(57)【要約】  本発明は、眼障害（例えば黄斑変性症など）の処置におけるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストの使用、ならびにＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた被験体の処置の適合性についての診断バイオマーカーとしての房水及び硝子体液中のＨＴＲＡ１レベルの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた投与についての被験体の処置の適合性を決定するための方法であって、前記方法は以下の工程を含み：
ｉ）被験体から得られた房水又は硝子体液のサンプル中のＨＴＲＡ１のレベルを決定すること
ｉｉ）工程ｉ）から得られたＨＴＲＡ１のレベルを、１つ以上の参照サンプル又は参照値と比較し；
被験体が、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた処置となる可能性が高い、又はそれに適合であるか否かを決定すること、
ここで、被験体は、眼障害（例えば黄斑変性症など）に罹患している、又はそれを発生するリスクがある、方法。
【請求項２】
房水又は硝子体液のサンプル中のＨＴＲＡ１のレベルが、サンプル中のＨＴＲＡ１タンパク質のレベルを定量化することにより決定される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＨＴＲＡ１タンパク質のレベルが、イムノアッセイを使用して（例えばＨＴＲＡ１特異的抗体を使用する、など）決定される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＨＴＲＡ１タンパク質のレベルが、質量分析を使用して決定される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
参照サンプル又は参照値の少なくとも１つが、黄斑変性症に罹患している対照被験体から得られる、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
参照サンプル又は参照値の少なくとも１つが、黄斑変性症に罹患していない対照被験体から得られる、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
参照サンプルの少なくとも１つが、処置の適合性が評価されている同じ被験体から以前に得られた値である、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
参照値が、網膜中のＨＴＲＡ１濃度及び房水又は硝子体液中のＨＴＲＡ１濃度の間の相関をモデル化するデータセットから由来する、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストが、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡを標的とするリボザイムからなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
方法が、被験体が網膜において増強されたＨＴＲＡ１発現を有するか否かを決定するためである、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
被験体が、黄斑変性疾患、例えば加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）（ウェット型（滲出型）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性のウェット型ＡＭＤを含む））及びドライ型（非滲出型）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性のドライ型ＡＭＤ（例、地図状委縮（ＧＡ））を含む）；糖尿病性網膜症（ＤＲ）及び他の虚血関連網膜症；眼内炎；ブドウ膜炎；脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）；未熟児網膜症（ＲＯＰ）；ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）；糖尿病性黄斑浮腫；病理学的近視；フォンヒッペル−リンダウ病；眼のヒストプラスマ症；網膜中心静脈閉塞（ＣＲＶＯ）；角膜血管新生；及び網膜血管新生からなる群より選択される眼障害に罹患している又はそれを発生するリスクがある、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
被験体が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、例えばウェット型（滲出型）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性のウェット型ＡＭＤを含む）、ドライ型（非滲出型）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性のドライ型ＡＭＤ（例、地図状委縮（ＧＡ））を含む）からなる群より選択されるＡＭＤなどに罹患している又はそれを発生するリスクのある、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
方法が、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた投与のための適切な投与計画を決定するためである、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストが、ＨＴＲＡ１標的核酸配列（例えば配列番号１又は配列番号２など）に完全に相補的である１０〜３０ヌクレオチドの近接ヌクレオチド領域を含むオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストが、配列番号７又は配列番号１６に少なくとも９０＆相補的である、例えば完全に相補的である少なくとも１２ヌクレオチドの長さの近接ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである又はそれを含む、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドなどである又はそれを含む、請求項１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストが、以下からなる群：
【化１２】
2021507253.tif 000017
ここで、大文字はベータＤオキシＬＮＡヌクレオシド単位を表し、小文字はＤＮＡヌクレオシド単位を表し、下付きのｓはホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し、ｍｃは５メチルシトシンＤＮＡヌクレオシドを表し、及び全てのＬＮＡシトシンは５−メチルシトシン；又はその医薬的に許容可能な塩
より選択される、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
黄斑変性症に罹患している又はそれを発生するリスクがある被験体を処置するための方法であって、前記方法は、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法を実施すること、及び被験体に有効量のＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを投与することを含む方法。
【請求項１９】
ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストが硝子体内投与を介した投与用である、請求項１〜１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
ＨＴＲＡ１  ＲＮＡアンタゴニスト治療用のコンパニオン診断薬としてのＨＴＲＡ１抗体の使用。
【請求項２１】
例えば請求項１〜２０のいずれか一項記載の、ＨＴＲＡ１  ＲＮＡアンタゴニスト治療薬、例えばＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストなどについての有効性についてのバイオマーカーとしてのＨＴＲＡ１抗体の使用。
【請求項２２】
例えば請求項１〜２１のいずれか一項記載の、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた処置を受けている、又はＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた処置の適合性について評価されている被験体から得られた房水又は硝子体液サンプル中のＨＴＲＡ１レベルの検出におけるＨＴＲＡ１抗体の使用。
【請求項２３】
例えば請求項１〜２２のいずれか一項記載の、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを含む治療的薬剤への被験体の可能性の高い応答を決定するためのバイオマーカーの使用であって、ここで、バイオマーカーは、健常な被験体からの参照サンプルから得られたＨＴＲＡ１のレベルと比較して、被験体の房水又は硝子体液から得られた生物学的サンプル中の上昇したＨＴＲＡ１のレベルを含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、眼障害（例えば黄斑変性症など）の処置におけるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストの使用、ならびにＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた被験体の処置の適合性についての診断バイオマーカーとしての房水及び硝子体液中のＨＴＲＡ１レベルの使用に関する。
【０００２】
背景
【０００３】
セリンプロテアーゼのヒト高温要求Ａ（ＨＴＲＡ）ファミリーは、プロテアーゼ及びシャペロンの二重機能を組み合わせることにより、細胞外画分においてタンパク質ホメオスタシスを維持することに含まれる、遍在的に発現するＰＤＺプロテアーゼである。ＨＴＲＡプロテアーゼは、細胞外マトリックスの組織化、細胞増殖、及び老化において関与する。ＨＴＲＡ活性の調節は、重度の疾患［デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Bakay et al. 2002, Neuromuscul. Disord. 12: 125-141）、関節炎、例えば変形性関節症など（Grau et al. 2006, JBC 281: 6124-6129）、癌、家族性虚血性脳小血管疾患及び加齢性黄斑変性症、ならびにパーキンソン病及びアルツハイマー病などを含む］に関係付けられる。ヒトＨＴＲＡ１は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合ドメインを含む。それは、ＩＧＦの可用性及び細胞成長を調節し（Zumbrunn and Trueb, 1996, FEES Letters 398:189-192）、腫瘍抑制特性を示すことが提唱されてきた。ＨＴＲＡ１発現は転移性メラノーマにおいて下方調節されており、このように、メラノーマの進行の程度を示しうる。転移性メラノーマ細胞株におけるＨＴＲＡ１の過剰発現によって、インビトロでの増殖及び浸潤が低下し、異種移植マウスモデルにおいて腫瘍成長が低下した（Baldi et al., 2002, Oncogene 21:6684-6688）。ＨＴＲＡ１発現はまた、卵巣癌において下方調節されている。卵巣癌細胞株においては、ＨＴＲＡ１過剰発現によって細胞死が誘導され、アンチセンスＨＴＲＡ１発現によって足場非依存性成長が促進された（Chien et al., 2004, Oncogene 23:1636-1644）。
【０００４】
ＩＧＦ経路に対するその効果に加えて、ＨＴＲＡ１はまた、成長因子のＴＧＦβファミリーによるシグナル伝達を阻害する（Oka et al., 2004, Development 131:1041-1053）。ＨＴＲＡ１はアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を切断することができ、及びＨＴＲＡ１阻害剤は培養細胞においてＡβペプチドの蓄積を起こす。このように、ＨＴＲＡ１はまた、アルツハイマー病において関与する（Grau et al.,2005, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 102:6021-6026）。
【０００５】
さらに、ＨＴＲＡ１上方調節が観察されており、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Bakay et al. 2002, Neuromuscul. Disord. 12: 125-141）及び変形性関節症（Grau et al. 2006, JBC 281: 6124-6129）及びＡＭＤ（Fritsche, et al. Nat Gen 2013 45(4):433-9.）に関連付けられるように思われる。
【０００６】
ＨＴＲＡ１プロモーター領域中の一塩基多型（ＳＮＰ）（ｒｓ１１２００６３８）は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を発生する１０倍増加したリスクに関連付けられる。さらに、ＨＴＲＡ１  ＳＮＰは、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を発生するリスク増加に関連付けられるＡＲＭＳ２  ＳＮＰ（ｒｓ１０４９０９２４）との連鎖不平衡にある。リスク対立遺伝子は、２〜３倍増加したＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ及びタンパク質発現に関連付けられ、及びＨＴＲＡ１は、ＡＭＤを伴う患者におけるドルーゼン中に存在する（Dewan et al., 2006, Science 314:989-992；Yang et al., 2006, Science 314:992-993）。ＨｔｒＡ１の過剰発現によって、マウスにおいてＡＭＤ様の表現型が誘導される。ｈＨＴＲＡトランスジェニックマウス（Veierkottn, PlosOne 2011）によって、ブルッフ膜の弾性板の分解が明らかになり、脈絡膜血管異常が決定され（Jones, PNAS 2011）、及びポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）病変が増加する（Kumar, IOVS 2014）。加えて、ｈＨＴＲＡ１  Ｔｇマウスにおけるブルッフ膜損傷（タバコの煙への曝露時に決定される）によって、ＣＮＶが３倍増加することが報告されている（Nakayama, IOVS 2014）。
【０００７】
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、６５歳を上回る人々における不可逆的な視力の喪失の主な原因である。ＡＭＤの発症に伴い、眼の裏における感光性の光受容細胞（それらを代謝的に支持する下層の色素上皮細胞）及びそれらによって提供される鋭い中心視野の緩やかな喪失がある。年齢はＡＭＤの発症についての主要なリスク因子である：ＡＭＤを発生する可能性は５５歳以後に３倍になる。喫煙、明るい虹彩色、性別（女性にはより大きなリスクがある）、肥満、及びＵＶ照射への反復曝露によって、また、ＡＭＤのリスクは増加する。ＡＭＤ進行は、３つの段階において定義することができる：１）早期、２）中等度、３）進行性ＡＭＤ。進行性ＡＭＤの２つの形態がある：ドライ型ＡＭＤ（また、地図状委縮、ＧＡと呼ぶ）及びウェット型ＡＭＤ（また、滲出型ＡＭＤとして公知である）。ドライ型ＡＭＤは、光受容体及び網膜色素上皮細胞の喪失により特徴付けられ、視力喪失に導く。ウェット型ＡＭＤは、病的な脈絡膜（また、網膜下として言及する）血管新生に関連付けられる。この過程において形成している異常な血管からの漏出によって、黄斑が損傷され、視力が損なわれ、最終的には失明にいたる。一部の場合では、患者は両方の型の進行性ＡＭＤに関連付けられる病理を呈しうる。ウェット型ＡＭＤについての処置戦略では、眼中への頻繁な注射が要求され、主に疾患進行を遅延させることに焦点が当てられている。現在、承認された処置は、ドライ型ＡＭＤについては利用可能ではない。
【０００８】
ＷＯ２０１７／０７５２１２は一般的に、抗ＨｔｒＡ１抗体及び同を使用する方法に関し、患者の選択のためのバイオマーカーとしての抗Ｈｔｒａ１抗体の使用を含む。
Tosi et al., IOVS 20017, p162 - 167では、血管新生加齢黄斑変性症を伴う患者の房水における上昇したＨＴＲＡ１濃度、及び房水におけるＨＴＲＡ１のレベルが、ラニビズマブ、及びＶＥＧＦ−Ａを標的とする抗体を用いた処置後に正常化されることが報告されている。
【０００９】
ＷＯ２００８／０１３８９３では、ＨＴＲＡ１遺伝子又はｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス配列を含む核酸分子を含む、加齢黄斑変性症に罹患している被験体を処置するための組成物が請求されている：アンチセンス分子は開示されていない。ＷＯ２００９／００６４６０では、ＨＴＲＡ１を標的とするｓｉＲＮＡ及びＡＭＤを処置する際でのそれらの使用が提供されている。
【００１０】
ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５９３７及びＥＰ１７１７３９６４．２では、それらの両方を、それらの全体において参照により組み入れ、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡの強力なインビボ阻害剤であるアンチセンスオリゴヌクレオチド及びそれらの治療的な使用（黄斑変性症を処置するための使用を含む）が開示されている。
【００１１】
発明の概要
【００１２】
本発明者らは、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いて処置された被験体からの網膜上皮細胞におけるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡの阻害と、被験体の房水及び硝子体液におけるＨＴＲＡ１タンパク質のレベルの間に直接的な相関があることを決定している。直接的な相関によって、診断的又は予後的な使用のためのバイオマーカーとしてのＨＴＲＡ１の使用が可能になり、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた処置、ならびに、例えば、患者モニタリングにおけるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニスト治療薬を用いたコンパニオン診断ついての被験体の適合性を決定する。
【００１３】
本発明は、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた投与についての被験体の処置の適合性を決定するための方法を提供し、前記方法は、以下の工程を含む：
ｉ）被験体から得られた房水又は硝子体液のサンプル中のＨＴＲＡ１のレベルを決定すること
ｉｉ）工程ｉ）から得られたＨＴＲＡ１のレベルを、１つ以上の参照サンプル又は参照値と比較すること；
被験体が、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた処置となる可能性が高い、又はそれに適合であるか否かを決定するためであって、
ここで、被験体は、眼障害（例えば黄斑変性症など）に罹患している、又はそれを発生するリスクがある。
【００１４】
本発明は、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた投与についての被験体の処置の適合性を決定するための診断的又は予後的な方法を提供し、前記方法は、以下の工程を含む：
ｉ）被験体から得られた房水又は硝子体液のサンプル中のＨＴＲＡ１のレベルを決定すること
ｉｉ）工程ｉ）から得られたＨＴＲＡ１のレベルを、１つ以上の参照サンプル又は参照値と比較すること；
被験体が、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた処置となる可能性が高い、又はそれに適合であるか否かを決定するためであって、
ここで、被験体は、眼障害（例えば黄斑変性症など）に罹患している、又はそれを発生するリスクがある。
【００１５】
本発明は、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた処置を必要とする被験体への、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストについての適切な投与計画を決定する方法を提供し、前記方法は、以下の工程を含む：
ｉ）被験体から得られた房水又は硝子体液のサンプル中のＨＴＲＡ１のレベルを決定すること
ｉｉ）工程ｉ）から得られたＨＴＲＡ１のレベルを、１つ以上の参照サンプル又は参照値と比較すること；
被験体が、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた処置となる可能性が高い、又はそれに適合であるか否かを決定するためであって、
ここで、被験体は、眼障害（例えば黄斑変性症など）に罹患している、又はそれを発生するリスクがある。
【００１６】
有利には、本発明の方法又は使用において言及される被験体から得られたサンプルは、被験体の房水のサンプルである。
【００１７】
本発明は、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた処置を必要とする被験体、例えば、黄斑変性症に罹患している、又はそれを発生するリスクがある被験体の処置の方法を提供し、前記方法は、以下を含む：
ｉ）被験体から得られた房水又は硝子体液のサンプル中のＨＴＲＡ１のレベルを決定すること
ｉｉ）工程ｉ）から得られたＨＴＲＡ１のレベルを、１つ以上の参照サンプル又は参照値と比較すること；
ｉｉｉ）被験体が、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた処置となる可能性が高い、又はそれに適合であるか否かを決定するためであって、
ｉｖ）有効量のＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを被験体に投与すること。
【００１８】
本発明は、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニスト治療薬のためのコンパニオン診断としてのＨＴＲＡ１抗体の使用を提供する。
【００１９】
本発明は、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた処置を受けている、又はＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた処置の適合性について評価されている被験体から得られた房水又は硝子体液サンプル中のＨＴＲＡ１レベルの検出におけるＨＴＲＡ１抗体の使用を提供する。
【００２０】
本発明は、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを含む治療用薬剤への、被験体の可能性の高い応答を決定するためのバイオマーカーの使用を提供し、ここで、バイオマーカーは、健常な被験体からの参照サンプルから得られたＨＴＲＡ１のレベルと比較して、被験体の房水又は硝子体液から得られた生物学的サンプル中の上昇したＨＴＲＡ１のレベルを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＨＴＲＡ１の例示的なＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドアンタゴニスト（配列番号１３、化合物ＩＤ＃１３、１）。
【図２】ＨＴＲＡ１の例示的なＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドアンタゴニスト（配列番号１５、化合物ＩＤ＃１５、３）。
【図３】ＨＴＲＡ１の例示的なＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドアンタゴニスト（配列番号１７、化合物ＩＤ＃１７）。
【図４】ＨＴＲＡ１の例示的なＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドアンタゴニスト（配列番号１８、化合物ＩＤ＃１８）。
【図５】ＨＴＲＡ１の例示的なＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドアンタゴニスト（配列番号１９、化合物ＩＤ＃１９）。
【図６Ａ】図２において示す化合物（化合物ＩＤ＃１５，３）を使用した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＰＫ／ＰＤ試験−実施例１、ＩＶＴ投与、２５μg/眼を参照のこと。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜中で測定されたＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）ＩＳＨにより例証されるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｃ−Ｄ）ＩＰ−ＭＳによる、それぞれ網膜及び硝子体中でのＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量化。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物（ｎ＝３）についての標準偏差を示す。
【図６Ｂ】図２において示す化合物（化合物ＩＤ＃１５，３）を使用した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＰＫ／ＰＤ試験−実施例１、ＩＶＴ投与、２５μg/眼を参照のこと。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜中で測定されたＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）ＩＳＨにより例証されるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｃ−Ｄ）ＩＰ−ＭＳによる、それぞれ網膜及び硝子体中でのＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量化。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物（ｎ＝３）についての標準偏差を示す。
【図６Ｃ】図２において示す化合物（化合物ＩＤ＃１５，３）を使用した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＰＫ／ＰＤ試験−実施例１、ＩＶＴ投与、２５μg/眼を参照のこと。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜中で測定されたＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）ＩＳＨにより例証されるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｃ−Ｄ）ＩＰ−ＭＳによる、それぞれ網膜及び硝子体中でのＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量化。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物（ｎ＝３）についての標準偏差を示す。
【図６Ｄ】図２において示す化合物（化合物ＩＤ＃１５，３）を使用した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＰＫ／ＰＤ試験−実施例１、ＩＶＴ投与、２５μg/眼を参照のこと。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜中で測定されたＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）ＩＳＨにより例証されるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｃ−Ｄ）ＩＰ−ＭＳによる、それぞれ網膜及び硝子体中でのＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量化。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物（ｎ＝３）についての標準偏差を示す。
【図７Ａ】図３（化合物ＩＤ＃７３、１）、４（化合物ＩＤ＃８６）、及び５（化合物ＩＤ＃６７）において示す化合物を使用したＮＨＰ  ＰＫ／ＰＤ試験（実施例２）：ＩＶＴ投与、２５μg/眼。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜中で測定されたＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）オリゴＥＬＩＳＡにより測定された網膜中のオリゴ含量。Ｃ）ＩＳＨにより例証されるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｄ−Ｅ）ＩＰ−ＭＳによる、それぞれ網膜及び硝子体中でのＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量化。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物（ｎ＝３）についての標準誤差を示す。Ｆ−Ｇ）ウェスタンブロットによりそれぞれ例証される、網膜及び硝子体中のＨＴＲＡ１タンパク質レベルにおける低下。
【図７Ｂ】図３（化合物ＩＤ＃７３、１）、４（化合物ＩＤ＃８６）、及び５（化合物ＩＤ＃６７）において示す化合物を使用したＮＨＰ  ＰＫ／ＰＤ試験（実施例２）：ＩＶＴ投与、２５μg/眼。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜中で測定されたＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）オリゴＥＬＩＳＡにより測定された網膜中のオリゴ含量。Ｃ）ＩＳＨにより例証されるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｄ−Ｅ）ＩＰ−ＭＳによる、それぞれ網膜及び硝子体中でのＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量化。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物（ｎ＝３）についての標準誤差を示す。Ｆ−Ｇ）ウェスタンブロットによりそれぞれ例証される、網膜及び硝子体中のＨＴＲＡ１タンパク質レベルにおける低下。
【図７Ｃ】図３（化合物ＩＤ＃７３、１）、４（化合物ＩＤ＃８６）、及び５（化合物ＩＤ＃６７）において示す化合物を使用したＮＨＰ  ＰＫ／ＰＤ試験（実施例２）：ＩＶＴ投与、２５μg/眼。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜中で測定されたＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）オリゴＥＬＩＳＡにより測定された網膜中のオリゴ含量。Ｃ）ＩＳＨにより例証されるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｄ−Ｅ）ＩＰ−ＭＳによる、それぞれ網膜及び硝子体中でのＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量化。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物（ｎ＝３）についての標準誤差を示す。Ｆ−Ｇ）ウェスタンブロットによりそれぞれ例証される、網膜及び硝子体中のＨＴＲＡ１タンパク質レベルにおける低下。
【図７Ｄ】図３（化合物ＩＤ＃７３、１）、４（化合物ＩＤ＃８６）、及び５（化合物ＩＤ＃６７）において示す化合物を使用したＮＨＰ  ＰＫ／ＰＤ試験（実施例２）：ＩＶＴ投与、２５μg/眼。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜中で測定されたＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）オリゴＥＬＩＳＡにより測定された網膜中のオリゴ含量。Ｃ）ＩＳＨにより例証されるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｄ−Ｅ）ＩＰ−ＭＳによる、それぞれ網膜及び硝子体中でのＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量化。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物（ｎ＝３）についての標準誤差を示す。Ｆ−Ｇ）ウェスタンブロットによりそれぞれ例証される、網膜及び硝子体中のＨＴＲＡ１タンパク質レベルにおける低下。
【図７Ｅ】図３（化合物ＩＤ＃７３、１）、４（化合物ＩＤ＃８６）、及び５（化合物ＩＤ＃６７）において示す化合物を使用したＮＨＰ  ＰＫ／ＰＤ試験（実施例２）：ＩＶＴ投与、２５μg/眼。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜中で測定されたＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）オリゴＥＬＩＳＡにより測定された網膜中のオリゴ含量。Ｃ）ＩＳＨにより例証されるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｄ−Ｅ）ＩＰ−ＭＳによる、それぞれ網膜及び硝子体中でのＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量化。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物（ｎ＝３）についての標準誤差を示す。Ｆ−Ｇ）ウェスタンブロットによりそれぞれ例証される、網膜及び硝子体中のＨＴＲＡ１タンパク質レベルにおける低下。
【図７Ｆ】図３（化合物ＩＤ＃７３、１）、４（化合物ＩＤ＃８６）、及び５（化合物ＩＤ＃６７）において示す化合物を使用したＮＨＰ  ＰＫ／ＰＤ試験（実施例２）：ＩＶＴ投与、２５μg/眼。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜中で測定されたＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）オリゴＥＬＩＳＡにより測定された網膜中のオリゴ含量。Ｃ）ＩＳＨにより例証されるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｄ−Ｅ）ＩＰ−ＭＳによる、それぞれ網膜及び硝子体中でのＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量化。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物（ｎ＝３）についての標準誤差を示す。Ｆ−Ｇ）ウェスタンブロットによりそれぞれ例証される、網膜及び硝子体中のＨＴＲＡ１タンパク質レベルにおける低下。
【図７Ｇ】図３（化合物ＩＤ＃７３、１）、４（化合物ＩＤ＃８６）、及び５（化合物ＩＤ＃６７）において示す化合物を使用したＮＨＰ  ＰＫ／ＰＤ試験（実施例２）：ＩＶＴ投与、２５μg/眼。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜中で測定されたＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）オリゴＥＬＩＳＡにより測定された網膜中のオリゴ含量。Ｃ）ＩＳＨにより例証されるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｄ−Ｅ）ＩＰ−ＭＳによる、それぞれ網膜及び硝子体中でのＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量化。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物（ｎ＝３）についての標準誤差を示す。Ｆ−Ｇ）ウェスタンブロットによりそれぞれ例証される、網膜及び硝子体中のＨＴＲＡ１タンパク質レベルにおける低下。
【図８Ａ】ＨＴＲＡ１タンパク質の定量化−免疫捕捉及びＬＣ−ＭＳアプローチ。８Ａ．アプローチの概略：図、８Ｂ．ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡを標的とするＬＮＡアンチセンス化合物の投与後の網膜、硝子体液、及び房水中でのＨＴＲＡタンパク質レベルのＬＣ−ＭＳによる定量化。８Ｃ．網膜、硝子体液、及び房水中でのＨＴＲＡ１タンパク質低下。８Ｄ．単一のＩＶＴ  ２５μg用量後の２、７、１４、及び２１日目に採取された一連の房水サンプルにおけるＰＤ分析。
【図８Ｂ】ＨＴＲＡ１タンパク質の定量化−免疫捕捉及びＬＣ−ＭＳアプローチ。８Ａ．アプローチの概略：図、８Ｂ．ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡを標的とするＬＮＡアンチセンス化合物の投与後の網膜、硝子体液、及び房水中でのＨＴＲＡタンパク質レベルのＬＣ−ＭＳによる定量化。８Ｃ．網膜、硝子体液、及び房水中でのＨＴＲＡ１タンパク質低下。８Ｄ．単一のＩＶＴ  ２５μg用量後の２、７、１４、及び２１日目に採取された一連の房水サンプルにおけるＰＤ分析。
【図８Ｃ】ＨＴＲＡ１タンパク質の定量化−免疫捕捉及びＬＣ−ＭＳアプローチ。８Ａ．アプローチの概略：図、８Ｂ．ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡを標的とするＬＮＡアンチセンス化合物の投与後の網膜、硝子体液、及び房水中でのＨＴＲＡタンパク質レベルのＬＣ−ＭＳによる定量化。８Ｃ．網膜、硝子体液、及び房水中でのＨＴＲＡ１タンパク質低下。８Ｄ．単一のＩＶＴ  ２５μg用量後の２、７、１４、及び２１日目に採取された一連の房水サンプルにおけるＰＤ分析。
【図８Ｄ】ＨＴＲＡ１タンパク質の定量化−免疫捕捉及びＬＣ−ＭＳアプローチ。８Ａ．アプローチの概略：図、８Ｂ．ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡを標的とするＬＮＡアンチセンス化合物の投与後の網膜、硝子体液、及び房水中でのＨＴＲＡタンパク質レベルのＬＣ−ＭＳによる定量化。８Ｃ．網膜、硝子体液、及び房水中でのＨＴＲＡ１タンパク質低下。８Ｄ．単一のＩＶＴ  ２５μg用量後の２、７、１４、及び２１日目に採取された一連の房水サンプルにおけるＰＤ分析。
【図９Ａ】化合物＃１５、３、及び＃１７をカニクイザルにおいて硝子体内投与し、房水サンプルを注射後３、８、１５、及び２２日目に収集した。未希釈サンプルからのタンパク質を、Peggy Sue装置（Protein Simple）を使用したキャピラリー電気泳動により分析した。ＨＴＲＡ１を、オーダーメイドのポリコロナルウサギ抗血清を使用して検出した。動物＃Ｊ６０１５４（賦形剤）、Ｊ６０１５８（Ｃ．Ｉｄ＃１５，３）、Ｊ６０１６２（Ｃ．Ｉｄ＃１７）からのデータを提示する。
【図９Ｂ】シグナル強度を、精製された組換え（Ｓ３２８Ａ変異体）ＨＴＲＡ１タンパク質（Origene、＃ＴＰ７００２０８）との比較により定量化した。検量曲線を本明細書に示す。
【図９Ｃ−１】上パネル：個々の動物からの算出されたＨＴＲＡ１房水濃度を、注射後の時間に対してプロットした。下パネル：各々の時間点での賦形剤群についての平均ＨＴＲＡ１濃度を決定し、処理された動物における対応する相対濃度を算出した。白丸：個々の値、黒丸：群平均。２２日目についてのＨＴＲＡ１低下（%）を示す。
【図９Ｃ−２】上パネル：個々の動物からの算出されたＨＴＲＡ１房水濃度を、注射後の時間に対してプロットした。下パネル：各々の時間点での賦形剤群についての平均ＨＴＲＡ１濃度を決定し、処理された動物における対応する相対濃度を算出した。白丸：個々の値、黒丸：群平均。２２日目についてのＨＴＲＡ１低下（%）を示す。
【図９Ｃ−３】上パネル：個々の動物からの算出されたＨＴＲＡ１房水濃度を、注射後の時間に対してプロットした。下パネル：各々の時間点での賦形剤群についての平均ＨＴＲＡ１濃度を決定し、処理された動物における対応する相対濃度を算出した。白丸：個々の値、黒丸：群平均。２２日目についてのＨＴＲＡ１低下（%）を示す。
【図１０】ＨＴＲＡ１転写産物を標的とする種々のＬＮＡ分子を用いて処置したカニクイザルにおける房水（青色ひし形）中又は網膜（赤色四角）中のＨＴＲＡ１タンパク質レベルに対してプロットされたＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ。値を、ＰＢＳ対照に対して標準化されたパーセンテージとして表す。
【図１１】房水中のＨＴＲＡ１タンパク質と、ＨＴＲＡ１転写物を標的とする種々のＬＮＡ分子を用いて処置されたカニクイザルにおける（Ａ）網膜中のＨＴＲＡ１タンパク質及び（Ｂ）網膜中のＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡとの相関。値を、ＰＢＳ対照に対して標準化されたパーセンテージとして表す。
【図１２Ａ】ＩＶＴ  ＬＮＡ適用後３６日目の平均ＨＴＲＡ１タンパク質レベル。青色で示されているパーセントＨＴＲＡ１抑制。エラーバー：群のｓｄ。
【図１２Ｂ】対照（○）動物及びＬＮＡ処置（●）動物における後眼組織に対する房水（ＡＨ）中のＨＴＲＡ１濃度。
【図１３】房水中のＨＴＲＡ１濃度の動態。黒色記号：活性な処置、白色記号：賦形剤処置。個々の標準化された値。
【図１４】ＬＮＡ処置を伴う及び伴わない異なる画分におけるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ発現レベル。ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベルを、１００万配列決定読み取り（ＲＰＫＭ）当たりのキロベース当たりの読み取りとして示す。エラーバーは、少なくとも３匹の動物からの平均ＲＰＫＭの周囲の標準偏差を表す。アステリスクは統計的有意性を表す（偽発見率＜０．０５）。バーの上の数字は、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベルの減少（%）を示す。
【００２２】
発明の定義及び詳細な説明
【００２３】
本明細書の記載において、用語「アルキル」は、単独で又は組み合わせにおいて、１〜８の炭素原子を伴う直鎖又は分岐鎖アルキル基、特に１から６の炭素原子を伴う直鎖又は分岐鎖アルキル基、特に１から４の炭素原子を伴う直鎖又は分岐鎖アルキル基を意味する。直鎖及び分岐鎖Ｃ１−Ｃ８アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、異性体ペンチル、異性体ヘキシル、異性体ヘプチル、及び異性オクチル、特にメチル、エチル、プロピル、ブチル、及びペンチルである。アルキルの特定の例は、メチル、エチル、及びプロピルである。
【００２４】
用語「シクロアルキル」は、単独で又は組み合わせにおいて、３から８の炭素原子を伴うシクロアルキル環、特に３から６の炭素原子を伴うシクロアルキル環を意味する。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチル、特にシクロプロピル及びシクロブチルである。「シクロアルキル」の特定の例は、シクロプロピルである。
【００２５】
用語「アルコキシ」は、単独で又は組み合わせにおいて、式アルキル−Ｏ−の基を意味し、ここで、用語「アルキル」は、以前に与えられた意味、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃブトキシ、及びｔｅｒｔブトキシなどを有する。特定の「アルコキシ」は、メトキシ及びエトキシである。メトキシエトキシは、「アルコキシアルコキシ」の特定の例である。
【００２６】
用語「オキシ」は、単独で又は組み合わせにおいて、−Ｏ−基を意味する。
【００２７】
用語「アルケニル」は、単独で又は組み合わせにおいて、オレフィン結合及び８まで、好ましくは６まで、特に好ましくは４までの炭素原子を含む直鎖又は分岐炭化水素残基を意味する。アルケニル基の例は、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、及びイソブテニルである。
【００２８】
用語「アルキニル」は、単独で又は組み合わせにおいて、三重結合及び８まで、好ましくは６まで、特に好ましくは４までの炭素原子を含む直鎖又は分岐炭化水素残基を意味する。
【００２９】
用語「ハロゲン」又は「ハロ」は、単独で又は組み合わせにおいて、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素、特にフッ素、塩素、又は臭素、特にフッ素を意味する。用語「ハロ」は、別の基との組み合わせにおいて、少なくとも１つのハロゲンを用いた前記の基の置換を表示し、特に１から５のハロゲン、特に１から４のハロゲン、即ち、１、２、３、又は４のハロゲンを用いて置換される。
【００３０】
用語「ハロアルキル」は、単独で又は組み合わせにおいて、少なくとも１つのハロゲンを用いて置換された、特に１から５のハロゲン、特に１から３のハロゲンを用いて置換されたアルキル基を表示する。ハロアルキルの例は、モノフルオロ−、ジフルオロ−又はトリフルオロ−メチル、−エチル又は−プロピル、例えば、３，３，３−トリフルオロプロピル、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、フルオロメチル、又はトリフルオロメチルを含む。フルオロメチル、ジフルオロメチル、及びトリフルオロメチルは特定の「ハロアルキル」である。
【００３１】
用語「ハロシクロアルキル」は、単独で又は組み合わせにおいて、少なくとも１つのハロゲンを用いて置換された、特に１から５のハロゲン、特に１から３のハロゲンを用いて置換された、上に定義するシクロアルキル基を表示する。「ハロシクロアルキル」の特定の例は、ハロシクロプロピル、特にフルオロシクロプロピル、ジフルオロシクロプロピル、及びトリフルオロシクロプロピルである。
【００３２】
用語「ヒドロキシル」及び「ヒドロキシ」は、単独で又は組み合わせにおいて、−ＯＨ基を意味する。
【００３３】
用語「チオヒドロキシル」及び「チオヒドロキシ」は、単独で又は組み合わせにおいて、−ＳＨ基を意味する。
【００３４】
用語「カルボニル」は、単独で又は組み合わせにおいて、−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。
【００３５】
用語「カルボキシ」又は「カルボキシル」は、単独で又は組み合わせにおいて、−ＣＯＯＨ基を意味する。
【００３６】
用語「アミノ」は、単独で又は組み合わせにおいて、第一級アミノ基（−ＮＨ２）、第二級アミノ基（−ＮＨ−）、又は第三級アミノ基（−Ｎ−）を意味する。
【００３７】
用語「アルキルアミノ」は、単独で又は組み合わせにおいて、上で定義する、１つ又は２つのアルキル基を用いて置換された、上で定義するアミノ基を意味する。
【００３８】
用語「スルホニル」は、単独で又は組み合わせにおいて、−ＳＯ２基を意味する。
【００３９】
用語「スルフィニル」は、単独で又は組み合わせにおいて、−ＳＯ−基を意味する。
【００４０】
用語「スルファニル」は、単独で又は組み合わせにおいて、−Ｓ−基を意味する。
【００４１】
用語「シアノ」は、単独で又は組み合わせにおいて、−ＣＮ基を意味する。
【００４２】
用語「アジド」は、単独又は組み合わせにおいて、−Ｎ３基を意味する。
【００４３】
用語「ニトロ」は、単独で又は組み合わせにおいて、ＮＯ２基を意味する。
【００４４】
用語「ホルミル」は、単独で又は組み合わせにおいて、−Ｃ（Ｏ）Ｈ基を意味する。
【００４５】
用語「カルバモイル」は、単独で又は組み合わせにおいて、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２基を意味する。
【００４６】
用語「カバミド」は、単独で又は組み合わせにおいて、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２基を意味する。
【００４７】
用語「アリール」は、単独で又は組み合わせにおいて、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、及びホルミルより独立して選択される１から３の置換基を用いて置換された、６から１０の炭素環原子を含む一価の芳香族炭素環式単又は二環式環系を表示する。アリールの例は、フェニル及びナフチル、特にフェニルを含む。
【００４８】
用語「ヘテロアリール」は、単独で又は組み合わせにおいて、Ｎ、Ｏ、及びＳより選択される１、２、３、又は４のヘテロ原子を含む、５から１２の環原子の一価の芳香族複素環式単又は二環式環系を表示し、残りの環原子は炭素であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、及びホルミルより独立して選択される１から３の置換基を用いて置換される。ヘテロアリールの例は、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、イソオキサゾリル、ベンゾフラニル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、カルバゾリル、又はアクリジニルを含む。
【００４９】
用語「ヘテロシクリル」は、単独で又は組み合わせにおいて、Ｎ、Ｏ、及びＳより選択される１、２、３、又は４の環ヘテロ原子を含む、４から１２、特に４から９の環原子の一価の飽和又は部分不飽和単又は二環式環系を意味し、残りの環原子は炭素であって、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、及びホルミルより独立して選択される１から３の置換基を用いて置換される。単環式飽和ヘテロシクリルの例は、アゼチジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロ−チエニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル、アゼパニル、ジアゼパニル、ホモピペラジニル、又はオキサゼパニルである。二環式飽和ヘテロシクロアルキルの例は、８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、キヌクリジニル、８−オキサ−３−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル、３−オキサ−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル、又は３−チア−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニルである。部分的に不飽和のヘテロシクロアルキルの例は、ジヒドロフリル、イミダゾリニル、ジヒドロ−オキサゾリル、テトラヒドロ−ピリジニル、又はジヒドロピラニルである。
【００５０】
用語「医薬的に許容可能な塩」は、遊離塩基又は遊離酸の生物学的な有効性及び特性を保持する塩を指し、それらは生物学的に又は他の点で望ましくないことはない。塩は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、特に塩酸など、及び有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ−アセチルシステインなどと形成される。また、これらの塩は、遊離酸への無機塩基又は有機塩基の付加から調製されうる。無機塩基から由来する塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩を含むが、これらに限定しない。有機塩基から由来する塩は、一級、二級、及び三級アミンの塩、天然の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、Ｎ−エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂などを含むが、これらに限定しない。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、両性イオンの形態において存在することができる。本発明の特に好ましい医薬的に許容可能な塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、及びメタンスルホン酸の塩である。
【００５１】
用語「保護基」は、単独で又は組み合わせにおいて、化学反応が別の無保護の反応部位で選択的に行われることができるように、多機能性化合物における反応部位を選択的に遮断する基を意味する。保護基は除去することができる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基、又はヒドロキシ保護基である。
【００５２】
「ヒドロキシル保護基」は、ヒドロキシル基の保護基であり、また、チオール基を保護するために使用される。ヒドロキシル保護基の例は、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、β−メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル（又はビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル）（ＤＭＴ）、トリメトキシトリチル（又はトリス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル）（ＴＭＴ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル（ＭＭＴ）、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリチル又はトリフェニルメチル（Ｔｒ）、シリルエーテル（例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリ−イソ−プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）及びトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）エーテル）、メチルエーテル、及びエトキシエチルエーテル（ＥＥ）である。ヒドロキシル保護基の特定の例は、ＤＭＴ及びＴＭＴ、特にＤＭＴである。
【００５３】
本発明の出発材料又は化合物の１つが、１つ以上の反応工程の反応条件下で安定ではない又は反応性である１つ以上の官能基を含む場合、適した保護基（例、“Protective Groups in Organic Chemistry” by T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd Ed., 1999, Wiley, New Yorkにおいて記載されている通り）を、当技術分野において周知の方法を適用する決定的な工程の前に導入することができる。そのような保護基は、文献中に記載されている標準的な方法を使用し、合成の後の段階で除去することができる。保護基の例は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、及びｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）である。
【００５４】
本明細書において記載する化合物は、いくつかの非対称中心を含むことができ、光学的に純粋なエナンチオマー、エナンチオマーの混合物、例えば、例、ラセミ体、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性ラセミ体、又はジアステレオ異性ラセミ体の混合物などの形態において存在することができる。
【００５５】
薬剤（例、医薬製剤）の「有効量」は、所望の治療的又は予防的結果を達成するための、必要な投与量で及び期間にわたり有効な量を指す。
【００５６】
オリゴヌクレオチド
【００５７】
本明細書中で使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、それが、２つ又はそれ以上の共有結合的に連結されたヌクレオシドを含む分子として当業者により一般的に理解されるように定義する。そのような共有結合的に結合したヌクレオシドはまた、核酸分子又はオリゴマーとして言及しうる。オリゴヌクレオチドは一般に、実験室において、固相化学合成、それに続く精製により作る。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合的に連結されたヌクレオチド又はヌクレオシドの、核酸塩基部分、又はその修飾の配列又は順番に言及する。オリゴヌクレオチドは人工的であり、化学的に合成し、典型的には精製又は単離する。オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含みうる。
【００５８】
本発明中で言及するＨＴＲＡ１  ＲＮＡアンタゴニストは、オリゴヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなどでありうるが、それらはＨＴＲＡ１標的核酸の発現を調節することが可能である。ＨＴＲＡ１  ＲＮＡアンタゴニストを介した調節は、例えば、ｍＲＮＡの分解又は転写の遮断により、あるいはＨＴＲＡ１プレｍＲＮＡの選択的スプライシング（ＨＴＲＡ１プレｍＲＮＡのスプライス調節）を介して、ＨＴＲＡ１の発現を阻害、下方調節、低下、抑制、除去、停止、遮断、防止、減少、低減、回避、又は終結する能力を含む。
【００５９】
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ
【００６０】
一部の実施形態では、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストはｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである。
【００６１】
ｓｉＲＮＡは短い二本鎖複合体で、１８〜２５塩基対の二本鎖領域を一緒に形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。ＨＴＲＡ１を標的とするｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＨＴＲＡ１標的核酸、例えばＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡなどに相補的である。ＵＳ２００７１８５３１７には、ＨＴＲＡ１を標的とするｓｉＲＮＡが開示されている。
【００６２】
ショートヘアピンＲＮＡ又はスモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ／ヘアピンベクター）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができる、タイトなヘアピンターンを伴う人工ＲＮＡ分子である。細胞中でのｓｈＲＮＡの発現は、典型的には、プラスミドの送達により、又はウイルスベクターもしくは細菌ベクターを通じて達成する。
【００６３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
【００６４】
有利には、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストは、ＨＴＲＡ１核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００６５】
本明細書中で使用する用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸を発現している細胞において、標的核酸、特に標的核酸上の近接配列にハイブリダイズすることにより、標的遺伝子の発現を調節することが可能なオリゴヌクレオチドとして定義する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的には二本鎖ではなく、従って、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己相補性内又は間の程度が、オリゴヌクレオチドの全長にわたり５０%を下回る限り、ヘアピン又は分子間二重構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重）を形成することができることが理解される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは人工的であり、化学的に合成し、典型的には精製又は単離する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含みうる。
【００６６】
近接ヌクレオチド配列
【００６７】
用語「近接ヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書において、用語「近接核酸塩基配列」及び用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドは、近接ヌクレオチド配列を構成する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、近接ヌクレオチド配列（例えばＦ−Ｇ−Ｆ’ギャップマー領域など）を含み、場合により、さらなるヌクレオチド、例えば、官能基を近接ヌクレオチド配列に付着させるために使用されうるヌクレオチドリンカー領域を含みうる。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であってもよく、又はなくてもよい。
【００６８】
ヌクレオチド
【００６９】
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明の目的のために、天然及び非天然のヌクレオチドの両方を含む。自然においては、ヌクレオチド（例えばＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドなど）は、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ以上のリン酸基（それは、ヌクレオシド中には存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、互換的に「単位」又は「単量体」として言及しうる。
【００７０】
修飾ヌクレオシド
【００７１】
本明細書中で使用する用語「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」は、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入により等価のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して、修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは修飾糖部分を含む。用語「修飾ヌクレオシド」は、本明細書において、用語「ヌクレオシド類似体」又は修飾「単位」又は修飾「単量体」と互換的に使用しうる。未修飾のＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を伴うヌクレオシドは、本明細書においてＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと呼ぶ。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域中に修飾を伴うヌクレオシドは、それらがＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの塩基対合を可能にする場合、依然として一般的にＤＮＡ又はＲＮＡと呼ぶ。
【００７２】
修飾ヌクレオシド間連結
【００７３】
用語「修飾ヌクレオシド間連結」は、ホスホジエステル（ＰＯ）連結以外の連結として当業者により一般的に理解されているように定義し、それによって２つのヌクレオシドが共有結合的にカップリングされる。本発明のオリゴヌクレオチドは、従って、修飾ヌクレオシド間連結を含みうる。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結によって、ホスホジエステル連結と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性が増加する。天然のオリゴヌクレオチドについて、ヌクレオシド間連結は、隣接ヌクレオシド間にホスホジエステル結合を作るリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間連結は、インビボでの使用のためにオリゴヌクレオチドを安定化する際に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチド中のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの領域で、例えば、ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で、ならびに修飾ヌクレオシドの領域（例えば領域Ｆ及びＦ’など）中で、ヌクレアーゼ切断に対して保護するのに役立ちうる。
【００７４】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、ヌクレアーゼ攻撃により耐性である、１つ以上の修飾ヌクレオシド間連結などの、天然ホスホジエステルからの修飾された１つ以上のヌクレオシド間連結を含む。ヌクレアーゼ耐性は、血清中でオリゴヌクレオチドをインキュベートすることにより、又はヌクレアーゼ耐性アッセイ（例、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を使用することにより決定してもよく、両方が当技術分野において周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強することが可能であるヌクレオシド間連結は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間連結として言及する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその近接ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間連結の少なくとも５０%を修飾し、オリゴヌクレオチド、又はその近接ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間連結の例えば少なくとも６０%など、例えば少なくとも７０%など、例えば少なくとも７５%など、例えば少なくとも８０%など、又は例えば少なくとも９０%などは、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間連結である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその近接ヌクレオチド配列のヌクレオシド間連結の全てが、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間連結である。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基（例えばコンジュゲートなど）に連結するヌクレオシドは、ホスホジエステルでありうることが認識されるであろう。
【００７５】
本発明のオリゴヌクレオチドにおける使用のための好ましい修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートである。
【００７６】
ホスホロチオエートヌクレオシド間連結は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態、及び製造の容易さに起因して特に有用である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその近接ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０%はホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチド、又はその近接ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間連結の例えば少なくとも６０%など、例えば少なくとも７０%など、例えば少なくとも７５%など、例えば少なくとも８０%など、又は少なくとも９０%などは、ホスホロチオエートである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその近接ヌクレオチド配列のヌクレオシド間連結の全てがホスホロチオエートである。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロジチオエート連結に加えて、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結及び少なくとも１つのホスホジエステル連結（例えば２、３、又は４のホスホジエステル連結など）の両方を含む。ギャップマーオリゴヌクレオチドにおいて、ホスホジエステル連結は、存在する場合、ギャップ領域Ｇ中の近接ＤＮＡヌクレオシド間に適切に位置付けられない。
【００７７】
ヌクレアーゼ耐性連結（例えばホスホロチオエート連結など）は、標的核酸（例えばギャップマーについての領域Ｇなど）と二本鎖を形成する場合、ヌクレアーゼを動員することが可能なオリゴヌクレオチド領域において特に有用である。ホスホロチオエート連結は、しかし、また、非ヌクレアーゼ動員領域及び／又は親和性増強領域（例えばギャップマーについての領域Ｆ及びＦ’など）において有用でありうる。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、一部の実施形態では、領域Ｆ又はＦ’、あるいは領域Ｆ及びＦ’の両方において１つ以上のホスホジエステル連結を含みうるが、そこで、領域Ｇにおける全てのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートでありうる。
【００７８】
有利には、オリゴヌクレオチドの近接ヌクレオチド配列中の全てのヌクレオシド間連結、又はオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート連結である。
【００７９】
ＥＰ２７４２１３５において開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間連結（ホスホジエステル及びホスホロチオエート以外）、例えば、アルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間（それらはＥＰ２７４２１３５に従う）は、例えば、他のＤＮＡホスホロチオエートギャップ領域において耐容されうる。
【００８０】
核酸塩基
【００８１】
用語「核酸塩基」は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成するヌクレオシド及びヌクレオチド中に存在するプリン（例、アデニン及びグアニン）及びピリミジン（例、ウラシル、チミン、及びシトシン）部分を含む。本発明の文脈において、用語「核酸塩基」はまた、天然の核酸塩基とは異なりうるが、しかし、核酸ハイブリダイゼーションの間に機能的である修飾核酸塩基を包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然の核酸塩基（例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンなど）、ならびに非天然の変異体の両方を指す。そのような変異体は、例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 and Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1において記載されている。
【００８２】
一部の実施形態では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを、修飾プリン又はピリミジン、例えば置換プリン又は置換ピリミジンなど、例えばイソシトシン、プソイドイソシトシン、５−メチルシトシン、５−チオゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、２’チオ−チミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、及び２−クロロ−６−アミノプリンより選択される核酸塩基などに変化させることにより修飾する。
【００８３】
核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基についての文字コード（例、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵ）により示されうるが、各々の文字は、場合により、等価の機能の修飾核酸塩基を含みうる。例えば、例示されたオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５−メチルシトシンより選択される。場合により、ＬＮＡギャップマーについて、５−メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドを使用してもよい。
【００８４】
修飾オリゴヌクレオチド
【００８５】
用語「修飾オリゴヌクレオチド」は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドを記載する。用語「キメラ」オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを伴うオリゴヌクレオチドを記載するために文献において使用されてきた用語である。
【００８６】
相補性
【００８７】
用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合のための能力を記載する。Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対は、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を伴うヌクレオシドを含みうることが理解されるであろうが、例えば、５−メチルシトシンは、シトシンの代わりにしばしば使用され、そのようなものとして、用語「相補性」は、非修飾及び修飾核酸塩基の間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を包含する（例えば、Hirao et al(2012)Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 and Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl。37 1.4.1を参照のこと）。
【００８８】
本明細書中で使用する用語「%相補的」は、近接ヌクレオチド配列にわたって、参照配列（例、標的配列又は配列モチーフ）に相補的である、核酸分子（例、オリゴヌクレオチド）中の近接ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセント）を指す。相補性のパーセンテージは、このように、２つの配列（標的配列５’−３’及び３’−５’からのオリゴヌクレオチド配列と整列させた場合）の間で（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対から）相補的である、整列された核酸塩基の数をカウントし、その数を、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数により割り、１００により乗じることにより算出する。そのような比較において、整列する（塩基対を形成する）ことのない核酸塩基／ヌクレオチドをミスマッチと呼ぶ。挿入及び欠失は、近接ヌクレオチド配列の相補性（%）の算出において許可されない。相補性を決定する際、核酸塩基の化学修飾は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を形成する核酸塩基の機能的能力が保持される限り無視されることが理解されるであろう（例、５’−メチルシトシンは、%同一性を算出する目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
【００８９】
用語「完全に相補的」は、１００%の相補性を指す。
【００９０】
同一性
【００９１】
本明細書中で使用する用語「同一性」は、近接ヌクレオチド配列にわたって、参照配列（例、配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例、オリゴヌクレオチド）中の近接ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表現する）を指す。同一性のパーセンテージは、このように、（本発明の化合物の近接ヌクレオチド配列中及び参照配列中の）２つの配列間で同一（一致）である整列された塩基の数をカウントし、その数を、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数により割り、１００により乗じることにより算出する。従って、同一性のパーセンテージ＝（一致×１００）／整列された領域の長さ（例、近接ヌクレオチド配列）。挿入及び欠失は、近接ヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージの算出において許可されない。同一性を決定する際、核酸塩基の化学修飾は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を形成する核酸塩基の機能的能力が保持される限り無視されることが理解されるであろう（例、５’−メチルシトシンは、%同一性を算出する目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
【００９２】
ハイブリダイゼーション
【００９３】
本明細書中で使用する用語「ハイブリダイズしている（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」又は「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）」は、反対鎖上の塩基対間に水素結合を形成し、それにより二本鎖を形成する２つの核酸鎖（例、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）として理解すべきである。２つの核酸鎖間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。それは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二本鎖になる温度として定義される融解温度（Ｔｍ）に関してしばしば記載される。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537）。標準状態のギブズ自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性のより正確な表現であり、ΔＧ°＝−ＲＴｌｎ（Ｋｄ）により反応の解離定数（Ｋｄ）に関連付けられ、ここで、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。従って、オリゴヌクレオチド及び標的核酸の間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチド及び標的核酸の間の強いハイブリダイゼーションを反映する。ΔＧ°は、水溶性の濃度が１Mであり、ｐＨが７であり、及び温度が３７℃である反応に関連付けられるエネルギーである。標的核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは自発的反応であり、自発的反応について、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Hansen et al., 1965,Chem. Comm.36-38及びHoldgate et al., 2005, Drug Discov Todayにおいて記載されているような等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）方法の使用により、実験的に測定することができる。当業者は、商業的な機器がΔＧ°測定用に利用可能であることを知っているであろう。ΔＧ°はまた、Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216及びMcTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405により記載されている適宜導出された熱力学的パラメーターを使用した、SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465により記載されている最近傍モデルを使用することにより数値的に推定することができる。ハイブリダイゼーションによりその意図される核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、長さが１０〜３０ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドについて−１０kcalを下回る推定ΔＧ°値を伴い、標的核酸にハイブリダイズする。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態のギブズ自由エネルギーΔＧ°により測定する。オリゴヌクレオチドは、８〜３０ヌクレオチドの長さであるオリゴヌクレオチドについて、−１０kcalの範囲を下回る、例えば−１５kcalを下回る、例えば−２０kcalを下回る、及び−２５kcalを下回る推定ΔＧ°値を伴い標的核酸にハイブリダイズしうる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、−１０から−６０kcal、例えば−１２から−４０など、例えば−１５から−３０kcalなど、又は−１６から−２７kcal、例えば−１８から−２５kcalなどの推定ΔＧ°値を伴い標的核酸にハイブリダイズする。
【００９４】
標的配列
【００９５】
本明細書中で使用する用語「標的配列」は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的である核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。一部の実施形態では、標的配列は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの近接ヌクレオチド配列に相補的である核酸塩基配列を伴う標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、標的ヌクレオチド配列、標的配列、又は標的領域として互換的に言及しうる。一部の実施形態では、標的配列は、単一のオリゴヌクレオチドの近接相補的配列よりも長く、例えば、本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドにより標的とされうる標的核酸の好ましい領域を表しうる。
【００９６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸（例えば本明細書中に記載する標的配列など）に相補的である近接ヌクレオチド配列を含む。
【００９７】
オリゴヌクレオチドが相補的である標的配列は、一般的に、少なくとも１０ヌクレオチドの近接核酸塩基配列を含む。近接ヌクレオチド配列は、１０から５０ヌクレオチドの間、例えば１２から３０など、例えば１４から２０など、例えば１５から１８などの近接ヌクレオチドである。
【００９８】
標的細胞
【００９９】
本明細書中で使用する用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。一部の実施形態では、標的細胞はインビボ又はインビトロであってよい。一部の実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞など、例えばマウス細胞又はラット細胞など、あるいは霊長類細胞、例えばサル細胞又はヒト細胞などである。
【０１００】
高親和性修飾ヌクレオシド
【０１０１】
高親和性修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド中に組み入れられた場合、例えば、融解温度（Ｔｍ）により測定されるように、その相補的標的についてのオリゴヌクレオチドの親和性を増強する修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシド当たり、＋０．５から＋１２℃の間、より好ましくは＋１．５から＋１０℃の間、及び最も好ましくは＋３から＋８℃の間の融解温度における増加をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野において公知であり、例えば、多くの２’置換ヌクレオシドならびにロックド核酸（ＬＮＡ）を含む（例、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213を参照のこと）。
【０１０２】
糖修飾
【０１０３】
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、即ち、ＤＮＡ及びＲＮＡ中に見いだされるリボース糖部分と比較した場合での糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含みうる。
【０１０４】
リボース糖部分の修飾を伴う多数のヌクレオシドが、主に、オリゴヌクレオチドの特定の特性（例えば親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性など）を改善する目的で作られてきた。
【０１０５】
そのような修飾は、リボース環構造が、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）、又は二環式環（それは、典型的には、リボース環（ＬＮＡ）上のＣ２及びＣ４炭素間にビラジカル（ｂｉｒａｄｉｃｌｅ）橋を有する）、又は連結されていないリボース環（それは、典型的には、Ｃ２及びＣ３炭素間の結合を欠く（例、ＵＮＡ））を用いた置換により修飾されているものを含む。他の糖修飾ヌクレオシドは、例えば、ビシクロヘキソース核酸（ＷＯ２０１１／０１７５２１）又は三環式核酸（ＷＯ２０１３／１５４７９８）を含む。修飾ヌクレオシドはまた、糖部分が、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はモルホリノ核酸の場合において、非糖部分を用いて置換されているヌクレオシドを含む。
【０１０６】
２’修飾ヌクレオシド
【０１０７】
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位置にＨ又は−ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）、又はリボース環中の２’炭素及び第２の炭素の間に架橋を形成することが可能な２’連結ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’−４’ビラジカル（ｂｉｒａｄｉｃｌｅ）架橋）ヌクレオシドなどである。
【０１０８】
実際に、多くの焦点が、２’置換ヌクレオシドを開発することに費やされてきたが、多数の２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチド中に組み入れられた場合、有益な特性を有することが見出されてきた。例えば、２’修飾糖は、オリゴヌクレオチドへの増強した結合親和性及び／又は増加したヌクレアーゼ耐性を提供しうる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、及び２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213、及びDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照のこと。以下は、一部の２’置換修飾ヌクレオシドの例証である。
【化１】
2021507253.tif 000002
【０１０９】
本発明に関連して、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡのような２’架橋ヌクレオシドを含まない。
【０１１０】
ロックド核酸（ＬＮＡ）
【０１１１】
「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’及びＣ４’を連結するビラジカル（また、「２’−４’架橋」として言及する）を含む２’−修飾ヌクレオシドであり、それによって、リボース環の立体構造が制限及びロックされる。これらのヌクレオシドはまた、文献において架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）と呼ぶ。リボースの立体構造のロックは、ＬＮＡが、相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子についてのオリゴヌクレオチド中に組み入れられる場合、ハイブリダイゼーションの増強された親和性（二本鎖安定化）に関連付けられる。これは、オリゴヌクレオチド／補体二本鎖の融解温度を測定することにより、ルーチン的に決定することができる。
【０１１２】
非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドが、ＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ００／０４７５９９、ＷＯ２００７／１３４１８１、ＷＯ２０１０／０７７５７８、ＷＯ２０１０／０３６６９８、ＷＯ２００７／０９００７１、ＷＯ２００９／００６４７８、ＷＯ２０１１／１５６２０２、ＷＯ２００８／１５４４０１、ＷＯ２００９／０６７６４７、ＷＯ２００８／１５０７２９、Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76、Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81、及びMitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238、及びWan and Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645-9667において開示されている。
【０１１３】
さらなる非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドを模式図１において開示する。
模式図１：
【化２】
2021507253.tif 000003
【０１１４】
特定のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、６’−メチル−ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）−６’−メチル−ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡなどのである。
【０１１５】
特に有利なＬＮＡは、実施例の化合物において使用するように、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【０１１６】
ＲＮａｓｅ  Ｈの活性及び動員
【０１１７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、相補的ＲＮＡ分子を伴う二本鎖中にある場合に、ＲＮａｓｅ  Ｈを動員するその能力を指す。ＷＯ０１／２３６１３には、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのインビトロ方法が提供されており、それは、ＲＮａｓｅＨを動員する能力を決定するために使用されうる。典型的には、オリゴヌクレオチドは、それが、相補的標的核酸配列と提供される場合、テストされている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用するが、しかし、オリゴヌクレオチド中の全ての単量体間にホスホロチオエート連結を伴うＤＮＡ単量体だけを含み、ＷＯ０１／２３６１３の実施例９１〜９５（本明細書により、参照により組み入れる）により提供される方法論を使用する場合に決定される初期速度の少なくとも５%、例えば少なくとも１０%の又は２０%を上回る初期速度（pmol/l/分で測定される通り）を有する場合、ＲＮａｓｅ  Ｈを動員することが可能であると見なす。ＲＨａｓｅ  Ｈ活性を決定する際での使用のために、組換えヒトＲＮａｓｅ  Ｈ１は、Lubio Science GmbH（スイス、ルツェルン）より入手可能である。
【０１１８】
ギャップマー
【０１１９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその近接ヌクレオチド配列はギャップマーでありうる。アンチセンスギャップマーは、ＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性の分解を介して標的核酸を阻害するために一般に使用される。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、「５−＞３」方向において、少なくとも３つの異なる構造領域５’隣接、ギャップ、及び３’隣接、Ｆ−Ｇ−Ｆ’を含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ  Ｈを動員することを可能にする一連の近接ＤＮＡヌクレオチドを含む。ギャップ領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’隣接領域（Ｆ）により、及び１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’隣接領域（Ｆ’）により隣接されている。領域Ｆ及びＦ’中の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸についてのオリゴヌクレオチドの親和性を増強する（即ち、親和性を増強する糖修飾ヌクレオシドである）。一部の実施形態では、領域Ｆ及びＦ’中の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性２’糖修飾など（例えばＬＮＡ及び２’-ＭＯＥより独立して選択される）である。
【０１２０】
ギャップマー設計において、ギャップ領域の最も５’及び３’のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、それぞれ５’（Ｆ）又は３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して位置付けられる。隣接は、ギャップ領域から最も遠い末端で、即ち、５’隣接の５’末端で及び３’隣接の３’末端で少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによりさらに定義されうる。
【０１２１】
領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’は近接ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその近接ヌクレオチド配列は、式Ｆ−Ｇ−Ｆ’のギャップマー領域を含みうる。
【０１２２】
ギャップマー設計Ｆ-Ｇ-Ｆ’の全長は、例えば、１２から３２ヌクレオシド、例えば１３から２４など、例えば１４から２２ヌクレオシドなど、例えば１４から１７など、例えば１６から１８ヌクレオシドなどでありうる。
【０１２３】
例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’１−８、例えば
Ｆ１−８−Ｇ７−１６−Ｆ’２−８など
条件として、ギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長が少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチドの長さなどである。
【０１２４】
領域Ｆ、Ｇ、Ｆ‘を以下でさらに定義し、Ｆ−Ｇ−Ｆ’式中に組み入れることができる。
【０１２５】
ギャップマー−領域Ｇ
【０１２６】
ギャップマーの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨ、例えばヒトＲＮａｓｅ  Ｈ１など（典型的にはＤＮＡヌクレオシド）を動員することを可能にするヌクレオシドの領域である。ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡ及びＲＮＡの間の二本鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素的に切断する細胞酵素である。適切には、ギャップマーは、少なくとも５又は６の近接ＤＮＡヌクレオシド、例えば５〜１６の近接ＤＮＡヌクレオシドなど、例えば６〜１５の近接ＤＮＡヌクレオシドなど、例えば７〜１４の近接ＤＮＡヌクレオシドなど、例えば８〜１２の近接ＤＮＡヌクレオチドなど、例えば８〜１２の近接ＤＮＡヌクレオチドなどの長さのギャップ領域（Ｇ）を有しうる。ギャップ領域Ｇは、一部の実施形態では、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６の近接ＤＮＡヌクレオシドからなりうる。ギャップ領域中のシトシン（Ｃ）ＤＮＡは、一部の例ではメチル化されうるが、そのような残基には、５−メチル−シトシン（ｍｅＣ又はｃの代わりにｅを伴う）としていずれかに注釈が付けられている。ギャップ中のシトシンＤＮＡのメチル化は、ｃｇジヌクレオチドが、潜在的な毒性を低下させるためにギャップ中に存在する場合に有利であり、修飾は、オリゴヌクレオチドの有効性に対する有意な影響を有さない。
【０１２７】
一部の実施形態では、ギャップ領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６の近接ホスホロチオエート連結ＤＮＡヌクレオシドからなりうる。一部の実施形態では、ギャップ中の全てのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート連結である。
【０１２８】
従来のギャップマーはＤＮＡギャップ領域を有するが、それらをギャップ領域内で使用する場合にＲＮａｓｅＨ動員を可能にする修飾ヌクレオシドの多数の例がある。ギャップ領域内に含まれる場合にＲＮａｓｅＨを動員することが可能であるとして報告されてきた修飾ヌクレオシドは、例えば、アルファ−Ｌ−ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ（ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９及びVester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300において記載されている通りであり、両方を参照により本明細書中に組み入れる）、ＡＮＡ及び２’Ｆ−ＡＮＡなどのアラビノース由来ヌクレオシド（Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661）、ＵＮＡ（アンロックド核酸）（Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039において記載されている通りであり、参照により本明細書中に組み入れる）を含む。ＵＮＡはアンロックド核酸であり、典型的には、ここで、リボースのＣ２及びＣ３の間の結合が除去されており、アンロックド「糖」残基を形成する。そのようなギャップマー中で使用される修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域中に導入された場合に２’エンド（ＤＮＡ様）構造を採用する（即ち、ＲＮａｓｅＨ動員を可能にする修飾）ヌクレオシドでありうる。一部の実施形態では、本明細書中に記載するＤＮＡギャップ領域（Ｇ）は、場合により、ギャップ領域中に導入された場合に２’エンド（ＤＮＡ様）構造を採用する１から３の糖修飾ヌクレオシドを含みうる。
【０１２９】
領域Ｇ−「ギャップブレーカー」
【０１３０】
あるいは、一部のＲＮａｓｅＨ活性を保持しながら、ギャップマーのギャップ領域中に３’エンド立体構造を付与する修飾ヌクレオシドの挿入の多数の報告がある。１つ以上の３’エンド修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を伴うそのようなギャップマーは、「ギャップブレーカー」又は「ギャップ破壊」ギャップマーとして言及し、例えば、ＷＯ２０１３／０２２９８４を参照のこと。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨ動員を可能にするために、ギャップ領域内にＤＮＡヌクレオシドの十分な領域を保持する。ＲＮａｓｅＨを動員するギャップブレーカーオリゴヌクレオチド設計の能力は、典型的には、配列又はさらには化合物に特異的である。Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487を参照のこと。ここでは、一部の例では、標的ＲＮＡのより特異的な切断を提供するＲＮａｓｅＨを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドが開示されている。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で使用される修飾ヌクレオシドは、例えば、３’エンド立体構造、例えば２’−Ｏ−メチル（ＯＭｅ）もしくは２’−Ｏ−ＭＯＥ（ＭＯＥ）ヌクレオシド、又はベータ−Ｄ  ＬＮＡヌクレオシド（ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’及びＣ４’の間の架橋は、ベータ立体構造中にある）、例えばベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ又はＳｃＥＴヌクレオシドなどを付与する修飾ヌクレオシドでありうる。
【０１３１】
上に記載する領域Ｇを含むギャップマーと同様に、ギャップブレーカー又はギャップ破壊ギャップマーのギャップ領域は、ギャップの５’末端でのＤＮＡヌクレオシド（領域Ｆの３’ヌクレオシドに隣接）、及びギャップの３’末端でのＤＮＡヌクレオシド（領域Ｆ’の５’ヌクレオシドに隣接）を有する。破壊されたギャップを含むギャップマーは、典型的には、ギャップ領域の５’末端又は３’末端のいずれかに少なくとも３つ又は４つの近接ＤＮＡヌクレオシドの領域を保持する。
【０１３２】
ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドについての例示的な設計は、以下を含む：
Ｆ１−８−［Ｄ３−４−Ｅ１−Ｄ３−４］−Ｆ’１−８
Ｆ１−８−［Ｄ１−４−Ｅ１−Ｄ３−４］−Ｆ’１−８
Ｆ１−８−［Ｄ３−４−Ｅ１−Ｄ１−４］−Ｆ’１−８
ここで、領域Ｇは括弧［Ｄｎ−Ｅｒ−Ｄｍ］内にあり、ＤはＤＮＡヌクレオシドの近接配列であり、Ｅは修飾ヌクレオシド（ギャップブレーカー又はギャップ破壊ヌクレオシド）であり、ならびにＦ及びＦ’は本明細書中で定義するような隣接領域であり、条件として、ギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチドの長さなどである。
【０１３３】
一部の実施形態では、ギャップ破壊ギャップマーの領域Ｇは、少なくとも６つのＤＮＡヌクレオシド、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６のＤＮＡヌクレオシドなどを含む。上に記載するように、ＤＮＡヌクレオシドは、条件として、ギャップ領域ＧがＲＮａｓｅＨ動員を媒介することが可能である場合、近接していてもよく、あるいは、場合により、１つ以上の修飾ヌクレオシドを伴い散在していてもよい。
【０１３４】
ギャップマー−隣接領域、Ｆ及びＦ’
【０１３５】
領域Ｆは、領域Ｇの５’ＤＮＡヌクレオシドに直ぐ隣接して位置付けられる。領域Ｆの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシドなど、例えば、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、又はＬＮＡヌクレオシドなどである。
【０１３６】
領域Ｆ’は、領域Ｇの３’ＤＮＡヌクレオシドに直ぐ隣接して位置付けられる。領域Ｆ’の最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシドなど、例えば、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、又はＬＮＡヌクレオシドなどである。
【０１３７】
領域Ｆは、１〜８の近接ヌクレオチドの長さ、例えば２〜６など、例えば３〜４の近接ヌクレオチドの長さなどである。有利には、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。一部の実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。一部の実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。一部の実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。一部の実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば２つの３’ＭＯＥヌクレオシドなどである。一部の実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドなどである。
【０１３８】
領域Ｆ’は、２〜８の近接ヌクレオチドの長さ、例えば３〜６など、例えば４〜５の近接ヌクレオチドの長さである。有利には、実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。一部の実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。一部の実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。一部の実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。一部の実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば２つの３’ＭＯＥヌクレオシドなどである。一部の実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドなどである。
【０１３９】
領域Ｆ又はＦ’の長さが１つである場合、それは有利にはＬＮＡヌクレオシドであることに注意すべきである。
【０１４０】
一部の実施形態では、領域Ｆ及びＦ’は、糖修飾ヌクレオシドの近接配列から独立してなる、又はそれを含む。一部の実施形態では、領域Ｆの糖修飾ヌクレオシドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、及び２’−フルオロ−ＡＮＡ単位より独立して選択してもよい。
【０１４１】
一部の実施形態では、領域Ｆ及びＦ’は、ＬＮＡ及び２’置換修飾ヌクレオシドの両方を独立して含む（混合ウイング設計）。
【０１４２】
一部の実施形態では、領域Ｆ及びＦ’は、糖修飾ヌクレオシドの１つの型だけ、例えばＭＯＥだけ、又はベータ-Ｄ-オキシＬＮＡだけ、又はＳｃＥＴだけなどからなる。そのような設計はまた、均一隣接又は均一ギャップマー設計と呼ぶ。
【０１４３】
一部の実施形態では、領域Ｆ又はＦ’、あるいはＦ及びＦ’の全てのヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドであり、例えばベータ-Ｄ-オキシＬＮＡ、ＥＮＡ、又はＳｃＥＴヌクレオシドより独立して選択する。一部の実施形態では、領域Ｆは、１〜５、例えば２〜４など、例えば３〜４など、例えば１、２、３、４、又は５などの近接ＬＮＡヌクレオシドからなる。一部の実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の全てのヌクレオシドが、ベータ-Ｄ-オキシＬＮＡヌクレオシドである。
【０１４４】
一部の実施形態では、領域Ｆ又はＦ’、あるいはＦ及びＦ’の全てのヌクレオシドが、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドなどである。一部の実施形態では、領域Ｆは、１、２、３、４、５、６、７、又は８の近接ＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドからなる。一部の実施形態では、隣接領域の１つだけが、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドなどからなることができる。一部の実施形態では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドなどからなるのは５’（Ｆ）隣接領域であるのに対し、３’（Ｆ’）隣接領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド又はｃＥＴヌクレオシドなどを含む。一部の実施形態では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドなどからなるのは３’（Ｆ’）隣接領域であるのに対し、５’（Ｆ）隣接領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド又はｃＥＴヌクレオシドなどを含む。
【０１４５】
一部の実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の全ての修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドであって、例えばベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ、ＥＮＡ、又はＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択され、ここで、領域Ｆ又はＦ’、あるいはＦ及びＦ’は、場合により、ＤＮＡヌクレオシドを含みうる（交互隣接、より詳細についてはこれらの定義を参照のこと）。一部の実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の全ての修飾ヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、ここで、領域Ｆ又はＦ’、あるいはＦ及びＦ’は、場合により、ＤＮＡヌクレオシドを含みうる（交互隣接、より詳細についてはこれらの定義を参照のこと）。
【０１４６】
一部の実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の最も５’及び最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ-Ｄ-オキシＬＮＡヌクレオシド又はＳｃＥＴヌクレオシドなどである。
【０１４７】
一部の実施形態では、領域Ｆ及び領域Ｇの間のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。一部の実施形態では、領域Ｆ’及び領域Ｇの間のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。一部の実施形態では、領域Ｆ又はＦ’、Ｆ’及びＦ’のヌクレオシド間のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。
【０１４８】
さらなるギャップマー設計は、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ２００７／１４６５１１、及びＷＯ２００８／１１３８３２において開示されており、本明細書により参照により組み入れる。
【０１４９】
ＬＮＡギャップマー
【０１５０】
ＬＮＡギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’のいずれか１つ又は両方が、ＬＮＡヌクレオシドを含む又はそれからなるギャップマーである。ベータ−Ｄ−オキシギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’のいずれか１つ又は両方が、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを含む又はそれからなるギャップマーである。
【０１５１】
一部の実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］１−５−［領域Ｇ］−［ＬＮＡ］１−５であり、ここで、領域Ｇは、ギャップマー領域Ｇの定義において定義される通りである。
【０１５２】
ＭＯＥギャップマー
【０１５３】
ＭＯＥギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。一部の実施形態では、ＭＯＥギャップマーは、設計［ＭＯＥ］１−８−［領域Ｇ］−［ＭＯＥ］１−８、例えば［ＭＯＥ］２−７−［領域Ｇ］５−１６−［ＭＯＥ］２−７など、例えば［ＭＯＥ］３−６−［領域Ｇ］−［ＭＯＥ］３−６などであり、ここで、領域Ｇはギャップマーの定義において定義されている通りである。５−１０−５設計（ＭＯＥ−ＤＮＡ−ＭＯＥ）を伴うＭＯＥギャップマーは、当技術分野において広く使用されてきた。
【０１５４】
混合ウィングギャップマー
【０１５５】
混合ウィングギャップマーはＬＮＡギャップマーであり、ここで、領域Ｆ及びＦ’の１つ又は両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、及び２’−フルオロ−ＡＮＡ単位、例えばＭＯＥヌクレオシドなどからなる群より独立して選択される２’置換ヌクレオシドなどを含む。領域Ｆ及びＦ’の少なくとも１つ、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む一部の実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドが、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群より独立して選択される。領域Ｆ及びＦ’の少なくとも１つ、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が、少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含む一部の実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドが、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群より独立して選択される。一部の混合ウイングの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の１つ又は両方が、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドをさらに含みうる。
【０１５６】
混合ウィングギャップマー設計が、ＷＯ２００８／０４９０８５及びＷＯ２０１２／１０９３９５において開示されており、それらの両方を、本明細書により、参照により組み入れる。
【０１５７】
交互隣接ギャップマー
【０１５８】
隣接領域は、ＬＮＡ及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含みうるが、それらがＬＮＡ−ＤＮＡ−ＬＮＡヌクレオシドの交互モチーフを含むため、「交互隣接」として言及する。そのような交互隣接を含むギャップマーを、「交互隣接ギャップマー」として言及する。「交互隣接ギャップマー」は、このように、ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドであり、ここで、隣接（Ｆ又はＦ’）の少なくとも１つが、ＬＮＡヌクレオシドに加えて、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、領域Ｆ又はＦ’の少なくとも１つ、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施形態では、隣接領域Ｆ又はＦ’、又はＦ及びＦ’の両方が、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、ここで、Ｆ及び／又はＦ’領域の最も５’及び３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。
【０１５９】
交互隣接ＬＮＡギャップマーが、ＷＯ２０１６／１２７００２において開示されている。
【０１６０】
交互隣接を伴うオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドであり、ここで、隣接（Ｆ又はＦ’）の少なくとも１つが、ＬＮＡヌクレオシドに加えて、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、領域Ｆ又はＦ’の少なくとも１つ、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施形態では、隣接領域Ｆ又はＦ’、あるいはＦ及びＦ’の両方が、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、ここで、Ｆ及び／又はＦ’領域の最も５’及び３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。
【０１６１】
一部の実施形態では、領域Ｆ又はＦ’の少なくとも１つ、あるいは領域Ｆ及びＦ’の両方が、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施形態では、隣接領域Ｆ又はＦ’、あるいはＦ及びＦ’の両方が、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、ここで、Ｆ又はＦ’領域の最も５’及び３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドであり、ＬＮＡ及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む隣接領域は、それらが、ＬＮＡ−ＤＮＡ−ＬＮＡヌクレオシドの交互モチーフを含むため、交互隣接として言及する。交互隣接ＬＮＡギャップマーが、ＷＯ２０１６／１２７００２において開示されている。
【０１６２】
交互隣接領域は、３つまでの近接ＤＮＡヌクレオシド、例えば１から２あるいは１又は２又は３の近接ＤＮＡヌクレオシドなどを含みうる。
【０１６３】
交互隣接は、一連の整数として注釈を付けることができ、多数のＬＮＡヌクレオシド（Ｌ）、それに続く多数のＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）を表し、例えば：
［Ｌ］１−３−［Ｄ］１−４−［Ｌ］１−３
［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−２−［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−２−［Ｌ］１−２
【０１６４】
オリゴヌクレオチドの設計において、これらは、２−２−１が５’［Ｌ］２−［Ｄ］２−［Ｌ］３’を表し、及び１−１−１−１−１が５’［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］３’を表すように、数字としてしばしば表されうる。交互隣接を伴うオリゴヌクレオチド中の隣接（領域Ｆ及びＦ’）の長さは、独立して、３から１０のヌクレオシド、例えば４から８など、例えば５から６のヌクレオシドなど、例えば４、５、６、又は７の修飾ヌクレオシドなどでありうる。一部の実施形態では、ギャップマーオリゴヌクレオチド中の隣接の１つだけが交互になり、他方はＬＮＡヌクレオチドで構成される。追加のエキソヌクレアーゼ耐性を付与するために、３’隣接（Ｆ’）の３’末端で少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを有することが有利でありうる。交互隣接を伴うオリゴヌクレオチドの一部の例は以下である：
［Ｌ］１−５−［Ｄ］１−４−［Ｌ］１−３−［Ｇ］５−１６−［Ｌ］２−６
［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−２−［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−２−［Ｌ］１−２−［Ｇ］５−１６−［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−３−［Ｌ］２−４
［Ｌ］１−５−［Ｇ］５−１６−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］２
条件として、ギャップマーの全長は少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチドの長さなどである。
【０１６５】
オリゴヌクレオチド中の領域Ｄ’又はＤ’’
【０１６６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、一部の実施形態では、標的核酸、例えばギャップマーＦ-Ｇ-Ｆ’、さらに５’及び／又は３’ヌクレオシドなどに相補的であるオリゴヌクレオチドの近接ヌクレオチド配列を含む、又はそれからなりうる。さらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的でありうる、又はないであろう。そのようなさらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、本明細書中で領域Ｄ’又はＤ’’として言及しうる。
【０１６７】
領域Ｄ’又はＤ’’の追加は、近接ヌクレオチド配列、例えばギャップマーなどを、コンジュゲート部分又は別の官能基に結合する目的のために使用してもよい。近接ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分と結合するために使用される場合、生体切断可能なリンカーとして機能することができる。あるいは、それは、エキソヌクレアーゼ保護を提供するために、又は合成もしくは製造の容易さのために使用してもよい。
【０１６８】
領域Ｄ’及びＤ’’を、領域Ｆの５’末端又は領域Ｆ’の３’末端にそれぞれ付着させ、以下の式Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’、又はＤ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’の設計を生成することができる。この例において、Ｆ−Ｇ−Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’又はＤ’’はオリゴヌクレオチドの別々の部分を構成する。
【０１６９】
領域Ｄ’又はＤ’’は、独立して、１、２、３、４、又は５の追加のヌクレオチドを含む、又はそれらからなりうるが、それらは、標的核酸に相補的又は非相補的でありうる。Ｆ又はＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチドではなく、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、又はこれらの塩基修飾バージョンなどである。Ｄ’又はＤ’’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たしうる（リンカーの定義を参照のこと）。一部の実施形態では、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチドを、ホスホジエステル連結を用いて連結し、ＤＮＡ又はＲＮＡである。領域Ｄ’又はＤ’’としての使用のために適切なヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーが、ＷＯ２０１４／０７６１９５において開示されており、それらは、例として、ホスホジエステル連結ＤＮＡジヌクレオチドを含む。ポリオリゴヌクレオチド構築物中での生体切断可能なリンカーの使用が、ＷＯ２０１５／１１３９２２において開示されており、そこで、それらは、単一のオリゴヌクレオチド内の複数のアンチセンス構築物（例、ギャップマー領域）を連結するために使用されている。
【０１７０】
一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する隣接ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’及び／又はＤ’’を含む。
【０１７１】
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ−Ｇ−Ｆ’；特にＦ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’２−８
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、特にＤ’１−３−Ｆ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’２−８
Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’、特にＦ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’２−８−Ｄ’’１−３
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’、特にＤ’１−３−Ｆ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’２−８−Ｄ’’１−３
【０１７２】
一部の実施形態では、領域Ｄ’及び領域Ｆの間に位置付けられるヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル連結である。一部の実施形態では、領域Ｆ’及び領域Ｄ’’の間に位置付けられるヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル連結である。
【０１７３】
コンジュゲート
【０１７４】
本明細書中で使用する用語「コンジュゲート」は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）に共有結合的に連結されるオリゴヌクレオチドを指す。
【０１７５】
本発明のオリゴヌクレオチドと１つ以上の非ヌクレオチド部分とのコンジュゲーションは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取り込み、又は安定性に影響を及ぼすことにより、オリゴヌクレオチドの薬理学を改善しうる。一部の実施形態では、コンジュゲート部分によって、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、透過性、及び／又は細胞取り込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性が修飾又は増強される。特に、コンジュゲートによって、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織、又は細胞型に標的化し、それにより、その器官、組織、又は細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性が増強されうる。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織、又は器官におけるオリゴヌクレオチドの活性、例えば、標的外活性あるいは非標的細胞型、組織、又は器官における活性を低下させる役割を果たしうる。ＷＯ９３／０７８８３及びＷＯ２０１３／０３３２３０には、適切なコンジュゲート部分が提供されており、それらを、本明細書により、参照により組み入れる。さらに適切なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）に結合することが可能なものである。特に、三価のＮ−アセチルガラクトサミンコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰｒへの結合のために適切である。例えば、ＷＯ２０１４／０７６１９６、ＷＯ２０１４／２０７２３２、及びＷＯ２０１４／１７９６２０を参照のこと（本明細書により、参照により組み入れ、特に、ＷＯ２０１４／０７６１９６の図１３又はＷＯ２０１４／１７９６２０の請求項１５８〜１６４）。
【０１７６】
オリゴヌクレオチドコンジュゲート及びそれらの合成はまた、Manoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001及びManoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103による包括的な総説において報告されているが、これらの各々を、その全体において参照により本明細書中に組み入れる。
【０１７７】
一実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬物物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例、カプシド）、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１７８】
リンカー
【０１７９】
連結又はリンカーは、目的の１つの化学基又はセグメントを、１つ以上の共有結合を介して、目的の別の化学基又はセグメントに連結する２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドに直接的に、又は連結部分（例、リンカー又はテザー）を通じて付着させることができる。リンカーは、第３の領域、例えば、コンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域（例。標的核酸（領域Ａ）に相補的なオリゴヌクレオチド又は近接ヌクレオチド配列）に共有結合的に接続する役割を果たし、それにより、領域Ａの末端の１つをＣに接続する。
【０１８０】
本発明の一部の実施形態では、本発明のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、場合により、標的核酸（領域Ａ又は第１の領域）に相補的なオリゴヌクレオチド又は近接ヌクレオチド配列及びコンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）の間に位置付けられるリンカー領域（第２の領域又は領域Ｂ及び／又は領域Ｙ）を含みうる。
【０１８１】
領域Ｂは、通常遭遇する又は哺乳類の体内で遭遇するものと類似の条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含む又はそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例、切断）を受ける条件は、化学的条件、例えばｐＨ、温度、酸化もしくは還元条件又は薬剤など、及び哺乳動物細胞において見いだされる又はそれにおいて遭遇するものと類似の塩濃度を含む。哺乳動物の細胞内条件はまた、タンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼからなどの哺乳動物細胞において通常存在する酵素活性の存在を含む。一実施形態では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断に感受性である。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、１及び１０の間のヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のヌクレオシドなど、より好ましくは２及び６の間のヌクレオシド、ならびに最も好ましくは、少なくとも２つの連続ホスホジエステル連結、例えば少なくとも３つ又は４つ又は５つの連続ホスホジエステル連結などを含む２及び４の間の連結ヌクレオシドを含む。好ましくは、ヌクレオシドはＤＮＡ又はＲＮＡである。ホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーが、ＷＯ２０１４／０７６１９５（本明細書により、参照により組み入れる）においてさらに詳細に記載されている。
【０１８２】
コンジュゲートはまた、非生体切断可能なリンカーを介してオリゴヌクレオチドに連結してもよく、又は一部の実施形態では、コンジュゲートは、生体切断可能なリンカー（領域Ｙ）に共有結合的に付着されている非切断可能なリンカーを含んでもよい。必ずしも生体切断可能ではないが、しかし、主にコンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａ又は第１の領域）に共有結合的に接続する役割を果たすリンカーは、反復単位（例えばエチレングリコールなど）、アミノ酸単位、又はアミノアルキル基の鎖構造又はオリゴマーを含む。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の領域要素Ａ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｙ−Ｃ、Ａ−Ｙ−Ｂ−Ｃ、又はＡ−Ｙ−Ｃで構築することができる。一部の実施形態では、非切断可能なリンカー（領域Ｙ）は、アミノアルキル、例えばＣ２−Ｃ３６アミノアルキル基など（例えば、Ｃ６からＣ１２アミノアルキル基を含む）である。好ましい実施形態では、リンカー（領域Ｙ）はＣ６アミノアルキル基である。コンジュゲートリンカー基を、アミノ修飾オリゴヌクレオチド、及びコンジュゲート基上の活性化エステル基の使用を介して、オリゴヌクレオチドにルーチン的に付着させてもよい。
【０１８３】
ＨＴＲＡ１
【０１８４】
本明細書中で使用する用語「ＨＴＲＡ１」は、他に示さない限り、哺乳動物の任意の天然タンパク質、例えば任意の哺乳動物供給源（霊長類（例、ヒト）及びげっ歯類（例、マウス及びラット）を含む）からの霊長類又はヒトの高温要求Ａ１タンパク質などを指す。この用語は、「完全長」のプロセッシングされていないＨＴＲＡ１、ならびに細胞中でのプロセッシングに起因するＨＴＲＡ１の任意の形態を包含する。この用語はまた、ＨＴＲＡ１の天然変異体（例、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体）を包含する。ヒトＨＴＲＡ１についてのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号はＱ９２７４３である。例示的なヒトＨＴＲＡ１のアミノ酸配列を配列番号１中に示す。
【化３】
2021507253.tif 000004
【０１８５】
例示的な霊長類ＨＴＲＡ１のアミノ酸配列を、配列番号２（カニクイザル）において示す。アカゲザルＨＴＲＡ１アミノ酸配列を、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｈ９ＦＸ９１において開示する。
【化４】
2021507253.tif 000005
【０１８６】
ＨＴＲＡ１はまた、当技術分野においてプロテアーゼ、セリン、１１（ＩＧＦ結合）（ＰＲＳＳ１１）、ＡＲＭＤ７、ＨｔｒＡ、及びＩＧＦＢＰ５−プロテアーゼとして公知である。用語「ＨＴＲＡ１」はまた、「ＨＴＲＡ１変異体」を包含し、それは、天然配列ＨｔｒＡ１ポリペプチド（例えば配列番号１又は配列番号２など）と少なくとも約９０%のアミノ酸配列同一性を有する活性ＨｔｒＡ１ポリペプチドを意味する。普通、ＨＴＲＡ１変異体は、天然ＨＴＲＡ１配列（例、配列番号１又は配列番号２）と少なくとも約９５%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９８%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９９%のアミノ酸配列同一性を有するであろう。
【０１８７】
用語「ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニスト」は、ＨＴＲＡ１核酸、例えばｍＲＮＡなど（ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡを含む）を標的とするＨＴＲＡ１アンタゴニストを指すために使用する。一部の実施形態では、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ又はリボザイムである。
【０１８８】
ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストは、ＨＴＲＡ１標的核酸を発現している細胞中でＨＴＲＡ１標的核酸の発現を阻害することが可能である。有利には、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストは、オリゴヌクレオチドの核酸塩基の近接配列が、オリゴヌクレオチド又はその近接ヌクレオチド配列の長さにわたって測定されるように、ＨＴＲＡ１標的核酸に相補的である、例えば完全に相補的であるなどの、オリゴヌクレオチドである、又はそれを含む。ＨＴＲＡ１標的核酸は、一部の実施形態では、ＲＮＡ又はＤＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡなど、例えば成熟ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡなどでありうる。一部の実施形態では、標的核酸は、哺乳動物ＨＴＲＡ１タンパク質、例えばヒトＨＴＲＡ１など、例、ヒトＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ配列、例えば配列番号３又は４として開示されているものなどをコードするＲＮＡである。例示的な標的核酸に関するさらなる情報を表１及び２中に提供する。
【表１】
2021507253.tif 000006
【表２】
2021507253.tif 000007
【０１８９】
ＨＴＲＡ１のオリゴヌクレオチドアンタゴニスト
【０１９０】
ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５９３７及びＥＰ１７１７３９６４．２（それらの両方を、それらの全体において参照により組み入れる）には、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡの強力なインビボ阻害剤である多数のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びそれらの治療的な使用（黄斑変性症を処置するための使用を含む）が開示されており、それらを本発明において使用してもよい。
【０１９１】
ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストは、哺乳動物ＨＴＲＡ１核酸（例えば配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６など）への少なくとも９０%の相補性を伴う（例えば完全に相補的など）１０〜３０ヌクレオチドの長さの近接ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡでありうる。
【０１９２】
有利には、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストは、ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドなどである。
【０１９３】
一部の実施形態では、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニスト、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドなど（ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド又はギャップマーオリゴヌクレオチドを含む）は、配列番号７への少なくとも９０%、例えば１００%相補性などである１０〜２２ヌクレオチドの近接ヌクレオチド領域を含む：
配列番号７：５’ＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴＴＴＧ  ３’
【０１９４】
一部の実施形態では、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニスト、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡなど；例えばＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド又はギャップマーオリゴヌクレオチドなどは、以下からなる群より選択される配列中に存在する少なくとも１２の近接ヌクレオチドの長さの近接ヌクレオチド領域を含む。
【化５】
2021507253.tif 000008
【０１９５】
一部の実施形態では、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニスト（アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、以下より選択される群より選択されるオリゴヌクレオチドである、又はそれを含む：
【化６】
2021507253.tif 000009
【０１９６】
ここで、大文字はベータＤオキシＬＮＡヌクレオシド単位を表し、小文字はＤＮＡヌクレオシド単位を表し、下付きのｓはホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し、ここで、全てのＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンである。
【０１９７】
一部の実施形態では、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストは、式５’ＴｓＡｓＴｓｔｓｔｓａｓｃｓｃｓｔｓｇｓｇｓｔｓＴｓＧｓＴｓＴ  ３’（配列番号１３）又は５’ＡｓｔｓＡｓＴｓｔｓｔｓａｓｃｓｃｓｔｓｇｓｇｓｔｓＴｓＧｓＴｓＴ  ３’（配列番号１５）のＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである、又はそれを含み、ここで、大文字はベータ−ＤオキシＬＮＡヌクレオシド単位を表し、小文字はＤＮＡヌクレオシド単位を表し、下付きのｓはホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し、ここで、全てのＬＮＡシトシンは５−メチルシトシン、又はその医薬的に許容可能な塩である。
【０１９８】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０〜３０のヌクレオチドの長さであり、ここで、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＴＲＡ１核酸を標的とし、配列番号１６への少なくとも９０%、例えば１００%相補性などである１０〜２２のヌクレオチドの近接ヌクレオチド領域を含む。
【化７】
2021507253.tif 000010
【０１９９】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１７、１８、及び１９のいずれか１つより選択される近接ヌクレオチド領域、又はその少なくとも１２の近接ヌクレオチドである、又はそれを含む：
【化８】
2021507253.tif 000011
【０２００】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下より選択される近接ヌクレオチド領域である、又はそれを含む：
【化９】
2021507253.tif 000012
ここで、大文字はＬＮＡヌクレオチドであり、及び小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、及びシトシン残基は場合により５−メチルシトシンである。
【０２０１】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下より選択される近接ヌクレオチド領域である、又はそれを含む：
【化１０】
2021507253.tif 000013
ここで、大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、下付きのｓはホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し、及びｍＣは５メチルシトシンベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、及びｍｃは５メチルシトシンＤＮＡヌクレオシドを表す。
【０２０２】
本発明に従った、又は本発明に従った方法における使用のためのＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストである例示的なＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物については、図１、２、３、４、及び５を参照のこと。
【０２０３】
眼障害及びＨＴＲＡ１関連障害
【０２０４】
用語「ＨｔｒＡ１関連障害」は、本明細書中で使用するように、最も広い意味において、ＨｔｒＡ１発現又は活性（異常なＨＴＲＡ１発現又は活性を含む）に関連付けられる任意の障害又は状態を指す。一部の実施形態では、ＨＴＲＡ１関連障害は、非定型症状が、身体における局所的（例、眼中）及び／又は全身的なＨＴＲＡ１のレベル又は活性に起因して現れうる過剰なＨＴＲＡ１レベル又は活性に関連付けられる。例示的なＨＴＲＡ１関連障害は、ＨＴＲＡ１関連眼障害を含み、それは、例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）（ウェット型（滲出型）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性のウェット型ＡＭＤを含む）及びドライ型（非滲出型）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性のドライ型ＡＭＤ（例、地図状委縮（ＧＡ））を含む）を含むが、これらに限定しない。
【０２０５】
本明細書中で使用するように、用語「眼障害」は、眼の障害（黄斑変性疾患、例えば加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）（ウェット型（滲出型）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性のウェット型ＡＭＤを含む））及びドライ型（非滲出型）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性のドライ型ＡＭＤ（例、地図状委縮（ＧＡ））を含む））；糖尿病性網膜症（ＤＲ）及び他の虚血関連網膜症；眼内炎；ブドウ膜炎；脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）；未熟児網膜症（ＲＯＰ）；ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）；糖尿病性黄斑浮腫；病理学的近視；フォンヒッペル−リンダウ病；眼のヒストプラスマ症；網膜中心静脈閉塞（ＣＲＶＯ）；角膜血管新生；及び網膜血管新生を含むが、これらに限定しない。一部の実施形態では、眼障害はＡＭＤ（例、ＧＡ）である。
【０２０６】
被験体
【０２０７】
「個体」又は「被験体」は哺乳動物である。哺乳動物は、霊長類（例、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサルなど）、ならびにげっ歯類（例、マウス及びラット）を含む。特定の実施形態では、個体又は被験体はヒトである。「被験体」は「患者」でありうる−患者は、処置を必要とするヒトの被験体であり、ＨＴＲＡ１関連障害、例えば眼疾患などを有する個人、ＨＴＲＡ１関連障害、例えば眼障害などを発生するリスクがある被験体でありうる。
【０２０８】
一部の実施形態では、患者は、眼障害、例えば本明細書中に列挙するものなど、例えばＡＭＤ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、又はポリープ状脈絡膜血管症からなる群より選択される眼障害などと診断された人である。一部の実施形態では、眼障害は、早期のドライ型ＡＭＤ、中等度のドライ型ＡＭＤ、又は進行性のドライ型ＡＭＤからなる群より選択される。一部の実施形態では、眼障害は地図状委縮である。
【０２０９】
一部の実施形態では、患者は、眼障害、例えば本明細書中に列挙するものなど、例えばＡＭＤ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、又はポリープ状脈絡膜血管症からなる群より選択される眼障害などを発生するリスクがあると特定されている人である。一部の実施形態では、眼障害は、早期のドライ型ＡＭＤ、中等度のドライ型ＡＭＤ、又は進行性のドライ型ＡＭＤからなる群より選択される。一部の実施形態では、眼障害は地図状委縮である。
【０２１０】
一部の実施形態では、患者は、彼らの房水又は硝子体液中で上昇したＨＴＲＡ１レベルを有していた人である。一部の実施形態では、患者は、ＨＴＲＡ１関連障害と診断されている人、又はＨＴＲＡ１関連障害を発生するリスクがあると特定されている人である。患者は、従って、彼らの房水又は硝子体液中で上昇したＨＴＲＡ１レベルを有する被験体でありうるが、場合により、無症候性でありうる。
【０２１１】
一部の実施形態では、患者は、ＨＴＲＡ１遺伝子又はＨＴＲＡ１制御配列中に１つ以上の疾患関連多型、例えばＨＴＲＡ１プロモーター多型ｒｓ１１２００６３８（Ｇ／Ａ）（例、DeWan et al., Science 314: 989-992, 2006を参照のこと。それを、参照によりその全体において本明細書中に組み入れる）を有する被験体でありうる。患者は、従って、彼らのＨＴＲＡ１遺伝子又はＨＴＲＡ１制御配列中に疾患関連多型を有する被験体でありうるが、場合により、無症候性でありうる。
【０２１２】
医薬的塩
【０２１３】
治療薬としての使用のために、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニスト、例えばＨＴＲＡ１を標的とするオリゴヌクレオチドなどは、本発明の方法又は使用に従って使用され、適切な医薬的塩、例えばナトリウム塩又はカリウム塩などとして提供してもよい。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドはナトリウム塩である。
【０２１４】
医薬的組成物
【０２１５】
さらなる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートのいずれか、ならびに医薬的に許容可能な希釈剤、担体、塩、及び／又はアジュバントを含む医薬的組成物を提供する。医薬的に許容可能な希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、及び医薬的に許容可能な塩は、ナトリウム塩及びカリウム塩を含むが、これらに限定しない。一部の実施形態では、医薬的に許容可能な希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５０〜３００μM溶液の濃度で医薬的に許容可能な希釈剤中で使用する。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜１０００μgの用量で投与する。
【０２１６】
ＷＯ２００７／０３１０９１には、医薬的に許容可能な希釈剤、担体、及びアジュバント（本明細書により、参照により組み入れる）の適切で好ましい例が提供されている。適切な投与量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療用薬剤との組み合わせ、プロドラッグ製剤がまた、ＷＯ２００７／０３１０９１において提供されている。
【０２１７】
本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートを、医薬的組成物又は製剤の調製のために、医薬的に許容可能な活性又は不活性物質と混合してもよい。医薬的組成物の製剤化のための組成物及び方法は、多数の基準（投与の経路、疾患の程度、又は投与される用量を含むが、これらに限定しない）に依存している。
【０２１８】
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートはプロドラッグである。特に、オリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、コンジュゲート部分は、一度プロドラッグが作用の部位（例、標的細胞）に送達されると、オリゴヌクレオチドから切断される。
【０２１９】
投与
【０２２０】
ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストは、局所（例えば皮膚へ、吸入、眼科、又は耳科など）又は経腸（例えば経口又は胃腸管を通じてなど）又は非経口（例えば静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、又は髄腔内など）を介して投与してもよい。
【０２２１】
一部の実施形態では、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを非経口経路（静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入、くも膜下腔内又は頭蓋内、例、脳内又は脳室内投与を含む）により投与する。一部の実施形態では、活性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートを静脈内投与する。別の実施形態では、活性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートを皮下投与する。
【０２２２】
眼障害を処置する際での使用のために、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニスト、例えば、本明細書中に記載するＬＮＡオリゴヌクレオチド、眼内注射を使用してもよい。
【０２２３】
一部の実施形態では、本発明の化合物、又はその医薬的に許容可能な塩は、眼内注射を介して、約１０μgから約２００μg/眼、例えば約５０μgから約１５０μg/眼など、例えば約１００μg/眼などの用量中で投与する。一部の実施形態では、投与間隔、即ち、連続投与間の期間は、少なくとも１ヶ月に１回、例えば少なくとも２ヶ月に１回、又は少なくとも３ヶ月に１回である。
【０２２４】
サンプル中のＨＴＲＡ１のレベルの決定。
【０２２５】
硝子体液又は房水、有利には房水のサンプルを被験体から得る。サンプル中に存在するＨＴＲＡ１のレベルは、適切にはイムノアッセイにおける抗ＨＴＲＡ１抗体の使用を介して、又は質量分析の使用を介して、当技術分野における任意の公知の方法により決定されてもよい。
【０２２６】
一部の実施形態では、ＨＴＲＡ１タンパク質レベルが、質量分析を使用して決定される。
【０２２７】
一部の実施形態では、ＨＴＲＡ１タンパク質のレベルが、イムノアッセイを使用して（例えばＨＴＲＡ１特異的抗体を使用するなど）決定される。
【０２２８】
一部の実施形態では、ＨＴＲＡ１タンパク質レベルを、ＨＴＲＡ１抗体捕捉、それに続くＬＣ−ＭＳを使用して決定する。
【０２２９】
一部の実施形態では、ＨＴＲＡ１タンパク質レベルを、プロテアーゼ（例、トリプシン）（被験体からの硝子体液又は房水のサンプルから得られた免疫捕捉ＨＴＲＡ１の消化タンパク質サンプル）のＬＣ-ＭＳを介して決定する。免疫捕捉ＨＴＲＡ１を消化するために使用されうる他のプロテアーゼは、ＬｙｓＣ、ＡｓｐＮ、ＧｌｕＣを含む。
【０２３０】
一部の実施形態では、ＨＴＲＡ１タンパク質を、ＨＴＲＡ１抗体を使用してサンプルから免疫捕捉する（例えば免疫捕捉酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を介する、又はウェスタンブロットを介するなど）。
【０２３１】
ＨＴＲＡ１のレベルと１つ以上の参照サンプルの比較。
【０２３２】
上で説明した通り、ＨＴＲＡ１過剰発現は、ＡＭＤ、例えば早期のドライ型ＡＭＤ、中等度のドライ型ＡＭＤ、又は進行性のドライ型ＡＭＤ（例えば地図状委縮など）などを含む多数の眼疾患に関連付けられる。工程ｉｉ）における本発明の方法は、従って、工程ｉ）において得られたＨＴＲＡ１レベル（例、ＨＴＲＡ１タンパク質レベル）と、眼疾患に罹患していない、又はＨＴＲＡ  １遺伝子（ＨＴＲＡ制御領域を含む）において疾患関連多型を有さない健常な被験体（陰性対照被験体）におけるＨＴＲＡ１レベルの１つ以上の参照値、あるいはそのような健常な被験体（陰性対照被験体）の集団から得られた平均又は平均参照値との比較を含みうる。あるいは、又はまた、工程ｉｉ）は、工程ｉｉ）において得られたＨＴＲＡ１レベル（例、ＨＴＲＡ１タンパク質レベル）と、ＨＴＲＡ１関連眼疾患と診断されている、又はＨＴＲＡ１を過剰発現するとして特徴付けられている、及び／又はＨＴＲＡ  １遺伝子（ＨＴＲＡ制御領域を含む）における疾患関連多型を有する（即ち、陽性対照）として特徴付けられている被験体におけるＨＴＲＡ１レベルの１つ以上の参照値との比較を含みうる。陰性対照被験体と比較して上昇した、及び／又は陽性対照値と類似又は等価であるＨＴＲＡ１レベルは、被験体が、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた処置になる可能性が高い、又はそれに適合であることの指標である。
【０２３３】
さらなる実施形態では、陽性及び／又は陰性対照値に加えて、同じ個々の被験体から以前に得られた値を使用してもよい。この参照サンプルには、従って、以前に同じ被験体から得られた履歴的な値、又は履歴値を含みうる。工程ｉ）において得られたＨＴＲＡ１レベルを、同じ被験体からの履歴値と比較することにより、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニスト治療の有効性のモニタリングが可能になり、従って、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストの可能性の高い有効用量を決定するために使用してもよい。これに関して、一部の実施形態では、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニスト治療の目的は、完全な阻害を達成するよりはむしろ、ＨＴＲＡ１レベルを本質的に正常化することである。本発明の方法又は使用は、従って、ＨＴＲＡ１処置に先立ち、その間に、又は後にＨＴＲＡ１レベルの患者モニタリングのために使用してもよく、例えば、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストの投与用量間で使用し、例えば、処置の有効性を最適化するための投与量の調節が可能になりうる。
【０２３４】
本発明のさらなる実施形態
【０２３５】
１．ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた投与についての被験体の処置の適合性を決定するための方法であって、前記方法は以下の工程を含み：
ｉ）被験体から得られた房水又は硝子体液のサンプル中のＨＴＲＡ１のレベルを決定すること
ｉｉ）工程ｉ）から得られたＨＴＲＡ１のレベルを、１つ以上の参照サンプル又は参照値と比較し；
被験体が、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた処置となる可能性が高い、又はそれに適合であるか否かを決定すること、
ここで、被験体は、眼障害（例えば黄斑変性症など）に罹患している、又はそれを発生するリスクがある、方法。
【０２３６】
２．房水又は硝子体液のサンプル中のＨＴＲＡ１のレベルが、サンプル中のＨＴＲＡ１タンパク質のレベルを定量化することにより決定される、実施形態１に従った方法。
【０２３７】
３．ＨＴＲＡ１タンパク質のレベルが、イムノアッセイを使用して（例えばＨＴＲＡ１特異的抗体を使用する、など）決定される、実施形態２に従った方法。
【０２３８】
４．ＨＴＲＡ１タンパク質のレベルが、質量分析を使用して（例えばＨＴＲＡ１抗体捕捉、それに続くＬＣ−ＭＳなどを介して、など）決定される、実施形態３に従った方法。
【０２３９】
５．参照サンプル又は参照値の少なくとも１つが、黄斑変性症に罹患している対照被験体から得られる、実施形態１〜４のいずれか１つに従った方法。
【０２４０】
６．参照サンプル又は参照値の少なくとも１つが、黄斑変性症に罹患していない対照被験体から得られる、実施形態１〜５のいずれか１つに従った方法。
【０２４１】
７．参照サンプルの少なくとも１つが、処置の適合性が評価されている同じ被験体から以前に得られた値である、実施形態１〜６のいずれか１つに従った方法。
【０２４２】
８．参照値が、網膜中のＨＴＲＡ１濃度及び房水又は硝子体液中のＨＴＲＡ１濃度の間の相関をモデル化するデータセットから由来する、実施形態１〜７のいずれか１つに従った方法。
【０２４３】
９．ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストが、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡを標的とするリボザイムからなる群より選択される、実施形態１〜８のいずれか１つに従った方法。
【０２４４】
１０．方法が、被験体が網膜（例えば網膜上皮細胞など）において増強されたＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ又はＨＴＲＡ１タンパク質発現を有するか否かを決定するためである、実施形態１〜９のいずれか１つに従った方法。
【０２４５】
１１．被験体が、黄斑変性疾患、例えば加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）（ウェット型（滲出型）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性のウェット型ＡＭＤを含む））及びドライ型（非滲出型）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性のドライ型ＡＭＤ（例、地図状委縮（ＧＡ））を含む）；糖尿病性網膜症（ＤＲ）及び他の虚血関連網膜症；眼内炎；ブドウ膜炎；脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）；未熟児網膜症（ＲＯＰ）；ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）；糖尿病性黄斑浮腫；病理学的近視；フォンヒッペル−リンダウ病；眼のヒストプラスマ症；網膜中心静脈閉塞（ＣＲＶＯ）；角膜血管新生；及び網膜血管新生からなる群より選択される眼障害に罹患している又はそれを発生するリスクがある、実施形態１〜１０のいずれか１つに従った方法。
【０２４６】
１２．被験体が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、例えばウェット型（滲出型）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性のウェット型ＡＭＤを含む）、ドライ型（非滲出型）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性のドライ型ＡＭＤ（例、地図状委縮（ＧＡ））を含む）；有利には、ドライ型ＡＭＤからなる群より選択されるＡＭＤなどに罹患している又はそれを発生するリスクのある、実施形態１〜１１のいずれか１つに従った方法。
【０２４７】
１３．方法が、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた投与のための適切な投与計画を決定するためである、実施形態１〜１２のいずれか１つに従った方法。
【０２４８】
１４．ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストが、ＨＴＲＡ１標的核酸配列（例えば配列番号１又は配列番号２など）に完全に相補的である１０〜３０ヌクレオチドの近接ヌクレオチド領域を含むオリゴヌクレオチドである、実施形態１〜１３のいずれか１つに従った方法。
【０２４９】
１５．ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストが、配列番号７又は配列番号１６に少なくとも９０＆相補的である、例えば完全に相補的である少なくとも１２ヌクレオチドの長さの近接ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである又はそれを含む、実施形態１〜１４のいずれか１つに従った方法。
【０２５０】
１６．ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドなどである又はそれを含む、実施形態１〜１５のいずれか１つに従った方法。
【０２５１】
１７．ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストが、以下からなる群：
【化１１】
2021507253.tif 000014
ここで、大文字はベータＤオキシＬＮＡヌクレオシド単位を表し、小文字はＤＮＡヌクレオシド単位を表し、下付きのｓはホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し、ｍｃは５メチルシトシンＤＮＡヌクレオシドを表し、及び全てのＬＮＡシトシンは５−メチルシトシン；又はその医薬的に許容可能な塩
より選択される、実施形態１〜１６のいずれか１つに従った方法。
【０２５２】
１８．黄斑変性症に罹患している又はそれを発生するリスクがある被験体を処置するための方法であって、前記方法は、実施形態１〜１７のいずれか１つに従った方法を実施すること、及び被験体に有効量のＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを投与することを含む方法。
【０２５３】
１９．ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストが硝子体内投与を介した投与用である、実施形態１〜１７のいずれか１つに従った方法。
【０２５４】
２０．ＨＴＲＡ１  ＲＮＡアンタゴニスト治療用のコンパニオン診断薬としてのＨＴＲＡ１抗体の使用。
【０２５５】
２１．例えば先行する実施形態のいずれか１つに従った、ＨＴＲＡ１  ＲＮＡアンタゴニスト治療薬、例えばＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストなどについての有効性についてのバイオマーカーとしてのＨＴＲＡ１抗体の使用。
【０２５６】
２２．例えば先行する実施形態のいずれか１つに従った、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた処置を受けている、又はＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを用いた処置の適合性について評価されている被験体から得られた房水又は硝子体液サンプル中のＨＴＲＡ１レベルの検出におけるＨＴＲＡ１抗体の使用。
【０２５７】
２２．例えば先行する実施形態のいずれか１つに従った、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストを含む治療的薬剤への被験体の可能性の高い応答を決定するためのバイオマーカーの使用であって、ここで、バイオマーカーは、健常な被験体からの参照サンプルから得られたＨＴＲＡ１のレベルと比較して、被験体の房水又は硝子体液から得られた生物学的サンプル中の上昇したＨＴＲＡ１のレベルを含む、使用。
【０２５８】
実施例
【０２５９】
オリゴヌクレオチド合成
【０２６０】
オリゴヌクレオチド合成は、当技術分野において一般的に公知である。以下は、適用されうるプロトコールである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用される器具、支持体、及び濃度に関してわずかに変動する方法により産生されているであろう。
【０２６１】
オリゴヌクレオチドは、Oligomaker 48上のホスホラミダイトアプローチを１μmolスケールで使用し、ウリジン汎用支持体上で合成する。合成の終了時に、オリゴヌクレオチドを、水性アンモニアを５〜１６時間にわたり６０℃で使用し、固体支持体から切断する。オリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により又は固相抽出により精製し、ＵＰＬＣにより特徴付け、分子量をＥＳＩ−ＭＳによりさらに確認する。
【０２６２】
オリゴヌクレオチドの伸長：
【０２６３】
β−シアノエチル−ホスホルアミダイト（ＤＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ−Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｔ、ＬＮＡ−５−メチル−Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ｇ（ｄｍｆ）、ＬＮＡ−Ｔ）のカップリングを、活性剤としてのアセトニトリル中の０．１Ｍの５’−Ｏ−ＤＭＴ保護アミダイト及びアセトニトリル中のＤＣＩ（４，５−ジシアノイミダゾール）（０．２５M）の溶液を使用することにより実施する。最終サイクルについては、所望の修飾を伴うホスホラミダイトを使用することができる（例、コンジュゲート基を付着させるためのＣ６リンカー又はそのようなものとしてのコンジュゲート基）。ホスホロチオエート連結の導入のためのチオール化を、水素化キサンタン（アセトニトリル／ピリジン９：１中で０．０１M）を使用することにより行う。ホスホジエステル連結は、ＴＨＦ／ピリジン／水７：２：１中の０．０２Mヨウ素を使用して導入することができる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成のために典型的に使用されるものである。
【０２６４】
固相合成後のコンジュゲーションのために、商業的に利用可能なＣ６アミノリンカーホスホルアミダイトを、固相合成の最後のサイクルにおいて使用することができ、脱保護及び固相支持体からの切断後、アミノ連結された脱保護オリゴヌクレオチドを単離する。コンジュゲートを、標準的な合成方法を使用した官能基の活性化を介して導入する。
【０２６５】
ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製：
【０２６６】
粗化合物は、Phenomenex Jupiter C18 10μ  １５０×１０mmカラム上での分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。０．１M酢酸アンモニウムｐＨ８及びアセトニトリルを、５mL/分の流速で緩衝液として使用する。収集した画分を凍結乾燥し、典型的には白色固体として精製化合物を与える。
【０２６７】
実施例１．カニクイザル（非ヒト霊長類、ＮＨＰ）インビボ薬物動態及び薬力学（ＰＫ／ＰＤ）試験、２１日間の処置、硝子体内（ＩＶＴ）注射、単回用量。
【０２６８】
ノックダウンが、網膜中のｍＲＮＡならびに網膜中及び硝子体中のタンパク質レベルの両方で、位置３３０４２〜３３０６４の間のヒトＨＴＲＡ１プレｍＲＮＡ中の「ホットスポット」を標的とする、１つの選択されたＨＴＲＡ１  ＬＮＡオリゴヌクレオチド１５．３について観察された（図６を参照のこと）。
【０２６９】
動物
【０２７０】
全ての実験をカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）で実施した。
【０２７１】
化合物及び投与手順
【０２７２】
ブプレノルフィン鎮痛薬を、テスト化合物注射に先立ち、及びその２日後に投与した。動物を、ケタミン及びキシラジンの筋肉内注射を用いて麻酔した。テスト品及び陰性対照（ＰＢＳ）を、テトラカイン麻酔薬の局所適用後の試験１日目に、麻酔された動物の両眼において硝子体内投与した（５０μL/投与）。
【０２７３】
安楽死
【０２７４】
生存期の終了時（２２日目）に、全てのサルをペントバルビタールの腹腔内の過量注射により安楽死させた。
【０２７５】
オリゴ含量測定及びｑＰＣＲによるＨｔｒａ１  ＲＮＡ発現の定量化。
【０２７６】
安楽死の直後、眼組織を素早く注意深く氷上で解剖し、輸送まで−８０℃で保存した。網膜サンプルを７００μLのMagNa Pure 96 LC RNA Isolation Tissue緩衝液中で溶解し、precellysエボリューションホモジナイザーを使用し、２mlチューブ当たり１つのステンレススチールビーズを２×１．５分加えることよりホモジナイズし、室温で３０分間のインキュベーションが続いた。サンプルを１３０００rpm、５分間遠心分離した。半分を生物分析用に取っておき、他の半分について、ＲＮＡ抽出を直接継続した。
【０２７７】
生物分析のために、サンプルを、ハイブリダイゼーションＥＬＩＳＡ方法を用いたオリゴ含量測定のために１０〜５０倍に希釈した。ビオチン化ＬＮＡ捕捉プローブ及びジゴキシゲニンコンジュゲートＬＮＡ検出プローブ（両方とも５×ＳＳＣＴ中で３５nM、各々が、検出されるＬＮＡオリゴヌクレオチドの１つの末端に相補的である）を、希釈したホモジネート又は関連する標準と混合し、ＲＴで３０分間にわたりインキュベートし、次に、ストレプトアビジンでコーティングされたＥＬＩＳＡプレート（Nunc、カタログ番号４３６０１４）に加えた。
【０２７８】
プレートを室温で１時間にわたりインキュベートし、２×ＳＳＣＴ（３００mM塩化ナトリウム、３０mMクエン酸ナトリウム、及び0.05%ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．０）中で洗浄した。捕捉されたＬＮＡ二本鎖を、アルカリホスファターゼ（Roche Applied Scienceカタログ番号１１０９３２７４９１０）及びアルカリホスファターゼ基質システム（Blue Phos基質、ＫＰＬ製品コード５０−８８−００）を用いてコンジュゲートされた抗ＤＩＧ抗体を使用して検出した。オリゴ複合体の量を、Biotekリーダー上で６１５nmでの吸光度として測定した。
【０２７９】
ＲＮＡ抽出のために、細胞ＲＮＡ大容量キット（０５４６７５３５００１、Roche）を、プログラムを伴うMagNA Pure 96システムにおいて使用した：製造業者の指示に従った組織ＦＦ標準ＬＶ３．１（ＤＮＡｓｅ処理を含む）。ＲＮＡの品質管理及び濃度を、Eonリーダー（Biotek）を用いて測定した。ＲＮＡ濃度をサンプルにわたり標準化し、その後のｃＤＮＡ合成及びｑＰＣＲを、qScript XLTワンステップRT-qPCR ToughMix Low ROX、95134-100（Quanta Biosciences）を使用し、ワンステップ反応において実施した。以下のTaqManプライマーアッセイをシングルプレックス反応において使用した：Ｈｔｒａ１、Ｍｆ０１０１６１５０＿、Ｍｆ０１０１６１５２＿ｍ１及びＲｈ０２７９９５２７＿ｍ１ならびにハウスキーピング遺伝子、ＡＲＦＧＡＰ２、Ｍｆ０１０５８４８８＿ｇ１及びＲｈ０１０５８４８５＿ｍ１、ならびにＡＲＬ１、Ｍｆ０２７９５４３１＿ｍ１（Life Technologiesから）。ｑＰＣＲ分析をViiA7機器（Life Technologies）で実行した。眼／群：ｎ＝３眼。各々の眼を、個別のサンプルとして処理した。相対的なＨｔｒａ１  ｍＲＮＡ発現レベルを、対照（ＰＢＳ）の%として示す。
【０２８０】
組織学
【０２８１】
眼球を除去し、１０%中性緩衝ホルマリン中で２４時間固定し、切り整えてパラフィン中に包埋した。
【０２８２】
ＩＳＨ分析のために、ホルマリン固定パラフィン包埋網膜組織（厚さ４μm）の切片を、RNAscope 2.5 VSプローブMmu- HTRA1、REF 486979（Advanced Cell Diagnostics、Inc.）を使用した、完全に自動化されたVentana Dicovery ULTRA染色モジュール（手順：mRNA Discovery Ultra Red 4.0 - v0.00.0152）を使用して処理した。使用した色素原は、Fastred、ヘマトキシリンＩＩ対比染色である。
【０２８３】
プレートベースの免疫沈降質量分析（ＩＰ−ＭＳ）アプローチを使用したＨＴＲＡ１タンパク質の定量化。
【０２８４】
サンプル調製、網膜
【０２８５】
網膜を、Precellys 24（５５００、１５秒、２サイクル）を使用し、プロテアーゼ阻害剤（完全ＥＤＴＡ不含、Roche）を伴う４容量（ｗ／ｖ）のＲＩＰＡ緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０mM  ＮａＣｌ、０．２５%デオキシコール酸、１%ＮＰ−４０、１mM  ＥＤＴＡ、Millipore）中でホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離し（１３，０００rpm、３分）、上清のタンパク質含量を決定した（Pierce BCAタンパク質アッセイ）。
【０２８６】
サンプル調製、硝子体
【０２８７】
硝子体（３００μl）を、プロテアーゼ阻害剤（完全ＥＤＴＡ不含、Roche）を伴う５×ＲＩＰＡ緩衝液（最終濃度：５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０mM  ＮａＣｌ、０．２５%デオキシコール酸、１%ＮＰ−４０、１mM  ＥＤＴＡ）を用いて希釈し、Precellys 24（５５００、１５秒、２サイクル）を使用してホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離し（１３，０００rpm、３分）、上清のタンパク質含量を決定した（Pierce BCAタンパク質アッセイ）。
【０２８８】
プレートベースのＨＴＲＡ１免疫沈降及びトリプシン消化。
【０２８９】
９６ウェルプレート（Nunc MaxiSorp）を、抗ＨＴＲＡ１マウスモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ＭＡＢ２９１６、５０μlのＰＢＳ中に５００ng/ウェル）を用いてコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ（２００μl）を用いて２回洗浄し、ＰＢＳ中の３%（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いて２０℃で３０分間にわたりブロッキングし、２回のＰＢＳ洗浄が続いた。サンプル（５０μlのＰＢＳ中の７５μgの網膜、１００μgの硝子体）を無作為化し、プレートに加え、シェーカー（１５０rpm）上で４℃で一晩のインキュベーションが続いた。プレートを次に、ＰＢＳを用いて２回、及び水を用いて１回洗浄した。５０mM  ＴＥＡＢ（３０μl）中の１０mM  ＤＴＴを次に、各々のウェルに加え、２０℃で１時間にわたるインキュベーションが続き、システインスルフヒドリルを還元した。５０mM  ＴＥＡＢ（５μl）中の１５０mMヨードアセトアミドを次に、各々のウェルに加え、システインスルフヒドリルをブロックするために、暗所における２０℃で３０分間にわたるインキュベーションが続いた。１０μlの消化溶液を各々のウェルに加え（最終濃度：１．２４ng/μlトリプシン、２０fmol/μlＢＳＡペプチド、２６fmol/μl同位体標識ＨＴＲＡ１ペプチド、１fmol/μlｉＲＴペプチド、Biognosys）、２０℃で一晩のインキュベーションが続いた。
【０２９０】
標的質量分析によるＨＴＲＡ１ペプチド定量化（選択された反応モニタリング、ＳＲＭ）。
【０２９１】
質量分析を、TSQ Quantiva三連四重極型質量分析計（Thermo Scientific）に連結されたUltimate RSLCnano LCで実施した。サンプル（２０μL）を、ＩＰ用に使用される９６ウェルプレートから直接注入し、充填緩衝液（０．５%ｖ／ｖギ酸、２%ｖ／ｖ  ＡＣＮ）中で、Acclaim Pepmap 100トラップカラム（１００μm×２cm、Ｃ１８、５μm、１００Å、Thermo Scientific）に５μL/分で６分間充填した。ペプチドを次に、流量２５０nL/分で以下の勾配を使用し、４０℃に加熱した統合エレクトロスプレーエミッターを用いて、PepMap Easy-SPRAY分析カラム（７５μm×１５cm、３μm、１００Å、Thermo Scientific）上で分離した：６分、９８%緩衝液Ａ（２%ＡＣＮ、０．１%ギ酸）、２%緩衝液Ｂ（ＡＣＮ＋０．１%ギ酸）；３６分、３０%緩衝液Ｂ；４１分、６０%緩衝液Ｂ；４３分、８０%緩衝液Ｂ；４９分、８０%緩衝液Ｂ；５０分、２%緩衝液Ｂ。TSQ Quantivaを、以下のパラメーターを伴うＳＲＭモードにおいて操作した：サイクル時間、１．５秒；スプレー電圧、１８００Ｖ；衝突ガス圧力、２mTorr；Ｑ１及びＱ３分解、０．７  ＦＷＨＭ；イオン移動チューブ温度３００℃。ＳＲＭ移行を、ＨＴＲＡ１ペプチド「ＬＨＲＰＰＶＩＶＬＱＲ」及び同位体標識（Ｌ−［Ｕ−１３Ｃ、Ｕ−１５Ｎ］Ｒ）合成バージョン（内部標準として使用した）について取得した。データ分析を、Skylineバージョン３．６を使用して実施した。
【０２９２】
実施例２：カニクイザルのインビボ薬物動態及び薬力学試験、２１日間の処置、硝子体内（ＩＶＴ）注射、単回用量。
【０２９３】
ノックダウンを、網膜中のｍＲＮＡならびに網膜中及び硝子体中のタンパク質レベルの両方で、位置５３１１３〜５３３８４の間のヒトＨＴＲＡ１プレｍＲＮＡ中の「ホットスポット」を標的とする３つのＨＴＲＡ１  ＬＮＡオリゴヌクレオチドについて観察した。
【０２９４】
動物
【０２９５】
全ての実験をカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）で実施した。
【０２９６】
４匹の動物を試験の各々の群において含めた（合計２０匹）。
【０２９７】
化合物及び投与手順
【０２９８】
ブプレノルフィン鎮痛薬を、テスト化合物の注射に先立ち、及びその２日後に投与した。動物を、ケタミン及びキシラジンの筋肉内注射を用いて麻酔した。テスト品及び陰性対照（ＰＢＳ）を、テトラカイン麻酔薬の局所適用後の試験１日目に、麻酔された動物の両眼において硝子体内投与した（５０μL/投与）。
【０２９９】
安楽死
【０３００】
生存期の終了時（２２日目）に、全てのサルをペントバルビタールの腹腔内の過量注射により安楽死させた。
【０３０１】
オリゴ含量測定及びｑＰＣＲによるＨｔｒａ１  ＲＮＡ発現の定量化。
【０３０２】
安楽死の直後、眼組織を素早く注意深く氷上で解剖し、輸送まで−８０℃で保存した。網膜サンプルを７００μLのMagNa Pure 96 LC RNA Isolation Tissue緩衝液中で溶解し、precellysエボリューションホモジナイザーを使用し、２mlチューブ当たり１つのステンレススチールビーズを２×１．５分加えることよりホモジナイズし、室温で３０分間のインキュベーションが続いた。サンプルを１３０００rpm、５分間遠心分離した。半分を生物分析用に取っておき、他の半分について、ＲＮＡ抽出を直接継続した。
【０３０３】
生物分析のために、サンプルを、ハイブリダイゼーションＥＬＩＳＡ方法を用いたオリゴ含量測定のために１０〜５０倍に希釈した。ビオチン化ＬＮＡ捕捉プローブ及びジゴキシゲニンコンジュゲートＬＮＡ検出プローブ（両方とも５×ＳＳＣＴ中で３５nM、各々が、検出されるＬＮＡオリゴヌクレオチドの１つの末端に相補的である）を、希釈したホモジネート又は関連する標準と混合し、ＲＴで３０分間にわたりインキュベートし、次に、ストレプトアビジンでコーティングされたＥＬＩＳＡプレート（Nunc、カタログ番号４３６０１４）に加えた。
【０３０４】
プレートを室温で１時間にわたりインキュベートし、２×ＳＳＣＴ（３００mM塩化ナトリウム、３０mMクエン酸ナトリウム、及び０．０５%ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．０）中で洗浄した。捕捉されたＬＮＡ二本鎖を、アルカリホスファターゼ（Roche Applied Scienceカタログ番号１１０９３２７４９１０）及びアルカリホスファターゼ基質システム（Blue Phos基質、KPL製品コード５０−８８−００）を用いてコンジュゲートされた抗ＤＩＧ抗体を使用して検出した。オリゴ複合体の量を、Biotekリーダー上で６１５nmでの吸光度として測定した。
【０３０５】
ＲＮＡ抽出のために、細胞ＲＮＡ大容量キット（０５４６７５３５００１、Roche）を、プログラムを伴うMagNA Pure 96システムにおいて使用した：製造業者の指示に従った組織ＦＦ標準ＬＶ３．１（ＤＮＡｓｅ処理を含む）。ＲＮＡの品質管理及び濃度を、Eonリーダー（Biotek）を用いて測定した。ＲＮＡ濃度をサンプルにわたり標準化し、その後のｃＤＮＡ合成及びｑＰＣＲを、qScript XLTワンステップRT-qPCR ToughMix Low ROX、95134-100（Quanta Biosciences）を使用し、ワンステップ反応において実施した。以下のTaqManプライマーアッセイをシングルプレックス反応において使用した：Ｈｔｒａ１、Ｍｆ０１０１６１５０＿、Ｍｆ０１０１６１５２＿ｍ１及びＲｈ０２７９９５２７＿ｍ１ならびにハウスキーピング遺伝子、ＡＲＦＧＡＰ２、Ｍｆ０１０５８４８８＿ｇ１及びＲｈ０１０５８４８５＿ｍ１、ならびにＡＲＬ１，Ｍｆ０２７９５４３１＿ｍ１（Life Technologiesから）。ｑＰＣＲ分析をViiA7機器（Life Technologies）で実行した。眼／群：ｎ＝３眼。各々の眼を、個別のサンプルとして処理した。相対的なＨｔｒａ１  ｍＲＮＡ発現レベルを、対照（ＰＢＳ）の%として示す。
【０３０６】
組織学
【０３０７】
眼球を除去し、１０%中性緩衝ホルマリン中で２４時間にわたり固定し、切り整えてパラフィン中に包埋した。
【０３０８】
ＩＳＨ分析のために、ホルマリン固定パラフィン包埋カニクイザル網膜組織（厚さ４μm）の切片を、RNAscope 2.5 VSプローブMmu- HTRA1、REF 486979（Advanced Cell Diagnostics、Inc.）を使用した、完全に自動化されたVentana Dicovery ULTRA染色モジュール（手順：mRNA Discovery Ultra Red 4.0 - v0.00.0152）を使用して処理した。使用した色素原は、Fastred、ヘマトキシリンＩＩ対比染色である。
【０３０９】
プレートベースの免疫沈降質量分析（ＩＰ−ＭＳ）アプローチを使用したＨＴＲＡ１タンパク質の定量化。
【０３１０】
サンプル調製、網膜
【０３１１】
網膜を、Precellys 24（５５００、１５秒、２サイクル）を使用し、プロテアーゼ阻害剤（完全ＥＤＴＡ不含、Roche）を伴う４容量（ｗ／ｖ）のＲＩＰＡ緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０mM  ＮａＣｌ、０．２５%デオキシコール酸、１%ＮＰ−４０、１mM  ＥＤＴＡ、Millipore）中でホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離し（１３，０００rpm、３分）、上清のタンパク質含量を決定した（Pierce BCAタンパク質アッセイ）。
【０３１２】
サンプル調製、硝子体
【０３１３】
硝子体液（３００μl）を、プロテアーゼ阻害剤（完全ＥＤＴＡ不含、Roche）を伴う５×ＲＩＰＡ緩衝液（最終濃度：５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０mM  ＮａＣｌ、０．２５%デオキシコール酸、１%ＮＰ−４０、１mM  ＥＤＴＡ）を用いて希釈し、Precellys 24（５５００、１５秒、２サイクル）を使用してホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離し（１３，０００rpm、３分）、上清のタンパク質含量を決定した（Pierce BCAタンパク質アッセイ）。
【０３１４】
プレートベースのＨＴＲＡ１免疫沈降及びトリプシン消化。
【０３１５】
９６ウェルプレート（Nunc MaxiSorp）を、抗ＨＴＲＡ１マウスモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ＭＡＢ２９１６、５０μlのＰＢＳ中に５００ng/ウェル）を用いてコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ（２００μl）を用いて２回洗浄し、ＰＢＳ中の３%（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いて２０℃で３０分間にわたりブロッキングし、２回のＰＢＳ洗浄が続いた。サンプル（５０μlのＰＢＳ中の７５μgの網膜、１００μgの硝子体）を無作為化し、プレートに加え、シェーカー（１５０rpm）上での４℃で一晩のインキュベーションが続いた。プレートを次に、ＰＢＳを用いて２回、及び水を用いて１回洗浄した。５０mM  ＴＥＡＢ（３０μl）中の１０mM  ＤＴＴを次に、各々のウェルに加え、２０℃で１時間にわたるインキュベーションが続き、システインスルフヒドリルを還元した。５０mM  ＴＥＡＢ（５μl）中の１５０mMヨードアセトアミドを次に、各々のウェルに加え、システインスルフヒドリルをブロックするために、暗所における２０℃で３０分間にわたるインキュベーションが続いた。１０μlの消化溶液を各々のウェルに加え（最終濃度：１．２４ng/μlトリプシン、２０fmol/μlＢＳＡペプチド、２６fmol/μl同位体標識ＨＴＲＡ１ペプチド、１fmol/μlｉＲＴペプチド、Biognosys）、２０℃で一晩のインキュベーションが続いた。
【０３１６】
標的質量分析によるＨＴＲＡ１ペプチド定量化（選択された反応モニタリング、ＳＲＭ）。
【０３１７】
質量分析を、TSQ Quantiva三連四重極型質量分析計（Thermo Scientific）に連結されたUltimate RSLCnano LCで実施した。サンプル（２０μL）を、ＩＰ用に使用される９６ウェルプレートから直接注入し、充填緩衝液（０．５%ｖ／ｖギ酸、２%ｖ／ｖ  ＡＣＮ）中のAcclaim Pepmap 100トラップカラム（１００μm×２cm、Ｃ１８、５μm、１００Å、Thermo Scientific）に５μL／分で６分間充填した。ペプチドを次に、流量２５０nL/分で以下の勾配を使用し、４０℃に加熱した統合エレクトロスプレーエミッターを用いて、PepMap Easy-SPRAY分析カラム（７５μm×１５cm、３μm、１００Å、Thermo Scientific）上で分離した：６分、９８%緩衝液Ａ（２%ＡＣＮ、０．１%ギ酸）、２%緩衝液Ｂ（ＡＣＮ＋０．１%ギ酸）；３６分、３０%緩衝液Ｂ；４１分、６０%緩衝液Ｂ；４３分、８０%緩衝液Ｂ；４９分、８０%緩衝液Ｂ；５０分、２%緩衝液Ｂ。TSQ Quantivaを、以下のパラメーターを伴うＳＲＭモードにおいて操作した：サイクル時間、１．５秒；スプレー電圧、１８００Ｖ；衝突ガス圧力、２mTorr；Ｑ１及びＱ３分解、０．７  ＦＷＨＭ；イオン移動チューブ温度３００℃。ＳＴＲＡ移行を、ＨＴＲＡ１ペプチド「ＬＨＲＰＰＶＩＶＬＱＲ」及び同位体標識（Ｌ−［Ｕ−１３Ｃ、Ｕ−１５Ｎ］Ｒ）合成バージョン（内部標準として使用した）について取得した。データ分析を、Skylineバージョン３．６を使用して実施した。
【０３１８】
ウェスタンブロット
【０３１９】
0.5 Precellysesチューブ（ＣＫ１４＿０．５ml、Bertin Technologies）中の解剖された網膜サンプルを、プロテアーゼ阻害剤（完全ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤Ｍｉｎｉ、１１  ８３６  １７０  ００１、Roche）を伴うＲＩＰＡ溶解緩衝液（２０−１８８、Milipore）中で溶解及びホモジナイズした。
【０３２０】
硝子体サンプルを、0.5 Precellysesチューブ（ＣＫ１４＿０．５ml、Bertin Technologies）に加え、プロテアーゼ阻害剤（完全ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤Ｍｉｎｉ、１１  ８３６  １７０  ００１、Roche）を伴う１／４ｘ  ＲＩＰＡ溶解緩衝液（２０−１８８、Milipore）中で溶解及びホモジナイズした。
【０３２１】
サンプル（網膜２０μgタンパク質、硝子体４０μgタンパク質）を４〜１５%勾配ゲル（＃５６７−８０８４  Bio-Rad）上で、還元条件下で分析し、Trans-Blot Turboデバイス（Bio-Radから）を使用してニトロセルロース（＃１７０−４１５９  Bio-Rad）上に移した。
【０３２２】
一次抗体：ウサギ抗ヒトＨＴＲＡ１（ＳＦ１）は、Ｓａｓｃｈａ  Ｆａｕｓｅｒ（ケルン大学）からの提供物であった。マウス抗ヒトＧａｐｄｈ（＃９８７９５  Sigma-Aldrich）。二次抗体：ヤギ抗ウサギ８００ＣＷ及びヤギ抗マウス６８０ＲＤはLi-Corからであった。
【０３２３】
ブロットをOdyssee CLX（Li-Corから）上で画像化及び分析した。
【０３２４】
実施例３−カニクイザルでのインビボ評価：房水中でのＨＴＲＡ１タンパク質の決定ならびに網膜中でのＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ及びタンパク質阻害との比較。
【０３２５】
実験方法論：実施例２を参照のこと。房水サンプルを採取し、サンプルを、実施例２の硝子体液サンプルに従って調製した。カニクイザルの房水サンプル（ＡＨ）を、分析方法論でのサイズベースのアッセイを用いて分析した：キャピラリー電気泳動システム（Peggy Sue（商標）、Proteinsimple）
【０３２６】
サンプルを氷上で解凍し、希釈せずに使用した。定量化のために、組換えＨＴＲＡ１−  Ｓ３２８Ａ変異体（Origene＃ＴＰ７００２０８）。調製は、供給業者により記載された通りであった。
【０３２７】
一次ウサギ抗ヒトＨＴＲＡ抗体ＳＦ１は、Ｄｒ．Ｓａｓｃｈａ  Ｆａｕｓｅｒ教授により提供され、１：３００に希釈して使用した。他の全ての試薬はProteinsimpleからであった。
【０３２８】
サンプルを、１２〜２３０kDaの分離モジュールを使用し、技術的には３通りに、２通りの検量線において処理した。ピーク下面積を、Xlfit（IDBSソフトウェア）を使用して計算及び分析した。
【表３】
2021507253.tif 000015
【０３２９】
図９Ａは、化合物＃１５、３、及び＃１７を用いて投与されたサルの房水中でのＨＴＲＡ１タンパク質レベルの視覚化を示し、サンプルは注射後３、８、１５、及び２２日目に採取した。図９Ｂは、ＨＴＲＡ１タンパク質レベルを算出する際に使用する検量線を提供する。図９Ｃは、注射後の時間に対してプロットされた、個々の動物からの房水からの算出されたＨＴＲＡ１レベルを提供する。
【０３３０】
図１０は、房水中のＨＴＲＡ１タンパク質のレベル及び網膜中のＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡのレベルの間での直接的な相関を例証する。房水ＨＴＲＡ１タンパク質レベルは、従って、ＨＴＲＡ１網膜ｍＲＮＡレベル又はＨＴＲＡ１網膜ｍＲＮＡ阻害についてのバイオマーカーとして使用してもよい。
【０３３１】
図１１は、網膜中のＨＴＲＡ１タンパク質レベル及び房水中のＨＴＲＡ１タンパク質レベルの間にも相関があることを例証するが、この相関は、この実験において、網膜中のＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ阻害及び房水中のＨＴＲＡ１タンパク質レベルの間の相関ほど強くはなかったが、房水ＨＴＲＡ１タンパク質レベルがＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストについてのバイオマーカーとして特に適していることを示す。
【０３３２】
実施例４：カニクイザルでのインビボ薬物動態及び薬力学試験、３６日間の処置、硝子体内（ＩＶＴ）注射、単回用量。
【０３３３】
ＨＴＲＡ１  ＬＮＡ曝露動物の房水中でのＨＴＲＡ１タンパク質の動態を、３６日間にわたって調べ、残存するＨＴＲＡ１タンパク質含量を、異なる眼組織画分（硝子体、神経網膜、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、及び脈絡膜）において死後に検証した。ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ抑制を終末サンプルにおいて評価した。
【０３３４】
動物
【０３３５】
全ての実験を、Charles Rivers Laboratories Montreal ULC（カナダ、センビル）の施設において、雄のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）で実施した。
【０３３６】
化合物及び投与手順
【０３３７】
局所抗生物質（トブラマイシン）を、各々の注射の前日に２回及び翌日に２回両眼に適用した。投与に先立ち、絶食動物は、ケタミン（５mg/kg）及びデクスメテドミジン（０．０１mg/kg）の鎮静薬カクテルの筋肉内注射を受け、マスクを通じたイソフルラン／酸素混合物が続いた。局所麻酔薬（０．５%プロパラカイン）を、５０μlの賦形剤（リン酸緩衝生理食塩水）中の１００μgのテスト品の両側硝子体内注射の前に、各々の眼中に点眼した。散瞳点眼薬（１%トロピカミド）を、必要に応じて各々の眼に適用した。投与手順の完了に続き、動物は、０．１mg/kgのアチパメゾール（デクスメテドミジン用の拮抗薬である）の筋肉内注射を受けた。
【０３３８】
手順の０日目に、４匹の動物に、５０μl中のＨＴＲＡ１  ＬＮＡ＃１８  １００μgを用いて、及び４匹の動物に、同容量の賦形剤を用いて両側注射した。
【０３３９】
房水のサンプリング
【０３４０】
動物を、各々２匹の対照及び２匹の処置されたサルを含む２つの群中に割り当てた。房水サンプルをベースライン時に収集した（全ての動物）；３日目及び１８日目（群１）；１１日目、２５日目（群２），３２日目（全ての動物）、及び安楽死後３６日目。動物を、化合物適用についてと同じ手順に従って麻酔し、３０〜４０μlの房水を散瞳後にサンプリングし、−８０℃で冷凍保存した。
【０３４１】
安楽死
【０３４２】
３６日目に、絶食動物を、ケタミン及びイソフルランを用いて麻酔し、大動脈及び大静脈を固定し、上体の経心臓灌流を、リン酸緩衝生理食塩水を用いて実施した。洗い流した眼球を付着組織から除去し、洗浄し、２００μlの房水をサンプリングした。左目をＲＮＡ調製のために、右目をタンパク質分析のために、さらに処理した。房水中のＨＴＲＡ１タンパク質を、剖検時に左眼及び右眼の両方から測定した。
【０３４３】
ＨＴＲＡ１タンパク質分析用のサンプル処理。
【０３４４】
最終収集のために、０．２mlまでの房水を、３０Ｇ、１／２”針を伴う超微細インスリンシリンジを用いて回収した。眼球を、付着筋肉から浄化、角膜縁から３mm後方での周囲切開により正面から開いた。硝子体を除去し、組織を、針を伴わない３ccシリンジを通じて押し込む（３回通過）ことによりホモジナイズし、遠心分離（４℃で３分間１６，０００ｘｇ）して凍結保存した。神経網膜を、下のＲＰＥから注意深く剥がし、氷上で瞬間凍結した。開いた杯状物を、前面を上にして維持し、プロテアーゼ阻害剤（cOmplete（商標）ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル、ｍｉｎｉ、Roche、１錠／１０ml）を含む１ml  ＲＩＰＡ緩衝液（Millipore、５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０mM  ＮａＣｌ、０．２５%デオキシコール酸、１%ＮＰ−４０、１mM  ＥＤＴＡ）を用いて満たし、回転プラットフォーム（２００rpm）上で５分間にわたり振盪した。結果として得られたＲＰＥライセートを遠心分離（４℃で３分１６，０００ｘｇ）により浄化し、凍結保存した。残りの後部眼杯状物を、リン酸緩衝生理食塩水を用いて洗い流し、４つの切開を作り、組織を平らに置き、ブルッフ膜及び付着している脈絡膜を剥がした。脈絡膜を、Genoグラインダー（２分間にわたり１５００rpm）を３回使用し（氷上で冷却しながら）、プロテアーゼ阻害剤を含む、組織１グラム当たり４mlのＲＩＰＡ緩衝液中でホモジナイズした。破片を遠心分離により除去し、抽出物を保存した（４℃で３分間１６，０００ｘｇ）。
【０３４５】
硝子体液を、プロテアーゼ阻害剤（完全ＥＤＴＡ不含、Roche）を伴う５×ＲＩＰＡ緩衝液（最終濃度：５０mM  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０mM  ＮａＣｌ、０．２５%デオキシコール酸、１%ＮＰ−４０、１mM  ＥＤＴＡ）を用いて希釈し、Precellys 24を使用して（５５００rpm、１５秒、２サイクル）ホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離した（１６，０００ｘｇ、３分）。神経網膜及び脈絡膜抽出物のタンパク質含量を、標準として血清アルブミンを使用し、ビシンコニン酸方法及びＰｉｅｒｃｅ（米国、ロックフォード）からの試薬を使用して測定した。
【０３４６】
ＲＮＡ調製のためのサンプル処理。
【０３４７】
ＲＮＡ調製について、最初の解剖工程はタンパク質手順と同様であった。
【０３４８】
剥がした網膜をホモジナイズ容器に移し、１０μl/mg組織均質化緩衝液を加えた（Maxwell RNA単離キット、Promega）。材料をGenoグラインダー中で、１５００rpmでの２分間の３サイクルにわたり処理した。結果として得られたライセートを、さらなる処理まで−８０℃で保存した。
【０３４９】
神経網膜の除去後、開いた杯状物を、ＲＮＡプロテクト細胞試薬（Qiagen）を用いて満たし、４℃の回転プラットフォーム（４００rpm）上で振盪した。結果として得られたＲＰＥ細胞懸濁液を１０分後に回収し、７００gで５分間にわたり遠心分離し、２００μlのMaxwell均質化緩衝液中に溶解した。ライセートを、さらなる処理まで−８０℃で保存した。
【０３５０】
新鮮なＲＮＡプロテクトを眼杯状物に加え、それを、さらに１０分間にわたり振盪し、残りのＲＰＥ細胞を除去し、廃棄した。４つの切開を作り、組織を平らに置き、ブルッフ膜及び付着している脈絡膜を剥がし、さらなる処理まで凍結保存した。均質化のために、凍結した脈絡膜を、解凍することなくPromegaの均質化緩衝液（１０μl/mg組織）に加え、Tissue Lyser II（Retsch）中で、２０Ｈｚで２分間の３サイクルにわたり処理した。
【０３５１】
ＲＮＡを、供給業者の指示に従って、Maxwell RNA単離ロボット及び対応する試薬（Promega）を使用してライセートから精製した。
【０３５２】
ＲＮＡの質を評価し、量を、Experion装置（BioRad）上でのキャピラリー電気泳動により測定した。
【０３５３】
ＲＮＡ配列決定を使用したＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ定量化。
【０３５４】
４００ngの全ＲＮＡを使用し、TruSeq（商標）Stranded mRNAライブラリー調製キット（lllumina  ２００２０５９４）を使用してｍＲＮＡ配列決定ライブラリーを調製した。ライブラリーを、Illumina HiSeq 4000シーケンサーで配列決定した（２×５０bp）。ベースコーリングを、BCL to FASTQファイルコンバーターｂｃｌ２ｆａｓｔｑ  ｖ２．１７．１．１４（Illumina（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｕｐｐｏｒｔ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ．ｈｔｍｌ））を用いて実施した。遺伝子発現レベルを推定するために、ペアエンドＲＮＡＳｅｑ読み取りを、デフォルトマッピングパラメーターを使用し、ＳＴＡＲアライナーバージョン２．５．２ａを用いて、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓゲノム（WashUからのmacFas5）にマッピングした（Dobin et al. 2013）。遺伝子の全てのＲｅｆＳｅｑ転写物変異体についてのマッピングされた読み取りの数（カウント）を、SAMTOOLSソフトウェア（Li et al. 2009）を使用することにより、単一の値に組み合わせ、ｒｐｋｍｓ（１００万の配列決定された読み取り当たりのキロベースの転写物当たりのマッピングされた読み取りの数、Mortazavi et al. 2008）として標準化した。
【０３５５】
キャピラリー電気泳動ベースの方法を使用したＨＴＲＡ１タンパク質定量化。
【０３５６】
異なる眼の画分からのタンパク質を、供給業者により記載される通りに、Peggy Sue装置（Protein Simple、米国カリフォルニア州サンホセ）上での１２〜２３０kDaの分離マトリックスを使用したキャピラリー電気泳動により分析した。ヒト組換え６Ｈｉｓタグ付きＨＴＲＡ１  Ｓ３２８Ａ（RD Biotech、フランス）サンプル（６２．５〜０．１２ng/ml）を、定量化のために並行して分析した。ＨＴＲＡ１タンパク質を、Ｄｒ．Ｓａｓｃｈａ  Ｆａｕｓｅｒ教授により提供されたウサギ抗ヒトＨＴＲＡ１抗血清ＳＦ１（１：３００希釈）を使用することにより検出した。５．５ng/ml  ＨＴＲＡ１を含むカニクイザルＲＰＥライセートを使用し、アッセイの再現性を評価した。
【０３５７】
予備実験（示さず）によってマトリックス効果が除外されたため、サンプルを、ＨＴＲＡ１抑制の最適な定量化を可能にする最も高い可能な濃度で分析した。房水サンプルは、未希釈で使用した；浄化されたホモジナイズされた硝子体サンプルは、プロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ緩衝液中に８０%希釈した。神経網膜、ＲＰＥ、及び脈絡膜ライセートの濃度を、０．５mg全タンパク質/mlに調整した。
【０３５８】
試験の間ずっと、アッセイ内変動は９．１%、及びアッセイ間変動は２１%であった。比較可能性を改善するために、各々の組織からの全てのサンプルを、一回の実施で分析した。終末サンプルと異なる実施において分析された、異なる時間点で収集された房水サンプルの例外を伴った。
【０３５９】
結果１：ＬＮＡ適用後３２日目の死後の異なる組織画分におけるＨＴＲＡ１タンパク質抑制：
【０３６０】
最も高いＨＴＲＡ１濃度は、脈絡膜ライセートにおいて見られ（ＰＢＳ群：２８ng/mg全タンパク質ｓｄ＝２．２）、ＬＮＡ処理によって、この解剖学的領域内でのわずかな抑制だけが起こった（ＬＮＡ群における１６%減少：２４ng/mg全タンパク質  ｓｄ＝３．５）。
【０３６１】
測定された最も低いＨＴＲＡ１濃度は、ＲＰＥライセートにおいてであったが（ＰＢＳ群：５．２ng/mg全タンパク質ｓｄ＝０．４）、介入の有意な影響を伴った（５５%減少、ＬＮＡ群：２．４ng/mg全タンパク質ｓｄ＝０．２）
【０３６２】
介入の最も高い影響が、神経網膜；硝子体液及び房水（ＡＨ）において観察され、賦形剤で処置された動物よりもそれぞれ７６%；８４%；及び７４%低い平均ＨＴＲＡ１レベルを伴った。異なる画分における群平均抑制を図１２Ａ中に示す。
【０３６３】
対照群において決定されたＨＴＲＡ１値の分散にもかかわらず、硝子体、網膜、及びＲＰＥにおいて測定されたＨｔｒａ１濃度は、一般的に房水において測定されたレベルと一致していた；標的会合バイオマーカーとしての潜在的な有用性を示唆する。図１２Ｂ中に例証する組織ＨＴＲＡ１レベル及び房水レベルの間の相関。
【０３６４】
結果２：房水中でのＨＴＲＡ１タンパク質濃度の動態。
【０３６５】
１つのベースラインサンプルを、不十分なサンプルの可用性のために測定することができず、その動物（賦形剤処置、群１）を今回の分析から除外した。
【０３６６】
房水中でのベースラインＨＴＲＡ１タンパク質濃度は不均一であったが（４．３２ng/ml標準偏差（ｓｄ）０．９８ng/ml）、処置群におけるより高い値を伴った（積極的処置３．６５ng/ml  ｓｄ  ０．１８ng/ml、賦形剤５．２３ng/ml  ｓｄ  ０．８２ng/ml）。ＩＶＴ後３日目に、両方の群においてＨＴＲＡ１濃度における増加についての傾向があった（積極的処置：ｎ＝２、＋５１%及び＋５４%；賦形剤ｎ＝１、＋４２%）。従って、介入の効果を、個々のベースライン値への、及び時間を一致させた賦形剤群への標準化後に分析した。処置は３日目に効果を有さなかったが、しかし、房水ＨＴＲＡ１濃度は１１日目から低下し（５２%）、効果は３６日目に６６%抑制に達した。データを図１３中に示す。
【０３６７】
結果３：ＬＮＡ適用後３２日目の死後の異なる組織画分におけるＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ抑制。
【０３６８】
ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベルを、８匹の動物（賦形剤群における４匹の動物及びＬＮＡ処置群における４匹の動物）からの左眼から解剖された網膜、ＲＰＥ、及び脈絡膜におけるＲＮＡ配列決定により測定した。平均１２９，８７６，６９０の読み取りがサンプル当たりで生成され、サンプル当たり平均１２２，０３８，７６０のマップされた読み取りを伴った。１つの網膜サンプルを賦形剤群及びＬＮＡ群から除外し、１つのＲＰＥサンプルを賦形剤群から除外した（品質管理対策に合格しなかったため）。残りのサンプルにおいて、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベルは、ＬＮＡ処理時の網膜において有意に強く低下した（ＬＮＡ群対賦形剤群における８０%減少）。わずかに低いが（６０%）、しかし、有意な減少が、ＬＮＡ処置時のＲＰＥにおいて観察された。有意な低下は、脈絡膜において認められなかった（図１４を参照のこと）。
【０３６９】
結論
【０３７０】
カニクイザルにおける１００μgのＨＴＲＡ１  ＬＮＡの単一の硝子体内注射によって、曝露後３６日目に、神経網膜における８０%減少したＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ発現及び網膜色素上皮における６０%低下が導かれた。対応して、ＨＴＲＡ１タンパク質の低下は、神経網膜及びＲＰＥにおいてそれぞれ７６%及び５５%であったが、探索された異なる眼画分における持続的な薬物活性ならびに薬物の広範な分布及び有効性を示す。予想通り、血液−網膜関門に起因して、脈絡膜は、オリゴヌクレオチドにより最小限だけ達せられた。結果的に、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡの有意な低下は、この組織において観察されなかった。重要なことに、これらのデータは、ＡＭＤの病態形成において中心的な役割を果たしているＲＰＥ層における有意な長期的影響を示す。ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルにおけるＨＴＲＡ１抑制間の強い相関は、局所的なＨＴＲＡ１合成が眼のタンパク質プールの主要な供給源であり、血液由来ＨＴＲＡ１の割合を無視できることを示す。本質的に無細胞の硝子体液及び房水中でのＨＴＲＡ１タンパク質レベルは、神経網膜と同様の程度で低下し（それぞれｒ８４%及び７４%）、これらの生体液中のタンパク質濃度を使用し、眼の背部における介入の有効性を評価できることを示す。房水における減少は、１１日目より前には検出することができず、この画分における遅延した作用の開始及び／又は低いＨＴＲＡ１タンパク質の代謝回転を例証する。
【０３７１】
参考文献
【表４】
2021507253.tif 000016
【図１】
2021507253.tif 000018
【図２】
2021507253.tif 000019
【図３】
2021507253.tif 000020
【図４】
2021507253.tif 000021
【図５】
2021507253.tif 000022
【図６Ａ】
2021507253.tif 000023
【図６Ｂ】
2021507253.tif 000024
【図６Ｃ】
2021507253.tif 000025
【図６Ｄ】
2021507253.tif 000026
【図７Ａ】
2021507253.tif 000027
【図７Ｂ】
2021507253.tif 000028
【図７Ｃ】
2021507253.tif 000029
【図７Ｄ】
2021507253.tif 000030
【図７Ｅ】
2021507253.tif 000031
【図７Ｆ】
2021507253.tif 000032
【図７Ｇ】
2021507253.tif 000033
【図８Ａ】
2021507253.tif 000034
【図８Ｂ】
2021507253.tif 000035
【図８Ｃ】
2021507253.tif 000036
【図８Ｄ】
2021507253.tif 000037
【図９Ａ】
2021507253.tif 000038
【図９Ｂ】
2021507253.tif 000039
【図９Ｃ−１】
2021507253.tif 000040
【図９Ｃ−２】
2021507253.tif 000041
【図９Ｃ−３】
2021507253.tif 000042
【図１０】
2021507253.tif 000043
【図１１】
2021507253.tif 000044
【図１２Ａ】
2021507253.tif 000045
【図１２Ｂ】
2021507253.tif 000046
【図１３】
2021507253.tif 000047
【図１４】
2021507253.tif 000048
【配列表】
2021507253000001.app
【国際調査報告】
2021507253.tif 000049
2021507253.tif 000050
2021507253.tif 000051
2021507253.tif 000052