(57)【要約】本発明は、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸に関し、本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸を用いると、マイクロＲＮＡが非正規標的遺伝子を抑制することによって示す生物学的な機能を効率的に増大したり、従来のマイクロＲＮＡが示す機能のうち一部、すなわち非正規標的遺伝子を抑制することによって示す生物学的機能のみを選択的に示す効果を有し、本発明の干渉誘導核酸を通じて細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節が可能であるところ、薬物、化粧品など多様な分野において活用が可能なものと期待される。【選択図】図１
2021525527.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴として、または
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）またはアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、当該部位のＧ：ＡまたはＧ：Ｕワブル配列がＵ：ＡまたはＡ：Ｕの正規的な塩基配列になるようにすることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項２】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子を選択的に抑制し、マイクロＲＮＡの正規標的遺伝子は抑制しないことを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項３】
前記特定マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１，ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−３０２およびｍｉＲ−３７２よりなる群から選ばれて、同じシード配列を有して１８〜２４個の塩基で構成された1つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項４】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端２番目から７番目の塩基配列が下記のうちいずれか1つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸：
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＡＡ  ＧＧＣ  Ｃ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２４−ＢＳ）；
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＧＧ  ＡＧＵ  Ｕ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２２−ＢＳ）；
ｍｉＲ−１５５の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＡ  ＡＵＧ  Ｇ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１５５−ＢＳ）；または
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＧＧ  ＡＡＵ  Ｕ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１−ＢＳ）。
【請求項５】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸の塩基配列が下記のうちいずれか1つ以上で示すことを特徴とする請求項４に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸：
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＡＡ  ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＧＣＧ  ＧＵＧ  ＡＡＵ  ＧＣＣ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２４−ＢＳ）；
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＧＵ  ＧＡＣ  ＡＡＵ  ＧＧＵ  ＧＵＵ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２２−ＢＳ）；
ｍｉＲ−１５５の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＵＡ  ＡＵＧ  ＧＣ  ＵＡＡ  Ｕ  ＣＧＵ  ＧＡＵ  ＡＧＧ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１５５−ＢＳ）；
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＧＧ  ＡＡＵ  ＵＧＵ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＧＵＡ  ＵＧＵ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１−ＢＳ）。
【請求項６】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列が下記のうちいずれか1つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸：
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＡＡ  ＵＧＣ  ＡＣＧ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＡＡ  ＧＵＣ  ＡＣＧ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕ）または５’−ＵＡＡ  ＵＵＣ  ＡＣＧ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４，５Ｕ）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＧＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＧＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＡＵ  ＵＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＡＡＵ  ＧＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，３Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＵＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ３，７Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＵＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，７Ｕ）または５’−ＵＵＵ  ＡＡＵ  ＵＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，３，７Ｕ）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＧＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ９Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，５Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，７Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，９Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＵＵ  ＧＵＧ（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，５Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，７Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，９Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，７Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，９Ｕ）、または５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＵ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７，９Ｕ）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１３３の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＵＵ  ＵＧＵ  ＣＣＣ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＧＵＵ  ＣＣＣ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ５Ｕ）または５’−ＵＵＵ  ＵＵＵ  ＣＣＣ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ４，５Ｕ）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｌｅｔ−７の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＧＧＵ  ＡＵＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ８Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，４Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，５Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＵＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，８Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＵＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，５Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＵＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，８Ｕ）、または５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＵＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５，８Ｕ）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−３０２ａの非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ６Ｕ）、または５’−ＵＡＡ  ＵＵＵ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４，６Ｕ）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；または
ｍｉＲ−３７２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＡＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＧ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＧ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ６Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＧＵＧ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ９Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＵＵＵ  ＣＵＧ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４，６Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４，９Ｕ）、または５’−ＡＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ６，９Ｕ）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項７】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸の塩基配列が下記のうちいずれか1つ以上で示すことを特徴とする請求項６に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸：
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＡＡ  ＵＧＣ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＵＧＡ  ＡＵＧ  ＣＣＡ  Ａ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＡＡ  ＧＵＣ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＵＧＡ  ＡＵＧ  ＣＣＡ  Ａ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕ）または５’−ＵＡＡ  ＵＵＣ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＵＧＡ  ＡＵＧ  ＣＣＡ  Ａ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４，５Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＧＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＧＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＡＵ  ＵＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＡＡＵ  ＧＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，３Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＵＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ３，７Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＵＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，７Ｕ）または５’−ＵＵＵ  ＡＡＵ  ＵＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，３，７Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＧＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ９Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，５Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，７Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，９Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＵＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，５Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＵＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，７Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，９Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＵＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，７Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，９Ｕ）または５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７，９Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１３３の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＵＵ  ＵＧＵ  ＣＣＣ  ＣＵＵ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＧＵＵ  ＣＣＣ  ＣＵＵ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ５Ｕ）または５’−ＵＵＵ  ＵＵＵ  ＣＣＣ  ＣＵＵ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ４，５Ｕ）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｌｅｔ−７の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸てあって、５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＧＧＵ  ＡＵＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ８Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，４Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，５Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＵＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，８Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＵＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，５Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＵＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，８Ｕ）または５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＵＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５，８Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−３０２ａの非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＵ  ＣＣＡ  ＵＧＵ  ＵＵＵ  ＧＧＵ  ＧＡ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＵ  ＣＣＡ  ＵＧＵ  ＵＵＵ  ＧＧＵ  ＧＡ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ６Ｕ）、または５’−ＵＡＡ  ＵＵＵ  ＣＵＵ  ＣＣＡ  ＵＧＵ  ＵＵＵ  ＧＧＵ  ＧＡ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４，６Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸；または
ｍｉＲ−３７２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＡＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＧ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＧ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ６Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＧＵＧ  ＣＵＵ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ９Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＵＵＵ  ＣＵＧ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４，６Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＵ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４，９Ｕ）、または５’−ＡＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＵ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ６，９Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含むマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含む細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節用組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、下記のうちいずれか1つ以上であることを特徴とする請求項９に記載の組成物：
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む癌細胞死滅誘導用組成物；
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む神経突起分岐分化誘導用組成物；
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む肝癌細胞の細胞周期停止誘導用組成物；
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む筋細胞分化促進または筋線維化促進用組成物；
ｍｉＲ−１５５の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む筋細胞死滅誘導用組成物；
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む神経芽細胞腫の細胞死滅促進用組成物；
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む神経芽細胞腫の細胞分裂増殖促進用組成物；
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む心筋肥大誘導用組成物；
ｍｉＲ−１３３の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む心筋肥大誘導用組成物；
ｌｅｔ−７の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む癌細胞の細胞周期停止誘導用組成物；
ｌｅｔ−７の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む肝細胞の細胞周期進行活性誘導用組成物；
ｍｉＲ−３０２ａの非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む逆分化促進用組成物；
ｍｉＲ−３７２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む逆分化促進用組成物；または
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む肝癌細胞の細胞移動阻害用組成物。
【請求項１１】
下記の段階を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法：
特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階、または
特定マイクロＲＮＡの５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、当該部位のＧ：ＡまたはＧ：Ｕワブル配列がＵ：ＡまたはＡ：Ｕの正規的な塩基配列になるようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を対象細胞にトランスフェクションする段階；
対象細胞に試験物質を処理する段階；および
対象細胞でＲＮＡ干渉誘導核酸が抑制するマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子の発現量乃至発現有無を確認する段階を含む、
細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節用試験物質をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴とし、
前記特定マイクロＲＮＡは、５’末端から６番目のヌクレオチドのリボース環の２’位にメチル基（２’ＯＭｅ）が添加されたことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項１４】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、当該ＲＮＡ干渉誘導核酸の正規シード標的遺伝子の発現のみを抑制することを特徴とする請求項１３に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項１５】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの非正規核隆起サイトのみを特異的に抑制し、新しく発生しうる非正規核隆起サイトを除去することを特徴とする請求項１３に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含むマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項１７】
下記の段階を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階；および
前記特定マイクロＲＮＡの５’末端から６番目のヌクレオチドのリボース環の２’位にメチル基（２’ＯＭｅ）を添加する段階を含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法。
【請求項１８】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項１９】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、非正規核隆起標的サイトのみを選択的に抑制し、マイクロＲＮＡの正規標的遺伝子は抑制しないことを特徴とする請求項１８に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項２０】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、下記表に示した配列番号１０３〜５２８のうちいずれか1つ以上で表示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項１８に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
2021525527.tif 000035
2021525527.tif 000036
2021525527.tif 000037
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【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含むマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項２２】
下記の段階を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階を含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法。
【請求項２３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から９番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有し、当該部位のＧ：Ａワブル（ｗｏｂｂｌｅ）がＵ：Ａの正規的な塩基配列になるようにすることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項２４】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目の塩基から始まって６個〜８個の連続的な塩基配列を含み、
前記塩基配列は、グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）塩基に少なくとも1つ以上置換されたことを特徴とする請求項２３に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項２５】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、Ｇ：Ａワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列で結合するマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子のみを選択的に抑制し、マイクロＲＮＡの正規標的遺伝子は抑制しないことを特徴とする請求項２３に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項２６】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端から２番目の塩基から始まって６個〜８個の連続的な塩基配列が下記表に示した配列番号５２９〜８６３のうちいずれか1つ以上で表示されることを特徴とする請求項２４に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
2021525527.tif 000043
2021525527.tif 000044
2021525527.tif 000045
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2021525527.tif 000048
【請求項２７】
請求項２３〜２６のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含むマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項２８】
下記の段階を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目の塩基から始まって６個〜８個の連続的な塩基配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階を含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法。
【請求項２９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する段階を含む、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制方法。
【請求項３０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸の、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用途。
【請求項３１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する段階を含む、細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節方法。
【請求項３２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸の、細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節用途。
【請求項３３】
請求項１３〜１５のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する段階を含む、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制方法。
【請求項３４】
請求項１３〜１５のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸の、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用途。
【請求項３５】
請求項１８〜２０のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する段階を含む、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制方法。
【請求項３６】
請求項１８〜２０のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸の、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用途。
【請求項３７】
請求項２３〜２６のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する段階を含む、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制方法。
【請求項３８】
請求項２３〜２６のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸の、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現を阻害するＲＮＡ干渉誘導核酸およびその用途に関し、マイクロＲＮＡの非正規標的を選択的に抑制することによって発揮される有用な効果を有する干渉誘導核酸およびその用途に関する。
【０００２】
本出願は、２０１８年５月３１日に出願された韓国特許出願第１０−２０１８−００６３０５４号、２０１８年５月３１日に出願された韓国特許出願第１０−２０１８−００６３０５５号、２０１９年５月３１日に出願された韓国特許出願第１０−２０１９−００６４３３３号、２０１９年５月３１日に出願された韓国特許出願第１０−２０１９−００６４３３４号、２０１９年５月３１日に出願された韓国特許出願第１０−２０１９−００６４３３５号、および２０１９年５月３１日に出願された韓国特許出願第１０−２０１９−００６４３８６号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書および図面に開示されたすべての内容は、本出願に援用される。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）は、転写後の段階で遺伝子の発現を抑制する現象をいう。自然的に存在するＲＮＡ干渉現象は、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）によって起こる。マイクロＲＮＡは、１８〜２５個の塩基で構成されており、そのうち大部分は、約２１個の塩基で構成される小さいＲＮＡであって、アルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）タンパク質を通じて標的となる遺伝子の伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡｓ）と相補的塩基配列をする。動物マイクロＲＮＡの場合、アルゴノートタンパク質と結合して標的となる伝令ＲＮＡと部分的な塩基配列をすることになるが、この際、マイクロＲＮＡの５’末端基準１番目から８番目までの核酸で定義されるシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）で最小限６個以上の連続的な塩基配列をする場合、標的と認識し、最も重要には、最小限５’末端基準２番目から７番目までの６個の塩基配列で連続的に標的伝令ＲＮＡと結合した場合に、十分に当該標的伝令ＲＮＡを分解したり翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）されることを抑制して、その発現を阻害する（Ｌｅｗｉｓ  ＢＰ，ｅｔ．ａｌ，２００３，Ｃｅｌｌ，１１５（７），７８７−９８）。このようにマイクロＲＮＡが部分的な塩基配列を通じて標的遺伝子の伝令ＲＮＡを認識するので、1つのマイクロＲＮＡは、通常、数百個から数千個の遺伝子発現に影響を及ぼすことができる。
【０００４】
マイクロＲＮＡの標的遺伝子発現阻害作用は、遺伝子発現の重要な機序の1つであって、正常状況では、細胞の分化と成長に関与し、機能に異常があるときは、癌および退行性疾患、糖尿病などを誘発することになって、生命現象の鍵として注目されている。したがって、マイクロＲＮＡの遺伝子発現阻害作用を人為的に誘導するために、マイクロＲＮＡのシード領域を含むＲＮＡ干渉素材（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）をデザインして細胞内に導入することによって、人為的に細胞を分化させたり機能を変え、場合に応じて疾病治療剤として使用したりする。したがって、アルゴノートで媒介されて標的伝令ＲＮＡを認識することになるマイクロＲＮＡシード領域での相補的塩基配列は、マイクロＲＮＡを含むＲＮＡ干渉素材が機能を発揮するにあたって重要である。特に、このようなＲＮＡ干渉素材を活用するためには、それぞれのマイクロＲＮＡの機能を把握することが要求され、この際、マイクロＲＮＡの機能は、いかなる標的遺伝子を抑制するかによって決定されるので、マイクロＲＮＡの全体標的遺伝子（標的体）に対する分析が必要になった。
【０００５】
転写体的水準から、マイクロＲＮＡ標的体に対する研究は、本発明者によりＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ（またはＣＬＩＰ−Ｓｅｑと呼ばれる）実験を通じて初めて行われた。Ａｇｏ  ＨＩＴＳ  ＣＬＩＰ実験方法は、細胞や組織サンプルにＵＶを照射して細胞内でＲＮＡとアルゴノートタンパク質（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ；Ａｇｏ）との間に共有結合を介した複合体を形成するようにし、このようなＲＮＡ−アルゴノート複合体をアルゴノート特異的認識抗体を用いて免疫沈降法で分離した後、分離したＲＮＡを次世代塩基配列（Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で分析する方法である。これを通してアルゴノートに結合したマイクロＲＮＡと、相補的塩基配列する標的伝令ＲＮＡ群とその位置を正確に分析することができる（Ｃｈｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６０（７２５４）：４７９−８６）。
【０００６】
その結果、本発明者らは、マイクロＲＮＡが標的伝令ＲＮＡと結合するとき、マイクロＲＮＡシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）と正確に相補関係でなくても結合する場合があることを明らかにした。より具体的に、マイクロＲＮＡの５’末端基準１番目から８番目の塩基配列で定義されるマイクロＲＮＡシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）が最小限６個以上の連続的且つ完ぺきな塩基配列の配列で伝令ＲＮＡと結合すること、特にそのうち最も重要には、５’末端基準２番目から７番目までの塩基配列で結合することを正規標的認識（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）といい、上述した規則から外れて、マイクロＲＮＡシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）と連続的且つ正確な相補配列関係でなくてもマイクロＲＮＡの標的と認識し結合することを非正規標的認識（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）という。Ａｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ分析結果によれば、マイクロＲＮＡがシード領域を通じて非正規的に標的を認識する頻度は、正規的に認識する頻度の約５０％に達するほど頻繁に現れることが分かる。
【０００７】
したがって、従来のマイクロＲＮＡのシード領域の配列を含むようにデザインされたＲＮＡ干渉素材（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）は、正規標的遺伝子だけでなく、様々な非正規標的遺伝子を抑制することによって生物学的機能が現れることが分かる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これより、本発明が解決しようとする課題は、従来のマイクロＲＮＡのシード領域の配列をそのまま含んでデザインされたＲＮＡ干渉素材が有する限界を解決し、効率を増大するためのものである。
【０００９】
より具体的に、従来のマイクロＲＮＡのシード領域の配列をそのまま含んでデザインされたＲＮＡ干渉素材は、正規標的遺伝子と非正規標的遺伝子の両方を抑制するものの、正規標的遺伝子は強く抑制するが、それに比べて非正規標的遺伝子は非常に弱く抑制する。したがって、本発明が解決しようとする課題は、従来のマイクロＲＮＡが非正規標的遺伝子を抑制することによって示す生物学的な機能を効率的に増大したり、従来のマイクロＲＮＡが示す機能のうち一部、すなわち非正規標的遺伝子を抑制することによって示す生物学的機能のみを選択的に示す効果を有する、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供するためのものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した課題を解決するために、本発明は、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【００１１】
より具体的に、
本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡで標的伝令ＲＮＡと結合で最も重要に作用する部位である５’末端基準２番目から７番目までの塩基配列を基準として、５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴とし、または
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）にまたはアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、当該部位のＧ：ＡまたはＧ：Ｕワブル配列がＵ：ＡまたはＡ：Ｕの正規的な塩基配列になるようにすることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【００１２】
好ましくは、前記特定マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１，ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−３０２およびｍｉＲ−３７２よりなる群から選ばれて、同じシード配列を有しながら１８〜２４個の塩基で構成されることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【００１３】
好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端２番目から７番目の塩基配列が下記のうちいずれか1つ以上であることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する：
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＡＡ  ＧＧＣ  Ｃ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２４−ＢＳ）（配列番号１）；
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＧＧ  ＡＧＵ  Ｕ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２２−ＢＳ）（配列番号２）；
ｍｉＲ−１５５の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＡ  ＡＵＧ  Ｇ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１５５−ＢＳ）（配列番号３）；または
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＧＧ  ＡＡＵ  Ｕ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１−ＢＳ）（配列番号４）。
【００１４】
好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸の塩基配列が下記のうちいずれか1つ以上で示すことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する：
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＡＡ  ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＧＣＧ  ＧＵＧ  ＡＡＵ  ＧＣＣ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２４−ＢＳ）（配列番号５）；
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＧＵ  ＧＡＣ  ＡＡＵ  ＧＧＵ  ＧＵＵ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２２−ＢＳ）（配列番号６）；
ｍｉＲ−１５５の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＵＡ  ＡＵＧ  ＧＣＵ  ＡＡＵ  ＣＧＵ  ＧＡＵ  ＡＧＧ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１５５−ＢＳ）（配列番号７）；または
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＧＧ  ＡＡＵ  ＵＧＵ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＧＵＡ  ＵＧＵ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１−ＢＳ）（配列番号８）。
【００１５】
好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列が下記のうちいずれか1つ以上であることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する：
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、５’−ＵＡＡ  ＵＧＣ  ＡＣＧ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕ）（配列番号９）、５’−ＵＡＡ  ＧＵＣ  ＡＣＧ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕ）（配列番号１０）または、５’−ＵＡＡ  ＵＵＣ  ＡＣＧ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４，５Ｕ）（配列番号１１）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、５’−ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＧＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ）（配列番号１２）、５’−ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＧＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ）（配列番号１３）、５’−ＵＧＧ  ＡＡＵ  ＵＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ）（配列番号１４）、５’−ＵＵＵ  ＡＡＵ  ＧＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，３Ｕ）（配列番号１５）、５’−ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＵＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ３，７Ｕ）（配列番号１６）、５’−ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＵＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，７Ｕ）（配列番号１７）または、５’−ＵＵＵ  ＡＡＵ  ＵＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，３，７Ｕ）（配列番号１８）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２Ｕ）（配列番号１９）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３Ｕ）（配列番号２０）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５Ｕ）（配列番号２１）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７Ｕ）（配列番号２２）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＧＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ９Ｕ）（配列番号２３）、５’−ＵＵＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ）（配列番号２４）、５’−ＵＵＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，５Ｕ）（配列番号２５）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，７Ｕ）（配列番号２６）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，９Ｕ）（配列番号２７）、５’−ＵＧＵ  ＡＵＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，５Ｕ）（配列番号２８）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，７Ｕ）（配列番号２９）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，９Ｕ）（配列番号３０）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，７Ｕ）（配列番号３１）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，９Ｕ）（配列番号３２）、または、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＵ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７，９Ｕ）（配列番号３３）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸であって、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２Ｕ）（配列番号１９）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３Ｕ）（配列番号２０）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５Ｕ）（配列番号２１）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７Ｕ）（配列番号２２）、５’−ＵＵＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ）（配列番号２４）、５’−ＵＵＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，５Ｕ）（配列番号２５）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，７Ｕ）（配列番号２６）、５’−ＵＧＵ  ＡＵＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，５Ｕ）（配列番号２８）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，７Ｕ）（配列番号２９）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，７Ｕ）（配列番号３１）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１３３の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、５’−ＵＵＵ  ＵＧＵ  ＣＣＣ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ４Ｕ）（配列番号３４）、５’−ＵＵＵ  ＧＵＵ  ＣＣＣ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ５Ｕ）（配列番号３５）または５’−ＵＵＵ  ＵＵＵ  ＣＣＣ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４，５Ｕ）（配列番号３６）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｌｅｔ−７の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２Ｕ）（配列番号３７）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４Ｕ）（配列番号３８）、５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５Ｕ）（配列番号３９）、５’−ＵＧＡ  ＧＧＵ  ＡＵＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ８Ｕ）（配列番号４０）、５’−ＵＵＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，４Ｕ）（配列番号４１）、５’−ＵＵＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，５Ｕ）（配列番号４２）、５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＵＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，８Ｕ）（配列番号４３）、５’−ＵＧＡ  ＵＵＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，５Ｕ）（配列番号４４）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＵＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，８Ｕ）（配列番号４５）、または５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＵＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５，８Ｕ）（配列番号４６）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸であって、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２Ｕ）（配列番号３７）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４Ｕ）（配列番号３８）、５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５Ｕ）（配列番号３９）、５’−ＵＵＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，４Ｕ）（配列番号４１）、５’−ＵＵＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，５Ｕ）（配列番号４２）、５’−ＵＧＡ  ＵＵＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，５Ｕ）（配列番号４４）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−３０２ａの非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、５’−ＵＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４Ｕ）（配列番号４７）、５’−ＵＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ６Ｕ）（配列番号４８）、または５’−ＵＡＡ  ＵＵＵ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４，６Ｕ）（配列番号４９）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；または
ｍｉＲ−３７２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、
５’−ＡＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＧ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４Ｕ）（配列番号５０）、５’−ＡＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＧ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ６Ｕ）（配列番号５１）、５’−ＡＡＡ  ＧＵＧ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ９Ｕ）（配列番号５２）、５’−ＡＡＡ  ＵＵＵ  ＣＵＧ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４，６Ｕ）（配列番号５３）、５’−ＡＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４，９Ｕ）（配列番号５４）、または５’−ＡＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ６，９Ｕ）（配列番号５５）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸。
【００１６】
好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸の塩基配列が下記のうちいずれか1つ以上で示すことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する：
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＡＡ  ＵＧＣ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＵＧＡ  ＡＵＧ  ＣＣＡ  Ａ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕ）（配列番号５６）、５’−ＵＡＡ  ＧＵＣ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＵＧＡ  ＡＵＧ  ＣＣＡ  Ａ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕ）（配列番号５７）または５’−ＵＡＡ  ＵＵＣ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＵＧＡ  ＡＵＧ  ＣＣＡ  Ａ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４，５Ｕ）（配列番号５８）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＧＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ）（配列番号５９）、５’−ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＧＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ）（配列番号６０）、５’−ＵＧＧ  ＡＡＵ  ＵＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ）（配列番号６１）、５’−ＵＵＵ  ＡＡＵ  ＧＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，３Ｕ）（配列番号６２）、５’−ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＵＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ３，７Ｕ）（配列番号６３）、５’−ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＵＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，７Ｕ）（配列番号６４）または５’−ＵＵＵ  ＡＡＵ  ＵＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，３，７Ｕ）（配列番号６５）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２Ｕ）（配列番号６６）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３Ｕ）（配列番号６７）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５Ｕ）（配列番号６８）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７Ｕ）（配列番号６９）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＧＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ９Ｕ）（配列番号７０）、５’−ＵＵＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ）（配列番号７１）、５’−ＵＵＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，５Ｕ）（配列番号７２）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，７Ｕ）（配列番号７３）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，９Ｕ）（配列番号７４）、５’−ＵＧＵ  ＡＵＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，５Ｕ）（配列番号７５）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＵＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，７Ｕ）（配列番号７６）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，９Ｕ）（配列番号７７）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＵＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，７Ｕ）（配列番号７８）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，９Ｕ）（配列番号７９）または５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７，９Ｕ）（配列番号８０）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１３３の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＵＵ  ＵＧＵ  ＣＣＣ  ＣＵＵ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ４Ｕ）（配列番号８１）、５’−ＵＵＵ  ＧＵＵ  ＣＣＣ  ＣＵＵ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ５Ｕ）（配列番号８２）または５’−ＵＵＵ  ＵＵＵ  ＣＣＣ  ＣＵＵ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ４，５Ｕ）（配列番号８３）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｌｅｔ−７の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２Ｕ）（配列番号８４）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４Ｕ）（配列番号８５）、５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５Ｕ）（配列番号８６）、５’−ＵＧＡ  ＧＧＵ  ＡＵＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ８Ｕ）（配列番号８７）、５’−ＵＵＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，４Ｕ）（配列番号８８）、５’−ＵＵＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，５Ｕ）（配列番号８９）、５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＵＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，８Ｕ）（配列番号９０）、５’−ＵＧＡ  ＵＵＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，５Ｕ）（配列番号９１）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＵＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，８Ｕ）（配列番号９２）または５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＵＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５，８Ｕ）（配列番号９３）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−３０２ａの非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＵ  ＣＣＡ  ＵＧＵ  ＵＵＵ  ＧＧＵ  ＧＡ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４Ｕ）（配列番号９４）、５’−ＵＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＵ  ＣＣＡ  ＵＧＵ  ＵＵＵ  ＧＧＵ  ＧＡ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ６Ｕ）（配列番号９５）、または５’−ＵＡＡ  ＵＵＵ  ＣＵＵ  ＣＣＡ  ＵＧＵ  ＵＵＵ  ＧＧＵ  ＧＡ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４，６Ｕ）（配列番号９６）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸；または
ｍｉＲ−３７２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＡＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＧ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４Ｕ）（配列番号９７）、５’−ＡＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＧ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ６Ｕ）（配列番号９８）、５’−ＡＡＡ  ＧＵＧ  ＣＵＵ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ９Ｕ）（配列番号９９）、５’−ＡＡＡ  ＵＵＵ  ＣＵＧ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４，６Ｕ）（配列番号１００）、５’−ＡＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＵ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４，９Ｕ）（配列番号１０１）、または５’−ＡＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＵ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ６，９Ｕ）（配列番号１０２）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸。
【００１７】
本発明のＲＮＡ干渉誘導核酸を含むマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用組成物を提供する。
【００１８】
本発明のＲＮＡ干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する段階を含む、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制方法を提供する。
【００１９】
本発明のＲＮＡ干渉誘導核酸の、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用途を提供する。
【００２０】
本発明のＲＮＡ干渉誘導核酸を含む細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、逆分化、分裂、増殖または死滅調節用組成物を提供する。
【００２１】
本発明のＲＮＡ干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する段階を含む、細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節方法を提供する。
【００２２】
本発明のＲＮＡ干渉誘導核酸の、細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節用途を提供する。
【００２３】
好ましくは、前記組成物は、下記のうちいずれか1つ以上であることを特徴とする、組成物を提供する：
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む癌細胞死滅誘導用組成物；
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む神経突起分岐分化誘導用組成物；
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む肝癌細胞の細胞周期停止誘導用組成物；
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む筋細胞分化促進または筋線維化促進用組成物；
ｍｉＲ−１５５の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む筋細胞死滅誘導用組成物；
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む神経芽細胞腫の細胞死滅促進用組成物；
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む神経芽細胞腫の細胞分裂増殖促進用組成物；
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む心筋肥大誘導用組成物；
ｍｉＲ−１３３の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む心筋肥大誘導用組成物；
ｌｅｔ−７の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む癌細胞の細胞周期停止誘導用組成物；
ｌｅｔ−７の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む肝細胞の細胞周期進行活性誘導用組成物；
ｍｉＲ−３０２ａの非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む逆分化促進用組成物；
ｍｉＲ−３７２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む逆分化促進用組成物；または
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む肝癌細胞の細胞移動阻害用組成物。
【００２４】
本発明は、下記の段階を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法を提供する：
特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階、または
特定マイクロＲＮＡの５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、当該部位のＧ：ＡまたはＧ：Ｕワブル配列がＵ：ＡまたはＡ：Ｕの正規的な塩基配列になるようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階。
【００２５】
また、本発明は、下記の段階を含む細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖、逆分化または死滅調節用試験物質をスクリーニングする方法を提供する：
ＲＮＡ干渉誘導核酸を対象細胞にトランスフェクションする段階；
対象細胞に試験物質を処理する段階；および
対象細胞でＲＮＡ干渉誘導核酸が抑制するマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子の発現量乃至発現有無を確認する段階。
【００２６】
また、本発明は、ＲＮＡ干渉誘導核酸に対して、下記１〜３を提供する：
【００２７】
１．２’ＯＭｅ変形されたＲＮＡ干渉誘導核酸に対して
本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴とし、
前記特定マイクロＲＮＡは、５’末端から６番目のヌクレオチドのリボース環の２’位にメチル基（２’ＯＭｅ）が添加されたことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【００２８】
好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、当該ＲＮＡ干渉誘導核酸の正規シード標的遺伝子の発現のみを抑制することを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【００２９】
好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの非正規核隆起サイトのみを特異的に抑制し、新しく発生しうる非正規核隆起サイトを除去することを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【００３０】
また、本発明は、ＲＮＡ干渉誘導核酸を含むマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用組成物を提供する。
【００３１】
また、本発明は、ＲＮＡ干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する段階を含む、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制方法を提供する。
【００３２】
また、本発明は、ＲＮＡ干渉誘導核酸の、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用途を提供する。
【００３３】
また、本発明は、下記の段階を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階；および
前記特定マイクロＲＮＡの５’末端から６番目のヌクレオチドのリボース環の２’位にメチル基（２’ＯＭｅ）を添加する段階を含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法を提供する。
【００３４】
２．マイクロＲＮＡの非正規核隆起標的サイトを抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸（配列番号１０３〜５２８）に対して
本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【００３５】
好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、非正規核隆起標的サイトのみを選択的に抑制し、マイクロＲＮＡの正規標的遺伝子は抑制しないことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【００３６】
好ましくは、前記特定マイクロＲＮＡは、ｌｅｔ−７／９８／４４５８／４５００、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ／１２５ｂ−５ｐ／３５１／６７０／４３１９、ｍｉＲ−１２４／１２４ａｂ／５０６、ｍｉＲ−９／９ａｂ、ｍｉＲ−２９ａｂｃｄ、ｍｉＲ−１０３ａ／１０７／１０７ａｂ、ｍｉＲ−２２１／２２２／２２２ａｂ／１９２８、ｍｉＲ−２６ａｂ／１２９７／４４６５、ｍｉＲ−１５ａｂｃ／１６／１６ａｂｃ／１９５／３２２／４２４／４９７／１９０７、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａｂｃｄｅｆ／３０ａｂｅ−５ｐ／３８４−５ｐ、ｍｉＲ−３３ａｂ／３３−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａｃ／３４ｂｃ−５ｐ／４４９ａｂｃ／４４９ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ａｂ、ｍｉＲ−９９ａｂ／１００、ｍｉＲ−１７／１７−５ｐ／２０ａｂ／２０ｂ−５ｐ／９３／１０６ａｂ／４２７／５１８ａ−３ｐ／５１９ｄ、ｍｉＲ−２７ａｂｃ／２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１８／２１８ａ、ｍｉＲ−２２／２２−３ｐ、ｍｉＲ−１８５／８８２／３４７３／４３０６／４６４４、ｍｉＲ−１８１ａｂｃｄ／４２６２、ｍｉＲ−３３８／３３８−３ｐ、ｍｉＲ−１２７／１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１０１／１０１ａｂ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−２４／２４ａｂ／２４−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−３ｐ／３６５／３６５−３ｐ、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１３８／１３８ａｂ、ｍｉＲ−１４３／１７２１／４７７０、ｍｉＲ−２５／３２／９２ａｂｃ／３６３／３６３−３ｐ／３６７、ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｍｉＲ−７／７ａｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１３５ａｂ／１３５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａｂ−３ｐ／１５２、ｍｉＲ−２８−５ｐ／７０８／１４０７／１６５３／３１３９、ｍｉＲ−１３０ａｃ／３０１ａｂ／３０１ｂ／３０１ｂ−３ｐ／４５４／７２１／４２９５／３６６６、ｍｉＲ−３１３２、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−４８５−３ｐ、ｍｉＲ−１３２／２１２／２１２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９−３ｐ、ｍｉＲ−３７４ａｂ、ｍｉＲ−１２９−３ｐ／１２９ａｂ−３ｐ／１２９−１−３ｐ／１２９−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−４２５／４２５−５ｐ／４８９、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−２１／５９０−５ｐ、ｍｉＲ−３１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１８ａｂ／４７３５−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８７−５ｐ、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−４８５−５ｐ／１６９８／１７０３／１９６２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３６−３ｐ、ｍｉＲ−５７６−３ｐ、ｍｉＲ−２０４／２０４ｂ／２１１、ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｍｉＲ−３４２−５ｐ／４６６４−５ｐ、ｍｉＲ−３６１−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａｂ−３ｐ／３１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−２９９−５ｐ／３５６３−５ｐ、ｍｉＲ−１９３／１９３ｂ／１９３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７７−５ｐ、ｍｉＲ−１４０／１４０−５ｐ／８７６−３ｐ／１２４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ／ｄ／ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−３ｐ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ／４０９ａ、ｍｉＲ−３７９／１１９３−５ｐ／３５２９、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１５４／８７２、ｍｉＲ−４６８４−３ｐ、ｍｉＲ−３６１−３ｐ、ｍｉＲ−３３５／３３５−５ｐ、ｍｉＲ−４２３ａ／４２３−５ｐ／３１８４／３５７３−５ｐ、ｍｉＲ−３７１／３７３／３７１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１１８５／３６７９−５ｐ、ｍｉＲ−３６１３−３ｐ、ｍｉＲ−９３／９３ａ／１０５／１０６ａ／２９１ａ−３ｐ／２９４／２９５／３０２ａｂｃｄｅ／３７２／３７３／４２８／５１９ａ／５２０ｂｅ／５２０ａｃｄ−３ｐ／１３７８／１４２０ａｃ、ｍｉＲ−８７６−５ｐ／３１６７、ｍｉＲ−３２９／３２９ａｂ／３６２−３ｐ、ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａｃ／１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３８０／３８０−３ｐ、ｍｉＲ−４９９−３ｐ／４９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５５１ａ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４２−３ｐ、ｍｉＲ−１２７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３１４５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−５ｐ、ｍｉＲ−７４４／１７１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−５０１−３ｐ／５０２−３ｐ／５００／５０２ａ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ／３１０７、ｍｉＲ−４５０ａ／４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３２６／３３０／３３０−５ｐ、ｍｉＲ−２１４／７６１／３６１９−５ｐ、ｍｉＲ−６１２／１２８５／３１８７−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−３７８／４２２ａ／３７８ｂｃｄｅｆｈｉ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｍｉＲ−６２５、ｍｉＲ−２００ｂｃ／４２９／５４８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５８４、ｍｉＲ−４１１、ｍｉＲ−５７３／３５３３／３６１６−５ｐ／３６４７−５ｐ、ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９−３ｐ、ｍｉＲ−８７６−３ｐ、ｍｉＲ−６５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０−３ｐ、ｍｉＲ−３６１４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−５ｐ、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−９６／５０７／１２７１、ｍｉＲ−５４８ａ−３ｐ／５４８ｅｆ／２２８５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２−３ｐ、ｍｉＲ−３９４２−５ｐ／４７０３−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｂ／４４９ｃ／１３６０／２６８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ／ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３６２−５ｐ／５００ｂ、ｍｉＲ−６７７／４４２０、ｍｉＲ−５７７、ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−１５０／５１２７、ｍｉＲ−５４４／５４４ａｂ／５４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−８７３、ｍｉＲ−３６１４−３ｐ、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−４８３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９６ａｂｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−３２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−６１６、ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−３ｐ、ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４５２／４６７６−３ｐ、ｍｉＲ−１２９−５ｐ／１２９ａｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４７５５−３ｐ、ｍｉＲ−１２４７、ｍｉＲ−３１２９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５−３ｐ、ｍｉＲ−５４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−４６８７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−５ｐ、ｍｉＲ−４７７２−５ｐ、ｍｉＲ−３３７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６／１９５−３ｐ、ｍｉＲ−３６７７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６６−５ｐ、ｍｉＲ−２９９／２９９−３ｐ／３５６３−３ｐ、ｍｉＲ−３１４０−３ｐ、ｍｉＲ−５３２−５ｐ／５１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−５ｐ、ｍｉＲ−４７７８−５ｐ、ｍｉＲ−６４２ｂ、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｍｉＲ−７６７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ、ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｍｉＲ−３１７３−３ｐ、ｍｉＲ−２１２７／４７２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−２−５ｐ、ｍｉＲ−３５９１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−５２２／５１８ｅ／１４２２ｐ、ｍｉＲ５４８ｄ−３ｐ／５４８ａｃｂｚ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２／２１５、ｍｉＲ−１５５１／４５２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５−３ｐ、ｍｉＲ−３１２６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ／１９１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ／ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−５６３／３８０−５ｐ、ｍｉＲ−１３０４、ｍｉＲ−２１６ｃ／１４６１／４６８４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６８１−５ｐ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−３ｐ、ｍｉＲ−８８８、ｍｉＲ−４８０２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ／ｇ−３ｐ、ｍｉＲ−７６２／４４９２／４４９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５１４／５１４ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０６−５ｐ、ｍｉＲ−３１８９−３ｐ、ｍｉＲ−６７５−５ｐ／４４６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４−５ｐ、ｍｉＲ−５０９−５ｐ／５０９−３−５ｐ／４４１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ／ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４７５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３−３ｐ、ｍｉＲ−３１３０−５ｐ／４４８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５７５／４６７６−５ｐ、ｍｉＲ−１３０７、ｍｉＲ−３９４２−３ｐ、ｍｉＲ−４６７７−５ｐ、ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２−５ｐ、ｍｉＲ−２１１４、ｍｉＲ−３６８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２２／１２２ａ／１３５２、ｍｉＲ−５５６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−２−３ｐ、ｍｉＲ−６４３、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１２４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１５−３ｐ、ｍｉＲ−５１８ｂｃｆ／５１８ａ−３ｐ／５１８ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３２００−３ｐ、ｍｉＲ−５４５／３０６５／３０６５−５ｐ、ｍｉＲ−１９０３／４７７８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−３１４４−５ｐ、ｍｉＲ−５８２−３ｐ、ｍｉＲ−４６６２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３１４０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３４５／３４５−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ／１５５４、ｍｉＲ−３１４５−５ｐ、ｍｉＲ−６７６、ｍｉＲ−３１７３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５８６−３ｐ、ｍｉＲ−６１５−３ｐ、ｍｉＲ−３６８８−３ｐ、ｍｉＲ−４６６２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４６５９ａｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５８６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ａｂｃ／１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８−３ｐ、ｍｉＲ−３１２７−５ｐ、ｍｉＲ−５０８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ｃ／５１４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８７−３ｐ、ｍｉＲ−３６６４−３ｐ、ｍｉＲ−３１８９−５ｐ、ｍｉＲ−４６７０−３ｐ、ｍｉＲ−１０５／１０５ａｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１０−３ｐ、ｍｉＲ−４９３／４９３ｂ、ｍｉＲ−３６０５−３ｐ、ｍｉＲ−１８８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−４７６１−５ｐ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−４７９６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５５６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−４６７７−３ｐ、ｍｉＲ−８７７、ｍｉＲ−５７６−５ｐ、ｍｉＲ−４９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８９−３ｐ、ｍｉＲ−４７８６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３１５８−３ｐ、ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｍｉＲ−５１８ｄ−５ｐ／５１９ｂｃ−５ｐ５２０ｃ−５ｐ／５２３ｂ／５２６ａ、ｍｉＲ−４７０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００４−３ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−５ｐ、ｍｉＲ−４６６１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−５ｐ、ｍｉＲ−４６７０−５ｐ、ｍｉＲ−６５９、ｍｉＲ−１７４５／３１９４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−３ｐ、ｍｉＲ−２９８／２３４７／２４６７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４７４６−３ｐ、ｍｉＲ−１
８９３／２２７７−５ｐ、ｍｉＲ−３６１９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３８−１−３ｐ、ｍｉＲ−４７２８−３ｐ、ｍｉＲ−３１２７−３ｐ、ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７７−３ｐ、ｍｉＲ−３１５７−５ｐ、ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｍｉＲ−５００ａ、ｍｉＲ−５４８ｇ、ｍｉＲ−５２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８４−３ｐ、ｍｉＲ−２０５／２０５ａｂ、ｍｉＲ−４７９３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−３１８０−５ｐ、ｍｉＲ−１４０４／２１１０、ｍｉＲ−３１５７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−３ｐ、ｍｉＲ−１３４６／３９４０−５ｐ／４５０７、ｍｉＲ−４７４６−５ｐ、ｍｉＲ−３９３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｊ／ｇ／ｘ−５ｐ、ｍｉＲ−４６５９ａｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４７−３ｐ、ｍｉＲ−２８９０／４７０７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９−３ｐ、ｍｉＲ−２２７７−３ｐ、ｍｉＲ−３５４７／３６６３−３ｐ、ｍｉＲ−３４ｂｃ−３ｐ、ｍｉＲ−５１８ｅｆ、ｍｉＲ−３１８７−３ｐ、ｍｉＲ−１３０６／１３０６−３ｐ、ｍｉＲ−３１７７−３ｐ、ｍｉＲ−１ａｂ／２０６／６１３、ｍｉＲ−１２８／１２８ａｂ、ｍｉＲ−１２９６、ｍｉＲ−５９８／５９８−３ｐ、ｍｉＲ−８８７、ｍｉＲ−１−５ｐ、ｍｉＲ−３７６ｃ／７４１−５ｐ、ｍｉＲ−３７４ｃ／６５５、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−６５１、ｍｉＲ−１３０１／５０４７、ｍｉＲ−３８１−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ、ｍｉＲ−３００／３８１／５３９−３ｐ、ｍｉＲ−１２４９、ｍｉＲ−５７９、ｍｉＲ−６５６、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−１１８０、ｍｉＲ−５９７／１９７０、ｍｉＲ−１９０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５３７、ｍｉＲ−８７４−５ｐ、ｍｉＲ−４１０／３４４ｄｅ／３４４ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ／２１９−３ｐ、ｍｉＲ−３６２０、ｍｉＲ−５０４／４７２５−５ｐ、ｍｉＲ−２９６４／２９６４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５０ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−５１１、ｍｉＲ−６５０５−３ｐ、ｍｉＲ−４３３−５ｐ、ｍｉＲ−６７４１−３ｐ、ｍｉＲ−３７０−５ｐ、ｍｉＲ−５７９−５ｐ、ｍｉＲ−３７６ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３７６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５５２／３０９７−５ｐ、ｍｉＲ−１９１０、ｍｉＲ−７５８、ｍｉＲ−６７３５−３ｐ、ｍｉＲ−３７６ａ−２−５ｐ、ｍｉＲ−５８５ｍｉＲ−４５１、およびｍｉＲ−１３７／１３７ａｂよりなる群から選ばれて、同じシード配列から５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有しながら６〜２４個の塩基で構成されることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【００３７】
好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、配列番号１０３〜５２８のうちいずれか1つ以上で表示される塩基配列を含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する（表３参照）。
【００３８】
また、本発明は、ＲＮＡ干渉誘導核酸を含むマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用組成物を提供する。
【００３９】
また、本発明は、ＲＮＡ干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する段階を含む、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制方法を提供する。
【００４０】
また、本発明は、ＲＮＡ干渉誘導核酸の、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用途を提供する。
【００４１】
また、本発明は、下記の段階を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階を含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法を提供する。
【００４２】
３．マイクロＲＮＡの非正規Ｇ：Ａワブル標的サイトを抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸（配列番号５２９〜８６３）に対して
本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から９番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有し、当該部位のＧ：Ａワブル（ｗｏｂｂｌｅ）がＵ：Ａの正規的な塩基配列になるようにすることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【００４３】
好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目の塩基から始まって６個〜８個の連続的な塩基配列を含み、
前記塩基配列は、グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）塩基に少なくとも1つ以上置換されたことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【００４４】
好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、Ｇ：Ａワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列で結合するマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子のみを選択的に抑制し、マイクロＲＮＡの正規標的遺伝子は抑制しないことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【００４５】
好ましくは、前記特定マイクロＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２−３ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−９８−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０８−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−２１９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１９ａ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４１１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２２ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−４９３−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０６５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８９−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７０８−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６６２ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７５８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２７７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７７２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４６７−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｂ／ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８９−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ｂ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７２０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６７７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−９８−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２−３ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｈｓａ−−４９３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｍ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−９３−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７／ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０９−３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−３６３−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９ａ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−２０８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−５２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｃ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ／ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ／ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、
ｈｓａ−ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−３１５７−３ｐよりなる群から選ばれて、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列または２番目から９番目の配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、当該部位のＧ：Ａワブル配列がＵ：Ａの正規的な塩基配列になるようにしつつ、６〜２４個の塩基で構成されることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【００４６】
好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端から２番目の塩基から始まって７番目までまたは２番目の塩基から始まって９番目までの６個〜８個の連続的な塩基配列が配列番号５２９〜８６３（表４参照）のうちいずれか1つ以上で表示されることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【００４７】
また、本発明は、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸を含むマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用組成物を提供する。
【００４８】
また、本発明は、ＲＮＡ干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する段階を含む、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制方法を提供する。
【００４９】
また、本発明は、ＲＮＡ干渉誘導核酸の、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用途を提供する。
【００５０】
また、本発明は、下記の段階を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目の塩基から始まって６個〜８個の連続的な塩基配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階を含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法を提供する。
【００５１】
以下、本発明を説明する。
【００５２】
マイクロＲＮＡが標的伝令ＲＮＡと結合するとき、マイクロＲＮＡシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）と正確に相補関係でなくてもマイクロＲＮＡの標的と認識し、伝令ＲＮＡに結合する場合があるところ、これを非正規標的認識（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）という。本発明者らは、このようなマイクロＲＮＡの非正規標的認識に着目して、マイクロＲＮＡの一部配列を変形させてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子を選択的に抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を開発し、その効能を明らかにすることによって、本発明を完成した。
【００５３】
本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現のみを抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴として、または
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）にまたはアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、当該部位のＧ：ＡまたはＧ：Ｕワブル配列がＵ：ＡまたはＡ：Ｕの正規的な塩基配列になるようにすることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【００５４】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖であって、好ましくは、マイクロＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、ＤｓｉＲＮＡ、ｌｓｉＲＮＡ、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ、ａｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、またはｅｎｄｏ−ｓｉＲＮＡなどが含まれる。
【００５５】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、マイクロＲＮＡの2つの非正規標的認識（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）を基とする。
【００５６】
より具体的に、マイクロＲＮＡは、正規標的遺伝子だけでなく、非正規標的遺伝子も認識する。マイクロＲＮＡが認識する非正規標的遺伝子は、マイクロＲＮＡと正確に一致する相補関係を有しない。
【００５７】
マイクロＲＮＡが認識する非正規標的遺伝子および前記非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の一様態は、次の通りである。
【００５８】
マイクロＲＮＡが結合する非正規標的遺伝子のうち1つの認識種類は、マイクロＲＮＡの５’末端から５番目までの塩基と全部連続的に相補関係を有する。しかしながら、マイクロＲＮＡの５’末端から６番目の塩基が認識する（マイクロＲＮＡの５’末端から６番目の塩基と配列される）遺伝子は、前記マイクロＲＮＡの５’末端から５番目の塩基と相補関係を有する塩基とすぐに連続する塩基でなく、すぐに連続する塩基は、隆起形に押し出し、その次にマイクロＲＮＡと相補関係を有する塩基がマイクロＲＮＡの５’末端から６番目の塩基が認識する塩基となる。
【００５９】
前記一様態のマイクロＲＮＡが認識する非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目までの４個の塩基配列を含む。また、前記４個の塩基配列に連続する２個の塩基は、互いに同一であり、前記２個の塩基配列は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれる。
【００６０】
このような特定マイクロＲＮＡが認識する非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸は、前記マイクロＲＮＡの塩基配列と比較したところ、少なくとも特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目までの４個の塩基配列を共通で含む。
【００６１】
また、ＲＮＡ干渉誘導核酸の５’末端から６番目の塩基配列と７番目の塩基配列は、同一であり得、これら２つの塩基配列は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれる。例えば、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基：前記６番目の塩基と配列できる塩基：前記６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基は、（Ａ：Ｕ，Ｇ：Ａ，Ｃ）、（Ｇ：Ａ，Ｕ，Ｃ：Ｕ，Ａ，Ｇ）、（Ｕ：Ｇ，Ａ：Ｃ，Ｕ）または（Ｃ：Ｇ：Ｃ）であり得る。例えば、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基がＡであるとき、ＲＮＡ干渉誘導核酸の５’末端から６番目の塩基配列と７番目の塩基配列は、ＡＡ，ＣＡであり得；特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基がＧであるとき、ＲＮＡ干渉誘導核酸の５’末端から６番目の塩基配列と７番目の塩基配列は、ＵＧ、ＡＧまたはＧＧであり得；特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基がＵであるとき、ＲＮＡ干渉誘導核酸の５’末端から６番目の塩基配列と７番目の塩基配列は、ＣＵ、ＵＵであり得；または特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基がＣであるとき、ＲＮＡ干渉誘導核酸の５’末端から６番目の塩基配列と７番目の塩基配列は、ＣＣであり得る。
【００６２】
好ましくは、ＲＮＡ干渉誘導核酸の５’末端から６番目の塩基配列と特定マイクロＲＮＡの５’末端から６番目の塩基配列は、同一であり得、好ましくは、ＲＮＡ干渉誘導核酸の５’末端から７番目の塩基配列と特定マイクロＲＮＡの５’末端から６番目の塩基配列は、同一であり得る。
【００６３】
また、好ましくは、ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から７番目の塩基配列を５’末端から８番目の塩基配列で含むことができる。
【００６４】
さらに他の様態として、マイクロＲＮＡが認識する非正規標的遺伝子および前記非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の一様態は、次の通りである。
【００６５】
マイクロＲＮＡが認識する非正規標的遺伝子は、マイクロＲＮＡとマイクロＲＮＡが認識する標的遺伝子の塩基がＡ：Ｕ，Ｇ：Ｃ，Ｃ：Ｇ，Ｕ：Ａの相補関係の配列と共にＧ：Ａのワブル関係の配列またはＧ：Ｕのワブル関係の配列を含む。
【００６６】
マイクロＲＮＡとマイクロＲＮＡが認識する標的遺伝子がＧ：Ａのワブル関係にあるとき、特定マイクロＲＮＡの塩基：前記特定マイクロＲＮＡが認識する標的遺伝子の塩基：前記特定マイクロＲＮＡが認識する標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の塩基の配列は、Ｇ：Ａ：Ｕである。また、マイクロＲＮＡとマイクロＲＮＡが認識する標的遺伝子がＧ：Ｕのワブル関係にあるとき、特定マイクロＲＮＡの塩基：前記特定マイクロＲＮＡが認識する標的遺伝子の塩基：前記特定マイクロＲＮＡが認識する標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の塩基の配列は、Ｇ：Ｕ：Ａである。
【００６７】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうち1つ以上のグアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）に置換された変形塩基配列を有する。または本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうち1つ以上のグアニン（Ｇ）塩基がアデニン（Ａ）に置換された変形塩基配列を有する。特定マイクロＲＮＡの５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン（Ｇ）塩基が1つ以上含まれた場合、含まれたグアニン塩基が全部ウラシル（Ｕ）またはアデニン（Ａ）に置換されることもでき、少なくとも1つ以上のグアニン塩基がウラシル（Ｕ）またはアデニン（Ａ）に置換される。特定マイクロＲＮＡの５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇ）塩基が1つ以上含まれた場合、ウラシルまたはアデニン塩基に置換される塩基の他に、残りの塩基は、特定マイクロＲＮＡの塩基と同一であり得る。
【００６８】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子を選択的に抑制し、マイクロＲＮＡの正規標的遺伝子は抑制しない。
【００６９】
本発明の具体的実施例２（図２参照）によれば、本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸の標的遺伝子に対する伝令ＲＮＡの発現調節機能は、非正規標的遺伝子に対して特異的であり、正規標的遺伝子に対しては抑制効果を示さなかった。
【００７０】
したがって、本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸を用いると、非正規標的遺伝子発現のみを選択的に抑制することができ、したがって、ＲＮＡ干渉誘導核酸発現の抑制を通じて期待される効果のみを選択的に誘導することができる。
【００７１】
本発明において、特定マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０２ａ、ｍｉＲ−３７２よりなる群から選ばれた1つ以上であり得る。
【００７２】
本発明において、それぞれヒトのｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０２ａおよびｍｉＲ−３７２の塩基配列は、マイクロＲＮＡの配列データベースであるｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）でＭＩＭＡＴ００００４２２、ＭＩＭＡＴ００００６４６、ＭＩＭＡＴ００００４２１、ＭＩＭＡＴ００００４１６，ＭＩＭＡＴ００００４２７、ＭＩＭＡＴ０００００６２、ＭＩＭＡＴ００００６８４、およびＭＩＭＡＴ００００７２４に記載されている通りである。
【００７３】
ただし、本発明による特定マイクロＲＮＡは、ヒトのマイクロＲＮＡに限定されず、哺乳動物を含む動物のマイクロＲＮＡを含む。
【００７４】
本発明による特定マイクロＲＮＡが認識する非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり得、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれることを特徴とするＲＮＡ干渉誘導核酸の長さは、６個以上の塩基配列を含み、これに制限されないが、通常、２１個程度であって、２４個以下の塩基配列を有することができる。
【００７５】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１２４であるとき、ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、ｍｉＲ−１２４の５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり得、６番目と７番目の塩基は、ｍｉＲ−１２４の６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記ｍｉＲ−１２４の６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるＲＮＡ干渉誘導核酸である。
【００７６】
例えば、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端２番目から７番目の塩基配列が５’−ＡＡ  ＧＧＣ  Ｃ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２４ＢＳ）であり得る。より好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’−ＵＡＡ  ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＧＣＧ  ＧＵＧ  ＡＡＵ  ＧＣＣ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２４ＢＳ）であり得る。
【００７７】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１２２であるとき、ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、ｍｉＲ−１２２の５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、ｍｉＲ−１２２の６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記ｍｉＲ−１２２の６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるＲＮＡ干渉誘導核酸である。
【００７８】
例えば、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端２番目から７番目の塩基配列が５’−ＧＧ  ＡＧＵ  Ｕ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２２ＢＳ）であり得る。より好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＧＵ  ＧＡＣ  ＡＡＵ  ＧＧＵ  ＧＵＵ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２２ＢＳ）であり得る。
【００７９】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１５５であるとき、ｍｉＲ−１５５の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、ｍｉＲ−１５５の５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、ｍｉＲ−１５５の６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記ｍｉＲ−１５５の６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるＲＮＡ干渉誘導核酸である。
【００８０】
例えば、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端２番目から７番目の塩基配列が５’−ＵＡ  ＡＵＧ  Ｇ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１５５ＢＳ）であり得る。より好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’−ＵＵＡ  ＡＵＧ  ＧＣ  ＵＡＡ  Ｕ  ＣＧＵ  ＧＡＵ  ＡＧＧ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１５５ＢＳ）であり得る。
【００８１】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１であるとき、ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、ｍｉＲ−１の５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、ｍｉＲ−１の６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記ｍｉＲ−１の６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるＲＮＡ干渉誘導核酸である。
【００８２】
例えば、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端２番目から７番目の塩基配列が５’−ＧＧ  ＡＡＵ  Ｕ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１ＢＳ）であり得る。より好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’−ＵＧＧ  ＡＡＵ  ＵＧＵ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＧＵＡ  ＵＧＵ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１ＢＳ）であり得る。
【００８３】
本発明による特定マイクロＲＮＡが認識する非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、特定マイクロＲＮＡの５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）またはアデニン（Ａ）に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有することを特徴とするＲＮＡ干渉誘導核酸の長さは、６個以上の塩基配列を有し、これに制限されないが、通常、２１個の程度であって、２４個以下の塩基配列を有することができる。
【００８４】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１２４であるとき、ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、ｍｉＲ−１２４の５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）またはアデニン（Ａ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するＲＮＡ干渉誘導核酸である。
【００８５】
例えば、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列が５’−ＵＡＡ  ＵＧＣ  ＡＣ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＡＡ  ＧＵＣ  ＡＣ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕ）または５’−ＵＡＡ  ＵＵＣ  ＡＣ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４，５Ｕ）を示すＲＮＡ干渉誘導核酸であり得る。より好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’−ＵＡＡ  ＵＧＣ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＵＧＡ  ＡＵＧ  ＣＣＡ  Ａ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＡＡ  ＧＵＣ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＵＧＡ  ＡＵＧ  ＣＣＡ  Ａ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕ）または５’−ＵＡＡ  ＵＵＣ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＵＧＡ  ＡＵＧ  ＣＣＡ  Ａ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４，５Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸であり得る。
【００８６】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１であるとき、ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、ｍｉＲ−１の５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）またはアデニン（Ａ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するＲＮＡ干渉誘導核酸である。
【００８７】
例えば、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列が５’−ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＧＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＧＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＡＵ  ＵＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＡＡＵ  ＧＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，３Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＵＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ３，７Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＵＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，７Ｕ）または５’−ＵＵＵ  ＡＡＵ  ＵＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，３，７Ｕ）を示すＲＮＡ干渉誘導核酸であり得る。より好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’−ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＧＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＧＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＡＵ  ＵＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＡＡＵ  ＧＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，３Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＵＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ３，７Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＵＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，７Ｕ）または５’−ＵＵＵ  ＡＡＵ  ＵＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，３，７Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸であり得る。
【００８８】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１２２であるとき、ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、ｍｉＲ−１２２の５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）またはアデニン（Ａ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するＲＮＡ干渉誘導核酸である。
【００８９】
例えば、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列が５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＧＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ９Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，５Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，７Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，９Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＵＵ  ＧＵＧ（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，５Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，７Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，９Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，７Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，９Ｕ）、または５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＵ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７，９Ｕ）を示すＲＮＡ干渉誘導核酸であり得る。より好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＧＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ９Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，５Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，７Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，９Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＵＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，５Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＵＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，７Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，９Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＵＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，７Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，９Ｕ）または５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７，９Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸であり得る。
【００９０】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１３３であるとき、ｍｉＲ−１３３の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、ｍｉＲ−１３３の５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）またはアデニン（Ａ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するＲＮＡ干渉誘導核酸である。
【００９１】
例えば、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列が５’−ＵＵＵ  ＵＧＵ  ＣＣＣ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＧＵＵ  ＣＣＣ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ５Ｕ）または５’−ＵＵＵ  ＵＵＵ  ＣＣＣ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４，５Ｕ）を示すＲＮＡ干渉誘導核酸であり得る。より好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’−ＵＵＵ  ＵＧＵ  ＣＣＣ  ＣＵＵ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＧＵＵ  ＣＣＣ  ＣＵＵ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ５Ｕ）または５’−ＵＵＵ  ＵＵＵ  ＣＣＣ  ＣＵＵ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ４，５Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸であり得る。
【００９２】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡがｌｅｔ−７であるとき、ｌｅｔ−７の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、ｌｅｔ−７の５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）またはアデニン（Ａ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するＲＮＡ干渉誘導核酸である。
【００９３】
例えば、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列が５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＧＧＵ  ＡＵＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ８Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，４Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，５Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＵＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，８Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＵＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，５Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＵＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，８Ｕ）、または５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＵＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５，８Ｕ）を示すＲＮＡ干渉誘導核酸であり得る。より好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＧＧＵ  ＡＵＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ８Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，４Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，５Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＵＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，８Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＵＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，５Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＵＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，８Ｕ）または５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＵＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５，８Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸であり得る。
【００９４】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡがｍｉＲ−３０２ａであるとき、ｍｉＲ−３０２ａの非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、ｍｉＲ−３０２ａの５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）またはアデニン（Ａ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するＲＮＡ干渉誘導核酸である。
【００９５】
例えば、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列が５’−ＵＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ６Ｕ）、または５’−ＵＡＡ  ＵＵＵ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４，６Ｕ）を示すＲＮＡ干渉誘導核酸であり得る。より好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’−ＵＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＵ  ＣＣＡ  ＵＧＵ  ＵＵＵ  ＧＧＵ  ＧＡ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＵ  ＣＣＡ  ＵＧＵ  ＵＵＵ  ＧＧＵ  ＧＡ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ６Ｕ）、または５’−ＵＡＡ  ＵＵＵ  ＣＵＵ  ＣＣＡ  ＵＧＵ  ＵＵＵ  ＧＧＵ  ＧＡ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４，６Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸であり得る。
【００９６】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡがｍｉＲ−３７２であるとき、ｍｉＲ−３７２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、ｍｉＲ−３７２の５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）またはアデニン（Ａ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するＲＮＡ干渉誘導核酸である。
【００９７】
例えば、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列が５’−ＡＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＧ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＧ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ６Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＧＵＧ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ９Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＵＵＵ  ＣＵＧ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４，６Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４，９Ｕ）、または５’−ＡＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ６，９Ｕ）を示すＲＮＡ干渉誘導核酸であり得る。より好ましくは、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、ｍｉＲ−３７２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＡＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＧ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＧ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ６Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＧＵＧ  ＣＵＵ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ９Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＵＵＵ  ＣＵＧ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４，６Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＵ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４，９Ｕ）、または５’−ＡＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＵ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ６，９Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸であり得る。
【００９８】
また、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴とし、
前記特定マイクロＲＮＡは、５’末端から６番目ヌクレオチドのリボース環の２’位にメチル基（２’ＯＭｅ）が添加されたことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【００９９】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基にＧ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基を含み、前記マイクロＲＮＡの５’末端から６番目ヌクレオチドのリボース環の２’位にメチル基（２’ＯＭｅ）が添加されている場合であれば、これを除いた残りの塩基配列には制限がなく、どんな塩基配列でも全部含まれ得、この際、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、６個〜２４個の塩基配列を含むことができ、好ましくは、６個〜１５個、さらに好ましくは、６個〜８個の塩基配列を含むことができるが、前記核酸の長さに特別な制限はない。
【０１００】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、マイクロＲＮＡの５’末端から６番目のヌクレオチドのリボース環の２’位にメチル基（２’ＯＭｅ）が添加されて化学的に変形が起こった塩基配列を含み、前記２’ＯＭｅ変形が起こったＲＮＡ干渉誘導核酸は、これの正規シード標的遺伝子の発現のみを選択的に抑制し、非正規シード標的遺伝子の発現は抑制しないことがある。これにより、前記２’ＯＭｅ変形が起こったＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの非正規核隆起サイトのみを特異的に抑制するための本発明の目的は維持しつつ、新しく発生しうる非正規核隆起サイトは完全に除去することができる。
【０１０１】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸において、前記メチル基（２’ＯＭｅ）が添加され得るマイクロＲＮＡの種類には制限がなく、マイクロＲＮＡの５’末端から６番目のヌクレオチドのリボース環の２’位であれば、どんなマイクロＲＮＡにも２’ＯＭｅが添加され得るが、本発明の具体的な実施例によれば、前記２’ＯＭｅが添加され得るマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１２４またはｍｉＲ−１であり得る。
【０１０２】
また、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【０１０３】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基にＧ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基を含んでいる場合であれば、これを除いた残りの塩基配列には制限がなく、どんな塩基配列でも全部含まれ得、この際、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、６個〜２４個の塩基配列を含むことができ、好ましくは、６個〜１５個、さらに好ましくは、６個〜８個の塩基配列を含むことができるが、前記核酸の長さに特別な制限はない。
【０１０４】
本発明による前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることによって、非正規核隆起標的サイトのみを選択的に抑制し、マイクロＲＮＡの正規標的遺伝子は抑制しない。
【０１０５】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、配列番号１０３〜５２８のうちいずれか1つ以上で表示される塩基配列を含むことができる（表３参照）。
【０１０６】
また、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現のみを抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から９番目の塩基の間の塩基配列、または５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有し、当該部位のＧ：Ａワブル（ｗｏｂｂｌｅ）がＵ：Ａの正規的な塩基配列になるようにすることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸を提供する。
【０１０７】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目の塩基から９番目の塩基の間の配列、または５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）塩基に少なくとも1つ以上置換されたものであり得、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目の塩基から９番目の塩基の間のグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を含む場合であれば、これを除いた残りの塩基配列には制限がなく、どんな塩基配列でも全部含まれ得る。この際、前記特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目の塩基から９番目の塩基の間の塩基配列、または５’末端基準２番目から７番目の配列のうちウラシル（Ｕ）塩基に置換される塩基の他に、残りの塩基は、特定マイクロＲＮＡの塩基と同じであってもよい。
【０１０８】
本発明による特定マイクロＲＮＡが認識する非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から９番目の塩基の間の塩基配列、または５’末端基準２番目から７番目の配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有することを特徴とするＲＮＡ干渉誘導核酸は、６個〜２４個の塩基配列を含むことができ、好ましくは、６個〜１５個、さらに好ましくは、６個〜８個の塩基配列を含むことができるが、前記特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目の塩基から始まって６個〜８個の連続的な塩基配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸であれば、核酸の長さに特別な制限はない。この際、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸において、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目の塩基から始まって６個〜８個の連続的な塩基配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を含む場合であれば、これを除いた残りの塩基配列の種類には制限がなく、どんな塩基配列でも全部含まれ得る。
【０１０９】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端から２番目の塩基から始まって６個〜８個の連続的な塩基配列のうちグアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有して当該部位のＧ：Ａワブル配列がＵ：Ａの正規的な塩基配列になるようにすることによって、Ｇ：Ａワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列で結合するマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子のみを選択的に抑制し、マイクロＲＮＡの正規標的遺伝子は抑制しない。
【０１１０】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、配列番号５２９〜８６３のうちいずれか以上で表示される塩基配列を含むことができる（表４参照）。
【０１１１】
本発明による上述したＲＮＡ干渉誘導核酸を用いると、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子を特異的に抑制することができる。
【０１１２】
これにより、本発明は、ＲＮＡ干渉誘導核酸を含むマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用組成物またはＲＮＡ干渉誘導核酸を含むマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用キットを提供する。
【０１１３】
また、本発明による上述したＲＮＡ干渉誘導核酸を用いると、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子を特異的に抑制することによって、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子の発現抑制によって起こる作用を選択的に調節することができる。
【０１１４】
より具体的に、本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸を用いると、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子を特異的に抑制するので、本発明による上述したＲＮＡ干渉誘導核酸を用いると、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現による作用（例えば、細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖、または死滅）を特異的に調節することができる。
【０１１５】
これにより、本発明は、ＲＮＡ干渉誘導核酸を含む細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖、または死滅調節用組成物またはキットを提供する。
【０１１６】
本発明において、前記「細胞周期」は、細胞が成長して分裂し、さらに成長する連続的な過程であって、細胞がＭ期（細胞分裂期）、Ｇ１期（第１分裂準備期）、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）、Ｇ２期（第２分裂準備期）の４期（ｐｈａｓｅ）を繰り返すことを意味する。Ｇ１期は、細胞分裂直後からＤＮＡ合成開始までのＤＮＡ合成準備期であり、Ｇ２期は、ＤＮＡ合成の終了から細胞分裂開始までの細胞分裂準備期である。
【０１１７】
本発明において、前記「細胞周期調節」は、細胞が前記４期（ｐｈａｓｅ）の間に変動するように誘導したり、前記変動を促進または停止（ａｒｒｅｓｔ）させることを含み、例えば、Ｇ２／Ｍ期の細胞をＧ１／Ｇ２期に変動するように誘導することが細胞周期調節の例として含まれ得る。
【０１１８】
本発明において、前記「細胞分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」は、細胞が形態的、機能的に特殊性を獲得する過程であって、細胞は、分化を通じて大きさや形態、膜電位、代謝活性、そして信号に対する反応が変化する。
【０１１９】
本発明において、前記「細胞分化調節」は、細胞が分化する速度を促進または遅延させたり、分化が始まるように誘導したり、分化が始まらないように抑制することを含み、例えば、神経細胞が分化するように誘導して形態的特殊性（例えば、神経突起分化）を獲得するように誘導することが、細胞分化調節の例として含まれ得る。または、例えば、筋細胞が分化するように誘導して形態的特殊性（例えば、筋細胞の筋線維化）を有するように誘導することが、細胞分化調節の例として含まれ得る。
【０１２０】
本発明において、前記「逆分化」とは、分化進行を戻すこと乃至ほぼ分化が完了した細胞を分化になる前の未分化時期の全分化能を獲得してさらに中期細胞のように変わる現象をいう。
【０１２１】
本発明において、前記「逆分化調節」は、細胞が逆分化されるように誘導、促進したり、逆分化進行を抑制、遅延することを含み、逆分化調節結果は、例えば細胞成長形態（例えば、群集形成など）、逆分化因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４）の活性などを確認することによって判断することができる。
【０１２２】
本発明において、前記「細胞形態」は、細胞の形態、構造、大きさなどを含む表現型上の特徴を意味し、細胞形態は、生物の種類によって、また、同じ生物であっても組織や器官の種類によって多種多様である。
【０１２３】
本発明において、前記「細胞形態調節」は、細胞の形態、構造、大きさなどを含む表現型上の特徴の変化を誘導することであり、細胞の自然的形態変化を促進、遅延、誘導または抑制することと、細胞の形態を非自然的に変化させることを促進乃至誘導することを含む。例えば、心筋細胞の心筋肥大現象を誘導することが一例として含まれ得る。
【０１２４】
本発明において、前記「細胞移動」は、細胞の動きを意味し、動物の成長および生理活動のために重要な過程であり、細胞は、主に与えられた刺激に速い反応を示し、通常、非集団的な形状で移動するのに対し、他の細胞類型は、特定の成長期間や特殊な状況だけで移動することができる。細胞移動は、神経管と脈管のシードや上皮組織の創傷治癒過程で主に起こり、細胞集団移動は、多種の腫瘍転移に寄与する。
【０１２５】
本発明において、前記「細胞移動調節」は、細胞の移動を遅延、促進、誘導または抑制（阻害）することを意味する。
【０１２６】
本発明において、「細胞分裂、増殖」は、母細胞が2つの娘細胞に分かれる過程であり、細胞数を増やす過程を意味する。
【０１２７】
本発明において、「細胞分裂、増殖調節」は、細胞分裂、増殖を遅延、促進、抑制乃至誘導することを含む。細胞周期のうちＭ期（細胞分裂期）に細胞の期（ｐｈａｓｅ）を誘導する場合、細胞分裂、増殖を誘導できることになる。例えば、Ｇ０／Ｇ１期に分布する細胞の数を減少させ、Ｇ２／Ｍ期に分布する細胞の数を増加させると、細胞分裂、増殖調節の例として含まれ得る。
【０１２８】
本発明において、「細胞死滅（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」は、細胞が機能的な役割は維持しつつ、遺伝的性質によって死に至る段階を意味し、早い細胞死滅と遅い細胞死滅が全部含まれる。細胞死滅によれば、細胞全体が萎縮して新しいタンパク質が合成され、細胞の自殺遺伝子により死に誘導される。
【０１２９】
本発明において、「細胞死滅調節」は、細胞死滅を誘導、遅延、促進または抑制することを含む。
【０１３０】
より具体的に、本発明は、ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸（好ましくは、ｍｉＲ−１２４ＢＳ）を含む癌細胞死滅誘導用組成物；
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸（好ましくは、ｍｉＲ−１２４ＢＳ）を含む神経突起分岐分化誘導用組成物；
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸（好ましくは、ｍｉＲ−１２２ＢＳ）を含む肝癌細胞の細胞周期停止誘導用組成物；
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸（好ましくは、ｍｉＲ−１ＢＳ）を含む筋細胞分化促進または筋線維化促進用組成物；
ｍｉＲ−１５５の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸（好ましくは、ｍｉＲ−１５５ＢＳ）を含む筋細胞死滅誘導用組成物；
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸（好ましくは、ｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕ）を含む神経芽細胞腫の細胞死滅促進用組成物；
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸（好ましくは、ｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕ）を含む神経芽細胞腫の細胞分裂増殖促進用組成物；
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸（好ましくは、ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ、ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ、ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ）を含む心筋肥大誘導用組成物；
ｍｉＲ−１３３の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸（好ましくは、ｍｉＲ−１３３−Ｇ４Ｕ）を含む心筋肥大誘導用組成物；
ｌｅｔ−７の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸（好ましくは、ｌｅｔ−７−Ｇ２Ｕ、ｌｅｔ−７−Ｇ２，４Ｕ）を含む癌細胞の細胞周期停止誘導用組成物；
ｌｅｔ−７の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸（好ましくは、ｌｅｔ−７−Ｇ４Ｕ）を含む肝細胞の細胞周期進行活性誘導用組成物；
ｍｉＲ−３０２ａの非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸（好ましくは、ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４Ｕ）を含む逆分化促進用組成物；
ｍｉＲ−３７２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸（好ましくは、ｍｉＲ−３７２−Ｇ４Ｕ）を含む逆分化促進用組成物；または
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸（好ましくは、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２Ｕ、またはｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ）を含む肝癌細胞の細胞移動阻害用組成物。
【０１３１】
また、本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸を用いると、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子を特異的に抑制することによって、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子の作用を選択的に調節できるところ、多様な分野（例えば、薬学、化粧品学、細胞学など）において活用され得る。
【０１３２】
また、本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸は、細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節用試験物質をスクリーニングする方法に活用され得る。
【０１３３】
より具体的に、本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸を対象細胞に導入する段階；
対象細胞に試験物質を処理する段階；および
対象細胞でＲＮＡ干渉誘導核酸が抑制するマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子の発現量乃至発現有無を確認する段階を含む、
細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節用試験物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０１３４】
本発明において、前記対象細胞は、ヒトを含む哺乳動物に由来したものであれば、制限されずに含まれ、対象細胞を抽出する組織乃至種類などは制限されず、例えば神経細胞、心筋細胞、癌細胞、筋細胞などが含まれ得る。
【０１３５】
本発明において、前記ＲＮＡ干渉誘導核酸の対象細胞への導入は、当業界に公知となった多様な方法により適宜行われ得、例えば、導入は、リン酸カルシウムを用いた形質感染（Ｇｒａｈａｍ、ＦＬなど，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３））、ＤＥＡＥデキストランによる形質感染、微細注射による形質感染（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，ＭＲ，Ｃｅｌｌ，２２：４７９（１９８０））、陽イオン性脂質による形質感染（Ｗｏｎｇ，ＴＫなど，Ｇｅｎｅ，１０：８７（１９８０））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｅなど、ＥＭＢＯ  Ｊ，１：８４１（１９８２））、形質導入またはトランスフェクションのように文献（Ｂａｓｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｄａｖｉｓなど，１９８６およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｄａｖｉｓなど，１９８６）に記載されたように、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者によく公知されている方法により行われる。好ましくは、トランスフェクションによることができる。トランスフェクション効率は、細胞の種類だけでなく、細胞培養条件、トランスフェクション試薬などによって大きな差が生じることができる
【０１３６】
本発明において、試験物質は、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子の発現を調節して細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅に影響を及ぼすかを検査するためにスクリーニングに用いられる未知の物質を意味し、化合物、抽出物、タンパク質または核酸などが含まれ、これらに制限されない。
【０１３７】
本発明において、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子の発現量乃至発現有無は、当業界に公知となった多様な発現分析方法により確認することができ、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ（参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）），ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ，ＦＡＣＳ  ａｎａｌｙｓｉｓなどが使用され得、これに制限されない。
【０１３８】
本発明において、前記マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子の発現量乃至発現有無を確認し、その結果、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子の発現量乃至発現において試験物質なしにＲＮＡ干渉誘導核酸のみを処理した場合と比較して差異があれば、試験物質は、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子の発現に影響を及ぼすものと判断することができる。ひいては、前記試験物質は、細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節機能を有するものと判断することができる。
【０１３９】
また、本発明は、上述したＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法を提供する。
【０１４０】
より具体的に、下記の段階を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法を提供する：
特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階、または
特定マイクロＲＮＡの５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシルまたはアデニンに少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階。
【０１４１】
また、本発明は、下記の段階を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階；および
前記特定マイクロＲＮＡの５’末端から６番目ヌクレオチドのリボース環の２’位にメチル基（２’ＯＭｅ）を添加する段階を含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法を提供する。
【０１４２】
また、本発明は、下記の段階を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階を含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法を提供する。
【０１４３】
また、本発明は、下記の段階を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目の塩基から始まって６個〜８個の連続的な塩基配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階を含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法を提供する。
【０１４４】
ＲＮＡ干渉誘導核酸に関しては、既に記載したので、重複記載を避けるために、説明を省略する。
【０１４５】
ＲＮＡ干渉誘導核酸作製は、当業界に公知となった多様な方法に従い、特定方法に制限されない。
【０１４６】
また、本発明は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から６番目ヌクレオチドのリボース環の２’位にメチル基（２’ＯＭＥ）を入れて変形した干渉誘導核酸を提供する。
【０１４７】
前記変形された干渉誘導核酸は、当該ｍｉＲＮＡの非正規核隆起サイトのみを特異的に抑制しようとする本発明の目的は維持しつつ、新しく現れることができる非正規核隆起結合は完全に除去する効果がある。
【発明の効果】
【０１４８】
本発明による干渉誘導核酸を用いると、従来のマイクロＲＮＡが非正規標的遺伝子を抑制することによって示す生物学的な機能を効率的に増大したり、従来のマイクロＲＮＡが示す機能のうち一部、すなわち非正規標的遺伝子を抑制することによって示す生物学的機能のみを選択的に示す効果を有することができる。また、このような干渉誘導核酸を通じて細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節が可能であるところ、薬物、化粧品など多様な分野において活用が可能なものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、マイクロＲＮＡの非正規標的を抑制する干渉誘導核酸の作用機序を図式化して示したものである。
【図２】図２ａ〜図２ｃは、ｍｉＲ−１２４の正規ターゲット（シード：Ｓｅｅｄ）と非正規核隆起ターゲット（核隆起：ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ）の標的遺伝子抑制をルシフェラーゼレポータの酵素で測定してｍｉＲ−１２４−ＢＳの非正規標的特異的発現抑制効果について確認したものである。
【図３】図３ａ〜図３ｂは、子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）でｍｉＲ−１２４の正規ターゲット（シード：Ｓｅｅｄ）と非正規核隆起ターゲット（核隆起：ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ）が誘導する細胞死滅をｍｉＲ−１２４−ＢＳでフローサイトメトリー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）分析を通じて確認した結果を示したものである。
【図４】図４ａ〜図４ｂは、ｍｉＲ−１２４の非正規核隆起ターゲット（核隆起：ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ）が誘導する神経突起分化をｍｉＲ−１２４−ＢＳのヒト神経腫瘍芽細胞腫（Ｓｈ−Ｓｙ−５ｙ）での発現を通じて細胞形態およびマーカーの発現様相で観察した結果を示したものである。
【図５】図５ａ〜図５ｂは、ｍｉＲ−１２４の核隆起ターゲット（核隆起：ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ）を正規ターゲット（シード：Ｓｅｅｄ）で調節するｍｉＲ−１２４−ＢＳの自然的な形態であるｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）とｍｉＲ−１２４と同じシード配列を有するｍｉＲ−１２４−（３７１４）が誘導する神経突起分岐分化を細胞形態上、分子生物学的特徴で観察した結果を示したものである。
【図６】図６ａ〜図６ｃは、マウス神経芽細胞腫（Ｎ２ａ）でｍｉＲ−１２４の非正規核隆起ターゲット（核隆起：ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ）が誘導する神経突起分岐分化がＭＡＰＲＥ１遺伝子の発現調節を通した機序であることを細胞形態上、分子生物学的特徴で観察した結果を示したものである。
【図７】図７ａ〜図７ｃは、マウス神経芽細胞腫（Ｎ２ａ）細胞でｍｉＲ−１２４−ＢＳが誘導する非正規核隆起ターゲット（核隆起：ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ）遺伝子の発現抑制を転写体水準でＲＮＡ−Ｓｅｑ分析を通じて確認した結果を示したものである。
【図８】図８ａ〜図８ｃは、ヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）でｍｉＲ−１２２の非正規核隆起ターゲット（核隆起：ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ）が誘導するｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔをｍｉＲ−１２２−ＢＳとフローサイトメトリー分析を通じて観察した結果を示したものである。
【図９】図９ａ〜図９ｅは、筋細胞株でｍｉＲ−１の非正規核隆起ターゲット（核隆起：ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ）が誘導する筋肉細胞の厚くなる効果とｍｉＲ−１５５非正規核隆起ターゲット（核隆起：ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ）が誘導する筋細胞分化阻害および細胞死滅誘導をそれぞれｍｉＲ−１−ＢＳ、ｍｉＲ−１５５−ＢＳを通じて細胞形態上、分子生物学的特徴とフローサイトメトリー分析で観察した結果を示したものである。
【図１０】図１０ａ〜図１０ｄは、ヒトの脳組織でアルゴノートタンパク質と結合するマイクロＲＮＡと標的体ＲＮＡデータであるＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ結果を生物情報学的に分析した結果であって、正規シードターゲット（シード：ｓｅｅｄ）だけでなく、非正規ＧＡ配列シード（Ｇ：Ａ  ｗｏｂｂｌｅ）ターゲットが自然的に存在することを確認した結果を示したものである。
【図１１】図１１ａ〜図１１ｄは、マウス神経芽細胞腫（Ｎ２ａ）細胞でｍｉＲ−１２４の４番非正規ＧＡ配列シードターゲット、５番非正規ＧＡ配列シードターゲットが脳細胞分化においてｍｉＲ−１２４と全く異なる機能を示すことをｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕ、ｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕを通じて細胞形態上の観察と、細胞死滅をフローサイトメトリー分析で観察した結果を示したものである。
【図１２】図１２ａ〜図１２ｂは、ヒト神経芽細胞腫（ＳＨ−ｓｙ−５ｙ）細胞でｍｉＲ−１２４の４番非正規ＧＡ配列シードターゲット、５番非正規ＧＡ配列シードターゲットの抑制の生物学的機能をｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕ、ｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕを通じて細胞分裂（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）と細胞周期分析に対するフローサイトメトリー分析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）で観察した結果を示したものである。
【図１３】図１３ａ〜図１３ｄは、ｍｉＲ−１の７番非正規ＧＡ配列シードターゲットが遺伝子抑制機能をするという点を蛍光タンパク質レポータでフローサイトメトリー分析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）を通じて心筋細胞株（ｈ９ｃ２）で確認した結果を示したものである。
【図１４】図１４ａ〜図１４ｃは、ｍｉＲ−１の２番、３番、７番非正規ＧＡ配列シードターゲットの機能をラット（ｒａｔ）の新生ラット心筋細胞（ｎｅｏｎａｔａｌ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）でｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ、ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ、ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕを発現させた後、心筋肥大誘導効果に対する細胞形態上と分子生物学的特徴に対する観察を通じて確認した結果を示したものである。
【図１５】図１５ａ〜図１５ｂは、ｍｉＲ−１３３の４番非正規ＧＡ配列シードターゲットの機能を心筋細胞（ｈ９ｃ２）でｍｉＲ−１３３−Ｇ４Ｕを発現させた後、心筋肥大誘導効果に対する細胞形態上の特徴を観察した結果を示したものである。
【図１６】図１６ａ〜図１６ｂは、ｍｉＲ−１２２の２番、３番非正規ＧＡ配列シードターゲットを通じて遺伝子の発現を抑制するという事実をヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）でルシフェラーゼレポータの酵素活性測定を通じて観察した結果を示したものである。
【図１７】図１７ａ〜図１７ｄは、ｍｉＲ−１２２による２番非正規ＧＡ配列シードターゲット、２、３番非正規ＧＡ配列シードターゲット発現の阻害がヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）の移動を阻害する機能をｍｉＲ−１２２−Ｇ２Ｕ、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３，Ｕの発現を通じて細胞形態上の観察で確認した結果を示したものである。
【図１８】図１８ａ〜図１８ｂは、ｍｉＲ−１２２による２、３番非正規ＧＡ配列シードターゲット発現の抑制がヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）の細胞周期停止（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ）を誘導することをｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕの発現を通じてフローサイトメトリー分析で確認した結果を示したものである。
【図１９】図１９ａ〜図１９ｂは、ｍｉＲ−１２２による２、３番非正規ＧＡ配列シードターゲット、２、７番非正規ＧＡ配列シードターゲットの発現阻害がヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）の細胞周期停止（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ）を誘導することをｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，７Ｕの発現を通じてフローサイトメトリー分析で確認した結果を示したものである。
【図２０】図２０ａ〜図２０ｂは、ｌｅｔ−７による２番または２、４番非正規ＧＡ配列シードターゲット発現の阻害がヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）の細胞周期停止（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ）を誘導することと、４番の非正規ＧＡ配列シードターゲット発現の阻害が細胞周期を促進することをｌｅｔ−７ａ−Ｇ２Ｕ、ｌｅｔ−７ａ−Ｇ２，４Ｕ、ｌｅｔ−７−Ｇ４Ｕの発現を通じてフローサイトメトリー分析で確認した結果を示したのである。
【図２１】図２１ａ〜図２１ｃは、ｍｉＲ−３７２またはｍｉＲ−３０２ａによる４番非正規ＧＡ配列シードターゲット発現の阻害を誘導するｍｉＲ−３７２−Ｇ４ＵまたはｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４ＵがｍｉＲ−３７２またはｍｉＲ−３０２ａとともに逆分化を促進させることをＯｃｔ４遺伝子発現レポータで確認した結果を示したものである。
【図２２】図２２ａ〜図２２ｂは、５’末端基準６番目に２’ＯＭｅ変形が当該ＲＮＡ干渉誘導体の非正規核隆起標的を抑制しない現象を確認した結果を示したものである。
【図２３】図２３ａ〜図２３ｂは、５’末端基準６番目に２’ＯＭｅ変形が転写体で全体非正規核隆起標的ｍＲＮＡを抑制しないことを確認した結果を示したものである。
【図２４】図２４ａ〜図２４ｂは、Ａｇｏ  ＨＩＴＳ  ＣＬＩＰ実験を通じて非正規核隆起サイトに結合するマイクロＲＮＡを分析した結果を示したものである。
【図２５】図２５ａ〜図２５ｆは、癌患者マイクロＲＮＡシーケンシングデータベース（ＴＣＧＡ）で配列変異を分析して非正規ＧＡ配列シードターゲットを正規ターゲットと認識するＧ＞Ｕ変異を腫瘍マイクロＲＮＡに同定した結果を示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１５０】
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかしながら、下記の実施例は、本発明の一例に過ぎず、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【０１５１】
［実施例１］マイクロＲＮＡの非正規標的を抑制する干渉誘導核酸の作用機序
本発明者らは、Ａｇｏ  ＨＩＴＳ  ＣＬＩＰ実験を通じて、アルゴノートタンパク質でマイクロＲＮＡが標的体と塩基配列をするとき、マイクロＲＮＡシードと完全相補的配列をする正規シードターゲットの他にも、マイクロＲＮＡシードと完全相補的配列をせずに標的伝令ＲＮＡと結合するという事実をアルゴノートタンパク質に結合したＲＮＡ複合体配列結果（Ａｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ）の分析を通じて確認した。しかも、このような特徴を有するＲＮＡの塩基配列を分析してみた結果、マイクロＲＮＡの６番塩基が標的体に核隆起（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ）を誘導して塩基配列する標的体（マイクロＲＮＡ非正規核隆起ターゲットサイト）と、マイクロＲＮＡシード領域でＧＡ配列（ｗｏｂｂｌｅ）を許容する標的体（マイクロＲＮＡ非正規ＧＡ配列シードターゲットサイト）が自然的に存在することを確認した（図１）。
【０１５２】
図１に示した図式化された例を見ると、ｍｉＲ−１２４は、アルゴノートタンパク質を媒介としてシード塩基配列（５’−ＵＡＡＧＧＣＡＣ−３’）を通じて標的体の塩基配列５’−ＧＵＧＣＣＵＵＡ−３’に対して最小６個の連続した相補的塩基配列をすることになり、このような塩基配列を有する標的体は、マイクロＲＮＡの正規シードターゲットサイト（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｅｅｄ  ｓｉｔｅ）であると報告されたことがある（Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６０（７２５４）：４７９−８６）。
【０１５３】
また、アルゴノートと結合したＲＮＡ複合体のうち、ｍｉＲ−１２４シード塩基配列（５’−ＵＡＡＧＧＣＡＣ−３’）とマイクロＲＮＡ非正規核隆起ターゲットサイト（５’−ＧＵＧＧＣＣＵＵ−３’）でｍｉＲ−１２４の５’末端基準５番目と６番目の間に標的伝令ＲＮＡのＧがバルジ（ｂｕｌｇｅ）で配列されるように相補的塩基配列をした標的を確認し、これを基にマイクロＲＮＡ非正規核隆起ターゲットサイトと相補的に塩基配列が可能なｍｉＲ−１２４のシード塩基配列は、ｍｉＲ−１２４シードの６番と７番の間に６番塩基がもう一度繰り返される塩基配列（５−ＵＡＡＧＧＣＣＡ−３）を有し、これに対して連続的で且つ完ぺきな相補配列は、ｍｉＲ−１２４の非正規核隆起ターゲットを抑制するｍｉＲ−１２４ＢＳ（ＢＳ：Ｂｕｌｇｅ  ｓｉｔｅ）ｓｉＲＮＡとして使用した。
【０１５４】
アルゴノートと結合したＲＮＡ複合体でマイクロＲＮＡと結合した標的伝令ＲＮＡの配列を分析したとき、従来の相補的な塩基配列以外にＧ：Ａワブル（ｗｏｂｂｌｅ）塩基配列がマイクロＲＮＡのシード配列と標的伝令ＲＮＡの結合で起こることを確認した。したがって、ｍｉＲ−１２４の場合、シード塩基配列（５’−ＵＡＡＧＧＣＡＣ−３’）で５’末端基準４番目のＧ塩基がＧ：Ａワブル配列をしてマイクロＲＮＡ非正規ＧＡ配列シードターゲットサイト（５’−ＵＧＧＣＡＵＵ−３’）を認識し、これを基にｍｉＲ−１２４の非正規ＧＡ配列シードターゲットサイトと連続的で且つ完ぺきに相補的な配列でｓｉＲＮＡをデザインしてｍｉＲ−１２４−ＧＵを発明し、このｓｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２４の非正規ＧＡ配列シードターゲットの発現を阻害するｓｉＲＮＡとして使用した。
【０１５５】
［実施例２］非正規核隆起ターゲットサイトと連続的で且つ完ぺきに相補的な塩基配列をシード領域に含むマイクロＲＮＡ−ＢＳの抑制能確認
自然的に存在するｍｉＲ−１２４の正規的なシードターゲットサイト（ｓｅｅｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅ）のうちｍｉＲ−１２４の５’末端基準２番目から７番目までの塩基と相補的なものは、５’−ＧＵＧＣＣＵＵ−３’塩基配列であり、このような正規的なシードターゲットサイトは、ｍｉＲ−１２４のシード（５’−ＵＡＡＧＧＣＡＣ−３’）と最小６個の連続した塩基で完全相補的塩基配列をすることになる（図２ａ）。
【０１５６】
Ａｇｏ  ＨＩＴＳ  ＣＬＩＰ実験を通じて発見したｍｉＲ−１２４の非正規核隆起ターゲットサイト（Ｎｕｃ  ｓｉｔｅ；ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ  ｓｉｔｅ）は、５’−ＧＵＧＧＣＣＵＵ−３’であり、ｍｉＲ−１２４の６番Ｃ塩基がターゲットと核隆起を形成して塩基配列することになり、これによって、ｍｉＲ−１２４の５’末端基準５番目と６番目の間に配列される標的ＲＮＡのＧがバルジ（ｂｕｌｇｅ）で形成される。これを基に非正規核隆起ターゲットサイト（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ  ｓｉｔｅ）と連続的で且つ完全に相補結合する塩基配列（５’−ＵＡＡＧＧＣＣＡ−３’）をマイクロＲＮＡシードとするｓｉＲＮＡをデザインしてｍｉＲ−１２４−ＢＳ  ｓｉＲＮＡと命名した（図２ａ）。ｍｉＲ−１２４−ＢＳは、ｍｉＲ−１２４の非正規標的である核隆起ターゲットサイト（Ｎｕｃ  ｓｉｔｅ）を正規的なシードターゲットと認識して、これを有している非正規的標的の遺伝子発現を特異的で且つより強力に阻害するものと考え、このような事実をルシフェラーゼレポータ実験を通じて確認した（図２ｂ−ｃ）。
【０１５７】
まず、ｍｉＲ−１２４が従来の正規的な標的なシードサイト（ｓｅｅｄ  ｓｉｔｅ）に比べてどれくらい非正規的な標的である核隆起ターゲットサイトを抑制できるかを確認するために、ルシフェラーゼレポータにｍｉＲ−１２４に対する当該サイトを挿入し、これと共に様々な濃度（０、０．０１、０．１、０．５、２．５、１５ｎＭ）のｍｉＲ−１２４を細胞に導入させた後、ルシフェラーゼの活性でＩＣ５０（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ５０）を測定してみた結果、正規シードサイトは、約０．５ｎＭ、非正規核隆起サイトは、約０．２ｎＭであって、類似していることを確認することができた（図２ｂ）。しかしながら、最高に抑制される比率を見ると、正規シードサイトは、約５０％、非正規核隆起サイトは、約８０％であって、非正規核隆起サイトを通した阻害が多少弱いことが分かった。特に遺伝子発現阻害が始まるという点を見たとき、正規シードターゲットは、約０．０１ｎＭ以上で、非正規核隆起ターゲットは、０．１ｎＭ以上の濃度条件で遺伝子抑制が始まるという点をルシフェラーゼ活性測定を通じて確認した（図２ｂ）。したがって、ｍｉＲ−１２４は、正規ターゲットと非正規核隆起ターゲットの発現を調節し、正規ターゲット発現調節効率が高いという点が分かった。
【０１５８】
この際、実施したルシフェラーゼレポータ実験は、該当するｍｉＲ−１２４ターゲットサイト配列をｐｓｉ−ｃｈｅｃｋ２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のレニラルシフェラーゼ遺伝子３’ＵＴＲ（３’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）部分に２回連続配列でクローニングして実施した。非正規隆起サイト配列は、ＭＩＮＫ１の３’ＵＴＲ部分に自然的に存在する非正規核隆起ターゲットサイトを使用した。ｍｉＲ−１２４は、ヒト由来の配列であって、ｍｉＲＢａｓｅデータベースによって、該当するガイド鎖（ｇｕｉｄｅ  ｓｔｒａｎｄ）、パッセンジャー鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）をそれぞれＢｉｏｎｅｅｒ社で化学的に合成製作後、ＨＰＬＣで分離、前記会社で提供した方法によってガイド鎖とパッセンジャー鎖の二重体（ｄｕｐｌｅｘ）で製造した。ｍｉＲ−１２４とルシフェラーゼレポータベクターは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造者のプロトコルによって略１０，０００個の子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ：ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）に伝達（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。ＨｅＬａ細胞は、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改質Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、トランスフェクションを行うときは、抗生剤ない完全培地で細胞を培養した。トランスフェクションを行った２４時間後、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍを用いてメーカーのプロトコルによってルシフェラーゼの活性を測定し、レニラルシフェラーゼ活性の計測は、ｐｒｏｍｅｇａ社のＧｌｏｍａｘ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて最小３回以上の反復実験を行い、ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼの活性により標準化されて計算した。
【０１５９】
ｍｉＲ−１２４の非正規核隆起ターゲットのみを特異的に抑制するために発明したｍｉＲ−１２４−ＢＳの機能を確認するために、同一にルシフェラーゼレポータを使用して実験した。その結果、ｍｉＲ−１２４−ＢＳは、ｍｉＲ−１２４正規シードターゲットに対してどんな濃度（０〜１０ｎＭ）でもルシフェラーゼレポータ酵素の活性を阻害させなかったが、ｍｉＲ−１２４非正規核隆起ターゲットレポータに対しては、０．１ｎＭ以上の濃度でルシフェラーゼレポータ酵素の活性を阻害させる効果を確認することができた（図２ｃ）。この際の遺伝子抑制効率をＩＣ５０で測定してみたとき、非正規核隆起ターゲットに対する抑制が約０．５ｎＭであることが示された。このような点から見て、ｍｉＲ−１２４−ＢＳのｍｉＲ−１２４非正規核隆起ターゲット発現調節機能は、非正規核隆起ターゲットサイト特異的であると解析することができる（図２ｃ）。この際のルシフェラーゼレポータ実験は、ｍｉＲ−１２４−ＢＳを以前と同一にバイオニア社で合成して製作し、当該ルシフェラーゼレポータベクターとともに子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ：ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）にトランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、２４時間後にルシフェラーゼ酵素の活性を測定して行った。
【０１６０】
上記の実施例で発明者は、マイクロＲＮＡの非正規有機標的のみを抑制することができるようにする目的で当該サイト配列に対して連続的で且つ完ぺきに相補的なシード領域配列を含むｍｉＲＮＡ−ＢＳを発明し、その効果を検証するためにｍｉＲ−１２４に適用してルシフェラーゼレポータ実験を通じて確認してみたとき、ｍｉＲ−１２４−ＢＳが正規シード標的の発現は抑制せず、非正規隆起標的の発現は効果的に抑制できるという特徴を検証することができた。
【０１６１】
［実施例３］ｍｉＲ−１２４の非正規核隆起ターゲット発現阻害を通じて誘導される子宮頸癌細胞の細胞死滅現象観察
ｍｉＲ−１２４−ＢＳが、ｍｉＲ−１２４が抑制する様々な標的のうち非正規隆起標的のみを抑制するという事実を以前の実施例で確認した後、これを通してｍｉＲ−１２４の特定機能のみを示すことができるかを確認しようとした。ｍｉＲ−１２４の場合、一般的に神経細胞にのみ特異的に発現するので、主に神経細胞に関連した役割をするものと知られている。しかしながら、腫瘍で発生した膠腫では、ｍｉＲ−１２４の発現が劣っており、これと関係してｍｉＲ−１２４の発現を人為的に腫瘍細胞に誘導する場合、腫瘍細胞の死滅を起こすことができるという事実が観察された。したがって、このようにｍｉＲ−１２４の多様で且つ異なる機能がその標的を認識する種類によって異なるかを確認するために、ｍｉＲ−１２４−ＢＳを子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）に導入し、細胞の死滅をフローサイトメトリー分析で観察した（図３ａ）。
【０１６２】
本実験は、７５ｎＭのｍｉＲ−１２４またはｍｉＲ−１２４−ＢＳ二重体を子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ：ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）にＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して製造者のプロトコルによってトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、７２時間後にトリプシンを処理して細胞を培養皿から引き離し、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社のＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ：ＦＩＴＣ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩを製造社が提供した方法によって細胞を処理してＢＤ  Ａｒｉａ  Ｉ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖではａｐｏｐｔｏｓｉｓを、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）ではｎｅｃｒｏｓｉｓを測定して行った。この際、対照群としては、美しい小さな線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のマイクロＲＮＡであるｃｅｌ−ｍｉＲ−６７の配列と同一に合成して使用した
【０１６３】
このような実験をそれぞれ対照群、ｍｉＲ−１２４発現、ｍｉＲ−１２４−ＢＳ発現に分けて比較してみた結果、ｍｉＲ−１２４が発現した場合、子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）で対照群に比べてａｐｏｐｔｏｓｉｓ（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖで染色された細胞の数）により死滅が進行される比率が、約３０％から約７８％に増加することを観察し、同一にｍｉＲ−１２４−ＢＳも、約７３％であって、２倍以上増加することを確認した（図３ａ）。ｍｉＲ−１２４−ＢＳがｍｉＲ−１２４の正規シードサイトは抑制せず、非正規隆起サイトのみを抑制した以前の実施例２の結果に照らしてみるとき、子宮頸癌の細胞死滅は、非正規核隆起ターゲットの発現抑制によって起こることが分かる。
【０１６４】
ｍｉＲ−１２４は、脳組織特異的マイクロＲＮＡであって、組織細胞特異的転写体発現がない全く異なる細胞では、脳組織特異的機能をしないと報告されたことがある（Ｆａｒｈ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１０（５７５５）１８１７−２１）。したがって、ｍｉＲ−１２４が非正規隆起標的を抑制することで起こす機能を神経細胞で観察するために、ｍｉＲ−１２４−ＢＳを小脳神経幹細胞株であるＣ１７．２に導入した後、細胞分化を細胞形態学的に観察した（図３ｂ、上図）。その結果、ｍｉＲ−１２４を導入した場合には、Ｃ１７．２細胞の神経突起分岐分化が長く作られながら促進されたが、ｍｉＲ−１２４−ＢＳの場合には、分化は観察されたが、分岐が短い形態で相異に観察された。したがって、ｍｉＲ−１２４により起こる一般的な神経突起分岐分化は、正規的なシードサイト標的を抑制することで起こることが分かる。この際、ｍｉＲＮＡの導入は、以前の実施例２と同じ方法で５０ｎＭのｍｉＲＮＡを合成してＲＮＡｉＭａｘ試薬で実行した。
【０１６５】
また、以前のＨｅＬａ細胞でｍｉＲ−１２４−ＢＳが細胞死滅を誘導したので、神経細胞でもこのような機能が現れるかを実施例２で行った方法と同一にＣ１７．２細胞でフローサイトメトリー分析で観察した。その結果、ｍｉＲ−１２４発現の場合には、細胞死滅が起こる比率が、対照群の２１％に比べてほぼ類似した程度である２２．４％であるのに対し、ｍｉＲ−１２４−ＢＳは、３３．４％であって、多少増加することが示された（図３ｂ、中間図）。これは、子宮頸癌細胞で同一に細胞死滅がｍｉＲ−１２４の非正規隆起標的抑制を通じて起こるという点から同じ傾向性を示すが、その増加率は、約２倍で現れる子宮頸癌よりは非常に小さいことが分かった。ｍｉＲ−１２４は、神経幹細胞で分化に関連した役割を主にするが、この際、細胞周期の調節は、重要な役割をすることができる。したがって、ｍｉＲ−１２４とｍｉＲ−１２４−ＢＳをＣ１７．４細胞に導入した後、細胞周期をＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）染色を通じてフローサイトメトリー分析を適用して観察した（図３ｂ、下図）。この際、ｍｉＲ−１２４は、Ｇ０／Ｇ１での細胞周期停止状態（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ）を対照群である６９％に比べて多少増加させた８３％で誘導させることが示された。これに対し、ｍｉＲ−１２４−ＢＳの発現は、細胞周期停止が顕著に起こらないことを観察することができた。この際の実験は、以前の実施例と同一に、当該マイクロＲＮＡをトランスフェクションし、４８時間の間培養後、細胞を引き離してエタノールで固定（ｆｉｘ）、１ｍｇ／ｍｌのｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．２ｍｇ／ｍｌのＲｎａｓｅＡとともに３７℃で３０分間反応させた後、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリー分析を行った。
【０１６６】
上記の実施例での結果を整理すると、ｍｉＲ−１２４−ＢＳによりｍｉＲ−１２４非正規核隆起ターゲット発現を阻害する場合だけでも、ｍｉＲ−１２４と同一に、子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ）の死滅を誘導し、これを通してｍｉＲ−１２４の非正規隆起標的の阻害機能は、癌細胞の死滅であることが分かる。また、神経幹細胞の場合、ｍｉＲ−１２４の発現によって神経突起分岐分化が起こり、若干の細胞死滅と細胞周期停止が起こるが、ｍｉＲ−１２４の非正規隆起標的のみを阻害するｍｉＲ−１２４−ＢＳでは、このような機能が多少異なる形態で現れる。したがって、ｍｉＲ−１２４の神経細胞分化機能は、従来の知られている正規的なシード標的遺伝子の抑制によって主に起こることが分かり、異なる形態としては、非正規隆起ターゲットを通じて起こり得ることを考えることができた。
【０１６７】
［実施例４］ｍｉＲ−１２４−ＢＳがｍｉＲ−１２４非正規核隆起ターゲット発現を阻害することによって、分岐が多く突起が短い異なる形態の神経分化（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｎｅｕｒｉｔｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）誘導機能確認
ｍｉＲ−１２４−ＢＳがｍｉＲ−１２４とは異なる形態の神経分岐突起分化を起こすことを以前の実施例で確認した後、これをより詳しく調べるために、ヒト神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）であるｓｈ−ｓｙ−５ｙ細胞株（ＣＲＬ−２２６６）を使用して実験をした。この際、追加的にｍｉＲ−１２４−ＢＳ以外にｍｉＲ−１２４の非正規核隆起サイトを認識し抑制できるシード配列を同一に有するが、その他の配列は、異なる配列を有しているマイクロＲＮＡ配列をｍｉＲ−１２４と同一にしたｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）を以前の実施例で記述した方法で合成して実験を進めた。この際、使用したｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）の配列は、５’−ＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＡＧ−３’であり、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、美しい小さな線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のマイクロＲＮＡであるｃｅｌ−ｍｉＲ−６７（ＮＴ；ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）の配列と同一に合成して使用した。該当するｍｉＲＮＡを以前の実施例で記述した同じ方法でトランスフェクションし、６０時間の間細胞を培養した後、細胞形態学的変化を光学顕微鏡で観察した（図４ａ）。
【０１６８】
その結果、ｍｉＲ−１２４の発現は、ヒト神経芽細胞腫（Ｓｈ−ｓｙ−５ｙ）の神経突起を長く分化させる形態上の変化を観察することができ、反面、ｍｉＲ−１２４の非正規隆起標的のみを抑制できるシード配列をｍｉＲ−１２４−ＢＳと同一に有しているｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）の場合には、短いが、1つの細胞で多数の神経突起分岐が生じる細胞形態（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｎｅｕｒｉｔｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）が観察された（図４ａ）。これを基に追加でカテコールアミン系神経細胞（ＣＡＤ，ＣＲＬ−１１１７９）でも同じ実験を進めてみた。この際は、当該マイクロＲＮＡをトランスフェクションさせ、５２時間の間細胞を培養した後、観察した（図４ｂ）。その結果、ヒト神経芽細胞腫（Ｓｈ−ｓｙ−５ｙ、ＣＲＬ−２２６６）細胞で示した結果と同一に、ｍｉＲ−１２４は、数字が少ないが、長い突起を形成し、ｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）は、短いが、多くの神経突起分岐が伸長する分化現象を観察することができた。（図４ｂ）。追加的に、ｍｉＲ−１２４とｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）を共に同一割合で細胞内に伝達する場合、長い神経突起を有する細胞と多くの神経突起分岐を形成させた細胞が同時に観察された。これは、発明したｍｉＲ−１２４−ＢＳと従来のｍｉＲ−１２４とともに発現した場合、人為的にさらに複雑な神経ネットワークで示される脳細胞と類似に多様な形態の神経分化を促進させることができる可能性を示す。
【０１６９】
追加的に、このようなマイクロＲＮＡにより促進されるＣＡＤ細胞株の神経分化は、神経細胞特異的なマーカーであるＴｕｊ１に対する免疫染色を通じて確認した（図４ｂ、下図）。この際の実験は、当該マイクロＲＮＡをトランスフェクションした後、５２時間後に、ＣＡＤ細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）後、１次抗体であるＴｕｊ１（ＭＲＢ−４３５Ｐ、Ｃｏｖａｎｃｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を１：１０００の割合で、Ａｌｅｘａ  ５９４蛍光３物質が結合された２次抗体（Ａｂｃａｍ：ａｂ１５００７６）は、１：１０００の割合で抗体染色（ｉｍｍｕｎｅ−ｓｔａｉｎｉｎｇ）した後、ＤＡＰＩで核を染色して行った。
【０１７０】
上記の実施例の結果から見て、ｍｉＲ−１２４は、非正規核隆起標的のみを抑制することによって、従来のｍｉＲ−１２４の機能とは異なる形態である短いが多くの神経突起分岐を形成させる機能を有していることが分かる。特にｍｉＲ−１２４−ＢＳとは配列が異なるが、同一にシード領域の配列を有していて、非正規核隆起標的のみを抑制できるｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）を使用してこのような事実を観察し、これは、非正規核隆起標的を認識できるシード配列を含んでいるＲＮＡ干渉誘導体は、ｍｉＲ−１２４−ＢＳと同じ効果を示すという事実を明らかにする。また、ｍｉＲ−１２４−ＢＳにより生成される複雑な神経突起分岐は、複雑な神経ネットワークを示すヒト脳細胞と類似に多様な形態の神経分化を促進させることができる方法として活用され得ることを示す。
【０１７１】
［実施例５］ｍｉＲ−１２４−ＢＳをｓｉＲＮＡとｓｈＲＮＡベクターで発現させた後、これによって誘導される神経突起分化（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｎｅｕｒｉｔｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）の形態および分子生物学的特徴確認
ｍｉＲ−１２４−ＢＳの発現で誘導される特異的な神経突起分化現象をラット神経芽細胞腫であるＮ２ａ（ＣＣＬ−１３１）で追加的に確認するために、実施例４と同一にｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）を細胞に導入した後、７２時間の間培養しながら細胞の形態変化を観察した（図５ａ）。また、同時にｍｉＲ−１２４のシード配列を同一に有しているが、その他の部分は、異なる配列を有するｍｉＲ−１２４（３７１４）も、５’−ＧＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧＵＧＣＵＣＣＣＣＵＧＵ−３’配列で合成してｓｉＲＮＡ形態で二重体を形成させた後、細胞に導入して実験した。この際、対照群としては、美しい小さな線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のマイクロＲＮＡであるｃｅｌ−ｍｉＲ−６７（ＮＴ；ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）の配列と同一に合成して使用した。
【０１７２】
その結果、ｍｉＲ−１２４が伝達された実験群では、カテコールアミン系神経細胞であるＣＡＤで見られたのと類似した長い神経突起を有する神経細胞を観察することができ、ｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）をトランスフェクションした細胞では、多様な方向に分岐を形成した短い神経突起を有する細胞形態上の特徴を確認することができた（図５ａ、上）。また、ｍｉＲ−１２４（３７１４）をトランスフェクションした実験群では、ｍｉＲ−１２４と同一に比較的長い細胞突起を示す細胞を多く観察することができた（図５ａ、上）。このような細胞形態上の変化は、分化した神経細胞で発現する当該タンパク質に対する抗体、Ｔｕｊ１（Ｃｏｖａｎｃｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＭＲＢ−４３５Ｐ）、ｖＧＬＵＴ１（ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｓ社、１３５−３０３）、ＭＡＰ２（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＡＢ３４１８）を使用してその発現量が増加したことを免疫ブロット実験（ｉｍｍｕｎｏ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を通じて４つの対照群タンパク質（ＡＣＴ−Ｂ、ＴＵＢ−Ａ、ＧＡＰＤＨ、Ｈ３Ｂ）の発現に対比して確認することができた（図５ａ、下）。これを通してｍｉＲ−１２４と類似しているが、異なる形態を示すｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）による神経分化は、形態学的には多少異なっているが、遺伝子発現マーカー上、同一に分化を誘導したことを確認することができ、ｍｉＲ−１２４と同じシード配列を有していて、同一に主に正規的シード標的を抑制するものと認められるｍｉＲ−１２４（３７１４）は、予想通りｍｉＲ−１２４のように神経細胞の分岐が長く分化する特徴を示すという点が分かった。また、ｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）、ｍｉＲ−１２４（３７１４）が発現した場合、いずれも、分化した神経細胞で見られるタンパク質発現量が増加したところ、これらは、いずれも、分化した形態の神経細胞の分子的特徴を有していることを確認することができた。
【０１７３】
以上の実施例でのマイクロＲＮＡの発現は、合成された二重体を細胞に導入して実施したが、マイクロＲＮＡの発現は、これを生成させることができるヘアピン形態のＲＮＡであるｓｈＲＮＡ形態を発現させるベクターを導入しても可能である。したがって、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡで発現させるベクターであるｐＣＡＧ−ｍｉＲ３０プラスミド（ａｄｄｇｅｎｅ  ＃１４７５８）を使用してｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）、ｍｉＲ−１２４（３７１４）をｓｈＲＮＡ形態で発現させるベクターを製作した。この際、使用したｐＣＡＧ−ｍｉＲ３０ベクターは、マイクロＲＮＡを強く発現させるためにＣＡＧプロモーターを使用し、マイクロＲＮＡ−３０のバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を発現させるようにデザインされて、マイクロＲＮＡ発現を最大化させる長所を有している（Ｐａｄｄｉｓｏｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ，２００４，１（２）：１６３−７）。
【０１７４】
それぞれｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）、ｍｉＲ−１２４（３７１４）を発現させるように作られたｐＣＡＧベクターは、何も発現しないｐＣＡＧベクターを対照群として使用して、Ｎ２ａ細胞に導入され、その後、細胞形態を観察した（図５ｂ）。神経芽細胞腫であるＮ２ａに導入されたヘアピン構造の実験群は、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）、ｍｉＲ−１２４（３７１４）二重体が見られる細胞形態上の変化と類似した変化を示した。トランスフェクション後、７２時間培養時、ｍｉＲ−１２４とｍｉＲ−１２４（３７１４）が発現した実験群では、長い神経突起を有する神経芽細胞腫を観察することができた。これに対し、ｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）が発現した実験群では、短くて多様な方向に伸長した神経突起を有する神経細胞腫を観察することができた（図５ｂ、上）。このような細胞形態の変化は、分化した神経細胞で発現するタンパク質であるＴｕｊ１（Ｏ．ｖｏｎ  Ｂｏｈｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２９，３，４０９−２０）の発現や、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ（ＳＹＰ）の発現が増加したことが確認され（図５ｂ、下）、したがって、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）、ｍｉＲ−１２４（３７１４）ヘアピンベクターが導入された細胞が対照群に比べて分化した形態の神経細胞の特徴を有することを確認することができた。ＴＵＪ１の増加は、以前の実施例と同じ方法で免疫ブロット実験で観察し、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎは、ｑＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）実験を通じて以前の論文（Ｓ．Ｅ．Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｎｅｕｒｏｎ  ７０，８４７−５４）で記述されたｐｒｉｍｅｒ配列を使用して進めた。この際の実験は、当該ベクターをＮ２ａ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を当該会社のプロトコルによって使用して行ってトランスフェクションした後、２４時間後にトータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）で抽出し、当該プロトコルによってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で逆転写し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でｑＰＣＲを行って、当該プライマーでＳＹＰの伝令ＲＮＡの量を測定し、ＧＡＰＤＨ伝令ＲＮＡ値で標準化した。
【０１７５】
上記の実施例の結果から推察するとき、マイクロＲＮＡの導入をｓｈＲＮＡ形態で発現するようにするベクターを使用しても、ｍｉＲ−１２４のシード部分の配列のみを同一に有する場合（ｍｉＲ−１２４（３７１４））、ｍｉＲ−１２４と同一に正規的な標的遺伝子の発現抑制を通じて一般的に長い神経突起分化を起こすことが分かる。また、ｍｉＲ−１２４の非正規隆起標的も、ｓｈＲＮＡ形態でシード部分のみがｍｉＲ−１２４−ＢＳと同一に発現（ｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３））されると、分岐がさらに多い神経突起分化を起こすことができる。このようにｍｉＲ−１２４による正規標的抑制と非正規隆起標的抑制が両方とも神経細胞の神経突起分化形態の分子的な遺伝子マーカー発現を示し、これを通して全部神経細胞に分化したことを確認することができた。
【０１７６】
［実施例６］ｍｉＲ−１２４−ＢＳがＭＡＰＲＥ１の発現調節を通じてマウス神経芽細胞腫（Ｎ２ａ）の神経突起分化誘導確認
追加的にｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）、ｍｉＲ−１２４（３７１４）の神経芽細胞腫（Ｎ２ａ）で神経突起分化誘導を細胞形態学上で観察し、これを定量的に分析してみた（図６ａ）。定量分析時、それぞれの神経細胞に由来した神経分岐を区分するために緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現させるｐＵｌｔｒａ（ａｄｄｇｅｎｅ  ＃２４１２９）プラスミドと当該マイクロＲＮＡ発現ベクターを以前の実施例での方法と同一にトランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、７２時間の間細胞培養を進めながら、神経突起を蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社）で観察して神経突起分岐の数を測定し、細胞当たり生成された神経突起の長さをイメージＪプログラムを通じて分析した。
【０１７７】
その結果、１００個の細胞に対して、細胞当たり発現した神経突起分岐の数（ｎｅｕｒｉｔｅ  ｂｒａｎｃｈ）が対照群に比べてｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）、ｍｉＲ−１２４（３７１４）では約３〜５倍増加したことを確認した（図６ａ、下左側）。しかしながら、ｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）が発現した場合には、ｍｉＲ−１２４やｍｉＲ−１２４（３７１４）が発現した場合に比べて有意的にさらに多くの分岐が形成されることが観察された。また、細胞当たり生成された神経突起の長さも、対照群に比べてｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）、ｍｉＲ−１２４（３７１４）実験群で４〜６倍に増加したことを確認することができ、より詳しくは、ｍｉＲ−１２４またはｍｉＲ−１２４（３７１４）が発現した場合には、ｍｉＲ−１２４−ＢＳ（４７５３）が発現したときよりさらに長い神経突起分岐が形成されることを観察することができた（図６ａ、右下側）。これは、以前の実施例（図４、図５、図６）で細胞形態学的に観察したのと同じ結果である。
【０１７８】
ｍｉＲ−１２４−ＢＳにより起こる特異的な神経分化現象がいかなる遺伝子の非正規隆起サイトにより起こるかを調べるために、神経分化に関連した遺伝子の３’ＵＴＲ部分に配列でｍｉＲ−１２４の非正規隆起標的配列を探してみた。その結果、神経細胞の分化を調節すると報告されたＭＡＰＲＥ１（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＲＰ／ＥＢ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １：Ｅｌｅｎａ  Ｔｏｒｔｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  ＥＭＢＯ  ３２，１２９３−１３０６）遺伝子を探すことになった。ＭＡＰＲＥ１は、神経突起を生成させるとき、これを構成するマイクロチューブル（ｍｉｃｏｒｏｔｕｂｕｌｅ）の端部につくタンパク質であって、当該マイクロチューブルの形成調節を通じて神経突起の形態を決めることができる。したがって、このＭＡＰＲＥ１遺伝子がｍｉＲ−１２４の非正規隆起標的と認識されてその発現が阻害されるかを確認するために、Ｎ２ａ細胞にｍｉＲ−１２４−ＢＳを導入した後、ＭＡＰＲＥ１の伝令ＲＮＡの量を実施例５ｂで行った方法によってｑＰＣＲ実験を実施して測定してみた（図６ｂ）。2つの異なるプライマーをもってｑＰＣＲを施行してみたとき、２つの結果がいずれも対照群に比較してｍｉＲ−１２４−ＢＳ導入された実験群では７０〜４０％水準にＭＡＰＲＥ１発現が減少することを確認することができた。これを通してＭＡＰＲＥ１がｍｉＲ−１２４の非正規隆起サイトでその発現が抑制されることを確認することができた。
【０１７９】
ＭＡＰＲＥ１がｍｉＲ−１２４の非正規隆起標的であり、非常に重要なターゲットであれば、ｍｉＲ−１２４−ＢＳの非正規隆起標的抑制によって現れる神経分化形態がＭＡＰＲＥ−１の発現減少によってさらに促進されなければならない。したがって、このような点を確認するためにＭＡＰＲＥ１を阻害できるｓｉＲＮＡを２つ製作し、これと共にｍｉＲ−１２４を共にＮ２ａ細胞にトランスフェクションし、細胞形態学上の変化を示すかを確認する実験を行った（図６ｃ）。その結果、ｍｉＲ−１２４のみを発現させた対照群に比べて、ｍｉＲ−１２４とＭＡＰＲＥ１に対するｓｉＲＮＡを共に発現させた実験群で神経突起分岐が多く増加したことを観察することができ、これは、二種類の異なる配列のＭＡＰＲＥ１  ｓｉＲＮＡを使用した実験でも同一に観察した（図６ｃ）。この際の実験は、以前の実施例で使用した方法と同一にＲＮＡを細胞に導入したら、その後、４８時間の間細胞培養しながら形態を観察した。
【０１８０】
これを通してｍｉＲ−１２４−ＢＳが誘導する短くて分岐が多い神経突起分化は、少なくとも部分的にはＭＡＰＲＥ１遺伝子の発現をｍｉＲ−１２４の非正規隆起標的サイトを通じて抑制して現れることができる生物学的機能であることを確認した。
【０１８１】
［実施例７］転写体水準でｍｉＲ−１２４−ＢＳの細胞導入時にｍｉＲ−１２４の非正規隆起標的遺伝子の阻害傾向性分析
マウス神経芽細胞腫（Ｎ２ａ）でｍｉＲ−１２４−ＢＳを通じて抑制された遺伝子は、究極的に神経芽細胞腫の神経突起分岐を多く生成させる神経細胞分化を誘導することを確認した（図５）。このような現象は、ｍｉＲ−１２４−ＢＳのシード配列がｍｉＲ−１２４の非正規隆起標的を認識し抑制する機序によって現れるものと考えられ、そのような可能性を標的遺伝子で捜し出したＭＡＰＲＥ１で確認した（図６）。しかしながら、実際には、数百個のｍｉＲ−１２４非正規隆起標的遺伝子が抑制されて起こる現象であろう。
【０１８２】
本発明者らが発明したｍｉＲ−１２４−ＢＳが実際にすべての遺伝子が発現している転写体水準でｍｉＲ−１２４の非正規隆起標的遺伝子のみを確認するために、ｍｉＲ−１２４とｍｉＲ−１２４−ＢＳをＮ２ａ細胞に導入した後に、ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析を施行した。この際の対照群としては、ｍｉＲ−１２４と同じ塩基配列や５’末端基準６番が非塩基（ｐｉ）である二重体（ｍｉＲ−１２４−６ｐｉ）を使用したら、このような変形は、ｍｉＲＮＡの５’末端基準６番目に塩基がないので、標的伝令ＲＮＡと全く配列しないと報告された（（Ｌｅｅ  ＨＳ  ｅｔ．Ａｌ．２０１５，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．６：１０１５４）。
【０１８３】
ＲＮＡ−Ｓｅｑ実験は、実験対照群として美しい小さな線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のマイクロＲＮＡであるｃｅｌ−ｍｉＲ−６７の配列で５’末端基準６番を非塩基に変換したもの（ＮＴ−６ｐｉ）を使用してＮ２ａ細胞にｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４−ＢＳ、ｍｉＲ−１２４−６ｐｉ二重体を７５ｎＭ濃度でそれぞれ伝達させ、２４時間培養後、全体ＲＮＡをＲＮＡｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）キットで抽出した後、Ｏｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓでライブラリーを製作し、次世代配列分析（Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。その後、前記実験で得られた配列データであるＦＡＳＴＡＱファイルをＴｏｐＨａｔ２プログラムでマウス誘電体配列（ｍｍ９）にマッピングし、Ｃｕｆｆｌｉｎｋ、Ｃｕｆｆｄｉｆｆプログラムで発現値（ＦＰＫＭ）を求めて、対照群ＮＴ−６ｐｉを導入したマウス神経芽細胞腫（Ｎ２ａ）細胞での結果で標準化して、ログ比（Ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ，ｌｏｇ２  ｒａｔｉｏ）で示して分析を実施した。
【０１８４】
マイクロＲＮＡの標的サイトを有している遺伝子の伝令ＲＮＡの量が当該マイクロＲＮＡの発現で阻害されるかをＲＮＡ−Ｓｅｑ結果で分析するために、ｍｉＲ−１２４の正規シードサイト（５’末端基準２番目から８番目までと塩基配列する７ｍｅｒ）を３’ＵＴＲに有しており、当該サイトの配列が複数種で保存されたものを選択するために、ｐｈａｓｔＣｏｎｓ点数が０．９以上である遺伝子を選別し、このようなプロファイル結果を当該マイクロＲＮＡの発現に依存的に阻害される順に累積比率（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）で比較分析した。また、同じ方法でｍｉＲ−１２４の非正規隆起サイト（ｎｕｃ、７ｍｅｒ）も同定して、当該遺伝子の抑制比率を同一に累積比率で分析した。この際、ｍｉＲ−１２４の非正規隆起サイトを有している遺伝子が同時に正規シードサイトを有していて、その抑制効果に対する判断が難しいことがあるので、全体伝令ＲＮＡにｍｉＲ−１２４の正規シード配列がない場合（ｎｕｃ  ｏｎｌｙ）と反対に、正規シードサイトのみがあり、非正規隆起サイトはない場合（ｓｅｅｄ  ｏｎｌｙ）も分析した。
【０１８５】
ｍｉＲ−１２４発現した実験群のＲＮＡ−Ｓｅｑ配列分析でｍｉＲ−１２４発現による比率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を累積比率（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）によって分析したとき、ｍｉＲ−１２４の保存された正規シードサイトを３’ＵＴＲに有している遺伝子（ｍｉＲ−１２４  ｓｅｅｄ）や当該サイトのみを有している遺伝子（ｍｉＲ−１２４  ｓｅｅｄ  ｏｎｌｙ）は、全体遺伝子（Ｔｏｔａｌ  ｍＲＮＡ）に分布に比べて非常に多く抑制される現象を確認し（図７ａ、上）、これに対し、ｍｉＲ−１２４の非正規隆起サイトを有している遺伝子は、有意に抑制され、非常に弱く阻害されることを観察することができた（図７ａ、下）。しかしながら、このような抑制現象は、対照群であるｍｉＲ−１２４−６ｐｉを導入した細胞では観察されなかった（図７ｂ）。
【０１８６】
本発明者が開発したｍｉＲ−１２４−ＢＳを発現させた場合では、ＲＮＡ−Ｓｅｑ配列分析でｍｉＲ−１２４−ＢＳ発現による比率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を累積比率（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）によって分析したとき、ｍｉＲ−１２４の保存された正規シードサイトを３’ＵＴＲに有している遺伝子（ｍｉＲ−１２４  ｓｅｅｄ）では、若干の阻害効果を示したが、ｍｉＲ−１２４の非正規隆起サイトはなく、当該正規シードサイトのみを有している遺伝子（ｍｉＲ−１２４  ｓｅｅｄ  ｏｎｌｙ）では、全く変化がないことを確認した（図７ｃ、上）。しかしながら、ｍｉＲ−１２４の非正規隆起標的を有している遺伝子の場合（ｍｉＲ−１２４  ｎｕｃ）や当該標的のみを有している遺伝子の場合（ｍｉＲ−１２４  ｎｕｃ  ｏｎｌｙ）、両方とも強くて且つ有効に遺伝子抑制現象が起こることが分かった（図７ｃ、下）。図７ｃでｍｉＲ−１２４−ＢＳが発現した場合、ｍｉＲ−１２４の正規シードサイトのみを（ｍｉＲ−１２４  ｓｅｅｄ  ｏｎｌｙ）有している遺伝子は、阻害が起こらないことから見てｍｉＲ−１２４の正規シードサイトを全く抑制しないと結論を下すことができるが、ｍｉＲ−１２４−ＢＳが多少ｍｉＲ−１２４のシードサイト標的を阻害したことは、ｍｉＲ−１２４の正規サイトがある場合には、おそらくｍｉＲ−１２４の非正規隆起サイトが共に存在して抑制効果を少しでも示すものと推察される。
【０１８７】
上記の実施例の結果から推察するとき、転写体水準でｍｉＲＮＡは、従来の正規シード標的遺伝子の抑制を非常に強くて且つ効率的に抑制するが、非正規隆起標的は、非常に弱く阻害することが分かり、ｍｉＲＮＡ−ＢＳは、転写体水準でｍｉＲＮＡの非正規隆起標的の発現を抑制するが、従来の正規シード配列は抑制しないことを確認することができた。
【０１８８】
［実施例８］ｍｉＲ−１２２−ＢＳがヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）で誘導する細胞周期停止状態（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ）のフローサイトメトリー分析を通した確認
ｍｉＲ−１２４の非正規核隆起標的によるｍｉＲ−１２４の神経細胞分化誘導を観察した結果を基に他のマイクロＲＮＡの非正規核隆起標的の生物学的機能に対する実験を行った。ｍｉＲ−１２２は、シード塩基配列として５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＧＵ−３’を有し、これの非正規核隆起ターゲットサイトと塩基配列するｓｉＲＮＡの塩基配列であるｍｉＲ−１２２−ＢＳは、６番Ｕがもう一度繰り返される形態であり得、この場合には、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  Ｕ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ−３’配列を５’末端に有して１９個の塩基で構成され、２０番目と２１番目の塩基としては、ｄｔ（Ｄｅｏｘｙ  Ｔｈｙｍｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）からなる。特に二重体構造では、当該ｄｔ部分が３’末端に２個のヌクレオチド突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を構成することができるようにガイドとパッセンジャー鎖の二重体で構成した。この際、パッセンジャー鎖は、ガイド鎖と完全相補塩基結合をし、５’末端基準１番目と２番目の両方を２’ＯＭｅで変形し、塩基配列の端部にｄｔを２個含むように構成した（図８ａ）。ｍｉＲ−１２２−ＢＳのガイド鎖とパッセンジャー鎖は、バイオニア社で化学的に合成し、ＨＰＬＣで分離し、前記会社で提供した方法によってガイド鎖とパッセンジャー鎖の二重体（ｄｕｐｌｅｘ）で製造した。
【０１８９】
このように製造したｍｉＲ−１２２−ＢＳ（図８ａ）をヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）に導入し、以後、細胞周期の変化をフローサイトメトリー分析を通じて観察した。この際の実験は、対照群であるＮＴ−６ｐｉ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２２−ＢＳの二重体を５０ｎＭの濃度でＨｅｐＧ２にＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬を用いて、細胞に伝達（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間培養後、ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）を１００ｎｇ／ｍｌで１６時間の間処理してＧ２／Ｍ（分裂準備期／分裂期）に細胞を同期化（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ）した後、ＭｕｓｅＴＭ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｋｉｔ（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＭＣＨ１００１０６、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて、会社が提供する実験方法によってＭｕｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）で細胞周期を分析した。
【０１９０】
その結果、ＮＴ−６ｐｉが伝達された対照群の細胞周期分析と比較して、ｍｉＲ−１２２−ＢＳ実験群は、Ｇ０／Ｇ１期の細胞が１０．７％から２４．３％に約２倍程度増加し、肝癌細胞であるＨｅｐＧ２の細胞周期停止が増加することを確認することができた（図８ｂ−ｃ）。このようなＧ０／Ｇ１期の細胞増加は、ｍｉＲ−１２２が伝達された細胞では観察されなかった。次に、ｍｉＲ−１２２−ＢＳが伝達されたヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）のＧ２／Ｍ期細胞分布は、対照群と比較時に８３．４％から６７．３％に減少し、このような結果は、ｍｉＲ−１２２が伝達された細胞では観察されなかった（図８ｂ、ｃ）。
【０１９１】
これを通してｍｉＲ−１２２−ＢＳは、ｍｉＲ−１２２の非正規核隆起標的発現の調節を通じて、ヒト肝癌細胞株で細胞周期停止を誘導する生物学的機能を示し、これは、ｍｉＲ−１２２が作用する生物学的機能とは全く異なる機能であることを観察することができた。
【０１９２】
［実施例９］ｍｉＲ−１−ＢＳが骨格筋肉細胞（Ｃ２Ｃ１２）で誘導する筋肉線維化機能および、ｍｉＲ−１５５−ＢＳが細胞死滅機能確認
ｍｉＲＮＡ−ＢＳがｍｉＲＮＡの正規シード標的の発現を抑制して現れる機能とは異なる新しい生物学的機能を観察したので、このような機能が筋肉細胞でどのように現れるかを観察するために、筋肉細胞で発現して重要な機能をするｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１５５にｍｉＲＮＡ−ＢＳを適用してみた。
【０１９３】
まず、ｍｉＲ−１は、筋組織特異的マイクロＲＮＡであって、筋細胞分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）に機能すると報告されているので（Ｃｈｅｎ  Ｊ  ｅｔ．ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００６，３８（２）：２２８−２３３），ｍｉＲ−１−ＢＳを骨格筋肉細胞株であるＣ２Ｃ１２に発現させた後、細胞形態学的変化（図９ａ）と分化時に発現する遺伝子マーカーの発現有無（図９ｂ）を調査した。この際、ｍｉＲ−１−ＢＳを以前の実施例で使用した同じ方法で合成し、細胞にトランスフェクションし、４８時間の間細胞培養時に１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１００  Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改質Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、これは、増殖培養条件（ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；ＧＭ）状態（図９ａ、上）とこのように成長させた後、ＦＢＳを除去した欠乏培養条件（ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；ＤＭ）で４８時間さらに培養した状態（図９ａ、下）に分けて観察した。以後、細胞は、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａ−ｆｏｒｍ  ａｌｄｅｈｙｄｅ：ＰＦＡ）を処理して細胞を固定し、分化した筋肉細胞に発現するｍｙｏｓｉｎ  ２  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎタンパク質を１次抗体（ＭＦ２０：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｂａｎｋ  ）で反応させた後、Ａｌｅｘａ  ４８８蛍光物質がついたマウス２次抗体（ａｂ１５０１０５）で染色して、細胞形態および分化を観察した（図９ａ）。
【０１９４】
その結果、ラット骨格筋肉細胞（Ｃ２Ｃ１２）は、増殖培養条件（ＧＭ）ではｍｉＲ−１−ＢＳが発現したとき、対照群であるＮＴやｍｉＲ−１二重体が伝達された細胞に比べてさらに多い数の分化した筋細胞をＭＦ２０染色結果で確認することができた。培養時に血清を減少させる欠乏培養条件（ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；ＤＭ）では、筋線維（ｍｕｓｃｌｅ  ｆｉｂｅｒ）への分化が進行されることを全部観察したが、ｍｉＲ−１−ＢＳが対照群であるＮＴを発現させた骨格筋肉細胞でさらに太い形態を観察することができた（図９ａ）。これは、ｍｉＲ−１−ＢＳが増殖培養条件でさらに速く筋細胞分化を誘導して生じた結果であり得る。このような筋肉細胞の分化は、分化時に発現が増加する遺伝子の発現量をマーカーで分子的に確認することがきるが、これによって、ｓｋ−ａｃｔｉｎとＭｙｏｇｅｎｉｎ発現量を当該伝令ＲＮＡに特異的なプライマーでＲＴ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）−ＰＣＲを行って、分化時にも発現量に差異がないｂ−ａｃｔｉｎの伝令ＲＮＡの量と比較して検出してみた（図９ｂ）。その結果、ｍｉＲ−１（１）とｍｉＲ−１−ＢＳ（１ＢＳ）が全部発現時にｓｋ−ａｃｔｉｎとＭｙｏｇｅｎｉｎの転写量が増加することを確認することができ、Ｍｙｏｇｅｎｉｎの場合、その量がｍｉＲ−１−ＢＳによりｍｉＲ−１よりさらに多く増加することを観察することができた。
【０１９５】
ｍｉＲ−１５５は、筋細胞分化を抑制するマイクロＲＮＡ（Ｓｅｏｋ  Ｈ  ｅｔ．Ａｌ，ＪＢＣ，２８６（４１）：３５３３９−４６  ２０１１）であって、上記でｍｉＲ−１に対して実施した同じ方法でｍｉＲ−１５５−ＢＳの効果を骨格筋肉細胞（Ｃ２Ｃ１２）の分化を通じて観察した（図９ｃ）。その結果、対照群であるＮＴ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１５５−ＢＳを発現させた後、増殖培養条件（ＧＭ）では細胞の特別な形態学的差異を観察しなかったが、筋細胞の分化を誘導する欠乏培養条件（ＤＭ）では対照群は分化し、ｍｉＲ−１５５が発現する場合には抑制されるが、ｍｉＲ−１５５−ＢＳを導入した場合には、分化がかえってなくなることをｍｙｏｓｉｎ  ２  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎタンパク質を通した免疫染色（ｉｍｍｕｎｅ−ｓｔａｉｎｉｎｇ）実験を通じて確認した（図９ｃ）。特に、ｍｉＲ−１５５−ＢＳを発現したＣ２Ｃ１２細胞を詳しく調べたとき、ｍｉＲ−１５５−ＢＳが細胞の死滅を誘導したことが観察された。これに対し、ｍｉＲ−１５５が伝達された筋細胞では、細胞死滅は全く観察されなかった（図９ｃ、下）。これをさらに詳しく調べるために、当該マイクロＲＮＡが発現したＣ２Ｃ１２細胞を４８時間の間増殖培養条件で成長させた後に、実施例３での方法と同じフローサイトメトリー分析を適用して細胞死滅を調べた（図９ｄ）。その結果、ｍｉＲ−１５５−ＢＳが伝達された実験群は、対照群に比べて約１．５〜２．５倍以上細胞死滅が増加したことが確認された（図９ｄ、ｅ）。
【０１９６】
上記の実施例を通じて、ｍｉＲ−１−ＢＳは、骨格筋肉細胞の分化を促進して太い筋線維分化を誘導し、ｍｉＲ−１５５−ＢＳは、骨格筋肉細胞の死滅を誘導し、このような機能は、従来の筋肉細胞を収縮させるｍｉＲ−１の機能と筋肉細胞分化を抑制するｍｉＲ−１５５の機能とは異なることを確認することができた。
【０１９７】
［実施例１０］Ａｇｏ  ＨＩＴＳ  ＣＬＩＰ分析でワブル（ｗｏｂｂｌｅ）塩基配列をマイクロＲＮＡのシード位置で許容する非正規標的サイトの発見
マイクロＲＮＡの標的を転写体水準で分析できる方法としては、Ａｇｏ  ＨＩＴＳ  ＣＬＩＰという実験方法が開発されて広く使用されている（Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６０（７２５４）：４７９−８６）。Ａｇｏ  ＨＩＴＳ  ＣＬＩＰ実験は、細胞や組織サンプルにＵＶを照射して細胞内でＲＮＡとアルゴノートタンパク質の間に共有結合を誘導し、このように生成されたＲＮＡ−アルゴノート複合体をアルゴノートを特異的に認識する抗体を用いて免疫沈降法で分離した後、分離したＲＮＡを次世代塩基配列（Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で分析する方法である。このように得られた塩基配列データは、生物情報学的分析を通じてマイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡを同定することができるだけでなく、その結合位置と配列も正確に分析することができる（Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６０（７２５４）：４７９−８６）。Ａｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰは、最初にラットの大脳皮質組織に適用されて脳組織でのマイクロＲＮＡの標的に対する地図を作成し、その後、今まで様々な組織に当該方法が適用された。このような様々なＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ分析を通じて様々な組織でのマイクロＲＮＡ結合位置が明らかにされ、特にこのような標的配列でマイクロＲＮＡのシード結合とは類似しているが、標的ｍＲＮＡの配列で異なる形態の非正規的結合標的が多く存在することを知ることになった（Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２  Ｆｅｂ  １２；１９（３）：３２１−７）。
【０１９８】
明らかにされた非正規的結合法則のうち一部は、従来の知られた塩基配列以外にＧ：Ｕ塩基配列を通したワブル（ｗｏｂｂｌｅ）で存在することが観察された。ワブル塩基配列は、従来の塩基配列とは異なって、特定ＲＮＡで発見され、よく知られたＧ：Ｕワブルは、マイクロＲＮＡの非正規標的でも配列できることが提示された。しかしながら、これに比べてその結合が弱く、頻繁に観察されず、特にＧ：Ａワブルの場合は、特定ＲＮＡで塩基配列を形成できるが、その他には全く調査されなかった。しかしながら、マイクロＲＮＡのシード配列のような場合には、塩基配列の自由エネルギー（ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ）が構造的にアルゴノートタンパク質により安定化されるので、一般的に弱いＧ：Ａ塩基配列が相対的に重要になり得、本発明者らは、このような事実に注目して次のような分析を進めた。
【０１９９】
まず、Ｇ：Ａを含むワブル塩基配列がヒトの脳組織でのマイクロＲＮＡ標的に存在するかを確認するために、死後脳組織の灰白質（ｇｒａｙ  ｍａｔｔｅｒ）にＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰを行ったデータ（Ｂｏｕｄｒｅａｕ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｕｒｏｎ、Ｖｏｌ．８１（２），２０１４，２９４−３０５）を分析した（図１０ａ）。この際の分析は、Ａｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰを開発（Ｎａｔｕｒｅ、２００９、４６０（７２５４）：４７９−８６）したときの方法によってアルゴノート−マイクロＲＮＡとともに結合したＲＮＡ配列をシーケンシングされたＦＡＳＴＱファイルでＢｏｗｔｉｅ２プログラムでヒト遺伝体配列に配列して行った。また、同時に当該シーケンシング結果をヒトマイクロＲＮＡ配列に配列して、当該脳組織でアルゴノートタンパク質と頻繋に結合している２０種類のマイクロＲＮＡ（ｔｏｐ２０  ｍｉＲＮＡ：図１０ｂ）も分析した。最終的には、このように把握したｔｏｐ２０  ｍｉＲＮＡに対して当該シード（ｓｅｅｄ）配列である５’末端から２番目から８番目までに対して相補的な配列を有する正規標的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ）サイトを調べた（図１０ｂ）。この際、マイクロＲＮＡ結合位置に、相当に多い数の正規シード標的サイトが発見されることを観察した（図３ｂ、メディアン値１２９２．５サイト、誤差範囲＋／−７０６．６２）。その後、このようなマイクロＲＮＡのシード塩基配列でＧ：ＵまたはＧ：Ａワブル塩基配列で結合できる非正規的標的サイトが存在するかをＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰデータで調べた。この際、分析に対する対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）としてマイクロＲＮＡシード（ｓｅｅｄ）塩基配列と同じ塩基配列によって塩基の相補的配列が不可能な標的配列を使用して分析した。
【０２００】
分析結果、Ｇ：Ａワブルが許容された標的（中央値１１１９．５サイト、誤差範囲＋／−５２６．４８）とＧ：Ｕワブルが許容された標的（中央値９９５サイト、誤差範囲＋／−５２３．２２）サイトが全部対照群（中央値８９１サイト、誤差範囲＋／−４１０．７１）に比べて高い分布を示し、特にＧ：Ａワブルが存在するマイクロＲＮＡ標的サイトは、Ｇ：Ｕワブルより約１．１倍さらに多く存在することを示した（図１０ｂ）。脳組織で特異的に発現するｍｉＲ−１２４は、シード部分に２個のＧを５’末端から４番目と５番目に有していて、これを通じたＧ：Ｕ，Ｇ：Ａワブル塩基配列をすることができる（図１０ｃ）。したがって、このような特定位置のＧによるＧ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル塩基配列を区別して分析してみた結果（図１０ｄ）、ｍｉＲ−１２４の正規シード標的サイト（ｓｅｅｄ）が最も多く発見された（１，９９２個）。しかしながら、これと比べることができるほどに４番目がＧ：Ｕワブル（１，５４２個）をなすことを発見し、その次には、Ｇ：Ａワブル（１，５４２個）をなすことを観察した。また、５番目のＧも、Ｇ：Ｕワブル（１，８００個）とＧ：Ａワブル（１，１９８個）をなす標的サイトが多く見られ、このように調査したすべてのサイトは、対照群の個数（６４７個）より全部多く存在することを確認することができた（図１０ｄ）。したがって、マイクロＲＮＡは、シード部分の塩基配列を通した標的ｍＲＮＡを認識する時、シード部分を通した正規的な塩基配列だけでなく、非正規的にＧ：ＵまたはＧ：Ａワブル塩基配列を許容し、特にＧ：Ａワブル塩基配列がこのような結合を通じて標的ｍＲＮＡと結合できることが分かった。このようなＧ：Ａワブル塩基を通したマイクロＲＮＡの標的認識は、報告されたことがない新しい結果であり、したがって、上記実施例で観察したように、様々なマイクロＲＮＡで非正規的な標的と認識されることを確認することができた。
【０２０１】
上記の実施例を通じて、マイクロＲＮＡの非正規標的認識には、シード配列にＧ：Ａワブル配列を許容する場合が存在し、これを通して多くのマイクロＲＮＡが標的遺伝子の伝令ＲＮＡに結合してその遺伝子の発現を抑制するものと思われる。
【０２０２】
［実施例１１］マイクロＲＮＡの非正規標的であるＧ：Ａシード配列サイトを認識するｍＩＲＮＡ−ＧＵの開発およびｍｉＲ−１２４適用時にｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕの神経細胞死滅増大効果確認
実施例１０において、マイクロＲＮＡの非正規標的認識には、シード配列にＧ：Ａワブル配列を許容する場合があることを発見し、これを非正規Ｇ：Ａシード配列サイトと名称し、これに対して相補的に配列できる新しいＲＮＡ干渉誘導物質の配列であるｍｉＲＮＡ−ＧＵを次のように発明した。このような配列決定技術をｍｉＲ−１２４を対象に適用してみると、ｍｉＲ−１２４は、シード配列が５’−ＡＡＧＧＣＡＣ−３’であって、非正規ＧＡ配列シード標的は、４番Ｇ塩基、５番Ｇ塩基がそれぞれＧ：Ａワブル塩基配列が可能な塩基配列であり、したがって、このようなＧ：Ａワブル配列を従来の相補的な塩基配列に変える形式であるｍｉＲＮＡ−ＧＵの配列に変えると、ｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕ（５’−ＡＡＵＧＣＡＣ−３’）、ｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕ（５’−ＡＡＧＵＣＡＣ−３’）に変更することができる。このように変更されたｍｉＲ−１２４−Ｇ４ＵとｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕは、従来のｍｉＲ−１２４がＧ：Ａワブル配列形態で弱く結合し認識した非正規標的サイトを相補的な配列で結合することができるので、ｍｉＲ−１２４での非正規Ｇ：Ａシード配列標的の機能を示すことができる。
【０２０３】
したがって、ｍｉＲＮＡ非正規ＧＡ配列シードターゲットを媒介とする生物学的機能を調べるために、非正規ＧＡ配列シードターゲットをｍｉＲ−１２４に適用して実験を行った。このために、以前に実施例での同じ方法によって対照群としてＮＴ（図１１ｂにＮ２ａで記述）、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕ、ｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕを神経芽細胞腫であるＮ２ａに導入し、細胞の形態を７２時間の間培養しながら、観察してみた（図１１ｂ）。その結果、ｍｉＲ−１２４を発現させた場合、長い神経分岐突起が形成される分化現象が起こるが、ｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕ、ｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕが伝達された実験群の場合、分化が起こらない現象を観察した（図１１ｂ）。このように従来のｍｉＲ−１２４の機能である神経分化能がｍｉＲＮＡ−ＧＵに変更したときに観察されないので、細胞死滅程度での変化をヒト神経芽細胞腫であるＳｈ−ｓｙ−５ｙ細胞株で観察した。この際のフローサイトメトリー分析は、実施例９で使用した方法と同様に、Ｍｕｓｅ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ａｎｄ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用い、Ｍｕｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を通じて行った。その結果、ｍｉＲ−１２４−Ｇ−５Ｕの発現は、細胞死滅を対照群に比べて２倍以上増加させたことを確認し（図１１ｃ）、これを早い細胞死滅（ｅａｒｌｙ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）や遅い細胞死滅（ｌａｔｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に細分化して分析した場合、ｍｉＲ−１２４が伝達された実験群に比べて、ｍｉＲ−１２４−Ｇ−５Ｕが伝達された実験群は、早い細胞死滅（ｅａｒｌｙ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）と遅い細胞死滅（ｌａｔｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の2つの場合が全部有意的に増加したと分析された（図１１ｄ）。ｍｉＲ−１２４−Ｇ−４Ｕが伝達された実験群の場合、ｍｉＲ−１２４が伝達された実験群に比べて遅い細胞死滅（ｌａｔｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が有意的に抑制され（図１１ｃ、ｄ）、生きている細胞の数も多いことを観察することができた（図１１ｂ）。
【０２０４】
これを基に、ｍｉＲ−１２４−ＧＵによるｍｉＲ−１２４非正規ＧＡ配列シードターゲット抑制は、ｍｉＲ−１２４により誘導される神経分化の能力は消え、その代わりに、異なる生物学的機能である細胞死滅調節機能を示すことを確認することができた。
【０２０５】
［実施例１２］ｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕが誘導する神経芽細胞の細胞分裂促進
以前の実施例でｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕの場合には、神経細胞分化能を喪失し、細胞死滅でも特別な機能が現れないので、細胞分裂に対して調べた。すなわち、対照群ＮＴ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕ、ｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕをそれぞれ神経芽細胞腫細胞であるＮ２ａに以前の実施例で行った方法と同じ方法で導入させた後、細胞分裂増殖現象に対してフローサイトメトリー分析を実施した（図１２ａ）。この際の実験は、Ｍｕｓｅ  Ｋｉ６７  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて製造社が提供した実験方法によって細胞を処理した後、Ｍｕｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）で細胞分裂を分析して進めた。この方法は、Ｋｉ６７が染色された細胞の数を測定することによって、細胞分裂増殖が増加した細胞の数を定量的に分析する方法である。Ｎ２ａ細胞でｍｉＲ−１２４を発現させると、対照群であるＮＴに比べて細胞が分化することによって、Ｋｉ６７の染色の強さが減少した細胞が増える。しかしながら、ｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕが伝達された実験群は、対照群（ＮＴ）に比較して細胞分裂が増殖した細胞であるＫｉ６７染色細胞が６１％から６５％に多少増えた。これに対し、ｍｉＲ−１４−Ｇ５Ｕは、対照群と比較して差異がないことを観察することができた。
【０２０６】
追加的にｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕが細胞周期にあたえる影響を調査するために、ヒト神経芽細胞腫であるｓｈ−ｓｙ−５ｙ細胞株を用いてフローサイトメトリー分析を実施した（図１２ｂ）。この際の分析は、ｍｉＲ−１２４−Ｇ４ＵとｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕの機能を細胞周期別に調べるために、ＭｕｓｅＴＭ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｋｉｔ（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＭＣＨ１００１０６、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて、Ｍｕｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）で分析した。その結果、ｍｉＲ−１２４の場合、細胞の周期がＧ０／Ｇ１にある数が増加する細胞分裂停止（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ）が観察されたが、ｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕ、ｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕは、ｍｉＲ−１２４による細胞分裂停止現象は消え、対照群と同一に細胞周期が進行されることを観察した。
【０２０７】
上記の実施例を通じてｍｉＲ−１２４非正規ＧＡ配列シードターゲットを抑制するＲＮＡ干渉誘導変形配列のうちｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕは、神経芽細胞の細胞分裂増殖を増加させる機能を有することが分かった。
【０２０８】
［実施例１３］心筋細胞株でｍｉＲ−１が非正規ＧＡ配列シードターゲット遺伝子の発現を抑制できることを蛍光タンパク質レポータを用いて確認
上記の実施例でマイクロＲＮＡが非正規的にシード配列でＧ：Ａワブル配列を許容して標的ｍＲＮＡと結合することができ、これが新しい機能を有することができるという事実を発見した後、このような結合が実際に標的遺伝子の抑制を起こすことができるかを細胞水準で確認するレポータ実験を進めた。この際、確認実験は、心筋細胞であるｈ９ｃ２のように筋肉系細胞で多く発現すると知られたｍｉＲ−１を対象に進め、特にｍｉＲ−１の５’末端から７番目に存在するＧに注目して、これを通したＧ：Ａワブル塩基配列を対象として行った（図１３）。マイクロＲＮＡによる遺伝子抑制は、より精密に個別細胞水準で測定するために、蛍光タンパク質発現レポータシステムを構築して使用した（図１３）。蛍光タンパク質発現レポータシステムは、２つの色の蛍光タンパク質が1つのベクターに発現するように構成され、この際、ＳＶ４０プロモーターには、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）が発現するようにし、その３’ＵＴＲ（３’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）部分にマイクロＲＮＡの標的サイトを複数個連続的に配列して、緑色蛍光タンパク質の強さを通じてマイクロＲＮＡによる遺伝子抑制効果を測定することができるようにし、同時に赤色蛍光タンパク質（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＲＦＰ）は、ＴＫプロモーターにより発現するようにして、その強さ程度で緑色蛍光信号を標準化して使用した（図１３ａ、上）。
【０２０９】
このように構築された蛍光タンパク質発現レポータベクターにｍｉＲ−１の５’末端から２番目から８番目まで塩基に対して相補的であり、７番目の塩基にＧに対してはＧ；Ａワブルで塩基配列する非正規標的サイト（７Ｇ：Ａ−ｓｉｔｅ）を挿入してレポータを製作した後（ＧＦＰ−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）、これがｍｉＲ−１により抑制されるかを実験を通じて確認した。この際、実験は、５００ｎｇ  ＧＦＰ−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅレポータベクターと２５ｕＭのｍｉＲ−１をｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）試薬を用いて会社で提供するプロトコルによって心筋細胞株であるＨ９ｃ２に同時に導入（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後にＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｕ社のＡｔｔｕｎｅ  ＮｘＴを通じてそれぞれの蛍光信号をフローサイトメトリー分析で測定した。その結果、ｍｉＲ−１の発現によってｍｉＲ−１の７Ｇ：Ａサイトが非常に効率的に抑制（図１３ａ、中間）されることを対照群核酸（ｃｏｎｔ；ＮＴ）を導入した細胞（図１３ａ、左側）と比較して確認した。すなわち、心筋細胞株であるｈ９ｃ２で２つの蛍光タンパク質の発現程度によって４つの部分（Ｑ５−１、Ｑ５−２、Ｑ５−３、Ｑ５−４）で分析した結果、ｍｉＲ−１が導入された細胞の場合、対照群核酸が導入された場合より１０３強さの赤色蛍光タンパク質と１０３強さの緑色蛍光タンパク質を示す細胞の分布が５９．５１％（ｃｏｎｔｒｏｌ：Ｑ５−３）から４１．８０％（ｍｉＲ−１：Ｑ５−３）に減少したことを観察した。
【０２１０】
ＧＦＰ−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅレポータベクターは、ｍｉＲ−１の導入なくとも、ｈ９ｃ２細胞である程度抑制されていることが対照群で観察された。これは、ｈ９ｃ２細胞内ですでに発現しているｍｉＲ−１によりレポータ標的ｍＲＮＡとのＧ；Ａワブル塩基配列を通じて抑制すると予想することができる。このような点を確認するために、ｈ９ｃ２細胞内のｍｉＲ−１の発現を抑制できるｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｈａｉｒｐｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｍｉＲ−１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、図１３ａ、右側）をＤｈａｒｍａｃｏｎ社から購入して５０ｕＭ濃度で細胞にトランスフェクションさせて使用した。このような結果、対照群に比べて（図１３ａ、左側）ｍｉＲ−１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを導入した場合（図１３ａ、右側）、１０３強さの赤色蛍光タンパク質と１０３強さの緑色蛍光タンパク質を示す細胞の分布が８１．５６％（ｍｉＲ−１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：Ｑ５−３）に増加することから見て、細胞内に存在するｍｉＲ−１がｍｉＲ−１の７Ｇ：Ａサイトを通じて遺伝子発現を抑制することができることを確認した（図１３ａ）。
【０２１１】
これは、追加的に蛍光タンパク質発現レポータにマイクロＲＮＡ標的サイトを入れない対照群（ＧＦＰ−ｎｏ  ｓｉｔｅ）とｍｉＲ−１の７Ｇ：Ａサイトが入ったレポータであるＧＦＰ−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅをＨ９ｃ２細胞に導入してその活性を比較して確認し、陽性対照群としては、ｍｉＲ−１を共に導入した場合と定量的に比較して確認した（図１３ｂ）。この際の分析は、フローサイトメトリー分析器で測定した赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）値を区間別に分け、この際の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）値を平均を出してログ比率で変換し、この際、対照群であるＧＦＰ−ｎｏ  ｓｉｔｅの緑色蛍光タンパク質数値を１に置いて（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｏｇ  ＧＦＰ）相対的に計算した。この際、ｍＲ−１と７番Ｇ塩基に対して、Ｇ：Ａワブル（ｗｏｂｂｌｅ）を通じて相補的に塩基配列されるサイトがある場合（ＧＦＰ−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）、特に１．５−３値の赤色蛍光タンパク質の発現（ｌｏｇ  ＲＦＰ）が見られる区間で、Ｇ：Ａワブル（ｗｏｂｂｌｅ）を通した緑色蛍光タンパク質の発現（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｏｇ  ＧＦＰ）が１より１０％程度低くなることを確認した。このような抑制は、陽性対照群では、特に１．５−４区間の赤色蛍光タンパク質の発現（ｌｏｇ  ＲＦＰ）で４０％−１０％程度緑色蛍光タンパク質の発現（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｏｇ  ＧＦＰ）が抑制されるパターンと同一に現れるという点を観察した。
【０２１２】
上記の実施例で観察した結果が当該蛍光タンパク質レポータで使用した互いに異なるプロモーターの強さと２つの異なる蛍光タンパク質が有する蛍光活性度の差異によって影響を受けないことを確認するために、2つの蛍光タンパク質を互いに変えられている蛍光タンパク質レポータであるｐ．ＵＴＡ．３．０（Ｌｅｍｕｓ−Ｄｉａｚ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，（７），２０１７）をＡｄｄｇｅｎｅ（ｐｌａｓｍｉｄ  ＃  ８２４４７）から購入して使用した。この際、レポータ実験は、ｐ．ＵＴＡ．３．０ベクターでＳＶ４０プロモーターにより調節される赤色蛍光タンパク質（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＲＦＰ）の３’ＵＴＲ部分にｍｉＲ−１−７Ｇ；Ａ配列を５回繰り返して挿入した後、レポータベクター（ＲＦＰ−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）を製作して進め、この際、赤色蛍光タンパク質発現数値は、Ｔｋプロモーターで発現する緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）値を細胞内に導入された程度を反映した標準化で使用して変形して使用した（図１３ｃ、上）。その結果、以前の実施例と同一にｍｉＲ−１の７Ｇ；Ａサイトがｈ９ｃ２で発現するｍｉＲ−１により抑制されることをｍｉＲＮＡ標的位置がないレポータ（ＲＦＰ−ｎｏ  ｓｉｔｅ）の対照群とｍｉＲ−１の７Ｇ；Ａ  ｓｉｔｅが入ったレポータ（ＲＦＰ−７Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）の結果を比較して確認し、同時に陽性対照群がｍｉＲ−１とのｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎでも以前の実施例のような現象を観察した（図１３ｃ−ｄ）。
【０２１３】
上記から、Ａｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ分析を通じて発見したマイクロＲＮＡの非正規標的が実際にマイクロＲＮＡのシード配列でＧ：Ａワブル配列を通じて結合することができるだけでなく、当該標的遺伝子の発現を抑制することができることを確認した。したがって、このような点から推察してみるとき、Ｇ；Ａワブル配列を通した標的サイトを用いてマイクロＲＮＡと十分に結合することができ、このような点をｍｉＲＮＡ−ＧＵを通じて類似に誘導できると、非正規的標的抑制によるマイクロＲＮＡの生物学的機能のみを活用できると考えられる。
【０２１４】
［実施例１４］ｍｉＲ−１の２、３、７番Ｇ塩基に対する非正規ＧＡ配列シードターゲット遺伝子調節を通した心筋細胞の肥大化誘導機能確認
このような非正規的な遺伝子抑制現象は、Ｇ：Ａワブル塩基配列がマイクロＲＮＡの非典型ターゲットとして作用して、生物学的機能を調節することもできるという可能性をｍｉＲＮＡ−ＧＵを通じて確認するために、以前の実施例で調べた心筋細胞のｍｉＲ−１を中心に実験を進めた。
【０２１５】
非正規的なＧ：Ａワブル標的が特定の生物学的機能を有しているかを調査するためには、ｍｉＲ−１が正規的な標的は認識せずに、非正規的なＧ：Ａワブル配列標的サイトのみを認識するようにしなければならないので、ｍｉＲ−１のシード領域にあるＧがＣでないＡと塩基配列するように当該ＧをＵに置換して製作したｍｉＲＮＡ−ＧＵを実験に使用した。本実験では、より生理学的に心臓と類似した条件で行うために、ラット（ｒａｔ）の心臓組織から１次心筋細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｒａｔ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を培養して行った。この際、心筋細胞の培養は、生後１日目のラット（ｒａｔ  ｎｅｏｎａｔｅ）の心臓組織から酵素反応を通じて心筋細胞を分離し（Ｃｅｌｌｕｔｒｏｎ社、ｎｅｏｍｙｔ  ｋｉｔ）、心筋細胞は、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、５％ＨＳ（ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改質Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＭ１９９（ＷｅｌｌＧｅｎｅ）培地を４：１で混ぜて準備した培地にｂｒｄＵを添加して、心臓組織に存在する細胞周期を有する他の細胞と区別して培養した。
【０２１６】
このように得られた１次培養心筋細胞で心筋肥大現象が誘導されるかを優先的に確認した（図１４ａ）。心筋細胞は、細胞周期を止め、心筋細胞の大きさを増加させることができる特徴を有しているが、これを心筋肥大現象という。心筋肥大現象は、心筋細胞の機能低下を補完する役割をし、心臓疾病の病理中間段階とも知られており、細胞形態学的観察および遺伝子発現プロファイル変化がよく知られた心臓疾病モデルシステムである。心筋肥大症の細胞モデルでは、フェニレフリン（ＰＥ）のようなアドレナリン作用性レセプター作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）を心筋細胞に処理すると、心筋肥大症を誘導することができる（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ，ＪＤ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｃｅｌｌ  ９３（２），２１５−２２８）。したがって、培養した心筋細胞に１００ｕＭのフェニレフリンを処理して心筋肥大を誘導し、これによって、何も処理しない対照群（図１４ａ、ｒＣＭＣ）と比較して心筋細胞の大きさが増加することを形態学的に確認した（図１４ａ、＋ＰＥ）。また、１次心筋細胞にｍｉＲ−１を導入したとき、心筋細胞の大きさが減少することを観察した（図１４ａ、右上側）。これは、よく知られた心筋肥大現象とｍｉＲ−１の心筋細胞での機能と一致する（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ，ＪＤ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｃｅｌｌ  ９３（２），２１５−２２８，Ｉｋｅｄａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  ｃｅｌｌ  ｂｏｉｌ，２００９，ｖｏｌ２９，２１９３−２２０４）。
【０２１７】
ｍｉＲ−１は、シード領域に３つのＧを含んでおり、これによって、正規的な標的は認識せずに、非正規的なＧ：Ａワブル配列標的サイトのみを認識するようにするために、このようなＧをＵに置換したｍｉＲ−１をデザインし、これをＧがある位置によって５’末端基準２番目の位置（ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ）、３番目の位置（ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ）、７番目の位置（ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ）に適用して合成した。この際、図１４に使用したｍｉＲ−１の置換塩基配列は、次の通りであり（ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ：５’ｐ−ＵＵＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ−３’；ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ：５’ｐ−ＵＧＵＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ−３’；ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ：５’ｐ−ＵＧＧＡＡＵＵＵＡＡＡＧＡＡＧＵＡＵＧＵＡＵ−３’）、これは、ガイド鎖で合成され、パッセンジャー鎖は、従来のｍｉＲ−１のものをデザインしてＢｉｏｎｅｅｒ社で化学的に合成製作後、ＨＰＬＣで分離、前記会社で提供した方法によってガイド鎖とパッセンジャー鎖の二重体（ｄｕｐｌｅｘ）で製造して使用した。当該マイクロＲＮＡの１次心筋細胞株への導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）は、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）試薬を用いて５０ｕＭ濃度で行った
【０２１８】
その結果、ｍｉＲ−１−Ｇ２ＵまたはｍｉＲ−１−Ｇ３ＵまたはｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕを１次心筋細胞培養に導入したとき、心筋細胞の形態が心筋肥大を誘導した細胞（図１４ａ、＋ＰＥ）と類似した水準に大きくなったことを観察することができた（図１４ａ）。この際、それぞれの細胞の大きさを定量的に分析するために、１００個以上の細胞がイメージＪプログラム（ＮＩＨ）を通じて定量化され、これによって、ｍｉＲ−１のＧ：Ａワブル配列サイトのみを認識するように合成したｍｉＲ−１置換体（ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ、ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ、ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ）が全部対照群（ＮＴ）核酸を導入したときと比較して約１．５〜１．８倍程度その大きさが大きくなったと分析された。これは、フェニレフリン（ＰＥ）薬物が誘導する心筋細胞肥大症モデルの心筋細胞の大きさと類似した水準であり、ｍｉＲ−１自体は、心筋細胞形態上では細胞の大きさを減少させる効果を示すことによって、その正規的な標的抑制効果がＧ；Ａワブルを通した標的抑制とは細胞形態学上で異なる機能を示すことを観察した（図１４ｂ）。また、追加的に本実施例で観察した心筋肥大現象を分子的水準で確認するために、マーカーでその発現が増加すると知られたＡＮＰ（ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｕｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）遺伝子の発現をｑＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）実験を通じてＧＡＰＤＨと比較して相対的な値で測定してみた（図１４ｃ）。その結果、ｍｉＲ−１のＧ：Ａワブル配列サイトのみを認識するように合成したｍｉＲ−１置換体（ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ、ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ、ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ）を心筋細胞に導入した場合には、全部ＡＮＰ発現量を対照群（ＮＴ）に比べて１．２〜１．５倍程度有意に増加させたことを４回の反復実験を通じて確認することができた。このようなＡＮＰ発現増加は、フェニレフリン（ＰＥ）薬物を処理した心筋細胞実験群が対照群に比べて大きさが約２倍程度増加したことよりは少ないが、本来のｍｉＲ−１が導入されたとき、かえってＡＮＰ発現が有意に減少する現象とは反対になることであって、これを通してｍｉＲ−１は、Ｇ：Ａワブル配列サイトを通じて完全に異なる生物学的機能を示すと見ることができる。
【０２１９】
上記からマイクロＲＮＡシード領域でＧ：Ａワブル配列を通じて抑制する非正規標的は、従来の正規的な標的認識とは生物学的に異なる機能を示すことができるという点が最終的に分かった。このような発見は、マイクロＲＮＡの正規的な標的を通した機能と非正規的標的を通した機能が互いに異なることを示し、このような点から推察してみるとき、マイクロＲＮＡのＧ：Ａワブル標的のみを抑制できると、Ｇ：Ａワブル標的により起こる生物学的機能のみを選択的に制御することができる。
【０２２０】
［実施例１５］心筋細胞株（Ｈ９ｃ２）でｍｉＲ−１３３−Ｇ４Ｕ発現を通した心肥大症の誘導観察
Ｇ：Ａワブル塩基配列がマイクロＲＮＡのシード部分に作用して認識する非正規的標的現象に対して、追加的にその生物学的機能を心筋細胞で確認するために、以前の実施例で調べたｍｉＲ−１以外に心筋細胞で機能をすると知られたｍｉＲ−１３３に対してｍｉＲＮＡ−ＧＵを適用してみた。ｍｉＲ−１３３は、筋細胞発達および疾病病理を調節し、心筋肥大現象の抑制機能を有すると知られた（Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００７，１３（５）：６１３−６１８；Ｉｋｅｄａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  ｃｅｌｌ  ｂｏｉｌ，２００９，ｖｏｌ２９，２１９３−２２０４）。したがって、本発明者は、ｍｉＲ−１３３の非正規ＧＡ配列ターゲットサイトのうち５’末端基準４番目のＧを通じて行われる標的認識を特異的に抑制する干渉誘導核酸であるｍｉＲ−１３３−Ｇ４Ｕ（５’−ＵＵＵＵＧＵＣＣＣＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧＣＵＧ−３’）を上記の実施例のようにバイオニア社で合成製作して、５０ｎＭ濃度の二重体でＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて心筋細胞株ｈ９ｃ２に伝達させてその細胞形態上の変化を観察した（図１５ａ）。その結果、ｍｉＲ−１３３−Ｇ４Ｕの発現がＨ９ｃ２細胞の大きさを対照群（ＮＴ）に比べて増大させ（図１５ａ）、１００個以上の細胞の大きさをイメージＪ（ＮＩＨ）プログラムを通じて定量的に分析した結果、約２倍程度有意に増加させることを確認することができた（図１５ｂ）。
【０２２１】
したがって、ｍｉＲ−１３３−Ｇ４Ｕにより起こるｍｉＲ−１３３の非正規ＧＡ配列シードターゲット発現低下は、心肥大症を誘導し、これは、心肥大症を抑制するｍｉＲ−１３３の正規シード標的阻害機能とは異なる新しい機能であることを類推することができる。
【０２２２】
［実施例１６］肝癌細胞内のｍｉＲ−１２２による非正規ＧＡ配列シードサイト遺伝子の発現阻害効果をルシフェラーゼレポータを通じて確認
以前の実施例１０でｍｉＲＮＡが非正規的にＧ：Ａワブル配列シードサイトと結合するという発見で、このような非正規的標的結合のみを特異的に認識するようにするｍｉＲＮＡ−ＧＵを発明することになり、これをｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３に適用したとき、従来の機能とは異なる効果が現れることを実施例１１、１２、１３、１４で観察した。そして、また、実際にマイクロＲＮＡに非正規的Ｇ：Ａワブル配列シードサイトを有している標的遺伝子の発現を阻害できるかを確認するために、実施例１３においてｍｉＲ−１を対象として心筋組織細胞株でその機能を確認した。追加的に肝組織と肝癌細胞に特異的に発現するｍｉＲ−１２２を対象として非正規Ｇ：Ａワブル配列シード標的遺伝子の発現を阻害できるかをルシフェラーゼレポータシステムを使用して確認しようとした（図１６）。
【０２２３】
肝癌または肝組織に特異的に発現して機能するｍｉＲ−１２２は、そのシード配列（５’シード基準１−８番塩基：５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＧＵ−３’）に５’末端基準２番目、３番目、５番目、７番目にＧ：Ａワブル配列をすることができるＧを有している。したがって、優先的には、このうち２番目のＧが非正規的にＧ：Ａワブル配列を通じて認識できる当該標的サイトを対象にその抑制効率を測定するために、実施例２で進めた同じ方法でＩＣ５０（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ５０）を測定して正規的シードサイトと比較して調べた（図１６ａ）。
【０２２４】
実験を進めるためのルシフェラーゼレポータベクターは、ｍｉＲ−１２２の２番Ｇ塩基に対してＧＡ塩基配列が可能な非正規ＧＡ配列シードターゲットの発現抑制を感知するために、ｍｉＲＮＡ−１２２の２番Ｇ塩基に対する非正規ＧＡ配列シードサイト（２Ｇ：Ａ）配列（５’シード基準１−９番塩基：５’−ＣＡＣ  ＡＣＵ  ＣＡＡ−３’）をｐｓｉ−ｃｈｅｃｋ２（Ｐｒｏｍｅｇａ社）ベクター内にあるレニラルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ（３’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）部分に５回連続的に配列されるように導入して製作した。また、同時に正規シードサイト（５’シード基準１−９番塩基：５’−ＣＡＣ  ＡＣＵ  ＣＣＡ−３’）に対するルシフェラーゼレポータベクターも同一に製作した。
【０２２５】
このように製作されたルシフェラーゼレポータベクターを有し、ｍｉＲ−１２２の様々な濃度で正規シードサイト（ｓｅｅｄ  ｓｉｔｅ）と５’末端基準２番目のＧを通した非正規ＧＡ配列シードサイト（２Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）を有する標的遺伝子の発現阻害効果を当該ルシフェラーゼレポータの活性の変化で測定し、ＩＣ５０（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ５０）値を調べた結果、ｍｉＲ−１２２は、正規シード標的サイトに対しては、約０．５ｎＭ、非正規ＧＡ配列シードサイト（２Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）に対しては、約７ｎＭで測定され、ｍｉＲ−１２２が非正規ＧＡ配列シードサイト（２Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）を有する遺伝子の発現を抑制することを確認し、その効率は、正規シードサイトに比べて低いことが分かる（図１６ａ）。また、遺伝子発現抑制が始まる濃度を非正規ＧＡ配列シードターゲットでルシフェラーゼレポータで調べたとき、１．５ｎＭ以上の濃度条件でルシフェラーゼ酵素活性が阻害されることを確認した（図１６ａ）。これは、ｍｉＲ−１２２が正規シードターゲットサイト発現を抑制することと約２倍程度抑制効率の差異を示した。
【０２２６】
本実験は、上記実施例で使用した同じ方法でｍｉＲ−１２２の二重体を合成し、これを様々な濃度（０、１、５、１０、２５ｎＭ）で当該ｐｓｉ−ｃｈｅｃｋ２ベクター（５０ｎｇ）とともにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造者のプロトコルによって略１０，０００個の肝癌細胞株（Ｈｕｈ７、ＫＣＬＢ：６０１０４）に伝達（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させて９６ｗｅｌｌで培養して進め、実施例２で行った方法と同一にルシフェラーゼ活性を測定して実行した。
【０２２７】
ｍｉＲ−１２２が非正規ＧＡ配列シードサイト遺伝子の発現を抑制するという事実を確認した後、これが細胞内に存在するｍｉＲ−１２２により同一に調節されるかを確認するために、ｍｉＲ−１２２が存在する肝癌細胞であるＨｕｈ７細胞株を使用して、５’末端基準２番目のＧおよび３番目のＧにより起こる非正規ＧＡ配列シードサイト（２Ｇ：Ａ）に対するルシフェラーゼレポータ実験を行った（図１６ｂ）。このような実験を進めるために追加的に５’末端基準３番目のＧにより起こる非正規ＧＡ配列シードサイト（３Ｇ：Ａ）に対するルシフェラーゼレポータベクター（ｌｕｃ−３Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）、５’末端基準２番目と３番目のＧにより共に起こる非正規ＧＡ配列シードサイト（ｌｕｃ−２Ｇ：Ａ、３Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）に対するルシフェラーゼレポータベクター、全体ｍｉＲ−１２２の配列に完全相補的な配列を測定するルシフェラーゼレポータベクター（ｌｕｃ−ＰＭ  ｓｉｔｅ）を上記に記述された同じ方法で製作し、５’末端基準２番目のＧにより起こる非正規ＧＡ配列シードサイト（２Ｇ：Ａ）に対するルシフェラーゼレポータベクター（ｌｕｃ−２Ｇ：Ａ  ｓｉｔｅ）とともに肝癌細胞株に導入後、ルシフェラーゼの活性を測定して実験した（図１６ｂ）。
【０２２８】
その結果、ｍｉＲ−１２２が存在すると知られたＨｕｈ７細胞にｌｕｃ−ＰＭ  ｓｉｔｅベクターを導入したとき、その活性がルシフェラーゼベクター自体のみが導入された対照群に比べて約５０％程度減少することを観察して、Ｈｕｈ７細胞にｍｉＲ−１２２が存在することを確認し、同時にｍｉＲ−１２２は、３番非正規ＧＡ配列シードターゲットレポータ（Ｌｕｃ−３Ｇ：Ａ）、２、３番非正規ＧＡ配列シードターゲットレポータ（Ｌｕｃ−２Ｇ：Ａ、３Ｇ：Ａ）の活性を抑制することを確認することができた。また、このような抑制効果がｍｉＲ−１２２により誘導されたのかを確認するために、ｍｉＲ−１２２の発現阻害剤（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＩＨ−３００５９１−０６−００１０）をダーマコン社で購入して５０ｎＭで処理し、この際、このようなすべての抑制現象が消えることを確認した。
【０２２９】
上記の実施例を通じて、ｍｉＲ−１２２は、たとえ正規的シードサイトよりは弱いが、５’末端基準２番非正規ＧＡ配列シードターゲットの発現を抑制することができるという事実を確認し、また、肝癌細胞であるＨｕｈ７に自然的に存在するｍｉＲ−１２２は、５’末端基準３番非正規ＧＡ配列シードターゲット遺伝子と、２、３番非正規ＧＡ配列シードターゲット遺伝子の発現を抑制するという事実が分かった。特に肝癌細胞であるＨｕｈ７で行われる抑制効果は、ｍｉＲ−１２２の発現阻害剤の処理によって消えることで、ｍｉＲ−１２２による調節であることを確認した（図１６ｂ）。したがって、ｍｉＲ−１２２は、非正規ＧＡ配列シードターゲット遺伝子の発現を抑制する調節機能があることが分かる。
【０２３０】
［実施例１７］ｍｉＲ−１２２の特定非正規ＧＡ配列シード標的遺伝子の発現抑制を通した肝癌細胞株の細胞移動阻害現象確認
ｍｉＲ−１２２の非正規ＧＡ配列シード標的の肝癌細胞内機能を調べるために、当該非正規ＧＡ配列シード標的サイトを相補的に認識して阻害するｍｉＲＮＡ−ＧＵを適用して、これを肝癌細胞であるｈｅｐＧ２に導入した後に、肝癌細胞の性質のうち癌転移に重要な細胞移動能力がどのように変るかを創傷治癒分析（ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を行って調べた。
【０２３１】
肝癌細胞株であるｈｅｐＧ２での創傷治癒分析は、まず、ｍｉＲ−１２２の５’末端基準２番非正規ＧＡ配列シードターゲット、３番非正規ＧＡ配列シードターゲット、２、３番非正規ＧＡ配列シードターゲットに相補的に認識するｍｉＲＮＡ−ＧＵを当該配列で合成した後、これを上記実施例で実行した同じ方法でｈｅｐＧ２細胞内に導入し、２４時間培養後、１０００ｕｌチップを用いて細胞培養層（ｃｅｌｌ  ｌａｙｅｒ）にスクラッチ（ｓｃｒａｔｃｈ）を作り、細胞を４８時間まで培養しながら、各実験群の細胞が移動することを対照群であるＮＴ−６ｐｉを導入したことと比較観察して進めた。この際、実験に使用された干渉誘導核酸の配列は、次の通りである（ｍｉＲ−１２２：５’−ＵＧ  ＧＡＧ  ＵＧＵ  ＧＡＣ  ＡＡＵ  ＧＧＵ  ＧＵＵ  ＵＧ−３’；ｍｉＲ−１２２−Ｇ２Ｕ：５’−ＵＵ  ＧＡＧ  ＵＧＵ  ＧＡＣ  ＡＡＵ  ＧＧＵ  ＧＵＵ  ＵＧ−３’；ｍｉＲ−１２２−Ｇ３Ｕ：５’−ＵＧ  ＵＡＧ  ＵＧＵ  ＧＡＣ  ＡＡＵ  ＧＧＵ  ＧＵＵ  ＵＧ−３’；ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ：５’−ＵＵ  ＵＡＧ  ＵＧＵ  ＧＡＣ  ＡＡＵ  ＧＧＵ  ＧＵＵ  ＵＧ−３’）。
【０２３２】
その結果、対照群であるＮＴ−６ｐｉの場合と同一にｍｉＲ−１２２を導入した場合には、４８時間細胞培養時に、作られたスクラッチがほぼ充填される細胞移動を観察することができた。しかしながら、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２Ｕ、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ  ｓｉＲＮＡが伝達された実験群では、このような細胞移動が阻害されることを示し、このような阻害現象は、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ  ｓｉＲＮＡが伝達された実験群で最も強く示された（図１７ａ）。これを定量的に測定してみた結果、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２Ｕ、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ  ｓｉＲＮＡの場合、対照群に比べて２〜３倍細胞移動が阻害されたことを確認した（図１７ｂ）。当該定量分析は、ｍｉＲ−１２２の細胞移動を細胞形態上で観察した後、この観察結果をイメージＪプログラム（ＮＩＨ）を用いて分析して測定した。追加的に、ｍｉＲ−１２２−Ｇ３Ｕ  ｓｉＲＮＡが誘導する細胞移動を実験を進めた結果、ｍｉＲ−１２２−Ｇ３Ｕによっては細胞移動阻害機能を観察することができなかった（図１７ｃ−ｄ）。
【０２３３】
これを基にｍｉＲ−１２２の非正規ＧＡ配列シード標的抑制は、肝癌細胞の移動を阻害し、これは、２番塩基のＧＡ配列が優先的に作用し、引き続いて添加的に３番塩基のＧＡ配列が加えられる場合、細胞移動阻害機能の強化が誘導されるという点が分かる。
【０２３４】
［実施例１８］ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕによる非正規ＧＡ配列シード標的調節による細胞周期停止（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ）の増加確認
細胞の移動は、細胞分裂と密接に関連しており、特に癌細胞で多く観察されている（Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，６４（２２）：８４２０−８４２７）。したがって、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕが誘導する肝癌細胞移動の阻害が細胞周期調節と関係があるかを確認するために、実施例１２での同じ方法でフローサイトメトリー分析実験を進めた。この際、ＮＴ−６ｐｉ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２、ｍｉＲ−１２２−３Ｕ、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕを肝癌細胞株であるＨｅｐＧ２に伝達した後、各細胞の細胞周期を測定した結果、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕが伝達された実験群で、Ｇ０／Ｇ１分布を示した細胞の比率が対照群（ＮＰ−６ｐｉ）の平均５２％から６８％に増加したことを確認し、Ｇ２／Ｍ期の細胞分布が顕著に低いことを確認した（図１８）。しかしながら、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２Ｕ、ｍｉＲ−１２２−Ｇ３Ｕは、対照群に比べて有意な差異点を観察しなかった。この際、細胞周期分析実験は、合成された当該ｓｉＲＮＡ二重体を５０ｎＭ濃度でＨｅｐＧに伝達して、２４時間培養し、Ｍｕｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｋｉｔ（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＭＣＨ１００１０６、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて、当該会社が提供するプロトコルによって実験を行い、Ｍｕｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）で測定した。
【０２３５】
したがって、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕが調節する癌細胞機能は、細胞分裂（Ｇ２／Ｍ）を低減し、細胞周期停止状態（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ：（Ｇ０／Ｇ１））を誘導することを確認し、これにより、本実施例の結果は、ｍｉＲ−１２２が非正規ＧＡ配列シードサイトを５’末端基準２番目のＧと３番目のＧの両方を同時にＧ：Ａワブル配列して認識して、肝癌細胞周期の進行を防ぐ機能を示すと解析することができる。
【０２３６】
［実施例１９］ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，７Ｕによる非正規ＧＡ配列シード標的調節による細胞周期停止状態誘導観察
ｍｉＲ−１２２の非正規ＧＡ配列シード標的の機能は、以前の実施例１７でｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕが肝細胞の移動を阻害する機能があるという点を把握し、この際、特にｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕの発現により誘導される細胞移動の阻害は、２番Ｇ塩基の非正規ＧＡ配列シード標的調節の生物学的機能に３番Ｇ塩基の調節効果が添加される場合、その機能が最大化されることを観察した（図１７）。したがって、ｍｉＲ−１２２の２，３，７番Ｇ塩基が追加的な組合せで非正規ＧＡ配列シード標的阻害の生物学的機能が変化することかを調べるために、ｍｉＲ−１２２−Ｇ７Ｕ、ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，７Ｕ、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，７Ｕ  ｓｉＲＮＡの細胞周期調節機能を追加的に確認する実験を行った。
【０２３７】
この際の実験は、同一に肝癌細胞株であるＨｅｐＧ２を使用し、以前の実施例１８での方法と同一に当該ｍｉＲＮＡ−ＧＵ二重体で製造して５０ｎＭ濃度で細胞にトランスフェクションした。しかしながら、今回の細胞周期観察では、２４時間培養後、ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）を１００ｎｇ／ｍｌで１６時間の間処理してＧ２／Ｍ（分裂準備期／分裂期）にＨｅｐＧ２細胞を同期化（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ）した後、どれほど多い数の細胞がＧ２／Ｍで止まっているかによってＧ０／Ｇ１での細胞周期停止状態の細胞の量をＭｕｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）フローサイトメトリー分析器で測定した（図１９）。
【０２３８】
その結果、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２Ｕは、対照群であるＮＴ−６ｐｉに比べて細胞周期停止状態であるＧ０／Ｇ１にある細胞数が差異がなかったが、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ  ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，７Ｕのように２番目のＧに添付的に非正規ＧＡ配列シードターゲットサイトを調節する場合、細胞周期停止状態（Ｇ０／Ｇ１）の比率が増加することを確認することができた（図１９ａ）。しかしながら、ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，７Ｕは、特別な増加を示さなかった（図１９ａ）。これを定量的に分析してみると、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ  ｓｉＲＮＡが伝達された実験群の場合、対照群に比べて約２倍以上細胞周期停止状態（Ｇ０／Ｇ１）の比率が増加し、引き続いてｍｉＲ−１２２−Ｇ２，７Ｕ実験群では、約１．５倍に細胞周期停止状態（Ｇ０／Ｇ１）の比率が増加することを観察した（図１９ｂ）。
【０２３９】
これを基に、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ  ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，７Ｕ  ｓｉＲＮＡによる非正規ＧＡ配列シード標的の調節を通じて細胞周期中止状態を増大させることができることを確認した。
【０２４０】
［実施例２０］ｌｅｔ−７ａ−Ｇ２Ｕ、ｌｅｔ−７ａ−Ｇ２，４Ｕによる非正規ＧＡ配列シード標的調節が誘導する細胞周期停止状態誘導観察
抗癌調節（Ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）機能をする代表的なマイクロＲＮＡとしては、ｌｅｔ−７  ｆａｍｉｌｙがある。これは、美しい小さな線虫の発達過程を調節する機能が報告（Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３（６７７２）：９０１−９０６）された以後、多様な癌細胞で抑制された発現（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００４，６４（１１）：３７５３−３７５６）および腫瘍形成過程（Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ）調節を通した抗癌機能（Ｃｅｌｌ，２００５，１２０（５）：６３５−６４７；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００７，２１（９）：１０２５−１０３０）が報告されてき、これを基に癌診断および抗癌剤開発の可能性を有する重要な遺伝子として研究されてきた。これにより、本発明者らは、ｌｅｔ−７の非正規ＧＡ配列シード標的の阻害が誘導する生物学的機能を調べる実験を進めた。
【０２４１】
ｌｅｔ−７ａの５’末端１番目から９番目までのシード配列は、５’−ＵＧＡ  ＧＧＵ  ＡＧＵ−３’であって、Ｇ：Ａワブル塩基配列をすることができるＧは、２番目、４番目、５番目、８番目に存在する。本発明者は、このうち２番目と４番目のＧに注目し、これをｍｉＲＮＡ−ＧＵで変形して合成し、これを肝癌細胞株であるＨｅｐＧ２細胞に導入した後、細胞周期でいかなる影響を及ぼすかを以前の実施例１９で実施した方法と同一に実験を行った。この際、合成して使用したｌｅｔ−７に対する塩基配列は、次の通りである（ｌｅｔ−７ａ：５’−Ｕ  ＧＡＧ  ＧＵＡ  ＧＵＡ  ＧＧＵ  ＵＧＵ  ＡＵＡ  Ｇ  ＵＵ−３’；ｌｅｔ−７ａ−Ｇ２Ｕ：５’−Ｕ  ＵＡＧ  ＧＵＡ  ＧＵＡ  ＧＧＵ  ＵＧＵ  ＡＵＡ  Ｇ  ＵＵ−３’；ｌｅｔ−７ａ−Ｇ４Ｕ：５’−Ｕ  ＧＡＵ  ＧＵＡ  ＧＵＡ  ＧＧＵ  ＵＧＵ  ＡＵＡ  Ｇ  ＵＵ−３’；ｌｅｔ−７ａ−Ｇ２，４Ｕ：５’−Ｕ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  ＧＵＡ  ＧＧＵ  ＵＧＵ  ＡＵＡ  Ｇ  ＵＵ−３’）。
【０２４２】
その結果、ｌｅｔ−７ａの場合は、対照群であるＮＴ−６ｐｉに比べて特別な差異を示さなかったが、ｌｅｔ−７ａ−Ｇ２Ｕとｌｅｔ−７ａ−Ｇ２，４Ｕは、Ｇ０／Ｇ１での細胞周期停止状態を増加させ、ｌｅｔ−７−Ｇ４Ｕは、かえってＧ２／Ｍにある細胞の量を増加させて細胞周期を速く進行させることを観察することができた（図２０ａ）。これを４回の反復実験で定量化してみると、ｌｅｔ−７ａ−Ｇ２Ｕ実験群の場合、Ｇ１／Ｇ０細胞の分布が対照群（Ｎｔ−６ｐｉ）と比較時に、約１．５倍程度増加し、Ｇ２／Ｍ細胞の分布が減少することを観察することができた（図２０ｂ）。これを通してｌｅｔ−７ａの２番非正規ＧＡ配列シードターゲットの発現抑制は、ＨｅｐＧ２細胞の細胞周期停止状態を誘導することを確認することができた。引き続いて、ｌｅｔ−７ａのシードに存在する４番Ｇ塩基の場合、単独ＧＡ配列（ｌｅｔ−７ａ−Ｇ４Ｕ）では、ＨｅｐＧ２の細胞周期停止状態を誘導を減少させ、かえってＧ２／Ｍ状態に速く進行されて、ノコダゾール薬物処理で多くの細胞数が留まる結果を示した。また、２番と４番が同時にＧＡ配列する場合（ｌｅｔ−７ａ−Ｇ２，４Ｕ）、ＨｅｐＧ２の細胞周期停止状態誘導を観察することができた。このような細胞周期停止状態は、ｌｅｔ−７ａが伝達されたＨｅｐＧ２細胞で観察されなかった（図２０ｂ）。したがって、ｌｅｔ−７ａの２番と２，４番非正規ＧＡ配列シードターゲットの発現抑制は、ＨｅｐＧ２細胞の細胞周期停止状態を誘導して、これは、ｌｅｔ−７ａが本発明者が行ったＨｅｐＧ２細胞調節で見られる機能とは全く異なる機能であることを確認した。
【０２４３】
上記の実施例を通じて、ｌｅｔ−７は、５’末端基準２番Ｇを通した非正規ＧＡシード配列サイトの遺伝子を抑制することによって癌細胞周期停止を促進させる役割をし、さらに好ましくは、５’末端基準２番Ｇと４番Ｇが共にＧ；Ａワブル配列で作用するとき、その効果が最も大きいことが分かる。また、ｌｅｔ−７の５’末端基準４番Ｇを通した非正規ＧＡシード配列サイトは、かえって癌細胞の細胞周期進行を促進させて、癌細胞の増殖を誘導すると思われる。
【０２４４】
［実施例２１］ｍｉＲ−３０２−４ＧＵ、ｍｉＲ−３７２−４ＧＵによる非正規ＧＡ配列シード標的阻害が誘導する逆分化促進をＯＣＴ４プロモーターレポータで観察
分化した細胞は、いくつかの転写因子の人為的な発現で分化能をさらに獲得することができ、最終的にさらに胚芽細胞のような全能分化能を獲得した細胞を逆分化細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）という。このような技術は、ラットの胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＭＥＭ）に４個の因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４）を導入して、幹細胞のように分化多様性を有する誘導万能幹細胞（ｉＰＳ  ｃｅｌｌ：ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を作ることができることが報告された（Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４）：６６３−６７６）。同様にヒトの体細胞に４個の因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８）伝達を通じて誘導万能幹細胞を作ることができることが報告されたことがある（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５８）：１９１７−１９２０）。これは、逆分化（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）過程を経て万能に分化できる再生可能性をヒト細胞を含む任意の細胞を通じても作り出すことができるという点からその応用可能性が非常に高い分野であり、最初発見後に、誘導万能幹細胞生成の効率性を高めるための努力が持続してきた。その一環として報告されたマイクロＲＮＡ誘導万能幹細胞（ｍｉｒＰＳ）も、効率的に万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を誘導する方法の1つであって、ｍｉＲ−３０２ａとｍｉＲ−３７２のようなマイクロＲＮＡが単独でまたは４個の因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４）とともに細胞を逆分化させる機能が報告された（ＲＮＡ，２００８  １４（１０）：２１１５−２１２４；Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１，２９（５）：４４３−４４８）。したがって、本発明者らは、ｍｉＲ−３０２ａとｍｉＲ−３７２の非正規ＧＡ配列シード標的発現の阻害が細胞を逆分化させる過程を促進することができるかを調べる実験を進めた。
【０２４５】
まず、万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）誘導をモニターするために、幹細胞で活性化すると報告されたＯｃｔ４プロモーターとこれに依存して発現する緑色蛍光タンパク質が含まれたプラスミドを購入した（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃２１３１９）（図２１ａ）。このようなＯｃｔ４発現レポータベクター（ｐＯｃｔ４：ＧＦＰ）を分化した子宮頸癌細胞ＨｅＬａに導入したときは、緑色蛍光タンパク質が発現しないが、当該細胞が逆分化して分化能を獲得したときは、Ｏｃｔ４発現レポータで緑色蛍光タンパク質が発現することになる。このようなＯｃｔ４発現レポータベクターとともに逆分化を起こすものと知られたマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−３０２ａ、ｍｉＲ−３７２を対象として実験を行った。ｍｉＲ−３０２ａとｍｉＲ−３７２のシード配列のうち５’末端基準２番目から８番目の配列は、「ＡＡ  ＧＵＧ  ＣＵ」であり、したがって、非正規ＧＡ配列シード配列は、５’末端基準４番目のＧと６番目のＧを通じて可能である。しかしながら、本発明者らは、４番目のＧに注目してｍｉＲ−３０２−Ｇ４Ｕ、ｍｉＲ−３７２−Ｇ４Ｕを合成して実験を行った。
【０２４６】
優先的に、実験は、ＨｅＬａ細胞にＯｃｔ４発現レポータベクター（ｐＯｃｔ４：ＧＦＰ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）試薬を用いて製造社のプロトコルによって伝達した後、ヒトｍｉＲ−３０２とｍｉＲ−３７２配列に基づいてガイド鎖とパッセンジャー鎖を上記実施例のようにバイオニアで合成製作して、二重体で製造し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）試薬を用いて５０ｎＭ濃度で順次的伝達をした。また、ｍｉＲ−３０２とｍｉＲ−３７２の非正規ＧＡ配列シード標的特異的ｓｉＲＮＡの製作は、シード内Ｇ塩基をＵに置換して上記例と同一に準備して、５０ｎＭ濃度で細胞に伝達した。これに使用された核酸の塩基配列は、次の通りである（ｍｉＲ−３０２：５’−ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵＵＧＧＵＧＡ−３’；ｍｉＲ−３０２−４ＧＵ：５’−ＵＡＡＵＵＧＣＵＵ  ＣＣＡＵＧＵＵＵＵＧＧＵＧＡ−３’；ｍｉＲ−３０２パッセンジャー鎖：５’−ＡＣＵＵＡＡＡＣＧＵＧＧＡＵＧＵＡＣＵＵＧＣＵ−３’；ｍｉＲ−３７２：５’−ＡＡＡＧＵＧＣＵＧＣＧ  ＡＣＡＵＵＵＧＡＧＣＧＵ−３’；ｍｉＲ−３７２−Ｇ４Ｕ：５’−ＡＡＡＵＵＧＣ  ＵＧＣＧＡＣＡ  ＵＵＵＧＡＧＣＧＵ−３’、ｍｉＲ−３７２パッセンジャー鎖：５’−ＣＣＵＣＡＡＡＵＧＵＧＧＡＧＣＡＣＵＡＵＵＣＵ−３’）。このようにレポータベクターとＲＮＡを導入したＨｅＬａ細胞は、１４日間１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改質Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、トランスフェクション実行時は、抗生剤ない完全培地で細胞を培養した。
【０２４７】
その結果、ｍｉＲ−３０２やｍｉＲ−３７２が単独で伝達された実験群では、対照群に比べて群集形態（ｃｏｌｏｎｙ）の細胞成長を示したが、Ｏｃｔ４プロモーターの活性を示す緑色蛍光タンパク質発現が１４日培養時期までは観察されなかった。しかしながら、ｍｉＲ−３０２とｍｉＲ−３７２非正規ＧＡ配列シード標的抑制ｓｉＲＮＡが導入された実験群では、群集形態の細胞成長だけでなく、Ｏｃｔ４プロモーターの活性を示す緑色蛍光タンパク質発現が観察され（図２１ｂ−ｃ、赤色矢印）、これは、ｍｉＲ−３０２とｍｉＲ−３７２とそれぞれの非正規ＧＡ配列シード標的抑制ｓｉＲＮＡが同時に細胞に伝達されたとき、さらに強くて且つ大きい緑色蛍光タンパク質発現細胞群集を観察することができた（図２１ｂ−ｃ）。これを基にｍｉＲ−３０２とｍｉＲ−３７２非正規ＧＡ配列シード標的の阻害は、細胞を逆分化させ、Ｏｃｔ４発現を通じて分化能を獲得することを促進することができるという点が分かる。
【０２４８】
上記の実施例を通じて、ｍｉＲ−３７２−Ｇ４ＵとｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４Ｕは、従来のｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３０２のみを単独で発現させて細胞の逆分化を起こすことより効率的に細胞の逆分化を促進させることができるという点を観察することができ、これによって、ｍｉＲ−３７２−Ｇ４ＵとｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４Ｕは、細胞の逆分化を促進させる素材に使用され得るという点が分かる。
【０２４９】
［実施例２２］５’末端基準６番目に２’ＯＭｅ変形が当該ＲＮＡ干渉誘導体の非正規核隆起標的を抑制しない現象を確認
上記実施例において、非正規核隆起ターゲットが正規シードターゲットとは全く異なる新しい生物学的機能を示し、したがって、非正規核隆起ターゲットの発現阻害のみを調節するＲＮＡ干渉誘導核酸であるｍｉＲＮＡ−ＢＳを発明し、その機能を確認した。しかしながら、ｍｉＲＮＡ−ＢＳの場合にも、従来のｍｉＲＮＡの非正規核隆起サイトを相補的に配列するようにそのシード配列が変わったが、変わったシード配列を通じてさらに新しい核隆起サイトが生じることを確認することができた。したがって、ｍｉＲＮＡ−ＢＳのようなＲＮＡ干渉誘導核酸が正規シード配列のみを認識し、非正規核隆起サイトは認識しない技術が必要になることが分かった。これにより、本発明者らは、非正規核隆起結合をするためには、シード配列において５’末端基準６番位置の塩基が重要であり、この６番位置に塩基配列の配列強さによって非正規核隆起結合が起こる程度が変われることに注目して、６番位置の塩基配列強さを減らす目的で、次のような実験を進めた。すなわち、ｍｉＲ−１２４の６番ヌクレオチドのリボース環の２’位にメチル基（２’ＯＭｅ）を入れて変形し、変形された干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２４−６ｍｅ）がｍｉＲ−１２４の非正規核隆起ターゲット阻害機能があるかをルシフェラーゼレポータ実験で観察した。２’ＯＭｅ変形されたｍｉＲ−１２４は、合成（バイオニア社）を通じて製造し、以前の実施例２で行った方法と同じ方法でルシフェラーゼレポータ実験を進め、遺伝子抑制効率をＩＣ５０で測定した（図２２ａ）。この際、使用したルシフェラーゼレポータベクターは、ｍｉＲ−１２４の正規シードサイト（Ｌｕｃ−ｓｅｅｄ）と非正規核隆起サイト（Ｌｕｃ−ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ）に対するものを使用した。
【０２５０】
その結果、実施例２で示されたｍｉＲ−１２４による非正規隆起標的遺伝子阻害効果が消え、反面、正規シードサイトを通した遺伝子発現抑制は、ＩＣ５０値が０．３ｎＭであり、２’ＯＭｅを６番目ヌクレオイドに加えても、依然として優れた抑制効果を示すことが観察された（図２２ａ）。追加的に同じ方法でｍｉＲ−１２４でなく、他のマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１の６番目ヌクレオイドに２’ＯＭｅを適用し（ｍｉＲ−１−６ｍｅ）、これをｍｉＲ−１の正規シードサイト（Ｌｕｃ−ｓｅｅｄ）と非正規核隆起サイト（Ｌｕｃ−ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｕｌｇｅ）を含むルシフェラーゼベクターで標的に対する遺伝子発現阻害効果を調べたとき（図２２ｂ）、以前のｍｉＲ−１２４での結果と同一に、ｍｉＲ−１による非正規隆起標的遺伝子阻害効果が消え、反面、正規シードサイトを介した遺伝子発現抑制は、ＩＣ５０値が０．７ｎＭと優れていることことを確認することができた。上記の実施例を通じて、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸の５’末端基準６番目に２’ＯＭｅ変形を加えると、当該ＲＮＡ干渉誘導核酸により誘導される正規シード標的遺伝子の発現抑制効果は維持され、非正規核隆起標的遺伝子の発現抑制は消えることを確認することができた。
【０２５１】
［実施例２３］５’末端基準６番目に２’ＯＭｅ変形が転写体で全体非正規核隆起標的ｍＲＮＡを抑制しないことをＲＮＡ−Ｓｅｑ分析で確認
上記実施例２２においてｍｉＲ−１の６番目のヌクレオイドに２’ＯＭ変形を加えると（ｍｉＲ−１−６ｍｅ）正規シード標的遺伝子の発現抑制効果は維持され、非正規核隆起標的遺伝子の発現抑制は減少することを確認した。したがって、本発明者らが発明したｍｉＲ−１−６ｍｅが実際にｍｉＲ−１機能に関連したすべての遺伝子が発現している心筋細胞株であるｈ９ｃ２の転写体でｍｉＲ−１の非正規隆起標的遺伝子の抑制機能が減少したかを確認するために、ｍｉＲ−１とｍｉＲ−１−６ｍｅをｈ９ｃ２細胞に導入した後にＲＮＡ−Ｓｅｑ分析を施行した。ＲＮＡ−Ｓｅｑ実験は、実験対照群として美しい小さな線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のマイクロＲＮＡであるｃｅｌ−ｍｉＲ−６７の配列で５’末端基準６番を非塩基に変換したもの（ＮＴ−６ｐｉ）を使用して実施例７と同じ方法で実験を行った。この際、ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーは、Ｌｅｘｏｇｅｎ社のＳＥＮＳＥ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔを使用して製作し、その後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉｎｉＳｅｑを使用してシーケンシングした。
【０２５２】
その後、前記実験で得られた配列データであるＦＡＳＴＡＱファイルをＴｏｐＨａｔ２プログラムでラット遺伝体配列（ｒｎ６）にマッピングし、Ｃｕｆｆｌｉｎｋ、Ｃｕｆｆｄｉｆｆプログラムで発現値（ＦＰＫＭ）を求めて、対照群ＮＴ−６ｐｉを導入したｈ９ｃ２細胞での結果で標準化してログ比（Ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ，ｌｏｇ２  ｒａｔｉｏ）で示して分析を実施した。この際、マイクロＲＮＡの標的サイトを有している遺伝子の伝令ＲＮＡの量が当該マイクロＲＮＡの発現で阻害されるかをＲＮＡ−Ｓｅｑ結果で分析するために、ｍｉＲ−１の正規シードサイト（５’末端基準２番目から８番目までと塩基配列する７ｍｅｒ）を３’ＵＴＲに有している遺伝子を選別し、このようなプロファイル結果を当該マイクロＲＮＡの発現に依存的に阻害される順に累積比率（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）で比較分析した（図２３ａ）。その結果、ｍｉＲ−１とｍｉＲ−１−６ｍｅが全部ｍｉＲ−１の正規シードサイトを３’ＵＴＲに有している遺伝子（ｓｅｅｄ）を全体遺伝子（Ｔｏｔａｌ  ｍＲＮＡ）の分布に比べて非常によく抑制することができることを確認した。その後、同じ方法でｍｉＲ−１の非正規隆起サイト（ｎｕｃ、７ｍｅｒ）を３’ＵＴＲに有している遺伝子に対しても累積比率で分析して、ｍｉＲ−１−６ｍｅによりｍｉＲ−１の非正規核隆起標的遺伝子の発現阻害が減少したかをｍｉＲ−１が導入された細胞とｍｉＲ−１−６ｍｅが導入された細胞内での当該標的ｍＲＮＡの量を相対的に比較してみた（図２３ｂ）。その結果、ｍｉＲ−１では、ｍｉＲ−１−６ｍｅでの発現と比較したとき、全体遺伝子（Ｔｏｔａｌ  ｍＲＮＡ）に比べて有意に相対的に非正規核隆起標的遺伝子が依然として阻害されることを観察し、これを通してｍｉＲ−１−６ｍｅで当該非正規核隆起標的遺伝子の発現抑制が減少することを確認することができた。
【０２５３】
上記の実施例の結果から推察してみるとき、転写体水準で従来のマイクロＲＮＡは、従来の正規シード標的遺伝子とともに非正規隆起標的遺伝子を共に効率的に抑制するが、６番目のヌクレオイドに２’ＯＭｅ変形を加えたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ−６ｍｅ）は、依然として正規シード標的遺伝子を抑制するが、非正規隆起標的遺伝子は抑制しないことが分かった。したがって、５’末端基準６番目に加える２’ＯＭｅ変形は、ｍｉＲＮＡ−ＢＳに適用して当該ｍｉＲＮＡの非正規核隆起サイトのみを特異的に抑制しようとする本来の意図は維持しつつ、新しく現れることができる非正規核隆起結合は完全に除去することによって、その副作用を最小化することができる。
【０２５４】
［実施例２４］Ａｇｏ  ＨＩＴＳ  ＣＬＩＰ実験分析を通じて非正規核隆起サイトに結合するマイクロＲＮＡの同定
マイクロＲＮＡが非正規核隆起サイトのみを認識して抑制できるように作った発明が適用され得るマイクロＲＮＡを同定するために、マイクロＲＮＡの標的を転写体水準で分析できる方法であるＡｇｏ  ＨＩＴＳ  ＣＬＩＰ実験結果を分析して、非正規核隆起サイトに結合するマイクロＲＮＡを分析した。まず、生まれて１３日が過ぎったマウス（ｐ１３）の大脳皮質で行ったＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰデータを実施例１０での方法と同一に配列分析して、まず、アルゴノートとともに結合する発現上位２０個のマイクロＲＮＡが標的ｍＲＮＡと非正規核隆起サイトと結合するという事実を確認した（図２４ａ）。したがって、当該マイクロＲＮＡ（図２４ｂ）は、シード部分の塩基配列を通した標的ｍＲＮＡを認識するとき、シード部分を通した正規的な塩基配列だけでなく、非正規的に核隆起サイトを通じて標的ｍＲＮＡと結合できることが分かった。
【０２５５】
上記実施例のマウスＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰデータ分析から拡張して、ヒトの脳と心臓組織で行った他のＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ結果（ｂｏｕｄｒｅａｕ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ，２０１４，Ｎｅｕｒｏｎ，８１（２）２９４−３０５，Ｓｐｅｎｇｌｅｒ  ＲＭ  ｅｔ  ａｌ，２０１６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４４（１５）７１２０−７１３１）を上記の実施例と同じ方法で分析し、Ａｇｏと当該マイクロＲＮＡが結合する正規シードサイトおよび非正規核隆起サイトの頻度数を計算した（ヒト脳マイクロＲＮＡ、表１；ヒト心臓マイクロＲＮＡ、表２）。
【０２５６】
【表１】
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【０２５７】
【表２】
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【０２５８】
その結果、当該結果表に記述されているマイクロＲＮＡ（表１〜表２）が当該組織で非正規核隆起サイトと結合しているという事実を確認することができた。したがって、上記実施例でＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰを分析したすべてのデータを総合して発掘されたマイクロＲＮＡに対して、非正規核隆起サイトを正規シードサイトと認識するように変形させる本発明を適用すると、下記表３に示されているように、トータル４２６個の配列（ＢＳ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）でＲＮＡ干渉核酸の５’末端基準２番目から７番目までのヌクレオイドが構成され、このように変形されたＲＮＡ干渉核酸は、当該マイクロＲＮＡの非正規隆起標的のみを結合し、当該機能のみを示すことになる。
【０２５９】
【表３】
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【０２６０】
上記の実施例のＡｇｏ  ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ実験シーケンシング分析を通じて、様々な組織細胞で非正規隆起標的に結合するマイクロＲＮＡを同定し、これに非正規核隆起サイトを正規シードサイトと認識するように変形させる本発明を適用すると、トータル４２６個の配列（ＢＳ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が作られることになり、これによって、マイクロＲＮＡの非正規標的抑制機能のみを示す技術を完成した。
【０２６１】
［実施例２５］癌患者マイクロＲＮＡシーケンシングデータベース（ＴＣＧＡ）で配列変異を分析し、これを通して非正規Ｇ：Ａワブルシード配列サイトに結合するマイクロＲＮＡの同定
上記の実施例を通じてマイクロＲＮＡが非正規的にＧ：Ａワブルサイトと結合して標的遺伝子発現を阻害するという事実を確認し、これを通して本発明で非正規Ｇ：Ａワブルサイトを正規シードサイトと認識するように配列を変形するマイクロＲＮＡ配列変換方式（ｍｉＲＮＡ−ＢＳ）を開発した。このように従来のマイクロＲＮＡシード配列にあるＧを通じてワブル配列で標的ｍＲＮＡのＡと結合することがマイクロＲＮＡの機能を変える場合、このような機序が腫瘍のような疾病でマイクロＲＮＡの配列変異を通じて現れることができるという考えから、癌患者の組織でマイクロＲＮＡをシーケンシングした結果（ｍｉＲＮＡ−Ｓｅｑ）を分析した。この際、癌患者マイクロＲＮＡ配列実験関連ＴＣＧＡデータベースから８１０５個を得、追加でＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）データベースから癌関連マイクロＲＮＡ配列結果４６８個を得て、トータル８，５７３個の腫瘍マイクロＲＮＡ配列結果を実施例１０で使用した方法と同一にｂｏｗｔｉｅ２プログラムを通じてマッピングし、変異が起こった部位を分析した。この際の各癌の種類別に分析に使用されたマイクロＲＮＡ配列データは、図２５ａに示されているのと同じである。
【０２６２】
当該結果で変異が起こった頻度（ｆｒａｃｔｉｏｎ）をマイクロＲＮＡ  ５’末端基準位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）別に区分して最も多く起こった変異１０，０００個（ｔｏｐ  １００００）と最も少なく起こった変異１０，０００個（ｂｏｔｔｏｍ  １００００）の分布を調べた結果（図２５ｂ）、最も多く起こった変異１０，０００個の場合には、マイクロＲＮＡのシード部分（２番目から８番目の間）に主に起こるという点を観察することができた。また、最も多く起こった変異１００個と最も少なく起こった変異１００個をｈｅａｔｍａｐ上で調べたときにも（図２５ｃ）、上記で実施例と同一に変異がシード領域に集まっていることが分かった。このようにシード部分に現れる傾向性を示す腫瘍マイクロＲＮＡの配列変異は、これを逆転写させてＤＮＡで配列分析した当該結果で塩基構成としてそれぞれＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇに区分して調べたとき、ただＧのみがシード配列で形成される傾向性を示した（図２５ｄ）。このような傾向性は、上位変異率１００個に対してだけでなく、これを超えて変異が起こるすべての場合に、Ｇで主に変異が起こることをさらに確認することができた（図２５ｅ）。
【０２６３】
これは、本発明者が注目した非正規Ｇ：Ａワブルを認識するマイクロＲＮＡのＧが反対側の標的ｍＲＮＡのＡをさらによく結合するために、Ｕに変異されて現れる現象であり得、実際に上位変異率で現れるＧに起こる変異でどんな塩基に変わったかを分析してみた結果（図２５ｆ）、大部分が逆転写させてＤＮＡで配列分析した当該結果でＧからＴに変わったことを観察した。このような結果は、マイクロＲＮＡが実際に癌組織ではシード部分に存在するＧが非正規Ｇ：Ａワブルシード標的をさらによく正規シードと認識するために、自分のＧをＵに変えて標的のＡと塩基配列することを意味し、したがって、このような方式の変異は、本発明で開発した非正規Ｇ：Ａワブルシード配列を正規シード配列と認識するようにする配列決定方式をいかなるマイクロＲＮＡのどんな位置のＧに適用しなければならないかを知らせる。したがって、このような結果を全部総合して、癌患者当たり正規化変異頻度数が２以上であるマイクロＲＮＡを選定した（表４参照）。表４に示されているように、トータル３３５個の配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ（Ｇ＞Ｕ））でＲＮＡ干渉核酸の５’末端基準２番目からヌクレオイドが構成され、このように変形されたＲＮＡ干渉核酸は、当該マイクロＲＮＡの非正規Ｇ：Ａワブル隆起標的のみを結合し、当該機能のみを示すことになる。
【０２６４】
【表４】
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【０２６５】
上記実施例のマイクロＲＮＡシーケンシング変異分析を通じて、様々な癌患者で非正規Ｇ：Ａワブルシード標的を正規標的と認識する変異マイクロＲＮＡを同定し、これに非正規Ｇ：Ａワブルシードサイトを正規シードサイトと認識するように変形させる本発明（ｍｉＲＮＡ−ＧＵ）を適用すると、トータル３３５個の配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ（Ｇ＞Ｕ））が作られ（表４）、これによって、マイクロＲＮＡの非正規標的抑制機能のみを示す技術を完成した。
【産業上の利用可能性】
【０２６６】
本発明によるＲＮＡ干渉誘導核酸を用いると、マイクロＲＮＡが非正規標的遺伝子を抑制することによって示す生物学的な機能を効率的に増大したり、従来のマイクロＲＮＡが示す機能のうち一部、すなわち非正規標的遺伝子を抑制することによって示す生物学的機能のみを選択的に示す効果を有し、本発明の干渉誘導核酸を通じて細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節が可能であところ、薬物、化粧品など多様な分野において活用が可能なものと期待される。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図１０ａ】
2021525527.tif 000073
【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２１ｃ】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２５ｃ】
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【図２５ｄ】
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【図２５ｅ】
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【図２５ｆ】
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【配列表】
2021525527000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月29日(2021.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴として、または
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）またはアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、当該部位のＧ：ＡまたはＧ：Ｕワブル配列がＵ：ＡまたはＡ：Ｕの正規的な塩基配列になるようにすることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項２】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子を選択的に抑制し、マイクロＲＮＡの正規標的遺伝子は抑制しないことを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項３】
前記特定マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１，ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−３０２およびｍｉＲ−３７２よりなる群から選ばれて、同じシード配列を有して１８〜２４個の塩基で構成された1つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項４】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端２番目から７番目の塩基配列が下記のうちいずれか1つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸：
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＡＡ  ＧＧＣ  Ｃ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２４−ＢＳ）；
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＧＧ  ＡＧＵ  Ｕ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２２−ＢＳ）；
ｍｉＲ−１５５の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＡ  ＡＵＧ  Ｇ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１５５−ＢＳ）；または
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＧＧ  ＡＡＵ  Ｕ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１−ＢＳ）。
【請求項５】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸の塩基配列が下記のうちいずれか1つ以上で示すことを特徴とする請求項４に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸：
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＡＡ  ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＧＣＧ  ＧＵＧ  ＡＡＵ  ＧＣＣ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２４−ＢＳ）；
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＧＵ  ＧＡＣ  ＡＡＵ  ＧＧＵ  ＧＵＵ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１２２−ＢＳ）；
ｍｉＲ−１５５の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＵＡ  ＡＵＧ  ＧＣ  ＵＡＡ  Ｕ  ＣＧＵ  ＧＡＵ  ＡＧＧ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１５５−ＢＳ）；
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＧＧ  ＡＡＵ  ＵＧＵ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＧＵＡ  ＵＧＵ−３’の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸（ｍｉＲ−１−ＢＳ）。
【請求項６】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列が下記のうちいずれか1つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸：
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＡＡ  ＵＧＣ  ＡＣＧ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＡＡ  ＧＵＣ  ＡＣＧ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕ）または５’−ＵＡＡ  ＵＵＣ  ＡＣＧ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４，５Ｕ）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＧＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＧＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＡＵ  ＵＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＡＡＵ  ＧＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，３Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＵＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ３，７Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＵＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，７Ｕ）または５’−ＵＵＵ  ＡＡＵ  ＵＵＡ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，３，７Ｕ）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＧＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ９Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，５Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，７Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，９Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＵＵ  ＧＵＧ（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，５Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，７Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，９Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＵＵＧ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，７Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＵ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，９Ｕ）、または５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＵ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７，９Ｕ）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１３３の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＵＵ  ＵＧＵ  ＣＣＣ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＧＵＵ  ＣＣＣ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ５Ｕ）または５’−ＵＵＵ  ＵＵＵ  ＣＣＣ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ４，５Ｕ）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｌｅｔ−７の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＧＧＵ  ＡＵＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ８Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，４Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，５Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＵＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，８Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＵＵ  ＡＧＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，５Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＵＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，８Ｕ）、または５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＵＵ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５，８Ｕ）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−３０２ａの非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ６Ｕ）、または５’−ＵＡＡ  ＵＵＵ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４，６Ｕ）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；または
ｍｉＲ−３７２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＡＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＧ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＧ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ６Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＧＵＧ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ９Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＵＵＵ  ＣＵＧ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４，６Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４，９Ｕ）、または５’−ＡＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ６，９Ｕ）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項７】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸の塩基配列が下記のうちいずれか1つ以上で示すことを特徴とする請求項６に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸：
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＡＡ  ＵＧＣ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＵＧＡ  ＡＵＧ  ＣＣＡ  Ａ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＡＡ  ＧＵＣ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＵＧＡ  ＡＵＧ  ＣＣＡ  Ａ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ５Ｕ）または５’−ＵＡＡ  ＵＵＣ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＵＧＡ  ＡＵＧ  ＣＣＡ  Ａ−３’（ｍｉＲ−１２４−Ｇ４，５Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
５’−ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＧＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＧＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ３Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＡＵ  ＵＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ７Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＡＡＵ  ＧＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，３Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＵＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ３，７Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＵＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，７Ｕ）または５’−ＵＵＵ  ＡＡＵ  ＵＵＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＵＡＵ  ＧＵＡ  Ｕ−３’（ｍｉＲ−１−Ｇ２，３，７Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＧＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ９Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＡＧＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，３Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＵＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，５Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＵＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，７Ｕ）、５’−ＵＵＧ  ＡＧＵ  ＧＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ２，９Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＵＵ  ＧＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，５Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＵＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，７Ｕ）、５’−ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＧＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３（ｍｉＲ−１２２−Ｇ３，９Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＵＵＧ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，７Ｕ）、５’−ＵＧＧ  ＡＵＵ  ＧＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ５，９Ｕ）または５’−ＵＧＧ  ＡＧＵ  ＵＵＵ  ＡＣＡ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  ＵＵＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１２２−Ｇ７，９Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−１３３の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＵＵ  ＵＧＵ  ＣＣＣ  ＣＵＵ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＵＵ  ＧＵＵ  ＣＣＣ  ＣＵＵ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ５Ｕ）または５’−ＵＵＵ  ＵＵＵ  ＣＣＣ  ＣＵＵ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＵ  Ｇ−３’（ｍｉＲ−１３３−Ｇ４，５Ｕ）の塩基配列を含むＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｌｅｔ−７の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸てあって、５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＧＧＵ  ＡＵＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ８Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＵＧＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，４Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＧＵＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，５Ｕ）、５’−ＵＵＡ  ＧＧＵ  ＡＵＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ２，８Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＵＵ  ＡＧＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，５Ｕ）、５’−ＵＧＡ  ＵＧＵ  ＡＵＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ４，８Ｕ）または５’−ＵＧＡ  ＧＵＵ  ＡＵＵ  ＡＧＧ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＡＧＵ  Ｕ−３’（ｌｅｔ−７−Ｇ５，８Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸；
ｍｉＲ−３０２ａの非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＵＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＵ  ＣＣＡ  ＵＧＵ  ＵＵＵ  ＧＧＵ  ＧＡ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４Ｕ）、５’−ＵＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＵ  ＣＣＡ  ＵＧＵ  ＵＵＵ  ＧＧＵ  ＧＡ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ６Ｕ）、または５’−ＵＡＡ  ＵＵＵ  ＣＵＵ  ＣＣＡ  ＵＧＵ  ＵＵＵ  ＧＧＵ  ＧＡ−３’（ｍｉＲ−３０２ａ−Ｇ４，６Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸；または
ｍｉＲ−３７２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、５’−ＡＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＧ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＧ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ６Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＧＵＧ  ＣＵＵ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ９Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＵＵＵ  ＣＵＧ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４，６Ｕ）、５’−ＡＡＡ  ＵＵＧ  ＣＵＵ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ４，９Ｕ）、または５’−ＡＡＡ  ＧＵＵ  ＣＵＵ  ＣＧＡ  ＣＡＵ  ＵＵＧ  ＡＧＣ  ＧＵ−３’（ｍｉＲ−３７２−Ｇ６，９Ｕ）の塩基配列を示すＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含むマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含む細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節用組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、下記のうちいずれか1つ以上であることを特徴とする請求項９に記載の組成物：
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む癌細胞死滅誘導用組成物；
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む神経突起分岐分化誘導用組成物；
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む肝癌細胞の細胞周期停止誘導用組成物；
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む筋細胞分化促進または筋線維化促進用組成物；
ｍｉＲ−１５５の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む筋細胞死滅誘導用組成物；
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む神経芽細胞腫の細胞死滅促進用組成物；
ｍｉＲ−１２４の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む神経芽細胞腫の細胞分裂増殖促進用組成物；
ｍｉＲ−１の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む心筋肥大誘導用組成物；
ｍｉＲ−１３３の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む心筋肥大誘導用組成物；
ｌｅｔ−７の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む癌細胞の細胞周期停止誘導用組成物；
ｌｅｔ−７の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む肝細胞の細胞周期進行活性誘導用組成物；
ｍｉＲ−３０２ａの非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む逆分化促進用組成物；
ｍｉＲ−３７２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む逆分化促進用組成物；または
ｍｉＲ−１２２の非正規標的遺伝子を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸を含む肝癌細胞の細胞移動阻害用組成物。
【請求項１１】
下記の段階を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法：
特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階、または
特定マイクロＲＮＡの５’末端から９番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）またはアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、当該部位のＧ：ＡまたはＧ：Ｕワブル配列がＵ：ＡまたはＡ：Ｕの正規的な塩基配列になるようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を対象細胞にトランスフェクションする段階；
対象細胞に試験物質を処理する段階；および
対象細胞でＲＮＡ干渉誘導核酸が抑制するマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子の発現量乃至発現有無を確認する段階を含む、
細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節用試験物質をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴とし、
前記特定マイクロＲＮＡは、５’末端から６番目のヌクレオチドのリボース環の２’位にメチル基（２’ＯＭｅ）が添加されたことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項１４】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、当該ＲＮＡ干渉誘導核酸の正規シード標的遺伝子の発現のみを抑制することを特徴とする請求項１３に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項１５】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの非正規核隆起サイトのみを特異的に抑制し、新しく発生しうる非正規核隆起サイトを除去することを特徴とする請求項１３に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含むマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項１７】
下記の段階を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階；および
前記特定マイクロＲＮＡの５’末端から６番目のヌクレオチドのリボース環の２’位にメチル基（２’ＯＭｅ）を添加する段階を含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法。
【請求項１８】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項１９】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、非正規核隆起標的サイトのみを選択的に抑制し、マイクロＲＮＡの正規標的遺伝子は抑制しないことを特徴とする請求項１８に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項２０】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、下記表に示した配列番号１０３〜５２８のうちいずれか1つ以上で表示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項１８に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
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【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含むマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項２２】
下記の段階を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から５番目の４個の塩基配列を含み、６番目と７番目の塩基は、同一であり、６番目と７番目の塩基は、特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロＲＮＡの６番目の塩基と配列できる塩基には、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロＲＮＡの５番目と６番目の間に標的遺伝子で隆起（ｂｕｌｇｅ）が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階を含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法。
【請求項２３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸であって、
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目から９番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有し、当該部位のＧ：Ａワブル（ｗｏｂｂｌｅ）がＵ：Ａの正規的な塩基配列になるようにすることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項２４】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目の塩基から始まって６個〜８個の連続的な塩基配列を含み、
前記塩基配列は、グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）塩基に少なくとも1つ以上置換されたことを特徴とする請求項２３に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項２５】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、Ｇ：Ａワブル（ｗｏｂｂｌｅ）配列で結合するマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子のみを選択的に抑制し、マイクロＲＮＡの正規標的遺伝子は抑制しないことを特徴とする請求項２３に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
【請求項２６】
前記ＲＮＡ干渉誘導核酸は、５’末端から２番目の塩基から始まって６個〜８個の連続的な塩基配列が下記表に示した配列番号５２９〜８６３のうちいずれか1つ以上で表示されることを特徴とする請求項２４に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸。
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【請求項２７】
請求項２３〜２６のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含むマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項２８】
下記の段階を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロＲＮＡの一部配列が変形されてマイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の発現を抑制するＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロＲＮＡの５’末端から２番目の塩基から始まって６個〜８個の連続的な塩基配列のうちグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）塩基がウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにＲＮＡ干渉誘導核酸を作製する段階を含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導核酸の製造方法。
【請求項２９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する段階を含む、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制方法。
【請求項３０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸の、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用途。
【請求項３１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する段階を含む、細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節方法。
【請求項３２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸の、細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節用途。
【請求項３３】
請求項１３〜１５のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する段階を含む、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制方法。
【請求項３４】
請求項１３〜１５のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸の、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用途。
【請求項３５】
請求項１８〜２０のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する段階を含む、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制方法。
【請求項３６】
請求項１８〜２０のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸の、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用途。
【請求項３７】
請求項２３〜２６のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する段階を含む、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制方法。
【請求項３８】
請求項２３〜２６のいずれか1項に記載のＲＮＡ干渉誘導核酸の、マイクロＲＮＡの非正規標的遺伝子発現抑制用途。
【国際調査報告】
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