(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つのキレート剤の使用を含む１つのろ過工程、少なくとも１つの透析ろ過膜の使用を含む交換工程、および膜吸着体の組合せの使用を含むポリッシング工程を連続的方式により含む、タンパク質を精製するための方法であって、前記組合せの２つの膜吸着体は、作用機序に関して直交性である、方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液からタンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）ろ過工程であって、
−  フロースルー方式により、少なくとも１つのキレート剤マトリックスを通して、溶液を通過させるステップ、
−  少なくとも１つの前記キレート剤マトリックスのフロースルーから、ろ過されたタンパク質溶液を回収するステップ
を含む、工程、
（ｂ）交換工程であって、
−  工程（ａ）の終わりに得られたろ過されたタンパク質溶液を、交換のための１つのみのバッファーを使用して、少なくとも１つの透析ろ過膜を通して通過させるステップ、
−  部分的に精製したタンパク質を含む、少なくとも１つの前記透析ろ過膜の残留液を回収するステップ
を含む、工程、
（ｃ）ポリッシング工程であって、
−  工程（ｂ）の終わりに得られた残留液を、フロースルー方式により、膜吸着体の組合せを通して通過させるステップであって、前記膜吸着体の組合せの２つの膜吸着体は、作用機序に関して直交性であり、前記膜吸着体の組合せは、工程（ｂ）において交換に使用する１つのバッファーと同一の平衡化バッファーにより予め平衡化されている、ステップ、
−  精製したタンパク質を、前記膜吸着体の組合せのフロースルーから回収するステップ
を含む、工程
を含み、プロテインＡによるクロマトグラフィー工程を含まない、前記方法。
【請求項２】
工程（ａ）の終わりに得られたろ過されたタンパク質溶液は、ｐＨの調整、バッファーの交換または希釈のようないかなる処理をも受けることなく、少なくとも１つの透析ろ過膜を通して直接通過する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）の終わりに得られた残留液は、ｐＨの調整、バッファーの交換または希釈のようないかなる処理をも受けることなく、前記膜吸着体の組合せを通して直接通過する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
３つの工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の間にいかなる中間的保存をも含まない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
機能的に閉鎖された流路を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
１つのみのバッファーは、精製方法全体にわたり使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
１つのバッファーは、トリス、トリス−ＨＣｌ、ビストリス、リン酸および／またはクエン酸を含み、特に、（ｉ）ビストリス、トリスまたはトリス−ＨＣｌ、（ｉｉ）酢酸、（ｉｉｉ）水、および（ｉｖ）場合により塩を含むか、またはこれらからなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ろ過工程の少なくとも１つのキレート剤マトリックスは、活性炭素、珪藻土、遊離の陽イオン交換樹脂、遊離の陰イオン交換樹脂、および遊離の混合方式樹脂からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのキレート剤マトリックスは、２つの異なるキレート剤マトリックスの組合せである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
２つの異なるキレート剤マトリックスの組合せは、活性炭素および遊離の陰イオン交換樹脂の組合せである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
交換工程の少なくとも１つの透析ろ過膜は、単一経路タンジェンシャルフローろ過（ＳＰＴＦＦ）モジュールまたはタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）モジュールである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
交換工程の少なくとも１つの透析ろ過膜は、カセット、中空糸または渦巻き状の形態である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ろ過されたタンパク質溶液は、交換工程中に濃縮される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ポリッシング工程の膜吸着体の組合せは、陽イオン交換膜吸着体、陰イオン交換膜吸着体、多様式膜吸着体および疎水性相互作用膜吸着体からなる群から選択される、少なくとも２つの膜吸着体の組合せである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ポリッシング工程の膜吸着体の組合せは、陽イオン交換膜吸着体および陰イオン交換膜吸着体の組合せである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）の後にナノろ過工程をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ナノろ過工程の後に最終的な限外ろ過および／または透析ろ過工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質は、モノクローナル抗体である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
１つのバッファーは、
−  酢酸により６〜９のｐＨに調整した、５〜４０ｍＭのビストリス、１５〜１５０ｍＭのＮａＣｌ、
−  酢酸により６〜９のｐＨに調整した、５〜４０ｍＭのトリスまたはトリス−ＨＣｌ、１５〜１５０ｍＭのＮａＣｌ、
−  クエン酸により６〜９のｐＨに調整した、５〜４０ｍＭのトリスまたはトリス−ＨＣｌ、１５〜１５０ｍＭのＮａＣｌ、あるいは
−  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４により６〜９のｐＨに調整した、１５〜１５０ｍＭのＮａＣｌ
を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
回収した精製タンパク質を医薬組成物に製剤化する工程をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）少なくとも１つのキレート剤マトリックス、少なくとも１つの透析ろ過膜、および膜吸着体の組合せであって、前記膜吸着体の組合せの２つの膜吸着体は、作用機序に関して直交性である、膜吸着体の組合せ、ならびに
（ｂ）トリス、トリス−ＨＣｌ、ビストリス、リン酸および／またはクエン酸を含む、１つのバッファー
を含むか、またはこれらからなる、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質、詳細には、モノクローナル抗体の小および大規模精製のための完全フロースルー精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体精製は、生物学的生成のうちの最もコストのかかる態様の１つであり得る。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、一般に、３つの工程である、３つの樹脂クロマトグラフィー方法を使用して、少なくとも１つの特異的バッファー系を各工程において使用して精製する。この従来の精製方法は、捕捉工程の後、中間精製工程を包含して、ポリッシング工程で完了し、通常、３〜５稼働日をかける（保存および開放相を含む）。このような従来の方法では、これら３つの工程は、一連の別個の単位操作により行い、これは、ｐＨ、モル濃度およびタンパク質濃度の調整が各工程間に必要であるため、連続的方式により操作することができない。したがって、従来の精製方法は、一般に、各工程の中止中およびいくつかの系の間に、多種多様なバッファーならびに多数の保存装置を必要とする。したがって、これらの従来の精製方法では、夾雑、技術的失敗およびヒューマンエラーを起こす傾向がある。加えて、溶出物の濃縮、ｐＨおよび伝導率の調整、ならびに次の工程の前の溶出物の保存のために各工程の間に中断を必要とするため、また、前の工程の完了前に工程を開始できないため、このような従来の精製方法は、特に長く、コストがかかる。
【０００３】
また、従来の方法が高価であるのは、第１の精製工程としてプロテインＡマトリックスを一般的に使用するためである。実際、歴史的に、最も選択的な樹脂は、一般に、プロテインＡの場合、方法の初期に投入して、できる限り多くの不純物を除去する。しかし、プロテインＡが、モノクローナル抗体精製に最も選択的な培地であっても、方法において残存する夾雑物が、なお存在する。また、この工程は、大量の夾雑物に接触する第１の工程としても使用するため、全方法のうちで最も高価である。加えて、残存する夾雑物は、医薬品の規格に準拠させるように除去することが非常に困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
生成に使用する細胞培養力価が上昇し細胞培養容量が大きくなるにつれて、下流の処理は、産業上のボトルネックであると考えられるようになる。これは、モノクローナル抗体生成にとって特に重要であり、ここで、焦点が、バッチ容量から下流の処理容量へ移った。さらに、初期の前臨床および臨床相研究では、より迅速に生成することが可能な大量の抗体を必要とする。したがって、タンパク質精製のため、特には、抗体精製のための、また、夾雑、技術的失敗およびヒューマンエラーのリスクにおいてバッチを得るのにかかる時間、ならびに方法の規模拡大の要件の両方の削減のための、連続的方式により行うことができる、より安価な方法の必要性が産業において存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者らは、タンパク質、特には、抗体を精製するための新しい方法であって、連続的完全フロースルー方式による３つの工程のみを含み、これらの工程のいずれもプロテインＡを含まず、１つのみのバッファーを有利に使用し、その上、高収量の精製抗体を優れた純度で得ることをなお可能とする、方法を見出した。したがって、精製したタンパク質は、医学的適用に適する。その結果、この方法は、臨床試験のため、および／またはタンパク質を含む医薬組成物の製造のためのタンパク質を精製するのに使用し得る。加えて、この方法は、いかなる中間工程の調整をも必要とせず、このため、精製するタンパク質の回収物から最終生成物まで閉鎖系において行うことができる。
【０００６】
簡潔には、この方法は、３つのみの連続的工程、第１の工程として使用する、大量の夾雑物の除去を目的とする安価な技術、残存する小量の夾雑物を除去し、このため、従来の方法におけるこれらの使用と比較して小規模において使用するために、ますます選択的となる、第２および第３の工程に使用する技術を含む。
【０００７】
したがって、本発明の方法は、少なくとも１つのキレート剤の使用を含む１つのろ過工程、少なくとも１つの透析ろ過膜の使用を含む交換工程、および膜吸着体の組合せの使用を含むポリッシング工程を連続的方式により含み、この場合、前記膜吸着体の組合せの２つの膜吸着体は、作用機序に関して直交性である。本発明の方法は、図１に図式化する。これら３つの精製工程は、この特定の順序で有利に実行する。加えて、１つのみのバッファーである、交換工程に使用するバッファーを、全方法を通して使用する必要があることが見出された。言い換えれば、ポリッシング工程おいて場合により使用する平衡化バッファーは、交換工程に使用するバッファーと有利に同一である。このバッファーは、ビストリス、トリス、トリス−ＨＣｌ、リン酸および／またはクエン酸を、例えば、ＮａＣｌ、酢酸および水と組み合わせて有利に含む。より詳細には、１つのみのバッファーを全方法に使用し、すべての工程間の適合性を確保し、サプライチェーン、製造および品質管理の省力、ならびに保存の必要性の削減を可能とすることができる。
【０００８】
本発明の方法は、開放相（すなわち、精製系が、新しいバッファーのためのクロマトグラフィーカラムの準備、試料の希釈、またはこのｐＨの調整のような手動操作を行うために開いている工程）の廃止をさらに可能とし、これにより、夾雑のリスクを削減し、より区分しない環境において作業する可能性を付与する。加えて、本発明の方法が、いかなるカラムの使用も有利に含まず、使い捨てのすぐに使える膜吸着体を主に使用するため、保存の必要性も再利用の確認も、カラムの準備または充填も関連する制御も、洗浄の確認および機器の制限も存在しない。したがって、方法のサイクルタイムは短縮され、方法の規模拡大の要件は最小化され、操作および保存の経費を削減することが可能である。このため、本発明の方法により、迅速でコスト効率の良いバッチ生成および精製系の占有時間の削減の両方が可能となる。したがって、本発明の方法は、規模拡大、および実験台から産業規模までの組換えタンパク質の精製に適する。
【０００９】
特定のプロトコールを設定し、２つの異なる抗体に実行した。このプロトコールでは、第１のろ過工程の終わりに得られたろ過されたタンパク質溶液は、ｐＨの調整、バッファーの交換または希釈のようないかなる処理をも受けることなく、少なくとも１つの透析ろ過膜を通して直接通過し、また、交換工程の終わりに得られた残留液は、ｐＨの調整、バッファーの交換または希釈のようないかなる処理をも受けることなく、少なくとも２つの膜吸着体の組合せを通して直接通過する。このプロトコールは、非常に迅速である（数時間）利点を有し、高収率（７０％超）、医薬品産業標準と同等の純度を生じ、使用するバッファーと保存設備の両方の削減を可能とする。その上、この方法は、一般に、従来の方法の最も高価な要素である、プロテインＡマトリックスの使用を含まないため、非常に柔軟であり、コスト削減の利点を有する。加えて、この方法は、完全に自動化し、連続的方式により実行することができ、いかなる開放相も含まない。その上、２つの異なる抗体について、この方法を行うことに成功した。
【００１０】
したがって、本発明は、溶液からタンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）ろ過工程であって、
−  フロースルー方式により、少なくとも１つのキレート剤マトリックスを通して、前記溶液を通過させるステップ、
−  前記少なくとも１つのキレート剤マトリックスのフロースルーから、ろ過されたタンパク質溶液を回収するステップ
を含む、工程、
（ｂ）交換工程であって、
−  工程（ａ）の終わりに得られたろ過されたタンパク質溶液を、交換のための１つのみのバッファーを使用して、少なくとも１つの透析ろ過膜を通して通過させるステップ、
−  部分的に精製したタンパク質を含む、前記少なくとも１つの透析ろ過膜の残留液を回収するステップ
を含む、工程、
（ｃ）ポリッシング工程であって、
−  工程（ｂ）の終わりに得られた残留液を、フロースルー方式により、膜吸着体の組合せを通して通過させるステップであって、前記膜吸着体の組合せの２つの膜吸着体は、作用機序に関して直交性であり、前記膜吸着体の組合せは、工程（ｂ）において交換に使用する１つのバッファーと同一の平衡化バッファーにより予め平衡化されている、ステップ、
−  精製したタンパク質を、前記膜吸着体の組合せのフロースルーから回収するステップ
を含む、工程
を含み、プロテインＡによるクロマトグラフィー工程を含まない、前記方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、溶液からタンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）ろ過工程であって、
−  フロースルー方式により、少なくとも１つのキレート剤マトリックスを通して、溶液を通過させるステップ、
−  前記少なくとも１つのキレート剤マトリックスのフロースルーから、ろ過されたタンパク質溶液を回収するステップ
を含む、工程、
（ｂ）交換工程であって、
−  工程（ａ）の終わりに得られたろ過されたタンパク質溶液を、交換のための１つのみのバッファーを使用して、少なくとも１つの透析ろ過膜を通して通過させるステップであって、前記１つのみのバッファーは、ポリッシング工程（ｃ）において使用する平衡化バッファーと同一である、ステップ、
−  部分的に精製したタンパク質を含む、前記少なくとも１つの透析ろ過膜の残留液を回収するステップ
を含む、工程、
（ｃ）ポリッシング工程であって、
−  工程（ｂ）の終わりに得られた残留液を、フロースルー方式により、膜吸着体の組合せを通して通過させるステップであって、前記膜吸着体の組合せの２つの膜吸着体は、作用機序に関して直交性であり、前記膜吸着体の組合せは、平衡化バッファーにより予め平衡化されている、ステップ、
−  精製したタンパク質を、前記膜吸着体の組合せのフロースルーから回収するステップ
を含む、工程
を含み、プロテインＡによるクロマトグラフィー工程を含まない、前記方法を提供する。
【００１２】
本発明は、特に、溶液からタンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）ろ過工程であって、
（ｉ）フロースルー方式により、少なくとも１つのキレート剤マトリックスを通して、溶液を通過させるステップ、
（ｉｉ）前記少なくとも１つのキレート剤マトリックスのフロースルーから、ろ過されたタンパク質溶液を回収するステップ
を含む、工程、
（ｂ）交換工程であって、
（ｉ）工程（ａ）の終わりに得られたろ過されたタンパク質溶液を、交換のための１つのみのバッファーを使用して、少なくとも１つの透析ろ過膜を通して通過させるステップ、
（ｉｉ）部分的に精製したタンパク質を含む、前記少なくとも１つの透析ろ過膜の残留液を回収するステップ
を含む、工程、および
（ｃ）ポリッシング工程であって、
（ｉ）平衡化バッファーを、膜吸着体の組合せを通して通過させるステップであって、前記平衡化バッファーは、工程（ｂ）において交換に使用する１つのバッファーと同一である、ステップ、
（ｉｉ）工程（ｂ）から得られた残留液を、フロースルー方式により、膜吸着体の組合せを通して通過させるステップ、
（ｉｉｉ）精製したタンパク質を、前記膜吸着体の組合せのフロースルーから回収するステップ
を含む、工程
を含み、プロテインＡによるクロマトグラフィー工程を含まない、前記方法を提供する。
【００１３】
本発明の一実施形態では、１つのみのバッファーは、精製方法全体にわたり使用される。特定の実施形態では、１つのバッファーは、トリス、トリス−ＨＣｌ、ビストリス、リン酸および／またはクエン酸を含む。別の実施形態では、１つのバッファーは、（ｉ）ビストリス、トリスまたはトリス−ＨＣｌ、（ｉｉ）酢酸、（ｉｉｉ）水、および（ｉｖ）場合により塩を含むか、またはこれらからなる。
【００１４】
一実施形態では、ろ過工程の少なくとも１つのキレート剤マトリックスは、活性炭素、珪藻土、遊離の陽イオン交換樹脂、遊離の陰イオン交換樹脂、および遊離の混合方式樹脂から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つのキレート剤マトリックスは、２つの異なるキレート剤マトリックスの組合せである。より特定の実施形態では、２つの異なるキレート剤マトリックスの組合せは、活性炭素および遊離の陰イオン交換樹脂の組合せである。別の特定の実施形態では、少なくとも１つのキレート剤マトリックスは、３つ以上、すなわち、３つ、４つ、５つまたは６つ以上の異なるキレート剤マトリックスの組合せである。
【００１５】
一実施形態では、交換工程の少なくとも１つの透析ろ過膜は、単一経路タンジェンシャルフローろ過（ＳＰＴＦＦ）モジュールまたはタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）モジュールである。特定の実施形態では、交換工程の少なくとも１つの透析ろ過膜は、カセット、中空糸または渦巻き状の形態である。特定の実施形態では、ろ過されたタンパク質溶液は、交換工程中に濃縮される。
【００１６】
一実施形態では、ポリッシング工程の膜吸着体の組合せは、２つの膜吸着体の組合せ、または少なくとも２つの膜吸着体、例えば、３つ、４つもしくは少なくとも４つの膜吸着体の組合せである。
【００１７】
一実施形態では、膜吸着体の組合せの膜吸着体は、陽イオン交換膜吸着体、陰イオン交換膜吸着体、多様式膜吸着体、疎水性相互作用膜吸着体、およびこれらの組合せからなる群から選択される。特定の実施形態では、ポリッシング工程の膜吸着体の組合せは、陽イオン交換膜吸着体および陰イオン交換膜吸着体の組合せである。
【００１８】
一実施形態では、ポリッシング工程の膜吸着体の組合せは、陽イオン交換膜吸着体、陰イオン交換膜吸着体、多様式膜吸着体および疎水性相互作用膜吸着体からなる群から選択される少なくとも２つの膜吸着体の組合せである。
【００１９】
本発明の一実施形態では、方法は、工程（ｃ）の後にナノろ過工程、ならびに場合により、ナノろ過工程の後に最終的な限外ろ過および／または透析ろ過工程をさらに含む。本発明の別の実施形態では、方法は、工程（ｃ）の後、ナノろ過工程の後、ならびに／または最終的な限外ろ過および／もしくは透析ろ過工程の後に低ｐＨ不活化工程をさらに含む。本発明の一実施形態では、方法は、工程（ａ）の前に、液体培養培地中、好ましくは、バイオリアクターにおいて、タンパク質を含む液体培養培地を用意する、細胞培養の工程を含む。培養した細胞は、哺乳動物、細菌または酵母細胞であり得る。好ましい実施形態では、培養した細胞は、哺乳動物細胞株（例えば、これらの細胞株の種々のサブタイプを含む、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等）ならびに初代または確立された哺乳動物細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞等から生成される）であり得る。
【００２０】
本発明の一実施形態では、精製するタンパク質は、抗体である。別の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。
【００２１】
したがって、本発明はまた、液体培養培地からの精製タンパク質の生成のための統合方法を提供する。
【００２２】
本発明のある特定の実施形態では、１つのバッファーは、酢酸により６〜９（特には７．５）のｐＨに調整した、５〜４０ｍＭ（特には２０ｍＭ）のビストリス、１５〜１５０ｍＭ（特には７５ｍＭ）のＮａＣｌを含む。
【００２３】
本発明のある特定の実施形態では、１つのバッファーは、酢酸により６〜９（特には７．５）のｐＨに調整した、５〜４０ｍＭ（特には２０ｍＭ）のトリスまたはトリス−ＨＣｌ、１５〜１５０ｍＭ（特には７５ｍＭ）のＮａＣｌを含む。
【００２４】
本発明のある特定の実施形態では、１つのバッファーは、クエン酸により６〜９（特には７．５）のｐＨに調製した、５〜４０ｍＭ（特には２０ｍＭ）のトリスまたはトリス−ＨＣｌ、１５〜１５０ｍＭ（特には７５ｍＭ）のＮａＣｌを含む。
【００２５】
本発明のある特定の実施形態では、１つのバッファーは、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（好ましくは、１０ｍＭ／９０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４から９０ｍＭ／１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４まで）により６〜９（特には７．５）のｐＨに調製した１５〜１５０ｍＭ（特には７５ｍＭ）のＮａＣｌを含む。
【００２６】
本発明は、少なくとも１つのキレート剤マトリックス、少なくとも１つの透析ろ過膜、および膜吸着体の組合せであって、前記膜吸着体の組合せの２つの膜吸着体は、作用機序に関して直交性である、膜吸着体の組合せ、ならびにトリス、トリス−ＨＣｌ、ビストリス、リン酸および／またはクエン酸を含み、特に、（ｉ）ビストリス、トリスまたはトリス−ＨＣｌ、（ｉｉ）酢酸、（ｉｉｉ）水、および（ｉｖ）場合によりＮａＣｌを含むか、またはこれらからなる、１つのバッファーを含む、キットを提供する。一部の実施形態では、キットは、本発明の方法を使用して、溶液からタンパク質を精製するために使用される。
【００２７】
また、本発明は、少なくとも１つのキレート剤マトリックス、少なくとも１つの透析ろ過膜、および膜吸着体の組合せであって、前記膜吸着体の組合せの２つの膜吸着体は、作用機序に関して直交性である、膜吸着体の組合せ、ならびに、トリス、トリス−ＨＣｌ、ビストリス、リン酸および／またはクエン酸を含み、特に、（ｉ）ビストリス、トリスまたはトリス−ＨＣｌ、（ｉｉ）酢酸、（ｉｉｉ）水、および（ｉｖ）場合によりＮａＣｌを含むか、またはこれらからなる、１つのバッファーを調製するための説明書を含む、キットを提供する。一部の実施形態では、キットは、本発明の方法を使用して、溶液からタンパク質を精製するために使用される。
【００２８】
また、本明細書に記載する方法のいずれかにより得た、単離したタンパク質、医薬品および医薬組成物を本明細書において提供する。
【００２９】
本開示の精製方法のこれらおよび他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲によりまとめる以下の詳細な説明により、さらに十分に理解される。特許請求の範囲は、本明細書に記載する特徴および利点の特定の考察ではなく、その詳述により、定義されることに留意されたい。
【００３０】
本発明の文脈では、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、他に述べない限り、非限定的用語（すなわち、「〜を含むが、限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。加えて、用語「含む」は、「〜からなる」を包含する（例えば、Ｘ「を含む」組成物は、専らＸからなり得るか、またはＸ＋Ｙのように、追加の何かを含み得る）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
タンパク質精製方法を単純化し、これを安価とするために、発明者らは、連続的で完全フロースルーであり、プロテインＡによるクロマトグラフィー工程を含まない、新しい精製方法を開発した。
【００３２】
本発明は、溶液からタンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）ろ過工程であって、
−  フロースルー方式により、少なくとも１つのキレート剤マトリックスを通して、溶液を通過させるステップ、
−  前記少なくとも１つのキレート剤マトリックスのフロースルーから、ろ過されたタンパク質溶液を回収するステップ
を含む、工程、
（ｂ）交換工程であって、
−  工程（ａ）の終わりに得られたろ過されたタンパク質溶液を、交換のための１つのみのバッファーを使用して、少なくとも１つの透析ろ過膜を通して通過させるステップ、
−  部分的に精製したタンパク質を含む、前記少なくとも１つの透析ろ過膜の残留液を回収するステップ
を含む、工程、
（ｃ）ポリッシング工程であって、
−  工程（ｂ）の終わりに得られた残留液を、フロースルー方式により、膜吸着体の組合せを通して通過させるステップであって、前記膜吸着体の組合せの２つの膜吸着体は、作用機序に関して直交性であり、前記膜吸着体の組合せは、工程（ｂ）において交換に使用する１つのバッファーと同一の平衡化バッファーにより予め平衡化されている、ステップ、
−  精製したタンパク質を、前記膜吸着体の組合せのフロースルーから回収するステップ
を含む、工程
を含み、プロテインＡによるクロマトグラフィー工程を含まない、前記方法に関する。
【００３３】
交換工程（ｂ）では、表現「工程（ａ）の終わりに得られたろ過されたタンパク質溶液を、交換のための１つのみのバッファーを使用して、少なくとも１つの透析ろ過膜を通して通過させる」は、前記ろ過されたタンパク質溶液および１つのバッファーを、少なくとも１つの透析ろ過膜を通して通過させることを意味する。
【００３４】
特定の実施形態では、本発明の方法は、
（ａ）ろ過工程であって、
（ｉ）フロースルー方式により、少なくとも１つのキレート剤マトリックスを通して、溶液を通過させるステップ、
（ｉｉ）前記少なくとも１つのキレート剤マトリックスのフロースルーから、ろ過されたタンパク質溶液を回収するステップ
を含む、工程、
（ｂ）交換工程であって、
（ｉ）工程（ａ）から得られたろ過されたタンパク質溶液を、１つのみのバッファーを使用して、少なくとも１つの透析ろ過膜を通して通過させるステップ、
（ｉｉ）部分的に精製したタンパク質を含む、前記少なくとも１つの透析ろ過膜の残留液を回収するステップ
を含む、工程、および
（ｃ）ポリッシング工程であって、
（ｉ）平衡化バッファーを、膜吸着体の組合せを通して通過させるステップであって、前記平衡化バッファーは、工程（ｂ）において交換に使用する１つのバッファーと同一である、ステップ、
（ｉｉ）工程（ｂ）から得られた残留液を、フロースルー方式により、膜吸着体の組合せを通して通過させるステップ、
（ｉｉｉ）精製したタンパク質を、前記膜吸着体の組合せのフロースルーから回収するステップ
を含む、工程
を含み、前記精製方法は、プロテインＡによるクロマトグラフィー工程を含まない。
【００３５】
上に示すように、本発明の上記方法は、それらのいずれもプロテインＡによるクロマトグラフィー工程ではない、３つの工程のみを含む。本発明による方法が、３つの工程のみを含み、プロテインＡによるクロマトグラフィー工程を含まなくても、医薬品としての目的、および特には、ヒトへの投与に適する精製タンパク質を得ることが可能となる。
【００３６】
精製方法において処理するヒトの非存在（および精製方法の完了に必要とする全時間の結果的削減）に加えて、本開示の方法は、精製に使用するバッファーの量を削減し、プロテインＡによるクロマトグラフィー工程の非存在により、コストが削減される。また、開示する精製方法は、ｍＡｂ精製を単純化し、全収率を向上させ、原料、保存設備、製品原価および処理時間を削減するのに加えて、多様なｍＡｂの精製を可能とする。
【００３７】
従来のタンパク質精製方法とは対照的に、上述のように、本明細書において開示する方法は、ユニークな１つのバッファーを使用し、このユニークなバッファーは、交換工程、およびポリッシング工程における膜吸着体の平衡化に使用される。
【００３８】
本明細書において使用する場合、「本発明によるバッファー」は、ビストリス、トリス、トリス−ＨＣｌ、リン酸および／またはクエン酸を含むバッファーを指す。ビストリス、トリスまたはトリス−ＨＣｌは、当業者に周知の化合物であり、
−  ビストリスのＩＵＰＡＣ名は、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール、ＣＡＳ番号は、６９７６−３７−０であり、
−  トリスは、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール、ＣＡＳ番号７７−８６−１であり、
−  トリス−ＨＣｌは、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール塩酸塩、ＣＡＳ番号１１８５−５３−１である。
【００３９】
本発明による、このようなバッファーは、交換バッファー、および平衡化バッファーに対応し得る。
【００４０】
より詳細には、本発明による、このようなバッファーは、変化濃度の同一の化学物質（このうちの１つは、ビストリス、トリス、トリス−ＨＣｌ、リン酸および／またはクエン酸である）を含むか、これからなり得る。特定の実施形態では、バッファーは、ビストリス、トリス、トリス−ＨＣｌ、リン酸および／またはクエン酸を含む。特定の実施形態では、バッファーは、（ｉ）ビストリス、トリス、またはトリス−ＨＣｌ、（ｉｉ）酢酸、および（ｉｉｉ）水を含むか、またはこれらからなる。より特定の実施形態では、バッファーは、（ｉ）ビストリス、トリスまたはトリス−ＨＣｌ、（ｉｉ）酢酸、（ｉｉｉ）ＮａＣｌおよび（ｉｖ）水を含むか、またはこれらからなる。他の場合では、このようなバッファーは、変化濃度の（ｉ）ビストリス、トリスまたはトリス−ＨＣｌ、（ｉｉ）酢酸、（ｉｉｉ）ＮａＣｌおよび（ｉｖ）水を含むか、またはこれらからなる。
【００４１】
交換バッファーは、例えば、酢酸により６〜９（例えば７．５）のｐＨに調整した、５〜４０ｍＭ（例えば２０ｍＭ）のビストリスおよび１５〜１５０ｍＭ（例えば７５ｍＭ）のＮａＣｌを含むか、またはこれらからなり得る。
【００４２】
交換バッファーは、あるいは、酢酸により６〜９（特には７．５）のｐＨに調整した、５〜４０ｍＭ（特には２０ｍＭ）のトリスまたはトリス−ＨＣｌ、１５〜１５０ｍＭ（特には７５ｍＭ）のＮａＣｌを含むか、またはこれらからなり得る。
【００４３】
交換バッファーは、あるいは、クエン酸により６〜９（特には７．５）のｐＨに調整した、５〜４０ｍＭ（特には２０ｍＭ）のトリスまたはトリス−ＨＣｌ、１５〜１５０ｍＭ（特には７５ｍＭ）のＮａＣｌを含むか、またはこれらからなり得る。
【００４４】
交換バッファーは、あるいは、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（好ましくは、１０ｍＭ／９０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４から９０ｍＭ／１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４まで）により６〜９（特には７．５）のｐＨに調整した１５〜１５０ｍＭ（特には７５ｍＭ）のＮａＣｌを含むか、またはこれからなり得る。
【００４５】
このような交換バッファーは、交換工程での、特には、ＴＦＦカセットとの使用にとりわけ適するが、膜吸着体の平衡化、特には、陽イオン交換膜吸着体および陰イオン交換膜吸着体の組合せの平衡化にも適する。
【００４６】
上記バッファーの配合の利点は、この方法の３つの工程、特には、交換工程およびポリッシング工程を、さらに高い適合性で通過し、その上、望ましくない相互作用を最小化し、ｐＨおよび伝導率の低下を制限し、従来の精製方法に対して収率の増加を促進するｍＡｂ生成物の能力を含む。このようなバッファーの配合の使用により、３つの工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の間にいかなる中間的保存の必要もなく、方法の実行が可能となる。
【００４７】
その結果、特定の実施形態では、方法は、３つの工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の間にいかなる中間的保存をも含まない。
【００４８】
衛生化バッファーは、ポリッシング工程の膜吸着体を再利用する場合、場合により使用し得る。このような衛生化バッファーは、少なくともＮａＯＨ、より好ましくは、０．０５Ｎ〜１Ｎ（例えば０．５Ｎ）のＮａＯＨを含むか、またはこれからなり得る。
【００４９】
用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書において使用する場合、
１）ａ）天然に存在し、詳細には、非組換えの細胞、またはｂ）遺伝子改変もしくは組換えの細胞により産生されるタンパク質である、ネイティブタンパク質の配列を有する分子、あるいは
２）１つもしくはそれ以上のアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換により、ならびに／または少なくとも１つの翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）により、ネイティブタンパク質の配列と異なる分子
を指す。
【００５０】
上記の項１）において言及される分子は、ネイティブタンパク質と称される場合がある。
【００５１】
上記の項２）において言及される分子は、非天然タンパク質である。
【００５２】
ある特定の態様では、精製するタンパク質は、抗体である。
【００５３】
用語「抗体」は、本明細書において使用する場合、インタクトな抗体、または特異的結合についてインタクトな抗体と同等である、この結合断片を指す。結合断片は、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＶＨＨ抗体（ナノボディ）のような単一ドメイン抗体および一本鎖抗体を含むが、これらに限定されない。用語「重鎖」は、抗原への特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを含む。
【００５４】
用語「重鎖」は、本明細書において使用する場合、完全長の重鎖およびこの断片を包含する。完全長の重鎖は、可変領域ドメイン、ＶＨならびに３つの定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端に存在し、ＣＨ３ドメインは、カルボキシル末端に存在する。
【００５５】
用語「軽鎖」は、本明細書において使用する場合、完全長の軽鎖およびこの断片を包含する。完全長の軽鎖は、可変領域ドメイン、ＶＬおよび定常領域ドメイン、ＣＬを含む。重鎖と同様に、軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する。用語「軽鎖」は、本明細書において使用する場合、抗原への特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを含む。
【００５６】
天然に存在する抗体構造単位は、典型的に、四量体を含む。このような四量体のそれぞれは、典型的に、ポリペプチド鎖の２つの相同対からなり、各対は、１つの完全長軽鎖（典型的に、約２５ｋＤａの分子量を有する）および１つの完全長重鎖（典型的に、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。軽および重鎖それぞれのアミノ末端部分は、典型的に、約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、これは、典型的に、抗原認識に関与する。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的に、エフェクター機能に関与する定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、典型的に、カッパおよびラムダ軽鎖に分類される。重鎖は、典型的に、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとそれぞれ定義する。ＩｇＧは、いくつかのサブクラスを有し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない。ＩｇＭは、サブクラスを有し、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むが、これらに限定されない。ＩｇＡは、同様に、サブクラスに細分され、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むが、これらに限定されない。完全長軽鎖および重鎖では、典型的に、可変および定常領域は、約１２またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合し、また、重鎖は、約１０またはそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。
【００５７】
軽／重鎖の各対の可変領域は、典型的に、抗原結合部位を形成する。可変領域は、典型的に、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの高頻度可変領域により結合した、相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と同一の一般構造を示す。各対の２つの鎖のＣＤＲは、典型的に、フレームワーク領域により整列され、これにより、特異性エピトープへの結合が可能となる。Ｎ末端からＣ末端では、軽および重鎖の両可変領域は、典型的に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割当は、典型的に、Ｋａｂａｔら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２の定義に従う。２重特異性または２機能性抗体は、典型的に、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。
【００５８】
Ｆ（ａｂ）断片は、１つの軽鎖およびＣＨ１ならびに１つの重鎖の可変領域からなる。Ｆ（ａｂ）分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。Ｆ（ａｂ’）断片は、１つの軽鎖および１つの重鎖を含み、これは、ＣＨ１およびＣＨ２のドメインの間にいくつかの定常領域を含み、これにより、２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合を形成してＦ（ａｂ’）２分子を形成し得る。Ｆｖ領域は、重および軽の両鎖の可変領域を含むが、定常領域を欠く。一本鎖抗体は、重および軽鎖可変領域が可動性リンカーにより結合しており、抗原結合領域を形成する単一のポリペプチド鎖を形成する、Ｆｖ分子である。「多特異性」または「多機能性」抗体以外の二価抗体は、ある特定の実施形態では、同一の抗原特異性を有する結合部位を含むことが理解される。
【００５９】
本開示の方法により精製することが可能なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、多様な技術により生成することができ、従来のモノクローナル抗体方法、例えば、当技術分野において周知の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む。体細胞ハイブリダイゼーションの手法は、好ましいが、原理的に、モノクローナル抗体を生成するための他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換を利用することができる。モノクローナル抗体は、例えば、マウス、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗体に対応し得る。
【００６０】
また、本発明の方法により精製し得る抗体の非限定的な例としては、パニツムマブ、オマリズマブ、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アブシキシマブ、アクトクスマブ（ａｃｔｏｘｕｍａｂ）、アダリムマブ、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ（ａｌａｃｉｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ（ａｌｔｕｍｏｍａｂ）、アマツキシマブ、アナツモマブ（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アポリズマブ、アチヌマブ（ａｔｉｎｕｍａｂ）、トシリズマブ、バシリジマブ（ｂａｓｉｌｉｚｉｍａｂ）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビシロマブ（ｂｉｃｉｒｏｍａｂ）、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エファングマブ（ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）、エルツマクソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、デュピルマブ、サリルマブまたはフレゾリムマブ（ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）を含む。
【００６１】
ある特定の態様では、精製するタンパク質は、酵素である。
【００６２】
本発明の方法により精製し得る酵素の非限定的な例としては、酸性α−グルコシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、ガラクトース−６−スルファターゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（α−ガラクトシダーゼＢ）、酸性リパーゼ、リソソーム酸性セラミダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、β−グルコシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、酸性β−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡまたはヘキソサミニダーゼＢを含む。
【００６３】
本発明の方法により精製し得るタンパク質の他の非限定的な例としては、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βまたはＴＮＦ−Ｋ）、インターフェロンアルファまたはインターフェロンベータを含む。
【００６４】
精製するタンパク質を含む溶液は、培養培地、好ましくは、清澄化培養培地であり得る。精製するタンパク質を含む溶液は、例えば、灌流バイオリアクターまたは流加バイオリアクターにおいて得た培養培地である。
【００６５】
灌流バイオリアクターまたは流加バイオリアクターの例は、米国特許出願公開第２０１４／２５５９９４号、米国特許出願公開第２０１５／２３２５０５号、米国特許出願公開第２０１５／１８３８２１号および米国特許出願公開第２０１７／２１８０１２号ならびに国際公開第２０１４／１３７９０３号に開示されている（この全体を参照によって本明細書に組み入れる）。
【００６６】
用語「清澄化培養培地」は、哺乳動物、細菌または酵母細胞を実質的に含まない（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％または９９％含まない）、哺乳動物、細菌または酵母細胞培養物から得られた液体培養培地を意味する。
【００６７】
特定の実施形態では、本発明の方法の第１のろ過工程は、細胞培養物の回収において清澄化培養培地を得るのに使用する清澄化工程に統合し、これにより、前記ろ過工程は、清澄化工程の一部となり得る。
【００６８】
句「タンパク質の回収」は、本明細書において使用する場合、開示の精製方法の使用後にタンパク質を採取することを指す。
【００６９】
本発明の文脈では、表現「キレート剤」は、任意の種類の粒子状吸着培地または固定化リガンド、例えば、活性炭素、珪藻土、ビーズ樹脂を指し、これは、精製方法において、吸収剤として作用して、混合物に存在する夾雑分子を、精製する標的分子から分離する。表現「キレート剤マトリックス」は、プロテインＡマトリックスを含まない。
【００７０】
本発明の方法のある特定の実施形態では、少なくとも１つのキレート剤マトリックスは、粒子状吸着培地である。
【００７１】
少なくとも１つのキレート剤マトリックスは、カラム、フィルターの形態であるか、または精製する生成物に粉末として加えることができる。特定の実施形態では、本発明の文脈において使用する少なくとも１つのキレート剤マトリックスは、精製する生成物に粉末として加える。
【００７２】
本開示の方法の特定の実施形態では、少なくとも１つのキレート剤マトリックスは、活性炭素フィルターである。本開示の方法の特定の他の実施形態では、少なくとも１つのキレート剤は、樹脂である。
【００７３】
少なくとも１つのキレート剤マトリックス、特には、活性炭素フィルターまたは樹脂培地は、夾雑物と相互作用し、不純物の効率の高い除去が生じる。キレート剤マトリックスを使用する、特には、活性炭素または樹脂を使用する別の利点は、モノクローナル抗体に対する低い親和性である。
【００７４】
本発明の特定の実施形態では、ろ過工程の少なくとも１つのキレート剤マトリックスは、活性炭素、珪藻土、遊離の陽イオン交換樹脂、遊離の陰イオン交換樹脂、および遊離の混合方式樹脂からなる群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つのキレート剤マトリックスは、２つの異なるキレート剤マトリックスの組合せである。より特定の実施形態では、２つの異なるキレート剤マトリックスの組合せは、活性炭素、特には、活性炭素フィルター、および遊離の陰イオン交換樹脂の組合せである。
【００７５】
本開示の方法の特定の実施形態では、活性炭素フィルターは、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ３５ＳＰ（３Ｍ社により商品化）、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ５３ＳＰ（３Ｍ社により商品化）、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ  ＣＲ４０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社により商品化）またはＺｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ５５ＳＰグレード（３Ｍ社により商品化）である。
【００７６】
本開示の方法の別の特定の実施形態では、遊離の陰イオン交換樹脂は、ＮＨ２−７５０Ｆ（Ｔｏｓｏｈ社により商品化）またはＥｍｐｈａｚｅ  ＡＥＸ（３Ｍ社により商品化）である。樹脂ＮＨ２−７５０Ｆの特性は、以下にまとめる。
【００７７】
【表１】
2021519303.tif 000002
【００７８】
本発明の文脈では、表現「透析ろ過」は、限外ろ過膜を使用して、溶液から塩または溶媒を完全に除去、置換またはこの濃度を低下させる技術を指す。
【００７９】
本明細書において使用する場合、「限外ろ過」または「ＵＦ」は、半透膜を使用して、ＵＦ膜の粒子サイズおよび孔径に基づいて、溶液から粒子および／またはイオンを物理的かつ選択的に除去する、ろ過技術を指す。
【００８０】
一実施形態では、交換工程の少なくとも１つの透析ろ過膜は、単一経路タンジェンシャルフローろ過（ＳＰＴＦＦ）モジュールまたはタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）モジュールである。特定の実施形態では、交換工程の少なくとも１つの透析ろ過膜は、カセット、中空糸または渦巻き状の形態である。
【００８１】
本開示の方法の特定の実施形態では、交換工程の少なくとも１つの透析ろ過膜は、Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｐｒｏｃｅｓｓ中空糸カートリッジ３０ｋＤａ（ＧＥ社により商品化）である。
【００８２】
本開示の方法の特定の実施形態では、交換工程の少なくとも１つの透析ろ過膜は、Ｃａｄｅｎｃｅ  Ｉｎｌｉｎｅ  Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（Ｐａｌｌ社により商品化）である。
【００８３】
一実施形態では、交換工程の少なくとも１つの透析ろ過膜は、Ｃａｄｅｎｃｅ  Ｉｎｌｉｎｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｐａｌｌ社により商品化）に先行または後続する。
【００８４】
本開示の方法の別の特定の実施形態では、交換工程の少なくとも１つの透析ろ過膜は、Ｐｅｌｌｉｃｏｎカセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社により商品化）またはＳａｒｔｏｃｏｎカセット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社により商品化）である。
【００８５】
交換工程は、ろ過されたタンパク質溶液の精製および濃縮の両方が有利に可能となる。表現「ろ過されたタンパク質溶液の濃縮」により、部分的に精製した残留液中のタンパク質の濃度が、ろ過されたタンパク質溶液中のこの濃度と比較して上昇することを、本明細書において意味する。
【００８６】
本発明の文脈では、「膜吸着体」は、親和性基およびイオン交換基のような官能基を有する、ポリマー、特には、アクリルポリマーの平らなシート、または繊維もしくは不織の媒体を指す。樹脂と膜との違いのうちの１つは、樹脂による拡散と膜による対流とによる、流量分布である。
【００８７】
ポリッシング工程において使用する膜吸着体の組合せは、作用機序に関して直交性である、少なくとも２種類の膜吸着体の使用を含む。
【００８８】
本発明の文脈では、表現「作用機序に関して直交性である膜吸着体」は、使用する膜吸着体が、反対または異なる作用機序、例えば、陽イオン交換および陰イオン交換相互作用、多様式および陰イオン交換相互作用、陽イオン交換および疎水性相互作用、または陰イオン交換および疎水性相互作用を有し、単一のろ過工程であるかのようにこれらをともに処理する、１つに統合した工程として作用することを意味する。
【００８９】
実際、発明者らは、膜吸着体のこのような組合せの使用により、不純物を捕らえ、その上、目的の生成物の吸着を最小化することが可能となることを示した。
【００９０】
ポリッシング工程の膜吸着体の組合せにおいて３つ以上の膜吸着体、すなわち、合計３、４または５以上の膜吸着体について、少なくとも１つの追加の膜吸着体を使用する、好ましい実施形態では、前記少なくとも１つの追加の膜吸着体は、作用機序に関して直交性である２つの膜吸着体と比較して、異なる作用機序を有する膜であり、この合計３つ以上の膜吸着体は、１つに統合した単一工程であるとなお考えられる。
【００９１】
非限定的な例としては、前記少なくとも１つの追加の膜吸着体は、作用機序に関して直交性である２つの膜吸着体が、陽イオン交換および陰イオン交換相互作用をそれぞれ有する場合、疎水性相互作用または多様式相互作用を有する。
【００９２】
本発明の文脈では、膜吸着体は、特に、１つに統合した工程として組み合わせる。したがって、工程およびバッファーの数は、大幅に削減される。また、調整および操作は排除され、したがって、全般的方法が単純化される。特には、膜吸着体の組合せの一方の膜吸着体と、膜吸着体のこのような組合せの他方の膜吸着体（複数可）との間に溶出、調整または保存工程が存在しない。
【００９３】
特定の実施形態では、ポリッシング工程の膜吸着体の特定の組合せおよび操作の条件（特にはｐＨ、伝導率および／またはバッファー）は、精製するタンパク質の物理化学的特性（例えばｐＩ、分子量等）に従って決定される。
【００９４】
当業者に理解されるように、ポリッシング工程の最適条件により、目的のタンパク質の最大収率を得ることが可能となる、すなわち、目的のタンパク質の、膜吸着体の組合せとの最も低い相互作用が可能となり、その上、最大限の夾雑物の除去が可能となるはずである、すなわち、膜吸着体の組合せの膜吸着体間にいかなる調整または溶出工程も必要なく、膜吸着体の組合せと夾雑物の最も高い相互作用が可能となるはずである。
【００９５】
ポリッシング工程のための２つの膜吸着体の最適な組合せを決定する例を、図３に例示する。この例では、最良の精製能力は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳおよびＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ膜吸着の組合せを使用して、抗体収率を最大化しながら高い夾雑物除去率（低いＨＣＰおよびＨＭＷ）により得られる。収率および夾雑物除去に対する負荷容量の影響についても、この図に示す。
【００９６】
本発明の文脈では、これらの最適条件を決定するために、膜吸着体の組合せの膜吸着体は、単一のろ過工程であるかのようにこれらをともに処理する、単一体または１つに統合した工程であると考えられるべきである。例えば、２つの膜吸着体の場合では、２つの膜吸着体を使用するとき、最適条件を決定する従来の方法は、第１の膜吸着体に対する最良条件の決定、次いで、第２の膜吸着体に対する最適条件の決定、次いで、両方の最適条件間における生成物の調整（例えば、ｐＨの調整、伝導率の調整またはバッファーの調整）を含むが、本発明の文脈では、２つの膜吸着体は唯一であると考えられ、妥協案は、２つの膜吸着体の分離挙動がある場合に決定して、なお良好な精製を達成することを可能とするべきである。
【００９７】
典型的には、所与のタンパク質の精製に使用する最適化バッファーを決定する場合、交換工程は、中性バッファーを用いて行うことができ、残留液を含む溶液のｐＨおよび伝導率は、手動で調整して、ポリッシング工程における精製の最適条件を決定することができる。最適条件を決定する場合、方法は、交換工程のために適切なバッファーを使用して再び行うことができ、これは、ポリッシング工程に使用する平衡化バッファーに対応する。
【００９８】
ポリッシング工程に使用する２つの膜吸着体の組合せによる最適なバッファー（例えば、バッファーの伝導率またはｐＨ）および目的のタンパク質のｐＩを決定する例は、図４に例示される。この例では、有利な精製を達成することが可能となるｐＨおよび伝導率の条件（５０〜５００ｎｇ／ｍｌのＨＣＰレベルに対応する）は、各プロットの黒色の領域に対応する。
【００９９】
本発明の文脈では、少なくとも２つの膜吸着体の平衡化に使用する１つのバッファーは、交換工程に使用するバッファーと同一である。これにより、精製するタンパク質の直接的フロースルーが可能となり、収率が最大化されるが、夾雑物の大部分が保持される。
【０１００】
特定の実施形態では、ポリッシング工程は、交換工程中にタンパク質の調整に使用するバッファーの多様なｐＨおよび伝導率により最適化される。
【０１０１】
特定の実施形態では、ポリッシング工程は、陽イオン交換膜吸着マトリックスの、陰イオン交換膜吸着マトリックスと組み合わせた使用を含む。他の実施形態では、ポリッシング工程は、多様式（混合方式）膜吸着マトリックスの、陰イオン交換膜吸着マトリックスと組み合わせた使用を含む。
【０１０２】
膜吸着マトリックスの組合せ、特には、陽イオン交換膜吸着体および陰イオン交換膜吸着体の組合せは、膜吸着体および夾雑物の間の相互作用により機能して、不純物を高い効率で除去する。夾雑物との相互作用は、いくつかの機序：イオン性、疎水性、ファンデルワールス力および水素結合による相互作用を原因とする。
【０１０３】
特定の実施形態では、陽イオン交換膜吸着体は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ膜吸着体（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）、ＨＤ−Ｃ膜吸着体（Ｎａｔｒｉｘ社）である。特定の実施形態では、陽イオン交換膜吸着体は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ膜吸着体（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）である。特定の実施形態では、陰イオン交換膜吸着体は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ膜吸着体（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜吸着体（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）またはＨＤ−Ｑ膜吸着体（Ｎａｔｒｉｘ社）である。特定の実施形態では、陰イオン交換膜吸着体は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ膜吸着体（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）またはＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜吸着体（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）である。他の実施形態では、多様式膜吸着体は、ＨＤ−Ｓｂ膜吸着体（Ｎａｔｒｉｘ社）である。他の実施形態では、疎水性相互作用膜吸着体は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｐｈｅｎｙｌ膜吸着体（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）である。
【０１０４】
特定の実施形態では、膜吸着体の組合せは、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ膜吸着体（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）およびＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ膜吸着体（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）の組合せである。
【０１０５】
本発明の方法のポリッシング工程においてカラムではなく膜吸着体を使用する主な利点を、次にまとめる。
−  同等の規模において、膜吸着体は、カラムよりも１０倍高い流量で使用することができ、これにより、処理時間が大幅に削減される。例えば、樹脂を充填した５ｍＬのカラムは、１ｍｌ／分の流量で使用されるが、対応する５ｍＬの膜吸着体は、１０ｍｌ／分の最小流量で使用される。その結果、ポリッシングに２つのクロマトグラフィー工程を使用する従来の方法を、樹脂を充填した２つのカラムを使用して２時間３０分行う場合、膜吸着体を使用して１５分未満で完了することができる。
−  カラムは再利用可能ではあるが、膜吸着体は、使い捨て可能なデバイスであり、このため、バッチ後に廃棄することができ、長期にわたって保存する必要がない。したがって、これらを試験して長期安定性を確保する必要がない。
−  膜吸着体を使用すると、カラムのコスト、カラムの充填およびカラムの保存を回避することにより安価となる。
【０１０６】
特定の実施形態では、膜吸着体の組合せが、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ膜吸着体（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）およびＳｔａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ膜吸着体（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）の組合せである場合、１つのバッファーは、図４の上パネルの黒色領域に開示する範囲のｐＨおよび伝導率を有する。
【０１０７】
別の特定の実施形態では、膜吸着体の組合せが、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ膜吸着体（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）およびＳｔａｒｔｂｉｎｄ  Ｑ膜吸着体（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）の組合せである場合、１つのバッファーは、図４の下パネルの黒色領域に開示する範囲のｐＨおよび伝導率を有する。
【０１０８】
本発明による精製方法は、完全フロースルー精製方法である。
【０１０９】
「完全フロースルー精製方法」は、この方法の種々の精製工程がすべて、目的のタンパク質に精製工程を通過させている間にのみ、不純物が結合する意味を含むことを本明細書において意味する。
【０１１０】
一実施形態では、本発明による方法は、ろ過工程の終わりのろ過されたタンパク質溶液および／または交換工程の終わりの残留液のｐＨの調整を含まない。
【０１１１】
特定の実施形態では、ろ過工程の終わりに得られたろ過されたタンパク質溶液は、透析ろ過膜を通して直接通過させる。より詳細には、次いで、２つの工程間に、いかなる処理（例えば、ｐＨの調整、バッファーの交換または希釈）も行わない。このような方法では、透析ろ過膜は、例えば、Ｃａｄｅｎｃｅ  Ｉｎｌｉｎｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒに先行または後続する、例えば、Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ３０ｋＤ中空糸モジュールまたはＣａｄｅｎｃｅ  Ｉｎｌｉｎｅ  Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎモジュールに対応し得る。加えて、特定の実施形態では、交換工程の終わりに得られた残留液は、ポリッシング工程の膜吸着体の組合せを通して直接通過させる。より詳細には、次いで、２つの工程間に、いかなる処理（例えば、ｐＨの調整、バッファーの交換または希釈）も行わない。このような方法では、透析ろ過膜は、例えば、Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ３０ｋＤ中空糸モジュール、ならびに／または例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ膜吸着体およびＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ膜吸着体の組合せに対応し得る、膜吸着体の組合せに対応し得る。
【０１１２】
このような方法では、手動による介入および精製系の開放（例えば、希釈、伝導率の調整およびｐＨの調整）を必要とする中間工程の処理は、まったく存在しない。
【０１１３】
したがって、本発明の方法は、配線および切替え弁を有する複数のポンプおよびセンサーを含む、一連のまたは連続的な３回の精製工程における操作のための柔軟で自動化されたクロマトグラフィー系において行い得る。
【０１１４】
多重操作系の非限定的な例は、適切に適応させた多重カラムクロマトグラフィー系ＭＣＣＳである。
【０１１５】
本発明の方法は、連続的方式により実行することができる。言い換えれば、本発明の方法は、溶液からタンパク質を精製するための連続的方法であり得る。
【０１１６】
用語「連続的方法」または「連続的方式による方法」は、少なくとも一部の系を通して液体を連続的に供給する方法を意味する。
【０１１７】
用語「液体」により、任意の液体、例えば、精製するタンパク質を含む溶液、バッファーまたはウイルス不活化のための低ｐＨもしくは酸性ｐＨの溶液を本明細書において意味する。
【０１１８】
特定の実施形態では、第１、第２および第３の精製工程は、液体を連続的に送り込む。
【０１１９】
用語「統合方法」は、協同的に機能して特定の結果（例えば、液体培養培地からの精製タンパク質の生成）を達成する構造要素を使用して行われる方法を意味する。
【０１２０】
さらに、本発明の方法は、方法の第１の工程から最後の工程まで閉鎖系において実行することができる。言い換えれば、本発明の方法は、好ましくは、機能的に閉鎖された流路を有する。特には、３つの精製工程、および場合により、ろ過工程（複数可）（例えば、ナノろ過工程ならびに／または最終的な限外ろ過および／もしくは透析ろ過工程）は、閉鎖系において実行することができる。本発明の方法の特定の実施形態では、タンパク質を含む溶液は、３つの精製工程を通して部分毎に通過させ、溶液の一部の各通過は、実行に対応する。次いで、各実行の終わりに回収したタンパク質を採取し、貯蔵する。このような方法では、精製工程の膜吸着体は、数回使用され、場合により、例えば、上に定義する衛生化バッファーを使用して衛生化し、これにより、膜吸着デバイスおよび必要とするバッファーの量の削減が可能となる。例えば、３〜５０回の一連の実行（例えば、３〜３０回、５〜２５回、１０〜２０回、または１５回の実行）は、連続的に行うことができる。より詳細には、３、４、５、６、７または８回の実行を連続的方式により行った後、膜吸着体を（例えば、衛生化バッファーを使用して）衛生化することができる。これは、図２に例示するように、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の回数、繰り返し得る。
【０１２１】
本明細書において開示する方法を使用して、精製したタンパク質を回収することができる。本明細書において使用する場合、「精製した」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質の有効な使用が可能となる純度を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの適用において有用となるタンパク質では、夾雑物、他のタンパク質、および／またはこのような適用においてこのタンパク質の使用に干渉し得るか、もしくは目的のタンパク質への含有が少なくとも望ましくない化学物質を実質的に不含であるべきである。このような適用は、治療組成物の調製、治療組成物中のタンパク質の投与、および本明細書に開示する他の方法を含む。好ましくは、「精製した」タンパク質は、本明細書において参照する場合、任意の方法により（すなわち、天然源から、組換え、または合成による直接的精製により）生成することが可能であり、タンパク質が、所与の組成物において、少なくとも約７０％の重量／総タンパク質の重量、より好ましくは、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、より好ましくは、少なくとも約９０％、より好ましくは、少なくとも約９１％、より好ましくは、少なくとも約９２％、より好ましくは、少なくとも約９３％、より好ましくは、少なくとも約９４％、より好ましくは、少なくとも約９５％、より好ましくは、少なくとも約９６％、より好ましくは、少なくとも約９７％、より好ましくは、少なくとも約９８％、より好ましくは、所与の組成物において、少なくとも約９９％の重量／総タンパク質の重量を含むように、他のタンパク質成分から精製されている、タンパク質である。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明の方法は、
（ａ）ろ過工程であって、
（ｉ）フロースルー方式により、少なくとも１つのキレート剤マトリックスを通して、溶液を通過させるステップ、
（ｉｉ）前記少なくとも１つのキレート剤マトリックスのフロースルーから、ろ過されたタンパク質溶液を回収するステップ
を含む、工程、
（ｂ）交換工程であって、
（ｉ）工程（ａ）から得られたろ過されたタンパク質溶液、および１つのバッファーを、少なくとも１つの透析ろ過膜を通して通過させるステップ、
（ｉｉ）部分的に精製したタンパク質を含む、前記少なくとも１つの透析ろ過膜の残留液を回収するステップ
を含む、工程、ならびに
（ｃ）ポリッシング工程であって、（ｉ）平衡化バッファーを、膜吸着体の組合せを通して通過させるステップであって、前記平衡化バッファーは、工程（ｂ）において交換に使用する１つのバッファーと同一である、ステップ、
（ｉｉ）工程（ｂ）から得られた残留液を、フロースルー方式により、膜吸着体の組合せを通して通過させるステップ、
（ｉｉｉ）精製したタンパク質を、前記膜吸着体の組合せのフロースルーから回収するステップ
を含む、工程
を含み、前記精製方法は、プロテインＡによるクロマトグラフィー工程を含まず、
１つのバッファーは、
−  酢酸により６〜９（例えば７．５）のｐＨに調整した、５〜４０ｍＭ（例えば２０ｍＭ）のビストリスおよび１５〜１５０ｍＭ（例えば７５ｍＭ）のＮａＣｌ、
−  酢酸により６〜９（例えば７．５）のｐＨに調整した、５〜４０ｍＭ（例えば２０ｍＭ）のトリスまたはトリス−ＨＣｌ、１５〜１５０ｍＭ（例えば７５ｍＭ）のＮａＣｌ、
−  クエン酸により６〜９（例えば７．５）のｐＨに調整した、５〜４０ｍＭ（例えば２０ｍＭ）のトリスまたはトリス−ＨＣｌ、１５〜１５０ｍＭ（例えば７５ｍＭ）のＮａＣｌ、あるいは
−  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（好ましくは、１０ｍＭ／９０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４から９０ｍＭ／１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４まで）により６〜９（例えば７．５）のｐＨに調整した、１５〜１５０ｍＭ（例えば７５ｍＭ）のＮａＣｌ
を含むか、またはこれらからなる。
【０１２３】
溶液からタンパク質を精製するための方法は、少なくとも１つの追加の最終的ろ過工程、例えば、ナノろ過工程、限外ろ過工程および／または透析ろ過工程を、ポリッシング工程の後に含み得る。医薬品としての目的のために組換えタンパク質を精製する場合、ポリッシング工程は、典型的に、追加の最終的ろ過工程に後続する。したがって、本発明の方法は、工程（ｃ）の後にナノろ過工程をさらに含み得る。限外ろ過および透析ろ過工程は、ナノろ過工程の後にさらに行い得る。本明細書において使用する場合、「限外ろ過」または「ＵＦ」は、半透膜を使用して、ＵＦ膜の粒子サイズおよび孔径に基づいて、溶液から粒子および／またはイオンを物理的かつ選択的に除去する、ろ過技術を指す。本明細書において使用する場合、「ナノろ過」は、例えば、ウイルス粒子の除去に使用するナノフィルターを通した溶液のろ過を指す。本明細書において使用する場合、「透析ろ過」は、限外ろ過膜を使用して、溶液から塩または溶媒を完全に除去、置換またはこの濃度を低下させる技術を指す。
【０１２４】
また、本発明の方法は、少なくとも１つのウイルス不活化工程をさらに含み得る。前記少なくとも１つのウイルス不活化工程は、本発明の方法の任意の段階、例えば、工程（ａ）の前、工程（ａ）の後、工程（ｂ）の後、工程（ｃ）の後、ナノろ過工程の後ならびに／または限外ろ過および／もしくは透析ろ過工程の後に行い得る。このようなウイルス不活化工程は、典型的に、低ｐＨまたは酸性ｐＨ不活化工程であり得る。本明細書において使用する場合、「低ｐＨまたは酸性ｐＨ不活化」は、酸性ｐＨを使用して、ウイルス、特には、エンベロープウイルスを変性させる、ウイルス不活化技術を指す。典型的には、低ｐＨまたは酸性ｐＨ不活化工程は、約３．０〜５．０（例えば、約３．５〜約４．５、約３．５〜約４．２５、約３．５〜約４．０、例えば４．０）のｐＨで、少なくとも１５分の期間（例えば、１５分〜１時間の期間、約３０分〜２時間の期間、または約４５分〜２時間の期間）、回収したタンパク質をインキュベートすることにより行われる。例えば、低ｐＨまたは酸性ｐＨ不活化工程は、ｐＨ４で、例えば、３０分〜２時間、回収したタンパク質をインキュベートすることにより行われる。
【０１２５】
また、本発明の方法は、清澄化して細胞が除去されており、細胞を実質的に含まない、精製するタンパク質を含む液体培養培地を用意する工程を、工程（ａ）の前に含むことがあり、この場合、前記液体培養培地は、少なくとも１つのキレート剤マトリックスを通して供給される。
【０１２６】
例えば、溶液からタンパク質を精製するための本発明の方法は、
（ａ前）清澄化して細胞が除去されており、細胞を実質的に含まない、精製するタンパク質を含む液体培養培地を用意する工程、
（ａ）ろ過工程であって、
−  工程（ａ前）の前記液体培養培地を、フロースルー方式により、少なくとも１つのキレート剤マトリックスを通して通過させるステップ、
−  前記少なくとも１つのキレート剤マトリックスのフロースルーから、ろ過されたタンパク質溶液を回収するステップ
を含む、工程、
（ｂ）交換工程であって、
−  工程（ａ）の終わりに得られたろ過されたタンパク質溶液を、交換のための１つのみのバッファーを使用して、少なくとも１つの透析ろ過膜を通して通過させるステップ、
−  部分的に精製したタンパク質を含む、前記少なくとも１つの透析ろ過膜の残留液を回収するステップ
を含む、工程、および
（ｃ）ポリッシング工程であって、
−  工程（ｂ）の終わりに得られた残留液を、フロースルー方式により、膜吸着体の組合せを通して通過させるステップであって、前記膜吸着体の組合せの２つの膜吸着体は、作用機序に関して直交性であり、前記膜吸着体の組合せは、工程（ｂ）において交換に使用する１つのバッファーと同一の平衡化バッファーにより予め平衡化されている、ステップ、
−  精製したタンパク質を、膜吸着体の上記組合せのフロースルーから回収するステップ
を含む、工程
を含むことがあり、精製方法は、プロテインＡによるクロマトグラフィー工程を含まない。
【０１２７】
最終的には、精製したタンパク質は、保存に適する組成物、ならびに／または特に、動物および／もしくはヒトへの投与に適する医薬組成物に製剤化し得る。
【０１２８】
本開示の方法の多数の利点のうちの１つは、高度に純粋なタンパク質の良好な収率を得ることが可能となることである。本発明の方法により回収する、精製したタンパク質は、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．５％または９９．９％の純度を示し得る。より詳細には、本開示の方法の多数の利点のうちの１つは、減少量の、夾雑ＤＮＡ、高分子量（ＨＭＷ）種（タンパク質凝集物に対応する）および／または宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む、高度に純粋なタンパク質の溶液を得ることが可能となることである。本発明の方法により回収した、精製したタンパク質を含む溶液は、例えば、０．４ｐｐｂ未満、０．３ｐｐｂ未満、０．２ｐｐｂ未満または０．１ｐｐｂ未満の夾雑ＤＮＡの量を示し得る。また、本発明の方法により回収した、精製したタンパク質を含む溶液は、例えば、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満または０．１％未満のＨＭＷ種の濃度を示し得る。また、本発明の方法により回収した、精製したタンパク質を含む溶液は、例えば、５００ｎｇ／ｍｌ未満、１００ｎｇ／ｍｌ未満、９０ｎｇ／ｍｌ未満、８５ｎｇ／ｍｌ未満、８０ｎｇ／ｍｌ未満、７５ｎｇ／ｍｌ未満または７０ｎｇ／ｍｌ未満のＨＣＰの濃度を示し得る。加えて、本発明の方法は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の収率の精製したタンパク質の回収を可能とする。
【０１２９】
本発明は、さらに、
（ａ）少なくとも１つのキレート剤マトリックス、少なくとも１つの透析ろ過膜、および膜吸着体の組合せであって、前記膜吸着体の組合せの２つの膜吸着体は、作用機序に関して直交性である、膜吸着体の組合せ、ならびに
（ｂ）トリス、トリス−ＨＣｌ、ビストリス、リン酸および／もしくはクエン酸を含み、特に、（ｉ）ビストリス、トリス、もしくはトリス−ＨＣｌ、（ｉｉ）酢酸、（ｉｉｉ）水、および（ｉｖ）場合によりＮａＣｌを含むか、もしくはこれらからなる、１つのバッファー、ならびに／またはトリス、トリス−ＨＣｌ、ビストリス、リン酸および／もしくはクエン酸を含み、特に、（ｉ）ビストリス、トリスもしくはトリス−ＨＣｌ、（ｉｉ）酢酸、（ｉｉｉ）水、および（ｉｖ）場合によりＮａＣｌを含むか、もしくはこれらからなる、１つのバッファーを調製するための説明書
を含むか、またはこれらからなる、キットに関する。
【０１３０】
本発明は、以下の図および実施例により、さらに例示する。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】本発明の３工程完全フロースルー方法を表す模式図である。
【図２】実施例４において使用する本発明の３工程完全フロースルー方法の連続的バージョンを表す模式図である。
【図３】膜吸着体の４つの組合せ（ＨＤ−Ｃ＋ＨＤ−Ｑ、ＨＤ−Ｓｂ＋ＨＤ−Ｑ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ＋Ｑ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ＋ＳＴＩＣ）により得た、収率（％）、ＨＭＷ（％）およびＨＣＰ（ｎｇ／ｍｌ）の、膜容量（ｍｇ／ｍｌ）による比較を表すヒストグラムである。
【図４】平衡化バッファーのｐＨおよび伝導率（ｍＳ／ｃｍ）による、膜吸着体の２つの組合せ（上パネル：Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ＋ＳＴＩＣ、下パネル：Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ＋Ｑ）および３つのｐＩ（６；７．５および９）の精製するタンパク質についてのスイートスポットのプロットである。有利な精製を達成することが可能となるｐＨおよび伝導率の条件（５０〜５００ｎｇ／ｍｌのＨＣＰレベルに対応する）は、各プロットの黒色の領域に対応する。
【図５】実験室規模の連続的方法実験における、膜を通した精製（Ｕ．Ｖ．２８０ｎｍ）の部分的クロマトグラムである。
【実施例１】
【０１３２】
本発明による実験室規模の方法
本発明の方法は、ヒト化モノクローナル抗体ｍＡｂ１の実験室規模のバッチ精製に利用した。
【０１３３】
この実験は、３つの工程の後に実験室規模で達成した不純物除去の結果を示す。目標は、凝集物（ＨＭＷ）および宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を、ＨＭＷでは１％未満およびＨＣＰでは５００ｎｇ／ｍｌ未満に除去することであった。
【０１３４】
発明者らは、２つの異なるキレート剤、１つの交換工程および１対の膜（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳおよびＳＴＩＣまたはＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳおよびＱ）を使用して功を奏した。
【０１３５】
【表２】
2021519303.tif 000003
【実施例２】
【０１３６】
本発明による実験室規模の方法
本発明の方法は、ヒト化モノクローナル抗体ｍＡｂ２の実験室規模のバッチ精製に利用した。
【０１３７】
この実験は、３つの工程の後に実験室規模で達成した不純物除去の結果を示す。目標は、凝集物（ＨＭＷ）および宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を、ＨＭＷでは１％未満およびＨＣＰでは５００ｎｇ／ｍｌ未満に除去することであった。発明者らは、２種類のキレート剤、１つの交換工程および１対の膜（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳおよびＳＴＩＣまたはＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳおよびＱ）を使用して功を奏した。最良の結果は、１対のＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ＋ＳＴＩＣを用いて、ｐＨ８．５および３ｍｓ／ｃｍに設定した負荷条件により得た。
【０１３８】
【表３】
2021519303.tif 000004
【実施例３】
【０１３９】
本発明によるパイロット規模の方法
本発明の方法は、ｍＡｂ１のパイロット規模のバッチ精製に利用した。
【０１４０】
実施例２に開示するものと同一の方法をパイロット規模に規模拡大した。目標は、３つの工程の後、ナノろ過工程を通して１０ｇを精製することであった。
【０１４１】
清澄化した細胞培養上清８Ｌを、本発明の方法の３つの工程およびナノろ過を通して精製した。８Ｌは、Ｔｏｓｏｈ  ＮＨ２−７５０Ｆ樹脂を２５０ｍｌ、次いで１３分撹拌し、活性炭素（Ｎｏｒｉｔ  ＳＡ２グレード）を１６０ｇ、次いで１４分撹拌し、活性炭素（Ｎｏｒｉｔ  ＳＡ２グレード）を３０ｇ、次いで１０分撹拌して２０Ｌの撹拌機に連続的に導入した。
【０１４２】
生成物をろ過した（Ｆｉｌｔｒｏｘフィルター）後、交換工程を開始した。生成物約９Ｌは、ろ過（生成物を滅菌水１Ｌによりフィルターの外部に押し出した）後に回収した。ＵＦ／ＤＦは、中空糸（７９０ｃｍ２−５０ＫＤ−Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂ社）を使用してＧＥ  Ｕｎｉｆｌｕｘ上で行った。生成物の中空糸を通した透析ろ過に使用したバッファーは、酢酸によりｐＨ７．２に調整するためにＱ．Ｓ．の２０ｍＭビストリスバッファーであった。
【０１４３】
２．６４ｋｇは、６．９ｇ／Ｌ（モノクローナル抗体１８．２ｇ）で回収した。次いで、回収した生成物２Ｌ（１４ｇ）は、２つの膜吸着体：７５ｍｌ用Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓおよび２００ｍｌ用Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑを通して押し出した。２つの膜を連続的に結合させ、ＧＥ  ＡｋｔａＰｒｏｃｅｓｓを使用して、フロースルー方式において使用した。
【０１４４】
最終的には、生成物は、前置フィルター（ＸＯＨＣ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）およびＶｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を通してナノろ過して、最終品質を得た。
【０１４５】
以下の表は、従来の方法および本発明の方法の間の比較を示す。
【０１４６】
【表４】
2021519303.tif 000005
【実施例４】
【０１４７】
本発明による実験室規模の完全連続的方法
本発明の方法は、連続的方式による、ヒト化モノクローナル抗体ｍＡｂ１の実験室規模のバッチ精製に利用した。
【０１４８】
実験の目標は、中断、保存または各工程間の調整がないことを意味する連続的方式を使用して、清澄化したバルク回収物からｍＡｂ１を精製することであった。発明者らは、キレート剤（固定化ＡＥＸ、活性炭素ＣＡ）上でのろ過、１つの交換工程（単一経路透析ろ過）および１対の膜（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳおよびＳＴＩＣ）を使用して功を奏した。
【０１４９】
清澄化した細胞培養上清３Ｌを、本発明の方法の３つの工程を通して精製した。生成物は、固定化陰イオン交換体（Ｅｍｐｈａｚｅ  ＡＥＸ  ＢＶ１２０）、次いで、活性炭素フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社ＣＲ４０  ２７０ｃｍ２）を通してろ過した。次いで、生成物を単一経路透析ろ過膜（０．２ｍ２）に直接流して、濃縮および透析ろ過（交換工程）した。生成物を通した透析ろ過に使用したバッファーは、酢酸によりｐＨ７．５に調整するためにＱ．Ｓ．の２０ｍＭビストリス、２０ｍＭのＮａＣｌバッファーであった。
【０１５０】
透析ろ過生成物は、中間サージバッグを通過させた残留液側から直接回収して、後の工程による流速差に適応させた。次いで、生成物は、２つのポリッシング膜吸着体：１ｍｌ用Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓおよび１ｍｌ用Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣを通して、さらに押し出した。２つの膜を連続的に結合させ、ＧＥ  Ａｋｔａ  Ｐｕｒｅを使用したフロースルー方式に使用した。各単位工程は、他方に直接連結させるか、またはサージバッグを通して連続的に処理した。
【０１５１】
複数サイクルの精製を膜吸着体上で行って、図５に示すように（膜による精製５０サイクルの抜粋）、全容量の生成物を処理した。生成物プール全体を、方法の終わりに無菌フィルターを通して回収した。ｍＡｂを４０ｍｇ、５分毎に精製すると、１時間に膜１リットルあたり２４０ｇ（２４０ｇ／Ｌ／ｈ）のｍＡｂ１の生産性が生じた。
【図１】
2021519303.tif 000006
【図２】
2021519303.tif 000007
【図３】
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【図４】
2021519303.tif 000009
【図５】
2021519303.tif 000010
【国際調査報告】
2021519303.tif 000011
2021519303.tif 000012
2021519303.tif 000013