(57)【要約】活性成分として、相乗的に有効な量の、(ｉ)天然もしくは合成由来のステロイドサポニン、これらの薬学的に許容される塩、又はステロイドサポニンを含有する植物抽出物、及び(ｉｉ) ヒドロキシケイ皮酸、フラボノイド、ヒドロキシ安息香酸からなる群から選択される少なくとも１つの第１のポリフェノール化合物、及び（ｉｉｉ）任意で第２のポリフェノール化合物を含み、第２のポリフェノール化合物がヒドロキシケイ皮酸である組み合わせ組成物、並びに神経変性疾患又は状態を有する患者の神経変性疾患又は状態の予防、抑制、遅延、又は治療に対するその使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み合わせ組成物であって、活性成分として、相乗的に有効な量の、
ａ．天然もしくは合成由来のステロイドサポニン、これらの薬学的に許容される塩、又はステロイドサポニンを含有する植物抽出物、及び
ｂ．第１のポリフェノール化合物としてカフェ酸、及び
ｃ．第２のポリフェノール化合物としてフェルラ酸
を含む組み合わせ組成物。
【請求項２】
前記ステロイドサポニンが、ジオスゲニン、サルササポゲニン、サルサポニン、スミラゲニン、チゴゲニン、ラキソゲニン、これらの誘導体、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組み合わせ組成物。
【請求項３】
前記ステロイドサポニン／カフェ酸／フェルラ酸のモル比が０．０３／５０００／１０００〜１０／５００００／１００００の間にある、請求項１又は２に記載の組み合わせ組成物。
【請求項４】
前記ステロイドサポニンが０．０１〜１５ｐＭの濃度で存在し、カフェ酸が１〜１００ｎＭの濃度で存在し、かつフェルラ酸が０．５〜２０ｎＭの濃度で存在する、請求項１〜３のうちいずれか一項に記載の組み合わせ組成物。
【請求項５】
前記植物抽出物が、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ、Ａｓｐａｒａｇａｃｅａｅ、Ｓｍｉｌａｃａｃｅａｅ、Ｆａｂａｃｅａｅからなる群から選択される科の植物、及びこれらの混合物から得られるエタノール抽出物である、請求項１〜４のうちいずれか一項に記載の組み合わせ組成物。
【請求項６】
薬剤又は栄養補助食品組成物として使用するための、請求項１〜５のうちいずれか一項に記載の組み合わせ組成物。
【請求項７】
少なくとも１種の薬学的又は栄養補助的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の組み合わせ組成物。
【請求項８】
前記組み合わせ組成物が、経口投与、局所投与、経皮投与、非経口投与、及びこれらの組み合わせに好適である、請求項１〜７のうちいずれか一項に記載の組み合わせ組成物。
【請求項９】
前記組成物が、顆粒、粉末、シロップ、溶液、懸濁液、エアロゾル、錠剤、カプセル、トローチ、丸剤、注射剤、座薬、クリーム、液滴、ゲル、又はパッチに製剤化される、請求項８に記載の組み合わせ組成物。
【請求項１０】
神経変性疾患又は状態を有する患者の神経変性疾患又は状態の予防、抑制、遅延、又は治療に用いるための、請求項１〜９のうちいずれか一項に記載の組み合わせ組成物。
【請求項１１】
前記神経変性疾患又は状態が、アルツハイマー病（ＡＤ）、アルツハイマー型老年認知症（ＳＤＡＴ）、パーキンソン病及びすべてのパーキンソン症候群、レビー小体型認知症、軽度認知障害（ＭＣＩ）、加齢に伴う記憶障害（ＡＡＭＩ）及び加齢に伴う問題、非認知性神経変性、非認知性神経筋変性、大脳皮質基底核神経節変性、多系統萎縮症、脳萎縮症、オリーブ橋小脳萎縮症、核上性麻痺、ニーマンピック病Ａ型、ピック病、外傷性神経変性、フリートライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症２型、ファール症候群、ジュベール症候群、ハンチントン病、ポリグルタミン病、歯状核赤核萎縮症、淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄萎縮症、筋緊張性ジストロフィー、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、重症筋無力症、ランバート・イートン症、乳児脊髄性筋萎縮症又は進行性脊髄性筋萎縮症、運動感覚神経変性、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、シャルコー・マリー・トゥース病（１型及び４型）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、白質ジストロフィー疾患、例えば異染性白質ジストロフィー及び副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、クラッベ病、ツェルウェーガー症候群、カナバン病、ペリツェウス・メルツバッハ病、副腎脊髄ニューロパチー、ならびに遺伝性ニューロパチー、糖尿病性ニューロパチー、及び抗有糸分裂性ニューロパチーを含むニューロパチーからなる群から選択される、請求項１０に記載の組み合わせ組成物。
【請求項１２】
前記神経変性疾患又は状態が、アルツハイマー病（ＡＤ）、アルツハイマー型老年認知症（ＳＤＡＴ）、及びパーキンソン病からなる群から選択される、請求項１１に記載の組み合わせ組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、神経変性疾患を治療するための、ステロイドサポニンを含む組み合わせ組成物、調製方法、及びその使用法に関する。本発明は、より具体的には、神経変性疾患又は状態を有する患者の神経変性疾患又は状態の予防、抑制、遅延、又は治療に用いる組み合わせ組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジオスゲニン及びサルササポゲニンならびにこれらの誘導体は非常に多く研究され、神経保護効果が示されている。これら２種のステロイドサポゲニンは、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ、Ｓｍｉｌａｃａｃｅａｅ、及びＡｓｐａｒａｇａｃｅａｅで最もよく見られる。２０１１年にＧｈａｙｕｒら（非特許文献１）は、ジオスゲニン及びフェノール化合物がビンロウジ抽出物における抗ＡＣｈＥ活性に関与している可能性があることを明らかにした。Ｃｈｉｕら（非特許文献２）は、ジオスゲニン（５〜１２５ｍｇ／ｋｇ）が認知障害を著しく改善し、マウスの脳で内因性抗酸化酵素の活性を高めることを示した。またジオスゲニンは、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）とグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＳＨ−Ｐｘ）の活性も高め、Ｄ−ガラクトース処理マウスの脳におけるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）濃度を減少させた。Ｋｏｈら（非特許文献３）は、ジオスゲニンがＡβ蓄積を減少させ、ＳＯＤ活性を亢進し、脂質過酸化を抑制することによって神経細胞死を抑制することを示した。その後ジオスゲニンは、ＡＣｈＥ活性を亢進させることによって脳のコリン作動性機能を回復させる。さらにジオスゲニンは、ＮＧＦ発現を促進し、ＮＧＦ受容体シグナル経路を刺激することによって神経細胞死を阻止する。Ｔｏｈｄａ（非特許文献４）は、抗アルツハイマー病（ＡＤ）治療の非常に重大な標的として１，２５Ｄ３−ＭＡＲＲＳ経路に焦点を当て、外因性刺激物質ジオスゲニンがこのシグナル経路を活性化することを明らかにした。Ｚｈａｎｇら（非特許文献５）は、サルササポゲニンがＡβ沈着を抑制でき、高グルコース培養したＨＴ−２２細胞で細胞生存率を高めたことを明らかにした。これはＰＰＡＲγの活性化と、それに続くＢＡＣＥ１の減少によって仲介されたと考えられた。サルササポゲニンは強力な神経保護効果を有し、恐らくアルツハイマー病である糖尿病関連認知機能低下の薬物療法の新たなアプローチとなり得ると著者らは考えている。Ｖｉｓａｎｊｉら（非特許文献６）は、スミラゲニン（サルササポゲニンの異性体）がｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで神経保護効果と神経修復効果の両方を有することを示した。またこの化合物は、中脳ニューロンのＭＰＰ＋、及びパーキンソン病のマウスモデルにおけるＭＰＴＰが誘発する神経損傷を阻止及び修復した。
【０００３】
ポリフェノールは自然界に最も広く分布している代謝産物であり、ほぼ至るところに存在している。フェニルプロパノイド系は既存の二次代謝産物２０万種の２０％を占める。ヒドロキシケイ皮酸及びその誘導体、フラボノイド、クマリン、又はスチルベンなど、自然界に生じるフェノール類の大半がこの系に含まれる。ヒドロキシケイ皮酸のうち、カフェ酸、フェルラ酸、クロロゲン酸、イソフェルラ酸、及びクマル酸は抗酸化活性を持つことが知られている。
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、有病率が高く、長期にわたり、介護者の負担が大きく、また介護費が高額であることから、公衆衛生上の大きな問題となっている。アルツハイマー病における最も特徴的な神経病理学的変化は、変性神経突起と神経細胞体に蓄積する対らせん状細線維束の存在を特徴とする老人斑と神経原線維タングルの形成である。代表的な老人斑は、変性神経突起のコロナに取り囲まれた、中心部に芯のあるβアミロイドペプチドである（非特許文献７）。対らせん状細線維のタンパク質組成は明確に定義されていないが、複数の微小管関連タンパク質がこれらの病変に関係している。そのため、アルツハイマー病に罹患した脳では微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）の量が一般に低下することが報告されている（非特許文献８、９）
【０００５】
現時点でアルツハイマー病の治療法はない。アルツハイマー病の有効な治療法を開発するという現在の取り組みは、アルツハイマー病患者にはコリン作動性神経伝達物質系に著しい障害があり、その結果、中枢神経系のアセチルコリン濃度が低下するという知見に基づいている。治療法には、アセチルコリン合成用前駆体、コリン作動性アゴニスト、アセチルコリン遊離エンハンサー、及びアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）阻害剤などがある。これまで最も効果的なのは、タクリン、ドネペジル、及びリバスチグミンなどのＡＣｈＥ阻害剤を使用するアプローチである。
【０００６】
アルツハイマー病の発症は、中枢神経系における毒性βアミロイドペプチド（Ａβ）の蓄積及び沈着によって引き起こされることが従来研究で示されている（非特許文献１０）。Ａβ蓄積の根底にある機構を標的とする植物療法は、この疾患を防ぐ効果的なアプローチであろう。
【０００７】
パーキンソン病（ＰＤ）は米国で２番目に多い神経変性疾患である。緩慢な動作、静止時振戦、筋固縮、及び歩行障害といったパーキンソン病の主な運動症状は、黒質（ＳＮ）におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失によって引き起こされる。殺虫剤の使用により、恐らく黒質におけるミトコンドリア呼吸鎖の複合体Ｉの活性が低下することでパーキンソン病のリスクが高まり、それがパーキンソン病の発症につながっていることが疫学調査から示唆されている。１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）及びその誘導体（ＭＰＰ＋）、つまりミトコンドリア複合体Ｉ阻害剤は、孤発性パーキンソン病の毒性モデルを作成するために広く用いられてきた。この毒素はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＤ様病態を引き起こすのに用いられる（非特許文献１１）。
【０００８】
特許文献１は、パーキンソン病、体位性低血圧症、自閉症、慢性疲労症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン症候群、湾岸戦争症候群、及び有機リン化合物への職業性曝露から選択される疾患の治療薬の調製における、サルササポゲニン及びスミラゲニンから選択される１種又は複数種の活性剤の使用に関する。特に、濃度が１〜１０μｍｏｌ／Ｌのサルササポゲニン及びスミラゲニンの、ＣＨＯ細胞におけるＭ２受容体の発現に対する影響が明らかにされている。しかしながら、そうした濃度が１μｍｏｌ／Ｌ又は１０μｍｏｌ／Ｌのサルササポゲニンは皮質ニューロン及び神経突起ネットワークに対して毒性がある。
【０００９】
特許文献２は、相乗的な栄養補助食品組成物の有効量を投与することを含む、パーキンソン病の治療を必要とする患者におけるパーキンソン病の治療法に関し、前記組成物は、２１ｍｇのＥｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ、１０６ｍｇのＰａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ、３２ｍｇのＲｈｏｄｉｏｌａ  ｒｏｓｅａ、４ｍｇのＳｃｈｉｚａｎｄｒａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、１０６ｍｇのＡｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ、１０６ｍｇのＧａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍ、１０６ｍｇのＵｎｃａｒｉａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、２１ｍｇのコエンザイムＱ１０、２１ｍｇのＧｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ、６４ｍｇのＨｙｄｒｏｃｏｔｙｌｅ  ａｓｉａｔｉｃａ、１０６ｍｇのＲａｄｉｘ  ｐｏｌｙｇａｌａｅ、２１ｍｇのＳｉｌｙｂｕｍ  ｍａｒｉａｎｕｍ、４ｍｇのＳｍｉｌａｘ  ｒｅｇｅｌｉｉ、２１ｍｇのＴａｂｅｂｕｉａ  ａｖｅｌｌａｎｅｄａｅ、１０６ｍｇのビタミンＢ１、及び１０６ｍｇのビタミンＥを、前記疾患を緩和するのに十分な、前記患者にとって薬学的に許容される賦形剤と併せて含む。しかしながら、特許文献２は、単にさまざまな植物抽出物の混合物を開示しており、ステロイドサポニン、及び第１のポリフェノール化合物、及び任意で第２のポリフェノール化合物を含む特定の組み合わせ組成物は開示していない。
【００１０】
したがって、神経変性疾患又は状態の予防、抑制、遅延、又は治療のための活性化合物を含み、より良好な治療計画で投与でき、また十分な効果をもたらしながらも、活性化合物が低濃度であるため患者の耐容性に優れている効果的な新規組成物が必要とされている。
【００１１】
これに鑑み、本発明者らは、ステロイドサポニン、及び第１のポリフェノール化合物、及び任意で第２のポリフェノール化合物を含む新規の相乗的組み合わせ組成物を開発した。実際に本発明者らは、ステロイドサポゲニンとポリフェノール化合物はアルツハイマー病の治療のために組み合わせて使用すると相乗効果があることを初めて示した。本発明者らは、アルツハイマー病のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとしてグルタミン酸塩で損傷させたラットの一次皮質ニューロンに対するＤｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ、Ａｓｐａｒａｇａｃｅａｅ、Ｓｍｉｌａｃａｃｅａｅ、及びＦａｂａｃｅａｅの植物抽出物の神経保護効果を検討した。得られた結果と抽出物の化学的プロファイルの解析的分析を踏まえて、ジオスゲニン、カフェ酸、及びフェルラ酸の３種の化合物が神経保護効果に関与している可能性があることが確認された。これらの化合物の相乗効果も検討した。前記化合物の効果を、βアミロイドペプチドで損傷させた一次皮質ニューロンである第２のアルツハイマー病ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでさらに検討した。
【００１２】
したがって、本発明の１つの目的は、アルツハイマー病などの中枢神経系障害を治療するための組み合せ組成物、及びその調製方法を提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１７１９５１２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８／１１８５８３号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｇｈａｙｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：（２０１１）９：６１９−６２５
【非特許文献２】Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｃｈｉｎ  Ｍｅｄ．（２０１１）３９：５５１−６３
【非特許文献３】Ｌａｂ  Ａｎｉｍ  Ｒｅｓ（２０１６）３２：１０５−１１５
【非特許文献４】Ｔｏｈｄａ，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（２０１６）３９，１５６９−１５７５
【非特許文献５】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ´ｓ  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２０１７）
【非特許文献６】Ｖｉｓａｎｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（２００８）２２：２４８８−２４９７
【非特許文献７】Ｅｓｉｒｉ  ＭＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（１９９８）６５：２９−３３
【非特許文献８】Ａｄｌａｒｄ  ＰＡ，Ｖｉｃｋｅｒｓ  ＪＣ；Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（２００２）１０３：３７７−３８３
【非特許文献９】Ｈｓｉａ  ＡＹ  ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９９）９６：３２２８−３２３３
【非特許文献１０】Ｃａｌｌｉｚｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．（２０１３）９１（５）：７０６−１６
【非特許文献１１】Ｖｉｓａｎｊｉ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００８；２２（７）：２４８８−９７
【非特許文献１２】Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｈａｒｍ．Ｓｅｔ，１９７７：６６：１−１９
【非特許文献１３】Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）
【非特許文献１４】Ｔａｎｇ  Ｙ，Ｙｉ  Ｔ，Ｃｈｅｎ  Ｈ，Ｚｈａｏ  Ｚ，Ｌｉａｎｇ  Ｚ，Ｃｈｅｎ  Ｈ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ  Ａｎａｌ．（２０１３）２４：４１３−２２
【非特許文献１５】Ｎａｒｖａｅｚ−Ｃｕｅｎｃａ  ＣＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１２）１３０：７３０−７３８
【非特許文献１６】Ｏｕｙａｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１６）５４（６）：１０２８−１０３６
【非特許文献１７】Ｒｅｈｅｃｈｏ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＬＷＴ−Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１１）４４：８７５−８８２
【非特許文献１８】Ｑｕｉｒａｎｔｅｓ−Ｐｉｎｅ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１３）２０：１１１２−１１１８
【非特許文献１９】Ｂｒｉｔｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１４）１９：１７４００−１７４２１
【非特許文献２０】Ｗａｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｈｅｍ．（２０１５）２０１５：１３０８７３
【非特許文献２１】Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９），１９（７），２４５５−２４６３
【非特許文献２２】Ｃａｌｌｉｚｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，（２０１３），Ｒｅｓ．９１（５），７０６−７１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、活性成分として、相乗的に有効な量の（ｉ）天然もしくは合成由来のステロイドサポニン、これらの薬学的に許容される塩、又はステロイドサポニンを含有する植物抽出物、及び（ｉｉ）ヒドロキシケイ皮酸、フラボノイド、ヒドロキシ安息香酸からなる群から選択される第１のポリフェノール化合物、及び任意で（ｉｉｉ）第２のポリフェノール化合物を含み、第２のポリフェノール化合物がヒドロキシケイ皮酸である組み合わせ組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に従って、用語「組み合わせ組成物」は、少なくとも異なる２種の活性化合物の混合物を含む組成物を指す。本発明に従って、用語「活性化合物」は、医学的又は生物学的に活性な化合物、特に神経保護活性を有する化合物を指す。本発明に従って、用語「相乗的に」又は「相乗作用」は、少なくとも２種以上の活性成分の相互作用を指し、この複合効果はこれら個々の効果よりも大きい。組成物中に含まれる化合物は立体異性体として存在し得る。本明細書で使用する用語「立体異性体」は、分子式は同じだが原子及び／又は官能基の空間配置が異なる異性体分子を指し、またこれを含む。用語「立体異性体」は、エナンチオマー（異なる異性体が互いに鏡像である）及びジアステレオマー（異なる異性体が互いに鏡像でない）を含む。用語「ジアステレオマー」は、配座異性体、メソ化合物、シストランス（Ｅ−Ｚ）異性体、及び非エナンチオマーの光学異性体などの異性体を含む。
【００１７】
本発明に従って、ステロイドサポニンは、天然もしくは合成由来のもの、これらの薬学的に許容される塩、又はステロイドサポニンを含有する植物抽出物であり得る。本発明の文脈において、用語「天然由来」は、植物由来の活性ステロイドサポニンを指す。
【００１８】
本発明の文脈において、用語「合成由来」は、半合成（ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｓｉｓ又はｈｅｍｉｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）によって得られ、その構造が植物由来の活性ステロイドサポニンの構造と似ている、又は少なくとも部分的に類似している活性ステロイドサポニンを指す。合成ステロイドサポニンの例として、合成ジオスゲニン、合成サルササポゲニン、合成サルサポニン、合成スミラゲニン、合成チゴゲニン、合成アスパラギン、及び合成ラキソゲニンなどが挙げられる。
【００１９】
本発明の文脈において、用語「植物抽出物」は、花の抽出物、葉の抽出物、根の抽出物、種の抽出物を指す。植物抽出物は、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ、Ａｓｐａｒａｇａｃｅａｅ、Ｓｍｉｌａｃａｃｅａｅ、Ｆａｂａｃｅａｅからなる群から選択される科の植物、及びこれらの混合物から得ることができる。有利には、植物抽出物は、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ又はＡｓｐａｒａｇａｃｅａｅから得られる。
【００２０】
本発明の文脈において、用語「薬学的に許容される塩」は、無機塩基及び有機塩基を含む薬学的に許容される非毒性塩基から調製される塩を指す。無機塩基から得られる塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン塩、マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などがある。特定の実施形態は、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、及びナトリウム塩を含む。薬学的に許容される有機非毒性塩基から得られる塩には、一級、二級、及び三級アミン、天然の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびに塩基イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどがある。Ｎ＋（Ｃ１−４アルキル）４などの第四アンモニウム塩も含まれる。薬学的に許容される塩は、無機酸及び有機酸を含む薬学的に許容される非毒性酸から調製される塩も指す。無機酸から得られる塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩などがある。薬学的に許容される有機非毒性酸から得られる塩には、ベンゼンスルホン酸塩、クエン酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、ヨウ素酸塩、イセチオン酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、メチレン−ビス−ｂ−オキシナフトエート、シュウ酸塩、パルモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、サリチル酸塩、酒石酸塩、テオフィリンアセテート（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎａｃｅｔａｔｅ）、及びｐ−トルエンスルホン酸塩などがある。前述の薬学的に許容される塩及び他の代表的な薬学的に許容される塩の調製については、Ｂｅｒｇｅらが詳述している（非特許文献１２）。
【００２１】
本発明に従って、組み合わせ組成物は、四環系トリテルペノイドとも呼ばれるステロイドサポニンを含む。本発明のステロイドサポニンは、ジオスゲニン、サルササポゲニン、サルサポニン、スミラゲニン、チゴゲニン、ラキソゲニン、これらの天然誘導体、及びこれらの混合物からなる群から選択できる。本発明に従って、ステロイドサポニンの天然誘導体はステロイドサポニンのヘテロシド（ｈｅｔｅｒｏｓｉｄｉｃ）誘導体又は置換誘導体を含む。本発明の文脈において、ヘテロシド誘導体又はグリコシドは、糖がステロイドサポニンの官能基に結合した分子である。このうち、ジオスシン又はプロトジオスシンについて言及し得る。本発明に従って、置換誘導体は、メトキシ基が酸素結合によってステロイドサポニンの官能基に結合した分子である。このうち、イコゲニン、Ｍｅ−プロトジオスシン、ジオスコレシドＥについて言及し得る。本発明の有利な実施形態では、ステロイドサポニンは、ジオスゲニン、サルササポゲニン、スミラゲニン、これらの天然誘導体、及びこれらの混合物からなる群から選択される。本発明の有利な実施形態では、ステロイドサポニンはジオスゲニン又はその天然誘導体である。本発明の別の有利な実施形態では、ステロイドサポニンは、サルササポゲニン又はその天然誘導体である。本発明の別の有利な実施形態では、ステロイドサポニンはスミラゲニン又はその天然誘導体である。
【００２２】
本発明に従って、組み合わせ組成物は第１のポリフェノール化合物を含む。本発明の第１のポリフェノール化合物は、ヒドロキシケイ皮酸、フラボノイド、及びヒドロキシ安息香酸からなる群から選択できる。有利には、ヒドロキシケイ皮酸は、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、カフェ酸、チコリ酸、ケイ皮酸、クロロゲン酸、ジフェルラ酸、イソフェルラ酸、クマル酸、フェルラ酸、シナピン酸、及びこれらの混合物からなる群から選択される。有利には、フラボノイドは、フラボン、例えばルテオリン及びアピゲニン、フラボノール、例えばケルセチン、フラバノール、例えばカテキン、ジヒドロフラボノール、フラバノン、オーロン、カルコン、ならびにジヒドロカルコンからなる群から選択される。有利には、ヒドロキシ安息香酸は、没食子酸、プロトカテク酸、又はシリング酸からなる群から選択される。
【００２３】
本発明の特定の実施形態では、組み合わせ組成物はステロイドサポニン及び第１のポリフェノール化合物を含み、ステロイドサポニンが、ジオスゲニン、サルササポゲニン、スミラゲニン、これらの天然誘導体、及びこれらの混合物からなる群から選択され、かつ第１のポリフェノール化合物が、カテキン、カフェ酸、及びフェルラ酸からなる群から選択される。
【００２４】
特定の一実施形態では、組み合わせ組成物はステロイドサポニン及び第１のポリフェノール化合物を含み、ステロイドサポニンが、ジオスゲニン、その天然誘導体、及びこれらの混合物であり、かつ第１のポリフェノール化合物がカテキンである。有利には、ステロイドサポニンとしてジオスゲニン、その天然誘導体、及びこれらの混合物を、かつ第１のポリフェノール化合物としてカテキンを含む組み合わせ組成物のモル比は１００／１０〜６０／１０の間にある。
【００２５】
別の特定の実施形態では、組み合わせ組成物はステロイドサポニン及び第１のポリフェノール化合物を含み、ステロイドサポニンが、ジオスゲニン、その天然誘導体、及びこれらの混合物であり、かつ第１のポリフェノール化合物がカフェ酸である、有利には、ステロイドサポニンとしてジオスゲニン、その天然誘導体、及びこれらの混合物を、かつ第１のポリフェノール化合物としてカフェ酸を含む組み合わせ組成物のモル比は０．０３／５０００〜０．３／５００の間にある。有利には、ステロイドサポニンとしてジオスゲニン、その天然誘導体、及びこれらの混合物を、かつ第１のポリフェノール化合物としてカフェ酸を含む組み合わせ組成物のモル比は０．３／５００である。本発明の特定の実施形態では、組み合わせは、活性成分として、相乗的に有効な量のジオスゲニン及びカフェ酸を含み、ジオスゲニンが０．０１〜０．５ｐＭ、有利には０．０３〜０．３ｐＭの濃度で存在し、かつカフェ酸が５０ｐＭ〜１０ｎＭ、有利には５００ｐＭ〜５ｎＭの濃度で存在する。
【００２６】
別の特定の実施形態では、組み合わせ組成物は、ステロイドサポニン及び第１のポリフェノール化合物を含み、ステロイドサポニンが、ジオスゲニン、その天然誘導体、及びこれらの混合物であり、かつ第１のポリフェノール化合物がフェルラ酸である。有利には、ステロイドサポニンとしてジオスゲニン、その天然誘導体、及びこれらの混合物を、かつ第１のポリフェノール化合物としてフェルラ酸を含む組み合わせ組成物のモル比は０．００３／１０００〜０．３／１０００の間にある。有利には、ステロイドサポニンとしてジオスゲニン、その天然誘導体、及びこれらの混合物を、かつ第１のポリフェノール化合物としてフェルラ酸を含む組み合わせ組成物のモル比は０．３／１０００又は０．０３／１０００である。本発明の特定の実施形態では、組み合わせは、活性成分として、相乗的に有効な量のジオスゲニン及びフェルラ酸を含み、ジオスゲニンが０．０１〜０．５ｐＭ、有利には０．０３〜０．３ｐＭの濃度で存在し、かつフェルラ酸が０．５〜１５ｎＭ、有利には１〜１０ｎＭの濃度で存在する。
【００２７】
別の特定の実施形態では、組み合わせ組成物はステロイドサポニン及び第１のポリフェノール化合物を含み、ステロイドサポニンが、サルササポゲニン、その天然誘導体、及びこれらの混合物であり、かつ第１のポリフェノール化合物がカフェ酸である。有利には、ステロイドサポニンとしてサルササポゲニン、その天然誘導体、及びこれらの混合物を、かつ第１のポリフェノール化合物としてカフェ酸を含む組み合わせ組成物のモル比は１／５０００〜１／５０の間にある。有利には、ステロイドサポニンとしてサルササポゲニン、その天然誘導体、及びこれらの混合物を、かつ第１のポリフェノール化合物としてカフェ酸を含む組み合わせ組成物のモル比は１／５０又は１／５００である。本発明の特定の実施形態では、組み合わせは、活性成分として、相乗的に有効な量のサルササポゲニン及びカフェ酸を含み、サルササポゲニンが０．５〜１５ｐＭ、有利には１〜１０ｐＭの濃度で存在し、かつカフェ酸が５０ｐＭ〜１０ｎＭ、有利には５００ｐＭ〜５ｎＭの濃度で存在する。
【００２８】
別の特定の実施形態では、組み合わせ組成物は、ステロイドサポニン及び第１のポリフェノール化合物を含み、ステロイドサポニンが、サルササポゲニン、その天然誘導体、及びこれらの混合物であり、かつ第１のポリフェノール化合物がフェルラ酸である。有利には、ステロイドサポニンとしてサルササポゲニン、その天然誘導体、及びこれらの混合物を、かつ第１のポリフェノール化合物としてフェルラ酸を含む組み合わせ組成物のモル比は０．１／１０００〜１０／１０００の間にある。有利には、ステロイドサポニンとしてサルササポゲニン、その天然誘導体、及びこれらの混合物を、かつ第１のポリフェノール化合物としてフェルラ酸を含む組み合わせ組成物のモル比は１０／１０００又は１／１０００である。本発明の特定の実施形態では、組み合わせは、活性成分として、相乗的に有効な量のサルササポゲニン及びフェルラ酸を含み、サルササポゲニンが０．５〜１５ｐＭ、有利には１〜１０ｐＭの濃度で存在し、かつフェルラ酸が０．５〜１５ｎＭ、有利には１〜１０ｎＭの濃度で存在する。
【００２９】
本発明の特定の実施形態では、組み合わせ組成物は、第２のポリフェノール化合物を任意で含み得、これがヒドロキシケイ皮酸である。有利には、本発明の組み合わせ組成物中で第２のポリフェノール化合物として使用されるヒドロキシケイ皮酸は、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、カフェ酸、チコリ酸、ケイ皮酸、クロロゲン酸、ジフェルラ酸、イソフェルラ酸、クマル酸、フェルラ酸、シナピン酸、及びこれらの混合物からなる群から選択される。
【００３０】
本発明の特定の実施形態では、組み合わせ組成物は、活性成分として、相乗的に有効な量の（ｉ）天然もしくは合成由来のステロイドサポニン、これらの薬学的に許容される塩、又はステロイドサポニンを含有する植物抽出物、及び（ｉｉ）ヒドロキシケイ皮酸、フラボノイド、ヒドロキシ安息香酸からなる群から選択される第１のポリフェノール化合物、及び（ｉｉｉ）第２のポリフェノール化合物を含み、第２のポリフェノール化合物がヒドロキシケイ皮酸である。
【００３１】
本発明の有利な実施形態では、組み合わせ組成物は、活性成分として、相乗的に有効な量の以下を含む：
（ｉ）天然もしくは合成由来のステロイドサポニン、これらの薬学的に許容される塩、又はステロイドサポニンを含有する植物抽出物、及び
（ｉｉ）第１のポリフェノール化合物であって、カテキン、カフェ酸、及びフェルラ酸から選択される第１のポリフェノール化合物、及び
（ｉｉｉ）第２のポリフェノール化合物であって、カフェ酸及びフェルラ酸から選択される第２のポリフェノール化合物。
【００３２】
本発明の特定の実施形態では、組み合わせ組成物は、活性成分として、相乗的に有効な量のステロイドサポニン、第１のポリフェノール化合物、及び第２のポリフェノール化合物を含み、ステロイドサポニンが、ジオスゲニン、サルササポゲニン、スミラゲニン、これらの天然誘導体、及びこれらの混合物からなる群から選択され、第１のポリフェノール化合物が、カテキン、カフェ酸、及びフェルラ酸からなる群から選択され、かつ第２のポリフェノール化合物が、カフェ酸及びフェルラ酸からなる群から選択される。
【００３３】
本発明の有利な実施形態では、組み合わせ組成物は、活性成分として、相乗的に有効な量の以下を含む：
（ｉ）天然もしくは合成由来のステロイドサポニン、これらの薬学的に許容される塩、又はステロイドサポニンを含有する植物抽出物、及び
（ｉｉ）第１のポリフェノール化合物としてカフェ酸、及び
（ｉｉｉ）第２のポリフェノール化合物としてフェルラ酸。
【００３４】
本発明の有利な実施形態では、組み合わせ組成物は、活性成分として、相乗的に有効な量の以下を含む：
−  ステロイドサポニンとしてジオスゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物、及び
−  第１のポリフェノール化合物としてカフェ酸、及び
−  第２のポリフェノール化合物としてフェルラ酸。
【００３５】
本発明の別の有利な実施形態では、組み合わせ組成物は、活性成分として、相乗的に有効な量の以下を含む：
−  ステロイドサポニンとしてサルササポゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物、及び
−  第１のポリフェノール化合物としてカフェ酸、及び
−  第２のポリフェノール化合物としてフェルラ酸。
【００３６】
本発明の別の有利な実施形態では、組み合わせ組成物は、活性成分として、相乗的に有効な量の以下を含む：
−  ステロイドサポニンとしてスミラゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物、及び
−  第１のポリフェノール化合物としてカフェ酸、及び
−  第２のポリフェノール化合物としてフェルラ酸。
【００３７】
本発明の特定の実施形態では、組み合わせは、活性成分として、相乗的に有効な量のステロイドサポニン、第１のポリフェノール化合物、及び第２のポリフェノール化合物を含み、ステロイドサポニン／第１のポリフェノール化合物／第２のポリフェノール化合物のモル比が０．０１／１０００／５００〜１５／１０００００／２００００の間にある。有利には、ステロイドサポニン／カフェ酸／フェルラ酸のモル比は０．０３／５０００／１０００〜１０／５００００／１００００の間にある。
【００３８】
有利には、ステロイドサポニン／第１のポリフェノール化合物／第２のポリフェノール化合物のモル比は０．０３／５０００／１０００〜０．３／５０００／１０００の間にあり、ステロイドサポニンがジオスゲニンである。有利には、ジオスゲニン／カフェ酸／フェルラ酸のモル比は以下の比から選択される：０．０３／５０００／１００００、０．３／５０００／１０００、０．３／５０００／１００００、０．３／５００００／１０００、又は０．３／５００００／１００００。
【００３９】
本発明の別の特定の実施形態では、組み合わせは、活性成分として、相乗的に有効な量のステロイドサポニン、第１のポリフェノール化合物、及び第２のポリフェノール化合物を含み、ステロイドサポニンがサルササポゲニン又はスミラゲニンのとき、ステロイドサポニン／第１のポリフェノール化合物／第２のポリフェノール化合物のモル比が１／５０００／１０００〜１／５００００／１００００の間にある。有利には、ステロイドサポニンがサルササポゲニン又はスミラゲニンのとき、ステロイドサポニン／カフェ酸／フェルラ酸のモル比は１／５０００／１０００〜１／５００００／１００００の間にある。
【００４０】
本発明の特定の実施形態では、組み合わせは、活性成分として、相乗的に有効な量のステロイドサポニン、第１のポリフェノール化合物、及び第２のポリフェノール化合物を含み、ステロイドサポニンが０．０１〜１５ｐＭの濃度で存在し、第１のポリフェノール化合物が１〜１００ｎＭの濃度で存在し、かつ第２のポリフェノール化合物が０．５〜２０ｎＭの濃度で存在する。有利には、ステロイドサポニンはジオスゲニン、サルササポニン、スミラゲニン、これらの天然誘導体、又はこれらの混合物からなる群から選択される。
【００４１】
本発明の特定の実施形態では、ステロイドサポニンがジオスゲニンのとき、ステロイドサポニンは０．０１〜０．５ｐＭ、有利には０．０１５〜０．４５ｐＭ、有利には０．０２〜０．４０ｐＭ、有利には０．０２５〜０．３５ｐＭ、有利には０．０３〜０．３ｐＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、本発明の組み合わせ組成物中のステロイドサポニンの濃度は、ステロイドサポニンがジオスゲニンのとき、０．３ｐＭ以下である。
【００４２】
本発明の別の特定の実施形態では、ステロイドサポニンがサルササポゲニン又はスミラゲニンのとき、ステロイドサポニンは０．５〜１５ｐＭ、有利には１〜１０ｐＭ、有利には１〜９ｐＭ、有利には１〜８ｐＭ、有利には１〜７ｐＭ、有利には１〜６ｐＭ、有利には１〜５ｐＭ、有利には１〜４ｐＭ、有利には１〜３ｐＭ、有利には１〜２ｐＭの濃度で存在する。
【００４３】
有利には、第１のポリフェノール化合物は１〜１００ｎＭ、有利には１〜９５ｎＭ、有利には１〜９０ｎＭ、有利には１〜８５ｎＭ、有利には１〜８０ｎＭ、有利には１〜７５ｎＭ、有利には１〜７０ｎＭ、有利には１〜６５ｎＭ、有利には１〜６０ｎＭ、有利には１〜５５ｎＭ、有利には１〜５０ｎＭ、有利には２〜５０ｎＭ、有利には３〜５０ｎＭ、有利には４〜５０ｎＭ、有利には５〜５０ｎＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、本発明の組み合わせ組成物中の第１のポリフェノール化合物の濃度は５０ｎＭ以下である。有利には、第１のポリフェノール化合物はカフェ酸である。
【００４４】
有利には、第２のポリフェノール化合物は０．５〜２０ｎＭ、有利には０．５〜１９ｎＭ、有利には０．５〜１８ｎＭ、有利には０．６〜１７ｎＭ、有利には０．６〜１６ｎＭ、有利には０．７〜１５ｎＭ、有利には０．７〜１４ｎＭ、有利には０．８〜１３ｎＭ、有利には０．８〜１２ｎＭ、有利には０．９〜１１ｎＭ、有利には０．９〜１０ｎＭ、有利には１〜１０ｎＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、本発明の組み合わせ組成物中の第２のポリフェノール化合物の濃度は１０ｎＭ以下である。有利には、第２のポリフェノール化合物はフェルラ酸である。
【００４５】
有利には、組み合わせは、活性成分として、ステロイドサポニン、第１のポリフェノール化合物、及び第２のポリフェノール化合物を含み、ステロイドサポニンが０．０３〜１５ｐＭの濃度で存在し、第１のポリフェノール化合物が５〜５０ｎＭの濃度で存在し、かつ第２のポリフェノール化合物が１〜１０ｎＭの濃度で存在する。
【００４６】
本発明の有利な実施形態では、組み合わせ組成物は、活性成分として、相乗的に有効な量の以下を含む：
−  ステロイドサポニンとしてジオスゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物、このときジオスゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物は０．０１〜０．５ｐＭ、有利には０．０３〜０．３ｐＭの濃度で存在し、及び
−  第１のポリフェノール化合物としてカフェ酸、このときカフェ酸は１〜１００ｎＭ、有利には５〜５０ｎＭの濃度で存在し、及び
−  第２のポリフェノール化合物としてフェルラ酸、このときフェルラ酸は０．５〜２０ｎＭ、有利には１〜１０ｎＭの濃度で存在する。
【００４７】
本発明の特に有利な実施形態では、組み合わせ組成物は以下を含む：
−  濃度０．０３ｐＭのジオスゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物、及び
−  濃度５ｎＭのカフェ酸、及び
−  濃度１ｎＭのフェルラ酸。
【００４８】
本発明の特に有利な実施形態では、組み合わせ組成物は以下を含む：
−  濃度０．０３ｐＭのジオスゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物、及び
−  濃度５ｎＭのカフェ酸、及び
−  濃度１０ｎＭのフェルラ酸。
【００４９】
本発明の特に有利な実施形態では、組み合わせ組成物は以下を含む：
−  濃度０．０３ｐＭのジオスゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物、及び
−  濃度５０ｎＭのカフェ酸、及び
−  濃度１０ｎＭのフェルラ酸。
【００５０】
本発明の特に有利な実施形態では、組み合わせ組成物は以下を含む：
−  濃度０．０３ｐＭのジオスゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物、及び
−  濃度５０ｎＭのカフェ酸、及び
−  濃度１ｎＭのフェルラ酸。
【００５１】
本発明の特に有利な実施形態では、組み合わせ組成物は以下を含む：
−  濃度０．３ｐＭのジオスゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物、及び
−  濃度５ｎＭのカフェ酸、及び
−  濃度１ｎＭのフェルラ酸。
【００５２】
本発明の特に有利な実施形態では、組み合わせ組成物は以下を含む：
−  濃度０．３ｐＭのジオスゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物、及び
−  濃度５ｎＭのカフェ酸、及び
−  濃度１０ｎＭのフェルラ酸。
【００５３】
本発明の特に有利な実施形態では、組み合わせ組成物は以下を含む：
−  濃度０．３ｐＭのジオスゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物、及び
−  濃度５０ｎＭのカフェ酸、及び
−  濃度１ｎＭのフェルラ酸。
【００５４】
本発明の特に有利な実施形態では、組み合わせ組成物は以下を含む：
−  濃度０．３ｐＭのジオスゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物、及び
−  濃度５０ｎＭのカフェ酸、及び
−  濃度１０ｎＭのフェルラ酸。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、組み合わせ組成物は、活性成分として、相乗的に有効な量の以下を含む：
−  ステロイドサポニンとしてサルササポゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物、このときサルササポゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物は０．５〜１５ｐＭ、有利には１〜１０ｐＭの濃度で存在し、及び
−  第１のポリフェノール化合物としてカフェ酸、このときカフェ酸は１〜１００ｎＭ、有利には５〜５０ｎＭの濃度で存在し、及び
−  第２のポリフェノール化合物としてフェルラ酸、このときフェルラ酸は０．５〜２０ｎＭ、有利には１〜１０ｎＭの濃度で存在する。
【００５６】
本発明の別の実施形態では、組み合わせ組成物は、活性成分として、相乗的に有効な量の以下を含む：
−  ステロイドサポニンとしてスミラゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物、このときスミラゲニン、又はその天然誘導体、又はこれらの混合物は０．５〜１５ｐＭ、有利には１〜１０ｐＭの濃度で存在し、及び
−  第１のポリフェノール化合物としてカフェ酸、このときカフェ酸は１〜１００ｎＭ、有利には５〜５０ｎＭの濃度で存在し、及び
−  第２のポリフェノール化合物としてフェルラ酸、このときフェルラ酸は０．５〜２０ｎＭ、有利には１〜１０ｎＭの濃度で存在する。
【００５７】
植物抽出物、特にＤｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ、Ａｓｐａｒａｇａｃｅａｅ、Ｓｍｉｌａｃａｃｅａｅ、及びＦａｂａｃｅａｅは、本発明による組み合わせ組成物としても使用し得る。ゆえに本発明に従って、前記組み合わせ組成物は、前記活性成分又は植物抽出物の水性又は有機混合物であり得る。そのような抽出物は、当技術分野における既知の技術によって、特に超音波（ＵＡＥ）又はマイクロ波（ＭＡＥ）を用いたエタノール冷浸によって調製し得る。有利には、植物抽出物はＤｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ、Ａｓｐａｒａｇａｃｅａｅ、Ｓｍｉｌａｃａｃｅａｅ、及びＦａｂａｃｅａｅからなる群から選択される科の植物、ならびにこれらの混合物から得られるエタノール抽出物である。本発明に従って、Ｒｈｏｄｉｏｌａ  ｒｏｓｅａ、Ｕｎｃａｒｉａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、又はＳｍｉｌａｘ  ｒｅｇｅｌｉｉの抽出物は本発明の組み合わせ組成物を調製するのに使用しない。つまり、植物抽出物から組み合わせ組成物を得る場合、この組成物はＲｈｏｄｉｏｌａ  ｒｏｓｅａ、Ｕｎｃａｒｉａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、又はＳｍｉｌａｘ  ｒｅｇｅｌｉｉの抽出物を含まない。
【００５８】
本発明の別の態様に従って、本発明による組み合わせ組成物は薬剤又は栄養補助食品組成物として使用し得る。本発明による組み合わせ組成物は、医薬組成物として、より具体的には神経保護医薬組成物として調製し得る。そのような組成物は、上記に定義した活性化合物を、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とともに含み得る。
【００５９】
組み合わせ組成物は、上記に定義した活性化合物を、少なくとも１種の栄養補助的に許容される賦形剤とともに含む栄養補助食品組成物として調製し得る。
【００６０】
本発明の文脈において、用語「薬学的に、又は栄養補助的に許容される賦形剤」は、１種もしくは複数種の化合物（又は１種もしくは複数種の有効成分）の投与を容易にするために、例えば化合物の溶解性を向上させるために使用される化合物又は材料を指し、またこれらを含む。固体担体の代表的な非限定例に、デンプン、ラクトース、ジリン酸カルシウム、スクロース、及びカオリンなどがある。液体担体の代表的な非限定例に、滅菌水、食塩水、緩衝液、非イオン性界面活性剤、及び食用油などがある。さらに、当技術分野で一般に使用されるさまざまな補助剤も含み得る。これら及び他のそのような化合物は、文献、例えば非特許文献１３に記載されている。
【００６１】
本明細書に記載する、治療を必要とする患者に治療上有効な量の組み合わせ組成物を投与することを含む実施形態に従って、「治療上有効な」又は「治療に有効な量」又は「薬学的に有効」は、病状を抑制する、又は回復させる（例えば、神経変性疾患を治療する）のに必要とされる本発明の組み合わせ組成物の量を表す。治療上有効な量の決定は、特に、薬剤の毒性及び有効性といった因子に依存する。これらの因子は、効力、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重症度、及び好ましい投与方法など他の因子によって異なってくる。毒性は当技術分野においてよく知られる方法を用いて決定し得る。有効性は同じ指示を利用して決定し得る。有効性は、例えば、皮質ニューロンの生存率及び皮質ニューロンの神経突起ネットワークの増加によって測定できる。したがって、薬学的に有効な量とは、毒物学的に許容可能で、さらに有効であると臨床医がみなす量である。
【００６２】
投与量は投与方法に応じて、所望の薬剤（例えば、本発明の組み合せ組成物）の局所又は全身濃度を達成するために適切に調整し得る。患者における反応がそのような用量で不十分である場合には、患者の耐容性が許す範囲でさらに高い用量（又は、より局所的な別の送達経路による効果的な高用量）を用いてもよい。また、活性化合物の適切な全身濃度を達成するために、１日に複数回投与してもよい。適切な全身濃度は、例えば、患者における薬物のピーク又は持続的な血漿中濃度を測定することで決定できる。「用量」及び「投与量」は本明細書において同じ意味で使用される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、患者に投与される組み合わせ組成物の量は、ステロイドサポニンとして週に１〜２０ｍｇ／ｋｇ、かつポリフェノール化合物として週に１〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、提供される組成物はｉｎ  ｖｉｖｏ投与に用いられる。意図するｉｎ  ｖｉｖｏ投与形態に応じて、使用する組成物は、固体、半固体又は液体の剤形、例えば、錠剤、丸剤、粉末、カプセル、ゲル、軟膏、液体、懸濁液などであり得る。好ましくは、組成物は正確な投与量の単回投与に好適な単位投与形態で投与される。また組成物は、所望の製剤に応じて、動物又はヒトへの投与用に医薬組成物を製剤化するのに一般的に使用される水性媒体と定義される、少なくとも１種の薬学的に許容される担体又は希釈剤を含み得る。希釈剤は、本発明の組み合せ組成物中に存在する活性化合物の生物学的活性に影響を与えないよう選択する。そのような希釈剤の例として、蒸留水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液などがある。同じ希釈剤を用いて、目的の凍結乾燥組み換えタンパク質を再構成し得る。また医薬組成物は、他の薬剤、医薬品、担体、補助剤、非毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤なども含み得る。このような希釈剤又は担体の有効量は、成分の溶解性、生物学的活性などの点で、薬学的に許容される製剤を得るのに有効な量である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は無菌である。
【００６５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ治療における投与は、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼内、膣内、及び直腸内など、任意の数の投与経路によって実施し得る。関節内、静脈内、及び腹腔内投与経路も利用し得る。当業者は、治療すべき障害に応じて投与経路が異なることを認識している。例えば、本明細書の組み合せ組成物は、経口、非経口、又は局所投与により患者に投与し得る。一実施形態では、本明細書の組み合せ組成物は経口投与される。
【００６６】
組成物は、全身に送達することが望ましい場合には、注射、例えばボーラス注入又は持続注入による非経口投与用に製剤化し得る。注射用製剤は、単位投与形態中に、例えばアンプル又は複数回投与容器に、防腐剤を添加した状態で存在し得る。組成物は、油性又は水性媒体中の懸濁液、溶液、又はエマルジョンなどの形態をとり得、かつ懸濁化剤、安定化剤、及び／又は分散化剤のような製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含み得る。
【００６７】
非経口投与用の医薬製剤は、水溶性形態の活性組成物の水溶液を含む。さらに、活性組成物の懸濁液は適切な油性注射懸濁液として調製し得る。好適な親油性溶剤又は媒体には、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、又はリポソームなどがある。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなどを含み得る。任意選択で、懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能にするために、組成物の溶解性を向上させるのに好適な安定剤又は薬剤も含み得る。別法として、活性組成物は使用前に、好適な媒体、例えば無菌パイロジェンフリー水を用いて構成するための粉末形態であり得る。
【００６８】
経口投与用の医薬製剤は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；賦形剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、又はシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手法で調製される、例えば錠剤又はカプセルなどの形態をとり得る。錠剤は当技術分野においてよく知られる方法で被覆し得る。経口投与用の液状製剤は、例えば、溶液、シロップ、もしくは懸濁液の形態をとり得る、又は使用前に、水もしくは好適な媒体を用いて構成するための乾燥製品として存在し得る。そのような液状製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、又は硬化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチン又はアカシア）；非水媒体（例えば、扁桃油、油状エステル、エチルアルコール、又は分別植物油）；及び防腐剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸もしくはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤を用いて従来の手法で調製し得る。調製には、必要に応じて、緩衝塩、香味料、着色料、及び甘味料も含み得る。１つ又は複数の成分は、抗体の経口送達を効果的にできるよう化学修飾し得る。通常、検討される化学修飾は、少なくとも１つの分子の抗体への付加であり、前記分子が（ａ）タンパク質分解の抑制；及び（ｂ）胃又は腸から血流への取り込みを可能にする。また、抗体の全体的な安定性が向上し、体内の循環時間が延長することが望ましい。そのような分子の例に、ポリエチレングリコール、エチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ならびにポリプロリンなどがある。使用される可能性のある他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカンである。前述のとおり、製薬用途にはポリエチレングリコール分子が好ましい。経口組成物では、放出部位は胃、小腸（十二指腸、空腸、もしくは回腸）、又は大腸であり得る。当業者であれば、胃では溶解せず、十二指腸又は腸内の他の場所で物質を放出する製剤が利用可能である。好ましくは、放出は、活性化合物を保護することによって、又は胃環境を過ぎてから腸内などで生物学的に活性な物質を放出することによって、胃環境の有害作用を回避する。
【００６９】
頬側投与では、組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤又はロゼンジの形態をとり得る。
【００７０】
吸入による投与では、本開示に従って使用するための組成物は、好適な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の好適なガスを使用して、加圧パック又はネブライザーからエアロゾル噴霧器で送り出す形態で好都合に送達し得る。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送達するための弁を設けることによって、投与単位を決定し得る。吸入器又は注入器で使用するための、例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジは、組成物の粉末混合物と、ラクトース又はデンプンなどの好適な粉末ベースとを含むよう製剤化し得る。
【００７１】
また本明細書では肺送達も検討する。組成物は、吸入中に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮内膜を通って血流に送達されることが可能である。本開示の実施態様において使用するために検討されるのは、ネブライザー、定量吸入器、及び粉末吸入器を含むがこれらに限定されない、治療用製剤を肺送達させるために設計された幅広い機械装置であり、これらはすべて当業者に周知である。
【００７２】
本明細書に開示する医薬組成物の経鼻送達も検討する。経鼻送達により、治療用製剤を鼻に投与した後、肺に製剤を沈着させずに、本開示の医薬組成物を直接血流に送ることができる。経鼻送達用の製剤は、デキストラン又はシクロデキストランを含む。
【００７３】
組成物は、例えばココアバター又は他のグリセリドなど従来の座薬ベースを含む、座薬又は停留浣腸などの直腸又は膣用組成物にも製剤化し得る。
【００７４】
医薬組成物は、好適な固相もしくはゲル相担体又は賦形剤も含み得る。そのような担体又は賦形剤の例として、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリマー、例えばポリエチレングリコールなどがあるが、これらに限定されない。
【００７５】
好適な液体又は固体の製剤形態は、例えば、吸入用水溶液又は食塩溶液、マイクロカプセル化されたもの、渦巻状化（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅ）されたもの、微細金粒子にコーティングされたもの、リポソームに含有されたもの、霧状化されたもの、エアロゾル、皮膚に埋め込むためのペレット、又は皮膚を引っ掻くための鋭利な物体に塗布する乾燥させたものである。また医薬組成物は、顆粒、カプセル、粉末、錠剤、丸剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル、座薬、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、ゲル、液滴、パッチ、トローチ、又は活性組成物を持続的に放出する製剤も含み、その製剤中に、賦形剤ならびに添加剤及び／又は助剤、例えば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、潤滑剤、香味料、甘味料、又は可溶化剤が、通例、前述のように使用される。医薬組成物は、さまざまな薬物送達システムでの使用に適している。
【００７６】
本発明の別の主題に従って、神経変性疾患又は状態を有する患者の神経変性疾患又は状態の予防、抑制、遅延、又は治療に用いる前述のような組み合わせ組成物を提供する。
【００７７】
より詳細には、本発明は、以下からなる群から選択される神経変性疾患又は状態の抑制、遅延、又は治療に用いる組み合せ組成物を提供する：アルツハイマー病（ＡＤ）、アルツハイマー型老年認知症（ＳＤＡＴ）、パーキンソン病及びすべてのパーキンソン症候群、レビー小体型認知症、軽度認知障害（ＭＣＩ）、加齢に伴う記憶障害（ＡＡＭＩ）及び加齢に伴う問題、非認知性神経変性、非認知性神経筋変性、大脳皮質基底核神経節変性、多系統萎縮症、脳萎縮症、オリーブ橋小脳萎縮症、核上性麻痺、ニーマンピック病Ａ型、ピック病、外傷性神経変性、フリートライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症２型、ファール症候群、ジュベール症候群、ハンチントン病、ポリグルタミン病、歯状核赤核萎縮症、淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄萎縮症、筋緊張性ジストロフィー、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、重症筋無力症、ランバート・イートン症、乳児脊髄性筋萎縮症又は進行性脊髄性筋萎縮症、運動感覚神経変性、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、シャルコー・マリー・トゥース病（１型及び４型）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、白質ジストロフィー疾患、例えば異染性白質ジストロフィー及び副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、クラッベ病、ツェルウェーガー症候群、カナバン病、ペリツェウス・メルツバッハ病、副腎脊髄ニューロパチー、ならびに遺伝性ニューロパチー、糖尿病性ニューロパチー、及び抗有糸分裂性ニューロパチー（ａｎｔｉ−ｍｉｔｏｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）を含むニューロパチー。
【００７８】
本発明の特定の実施形態では、神経変性疾患又は状態は、アルツハイマー病（ＡＤ）、アルツハイマー型老年認知症（ＳＤＡＴ）、及びパーキンソン病からなる群から選択される。
【００７９】
本発明の別の主題は、必要とする患者において神経変性疾患又は状態を予防する方法であって、活性物質として治療上有効な量のステロイドサポゲニン及び第１のポリフェノール化合物及び任意で第２のポリフェノール化合物、ならびに上記に定義した少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の前記患者への投与を含む方法に関する。特に有利な実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の予防を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のステロイドサポゲニン及び第１のポリフェノール化合物及び任意で第２のポリフェノール化合物を含む医薬組成物の使用に関する。
【００８０】
特定の実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の予防を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のジオスゲニン及びカテキンを含む医薬組成物の使用に関する。
【００８１】
特定の実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の予防を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のジオスゲニン及びカフェ酸を含む医薬組成物の使用に関する。
【００８２】
特定の実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の予防を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のジオスゲニン及びフェルラ酸を含む医薬組成物の使用に関する。
【００８３】
特定の実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の予防を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のサルササポゲニン及びカフェ酸を含む医薬組成物の使用に関する。
【００８４】
特定の実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の予防を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のサルササポゲニン及びフェルラ酸を含む医薬組成物の使用に関する。
【００８５】
本発明の別の主題は、必要とする患者において神経変性疾患又は状態を予防する方法であって、活性化合物として治療上有効な量のステロイドサポゲニン及び第１のポリフェノール化合物及び第２のポリフェノール化合物、ならびに上記に定義した少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の前記患者への投与を含む方法に関する。
【００８６】
特に有利な実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の予防を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のステロイドサポゲニン及び第１のポリフェノール化合物及び第２のポリフェノール化合物を含む医薬組成物の使用に関する。
【００８７】
特に有利な実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の予防を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のジオスゲニン、カフェ酸、及びフェルラ酸を含む医薬組成物の使用に関する。
【００８８】
特に有利な実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の予防を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のサルササポゲニン、カフェ酸、及びフェルラ酸を含む医薬組成物の使用に関する。
【００８９】
特に有利な実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の予防を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のスミラゲニン、カフェ酸、及びフェルラ酸を含む医薬組成物の使用に関する。
【００９０】
本発明の別の主題は、必要とする患者において神経変性疾患又は状態を治療する方法であって、活性物質として治療上有効な量のステロイドサポゲニン及び第１のポリフェノール化合物及び任意で第２のポリフェノール化合物、ならびに上記に定義した少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の前記患者への投与を含む方法に関する。
【００９１】
特に有利な実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の治療を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のステロイドサポゲニン及び第１のポリフェノール化合物及び任意で第２のポリフェノール化合物を含む医薬組成物の使用に関する。
【００９２】
特定の実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の治療を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のジオスゲニン及びカテキンを含む医薬組成物の使用に関する。
【００９３】
特定の実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の治療を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のジオスゲニン及びカフェ酸を含む医薬組成物の使用に関する。
【００９４】
特定の実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の治療を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のジオスゲニン及びフェルラ酸を含む医薬組成物の使用に関する。
【００９５】
特定の実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の治療を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のサルササポゲニン及びカフェ酸を含む医薬組成物の使用に関する。
【００９６】
特定の実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の治療を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のサルササポゲニン及びフェルラ酸を含む医薬組成物の使用に関する。
【００９７】
本発明の別の主題は、必要とする患者において神経変性疾患又は状態を治療する方法であって、活性化合物として治療上有効な量のステロイドサポゲニン及び第１のポリフェノール化合物及び第２のポリフェノール化合物、ならびに上記に定義した少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の前記患者への投与を含む方法に関する。
【００９８】
特に有利な実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の治療を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のステロイドサポゲニン及び第１のポリフェノール化合物及び第２のポリフェノール化合物を含む医薬組成物の使用に関する。
【００９９】
特に有利な実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の治療を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のジオスゲニン、カフェ酸、及びフェルラ酸を含む医薬組成物の使用に関する。
【０１００】
特に有利な実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の治療を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のサルササポゲニン、カフェ酸、及びフェルラ酸を含む医薬組成物の使用に関する。
【０１０１】
特に有利な実施形態では、本発明は、神経変性疾患又は状態の治療を目的とする医薬品の製造における、活性化合物として治療上有効な量のスミラゲニン、カフェ酸、及びフェルラ酸を含む医薬組成物の使用に関する。
【０１０２】
本発明は、以下の非限定的な実施例及び添付の図１〜２０でさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１Ａ】ＮＳＰ０２−１４−Ｅ００２（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にＰＬＳＤフィッシャー検定）。
【図１Ｂ】ＮＳＰ０２−１４−Ｅ００２（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワークに及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にＰＬＳＤフィッシャー検定）。
【図１Ｃ】試験したＮＳＰ０２−１４−Ｅ００２抽出物の投与量におけるさまざまな化合物の濃度を示す（網掛け部分は活性濃度の範囲）。
【図２Ａ】ＮＳＰ０２−２９−Ｅ００１（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にＰＬＳＤフィッシャー検定）。
【図２Ｂ】ＮＳＰ０２−２９−Ｅ００１（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワークに及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にＰＬＳＤフィッシャー検定）。
【図２Ｃ】試験したＮＳＰ０２−２９−Ｅ００１抽出物の投与量におけるさまざまな化合物の濃度を示す（網掛け部分は活性濃度の範囲）。
【図３Ａ】ＮＳＰ０２−２９−Ｅ００２（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にＰＬＳＤフィッシャー検定）。
【図３Ｂ】ＮＳＰ０２−２９−Ｅ００２（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワークに及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にＰＬＳＤフィッシャー検定）。
【図３Ｃ】試験したＮＳＰ０２−２９−Ｅ００２抽出物の投与量におけるさまざまな化合物の濃度を示す（網掛け部分は活性濃度の範囲）。
【図４Ａ】ＮＳＰ１９−３０−Ｅ００２（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にＰＬＳＤフィッシャー検定）。
【図４Ｂ】ＮＳＰ１９−３０−Ｅ００２（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワークに及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にＰＬＳＤフィッシャー検定）。
【図４Ｃ】試験したＮＳＰ１９−３０−Ｅ００２抽出物の投与量におけるさまざまな化合物の濃度を示す（網掛け部分は活性濃度の範囲）。
【図５Ａ】ＮＳＰ２０−３１−Ｅ００２（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にＰＬＳＤフィッシャー検定）。
【図５Ｂ】ＮＳＰ２０−３１−Ｅ００２（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワークに及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にＰＬＳＤフィッシャー検定）。
【図５Ｃ】試験したＮＳＰ２０−３１−Ｅ００２抽出物の投与量におけるさまざまな化合物の濃度を示す（網掛け部分は活性濃度の範囲）。
【図６Ａ】サルササポゲニン（ＳＡＲ）（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図６Ｂ】サルササポゲニン（ＳＡＲ）（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワークに及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図７Ａ】ジオスゲニン（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図７Ｂ】ジオスゲニン（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワークに及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図８Ａ】ジオスシン（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図８Ｂ】ジオスシン（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワークに及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図９Ａ】ケルセチン（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図９Ｂ】ケルセチン（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワークに及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図１０Ａ】カテキン（ＣＡＴ）（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図１０Ｂ】カテキン（ＣＡＴ）（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワークに及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図１１Ａ】カフェ酸（ＣＡＦ）（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図１１Ｂ】カフェ酸（ＣＡＦ）（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワークに及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図１２Ａ】クマル酸（ＣＯＵ）（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図１２Ｂ】クマル酸（ＣＯＵ）（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワークに及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図１３Ａ】フェルラ酸（ＦＡ）（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図１３Ｂ】フェルラ酸（ＦＡ）（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワークに及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図１４Ａ】没食子酸（ＧＡＬＬＩＣ）（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図１４Ｂ】没食子酸（ＧＡＬＬＩＣ）（各種濃度）の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワークに及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図１５】混合化合物（各種濃度の２種組み合わせ（ＤＩＯＳＧ／ＣＡＦ及びＤＩＯＳＧ／ＦＡ））の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図１６】混合化合物（各種濃度の２種組み合わせ（ＤＩＯＳＧ／ＣＡＦ及びＤＩＯＳＧ／ＦＡ））の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワーク（右）に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図１７】混合化合物（各種濃度の２種組み合わせ（ＳＡＲ／ＣＡＦ及びＳＡＲ／ＦＡ））の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図１８】混合化合物（各種濃度の２種組み合わせ（ＳＡＲ／ＣＡＦ及びＳＡＲ／ＦＡ））の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワーク（右）に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図１９】混合化合物（各種濃度の３種組み合わせ（ＤＩＯＳＧ／ＣＡＦ／ＦＡ））の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が一次皮質ニューロンの生存率に及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【図２０】混合化合物（各種濃度の３種組み合わせ（ＤＩＯＳＧ／ＣＡＦ／ＦＡ））の存在下又は不在下においてグルタミン酸塩（４０μＭ、２０分）が神経突起ネットワークに及ぼす影響を示す。データは平均値±ＳＥＭとして対照に対する割合として表した（１００％＝グルタミン酸塩なし）。＊ｐ＜０．０５対グルタミン酸塩（一元配置分散分析の後にダネット検定）。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
[実施例１]
アルツハイマー病（ＡＤ）モデルに対する神経保護効果
グルタミン酸塩の興奮毒性は、神経変性疾患などの急性神経障害におけるニューロン死に関与している。カルシウム恒常性の喪失は、グルタミン酸塩誘発細胞死の重要なメディエーターである。発明者らは、グルタミン酸塩で損傷させた一次皮質ニューロンに対するグルタミン酸塩の毒作用を予防又は低減する能力について、Ｖｅｒｂｅｎａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの抽出物を試験した。
【０１０５】
１．材料及び方法
１．１．植物抽出物の調製
欧州薬局方０４／２００８−０７６５に従って、超音波（ＵＡＥ）を用いたエタノール冷浸（ＥｔＯＨ５０〜７０％（ｖ／ｖ））によって得た抽出物をＮＳＰ０２−１４−Ｅ００２（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｐｅｒｓｉｍｉｌｉｓ）、ＮＳＰ０２−２９−Ｅ００２（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｖｉｌｌｏｓａ）、ＮＳＰ１９−３０−Ｅ００２（Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ＮＳＰ２０−３１−Ｅ００２（Ｓｍｉｌａｘ  ａｓｐｅｒａ）と名づける。従来の（及びマイクロ波によって最適化した、又はしていない）煎出方法によって得た抽出物をＮＳＰ０２−２９−Ｅ００１（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｖｉｌｌｏｓａ）と名づける。
【０１０６】
抽出物の四環系トリテルペノイドプロファイル及びフェノール化合物プロファイルを、２種類の超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）法で測定する。これらのプロファイルから各種化合物の濃度を計算する。ＥＳＩ源を装備した正確な質量分析計（ＭＳ）（ＩｍｐａｃｔＩＩ、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ（登録商標））を接続したＵＨＰＬＣ−ＱｑＴｏＦ装置（ＲＳポンプ、オートサンプラー、恒温カラムコンパートメント、及びＵＶダイオードアレイを装備したＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））で試料及び標準を分析した。化合物の物理的及び化学的特性に従って、陽性及び陰性モードで質量スペクトルを得た。第１の方法は、フェノール化合物（ヒドロキシケイ皮酸、ヒドロキシ安息香酸、フラボノイド、及びこれらの置換／ヘテロシド誘導体）を同定及び定量化でき、第２の方法は四環系トリテルペノイドに特異的である。これらの方法は、さまざまな分析法を改変したり置き換えたりしたものである［非特許文献１４〜２０］。
【０１０７】
ヒドロキシケイ皮酸、ヒドロキシ安息香酸、フラボノイド、及びこれらの置換／ヘテロシド誘導体の実施例：
試料：０．００２０ｇの乾燥抽出物を５ｍＬのＭｅＯＨ及び５ｍＬのＥｔＯＨ  ６０％（ｖ／ｖ）（エタノール：Ｌｉｃｈｒｏｓｏｌｖ（登録商標）、グラジエントグレード、水：Ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖ（登録商標）、グラジエントグレード；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、リヨン、フランス）で溶解する。超音波で５分間ホモジナイズする。
標準（原液）：０．００５０ｇの各標準を５ｍＬの好適な混合溶剤で溶解する。超音波で５分間ホモジナイズする。カテキン、ルチン、没食子酸、クロロゲン酸、カフェ酸、フェルラ酸、ロスマリン酸、及び４，５−ジカフェオイルキナ酸［Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ、ジュネ、フランス；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、リヨン、フランス；Ｐｈｙｔｏｌａｂ、フェステンベルクスグロイト、ドイツ］には０．５ｍＬのＥｔＯＨ  ６０％及び０．５ｍＬのＭｅＯＨ（Ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖ（登録商標）、グラジエントグレード；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、リヨン、フランス）を添加する。ホモジナイズして１ｍＬのＥｔＯＨ  ６０％を添加し、３ｍＬの水で５ｍＬに調整する。ルテオリン−７−グルコシド及びビテキシン（Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ、ジュネ、フランス）には、０．５ｍＬのＥｔＯＨ  ６０％、０．５ｍＬのＭｅＯＨ、及び０．５ｍＬのＨ２Ｏを添加する。ホモジナイズして０．５ｍＬの２−ＰｒＯＨを添加し、３ｍＬの水で５ｍＬに調整する。アピゲニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、リヨン、フランス）には、３ｍＬのＥｔＯＨ  ６０％及び２ｍＬの２−ＰｒＯＨを、ルテオリン及びケルセチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、リヨン、フランス）には４ｍＬのＥｔＯＨ  ６０％及び１ｍＬの２−ＰｒＯＨ（ＬＣ−ＭＳ  ＬｉＣｈｒｏｓｏｌｖ（登録商標）、ハイパーグレード、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、リヨン、フランス）を添加する。５０．０μＬの各原液を５ｍＬのメスフラスコに入れ、３００μＬのＨ２Ｏを添加し、ＥｔＯＨ  ６０％で５ｍＬに調整する。
【０１０８】
ＤＩＯＮＥＸ  Ａｃｃｌａｉｍ（登録商標）Ｃ１８カラム（２．２μｍ、１５０×２．１ｍｍ）を用いて５０℃で試料及び標準を分析した。使用した溶離液は、水／ギ酸（９９．９：０．１、ｖ／ｖ）（溶離液Ａ）及びアセトニトリル／ギ酸（９９．９：０．１、ｖ／ｖ）（溶離液Ｂ）（Ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖ（登録商標）、グラジエントグレード、及びＬＣ−ＭＳウルトラグレード；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、リヨン、フランス）であった。溶離プログラム（溶離条件）は０〜６．５分、３〜１１％Ｂ；６．５〜１７分、１１〜２０％Ｂ；１７〜２２分、２０〜３６％Ｂ；２２〜２９分、３６〜４８％Ｂ；２９〜３２分、４８〜５５％Ｂ；３２〜３５分、５５〜７４％Ｂ；３５〜３７分、７４〜９０％Ｂ；３７〜４０分、９０％Ｂ；４０〜４０．５分、９０〜３％Ｂ；４０．５〜４２分、３％Ｂであった。流量は３８０μＬ／ｍｉｎ、ＤＡＤ検出は２４０ｎｍ及び２８０ｎｍ、ＭＳ検出は、陰イオンモード、電源電圧３．５ｋＶで、イオン移動管温度が３５０℃であった。ｍ／ｚ値が５０〜１５００の範囲にわたってフルスキャン質量スペクトルを記録した。注入量は２μＬであった。
【０１０９】
四環系トリテルペノイド及びこれらの誘導体の実施例：
試料：０．００２０ｇの乾燥抽出物を５ｍＬのＭｅＯＨ及び５ｍＬのＥｔＯＨ  ６０％（ｖ／ｖ）で溶解する。超音波で５分間ホモジナイズする。
標準（原液）：０．００５０ｇの各標準を５ｍＬの好適な混合溶剤で溶解する。超音波で５分間ホモジナイズする。プロトジオスシン、ジオスシン、ジオスゲニン、及びサルササポゲニン（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ−Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ、スフェルヴェイヤールハイム、フランス）には５ｍＬのＭｅＯＨを添加し、超音波で５分間ホモジナイズする。５００．０μＬの各原液を５ｍＬのメスフラスコに入れ、０．５ｍＬのＭｅＯＨ及び１．０ｍＬのＥｔＯＨ  ６０％で２．０ｍＬに調整する。
【０１１０】
ＤＩＯＮＥＸ  Ａｃｃｌａｉｍ（登録商標）Ｃ１８カラム（２．２μｍ、１５０×２．１ｍｍ）を用いて５０℃で試料及び標準を分析した。使用した溶離液は、水／ギ酸（９９．９：０．１、ｖ／ｖ）（溶離液Ａ）及びアセトニトリル／ギ酸（９９．９：０．１、ｖ／ｖ）（溶離液Ｂ）であった。溶離プログラム（溶離条件）は０〜１分、１０％Ｂ；１〜１４分、１０〜９０％Ｂ；１４〜１６．５分、９０〜９５％Ｂ；１６．５〜２０．５分、９５％Ｂ；２０．５〜２１分、９５〜１０％Ｂ；２１〜２５分、１０％Ｂであった。流量は４５０μＬ／ｍｉｎ、ＤＡＤ検出は２１０ｎｍ、ＭＳ検出は、陰イオンモード、電源電圧３．５ｋＶで、イオン移動管温度が３５０℃であった。ｍ／ｚ値が５０〜１５００の範囲にわたってフルスキャン質量スペクトルを記録した。注入量は２μＬであった。
【０１１１】
１．２．細胞モデル
ラット皮質ニューロンを、Ｓｉｎｇｅｒら（非特許文献２１）及びＣａｌｌｉｚｏｔら（非特許文献２２）が記載するように培養した。
【０１１２】
妊娠１５日目の雌ラット（Ｗｉｓｔａｒ；ＪａｎｖｉｅｒＬａｂｓ、サン・ベルトヴァン、フランス）を頸椎脱臼により安楽死させた。胎児を回収し、すぐさま２％ペニシリン（１０．０００Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）溶液（ＰＳ；Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、アイデンバッハ、ドイツ）及び１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、アイデンバッハ、ドイツ）を加えた氷冷のＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ１５培地（Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、アイデンバッハ、ドイツ）に入れた。皮質は、終濃度０．０５％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡのトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、アイデンバッハ、ドイツ）溶液を用いて３７℃で２０分間処理した。ＤＮＡｓｅ  ＩグレードＩＩ（終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ；Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、セルジー・ポントワーズ、フランス）を含有する、４．５ｇ／Ｌのグルコース（Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、アイデンバッハ、ドイツ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を添加して解離を停止させた。細胞を１０ｍＬピペットのチップに３回強制的に通すことによって機械的に解離させた。次いで、細胞５１５ｇを４℃で１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットをＢ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、セルジー・ポントワーズ、フランス）の２％溶液、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン（Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、アイデンバッハ、ドイツ）、２％のＰＳ溶液、及び１０ｎｇ／ｍＬの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、アイデンバッハ、ドイツ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、セルジー・ポントワーズ、フランス）からなる限定培養培地に再懸濁させた。生細胞をノイバウエル血球計算盤でトリパンブルー排除法を用いて計数した。この細胞を、ポリ−Ｌ−リジンでプレコートした９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｂｉｏｃｏａｔ、テュークスバリー、米国）にウェル当たり３０，０００の密度で播種し、空気（９５％）−ＣＯ２（５％）インキュベーターで３７℃で培養した。培地は２日ごとに交換した。皮質ニューロンは培養１３日後にグルタミン酸塩溶液（下記参照）で中毒させた。
【０１１３】
１．３．グルタミン酸塩暴露
１３日目に、試験化合物の存在下又は不在下でグルタミン酸塩（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、リヨン、フランス）を対照培地で希釈して終濃度が４０μΜとなるように細胞培養物に加え、２０分間置いた。２０分後に、細胞を洗浄し、ＮＳＰＸＸ−Ｅ２又はＮＳＰＸＸ−Ｅ１抽出物を含有する又は含有しない新たな新鮮培地を加えてさらに４８時間置いた。
【０１１４】
１．４．生存率評価
グルタミン酸塩で４８時間中毒させた後、細胞をエタノール（９５％、Ｓｉｇｍａ）及び酢酸（５％、Ｓｉｇｍａ）の冷溶液により−２０℃で５分間固定した。０．１％のサポニン（Ｓｉｇｍａ）で透過処理した後、細胞を１％ウシ胎児血清及び０．１％サポニンを含有するＰＢＳ（Ｐａｎ  ｂｉｏｔｅｃｈ）中で、１／４００希釈の微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ−２；Ｓｉｇｍａ）に対するマウスモノクローナル抗体とともに２時間インキュベートした。
【０１１５】
この抗体を、１％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．１％サポニンを含有するＰＢＳ中で、１／４００希釈のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて室温で１時間可視化した。
【０１１６】
１．５．技術分析及び統計分析
１．５．１．神経突起ネットワーク長の評価
各条件につき６ウェルを評価し、ウェル当たり３０枚の写真を、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（分子素子）を用いて倍率２０倍で撮影して（２０倍で３０枚の写真はウェルの全表面の約８０％に相当）神経突起ネットワークを評価した（ＭＡＰ−２染色）。写真の解析はＭｅｔａＸｐｒｅｓｓカスタムモジュールエディタソフトウエア（分子素子）を用いて行い、写真１枚当たりの総神経突起長を記録した。各ウェルについて写真１０枚の平均神経突起長を自動計算した後、各ウェルにつき１つのデータを示した（各条件につき合計６の生データを示した）。
【０１１７】
１．５．２．ニューロン生存率の評価
各条件につき６ウェルを評価し、ウェル当たり３０枚の写真を、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（分子素子）を用いて倍率２０倍で撮影して細胞体を評価した（ＭＡＰ−２染色）。写真の解析はＭｅｔａＸｐｒｅｓｓカスタムモジュールエディタソフトウエア（分子素子）を用いて行い、写真１枚当たりのニューロン数を記録した。各ウェルについて写真１０枚の平均ニューロン数を自動計算した後、各ウェルにつき１つのデータを示した（各条件につき合計６の生データを示した）。
【０１１８】
１．６．統計分析
値はすべて、平均±ｓ．ｅ．平均（ＳＥＭ）として表した。データは、グルタミン酸塩損傷を表すために、対照条件（中毒なし、グルタミン酸塩なし＝１００％）に対する割合で表した。
【０１１９】
統計分析は、異なる条件（可能な場合は、一元配置分散分析の後にダネット検定又はＰＬＳＤフィッシャー検定を実施、Ｓｔａｔｖｉｅｗソフトウェア・ヴァージョン５．０）で行った。ｐ＜０．０５を有意とした。
【０１２０】
２．結果
２．１．植物抽出物ＮＳＰ０２−１４−Ｅ００１（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｐｅｒｓｉｍｉｌｉｓのエタノール抽出物）から得られた結果
結果を図１に示す。
【０１２１】
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意なニューロン死（約３０％）を誘導した。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したＮＳＰ０２−１４−Ｅ００２（５００ｎｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬ）の存在下では、ニューロン生存率（図１Ａ）及び神経突起ネットワーク（図１Ｂ）に有意な保護効果が認められた（約８０％の生存率）。
【０１２２】
植物抽出物ＮＳＰ０２−１４−Ｅ００１は、抽出物中に神経保護化合物が存在しているかを確認するために、上記１．１に記載したように、ＤＩＯＮＥＸ  Ａｃｃｌａｉｍ（登録商標）Ｃ１８カラム（２．２μｍ、１５０×２．１ｍｍ）を用いて５０℃で分析した。結果を図１Ｃに示す。
【０１２３】
植物抽出物ＮＳＰ０２−１４−Ｅ００１（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｐｅｒｓｉｍｉｌｉｓ）はカテキン及び微量のジオスゲニン誘導体（ジオスシン）を含有していた。
【０１２４】
２．２．植物抽出物ＮＳＰ０２−２９−Ｅ００１（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｖｉｌｌｏｓａの水性抽出物）で得られた結果
結果を図２に示す。
【０１２５】
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意なニューロン死（約３０％）を誘導した。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したＮＳＰ０２−２９−Ｅ００１（１０〜５００ｎｇ／ｍＬ）の存在下では、ニューロン生存率（図２Ａ）及び神経突起ネットワーク（図２Ｂ）に保護効果が認められ（約８０％の生存率）、保護効果は５０〜５００ｎｇ／ｍＬで有意であった。
【０１２６】
抽出物は最高濃度では毒性があった。
【０１２７】
植物抽出物ＮＳＰ０２−２９−Ｅ００１は、抽出物中に神経保護化合物が存在しているかを確認するために、上記１．１に記載したように、ＤＩＯＮＥＸ  Ａｃｃｌａｉｍ（登録商標）Ｃ１８カラム（２．２μｍ、１５０×２．１ｍｍ）を用いて５０℃で分析した。結果を図２Ｃに示す。
【０１２８】
植物抽出物ＮＳＰ０２−２９−Ｅ００１（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｖｉｌｌｏｓａ）はカテキン及びジオスゲニン誘導体（ジオスシン及びプロトジオスシン）を含有していた。
【０１２９】
２．３．植物抽出物ＮＳＰ０２−２９−Ｅ００２（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｖｉｌｌｏｓａの水アルコール抽出物）で得られた結果
結果を図３に示す。
【０１３０】
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意なニューロン死（約３０％）を誘導した。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したＮＳＰ０２−２９−Ｅ００２（５０〜５００ｎｇ／ｍＬ）の存在下では、ニューロン生存率（図３Ａ）及び神経突起ネットワーク（図３Ｂ）に保護効果が認められ（約８０％の生存率）、保護効果は１００〜５００ｎｇ／ｍＬで有意であった。
【０１３１】
抽出物は最高濃度では毒性があった。
【０１３２】
植物抽出物ＮＳＰ０２−２９−Ｅ００２は、抽出物中に神経保護化合物が存在しているかを確認するために、上記１．１に記載したように、ＤＩＯＮＥＸ  Ａｃｃｌａｉｍ（登録商標）Ｃ１８カラム（２．２μｍ、１５０×２．１ｍｍ）を用いて５０℃で分析した。結果を図３Ｃに示す。
【０１３３】
植物抽出物ＮＳＰ０２−２９−Ｅ００２（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｖｉｌｌｏｓａ）はカテキン及び微量のジオスゲニン誘導体（ジオスシン及びプロトジオスシン）を含有していた。
【０１３４】
２．４．植物抽出物ＮＳＰ１９−３０−Ｅ００２（Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの水アルコール抽出物）で得られた結果
結果を図４に示す。
【０１３５】
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意なニューロン死（約３０％）を誘導した。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したＮＳＰ１９−３０−Ｅ００２（５００ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ）の存在下では、ニューロン生存率（図４Ａ）及び／又は神経突起ネットワーク（図４Ｂ）に有意な保護効果が認められた（約８０％の生存率）。
【０１３６】
植物抽出物ＮＳＰ１９−３０−Ｅ００２は、抽出物中に神経保護化合物が存在しているかを確認するために、上記１．１に記載したように、ＤＩＯＮＥＸ  Ａｃｃｌａｉｍ（登録商標）Ｃ１８カラム（２．２μｍ、１５０×２．１ｍｍ）を用いて５０℃で分析した。結果を図４Ｃに示す。
【０１３７】
植物抽出物ＮＳＰ１９−３０−Ｅ００２（Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）はサルササポゲニン、カフェ酸、及びクマル酸を含有していた。
【０１３８】
２．５．植物抽出物ＮＳＰ２０−３１−Ｅ００２（Ｓｍｉｌａｘ  ａｓｐｅｒａの水アルコール抽出物）で得られた結果
結果を図５に示す。
【０１３９】
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意なニューロン死（約３０％）を誘導した（図５Ａ）。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したＮＳＰ２０−３１−Ｅ００２（１〜５μｇ／ｍＬ）の存在下では、神経突起ネットワーク（図５Ｂ）に有意な保護効果が認められた（約８０％の生存率）。
【０１４０】
植物抽出物ＮＳＰ２０−３１−Ｅ００２は、抽出物中に神経保護化合物が存在しているかを確認するために、上記１．１に記載したように、ＤＩＯＮＥＸ  Ａｃｃｌａｉｍ（登録商標）Ｃ１８カラム（２．２μｍ、１５０×２．１ｍｍ）を用いて５０℃で分析した。結果を図５Ｃに示す。
【０１４１】
植物抽出物ＮＳＰ２０−３１−Ｅ００２（Ｓｍｉｌａｘ  ａｓｐｅｒａ）はサルササポゲニンを含有していた。
【０１４２】
[実施例２]
サルササポゲニン（ＳＡＲ）、ジオスゲニン（ＤＩＯＳＧ）、ジオスシン（ＤＩＯＳ）、ケルセチン、カテキン、カフェ酸（ＣＡＦ）、クマル酸（ＣＯＵ）、フェルラ酸（ＦＡ）、及び没食子酸の神経保護効果の評価
ＮＳＰ０２−２９−Ｅ００１、ＮＳＰ０２−２９−Ｅ００２、及びＮＳＰ１９−３０−Ｅ００２抽出物の急性解析的分析を行った。いくつかの化合物がこの効果に関与し、相乗的に作用するとみられた。この試験では、単一分子の混合物が、グルタミン酸塩曝露によって損傷させた一次皮質ニューロンに及ぼす神経保護効果を、実施例１に示した方法に従って評価した。
【０１４３】
１．サルササポゲニン（ＳＡＲ、ステロイドサポニン）の効果
結果を図６に示す。
【０１４４】
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意なニューロン死（約３０％）を誘導した。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したＳＡＲ（１００ｐＭ〜１００ｎＭ）の存在下では、ニューロン生存率及び神経突起ネットワークに保護効果が認められ（約８０％の生存率）、保護効果は神経突起ネットワークでは１００ｐＭ〜１０ｎＭで（図６Ｂ）、及びニューロン生存率では１００ｎＭ（図６Ａ）で有意であった。
【０１４５】
抽出物は最高濃度では毒性があった。
【０１４６】
２．ジオスゲニン（ＤＩＯＳＧ、ステロイドサポニン）の効果
結果を図７に示す。
【０１４７】
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意なニューロン死（約３０％）を誘導した。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したＤＩＯＳＧ（３〜３０ｐＭ）の存在下では、ニューロン生存率（図７Ａ）及び神経突起ネットワーク（図７Ｂ）に有意な保護効果が認められた（約８０％の生存率）。
【０１４８】
３．ジオスシン（ＤＩＯ、ステロイドサポニン、ジオスゲニンのヘテロシド誘導体）の効果
結果を図８に示す。
【０１４９】
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意なニューロン死（約３０％）を誘導した。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したＤＩＯＳ（６．３〜６３０ｎＭ）の存在下では、ニューロン生存率（図８Ａ）及び神経突起ネットワーク（図８Ｂ）に有意な保護効果が認められた（約８０％の生存率）。
【０１５０】
４．ケルセチン（フェニルプロパノイド−フラボノイド）の効果
結果を図９に示す。
【０１５１】
グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したケルセチンの存在下では、１及び１０ｎＭでニューロン生存率（図９Ａ）に、また１００ｎＭ及び１μＭで神経突起ネットワーク（図９Ｂ）に有意な保護効果が認められた（８５％の生存率）。
【０１５２】
５．カテキン（フェニルプロパノイド−フラボノイド）の効果
結果を図１０に示す。
【０１５３】
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意なニューロン死（約３０％）を誘導した。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したＣＡＴ（１ｎＭ〜１μＭ）の存在下では、ニューロン生存率（図１０Ａ）及び神経突起ネットワーク（図１０Ｂ）に保護効果が（約８０％の生存率）、１００ｎＭ〜１μＭでニューロン生存率に有意な保護効果が認められた。
【０１５４】
６．カフェ酸（ＣＡＦ、フェニルプロパノイド−ヒドロキシケイ皮酸）の効果
結果を図１１に示す。
【０１５５】
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意なニューロン死（約３０％）を誘導した。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したＣＡＴ（５００ｎＭ〜５μＭ）の存在下では、ニューロン生存率（図１１Ａ）及び神経突起ネットワーク（図１１Ｂ）に保護効果が（約８０％の生存率）、５００ｎＭ〜５μＭで神経突起ネットワークに有意な保護効果が認められた。
【０１５６】
７．クマル酸（ＣＯＵ、フェニルプロパノイド−ヒドロキシケイ皮酸）の効果
結果を図１２に示す。
【０１５７】
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意なニューロン死（約３０％）を誘導した。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したＣＯＵ（１００ｎＭ〜１μＭ）の存在下では、ニューロン生存率（図１２Ａ）及び神経突起ネットワーク（図１２Ｂ）に保護効果が（約８０％の生存率）、１００ｎＭでニューロン生存率に有意な保護効果が認められた。
【０１５８】
８．フェルラ酸（ＦＡ）の効果
結果を図１３に示す。
【０１５９】
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意なニューロン死（約３０％）を誘導した。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したＦＡ（１〜１００μＭ）の存在下では、ニューロン生存率（図１３Ａ）及び神経突起ネットワーク（図１３Ｂ）に保護効果が（約８０％の生存率）、１〜１００μＭで神経突起ネットワークに有意な保護効果が認められた。
【０１６０】
９．没食子酸の効果
結果を図１４に示す。
【０１６１】
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意なニューロン死（約３０％）を誘導した。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置した没食子酸（１０μＭ）の存在下では、ニューロン生存率（図１４Ａ）及び神経突起ネットワーク（図１４Ｂ）に保護効果が（約８０％の生存率）、１０ｐＭ〜１μＭで神経突起ネットワークに有意な保護効果が認められた。
【０１６２】
[実施例３]
２種又は３種組み合わせの神経保護効果
実施例２において単独で試験した２種又は３種の分子の混合物が、グルタミン酸塩曝露によって損傷させた一次皮質ニューロンに及ぼす神経保護効果を、実施例１に示した方法に従って評価した。またこれらの相乗効果も評価した。
【０１６３】
１．２種組み合わせ組成物
以下の２種組み合わせ組成物をさまざまな濃度で試験した。
−  ステロイドサポニンとしてのジオスゲニン（ＤＩＯＳ）と第１のポリフェノール化合物としてのカフェ酸（ＣＡＦ）又はフェルラ酸（ＦＡ）との組み合わせ；及び
−  ステロイドサポニンとしてのサルササポゲニン（ＳＡＲ）と第１のポリフェノール化合物としてのカフェ酸（ＣＡＦ）又はフェルラ酸（ＦＡ）との組み合わせ。
【０１６４】
１．１．ステロイドサポニンとしてのジオスゲニン（ＤＩＯＳ）に第１のポリフェノール化合物としてのカフェ酸（ＣＡＦ）又はフェルラ酸（ＦＡ）を組み合わせた効果
結果を図１５及び１６に示す。
【０１６５】
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意なニューロン死（約３０％）及び神経突起の大幅な喪失（約４０％）を誘導した。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置した混合化合物（ＤＩＯＳＧ／ＣＡＦ又はＤＩＯＳＧ／ＦＡの２種組み合わせ）の存在下では、濃度０．３ｐＭ／１０ｎＭ及び０．３ｐＭ／１ｎＭのＤＩＯＳＧ／ＦＡ混合物においてニューロン生存率及び神経突起ネットワークに保護効果が認められ（約８０％の生存率）、同じ濃度のＤＩＯＳＧ／ＣＡＦ混合物（０．３ｐＭ／５００ｐＭ）において神経突起ネットワークに有意な保護効果が認められた。
【０１６６】
ジオスゲニンとカフェ酸又はフェルラ酸とを組み合わせることによって、ジオスゲニンの濃度は、ジオスゲニンを単独で使用する場合のジオスゲニンの濃度と比べて１０分の１に低減された。
【０１６７】
１．２．ステロイドサポニンとしてのサルササポゲニンに第１のポリフェノール化合物としてのカフェ酸又はフェルラ酸を組み合わせた効果
結果を図１７及び１８に示す。
【０１６８】
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意なニューロン死（約３０％）及び神経突起の大幅な喪失（約４０％）を誘導した。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置した混合化合物（ＳＡＲ／ＣＡＦ又はＳＡＲ／ＦＡの２種組み合わせ）の存在下では、濃度１０ｐＭ／５ｎＭ及び１０ｐＭ／５００ｎＭのＳＡＲ／ＣＡＦ混合物、ならびに濃度１０ｐＭ／１ｎＭ及び１０ｐＭ／１０ｎＭのＳＡＲ／ＦＡ混合物においてニューロン生存率及び神経突起ネットワークに保護効果が認められ（約８０％の生存率）、同じ濃度で神経突起ネットワークに有意な保護効果が認められた。
【０１６９】
サルササポゲニンとカフェ酸又はフェルラ酸とを組み合わせることによって、サルササポゲニンの濃度は、サルササポゲニンを単独で使用する場合のサルササポゲニンの濃度と比べて１０分の１に低減された。
【０１７０】
２．３種組み合わせ組成物
以下を用いて３種組み合わせを調製した：
−  ０．０３〜０．３ｐＭのジオスゲニンの投与量、
−  濃度５〜５０ｎＭのカフェ酸の投与量、及び
−  濃度１〜１０ｎＭのフェルラ酸の投与量。
【０１７１】
結果を図１９及び２０に示す。
【０１７２】
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意なニューロン死（約３０％）及び神経突起の大幅な喪失（約４０％）を誘導した。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置した混合化合物（ＤＩＯＳＧ／ＣＡＦ／ＦＡの３種組み合わせ）の存在下では、以下の濃度で、ニューロン生存率及び神経突起ネットワークに有意な保護効果が認められた（約８０〜９０％の生存率）：
（ｉ）０．０３ｐＭ／５ｎＭ／１ｎＭ（ニューロン生存率）
（ｉｉ）０．０３ｐＭ／５ｎＭ／１０ｎＭ（両方）
（ｉ）０．０３ｐＭ／５０ｎＭ／１０ｎＭ（ニューロン生存率）
（ｉｉ）０．３ｐＭ／５ｎＭ／１ｎＭ（両方）
（ｉｉｉ）０．３ｐＭ／５ｎＭ／１０ｎＭ（両方）
（ｉｖ）０．３ｐＭ／５０ｎＭ／１ｎＭ（両方）
（ｖ）０．３ｐＭ／５０ｎＭ／１０ｎＭ（両方）。
【０１７３】
ＤＩＯＳＧ／ＣＡＦ／ＦＡを組み合わせることによって、ジオスゲニンの濃度は０．０３ｐＭと、ジオスゲニンを単独で使用する場合のジオスゲニンの濃度と比べて１００分の１に低減された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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