(57)【要約】  対応する野生型遺伝子の発現に対して一塩基多型（ＳＮＰ）を含有する遺伝子の発現のサイレンシングを増強する新規のヌクレオチドが提供される。対応する野生型遺伝子の発現に対してＳＮＰを含有する遺伝子の発現のサイレンシングを増強する新規のヌクレオチドを使用する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’末端、３’末端及びシード領域を有するオリゴヌクレオチドであって、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的であり、
前記シード領域内の位置での一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチドであって、前記アレル多型と相補的である一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチド；及び
前記遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置するミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチド
を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
式：
【化１】
2021533762.tif 000042
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート（ＶＰ）修飾をさらに含む、請求項２に記載のＲＮＡ。
【請求項４】
ＶＰモチーフは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又は前記ＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される、請求項３に記載のＲＮＡ。
【請求項５】
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイド、ＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ギャップマー、ミックスマー、ｍｉＲＮＡ阻害剤、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
ＡＳＯ又は二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
アレル多型を含む前記遺伝子の前記領域と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第１の鎖；及び
前記第１の鎖の少なくとも一部と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第２の鎖
を含み、
前記第１の鎖は、前記アレル多型と相補的である、前記５’末端から２〜６位における前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドを含み、
前記第１の鎖は、前記遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置する前記ＭＭ位置ヌクレオチドを含む、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項８】
前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、前記５’末端から２位にある、請求項７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項９】
前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、前記５’末端から４位にある、請求項７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１０】
前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、前記第１の鎖の前記５’末端から６位にある、請求項７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１１】
前記ＭＭ位置ヌクレオチドは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドの２ヌクレオチド以内又は３ヌクレオチド以内に位置する、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１２】
前記ＭＭ位置ヌクレオチドは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドの４ヌクレオチド以内に位置する、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１３】
前記ＭＭ位置ヌクレオチドは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドの６ヌクレオチド以内に位置する、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１４】
平滑末端である、請求項７〜１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１５】
少なくとも１つの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項７〜１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１６】
天然に存在するヌクレオチドを含む、請求項７〜１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１７】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項７〜１６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１８】
各ヌクレオチドは、修飾される、請求項７〜１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、コレステリル誘導体に連結された末端ヌクレオチド及びドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２０】
前記修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート及び非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２１】
少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド及び５’−ホスホロチオエート基を含む、請求項７〜２０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２２】
前記第１の鎖は、少なくとも３つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項７〜２１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２３】
前記第１の鎖は、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドのいずれかの側で２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２４】
疎水性部分を含む、請求項７〜２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２５】
前記アレル多型を含む遺伝子の前記領域は、配列番号１〜１０からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項７〜２４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２６】
前記第１の鎖は、ＵＵＣＵＧＵＡＧＣＡＵＣＡＧＣＵＵＣＵＣを含む、請求項７〜２５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２７】
二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であって、
アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第１の鎖；及び
前記第１の鎖の少なくとも一部と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第２の鎖
を含み、
前記第１の鎖は、前記アレル多型と相補的である、５’末端から４位における一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチドを含み、
前記第１の鎖は、前記遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、前記５’末端から７位に位置するミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチドを含む、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）。
【請求項２８】
式：
【化２】
2021533762.tif 000043
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む、請求項２７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２９】
ＶＰモチーフは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又は前記ＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される、請求項２８に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項３０】
前記第１の鎖は、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドのいずれかの側で２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項２７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３１】
前記第１の鎖は、少なくとも３つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３２】
５’−ホスホロチオエート基を含む、請求項３１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３３】
アレル多型を含む前記遺伝子は、ハンチンチン（ｈｔｔ）遺伝子である、請求項２７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３４】
前記アレル多型を含む遺伝子の前記領域は、配列番号１〜１０からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項２７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３５】
前記第１の鎖は、ＵＵＣＵＧＵＡＧＣＡＵＣＡＧＣＵＵＣＵＣを含む、請求項２７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３６】
二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であって、
アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第１の鎖；及び
前記第１の鎖の少なくとも一部と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第２の鎖
を含み、
前記第１の鎖は、前記アレル多型と相補的である、５’末端から６位における一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチドを含み、
前記第１の鎖は、前記遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、前記５’末端から１１位に位置するミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチドを含む、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）。
【請求項３７】
式：
【化３】
2021533762.tif 000044
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む、請求項３６に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３８】
ＶＰモチーフは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又は前記ＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される、請求項３７に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項３９】
前記第１の鎖は、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドのいずれかの側で２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項３６に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４０】
前記第１の鎖は、少なくとも３つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４１】
５’−ホスホロチオエート基を含む、請求項３６に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４２】
アレル多型を含む前記遺伝子は、ハンチンチン（ｈｔｔ）遺伝子である、請求項３６に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４３】
前記アレル多型を含む遺伝子の前記領域は、配列番号１〜１０からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項３６に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４４】
前記第１の鎖は、ＵＵＣＵＧＵＡＧＣＡＵＣＡＧＣＵＵＣＵＣを含む、請求項３６に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４５】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載のＲＮＡ及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項４６】
細胞におけるアレル多型を含む遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項１〜４４のいずれか一項に記載のＲＮＡと接触させることを含む方法。
【請求項４７】
アレル多型を含む遺伝子によって特徴付けられるか又は引き起こされる疾患又は障害の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効量の、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的である、５’末端、３’末端及びシード領域を有するＲＮＡを対象に投与することを含み、前記ＲＮＡは、
前記アレル多型と相補的である、前記シード領域内の位置での一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチド；及び
前記遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置するミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチド
を含む、方法。
【請求項４８】
前記ＲＮＡは、式：
【化４】
2021533762.tif 000045
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＶＰモチーフは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又は前記ＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される、請求項４８に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項５０】
前記ＲＮＡは、ＡＳＯ又はｄｓＲＮＡである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記ｄｓＲＮＡは、
アレル多型を含む前記遺伝子の前記領域と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第１の鎖；及び
前記第１の鎖の少なくとも一部と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第２の鎖
を含み、
前記第１の鎖は、前記アレル多型と相補的である、前記５’末端から２〜６位における前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドを含み、
前記第１の鎖は、前記遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置する前記ＭＭ位置ヌクレオチドを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記ｄｓＲＮＡは、前記対象の脳に投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｄｓＲＮＡは、線条体内注入によって投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
線条体における前記遺伝子の発現の減少は、達成される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
皮質における前記遺伝子の発現の減少は、達成される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
アレル多型を含む前記遺伝子は、ハンチンチン（ｈｔｔ）遺伝子である、請求項４７〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記疾患は、ハンチントン病である、請求項４７〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、前記ＲＮＡの前記５’末端から２、４又は６位に位置し、及び前記ＭＭ位置ヌクレオチドは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置する、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項５９】
２つのＲＮＡを含む二分岐オリゴヌクレオチド化合物であって、前記ＲＮＡは、リンカー、スペーサー及び分岐点から選択される１つ以上の部分によって互いに連結され、各ＲＮＡは、５’末端、３’末端及びシード領域を有し、各ＲＮＡは、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的であり、各ＲＮＡは、
前記シード領域内の位置での一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチドであって、前記アレル多型と相補的である一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチド；及び
前記遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置するミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチド
を含む、二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項６０】
前記ＲＮＡは、式：
【化５】
2021533762.tif 000046
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む、請求項５９に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項６１】
ＶＰモチーフは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又は前記ＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される、請求項６０に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項６２】
ｈｓｉ−ＲＮＡ構造を有する、請求項５９に記載の二分岐オリゴヌクレオチド。
【請求項６３】
前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、ｒｓ３６３１２５、ｒｓ３６２２７３、ｒｓ３６２３０７、ｒｓ３６２３３６、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ３６２２７２、ｒｓ３６２３０６、ｒｓ３６２２６８、ｒｓ３６２２６７及びｒｓ３６３０９９からなる群から選択されるｈｔｔ  ＳＮＰのアレル多型と相補的である、請求項５９に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項６４】
前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、ｒｓ３６３１２５、ｒｓ３６２２７３、ｒｓ３６２３０７、ｒｓ３６２３３６、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ３６２２７２、ｒｓ３６２３０６、ｒｓ３６２２６８、ｒｓ３６２２６７及びｒｓ３６３０９９からなる群から選択されるｈｔｔ  ＳＮＰのアレル多型と相補的である、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項６５】
ホスフェート、ビニルホスホネート、Ｃ５−メチル（Ｒ、又はＳ、又はラセミ）、ビニル上のＣ５−メチル及び還元ビニルからなる群から選択される５’安定化部分をさらに含む、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項６６】
アルキル鎖、ビタミン、ペプチド、スフィンゴ糖脂質、多価不飽和脂肪酸、セコステロイド、ステロイドホルモン及びステロイド脂質からなる群から選択されるコンジュゲート部分をさらに含む、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項６７】
アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的である、５’末端、３’末端及びシード領域を有する核酸であって、
前記シード領域内の位置での一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチドであって、前記アレル多型と相補的である一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチド；
前記遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチであるミスマッチ（ＭＭ）位置；及び
前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドのいずれかの側での少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｘ）であって、各Ｘは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドから４、３又は２ヌクレオチド以内に位置する、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｘ）
を含む、核酸。
【請求項６８】
式：
【化６】
2021533762.tif 000047
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む、請求項６７に記載の核酸。
【請求項６９】
ＶＰモチーフは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又は前記ＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される、請求項６８に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項７０】
アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的である、５’末端、３’末端及びシード領域を有する核酸であって、
前記シード領域内の位置での一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチドであって、前記アレル多型と相補的である一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチド；
前記遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチであるミスマッチ（ＭＭ）位置；及び
前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドのいずれかの側での少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｘ）であって、各Ｘは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドから４、３又は２ヌクレオチド以内に位置する、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｘ）
を含む、核酸。
【請求項７１】
式：
【化７】
2021533762.tif 000048
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む、請求項７０に記載の核酸。
【請求項７２】
ＶＰモチーフは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又は前記ＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される、請求項７１に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項７３】
アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的である、５’末端、３’末端及びシード領域を有する核酸であって、
前記シード領域内の位置での一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチドであって、前記アレル多型と相補的である一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチド；
前記遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチであるミスマッチ（ＭＭ）位置；及び
前記ＭＭ位置ヌクレオチドのいずれかの側での少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｙ）であって、各Ｙは、前記ＭＭ位置ヌクレオチドから４、３又は２ヌクレオチド以内に位置する、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｙ）
を含む、核酸。
【請求項７４】
式：
【化８】
2021533762.tif 000049
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む、請求項７３に記載の核酸。
【請求項７５】
ＶＰモチーフは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又は前記ＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される、請求項７４に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項７６】
Ｘは、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−リボ、２’−デオキシリボ、２’−Ｆ−４’−チオアラビノ（２’−Ｆ−ＡＮＡ）、２−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−ＭＯＥ）、４’−Ｓ−ＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、４’−Ｓ−Ｆ−ＡＮＡ、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−エチルアミン、２−シアノエチル−ＲＮＡ（ＣＮｅｔ−ＲＮＡ）、トリシクロ−ＤＮＡ、シクロヘキシル核酸（ＣｅＮＡ）、アラビノ核酸（ＡＮＡ）及びヘキシトール核酸（ＨＮＡ）からなる群から選択される糖修飾を含む、請求項７０に記載の核酸。
【請求項７７】
Ｙは、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、２’−リボ、２’−デオキシリボ、２’−Ｆ−ＡＮＡ、２’−ＭＯＥ、４’−Ｓ−ＲＮＡ、ＬＮＡ、４’−Ｓ−Ｆ−ＡＮＡ、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−エチルアミン、ＣＮｅｔ−ＲＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ＣｅＮＡ、ＡＮＡ及びＨＮＡからなる群から選択される糖修飾を含む、請求項７３に記載の核酸。
【請求項７８】
Ｘは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する５’の直近又は前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する３’の直近に位置する、請求項７０に記載の核酸。
【請求項７９】
Ｘは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する５’の直近及び前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する３’の直近に位置する、請求項７０に記載の核酸。
【請求項８０】
Ｙは、前記ＭＭ位置ヌクレオチドに対する５’の直近又は前記ＭＭ位置ヌクレオチドに対する３’の直近に位置する、請求項７３に記載の核酸。
【請求項８１】
Ｙは、前記ＭＭ位置ヌクレオチドに対する５’の直近及び前記ＭＭ位置ヌクレオチドに対する３’の直近に位置する、請求項７３に記載の核酸。
【請求項８２】
前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、前記５’末端から２位〜６位に存在する、請求項７０又は７３に記載の核酸。
【請求項８３】
前記ＭＭ位置ヌクレオチドは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置する、請求項７０又は７３に記載の核酸。
【請求項８４】
前記ＭＭ位置ヌクレオチドは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置する、請求項７０又は７３に記載の核酸。
【請求項８５】
アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的である、５’末端、３’末端及びシード領域を有する核酸であって、
前記シード領域内の位置での一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチドであって、前記アレル多型と相補的である一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチド；
前記遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチであるミスマッチ（ＭＭ）位置；及び
前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドのいずれかの側での少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｘ）であって、各Ｘは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドから４、３又は２ヌクレオチド以内に位置する、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｘ）；及び
前記ＭＭ位置ヌクレオチドのいずれかの側での少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｙ）であって、各Ｙは、前記ＭＭ位置ヌクレオチドから４、３又は２ヌクレオチド以内に位置する、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｙ）
を含む、核酸。
【請求項８６】
式：
【化９】
2021533762.tif 000050
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む、請求項８５に記載の核酸。
【請求項８７】
ＶＰモチーフは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又は前記ＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される、請求項８６に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項８８】
Ｘは、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、２’−リボ、２’−デオキシリボ、２’−Ｆ−ＡＮＡ、２’−ＭＯＥ、４’−Ｓ−ＲＮＡ、ＬＮＡ、４’−Ｓ−Ｆ−ＡＮＡ、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−エチルアミン、ＣＮｅｔ−ＲＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ＣｅＮＡ、ＡＮＡ及びＨＮＡからなる群から選択される糖修飾を含む、請求項８５に記載の核酸。
【請求項８９】
Ｙは、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、２’−リボ、２’−デオキシリボ、２’−Ｆ−ＡＮＡ、２’−ＭＯＥ、４’−Ｓ−ＲＮＡ、ＬＮＡ、４’−Ｓ−Ｆ−ＡＮＡ、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−エチルアミン、ＣＮｅｔ−ＲＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ＣｅＮＡ、ＡＮＡ及びＨＮＡからなる群から選択される糖修飾を含む、請求項８５に記載の核酸。
【請求項９０】
Ｘは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する５’の直近又は前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する３’の直近に位置する、請求項８５に記載の核酸。
【請求項９１】
Ｘは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する５’の直近及び前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する３’の直近に位置する、請求項８５に記載の核酸。
【請求項９２】
Ｙは、前記ＭＭ位置ヌクレオチドに対する５’の直近又は前記ＭＭ位置ヌクレオチドに対する３’の直近に位置する、請求項８５に記載の核酸。
【請求項９３】
Ｙは、前記ＭＭ位置ヌクレオチドに対する５’の直近及び前記ＭＭ位置ヌクレオチドに対する３’の直近に位置する、請求項８５に記載の核酸。
【請求項９４】
前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、前記５’末端から２位〜６位に存在する、請求項８５に記載の核酸。
【請求項９５】
前記ＭＭ位置ヌクレオチドは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置する、請求項８５に記載の核酸。
【請求項９６】
前記ＭＭ位置ヌクレオチドは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置する、請求項８５に記載の核酸。
【請求項９７】
Ｘ及びＹは、同じである、請求項７０、７３又は８５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９８】
Ｘ及びＹは、異なる、請求項７０、７３又は８５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９９】
２つ以上の核酸配列を含む二分岐オリゴヌクレオチド化合物であって、前記核酸配列（Ｎ）は、リンカー（Ｌ）、スペーサー（Ｓ）及び任意選択的に分岐点（Ｂ）から選択される１つ以上の部分によって互いに連結され、
各核酸配列は、二重鎖であり、且つセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、それぞれ５’末端及び３’末端を有し、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、それぞれ１つ以上の化学修飾されたヌクレオチドを含み、
各アンチセンス鎖は、シード領域を有し、各アンチセンス鎖は、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的であり、各アンチセンス鎖は、
前記シード領域内の位置での一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチドであって、前記アレル多型と相補的である一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチド；及び
前記遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置するミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチド
を含む、二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１００】
前記ＲＮＡは、式：
【化１０】
2021533762.tif 000051
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む、請求項９９に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１０１】
ＶＰモチーフは、前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又は前記ＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される、請求項１００に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１０２】
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、それぞれ＞８０％の化学修飾されたヌクレオチドを含む、請求項９９に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１０３】
前記センス及びアンチセンス鎖の前記５’末端から１及び２位での前記ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結される、請求項９９に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１０４】
各アンチセンス鎖は、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、各センス鎖は、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、且つ前記アンチセンス鎖に対して相補性を有する、請求項９９に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１０５】
前記分岐オリゴヌクレオチド化合物の末端５’位に結合された疎水性部分をさらに含む、請求項９９に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１０６】
各二重鎖核酸配列は、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の前記３’末端又は前記５’末端でのリンカー、スペーサー又は分岐点に独立して連結される、請求項９９に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１０７】
前記ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、ｒｓ３６３１２５、ｒｓ３６２２７３、ｒｓ３６２３０７、ｒｓ３６２３３６、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ３６２２７２、ｒｓ３６２３０６、ｒｓ３６２２６８、ｒｓ３６２２６７及びｒｓ３６３０９９からなる群から選択されるｈｔｔ  ＳＮＰのアレル多型と相補的である、請求項９９に記載の二分岐オリゴヌクレオチド化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／７１７，２８７号明細書及び２０１９年３月２８日に出願された同第６２／８２５，４２９号明細書に対する優先権を主張する。これらの出願の全体的な内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の支援を受けた研究の申告
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられた助成金番号ＮＳ１０４０２２及びＧＭ１０８８０３の下で政府の援助によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ干渉は、遺伝子の機能を阻害するための単純且つ効果的なツールとなる。ＲＮＡサイレンシング剤は、高度な配列特異性を有する特定のタンパク質の発現をノックダウンするそれらの能力のため、研究ツール及び治療剤として特に関心を集めている。ＲＮＡサイレンシング剤の配列特異性は、特定の遺伝子の１つの変異体及び１つの野生型コピーを有するヘテロ接合体における顕性変異によって引き起こされる疾患の治療に特に有用である。しかしながら、野生型アレルの発現に影響を与えないか又は影響を最小限にとどめながら、変異体、疾患発病性アレル発現を優先的にサイレンシングできるＲＮＡサイレンシング剤が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ヘテロ接合体における対応する野生型遺伝子の発現に対して一塩基多型（ＳＮＰ）（例えば、ヘテロ接合型ＳＮＰ）を含有する遺伝子の発現のサイレンシングを、例えば１００倍を超えるまで高める新規のオリゴヌクレオチドの驚くべき発見に基づく。ある種の態様では、分解のためにＳＮＰ含有核酸を優先的に標的化するオリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡ）が提供され、オリゴヌクレオチド（例えば、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ））は、分解のために対応する野生型（非ＳＮＰ含有）核酸を標的化しないか、又はより低い程度で標的化する。ある種の態様では、本発明のオリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、１）標的核酸におけるＳＮＰ位置と相補的であり；且つ２）ＳＮＰに対して標的核酸の特定の位置でのミスマッチを含有する。ある種の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、対応する野生型核酸配列に対して：１）野生型ＳＮＰ位置；及び２）野生型ＳＮＰ位置に対する標的核酸配列の特定の位置での２つのミスマッチも含有する。したがって、例示的なオリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、ＳＮＰ含有標的に対する１つのミスマッチ及び対応する野生型配列に対する２つのミスマッチを含有し、したがって対応する野生型配列に対してＳＮＰ含有標的の優先的な切断をもたらす。
【０００５】
一態様では、５’末端、３’末端及びシード領域を有するオリゴヌクレオチドであって、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的であり、シード領域内の位置でのＳＮＰ位置ヌクレオチドであって、アレル多型と相補的であるＳＮＰ位置ヌクレオチド；及び遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置するミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドは、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的であり、オリゴヌクレオチドは、５’末端から２〜６位のいずれか１つでのＳＮＰ位置ヌクレオチド；及び遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置するミスマッチ位置ヌクレオチドを含む。
【０００６】
ある種の例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡである。
【０００７】
ある種の例示的な実施形態では、ＲＮＡは、式：
【化１】
2021533762.tif 000002
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート（ＶＰ）修飾をさらに含む。
【０００８】
ある種の例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又はＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される。
【０００９】
ある種の例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイド、ＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ギャップマー、ミックスマー、ｍｉＲＮＡ阻害剤、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群から選択される。
【００１０】
ある種の例示的な実施形態では、ＲＮＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）又はｄｓＲＮＡである。
【００１１】
ある種の例示的な実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第１の鎖及び第１の鎖の少なくとも一部と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖は、アレル多型と相補的である、シード領域（例えば、５’末端から２〜６位で）におけるＳＮＰ位置ヌクレオチドを含み、第１の鎖は、遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置するＭＭ位置ヌクレオチドを含む。
【００１２】
ある種の例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、ＲＮＡの５’末端から２、４又は６位に位置し、及びＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置する。
【００１３】
ある種の例示的な実施形態では、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの２、３、４又は６ヌクレオチド以内に位置する。ある種の例示的な実施形態では、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの５ヌクレオチド以内に位置する。
【００１４】
ある種の例示的な実施形態では、ｄｓＲＮＡは、平滑末端である。ある種の例示的な実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む。ある種の例示的な実施形態では、ｄｓＲＮＡは、天然に存在するヌクレオチドを含む。ある種の例示的な実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。ある種の例示的な実施形態では、ｄｓＲＮＡの各ヌクレオチドは、修飾される。
【００１５】
ある種の例示的な実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、コレステリル誘導体に連結された末端ヌクレオチド及びドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群から選択される。
【００１６】
ある種の例示的な実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート及び非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される。
【００１７】
ある種の例示的な実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド及び５’−ホスホロチオエート基を含む。
【００１８】
ある種の例示的な実施形態では、第１の鎖は、少なくとも３つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。ある種の例示的な実施形態では、第１の鎖は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドのいずれかの側で２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。
【００１９】
ある種の例示的な実施形態では、ｄｓＲＮＡは、疎水性部分を含む。
【００２０】
ある種の例示的な実施形態では、アレル多型を含む遺伝子の領域は、配列番号１〜１０からなる群から選択される核酸配列を含む。ある種の例示的な実施形態では、第１の鎖は、ＵＵＣＵＧＵＡＧＣＡＵＣＡＧＣＵＵＣＵＣを含む。
【００２１】
ある種の例示的な実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡの第１の鎖）は、２−７、４−７、４−８、４−１５、６−５、６−８、６−１１、６−１４、６−１６、３−５、３−７及び３−８からなる群から選択されるＳＮＰ位置ヌクレオチド（５’末端から参照される）−ＭＭ位置ヌクレオチド（５’末端から参照される）の組合せを含む。
【００２２】
ある種の例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、ｒｓ３６３１２５、ｒｓ３６２２７３、ｒｓ３６２３０７、ｒｓ３６２３３６、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ３６２２７２、ｒｓ３６２３０６、ｒｓ３６２２６８、ｒｓ３６２２６７及びｒｓ３６３０９９からなる群から選択されるｈｔｔ  ＳＮＰのアレル多型と相補的である。
【００２３】
ある種の例示的な実施形態では、ＲＮＡは、ホスフェート、ビニルホスホネート、Ｃ５−メチル（Ｒ、又はＳ、又はラセミ）、ビニル上のＣ５−メチル及び還元ビニルからなる群から選択される５’安定化部分をさらに含む。
【００２４】
ある種の例示的な実施形態では、ＲＮＡは、アルキル鎖、ビタミン、ペプチド、スフィンゴ糖脂質、多価不飽和脂肪酸、セコステロイド、ステロイドホルモン及びステロイド脂質からなる群から選択されるコンジュゲート部分をさらに含む。
【００２５】
一態様では、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第１の鎖及び第１の鎖の少なくとも一部と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第２の鎖を含むｄｓＲＮＡであって、第１の鎖は、アレル多型と相補的である、シード領域（例えば、５’末端から２〜６位の１つ）における位置のいずれか１つでのＳＮＰ位置ヌクレオチドを含み、第１の鎖は、遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置するＭＭ位置ヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡが提供される。
【００２６】
ある種の例示的な実施形態では、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第１の鎖及び第１の鎖の少なくとも一部と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第２の鎖を含むｄｓＲＮＡであって、第１の鎖は、アレル多型と相補的である、５’末端から２、４又は６位におけるＳＮＰ位置ヌクレオチドを含み、第１の鎖は、遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置するＭＭ位置ヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡが提供される。
【００２７】
ある種の例示的な実施形態では、ＲＮＡは、式：
【化２】
2021533762.tif 000003
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む。
【００２８】
ある種の例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又はＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される。
【００２９】
ある種の例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、第１の鎖の５’末端から２位、第１の鎖の５’末端から４位又は第１の鎖の５’末端から６位にある。他の例示的な実施形態では、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの２ヌクレオチド以内に位置するか、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの３ヌクレオチド以内に位置するか、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの４ヌクレオチド以内に位置するか、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの５ヌクレオチド以内に位置するか、又はＳＮＰ位置ヌクレオチドの６ヌクレオチド以内に位置する。ある種の例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から４ヌクレオチドに位置し、及びＭＭ位置ヌクレオチドは、５’末端から７ヌクレオチドに位置する。他の例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から６ヌクレオチドに位置し、及びＭＭ位置ヌクレオチドは、５’末端から１１ヌクレオチドに位置する。
【００３０】
別の態様では、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第１の鎖及び第１の鎖の少なくとも一部と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第２の鎖を含むｄｓＲＮＡであって、第１の鎖は、アレル多型と相補的である、５’末端から６位におけるＳＮＰ位置ヌクレオチドを含み、第１の鎖は、遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、５’末端から１１位に位置するＭＭ位置ヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡが提供される。
【００３１】
ある種の例示的な実施形態では、ＲＮＡは、式：
【化３】
2021533762.tif 000004
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む。ある種の例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又はＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される。
【００３２】
ある種の例示的な実施形態では、第１の鎖は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドのいずれかの側で２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。ある種の例示的な実施形態では、第１の鎖は、少なくとも３つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。
【００３３】
ある種の例示的な実施形態では、ｄｓＲＮＡは、５’−ホスホロチオエート基を含む。
【００３４】
ある種の例示的な実施形態では、アレル多型を含む遺伝子は、ハンチンチン（ｈｔｔ）遺伝子である。
【００３５】
ある種の例示的な実施形態では、アレル多型を含む遺伝子の領域は、配列番号１〜１０からなる群から選択される核酸配列を含む。ある種の例示的な実施形態では、第１の鎖は、ＵＵＣＵＧＵＡＧＣＡＵＣＡＧＣＵＵＣＵＣを含む。
【００３６】
ある種の態様では、本明細書に記載されるＲＮＡ及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００３７】
ある種の態様では、細胞においてアレル多型を含む遺伝子の発現を阻害する方法であって、細胞を、本明細書に記載されるものと接触させることを含む方法が提供される。
【００３８】
別の態様では、アレル多型を含む遺伝子によって特徴付けられるか又は引き起こされる疾患又は障害の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効量の、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的である、５’末端、３’末端及びシード領域を有するＲＮＡを対象に投与することを含み、ＲＮＡは、アレル多型と相補的である、シード領域中の位置でのＳＮＰ位置ヌクレオチド及び遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置するＭＭ位置ヌクレオチドを含む、方法が提供される。ある種の例示的な実施形態では、ＲＮＡは、式：
【化４】
2021533762.tif 000005
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む。
【００３９】
ある種の例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又はＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される。
【００４０】
ある種の例示的な実施形態では、ＲＮＡは、ＡＳＯ又はｄｓＲＮＡである。
【００４１】
ある種の例示的な実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第１の鎖及び第１の鎖の少なくとも一部と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖は、アレル多型と相補的である、シード領域（例えば、５’末端から２〜６位のいずれか１つ、例えば５’末端から２、４又は６位で）内におけるＳＮＰ位置ヌクレオチドを含み、第１の鎖は、遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置するＭＭ位置ヌクレオチドを含む。
【００４２】
ある種の例示的な実施形態では、前記ｄｓＲＮＡは、対象の脳に投与される。ある種の例示的な実施形態では、前記ｄｓＲＮＡは、線条体内注入によって投与される。ある種の例示的な実施形態では、線条体における遺伝子の発現の減少が達成される。ある種の例示的な実施形態では、皮質における遺伝子の発現の減少が達成される。
【００４３】
ある種の例示的な実施形態では、アレル多型を含む遺伝子は、ハンチンチン（ｈｔｔ）遺伝子である。ある種の例示的な実施形態では、疾患は、ハンチントン病である。
【００４４】
ある種の例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、ＲＮＡの５’末端から２、４又は６位に位置し、及びＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置する。
【００４５】
別の態様では、２つのＲＮＡを含む二分岐オリゴヌクレオチド化合物であって、ＲＮＡは、リンカー、スペーサー及び分岐点から選択される１つ以上の部分によって互いに連結され、各ＲＮＡは、５’末端、３’末端及びシード領域を有し、各ＲＮＡは、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的であり、各ＲＮＡは、シード領域内の位置でのＳＮＰ位置ヌクレオチドであって、アレル多型と相補的なＳＮＰ位置ヌクレオチド及び遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置するＭＭ位置ヌクレオチドを含む、二分岐オリゴヌクレオチド化合物が提供される。
【００４６】
ある種の例示的な実施形態では、ＲＮＡは、式：
【化５】
2021533762.tif 000006
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む。
【００４７】
ある種の例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又はＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される。
【００４８】
ある種の例示的な実施形態では、二分岐オリゴヌクレオチド化合物は、ｈｓｉ−ＲＮＡ構造を有する。
【００４９】
ある種の例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、ｒｓ３６３１２５、ｒｓ３６２２７３、ｒｓ３６２３０７、ｒｓ３６２３３６、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ３６２２７２、ｒｓ３６２３０６、ｒｓ３６２２６８、ｒｓ３６２２６７及びｒｓ３６３０９９からなる群から選択されるｈｔｔ  ＳＮＰのアレル多型と相補的である。
【００５０】
別の態様では、２つ以上の核酸配列を含む二分岐オリゴヌクレオチド化合物であって、核酸配列（Ｎ）は、リンカー（Ｌ）、スペーサー（Ｓ）及び任意選択的に分岐点（Ｂ）から選択される１つ以上の部分によって互いに連結され、各核酸配列は、二重鎖であり、且つセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ５’末端及び３’末端を有し、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ１つ以上の化学修飾されたヌクレオチドを含み、各アンチセンス鎖は、シード領域を有し、各アンチセンス鎖は、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的であり、各アンチセンス鎖は、シード領域内の位置でのＳＮＰ位置ヌクレオチドであって、アレル多型と相補的なＳＮＰ位置ヌクレオチド及び遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置するミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチドを含む、二分岐オリゴヌクレオチド化合物が提供される。
【００５１】
ある種の例示的な実施形態では、ＲＮＡは、式：
【化６】
2021533762.tif 000007
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む。
【００５２】
ある種の例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又はＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される。
【００５３】
ある種の例示的な実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ＞８０％の化学修飾されたヌクレオチドを含む。
【００５４】
ある種の例示的な実施形態では、センス及びアンチセンス鎖の５’末端から１及び２位でのヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結される。
【００５５】
ある種の例示的な実施形態では、各アンチセンス鎖は、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、各センス鎖は、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、且つアンチセンス鎖に対して相補性を有する。
【００５６】
ある種の例示的な実施形態では、化合物は、分岐オリゴヌクレオチド化合物の末端５’位に結合された疎水性部分をさらに含む。
【００５７】
ある種の例示的な実施形態では、各二重鎖核酸配列は、センス鎖又はアンチセンス鎖の３’末端又は５’末端でのリンカー、スペーサー又は分岐点に独立して連結される。
【００５８】
ある種の例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、ｒｓ３６３１２５、ｒｓ３６２２７３、ｒｓ３６２３０７、ｒｓ３６２３３６、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ３６２２７２、ｒｓ３６２３０６、ｒｓ３６２２６８、ｒｓ３６２２６７及びｒｓ３６３０９９からなる群から選択されるｈｔｔ  ＳＮＰのアレル多型と相補的である。
【００５９】
別の態様では、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的である、５’末端、３’末端及びシード領域を有する核酸であって、シード領域内の位置でのＳＮＰ位置ヌクレオチドであって、アレル多型と相補的であるＳＮＰ位置ヌクレオチド、遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチであるＭＭ位置及びＳＮＰ位置ヌクレオチドのいずれかの側での少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｘ）であって、各Ｘは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから４、３又は２ヌクレオチド以内に位置する、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｘ）を含む、核酸が提供される。
【００６０】
ある種の例示的な実施形態では、ＲＮＡは、式：
【化７】
2021533762.tif 000008
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む。
【００６１】
ある種の例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又はＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される。
【００６２】
ある種の例示的な実施形態では、Ｘは、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−リボ、２’−デオキシリボ、２’−Ｆ−４’−チオアラビノ（２’−Ｆ−ＡＮＡ）、２−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−ＭＯＥ）、４’−Ｓ−ＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、４’−Ｓ−Ｆ−ＡＮＡ、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−エチルアミン、２−シアノエチル−ＲＮＡ（ＣＮｅｔ−ＲＮＡ）、トリシクロ−ＤＮＡ、シクロヘキシル核酸（ＣｅＮＡ）、アラビノ核酸（ＡＮＡ）及びヘキシトール核酸（ＨＮＡ）からなる群から選択される糖修飾を含む。
【００６３】
ある種の例示的な実施形態では、Ｘは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する５’の直近又はＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する３’の直近に位置する。ある種の例示的な実施形態では、Ｘは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する５’の直近及びＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する３’の直近に位置する。
【００６４】
ある種の例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２位〜６位に存在する。ある種の例示的な実施形態では、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置する。ある種の例示的な実施形態では、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置する。
【００６５】
別の態様では、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的である、５’末端、３’末端及びシード領域を有する核酸であって、シード領域内の位置でのＳＮＰ位置ヌクレオチドであって、アレル多型と相補的であるＳＮＰ位置ヌクレオチド、遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチであるＭＭ位置及びＭＭ位置ヌクレオチドのいずれかの側での少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｙ）であって、各Ｙは、ＭＭ位置ヌクレオチドから４、３又は２ヌクレオチド以内に位置する、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｙ）を含む、核酸が提供される。
【００６６】
ある種の例示的な実施形態では、ＲＮＡは、式：
【化８】
2021533762.tif 000009
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む。
【００６７】
ある種の例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又はＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される。
【００６８】
ある種の例示的な実施形態では、Ｙは、ＭＭ位置ヌクレオチドに対する５’の直近又はＭＭ位置ヌクレオチドに対する３’の直近に位置する。ある種の例示的な実施形態では、Ｙは、ＭＭ位置ヌクレオチドに対する５’の直近及びＭＭ位置ヌクレオチドに対する３’の直近に位置する。
【００６９】
ある種の例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２位〜６位に存在する。ある種の例示的な実施形態では、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置する。ある種の例示的な実施形態では、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置する。
【００７０】
別の態様では、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的である、５’末端、３’末端及びシード領域を有する核酸であって、シード領域内の位置でのＳＮＰ位置ヌクレオチドであって、アレル多型と相補的であるＳＮＰ位置ヌクレオチド、遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチであるＭＭ位置、及びＳＮＰ位置ヌクレオチドのいずれかの側での少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｘ）であって、各Ｘは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから４、３又は２ヌクレオチド以内に位置する、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｘ）、及びＭＭ位置ヌクレオチドのいずれかの側での少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｙ）であって、各Ｙは、ＭＭ位置ヌクレオチドから４、３又は２ヌクレオチド以内に位置する、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（Ｙ）を含む、核酸が提供される。
【００７１】
ある種の例示的な実施形態では、ＲＮＡは、式：
【化９】
2021533762.tif 000010
を有するサブユニット間結合において少なくとも１つのビニルホスホネート修飾をさらに含む。
【００７２】
ある種の例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣又はＭＭ位置ヌクレオチドの隣に挿入される。
【００７３】
ある種の例示的な実施形態では、Ｘは、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、２’−リボ、２’−デオキシリボ、２’−Ｆ−ＡＮＡ、２’−ＭＯＥ、４’−Ｓ−ＲＮＡ、ＬＮＡ、４’−Ｓ−Ｆ−ＡＮＡ、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−エチルアミン、ＣＮｅｔ−ＲＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ＣｅＮＡ、ＡＮＡ及びＨＮＡからなる群から選択される糖修飾を含む。ある種の例示的な実施形態では、Ｙは、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、２’−リボ、２’−デオキシリボ、２’−Ｆ−ＡＮＡ、２’−ＭＯＥ、４’−Ｓ−ＲＮＡ、ＬＮＡ、４’−Ｓ−Ｆ−ＡＮＡ、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−エチルアミン、ＣＮｅｔ−ＲＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ＣｅＮＡ、ＡＮＡ及びＨＮＡからなる群から選択される糖修飾を含む。
【００７４】
ある種の例示的な実施形態では、Ｘは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する５’の直近又はＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する３’の直近に位置する。ある種の例示的な実施形態では、Ｘは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する５’の直近及びＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する３’の直近に位置する。
【００７５】
ある種の例示的な実施形態では、Ｙは、ＭＭ位置ヌクレオチドに対する５’の直近又はＭＭ位置ヌクレオチドに対する３’の直近に位置する。ある種の例示的な実施形態では、Ｙは、ＭＭ位置ヌクレオチドに対する５’の直近及びＭＭ位置ヌクレオチドに対する３’の直近に位置する。
【００７６】
ある種の例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２位〜６位に存在する。ある種の例示的な実施形態では、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置する。ある種の例示的な実施形態では、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置する。
【００７７】
ある種の例示的な実施形態では、Ｘ及びＹは、同じである。
【００７８】
本発明の前述及び他の特徴並びに利点は、添付の図面と組み合わせて例示的実施形態の以下の詳細な説明からより詳細に理解されることになる。本特許又は出願ファイルは、有色で作成された少なくとも１つの図面を含む。有色の図面を有する本特許又は特許出願公報のコピーは、入手を要請し、必要な手数料を支払えば、特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、ｈｔｔの野生型領域又はＳＮＰ、ｒｓ３６２２７３を有するｈｔｔの同じ領域のいずれかを含有するｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドを示す。
【図２】図２は、様々な位置においてＳＮＰヌクレオチドを有するｈｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞におけるｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドアッセイ後のルシフェラーゼ活性を示す棒グラフを示す。この一次選別により、複数の有効な疎水性修飾ｓｉＲＮＡ（ｈｓｉＲＮＡ）配列が得られた。
【図３】図３は、ｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドに対する本発明の３つの例示的なｈｓｉＲＮＡのサイレンシング効果を示す用量反応曲線を示す。
【図４】図４は、サイレンシングｈｔｔ  ｍＲＮＡに対する２つのｈｓｉＲＮＡの効力を示す用量反応曲線を示す。
【図５】図５は、様々な位置で第２のミスマッチを有するｈｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞におけるｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドアッセイ後のルシフェラーゼ活性を示す棒グラフを示す。
【図６】図６は、（ｍｍ２−７）を有するか又は（ｍｍ２−０）追加のミスマッチを有しないＳＮＰ２  ｈｓｉＲＮＡのサイレンシング効果を比較する用量反応曲線を示す。
【図７】図７は、追加のミスマッチを有するか又は有しないＳＮＰ４  ｈｓｉＲＮＡのサイレンシング効果を比較する用量反応曲線を示す。
【図８】図８は、追加のミスマッチを有するか又は有しないＳＮＰ６  ｈｓｉＲＮＡのサイレンシング効果を比較する用量反応曲線を示す。
【図９】図９は、追加のミスマッチ（ＳＮＰ４−０及びＳＮＰ４−１１）を有しない同じｈｓｉＲＮＡと比較して、追加のミスマッチ（それぞれＳＮＰ４−７及びＳＮＰ６−１１）を有するＳＮＰ４又はＳＮＰ６  ｈｓｉＲＮＡのサイレンシング効果を比較する用量反応曲線を示す。２つのレポータープラスミドの１つでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞は、受動的な取込みによってｈｓｉＲＮＡでリバーストランスフェクトされ、且つ７２時間処理された。レポーター発現は、二重ルシフェラーゼアッセイにより測定された。
【図１０】図１０は、追加のミスマッチを有するｈｓｉＲＮＡのサイレンシング効力を測定するｈｔｔ  ｍＲＮＡ発現の用量反応曲線を示す。
【図１１】図１１は、本発明のある種の実施形態によるｈｓｉＲＮＡ及び例示的な修飾を概略的に示す。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｃは、それぞれＳＮＰ２、ＳＮＰ４及びＳＮＰ６  ｈｓｉＲＮＡライブラリーを示す。アンチセンス鎖は、赤色のＳＮＰ部位及び青色のミスマッチとともに５’〜３’で示される。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｃは、それぞれＳＮＰ２、ＳＮＰ４及びＳＮＰ６  ｈｓｉＲＮＡライブラリーを示す。アンチセンス鎖は、赤色のＳＮＰ部位及び青色のミスマッチとともに５’〜３’で示される。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｃは、それぞれＳＮＰ２、ＳＮＰ４及びＳＮＰ６  ｈｓｉＲＮＡライブラリーを示す。アンチセンス鎖は、赤色のＳＮＰ部位及び青色のミスマッチとともに５’〜３’で示される。
【図１３】図１３は、アンチセンス及びセンス鎖配列並びにある種の実施形態による様々なｈｓｉＲＮＡコンストラクトに関する修飾パターンを示す。ｍｍ４−７及びｍｍ６−１１は、優れたＳＮＰの識別を実証し、さらなる選別のために選択された。
【図１４】図１４は、ジ−ｓｉＲＮＡとして設計された例示的なＳＮＰ選択的化合物を示す。
【図１５】図１５は、ある種の例示的な実施形態による骨格結合を示す。オリゴヌクレオチド骨格は、ホスフェート、ホスホロチオエート（ラセミ混合物又は立体特異的）、ジホスホロチオエート、ホスホロアミダート、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ボラノホスフェート、２’−５’−ホスホジエステル、アミド、ホスホノアセテート、モルホリノなどの１つ又は任意の組合せを含み得る。
【図１６】図１６は、ある種の例示的な実施形態による糖修飾を示す。糖修飾は、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−リボ、２’−デオキシリボ、２’−Ｆ−ＡＮＡ、ＭＯＥ、４’−Ｓ−ＲＮＡ、ＬＮＡ、４’−Ｓ−Ｆ−ＡＮＡ、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−エチルアミン、ＣＮｅｔ−ＲＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ＣｅＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡなどの１つ又は任意の組合せを含む。
【図１７】図１７は、ある種の例示的な実施形態によるヌクレオチド間結合を示す。可能なヌクレオチド間結合は、任意の所与のオリゴヌクレオチド鎖の５’又は３’末端で第１の２つのヌクレオチド間において、示された部分のいずれかにより安定化され得る。
【図１８】図１８は、ある種の例示的な実施形態による５’安定化修飾を示す。好適な５’安定化修飾は、ホスフェート、非ホスフェート、ビニルホスホネート、Ｃ５−メチル（Ｒ又はＳ又はラセミ体）、ビニル上のＣ５−メチル、還元ビニル（例えば、３つの炭素アルキル）などであり得る。
【図１９】図１９は、ある種の例示的な実施形態によるコンジュゲート部分を示す。好適なコンジュゲート部分は、任意の長さのアルキル鎖、ビタミン、リガンド、ペプチド又は生理活性コンジュゲート、例えばスフィンゴ糖脂質、多価不飽和脂肪酸、セコステロイド、ステロイドホルモン、ステロイド脂質などであり得る。
【図２０】図２０は、５’末端から６位におけるＳＮＰ位置ヌクレオチド及び５’末端から１１位に位置するミスマッチ位置ヌクレオチドを含むＳＮＰ識別骨格の活性が配列依存的であることを図で示す。
【図２１】図２１は、本明細書に記載されるビニルホスホネート（ＶＰ）修飾サブユニット間結合の代表的な合成を示す。
【図２２】図２２は、ＶＰ修飾サブユニット間結合を有するオリゴヌクレオチドを調製するための方法を示す。
【図２３】図２３は、ある種の例示的な実施形態によるＶＰ修飾ＲＮＡの図による説明である。
【図２４】図２４は、ある種の例示的な実施形態に従って合成されたＶＰ修飾オリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図２５】図２５は、ｓｉＲＮＡ効力の包括的試験の概要である。
【図２６】図２６は、ＳＮＰ部位  ｒｓ３６２２７３の周囲のＨＴＴ配列に整列されたｈｓｉＲＮＡアンチセンス骨格の概略図であり、緑色のボックスは、ＳＮＰ部位の位置を示す。
【図２７Ａ】図２７Ａ〜２７Ｂは、変異体アレルのサイレンシングを損なうことなくアレル識別を向上させる、ｓｉＲＮＡ配列におけるミスマッチを付加する影響を示す。
【図２７Ｂ】図２７Ａ〜２７Ｂは、変異体アレルのサイレンシングを損なうことなくアレル識別を向上させる、ｓｉＲＮＡ配列におけるミスマッチを付加する影響を示す。
【図２８Ａ】図２８Ａ〜２８Ｂは、合成装置によって調製されるＶＰ修飾配列を示す。
【図２８Ｂ】図２８Ａ〜２８Ｂは、合成装置によって調製されるＶＰ修飾配列を示す。
【図２９】図２９は、本明細書で提供されるＶＰ修飾オリゴヌクレオチドを調製するための別の方法を実証する。
【図３０−１】図３０は、ＳＮＰ選択的ｓｉＲＮＡの標的／非標的識別に対してＶＰ修飾結合が有する効果を実証する。
【図３０−２】図３０は、ＳＮＰ選択的ｓｉＲＮＡの標的／非標的識別に対してＶＰ修飾結合が有する効果を実証する。
【図３１】図３１は、二分岐ｓｉＲＮＡ化学骨格の例を示す。
【図３２Ａ】図３２Ａは、ＨＴＴタンパク質レベルを測定するために実施されたウエスタンブロットである。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、ビンクリンに標準化されたタンパク質レベルを示す。
【図３３】図３３は、Ａの代わりにＳＮＰ部位でＧを標的化するオリゴヌクレオチドのためのサイレンシング効果を比較する用量反応曲線を示す。
【図３４】図３４は、用量反応のために以前に選択された配列において単一のミスマッチを導入する配列の例を示す。
【図３５】図３５は、いくつかの例示的なオリゴヌクレオチド骨格修飾を示す。
【図３６】図３６は、ある種の例示的な実施形態によるオリゴヌクレオチド分岐モチーフを示す。二重らせんは、オリゴヌクレオチドを表す。異なるリンカー、スペーサー及び分岐点の組合せは、多様な分岐ｈｓｉＲＮＡ構造の生成を可能にする。
【図３７】図３７は、コンジュゲートされた生理活性部分を有する本発明の分岐オリゴヌクレオチドを示す。
【図３８】図３８は、例示的なアミダイトリンカー、スペーサー及び分岐部分を示す。
【図３９】図３９は、代替的なＳＮＰ部位ｒｓ３６２２７３の周囲のＨＴＴ配列に整列されたｈｓｉＲＮＡアンチセンス骨格の概略図である。
【図４０】図４０は、図３９のｈｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞におけるｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドアッセイ後のルシフェラーゼ活性を示す棒グラフを示す。「ＳＮＰ」に続く数は、ｓｉＲＮＡにおけるＳＮＰの位置を表す。
【図４１】図４１は、ＳＮＰ３部位でＣ又はＴを標的化する図３９のオリゴヌクレオチドに対するサイレンシング効果を比較する用量反応曲線を示す。
【図４２】図４２は、様々な位置で修飾されて第２のミスマッチを備えた、図３９のｈｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞におけるｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドアッセイ後のルシフェラーゼ活性を示す棒グラフを示す。
【図４３】図４３は、修飾サブユニット間リンカーの例を示す。
【図４４Ａ】図４４Ａは、本明細書で提供される修飾ホスフィネート含有オリゴヌクレオチドに関する単量体を調製するための代表的な例を示す。
【図４４Ｂ】図４４Ｂは、本明細書で提供される修飾ホスフィネート含有オリゴヌクレオチドに関する別の単量体を調製するための代表的な例を示す。
【図４４Ｃ】図４４Ｃは、本明細書で提供される修飾ホスフィネート含有オリゴヌクレオチドを調製するための代表的な例を示す。
【図４５】図４５は、ＨＴＴ遺伝子（配列番号１〜１０（上端から下端に番号付けされる））内の例示的なＳＮＰを示す。
【図４６−１】図４６は、ＳＮＰ識別ｓｉＲＮＡを生成し、且つ選択するための方法論を示すフローチャートである。
【図４６−２】図４６は、ＳＮＰ識別ｓｉＲＮＡを生成し、且つ選択するための方法論を示すフローチャートである。
【図４７】図４７は、ｓｉＲＮＡ内のＳＮＰの位置を意味する命名規則を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
本開示は、変異体タンパク質をコードする遺伝子内に位置するアレル多型をサイレンシングするのに有用であるオリゴヌクレオチド、例えばＲＮＡ、サイレンシング剤、例えば二重鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）などのＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（「ＡＳＯ」）などを含む組成物に関する。特定の態様では、オリゴヌクレオチド、例えばＲＮＡ、サイレンシング剤は、対応する変異体ｍＲＮＡ（例えば、ＳＮＰ含有ｍＲＮＡ）をヌクレオチド特異性及び選択性により破壊する本明細書で提供されるｄｓＲＮＡ剤である。オリゴヌクレオチド、例えばＲＮＡ、サイレンシング剤、例えば本明細書で開示されるｄｓＲＮＡ剤は、変異体遺伝子の多型領域に対応するｍＲＮＡを標的化し、変異体ｍＲＮＡの切断をもたらし、且つ対応する変異体タンパク質の合成、例えばハンチンチンタンパク質などの機能変異体タンパク質の獲得を妨げる。
【００８１】
定義
本明細書で別段の定義がない限り、本明細書で使用される科学用語及び専門用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。任意の潜在的多義性の場合、本明細書で提供される定義は、任意の辞書又は外的な定義よりも優先される。文脈によって別段の要求がない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。「又は」の使用は、他で示されない限り「及び／又は」を意味する。用語「含んでいる」並びに「含む」及び「含まれる」などの他の形の使用は、限定するものではない。
【００８２】
オリゴヌクレオチド配列に関連して本明細書で使用されるとおり、「Ａ」は、塩基アデニン（例えば、アデノシン又はその化学修飾された誘導体）を含むヌクレオシドを表し、「Ｇ」は、塩基グアニン（例えば、グアノシン又はその化学修飾された誘導体）を含むヌクレオシドを表し、「Ｕ」は、塩基ウラシル（例えば、ウリジン又はその化学修飾された誘導体）を含むヌクレオシドを表し、且つ「Ｃ」は、塩基アデニン（例えば、シチジン又はその化学修飾された誘導体）を含むヌクレオシドを表す。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、用語「キャッピング基」は、アルコール（ＲＯＨ）、カルボン酸（ＲＣＯ２Ｈ）又はアミン（ＲＮＨ２）などの官能基中の水素原子を置き換える化学部分を指す。キャッピング基の非限定的な例としては、アルキル（例えば、メチル、三級ブチル）；アルケニル（例えば、ビニル、アルキル）；カルボキシル（例えば、アセチル、ベンゾイル）；カルバモイル；ホスフェート；及びホスホネート（例えば、ビニルホスホネート）が挙げられる。他の好適なキャッピング基は、当業者に知られている。
【００８４】
用語「ヌクレオチド類似体」、又は「改変ヌクレオチド」、又は「修飾ヌクレオチド」は、天然に存在しないリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む非標準的なヌクレオチドを指す。例示的なヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの特定の化学的特性を変化させながらも、その意図された機能を果たすヌクレオチド類似体の能力を保持するように任意の位置で修飾される。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例としては、５位、例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン、５−プロピンウリジン、５−プロペニルウリジンなど；６位、例えば６−（２−アミノ）プロピルウリジン；アデノシン及び／又はグアノシンに関する８位、例えば８−ブロモグアノシン、８−クロログアノシン、８−フルオログアノシンなどが挙げられる。ヌクレオチド類似体としては、デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシン；Ｏ及びＮ修飾（例えば、アルキル化、例えばＮ６−メチルアデノシン又は当技術分野で知られる他のもの）ヌクレオチド；及びＨｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，２０００  Ａｕｇ．１０（４）：２９７−３１０に記載されるものなどの他の複素環式修飾ヌクレオチド類似体も挙げられる。
【００８５】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体の短いポリマーを指す。用語「ＲＮＡ類似体」は、対応する未改変又は未修飾ＲＮＡと比較して少なくとも１つの改変又は修飾ヌクレオチドを有するが、対応する未改変又は未修飾ＲＮＡと同じ又は類似の性質又は機能を保持するポリヌクレオチド（例えば、化学的に合成されたポリヌクレオチド）を指す。上記のとおり、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を有するＲＮＡ分子と比較して、遅い速度のＲＮＡ類似体の加水分解をもたらす結合と連結され得る。例えば、類似体のヌクレオチドは、メチレンジオール、エチレンジオール、オキシメチルチオ、オキシエチルチオ、オキシカルボニルオキシ、ホスホロジアミダート、ホスホロアミダート及び／又はホスホロチオエート結合を含み得る。特定の実施形態では、ＲＮＡ類似体は、糖及び／若しくは骨格修飾リボヌクレオチド並びに／又はデオキシリボヌクレオチドを含む。そのような改変又は修飾は、ＲＮＡの末端又は内部的（ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドで）などの非ヌクレオチド材料の付加をさらに含み得る。ＲＮＡ類似体は、ＲＮＡ干渉を媒介する能力を有する天然ＲＮＡに十分に類似し得る。
【００８６】
本明細書で使用する場合、例示的なオリゴヌクレオチドとしては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイド、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＡＶオリゴヌクレオチド、ギャップマー、ミックスマー、ｍｉＲＮＡ阻害剤、ＳＳＯ、ＰＭＯ、ＰＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
本明細書で使用する場合、用語「ＲＮＡ干渉」（「ＲＮＡｉ」）は、ＲＮＡの選択的な細胞内分解を指す。ＲＮＡｉは、外来ＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ）を除去するために細胞内で自然に起こる。天然ＲＮＡｉは、他の同様のＲＮＡ配列に対する分解機構を誘導する遊離ｄｓＲＮＡから切断された断片を介して進行する。代わりに、ＲＮＡｉは、例えば、標的遺伝子の発現をサイレンシングするために人為的に開始され得る。
【００８８】
本明細書で使用する場合、用語「ｈｓｉＲＮＡ」は、本明細書で提供される二重鎖ＲＮＡの実施形態を指し、ＲＮＡ分子は、完全に化学的に修飾され、本明細書に記載されるとおりの１つ以上の疎水性修飾を含む。
【００８９】
「標的特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する標的ｍＲＮＡ配列に十分に相補的な配列」である鎖を有するＲＮＡｉ剤、例えばＲＮＡサイレンシング剤は、鎖が、ＲＮＡｉ機構又はプロセスによって標的ｍＲＮＡの破壊を引き起こすのに十分な配列を有することを意味する。
【００９０】
本明細書で使用する場合、用語「単離ＲＮＡ」（例えば、「単離ｓｉＲＮＡ」又は「単離ｓｉＲＮＡ前駆体」）は、組換え技術によって生成される場合に他の細胞性材料若しくは培養物を実質的に含まないか、又は化学的に合成される場合に化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まないＲＮＡ分子を指す。
【００９１】
本明細書で使用する場合、用語「ＲＮＡサイレンシング」は、対応するタンパク質をコードする遺伝子の発現の阻害又は「サイレンシング」をもたらすＲＮＡ分子によって媒介される配列特異的な調節機構（例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写型遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング、共抑制、翻訳抑制など）の一群を指す。ＲＮＡサイレンシングは、植物、動物及び菌類を含む多くの種類の生物において観察されている。
【００９２】
用語「識別ＲＮＡサイレンシング」は、「第１の」又は「標的」ポリヌクレオチド配列の発現を実質的に阻害する一方、「第２の」又は「非標的」ポリヌクレオチド配列の発現を実質的に阻害しない（例えば、両方のポリヌクレオチド配列が同じ細胞中に存在するとき）ＲＮＡ分子の能力を指す。ある種の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子に対応するが、非標的ポリヌクレオチド配列は、非標的遺伝子に対応する。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、標的アレルに対応するが、非標的ポリヌクレオチド配列は、非標的アレルに対応する。ある種の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の調節領域（例えば、プロモーター又はエンハンサーエレメント）をコードするＤＮＡ配列である。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡである。
【００９３】
疾患又は障害に「関与する」遺伝子は、疾患若しくは障害又は前記疾患若しくは障害の少なくとも１つの症状をもたらすか又は引き起こす正常な又は異常な発現又は機能の遺伝子を含む。
【００９４】
本明細書で使用する場合、用語「標的遺伝子」（例えば、ヘテロ接合型多型、例えばヘテロ接合型ＳＮＰの変異体アレル）は、発現が実質的に阻害又は「サイレンシングされる」ことになる遺伝子である。このサイレンシングは、ＲＮＡサイレンシングにより、例えば標的遺伝子のｍＲＮＡを切断すること又は標的遺伝子の翻訳抑制により達成され得る。用語「非標的遺伝子」（例えば、野生型アレル）は、発現が実質的にサイレンシングされない遺伝子である。一実施形態では、標的及び非標的遺伝子のポリヌクレオチド配列（例えば、標的及び非標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ）は、１つ以上のヌクレオチドで異なり得る。別の実施形態では、標的及び非標的遺伝子は、１つ以上の多型（例えば、一塩基多型又はＳＮＰ）で異なり得る。別の実施形態では、標的及び非標的遺伝子は、１００％未満の配列同一性を共有し得る。別の実施形態では、非標的遺伝子は、標的遺伝子のホモログ（例えば、オルソログ又はパラログ）であり得る。
【００９５】
「標的アレル」は、発現が選択的に阻害又は「サイレンシングされる」ことになるアレル（例えば、ＳＮＰアレル）である。このサイレンシングは、ＲＮＡサイレンシングにより、例えば標的遺伝子又は標的アレルのｍＲＮＡをｓｉＲＮＡによって切断することにより達成され得る。用語「非標的アレル」は、発現が実質的にサイレンシングされないアレル（例えば、対応する野生型アレル）である。ある種の実施形態では、標的及び非標的アレルは、同じ標的遺伝子に対応し得る。他の実施形態では、標的アレルは、標的遺伝子に対応するか又はそれと関連し、非標的アレルは、非標的遺伝子に対応するか又はそれと関連する。一実施形態では、標的及び非標的アレルのポリヌクレオチド配列は、１つ以上のヌクレオチドで異なり得る。別の実施形態では、標的及び非標的アレルは、１つ以上のアレル多型（例えば、１つ以上のＳＮＰ）で異なり得る。別の実施形態では、標的及び非標的アレルは、１００％未満の配列同一性を共有し得る。
【００９６】
用語「多型」は、本明細書で使用する場合、異なる供給源又は対象（しかし、同じ生物）に由来する同じ配列が比較されるときに同定又は検出される遺伝子配列における変種（例えば、１つ以上の欠失、挿入又は置換）を指す。例えば、多型は、異なる対象に由来する同じ遺伝子配列が比較されるときに同定され得る。そのような多型の同定は、当技術分野において通例のことであり、方法論は、例えば、乳癌点変異を検出するために使用されるものと同様である。同定は、例えば、対象のリンパ球から抽出されたＤＮＡからなされ得、その後、多型領域を、前記多型領域に対する特異的なプライマーを使用して増幅させる。代わりに、多型は、同じ遺伝子の２つのアレルが比較されるときに同定され得る。
【００９７】
特定の実施形態では、多型は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。生物体内の同じ遺伝子の２つのアレル間の配列における変種は、本明細書で「アレル多型」と呼ばれる。ある種の実施形態では、アレル多型は、ＳＮＰアレルに対応する。例えば、アレル多型は、本明細書でヘテロ接合型ＳＮＰとも呼ばれるＳＮＰの２つのアレル間の単一のヌクレオチド変種を含み得る。多型は、コード領域内のヌクレオチドに存在し得るが、遺伝暗号の縮重のためにアミノ酸配列の変化をコードされない。代わりに、多型配列は、特定の位置で異なるアミノ酸をコードし得るが、アミノ酸における変化は、タンパク質機能に影響を及ぼさない。多型領域は、遺伝子の非コード領域でも見出され得る。特定の実施形態では、多型は、遺伝子のコード領域又は遺伝子の非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲ）において見出される。
【００９８】
本明細書で使用する場合、用語「アレル頻度」は、個体の集団における単一の座位でのアレル（例えば、ＳＮＰアレル）の相対頻度の尺度（例えば、比率又はパーセンテージ）である。例えば、個体の集団がそれらの体細胞の各々において特定の染色体座位（及び座位を占有する遺伝子）のｎ座位を有する場合、アレルのアレル頻度は、アレルが集団内で占有する座位の割合又はパーセンテージである。特定の実施形態では、アレル（例えば、ＳＮＰアレル）のアレル頻度は、検体集団において少なくとも１０％（例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％以上）である。
【００９９】
用語「機能獲得変異」は、本明細書で使用する場合、前記遺伝子によってコードされるタンパク質（すなわち変異体タンパク質）が、疾患又は障害を引き起こすか又はそれに寄与するタンパク質（すなわち野生型タンパク質）と通常関連しない機能を獲得する遺伝子における任意の変異を指す。機能獲得変異は、コードされるタンパク質の機能において変化を起こす遺伝子における１つ又は複数のヌクレオチドの欠失、付加又は置換であり得る。一実施形態では、機能獲得変異は、変異体タンパク質の機能を変化させるか又は他のタンパク質との相互作用をもたらす。別の実施形態では、機能獲得変異は、正常な野生型タンパク質の減少又は除去を、例えば改変された変異体タンパク質と前記正常の野生型タンパク質の相互作用によってもたらす。
【０１００】
本明細書で使用する場合、用語「機能獲得障害」は、機能獲得変異によって特徴付けされる障害を指す。一実施形態では、機能獲得障害は、機能獲得変異体によって引き起こされる神経変性疾患、例えばポリグルタミン障害及び／又はトリヌクレオチドリピート疾患、例えばハンチントン病である。別の実施形態では、機能獲得障害は、癌遺伝子における機能獲得によって引き起こされ、変異した遺伝子産物は、機能獲得変異体、例えばｒｅｔ癌遺伝子（例えば、ｒｅｔ−１）中の変異によって引き起こされる癌、例えば内分泌腫瘍、髄質性甲状腺腫瘍、副甲状腺ホルモン腫瘍、２型多発性内分泌新生物などである。追加の例示的な機能獲得障害としては、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ヒト免疫不全障害（ＨＩＶ）及びスローチャネル型先天性筋無力症（ＳＣＣＭＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
用語「トリヌクレオチドリピート疾患」は、本明細書で使用する場合、遺伝子内に位置する拡張されたトリヌクレオチドリピート領域によって特徴付けられる任意の疾患又は障害を指し、拡張されたトリヌクレオチドリピート領域は、疾患又は障害の原因となる。トリヌクレオチドリピート疾患の例としては、１２型脊髄小脳失調症、８型脊髄小脳失調症、脆弱Ｘ症候群、脆弱ＸＥ精神遅滞、フリートライヒ運動失調症及び筋強直性ジストロフィーが挙げられるが、これらに限定されない。本発明による治療のために好ましいトリヌクレオチドリピート疾患は、疾患又は障害を引き起こすか又は原因となる変異体タンパク質をコードする遺伝子のコード領域の５’末端での拡張されたトリヌクレオチドリピート領域によって特徴付けられるか又は引き起こされるものである。変異がコード領域と関連しないある種のトリヌクレオチド疾患、例えば脆弱Ｘ症候群は、ＲＮＡｉによって標的化されることになる好適なｍＲＮＡが存在しないため、本発明の方法論に従う治療に好適ではない可能性がある。対照的に、フリートライヒ運動失調症などの疾患は、原因となる変異がコード領域内にない（すなわちイントロン内にある）が、変異が例えばｍＲＮＡ前駆体（例えば、スプライシングされる前のｍＲＮＡ前駆体）内にあり得るため、本発明の方法論に従う治療のために好適であり得る。
【０１０２】
用語「ポリグルタミン障害」は、本明細書で使用する場合、コード領域の５’末端での（ＣＡＧ）ｎリピートの拡張（したがってコードされたタンパク質において拡張されたポリグルタミン領域をコードする）によって特徴付けられる任意の疾患又は障害を指す。一実施形態では、ポリグルタミン障害は、神経細胞の進行性の変性によって特徴付けられる。ポリグルタミン障害の例としては、ハンチントン病、１型脊髄小脳失調症、２型脊髄小脳失調症、３型脊髄小脳失調症（マシャド・ジョセフ病としても知られる）及び６型脊髄小脳失調症、７型脊髄小脳失調症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｉｕｂｒａｌ−ｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ  ａｔｒｏｐｈｙ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
用語「一塩基多型障害」又は「ＳＮＰ障害」は、ＳＮＰ、例えばヘテロ接合型ＳＮＰの存在によって特徴付けられる障害を指す。ＳＮＰ障害としては、フェニルケトン尿症、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、白皮症、ハンチントン病、１型筋強直性ジストロフィー、高コレステロール血症（常染色体優性、Ｂ型）、神経線維腫症（１型）、多発性嚢胞腎（１及び２）、血友病Ａ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、Ｘ連鎖低リン血症性くる病、レット症候群、非閉塞性精子形成不全などが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なヘテロ接合型ＳＮＰ障害は、ハンチントン病である。
【０１０４】
ある種の態様では、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第１の鎖及び第１の鎖の少なくとも一部と相補的な約１５〜３５ヌクレオチドの第２の鎖を含む二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が提供され、第１の鎖は、アレル多型と相補的である、５’末端から２〜７位で一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチド；及び遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置するミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチドを含む。いくつかの場合、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置から２〜１０ヌクレオチドに位置する。いくつかの場合、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２〜６位のいずれか１つである。例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２、４又は６位にあり、及びミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置する。いくつかの場合、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２〜６位のいずれか１つであり、及びヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置する。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、「一塩基多型位置ヌクレオチド」又は「ＳＮＰ位置ヌクレオチド」は、標的核酸配列（すなわちＳＮＰアレルに対応する変異体ヌクレオチド又は野生型アレルに対応する野生型ヌクレオチドのいずれか）の多型位置に対応する、本明細書に記載されるＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡの第１の鎖）の位置を指す。例えば、鎖は、ＳＮＰの位置が鎖の５’末端から２、３又は４ヌクレオチドにあると表示するために「ＳＮＰ２」、「ＳＮＰ３」又は「ＳＮＰ３」と標識され得る。
【０１０６】
ある種の例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、シード領域内にある。ある種の例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２位〜７位、５’末端から２位〜６位又は５’末端から２位〜５位に位置する。ある種の例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、本明細書に記載されるＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡの第１の鎖）の５’末端から２位、５’末端から３位、５’末端から４位、５’末端から５位、５’末端から６位又は５’末端から７位に位置する。ある種の例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、表５〜７に記載される位置に位置する。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、用語「シード領域」は、ＲＮＡ鎖の５’末端から２〜７位に対応する６ヌクレオチド区間を指す。標的ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ識別は、そのアンチセンス鎖のシード領域によって与えられると考えられる。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、「ミスマッチ位置ヌクレオチド」又は「ＭＭ位置ヌクレオチド」は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドに対応しない位置にある、本明細書に記載されるＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡの第１の鎖）の位置を指す。ＭＭ位置ヌクレオチドは、本明細書に記載されるＲＮＡの５’末端若しくは３’末端（例えば、ｄｓＲＮＡの第１の鎖の５’若しくは３’末端）からのその位置によって定義され得るか、又は本明細書に記載されるＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡの第１の鎖）のＳＮＰ位置ヌクレオチドに対するその位置によって定義され得る。
【０１０９】
ある種の例示的な実施形態では、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチド、２〜１０ヌクレオチド、２〜９ヌクレオチド、２〜８ヌクレオチド、２〜７ヌクレオチド又は２〜６ヌクレオチドに位置する。ある種の例示的な実施形態では、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから１１ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、９ヌクレオチド、８ヌクレオチド、７ヌクレオチド、６ヌクレオチド、５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド又は２ヌクレオチドに位置する。ある種の例示的な実施形態では、ＭＭ位置ヌクレオチドは、表５〜７に記載される位置に位置する。
【０１１０】
一実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡの第１の鎖）は、アレル多型に対応するヌクレオチドに対する特定の位置での１つのミスマッチオリゴヌクレオチドを除いて、アレル多型に対して相同である。ある種の実施形態では、ミスマッチは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの約６ヌクレオチド以内、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの約５ヌクレオチド以内、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの約４ヌクレオチド以内、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの約３ヌクレオチド以内、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの約２ヌクレオチド以内又はＳＮＰ位置ヌクレオチドの約１ヌクレオチド以内にある。特定の実施形態では、ミスマッチは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドに隣接しない。
【０１１１】
別の実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２、３、４、５又は６位にある。ある実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２位にある。ある実施形態では、５’末端から３位にある。ある実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から４位にある。ある実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から５位にある。ある実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から６位にある。
【０１１２】
ある種の例示的な実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡの第１の鎖）は、５’末端から５、７、８、１１、１４、１５又は１６位にあるＭＭ位置ヌクレオチドを含む。ある種の例示的な実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡの第１の鎖）は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから１、２、３、４、５、８、９、１０又は１１ヌクレオチドにあるＭＭ位置ヌクレオチドを含む。
【０１１３】
ある種の例示的な実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡの第１の鎖）は、２−７、４−７、４−８、４−１５、６−５、６−８、６−１１、６−１４、６−１６、３−５、３−７及び３−８からなる群から選択されるＳＮＰ位置ヌクレオチド（５’末端から参照される）−ＭＭ位置ヌクレオチド（５’末端から参照される）の組合せを含む。
【０１１４】
特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡの第１の鎖）は、５’末端から６位にあるＳＮＰ位置ヌクレオチド及び５’末端から１１位にあるＭＭ位置ヌクレオチドを含む。別の特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡの第１の鎖）は、５’末端から４位にあるＳＮＰ位置ヌクレオチド及び５’末端から７位にあるミスマッチを含む。
【０１１５】
一態様では、本明細書で提供される二重鎖ＲＮＡは、アレル多型を有する変異体アレルを選択的にサイレンシングする。ある実施形態では、本明細書で提供される二重鎖ＲＮＡは、アレル多型を有する変異体アレルをサイレンシングし、同じ遺伝子の野生型アレルに影響を及ぼさない。別の実施形態では、本明細書で提供される二重鎖ＲＮＡは、アレル多型を有する変異体アレルをサイレンシングし、変異体アレルより低い程度まで同じ遺伝子の野生型アレルをサイレンシングする。
【０１１６】
したがって、一態様では、本発明は、有効量の、変異体タンパク質（例えば、ハンチンチンタンパク質）をコードする遺伝子内のアレル多型を標的化するＲＮＡｉ剤を対象に投与することにより、アレル多型と関連する変異体タンパク質によって特徴付けられるか又は引き起こされる疾患を有するか又はそのリスクを有する対象を治療する方法を提供し、その結果、遺伝子の配列特異的干渉は、疾患のために有効な治療をもたらす。
【０１１７】
一態様では、本明細書で開示されるＲＮＡサイレンシング剤は、対応する野生型アレルより効率的に、多型を含む変異体アレルを優先的にサイレンシングする。ある種の例示的な実施形態では、本明細書で開示されるｄｓＲＮＡは、対応する野生型アレルより約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％又は約９０％多い多型を含むアレルをサイレンシングする。ある実施形態では、本明細書で開示されるＲＮＡサイレンシング剤は、対応する野生型アレルより少なくとも約５０％多い多型を含むアレルをサイレンシングする。ある種の例示的な実施形態では、本明細書で開示されるｄｓＲＮＡは、多型を含むアレルを、対応する野生型アレルのサイレンシングのレベルより少なくとも約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍、約１００倍、約１１０倍、約１２０倍、約１３０倍、約１４０倍、約１５０倍、約１６０倍、約１７０倍、約１８０倍、約１９０倍、約２００倍、約２５０倍、約３００倍、約３５０倍、約４００倍、約４５０倍又は最大約５００倍サイレンシングする。
【０１１８】
本明細書で使用する場合、ＲＮＡサイレンシング剤、例えばｓｉＲＮＡ又はＲＮＡサイレンシング剤の用語「アンチセンス鎖」は、サイレンシングのために標的化される遺伝子のｍＲＮＡの約１０〜５０ヌクレオチド、例えば約１５〜３０、１６〜２５、１８〜２３又は１９〜２２ヌクレオチドの一部分と実質的に相補的な鎖を指す。アンチセンス鎖又は第１の鎖は、標的特異的サイレンシングを誘導する所望の標的ｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、例えばＲＮＡｉ機構又はプロセス（ＲＮＡｉ干渉）による所望の標的ｍＲＮＡの破壊を誘発するのに十分に相補的又は所望の標的ｍＲＮＡの翻訳抑制を誘発するのに十分に相補的な配列を有する。
【０１１９】
ＲＮＡサイレンシング剤、例えばｓｉＲＮＡ又はＲＮＡサイレンシング剤の用語「センス鎖」又は「第２の鎖」は、アンチセンス鎖又は第１の鎖と相補的な鎖を指す。アンチセンス及びセンス鎖は、標的配列と相補性を有する第１又は第２の鎖及び前記第１又は第２の鎖と相補性を有するそれぞれの第２又は第１の鎖である第１又は第２の鎖と呼ばれる場合もある。ｍｉＲＮＡ二本鎖中間体又はｓｉＲＮＡ様二本鎖は、サイレンシングのために標的化される遺伝子のｍＲＮＡの約１０〜５０ヌクレオチドの一部分と十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ鎖及びｍｉＲＮＡ鎖と二本鎖を形成する十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ＊鎖を含む。
【０１２０】
本明細書で使用する場合、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「ＡＳＯ」は、有効な様式、例えば標的ｍＲＮＡの翻訳及び／又は標的プレｍＲＮＡのスプライシングを阻害するのに有効な様式で標的ＲＮＡの領域を遮断するために、ＲＮＡ（例えば、ＳＮＰ含有ｍＲＮＡ又はＳＮＰ含有プレｍＲＮＡ）を標的化する十分な配列相補性を有する核酸（例えば、ＲＮＡ）を指す。「標的ＲＮＡと十分に相補的な配列」を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス剤が、別の方法でスプライシングを調節するであろうタンパク質のための結合部位をマスクするのに十分な配列を有すること、並びに／又はアンチセンス剤が、リボソームのための結合部位をマスクするのに十分な配列を有すること、並びに／又はアンチセンス剤が、スプライシング及び／又は翻訳を妨げる標的化されるＲＮＡの三次元構造を改変するのに十分な配列を有することを意味する。
【０１２１】
本明細書で使用する場合、アンチセンス鎖の５’末端の場合のような「５’末端」は、例えば、アンチセンス鎖の５’末端での１〜約５ヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドを指す。本明細書で使用する場合、センス鎖の３’末端の場合のような「３’末端」は、領域、例えば相補的なアンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドと相補的な１〜約５ヌクレオチドの領域を指す。
【０１２２】
本明細書で使用する場合、用語「塩基対」は、オリゴヌクレオチド二本鎖（例えば、ＲＮＡサイレンシング剤の鎖と標的ｍＲＮＡ配列によって形成される二本鎖）の反対側の鎖上のヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）の対間、主に前記ヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）間のＨ結合、ファンデルワールス相互作用などに起因する相互作用を指す。本明細書で使用する場合、用語「結合強度」又は「塩基対強度」は、塩基対の強度を指す。
【０１２３】
本明細書で使用する場合、用語「ミスマッチ塩基対」は、例えば、通常の相補的なＧ：Ｃ、Ａ：Ｔ又はＡ：Ｕ塩基対ではない非相補的又は非ワトソン−クリック塩基対からなる塩基対を指す。本明細書で使用する場合、用語「曖昧な塩基対」（非識別塩基対としても知られる）は、ユニバーサルヌクレオチドによって形成される塩基対を指す。
【０１２４】
本発明のコンジュゲートされた化合物において有用なリンカーとしては、グリコール鎖（例えば、ポリエチレングリコール）、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びその組合せが挙げられる。本明細書で使用する場合、略称「ＴＥＧ」は、トリエチレングリコールを指す。
【０１２５】
オリゴヌクレオチドの設計
ある種の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡは、センス鎖及び相補的なアンチセンス鎖からなる二本鎖であり、アンチセンス鎖は、ＲＮＡｉを媒介するアレル多型を含有する標的ｍＲＮＡと十分な相補性を有する。例示的な実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０〜５０以上のヌクレオチド長を有し、すなわち、各鎖は、１０〜５０ヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）を含む。特定の例示的な実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、各鎖において約１５〜３５、例えば約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４又は約３５ヌクレオチド長を有し、鎖の一方は、標的領域と十分に相補的である。例示的な実施形態では、鎖は、整列されていない鎖の末端に少なくとも１、２又は３つの塩基が存在するように整列され（すなわち反対側の鎖と相補的な塩基が存在しない）、その結果、１、２又は３つの残基のオーバーハングは、鎖がアニーリングされたときに二本鎖の一方又は両方の末端に生じる。例示的な実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０〜５０以上のヌクレオチド長を有し、すなわち、各鎖は、１０〜５０ヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）を含む。特定の例示的な実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、各鎖において約１５〜３５、例えば約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４又は約３５ヌクレオチド長を有し、鎖の一方は、アレル多型を含有する標的配列と実質的に相補的であり、及び他方の鎖は、第１の鎖と相補的であるか又は実質的に相補的である。ある実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、第２のミスマッチとしても知られる１つの追加のミスマッチを除いて、アレル多型を含有する標的配列と完全に相補的である。
【０１２６】
一般に、ｓｉＲＮＡは、当技術分野で知られる任意の方法を使用することにより、例えば以下のプロトコルを使用することによって設計され得る。
【０１２７】
１．ｓｉＲＮＡは、アレル多型を含有する標的配列に特異的であり得る。例示的な実施形態では、第１の鎖は、アレル多型を含有する標的配列に対して１つのミスマッチを有するアレル多型を含有する標的配列と実質的に相補的であり、及び他方の鎖は、第１の鎖と実質的に相補的である。ある実施形態では、標的配列は、標的遺伝子のコード領域の外部にある。例示的な標的配列は、標的遺伝子の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）又はイントロン領域から選択される。これらの部位でのｍＲＮＡの切断は、対応する変異体タンパク質の翻訳を排除するはずである。ｈｔｔ遺伝子の他の領域に由来する標的配列も標的化するのに好適である。センス鎖は、標的配列に基づいて設計される。さらに、より低いＧ／Ｃ含量（３５〜５５％）を有するｓｉＲＮＡは、５５％より高いＧ／Ｃ含量を有するものより活性であり得る。したがって、一実施形態では、本発明は、３５〜５５％のＧ／Ｃ含量を有する核酸分子を含む。
【０１２８】
２．ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、選択された標的部位及びアレル多型の位置の配列に基づいて設計される。例示的な実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ＰＫＲ応答を誘発しない（すなわち十分に短い長さである）。しかしながら、より長いＲＮＡ剤は、例えば、ＰＫＲ応答を生成できない細胞型において又はＰＫＲ応答が代替の手段によって下方制御されたか若しくは弱められた状況において有用であり得る。
【０１２９】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介できるように標的配列と十分な相補性を有する。一般に、標的遺伝子のＲＩＳＣ媒介性切断をもたらす標的遺伝子の標的配列部分と十分に同一なヌクレオチド配列を含有するｓｉＲＮＡが使用される。したがって、例示的な実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、アレル多型を含有する標的の一部と十分に同一な配列を有するように設計される。本発明は、ＲＮＡｉの効率及び特異性を高めるある種の配列変種を許容できる利点を有する。ある態様では、センス鎖は、野生型と変異体アレルとの間で少なくとも１つの塩基対が異なる標的領域、例えば機能獲得変異を含む標的領域などのアレル多型を含有する標的領域とともに１つのミスマッチヌクレオチドを有し、及び他方の鎖は、第１の鎖と同一であるか又は実質的に同一である。いくつかの実施形態では、ミスマッチは、アレル多型に対応するヌクレオチドの４ヌクレオチド上流、３ヌクレオチド上流、アレル多型に対応するヌクレオチドの２ヌクレオチド上流、アレル多型に対応するヌクレオチドの１ヌクレオチド上流、１ヌクレオチド下流、アレル多型に対応するヌクレオチドの２ヌクレオチド下流、アレル多型に対応するヌクレオチドの３ヌクレオチド下流、アレル多型に対応するヌクレオチドの４ヌクレオチド下流又はアレル多型に対応するヌクレオチドの５ヌクレオチド下流である。ある種の実施形態では、ミスマッチは、アレル多型に対応するヌクレオチドに隣接しない。さらに、１又は２つのヌクレオチドの小さい挿入又は欠失を伴うｓｉＲＮＡ配列もＲＮＡｉを媒介するために効果的であり得る。代わりに、ヌクレオチド類似体置換又は挿入を伴うｓｉＲＮＡ配列は、阻害のために効果的であり得る。
【０１３０】
配列同一性は、配列比較及び当技術分野において知られるアラインメントアルゴリズムによって決定され得る。２つの核酸配列（又は２つのアミノ酸配列）の同一性パーセントを決定するため、配列は、最適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップは、最適なアラインメントのために第１の配列又は第２の配列に導入され得る）。次に、対応するヌクレオチド（又はアミノ酸）位置でのヌクレオチド（又はアミノ酸残基）が比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じ残基によって占められる場合、これらの分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり（すなわちパーセント（％）相同性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）、任意選択的に導入されるギャップの数及び／又は導入されるギャップの長さに関してスコアにペナルティーを課す。
【０１３１】
配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。一実施形態では、アラインメントは、低い程度の同一性を有する部分（すなわち局所的アラインメント）に対してではなく、十分な同一性を有して整列された配列の特定の部分に対して発生した。配列の比較のために利用される局所的アラインメントアルゴリズムの例示的な非限定的例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７の場合のように修飾された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。
【０１３２】
別の実施形態では、アラインメントは、適切なギャップを導入することによって最適化され、同一性パーセントは、整列された配列の長さに対して決定される（すなわちギャップ付きアラインメント）。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るため、ギャップ付きＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２において記載されるとおりに利用され得る。別の実施形態では、アラインメントは、適切なギャップを導入することによって最適化され、同一性パーセントは、整列された配列の全長に対して決定される（すなわちグローバルアラインメント）。配列のグローバル比較のために利用される数学的アルゴリズムの例示的な非限定的例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティー及び４のギャップペナルティーが使用され得る。
【０１３３】
３．ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖又はガイド鎖は、通常、センス鎖と同じ長さであり、且つ相補的ヌクレオチドを含む。一実施形態では、ガイド及びセンス鎖は、完全に相補的であり、すなわち、鎖は、整列又はアニールされるときに平滑末端である。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡの鎖は、１〜４、例えば２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するように対形成され得る。オーバーハングは、標的遺伝子（又はその相補体）に対応するヌクレオチドを含み得る（又はそれからなり得る）。代わりに、オーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド、例えばｄＴ若しくはヌクレオチド類似体又は他の好適な非ヌクレオチド材料を含み得る（又はそれからなり得る）。したがって、別の実施形態では、核酸分子は、ＴＴなどの２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有し得る。オーバーハングヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかであり得る。上記のとおり、変異体：野生型ミスマッチは、プリン：プリンミスマッチである標的領域を選択することが望ましい。
【０１３４】
４．当技術分野において知られる任意の方法を使用して、適切なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラットなど）に対して潜在的な標的を比較し、他のコード配列と有意な相同性を有する任意の標的配列を考慮から除外する。そのような配列相同性検索のための１つのそのような方法は、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ウェブサイトで利用可能なＢＬＡＳＴとして知られる。
【０１３５】
５．評価のための判定基準を満たす１つ以上の配列を選択する。
【０１３６】
ｓｉＲＮＡの設計及び使用についてのさらなる一般的な情報は、Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｋａｌｉｓｈｅ  Ｃｈｅｍｉｅウェブサイトで利用可能な「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」において見出され得る。
【０１３７】
代わりに、ｓｉＲＮＡは、標的配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列（又はオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義され得る（例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１２〜１６時間の５０℃又は７０℃でのハイブリダイゼーション、続いて洗浄する）。追加の例示的なハイブリダイゼーション条件は、１ｘＳＳＣ中における７０℃若しくは１ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド中における５０℃でのハイブリダイゼーション後の０．３ｘＳＳＣ中における７０℃での洗浄又は４ｘＳＳＣ中における７０℃若しくは４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド中における５０℃でのハイブリダイゼーションに続く１ｘＳＳＣ中における６７℃での洗浄を含む。５０塩基対長より短いと予測されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低くあるべきであり、Ｔｍは、以下の式に従って決定される。１８塩基対長より短いハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８〜４９塩基対長のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、Ｎは、ハイブリッド中の塩基の数であり、且つ［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液（１ｘＳＳＣ＝０．１６５Ｍに関する［Ｎａ＋］）中のナトリウムイオンの濃度である。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件の追加の例は、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，９章及び１１章並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２．１０節及び６．３〜６．４節において提供される。
【０１３８】
陰性対照ｓｉＲＮＡは、選択されたｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、適切なゲノムに対して有意な配列相補性を有するべきではない。そのような陰性対照は、選択されたｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を無作為に混ぜることによって設計され得る。相同性検索は、陰性対照が適切なゲノムにおける任意の他の遺伝子に対する相同性を確実に欠くように実施され得る。加えて、陰性対照ｓｉＲＮＡは、１つ以上の塩基ミスマッチを配列に導入することによって設計され得る。
【０１３９】
６．ｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡ（例えば、野生型又は変異体ハンチンチンｍＲＮＡ）を破壊する有効性を検証するため、ｓｉＲＮＡは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を用いるインビトロｍＲＮＡ発現系において標的ｃＤＮＡ（例えば、ハンチンチンｃＤＮＡ）とインキュベートされ得る。３２Ｐで放射標識された新たに合成された標的ｍＲＮＡ（例えば、ハンチンチンｍＲＮＡ）は、アガロースゲル上でオートラジオグラフにより検出される。切断された標的ｍＲＮＡの存在は、ｍＲＮＡヌクレアーゼ活性を示す。好適な対照は、ｓｉＲＮＡの省略及び非標的ｃＤＮＡの使用を含む。代わりに、対照ｓｉＲＮＡは、選択されたｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、適切な標的遺伝子に対して有意な配列相補性を有しないように選択される。そのような陰性対照は、選択されたｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を無作為に混ぜることによって設計され得る。相同性検索は、陰性対照が適切なゲノムにおける任意の他の遺伝子に対する相同性を確実に欠くように実施され得る。加えて、陰性対照ｓｉＲＮＡは、１つ以上の塩基ミスマッチを配列に導入することによって設計され得る。
【０１４０】
ｓｉＲＮＡは、上記の標的配列のいずれかを標的化するように設計され得る。前記ｓｉＲＮＡは、標的配列のサイレンシングを媒介する標的配列と十分に相補的なアンチセンス鎖を含む。ある種の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、ｓｉＲＮＡである。
【０１４１】
最適なｍＲＮＡ特異性及び最大のｍＲＮＡ切断をもたらすｓｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ相補性部位が選択される。
【０１４２】
ｓｉＲＮＡ様分子
本発明のｓｉＲＮＡ様分子は、ＲＮＡｉ又は翻訳抑制のいずれかによって遺伝子サイレンシングを誘導するｍＲＮＡ（例えば、ｈｔｔ  ｍＲＮＡ）の標的配列と「十分に相補的」である配列を有する（すなわち配列を有する鎖を有する）。ｓｉＲＮＡ様分子は、ｓｉＲＮＡ分子と同じ方法で設計されるが、センス鎖と標的ＲＮＡとの間の配列同一性の程度は、ｍｉＲＮＡとその標的との間に観察されるものに近い。一般に、ｍｉＲＮＡ配列と対応する標的遺伝子配列との間の配列同一性の程度は、減少するため、ＲＮＡｉではなく、翻訳抑制によって転写後遺伝子サイレンシングを媒介する傾向が増大する。したがって、代替的な実施形態では、標的遺伝子の翻訳抑制による転写後遺伝子サイレンシングが望まれる場合、ｍｉＲＮＡ配列は、標的遺伝子配列と部分的な相補性を有する。ある種の実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、標的ｍＲＮＡ内（例えば、標的ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ内）に分散した１つ以上の短い配列（相補性部位）と部分的な相補性を有する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２；Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００２；Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，２００３；Ｄｏｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．，２００３）。翻訳抑制の機構は協同的であるため、複数の相補性部位（例えば、２、３、４、５又は６）がある種の実施形態において標的化され得る。
【０１４３】
ＲＮＡｉ又は翻訳抑制を媒介するｓｉＲＮＡ様二本鎖の能力は、相補性部位における標的遺伝子配列と、サイレンシング剤のヌクレオチド配列との間の非同一ヌクレオチドの分布によって予測され得る。一実施形態では、翻訳抑制による遺伝子サイレンシングが望まれる場合、少なくとも１つの非同一ヌクレオチドは、相補性部位の中央部分に存在し、その結果、ｍｉＲＮＡガイド鎖と標的ｍＲＮＡによって形成される二本鎖は、中央「バルジ」を含有する（Ｄｏｅｎｃｈ  Ｊ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．，２００３）。別の実施形態では、２、３、４、５又は６個の連続的又は非連続的非同一ヌクレオチドが導入される。非同一ヌクレオチドは、ゆらぎ塩基対（例えば、Ｇ：Ｕ）又はミスマッチ塩基対（Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ、Ｕ：Ｕ）を形成するように選択され得る。さらなる例示的な実施形態では、「バルジ」は、ｍｉＲＮＡ分子の５’末端から１２及び１３位のヌクレオチドで中央に置かれる。
【０１４４】
修飾ＲＮＡサイレンシング剤
本発明のある種の態様では、上記のとおりの本発明のＲＮＡサイレンシング剤（又はその任意の部分）は、薬剤の活性がさらに改善されるように修飾され得る。例えば、上記のＲＮＡサイレンシング剤は、下記の修飾のいずれかで修飾され得る。修飾は、部分的には、標的の識別をさらに高めること、薬剤の安定性を高めること（例えば、分解を防止すること）、細胞内取込みを促進すること、標的効率を高めること、結合（例えば、標的に対する）の効力を改善すること、薬剤に対する患者の耐性を改善すること及び／又は毒性を低減することに役立ち得る。
【０１４５】
１）標的の識別を高める修飾
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、単一ヌクレオチドの標的識別を高める不安定化ヌクレオチドで置換され得る（両方が参照により本明細書に組み込まれる、２００７年１月２５日に出願された米国特許出願公開第１１／６９８，６８９号明細書及び２００６年１月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／７６２，２２５号明細書を参照されたい）。このような修飾は、非標的ｍＲＮＡ（例えば、野生型ｍＲＮＡ）に対するＲＮＡサイレンシング剤の特異性を消失させるのに十分であり得るが、標的ｍＲＮＡ（例えば、機能獲得変異体ｍＲＮＡ）に対するＲＮＡサイレンシング剤の特異性に認識できるほどに影響を及ぼさない。
【０１４６】
ある種の例示的な実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、そのアンチセンス鎖中の少なくとも１つのユニバーサルヌクレオチドの導入によって修飾される。ユニバーサルヌクレオチドは、４つの通常のヌクレオチド塩基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）のいずれかと無差別に塩基対形成できる塩基部分を含む。ユニバーサルヌクレオチドは、通常、それがＲＮＡ二本鎖又はＲＮＡサイレンシング剤及び標的ｍＲＮＡのガイド鎖によって形成される二本鎖の安定性に対して相対的に低い効果を有するため利用される。例示的なユニバーサルヌクレオチドとしては、デオキシイノシン（例えば、２’−デオキシイノシン）、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２’−アザ−２’−デオキシイノシン、ＰＮＡ−イノシン、モルホリノ−イノシン、ＬＮＡ−イノシン、ホスホロアミダート−イノシン、２’−Ｏ−メトキシエチル−イノシン及び２’−ＯＭｅ−イノシンからなる群から選択されるイノシン塩基部分又はイノシン類似体塩基部分を有するものが挙げられる。特定の例示的な実施形態では、ユニバーサルヌクレオチドは、イノシン残基又は天然に存在するその類似体である。
【０１４７】
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、特異性決定ヌクレオチドから１１ヌクレオチド以内（例えば、疾患関連多型（例えば、ＳＮＰ位置ヌクレオチド）を認識するヌクレオチドから１１ヌクレオチド以内）での少なくとも１つの不安的化ヌクレオチドの導入によって修飾される。例えば、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ヌクレオチド以内にある位置で導入され得る。例示的な実施形態では、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから３ヌクレオチドにある位置で導入される（すなわち不安定化ヌクレオチド及び特異性決定ヌクレオチド間に２つの安定化ヌクレオチドが存在するように）。２つの鎖又は鎖部分（例えば、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ）を有するＲＮＡサイレンシング剤において、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドを含有しない鎖又は鎖部分において導入され得る。特定の例示的な実施形態では、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドを含有する同じ鎖又は鎖部分において導入される。
【０１４８】
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、式１：
【化１０】
2021533762.tif 000011
（式中、
Ｄは、Ｏ、ＯＣＨ２、ＯＣＨ、ＣＨ２及びＣＨからなる群から選択され；
Ｃは、Ｏ−、ＯＨ、ＯＲ１、ＮＨ−、ＮＨ２、Ｓ−及びＳＨからなる群から選択され；
Ａは、Ｏ及びＣＨ２からなる群から選択され；
Ｒ１は、保護基であり；
【化１１】
2021533762.tif 000012
は、任意選択的な二重結合であり；及び
サブユニット間は、２つの任意選択的に修飾されたヌクレオシドを架橋している）
の修飾されたサブユニット間結合の導入によって修飾される。
【０１４９】
ある実施形態では、Ｃは、Ｏ−であり、Ａ又はＤのいずれかは、Ｏではない。
【０１５０】
ある実施形態では、Ｄは、ＣＨ２である。別の実施形態では、式ＶＩＩＩの修飾されたサブユニット間結合は、式２：
【化１２】
2021533762.tif 000013
の修飾されたサブユニット間結合である。
【０１５１】
ある実施形態では、Ｄは、Ｏである。別の実施形態では、式ＶＩＩＩの修飾されたサブユニット間結合は、式３：
【化１３】
2021533762.tif 000014
の修飾されたサブユニット間結合である。
【０１５２】
ある実施形態では、Ｄは、ＣＨ２である。別の実施形態では、式ＶＩＩＩの修飾されたサブユニット間結合は、式４：
【化１４】
2021533762.tif 000015
の修飾されたサブユニット間結合である。
【０１５３】
別の実施形態では、修飾されたサブユニット間結合は、式５：
【化１５】
2021533762.tif 000016
の修飾されたサブユニット間結合である。
【０１５４】
ある実施形態では、Ｄは、ＯＣＨ２である。別の実施形態では、修飾されたサブユニット間結合は、式６：
【化１６】
2021533762.tif 000017
の修飾されたサブユニット間結合である。
【０１５５】
別の実施形態では、式ＶＩＩの修飾されたサブユニット間結合は、式７：
【化１７】
2021533762.tif 000018
の修飾されたサブユニット間結合である。
【０１５６】
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、図４３のサブユニット間リンカーの１つ以上の導入によって修飾される。例示的な実施形態では、図４３のサブユニット間リンカーは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドと、アンチセンス鎖のＳＮＰ位置ヌクレオチドに直接的に隣接し、且ついずれかの側の位置にあるヌクレオチドとの間に挿入される。
【０１５７】
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、以下の式：
【化１８】
2021533762.tif 000019
を有するサブユニット間リンカーにおける１つ以上のビニルホスホネート（ＶＰ）モチーフの導入によって修飾される。
【０１５８】
ある種の実施形態では、ＶＰモチーフは、オリゴヌクレオチド、例えばＲＮＡの任意の位置で挿入される。例えば、２０ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドに関して、ＶＰモチーフは、位置１−２、２−３、３−４、４−５、５−６、６−７、７−８、８−９、９−１０、１０−１１、１１−１２、１２−１３、１３−１４、１４−１５、１５−１６、１６−１７、１７−１８、１８−１９又は１９−２０及びこれらの任意の組合せで挿入され得る。
【０１５９】
ある種の例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、アンチセンス鎖の位置１−２、５−６、６−７、１０−１１、１８−１９及び／又は１９−２０の１つ以上で挿入される。
【０１６０】
他の例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、アンチセンス鎖の位置１−２、６−７、１０−１１及び／又は１９−２０の１つ以上で挿入される。
【０１６１】
例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、アンチセンス鎖のＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣（すなわちＳＮＰ位置ヌクレオチドと、それに直接的に隣接し、且ついずれかの側の位置にあるヌクレオチドとの間）に挿入される。別の例示的な実施形態では、ＶＰモチーフは、アンチセンス鎖のＭＭ位置ヌクレオチドの隣（すなわちＭＭ位置ヌクレオチドと、それに直接的に隣接し、且ついずれかの側の位置にあるヌクレオチドとの間）に挿入される。
【０１６２】
２）効力及び特異性を高める修飾
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、非対称設計規則に従ってＲＮＡｉを媒介する効力及び特異性の増強を促進するように改変され得る（米国特許第８，３０９，７０４号明細書、同第７，７５０，１４４号明細書、同第８，３０４，５３０号明細書、同第８，３２９，８９２号明細書及び同第８，３０９，７０５号明細書を参照されたい）。そのような改変は、センス鎖に有利なようにｓｉＲＮＡ（例えば、本発明の方法を使用して設計されたｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡから生成されたｓｉＲＮＡ）のアンチセンス鎖のＲＩＳＣへの侵入を促進し、その結果、アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡの切断又は翻訳抑制を優先的に誘導し、したがって標的切断及びサイレンシングの効率を増大させるか又は改善する。例示的な実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤の非対称は、ＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖５’末端（ＡＳ５’）とセンス鎖３’末端（Ｓ３’）との間の塩基対強度を、前記サイレンシング剤のアンチセンス鎖３’末端（ＡＳ３’）とセンス鎖５’末端（Ｓ’５）との間の結合強度又は塩基対強度に対して低下させることによって高められる。
【０１６３】
一実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称は、第１又はアンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖部分の５’末端との間より、第１又はアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間でＧ：Ｃ塩基対が少なくなるように高められ得る。別の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称は、第１又はアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間に少なくとも１つのミスマッチ塩基対があるように高められ得る。例示的な実施形態では、ミスマッチ塩基対は、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ及びＵ：Ｕからなる群から選択される。別の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称は、第１又はアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間に少なくとも１つのゆらぎ塩基対、例えばＧ：Ｕがあるように高められ得る。別の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称は、希少ヌクレオチド、例えばイノシン（Ｉ）を含む少なくとも１つの塩基対があるように高められ得る。例示的な実施形態では、塩基対は、Ｉ：Ａ、Ｉ：Ｕ及びＩ：Ｃからなる群から選択される。さらに別の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称は、修飾ヌクレオチドを含む少なくとも１つの塩基対があるように高められ得る。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２−アミノ−Ｇ、２−アミノ−Ａ、２，６−ジアミノ−Ｇ及び２，６−ジアミノ−Ａからなる群から選択される。
【０１６４】
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、以下の式：
【化１９】
2021533762.tif 000020
を有するビニルホスホネート（ＶＰ）モチーフの導入によってオリゴヌクレオチドにおける１つ以上のサブユニット間結合で改変される。
【０１６５】
３）安定性の増強を有するＲＮＡサイレンシング剤
本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、細胞培養のための血清又は増殖培地における安定性を改善するように修飾され得る。安定性を増強するため、３’残基は、分解に対して安定化され得、例えば、それらは、プリンヌクレオチド、特にアデノシン又はグアノシンヌクレオチドからなるように選択され得る。代わりに、修飾された類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば２’−デオキシチミジンによるウリジンの置換は、許容され、且つＲＮＡ干渉の効率に影響を及ぼさない。
【０１６６】
特定の態様では、本発明は、対応する未修飾のＲＮＡサイレンシング剤と比較してインビボでの安定性が増強されるような、第２の鎖及び／又は第１の鎖が、内部ヌクレオチドの修飾ヌクレオチドによる置換によって修飾される第１及び第２の鎖を含むＲＮＡサイレンシング剤を特徴とする。本明細書で定義されるとおり、「内部」ヌクレオチドは、核酸分子、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端以外の任意の位置に存在するものである。内部ヌクレオチドは、一本鎖分子内又は二本鎖又は二重鎖分子の鎖内に存在し得る。一実施形態では、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、少なくとも１つの内部ヌクレオチドの置換によって修飾される。別の実施形態では、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個以上の内部ヌクレオチドの置換によって修飾される。別の実施形態では、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、内部ヌクレオチドの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の置換によって修飾される。さらに別の実施形態では、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、内部ヌクレオチドの全ての置換によって修飾される。
【０１６７】
本発明の特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド類似体を含有し得る。ヌクレオチド類似体は、標的特異的サイレンシング活性、例えばＲＮＡｉ媒介性活性又は翻訳抑制活性が例えばｓｉＲＮＡ分子の５’末端及び／又は３’末端の領域において実質的に生じない位置に位置し得る。特に、末端は、修飾されたヌクレオチド類似体を組み込むことによって安定化され得る。
【０１６８】
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、以下の式：
【化２０】
2021533762.tif 000021
を有するビニルホスホネート（ＶＰ）モチーフの導入によってオリゴヌクレオチドにおける１つ以上のサブユニット間結合で改変される。
【０１６９】
様々なオリゴヌクレオチド型（例えば、ギャップマー、ミックスマー、ｍｉＲＮＡ阻害剤、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（「ＳＳＯ」）、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴヌクレオチド（「ＰＭＯ」）、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」）など）は、任意選択的に、修飾（例えば、化学修飾）並びに／又は本明細書及び例えば各々が全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第１５／０８９，４２３号明細書；米国特許出願公開第１５／２３６，０５１号明細書；米国特許出願公開第１５／４１９，５９３号明細書；米国特許出願公開第１５／６９７，１２０号明細書及び米国特許第９，８０９，８１７号明細書；及び米国特許出願公開第１５／８１４，３５０号明細書及び米国特許第９，８６２，３５０号明細書において記載されるコンジュゲートの様々な組合せを利用して、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドにおいて使用され得る。
【０１７０】
例示的なヌクレオチド類似体としては、糖及び／又は骨格修飾リボヌクレオチド（すなわちホスフェート−糖骨格に対する修飾を含む）が挙げられる。例えば、天然のＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素又は硫黄ヘテロ原子の少なくとも１つを含むように修飾され得る。例示的な骨格修飾リボヌクレオチドにおいて、隣接リボヌクレオチドに連結するホスホエステル基は、修飾基、例えばホスホチオエート基によって置き換えられる。例示的な糖−修飾リボヌクレオチドにおいて、２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２又はＯＮから選択される基によって置き換えられ、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、及びハロは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである。
【０１７１】
特定の実施形態では、修飾は、２’−フルオロ、２’−アミノ及び／又は２’−チオ修飾である。特に、例示的な修飾としては、２’−フルオロ−シチジン、２’−フルオロ−ウリジン、２’−フルオロ−アデノシン、２’−フルオロ−グアノシン、２’−アミノ−シチジン、２’−アミノ−ウリジン、２’−アミノ−アデノシン、２’−アミノ−グアノシン、２，６−ジアミノプリン、４−チオ−ウリジン及び／又は５−アミノ−アリル−ウリジンが挙げられる。特定の実施形態では、２’−フルオロリボヌクレオチドは、あらゆるウリジン及びシチジンである。追加の例示的な修飾としては、５−ブロモ−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、５−メチル−シチジン、リボ−チミジン、２−アミノプリン、２’−アミノ−ブチリル−ピレン−ウリジン、５−フルオロ−シチジン及び５−フルオロ−ウリジンが挙げられる。２’−デオキシ−ヌクレオチド及び２’−Ｏｍｅヌクレオチドも本発明の修飾ＲＮＡサイレンシング剤部分内で使用され得る。追加の修飾残基としては、デオキシ−脱塩基、イノシン、Ｎ３−メチル−ウリジン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン、プソイドウリジン、プリンリボヌクレオシド及びリバビリンが挙げられる。特定の例示的な実施形態では、２’部分は、連結部分が２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドであるようにメチル基である。
【０１７２】
例示的な実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。ＬＮＡは、ヌクレアーゼ活性に抵抗し（高度に安定である）、且つｍＲＮＡのための単一ヌクレオチド識別を有する糖修飾ヌクレオチドを含む（Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（２００５），３３（１）：４３９−４４７；Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：７９６７−７９７５，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：７４−８１）。これらの分子は、２’−デオキシ−２’’−フルオロウリジンなどの可能な修飾とともに２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸を有する。さらに、ＬＮＡは、糖部分を３’−エンド立体構造に限定し、それにより塩基対形成のためにヌクレオチドを事前に構築し、且つ１塩基当たり１０℃もオリゴヌクレオチドの融解温度を上昇させることにより、オリゴヌクレオチドの特異性を増大させる。
【０１７３】
別の例示的な実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ＰＮＡは、ヌクレオチドの糖−ホスフェート部分がヌクレアーゼ消化に対して高度に抵抗性であり、且つ分子への結合特異性の改善を施すポリアミド骨格を形成できる中性２−アミノエチルグリシン部分と置き換えられる修飾ヌクレオチドを含む（Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２００１），２５４：１４９７−１５００）。
【０１７４】
ある種の例示的な実施形態では、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち天然に存在する核酸塩基の代わりに少なくとも１つの天然に存在しない核酸塩基を含有するリボヌクレオチドが使用される。塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性を遮断するように修飾され得る。例示的な修飾核酸塩基としては、５位で修飾されたウリジン及び／又はシチジン、例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシン及び／又はグアノシン、例えば８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシン；Ｏ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンが挙げられ、好適であるが、これらに限定されない。上記の修飾が組み合わせられ得ることが留意されるべきである。
【０１７５】
他の実施形態では、架橋は、ＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態を改変する、例えば体内での半減期を増大させるために利用され得る。したがって、本発明は、核酸の２つの相補鎖を有するＲＮＡサイレンシング剤を含み、２つの鎖は、架橋される。本発明は、別の部分（例えば、ペプチドなどの非核酸部分）、有機化合物（例えば、色素）などに（例えば、その３’末端で）コンジュゲートされるか又はコンジュゲートされないＲＮＡサイレンシング剤も含む。このようにしてｓｉＲＮＡ誘導体を修飾することは、対応するｓｉＲＮＡと比較して、得られるｓｉＲＮＡ誘導体の細胞内取込みを改善するか若しくは細胞における標的化活性を増強する場合があるか、細胞内でのｓｉＲＮＡ誘導体の追跡に有用であるか、又は対応するｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡ誘導体の安定性を改善する。
【０１７６】
他の例示的な修飾としては、（ａ）２’修飾、例えばセンス鎖又はアンチセンス鎖、特にセンス鎖上のＵ上での２’ＯＭｅ部分の提供又は３’オーバーハングでの２’ＯＭｅ部分の提供、例えば３’末端で（３’末端は、分子の３’原子又は最も３’の部分、例えば文脈によって示されるとおり最も３’のＰ又は２’位を意味する）；（ｂ）骨格の修飾、例えばホスフェート骨格におけるＯのＳによる置換を有する、例えばＵ若しくはＡ若しくはその両方でのホスホロチオエート修飾の提供、特にアンチセンス鎖上；例えば、ＰのＳによる置換を有する；（ｃ）ＵのＣ５アミノリンカーによる置換；（ｄ）ＡのＧによる置換（ほとんどの場合、配列変化は、アンチセンス鎖ではなく、センス鎖上に位置する）；及び（ｄ）２’、６’、７’又は８’位での修飾が挙げられる。例示的な実施形態は、これらの修飾の１つ以上が、アンチセンス鎖ではなく、センス鎖上に存在するものであるか、又はアンチセンス鎖がより少ないそのような修飾を有する実施形態である。さらに他の例示的な修飾としては、３’オーバーハング、例えば３’末端におけるメチル化Ｐの使用；２’修飾の組合せ、例えば２’ＯＭｅ部分及び骨格の修飾の提供、例えばＰのＳによる置換を有する、例えばホスホロチオエート修飾の提供又は３’オーバーハング、例えば３’末端でのメチル化Ｐの使用；３’アルキルによる修飾；３’オーバーハング、例えば３’末端での脱塩基ピロリドンによる修飾；ナプロキセン、イブプロフェン又は３’末端で分解を阻害する他の部分による修飾が挙げられる。
【０１７７】
４）細胞取込みを高める修飾
他の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、例えば、標的細胞（例えば、神経細胞）による細胞取込みを増強するために化学部分で修飾され得る。したがって、本発明は、別の部分（例えば、ペプチドなどの非核酸部分）、有機化合物（例えば、色素）などに（例えば、その３’末端で）コンジュゲートされるか又はコンジュゲートされないＲＮＡサイレンシング剤を含む。コンジュゲーションは、例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．：４７（１），９９−１１２（２００１）（ポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）ナノ粒子にロードされた核酸を記載する）；Ｆａｔｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５３（１−３）：１３７−４３（１９９８）（ナノ粒子に結合された核酸を記載する）；Ｓｃｈｗａｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．５  Ｓｕｐｐｌ．４：５５−８（１９９４）（挿入剤、疎水性基、ポリカチオン又はＰＡＣＡナノ粒子に連結された核酸を記載する）；及びＧｏｄａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２（２）：４０４−１０（１９９５）（ナノ粒子に連結された核酸を記載する）の方法を使用して、当技術分野において知られる方法によって行われ得る。
【０１７８】
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤に対する修飾は、オリゴヌクレオチドの１つ以上のサブユニット間リンカーにおいてビニルホスホネート（ＶＰ）モチーフを含み、ＶＰモチーフは、以下の式：
【化２１】
2021533762.tif 000022
を有する。
【０１７９】
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、親油性部分にコンジュゲートされる。一実施形態では、親油性部分は、カチオン性基を含むリガンドである。別の実施形態では、親油性部分は、ｓｉＲＮＡの一方又は両方の鎖に結合される。例示的な実施形態では、親油性部分は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の一方の末端に結合される。別の例示的な実施形態では、親油性部分は、センス鎖の３’末端に結合される。ある種の実施形態では、親油性部分は、コレステロール、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＡ、葉酸又はカチオン性色素（例えば、Ｃｙ３）からなる群から選択される。例示的実施形態では、親油性部分は、コレステロールである。他の親油性部分としては、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル又はフェノキサジンが挙げられる。
【０１８０】
５）テザーリガンド
他の要素が本発明のＲＮＡサイレンシング剤に繋ぎ止められ得る。例えば、安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織若しくは細胞型への標的化又は細胞透過性を、例えばエンドサイトーシス依存的又は非依存的機構によって改善するためにＲＮＡサイレンシング剤に繋ぎ止められたリガンドである。リガンド及び関連する修飾はまた、配列特異性を増大させることができ、結果的にオフサイト標的化を減少させることができる。テザーリガンドは、干渉物質として機能できる１つ以上の修飾塩基又は糖を含み得る。ある種の例示的な実施形態では、これらは、ＲＮＡサイレンシング剤／標的二本鎖のバルジなどの内部領域に位置する。干渉物質は、芳香族、例えば多環式芳香族又は複素環式芳香族化合物であり得る。多環式干渉物質は、スタッキング能を有することができ、且つ２、３又は４つの縮合環を有する系を含むことができる。本明細書に記載されるユニバーサル塩基がリガンド上に含まれ得る。一実施形態では、リガンドは、標的核酸の切断によって標的遺伝子阻害に寄与する切断基を含み得る。切断基は、例えば、ブレオマイシン（例えば、ブレオマイシン−Ａ５、ブレオマイシン−Ａ２又はブレオマイシン−Ｂ２）、ピレン、フェナントロリン（例えば、Ｏ−フェナントロリン）、ポリアミン、トリペプチド（例えば、ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｌｙｓトリペプチド）又は金属イオンキレート化基であり得る。金属イオンキレート化基は、Ｌｕ（ＩＩＩ）などの遊離金属イオンによるバルジの部位での標的ＲＮＡの選択的切断を促進できる、例えばＬｕ（ＩＩＩ）又はＥＵ（ＩＩＩ）大環状錯体、Ｚｎ（ＩＩ）  ２，９−ジメチルフェナントリン誘導体、Ｃｕ（ＩＩ）テルピリジン又はアクリジンを含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリガンドは、標的ＲＮＡの、例えばバルジ領域での切断を促進するＲＮＡサイレンシング剤に繋ぎ止められ得る。例えば、１，８−ジメチル−１，３，６，８，１０，１３−ヘキサアザシクロテトラデカン（サイクラム）は、標的ＲＮＡ切断を促進するペプチドに（例えば、アミノ酸誘導体によって）コンジュゲートされ得る。テザーリガンドは、ハイブリダイゼーション特性の改善又は配列特異性の改善を有するＲＮＡサイレンシング剤をもたらし得るアミノグリコシドリガンドであり得る。例示的なアミノグリコシドとしては、グリコシル化ポリリジン、ガラクトシル化ポリリジン、ネオマイシンＢ、トブラマイシン、カナマイシンＡ並びにネオ−Ｎ−アクリジン、ネオ−Ｓ−アクリジン、ネオ−Ｃ−アクリジン、トブラ−Ｎ−アクリジン及びカナＡ−Ｎ−アクリジンなどのアミノグリコシドのアクリジンコンジュゲートが挙げられる。アクリジン類似体の使用は、配列特異性を増大させることができる。例えば、ネオマイシンＢは、ＤＮＡと比較してＲＮＡについて高い親和性を有するが、配列特異性が低い。アクリジン類似体であるネオ−５−アクリジンは、ＨＩＶ  Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）についての親和性の増大を有する。いくつかの実施形態では、アミノグリコシドリガンドのグアニジン類似体（グアニジノグリコシド）は、ＲＮＡサイレンシング剤に繋ぎ止められる。グアニジノグリコシドにおいて、アミノ酸上のアミン基は、グアニジ��基と交換される。グアニジン類似体の結合は、ＲＮＡサイレンシング剤の細胞透過性を増強することができる。テザーリガンドは、オリゴヌクレオチド剤の細胞取込みを増強できるポリ−アルギニンペプチド、ペプトイド又はペプチド模倣体であり得る。
【０１８１】
例示的なリガンドは、介在性テザーを介して、典型的には共有結合的にリガンドコンジュゲート担体に直接的又は間接的に結合される。例示的な実施形態では、リガンドは、介在性テザーを介して担体に結合される。例示的な実施形態では、リガンドは、組み込まれるＲＮＡサイレンシング剤の分布、標的化又は寿命を改変する。例示的な実施形態では、リガンドは、例えば、そのようなリガンドを欠く種と比較して、選択された標的、例えば分子、細胞又は細胞型、区画、例えば細胞又は器官の区画、組織、器官又は体の領域に対する親和性の増強をもたらす。
【０１８２】
例示的なリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション及び特異性特性を改善することができ、且つ結果として生じる天然若しくは修飾ＲＮＡサイレンシング剤又は本明細書に記載される単量体及び／若しくは天然若しくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含むポリマー分子のヌクレアーゼ抵抗性も改善し得る。リガンドは、一般に、例えば取込みを増強するための治療的修飾因子；例えば、分布をモニタリングするための診断用化合物又はレポーター基；架橋剤；ヌクレアーゼ抵抗性付与部分；及び天然又は異例の核酸塩基を含み得る。一般的な例としては、親油性物質、脂質、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えばサルササポゲニン、フリーデリン、エピフリエデラノール誘導体化リトコール酸）、ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール）、炭水化物、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的化分子、ポリカチオン性物質、ペプチド、ポリアミン及びペプチド模倣体が挙げられる。リガンドは、天然に存在する物質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）又はグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン又はヒアルロン酸）；アミノ酸又は脂質を含み得る。リガンドは、合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸などの組換え又は合成分子でもあり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コグリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー又はポリホスファジンであるポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩又はアルファヘリックスペプチドが挙げられる。
【０１８３】
リガンドは、標的化基、例えば細胞又は組織標的化剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質、例えば腎臓細胞などの特定の細胞型に結合する抗体も含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパレート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン又はＲＧＤペプチド若しくはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えば、アクリジン及び置換アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン、フェナントロリン、ピレン）、ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｌｙｓトリペプチド、アミノグリコシド、グアニジウムアミノグリコシド、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えばコレステロール（及びそのチオ類似体）、コール酸、コラン酸、リトコール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、グリセロール（例えば、エステル（例えば、モノ、ビス又はトリス脂肪酸エステル、例えばＣ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９又はＣ２０脂肪酸）及びそのエーテル、例えばＣ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９又はＣ２０アルキル；例えば、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、１，３−ビス−Ｏ（オクタデシル）グリセロール）、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ステアリン酸（例えば、グリセリルジステアリン酸）、オレイン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル又はフェノキサジン）及びペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ナプロキセン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環状分子のＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ又はＡＰが挙げられる。
【０１８４】
リガンドは、タンパク質、例えば糖タンパク質又はペプチド、例えばコリガンド又は抗体、例えば癌細胞、内皮細胞又は骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体に対して特異的な親和性を有する分子であり得る。リガンドは、ホルモン及びホルモン受容体も含み得る。それらは、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、コファクター、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース又は多価フコースなどの非ペプチド性種も含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼの活性化因子又はＮＦ−κＢの活性化因子であり得る。
【０１８５】
リガンドは、細胞へのＲＮＡサイレンシング剤の取込みを、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、例えば細胞の微小管、マイクロフィラメント及び／又は中間径フィラメントを破壊することにより増大させることができる物質、例えば薬物であり得る。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン又はミオセルビンであり得る。リガンドは、例えば、炎症反応を活性化することにより、ＲＮＡサイレンシング剤の細胞への取込みを増大させることができる。そのような効果を有することになる例示的なリガンドは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、インターロイキン−１ベータ又はガンマインターフェロンを含む。
【０１８６】
一態様では、リガンドは、脂質又は脂質系分子である。そのような脂質又は脂質系分子は、通常、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。リガンドに結合するＨＳＡは、標的組織、例えば体の非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分布を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合できる他の分子もリガンドとして使用され得る。例えば、ナプロキセン又はアスピリンが使用され得る。脂質又は脂質系リガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する抵抗性を増大させることができ、（ｂ）標的細胞又は細胞膜への標的化又は輸送を増大させることができ、且つ／又は（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡへの結合を調整するために使用され得る。脂質系リガンドを使用して、標的組織へのコンジュゲートの結合を調節、例えば制御することができる。特定の実施形態では、脂質系リガンドは、ＨＳＡに結合する。しかしながら、ＨＳＡリガンド結合を元に戻すことができないほど親和性が強くないことが望まれる。別の例示的な実施形態では、脂質系リガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか又は決して結合しない。
【０１８７】
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば増殖性細胞によって取り入れられる部分、例えばビタミンである。これらは、例えば、悪性又は非悪性型、例えば癌細胞の望まれない細胞増殖によって特徴付けられる障害を治療するのに特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ及びＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、Ｂビタミン、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール又は癌細胞によって取り入れられる他のビタミン若しくは栄養素が挙げられる。ＨＳＡ及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
【０１８８】
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、典型的にはらせん状細胞透過剤である。ある種の例示的な実施形態では、薬剤は、両親媒性である。例示的な薬剤は、ｔａｔ又はアンテナペディアなどのペプチドである。薬剤がペプチドである場合、それは、修飾され得、ペプチド模倣体、逆転異性体、非ペプチド又はプソイドペプチド結合及びＤ−アミノ酸の使用を含む。らせん状薬剤は、通常、典型的には親油性面及び疎油性面を有するアルファヘリックス薬剤である。
【０１８９】
リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書でオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然のペプチドと同様に既定の三次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチド及びペプチド模倣体のオリゴヌクレオチド剤への結合は、細胞認識及び吸収を高めることによってなど、ＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチド又はペプチド模倣体部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０アミノ酸長であり得る。ペプチド又はペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド又は疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、規制ペプチド又は架橋ペプチドであり得る。ペプチド部分は、Ｌーペプチド又はＤ−ペプチドであり得る。別の選択肢において、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。ペプチド又はペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー又はｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリー（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４，１９９１）から同定されるペプチドなど、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る。例示的な実施形態では、組み込まれた単量体単位を介してＲＮＡサイレンシング剤に繋ぎ止められたペプチド又はペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド又はＲＧＤ模倣物などの細胞標的化ペプチドである。ペプチド部分は、約５アミノ酸から約４０アミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、例えば、安定性を増大させるか又は立体構造特性を誘導する構造修飾を有し得る。下記の構造修飾のいずれかが利用され得る。
【０１９０】
６）疎水性部分
本明細書で提供される二重鎖ＲＮＡのある種の実施形態では、ＲＮＡ分子は、１つ以上の疎水性部分にコンジュゲートされる（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／０３１９３３号パンフレットを参照されたい）。ある実施形態では、疎水性部分は、低密度リポタンパク質及び／又は中間密度リポタンパク質に対する親和性を有する。関連する実施形態では、疎水性部分は、３個未満の二重結合を有する飽和又は不飽和部分である。
【０１９１】
別の実施形態では、疎水性部分は、高密度リポタンパク質に対する親和性を有する。関連する実施形態では、疎水性部分は、３個以上の二重結合を有する（例えば、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の二重結合を有する）多価不飽和部分である。特定の実施形態では、疎水性部分は、３個の二重結合を有する多価不飽和部分である。特定の実施形態では、疎水性部分は、４個の二重結合を有する多価不飽和部分である。特定の実施形態では、疎水性部分は、５個の二重結合を有する多価不飽和部分である。特定の実施形態では、疎水性部分は、６個の二重結合を有する多価不飽和部分である。
【０１９２】
別の実施形態では、疎水性部分は、脂肪酸、ステロイド、セコステロイド、脂質、ガングリオシド及びヌクレオシド類似体並びにエンドカンナビノイドからなる群から選択される。
【０１９３】
別の実施形態では、疎水性部分は、神経調節性脂質、例えばエンドカンナビノイドである。エンドカンナビノイドの非限定的な例としては、アナンダミド、アラキドノイルエタノールアミン、２−アラキドノイルグリセリルエーテル（ノラジンエーテル）、２−アラキドノイルグリセリルエーテル（ノラジンエーテル）、２−アラキドノイルグリセロール及びＮ−アラキドノイルドーパミンが挙げられる。
【０１９４】
別の実施形態では、疎水性部分は、オメガ−３脂肪酸である。オメガ−３脂肪酸の非限定的な例としては、ヘキサデカトリエン酸（ＨＴＡ）、アルファ−リノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、ティムノドン酸）、ヘネイコサペンタエン酸（ＨＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、イワシ酸）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、セルボン酸）、テトラコサペンタエン酸及びテトラコサヘキサエン酸（ニシン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９５】
別の実施形態では、疎水性部分は、オメガ−６脂肪酸である。オメガ−６脂肪酸の非限定的な例としては、リノール酸、ガンマ−リノール酸（ＧＬＡ）、エイコサジエン酸、ジホモ−ガンマ−リノール酸（ＤＧＬＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸（オズボンド酸）、テトラコサテトラエン酸及びテトラコサペンタエン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９６】
別の実施形態では、疎水性部分は、オメガ−９脂肪酸である。オメガ−９脂肪酸の非限定的な例としては、オレイン酸、エイコセン酸、ミード酸、エルカ酸及びネルヴォン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９７】
別の実施形態では、疎水性部分は、コンジュゲートされたリノレン酸である。コンジュゲートされたリノレン酸の非限定的な例としては、α−カレンジン酸、β−カレンジン酸、ジャカル酸、α−エレオステアリン酸、β−エレオステアリン酸、カタルプ酸及びプニカ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９８】
別の実施形態では、疎水性部分は、飽和脂肪酸である。飽和脂肪酸の非限定的な例としては、カプリル酸、カプリン酸、ドコサン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸及びセロチン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９９】
別の実施形態では、疎水性部分は、ルメレン酸、α−パリナリン酸、β−パリナリン酸、ボセオペンタエン酸、ピノレン酸及びポドカルプ酸からなる群から選択される酸である。
【０２００】
別の実施形態では、疎水性部分は、ドコサン酸（ＤＣＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、疎水性部分は、ドコサン酸（ＤＣＡ）である。別の特定の実施形態では、疎水性部分は、ＤＨＡである。別の特定の実施形態では、疎水性部分は、ＥＰＡである。
【０２０１】
別の実施形態では、疎水性部分は、セコステロイドである。特定の実施形態では、疎水性部分は、カルシフェロールである。別の実施形態では、疎水性部分は、コレステロール以外のステロイドである。
【０２０２】
特定の実施形態では、疎水性部分は、コレステロールではない。
【０２０３】
別の実施形態では、疎水性部分は、アルキル鎖、ビタミン、ペプチド又は生理活性コンジュゲートであり、スフィンゴ糖脂質、多価不飽和脂肪酸、セコステロイド、ステロイドホルモン又はステロール脂質を含むが、これらに限定されない。
【０２０４】
ある実施形態では、本明細書で提供される二重鎖ＲＮＡは、１つ以上の化学修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、二重鎖ＲＮＡは、２’−メトキシ−ヌクレオチド及び２’−フルオロ−ヌクレオチドを交互に含む。別の特定の実施形態では、二重鎖ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結される。本明細書で開示されるｄｓＲＮＡのある種の実施形態では、ミスマッチヌクレオチド及びミスマッチヌクレオチドに隣接するヌクレオチドは、２’−メトキシ−リボヌクレオチドである。
【０２０５】
別の特定の実施形態では、本明細書で提供される二重鎖ＲＮＡの３’末端から１及び２位にあるヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結される。さらに別の特定の実施形態では、二重鎖ＲＮＡの３’末端から１及び２位にあるヌクレオチド並びに二重鎖ＲＮＡの５’末端から１及び２位にあるヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結される。
【０２０６】
二重鎖ＲＮＡの一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１６個の連続したヌクレオチド、５’末端、３’末端を含み、標的と相補性を有し、
（１）第１のオリゴヌクレオチドは、２’−メトキシ−ヌクレオチド及び２’−フルオロ−ヌクレオチドを交互に含み；
（２）５’末端から２及び１４位にあるヌクレオチドは、２’−メトキシ−ヌクレオチドではなく；
（３）ヌクレオチドは、ホスホジエステル又はホスホロチオエート結合を介して連結され；及び
（４）３’末端から１〜６位又は３’末端から１〜７位にあるヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結される。
【０２０７】
７）高度な安定化パターン
本明細書で提供される二重鎖ＲＮＡの一実施形態では、
（１）第１のオリゴヌクレオチドは、２’−メトキシ−リボヌクレオチド及び２’−フルオロ−リボヌクレオチドを交互に含み、各ヌクレオチドは、２’−メトキシ−リボヌクレオチド又は２’−フルオロ−リボヌクレオチドであり；且つ第１のオリゴヌクレオチドの５’末端から２及び１４位にあるヌクレオチドは、２’−メトキシ−リボヌクレオチドではなく；
（２）第２のオリゴヌクレオチドは、２’−メトキシ−リボヌクレオチド及び２’−フルオロ−リボヌクレオチドを交互に含み、各ヌクレオチドは、２’−メトキシ−リボヌクレオチド又は２’−フルオロ−リボヌクレオチドであり；且つ第２のオリゴヌクレオチドの５’末端から２及び１４位にあるヌクレオチドは、２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり；
（３）第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホジエステル又はホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結され、３’末端から１〜６位又は３’末端から１〜７位にあるヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結され；及び
（４）第２のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホジエステル又はホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結され、３’末端から１及び２位にあるヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結される。
【０２０８】
二重鎖ＲＮＡの一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドより３〜７個多いリボヌクレオチドを有する。
【０２０９】
一実施形態では、二重鎖ＲＮＡは、１１〜１６塩基対二本鎖を含み、各塩基対二本鎖のヌクレオチドは、異なる化学修飾を有する（例えば、１つのヌクレオチドは、２’−フルオロ修飾を有し、及び他のヌクレオチドは、２’−メトキシを有する）。
【０２１０】
二重鎖ＲＮＡの一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドより３〜７個多いリボヌクレオチドを有する。別の実施形態において。
【０２１１】
一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖であり、第２のオリゴヌクレオチドは、センス鎖である。参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／１６１３８８号パンフレットを参照されたい。
【０２１２】
一実施形態では、第１又は第２のオリゴヌクレオチドは、以下の式：
【化２２】
2021533762.tif 000023
を有する１つ以上のＶＰサブユニット間修飾を含む。
【０２１３】
８）分岐オリゴヌクレオチド
上で開示されるとおりの２つ以上のＲＮＡサイレンシング剤、例えばｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドコンストラクトは、リンカー、スペーサー及び分岐点から独立して選択される１つ以上の部分によって互いに連結されて、２つ以上のＲＮＡサイレンシング剤を含有する分岐オリゴヌクレオチドを形成し得る。図３１は、２つのｓｉＲＮＡを送達するための例示的なジ−ｓｉＲＮＡ二分岐骨格を示す。代表的な実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドの核酸は、それぞれアンチセンス鎖（又はその部分）を含み、アンチセンス鎖は、ヘテロ接合型一塩基多型に対する十分な相補性を有して、ＲＮＡに媒介されるサイレンシング機構（例えば、ＲＮＡｉ）を媒介する。他の実施形態では、アンチセンス転写物をサイレンシングするためのセンス鎖（又はその部分）を含む核酸を特徴とする分岐オリゴヌクレオチドの第２の型が提供され、センス鎖は、アンチセンス転写物に対する十分な相補性を有して、ＲＮＡに媒介されるサイレンシング機構を媒介する。さらなる実施形態では、両方の型の核酸、すなわちアンチセンス鎖（又はその部分）及びセンス鎖（又はその部分）を含むオリゴヌクレオチドを含む核酸を含む分岐オリゴヌクレオチドの第３の型が提供される。
【０２１４】
例示的な実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドは、リンカーを通して結合された２〜８個のＲＮＡサイレンシング剤を有し得る。リンカーは、疎水性であり得る。特定の実施形態では、本出願の分岐オリゴヌクレオチドは、２〜３個のオリゴヌクレオチドを有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、独立して、実質的な化学的安定化を有する（例えば、成分塩基の少なくとも４０％が化学的に修飾される）。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、完全な化学的安定化を有する（すなわち成分塩基の全てが化学的に修飾される）。いくつかの実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドは、それぞれ独立して２〜２０個のヌクレオチドを有する１つ以上の一本鎖ホスホロチオエートテールを含む。特定の実施形態では、各一本鎖テールは、８〜１０個のヌクレオチドを有する。
【０２１５】
ある種の実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドは、３つの特性によって特徴付けられる：（１）分岐構造、（２）完全な代謝安定化、及び（３）ホスホロチオエートリンカーを含む一本鎖テールの存在。特定の実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドは、２又は３つの分岐を有する。分岐構造の全体的なサイズの増大は、取込みの増加を促進すると考えられる。また、活性の特定の理論に束縛されることなく、複数の隣接する分岐（例えば、２又は３）は、各分岐に協同的に作用させ、したがって内部移行、輸送及び放出の速度を劇的に高めることができると考えられる。
【０２１６】
分岐オリゴヌクレオチドは、様々な構造的に多様な実施形態において提供される。図３６に示されるとおり、例えばいくつかの実施形態では、分岐点で結合された核酸は、一本鎖であり、且つｍｉＲＮＡ阻害剤、ギャップマー、ミックスマー、ＳＳＯ、ＰＭＯ又はＰＮＡからなる。これらの一本鎖は、それらの３’又は５’末端で結合され得る。ｓｉＲＮＡ及び一本鎖オリゴヌクレオチドの組合せも二重の機能のために使用され得る。別の実施形態では、ギャップマー、ミックスマー、ｍｉＲＮＡ阻害剤、ＳＳＯ、ＰＭＯ及びＰＮＡと相補的な短い核酸は、これらの活性一本鎖核酸を運び、且つ分布及び細胞内部移行を高めるために使用される。短い二本鎖領域は、分岐構造の細胞への内部移行時の迅速な解離のために低い融解温度（Ｔｍ  約３７℃）を有する。
【０２１７】
図３７に示されるとおり、ジ−ｓｉＲＮＡ分岐オリゴヌクレオチドは、化学的に多様なコンジュゲートを含み得る。コンジュゲートされた生理活性リガンドは、細胞特異性を高め、且つ膜会合、内部移行及び血清タンパク質結合を促進するために使用され得る。コンジュゲーションのために使用されることになる生理活性部分の例は、ＤＨＡｇ２、ＤＨＡ、ＧａｌＮＡｃ及びコレステロールを含む。これらの部分は、連結リンカー又はスペーサーのいずれかを通してジ−ｓｉＲＮＡに結合され得るか、又は別の遊離ｓｉＲＮＡ末端に結合された追加のリンカー又はスペーサーを介して付加され得る。
【０２１８】
分岐構造の存在は、同一の化学組成の非分岐化合物と比較して１００倍を超えて脳における組織保持のレベルを改善するが、これは、細胞保持及び分布の新しい機構を示唆している。分岐オリゴヌクレオチドは、予想外にも、脊髄及び脳全体にわたる均一な分布を有する。さらに、分岐オリゴヌクレオチドは、予想外にも、様々な組織への効率的な全身送達及び非常に高いレベルの組織蓄積を呈する。
【０２１９】
分岐オリゴヌクレオチドは、ＡＳＯ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤、スプライススイッチング、ＰＭＯ、ＰＮＡを含む様々な治療用核酸を含む。いくつかの実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドは、コンジュゲートされた疎水性部分をさらに含み、且つインビトロ及びインビボでの前例のないサイレンシング及び効力を呈する。
【０２２０】
リンカー
分岐オリゴヌクレオチドのある実施形態では、各リンカーは、独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミダート、エステル、アミド、トリアゾール及びこれらの組合せから選択され；リンカーのいずれかの炭素又は酸素原子は、任意選択的に、窒素原子と置き換えられるか、ヒドロキシル置換基を有するか、又はオキソ置換基を有する。一実施形態では、各リンカーは、エチレングリコール鎖である。別の実施形態では、各リンカーは、アルキル鎖である。別の実施形態では、各リンカーは、ペプチドである。別の実施形態では、各リンカーは、ＲＮＡである。別の実施形態では、各リンカーは、ＤＮＡである。別の実施形態では、各リンカーは、ホスフェートである。別の実施形態では、各リンカーは、ホスホネートである。別の実施形態では、各リンカーは、ホスホロアミダートである。別の実施形態では、各リンカーは、エステルである。別の実施形態では、各リンカーは、アミドである。別の実施形態では、各リンカーは、トリアゾールである。別の実施形態では、各リンカーは、図３７の式から選択される構造である。
【０２２１】
９）式（Ｉ）の化合物
別の態様において、本明細書では、式（Ｉ）：
Ｌ−（Ｎ）ｎ  （Ｉ）
（式中、Ｌは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミダート、エステル、アミド、トリアゾール及びこれらの組合せから選択され、式（Ｉ）は、任意選択的に、１つ以上の分岐点Ｂ及び１つ以上のスペーサーＳをさらに含み；Ｂは、それぞれの存在に関して独立して、多価有機種又はその誘導体であり；Ｓは、それぞれの存在に関して独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミダート、エステル、アミド、トリアゾール及びこれらの組合せから選択され；Ｎは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡ二本鎖であり、アンチセンス鎖は、アレル多型を含む遺伝子の領域と実質的に相補的な相補性の領域を含み、アンチセンス鎖は、アレル多型と相補的である、５’末端から２〜７位にある一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチド；及び遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置するミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチドを含む）
の分岐オリゴヌクレオチド化合物が提供される。例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２、４又は６位にあり、及びミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置する。
【０２２２】
センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、１つ以上の化学修飾を含み；及びｎは、２、３、４、５、６、７又は８である。
【０２２３】
ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、表１の式（Ｉ−１）〜（Ｉ−９）から選択される構造を有する。
【０２２４】
【表１】
2021533762.tif 000024
【０２２５】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−１）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−２）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−３）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−４）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−５）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−６）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−７）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−８）である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−９）である。
【０２２６】
式（Ｉ）の化合物のある実施形態では、各リンカーは、独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミダート、エステル、アミド、トリアゾール及びこれらの組合せから選択され；リンカーのいずれかの炭素又は酸素原子は、任意選択的に、窒素原子と置き換えられるか、ヒドロキシル置換基を有するか、又はオキソ置換基を有する。式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、各リンカーは、エチレングリコール鎖である。別の実施形態では、各リンカーは、アルキル鎖である。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、ペプチドである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、ＲＮＡである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、ＤＮＡである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、ホスフェートである。別の実施形態では、各リンカーは、ホスホネートである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、ホスホロアミダートである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、エステルである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、アミドである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、トリアゾールである。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、各リンカーは、図３６の式から選択される構造である。
【０２２７】
式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、Ｂは、多価有機種である。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、Ｂは、多価有機種の誘導体である。式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、Ｂは、トリオール又はテトラオール誘導体である。別の実施形態では、Ｂは、トリ−又はテトラ−カルボン酸誘導体である。別の実施形態では、Ｂは、アミン誘導体である。別の実施形態では、Ｂは、トリ−又はテトラ−アミン誘導体である。別の実施形態では、Ｂは、アミノ酸誘導体である。式（Ｉ）の化合物の別の実施形態では、Ｂは、図３８の式から選択される。
【０２２８】
多価有機種は、炭素及び３つ以上の結合価を含む部分（すなわち上で定義されるとおりのＳ、Ｌ又はＮなどの部分との結合点）である。多価有機種の非限定的な例としては、トリオール（例えば、グリセロール、フロログルシノールなど）、テトラオール（例えば、リボース、ペンタエリスリトール、１，２，３，５−テトラヒドロキシベンゼンなど）、トリ−カルボン酸（例えば、クエン酸、１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸、トリメシン酸など）、テトラ−カルボン酸（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸、ピロメリト酸など）、三級アミン（例えば、トリプロパルギルアミン、トリエタノールアミンなど）、トリアミン（例えば、ジエチレントリアミンなど）、テトラミン並びにヒドロキシル、チオール、アミノ及び／又はカルボキシル部分の組合せを含む種（例えば、リジン、セリン、システインなどのアミノ酸）が挙げられる。
【０２２９】
式（Ｉ）の化合物のある実施形態では、各核酸は、１つ以上の化学修飾されたヌクレオチドを含む。式（Ｉ）の化合物のある実施形態では、各核酸は、化学修飾されたヌクレオチドからなる。式（Ｉ）の化合物のある種の実施形態では、各核酸の＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％又は＞５０％は、化学修飾されたヌクレオチドを含む。
【０２３０】
ある実施形態では、各アンチセンス鎖は、独立して、表２の群から選択される５’末端基Ｒを含む。
【０２３１】
【表２】
2021533762.tif 000025
【０２３２】
一実施形態では、Ｒは、Ｒ１である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ２である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ３である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ４である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ５である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ６である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ７である。別の実施形態では、Ｒは、Ｒ８である。
【０２３３】
式（ＩＩ）の構造
ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）：
【化２３】
2021533762.tif 000026
（式中、Ｘは、各存在に関して独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン及びその化学修飾された誘導体から選択され；Ｙは、各存在に関して独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン及びその化学修飾された誘導体から選択され；−は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し；＝は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し；及び−−−は、各存在に関して個別に、塩基対形成相互作用又はミスマッチを表す）
の構造である。
【０２３４】
ある種の実施形態では、式（ＩＩ）の構造は、ミスマッチを含有しない。一実施形態では、式（ＩＩ）の構造は、１個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、２個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、３個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、４個のミスマッチを含有する。ある実施形態では、各核酸は、化学修飾されたヌクレオチドからなる。
【０２３５】
ある種の実施形態では、式（ＩＩ）の構造のＸの＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％又は＞５０％は、化学修飾されたヌクレオチドである。他の実施形態では、式（ＩＩ）の構造のＸの＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％又は＞５０％は、化学修飾されたヌクレオチドである。
【０２３６】
式（ＩＩＩ）の構造
ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩＩ）：
【化２４】
2021533762.tif 000027
（式中、
【化２５】
2021533762.tif 000028
は、各存在に関して独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；Ｘは、各存在に関して独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドであり；
【化２６】
2021533762.tif 000029
は、各存在に関して独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；及びＹは、各存在に関して独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドである）
の構造を有する。
【０２３７】
ある実施形態では、Ｘは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンからなる群から選択される。ある実施形態では、Ｘは、２’−Ｏ−メチル修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンからなる群から選択される。ある実施形態では、Ｙは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンからなる群から選択される。ある実施形態では、Ｙは、２’−Ｏ−メチル修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンからなる群から選択される。
【０２３８】
ある種の実施形態では、式（ＩＩＩ）の構造は、ミスマッチを含有しない。一実施形態では、式（ＩＩＩ）の構造は、１個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、２個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、３個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、４個のミスマッチを含有する。
【０２３９】
式（ＩＶ）の構造
ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＶ）：
【化２７】
2021533762.tif 000030
（式中、Ｘは、各存在に関して独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン及びその化学修飾された誘導体から選択され；Ｙは、各存在に関して独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン及びその化学修飾された誘導体から選択され；−は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し；＝は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し；及び−−−は、各存在に関して個別に、塩基対形成相互作用又はミスマッチを表す）
の構造を有する。
【０２４０】
ある種の実施形態では、式（ＩＶ）の構造は、ミスマッチを含有しない。一実施形態では、式（ＩＶ）の構造は、１個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、２個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、３個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、４個のミスマッチを含有する。ある実施形態では、各核酸は、化学修飾されたヌクレオチドからなる。
【０２４１】
ある種の実施形態では、式（ＩＩ）の構造のＸの＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％又は＞５０％は、化学修飾されたヌクレオチドである。他の実施形態では、式（ＩＩ）の構造のＸの＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％又は＞５０％は、化学修飾されたヌクレオチドである。
【０２４２】
式（Ｖ）の構造
ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｖ）：
【化２８】
2021533762.tif 000031
（式中、
【化２９】
2021533762.tif 000032
は、各存在に関して独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；Ｘは、各存在に関して独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドであり；
【化３０】
2021533762.tif 000033
は、各存在に関して独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；及びＹは、各存在に関して独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドである）
の構造を有する。
【０２４３】
ある種の実施形態では、Ｘは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンからなる群から選択される。ある実施形態では、Ｘは、２’−Ｏ−メチル修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンからなる群から選択される。ある実施形態では、Ｙは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンからなる群から選択される。ある実施形態では、Ｙは、２’−Ｏ−メチル修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンからなる群から選択される。
【０２４４】
ある種の実施形態では、式（Ｖ）の構造は、ミスマッチを含有しない。一実施形態では、式（Ｖ）の構造は、１個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、２個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、３個のミスマッチを含有する。別の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、４個のミスマッチを含有する。
【０２４５】
可変リンカー
式（Ｉ）の化合物のある実施形態では、Ｌは、Ｌ１：
【化３１】
2021533762.tif 000034
の構造を有する。
【０２４６】
Ｌ１のある実施形態では、Ｒは、Ｒ３であり、及びｎは、２である。
【０２４７】
式（ＩＩ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。式（ＩＩＩ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。式（ＩＶ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。式（Ｖ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。式（ＶＩ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。式（ＶＩ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。
【０２４８】
式（Ｉ）の化合物のある実施形態では、Ｌは、Ｌ２：
【化３２】
2021533762.tif 000035
の構造を有する。
【０２４９】
Ｌ２のある実施形態では、Ｒは、Ｒ３であり、及びｎは、２である。式（ＩＩ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。式（ＩＩＩ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。式（ＩＶ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。式（Ｖ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。式（ＶＩ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。式（ＶＩ）の構造のある実施形態では、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。
【０２５０】
１０）送達系
さらなる態様では、本明細書では、式（ＶＩ）：
Ｌ−（ｃＮＡ）ｎ  （ＶＩ）
（式中、Ｌは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミダート、エステル、アミド、トリアゾール及びこれらの組合せから選択され、式（ＶＩ）は、任意選択的に、１つ以上の分岐点Ｂ及び１つ以上のスペーサーＳをさらに含み；Ｂは、各存在に関して独立して、多価有機種又はその誘導体であり；Ｓは、各存在に関して独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミダート、エステル、アミド、トリアゾール及びその組合せから選択され；各ｃＮＡは、独立して、１つ以上の化学修飾を含む担体核酸であり；及びｎは、２、３、４、５、６、７又は８である）
の構造を有する治療用核酸のための送達系が提供される。
【０２５１】
送達系の一実施形態では、Ｌは、エチレングリコール鎖である。送達系の別の実施形態では、Ｌは、アルキル鎖である。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ペプチドである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ＲＮＡである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ＤＮＡである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ホスフェートである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ホスホネートである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、ホスホロアミダートである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、エステルである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、アミドである。送達系の別の実施形態では、Ｌは、トリアゾールである。
【０２５２】
送達系の一実施形態では、Ｓは、エチレングリコール鎖である。別の実施形態では、Ｓは、アルキル鎖である。送達系の別の実施形態では、Ｓは、ペプチドである。別の実施形態では、Ｓは、ＲＮＡである。送達系の別の実施形態では、Ｓは、ＤＮＡである。送達系の別の実施形態では、Ｓは、ホスフェートである。送達系の別の実施形態では、Ｓは、ホスホネートである。送達系の別の実施形態では、Ｓは、ホスホロアミダートである。送達系の別の実施形態では、Ｓは、エステルである。別の実施形態では、Ｓは、アミドである。別の実施形態では、Ｓは、トリアゾールである。
【０２５３】
送達系の一実施形態では、ｎは、２である。送達系の別の実施形態では、ｎは、３である。送達系の別の実施形態では、ｎは、４である。送達系の別の実施形態では、ｎは、５である。送達系の別の実施形態では、ｎは、６である。送達系の別の実施形態では、ｎは、７である。送達系の別の実施形態では、ｎは、８である。
【０２５４】
ある種の実施形態では、各ｃＮＡは、＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％又は＞５０％の化学修飾されたヌクレオチドを含む。
【０２５５】
ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、表３の式（ＶＩ−１）〜（ＶＩ−９）から選択される構造を有する。
【０２５６】
【表３】
2021533762.tif 000036
【０２５７】
ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−１）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−２）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−３）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−４）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−５）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−６）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−７）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−８）の構造である。ある実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−９）の構造である。
【０２５８】
ある実施形態では、式（ＶＩ）（例えば、式（ＶＩ−１）〜（ＶＩ−９）を含む）の化合物、各ｃＮＡは、独立して、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施形態では、各ｃＮＡは、独立して、化学修飾されたヌクレオチドからなる。
【０２５９】
ある実施形態では、送達系は、ｎ個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含み、各ＮＡは、アレル多型を含む遺伝子の領域と実質的に相補的な相補性の領域を含み、アンチセンス鎖は、アレル多型と相補的である、５’末端から２〜７位にある一塩基多型（ＳＮＰ）位置ヌクレオチド；及び遺伝子中のヌクレオチドとミスマッチである、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜１１ヌクレオチドに位置するミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチドを含む。例示的な実施形態では、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２、４又は６位にあり、及びミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２〜６ヌクレオチドに位置する。また、各ＮＡは、少なくとも１つのｃＮＡにハイブリダイズされる。一実施形態では、送達系は、２個のＮＡで構成される。別の実施形態では、送達系は、３個のＮＡで構成される。別の実施形態では、送達系は、４個のＮＡで構成される。別の実施形態では、送達系は、５個のＮＡで構成される。別の実施形態では、送達系は、６個のＮＡで構成される。別の実施形態では、送達系は、７個のＮＡで構成される。別の実施形態では、送達系は、８個のＮＡで構成される。
【０２６０】
ある実施形態では、各ＮＡは、独立して、少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施形態では、各ＮＡは、独立して、１６〜２０個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施形態では、各ＮＡは、独立して、１６個の連続したヌクレオチドを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、１７個の連続したヌクレオチドを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、１８個の連続したヌクレオチドを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、１９個の連続したヌクレオチドを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、２０個の連続したヌクレオチドを含む。
【０２６１】
ある実施形態では、各ＮＡは、少なくとも２個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、少なくとも３個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、少なくとも４個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、少なくとも５個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。別の実施形態では、各ＮＡは、少なくとも６個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。ある実施形態では、オーバーハングのヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して連結される。
【０２６２】
ある実施形態では、各ＮＡは、独立して、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ、ギャップマー、ミックスマー又はガイドＲＮＡからなる群から選択される。一実施形態では、各ＮＡは、独立して、ＤＮＡである。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、アンタゴｍｉＲである。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、ｍｉＲＮＡである。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、ギャップマーである。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、ミックスマーである。別の実施形態では、各ＮＡは、独立して、ガイドＲＮＡである。ある実施形態では、各ＮＡは、同じである。ある実施形態では、各ＮＡは、同じではない。
【０２６３】
ある実施形態では、ｎ個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む送達系は、本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）及びその実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、２個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）及びその実施形態から選択される構造を有する。別の実施形態では、送達系は、３個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）及びその実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、４個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）及びその実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、５個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）及びその実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、６個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）及びその実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、７個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）及びその実施形態から選択される構造を有する。一実施形態では、送達系は、８個の治療用核酸（ＮＡ）をさらに含む、本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）及びその実施形態から選択される構造を有する。
【０２６４】
一実施形態では、送達系は、構造Ｌ１又はＬ２のリンカーをさらに含む式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）から選択される構造を有し、Ｒは、Ｒ３であり、及びｎは、２である。別の実施形態では、送達系は、構造Ｌ１のリンカーをさらに含む式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）から選択される構造を有し、Ｒは、Ｒ３であり、及びｎは、２である。別の実施形態では、送達系は、構造Ｌ２のリンカーをさらに含む式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）から選択される構造を有し、Ｒは、Ｒ３であり、及びｎは、２である。
【０２６５】
医薬組成物及び投与の方法
一態様において、本明細書では、治療有効量の、本明細書に記載されるとおりの１つ以上の化合物、オリゴヌクレオチド又は核酸及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されるとおりの１つ以上の二重鎖の化学修飾された核酸及び薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されるとおりの１つの二重鎖の化学修飾された核酸及び薬学的に許容される担体を含む。別の特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されるとおりの２つの二重鎖の化学修飾された核酸及び薬学的に許容される担体を含む。
【０２６６】
特定の実施形態では、医薬組成物は、ヘテロ接合型ＳＮＰ変異体タンパク質をコードする遺伝子の領域であって、アレル多型を含む前記領域と相補的な約１５〜３５個のヌクレオチドを含む二重鎖ＲＮＡ分子及び第１の鎖と相補的な約１５〜３５個のヌクレオチドを含む第２の鎖を含み、ｄｓＲＮＡ分子は、アレル多型の位置にないミスマッチ；及びｄｓＲＮＡ分子の中心にない多型に対応するミスマッチ及びヌクレオチドを含む。
【０２６７】
ある実施形態では、ミスマッチは、アレル多型に対応するヌクレオチドの４ヌクレオチド上流、３ヌクレオチド上流、アレル多型に対応するヌクレオチドの２ヌクレオチド上流、アレル多型に対応するヌクレオチドの１ヌクレオチド上流、１ヌクレオチド下流、アレル多型に対応するヌクレオチドの２ヌクレオチド下流、アレル多型に対応するヌクレオチドの３ヌクレオチド下流、アレル多型に対応するヌクレオチドの４ヌクレオチド下流又はアレル多型に対応するヌクレオチドの５ヌクレオチド下流である。ある種の実施形態では、ミスマッチは、アレル多型に対応するヌクレオチドに隣接しない。
【０２６８】
医薬組成物の別の実施形態では、二重鎖ＲＮＡは、５’末端から２、３、４、５又は６位にあるアレル多型に対応するヌクレオチドを含む。ある実施形態では、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から２位にある。ある実施形態では、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から３位にある。ある実施形態では、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から４位にある。ある実施形態では、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から５位にある。ある実施形態では、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から６位にある。
【０２６９】
医薬組成物のある実施形態では、二重鎖ＲＮＡは、アレル多型、例えばヘテロ接合型ＳＮＰを有する変異体アレルを選択的にサイレンシングする。医薬組成物のある実施形態では、二重鎖ＲＮＡは、アレル多型を有する変異体アレルをサイレンシングし、同じ遺伝子の野生型アレルに影響を及ぼさない。医薬組成物の別の実施形態では、本明細書で提供される二重鎖ＲＮＡは、アレル多型を有する変異体アレルをサイレンシングし、変異体アレルより低い程度まで同じ遺伝子の野生型アレルをサイレンシングする。
【０２７０】
本発明の医薬組成物は、その目的の投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内（ＩＶ）、皮内、皮下（ＳＣ又はＳＱ）、腹腔内、筋肉内、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）及び経粘膜投与が挙げられる。非経口、皮内又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などの緩衝液及び塩化ナトリウム又はブドウ糖などの浸透圧の調整用薬剤を含み得る。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整され得る。非経口製剤は、アンプル、ディスポーザブルシリンジ又はガラス若しくはプラスチック製の複数回投与バイアル内に封入され得る。
【０２７１】
注射用途に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散体及び注射用滅菌溶液又は分散体の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与のために好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合、組成物は、無菌でなければならず、また容易に注射できる程度の流体でなければならない。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコールなど）及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散体の場合に必要とされる粒径の維持及び界面活性剤の使用により維持され得る。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張化剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを含むことが望ましいであろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含むことによりもたらされ得る。
【０２７２】
注射用滅菌溶液は、必要に応じて上に列挙された成分の１つ又は組合せによる適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、その後、滅菌濾過を施すことによって調製され得る。一般に、分散体は、塩基性分散媒体及び上に列挙されたものに由来する必要な他の成分を含有する無菌溶媒に活性化合物を組み込むことにより調製される。注射用滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、典型的な調製方法は、活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末を、予め滅菌濾過されたそれらの溶液から生成する真空乾燥及びフリーズドライである。
【０２７３】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトで使用するための投与量の範囲を構築する際に使用され得る。そのような化合物の投与量は、通常、毒性がほとんど又は全くなく、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあるべきである。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。本発明の方法で使用される任意の化合物のために、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから概算することができる。用量は、細胞培養で決定されるとおりのＥＣ５０（すなわち最大半量の応答を達成する試験化合物の濃度）を含む循環する血漿中の濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて構築され得る。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【０２７４】
治療方法
本発明は、アレル多型（例えば、ヘテロ接合型ＳＮＰ）によって全体的に又は部分的に引き起こされる疾患又は障害のリスクのある（又はそれになりやすい）対象を治療する予防的且つ治療的方法の両方を提供する。一実施形態では、疾患又は障害は、トリヌクレオチドリピート疾患又は障害である。別の実施形態では、疾患又は障害は、ポリグルタミン障害である。ある実施形態では、方法は、治療有効量の、本明細書で提供される二重鎖ＲＮＡ分子を投与することを含む。ある実施形態では、疾患又は障害は、ハンチンチンの発現と関連する障害であり、且つハンチンチンの改変、特にＣＡＧリピートのコピー数の増幅がハンチンチン遺伝子（構造又は機能）又はハンチンチンタンパク質（構造又は機能又は発現）の欠損をもたらし、その結果、臨床症状は、ハンチントン病患者に見られるものを含む。
【０２７５】
方法の実施形態では、本明細書で開示される二重鎖ＲＮＡは、アレル多型に対応するヌクレオチドに対する特定の位置での１つのミスマッチオリゴヌクレオチドを除いて、アレル多型に対して相同である。ある種の実施形態では、ミスマッチは、アレル多型に対応するヌクレオチドの約６ヌクレオチド以内、アレル多型に対応するヌクレオチドの約５ヌクレオチド以内、アレル多型に対応するヌクレオチドの約４ヌクレオチド以内、アレル多型に対応するヌクレオチドの約３ヌクレオチド以内、アレル多型に対応するヌクレオチドの約２ヌクレオチド以内又はアレル多型に対応するヌクレオチドの約１ヌクレオチド以内にある。特定の例示的な実施形態では、ミスマッチは、アレル多型に対応するヌクレオチドに隣接しない。
【０２７６】
方法の別の実施形態では、二重鎖ＲＮＡは、５’末端から２、３、４、５又は６位にあるアレル多型に対応するヌクレオチドを含む。ある実施形態では、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から２位にある。ある実施形態では、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から３位にある。ある実施形態では、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から４位にある。ある実施形態では、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から５位にある。ある実施形態では、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から６位にある。
【０２７７】
方法のある実施形態では、ｄｓＲＮＡは、５’末端から６位にある多型に対応するヌクレオチド及び５’末端から１１位にあるミスマッチを含む。方法のある実施形態では、ｄｓＲＮＡは、５’末端から４位にある多型に対応するヌクレオチド及び５’末端から７位にあるミスマッチを含む。
【０２７８】
方法の別の実施形態では、二重鎖ＲＮＡは、アレル多型を有する変異体アレルを選択的にサイレンシングする。ある実施形態では、二重鎖ＲＮＡは、アレル多型を有する変異体アレルをサイレンシングし、同じ遺伝子の野生型アレルに影響を及ぼさない。別の実施形態では、二重鎖ＲＮＡは、アレル多型を有する変異体アレルをサイレンシングし、変異体アレルより低い程度まで同じ遺伝子の野生型アレルをサイレンシングする。
【０２７９】
方法のある実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のＶＰサブユニット間結合修飾を含み、サブユニット間結合は、以下の式：
【化３３】
2021533762.tif 000037
を有する。
【０２８０】
追加の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、図４３に示されるサブユニット間結合修飾の１つ以上を含む。
【０２８１】
本明細書で使用する場合、「治療」又は「治療すること」は、疾患若しくは障害、疾患若しくは障害の症状又は疾患に対する素因を治癒させるか、治すか、軽減するか、緩和するか、変化させるか、矯正するか、寛解させるか、改善するか又は影響を及ぼすための、患者への治療剤（例えば、ＲＮＡ剤又はベクター又はそれをコードする導入遺伝子）の適用又は投与或いは疾患若しくは障害、疾患若しくは障害の症状又は疾患若しくは障害に対する素因を有する患者に由来する単離された組織又は細胞株への治療剤の適用又は投与として定義される。
【０２８２】
一態様では、本発明は、対象において、上記のとおりの疾患又は障害を、対象に治療剤（例えば、ＲＮＡｉ剤又はベクター又はそれをコードする導入遺伝子）を投与することによって予防するための方法を提供する。疾患のリスクのある対象は、例えば、本明細書に記載されるとおりの診断又は予後アッセイのいずれか又は組合せによって同定され得る。予防剤の投与は、疾患又は障害の症状の特徴の顕在化前に行うことができ、その結果、疾患又は障害が予防されるか、又は代わりにその進行が遅延される。
【０２８３】
本発明の別の態様は、対象を治療的に治療する方法に関し、すなわち疾患又は障害の症状の発症を変化させる。例示的な実施形態では、本発明の調節的な方法は、機能獲得変異体を発現する細胞を、遺伝子内の１つ以上の標的配列に特異的な治療剤（例えば、ＲＮＡｉ剤又はベクター又はそれをコードする導入遺伝子）と接触させることを含み、その結果、遺伝子による配列特異的な干渉が果たされる。これらの方法は、インビトロで（例えば、細胞を薬剤とともに培養することによって）又は代わりにインビボで（例えば、対象に薬剤を投与することによって）実施され得る。
【０２８４】
神経細胞への取込みの増強のために修飾されたＲＮＡサイレンシング剤は、体重１ｋｇ当たり約１．４ｍｇ未満又は体重１ｋｇ当たり１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５若しくは０．００００１ｍｇ未満及び体重１ｋｇ当たり２００ｎｍｏｌｅ未満のＲＮＡ剤（例えば、約４．４×１０１６コピー）又は体重１ｋｇ当たり１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５若しくは０．０００１５ｎｍｏｌｅ未満のＲＮＡサイレンシング剤の単位用量で投与され得る。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内又は筋肉内、髄腔内又は脳への直接的な）、吸入投与又は局所適用によって投与され得る。例示的な実施形態では、投与量は、２、１又は０．１ｍｇ／体重のｋｇ未満である。
【０２８５】
ＲＮＡサイレンシング剤の器官への直接的な（例えば、脳への直接的な）送達は、１器官当たり約０．００００１ｍｇ〜約３ｍｇ又は１器官当たり約０．０００１〜０．００１ｍｇ、１器官当たり約０．０３〜３．０ｍｇ、１器官当たり約０．１〜３．０ｍｇ若しくは１器官当たり約０．３〜３．０ｍｇの程度の投与量であり得る。投与量は、神経疾患又は障害（例えば、ハンチントン病）を治療又は予防するのに有効な量であり得る。一実施形態では、単位用量は、１日１回よりも少ない頻度、例えば２日、４日、８日又は３０日毎より少ない頻度で投与される。別の実施形態では、単位用量は、ある頻度で投与されない（例えば、規則的な頻度ではない）。例えば、単位用量は、１回投与され得る。一実施形態では、有効用量は、他の従来の治療モダリティーとともに投与される。
【０２８６】
一実施形態では、対象は、初回用量及び１回以上の維持用量のＲＮＡサイレンシング剤を投与される。維持用量は、一般に、初回用量未満、例えば初回用量の２分の１未満である。維持レジメンは、１日当たり０．０１μｇ〜１．４ｍｇ／体重のｋｇの範囲の用量、例えば１日当たり体重の１ｋｇ当たり１０、１、０．１、０．０１、０．００１又は０．００００１ｍｇで対象を治療することを含み得る。維持用量は、通常、５、１０又は３０日毎に１回以下投与される。さらに、治療レジメンは、特定の疾患、その重症度及び患者の全体的な状態の性質に依存して変動することになる期間にわたって続き得る。特定の実施形態では、投与量は、１日当たり１回以下、例えば２４、３６又は４８時間以上当たり１回以下、例えば５又は８日毎に１回以下送達され得る。治療後、患者は、患者の状態の変化及び病状の症状の軽減ついてモニターされ得る。化合物の投与量は、患者が目下の投与量レベルに著しく応答しない場合に増加され得るか、又は病状の症状の軽減が観察される場合、病状が切除された場合若しくは望ましくない副作用が観察される場合に用量を減少させ得る。
【０２８７】
ハンチントン病
本発明のある種の態様では、ＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチントン病の治療のために変異体ヒトハンチンチンタンパク質（ｈｔｔ）における多型（例えば、ヘテロ接合型一塩基多型）を標的化するために設計される。したがって、別の態様において、本明細書では、ハンチントン病を治療又は処置する方法であって、そのような治療又は処置を必要とする患者に、治療有効量の、本明細書に記載されるとおりの化合物、オリゴヌクレオチド若しくは核酸又は前記化合物、オリゴヌクレオチド若しくは核酸を含む医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。
【０２８８】
常染色体優性疾患として遺伝されるハンチントン病は、認知障害及び運動疾患を引き起こす。飢餓又は感染症による若年死亡前に、患者は、重度の衰弱を伴って１０年以上生存できる。疾患は、ほとんどの症例では３０代又は４０代で発症するが、一部の患者は１０代で疾患を発症する。ハンチントン病の遺伝的変異は、ハンチンチン遺伝子における伸長したＣＡＧリピートである。ＣＡＧリピートは、正常な個体において８〜３５コピーの数でばらつきがある（Ｋｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。遺伝的変異（例えば、正常なハンチンチン遺伝子における３６個未満から疾患における３６個超へのＣＡＧリピートの長さの増大）は、３６個を超える連続したポリグルタミン残基を有する変異体ハンチンチンタンパク質の合成と関連する（Ａｒｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。一般に、３６以上のＣＡＧリピートを有する個体は、ハンチントン病に罹ることになる。根底にある変異として伸長したＣＡＧを有する２０もの他の疾患の原型となっているハンチントン病は、依然として有効な療法がない。様々な介入（アポトーシス経路の妨害、ミトコンドリア効率をブーストする試薬の添加及びＮＭＤＡ受容体の遮断など）がハンチントン病の細胞培養及びマウスモデルにおいて有望であることが示されている。しかしながら、最良でも、これらの手法は、細胞又は動物の生存時間の短い延長を示す。
【０２８９】
ハンチントン病につながる疾患遺伝子は、ハンチンチン又は（ｈｔｔ）と呼ばれる。ハンチンチン座位は、１８０ｋｂの広い範囲に及び、６７個のエクソンからなる。ハンチンチン遺伝子は、広範に発現され、正常な発生に必要となる。それは、様々な胎児及び成体組織において異なる相対的存在量を示す２種類の選択的にポリアデニル化された形態として発現される。大きい方の転写物は、およそ１３．７ｋｂであり、主に成体及び胎児の脳において発現される一方、およそ１０．３ｋｂの小さい方の転写物は、より広範に発現される。２種類の転写物は、それらの３’非翻訳領域に関して異なる（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。両方のメッセージは、３１４４アミノ酸を含有する３４８キロダルトンのタンパク質をコードすると予測される。ハンチントン病を引き起こす遺伝的異常は、ｍＲＮＡに対して新たな特性を付与するか又はタンパク質の機能を改変すると考えられる。
【０２９０】
ハンチントン病は、遺伝学のセントラルドグマに従う：変異体遺伝子は、変異体ｍＲＮＡの産生のための鋳型として機能し；次に、変異体ｍＲＮＡは、変異体タンパク質の合成を誘導する（Ａｒｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；ＤｉＦｉｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。変異体ハンチンチン（タンパク質）は、線条体及び皮質中の選択性ニューロンにおいて蓄積し、未決定の細胞活性を妨害し、且つ神経細胞の機能障害及び死を引き起こす可能性がある（Ａｒｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｌａｆｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。変異体遺伝子の単一コピーが、ハンチントン病を引き起こすのに十分であるため、最も簡潔な治療は、変異体遺伝子を無効にするであろう。理論的な手法は、変異体ハンチンチンの遺伝子転写を止めること、変異体ｍＲＮＡを破壊すること及び翻訳を遮断することを含み得る。各々は、変異体ハンチンチンの消失という同じ帰結を有する。
【０２９１】
ハンチントンＳＮＰ
ある種の例示的な実施形態に従って標的化するのに好適なハンチンチン遺伝子配列における例示的なＳＮＰは、下の表４に開示される。各ＳＮＰ部位に関するゲノム配列は、例えば、ＮＣＢＩによって維持される公的に利用可能な「ＳＮＰ  Ｅｎｔｒｅｚ」データベースにおいて見出すことができる。ＨＤ患者に関する各ＳＮＰ部位についてのヘテロ接合性の頻度及び対照ＤＮＡは、表４においてさらに示される。頻度の高いヘテロ接合型ＳＮＰの組合せを標的化することにより、比較的少ない数のアレル特異的ＲＮＡサイレンシング剤を使用して、ＨＤ集団における高い割合の個体の治療が可能になる。
【０２９２】
【表４】
2021533762.tif 000038
【０２９３】
一実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、表４に列挙されるＳＮＰ部位の１つ以上を標的化できる。一実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６３１２５  ＳＮＰ部位を標的化できる。別の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６２２７３  ＳＮＰ部位を標的化できる。別の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６２３０７  ＳＮＰ部位を標的化できる。別の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６２３３６  ＳＮＰ部位を標的化できる。別の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６２３３１  ＳＮＰ部位を標的化できる。別の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６２２７２  ＳＮＰ部位を標的化できる。別の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６２３０６  ＳＮＰ部位を標的化できる。別の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６２２６８  ＳＮＰ部位を標的化できる。別の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６２２６７  ＳＮＰ部位を標的化できる。別の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６３０９９  ＳＮＰ部位を標的化できる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤によって標的化されるＳＮＰ部位は、ハンチントン病と関連する。特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤によって標的化されるＳＮＰ部位は、ハンチントン病と著しく関連する。
【０２９４】
追加の例示的な実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、表５〜７の配列の１つ以上を含む。
【０２９５】
【表５】
2021533762.tif 000039
【０２９６】
【表６】
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【０２９７】
【表７】
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【０２９８】
核酸を送達する方法
本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、細胞（例えば、神経細胞）（すなわち細胞内に）に直接的に導入され得るか；又は生物体の腔、組織間隙、循環へと細胞外に導入され得るか、経口的に導入され得るか、又は核酸を含有する溶液中に細胞又は生物体を浸すことによって導入され得る。血管性又は血管外循環である血液又はリンパ系及び脳脊髄液は、核酸が導入され得る部位である。
【０２９９】
本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、核酸を含有する溶液の注射、核酸によって覆われた粒子による照射、核酸の溶液中での細胞又は生物体の浸漬又は核酸の存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含む、当技術分野で知られる核酸送達方法を使用して導入され得る。脂質に媒介される担体輸送、化学物質に媒介される輸送及びリン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクションなどの核酸を細胞に導入するための、当技術分野において知られる他の方法が使用され得る。核酸は、次の活性：細胞による核酸取込みの増強又は別の方法による標的遺伝子の阻害の増大の１つ以上を発揮する他の成分とともに導入され得る。
【０３００】
核酸を導入する物理的な方法は、ＲＮＡを含有する溶液の注射、ＲＮＡによって覆われた粒子による照射、ＲＮＡの溶液中での細胞又は生物体の浸漬又はＲＮＡの存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含む。ウイルス粒子にパッケージ化されたウイルスコンストラクトは、発現コンストラクトの細胞への効率的な導入及び発現コンストラクトによってコードされるＲＮＡの転写の両方を達成するであろう。脂質に媒介される担体輸送、リン酸カルシウムなどの化学物質ＩＳに媒介される輸送などの核酸を細胞に導入するための、当技術分野において知られる他の方法が使用され得る。したがって、ＲＮＡは、次の活性：細胞によるＲＮＡ取込みの増強、一本鎖のアニーリングの阻害、一本鎖の安定又は別の方法による標的遺伝子の阻害の増大の１つ以上を発揮する成分とともに導入され得る。
【０３０１】
ＲＮＡは、細胞（すなわち細胞内に）に直接的に導入され得るか、又は生物体の腔、組織間隙、循環へと細胞外に導入され得るか、経口的に導入され得るか、又はＲＮＡを含有する溶液中に細胞又は生物体を浸すことによって導入され得る。血管性又は血管外循環である血液又はリンパ系及び脳脊髄液は、ＲＮＡが導入され得る部位である。
【０３０２】
標的遺伝子を有する細胞は、生殖系列又は体細胞、分化全能性又は多能性、分裂又は非分裂、実質又は上皮、不死化又は形質転換したものなどに由来し得る。細胞は、幹細胞又は分化細胞であり得る。分化される細胞型としては、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮、ニューロン、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、角化細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌腺又は外分泌腺の細胞が挙げられる。
【０３０３】
特定の標的遺伝子及び送達される二重鎖ＲＮＡ材料の用量に依存して、このプロセスは、標的遺伝子の機能の部分的喪失又は完全喪失をもたらし得る。標的化される細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上における遺伝子発現の低減又は喪失が典型的である。遺伝子発現の阻害は、標的遺伝子に由来するタンパク質及び／又はｍＲＮＡ産物のレベルの欠如（又は観察可能な減少）を指す。特異性は、細胞の他の遺伝子に対して明らかな影響を及ぼさずに標的遺伝子を阻害する能力を指す。阻害の結果は、細胞又は生物体の外面的な特性の試験（実施例において下に示されるとおり）によって又はＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現のモニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、他のイムノアッセイ、蛍光活性化細胞分析（ＦＡＣＳ）などの生化学的手法によって確認され得る。
【０３０４】
細胞株又は生物体全体におけるＲＮＡ媒介性の阻害に関して、遺伝子発現は、タンパク質産物が容易にアッセイされるレポーター又は薬剤耐性遺伝子の使用によって便利にアッセイされる。そのようなレポーター遺伝子としては、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータグルコロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）及びその誘導体が挙げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン及びテトラサイクリンに対する抵抗性を与える複数の選択マーカーが利用可能である。アッセイに依存して、遺伝子発現の量の定量化により、本発明に従って治療されない細胞と比較して１０％、３３％、５０％、９０％、９５％又は９９％より大きい阻害の程度を決定することが可能になる。注射される材料の用量が少ないほど及びＲＮＡｉ剤の投与後の時間が長いほど、より少ない割合の細胞の阻害がもたらされ得る（例えば、標的化される細胞の少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、９０％又は９５％）。細胞における遺伝子発現の量子化は、標的ｍＲＮＡの蓄積又は標的タンパク質の翻訳のレベルでより少ない量の阻害を示し得る。例として、阻害の効率は、細胞中の遺伝子産物の量を評価することによって決定され得る。ｍＲＮＡは、阻害性二重鎖ＲＮＡのために使用される領域の外部にあるヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブで検出され得るか、又は翻訳されたポリペプチドは、その領域のポリペプチド配列に対して産生された抗体で検出され得る。
【０３０５】
ＲＮＡは、１細胞当たり少なくとも１つのコピーの送達を可能にする量で導入され得る。材料の用量が高いほど（例えば、１細胞当たり少なくとも５、１０、１００、５００又は１０００コピー）、より効率的な阻害をもたらし得；より低い用量も特定の適用のために有用である場合がある。
【０３０６】
特定の態様では、本発明のＲＮＡｉ剤（例えば、変異体遺伝子における多型を標的化するｓｉＲＮＡ）の効力は、細胞、特にニューロン（例えば、線条体又は皮質神経細胞クローン株及び／又は一次ニューロン）における変異体ｍＲＮＡ（例えば、変異体ｈｔｔ  ｍＲＮＡ及び／又は変異体ハンチンチンタンパク質の産生）を特異的に分解するその能力について試験される。他の容易にトランスフェクト可能な細胞、例えばＨｅＬａ細胞又はＣＯＳ細胞も、細胞に基づく検証アッセイに好適である。細胞は、ヒト野生型又は変異体ｃＤＮＡ（例えば、ヒト野生型又は変異体ハンチンチンｃＤＮＡ）でトランスフェクトされる。Ｕ−ループｍＲＮＡからｓｉＲＮＡを生成できる標準的なｓｉＲＮＡ、修飾ｓｉＲＮＡ又はベクターがコトランスフェクトされる。変異体ｍＲＮＡ（例えば、変異体ハンチンチンｍＲＮＡ）及び／又は変異体タンパク質（例えば、変異体ハンチンチン）の選択的な減少が測定される。変異体ｍＲＮＡ又はタンパク質の減少は、正常なｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルと比較され得る。外因的に導入された正常なｍＲＮＡ又はタンパク質（又は内在性の正常なｍＲＮＡ若しくはタンパク質）は、比較目的のためにアッセイされ得る。標準的なトランスフェクション技術に対してある程度抵抗性であることが知られる神経細胞を利用する場合、受動的な取込みによってＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）を導入することが望ましい場合がある。
【０３０７】
ある種の例示的な実施形態では、本発明のＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤を含む組成物は、様々な経路によって対象の神経系に送達され得る。例示的な経路としては、髄腔内、実質部（例えば、脳内）、経鼻及び眼球への送達が挙げられる。組成物は、例えば、静脈内、皮下又は筋肉内注射によっても全身的に送達され得、これは、ＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤の末梢ニューロンへの送達に特に有用である。送達の例示的な経路は、脳、例えば脳の脳室若しくは視床下部への又は脳の側方若しくは背側領域への直接的なものである。神経細胞送達のためのＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤は、投与に好適な医薬組成物に組み込まれ得る。
【０３０８】
例えば、組成物は、ＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤の１つ以上の種及び薬学的に許容される担体を含み得る。本発明の医薬組成物は、局所性又は全身性の治療が所望されるかどうかに依存して且つ治療されることになる領域に依存して、いくつかの様式で投与され得る。投与は、局所的（眼部、鼻腔内、経皮を含む）、経口又は非経口であり得る。非経口投与は、点滴静脈内注射、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射、髄腔内又は脳室内（例えば、側脳室内）投与を含む。ある種の例示的な実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、本明細書に記載される様々な好適な組成物及び方法を使用して、血液脳関門（ＢＢＢ）を通して送達される。
【０３０９】
送達の経路は、患者の障害に依存し得る。例えば、ハンチントン病と診断された対象は、本発明の抗ｈｔｔ  ＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤を脳に（例えば、基底核の淡蒼球又は線条体及び線条体の中型有棘ニューロンの近傍に）直接的に投与され得る。本発明のＲＮＡサイレンシング剤に加えて、患者は、第２の療法、例えば対症療法及び／又は疾患特異的療法を施され得る。第２の療法は、例えば、対症（例えば、症状を軽減するため）、神経保護（例えば、疾患進行を遅らせるか又は止めるため）又は回復性（例えば、疾患プロセスを元に戻すため）であり得る。ハンチントン病の治療のために、例えば、対症療法は、薬物のハロペリドール、カルバマゼピン又はバルプロ酸塩を含み得る。他の療法は、精神療法、理学療法、言語療法、コミュニケーション及び記憶の援助、社会支援サービス及び食餌の助言を含み得る。
【０３１０】
ＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤は、脳の神経細胞に送達され得る。血液脳関門を越える組成物の通過を必要としない送達方法が利用され得る。例えば、ＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤を含有する医薬組成物は、疾患に冒された細胞を含有する領域への直接的な注射によって患者に送達され得る。例えば、医薬組成物は、脳への直接的な注射によって送達され得る。注射は、脳の特定の領域（例えば、黒質、皮質、海馬、線条体又は淡蒼球）への定位的な注射によるものであり得る。ＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤は、中枢神経系の複数の領域（例えば、脳の複数の領域及び／又は脊髄）に送達され得る。ＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤は、脳の拡散した領域に送達され得る（例えば、脳の皮質への拡散した送達）。
【０３１１】
一実施形態では、ＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤は、カニューレ又は組織、例えば脳、例えば脳の黒質、皮質、海馬、線条体若しくは淡蒼球に移植された１つの末端を有する他の送達デバイスの方法によって送達され得る。カニューレは、ＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤のリザーバーに連結され得る。流動又は送達は、ポンプ、例えばＡｌｚｅｔポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）などの浸透圧ポンプ又はミニポンプによって媒介され得る。一実施形態では、ポンプ及びリザーバーは、組織から離れた領域、例えば腹部に移植され、送達は、ポンプ又はリザーバーから放出部位に導く導管によって行われる。脳への送達のためのデバイスは、例えば、米国特許第６，０９３，１８０号明細書及び同第５，８１４，０１４号明細書において記載される。
【０３１２】
本発明のＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤は、血液脳関門を横切ることができるようにさらに修飾され得る。例えば、ＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤は、薬剤が関門を横切ることを可能にする分子にコンジュゲートされ得る。そのような修飾ＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤は、任意の所望の方法、例えば脳室内若しくは筋肉内注射又は肺性送達などによって投与され得る。
【０３１３】
ある種の実施形態では、エキソソームを使用して、本発明のＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤を送達する。エキソソームは、ＢＢＢを通過することができ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、化学療法剤及びタンパク質を全身注射後にニューロンに特異的に送達することができる（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  Ｌ，Ｓｅｏｗ  Ｙ，Ｙｉｎ  Ｈ，Ｂｅｔｔｓ  Ｃ，Ｌａｋｈａｌ  Ｓ，Ｗｏｏｄ  ＭＪ．（２０１１）．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ａｐｒ；２９（４）：３４１−５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１８０７；Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  Ｓ，Ｌｅｅ  Ｙ，Ｌａｋｈａｌ−Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ  Ｓ，Ｌｉ  Ｊ，Ｓｅｏｗ  Ｙ，Ｇａｒｄｉｎｅｒ  Ｃ，Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  Ｌ，Ｓａｒｇｅｎｔ  ＩＬ，Ｗｏｏｄ  ＭＪ．（２０１１）．Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２  Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２−２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１；ＥＬ  Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  Ｓ，Ｍａｅｇｅｒ  Ｉ，Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ  ＸＯ，Ｗｏｏｄ  ＭＪ．（２０１３）．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１３  Ｍａｙ；１２（５）：３４７−５７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ３９７８；Ｅｌ  Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  Ｓ，Ｌａｋｈａｌ  Ｓ，Ｍａｅｇｅｒ  Ｉ，Ｗｏｏｄ  ＭＪ．（２０１３）．Ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｃｒｏｓｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂａｒｒｉｅｒｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１３  Ｍａｒ；６５（３）：３９１−７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０８．００８を参照されたい）。
【０３１４】
ある種の実施形態では、１つ以上の親油性分子を使用して、本発明のＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤のＢＢＢを越えた送達が可能になる（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔ（２０１１））。次に、ＲＮＡサイレンシング剤は、例えば、親油性偽装物の酵素分解によって活性化されて、薬物をその活性形態に放出するであろう。
【０３１５】
ある種の実施形態では、１つ以上の受容体媒介性の透過性化合物を使用して、ＢＢＢの透過性を増加させて、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の送達を可能にすることができる。これらの薬物は、内皮細胞間の緊密な接合点をゆるめる血液中の浸透圧を増大させることによってＢＢＢの透過性を一時的に増大させる（Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ（２０１２））。緊密な接合点をゆるめることにより、ＲＮＡサイレンシング剤の通常の静脈内注射が実施され得る。
【０３１６】
ある種の実施形態では、ナノ粒子に基づく送達系を使用して、本発明のＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤を、ＢＢＢを越えて送達する。本明細書で使用する場合、「ナノ粒子」は、典型的には、固体、生分解性、コロイド系であり、薬物又は遺伝子担体として広く研究されている高分子ナノ粒子を指す（Ｓ．Ｐ．Ｅｇｕｓｑｕｉａｇｕｉｒｒｅ，Ｍ．Ｉｇａｒｔｕａ，Ｒ．Ｍ．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，ａｎｄ  Ｊ．Ｌ．Ｐｅｄｒａｚ，“Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，”Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４，ｎｏ．２，ｐｐ．８３−９３，２０１２）。高分子ナノ粒子は、天然ポリマー及び合成ポリマーの２つの主要な部類に分類される。ｓｉＲＮＡ送達のための天然ポリマーとしては、シクロデキストリン、キトサン及びアテロコラーゲンが挙げられるが、これらに限定されない（Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｌｉ，Ｙ．Ｈａｎ，Ｌ．Ｈ．Ｌｉａｎｇ，ａｎｄ  Ａ．Ｊｉ，“Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｖｏｌ．１１，ｎｏ．２，ｐｐ．１８２−１９６，２０１０）。合成ポリマーとしては、集中的に研究されてきたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ（ｄｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）及びデンドリマーが挙げられるが、これらに限定されない（Ｘ．Ｙｕａｎ，Ｓ．Ｎａｇｕｉｂ，ａｎｄ  Ｚ．Ｗｕ，“Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．８，ｎｏ．４，ｐｐ．５２１−５３６，２０１１）。ナノ粒子及び他の好適な送達系の概説については、Ｊｏｎｇ−Ｍｉｎ  Ｌｅｅ，Ｔａｅ−Ｊｏｎｇ  Ｙｏｏｎ，ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ−Ｓｅｏｋ  Ｃｈｏ，“Ｒｅｃｅｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｂａｓｅｄ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ｖｏｌ．２０１３，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ７８２０４１，１０  ｐａｇｅｓ，２０１３．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１３／７８２０４１（全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。
【０３１７】
本発明のＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤を眼球に投与して、例えば網膜障害、例えば網膜症を治療することができる。例えば、医薬組成物は、眼の表面又は近くの組織、例えば眼瞼の内部に適用され得る。それらは、例えば、噴霧により、液滴において、洗眼薬又は軟膏剤として局所的に適用され得る。軟膏剤又は滴下可能な液体は、塗布器又は点眼容器など、当技術分野において知られる眼性送達系によって送達され得る。そのような組成物は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はポリ（ビニルアルコール）などの粘液模倣物、ソルビン酸、ＥＤＴＡ又は塩化ベンジルクロムなどの保存剤並びに通常の量の希釈剤及び／又は担体を含み得る。医薬組成物はまた、眼の内部に投与され得、且つ選択された領域又は構造にそれを導入できる針又は他の送達デバイスによって導入され得る。ＲＮＡサイレンシング剤を含有する組成物は、眼パッチを介しても適用され得る。
【０３１８】
一般に、本発明のＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤は、任意の好適な方法によって投与され得る。本明細書で使用する場合、局所送達は、眼、粘膜、体腔の表面を含む身体の任意の表面又は任意の内表面へのＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤の直接的な適用を指し得る。局所投与のための製剤は、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、液滴、噴霧剤及び液体を含み得る。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要であるか又は望ましい場合がある。局所投与は、対象の表皮若しくは真皮又はその特定の層或いは根底にある組織にＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤を選択的に送達する手段としても使用され得る。
【０３１９】
髄腔内又は脳室内（例えば、側脳室内）投与のための組成物は、緩衝液、希釈剤及び他の好適な添加剤を含有し得る滅菌水溶液を含み得る。髄腔内又は脳室内投与のための組成物は、通常、例えばＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤に結合した親油性部分のみならず、トランスフェクション試薬又は追加の親油性部分を含まない。
【０３２０】
非経口投与のための製剤は、緩衝液、希釈剤及び他の好適な添加剤を含有し得る滅菌水溶液を含み得る。脳室内注射は、例えば、リザーバーに取り付けられた、脳室内カテーテルによって促進され得る。静脈内での使用のために、溶質の総濃度は、調製物を等張にするように制御されるべきである。
【０３２１】
本発明のＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤は、肺性送達によって対象に投与され得る。肺性送達組成物は、分散体内の組成物が、肺胞領域を通して血液循環に直接的に容易に吸収され得る肺に到達できるように分散体の吸入によって送達され得る。肺性送達は、肺の疾患を治療する全身送達及び局所送達の両方にとって効率的であり得る。一実施形態では、肺性送達によって投与されるＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤は、血液脳関門を横切ることができるように修飾されている。
【０３２２】
肺性送達は、噴霧、エアロゾル化、ミセル及び乾燥粉末系製剤の使用を含む様々な手法によって行われ得る。送達は、液体噴霧器、エアロゾル系吸入器及び乾燥粉末分散デバイスにより行われ得る。定量デバイスが典型的である。噴霧器又は吸入器を使用する利点の１つは、デバイスが独立型であるため汚染の可能性が最小化されることである。乾燥粉末分散体デバイスは、例えば、乾燥粉末として容易に製剤化され得る薬物を送達する。ＲＮＡサイレンシング剤組成物は、単独で又は好適な粉末担体と組み合わせて凍結乾燥又は噴霧乾燥された粉末として安定的に保管され得る。吸入のための組成物の送達は、デバイスに組み込まれるとき、エアロゾル薬物の投与中の患者に対する用量の追跡、服薬遵守の監視及び／又は用量の誘発を可能にするタイマー、用量カウンター、時間測定デバイス又は時間表示器を含み得る投与タイミング要素によって媒介され得る。
【０３２３】
担体として有用な医薬賦形剤の種類としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定剤、炭水化物などの充填剤、アミノ酸及びポリペプチド；ｐＨ調整剤又は緩衝液；塩化ナトリウムなどの塩などが挙げられる。これらの担体は、結晶形態若しくは非結晶形態であり得るか、又はその２つの混合物であり得る。
【０３２４】
特に有用な充填剤としては、適合性の炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸又はこれらの組合せが挙げられる。好適な炭水化物としては、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖類；ラクトース、トレハロースなどの二糖類；２−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン；及びラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなどの多糖類；マンニトール、キシリトールなどのアルジトールが挙げられる。炭水化物の例示的な基としては、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリン及びマンニトールが挙げられる。好適なポリペプチドとしては、アスパルテームが挙げられる。アミノ酸としては、アラニン及びグリシンが挙げられ、グリシンが典型的である。
【０３２５】
好適なｐＨ調整剤又は緩衝液としては、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどの有機酸及び塩基（クエン酸ナトリウムが典型的である）から調製される有機酸塩が挙げられる。
【０３２６】
本発明のＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤は、経口及び経鼻送達によって投与され得る。例えば、これらの膜を通して投与される薬物は、迅速な作用発現を有し、治療的な血漿レベルをもたらし、肝代謝の初回通過効果を回避し、且つ不適な胃腸管（ＧＩ）環境への薬物の暴露を回避する。追加の利点は、膜部位への容易なアクセスを含み、その結果、薬物が容易に適用され、局在化され、且つ除去され得る。一実施形態では、経口又は経鼻送達によって投与されるＲＮＡサイレンシング剤は、血液脳関門を横切ることができるように修飾されている。
【０３２７】
一実施形態では、ＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤を含む単位用量又は測定された用量の組成物は、移植デバイスによって分注される。デバイスは、対象内のパラメーターを監視するセンサーを含み得る。例えば、デバイスは、浸透圧ポンプなどのポンプ及び任意選択的に関連する電子機器を含み得る。
【０３２８】
本明細書に記載される方法の他の好適な変更形態及び適応形態は、本明細書で開示される実施形態の範囲から逸脱することなく、好適な均等物を使用して行われ得ることが当業者に容易に明らかであろう。ある種の実施形態を詳細に記載してきたが、例示のためのみに含まれ、且つ限定することが意図されない以下の実施例を参照することにより、それらがより明確に理解されるであろう。
【実施例】
【０３２９】
実施例１：ＳＮＰの識別はミスマッチの位置に応じて変動する
図４６は、ＨＴＴの場合に構築されたＳＮＰ識別ｓｉＲＮＡを生成し、且つ選択するための方法論を示すフローチャートであるが、他の遺伝子におけるＳＮＰにも適用可能である。一次選別は、ＳＮＰが置かれるいずれの位置が最大の識別をもたらすかを決定するために実行される。次に、最良の結果をもたらすミスマッチ位置が選択され、非標的アレルに対する親和性は、選択性及び／又は力価の改善を有するｓｉＲＮＡ分子への化学的及び構造的最適化が選択される二次選別においてさらに低減される。
【０３３０】
ＨＤ患者において高い比率のヘテロ接合性を有するＨＴＴ遺伝子内にいくつかのＳＮＰが存在する（図４５）。ハンチンチンのＳＮＰ特異的ＲＮＡｉ媒介性サイレンシングの最適化のために、ＨＴＴ  ｍＲＮＡのエクソン５７中のＳＮＰ  ｒｓ３６２２７３がＳＮＰ選択的サイレンシングの最適化のためのモデル標的として使用された。このＳＮＰヘテロ接合性は、ＨＤ患者集団の３５％に存在する。
【０３３１】
本明細書に記載されるｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドは、Ｒｌｕｃ  ３’ＵＴＲ内にＳＮＰ  ｒｓ３６２２７３及びｈｔｔのエクソン５７からの部分的な隣接領域を含有する。野生型ｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドは、ＳＮＰを有しないｈｔｔの同じ領域を含有する（図１）。
【０３３２】
変異体ＳＮＰ（２２７３−１（Ａ））を含有するハンチンチン（ｈｔｔ）ｍＲＮＡと相補的であるように設計された疎水性修飾ＲＮＡ（ｈｓｉＲＮＡ）は、ｐｓｉＣｈｅｃｋレポータープラスミド系により効力について選別された。ＳＮＰに続く数は、ｓｉＲＮＡにおけるＳＮＰの位置を表す（図４７）。図２は、２、４又は６位にＳＮＰを置くことが、変異体アレルに対する効力を損なうことなく、最大のＳＮＰ識別をもたらしたことを示す。２つのレポータープラスミドの１つでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞は、受動的な取込みによって１．５μＭ  ｈｓｉＲＮＡでリバーストランスフェクトされ、且つ７２時間処理された。ルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの７２時間後に測定された（図２）。
【０３３３】
ｈｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞による用量反応二重ルシフェラーゼアッセイにおけるアレル識別についてさらに試験された（図３）。複数のｈｓｉＲＮＡは、野生型レポータープラスミドと比較して、変異体ＳＮＰを含有するレポータープラスミドを優先的にサイレンシングした。２つのレポータープラスミドの１つでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞は、受動的な取込みによって１．５μＭ  ｈｓｉＲＮＡでリバーストランスフェクトされ、且つ７２時間処理された。レポータープラスミド発現は、トランスフェクションの７２時間後に測定された（図３）。
【０３３４】
実施例２：内在性Ｈｔｔ  ｍＲＮＡにおけるＳＮＰ識別
ｈｓｉＲＮＡは、ホモ接合型ｒｓ３６２２７３  ＳＮＰを含有する内在性ハンチンチンｍＲＮＡに対する効力について試験された。ＨｅＬａ細胞は、各アレル上にＡを有するｒｓ３６２２７３でホモ接合型であるため、アレル識別は、このアッセイで評価されなかった。代わりに、図４は、２つのｈｓｉＲＮＡ、ＳＮＰ４−０及びＳＮＰ６−０が、妥当なＳＮＰを含有するｈｔｔ  ｍＲＮＡをサイレンシングする際に非常に有効であったことを示す。ｍＲＮＡレベルは、７２時間の受動的な取込みによりｈｓｉＲＮＡでＨｅＬａ細胞を処理した後、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０  ｂＤＮＡアッセイを使用して測定された。ヒトｈｔｔ  ｍＲＮＡレベルは、ヒトＨＰＲＴに標準化された。
【０３３５】
実施例３：より高いアレル識別のための第２のミスマッチを有するｈｓｉＲＮＡの設計
用量反応のために以前に選択された３つのｈｓｉＲＮＡ（ＳＮＰ２−０、ＳＮＰ４−０及びＳＮＰ６−０は、それぞれｍｍ２、ｍｍ４及びｍｍ６とも呼ばれる）の各々について、１６個の新規のｈｓｉＲＮＡが設計され、軽微な配列修飾を伴って合成された（図３４）。これらの配列は、第２のミスマッチが、標的ＳＮＰのサイレンシングにほとんど影響を与えることなく、オフターゲットＳＮＰのサイレンシングを以前よりも著しく損なうかどうかを試験するために、元の配列に沿う全ての可能な位置に単一のミスマッチを導入した。アンチセンス鎖配列は、赤色のＳＮＰ部位及び青色の新たなミスマッチとともに５’〜３’で示される（図１２）。
【０３３６】
図１２におけるｈｓｉＲＮＡの効力の一次選別は、ＳＮＰに対応するヌクレオチドの位置に対する第２のミスマッチの位置がＨｅＬａ細胞におけるＳＮＰ識別の様々なレベルをもたらすことを示した。２つのｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドの１つでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞は、受動的な取込みによって１．５μＭ  ｈｓｉＲＮＡでリバーストランスフェクトされ、且つ７２時間処理された。ルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの７２時間後に測定された。図５は、複数のｈｓｉＲＮＡが、野生型レポータープラスミドと比較して、ＳＮＰ変異を含有するレポータープラスミドを優先的にサイレンシングしたことを示す。
【０３３７】
第２のミスマッチを含有する最も有効なｈｓｉＲＮＡをさらに用量反応曲線において試験して、ＳＮＰ識別の改善を検証した。２つのレポータープラスミドの１つでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞は、受動的な取込みによってｈｓｉＲＮＡでリバーストランスフェクトされ、且つ７２時間処理された。レポーター発現は、二重ルシフェラーゼアッセイにより測定された。図６〜８は、野生型レポータープラスミドに対してＳＮＰ変異を含有するレポータープラスミドをサイレンシングするための２つのミスマッチを有するｈｓｉＲＮＡのＩＣ５０値を示す。ＳＮＰ６−１１  ｈｓｉＲＮＡ（５’末端から６位にある多型及び５’末端から１１位にあるミスマッチに対応するヌクレオチドを有するｈｓｉＲＮＡ分子）及びＳＮＰ４−７  ｈｓｉＲＮＡ（５’末端から４位にある多型及び５’末端から７位にあるミスマッチに対応するヌクレオチドを有するｈｓｉＲＮＡ）は、最も有効であることが示された（図７〜９を参照されたい）。驚くべきことに、ＳＮＰの周囲の修飾パターンの改変は、識別を損なうことなく、第２のミスマッチを導入することによって効力の喪失を救出する。ＳＮＰ６−１１  ｈｓｉＲＮＡは、それが、ミスマッチヌクレオチドに隣接して２’Ｏ−メチル修飾（及びそれ自体２’Ｏ−メチル修飾を有するミスマッチヌクレオチド）を有するように改変された（図１０を参照されたい）。
【０３３８】
実施例４：追加の修飾
様々なオリゴヌクレオチド型（例えば、ギャップマー、ミックスマー、ｍｉＲＮＡ阻害剤、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（「ＳＳＯ」）、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴヌクレオチド（「ＰＭＯ」）、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」）など）は、任意選択的に、修飾（例えば、化学修飾）並びに／又は本明細書及び例えば各々が全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第１５／０８９，４２３号明細書；米国特許出願公開第１５／２３６，０５１号明細書；米国特許出願公開第１５／４１９，５９３号明細書；米国特許出願公開第１５／６９７，１２０号明細書及び米国特許第９，８０９，８１７号明細書；及び米国特許出願公開第１５／８１４，３５０号明細書及び米国特許第９，８６２，３５０号明細書において記載されるコンジュゲートの様々な組合せを利用して、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドにおいて使用され得る。
【０３３９】
例えば、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、ジ−ｓｉＲＮＡとして設計され得る（例えば、図１４を参照されたい）。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、１つ以上の異なる骨格結合を含み得る（例えば、図１５を参照されたい）。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、様々な糖修飾を含み得る（例えば、図１６を参照されたい）。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、様々なヌクレオチド間結合を含み得る（例えば、図１７を参照されたい）。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、１つ以上の５’安定化修飾を含み得る（例えば、図１８を参照されたい）。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、１つ以上のコンジュゲート部分を含み得る（例えば、図１９を参照されたい）。いくつかの例示的なオリゴヌクレオチド骨格修飾が図３５において示される。
【０３４０】
本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドを効果的に使用して、単にＳＮＰ位置で塩基を変えることによってＳＮＰ部位でＧを標的化することができる。図３３に見られるとおり、化合物ＳＮＰ６−１１は、２回目に合成され、このとき、Ａの代わりにＳＮＰ部位でＧを標的化した。これは、いずれかのアレルを選択的にサイレンシングすることを可能にし、同じＳＮＰ部位で異なるヘテロ接合性を有する患者にとって非常に有用な戦略である。
【０３４１】
ある種の例示的な実施形態では、１つ以上の脱塩基ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチド、ＭＭ位置ヌクレオチド、５’末端、３’末端又はこれらの任意の組合せで利用される。
【０３４２】
ある種の例示的な実施形態では、ｈｓｉＲＮＡは、アレル特異性を改善するミスマッチの周囲の様々な糖修飾、例えば２’Ｆの代わりに２’ＦＡＮＡ；ＳＮＰ／ミスマッチ位置の周囲の三重の２’Ｆ又は三重の２’ＯＭｅを伴って合成される。
【０３４３】
実施例５：ＨＴＴマウスモデル
ＢＡＣ９７−ＨＤは、ヒトｈｔｔエクソン１を連続したポリグルタミン（ポリＱ）区間をコードする９７個の混合されたＣＡＡ−ＣＡＧリピートを含有するｌｏｘＰ隣接ヒト変異体ｈｔｔエクソン１配列と置き換えることによって改変された、全体の病因となる１７０ｋｂヒトハンチンチン（ｈｔｔ）ゲノム座位を含有するヒトバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）トランスジェニックインサートを含むトランスジェニックマウスを指す。
【０３４４】
リード化合物（ＳＮＰ６−１１）は、図３１に示される構造を有する二分岐化学骨格に合成され、続いて８週齢のＢＡＣ９７−ＨＤ雌マウスにおいて４０ｎｍｏｌ両側性脳室内（ＩＣＶ）注射（各側に対して２０ｎｍｏｌ）を介してインビボで試験された。マウスは、ＳＮＰ  ｒｓ３６２２７３でＧを有する正常マウスｈｔｔ遺伝子及びＳＮＰ  ｒｓ３６２２７３ＡでＡを有する病因となるヒトｈｔｔ遺伝子のトランスジェニックインサートの２コピーを有した。ＲＮＡトランスクリプトーム中の標的とマッチしないナンセンス配列も同じ二分岐骨格に合成され、陰性対照（ＮＴＣ）としてマウスにおいて注射された。
【０３４５】
いくつかの脳領域が注射後１ヶ月のＲＮＡ及びタンパク質分析のためにマウスから回収され、ＨＴＴタンパク質レベルは、Ａｂ１抗体を使用するウエスタンブロットによって測定された。図３２Ａは、回収された線条体組織に対して実施されたウエスタンブロットであり、ビンクリンに標準化されたタンパク質レベルは、図３２Ｂにおいて示される。
【０３４６】
実施例６：ＳＮＰ標的化は、配列に非依存的である
リード化合物のＳＮＰ識別が配列依存的であったかどうかが評価された。ｒｓ３６２２７３におけるＧに対するＵのミスマッチ又はＡに対するＣのミスマッチを含有するハンチンチン（ｈｔｔ）ｍＲＮＡと相補的であるように設計された疎水的に修飾されたＲＮＡ（ｈｓｉＲＮＡ）が使用された。Ｇに対するＵのミスマッチと相補的な６−１１  ｈｓｉＲＮＡ及びＡに対するＣのミスマッチと相補的な６−１１  ｈｓｉＲＮＡの両方が標的ＳＮＰを優先的に切断した（図２０）。
【０３４７】
実施例７：ビニルホスホネート修飾されたサブユニット間結合の合成
本明細書で論じられるビニルホスホネート修飾されたサブユニット間結合の代表的な合成は、図２１及び２９において示される。図２１の合成手順は、下に詳述される。
【０３４８】
化合物３ａの合成
ピリジン（１００ｍＬ）中の化合物２ａ（１６．６ｇ、２０．８ｍｍｏｌ）の無水溶液に無水ＤＩＰＥＡ（６．５ｍＬ、３７．４ｍｍｏｌ）及び塩化ベンゾイル（３．６ｍＬ、３１．２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で４時間撹拌した後、過剰なピリジンを蒸発させ、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。有機溶液をＮａＨＣＯ３飽和水溶液によって洗浄した。有機層を回収し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗製の材料をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、４：１〜１：１）により精製して、淡黄色フォームとして化合物３ａを得た（１４．５ｇ、７８％）；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．８８−７．８７（ｍ，２Ｈ），７．８４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．６７−７．５８（ｍ，５Ｈ），７．４８−７．４５（ｍ，４Ｈ），７．３９−７．３２（ｍ，４Ｈ），７．２５−７．２３（ｍ，３Ｈ），７．１８−７．１７（ｍ，２Ｈ），７．１２−７．０７（ｍ，４Ｈ），６．８０−６．７５（ｍ，４Ｈ），６．０８（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝１．５Ｈｚ，ＪＨＦ＝１５．２Ｈｚ），５．１４，（ｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．３Ｈｚ），４．５９（ｄｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝３．７，１．５Ｈｚ，ＪＨＦ＝５１．９Ｈｚ），４．４３（ｄｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝７．４，４．０Ｈｚ，ＪＨＦ＝１９．１Ｈｚ），４．２４−４．２３（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），３．６２（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝１１．２，２．０Ｈｚ），３．３５（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝１１．１，２．０Ｈｚ），１．００（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６８．４，１６１．８，１５８．７２，１５８．６６，１４８．９，１４３．９，１３９．４，１３５．７１．１３５．７０，１３５．１，１３４．８，１３４．７，１３２．３，１３２．２，１３１．３，１３０．４，１３０．２，１３０．１，１２９．１，１２８．２，１２８．０，１２７．９１，１２７．８９，１２７．２，１１３．１９，１１３．１６，１０２．２，９２．５（ｄ，ＪＣＦ＝１９４．４Ｈｚ），８７．７（ｄ，ＪＣＦ＝３４．５Ｈｚ），８７．２，８２．４，７０．０（ｄ，ＪＣＦ＝１５．４Ｈｚ），６０．７，６０．４，５５．２，２６．６。
【０３４９】
化合物４ａの合成
化合物３ａ（１４．５ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）を、トリエチルシラン（８．０ｍＬ、５０．１ｍｍｏｌ）を含有する３％トリクロロ酢酸／ＣＨ２Ｃｌ２溶液（２００ｍＬ）中に溶解させ、室温で１時間撹拌した。溶液をＮａＨＣＯ３飽和水溶液によって３回洗浄し、回収された有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗製の材料をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、４：１〜３：７）により精製して、白色フォームとして化合物４ａを得た（８．６７ｇ、９１％）；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．８９−７．８８（ｍ，２Ｈ），７．６８−７．６４（６Ｈ，ｍ），７．５１−７．４５（ｍ，４Ｈ），７．４２−７．３８（４Ｈ，ｍ），５．９３（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝２．９Ｈｚ，ＪＨＦ＝１５．１Ｈｚ），５．７３（ｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．２Ｈｚ），４．７４（ｄｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝４．１，３．２Ｈｚ，ＪＨＦ＝５２．２Ｈｚ），４．３１（ｄｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝５．８，４．７，ＪＨＦ＝１５．４Ｈｚ），４．１１−４．０９（ｍ，１Ｈ），３．８２−３．７９（ｍ，１Ｈ），３．３９（ｄｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝１２．１，５．６，１．５Ｈｚ），１．６４（ｂｒ，１Ｈ），１．１１（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６８．３，１６１．８，１４９．０，１４０．５，１３５．７，１３５．２，１３２．８，１３２．３，１３１．３，１３０．５，１３０．４，１３０．３，１２９．２，１２８．０２，１２７．９６，１０２．４，９１．８（ｄ，ＪＣＦ＝９１．８Ｈｚ），８９．５（ｄ，ＪＣＦ＝３３．６Ｈｚ），６９．５（ｄ，ＪＣＦ＝６９．５Ｈｚ），６０．３，２６．８。
【０３５０】
化合物６ａの合成
化合物４ａ（６．５ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の無水溶液にＩＢＸ（７．７ｇ、２７．６ｍｍｏｌ）を加え、８５℃で２時間撹拌した。氷浴中で混合物を冷却した後、溶液中の沈殿物を、セライトに通して濾別した。回収された溶出液を蒸発させ、アルゴン雰囲気下で無水ＣＨ３ＣＮとともに３回共蒸発させ、白色フォームとして化合物５ａを得て、さらに精製することなく使用した。別々のフラスコにおいて、ＣＢｒ４（７．３ｇ、２２．１ｍｍｏｌ）を含有する無水ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）溶液にＰＰｈ３（１１．６ｇ、４４．２ｍｍｏｌ）を０℃で加え、０℃で０．５時間撹拌した。この溶液に化合物５ａの無水ＣＨ２Ｃｌ２溶液（２５ｍＬ）を０℃で滴下して加え（１０分）、０℃で２時間撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２で希釈した後、有機溶液をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液によって洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた材料を最小量のジエチルエーテル中に溶解させ、０℃で激しく撹拌しながら過剰なジエチルエーテル溶液に滴下して加えた。溶液中の沈殿物を、セライトに通して濾別し、溶出液を蒸発させた。得られた粗製の材料をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、９：１〜１：１）により精製して、白色フォームとして化合物６ａを得た（４．３ｇ、５２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．６８−７．８４（ｍ，２Ｈ），７．７０−７．６５（ｍ，３Ｈ），７．６０−７．５８（ｍ，２Ｈ），７．５２−７．４９（ｍ，２Ｈ），７．４２−７．３６（ｍ，４Ｈ），７．３１−７．２８（ｍ，２Ｈ），７．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），６．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），５．７５（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＦ＝８．２４Ｈｚ），５．４９（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＦ＝２１．４Ｈｚ），４．７７（ｔ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．５Ｈｚ，ＪＨＦ＝８．５Ｈｚ），４．３８（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝４．１Ｈｚ，ＪＨＦ＝５２．１Ｈｚ），４．２５（ｄｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．１，４．９Ｈｚ，ＪＨＦ＝１９．４Ｈｚ），１．１０（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６７．９，１６１．６，１４８．３，１４１．４，１３５．８，１３４．７（ｄ，ＪＣ−Ｂｒ＝１３９．０Ｈｚ），１３２．５，１３２．２，１３１．１，１３０．５，１３０．３，１３０．２，１２９．２，１２７．９，１０２．７，９７．３，９３．３（ｄ，ＪＣＦ＝３９．１Ｈｚ），９１．５（ｄ，ＪＣＦ＝１９０．７Ｈｚ），８２．４，７３．９（ｄ，ＪＣＦ＝１６．４Ｈｚ），２６．７。
【０３５１】
化合物７ａ−Ｅ及び７ａ−Ｚの合成
ＤＭＦ（２５ｍＬ）中の化合物６ａ（４．２ｇ、５．６６ｍｍｏｌ）の無水溶液に亜リン酸ジメチル（２．０９ｍＬ、２２．６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５８ｍＬ、１１．３ｍｍｏｌ）を０℃で加え、続いて室温で一晩撹拌した。溶液を酢酸エチルで希釈した後、有機溶液をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液及び塩水で洗浄した。次に、有機溶液をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗製の材料を、全ての純粋な異性体化合物が別々に回収されるまで、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、９：１〜１：１）により繰り返し精製して、化合物７ａ−Ｅ（１．９５ｇ、５２％）を得た；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．８７−７．８５（ｍ，２Ｈ），７．８９−７．８５（ｍ，３Ｈ），７．６１−７．５９（ｍ，２Ｈ），７．５２−７．４８（ｍ，２Ｈ），７．４５−７．３２（ｍ，６Ｈ），７．０８（ｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．２），６．４９（ｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝１３．７），５．９９（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝１３．７Ｈｚ，８．１Ｈｚ），５．７５（ｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝  ８．２），５．６３（ｄ，１Ｈ，ＪＨＦ＝１９．８Ｈｚ），４．４３（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＦ＝５２．６Ｈｚ，ＪＨＨ＝４．３Ｈｚ），４．４２（ｔ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．０Ｈｚ），４．０７（ｄｄｄ，ＪＨＨ＝７．８，４．７Ｈｚ，ＪＨＦ＝１９．５Ｈｚ），１．０８（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １４８．４，１４０．４，１３５．８，１３５．７，１３５．３，１３３．３，１３２．３，１３２．４，１３２．１，１３１．１，１３０．５，１３０．４，１３０．３，１２９．２，１２７．９５，１２７．９３，１１２．４，１０２．７，９１．７（ｄ，ＪＣＦ＝３６．３Ｈｚ），９１．６（ｄ，ＪＣＦ＝１９１．６Ｈｚ），８２．８，７３．９（ｄ，ＪＣＦ＝１６．４Ｈｚ），２６．７，１９．１；及び７ａ−Ｚ（０．５８ｇ、１５％）；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．８７−７．８５（ｍ，２Ｈ），７．６８−７．６５（ｍ，３Ｈ），７．６１−７．５９（ｍ，２Ｈ），７．５２−７．４８（ｍ，２Ｈ），７．４２−７．３９（ｍ，２Ｈ），７．３４−７．２９（ｍ，４Ｈ），７．１２（ｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．２Ｈｚ），６．５１（ｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝７．４Ｈｚ），５．９６（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．４Ｈｚ，７．４Ｈｚ），５．７５（ｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．２Ｈｚ），５．５７（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝１．２Ｈｚ，ＪＨＦ＝２０．６Ｈｚ），５．０４（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．２Ｈｚ），４．４８（ＪＨＨ＝３．５Ｈｚ，ＪＨＦ＝５３．１Ｈｚ），４．２４（ｄｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝７．８，４．９Ｈｚ，ＪＨＦ＝１８．６Ｈｚ），１．０９（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６８．０，１６１．７，１４８．４，１４１．４，１３５．９，１３５．８，１３５．２，１３２．６，１３２．５，１３１．２，１３０．６，１３０．５，１３０．２，１３０．１，１２９．２，１２７．８，１２７．７，１１４．５，１０２．６，９３．０（ｄ，ＪＣＦ＝３７．２Ｈｚ），９１．６（ｄ，ＪＣＦ＝１９１．６Ｈｚ），８０．３，７４．３（ｄ，ＪＣＦ＝１６．４Ｈｚ），２６．７，１９．１。
【０３５２】
化合物９ａの合成
無水化合物７ａ−Ｅ（１．９５ｇ、２．９４ｍｍｏｌ）、及びＰｄ（ＯＡｃ）２（１２５ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）、及び［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（６５２ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）をアルゴンでパージし、続いて無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）中に溶解させた。プロピレンオキシド（２．０６ｍＬ、２９．４ｍｍｏｌ）を加えた後、化合物８ａ（２．０７ｇ、３．２４ｍｍｏｌ）を一度に加え、７０℃で４時間撹拌した。減圧下で溶媒を除去した後、粗製の混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、５０：５０〜０：１００）により精製し、化合物９ａを含有する得られた画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ、０％〜５％）によりさらに精製して、ジアステレオ異性体の混合物として化合物９ａを得た（２．０４ｇ、５７％）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １８．３。
【０３５３】
化合物１０ａの合成
無水ＴＨＦ（２２．５ｍＬ）中の化合物９ａ（２．０ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）に１．０Ｍ  ＴＢＡＦ−ＴＨＦ（２．５ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）を加え、周囲温度で３０分間撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２（１２０ｍＬ）で希釈した後、有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗製の材料をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％  ＴＥＡ−ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、０％〜６％）により精製して、化合物１０ａを得た（１．５２ｇ、９４％）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １９．０，１８．７。
【０３５４】
化合物１１ａの合成
化合物１０ａ（５８９．７ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ３ＣＮとの共蒸発の繰り返しによって無水にし、続いて無水ＣＨ２Ｃｌ２（６．０ｍＬ）中に溶解した。この溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３１ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．１６ｍＬ、０．７２ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。０℃で３０分間撹拌した後、反応混合物を過剰なＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。有機層をＮａＨＣＯ３飽和水溶液で繰り返し洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗製の材料をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％  ＴＥＡ−ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、１００％〜４％）により精製して、白色フォームとして化合物１１ａを得た（５７０ｍｇ、８０％）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １５０．３，１５１．２，１５１．１，１５１．０，１８．７２，１８．６５，１８．５５，１８．３。
【０３５５】
化合物４ｂの合成
ピリジン（１０ｍＬ）中の化合物３ｂ（１．３５ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の無水溶液にＤＩＰＥＡ（０．６３ｍＬ、３．６ｎｎｏｌ）及び塩化ベンゾイル（０．３５ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。過剰なＣＨ２Ｃｌ２で希釈した後、有機溶液をＮａＨＣＯ３飽和水溶液及び塩水で洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥させた後、濾過し、蒸発させ、得られた粗製の材料をさらに精製することなく次の反応のために使用した。化合物３ｂを含有する得られた粗製の材料にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）及びトリエチルシラン（１ｍＬ、６．２６ｍｍｏｌ）中の３％トリクロロ酢酸を加え、室温で１時間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈した後、溶液をＮａＨＣＯ３飽和水溶液で３回洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、続いて蒸発させた。得られた粗製の材料をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、４：１〜１：４）により精製して、純粋な化合物４ｂを得た（５９６．７ｍｇ、２工程で６３％）；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．１３（ｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．２Ｈｚ），７．９５（ｄ，２Ｈ，ＪＨＨ＝７．３Ｈｚ），７．８１（ｔ，１Ｈ，ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ），７．６９−７．６８（ｍ，２Ｈ），７．６４−７．５９（ｍ，４Ｈ），７．４９−７．４２（ｍ，６Ｈ），５．９３（ｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝４．６Ｈｚ），５．２６（ｔ，１Ｈ，ＪＨＨ＝４．６Ｈｚ），４．３６（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝４．６，４．６Ｈｚ），４．０２−４．００（ｍ，１Ｈ），３．６５−３．６１（ｍ，１Ｈ），３．５４（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝４．６，４．６Ｈｚ），３．０９（ｓ，３Ｈ），１．０３（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６Ｈｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１６９．８，１６２．１，１４９．５，１４１．３，１３６．１，１３５．９，１３５．８，１３３．４，１３３．２，１３１．５，１３０．７，１３０．５２，１３０．４８，１３０．０，１２８．４，１２８．３，１０２．１，８６．７，８５．６，８２．８，７９．７，７０．８，６０．２，５７．８，２７．２，１９．４；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ３３Ｈ３５Ｎ２Ｏ７Ｓｉ−［Ｍ−Ｈ］−に対するｍ／ｚ計算値  ｍ／ｚ  ５９９．２２１９、実測値  ｍ／ｚ  ５９９．２２５８。
【０３５６】
化合物６ｂの合成
ＣＨ３ＣＮ（５ｍＬ）中の化合物４ｂ（３００．４ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の無水溶液にＩＢＸ（３５０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を加え、８５℃で２時間撹拌した。０℃で溶液を冷却した後、沈殿物をセライト濾過によって濾別した。化合物５ｂを含有する得られた溶出液を蒸発させ、無水ＣＨ３ＣＮとの共蒸発の繰り返しによって無水し、さらに精製することなく次の反応のために使用した。ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中のＣＢｒ４（３３１．６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の分離用の調製された無水溶液にトリフェニルホスフィン（５２４．６ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を０℃で一度に加え、０℃で３０分間撹拌した。この溶液に無水ＣＨ２Ｃｌ２（１．５ｍＬ）中の化合物５ｂを０℃で滴下して加え（１０分）、０℃で２時間撹拌した。次に、溶液をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液及び塩水で洗浄した。有機溶液をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、得られた粗製の材料をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、９：１〜４：６）により精製して、化合物６ｂを得た（２１０．９ｍｇ、５６％）；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．８８（ｄ，２Ｈ，ＪＨＨ＝７．３Ｈｚ），７．７０−７．６２（５Ｈ，ｍ），７．５１−７．３８（ｍ，９Ｈ），７．０８（ｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．２Ｈｚ），６．２６（ｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．６Ｈｚ），５．７５（ｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．２Ｈｚ），５．６８（ｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝０．８Ｈｚ），４．８４（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．６Ｈｚ，８．６Ｈｚ），３．８６（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ，５．０Ｈｚ），３．３０（ｓ，３Ｈ），３．１８（ｂｒ，１Ｈ），１．１１（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）１６８．３，１６１．７，１４８．６，１３８．９，１３５．９，１３５．８，１３４．３，１３２．６，１３２．４，１３１．２，１３０．５，１３０．４，１３０．３，１２９．２，１２８．０，１２７．９，１０２．４，９７．５，９０．０，８２．４４，８２．３９，７４．４，５８．２，２６．７，１９．１；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ３４Ｈ３３Ｂｒ２Ｎ２Ｏ６Ｓｉ−［Ｍ−Ｈ］−に対するｍ／ｚ計算値  ｍ／ｚ  ７５１．０４８０［Ｍ−Ｈ］−，実測値  ｍ／ｚ  ７５３．６４９５。
【０３５７】
７ｂ−Ｅ及び７ｂ−Ｚの合成
ＤＭＦ（３５ｍＬ）中の化合物６ｂ（６．１１ｇ、８．１ｍｍｏｌ）の無水溶液に亜リン酸ジメチル（２．９７ｍＬ、３４．０ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．２６ｍＬ、１７．０ｍｍｏｌ）を０℃で加え、続いて室温で一晩撹拌した。溶液を酢酸エチルで希釈した後、有機溶液をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液及び塩水で洗浄した。次に、有機溶液をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、粗製の材料を得て、全ての純粋な異性体化合物が別々に回収されるまで、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、９：１〜１：１）により繰り返し精製して、化合物７ｂ−Ｅを得た（３．０ｇ、５５％）；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．８９−７．８７（ｍ，２Ｈ），７．７０−７．６２（ｍ，５Ｈ），７．５１−７．３９（ｍ，８Ｈ），７．１０（ｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．３Ｈｚ），６．４７（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝１３．６，０．８Ｈｚ），６．０１（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝１３．６，７．９Ｈｚ），５．７６−５．７４（ｍ，２Ｈ），４．５１（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝７．８，７．８Ｈｚ），７．３６（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝７．８Ｈｚ，４．９Ｈｚ），３．３４（ｓ，３Ｈ），３．１７（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝４．７，１．２Ｈｚ），１．０９（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６８．３，１６１．７，１４８．７，１３８．４，１３５．９，１３５．８，１３５．３，１３３．８，１３２．６，１３２．４，１３１．２，１３０．５，１３０．４，１３０．３，１２９．２，１２８．０，１２７．９，１１２．１，１０２．３，８８．９，８２．８，８２．６，７７．２，７４．２，５８．１，２６．８，１９．１；及び７ｂ−Ｚ（１．２３ｇ、２２％）；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．８９−７．８７（ｍ，２Ｈ），７．７２−７．７０（ｍ，２Ｈ），７．６８−７．６３（ｍ，３Ｈ），７．５１−７．４４（ｍ，４Ｈ），７．４１−７．３７（ｍ，４Ｈ），７．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ−８．２Ｈｚ），６．５３（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝７．４，０．６Ｈｚ），６．０３（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．５，７．４Ｈｚ），５．７５−５．７３（ｍ，２Ｈ），５．１２（ｔ，１Ｈ，ＪＨＨ＝８．１Ｈｚ），３．９３（ｄｄ，１Ｈ，ＪＨＨ＝６．９，５．０Ｈｚ），３．３２（ｂｒ，１Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），１．１０（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６８．３，１６１．８，１４８．７，１３９．３，１３５．９１，１３５．８５，１３５．２２，１３２．７４，１３２．７１，１３１．２，１３０．８，１３０．５，１３０．２３，１３０．１６，１２９．２，１２７．７８，１２７．７５，１１４．６，１０２．２，９０．１，８２．４，８０．６，７７．２，７４．８，５８．１，２６．８，１９．２。
【０３５８】
化合物８ｂの合成
無水５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−２’−デオキシ−２’−フルオロ−３’−［メチル−Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピル）アミノ］ホスホロアミダイト（４．２６ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を０．４５Ｍ  １Ｈ−テトラゾール／ＣＨ３ＣＮ溶液（２７ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）中で溶解させ、室温で３０分間撹拌した。この溶液にＨ２Ｏ（３．６ｍＬ）を加え、室温で３０分間撹拌した。酢酸エチルで希釈した後、有機溶液を塩水で６回洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、続いて蒸発させた。少量の不純物とともに得られた化合物８ｂをさらに精製することなく次の反応のために使用した；３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，２０２ＭＨｚ）δ  ８．９２，８．２８。
【０３５９】
化合物９ｂの合成
無水化合物７ｂ−Ｅ（２．８４ｇ、４．２０ｍｍｏｌ）及びＰｄ（ＯＡｃ）２（１８８．６ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）及び［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（９３１．４ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）をアルゴンでパージし、続いて無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）中に溶解させた。プロピレンオキシド（２．９４ｍＬ、４２．０ｍｍｏｌ）を加えた後、化合物９ｂ（３．１６ｇ、５．０４ｍｍｏｌ）を一度に加え、７０℃で４時間撹拌した。減圧下で溶媒を除去した後、粗製の混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、５０：５０〜０：１００）により精製し、化合物９ｂを含有する得られた画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％  ＴＥＡ−ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、０％〜５％）によりさらに精製して、ジアステレオ異性体の混合物として化合物９ａを得た（３．３ｇ、６４％）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １９．３１，１８．７２。
【０３６０】
化合物１０ｂの合成
無水ＴＨＦ（３６．５ｍＬ）中の化合物９ｂ（３．３ｇ、２．７０ｍｍｏｌ）に１．０Ｍ  ＴＢＡＦ−ＴＨＦ（４．０５ｍＬ、４．０５ｍｍｏｌ）を加え、周囲温度で３０分間撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）で希釈した後、有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、続いて蒸発させた。得られた粗製の材料をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％  ＴＥＡ−ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、０％〜８％）により精製して、化合物１０ｂを得た（１．２５ｇ、４７％）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １９．８，１９．１。
【０３６１】
化合物１１ｂの合成
化合物１０ｂ（３９３．２ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ３ＣＮとの共蒸発の繰り返しによって無水にし、続いて無水ＣＨ２Ｃｌ２（４．０ｍＬ）中に溶解した。この溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２１ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．１１ｍＬ、０．４８ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。０℃で３０分間撹拌した後、反応混合物を過剰なＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。有機層をＮａＨＣＯ３飽和水溶液で繰り返し洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗製の材料をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％  ＴＥＡ−ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、１００％〜４％）により精製して、白色フォームとして化合物１１ｂを得た（３１９．６ｍｇ、６８％）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５０．７，１５０．４，１５０．３，１９．９，１９．５，１９．４，１８．８。
【０３６２】
実施例８：ビニルホスホネート修飾されたオリゴヌクレオチドの固体支持体に媒介された合成
ビニルホスフィネート修飾されたサブユニット間結合を有するオリゴヌクレオチドの代表的な合成は、図２２において示される。合成されたＶＰ修飾された配列の例は、図２８Ａ及び２８Ｂにおいて見出され得る。
【０３６３】
ヌクレオチド間（Ｅ）−ビニルホスホネート修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成。
１つのビニルホスホネート結合を有する合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２’−修飾（２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル）ホスホロアミダイト及びビニルホスホネート結合二量体ホスホロアミダイトの０．１Ｍ無水ＣＨ３ＣＮ溶液を使用して、ＭｅｒＭａｄｅ  １２自動化ＲＮＡ合成機（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）上で実施された。固体支持体については、ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ支持体（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）が使用された。合成は、（ｉ）脱トリチル化、（ｉｉ）カップリング、（ｉｉｉ）キャッピング、及び（ｉｖ）ヨウ素酸化からなる標準的な１．０μｍｏｌスケールのＲＮＡホスホロアミダイト合成サイクルによって実行された。無水ＣＨ３ＣＮ中の５−（ベンジルチオ）−１Ｈ−テトラゾールは、ホスホロアミダイト活性化試薬のために使用され、ＣＨ２Ｃｌ２中の３％ジクロロ酢酸は、脱トリチル化のために使用された。テトラヒドロフラン中の１６％  Ｎ−メチルイミダゾール（Ｃａｐ  Ａ）及び８０：１０：１０（ｖ／ｖ／ｖ）テトラヒドロフラン−Ａｃ２Ｏ−２，６−ルチジン（Ｃａｐ  Ｂ）がキャッピング反応のために使用された。ＴＨＦ−ピリジン−Ｈ２Ｏ（７：２：１、ｖ／ｖ／ｖ）中の０．０２Ｍ  Ｉ２が酸化のために使用され、ピリジン：ＣＨ３ＣＮ（９：１、ｖ／ｖ）中の０．１Ｍ  ３−［（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール３−チオンが硫化のために使用された。５’末端リン酸化のためにビス（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトが使用された。３’−コレステロール修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチド合成のためにコレステロール３’−ｌｃａａ  ＣＰＧ  ５００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）が使用され、ＲＮＡ合成は、ＶＰ修飾されたＲＮＡのために使用された条件と同じ条件において実行された。化学的な鎖伸長後、固体支持体からの脱保護及び切断は、ＮＨ４ＯＨ−ＥｔＯＨ（３：１、ｖ／ｖ）によって２６℃で４８時間実行された。ビニルホスホネート修飾されたＲＮＡの場合、固体支持体上のＲＮＡは、最初に、ＴＭＳＢｒ−ピリジン−ＣＨ２Ｃｌ２（３：１：１８、ｖ／ｖ／ｖ）によりＲＮＡ合成カラムにおいて周囲温度で１時間処理された。次に、固体支持体は、合成カラムに通して流動溶液による水（１ｍＬ×３）、ＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ×３）及びＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ×３）によって洗浄され、続いて真空下で乾燥させた。固体支持体をスクリューキャップ付きの試料チューブに移した後、ＮＨ４ＯＨ−ＥｔＯＨ（３：１、ｖ／ｖ）による２６℃で４８時間の塩基処理が実行された。コレステロールコンジュゲートを伴わない粗製のＲＮＡオリゴヌクレオチドは、標準的なアニオン交換ＨＰＬＣによって精製されたが、コレステロールコンジュゲートを伴うＲＮＡは、逆相ＨＰＬＣによって精製された。得られた全ての精製ＲＮＡは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって脱塩され、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）分析によって特徴付けられた。
【０３６４】
実施例９：サイレンシング効力
図２３及び２４は、本明細書で試験されるＶＰ修飾されたｓｉＲＮＡの視覚的な表示を提供する。図２５は、ガイド鎖上の様々な位置でのサブユニット間結合における１つ以上のビニルホスホネート修飾がサイレンシングに対して有する効果を例示する。図２５におけるデータから見ることができるとおり、ＲＩＳＣは、ＶＰ修飾に対して非常に感受性であり、且つ様々な位置でミスマッチ塩基対を有することにより、ｓｉＲＮＡ力価を破壊できる。
【０３６５】
図２６、２７Ａ及び２７Ｂは、変異体アレルをサイレンシングするＶＰ修飾されたｓｉＲＮＡの能力も示す。図２７Ａ及び２７Ｂによって見ることができるとおり、ｓｉＲＮＡ配列においてミスマッチを付加することは、変異体アレルのサイレンシングに影響を及ぼすことなくアレル識別を改善できた。図３０は、ＳＮＰ部位の隣のＶＰ修飾された結合の導入がＳＮＰ選択的ｓｉＲＮＡの標的／非標的識別を有意に増強したことを実証している。一次（６位）及び二次（１１位）ＳＮＰを含有する化合物は、５位と６位との間にＶＰ修飾を伴って又は伴わずに合成された。図３０において見ることができるとおり、ＶＰ修飾の存在は、「オンターゲット」活性に影響を与えないが、非標的ｍＲＮＡのための任意の検出可能なサイレンシングを完全に除去した。図２５、２６、２７Ａ及び２７Ｂにおいてデータを生成するための方法は、下に記載される。
【０３６６】
ｈｓｉＲＮＡの受動的送達。
細胞は、９６ウェル細胞培養プレートにおけるウェル毎に８，０００細胞で６％  ＦＢＳを含有するダルベッコ改変イーグル培地中に播種された。ｈｓｉＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；３１９８５−０８８）中で最終濃度の２倍に希釈し、５０μＬの希釈されたｈｓｉＲＮＡを５０μＬの細胞に加え、最終の３％  ＦＢＳをもたらした。細胞を３７℃及び５％のＣＯ２で７２時間インキュベートした。インビトロ用量反応アッセイにおける最大用量は、１．５μＭの化合物であった。
【０３６７】
標的ｍＲＮＡの定量的分析のための方法。
ｍＲＮＡは、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０アッセイキット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＱＳ００１１）を使用して細胞から定量化された。細胞を、１つの部分の溶解混合物（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、１３２２８）、２つの部分のＨ２Ｏ及び０．１６７μｇ／μＬのプロテイナーゼＫ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＱＳ０１０３）で構成される２５０μＬの希釈された溶解混合物中において５５℃で３０分間溶解させた。細胞溶解物を十分に混合し、４０μＬの各溶解物を、プロテイナーゼＫを伴わない２０μＬ希釈された溶解混合物とともに捕捉プレートのウェル毎に添加した。ヒトＨＴＴ及びＨＰＲＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ；＃ＳＡ−５０３３９、ＳＡ−１００３０）のためのプローブセットを希釈し、製造業者の推奨するプロトコルに従って使用した。データセットは、ＨＰＲＴに標準化された。
【０３６８】
棒グラフを作成するための方法。
データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して分析された。濃度依存的ＩＣ５０曲線は、反応に対するｌｏｇ（阻害剤）−可変勾配（４パラメーター）を使用してフィッティングされた。各細胞処理プレートに関して、各用量でのノックダウンのレベルは、対照群（未処理群）の平均に標準化された。曲線の下限は５未満に設定され、曲線の上限は、９５超に設定された。棒グラフを作成するため、相違のパーセントは、対応する各対照化合物のＩＣ５０値から各化合物のＩＣ５０値を引き、対照化合物のＩＣ５０値で除算し、１００を乗じて計算された。相違のパーセントが−５００％未満であった場合、相違のパーセントは、−５００％に人為的に設定された。グラフの下限は、−３００％で切られた。
【０３６９】
本出願を通して引用され得る全ての参考文献（文献参照、特許、特許出願及びウェブサイトを含む）の内容は、そこに引用された参考文献と同様に、いかなる目的のためにも、それらの全体が参照により明示的に本明細書によって組み込まれる。本開示は、別段の指示がない限り、当技術分野でよく知られる免疫学、分子生物学及び細胞生物学の従来技術を採用することになる。
【０３７０】
本開示は、その趣旨又は本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態において具体化され得る。したがって、前述の実施形態は、本開示の限定ではなく、例示的な全ての観点において考えられることになる。したがって、本開示の範囲は、前述の記載ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、そのため、特許請求の範囲の趣旨及び均等性の範囲内に収まる全ての変化形態が本明細書に包含されることになると意図される。
【０３７１】
実施例１０：一次選別は、ＳＮＰ  ｒｓ３６２３０７ヘテロ接合性のための複数の有効なｓｉＲＮＡ配列をもたらす
別の変異体ＳＮＰ（ｒｓ３６２３０７）（図３９）を含有するＨＴＴ  ｍＲＮＡと相補的であるように設計されたｓｉＲＮＡの全ては、目的のＳＮＰに関する標的領域を含有するレポータープラスミドにより選別された（図４０）。２つのレポータープラスミドの１つでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞は、受動的な取込みによって１．５ｕＭ  ｈｓｉＲＮＡでリバーストランスフェクトされ、且つ７２時間処理された。ＳＮＰに続く数は、ｓｉＲＮＡにおけるＳＮＰの位置を表す。このＳＮＰは、その周りの領域の高いＧ／Ｃ含量に基づいて標的化することがより難しくなるであろうと予想された。３位におけるＳＮＰを置き換えることは、変異体アレルに対する効力を失うことなく、最大のＳＮＰ識別をもたらし、最適なＳＮＰ位置が配列特異的であることを示すと思われる（図４１）。したがって、この一次選別プロセスは、任意のＳＮＰのための最適なＳＮＰ位置を選択するために実行され得る。
【０３７２】
実施例１１：ＳＮＰ  ｒｓ３６２３０７に適用されるとき、第２のミスマッチを続けてアレル識別を改善する
図４２において報告されるとおり、全ての可能な位置に導入されるミスマッチを有する新規の配列の一次選別により、位置ｒｓ３６２３０７でもＳＮＰ識別の上昇を有する複数の有効なｈｓｉＲＮＡを得る。７位及び８位でのミスマッチの導入は、選択性を増大させるように見えたが、標的サイレンシング効力を保った。他の第２のミスマッチは、優れた識別をもたらしたが、全体的な活性が低下した。
【０３７３】
実施例１２：ＳＮＰを含む配列におけるＳＮＰ識別の測定
表５〜７に開示される配列の各々（すなわち特定のＳＮＰ位置ヌクレオチド及びミスマッチ（ＭＭ）位置ヌクレオチドの組合せを有する各ｈｓｉＲＮＡ）によってＳＮＰ識別を測定するために、ｈｔｔの野生型領域又は配列のＳＮＰを有するｈｔｔの同じ領域のいずれかを含有するｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドが調製され、二重ルシフェラーゼを使用して試験された。２つのレポータープラスミドの１つでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞は、受動的な取込みによってｈｓｉＲＮＡでリバーストランスフェクトされ、且つ７２時間処理される。ルシフェラーゼ活性は、追加のミスマッチを伴うか又は伴わないアッセイにおいて測定され、続いて用量反応曲線においてプロットし、比較して、サイレンシングの識別及び効力に関する最良の結果をもたらす配列を明らかにする。
【０３７４】
実施例１３：ホスフィネート修飾されたサブユニット間結合の合成
本発明のホスフィネート修飾されたサブユニット間結合を調製するための方法は、図４４Ａ〜４４Ｃにおいて要約される。この方法は、遊離アルコールから対応するケトンへのジョーンズ酸化に続いて、Ｗｉｔｔｉｇオレフィン化を行い、中間体化合物３で示されるエキソメチレン部分を得ることを含む。ＢＯＭによるアミドの保護後のヒドロホウ素化−酸化により、遊離アルコール中間体５が得られる。メシル化後の改変されたフィンケルシュタイン反応は、ヨウ化中間体７を生成し、続いてさらなる官能化を経て、メチルホスフィネート単量体９を得る。
【０３７５】
単量体１８を得るために、様々な保護及び脱保護工程を利用して、中間体１３を得る。ＩＢＸ酸化は、対応するケトンを生成した後、Ｗｉｔｔｉｇオレフィン化により、メチレンを得る。もう一度、ヒドロホウ素化−酸化に続いて、メシル化及びフィンケルシュタイン反応を行って、単量体１８を得る。
【０３７６】
塩基性条件下で単量体９及び１８を組み合わせることにより、ホスフィネート連結二量体１９を得る。酸媒介性及びパールマン触媒による脱保護後のさらなるホスファンアミン官能化により、二量体２２を得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５】
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【図４６−１】
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【図４６−２】
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【図４７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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