(57)【要約】  本発明は、組換えヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）株をコードする核酸分子、前記ＨＣＭＶ株によって産生されるデンスボディ、および医薬における（特にＨＣＭＶに対するワクチンとしての）使用のための前記デンスボディの調製物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＨＣＭＶ株のゲノムをコードする核酸分子であって、
前記組換えＨＣＭＶ株は、ＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅの遺伝子改変バリアントであり、前記核酸分子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３１５１９７の下で寄託されているＴｏｗｎｅ−ＢＡＣ中に存在する、前記ＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅのヌクレオチド配列と、ＵＬ１３０遺伝子および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子をコードする配列以外で、その全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有し、
前記組換えＨＣＭＶ株は、機能的なＵＬ１３０タンパク質をコードし、かつ機能的な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしない、核酸分子。
【請求項２】
少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
ＧＦＰ遺伝子が欠失されており、かつ異種遺伝子、特に細菌ガラクトキナーゼ遺伝子、が挿入されている、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
組換えＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰのゲノムをコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項５】
ベクター上、特にＢＡＣベクター上、に配置されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のゲノムを有するＨＣＭＶ株での哺乳動物標的細胞の感染によって産生されるデンスボディであって、前記デンスボディは、ウイルスタンパク質ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａからなる５量体複合体を含み、かつＧＦＰを含まない、デンスボディ。
【請求項７】
前記ウイルスタンパク質ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８およびＵＬ１３１ＡはＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅに由来し、前記ウイルスタンパク質ＵＬ１３０はＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅに由来する、請求項６に記載のデンスボディ。
【請求項８】
薬学的に許容されるキャリア中の請求項６または７に記載のデンスボディの調製物。
【請求項９】
例えばＵＶ照射によって、不活化されている、請求項８に記載の調製物。
【請求項１０】
不活化されていない、請求項８に記載の調製物。
【請求項１１】
医薬における使用のための、特にヒト医薬による、さらに特にＨＣＭＶに対するワクチンとしての使用のための、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１２】
ワクチン接種されたヒト対象におけるＨＣＭＶ関連障害の発生を予防および／または改善するための、ならびに／あるいはさらなるヒト対象へのＨＣＭＶ感染の伝播を阻害するための方法における使用のための、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の使用のため、およびワクチン接種されたヒト対象の内在性免疫を維持するための、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１４】
請求項１１または１２に記載の使用のため、およびワクチン接種されたヒト対象においてインターフェロン反応を刺激するための、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１５】
請求項１１または１２に記載の使用のため、およびワクチン接種されたヒト対象においてウイルスタンパク質のオートファジーを促進するための、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の調製物であって、自己貪食されるタンパク質は分解され、ＭＨＣ分子によって、特にＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子によって、提示される、調製物。
【請求項１６】
ＨＣＭＶに対してヒト対象をワクチン接種するための方法であって、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のデンスボディの調製物の免疫原性有効用量を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）株をコードする核酸分子、前記ＨＣＭＶ株によって産生されるデンスボディ、および医薬における（特にＨＣＭＶに対するワクチンとしての）使用のための前記デンスボディの調製物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）での感染は、易感染性の免疫状態を有する（例えば、固形臓器または造血幹細胞の移植後の）患者における疾患の主要な原因である。さらに、妊娠中のウイルスの伝播は、先天性感染を生じ得る。そのような感染は、西洋国における全ての出生の２パーセントに至る頻度で生じ得る。従って、先天性ＨＣＭＶ感染は主要な公衆衛生上の懸念である。その結果、ＨＣＭＶワクチンの開発は最優先の健康管理目標である。
【０００３】
いくつかのワクチン候補が確立されている。これらには、免疫優性エンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に基づく組換えタンパク質ワクチン、ＤＮＡプラスミドまたはペプチドベースの技術を使用する、ｇＢ＋Ｔ細胞標的ｐｐＵＬ８３［ｐｐ６５］および／または主要前初期タンパク質１（ＩＥ１）を含む免疫原性ウイルス遺伝子産物を発現するワクチン；生ウイルス（life virus）またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）系を使用する、ｇＢおよび他のＨＣＭＶ抗原の発現を含むベクターベースのワクチンアプローチ；ならびに複製損傷または複製有効ＨＣＭＶ（弱毒化ワクチンまたは無能化単一サイクルワクチン（disabled single-cycle vaccine））が含まれる。
【０００４】
ＷＯ２０００／０５３７２９（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、デンスボディ（ＤＢ）（すなわち、脂質膜によって囲まれ、その中にウイルス糖タンパク質は埋め込まれているが、ウイルスＤＮＡもカプシドも含まない、ＨＣＭＶによる哺乳動物細胞の感染後に放出されるウイルス粒子）は、高度に免疫原性であることが見出された。融合タンパク質を含むＤＢがＷＯ２０１１／１２４３７１（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０００５】
最近の刊行物は、ＤＢが単球由来未熟樹状細胞の成熟化および活性化を刺激することを実証している（１）。これらの研究の過程で、ウイルスタンパク質ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの５量体複合体を発現するＤＢが、ＨＣＭＶ感染に対する強力な中和抗体応答を生じさせることが見出された。
【発明の概要】
【０００６】
本発明により、２段階のＢＡＣ変異誘発によって生成された、ＨＣＭＶ実験室株Ｔｏｗｎｅの５量体陽性バリアントは、５量体含有ＤＢを産生することができることが見出された。
【０００７】
細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターＴｏｗｎｅ  ＢＡＣ中にクローン化され（３）そして配列決定された（４）、（２）に記載のようなＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅのゲノムから出発して（ＧｅｎＢａｎｋデータベースアクセッション番号ＡＹ３１５１９７参照）、新規なＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰを生成した。これは、ＨＣＭＶに対する新世代ＤＢベースワクチンの開発のための親ゲノムとして作用する。
【０００８】
ＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰは、ウイルスタンパク質ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの機能的な５量体複合体を発現するその能力、および親株Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐ中には存在する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする機能的な遺伝子の不在によって特徴付けられる。
【０００９】
ＧＦＰ遺伝子の欠失を、Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐのゲノム中の細菌ガラクトキナーゼ（ＧａｌＫ）遺伝子の挿入によって行った。ＧａｌＫ陰性細菌宿主細胞におけるＧａｌＫの発現は、ガラクトースを添加したときの最少寒天プレート上での組換え構築物のポジティブ選択を可能にする（５）。ＧａｌＫ遺伝子は、細菌プロモーターと作動可能に連結されている。得られるＢＡＣベクターはまた、細菌宿主細胞におけるさらなる選択マーカーとして、細菌プロモーターと作動可能に連結にされているクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。
【００１０】
さらに、本発明者らは、Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰによって産生されるＤＢの宿主免疫系に対する影響を調べるための研究を実施した。驚くべきことに、免疫原性５量体複合体を含むＤＢは、内在性宿主免疫を維持することができ、インターフェロン反応の刺激において有効であり、そして細胞内分解ならびにＭＨＣクラスＩおよび／またはＩＩ分子による提示をもたらすウイルスタンパク質のオートファジーを促進することが見出された。従って、本発明のＤＢは、ワクチン接種されたヒト対象（特にヒト対象）におけるＨＣＭＶ関連障害の発生の予防および／または改善、ならびに／あるいはＨＣＭＶ感染の別のヒト対象への伝播の阻害において有効なワクチンとしての高い潜在力を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−１】Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰの特徴付け。Ａ）Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐ−ＢＡＣおよびＢ）Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰ−ＢＡＣを確立するためのＢＡＣクローニングストラテジーの模式図。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子をＡおよびＢに示す。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、染色体分配タンパク質ＳｏｐＡおよびＳｏｐＢ、複製開始タンパク質ＲｅｐＥ、ならびにガラクトキナーゼｇａｌＫの原核生物遺伝子をＢ）に示す。
【図１−２】Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰの特徴付け。Ｃ）Ｔｏｗｎｅ−ＢＡＣ、Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐおよびＴｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰでのＡＲＰＥ−１９細胞の感染の間接免疫蛍光分析。Ｄ）Ｔｏｗｎｅ−ＢＡＣ−、Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐ−およびＴｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰ−ＤＢ中へのｐＵＬ１３０およびＧＦＰのパッケージングのイムノブロット分析。
【図２】超遠心分離による細胞外ＨＣＭＶ粒子の分離。５０ｎＭレテルモビルを含む培養培地中で増殖させた、Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰ感染ＨＦＦ細胞からの澄明化された培地を、グリセロール酒石酸塩勾配の頂部に重層し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１ローター中で遠心分離した（６０分間、２３，０００ｒｐｍおよび１０℃）。勾配の頂部からの照明によって、非感染性エンベロープ粒子（ＮＩＥＰ）およびデンスボディ（ＤＢ）含有広域と名付けた２つの光散乱バンドが明らかになった。
【図３】ＨＦＦ細胞におけるＰＭＬの分布に対するＤＢ投与の効果。（ａ）非感染細胞（モック）は、ＰＭＬの典型的なドット様核分布を示す。ＨＦＦは平均２０個の不均等サイズのＰＭＬボディを示す。（ｂ）２４適用後時間（ｈ．ｐ．ａ．）において、ＵＶ不活化したＤＢに曝露した細胞は、非感染細胞の斑点のあるプロファイル（speckled profile）を示した。（ｃ）ＨＣＭＶ感染細胞は、２４ｈ．ｐ．ａ．においてＨＣＭＶ  ＩＥ１発現の存在下でＰＭＬの破壊を示した。
【図４】ＨＦＦ細胞におけるＤＢ誘導ＩＳＧ１５発現。（Ａ）ＨＦＦモック感染（mock）、血清飢餓（starv.）、ＨＣＭＶ感染（ＴｏｗｎｅＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰ株；virus）、および１０μｇ／μｌ  ＵＶ不活化ＤＢに曝露したＨＦＦからの総タンパク質を、示した時間で採集した。mock、starv.およびvirusサンプルを４８ｈ．ｐ．ａ．で採集した。タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＩＳＧ１５、ＩＥ１およびチューブリン（ロード対照）に特異的な抗体を使用して、イムノブロッティングによって分析した。（Ｂ）チューブリンに対して規準化されたデンシトメトリーによるＩＳＧ１５のタンパク質レベルの定量。
【図５】ＨＦＦ細胞におけるＤＢ誘導オートファジー。（Ａ）示した時間、モック感染（mock）、飢餓（starv.）、ＨＣＭＶ感染（ＴｏｗｎｅＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰ株；virus；ＭＯＩ  １）、または１０μｇ／μｌ  ＵＶ不活化ＤＢへの曝露をしたＨＦＦにおけるＬＣ３ＩＩレベルのイムノブロット分析。mock、starv.およびvirusサンプルを４８ｈ．ｐ．ａ．で採集した。ＬＣ３およびＩＥ１に特異的な抗体を使用した。チューブリンをロード対照として使用した。（Ｂ）チューブリンに対して規準化されたデンシトメトリーによるＬＣ３ＩＩのタンパク質レベルの定量。
【図６】２４時間の非ＵＶ不活化ＤＢへの曝露の後に富化された細胞タンパク質。ＩＦＩＴ３、テトラトリコペプチドリピートを有するインターフェロン誘導タンパク質３；ＩＳＧ１５、インターフェロン誘導遺伝子１５；ＭＸ１、ＭＸダイナミン様ＧＴＰアーゼ１；ＳＴＡＴ１、シグナル伝達兼転写活性化因子１；ＣＯＬ１Ａ１、Ｉ型コラーゲンα１鎖。
【図７】６時間のＵＶ不活化ＤＢへの曝露の後に富化されたウイルスおよび細胞タンパク質。ＵＬ８３、６５ｋＤａリン酸化タンパク質ｐｐ６５；ＵＬ２５、テグメントタンパク質ＵＬ２５；ＵＬ１２３，ＩＥ１。
【図８】２４時間のＵＶ不活化ＤＢ曝露の後に富化されたかまたは低下したウイルスおよび細胞タンパク質。ＵＬ８３、６５ｋＤａリン酸化タンパク質ｐｐ６５；ＴＯＰ２Ａ、ＤＮＡトポイソメラーゼ２α；ＲＰＬ６，６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ６；ＭＡＤ２Ｌ１、紡錘体アセンブリチェックポイントタンパク質ＭＡＤ２Ａ；ＩＦＩＴ１、テトラトリコペプチドリピートを有するインターフェロン誘導タンパク質１；ＨＥＬ５５（HEL5, 5）、精巣上体管腔タンパク質５５；ＣＯＬ１Ａ１、コラーゲンα１（Ｉ）鎖。
【図９】４８時間のＵＶ不活化ＤＢへの曝露の後に富化されたかまたは低下したウイルスおよび細胞タンパク質。ＵＬ８３、６５ｋＤａリン酸化タンパク質ｐｐ６５；ＯＸＳＲ１、セリン／スレオニンプロテインキナーゼＯＳＲ１；ＴＯＰ２Ａ、ＤＮＡトポイソメラーゼ２α；ＰＦＫＭ、ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ；ＣＯＬ６Ａ１、コラーゲンα１（ＶＩ）鎖；ＣＯＬ１Ａ１、コラーゲンα１（Ｉ）鎖；ＣＯＬ１Ａ２、コラーゲンα２（Ｉ）鎖；ＰＴＭＡ、プロサイモシンα。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の第１の態様は、組換えＨＣＭＶ株のゲノムをコードする核酸分子であって、
組換えＨＣＭＶ株は、ＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅの遺伝子改変バリアントであり、
組換えＨＣＭＶ株は、機能的なＵＬ１３０タンパク質をコードし、そして機能的な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしない、核酸分子を指す。
【００１３】
組換えＨＣＭＶ株は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３１５１９７によるＴｏｗｎｅ−ＢＡＣクローン（３、４）中に存在するＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅの遺伝子改変バリアントである。Ｔｏｗｎｅ−ＢＡＣ中に存在する以前の利用可能なＴｏｗｎｅゲノムとは異なって、遺伝子改変は、ウイルスＵＬ１３０タンパク質をコードする機能的な遺伝子の存在および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする機能的な遺伝子の不在を含む。本発明の組換えＨＣＭＶ株は、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３１５１９７によるＴｏｗｎｅ−ＢＡＣクローン（３、４）中に存在するＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅのヌクレオチド配列に対する、ＵＬ１３０遺伝子およびＧＦＰ遺伝子をコードする配列以外での、その全長にわたる少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．８％の配列同一性によって特徴付けられる。
【００１４】
本発明の核酸分子は、５量体複合体、すなわち、ウイルスタンパク質ｇＨ（ＵＬ７５）、ｇＬ（ＵＬ１１５）、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａ（特に、クローンＴｏｗｎｅ−ＢＡＣ（ＡＹ３１５１９７）中に存在するＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅ由来のｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８およびＵＬ１３１Ａタンパク質、ならびにＨＣＭＶ株ＴＢ４０由来の機能的なＵＬ１３０タンパク質）を含む複合体を形成することができる機能的なウイルスタンパク質をコードする。この株は、単離され、そしてＢＡＣベクター中にクローン化されている（６、７）。クローンＴＢ４０−ＢＡＣ４の完全核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＦ９９９９２１．１の下に記載されている。
【００１５】
特定の実施形態において、本発明の組換え株は、配列番号１に示すアミノ酸配列、または配列番号１に対してその全長にわたって少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質ｇＨ（ＵＬ７５）Ｔｏｗｎｅ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＱ１２１０４１．１由来）、配列番号２に示すアミノ酸配列、または配列番号２に対してその全長にわたって少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質ｇＬ（ＵＬ１１５）Ｔｏｗｎｅ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＱ１２１０４１．１由来）、配列番号３に示すアミノ酸配列、または配列番号３に対してその全長にわたって少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質ＵＬ１２８  Ｔｏｗｎｅ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＱ１２１０４１．１由来）、配列番号４に示すアミノ酸配列、または配列番号４に対してその全長にわたって少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質ＵＬ１３０  ＴＢ４０−ＢＡＣ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＦ９９９９２１．１由来）、および配列番号５に示すアミノ酸配列、または配列番号５に対してその全長にわたって少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質ＵＬ１３１Ａ  Ｔｏｗｎｅ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＱ１２１０４１．１由来）をコードする。
【００１６】
一定の実施形態において、核酸分子は、融合タンパク質（例えば、ＷＯ２０１１／１２４３７１に開示されるような融合タンパク質）をさらにコードしてもよい。一定の実施形態において、核酸分子は、いかなる機能的な異種の、すなわち非ＨＣＭＶのタンパク質もコードしない。
【００１７】
一定の実施形態において、元のＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅ中に存在するＧＦＰ遺伝子は欠失され、そして異種遺伝子、特に細菌ガラクトキナーゼ遺伝子が、ＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅゲノムにおけるその以前の位置で挿入される。
【００１８】
具体的な実施形態において、核酸分子は、組換えＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰのゲノムをコードし、その調製は本実施例に記載される。
【００１９】
一定の実施形態において、組換えＨＣＭＶ株のゲノムは、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）において発現されることができる形態の選択マーカーをコードする核酸配列の不在によって特徴付けられる。例えば、組換えＨＣＭＶ株のゲノムは、哺乳動物細胞において発現されることができない原核生物発現制御配列と作動可能に連結されているｇａｌＫまたはクロラムフェニコール耐性遺伝子のような選択マーカー遺伝子を含んでもよい。
【００２０】
本発明の核酸分子は、任意の一本鎖または二本鎖核酸分子、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。一定の実施形態において、核酸分子は二本鎖ＤＮＡである。
【００２１】
核酸分子は、それ自体で、またはベクター（例えば、ＢＡＣベクターまたは酵母ベクター）上に配置されて存在してもよい。適切な酵母ベクターは（８）に記載されている。
【００２２】
本発明の核酸分子での哺乳動物標的細胞のトランスフェクションは、ウイルス粒子およびデンスボディ（すなわち、カプシドまたはウイルスＤＮＡなしのウイルス粒子）の産生をもたらす。一定の実施形態において、標的細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト線維芽細胞、例えば、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）またはヒト肺線維芽細胞、例えば、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）である。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、哺乳動物標的細胞、特にヒト標的細胞、例えば、ヒト線維芽細胞の、ＨＣＭＶ株でのトランスフェクションによって、特に、上記のようなＨＣＭＶ株でのトランスフェクションによって産生されるデンスボディ（ＤＢ）であり、ここで、ＤＢは、ウイルスタンパク質ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａからなる５量体複合体を含み、そしてＧＦＰを含まない。
【００２４】
本発明によるＤＢは、哺乳動物標的細胞、例えば、ヒト線維芽細胞の、ＨＣＭＶによるトランスフェクションの後、特に、上記のような組換えＨＣＭＶ株によるトランスフェクションの後に放出されるウイルス粒子であってもよく、ここで：
−  粒子は、その中にウイルス糖タンパク質が埋め込まれている脂質膜によって囲まれており、
−  粒子は、実質的な量のウイルスＤＮＡまたはカプシドを含まず、
−  粒子は、特に上記のような、ウイルスタンパク質ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１からなる５量体複合体を含み、そして
−  粒子は、ＧＦＰを含まない。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、哺乳動物標的細胞、特にヒト標的細胞、例えば、ヒト線維芽細胞の、ＨＣＭＶ株での感染によって、特に、上記のようなＨＣＭＶ株での感染によって産生されるデンスボディ（ＤＢ）であり、ここで、ＤＢは、ウイルスタンパク質ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａからなる５量体複合体を含み、そしてＧＦＰを含まない。
【００２６】
本発明によるＤＢは、哺乳動物標的細胞、例えば、ヒト線維芽細胞の、ＨＣＭＶによる感染の後、特に、上記のような組換えＨＣＭＶ株による感染の後に放出されるウイルス粒子であってもよく、ここで： 
−  粒子は、その中にウイルス糖タンパク質が埋め込まれている脂質膜によって囲まれており、
−  粒子は、実質的な量のウイルスＤＮＡまたはカプシドを含まず、
−  粒子は、特に上記のような、ウイルスタンパク質ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１からなる５量体複合体を含み、そして
−  粒子は、ＧＦＰを含まない。
【００２７】
デンスボディは、従来の方法、例えば、実施例に記載されるような勾配遠心分離によって、上記のようなウイルス感染細胞の細胞培養上清から単離され得る。これにより、ＤＢの調製物が得られる。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、薬学的に許容されるキャリア、例えば、水性キャリア、非水性キャリアまたはその任意の組み合わせを含む液体キャリア中の上記のようなＤＢの調製物に関する。
【００２９】
一定の実施形態において、調製物は、不活化処理、例えば、ＵＶ照射に供されているＤＢを含む。不活化は、検出可能なウイルス混入の不在によって決定され得る。これは、例えば、インジケーター細胞培養物におけるデノボのＨＣＭＶ  ＩＥ１タンパク質発現の不在によって（９）、ＤＢ調製物のＤＮＡ含量の定量によって、ＤＢ調製物に曝露されたインジケーター細胞培養物の細胞培養上清におけるウイルスゲノムＤＮＡの定量によって、またはＤＢ調製物の電子顕微鏡分析によって達成され得る。
【００３０】
一定の実施形態において、調製物は、不活化処理に供されていないＤＢを含む。
【００３１】
本発明によるＤＢの調製物は、内在性宿主免疫に対する、およびインターフェロン応答を効率的に刺激することへの負の効果の欠如によって特徴付けられ、従って、ワクチン接種された宿主において即時の抗ウイルス免疫応答を惹起することができる。
【００３２】
さらに、ＤＢがヒト標的細胞において（例えば、ヒト線維芽細胞において、またはヒト内皮細胞において）オートファジーを誘導することができることが見出された。オートファジーは、ウイルスタンパク質の細胞内分解および由来するウイルスペプチドのＭＨＣ分子による、特にＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子による提示をもたらし得る。さらに、ＤＢが免疫細胞、例えば、樹状細胞およびその他の抗原提示細胞においてもオートファジーを誘導し、従って、これらの細胞によるウイルスペプチドの提示を支持し得ることが予想される。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、医薬、特にヒト医薬における使用のための、さらに特にＨＣＭＶに対するワクチンとしての使用のための、上記のようなＤＢの調製物を指す。本発明の調製物は、ワクチン接種された対象（例えば、ヒト対象）におけるＨＣＭＶ関連障害の発生の予防および／または改善における使用のために、ならびに／あるいはワクチン接種された対象（例えば、ヒト対象）からさらなる対象へのＨＣＭＶ感染の伝播の阻害のために適切である。
【００３４】
例えば、調製物は、移植、例えば、心臓、腎臓、肝臓もしくは肺のような固形臓器の、または造血幹細胞の移植のＨＣＭＶ関連合併症の処置および／または予防のために使用され得る。さらに、組成物は、ＨＣＭＶの出生前または出生時の伝播の予防のために適切である。
【００３５】
本発明の組成物は、非経口経路による、例えば、皮下または筋肉内投与による投与のために適切である。一定の実施形態において、調製物はアジュバントと一緒に投与される。他の実施形態において、調製物はさらなるアジュバントなしで投与される。
【００３６】
本発明のワクチンは、出生前感染または出生前感染に次ぐＨＣＭＶ関連障害を予防するために使用され得る。その結果、ワクチンについての所望される標的集団は小児または青年期の女性対象となる。第２の所望される標的集団は、同種異系または自己移植片、例えば、固形臓器または造血幹細胞を受けている患者である。さらなる展望において、一般集団のワクチン接種が想定される。
【００３７】
特定の実施形態において、調製物は、ワクチン接種されたヒト対象の内在性免疫の維持における使用のために適切であり、それによって投与後の所望されないプロウイルス副作用の発生が回避される。
【００３８】
さらなる特定の実施形態において、本発明の調製物は、ワクチン接種されたヒト対象におけるインターフェロン反応の刺激における使用のためのものである。
【００３９】
なおさらなる実施形態において、本発明の調製物は、ワクチン接種されたヒト対象におけるウイルスタンパク質のオートファジーの促進における使用のためのものであり、ここで、自己貪食されたタンパク質は分解され、そしてＭＨＣ分子によって、特にＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される。
【００４０】
さらに、本発明は、標的細胞、例えば上記のようなヒト線維芽細胞の感染、および細胞培養培地の上清からのＤＢの単離による、上記のようなデンスボディ調製物の調製方法に関する。
【００４１】
さらに、本発明は、標的細胞、例えば上記のようなヒト線維芽細胞のトランスフェクション、および細胞培養培地の上清からのＤＢの単離による、上記のようなデンスボディ調製物の調製方法に関する。
【００４２】
最後に、本発明は、上記のようなＤＢ調製物の免疫原性有効用量を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む、ＨＣＭＶに対して対象、特にヒト対象をワクチン接種するための方法に関する。
【００４３】
さらに、本発明を以下の図面および実施例によってより詳細に説明する。
【実施例】
【００４４】
実施例１
５量体陽性ＤＢ産生株の生成
ＤＢを、ヒト線維芽細胞において、組換えＨＣＭＶ種ウイルスでの感染に際して産生した。この種ウイルスを、以下に記載するようなＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株のゲノムの遺伝子改変型をコードするＢＡＣプラスミドでの細胞のトランスフェクションに際して得た。
【００４５】
ＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ−ＢＡＣは、新世代ＤＢワクチンの生成のための親ゲノムとして作用するＴｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰ−ＢＡＣを生成するための基礎を構成した。ＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ−ＢＡＣを、ｐＵＳＦ−３と称するベクターｐＭＢＯ１３７４の改変型、および野生型ＴｏｗｎｅウイルスＤＮＡの相同組換えによって構築した（３）。ｐＭＢＯ１３７４はＦプラスミドベクターｐＭＢＯ１３１の誘導体であり、その中で、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）のマルチクローニング部位が埋め込まれたｌａｃＺ遺伝子を含む６４５ｂｐ  ＨａｅＩＩフラグメントがｐＭＢＯ１３１のユニークＳａｌＩ部位中にサブクローニングされて、いくつかのユニーククローニング部位の挿入がもたらされている（１０）。ｐＵＳＦ−３はさらに、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＢＡＣとしての維持のための原核生物遺伝子エレメント、ウイルスゲノムの特有の短い領域への直接相同組換えのためのＨＣＭＶ  ＤＮＡ配列、および真核生物細胞における組換えＨＣＭＶの同定および精製のためのＧＦＰマーカーを含む（３）。
【００４６】
ｐＵＳＦ−３を構築するために、ｐＭＢＯ１３７４中のユニークＢａｍＨＩ部位および２つのＣｌａＩ部位のうちの１つを除去した。相同組換えのためのフランキングＨＣＭＶ  ＤＮＡとして使用したｐＵＳＦ−３中の２つのＨＣＭＶ  ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって、ＨＣＭＶ株ＡＤ１６９のゲノムのフラグメントを含むコスミドクローンｐＣＭ１０５２（１１）から誘導した。ＤＮＡフラグメントの増幅のために使用したプライマーは、ＡＤ１６９  ＨＣＭＶの公開された配列（１２）に由来し、そしてＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩオーバーハングを伴なって伸長させた。ＨＣＭＶ  ＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩで消化し、ライゲーションして５．２ｋｂフラグメントを得、これを次にＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローン化した。最後に、ｐＧＥＴ−０７（１３）由来のＳＶ４０初期プロモーター、ＧＦＰ遺伝子およびポリＡを有するＰＣＲアンプリコンを、残存するＣｌａＩ部位中にクローン化した。相同組換えのために、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を、ＨＣＭＶのＴｏｗｎｅ株に感染させたＨＦＦ細胞から単離した総ウイルス粒子から精製した野生型ＴｏｗｎｅウイルスＤＮＡを、直鎖状化した（ＢａｍＨＩ消化した）ｐＵＳＦ−３およびＨＣＭＶテグメントタンパク質ｐｐ７１のための発現プラスミド（１４）とともに用いてエレクトロポレーションした。相同組換えに際して、フランキングＤＮＡは、細胞培養物中でのＨＣＭＶ複製に不必要であるＨＣＭＶのＵＳ領域内の８．９ｋｂのＤＮＡ（ａａ７１９の後のＩＲＳ１、リーディングフレームＵＳ１〜ＵＳ１１＋ＵＳ１２のＣ末端の１／３）を欠失させる（１５）。Ｔｏｗｎｅ−ＢＡＣ単離物の配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されている（アクセッション番号ＡＹ３１５１９７）（４）（参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４７】
ＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ  ＤＢは、ＵＬ１３０遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）におけるフレームシフト変異に起因して５量体複合体を保有せず、そして偶発的にパッケージングされたＧＦＰを含む。
【００４８】
ヒトへのＤＢ適用の後のＧＦＰの有害な効果の潜在的な危険性を回避するために、そして広範な免疫応答を惹起するために重大な５量体複合体の形成を再構成するために、本発明者らは、ガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）ネガティブ−ポジティブ選択手順を使用することによって、元のＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ−ＢＡＣを遺伝子改変して、Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰ−ＢＡＣを生成した：第１に、変異したＵＬ１３０  ＯＲＦを、ＴＢ４０／Ｅ株由来のその機能的ホモログで置換した（図１Ａ）。第２に、ＧＦＰ遺伝子を、得られたＴｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐ−ＢＡＣから欠失させた（図１Ｂ）。５量体複合体の再構成により、Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰウイルス粒子の上皮細胞への感染が可能になった（図１Ｃ）。さらに、ｐＵＬ１３０の存在によって測定したところ、５量体複合体の形成は回復し、そしてＧＦＰのパッケージングは、再構成されたＴｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰウイルスでの感染に際して得られたＤＢにおいて防止された（図１Ｄ）。
【００４９】
粒子の精製のために、１．８×１０６個の初代ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を２０個の１７５ｃｍ２組織培養フラスコ中、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、Ｌ−グルタミン（１００ｍｇ／リットル）、およびゲンタマイシン（５０ｍｇ／リットル）を補充した最少必須培地（ＭＥＭ；Gibco-BRL, Glasgow, Scotland）中で１日間増殖させた。細胞を、ヒトサイトメガロウイルスのＴｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰ株の凍結ストック０．５ｍｌを用いて感染させた。ウイルス接種物を１．５時間３７℃で吸着させた。培養ＭＥＭにおいて５０ｎＭレテルモビル（MedChem Express (MCE)、HY-15233、１ｍｌ  ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を添加して、細胞を少なくとも７日間インキュベートした。レテルモビルを３日毎にリフレッシュした。
【００５０】
細胞が後期ＨＣＭＶ感染のＣＰＥ（細胞変性効果）を示したときに（通常、感染後［ｐ．ｉ．］７日目）、上清を収集し、そして１０分間２，８００ｒｐｍで遠心分離して、細胞デブリを除去した。その後、上清を採集し、そして３０，０００ｒｐｍで（７０分間、１０℃）、ＳＷ３２Ｔｉローター中、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａ  Ｌ−９０Ｋ超遠心分離機中で遠心分離した。ペレットを２ｍｌの１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。グリセロール酒石酸塩勾配を使用直前に調製した。このために、０．０４Ｍ  Ｎａリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中３５％の酒石酸Ｎａ溶液４ｍｌを１つのカラムにアプライし、そして０．０４Ｍ  Ｎａリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中１５％の酒石酸Ｎａ−３０％グリセロール溶液５ｍｌをグラジエントミキサーの第２のカラムにアプライした。勾配を、溶液を４５°の角度で配置したＢｅｃｋｍａｎ  Ｕｌｔｒａ−ｃｌｅａｒ遠心チューブ（１４×８９ｍｍ）中にゆっくりと滴下することによって調製した。次いで、１ｍｌ（One 1 ml）のウイルス粒子を勾配の頂部に慎重に重層した。超遠心分離をブレーキなしでＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１スイングアウトローター中６０分間２３，０００ｒｐｍ、１０℃で実施した。粒子を、光散乱によって照明し（図２）、バンドの下で中空針を遠心チューブに穿通させることによって勾配から採集した。サンプルを、シリンジを用いてチューブから慎重に引き抜いた。
【００５１】
Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰ  ＤＢの初期分析のための粒子を、１×ＰＢＳで洗浄し、そしてＳＷ４１スイングアウトローター中９０分間２４，０００ｒｐｍ、１０℃でペレット化した。最後の遠心分離工程の後、ＤＢを２５０μｌ〜３５０μｌの１×ＰＢＳ中に再懸濁し、そして−８０℃で貯蔵した。精製されたＤＢのタンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Thermo Scientific, Bonn, Germany）を用いて決定した。
【００５２】
実施例２
デンスボディのＵＶ不活化
液体がスポットプレートに固着するので、ＵＶ不活化の前に、ＤＢの量を調整する必要があった。ＤＢの必要量を２００μｌのＰＢＳに添加し、そして不活化の後に１０μｇのＤＢが１５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁されるようにスポットプレート上に滴下した。その後、スポットプレートをＵＶランプ下に置き、そして２５４ｎｍの波長のスイッチを２分間作動させた。ＤＢのＵＶ不活化のために、ＵＶ−Ｈａｎｄランプ（Herolab GmbH Laborgerate, Wiesloch; Type NU-4）を使用した。１５０μｌのＰＢＳ／ＤＢ懸濁液（１５０μｌのＰＢＳ中１０μｇのＤＢ）を新たなチューブに移した。１０ｃｍディッシュ中の５×１０５個のＨＦＦへのＤＢの適用のために、１３５０μｌの培養ＭＥＭと１５０μｌのＤＢ／ＰＢＳとを混合し、そしてＤＢ接種物を１．５時間３７℃で吸着させた。次いで、培養ＭＥＭを添加し、そして細胞を示した時間インキュベートした。
【００５３】
実施例３
核内構造体（ＮＢ）媒介内在性免疫に対するＤＢの影響
タンパク質ＰＭＬは、核内構造体（ＮＢ）としても知られるＮＤ１０ドメインの形成のために重要であることが以前に示されている（総説については（１６、１７）を参照のこと）。これらの核内構造は、ヘルペスウイルス感染に対抗する複数の細胞タンパク質の集積を表す。ＮＤ１０ドメインのインターフェロン誘導性アップレギュレーションを示した以前のデータに基づいて、ＰＭＬが細胞の内在性抗ウイルス防御機構に寄与することが示唆された。ＨＣＭＶは、この抗ウイルス活性に対抗するためのストラテジーを進化させた。ＨＣＭＶ感染の間、前初期タンパク質１（ＩＥ１）はＰＭＬボディにおいて集積し、その後ＰＭＬの分散を誘導し、それによってＮＢ媒介内在性免疫に拮抗する。ＰＭＬ分散に対するＤＢの影響を分析した。
【００５４】
間接免疫蛍光分析のために、ＨＦＦ細胞（２×１０５）を６ウェルプレート中のカバーグラス上で増殖させた。翌日、細胞を、モック感染させるか、ＨＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰ株）に感染させるか、または１０μｇのＵＶ不活化ＤＢ（ＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰ）に曝露するかのいずれかをした。ＤＢを、検出可能なビリオン混入およびデノボのＣＭＶ遺伝子発現（前初期１タンパク質（ＩＥ１）の発現について染色することによって決定）を消失させるために必要とされる最小の曝露時間（２分間）のＵＶ光を適用することによって不活化した。２４時間後、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、そしてメタノール中で１０分間−２０℃で固定した。３回１×ＰＢＳで１０分間洗浄した後、細胞を３０分間１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳを用いて室温でブロッキングした。内因性ＰＭＬタンパク質の検出のために、１次モノクローナル抗体ＰＧ−Ｍ３（Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, Calife）を加湿したチャンバー中１時間３７℃で添加した。ＩＥ１（ｐ６３−２７）またはｐｐ６５（６５−３３、W. Britt, UAB, Birmingham, ALにより提供）に対する第２の１次抗体を、３７℃での洗浄工程の後にさらに１時間添加した。先行する洗浄工程の後、２次抗体とのインキュベーションの前に細胞をさらに１０分間１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳを用いてブロッキングした。検出を、抗マウスＡｌｅｘａ  ５４６または抗ウサギＡｌｅｘａ  ４８８結合（Molecular Probes）２次抗体の加湿したチャンバー中３７℃でのさらなる１時間の添加、および１０分間室温での核染色（ＤＡＰＩ）によって実施した。細胞を３回１×ＰＢＳで２０分間、次いで１回ｄｄＨ２Ｏで洗浄した。カバーグラスを、封入剤を用いて顕微鏡スライド上で埋封し、一晩３７℃で乾燥させ、そして＋４℃で分析まで貯蔵した。
【００５５】
ここで、本発明者らは、２４適用後時間（ｈ．ｐ．ａ．）のヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ細胞）におけるＰＭＬの細胞内局在に対するＤＢの効果を調べた。非感染細胞において、ＰＭＬは核において特徴的なドット様パターンの分布と関連していた。ＨＦＦは平均２０個の不均等サイズのＰＭＬボディを示した（図３ａ）。ＰＭＬボディの破壊がＨＣＭＶ感染細胞において観察され、ここで、効果はＩＥ１発現に起因した（図３ｃ）。このＩＥ１の介入は効率的なウイルス複製のために必要とされる。ＵＶ不活化ＤＢに曝露した細胞は、非感染細胞の斑点のあるプロファイルを示し（図３ａ、ｂ）、ＤＢはＰＭＬボディの分布に影響を及ぼしていなかったと考えられる。
【００５６】
これらの実験は、ＤＢが単独でＰＭＬボディを分散できないことを示した。結果として、ＨＣＭＶ感染の後に見られるＰＭＬボディのプロウイルス分散はＤＢによって模倣されず、このレベルでのこれらの粒子のプロウイルス効果は排除される。このことは、ＤＢがＨＣＭＶのための適切なワクチンであるとの考えをさらに強調する。
【００５７】
実施例４
インターフェロン誘導遺伝子１５（ＩＳＧ１５）発現の誘導に対するＤＢの影響
インターフェロンは、ウイルス感染に対する自然免疫応答のために重要である。全てのインターフェロンは、数百のインターフェロン誘導遺伝子（ＩＳＧ）の転写を誘発し、そのタンパク質産物は抗ウイルス活性を示す。インターフェロン誘導遺伝子１５は、Ｉ型ＩＦＮによって誘導されるユビキチン様タンパク質（ＩＳＧ１５）をコードする。ＩＳＧ１５によるタンパク質修飾（ＩＳＧ化（ISGylation））は多くのウイルスの複製を阻害することが知られている（１８）。ＨＣＭＶ誘導ＩＳＧ１５集積は、宿主の、細胞質二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の検出によって誘発される。しかし、この集積は後にＨＣＭＶ  ＩＥ１発現によって抑制される（１９、２０）
【００５８】
この節において取り組む問いは、ＨＦＦ細胞へのＤＢ適用がＩＳＧ１５発現を誘導するかどうかであった。
【００５９】
イムノブロット分析のために、ＨＦＦ細胞（５×１０５）を１０ｃｍ細胞培養ディッシュ中で増殖させた。翌日、細胞をモック感染させるか、無血清ＭＥＭ培地中で飢餓にさせるか、ＨＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰ株、ＭＯＩ  １）に感染させるか、または１０μｇのＵＶ不活化ＤＢ（ＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰ）に曝露するかのいずれかをした。ＤＢを、ビリオン混入およびデノボのＣＭＶ遺伝子発現（前初期１タンパク質（ＩＥ１）の発現について染色することによって決定）を消失させるために必要とされるＵＶ光への最小の曝露（２分間）を与えて、不活化した。
【００６０】
示す適用後（ｐ．ａ．）時間に、ＨＦＦ細胞をＰＢＳで洗浄し、掻き取り、そして採集した。１５，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離およびＰＢＳでの洗浄の後、細胞を計数し、そしてレムリ（Laemmli）細胞溶解緩衝液中１×１０５細胞／１０μｌに調整した。次いで、混合物を９５℃で１０分間煮沸した。その後、２０μｌの各々のサンプルをビス／アクリルアミドゲル（Invitrogen, Thermo Fisher Scientific）にロードした。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中でのタンパク質サンプルの分離の後、分離されたタンパク質をＰＶＤＦメンブランに転写した。次いで、ＰＶＤＦメンブラン（Millipore, Burlington, MA）を１時間ＴＢＳＴ中の５％脱脂粉乳でブロッキングし、そして１次抗体と４℃で一晩インキュベートした。この研究において使用した１次抗体は、マウス抗ＩＥ（ｐ６３−２７）、マウス抗ＩＳＧ１５（Santa Cruz、１：５００希釈）、およびマウス抗チューブリン（Sigma、１：５００希釈）であった。３回ＴＢＳＴで１０分間洗浄した後、抗マウスＩＲＤｙｅ  ８００  ２次抗体を２時間のインキュベーションのために１：１０，００００希釈で使用した。各々のバンドにおけるタンパク質濃度を、ＬＩ−ＣＯＲによって提供されるＩｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｌｉｔｅソフトウェアを使用したチューブリンレベルに対する規準化によって定量的に概算した。
【００６１】
実験は、ＵＶ不活化ＤＢがＩＳＧ１５発現を誘導できることを示す。ＤＢはウイルスＤＮＡを含まないので、この効果はｄｓＤＮＡ（ＩＳＧ１５発現の１つの既知の誘導物質）に非依存性であるようである。ＩＳＧ１５はＨＣＭＶでの感染の後に誘導されることが知られているので、ウイルス感染を陽性対照として使用した。ＩＳＧ１５誘導はＤＢ曝露の２４時間後に高レベルに到達し、そしてその後減少した。ウイルス感染単独に比較して、ＤＢおよびウイルスに同時に曝露した細胞由来のサンプルにおいて、より高いレベルのＩＳＧ１５発現への傾向が存在した。
【００６２】
実験は、ＤＢが、それ自体が抗ウイルス活性を与えると考えられているＩＳＧ１５発現を誘導することの証拠を提供する。従って、ＤＢは、このレベルでの抗ウイルス効果を提供するようである。
【００６３】
実施例５
ＤＢ適用はオートファジーを誘導する
本発明者らおよび他者は、ＤＢの適用が、ウイルスペプチドの確かな主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ媒介提示に導くことを示した。本発明者らは、ＤＢ由来抗原がオートファジーの誘導を介してＭＨＣクラスＩ経路に導入されるという仮定を追求する。ここで、本発明者らは、ヒト包皮線維芽細胞へのＨＣＭＶのＵＶ不活化ＤＢの適用が実際にオートファジーの誘導をもたらすことを示す。
【００６４】
ＤＢをＨＦＦ細胞に再度適用した。４、２４、４８および７２ｐ．ａ．時間で、ＨＦＦ細胞をＰＢＳで洗浄し、掻き取り、そして採集した。１５，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離およびＰＢＳでの洗浄の後、細胞を計数し、そしてレムリ細胞溶解緩衝液中１×１０５細胞／１０μｌに調整した。次いで、混合物を９５℃で１０分間煮沸した。その後、２０μｌの各々のサンプルをビス／アクリルアミドゲル（Invitrogen, Thermo Fisher Scientific）にロードした。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中でのタンパク質サンプルの分離の後、分離されたタンパク質をＰＶＤＦメンブランに転写した。ＰＶＤＦメンブラン（Millipore, Burlington, MA）を１時間ＴＢＳＴ中の５％脱脂粉乳でブロッキングし、そして１次抗体と４℃で一晩インキュベートした。この研究において使用した１次抗体は、マウス抗ＩＥ（ｐ６３−２７）、ウサギ抗ＬＣ３ＩＩ（Cell Signaling Technologies、１：１，０００希釈）、マウス抗チューブリン（Sigma、１：５００希釈）であった。
【００６５】
３回ＴＢＳＴで１０分間洗浄した後、抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０および抗マウスＩＲＤｙｅ  ８００  ２次抗体を２時間のインキュベーションのために１：１０，０００希釈で使用した。各々のバンドにおけるタンパク質濃度を、ＬＩ−ＣＯＲによって提供されるＩｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｌｉｔｅソフトウェアを使用したチューブリンレベルに対する規準化によって定量的に概算した。
【００６６】
ヒトサイトメガロウイルスでのＨＦＦ細胞の感染（virus）および飢餓の両方がオートファジーの誘導をもたらし、そして陽性対照として作用した（図５）。これは、オートファジーの特徴である微小管結合タンパク質１軽鎖３（ＬＣ３ＩＩ）の脂質化の増加によって実証される。１０μｇ／μｌのＵＶ不活化ＤＢに曝露したＨＦＦは、ＬＣ３ＩＩ発現の増加を示した（図５）。増加は早くも４ｈ．ｐ．ａ．に見られ、そして２４時間でピークレベルに到達した。ＬＣ３ＩＩのレベルは４８〜７２ｈ．ｐ．ａ．に徐々に減少した。
【００６７】
実験は、オートファジーがＤＢによって誘導されることを実証する。これは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子によるウイルス抗原の提示の増加に導き得る。さらに、オートファジーの誘導はＨＣＭＶ複製を低下させることが示されているので（２１）、ＤＢによる誘導は抗ウイルス効果を有すると考えられ得る。
【００６８】
実施例６
ＤＢ曝露後の細胞プロテオームの質量分析
細胞に対するＤＢの影響のより包括的な描写を得るために、ラベルフリー質量分析をＤＢ処理ＨＦＦ細胞に対して実施した。
【００６９】
第１の予備的な実験において、ＨＦＦ細胞（５×１０６）を１０ｃｍ細胞培養ディッシュ中で増殖させた。翌日、細胞を、モック処理するか、または２μｇのＤＢ（ＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰ；培養物由来のＤＢの調製物、レテルモビル阻害下で保持［上記を参照のこと］）に曝露するかのいずれかをした。ＤＢをＵＶによって不活化しなかった。
【００７０】
２４ｈ．ｐ．ａ．に、ＨＦＦ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、掻き取り、そして採集した。１５，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離およびＰＢＳでの洗浄の後、細胞をレムリ緩衝液５０μｌ中で溶解し、そして９５℃で１０分間煮沸した。次いで、サンプルをＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（AG Butter, Institute for Molecular Biology, Mainz）のために調製した（下記を参照のこと）。
【００７１】
本発明者らは、インターフェロン応答性であることが知られている（そして抗ウイルス効果を有すると報告された）いくつかのアップレギュレートされたタンパク質（ＩＦＩＴ３、ＩＳＧ１５、ＭＸ１およびＳＴＡＴ１）を同定した（図６）。さらに、本発明者らは、コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）のダウンレギュレーションを観察した。
【００７２】
第２の定量的な質量分析ベースの（ＭＳ）プロテオミクス実験において、ＨＦＦ細胞（５×１０５）を１０ｃｍ細胞培養ディッシュ中で増殖させた。翌日、細胞を、モック感染させるか、ＨＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰ株、ＭＯＩ  １）に感染させるか、または１０μｇのＵＶ不活化ＤＢ（ＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅ−ＵＬ１３０ｒｅｐΔＧＦＰ；培養物由来のＤＢの調製物、レテルモビル阻害下で保持［上記を参照のこと］）に曝露するかのいずれかをした。ＤＢを、ビリオン混入を消失させるために必要とされるＵＶ光への最小の曝露（２分間）を適用することによって不活化した。
【００７３】
６、２４、および４８ｈ．ｐ．ａ．に、ＨＦＦ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、掻き取り、そして採集した。１５，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離およびＰＢＳでの洗浄の後、細胞をレムリ緩衝液５０μｌ中で溶解し、そして９５℃で１０分間煮沸した。次いで、サンプルをＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（AG Butter, Institute for Molecular Biology, Mainz）のために調製した。
【００７４】
サンプル調製：
試薬還元サンプル                              19.5μＬ（min. 20μg）
NuPAGE（登録商標）LDSサンプル緩衝液（4×）     7.5μL
1Mジチオスレイトール（DTT）                    3μL
総体積                                        30μL
【００７５】
次いで、サンプルを７０℃で１０分間加熱した。
【００７６】
サンプルを測定した後、質量分析データを、ＭａｘＱｕａｎｔ（Version: 1.5.2.8; Download: www.maxquant.org (http://maxquant.org)）を使用してフィルターにかけた。アウトプットテーブルをフィルターにかけた（潜在的な共通混入物およびリバースデータベースエントリーの除去を含む）。以下のＦａｓｔａデータベースに対してサーチを実施した。
【００７７】
Homo_sapiens_(HUMAN)_Uniprot_20180108.fasta
Human_cytomegalovirus_(HCMV)_Uniprot_20180108.fasta
Human_cytomegalovirus_(HCMVA)Uniprot(strain_AD169)_20180108.fasta
Human_cytomegalovirus_(HCMVT)Uniprot(strain_Towne)_20180108.fasta
【００７８】
品質管理として、標識タンパク質群の分布および規準化を使用した。規準化は、大多数のタンパク質が調節されないままである場合にのみ使用することができる。同定された、少なくとも２つのペプチド（１つはユニークである必要がある）を有するタンパク質のみが許容された。これらの初期分析はＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙのサービスであった。同定されたタンパク質はエクセルファイルとして提供された。
【００７９】
受領したデータをｌｏｇ２変換比でフィルターにかけた。最小で１．５倍富化されたタンパク質群を示した。
【００８０】
本発明者らの結果において（図７、８および９）、本発明者らは、ＨＣＭＶデンスボディタンパク質であると以前に報告されたｐＵＬ８３（ｐｐ６５）およびｐＵＬ２５を検出した。ｐＵＬ８３（ｐｐ６５）は、ＤＢ中に存在する優勢なテグメントタンパク質である。ｐＵＬ２５もＤＢにおいて豊富であることが見出されている。ＵＬ８３のみを、３つ全ての時点で検出することができ、これは経時的に減少した。さらに、本発明者らは、コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ６Ａ１、およびＣＯＬ１Ａ２）の一貫したダウンレギュレーションを観察した。
【００８１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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