(57)【要約】【課題】ＴＤＰ−４３プロテオパチー、ＳＭＡ、アミロイド陽性癌、正常および早期老化などのコンフォメーション病を治療および予防するための医薬組成物および方法、並びにコンフォメーション病を治療するための治療候補をスクリーニングするためのインビトロスクリーニング方法を提供する。【解決手段】コンフォメーション病を治療するための治療候補をスクリーニングするための方法は、凝集しやすいタンパク質のプリオン様折り畳みの発現レベル、またはＰ５３凝集体の発現レベルを測定することである。
2021529790.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体におけるコンフォメーション病を予防または治療するための方法であって、
それを必要とする被験体に、凝集しやすいタンパク質のプリオン様折り畳みの発現レベルを増加させる、またはプリオン様ＬＣタンパク質の分解断片や誤って折り畳まれた凝集体を減少させるための有効量の治療薬を投与することを含み、それによってコンフォメーション病の症状または徴候を軽減させることを特徴とする、コンフォメーション病を予防または治療するための方法。
【請求項２】
前記治療薬はフラボノイドであり、治療されるコンフォメーション病は、ＴＤＰ−４３プロテオパチー、海馬硬化症（ＨＳ）、ユビキチン陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ−Ｕ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、混合神経病理学、ダウン症、緑内障または脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療薬はフラボノイドであり、予防されるコンフォメーション病はアルツハイマー病または老化であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記フラボノイドは、バイカレインまたはその誘導体であることを特徴とする、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記治療薬は、ＨＳＰ２７に対するｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＨＳＰ２７に対する前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８と少なくとも９０〜１００％同一であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記治療薬は、二次凝集しやすいタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記二次凝集しやすいタンパク質は、ＴＤＰ−４３であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記治療薬は、プリオン様ＬＣドメインを発現するプラスミドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療薬は、熱ショックタンパク質モジュレーターであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記熱ショックタンパク質モジュレーターは、１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）またはアリモクロモールであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記治療薬は、熱ショックタンパク質モジュレーターとフラボノイドの組み合わせであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分解断片は、約２０〜約２０ｋＤａのＴＤＰ−４３凝集体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記凝集しやすいタンパク質のプリオン様折り畳みは、クロスβポリマーであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記コンフォメーション病は、アミロイド陽性癌、老化、分解性コンフォメーション病、アミロイド凝集コンフォメーション病および非アミロイド凝集コンフォメーション病であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）熱ショックタンパク質モジュレーター；及び
（ｂ）フラボノイド；
を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１７】
前記熱ショックタンパク質モジュレーターは、１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）またはアリモクロモールであることを特徴とする、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記フラボノイドは、バイカレインまたはその誘導体であることを特徴とする、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
凝集コンフォメーション病を治療するための治療候補を同定するためのインビトロ方法であって、
（ａ）前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させる前に、その１つまたは複数の試験細胞におけるＰ５３凝集体の発現レベルを決定するステップ；及び
（ｂ）前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させた後、ステップ（ａ）におけるＰ５３凝集体の発現レベルを決定するステップ；
を含み、
前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させる前のＰ５３凝集体の発現レベルと比較して、前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させた後のＰ５３凝集体の発現レベルの減少は、前記治療候補がコンフォメーション病の治療に有効であることを示すことを特徴とする、凝集コンフォメーション病を治療するための治療候補を同定するためのインビトロ方法。
【請求項２０】
前記Ｐ５３凝集体のサイズは、約０．１〜約１００ｕｍであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
コンフォメーション病を治療するための治療候補を同定するためのインビトロ方法であって、
（ａ）前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させる前に、その１つまたは複数の試験細胞から選択されたコンフォメーション病に特異的なポリマーの発現レベルを決定するステップ；及び
（ｂ）前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させた後、ステップ（ａ）における前記ポリマーの発現レベルを決定するステップ；
を含み、
前記ポリマーは、実質的にＴＤＰ−４３、Ｈｔｔ、ラミンＢ１、ＦＵＳ、ＴＩＡ−１、Ｔａｕ、ＳＭＮ、ｐ５３、Ｒｂ、ＰＦＮ１およびＳＭＮ、からなる群から選択され、
前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させる前の前記ポリマーの発現レベルと比較して、前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させた後の前記ポリマーの発現レベルの増加は、前記治療候補がコンフォメーション病の治療に有効であることを示すことを特徴とする、コンフォメーション病を治療するための治療候補を同定するためのインビトロ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月２８日出願の米国特許出願第６２／６９１，１４２号の優先権を主張するものであり、その全内容を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、生物学的多価形態を安定化させること、タンパク質分解または誤って折りたたまれた凝集体を減少させること、またはプリオン様ＬＣタンパク質のプリオン様コンフォーマーを増加させることによって、プロテオパチー、神経変性疾患、アミロイド陽性癌、正常な老化および早期老化、非アミロイド形成性およびアミロイド形成性疾患などのコンフォメーション性疾患の治療および予防のための医薬組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
立体配座障害（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）は、さまざまなヒトの病気、特に神経変性疾患を引き起こす。
【０００４】
加齢性認知症および神経変性疾患、例えば、辺縁優勢の加齢性ＴＤＰ−４３脳症（ＬＡＴＥ）、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ユビキチン陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ−Ｕ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）と脳損傷は、世界中で主要な公衆衛生問題を引き起こす慢性疾患である。神経変性疾患は、患者自身だけでなく、その家族や友人にも深刻な影響を及ぼす。
【０００５】
誤って折りたたまれたタンパク質凝集体は神経変性の主な原因であり、複数の神経変性プロテオパチーの同時発生が認知症の患者で頻繁に観察される。その誤って折りたたまれた疾患タンパク質の生物活性を直接回復するための混合神経病理学的な治療法は、まだ利用できるほどのものではない。
【０００６】
本質的に無秩序なタンパク質のサブタイプは、酵母プリオンの形成を引き起こすものと同様の低複雑性（ＬＣ）領域を含み、最近、発明者や他の研究者によって特定された。酵母プリオンとのタンパク質配列類似性に基づくコンピューターアルゴリズムは、２５０を超えるヒトタンパク質が、神経変性疾患に関連するいくつかのＲＮＡ結合タンパク質、すなわちＴＤＰ−４３（配列番号１）、Ｈｔｔ（配列番号２）、ＰＦＮ１（配列番号３）、ＦＵＳ（配列番号４）、およびＴＩＡ１（配列番号５）を含む独特のプリオン様セグメントを有すると予測した。これらのドメインは通常、非荷電アミノ酸（Ｑ、Ｎ、Ｙ、Ｓ、およびＧ）が豊富で、柔軟な構造を持ち、クロスβポリマーを形成できる。このプリオン様ドメインは、一時的なホモおよびヘテロクロスβ重合（プリオン様相互作用）を通じて、膜のない顆粒の組織化、選択的スプライシング、ヘテロクロマチン形成など、通常の生物学におけるさまざまな役割を果たすことが観察された。
【０００７】
ＰＬＤの構造的可塑性により、コンフォメーションの変換および過渡、環境刺激後のプリオン様クロスβ重合による液体のような相分離コンパートメント、つまり膜のないオルガネラへの一時的で可逆的な凝集が可能になる。プリオン様タンパク質が自己重合し、他の成分と複数の相互作用を受ける能力は、分子足場としての機能を示している。
【０００８】
ユビキチン化され、リン酸化されたＴＤＰ−４３Ｃ末端型の有毒な封入体は、最初にＦＴＬＤ−ＵおよびＡＬＳの患者の脳で発見された。ＴＤＰ−４３の病状は、ＴＤＰ−４３の異常な蛍光体エピトープに特異的な抗体を使用して、海馬硬化症（ＨＳ）症例の９０％およびアルツハイマー病（ＡＤ）症例の約３０％でも検出された。最新の研究では、８０歳以降に一般的なＴＤＰ−４３プロテオパチーが発生することが示唆されている。
【０００９】
また、ＡＬＳの原因となる約５０の突然変異がＣ末端に見出されたことは、このタンパク質の直接的な疾患の原因となる役割をさらに支持した。
【００１０】
一実施例では、各訓練画像の前記診断データが含まれた一部を識別し；及び前記訓練データ及び識別された前記一部を使用して前記モデルを発展させることをさらに含む。
【００１１】
ＴＤＰ−４３は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方に結合し、ポリメラーゼＩＩ依存性転写、プレｍＲＮＡスプライシング、マイクロＲＮＡ生合成およびタンパク質翻訳を含む生物学的プロセスの多くの側面を調節する、普遍的に発現される核タンパク質である。ＴＤＰ−４３のさまざまな機能は、神経突起伸長、軸索輸送、細胞周期、アポトーシスに関与している。
【００１２】
ＴＤＰ−４３タンパク質の大部分は細胞核に現れ、細胞核とサイトゾルの間を往復してＲＮＡを輸送する。プリオン様ＲＮＡ結合タンパク質と構造および機能的に類似しているＴＤＰ−４３は、Ｃ末端に２つのＲＮＡ結合ドメインとプリオン様低複雑性ドメイン（ＬＣドメイン）を含み、自己分子内または自己分子間の相互作用を介してクロスβポリマーに組み立てることができる。
【００１３】
ＰＬＤの自己会合は、ＴＤＰ−４３核体の形成、ＣＦＴＲの選択的スプライシング、およびＴＤＰ−４３のタンパク質安定性に必要である。機能不全の自己相互作用は、ＴＤＰ−４３の分解と誤った折り畳みにつながり、ＴＤＰ−４３プロテオパチーの潜在的な病因となる。
【００１４】
誤って折りたたまれたタンパク質凝集体の毒性が効果的に減少すると、マウスモデルの病理学的衰退が遅くなることが示されているため、現在、誤って折りたたまれた疾患タンパク質に関するほとんどの臨床試験研究は、タンパク質分解システムの活性化、免疫療法、または疾患タンパク質合成の阻害を介してアミロイド沈着の負担を取り除くことを目的としている。ただし、誤って折りたたまれたタンパク質凝集体を除去することに加えて、ＴＤＰ−４３の病状の場合、ＴＤＰ−４３の細胞機能の喪失は細胞周期の異常に繋がり、ハエ、魚、げっ歯類の神経変性を引き起こすので、ＴＤＰ−４３の生理学的機能を取り戻すことは治療効率の重要な決定要因である。特に、欠陥のあるＴＤＰ−４３は、プレｍＲＮＡの選択的スプライシングを阻害し、転移因子の誤調節を誘発することが、ＴＤＰ−４３の病状の患者で観察される。
【００１５】
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は常染色体劣性神経筋障害であり、毎年世界中で生まれる乳児１０００人に約１人が罹患している。ＳＭＮタンパク質の欠損は、脊髄の前角の運動ニューロンの段階的な喪失と、それに続く骨格筋のシステム全体の萎縮をもたらす。ＳＭＡの原因となる遺伝子である生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）（配列番号７）がすでに同定されている。
【００１６】
遺伝子のほぼ同一のコピーであるＳＭＮ２は、通常、ＳＭＡのすべての患者で発現する。ＳＭＮ１と同一の完全長タンパク質が少量生成されるが、すべての個体でＳＭＮ２のエクソン７にＣからＴへの遷移を有するエクソンスプライシングサイレンサーはエクソン７をスキップしている。ＳＭＮ２のコピー数の増加はＳＭＡの重症度を調節するが、ＳＭＮ１の喪失を完全には補償することはない。
【００１７】
タンパク質産物ＳＭＮΔ７は不安定で急速に分解するようであり、その生物学的機能はまだ明かされていない。ＳＭＮ１は２０年前にＳＭＡの原因となる変異遺伝子として同定されたが、エクソン７の欠失による細胞機能の変化と、ＳＭＡ関連の変異が疾患を引き起こす分子メカニズムは未知のままである。
【００１８】
ｐ５３（配列番号８）およびＲＢ１（配列番号９）を含む腫瘍抑制遺伝子は、通常、細胞増殖を阻害し、ゲノムの完全性を維持するように作用する。腫瘍抑制遺伝子の変異は癌を引き起こす。それらは、癌へ進むことから細胞を保護する。
【００１９】
ｐ５３凝集体は、チオフラビンＴへの結合によりアミロイド構造にβシートレジストリを持つアルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病で同定されたものと同様のアミロイドオリゴマーと原繊維を形成することが実験的に示されている。
【００２０】
誤って折りたたまれたｐ５３凝集体は一般、悪性腫瘍、特に化学療法で治療された腫瘍またはｐ５３変異を有する高転移性癌で観察される。ｐ５３に関連する癌の変異の３０〜４０％がタンパク質の構造に影響を及ぼし、その結果、凝集する傾向が高まる。現在知られているｐ５３凝集を有する癌の種類には、乳癌、結腸癌、皮膚癌、卵巣癌、および前立腺癌が含まれる。
【００２１】
ｐ５３タンパク質はホモ四量体腫瘍抑制因子であり、大多数のヒト腫瘍において突然変異、欠失、または誤った折り畳みによって頻繁に不活性化される。ｐ５３タンパク質は、ＤＮＡ修復、細胞周期制御、アポトーシス、老化など、多くの細胞プロセスの調節に重要な役割を果たしている。
【００２２】
誤って折りたたまれたｐ５３凝集体と癌の浸潤および化学療法抵抗性の間には、強い臨床的相関関係がある。
【００２３】
過去５０年間にコンフォメーション病の診断と治療が進歩しているが、医学界は依然として多くの種類のコンフォメーション病を治療するという課題に直面している。したがって、コンフォメーション病のより効果的な治療が依然として必要とされる。本発明は、この需要および他の需要に応じるものである。
【発明の概要】
【００２４】
一実施例において、本発明は一種の医薬組成物を提供する。この薬剤の組み合わせは、相乗効果によって、ＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体および／またはＴＤＰ−４３およびＳＭＮの分解されたフラグメントを減少させることができる。
【００２５】
別の実施形態において、被験体におけるコンフォメーション病を予防または治療するための方法が提供され、その方法は、それを必要とする被験体に、凝集しやすいタンパク質のプリオン様折り畳みの発現レベルを増加させる、またはプリオン様ＬＣタンパク質の分解断片や誤って折り畳まれた凝集体を減少させるための有効量の治療薬を投与することを含み、それによってコンフォメーション病の症状または徴候を軽減させる。
【００２６】
本発明はまた、コンフォメーション病を治療するための治療候補を同定するためのインビトロ方法が提供され、その方法は、（ａ）前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させる前に、その１つまたは複数の試験細胞におけるＰ５３凝集体の発現レベルを決定するステップ；及び（ｂ）前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させた後、ステップ（ａ）におけるＰ５３凝集体の発現レベルを決定するステップ；を含み、前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させる前のＰ５３凝集体の発現レベルと比較して、前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させた後のＰ５３凝集体の発現レベルの減少は、前記治療候補がコンフォメーション病の治療に有効であることを示す。
さらに提供されるのは、コンフォメーション病を治療するための治療候補を同定するためのインビトロ方法が提供され、その方法は、（ａ）前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させる前に、その１つまたは複数の試験細胞から選択されたコンフォメーション病に特異的なポリマーの発現レベルを決定するステップ；及び（ｂ）前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させた後、ステップ（ａ）における前記ポリマーの発現レベルを決定するステップ；を含み、前記ポリマーは、実質的にＴＤＰ−４３、Ｈｔｔ、ラミンＢ１、ＦＵＳ、ＴＩＡ−１、Ｔａｕ（配列番号６）、ＳＭＮ、ｐ５３、Ｒｂ（Ｒｂ１）、ＰＦＮ１およびＳＭＮ、からなる群から選択され、前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させる前の前記ポリマーの発現レベルと比較して、前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させた後の前記ポリマーの発現レベルの増加は、前記治療候補がコンフォメーション病の治療に有効であることを示す。なお、本出願で使用される「発明」、「当該発明」、「この発明」および「本発明」という用語は、本出願のすべての保護対象および下記の特許請求の範囲を広く指すことを意図している。これらの用語を含む陳述は、本文に記載されている保護対象を制限し、下記の特許請求の範囲の意味や範囲を制限するものではないことを理解すべきである。本出願の保護対象となる発明の実施形態は、この要約的説明ではなく、下記の特許請求の範囲によって定義される。この要約的説明は、本発明の様々な側面の高レベルの概要であり、以下の詳細な説明のセクションでさらに説明されるいくつかの概念を紹介するものである。この要約的説明は、主張された保護対象の重要なまたは本質的な特徴を特定することを意図しておらず、主張された保護対象の範囲を決定するために単独で使用されることも意図されていない。本出願の保護対象は、明細書全体、一部またはすべての図面、および各請求項の適切な部分を参照することによって理解されるべきである。
【００２７】
本発明は、以下の添付の図および詳細な説明とともに読むと、より明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明の例示的な実施形態は、以下の図を参照して以下に詳細に説明される。
【図１】図１は、バイカレイン（Ｂａｉｃａｌｅｉｎ）がインビトロでＴＤＰ−４３繊維をＴＤＰ−４３ポリマーに改造することを示す画像の集合である。パネル（ａ）および（ｂ）には、精製された完全長ＴＤＰ−４３組換えタンパク質（３μＭモノマーに相当）が含まれ、電子顕微鏡で検証された後に、バイカレインの非存在下（ａ）または存在下（３μＭ；ｂ）でアセンブルされたバッファーを室温で３０分、６０分、および９０分間撹拌してインキュベートする。ｂの矢印は、下部パネルのＴＤＰ−４３ポリマーの代表的な高倍率画像を示す。分岐点の１つを矢印で示す。ａのバー：１μｍ；ｂのバー：０．５μｍ。パネル（ｃ）には、ＴＤＰ−４３繊維とＴＤＰ−４３ポリマーの長さの統計分析が含まれる。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝６）として表される。パネル（ｄ）には、バイカレイン誘導ＴＤＰ−４３ポリマーの分岐点分析を示す棒グラフが含まれる。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝１０）として表される。パネル（ｅ）は、重合ＴＤＰ−４３のネガティブ染色構造の選択された２つの電子顕微鏡写真である。スケールバー：１００ｎｍ。
【図２】図２は、病理学的なＴＤＰ−４３の封入を減らし、溶解度を高めたオフアミロイド（ｏｆｆ−ａｍｙｌｏｉｄ）経路化合物を示す画像の集合である。パネル（ａ）には、ＴＤＰ−４３−ＩＩＰＬＤを含む２９３Ｔ細胞が含まれており、５０μＭのバイカレインまたはバイカレインなしで処理されている。矢印はＴＤＰ−４３−ＩＩＰＬＤ凝集体を示す。バー：１０μｍ。パネル（ｂ）には、ＴＤＰ−４３−ＩＩＰＬＤ凝集体に対するバイカレインの有効性の統計分析が示された。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として表される。＊ｔ検定によるＰ＜０．０５。パネル（ｃ）は、低用量または高用量のバイカレインでそれぞれ４８時間または９時間処理後のＴＤＰ−４３−ＩＩＰＬＤの溶解度を高めるバイカレインの有効性を示すウエスタンブロットの写真である。パネル（ｄ）は、５０μＭのＥＧＣＧで処理したＴＤＰ−４３−ＩＩＰＬＤを含む２９３Ｔ細胞を示す。個々の処理の２つの画像が表示される。バー：１０μｍ。パネル（ｅ）には、形成されたＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体をＥＧＣＧの用量依存的に分解した画像が含まれる。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として表される。＊ｔ検定によるＰ＜０．０５。パネル（ｆ）は、ＥＧＣＧ（０、５、１０、１５、２０、および３０μＭ）で２４時間処理後の尿素画分中のＴＤＰ−４３−ＩＩＰＬＤを示すウエスタンブロットの写真である。パネル（ｇ）は、バイカレインとＥＧＣＧを含む医薬組成物がＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体の減少に及ぼす相乗効果を示している。パネル（ｈ）および（ｉ）は、バイカレインおよび１７−ＡＡＧを含む医薬組成物と、１７−ＡＡＧを含むＥＧＣＧを含む医薬組成物が、それぞれ７時間および２４時間でのＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体の減少に対する相乗効果を示している。すべてのデータは、ＳＤの平均として表示される。
【図３】図３は、ＡＬＳの遺伝性ＶＣＰ／ｐ９７変異細胞ベースのモデルでバイカレインが回復したＴＤＰ−４３を介したＣＦＴＲエクソン９のスキップを示す画像の集合である。パネル（ａ）には、バイカレインを含むまたは含まないＶＣＰ／ｐ９７変異体Ｒ１５５Ｈの存在下でのＴＤＰ−４３のインビボスプライシング分析が含まれる。エクソン９の包含（＋）および除外（−）バンドが示される。＊：異常なスプライシング産物。パネル（ｂ）には、バイカレインを含むまたは含まない状態で処理された細胞におけるＴＤＰ−４３を介したＣＦＴＲエクソン９スキッピングのインビボスプライシング分析が含まれる。パネル（ｃ）は、ＴＤＰ−４３の過剰発現がない場合のＣＦＴＲエクソン９スキップに対するバイカレインの効果のインビボスプライシング分析を示す。パネル（ｄ）は、バイカレインを含むまたは含まない状態でＴＤＰ−４３タンパク質の発現を示すウエスタンブロットの写真である。２９３Ｔ細胞は、核、サイトゾル、および尿素画分に分離した後、０、２５、または５０μＭのバイカレインで処理された。矢印はＴＤＰ−４３ポリマーを示す。パネル（ｅ）は、バイカレインを含むまたは含まない状態でＶＣＰ／ｐ９７Ｒ１５５Ｈ発現細胞のＴＤＰ−４３タンパク質を示すウエスタンブロットの写真である。矢印はＴＤＰ−４３ポリマーを示す。
【図４】図４は、ＴＤＰ−４３重合およびＴＤＰ−４３を介したＣＦＴＲエクソン９スキッピングにおけるＶＣＰ／ｐ９７ＡＴＰａｓｅ活性の分析を示す画像の集合である。パネル（ａ）には、ＶＣＰ／ｐ９７−ＷＴまたはＶＣＰ／ｐ９７−ＱＱでトランスフェクトされた細胞におけるＴＤＰ−４３の局在を示す顕微鏡写真が含まれる。バー：１０μｍ。パネル（ｂ）は、０．１、０．２、０．５、１．５、または２．０μｇのＶＣＰ／ｐ９７−ｗｔでトランスフェクトされた細胞におけるＴＤＰ−４３ポリマー（矢印）のレベルを示すウエスタンブロットの写真である。パネル（ｃ）には、０．１、０．２、０．５、１．５、または２．０μｇのＶＣＰ／ｐ９７−ＱＱでトランスフェクトされた細胞におけるＴＤＰ−４３ポリマー（矢印）のレベルのイムノブロット分析が含まれる。パネル（ｄ）には、ＶＣＰ／ｐ９７バリアントの存在下でのＴＤＰ−４３のインビボスプライシング分析が含まれる。エクソン９の包含（＋）および除外（−）バンドが示される。＊：異常なスプライシング産物。パネル（ｅ）には、バイカレインを含むまたは含まない状態で、ＶＣＰ／ｐ９７−ＱＱ発現細胞におけるＴＤＰ−４３のインビボスプライシング分析が含まれる。パネル（ｆ）は、クロスＩＰによるインビボでのＴＤＰ−４３とＶＣＰ／ｐ９７間の相互作用を示す。Ｈｉｓ−ＶＣＰ／ｐ９７変異体を発現する２９３Ｔ細胞から採取したタンパク質溶解物を抗Ｈｉｓ抗体による免疫沈降に使用し、抗ＴＤＰ抗体によるイムノブロッティングによってさらに検証した。パネル（ｇ）には、ＴＤＰ−４３のＲ３６１Ｓ変異体およびＶＣＰ／ｐ９７変異体の存在下でのＴＤＰ−４３のインビボスプライシング分析が含まれる。パネル（ｈ）には、バイカレインを含むまたは含まない状態で、ＶＣＰ／ｐ９７−ＱＱ発現細胞におけるＴＤＰ−４３のＲ３６１Ｓ変異体のインビボスプライシング分析が含まれる。
【図５】図５は、ＨＳＰＢ１（ＨＳＰ２７）によるＴＤＰ−４３重合およびＴＤＰ−４３媒介性ＣＦＴＲエクソン９スキッピングを示す画像の集合である。パネル（ａ）は、ＨＳＰＢ１（ＨＳＰ２７）の０、１００、または２００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞におけるＴＤＰ−４３ポリマーのレベルのイムノブロット分析を示す。矢印はＴＤＰ−４３ポリマーを示す。パネル（ｂ）は、インビボスプライシングアッセイによるＨＳＰＢ１ｓｉＲＮＡの存在下でのＴＤＰ−４３の選択的スプライシング分析を示す。エクソン９の包含（＋）および除外（−）バンドが示される。＊：異常なスプライシング産物。パネル（ｃ）には、ＧＦＰ−ＨＳＰＢ１の５または１０μｇプラスミドでトランスフェクトされた細胞におけるＴＤＰ−４３ポリマーのレベルのイムノブロット分析が含まれる。矢印はＴＤＰ−４３ポリマーを示す。パネル（ｄ）には、ＧＦＰ−ＨＳＰＢ１を発現する細胞におけるＴＤＰ−４３のインビボ選択的スプライシングアッセイが含まれる。
【図６】図６は、核のＴＤＰ−４３複合体およびポリマーの同定を示す画像の集合である。パネル（ａ）には、細胞のグルタミン／アスパラギンに富むタンパク質複合体に適用される単離方法を示す免疫沈降−ＥＭの概略図が含まれる。パネル（ｂ）は、ＴＤＰ−４３、ＣＢＰ、およびＴＩＡＲの免疫沈降効率を、前固定の有無に分かれて示す。この３つのタンパク質は、抗ＴＤＰ−４３またはＴＩＡＲ、ＣＢＰ抗体を使用して、変更されたプロトコルに従うことにより、２９３Ｔ細胞溶解物から精製された。免疫沈降物は、抗ＴＤＰ−４３、またはＴＩＡＲ、ＣＢＰ抗体を用いたイムノブロッティングによってさらに検証した。パネル（ｃ）には、抗ＴＤＰ−４３抗体を使用してネガティブ染色された免疫沈降物を示す顕微鏡写真が含まれる。バー：２０ｎｍ。矢印は、ｄ−ｆおよびｈ−ｊで分離されたＴＤＰ−４３複合体の代表的な高倍率画像を示す。パネル（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）には、前固定プロセッサーに従って細胞溶解物から単離されたＴＤＰ−４３ポリマーのネガティブ染色構造の選択された３つの電子顕微鏡写真を示す顕微鏡写真が含まれる。ＴＤＰ−４３の螺旋状ポリマー構造は細胞から分離された。選択した画像ｆは、ＴＤＰ−４３ポリマーの２つの分岐を示す。スケールバー：２０ｎｍ。パネル（ｇ）には、２９３Ｔ細胞の核におけるＴＤＰ−４３タンパク質のストレートイムノゴールド標識を示す顕微鏡写真が含まれる。スケールバー：１００ｎｍ。パネル（ｈ）、（ｉ）、および（ｊ）には、さまざまな顕微鏡写真からの単一の球状構造を示す顕微鏡写真が含まれる。スケールバー：２０ｎｍ。パネル（ｋ）には、前固定なしで分離されたＴＤＰ−４３の繊維顆粒ネットワークのネガティブ染色構造の電子顕微鏡写真が含まれる。スケールバー：１００ｎｍ。パネル（ｌ）には、前固定で分離されたＴＤＰ−４３の繊維顆粒ネットワークのネガティブ染色構造の電子顕微鏡写真が含まれる。スケールバー：１００ｎｍ。パネル（ｍ）には、内因性ＴＤＰ−４３の免疫蛍光染色が含まれる。スケールバー：５μｍ。パネル（ｎ）は、ＴＤＰ−４３−ＦＬ−およびＴＤＰ−４３−ＰＬＤΔ−発現パターンの分析により、ＴＤＰ−４３の繊維顆粒ネットワークのこぶ構造を形成するために必要なＴＤＰ−４３のプリオン様傾向を示す。矢印はフィブリル構造を示す。スケールバー：１０μｍ。
【図７】図７は、ハッチンソン−ギルフォード早老症候群におけるＴＤＰ−４３の機能障害を示す画像の集合である。パネル（ａ）：ＴＤＰ−４３およびラミンＡ／Ｃ（Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ）の免疫染色。緑：ＴＤＰ−４３；赤：ラミンＡ／Ｃ、スケールバー：５μｍ。矢印は、ＴＤＰ−４３とラミンＡの共局在を示す。パネル（ｂ）：ラミンＡおよび早老症（Ｐｒｏｇｅｒｉａ）を発現する細胞におけるＧＦＰ−ＴＤＰ−４３−ＦＬタンパク質の局在。矢印はＴＤＰ−４３のサイトゾル凝集体を示す。スケールバー：１０μｍ。パネル（ｃ）：インビボスプライシングアッセイによるラミンＡまたは早老症の存在下でのＴＤＰ−４３選択的スプライシング能力の検査。エクソン９の包含（＋）および除外（−）バンドが示される。＊：異常なスプライシング産物。パネル（ｄ）：早老症発現細胞におけるＴＤＰ−４３ポリマーの検証のためのウエスタンブロッティング。パネル（ｅ）：バイカレインを含むまたは含まない状態で、早老症を発現している細胞におけるＴＤＰ−４３の局在。バー：１０μｍ。パネル（ｆ）：ＴＤＰ−４３核局在化のバイカレインレスキューの統計分析が示される。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として示される。＊ｔ検定によるＰ＜０．０５。パネル（ｇ）：インビボスプライシングアッセイによる早老症を発現する細胞におけるバイカレインの存在下でのＴＤＰ−４３選択的スプライシング能力の検査。エクソン９の包含（＋）および除外（−）バンドが示される。＊：異常なスプライシング産物。パネル（ｈ）：抗ラミンＡ／Ｃ抗体を使用した、バイカレインを含むまたは含まない状態で、早老症発現細胞の核形状の免疫染色。ｂの矢印は奇形の核を示し、ｃの矢印はレスキューされた核を示す。バー：１０μｍ。パネル（ｉ）：ラミンＡ発現細胞におけるＴＤＰ−４３タンパク質の検証のためのウエスタンブロッティング。
【図８】図８は、疾患ＴＤＰ−４３タンパク質の治療における小化合物のモデルの概略図である。通常の生理学的条件下でのＴＤＰ−４３を介したエクソンスキッピングのために提案された時空間的な組織化。ポリマーに再構築されたＴＤＰ−４３タンパク質は、核繊維顆粒ネットワークでスプライシング機能を実行した。ＲＯＳや遺伝性変異などの危険因子によって引き起こされた前駆症状または臨床疾患の段階で、病理学的封入体の凝集に続いて、サイトゾルに転座したＴＤＰ−４３Ｃ末端が分解された。バイカレインによる薬理学的介入は、核内の活性なＴＤＰ−４３ポリマーの数を増やすことにより、病理学的封入体を分解し、ＴＤＰ−４３の核機能をレスキューした。さらに、ＥＧＣＧまたは１７−ＡＡＧは、ＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体を減らす際に、単独で、またはバイカレインと相乗的に効果的に機能する可能性がある。
【図９】図９は、ＳＭＮのプリオン様傾向の識別を示す画像の集合である。パネル（ａ）：ｂ−ｉｓｏｘはｍｅｓ２３．５細胞からＳＭＮタンパク質を沈殿させる。パネル（ｂ）：２９３Ｔ細胞の異なる細胞内画分におけるＳＭＮおよびＰＦＮ１のプリオン様コンフォーマーのレベルの分析。パネル（ｃ）：ｂ−ｉｓｏｘを含むまたは含まない状態で処理された細胞溶解物からの分画されたタンパク質の結果が示される。パネル（ｄ）：ＳＭＮ変異体の概略図。パネル（ｅ）：ＳＭＮのプリオン様ドメインの同定。パネル（ｆ）：ＳＭＮ変異体の細胞内局在。スケールバー、１０μｍ。パネル（ｇ）：上部パネル、ミスセンスＳＭＮ変異体Ｙ２７２ＣおよびＧ２７９Ｖのｂ−ｉｓｏｘ化学結合分析。中央および下のパネル、Ｙ２７２ＣおよびＧ２７９Ｖ変異体の溶解度。パネル（ｈ）：Ｙ２７２ＣおよびＧ２７９Ｖ変異体の細胞発現パターンと局在。パネル（ｉ）：ＳＭＮΔ７のｂ−ｉｓｏｘ化学結合分析。
【図１０】図１０は、バイカレインによるＳＭＮΔ７の完全長ＳＭＮへの機能的変換を示す画像の集合である。パネル（ａ）：完全長ＳＭＮ、ＳＭＮΔ７およびＳＭＡミスセンス変異体の提案された構造特性の概略図。パネル（ｂ）：バイカレインはＳＭＮΔ７凝集体の数を減少させた。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として示されている。＊ｔ検定によるＰ＜０．０５。パネル（ｃ）：５０μＭのバイカレインで処理したＳＭＮΔ７発現細胞の細胞生存率アッセイの結果。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として示されている。＊ｔ検定によるＰ＜０．０５。パネル（ｄ）：バイカレインは、神経突起様構造を持つＳＭＮΔ７細胞の数を増加させた。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として示されている。＊ｔ検定によるＰ＜０．０５。パネル（ｅ）：バイカレインの存在下でＳＭＮΔ７とＰＦＮ１の物理的相互作用を調べた。パネル（ｆ）：バイカレインはＳＭＮΔ７タンパク質の分解を弱める。パネル（ｇ）：培養ＮＳＣ３４運動ニューロンの軸索長に対するバイカレインの効果。バイカレイン（５０μＭ）または模擬処理されたＮＳＣ３４は、βＩＩ−チューブリン抗体（紫）で染色された。ＳＭＮΔ７でトランスフェクトされた細胞は、赤いｍＣｈｅｒｒｙシグナルで示す。スケールバー、５０μｍ。パネル（ｈ）：ＳＭＮΔ７トランスフェクト細胞の神経突起長の定量。統計的比較は、両側スチューデントのｔ検定を使用して実行された。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として示す。＊＊＊ｐ＜０．００１。パネル（ｉ）：ＳＭＡマウスの運動機能に対するバイカレインの治療効果。ＳＭＡマウスとヘテロ接合同腹仔は、出生時から毎日腹腔内バイカレイン注射で治療され、その後運動機能分析が行われた。未処理（ＳＭＡ、ｎ＝２７；ヘテロ接合、ｎ＝２３）およびバイカレイン処理（ＳＭＡ／ＴＸ、ｎ＝１８；ヘテロ接合）の立ち直り時間（左パネル）、チューブスコア（中央パネル）、および傾斜スコア（右パネル）／ＴＸ、ｎ＝２７）ＳＭＡおよびヘテロ接合マウスが示される。ＳＭＡマウスの運動機能は、バイカレイン治療後、特に生後６日目に有意に改善され、生後８日目に部分的に改善された（ＬＳＤ事後分析による一元配置分散分析）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１１】図１１は、ＳＭＮΔ７を発現する運動ニューロンからの軸索伸長に対するプリオン様ドメインのレベルの効果を示す画像の集合である。パネル（ａ）：同時トランスフェクトされたＮＳＣ３４細胞（矢印で示されている）は、βＩＩ−チューブリン抗体（紫色）で染色された。スケールバー、５０μｍ。パネル（ｂ）：同時トランスフェクトされた細胞の神経突起の長さの定量化。統計的比較は、両側スチューデントのｔ検定を使用して実行された。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として示されている。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１２】図１２は、誤って折りたたまれたＳＭＮタンパク質を修正することによってＳＭＡを治療するためのプリオン様コンフォーマーベースの治療戦略のモデリングを示す画像の集合である。発明者の研究では、薬理学的シャペロンによって誘発される「プリオン様アイソコンフォーマー（ｐｒｉｏｎ−ｌｉｋｅ  ｉｓｏ−ｃｏｎｆｏｒｍｅｒｓ）」を通じて、プリオン様コンフォーマーのレベルが不十分であるという問題に取り組む、ＳＭＡ用の小分子構造補正剤であるバイカレインを特定した。
【図１３】図１３は、異種ＬＣドメインのインビボ構造テンプレートを示す画像の集合である。パネル（ａ）：ＧＦＰ−Ｈｔｔ９７Ｑの細胞画像。スケールバー：１０μｍ。パネル（ｂ）：ＧＦＰ−Ｈｔｔ９７Ｑタンパク質の溶解度分析。パネル（ｃ）：ＧＦＰ−Ｈｔｔ−９７Ｑによるクロスβコンフォーマーのテンプレート化された折り畳みと増殖。パネル（ｄ）：ＴＤＰ−４３−ＦＬ、ＴＤＰ−４３−ＰＬＤΔおよびＴＤＰ−４３−Ｆ１４７／１４９Ｌのクロスβコンフォーマーのレベルの分析。ＴＤＰ−４３−ＦＬ、ＴＤＰ−４３−ＰＬＤΔおよびＴＤＰ−４３−Ｆ１４７／１４９Ｌ（ＲＤ）タンパク質を発現する細胞におけるクロスβポリマーのＢ−ｉｓｏｘ結合分析。パネル（ｅ）：ｈＴＤＰ−４３ＦＬおよびｈＴＤＰＫ１３６Ｒタンパク質を発現する細胞におけるクロスβポリマーのＢ−ｉｓｏｘ結合分析。パネル（ｆ）：ｈＴＤＰ−４３ＦＬおよびｈＴＤＰＫ１３６Ｒをトランスフェクトした細胞の細胞溶解物におけるＴＤＰ相互作用パートナーの免疫沈降分析。パネル（ｇ）：ｈＴＤＰ−４３ＦＬおよびｈＴＤＰＫ１３６Ｒの核膜局在化の統計分析。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝５）として表される。＊ｔ検定によるＰ＜０．０５。パネル（ｈ）：精製された完全長ＴＤＰ−４３およびＬａｍ  Ｂ組換えタンパク質（３μＭモノマーに相当）を、ＲＴでアセンブリバッファー中のｂ−ｉｓｏｘ（１００μＭ；中央）の非存在下（左）または存在下でインキュベートした。その後、電子顕微鏡による検証が行われる。ＴＤＰ−４３とＬａｍ  Ｂ組換えタンパク質を別々に１時間インキュベートした後、１時間混合した（右）。バー：１μｍ。パネル（ｉ）：２９３Ｔ細胞の異なる細胞内画分における内因性クロスβコンフォーマーのレベルの分析。パネル（ｊ）：ウエスタンブロッティングによるＭｅｓ２３．５細胞におけるＴＤＰ−４３の内因性クロスβコンフォーマーのパーセンテージの計算。
【図１４】図１４は、ＡＬＳの細胞ベースのモデルにおけるクロスβコンフォーマーの分析およびテンプレート化を示す画像の集合体である。パネル（ａ）：ＰＦＮ１−ＦＬおよびＰＦＮ１Ｇ１１８Ｖタンパク質を発現する細胞におけるプリオン様タンパク質のＢ−ｉｓｏｘ結合分析。パネル（ｂ）：ＰＦＮ１−ＦＬおよびＰＦＮ１Ｇ１１８Ｖをトランスフェクトした細胞の細胞抽出物中のＴＤＰ相互作用パートナーの免疫沈降分析。パネル（ｃ）：ＶＣＰおよびＶＣＰＲ１５５Ｈをトランスフェクトした細胞におけるＴＤＰ−４３のｂ−ｉｓｏｘ結合分析。パネル（ｄ）：ＶＣＰおよびＶＣＰＲ１５５Ｈをトランスフェクトした細胞におけるＴＤＰ−４３の免疫染色。スケールバー：５μｍ。パネル（ｅ）：ＶＣＰおよびＶＣＰＡ２３４Ｅをトランスフェクトした細胞におけるＴＤＰ−４３発現の細胞内分画分析。矢印は９０ｋＤＴＤＰ−４３ダイマーを示す。パネル（ｆ）：ＶＣＰおよびＶＣＰＲ１５５Ｈ発現の細胞内分画分析。矢印は、クロマチン非結合ＶＣＰタンパク質の割合を示す。
【図１５】図１５は、クロスβ永続化のモデルを示す画像の集合である。新しいタイプのβシートに富むドメインは、それ自体または他のタンパク質の変換を触媒し、生体高分子に集合し、プリオン様ネットワークを順次再構築して、「クロスβ永続化」と呼ばれる細胞の恒常性を再形成することにより、構造複製が可能である。クロスβ永続化は、形質転換可能なＬＣタンパク質、ＲＮＡ、および翻訳後修飾の増加によって開始できる。この新タイプの調節は、既存のタンパク質のセットを再編成することにより、細胞の生化学を劇的に再形成する。
【図１６】図１６は、誤って折りたたまれたｐ５３凝集体の表現型の特徴を示す画像の集合である。パネル（ａ）および（ｂ）には、ｐ５３抗体（１Ｃ１２）による２９３Ｔ細胞の免疫染色を示す顕微鏡写真が含まれる。矢印は、３種類の凝集したｐ５３タンパク質を示す。バー：１０μｍ。  ｐ５３凝集体のサイズの統計分析をｂに示した。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として表される。パネル（ｃ）は、ｐ５３凝集に対するＭＧ１３２の効果の発見を示す。バー：１０μｍ。パネル（ｄ）には、ｐ５３株の分離を示すフローチャートが含まれる。パネル（ｅ）には、ｐ５３［Ｌ］、ｐ５３［Ｓ］、ｐ５３［Ｐ］、ｐ５３−ＮＶＡの４つのｐ５３株の選択された画像が含まれる。バー：１０μｍ。パネル（ｆ）には、アクチン抗体を用いた４つのｐ５３株の免疫染色顕微鏡写真が含まれる。バー：１０μｍ。パネル（ｇ）には、有糸分裂中のｐ５３凝集体分布の分析が含まれる。細胞をｐ５３抗体とＤＡＰＩで二重染色した。バー：１０μｍ。パネル（ｈ）は、４つのｐ５３株における細胞内ＲＯＳレベルの検出に関する所見を示す。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として表される。＊ｔ検定によるＰ＜０．０５。
【図１７】図１７は、ｐ５３株の発癌性の研究の実験的発見を示す画像の集合である。パネル（ａ）には、フローサイトメトリーによって検証されたｐ５３株の細胞周期分布分析のグラフが含まれる。  パネル（ｂ）には、個々のｐ５３株の細胞周期倍加時間を示す棒グラフが含まれる。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として表される。パネル（ｃ）には、ＭＴＴアッセイを使用してスペルミジンで処理された４つのｐ５３株の細胞生存率分析が含まれる。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として表される。パネル（ｄ）には、ＭＴＴアッセイを使用してＨ２Ｏ２で処理した４つのｐ５３株の細胞生存率分析が含まれる。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として示す。パネル（ｅ）には、癌の幹細胞性とエピジェネティックな調節に関連する特異的抗体を含む４つのｐ５３株の発現プロファイルのウエスタンブロット分析が含まれる。
【図１８】図１８は、ｐ５３株の感染力を示す。パネル（ａ）には、ｐ５３［Ｌ］、［Ｓ］、および［Ｐ］細胞からのライセートとのインキュベーションによるｐ５３−ＮＶＡ細胞での目に見えるｐ５３凝集誘導を示す顕微鏡写真が含まれる。矢印は、誘導されたｐ５３凝集体を示す。バー：２０μｍ。パネル（ｂ）には、ｐ５３凝集体誘導効率の統計分析が含まれる。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として表される。
【図１９】図１９は、ｐ５３とＴＤＰ−４３の間の凝集傾向の相互作用を説明するための実験結果の集合である。パネル（ａ）は、４つのｐ５３株におけるＴＤＰ−４３の局在を示す。ＴＤＰ−４３サイトゾル病巣は矢印で示す。バー：１０μｍ。パネル（ｂ）は、ｐ５３［Ｓ］およびｐ５３−ＮＶＡ株におけるサイトゾルＧＦＰ−ＴＤＰ−４３ＦＬ凝集体の統計分析を示す棒グラフである。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として表される。パネル（ｃ）は、ｐ５３［Ｓ］およびｐ５３−ＮＶＡ株におけるＧＦＰ−ＴＤＰ−４３ＩＩＰＬＤ凝集体の統計分析を示す棒グラフである。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として表される。＊ｔ検定によるＰ＜０．０５。パネル（ｄ）は、ネイティブＰＡＧＥによる４つのｐ５３株のＴＤＰ−４３種を示すウエスタンブロット分析を示す。パネル（ｅ）は、ｐ５３［Ｓ］およびｐ５３−ＮＶＡ株におけるＴＤＰ−４３の選択的スプライシング能力のインビボ選択的スプライシング分析を示す。エクソン−９包含（＋）およびエクソン−９除外（−）バンドが示される。＊：異常なスプライシング産物。パネル（ｆ）には、ＴＤＰ−４３ノックダウン細胞におけるｐ５３の凝集を示す棒グラフが含まれる。バー：１０μｍ。パネル（ｇ）には、ＴＤＰ−４３ノックダウン細胞内のｐ５３凝集体の統計分析を示す棒グラフが含まれる。すべてのデータは、ＳＤ（ｎ＝３）の平均として表される。＊ｔ検定によるＰ＜０．０５。パネル（ｈ）には、ＧＦＰタグ付きＴＤＰバリアントを過剰発現させることによるｐ５３凝集体のクリアランスを示す棒グラフが含まれる。ＦＬとＰＬＤのみがｐ５３凝集体を効率的に洗浄する。ｐ５３凝集体は、ｐ５３  １ｃ１２抗体を使用した免疫染色によって検出された（ｎ＝５）。
【図２０】図２０は、ｐ５３アミロイド集合に対するＨＳＰＢ１の効果を示す画像の集合である。  パネル（ａ）は、４つのｐ５３株におけるＨＳＰＢ１タンパク質のウエスタンブロットデータの定量分析を示す。パネル（ｂ）は、４つのｐ５３株におけるＨＳＰＢ１、ＨＳＰＢ８、およびＨＳＰ９０のｍＲＮＡ発現レベルを示す。パネル（ｃ）には、ｐ５３−ＮＶＡ株におけるＨＳＰＢ１ノックダウンによるｐ５３凝集体誘導効率の統計分析が含まれる。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として表される。＊ｔ検定によるＰ＜０．０５。パネル（ｄ）には、ＨＳＰＢ１ノックダウン細胞におけるｐ５３の溶解度のウエスタンブロッティング分析が含まれる。矢印は不溶性タンパク質を示す。パネル（ｅ）には、ＨＳＰＢ１を過剰発現している４つのｐ５３株のｐ５３凝集体の棒グラフが含まれる。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として表される。
【図２１】図２１は、Ｗｔ  ｐ５３またはｐ５３Ｒ２８０Ｓ変異体を発現する細胞における誤って折りたたまれたｐ５３凝集体の分析を含む。パネル（ａ）は、ＧＦＰ−ｐ５３またはＧＦＰ−ｐ５３Ｒ２８０Ｓタンパク質を過剰発現している細胞内のｐ５３凝集体を示す。２９３Ｔ細胞にＧＦＰ−ｐ５３ＷＴまたはＧＦＰ−ｐ５３Ｒ２８０Ｓプラスミドをトランスフェクトし、ｐ５３抗体で染色した。バー：１０μｍ。パネル（ｂ）には、ＧＦＰ−ｐ５３ＷＴおよびＧＦＰ−ｐ５３Ｒ２８０Ｓトランスフェクタントにおける内因性ｐ５３凝集体の洗浄効率の棒グラフが含まれる。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として表される。＊ｔ検定によるＰ＜０．０５。パネル（ｃ）は、ＧＦＰ−ｐ５３またはＧＦＰ−ｐ５３Ｒ２８０Ｓタンパク質を発現する細胞におけるＣＤ１３３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３の発現のウエスタンブロッティング分析を示す。パネル（ｄ）は、２５μＭバイカレインを含むまたは含まない状態で処理された細胞におけるｐ５３アミロイド凝集体の分析を示す。２５μＭバイカレインを含むまたは含まない状態で処理された細胞におけるｐ５３アミロイドの選択された画像と統計分析が示される。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝４）として表される。バー：１０μｍ。パネル（ｅ）は、バイカレインによるｐ５３凝集体の自発的形成の抑制を示す。すべてのデータは、ＳＤの平均（ｎ＝３）として表される。＊ｔ検定によるＰ＜０．０５。バー：１０μｍ。
【図２２】図２２は、Ｒｂ（Ｒｂ１）のプリオン様傾向の識別を示す画像の集合である。パネル（ａ）：２９３Ｔ細胞の異なる細胞内画分におけるＲｂのプリオン様コンフォーマーのレベルの分析。パネル（ｂ）：Ｒｂ変異体の概略図とＲｂのプリオン様ドメインの同定。パネル（ｃ−ｄ）：Ｒｂ変異体のタンパク質安定性の分析。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
コンフォメーション性疾患を治療するための医薬組成物および方法が、本明細書に記載されている。当該組成物は、熱ショックタンパク質モジュレーターとフラボノイドの組み合わせを含む、または熱ショックタンパク質モジュレーター、フラボノイドおよびポリフェノール化合物の組み合わせを含む。ポリフェノール化合物は、アピゲニン、カテキン、エピカテキン、ケンペロール、２，２¢−ジヒドロキシベンゾフェノン、２，３，４，２¢、４¢−ペンタヒドロキシベンゾフェノン、ゴッシペチン、ケルセチン、モーリン、およびミリセチンを含む群から選択することができる。細胞、組織または被験体に投与されると、これらの様々な組み合わせのそれぞれは、ＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体および／またはＴＤＰ−４３の分解された断片を相乗的に減少させる。
【００３０】
治療薬を投与することにより、ＴＤＰ−４３およびＳＭＮタンパク質の生物学的形態を安定化する、および／またはＴＤＰ−４３およびＳＭＮタンパク質の生物学的活性を回復するための方法もまた、本明細書に記載される。
【００３１】
さらに、有効量の治療薬を細胞、組織または被験体に投与することによって、細胞、組織、または被験体において、ＴＤＰ−４３およびＳＭＮの誤って折りたたまれた凝集体を低減する、または生物学的形態のＴＤＰ−４３およびＳＭＮタンパク質を回復するための方法が本明細書に記載される。細胞、組織、または被験体は、ＴＤＰ−４３およびＳＭＮの誤って折りたたまれた凝集体のレベルを下げるか、アクティブなＴＤＰ−４３コンフォーマーを増やす。一実施形態では、治療薬はフラボノイドである。別の実施形態では、治療薬は、熱ショックタンパク質モジュレーターである。別の実施形態では、治療薬はポリフェノール化合物である。さらに別の実施形態では、治療薬は、本明細書に記載の医薬組成物である。
【００３２】
細胞、組織または被験体に有効量のフラボノイドを投与してＴＤＰ−４３ポリマーのレベルを変更することにより、細胞、組織または被験体中のＴＤＰ−４３ポリマーの量を変更する方法も記載されている。
【００３３】
＜用語の定義＞
上記および本開示全体を通して使用されるように、以下の用語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。
【００３４】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形の参照を含む。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、量、時間的持続時間などのような測定可能な値を指す場合、特に明記しない限り、指定された値からの±１０％の変動を包含することを意味する。これは、そのような変動が治療薬の投与量に適切であるためである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、範囲を指す場合、特に明記しない限り、指定された値からの±１０％の変動を包含することを意味する。これは、そのような変動が治療薬の投与量に適切であるためである。
【００３６】
本明細書で使用される「有効量」とは、ＴＤＰ−４３分解フラグメントまたはＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体またはｐ５３誤って折りたたまれた凝集体、またはコンフォメーション病の症状または徴候の量を減らすのに十分な薬剤の用量を含む。
【００３７】
本明細書で使用される「治療する」、「治療される」、または「治療」という用語は、予防的（例えば、予防医学的）、一時緩和的、および治癒的使用または結果を含む。
【００３８】
「減少する」または「減らす」という用語は、ＴＤＰ−４３、ＳＭＮまたはｐ５３の誤って折りたたまれた凝集体またはＴＤＰ−４３またはＳＭＮ分解フラグメントの形成を遅らせるかまたは停止させること、またはＴＤＰ−４３、ＳＭＮまたはｐ５３の誤って折りたたまれた凝集体を分解することを含む。
【００３９】
「プロドラッグ」という用語は、代謝変換によって薬理学的に活性な薬剤に変換される薬理学的に不活性な化合物である。
【００４０】
医薬組成物の酸性治療薬の「薬学的に許容される塩」という用語は、塩基、すなわち、アルカリなどの塩基付加塩およびナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩で形成される塩、及びアンモニウム、トリメチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル−アンモニウム塩などの４つのアンモニウム塩である。同様に、鉱酸、有機カルボン酸および有機スルホン酸、例えば塩酸、メタンスルホン酸、マレイン酸などの酸付加塩もまた構成の一部として、ピリジルなどの構成要素を有する塩基性治療薬に提供することが可能である。
【００４１】
「コンフォメーション病」という用語は、正常な老化、早期老化、分解性コンフォメーション病、コンフォメーション病（アミロイド凝集コンフォメーション病および非アミロイド凝集コンフォメーション病を含む）の状態を広く含むが、これらに限定されない。分解性コンフォメーション病には、ＳＭＡ、小児がん、網膜芽細胞腫（ＲＢ）、膀胱がん、乳がん、骨肉腫、およびＲｂ（Ｒｂ１）欠損がんが含まれるが、これらに限定されない。アミロイド凝集コンフォメーション病には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ｐ５３凝集を伴う癌、ダウン症候群、または緑内障が含まれるが、これらに限定されない。非アミロイド凝集コンフォメーション疾患には、ＴＤＰ−４３プロテオパチー（ＦＴＬＤ−ＵまたはＡＬＳなど）、海馬硬化症、または混合プロテオパチーが含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書で使用される「ＴＤＰ−４３タンパク質症」という用語は、ＴＤＰ−４３タンパク質の構造および／または機能の１つまたは複数の態様の変化に関連する状態を広く意味する。ＴＤＰ−４３プロテオパチーは、ＴＤＰ−４３タンパク質の構造および／または機能の１つまたは複数の側面が、集団で発生する正常レベルまたはベースラインレベルから逸脱していることを特徴とする場合がある。これらの逸脱は、ＴＤＰ−４３分解フラグメントおよびＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体を含む、異常な構成を有するＴＤＰ−４３分子の量、またはＴＤＰ−４３の可溶性および不溶性のコンフォーマーを含むさまざまな多量体形態の量など、ＴＤＰ−４３タンパク質の構造の異常として現れる可能性がある。これらの逸脱は、ＴＤＰ−４３のさまざまな分子形態の細胞および組織分布の異常、正常な機能の喪失、毒性機能または毒性の獲得を含むＴＤＰ−４３タンパク質の機能の逸脱、またはＴＤＰ−４３に関連するタンパク質と細胞経路の調節の逸脱としても現れる。ＴＤＰ−４３に関連して、または一般的に使用される「プロテオパチー」という用語は、「プロテオパチー」、「ミスフォールディング障害」、または「ミスフォールディング疾患」という用語と交換可能に使用することができる。現在ＴＤＰ−４３プロテオパチーと見なされている状態の例は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ユビキチンを伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＤＬ−Ｕ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、および神経変性の混合病理である。ＴＤＰ−４３プロテオパチーは上記の条件に限定されないことを理解されたい。
【００４３】
「プリオン様ＬＣタンパク質」という用語は、ＴＤＰ−４３に関して使用されるか、または一般に、「クロスβ永続化ドメインを有するタンパク質」、「低複雑度タンパク質」、「プリオン」、または「相分離タンパク質」という用語と交換可能に使用され得る。
【００４４】
本明細書で使用される「プリオン様折り畳み」という用語は、自己または他のタンパク質変換を触媒し、生理学的ポリマーを順次形成することによって構造複製が可能な新規タイプのβシートに富む構造を広く意味する。低複雑性（ＬＣ）、クロスβ伝播、クロスβ永続化、凝集しやすい、プリオノゲンまたは液相分離ドメインとして多様に説明されているプリオン様ドメインは、一時的にクロスβポリマー凝縮相を形成して、膜のない細胞内器官、プレｍＲＮＡスプライシング、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性転写、ヘテロクロマチン緩和などの重要な生物学的プロセスを実行する。さらに、ｂ−ｉｓｏｘは、ＴＤＰ−４３、ＦＵＳ、ｈｎＲＮＰＡ１、ＴＩＡ１、ＰＦＮ１、ラミンＢ１、ＳＭＮ、Ｒｂ、ｐ５３などのプリオン様ＬＣタンパク質のグループを捕捉し、ＬＣドメインのクロスβプリオン様ポリマーの特定の化学プローブとして機能する。
【００４５】
「ポリマー」という用語は、多価タンパク質またはドメインに関して使用される。ポリマーは、ウエスタンブロッティングを使用した分子量、電子顕微鏡を使用した形態、または免疫蛍光染色を使用した液滴形成（膜のない細胞内器官など）、プローブとしてｂ−ｉｓｏｘを使用した化学沈殿によって分析できる。
【００４６】
「クロスβポリマー」という用語は、多価プリオン様ＬＣタンパク質に関して使用され、「プリオン様ポリマー」という用語と交換可能に使用することができ、かつｂ−ｉｓｏｘによって認識される。
【００４７】
「二次凝集しやすいタンパク質」という用語は、欠陥のある凝集しやすいタンパク質の役割を補う凝集しやすいタンパク質に関連して使用される。二次凝集しやすいタンパク質は、プラスミドによって発現されるか、タンパク質または脂質ベースのナノ粒子、またはスマートメソポーラスシリカナノ粒子（ＨＪ  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ“  Ｓｍａｒｔ  Ｍｅｓｏｐｏｒｅ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”  Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１９、９（４）、  ５１１．参照）によって送達される。
【００４８】
「状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」という用語は、医学的または臨床的状態を指すために使用することができ、身体または生物で広く発生し、特定の症状および徴候によって区別されるプロセスを意味する。状態という用語は、病気または病状を指すために使用することができ、身体または生物に影響を与える異常な病気または状態を広く意味する。「状態」という用語は、正常な生物学的状態またはプロセスを示すために使用することもできる。
【００４９】
本明細書で使用される「治療的介入」という用語は、治癒の結果、症状の改善、または健康の回復をもたらすことが期待されて取られた行動を広く意味する。
【００５０】
異なる三次元構造、すなわち、二次、三次、または四次構造の１つまたは複数の違いを有するＴＤＰ−４３タンパク質の形態は、ＴＤＰ−４３コンフォメーション、ＴＤＰ−４３コンフォメーション、ＴＤＰ−４３コンフォメーションバリアント、ＴＤＰ−４３タンパク質バリアント、ＴＤＰ−４３フォールディングバリアント、およびその他の関連用語と呼ばれ得る。ＴＤＰ−４３は同じまたは異なる一次構造またはアミノ酸配列を有することができることを理解されたい。ＴＤＰ−４３コンフォーマーには、インビトロで見られる形態、ＴＤＰ−４３プロテオパチーに関連する形態、インビボで見られる形態、および人工的に生成された形態が含まれるが、これらに限定されない。ＴＤＰ−４３プロテオパチーは、神経細胞および神経組織における特定のＴＤＰ−４３コンフォーマーの量によって特徴付けまたは関連することができる。
【００５１】
「量」という用語は、本文書において、何かの量または分布を示すために使用される。いくつかの実施形態では、本発明は、１つまたは複数のタンパク質、ならびにそのようなタンパク質のクラスおよびサブクラスに関連する「量」という用語の意味に含まれる前述の情報のいずれかを利用することができる。タンパク質の量に関するこのような情報の組み合わせは、「パターン」と呼ばれる。
【００５２】
本明細書で使用される「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は、典型的には、コンフォメーション病を有するか、またはコンフォメーション病を有することが疑われるヒトまたは動物を指す。被験体は、研究対象などの既知のまたは疑われるコンフォメーション疾患のない対象であり得ることもまた、「被験体」という用語の範囲内に含まれることが理解されるべきである。
【００５３】
それぞれ「ＨＳＰ」および「ＨＳＰｓ」と略される「熱ショックタンパク質」という用語は、「熱ショック応答」、温度上昇または他のストレス因子に対する細胞応答に関与するタンパク質を指す。これには、細胞の内部保護および修復メカニズムの一部として、熱ショックタンパク質をコードする遺伝子の転写アップレギュレーションが含まれる。ストレスタンパク質とも呼ばれるＨＳＰは、ストレスの多い状態、例えば寒さや酸素の欠乏に対するさまざまな細胞反応に関与するが、これらに限定されない。ＨＳＰは、通常条件下の細胞内でも存在し、機能する。一部のＨＳＰは、タンパク質が正しい構造を獲得および維持するのを支援する分子シャペロンである。たとえば、ＨＳＰシャペロンはタンパク質の折り畳みを助け、タンパク質分子の凝集を防ぐことができる。他のＨＳＰは、細胞内のある区画から別の区画にタンパク質をシャトルし、誤って折りたたまれたタンパク質をプロテアーゼに向けて分解することができる。熱ショック応答は、例えば、Ｒｉｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｔｈｅ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ：Ｌｉｆｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｖｅｒｇｅ  ｏｆ  Ｄｅａｔｈ”、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ４０：２５３（２０１０）で討論されている。
【００５４】
細胞、組織または生物における熱ショックタンパク質活性または熱ショックタンパク質経路を調節する薬剤は、「熱ショックタンパク質モジュレーター」と呼ばれ得る。熱ショックタンパク質モジュレーターは、さまざまなメカニズムによってＨＳＰまたはＨＳＰ経路の機能を活性化または阻害することができる。熱ショックタンパク質または経路の活性を低下または阻害するＨＳＰモジュレーターは、ＨＳＰ阻害剤と呼ばれる。熱ショックモジュレーターの一例は、抗生物質ゲルダナマイシンの誘導体である１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）である。１７−ＡＡＧは、「クライアントタンパク質」として知られるシグナル伝達タンパク質に結合するタンパク質シャペロンであるＨＳＰ９０（熱ショックタンパク質９０）に結合し、その活性を阻害する。１７−ＡＡＧはＨＳＰ９０−クライアントタンパク質複合体を破壊することができる。熱ショックタンパク質または経路の活性を活性化または増加させるＨＳＰモジュレーターは、ＨＳＰアクチベーターと呼ばれる。活性化因子である熱ショックタンパク質モジュレーターの一例は、ＨＳＰ７０およびＨＳＰ９０などの１つまたは複数の分子シャペロンＨＳＰの発現を誘導することが知られているアリモクロモールである。
【００５５】
「フラボノイド」という用語は、コガネバナの根から最初に単離されたバイカレインを含むフラボンを含む。バイカレインは、体内の薬物を代謝するシトクロムＰ４５０システムの酵素であるＣＹＰ２Ｃ９の阻害剤である。フラボノイドには、バイカレインとその誘導体が含まれている。
【００５６】
＜ＴＤＰ−４３凝集体をリモデリング、及びＴＤＰ−４３タンパク質の生物学的形態を安定化する方法＞
神経変性疾患は、タンパク質が凝集しやすいＴＤＰ−４３プロテオパチーなどの疾患を指す。ＴＤＰ−４３のＱ／Ｎリッチドメインは、酵母プリオンドメインＳｕｐ３５Ｎで機能的に置換でき、プレｍＲＮＡスプライシング、細胞内局在、ＣＦＴＲのエクソンスキッピング、核顆粒アセンブリ、細胞の折り畳み安定性などの細胞機能に新しい固有の特性を持っている。（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｔｈｅ  ｓｅｌｆ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ＴＤＰ−４３  Ｃ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｔｓ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ”ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ。３：７６６（２０１２）２０１２）。ＴＤＰ−４３Ｃ末端のこのＱ／Ｎリッチドメインは、「プリオン様ドメインまたはＰＬＤ」としても知られている。ただし、ほとんどの既知のプリオンとは対照的に、インビトロでのＴＤＰ−４３の機能的または誤って折りたたまれた凝集体は、アミロイド特異的色素コンゴーレッドと反応せず、ＴＤＰ−４３  ＰＬＤがプリオン形成ドメインではない可能性があることを示している（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ．  ２０１２）。ＰＬＤは、ネイティブＴＤＰ−４３  Ｃ末端が安定化され、複数のＴＤＰ−４３タンパク質が相互接続されて核内にＴＤＰ−４３機能凝集体を形成し、機能ＴＤＰ−４３ポリマーが増加する細胞フォールディングに関与する（図２、６および７参照）。
【００５７】
生体内では、コンフォメーション病タンパク質の折り畳まれた状態は、老化および神経変性疾患の病因と関連している。これらの疾患の原因となるタンパク質には、高い構造可塑性と構造多型を持ち、細胞結合、転写後修飾、ＲＯＳなどのさまざまな生物学的および病理学的要因によるフォールディング状態の切り替えを可能にする固有の無秩序ドメインが含まれる。このタイプのタンパク質の折り畳み状態に対する病理学的影響は、誤って折り畳まれた凝集と恒常性の維持の失敗につながり、神経変性を引き起こす可能性がある。
【００５８】
通常の条件下では、プリオン様の性質は、自己組織化ＴＤＰ−４３タンパク質を関与させて、３Ｄ核空間の繊維顆粒ネットワークにクラスター化し、そこで、ＴＤＰ−４３タンパク質は、選択的スプライシング機能を実行し、ｍＲＮＡプロセシングハブになる。前駆症状または臨床疾患の段階で、病理学的危険因子は、ＴＤＰ−４３タンパク質の機能的折り畳みを誘発して誤って折り畳まれた状態に変換し、続いてユビキチン化、リン酸化、およびサイトゾルでの凝集を引き起こす。ＶＣＰ／ｐ９７関連のＴＤＰ−４３プロテオパチーの場合、ＶＣＰ／ｐ９７およびＶＣＰ／ｐ９７  Ｒ１５５Ｈによって免疫沈降されるＴＤＰ−４３は、さまざまなＴＤＰ−４３プロテオパチーで示唆されている。ここでの発明者らの研究はさらに、ＶＣＰ／ｐ９７Ｒ１５５Ｈ変異またはＶＣＰ／ｐ９７  ＡＴＰａｓｅ活性の欠損が、高次ＴＤＰ−４３ポリマーの細胞局在化および核集合を妨害し、ＴＤＰ−４３のエクソンスキッピング能力を順次破壊することを示唆した。さらに、散発的または遺伝性のＦＴＬＤ／ＡＬＳ関連ＴＤＰ−４３変異（すなわち、ＴＤＰ−４３  Ｒ３６１Ｓ）も病因を加速することがわかった。したがって、オフパスウェイ化合物のバイカレインとＥＧＣＧは、ＴＤＰ−４３の不溶性非アミロイド病理学的凝集体を可溶性画分に分解し、インビボでの処理後２４時間で誤って折りたたまれた凝集体を減らすという１７−ＡＡＧとの相乗効果を効果的に生み出すことを発見した。注目すべきことに、バイカレインはＴＤＰ−４３繊維を分解するだけでなく、ＣＦＴＲのＴＤＰ−４３を介したエクソンスキッピングにより、疾患のＴＤＰ−４３タンパク質を活性なＴＤＰ−４３ポリマーに機能的に修正した。出願人は、疾患を引き起こすタンパク質の折り畳み状態を活性状態にリダイレクトすることにより、疾患タンパク質自体の機能の獲得および喪失、プリオン様拡散および標的外効果に由来する症状を含む、いくつかの誤って折り畳まれたタンパク質の病状を同時に解決できると考えている。神経変性の複数の誤って折りたたまれた疾患タンパク質を治療する単一の小化合物療法は、併発する混合プロテオパチーを有する患者の重篤で複雑な病状を緩和するための併用療法よりも安全であろう。
【００５９】
ＴＤＰ−４３タンパク質の細胞フォールディングを安定化する方法は、治療薬を投与することによって本明細書に提供される。一実施形態では、治療薬はフラボノイドであり、これはＴＤＰ−４３タンパク質の細胞フォールディングを安定化し（バイカレインの様々な実施形態については図１、２および３を参照）、それによりバイカレインはＴＤＰ−４３繊維をインビトロでポリマーにリモデリングすることにより、核内にはより多くのＴＤＰ−４３機能的コンフォーマーがある。さらに、イソオキサゾールは、ＴＤＰ−４３を含むプリオン様タンパク質のグループを捕捉し、イソオキサゾールがＴＤＰ−４３プロテオパチーの治療的介入においてバイカレインとして作用する可能性があることを示唆している。
【００６０】
＜不溶性ＴＤＰ−４３分解フラグメントおよび誤って折りたたまれたＴＤＰ−４３凝集体を低減するための方法＞
特定の理論に拘束されることなく、病理学的切断、ＡＬＳ関連突然変異または他の未知の細胞因子によるＴＤＰ−４３  Ｃ末端のＰＬＤの喪失は、ＴＤＰ−４３  Ｃ末端の細胞的またはプリオン様の折り畳みの破壊と、ＴＤＰ−４３タンパク質の分解によるＴＤＰ−４３分解フラグメントおよび／またはＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体の形成を引き起こすと考えられている。ＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体は、重度のニューロンの喪失とＴＤＰ−４３タンパク質障害の発症につながる可能性がある。
【００６１】
ＴＤＰ−４３分解フラグメントは可溶性であり、約２２から約２７ｋＤａである（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．， “Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｅｄ  ＴＤＰ−４３  ｉｎ  Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｌｏｂａｒ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４，  １３０  （２００６））。図２に示すように、ＴＤＰ−４３で分解されたフラグメントは、細胞質内でＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体の形成につながる可能性がある。
【００６２】
本明細書で提供される方法の様々な実施形態では、治療薬は、熱ショックタンパク質モジュレーター、ポリフェノール化合物、フラボノイド、または提供される医薬組成物に関して本明細書に記載される組み合わせのいずれかであり、不溶性のＴＤＰ−４３分解フラグメント或いは細胞、組織または被験体中でＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体のレベルを低下させる。細胞、組織、または被験体における不溶性ＴＤＰ−４３分解フラグメントおよび／またはＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれたフラグメントのレベルの低下は、被験体のＴＤＰ−４３プロテオパチーに有益な効果をもたらす可能性がある。その有益な効果は、ＴＤＰ−４３プロテオパチーのリスクまたは発生率の低下、ＴＤＰ−４３プロテオパチーの進行の減弱または抑制、神経変性の抑制、運動および／または神経機能の改善、ＴＤＰ−４３プロテオパチーの症状および徴候の減少、ＴＤＰ−４３プロテオパチーの進行、およびＴＤＰ−４３プロテオパチーを患っている被験者の寿命の延長。
【００６３】
本明細書に記載の方法は、ＴＤＰ−４３分解フラグメントおよび／またはＴＤＰ−４３の量の減少など、検出可能な量の不溶性ＴＤＰ−４３分解フラグメントおよび／またはＴＤＰ−４３誤って折りたたまれた凝集体を減少させるのに有用である。例えば、ＴＤＰ−４３分解断片および／またはＴＤＰ−４３誤って折りたたまれた骨材の量の減少、ＴＤＰ−４３分解断片および／またはＴＤＰ−４３誤って折りたたまれた凝集体の分解または解体、例えばＴＤＰ−４３誤って折りたたまれた凝集体の分解、ＴＤＰ−４３分解フラグメントを健康な細胞に関連する機能的なＴＤＰ−４３タンパク質への移行、または細胞または組織内のＴＤＰ−４３分解フラグメントおよび／またはＴＤＰ−４３誤って折りたたまれた凝集体の分布または分配の変更。
【００６４】
本明細書で提供される方法を実施するために、熱ショックタンパク質モジュレーター、ポリフェノール化合物、フラボノイド、または本明細書に記載の医薬組成物から選択される治療薬が、細胞、組織または被験体に、ＴＤＰ−４３分解フラグメントおよび／またはＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体を減少するのに有効な量で投与される。本明細書で提供される方法は、ＴＤＰ−４３プロテオパチーを治療または弱毒化する方法を含む治療方法および使用、ならびに被験体におけるＴＤＰ−４３プロテオパチーの量の確率を防止または低減する方法を含む予防方法を包含する。本明細書で提供される方法はまた、細胞、組織または被験体におけるＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれたフラグメントのＴＤＰ−４３分解フラグメントを低減するインビトロおよびエクスビボの方法を含む、研究方法および使用を包含する。細胞、組織または被験体における不溶性ＴＤＰ−４３分解フラグメントまたはＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれたフラグメントを低減するための薬剤の製造のための本明細書に記載の熱ショックタンパク質モジュレーター、ポリフェノール化合物、フラボノイドまたは医薬組成物の使用もまた、本明細書に記載の方法の実施形態に含まれる。
【００６５】
本明細書で提供される方法は、様々なＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体を低減する。一実施形態では、ＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体は、ＴＤＰ−４３の病理学的断片を模倣する、ＴＤＰ−４３のＣ末端の分解された断片の融合からの誤って折りたたまれた凝集体である。別の実施形態では、ＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体は、全長ＴＤＰ−４３タンパク質からの誤って折りたたまれた凝集体である。
【００６６】
ＴＤＰ−４３分解フラグメントおよびＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体は、罹患細胞の細胞質に位置し、アミロイド特異的コンゴーレッドと反応しないため、「非アミロイド構造」である。
【００６７】
ＴＤＰ−４３分解フラグメントまたはＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体を低減するために投与することができるＨＳＰモジュレーターの非限定的な例は、１７−ＡＡＧ、その薬学的に許容される塩、その誘導体、そのプロドラッグ、またはその構造類似体である。一実施形態では、１７−ＡＡＧの有効量は、約１５０ｎＭから約４００ｎＭである。
【００６８】
ＴＤＰ−４３分解フラグメントまたはＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体を低減するために投与することができるポリフェノール化合物の非限定的な例は、ＥＧＣＧ、その薬学的に許容される塩、その誘導体、そのプロドラッグ、またはその構造類似体である。
【００６９】
ＴＤＰ−４３分解フラグメントまたはＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体を低減するために投与することができるフラボノイドの非限定的な例は、バイカレイン、その薬学的に許容される塩、その誘導体、そのプロドラッグ、またはその構造類似体である。
【００７０】
本明細書で提供される方法による投与のために、熱ショックタンパク質モジュレーター、ポリフェノール化合物、またはフラボノイドは、単独で、または本明細書に記載の医薬組成物などの適切な医薬組成物に単独でまたは組み合わせて組み込まれる。
【００７１】
＜機能性ＴＤＰ−４３ポリマーを増加させる方法＞
ＶＣＰ／ｐ９７のＡＴＰａｓｅ活性がＴＤＰ−４３の細胞内局在とＴＤＰ−４３ポリマーの集合に関与していることが、出願人によって発見された（図４）。出願人はまた、ＨＳＰＢ１の発現が、ＴＤＰ−４３を介したエクソンスキッピングと結びついたアセンブリＴＤＰ−４３ポリマーに影響を及ぼし、新種（つまり、ＴＤＰ−４３を介したエクソンスキッピングを実行する核ＴＤＰ−４３ポリマー）がバイカレインに依存しない証拠を提供することを発見した（図５）。したがって、出願人は、ＶＣＰ／ｐ９７およびＨＳＰＢ１のＡＴＰアーゼ活性が、ＴＤＰ−４３コンフォーマー変換に影響を及ぼし、ＴＤＰ−４３ポリマーを増加させ、したがってＴＤＰ−４３プロテオパチーを修正するための効果的な薬物標的であることを発見した。
【００７２】
ＶＣＰ／９７突然変異Ｒ１５５Ｈを有するＦＴＬＤ／ＡＬＳにおけるＴＤＰ−４３プロテオパチーが特徴付けられた。ＶＣＰ／９７変異Ｒ１５５Ｈは、ＶＣＰ／９７の機能を変化させ、ＴＤＰ−４３をサイトゾルに再分配し、ＴＤＰ−４３の不溶性凝集体を形成する。ＣＦＴＲのＴＤＰ−４３を介したエクソンスキッピングの救済とＴＤＰ−４３ポリマーの増加の出現との間の機能的相関も、バイカレイン処理されたＶＣＰ／ｐ９７  Ｒ１５５Ｈ細胞で観察された（図３ｅ）。
【００７３】
ＶＣＰ／ｐ９７によって免疫沈降されたＴＤＰ−４３が少ないことが、ＴＤＰ−４３プロテオパチーのスペクトルにおいて示唆されており、これは、ＶＣＰ／ｐ９７とＴＤＰ−４３との間の相互作用の干渉が、散発性または遺伝性のＴＤＰ−４３プロテオパチー患者における病因の重要なステップであることを意味する。ＶＣＰ／ｐ９７とＴＤＰ−４３の相互作用に重大な欠陥があると、バイカレインで修正できるＴＤＰ−４３ポリマーの組み立てに失敗する。
【００７４】
細胞、組織または被験体における１つまたは複数の機能的ＴＤＰ−４３ポリマーの量を変更するために、ＶＣＰ／ｐ９７またはフラボノイド、例えばバイカレインおよびその誘導体および構造類似体のＨＳＰＢ１またはＡＴＰアーゼ活性のモジュレーターを使用する方法は次に提供する。ＨＳＰＢ１（ＨＳＰ２７としても知られる）モジュレーターの例には、ＨＳＰ２７に対するｓｉＲＮＡを含む。例示的な実施形態において、ＨＳＰ２７に対するｓｉＲＮＡは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８と少なくとも９０、９５または１００％同一である。
【００７５】
被験体における１つまたは複数のＴＤＰ−４３コンフォーマーの量を変更することは、被験体におけるＴＤＰ−４３プロテオパチーに有益な効果をもたらす可能性がある。例えば、限定されないが、ＴＤＰ−４３プロテオパチーの発生リスクの低下、ＴＤＰ−４３プロテオパチーの進行の減弱または抑制、神経変性の抑制、運動および／または神経機能の改善、ＴＤＰ−４３プロテオパチーの症状の軽減、進行の遅延ＴＤＰ−４３プロテオパチー、および被験体の寿命の増加。
【００７６】
本明細書で提供される方法の実施形態を実施するために、ＨＳＰＢ１ＲＮＡｉまたはＶＣＰ／ｐ９７プラスミドなどのタンパク質発現モジュレーター、またはバイカレインおよびその誘導体および構造類似体などのフラボノイドを、細胞、組織、または被験体における１つまたは複数のＴＤＰ−４３コンフォーマーを改変するのに有効な量で細胞、組織、または被験体に投与する。本明細書で提供される方法は、ＴＤＰ−４３プロテオパチーを治療または減弱する方法を含む治療方法および使用、ならびに対象におけるＴＤＰ−４３プロテオパチーの量の確率を防止または低減する方法を含む予防方法を包含する。この方法はまた、細胞、組織、または被験体における１つまたは複数の機能的ＴＤＰ−４３コンフォーマーの量を変更するインビトロおよびエクスビボの方法を含む研究方法および使用を包含する。細胞、組織または被験体における１つまたは複数の機能的ＴＤＰ−４３コンフォーマーの量を変更するための薬剤の製造のためのＨＳＰモジュレーターの使用もまた、本明細書に記載の方法の実施形態に含まれる。
【００７７】
本明細書で提供される方法は、様々なＴＤＰ−４３コンフォーマーの量を変えることを含む。ＴＤＰ−４３コンフォーマーの一例は、２００ｋＤａ以上の分子量を有する可溶性ＴＤＰ−４３ポリマーなどの可溶性ＴＤＰ−４３ポリマーである（「可溶性ＴＤＰ−４３コンフォーマー」）。
【００７８】
本明細書で提供される方法により、細胞、組織、または被験体における１つまたは複数のＴＤＰ−４３コンフォーマーの量を変更することは、検出可能な量のＴＤＰ−４３コンフォーマーの減少、例えばサイトゾル中の２００ｋＤａ以上のＴＤＰ−４３コンフォーマーの量の減少、ＴＤＰ−４３コンフォーマーの分解または解体、例えば不溶性ＴＤＰ−４３コンフォーマーの分解、ＴＤＰ−４３のあるコンフォーマーから別のコンフォーマーへの移行、例えばＴＤＰ−４３コンフォーマーに関連するＴＤＰ−プロテオパチーから健康な細胞に関連する機能的多量体への移行、または細胞または組織内のコンフォーマーの分布または分配の変化などを含む。
【００７９】
１つまたは複数のＴＤＰ−４３コンフォーマーの量を変更するために投与することができるフラボノイドのいくつかの例は、バイカレインおよびその誘導体および構造類似体である。
【００８０】
本明細書で提供される方法による投与のために、フラボノイドは、単独で投与されるか、または本明細書に記載されるように適切な医薬組成物に組み込まれ得る。
【００８１】
＜ＴＤＰ−４３プロテオパチーおよび早期老化を治療するための創薬可能経路としてのＴＤＰ−４３とラミンＡの機能的相互作用の方法＞
出願人は、ＴＤＰ−４３が、既知の繊維顆粒リボ核タンパク質と同様に、核中間径フィラメントラミンＡ／Ｃに接続された、球状構造に関連する分岐したこぶ状フィラメントからなる繊維顆粒ネットワークを形成することを観察した（図６および図７を参照）。
【００８２】
欠陥のあるラミンＡ変異体、早老症は、早期老化障害、ハッチンソン−ギルフォード早老症症候群（ＨＧＰＳ）を引き起こす。出願人は、早老症突然変異がＴＤＰ−４３ポリマー集合を妨害し、ＴＤＰ−４３媒介代替スプライシングの失敗をもたらすことを観察した。ＴＤＰ−４３の機能不全は、ＨＧＰＳ患者の代替スプライシングに大きな変化をもたらす可能性がある（図７）。重要なことに、加齢関連タンパク質によるＴＤＰ−４３のサイトゾル凝集の誘導は、ＴＤＰ−４３プロテオパチーにおける加齢依存性についての手がかりを明かす。
【００８３】
＜凝集しやすいドメインのプリオン様折り畳みのレベルを上げることによってＳＭＡを治療する方法＞
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、運動ニューロンの喪失および進行性の筋力低下を引き起こす。ＳＭＡ患者の９５％において、生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）遺伝子の両方の対立遺伝子が削除されるか、または遺伝子にミスセンス変異が含まれる。
【００８４】
ＳＭＮは、固有のプリオン様傾向を有し、ＳＭＮのホモおよびヘテロクロスβオリゴマー化を駆動して、Ｇｅｍｓ形成、ＳＭＮタンパク質安定性、および運動ニューロンの軸索伸長を調節することに留意されたい。疾患を引き起こすミスセンス変異と、タンパク質のエキソン７欠失（ＳＭＮΔ７）は、誤って折りたたまれた状態になり、機能的なプリオン様相互作用を無効にする。これらのタンパク質産物は不安定で、急速に分解されるようである。
【００８５】
バイカレインによるＳＭＮΔ７のプリオン様コンフォーマーの強制的再構築は、分解フラグメントの減少、タンパク質安定性の増加、他のプリオン様タンパク質とのプリオン様相互作用、すなわち、ＰＦＮ１、軸索伸長、およびＳＭＮΔ７を発現する培養運動ニューロンにおける細胞生存率とＳＭＡマウスの運動機能の改善（図１０を参照）。
【００８６】
ＳＭＡマウスにおけるＳＭＮΔ７の機能的欠損の回復はまた、ＴＤＰ−４３のプリオン様ドメインの過剰発現によって達成された（図１１を参照）。これらの発見は、ＳＭＡに正確に関連し、プリオン様活性を単に回復することによってＳＭＡを引き起こす突然変異を有する患者に、治療を提供するＳＭＮの固有の分子特性を明らかにした。
【００８７】
＜誤って折りたたまれたｐ５３凝集体を減少する方法＞
誤って折りたたまれたｐ５３凝集体は、悪性腫瘍、特に化学療法で治療された腫瘍またはｐ５３突然変異を有する高度に転移性の癌において一般的に観察される。ｐ５３に関連する癌の変異の３０〜４０％がタンパク質の構造に影響を及ぼし、その結果、凝集する傾向が高まる。現在知られているｐ５３凝集体陽性癌の種類には、乳がん、結腸がん、皮膚がん、卵巣がん、および前立腺がんが含まれる。ｐ５３凝集体は、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病で同定されたものと同様のアミロイドオリゴマーと原繊維を形成することが実験的に示されている。これらは、チオフラビンＴへの結合によりベータシートレジストリアミロイド構造を持つ。
【００８８】
＜ｐ５３プロテオパチーの薬物スクリーニングシステムの方法＞
有毒なアミロイドがどのように腫瘍形成を誘発するのかは不明である。この仮説を調査するインビボ実験は、ｐ５３凝集の誘導が同時にｐ５３腫瘍抑制活性を阻害し、それ自体が発癌につながる可能性があるため、腫瘍形成に対するｐ５３アミロイドの影響を分析する単純なシステムの欠如によって妨げられている。さらに、細胞培養に人工的にｐ５３繊維を追加して、細胞のｐ５３凝集体の形成を誘導すると、細胞死が引き起こされ、ｐ５３凝集体陽性癌が増殖の促進を示す臨床観察とは相容れない。その上、下流の発癌性エフェクターまたは経路のいずれも同定されていない。ここでは、自発的な野生型ｐ５３（Ｗｔ  ｐ５３）凝集が２９３Ｔ細胞で発生することを示し、ｐ５３アミロイドが臨床報告と同様に動作する誤って折りたたまれたｐ５３凝集体を研究できるようにした。我々は、４つの株：３つのｐ５３アミロイド株−ｐ５３［Ｌ］（長繊維）、ｐ５３［Ｓ］（短繊維）、ｐ５３［Ｐ］（点状凝集体）、及びｐ５３−ＮＶＡ株（可視的なｐ５３凝集体なし）を分離して単一のクローン増殖させた。個々のｐ５３アミロイド株の表現型は、親株から娘細胞に伝達された。これらの利点を利用して、ｐ５３凝集体のいくつかの重要な側面、特にそれらのプリオン特性、発癌性、およびそれらの下流エフェクターを調査した。注目すべきことに、２９３Ｔ細胞から分離されたユニークな４つのｐ５３株は、この細胞株が実際に細胞型の異種プールであることを示唆する。
【００８９】
出願人はまた、３つのｐ５３株凝集体が、核形成および水平感染などのいくつかのプリオン特徴を共有するだけでなく、他のプリオンまたはプリオン様タンパク質としての細胞機能にも影響を与えることを発見した。しかし、ｐ５３［Ｐ］株だけが他の細胞に感染することができる。
【００９０】
個々の表現型は、それら自身の別個の特徴を有している。生化学、免疫蛍光法、および遺伝子プロファイリングという一連の分析により、ＲＯＳの劇的な増加やｐ５３［Ｌ］株でのＨ３Ｋ２７ｍｅ３の喪失など、３つの株の異なる病態生理学が明らかにした。癌幹細胞マーカーであるＣＤ１３３の発現は、ｐ５３［Ｓ］およびｐ５３［Ｐ］株で有意に増加した。さらに、点状の表現型を示すｐ５３［Ｐ］株のみが細胞に感染することができ、非細胞自律的影響を示している。
【００９１】
＜ｐ５３凝集体によって誘発される誤調節タンパク質、抗アミロイド剤、ＨＳＰＢ１発現の低下、またはｐ５３プロテオパチーの創薬可能標的としてのｐ５３発現を増加させる方法＞
ｐ５３−ＮＶＡ株と比較して、ｐ５３凝集株は、加速された細胞増殖、上皮間葉転換（ＥＭＴ）活性化、癌幹細胞性の増加を示す。同定された一般的な下流エフェクターには、ホルモン関連濃度およびＥＧＦＲ経路に関与するタンパク質、ならびにｐ５３アミロイドの一般的な病理学的標的であるＨ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ＡｃおよびＤＮＭＴ１を含むエピジェネティックレギュレーターのグループが含まれる。
【００９２】
出願人は、ｐ５３凝集に関連するより低いＨＳＰＢ１発現が、ｐ５３株およびＨＳＰＢ１ノックダウン細胞で観察されたことを発見した。
【００９３】
出願人はまた、抗アミロイド剤を発見し、ｐ５３プラスミドの過剰発現は、２４時間以内にすべての株におけるｐ５３凝集を効果的に排除し、細胞生存率および癌幹細胞性を低下させ、誤って折りたたまれたｐ５３凝集体陽性癌を治療するための潜在的な戦略を提供する。
【００９４】
＜誤って折りたたまれた疾患タンパク質の感染性を遮断することによりアミロイド陽性癌および／または癌幹細胞を治療するための方法＞
アミロイドを含まない細胞へのｐ５３アミロイド抽出物の添加に続いて、出願人は、ｐ５３点状が感染性実体として動くことができることを観察した。
【００９５】
ｐ５３凝集体は他の細胞や組織に感染する可能性があり、癌の進行中にプリオン様伝達が起こる可能性があることを示唆している。したがって、ワクチンまたはペプチドを使用して凝集陽性腫瘍を予防および／または治療するための２つの潜在的な治療戦略を提案した。抗アミロイド免疫療法戦略のための抗原は、誤って折りたたまれたタンパク質凝集の核形成および／または伝達を遮断することができる「化学修飾および／または変異」タンパク質フラグメント、ペプチド、誘導体、およびそれらの変異体として設計される。これらの抗原ペプチドは核形成を阻止できるため、アミロイド形成性疾患を治療するための治療ペプチドとして、治療にさらに適用することができる。神経変性関連凝集体に対するワクチンの現在のアプローチは、プリオンの種子に接種し、プロテオパチーを引き起こす可能性のある病理学的コンフォメーション抗原を再構築することである。実際、ヒトの病理学的Ａβおよびα−シヌクレインがプリオンのように増殖するという証拠が最近示唆されている（Ｊａｕｎｍｕｋｔａｎｅ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５；Ｐｒｕｓｉｎｅｒ  ＳＢ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）。
【００９６】
ｐ５３点状物は感染性実体として振る舞うことができ、ｐ５３自己抗体が癌患者で発見されたので、我々は、患者のｐ５３の誤って折りたたまれたタンパク質に対する特定の自己抗体を生成するために、免疫応答を誘発可能のｐ５３の誤って折りたたまれた凝集体の伝達を提案した。同様のメカニズムは、神経変性疾患や子癇前症などの他のアミロイド形成性疾患でも発生する可能性がある。したがって、プロテオパチータンパク質の自己抗体および／または誤って折りたたまれた患者の凝集体を検出することで、健康な人や関連疾患のある患者の初期のプロテオパチーを評価できる。血漿またはＣＳＦ中の疾患凝集体は、フラボノイド、ポリフェノール、またはポリペプチドを含む凝集体結合分子によって検出できる。その結合分子は例えば、ｐ５３、ＴＤＰ−４３、アミロイドオリゴマー、Ｔａｕ、ベータアミロイド、ＩＡＰＰ、ＰｒＰＳＣ、ハンチンチン、カルシトニン、心房ナトリウム利尿因子、アポリポタンパク質Ａ１、血清アミロイドＡ、メディン、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、ベータ２ミクログロブリン、ゲルゾリン、ケラトエピテリン、シスタチン、免疫グロブリン軽鎖ＡＬ、Ｓ−ＩＢＭ、炭酸アンヒドラーゼＩＩ、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）、Ｆｕｓ、およびα−シヌクレインの凝集体またはオリゴマーに結合するヒト抗体、免疫グロブリン鎖、フラグメント、誘導体、およびそれらの変異体。
【００９７】
＜二次凝集しやすいタンパク質のダウンレギュレーションによるアミロイド陽性癌および／または癌幹細胞の治療方法＞
出願人は、ｐ５３アミロイド陽性コンテンツでＴＤＰ−４３とｐ５３の相互作用を発見した（図１３）。ここで、ＴＤＰ−４３はｐ５３アミロイドとの関連で他のプリオン様タンパク質であるため、ＴＤＰ−４３を二次凝集しやすいタンパク質と呼ぶ。Ｐ５３は一次凝集タンパク質である。
【００９８】
出願人はまた、ＴＤＰ−４３  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞において、ｐ５３アミロイド繊維の有意な減少が見出されたことを発見した（図１３ｆおよびｇ）。
【００９９】
＜アミロイドを妨害することによってＴＤＰ−４３プロテオパチーを治療するための方法＞
出願人は、ｐ５３アミロイド株が他の凝集しやすいタンパク質の特徴および細胞機能を調節できることを発見した。ＴＤＰ−４３の場合、ＣＦＴＲエクソン９をスキップする能力に順次影響を与えるＴＤＰ−４３凝集傾向の変化が含まれている（図１３ａ−ｅ）。
【０１００】
＜医薬組成物＞
ＴＤＰ−４３タンパク質の細胞フォールディングを安定化、ならびにＴＤＰ−４３分解フラグメントおよびＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体を減少するための医薬組成物が本明細書で提供される。本明細書で提供される医薬組成物は、好ましくは組み合わせの有利な相乗効果によって、ＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体を低減するのに有用である。
【０１０１】
一実施形態では、医薬組成物は、熱ショックタンパク質モジュレーター、例えば１７−ＡＡＧ、その誘導体、その薬学的に許容される塩、またはそのプロドラッグと、ポリフェノール化合物、例えばＥＧＣＧ、その誘導体、その薬学的に許容される塩、またはそのプロドラッグとの組み合わせを含む。必要に応じて、医薬組成物は、フラボノイド、例えばバイカレイン、その誘導体、その薬学的に許容される塩、またはそのプロドラッグをさらに含む。
【０１０２】
別の実施形態では、医薬組成物は、熱ショックタンパク質モジュレーター、例えば１７−ＡＡＧ、その誘導体、その薬学的に許容される塩、またはそのプロドラッグと、フラボノイド、例えばバイカレイン、その誘導体、その薬学的に許容される塩、またはそのプロドラッグとの組み合わせを含む。必要に応じて、医薬組成物は、ポリフェノール化合物、例えばＥＧＣＧ、その誘導体、その薬学的に許容される塩、またはそのプロドラッグをさらに含む。
【０１０３】
別の実施形態では、医薬組成物は、ポリフェノール化合物、例えばＥＧＣＧ、その誘導体、その薬学的に許容される塩、またはそのプロドラッグと、フラボノイド、例えばバイカレイン、その誘導体、その薬学的に許容される塩、またはそのプロドラッグとの組み合わせを含む。必要に応じて、医薬組成物は、熱ショックタンパク質モジュレーター、例えば１７−ＡＡＧ、その誘導体、その薬学的に許容される塩、またはそのプロドラッグをさらに含む。
【０１０４】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態の方法に従って投与される医薬組成物は、医薬的に許容される担体を用いて容易に処方、調製、または投与することができる。このような調製物は、様々な技術によって調製することができる。そのような技術には、医薬組成物と適切な担体の活性成分（フラボノイド、熱ショックタンパク質モジュレーターまたはポリフェノール化合物など）を関連付けることが含まれる。一実施形態では、医薬組成物は、医薬組成物の活性成分を液体担体、固体担体、またはその両方と均一かつ密接に結合させることによって調製される。液体担体には、水性製剤、非水性製剤、またはその両方が含まれるが、これらに限定されない。固体担体には、生物学的担体、化学担体、またはその両方が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
医薬組成物は、水性懸濁液、油型乳濁液、油中水型乳濁液および水中油型水型乳濁液、ならびにクリーム、ゲル、リポソーム（中性、アニオン性またはカチオン性）、脂質ナノスフェアまたはミクロスフェア、中性、アニオン性またはカチオン性ポリマーナノ粒子またはマイクロ粒子、部位特異的エマルジョン、長期滞留エマルジョン、粘着性エマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、ミクロスフェア、ナノスフェア、ナノ粒子およびミニポンプ、およびアニオン性、中性またはカチオン性多糖類およびアニオン性、中性カチオン性ポリマーまたはコポリマーを含む医薬組成物の持続放出を可能にする様々な天然または合成ポリマー、を含む担体で投与されるが、これらに限定されない。ミニポンプまたはポリマーは、医薬組成物の送達が必要な場所の近くに埋め込む必要がある。さらに、本明細書で提供される医薬組成物の活性成分は、担体のいずれか１つまたは任意の組み合わせで有用である。これらには、抗酸化剤、緩衝剤、および静菌剤が含まれるが、これらに限定されない、必要に応じて懸濁剤及び増粘剤を含む。
【０１０６】
非水性担体での投与の場合、本明細書で提供される医薬組成物の活性成分は、鉱油、またはジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、脂質、油およびそれらの混合物などの中性油で乳化されるが、これらに限定されない。ここでの油は、多価不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸の適切な混合物を含む。例としては、大豆油、カノーラ油、パーム油、オリーブ油、およびミグリオールが挙げらるが、これらに限定されない。そのうち、脂肪酸炭素の数は１２〜２２であり、脂肪酸は飽和または不飽和であり得る。必要に応じて、荷電脂質またはリン脂質を中性油に懸濁させる。適切なリン脂質は、マクロファージ上の受容体を標的とするホスファチジルセリンであるが、これに限定されない。本明細書で提供される医薬組成物は、必要に応じて、既知の技術を使用して水性媒体中、またはエマルジョンとして処方される。
【０１０７】
本明細書で提供される医薬組成物は、必要に応じて、本明細書以外の場所に記載される活性剤、そして他の治療および／または予防成分を含み得る。担体および他の治療成分は、組成物の他の成分と適合性があり、そのレシピエントに有害ではないという前提で許容可能でなければならない。
【０１０８】
医薬組成物は、ＴＤＰ−４３分解フラグメントおよび／またはＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体を低減するために、またはヒトを含む動物において治療反応を誘発するために有効な量で投与される。投与される医薬組成物の投与量は、治療される状態、特定の製剤、および受容者の体重および状態ならびに投与経路などの他の臨床的要因に依存するであろう。一実施形態では、投与される医薬組成物の量は、用量あたり約０．００００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの活性成分に対応する。別の実施形態において、投与される医薬組成物の量は、用量あたり約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの活性成分に対応する。さらなる実施形態において、投与される医薬組成物の量は、用量あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの活性成分に対応する。別の実施形態において、投与される医薬組成物の量は、用量あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇの活性成分に対応する。さらなる実施形態において、投与される医薬組成物の量は、用量あたり約０．１ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの活性成分に対応する。
【０１０９】
本明細書で提供される医薬組成物の有用な投与量は、それらのインビトロ活性、および動物モデルにおけるインビボ活性を比較することによって決定される。マウスおよび他の動物における有効な投与量をヒトに外挿するための方法は、当技術分野で知られている。例えば、米国特許第４，９３８，９４９号は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
本明細書で提供される方法によれば、医薬組成物は、注射（例：皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内）；継続的な静脈内注入；皮膚；皮膚；経皮的に；経口（例：錠剤、ピル、薬液、食用フィルムストリップ）；埋め込まれた浸透圧ポンプ；坐剤；またはエアゾールスプレーを含む様々な経路のいずれかによって送達されるが、これらに限定されない。投与経路には、局所、皮内、髄腔内、病変内、腫瘍内、膀胱内、膣内、眼内、直腸内、肺内、脊髄内、皮膚、皮下、関節内、体腔内への配置、経鼻吸入、肺吸入、皮膚に付着およびエレクトロポレーションが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
投与経路に応じて、許容可能な担体中に本明細書で提供される用量あたりの医薬組成物の体積は、約０．００１ｍｌから約１００ｍｌである。一実施形態では、許容可能な担体中の医薬組成物の体積は、用量あたり、約０．０１ｍｌから約５０ｍｌである。別の実施形態において、許容可能な担体中の医薬組成物の容量は、用量あたり、約０．１ｍｌから約３０ｍｌである。医薬組成物は、単回投与治療または複数回投与治療で、スケジュールに従って、または治療される疾患、受容者の状態および投与経路に適切な期間にわたって投与することができる。所望の用量は、都合よく単回用量で、または適切な間隔で投与される分割用量として、例えば、１日あたり２、３、４、またはそれ以上のサブ用量として提供され得る。サブ用量自体は、例えば、さらにいくつかの個別のゆるい間隔の投与に分割することができる。
【０１１２】
＜コンフォメーション病のためのインビトロ薬物スクリーニング方法＞
バイカレインは、既存のＴＤＰ−４３凝集体をインビトロおよびインビボで可溶性ポリマー状態にリモデリングする（図１および図３）。ＴＤＰ−４３の可溶性ポリマーは、生物学的機能を果たし、例えばＣＦＴＲのエクソンスキッピング（図３および図５）。
【０１１３】
バイカレインは、加齢関連疾患の複数の細胞ベースのモデルにおいて、誤って折りたたまれたＴＤＰ−４３タンパク質の生物活性を回復させる（図３および図７）。
【０１１４】
ＴＤＰ−４３のバイカレイン誘導ポリマーは、ＴＤＰ−４３の核機能を実行する。これは、プリオン様ＬＣタンパク質の重合を使用して、コンフォメーション病の治療候補をスクリーニングし、コンフォメーション病の誤って折りたたまれたプリオン様疾患タンパク質の生物活性を回復できることを示唆している。
【実施例】
【０１１５】
本発明は以下の実施例によってさらに説明される。実施例はいかなる方法でも本発明の範囲を制限することは意図されない。一方、手段は多くの他の実施態様、変更および等価手段を有し、本明細書に記載する説明を読んだ後に、本発明の精神および特許請求の範囲の記載から離れることなく明確に理解されるべきである。以下の実施例に記載される研究において、特に明記しない限り、従来の手順に従う。説明のために、いくつかの手順を以下に説明する。
【０１１６】
＜実施例で使用されている材料と方法の説明＞
以下の実施例では、以下の材料および方法を使用した。
【０１１７】
細胞培養および薬物治療：２９３Ｔ細胞が実験研究を通して使用された。２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％Ｌ−グルタミン酸を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２で増殖させた。ラット海馬ニューロンの初代培養物は、以前に記載されたように（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，ＴＤＰ−４３，ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ＦＴＬＤ−Ｕ，ｉｓ  ａ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１０５，７９７-８０６（２００８））、１７日目のラット胚から調製された。ラットを取り扱うためのすべての手順は、中央研究院の動物実験委員会によって承認されたガイドラインに従って実施された。海馬細胞をポリ−ｌ−リジンでコーティングしたカバースライドに低密度（１０，０００細胞／ｃｍ２）でプレーティングし、神経基礎培地／Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。２９３Ｔ細胞は、製造元の指示に従ってリン酸カルシウムプロトコルを使用して、Ｗａｎｇらによって以前に記載されたように（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ  ＵＳＡ．９９，１３５８３−１３５８８（２００２））トランスフェクトした。すべてのプラスミド構築物は、（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，２０１２）に記載された。２９３Ｔ細胞（１ｘ１０５）を６ウェルプレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターで一晩インキュベートした。病理学的凝集体の減少に対する経路外安定剤の効果を決定するために、細胞を、示された濃度（２５または５０μＭ）で１２、２４、または４８時間バイカレインおよびＥＧＣＧで処理した。バイカレイン、ＥＧＣＧ、および１８０ｎＭの１７−ＡＡＧの病理学的凝集体の減少に対する相乗効果を決定するために、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３−ＩＩＰプラスミドによるトランスフェクションの２４時間後に細胞を前記配合剤で処理した。
【０１１８】
試薬および抗体：バイカレインおよびＥＧＣＧはＳｉｇｍａから入手した。１７−ＡＡＧはＳｉｇｍａから購入し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。ＨＳＰＢ１に対する一次抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した。ラミンＡ／Ｃに対する一次抗体はＭｉｌｌｉｐｏｒｅＩｎｃから購入した。Ｕ１ｓｎＲＮＰＣに対する一次抗体はＳｉｇｍａから購入した。ＤＮＭＴ１、ｅＩＦ４Ａ１、ｐ−ＥＧＦＲ、ＨＩＦ１−αに対する一次抗体はＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ．ｃｏｍから購入した。ＣＤ１３３に対する一次抗体はａｂｃａｍ．ｃｏｍから購入した。
【０１１９】
限界希釈による単一ｐ５３株の単離：２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２で最終濃度１細胞／１００μｌまで希釈した。９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌの細胞懸濁液を播種し、２週間培養した。単一コロニーを含むウェルのみがさらに拡張された。
【０１２０】
ＴＤＰ−４３およびｐ５３の溶解度アッセイ：ＴＤＰ−４３−ＦＬまたはＴＤＰ−４３−Ｑ３０３Ｐのトランスフェクションを伴うまたは伴わない細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、ｐＨ７．４）で溶解した。そして溶解物を１６，０００ｇで５分間４℃で遠心分離することによりさらに分画した。次に、不溶性ペレットを８Ｍ尿素／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に溶解した。タンパク質は、ポリクローナルＴＤＰ−４３抗体またはモノクローナルｐ５３抗体を使用したウエスタンブロッティングによって同定した。
【０１２１】
ＴＤＰ−４３繊維形成のインビトロ分析：３マイクロモルの全長ＴＤＰ−４３組換えタンパク質（ＧｅｎＷａｙ）を、アセンブリー緩衝液中で３μＭのバイカレインと共にインキュベートした。反応は、ＲＴで撹拌しながら３０分、６０分、および９０分間行った。得られたサンプルを４％酢酸ウラニルで１分間染色した。ＥＭ分析は、ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｇ２  ＳｐｉｒｉｔＴＷＩＮ透過型電子顕微鏡を使用して実行された。
【０１２２】
感染アッセイ：ｐ５３  ［Ｌ］、［Ｓ］、または［Ｐ］細胞をＰＢＳですすぎ、そして１ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁した。遠心分離後、上清と再懸濁したペレットをプレートしたｐ５３−ＮＶＡレシピエント細胞に加えた。曝露の２４時間後、細胞をＰＢＳでリンスし、ｐ５３特異的抗体（１Ｃ１２；  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃２５２４）抗体を使用して免疫染色のために固定した。
【０１２３】
ｓｉＲＮＡおよびトランスフェクション：ＨＳＰＢ１（ＨＳＰ２７）およびＴＤＰ−４３に対するｓｉＲＮＡは、それぞれ、サンタクルス（ＳＣ−２９３５０）およびダルマコンから購入した。過剰発現およびノックダウン実験では、製造元のガイドラインに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、個々のプラスミド（３μｇ）またはｓｉＲＮＡ（２５または６０ｐｍｏｌ）を２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトした。
【０１２４】
プラスミド：ＨＳＰＢ１およびｐ５３Ｒ２８０Ｓは、プライマーセットＨＳＰＢ１およびＲ２８０Ｓを使用するＰＣＲによって、ヒトｃＤＮＡから個別に増幅された。得られたフラグメントをさらにｐＥＧＦＰ−Ｎ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）にクローン化した。ＧＦＰ−ｐ５３は、ＧＦＰ−Ｐ５３Ｒ２８０Ｓをテンプレートとして使用した部位特異的変異誘発によって生成された。部位特異的変異誘発は、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ＨＳ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ）とプライマーセットＳ２８０Ｒを使用した標準プロトコルに従って実行された。
【０１２５】
免疫組織化学：以前に記載されたように（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、蛍光染色を実施した。プラスミドまたはｓｉＲＮＡを含むまたは含まない状態で細胞をトランスフェクトし、２４〜４８時間増殖させた。細胞をＰＢＳ中の３．７％パラホルムアルデヒドでＲＴで１５分間固定し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理した。固定した細胞を一次抗体とＲＴで２時間インキュベートした後、Ｃｙ２−またはＣｙ３−で標識した二次抗体（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）とインキュベートした。スライドは、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ＤＡＰＩ  Ｈ−１２００（Ｖｅｃｔｏｒ）を使用してマウントした。ＬＳＭ７１０  ＭＥＴＡレーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、細胞の蛍光画像を収集した。
【０１２６】
選択的スプライシングアッセイ：ＴＤＰ−４３を介したＣＦＴＲエクソン９スキッピングアッセイを以前に記載されたように実施した。簡単に説明すると、細胞にＴＤＰ−４３プラスミド、ｈＣＦ−（ＴＧ）１３（Ｔ）５ミニ遺伝子、およびＶＣＰ／ｐ９７  ｗｔ、ＶＣＰ／ｐ９７  ＱＱ、ＨＳＰＢ１、ラミンＡまたは早老症、またはＨＳＰＢ１  ｓｉＲＮＡを含む示されたプラスミドを同時トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞のトータルＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分離され、ＲＴ−ＰＣＲはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、製造元のプロトコルに従ってＣＦＴＲのエクソン８〜１０を増幅する特定のプライマーを使用して実行された。ｃＤＮＡの相対量は１．３％アガロースゲルで検証された。
【０１２７】
統計分析：統計的有意性は、分散分析（ｔ検定）によって計算された。Ｐ値が＜０．０５の場合、グループ間の差は有意であると見なされる。
【０１２８】
マウス：ＳＭＡのマウスモデルは、Ｓｍｎ遺伝子のエキソン７を削除し、ヒトＳＭＮ２遺伝子（Ｓｍｎ−／−ＳＭＮ２＋／−）をノックインすることによって作製された。より均質な遺伝的背景を得るために戻し交配により、より重篤な疾患の症状を示す変異体を生成することができた。重度のＳＭＡのこのモデルには、ＳＭＮ２導入遺伝子の２つのコピー（Ｓｍｎ−／−ＳＭＮ２＋／−）が含まれる。ＳＭＡのマウスモデルは、ヘテロ接合型ノックアウトマウス（Ｓｍｎ＋／−ＳＭＮ２−／−）と、ＳＭＮ２導入遺伝子のコピーを２つ持つホモ接合型ノックアウトマウス（Ｓｍｎ−／−ＳＭＮ２＋／＋）を交配することで作成された。ＳＭＡマウスは、バイカレイン（アルコール中４０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）またはアルコールのみ（対照）を出生時から毎日腹腔内注射し、運動機能検査と生存分析を行う。前述のように、ＳＭＡ（Ｓｍｎ−／−ＳＭＮ２＋／−）およびヘテロ接合性同腹仔（Ｓｍｎ＋／−ＳＭＮ２＋／−）のマウスの運動機能を評価するために、３つの行動テスト、ターンオーバーテスト、チューブテスト、および負のジオタキシステストが実施された。ターンオーバーテストでは、マウスが自分自身を直立させ、腹臥位から４本の足すべてを地面に置くのに必要な時間を記録した（カットオフ時間は６０秒でした）。チューブテストは、後肢と尾の姿勢に従って後肢の強度を決定するために使用された。スコアは０（最低）から４（最高）の範囲でした。負のジオタキシス試験では、マウスを頭を下に向けて４５°の傾斜に置いた。応答（方向転換とよじ登り）は、０（最悪）から４（最高）までスコアリングされた。
【０１２９】
Ｂ−ｉｓｏｘ沈殿：２９３Ｔ細胞を収集し、そしてＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。タンパク質濃度を１〜１０ｍｇ／ｍＬに調整し、１０ｍＭビオチン化イソオキサゾールを細胞溶解物に添加して最終濃度を１００〜２００μＭにした。次に、混合物を４℃で６０分間インキュベートし、１５０００ｒｐｍで１５分間４℃で遠心分離し、上澄みを廃棄した。全反応容量をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングに供した。
【０１３０】
実施例
＜実施例１：オフアミロイド経路化合物であるバイカレインは、インビトロで天然に折りたたまれていないモノマーと誤って折りたたまれたＴＤＰ−４３繊維をＴＤＰ−４３ポリマーにリモデリングする＞
ＴＤＰ−４３の非アミロイドプリオン様ドメインの、ｓｕｐ３５のアミロイドプリオンドメインによる機能的置換は、ＴＤＰ−４３プロテオパチーをオフアミロイド安定剤で治療するための潜在的な共通の構造を明らかにした。我々の仮説を検証するために、いくつかの既知のオフアミロイド経路化合物を選択し、ＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体の分解に対するそれらの効果を検証した。精製されたＴＤＰ−４３組換えタンパク質を、これらのオフパスウェイ化合物（等モル濃度）を含むまたは含まない状態で、アセンブルバッファー中で室温で０、３０、６０、および９０分間撹拌しながらインキュベートした。経路外化合物の効果は、ネガティブ染色電子顕微鏡法によって調べられた。これらの化合物がない場合、ＴＤＰ−４３繊維の長さは３から１０μｍに徐々に増加した（図１ａ）。バイカレインの存在下で、ＴＤＰ−４３繊維、オリゴマー、または天然に折りたたまれていないモノマーは、規則正しいＴＤＰ−４３ポリマーに効率的にリモデリングされ、ＴＤＰ−４３タンパク質は、時間依存的に、ストリングに沿った球状構造（長さ約３０ｎｍ）に近似した（図１ｂ）。矢印は、ＴＤＰ−４３ポリマーの代表的な高倍率画像を示す。バイカレイン誘導ＴＤＰ−４３ポリマーは、長さが０．１５〜０．９μｍで、ＴＤＰ−４３繊維よりもかなり短い。異なる時点でのＴＤＰ−４３繊維とＴＤＰ−４３ポリマーの長さを分析した（図１ｃ）。特に、プロト繊維などの管状構造とは異なり、これらのバイカレイン誘導ＴＤＰ−４３ポリマーは高度に分岐した構造を持ち、分岐は徐々に増加して、反応時間の増加とともに規則正しいマクロ複合体を形成した（図１ｄ）。分岐点の１つは、図１ｂの下のパネルに矢印で示す。図１ｅは、ＴＤＰ−４３ポリマーの重合の２つの選択された画像を示す。これらの結果は、バイカレインがＴＤＰ−４３繊維に直接結合して分解し、凝集状態をＴＤＰ−４３ポリマーに変換したことを示す。
【０１３１】
＜実施例２：バイカレイン、ＥＧＣＧおよび１７−ＡＡＧはインビボで病理学的ＴＤＰ−４３封入体を分解する＞
次に、本発明者らは、インビボでのＴＤＰ−４３の誤って折りたたまれた凝集体の分解に対するバイカレインの効果を検証した。ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３病理学的（ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３−ＩＩＰＬＤ）封入体発現２９３Ｔ細胞を、顕微鏡分析およびウエスタンブロッティング検証に続いて、５０μＭバイカレインを含むまたは含まない状態で１２時間処理した。図２ａに示すように、バイカレインはＴＤＰ−４３−ＩＩＰＬＤタンパク質性核形成粒子の集合を阻害した（矢印はＴＤＰ−４３−ＩＩＰＬＤ凝集体を示す）。統計分析は、バイカレインによるＴＤＰ−４３−ＩＩＰＬＤ凝集体の用量依存的な減少を示した（図２ｂ）。さらに、ウエスタンブロッティングは、バイカレイン処理細胞における不溶性ＴＤＰ−４３−ＩＩＰＬＤタンパク質の減少を示した（図２ｃ）。高用量のバイカレイン（３０−４００μＭ）で処理された細胞は、可溶性画分の有意な代償的増加を示し、バイカレインが分解を促進する代わりに病理学的ＴＤＰ−４３凝集体を分解したことを示唆する（図２ｃ）。同様に、他の経路外安定剤であるＥＧＣＧも、ＴＤＰ−４３タンパク質性核形成粒子を減少させ、可溶性ＴＤＰ−４３−ＩＩＰＬＤタンパク質を増加させることが示された（図２ｄ、２ｅ、および２ｆ）。バイカレインとＥＧＣＧの２つの経路外化合物が、ＴＤＰ−４３の病理学的凝集体を分解し、細胞ベースの疾患モデルで可溶性画分にリダイレクトすることを発見した（図２ａ−ｆ）。
【０１３２】
より低用量での潜在的な治療および効果的な抗凝集化合物との併用療法をさらに調査するために、７または２４時間での治療後（図２ｇ、２ｈおよび２ｉ）の、バイカレイン、ＥＧＣＧおよび１７−ＡＡＧを含むオフＴＤＰ−４３凝集化合物の相乗効果を検証した。バイカレインとＥＧＣＧまたは１７−ＡＡＧは、処理後７時間および２４時間でＴＤＰ−４３−ＩＩＰＬＤの誤って折りたたまれた凝集体の減少に相乗効果を示すことがわかった（図２ｈおよび２ｉ）。
【０１３３】
＜実施例３：バイカレインによるＦＴＬＤ−ＵおよびＡＬＳのＶＣＰ９７遺伝性突然変異細胞ベースのモデルにおけるＴＤＰ−４３機能障害の救済＞
次に、バイカレインが疾患のＴＤＰ−４３タンパク質を機能的に救済できるかどうかを試験した。ＶＣＰ／９７変異Ｒ１５５Ｈを伴うＦＴＬＤ／ＡＬＳのＴＤＰ−４３プロテオパチーが特徴づけられている。ＶＣＰ／９７変異Ｒ１５５Ｈは、ＶＣＰ／９７の機能を変化させ、ＴＤＰ−４３をサイトゾルに再分配し、ＴＤＰ−４３の形態不溶性凝集体をもたらす。機能的なＴＤＰ−４３タンパク質はＣＦＴＲエクソン９スキッピングを促進できるため、バイカレインの存在下での細胞ＴＤＰ−４３タンパク質のフォールディング状態を検証するためにインビボスプライシングアッセイを使用した（図３ａ）。重要なことに、ＴＤＰ−４３とＶＣＰ／ｐ９７  Ｒ１５５Ｈ変異体でコトランスフェクトされた細胞では、ＴＤＰ−４３はＣＦＴＲエクソン９スキッピングを促進できなかった。しかし、この失敗はバイカレインの存在下で修正された（図３ａ）。バイカレインのみで処理された細胞は、ＴＤＰ−４３を介したＣＦＴＲエクソン９のスキップを用量依存的に促進する増強された能力を示した（図３ｂ）。ＴＤＰ−４３タンパク質を共過剰発現しないと、バイカレインはＣＦＴＲのエクソンスキッピングに影響を与えなかった（図３ｃ）。これは、ＣＦＴＲのエクソンスキッピングの促進に対するバイカレインの効果がＴＤＰ−４３タンパク質を介して発生することを示唆している。これらの結果は、バイカレインがＶＣＰ／９７変異誘発性疾患モデルにおいてＴＤＰ−４３疾患タンパク質を機能的に修正したことを示した。図１に示すように、バイカレインはＴＤＰ−４３繊維をリモデリングし、ＴＤＰ−４３モノマーをポリマーにネイティブに展開するため、バイカレイン処理細胞のＴＤＰ−４３タンパク質種を分析することにより、バイカレインの薬理作用をさらに調査した。ＴＤＰ−４３ポリマーは、バイカレイン処理細胞の不溶性尿素画分を大幅に減少させたが、核画分を代償的に増加させることを発見した（図３ｄ、矢印で示す）。ＣＦＴＲのＴＤＰ−４３を介したエクソンスキッピングの救済とＴＤＰ−４３ポリマーの増加の出現との間の機能的相関も、バイカレイン処理されたＶＣＰ／ｐ９７  Ｒ１５５Ｈ細胞で観察された（図３ｅ）。これらの結果は、ＣＦＴＲのエクソンスキッピングを促進するＴＤＰ−４３の能力が可溶性ＴＤＰ−４３ポリマーと関連していることを示した。残念ながら、ＥＧＣＧは、高次ＴＤＰ−４３ポリマーではなく、ｍＲＮＡプロセッシングでＴＤＰ−４３の機能不全を修正するには不十分な１３０  ｋＤＴＤＰ−４３のレベルを増加させた。この結果は、バイカレインとＥＧＣＧの薬理作用の違いを示唆している。
【０１３４】
＜実施例４：ＶＣＰ／ｐ９７のＡＴＰａｓｅ活性は、ＴＤＰ−４３ポリマーの組み立てとＴＤＰ−４３を介したエクソンスキッピングに関与している＞
本発明者らは、ＶＣＰ／ｐ９７のＡＴＰアーゼ活性が、ＴＤＰ−４３の細胞局在化およびＴＤＰ−４３ポリマーの集合に関与しているかどうかをさらに調査した。野生型ＶＣＰ／ｐ９７またはＡＴＰａｓｅ欠損ＶＣＰ／ｐ９７変異体ＶＣＰ／ｐ９７−ＱＱでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるＴＤＰ−４３タンパク質の局在とＴＤＰ−４３ポリマーを分析した（図４ａおよび４ｂ）。我々は、ＶＣＰ／ｐ９７−ＱＱを発現する細胞でＴＤＰ−４３がサイトゾル凝集体を形成することを発見した（図４ａ、矢印）。ＴＤＰ−４３ポリマーは、ＶＣＰ／ｐ９７−ｗｔでトランスフェクトされた細胞の用量依存的な増加を示した（図４ｂ、矢印）。逆に、ＶＣＰ／ｐ９７−ＱＱ発現細胞では徐々に減少するＴＤＰ−４３ポリマーが観察された（図４ｃ、矢印）。インビボスプライシングアッセイはさらに、ＶＣＰ／ｐ９７−ＱＱがＴＤＰ−４３を介したＣＦＴＲエクソン９スキッピングを抑制したことを明らかにした（図４ｄ）。次に、バイカレインがＣＦＴＲエクソン９スキッピングに対するＴＤＰ−４３のＶＣＰ／９７−ＱＱ誘発性不能を救済できるかどうかをテストし、バイカレインがＶＣＰ／ｐ９７−ＱＱ発現細胞でＣＦＴＲエクソン９スキッピングを増加させることを発見した（図４ｅ）。クロスＩＰ検査により、ＶＣＰ／ｐ９７がＴＤＰ−４３と物理的に相互作用することが明らかにした。これは、Ｇｉｔｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．による研究と一致している（図４ｆ）。ＶＣＰ／ｐ９７−ｗｔと比較してＴＤＰ−４３とＶＣＰ／ｐ９７−ＱＱの共免疫沈降効率が低いことが観察された。これは、ＴＤＰ−４３とＶＣＰ／ｐ９７の相互作用で機能して高次ＴＤＰ−４３ポリマーの形成を調節するＶＣＰ／ｐ９７ＡＴＰａｓｅ活性が示唆された。注目すべきことに、ＶＣＰ／ｐ９７によって免疫沈降されたＴＤＰ−４３の減少は、ＴＤＰ−４３プロテオパチーのスペクトルで示唆されている。これは、ＶＣＰ／ｐ９７とＴＤＰ−４３の間の相互作用の干渉が、散発性または遺伝性のＴＤＰ−４３プロテオパチーの患者における病因の重要なステップであることを意味する。ＶＣＰ／ｐ９７とＴＤＰ−４３の相互作用に重大な欠陥があると、バイカレインで修正できるＴＤＰ−４３ポリマーの組み立てに失敗する。
【０１３５】
さらに、バイカレインが疾患関連ＴＤＰ−４３変異体を機能的に修正できるかどうかを調べるために、ＦＴＬＤ／ＡＬＳ関連散発性変異ＴＤＰ−４３Ｒ３６１ＳとＶＣＰ／ｐ９７−ＱＱの共発現を使用してＴＤＰ−４３の細胞ベースの疾患モデルを設計した。ＶＣＰ／ｐ９７とＴＤＰ−４３Ｒ３６１Ｓの関連性の低下、およびＶＣＰ／ｐ９７−ＱＱの過剰発現によるＴＤＰ−４３のエクソンスキッピング機能の低下は、病的状態をシミュレートするために設計された。バイカレインは、ＶＣＰ／ｐ９７−ＱＱを発現する細胞において、ＴＤＰ−４３のＦＴＬＤ／ＡＬＳ関連散発性変異Ｒ３６１Ｓおよびプリオン様アセンブリを部分的に失ったプロリン置換変異体ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３−Ｑ３０３Ｐによって引き起こされる機能障害を救済することを発見した（図４ｇ、４ｈ）。これらの結果は、バイカレインが誤って折りたたまれたｗｔＴＤＰ−４３だけでなく、継承されたＴＤＰ−４３変異体も救済することを意味する。
【０１３６】
＜実施例５：ＨＳＰＢ１の欠損は、核のＴＤＰ−４３ポリマーを増加し、ＣＦＴＲエクソン９のスキップを活性化させる＞
本発明者らは、ＴＤＰ−４３ポリマーの集合を調節する他の細胞因子をさらに調査した。ＴＤＰ−４３機能的凝集体の潜在的な調節因子であるＨＳＰＢ１は、酸化ストレス下でサイトゾル内の高次ＴＤＰ−４３オリゴマーの集合に影響を及ぼし、ＴＤＰ−４３と物理的に相互作用する。トランスフェクトされたＨＳＰＢ１ｓｉＲＮＡによる２９３Ｔ細胞のＨＳＰＢ１の欠損は、核内の核ＴＤＰ−４３ポリマーを増加させた（図５ａ）。高効率のＨＳＰＢ１ノックダウンが確認された（図５ａ）。さらに、インビボスプライシングアッセイは、ＨＳＰＢ１ノックダウン細胞におけるＣＦＴＲエクソン９スキップの対応する増加を明らかにした（図５ｂ）。逆に、ＨＳＰＢ１の過剰発現は、サイトゾルのＴＤＰ−４３ポリマーを増加させ、ＣＦＴＲエクソン９のスキップを減少させた（図５ｃおよび５ｄ）。ＨＳＰＢ１の発現は、ＴＤＰ−４３を介したエクソンスキッピングと結合したＴＤＰ−４３ポリマーの集合に影響を及ぼし、バイカレインに依存しない新種（つまり、ＴＤＰ−４３を介したエクソンスキッピングを実行する核ＴＤＰ−４３ポリマー）の証拠を提供した。
【０１３７】
＜実施例６：ＴＤＰ−４３核複合体の超微細構造＞
ＴＤＰ−４３核複合体、特に高分子構造の細胞構成を特徴づけるために、免疫沈降の前に細胞を固定し、続いて電子顕微鏡法のためにネガティブ染色することを含む修正された方法を開発した。細胞のＴＤＰ−４３含有複合体を精製するための実験プロセスを図６ａに示す。それらの構造的完全性を維持するために、細胞は、収穫前に３．７％パラホルムアルデヒドで１０分間部分的に固定された。次に、細胞を分画し、細胞核抽出物からこれらのタンパク質を標的とする抗体の免疫沈降により、ＴＤＰ−４３、ＴＩＡＲ、およびＣＢＰに関連する細胞複合体を単離した。ウエスタンブロッティングにより、ＴＤＰ−４３タンパク質複合体の精製が成功したことが確認された（図６ｂ）。ＴＩＡＲおよびＣＢＰタンパク質は、特定の分離のコントロールとして使用された（図６ｂ）。電子顕微鏡免疫沈降は、ＴＤＰ−４３を含む核複合体が直径６〜４３ｎｍの範囲の短繊維およびオリゴマーを形成することを示した（図６ｃ）。矢印は、図６ｄ−６ｆおよび６ｈ−６ｊのＴＤＰ−４３複合体の代表的な高倍率画像を示す。ＴＤＰ−４３ポリマーは、短い管状の非平行組織を示した（図６ｄ、６ｅ、および６ｆ）。主要なＴＤＰ−４３含有ポリマーの長さは１５０−３５０ｎｍでした。図６ｆに提供される代表的な画像は、重合を受けている可能性のある単離されたポリマーの２つの分岐を示す。ＴＤＰ−４３含有ポリマーは、緩んだＦ−アクチン様アセンブリを形成するインビトロバイカレイン誘導ＴＤＰ−４３ポリマーと類似していたが、それらの形態には不規則な形状と不均一性が含まれていた。注目すべきことに、ＴＤＰ−４３の線形免疫金標識も核で観察された（図６ｇ）。注目すべきことに、ＴＤＰ−４３抗体で沈殿した既知の繊維顆粒リボ核タンパク質と同様に、球状構造に関連する分岐したこぶ状フィラメントで構成される繊維顆粒ネットワークが観察された（図６ｋおよび６ｌ）。ＴＩＡＲまたはＣＢＰ抗体を使用しても同様の構造は沈殿しなかった（データ未掲載）。ＴＤＰ−４３タンパク質が核内の繊維顆粒ネットワークを構成するかどうかを注意深く検証するために、長い抗体インキュベーション期間（４℃、１６〜１８時間）で免疫蛍光実験を行い、１２０ｎｍの解像度で蛍光顕微鏡を使用した。免疫蛍光分析は、図６ｋ（図６ｍ）に示すように、ＴＤＰ−４３が伸長したフィラメントと高密度の凝集体に沿って分布しているＴＤＰ−４３のフィラメント状ネットワークを一貫して明らかにした。さらに、ＧＦＰ−ｍＴＤＰ−４３−ＦＬタンパク質は、内因性ＴＤＰ−４３と同様に、球状構造に関連する分岐したこぶ状フィラメントに現れたが、ｍＴＤＰ−４３−ＰＬＤΔタンパク質は球状構造を形成せず、フィラメントが減少した（図６ｎ）。この結果は、ＴＤＰ−４３をこぶ状のフィラメントに隔離するためにＴＤＰ−４３のプリオン様ドメインが必要であることを示す。レアなＧＦＰ−ｍＴＤＰ−４３−ＰＬＤΔタンパク質がフィラメントに現れた。これは、ＲＮＡ結合ドメインを介した内因性ＴＤＰ−４３による隔離が原因である可能性がある。ここでは、オリゴマー複合体、緩んだフィラメント状ポリマー、および繊維顆粒ネットワークを含む、細胞のＴＤＰ−４３タンパク質の基本的な構成要素��特定した。
【０１３８】
＜実施例７：プリオン様タンパク質の異常相を修正することによる早期老化の救済＞
ＴＤＰ−４３タンパク質が、ラミナＡ／Ｃなどのタンパク質からなる核マトリックスに存在するかどうかをさらに特徴づけるために、我々は、ラミナＡ／Ｃ（赤）でＴＤＰ−４３（緑）を二重染色した（図７）。ＴＤＰ−４３繊維顆粒フレームワークは部分的にラミナＡ／Ｃに接続された（図７ａ、矢印は共局在領域を示す）。欠陥のあるラミンＡは早老症と早期老化障害ＨＧＰＳを引き起こす可能性があるため、早老症タンパク質の過剰発現は老化の細胞モデルと見なされ、ＴＤＰ−４３と老化またはラミンＡの病理とのメカニズムの関連を探ることができる。したがって、早老症タンパク質を過剰発現させ、ＴＤＰ−４３の局在、ＴＤＰ−４３ＰＬＤを介したエクソン９スキッピングの効率、およびＴＤＰ−４３ポリマーを調べた。早老症発現細胞では、ＴＤＰ−４３タンパク質が拡散と細胞質の誤局在のパターンを示し、ＣＦＴＲエクソン９スキッピングを促進できなかったことがわかった（それぞれ図７ｂと７ｃ）。重要なことに、いくつかの細胞で、ＴＤＰ−４３プロテオパチーの病理学的特徴であるＴＤＰ−４３の細胞質ゾル凝集体が観察された（図７ｂ、矢じり）。ウエスタンブロッティングはさらに、早老症発現細胞におけるＴＤＰ−４３ポリマーアセンブリの失敗を示唆した（図７ｄ）。さらに、ＴＤＰ−４３  ＰＬＤの薬理学シャペロンであるバイカレインが、早老症によって誘発されたＴＤＰ−４３の機能障害を救うことができるかどうかをテストした。図４Ｅに示すように、バイカレインは早老症タンパク質を発現する細胞で核ＴＤＰ−４３の保持を有意に誘導し、統計分析を図７ｆに示し。インビボスプライシングアッセイは、バイカレインが早老症によって引き起こされたＴＤＰ−４３機能不全を用量依存的に救済したことを明らかにした（図７ｇ）。バイカレインによるエクソンスキッピングの回復率は１．３１から１．９１で、バイカレインの投与量は１０μｍから５０μｍである（この比率は図７ｇの下部に示されている）。
【０１３９】
これらの結果は、早老症突然変異が、おそらくＴＤＰ−４３ポリマーアセンブリの失敗およびＴＤＰ−４３機能不全のために、ＴＤＰ−４３  ＰＬＤ媒介選択的スプライシングを妨害し、ＨＧＰＳ患者における選択的スプライシングの広範な変化をもたらすことを示した。これらのＴＤＰ−４３の機能障害は、バイカレインによって機能的に修正することができる。興味深いことに、バイカレインはＴＤＰ−４３の活性を回復するだけでなく、ＨＧＰＳの核形状の欠陥も修正することがわかった（図７ｊ；矢印は救済された核を示す）。この結果は、核膜が誤って折りたたまれたＴＤＰ−４３タンパク質によって破壊されたという以前の報告と一致している。
【０１４０】
本発明者らは、ラミンＡとＴＤＰ−４３との相互関係をさらに分析した。ラミンＡを発現している細胞でＴＤＰ−４３種の劇的な変化が観察された（図７ｉ）。５４ｋＤ−および７０ｋＤ−ＴＤＰ−４３種は消失したが、ラミンＡを過剰発現している細胞では不溶性の９０ｋＤ−ＴＤＰ−４３タンパク質（矢印）の集合が観察された（図７ｉ）。しかし、免疫蛍光法によりＴＤＰ−４３とラミンＡ／Ｃがプンタに部分的に共局在していることが明らかになったものの、共免疫沈降によるＴＤＰ−４３とラミンＡ／Ｃ間の物理的相互作用を特定できなかった（図７ａ）。おそらく、ＴＤＰ−４３はラミンＢ（配列番号１０）を介してラミンＡと相互作用する。これは、ラミンＢがプリオン様タンパク質として作用してｂ−ｉｓｏｘに結合するためである。それとともに、ラミノパシーの救済におけるバイカレインの薬理学的効果は、疾患の老化におけるＴＤＰ−４３タンパク質のプリオン様折り畳みの重要な役割を示唆している。
【０１４１】
＜実施例８：ＳＭＮ固有のプリオン様傾向＞
ＳＭＮは、Ｇｅｍｓと呼ばれる核内体に集中することが示されており、プリオン様タンパク質ＴＩＡ１との相互作用を介してサイトゾルストレス顆粒（ＳＧ）に組み込まれる。Ｌｏｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．はさらに、ＳＭＮ１のエクソン６にモジュール式の自己オリゴマー化領域が特定され、疾患の重症度は、オリゴマー化能力のあるＳＭＮタンパク質の細胞内濃度とＧｅｍｓの喪失に反比例する。ＳＭＮのこれらのよく特徴付けられた分子挙動と特性は、我々のグループや他の人々によって最近発見された固有のプリオン様傾向によって説明することができる。したがって、ＳＭＮタンパク質はエクソン６にプリオン様ドメインを持っていると仮定した。ＳＭＮのプリオン様フォールディングの破壊は、プリオン様自己重合の喪失につながり、その後のＳＭＡ病理の発症をもたらす。
【０１４２】
最近同定された特定の化学プローブであるビオチン化イソオキサゾール（ｂ−ｉｓｏｘ）は、クロスβプリオン様ポリマーを特異的に認識し、複雑性の低いタンパク質、プリオン様ドメイン、またはＴＤＰ−４３とＦｕｓのような相分離ドメインで順次沈殿する。最初に１００μＭのｂ−ｉｓｏｘをｍｅｓ２３．５および２９３Ｔ細胞の細胞溶解物と４°Ｃでインキュベートしてプリオン様タンパク質全体を化学的に沈殿させ、次にＳＭＮのプリオン様または相転移の可能性を評価するためにウエスタンブロッティングによってＳＭＮ結合の効率を分析した（図８ａおよびｂ）。ウエスタンブロッティングにより、ｂ−ｉｓｏｘによるＳＭＮとスモイル化ＳＭＮの両方の沈殿が明らかになった（図８ａおよびｂ）。細胞内分画分析はさらに、内因性スモイル化ＳＭＮタンパク質が不溶性尿素画分で検出された主要なＳＭＮコンフォメーションであり、これらのタンパク質がｂ−ｉｓｏｘ処理後に消失したことを明らかにした（図８ｃ）。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３タンパク質を不溶性ローディングのコントロールとして使用した（図８ｃ）。実際、不溶性のＳＭＮは、ＳＵＭＯのような相互作用モチーフ（ＳＩＭのような）を介したカハール体（ＣＢ）の組み立てに重要であると報告されている。したがって、ＳＵＭＯ化は、クロスβ重合によって核ＳＭＮが分離相を形成するきっかけとなる細胞調節メカニズムの１つである。ＧｅｍｓおよびＣＢへのＳＭＮの機能不全の標的化は、患者におけるＳＭＡの特徴であることが示唆されている。
【０１４３】
予期せぬことに、我々はｂ−ｉｓｏｘによって認識されるＳＭＮの主要なコンフォメーションがサイトゾルに位置することを発見した（図８ｂ）。目に見えるＳＭＮ顆粒は通常の条件下ではサイトゾルで観察されなかったため、ＳＭＮポリマーは他のプリオン様タンパク質とのヘテロマー相互作用に関与してサイトゾルの生物学的機能を果たす可能性があると推測した。したがって、タンパク質をｂ−ｉｓｏｘで沈殿させることにより、既知のＳＭＮインタラクターの相転移の可能性をテストし、サイトゾルの既知のＳＭＮインタラクターであるＰＦＮ１がｂ−ｉｓｏｘで沈殿することを発見した（図８ｂ）。ＰＦＮ１の変異は、家族性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の患者で、ＴＤＰ−４３との共凝集を引き起こし、ＰＦＮ１がプリオン様タンパク質であるという仮説を支持する。以前の研究では、ＰＦＮ１は、自己オリゴマー化領域にあるＳＭＮのポリプロリンストレッチとの直接相互作用を通じて細胞骨格のダイナミクスを調節することが示唆されている。したがって、これらの相互作用はプリオン様性質によって媒介されたと仮定した。さらに、完全長のＳＭＮまたはＳＭＮのエクソン欠失コンストラクトのパネルをｂ−ｉｓｏｘとインキュベートし、ウエスタンブロット分析を行ってＳＭＮのｂ−ｉｓｏｘ結合部位を特定した。ＳＭＮバリアントと結果のマップを図８ｄに示す。エクソン１−３、４−７、および６−７によってコードされる領域は、ｂ−ｉｓｏｘで十分に沈殿したが、プロリンに富むドメインとＧｅｍｉｎ２はｂ−ｉｓｏｘで沈殿しなかった（図８ｄ）。エクソン２ｂおよび６によってエンコードされたドメインは、一貫して自己相互作用することが報告されている。エクソン２とエクソン６の両方によってコードされるドメインは、クロスβ重合によって相転移を起こす可能性を示したが、エクソン６によってコードされる領域を含むフラグメントのみが目に見える顆粒を形成した（図８ｆ、矢印）。溶解度試験の結果に基づくと、エクソン６〜７を含む変異体は不溶性画分に検出されなかったが、これらの変異体は目に見える顆粒を形成した。したがって、不溶性は顆粒形成に比例しない可能性がある。ＳＭＮのＮ末端とＣ末端はどちらもクロスβポリマーコンフォメーションを採用しているが、ＳＭＮの２つのドメインには異なる生化学的特性と挙動がある。
【０１４４】
＜実施例９：ＳＭＡ疾患の原因となる変異およびエクソン７の欠失によるＳＭＮのクロスβ構造および誤って折りたたまれたタンパク質凝集体の増加＞
ＳＭＮのプリオン様折り畳みの欠陥がＳＭＡ重症度と相関するかどうかを試験した。ｂ−ｉｓｏｘを使用して、患者由来のミスセンスＳＭＮ変異体Ｙ２７２ＣおよびＧ２７９Ｖの細胞コンフォメーションを直接調べた。ＳＭＡタイプＩ変異Ｙ２７２ＣおよびＧ２７９Ｖは、自己オリゴマー化を妨害することが示されているＹＧボックスの点変異である。ＳＭＡタイプＩは最も重症で一般的なタイプであり、ＳＭＡと診断された患者の推定５０％から７０％を占める。野生型ＳＭＮと比較して、ｂ−ｉｓｏｘはＹ２７２ＣおよびＧ２７９ＶＳＭＮタンパク質を強く沈殿させた（図９ａ）。ｂ−ｉｓｏｘの結合親和性の変化は、これら２つの変異体の細胞コンフォメーションが変化したことを反映している。興味深いことに、ＴＤＰ−４３Ｃ末端の病理学的に誤って折りたたまれた凝集体と同様に、かなりの量のＹ２７２ＣおよびＧ２７９ＶＳＭＮタンパク質が不溶性尿素画分に蓄積した（図９ａ）。さらに、２つの疾患の原因となる変異体の局在を分析して、これら２つの変異体が病理学的な封入体を形成するかどうかを判断した。実際、Ｙ２７２ＣおよびＧ２７９ＶＳＭＮタンパク質を発現する培養運動ニューロンでは、目に見えるタンパク質凝集体の増加が観察された（図９ｂ）。したがって、Ｙ２７２ＣおよびＧ２７９Ｖの変異は、元の機能的コンフォメーションを変化させ、ＳＭＮの誤った折り畳みにつながる。変異型Ｙ２７２ＣまたはＧ２７９ＶＳＭＮタンパク質の誤って折りたたまれたタンパク質凝集体は、ＳＭＡの患者では報告されていない。Ｙ２７２ＣおよびＧ２７９ＶＳＭＮタンパク質の過剰発現は、タンパク質分解システムの能力を過負荷にする誤って折りたたまれたタンパク質をもたらすと推定した。この非効率的なタンパク質クリアランスはタンパク質凝集を引き起こし、分子レベルで変異体の異なる特性と挙動を検出することを可能にする。
【０１４５】
さらに、ＳＭＮΔ７タンパク質の過剰発現は、細胞質および核の凝集体の形成をもたらし、これは、ＳＭＮΔ７のコンフォメーションが完全長のＳＭＮと異なるかどうかを試験することを促した。実際、ｂ−ｉｓｏｘによるＳＭＮΔ７タンパク質の沈殿は、上記の２つのＳＭＡ変異体と同様に、ＳＭＮと比較して増加した（図９ｃ）。これらの結果に基づいて、アミノ酸２７２と２７９およびエクソン７は、タンパク質が有能なプリオン様コンフォメーションを採用するために重要である。したがって、ＳＭＮが有能なプリオン様折り畳みを採用できないことは、誤って折り畳まれたタンパク質を表しており、通常、リソソームおよびオートファゴソームを介した細胞クリアランスによる分解を受け、最終的にコンフォメーション病の発症につながる。この現象は、ＳＭＮΔ７が不安定なタンパク質である理由を説明している。ＳＭＮΔ７タンパク質の急速な分解が報告されており、ＳＭＮ機能を補償し、ＳＭＡ患者の細胞死をもたらす主要な制限要因と考えられる。
【０１４６】
＜実施例１０：バイカレインによるＳＭＮΔ７発現ニューロンとＳＭＡマウスの機能的救済＞
図８（図１０ａ）に示すように、本発明者らは、バイカレインが薬理学的シャペロンとして作用して、誤って折りたたまれたＳＭＮΔ７を機能的なプリオン様ドメインにリフォールディングできるかどうかを調査する。一貫して、バイカレインは、２９３Ｔ細胞におけるＳＭＮΔ７凝集体の形成を用量依存的に減少させ、ＳＭＮΔ７細胞の生存率を約２倍増加させた（図１０ｂおよび１０ｃ）。興味深いことに、バイカレインはＳＭＮΔ７細胞の神経突起様構造を増加させた（図１０ｄ）。逆に、ＳＭＮΔ７細胞はｂ−ｉｓｏｘで処理した後、丸くなり、剥離した。さらに、共免疫沈降分析により、バイカレインの存在下で、ＰＦＮ１とＳＭＮΔ７の間の相互作用が有意に増加したことが明らかになった（図１０ｅ）。ＰＦＮ１は、サイトゾルの既知のＳＭＮインタラクターである。さらに、バイカレインがＳＭＮΔ７タンパク質の分解を弱めるかどうかを調べた。実際、バイカレインはＳＭＮΔ７の分解を有意に減少させた（図１０ｆ、矢印）。さらに、以前の研究では、ＳＭＮΔ７でトランスフェクトされたニューロンは著しく短い神経突起を伸ばした。バイカレインは、ＳＭＮΔ７を発現するＮＳＣ３４細胞からの軸索の長さを約２倍増加させることがわかった（図１０ｇ）。統計分析を図１０ｈに示す。これらの結果に基づいて、誤って折りたたまれたＴＤＰ−４３のプリオン様生物活性を回復するバイカレインは、ＳＭＮΔ７のプリオン様機能的欠損も回復する。
【０１４７】
ＳＭＡのマウスモデルは、出生からバイカレイン（１３．６ｍｇ／ｋｇ／ｄ）の毎日の腹腔内注射を受け、次いで、運動機能試験および生存分析を使用して動物を評価し、インビトロ所見がインビボでのマウスモデル（図１０ｉ）で再現されたかどうかを決定した。ただし、バイカレイン治療後、立ち直り時間、チューブスコア、傾斜スコアなどのＳＭＡマウスの機能的パフォーマンスは、生後６日目に改善され（ｐ＜０．０５）、結果はバイカレインの有無にかかわらずヘテロ接合の同腹仔と同様でした。生後８日目に、バイカレインで処理したＳＭＡマウスの機能的パフォーマンスは、チューブテスト（ｐ＝０．００９）ではコントロールＳＭＡマウスよりも優れていたが、ターンオーバーテスト（ｐ＝０．０６５）または陰性ジオタキシステスト（ｐ＝０．５８）（図１０ｉ）ではそうではなかった。我々の研究は、ＳＭＮΔ７Ｃ末端およびＳＭＡ関連変異体のフォールディングを調節して機能的なＳＭＮタンパク質を復元し、タンパク質が完全長ＳＭＮの細胞機能を確実に実行する方法を提供する。
【０１４８】
＜実施例１１：ＴＤＰ−４３のプリオン様ドメインを過剰発現させることによるＳＭＮΔ７発現ニューロンの救済＞
機能的なプリオン様コンフォーマーのレベルの低下がＳＭＮΔ７発現ニューロンの軸索変性を引き起こしたことを確認するために、我々は、ＳＭＮΔ７タンパク質を発現するＮＳＣ３４運動ニューロン細胞においてＴＤＰ−４３プリオン様ドメイン（ＴＤＰ−４３−ＰＬＤ）を過剰発現させることにより、機能的なプリオン様ドメインの量を増加させた。ＴＤＰ−４３−ＰＬＤは、ヘテロ重合によってＳＭＮのプリオン様機能を補うために、一般的な構造的に類似したβシートを採用することが期待されている。我々の実験は、ＧＦＰおよびＧＦＰ−ＮＰＬＤを発現する対照と比較して、ＳＭＮΔ７およびＧＦＰ−ＴＤＰ−４３  ＰＬＤの両方を発現する細胞における軸索長の増加を示した（図１１ａ、矢印）。統計分析を図１１ｂに示す。一貫して、運動ニューロンにおけるＳＭＮの過剰発現は、変異型ＴＤＰ−４３のモデルにおいてＡＬＳの発症と病理学的症状を遅らせることも示されている。したがって、プリオン様コンフォーマーのレベルは運動ニューロンの生存にとって重要であり、他の機能的に無関係なプリオン様タンパク質は、欠陥のあるタンパク質の機能を補うことができる。
【０１４９】
＜実施例１２：プリオン様コンフォーマーに基づく治療戦略＞
運動ニューロンにおけるプリオン様コンフォーマーの独特の役割に基づいて、本発明者らは、ＳＭＡの治療モデル、「プリオン様コンフォーマーに基づく治療戦略」を提案し、ここで、部分的に誤って折りたたまれたＳＭＡ疾患を引き起こす変異体およびＳＭＮΔ７がプリオン様折りたたまれたタンパク質に変換される（図１２）。バイカレインは、ＳＭＮ変異体とＳＭＮΔ７がプリオン様活性を取り戻すことを可能にし、続いてＳＭＮ−ＰＦＮ１相互作用を増加させ、タンパク質分解を減少させ、神経突起様の成長と運動ニューロンの生存を促進し、ＳＭＡマウスの運動機能を改善した。薬理学的シャペロンによるＳＭＮ変異体およびＳＭＮΔ７の再構築されたプリオン様コンフォーマーは、プリオン様アイソコンフォーマーと呼ばれる。
【０１５０】
＜実施例１３：細胞内のＬＣ配列ドメインの同時異種クロスβテンプレート＞
プリオン様タンパク質の可溶性クロスβコンフォーマーが自己複製可能であるかどうかを試験するために、特定のプリオン様タンパク質の過剰発現とそれに続くビオチン化イソオキサゾール（ｂ−ｉｓｏｘ）沈殿を誘導した後、プリオン様タンパク質の細胞クロスβコンフォーマーのレベルを体系的に調べた（図１３）。最近同定された特定の化学プローブであるＢ−ｉｓｏｘは、ＬＣドメインのクロスβプリオン様ポリマーと特異的に共沈した。１００μＭのｂ−ｉｓｏｘをＨｔｔ−９７Ｑを過剰発現する２９３Ｔ細胞の細胞溶解物と４°Ｃでインキュベートしてクロスβポリマーを化学的に沈殿させ、ウエスタンブロッティングによってプリオン様タンパク質の結合効率を分析した（図１３ａ−ｃ）。採取前のトランスフェクト細胞におけるＨｔｔ−９７Ｑを図１Ａに示す。Ｈｔｔ−９７Ｑタンパク質は目に見える凝集体を形成するが、ほとんどのＨｔｔ−９７Ｑタンパク質分子は可溶性である（図１３ｂ）。重要なことに、コントロールと比較して、ｂ−ｉｓｏｘはＴＤＰ−４３およびＰＦＮ１プリオン様タンパク質の沈殿量を増加させたが、Ｈｔｔ９７Ｑ過剰発現細胞におけるＳＭＮおよびラミンＢ１プリオン様タンパク質の沈殿効率を変化させなかったことがわかった（図１３ｃ）。さらに、クロスβコンフォメーションをテンプレート化する機能に基づいて、このタイプのＬＣドメインをクロスβ核形成ドメインとして定義した。
【０１５１】
ＴＤＰ−４３およびＦｕｓを含むいくつかのＬＣタンパク質は、ＲＮＡ結合ドメインを含むので、本発明者らは、ＴＤＰ−４３のクロスβフォールディングおよびテンプレート化に対するＲＮＡの効果を試験した。ＴＤＰ−４３残基１４７および１４９は、核酸結合に重要であることが示されている。我々以前の研究はさらに、ＲＮＡ結合欠損変異体ＴＤＰ−４３−Ｆ１４７／１４９Ｌが核内で可溶性の目に見える顆粒に凝集することを示した。これは、ＲＮＡ結合の喪失がプリオン様ＴＤＰ−４３のドメインの構造変換を通じて相分離を誘発することを示した。ＲＮＡ結合欠損変異体ＴＤＰ−４３−Ｆ１４７／１４９Ｌの細胞構造とテンプレート能力をインビボで調べるために、ＴＤＰ−４３のＲＮＡ結合欠損変異タンパク質をｂ−ｉｓｏｘとインキュベートした後、ウエスタンブロッティングを行った（図１３ｄ）。予期せぬことに、ＴＤＰ−４３のプリオン様ドメイン欠失変異体であるｍＴＤＰ−４３−ＰＬＤΔと同様に、ＲＮＡ結合欠損変異体は、目に見える顆粒を形成したが、ＰＦＮ１とＬａｍ  Ｂのクロスβコンフォーマーとテンプレートフォールディングを形成する能力を失った。これらの結果は、ＲＮＡがＴＤＰ−４３でのクロスβコンフォメーションの採用を促進し、生理学的状態の根底にあるクロスβコンフォマーへの変換のためにプリオン様タンパク質のサブグループを順次動員したことを意味した（図１３ｄ）。さらに、ストレス顆粒とは異なり、ＲＮＡ非結合ＴＤＰ−４３の目に見える顆粒は、異なるコンフォメーションとクロスβ非依存性メカニズムを介して別の相に集合すると推定した。
【０１５２】
次に、ＳＵＭＯ化欠損ＴＤＰ−４３変異体Ｋ１３６Ｒを構築し、クロスβテンプレートのそのインビボ能力を調べた。我々の実験は、ｈＴＤＰ−４３と比較して、ｈＴＤＰＫ１３６Ｒ変異体がｂ−ｉｓｏｘに強く結合し、内因性ＴＤＰ−４３とプリオン様タンパク質Ｌａｍ  ＢおよびＰＦＮ１のクロスβコンフォーマーを有意に増加させることを示した（図１３ｅ）。図１３ｃおよびｄの結果と一致して、ＬＣドメインのｂ−ｉｓｏｘ結合の能力は、クロスβのテンプレート能力に比例することがわかった。抗ＦｌａｇまたはＬａｍ  Ｂ抗体を使用して、免疫沈降分析により、ｈＴＤＰＫ１３６ＲがＬａｍ  Ｂとの結合を増加させることがさらに明らかになった（図１３ｆ）。したがって、我々は、ｈＴＤＰＫ１３６ＲがＬａｍ  Ｂが局在する核膜に局在することを好むことを見出した。ｈＴＤＰ−４３  ＦＬの約２４％の核膜局在化と比較して、約７０％のｈＴＤＰＫ１３６Ｒは核膜に局在化した（図１３ｇ）。ＳＵＭＯ化などの翻訳後修飾のダイナミクスは、プリオン様タンパク質フォールディングの変換を通じて遺伝子発現を指示する核構造の構造的調節因子である可能性がある。
【０１５３】
クロスβの異型相互作用のデノボメカニズムを調査するために、本発明者らは、ＴＤＰ−４３およびＬａｍ  Ｂ組換えタンパク質を、ｂ−ｉｓｏｘを含むまたは含まない状態で、インビトロで２時間インキュベートした。我々は、ＴＤＰ−４３とＬａｍ  Ｂがｉｎｖｉｔｒｏで短い円筒形のフィラメントに組み立てられ、ｂ−ｉｓｏｘの存在下で破壊されることを発見した（図１３ｈ）。  この発見は、ＴＤＰ−４３とラムＢのクロスβ相互作用を示唆した。したがって、ＴＤＰ−４３とＬａｍ  Ｂ組換えタンパク質を別々に１時間インキュベートし、２つの組換えタンパク質を混合してから１時間インキュベートした。ＴＤＰ−４３とＬａｍ  Ｂはオリゴマーのような構造を形成し、短い円筒形フィラメントの組み立てに失敗することがわかった（図１３ｈ）。この発見は、単量体ＬＣドメインがプリオン様タンパク質の異型クロスβ相互作用の前提条件であり、クロスβコンフォーマーの形成が細胞内コンパートメント内のプリオン様タンパク質のレベルに比例しなかったことを説明する可能性があることを示唆した（図１３ｉ）。細胞内では、ＬＣタンパク質のクロスβコンフォーマーの割合は、ｂ−ｉｓｏｘ結合分析によって約１０〜７０％であり、例えばＭｅｓ２３．５ドーパミン作動性ニューロンにおけるＴＤＰ−４３の２１．２％クロスβコンフォーマー（図１３ｊ）。細胞内では、本質的に無秩序なＬＣドメインのほとんどが、構造の折り畳みまたは他のタンパク質との結合によって保護されており、クロスβ核形成反応が制限されていると考えられる。単量体のＬＣドメインが放出されるか、新たに合成される一方で、可溶性クロスβの異種増殖が細胞内で起こることを示唆した。
【０１５４】
＜実施例１４：ＡＬＳの病的状態下でのクロスβ同期の喪失および疾患を引き起こすタンパク質の相互作用＞
次に、野生型ＰＦＮ１または患者由来の変異体ＰＦＮ１Ｇ１１８Ｖのいずれかを過剰発現する２９３Ｔ細胞の溶解物をｂ−ｉｓｏｘとインキュベートし、続いてウエスタンブロット分析を行った。ＰＦＮ１Ｇ１１８Ｖと比較して、ＰＦＮ１−ＦＬはｂ−ｉｓｏｘに強く結合し、これは、内因性ＰＦＮ１およびＬａｍ  Ｂの沈殿の増加と相関していた。しかし、ＴＤＰ−４３タンパク質の沈殿に変化は見られなかった（図１４ａ）。これらの結果は、プリオン様タンパク質のクロスβコンフォーマーの増加が、ヘテロ型またはホモタイプのプリオン様タンパク質の可溶性クロスβコンフォーマーの選択的サブセットを増加させることを示唆した。特に、Ｇ１１８Ｖ疾患の変異は、ＰＦＮ１がクロスβ構造を折りたたんで増殖させる能力を損なった。
【０１５５】
プリオン様ドメインの自己相互作用を考慮して、免疫沈降により、ＰＦＮ１−ＦＬおよびＰＦＮ１−Ｇ１１８Ｖのヘテロ相互作用パートナーをさらに検証した。我々の実験は、ＰＦＮ１−ＦＬが過剰発現されたときにＴＤＰ−４３とＰＦＮ１またはＬａｍ  Ｂとの関連が増加したが、対照またはＰＦＮ１−Ｇ１１８Ｖ変異体では変化しなかったことを示した（図１４ｂ）。ＰＦＮ１およびＬａｍ  Ｂの可溶性クロスβコンフォーマーの量とＴＤＰ−４３とのプリオン様相互作用の正の相関が観察された。全体として、ＬＣドメインのクロスβコンフォーマーは細胞内で複製してＬＣタンパク質間のデノボアソシエーションネットワークを開始することができ、このメカニズムはＰＦＮ１関連ＡＬＳの病的状態では発生しなかった。この結果は、クロスβ重合欠陥とＡＬＳの病因との潜在的な関係を示唆している。
【０１５６】
さらに、ＴＤＰ−４３のインビボクロスβコンフォメーションを検出するためにｂ−ｉｓｏｘ沈殿アッセイを使用して、ＴＤＰ−４３とのｂ−イソックスのクロスβ結合親和性が、ＡＬＳ−関連ＶＣＰ変異体ＶＣＰＲ１５５Ｈを過剰発現する細胞において増加することを見出した。これはＡＬＳのインビトロ疾患モデルと見なされている（図１４ｃ）。しかし、ｂ−ｉｓｏｘのクロスβ結合親和性はラミンｂおよびＰＦＮ１とともに減少し、ＴＤＰ−４３のクロスβの増加が伝播しなかったことを示唆した。ＴＤＰ−４３の核構造が乱されていることに気づき、ＡＬＳ関連変異体のサイトゾルに核ＴＤＰ−４３の誤局在が現れるのを観察した（図１４ｄおよびｅ）。我々は、ＶＣＰＲ１５５Ｈが内因性ＴＤＰ−４３の一部をクロスβ構造を持つ疾患の原因となるコンフォーマーに変換したと推定し、それによってＴＤＰ−４３の生理学的クロスβを減少させる。ＴＤＰ−４３の生理学的クロスβを減少させると、ラミンｂやＰＦＮ１などの他のプリオン様ＬＣタンパク質のクロスβ相互作用が減少し、続いてＡＬＳ関連変異体におけるＴＤＰ−４３−ＰＬＤ構造の残留フレームワークが破壊される。
【０１５７】
分画分析はさらに、ＶＣＰ  Ｒ１５５Ｈタンパク質がＶＣＰ野生型タンパク質よりも安定であり、ＶＣＰ  Ｒ１５５Ｈタンパク質が核クロマチン非結合画分、すなわち核質画分で特異的に増加したことを明らかにした（図１４ｆ、矢印は核クロマチン非結合画分におけるＶＣＰタンパク質を示す）。ＶＣＰが分離酵素として作用することが示唆されていることを考えると、根底にある病因、ＡＬＳ関連ＶＣＰ変異は核質ＶＣＰタンパク質の安定性を高め、核構造フレームワークからのＴＤＰ−４３の解離、および核ＴＤＰ−４３タンパク質の連続的な誤局在化につながる可能性があると仮定した。増加したＶＣＰ活性が核ＴＤＰ−４３のコンフォメーションを変換する方法は完全には明らかではないが、我々の結果によって重要な洞察が提供され、規制緩和された生理学的クロスβネットワークを介した分子レベルでのＡＬＳの新たな重要な病因を示唆している。
【０１５８】
＜実施例１５：細胞のクロスβ自己永続化の提案モデル＞
生物学的プロセスの現在知られている調節メカニズムには、頻度、速度、または程度の調節による遺伝子およびタンパク質の発現、タンパク質の修飾、および非コードＲＮＡの制御が含まれる。ここでは、新しいタイプのβシートに富むドメインが、自己または他のタンパク質変換を触媒し、生体高分子を順次形成することによって構造複製が可能である調節層を明らかにした。新しいプリオン様ネットワークの再構築または空間的再編成を通じて、これらの自然に自己テンプレート化された組み立てられた生体高分子は、機能的および構造的な複雑さを超えて、細胞の恒常性および細胞の適応をリセットする。この生物学的反応を「クロスβ自己永続化（ｃｒｏｓｓ−β  ｓｅｌｆ−ｐｅｒｐｅｔｕａｔｉｎｇ）」と称した。クロスβ自己永続化の提案モデルを図１５に示す。この生物学的プロセスを、誘導、同期、機能切り替えの３つの段階に分けた。誘導段階では、感染性コンフォメーションは、プリオン様タンパク質、ＲＮＡ、または後修飾によってタンパク質レベルで誘導される可能性がある。これらのβシートに富むコンフォメーションは、同種または異種のプリオン様分子に結合し、同期段階でそれらの変換を触媒し、ポリマーの組み立てに続いて、機能切り替え段階で新しいプリオン様相互作用ネットワークを再構築する。遺伝性プロテオパチーのＡＬＳ患者では、病理学的変異によりクロスβポリマーをテンプレート化する能力が失われ、正常な細胞機能が失われ、不可逆的な病理学的βシートに富む凝集体が得られる。この新しいタイプの調節は、ＤＮＡやＲＮＡを変えることなく、既存のタンパク質のセットを組織化することにより、細胞の生化学を劇的に再形成することができる。
【０１５９】
＜実施例１６：ｐ５３のアミロイド形成性株の水平伝播＞
長繊維（５〜１０μｍ）、短繊維（１．６〜３．２μｍ）および点状凝集体（０．５〜１μｍ）（図１６ａ、矢印）を含む、ｐ５３抗体を用いた免疫蛍光法により、２９３Ｔ細胞のサイトゾル中のｐ５３凝集体間に著しい程度の不均一性が観察された。ｐ５３繊維とｐ５３凝集体の長さを分析した（図１６ｂ）。タンパク質分解経路を乱すことによるアミロイド沈着物の蓄積と一致して、ＭＧ１３２プロテアーゼ阻害剤はｐ５３凝集体を有意に増加させ、３種類のｐ５３繊維を不規則な封入体に変換した（図１６ｃ）。これらの不均一なｐ５３アミロイドパターンが遺伝されたか、ランダムな変換されたかを判断するために、細胞の不均一なプールから単一コロニーを継代培養して分離した。実験フローチャートを図１６ｄに示す。単一のクローン増殖後、単一の細胞由来のクローンで１つのｐ５３アミロイドパターンのみが観察され、その特定の表現型を安定して発現した。図１６ａに示すように、長繊維、短繊維、斑点、びまん性核染色を含む４つの表現型が得られ、これらの表現型は安定して増殖した（図１６ｅ）。分離株のこれらのｐ５３表現型を次のように命名した：ｐ５３［Ｌ］（長繊維）、ｐ５３［Ｓ］（短繊維）、ｐ５３［Ｐ］（斑点）およびｐ５３−ＮＶＡ（見える凝集体なし）。ｐ５３凝集体を有する細胞は、より良好な付着および間葉様形態を示した（図１６ｆ；下の対応アクチン染色）。
【０１６０】
＜実施例１７：ｐ５３アミロイド形成性株の遺伝性発癌性と癌幹細胞性＞
我々のクローン的に拡張されたシステムは、インビボでの株特異的ｐ５３アミロイドコンフォメーションの発癌性を正確に調査するための優れた細胞モデルを提供した。細胞周期の流れを調べ、倍加時間を数えることにより、４つのｐ５３アミロイド株の細胞増殖を分析した（図１７ａおよび１７ｂ）。フローサイトメトリー分析により、ｐ５３［Ｌ］、［Ｓ］、および［Ｐ］細胞でＳ（合成）期細胞の割合がそれぞれ４．１％、１０．７％、および３．９％増加することが明らかになる（図１７ａ）。加速された細胞増殖と一致して、ｐ５３［Ｌ］および［Ｐ］を含むサイトゾルｐ５３凝集体を有する細胞は、播種後４８〜７２時間で倍加時間が速いことがわかった（図１７ｂ）。ｐ５３［Ｌ］は、２４時間の遅延期を示し、その後、勾配が急激に増加した（図１７ｂ）。神経変性の状況で観察される毒性アミロイドとは対照的に、ｐ５３アミロイドは細胞増殖を促進するようである。さらに、ストレス反応を評価するために、４つの細胞株にスペルミジンとＨ２Ｏ２をチャレンジした（図１７ｃおよび１７ｄ）。細胞の生存率は、すべてのストレス条件下で損なわれた。しかし、ｐ５３［Ｐ］クローンは、スペルミジンが誘導する細胞生存率への影響に対していくらか耐性があり、酸化ストレスに対してより高い耐性を示した（図１７ｃおよび１７ｄ）。これらの結果は、これらの菌株特異的なｐ５３アミロイドコンフォメーションが独特で長期的な生化学的および生理学的効果を持っていることを示唆している。ｐ５３凝集体の機能獲得の腫瘍形成に関与する主要な病態生理学的経路をさらに特定するために、ウエスタンブロッティングによる連続スクリーニングを実施し、４つの株における癌関連タンパク質の発現を比較した。一般に、ｐ５３［Ｓ］と［Ｐ］は同様の発現プロファイルを示した（図１７ｅ）。最も重要なことは、癌幹細胞性バイオマーカーであるＣＤ１３３の発現が、３つのｐ５３凝集クローンで上昇したことである（図１７ｅ）。さらに、エピジェネティックなレギュレーターのグループは、ｐ５３凝集体の存在下でそれらの発現を変化させた。エピジェネティックなサイレンシングに関連するＨ３Ｋ２７ｍｅ３は、ｐ５３凝集株で劇的に減少したが、別のサイレンシングレギュレーターであるＤＮＭＴ１はｐ５３凝集株で増加した（図１７ｅ）。ｐ−ＥＧＦＲおよびＨＩＦ−１αを含む上皮間葉転換（ＥＭＴ）関連遺伝子も、形態スイッチと相関するｐ５３凝集株で増加した。これらの結果は、癌細胞幹細胞性の誘導におけるｐ５３アミロイドの役割、および遺伝子発現の全体的な変化につながる可能性のあるメチル化ヒストンＨ３のダウンレギュレーションにおけるｐ５３アミロイドの役割の最初の直接的な証拠を明らかにしている。図１６に示す水平方向の伝達率とともに、３つの内因性ｐ５３凝集体は、ＥＭＴの活性化、癌の幹細胞性の増加、エピジェネティックな調節因子の劇的な変化、そして菌株特異的なｐ５３アミロイドは、タンパク質ベースのメカニズムを介して発癌性の遺伝を伝播することができる。
【０１６１】
＜実施例１８：ｐ５３アミロイド株の感染力＞
天然に存在するｐ５３アミロイドが細胞に感染し、プリオン様活性を促進できるかどうかを評価するために、個々の株特異的ｐ５３クローンから単離された細胞抽出物をｐ５３−ＮＶＡレシピエント細胞に加えた（図１８）。細胞を膨潤させ、遠心分離によって可溶性画分と不溶性画分を分離する低張緩衝液を使用して抽出物を生成した。ｐ５３抗体による免疫染色を使用して決定されたように、ｐ５３［Ｐ］クローンから生成された抽出物は、可溶性または不溶性画分のいずれかを使用して、ｐ５３−ＮＶＡ細胞でｐ５３凝集体を誘導した。特に、３種類すべてのｐ５３アセンブリがレシピエント細胞で見つかり、抽出プロセス中にｐ５３［Ｐ］の継承性が失われたことを示唆している（図１８ａ、矢印）。ｐ５３［Ｌ］またはｐ５３［Ｓ］株のいずれかから生成された抽出物を添加した後、ｐ５３繊維の有意な誘導は観察されなかったが、ｐ５３［Ｓ］の細胞周辺に標識されたドット蛍光シグナルはほとんどなかった（図１８ａ）。内因性ｐ５３［Ｌ］および［Ｓ］抽出物がｐ５３−ＮＶＡ細胞で繊維形成を誘導できないことは、インビトロｐ５３繊維の誘導を示す結果と一致していなかった。ｐ５３［Ｌ］と［Ｓ］の凝集体サイズは、レシピエント細胞に入るには大きすぎる可能性があると推測した。誘導効率の統計分析を図１８ｂに示す。ｐ５３アミロイド抽出物を非アミロイド細胞に添加した後、ｐ５３［Ｐ］は感染性の実体として振る舞うことができるが、レシピエント細胞の３つのｐ５３株で観察されたプリオン継承パターンは観察されなかった。
【０１６２】
＜実施例１９：ｐ５３アミロイド陽性コンテンツにおけるＴＤＰ−４３とｐ５３の相互作用＞
プリオンまたは凝集しやすいタンパク質は、二次タンパク質の誤った折り畳みを誘発する可能性がある。したがって、ｐ５３凝集がＴＤＰ−４３、ＦＴＬＤ−ＵおよびＡＬＳ患者のユビ陽性封入体の凝集体に見られるプリオン様タンパク質に影響を与えるかどうかをテストした。蛍光顕微鏡により、４つの株におけるＴＤＰ−４３の局在を調べた（図１９ａ）。ＴＤＰ−４３タンパク質がＴＤＰ−４３サイトゾル病巣に特異的にｐ５３［Ｓ］で隔離されていることを発見し、ｐ５３［Ｓ］アミロイドがＴＤＰ−４３凝集傾向を調節したことを示唆した（図１９ａ；矢印）。機能的に誤って折りたたまれた病理学的様ＴＤＰ−４３タンパク質に対するｐ５３アミロイドの影響を注意深く調査するために、ｐ５３  ［Ｓ］またはｐ５３−ＮＶＡクローンでのＧＦＰ−ＴＤＰ−４３−ＦＬタンパク質または病理学的なＧＦＰ−ＴＤＰ−４３ＩＩＰフラグメントを過剰発現させ、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３タンパク質の局在を調べた（図１９ｂおよび１９ｃ）。ＴＤＰ−４３−ＦＬのサイトゾル病巣への隔離は、ｐ５３−ＮＶＡクローンと比較してｐ５３［Ｓ］クローンで６倍増加し、特定の折りたたまれたアミロイドが機能的なＴＤＰ−４３凝集を増強できることを示唆している（図１９ｂ）。逆に、ＴＤＰ−４３（ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３ＩＩＰ）の病理学的な封入体の形成は、ｐ５３−ＮＶＡクローンと比較してｐ５３［Ｓ］クローンで６分の１に減少した。おそらくｐ５３とＴＤＰ−４３は、誤って折りたたまれた凝集の形成に関与する細胞因子と競合する可能性があると推測した（図１９ｃ）。
【０１６３】
さらに、天然ゲル分析を使用して、ｐ５３−ＮＶＡクローンから抽出されたＴＤＰ−４３タンパク質は、ｐ５３凝集体クローンから抽出されたものよりも高い分子量を有していた（図１９ｄ）。Ｑリッチタンパク質Ｓｐ１をコントロールとして使用した。ｐ５３アミロイドがＴＤＰ−４３を介した生物学的プロセスに影響を与えるかどうかをテストするために、ＴＤＰ−４３のプリオン様活性によって調節されるＣＦＴＲエクソン９スキッピングに対してインビボでの代替スプライシングアッセイを実施した。ｐ５３−ＮＶＡクローンと比較して、ｐ５３［Ｓ］クローンではより効率的なＣＦＴＲエクソン９スキッピングが観察された（図１９ｅ）。
【０１６４】
さらに、ｐ５３アミロイド繊維の有意な減少が、ＴＤＰ−４３  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞において見出された（図１９ｆ）。３つのｐ５３凝集体表現型のｐ５３凝集体の統計分析を図１９ｇに示す。これらの結果は、ｐ５３とＴＤＰ−４３の間の凝集傾向の相互作用を示している。
【０１６５】
ｐ５３アミロイド繊維の有意な減少が、ＴＤＰ−４３変異体でトランスフェクトされた細胞において見出された（図１９ｈ）。ｐ５３凝集体の統計分析を図１９ｈに示す。これらの結果は、ここでのＴＤＰ−４３などの二次凝集傾向タンパク質を操作すると、ｐ５３の凝集傾向を調節できることを示している。
【０１６６】
＜実施例２０：ＨＳＰＢ１によるｐ５３凝集形成の決定＞
ウエスタンブロッティングおよび免疫染色分析は、ｐ５３［Ｌ］、［Ｓ］、および［Ｐ］クローンにおけるＨＳＰＢ１発現の同時喪失を明らかにしたが、ｐ５３−ＮＶＡクローンではそうではなかった（図２０ａ）。４つの株におけるＨＳＰＢ１のタンパク質発現プロファイリングと一致して、ＨＳＰＢ１  ｍＲＮＡ発現がｐ５３［Ｌ］、［Ｓ］、および［Ｐ］クローンでそれぞれ正常レベルの３５％、２５．２％、および４７．９％に減少することを発見した（図２０ｂ）。
【０１６７】
興味深いことに、マイクロアレイチップ上に存在する２５個の熱ショックタンパク質のうち、ＨＳＰＢ１およびＨＳＰＢ８のみが、ｐ５３凝集株において減少したｍＲＮＡ発現を示した。ＨＳＰ７０およびＨＳＰ９０を含む他の熱ショックタンパク質は、ｍＲＮＡ発現の変化を示さなかった（図２０ｂ；データは示されていない）。したがって、ｐ５３−ＮＶＡクローンにおけるＨＳＰＢ１発現の減少が、ＨＳＰＢ１のｓｉＲＮＡノックダウンを使用してｐ５３アミロイド繊維を誘導できるかどうかをテストした。実際、ＨＳＰＢ１によって誘導されたｐ５３フィブリルと点状のノックダウンとｐ５３凝集体を含むｐ５３−ＮＶＡ細胞の統計分析を図１４ｃに示す。ウエスタンブロッティング分析により、ＨＳＰＢ１  ｓｉＲＮＡノックダウン細胞における不溶性ｐ５３タンパク質の量の増加がさらに確認された（図２０ｄ）。
【０１６８】
さらに、本発明者らは、ＨＳＰＢ１発現も減少させるＨ２Ｏ２処理が、ｐ５３凝集体形成を誘導することを見出した。注目すべきことに、ｐ５３［Ｌ］、［Ｓ］、または［Ｐ］クローンでのＨＳＰＢ１の過剰発現は、ｐ５３アミロイドを有意に減少させなかった（図２０ｅ）。したがって、ＨＳＰＢ１は機能的なｐ５３の維持に必要であるが、誤って折りたたまれたｐ５３タンパク質をリフォールディングするために役立つことはできない。
【０１６９】
＜実施例２１：ｐ５３タンパク質とＡβアミロイド分解剤の過剰発現によるｐ５３凝集体の効率的な除去＞
生細胞におけるｐ５３アミロイドの挙動をモニターするために、本発明者らは、ｐ５３自体の過剰発現がｐ５３凝集体に隔離されるかどうかを試験した（図２１）。予期せぬことに、外因性ＧＦＰ−ｐ５３ＷＴタンパク質が株特異的繊維に隔離されておらず、涙点染色も示されていないことがわかった（図２１ａ）。ワイルドタイプのｐ５３の過剰発現は、ｐ５３［Ｌ］、［Ｓ］、［Ｐ］の凝集体を最大６０％効率的に除去した。また、ｐ５３変異体Ｒ２８０Ｓ（ＧＦＰ−ｐ５３Ｒ２８０Ｓ）がｐ５３凝集体をほぼ完全に排除できることもわかった（図２１ｂ）。ｐ５３アミロイドクリアランス効率が計算され、図２１ｂに要約されている。
【０１７０】
注目すべきことに、過剰発現されたｐ５３ＷＴおよびＲ２８０Ｓタンパク質の両方が、ＣＤ１３３の発現を減少させただけでなく、これは、ｐ５３が凝集して細胞死を誘導する間に上昇した（図２１ｃ）。
【０１７１】
さらに、本発明者らは、抗ｐ５３抗体による免疫蛍光染色に続いて、２９３Ｔ細胞をＡβアミロイド分解剤、バイカレインで処理した。バイカレインはまた、ｐ５３の誤って折りたたまれた凝集体を減少させ、ｐ５３の自発的な凝集を抑制したことを発見した（図２１ｄおよび２１ｅ）。これらの結果は、Ａβアミロイド分解化合物が癌治療に使用できる可能性があることを示唆している。
【０１７２】
＜実施例２２：Ｒｂのプリオン様ＬＣドメインの同定＞
１００μＭのｂ−イソックスを２９３Ｔ細胞の細胞溶解物と共に４℃でインキュベートして、プリオン様タンパク質全体を化学的に沈殿させ、次いで、ウエスタンブロッティングによってＲｂ結合の効率を分析して、Ｒｂのプリオン様または相転移の可能性を評価した（図２２）。ウエスタンブロッティングにより、ｂ−ｉｓｏｘによるＲｂの沈殿が明らかになった（図２２ａ）。溶解度分析により、Ｒｂの小さなポケット（ａａ．２６３−７８８）がプリオン様ドメインであることがさらに明らかになった（図２２ｂ）。ＲｂのＮ末端（ａａ．１０−５６）は、プリオンのようなコンフォメーションを安定化する（図２２ｃ）。ＲｂのＮ末端を削除すると、タンパク質が分解される（図２２ｄ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年3月3日(2021.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラボノイド、ＨＳＰ２７に対するｓｉＲＮＡ、二次凝集しやすいタンパク質、プリオン様ＬＣドメインを発現するプラスミド、熱ショックタンパク質モジュレーター、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一を含む、コンフォメーション病を予防または治療するための医薬組成物であって、
この際、コンフォメーション病は、分解性コンフォメーション病、非アミロイド凝集コンフォメーション病、またはｐ５３凝集を伴う癌、ダウン症候群、および緑内障からなる群から選択されるアミロイド凝集コンフォメーション病である、コンフォメーション病の予防または治療するための医薬組成物。
【請求項２】
前記フラボノイドは、バイカレインまたはその誘導体であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＨＳＰ２７に対する前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８と少なくとも９０〜１００％同一であることを特徴とする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記二次凝集しやすいタンパク質は、ＴＤＰ−４３であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記熱ショックタンパク質モジュレーターは、１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）またはアリモクロモールであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記分解性コンフォメーション病は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、小児がん、網膜芽細胞腫、膀胱がん、乳がん、骨肉腫、またはＲｂ（Ｒｂ１）欠損がんである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記非アミロイド凝集コンフォメーション病は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ユビキチンを伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＤＬ−Ｕ）、海馬硬化症、または混合プロテオパチーである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
フラボノイドまたはＨＳＰ２７に対するｓｉＲＮＡを含む、プリオン様ＬＣタンパク質のプリオン様コンフォーマーを増加させるための医薬組成物。
【請求項９】
前記フラボノイドは、バイカレインまたはその誘導体であることを特徴とする、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＨＳＰ２７に対する前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８と少なくとも９０〜１００％同一であることを特徴とする、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
プリオン様タンパク質を含む、ＴＤＰ−４３プロテオパチーを治療するための医薬組成物。
【請求項１２】
ＴＤＰ−４３プロテオパチーが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ユビキチンを伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＤＬ−Ｕ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、および神経変性の混合病理である、請求項１１の医薬組成物。
【請求項１３】
（ａ）熱ショックタンパク質モジュレーター；及び
（ｂ）フラボノイド；
を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１４】
前記熱ショックタンパク質モジュレーターは、１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）またはアリモクロモールであることを特徴とする、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記フラボノイドは、バイカレインまたはその誘導体であることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
凝集コンフォメーション病を治療するための治療候補を同定するためのインビトロ方法であって、
（ａ）前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させる前に、その１つまたは複数の試験細胞におけるＰ５３凝集体の発現レベルを決定するステップ；及び
（ｂ）前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させた後、ステップ（ａ）におけるＰ５３凝集体の発現レベルを決定するステップ；
を含み、
前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させる前のＰ５３凝集体の発現レベルと比較して、前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させた後のＰ５３凝集体の発現レベルの減少は、前記治療候補がコンフォメーション病の治療に有効であることを示すことを特徴とする、凝集コンフォメーション病を治療するための治療候補を同定するためのインビトロ方法。
【請求項１７】
前記Ｐ５３凝集体のサイズは、約０．１〜約１００ｕｍであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
コンフォメーション病を治療するための治療候補を同定するためのインビトロ方法であって、
（ａ）前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させる前に、その１つまたは複数の試験細胞から選択されたコンフォメーション病に特異的なポリマーの発現レベルを決定するステップ；及び
（ｂ）前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させた後、ステップ（ａ）における前記ポリマーの発現レベルを決定するステップ；
を含み、
前記ポリマーは、実質的にＴＤＰ−４３、Ｈｔｔ、ラミンＢ１、ＦＵＳ、ＴＩＡ−１、Ｔａｕ、ＳＭＮ、ｐ５３、Ｒｂ、ＰＦＮ１およびＳＭＮ、からなる群から選択され、
前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させる前の前記ポリマーの発現レベルと比較して、前記治療候補を１つまたは複数の試験細胞と接触させた後の前記ポリマーの発現レベルの増加は、前記治療候補がコンフォメーション病の治療に有効であることを示すことを特徴とする、コンフォメーション病を治療するための治療候補を同定するためのインビトロ方法。
【国際調査報告】
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