(57)【要約】  本発明は、天然ＩｇＧ特性を有し、重鎖と軽鎖がミスマッチすることなく高度に安定なヘテロ二量体形態である、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７二重特異性抗体、ならびにその製造方法を提供する。該二重特異性抗体の第１のＦｃ鎖または第２のＦｃ鎖の一方は、位置３６６および３９９にアミノ酸置換を含み、他方は位置３５１、４０７および４０９にアミノ酸置換を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖、ならびにＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する第１の抗原結合機能領域およびＣＤ４７に特異的に結合する第２の抗原結合機能領域を含む、ヘテロ二量体形態の二重特異性抗体であって、ここで、
第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖がそれぞれ、アミノ酸置換を含む免疫グロブリンＧ Ｆｃフラグメントであり、該第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖が合して、Ｆｃ受容体に結合し得るヘテロ二量体を構成し、
第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖が、それぞれ、共有結合またはリンカーにより第１の抗原結合機能領域および第２の抗原結合機能領域に連結されており、
第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方が、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付けシステムに従って番号付けされているアミノ酸位置３６６および３９９でのアミノ酸置換を含み、他方が、アミノ酸位置３５１、４０７および４０９でのアミノ酸置換を含む、
ヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【請求項２】
第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のアミノ酸置換が、以下：
ａ）Ｌ３５１Ｇ、Ｌ３５１Ｙ、Ｌ３５１Ｖ、Ｌ３５１Ｐ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｅ、Ｌ３５１ＫまたはＬ３５１Ｗ；
ｂ）Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｐ、Ｔ３６６ＷまたはＴ３６６Ｖ；
ｃ）Ｄ３９９Ｃ、Ｄ３９９Ｎ、Ｄ３９９Ｉ、Ｄ３９９Ｇ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９ＴまたはＤ３９９Ａ；
ｄ）Ｙ４０７Ｌ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｐ、Ｙ４０７Ｆ、Ｙ４０７ＴまたはＹ４０７Ｈ；および
ｅ）Ｋ４０９Ｃ、Ｋ４０９Ｐ、Ｋ４０９Ｓ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｖ、Ｋ４０９ＱまたはＫ４０９Ｒである、
請求項１記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【請求項３】
アミノ酸置換が、以下：
ａ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＬおよびＤ３９９Ｒ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７ＬおよびＫ４０９Ｖ置換；
ｂ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＬおよびＤ３９９Ｃ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｇ、Ｙ４０７ＬおよびＫ４０９Ｃ置換；
ｃ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＬおよびＤ３９９Ｃ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７ＡおよびＫ４０９Ｐ置換；
ｄ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＰおよびＤ３９９Ｎ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｖ、Ｙ４０７ＰおよびＫ４０９Ｓ置換；
ｅ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＷおよびＤ３９９Ｇ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｄ、Ｙ４０７ＰおよびＫ４０９Ｓ置換；
ｆ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＰおよびＤ３９９Ｉ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｐ、Ｙ４０７ＦおよびＫ４０９Ｆ置換；
ｇ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＶおよびＤ３９９Ｔ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｋ、Ｙ４０７ＴおよびＫ４０９Ｑ置換；
ｈ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＬおよびＤ３９９Ａ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｗ、Ｙ４０７ＨおよびＫ４０９Ｒ置換
を含む、請求項１または２記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【請求項４】
アミノ酸置換が、以下：
ａ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＬおよびＫ４０９Ｖ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７ＬおよびＤ３９９Ｒ置換；
ｂ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＬおよびＫ４０９Ｃ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｇ、Ｙ４０７ＬおよびＤ３９９Ｃ置換；
ｃ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＬおよびＫ４０９Ｐ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７ＡおよびＤ３９９Ｃ置換；
ｄ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＰおよびＫ４０９Ｓ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｖ、Ｙ４０７ＰおよびＤ３９９Ｎ置換；
ｅ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＷおよびＫ４０９Ｓ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｄ、Ｙ４０７ＰおよびＤ３９９Ｇ置換；
ｆ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＰおよびＫ４０９Ｆ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｐ、Ｙ４０７ＦおよびＤ３９９Ｉ置換；
ｇ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＶおよびＫ４０９Ｑ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｋ、Ｙ４０７ＴおよびＤ３９９Ｔ置換；
ｈ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＬおよびＫ４０９Ｒ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｗ、Ｙ４０７ＨおよびＤ３９９Ａ置換
を含む、請求項１から３のいずれか一項記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【請求項５】
第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方におけるアミノ酸が、Ｔ３６６ＬおよびＤ３９９Ｒに置換され、他方におけるアミノ酸が、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７ＬおよびＫ４０９Ｖに置換される、請求項１から４のいずれか一項記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【請求項６】
第１の抗原結合機能領域および第２の抗原結合機能領域が、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、可変ドメインフラグメントＦｖおよび重鎖抗体の重鎖可変領域フラグメントＶＨＨから選択される、請求項１から５のいずれか一項記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【請求項７】
第１の抗原結合機能領域および第２の抗原結合機能領域が両方とも、Ｆａｂフラグメントである、請求項１から６のいずれか一項記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【請求項８】
第１の抗原結合機能領域および第２の抗原結合機能領域のうち、一方がＦａｂフラグメントであり、他方がｓｃＦｖである、請求項１から６のいずれか一項記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【請求項９】
Ｆａｂフラグメントが、異なる第１の重鎖可変領域および第２の重鎖可変領域、ならびに異なる第１の軽鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域を含む、請求項７記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【請求項１０】
還元剤が存在し、他のポリペプチドを含まない溶液中において、第１のＦｃ鎖およびそれに共有結合した第１の抗原結合機能領域ならびに第２のＦｃ鎖およびそれに共有結合した第２の抗原結合機能領域に、第１のＦｃ鎖およびそれに共有結合した第１の抗原結合機能領域ならびに第２のＦｃ鎖およびそれに共有結合した第２の抗原−抗原結合機能領域を加えて、すべてのポリペプチド鎖の重量に基づき５０％未満のホモ二量体を形成する、請求項１から９のいずれか一項記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【請求項１１】
第１の抗原結合機能領域が、配列番号２および６のアミノ酸配列を含む、請求項１から１０のいずれか一項記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【請求項１２】
第２の抗原結合機能領域が、配列番号１０および１２のアミノ酸配列を含む、請求項１から１０のいずれか一項記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【請求項１３】
第１の抗原結合機能領域が、配列番号４および８のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１１記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【請求項１４】
第２の抗原結合機能領域が、配列番号４および１４のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１２記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体をコード化する、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
第１の抗原結合機能領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１および５を含む、請求項１５記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
第２の抗原結合機能領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が、配列番号９および１１を含む、請求項１５記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
第１の抗原結合機能領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が、配列番号３および７をさらに含む、請求項１６記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
第２の抗原結合機能領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が、配列番号３および１３をさらに含む、請求項１７記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１５から１９のいずれか一項記載の単離ポリヌクレオチドを含む、組換え発現ベクター。
【請求項２１】
発現ベクターが、ｐＣＤＮＡから改変されたプラスミドベクターＸ０ＧＣである、請求項２０記載の組換え発現ベクター。
【請求項２２】
請求項１５から１９のいずれか一項記載の単離ポリヌクレオチド、または請求項２０もしくは２１記載の組換え発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２３】
ヒト胎児由来腎細胞ＨＥＫ２９３もしくはＨＥＫ２９３細胞から改変されたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ；ハムスター卵巣細胞ＣＨＯもしくはＣＨＯ細胞から改変されたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ；大腸菌(Escherichia coli)もしくは大腸菌から改変された大腸菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉ；酵母もしくは酵母から改変されたピキア酵母、出芽酵母、クルイベロマイセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ；昆虫細胞もしくは昆虫細胞から改変されたＨｉｇｈ５、ＳＦ９細胞；植物細胞；哺乳動物の乳房細胞、体細胞、から選択される、請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１から１４のいずれか一項記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体、請求項１５から１９のいずれか一項記載の単離ポリヌクレオチド、請求項２０もしくは２１記載の組換え発現ベクター、または請求項２２もしくは２３記載の宿主細胞、および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項２５】
請求項１から１４のいずれか一項記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体の製造方法であって、
１）請求項１５から１９のいずれか一項記載の単離ポリヌクレオチドまたは請求項２０もしくは２１記載の組換え発現ベクターを宿主細胞中で発現させる工程；
２）宿主細胞中でそれぞれ発現されたタンパク質を還元する工程；および
３）還元タンパク質を混合し、混合物を酸化する工程
を含む、方法。
【請求項２６】
宿主細胞が、ヒト胎児由来腎細胞ＨＥＫ２９３もしくはＨＥＫ２９３細胞から改変されたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｅ；ハムスター卵巣細胞ＣＨＯもしくはＣＨＯ細胞から改変されたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ；大腸菌もしくは大腸菌から改変された大腸菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉ；酵母もしくは酵母から改変されたピキア酵母、出芽酵母、クルイベロマイセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ；昆虫細胞もしくは昆虫細胞から改変されたＨｉｇｈ５、ＳＦ９細胞；植物細胞；哺乳動物の乳房細胞、体細胞から選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
還元工程が、１）２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンまたは他の化学誘導体からなる群より選択される還元剤の存在下で、還元反応を行い；２）還元剤を除去する
ことを含む、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項２８】
酸化工程が、空気中での酸化であり、Ｌ−デヒドロアスコルビン酸またはその化学誘導体からなる群より選択される酸化剤の存在下で、酸化反応を行うことも含む、請求項２５から２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
分離および精製工程をさらに含む、請求項２５から２８のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
対象において疾患を予防および／または処置するための医薬の製造を目的とする、請求項１から１４のいずれか一項記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体、および／または請求項１５から１９のいずれか一項記載の単離ポリヌクレオチド、および／または請求項２０もしくは２１記載の組換え発現ベクター、および／または請求項２２もしくは２３記載の宿主細胞、および／または請求項２４記載の組成物の、使用。
【請求項３１】
対象において疾患を予防および／または処置するための医薬として使用するための、請求項１から１４のいずれか一項記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体、および／または請求項１５から１９のいずれか一項記載の単離ポリヌクレオチド、および／または請求項２０もしくは２１記載の組換え発現ベクター、および／または請求項２２もしくは２３記載の宿主細胞、および／または請求項２４記載の組成物。
【請求項３２】
疾患を予防および／または処置する方法であって、請求項１から１４のいずれか一項記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体、および／または請求項１５から１９のいずれか一項記載の単離ポリヌクレオチド、および／または請求項２０もしくは２１記載の組換え発現ベクター、および／または請求項２２もしくは２３記載の宿主細胞、および／または請求項２４記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項３３】
対象が哺乳動物、好ましくは、ヒト対象である、請求項３０記載の使用、請求項３１記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体、単離ポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、宿主細胞または組成物、あるいは請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
疾患が、以下の腫瘍：白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、上咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫、小細胞肺癌、骨癌から選択される、請求項３０記載の使用、請求項３１記載のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体、単離ポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、宿主細胞または組成物、あるいは請求項３２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、天然抗体様構造を有し、ヘテロ二量体形態の抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７二重特異性抗体、ならびにその製造方法に関する。具体的には、本発明は、天然ＩｇＧ特性を有し、重鎖と軽鎖がミスマッチすることなく高度に安定なヘテロ二量体形態である、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７二重特異性抗体、ならびにその製造方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景
プログラムされた細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）は、免疫チェックポイントのプログラムされた細胞死−１（ＰＤ−１）のリガンドであり、Ｂ７ファミリーに属し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＤＣ細胞および内皮細胞、上皮細胞などを含む種々の免疫細胞の表面に発現されるように誘導される。ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合した後、それは主にＴ細胞活性化の負の調節に関与し、免疫応答の強さおよび持続時間を調整できる。ＰＤ−１リガンドであることに加えて、ＰＤ−Ｌ１はＣＤ８０のリガンドとしても機能し、Ｔ細胞に負の調節シグナルを伝達し、Ｔ細胞の免疫寛容を誘導する（Autoimmun Rev, 2013, 12(11): 1091-1100. Front Immunol, 2013、4: 481. Nat Rev Cancer, 2012, 12(4): 252-264. Trends Mol Med. 2015 Jan;21(1):24-33. Clin Cancer Res. 2012 Dec 15;18(24):6580-7）。通常の状況下では、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１は、身体組織の自己免疫寛容を媒介および維持し、免疫系が過度に活性化されて炎症反応によって自身の組織を損傷するのを防ぎ、そして自己免疫疾患の発症の回避に正の効果を有し得る。病的状態下では、腫瘍免疫や様々な自己免疫疾患の発症と進展に関与している。ＰＤ−Ｌ１は種々の腫瘍組織で高発現しており、ＰＤ−１は腫瘍浸潤リンパ球で高発現しており、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の過剰発現は、腫瘍の臨床的予後不良と密接に関連していることが多くの研究で報告されている（Anticancer Agents Med Chem. 2015;15(3):307-13. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 2014 Mar;7(1):1-17. Trends Mol Med. 2015 Jan;21(1):24-33. Immunity. 2013 Jul 25;39(1):61-73. J Clin Oncol. 2015 Jun 10;33(17):1974-82）。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１とＣＤ８０／ＰＤ−Ｌ１の相互作用を阻止するＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の使用は、前臨床試験およびと臨床治験で優れた抗腫瘍効果を示している。現在、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、非小細胞肺癌や尿路上皮癌などのさまざまな腫瘍の処置に承認されている。しかしながら、わずかな腫瘍患者のみが、このタイプのモノクローナル抗体療法の恩恵を受けることができ、ほとんどの患者は、このタイプのモノクローナル抗体に応答しない（Expert Opin Ther Targets. 2014 Dec;18(12):1407-20. Oncology (Williston Park). 2014 Nov;28 Suppl 3:15-28）。
【０００３】
ＣＤ４７は、インテグリン関連タンパク質とも呼ばれ、５０ｋＤの膜貫通タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。これは、種々の細胞上に広範に発現されるが、その発現は種々の腫瘍細胞で顕著に増強される（Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109(17): 6662-6667）。ＣＤ４７のリガンドは、主にマクロファージで発現されるシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）である。ＣＤ４７に結合すると、“私を食べないで（don't eat me）”というシグナルを伝達し、マクロファージの食作用を阻害する（Curr Opin Immunol, 2009, 21(1):47-52）。抗ＣＤ４７抗体の使用は、ＣＤ４７−ＳＩＲＰαシグナル伝達経路を阻害でき、それによって抗腫瘍効果を発揮する。現在、さまざまな抗ＣＤ４７モノクローナル抗体が、さまざまな血液の癌および固形腫瘍の処置のための臨床研究段階に入っている。ただし、ＣＤ４７は赤血球の表面にも発現しているため、これらの抗ＣＤ４７療法は、貧血および血小板減少症などの深刻な副作用を引き起こし、バイオアベイラビリティが低下し得る。
【０００４】
この分野では、ＰＤ−Ｌ１およびＣＤ４７シグナル伝達経路の両方を遮断する新規治療剤を検討する必要がある。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本発明は、ＰＤ−Ｌ１およびＣＤ４７を同時に遮断することができ、天然ＩｇＧ構造特性を有し、重鎖および軽鎖ミスマッチのない高度に安定なヘテロ二量体形態を有する新規の二機能性抗体ならびにその製造方法を提供する。二機能性抗体は、ＰＤ−Ｌ１およびＣＤ４７を同時に発現する腫瘍細胞に選択的に結合し、それにより効果的かつ特異的細胞致死効果を発揮するが、毒性が低く、副作用が少ない傾向がある。
【０００６】
本発明の第１の面は、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖、ならびにＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し得る第１の抗原結合機能領域およびＣＤ４７に特異的に結合し得る第２の抗原結合機能領域を含む、ヘテロ二量体形態の二重特異性抗体であって、
ここで、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖がそれぞれ、１つのアミノ酸置換を含む免疫グロブリンＧ Ｆｃフラグメントであり、該第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖が合して、Ｆｃ受容体に結合し得るヘテロ二量体を構成し、
ここで、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖が、それぞれ、共有結合またはリンカーにより第１の抗原結合機能領域および第２の抗原結合機能領域に連結されており、そして
ここで、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方が、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付けシステムに従って番号付けされているアミノ酸位置３６６および３９９でのアミノ酸置換を含み、他方が、アミノ酸位置３５１、４０７および４０９でのアミノ酸置換を含む、ヘテロ二量体形態の二重特異性抗体に関する。
【０００７】
本明細書中、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖は、存在する２つのＦｃ鎖を区別する目的でのみ定義されており、重要性やその順序が異なっていることを意味しない。同時に、第１の抗原結合機能領域および第２の抗原結合機能領域への第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖の結合もまた、任意である。すなわち、第１のＦｃ鎖は、第１の抗原結合機能領域または第２の抗原結合ドメインに結合し得て、このことは第２のＦｃ鎖についても同様である。
【０００８】
ある態様にいて、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖アミノ酸置換は、以下の通りである：
ａ）Ｌ３５１Ｇ、Ｌ３５１Ｙ、Ｌ３５１Ｖ、Ｌ３５１Ｐ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｅ、Ｌ３５１ＫまたはＬ３５１Ｗ；
ｂ）Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｐ、Ｔ３６６ＷまたはＴ３６６Ｖ；
ｃ）Ｄ３９９Ｃ、Ｄ３９９Ｎ、Ｄ３９９Ｉ、Ｄ３９９Ｇ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９ＴまたはＤ３９９Ａ；
ｄ）Ｙ４０７Ｌ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｐ、Ｙ４０７Ｆ、Ｙ４０７ＴまたはＹ４０７Ｈ；および
ｅ）Ｋ４０９Ｃ、Ｋ４０９Ｐ、Ｋ４０９Ｓ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｖ、Ｋ４０９ＱまたはＫ４０９Ｒ。
【０００９】
ある態様において、アミノ酸置換は、
ａ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＬおよびＤ３９９Ｒ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７ＬおよびＫ４０９Ｖ置換；
ｂ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＬおよびＤ３９９Ｃ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｇ、Ｙ４０７ＬおよびＫ４０９Ｃ置換；
ｃ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＬおよびＤ３９９Ｃ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７ＡおよびＫ４０９Ｐ置換；
ｄ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＰおよびＤ３９９Ｎ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｖ、Ｙ４０７ＰおよびＫ４０９Ｓ置換；
ｅ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＷおよびＤ３９９Ｇ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｄ、Ｙ４０７ＰおよびＫ４０９Ｓ置換；
ｆ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＰおよびＤ３９９Ｉ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｐ、Ｙ４０７ＦおよびＫ４０９Ｆ置換；
ｇ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＶおよびＤ３９９Ｔ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｋ、Ｙ４０７ＴおよびＫ４０９Ｑ置換；
ｈ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＬおよびＤ３９９Ａ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｗ、Ｙ４０７ＨおよびＫ４０９Ｒ置換
を含む。
【００１０】
ある態様において、アミノ酸置換は、
ａ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＬおよびＫ４０９Ｖ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７ＬおよびＤ３９９Ｒ置換；
ｂ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＬおよびＫ４０９Ｃ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｇ、Ｙ４０７ＬおよびＤ３９９Ｃ置換；
ｃ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＬおよびＫ４０９Ｐ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７ＡおよびＤ３９９Ｃ置換；
ｄ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＰおよびＫ４０９Ｓ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｖ、Ｙ４０７ＰおよびＤ３９９Ｎ置換；
ｅ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＷおよびＫ４０９Ｓ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｄ、Ｙ４０７ＰおよびＤ３９９Ｇ置換；
ｆ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＰおよびＫ４０９Ｆ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｐ、Ｙ４０７ＦおよびＤ３９９Ｉ置換；
ｇ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＶおよびＫ４０９Ｑ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｋ、Ｙ４０７ＴおよびＤ３９９Ｔ置換；
ｈ）第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方において、Ｔ３６６ＬおよびＫ４０９Ｒ置換、そして他方において、Ｌ３５１Ｗ、Ｙ４０７ＨおよびＤ３９９Ａ置換
を含む。
【００１１】
ある態様において、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のいずれか一方におけるアミノ酸が、Ｔ３６６ＬおよびＤ３９９Ｒに置換され、他方におけるアミノ酸が、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７ＬおよびＫ４０９Ｖに置換される。
【００１２】
ある態様において、第１の抗原結合機能領域および第２の抗原結合機能領域は、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、可変ドメインフラグメントＦｖおよび重鎖抗体の重鎖可変領域フラグメントＶＨＨから選択される。
【００１３】
ある態様において、第１の抗原結合機能領域および第２の抗原結合機能領域は両方とも、Ｆａｂフラグメントである。
【００１４】
ある態様において、第１の抗原結合機能領域および第２の抗原結合機能領域のうち一方が、Ｆａｂフラグメントであり、他方がｓｃＦｖである。
【００１５】
ある態様において、Ｆａｂフラグメントは、異なる第１の重鎖可変領域および第２の重鎖可変領域、ならびに異なる第１の軽鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域を含む。
【００１６】
ある態様において、還元剤が存在し、他のポリペプチドを含まない溶液中の場合、第１のＦｃ鎖およびそれに共有結合した第１の抗原結合機能領域ならびに第２のＦｃ鎖およびそれに共有結合した第２の抗原結合機能領域に、第１のＦｃ鎖およびそれに共有結合した第１の抗原結合機能領域ならびに第２のＦｃ鎖およびそれに共有結合した第２の抗原−抗原結合機能領域を加えて、すべてのポリペプチド鎖の重量に基づき５０％未満のホモ二量体を形成する。
【００１７】
ある態様において、第１の抗原結合機能領域は、配列番号２および６のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
ある態様において、第２の抗原結合機能領域は、配列番号１０および１２のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
ある態様において、第１の抗原結合機能領域は、配列番号４および８のアミノ酸配列をさらに含む。
【００２０】
ある態様において、第２の抗原結合機能領域は、配列番号４および１４のアミノ酸配列をさらに含む。
【００２１】
ある態様において、二重特異性抗体のアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４の対応する組み合わせである。例えば、配列番号２、４、６および８は、互いに組み合わされ、配列番号１０、４、１２および１４は、互いに組み合わされ、次いで、合わされた２つは、さらに組み合わされて本発明の二重特異性抗体を形成する。
【００２２】
本発明の第２の面は、第１面のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体をコード化する単離ポリヌクレオチドに関する。
【００２３】
ある態様において、第１の抗原結合機能領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１および５から選択される。
【００２４】
ある態様において、第２の抗原結合機能領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９および１１から選択される。
【００２５】
ある態様において、第１の抗原結合機能領域のアミノ酸をコード化するヌクレオチド配列は、配列番号３および７からさらに選択される。
【００２６】
ある態様において、第２の抗原結合機能領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３および１３からさらに選択される。
【００２７】
ある態様において、ポリヌクレオチドの配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３の対応する組み合わせである。例えば、配列番号１、３、５および７は、互いに組み合わされ、配列番号９、３、１１および１３は、互いに組み合わされる。
【００２８】
本発明の第３の面は、第２の面の単離ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターに関する。
【００２９】
ある態様において、発現ベクターは、ｐＣＤＮＡから改変されたプラスミドベクターＸ０ＧＣである。
【００３０】
本発明の第４の面は、第２の面の単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または第３の面の組換え発現ベクターに関する。
【００３１】
ある態様において、宿主細胞は、ヒト胎児由来腎細胞ＨＥＫ２９３もしくはＨＥＫ２９３細胞から改変されたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｅ；ハムスター卵巣細胞ＣＨＯもしくはＣＨＯ細胞から改変されたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ；大腸菌（Escherichia coli）もしくは大腸菌から改変された大腸菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉ；酵母もしくは酵母から改変されたピキア酵母、出芽酵母、クルイベロマイセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ；昆虫細胞もしくは昆虫細胞から改変されたＨｉｇｈ５、ＳＦ９細胞；植物細胞；哺乳動物の乳房細胞、体細胞から選択される。
【００３２】
本発明の第５の面は、第１の面のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体、または第２の面の単離ポリヌクレオチド、または第３の面の組換え発現ベクター、または第４の面の宿主細胞、および薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。
【００３３】
本発明の第６の面は、第１の面のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体の製造方法に関し、当該製造方法は、以下の工程を含む：
１）第２の面の単離ポリヌクレオチドまたは第３の面の組換え発現ベクターをそれぞれ宿主細胞中で発現させる工程；
２）宿主細胞中でそれぞれ発現されたタンパク質を還元する工程；および
３）還元タンパク質を混合し、混合物を酸化する工程。
【００３４】
ある態様において、宿主細胞は、ヒト胎児由来腎細胞ＨＥＫ２９３もしくはＨＥＫ２９３細胞から改変されたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｅ；ハムスター卵巣細胞ＣＨＯもしくはＣＨＯ細胞から改変されたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ；大腸菌(Escherichia coli)もしくは大腸菌から改変された大腸菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉ；酵母もしくは酵母から改変されたピキア酵母、出芽酵母、クルイベロマイセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ；昆虫細胞もしくは昆虫細胞から改変されたＨｉｇｈ５、ＳＦ９細胞；植物細胞；哺乳動物の乳房細胞、体細胞から選択される。
【００３５】
ある態様において、還元工程は、１）２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンまたは他の化学誘導体からなる群より選択される還元剤の存在下で、還元反応を行うこと；２）還元剤を除去すること、例えば、０．１ｍＭ以上の濃度のジチオスレイトールの存在下、４℃にて少なくとも３時間還元反応を行うことを含む。還元剤のおよび還元反応条件の説明は、本明細書の還元剤および還元反応の使用に伴う他の状況にも適用される。
【００３６】
ある態様において、酸化工程が、空気中での酸化であり、Ｌ−デヒドロアスコルビン酸またはその化学誘導体からなる群より選択される酸化剤の存在下で、酸化反応を行うことも含む。例えば、酸化反応は、０．５ｍＭ以上の濃度でＬ−デヒドロアスコルビン酸の存在下、４℃にて少なくとも５時間行われる。
【００３７】
ある態様において、該方法はさらに、分離および精製工程を含む。
【００３８】
本発明の第７の面は、対象において疾患を予防および／または処置するための医薬の製造を目的とする、第１の面のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体および／または第２の面の単離ポリヌクレオチドおよび／または第３の面の組換え発現ベクターおよび／または第４の面の宿主細胞および／または第５の面の組成物の使用に関する。
【００３９】
本発明の第８の面は、対象において疾患を予防および／または処置するための医薬として使用するための、第１の面のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体および／または第２の面の単離ポリヌクレオチドおよび／または第３の面の組換え発現ベクターおよび／または第４の面の宿主細胞および／または第５の面の組成物の使用に関する。
【００４０】
本発明の第９の面は、疾患を予防および／または処置する方法であって、第１の面のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体および／または第２の面の単離ポリヌクレオチドおよび／または第３の面の組換え発現ベクターおよび／または第４の面の宿主細胞および／または第５の面の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。
【００４１】
ある態様において、対象は哺乳動物であり、好ましくはヒト対象である。
【００４２】
ある態様において、疾患は、以下の腫瘍：白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、上咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫、小細胞肺癌、骨癌から選択される。
【００４３】
本発明は、新規のヘテロ二量体形態の抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７天然抗体構造様二重特異性抗体を設計する 。これは、天然ＩｇＧの特性を有しており、重鎖および軽鎖ミスマッチを有さず、およびヘテロ二量体形態の高度に安定な抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７二重特異性抗体である。本発明により調製された二重特異性抗体は、２つの標的分子ＰＤ−Ｌ１およびＣＤ４７に同時に結合することができ、複合疾患の処置に適用すると、単一の治療薬よりも優れた効果を発揮し得る。同時に、複数の薬剤の併用療法に比べて、単一の治療分子としての二重特異性抗体は、患者および医療従事者の使用を容易にするだけでなく、複雑な新薬開発プロセスを簡素化する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、抗ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ１の溶出ピーククロマトグラムを示す。
【図２】図２は、抗ＣＤ４７−Ｆｃ２の溶出ピーククロマトグラムを示す。
【図３】図３は、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体分子の構造を示す。
【図４】図４は、１つの重鎖および１つの軽鎖の半抗体分子の構造を示す。
【図５】図５は、１つの重鎖および１つの軽鎖の半抗体分子のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す。パネルＡおよびパネルＢは、抗ＰＤ−Ｌ１半抗体分子および抗ＣＤ４７半抗体分子それぞれの結果を示す。
【図６】図６は、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体分子のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図７】図７は、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体分子のＲＰＣ分析の結果を示す。
【図８】図８は、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体分子のＣＥ分析の結果を示す。
【図９】図９パネルＡは、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体のＰＤ−Ｌ１に対する親和性を示す。パネルＢは、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体のＣＤ４７に対する親和性を示す。
【図１０】図１０は、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体およびＣＤ４７の組み合わせが、ＰＤ−Ｌ１およびＣＤ４７に同時に結合できず、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体のみが、２つの抗原に同時に結合する活性を有することを示す。
【図１１】図１１パネルＡおよびＢは、ＨＣＣ８２７およびＲＢＣのそれぞれに対する、ＣＤ４７モノクローナル抗体の結合活性および抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体の結合活性を示す。
【図１２】図１２は、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体のＴ細胞調節活性を示す。
【図１３】図１３は、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体により仲介される腫瘍細胞上のマクロファージの食作用活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
詳細な説明
定義：
共有結合とは、ヘテロ二量体形態の二重特異性抗体において、２つのＦｃ鎖ならびに一方のＦｃ鎖および抗原結合機能領域が、共有結合により連結されて１つの分子になることを意味し、ここで、Ｆｃ鎖は、１以上の共有結合（ジスルフィド結合鎖など）を介して連結された第１の抗原結合機能領域および第２の抗原結合機能領域を含む。第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖はそれぞれ、共有結合（例えば、イミン結合またはアミド結合）を介して機能的抗原領域に連結されている。
【００４６】
抗原結合機能領域とは、抗原などの標的分子と特異的に相互作用できる領域を意味し、その選択性は高い。１つの標的分子を認識する配列は、通常、他の分子の配列を認識することができない。代表的な抗原結合機能領域は、抗体可変領域、抗体可変領域の構造変異体、受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、または酵素結合ドメインを含む。
【００４７】
１以上のジスルフィド結合鎖間の結合は、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖が１以上のジスルフィド結合鎖を介して連結されてヘテロ二量体フラグメントを形成することを意味する。本発明において、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖、または第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖およびそれらに連結された抗原結合機能領域が同じ細胞中で合成されるとき、または第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖、または第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖およびそれらに連結された抗原結合機能領域が異なる細胞中で別個に合成され、次いでインビトロで還元および酸化方法により形成されるとき、１以上のジスルフィド結合が形成され得る。
【００４８】
第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖は、共有結合によって形成される結合フラグメントを意味する。共有結合は、ジスルフィド結合を含み、各鎖は免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも一部を含む。また、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖は、少なくとも１つの異なるアミノ酸を含み、アミノ酸配列が異なる。本発明において第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖において、同一の鎖との間には強い相互反発があり、異なる鎖間には相互親和性がある。従って、細胞内で共発現させると、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖、または第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖およびそれらに連結された抗原結合機能領域は、ヘテロ二量体を形成する傾向がある。第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖、または第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖およびそれらに連結された抗原結合機能領域が２つの宿主細胞中でそれぞれ発現されるとき、第１のＦｃ鎖または第１のＦｃ鎖およびそれに結合された抗原結合機能領域は、ホモ二量体を形成する傾向はなく、第２のＦｃ鎖または第２のＦｃ鎖およびそれに連結された抗原結合機能領域は、ホモ二量体を形成する傾向がない。本発明において、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖、または第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖およびそれらに連結された抗原結合機能領域が、それぞれ２つの宿主細胞中、還元剤の存在下で発現されるとき、ホモ二量体の比率は５０％未満であり、すなわち、単量体（１つのＦｃ鎖または１つのＦｃ鎖およびそれに連結された抗原結合機能領域）の割合は、５０％よりも大きい。
【００４９】
免疫グロブリンは、そのうち２つが同一の重鎖であり、それは比較的長く、比較的大きい分子量を有し、４５０から５５０アミノ酸残基を含み、かつ５５，０００から７０，０００Ｄａの間の相対分子量を有し；そのうち２つが同一の軽鎖（Ｌ鎖）であり、それは比較的短く、比較的小さい分子量を有し、かつ約２１０アミノ酸残基を含み、約２４，０００Ｄａの相対分子量を有する、４つのポリペプチド鎖を有する対称構造である。Ｎ末端付近の約１１０アミノ酸の配列は、異なる免疫グロブリン重鎖および軽鎖間で顕著に異なり、これは可変領域（Ｖ領域）と呼ばれており、一方、Ｃ末端付近の残りのアミノ酸配列は、比較的安定であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれている。重鎖において、可変領域は、重鎖の長さの約１／４を構成し、定常領域は、重鎖の長さの約３／４を構成する。５つの既知のＩｇ、ＩｇＧ（γ）、ＩｇＡ（α）、ＩｇＤ（δ）、ＩｇＭ（μ）およびＩｇＥ（ε）について、Ｉｇの最初の３つのクラスは、Ｈ鎖に３つの定常領域、すなわちＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を有する。後の２つのクラス（ＩｇＭおよびＩｇＥ）のＨ鎖は、ＶＨ領域および４つの定常領域、すなわちＣＨ１からＣＨ４を有する。定常領域は、免疫グロブリン分子の骨格であるだけでなく、免疫応答を活性化する部位の１つでもある。本発明の実施例はＩｇＧに関するが、当業者は、要すれば、本発明の抗体クラスを公知の方法によって切り替えることができことを知っている。例えば、もともとＩｇＭであった本発明の抗体は、本発明のＩｇＧ抗体にクラススイッチすることができる。さらに、クラススイッチング技術を用いて、あるＩｇＧサブクラスを別のＩｇＧサブクラスに変換する、たとえばＩｇＧ１からＩｇＧ２に変換することができる。従って、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療用途のためのアイソタイプスイッチングにより、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体に変化させることができる。ある実施例において、本発明の抗体は、ＩｇＧ１、κのような、ＩｇＧ抗体である。
【００５０】
本発明における定常領域の一部は、少なくとも第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖が相互作用する領域を含む。ＩｇＧに関して、この領域は、少なくともＧＬＮ３４７、ＴＹＲ３４９、ＴＨＲ３５０、ＬＥＵ３５１、ＳＥＲ３５４、ＡＲＧ３５５、ＡＳＰ３５６、ＧＬＵ３５７、ＬＹＳ３６０、ＳＥＲ３６４、ＴＨＲ３６６、ＬＥＵ３６８、ＬＹＳ３７０、ＡＳＮ３９０、ＬＹＳ３９２、ＴＨＲ３９４、ＰＲＯ３９５、ＶＡＬ３９７、ＡＳＰ３９９、ＳＥＲ４００、ＰＨＥ４０５、ＴＹＲ４０７、ＬＹＳ４０９、ＬＹＳ４３９を含む、ＣＨ３領域に位置するアミノ酸部分である。
【００５１】
共有結合またはリンカーを介して、それぞれ、抗原結合機能領域に連結された第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖は、抗原結合機能領域に連結された第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖が、抗体の抗原結合フラグメント、または抗原を認識し得る一本鎖抗体、抗原を認識し得る他の抗体フラグメント変異体、リガンドを認識し得る受容体、または共有結合もしくはリンカーを介して受容体を認識し得るリガンドに連結したことを意味する。共有結合は、化学結合の一種であり、２個以上の原子が結合して、それらの外殻の電子を共有して、理想の条件下で、電子飽和の状態が達成され、それにより化学結合と称される相対的に安定な化学構造が形成されるか、または共有結合は、共有電子対によって形成された原子間の相互作用である。同じ元素の原子または異なる元素の原子は、共有結合を介してすべて連結され得る。本発明の第１のＦｃ鎖と第２のＦｃ鎖との間の共有結合は、１つの分子のアミノ酸のアミノ基と別の分子のアミノ酸のカルボキシル基との間の脱水によって形成されるアミド結合、あるいはエチレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのアルデヒド基または他の化合物またはそのポリマーと１分子のアミノ酸のアミノ基との間に形成されるアミノ結合またはイミド結合を含むが、これらに限定されない。リンカーは、共有結合を介して２つのポリペプチド鎖を連結することができる、アミノ酸配列または化合物または化合物の多量体であり、ここで、該アミノ酸配列は、例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳなどの小ペプチドを含むが、これに限定されず、該アミノ酸配列は、第１のＦｃ鎖または第２のＦｃ鎖および抗原を認識し得る一本鎖抗体、またはアミド結合を介して抗原を認識し得る他の抗体フラグメントの構造変異体に結合する。
【００５２】
第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖は、ヘテロ二量体を形成する傾向があり、ホモ二量体を形成する傾向はなく、このことは、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖において、同じポリペプチド鎖間には強力な反発力が存在し、異なるポリペプチド鎖間には引力が存在するため、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖、または第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖およびそれに結合する抗原結合機能領域は、細胞中で共発現されるとき、ヘテロ二量体を形成する傾向がある。第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖、または第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖およびそれに結合する抗原結合機能領域は、それぞれ、２つの宿主細胞で発現され、第１のＦｃ鎖、または第１のＦｃ鎖およびそれに結合する抗原結合機能領域は、ホモ二量体を形成する傾向はなく、そして第２のＦｃ鎖、または第２のＦｃ鎖およびそれに結合する抗原結合機能領域もまた、ホモ二量体を形成する傾向はない。
【００５３】
ＫａｂａｔのＥＵ番号付けシステムは、Ｋａｂａｔが抗体配列の各アミノ酸に番号を割り当てることを意味し、各残基の番号を割り当てるこの方法は、この分野で標準手法となっている。Ｋａｂａｔの方法は、保存されたアミノ酸に基づいてＫａｂａｔによって特定されたコンセンサス配列の１つと標的抗体を整列させることにより、Ｋａｂａｔの範囲に含まれていない他の抗体にも拡張できる。
【００５４】
Ｆｃドメインとは、結晶化可能なフラグメント（Ｆｃ）を意味し、ＩｇのＣＨ２およびＣＨ３構造ドメインに対応し、そしてＩｇとエフェクター分子間または細胞間の相互作用が生じる部位である。
【００５５】
ＩｇＧとは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の略語で、血清中の抗体の主成分である。ヒトＩｇＧは、ＩｇＧ分子におけるｒ鎖の抗原性の違いに基づき、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の４つのサブクラスを有する。
【００５６】
半抗体分子とは、抗体の１つの重鎖および１つの軽鎖によって形成される構造を意味し、ここで、該重鎖および軽鎖は、共有結合により連結されているか、または共有結合なしで形成される、抗原を認識する一価の抗体構造を有している。
【００５７】
Ｆａｂフラグメントは、分子認識配列であり、抗原結合（Ｆａｂ）のフラグメントであり、抗体分子の２つのアームに対応し、それぞれが完全な軽鎖ならびに重鎖のＶＨおよびＣＨ１構造ドメインで構成されている。ｓｃＦｖは、分子認識配列であり、抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を遺伝子操作して得られた抗体フラグメントの構造異性体である。膜受容体の細胞外ドメインは、分子認識配列であり、膜受容体は通常、細胞外に位置し、対応する抗原またはリガンドを認識して結合する細胞外領域、受容体を細胞表面上に固定する膜貫通領域ならびに細胞内キナーゼ活性もしくはシグナル伝達経路を有する細胞内領域含む。細胞膜受容体のリガンドは、膜受容体の細胞外領域によって認識され結合され得るタンパク質、小ペプチドまたは化合物を意味する。サイトカインは、免疫原、マイトジェンまたは他の刺激物質によって誘導されるさまざまな種類の細胞によって産生される低分子量の可溶性タンパク質であり、自然免疫および適応免疫の調節、造血、細胞増殖、ＡＰＳＣ多能性細胞および損傷組織修復などの種々の機能を有している。サイトカインは、インターロイキン類、インターフェロン類、腫瘍壊死因子スーパーファミリー、コロニー刺激因子、走化性因子、増殖因子などに分類される。タンパク質発現タグは、標的タンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加されたアミノ酸配列を意味し、小さなペプチドまたは長いアミノ酸であり得る。タグの追加は、タンパク質の正しい折りたたみ、タンパク質の単離および精製、ならびに細胞内タンパク質の分解に有利であり得る。頻繁に用いられるタグとしては、ＨＡ、ＳＵＭＯ、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、ＧＦＰおよびＦｌａｇが含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体に適用可能な抗体に制限はない。好ましくは、疾患の処置および／または予防のために当技術分野で既に用いられている抗体は、本発明に適用することができる。
【００５９】
本発明のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体は、１以上の置換、欠失、付加および／または挿入を有し得る。例えば、いくつかのアミノ酸は、他のポリペプチド（例えば、抗原）または細胞に結合する能力を顕著に失うことなく、タンパク質の構造において他のアミノ酸と置換され得る。タンパク質の結合能力および特性がタンパク質の生物学的機能活性を決定するため、タンパク質配列上のいくつかのアミノ酸の置換は、その生物学的有用性または活性の顕著でない喪失を引き起こし得る。
【００６０】
多くの場合、ポリペプチド変異体は、１以上の保存的置換を含む。“保存的置換”とは、ペプチド化学分野の当業者がポリペプチドの二次構造および親水性を実質的に変化させないことを期待できるように、その中のアミノ酸が類似の特性を有する他のアミノ酸によって置換されることを意味する。
【００６１】
アミノ酸置換は、一般的に、疎水性、親水性、電荷、サイズなどのアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に基づく。上記のさまざまな特性を考慮した例示的置換は、当業者に周知であり、アルギニンおよびリシン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびに、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
【００６２】
本明細書で用いる用語“同一性”は、当技術分野で一般に知られている意味を有し、当業者は、異なる配列間の同一性を決定するための規則および基準にも精通しており、同一性とは、（必要に応じて、最大の相同性％を達成するために）配列を整列させギャップを導入した後の、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列変異体の配列と非変異体配列の残基との間の相同性の割合を意味する。本発明において、同一性の定義を満たしているとき、得られた変異体配列は、親配列が有する生物学的活性を有することも必要とされる。上記の活性を用いて変異配列をスクリーニングするための方法および手段は、当業者に周知である。このような変異配列は、本明細書の教示から当業者により容易に得られ得る。特定の態様において、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド変異体は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％もしくは９９．９％のポリヌクレオチドまたはポリペプチド同一性を有する。遺伝子コードの縮重のために、同じアミノ酸配列をコードするこれらの配列の変異体が存在する。
【００６３】
本発明の別の態様は、中程度から高度にストリンジェントな条件下で、本発明によって提供されるポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントまたはその相補配列にハイブリダイズできるポリヌクレオチド組成物を提供する。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野でよく知られている。説明の目的で、本発明のポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを試験するための適切な適度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液で事前洗浄し；５ｘＳＳＣ中、５０℃から６０℃にて一晩ハイブリダイゼーションを行い；そして、０．１％ＳＤＳを含む２ｘ、０．５ｘおよび０．２ｘＳＳＣでそれぞれ２回、６５℃にて２０分間洗浄することを含み得る。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが、例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩含有量および／またはハイブリダイゼーション温度を変化させることによって容易に操作できることを理解する。例えば、別の態様では、適切な高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、ハイブリダイゼーション温度を、例えば、６０℃から６５℃または６５℃から７０℃に上げることを除いて、上記の条件を含む。
【００６４】
本発明の宿主細胞は、外来遺伝子発現において用いられ得る任意の細胞であってよく、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
本発明のベクターとしては、細胞または生物の任意のタイプ内で複製できるベクターが挙げられ、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、コスミドおよびミニ染色体が挙げられる。いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、ポリヌクレオチドの伝播または複製に適するベクター、または本発明のポリペプチドの発現に適するベクターである。かかるベクターは、当技術分野で知られており、市販されている。
【００６６】
“ベクター”には、シャトルベクターおよび発現ベクターが含まれ得る。一般的に、プラスミド構築物は、それぞれ細菌におけるプラスミド複製および選択のための複製起点（例えば、ＣｏｌＥ１複製起点）および選択可能マーカー（例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性）も含み得る。“発現ベクター”とは、細菌または真核細胞における、抗体フラグメントを含む、本発明の抗体の発現に必要な制御配列または調節要素を含むベクターを意味する。
【００６７】
本発明のベクターは、外来遺伝子発現に用いられる任意のベクターであってよく、プラスミドベクターを含み得るが、これらに限定されず、ここで、プラスミドベクターは、少なくとも複製起点、プロモーター、目的の遺伝子、マルチクローニングサイト、選択マーカー遺伝子を含む。好ましくは、本発明のベクターとしては、Ｘ０ＧＣベクターなどのｐｃＤＮＡを改変することにより得られるプラスミドベクターが挙げられるが、これに限定されない。
【００６８】
本発明の対象としては、鳥類、爬虫類、哺乳動物などが挙げられ得る。哺乳動物としては、げっ歯動物、霊長動物が挙げられる。好ましくは、霊長動物にはヒトが含まれる。
【００６９】
本発明に関与する疾患の範囲としては、腫瘍が挙げられるが、これに限定されない。好ましくは、腫瘍には、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、上咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫、小細胞肺癌、骨癌が含まれ得る。
【００７０】
薬学的に許容される担体は、医薬分野で通常用いられる医薬担体、例えば、希釈剤、賦形剤、水など；デンプン、スクロース、ラクトース、微結晶セルロースなどの充填剤など；セルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチンおよびポリビニルピロリドンなどの結合剤；グリセリンなどの湿潤剤；カルボキシメチルデンプンナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、クロスカルメロース、寒天、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウムなどの崩壊剤など；第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；セタノール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤；カオリナイト、ベントナイトなどの吸着担体；タルク、ステアリン酸カルシウムおよびステアリン酸カルシウム、微粉化シリカゲル、ポリエチレングリコールなどの潤滑剤を意味する。加えて、香味剤、甘味料などの他の添加剤を組成物に添加してもよい。
【００７１】
ある態様において、本発明は、以下の技術的解決を提供する。
【００７２】
技術的解決１．ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し得る第１の抗原結合機能領域およびＣＤ４７に特異的に結合し得る第２の抗原結合機能領域を含むヘテロ二量体形態の二重特異性抗体であって、ここで、該二重特異性抗体は、１以上のジスルフィド結合鎖を介して連結された第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖を含み、該第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖は、ＰＤ−Ｌ１抗原結合機能領域およびＣＤ４７抗原結合機能領域それぞれに共有結合またはリンカーを介して連結されているか、または第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖は、ＣＤ４７抗原結合機能領域およびＰＤ−Ｌ１抗原結合機能領域それぞれに共有結合またはリンカーを介して連結されており；そして、該第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖は、以下の位置に５個のアミノ酸置換を含み：
１）第１のＦｃ鎖における位置３６６および３９９でのアミノ酸置換、ならびに第２のＦｃ鎖における位置３５１、４０７および４０９でのアミノ酸置換；または
２）第１のＦｃ鎖における位置３６６および４０９でのアミノ酸置換、ならびに第２のＦｃ鎖における位置３５１、３９９および４０７でのアミノ酸置換；
該上記のアミノ酸置換を含む第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖は、各々がホモ二量体を形成するよりむしろ、互いにヘテロ二量体を形成する傾向があり、
ここで、アミノ酸位置は、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付けシステムに従って番号付けされている、
ヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【００７３】
技術的解決２．技術的解決１のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体であって、ここで、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖のアミノ酸置換が、以下：
ａ）位置３５１でのグリシン、チロシン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシンまたはトリプトファンによる置換；
ｂ）位置３６６でのロイシン、プロリン、トリプトファンまたはバリンによる置換；
ｃ）位置３９９でのシステイン、アスパラギン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、スレオニンまたはアラニンによる置換；
ｄ）位置４０７でのロイシン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、スレオニンまたはヒスチジンによる置換；および
ｅ）位置４０９でのシステイン、プロリン、セリン、フェニルアラニン、バリン、グルタミンまたはアルギニンによる置換
である、
ヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【００７４】
技術的解決３．技術的解決１または２のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体であって、ここで、該アミノ酸置換が、
ａ）第１のＦｃ鎖におけるＴ３６６ＬおよびＤ３９９Ｒ置換、ならびに第２のＦｃ鎖におけるＬ３５１Ｅ、Ｙ４０７ＬおよびＫ４０９Ｖ置換；
ｂ）第１のＦｃ鎖におけるＴ３６６ＬおよびＤ３９９Ｃ置換、ならびに第２のＦｃ鎖におけるＬ３５１Ｇ、Ｙ４０７ＬおよびＫ４０９Ｃ置換；
ｃ）第１のＦｃ鎖におけるＴ３６６ＬおよびＤ３９９Ｃ置換、ならびに第２のＦｃ鎖におけるＬ３５１Ｙ、Ｙ４０７ＡおよびＫ４０９Ｐ置換；
ｄ）第１のＦｃ鎖におけるＴ３６６ＰおよびＤ３９９Ｎ置換、ならびに第２のＦｃ鎖Ｌ３５１Ｖ、Ｙ４０７ＰおよびＫ４０９Ｓ置換；
ｅ）第１のＦｃ鎖におけるＴ３６６ＷおよびＤ３９９Ｇ置換、ならびに第２のＦｃ鎖におけるＬ３５１Ｄ、Ｙ４０７ＰおよびＫ４０９Ｓ置換；
ｆ）第１のＦｃ鎖におけるＴ３６６ＰおよびＤ３９９Ｉ置換、ならびに第２のＦｃ鎖におけるＬ３５１Ｐ、Ｙ４０７ＦおよびＫ４０９Ｆ置換；
ｇ）第１のＦｃ鎖におけるＴ３６６ＶおよびＤ３９９Ｔ置換、ならびに第２のＦｃ鎖におけるＬ３５１Ｋ、Ｙ４０７ＴおよびＫ４０９Ｑ置換；
ｈ）第１のＦｃ鎖におけるＴ３６６ＬおよびＤ３９９Ａ置換、ならびに第２のＦｃ鎖におけるＬ３５１Ｗ、Ｙ４０７ＨおよびＫ４０９Ｒ置換
である、ヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【００７５】
技術的解決４．技術的解決１から３のいずれか１つのヘテロ二量体形態の二重特異性抗体であって、ここで、該アミノ酸置換が、
ａ）第１のＦｃ鎖におけるＴ３６６ＬおよびＫ４０９Ｖ置換、ならびに第２のＦｃ鎖におけるＬ３５１Ｅ、Ｙ４０７ＬおよびＤ３９９Ｒ置換；
ｂ）第１のＦｃ鎖におけるＴ３６６ＬおよびＫ４０９Ｃ置換、ならびに第２のＦｃ鎖におけるＬ３５１Ｇ、Ｙ４０７ＬおよびＤ３９９Ｃ置換；
ｃ）第１のＦｃ鎖におけるＴ３６６ＬおよびＫ４０９Ｐ置換、ならびに第２のＦｃ鎖におけるＬ３５１Ｙ、Ｙ４０７ＡおよびＤ３９９Ｃ置換；
ｄ）第１のＦｃ鎖におけるＴ３６６ＰおよびＫ４０９Ｓ置換、ならびに第２のＦｃ鎖Ｌ３５１Ｖ、Ｙ４０７ＰおよびＤ３９９Ｎ置換；
ｅ）第１のＦｃ鎖におけるＴ３６６ＷおよびＫ４０９Ｓ置換、ならびに第２のＦｃ鎖におけるＬ３５１Ｄ、Ｙ４０７ＰおよびＤ３９９Ｇ置換；
ｆ）第１のＦｃ鎖におけるＴ３６６ＰおよびＫ４０９Ｆ置換、ならびに第２のＦｃ鎖におけるＬ３５１Ｐ、Ｙ４０７ＦおよびＤ３９９Ｉ置換；
ｇ）第１のＦｃ鎖におけるＴ３６６ＶおよびＫ４０９Ｑ置換、ならびに第２のＦｃ鎖におけるＬ３５１Ｋ、Ｙ４０７ＴおよびＤ３９９Ｔ置換；
ｈ）第１のＦｃ鎖におけるＴ３６６ＬおよびＫ４０９Ｒ置換、ならびに第２のＦｃ鎖におけるＬ３５１Ｗ、Ｙ４０７ＨおよびＤ３９９Ａ置換
である、ヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【００７６】
技術的解決５．技術的解決１のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体であって、ここで、該第１のＦｃ鎖のアミノ酸は、Ｔ３６６ＬおよびＤ３９９Ｒにより置換され、第２のＦｃ鎖のアミノ酸は、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７ＬおよびＫ４０９Ｖにより置換されている、ヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【００７７】
技術的解決６．技術的解決１から５のいずれか１つのヘテロ二量体形態の二重特異性抗体であって、ここで該Ｆｃ鎖はＩｇＧに由来する、ヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【００７８】
技術的解決７．技術的解決１から６のいずれか１つのヘテロ二量体形態の二重特異性抗体であって、ここで、該ＰＤ-Ｌ１およびＣＤ４７抗原結合機能領域は、ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントである、ヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【００７９】
技術的解決８．技術的解決１から７のいずれか１つのヘテロ二量体形態の二重特異性抗体であって、ここで、該ＰＤ-Ｌ１およびＣＤ４７抗原結合機能領域が両方ともＦａｂフラグメントである、ヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【００８０】
技術的解決９．技術的解決１から７のいずれか１つのヘテロ二量体形態の二重特異性抗体であって、ここで、ＰＤ-Ｌ１およびＣＤ４７抗原結合機能領域の一方がＦａｂフラグメントであり、他方がｓｃＦｖである、ヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【００８１】
技術的解決１０．技術的解決７から９のいずれか１つのヘテロ二量体形態の二重特異性抗体であって、ここで、該Ｆａｂフラグメントが、異なる第１の重鎖可変領域および第２の重鎖可変領域、ならびに異なる第１の軽鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域を含む、ヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【００８２】
技術的解決１１．技術的解決１から１０のいずれか１つのヘテロ二量体形態の二重特異性抗体であって、ここで、第１のＦｃ鎖およびそれに連結されたＰＤ−Ｌ１抗原結合機能領域、ならびに第２のＦｃ鎖およびそれに連結されたＣＤ４７抗原結合機能領域、または第１のＦｃ鎖およびそれに連結されたＣＤ４７抗原結合機能領域、および第２のＦｃ鎖およびそれに連結されたＰＤ−Ｌ１抗原結合機能領域が、単独で、または還元剤と共に存在し、重量に基づき５０％未満のホモ二量体を形成する、ヘテロ二量体形態の二重特異性抗体。
【００８３】
技術的解決１２．技術的解決１から１１のいずれか１つのヘテロ二量体形態の二重特異性抗体であって、ここで、該二重特異性抗体のアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４から選択される。
【００８４】
技術的解決１３．技術的解決１から１２のいずれか１つのヘテロ二量体形態の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド単離ポリヌクレオチド。
【００８５】
技術的解決１４．配列番号１、３、５、７、９、１１および１３から選択される配列を有する、技術的解決１３の単離ポリヌクレオチド。
【００８６】
技術的解決１５．技術的解決１３または１４の単離ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【００８７】
技術的解決１６．技術的解決１５の組換え発現ベクターであって、ここで該発現ベクターが、ｐＣＤＮＡから改変されたプラスミドベクターＸ０ＧＣである、組換え発現ベクター。
【００８８】
技術的解決１７．技術的解決１３または１４の単離ポリヌクレオチド、または技術的解決１５から１９のいずれか１つの組換え発現ベクターを含む、宿主細胞。
【００８９】
技術的解決１８．ヒト胎児由来腎細胞ＨＥＫ２９３もしくはＨＥＫ２９３細胞から改変されたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ；ハムスター卵巣細胞ＣＨＯもしくはＣＨＯ細胞から改変されたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ；大腸菌もしくは大腸菌から改変された大腸菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉ；酵母もしくは酵母から改変されたピキア酵母、出芽酵母、クルイベロマイセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ；昆虫細胞もしくは昆虫細胞から改変されたＨｉｇｈ５、ＳＦ９細胞；植物細胞；哺乳動物の乳房細胞、体細胞、から選択される、技術的解決１７の宿主細胞。
【００９０】
技術的解決１９．技術的解決１−１２のいずれか１つのヘテロ二量体形態の二重特異性抗体、技術的解決１３または１４の単離ポリヌクレオチド、技術的解決１５または１６の組換え発現ベクター、あるいは技術的解決１７または１８の宿主細胞、および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【００９１】
技術的解決２０．技術的解決１から１２のいずれか１つのヘテロ二量体形態の二重特異性抗体の製造方法であって、
１）技術的解決１３または１４の単離ポリヌクレオチドあるいは技術的解決１５または１６の組換え発現ベクターをそれぞれ宿主細胞中で発現させる工程；
２）宿主細胞中でそれぞれ発現されたタンパク質を還元する工程；および
３）還元タンパク質を混合し、混合物を酸化する工程
を含む、方法。
【００９２】
技術的解決２１．宿主細胞が、ヒト胎児由来腎細胞ＨＥＫ２９３もしくはＨＥＫ２９３細胞から改変されたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｅ；ハムスター卵巣細胞ＣＨＯもしくはＣＨＯ細胞から改変されたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ；大腸菌もしくは大腸菌から改変された大腸菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉ；酵母もしくは酵母から改変されたピキア酵母、出芽酵母、クルイベロマイセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ；昆虫細胞もしくは昆虫細胞から改変されたＨｉｇｈ５、ＳＦ９細胞；植物細胞；哺乳動物の乳房細胞、体細胞から選択される、技術的解決２０の方法。
【００９３】
技術的解決２２．還元工程が、１）２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンまたは他の化学誘導体からなる群より選択される還元剤を添加し；２）０．１ｍＭ以上の濃度のジチオスレイトールの存在下、４℃にて少なくとも３時間還元反応を行い、３）脱塩などにより還元剤を除去する
ことを含む、技術的解決２０または２１の方法。
【００９４】
技術的解決２３．酸化工程が、１）空気中での酸化であり、Ｌ−デヒドロアスコルビン酸または他の化学誘導体からなる群より選択される酸化剤を添加することも含み、２）０．５ｍＭ以上の濃度でＬ−デヒドロアスコルビン酸の存在下、４℃にて少なくとも５時間、酸化反応を行うことを含む、技術的解決２０から２２のいずれか１つの方法。
【００９５】
技術的解決２４．分離および精製工程をさらに含む、技術的解決２０から２３のいずれか１つの方法。
【００９６】
技術的解決２５．対象において疾患を予防および／または処置するための医薬の製造における、技術的解決１から１２のいずれか１つのヘテロ二量体形態の二重特異性抗体および／または技術的解決１３もしくは１４の単離ポリヌクレオチドおよび／または技術的解決１５もしくは１６の組換え発現ベクターおよび／または技術的解決１７もしくは１８の宿主細胞および／または技術的解決１９の組成物の使用。
【００９７】
技術的解決２６．対象において疾患を予防および／または処置するための医薬として使用するための、技術的解決１から１２のいずれか１つのヘテロ二量体形態の二重特異性抗体および／または技術的解決１３もしくは１４の単離ポリヌクレオチドおよび／または技術的解決１５もしくは１６の組換え発現ベクターおよび／または技術的解決１７もしくは１８の宿主細胞および／または技術的解決１９の組成物。
【００９８】
技術的解決２７．疾患を予防および／または処置する方法であって、技術的解決１から１２のいずれか１つのヘテロ二量体形態の二重特異性抗体および／または技術的解決１３もしくは１４の単離ポリヌクレオチドおよび／または技術的解決１５もしくは１６の組換え発現ベクターおよび／または技術的解決１７もしくは１８の宿主細胞および／または技術的解決１９の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【００９９】
技術的解決２８．対象が哺乳動物、好ましくは、ヒト対象である、技術的解決２５の使用、技術的解決２６のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体、単離ポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、宿主細胞または組成物、あるいは技術的解決２７の方法。
【０１００】
技術的解決２９．疾患が、以下の腫瘍：白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、上咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫、小細胞肺癌、骨癌から選択される、技術的解決２５の使用、技術的解決２６のヘテロ二量体形態の二重特異性抗体、単離ポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、宿主細胞または組成物、あるいは技術的解決２７の方法。
【０１０１】
以下、本発明を、以下の非限定的な実施例を参照してより詳細に説明する。本発明の趣旨を逸脱することなく、種々の変更が可能であり、それらも本発明の範囲に含まれることは、当業者には理解され得る。
【実施例】
【０１０２】
以下の試験方法は、特記されない限りすべて公知の方法であり、特記されない限り、使用する試験材料は事業者から容易に入手することができる。本発明の以下の実施例で用いられる諸種の抗体は、すべて商業的経路から得られる標準的な抗体である。
【０１０３】
実施例１：抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体分子のベクターの構築
抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖および軽鎖を含むＸ０ＧＣ発現ベクターをそれぞれ構築し、ここで、抗体の可変領域の配列は、http://imgt.org/mAb-DB/mAbcard−AbId=526に由来し、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１であった（Ｆｃ１、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ作用を排除するためにＮ２９７Ａ変異が導入された）。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列番号１に示されており、そのアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、配列番号３に示されており、そのアミノ酸配列は、配列番号４に示されている。重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列番号５に示されており、そのアミノ酸配列は、配列番号６に示されている。重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、配列番号７に示されており、そのアミノ酸配列は配列番号８に示されている。軽鎖可変領域および軽鎖定常領域、ならびに重鎖可変領域および重鎖定常領域をそれぞれＰＣＲで増幅させた。本発明の全てのＰＣＲ反応において、ＮＥＢ社のPhusion high-fidelity ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆ−５３０Ｌ）を用いた。ＰＣＲプライマーは、通常、塩基相補性の原理および酵素消化部位の必要性に従って公知法により設計された。反応システムはそれぞれ、８．９μｌのＨ２Ｏ、４μｌの５×Phusion high-fidelity ＤＮＡポリメラーゼバッファー、４μｌの１ｍＭ ｄＮＴＰ、１μｌのフォワードプライマー、１μｌのリバースプライマー、０．１μlのPhusion high-fidelity ＤＮＡポリメラーゼおよび１μｌのテンプレートで構成された。可変領域および定常領域のＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、対応するフラグメントをＤＮＡ回収キット（Promega、Ａ９２８２、以下同じ）を用いて回収した。回収された可変領域フラグメントおよび定常領域フラグメントをテンプレートとして用い、可変領域のフォワードプライマーおよび定常領域のリバースプライマーを用いて、ＰＣＲの別のサイクルを実施した。対応するフラグメントを再度回収し、軽鎖または重鎖の完全長フラグメントを得た。Ｘ０ＧＣベクターおよび完全長フラグメントを、ＥｃｏＲＩ（NEB、カタログ番号R3101L）およびＨｉｎｄＩＩＩ（NEB、カタログ番号R3104L）で酵素的に消化した。酵素消化システムは、２μｌの１０×バッファー３、各０．５μｌのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ、ゲルから回収した３μｌの完全長フラグメントおよび１４．５μｌのＨ２Ｏで構成された。酵素消化システムは、３７℃にて３時間反応させた。酵素消化産物を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（NEB、カタログ番号M0202V）（以下同じ）を用いて連結させ、反応システムを、２μlの１０×リガーゼバッファー、０．５μlのリガーゼ、ゲルから回収した３μｌの完全長フラグメント、ゲルから回収した３μlのＸ０ＧＣベクターおよび１１．５μｌのＨ２Ｏで構成した。ライゲーションは、室温にて１２時間行った。ライゲーション産物を大腸菌コンピテントセルＤＨ５α（Tiangen、CB104、以下同じ）中に形質転換した。真核細胞で抗体重鎖（Ｆｃ１）および軽鎖をそれぞれ発現させるために、該抗体重鎖および軽鎖のＸ０ＧＣ発現ベクターを得た。
【０１０４】
本発明において、抗ヒトＣＤ４７抗体の重鎖および軽鎖を含むＸ０ＧＣ発現ベクターをそれぞれ構築し、ここで、抗体の可変領域の配列は、ＷＯ２０１６１０９４１５Ａ１に由来した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列番号９に示されており、そのアミノ酸配列は、配列番号１０に示されている。軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、配列番号３に示されており、そのアミノ酸配列は配列番号４に示されている。重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列番号１１に示されており、そのアミノ酸配列は配列番号１２に示されている。重鎖定常領域のヌクレオチド配列は配列番号１３に示されており、そのアミノ酸配列は配列番号１４に示されている。抗体重鎖および軽鎖のＸ０ＧＣ発現ベクターを、真核細胞において抗体重鎖（Ｆｃ２）および軽鎖をそれぞれ発現させるために得た。
【０１０５】
実施例２：抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体分子の発現
抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖および軽鎖を含む発現ベクターをそれぞれ、２９３Ｆ細胞（FreeStyle（商標） 293-F細胞、カタログ番号R79007、Invitrogen)中にトランスフェクトし、抗ヒトＣＤ４７抗体の重鎖および軽鎖を含む発現ベクターもそれぞれ、２９３Ｆ細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの１日前に、細胞を播種した。トランスフェクション当日に、遠心により細胞を回収し、新鮮なFreeStyle（商標） 293 発現培地（カタログ番号12338001、Gibco）に２００×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。トランスフェクション量に応じてプラスミドを終濃度３６．６７μｇ／ｍＬまで加え、培地を穏やかに混合して均一にした。次いで、線形ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、直鎖状、分子量２５０００、カタログ番号４３８９６、Alfa Aesar）を終濃度５５μｇ／ｍＬで添加し、培地を穏やかに混合して均一にした。次いで、混合物をインキュベーターに入れ、１２０ｒｐｍシェーカーで３７℃にて１時間インキュベートした。その後、トランスフェクション量の１９倍量の新鮮な培地をそれに加えた。３７℃にて１２０ｒｐｍシェーカー上でインキュベーションを継続した。遠心分離により５から６日間トランスフェクションした細胞の培養上清を回収した。
【０１０６】
発現レベルをＥＬＩＳＡにより決定した。クロマトグラフィーカラムによる精製の前に、０．２μｍフィルターでろ過して沈殿物を除去した。この工程を４℃で行った。
【０１０７】
実施例３．抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体分子の発現産物の精製
精製を４℃にてAKTA explorer type 100 タンパク質精製システム（GE Healthcare）および親和性クロマトグラフィーカラムｒプロテインＡセファロース Fast Flow（16 mm I.D.、22 ml、GE Healthcare）を用いて行った。最初に、移動相Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）を用いて、クロマトグラフィーカラムを平衡化した。ベースラインが安定した後、上記の処理細胞の上清を５ｍＬ／分の流速で負荷した。サンプルを負荷後、平衡化は、移動相Ａを用いて行った。サンプルは、それぞれ、抗ＰＤ−Ｌ１発現産物および抗ＣＤ４７発現産物であった。その後、移動相Ｂ１（０．５Ｍアルギニンを含む移動相Ａ）を用いて、５カラム容量を溶出した。次いで、移動相Ｂ２（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０）を用いて、５カラム容量を溶出し、溶出ピーク、すなわち目的のタンパク質のピークを収集した。上記の洗浄工程中の流速は、すべて５ｍＬ／分であった。抗ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ１の溶出ピークのクロマトグラムを図１に示し、抗ＣＤ４７−Ｆｃ２の溶出ピークを図２に示す。示された溶出ピーク（図中、灰色の領域）を回収し、ｐＨを１Ｍ酢酸ナトリウム溶液の滴下によって５．０に調節した。
【０１０８】
実施例４．抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体分子の調製および精製
抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体分子の構造を図３に示す。
【０１０９】
上記のｒプロテインＡセファロース Fast Flow（16 mm I.D.、22 mL、GE Healthcare）法で得られた産物にインビトロで組換えを行い、ヘテロ二量体を得た。最初に、上記の精製され収集されたタンパク質溶液を、限外濾過濃縮チューブ（１０ｋＤａの公称分子量カットオフ）を通して限外濾過により濃縮し、溶液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ＝７．４）で置き換えた。得られた抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＤ４７精製産物の溶液を、ＰＢＳを添加することにより、それぞれ１ｍｇ／ｍＬに調整し、最終容量の１／２００倍量の１Ｍ ＤＴＴを添加した（ＤＴＴの終濃度が、それぞれ０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）。還元を４℃（３から８時間）で行い、この還元工程でジスルフィド結合が開裂した。抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＤ４７産物に含まれる抗体ホモ二量体分子のヒンジ領域のジスルフィド結合もまた開裂し、それにより１つの重鎖および１つの軽鎖を含む半抗体分子が形成され、その構造を図４に示す。還元サンプルを、移動相バッファー中に１ｍＭ 還元剤を含むＳＥＣ−ＨＰＬＣ（TOSOH、TSKgel superSW3000）により分析した。結果を図５に示す。抗ＰＤ−Ｌ１と抗ＣＤ４７ ホモ二量体の割合は、全て１０％未満であったが、半抗体分子の割合は、すべて９０％以上であった。
【０１１０】
その後、還元された抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＤ４７半抗体分子を、等モル比で混合し、４℃にて０．５から２４時間、組換え反応を行った。組換え中、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＤ４７半抗体分子の両方を含むヘテロ二量体二重特異性抗体を、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＤ４７半抗体分子のＣＨ２とＣＨ３の間の非共有相互作用を介して形成した。次いで、タンパク質溶液を、限外濾過濃縮チューブ（１０ｋＤａの公称分子量カットオフ）を通して限外濾過により濃縮し、溶液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ＝７．４）で置き換えて、還元を停止させた。該溶液を、空気中または酸化剤を用いて酸化して、ヘテロ二量体二重特異性抗体のジスルフィド結合を形成させた。酸化条件には以下が含まれる：サンプルを空気中に１日、３日、４日間置いた。酸化剤として１００ｍＭ Ｌ−デヒドロアスコルビン酸（タンパク質の終濃度は、１ｍｇ／ｍＬであり、酸化剤の終濃度は、０．５ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭであった）を添加し、酸化を４℃にて２４時間行った。
【０１１１】
上記の抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＤ４７発現産物の還元／酸化により得られた抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体分子を、限外濾過濃縮チューブ（１０ｋＤａの公称分子量カットオフ）を通して限外濾過により濃縮し、溶液をリン酸ナトリウムバッファー溶液、ｐＨ５．８に置換した。精製を、４℃にてAKTA explorer type 100 タンパク質精製システム（GE Healthcare）およびイオンクロマトグラフィーカラムSource 15S（16mm I.D.、17mL、GE Healthcare）を用いて行った。最初に、移動相Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いて、クロマトグラフィーカラムを平衡化した。ベースラインが安定した後、上記の処理タンパク質溶液を３ｍＬ／分の流速で負荷した。サンプルを負荷後、平衡化を移動相Ａを用いて行った。その後、２０カラム容量（０％ Ｂ−１００％ Ｂ、１７０分、流速２ｍＬ／分）を、Ａ（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ５．８）からＢ（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ５．８）の勾配で洗浄した。溶出主ピークを集め、集めたタンパク質溶液を限外濾過濃縮チューブ（１０ｋＤａの公称分子量カットオフ）を通して限外濾過により濃縮した。溶液をリン酸溶液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）で置換し、濾過および滅菌し、次いで４℃で貯蔵した。精製産物の純度をＳＥＣ−ＨＰＬＣ法により分析し、結果を図６に示す。純度は９９．３％であった。ＲＰＣ−ＨＰＬＣ（Thermo Fisher、MAbPac RP）分析の結果、図７に示す通り、純度は１００％であった。ＣＥ分析の結果、図８に示す通り、純度は９７．１％であった。
【０１１２】
実施例５．抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体分子の標的結合活性
抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体の単一抗原への結合能を、酵素結合免疫吸着測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により判定した。
【０１１３】
ＥＬＩＳＡの詳細な操作は、次の通りであった：組換えヒトＰＤ−Ｌ１（Sino Biological Inc., カタログ番号10377-H08H）またはヒトＣＤ４７（Beijing ACROBiosystems、カタログ番号CD7-H5227）を、９６ウェルの高吸着ＥＬＩＳＡプレート（Costar、カタログ番号42592）上に、１ウェル当たり、１μｇ／ｍＬのコーティング濃度および１００μＬのコーティング量でｐＨ９．６の炭酸緩衝溶液（０．０５Ｍ）を用いてコーティングした。コーティングを４℃にて一晩行った。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。プレートを、３００μＬ／ウェルの１％ ＢＳＡを含むＰＢＳＴでブロッキングし、２５℃にて１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ ＢＳＡを含むＰＢＳＴでそれぞれ連続希釈したヘテロ二量体抗体サンプルおよび対照を、１ウェル当たり１００μｌ量で添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。その後、１％ ＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１００００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Chemicon、カタログ番号AP309P）を、１ウェル当たり１００μｌの量で添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。比色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルの量で添加し、１０分間、室温にて発色させた。発色を、１００μＬ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することにより停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
【０１１４】
その結果、図９、パネルＡに示すように、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体は、ＰＤ−Ｌ１に対して高い親和性を有し、これは、ＰＤ−Ｌ１二価モノクローナル抗体の抗原結合活性と同等である。図９、パネルＢに示すように、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体は、ＣＤ４７に対して高い親和性を有し、これは、ＣＤ４７二価モノクローナル抗体の抗原結合活性と同等である。
【０１１５】
実施例６．二重標的（dual target）に対する抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体の同時結合活性
２つの異なる抗原に対する抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体の同時結合能を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により判定した。
【０１１６】
ＥＬＩＳＡの詳細な操作は、以下の通りである：組換えヒトＣＤ４７（Beijing ACROBiosystems、カタログ番号CD7-H5227）を、９６ウェルの高吸着ＥＬＩＳＡプレート上に、１ウェル当たり、１μｇ／ｍＬのコーティング濃度および１００μＬのコーティング量でｐＨ９．６の炭酸緩衝溶液を用いてコーティングした。コーティングを４℃にて一晩行った。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。プレートを、３００μＬ／ウェルの１％ ＢＳＡを含むＰＢＳＴでブロッキングし、２５℃にて１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ ＢＳＡを含むＰＢＳＴでそれぞれ連続希釈したヘテロ二量体抗体サンプルおよび対照を、１ウェル当たり１００μｌ量で添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ ＢＳＡを含むＰＢＳＴで希釈したビオチン標識したＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（Beijing Hanmi pharmaceutical）０．５μｇ／ｍＬを、１ウェル当たり１００μｌの量で添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ ＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１０００に希釈したストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（BD Pharmingen、カタログ番号54066）を、１ウェル当たり１００μｌの量で添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。比色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルの量で添加し、１０分間、室温にて発色させた。発色を、１００μＬ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することにより停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
【０１１７】
結果は、図１０に示す通り、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体およびＣＤ４７の組合せは、ＰＤ−Ｌ１およびＣＤ４７に同時に結合することができず、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体のみが、該２つの抗原に同時に結合する活性を有する。
【０１１８】
実施例７．抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体の腫瘍細胞／赤血球への結合
ＨＣＣ８２７腫瘍細胞は、ＰＤ−Ｌ１およびＣＤ４７を発現し、赤血球（ＲＢＣ）はＣＤ４７のみを発現する。ＨＣＣ８２７およびＲＢＣを混合し、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いて、ヘテロ二量体が、混合細胞における２つの細胞の結合に選択的であったかどうかを決定した。
【０１１９】
この方法の具体的操作は以下の通りであった：ＨＣＣ８２７細胞（ＡＴＣＣから購入）およびＲＢＣ細胞（健常者から収集）を集め、２％ ＦＢＳ（Hyclone、カタログ番号SH30084.03）を含む冷ＤＰＢＳ（GIBCO、カタログ番号14190-235）で１回洗浄した。ＨＣＣ８２７を、１×１０６細胞／チューブで混合し、ＲＢＣを１０×１０６細胞／チューブで混合し、２００μＬの２％ ＦＢＳを含む冷ＤＰＢＳ中に再懸濁した。それぞれ連続希釈したヘテロ二量体抗体サンプルおよび対照を添加した。フローサイトメトリーチューブを氷上で３０分間インキュベートし、２％ＦＢＳを含むＤＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、２％ＦＢＳおよび１：１０００希釈されたＦＩＴＣ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体（Beijing Zhongshan Goldenbridge、カタログ番号ZF0306）を含有する冷ＤＰＢＳ２００μｌに再懸濁し、氷上で３０分間、暗闇中でインキュベートした。細胞を、２％ＦＢＳを含むＤＰＢＳで洗浄し、次いで、５００μＬの冷ＤＰＢＳ中に再懸濁した。細胞懸濁液をフローサイトメーター（BD、FACS、キャリバー）で分析し、混合細胞における２つの細胞のそれぞれの蛍光強度を読み取った。
【０１２０】
結果は、図１１に示す通り、ＣＤ４７モノクローナル抗体の混合ＨＣＣ８２７およびＲＢＣへの結合は、基本的に同じである（パネルＡ）が、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体は、ＰＤ−Ｌ１およびＣＤ４７を発現するＨＣＣ８２７細胞に結合する傾向を有するが、ＣＤ４７のみを発現するＲＢＣには弱く結合し、このことは、結合の選択性を示す（パネルＢ）。
【０１２１】
実施例８．抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体のＴ細胞調節活性
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を用いて、Ｔ細胞免疫応答に対する抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体の調節活性を決定した。
【０１２２】
ヒト樹状細胞（ＤＣ）の取得：ヒトＰＢＭＣ細胞（Lonza、カタログ番号CC-2702）を解凍として収集した。ヒトＰＢＭＣ細胞を血清不含有ＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO、カタログ番号22400-089）中に５×１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁し、細胞培養フラスコ中に播種し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて９０分間インキュベートした。培養上清および浮遊細胞を捨てた。接着細胞を完全培地（１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）中で培養し、１００ｎｇ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦ（Sino Biological Inc.、カタログ番号10015-HNAH）および１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−４（Sino Biological Inc.、カタログ番号11846-HNAE）を添加した。細胞を３日間インキュベートした。培地を新鮮なものに交換した後、細胞をさらに３日間インキュベートした。その後、培地を、１００ｎｇ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−４および２０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−αを含む完全培地（１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）に交換し、細胞を１日インキュベートして、ＤＣ細胞を得た。
【０１２３】
ヒトＴ細胞の取得：ヒトＰＢＭＣ細胞を解凍により集めた。そのようなＰＢＭＣおよびＤＣ細胞を誘導するためのＰＢＭＣは、異なる個体に由来した。Ｔ細胞を、Pan T Cell Isolation Kit（Miltenyi Biotech、カタログ番号5150414820）の取扱説明書に従って単離した。簡単には、ＰＢＭＣをＤＰＢＳで１回洗浄し、次いで、４０μＬの分離緩衝液（2mM EDTA、0.5% BSAを含むDPBS、pH=7.2）当たり１０７細胞で再懸濁し（以下の量は、全て１０７細胞に基づく）、１０μＬのPan T cell ビオチン抗体カクテルを添加し、４℃にて５分間インキュベートした。３０μＬの分離緩衝液および２０μＬのPan Cell MicroBead カクテルを添加後、細胞を４℃にて１０分間インキュベートした。ＭＡＣＳ分離カラムを通した後、Ｔ細胞を得た。
【０１２４】
集めたヒトＤＣ細胞およびヒトＴ細胞を完全培地（１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）中に再懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。ＤＣ細胞およびＴ細胞をそれぞれ、１×１０４／ウェルおよび１×１０５／ウェルで播種し、混合して培養した。完全培地でそれぞれ連続希釈したヘテロ二量体抗体サンプルおよび対照を添加した。プレートを、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて５日間インキュベートした。インキュベーション後、ウェル中の上清を除去し、サイトカインＩＦＮ−γを、キット（RayBiotech、カタログ番号ELH-IFNg）の取扱説明書に従って検出した。
【０１２５】
図１２に示すように、ヒトＴ細胞は、同種ＤＣ細胞により刺激された後、活性化されて、ＩＦＮ−γを分泌した。ＰＤ−Ｌ１抗体を添加すると、Ｔ細胞の活性化が増強され、サイトカインの分泌が促進され得る。抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体はまた、強力なＴ細胞調節活性、顕著なサイトカインＩＦＮ−γ分泌促進を示す。
【０１２６】
実施例９．抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体を介した腫瘍細胞に対するマクロファージの食細胞作用活性（phagocytic activity）
成熟ヒトマクロファージの調製：ヒトＰＢＭＣ細胞（Lonza、カタログ番号CC-2702）を、解凍して集めた。ヒトＰＢＭＣ細胞を血清不含有ＲＰＭＩ１６４０培地に５×１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁し、細胞培養フラスコ中に播種し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて９０分間インキュベートした。培養上清および浮遊細胞を捨てた。接着細胞を完全培地（１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）中で培養し、２５ｎｇ／ｍＬ Ｍ−ＣＳＦ（Sino Biological Inc.、カタログ番号10015-HNAH）を添加した。細胞を７日間インキュベートした。その後、マクロファージを集め、２５ｎｇ／ｍＬ Ｍ−ＣＳＦおよび５０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ−γ（Sino Biological Inc.、カタログ番号11725-HNAS）を含む完全培地（１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）中に再懸濁した。細胞懸濁液を、１ウェル当たり５００００細胞で４８ウェル細胞培養プレートに播種し、１日インキュベートして、マクロファージを成熟させ、すぐ使用できるようにした。
【０１２７】
Ｒａｊｉ腫瘍細胞を、ＣＦＳＥキット（Life Technology、カタログ番号C34554）の取扱説明書に従って染色した。簡単には、ＣＦＳＥをＤＰＢＳで希釈して、５μＭの濃度にした。３７℃で予め加熱した後、Ｒａｊｉ細胞を１０００ｒｐｍで５分間の遠心により集めた。予め温めたＣＦＳＥ溶液に再懸濁し、Ｒａｊｉ細胞を３７℃にて１５分間インキュベートした。細胞を完全培地で１回洗浄し、完全培地に再懸濁し、３０分間インキュベートし、完全培地で２回洗浄し、その後、使用のために完全培地に再懸濁した。
【０１２８】
４８ウェルプレートを完全培地で３回洗浄した。ＣＦＳＥ染色したＲａｊｉ細胞を、試験すべきヘテロ二量体サンプルおよび対照と、１５分間、予めインキュベートし、次いで４８ウェルプレートに添加し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて２時間インキュベートした。インキュベーション後、４８ウェルプレートを完全培地で３回洗浄し、完全培地中に希釈した１０μｇ／ｍＬの小麦胚芽アグルチニン、アレクサ、fluor 555（Life technologies、カタログ番号W32464）を添加し、暗所で１５分間インキュベートした。４８ウェルプレートを完全培地でさらに３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。４８ウェルプレートを完全培地でさらに３回洗浄し、完全培地を加えた。細胞を蛍光顕微鏡で撮影することにより計数した。食細胞作用指数（％）の算出方法は、貪食された緑色標識されたＲａｊｉ細胞の数／存在する赤色標識されたマクロファージの数 × １００である。
【０１２９】
図１３に示すように、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ４７ヘテロ二量体抗体は、マクロファージを介してＲａｊｉ腫瘍細胞を貪食することができ、これはＣＤ４７モノクローナル抗体の活性と同程度である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021505195.tif 000016
2021505195.tif 000017
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