(57)【要約】  本発明は、心筋細胞製剤、その製造方法及び心不全の治療における製剤の応用を提供する。その心筋細胞製剤には、多能性幹細胞から分化した心筋細胞及び線維芽細胞を含み、心筋細胞製剤中での心筋細胞の濃度は０．７５×１０  ７〜１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、心筋細胞の含有量は、８０％より高くなり、且つ線維芽細胞の含有量は、２０％以下である。その心筋細胞製剤は、心臓の駆出率及び左室内径短縮率を改善させ、左心室の壁の厚さを増加させることができる。
2021525107.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞から分化した心筋細胞及び線維芽細胞を含む心筋細胞製剤であって、前記心筋細胞製剤中の心筋細胞濃度は０．７５×１０７〜１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、前記心筋細胞の含有量は８０％より高くなり、且つ前記線維芽細胞の含有量は、２０％以下である、ことを特徴とする心筋細胞製剤。
【請求項２】
前記心筋細胞の濃度は０．５×１０８〜１．２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項１に記載の心筋細胞製剤。
【請求項３】
前記心筋細胞製剤中の多能性幹細胞の残存量は１％以下である、ことを特徴とする請求項１に記載の心筋細胞製剤。
【請求項４】
前記心筋細胞製剤中の多能性幹細胞の残存量は０．３％以下である、ことを特徴とする請求項３に記載の心筋細胞製剤。
【請求項５】
前記心筋細胞は、多能性幹細胞から以下の手順で調製される。
多能性幹細胞の前処理：前記多能性幹細胞を０．９×１０５〜３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で多能性幹細胞培養用培地に播種し、５％ＣＯ２、３７℃条件下で密度が４０％以上を超えるまで培養すること；
心筋細胞の分化：前記多能性幹細胞培養用培地を吸引除去し、濃度が０．０１〜０．０９ｍＭのＣＨＩＲ９９０２１を含む心筋細胞分化誘導用培地を加えて４８時間培養し、その培地を濃度が０．０１〜０．０５ｍＭのＩＷＲ−１を含む心筋細胞分化誘導用培地に交換し、４８時間培養し続け、さらに、心筋細胞分化誘導用培地で培養し続け、しかも、細胞増殖状態に応じて心筋細胞分化誘導用培地を交換すること；
心筋細胞の精製：観察可能な拍動が見られるまで心筋細胞の分化を経た細胞を培養し続け、細胞を心筋細胞分化誘導用培地に６．０×１０５〜９．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、線維芽細胞の含有量を心筋細胞の精製液で２０％未満に調整することである、ことを特徴とする請求項１に記載の心筋細胞製剤の製造方法。
【請求項６】
前記多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞及び胚性幹細胞を含む、ことを特徴とする請求項５に記載の心筋細胞製剤の製造方法。
【請求項７】
前記心筋細胞の精製は、さらに、濃度が０．７５〜５μＭのＳＴＦ−３１を含む心筋細胞培地で細胞を２〜５日間培養することを含む、ことを特徴とする請求項５に記載の心筋細胞製剤の製造方法。
【請求項８】
心筋細胞の精製で得られた細胞及び生理食塩水は、無菌条件下で心筋細胞の濃度が０．７５×１０７〜１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液に調製される、ことを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の心筋細胞製剤の製造方法。
【請求項９】
心不全治療薬の調製における請求項１に記載の心筋細胞製剤の応用。
【請求項１０】
前記心筋細胞製剤は、ＨＦｒＥＦの治療に用いれる、ことを特徴とする請求項９に記載の心不全治療薬の調製における心筋細胞製剤の応用。
【請求項１１】
前記心筋細胞製剤は、注射器により外科心外膜を通して瘢痕領域または心筋壁の菲薄化した領域に注射される、ことを特徴とする請求項９に記載の心不全治療薬の調製における心筋細胞製剤の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞製剤の技術分野に関し、具体的には、心筋細胞製剤及びその製造方法、並びに応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全とは、心臓のさまざまな病気が後期に進行することによって引き起こされる心不全状態の病理学的現象を意味し、心臓の収縮機能又は拡張機能の障害によって心室充満または駆出能力が損なわれる臨床症候群であり、臨床的には、駆出率及び左室内径短縮率の低減、心筋内圧力の増加、心腔内径の増大、左心室拡張期及び収縮期容積の増加が表される。
ＡＣＣ／ＡＨＡは、心不全をＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤの４つの段階に分けられ、段階Ａ及びＢとは、患者は心不全の初期症状がないが、危険因子または心臓異常があることを指し、これらの異常は、心臓の形態および構造の改変を含み、段階Ｃとは、患者が現在または以前に心不全の症状、例えば、息切れなどがあり、段階Ｄとは、末期心不全または難治性心不全と呼ばれる重度の心不全の段階を指す。
【０００３】
中国の心不全の疫学調査によると、現在の中国の男性の発生率は０．７％、女性の発生率は１％であり、しかも、加齢とともに心不全の発生率は徐々に増加してきて、心不全が発生すると、患者には悪循環を形成し、これも高齢者の死亡率が非常に高い疾患であり、中国の高齢化社会の深刻化する現象に伴い、心不全は国民の体力を深刻に危険にさらす理由の１つになる。
現在、心不全（ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）の治療法は、主に、化学的医薬品により神経内分泌系の活動を低下させ、ＡＴ１Ｒの過剰興奮によって引き起こされる悪影響を遮断または改善するか、又は心不全時の水分及びナトリウム貯留を排除することにより心不全の治療の役割を果たすが、臨床的実践では、これらの化学的医薬品は、心不全の治療においていずれも、例えば、低血圧や腎機能の低下などさまざまな副作用があることを示す。
幹細胞技術の発展に伴い、この分野の学者は、幹細胞移植によるさまざまな心疾患に起因する末期心不全の治療方法の研究に取り組んでいるが、心臓機能を改善する効果は明らかではなく、フォローアップの安全性研究では、体内への注射後の幹細胞は腫瘍形成能があり、臨床的研究や治療には適さない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、その目的の一態様は、心不全患者の心機能を効果的に高めることができ、且つ安全で信頼性の高い心筋細胞製剤を提供することであり、前記心筋細胞製剤は、多能性幹細胞から分化した心筋細胞及び線維芽細胞を含み、ここで、前記心筋細胞製剤中の心筋細胞濃度は０．７５×１０７〜１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、前記心筋細胞の含有量は、８０％より高くなり、且つ前記線維芽細胞の含有量は、２０％以下である。
前記心筋細胞は、多能性幹細胞から直接分化した心筋細胞であってもよく、凍結保存によって蘇生された心筋細胞であってもよくい。
本発明の実施例で提供される心筋細胞製剤中の心筋細胞の濃度は、０．７５×１０７〜１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬに限定され、該濃度は、心筋細胞製剤中での細胞生存率を高めるだけでなく、前記心筋細胞製剤が心不全患者の駆出率及び左室内径短縮率を効果的に向上させ、心室壁の厚さを増加させ、心不全患者の心機能を改善することができる。また、本発明者らは、大量の実験を通じて、心筋細胞製剤に一定量の線維芽細胞を含ませることで心不全患者の心機能を改善するのに役立ち、心筋細胞製剤中の線維芽細胞の含有量が２０％未満である場合には、前記心筋細胞製剤は、心臓の駆出率を効果的に向上させることができ、線維芽細胞の含有量が２０％より高くなる場合には、駆出率の改善は明らかではなく、線維芽細胞の含有量が増加するにつれて減少することを発見した。
【０００５】
本発明の実施例は、心筋細胞製剤中の心筋細胞の含有量を８０％より高く制限するため、心筋細胞製剤中での多能性幹細胞の含有量がある程度低減するように制限され、多能性幹細胞の腫瘍形成能を低下させ、、心筋細胞製剤による心不全患者の心機能を改善することを保証するとともに、細胞製剤の安全性も向上させる。
好ましくは、前記心筋細胞製剤において、前記心筋細胞の濃度は、０．５×１０８〜１．２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。心筋細胞製剤中の心筋細胞濃度はこの範囲にある場合には、前記心筋細胞製剤は、心不全患者の心機能を改善するより良い作用を有する。
好ましくは、前記心筋細胞製剤において、多能性幹細胞の残存量は１％以下であり、具体的には、前記心筋細胞製剤においてＮａｎｏｇ、ＳＳｅａ４及びＯｃｔ３／４が陽性に発現する細胞の含有量は、１％以下である。
【０００６】
本発明の実施例で提供される多能性幹細胞の残存量が３０％を超える心筋細胞製剤は、腫瘍形成能を有する可能性があり、心筋細胞製剤の使用中の潜在的なリクスを排除するために、大量のｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験データから、心筋細胞製剤中の多能性幹細胞の含有量を１％以内に制御することにより心筋細胞製剤の腫瘍形成能を効果的に排除することができる。
さらに好ましくは、前記心筋細胞製剤において、多能性幹細胞の残存量は０．３％以下であり、具体的には、前記心筋細胞製剤においてＮａｎｏｇ、ＳＳｅａ４、Ｏｃｔ３／Ｏｃｔ４が陽性に発現する細胞の含有量は、０．３％以下である。
他の一態様、本発明の実施例は、多能性幹細胞から以下の手順で調製される前記心筋細胞製剤の製造方法を提供する。
多能性幹細胞の前処理：前記多能性幹細胞を０．９×１０５〜３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で多能性幹細胞培養用培地に播種し、５％  ＣＯ２、３７℃条件下で密度が４０％以上を超えるまで培養すること；
心筋細胞の分化：前記多能性幹細胞培養用培地を吸引除去し、濃度が０．０１〜０．０９  ｍＭのＣＨＩＲ９９０２１を含む心筋細胞分化誘導用培地を加えて４８時間培養し、その培地を濃度が０．０１〜０．０５ｍＭのＩＷＲ−１を含む心筋細胞分化誘導用培地に交換し、４８時間培養し続け、さらに、心筋細胞分化誘導用培地で培養し続け、細胞増殖状態に応じて心筋細胞分化誘導用培地を交換すること；
【０００７】
心筋細胞の精製：観察可能な拍動が見られるまで心筋細胞の分化を経た細胞を培養し続け、細胞を心筋細胞分化誘導用培地に６．０×１０５〜９．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、線維芽細胞の含有量を心筋細胞の精製液で２０％未満に調整することである。
好ましくは、前記心筋細胞製剤の製造方法において、前記多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞及び胚性幹細胞を含む。
さらに好ましくは、前記心筋細胞製剤の製造方法において、前記心筋細胞の精製は、さらに、濃度が０．７５〜５μＭのＳＴＦ−３１を含む心筋細胞培地で細胞を２〜５日間培養することを含む。ＳＴＦ−３１は、心筋細胞の分化での未分化の多能性幹細胞を除去し、心筋細胞の純度を向上させることができ、ＳＴＦ−３１の濃度又は精製時間を変えることにより細胞中の多能性幹細胞の含有量を制御することができる。
【０００８】
さらにより好ましくは、前記心筋細胞製剤の製造方法において、心筋細胞の精製で得られた細胞と生理食塩水を無菌条件下で心筋細胞濃度０．７５×１０７〜１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液に調製する。
多能性幹細胞から調製された心筋細胞は、それぞれ心筋細胞、多能性幹細胞及び線維芽細胞の含有量が検出された後、心筋細胞の濃度を制御するために必要に応じて生理食塩水の添加量を選択する。
他の一態様、本発明の実施例は、さらに、心不全治療薬の調製における心筋細胞製剤の応用を提供する。
【０００９】
好ましくは、前記心不全治療薬の調製における心筋細胞製剤の応用において、前記心筋細胞製剤は、ＨＦｒＥＦの治療に用いられる。本発明の実施例で提供される心筋細胞製剤は、ＨＦｒＥＦ型心不全患者の心機能に対する改善がＨＦｐＥＦ型心不全患者の心機能に対する改善よりも優れた。
さらに好ましくは、前記心不全治療薬の調製における心筋細胞製剤の応用において、前記心筋細胞製剤が注射器により外科心外膜を通して瘢痕領域または心筋壁の菲薄化した領域に注射される。
本発明の実施例で提供される心筋細胞製剤は、以下の有益な効果を有する。即ち、本発明の実施例で提供される濃度範囲内の心筋細胞製剤は、心不全患者の心臓駆出率の低減を効果的に緩和し、左室内径短縮率を向上させ、心室壁の厚さを増加させ、心機能を改善させることができるとともに、腫瘍形成能を持たない。本発明の実施例で提供される心筋細胞製剤の製造方法は、手順が簡単で、反復率が高く、大規模な生産に適する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例３の対照群及び実験群の、それぞれ心不全モデルを構築した前（ベースライン）、Ｄ０及びＤ２８の左室短軸Ｍモード超音波結果を示す。ここで、対照群の心不全モデルは、左室前壁は経時的に薄くなり、Ｄ２８の実験群はＤ２８の対照群の左室前壁厚よりも大きくなる。
【図２】図２Ａは、実施例３の対照群及び実験群の、それぞれ心不全モデルを構築した前（ベースライン）、Ｄ０及びＤ２８という３つの時点の駆出率を示し、図２Ｂは、それぞれ実験群及び対照群の、Ｄ０に対するＤ２８の駆出率の変化量を示し、実験群はＤ２８の駆出率が、Ｄ０よりも増加し、駆出率の変化量が８．３１％である。
【図３】図３は、実施例３の対照群及び実験群の、それぞれ心不全モデルを構築した前（ベースライン）、Ｄ０及びＤ２８といった３つの時点の的左室内径短縮率を示し、実験群は対照群よりもＤ２８の左室内径短縮率が増加する。
【図４】図４Ａは、実施例３の対照群及び実験群の、心不全モデルを構築した前（ベースライン）、Ｄ０及びＤ２８という３つの時点の左室収縮末期径を示し、図４Ｂは、実施例３の対照群及び実験群の、それぞれ心不全モデルを構築した前（ベースライン）、Ｄ０及びＤ２８といった３つの時点の左室収縮末期容積を示し、実験群の左室収縮末期径及び左心室収縮期容積は、対照群よりもＤ０からＤ２８において増加し続けず、心不全の程度が抑制される。
【図５】図５は、実施例３の対照群及び実験群の、それぞれ心不全モデルを構築した前（ベースライン）、Ｄ０及びＤ２８という３つの時点の収縮末期左室前壁厚を示し、対照群のＤ２８の収縮末期左室前壁厚はＤ０よりも薄くなるが、実験群のＤ２８の収縮末期左室前壁厚は、Ｄ０よりも増加する。
【図６】図６は、実施例７の対照群及び実験群の、それぞれ心不全モデルを構築した前（ベースライン）、Ｄ０及びＤ２８という３つの時点の駆出率を示し、ここで、対照群のＤ２８の駆出率はＤ０よりも低減するが、実験群のＤ２８の駆出率は、Ｄ０よりも高くなり、駆出率の変化量は２２．９９％である。  本発明の実施例に記載のベースラインは、心不全モデリング構築前のラットの心機能状況であり、ラットの正常な心機能状況を反映する。  Ｄ０は、対照群又は実験群の心不全モデルの注射前のデータであり、心不全モデルラットの心機能を反映する。  Ｄ２８は、対照群又は実験群の心不全モデルの注射後２８日目のデータであり、心不全モデルラットの心機能を反映し、Ｄ０のデータと組み合わせて心不全モデル心機能の変化を評価する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の実施形態が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本発明をより明らかに説明するために、以下の用語を定義する。
多能性幹細胞培養用培地とは、多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞及び胚性幹細胞を含む）の培養及び増殖に用いれる培地。多能性幹細胞の最初に用いれる培養条件は、ゼラチンコート及びフィーダー層として使用されるマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）が必要であり、伝統的な培地は、さらに成分が複雑なノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）を主な培地添加剤として使用する。技術の継続的な最適化に伴い、基本培地を添加剤被と組み合わせて多能性幹細胞の培養に用いられ、基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含むが、これに限定されなく、一定の濃度のグルコースを含み、干細胞の増殖に必要な必須アミノ酸がある培地も基本培地として使用でき、添加剤は、炭酸水素ナトリウム、組換え型ヒト塩基性線維芽細胞成長因子、組換えヒトラクトフェリン、インスリン、アスコルビン酸、組換えヒト形質転換成長因子などを含むが、これらに限定されなく、本発明の実施例で使用される多能性幹細胞培養用培地は、前記の様々な培地に限定されなく、当業者に周知のすべての多能性幹細胞の培養に適用できる培地は、いずれも本発明の保護範囲に含まれるべきである。
【００１２】
心筋細胞培地とは、心筋細胞に栄養を供与し、心筋細胞の機能を維持するために使用される培地である。
本発明における心筋細胞とは、多能性幹細胞から分化した、ｃＴｎＴを特異的に発現できる細胞を意味する。
多能性幹細胞の残存量とは、本発明において、多能性幹細胞から心筋細胞を分化した細胞産物において、未分化の多能性幹細胞の数量が細胞総量に占める比率％を意味する。
駆出率（ＥＦ）とは、心拍ごとに心臓が放出する血液量を心臓が拡張 したときの容積で除した値であり、容積の観点から心室の駆出機能を反映し、カラードップラー心臓超音波で検査でき、駆出率は、心筋の収縮性に関連し、心筋収縮力が強いほど、駆出率が高くなる。
【００１３】
本発明の実施例において、各々の心不全モデルラットは心筋細胞製剤を注射する場合、心機能状態（評価指標として駆出率を選択する）が異なり、心筋細胞製剤が心機能に与える影響を客観的に評価するために、駆出率の変化量の概念を組み込まれる。
駆出率の変化量＝心筋細胞製剤治療後の駆出率−注射心筋細胞製剤前の駆出率
ＨＦｒＥＦとは、駆出率が低下した心不全であり、このタイプの心不全患者は、主な診断指標として身体症状及び左室駆出率（ＬＶＥＦ）に基づいて判定され、ＬＶＥＦ＜４０であるを指す。
ＨＦｐＥＦとは、駆出率が維持された心不全であり、左室拡張期能動的弛緩能が損なわれ、心筋のコンプライアンスが低下するので、左室拡張期充満が障害され、心拍出量が低減し、左室拡張末期圧が上昇し、心不全の症状及び身体症状が発生し、左室駆出率（ＬＶＥＦ）はほぼ正常であり、ＬＶＥＦ＞５０であることを指す。
【００１４】
以下、本発明の具体的な実施形態を図面によりさらに説明するが、本発明は、異なる形態で具体化することができ、且つ本明細書に記載の実施形態に限定されると理解すべきではない。逆に、これらの実施形態は、本発明をさらに完全にし、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるために提供される。
一、心筋細胞製剤の製造方法
１、多能性幹細胞から心筋細胞への分化
多能性幹細胞の前処理：胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）をそれぞれ０．９×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２及び３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で多能性幹細胞培養用培地に播種し、５％ＣＯ２、３７℃条件下で密度超が４０％以上を超えるまで培養した。ここで、多能性幹細胞培養用培地は、ＴｅＳＲＴＭ−Ｅ８ＴＭ培地である。多能性幹細胞の播種密度は、多能性幹細胞の増殖速度に影響を与え、多能性幹細胞の全体的な分化効率を向上させるため、本発明の実施例では、０．９×１０５〜３．０×１０５の播種密度を使用した。
【００１５】
多能性幹細胞培養用培地は、さらに、ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地に組換えヒトインスリン、組換えトランスフェリン、トアルブミン、クエン酸第二鉄、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−β、Ｌ−アスコルビン酸及びβ−メルカプトエタノールを適量添加して多能性幹細胞の増殖に適した環境を作製してもよい。
心筋細胞の分化：多能性幹細胞の密度が４０％以上を超える場合には、多能性幹細胞培養用培地を吸引除去し、ＣＨＩＲ９９０２１を含む心筋細胞分化誘導用培地を加えて４８時間後培養し、その培地をＩＷＲ−１を含む心筋細胞分化誘導用培地に交換し、４８時間培養後に心筋細胞分化誘導用培地で培養し続け、４８時間ごとに培地を交換し、拍動が観察されるまで細胞を培養する際にその心筋細胞及線維芽細胞の含有量を検出し、ここで、本発明の実施例で提供される心筋細胞分化誘導用培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地にインスリンが含まれていないＢ２７（ＲＰＭＩ１６４０培地とＢ２７の量は１００：２）を添加し、本発明の実施例に係る心筋細胞培地は、多能性幹細胞を心筋細胞に分化させるために使用できる他の培地であってもよい。
ＣＨＩＲ９９０２１の最終濃度が０．０１〜０．０９ｍＭ、ＩＷＲの最終濃度が０．０１〜０．０５ｍＭになる場合には、心筋細胞の分化効率は比較的に高くなり、心筋細胞の分化効率をさらに向上させるために、心筋細胞が６日間分化した後に成熟促進因子、例えば、インスリン含有Ｂ２７を添加してもよい。多能性幹細胞の培養密度が４０％を超える場合には、心筋細胞の分化効率に明らかな影響を与えなく、生産コストを削減するために、本発明の実施例は、多能性幹細胞の培養密度が４０％になる際に心筋細胞の分化を行うことを使用してもよい。
【００１６】
心筋細胞の精製：心筋細胞分化誘導用培地中での細胞の培養時間の延長に伴い、多能性幹細胞の含有量が低減するが、心筋細胞及び線維芽細胞の含有量が増加する。線維芽細胞の含有量をさらに制御するために、上記手順で調製された細胞を精製する必要があった。上記手順で調製された細胞をアキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）で消化し、遠心分離した後に以上のステップでの心筋細胞分化誘導用培地を加え、濃度が６．０×１０６〜９．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬである細胞懸濁液を調製し、６．０×１０５〜９．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で心筋細胞分化誘導用培地を含むＭａｔｒｉｇｅｌでコートされた細胞培養皿に播種し、心筋細胞の精製液で精製し、４８時間ごとに心筋細胞の精製液を交換し、ここで、心筋細胞の精製液は、最終濃度で１μＭのシトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド及び０．０２Ｍの乳酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ無糖培地であり、精製時間の延長に伴い、線維芽細胞の含有量は徐々に減少し、線維芽細胞の含有量が本発明の実施例の心筋細胞製剤の要求を満たす場合、精製を終了することができた。
【００１７】
以上の精製工程には、さらに、多能性幹細胞の含有量に応じて心筋細胞分化工程又は心筋細胞精製工程で調製された細胞を濃度が０．７５〜５μＭのＳＴＦ−３１を含む心筋細胞培地で２〜５日間培養し、ＳＴＦ−３１を含む心筋細胞培地での精製時間の延長に伴い、多能性幹細胞の含有量は徐々に減少し、必要に応じて適合なＳＴＦ−３１の濃度及び精製時間を選択した。
調製された細胞を免疫蛍光法により同定し、以上の操作はいずれも無菌条件下で行った。
当業者に知られている他の多能性幹細胞から心筋細胞への分化方法及び心筋細胞中の多能性幹細胞又は線維芽細胞の精製方法も同様に本発明に適用できる。
【００１８】
２、心筋細胞製剤の調製方法
本発明の実施例において、多能性幹細胞から分化した細胞を注射液として異なる濃度の心筋細胞を有する心筋細胞製剤に調製した。具体的な方法は、以下の通りである。
心筋細胞分化及び精製工程で心筋細胞の純度、線維芽細胞の純度及び多能性幹細胞の残存量の検出により、必要に応じて心筋細胞分化及び精製工程のパラメーターを制御して心筋細胞及び線維芽細胞の含有量を調整し、多能性幹細胞の残存量をできるだけ低減させた。本発明の実施例はフローサイトメトリーを使用して上記の３つの細胞の含有量を検出した。
【００１９】
心筋細胞の純度の検出：被験細胞をカウントした後に４％ＰＦＡで固定し、さらに、ＤＰＢＳで濃度が１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液１００μＬに調製し、遠心分離後、濃度が１％のＢＳＡ  ７０μＬ及びＦＣＲ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ２０μＬを加えて室温で３０分間ブロッキングした後、Ａｎｔｉ−Ｃａｒｄｉａｃ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ−ＦＩＴＣ  １０μＬを加えて均一に混合し、室温、暗所で３０分間インキュベートし、ＤＰＢＳで洗浄して遠心分離した後、フローサイトメーターで分析した。ここで、対照群は、濃度が１％のＢＳＡ  ８０μＬ及びＦＣＲ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ２０μＬでインキュベートした。
線維芽細胞の純度の検出：被験細胞をカウントした後、４％  ＰＦＡで固定し、さらにＤＰＢＳで１００μＬ濃度が１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液に調製し、遠心分離後、７５μＬ濃度が１％のＢＳＡ及び２０μＬのＦＣＲ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔを加え、室温で３０分間ブロッキングした後、５μＬのＡｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｖｉｍｅｎｔｉｎ  Ａｌｅｘａ  ４８８を加えて均一に混合した後、室温、暗所で３０分間インキュベートし、ＤＰＢＳ洗浄して遠心分離した後、フローサイトメーター分析を行い、ここで、対照群は、８０μＬ濃度が１％のＢＳＡ及び２０μＬのＦＣＲ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔでインキュベートした。
【００２０】
多能性幹細胞残存量の検出：被験細胞をカウントした後に４％ＰＦＡで固定し、さらにＤＰＢＳで濃度が１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液１００μＬを調製し、遠心してブロッキングした後、それぞれ希釈された抗体であるＡｎｔｉ−ＳＳＥＡ−４−ＰＥ、ＰＥ  Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｎａｎｏｇ及びＰＥ  Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−Ｏｃｔ３／４でインキュベートし、フローサイトメーターで分析した。
本発明の実施例で提供される心筋細胞精製工程によれば、心筋細胞の精製液における精製の７日目的心筋細胞の純度は７１．４９％であり、線維芽細胞の純度は２２．３８％であり、多能性幹細胞の残存量は４．２％であり、心筋細胞の精製液での細胞の精製時間を１２日間に延長して精製後の細胞を濃度が０．７５〜５μＭのＳＴＦ−３１を含む心筋細胞培地で２日間培養し、それぞれ心筋細胞の純度、線維芽細胞の純度及び多能性幹細胞の残存量をフローサイトメトリーにより検出し、ここで、心筋細胞の純度は９４．４２％であり、線維芽細胞の含有量は３．１５％であり、誘導多能性幹細胞の残存量は０．５３％であった。
【００２１】
上記細胞を注射用生理食塩水で細胞懸濁液に調製し、細胞懸濁液中の心筋細胞をカウントし、生理食塩水の添加量の調整により細胞懸濁液中の心筋細胞の濃度を制御し、適合な心筋細胞濃度の細胞懸濁液を心筋細胞製剤として選択した。
本発明の実施例は、注射液として生理食塩水を使用した以外は、心筋細胞製剤の調製のために以下の注射液も提供した。即ち
（１）濃度が５％のヒト血清アルブミン；
（２）ＤＭＳＯとＨＡＳと１５％グルコースとブドウ糖加デキストラン４０注射液と生理食塩水が７．５：２０：３０：１０：３２．５の体積比で均一に混合された混合溶液。
【００２２】
ここで、本発明の実施例で使用されるヒト血清アルブミンはＢａｘｔｅｒから購入され、ＤＭＳＯはＳｉｇｍａから購入され、ＨＡＳは貴州邦泰から購入され、ブドウ糖加デキストラン４０注射液は四川科倫から購入された。心筋細胞製剤の調製は、どのような溶液を使用する場合でも、心筋細胞が主な有効成分であった。
３、異なる濃度の心筋細胞製剤中の細胞生存率
心筋細胞製剤のサンプルの調製：上記分化工程による細胞から細胞懸濁液を調製した後、心筋細胞、多能性幹細胞及び線維芽細胞の含有量を検出し、心筋細胞の含有量が８０％超え、線維芽細胞の含有量が２０％以下且つ多能性幹細胞の残存量が１％以下であることを満たす細胞を心筋細胞の数量に応じて生理食塩水にて無菌条件下で心筋細胞の濃度が０．５×１０７、０．７５×１０７、０．３×１０８、０．５×１０８、１．２×１０７、０．７５×１０９、１．０×１０９及び３．０×１０９（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）である心筋細胞製剤を調製した。
【００２３】
細胞生存率の検出：それぞれ上記濃度の心筋細胞製剤５ｍＬを採取し、０．２％トリパンブルーで染色した後、Ｃｏｕｎｔｓｔａｒを使用して細胞生存率を測定し、上記濃度の心筋細胞製剤を冷蔵庫に４℃で４ｈ保存し、同様の方法を使用して細胞生存率を測定した結果は、表１に示した。
細胞生存率に対する心筋細胞濃度の影響
【表１】
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表１には、それぞれ調製された異なる濃度の心筋細胞製剤の細胞生存率、及び異なる濃度の心筋細胞製剤が４℃で４ｈ保存された後の細胞生存率を示し、表１から、心筋細胞の濃度が細胞生存率に影響を与え、濃度が高いほど、細胞生存率の低下が大きくなることが分かり、４時間以内の心筋細胞製剤での細胞生存率により、心筋細胞製剤の調製から使用までの過程中に、心筋細胞の損失をできるだけ回避するために、心筋細胞の濃度が１．０×１０９以下に選択する必要があった。
【００２４】
二、動物実験
１、ラット心不全モデルの構築
ラット心筋梗塞後心不全モデルの作製原理は、ラットに心筋を壊死させ、心室壁運動およびコンプライアンスを低下させ、心機能が代償から代償不全へ変換し、最終的に心不全になることであり、現在、最も一般的に使用される方法は、冠動脈結紮法であるが、但し、結紮位置が高すぎてラットの死亡を引き起こしやすく、低すぎると梗塞領域が小さくなった。
本発明の実施例において、以下のように心不全モデルを構築した。ラットが麻酔された後、小動物呼吸換気装置が経口的にカニューレを介して接続され、開胸した視野下で冠動脈前下行枝を結紮した。手術後、１６０  ＩＵ／ｋｇのペニシリンを３〜５日間、毎日腹腔内注射する必要があった。
心エコー検査は、動物の心機能を動的に観察できる心機能の非侵襲的評価法であり、本発明の実施例では、左室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）、左室収縮末期容積（ＬＶＥＳＶ）、収縮末期左室前壁厚（ＬＶＡＷ）、左室駆出率（ＥＦ）及び左室短軸短縮率（ＦＳ）を心機能評価指標として選択した。
冠動脈結紮後のラットを２〜６週間飼育し、その左室駆出率（ＥＦ）を心エコー検査で測定し、ＥＦ＜４０％のラットは実験選択基準を満たし、成功した心不全モデルとして使用できた。
【００２５】
２、異なる濃度の心筋細胞製剤による心機能の改善作用
本発明に係る心筋細胞製剤は、心不全の対象に応じて、同種異体由来の多能性幹細胞から調製された。研究によると、心不全モデルに同じ数量の心筋細胞を注入することを前提として、心機能の改善程度は、心筋細胞製剤中の心筋細胞の濃度によって異なることを発見し、心筋細胞の濃度が治療效果に及ぼす影響をさらに理解するために、上記の生理食塩水による心筋細胞製剤の調製方法に従い、表２に示す心筋細胞製剤を選択してラットの心外膜を通して瘢痕領域または心筋壁の菲薄化した領域に注射された後、免疫拒絶反応を防ぐためにラット１５ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡ及び２ｍｇ／ｋｇのメチルプレドニゾロンを毎日胃内投与し、心エコー検査により心不全モデルの心機能の回復を観察した。
本発明の実施例に係る中心筋細胞製剤は、誘導多能性幹細胞から分化してもよく、胚性幹細胞から分化してもよく、２つの由来源の心筋細胞製剤は、心不全モデルの心機能に対する改善に有意差はなく、次の実施例では、誘導多能性幹細胞から分化した心筋細胞を使用して心筋細胞製剤を調製した。
心不全モデル駆出率の変化量に対する異なる心筋細胞製剤の影響
【表２】
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【００２６】
ここで、心不全モデルラットの心臓に実験群（実施例１〜１２）と同じ用量の生理食塩水を同様の注射方式で注射し、同様の注射方式で免疫抑制薬を投与して対照群とし、対照群及び実験群は、同時に心エコー検査により心機能を反映する様々なパラメーターを測定し、本発明の実施例において、駆出率の変化量は、Ｄ２８駆出率とＤ０駆出率の差を選択した。
ここで、実験群において、各々の実施例で注射される細胞総量が同じであり、且つ各実施例中の心筋細胞の濃度に応じて適合な注射量を選択し、例えば、各実施例で注射される細胞総量は１．２×１０６個であり、実施例６中の心筋細胞濃度は１．２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、実施例６では心筋細胞製剤１０μｌを注射して総注射量で１．２×１０６個の細胞に達した。
表２中の駆出率の変化量は、注射される心筋細胞総量が１．２×１０７個である実験群に心筋細胞製剤を注射してから２８日後の駆出率と心筋細胞が注射される前の駆出率の差であり、図１は、対照群では時間とともに左室前壁が薄くなり、左心室内径と左心室容積がいずれも時間とともにある程度増加し、心機能が低下するが、実験群のＤ２８での心機能は対照群のＤ２８での心機能よりも優れたことを示した。本発明の実施例で提供される心筋細胞製剤は、心機能低下の程度を効果的に低減することができた。
【００２７】
図２及び６は、それぞれ表２の実施例３及び７の心筋細胞製剤が駆出率に与える影響を示し、表２は、異なる濃度の心筋細胞製剤による心機能の改善の程度が異なり、ここで、実施例７の心筋細胞濃度が１．２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、且つ線維芽細胞の含有量が１０％である心筋細胞製剤は駆出率への改善効果が最高であることを示した。図３より、対照群の左室内径短縮率は時間とともに低減するが、実験群では心筋細胞注射２８日後の左室内径短縮率は心筋細胞注射前よりも高くなることを示し、心筋細胞製剤注射後に心機能が回復することが明らかになった。
図４及び５は、それぞれ細胞療法を受けていない心不全モデルが時間とともに左室収縮末期径及び左室収縮末期容積が大きくなり、収縮末期左室前壁厚が薄くなるが、実験群で心筋細胞製剤による治療を受けてから２８日後に左室収縮末期径及び左室収縮末期容積が拡大し続けず、しかも、収縮末期左室前壁厚が細胞治療後にある程度増加することを示すため、心機能を評価するためのさまざまな指標の観察によると、心筋細胞製剤は心筋収縮力をある程度高め、心室壁張力を増加させ、心機能を改善することができることが分かった。
本発明の実施例は、さらに、それぞれ心不全モデルに投与する心筋細胞総量７．５×１０６個及び心筋細胞総量２．０×１０８個の実験中の心筋細胞濃度が心機能に与える影響を研究した。ここで、各実験群あたりの各心不全モデルへの総注射量が特定される前提下で（同じ心筋細胞総量を注射する実施例は１群である）、心筋細胞製剤の注射方式は、１回の注射であってもよく、複数回の注射であってもよく、複数群の実験結果は、いずれも心筋細胞の濃度が心機能の改善に影響を与えることを示し、異なる群の実験において心機能の改善が心筋細胞濃度に伴う変化及び心筋細胞の総注射量が１．２×１０７個の心筋細胞である実験群の結果と一致し、実際の心不全治療過程中に、心不全の対象及び心不全の重症度に応じて適合な注射量及び適合な心筋細胞濃度の心筋細胞製剤を選択する必要があった。
【００２８】
三、心筋細胞製剤の腫瘍形成能の検出
腫瘍形成能とは、細胞が動物に播種された後、播種細胞が動物体内で腫瘍を形成する過程を意味し、本発明の実施例では、それぞれヌードマウス体内腫瘍形成能実験及び軟寒天コロニー形成試験を使用して心筋細胞製剤の腫瘍形成能を評価し、本発明の実施例では、それぞれ誘導多能性幹細胞に由来する心筋細胞製剤及び胚性幹細胞に由来する心筋細胞製剤の腫瘍形成能の検出を研究し、ここで、Ｈｅｌａ細胞は、陽性対照とした。腫瘍形成能の被験試料のパラメーターはそれぞれ表３、４に示した。
誘導多能性幹細胞に由来する心筋細胞製剤の腫瘍形成能検出用試料のパラメーター
【表３】
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胚性幹細胞に由来する心筋細胞製剤中の残存多能性幹細胞も腫瘍形成能を有する可能性があり、表４には、心筋細胞製剤中の異なる残存量の多能性幹細胞の腫瘍形成能の実験試料を示した。
胚性幹細胞に由来する心筋細胞製剤の腫瘍形成能を検出するための試料のパラメーター
【表４】
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以上の実施例では心筋細胞製剤中の線維芽細胞の含有量はいずれも１０％であった。
【００２９】
１、ヌードマウスによる腫瘍形成実験
ヌードマウスを無作為に実験群、空白対照群及び陽性対照群に分け、表３及び４に示される実験試料を実験群とし、生理食塩水を空白対照群とし、濃度が１．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＨｅｌａを陽性対照とし、ヌードマウスの背中皮下に細胞を播種し、播種量はいずれも０．２ｍＬであり、各実施例あたり５群の並行実験が行われ、播種されたヌードマウスの播種部位を定期的に観察した。
結果は、空白対照群、実施例１３〜２２、実施例２４〜３３では播種後６か月以内にいずれも腫瘍形成を認めず、接種部位に結節が形成されず、腫瘍形成率が０であり、実施例２３の５群の並行実験において、１匹のヌードマウスが接種後２８日目に播種部位で小さくて硬い小結節が触れ、播種２か月後に、そのヌードマウスの背中に明らかなしこりが見られ、その心筋細胞製剤の腫瘍形成率が１／５であることを示した。
【００３０】
２、軟寒天コロニー形成試験
１．２％アガロースと多能性幹細胞培養液を１：１で混合し、６ｃｍ培養皿に５ｍＬを加えて底層寒天とし、０．５％アガロースと多能性幹細胞培養液を１：１で混合して上層寒天とし、実施例１３〜３３の心筋細胞製剤について細胞計数及び生細胞検出を行い、それぞれ実施例１３〜３３の心筋細胞製剤１ｍＬを取り出して上層寒天５ｍＬを加え、徐々に培養皿へ注入し、空白対照及び濃度が１．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＨｅｌａ細胞を陽性対照として設定し、２層軟寒天培養皿を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに置いて３０日目培養し、顕微鏡下で細胞クローンの形成を観察し、細胞コロニーのクローン率を計算した。
細胞コロニーのクローン率＝（細胞コロニー数÷各ウェルに加えた細胞の数）×１００％
【００３１】
軟寒天細胞コロニー形成実験は、細胞外マトリックスの半固体増殖環境をｉｎ  ｖｉｖｏで模擬し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞コロニ形成能を検出する通常の実験方法であり、腫瘍細胞は無期限に増殖可能であり、強いクローン能力を示すが、分化成熟した細胞はコロニーを形成できなかった。この特徴によれば、本発明の実施例は、異なる残存量の多能性幹細胞に由来する心筋細胞製剤の細胞コロニーのクローン率を比較することにより心筋細胞製剤の腫瘍形成能を評価した。
陽性対照群の細胞コロニーのクローン率は５．１％であり、空白対照群及び実施例１６、１７、２１、２２、２６、２７、３１、３２、３３はコロニーを形成していないが、残りの実施例は、いずれも異なる細胞コロニー数があり、細胞コロニーのクローン率は、多能性幹細胞の残存量が増加するにつれて高くなった。
【００３２】
ヌードマウス体内腫瘍形成実験及び軟寒天コロニー形成試験に基づいて、筋細胞製剤の安全性を確保するために心筋細胞製剤中の多能性幹細胞の残存量を１％以内に制御する必要があった。
以上の実施例は、本発明をさらに説明するためにのみ使用されるが、本発明の実施形態が上記の実施例によって限定されなく、本発明に基づいて加えた本発明と本質的に同じである他の変更、修飾、置換、組合せは、同等の交換手段とみなされ、本発明の保護範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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