(57)【要約】  眼へのコンストラクトの注入、及び眼組織における分子の浸透又は細胞発現を増強するための電流の印加を含む、遺伝子治療コンストラクトを眼に投与する方法。これらの方法は、遺伝子治療ベクター、特にＡＡＶベクター及びナノ粒子の眼内送達に効果的な技術を提供する。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用タンパク質をコードする発現ベクターを被験体の眼に送達する方法であって、前記眼に電流を印加することを含む、方法。
【請求項２】
前記被験体が、任意の単一遺伝子又は多遺伝子の網膜疾患の治療を受けている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体が、シュタルガルト病、Ｘ連鎖性網膜分離症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、網膜剥離（疾患、傷害、又は自然剥離による）、嚢胞、嚢胞様黄斑浮腫、網膜色素変性症、老人性スキーシス、フックス角膜ジストロフィー及び他の角膜ジストロフィー、緑内障、並びに白内障からなる群から選択される眼の状態の治療を受けている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体がＸ染色体性若年網膜分離症（ＸＬＲＳ）の治療を受けている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
注射の方法が、前房内注射、角膜内注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、網膜下注射、硝子体内注射、脈絡膜上注射、及び前眼房への注射からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
注射の方法が硝子体内注射である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記硝子体内注射が、前記眼の後部硝子体腔内の網膜の表面から０ｍｍ〜１３ｍｍの傍網膜注射である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記硝子体内注射が、前記眼の後部硝子体腔内の網膜の表面から０ｍｍ〜１０ｍｍである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記硝子体内注射が、前記眼の後部硝子体腔内の網膜の表面から０ｍｍ〜５ｍｍである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記硝子体内注射が、前記眼の後部硝子体腔内の網膜の表面から０ｍｍ〜３ｍｍである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記硝子体内注射が前記網膜の中心窩領域で又はその近くである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記眼に印加される電流が、約１．０マイクロアンペア（μＡ）〜約１５ミリアンペア（ｍＡ）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記電流が、約１ミリ秒（ｍｓ）〜約２４時間の期間で眼に印加される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記眼に印加される電流が固定電流として印加される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記眼に印加される電流が可変電流として印加される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記眼に印加される電流がパルス電流として印加される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記眼に印加される電流が二相性電流として印加される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記眼に印加される電流が１回の印加で印加される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記眼に印加される電流が反復印加で印加される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記電流が、前記発現ベクターの注入と同時に眼に印加される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記電流が、前記発現ベクターの注入前６０秒から注入後６０秒までの期間に眼に印加される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記電流が、前記発現ベクターの注入前に眼に印加される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記電流が、前記発現ベクターの注入の最大４８時間前までに眼に印加される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記電流が、前記発現ベクターの注入前２４時間〜４８時間の期間に眼に印加される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記電流が、前記発現ベクターの注入前１２時間〜２４時間の期間に眼に印加される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記電流が、前記発現ベクターの注入前６時間〜１２時間の期間に眼に印加される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記電流が、前記発現ベクターの注入前１時間〜６時間の期間に眼に印加される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記電流が、前記発現ベクターの注入前１分〜６０分の期間に眼に印加される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記電流が、前記発現ベクターの注入後に眼に印加される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記電流が、前記発現ベクターの注入の最大４８時間後までに眼に印加される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記電流が、前記発現ベクターの注入後２４時間〜４８時間の期間に眼に印加される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記電流が、前記発現ベクターの注入後１２時間〜２４時間の期間に眼に印加される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記電流が、前記発現ベクターの注入後６時間〜１２時間の期間に眼に印加される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記電流が、前記発現ベクターの注入後１時間〜６時間の期間に眼に印加される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記電流が、前記発現ベクターの注入後１分〜６０分の期間に眼に印加される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験体を少なくとも第１及び第２の電極と接触させることによって、前記電流が眼に印加され、ここで、前記第１の電極は、前記被験体の眼の角膜と接触して設置され、前記第２の電極は前記被験体の身体の一部と接触して設置される、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記被験体を少なくとも第１及び第２の電極と接触させることによって、前記電流が眼に印加され、ここで、前記第１の電極は、前記被験体の眼の角膜と接触して設置され、前記第２の電極は前記被験体の眼の別の部分と接触して設置される、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第２の電極が、前記被験体の角膜の外側の眼の一部と接触して設置される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の電極が、前記眼の内側の眼の一部又は硝子体と接触して設置される、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験体を少なくとも第１及び第２の電極と接触させることによって、前記電流が眼に印加され、ここで、前記第１及び第２の両方の電極が前記被験体の眼と接触して設置され、且ついずれの電極も前記被験体の眼の角膜と接触して設置されていない、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記角膜に正の電圧を印加することによって、前記発現ベクターが眼の前眼部に送達され、前記発現ベクターが眼の水晶体、虹彩、毛様体、及び角膜の少なくとも１つに入ることを可能にする、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記角膜に負の電圧を印加することによって、前記発現ベクターが眼の後眼部に送達され、それによって前記発現ベクターが網膜に入ることを可能にする、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記発現ベクターが、光受容体、並びに網膜色素上皮（ＲＰＥ）、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、水平細胞、双極細胞、神経線維層構造物、及び無軸索細胞からなる群から選択される眼の細胞において発現される、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記発現ベクターが、ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、そのゲノムに対して異種の核酸分子を含む組換えウイルス、複製欠損ウイルス、被験体の細胞の核内で複製するウイルス、非分裂細胞又は分裂細胞に感染するウイルス、及び眼の組織に指向性を示すウイルスに由来する１つ以上の核酸配列を含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記発現ベクターがＤＮＡプラスミドである、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記発現ベクターがウイルスゲノムである、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記発現ベクターが、プラスミド由来の核酸配列及びウイルスゲノム由来の核酸配列を含み、核酸分子の送達及びコードされた治療用分子の高レベルの発現を可能にする、直鎖又は環状のＤＮＡ分子である、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記発現ベクターがＡＡＶ発現ベクターである、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記発現ベクターが、レチノスキシン遺伝子をコードする核酸配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記レチノスキシン遺伝子をコードする核酸配列が、前記レチノスキシン遺伝子の第１のイントロンの少なくとも３００塩基対の部分を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記発現ベクターが、光受容体、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、双極細胞、ミュラー細胞、及び網膜神経節細胞からなる群から選択される眼の細胞において発現される、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記プロモーターが眼特異的プロモーターである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、レチノスキシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、ＣＲＸプロモーター、及び細胞における発現を制御する任意の他のプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記発現ベクターが、前記プロモーターの活性を増強するエンハンサー配列を含む、請求項４８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記エンハンサー配列が、光受容体間レチノイド結合タンパク質エンハンサー配列である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
光受容体間レチノイド結合遺伝子エンハンサーエレメントが、レチノスキシン遺伝子プロモーター内のＡｌｕリピート配列を置換する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している、請求項４８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＩＴＲの少なくとも１つが、ｒｅｐニッキング部位又はＤ領域内で修飾されている、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
発現カセットの５’側のＩＴＲが、野生型ＩＴＲ配列のパリンドロームのＡ領域におけるＩＴＲ配列の１５塩基対の欠失を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記５’ＩＴＲが、野生型ＩＴＲ配列中の前記ｒｅｐニッキング部位を含む前記Ｄ領域の除去によって更に修飾される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
発現カセットの３’側のＩＴＲが完全長の野生型ＩＴＲ配列である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記発現ベクターが自己相補的アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４８に記載の方法。
【請求項６３】
前記発現ベクターが、ヒトβ−グロビン３’非翻訳領域及びポリアデニル化部位を含む、請求項４８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記発現ベクターがナノ粒子に会合している、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ナノ粒子が標的化された又は放射性標識されたナノ粒子である、請求項６４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１８年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／７０１，２６７号、２０１８年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／７２４，４８０号及び２０１８年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／７６８，５９０号の恩典を主張し、これらの特許出願は、引用することにより本明細書の一部をなす。
【０００２】
本発明は、眼の障害を治療する方法に関する。特に、本発明は、眼の障害の治療のために標的遺伝子又は遺伝子産物を調節することができる発現ベクターを投与する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
組換えベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）は、前臨床研究及び臨床試験で実証された肯定的な安全性及び有効性の結果により、眼の遺伝子治療の可能性を示す。ＡＡＶベースの遺伝子治療の臨床応用を成功させるには、標的細胞による効率的な形質導入及び発現が必要である。多くの遺伝性網膜変性症は、光受容体及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）で発現される遺伝子とかかわっているため、これらは治療のための遺伝子発現にとって重要な細胞である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ベクターの投与経路は、網膜遺伝子治療の有効性に影響を及ぼす。一般的に使用されるＡＡＶ血清型１、２、５、８、９、及びｒｈ１０は、網膜下注射によって与えられた場合にのみ、野生型（ＷＴ）成体齧歯類網膜のＲＰＥ及び／又は光受容体を効率的に形質導入する。残念ながら、これは主に網膜下投与部位の周辺領域へのベクター分布を制限する。このアプローチはまた、特に退行性で外科的に脆弱な網膜状態の場合、傷害を引き起こす可能性がある。硝子体内注射は、ＡＡＶベクターを網膜に送達するための侵襲性の低い方法としてより望ましい。硝子体内注射の後、ＡＡＶベクターは硝子体液を通して拡散し、理論的には分布が網膜全体に達する。しかしながら、脊椎動物の網膜の広範な積層構造は、硝子体適用後にＡＡＶベクターが外側の網膜の細胞に到達することを更に制限し、これらのＲＰＥ及び光受容体細胞はしばしば限定的な形質導入を示す。かかる組織バリア（例えば、拡散及び膜）を克服するためのアプローチとして、内境界膜（ＩＬＭ）の穏やかな酵素消化、硝子体切除術、及び外科的ＩＬＭ剥離が挙げられる。これらのアプローチを使用すると、複数の網膜細胞型でウイルス形質導入の増強が観察されることがあるが、遺伝子治療ベクターを眼に投与するためのより効果的、効率的で便利な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、硝子体に投与される治療用アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターコンストラクトを含む遺伝子治療ベクターの送達を増強させるために、遺伝子治療ベクターの戦略的硝子体内留置を単独で、及びｉｎ  ｖｉｖｏで眼全体に印加される低電流刺激の使用と組み合わせて調べた。ＡＡＶは、比較的熱安定性であり、穏やかなタンパク質分解消化及び非イオン性界面活性剤に耐性のある二十面体の非エンベロープＤＮＡウイルスである。ＡＡＶは中性環境で全体的に正味の負電荷を持っているため、眼内投与及び遺伝子治療発現研究を試験するためのモデル遺伝子治療ベクターである。これらのモデルを使用して、本発明者らは、硝子体内ベクター注入と共に電流を印加する新規の非侵襲的アプローチ（電流ベクター移動（ＥＣＶＭ））を開発して試験し、この戦略が野生型（ＷＴ）マウスの網膜におけるＡＡＶベクターの形質導入効率を大幅に改善することを示した。
【０００６】
よって、本発明は、硝子体内注射単独で、又は注射された眼への電流の印加と組み合わせて発現ベクターを投与することにより、標的遺伝子又は遺伝子産物を調節することができる発現ベクターを治療的有効量、被験体に投与することを含む、眼の疾患又は障害を治療する方法に関する。
【０００７】
これらの方法では、遺伝子治療ベクターは、哺乳動物の眼において遺伝子治療を実施するための任意の好適な発現ベクターであり得る。これには、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、及び／又は神経向性ウイルスが含まれ得る。これらの投与方法は、封入されたベクター（例えば、ナノ粒子）、修飾されたＤＮＡ又はベクター（例えば、修飾としてのペグ化）に適用することができ、また、眼へのネイキッドＤＮＡプラスミドの投与にも適用され得る。
【０００８】
これらの方法は、組織、例えば眼の組織への及び該組織を介した遺伝子治療ベクターの送達を増強する。より具体的には、本明細書に記載される方法は、電流の印加を利用して、遺伝子治療発現ベクター、例えば、ＡＡＶベクターを哺乳動物の眼に能動的に送達する。この方法は、眼において、特に眼の内境界膜（ＩＬＭ）を越えて、並びに光受容体、双極細胞、無軸索細胞、網膜神経節細胞、及び／又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）内での遺伝子送達、タンパク質発現、及び分布を最大化するための発現ベクターの効果的な送達に焦点を当てている。
【０００９】
この方法は、適用される眼の遺伝子治療の送達、発現、及び分布を最適化するために、異なる電流レベル及び印加時間を包含する。これらの投与方法は、感染又は網膜外傷の重大なリスクを伴うことなく、網膜下注射のみによって達成される結果と同等又はそれ以上の結果をもたらすことができる。
【００１０】
例えば、Ｘ染色体性若年網膜分離症（ＸＬＲＳ）の遺伝子治療の処置では、遺伝子送達の標的は、タンパク質発現の標的細胞である眼の光受容体であり、網膜の他の細胞の後ろに位置している。光受容体は本質的には神経細胞であり、その幾つかは網膜神経節細胞と接触している。網膜神経節細胞は束ねられており、脳内に伸びる視神経を構成する長く伸長する構造を持つ。網膜神経節は、疾患及び傷害の侵襲に非常に敏感である。そのため、これらの細胞の傷害又は死を防ぐ又は実質的に低減する投与方法（複数の場合もある）によってこれらの細胞に遺伝子治療を送達する能力は、ＸＬＲＳ等の眼疾患の場合にこれらの細胞に向けられた眼遺伝子治療の安全性及び有効性の大幅な増加を表す。
【００１１】
本開示は、遺伝子治療ベクターを被験体の眼に注射により投与し、注射された眼に電流を印加し、それにより遺伝子治療ベクターを眼又は網膜へと送達することによって、遺伝子治療ベクターを被験体の眼に送達する方法に関する。
【００１２】
これらの方法では、注射の方法は、前房内注射、角膜内注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、網膜下注射、硝子体内注射、脈絡膜上注射、及び前眼房への注射からなる群から選択され得る。好ましくは、注射は硝子体内注射である。
【００１３】
本開示で使用される、遺伝子ベクター（又は他の治療薬）の「傍網膜」硝子体内注射は、網膜の所望の領域に近接する（例えば、網膜の中心窩領域の近くの）硝子体腔へのベクターの注入による標的送達を伴う。中部硝子体腔に製品を沈着させるように設計された短い針を使用して行われる、直接の可視化を必要としない通常の硝子体内注射とは対照的に、傍網膜注射は、製品を網膜近くの後部硝子体腔に送達可能なより長い針の直接可視化の下で行われる。治療薬（例えば、遺伝子治療ベクター）を、網膜から０ｍｍ〜１３ｍｍの距離で、又は網膜から０ｍｍ〜１０ｍｍの距離で、網膜から０ｍｍ〜５ｍｍの距離で、又は好ましくは網膜から０ｍｍ〜３ｍｍの距離で硝子体腔に沈着させることができる。この送達技術の１つのバージョンは、ヒトの眼の後極に到達するのに十分な長さ（２５ｍｍ又は同様のもの）のゲージの小さい針（３０ゲージ又は同様のもの）の使用、外部又は内部の照明、及び顕微鏡を用いる可視化、並びに後部硝子体腔及び網膜に焦点を合わせることを可能とするための角膜コンタクトレンズの使用を伴う。これは、典型的には、適切な鎮痛及び消毒の後に行われ、その時点で角膜コンタクトレンズと眼とを合わせ、網膜後部を見るために顕微鏡を配置する。針を毛様体扁平部の眼壁を通して挿入し、その先端が可視化される。直接可視化の下で、針先を網膜表面に近い所望の場所に進める。シリンジプランジャーを前進させて、ベクター（任意の好適な組成物又は製剤に含まれ得る）をゆっくりと沈着させる。針を抜いて目を検査する。ポートは縫合糸で閉じてもよいが、十分に小さい口径の針（３０ゲージ等）の場合、針路を閉じるための縫合は必要ではない。軟膏及びアイシールドを適用してもよく、必要に応じて、製品の高い傍網膜濃度を更に促進するために、術後の期間、被験体を仰臥位に保つ場合がある。送達器具のバリエーションとしては、鈍端カニューレの使用を可能にする硝子体切除ポートの使用を伴う又は伴わない強膜切開の作製、及び／又は網膜表面への近接度及び安全性を最適化するための先の細い（tapered）及び／又は可撓性の拡張可能な先端若しくはサイドポートを備えたカニューレ設計、及び／又は単純なシリンジプランジャーの代わりの空気圧システムの使用を挙げることができる。
【００１４】
理論に束縛されることを意図するものではないが、発現ベクターの眼内注射に続いて被験体に印加される電流は、一般に、電流の印加によって確立される電場内の荷電粒子の動きによって、ベクターの実質的に増強された送達を与える可能性がある。有効なメカニズムは、生体膜バリア、又は網膜組織層等の組織若しくは細胞層の破壊の場合もあり、したがって、本開示の投与方法は、荷電発現ベクターと並んで非荷電発現ベクターの送達を大幅に増強するのに有効な可能性がある。或いは又は加えて、電流の印加は、発現ベクターの送達を改善する栄養因子又は他の因子の合成及び／又は放出を引き起こす場合がある。例えば、電流の印加は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）等の栄養因子の発現の増強を引き起こす可能性があり、これは、最終的には、眼の組織における遺伝子治療ベクターの発現を増強する可能性がある。或いは又は加えて、電流は、組織の細胞層全体に存在する電荷を変化させる可能性がある。或いは又は加えて、電流は、発現ベクターの取り込みを増大させ、それによって細胞発現を増加させる可能性がある。よって、電流は、眼の標的組織の領域に１つ以上の治療用物質を起電（electromotivate）、電気伝導（electroconduct）、電気誘導（electroinduct）、電気輸送、及び／又は電気泳動することができる刺激を提供し、それにより、１つ以上の治療用生物学的物質又は他の物質を眼の標的組織（複数の場合もある）に近接して、又はその上に、又はその内部に留置することができる。
【００１５】
これらの方法では、電流の印加と併せた眼投与は、遺伝子治療ベクターを注入する工程の前、最中、又は後に行われ得る。
【００１６】
これらの方法では、送達される遺伝子治療発現ベクターは、ウイルス又はウイルス発現ベクターであり得る。発現ベクターがウイルスである本明細書の例では、ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、そのゲノムに対して異種の核酸分子を含む組換えウイルス、複製欠損ウイルス、被験体の細胞の核内で複製するウイルス、非分裂細胞又は分裂細胞に感染するウイルス、眼の組織に対して向性を示すウイルスであり得る。例示的な実施の形態では、遺伝子治療ベクターは、治療用タンパク質をコードする核酸配列を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はその誘導体であり得て、ここで、発現ベクターは、高レベルの治療用タンパク質を発現する。治療用タンパク質をコードする核酸は、眼特異的プロモーターに連結され得る。さらに、プロモーターは、網膜等の眼の或る特定の組織に特異的であり得る。かかる実施の形態では、網膜特異的プロモーターは、レチノスキシン遺伝子プロモーターの一部を含み得る。これらの方法では、発現ベクターは、標的化された又は放射性標識されたナノ粒子であり得るナノ粒子と会合し得る。
【００１７】
これらの方法では、遺伝子治療ベクターは、数秒、数分、又は数時間の持続時間で印加される１．０マイクロアンペア（μＡ）以上の電流と併せて送達される。これらの方法では、電流は可変電流又は固定電流（すなわち、定常電流又はパルス電流）で、又は二相性電流を使用して（すなわち、極性を負と正との間で周期的に反転させる）印加され得る。電流は、１秒〜６０秒等の数秒間にわたり印加され得る。電流は、１分〜６０分等の数分間にわたり印加され得る。電流は、１時間〜２０時間等の数時間にわたり印加され得る。電流は、数秒、数分、又は数時間の期間にわたって、１回の印加で、又は別々の日等の別々の反復印加として印加され得る。
【００１８】
これらの方法では、眼への電流の印加と併せて遺伝子治療の投与によって治療される眼の疾患又は障害は、例えば、シュタルガルト病、網膜分離症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、網膜剥離（疾患、傷害又は自然剥離による）、嚢胞、嚢胞様黄斑浮腫、網膜色素変性症、老人性スキーシス、フックス角膜ジストロフィー及び他の角膜ジストロフィー、緑内障、並びに白内障から選択される疾患又は障害を含む任意の単一遺伝子又は多遺伝子の網膜疾患であり得る。好ましい実施の形態では、眼の疾患は、Ｘ染色体性若年網膜分離症（ＸＬＲＳ）である。
【００１９】
本開示の別の態様は、遺伝子治療ベクターを被験体の眼に送達するためのキットであり、該キットは、定常電流又は断続電流で約１．０マイクロアンペア（μＡ）以上の電流を数秒間から数時間の期間で印加するために使用される。これらのキットは、発現ベクター、又は発現ベクターを含むナノ粒子を被験体の眼に送達するための装置の構成要素を含み得る。任意に、これらのキットは、被験体の眼への治療用タンパク質をコードする遺伝子治療コンストラクトの送達に適した１つ以上の遺伝子治療ベクターを含み得る。
【００２０】
この概要は、本発明の全ての程度及び範囲を代表することを意図するものでも、そのように解釈されるべきものでもない。さらに、本明細書において「本開示」又はその態様を参照することは、本発明の或る特定の実施の形態を意味すると理解され、必ずしも全ての実施の形態が特定の記載に限定されると解釈されるべきではない。本発明は、この概要、並びに添付の図面及び詳細な説明において様々な詳細レベルで記載されており、本開示の範囲に関する限定は、この概要では要素、構成要素等の包含又は非包含のいずれかを意図するものではない。本発明の追加の態様は、特に図面と合わせて考慮すると、詳細な説明からより容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａ〜図１Ｃは、電流ベクター移動（ＥＣＶＭ）の適用により、硝子体内送達後の野生型（ＷＴ）網膜におけるＡＡＶ８媒介遺伝子導入が大幅に強化されることを示す図である。ＷＴマウスの眼を、ＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＥＧＦＰの硝子体内注射の直後にＥＣＶＭ（連続直流、１０μＡで２０分間）で処理した。ＥＣＶＭを適用せずにベクターを注入したＷＴの眼は対照としての役割を果たした。眼底画像を注射後（ＰＩ）６週間目に撮影した。図１Ａは、注入ＥＣＶＭ処理した眼（ＥＣＶＭ）及び電流を印加していない注入した眼（対照）の代表的な眼底画像を示し、形質導入された眼底面積に関しては、異なるＧＦＰ発現（１０％未満、１０％〜２５％、２５％〜６５％、６５％超）を有するサンプルから示される。破線の円は中心網膜の輪郭を示している。図１Ｂは、それぞれ対照（ｎ＝２１）群及びＥＣＶＭ（ｎ＝１６）群のＧＦＰ発現（平均±ＳＥＭ）を示す、眼底面積の平均パーセンテージとして定量されて表される、眼底画像のＧＦＰ陽性面積を示す。＊ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定。図１Ｃは、注入された眼が６５％超、２５％〜６５％、１０％〜２５％、及び１０％未満のＧＦＰ陽性面積カバー範囲を有する確率を示す円グラフである。
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、ＥＣＶＭの適用が、低減されたベクター用量で、硝子体からのＡＡＶベクターのＷＴ網膜における形質導入効率を高めることを示す図である。ＷＴマウスの眼を、ＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＥＧＦＰの硝子体内送達の直後にＥＣＶＭ（連続直流、１０μＡで２０分間）で処理した。ＥＣＶＭを適用せずにベクターを注入したＷＴ眼は対照としての役割を果たした。眼底画像を、注射後（ＰＩ）４．５週間目に撮影した。図２Ａは、（ＥＣＶＭ）を伴う及び電流を伴わない（対照）注入された眼の代表的な眼底画像を示し、形質導入された眼底面積に関しては、異なるＧＦＰ発現（１０％未満、１０％〜５０％、５０％超）を有するサンプルから示した。破線の円は中心網膜の輪郭を示している。図２Ｂは、定量されて、ＧＦＰ発現を示す眼底面積のパーセンテージとして表される、各サンプルからの眼底画像のＧＦＰ陽性面積を示す（ｐ＜０．０００１、マンホイットニー検定、各群についてｎ＝１１）。図２Ｃは、２群間の差が、ＥＣＶＭ群から取り出した最も大きな形質導入された網膜面積（外れ値）を示す２つのサンプルで非常に有意であったことを示す（ｐ＝０．０００３、マンホイットニー検定、ＥＣＶＭ群でｎ＝９、及び対照群でｎ＝１１）。図２Ｄは、代表的な網膜切片のＧＦＰ免疫蛍光が定量され、対照群及びＥＣＶＭ群のＧＦＰ強度として（ピクセル／面積、平均±ＳＥＭ）それぞれプロットされたことを示す。＊＊＊ｐ＝０．０００７、マンホイットニー検定。
【図３】図３Ａ〜図３Ｅは、ＡＡＶ８−ＧＦＰベクターがＥＣＶＭの適用により硝子体から全ての網膜層に浸透することを示す図である。ＷＴマウスの眼を、ＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（８×１０５ｖｇ／眼）の硝子体内送達の直後にＥＣＶＭ（連続直流、１０μＡで２０分間）で処理し、注射後５週間目に収集した。図３Ａは、ベクター注入されてＥＣＶＭ処理された眼の断面における免疫染色されていない網膜の代表的な大きな画像であり、網膜における形質導入細胞の分布を示し、網膜層全体にわたる元のＧＦＰ蛍光を示している。ＲＰＥ及びＯＮＬの区域の全長の少なくとも４分の３は、ＡＡＶ８  ＧＦＰベクターによって或る程度形質導入された。スケールバー：２００μｍ。高倍率の画像は、網膜の厚さ全体にわたる蛍光プロファイルを示す（図３Ｂ〜図３Ｅ）。ＲＰＥ及びＯＮＬ（光受容体）（図３Ｂ及び図３Ｃ）、又はほぼ全ての網膜層（図３Ｄ及び図３Ｅ）でＧＦＰシグナルが観察された。ＲＰＥ−網膜色素上皮、ＯＳ−外節、ＩＳ−内節、ＯＮＬ−外顆粒層、ＯＰＬ−外網状層、ＩＮＬ−内顆粒層、ＩＰＬ−内網状層、ＧＣＬ−神経節細胞層。スケールバー：５０μｍ。
【図４】図４Ａ〜図４Ｈは、電流ベクター移動（ＥＣＶＭ）で処理された眼が正常な網膜機能を有することを示す図である。野生型マウスの眼（ｎ＝７）をＥＣＶＭ（単相、１０μＡで２０分間）で処理した。これらのマウスの網膜機能を測定し、ＥＣＶＭ適用前（ＷＴ−ベースライン）と適用後（ＷＴ−ＥＣＶＭ）の桿体応答及び錐体応答の網膜電図（ＥＲＧ）によって比較した。暗順応ＥＲＧによって測定された網膜応答の場合、ＷＴ−ＥＣＶＭマウスのａ波（図４Ａ及び図４Ｂ）及びｂ波（図４Ｃ及び４Ｄ）は、示されているように、強度範囲全体で正常な振幅及びタイミングを有する。明順応ＥＲＧの場合、ＷＴ−ＥＣＶＭの眼のａ波（図４Ｅ及び図４Ｆ）及びｂ波（図４Ｇ及び図４Ｈ）の振幅及び陰的時間は、示されているように、強度範囲全体でベースライン記録と有意差はなかった。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、経眼ＥＣＶＭが野生型マウスの網膜構造に悪影響を及ぼさないことを示す図である。野生型マウスの眼（ＷＴ−ＥＣＶＭ、ｎ＝１２）をＥＣＶＭ（単相、１０μＡで２０分間）で処理し、３週間後に網膜組織像を調べた。未処理の野生型の目（ＷＴ−対照、ｎ＝４）は対照としての役割を果たした。図５Ａは、垂直軸に沿って視神経乳頭（ＯＮＨ）を切断したヘマトキシリン及びエオシン染色切片による網膜形態を示しており、ＷＴ−ＥＣＶＭマウスの正常な網膜構造を示している。スケールバー、２５μｍ。図５Ｂは、ＯＮＨを含む切片の網膜長に沿った１０点でＯＮＬ幅にわたってＯＮＬ核の列（ＯＮＬ層）を数えることによって評価した外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さを示す。ＷＴ−ＥＣＶＭマウスのＯＮＬの厚さは、ＷＴ対照マウスと区別がつかなかった。ＯＳ−外節；ＩＳ−内節；ＯＮＬ−外顆粒層；ＯＰＬ−外網状層；ＩＮＬ−内顆粒層；ＩＰＬ−内網状層；ＧＣＬ−神経節細胞層。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃは、５×１０１１のＡＡＶ−ＣＭＶ−ＧＦＰベクターゲノム（ｖｇ）をウサギの眼の硝子体に注入した後のｉｎ  ｖｉｖｏでの眼底自己蛍光画像化による網膜ＡＡＶ−ＧＦＰ発現を示す図である。図６Ａは、「髄放線（medullary rays）」と呼ばれる、視神経乳頭から放射状に伸びる神経線維の特殊な領域において、注射後１１週間目にモニターしたＧＦＰ発現を示す。図６Ｂは、対照ウサギに由来する眼におけるＧＦＰ発現を示す（ベクターゲノムの注入後にＥＣＶＭは適用されていない）。図６Ｃは、ベクターゲノムの注入後にＥＣＶＭが適用されたウサギに由来する眼におけるＧＦＰ発現を示す。
【図７】両眼にＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（１×１０１２ｖｇ／用量）を硝子体内注射したアカゲザルの眼の中心窩（矢印）におけるＧＦＰシグナルの比較を示す図である。片方の眼（ＥＣＶＭ）は硝子体内注射に続いてＥＣＶＭ（８５０μＡ／２０分）を受けたが、もう一方の眼（対照）はＥＣＶＭを受けなかった。
【図８】ＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＥＧＦＰベクターを傍網膜注射したウサギの眼におけるベクターゲノムの分布を示す図である。各眼には、網膜の隣に１．５×１０１１ｖｇのＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＥＧＦＰを投与した。投与の１時間後、動物を屠殺し、眼を収集した。各眼を凍結し、後眼部及び前眼部に半切断した。ＡＡＶ力価をｑＰＣＲ分析によって決定した。エラーバーは±ＳＥＭ（ｎ＝５）を表す。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、非ヒト霊長類の眼への遺伝子治療ベクターの傍網膜及び中部硝子体（mid-vitreous）の送達の効果を示す図である。図９Ａは、ｓｃＡＡＶ８−ＨＲＳＰ／ＩＲＢＰ−ｈＲＳ／ｍｙｃの傍網膜送達後のカニクイザル網膜におけるレチノスキシンタンパク質及びＲＳ１−ｍｙｃタグ付きタンパク質の免疫蛍光アッセイを示す。図９Ｂは、ｓｃＡＡＶ８−ＨＲＳＰ／ＩＲＢＰ−ｈＲＳ／ｍｙｃ又はビヒクルの中部硝子体送達後のカニクイザル網膜におけるレチノスキシンタンパク質（ＲＳ１）及びＲＳ１−ｍｙｃタグ付きタンパク質の免疫蛍光アッセイを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、概して、かかる治療方法において有用なベクターの投与によって眼の疾患又は障害を治療するための改善された方法に関する。より具体的には、本発明は、眼においてコードされたタンパク質のより高いレベルの発現をもたらす発現ベクターを投与する改善された方法に関する。これらの投与方法は、眼内で特定のタンパク質を産生することができないこと、又は眼内で機能しないタンパク質を産生することに起因する眼の疾患を治療するのに特に有用である。
【００２３】
本発明の方法は、概して、かかる治療を必要とする患者の眼に、眼の組織においてより高いレベルで発現される治療用分子をコードする発現ベクターを投与することによって達成することができ、該発現ベクターは眼に注入され、電流が眼に印加されて、注入された発現ベクターの送達をもたらす。
【００２４】
本発明は、記載される特定の実施形態が変わり得ることから、かかる実施形態には限定されない。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲は特許請求の範囲のみによって限定されることから、限定を意図するものではない。
【００２５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形（the singular forms "a," "an," and "the"）は、文脈上別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、核酸分子は、１つ以上の核酸分子を指す。数量を指定しない用語（"a," "an"）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つの」という用語は、区別なく使用することができる。同様に、「含む（comprising）」、「含む、挙げられる（including）」、及び「有する（having）」という用語も区別なく使用することができる。特許請求の範囲は、あらゆる任意の要素を排除するように作成され得ることに更に留意されたい。そのため、この記載は、特許請求の範囲の要素の記述と関連して「単独で」、「のみ」等の排他的なかかる用語の使用に対して、又は「否定的な」限定の使用に対して先行詞としてはたらくことが意図される。
【００２６】
本明細書で検討される刊行物は、もっぱら本出願の出願日前のそれらの開示のため提供される。本明細書中のいずれの記載も、本発明が先行発明のためにかかる刊行物に先行する権利がないと認めるものと解釈されるものではない。さらに、提示される出版日は、実際の出版日とは異なる可能性があり、個別に確認を要する場合がある。
【００２７】
他に特に規定がなければ、本明細書に用いられる技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似の又は同等のあらゆる方法及び材料も本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載している。本明細書で言及される全ての刊行物は、それによって引用される刊行物と関連して上記方法及び／又は材料を開示及び説明するため引用することにより本明細書の一部をなす。
【００２８】
また、明確にするため個々の実施形態と関連して記載される本発明の或る特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供される場合もあることが理解される。また、逆に言えば、簡潔にするため単一の実施形態と関連して記載される本発明の様々な特徴は、別々に、又は任意の好適なサブコンビネーションで提供される場合もある。実施形態の全ての組合せは、本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆる組合せが個別にかつ明確に開示されるかのように本明細書に開示される。さらに、全てのサブコンビネーションも本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆるかかるサブコンビネーションが本明細書に個別かつ明確に開示されるかのように本明細書に開示される。
【００２９】
本明細書で使用される「個体」、「被験体」及び「患者」という用語は、眼疾患の治療を必要とする任意のヒト又は他の動物を指すために区別なく使用される。例として、限定されないが、ヒト及び他の霊長類、チンパンジー及び他の類人猿等の非ヒト霊長類、並びにサル種；ウシ、ヒツジ、ブタ、アザラシ、ヤギ及びウマ等の家畜；イヌ及びネコ等の家畜化された哺乳動物；マウス、ラット及びモルモット等の齧歯類を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ及び他の家禽の鳥等の家畜化された鳥、野鳥及び猟鳥、アヒル、ガチョウ等を含む鳥類が挙げられる。好ましい治療患者はヒト患者である。個体、被験体及び患者という用語は、それ自体によって特定の年齢、性別、人種等を示すものではない。そのため、男性又は女性を問わず、任意の年齢の個体が本発明の開示によって包含されることが意図され、限定されないが、高齢者、成人、子供、赤ん坊、乳児、及び幼児が挙げられる。同様に、本発明の方法を、例えば、コーカサス人（白人）、アフリカ系アメリカ人（黒人）、ネイティブアメリカン、ネイティブハワイアン、スペイン系アメリカ人、ラテン系アメリカ人、アジア人、及びヨーロッパ人を含む任意の人種に適用することができる。
【００３０】
本明細書で使用される「有効性」という用語は、所望の効果が得られる程度を指す。具体的には、該用語は、遺伝子治療ベクターが、該ベクターを投与した後に眼の疾患又は障害を治療するのに有効な程度を指す。本発明の文脈で使用される「有効性」という用語はまた、眼の疾患又は障害に関連する１つ以上の症状又は臨床事象の緩和又は軽減を指す。
【００３１】
発現ベクターの「投与」又はそれを「投与すること」という用語は、治療を必要とする被験体に、注射用剤形及びナノ粒子等を含むがこれらに限定されない、治療上有用な形態及び治療的有効量でその被験体の体内に導入され得る形態で発現ベクターを提供することを意味すると理解される。
【００３２】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の生物学的応答を誘発するために必要な量を指す。当業者によって理解されるように、遺伝子治療ベクターの有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される遺伝子（複数の場合もある）、封入マトリックスの組成、標的組織等の因子に応じて変化し得る。
【００３３】
「予防する」という用語は、眼の疾患又は障害に関連して使用される場合、当技術分野で理解されており、発現ベクターを受けない被験体と比較して、被験体において眼の疾患又は障害の症状の頻度を低減するか、又はその発症を遅らせる発現ベクターの投与を含む。
【００３４】
「薬学的に許容可能な」とは、担体、希釈剤、又は賦形剤が製剤の他の配合成分と適合性でなければならず、そのレシピエントに有害であってはならないことを意味する。
【００３５】
「相乗的」という用語は、全体の効果が成分の合計よりも大きくなるように一緒にはたらく２つ以上の成分を指す。
【００３６】
「治療する」という用語は、任意の眼の状態又は障害の少なくとも１つの症状を治癒すること及び改善することを指す。
【００３７】
「予防的処置」という用語は、望ましくない状態（例えば、宿主動物の疾患又は他の望ましくない状態）の臨床所見に先立って１つ以上の治療用組成物（例えば、遺伝子治療ベクター）の被験体への投与を含むのであればその処置は予防的である（すなわち、望ましくない眼の状態の発症から宿主を保護する）。眼の状態の発現後に治療用組成物（例えば、遺伝子治療ベクター）が投与される場合、その処置は治療的である（すなわち、既存の望ましくない状態又はその副作用を減少、改善、又は安定化することを目的としている）。
【００３８】
本明細書で使用される「発現ベクター」は、本発明の治療用分子をコードする核酸配列（例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を含む組換え核酸分子であり、その核酸配列は、発現ベクターを、例えば、被験体又は臓器、組織若しくは細胞に投与した場合に治療用分子の高レベルの発現を駆動するプロモーターに連結される。本開示の発現ベクターは、人の介入により製造され、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその変異体であってもよい。発現ベクターは、線状分子（例えば、線状核酸分子、線状ウイルスゲノム等）であってもよく、又はプラスミド等の環状分子であってもよい。一実施形態では、発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶベクター）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶベクター）、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス（ワクシニアベクター）、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、又は任意の他のＤＮＡウイルス若しくはＲＮＡウイルスに由来する１つ以上の核酸配列を含んでもよい。一実施形態では、発現ベクターはＤＮＡプラスミドであってもよい。一実施形態では、発現ベクターはウイルスゲノムであってもよい。一実施形態では、発現ベクターは、核酸分子の送達及びコードされた治療用分子の高レベルの発現を可能とするためのプラスミドに由来する核酸配列、及びウイルスゲノムに由来する核酸配列を含む線状又は環状のいずれかのＤＮＡ分子であってもよい。一実施形態では、発現ベクターはＡＡＶ発現ベクターである。本明細書で使用されるＡＡＶ発現ベクターは、核酸分子の複製、パッケージング、及び／又は発現を可能とするＡＡＶ配列を含む核酸分子である。発現ベクターを構築する一般的な方法は当該技術分野で知られており、例えば、いずれもその全体が引用することにより本明細書の一部をなすMolecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edition, Sambrook et al. 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press、及びCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1994にも開示される。
【００３９】
本開示の投与方法内で送達される発現ベクターは、裸で又は送達試薬と組み合わせて、被験体の眼に投与され得る。本開示の方法と組み合わせて投与する送達試薬の例として、限定されないが、親油性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン（例えば、ポリリジン）、ミセル、ＰＥＧ化リポソーム又はナノ粒子、オリゴヌクレオチドナノ粒子、シクロデキストリンポリマー（ＣＤＰ）ベースのナノ粒子、ポリ−（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、又はＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）を配合した生分解性高分子ナノ粒子、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）、ビタミンＡ結合脂質ナノ粒子、及びそれらの組合せが挙げられる。これらのナノ粒子は、眼の組織を標的とする１つ以上の部分に複合化されている脂質ナノ粒子であり得る。
【００４０】
上述のように、本開示の方法によって投与される発現ベクターは、治療用分子をコードする核酸配列の高レベルの発現を駆動するプロモーターを含む。本明細書で使用される「発現を駆動する」の文言は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からの転写を促進するプロモーターの能力を指す。本開示によれば、本発明の発現ベクターで使用されるプロモーターは、眼の細胞に特異的である（すなわち、眼特異的プロモーター）。すなわち、プロモーターは、発現ベクターが眼の細胞に導入された場合のみＯＲＦからの発現を駆動する。かかるプロモーターは、光受容体細胞、双極細胞、水平細胞、無軸索細胞、及び神経節細胞等の細胞に特異的である。かかるプロモーターの例として、限定されないが、レチノスキシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、ＣＲＸプロモーター、及び光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）プロモーターが挙げられる。そのプロモーターがＯＲＦの高レベルの発現を駆動する限り、コードされるタンパク質の眼特異的発現を可能とする任意のプロモーターを使用することができる。よって、一実施形態では、発現ベクターは眼特異的プロモーターを含む。
【００４１】
本明細書で使用される治療用分子は、眼の内部に導入された場合に、眼疾患の症状を改善又は排除することができる分子である。治療用分子の例として、タンパク質、及びｓｉＲＮＡを含むＲＮＡが挙げられる。かかる分子は、疾患に罹患した眼において失われているか、又は著しく減少される活性を提供することにより作用し得る。また、かかる分子は、疾患に罹患した眼において過剰発現された、又は正常レベルを顕著に上回って上昇された活性を変更若しくは減少することにより作用し得る。例えば、治療用分子は、眼の細胞において欠損している活性（例えば、特異的結合活性、酵素活性、転写調節活性等）を持つタンパク質であってもよい。かかる活性の欠損は、細胞がタンパク質を産生することができないこと、突然変異した不活性形態のタンパク質の産生、又は不活性形態を生じるタンパク質のミスフォールディングに起因し得る。幾つかの場合では、タンパク質の「良好な」（すなわち、機能的な）コピーを導入することが、失われた活性を直接的に置き換えることによって疾患の症状を緩和する場合がある。代替的には、治療用分子は、眼の細胞において他のタンパク質の活性を増加又は減少することによって作用し得る。例えば、治療用タンパク質は、別のタンパク質に結合することにより、第２のタンパク質の活性を減少又は排除する場合がある。代替的には、眼の細胞における治療用タンパク質の別のタンパク質への結合は、かかるタンパク質の安定化及び／又は関連する活性の増加をもたらす場合がある。最後に、治療用分子は、眼の細胞において遺伝子の転写、又は遺伝子に由来する転写産物の翻訳を増加又は減少する場合がある。例えば、治療用タンパク質は、遺伝子の転写領域に結合することにより、その遺伝子の転写を増加又は減少する場合がある。
【００４２】
本発明を、眼疾患を含む任意の単一遺伝子の網膜疾患の治療に使用することができ、ここで、眼疾患はタンパク質の不適切な発現、又は眼において発現される機能不全型又は機能障害型のタンパク質の発現のいずれかに起因する。タンパク質の不適切な発現は、タンパク質の発現の欠如、低発現又は過剰発現を指す場合がある。機能不全型のタンパク質の発現は、そのタンパク質の活性を変更する１つ以上の突然変異を有するタンパク質の発現を指す。活性の変更は、タンパク質活性の完全な不活性化、タンパク質活性の減少、又はタンパク質活性の増加を指す場合がある。変更された活性は、例えば、タンパク質の活性部位の直接的な不活性化又はミスフォールディングに起因する場合がある。本開示の投与方法を使用して治療することができる眼疾患の例として、シュタルガルト病、Ｘ連鎖性網膜分離症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、網膜剥離（疾患、傷害、又は自然剥離による）、嚢胞、嚢胞様黄斑浮腫、網膜色素変性症、老人性スキーシス、フックス角膜ジストロフィー及び他の角膜ジストロフィー、緑内障、並びに白内障が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本発明の発現カセットとして、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、又は色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）等のタンパク質、治療用ペプチド、又はタンパク質フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を挙げることができる。例えば、本発明者らは、水晶体上皮由来成長因子（ＬＥＤＧＦ）を発現するベクターを試験し、網膜色素変性症（ＲＰ）のＲＣＳラットモデルにおいて保護効果を実証した。好ましい実施形態では、本開示の方法を使用して治療される眼疾患は、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）である。Ｘ連鎖性網膜分離症は、視力障害及び網膜剥離の傾向を引き起こす神経発生的な網膜の異常である。ＸＬＲＳは、網膜のニューロン層及び網状層の正常な積層における構造異常を特徴とする。臨床検査は、黄斑内の小嚢胞、及びスキーシス又は周辺部網膜の層の内部解離を示す。Ｘ染色体性若年網膜分離症は、網膜及び松果体によってのみ発現される２２４アミノ酸の分泌タンパク質であるレチノスキシンをコードする遺伝子における突然変異によって引き起こされる。
【００４３】
タンパク質が眼疾患の治療に治療的に有利な活性を持つ限り、任意のタンパク質を治療用タンパク質として使用することができる。例えば、治療される疾患が異常な血管の成長（例えば、滲出型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症等）に関連している場合、有用な治療用タンパク質は、抗血管新生活性を有する任意のタンパク質とすることができる。更なる例として、治療される疾患が眼のニューロパシー（例えば、緑内障、網膜色素変性症等）に起因する場合、有用な治療用タンパク質は、眼において神経保護効果を提供する任意のタンパク質又は分子とすることができる。かかるタンパク質の例として、限定されないが、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、及び色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）が挙げられる。
【００４４】
また、本発明の治療用タンパク質は、野生型タンパク質の変異体であってもよい。本明細書で使用される変異体は、その配列が参照配列に類似するが、同一ではないタンパク質、又は核酸分子を指し、ここで、その変異体タンパク質（又は変異体核酸分子によってコードされるタンパク質）の活性は著しく変更されていない。これらの配列の変異は、自然発生的な変異であってもよく、又は当業者に既知の遺伝子工学の技法を使用して変異を操作してもよい。かかる技法の例は、Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57のSambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al.、又はCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に見出され得る。
【００４５】
変異体に関し、得られる変異体タンパク質が野生型タンパク質の機能を保持する限り、アミノ酸配列、又は核酸配列における任意の種類の改変が許容される。かかる変異の例として、限定されないが、欠失、挿入、置換及びそれらの組合せが挙げられる。例えば、タンパク質に関して、そのタンパク質の活性に著しく影響を及ぼすことなく、タンパク質のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端から１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又はｒｈ１０）のアミノ酸を除去することができることが多いことが当業者に十分理解されている。同様に、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又はｒｈ１０）のアミノ酸を、そのタンパク質の活性に著しく影響を及ぼすことなく、タンパク質へと挿入することができることが多い。
【００４６】
有用な治療用タンパク質の一例は、２２４アミノ酸のジスコイジンドメイン含有網膜特異的分泌タンパク質のレチノスキシンタンパク質である。レチノスキシンタンパク質機能の喪失は、Ｘ連鎖性網膜分離症に関係があるとされている。本明細書で使用されるレチノスキシンタンパク質は、全長レチノスキシンタンパク質、又は野生型レチノスキシンタンパク質の少なくとも１つの活性を有するその任意の部分を指す。よって、治療用タンパク質は、レチノスキシンタンパク質の少なくとも一部を含み得る。かかる部分は、得られる治療用タンパク質が全長レチノスキシンタンパク質の少なくとも１つの機能を持つ限り、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも１２５アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１７５アミノ酸、又は少なくとも２００アミノ酸を含んでもよい。関連する実施形態では、治療用タンパク質は、全長レチノスキシンタンパク質又は野生型レチノスキシンタンパク質の少なくとも１つの活性を有するその任意の部分に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するレチノスキシンタンパク質である。具体的な実施形態では、治療用タンパク質は、全長ヒトレチノスキシンタンパク質又は野生型レチノスキシンタンパク質の少なくとも１つの活性を有するその任意の部分に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヒトレチノスキシンタンパク質である。レチノスキシンタンパク質の既知の機能として、陰イオン性リン脂質への結合、ステライルα及びＴＩＲモチーフ含有タンパク質（ＳＡＲＭ１）への結合、α−Ｂ結晶性タンパク質への結合、及びβ２ラミニンへの結合が挙げられる。
【００４７】
本開示の投与方法内で送達される発現ベクターは、ウイルス系によるベクターの複製及びウイルスベクターへの発現ベクターのパッケージングを可能にする核酸配列を含み得る。かかる配列の一例は、アデノ随伴ウイルスに見られる逆位末端反復（ＩＴＲ）配列である。ウイルス複製系の例は当該技術分野で知られており、例えば、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）、及びＡＡＶ  ＩＴＲ配列を認識して、ＩＴＲ配列を含む核酸分子の複製を指示するタンパク質を発現する組換え細胞（例えば、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質を発現する細胞）の使用が挙げられる。同様に、発現ベクターをウイルスベクターにパッケージングすることができるパッケージングシステムが当業者に知られている（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質を発現する組換え細胞）。よって、一実施形態では、発現ベクターは少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含む。一実施形態では、発現ベクターは一対のＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含む。本発明の発現ベクターを構築するのに有用なＡＡＶ  ＩＴＲ配列は、それらがＡＡＶ複製系による発現ベクターの複製、及びウイルスベクターへの発現ベクターのパッケージングを可能とすることができる限り、どんなＡＡＶに由来するものであってもよい。一実施形態では、発現ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ１０からなる群から選択されるウイルスに由来する少なくとも１つのＩＴＲ配列を含む。一実施形態では、発現ベクターはＡＡＶ８に由来する少なくとも１つのＩＴＲ配列を含む。
【００４８】
検討されているように、ウイルスベクターへの発現ベクターのパッケージングは、眼の細胞への発現ベクターの送達効率を増加し得る。本明細書で使用されるウイルスベクターは、１つ以上のウイルスに由来するキャプシドタンパク質を含み、その粒子内に発現ベクターを封入するか、又は含有することができる粒子を指す。ウイルスベクターは、細胞表面の受容体へと結合して内部移行し、それにより眼の細胞の内部へと発現ベクターを送達することによって（例えば、細胞膜との融合により又はエンドサイトーシスにより）送達効率を増加し得る。得られるウイルスベクターが眼の細胞へと発現ベクターを送達することができる限り、任意のウイルスのキャプシドタンパク質を使用してウイルスベクターを構築することができる。ウイルスベクターの構築に使用される好ましいキャプシドタンパク質は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶウイルス）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、及びシンドビスウイルスからなる群から選択されるウイルスから得ることができる。
【００４９】
現在、幾つかの既知のＡＡＶが存在し、その例としてＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ１０が挙げられる。得られる粒子が本発明の発現ベクターを封入して眼の細胞へとそれを送達することができる限り、任意のＡＡＶに由来するキャプシドタンパク質を使用することができる。好ましい実施形態では、キャプシドタンパク質はＡＡＶ８に由来する。よって、本発明の一実施形態は、ＡＡＶ８に由来するキャプシドタンパク質を含むウイルスベクター（ＡＡＶ８ベクター）であり、そのウイルスベクターは発現ベクターを含む。特に好ましい発現ベクター、及びかかる発現ベクターを包含するウイルスベクターは、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０１６３８９号（国際公開第２０１４／１２７１９６号、２０１４年８月２１日）に記載されている。
【００５０】
これらの方法では、発現ベクターは、単独で、又は封入された形で、又はナノ粒子に組み込まれて、眼に注入される。これは、筋肉内、皮内、皮下、結膜下及びテノン嚢下、硝子体内、網膜下、静脈内及び前房内の注射を含んでもよい。かかる注射は、眼内液又は網膜内の場所に発現ベクター又は発現ベクターを含むウイルスベクターを送達することができる。一実施形態では、注射は、眼内液へと発現ベクター又は発現ベクターを含むウイルスベクターを送達する。一実施形態では、注射は網膜へと発現ベクター又は発現ベクターを含むウイルスベクターを送達する。一実施形態では、発現ベクターは硝子体内注射により投与される。別の実施形態では、発現ベクターは網膜下注射により投与される。別の実施形態では、発現ベクターはテノン嚢下注射により投与される。眼内注射を行う方法は当業者に知られている。これら全ての方法において、発現ベクターはポリプロピレンシリンジ内に含まれ、それを介して投与されることが好ましい。これらの手段によって投与する場合、単一注射投与量としては、１×１０８ｖｇ／眼〜３×１０１３ｖｇ／眼（すなわち、１つの眼につき１ｘ１０８ベクターゲノム（ｖｇ）〜１つの眼につき３ｘ１０１３ベクターゲノム）を挙げることができる。これらの手段によって投与する場合、単一注射投与量は、３×１０８ｖｇ／眼〜１×１０１３ｖｇ／眼、又は１×１０９ｖｇ／眼〜１×１０１３ｖｇ／眼、又は３×１０９ｖｇ／眼〜１×１０１３ｖｇ／眼、又は１×１０１０ｖｇ／眼〜１×１０１３ｖｇ／眼、又は３×１０１０ｖｇ／眼〜１×１０１３ｖｇ／眼、又は１×１０１１ｖｇ／眼〜１×１０１３ｖｇ／眼、又は３×１０１１ｖｇ／眼〜１×１０１３ｖｇ／眼、又は１×１０１２ｖｇ／眼〜１×１０１３ｖｇ／眼、又は３×１０１２ｖｇ／眼〜１×１０１３ｖｇ／眼であってもよい。
【００５１】
本開示の投与方法の実施形態では、電流は、例えば、約１マイクロアンペア〜約２００マイクロアンペア、約１０マイクロアンペア〜約１９０マイクロアンペア、約２０マイクロアンペア〜約１８０マイクロアンペア、約３０マイクロアンペア〜約１７０マイクロアンペア、約４０マイクロアンペア〜約１６０マイクロアンペア、約５０マイクロアンペア〜約１５０マイクロアンペア、約６０マイクロアンペア〜約１４０マイクロアンペア、約７０マイクロアンペア〜約１３０マイクロアンペア、約８０マイクロアンペア〜約１２０マイクロアンペア、約９０マイクロアンペア〜約１００マイクロアンペア、約１００マイクロアンペア〜約１５０マイクロアンペア、約１５０マイクロアンペア〜約２００マイクロアンペア、約２００マイクロアンペア〜約２５０マイクロアンペア、約２５０マイクロアンペア〜約３００マイクロアンペア、約３００マイクロアンペア〜約３５０マイクロアンペア、約３５０マイクロアンペア〜約４００マイクロアンペア、約４００マイクロアンペア〜約４５０マイクロアンペア、約４５０マイクロアンペア〜約５００マイクロアンペア、約５００マイクロアンペア〜約５５０マイクロアンペア、約５５０マイクロアンペア〜約６００マイクロアンペア、約６００マイクロアンペア〜約６５０マイクロアンペア、約６５０マイクロアンペア〜約７００マイクロアンペア、約７００マイクロアンペア〜約７５０マイクロアンペア、約７５０マイクロアンペア〜約８００マイクロアンペア、約８００マイクロアンペア〜約８５０マイクロアンペア、約８５０マイクロアンペア〜約９００マイクロアンペア、約９００マイクロアンペア〜約９５０マイクロアンペア、約９５０マイクロアンペア〜約１０００マイクロアンペア（１ミリアンペア（ｍＡ））、約１．０ｍＡ〜約１．１ｍＡ、約１．１ｍＡ〜約１．２ｍＡ、約１．２ｍＡ〜約１．３ｍＡ、約１．３ｍＡ〜約１．４ｍＡ、約１．４ｍＡ〜約１．５ｍＡ、約１．５ｍＡ〜約１．６ｍＡ、約１．６ｍＡ〜約１．７ｍＡ、約１．７ｍＡ〜約１．８ｍＡ、約１．８ｍＡ〜約１．９ｍＡ、約１．９ｍＡ〜約２．０ｍＡ、約２．０ｍＡ〜約２．１ｍＡ、約２．１ｍＡ〜約２．２ｍＡ、約２．２ｍＡ〜約２．３ｍＡ、約２．３ｍＡ〜約２．４ｍＡ、約２．４ｍＡ〜約２．５ｍＡ、約２．５ｍＡ〜約２．６ｍＡ、約２．６ｍＡ〜約２．７ｍＡ、約２．７ｍＡ〜約２．８ｍＡ、約２．８ｍＡ〜約２．９ｍＡ、約２．９ｍＡ〜約３．０ｍＡ、約３．０ｍＡ〜約３．１ｍＡ、約３．１ｍＡ〜約３．２ｍＡ、約３．２ｍＡ〜約３．３ｍＡ、約３．３ｍＡ〜約３．４ｍＡ、約３．４ｍＡ〜約３．５ｍＡ、約３．５ｍＡ〜約３．６ｍＡ、約３．６ｍＡ〜約３．７ｍＡ、約３．７ｍＡ〜約３．８ｍＡ、約３．８ｍＡ〜約３．９ｍＡ、約３．９ｍＡ〜約４．０ｍＡ、約４．０ｍＡ〜約４．１ｍＡ、約４．１ｍＡ〜約４．２ｍＡ、約４．２ｍＡ〜約４．３ｍＡ、約４．３ｍＡ〜約４．４ｍＡ、約４．４ｍＡ〜約４．５ｍＡ、約４．５ｍＡ〜約５．０ｍＡ、約５．０ｍＡ〜約５．５ｍＡ、約５．５ｍＡ〜約６．０ｍＡ、約６．０ｍＡ〜約６．５ｍＡ、約６．５ｍＡ〜約７．０ｍＡ、約７．５ｍＡ〜約８．０ｍＡ、約８．０ｍＡ〜約８．５ｍＡ、約８．５ｍＡ〜約９．０ｍＡ、約９．０ｍＡ〜約９．５ｍＡ、約９．５ｍＡ〜約１０．０ｍＡ、約１０．０ｍＡ〜約１０．５ｍＡ、約１０．５ｍＡ〜約１１．０ｍＡ、約１１．０ｍＡ〜約１１．５ｍＡ、約１１．５ｍＡ〜約１２．０ｍＡ、約１２．０ｍＡ〜約１２．５ｍＡ、約１２．５ｍＡ〜約１３．０ｍＡ、約１３．０ｍＡ〜約１３．５ｍＡ、約１３．５ｍＡ〜約１４．０ｍＡ、約１４．０ｍＡ〜約１４．５ｍＡ、約１４．５ｍＡ〜約１５．０ｍＡ等の低レベル電流であり得る。
【００５２】
本開示の投与方法の実施形態では、電流は、例えば、約１マイクロアンペア〜約４００マイクロアンペア、約２０マイクロアンペア〜約３８０マイクロアンペア、約４０マイクロアンペア〜約３６０マイクロアンペア、約６０マイクロアンペア〜約３４０マイクロアンペア、約８０マイクロアンペア〜約３２０マイクロアンペア、約１００マイクロアンペア〜約３０００マイクロアンペア、約１２０マイクロアンペア〜約２８０マイクロアンペア、約１４０マイクロアンペア〜約２６０マイクロ−アンペア、約１６０マイクロアンペア〜約２４０マイクロアンペア、約１８０マイクロアンペア〜約２２０マイクロアンペア等の低レベル電流であり得る。
【００５３】
本開示の投与方法の実施形態では、電流は、例えば、約１マイクロアンペア〜約１ミリアンペア、約５０マイクロアンペア〜約８００マイクロアンペア、約２００マイクロアンペア〜約６００マイクロアンペア、約４００マイクロアンペア〜約５００マイクロアンペア等の低レベル電流であり得る。
【００５４】
本開示の投与方法の実施形態では、電流は、約１０マイクロアンペア、約２０マイクロアンペア、約３０マイクロアンペア、約４０マイクロアンペア、約５０マイクロアンペア、約６０マイクロアンペア、約７０マイクロアンペア、約８０マイクロアンペア、約９０マイクロアンペア、約１００マイクロアンペア、約１１０マイクロアンペア、約１２０マイクロアンペア、約１３０マイクロアンペア、約１４０マイクロアンペア、約１５０マイクロアンペア、約１６０マイクロアンペア、約１７０マイクロアンペア、約１８０マイクロアンペア、約１９０マイクロアンペア、約２００マイクロアンペア、約２１０マイクロアンペア、約２２０マイクロアンペア、約２４０マイクロアンペア、約２６０マイクロアンペア、約２８０マイクロアンペア、約３００マイクロアンペア、約３２０マイクロアンペア、約３４０マイクロアンペア、約３６０マイクロアンペア、約３８０マイクロアンペア、約４００マイクロアンペア、約４５０マイクロアンペア、約５００マイクロアンペア、約５５０マイクロアンペア、約６００マイクロアンペア、約６５０マイクロアンペア、約７００マイクロアンペア、約７５０マイクロアンペア、約８００マイクロアンペア、約８５０マイクロアンペア、約９００マイクロアンペア、約９５０マイクロアンペア、約１ミリアンペア等の低レベル電流であり得る。
【００５５】
本開示の投与方法の実施形態では、電流は、約１０マイクロアンペア以下、又は約２０マイクロアンペア以下、約３０マイクロアンペア以下、約４０マイクロアンペア以下、約５０マイクロアンペア以下、約６０マイクロアンペア以下、約７０マイクロアンペア以下、約８０マイクロアンペア以下、約９０マイクロアンペア以下、約１００マイクロアンペア以下、約１１０マイクロアンペア以下、約１２０マイクロアンペア以下、約１３０マイクロアンペア以下、約１４０マイクロアンペア以下、約１５０マイクロアンペア以下、約１６０マイクロアンペア以下、約１７０マイクロアンペア以下、約１８０マイクロアンペア以下、約１９０マイクロアンペア以下、約２００マイクロアンペア以下、約２１０マイクロアンペア以下、約２２０マイクロアンペア以下、約２３０マイクロアンペア以下、約２４０マイクロアンペア以下、約２５０マイクロアンペア以下、約２６０マイクロアンペア以下、約２７０マイクロアンペア以下、約２８０マイクロアンペア以下、約２９０マイクロアンペア以下、約３００マイクロアンペア以下、約３１０マイクロアンペア以下、約３２０マイクロアンペア以下、約３４０マイクロアンペア以下、約３６０マイクロアンペア以下、約３８０マイクロアンペア以下、約４００マイクロアンペア以下、約４２０マイクロアンペア以下、約４４０マイクロアンペア以下、約４６０マイクロアンペア以下、約４８０マイクロアンペア以下、約５００マイクロアンペア以下、約５２０マイクロアンペア以下、約５４０マイクロアンペア以下、約５６０マイクロアンペア以下、約５８０マイクロアンペア以下、約６００マイクロアンペア以下、約６２０マイクロアンペア以下、約６４０マイクロアンペア以下、約６６０マイクロアンペア以下、約６８０マイクロアンペア以下、約７００マイクロアンペア以下、約７２０マイクロアンペア以下、約７４０マイクロアンペア以下、約７６０マイクロアンペア以下、約７８０マイクロアンペア以下、約８００マイクロアンペア以下、約８２０マイクロアンペア以下、約８４０マイクロアンペア以下、約８６０マイクロアンペア以下、約８８０マイクロアンペア以下、約９００マイクロアンペア以下、約９２０マイクロアンペア以下、約９４０マイクロアンペア以下、約９６０マイクロアンペア以下、約９８０マイクロアンペア以下等の低レベル電流であり得る。
【００５６】
本開示の投与方法の実施形態では、電流は、１０マイクロアンペア以上、２０マイクロアンペア以上、３０マイクロアンペア以上、４０マイクロアンペア以上、５０マイクロアンペア以上、６０マイクロアンペア以上、７０マイクロアンペア以上、８０マイクロアンペア以上、９０マイクロアンペア以上、１００マイクロアンペア以上、１１０マイクロアンペア以上、１２０マイクロアンペア以上、１３０マイクロアンペア以上、１４０マイクロアンペア以上、１５０マイクロアンペア以上、１６０マイクロアンペア以上、１７０マイクロアンペア以上、１８０マイクロアンペア以上、１９０マイクロアンペア以上、２００マイクロアンペア以上、２１０マイクロアンペア以上、２２０マイクロアンペア以上、２３０マイクロアンペア以上、２４０マイクロアンペア以上、２５０マイクロアンペア以上、２６０マイクロアンペア以上、２７０マイクロアンペア以上、２８０マイクロアンペア以上、２９０マイクロアンペア以上、３００マイクロアンペア以上、３１０マイクロアンペア以上、３２０マイクロアンペア以上、３３０マイクロアンペア以上、３４０マイクロアンペア以上、３５０マイクロアンペア以上、３６０マイクロアンペア以上、３７０マイクロアンペア以上、３８０マイクロアンペア以上、３９０マイクロアンペア以上、４００マイクロアンペア以上、約４２０マイクロアンペア以上、約４４０マイクロアンペア以上、約４６０マイクロアンペア以上、約４８０マイクロアンペア以上、約５００マイクロアンペア以上、約５２０マイクロアンペア以上、約５４０マイクロアンペア以上、約５６０マイクロアンペア以上、約５８０マイクロアンペア以上、約６００マイクロアンペア以上、約６２０マイクロアンペア以上、約６４０マイクロアンペア以上、約６６０マイクロアンペア以上、約６８０マイクロアンペア以上、約７００マイクロアンペア以上、約７２０マイクロアンペア以上、約７４０マイクロアンペア以上、約７６０マイクロアンペア以上、約７８０マイクロアンペア以上、約８００マイクロアンペア以上、約８２０マイクロアンペア以上、約８４０マイクロアンペア以上、約８６０マイクロアンペア以上、約８８０マイクロアンペア以上、約９００マイクロアンペア以上、約９２０マイクロアンペア以上、約９４０マイクロアンペア以上、約９６０マイクロアンペア以上、約９８０マイクロアンペア以上等の低レベル電流であり得る。
【００５７】
本開示の投与方法の実施形態では、電流は、１ミリ秒（millisecond (ms)）〜１０００ミリ秒、５ミリ秒〜９９５ミリ秒、１０ミリ秒〜９００ミリ秒、２０ミリ秒〜８００ミリ秒、２５ミリ秒〜７５０ミリ秒、３０ミリ秒〜７００ミリ秒、３５ミリ秒〜６５０ミリ秒、４０ミリ秒〜６００ミリ秒、４５ミリ秒〜５００ミリ秒、５０ミリ秒〜５００ミリ秒等の期間で印加され得る。
【００５８】
本開示の投与方法の実施形態では、電流は、１秒（second (s)）〜６０秒、２秒〜５８秒、４秒〜５６秒、６秒〜５４秒、８秒〜５２秒、１０秒〜５０秒、１２秒〜４８秒、１４秒〜４６秒、１６秒〜４４秒、１８秒〜４２秒、２０秒〜４０秒、２２秒〜３８秒、２４秒〜３６秒、２６秒〜３４秒、２８秒〜３２秒等の期間で印加され得る。
【００５９】
本開示の投与方法の実施形態では、電流は、１分（minute (min)）〜６０分、２分〜５８分、４分〜５６分、６分〜５４分、８分〜５２分、１０分〜５０分、１２分〜４８分、１４分〜４６分、１６分〜４４分、１８分〜４２分、２０分〜４０分、２２分〜３８分、２４分〜３６分、２６分〜３４分、２８分〜３２分等の期間で印加され得る。
【００６０】
本開示の投与方法の実施形態では、電流は、１時間（hour (hr)）〜２４時間、２時間〜２２時間、４時間〜２０時間、６時〜１８時間、８時間〜１６時間、１０時間〜１４時間、１２時間〜１３時間等の期間で印加され得る。
【００６１】
本開示の投与方法の実施形態では、電流は、発現ベクターの注入と同時に眼に印加され得る。実際上は、この投与タイミングは、発現ベクターの注入の１分前から注入の１分後以内までの期間での電流の印加を包含し得る。
【００６２】
本開示の投与方法の実施形態では、発現ベクターの注入前に眼に電流を印加することができる。これらの方法では、発現ベクターを注入する最大４８時間前まで眼に電流を印加することができる。これらの方法では、電流は、発現ベクターの注入前２４時間〜４８時間、又は発現ベクターの注入前１２時間〜２４時間、又は発現ベクターの注入前６時間〜１２時間、又は発現ベクターの注入前１時間〜６時間、又は発現ベクターの注入前１分〜６０分の期間に眼に印加され得る。
【００６３】
本開示の投与方法の他の実施形態では、発現ベクターの注射後に眼に電流を印加することができる。これらの方法では、発現ベクターの注入から最大４８時間後まで眼に電流を印加することができる。これらの方法では、電流は、発現ベクターの注入後２４時間〜４８時間、又は発現ベクターの注入後１２時間〜２４時間、又は発現ベクターの注入後６時間〜１２時間、又は発現ベクターの注入後１時間〜６時間、又は発現ベクターの注入後１分〜６０分の期間に眼に印加され得る。
【００６４】
例えば（１）不活性電極及び（２）活性電極を含む、様々なタイプの電極を使用して、印加電流を生成することができる。活性電極には、電解質を含む水性媒体が必要である。薬物送達電極の電気極性は、発現ベクター又はナノ粒子の化学的性質、具体的にはそのｐＫａ（複数の場合もある）／等電点及び初期投与溶液のｐＨに応じて選択され得る。電気分解によって生成されたイオンと発現ベクターの電荷との間の電気化学的反発は、発現ベクターを組織へと駆動する可能性がある。そのため、電流の印加と組み合わせた投与は、それが薬物吸収を増加させるという点で、局所薬物適用よりも大きな利点を提供する。薬物送達の速度は、当業者によって決定されるように、印加される電流又は時間を変化させることによって調整され得る。
【００６５】
本開示の投与方法において有用な不活性電極として、限定されないが、銅金属及び／又は銀金属及び／又は金金属の電極、及び／又は白金及び又は水銀、及び／又は炭素の電極を含む、任意の導電性材料を含む電極が挙げられる。
【００６６】
本開示の方法内で投与される遺伝子治療ベクターは、最適な薬学的有効性を提供する投薬量でかかる治療を必要とする被験体（例えば、ヒト、並びにイヌ、ネコ及びウマ等のコンパニオンアニマルを含む動物）に投与することができる。任意の特定の用途での使用に必要な用量は、選択される特定の発現ベクター又は組成物のみならず、投与経路、治療される状態の性質、患者の年齢及び状態、その後患者が従う同時の投薬又は特別な食事、及び当業者が認識する他の要因によっても患者ごとに異なり、適切な投与量は、最終的には主治医の裁量に委ねられることが理解されよう。
【００６７】
幾つかの相互依存する要因が、眼の疾患又は障害の治療における遺伝子治療ベクター調製物の全体的な有効性及び安全性に影響を及ぼす。これらには、ＩＬＭ、角膜、強膜、又は血液眼関門を通って浸透する遺伝子治療ベクターの能力、相対的な発現効率、作用の持続時間、及び標的組織における分布、投与の用量及び頻度、有害事象プロファイル、並びに投与部位が含まれる。好ましくは、遺伝子治療ベクターは、最初に、標的とされる組織に近い場所に注入され、網膜の場合、上記のように、硝子体内注射が好ましく、また、これは水晶体の後部及び毛様体に到達するのに適した場所であり得る。角膜内皮（フックス角膜内皮ジストロフィー等の非常に疾患頻度の高い部位）の場合は水晶体、また線維柱帯網（眼圧の増加を伴う緑内障に関与する）の場合は前眼房にベクターを注入することが好ましい。
【００６８】
遺伝子治療ベクター組成物の送達効率に影響を与える適切なパラメーターは、投与される組成物のｐＨ（例えば、リン酸塩緩衝液を含む様々な緩衝系を使用して酸又は塩基でｐＨ調整することにより、様々なｐＨ範囲が得られる）；投与される組成物の導電率（塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等）の濃度を変えることにより、様々な導電率範囲が得られる）；投与される組成物の浸透圧（例えば、マンニトールの添加により、様々な浸透圧範囲が得られる）；イオン強度（様々なイオン性化合物（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２等）の添加により、様々なイオン強度が得られる）；投与される組成物の粘度（例えば、様々なポリエチレングリコール種（ＰＥＧ）の添加により、様々な粘度が得られる）である。
【００６９】
本開示の方法による発現ベクターの送達を最適化する際に考慮される他のパラメーターとして、例えば、不活性対活性電極の使用、緩衝系の選択、賦形剤の選択（おそらく浸透圧の調整に必要）、発現ベクター電荷（例えば、ｐＫａ及びｐＩ）、発現ベクターの溶解度、発現ベクターの濃度、発現ベクターの安定性、薬物安定剤、共溶媒、及びエマルジョンの選択が挙げられる。
【００７０】
本開示の方法内での電流の印加は、一般に、角膜上に又は眼内に単純な電極を設置すること（例えば、負極としての単線）、及び被験体の身体の任意の場所又は眼の他の場所に別の単純な電極を設置することを含み得る。電極の設置を選択する目的は、電流を眼に流すことにより、発現ベクターが眼の所望の組織、例えば、後眼部にある網膜、又は前眼部にある角膜、水晶体、虹彩、線維柱帯網若しくは毛様体に入るのを可能にすることである。そのため、印加電流が眼全体を通過するように、一方若しくは両方の電極を角膜に接触させて、又はどちらの電極も角膜に接触させずに、眼に２つの電極を設置することも可能である。電極の設置はまた、電極を眼に挿入することを含み得て、これは、網膜のより近くに電流を印加し、したがって、遺伝子発現の送達を増強することに大きな影響を及ぼし得る。例えば、これは、先端のみが露出金属であり、シャフトがテフロン（登録商標）（又は他の）絶縁体でコーティングされている皮内電極に対して行われ、かかる電極材料及びセットアップは、本開示の投与方法において容易に使用され得る。かかる場合、針電極は眼を貫通し、好ましくは硝子体内に配置され、一方、第２の電極は、身体の「接地（アース）」を含めて眼の外側にある。これらの方法では、硝子体内に設置された眼の手術器具に電流を印加することができ、それによって眼に挿入された電極として作用し得る。身体の上の電極は本質的に「コモン（common）」又は「接地」であり、眼に設置された電極は、そこから電流が多かれ少なかれ放射状に広がるポイントである。
【００７１】
電流を、発現ベクター又はナノ粒子を眼の硝子体腔に適用する前又はその後に印加することができる。例えば、電流は、発現ベクター又はナノ粒子を眼に注入する４８時間も前に印加され得る。よって、電流は、発現ベクター又はナノ粒子の眼への注入前１時間〜４８時間、又は注入前３０分〜２４時間、又は注入前３０秒〜１２時間、又は注入前３０ミリ秒〜６時間の期間で眼に印加され得る。別の例では、電流は、発現ベクター又はナノ粒子を眼に注入してから４８時間も後に印加され得る。よって、電流は、発現ベクター又はナノ粒子の眼への注入後１時間〜４８時間、又は注入後３０分〜２４時間、又は注入後３０秒〜１２時間、又は注入後３０ミリ秒〜６時間の期間で眼に印加され得る。印加する間、電流をモニターすることが好ましい。当然のことながら、当業者は、マイクロアンペアからミリアンペアの範囲の電流を正確に印加及び／又は制御及び／又はモニターすることができる定電流電源を使用することの制御及び一貫性を十分理解するであろう。
【００７２】
上記の発現ベクターの投与及び電流の印加に関連するパラメーターは、２つの電極間の電流の方向を制御する。例えば、例示的な実施形態では、負極を角膜上に設置することができ、正極は皮下に設置する。関連する実施形態では、電極の電荷を逆にすることができる（すなわち、正極を角膜に設置し、負極を皮下に設置する）。これは、発現ベクター／粒子が水晶体、虹彩、毛様体、及び／又は角膜の組織に入り、それによって、治療のため前眼部においてそれらの組織及び眼構造物のトランスフェクションを増強することを可能にし得る。
【００７３】
本発明はまた、本開示の方法を実施するためのキットを提供する。本開示のキットは、眼の疾患又は障害の治療に有効な発現ベクター及びウイルスベクターを備え得る。かかるキットはまた、希釈剤、シリンジ、針、化合物を被験体の眼に送達するための装置（又は装置の構成要素）、及びかかる試薬を投与するための指示書等の開示される方法を実施するために必要な試薬及び道具を備えてもよい。これらのキットはまた、被験体の眼への治療用タンパク質をコードする遺伝子治療コンストラクトの送達に適した１つ以上の遺伝子治療ベクターを備え得る。
【００７４】
本発明はその具体的な実施形態を参照して説明されるが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な変更を行ってもよく、等価物を置換することができることが当業者によって理解される。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセス工程（単数又は複数）を本発明の目的、趣旨及び範囲に適合させるために多くの修正を行ってよい。かかる修飾は全て、特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【実施例】
【００７５】
下記方法を使用して、以下の実施例１〜実施例４に記載される実験を行った。
【００７６】
動物：マウス実験では、８週齢〜１２週齢の成体野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（メイン州バーハーバーのJackson Laboratory）を使用した。１２時間／１２時間の明／暗サイクルで名目上６０ルクスの薄暗い白色蛍光灯のもとマウスを収容した。実験プロトコルは、ＮＩＨ動物実験委員会によって承認され、眼科及び視覚研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ声明を順守した。全ての手順で、腹腔内ケタミン（９２．６ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（５．６ｍｇ／ｋｇ）溶液を用いて麻酔を行い、局所用０．５％テトラカインを眼に塗布した後、眼局所用０．５％トロピカミド（Alcon Laboratories）及び０．５％フェニレフリン塩酸塩（Bausch & Lomb）で瞳孔を散大させた。
【００７７】
網膜ＡＡＶ−ＧＦＰ発現を、Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ眼底カメラ（ドイツ国ハイデルベルクのHeidelberg Engineering）を使用したｉｎ  ｖｉｖｏでの眼底画像化によって評価した。研究の終了時に眼を採取し、網膜免疫組織化学を行って、電流処理した眼及び電流処理をしていない眼でＡＡＶ８−ＥＧＦＰによって形質導入された網膜細胞の分布を評定した。
【００７８】
アデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ８）ベクター：ＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＥＧＦＰベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、キメラＣＭＶ／ヒトβ−グロビンイントロン、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子、及びヒトβ−グロビンポリアデニル化（ＰｏｌｙＡ）部位を有している。以前に記載されるように（Park T. K., et al., (2009). Intravitreal delivery of AAV8 retinoschisin results in cell type-specific gene expression and retinal rescue in the Rs1-KO mouse. Gene Ther. 16: 916-926）、トリプルトランスフェクション法によって組換えＡＡＶを製造し、ポリエチレングリコール沈殿及びそれに続く塩化セシウム密度勾配分画によって精製した。精製されたＡＡＶベクターを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１８０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４及び０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ−６８  ｐＨ７．４に製剤化し、−８０℃で保存した。ベクターの定量を、線形化されたプラスミド標準を使用したリアルタイムＰＣＲによって行った。
【００７９】
硝子体内注射及び眼電流（ＥＣＶＭ）の適用：ＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＥＧＦＰベクター希釈液５×１０８ｖｇ／眼又は１×１０９ｖｇ／眼を成体ＷＴマウスに硝子体内注射により投与した。最初にマウスに麻酔をかけ、瞳孔を散大させた。動物を、注射された眼を上に向けて、解剖顕微鏡下に配置した。ＡＡＶ８−ＥＧＦＰ  １μｌ懸濁液を、１０μＬ  Ｎａｎｏｆｉｌシリンジ（米国フロリダ州サラソータのWorld Precision Instruments, Inc.）に取り付けられた３５ゲージのベベルチップ（beveled-tip）針を使用して、角膜輪部のおよそ１ｍｍ後方の鼻側強膜を通して硝子体に注入した。ネオマイシン、ポリミキシンＢ、及びバシトラシンの三重抗生物質眼軟膏を眼に塗布した。次いで、注射された眼は、注射後すぐに（およそ５分）電流（ＥＣＶＭ）の印加を受けた。動物を３２℃〜３３℃の加温パッド上で保持した。電流を印加せずに注射した眼は対照としての役割を果たした。マウスの眼及び硝子体腔のサイズは非常に小さいため、入口部位の対向側の針先で網膜に触れることによって網膜の傷害が発生することがあった。本発明者らがＯＣＴで明らかな網膜損傷を観察したとき、これらの眼の幾つかは広範囲のＧＦＰ発現を示した。本発明者らは、それらの眼を分析から除外した。これは、注射された６５個の眼のうち６個で起こった。
【００８０】
経眼ＥＣＶＭの適用。マウスに麻酔をかけ、ＧＯＮＡＫヒプロメロース（Akorn, Inc.）の薄層又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で角膜の水分を維持しながら、金のワイヤーリング電極を角膜の中心に設置した。角膜を瞼に電気的に短絡させないように、角膜に最小限の流体を使用するように注意を払った。同じ瞼の上の額に皮下針電極を皮下挿入した。２つの電極はおよそ１ｃｍ離れていた。神経保護のための経眼的電流の以前の研究では、網膜変性を有する齧歯類の眼にとって安全な二相性の１．５マイクロアンペア〜３００マイクロアンペア（μＡ）を３０分〜６０分間使用した（Pardue M. T., et al., (2014). Neuroprotective effects of low level electrical stimulation therapy on retinal degeneration. Adv Exp Med Biol. 801:845-851）。本発明者らは、最初に、定電流刺激アイソレーター（Ａ３６５、World Precision Instruments）を使用して、角膜の負極で１０μＡ及び５０μＡの連続直流（ＤＣ）を２０分間試験した。これらの電流は、３ボルト又は４ボルト未満の印加で達成された。５０μＡの電流を印加すると、電極リングに隣接する角膜の瘢痕化、及び時折白内障が発生したが、１０μＡの電流は合併症を引き起こさなかった。網膜の安全性を評価するため、７匹のマウスでベースライン網膜電図（ＥＲＧ）を記録し、１週間後、角膜に１０μＡのＤＣ電流を２０分間印加した。電流を印加してから３週間後に再度、ＥＲＧ機能を試験した。ベースラインと比較して、桿体及び錐体応答の網膜ＥＲＧ機能は、１０μＡ  ＤＣ電流後の振幅又はタイミングに変化を示さず、ａ波及びｂ波の応答の強さ−反応曲線は変化しなかった。網膜組織像のため３日後に眼を摘出したところ、形態及びＯＮＬの厚さはいずれも、対照としての役割を果たす未処理のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較して、影響を受けていなかった。網膜ＥＲＧ、形態及びＯＮＬ厚さの結果を（図４Ａ〜図４Ｈ及び図５Ａ、図５Ｂ）に示す。本発明者らは、マウスで更に試験するため、１０μＡの電流を選択した。
【００８１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ眼底画像化によるＧＦＰ発現：硝子体内ＡＡＶ８−ＥＧＦＰ適用の４週間〜６週間後、ＧＦＰ発現をｉｎ  ｖｉｖｏでの眼底画像化（Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ眼底カメラ、Heidelberg Engineering）によって評価した。マウスに麻酔をかけ、瞳孔を散大させた。青色蛍光眼底画像を超広視野（１０２度）レンズで撮影した。中心網膜のＧＦＰ陽性面積を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（imagej.nih.gov/ij）による強度閾値法を使用して測定した。簡単に言えば、分析では視神経円板を中央にした写真を使用し、強度閾値を適用して、バックグラウンドシグナルからＧＦＰ陽性面積を選択した。全ての分析に同じ閾値設定を使用した。中心網膜のＧＦＰシグナルの面積を中心網膜の総面積で割ることによって、グラフ内のＧＦＰ発現の面積パーセンテージを計算した。
【００８２】
網膜免疫組織化学で決定されたＧＦＰ強度及び分布：網膜免疫組織化学を以前に記載された通りに実施した（Song H., et al. (2016). NADPH Oxidase Contributes to Photoreceptor Degeneration in Constitutively Active RAC1 Mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57: 2864-75）。簡単に説明すると、眼を固定し、凍結保護し、包埋し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（米国のSakura Finetek）で急速凍結し、１０μｍの厚さの凍結切片を作製した。ＧＦＰ強度の分析のため、凍結切片をブロッキングバッファーでブロックし、マウス抗ＧＦＰ（１：１０００、Cell Signaling Technology）一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした後、抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８二次抗体（１：１０００；オレゴン州ユージーンのInvitrogen）と共にインキュベートした。網膜核をＤＡＰＩで対比染色し、画像化のために切片をＦｌｕｏｒｏ−Ｇｅｌバッファー（Electron Microscopy Sciences）にマウントした。画像を、ＮＩＳ−ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＡＲソフトウェアを搭載したＮｉｋｏｎ  Ｃ２共焦点顕微鏡（Nikon）によって生成及び分析し、更にＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ４、バージョン１１．０を使用して編集した。全てのサンプルの分析に同じ画像化設定を使用した。各眼について、ＧＦＰシグナルが最も強い網膜切片を選択した。ピクセル強度及びＧＦＰシグナルの面積を、以前に記載されているＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いる方法（Jensen, E. C. (2013). Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anat Rec (Hoboken). 296:378-81）を使用して、ＧＦＰ陽性外顆粒層（ＯＮＬ）の全長に沿って測定した。ＧＦＰ強度を、各群のピクセル／面積（平均±ＳＥＭ）として表し、プロットした（各群でＮ＝１１）。網膜のＧＦＰ分布を分析するため、本発明者らは、免疫染色していない代表的な網膜切片の顕微鏡写真を使用して、元のＧＦＰシグナルの平均強度Ｚ投影を示し、ＩｍａｇｅＪのプロットプロファイル関数を使用してＲＰＥからの距離に対してＧＦＰ強度をプロットした。
【００８３】
組織像：網膜の組織学的分析のため、凍結切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ及びＥ）で染色し、ＤＳ−Ｒｉ２デジタルカメラを搭載したＮｉｋｏｎ  Ｃ２共焦点顕微鏡（Nikon）を使用して写真を撮影した。厚さを、網膜切片の下半分及び上半分で、視神経乳頭から２００μｍ〜１０００μｍの区域において、２００μｍ間隔でＯＮＬ幅全体の核の列を数えることによって評価した。単一の網膜切片で、定義された区域の各ポイントでの核数を平均して、その網膜のＯＮＬの厚さの全体的な推定値を求めた。核をＥＣＶＭ処理（ｎ＝１２）及び未処理（ｎ＝４）マウスで数えた。各群について、サンプルごとに２枚の切片を数えた。
【００８４】
網膜電図（ＥＲＧ）：全視野ガンツフェルト暗順応及び明順応ＥＲＧを、１２時間の暗順応後、ＣｏｌｏｒＤｏｍｅガンツフェルト刺激を備えたＥｓｐｉｏｎ  Ｅ２電気生理学システム（Diagnosys LLC）を使用して記録した。動物に麻酔をかけ、瞳孔を散大させた。ＥＣＶＭ適用の前後に７匹の動物で測定を行った。ＥＣＶＭ適用前の測定値はベースラインとしての役割を果たした。応答を、分析のため強度応答関数としてプロットした。これらのＥＲＧの方法及び分析は、以前に詳述されている（Song H., et al. (2014). Transgenic expression of constitutively active RAC1 disrupts mouse rod morphogenesis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55:2659-68、Marangoni D., et al. (2015). Intravitreal Ciliary Neurotrophic Factor Transiently Improves Cone-Mediated Function in a CNGB3-/- Mouse Model of Achromatopsia. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56: 6810-22）。
【００８５】
統計学的分析：定量的データを平均±ＳＥＭとして表す。ＥＲＧのａ波及びｂ波の振幅及び陰的時間の統計的比較は、２元配置分散分析を使用して刺激強度の範囲全体で行われ、Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０７（GraphPad Software）でホルム−サイダック（Holm-Sidak）法を使用して多重比較を補正した。２群間で平均を比較するため、本発明者らは、最初にダゴスティーノ及びピアソン（D'Agostino & Pearson）のオムニバス正規性検定を行った。正規性検定に合格したデータセットに対して、本発明者らは、スチューデントのｔ検定を使用した。そうでない場合、本発明者らは、マンホイットニー検定を使用した。
【００８６】
実施例１
マウスにおける眼送達後の形質導入効率及び網膜発現
予備研究では、２０分間の１０μＡの直流電流は、眼の構造又は機能に悪影響を及ぼさないことが示された（図４Ａ〜図４Ｈ及び図５Ａ、図５Ｂを参照されたい）。次いで、本発明者らは、１×１０９ベクターゲノム（ｖｇ）をマウスの眼の硝子体に注入した直後に印加した場合に、これがＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＧＦＰの網膜形質導入効率を高めるかどうかを評価した。対照眼にはＧＦＰベクターを注射したが、電流を印加しなかった。ＧＦＰ発現を、注射後（ＰＩ）６週間目にｉｎ  ｖｉｖｏ眼底画像化によって評価した。ＧＦＰ発現を示す網膜面積の広さ（パーセントで表される、図１Ａ）を、ＡＡＶ８ベクター形質導入の効率を示すために使用した。
【００８７】
平均ＧＦＰ発現の網膜面積（３０．５％）は、電流ベクター移動（ＥＣＶＭ、３０．５％）のアプローチにより処理した眼では、対照群（電流なし）よりも有意に大きかった（８．４％；ｐ＝０．０３８；マンホイットニー検定；図１Ｂ）。ほとんどの対照眼（２１個のうち１４個、６７％）は、中心網膜の１０％未満にわたってＧＦＰ発現を示し、どの対照眼も、中心網膜領域の２５％を超えて形質導入を示すことはなかった（図１Ａ及び図１Ｃ）。比較すると、経眼的電流を受けた１６個の注入された眼のうち７個（４４％）は、中心網膜領域の４５％超が形質導入されたことを示し、１６個の眼うち４個（２５％）は、中心網膜の６５％超を占めるＧＦＰ発現があった。これらの結果は、ＥＣＶＭが硝子体内注射後のＷＴマウス網膜におけるＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＧＦＰの形質導入効率を有意に促進することを示す。
【００８８】
実施例２
マウスにおける形質導入効率及び網膜発現に対する用量及び投与時間の効果
本発明者らはまた、５×１０８ｖｇ／眼のより少ない用量で結果を評価し、硝子体内注射後の４．５週間目のより早期に分析を行った（図２Ａ〜図２Ｄ）。これにより、ＥＣＶＭで処理した眼と処理していない眼との間の格差が拡大した。ＥＣＶＭを適用していない眼のうち、８２％（１１個のうち９個）が中心網膜全体でＧＦＰ発現を示さなかった（図２Ａ及び図２Ｂ）。比較すると、ＥＣＶＭを受けた眼のほぼ半数が中心網膜の２０％超でＧＦＰ発現を示し、処理した１１個の眼のうち２個で中心網膜の５０％超が形質導入されていた。ＧＦＰ発現の平均網膜面積は、電流を受けずに注射された対照（２．３％；ｐ＜０．０００１、マンホイットニー検定；図２Ｂ）と比較して、ＥＣＶＭ処理された眼において有意に大きかった（２２％）。本発明者らは、ＥＣＶＭ処理を受けた残りの９個の眼よりも２個の眼がより多くの発現を示したことに注目した。十分な注意を払って、本発明者らは、異常に大きな網膜領域が形質導入された可能性があると想定して、最初にこれら２つのサンプルを除いた後に再び分析を行った。ＥＣＶＭ処理（ｎ＝９）対対照（ｎ＝１１）の眼の差は、依然として非常に有意であった（ｐ＝０．０００３、マンホイットニー検定；図２Ｃ）。
【００８９】
実施例３
マウスにおける眼送達後の遺伝子発現強度の評価
次いで、本発明者らは、この５×１０８ｖｇ／眼の低用量群の眼を収集し、注射後５週目の網膜組織学的凍結切片に対する免疫蛍光法によるＧＦＰ発現強度を比較した。ＥＣＶＭ適用を受けた注射した眼は、対照の眼と比較して約６倍（５．９±１．２）高い強度を示した（ｐ＝０．０００７；マンホイットニー検定；図２Ｄ）。これらのデータは、経眼ＥＣＶＭが硝子体内投与後のＡＡＶベクターの網膜形質導入効果を高めたという知見を更に支持する。
【００９０】
実施例４
マウスにおける眼送達後の遺伝子発現分布の評価
本発明者らはまた、ＥＣＶＭで処理した眼においてＡＡＶ８−ＥＧＦＰによって形質導入された網膜細胞の分布を評価した。ＧＦＰは、ＥＣＶＭで処理された眼の全ての網膜層で観察された（図３Ａ〜図３Ｅ）。ほとんどの網膜切片は、より深い網膜細胞によって、ＲＰＥ及び光受容体で最大のＧＦＰ蛍光を示した（図３Ａ）。幾つかの切片は更に神経節細胞の形質導入を示した（図３Ｂ）。これは、ＧＦＰ強度の網膜分布プロファイルによって確認された。
【００９１】
これらの研究は、遺伝子発現ベクターの硝子体内投与後の網膜における遺伝子導入効果を増強する安全で効率的、且つ非侵襲的な方法を実証している。本発明者らは、硝子体内ベクター投与と共に、ｉｎ  ｖｉｖｏで眼全体に微小電流を印加すること、すなわちＥＣＶＭは、外科的な摘除又はＩＬＭの穿孔を行わずに、網膜表面で内境界膜（ＩＬＭ）のベクター浸透を増大させ、網膜の外側にある細胞の形質導入を増加することを実証した。２０分間の連続的な１０μＡの直流は、成体マウスの眼にとって安全であり、経眼的電流は他の状況で安全に使用されていることから、このアプローチはヒト応用の可能性を実証する。
【００９２】
実施例５
ウサギ網膜におけるベクター形質導入の経眼微小電流増強の評価
マウス（上記実施例１〜実施例４）で実証されたように、硝子体内ＡＡＶベクター投与後の内境界膜（ＩＬＭ）を横切るＡＡＶ媒介ベクターの浸透に対する電流ベクター移動（ＥＣＶＭ）の効果を、ウサギモデルまで広げた。この研究は、実験概念を第２の種としてウサギに拡大し、経眼的電流が野生型ウサギにおいて電流ベクター移動（ＥＣＶＭ）によって硝子体内に投与されたＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰの網膜形質導入効率を増大するかどうかを評価した。
【００９３】
これらの実験では、６ヵ月齢〜８ヵ月齢の成体の野生型ニュージーランドホワイトウサギを使用した。５０μｌ／眼の５×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）のＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰベクターを硝子体内注射により成体ＷＴウサギの眼に投与した。この実証には、ＡＡＶ血清型８を使用した。硝子体内注射の直後、Ｂｕｒｉａｎ−Ａｌｌｅｎ  ＥＲＧ電極をＧＯＮＡＫヒプロメロースの薄層と共に角膜の中心に設置した。電気回路を完成させ、「全眼刺激」の状態を作り出すために、皮下針電極を第２の電極として同側の耳の後ろの皮下に挿入した。ＤＣ電流（８００μＡ  角膜陰性（cornea-negative）、単相、連続）を、定電流の刺激アイソレーター電源（Ａ３６５、フロリダ州サラソータのWorld Precision Instruments）から２０分間印加した。これと同じＡＡＶベクター及び用量を注入したが、電流を印加しなかった眼は、対照としての役割を果たした。
【００９４】
網膜ＡＡＶ−ＧＦＰ発現を、Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ眼底カメラ（Heidelberg Engineering）を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの眼底画像化によって評価した。研究の終了時に眼を採取し、網膜免疫組織化学を行って、電流処理した眼及び電流処理をしていない眼でＡＡＶ８−ＥＧＦＰによって形質導入された網膜細胞の分布を評定した。
【００９５】
本発明者らは、５×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）をウサギの眼の硝子体に注入した直後に印加した場合、ＥＣＶＭがＡＡＶ−ＣＭＶ−ＧＦＰの網膜形質導入効率を増強するかどうかを評価した。対照眼にはＧＦＰベクターを注射したが、電流を印加しなかった。網膜ＧＦＰ発現を、注射後（ＰＩ）１１週目にｉｎ  ｖｉｖｏ眼底自家蛍光画像化によってモニターした。ウサギの網膜には、髄放線と呼ばれる、視神経乳頭から放射状に伸びる有髄神経線維の特殊な区域がある（図６Ａ）。眼底は、ベクター適用から１１週間後、この領域でＧＦＰシグナルの大部分を示す。そのため、有髄区域におけるＧＦＰ発現の程度を使用して、ＡＡＶベクター形質導入の効率を示した。対照眼の場合（図６Ｂ）、１４個の対照眼のうち１３個（９３％）が有髄区域全体でＧＦＰシグナルを全く又はほとんど示さなかったように、大半の例でベクターの取り込み及び発現を示さず、１４個のうち１個（７％）のみが、髄放線全体で目に見えるが弱いＧＦＰシグナルを示し、本発明者らは、これをＧＦＰ陽性とした。比較すると、ＥＣＶＭを受けた１４個の眼のうち６個（４３％）には、髄放線の領域で陽性ＧＦＰシグナルがあった（図６Ｃ）。
【００９６】
また、本発明者らは、ＥＣＶＭ電流処理した１４個の眼のうち６個（４３％）が点状ＧＦＰ発現のある網膜周辺区域を示したが、これはＥＣＶＭを適用していない１４個の対照眼のうち３個（２１％）でのみ観察されたことにも注目した。さらに、６個のＥＣＶＭ処理眼のうち１個は網膜下に点状ＧＦＰシグナルのある大きな領域を有し、これは、電流を受けていないどの対照眼でも観察されなかった。
【００９７】
また、本発明者らは、ＥＣＶＭ処理眼においてＡＡＶ−ＥＦＧＰによって形質導入された網膜細胞の分布を評価した。ＧＦＰは幾つかの網膜層で観察され、ＧＦＰ強度は神経線維層（すなわち髄放線）で最も高かった。ＧＦＰは、ＲＧＣ層、内網状層（ＩＰＬ）、内顆粒層（ＩＮＬ）、及び外網状層（ＯＰＬ）の細胞にも見られた。これらの区域は、野生型マウスにおいてＥＣＶＭ法で本発明者らが見たものよりも比較的小さかった。しかしながら、マウスの眼とウサギの眼の形状は、網膜ＩＬＭ表面に対する水晶体の後面の寸法がかなり異なっていることを認識することが重要であり、本発明者らは、このウサギの実験における電流又は硝子体腔へのベクター投与の最適化についてはまだ試みていない。
【００９８】
ＡＡＶの形質導入及び発現は、外顆粒層（ＯＮＬ）から外境界膜（ＯＬＭ）の厚み全体に伸長するプロセスを含む、一部のミュラーグリア細胞でも顕著であった。他の網膜区域は、ＩＰＬで豊富な斑状のＧＦＰシグナルを示した。比較すると、経眼的電流を受けなかった眼からの対照切片は、網膜全体でＧＦＰ発現がはるかに少なく、ＧＦＰシグナルの程度が低いことを示した。
【００９９】
これらのデータは、ＥＣＶＭが硝子体内注射後のＷＴウサギ網膜におけるＡＡＶ−ＣＭＶ−ＧＦＰの形質導入効率を促進することを実証し、更に硝子体への投与後、２つ種の網膜へのＡＡＶ−ベクターコンストラクトの浸透及び発現を増強するＥＣＶＭ技術の有用性を実証する。
【０１００】
実施例６
アカゲザル網膜におけるベクター形質導入の経眼微小電流増強の評価
マウス（実施例１〜４、上記）及びウサギ（実施例５）で実証されているように、硝子体内ＡＡＶベクター投与後の内境界膜（ＩＬＭ）を横切るＡＡＶ媒介ベクターの浸透に対する電流ベクター移動（ＥＣＶＭ）の効果をアカゲザルモデルまで広げた。
【０１０１】
アカゲザルは、両眼にＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（１×１０１２ｖｇ／用量）の硝子体内注射を受けた。片方の眼は、ベクターの硝子体内注射後に適用されるＥＣＶＭ（８５０μＡ／２０分）を受けた。ｉｎ  ｖｉｖｏ眼底蛍光画像（図７）は、注入されＥＣＶＭ処理された眼（ＥＣＶＭ）が、もう片方の対照眼と比較して、中心窩の周囲及び内部（矢印）でより強いＧＦＰシグナルを有していたことを示す。これらのデータは、ＥＣＶＭが硝子体内ベクター送達後に非ヒト霊長類（アカゲザル）網膜においてＡＡＶベクターの形質導入効率を高めることを実証している。
【０１０２】
実施例７
ウサギの網膜表面を覆っている深部硝子体への適用（傍網膜送達）後のＡＡＶ８ベクターの硝子体分布の評価
硝子体は非常に粘性が高く、硝子体全体への遺伝子治療ベクターの急速な拡散及び分布を妨げる。そのため、硝子体内注射後にベクターが網膜の表面に到達するためには、ベクターを網膜に近接して留置する必要がある。これらの研究を、ウサギの眼の網膜表面を覆う深部硝子体内の注射から１時間後及び２０時間後の硝子体後部対前部におけるＡＡＶ８ベクターの分配及び分布を評価するために行った。
【０１０３】
この実験では、４匹のニュージーランドホワイトウサギを使用した。ウサギをケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）で鎮静し、瞳孔をフェニレフリン１０％及びトロピカミド１％で散大させた。局所麻酔のためプロパラカイン０．５％及びポビドンヨード５％で注射部位を処理した。１．５×１０１１ｖｇ／眼の用量のＡＡＶ８−ＣＭＶ  ２５μｌを色素（１／１００）と混合し、角膜輪部から２．５ｍｍに挿入された２８ゲージ、長さ０．５インチの針を使用して上側頭四分円（superotemporal quadrant）に投与した。毛様体扁平部を通して挿入すると、この針は視神経の表面近くまで伸びる。注射を、手術顕微鏡（Ａｌｃｏｎ  ＮＧＥＮＵＩＴＹ可視化システムを搭載したＺｅｉｓｓ  Ｌｕｍｅｒａ顕微鏡）を使用して直接可視化のもとで針を挿入することによって行った。後部注射の場合、針先を視神経円板の真上にベベルダウン（bevel down）で配置し、後極に溜まるのを見ながら、ベクター溶液をゆっくりと注入した。前部注射の場合、針先をベベルアップ（bevel up）で眼壁の内側およそ２ｍｍに挿入し、外傷を避けるために水晶体から離れた角度でベクター溶液をゆっくりと注入した。注射後、潤滑軟膏（鉱油１５％、白色ワセリン８３％、ラノリン２％）を各眼に塗布した。麻酔から回復している間、ウサギ＃１及びウサギ＃３は右側に置き、ウサギ＃２及びウサギ＃４は左側に置いた。ウサギ＃１及びウサギ＃２を１時間で安楽死させ、眼を摘出し、液体窒素（−１８６℃）で急速凍結し、更に処理するまで−８０℃に保った。ウサギ＃３及びウサギ＃４を２０時間ケージに戻し、安楽死させて眼球摘出術が行われるまで動き回れるようにした。
【０１０４】
凍結した硝子体を無傷で取り出した。次いで、硝子体を冷たい外科用メスで半切除し、前眼部及び後眼部を別々のチューブに移し、力価を決定するためにｑＰＣＲを行うまで−８０℃の冷凍庫に保管した。前眼部及び後眼部（Segments）を解凍し、それぞれからの１０μｌの硝子体液を５０μｌの反応容量のＤＮａｓｅ  Ｉで処理し、５０μｌの２００ｍＭ  ＥＤＴＡを添加してＤＮａｓｅ  Ｉ酵素を不活性化した。１０μｌを９９０μｌのＱ−ＰＣＲ希釈バッファーに移して反応ミックスを希釈した。５μｌのＤＮａｓｅ  Ｉを添加してＱ−ＰＣＲのために消化した。プラスミドｐＶ５．２  ＣＭＶ  ＥＧＦＰをＳｍａ  Ｉで消化し、各硝子体サンプルのコピー数を計算するための標準曲線を作成するのに使用した。
【０１０５】
分析を単純化するため、本発明者らは、注射部位（後部又は前部）に対応する位置を参照して、ベクター濃度比を計算した。投与後１時間で、ベクターが網膜の近くに送達されたとき、ウイルスコピー数は、両眼の前眼部よりも後部硝子体で実質的に高かった（前眼部よりも１３倍〜３４倍高かった）。前部硝子体への注射の１時間後、サンプルは後部硝子体サンプルに対して前部硝子体サンプルで３４倍高い濃度を有していた。しかしながら、片方の目では逆が見られた。したがって、４個の眼のうち３個では、ベクターは投与後最初の１時間に限定的な混合を示した。
【０１０６】
下記表は、この研究のデータ結果を示す。
【０１０７】
【表１】
2021530239.tif 000003
【０１０８】
投与後２０時間までに、ベクターは後眼部と前眼部と間でより分布し、硝子体全体の分散と一致していた。４個の眼のうち３個では、ベクターは２０時間前に注入された場所でわずかに高い濃度（１．１、１．２、１．８）を保持していた。４個の眼のうちの１個は、１時間と比較して混合を示したが、濃度は反対方向で５倍高く、すなわち、前部硝子体に注入したにもかかわらず、後部硝子体でより高かった。注射を受けた後のウサギのポジショニングは、ウイルスの分布に影響を与えないようであった。
【０１０９】
これらのデータは、硝子体内注射のために網膜近くの後部硝子体に針先を配置すると、適用の１時間後にサンプリングされたときに網膜表面に高濃度のベクターが生じることを実証している。濃度差は注射後２０時間までに減少する。硝子体の深部に適用することの利点は、網膜細胞によるその後の取り込み及びより大きな遺伝子発現と共に、網膜への進入を改善し、より高濃度のベクターを得ることである。これは、次に、より高い形質導入効率及び治療効果につながる。
【０１１０】
実施例８
ニュージーランドのウサギの眼への傍網膜送達の効果
この研究は、ＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＥＧＦＰベクターを用いた傍網膜遺伝子送達が、前眼部と比較してウサギ眼の後眼部においてより高い局所濃度のベクターを提供するかどうかを更に評定するために行われた。
【０１１１】
この実験では、ニュージーランドホワイトウサギに、傍網膜位置でＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＥＧＦＰベクターを投与した（すなわち、実施例６で詳述した通り、網膜表面に近接する硝子体内注射）。実施例７に記載されているように、ウサギを鎮静した。１．５×１０１１ｖｇ／眼の用量のＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（３０μｌ）を色素（１／１００）と混合し、角膜輪部から２．５ｍｍに挿入された２８ゲージ、長さ０．５インチの針を使用して上側頭四分円に投与した。毛様体扁平部を通して針を挿入すると、網膜及び視神経の表面近くまで伸びる。注射を、手術顕微鏡（Ａｌｃｏｎ  ＮＧＥＮＵＩＴＹ可視化システムを搭載したＺｅｉｓｓ  Ｌｕｍｅｒａ顕微鏡）を使用して直接可視化のもとで針を挿入することによって行った。目視観察により、「良好な」注入と「失敗した」注入とを即座に識別することができた。この判断は、注入時に直ちに、並びに眼球摘出及びその後の任意の定量の前に行われた。可視化の時点で、３匹のウサギの５個の眼は許容可能（「良好」）と見なされた（１匹のウサギの１個の眼は、注入が不完全だったため、この研究では検討されなかった）。ウサギの眼の網膜後部と水晶体との間の６ｍｍの距離は、傍網膜注射を上手く行うのが難しい標的である。傍網膜注射の場合、針先を視神経円板の真上にベベルダウンで配置し、後極に溜まるのを見ながら、ベクター溶液をゆっくりと注入した。注入後、快適さという点で潤滑軟膏（鉱油１５％、白色ワセリン８３％、ラノリン２％）を各眼に塗布した。
【０１１２】
ベクター適用の１時間後に眼球摘出を行った。各ウサギを麻酔薬の過剰摂取により安楽死させ、標準的な眼球摘出法により眼球を取り出した。簡単に説明すると、はさみによって眼球を結膜、第三眼瞼及び外眼筋から分離した後、眼球を摘出した。目を液体窒素に浸漬し、ドライアイスを入れた箱に移した。
【０１１３】
続いて、凍結した硝子体を外眼組織から無傷で取り出した。次いで、硝子体を半切除し、別々のチューブに移して、力価を決定するためにｑＰＣＲを行うまで−８０℃の冷凍庫に保管した（実施例７に記載される通り）。前眼部及び後眼部を解凍し、それぞれからの１０μｌの硝子体液を５０μｌの反応容量のＤＮａｓｅ  Ｉで処理し、５０μｌの２００ｍＭ  ＥＤＴＡを添加してＤＮａｓｅ  Ｉ酵素を不活性化した。１０μｌを９９０μｌのＱ−ＰＣＲ希釈バッファーに移して反応ミックスを希釈した。総反応量２５μｌで、希釈したサンプル５マイクロリットルをＱ−ＰＣＲに使用した。プラスミドｐＶ５．２  ＣＭＶ  ＥＧＦＰをＳｍａ  Ｉで消化し、各硝子体サンプルのコピー数を計算するための標準曲線を作成するのに使用した。
【０１１４】
この研究（ｎ＝５のウサギの眼）に基づくと、５個の眼のうち４個は、水晶体に隣接する前部硝子体よりも網膜に隣接する硝子体の後部でより高いベクターゲノムを有していた。後眼部／前眼部（Ｐ／Ａ）比を各眼について計算すると、全ての眼の平均Ｐ／Ａ比が７．４３と算出された。５個の眼の後眼部及び前眼部の平均ベクター力価濃度を比較すると、本発明者らは、傍網膜にベクターを留置した後、注入から１時間後のウサギの眼の後眼部のＡＡＶベクターゲノムのレベルが前眼部よりも３倍高いことを見出した（図８）。
【０１１５】
これらの結果は、高分子ＡＡＶベクター傍網膜（すなわち、硝子体の後部及び網膜表面に近接して）投与すると、注入後少なくとも最初の１時間はベクター量が増加することを示している。網膜から離れたところにあるベクター粒子は、取り込みのために網膜へと容易に移動せず、これらのベクターゲノムは抗体及び他の免疫機構による破壊に対して脆弱であるため、この期間は網膜がベクターを取り込むのに重要である。これらの知見は、実施例７の結果を更に実証し、傍網膜送達が、標的網膜細胞に隣接するウイルスゲノムのより高い局所濃度を提供し、眼において粘度が高い硝子体を迂回することを実証しており、網膜細胞に接して並置されたこのより高いベクター力価により、形質導入が改善され、網膜細胞へのベクターの浸透が大きくなって、所与の用量でより大きな利益又は有効性につながる。
【０１１６】
実施例９
非ヒト霊長類における眼への傍網膜送達及び中部硝子体送達の比較
非ヒト霊長類における発現ベクターの網膜送達の改善可能性を評価するため、眼ごとのベクターゲノムが３×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）の同じ用量のｍｙｃでタグ付けされているヒトレチノスキシン遺伝子（ＲＳ１）を持つＡＡＶ８ベクター（ｓｃＡＡＶ８−ＨＲＳＰ／ＩＲＢＰ−ｈＲＳ／ｍｙｃ）を２匹のサルに注入した。１匹目のサルはウイルスベクターで右（ＯＤ）と左（ＯＳ）の両方の眼に傍網膜送達を受けた。２匹目のサルは、右（ＯＤ）眼へのウイルスベクターによる典型的な中部硝子体注射を受け、反対側の眼すなわち左（ＯＳ）眼にはビヒクル（陰性対照）の中部硝子体送達を受けた。注射の９．５週間後にウイルスのｍｙｃタグ付きヒトレチノスキシン（ｈＲＳ１）の発現を評価するためにサルの眼を摘出した。
【０１１７】
図９Ａは、注射された眼の中心窩領域（全ての錐体光受容体）におけるＲＳ１及びｍｙｃタグ抗体の対比染色の結果を示す。抗ＲＳ１抗体は、内因性のサルレチノスキシンタンパク質とウイルスｍｙｃタグ付きヒトＲＳ１の両方を染色する。抗ｍｙｃタグ抗体はウイルスヒトＲＳ１−ｍｙｃタグ融合タンパク質のみを染色する。図９Ａは、眼ごとに１回の傍網膜注射を受けたサル１の両眼における免疫蛍光パターンの分布を示している。図９Ａの上部パネルは、右眼（ＯＤ）の網膜画像を示し、下部パネルは、左眼（ＯＳ）の網膜画像を示す。パネルＡ及びパネルＤは、ＲＳ１抗体染色の画像を示す。錐体光受容体（ＯＮＬ）の内節（ＩＳ）内に強い染色があり、光受容体細胞及び外網状層（ＯＰＬ）（網膜の神経シナプスの層）にも染色がある。パネルＢ及びパネルＥは、ｍｙｃタグ抗体染色の画像を示す。ｍｙｃタグ抗体はＩＳを染色し、光受容体細胞は注射された両眼で検出され、注射された右眼のＯＰＬに強い染色があった。パネルＣ及びパネルＦは、抗ＲＳ１及び抗ｍｙｃ抗体の複合染色を示す。
【０１１８】
図９Ｂは、ＡＡＶ８ベクター（ｓｃＡＡＶ８−ＨＲＳＰ／ＩＲＢＰ−ｈＲＳ／ｍｙｃ）又はビヒクルのいずれかの標準的な中部硝子体の硝子体内送達を受けているサルの眼における免疫蛍光アッセイの結果を示す。図９Ｂの上部パネルは、眼へのＡＡＶベクターの中部硝子体注射を受けた右眼（ＯＤ）の画像を示し、下部パネルは、ビヒクルの中部硝子体注射を受けた左眼（ＯＳ）の画像を示す。パネルＡ及びパネルＤは、１匹目のサルで観察されたように、右眼と左眼の両方のＩＳ、ＯＮＬ、及びＯＰＬにおける内因性サルＲＳ１染色を示す。サル１の知見とは対照的に、ベクターの中部硝子体送達によれば、抗ｍｙｃタグ抗体を用いた緑色蛍光染色がわずかであり（図９Ｂ、パネルＢ）、眼の中部硝子体部分に導入された場合、ウイルスベクターは、ｓｃＡＡＶ８−ＨＲＳＰ／ＩＲＢＰ−ｈＲＳ／ｍｙｃベクターによる形質導入が不十分であり、その結果、ｍｙｃタグ付きヒトＲＳ１の低発現をもたらすことを示している。ビヒクルで注射したサルの眼には、ｍｙｃタグの染色は見られない（図９Ｂ、パネルＥ）。パネルＣ及びパネルＥは、抗ＲＳ１及び抗ｍｙｃタグ染色のオーバーレイである。
【０１１９】
これらのデータは、ヒトＲＳ１  ｃＤＮＡを含み、ｍｙｃでタグ付けされたＡＡＶベクターの傍網膜送達が、同じ用量の同じベクターの通常の中部硝子体送達と比較して、網膜の深部層内でのヒトＲＳ１−ｍｙｃタグ融合タンパク質の発現を改善したことを実証する。さらに、ヒトＲＳ１−ｍｙｃタグ発現ｓｃＡＡＶ８−ＨＲＳＰ／ＩＲＢＰ−ｈＲＳ／ｍｙｃは、目的の標的領域である網膜の中心窩領域の光受容体の内節、光受容体層、及び外網状層に見られた。
【０１２０】
上記の様々な特徴及びプロセスを、互いに独立して使用してもよく、又は様々な方法で組み合わせてもよい。遺伝子治療ベクター、注射用量、電流、印加時間、及び眼疾患状態の全ての可能な組合せ及びサブコンビネーションは、本開示の範囲内に含まれることが意図されている。加えて、或る特定の方法又はプロセスのブロックは、一部の実施態様では省略されてもよい。また、本明細書に記載される方法及びプロセスは、いかなる特定の順序にも限定されず、それに関連するブロック又は状態は、適切な他の順序で行うこともできる。例えば、処理工程の方法は、具体的に開示された順以外の順で行われてもよく、又は複数の工程が単一の工程に組み合わされてもよい。処理工程の方法は、連続して、並行して、又は他の何らかの方法で行われ得る。工程又は手順は、開示される例示的な実施形態に追加されてもよく、又はそれから削除されてもよい。本明細書に記載される例示的なシステム及び構成要素は、記載されるものとは異なって構成されてもよい。例えば、要素は、例示的な実施形態で開示される方法及び／又は電気装置と比較して、追加され、削除され、又は再配置されてもよい。
【０１２１】
特に、「できる」、「できた」、「してもよい」、「し得る」、「例えば」等のような、本明細書において用いられる条件語句は、特に別様に記載のない限り、又は用いられる文脈内で別様に理解されない限り、一般に、或る特定の実施形態が、他の実施形態は含まないが、或る特定の特徴、要素、及び／又は工程を含むことを伝えることを意図される。したがって、そのような条件語句は一般に、特徴、要素、及び／又は工程が、１つ以上の実施形態で任意の方法で必要とされること、又は、１つ以上の実施形態が、作者の入力若しくはプロンプトあり若しくはなしで、これらの特徴、要素、及び／又は工程が含まれるか否か、若しくは任意の特定の実施形態で実行すべきか否かを決定する論理を必然的に含むことを暗に示すことを意図されない。「含む（comprising）」、「含む（including）」、「有する（having）」等の用語は同義であり、オープンエンドの様式において包括的に使用され、追加の要素、特徴、作用、操作等は除外されない。また、「又は」という用語をその包括的な文において使用し（その排他的な意味において使用せず）、そうして例えば一覧の要素をつなげて使用するとき、「又は」という用語は、一覧の要素の１つ、幾つか、又は全てを意味する。
【０１２２】
眼の遺伝子治療処置の或る特定の例示的な実施形態がマウス、ウサギ、及び非ヒト霊長類に関して記載されているが、これらの実施形態は、例として提示されているにすぎず、本明細書に開示される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。したがって、前述の記載のいずれも、任意の特定の特徴、特性、工程、又は装置が必要又は不可欠であることを意味することを意図するものではない。実際、本明細書に記載される新規な方法及びシステムは、他の様々な形態で具体化され得て、更に、本明細書に開示される本発明の趣旨から逸脱することなく、本明細書に記載される治療方法及び投与システムの形態における様々な省略、置換、及び変更を行うことができる。添付の特許請求の範囲は、本明細書に開示される或る特定の本発明の範囲及び趣旨に含まれ得るような形態又は修正を網羅することを意図している。
【図１Ａ】
2021530239.tif 000004
【図１Ｂ】
2021530239.tif 000005
【図１Ｃ】
2021530239.tif 000006
【図２Ａ】
2021530239.tif 000007
【図２Ｂ】
2021530239.tif 000008
【図２Ｃ】
2021530239.tif 000009
【図２Ｄ】
2021530239.tif 000010
【図３Ａ】
2021530239.tif 000011
【図３Ｂ】
2021530239.tif 000012
【図３Ｃ】
2021530239.tif 000013
【図３Ｄ】
2021530239.tif 000014
【図３Ｅ】
2021530239.tif 000015
【図４Ａ】
2021530239.tif 000016
【図４Ｂ】
2021530239.tif 000017
【図４Ｃ】
2021530239.tif 000018
【図４Ｄ】
2021530239.tif 000019
【図４Ｅ】
2021530239.tif 000020
【図４Ｆ】
2021530239.tif 000021
【図４Ｇ】
2021530239.tif 000022
【図４Ｈ】
2021530239.tif 000023
【図５Ａ】
2021530239.tif 000024
【図５Ｂ】
2021530239.tif 000025
【図６Ａ】
2021530239.tif 000026
【図６Ｂ】
2021530239.tif 000027
【図６Ｃ】
2021530239.tif 000028
【図７】
2021530239.tif 000029
【図８】
2021530239.tif 000030
【図９Ａ】
2021530239.tif 000031
【図９Ｂ】
2021530239.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月24日(2021.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において眼の状態を眼内送達により治療する方法に使用するための、治療用タンパク質をコードする発現ベクターであって、前記送達が、眼に電流を印加することを含む、発現ベクター。
【請求項２】
前記眼の状態が、シュタルガルト病、Ｘ連鎖性網膜分離症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、網膜剥離（疾患、傷害、又は自然剥離による）、嚢胞、嚢胞様黄斑浮腫、網膜色素変性症、老人性スキーシス、フックス角膜ジストロフィー及び他の角膜ジストロフィー、緑内障、並びに白内障からなる群から選択される、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記眼内送達が、前記発現ベクターを、眼の後部硝子体腔内の網膜の表面から０ｍｍ〜１３ｍｍ、任意に、眼の後部硝子体腔内の網膜の表面から０ｍｍ〜３ｍｍに傍網膜注射することを含む、請求項１又は２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
（ａ）前記眼に印加される電流が、約１．０マイクロアンペア（μＡ）〜約１５ミリアンペア（ｍＡ）である、及び／又は
（ｂ）前記電流が、約１ミリ秒（ｍｓ）〜約２４時間の期間、眼に印加される、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記眼に印加される電流が、
（ａ）固定電流として印加される、又は
（ｂ）可変電流、パルス電流、及び二相性電流から選択される電流として印加される、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記電流が、
（ａ）前記発現ベクターの注入と同時に、
（ｂ）前記発現ベクターの注入前６０秒から注入後６０秒までの期間に、
（ｃ）前記発現ベクターの注入前に、又は
（ｄ）前記発現ベクターの注入後に、
眼に印加される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記被験体を少なくとも第１及び第２の電極と接触させることによって、前記電流が眼に印加され、
（ａ）前記第１の電極は、前記被験体の眼の角膜と接触して設置され、前記第２の電極は、前記被験体の身体の一部と接触して設置される、
（ｂ）前記第１の電極は、前記被験体の眼の角膜と接触して設置され、前記第２の電極は、前記被験体の眼の別の部分と接触して設置される（ここで、任意に、
（ｉ）前記第２の電極は、前記被験体の角膜の外側の眼の一部と接触して設置される、及び／又は
（ｉｉ）前記第１の電極は、眼の内側の眼の一部又は硝子体と接触して設置される）、或いは
（ｃ）前記第１及び第２の両方の電極が前記被験体の眼と接触して設置され、且ついずれの電極も前記被験体の眼の角膜と接触して設置されていない、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項８】
（ａ）角膜に正の電圧を印加することによって、眼の前眼部に送達され、眼の水晶体、虹彩、毛様体、及び角膜の少なくとも１つに入ることが可能になる、又は
（ｂ）角膜に負の電圧を印加することによって、眼の後眼部に送達され、それによって網膜に入ることが可能になる、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項９】
光受容体、並びに網膜色素上皮（ＲＰＥ）、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、水平細胞、双極細胞、神経線維層構造物、及び無軸索細胞からなる群から選択される眼の細胞において発現される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、そのゲノムに対して異種の核酸分子を含む組換えウイルス、複製欠損ウイルス、被験体の細胞の核内で複製するウイルス、非分裂細胞又は分裂細胞に感染するウイルス、及び眼の組織に指向性を示すウイルスに由来する１つ以上の核酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
（ａ）ＤＮＡプラスミド又は（ｂ）ウイルスゲノムである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
プラスミド由来の核酸配列及びウイルスゲノム由来の核酸配列を含み、核酸分子の送達及びコードされた治療用分子の高レベルの発現を可能にする、直鎖又は環状のＤＮＡ分子である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
ＡＡＶ発現ベクターである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
（ａ）レチノスキシン遺伝子をコードする核酸配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む（ここで、任意に、
（ｉ）前記レチノスキシン遺伝子をコードする核酸配列が、レチノスキシン遺伝子の第１のイントロンの少なくとも３００塩基対の部分を含む、もしくは
（ｉｉ）前記プロモーターが、眼特異的プロモーターであり、任意に、ＣＭＶプロモーター、レチノスキシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、ＣＲＸプロモーター、及び細胞における発現を制御する任意の他のプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む）、及び／又は
（ｂ）光受容体、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、双極細胞、ミュラー細胞、及び網膜神経節細胞からなる群から選択される眼の細胞において発現される、及び／又は
（ｃ）プロモーターの活性を増強するエンハンサー配列を含み、任意に、前記エンハンサー配列が、光受容体間レチノイド結合タンパク質エンハンサー配列である（ここで、任意に、光受容体間レチノイド結合遺伝子エンハンサーエレメントが、レチノスキシン遺伝子プロモーター内のＡｌｕリピート配列を置換する）、及び／又は
（ｄ）アデノ随伴ウイルス逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接し、任意に、前記ＩＴＲの少なくとも１つが、ｒｅｐニッキング部位又はＤ領域内で修飾されている（ここで、任意に、
（ｉ）発現カセットの５’側のＩＴＲが、野生型ＩＴＲ配列のパリンドロームのＡ領域におけるＩＴＲ配列の１５塩基対の欠失を含み、任意に、前記５’ＩＴＲが、野生型ＩＴＲ配列中の前記ｒｅｐニッキング部位を含む前記Ｄ領域の除去によって更に修飾されている、もしくは
（ｉｉ）発現カセットの３’側のＩＴＲが完全長の野生型ＩＴＲ配列である）、及び／又は
（ｅ）自己相補的アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、及び／又は
（ｆ）ヒトβ−グロビン３’非翻訳領域及びポリアデニル化部位を含む、
請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
ナノ粒子に会合しており、任意に、前記ナノ粒子が標的化された又は放射性標識されたナノ粒子である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の発現ベクター。 
【国際調査報告】
2021530239.tif 000033
2021530239.tif 000034
2021530239.tif 000035