において、コード鎖に対して増幅されるDNA配列に対して位置5を指すために使用される。「リバースプライマー」とは、増幅されるDNA配列の下流にある二本鎖DNA鋳型に実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「下流」は、本明細書において、コード鎖に対して増幅されるDNA配列に対して位置3'を指すために使用される。
【０１５０】
また、RNAの安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造を使用してもよい。RNAは好ましくは5'および3'UTRを有する。1つの態様において、5'UTRは長さ0〜3000ヌクレオチドである。コード領域に付加される5'および3'UTR配列の長さは、UTRの異なる領域にアニーリングするPCRのためのプライマーの設計をはじめとする様々な方法によって変えることができる。この手法を使用して、当業者は、転写されたRNAのトランスフェクションののち、最適な翻訳効率を達成するために必要な5'および3'UTR長さを変更することができる。
【０１５１】
5'および3'UTRは、関心対象の遺伝子に関して自然に存在する内因性5'および3'UTRであることができる。あるいはまた、関心対象の遺伝子に対して内因性ではないUTR配列を、フォワードおよびリバースプライマーに組み込むことにより、または鋳型の他の改変により、付加することもできる。関心対象の遺伝子に対して内因性ではないUTR配列の使用は、RNAの安定性および／または翻訳効率を変えるのに有用であることができる。たとえば、3'UTR配列のAUリッチエレメントがmRNAの安定性を低下させ得ることが知られている。したがって、当技術分野において周知であるUTRの性質に基づき、転写されたRNAの安定性を高めるように3'UTRを選択または設計することができる。
【０１５２】
1つの態様において、5'UTRは、内因性遺伝子のコザック配列を含むことができる。あるいは、関心対象の遺伝子に対して内因性ではない5'UTRが上記のようにPCRによって付加される場合、5'UTR配列を加えることにより、コンセンサスコザック配列を再設計することもできる。コザック配列は、一部のRNA転写物の翻訳効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするためにすべてのRNAに必要なわけではないようである。多くのmRNAの場合のコザック配列の必要性は当技術分野において公知である。他の態様において、5'UTRは、RNAゲノムが細胞内で安定であるRNAウイルスに由来することができる。他の態様においては、様々なヌクレオチド類似体を3'または5'UTR中に使用して、mRNAのエキソヌクレアーゼ分解を阻止することができる。
【０１５３】
DNA鋳型からのRNAの合成を可能にするためには、転写のプロモータを、転写される配列の上流のDNA鋳型に取り付けるべきである。RNAポリメラーゼのためのプロモータとして機能する配列がフォワードプライマーの5'末端に付加されると、RNAポリメラーゼプロモータは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のPCR産物に組み込まれる。1つの態様において、プロモータは、本明細書の他の箇所に記載されているように、T7ポリメラーゼプロモータである。他の有用なプロモータとしては、T3およびSP6 RNAポリメラーゼプロモータがあるが、これらに限定されない。T7、T3およびSP6プロモータのためのコンセンサスヌクレオチド配列は当技術分野において公知である。
【０１５４】
1つの態様において、mRNAは、5'末端上のキャップおよび3'ポリ（A）テールを有し、これらがリボソーム結合、翻訳の開始および細胞中の安定性mRNAを決定する。環状DNA鋳型、たとえばプラスミドDNA上で、RNAポリメラーゼは、真核細胞中での発現に適さないおそれのある長いコンカテマー生成物を生成する。3'UTRの端部で線形化されたプラスミドDNAの転写は通常サイズのmRNAを生じさせ、それは、転写後にポリアデニル化されたとしても、真核生物トランスフェクションには無効であるかもしれない。
【０１５５】
線形DNA鋳型上、ファージT7 RNAポリメラーゼが転写物の3'末端を鋳型の最後の塩基よりも先まで延ばすことができる（Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)；Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J Biochem., 270:1485-65 (2003)。
【０１５６】
ポリA/TストレッチをDNA鋳型に組み込む従来の方法は分子クローニングによる方法である。しかし、プラスミドDNAに組み込まれたポリA/T配列はプラスミド不安定性を生じさせることがあり、それが、細菌細胞から得られたプラスミドDNA鋳型が多くの場合、欠失および他の異常でひどく汚染されている理由である。これは、クローニング手順を、労力と時間を要するだけでなく、多くの場合、信頼性をも欠くものにする。これこそが、クローニングなしでポリA/T3'ストレッチを有するDNA鋳型の構築を可能にする方法が非常に望ましい理由である。
【０１５７】
転写DNA鋳型のポリA/Tセグメントは、PCR中に、ポリTテール、たとえば100Tテールを含有するリバースプライマー（サイズは50〜5000Tであることができる）を使用して生成することもできるし、PCR後に、DNAライゲーションまたはインビトロ組換えをはじめとする任意の他の方法によって生成することもできる。ポリ（A）テールはまた、RNAに安定性を提供し、RNAの分解を減らす。一般に、ポリ（A）テールの長さは、転写されるRNAの安定性と正相関する。1つの態様において、ポリ（A）テールは100〜5000アデノシンである。
【０１５８】
RNAのポリ（A）テールは、インビトロ転写ののち、大腸菌ポリAポリメラーゼ（E-PAP）などのポリ（A）ポリメラーゼを用いてさらに延ばすことができる。1つの態様において、ポリ（A）テールの長さを100ヌクレオチドから300〜400ヌクレオチドに増すと、RNAの翻訳効率の約2倍の増加が得られる。加えて、3'末端への様々な化学基の付着がmRNA安定性を高めることができる。そのような付着物は、改変された／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含むことができる。たとえば、ポリ（A）ポリメラーゼを使用してATP類似体をポリ（A）テールに組み込むことができる。ATP類似体はRNAの安定性をさらに高めることができる。
【０１５９】
5'キャップもまた、RNA分子に安定性を提供する。好ましい態様において、本明細書に開示される方法によって生成されるRNAは5'キャップを含む。5'キャップは、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される技術を使用して提供される（Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)；Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)；Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)）。
【０１６０】
本明細書に開示される方法によって生成されるRNAはまた、配列内リボソーム進入部位（IRES）配列を含むことができる。IRES配列は、mRNAへのキャップ非依存性リボソーム結合を開始し、翻訳の開始を促進する任意のウイルス、染色体または人工的に設計された配列であり得る。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化物質および界面活性剤など、細胞膜透過性および生存能力を促進する因子を含むことができる、細胞エレクトロポレーションに適した任意の溶質を含めることができる。
【０１６１】
いくつかの態様において、RNAは、インビトロ転写されたRNAなどの細胞の中にエレクトロポレーションされる。
【０１６２】
方法はまた、たとえば、プロモータまたは投入RNAの量を変えることによって発現レベルを広い範囲で制御する能力を提供して、発現レベルを個別に調節することを可能にする。さらに、PCRベースのmRNA生成技術は、様々な構造およびそれらのドメインの組み合わせを有するmRNAの設計を大幅に促進する。
【０１６３】
本発明のRNAトランスフェクション法の1つの利点は、RNAトランスフェクションが本質的に一過的であり、ベクターを含まないことである。RNA導入遺伝子をリンパ球に送達し、短いインビトロ細胞活性化ののち、任意のさらなるウイルス配列を要することなく、最小限の発現カセットとしてその中で発現させることができる。これらの条件下、導入遺伝子が宿主細胞ゲノムに組み込まれる可能性は低い。RNAのトランスフェクションの効率およびリンパ球集団全体を均一に改変するその能力のおかげで、細胞のクローニングは不要である。
【０１６４】
インビトロ転写されたRNA（IVT-RNA）による細胞の遺伝子改変は2つの異なる方略を利用し、それらのいずれも様々な動物モデルにおいて試験されて成功を収めている。細胞は、リポフェクションまたはエレクトロポレーションにより、インビトロ転写されたRNAをトランスフェクトされる。移入されたIVT-RNAの長期的な発現を達成するために、様々な改変を使用してIVT-RNAを安定化することが望ましい。
【０１６５】
いくつかのIVTベクターが文献において知られており、それらは、インビトロ転写の鋳型として標準的な方法で利用され、安定したRNA転写物が生成されるようなやり方で遺伝子改変されている。現在、当技術分野において使用されているプロトコルは、以下の構造を有するプラスミドベクターに基づく：RNA転写を可能にする5'RNAポリメラーゼプロモータ、次いで、3'および／または5'非翻訳領域（UTR）が隣接する関心対象の遺伝子、および50〜70のAヌクレオチドを含む3'ポリアデニルカセット。インビトロ転写の前に、環状プラスミドは、II型制限酵素によってポリアデニルカセットの下流で線形化される（認識配列が切断部位に対応する）。したがって、ポリアデニルカセットは、転写物中の後のポリ（A）配列に対応する。この手順の結果として、一部のヌクレオチドは線形化後に酵素切断部位の一部として残り、3'末端でポリ（A）配列を延ばす、または隠蔽する。この非生理学的オーバーハングが、そのような構築物から細胞内的に産生されるタンパク質の量に影響するかどうかは不明である。
【０１６６】
RNAは、より従来的なプラスミドまたはウイルス手法を上回るいくつかの利点を有する。RNA供給源からの遺伝子発現は転写を必要とせず、タンパク質産物はトランスフェクションののち速やかに産生される。さらに、RNAは、核ではなく細胞質にアクセスするだけでよく、したがって、一般的なトランスフェクション法がきわめて高いトランスフェクション率を生じさせる。加えて、プラスミドベースの手法は、関心対象の遺伝子の発現を駆動するプロモータが実験下の細胞中で活性であることを必要とする。
【０１６７】
別の局面において、RNA構築物はエレクトロポレーションによって細胞の中に送達される。たとえば、US2004/0014645、US2005/0052630A1、US2005/0070841A1、US2004/0059285A1、US2004/0092907A1に教示されている、哺乳動物細胞中への核酸構築物のエレクトロポレーションの策定および方法を参照すること。任意の公知の細胞型のエレクトロポレーションに求められる電場強度を含む様々なパラメータが当技術分野の関連する研究文献ならびに数多くの特許および特許出願から一般に知られている。たとえば、米国特許第6,678,556号、米国特許第7,171,264号および米国特許第7,173,116号を参照すること。エレクトロポレーションの治療への応用のための装置は市販され（たとえば、MedPulser（商標）DNA Electroporation Therapy System（Inovio/Genetronics, San Diego, Calif.））、米国特許第6,567,694号；米国特許第6,516,223号、米国特許第5,993,434号、米国特許第6,181,964号、米国特許第6,241,701号および米国特許第6,233,482号などの特許に記載されている。エレクトロポレーションはまた、たとえばUS20070128708A1に記載されているように、インビトロで細胞のトランスフェクションに使用されてもよい。エレクトロポレーションはまた、インビトロで核酸を細胞中に送達するために利用されてもよい。したがって、当業者には公知の数多くの利用可能な装置およびエレクトロポレーションシステムのいずれかを利用する、発現構築物を含む核酸の、細胞中へのエレクトロポレーション媒介投与は、関心対象のRNAを標的細胞に送達するための興味をそそる新たな手段を提示する。
【０１６８】
細胞の供給源
1つの態様において、細胞は対象から得られる。対象の非限定的な例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ブタおよびそれらのトランスジェニック種を含む。好ましくは、対象はヒトである。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、臍帯、がん細胞および腫瘍を含む数多くの供給源から得ることができる。特定の態様において、当技術分野において利用可能な任意の数の細胞株を使用し得る。特定の態様において、細胞は、Ficoll分離など、当業者に公知の任意の数の技術を使用して、対象から採取された血液の単位から得ることができる。1つの態様において、個体の循環血からの細胞はアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は通常、T細胞、単球、顆粒球、B細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球および血小板を含有する。アフェレーシスによって採取された細胞を洗浄して、血漿分画を除去し、細胞を適切な緩衝液または培地、たとえばリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に入れてもよいし、または洗浄液は、後続の処理工程のために、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてもよいし、すべてではないとしても多くの二価カチオンを欠いてもよい。洗浄後、細胞を多様な生体適合性緩衝液、たとえばCaを含まない、Mgを含まないPBSに再懸濁させ得る。あるいはまた、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を直接培地に再懸濁させてもよい。
【０１６９】
別の態様において、細胞は末梢血から単離される。あるいはまた、細胞は臍帯から単離されることもできる。いずれにしても、特定の細胞部分集団をポジティブまたはネガティブ選択技術によってさらに単離することができる。
【０１７０】
また、細胞を凍結することもできる。多くの凍結溶液およびパラメータが当技術分野において公知であり、これに関して有用であるが、非限定的な例において、1つの方法は、20％ DMSOおよび8％ヒト血清アルブミンを含有するPBSまたは他の適当な細胞凍結媒体を使用することを含む。そして、細胞を、液体窒素貯蔵タンクの気相中、毎分1℃の速度で−80℃まで凍結させ、貯蔵する。制御された凍結の他の方法ならびに制御せずに−20℃または液体窒素中でただちに凍結させる方法を使用することができる。
【０１７１】
薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載される改変細胞を、1つまたは複数の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、緩衝液、たとえば中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など；炭水化物、たとえばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、たとえばグリシン；抗酸化物質；キレート剤、たとえばEDTAまたはグルタチオン；アジュバント（たとえば水酸化アルミニウム）および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与のために製剤化される。
【０１７２】
本発明の薬学的組成物は、治療（または予防）される疾患に適切なやり方で投与され得る。投与の量および頻度は、患者の状態ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度などの要因によって決まるが、適切な用量は治験によって決定され得る。
【０１７３】
本明細書に記載される改変細胞を含む薬学的組成物は、細胞104〜109個/kg体重、いくつかの例においては細胞105〜106個/kg体重（これらの範囲内のすべての整数値を含む）の投与量で投与され得ると一般に述べることができる。本発明の組成物はまた、これらの投与量で複数回投与されてもよい。細胞またはベクターは、免疫療法において一般に公知である注入技術を使用して投与することができる（たとえば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照）。特定の患者に最適な投与量および治療レジメンは、医学の当業者により、疾患の徴候に関して患者をモニタし、相応に治療を調節することによって容易に決定することができる。
【０１７４】
本発明の改変細胞またはベクターの投与は、当業者に公知の任意の好都合なやり方で実施され得る。本発明の細胞またはベクターは、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、植込みまたは移植によって対象に投与し得る。本明細書に記載される組成物は、患者に対し、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、嚢胞内、筋肉内、静脈内注射により、非経口または腹腔内投与され得る。他の例において、本発明の細胞は、対象中の炎症部位、対象中の局所罹患部位、リンパ節、臓器、腫瘍などに直接注入される。
【０１７５】
本発明において有用であろう方法および組成物は、実施例に記載される特定の策定に限定されないということが理解されるべきである。以下の実施例は、細胞を作製し、使用する方法、増殖および培養方法ならびに発明の治療法の完全な開示および説明を当業者に提供するために記載されるものであり、本発明者らが自らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図したものではない。
【０１７６】
別段の指示がない限り、本発明の実施は、十分に当業者の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を用いる。そのような技術は文献、たとえば"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", fourth edition (Sambrook, 2012)；"Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984)；"Culture of Animal Cells" (Freshney, 2010)；"Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1997)；"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)；"Short Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 2002)；"Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting", (Babar, 2011)；"Current Protocols in Immunology" (Coligan, 2002)において十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に適用可能であり、そのようなものとして、本発明を構成し、実施する際に考慮され得る。特定の態様に特に有用な技術を以下のセクションで詳述する。
【実施例】
【０１７７】
実験例
ここに、本発明を以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は、例証の目的のためだけに提供されるものであって、本発明は、これらの実施例に限定されることなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかとなるすべての変形物を包含する。
【０１７８】
これらの実験において用いられる材料および方法をここに記載する。
【０１７９】
レンチウイルスSAMライブラリーの生産：マウスCRISPR活性化プラスミドライブラリー（lenti-U6-mSAM-EFS-Puro）をエレクトロポレーションによって増大させた（Konermann et al. (2015) Nature 517, 583-588）。エレクトロポレーションで推定ライブラリーカバレッジ＞100×（sgRNA当たりコロニー＞100）を達成し、その後、sgRNAのカバレッジをIlluminaシーケンシングによって配列検証した。レンチウイルス生産のために、lenti-EF1a-NLS-dCas9-VP64-P2A-Blast、lenti-EF1a-MS2-p65-HSF1-P2A-Hygroまたはlenti-U6-SAM-EFS-Puroライブラリーのプラスミド20μgを、pMD2.G 10μgおよびpsPAX2 15μgと一緒に、150mmディッシュ中、80〜90％の密集度のHEK293FT細胞に、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（PEI）130μgを使用して共トランスフェクトした。6〜12時間後、培地を新鮮なDMEM＋10％ FBSに交換した。トランスフェクションの48時間後および72時間後にウイルス上清を収集し、1500gで10分間遠心し、0.45μmのフィルタに通して細胞残屑を除去し；分割して、-80℃で保存した。E0771細胞への感染とその後の5μg/mlのピューロマイシン下での選択によって、ウイルスを力価測定した。
【０１８０】
細胞に基づくCAVacの作製：dCas9-VP64およびMS2-P65-HSF1を安定に発現するE0771細胞（E0771-dCas9-MPH）は、lenti-EF1a-NLS-dCas9-VP64-2A-Blastおよびlenti-EF1a-MS2-p65-HSF1-2A-Hygroを含有するレンチウイルスをE0771細胞に形質導入した後に10μg/mlのブラストサイジンおよび500μg/mlのハイグロマイシンの圧力下で7日間選択することによって作製した。次いで、mSAMライブラリー含有レンチウイルスを用いてMOI 0.2〜0.3で、過去に記載されているようにsgRNA当たり200×形質導入細胞の最小表示で、E0771-dCas9-MPH細胞を形質導入した（Konermann et al. (2015) Nature 517, 583-588）。簡単に述べると、1×108個の細胞に、ライブラリー含有ウイルスを算出MOI 0.2で感染させ、37℃で1日超培養した後、5μg/mlのピューロマイシンを含有する培地と交換し、使用前に7日間形質導入細胞を薬物によって選択した。
【０１８１】
SAM sgRNAライブラリー表示のシーケンシング確認：ライブラリー形質導入細胞を、標準的な分子生物学プロトコルを使用したゲノムDNA（gDNA）抽出に供した。sgRNAライブラリーの読み出しを、2工程PCR戦略を使用して実施し、ここで、第一のPCRは、完全なライブラリー複雑性を保持するのに十分なゲノムDNAを含み、第二のPCRは、第一のPCR由来の産物に適切なシーケンシングアダプターを付加する。
【０１８２】
PCR1プライマー：
2021522188.tif 000022
【０１８３】
Phusion Flash High Fidelity Master Mix（PF）またはDreamTaq Green PCR Master Mix（DT）（ThermoFisher）を使用してPCRを実施した。PFを使用した反応では、PCR#1において、熱サイクルパラメーターは、98℃で1分間、16〜20サイクル（98℃で1秒間、62℃で5秒間、72℃で30秒間）、そして、72℃で2分間とした。DTを使用した反応では、熱サイクルパラメーターを製造業者のプロトコルに従って調整した。各PCR#1反応において、トータルgDNA 3μgを使用した。合計8〜12個のPCR#1反応を使用して、細胞におけるライブラリーのフルリプレゼンテーションを捕捉した。各生体試料についてのPCR#1産物をプールし、バーコード化第二PCRプライマーを用いた増幅に使用した。
【０１８４】
使用したバーコーディング第二PCRプライマー：
2021522188.tif 000023
【０１８５】
PFを使用した反応では、PCR#2において、熱サイクルパラメーターは、98℃で1分間、18〜24サイクル（98℃で1秒間、60℃で5秒間、72℃で30秒間）、そして、72℃で2分間とした。第二PCR産物をプールし、次いで、各生体試料に対して正規化した後、独自にバーコード化された別々の生体試料を組み合わせた。次いで、プールした産物を、QiaQuick kit（Qiagen）を使用して2％ E-gel EX（Life Technologies）からゲル精製した。次いで、精製したプールライブラリーを、Low-Range Quantitative Ladder Life Technologies、dsDNA High-Sensitivity Qubit（Life Technologies）、BioAnalyzer（Agilent）および／またはqPCRを使用したゲルに基づく方法で定量した。5〜20％PhiXを含む希釈したライブラリーを、MiSeq、HiSeq 2500またはHiSeq 4000システム（Illumina）で配列決定した。
【０１８６】
未加工のシングルエンドfastqリードファイルを、Cutadaptを使用して、フィルタリングおよび逆多重化した（Martin et al. (2011) EMBnet.journal 17, 10-12）。sgRNAスペーサー配列の下流（すなわち、3'末端）にある余分な配列を除去するために、以下の設定を使用した：cutadapt --discard-untrimmed -a GTTTTAGAGCTAGGCCAAC（SEQ ID NO: 24,115）。sgRNA表示を読み出すために使用するフォワードPCRプライマーは、マルチプレックスシーケンシングを容易にするために種々のバーコードを有するように設計されていたため、これらのフィルタリングしたリードを次いで以下の設定で逆多重化した：cutadapt -g file:fbc.fasta --no-trim（fbc.fastaは、フォワードプライマー内に12個の可能性のあるバーコード配列を含有した）。最後に、sgRNAスペーサーの上流（すなわち、5'末端）にある余分な配列を除去するために、以下の設定を使用した：cutadapt --discard-untrimmed -g GTGGAAAGGACGAAACACCG（SEQ ID NO: 24,116）。この手順を通して、未加工のfastqリードファイルは、20bpのsgRNAスペーサー配列にまで徐々に減少させることができた。各々の逆多重化した試料由来のこれらの20bpのsgRNAスペーサー配列から、Bowtie 1.1.2（Langmead et al. (2009) Genome Biol 10, R25）: bowtie -v 1 --suppress 4,5,6,7 --chunkmbs 2000-bestを使用して、sgRNAスペーサーをmSAMライブラリーにマッピングさせた。得られたマッピングアウトプットを使用して、ライブラリー内の各sgRNAにマッピングされたリードの数を定量した。sgRNA表示をカウントするために、検出閾値log2rpm≧1を設定し、各試料に存在する固有のsgRNAの数をカウントした。
【０１８７】
マウス：動物研究はすべて、IACUCによって承認されており、承認されたプロトコルを用いて実施された。5〜12週齢の両方の性のマウスを研究に使用した。様々な動物をこの研究で使用した。5〜10週齢のC57BL/6Jマウスを実験に使用した。雌のマウスを乳がんモデルに使用した。雄のマウスを膵臓腺癌（Pan02）モデルに使用した。雄と雌の両マウスの混合を黒色腫（B16F10）モデルに使用した。すべての動物を、12時間：12時間または13時間：11時間の明サイクル、室温（21〜23℃）および相対湿度40〜60％の標準的な個別に換気された病原体除去条件で飼育した。試料サイズは、使用する動物の数に基づいて決定した。使用するマウスの数の事前推定は、その分野の類似の腫瘍モデルに基づいて推定された。動物のコホートが複数の処置を受けるとき、同腹仔、年齢のわずかな違い、ケージ、収容位置（該当する場合）の影響を最小限に抑えるために、1）同腹仔を使用して動物を異なる群に無作為に割り当てること、2）処置前に雌を無作為に混合して、各群の異なるケージからのマウスの均一性もしくは表示を最大にすること、および／または、3）マウスを各群に無作為に割り当てることによって、動物を無作為化した。
【０１８８】
C57BL/6J、Nu/Nu、またはRag1-/-マウスにおけるE0771-SAMの腫瘍形成：5×106個のE0771-SAMまたはE0771-Vector腫瘍細胞を、5〜8週齢の雌のシンジェニックC57BL/6Jマウス、Nu/Nu、またはRag1-/-マウスの同所性乳房脂肪体に注射した。3〜4日毎に測径器によって腫瘍サイズを3つの直径で測定し、式：Vol＝π/6 *x*y*zを用いた近似楕円体としてサイズを計算した。本研究におけるすべての腫瘍成長曲線の統計的有意性を、分散分析（二元配置ANOVA）により、腫瘍成長に対する処置および時間経過の影響を一緒に考慮に入れて評価した。CD4およびCD8 T細胞の枯渇のために、α-CD4（GK1.5、BioXcell）200ugおよびα-CD8（YTS 169.4）200ugを、腫瘍を移植したC57BL/6Jマウスにdpi 7およびdpi 14に腹腔内注射して、腫瘍形成の初期段階でのT細胞の効果を遮断した。dpi 14および21にマウスからPBMCを単離し、CD8＋ T細胞集団をフローサイトメトリーで解析することによって、CD8 T細胞の枯渇の成功を確認した。
【０１８９】
細胞に基づくMAEGIの作製：E0771-SAM細胞（上記）を10ug/mlのマイトマイシンで2時間超処理し、細胞の完全性を維持しながらその増殖能を抑制することによって、細胞に基づくMAEGI（c-MAEGI）を生産した。並行して、マイトマイシンで処理したE0771-Vector（模擬Cell-Vectorと称される）を対照として使用した。また、同じ数のE0771-mSAMおよびE0771-Vector細胞の熱不活化ライセートの治療効果も比較のために使用した。E0771およびc-MAEGIの熱誘導細胞溶解は、65℃で30分間のインキュベーションとそれに続く3回の凍結-融解サイクルを行い、細胞を溶解し、細胞表面のペプチド-MHC複合体の完全性を破壊することによって実施した。
【０１９０】
シンジェニック腫瘍モデルにおけるCAVac（c-MAEGI）の予防的適用：5×106個のmSAM形質導入E0771腫瘍細胞を、5〜8週齢の雌のシンジェニックC57BL/6Jマウスの乳房脂肪体に同所性注射した。CAVac接種の3日後、7日後または14日後に、C57BL/6Jマウスの乳房脂肪体に5×106個のE0771腫瘍細胞を移植した。異なる起源の細胞に由来する腫瘍による負荷のために、E0771-CAVacワクチン接種を受けたC57BL/6Jマウスの横腹に5×106個のLCC細胞を皮下注射した。腫瘍の成長を継続的にモニタリングし、測径器によって週2回測定した。該当する場合には、対応のあるt検定および／または分散分析（ANOVA）によって統計的有意性を評価した。
【０１９１】
シンジェニック腫瘍モデルにおけるCAVac（c-MAEGI）の治療効果：5〜8週齢の雌のC57BL/6Jマウスの乳房脂肪体に2×106個または5×106個のE0771細胞を移植することによって、シンジェニック同所性乳房腫瘍を確立した。移植の4日後、8日後および14日後に、5×106〜1×107個のmSAM形質導入E0771細胞を使用して作製された治療用CAVacを、腫瘍担持マウスの左横腹に皮下（s.c.）注射した。3〜4日毎に測径器を使用して腫瘍を測定し、式：Vol＝π/6 *x*y*zを用いてサイズを計算した。
【０１９２】
AAV-CAVac（AAVに基づくMAEGI）の作製：CRISPR活性化ベクターのAAVバージョン（AAV-CRISPRaベクター、すなわち、U6p-sgSapI-EF1a-MS2-p65-HSF1-WPRE）、およびdCas9ベクターのAAVバージョン（AAV-dCas9、すなわち、EFS-dCas9-VP64-spA）を制限クローニングおよびギブソンアセンブリによって作製した。mSAMのsgRNAライブラリーを、SapI消化による線形化およびギブソンアセンブリによって、上記CRISPRaプラスミドにクローニングした。ギブソン産物の精製およびEnduraエレクトロコンピテントセルへのエレクトロポレーションを、過去に記載されているように（Joung, et al. (2017) Nat Protoc 12, 828-863）、sgRNA当たり表示されるコロニーのカバレッジが少なくとも100×で実施した。CRISPR活性化ベクターまたはライブラリーの上記AAVプラスミド（AAV-mSAM）、AAV9血清型プラスミドおよびヘルパープラスミドPDF6をHEK293FT細胞に共トランスフェクトすることによって、AAV9を生産した。簡単に述べると、AAV-ベクターまたはAAV-mSAM 5.2μg、AAV9血清型プラスミド8.7μgおよびpDF6 10.4μgをPEIと室温で10分間混合した後、150mmディッシュ中、80〜90％の密集度のHEK293FT細胞にそれらを滴下した。複数のディッシュから収集したレプリケートをプールし、生産収率を高めた。トランスフェクションの72時間後に細胞を収集した。AAV9精製のために、1/10体積のクロロホルムを加え、混合物を37℃で1時間激しく振盪した。NaClを加えて終濃度1Mにし、溶解するまで混合物を振盪し、次いで、4℃で15分間、20,000gでペレット化した。水層を廃棄し、一方で、クロロホルム層を別のチューブに移した。PEG8000を10％（w/v）まで加え、溶解するまで振盪した。混合物を4℃で1時間インキュベートし、次いで、4℃で15分間、20,000gでスピンした。上清を廃棄し、ペレットをDPBS＋MgCl2に再懸濁し、Benzonase（Sigma）で処理して37℃で30分間インキュベートした。次いで、クロロホルム（1：1体積）を加え、振盪し、4℃で15分間、12,000gでスピンダウンした。水層を単離し、100kDa MWCO（Millipore）に通した。濃縮した溶液をPBSで洗浄し、濾過プロセスを繰り返した。操作されたU6プロモータを標的とするカスタムTaqmanアッセイ（ThermoFisher）を使用したリアルタイム定量PCRによって、AAVのゲノムコピー数（GC）を判定した。
【０１９３】
CAVac（c-MAEGI）およびモノクローナル抗体を使用した組み合わせ治療：治療用CAVac（c-MAEGI）と免疫チェックポイント遮断またはCD4枯渇との間の相乗効果を調べるために、5mg/kgの抗CTLA4モノクローナル抗体（9D9、BioXcell）、8mg/kgの抗PD1モノクローナル抗体（RMP1-14、BioXcell）またはマウス1匹当たり200μgの抗CD4抗体（GK1.5、BioXcell）を、本明細書の他の箇所に記載のように、CAVacワクチン接種ありまたはなしで、7日目および14日目に腹腔内（i.p.）注射によって投与した。二元配置ANOVAを使用して、処置群間の成長曲線を比較した。完全奏効を経験したマウスの反対側の脂肪体に5×106個のE0771細胞を注射することによって、腫瘍再負荷を行った。
【０１９４】
ELISPOTアッセイ：IFN-γ ELISPOTマウスキット（BD Biosciences）を製造業者の説明書に従って使用した。簡単に述べると、96ウェル濾過プレートを捕捉モノクローナル抗体により4℃で一晩コートした；次いで、プレートを洗浄し、10％ FBSを含有するRPMI-1640培地を用いて室温で2時間ブロッキングした。次いで、RPMI-1640中の脾細胞（1×106個の細胞／ウェル）を加え、その後、5×104個のマイトマイシンで処置したE0771細胞を刺激抗原として加えた；プレートを37℃および5％ CO2でおよそ45時間培養した。DI水で1回、PBSTで3回洗浄した後、プレートをビオチン化検出抗体と室温で2時間インキュベートした。次いで、PBSTで3回洗浄した後、プレートをHRPコンジュゲートストレプトアビジンと室温で1時間インキュベートした。AEC基質試薬キット（BD Bioscience）を室温で使用してスポットを明らかにし、Immunospot Reader（Cellular Technology）を使用してカウントした。
【０１９５】
シンジェニック腫瘍モデルにおけるAAV-CAVac（g-MAEGI）の治療的試験：5〜8週齢の雌のC57BL/6Jマウスの乳房脂肪体に2×106個のE0771-dCas9-VP64細胞を移植することによって、シンジェニック同所性乳房腫瘍を確立した。移植の4日後、10日後、14日後および21日後に、2〜5×1010個のGCのAAV-CAVacまたはPBSを腫瘍担持マウスに腫瘍内注射した。B16F10黒色腫モデルについて、5×105個のdCas9-VP64発現がん細胞をC57BL/6Jマウスの横腹に皮下注射した。移植の7日後、10日後、14日後および20日後に、5〜10×1010個のGCのAAV-CAVac（AAV-g-MAEGI）、AAV-ベクターまたはPBSを腫瘍担持マウスに腫瘍内投与した。膵臓腫瘍モデルについて、2×106個のPan02がん細胞をC57BL/6Jマウスの横腹に皮下注射した。移植の5日後、13日後、21日後および35日後に、5〜10×1010個のGCのAAV-CAVacまたはPBSを腫瘍担持マウスに腫瘍内投与した。3〜4日毎に測径器を使用して腫瘍を測定し、式：Vol＝π/6 *x*y*zを用いてサイズを計算した。
【０１９６】
脾細胞および腫瘍浸潤リンパ球の単離：5〜8週齢の雌のC57BL/6Jマウスの乳房脂肪体に2×106個のE0771細胞を移植することによって、シンジェニック乳房腫瘍を確立した。腫瘍担持マウスを異なる処置群に無作為に集め、PBS、CAVac、ICBモノクローナル抗体、CAVac＋ICB抗体で適宜処置した。移植後35日目にマウスを安楽死させ、腫瘍および脾臓を収集し、氷冷2％ FBS中で維持した。脾臓について、これらを氷冷2％FBS中に入れ、100μmのフィルタに通してすりつぶした。脾細胞を2％FBSで1回洗浄した。脾臓1個当たりACK Lysis Buffer（Lonza）1mlと室温で2分間インキュベートすることによってRBCを溶解し、続いて、それを2％ FBS 10mlで希釈し、40μmのフィルタに通した。脾細胞を2％ FBS緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー染色またはRNA単離のためにカウントした。スカルパーを使用して腫瘍を1〜3mmサイズ片に切り刻み、次いで、37℃で撹拌しながら100 U/mLのCollagenase IVを使用して30〜60分間消化した。腫瘍懸濁液を100μmのセルストレーナーに2回通し、40μmのセルストレーナーに1回通して濾過し、大きな塊を取り除いた。その後、単一細胞懸濁液を直接FACS染色に使用するか、またはさらなるFicoll精製に使用して腫瘍浸潤リンパ球を得ることができる。Ficoll-Paque精製のために、密度（約107個の細胞/ml）の単一細胞懸濁液をFicoll-Paque培地（GE Healthcare）上に慎重に層化し、400gで30分間遠心した。界面にある細胞を慎重に収集し、2％ FBSで2回洗浄し、カウントし、RNA単離またはフローサイトメトリー染色に使用した。
【０１９７】
フローサイトメトリー：抗体はすべてBiolegendから購入した。腫瘍または脾臓由来の単一細胞懸濁液は、過去に記載されているように調製した。表面染色のために、細胞を抗Fc受容体抗CD16/CD32でブロッキングし、PBS＋2％ FBS中、抗CD45.2-APC/Cy7、抗CD3-PE、抗CD4-FITC、抗CD8a-APCで、氷上で30分間表面染色した。BD FACSAriaで分析または選別する前に、試料をPBS＋2％ FBSで2回洗浄した。MAC（登録商標）ワークステーションでFlowJoソフトウェアを使用してデータを解析した。
【０１９８】
腫瘍由来のCD45＋細胞の蛍光活性化セルソーティング（FACS）単離：gentleMACSシステムを「脾細胞および腫瘍浸潤リンパ球の単離」に記載の方法で使用して、単一腫瘍細胞懸濁液を調製した。腫瘍細胞を抗Fc受容体抗CD16/CD32を使用してブロッキングした。LIVE/DEAD（商標）Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kitを製造業者の説明書に従って用いて染色することによって、フローサイトメトリーにおいて生細胞と死細胞を識別した。107個/mlの密度の細胞を、DMSOに溶解した生/死染色色素およびPBS＋2％ FBS中のPerCP/Cy5.5またはAPCコンジュゲートCD45抗体で染色し、氷上で30分間インキュベートした。BD FACSAriaで分析およびFACS単離する前に、染色した細胞を3回洗浄した。PerCP/Cy7＋APC/Cy7−またはAPC＋APC/Cy7−集団に対してゲーティングすることによって、腫瘍浸潤CD45＋ 汎免疫細胞（TIIC）を単離した。選別したTIICをカウントし、scRNAseqおよびELISpot分析に使用した。
【０１９９】
シングルセルRNA-seqによる免疫細胞プロファイリング：腫瘍由来の単一細胞懸濁液を過去に記載されているように調製した。CD45＋細胞単離のために、細胞を抗Fc受容体抗CD16/CD32でブロッキングし、PBS＋2％ FBS中の抗CD45.2を用いて氷上で30分間表面染色した。試料をPBS＋2％ FBSで2回洗浄し、BD FACSAriaを使用して腫瘍中のCD45＋細胞集団をFACS選別した。選別した細胞をPBS＋2％ FBS中に収集し、トリパンブルー染色およびCountess II FL Automated Cell Counter（Thermo）でのカウントによって、細胞数および生存率を評価した。腫瘍から単離した10,000個のCD45+細胞を、10x Genomicsからのプロトコルに従うシングルセルRNAseqに使用した。
【０２００】
シングルセルRNA-seqのデータ処理：汎免疫細胞scRNA-seqデータは、確立されたカスタムパイプラインを使用して前処理した。簡単に述べると、未加工のIlluminaデータファイルは、Cell Ranger 1.3（10x Genomics）（Zheng, et al. (2017) Nat Commun 8, 14049）により、cellranger mkfastqを使用してIlluminaのbcl2fastqをラップし、シーケンシング試料を正確に逆多重化し、バーコードおよびリードデータをFASTQファイルに変換するように処理した。次いで、cellrangerカウントを使用して、FASTQファイルを取得し、マウスゲノム（mm10）へのアライメント（Dobin, et al. (2013) Bioinformatics 29, 15-21）、フィルタリング、およびUMIカウンティングを実施した。Seurat（Butler & Satija (2017) bioRxiv）を使用して、Cell Rangerパイプラインによって課せられた初期品質管理の評価基準をパスした細胞を、ミトコンドリア遺伝子がライブラリーの全％を不均衡に構成していた（経験的に決定されたカットオフがミトコンドリアリード5％）すべての細胞を除外することによって、さらにフィルタリングした。このフィルタを用いて、7,458個の最終細胞セットをさらなる分析のために保持した（最初の7,492個の細胞から）。ログ正規化後、フラットカットオフ評価基準を使用して、分散の低い遺伝子が除外されるように、27,998個の遺伝子/特徴をフィルタリングし、1267個の遺伝子が残った。次いで、データをUMI総カウントおよびミトコンドリアリードの％に基づいてスケール設定した。上記の最後の正規化および処理されたデータセットを使用して、t-SNE次元縮小を実施した（Maaten & Hinton (2008) J. Mach. Learn. Res. 9, 2579-2605; Maaten (2014) J. Mach. Learn. Res. 15, 3221-3245）。個々のデータ点は、各細胞の処置条件に基づいて、またはSeuratで実施された偏りのないk平均クラスタリングに基づいて色付けした。クラスター間および／または処置条件間の差次的発現分析をノンパラメトリックWilcoxon順位和検定によって実施した。複数の仮説補正をBenjamini-Hochberg法によって実施した。有意に差次的に発現された遺伝子を、Benjamini-Hochberg調整p値＜0.05を有すると定義した。
【０２０１】
RNA抽出、逆転写および定量PCR：細胞、脾細胞および腫瘍浸潤リンパ球中のRNAを、TRIzol試薬（Invitrogen）を使用して標準的なRNA抽出プロトコルに従って抽出した。SuperScript（商標）IV Reverse Transcriptase（Invitrogen）を使用してRNAのファーストストランドcDNAを合成した。cDNAの濃度をヌクレアーゼフリー水で正規化した後、関心対象の遺伝子の指定されたTaqmanプローブを加えることによって定量PCR（qPCR）を実施し、GAPDHを内部陽性対照として使用した。
【０２０２】
ウエスタンブロット：6ウェルプレート内のE0771、E0771-dCas9-VP64およびE0771-dCas9-VP64-MPH細胞を氷冷PBSで2回洗浄した後、1×RIPA緩衝液で溶解し、それを氷上で15分間維持した。細胞ライセートを、4℃で15分間、12,000gで遠心し、タンパク質を含有する上清を収集した。標準的なBradfordアッセイ（BioRad）を使用してタンパク質濃度を測定し、各試料中のタンパク質20μgをSDS-PAGEゲルにロードした。電気泳動後、ゲル内で分離されたタンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写した。TBST中5％スキムミルクを使用してメンブレンを室温で1時間ブロッキングし、続いて、一次抗体と4℃で一晩インキュベートした。TBSTで3回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲート二次抗体を加えて、室温で30〜60分間インキュベートした。化学発光基質（Clarity Western ECL Substrate, Bio-Rad）を製造業者の説明書に従ってブロットメンブレンの上部に加えた。CCDカメラを搭載したイメージャー（GE Healthcare）を使用してシグナルを捉えた。
【０２０３】
組織学および免疫組織化学：一致した時点に、異なる処置群からの腫瘍を収集し、10％中性ホルマリン中で2〜5日間固定した。長期貯蔵のために組織を70％エタノール中に移した。ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色または抗体染色を、標準的な手順を使用して3〜5μmの組織切片に対して実施した。
【０２０４】
T細胞受容体シーケンシング（TCR-seq）：異なる処置群のマウスを移植の30〜40日後に安楽死させた。腫瘍および脾臓を収集し、使用するまで氷冷2％FBS中に維持した。腫瘍または脾臓由来の単一細胞懸濁液を過去に記載されているように調製した。収集した脾細胞およびTIL由来のRNAを、Trizolを使用して製造業者の説明書に従って抽出した。
【０２０５】
TCR-seqデータ解析：TCR-seqからの未加工のfastqファイルは、MiXCRを使用し、5' RACEに基づくライブラリープロトコルに関する著者の推奨に従ってクローン型に処理した（Bolotin, et al. (2015) Nat Methods 12, 380-381）。具体的には、最初にmixcrアライン関数を使用してVセグメント転写物にアラインし、続いて、mixcrアセンブルおよびmixcr exportClonesを使用してクローン型アセンブリを行った。その後、tcRパッケージ（Nazarov, et al. (2015) BMC Bioinformatics 16, 175）を使用してTCR-seqデータを解析し、各試料におけるクローン割合および占有クローンホメオスタシスを判定した。生態的多様性、ジニ・シンプソンおよびChao指数を使用して、多様性の評価基準を算出した。
【０２０６】
E0771のエクソームシーケンシングおよびすべての遺伝子変異スペクトラムの特定：E0771細胞および健常な未処置の6〜8週齢の雌のC57BL/6Jマウスから新たに切開した乳房脂肪体を標準的なプロトコルに従うgDNA抽出に供した。1試料当たり合計2μgのgDNAを、製造業者のプロトコルに従って、マウスエキソームプローブ（Roche）を使用したエキソーム捕捉、次いで、Illuminaライブラリー調製に供した。エキソーム捕捉ペアエンドfastqファイルを、Bowtie v2.2.9（Langmead et al. (2009) Genome Biol 10, R25）を使用してmm10ゲノムにマッピングし、Samtools（Li et al. (2009) Bioinformatics 25, 2078-2079）によってソートした。次いで、VarScan v2.3.9（Koboldt, D. C. et al. (2012) Genome Res 22, 568-576）をソマティックモードで使用して、E0771細胞に特異的であったが野生型C57BL/6J乳房脂肪体組織に見られなかったインデルおよびSNPをコールした。その後、生殖細胞系列コールをフィルタリング除去した。残りのバリアントを遺伝子レベルまで分解し、各遺伝子についてのインデルまたはSNPの数を表にした。
【０２０７】
変異スペクトラムによってガイドされた精密AAV-CAVac（AAV-PCAVac/AAV-p-MAEGI）の作製：遺伝子を、E0771細胞中に存在するが健常な乳房脂肪体中に存在しない体細胞バリアントの数によってランク付けした。1,116個の上位変異遺伝子のセットをE0771において差次的に変異した遺伝子として選び、プロモータ領域を標的とする（遺伝子の大部分について）1遺伝子当たり3個のsgRNAを選んだ。3,839個のsgRNA（SEQ ID NO：349〜4,187）からなるCRISPRaライブラリーを、E0771の上位変異遺伝子セット用に設計し、プール合成し（Customarray）、上記のAAV-CRISPRaベクターにクローニングした。AAVライブラリーパッケージングを上記のとおり行って、E0771用のAAV-PCAVacを作製した。
【０２０８】
AAV-PCAVac（p-MAEGI）の治療的試験：5〜8週齢の雌のC57BL/6Jマウスの乳房脂肪体への2×106個のE0771細胞の同所性移植によって、シンジェニックTNBCを確立した。腫瘍誘導の5日後、12日後および18日後に、5×1010〜1×1011個のGCのAAV-CAVac、AAV-ベクターまたはPBSを腫瘍担持マウスに腫瘍内投与した。遠達効果の試験のために、同側の乳房脂肪体への2×106個のE0771細胞、反対側の乳房脂肪体への2.5×105個のE0771細胞の同所性移植によって、シンジェニックTNBCを確立した。腫瘍誘導の4日後、11日後、18日後および24日後に、5×1010〜1×1011個のGCのAAV-p-MAEGIまたはAAV-ベクターを同側の腫瘍に腫瘍内投与した。3〜4日毎に測径器を使用して腫瘍を測定し、式：Vol＝π/6 *x*y*zを用いてサイズを計算した。二元配置ANOVAを使用して、処置群間の成長曲線を比較した。治療に対する応答を、RECIST 1.1基準に類似の方法によって定義した（CR、完全奏効、この場合、終点の腫瘍サイズ＝0；Near-CR、完全奏効に近い奏効、この場合、最後の2回の測定で腫瘍サイズ＜50mm3；PR、部分奏効、この場合、少なくとも2回の連続した測定で腫瘍サイズが減少；SD、病態安定、この場合、腫瘍サイズは、最初の処置時の初期腫瘍サイズの70〜100％の間である；PD、病態進行、この場合、腫瘍サイズ＞最初の処置時の初期腫瘍サイズ）。
【０２０９】
実験の結果をここに説明する。
【０２１０】
実施例1：内因性遺伝子活性化は、予防的抗腫瘍応答を誘導する
変異プロファイルは患者間で劇的に変動し得る。したがって、汎用の多重腫瘍ワクチン接種の概念を調査するために、すべての内因性コード遺伝子の偏りのない活性化が、増強されたインビボ抗腫瘍応答を導くことができるかどうかを最初に実験で調べた。完全に免疫応答性の宿主の乳房脂肪体にE0771細胞が移植された、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）のシンジェニックマウスモデルを使用した。dCas9-VP64およびMS2-p65-HSF1を発現するレンチウイルスベクターでE0771細胞を形質導入した（E0771-dCas9-MPH）（図1A）。CRISPRaシステムによるロバストな内因性遺伝子活性化を確認した後（図5B）、マウスのゲノムスケールレンチウイルスSAM CRISPRa sgRNAライブラリー（mSAM、または略してSAM）（Konermann et al. (2015) Nature 517, 583-588）をE0771-dCas9-MPH細胞に形質導入し、ライブラリー全体を包含する高度に多様な細胞集団（E0771-SAM）を作製した。これは、インビボ実験で使用した6つの独立したレプリケートすべてについてのライブラリー表示のIlluminaシーケンシング読み出しによって確認された（図5A〜5B）。E0771-SAM細胞プールをC57BL/6Jマウスに移植して、シンジェニック腫瘍を形成するその能力を調べた。ベクター形質導入E0771細胞（拒絶0/8、すなわち、生着8/8、すべてが大きな腫瘍を有する）とは際立って対照的に、E0771-SAM細胞プールは、ほとんどのマウス（42/50、84％）で拒絶され、残りの8/50（16％）では小さな腫瘍に成長した（p＜2.2e-16、図6A〜6B）。注目すべきことに、E0771-SAMで大きく成長した腫瘍は、チェックポイント遮断免疫療法（CBI）に感受性であり、プログラム死-1（PD-1）または細胞傷害性T-リンパ球関連抗原-4（CTLA-4）に対するモノクローナル免疫チェックポイント遮断（ICB）抗体の処置下で急速な完全退縮に至った（p＜1e-5、図7A〜7D）。腫瘍拒絶応答における自然免疫応答および適応免疫応答の役割を調べるために、E0771-SAM細胞を免疫不全Nu/NuマウスおよびRag1-/-マウスの乳房脂肪体に移植した。免疫応答性のC57BL/6J宿主（小さなモジュールあり2/5、腫瘍フリー3/5）とは際立って対照的に、すべてのNu/Nuマウス（4/4）およびRag1-/-マウス（5/5）で、E0771-SAMから大きな乳房腫瘍が成長した（p＜1e-5、図6C〜6F）。特に、E0771-SAMは、Nu/Nuマウスにおける腫瘍と比較して、Rag1-/-マウスにおいて有意に大きな腫瘍を形成した（p＜0.0001、図6C）。さらに、抗CD4＋抗CD8両モノクローナル抗体での処置によってC57BL/6JマウスにおいてCD4＋ T細胞とCD8＋ T細胞の両方を薬理学的に枯渇させたとき、E0771-SAM移植を受けたすべてのマウスが大きな腫瘍を形成し（4/4）、この場合も同じく未処置（0/11）とは際立って対照的であった（p＜1e-9、図6G〜6H）。まとめると、これらの結果は、CRISPRaシステムをゲノムスケール様式で使用した内因性遺伝子の活性化が、インビボで強力な予防的抗腫瘍免疫応答を誘導し、免疫応答性の宿主によるシンジェニックがん細胞のロバストな腫瘍拒絶を導いたことを示した。
【０２１１】
実施例2：予防用および治療用がんワクチンとしての大規模並列遺伝子活性化
E0771-SAMライブラリー細胞が宿主によって一貫して拒絶されたという観察は、内因性遺伝子の多重活性化が、広範な抗腫瘍免疫応答を刺激して同じタイプの腫瘍から宿主を保護することができ、それにより予防用または治療用ワクチンとして役立つという推論を導いた（図1A）。ワクチンとしてのCRISPRa媒介性内因性遺伝子活性化（CAVac）の適用を調べるために、ゲノムスケールCRISPRa sgRNAライブラリーをE0771-dCas9-MPH細胞に形質導入し、続いて、マイトマイシン処理して老化を誘導することによって、E0771-CAVacを作製し、次いで、細胞に基づくワクチン（E0771-CAVac、または略してCAVac）として試験した。予防ワクチンの概念を調べるために、腫瘍誘導の前にC57BL/6JマウスにE0771-CAVacを接種した（図1A）。ワクチン接種を受けていないマウス（腫瘍フリー0％）とは際立って対照的に、E0771-CAVacによるワクチン接種は、2種のワクチン接種レジメン（腫瘍負荷の7日前または14日前）の各場合で、その後の未改変の親がん細胞株（E0771）による腫瘍負荷に対して宿主の完全な保護（腫瘍フリー100％）を付与した（それぞれ、p＜2.2e-16、2.2e-16）。腫瘍負荷の3日前のワクチン接種も、宿主にほぼ完全な保護を付与した（小さなモジュールありのマウス1/6、腫瘍フリー5/6）（p＜1e-10）（図1B）。結果は、CRISPRaを使用した内因性遺伝子のゲノムスケール活性化が、それ以外の点では同一の遺伝的背景を有する腫瘍に対して予防的ワクチン接種をもたらす有効なアプローチであることを実証した。
【０２１２】
治療的介入としてのCAVacを調べるために、CAVacでマウスを処置する前に同所性シンジェニックE0771腫瘍を誘導した（図1A）。3用量処置スキームに続いて、CAVacで処置したマウスの腫瘍は、PBSで処置したものよりも有意に小さかった（p＜0.05、図1C、図8A〜8B）。遺伝子活性化なしの親細胞株を使用して、効果は観察されなかった（p＝0.77、図9A）。さらに、CAVacを熱不活化したら治療効果は無効化された（p＝0.775、図9B）。注目すべきことに、単回用量のCAVac処置でも、3用量処置と同等な効力を達成した（p＜0.05、図9C）。実験の最後に、腫瘍の組織病理学を分析したところ、炎症がほとんどなくCD8＋細胞がわずかである急速に増殖しているPBS処置腫瘍と比較して、CAVacで処置した腫瘍ではCD8＋リンパ球を有する大きな炎症部位およびがん細胞死が観察された（図1D〜1E）。抗腫瘍効果が（少なくとも部分的に）がん特異的T細胞応答によって媒介されたかどうかを調査するために、酵素結合免疫スポット（ELISPOT）アッセイを実施した。CAVacは、ワクチン接種を受けたマウスの腫瘍特異的インターフェロンγ（Ifnγ）産生を有意に増強させた（p＜0.05、図1F〜1G）。さらに、抗CD8抗体によるCD8＋ Tリンパ球単独（CD4＋ Tリンパ球ではない）の枯渇は、CAVacの治療効力を無効にし（図9D）、このことは、CAVacによって誘発される抗腫瘍応答にCD8＋ T細胞が不可欠であることを示している。
【０２１３】
CAVacを他の免疫療法または免疫調節と併せて使用できるかどうかを調べるために、CAVac処置を組み合わせ抗CTLA4において試験した（図1H）。CAVac＋抗CTLA4の組み合わせは、同じE0771 TNBCシンジェニックモデルにおいてCAVac単独（p＜1e-7）と抗CTLA4単独（p＜1e-4）の両方の効力を強化し、その結果、確立された腫瘍の完全退縮を（図1I〜1J；図8C〜8E）、実験の終了と共に90日目までいかなる再発も観察されることなく導き（図8G）、このことは、これらのマウスにおける長期保護記憶を示唆している。免疫抑制微小環境は、抗腫瘍免疫応答およびチェックポイント遮断免疫療法の鈍化の主な寄与因子であることが知られており、この場合、CD4＋制御性Tリンパ球がしばしば、乳がんにおいてCD8＋ T細胞の細胞傷害効果を負に調節している。この理由から、CAVacの効力にCD4＋ T細胞の枯渇が影響を及ぼし得るかどうかを調べた。モノクローナル抗CD4抗体を使用したCD4＋枯渇は、CAVacの効力を有意に強化し（p＜1e-4、図1I〜1K；図8C〜8D＆8F）、この場合、CAVac＋抗CD4の組み合わせは、確立された腫瘍のほぼ完全な退縮を導いた（図1K；図8F）。
【０２１４】
実施例3：確立された腫瘍に対するAAV-CAVacを使用した多重化インサイチューワクチン接種
生細胞に基づくワクチンは、臨床への転換に対して明確な限界があるため、直接のインビボ腫瘍ワクチン接種のためのCAVacを運ぶより安全な送達ビヒクルを調査した。アデノ随伴ウイルス（AAV）は、マウスモデルおよびヒトにおいて様々な臓器への効率的な導入遺伝子送達を媒介することが示されている、強力な非伝播性ウイルスベクターである。これらの特性のため、AAVは、遺伝子療法のための臨床試験においてよく使用されており、FDAの承認を最近受けた。CAVacの直接送達を可能にするために、AAV-CRISPRaベクターを作製してSAMモジュールならびにゲノムスケールsgRNAライブラリーをクローニングし、次いでAAV9にプールパッケージングすることによる、CAVacのAAVバージョン（AAV-CAVac）が考案された（図2A）。内因性遺伝子を活性化する際のプールパッケージングしたAAV-CRISPRaの有効性は、Cd70、Cd80およびCD86を含む遺伝子を標的とする小さなsgRNAプールを保有するAAVを腫瘍細胞に感染させることによって確認した（図10A）。シンジェニック同所性E0771腫瘍を担持するC57BL/6Jマウスを、この形態のワクチンで腫瘍内投与によって処置した（図2A）。PBS（p＝0.00014、図2Bおよび図10B〜10D）およびAAV-ベクター（p＝0.0078、図2Bおよび図10B〜10D）と比較して、これらの腫瘍に対するAAV-CAVac単独の強い効果が観察され、マウスの一部（3/9、33％）が完全またはほぼ完全な退縮を示した（図10D）。注目すべきことに、AAVベクター処置は、E0771モデルにおいて腫瘍に対して中程度であるが統計的に有意でない効果を示したが、AAV-CAVacの効果よりも有意に弱かった（p＝0.26、図2B）。AAV-CAVの広範な有用性を調べるために、シンジェニック転移性黒色腫マウスモデル（B16F10）に対して類似の処置を実施し、この場合も同じく、有意な効力を実証した（図2C、図10C〜10D）。実験の最後に、腫瘍の組織病理学を分析した。PBSまたはAAV-ベクターで処置した腫瘍における急速な増殖および稀なCD8＋リンパ球浸潤と比較して、AAV-CAVacで処置した腫瘍においてCD8+リンパ球を有する大きな炎症部位およびがん細胞死が観察された（図2D〜2E）。ELISPOTを使用して、AAV-CAVacは、PBS（p＝0.0028、図2F〜2G）およびAAV-ベクター（p＝0.005、図2F〜2G）と比較して、はるかにより強い抗腫瘍T細胞応答を誘発した（IFNγ産生脾細胞に関して）ことが確認された。PBSとAAV-ベクターとの間でT細胞IFNγ応答に差は観察されなかったが（図2F〜2G）、このことは、AAV-ベクターに由来する中程度の抗腫瘍効果がT細胞によって媒介される可能性が低いことを示唆している。後ろ向き比較は、AAV-CAVacが、PBSで処置した腫瘍が類似の動態で成長した状況下（p＝0.3）、細胞に基づくCAVacと比較してより強い効力を有することを示した（対応のないt検定、両側、p＝0.016）。これらのデータは、CAVacのAAV媒介送達によるインサイチューワクチン接種が、確立された腫瘍に対する特異的な宿主免疫応答を増強できることを示した。
【０２１５】
実施例4：AAV-CAVacは、宿主腫瘍微小環境を再構成する
宿主腫瘍微小環境に対するAAV-CAVacの効果を調査するために、シングルセルRNAシーケンシング（scRNA-seq）を実施して、腫瘍浸潤免疫細胞（TII）の全集団およびそれらの遺伝子発現シグネチャーを同時にプロファイリングした（図3A）。終点腫瘍の単一細胞懸濁液から、CD45＋免疫細胞の蛍光活性化セルソーティング（FACS）によって総TIIを単離し、次いで、AAV-CAVacで処置したマウス由来の合計2,075個のCD45＋細胞を、PBSで処置したマウス由来の5,383個と共に配列決定した（図3B〜3C）。クラスタリングおよび次元縮小を使用して、AAV-CAVac群およびPBS群の両方から合計11個のTIIの固有のクラスターを特定した（図3B〜3C）。際立ったことに、これらのクラスターのほとんど（10/11）は、PBSと比較してAAV-CAVacにおいて強いシフトを示す（p＜0.001、図3D）。クラスター特異的発現分析は、各クラスターに特異的な遺伝子シグネチャーを明らかにした。特に、最初のクラスター（クラスター#0）は、PBSと比較してAAV-CAVac TII集団において大幅に増加した（総細胞の54.75％対2.23％、p＜2.2 * 10-16、図3D）。この集団は、高レベルのMHCクラスII転写物（H2-Aa、H2-Ab1およびH2-Eb1など）を有しており、これは抗原提示細胞に特徴的である（図3E）。二番目の最も豊富な集団（クラスター#1）は、PBSと比較してAAV-CAVac TII集団において減少した（図3D〜3E）。この集団は、Ifit（テトラトリコペプチドリピートを有するインターフェロン誘導タンパク質）遺伝子ファミリーなどの自然免疫細胞に関連する遺伝子を発現した。
【０２１６】
興味深いことに、Cd3d、Cd3gおよびGzmb（グランザイムB）転写物の高度な差示的発現に起因してT細胞と類似性をもつクラスター#9（図3E）は、AAV-CAVac TII集団内で有意な比例的増加を示した（図3D）。クラスターによる差次的発現分析は、各細胞集団において有意に変化した遺伝子発現を明らかにした。例えば、Ccl7およびCcl8は、PBSの場合と比較して、AAV-CAVac TII集団のクラスター#0において有意にアップレギュレーションされたが、PkmおよびAldoaは有意にダウンレギュレーションされた（図11A）。また、クラスター#1におけるTIIも、Ccl8のアップレギュレーションおよびPkmのダウンレギュレーションを示した（図11B）。AAV-CAVac TII集団内の推定T細胞クラスター（#9）は、Ccl8、mt-Nd2（ミトコンドリアにコードされたNADH：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット2）およびGm26917（未特定遺伝子）などの遺伝子の発現上昇を示し、Hmox1（ヘムオキシゲナーゼ1）などの遺伝子をダウンレギュレーションした（図11C）。
【０２１７】
T細胞受容体シーケンシング（TCR-seq）を実施して、CAVacワクチン接種を受けたマウス、AAV-CAVacワクチン接種を受けたマウスおよびワクチン接種を受けていないマウスにおいてTCRレパートリーをプロファイリングした（図12A）。脾臓は高度に多様なTCRレパートリーを保存した一方で、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）においてクローンのサブセットのクローン増大が観察された（図12B〜12C）。興味深いことに、ワクチン接種を受けた動物のすべてで、腫瘍サイズが減少するにつれてクローン分布のジニ・シンプソン指数が有意に減少し、ここで、より小さなジニ・シンプソン指数は、クローンサイズ分布におけるより大きな歪度を表す（R＝0.54、p＝0.036、図12D）。この知見は、増強された抗腫瘍活性が、インビボでのより強力な選択に関連することを暗示した。TILの相補性決定領域3（CDR3）ペプチド配列の調査は、CAVacおよびAAV-CAVacのワクチン接種を受けた腫瘍において最も優位なクローンを明らかにし、その中で一部のクローンは、最大20.7％の極めて高い頻度に達することができる（図12E）。これらの観察は、まとめると、AAV-CAVacによるワクチン接種が宿主腫瘍微小環境を有意に変化させたことを明らかにした。
【０２１８】
実施例5：概念実証の多重化精密ワクチン接種としての変異遺伝子のプール活性化
個々の腫瘍それぞれがその固有の変異プロファイルを有するので、AAV-CAVacシステムもまた、精密な標的指向型ライブラリー設計（精密AAV-CAVac、またはAAV-PCAVac）の適応によって、カスタマイズされた一連の変異内因性遺伝子を活性化することが可能であった（図4A）。AAVライブラリーを内因性遺伝子活性化向けにカスタマイズすることは、潜在的に抗原性の変異体を濃縮し、かつ、潜在的に有害作用を引き起こす遺伝子を選択的に排除した。E0771がん細胞の全エクソームシーケンシングを実施し、すべてのSNP、挿入および欠失（インデル）を、すべてのアノートされた遺伝子において、野生型C57BL/6Jマウス由来の健常な乳房脂肪体との比較によってコールした（図4A）。全E0771特異的変異プロファイルが明らかになった（図4B〜4C）。これらのデータを、CRISPRa sgRNAライブラリー設計に送り、1,116個のE0771変異遺伝子を標的とする3,839個の活性化sgRNA（SEQ ID NO：349〜4,187）のライブラリーを作製した（図4A＆4C）。ライブラリーを合成してプールクローニングし、E0771特異的精密ワクチン（E0771 AAV-PCAVac）を作製した（図4A）。E0771シンジェニック同所性TNBCを担持するC57BL/6Jマウスを、AAV-PCAVacで処置したところ、強い効力が観察された（p＜1e-7、図4D〜4G）。注目すべきことに、AAVベクターで処置した群において中程度ではあるが統計的に有意でない効果が認められた（p＝0.25、図4E）。際立って対照的に、AAV-PCAVacで処置した腫瘍はすべて、PBSで処置した群のすべてのマウスおよびAAVベクター群のほとんどのマウスにおける大きくかつ急速に成長している腫瘍と比較して、処置後3週間以内に完全に退縮したか、サイズがゼロに減少したか、または小さなモジュールとして残った（図4D〜4F）。長期観察で再発の徴候が検出されなかったので、AAV-PCAVacの治療有益性は、完全退縮を経験したマウスにおいて持続する（図4F）。
【０２１９】
ELISPOTを使用して、AAV-PCAVacが、PBS（p＜0.001）およびAAV-ベクター（p＜0.01）と比較して、ワクチン接種を受けたマウスにおいて腫瘍特異的なIfnγ産生脾細胞を有意に増強したことが観察された（図4G〜4H）。適応免疫応答を調査するために、脾臓と腫瘍の両方に由来するT細胞集団に対してFACS解析を実施した（図13A〜13B）。脾細胞集団では、AAV-PCAVac処置は、CD4＋およびCD8＋ T細胞の存在量を、総細胞においてかつCD45＋相対分画において有意に増加させた（図4H〜4I、図15A〜15B）。例えば、AAV-PCAVacで処置したマウスは、PBSおよびAAVベクターで処置したマウスと比較して2.4倍を超えるCD8＋ T細胞の増加を有する（p＜0.01、図4I、図5B）。これらの観察はTIL集団においても当てはまり（図4J〜4K、図15C〜15D）、例えば、AAV-PCAVacで処置した腫瘍は、PBSで処置したマウスと比較して平均15倍多くのCD8＋ TILを有し（p＜0.05、図4K、図5D）、このことは、AAV-PCAVac処置によって誘導された強い抗腫瘍免疫応答と一致する（図4D〜4G）。これらのデータは、まとめると、AAV-PCAVacが、特異的な抗腫瘍免疫応答を刺激して、確立された腫瘍の有意な退縮または排除をもたらす強力な手段であることを明らかにしており、このことは、費用効果の高い精密多重ワクチン接種アプローチの概念実証となる。
【０２２０】
実施例6：考察
悪性腫瘍細胞を破壊するために免疫系を利用する新たな技術は、がん治療法を変容させた。がん免疫療法の概念は、1世紀以上前に初めて提唱され、その後、免疫系が免疫監視理論で腫瘍細胞を認識および排除できることが正式に提唱されたときに再び活力が与えられた。しかしながら、現在、がんは、これらの免疫圧力に急速に適応することができ、多くの異なる機序を使用して免疫排除を逃れる新たな変化を獲得することが知られている。腫瘍細胞は、免疫認識を低下させるまたは細胞傷害性殺傷への耐性を増加させる変異を獲得することができ、また様々な異なる方法で免疫抑制微小環境を助長することもできる。細胞傷害性Tリンパ球（CTL）は、抗腫瘍免疫において、最も顕著なことには腫瘍関連抗原（TAA）に応答した腫瘍細胞の特異的殺傷により、重要な役割を果たしている。エクスビボで増大された天然に存在するまたは操作されたキメラ抗原T（CAR-T）細胞の養子移入は、複数のタイプの液性がんの免疫療法において成功を収めてきた。しかしながら、不十分な浸潤、アネルギー、枯渇および抑制的微小環境を含めた多くの要因が、固形腫瘍においてT細胞に基づく処置の非応答性を導き得る。共刺激性および共阻害性の受容体は、T細胞の状態および運命において極めて重大な役割を果たしている。例えば、CTLA-4およびPD-1は、自己免疫を回避するために免疫応答を加減するように設計されたT細胞上の2つの重要な受容体であるが、これらは、腫瘍によって抗腫瘍免疫を遮断するように操作され得る。CTLA-4およびPD-1を抗体で遮断することによる免疫チェックポイント遮断療法は、転移性および化学療法抵抗性の腫瘍であっても、多くの腫瘍タイプにわたって永続性のある応答を伴い有意な臨床的有益性をもたらしてきた。それにもかかわらず、一部の患者だけが持続した臨床応答を示し、このことは、他の治療的アプローチまたは組み合わせ治療法の必要性を実証している。本発明は、そのようなアプローチを提供する。
【０２２１】
ワクチン接種は、永続性のある適応免疫防御の刺激におけるその効力に起因して、感染因子からの宿主の保護において並外れた成功を収めてきた。しかしながら、治療用ワクチンに基づく承認されているがん治療は不十分である。腫瘍抗原認識は、T細胞媒介腫瘍拒絶に重要であり、TAA、とりわけネオアンチゲンの負荷は、細胞溶解性T細胞活性化および患者の免疫チェックポイント遮断への応答性と相関することが示されている。しかしながら、変異および自己抗原の自発的な免疫認識は、通常、がん免疫編集などの複雑なインビボのがん-免疫進化過程に起因して、有効な腫瘍拒絶にとって非効率的である。これはまた、ヒト黒色腫におけるネオアンチゲンのランドスケープ動態が、がん細胞-T細胞相互作用によって共有される臨床状況下でも観察された。ワクチン接種は、潜在的に、がん特異的変異体の免疫認識を強化する有効なアプローチである。しかしながら、多くの要因が、有効な抗腫瘍応答の媒介におけるワクチンの効力の欠如に寄与し得る。最新のワクチンは、T細胞による有効な抗腫瘍応答を媒介することも、免疫編集および他の機序による腫瘍回避に対抗することもできない。特に、誘引されたT細胞受容体のペプチド-MHCクラスI（p-MHCI）複合体への低親和性および進行がんにおける抗原レパートリーのシフトが、多くのワクチン製剤、とりわけ1つだけまたは少数のポリペプチドを有するワクチン製剤の効力の欠如の根底にある潜在的理由である。ハイスループットエクソームシーケンシングを用いて、患者特異的変異を標的とする個別化された免疫療法の概念が技術的に実現可能となりつつあり、ペプチドおよびRNAに基づくワクチンを使用した最近の研究は、変異したネオアンチゲンの標的指向型送達が強い抗腫瘍効果をもたらすことができることを示している。有効なペプチドまたはRNAの大規模スクリーニングおよび作製は、高価で時間のかかるものである。RNAまたはペプチドのサブセットの選択は、フルスペクトルの内因性変異において他の免疫原性ネオアンチゲンを見逃す可能性があり、それによって腫瘍進化を経て継続した免疫回避の可能性が残る。さらに、ペプチドとRNAは共に、比較的短い半減期を有する。有効な抗腫瘍免疫応答の長期的な誘導のために、抗原の持続的発現が有益となる可能性がある。内因性遺伝子の直接活性化は、ネオアンチゲンのシグナルを増幅するために持続かつ調整可能な変異遺伝子の過剰発現を提供することによってこれらの課題を克服する（図14）。CRISPRaライブラリーを使用したプールされた遺伝子活性化は、任意の選択された遺伝子セットまたは全ゲノムの発現を増強するようにカスタマイズすることができ、それによって、T細胞認識のためのネオアンチゲン提示が強化される。ここで観察された抗腫瘍応答の根底にある作用機序は、T細胞単独が関与するよりもさらに複雑である可能性が高いが、データは、CAVac、AAV-CAVacおよびAAV-PCAVacを含めた内因性遺伝子活性化に基づく治療が、他の確立された免疫療法モダリティと協力して機能することができる、次元の異なる（orthogonal）がん免疫療法用ワクチン接種アプローチを提供することを実証している。
【０２２２】
実施例7：ヒト腫瘍に対する精密多重腫瘍ワクチン接種（AAV-PCAVac）としての、エキソームによってガイドされるAAV-CRISPRaに基づく変異遺伝子セット活性化
工程1−患者腫瘍プロファイリング：
コア生検由来の腫瘍試料および正常試料（末梢血）のゲノムDNAを抽出し、精製し、全エクソームシーケンシングに供する。
任意：コア生検由来の腫瘍試料および正常試料（末梢血）のRNAを抽出し、精製し、RNAシーケンシングに供して遺伝子発現を検出し、これをまた、変異コールおよび潜在的な抗原性変異体の発現の両方に使用する。
【０２２３】
工程2−変異マッピングおよび変異体遺伝子のランク付け：
がん細胞における体細胞SNPおよびインデルを、一致した正常組織との比較によって特定し、変異を各遺伝子にマッピングする。
【０２２４】
工程3−CRISPRa sgRNAライブラリー設計：
これらの変異体を標的とするCRISPRa sgRNAを設計する。変異遺伝子セットがカスタマイズされたsgRNAライブラリーを合成して、AAV-CRISRPaベクターにプールクローニングし、これをAAV9にパッケージングして、腫瘍-変異が一致した（精密／個別化）AAVワクチン（AAV-PCAVac）を作製する。
【０２２５】
工程4−AAV GMP/cGMP：
AAV-PCAVacを生産および品質検査のためにGMP/cGMPに供する。
【０２２６】
工程5a−切除不能腫瘍へのAAV-PCAVac送達：
臨床試験または臨床処置の状況下で、臨床医は、特定の変異遺伝子を保有する残留または潜在的に転移したがん細胞に対して免疫応答を誘発する処置として、切除不能疾患である原発性または転移性腫瘍部位にAAV-PCAVacを送達する。
【０２２７】
工程5b−外科手術のアジュバントとしての腫瘍へのAAV-PCAVac送達：
臨床試験または臨床処置の状況下で、臨床医は、特定の変異遺伝子を保有する残留または潜在的に転移したがん細胞に対して免疫応答を誘発するアジュバント処置として外科手術後に残留腫瘍部位にAAV-PCAVacを送達する。
【０２２８】
実施例8：既存の方法との比較ならびに本発明の独自性および利点の考察
ハイスループットエクソームシーケンシングを用いて、患者特異的変異を標的とする個別化された免疫療法の概念が技術的に実現可能となりつつあり、ペプチドおよびRNAに基づくワクチンを使用した最近の研究は、変異したネオアンチゲンの標的指向型送達が強い抗腫瘍効果をもたらすことができることを示している。しかしながら、有効なペプチドまたはRNAの大規模スクリーニングおよび作製は、高価で時間のかかるものである。その一方で、RNAまたはペプチドのサブセットの事前選択は、フルランドスケープの内因性変異内の他の重要な免疫原性ネオアンチゲンを見逃す可能性があり、それによって腫瘍進化を経て継続した免疫回避の可能性が残る。さらに、ペプチドとRNAは共に、比較的短い半減期を有し、その結果、そのような介入の永続性を潜在的に制限するか、またはより高頻度の再投薬を必要とする。有効な抗腫瘍免疫応答の長期誘導のために、抗原の持続的発現が有利である。
【０２２９】
本明細書において実証するように、内因性遺伝子の直接活性化は、ベースライン時に発現され得ないネオアンチゲンのシグナルを増幅するために持続かつ調整可能な変異遺伝子の過剰発現を提供することによってこれらの課題を克服する（図14）。CRISPR活性化は、内因性遺伝子それ自体に対して作用するので、潜在的なネオアンチゲンをコードする新たな変異が獲得されると、CRISPR活性化ライブラリーは、新たな変異体遺伝子の発現を自動的に駆動する。内因性遺伝子活性化の性質に起因して、このワクチン接種アプローチは、腫瘍それ自体と一緒に進化し続け、それが、変異がん細胞を自然にロックダウンし、それによって免疫回避の道を排除する。重要なことに、CRISPRaライブラリーを使用したプールされた遺伝子活性化は、任意の選択された遺伝子セットまたは全ゲノムの発現を増強するようにカスタマイズすることができ、それによって、T細胞認識のためのネオアンチゲン提示が強化される。ここで観察された抗腫瘍応答の根底にある作用機序は、T細胞単独が関与するよりもさらに複雑である可能性が高いが、本明細書におけるデータは、CAVac、AAV-CAVacおよびAAV-PCAVacを含めた内因性遺伝子活性化に基づく治療が、他の確立された免疫療法モダリティと協力して機能することができる、次元の異なるがん免疫療法用ワクチン接種アプローチを提供することを実証している。
【０２３０】
実施例9：既製型およびカスタマイズ可能な内因性遺伝子ワクチン接種用がんワクチンのための組成物および方法
CRISPRaシステムを使用した内在性遺伝子活性化を伴う多重ワクチン接種の2つのモードを本明細書において提示する。ワクチン接種を受けていない個体では、腫瘍細胞は、転写され、翻訳され、次いでペプチド（ネオアンチゲン）としてMHCクラスI分子上に提示される、腫瘍特異的変異遺伝子を含有する（図17A）。しばしば、これらのネオアンチゲンは、低レベルで発現され、したがってCD8+ T細胞のTCRに結合した際に弱い応答を誘発する。本明細書に記載の1つのアプローチである変異遺伝子CRISPR活性化（MGCA）による多重ワクチン接種では、複数の変異体内因性遺伝子が、これらの変異体内因性遺伝子に特異的なsgRNAを使用したCRISPRaシステムによって活性化される（実施例4、5および6を参照のこと）。これは、MHCクラスI分子上でのネオアンチゲンの高発現を導き、ロバストなCD8+ T細胞応答をもたらす（図17B）。本明細書において利用される第二のアプローチである抗原提示CRISPR操作（APCM）による多重ワクチン接種では、複数の抗原提示遺伝子が、これらの抗原提示遺伝子に特異的なsgRNAを使用したCRISPRaシステムによって活性化される（以下の実施例10を参照のこと）。これは、抗原提示機構の増強、サイトカインおよび／または免疫学的調節因子の発現増加、MHCクラスI分子上でのネオアンチゲンの提示の増加、ならびにロバストなCD8+ T細胞応答を導く（図17C）。
【０２３１】
精密（「個別化」）AAV-PCAVacシステムは、治療用ワクチンとして有効であると証明された。AAV-PCAVacを、雌のC57BL/6Jマウスの正常な乳房脂肪体と比較してE0771細胞において最も高度に変異した遺伝子セットを標的とするように設計した（SEQ ID NO：349〜4,187；表4）。AAV-PCAVac多重内在性遺伝子活性化の効力を、C57BL/6J宿主でのシンジェニック同所性モデルを使用して試験した。E0771トリプルネガティブ乳がん（TNBC）細胞を雌のC57BL/6Jマウスの乳房脂肪体内に生着させた。PBS、AAV-ベクター、またはAAV-PCAVacライブラリー（SEQ ID NO. 349〜4,187）でマウスを処置した。すべての処置群について生存可能時間をモニタリングした（図18）。効力はAAV-ベクターとAAV-PCAVacの両方で見られたが、AAV-PCAVacがより強い抗腫瘍効果を有していた（図18〜19）。
【０２３２】
C57BL/6Jマウスにおいて原発部位と遠位部位の2箇所で腫瘍（E0771 TNBC）が誘導される、両側腫瘍誘導を実施した。PBS、AAV-ベクター、またはAAV-PCAVのいずれかを用いてマウスを原発部位で処置した。AAV-PCAVacで処置したマウスにおいて原発腫瘍と遠位腫瘍の両方の退縮が観察された（図20）。
【０２３３】
シンジェニック同所性TNBCモデルを使用して、AAV-PCAVac処置後の最初のE0771腫瘍の完全退縮後にC57BL/6JマウスにE0771腫瘍細胞を再負荷した。再負荷後、AAV-PCAVacで処置したマウスにおいて成長は見られなかった（図21）。
【０２３４】
精密（「個別化」）AAV-PCAVacシステムを、TNBCに対する治療用ワクチンとしてさらに検証した。E0771 TNBCを雌のC57BL/6Jマウスの乳房脂肪体内に生着させた。PBS、AAV-ベクター、AAV-Emut11ライブラリーまたはAAV-PCAVacライブラリーでマウスを処置した。Emut11ライブラリーは、E0771細胞における最上位11個の変異遺伝子セット（Tekt2、RSC1a1、Acer2、Slc36a1、Tmem106b、Gabrg2、Ago4、G3bp1、FAT2、Hmmr、Trp53）を標的とする。AAV-ベクター、AAV-Emut11およびAAV-PCAVacで共に効力が見られたが、AAV-PCAVacが最も強い抗腫瘍効果を有していた（図22）。
【０２３５】
B16F10（黒色腫）、GL261（神経膠腫）、Hepa1-6（肝細胞腫）、MC38（結腸がん）およびPan02（膵臓がん）細胞における最も高度に変異した遺伝子セットを標的とするように、sgRNAを設計した（SEQ ID NO. 11,809〜23,776）。sgRNAを、本明細書の他の箇所に記載のようにアデノ随伴ウイルスベクターにクローニングしてパッケージングした。
【０２３６】
実施例10：抗原提示CRISPR操作（AAV-APCM）システム
既製型抗原提示CRISPR操作（AAV-APCM）システムを、治療用ワクチンとして設計および試験した。免疫応答を誘発する小さな遺伝子セット：B2M、B7-H2（ICOSL）、カルネキシン、カルレティキュリン、CCL5、CD30L(TNFSF8）、CD40L、CD70、CD80、CD83、CD86、CXCL10、CXCL3、CXCL9、シスタチンB、シスタチンC（x）、ERAP1、ERp57(PDIA3）、Flt3L、GITRL(TNFSF18）、IFNa4、IFNb1、IFNg、IL-2、LIGHT（TNFRSF14）、NLRC5/CITA、OX40L/TNFSF4、Sec61a1、Sec61b、Sec61g、TAP1、TAP2、タパシン、TAPBPR、TL1A（TNFSF15）、およびTNFSF9（4-1BBL）を最初に選択することによってAAV-Apcmライブラリーを設計した。マウスにおいてこれらの遺伝子を標的とするようにsgRNA配列を設計し、107個のsgRNAのライブラリー（SEQ ID NO. 23,779〜23,885）を生成した（図27）。組成が固定されているので、当然ながらこのAPCMライブラリーも「既製型」ワクチンであるが、一方で、これは確実に、個別化されたワクチンと組み合わせることができる。sgRNAを、本明細書の他の箇所に記載のようにアデノ随伴ウイルスベクターにクローニングしてパッケージングした。AAV-APCM多重内因性遺伝子活性化の効力を、C57BL/6J宿主でのシンジェニック同所性モデルで試験した。E0771 TNBC細胞を雌のC57BL/6Jマウスの乳房脂肪体内に生着させた。PBS、AAV-ベクター、またはAAV-Apcmライブラリーでマウスを処置した。AAV-ベクター処置とAAV-Apcm処置の両方で効力が見られたが、AAV-Apcm処置がより強い抗腫瘍効果を有していた（図23）。
【０２３７】
ヒト遺伝子に特異的に設計/最適化された第二のAAV-APCMライブラリー（AAV-Apch）を作製した。上記と同じ抗原提示遺伝子セットを標的とするようにsgRNAを設計し、219個のsgRNAのライブラリー（SEQ ID NO：23,886〜24,104）を生成した（図28A〜28B）。sgRNAを、本明細書の他の箇所に記載のようにアデノ随伴ウイルスベクターにクローニングしてパッケージングした。
【０２３８】
実施例11：「既製型」全ゲノムライブラリー
既製型全ゲノムAAV-CAVacシステムを、黒色腫に対する治療用ワクチンとして設計および試験した。腫瘍内投与による確立された同所性シンジェニックB16F10腫瘍に対する全ゲノム遺伝子活性化AAV-CAVac（すなわち、AAV-SAM）の治療効力が実証された。PBSおよびAAV-CAVacで指定の時間（注射後の日数；矢印）に処置されたC57BL/6Jマウスにおける同所性移植B16F10腫瘍の成長曲線を図24に示す。
【０２３９】
また、既製型全ゲノムAAV-CAVacシステムを、膵臓がんに対する治療用ワクチンとして確立した。腫瘍内投与による確立された同所性シンジェニックPan02腫瘍に対する全ゲノム遺伝子活性化AAV-CAVac（すなわち、AAV-SAM）の治療効力が実証された。PBSおよびAAV-CAVacで指定の時間（矢印）に処置されたC57BL/6Jマウスにおける皮下移植Pan02腫瘍の成長曲線を図25に示す。
【０２４０】
既製型AAV-SingleCAVacシステムは、予防用ワクチンとして有効であることが証明された（図26）。C57BL/6J宿主でのシンジェニック同所性モデルにおけるAAV-SingleCAVac内因性遺伝子活性化の効力が実証された。Arhgap30またはNolc1活性化E0771細胞によって誘導されたシンジェニック同所性腫瘍の成長曲線を示す。ベクター形質導入細胞と比較して、sg-Arhgap30またはsg-Nolc1形質導入E0771細胞は、よりゆっくりと成長した腫瘍を生成し、しばしばC57Bl/6J宿主によって拒絶された。
【０２４１】
異なるがんタイプに対する治療的および予防的使用のためにAAV-CAVac（すなわち、AAV-SAM）システムのヒトバージョンを設計する。異なるがんタイプにおいて発現される内在性ヒト遺伝子に対してsgRNAを設計する。sgRNAを、本明細書に記載のとおりにウイルスベクターにクローニングしてパッケージングする。
【０２４２】
実施例12：多重内因性遺伝子活性化は、免疫媒介機序を通じて腫瘍拒絶を導く
CRISPRaシステムは、ヌクレアーゼ活性なしの触媒活性を示さないCas9（dCas9）を使用し、それによって、dCas9-転写活性化ドメイン融合を通じて単純かつ柔軟性のある遺伝子発現の調節を可能にする。このシステムは、相乗的活性化メディエーター（SAM）などの他のエフェクタの動員によってさらに増強することができる。本明細書においては、ゲノム中のすべてのコード配列の活性化がすべての変異遺伝子の活性化を含むため、広範なゲノムワイドCRISPRaライブラリーを初期実験に利用した。
【０２４３】
がん細胞の免疫原性に対する内因性遺伝子活性化の効果を調べるために、完全に免疫応答性の腫瘍モデルを利用することが不可欠であった。完全に免疫応答性のC57BL/6マウスの乳房脂肪体にE0771がん細胞が移植された、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）のE0771シンジェニックマウスモデルを使用した。dCas9-VP64およびMS2-p65-HSF1を発現するCRISPRaレンチウイルスベクターでE0771細胞を形質導入した（E0771-dCas9-VP64-MPH）（図29Aおよび図30A）。dCas9-VP64単独が腫瘍成長に対して中程度の効果を有するという観察（図30B）から、E0771-dCas9-VP64細胞を使用して後続のすべての実験を実施した。次に、マウスゲノムスケールレンチウイルスSAM CRISPRa sgRNAライブラリー（mSAM、または略してSAM）（Konermann et al. (2015) Nature 517, 583-588）をE0771-dCas9-VP64-MPH細胞に形質導入して、ライブラリー全体を包含する高度に多様な細胞集団（E0771-dCas9-VP64-MPH-SAM細胞プール、または略してE0771-SAM）を作製した。これは、6つの独立したレプリケートについてのIlluminaシーケンシングによって確認された（図30C）。対照として、不活性なsgRNAおよびMS2-ループ-tracrRNAキメラ骨格を発現する空のレンチウイルスベクターで形質導入したE0771-dCas9-VP64-MPH細胞（略してE0771-Vector）を使用した。
【０２４４】
E0771-SAM細胞プールをC57BL/6Jマウスに移植して、シンジェニック腫瘍を形成するその能力を調べた（図29A）。E0771-Vector細胞（拒絶0/8、すなわち、生着8/8、すべてが大きな腫瘍を有する）とは際立って対照的に、E0771-SAM細胞プールは、ほとんどのマウス（42/50、84％）で拒絶され、残りのマウス（8/50、16％）には小さな腫瘍ができた（図29B）。E0771-SAM細胞の拒絶への自然免疫応答および適応免疫応答の寄与を調べるために、E0771-SAM細胞を免疫不全Nu/NuマウスおよびRag1-/-マウスの乳房脂肪体内に移植した。免疫応答性のC57BL/6J宿主（5/5で完全に拒絶されたかまたは小さなモジュールだけ有するかのいずれか）とは異なり、すべての免疫不全Nu/Nuマウス（4/4）およびRag1-/-マウス（5/5）で、E0771-SAM細胞から大きな腫瘍が急成長した（図29C）。特に、E0771-SAM細胞は、Nu/Nuマウスの場合と比較して、Rag1-/-マウスにおいて有意に大きな腫瘍を形成した（図29C）。α-CD4およびα-CD8モノクローナル抗体での処置によってC57BL/6JマウスにおいてCD4＋ T細胞とCD8＋ T細胞の両方を薬理学的に枯渇させたとき、E0771-SAM移植を受けたすべてのマウスが、未処置マウス（腫瘍あり0/11）とは対照的に、大きな腫瘍を形成した（4/4）（図29D）。注目すべきことに、E0771-SAMで大きく成長した「エスケーパ」腫瘍は、免疫チェックポイント遮断（ICB）に感受性であり、プログラム死-1（PD-1）または細胞傷害性T-リンパ球関連抗原-4（CTLA-4）に対する抗体で処置した際に急速な完全退縮に至った（図30D〜30G）。まとめると、これらの結果は、CRISPRaシステムをゲノムスケール様式で使用したプールされた内因性遺伝子の活性化が、免疫応答性の宿主においてのみ強力なインビボ腫瘍拒絶を誘導したことを示した。
【０２４５】
実施例13：免疫療法としての細胞に基づく内因性遺伝子の多重活性化（MAEGI）は、シンジェニック腫瘍モデルにおいて予防および治療効力を有する
宿主免疫系がE0771-SAM細胞を一貫して拒絶したということに興味を持って、次に、腫瘍細胞内の内因性遺伝子のCRISPRa媒介活性化が広範な抗腫瘍免疫応答を刺激できるかどうかを調査した。内因性遺伝子の多重活性化は、すべての既存のモダリティとは異なる新しい免疫療法アプローチ(MAEGIまたはCAVac、本明細書において互換的に使用される)として利用できるという仮説を立てた。これを実験で調べるために、CRISPR媒介遺伝子活性化をこの系で確認した（図5D）。次いで、SAMレンチウイルス-sgRNAライブラリーをE0771-dCas9-VP64-MPH細胞に形質導入して、E0771-SAM細胞を生成させ、続いて、マイトマイシン処置して、細胞表面でのペプチド-MHC-I複合体の完全性を維持しながら老化を誘導した。この手順から、細胞に基づくMAEGI（c-MAEGIまたは細胞に基づくCAVac、これらは本明細書において互換的に使用される）を作製した。対照として、並行してマイトマイシンで処置したE0771-Vector細胞（Cell-Vector対照）を使用した。E0771腫瘍誘導の前に、c-MAEGIをC57BL/6Jマウスに接種した。未処置マウスまたはCell-Vector対照で処置したマウス（共に腫瘍フリー0％）とは際立って対照的に、c-MAEGIで処置したマウスは、未改変の親がん細胞株（E0771）によるその後の腫瘍負荷に対して完全な保護（腫瘍フリー100％）を有していた。これは、2種のワクチン接種レジメン（すなわち、腫瘍負荷の7日前または14日前）の各場合に当てはまり、一方、腫瘍負荷の3日前のワクチン接種は、ほぼ完全な保護を付与した（小さなモジュールありのマウス1/6、腫瘍フリー5/6）。結果は、CRISPRaを使用した内因性遺伝子のゲノムスケール活性化（c-MAEGI）が、それ以外の点では同一の遺伝的背景を有する腫瘍に対して予防のための有効なアプローチであることを実証した。
【０２４６】
予防的作用物質としてのその効力を前提として、確立された腫瘍における治療的介入としてもc-MAEGIを使用することができると想定した。これを調べるために、マウスをc-MAEGIで処置する前に同所性シンジェニックE0771腫瘍を誘導した。3用量処置スキームを使用して、c-MAEGIで処置したマウスの腫瘍は、Cell-Vector対照またはPBSで処置したマウスの腫瘍よりも有意に小さかった。E0771親細胞の熱不活化ライセート、または熱不活化c-MAEGIを使用して、効力は観察されなかったが（図31A〜31B）、このことは、この状況において免疫刺激のために細胞成分の完全性を維持することの重要性を示唆している。抗腫瘍応答を駆動する際のT細胞媒介免疫の寄与を調べるために、C57BL/6Jマウスにおいてα-CD8抗体でCD8＋ Tリンパ球を特異的に枯渇させた。CD8＋ T細胞枯渇は、c-MAEGIの治療効力を無効化したが（図31C〜31F）、このことは、c-MAEGI媒介抗腫瘍応答にCD8＋ T細胞が不可欠であることを示している。
【０２４７】
次いで、c-MAEGIを他の免疫療法または免疫調節剤と併せて使用できるかどうかを調査した。興味深いことに、c-MAEGI＋α-CTLA4の組み合わせは、c-MAEGI単独（p＜0.0001）または抗CTLA4単独（p＝0.0005）よりも有意により有効であり、このことは、確立された腫瘍の完全退縮を導いた（図1J）。さらに、完全応答を経験したマウスは、腫瘍再負荷に対して完全に耐性を示したが（図31G）、このことは、処置したマウスにおける長期保護記憶を示唆している。
【０２４８】
実施例14：免疫療法剤としての内因性遺伝子のAAV媒介インサイチュー活性化（AAV-MAEGI）
細胞に基づくMAEGIは、有意な抗腫瘍効力を示したが、ウイルスビヒクルを用いたMAEGIの標的腫瘍への直接インビボ送達が、送達可能な治療モダリティをもたらすことができ、またさらに効力も改善する場合があると推察された。アデノ随伴ウイルス（AAV）は、マウスおよびヒトにおける様々な臓器への効率的な導入遺伝子送達を媒介することが可能な強力なウイルスベクターである。これらは、ヘルパーアデノウイルスなしで非複製型であり、血清型指定向性を有し、最小限の毒性または望ましくない免疫応答を引き起こす。これらの特性のため、AAVは、遺伝子療法の臨床研究においてよく使用されており、AAVに基づく処置は、FDAの承認を最近受けた。腫瘍へのMAEGIの直接送達を可能にするために、CRISPRaモジュール（EF1α-MPHおよびU6-sgRNABackbone-MS2）を有するAAV-CRISPRaベクターを作製し、ゲノムスケールSAM sgRNAライブラリーにクローニングすることによる、MAEGIのAAVバージョン（AAV-g-MAEGIまたはAAV-CAVac、本明細書において互換的に使用される）が考案された。次いで、得られたライブラリーをAAVにプールパッケージングした（図2A）。プールパッケージングされたAAV-CRISPRaの内因性遺伝子の活性化における有効性は、Cd70、Cd80およびCd86を含む遺伝子を標的とする小さなsgRNAプールを保有するCRISPRa AAVをE0771-dCas9-VP64細胞に感染させることによって確認された（図32A）。さらに、PGKプロモータによって駆動されるモデル抗原導入遺伝子（ニワトリオボアルブミン、OVA）をE0771-dCas9-VP64細胞に導入することによって、AAVによって送達されたPGKプロモータ標的指向型sgRNAが、クラスI主要組織適合性複合体（pMHC-I）に結合したSIINFEKLペプチドの複合体に特異的な抗体を用いたフローサイトメトリー染色によって明らかなように、プロセシングされた抗原ペプチドの細胞表面上での提示を有意に増加させることができることが確認された（図32B〜32C）。
【０２４９】
次いで、シンジェニック同所性E0771腫瘍を担持するC57BL/6JマウスをAAV-g-MAEGIで腫瘍内投与によって処置した（図2A）。AAV-g-MAEGIは、AAV-ベクターまたはPBSのいずれかと比較して有意により効果的であった（図2B）。注目すべきことに、AAV-ベクター処置はまた、E0771モデル（EF1α-MPHおよびU6-sgRNABackbone-MS2を有するウイルスベクター）において腫瘍に対して有意な効果を示したが、それにもかかわらずAAV-g-MAEGIよりも有意に弱かった（図2A）。組織学および免疫組織化学によって腫瘍へのCD8＋ T細胞浸潤が観察された（図33A〜33B）。AAV-g-MAEGIは、AAV-ベクターまたはPBSと比較して、処置されたマウスにおいてより高頻度の腫瘍反応性の免疫細胞を誘発した（腫瘍抗原によって刺激されるIFNγ産生脾細胞の頻度に関して）（図2F〜2G）。PBSとAAV-ベクターとの間で腫瘍反応性のIFNγ分泌脾細胞の頻度に差は観察されなかった（図2G）。これらのデータは、AAV-g-MAEGIによる内因性遺伝子の多重化インサイチュー活性化がロバストで特異的な抗腫瘍免疫応答を誘発できることを実証した。
【０２５０】
MAEGIの広範な有用性を調べるために、他の高悪性度の腫瘍タイプの処置について同じモダリティを試験した。シンジェニック黒色腫マウスモデル（B16F10、dCas9-VP64を発現する）では、AAV-g-MAEGIはこの場合も有意な効力を実証した（図2C）。加えて、膵臓がんのシンジェニックモデルにおけるAAV-g-MAEGIの効力を、Pan02細胞株を使用して試験した。確立されたPan02-dCas9-VP64腫瘍に対して、AAV-ベクターはこの場合もPBSと比較して抗腫瘍効果を有していたが、一方で、AAV-g-MAEGIは、AAV-ベクターとPBSの両方と比較して、これらの腫瘍に対して有意により強い効力を有していた（図25）。腫瘍内AAV送達の感染率を評価するために、GFPレポーターを含有する力価の一致したAAVを使用して実験を繰り返した。腫瘍内AAV注射の4日後に、腫瘍細胞、腫瘍浸潤免疫細胞（TIIC、CD45＋）、および非腫瘍臓器由来の細胞を採取した。フローサイトメトリーによるGFP発現の解析は、注射されたすべての腫瘍においてがん細胞がAAVによって形質導入されたこと（12/12、100％）、腫瘍細胞に対する感染率が4.2±0.51％（平均±s.e.m.）であり、これが局所注射を反映していることを明らかにした（図33C）。対照的に、注射された腫瘍の25％（4/12）は、汎免疫（CD45＋）細胞においてバックグラウンドを超える形質導入を示し、感染率が0.74±0.25％であった（図33C）。同じマウスコホートにおける脾臓、肝臓、肺および心臓についてのオフターゲット感染率は、それぞれ、0±0％、0.04±0.04％、0.18±0.06％および0.11±0.08％であった（図33D）。これらのデータは、まとめると、ゲノムスケールCRISPRaライブラリーのAAV媒介送達によるインサイチューMAEGIが、複数の悪性がんタイプにわたり確立された腫瘍に対して宿主免疫応答を誘発し、非がん細胞および他のオフターゲット臓器に対しては効果が最小であったことを実証した。
【０２５１】
実施例15：精密免疫療法としての腫瘍特異的変異遺伝子セットの多重化インサイチュー活性化
個々の腫瘍は、正常組織と区別されるそれら独自の固有の変異プロファイルを有するので、MAEGIアプローチを腫瘍特異的変異遺伝子セット向けにカスタマイズした。このアプローチを、精密MAEGI（p-MAEGIまたはPCAVac、これらは本明細書において互換的に使用される）と呼んだ（図4A）。AAVライブラリーを腫瘍特異的変異体遺伝子向けにカスタマイズすることによって、精密バージョンが、潜在的に抗原性の変異体を濃縮することも、有害作用を引き起こし得る遺伝子を排除することもできると仮説を立てた。E0771がん細胞の全エクソームシーケンシングを実施し、アノートされた遺伝子におけるすべてのSNP、挿入および欠失（インデル）を、並行して配列決定された野生型C57BL/6Jマウス由来の健常な乳房脂肪体細胞との比較によってコールした（図4A）。エクソームシーケンシングデータは、E0771特異的変異プロファイルを明らかにした（図4B〜4C）。次いで、差次的変異データをCRISPRa sgRNAライブラリー設計に利用して、1,116個のE0771変異遺伝子を標的とする3,839個の活性化sgRNA（SEQ ID NO：349〜4,187）のライブラリーを作製した。ライブラリーを合成し、プールクローニングした。クローニングの成功をIlluminaシーケンシングによって検証し、AAVプールを、E0771特異的精密MAEGI（E0771 AAV-p-MAEGIまたはE0771 AAV-PCAVac、本明細書において互換的に使用される）として生産した。
【０２５２】
E0771シンジェニック同所性TNBCを担持するC57BL/6Jマウスを、AAV-ベクターおよびPBS対照と一緒に、AAV-p-MAEGIで処置した。AAV-ベクターはそれ自体で、PBSと比較して抗腫瘍効果を示したが、AAV-p-MAEGIは、AAV-ベクターとPBSの両方と比較して劇的な効力を示し（図4E）、このことは、変異体遺伝子特異的CRISPRa sgRNAが強力な抗腫瘍応答をもたらしたことを示している。完全奏効（CR）率および完全奏効に近い奏効（nCR）率を処置毎に決定し、それから、組み合わせnCR/CR率がPBSで0％、AAV-ベクターで0％、AAV-p-MAEGIで50％であることが明らかになった（図4M）。初期腫瘍移植の3ヶ月後、完全奏効を経験した9匹のAAV-p-MAEGI処置マウスに再負荷した。すべて（9/9）のマウスは、E0771腫瘍再負荷を完全に拒絶した（図4F）。AAV-p-MAEGI処置マウスの完全奏効は、実験の終了と共に180日にわたって長期有益性を保持した（図4F）。これらのデータは、AAV-p-MAEGIが強力で永続性のある抗腫瘍応答を誘導したことを示した。
【０２５３】
AAV-p-MAEGIの効力は、Rag1-/-マウスにおけるすべての処置群のほぼ同一の成長曲線によって証明されるように、免疫不全宿主において完全に無効化されたが（図4N）、このことは、適応免疫系がAAV-p-MAEGIの抗腫瘍効果に不可欠であることを示している。このことと一致して、組織学および免疫組織化学によって腫瘍へのCD8＋ T細胞浸潤が観察された（図34A〜34B）。AAV-p-MAEGIで処置した腫瘍はまた、低下した増殖も示した（図34C〜34D）。これらの抗腫瘍応答の駆動における適応免疫の重要性を前提として、AAV-p-MAEGIの腫瘍内送達が全身性の抗腫瘍免疫を誘発して遠位部位に影響を及ぼし得るかどうかを調査した（図4O）。マウスが局所と遠位の両方の乳房脂肪体腫瘍を担持するE0771 TNBCのシンジェニックモデルでは、局所腫瘍へのAAV-p-MAEGI単独の投与後、局所腫瘍とAAV-p-MAEGIが直接感染していなかった遠位腫瘍の両方に対して有意な抗腫瘍効果が観察された（図4P〜4Q）。AAV-p-MAEGE処置下、遠位腫瘍で67％の完全奏効率が観察された（図4Q）。これらのデータは、AAV-p-MAEGI処置が全身性の抗腫瘍免疫応答を刺激することに成功したことを実証した。
【０２５４】
実施例16：AAV-p-MAEGIは、活性なTエフェクタ細胞を腫瘍に動員する
経時的なT細胞適応免疫応答を調べるために、腫瘍浸潤T細胞集団のフローサイトメトリー解析を数回の時点で実施した（図35A）。AAV-p-MAEGI処置は、AAV-ベクターまたはPBS処置と比較して、CD4＋ T細胞およびCD8＋ T細胞の腫瘍浸潤を有意に増強し、29日目以降CD8＋ T細胞およびCD4＋ T細胞が有意に増加した（図36A〜36B）。19日目に最初の著しい腫瘍退縮が観察されたので、その時点に他の免疫細胞集団を調べた（図35B）。結果は、AAV-p-MAEGI処置がAAV-ベクター処置に対してMHC-II＋抗原提示細胞の分画を増加させたこと（図36C）、樹状細胞の増加傾向があったが（図36D）、マクロファージ、単球または好中球の存在量に有意な変化がなかったことを示した（図36E〜36G）。これらのデータは、まとめると、AAV-p-MAEGI処置が腫瘍へのT細胞浸潤を増加させ、ある特定の浸潤性免疫細胞の組成を変化させ、最終的に、腫瘍退縮をもたらしたことを明らかにした。
【０２５５】
これらの知見を前提として、次に、AAV-p-MAEGIによって誘導された適応免疫応答が腫瘍特異的であるかどうかを調査した。E0771腫瘍担持マウスから採取した脾細胞に対してELISPOTを実施することによって、AAV-p-MAEGIが、PBSおよびAAV-ベクター処置マウスと比較して、腫瘍反応性のIFNγ産生脾細胞の頻度を有意に増強したことが観察された（図36H〜36J）。これらの刺激された免疫細胞が健常な正常組織ではなく内因性腫瘍抗原に特異的であるかどうかを調べるために、E0771腫瘍担持マウスをこの場合も同じくAAV-p-MAEGIまたはAAV-ベクターで処置した。E0771がん細胞または一致した正常組織（乳房脂肪体から単離した初代C57BL/6J野生型細胞）のいずれかで刺激した脾細胞と蛍光活性化セルソーティング（FACS）で単離した腫瘍浸潤免疫細胞（TIIC）の両方に対して、ELISPOTアッセイを実施した（図36H）。AAV-ベクターとAAV-p-MAEGIの両条件で、ELISPOTアッセイは、正常な初代細胞での刺激と比較して、E0771腫瘍細胞による刺激後に有意に高いIFNγ産生脾細胞およびTIICを示した（図36K〜36N）。重要なことに、E0771で刺激した実験群内で、AAV-p-MAEGIで処置したマウスは、AAV-ベクターで処置したマウスよりも有意に高い頻度のIFNγ分泌免疫細胞を有していた。この効果は、TIICにおいて特に顕著であり、この場合、AAV-p-MAEGIは、E0771刺激に応答してIFNγ分泌免疫細胞の頻度を有意に増強したが、一致した正常細胞にはそうしなかった（図36M〜36N）。AAV-p-MAEGIの抗腫瘍特異性は、脾細胞においても同様に観察された（図36K〜36L）。これらの結果は、腫瘍抗原特異的な免疫応答がAAV-p-MAEGIによって誘発されたことを実証した。
【０２５６】
実施例17：AAV-p-MAEGIは、宿主腫瘍微小環境を再構成する
MAEGIによって動員されるT細胞のレパートリーを理解するために、T細胞受容体シーケンシング（TCR-seq）を実施して、AAV-p-MAEGI、AAV-g-MAEGI、AAV-ベクターまたはPBSで処置したマウスにおいてTCRレパートリーをプロファイリングした（図37A）。TCRクローンの割合を評価し、様々な測定基準を算出した（図37B〜37D）。PBSまたはAAV-ベクターと比較すると、AAV-p-MAEGIは、Chao1指数による測定で、脾臓とTILの両方でTCR多様性を有意に増加させた（図37C）。AAV-g-MAEGIで処置したマウス（ゲノムワイドAAV-MAEGI）と比較すると、AAV-p-MAEGI（精密AAV-MAEGI）で処置したマウス由来の脾細胞は、より高いChao1指数を有しており、TILの間で有意差はなかった（図37C）。次に、TCRクローン存在量の均一性を定量化するジニ・シンプソン指数を算出した。異なる処置条件由来の脾臓試料の間で有意差はなかった一方で、AAV-p-MAEGIで処置したマウス由来のTILは、PBSまたはAAV-ベクターで処置したマウスと比較して有意に高いジニ・シンプソン指数を有していたが、AAV-g-MAEGIで処置したマウスとの比較では有意差はなかった。AAV-p-MAEGIで処置したマウス由来のTIL間の増加したTCR多様性およびクローン均一性に興味を持って、これらの変化がT細胞浸潤の差に起因するものかどうかを調査した。各試料において特定された固有のCDR3クローン型の数（すなわち、TCRの豊富さ）を調べた（図35C）。AAV-p-MAEGIマウスは、脾臓試料とTIL試料の両方において、PBSまたはAAV-ベクター試料よりも有意により多くの固有のクローン型を有していた（図37E〜37F）。まとめると、TCR-シーケンシングデータは、腫瘍浸潤T細胞の豊富さおよび多様性を追加で明らかにしながら、AAV-p-MAEGIが腫瘍へのT細胞浸潤を有意に増強したというフローサイトメトリー解析の結論を確認した。
【０２５７】
腫瘍微小環境に対するAAV-p-MAEGIの効果をさらに調査するために、シングルセルRNAシーケンシング（scRNAseq）を実施して、TIICの組成と同時にその遺伝子発現シグネチャーをプロファイリングした（図38A）。腫瘍の単一細胞懸濁液から、CD45＋細胞のFACSによって総TIICを単離して、scRNAseqを実施し、合計4,381個の細胞をAAV-p-MAEGI処置マウスから、3,482個の細胞をAAV-ベクター処置マウスから回収した（条件毎にn＝3匹のマウスをプール）。低品質細胞および低発現された遺伝子をフィルタリングした後、インピュテーションおよびk平均クラスタリングを実施して、合計9個の別個のクラスターを特定した。各クラスターにおける差次的に発現された遺伝子の解析は、各クラスターの細胞タイプアイデンティティを明らかにした（図38Bおよび図39A〜39F）。Cd45遺伝子発現（Ptprcによってコードされる）に陰性であった細胞の集団（k平均クラスター7、またはk7）を排除した後（図39A〜39B）、TIICの最終のデータセットは、AAV-p-MAEGIで処置したマウスから4,065個の単一細胞、AAV-ベクターで処置したマウスから2,799個の細胞のトランスクリプトームを含んでいた（図38C）。
【０２５８】
フローサイトメトリーデータおよびTCR-seq解析が共に、AAV-ベクターと比較してAAV-p-MAEGIによる増加したT細胞腫瘍浸潤を特定したことを前提として、これらの知見がscRNAseqによって全般的規模で概括されるかどうかを調査した。T細胞集団に対してインシリコ解析を実施するために、k6またはk9中の細胞上でmRNA転写物発現レベルをフィルタリングしたが（「mRNAゲーティングされる」）、これは、これらのクラスターがCd3e、Cd4およびCd8aをロバストに発現する細胞を含むためである（図39C）。k6およびk9内のCd3e＋細胞を調べるために、細胞をCd8a＋Cd4−およびCd4＋Cd8a−集団にmRNAゲーティングした。t-SNE次元縮小によるこれらの細胞群の可視化は、推定CD8＋ T細胞（Cd8a＋Cd3e＋Cd4− mRNAゲーティングによって定義される）のCD4＋ T細胞（Cd4＋Cd3e＋Cd8a− mRNAゲーティングによって定義される）からの明確な分離を明らかにした（図38D）。k6およびk9中のこれらの異なるT細胞集団の相対存在量を定量したところ、AAV-p-MAEGIマウスが有意により多いCd3e＋ T細胞、推定CD8＋ T細胞、および推定CD4＋ T細胞を有していたことが明らかになった（図38E）。さらに、これらの推定CD4＋ T細胞の中で、AAV-p-MAEGIで処置したマウスは、抗腫瘍Th1細胞の指標となるTbx21＋、Ifng＋およびTbx21＋Ifng＋細胞の存在量が増加していた（図38F）。したがって、全般的なTIICに対する単一細胞トランスクリプトーム解析は、AAV-p-MAEGIがT細胞腫瘍浸潤を促進するというFACSおよびTCR-seqによる早期の細胞タイプ特異的な観察を再確認した。
【０２５９】
AAV-p-MAEGI処置が腫瘍浸潤T細胞のトランスクリプトーム変化を導くかどうかを調査するために、差次的発現分析を実施して、AAV-p-MAEGIで処置したマウスとAAV-ベクターで処置したマウスに由来するT細胞を比較した。k6（k9と比較してより高いGzmb発現によって特徴付けられる）中の推定CD8＋ T細胞（図39C）の中で、AAV-ベクターと比較して、AAV-p-MAEGIで処置したマウスにおいて267個のアップレギュレーションされた遺伝子および753個のダウンレギュレーションされた遺伝子が特定された（図40A）。遺伝子オントロジー解析は、適応免疫、T細胞活性化およびT細胞受容体複合体を含め、アップレギュレーションされた遺伝子セット内で数種のT細胞シグネチャーの濃縮を明らかにした。興味深いことに、最も強く濃縮された遺伝子セットは、AIG1ファミリーのGTPアーゼ、特にGimap遺伝子（免疫関連タンパク質のGTPアーゼ）であった。Gimapタンパク質は、T細胞の活性化および生存において重要な役割を果たすことが知られている。k9中の推定CD8＋ T細胞に関しては、AAV-p-MAEGI処置により665個の遺伝子がアップレギュレーションされ、80個の遺伝子がダウンレギュレーションされた（図40B）。アップレギュレーションされた遺伝子セットにおける濃縮された遺伝子オントロジーは、ミトコンドリア、エクソソーム、プロテアソーム、RNA結合、適応免疫、リボ核タンパク質、AIG1/Gimap、およびrRNAプロセシングを含んでいた。推定CD4＋ T細胞に対して同じ解析を実施したところ、AAV-p-MAEGI処置による335個のアップレギュレーションされた遺伝子および65個のダウンレギュレーションされた遺伝子が明らかになった（図40C）。推定CD4＋ T細胞におけるAAV-p-MAEGIでアップレギュレーションされた遺伝子オントロジーは、プロテアソーム、細胞外エクソソーム、ポリ(A)RNA結合、ミトコンドリア、スプライソソーム、およびリボ核タンパク質を含んでいた。まとめると、scRNAseqデータは、AAV-p-MAEGIがT細胞腫瘍浸潤を増加させた作用機序をさらに精緻化し、MAEGI処置後のTILの有意なトランスクリプトーム変化を追加で明らかにした。
【０２６０】
実施例18：RNAまたはペプチドネオアンチゲンワクチンとの比較
腫瘍ネオアンチゲンを標的とする現行の最先端アプローチは、主に、変異体RNAまたはペプチドをリンパ系組織に送達することに焦点を当てている。AAV-MAEGIは腫瘍内注射によって腫瘍免疫原性を直接増幅させるので、AAV-MAEGIアプローチは、これらのネオアンチゲンワクチンと直接比較可能ではない。それにもかかわらず、腫瘍内／インサイチュー処置スキーム下、実験を行って、AAV媒介CRISPRa遺伝子活性化を、AAV媒介変異体ミニ-ORF発現（送達様式を依然維持しながらもRNAまたはペプチドワクチンに最も近い類似体）と比較した。特に、変異体ミニ-ORF戦略は、腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルスベクターを使用して、一部のバイオテクノロジー新興企業によって採用されている。
【０２６１】
興味深いことに、同じE0771シンジェニックモデル（図41）では、データは、AAV-MAEGIが非常に効果的である（図41、左パネル）一方で、予測された上位20個の変異体ミニ-ORF（AAV-20MutORF）のAAVによる腫瘍内送達はAAV-ベクター単独よりも有効ではないことを示している。＞1,000個の変異体ORFをAAV-p-MAEGIとのさらに厳密な比較に使用できるのではないかと考えるが、そのようにするには、20個のペプチドをコードするCDSを各々有する約50個の異なるAAV-ORF構築物を作らなければならないという理由から今のところ実用的でない。拡張性に関する同様の問題がmRNA ORF（また約50個のmRNA構築物を必要とする）または合成ペプチド（＞1000個の構築物）に適用されるが、共に臨床的実現可能性の範囲を十分に超える。しかしながら、AAV-MAEGIアプローチは、本明細書において実証するように、sgRNAをプールとして合成して1つの混合産物として作製することができるので、高度に拡張可能である。このことは、既存のネオアンチゲンに基づくアプローチに勝る複数の利点を持つ新たなアプローチとしてのAAV-MAEGIの有望性を支持する。
【０２６２】
実施例19：腫瘍細胞免疫原性を増幅する他の腫瘍内アプローチとの比較
腫瘍細胞免疫原性を直接増幅させるためのいくつかの他のアプローチが文献に記載されている。しかしながら、どれも、CRISPRに基づくMAEGIアプローチの柔軟性および拡張性に対抗することはできない。AAV-MAEGIの抗腫瘍効力におけるライブラリーサイズ（ひいては拡張性）の重要性を評価するために、B16F10シンジェニックモデルにおいてAAV-g-MAEGI（エキソームワイドライブラリー）をミニ-プールMAEGI（AAV-ミニ-MAEGI）と直接比較した。AAV-g-MAEGIは、AAV-ミニ-MAEGI（先行のB16F10黒色腫ワクチンについて予測された抗原性に基づいて選ばれた同じ15個の遺伝子を標的とする）より優れていた（図42）。実際に、抗原/発現に基づくミニ-プールは、いくらかの初期効力を示したが、その効果は、おそらくは15個の選択された抗原の免疫回避に起因して、腫瘍の成長と共に急速に消失した（AAV-ベクターと類似した成長曲線を有する）。対照的に、より広範なAAV-g-MAEGIライブラリーは、より強くより持続した効力を示した。
【０２６３】
さらに、E0771モデル（Emut11、E0771における上位11個の変異体遺伝子を標的とするsgRNAライブラリーを保有する）について少数の変異遺伝子セットを標的とする実験も実施した。図43のデータが例証するように、1,116個の変異体遺伝子を標的とするsgRNAライブラリーを保有するE0771-p-MAEGIでの強い効力（左パネル、50％のnCR/CR率）と比較して、Emut11で低下した効力が観察された（右パネル、わずか20％のnCR/CR率）。
【０２６４】
それゆえ、最大の効力容量を最適に利用可能にするために多数の変異体遺伝子を標的とする能力が重要である。これは、従来のmRNA/ペプチド/CDSアプローチではすぐに実用的とならないが、ライブラリー中のsgRNAの所望の数をゲノム全体まで拡大することによって本明細書に開示されるCRISPRaアプローチで容易に実現可能である。
【０２６５】
実施例20：デュアルAAV送達
本明細書において、完全に未改変の親E0771細胞へのデュアルAAV送達が、内因性遺伝子の活性化を媒介できることが実証された（図44A〜44B）。これは、2つの異なるAAV血清型：AAV9とAAV-DJの両方を使用して達成された（図44A〜45）。
【０２６６】
MAEGIのインビトロおよびインビボ送達のためのデュアルAAVシステムを本明細書において開発した。CRISPR活性化のデュアルAAVベクターシステム（AAV-dCas9、すなわち、EFs-dSpCas9-spA；およびAAV-CRISPRaベクター、すなわち、U6p-sgSapI-EF1a-MS2-p65-HSF1-WPRE）を、制限クローニングおよびギブソンアセンブリによって作製した。個々のsgRNAまたはsgRNAライブラリーをAAV-CRISPRaプラスミドにクローニングした。本明細書の他の箇所に詳述しているような方法を使用して、dCas9またはU6-sgRNA-EF1a-MS2-p65-HSF1を発現するAAVを生産した。インビトロおよびインビボ送達のために、AAV-dCas9およびAAV-CRISPRaを培養細胞に同時に加えるかまたは1：1の比で腫瘍に同時注射した。
【０２６７】
5〜8週齢の雌のC57BL/6Jマウスの乳房脂肪体への2×106個のE0771細胞の同所性移植によってシンジェニックTNBCを確立した。腫瘍誘導の4日後、9（または11）日後および18日後に、1〜5×1010個のGCのAAV-dCas9を、同じ力価のAAV-p-MAEGIもしくはAAV-ベクターまたはPBSと共に、腫瘍担持マウスに腫瘍内投与した。3〜4日毎に測径器を使用して腫瘍を測定し、式：Vol＝π/6 *x*y*zを用いてサイズを計算した。二元配置ANOVAを使用して、処置群間で成長曲線を比較した。
【０２６８】
完全に未改変の親E0771細胞への個別化されたライブラリーのデュアルAAV送達（AAV-PCAVac、すなわち、AAV-p-MAEGI）は、C57BL/6マウスにおいてインビボ抗腫瘍活性を媒介した（図46）。
【０２６９】
また、完全に未改変の親E0771細胞へのAPCMライブラリーのデュアルAAV送達が、C57BL/6マウスにおいてインビボ抗腫瘍活性を媒介できることも実証された（図47）。
【０２７０】
実施例21：血清型によるインビボAAV感染力
GFPを発現するAAVの腫瘍内送達およびフローサイトメトリー解析によって、様々な血清型のAAV感染効率を評価した（図48）。PBS（n＝3）またはAAV-GFP（n＝12）の腫瘍内注射の4日後のマウス由来の腫瘍内のGFP＋細胞のパーセンテージを、CD45＋細胞およびCD45−細胞によってグループ分けした。バックグラウンドGFP蛍光を、PBS試料における最大GFP陽性％として設定した（破線によって表される）。AAV条件を超える分画は、指定の細胞集団におけるバックグラウンドを上回る％GFP陽性を有する試料の数を表す。データは、異なるAAV血清型を通してインビボ感染力が類似していたことを実証した（図48）。
【０２７１】
他の態様
本明細書での変数の任意の定義における要素のリストの列記は、リストされた要素の任意の単一の要素または組み合わせ(または部分的組み合わせ)としての変数の定義を含む。本明細書におけるある態様の列記は、その態様を、任意の単一の態様として、または任意の他の態様もしくはその部分との組み合わせで含む。
【０２７２】
値および範囲が本明細書に提供される場合は常に、これらの値および範囲によって包含されるすべての値および範囲が本発明の範囲内に包含されることを意味すると理解されるべきである。さらに、これらの範囲内に入るすべての値だけでなく、値の範囲の上限または下限もまた、本出願によって想定される。
【０２７３】
本明細書において引用されているありとあらゆる特許、特許出願、および刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本発明は、具体的な態様を参照して開示されているが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の他の態様および変形物が当業者により考案され得ることが明白である。添付の特許請求の範囲は、すべてのそのような態様および同等の変形物を含むと解釈されるものとする。
【０２７４】
（表４）個別化sgRNAミニプール：E0771（TNBC）エクソームベースのPCAVac sgRNA（SEQ ID NO: 349〜4,187）、ルイス（肺）エクソームベースのPCAVac sgRNA（SEQ ID NO: 4,188〜7,980）およびGL261（GBM）エクソームベースのPCAVac sgRNA（SEQ ID NO: 7,981〜11,808）
2021522188.tif 000024
2021522188.tif 000025
2021522188.tif 000026
2021522188.tif 000027
2021522188.tif 000028
2021522188.tif 000029
2021522188.tif 000030
2021522188.tif 000031
2021522188.tif 000032
2021522188.tif 000033
2021522188.tif 000034
2021522188.tif 000035
2021522188.tif 000036
2021522188.tif 000037
2021522188.tif 000038
2021522188.tif 000039
2021522188.tif 000040
2021522188.tif 000041
2021522188.tif 000042
2021522188.tif 000043
2021522188.tif 000044
2021522188.tif 000045
2021522188.tif 000046
2021522188.tif 000047
2021522188.tif 000048
2021522188.tif 000049
2021522188.tif 000050
2021522188.tif 000051
2021522188.tif 000052
2021522188.tif 000053
2021522188.tif 000054
2021522188.tif 000055
2021522188.tif 000056
2021522188.tif 000057
2021522188.tif 000058
2021522188.tif 000059
2021522188.tif 000060
2021522188.tif 000061
2021522188.tif 000062
2021522188.tif 000063
2021522188.tif 000064
2021522188.tif 000065
2021522188.tif 000066
2021522188.tif 000067
2021522188.tif 000068
2021522188.tif 000069
2021522188.tif 000070
2021522188.tif 000071
2021522188.tif 000072
2021522188.tif 000073
2021522188.tif 000074
2021522188.tif 000075
2021522188.tif 000076
2021522188.tif 000077
2021522188.tif 000078
2021522188.tif 000079
2021522188.tif 000080
2021522188.tif 000081
2021522188.tif 000082
2021522188.tif 000083
2021522188.tif 000084
2021522188.tif 000085
2021522188.tif 000086
2021522188.tif 000087
2021522188.tif 000088
2021522188.tif 000089
2021522188.tif 000090
2021522188.tif 000091
2021522188.tif 000092
2021522188.tif 000093
2021522188.tif 000094
2021522188.tif 000095
2021522188.tif 000096
2021522188.tif 000097
2021522188.tif 000098
2021522188.tif 000099
2021522188.tif 000100
2021522188.tif 000101
2021522188.tif 000102
2021522188.tif 000103
【０２７５】
（表５）「個別化」sgRNAライブラリー（SEQ ID NO: 11,809〜23,776）
2021522188.tif 000104
2021522188.tif 000105
2021522188.tif 000106
2021522188.tif 000107
2021522188.tif 000108
2021522188.tif 000109
2021522188.tif 000110
2021522188.tif 000111
2021522188.tif 000112
2021522188.tif 000113
2021522188.tif 000114
2021522188.tif 000115
2021522188.tif 000116
2021522188.tif 000117
2021522188.tif 000118
2021522188.tif 000119
2021522188.tif 000120
2021522188.tif 000121
2021522188.tif 000122
2021522188.tif 000123
2021522188.tif 000124
2021522188.tif 000125
2021522188.tif 000126
2021522188.tif 000127
2021522188.tif 000128
2021522188.tif 000129
2021522188.tif 000130
2021522188.tif 000131
2021522188.tif 000132
2021522188.tif 000133
2021522188.tif 000134
2021522188.tif 000135
2021522188.tif 000136
2021522188.tif 000137
2021522188.tif 000138
2021522188.tif 000139
2021522188.tif 000140
2021522188.tif 000141
2021522188.tif 000142
2021522188.tif 000143
2021522188.tif 000144
2021522188.tif 000145
2021522188.tif 000146
2021522188.tif 000147
2021522188.tif 000148
2021522188.tif 000149
2021522188.tif 000150
2021522188.tif 000151
2021522188.tif 000152
2021522188.tif 000153
2021522188.tif 000154
2021522188.tif 000155
2021522188.tif 000156
2021522188.tif 000157
2021522188.tif 000158
2021522188.tif 000159
2021522188.tif 000160
2021522188.tif 000161
2021522188.tif 000162
2021522188.tif 000163
2021522188.tif 000164
2021522188.tif 000165
2021522188.tif 000166
2021522188.tif 000167
2021522188.tif 000168
2021522188.tif 000169
2021522188.tif 000170
2021522188.tif 000171
2021522188.tif 000172
2021522188.tif 000173
2021522188.tif 000174
2021522188.tif 000175
2021522188.tif 000176
2021522188.tif 000177
2021522188.tif 000178
2021522188.tif 000179
2021522188.tif 000180
2021522188.tif 000181
2021522188.tif 000182
2021522188.tif 000183
2021522188.tif 000184
2021522188.tif 000185
2021522188.tif 000186
2021522188.tif 000187
2021522188.tif 000188
2021522188.tif 000189
2021522188.tif 000190
2021522188.tif 000191
2021522188.tif 000192
2021522188.tif 000193
2021522188.tif 000194
2021522188.tif 000195
2021522188.tif 000196
2021522188.tif 000197
2021522188.tif 000198
2021522188.tif 000199
2021522188.tif 000200
2021522188.tif 000201
2021522188.tif 000202
2021522188.tif 000203
2021522188.tif 000204
2021522188.tif 000205
2021522188.tif 000206
2021522188.tif 000207
2021522188.tif 000208
2021522188.tif 000209
2021522188.tif 000210
2021522188.tif 000211
2021522188.tif 000212
2021522188.tif 000213
2021522188.tif 000214
2021522188.tif 000215
2021522188.tif 000216
2021522188.tif 000217
2021522188.tif 000218
2021522188.tif 000219
2021522188.tif 000220
2021522188.tif 000221
2021522188.tif 000222
2021522188.tif 000223
2021522188.tif 000224
2021522188.tif 000225
2021522188.tif 000226
2021522188.tif 000227
2021522188.tif 000228
2021522188.tif 000229
2021522188.tif 000230
2021522188.tif 000231
2021522188.tif 000232
2021522188.tif 000233
2021522188.tif 000234
【図１−１】
2021522188.tif 000236
【図１−２】
2021522188.tif 000237
【図１−３】
2021522188.tif 000238
【図１−４】
2021522188.tif 000239
【図１−５】
2021522188.tif 000240
【図１−６】
2021522188.tif 000241
【図２Ａ】
2021522188.tif 000242
【図２Ｂ】
2021522188.tif 000243
【図２Ｃ】
2021522188.tif 000244
【図２Ｄ】
2021522188.tif 000245
【図２Ｅ】
2021522188.tif 000246
【図２Ｆ】
2021522188.tif 000247
【図２Ｇ】
2021522188.tif 000248
【図３Ａ】
2021522188.tif 000249
【図３Ｂ】
2021522188.tif 000250
【図３Ｃ】
2021522188.tif 000251
【図３Ｄ】
2021522188.tif 000252
【図３Ｅ】
2021522188.tif 000253
【図４Ａ】
2021522188.tif 000254
【図４Ｂ】
2021522188.tif 000255
【図４Ｃ】
2021522188.tif 000256
【図４Ｄ】
2021522188.tif 000257
【図４Ｅ】
2021522188.tif 000258
【図４Ｆ】
2021522188.tif 000259
【図４Ｇ】
2021522188.tif 000260
【図４Ｈ】
2021522188.tif 000261
【図４Ｉ】
2021522188.tif 000262
【図４Ｊ】
2021522188.tif 000263
【図４Ｋ】
2021522188.tif 000264
【図４Ｌ】
2021522188.tif 000265
【図４Ｍ】
2021522188.tif 000266
【図４Ｎ】
2021522188.tif 000267
【図４Ｏ】
2021522188.tif 000268
【図４Ｐ】
2021522188.tif 000269
【図４Ｑ】
2021522188.tif 000270
【図５Ａ】
2021522188.tif 000271
【図５Ｂ】
2021522188.tif 000272
【図５Ｃ】
2021522188.tif 000273
【図５Ｄ】
2021522188.tif 000274
【図６−１】
2021522188.tif 000275
【図６−２】
2021522188.tif 000276
【図７】
2021522188.tif 000277
【図８−１】
2021522188.tif 000278
【図８−２】
2021522188.tif 000279
【図９】
2021522188.tif 000280
【図１０−１】
2021522188.tif 000281
【図１０−２】
2021522188.tif 000282
【図１１】
2021522188.tif 000283
【図１２Ａ】
2021522188.tif 000284
【図１２Ｂ】
2021522188.tif 000285
【図１２Ｃ】
2021522188.tif 000286
【図１２Ｄ】
2021522188.tif 000287
【図１２Ｅ】
2021522188.tif 000288
【図１３Ａ】
2021522188.tif 000289
【図１３Ｂ】
2021522188.tif 000290
【図１４】
2021522188.tif 000291
【図１５Ａ】
2021522188.tif 000292
【図１５Ｂ】
2021522188.tif 000293
【図１５Ｃ】
2021522188.tif 000294
【図１５Ｄ】
2021522188.tif 000295
【図１６−１】
2021522188.tif 000296
【図１６−２】
2021522188.tif 000297
【図１７】
2021522188.tif 000298
【図１８】
2021522188.tif 000299
【図１９】
2021522188.tif 000300
【図２０】
2021522188.tif 000301
【図２１】
2021522188.tif 000302
【図２２】
2021522188.tif 000303
【図２３】
2021522188.tif 000304
【図２４】
2021522188.tif 000305
【図２５】
2021522188.tif 000306
【図２６】
2021522188.tif 000307
【図２７】
2021522188.tif 000308
【図２８Ａ】
2021522188.tif 000309
【図２８Ｂ】
2021522188.tif 000310
【図２９】
2021522188.tif 000311
【図３０−１】
2021522188.tif 000312
【図３０−２】
2021522188.tif 000313
【図３１−１】
2021522188.tif 000314
【図３１−２】
2021522188.tif 000315
【図３１−３】
2021522188.tif 000316
【図３２】
2021522188.tif 000317
【図３３Ａ】
2021522188.tif 000318
【図３３Ｂ】
2021522188.tif 000319
【図３３Ｃ】
2021522188.tif 000320
【図３３Ｄ】
2021522188.tif 000321
【図３４Ａ】
2021522188.tif 000322
【図３４Ｂ】
2021522188.tif 000323
【図３４Ｃ】
2021522188.tif 000324
【図３４Ｄ】
2021522188.tif 000325
【図３５−１】
2021522188.tif 000326
【図３５−２】
2021522188.tif 000327
【図３６−１】
2021522188.tif 000328
【図３６−２】
2021522188.tif 000329
【図３６−３】
2021522188.tif 000330
【図３７−１】
2021522188.tif 000331
【図３７−２】
2021522188.tif 000332
【図３７−３】
2021522188.tif 000333
【図３８−１】
2021522188.tif 000334
【図３８−２】
2021522188.tif 000335
【図３９−１】
2021522188.tif 000336
【図３９−２】
2021522188.tif 000337
【図３９−３】
2021522188.tif 000338
【図４０−１】
2021522188.tif 000339
【図４０−２】
2021522188.tif 000340
【図４１】
2021522188.tif 000341
【図４２】
2021522188.tif 000342
【図４３】
2021522188.tif 000343
【図４４】
2021522188.tif 000344
【図４５】
2021522188.tif 000345
【図４６】
2021522188.tif 000346
【図４７】
2021522188.tif 000347
【図４８】
2021522188.tif 000348
【配列表】
2021522188000001.app
【国際調査報告】
2021522188.tif 000349
2021522188.tif 000350
2021522188.tif 000351
2021522188.tif 000352
2021522188.tif 000353
2021522188.tif 000354
2021522188.tif 000355