(57)【要約】本開示は、標的化され、効率的で、環境上持続可能な様式で大気窒素を固定し、そのような窒素を植物に送達させることができる非属間のリモデリングされた微生物を提供する。教示の微生物製品を利用すると、農業従事者は、外因性窒素含有肥料の必要性を軽減するか排除することにより、伝統的な合成的に誘導された窒素肥料と関連する栄養素の分解、浸出、または毒素の流出を伴わずに、より生産性が高く、かつ予測可能な収穫高を実現することができるであろう。リモデリングされた微生物は、前述の微生物が、空間を標的にし（例えば、根圏性）、時間を標的にした（例えば、植物の生活環の有利な時期に）様式で、窒素を穀物用植物に送達させることが可能な固有のコロニー化能および窒素固定能を有する。
2021530984.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定大気窒素を穀物用植物に提供する方法であって、
ａ．各々が少なくとも約５．４９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する複数の非属間のリモデリングされた細菌を所定位置に提供する工程；および
ｂ．前記位置に複数の穀物用植物を提供する工程
を含み、
ここで、前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が前記複数の穀物用植物の根表面にコロニー化して、前記穀物用植物に固定Ｎを供給し、ここで、前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、方法。
【請求項２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約４．０３×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前記複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約２５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前記複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約５０ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前記複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約７５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前記複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１００ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、図３１、３２、３３、３４、または３５に従った全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で、前記複数の穀物用植物の根表面にコロニー化する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約２０日間、前記複数の穀物用植物の根表面にコロニー化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約３０日間、前記複数の穀物用植物の根表面にコロニー化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約６０日間、前記複数の穀物用植物の根表面にコロニー化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前記複数の穀物用植物の末梢根の根表面に、前記細菌が他の根にコロニー化するのと同様に、等しくコロニー化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前記複数の穀物用植物の末梢根の根表面に、前記細菌が他の根にコロニー化する程度よりも高い程度にコロニー化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌および穀物用植物が付与された後に、外因性窒素が前記位置に付与されない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌および穀物用植物が付与された後に、外因性窒素を含む側条施肥が前記位置に付与されない、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
工程ａ）およびｂ）の前に、外因性窒素を前記位置に付与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
工程ａ）およびｂ）の前に、外因性窒素を前記位置に付与し、工程ａ）およびｂ）の後に外因性窒素を前記位置に付与しない工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記穀物用植物が、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、モロコシ、雑穀、オートムギ、ライ麦、またはライコムギである、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記穀物用植物がトウモロコシ植物であり、前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前記トウモロコシ植物のＶＴ期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記穀物用植物がトウモロコシ植物であり、前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前記トウモロコシ植物のＲ１期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記穀物用植物がトウモロコシ植物であり、前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前記トウモロコシ植物のＲ６期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前記細菌に暴露された複数の穀物用植物のうちの個別の前記穀物用植物中に１％またはそれを超える前記固定窒素を産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、外因性窒素の存在下で大気窒素を固定することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前記窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された導入調節配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前記窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前記ａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子；アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子；変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前記ａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子；およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子および変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前記ａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、菌体外多糖産生、エンドポリガラクツロナーゼ産生、トレハロース産生、およびグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、少なくとも２つの異なる細菌種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、同種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、着生性または根圏性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９５％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９９％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列を含む細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
必要なときに外因性窒素付与を追加する必要のない、固定大気窒素をトウモロコシ植物に提供する方法であって、
ａ．各々が少なくとも約５．４９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する複数の非属間のリモデリングされた細菌を所定位置に提供する工程；および
ｂ．前記位置に複数のトウモロコシ植物を提供する工程
を含み、
ここで、前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化して、前記トウモロコシ植物に固定Ｎを供給し、ここで、前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生し、ここで、前記複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が付与された後に、外因性窒素が前記位置に付与されない、方法。
【請求項４７】
外因性窒素が側条施肥として付与されない、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約４．０３×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前記複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約２５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前記複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約５０ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前記複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約７５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前記複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１００ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、図３１、３２、３３、３４、または３５に従った全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で、前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約２０日間、前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約３０日間、前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約６０日間、前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前記複数のトウモロコシ植物の末梢根の根表面に、前記細菌が他の根にコロニー化するのと同様に、等しくコロニー化する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前記複数のトウモロコシ植物の末梢根の根表面に、前記細菌が他の根にコロニー化する程度よりも高い程度にコロニー化する、請求項４６に記載の方法。
【請求項６０】
工程ａ）およびｂ）の前に、外因性窒素を前記位置に付与する工程をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項６１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前記トウモロコシ植物のＶＴ期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項４６に記載の方法。
【請求項６２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前記トウモロコシ植物のＲ１期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項４６に記載の方法。
【請求項６３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前記トウモロコシ植物のＲ６期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項４６に記載の方法。
【請求項６４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前記細菌に暴露された複数のトウモロコシ植物のうちの個別のトウモロコシ植物中に１％またはそれを超える前記固定窒素を産生する、請求項４６に記載の方法。
【請求項６５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、外因性窒素の存在下で大気窒素を固定することができる、請求項４６に記載の方法。
【請求項６６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項６７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前記窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された導入調節配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項６８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前記窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項６９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７０】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前記ａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子；アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子；変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前記ａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子；およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子および変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前記ａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、菌体外多糖産生、エンドポリガラクツロナーゼ産生、トレハロース産生、およびグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、少なくとも２つの異なる細菌種を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項８０】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、同種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項８１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項８２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、着生性または根圏性である、請求項４６に記載の方法。
【請求項８３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項８４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項８５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９５％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項８６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９９％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項８７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列を含む細菌を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項８８】
１エーカーあたりのトウモロコシ収穫高を増加させる方法であって、
ａ．各々が少なくとも約５．４９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する複数の非属間のリモデリングされた細菌を所定位置に提供する工程；および
ｂ．前記位置に複数のトウモロコシ植物を少なくとも３５，０００種子／エーカーの密度で提供する工程
を含み、
ここで、前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化して、前記トウモロコシ植物に固定Ｎを供給し、ここで、前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生し、ここで、前記複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が付与された後に、外因性窒素が前記位置に付与されない、方法。
【請求項８９】
外因性窒素が側条施肥として付与されない、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約４．０３×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前記複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約２５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前記複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約５０ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前記複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約７５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前記複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１００ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、図３１、３２、３３、３４、または３５に従った全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で、前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約２０日間、前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約３０日間、前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約６０日間、前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、請求項８８に記載の方法。
【請求項１００】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前記複数のトウモロコシ植物の末梢根の根表面に、前記細菌が他の根にコロニー化するのと同様に、等しくコロニー化する、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前記複数のトウモロコシ植物の末梢根の根表面に、前記細菌が他の根にコロニー化する程度よりも高い程度にコロニー化する、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０２】
工程ａ）およびｂ）の前に、外因性窒素を前記位置に付与する工程をさらに含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前記トウモロコシ植物のＶＴ期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前記トウモロコシ植物のＲ１期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前記トウモロコシ植物のＲ６期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前記細菌に暴露された複数のトウモロコシ植物のうちの個別のトウモロコシ植物中に１％またはそれを超える前記固定窒素を産生する、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、外因性窒素の存在下で大気窒素を固定することができる、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前記窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された導入調節配列を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前記窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１１３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１１４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１１５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前記ａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１１６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子；アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子；変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前記ａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子；およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１１７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１１８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子および変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前記ａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１１９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、菌体外多糖産生、エンドポリガラクツロナーゼ産生、トレハロース産生、およびグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、少なくとも２つの異なる細菌種を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１２２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、同種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１２３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１２４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、着生性または根圏性である、請求項８８に記載の方法。
【請求項１２５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１２６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１２７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９５％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１２８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９９％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１２９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列を含む細菌を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１３０】
農耕困難土壌における１エーカー当たりのトウモロコシ収穫高を増加させる方法であって、
ａ．農耕困難土壌中に存在する所定位置に、各々が少なくとも約５．４９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する複数の非属間のリモデリングされた細菌を提供する工程；および
ｂ．農耕困難土壌中に存在する前記位置に複数のトウモロコシ植物を提供する工程
を含み、
ここで、前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化して、前記トウモロコシ植物に固定Ｎを供給し、
ここで、前記農耕困難土壌が、少なくとも約３０％の砂を含む土壌を含み、
ここで、対照とされる複数のトウモロコシ植物を前記位置に提供したときの前記対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、前記複数のトウモロコシ植物が、少なくとも１ブッシェル／エーカーの収穫高の増加を達成する、方法。
【請求項１３１】
前記農耕困難土壌が、少なくとも約４０％の砂を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記農耕困難土壌が、少なくとも約５０％の砂を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３３】
前記農耕困難土壌が、約３０％未満のシルトを含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３４】
前記農耕困難土壌が、約２０％未満の粘土を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３５】
前記農耕困難土壌のｐＨが約５〜約８である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３６】
前記農耕困難土壌のｐＨが約６．８である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３７】
前記農耕困難土壌の有機物含有量が約０．４０〜約２．８である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３８】
前記農耕困難土壌の有機物含有量が約１．４２である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３９】
前記農耕困難土壌が、砂質ロームまたはローム土である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１４０】
前記農耕困難土壌が、前記土壌の変数のうちの少なくとも１つを表３５に列挙した近似量で含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１４１】
前記複数のトウモロコシ植物が、対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、少なくとも５ブッシェル／エーカーの収穫高の増加を達成する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記複数のトウモロコシ植物が、対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、少なくとも１０ブッシェル／エーカーの収穫高の増加を達成する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１４３】
前記対照とされる複数のトウモロコシ植物が、前記対照とされる複数のトウモロコシ植物が植栽された後に、前記植物に付与された外因性窒素を有する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１４４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に、外因性窒素が前記位置に付与されない、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１４５】
前記対照とされる複数のトウモロコシ植物が、前記複数の非属間のリモデリングされた細菌を用いずに前記位置に提供される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１４６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に前記位置に外因性窒素が付与されないが、対照とされる複数のトウモロコシ植物には外因性窒素が付与され、前記対照とされる複数のトウモロコシ植物は、複数の非属間のリモデリングされた細菌を提供されない、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１４７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に前記位置に外因性窒素が付与されないが、対照とされる複数のトウモロコシ植物には外因性窒素が付与され、前記対照とされる複数のトウモロコシ植物は、複数の非属間のリモデリングされた細菌を提供されず、ここで、前記リモデリングされた細菌を用いた前記複数のトウモロコシ植物が、前記リモデリングされた細菌を用いない前記対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、少なくとも約１７ブッシェル／エーカーの収穫高の増加を達成する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１４８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１４９】
外因性窒素が側条施肥として付与されない、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１５０】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１５１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約４．０３×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約２５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１５３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約５０ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１５４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約７５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１５５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１００ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１５６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、図３１、３２、３３、３４、または３５に従った全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で、前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１５７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約２０日間、前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１５８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約３０日間、前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１５９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約６０日間、前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１６０】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前記複数のトウモロコシ植物の末梢根の根表面に、前記細菌が他の根にコロニー化するのと同様に、等しくコロニー化する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１６１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前記複数のトウモロコシ植物の末梢根の根表面に、前記細菌が他の根にコロニー化する程度よりも高い程度にコロニー化する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前記トウモロコシ植物のＶＴ期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１６３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前記トウモロコシ植物のＲ１期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１６４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前記トウモロコシ植物のＲ６期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１６５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前記細菌に暴露された複数のトウモロコシ植物のうちの個別のトウモロコシ植物中に１％またはそれを超える前記固定窒素を産生する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１６６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、外因性窒素の存在下で大気窒素を固定することができる、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１６７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１６８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前記窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された導入調節配列を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１６９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前記窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１７０】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１７１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１７３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１７４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前記ａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１７５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子；アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子；変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前記ａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子；およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１７６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１７７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子および変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前記ａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１７８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、菌体外多糖産生、エンドポリガラクツロナーゼ産生、トレハロース産生、およびグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１７９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１８０】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、少なくとも２つの異なる細菌種を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１８１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、同種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１８２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１８３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、着生性または根圏性である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１８４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１８５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１８６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９５％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１８７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９９％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１８８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列を有する細菌を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１８９】
１エーカー当たりのトウモロコシ収穫高の圃場内変動を減少させる方法であって、
ａ．各々が少なくとも約５．４９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する複数の非属間のリモデリングされた細菌を所定位置に提供する工程；および
ｂ．前記位置に複数のトウモロコシ植物を提供する工程
を含み、
ここで、前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化して、前記トウモロコシ植物に固定Ｎを供給し、
ここで、ブッシェル／エーカーで測定した場合の前記位置にわたって測定したトウモロコシ平均収穫高の標準偏差が、対照とされる複数のトウモロコシ植物を前記位置に提供したときの前記対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、前記非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化した前記複数のトウモロコシ植物で低い、方法。
【請求項１９０】
前記非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化した複数のトウモロコシ植物の前記標準偏差が、前記対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、１９ブッシェル／エーカー未満であり、前記対照とされる複数のトウモロコシ植物は、非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化していない、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
前記非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化した前記複数のトウモロコシ植物の間の収穫高が、前記対照とされる複数のトウモロコシ植物の収穫高の１〜１０％以内であり、前記対照とされる複数のトウモロコシ植物は、非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化していない、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９２】
前記対照とされる複数のトウモロコシ植物が、前記対照とされる複数のトウモロコシ植物が植栽された後に、前記植物に付与された外因性窒素を有する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に、外因性窒素が前記位置に付与されない、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９４】
前記対照とされる複数のトウモロコシ植物が、前記複数の非属間のリモデリングされた細菌を用いずに前記位置に提供される、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に前記位置に外因性窒素が付与されないが、対照とされる複数のトウモロコシ植物には外因性窒素が付与され、前記対照とされる複数のトウモロコシ植物は、複数の非属間のリモデリングされた細菌を提供されない、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に前記位置に外因性窒素が付与されないが、対照とされる複数のトウモロコシ植物には外因性窒素が付与され、前記対照とされる複数のトウモロコシ植物は、複数の非属間のリモデリングされた細菌を提供されず、ここで、前記非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化した前記複数のトウモロコシ植物の間の収穫高が、前記対照とされる複数のトウモロコシ植物の収穫高の１〜１０％以内である、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９８】
外因性窒素が側条施肥として付与されない、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２００】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約４．０３×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２０１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約２５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２０２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約５０ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２０３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約７５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２０４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１００ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２０５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、図３１、３２、３３、３４、または３５に従った全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で、前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２０６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約２０日間、前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２０７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約３０日間、前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２０８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約６０日間、前記複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２０９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前記複数のトウモロコシ植物の末梢根の根表面に、前記細菌が他の根にコロニー化するのと同様に、等しくコロニー化する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２１０】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前記複数のトウモロコシ植物の末梢根の根表面に、前記細菌が他の根にコロニー化する程度よりも高い程度にコロニー化する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２１１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前記トウモロコシ植物のＶＴ期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２１２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前記トウモロコシ植物のＲ１期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２１３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前記トウモロコシ植物のＲ６期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２１４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前記細菌に暴露された複数のトウモロコシ植物のうちの個別のトウモロコシ植物中に１％またはそれを超える前記固定窒素を産生する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２１５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、外因性窒素の存在下で大気窒素を固定することができる、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２１６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２１７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前記窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された導入調節配列を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２１８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前記窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２１９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２２０】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２２１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２２２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２２３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前記ａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２２４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子；アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子；変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前記ａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子；およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２２５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２２６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前記ｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子および変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前記ａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２２７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、菌体外多糖産生、エンドポリガラクツロナーゼ産生、トレハロース産生、およびグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２２８】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２２９】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、少なくとも２つの異なる細菌種を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２３０】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、同種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２３１】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２３２】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、着生性または根圏性である、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２３３】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２３４】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２３５】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９５％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２３６】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９９％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２３７】
前記複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列を有する細菌を含む、請求項１８９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月１１日出願の米国特許仮出願第６２／６９６，４５２号および２０１９年２月５日出願の米国特許仮出願第６２／８０１，５０４号（各々の内容全体が本明細書中で参考として援用される）の優先権の利益を主張する。
配列表に関する記載
【０００２】
本明細書とともに電子的に提出した以下のテキストファイルの内容は、その全体が本明細書中で参考として援用される：ファイル名：ＰＩＶＯ＿００６＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、作成日２０１９年７月１０日、ファイルサイズ約６３２キロバイトである配列表のコンピュータ可読形式のコピー。
【背景技術】
【０００３】
開示の背景
国際連合食糧農業機関は、人口増加のニーズに対応するためには２０５０年までに世界全体の食糧生産を７０％増加させる必要があると推定しており、この課題は、淡水資源の減少、耕地争奪の激化、エネルギー価格の上昇、投入原価の増加などが挙げられる多くの要因によって深刻化しており、さらなる乾燥、さらなる気温上昇、より過酷な全地球的気候という苦難に対応する作物が必要である。
【０００４】
現在の農業は、この食糧生産に対する需要の増加を満たすと同時に農業にさらに重点を置くことに起因する環境への影響とバランスを取るようには十分に対応していない。
【０００５】
世界的な食糧需要を満たすために必要とされる主な農業資本のうちの１つは窒素肥料である。しかしながら、窒素肥料を生産するために利用される現行の標準的な工業的方法は、ハーバー・ボッシュ法と呼ばれる人工的な窒素固定法であり、この方法は、高温高圧下で金属触媒を使用して水素（Ｈ２）と反応させることにより大気窒素（Ｎ２）をアンモニア（ＮＨ３）に変換する。このプロセスは、資源集約的で環境に有害である。
【０００６】
ハーバー・ボッシュ合成法と対照的に、大気窒素を固定するためのある特定の生物学的システムが進化を遂げている。これらのシステムは、Ｎ２とＨ２との間の反応を触媒するニトロゲナーゼと呼ばれる酵素を利用し、その結果窒素が固定される。例えば、根粒菌は、マメ科植物の根粒の内側に定着されるようになった後に窒素を固定するジアゾ栄養微生物である。窒素固定研究の重要な目的は、この表現型を、マメ科以外の植物、特に、作物栽培学的に重要なイネ科植物（コムギ、イネ、およびトウモロコシなど）に拡張することである。しかしながら、根粒菌とマメ科植物との間の窒素固定共生の発達に関する理解が著しく進展しているにもかかわらず、非マメ科作物に窒素固定根粒を誘導する知識を使用するための道筋は依然として明確ではない。
【０００７】
したがって、大多数の現代の条植え作物農業は、資源集約的で環境に有害なハーバー・ボッシュ法によって生産された窒素肥料を利用する。例えば、ＵＳＤＡは、平均的な米国のトウモロコシ農業従事者が典型的にはエーカーあたり１３０と２００ｌｂとの間（１４６〜２２４ｋｇ／ｈａ）の窒素を散布していることを示している。この窒素は、資源集約的な合成プロセスで生産されるだけでなく、重機による横断／土壌への影響、石油の燃焼、および長時間の労働によって散布される。
【０００８】
さらに、工業的ハーバー・ボッシュ法によって生産された窒素肥料は、標的作物によって十分に利用されない。雨、流出、熱、揮発、および土壌マイクロバイオームが散布した化学肥料を分解する。これは浪費に等しいだけでなく、収穫高と引き換えに汚染を増大させる。この目的のために、国際連合の算出によると、作物が肥料を利用できる前にほぼ８０％の肥料が喪失される。したがって、現代の農業用肥料の生産および送達は、環境に有害なだけでなく、極めて非効率である。
【０００９】
世界的に増大している食糧供給のニーズを満たしながら、資源活用と環境システムへの影響を最小にすることのバランスも取るために、窒素の固定および植物への送達へのより良い手法が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
開示の概要
いくつかの実施形態では、固定大気窒素を穀物用植物に提供する方法であって、各々が少なくとも約５．４９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する複数の非属間のリモデリングされた細菌を所定位置に提供する工程；および前述の位置に複数の穀物用植物を提供する工程を含み、ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が前述の複数の穀物用植物の根表面にコロニー化して、前述の穀物用植物に固定Ｎを供給し、ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、方法を本明細書中に提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、必要なとき（ｉｎ−ｓｅａｓｏｎ）に外因性窒素付与を追加する必要のない、固定大気窒素をトウモロコシ植物に提供する方法であって、各々が少なくとも約５．４９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する複数の非属間のリモデリングされた細菌を所定位置に提供する工程；および前述の位置に複数のトウモロコシ植物を提供する工程を含み、ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化して、前述のトウモロコシ植物に固定Ｎを供給し、ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生し、ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌および穀物用植物が付与された後に、外因性窒素が前述の位置に付与されない、方法を本明細書中に提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、１エーカーあたりのトウモロコシ収穫高を増加させる方法であって、各々が少なくとも約５．４９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する複数の非属間のリモデリングされた細菌を所定位置に提供する工程；および前述の位置に複数のトウモロコシ植物を少なくとも３５，０００種子／エーカーの密度で提供する工程を含み、ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化して、前述のトウモロコシ植物に固定Ｎを供給し、ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生し、ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌および穀物用植物が付与された後に、外因性窒素が前述の位置に付与されない、方法を本明細書中に提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、農耕困難土壌における１エーカー当たりのトウモロコシ収穫高を増加させる方法であって、農耕困難土壌中に存在する所定位置に、各々が少なくとも約５．４９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する複数の非属間のリモデリングされた細菌を提供する工程；および農耕困難土壌中に存在する前述の位置に複数のトウモロコシ植物を提供する工程を含み、ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化して、前述のトウモロコシ植物に固定Ｎを供給し、ここで、前述の農耕困難土壌が、少なくとも約３０％の砂を含む土壌を含み、ここで、対照とされる複数のトウモロコシ植物を前述の位置に提供したときの前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、前述の複数のトウモロコシ植物が、少なくとも１ブッシェル／エーカーの収穫高の増加を達成する、方法を本明細書中に提供する。これらの実施形態のうちのいくつかでは、前述の複数のトウモロコシ植物は、対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、少なくとも５ブッシェル／エーカーの収穫高の増加または少なくとも１０ブッシェル／エーカーの収穫高の増加を達成する。これらの実施形態のうちのいくつかでは、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物は、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物が植栽された後に、前述の植物に付与された外因性窒素を有する。これらの実施形態のうちのいくつかでは、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に、外因性窒素は前述の位置に付与されない。これらの実施形態のうちのいくつかでは、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物は、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌を用いずに前述の位置に提供される。これらの実施形態のうちのいくつかでは、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に前述の位置に外因性窒素が付与されないが、対照とされる複数のトウモロコシ植物には外因性窒素が付与され、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物は、複数の非属間のリモデリングされた細菌を提供されない。これらの実施形態のうちのいくつかでは、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に前述の位置に外因性窒素が付与されないが、対照とされる複数のトウモロコシ植物には外因性窒素が付与され、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物は、複数の非属間のリモデリングされた細菌を提供されず、ここで、前述のリモデリングされた細菌を用いた前述の複数のトウモロコシ植物が、前述のリモデリングされた細菌を用いない前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、少なくとも約１７ブッシェル／エーカーの収穫高の増加を達成する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、１エーカー当たりのトウモロコシ収穫高の圃場内変動を減少させる方法であって、各々が少なくとも約５．４９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する複数の非属間のリモデリングされた細菌を所定位置に提供する工程；および前述の位置に複数のトウモロコシ植物を提供する工程を含み、ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化して、前述のトウモロコシ植物に固定Ｎを供給し、ここで、ブッシェル／エーカーで測定した場合の前述の位置にわたって測定したトウモロコシ平均収穫高の標準偏差が、対照とされる複数のトウモロコシ植物を前述の位置に提供したときの前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、前述の非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化した前述の複数のトウモロコシ植物で低い、方法を本明細書中に提供する。これらの実施形態のうちのいくつかでは、前述の非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化した複数のトウモロコシ植物の前述の標準偏差は、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、１９ブッシェル／エーカー未満であり、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物は、非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化していない。これらの実施形態のうちのいくつかでは、前述の非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化した前述の複数のトウモロコシ植物の間の収穫高が、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物の収穫高の１〜１０％以内であり、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物は、非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化していない。これらの実施形態のうちのいくつかでは、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物は、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物が植栽された後に、前述の植物に付与された外因性窒素を有する。これらの実施形態のうちのいくつかでは、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に、外因性窒素は前述の位置に付与されない。これらの実施形態のうちのいくつかでは、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物は、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌を用いずに前述の位置に提供される。これらの実施形態のうちのいくつかでは、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に前述の位置に外因性窒素が付与されないが、対照とされる複数のトウモロコシ植物には外因性窒素が付与され、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物は、複数の非属間のリモデリングされた細菌を提供されない。これらの実施形態のうちのいくつかでは、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に前述の位置に外因性窒素が付与されないが、対照とされる複数のトウモロコシ植物には外因性窒素が付与され、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物は、複数の非属間のリモデリングされた細菌を提供されず、ここで、前述の非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化した前述の複数のトウモロコシ植物の間の収穫高が、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物の収穫高の１〜１０％以内である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々は、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々は、少なくとも約４．０３×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々は、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前述の複数の細菌は、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約２５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々は、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前述の複数の細菌は、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約５０ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々は、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前述の複数の細菌は、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約７５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々は、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前述の複数の細菌は、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１００ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、図３１、３２、３３、３４、または３５に従った全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で、複数の穀物用植物の根表面にコロニー化する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約２０日間、複数の穀物用植物の根表面にコロニー化する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約３０日間、複数の穀物用植物の根表面にコロニー化する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約６０日間、複数の穀物用植物の根表面にコロニー化する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、複数の穀物用植物の末梢根の根表面に、他の根にコロニー化するのと同様に、等しくコロニー化する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、複数の穀物用植物の末梢根の根表面に、前述の細菌が他の根にコロニー化する程度よりも高い程度にコロニー化する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌および穀物用植物が付与された後に、外因性窒素は前述の位置に付与されない。
【００２８】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌および穀物用植物が付与された後に、外因性窒素を含む側条施肥は前述の位置に付与されない。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本明細書中に提供した方法は、工程ａ）およびｂ）の前に、外因性窒素を前述の位置に付与する工程をさらに含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本明細書中に提供した方法は、工程ａ）およびｂ）の前に、外因性窒素を前述の位置に付与し、工程ａ）およびｂ）の後に外因性窒素を前述の位置に付与しない工程をさらに含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、外因性窒素は側条施肥として付与されない。
【００３２】
いくつかの実施形態では、穀物用植物は、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、モロコシ、雑穀、オートムギ、ライ麦、またはライコムギである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、穀物用植物はトウモロコシ植物であり、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＶＴ期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、穀物用植物はトウモロコシ植物であり、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＲ１期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、穀物用植物はトウモロコシ植物であり、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＲ６期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、細菌に暴露された複数の穀物用植物のうちの個別の穀物用植物中に１％またはそれを超える固定窒素を産生する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、外因性窒素の存在下で大気窒素を固定することができる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーは、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーは、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された導入調節配列を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーは、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーは、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーは、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーは、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーは、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーは、変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーは、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子；アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子；変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子；およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーは、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーは、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子および変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーは、菌体外多糖産生、エンドポリガラクツロナーゼ（ｅｎｄｏ−ｐｏｌｙｇａｌａｔｕｒｏｎａｓｅ）産生、トレハロース産生、およびグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーは、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、少なくとも２つの異なる細菌種を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、同種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、着生性または根圏性である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９５％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９９％の配列同一性を共有する核酸配列を含む細菌を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列を含む細菌を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、農耕困難土壌は、少なくとも約４０％の砂を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、農耕困難土壌は、少なくとも約５０％の砂を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、農耕困難土壌は、約３０％未満のシルトを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、農耕困難土壌は、約２０％未満の粘土を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、農耕困難土壌のｐＨは約５〜約８である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、農耕困難土壌のｐＨは約６．８である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、農耕困難土壌の有機物含有量は約０．４０〜約２．８である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、農耕困難土壌の有機物含有量は約１．４２である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、農耕困難土壌は、砂質ロームまたはローム土である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、農耕困難土壌は、土壌の変数のうちの少なくとも１つを表３５に列挙した近似量で含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、複数の非属間のリモデリングされた細菌は、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１−１】図１Ａは、実施形態に従った微生物リモデリング誘導プロセスの概要を示す。
【００７２】
【図１−２】図１Ｂは、図１Ａに示したマイクロバイオーム組成の測定の拡大図を示す。
【００７３】
【図１−３】図１Ｃは、教示した微生物リモデリング誘導（ＧＭＲ）プラットフォームと比較していくつかの欠点を有する、問題のある「伝統的なバイオプロスペクティング」手法を示す。
【００７４】
【図１−４】図１Ｄは、教示した微生物リモデリング誘導（ＧＭＲ）プラットフォームと比較していくつかの欠点を有する、問題のある「バイオプロスペクティングへのフィールドファースト手法」システムを示す。
【００７５】
【図１−５】図１Ｅは、トウモロコシの成長周期中の植物が窒素を最も必要とする時点を示す。
【００７６】
【図１−６】図１Ｆは、リモデリングされた微生物のための圃場開発プロセスの概要を示す。
【００７７】
【図１−７】図１Ｇは、微生物リモデリング誘導プラットフォーム実施形態の概要を示す。
【００７８】
【図１−８】図１Ｈは、計算による微生物リモデリング誘導プラットフォームの概要を示す。
【００７９】
【図１−９】図１Ｉは、微生物リモデリング誘導プラットフォームの態様におけるモデリングと組み合わせた圃場データの使用を示す。
【００８０】
【図１−１０】図１Ｊは、本開示のリモデリングされた微生物が保有することができる５つの性質を示す。
【００８１】
【図１−１１】図１Ｋは、微生物ＰＢＣ６．１のモデリング手法の略図を示す。
【００８２】
【図１−１２】図１Ｌは、リモデリングされた微生物における内因性窒素制御からのｎｉｆＡ発現の分離を示す。
【００８３】
【図１−１３】図１Ｍは、リモデリングされた微生物による固定窒素の同化および排出の改善を示す。
【００８４】
【図１−１４】図１Ｎは、リモデリングされた微生物に起因するトウモロコシ収穫高の改善を示す。
【００８５】
【図１−１５】図１Ｏは、施肥不足の圃場、過剰に施肥された圃場、および環境に有害な窒素流出をもたらす現在の窒素送達システムの非効率さを示す。
【００８６】
【図２】図２は、ＰＢＣ６．１が、根付随微生物叢のほぼ２１％の存在量までトウモロコシ根でコロニー化することを示す。存在量データは、ＰＢＣ６．１を接種し、温室条件で成長させたトウモロコシ植物の根圏および内圏の１６Ｓアンプリコン配列決定に基づいている。
【００８７】
【図３】図３Ａ〜３Ｅは、高硝酸塩農業土壌に類似する条件下で窒素をｉｎ  ｖｉｔｒｏで固定および排出する誘導体微生物を示す。図３Ａは、重要な連結点であるＮｉｆＬ、ＮｉｆＡ、ＧＳ、２ドメインＡＴａｓｅ−ＡＲ酵素として示されているＧｌｎＥ、およびＡｍｔＢを含む、ＰＢＣ６．１において窒素固定および同化を制御する制御ネットワークを示す。図３Ｂは、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ分離株ＰＢＣ６．１のゲノムを示す。ゲノムの周りの３つのトラックは、それぞれＰＢＣ６．１、ＰＢＣ６．３８の転写データ、および菌株間の発現差異を示す。図３Ｃは、窒素固定遺伝子クラスターを示し、転写データは、詳細をより詳しく示すための拡大されている。図３Ｄは、様々な濃度の外因性窒素下におけるニトロゲナーゼ活性が、アセチレン還元アッセイで測定されていることを示す。野生型菌株は、グルタミン濃度が増加すると共にニトロゲナーゼ活性の抑制を示すが、誘導体菌株は、様々な程度の頑強性を示す。折れ線グラフにおいて、三角は菌株ＰＢＣ６．２２を示し；円は菌株ＰＢＣ６．１を示し；四角は菌株ＰＢＣ６．１５を示し；菱形は菌株ＰＢＣ６．１４を示す。エラーバーは、少なくとも３つの生物学的反復物の平均の標準誤差を表わす。図３Ｅは、誘導体菌株によるアンモニアの経時的な排出が、ｍＭ濃度で観察されることを示す。野生型菌株は、固定窒素を排出することが観察されず、培地に蓄積するアンモニアは無視できる程度である。エラーバーは、平均の標準誤差を表わす。
【００８８】
【図４】図４は、ＰＢＣ６．１の誘導体菌株におけるｎｉｆＡの転写率が、アセチレン還元速度と相関していたことを示す。ＡＲＡアッセイを、「方法」に記載の通りに実施し、その後、培養物を試料採取し、ｑＰＣＲ分析にかけて、ｎｉｆＡ転写物レベルを決定した。エラーバーは、各測定での少なくとも３つの生物学的反復物の平均の標準誤差を示す。
【００８９】
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、温室実験により、トウモロコシ中での微生物窒素固定が実証されていることを示す。図５Ａは、ＰＢＣ６．１誘導体菌株によってトウモロコシ植物に接種した６週間後の微生物コロニー化を示す。エラーバーは、少なくとも８つの生物学的反復物の平均の標準誤差を示す。図５Ｂは、全ＲＮＡを根から抽出し、その後Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析を行うことにより測定したｎｉｆＨのｉｎ  ｐｌａｎｔａ転写を示す。誘導体菌株のみが、根環境にてｎｉｆＨ転写を示す。エラーバーは、少なくとも３つの生物学的反復物の平均の標準誤差を示す。図５Ｃは、植物組織での同位体トレーサーの希釈により測定された微生物窒素固定を示す。誘導体微生物は、植物への固定窒素の実質的な移入を示す。エラーバーは、少なくとも１０の生物学的反復物の平均の標準誤差を示す。
【００９０】
【図６】図６は、菌株ＣＩ００６に由来する改変菌株の系統を示す。
【００９１】
【図７】図７は、菌株ＣＩ０１９に由来する改変菌株の系統を示す。
【００９２】
【図８】図８は、ｍｍｏｌ窒素／微生物−時間による生重量１ｇ当たりの微生物の関数として記録された、本開示の微生物による１エーカー−季節当たりの送達された窒素のポンドのヒートマップを示す。大きい方の画像を横切る細線の下方は、１エーカー−季節当たり１ポンド未満の窒素を送達する微生物であり、この線の上方は、１エーカー−季節当たり１ポンドよりも多くの窒素を送達する微生物である。ヒートマップの下方にある表は、ヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ  ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ  Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ  Ｎ／微生物  時間）を示している。ヒートマップに使用されている微生物は、トウモロコシでのＮ産生についてアッセイされた。ＷＴ菌株ＣＩ００６およびＣＩ０１９の場合、トウモロコシ根コロニー化データは、単一の圃場現場から得た。残りの菌株の場合、コロニー化は、ＷＴ圃場レベルと同じであると仮定した。Ｎ固定活性は、５ｍＭグルタミンでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＡアッセイを使用して決定した。
【００９３】
【図９】図９は、菌株ＣＩ００６に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率である。
【００９４】
【図１０】図１０は、菌株ＣＭ０２９に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率である。
【００９５】
【図１１】図１１は、菌株ＣＭ０３８に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率である。
【００９６】
【図１２】図１２は、菌株ＣＩ０１９に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率である。
【００９７】
【図１３】図１３は、菌株ＣＭ０８１に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率である。
【００９８】
【図１４】図１４は、菌株ＣＭ０２９およびＣＭ０８１に曝露された植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率である。
【００９９】
【図１５】図１５は、集計したブッシェル増加／喪失として植物の植物収穫高を示す。円の面積は、相対的収穫高に対応し、濃淡は、特定のＭＲＴＮ処理に対応する。ｘ軸はｐ値であり、ｙ軸は成功率である。
【０１００】
【図１６】図１６は、２０１７年夏の圃場試験実験の結果を示す。得られた収穫高の結果は、本開示の微生物が、潜在的な肥料置換物としての役目を果たすことができることを実証する。例えば、本開示の微生物（すなわち、６−４０３）の使用は、野生型菌株（ＷＴ）より高い収穫高および未処理対照（ＵＴＣ）よりも高い収穫高をもたらした。「−２５ｌｂ  Ｎ」処理では、その地域の標準的農作業よりも１エーカー当たり２５ｌｂ少ないＮが使用される。「１００％Ｎ」ＵＴＣ処理は、その地域の標準的農作業を示すことが意図されており、Ｎの標準的使用の１００％が、農業従事者により配置される。微生物「６−４０３」は、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託され、表１に見出すことができる。これは変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ（ＣＭ０３７とも呼ばれる）であり、ＣＩ００６  ＷＴに由来する後代変異体菌株である。
【０１０１】
【図１７】図１７は、２０１７年夏の圃場試験実験の結果を示す。得られた収穫高の結果は、本開示の微生物が、栽培地全体にわたって一貫して性能を発揮することを実証する。さらに、収穫高の結果は、本開示の微生物が、窒素ストレス環境ならびに十分な窒素供給を有する環境の両方で良好な性能を発揮することを実証する。微生物「６−８８１」（ＣＭ０９４、ＰＢＣ６．９４としても知られている）は、ＣＩ００６  ＷＴに由来する後代変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託され、表１に見出すことができる。微生物「１３７−１０３４」は、ＣＩ１３７  ＷＴに由来する後代変異体Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託され、表１に見出すことができる。微生物「１３７−１０３６」は、ＣＩ１３７  ＷＴに由来する後代変異体Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託され、表１に見出すことができる。微生物「６−４０４」（ＣＭ３８、ＰＢＣ６．３８としても知られている）は、ＣＩ００６  ＷＴに由来する後代変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託され、表１に見出すことができる。「栄養ストレス」条件は、０％窒素レジメに相当する。「十分な肥料」条件は、１００％窒素レジメに相当する。
【０１０２】
【図１８】図１８は、菌株ＣＩ００６（「６」、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ  ＷＴとも名付けられている）に由来する改変菌株の系統を示す。
【０１０３】
【図１９】図１９は、菌株ＣＩ０１９（「１９」、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ  ＷＴとも名付けられている）に由来する改変菌株の系統を示す。
【０１０４】
【図２０】図２０は、菌株ＣＩ１３７（「１３７」、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ  ＷＴとも名付けられている）に由来する改変菌株の系統を示す。
【０１０５】
【図２１】図２１は、菌株１０２１（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ  ＷＴ）に由来する改変菌株の系統を示す。
【０１０６】
【図２２】図２２は、菌株９１０（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ  ＷＴ）に由来する改変菌株の系統を示す。
【０１０７】
【図２３】図２３は、菌株６３（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ  ＷＴ）に由来する改変菌株の系統を示す。
【０１０８】
【図２４】図２４は、ｍｍｏｌ窒素／微生物−時間による生重量１ｇ当たりの微生物の関数として記録された、本開示の微生物による１エーカー−季節当たりの送達された窒素のポンドのヒートマップを示す。大きい方の画像を横切る細線の下方は、１エーカー−季節当たり１ポンド未満の窒素を送達する微生物であり、この線の上方は、１エーカー−季節当たり１ポンドよりも多くの窒素を送達する微生物である。実施例５の表２８は、ヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ  ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ  Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ  Ｎ／微生物  時間）を示している。図２４のデータは、圃場条件におけるトウモロコシ中のＮ産生をアッセイした微生物菌株に由来する。各点は、単一の圃場現場からのトウモロコシ根コロニー化データを使用した、微生物により産生されたｌｂ  Ｎ／エーカーを表わす。Ｎ固定活性は、グルタミンまたはリン酸アンモニウムの形態の５ｍＭ  Ｎでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＡアッセイを使用して決定した。
【０１０９】
【図２５】図２５は、ｍｍｏｌ窒素／微生物−時間による生重量１ｇ当たりの微生物の関数として記録された、本開示の微生物による１エーカー−季節当たりの送達された窒素のポンドのヒートマップを示す。大きい方の画像を横切る細線の下方は、１エーカー−季節当たり１ポンド未満の窒素を送達する微生物であり、この線の上方は、１エーカー−季節当たり１ポンドよりも多くの窒素を送達する微生物である。実施例５の表２９は、ヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ  ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ  Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ  Ｎ／微生物  時間）を示している。図２５のデータは、実験室および温室条件におけるトウモロコシ中のＮ産生をアッセイした微生物菌株に由来する。各点は、単一の菌株により産生されたｌｂ  Ｎ／エーカーを表わす。白色点は、トウモロコシ根コロニー化データが温室条件で収集された菌株を表わす。黒色点は、トウモロコシ根コロニー化レベルが、野生型親菌株の平均圃場トウモロコシ根コロニー化レベルから導き出されている変異体菌株を表わす。斜線付き点は、平均圃場トウモロコシ根コロニー化レベルの野生型親菌株を表わす。全ての場合で、Ｎ固定活性は、グルタミンまたはリン酸アンモニウムの形態の５ｍＭ  Ｎでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＡアッセイにより決定した。
【０１１０】
【図２６】図２６は、土壌における生物学的Ｎ２固定システムのタイプ、エネルギー源、および固定能力を示す。
【０１１１】
【図２７】図２７は、全栽培季節におけるトウモロコシ植物の窒素必要量を示す。窒素固定微生物が栽培季節にわたってトウモロコシ植物に必要とする全ての窒素を供給する（したがって、合成肥料と完全に置換する）ためには、微生物（集合体として）は、約２００ポンドの窒素／エーカーを産生する必要がある。また、図２７は、菌株ＰＢＣ１３７−１０３６（すなわち、リモデリングされたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ）が約２０ポンドの窒素／エーカーを供給することを示す。
【０１１２】
【図２８−１】図２８Ａは、肥料を本開示のリモデリングされた微生物と置換することができるシナリオを提供する。上の図２７に記載のように、破線は、トウモロコシの窒素必要量（約２００ポンド／エーカー）である。実線は、すでに考察しているように、リモデリングされた１３７−１０３６菌株によって供給することができる現在の窒素量（約２０ポンド／エーカー）である。「Ａ」バブルシナリオでは、本発明者らは、１３７−１０３６菌株の活性が５倍増加すると予測している（これを達成するためのＧＭＲキャンペーンストラテジーについては、図２９を参照のこと）。「Ｂ」シナリオでは、本発明者らは、１３７−１０３６菌株のコロニー化プロフィールを補完する特定のコロニー化プロフィールを有し、成長周期の後期の植物に窒素を供給するリモデリングされた微生物を利用することを予測している。
【０１１３】
【図２８−２】図２８Ｂは、仮出願時点の菌株１３７−１０３６による窒素産生と比較した、本出願時点のさらにリモデリングされた菌株１３７−３８９０による窒素産生を示す。破線は、全栽培季節におけるトウモロコシ植物の窒素必要量を示す。
【０１１４】
【図２９−１】図２９Ａは、ＰＢＣ６．１（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ）のＧＭＲキャンペーンに関して使用された遺伝子の特徴（すなわち、非属間の遺伝子の改変）を示す。示すように、微生物菌株の操作によって得られたさらなる特徴の各々により、予想Ｎ産生量（Ｎのｌｂｓ数／エーカー）が増加した。図２９Ａに示すＰＢＣ６．１についてのＧＭＲキャンペーンに加えて、ＰＢＣ１３７（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ）に対してＧＭＲキャンペーンを実施する予定であることも理解できる。仮出願時点で、宿主菌株にニトロゲナーゼ発現の特徴（Ｆ１）を操作していた。特徴２〜６を実施する予定であったので、仮出願時点でのこれらの特徴のＮ産生量（Ｎのｌｂｓ数／エーカー）への予測される寄与を、破線で示した棒グラフによって示す。これらの予測を、ＰＢＣ６．１  ＧＭＲキャンペーン由来のデータによって報告した。図２８Ａのシナリオ「Ａ」に見られるように、ＰＢＣ１３７においてＧＭＲキャンペーンが完了した時点で、非属間のリモデリングされた菌株（田畑中の全微生物／コロニー化植物を考慮した集合体として）が、トウモロコシ植物の成長周期の初期にわたるトウモロコシ植物のほぼ全ての窒素必要量を供給することができると予想される。
【０１１５】
【図２９−２】図２９Ｂは、ＰＢＣ６．１（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ）のＧＭＲキャンペーンに関して使用された遺伝子の特徴（すなわち、非属間の遺伝子の改変）を示す。示すように、微生物菌株の操作によって得られたさらなる特徴の各々により、予想Ｎ産生量（Ｎのｌｂｓ数／エーカー）が増加した。図２９Ａに示すＰＢＣ６．１についてのＧＭＲキャンペーンに加えて、ＰＢＣ１３７（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ）に対してＧＭＲキャンペーンを実施する予定であることも理解できる。現在、特徴Ｆ１〜Ｆ３を宿主菌株で操作しており、特徴Ｆ４〜Ｆ６を実施する予定である。図２８Ａのシナリオ「Ａ」に見られるように、ＰＢＣ１３７においてＧＭＲキャンペーンが完了した時点で、非属間のリモデリングされた菌株（田畑中の全微生物／コロニー化植物を考慮した集合体として）が、トウモロコシ植物の成長周期の初期にわたるトウモロコシ植物のほぼ全ての窒素必要量を供給することができると予想される。
【０１１６】
【図３０−１】図３０Ａは、図２９Ａと同一の予測を示し、付与可能な特徴セットに対する予測される窒素産生量の増加をマッピングしている。
【０１１７】
【図３０−２】図３０Ｂは、特徴Ｆ１（ニトロゲナーゼ発現）、Ｆ２（窒素同化）、およびＦ３（アンモニウム排出）が組み込まれた時点でのＰＢＣ１３７のリモデリングされた菌株によるＮのｍｍｏｌ／ＣＦＵ／時間としてのＮ産生量を示す。
【０１１８】
【図３１】図３１は、非属間のリモデリングされた微生物１３７−１０３６のコロニー化１〜１３０日および総ＣＦＵ／エーカーを示す。
【０１１９】
【図３２】図３２は、提案された非属間のリモデリングされた微生物（１３７−１０３６の子孫、提案された遺伝子変更の特徴については、図２９および図３０を参照のこと）のコロニー化１〜１３０日および総ＣＦＵ／エーカーを示す。
【０１２０】
【図３３】図３３は、１３７−１０３６微生物を補完するコロニー化プロフィールを有する提案された非属間のリモデリングされた微生物のコロニー化１〜１３０日および総ＣＦＵ／エーカーを示す。記載のように、この微生物は、約１００ポンドの窒素／エーカー（集合体として）（図２８中のシナリオ「Ｂ」）を産生すると予測され、１３７−１０３６微生物が減少し始めるのとほぼ同時にコロニー化を開始するはずである。
【０１２１】
【図３４】図３４は、上のパネル中の１３７−１０３６のコロニー化プロフィールおよび下のパネル中のより後期／補完コロニー化動態を有する微生物のコロニー化プロフィールを提供する。
【０１２２】
【図３５】図３５は、以下の２つのシナリオを示す：（１）示したコロニー化プロフィールを有する非属間のリモデリングされた微生物の提案したコンソーシアのコロニー化１〜１３０日および総ＣＦＵ／エーカー、または（２）示したコロニー化プロフィールを有する提案した単一の非属間のリモデリングされた微生物のコロニー化１〜１３０日および総ＣＦＵ／エーカー。
【０１２３】
【図３６】図３６は、実施例９で利用した一般的な実験デザインを示し、このデザインには、１０週間にわたってトウモロコシからコロニー化および転写物試料の採取が必要であった。これらの試料により、微生物のコロニー化能力および微生物の活性の計算が可能であった。
【０１２４】
【図３７】図３７は、実施例９で利用した試料採取スキームの態様を視覚的に示し、これにより、「標準」種子節根試料とより「末梢の」根試料との間のコロニー化パターンを区別可能である。
【０１２５】
【図３８】図３８は、実施例９で利用した試料採取スキームの態様を視覚的に示す。
【０１２６】
【図３９】図３９は、ＷＴ１３７（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ）、０１９（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、および００６（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ）の全てが類似のコロニー化パターンを有することを示す。
【０１２７】
【図４０】図４０は、実施例９においてトウモロコシ根を試料採取するために利用した実験スキームを示す。プロット：各四角は時点であり、Ｙ軸は距離であり、Ｘ軸は節である。標準試料を、常に、成長点と共に採取した。末梢部および中間部の試料は週毎に変化したが、一貫性があるように試みた。
【０１２８】
【図４１】図４１は、実施例９由来の全ての結果を示し、図４０の試料採取スキームで取得した全てのデータを利用し、平均値を求めている。図４１に見られるように、菌株１３７は、菌株６または菌株１９よりも末梢根でより高いコロニー化を維持する。「標準試料」は、他の根の位置由来の試料と比較するときのこの菌株の最も代表的な試料であった。
【０１２９】
【図４２】図４２は、本開示の微生物が、前述の微生物に暴露されたトウモロコシ作物の圃場内変動を減少させることが可能であり、結果として、農業従事者における収穫高の安定性が改善されることを示すＮＤＶＩデータを示す。
【０１３０】
【図４３】図４３は、８つのリモデリングされた細菌菌株からのアンモニウム排出量を示す。株１３７−１０３６は、２２．１５ポンドの窒素／エーカーを産生すると推定される。菌株１３７−２０８４は、３８．７７ポンドの窒素／エーカーを産生すると推定される。菌株１３７−２２１９は、７５．７４ポンドの窒素／エーカーを産生すると推定される。
【発明を実施するための形態】
【０１３１】
開示の詳細な説明
本開示の種々の実施形態が本明細書に表示および記載されているが、そのような実施形態は例示のために提供されているに過ぎないことは、当業者には明白であろう。当業者により、本開示から逸脱せずに多数の改変、変更、および置換を起想され得る。本明細書に記載の本開示の実施形態の種々の代替形態を用いることができることが理解されるべきである。
【０１３２】
肥料使用を増加させることは、それと共に環境上の懸念をもたらし、また、多くの経済的苦境にある地球上の地域では可能でない可能性が高い。さらに、微生物分野の多くの産業関係者が、属間微生物の作出に着目している。しかしながら、属間であると特徴付けられる／分類される操作された微生物には、厳しい規制負担が課せられる。これらの属間微生物は、広範な採用および実施を困難にするより大きな規制負担に直面するだけでなく、厳しい市民の監視の目にさらされる。
【０１３３】
現在、非属間であり、非マメ科作物での窒素固定を増加させることが可能である市販の操作された微生物は存在しない。そのような微生物のこの欠如は、真に環境に優しく、より持続可能な２１世紀型農業システムへの導きを支援するために欠けている要素である。
【０１３４】
本開示は、前述の問題を解決し、作物中で窒素を容易に固定するように操作されている非属間微生物を提供する。さらに、教示される非属間微生物は、２１世紀の農業従事者が、かつてなく増加する量の外因性窒素肥料の使用に依存しなくなるように支援する役目を果たすであろう。
【０１３５】
定義
本開示を記載する状況（特に、以下の特許請求の範囲の状況）での用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および類似の参照対象の使用は、本明細書に別様の指示がない限り、または状況と明らかに矛盾しない限り、単数および複数を両方とも包含すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、別様の指示がない限り、非限定的用語として解釈されるべきである（すなわち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）が、限定されない」ことを意味する）。本明細書における数値範囲の記載は、本明細書で別様の指示がない限り、各別個の数値がその範囲内に入ることを個々に参照するための簡略的な方法としての役目を果たすことが意図されているに過ぎず、各別個の数値は、それが本明細書にあたかも個々に記載されているが如く、本明細書に組み込まれる。例えば、範囲１０〜１５が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４も開示されている。本明細書に記載されている方法は全て、本明細書に別様の指示がない限り、または状況と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されているありとあらゆる例または例示的な文言（例えば、「など」）の使用は、本開示をより良好に説明するためのものに過ぎず、別様に特許請求されない限り、本開示の範囲を限定しない。本明細書中の文言は、任意の特許請求されていない要素を、本開示の実施に不可欠なものであることを示すものとして解釈されるべきでない。
【０１３６】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、あらゆる３次元構造も有してもよく、公知か未知かに関わらず、あらゆる機能を発揮してもよい。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、以下：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析で規定された遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などのうちの１またはそれを超える改変ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチド構造への改変は、存在する場合、ポリマー構築の前に付与されてもよく、または後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどによって、重合後にさらに改変されてもよい。
【０１３７】
「ハイブリダイゼーション」は、１またはそれを超えるポリヌクレオチドを反応させて、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン−クリック型塩基対により生じてもよく、フーグスティン結合により生じてもよく、または塩基相補性による任意の他の配列特異的様式で生じてもよい。複合体は、二本鎖構造を形成する２本の鎖、複数鎖複合体を形成する３本またはそれを超える鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはそれらの任意の組合せを含んでもよい。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、またはエンドヌクレアーゼによるポリヌクレオチドの酵素切断などの、より広範なプロセスの工程を構成してもよい。第１の配列に相補的な第２の配列は、第１の配列の「相補体」と呼ばれる。用語「ハイブリダイズ可能な」は、ポリヌクレオチドに付与される場合、ポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション反応にて、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化される複合体を形成する能力を指す。
【０１３８】
「相補性」は、核酸が、従来のワトソン−クリック型または他の非従来型のいずれかにより別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック型塩基対）を形成することができる、核酸分子中の残基のパーセントを示す（例えば、１０個のうち５、６、７、８、９、１０個は、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補性である）。「完全に相補的」は、核酸配列の隣接残基が全て、第２の核酸配列中の同数の隣接残基と水素結合することになることを意味する。「実質的に相補的」は、本明細書中で使用される場合、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０個、またはそれを超えるヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％である相補性の程度を指すか、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。相補性パーセントを評価する目的のためなどの配列同一性は、限定されないが、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能なＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅアライナーを参照のこと。任意選択で初期設定を使用してもよい）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで入手可能なＢＬＡＳＴアラインメントツールを参照のこと。任意選択で初期設定を使用してもよい）、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能なＥＭＢＯＳＳ  Ｗａｔｅｒアライナーを参照のこと。任意選択で初期設定を使用してもよい）を含む任意の適切なアラインメントアルゴリズムにより測定することができる。初期設定パラメータを含む、選択したアルゴリズムの任意の適切なパラメータを使用して、最適なアラインメントを評価することができる。
【０１３９】
一般的に、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」は、標的配列との相補性を有する核酸が、主に標的配列とハイブリダイズするが、非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般的に配列依存性であり、幾つかの要因に応じて様々である。一般的に、配列が長いほど、その配列がその標的配列と特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｉ、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．に詳細に記載されている。
【０１４０】
本明細書中で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へとなど）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが引き続きペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードポリペプチドは、「遺伝子産物」と総称される場合がある。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞でのｍＲＮＡスプライシングを含む場合がある。
【０１４１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書では相互交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖であってもよくまた分岐していてもよく、改変アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により中断されてもよい。また、これら用語は、改変されているアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作を包含する。用語「アミノ酸」は、本明細書中で使用される場合、グリシンおよびＤまたはＬの両光学異性体を含む天然および／もしくは非天然のまたは合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む。
【０１４２】
本明細書中で使用される場合、用語「約」は、用語「およそ」と同義的に使用される。例示的には、量に関する用語「約」の使用は、数値が、言及されている数値のわずかに外側にあること、例えば、プラスまたはマイナス０．１％〜１０％であることを示す。
【０１４３】
用語「生物学的に純粋な培養物」または「実質的に純粋な培養物」は、培養物の複製を妨げたり、または通常の細菌学的技法によって検出されたりするほどの量の他の細菌種を含まない、本明細書に記載の細菌種の培養物を指す。
【０１４４】
「植物生産性」は、一般的に、植物を成長させる根拠となる植物の成長または発達のあらゆる態様を指す。穀物または野菜などの食用作物の場合、「植物生産性」は、特定の作物から収穫される穀物または果実の収穫高を指す場合がある。本明細書中で使用される場合、植物生産性の改善は、穀物、果実、花、または種々の目的で収穫される他の植物部分の収穫高の改善；茎、葉、および根を含む植物部分の成長の改善；植物成長の促進；葉における高葉緑素含有量の維持；果実数または種子数の増加；果実重量または種子重量の増加；窒素肥料使用量の削減によるＮＯ２排出削減；および植物の成長および発達の類似の改善を、幅広く指す。
【０１４５】
食用作物内および周囲の微生物は、それら作物の形質に影響を及ぼす場合がある。微生物により影響を受ける場合がある植物形質としては、以下が挙げられる：収穫高（例えば、穀物生産、バイオマス生成、果実形成、着花）；栄養（例えば、窒素、リン、カリウム、鉄、微量栄養素の獲得）；非生物ストレス管理（例えば、干ばつ耐性、耐塩性、耐熱性）；および生物ストレス管理（例えば、有害生物、雑草、昆虫、真菌、および細菌）。作物形質を変更するための戦略としては、以下が挙げられる：重要な代謝物濃度を増加させること；重要な代謝物に対する微生物影響の経時的動態を変更すること；微生物代謝物産生／分解を新しい環境的要因と関連させること；負の代謝物を減少させること；および代謝物またはそれらの根底をなすタンパク質のバランスを改善させること。
【０１４６】
本明細書中で使用される場合、「調節配列」は、オペレーター、プロモーター、サイレンサー、またはターミネーターを指す。
【０１４７】
本明細書中で使用される場合、「ｉｎ  ｐｌａｎｔａ」は、使用状況に応じて、植物の中、植物の上、または植物と緊密に付随する（例えば、内部寄生性、着生性、または根圏性に付随する）ことを指し得る。植物は、植物の部分、組織、葉、根、根毛、根茎、茎、種子、胚珠、花粉、花、果実などを含んでよい。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子のネイティブ調節配列または内因性調節配列は、１またはそれを超える属内調節配列と置換されている。
【０１４９】
本明細書中で使用される場合、「導入」は、天然の導入ではなく、現代のバイオテクノロジーによる導入を指す。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本開示の細菌は、改変されており、天然に存在する細菌ではない。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本開示の細菌は、植物の生重量または乾燥重量の１グラム当たり、少なくとも１０３ｃｆｕ、１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕ、１０６ｃｆｕ、１０７ｃｆｕ、１０８ｃｆｕ、１０９ｃｆｕ、１０１０ｃｆｕ、１０１１ｃｆｕ、または１０１２ｃｆｕの量で植物中に存在する。いくつかの実施形態では、本開示の細菌は、植物の生重量または乾燥重量の１グラム当たり、少なくとも約１０３ｃｆｕ、約１０４ｃｆｕ、約１０５ｃｆｕ、約１０６ｃｆｕ、約１０７ｃｆｕ、約１０８ｃｆｕ、約１０９ｃｆｕ、約１０１０ｃｆｕ、約１０１１ｃｆｕ、または約１０１２ｃｆｕの量で植物中に存在する。いくつかの実施形態では、本開示の細菌は、植物の生重量または乾燥重量の１グラム当たり、少なくとも１０３〜１０９、１０３〜１０７、１０３〜１０５、１０５〜１０９、１０５〜１０７、１０６〜１０１０、１０６〜１０７ｃｆｕの量で植物中に存在する。
【０１５２】
本開示の肥料および外来性窒素は、以下の窒素含有分子：アンモニウム、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニア、グルタミンなどを含んでもよい。本開示の窒素源としては、以下のものを挙げることができる：無水アンモニア、硫酸アンモニア、尿素、リン酸二アンモニウム、尿素の形態、リン酸一アンモニウム、硝酸アンモニウム、窒素溶液、硝酸カルシウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウムなど。
【０１５３】
本明細書中で使用される場合、「外因性窒素」は、アンモニア、アンモニウム、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、尿酸、アンモニウム酸などを含む、非窒素制限条件下で存在する、土壌、圃場、または増殖培地で容易に利用可能な非大気窒素を指す。
【０１５４】
本明細書中で使用される場合、「非窒素制限条件」は、Ｋａｎｔら．（２０１０．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．６２（４）：１４９９−１５０９）（本明細書中で参考として援用される）に開示されているような、約４ｍＭ窒素を超える濃度で土壌、圃場、培地で利用可能な非大気窒素を指す。
【０１５５】
本明細書中で使用される場合、「属間微小生物」は、元々は異なる分類学的属の生物から単離された遺伝物質の意図的な組合せにより形成されている微小生物である。「属間変異」は、「属間微小生物」と相互交換可能に使用することができる。例示的な「属間微小生物」は、レシピエント微小生物とは異なる属の微小生物で最初に同定された可動遺伝要素を含有する微小生物を含む。さらなる説明は、特に、連邦規則集第４０巻セクション７２５．３に見出すことができる。
【０１５６】
態様では、本明細書で教示された微生物は、「非属間」であり、これは、微生物が属間ではないことを意味する。
【０１５７】
本明細書中で使用される場合、「属内微小生物」は、元々は同じ分類学的属の生物から単離された遺伝物質の意図的な組合せにより形成されている微小生物である。「属内変異」は、「属内微小生物」と相互交換可能に使用することができる。
【０１５８】
本明細書中で使用される場合、「導入された遺伝物質」は、レシピエントのゲノムに付加され、レシピエントのゲノムの成分として残留する遺伝物質を意味する。
【０１５９】
本明細書中で使用される場合、非属間微小生物の文脈において、用語「リモデリングされた」は、用語「操作された」と同義的に使用される。したがって、「非属間のリモデリングされた微小生物」は、「非属間の操作された微小生物」と同義の意味を有し、相互交換可能に使用されるであろう。さらに、本開示は、「操作された菌株」または「操作された誘導体」または「操作された非属間微生物」を指し得、これらの用語は、「リモデリングされた菌株」または「リモデリングされた誘導体」または「リモデリングされた非属間微生物」と同義的に使用される。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、窒素固定および同化の遺伝子制御ネットワークは、遺伝子をコードするポリヌクレオチドならびに微生物の窒素固定および／または同化を指示、調整、および／または調節する非コード配列を含み、ｎｉｆクラスター（例えば、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＣ、．．．．．．．ｎｉｆＺ）のポリヌクレオチド配列、窒素制御タンパク質Ｃをコードするポリヌクレオチド、窒素制御タンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎクラスター（例えば、ｇｌｎＡおよびｇｌｎＤ）のポリヌクレオチド配列、ｄｒａＴ、およびアンモニア輸送体／パーミアーゼを含み得る。一部の場合では、Ｎｉｆクラスターは、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＸ、ｈｅｓａ、およびＮｉｆＶを含んでいてもよい。一部の場合では、Ｎｉｆクラスターは、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＸ、ｈｅｓａ、およびＮｉｆＶのサブセットを含んでいてもよい。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本開示の肥料は、重量で少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の窒素を含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本開示の肥料は、重量で少なくとも約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の窒素を含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、本開示の肥料は、重量で約５％〜５０％、約５％〜７５％、約１０％〜５０％、約１０％〜７５％、約１５％〜５０％、約１５％〜７５％、約２０％〜５０％、約２０％〜７５％、約２５％〜５０％、約２５％〜７５％、約３０％〜５０％、約３０％〜７５％、約３５％〜５０％、約３５％〜７５％、約４０％〜５０％、約４０％〜７５％、約４５％〜５０％、約４５％〜７５％、または約５０％〜７５％の窒素を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、窒素固定の増加および／または植物における１％またはそれを超える窒素の産生は、本開示の細菌に曝露していない対照植物と比較して測定される。細菌の増加または減少は全て、対照細菌と比較して測定される。植物の増加または減少は全て、対照植物と比較して測定される。
【０１６５】
本明細書中で使用される場合、「構成的プロモーター」は、ほとんどの条件下でおよび／またはほとんどの発生段階中で活性なプロモーターである。バイオテクノロジーで使用される発現ベクター中で構成的プロモーターを使用することは、トランスジェニック細胞または生物を選択するために使用されるタンパク質の高レベル産生；容易な検出および定量化を可能にするレポータータンパク質またはスコア化可能なマーカーの高レベル発現；転写制御系の一部である転写因子の高レベル産生；生物中で遍在活性が必要とされる化合物の産生；および全ての発生段階中に必要とされる化合物の産生などの幾つかの利点がある。非限定的で例示的な構成的プロモーターとしては、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、オパインプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターなどが挙げられる。
【０１６６】
本明細書中で使用される場合、「非構成的プロモーター」は、ある特定の条件下で、ある特定のタイプの細胞で、および／またはある特定の発生段階中に活性なプロモーターである。例えば、組織特異的、組織優先的、細胞タイプ特異的、細胞タイプ優先的な誘導性プロモーター、および発生調節下にあるプロモーターは、非構成的プロモーターである。発生調節下にあるプロモーターの例としては、ある特定の組織で優先的に転写を開始させるプロモーターが挙げられる。
【０１６７】
本明細書中で使用される場合、「誘導性」または「抑制可能な」プロモーターは、化学因子または環境因子の調節下にあるプロモーターである。誘導性プロモーターによる転写に影響を及ぼし得る環境条件の例としては、嫌気条件、ある特定の化学物質、光の存在、酸性または塩基性条件などが挙げられる。
【０１６８】
本明細書中で使用される場合、「組織特異的」プロモーターは、ある特定の組織でのみ転写を開始させるプロモーターである。遺伝子の構成的発現とは異なり、組織特異的な発現は、いくつかの遺伝子制御レベルの相互作用の結果である。したがって、当該分野では、時には、同種のまたは緊密に関連する種に由来するプロモーターを使用して、特定の組織における効率的で信頼性の高い導入遺伝子の発現を達成することが好ましい。これは、特定の組織から単離された組織特異的プロモーターが大量に、科学文献および特許文献の両方に見出されることの主な理由の１つである。
【０１６９】
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結した」は、一方の機能が他方により制御されるように、核酸配列を単一の核酸断片上で関連させることを指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を制御することが可能な（すなわち、コード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、そのコード配列と作動可能に連結している。コード配列は、センス配向性またはアンチセンス配向性で制御配列に作動可能に連結することができる。別の例では、本開示の相補的ＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡの５’に、または標的ｍＲＮＡの３’に、または標的ｍＲＮＡ内に、直接または間接のいずれかで作動可能に連結することができるか、第１の相補的領域が５’であり、その相補体は標的ｍＲＮＡの３’である。
【０１７０】
態様では、「植物に複数の非属間細菌を付与する」は、植物（種子、根、茎、組織などの植物部分を含む）を、植物の生活環の任意の段階にて前述の細菌と接触させる（すなわち、曝露する）ための任意の手段を含む。したがって、「植物に複数の非属間細菌を付与する」は、植物（種子、根、茎、組織などの植物部分を含む）を前述の細菌に曝露するための以下の手段のいずれかを含む：植物に噴霧すること、植物に滴下すること、種子被膜として塗布すること、その後種子を植栽することになる圃場に施すこと、種子を既に植栽した圃場に施すこと、成体植物を有する圃場に施すことなど。
【０１７１】
本明細書中で使用される場合、「ＭＲＴＮ」は、対窒素最大収益の頭字語であり、実施例の実験処理として使用されている。ＭＲＴＮは、アイオワ州立大学により開発され、情報は、ｃｎｒｃ．ａｇｒｏｎ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／に見出すことができる。ＭＲＴＮは、窒素付与の経済的純収益が最大化される窒素割合である。ＭＲＴＮを算出する手法は、個々の状態のトウモロコシ窒素割合ガイドラインを開発するための地域別手法である。大豆後のトウモロコシ植栽およびトウモロコシ後のトウモロコシ植栽に関して適切な数の研究試験が入手可能であったイリノイ州、アイオワ州、ミシガン州、ミネソタ州、オハイオ州、およびウィスコンシン州の窒素割合試験データが評価された。試験は、噴出施肥、側方施肥、または植栽前／側方分割施肥で付与した窒素で実施され、現場は、ウィスコンシン州の潅漑砂地で示されたものを除いて潅漑されなかった。ＭＲＴＮは、トウモロコシ生産に必要とされる示唆された窒素割合を決定するための方法に明白な差異があること、窒素割合ガイドラインに関する誤解、および付与割合に対する懸念があるため、アイオワ州立大学により開発された。ＭＲＴＮの算出により、実施者は、以下のことを決定することができる：（１）窒素付与の経済的純収益が最大化される窒素割合、（２）窒素の最終増分が、追加の窒素の費用を賄うのに十分大きな収穫高増加を生み出すポイントである経済的に最適な窒素割合、（３）窒素付与に起因するトウモロコシ穀物増加の値、およびより多くの窒素の付与がトウモロコシ収穫高の増加をもたらさない収穫高である最大収穫高。したがって、ＭＲＴＮ計算は、様々な地域でのトウモロコシ作物を最大化しつつ、窒素付与からの金融上の利得を最大化する手段を実施者に提供する。
【０１７２】
用語「ｍｍｏｌ」は、ミリモルの略語であり、本明細書中でｍｏｌと略されるモルの１０００分の１（１０−３）である。
【０１７３】
本明細書中で使用される場合、用語「植物」は、植物の部分、組織、葉、根、根毛、根茎、茎、種子、胚珠、花粉、花、果実などを含むことができる。したがって、本開示が複数のトウモロコシ植物を特定の位置に提供することを考察するとき、これは、特定の位置にトウモロコシ種子を植栽することを必要とし得ると理解される。
【０１７４】
本明細書中で使用される場合、「微小生物」または「微生物」という用語は、広義に解釈されるべきである。これらの用語は、相互交換可能に使用され、２つの原核生物ドメインである細菌および古細菌を含むが、それらに限定されない。この用語は、真核生物である真菌および原生生物を包含することもできる。
【０１７５】
本明細書中で使用される場合、本開示が受入番号による特定の微生物寄託を考察するとき、本開示が、前述の寄託された微生物の同定されている特徴の全てを有する微生物菌株および／またはその変異体も企図すると理解される。
【０１７６】
用語「微生物コンソーシア」または「微生物コンソーシアム」は、個々の微生物種または種の菌株の微生物共同体のサブセットを指し、共通の機能を実施すると説明することができるか、または目的の表現型形質などの認識可能なパラメータに関与する、もしくは結び付く、もしくは相関すると説明することができる。
【０１７７】
用語「微生物共同体」は、２またはそれを超える種または菌株を含む微生物の群を意味する。微生物コンソーシアとは異なり、微生物共同体は、共通の機能を実施している必要はないか、または目的の表現型形質などの認識可能なパラメータに関与する、もしくは結び付く、もしくは相関する必要はない。
【０１７８】
本明細書中で使用される場合、「単離する」、「単離された」、「単離された微生物」、および類似の用語は、１またはそれを超える微小生物が、特定の環境（例えば、土壌、水、植物組織など）に付随している物質の少なくとも１つから分離されていることを意味することが意図されている。したがって、「単離された微生物」は、その天然に存在する環境に存在せず、むしろ、微生物は、本明細書に記載の種々の技法により、その自然状況から取り出されており、天然に存在しない存在状態に置かれている。したがって、単離された菌株または単離された微生物は、例えば、生物学的に純粋な培養物または胞子（または菌株の他の形態）として存在していてもよい。態様では、単離された微生物は、農業的に許容され得る担体であってもよい許容され得る担体に付随していてもよい。
【０１７９】
本開示のある特定の態様では、単離された微生物は、「単離された生物学的に純粋な培養物」として存在する。当業者であれば、特定の微生物の単離された生物学的に純粋な培養物は、前述の培養物が、他の生存生物を実質的に含まず、問題としている個々の微生物のみを含むことを示すことを理解するであろう。培養物は、様々な濃度の前述の微生物を含むことができる。本開示では、単離された生物学的に純粋な微生物は、「より純粋でないかまたは不純な物質とは必然的に異なる」ことが多いことが留意される。例えば、Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍに関して、４２７  Ｆ．２ｄ  １３９４（ＣＣＰＡ１９７０）（精製プロスタグランジンに関する考察）、またＢｅｒｇｙに関して、５９６  Ｆ．２ｄ  ９５２（ＣＣＰＡ１９７９）（精製微生物に関する考察）、またＰａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ＆Ｃｏ．ｖ．Ｈ．Ｋ．Ｍｕｌｆｏｒｄ＆Ｃｏ．に関して、１８９  Ｆ．９５（Ｓ．Ｄ．Ｎ．Ｙ．１９１１）（精製アドレナリンに関するＬｅａｒｎｅｄ  Ｈａｎｄの考察）、部分的に支持され部分的に破棄されている１９６  Ｆ．４９６（２ｄ  Ｃｉｒ．１９１２）（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。さらに、いくつかの態様では、本開示は、単離された生物学的に純粋な微生物培養物内に見出されなければならない濃度または純度限定に関するある特定の定量的尺度を提供する。ある特定の実施形態では、これらの純度値の存在は、本開示の微生物を、天然の状態で存在する微生物と区別するさらなる属性である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ．ｖ．Ｏｌｉｎ  Ｍａｔｈｉｅｓｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、２５３  Ｆ．２ｄ  １５６（４ｔｈ  Ｃｉｒ．１９５８）（微生物により産生されるビタミンＢ１２の純度限定に関する考察）を参照のこと。
【０１８０】
本明細書中で使用される場合、「個々の単離株」は、１またはそれを超える他の微小生物から分離された後の、微小生物の優位な単一の属、種、または菌株を含む組成物または培養物を意味すると解釈されるべきである。
【０１８１】
本開示の微生物は、胞子および／または栄養細胞を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の微生物は、生存可能であるが培養不能な（ＶＢＮＣ）状態の微生物を含む。本明細書中で使用される場合、「胞子」または「胞子（複数）」は、生存および散布に適した、細菌および真菌により生成された構造物を指す。胞子は、一般的には、休眠構造と特徴付けられるが、胞子は、発芽プロセスにより分化することが可能である。発芽は、胞子が、代謝活性、成長、および生殖が可能な栄養細胞へと分化することである。単一の胞子の発芽は、単一の真菌または細菌栄養細胞をもたらす。真菌胞子は、無性生殖の単位であり、一部の場合では、真菌生活環に必要な構造物である。細菌胞子は、通常は、栄養細胞の生存または成長に貢献しない場合がある生存条件の場合の構造物である。
【０１８２】
本明細書中で使用される場合、「微生物組成物」は、本開示の１またはそれを超える微生物を含む組成物を指す。いくつかの実施形態では、微生物組成物は、植物（種々の植物部分を含む）および／または農業圃場に投与される。
【０１８３】
本明細書中で使用される場合、「担体」、「許容され得る担体」、または「農業的に許容され得る担体」は、微生物を共に投与することができ、微生物に有害な影響を及ぼさない希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の微生物および／または遺伝子改変は、２０１８年１月１２日に出願され、発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｉｔｓ」であるＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１３６７１号（ＷＯ２０１８／１３２７７４Ａ１号）に教示の微生物ではない。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、２０１８年１月１２日に出願され、発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｉｔｓ」であるＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１３６７１号（ＷＯ２０１８／１３２７７４Ａ１号）に教示の方法ではない。したがって、本開示は、前述の出願に開示の微生物、方法、および遺伝子改変とは異なる条件を有する実施形態を企図する。
【０１８５】
窒素固定の制御
いくつかの場合では、窒素固定経路は、遺伝子操作および最適化の標的としての役目を果たす場合がある。本明細書中に記載の方法による制御の標的となり得る１つの形質は、窒素固定である。窒素肥料は、農場における最も大きな運営上の出費であり、トウモロコシおよび小麦のような条植え作物の収穫高を改善させる最大の誘因である。本明細書には、非マメ科作物に再生可能な形態の窒素を送達することができる微生物製品が記載されている。一部の内部寄生菌は、純粋培養での窒素固定に必要な遺伝的特徴を有するが、根本的な技術的難問は、穀類およびイネ科植物の野生型内部寄生菌は、施肥圃場では窒素固定を中止してしまうことである。化学肥料の施肥および圃場土壌中の残留窒素レベルは、微生物に対して、窒素固定の生化学経路を停止するようにシグナルを送る。
【０１８６】
肥料の存在下でも窒素を固定してトウモロコシへと移行させることが可能な微生物の開発のためには、窒素固定制御ネットワークの構成成分の転写レベルおよび翻訳後レベルを変更することが有益であり得る。そのため、本明細書中には、制御ネットワークを的確に進化させ、新規の表現型を誘発させるための宿主微生物進化（ＨｏＭＥ）技術が記載されている。また、本明細書中には、トウモロコシから単離された窒素固定内部寄生菌の固有の独自ライブラリーが、窒素ストレスおよび窒素過剰のような異なる環境条件下での微生物および宿主植物の相互作用を取り巻く広範なオーミクスデータと対にして記載されている。いくつかの実施形態では、この技術により、内部寄生菌の遺伝子制御ネットワークを的確に進化させて、圃場に肥料が存在する場合であっても活発に窒素を固定する微生物を産生することが可能になる。また、本明細書中には、トウモロコシ根組織にコロニー化し、施肥されている植物のために窒素を産生する微生物に進化させる技術的可能性の評価ならびに微生物を現代の窒素管理戦略に統合する実現可能性を決定するために、内部寄生菌と、標準的製剤化慣例および多様な土壌との適合性の評価が記載されている。
【０１８７】
窒素元素（Ｎ）を化学合成に利用するために、生命体は、窒素固定として公知であるプロセスにおいて、大気中で利用可能な窒素ガス（Ｎ２）を水素と化合させる。生物学的窒素固定は性質がエネルギー集約的であるため、ジアゾトロフ（大気窒素ガスを固定する細菌および古細菌）は、環境中の酸素および利用可能な窒素に応答してｎｉｆ遺伝子クラスターを精巧および厳密に制御するように進化している。Ｎｉｆ遺伝子は、窒素固定に関与する酵素（ニトロゲナーゼ複合体などの）および窒素固定を制御するタンパク質をコードする。Ｓｈａｍｓｅｌｄｉｎ（２０１３．Ｇｌｏｂａｌ  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８（４）：８４−９４）には、ｎｉｆ遺伝子およびそれらの産物の詳細な記載が開示されており、この文献は、本明細書中で参考として援用される。本明細書中には、改善された形質を有する植物を産生するための方法であって、第１の植物から細菌を単離する工程；単離された細菌の遺伝子に遺伝子変異を導入して窒素固定を増加させる工程；第２の植物を変異細菌に曝露する工程；第１の植物と比べて改善された形質を有する第２の植物から細菌を単離する工程；および第２の植物から単離された細菌を用いて工程を繰り返す工程を含む方法が記載されている。
【０１８８】
プロテオバクテリアでは、ｎｉｆクラスターの正の転写制御因子である、σ５４依存性エンハンサー結合タンパク質ＮｉｆＡが、窒素固定の制御に中心的な役割を果たす。活性ＮｉｆＡの細胞内レベルは、２つの主な因子：ｎｉｆＬＡオペロンの転写およびＮｉｆＬとのタンパク質間相互作用によるＮｉｆＡ活性の阻害により調節される。これらプロセスは両方とも、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードを介して、細胞内グルタミンレベルに応答性である。このカスケードは、ＧｌｎＤにより媒介され、ＧｌｎＤは、グルタミンを直接的に感知し、結合グルタミンの非存在または存在に応答して、２つのＰＩＩ制御タンパク質ＧｌｎＢおよびＧｌｎＫのウリジリル化または脱ウリジリル化をそれぞれ触媒する。窒素過剰条件下では、未改変ＧｌｎＢが、ｎｉｆＬＡプロモーターの非活性化シグナルを送る。しかしながら、窒素制限条件下では、ＧｌｎＢは翻訳後修飾を受け、それによりその活性が阻害され、ｎｉｆＬＡオペロンの転写に結び付く。このように、ｎｉｆＬＡ転写は、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードにより、環境窒素に応答して厳密に調節されている。ＮｉｆＡの翻訳後レベル調節では、ＧｌｎＫは、細胞内の遊離ＧｌｎＫの全体的レベルに依存する状況でＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用を阻害する。
【０１８９】
ＮｉｆＡは、ｎｉｆＬＡオペロンから転写され、そのプロモーターは、別のσ５４依存性制御因子であるリン酸化ＮｔｒＣにより活性化される。ＮｔｒＣのリン酸化状態は、ヒスチジンキナーゼＮｔｒＢにより媒介され、ＮｔｒＢは、脱ウリジリル化ＧｌｎＢとは相互作用するが、ウリジリル化ＧｌｎＢとは相互作用しない。窒素過剰条件下では、高い細胞内レベルのグルタミンは、ＧｌｎＢの脱ウリジリル化に結び付き、脱ウリジリル化されたＧｌｎＢは、その後ＮｔｒＢと相互作用して、そのリン酸化活性を不活化し、そのホスファターゼ活性を活性化させて、ＮｔｒＣの脱リン酸化およびｎｉｆＬＡプロモーターの不活化がもたらされる。しかしながら、窒素制限条件下では、低レベルの細胞内グルタミンは、ＧｌｎＢのウリジリル化をもたらし、それにより、ＮｔｒＢとのその相互作用が阻害され、ＮｔｒＣのリン酸化およびｎｉｆＬＡオペロンの転写を可能にする。このように、ｎｉｆＬＡ発現は、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードにより、環境窒素に応答して厳密に調節される。ｎｉｆＡ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、およびｇｌｎＢは全て、本明細書中に記載の方法で変異させることができる遺伝子である。また、これらのプロセスは、アンモニア、尿素、または硝酸塩の細胞内または細胞外レベルに応答する場合がある。
【０１９０】
また、ＮｉｆＡの活性は、最も典型的にはＮｉｆＡ活性のＮｉｆＬ媒介性阻害により、環境窒素に応答して翻訳後に制御される。一般的に、ＮｉｆＬとＮｉｆＡとの相互作用は、ＧｌｎＫを介したＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードにより影響を受けるが、ＧｌｎＫとＮｉｆＬ／ＮｉｆＡとの相互作用の性質は、ジアゾトロフ間で著しく異なる。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでは、両形態のＧｌｎＫが、ＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用を阻害し、ＧｌｎＫとＮｉｆＬ／ＮｉｆＡとの相互作用は、細胞内の遊離ＧｌｎＫの全体的レベルにより決定される。窒素過剰条件下では、脱ウリジリル化ＧｌｎＫは、アンモニウム輸送体ＡｍｔＢと相互作用し、これは、ＡｍｔＢによるアンモニウム取り込みを阻止すると共に、ＧｌｎＫを膜に隔離し、ＮｉｆＬによるＮｉｆＡの阻害を可能にする役目を果たす。一方、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉでは、ＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用およびＮｉｆＡ阻害には、脱ウリジリル化ＧｌｎＫとの相互作用が必要であるが、ＧｌｎＫのウリジリル化は、ＮｉｆＬとの相互作用を阻害する。ｎｉｆＬ遺伝子が欠如したジアゾトロフでは、ＮｉｆＡ活性は、窒素過剰条件下では、ＧｌｎＫおよびＧｌｎＢの両方の脱ウリジリル化形態との相互作用により直接的に阻害されるという証拠が存在する。一部の細菌では、Ｎｉｆクラスターが、ｇｌｎＲにより制御される場合があり、さらにいくつかの場合では、これは、負の制御を含む場合がある。その機序に関わらず、ほとんどの公知ジアゾトロフでは、ＮｉｆＡの翻訳後阻害は、ｎｉｆクラスターの重要な制御因子である。加えて、ｎｉｆＬ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＫおよびｇｌｎＲは、本明細書中に記載の方法で変異させることができる遺伝子である。
【０１９１】
多くのジアゾトロフは、ｎｉｆ遺伝子クラスターの転写制御に加えて、ニトロゲナーゼ遮断として公知である、ニトロゲナーゼ酵素自体の直接的翻訳後修飾および阻害の機序を進化させている。これは、窒素過剰条件下でのＦｅタンパク質（ＮｉｆＨ）のＡＤＰリボシル化により媒介され、それにより、ＭｏＦｅタンパク質複合体（ＮｉｆＤＫ）との相互作用が妨害され、ニトロゲナーゼ活性が消失する。ＤｒａＴは、Ｆｅタンパク質のＡＤＰリボシル化およびニトロゲナーゼの遮断を触媒し、ＤｒａＧは、ＡＤＰリボースの除去およびニトロゲナーゼの再活性化を触媒する。ｎｉｆＬＡ転写およびＮｉｆＡ阻害の場合と同様に、ニトロゲナーゼ遮断は、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードによっても制御される。窒素過剰条件下では、脱ウリジリル化ＧｌｎＢは、ＤｒａＴと相互作用してＤｒａＴを活性化し、脱ウリジリル化ＧｌｎＫは、ＤｒａＧおよびＡｍｔＢの両方と相互作用して複合体を形成し、ＤｒａＧを膜に隔離する。窒素制限条件下では、ＧｌｎＢおよびＧｌｎＫのウリジリル化形態は、それぞれＤｒａＴおよびＤｒａＧと相互作用せず、ＤｒａＴの不活化およびＤｒａＧのＦｅタンパク質への拡散に結び付き、そこでＡＤＰリボースが除去され、ニトロゲナーゼが活性化される。また、本明細書中に記載の方法では、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、およびｄｒａＴ遺伝子に遺伝子変異を導入することが企図される。
【０１９２】
いくつかの内部寄生菌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで窒素を固定する能力を有するが、この遺伝的特徴は、しばしば、圃場では高レベルの外因性化学肥料によりサイレンシングされる。圃場に基づく窒素固定を容易にするために、外因性窒素の感知をニトロゲナーゼ酵素の発現と切り離すことができる。さらに、ニトロゲナーゼ活性の統合を経時的に改善させることは、作物により利用される窒素の産生を増大させる役目を果たす。本明細書中に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための具体的な標的としては、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される１またはそれを超える遺伝子が挙げられる。
【０１９３】
本明細書中に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための追加の標的は、ＮｉｆＡタンパク質である。ＮｉｆＡタンパク質は、典型的には、窒素固定遺伝子発現の活性化因子である。ＮｉｆＡの産生を増加させることにより（構成的にまたは高アンモニア条件中のいずれかで）、天然アンモニア感知経路が回避される。加えて、ＮｉｆＡの公知の阻害剤であるＮｉｆＬタンパク質の産生を低減することは、遊離活性ＮｉｆＡレベルの増加にも結び付く。加えて、ｎｉｆＡＬオペロンの転写レベルを増加させることは（構成的にまたは高アンモニア条件中のいずれかで）、全体的により高いレベルのＮｉｆＡタンパク質にも結び付く。ｎｉｆＡＬ発現のレベル上昇は、プロモーター自体を変更することにより、またはＮｔｒＢ（元々は高窒素条件中にｎｉｆＡＬオペロンの遮断をもたらすことになるｎｔｒＢおよびｎｔｒＣシグナル伝達カスケードの一部）の発現を低減させることにより達成される。これらまたは本明細書中に記載の任意の他の方法により達成される高レベルのＮｉｆＡは、内部寄生菌の窒素固定活性を増加させる。
【０１９４】
本明細書中に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための別の標的は、ＧｌｎＤ／ＧｌｎＢ／ＧｌｎＫ  ＰＩＩシグナル伝達カスケードである。細胞内グルタミンレベルは、ＧｌｎＤ／ＧｌｎＢ／ＧｌｎＫ  ＰＩＩシグナル伝達カスケードにより感知される。ＧｌｎＤのウリジリル除去活性を消失させるＧｌｎＤの活性部位変異は、窒素感知カスケードを妨害する。加えて、ＧｌｎＢ濃度の低減は、グルタミン感知カスケードを短絡させる。これらの変異により、細胞を「騙して」窒素制限状態であると認識させ、それにより窒素固定レベル活性を増加させる。また、これらのプロセスは、アンモニア、尿素、または硝酸塩の細胞内または細胞外レベルに応答する場合がある。
【０１９５】
ａｍｔＢタンパク質も、本明細書中に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための標的である。環境からのアンモニア取り込みは、ａｍｔＢタンパク質の発現レベルを減少させることにより低減させることができる。細胞内アンモニアが存在しないと、内部寄生菌は、アンモニアのレベルが高いことを感知することができず、窒素固定遺伝子の下方制御が防止される。細胞内区画への進入を果たしたアンモニアは全てグルタミンに変換される。細胞内グルタミンレベルは、窒素を感知するための主要な媒介物である。細胞内グルタミンレベルを減少させることにより、細胞が、環境中のアンモニウムレベルが高いことを感知することが防止される。この効果は、グルタミンをグルタメートに変換する酵素であるグルタミナーゼの発現レベルを増加させることにより達成できる。加えて、細胞内グルタミンは、グルタミン合成酵素（アンモニアをグルタミンに変換する酵素）を減少させることによっても低減させることができる。ジアゾトロフでは、固定されたアンモニアは、細胞プロセスに使用されることになるグルタミンおよびグルタメートへと迅速に同化される。アンモニア同化の妨害は、固定窒素を転換して、アンモニアとして細胞から搬出されることを可能にする場合がある。固定されたアンモニアは、主にｇｌｎＡによりコードされているグルタミン合成酵素（ＧＳ）によりグルタミンへと、その後はグルタミンオキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＧＡＴ）によりグルタミンへと同化される。いくつかの例では、ｇｌｎＳは、グルタミン合成酵素をコードする。ＧＳは、ＧＳアデニリルトランスフェラーゼ（ＧｌｎＥ）、つまり、それぞれアデニリルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインおよびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインの活性によりＧＳのアデニリル化および脱アデニリル化の両方を触媒する、ｇｌｎＥによりコードされた二機能性酵素により、翻訳後に制御される。窒素制限条件下では、ｇｌｎＡが発現され、ＧｌｎＥのＡＲドメインは、ＧＳを脱アデニリル化し、ＧＳの活性化を可能にする。窒素過剰条件下では、ｇｌｎＡ発現は中止され、ＧｌｎＥのＡＴドメインは、グルタミンによりアロステリック的に活性化され、ＧＳのアデニリル化および非活性化が引き起こされる。
【０１９６】
さらに、ｄｒａＴ遺伝子もまた、本明細書中に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための標的であってもよい。細胞により窒素固定酵素が産生されると、ニトロゲナーゼ遮断が、細胞が高窒素条件で固定活性を下方制御する別のレベルを表す。この遮断は、ＤｒａＴの発現レベルを減少させることにより除去することができる可能性がある。
【０１９７】
新しい微生物表現型を付与するための方法は、転写レベル、翻訳レベル、および翻訳後レベルで実施することができる。転写レベルでは、プロモーターを変更すること（プロモーターの全てまたは一部の欠失を含む、転写因子に対するシグマ因子親和性または結合部位の変更など）または転写ターミネーターおよびアテニュエータを変更することが含まれる。翻訳レベルでは、リボソーム結合部位での変更、およびｍＲＮＡ分解シグナルを変更することが含まれる。翻訳後レベルでは、酵素の活性部位を変異させること、およびタンパク質間相互作用を変更させることが含まれる。これらの変更は、数多くの方法で達成することができる。発現レベルの低減（または完全な消失）は、天然リボソーム結合部位（ＲＢＳ）またはプロモーターを、強度／効率がより低いものと交換することにより達成することができる。ＡＴＧ開始部位を、ＧＴＧ、ＴＴＧ、またはＣＴＧ開始コドンと交換することができ、それにより、コード領域の翻訳活性の低減がもたらされる。発現の完全な消失は、遺伝子のコード領域をノックアウト（欠失）することにより行うことができる。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をフレームシフトすると、ＯＲＦに中途終止コドンがもたらされ、非機能性の短縮産物が作成されることになる可能性がある。同様に、インフレーム終止コドンの挿入も、非機能性の短縮産物を作出することになる。ＮまたはＣ末端に分解タグを付加することでも、特定の遺伝子の有効濃度を低減することができる。
【０１９８】
反対に、本明細書に記載されている遺伝子の発現レベルは、より強力なプロモーターを使用することにより達成することができる。高窒素レベル条件（または任意の他の条件）中のプロモーター活性を確実に高くするために、高窒素レベル条件における全ゲノムの転写プロファイルを取得し、そのデータセットから、所望の転写レベルを有する活性プロモーターを選択して、弱いプロモーターを置換することができる。弱い開始コドンを、より良好な翻訳開始効率のＡＴＧ開始コドンと交換してもよい。また、弱いリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を、より高い翻訳開始効率を有する異なるＲＢＳと交換してもよい。また、加えて、部位特異的変異を実施して、酵素の活性を変更してもよい。
【０１９９】
植物に生じる窒素固定のレベルを増加させることは、作物生産に必要とされる化学肥料の量の低減に結びつき、温室効果ガス排出（例えば、亜酸化窒素）を削減することができる。
【０２００】
コロニー化可能性の制御
本明細書中に記載の方法による制御の標的となり得る１つの形質は、コロニー化可能性である。したがって、いくつかの実施形態では、コロニー化に関与する経路および遺伝子は、遺伝子操作および最適化の標的としての役目を果たす場合がある。
【０２０１】
いくつかの場合では、菌体外多糖は、植物の細菌コロニー化に関与する場合がある。いくつかの場合では、植物コロニー化微生物は、バイオフィルムを産生し得る。いくつかの場合では、植物コロニー化微生物は、植物への接着または植物免疫応答からの回避を補助し得る分子を分泌する。いくつかの場合では、植物コロニー化微生物は、微生物に対する植物の応答を変化させるシグナル伝達分子を排出し得る。いくつかの場合では、植物コロニー化微生物は、局所微小環境を変化させる分子を分泌し得る。いくつかの場合では、植物コロニー化微生物は、前述の微生物が近くに存在する植物に適応するために遺伝子発現を変化させることができる。いくつかの場合では、植物コロニー化微生物は、局所環境中の植物の存在を検出することができ、それに応じて遺伝子発現を変化させることができる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、コロニー化を改善するために、菌体外多糖産生、エンドポリガラクツロナーゼ（ｅｎｄｏ−ｐｏｌｙｇａｌａｔｕｒｏｎａｓｅ）産生、トレハロース産生、およびグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子は、遺伝子操作および最適化の標的となり得る。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、菌体外多糖の産生に関与する酵素または経路を、コロニー化を改善するために遺伝子改変することができる。コロニー化を改善するための標的となり得る菌体外多糖産生酵素をコードする例示的な遺伝子としては、限定されないが、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、およびｙｊｂＥが挙げられる。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、繊維状赤血球凝集素の産生に関与する酵素または経路を、コロニー化を改善するために遺伝子改変することができる。例えば、繊維状赤血球凝集素をコードするｆｈａＢ遺伝子は、コロニー化を改善するための標的となり得る。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、エンドポリガラクツロナーゼ（ｅｎｄｏ−ｐｏｌｙｇａｌａｔｕｒｏｎａｓｅ）の産生に関与する酵素または経路を、コロニー化を改善するために遺伝子改変することができる。例えば、エンドポリガラクツロナーゼ（ｅｎｄｏ−ｐｏｌｙｇａｌａｔｕｒｏｎａｓｅ）前駆体をコードするｐｅｈＡ遺伝子は、コロニー化を改善するための標的となり得る。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、トレハロースの産生に関与する酵素または経路を、コロニー化を改善するために遺伝子改変することができる。コロニー化を改善するための標的となり得るトレハロース産生酵素をコードする例示的な遺伝子としては、限定されないが、ｏｔｓＢおよびｔｒｅＺが挙げられる。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、グルタミンの変換に関与する酵素または経路を、コロニー化を改善するために遺伝子改変することができる。例えば、ｇｌｓＡ２遺伝子は、グルタミンをアンモニウムおよびグルタメートに変換するグルタミナーゼをコードする。ｇｌｓＡ２が上方制御されると、細胞のグルタメートプールが増加し、それにより、細胞が利用可能なＮが増加することによって適応度が改善される。したがって、いくつかの実施形態では、ｇｌｓＡ２遺伝子は、コロニー化を改善するための標的となり得る。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組合せからなる群から選択されるコロニー化遺伝子を、コロニー化を改善するために遺伝子改変することができる。
【０２０９】
コロニー化可能性を改善するための標的となり得るコロニー化遺伝子は、ＰＣＴ公開ＷＯ／２０１９／０３２９２６号（その全体が、本明細書中で参考として援用される）にも記載されている。
【０２１０】
細菌集団の生成
細菌の単離
本明細書中に開示の方法および組成物に有用な微生物は、天然植物の表面または組織から微生物を抽出することにより得ることができる。微生物は、種子を粉砕して微生物を単離することにより得ることができる。微生物は、種子を多様な土壌試料に植栽し、組織から微生物を回収することにより得ることができる。加えて、微生物は、植物に外因性微生物を接種し、どの微生物が植物組織に出現するかを決定することにより得ることができる。植物組織の非限定的な例としては、種子、実生、葉、挿穂、植物、鱗茎、または塊茎を挙げることができる。
【０２１１】
微生物を得るための方法は、細菌を土壌から分離することによるものであってもよい。細菌は、種々の土壌タイプから収集することができる。いくつかの例では、土壌は、高肥沃度または低肥沃度、水分のレベル、ミネラルのレベル、および種々の作付け実施などの形質により特徴付けられ得る。例えば、土壌は、異なる作物が、連続した植栽季節で同じ土壌に植栽される輪作に関与する場合がある。同じ土壌での異なる作物の連続栽培は、ある特定のミネラルの不均衡な欠乏を予防することができる。細菌は、選択された土壌で成長する植物から単離することができる。実生植物は、２〜６週間の栽培で収穫することができる。例えば、少なくとも４００個の分離株を、１ラウンドの収穫で収集することができる。土壌および植物タイプは、植物表現型、ならびにある特定の表現型の下流濃縮を可能にする条件を明らかにする。
【０２１２】
微生物を植物組織から単離して、微生物の形質を評価することができる。組織試料を処理するためのパラメーターを変化させて、根圏菌、着生菌、または内部寄生菌などの、異なるタイプの付随微生物を単離することができる。分離株を無窒素培地で培養して、窒素固定を実施する細菌を濃縮することができる。あるいは、世界の菌株バンクから微生物を得ることができる。
【０２１３】
ｉｎ  ｐｌａｎｔａ分析を実施して、微生物の形質を評価する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡおよびＲＮＡのハイスループット処理によりスクリーニングを行うために、植物組織を処理することができる。加えて、非侵襲性測定を使用して、コロニー化などの植物特徴を評価することができる。野生微生物の測定は、植物ごとに得ることができる。また、野生微生物の測定は、圃場でミディアムスループット法を使用して得ることができる。測定は、経時的に逐次的に行うことができる。Ｓｅｔａｒｉａを含むが、それに限定されないモデル植物系を使用することができる。
【０２１４】
植物系中の微生物を、植物系での微生物の転写プロファイリングによりスクリーニングすることができる。転写プロファイリングによるスクリーニングの例は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、転写物検出用の分子バーコード、次世代配列決定法、および蛍光マーカーでの微生物のタグ付けの方法を使用することである。マイクロバイオーム、非生物要因、土壌条件、酸素、水分、温度、接種物条件、および根局在化を含むが、それらに限定されない影響要因を測定して、温室でのコロニー化を評価することができる。細菌中での窒素固定は、本明細書中に記載のＩＲＭＳまたはＮａｎｏＳＩＭＳを用いて１５Ｎ気体／肥料（希釈）を測定することにより評価することができる。ＮａｎｏＳＩＭＳは、高分解能二次イオン質量分析法である。ＮａｎｏＳＩＭＳ技法は、生物学的試料に由来する化学活性を調査するための様式である。微小生物の代謝を駆動する酸化反応を還元する触媒作用を、細胞レベル、亜細胞レベル、分子レベル、および元素レベルで調査することができる。ＮａｎｏＳＩＭＳは、０．１μｍを超える高い空間分解能を提供することができる。ＮａｎｏＳＩＭＳは、１３Ｃ、１５Ｎ、および１８Ｏなどの同位体トレーサーの使用を検出することができる。したがって、ＮａｎｏＳＩＭＳは、細胞の化学的活性窒素に対して使用することができる。
【０２１５】
ｐｌａｎｔａ分析には、自動化温室を使用することができる。微生物曝露に応答した植物測定基準としては、限定されないが、バイオマス、葉緑体分析、ＣＣＤカメラ、容積トモグラフィー測定が挙げられる。
【０２１６】
微生物集団を濃縮するための１つの様式は、遺伝子型によるものである。例えば、標的化プライマーまたは特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイである。ジアゾトロフは、窒素固定のプロセス中にｎｉｆＨ遺伝子を発現するため、ｎｉｆＨ遺伝子に対して設計されたプライマーを使用して、ジアゾトロフを同定することができる。また、微生物集団は、単一細胞培養非依存的手法および走化性誘導単離手法により濃縮することができる。あるいは、微生物の標的化単離は、微生物を選択培地で培養することにより実施することができる。微生物集団を所望の形質について濃縮するための計画的な手法は、バイオインフォマティクスデータによってガイドされ得、これは本明細書に記載されている。
【０２１７】
バイオインフォマティクスを使用した窒素固定能力を有する微生物の濃縮
バイオインフォマティックツールを使用して、植物成長促進性根圏細菌（ＰＧＰＲ）を同定および単離することができ、前述の細菌は、窒素固定を実施する能力に基づいて選択される。高い窒素固定能力を有する微生物は、植物の好ましい形質を促進することができる。ＰＧＰＲを同定するためのバイオインフォマティック分析モードとしては、限定されないが、ゲノミクス、メタゲノミクス、標的化単離、遺伝子配列決定、トランスクリプトーム配列決定、およびモデリングが挙げられる。
【０２１８】
ゲノミクス分析を使用して、ＰＧＰＲを同定し、本明細書中に記載の次世代配列決定法および微生物バージョン管理法により変異の存在を確認することができる。
【０２１９】
コロニー化の予測アルゴリズムを使用してＰＧＰＲを同定および単離するためにメタゲノミクスを使用することができる。また、メタデータを使用して、環境試料および温室試料中の操作された菌株の存在を同定することができる。
【０２２０】
トランスクリプトーム配列決定を使用して、ＰＧＰＲ表現型に結び付く遺伝子型を予測することができる。加えて、トランスクリプトームデータを使用して、遺伝子発現を変更するためのプロモーターを同定する。トランスクリプトームデータを、全ゲノム配列（ＷＧＳ）と併せて分析して、代謝および遺伝子制御ネットワークのモデルを生成することができる。
【０２２１】
微生物の順化
自然界から単離された微生物は、微生物が、遺伝学的に追跡可能および同定可能な形態に変換される順化プロセスを起こす場合がある。微生物を順化させる１つの様式は、抗生物質耐性を用いて微生物を操作することである。抗生物質耐性を操作するプロセスは、野生型微生物菌株の抗生物質感受性を決定することから開始することができる。細菌が抗生物質に感受性である場合、その抗生物質は、抗生物質耐性操作の良好な候補であり得る。その後、組換え法を使用して、抗生物質耐性遺伝子または対抗選択可能な自殺ベクターを、微生物のゲノムに組み込むことができる。対抗選択可能な自殺ベクターは、目的の遺伝子の欠失、選択マーカー、および対抗選択マーカーｓａｃＢからなり得る。対抗選択を使用して、天然微生物ＤＮＡ配列を抗生物質耐性遺伝子と交換することができる。ミディアムスループット法を使用して、複数の微生物を同時に評価して、並行順化を可能にすることができる。順化の代替方法としては、ホーミングヌクレアーゼを使用して、自殺ベクター配列がループアウトすることまたは介在ベクター配列を得ることを防止することを含む。
【０２２２】
ＤＮＡベクターは、エレクトロポレーションおよび化学的形質転換を含むいくつかの方法により細菌に導入することができる。ベクターの標準的ライブラリーを形質転換に使用することができる。遺伝子編集法の例は、Ｃａｓ９試験を行って微生物でのＣａｓ９の活性を確実にした後のＣＲＩＳＰＲである。
【０２２３】
微生物の非トランスジェニック操作
好ましい形質を有する微生物集団は、定向進化により得ることができる。定向進化（ｄｉｒｅｃｔ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）は、自然淘汰プロセスを模倣して、タンパク質または核酸を使用者の設定目標に向かって進化させる手法である。定向進化（ｄｉｒｅｃｔ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）の例は、ランダム変異を微生物集団に導入した場合、最も好ましい形質を有する微生物を選択し、選択した微生物の増殖を継続させることである。成長促進性根圏細菌（ＰＧＰＲ）の最も好ましい形質は、窒素固定であってもよい。定向進化法は、各反復後の選択プロセスに基づき、反復性および適応性であってもよい。
【０２２４】
高い窒素固定能力を有する植物成長促進性根圏細菌（ＰＧＰＲ）を生成することができる。ＰＧＰＲの進化は、遺伝子変異の導入により実施することができる。遺伝子変異は、ポリメラーゼ連鎖反応変異誘発、オリゴヌクレオチド誘導変異誘発、飽和変異誘発、断片シャフリング変異誘発、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、化学的変異誘発、およびそれらの組合せにより導入することができる。これらの手法は、ランダム変異を微生物集団に導入することができる。例えば、変異体は、オリゴヌクレオチド誘導変異誘発により合成ＤＮＡまたはＲＮＡを使用して生成することができる。変異体は、プラスミド上に含まれるツールを使用して生成することができ、その後にプラスミドは取り除かれる。目的の遺伝子は、限定されないが、ＰＧＰＲ特性の改善、穀類のコロニー化の改善、酸素感受性の増加、窒素固定の増加、およびアンモニア排出の増加が挙げられる、形質の改善を有する他の種に由来するライブラリーを使用して同定することができる。これらのライブラリーに基づき、ＧｅｎｅｉｏｕｓまたはＰｌａｔｙｐｕｓ設計ソフトウェアなどのソフトウェアを使用して、属内遺伝子を設計することができる。変異は、機械学習の支援により設計することができる。変異は、代謝モデルの支援により設計することができる。ａ  ｌａ  Ｐｌａｔｙｐｕｓを使用して変異の自動設計を実施することができ、Ｃａｓ誘導変異誘発のためのＲＮＡが誘導されることになる。
【０２２５】
属内遺伝子を、宿主微生物に移入することができる。加えて、レポーター系も微生物に移入することができる。レポーター系は、プロモーターを特徴付け、形質転換成功を決定し、変異体をスクリーニングし、陰性スクリーニングツールとして作用する。
【０２２６】
変異を保持する微生物は、連続継代により培養することができる。微生物コロニーは、微生物の単一変異体を含む。微生物コロニーは、自動コロニーピッカーおよび液体ハンドラーの支援によりスクリーニングされる。遺伝子重複およびコピー数増加を有する変異体は、所望の形質のより高い遺伝子型を発現する。
【０２２７】
窒素固定に基づく植物成長促進性微生物の選択
微生物コロニーは、種々のアッセイを使用してスクリーニングして、窒素固定を評価することができる。窒素固定を測定するための１つの様式は、窒素排出が測定される単一の発酵アッセイによる。代替方法は、経時的なインライン試料採取によるアセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）である。ＡＲＡは、マイクロチューブアレイのハイスループットプレートで実施することができる。ＡＲＡは、生植物および生植物組織で実施することができる。ＡＲＡアッセイでは、培地処方および培地酸素濃度を変化させることができる。微生物変異体をスクリーニングするための別の方法は、バイオセンサーの使用による。ＮａｎｏＳＩＭＳおよびラマン顕微分光法の使用は、微生物の活性を調査するために使用することができる。また、いくつかの場合では、細菌を、バイオリアクターでの発酵法を使用して培養および増殖させることができる。バイオリアクターは、細菌成長の頑強性を改善させ、細菌の酸素感受性を減少させるように設計されている。中〜高ＴＰプレートに基づくマイクロ発酵槽を使用して、酸素感受性、栄養必要性、窒素固定、および窒素排出を評価する。また、細菌を、競合性のまたは有益な微生物と共培養して、隠れた経路を明らかにすることができる。化学的、比色定量的、または蛍光性の指示薬を使用して、高レベルの窒素を産生する細菌をスクリーニングするために、フローサイトメトリーを使用することができる。細菌を、窒素源の存在下または非存在下で培養してもよい。例えば、細菌を、グルタミン、アンモニア、尿素、または硝酸塩と共に培養してもよい。
【０２２８】
微生物リモデリング誘導−概要
微生物リモデリング誘導は、作物マイクロバイオーム内の種の役割を系統的に同定および改善する方法である。いくつかの態様では、特定のグループ分け／カテゴリー化法によれば、この方法は、以下の３つの工程を含む：１）植物−微生物相互作用をマッピングし、特定の表現型に関連する制御ネットワークを予測することにより候補種を選択すること、２）制御ネットワークおよび微生物のゲノム内の遺伝子クラスターの種内交差により、微生物表現型を実用的におよび予測可能に改善すること、および３）所望の作物表現型を生成する新しい微生物遺伝子型をスクリーニングおよび選択すること。
【０２２９】
菌株の改善を系統的に評価するために、微生物共同体のコロニー化動態を、主要な種による遺伝子活性と関連付けるモデルを作出する。このモデルを使用して、遺伝子標的を、非属間遺伝子リモデリング（すなわち、非トランスジェニック様式での微生物の遺伝子アーキテクチャーの操作）について予測する。このプロセスの実施形態のグラフ図については、図１Ａを参照のこと。
【０２３０】
図１Ａに示されているように、作物マイクロバイオームの合理的改善を使用して、土壌生物多様性を増加させ、要となる種の影響を調整し、そして／または重要な代謝経路のタイミングおよび発現を変更することができる。
【０２３１】
この目的のために、本発明者らは、作物マイクロバイオーム内の菌株の役割を特定および改善するためのプラットフォームを開発した。いくつかの態様では、本発明者らは、このプロセスを微生物品種改良と呼ぶ。
【０２３２】
前述の「微生物リモデリング誘導」プロセスは、実施例（例えば、実施例１の表題「微生物リモデリング誘導−農業用微生物種の合理的な改善のためのプラットフォーム」）にさらに詳述されるであろう。
【０２３３】
連続継代
植物形質（例えば、窒素固定）を改善させる細菌の産生は、連続継代により達成することができる。これらの細菌の生産は、１またはそれを超える植物に１またはそれを超える改善された形質を付与することが可能な細菌および／または組成物を同定することに加えて、微生物叢により影響を受ける特定の改善された形質を有する植物を選択することにより行うことができる。植物形質を改善させる細菌を産生するための１つの方法は、（ａ）第１の植物の組織または土壌から細菌を単離する工程；（ｂ）１またはそれを超える細菌に遺伝子変異を導入して、１またはそれを超える変異細菌を産生する工程；（ｃ）複数の植物を変異細菌に曝露する工程；（ｄ）複数の植物のうち１つの組織または土壌から細菌を単離する工程であって、細菌を単離した植物が、複数の植物中の他の植物と比べて改善された形質を有する、工程；および（ｅ）改善された形質を有する植物から単離された細菌（工程（ｄ））を用いて、工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返す工程を含む。工程（ｂ）〜（ｄ）は、植物の改善された形質が所望のレベルに達するまで、何回でも（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、１０回、またはそれを超える回数）繰り返すことができる。さらに、複数の植物は、１０〜２０個の植物、または２０個もしくはそれを超える、５０個もしくはそれを超える、１００個もしくはそれを超える、３００個もしくはそれを超える、５００個もしくはそれを超える、または１０００個もしくはそれを超える植物などの、２個を超える植物であり得る。
【０２３４】
改善された形質を有する植物を得ることに加えて、１またはそれを超える遺伝子（例えば、窒素固定を制御する遺伝子）に導入された１またはそれを超える遺伝子変異を含む細菌を含む細菌集団が得られる。上記の工程を繰り返すことにより、目的の植物形質と相関する集団の最も適切なメンバーを含む細菌の集団を得ることができる。遺伝子分析および／または表現型分析などにより、この集団内の細菌を同定して、それらの有益な特性を決定することができる。工程（ａ）にて、単離された細菌の遺伝子分析を行ってもよい。表現型および／または遺伝子型の情報は、以下のものを含む技法を使用して得ることができる：植物由来の化学成分のハイスループットスクリーニング；遺伝物質のハイスループット配列決定を含む配列決定技法；ディファレンシャルディスプレイ技法（ＤＤＲＴ−ＰＣＲおよびＤＤ−ＰＣＲを含む）；核酸マイクロアレイ技法；ＲＮＡシーケンシング（全トランスクリプトームショットガンシーケンシング）；およびｑＲＴ−ＰＣＲ（定量リアルタイムＰＣＲ）。得られた情報を使用して、系統発生分析、またはｒＲＮＡオペロンもしくは他の分類学的に有益な遺伝子座の成分をコードする核酸のマイクロアレイに基づくスクリーニングなどにより、存在する細菌の同一性および活性に関する群生プロファイル情報を得ることができる。分類学的に有益な遺伝子座の例としては、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、１２Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、２８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子、ｆｕｓＡ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、ｃｏｘｌ遺伝子、ｎｉｆＤ遺伝子が挙げられる。集団に存在する分類群を決定するための分類学的プロファイリングの例示的な方法は、米国特許出願公開第２０１４０１５５２８３号に記載されている。細菌の同定は、窒素固定経路に関連する遺伝子などの、１またはそれを超える遺伝子または１またはそれを超えるシグナル経路の活性を特徴付けることを含んでもよい。また、異なる細菌種間の相乗効果的な相互作用（２つの成分を組み合わせることにより、付加的な量を超えて所望の効果が増加すること）が、細菌集団に存在している場合がある。
【０２３５】
遺伝子変異−ゲノム変更の位置および供給源
遺伝子変異は、以下からなる群から選択される遺伝子であってもよい：ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱ。遺伝子変異は、以下のからなる群から選択される機能性を有するタンパク質をコードする遺伝子の変異であってもよい：グルタミン合成酵素、グルタミナーゼ、グルタミン合成酵素アデニリルトランスフェラーゼ、転写活性化因子、抗転写活性化因子、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、フラボドキシン、およびＮＡＤ＋二窒素レダクターゼａＤＰ−Ｄ−リボシルトランスフェラーゼ。遺伝子変異は、以下のうちの１つまたは複数をもたらす変異であってもよい：ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少。遺伝子変異は、以下からなる群から選択される遺伝子の変異であってもよい：ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、遺伝子変異は、本開示の至る所に記載の任意の遺伝子の変異であってもよい。
【０２３６】
遺伝子変異の導入は、１、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００個、またはそれを超えるヌクレオチドなどの、標的部位のうちの１またはそれを超えるヌクレオチドの挿入および／または欠失を含んでもよい。本明細書に開示されている方法の１またはそれを超える細菌に導入された遺伝子変異は、ノックアウト変異（例えば、プロモーターの欠失、中途終止コドンを生成する挿入または欠失、全遺伝子の欠失）であってもよく、または、タンパク質ドメインの活性の排除または消失（例えば、活性部位に影響を及ぼす点変異、またはタンパク質産物の関連部分をコードする遺伝子の部分の欠失）であってもよく、または標的遺伝子の制御配列の変更または消失であってもよい。また、異種制御配列、および遺伝子変異が導入されている細菌に対応する細菌種または属のゲノム内に見出される制御配列が挙げられる、１またはそれを超える制御配列を挿入してもよい。さらに、制御配列は、細菌培養物中または植物組織内の遺伝子の発現レベルに基づいて選択してもよい。遺伝子変異は、標的部位に特異的に導入される所定の遺伝子変異であってもよい。遺伝子変異は、標的部位内のランダム変異であってもよい。遺伝子変異は、１またはそれを超えるヌクレオチドの挿入または欠失であってもよい。いくつかの場合では、形質改善を評価するために細菌を植物に曝露する前に、複数の異なる遺伝子変異（例えば、２、３、４、５、１０個、またはそれを超える）が、単離された細菌のうちの１つまたは複数に導入される。複数の遺伝子変異は、上記のタイプのいずれであってもよく、同じタイプであってもよく、または異なるタイプであってもよく、任意の組合せであってもよい。いくつかの場合では、複数の異なる遺伝子変異は、複数の遺伝子変異が細菌に蓄積され、改善された形質が関連する植物に徐々に付与されるように、連続的に、第１の単離工程後に第１の遺伝子変異を導入し、第２の単離工程後に第２の遺伝子変異を導入することなどによって導入される。
【０２３７】
遺伝子変異−ゲノム変更を導入する方法
一般に、用語「遺伝子変異」は、基準ゲノムもしくはその部分または基準遺伝子もしくはその部分などの基準ポリヌクレオチドと比較した、ポリヌクレオチド配列に導入される任意の変更を指す。遺伝子変異は、「変異」と呼ばれる場合もあり、遺伝子変異を含む配列または生物は、「遺伝子バリアント」または「変異体」と呼ばれる場合がある。遺伝子変異は、遺伝子発現、代謝、および細胞シグナル伝達を含むいくつかの生物学的活性の増加または減少などの、任意の数の効果を有し得る。遺伝子変異は、標的部位に特異的に導入されてもよく、またはランダムに導入されてもよい。遺伝子変異を導入するための様々な分子ツールおよび方法が利用可能である。例えば、遺伝子変異は、ポリメラーゼ連鎖反応変異誘発、オリゴヌクレオチド誘導変異誘発、飽和変異誘発、断片シャフリング変異誘発、相同組換え、組換え操作、ランブダ−Ｒｅｄ媒介性組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、化学的変異誘発、およびそれらの組合せにより導入することができる。遺伝子変異を導入するための化学的方法としては、ＤＮＡを、化学的変異原、例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、メチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）、Ｎ−ニトロソ尿素（ＥＮＵ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ’−ニトロソグアニジン、４−ニトロキノリンＮ−オキシド、硫酸ジエチル、ベンゾピレン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、トリエチルメラミン、アクリルアミドモノマー、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジエポキシアルカン（例えば、ジエポキシブタン）、ＩＣＲ−１７０、ホルムアルデヒド、塩酸プロカルバジン、エチレンオキシド、ジメチルニトロソアミン、７，１２ジメチルベンズ（ａ）アントラセン、クロラムブシル、ヘキサメチルホスホラミド、およびビスルファンなどに曝露することが挙げられる。放射線変異誘導因子としては、紫外放射線、γ線、Ｘ線、および高速中性子衝撃が挙げられる。また、例えば、トリメチルソラレンを紫外光と共に使用して、核酸に遺伝子変異を導入することができる。可動ＤＮＡエレメント、例えば転位エレメントのランダムな挿入または標的挿入は、遺伝子変異を生成するための別の適切な方法である。遺伝子変異は、例えば、誤りがちのＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を使用して、無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系での増幅中に核酸に導入することができる。遺伝子変異は、ＤＮＡシャフリング技法（例えば、エクソンシャフリングおよびドメイン交換など）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸に導入することができる。また、遺伝子変異は、細胞のＤＮＡ修復酵素の欠損の結果として核酸に導入することができる。例えば、変異ＤＮＡ修復酵素をコードする変異遺伝子が細胞に存在すると、その細胞のゲノムには、高頻度の変異（すなわち、約１個の変異／１００遺伝子〜１個の変異／１０，０００遺伝子）が生成されることが予想される。ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子の例としては、限定されないが、Ｍｕｔ  Ｈ、Ｍｕｔ  Ｓ、Ｍｕｔ  Ｌ、およびＭｕｔ  Ｕ、ならびに他の種におけるそれらのホモログ（例えば、ＭＳＨ１６、ＰＭＳ１２、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、およびＥＲＣＣ−１など）が挙げられる。遺伝子変異を導入するための種々の方法の例���的な記載は、例えば、Ｓｔｅｍｐｌｅ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ５：１−７；Ｃｈｉａｎｇら．（１９９３）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ  ２（３）：２１０−２１７；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１；ならびに米国特許第６，０３３，８６１号、および同第６，７７３，９００号に提供されている。
【０２３８】
微生物に導入される遺伝子変異は、トランスジェニック、シスジェニック、ゲノム内、属内、属間、合成、進化、再構成、またはＳＮＰとして分類することができる。
【０２３９】
遺伝子変異を、微生物内の多数の代謝経路に導入して、上記の形質の改善を誘発することができる。代表的な経路としては、硫黄取込み経路、グリコーゲン生合成、グルタミン制御経路、モリブデン取込み経路、窒素固定経路、アンモニア同化、アンモニア排出または分泌、窒素取込み、グルタミン生合成、コロニー化経路、アナモックス、リン酸塩可溶化、有機酸輸送、有機酸産生、凝集素産生、活性酸素ラジカルスカベンジング遺伝子、インドール酢酸生合成、トレハロース生合成、植物細胞壁分解酵素または経路、根付着遺伝子、菌体外多糖分泌、グルタミン酸合成酵素経路、鉄取込み経路、シデロフォア経路、キチナーゼ経路、ＡＣＣデアミナーゼ、グルタチオン生合成、亜リン酸シグナル伝達遺伝子、クオラムクエンチング経路、チトクロム経路、ヘモグロビン経路、細菌ヘモグロビン様経路、スモールＲＮＡ  ｒｓｍＺ、リゾビトキシン生合成、ｌａｐＡ接着タンパク質、ＡＨＬクオラムセンシング経路、フェナジン生合成、環状リポペプチド生合成、および抗生物質産生が挙げられる。
【０２４０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系を使用して、所望の変異を導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用して、侵入核酸のサイレンシングをガイドすることにより、ウイルスおよびプラスミドに対する適応免疫を細菌および古細菌に提供する。Ｃａｓ９タンパク質（またはその機能的等価物および／もしくは変異体、すなわちＣａｓ９様タンパク質）は、このタンパク質と、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる（ガイドＲＮＡとも呼ばれる）２つの天然または合成ＲＮＡ分子との結合に依存するＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を天然で含有する。いくつかの場合では、２つの分子は、共有結合で連結されて、単一分子（単鎖ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）とも呼ばれる）を形成する。したがって、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、ＤＮＡを標的とするＲＮＡ（この用語は、２分子ガイドＲＮＡ配置および単一分子ガイドＲＮＡ配置を両方とも包含する）と結合し、それによりＣａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質を活性化し、このタンパク質が標的核酸配列にガイドされる。Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、その天然酵素機能が維持されている場合、標的ＤＮＡを切断して、二本鎖切断を作成し、それによりゲノム変更（すなわち、編集、欠失、挿入（ドナーポリヌクレオチドが存在する場合）、置換など）をもたらすことができ、それにより遺伝子発現が変更される。Ｃａｓ９のいくつかの変異体（変異体は、用語Ｃａｓ９様に含まれる）は、ＤＮＡ切断活性が減少するように変更されている（変異体は、いくつかの場合では、標的ＤＮＡの両鎖ではなく１本の鎖を切断し、他の場合には、著しく還元されて、ＤＮＡ切断活性を示さない）。遺伝子変異を導入するためのＣＲＩＳＰＲ系のさらなる例示的な記載は、例えば、米国特許第８７９５９６５号に見出すことができる。
【０２４１】
サイクル増幅技法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異誘発では、変異原性プライマーを使用して、所望の変異を導入する。ＰＣＲは、変性、アニーリング、および伸長のサイクルで実施される。ＰＣＲによる増幅後、変異ＤＮＡの選択および親プラスミドＤＮＡの除去は、以下のようにして達成することができる：１）ＰＣＲ中にｄＣＴＰをヒドロキシメチル化ｄＣＴＰで置換し、その後制限酵素で消化して、非ヒドロキシメチル化親ＤＮＡのみを除去する；２）抗生物質耐性遺伝子および研究対象遺伝子を両方とも同時に変異誘発させ、プラスミドを異なる抗生物質耐性を有するように変化させ、新たな抗生物質耐性により、その後の所望の変異の選択が容易にする；３）所望の変異を導入した後、メチル化ＤＮＡのみを切断する制限酵素Ｄｐｎｌにより親メチル化鋳型ＤＮＡを消化し、それにより変異誘発非メチル化鎖を回収する；または４）変異ＰＣＲ産物を、追加のライゲーション反応で環状化して、変異ＤＮＡの形質転換効率を増加させる。例示的な方法のさらなる記載は、例えば、米国特許第７１３２２６５号、米国特許第６７１３２８５号、米国特許第６６７３６１０号、米国特許第６３９１５４８号、米国特許第５７８９１６６号、米国特許第５７８０２７０号、米国特許第５３５４６７０号、米国特許第５０７１７４３号、および米国特許出願公開第２０１００２６７１４７号に見出すことができる。
【０２４２】
部位特異的変異誘発とも呼ばれるオリゴヌクレオチド誘導変異誘発では、典型的には、合成ＤＮＡプライマーが利用される。この合成プライマーは、所望の変異を含有し、目的の遺伝子のＤＮＡとハイブリダイズすることができるように、変異部位付近が鋳型ＤＮＡと相補的である。変異は、単一塩基の変更（点変異）、複数塩基の変更、欠失、または挿入、またはこれらの組合せであってもよい。その後、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、一本鎖プライマーを伸長させ、それにより遺伝子の残りを複製する。このように複製された遺伝子は、変異部位を含有し、その後ベクターとしての宿主細胞に導入し、クローニングしてもよい。最後に、変異体をＤＮＡ配列決定により選択して、それらが所望の変異を含有することを確認することができる。
【０２４３】
遺伝子変異は、誤りがちのＰＣＲを使用して導入してもよい。この技法では、目的の遺伝子は、配列複製の忠実度が不十分である条件下でＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅される。その結果、増幅産物は、少なくとも１つのエラーを配列に含有する。遺伝子を増幅し、得られた反応産物（複数可）が、鋳型分子と比較して１またはそれを超える変更を配列に含有する場合、得られた産物は、鋳型と比較して変異誘発されている。ランダム変異を導入する別の手段は、細胞を、ニトロソグアニジンまたはエチルメタンスルホン酸などの化学的変異原に曝露し（Ｎｅｓｔｍａｎｎ，Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ  １９７５  Ｊｕｎｅ；２８（３）：３２３−３０）、その後、その遺伝子を含むベクターを宿主から単離することである。
【０２４４】
飽和変異誘発は、別の形態のランダム変異誘発であり、特異的部位にまたは遺伝子の狭い領域に、全てのまたはほぼ全ての考え得る変異を生成しようするものである。一般的な意味では、飽和変異誘発は、変異誘発させようとする確定ポリヌクレオチド配列（変異誘発させようとする配列は、例えば１５〜１００，０００塩基長である）に変異原性カセットの完全なセット（各カセットの長さは、例えば１〜５００塩基である）を変異誘発させることから構成されている。したがって、一群の変異（例えば、１から１００個までの範囲の変異）が、変異誘発させようとする各カセットに導入される。１つのカセットに導入される変異のグループ分けは、飽和変異誘発の１ラウンドを施している間に第２のカセットに導入される変異の第２のグループ分けと異なっていてもよく、または同じであり得る。そのようなグループ分けは、欠失、付加、特定のコドンのグループ分け、および特定のヌクレオチドカセットのグループ分けにより例示される。
【０２４５】
ＤＮＡシャフリングとも呼ばれる断片シャフリング変異誘発は、有益な変異を迅速に増幅させる方法である。シャフリングプロセスの一例では、ＤＮＡｓｅを使用して、１セットの親遺伝子を、例えば約５０〜１００ｂｐ長の小片に断片化する。その後、これにプライマーを用いないポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が続き、十分な重複相同性配列を有するＤＮＡ断片が互いにアニーリングすることになり、その後ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。ＤＮＡ分子のいくつかが親遺伝子のサイズに到達した後も、このＰＣＲ伸長を数ラウンド行う。その後、これらの遺伝子を、今度は、鎖の末端に相補的になるように設計したプライマーを添加した別のＰＣＲで増幅することができる。プライマーは、クローニングベクターへのライゲーションに必要とされる制限酵素認識部位の配列などの追加の配列が、それらの５’末端に付加されてもよい。シャフリング技法のさらなる例は、米国特許出願公開第２００５０２６６５４１号に提供されている。
【０２４６】
相同組換え変異誘発は、外因性ＤＮＡ断片と標的ポリヌクレオチド配列との間の組換えを含む。二本鎖切断が生じた後、切断物の５’末端付近のＤＮＡの区画は、切除と呼ばれるプロセスで切り離される。その後のストランド侵入工程では、切断されたＤＮＡ分子の突出３’末端が、切断されていない類似のまたは同一のＤＮＡ分子に「侵入」する。この方法を使用すると、遺伝子を欠失させ、エクソンを除去し、遺伝子を付加し、点変異を導入することができる。相同組換え変異誘発は、恒久的または暫定的であり得る。典型的には、組換え鋳型も提供される。組換え鋳型は、別のベクターの成分であってもよく、別個のベクターに含有されていてもよく、または別個のポリヌクレオチドとして提供されてもよい。いくつかの実施形態では、組換え鋳型は、部位特異的ヌクレアーゼによりニックまたは切断される標的配列内または付近などで相同組換えの鋳型としての役目を果たすように設計されている。鋳型ポリヌクレオチドは、長さが約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約５０個、約７５個、約１００個、約１５０個、約２００個、約５００個、約１０００個もしくはそれを超え、またはそれを超えるヌクレオチドなど、任意の適切な長さであってもよい。いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの部分に相補的である。鋳型ポリヌクレオチドは、最適にアランメントされる場合、標的配列のうちの１またはそれを超えるヌクレオチドと重複してもよい（例えば、約１個、約５個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個もしくはそれを超え、またはそれを超えるヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、鋳型配列および標的配列を含むポリヌクレオチドが最適にアランメントされる場合、鋳型ポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から、約１個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、７５個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、１０００個、５０００個、１００００個またはそれを超えるヌクレオチド内にある。相同組換えの方法に有用な部位特異的ヌクレアーゼの非限定的な例としては、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼが挙げられる。そのようなヌクレアーゼの使用に関するさらなる記載は、例えば、米国特許第８７９５９６５号および米国特許出願公開第２０１４０３０１９９０号を参照のこと。
【０２４７】
化学的変異原または放射線を含む、主に点変異、ならびに短い欠失、挿入、転換、および／または転移を生じる変異原を使用して、遺伝子変異を作出してもよい。変異原としては、限定されないが、エチルメタンスルホン酸、メチルメタンスルホン酸、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、トリエチルメラミン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、硫酸ジエチル、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン、ニトロソグアニジン、２−アミノプリン、７，１２ジメチル−ベンズ（ａ）アントラセン、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホラミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン、ジエポキシブタンなど）、２−メトキシ−６−クロロ−９［３−（エチル−２−クロロ−エチル）アミノプロピルアミノ］アクリジン二塩酸塩、およびホルムアルデヒドが挙げられる。
【０２４８】
遺伝子変異の導入は、不完全なプロセスであってもよく、細菌の処置集団中のいくつかの細菌は、所望の変異を保持するが、他のものは保持していない。いくつかの場合では、所望の遺伝子変異を保持する細菌が富化されるように、選択圧を加えることが望ましい。伝統的には、遺伝子変異が成功した変異体の選択は、抗生物質耐性遺伝子の挿入または非致死性化合物を致死性代謝物へと変換することが可能な代謝活性の消失の場合など、遺伝子変異により機能が付与または消失されたものを選択することまたはそれらに対して選択することを含んでいた。所望の遺伝子変異のみを導入すればよい（例えば、選択マーカーさえ必要としない）ように、ポリヌクレオチド配列自体に基づく選択圧を加えることも可能である。この場合、選択圧は、遺伝子変異を導入することが求められている基準配列に対して選択が効果的に向けられるように、標的部位に導入される遺伝子変異が欠如したゲノムを切断することを含むことができる。典型的には、切断は、標的部位の１００個のヌクレオチド内で生じる（例えば、標的部位から７５個、５０個、２５個、１０個、またはそれより少数のヌクレオチド内、標的部位でのまたは標的部位内での切断を含む）。切断は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼにより指示されてもよい。そのようなプロセスは、相同組換えの鋳型が提供されないこと以外は、標的部位での相同組換えを強化するためのプロセスに類似する。その結果、所望の遺伝子変異が欠如した細菌は、修復されずに細胞死に至る切断を受ける可能性がより高い。その後、選択を生き残った細菌を単離し、植物に曝露して、改善された形質の付与を評価するために使用することができる。
【０２４９】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを部位特異的ヌクレアーゼとして使用して、標的部位に切断を指示してもよい。変異微生物の選択の改善は、Ｃａｓ９を使用して非変異細胞を死滅させることにより得ることができる。その後、植物に変異微生物を接種して共生を再確認し、進化的圧力を作出して、効率的な共生生物を選択する。その後、微生物を植物組織から再単離することができる。非変異体に対する選択に用いられるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ系は、相同組換えの鋳型が提供されないこと以外は、遺伝子変異の導入に関して上記のものと同様のエレメントを用いることができる。したがって、標的部位に指示された切断は、影響を受ける細胞の死を増強する。
【０２５０】
標的部位での切断を特異的に誘導するための他の選択肢は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系、およびメガヌクレアーゼなどが利用可能である。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより生成された人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＺＦＮは、所望のＤＮＡ配列を標的とするように操作することができ、それにより、亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、固有の標的配列を切断することが可能になる。ＺＦＮは、細胞内に導入される場合、二本鎖切断を誘導することにより細胞の標的ＤＮＡ（例えば、細胞のゲノム）を編集するために使用することができる。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより生成された人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮは、事実上任意の所望のＤＮＡ配列に結合するよう迅速に操作することができ、ＴＡＬＥＮは、細胞内に導入される場合、二本鎖切断を誘導することにより細胞の標的ＤＮＡ（例えば、細胞のゲノム）を編集するために使用することができる。メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）は、大型認識部位（１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）により特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼを使用して、高度に標的化された様式で配列を置換、排除、または改変することができる。タンパク質工学によりそれらの認識配列を改変することにより、標的配列を変更することができる。メガヌクレアーゼは、細菌、植物、または動物に関わらず、あらゆるゲノムタイプの改変に使用することができ、通例では、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー（配列番号１）、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリーに分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。
【０２５１】
遺伝子変異−同定方法
本開示の微生物は、前述の微生物へ導入されている１またはそれを超える遺伝子の改変または変更により同定することができる。前述の遺伝子の改変または変更を同定することができる１つの方法は、遺伝子の改変または変更を同定するのに十分な微生物のゲノム配列の部分を含む配列番号を参照することによる。
【０２５２】
さらに、遺伝子の改変または変更がそれらのゲノムに導入されていない微生物（例えば、野生型、ＷＴ）の場合、本開示では、１６Ｓ核酸配列を使用して、前述の微生物を同定することができる。１６Ｓ核酸配列は、「分子マーカー」または「遺伝子マーカー」の例であり、核酸配列の特徴の差異を可視化するための方法で使用される指標を指す。他のそのような指標の例は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入変異、マイクロサテライトマーカー（ＳＳＲ）、配列特徴的増幅領域（ＳＣＡＲ）、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカー、またはアイソザイムマーカー、または特定の遺伝子および染色体位置を規定する本明細書中に記載のマーカーの組合せである。マーカーとしては、１６Ｓまたは１８Ｓ  ｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、および互いと比較して関係性または特徴の解明に特に有用であることが証明されている小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子と大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子との間に見出される配列である内部転写スペーサー（ＩＴＳ）配列がさらに挙げられる。さらに、本開示は、本明細書中に開示の微生物を同定するために、目的の遺伝子（例えば、ｎｉｆＨ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ａ、ｇｌｎＥ、ａｍｔＢなど）に見出される固有配列を使用する。
【０２５３】
主要ｒＲＮＡサブユニット１６Ｓの一次構造は、異なる速度で進化し、ドメインなどの非常に古代の系統および属などのより最近の系統の両方の解明を可能にする保存された領域、可変領域、および超可変領域の特定の組合せを含む。１６Ｓサブユニットの二次構造は、残基の約６７％の塩基対合をもたらすおよそ５０個のヘリックスを含む。これらの高度に保存された二次構造特徴は、機能的に非常に重要であり、多重配列アラインメントおよび系統学的分析における位置的相同性を確保するために使用することができる。これまで数十年間にわたって、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、最も多く配列決定された分類学的マーカーになっており、細菌および古細菌の現在の系統的分類の基盤である（Ｙａｒｚａら．２０１４．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏ．１２：６３５−４５）。
【０２５４】
したがって、ある特定の態様では、本開示は、表２３、２４、３０、３１、および３２におけるいずれかの配列と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する配列を提供する。
【０２５５】
したがって、ある特定の態様では、本開示は、配列番号６２〜３０３と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表３１および３２に見出され得る。
【０２５６】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号８５、９６、１１１、１２１、１２２、１２３、１２４、１３６、１４９、１５７、１６７、２６１、２６２、２６９、２７７〜２８３と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する１６Ｓ核酸配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表３２に見出され得る。
【０２５７】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号８６〜９５、９７〜１１０、１１２〜１２０、１２５〜１３５、１３７〜１４８、１５０〜１５６、１５８〜１６６、１６８〜１７６、２６３〜２６８、２７０〜２７４、２７５、２７６、２８４〜２９５と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する核酸配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表３２に見出され得る。
【０２５８】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する核酸配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表３２に見出され得る。
【０２５９】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号３０４〜４２４と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する核酸配列を含む微生物、またはプライマー、またはプローブ、またはノンネイティブジャンクション配列を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表３０に見出され得る。
【０２６０】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号３７２〜４０５と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有するノンネイティブジャンクション配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表３０に見出され得る。
【０２６１】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号７７、７８、８１、８２、または８３と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む微生物を提供する。これらの配列およびその関連の記載は、表３１に見出され得る。
【０２６２】
遺伝子変異−検出方法：プライマー、プローブ、およびアッセイ
本開示は、本明細書で教示された微生物の検出に有用なプライマー、プローブ、およびアッセイを教示する。いくつかの態様では、本開示は、ＷＴ親菌株を検出するための方法を提供する。他の態様では、本開示は、ＷＴ菌株に由来する非属間の操作された微生物を検出するための方法を提供する。態様では、本開示は、微生物の非属間遺伝子変更を同定するための方法を提供する。
【０２６３】
態様では、本開示のゲノム操作法は、誘導された非属間微生物中の非天然ヌクレオチド「ジャンクション」配列の作出に結び付く。これらの天然に存在しないヌクレオチドジャンクションを、本明細書で教示された微生物における特定の遺伝子改変の存在を示す特徴的タイプとして使用することができる。
【０２６４】
本技法は、固有に設計されたプライマーおよびプローブを含む特化した定量的ＰＣＲ法を使用することにより、これらの天然に存在しないヌクレオチドジャンクションを検出することができる。いくつかの態様では、本開示のプローブは、天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列に結合する。いくつかの態様では、従来のＰＣＲが使用される。他の態様では、リアルタイムＰＣＲが使用される。いくつかの態様では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が使用される。
【０２６５】
したがって、本開示は、リアルタイムでＰＣＲ産物を検出するための２つの一般的な方法の使用を包含することができる：（１）任意の二本鎖ＤＮＡにインターカレートする非特異的蛍光色素、および（２）蛍光レポーターで標識されているオリゴヌクレオチドからなる配列特異的ＤＮＡプローブであって、このプローブがその相補的配列とハイブリダイゼーションした後でのみ検出が可能になる配列特異的ＤＮＡプローブ。いくつかの態様では、天然に存在しないヌクレオチドジャンクションのみが、教示されるプライマーにより増幅されることになり、結果的に、非特異的色素または特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用のいずれかにより検出することができる。他の態様では、本開示のプライマーは、プライマーがジャンクション配列のいずれかの側に隣接するように選択され、したがって、増幅反応が生じると、前述のジャンクション配列が存在する。
【０２６６】
本開示の態様は、天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列分子それ自体に加えて、穏やかからストリンジェントまでのハイブリダイゼーション条件下で、前述の天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列に結合することが可能な他のヌクレオチド分子を含む。いくつかの態様では、穏やかからストリンジェントまでのハイブリダイゼーション条件下で、前述の天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列に結合することが可能なヌクレオチド分子は、「ヌクレオチドプローブ」と名付けられる。
【０２６７】
態様では、ゲノムＤＮＡを、試料から抽出し、ｑＰＣＲを使用することにより本開示の微生物の存在を定量化するために使用することができる。ｑＰＣＲ反応に使用されるプライマーは、野生型ゲノムの固有領域または操作された非属間変異体菌株の固有領域を増幅するように、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｂｌａｓｔ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ−ｂｌａｓｔ／）により設計されたプライマーであり得る。ｑＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＥＲ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｐ／Ｎ１１７６２１００）キットを使用し、順方向および逆方向増幅プライマーのみを使用して実施することができ、あるいは、Ｋａｐａ  Ｐｒｏｂｅ  Ｆｏｒｃｅキット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐ／Ｎ  ＫＫ４３０１）を、増幅プライマー、ならびに５’末端のＦＡＭ色素標識、内部ＺＥＮクエンチャー、ならびに３’末端の副溝結合剤および蛍光クエンチャーを含むＴａｑＭａｎプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて使用してもよい。
【０２６８】
ある特定のプライマー、プローブ、およびノンネイティブジャンクション配列は、表３０に列挙されている。ｑＰＣＲ反応効率は、標的ゲノムに由来する既知量のｇＤＮＡから作成される標準曲線を使用して測定することができる。データは、組織重量および抽出容積を使用して、生重量１ｇ当たりのゲノムコピー数に正規化することができる。
【０２６９】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、１またはそれを超える核酸配列の増幅を、リアルタイムで定量化する方法である。ＰＣＲアッセイのリアルタイム定量化は、増幅中の目的の核酸および校正標準としての役目を果たすことができる適切な対照核酸配列を比較することにより、ＰＣＲ増幅工程により生成されている核酸の量の決定を可能にする。
【０２７０】
ＴａｑＭａｎプローブは、標的核酸配列を定量化するために特異性を増加させることが必要なｑＰＣＲアッセイで使用されることが多い。ＴａｑＭａｎプローブは、５’末端に付着されたフルオロフォア、およびプローブの３’末端に付着されたクエンチャーを有するオリゴヌクレオチドプローブを含む。ＴａｑＭａｎプローブが、プローブの５’および３’末端が依然として互いに緊密に接触したままである場合、クエンチャーは、フルオロフォアからの蛍光シグナル伝達を防止する。ＴａｑＭａｎプローブは、特異的なプライマーセットにより増幅される核酸領域内にアニーリングするように設計されている。Ｔａｑポリメラーゼが、プライマーを伸長し、新生鎖を合成するときに、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にアニーリングしたプローブが分解される。このプローブ分解によりフルオロフォアが放出されるため、クエンチャーへの緊密な近接が破られ、フルオロフォアの蛍光発生が可能になる。ｑＰＣＲアッセイで検出される蛍光は、放出されるフルオロフォアおよび反応中に存在するＤＮＡ鋳型の量に正比例する。
【０２７１】
ｑＰＣＲの特徴は、実施者が、従来のＰＣＲアッセイの増幅産物の観察に一般的に必要とされる労働集約的な増幅後のゲル電気泳動調製工程を排除することが可能なことである。従来のＰＣＲに対するｑＰＣＲの利益は大きく、利益としては、速さの増加、使いやすさ、再現性、および定量化能力が挙げられる。
【０２７２】
形質の改善
本開示の方法は、様々な望ましい形質のうちの１つまたは複数を導入または改善させるために用いることができる。導入または改善される形質の例としては、以下が挙げられる：根バイオマス、根長、植物丈、苗条長、葉数、水利用効率、全体的バイオマス、収穫高、果実サイズ、穀粒サイズ、光合成速度、干ばつ耐性、耐熱性、耐塩性、線虫ストレス耐性、真菌病原体耐性、細菌病原体耐性、ウイルス病原体耐性、代謝物のレベル、およびプロテオーム発現。植物丈、全体的バイオマス、根および／または苗条バイオマス、種子発芽、実生生存、光合成効率、蒸散率、種子／果実数または質量、植物穀物または果実の収穫高、葉葉緑素含有量、光合成速度、根長、またはそれらの任意の組合せを含む望ましい形質を使用して、成長を測定することができ、同一条件下で栽培された基準農業植物（例えば、改善された形質を有していない植物）の成長速度と比較することができる。
【０２７３】
導入または改善される好ましい形質は、本明細書に記載されているような窒素固定である。導入または改善される第２の好ましい形質は、本明細書に記載されているようなコロニー化可能性である。いくつかの場合では、本明細書中に記載の方法から生じる植物は、同一の土壌条件下で栽培された基準農業植物よりも少なくとも約５％大きな、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、またはそれを超えて大きな形質の差異を示す。さらなる例では、本明細書中に記載の方法から生じる植物は、類似の土壌条件下で栽培された基準農業植物よりも少なくとも約５％大きな、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、またはそれを超えて大きな形質の差異を示す。
【０２７４】
改善される形質は、１またはそれを超える生物ストレス因子または非生物ストレス因子を付与することを含む条件下で評価してもよい。ストレス因子の例としては、非生物ストレス（熱ストレス、塩ストレス、干ばつストレス、寒冷ストレス、および低栄養ストレスなど）および生物ストレス（線虫ストレス、昆虫草食ストレス、真菌病原体ストレス、細菌病原体ストレス、およびウイルス病原体ストレスなど）が挙げられる。
【０２７５】
本開示の方法および組成物により改善された形質は、以前は窒素固定が可能ではなかった植物における窒素固定を含む窒素固定であってもよい。いくつかの場合では、本明細書中に記載の方法により単離された細菌は、植物の窒素の１％またはそれよりも多く（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、またはそれよりも多く）を産生し、これは、いかなる遺伝子変異を導入する前の第１の植物から単離された細菌と比較して、少なくとも２倍（例えば、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはそれよりも多く）の窒素固定能力の増加に相当し得る。いくつかの場合では、細菌は、植物の窒素のうちの５％またはそれを超える窒素を産生する。所望の窒素固定レベルは、遺伝子変異を導入する工程、複数の植物に曝露する工程、および改善された形質を有する植物から細菌を単離する工程を、１回またはそれを超える回数（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２５回、またはそれを超える回数）繰り返した後で達成されてもよい。いくつかの場合では、窒素固定レベルの増強は、グルタミン、アンモニア、または窒素の他の化学的供給源を補充された肥料の存在下で達成される。窒素固定の程度を評価するための方法は公知であり、それらの例は、本明細書中に記載されている。
【０２７６】
微生物品種改良は、作物マイクロバイオーム内の種の役割を系統的に同定および改善するための方法である。この方法は、以下の３つの工程を含む：１）植物−微生物相互作用をマッピングし、特定の表現型に関連する制御ネットワークを予測することにより候補種を選択すること、２）制御ネットワークおよび遺伝子クラスターの種内交差により、微生物表現型を実用的におよび予測可能に改善させること、ならびに３）所望の作物表現型を生成する新しい微生物遺伝子型をスクリーニングおよび選択すること。菌株の改善を系統的に評価するために、微生物共同体のコロニー化動態を、主要な種による遺伝子活性と関連付けるモデルを作出する。このモデルを使用して、遺伝子標的を品種改良について予測し、農学的に関連するマイクロバイオームコード形質の改善の選択頻度を改善させる。
【０２７７】
農業的に関連する圃場状況で送達された窒素の測定
圃場では、窒素送達量は、コロニー化×活性の関数により決定することができる。
【数１】
2021530984.tif 000003
時間および空間
【０２７８】
上記の数式は、（１）植物組織１単位当たりの平均コロニー化、および（２）窒素固定量または各微生物細胞により排出されるアンモニア量のいずれかとしての活性を必要とする。１エーカー当たりの窒素のポンド数に変換するために、トウモロコシ成長生理学、例えば植物のサイズおよび付随根系を、経時的に成熟段階の全体にわたって追跡する。
【０２７９】
１エーカー−季節当たりの作物に送達された窒素のポンド数は、以下の数式により算出することができる：
【数２】
2021530984.tif 000004
【０２８０】
植物組織（ｔ）は、栽培時間（ｔ）にわたるトウモロコシ植物組織の生重量である。合理的に計算を行うための値は、Ｒｏｏｔｓ，Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｕｐｔａｋｅ（Ｍｅｎｇｅｌ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ  Ｐｕｂ．＃ＡＧＲＹ−９５−０８（Ｒｅｖ．Ｍａｙ−９５．ｐ．１−８．）と題する刊行物に詳述されている。
【０２８１】
コロニー化（ｔ）は、栽培季節中の任意の特定の時間ｔにおける、植物組織の生重量１グラム当たりの植物組織内に見出される目的の微生物の量である。単一時点のみが利用可能である場合、単一時点は、季節全体のピークコロニー化速度として正規化され、残りの時点のコロニー化速度は、それに応じて調整される。
【０２８２】
活性（ｔ）は、栽培季節中の任意の特定の時間ｔにおいて、Ｎが、目的の微生物により１単位時間当たりに固定される速度である。本明細書中に開示の実施形態では、この活性速度は、５ｍＭグルタミン存在下のｉｎ  ｖｉｔｒｏアセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）培地でのＡＲＡ、または５ｍＭアンモニウムイオンの存在下のＡＲＡ培地でのアンモニウム排出アッセイにより近似される。
【０２８３】
次いで、上記の関数を積分することにより窒素送達量を算出する。上記の変数の値が、設定された時点で個別に測定される場合、それらの時点の間の値は、線形補間を実施することにより近似される。
【０２８４】
窒素固定
本明細書中には、植物における窒素固定を増加させるための方法であって、植物を、窒素固定を制御する１またはそれを超える遺伝子に導入された１またはそれを超える遺伝子変異を含む細菌に曝露する工程を含み、細菌が、植物における窒素の１％またはそれを超える（例えば、２％、５％、１０％、またはそれを超える）窒素を産生し、産生が、細菌の非存在下における植物と比較して、少なくとも２倍の窒素固定能力に相当し得る方法が記載されている。細菌は、グルタミン、尿素、硝酸塩、またはアンモニアを補充した肥料の存在下で窒素を産生し得る。遺伝子変異は、上記で提供されている例を任意の数および任意の組合せで含む、本明細書中に記載されている任意の遺伝子変異であり得る。遺伝子変異は、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される遺伝子に導入されてもよい。遺伝子変異は、以下のうちの１つまたは複数をもたらす変異であってもよい：ｎｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少。本明細書に開示されている方法のうちの１またはそれを超える細菌に導入される遺伝子変異は、ノックアウト変異であってもよく、または標的遺伝子の制御配列を消失させてもよく、または異種制御配列の挿入、例えば、同一の細菌種または属のゲノム内に見出される制御配列の挿入を含んでもよい。制御配列は、細菌培養物のまたは植物組織内の遺伝子の発現レベルに基づいて選択することができる。遺伝子変異は、化学的変異誘発により生成されてもよい。工程（ｃ）にて栽培された植物を、生物ストレス因子または非生物ストレス因子に曝露してもよい。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、本開示の非属間のリモデリングされた細菌の各々は、少なくとも約２×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約２．５×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約３×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約３．５×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約４×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約４．５×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約５×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約５．５×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約６×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約６．５×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約７×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約７．５×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約８×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約８．５×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約９．５×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、または約１０×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、本開示の非属間のリモデリングされた細菌の各々は、少なくとも約２×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約２．２５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約２．５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約３×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約３．２５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約３．５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約３．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約４×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約４．２５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約４．５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約４．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約５．２５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約５．５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約５．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約６×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約６．２５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約６．５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約６．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約７×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約７．２５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約７．５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約７．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約８×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約８．２５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約８．５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約８．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約９×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約９．２５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約９．５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、約９．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間、または約１０×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、本開示の非属間のリモデリングされた細菌の各々は、少なくとも約５．４９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する。いくつかの実施形態では、本開示の非属間のリモデリングされた細菌は、少なくとも約４．０３×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する。いくつかの実施形態では、本開示の非属間のリモデリングされた細菌は、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、本開示の非属間のリモデリングされた細菌は、集合体として、少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカー、少なくとも約２０ポンドの固定Ｎ／エーカー、少なくとも約２５ポンドの固定Ｎ／エーカー、少なくとも約３０ポンドの固定Ｎ／エーカー、少なくとも約３５ポンドの固定Ｎ／エーカー、少なくとも約４０ポンドの固定Ｎ／エーカー、少なくとも約４５ポンドの固定Ｎ／エーカー、少なくとも約５０ポンドの固定Ｎ／エーカー、少なくとも約５５ポンドの固定Ｎ／エーカー、少なくとも約６０ポンドの固定Ｎ／エーカー、少なくとも約６５ポンドの固定Ｎ／エーカー、少なくとも約７０ポンドの固定Ｎ／エーカー、少なくとも約７５ポンドの固定Ｎ／エーカー、少なくとも約８０ポンドの固定Ｎ／エーカー、少なくとも約８５ポンドの固定Ｎ／エーカー、少なくとも約９０ポンドの固定Ｎ／エーカー、少なくとも約９５ポンドの固定Ｎ／エーカー、または少なくとも約１００ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、本開示の非属間のリモデリングされた細菌は、本明細書中に開示の量の固定Ｎを、少なくとも約０日間〜約８０日間、少なくとも約０日間〜約７０日間、少なくとも約０日間〜約６０日間、少なくとも約１日間〜約８０日間、少なくとも約１日間〜約７０日間、少なくとも約１日間〜約６０日間、少なくとも約２日間〜約８０日間、少なくとも約２日間〜約７０日間、少なくとも約２日間〜約６０日間、少なくとも約３日間〜約８０日間、少なくとも約３日間〜約７０日間、少なくとも約３日間〜約６０日間、少なくとも約４日間〜約８０日間、少なくとも約４日間〜約７０日間、少なくとも約４日間〜約６０日間、少なくとも約５日間〜約８０日間、少なくとも約５日間〜約７０日間、少なくとも約５日間〜約６０日間、少なくとも約６日間〜約８０日間、少なくとも約６日間〜約７０日間、少なくとも約６日間〜約６０日間、少なくとも約７日間〜約８０日間、少なくとも約７日間〜約７０日間、少なくとも約７日間〜約６０日間、少なくとも約８日間〜約８０日間、少なくとも約８日間〜約７０日間、少なくとも約８日間〜約６０日間、少なくとも約９日間〜約８０日間、少なくとも約９日間〜約７０日間、少なくとも約９日間〜約６０日間、少なくとも約１０日間〜約８０日間、少なくとも約１０日間〜約７０日間、少なくとも約１０日間〜約６０日間、少なくとも約１５日間〜約８０日間、少なくとも約１５日間〜約７０日間、少なくとも約１５日間〜約６０日間、少なくとも約２０日間〜約８０日間、少なくとも約２０日間〜約７０日間、または少なくとも約２０日間〜約６０日間にわたって産生する。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、本開示の非属間のリモデリングされた細菌は、本開示の任意の量の固定Ｎを、少なくとも約８０日間±５日間、少なくとも約８０日間±１０日間、少なくとも約８０日間±１５日間、少なくとも約８０日間±２０日間、少なくとも約７５日間±５日間、少なくとも約７５日間±１０日間、少なくとも約７５日間±１５日間、少なくとも約７５日間±２０日間、少なくとも約７０日間±５日間、少なくとも約７０日間±１０日間、少なくとも約７０日間±１５日間、少なくとも約７０日間±２０日間、少なくとも約６０日間±５日間、少なくとも約６０日間±１０日間、少なくとも約６０日間±１５日間、少なくとも約６０日間±２０日間にわたって産生する。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、本開示の非属間のリモデリングされた細菌は、本開示の任意の量の固定Ｎを、少なくとも約１０日間〜約８０日間、少なくとも約１０日間〜約７０日間、または少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって産生する。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、本開示の非属間のリモデリングされた細菌は、図３０Ａの右のパネルに示した量および時間で固定Ｎを産生する。
【０２９３】
本明細書中に記載の植物に生じる窒素固定の量は、いくつかの方法で、例えばアセチレン還元（ＡＲ）アッセイにより測定することができる。アセチレン還元アッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。特定の細菌が植物に固定窒素を提供している証拠としては、以下を挙げることができる：１）接種すると、総植物Ｎが著しく増加し、好ましくはそれに伴って植物におけるＮ濃度が増加すること；２）接種すると、窒素欠乏症状がＮ制限条件下で緩和されること（緩和には、乾燥物質の増加が含まれるべきである）；３）Ｎ２固定が、１５Ｎ手法（同位体希釈実験であってもよく、１５Ｎ２還元アッセイであってよく、または１５Ｎ天然存在量アッセイであってもよい）の使用により実証されること；４）固定されたＮが、植物タンパク質または代謝物に組み込まれること；および５）これら効果の全てが、未接種の植物または接種菌株の変異体を接種した植物で見られるわけではないこと。
【０２９４】
野生型の窒素固定制御カスケードは、入力Ｏ２およびＮＨ４＋がＮＯＲゲートを通過し、その出力が、ＡＴＰに加えてＡＮＤゲートに入力されるデジタル論理回路として表すことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法は、微生物が施肥圃場であっても窒素を産生することができるように、この回路に対するＮＨ４＋の影響を制御制御カスケードの複数地点で妨害する。しかしながら、本明細書に開示されている方法では、上記回路に対するＡＴＰまたはＯ２の影響を変更すること、または回路を細胞の他の制御カスケードと置換すること、または窒素固定以外の遺伝子回路を変更することも起想される。異種制御系の制御下で機能性産物を生成するように遺伝子クラスターを再操作してもよい。遺伝子クラスターのコード配列の外部および内部の天然制御エレメントを排除することにより、およびそれらを代替制御系と置換することにより、複雑な遺伝子オペロンおよび他の遺伝子クラスターの機能性産物を制御することができ、および／または天然遺伝子が由来していた種以外の異なる種の細胞を含む異種細胞に移動させることができる。合成遺伝子クラスターは、再操作されると、遺伝子回路または他の誘導可能な制御系により調節され、それにより産物の発現を所望のように調節することができる。ロジックゲート、パルス発生器、発振器、スイッチ、またはメモリデバイスとして作用するような発現カセットを設計してもよい。調節性発現カセットは、発現カセットが、酸素、温度、接触、浸透圧ストレス、膜ストレス、または酸化還元センサなどの環境センサとして機能するように、プロモーターに連結することができる。
【０２９５】
例として、ｎｉｆＬ、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＴ、およびｎｉｆＸ遺伝子を、ｎｉｆ遺伝子クラスターから排除してもよい。各アミノ酸配列をコードするＤＮＡをコドンランダム化することにより合成遺伝子を設計することができる。コドン選択を実施して、コドン使用頻度を天然遺伝子のコドン使用頻度からできるだけ逸脱するよう特定する。提案された配列を、制限酵素認識部位、トランスポゾン認識部位、反復配列、シグマ５４およびシグマ７０プロモーター、潜在性リボソーム結合部位、およびｒｈｏ非依存性ターミネーターなどの、あらゆる望ましくない特徴について走査する。合成リボソーム結合部位を、遺伝子の開始コドンを取り囲む１５０ｂｐ（−６０から＋９０まで）が蛍光遺伝子に融合されている蛍光レポータープラスミドを構築することなどにより、各々対応する天然リボソーム結合部位の強度と一致するように選択する。このキメラをＰｔａｃプロモーターの制御下で発現させ、フローサイトメトリーにより蛍光を測定することができる。合成リボソーム結合部位を生成するために、合成発現カセットの１５０ｂｐ（−６０〜＋９０）を使用するレポータープラスミドのライブラリーを生成する。簡潔に述べれば、合成発現カセットは、ランダムＤＮＡスペーサー、ＲＢＳライブラリーをコードする縮重配列、および各合成遺伝子のコード配列からなり得る。複数のクローンをスクリーニングして、天然リボソーム結合部位に最も良好に一致した合成リボソーム結合部位を同定する。このようにして天然オペロンと同じ遺伝子からなる合成オペロンを構築し、機能的な相補性について試験する。合成オペロンのさらなる例示的な記載は、米国特許出願公開第２０１４０３２９３２６号に提供されている。
【０２９６】
細菌種
本明細書中に開示の方法および組成物に有用な微生物は、任意の供給源から得ることができる。いくつかの場合では、微生物は、細菌、古細菌、原生動物、または真菌であってもよい。本開示の微生物は、窒素固定微生物、例えば窒素固定細菌、窒素固定古細菌、窒素固定真菌、窒素固定酵母、または窒素固定原生動物であってもよい。本明細書中に開示の方法および組成物に有用な微生物は、胞子形成微生物、例えば胞子形成細菌であってもよい。いくつかの場合では、本明細書中に開示の方法および組成物に有用な細菌は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であってもよい。いくつかの場合では、細菌は、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ門の内生胞子形成細菌であってもよい。いくつかの場合では、細菌は、ジアゾトロフであってもよい。いくつかの場合では、細菌は、ジアゾトロフでなくともよい。
【０２９７】
本開示の方法および組成物は、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓなどの古細菌と共に使用することができる。
【０２９８】
いくつかの場合には、有用であり得る細菌として、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｒｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｉｚａｗａｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｂｏｌａｃｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｉｎｏｇｌｕｃｏｓｉｄｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓとしても公知）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ（同義語：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｎｄｏｒｈｙｔｈｍｏｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｄｕｓａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｉｔｉｎｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｎｄｏｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｒｓｔａｋｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｃｏｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｍｏｒｂｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓとしても公知）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｒｏｃｃａｎｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｔｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｔｔｏ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｅｍａｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｒｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｙｃｈｒｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉａｍｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｕｎｉｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ（以前は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｂｔｓｕｇａｅ、Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ（以前は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）、Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ（以前は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｕｓｇａｅ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ（以前は、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ（以前は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａとして公知）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｒｏｒａｄｉｘ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｏｍｂｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇａｌｂｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒａｓｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓａｒａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ  ＡＱ７１９（ＮＲＲＬアクセッション番号Ｂ−２１６６３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＡＱ１７５（ＡＴＣＣアクセッション番号５５６０８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＡＱ  １７７（ＡＴＣＣアクセッション番号５５６０９）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＡＱ１７８（ＡＴＣＣアクセッション番号５３５２２）、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．菌株ＮＲＲＬアクセッション番号Ｂ−３０１４５が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合には、細菌は、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｋｌｅｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂｃｔｅｒ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、またはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉであり得る。
【０２９９】
いくつかの場合では、細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの種、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍであり得る。
【０３００】
いくつかの場合では、本開示の方法および組成物と共に使用される細菌は、シアノバクテリアであってもよい。シアノバクテリア属の例としては、Ａｎａｂａｅｎａ（例えば、Ａｎａｇａｅｎａ  ｓｐ．ＰＣＣ７１２０）、Ｎｏｓｔｏｃ（例えば、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、またはＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ（例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）が挙げられる。
【０３０１】
いくつかの場合では、本開示の方法および組成物と共に使用される細菌は、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ門、例えばＣｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍに属していてもよい。
【０３０２】
いくつかの場合では、本開示の方法および組成物と共に使用される微生物は、公知のＮｉｆＨ遺伝子と相同性である遺伝子を含んでいてもよい。公知のＮｉｆＨ遺伝子の配列は、例えば、Ｚｅｈｒ研究室ＮｉｆＨデータベース（ｗｗｗｚｅｈｒ．ｐｍｃ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｎｉｆＨ＿Ｄａｔａｂａｓｅ＿Ｐｕｂｌｉｃ／、２０１４年４月４日）、またはＢｕｃｋｌｅｙ研究室ＮｉｆＨデータベース（ｗｗｗ．ｃｓｓ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ｆａｃｕｌｔｙ／ｂｕｃｋｌｅｙ／ｎｉｆｈ．ｈｔｍ、およびＧａｂｙ，Ｊｏｈｎ  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，ａｎｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｈ．Ｂｕｃｋｌｅｙ、「Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｌｉｇｎｅｄ  ｎｉｆＨ  ｇｅｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅ：ａ  ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｉｘｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ．」、Ｄａｔａｂａｓｅ  ２０１４（２０１４）：ｂａｕ００１）に見出すことができる。いくつかの場合では、本開示の方法および組成物と共に使用される微生物は、Ｚｅｈｒ研究室ＮｉｆＨデータベース（ｗｗｗｚｅｈｒ．ｐｍｃ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｎｉｆＨ＿Ｄａｔａｂａｓｅ＿Ｐｕｂｌｉｃ／、２０１４年４月４日）に由来する配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または９９％よりも高い配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含んでいてもよい。いくつかの場合では、本開示の方法および組成物と共に使用される微生物は、Ｂｕｃｋｌｅｙ研究室ＮｉｆＨデータベース（Ｇａｂｙ，Ｊｏｈｎ  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，ａｎｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｈ．Ｂｕｃｋｌｅｙ、「Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｌｉｇｎｅｄ  ｎｉｆＨ  ｇｅｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅ：ａ  ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｉｘｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ．」、Ｄａｔａｂａｓｅ  ２０１４（２０１４）：ｂａｕ００１）に由来する配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または９９％よりも高い配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含んでいてもよい。
【０３０３】
本明細書に開示されている方法および組成物に有用な微生物は、天然植物の表面または組織から微生物を抽出することにより；種子を粉砕して微生物を単離することにより；多様な土壌試料に種子を植栽し、組織から微生物を回収することにより；または植物に外因性微生物を接種し、微生物が植物組織に出現するか否かを決定することにより得ることができる。植物組織の非限定的な例としては、種子、実生、葉、挿穂、植物、鱗茎、塊茎、根、および根茎が挙げられる。いくつかの場合では、細菌は、種子から単離される。試料を処理するためのパラメータを変化させて、根圏菌、着生菌、または内部寄生菌などの、異なるタイプの付随微生物を単離することができる。また、細菌は、第１の植物から初期に分離する代わりに、環境菌株コレクションなどのレポジトリを供給源としてもよい。微生物は、単離された微生物のゲノムを配列決定することにより；ｉｎ  ｐｌａｎｔａ群生の組成物をプロファイリングすることにより；群生もしくは単離された微生物のトランスクリプトーム機能性を特徴付けることにより；または選択培地もしくは表現型培地（例えば、窒素固定またはリン酸可溶化表現型）を使用して微生物の特徴をスクリーニングすることにより、遺伝子型および表現型を決定することができる。選択する候補菌株または集団は、配列データ；表現型データ；植物データ（例えば、ゲノム、表現型、および／または収穫高データ）；土壌データ（例えば、ｐＨ、Ｎ／Ｐ／Ｋ含有量、および／またはバルク土壌生物群生）；またはこれらの任意の組合せにより得ることができる。
【０３０４】
本明細書中に記載の細菌および細菌を産生するための方法は、有害な植物防御反応を誘導せずに、葉表面、根表面、もしくは内部植物組織で効率的に自己増幅することができる細菌、または植物防御応答に耐性である細菌に付与してもよい。本明細書中に記載の細菌は、窒素が添加されていない培地で植物組織抽出物または葉表面洗浄液を培養することにより単離してもよい。しかしながら、細菌は、培養可能でない場合があり、すなわち、培養可能かどうか公知でないか、当該分野で公知の標準的方法の使用では培養が困難である場合がある。本明細書中に記載の細菌は、内部寄生菌、または着生菌、または植物根圏に生息する細菌（根圏細菌）であってもよい。遺伝子変異を導入する工程、複数の植物に曝露する工程、および改善された形質を有する植物から細菌を単離する工程を、１回または複数回（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２５回、またはそれよりも多く）繰り返した後で得られる細菌は、内部寄生性、着生性、または根圏性であってもよい。内部寄生菌は、病徴を引き起こさずに、または共生構造の形成を誘発せずに、植物の内部に進入する生物であり、植物成長を増強し、植物の栄養を改善させる（例えば、窒素固定により）ことができるため農耕学的に興味深い生物である。細菌は、種子伝染性内部寄生菌であってもよい。種子伝染性内部寄生菌としては、成熟し乾燥した無損傷の（例えば、ひび割れ、目に見える真菌感染、または早期発芽がない）種子に見出される種子伝染性細菌性内部寄生菌などの、イネ化植物または植物の種子に付随するまたは由来する細菌が挙げられる。種子伝染性細菌性内部寄生菌は、種子の表面に付随もしくは由来してもよく、その代わりにまたはそれに加えて、内部種子区画（例えば、表面滅菌種子の）に付随もしくは由来してもよい。いくつかの場合では、種子伝染性細菌性内部寄生菌は、植物組織内で、例えば種子の内部で複製することが可能である。また、いくつかの場合では、種子伝染性細菌性内部寄生菌は、乾燥を生き抜くことが可能である。
【０３０５】
本開示の方法により単離されるまたは本開示の方法もしくは組成物において使用される細菌は、複数の異なる細菌分類群を組合せで含むことができる。例として、細菌としては、プロテオバクテリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｕｇａｎｅｌｌａ、Ｄｅｌｆｔｉａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｎ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、およびＨａｌｏｍｏｎａｓなど）、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、およびＡｃｅｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍなど）、およびＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｒｈｏｄａｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＣｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍなど）が挙げられ得る。本開示の方法および組成物で使用される細菌は、２つまたはそれを超える種の窒素固定細菌コンソーシアを含んでいてもよい。いくつかの場合では、細菌コンソーシアの１またはそれを超える細菌種は、窒素を固定することが可能であってもよい。いくつかの場合では、細菌コンソーシアの１またはそれを超える種は、窒素を固定する他の細菌の能力を促進または増強することができる。窒素を固定する細菌および窒素固定する他の細菌の能力を増強する細菌は、同じであってもよく、または異なっていてもよい。いくつかの例では、細菌菌株は、異なる細菌菌株と組み合わせると、またはある特定の細菌コンソーシアでは、窒素を固定することができる場合があるが、単一培養では窒素を固定することができない場合がある。窒素固定細菌コンソーシアに見出すことができる細菌属の例としては、限定されないが、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、およびＢａｃｉｌｌｕｓが挙げられる。
【０３０６】
本明細書に開示されている方法により産生することができる細菌としては、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．、およびＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．が挙げられる。いくつかの例では、細菌は、以下のものからなる群から選択されてもよい：Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ。いくつかの場合には、細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属またはＲａｈｎｅｌｌａ属であり得る。いくつかの場合には、細菌は、Ｆｒａｎｋｉａ属またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属であり得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌の例として、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｉｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合には、細菌は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｚｏｔｏｆｉｘａｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｕｒｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｉｂｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｕｃａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｒｖａｅ  ｓｕｂｓｐ．Ｌａｒｖａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｒｖａｅ  ｓｕｂｓｐ．Ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｂｕｌｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｏｒｉａｅ、またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａであり得る。
【０３０７】
いくつかの例では、本開示の方法によって単離された細菌は、以下の分類群：Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｚ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｆｉｐｉａ、Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ、Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｔｏｐｏｓｔｉｐｅｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ、Ｂｏｓｅａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｈａｌｏｒｅｄｉｖｉｖｕｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒａｌｉｏｍａｒｇａｒｉｔａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｒｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｌｆｔｉａ、Ｄｅｓｅｍｚｉａ、Ｄｅｖｏｓｉａ、Ｄｏｋｄｏｎｅｌｌａ、Ｄｙｅｌｌａ、Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ／Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｅｒｒｏｇｌｏｂｕｓ、Ｆｉｌｉｍｏｎａｓ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ、Ｆｌａｖｉｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒｉｇｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｆｎｉａ、Ｈａｌｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｈａｌｏｓｉｍｐｌｅｘ、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｈｙｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｏｃｕｒｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ、Ｌｅｎｔｚｅａ、Ｌｕｔｅｉｂａｃｔｅｒ、Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ、Ｍａｓｓｉｌｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｖｉｒｇａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｏｃｅａｎｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ、Ｏｋｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ、Ｏｒｙｚｉｈｕｍｕｓ、Ｏｘａｌｏｐｈａｇｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｎｔｅｏａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｅｌｏｍｏｎａｓ、Ｐｅｒｌｕｃｉｄｉｂａｃａ、Ｐｌａｎｔｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｌａｖａ、Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｒｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅａｔｅｌｅｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏ���ｃｕｓ、Ｓｅｂａｌｄｅｌｌａ、Ｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｈｉｎｅｌｌａ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｉｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｉｃｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、２５  Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｙｇｉｏｌｏｂｕｓ、Ｓｕｌｆｕｒｉｓｐｈａｅｒａ、Ｔａｔｕｍｅｌｌａ、Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎａｓ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ、ＷＰＳ−２  ｇｅｎｅｒａ  ｉｎｃｅｒｔａｅ  ｓｅｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎｅｌｌａのうちの１またはそれを超えるメンバーであり得る。
【０３０８】
いくつかの場合では、以下の属：Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、およびＲａｈｎｅｌｌａのうちの少なくとも１つから選択される細菌種が利用される。いくつかの場合では、以下の属：Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、およびＲａｈｎｅｌｌａからの細菌種の組合せが利用される。いくつかの場合では、利用される種は、以下：Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＲａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓのうちの１またはそれを超える種であり得る。
【０３０９】
いくつかの場合では、グラム陽性微生物は、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＸ、ｈｅｓＡ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＩ１、およびｎｉｆＩ２を含むモリブデン−鉄ニトロゲナーゼ系を有していてもよい。いくつかの場合では、グラム陽性微生物は、ｖｎｆＤＧ、ｖｎｆＫ、ｖｎｆＥ、ｖｎｆＮ、ｖｕｐＣ、ｖｕｐＢ、ｖｕｐＡ、ｖｎｆＶ、ｖｎｆＲ１、ｖｎｆＨ、ｖｎｆＲ２、ｖｎｆＡ（転写制御因子）を含むバナジウムニトロゲナーゼ系を有していてもよい。いくつかの場合では、グラム陽性微生物は、ａｎｆＫ、ａｎｆＧ、ａｎｆＤ、ａｎｆＨ、ａｎｆＡ（転写制御因子）を含む鉄のみのニトロゲナーゼ系を有していてもよい。いくつかの場合では、グラム陽性微生物は、ｇｌｎＢおよびｇｌｎＫ（窒素シグナル伝達タンパク質）を含むニトロゲナーゼ系を有していてもよい。グラム陽性微生物の窒素代謝に関与する酵素のいくつかの例としては、ｇｌｎＡ（グルタミン合成酵素）、ｇｄｈ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）、ｂｄｈ（３−ヒヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ）、グルタミナーゼ、ｇｌｔＡＢ／ｇｌｔＢ／ｇｌｔＳ（グルタミン酸合成酵素）、ａｓｎＡ／ａｓｎＢ（アスパラギン酸−アンモニアリガーゼ／アスパラギン合成酵素）、およびａｎｓＡ／ａｎｓＺ（アスパラギナーゼ）が挙げられる。グラム陽性微生物の窒素輸送に関与するタンパク質のいくつかの例としては、ａｍｔＢ（アンモニウムトランスポーター）、ｇｌｎＫ（アンモニウム輸送の制御因子）、ｇｌｎＰＨＱ／  ｇｌｎＱＨＭＰ（ＡＴＰ依存性グルタミン／グルタミン酸トランスポーター）、ｇｌｎＴ／ａｌｓＴ／ｙｒｂＤ／ｙｆｌＡ（グルタミン様プロトン共輸送トランスポーター）、およびｇｌｔＰ／ｇｌｔＴ／ｙｈｃｌ／ｎｑｔ（グルタミン酸様プロトン共輸送トランスポーター）が挙げられる。
【０３１０】
特に興味深い可能性があるグラム陽性微生物の例としては、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｉｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｉｏｇｒａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｕｍ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｈｅｌｉｏｐｈｉｌｕｍ  ｓｐ．、Ｈｅｌｉｏｒｅｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｔｉｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｓｐｏｒａ  ｓｐ．、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、およびＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．が挙げられる。
【０３１１】
グラム陽性微生物で可能な遺伝子変更のいくつかの例としては、ｇｌｎＲを欠失させて、環境窒素の存在下でのＢＮＦの負の制御を除去すること；ｎｉｆクラスターのすぐ上流に異なるプロモーターを挿入して、環境窒素に応答したＧｌｎＲによる制御を除去すること；ｇｌｎＡを変異させて、ＧＳ−ＧＯＧＡＴ経路によるアンモニウム同化の速度を低減すること；ａｍｔＢを欠失させて、培地からのアンモニウムの取込みを低減させること；ｇｌｎＡを変異させ、それにより構成的にフィードバック阻害（ＦＢＩ−ＧＳ）状態にして、ＧＳ−ＧＯＧＡＴ経路によるアンモニウム同化を低減させることが挙げられる。
【０３１２】
いくつかの場合では、ｇｌｎＲは、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種におけるＮの代謝および固定の主要な制御因子である。いくつかの場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、ｇｌｎＲを産生するための遺伝子を含んでいなくともよい。いくつかの場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、ｇｌｎＥまたはｇｌｎＤを産生するための遺伝子を含んでいなくともよい。いくつかの場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、ｇｌｎＢまたはｇｌｎＫを産生するための遺伝子を含んでいてもよい。例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＷＬＹ７８は、ｇｌｎＢの遺伝子、または古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓに見出されるそのホモログであるｎｉｆＩ１およびｎｉｆＩ２を含んでいない。いくつかの場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、様々であってもよい。例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｉｘａ  Ｅ６８１は、ｇｌｎＫおよびｇｄｈを欠如し、いくつかの窒素化合物トランスポーターを有するが、ａｍｔＢのみが、ＧｌｎＲにより制御されると考えられる。別の例では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＪＤＲ２は、ｇｌｎＫ、ｇｄｈ、およびほとんどの他の中心的な窒素代謝遺伝子を有し、はるかにより少数の窒素化合物トランスポーターを有するが、ＧｌｎＲにより制御されるｇｌｎＰＨＱを有する。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｉｏｇｒａｎｄｅｎｓｉｓ  ＳＢＲ５は、標準ｇｌｎＲＡオペロン、ｆｄｘ遺伝子、主要ｎｉｆオペロン、二次ｎｉｆオペロン、およびａｎｆオペロン（鉄のみのニトロゲナーゼをコードする）を含んでいる。推定上のｇｌｎＲ／ｔｎｒＡ部位が、これらのオペロンの各々の上流に見出された。ＧｌｎＲは、ａｎｆオペロンを除き、上記オペロンの全てを制御することができる。ＧｌｎＲは、二量体として、これらの制御配列の各々に結合することができる。
【０３１３】
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｎ固定菌株は、以下の２つの部分群に分類することができる：最小限のｎｉｆ遺伝子クラスターのみを含む部分群Ｉ；ならびに最小限のクラスターに加えて、ｎｉｆＸとｈｅｓＡとの間にある特徴付けられていない遺伝子、および多くの場合はｎｉｆＨ、ｎｉｆＨＤＫ、ｎｉｆＢＥＮなどのｎｉｆ遺伝子の一部が重複している他のクラスター、またはバナジウム（ｖａｎａｄａｉｕｍ）ニトロゲナーゼ（ｖｎｆ）もしくは鉄のみのニトロゲナーゼ（ａｎｆ）遺伝子をコードするクラスターを含む部分群ＩＩ。
【０３１４】
いくつかの場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、ｇｌｎＢまたはｇｌｎＫを産生するための遺伝子を含んでいなくともよい。いくつかの場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、シグマ−７０プロモーターから転写される９つの遺伝子を有する最小限のｎｉｆクラスターを含んでいてもよい。いくつかの場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｉｆクラスターは、窒素または酸素により負に制御されてもよい。いくつかの場合では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種のゲノムは、シグマ−５４を産生するための遺伝子を含んでいなくともよい。例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＷＬＹ７８は、シグマ−５４の遺伝子を含んでいない。いくつかの場合では、ｎｉｆクラスターは、ｇｌｎＲおよび／またはＴｎｒＡにより制御されてもよい。いくつかの場合では、ｎｉｆクラスターの活性は、ｇｌｎＲおよび／またはＴｎｒＡの活性を変更することにより変更されてもよい。
【０３１５】
Ｂａｃｉｌｌｉでは、グルタミン合成酵素（ＧＳ）は、高濃度の細胞内グルタミンによりフィードバック阻害され、シフト・イン・コンファメーションを引き起こす（ＦＢＩ−ＧＳと呼ばれる）。Ｎｉｆクラスターは、いくつかのＢａｃｉｌｌｉ種では、制御因子ＧｌｎＲおよびＴｎｒＡに対して個別の結合部位を含む。ＧｌｎＲは、過剰な細胞内グルタミンおよびＡＭＰの存在下で結合し、遺伝子発現を抑制する。ＧｌｎＲの役割は、高窒素利用可能条件下で、グルタミンおよびアンモニウムの流入および細胞内産生を防止することであってもよい。ＴｎｒＡは、限定的な細胞内グルタミンの存在下および／またはＦＢＩ−ＧＳの存在下で結合し、および／または遺伝子発現を活性化する（または抑制する）ことができる。いくつかの場合では、Ｂａｃｉｌｌｉ  ｎｉｆクラスターの活性は、ＧｌｎＲの活性を変更することにより変更することができる。
【０３１６】
フィードバック阻害されたグルタミン合成酵素（ＦＢＩ−ＧＳ）は、ＧｌｎＲに結合し、認識配列に対するＧｌｎＲの結合を安定化することができる。いくつかの細菌種は、ｎｉｆクラスターの上流にＧｌｎＲ／ＴｎｒＡ結合部位を有する。ＦＢＩ−ＧＳおよびＧｌｎＲの結合を変更することにより、ｎｉｆ経路の活性を変更することができる。
【０３１７】
微生物の供給源
細菌（または本開示に従う任意の微生物）は、その土壌、植物、真菌、動物（無脊椎動物を含む）、ならびに湖および川の堆積物、水、および生物相を含む他の生物相を含む任意の一般的陸生環境；海洋環境、その生物相および堆積物（例えば、海水、海泥、海洋植物、海洋無脊椎動物（例えば、海綿動物）、海洋脊椎動物（例えば、魚類））；陸生および海洋性地圏（表土および岩石、例えば、粉砕された地中岩石、砂、および粘土）；氷雪圏およびその融雪氷水；大気（例えば、濾過空気粉塵、雲、および雨滴）；都市環境、工業環境、および他の人為的環境（例えば、コンクリート、道路側溝、屋根表面、および道路表面に蓄積された有機物および無機物）から得ることができる。
【０３１８】
細菌（または本開示に従う任意の微生物）が得られる植物は、１またはそれを超える望ましい形質を有する植物、例えば、特定の環境でまたはある特定の目的の条件下で自然に成長する植物であってもよい。例として、ある特定の植物は、砂質土壌および高塩分の砂地で、もしくは極端な温度下で、もしくは水がほとんどなくとも自然に成長することができ、または環境に存在するある特定の有害生物または疾患に耐性であってもよく、商品作物は、そのような条件下で成長することが望ましい場合があり、そのような条件が、例えば特定の地理的位置において利用可能な唯一の条件である場合は特にそうである。さらなる例としては、細菌は、そのような環境で栽培された商品作物から、またはより具体的には、任意の特定の環境で栽培された作物のうち目的の形質を最も良好に示す作物植物個体：例えば、塩分制限土壌で栽培された作物のうち最も迅速に成長する植物、深刻な虫害もしくは疾患流行に曝露された作物のうち最も被害が少なかった植物、または繊維含量および油分含量などを含む、ある特定の代謝物および他の化合物の所望の量を有する植物、または望ましい色、味、もしくは匂いを示す植物から収集してもよい。細菌は、以前に参照されているような環境中の真菌および他の動物相および植物相、土壌、水、堆積物、ならびに他の要素を含む、目的の環境に生じる目的の植物または任意の物質から収集してもよい。
【０３１９】
細菌（または本開示に従う任意の微生物）は、植物組織から単離してもよい。この単離は、例えば、根、茎葉、および植物再生組織を含む、植物の任意の適切な組織から行ってもよい。例として、植物から単離するための従来の方法は、典型的には、目的の植物物質（例えば、根長、または茎長、葉）を無菌切除すること、適切な溶液（例えば、２％次亜塩素酸ナトリウム）で表面を滅菌してから、植物物質を、微生物培養用の栄養培地に配置することを含む。あるいは、表面を滅菌した植物物質を滅菌液中（通常は、水）で粉砕し、粉砕した植物物質の小片を含む懸濁液を、選択的であってもよくまたは非選択的であってもよい（例えば、リンの供給源としてフィチン酸のみを含有する）適切な固体寒天培地（複数可）の表面に播種してもよい。この手法は、単離されたコロニーを形成し、個々に摘取して栄養培地のプレートから分離することができ、さらに周知の方法により単一種に精製することができる細菌に特に有用である。あるいは、植物根または葉試料を表面滅菌せず、穏やかな洗浄のみを行って、表面に生息する着生微生物を単離プロセスに含めてもよく、または植物の根、茎、もしくは葉の小片を寒天培地の表面に押しつけてから離し、その後上記のように個々のコロニーを単離することにより、着生微生物を別々に単離してもよい。この手法は、例えば、細菌に特に有用である。あるいは、根に付着している少量の土を洗い流さずに、したがって植物根圏でコロニー化する微生物を含むように、根を処理してもよい。そうでなければ、根に付着している土壌を取り出し、希釈し、適切な選択的および非選択的培地の寒天上に播種して、根圏細菌の個々のコロニーを単離してもよい。
【０３２０】
特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
本開示の微生物寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の条項に基づいてなされた。
【０３２１】
出願人は、米国特許規則第１．８０８条（ａ）（２）に準じて、「寄託されている材料の公衆への提供可能性に関して寄託者によって課せられている制限の全てが、特許が付与されたとき、取消不能の条件で撤回される」ことを申し立てる。この陳述は、この項の段落（ｂ）（すなわち、米国特許規則第１．８０８条（ｂ））に従うことを条件とする。
【０３２２】
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｃｃｈａｒｉは、現在、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉとして再分類されており、この生物の名称は、本明細書全体にわたって相互交換可能に使用され得る。
【０３２３】
図６および図７に示されているように、本開示の多数の微生物は、２つの野生型菌株に由来する。菌株ＣＩ００６は、以前はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属（前述のＫｏｓａｋｏｎｉａへの再分類を参照）に分類されていた細菌種であり、図６には、ＣＩ００６に由来する変異体の系統が同定されている。菌株ＣＩ０１９は、Ｒａｈｎｅｌｌａ属に分類されている細菌種であり、図７には、ＣＩ０１９に由来する変異体の系統が同定されている。図６および図７に関して、名称にＣＭを含む菌株は、前述のＣＭ菌株のすぐ左側に示されている菌株の変異体である。ＣＩ００６  Ｋｏｓａｋｏｎｉａ野生型（ＷＴ）およびＣＩ０１９  Ｒａｈｎｅｌｌａ  ＷＴの寄託情報は、下記の表１に見出される。
【０３２４】
本出願に記載されているいくつかの微小生物は、２０１７年１月６日または２０１７年８月１１日に、６０  Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｄｒｉｖｅ，Ｅａｓｔ  Ｂｏｏｔｈｂａｙ，Ｍａｉｎｅ  ０４５４４，ＵＳＡに所在する、Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託された。前述のように、寄託は全て、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に基づいてなされた。前述のブダペスト条約寄託に関する、Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａのアクセッション番号および寄託日は、表１に提供されている。
【０３２５】
Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ（ＷＴ）、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ（ＷＴ）、およびバリアント／リモデリングされたＫｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ菌株の生物学的に純粋な培養物は、２０１７年１月６日に、６０  Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｄｒｉｖｅ，Ｅａｓｔ  Ｂｏｏｔｈｂａｙ，Ｍａｉｎｅ  ０４５４４，ＵＳＡに所在する、Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託され、それぞれＮＣＭＡ特許寄託指定番号第２０１７０１００１号、第２０１７０１００３号、および第２０１７０１００２号が割り当てられた。該当する寄託情報は、下記の表１に見出される。
【０３２６】
バリアント／リモデリングされたＫｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ菌株の生物学的に純粋な培養物は、２０１７年８月１１日に、６０  Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｄｒｉｖｅ，Ｅａｓｔ  Ｂｏｏｔｈｂａｙ，Ｍａｉｎｅ  ０４５４４，ＵＳＡに所在する、Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託され、それぞれＮＣＭＡ特許寄託指定番号第２０１７０８００４号、第２０１７０８００３号、および第２０１７０８００２号が割り当てられた。該当する寄託情報は、下記の表１に見出される。
【０３２７】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ（ＷＴ）の生物学的に純粋な培養物は、２０１７年８月１１日に、６０  Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｄｒｉｖｅ，Ｅａｓｔ  Ｂｏｏｔｈｂａｙ，Ｍａｉｎｅ  ０４５４４，ＵＳＡに所在する、Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託され、ＮＣＭＡ特許寄託指定番号第２０１７０８００１号が割り当てられた。２つのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａのバリアント／リモデリングされた菌株の生物学的に純粋な培養物は、２０１７年１２月２０日に、６０  Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｄｒｉｖｅ，Ｅａｓｔ  Ｂｏｏｔｈｂａｙ，Ｍａｉｎｅ  ０４５４４，ＵＳＡに所在する、Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（ＮＣＭＡ）に寄託され、それぞれＮＣＭＡ特許寄託指定番号第２０１７１２００１号および第２０１７１２００２号が割り当てられた。該当する寄託情報は、下記の表１に見出される。
表１：ブダペスト条約に基づいて寄託された微小生物
【表１−１】
2021530984.tif 000005
【表１−２】
2021530984.tif 000006
【０３２８】
単離された生物学的に純粋な微小生物
本開示は、ある特定の実施形態では、特に農業に付与される単離された生物学的に純粋な微小生物を提供する。開示される微小生物は、単離された生物学的に純粋な状態で使用することができ、組成物に製剤化することもできる（例示的な組成物の説明は、下記のセクションを参照）。さらに、本開示は、開示される単離された生物学的に純粋な微小生物の少なくとも２つのメンバーを含む微生物組成物、ならびに前述の微生物組成物を使用するための方法を提供する。さらに、本開示は、開示される単離された生物学的に純粋な微生物の使用により植物中の窒素固定を調整するための方法を提供する。
【０３２９】
いくつかの態様では、本開示の単離された生物学的に純粋な微小生物は、表１に示されているものである。他の態様では、本開示の単離された生物学的に純粋な微小生物は、表１の微小生物から誘導される。例えば、表１の微小生物の菌株、子孫、変異体、または誘導体が、本明細書で提供されている。本開示では、表１に列挙されている微生物のあらゆる考え得る組合せが企図され、前述の組合せは微生物コンソーシアを形成することがある。表１の微生物は、個々にまたは任意の組合せのいずれでもよく、本開示で言及されている任意の植物、活性分子（合成、有機など）、アジュバント、担体、栄養補助剤、または生物学的製剤と組み合わせることができる。
【０３３０】
いくつかの態様では、本開示は、表２〜８にグループ分けした種を含む微生物組成物を提供する。いくつかの態様では、種々の微生物種を含むこれらの組成物は、微生物コンソーシアまたは微生物コンソーシアムと名付けられる。
【０３３１】
表２〜８に関して、文字Ａ〜Ｉは、以下のように定義した、本開示の微小生物の非限定的な選択を表す：
【０３３２】
Ａ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７０１００１を有する微生物；
【０３３３】
Ｂ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７０１００３を有する微生物；
【０３３４】
Ｃ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７０１００２を有する微生物；
【０３３５】
Ｄ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７０８００４を有する微生物；
【０３３６】
Ｅ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７０８００３を有する微生物；
【０３３７】
Ｆ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７０８００２を有する微生物；
【０３３８】
Ｇ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７０８００１を有する微生物；
【０３３９】
Ｈ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７１２００１を有する微生物；および
【０３４０】
Ｉ＝表１で同定したアクセッション番号２０１７１２００２を有する微生物。
表２：８菌株および９菌株の組成物
【表２】
2021530984.tif 000007
表３：７菌株組成物
【表３】
2021530984.tif 000008
表４：６菌株組成物
【表４−１】
2021530984.tif 000009
【表４−２】
2021530984.tif 000010
表５：５菌株組成物
【表５】
2021530984.tif 000011
表６：４菌株組成物
【表６】
2021530984.tif 000012
表７：３菌株組成物
【表７−１】
2021530984.tif 000013
【表７−２】
2021530984.tif 000014
表８：２菌株組成物
【表８】
2021530984.tif 000015
【０３４１】
いくつかの実施形態では、微生物組成物は、表２〜８由来の任意の群メンバーから選択され得る。
【０３４２】
農業組成物
本明細書中に記載の方法により産生される細菌または細菌集団を含み、そして／または本明細書中に記載のような特徴を有する組成物は、液体、泡沫、または乾燥製品の形態であってもよい。また、本明細書中に記載の方法により産生される細菌または細菌集団を含み、そして／または本明細書中に記載のような特徴を有する組成物を使用して、植物形質を改善させることができる。いくつかの例では、細菌集団を含む組成物は、乾燥粉末、粉末および水のスラリー、または流動性種子処理剤の形態であってもよい。細菌集団を含む組成物は、種子の表面にコーティングしてもよく、液体形態であってもよい。
【０３４３】
組成物は、連続撹拌槽型反応器、回分反応器などのバイオリアクターで、および農場で製造することができる。いくつかの例では、組成物は、ジャグなどの容器中でまたはミニバルクで保管することができる。いくつかの例では、組成物は、ボトル、ジャー、アンプル、パッケージ、入れ物、袋、箱、ビン、封筒、紙箱、容器、サイロ、発送容器、トラック荷台、およびケースからなる群から選択される物体内で保管してよい。
【０３４４】
また、組成物は、植物形質を改善させるために使用することができる。いくつかの例では、１またはそれを超える組成物を、種子にコーティングしてもよい。いくつかの例では、１またはそれを超える組成物を、実生にコーティングしてもよい。いくつかの例では、１またはそれを超える組成物を、種子の表面にコーティングしてもよい。いくつかの例では、１またはそれを超える組成物を、種子の表面上方の層としてコーティングしてもよい。いくつかの例では、種子にコーティングされる組成物は、液体形態であってもよく、乾燥製品形態であってもよく、泡沫形態であってもよく、粉末および水のスラリー形態であってもよく、または流動性種子処理剤であってもよい。いくつかの例では、１またはそれを超える組成物を種子および／または実生に、噴霧、浸漬、コーティング、封入、および／または散布することにより、１またはそれを超える組成物を種子および／または実生に付与してもよい。いくつかの例では、複数の細菌または細菌集団を、植物の種子および／または実生にコーティングすることができる。いくつかの例では、細菌組合せのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、または１０種を超える細菌は、以下の属：Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、およびＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓのうちの１つから選択され得る。
【０３４５】
いくつかの例では、内部寄生性組合せのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、または１０種を超える細菌および細菌集団は、以下の科：Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｉｌｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｎａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉａｃｅａｅ、Ｇｎｏｍｏｎｉａｃｅａｅ、Ｉｎｃｅｒｔａｅ  ｓｅｄｉｓ、Ｌａｓｉｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ、Ｎｅｔｒｉａｃｅａｅ、およびＰｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅのうちの１つから選択される。
【０３４６】
いくつかの例では、内部寄生性組合せのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種（ｎｉｇｈｔ）、少なくとも１０種、または１０種を超える細菌および細菌集団は、以下の科：Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｉｌｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｎａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉａｃｅａｅ、Ｇｎｏｍｏｎｉａｃｅａｅ、Ｉｎｃｅｒｔａｅ  ｓｅｄｉｓ、Ｌａｓｉｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ、Ｎｅｔｒｉａｃｅａｅ、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅのうちの１つから選択される。
【０３４７】
組成物の例としては、商業的に重要な農業作物、例えば、モロコシ、キャノーラ、トマト、イチゴ、オオムギ、イネ、メイズ、およびコムギのための種子コーティングを挙げることができる。また、組成物の例としては、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、モロコシ、ジャガイモ、イネ、野菜、穀類、および脂肪種子のための種子コーティングを挙げることができる。本明細書で提供される種子は、遺伝子改変生物（ＧＭＯ）であってもよく、非ＧＭＯであってもよく、有機的なものであってもよく、従来のものであってもよい。いくつかの例では、組成物を、植物の地上部に噴霧してよく、植物の種子が植栽されている植溝に挿入するか、土壌に灌水するか、組成物の懸濁液中に根を浸漬することによって付与してもよい。いくつかの例では、組成物は、細胞生存、および宿主植物での人為的接種およびコロニー化の能力を維持する適切な様式で脱水してもよい。細菌種は、１０８〜１０１０ＣＦＵ／ｍｌの間の濃度で組成物中に存在してもよい。いくつかの例では、組成物は、モリブデンイオン、鉄イオン、マンガンイオン、またはこれらイオンの組合せなどの微量金属イオンで補充されてもよい。本明細書中に記載の組成物の例におけるイオンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭの間であってもよい。また、組成物のいくつかの例は、ベータ−グルカン、カルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）、細菌性細胞外ポリマー物質（ＥＰＳ）、糖、畜乳、または他の適切な担体などの担体と共に製剤化されてもよい。いくつかの例では、泥炭または植栽用物質を担体として使用してもよく、または組成物がバイオポリマーに捕捉されているバイオポリマーを担体として使用してもよい。本明細書中に記載の細菌集団を含む組成物は、植物成長の促進、葉中の高葉緑素含有量の維持、果実数または種子数の増加、および果実単位重量または種子単位重量の増加など、植物形質を改善させることができる。
【０３４８】
本明細書中に記載の細菌集団を含む組成物は、種子の表面上にコーティングしてもよい。そのため、本明細書中に記載の１またはそれを超える細菌でコーティングされた種子を含む組成物も企図される。種子コーティングは、細菌集団を、多孔性の化学的に不活性な粒状担体と混合することにより形成することができる。あるいは、組成物は、種子が植栽される植溝内に直接挿入してもよく、植物葉に噴霧してもよく、または根を組成物の懸濁液に浸漬することにより付与してもよい。有効量の組成物を使用して、植物の根に隣接する心土領域に生存可能な細菌増殖を定植させてもよく、または植物の葉に生存可能な細菌増殖を定植させてもよい。一般的に、有効量は、改善された形質（例えば、所望のレベルの窒素固定）を有する植物をもたらすのに十分な量である。
【０３４９】
本明細書中に記載の細菌組成物は、農業的に許容され得る担体を使用して製剤化することができる。これらの実施形態に有用な製剤は、粘着付与剤、微生物安定化剤、殺真菌剤、抗菌剤、保存剤、安定化剤、界面活性剤、抗錯体剤、除草剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物成長調節物質、肥料、殺鼠剤、乾燥剤（ｄｅｓｓｉｃａｎｔ）、殺菌剤、栄養素、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含んでいてもよい。いくつかの例では、組成物は、長期保存可能であり得る。例えば、本明細書中に記載の組成物はいずれも、農業的に許容され得る担体（例えば、天然に存在しない肥料などの肥料、天然に存在しない付着剤などの付着剤、および天然に存在しない農薬などの農薬のうちの１つまたは複数）を含み得る。天然に存在しない付着剤は、例えば、ポリマー、コポリマー、または合成ろうであり得る。例えば、本明細書中に記載されているコーティングされた種子、実生、または植物はいずれも、種子コーティングにそのような農業的に許容され得る担体を含有することができる。本明細書中に記載の組成物または方法のいずれにおいても、農業的に許容され得る担体は、天然に存在しない化合物（例えば、天然に存在しない肥料、天然に存在しない付着剤（ポリマー、コポリマー、もしくは合成ろうなど）、または天然に存在しない農薬）であり得るか、含み得る。農業的に許容され得る担体の非限定的な例は、以下に記載されている。農業的に許容され得る担体のさらなる例は、当該分野で公知である。
【０３５０】
いくつかの場合では、細菌は、農業的に許容され得る担体と混合される。担体は、固体担体または液体担体、ミクロスフェア、粉末、およびエマルジョンなどが含まれる種々の形態であり得る。担体は、安定性、湿潤性、または分散性の増加などの様々な特性を付与するいくつかの担体のいずれか１つまたは複数であってもよい。非イオン性界面活性剤またはイオン性界面活性剤、またはそれらの組合せであり得る天然または合成の界面活性剤などの湿潤剤が、組成物中に含まれ得る。また、単離された細菌を含む組成物を製剤化するために、油中水型乳濁液を使用することができる（例えば、米国特許第７，４８５，４５１号を参照のこと）。調製することができる適切な製剤としては、水和性粉末、顆粒、ゲル、寒天片またはペレット、および増粘剤など、ならびにマイクロカプセル化粒子など、流動性水溶液、水性懸濁液、油中水型乳濁液などの液体などが挙げられる。製剤は、穀物またはマメ科植物産物、例えば、粉砕した穀物もしくは豆、穀物もしくは豆に由来するブロスもしくは粉末、デンプン、糖、または油を含んでもよい。
【０３５１】
いくつかの実施形態では、農業担体は、土壌であってもよく、または植物生育培地であってもよい。使用することができる他の農業担体としては、水、肥料、植物系の油、湿潤薬、またはそれらの組合せが挙げられる。あるいは、農業担体は、顆粒、ペレット、または懸濁液を含む、珪藻土、ローム、シリカ、アルギン酸塩、粘土、ベントナイト、バーミキュライト、種子鞘、他の植物および動物産物、または組合せなどの固形物であってもよい。限定されないが、ローム、砂、または粘土などの中のペスタ（ｐｅｓｔａ）（粉末およびカオリン粘土）、寒天または粉末に基づくペレットなどの、前述の成分のいずれかの混合物も担体として企図される。製剤は、オオムギ、イネ、もしくは種子、植物部分、サトウキビバガス、穀物処理に由来する殻もしくは柄、建築現場廃物に由来する粉砕された植物材料もしくは木材、紙、織物、もしくは木材の再利用に由来するおが屑もしくは繊維片などの他の生物学的材料などの細菌の食料源を含んでもよい。
【０３５２】
例えば、肥料を使用して、成長促進または、種子、実生、もしくは植物への栄養素の供給を支援することができる。肥料の非限定的な例としては、窒素、リン、カリウム、カルシウム、硫黄、マグネシウム、ホウ素、塩化物、マンガン、鉄、亜鉛、銅、モリブデン、およびセレン（またはそれらの塩）が挙げられる。肥料のさらなる例としては、１またはそれを超えるアミノ酸、塩、炭水化物、ビタミン、グルコース、ＮａＣｌ、酵母抽出物、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、グリセロール、バリン、Ｌ−ロイシン、乳酸、プロピオン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸水素カリウム、キシロース、リキソース、およびレシチンが挙げられる。１つの実施形態では、製剤は、他の活性剤が物質（例えば、種子の表面）に結合するのを支援するために、粘着付与剤または粘着物質（接着剤と呼ばれる）を含み得る。そのような薬剤は、他の化合物（例えば、生物学的ではない調節剤）を含有することができる担体を細菌と組み合わせて、コーティング組成物を生成するために有用である。そのような組成物は、植物または種子の周囲にコーティングを作出して、微生物および他の薬剤と植物または植物部分との接触の維持を支援する。１つの実施形態では、粘着剤は、以下からなる群から選択される：アルギン酸塩、ゴム、デンプン、レシチン、ホルモノネチン、ポリビニルアルコール、アルカリホルモノネチネート、ヘスペレチン、ポリ酢酸ビニル、ケファリン、アラビアゴム、キサンタンガム、鉱油、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アラビノ−ガラクタン、メチルセルロース、ＰＥＧ４００、キトサン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリアクリロニトリル、グリセロール、トリエチレングリコール、酢酸ビニル、ジェランガム、ポリスチレン、ポリビニル、カルボキシメチルセルロース、ガッチゴム、およびポリオキシエチレン−ポリオキシブチレンブロックコポリマー。
【０３５３】
いくつかの実施形態では、粘着剤は、例えば、カルナウバろう、みつろう、中国ろう、セラックろう、鯨ろう、カンデリラろう、キャスターろう、オーリクリーろう、および米ぬかろうなどのろう、ポリサッカリド（例えばデンプン、デキストリン、マルトデキストリン、アルギン酸塩、およびキトサン）、脂肪、油、タンパク質（例えば、ゼラチンおよびゼイン）、アラビアガム、ならびにシェラックであり得る。接着剤は、天然に存在しない化合物、例えばポリマー、コポリマー、およびろうであり得る。例えば、接着剤として使用することができるポリマーの非限定的な例としては、以下が挙げられる：ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニルコポリマー、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールコポリマー、セルロース（例えば、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびカルボキシメチルセルロース）、ポリビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデンコポリマー、リグノスルホン酸カルシウム、アクリルコポリマー、ポリビニルアクリレート、ポリエチレンオキシド、アシルアミドポリマーおよびコポリマー、ポリヒドロキシエチルアクリレート、メチルアクリルアミドモノマー、ならびにポリクロロプレン。
【０３５４】
いくつかの例では、付着剤、抗真菌剤、成長制御剤、および農薬（例えば、殺虫剤）のうちの１つまたは複数は、天然に存在しない化合物（例えば、任意の組合せの）である。農業的に許容され得る担体のさらなる例としては、分散物質（例えば、ポリビニルピロリドン／ビニルアセテートＰＶＰＩＶＡ  Ｓ−６３０）、界面活性剤、結合剤、および充填剤が挙げられる。
【０３５５】
製剤は、界面活性剤を含むこともできる。界面活性剤の非限定的な例としては、Ｐｒｅｆｅｒ  ２８（Ｃｅｎｅｘ）、Ｓｕｒｆ−Ｎ（ＵＳ）、Ｉｎｈａｎｃｅ（Ｂｒａｎｄｔ）、Ｐ−２８（Ｗｉｌｆａｒｍ）、およびＰａｔｒｏｌ（Ｈｅｌｅｎａ）などの窒素−界面活性剤ブレンドが挙げられる；エステル化種子油としては、Ｓｕｎ−Ｉｔ  ＩＩ（ＡｍＣｙ）、ＭＳＯ（ＵＡＰ）、Ｓｃｏｉｌ（Ａｇｓｃｏ）、Ｈａｓｔｅｎ（Ｗｉｌｆａｒｍ）、およびＭｅｓ−１００（Ｄｒｅｘｅｌ）が挙げられる；有機シリコーン界面活性剤としては、Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ７７（ＵＡＰ）、Ｓｉｌｉｋｉｎ（Ｔｅｒｒａ）、Ｄｙｎｅ−Ａｍｉｃ（Ｈｅｌｅｎａ）、Ｋｉｎｅｔｉｃ（Ｈｅｌｅｎａ）、Ｓｙｌｇａｒｄ  ３０９（Ｗｉｌｂｕｒ−Ｅｌｌｉｓ）、およびＣｅｎｔｕｒｙ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）が挙げられる。１つの実施形態では、界面活性剤は、０．０１％ｖ／ｖ〜１０％ｖ／ｖの間の濃度で存在する。別の実施形態では、界面活性剤は、０．１％ｖ／ｖ〜１％ｖ／ｖの間の濃度で存在する。
【０３５６】
ある特定の場合では、製剤は、微生物安定剤を含む。そのような薬剤としては、乾燥剤として分類することができる任意の化合物または化合物の混合物を含むことができる乾燥剤を挙げることができ、化合物（複数可）は、液体接種物に対して実際に乾燥効果を有するような濃度で使用されるか否かを問わない。そのような乾燥剤は、理想的には、使用される細菌集団と適合性を有し、微生物集団が種子へと付与されても生存し、乾燥しても生存する能力を促進すると予想される。適切な乾燥剤の例としては、トレハロース、スクロース、グリセロール、およびメチレングリコールのうちの１つまたは複数が挙げられる。他の適切な乾燥剤としては、限定されないが、非還元糖および糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）が挙げられる。製剤に導入される乾燥剤の量は、重量／容積で約５％から約５０％まで、例えば、約１０％〜約４０％の間、約１５％〜約３５％の間、または約２０％〜約３０％の間の範囲であり得る。いくつかの場合では、製剤は、殺真菌剤、抗菌剤、除草剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物成長調節物質、殺鼠剤、殺菌剤、または栄養素などの薬剤を含有することが有利である。いくつかの例では、薬剤は、種子表面伝染性病原体から保護する保護剤を含んでもよい。いくつかの例では、保護剤は、いくらかのレベルで土壌伝染性病原体を調節することができる。いくつかの例では、保護剤は、主に種子表面で有効であり得る。
【０３５７】
いくつかの例では、殺真菌剤は、化学的かまたは生物学的かに関わらず、真菌の成長を阻害することができるか、真菌を死滅させることができる化合物または薬剤を含んでいてもよい。いくつかの例では、殺真菌剤は、静真菌性または殺真菌性であり得る化合物を含んでいてもよい。いくつかの例では、殺真菌剤は、保護剤であり得るか、主に種子表面で有効であり、種子表面伝染性病原体から保護し、いくらかのレベルで土壌伝染性病原体を調節する薬剤であってもよい。保護剤である殺真菌剤の非限定的な例としては、カプタン、マネブ、チラム、またはフルジオキソニルが挙げられる。
【０３５８】
いくつかの例では、殺真菌剤は、出芽中の実生に吸収され、宿主植物組織内部の真菌を阻害または死滅させることができる浸透移行性殺真菌剤であってもよい。種子処理に使用される浸透移行性殺真菌剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アゾキシストロビン、カルボキシン、メフェノキサム、メタラキシル、チアベンダゾール、トリフロキシストロビン、ならびにジフェノコナゾール、イプコナゾール、テブコナゾール、およびトリチコナゾールを含む種々のトリアゾール殺真菌剤。メフェノキサムおよびメタラキシルは、主に、水生カビ真菌ＰｙｔｈｉｕｍおよびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａを標的とするために使用される。病原性真菌種の感受性に微妙な差異があるため、または植物の殺真菌剤分布もしくは感受性に差異があるためのいずれかのため、植物種に応じて、ある殺真菌剤は、他の殺真菌剤よりも好ましい。いくつかの例では、殺真菌剤は、細菌または真菌などの生物学的制御因子であり得る。そのような生物は、病原性真菌に寄生性であってもよく、または真菌を死滅させるかもしくはそうでなければ真菌の成長を防止することができる毒素もしくは他の物質を分泌してもよい。任意のタイプの殺真菌剤、特に植物に対して一般に使用されるものを、種子組成物中の調節剤として使用することができる。
【０３５９】
いくつかの例では、種子コーティング組成物は、抗細菌特性を有する調節剤を含む。１つの実施形態では、抗細菌特性を有する調節剤は、本明細書中の他所に記載されている化合物から選択される。別の実施形態では、化合物は、ストレプトマイシン、オキシテトラサイクリン、オキソリン酸、またはゲンタマイシンである。種子コーティング組成物の一部分として使用することができる抗細菌化合物の他の例としては、ジクロロフェンおよびベンジルアルコールヘミホルマールに基づくもの（ＩＣＩのＰｒｏｘｅｌ（登録商標）またはＴｈｏｒ  ＣｈｅｍｉｅのＡｃｔｉｃｉｄｅ（登録商標）ＲＳ、およびＲｏｈｍ＆ＨａａｓのＫａｔｈｏｎ（登録商標）ＭＫ２５）、ならびにアルキルイソチアゾリノンおよびベンゾイソチアゾリノンなどのイソチアゾリノン誘導体に基づくもの（Ｔｈｏｒ  ＣｈｅｍｉｅのＡｃｔｉｃｉｄｅ（登録商標）ＭＢＳ）が挙げられる。
【０３６０】
いくつかの例では、成長制御因子は、以下からなる群から選択される：アブシジン酸、アミドクロル、アンシミドール、６−ベンジルアミノプリン、ブラシノリド、ブトラリン、クロルメコート（塩化クロルメコート）、塩化コリン、シクラニリド、ダミノジド、ジケグラック、ジメチピン、２，６−ジメチルプリジン、エテホン、フルメトラリン、フルルプリミドール、フルチアセト、フォルクロルフェヌロン、ジベレリン酸、イナベンフィド、インドール−３−酢酸、マレイン酸ヒドラジド、メフルイジド、メピクアト（塩化メピクアト）、ナフタレン酢酸、Ｎ−６−ベンジルアデニン、パクロブトラゾール、プロヘキサジオンホスホロトリチオエート、２，３，５−トリ−ヨード安息香酸、トリネキサパック−エチル、およびウニコナゾール。成長制御因子の追加の非限定的な例としては、ブラシノステロイド、サイトカイニン（ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｅ）（例えば、キネチンおよびゼアチン）、オーキシン（例えば、インドリル酢酸およびアスパラギン酸インドリルアセチル）、フラボノイドおよびイソフラボノイド（ｉｓｏｆｌａｖａｎｏｉｄ）（例えば、ホルモノネチンおよびジオスメチン）、フィトアレキシン（ｐｈｙｔｏａｉｘｉｎ）（例えば、グリセオリン）、およびフィトアレキシン誘導性オリゴ糖（例えば、ペクチン、キチン、キトサン、ポリガラクツロン酸（ｐｏｌｙｇａｌａｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、およびオリゴガラクツロン酸）、ならびにジベレリン（ｇｉｂｅｌｌｅｒｉｎ）が挙げられる。そのような薬剤は、理想的には、製剤が付与される農業用の種子または実生と適合性を有する（例えば、植物の成長または健康に有害であるべきではない）。さらに、薬剤は、理想的には、ヒト、動物、または工業使用に関して安全性の懸念を引き起こさないものである（例えば、安全性の問題がないか、または化合物は、十分に不安定であり、植物に由来する商品植物製品に含まれる化合物の量は無視できる程度である）。
【０３６１】
線虫拮抗性生物防除剤のいくつかの例としては、ＡＲＦ１８；３０  Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｓｐｐ．；Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ  ｓｐｐ．；Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ  ｓｐｐ．；Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．；Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．；Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．；Ｐｏｃｈｏｎｉａ  ｓｐｐ．；Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．；嚢状体−樹枝状体菌根菌、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ．；Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．；およびＲｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａが挙げられる。特に好ましい線虫拮抗性生物防除剤としては、ＡＲＦ１８、Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ、Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｇｌｏｂｏｓｕｍ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｎｅｍａ、Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ  ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ、Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ  ｐｉｓｃｉｐｈｉｌａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｖｉｘｅｎｓ、Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ  ｒｈｏｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔｅｎｓｉｓ、Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｌｅｃａｎｉｉ、Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｉ、Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｇｅｐｈｙｒｏｐａｇｕｍ、Ｍｙｒｏｔｅｈｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｌａｃｉｎｕｓ、Ｐｏｃｈｏｎｉａ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ、Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ  ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｅ、Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐｈａｓｅｏｌｉ、嚢状体−樹枝状体菌根菌、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｔｈｏｒｎｅｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｎｉｓｈｉｚａｗａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｒａｍｏｓａ、Ｐａｓｔｒｕｅｉａ  ｕｓａｇｅ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ菌株Ｇ４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、およびＲｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａが挙げられる。
【０３６２】
栄養素のいくつかの例は、窒素肥料（尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、無加圧窒素溶液、アンモニア水、無水アンモニア、チオ硫酸アンモニウム、硫黄被覆尿素、尿素−ホルムアルデヒド、ＩＢＤＵ、ポリマー被覆尿素、硝酸カルシウム、ウレアホルム、およびメチレン尿素が含まれるが、これらに限定されない）、リン肥料（リン酸二アンモニウム、リン酸一アンモニウム、ポリリン酸アンモニウム、濃縮過リン酸石灰、および重過リン酸石灰など）、およびカリ肥料（塩化カリウム、硫酸カリウム、硫酸カリウムマグネシウム、硝酸カリウムなど）からなる群から選択することができる。そのような組成物は、種子被膜組成物内の遊離塩またはイオンとして存在することができる。あるいは、栄養素／肥料は、経時的な持続放出を提供するように錯体化またはキレート化され得る。
【０３６３】
殺鼠剤のいくつかの例としては、２−イソバレリルインダン−１，３−ジオン、４−（キノキサリン−２−イルアミノ）ベンゼンスルホンアミド、アルファ−クロロヒドリン、リン化アルミニウム、ａｎｔｕ、酸化ヒ素、炭酸バリウム、ビスチオセミ、ブロジファコウム、ブロマジオロン、ブロメタリン、シアン化カルシウム、クロラロース、クロロファシノン、コレカルシフェロール、クマクロル、クマフリル、クマテトラリル、クリミジン、ジフェナコウム、ジフェチアロン、ジファシノン、エルゴカルシフェロール、フロクマフェン、フルオロアセトアミド、フルプロパジン、フルプロパジン塩酸酸、シアン化水素、ヨードメタン、リンダン、リン化マグネシウム、臭化メチル、ノルボルミド、ホサセチン、ホスフィン、リン、ピンドン、亜ヒ酸カリウム、ピリヌロン、シリロシド、亜砒酸ナトリウム、シアン化ナトリウム、フルオロ酢酸ナトリウム、ストリキニーネ、硫酸タリウム、ワルファリン、およびリン化亜鉛からなる物質の群から選択されるものを挙げることができる。
【０３６４】
液体形態、例えば、溶液または懸濁液では、細菌集団は、水または水溶液に混合または懸濁することができる。適切な液体希釈剤または担体としては、水、水溶液、石油蒸留物、または他の液体担体が挙げられる。
【０３６５】
固体組成物は、泥炭、コムギ、ふすま、バーミキュライト、粘土、タルク、ベントナイト、珪藻土、フラー土、および低温滅菌土などの適切に分割された固体担体内にまたは固体担体上に細菌集団を分散させることにより調製することができる。そのような製剤が水和性粉末として使用される場合、非イオン性、陰イオン性、両性、または陽イオン性の分散剤および乳化剤などの生物学的適合性を示す分散剤を使用することができる。
【０３６６】
製剤時に使用される固体担体としては、例えば、カオリン粘土、パイロフィライト、ベントナイト、モンモリロナイト、珪藻土、酸性白土、バーミキュライト、およびパーライトなどの鉱物担体、ならびに硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウム、および炭酸カルシウムなどの無機塩が挙げられる。また、小麦粉、小麦ふすま、および米ぬかなどの有機微細粉末を使用してもよい。液体担体としては、ダイズ油および綿実油などの植物油、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコールなどが挙げられる。
【０３６７】
有害生物
本明細書中に教示の任意の微生物を含み得る本開示の農業組成物は、時折、１またはそれを超える農薬と組み合わせられる。
【０３６８】
本開示の微生物と組み合わせられる農薬は、下記の任意の有害生物を標的にし得る。
【０３６９】
「有害生物」としては、限定されないが、昆虫、真菌、細菌、線虫、コダニ、およびマダニなどが挙げられる。害虫としては、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ  Ｏｒｔｈｒｏｐｔｅｒａ、Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ、Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ、Ｉｓｏｐｔｅｒａ、Ａｎｏｐｌｕｒａ、Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａなど、特に、ＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａおよびＣｏｌｅｏｐｔｅｒａの目から選択される昆虫が挙げられる。
【０３７０】
当業者は、全ての化合物が全ての有害生物に同様に有効なわけではないことを認識するであろう。本開示の微生物と組み合わせることができる化合物は、害虫に活性を示すことができ、害虫としては、経済的に重要な農学、森林、温室、苗畑の観賞植物、食物および繊維、公衆衛生および動物衛生、家庭用および商業用の構造物、家庭用品および貯蔵製品の有害生物が挙げられ得る。
【０３７１】
前述のように、本開示の農業組成物（本明細書中に教示の任意の微生物を含み得る）を、実施形態で、１またはそれを超える農薬と組み合わせる。これらの農薬は、以下の有害生物のうちのいずれかに対して活性であり得る：
【０３７２】
Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の幼虫としては、制限されないが、Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ科のヨトウムシ、ネキリムシ、シャクトリムシ、およびタバコガ：Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｊ  Ｅ  Ｓｍｉｔｈ（ツマジロクサヨトウ）；Ｓ．ｅｘｉｇｕａ  Ｈｕｂｎｅｒ（シロイチモンジョトウ）；Ｓ．ｌｉｔｕｒａ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（ハスモンヨトウ（ｔｏｂａｃｃｏ  ｃｕｔｗｏｒｍ）、ハスモンヨトウ（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ  Ｗａｌｋｅｒ（ベルタアーミーワーム）；Ｍ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（コナガ）；Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ  Ｈｕｆｎａｇｅｌ（タマナヤガ）；Ａ．ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（ウェスタンカットワーム）；Ａ．ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（グラニュレートカットワーム）；Ａｌａｂａｍａ  ａｒｇｉｌｌａｃｅａ  Ｈｕｂｎｅｒ（コットンリーフワーム）；Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ  Ｈｕｂｎｅｒ（キャベツシャクトリムシ）；Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ  Ｗａｌｋｅｒ（ソイビーンルーパー）；Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ  Ｈｕｂｎｅｒ（ハッショウマメイモムシ）；Ｈｙｐｅｎａ  ｓｃａｂｒａ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（グリーンクローバーワーム）；Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（オオタバコガ幼虫）；Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ  Ｈａｗｏｒｔｈ（ヨトウムシ）；Ａｔｈｅｔｉｓ  ｍｉｎｄａｒａ  Ｂａｒｎｅｓ  ａｎｄ  Ｍｃｄｕｎｎｏｕｇｈ（ラフスキンドカットワーム）；Ｅｕｘｏａ  ｍｅｓｓｏｒｉａ  Ｈａｒｒｉｓ（ダークサイディッドカットワーム）；Ｅａｒｉａｓ  ｉｎｓｕｌａｎａ  Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ（スピニーボールワーム）；Ｅ．ｖｉｔｔｅｌｌａ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（スポッテドボールワーム）；Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ  Ｈｕｂｎｅｒ（オオタバコガ）；Ｈ．ｚｅａ  Ｂｏｄｄｉｅ（アメリカタバコガまたはコットンボールワーム）；Ｍｅｌａｎｃｈｒａ  ｐｉｃｔａ  Ｈａｒｒｉｓ（ゼブラキャタピラー）；Ｅｇｉｒａ（Ｘｙｌｏｍｙｇｅｓ）ｃｕｒｉａｌｉｓ  Ｇｒｏｔｅ（シトラスカットワーム）；Ｐｙｒａｌｉｄａｅ科由来の穿孔動物、ケースベアラー、ウェブワーム、コーンワーム、およびスケルトナイザー：Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ  Ｈｕｂｎｅｒ（セイヨウアワノメイガ）；Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ  Ｗａｌｋｅｒ（ネーブルオレンジワーム（ｎａｖａｌ  ｏｒａｎｇｅｗｏｒｍ））；Ａｎａｇａｓｔａ  ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ  Ｚｅｌｌｅｒ（スジコナマダラメイガ）；Ｃａｄｒａ  ｃａｕｔｅｌｌａ  Ｗａｌｋｅｒ（アーモンドモス）；Ｃｈｉｌｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ  Ｗａｌｋｅｒ（ニカメイガ）；Ｃ．ｐａｒｔｅｌｌｕｓ、（ソルガムボーラー）；Ｃｏｒｃｙｒａ  ｃｅｐｈａｌｏｎｉｃａ  Ｓｔａｉｎｔｏｎ（ライスモス）；Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ  Ｃｌｅｍｅｎｓ（コーンルートウェブワーム）；Ｃ．ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ  Ｚｉｎｃｋｅｎ（シバツトガ）；Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ  ｍｅｄｉｎａｌｉｓ  Ｇｕｅｎｅｅ（��ネタテハマキ）；Ｄｅｓｍｉａ  ｆｕｎｅｒａｌｉｓ  Ｈｕｂｎｅｒ（グレープリーフフォールダー）；Ｄｉａｐｈａｎｉａ  ｈｙａｌｉｎａｔａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（メロンワーム）；Ｄ．ｎｉｔｉｄａｌｉｓ  Ｓｔｏｌｌ（ピックルワーム）；Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ  Ｄｙａｒ（サウスウェスタンコーンボーラー）、Ｄ．ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（サトウキビメイガ）；Ｅｏｒｅｕｍａ  ｌｏｆｔｉｎｉ  Ｄｙａｒ（メキシカンライスボーラー）；Ｅｐｈｅｓｔｉａ  ｅｌｕｔｅｌｌａ  Ｈｕｂｎｅｒ（タバコ（カカオ）モス）；Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（オオハチミツガ）；Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ  Ｗａｌｋｅｒ（ソッドウェブワーム）；Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ  ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ  Ｈｕｌｓｔ（サンフラワーモス）；Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ  Ｚｅｌｌｅｒ（モロコシマダラメイガ）；Ａｃｈｒｏｉａ  ｇｒｉｓｅｌｌａ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（レサーワックスモス）；Ｌｏｘｏｓｔｅｇｅ  ｓｔｉｃｔｉｃａｌｉｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ビートウェブワーム）；Ｏｒｔｈａｇａ  ｔｈｙｒｉｓａｌｉｓ  Ｗａｌｋｅｒ（ティーツリーウェブモス）；Ｍａｒｕｃａ  ｔｅｓｔｕｌａｌｉｓ  Ｇｅｙｅｒ（ビーンポッドボーラー）；Ｐｌｏｄｉａ  ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ  Ｈｕｂｎｅｒ（ノシメマダラメイガ）；Ｓｃｉｒｐｏｐｈａｇａ  ｉｎｃｅｒｔｕｌａｓ  Ｗａｌｋｅｒ（イエローステムボーラー）；Ｕｄｅａ  ｒｕｂｉｇａｌｉｓ  Ｇｕｅｎｅｅ（セロリリーフタイヤー）；ならびに以下のＴｏｒｔｒｉｃｉｄａｅ科のハマキムシ、アオムシ、種子蠕虫、および果実蠕虫：Ａｃｌｅｒｉｓ  ｇｌｏｖｅｒａｎａ  Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ（ウェスタンブラックヘディッドバッドワーム）；Ａ．ｖａｒｉａｎａ  Ｆｅｒｎａｌｄ（イースタンブラックヘディッドバッドワーム）；Ａｒｃｈｉｐｓ  ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ  Ｗａｌｋｅｒ（フルーツツリーリーフローラー）；Ａ．ｒｏｓａｎａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ヨーロピアンリーフローラー）；および他のＡｒｃｈｉｐｓ種、Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ  ｏｒａｎａ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｖｏｎ  Ｒｏｓｓｌｅｒｓｔａｍｍ（サマーフルーツハマキガ）；Ｃｏｃｈｙｌｉｓ  ｈｏｓｐｅｓ  Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ（バンディットサンフラワーモス）；Ｃｙｄｉａ  ｌａｔｉｆｅｒｒｅａｎａ  Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ（フィルバートワーム）；Ｃ．ｐｏｍｏｎｅｌｌａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（コドリンガ（ｃｏｌｄｉｎｇ  ｍｏｔｈ））；Ｐｌａｔｙｎｏｔａ  ｆｌａｖｅｄａｎａ  Ｃｌｅｍｅｎｓ（バリアゲイティドリーフローラー）；Ｐ．ｓｔｕｌｔａｎａ  Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ（オムニボラスリーフローラー）；Ｌｏｂｅｓｉａ  ｂｏｔｒａｎａ  Ｄｅｎｉｓ  ＆  Ｓｃｈｉｆｆｅｒｍｕｌｌｅｒ（ヨーロピアングレープバインモス）；Ｓｐｉｌｏｎｏｔａ  ｏｃｅｌｌａｎａ  Ｄｅｎｉｓ  ＆  Ｓｃｈｉｆｆｅｒｍｕｌｌｅｒ（アイスポッティッドバッドモス）；Ｅｎｄｏｐｉｚａ  ｖｉｔｅａｎａ  Ｃｌｅｍｅｎｓ（グレープベリーモス）；Ｅｕｐｏｅｃｉｌｉａ  ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ  Ｈｕｂｎｅｒ（バインモス）；Ｂｏｎａｇｏｔａ  ｓａｌｕｂ��ｉｃｏｌａ  Ｍｅｙｒｉｃｋ（ブラジリアンアップルリーフローラー）；Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ  ｍｏｌｅｓｔａ  Ｂｕｓｃｋ（ナシノヒメシンクイ）；Ｓｕｌｅｉｍａ  ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ  Ｒｉｌｅｙ（サンフラワーバッドモス）；Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ  ｓｐｐ．；Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｓｐｐ．が挙げられる。
【０３７３】
Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目で選択される他の農学有害生物としては、制限されないが、Ａｌｓｏｐｈｉｌａ  ｐｏｍｅｔａｒｉａ  Ｈａｒｒｉｓ（フォールカンカーワーム）；Ａｎａｒｓｉａ  ｌｉｎｅａｔｅｌｌａ  Ｚｅｌｌｅｒ（ピーチツウィッグボーラー）；Ａｎｉｓｏｔａ  ｓｅｎａｔｏｒｉａ  Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ（オレンジストライプドオークワーム）；Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ  Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ（チャイニーズオークタッサーモス）；Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（カイコ）；Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ  ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ  Ｂｕｓｃｋ（コットンリーフパーフォレイター）；Ｃｏｌｉａｓ  ｅｕｒｙｔｈｅｍｅ  Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ（アルファルファキャタピラー）；Ｄａｔａｎａ  ｉｎｔｅｇｅｒｒｉｍａ  Ｇｒｏｔｅ  ＆  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（ウォルナットキャタピラー）；Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ  Ｔｓｃｈｅｔｗｅｒｉｋｏｖ（シベリアンシルクモス）、Ｅｎｎｏｍｏｓ  ｓｕｂｓｉｇｎａｒｉａ  Ｈｕｂｎｅｒ（エルムスパンワーム）；Ｅｒａｎｎｉｓ  ｔｉｌｉａｒｉａ  Ｈａｒｒｉｓ（リンデンシャクトリムシ）；Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ  ｃｈｒｙｓｏｒｒｈｏｅａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（シロバネドクガ）；Ｈａｒｒｉｓｉｎａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ  Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ（グレープリーフスケルトナイザー）；Ｈｅｍｉｌｅｕｃａ  ｏｌｉｖｉａｅ  Ｃｏｃｋｒｅｌｌ（レンジキャタピラー）；Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ  ｃｕｎｅａ  Ｄｒｕｒｙ（アメリカシロヒトリ）；Ｋｅｉｆｅｒｉａ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｅｌｌａ  Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ（トマトピンワーム）；Ｌａｍｂｄｉｎａ  ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ  ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ  Ｈｕｌｓｔ（イースタンヘムロックルーパー）；Ｌ．ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ  ｌｕｇｕｂｒｏｓａ  Ｈｕｌｓｔ（ウェスタンヘムロックルーパー）；Ｌｅｕｃｏｍａ  ｓａｌｉｃｉｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（サテンモス）；Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（マイマイガ）；Ｍａｎｄｕｃａ  ｑｕｉｎｑｕｅｍａｃｕｌａｔａ  Ｈａｗｏｒｔｈ（ファイブスポッティッドホークモス、トマトホーンワーム）；Ｍ．ｓｅｘｔａ  Ｈａｗｏｒｔｈ（トマトホーンワーム（ｔｏｍａｔｏ  ｈｏｍｗｏｒｍ）、タバコホーンワーム）；Ｏｐｅｒｏｐｈｔｅｒａ  ｂｒｕｍａｔａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ウインターモス）；Ｐａｌｅａｃｒｉｔａ  ｖｅｒｎａｔａ  Ｐｅｃｋ（スプリングカンカーワーム）；Ｐａｐｉｌｉｏ  ｃｒｅｓｐｈｏｎｔｅｓ  Ｃｒａｍｅｒ（ジャイアントスワローテールオレンジドッグ）；Ｐｈｒｙｇａｎｉｄｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  Ｐａｃｋａｒｄ（カリフォルニアオークワーム）；Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａ  Ｓｔａｉｎｔｏｎ（ミカンハモグリガ）；Ｐｈｙｌｌｏｎｏｒｙｃｔｅｒ  ｂｌａｎｃａｒｄｅｌｌａ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（スポッティッドテンチフォームリーフマイナー）；Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ラージホワイトバタフライ）；Ｐ．ｒａｐａｅ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（スモールホワイトバタフライ）；Ｐ．ｎａｐｉ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（グリーンべインドホワイトバタフライ）；Ｐｌａｔｙｐｔｉｌｉａ  ｃａｒｄｕｉｄａｃｔｙｌａ  Ｒｉｌｅｙ（アーティチョークプルームモス）；Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（コナガ）；Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ（ピンクボールワーム）；Ｐｏｎｔｉａ  ｐｒｏｔｏｄｉｃｅ  Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ  ａｎｄ  Ｌｅｃｏｎｔｅ（サザンキャベツワーム）；Ｓａｂｕｌｏｄｅｓ  ａｅｇｒｏｔａｔａ  Ｇｕｅｎｅｅ（オムニボラスルーパー）；Ｓｃｈｉｚｕｒａ  ｃｏｎｃｉｎｎａ  Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ（レッドハンプドキャタピラー）；Ｓｉｔｏｔｒｏｇａ  ｃｅｒｅａｌｅｌｌａ  Ｏｌｉｖｉｅｒ（アングモアグレインモス）；Ｔｈａｕｍｅｔｏｐｏｅａ  ｐｉｔｙｏｃａｍｐａ  Ｓｃｈｉｆｆｅｒｍｕｌｌｅｒ（パインプロセショナリーキャタピラー）；Ｔｉｎｅｏｌａ  ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ  Ｈｕｍｍｅｌ（ウェビングクローズモス）；Ｔｕｔａ  ａｂｓｏｌｕｔａ  Ｍｅｙｒｉｃｋ（トマトキバガ）；Ｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ  ｐａｄｅｌｌａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（アーミンモス）；Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｓｕｂｆｌｅｘａ  Ｇｕｅｎｅｅ；Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．およびＯｒｇｙｉａ  ｓｐｐ．；Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ（セイヨウアワノメイガ）；タネバエ；Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ（タマナヤガ）が挙げられる。
【０３７４】
Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目の幼虫および成虫としては、Ａｎｔｈｒｉｂｉｄａｅ科、Ｂｒｕｃｈｉｄａｅ科、およびＣｕｒｃｕｌｉｏｎｉｄａｅ科由来のゾウムシ（制限されないが、以下が挙げられる：Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ  Ｂｏｈｅｍａｎ（ワタミハナゾウムシ）；Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ  ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ  Ｋｕｓｃｈｅｌ（イネミズゾウムシ）；Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｇｒａｎａｒｉｕｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（グラナリアコクゾウムシ）；Ｓ．ｏｒｙｚａｅ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ココクゾウムシ）；Ｈｙｐｅｒａ  ｐｕｎｃｔａｔａ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（クローバーリーフウィービル）；Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｏｐｔｕｒｕｓ  ａｄｓｐｅｒｓｕｓ  ＬｅＣｏｎｔｅ（サンフラワーステムウィービル）；Ｓｍｉｃｒｏｎｙｘ  ｆｕｌｖｕｓ  ＬｅＣｏｎｔｅ（レッドサンフラワーシードウィービル）；Ｓ．ｓｏｒｄｉｄｕｓ  ＬｅＣｏｎｔｅ（グレイサンフラワーシードウィービル）；Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ  ｍａｉｄｉｓ  Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ（メイズビルバグ））；Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ科のノミハムシ、キューカンバービートル、ルートワーム、ハムシ、ジャガイモハムシ、およびハモグリムシ（制限されないが、以下が挙げられる：Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ  Ｓａｙ（コロラドハムシ）；Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ＬｅＣｏｎｔｅ（ウェスタンコーンルートワーム）；Ｄ．ｂａｒｂｅｒｉ  Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ（ノーザンコーンルートワーム）；Ｄ．ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ  Ｂａｒｂｅｒ（サザンコーンルートワーム）；Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ  ｐｕｌｉｃａｒｉａ  Ｍｅｌｓｈｅｉｍｅｒ（ミノハムシ）；Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ  Ｇｏｅｚｅ（クルシファーフリービートル）；Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｓｔｒｉｏｌａｔａ（キスジノミハムシ）；Ｃｏｌａｓｐｉｓ  ｂｒｕｎｎｅａ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（グレープコラスピス）；Ｏｕｌｅｍａ  ｍｅｌａｎｏｐｕｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（クビアカクビボソハムシ）；Ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ  ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（サンフラワービートル））；Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅ科由来のビートル（制限されないが、以下が挙げられる：Ｅｐｉｌａｃｈｎａ  ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ  Ｍｕｌｓａｎｔ（メキシカンビーンビートル））；Ｓｃａｒａｂａｅｉｄａｅ科由来のコガネムシおよび他のビートル（制限されないが、以下が挙げられる：Ｐｏｐｉｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｎｅｗｍａｎ（マメコガネ）；Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ  ｂｏｒｅａｌｉｓ  Ａｒｒｏｗ（ノーザンマスクドチェイファー、ホワイトグラブ）；Ｃ．ｉｍｍａｃｕｌａｔａ  Ｏｌｉｖｉｅｒ（サザンマスクドチェイファー、ホワイトグラブ）；Ｒｈｉｚｏｔｒｏｇｕｓ  ｍａｊａｌｉｓ  Ｒａｚｏｕｍｏｗｓｋｙ（ヨーロピアンチェイファー）；Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ  ｃｒｉｎｉｔａ  Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ（ホワイトグラブ）；Ｌｉｇｙｒｕｓ  ｇｉｂｂｏｓｕｓ  Ｄｅ  Ｇｅｅｒ（キャロットビートル））；Ｄｅｒｍｅｓｔｉｄａｅ科由来のカーペットビートル；Ｅｌａｔｅｒｉｄａｅ科由来のコメツキムシ：Ｅｌｅｏｄｅｓ  ｓｐｐ．、Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ  ｓｐｐ．；Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ  ｓｐｐ．；Ｌｉｍｏｎｉｕｓ  ｓｐｐ．；Ａｇｒｉｏｔｅｓ  ｓｐｐ．；Ｃｔｅｎｉｃｅｒａ  ｓｐｐ．；Ａｅｏｌｕｓ  ｓｐｐ．；Ｓｃｏｌｙｔｉｄａｅ科由来のキクイムシおよびＴｅｎｅｂｒｉｏｎｉｄａｅ科由来のビートル；Ｃｅｒｏｔｏｍａ  ｔｒｉｆｕｒｃａｔｅ（ビーンリーフビートル）；ならびにコメツキムシが挙げられる。
【０３７５】
Ｄｉｐｔｅｒａ目の成体および幼体としては、ハモグリムシＡｇｒｏｍｙｚａ  ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ  Ｌｏｅｗ（コーンブロッチリーフマイナー）；小昆虫（制限されないが、以下が挙げられる：Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ  ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ  Ｃｏｑｕｉｌｌｅｔｔ（ソルガムミッジ）；Ｍａｙｅｔｉｏｌａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ  Ｓａｙ（ヘシアンバエ）；Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ  ｍｏｓｅｌｌａｎａ  Ｇｅｈｉｎ（ムギアカタマバエ）；Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ  ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ  Ｆｅｌｔ、（サンフラワーシードミッジ））；ミバエ（Ｔｅｐｈｒｉｔｉｄａｅ）、Ｏｓｃｉｎｅｌｌａ  ｆｒｉｔ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ミバエ）；ウジ（制限されないが、以下が挙げられる：Ｄｅｌｉａ  ｐｌａｔｕｒａ  Ｍｅｉｇｅｎ（タネバエ）；Ｄ．ｃｏａｒｃｔａｔａ  Ｆａｌｌｅｎ（ウィートバルブフライ）、および他のＤｅｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｍｅｒｏｍｙｚａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ  Ｆｉｔｃｈ（ムギキモグリバエ）；Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（イエバエ）；Ｆａｎｎｉａ  ｃａｎｉｃｕｌａｒｉｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ、Ｆ．ｆｅｍｏｒａｌｉｓ  Ｓｔｅｉｎ（ヒメイエバエ）；Ｓｔｏｍｏｘｙｓ  ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（サシバエ））；フェイスフライ、ノサシバエ、ホホアカクロバエ、Ｃｈｒｙｓｏｍｙａ  ｓｐｐ．；Ｐｈｏｒｍｉａ  ｓｐｐ．および他のマスコイドフライペスト、ウマバエＴａｂａｎｕｓ  ｓｐｐ．；ボットフライ  Ｇａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．；Ｏｅｓｔｒｕｓ  ｓｐｐ．；ウシバエＨｙｐｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．；メクラアブＣｈｒｙｓｏｐｓ  ｓｐｐ．；Ｍｅｌｏｐｈａｇｕｓ  ｏｖｉｎｕｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ヒツジシラミバエ）および他のＢｒａｃｈｙｃｅｒａ、カＡｅｄｅｓ  ｓｐｐ．；Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｐｐ．；Ｃｕｌｅｘ  ｓｐｐ．；ブユＰｒｏｓｉｍｕｌｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｓｉｍｕｌｉｕｍ  ｓｐｐ．；ヌカカ、スナバエ、シアリド、および他のＮｅｍａｔｏｃｅｒａが挙げられる。
【０３７６】
制限されないが、以下などのＨｅｍｉｐｔｅｒａ目およびＨｏｍｏｐｔｅｒａ目の成虫および若虫：Ａｄｅｌｇｉｄａｅ科由来のカサアブラムシ、Ｍｉｒｉｄａｅ科由来のプラントバグ、Ｃｉｃａｄｉｄａｅ科由来のセミ、ヨコバイ、Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｓｐｐ．；Ｃｉｃａｄｅｌｌｉｄａｅ科由来、Ｃｉｘｉｉｄａｅ科、Ｆｌａｔｉｄａｅ科、Ｆｕｌｇｏｒｏｉｄｅａ科、Ｉｓｓｉｄａｅ科、およびＤｅｌｐｈａｃｉｄａｅ科由来のプラントホッパー、Ｍｅｍｂｒａｃｉｄａｅ科由来のツノゼミ、Ｐｓｙｌｌｉｄａｅ科由来のサイリッド、Ａｌｅｙｒｏｄｉｄａｅ科由来のコナジラミ、Ａｐｈｉｄｉｄａｅ科由来のアブラムシ、Ｐｈｙｌｌｏｘｅｒｉｄａｅ科由来のネアブラムシ、Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｉｄａｅ科由来のコナカイガラムシ、Ａｓｔｅｒｏｌｅｃａｎｉｄａｅ科、Ｃｏｃｃｉｄａｅ科、Ｄａｃｔｙｌｏｐｉｉｄａｅ科、Ｄｉａｓｐｉｄｉｄａｅ科、Ｅｒｉｏｃｏｃｃｉｄａｅ科、Ｏｒｔｈｅｚｉｉｄａｅ科、Ｐｈｏｅｎｉｃｏｃｏｃｃｉｄａｅ科、およびＭａｒｇａｒｏｄｉｄａｅ科由来のカイガラムシ、Ｔｉｎｇｉｄａｅ科由来のグンバイムシ、Ｐｅｎｔａｔｏｍｉｄａｅ科由来のカメムシ、シンチバグ、Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｓｐｐ．；およびＬｙｇａｅｉｄａｅ科由来の他のシードバグ、Ｃｅｒｃｏｐｉｄａｅ科由来のアワフキムシ、Ｃｏｒｅｉｄａｅ科由来のスカッシュバグ、ならびにＰｙｒｒｈｏｃｏｒｉｄａｅ科由来のツツガムシおよびコットンステイナー。
【０３７７】
Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ目由来の農学的に重要なメンバーとしては、限定されないが、以下がさらに挙げられる：Ａｃｙｒｔｈｉｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ  Ｈａｒｒｉｓ（エンドウヒゲナガアブラムシ）；Ａｐｈｉｓ  ｃｒａｃｃｉｖｏｒａ  Ｋｏｃｈ（マメアブラムシ）；Ａ．ｆａｂａｅ  Ｓｃｏｐｏｌｉ（マメクロアブラムシ）；Ａ．ｇｏｓｓｙｐｉｉ  Ｇｌｏｖｅｒ（ワタアブラムシ、メロンアフィッド）；Ａ．ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ  Ｆｏｒｂｅｓ（コットンルートアフィッド）；Ａ．ｐｏｍｉ  Ｄｅ  Ｇｅｅｒ（アップルアフィッド）；Ａ．ｓｐｉｒａｅｃｏｌａ  Ｐａｔｃｈ（スパイリアアフィッド）；Ａｕｌａｃｏｒｔｈｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  Ｋａｌｔｅｎｂａｃｈ（フォックスグラブアフィッド）；Ｃｈａｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ｆｒａｇａｅｆｏｌｉｉ  Ｃｏｃｋｅｒｅｌｌ（ストロベリーアフィッド）；Ｄｉｕｒａｐｈｉｓ  ｎｏｘｉａ  Ｋｕｒｄｊｕｍｏｖ／Ｍｏｒｄｖｉｌｋｏ（ロシアンウィートアフィッド）；Ｄｙｓａｐｈｉｓ  ｐｌａｎｔａｇｉｎｅａ  Ｐａａｓｅｒｉｎｉ（ロージーアップルアフィッド）；Ｅｒｉｏｓｏｍａ  ｌａｎｉｇｅｒｕｍ  Ｈａｕｓｍａｎｎ（ウーリーアップルアフィッド）；Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ダイコンアブラムシ）；Ｈｙａｌｏｐｔｅｒｕｓ  ｐｒｕｎｉ  Ｇｅｏｆｆｒｏｙ（ミーリープラムアフィッド）；Ｌｉｐａｐｈｉｓ  ｅｒｙｓｉｍｉ  Ｋａｌｔｅｎｂａｃｈ（ニセダイコンアブラムシ）；Ｍｅｔｏｐｏｌｏｐｈｉｕｍ  ｄｉｒｒｈｏｄｕｍ  Ｗａｌｋｅｒ（シリアルアフィッド）；Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ  ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ  Ｔｈｏｍａｓ（ポテトアフィッド）；Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ  Ｓｕｌｚｅｒ（ピーチポテトアフィッド、グリーンピーチアフィッド）；Ｎａｓｏｎｏｖｉａ  ｒｉｂｉｓｎｉｇｒｉ  Ｍｏｓｌｅｙ（レタスアフィッド）；Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ  ｓｐｐ．（ルートアフィッドおよびゴールアフィッド）；Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｍａｉｄｉｓ  Ｆｉｔｃｈ（トウモロコシアブラムシ）；Ｒ．ｐａｄｉ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（バードチェリーオートアフィッド）；Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ  ｇｒａｍｉｎｕｍ  Ｒｏｎｄａｎｉ（グリーンバグ）；Ｓｉｐｈａ  ｆｌａｖａ  Ｆｏｒｂｅｓ（イエローシュガーケーンアフィッド）；Ｓｉｔｏｂｉｏｎ  ａｖｅｎａｅ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（イングリッシュグレインアフィッド）；Ｔｈｅｒｉｏａｐｈｉｓ  ｍａｃｕｌａｔａ  Ｂｕｃｋｔｏｎ（スポッティッドアルファアフィッド）；Ｔｏｘｏｐｔｅｒａ  ａｕｒａｎｔｉｉ  Ｂｏｙｅｒ  ｄｅ  Ｆｏｎｓｃｏｌｏｍｂｅ（コミカンアブラムシ）およびＴ．ｃｉｔｒｉｃｉｄａ  Ｋｉｒｋａｌｄｙ（ブラウンシトラスアフィッド）；Ｍｅｌａｎａｐｈｉｓ  ｓａｃｃｈａｒｉ（シュガーケーンアフィッド）；Ａｄｅｌｇｅｓ  ｓｐｐ．（カサアブラムシ）；Ｐｈｙｌｌｏｘｅｒａ  ｄｅｖａｓｔａｔｒｉｘ  Ｐｅｒｇａｎｄｅ（ペカンフィロキセラ）；Ｂｅｍｉｓｉａ  ｔａｂａｃｉ  Ｇｅｎｎａｄｉｕｓ（タバコホワイトフライ、スイートポテトホワイトフライ）；Ｂ．ａｒｇｅｎｔｉｆｏｌｉｉ  Ｂｅｌｌｏｗｓ  ＆  Ｐｅｒｒｉｎｇ（シルバーリーフホワイトフライ）；Ｄｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ｃｉｔｒｉ  Ａｓ��ｍｅａｄ（シトラスホワイトフライ）；Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ａｂｕｔｉｌｏｎｅｕｓ（バンデッドウイングドホワイトフライ）およびＴ．ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍ  Ｗｅｓｔｗｏｏｄ（グリーンハウスホワイトフライ）；Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ  Ｈａｒｒｉｓ（ポテトリーフホッパー）；Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ  ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ  Ｆａｌｌｅｎ（スモーラーブラウンプラントホッパー）；Ｍａｃｒｏｌｅｓｔｅｓ  ｑｕａｄｒｉｌｉｎｅａｔｕｓ  Ｆｏｒｂｅｓ（アスターリーフホッパー）；Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｔｉｃｅｐｓ  Ｕｈｌｅｒ（グリーンリーフホッパー）；Ｎ．ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ  Ｓｔａｌ（ライスリーフホッパー）；Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ  ｌｕｇｅｎｓ  Ｓｔａｌ（ブラウンプラントホッパー）；Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ  ｍａｉｄｉｓ  Ａｓｈｍｅａｄ（トウモロコシウンカ）；Ｓｏｇａｔｅｌｌａ  ｆｕｒｃｉｆｅｒａ  Ｈｏｒｖａｔｈ（セジロウンカ）；Ｓｏｇａｔｏｄｅｓ  ｏｒｉｚｉｃｏｌａ  Ｍｕｉｒ（ライスデルファシド）；Ｔｙｐｈｌｏｃｙｂａ  ｐｏｍａｒｉａ  ＭｃＡｔｅｅ（ホワイトアップルリーフホッパー）；Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｏｕｒａ  ｓｐｐ．（グレープリーフホッパー）；Ｍａｇｉｃｉｃａｄａ  ｓｅｐｔｅｎｄｅｃｉｍ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（周期ゼミ）；Ｉｃｅｒｙａ  ｐｕｒｃｈａｓｉ  Ｍａｓｋｅｌｌ（イセリアカイガラムシ）；Ｑｕａｄｒａｓｐｉｄｉｏｔｕｓ  ｐｅｒｎｉｃｉｏｓｕｓ  Ｃｏｍｓｔｏｃｋ（サンホセカイガラムシ）；Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｉｔｒｉ  Ｒｉｓｓｏ（シトラスミーリーバグ）；Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．（他のミーリーバグ複合物）；Ｃａｃｏｐｓｙｌｌａ  ｐｙｒｉｃｏｌａ  Ｆｏｅｒｓｔｅｒ（ペアシラ）；Ｔｒｉｏｚａ  ｄｉｏｓｐｙｒｉ  Ａｓｈｍｅａｄ（カキノキキジラミ）。
【０３７８】
Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ目由来の種としては、制限されないが、以下が含まれる：Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ  Ｓａｙ（グリーンスティンクバグ）；Ａｎａｓａ  ｔｒｉｓｔｉｓ  Ｄｅ  Ｇｅｅｒ（スカッシュバグ）；Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  Ｓａｙ（チンチバグ）；Ｃｏｒｙｔｈｕｃａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（コットンレースバグ）；Ｃｙｒｔｏｐｅｌｔｉｓ  ｍｏｄｅｓｔａ  Ｄｉｓｔａｎｔ（トマトバグ）；Ｄｙｓｄｅｒｃｕｓ  ｓｕｔｕｒｅｌｌｕｓ  Ｈｅｒｒｉｃｈ−Ｓｃｈａｆｆｅｒ（コットンステイナー）；Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｓｅｒｖｕｓ  Ｓａｙ（ブラウンスティングバグ）；Ｅ．ｖａｒｉｏｌａｒｉｕｓ  Ｐａｌｉｓｏｔ  ｄｅ  Ｂｅａｕｖａｉｓ（ワンスポッティッドスティンクバグ）；Ｇｒａｐｔｏｓｔｅｔｈｕｓ  ｓｐｐ．（シードバグの複合物）；Ｌｅｐｔｏｇｌｏｓｓｕｓ  ｃｏｒｃｕｌｕｓ  Ｓａｙ（リーフフッテッドパインシードバグ）；Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ  Ｐａｌｉｓｏｔ  ｄｅ  Ｂｅａｕｖａｉｓ（ターニッシュドプラントバグ）；Ｌ．Ｈｅｓｐｅｒｕｓ  Ｋｎｉｇｈｔ（ウェスタンターニッシュドプラントバグ）；Ｌ．ｐｒａｔｅｎｓｉｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（コモンメドウバグ）；Ｌ．ｒｕｇｕｌｉｐｅｎｎｉｓ  Ｐｏｐｐｉｕｓ（ヨーロピアンターニッシュドプラントバグ）；Ｌｙｇｏｃｏｒｉｓ  ｐａｂｕｌｉｎｕｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（コモングリーンキャプシド）；Ｎｅｚａｒａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（サザングリーンスティンクバグ）；Ｏｅｂａｌｕｓ  ｐｕｇｎａｘ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（イネカメムシ）；Ｏｎｃｏｐｅｌｔｕｓ  ｆａｓｃｉａｔｕｓ  Ｄａｌｌａｓ（ラージミルクウィードバグ）；Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ  ｓｅｒｉａｔｕｓ  Ｒｅｕｔｅｒ（コットンフリーホッパー）。
【０３７９】
Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ（Ｃａｌｏｃｏｒｉｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  Ｇｍｅｌｉｎ（ストロベリーバグ）；Ｏｒｔｈｏｐｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ；Ｐｌｅｓｉｏｃｏｒｉｓ  ｒｕｇｉｃｏｌｌｉｓ  Ｆａｌｌｅｎ（アップルキャプシド）；Ｃｙｒｔｏｐｅｌｔｉｓ  ｍｏｄｅｓｔｕｓ  Ｄｉｓｔａｎｔ（トマトバグ）；Ｃｙｒｔｏｐｅｌｔｉｓ  ｎｏｔａｔｕｓ  Ｄｉｓｔａｎｔ（サックフライ）；Ｓｐａｎａｇｏｎｉｃｕｓ  ａｌｂｏｆａｓｃｉａｔｕｓ  Ｒｅｕｔｅｒ（ホワイトマークドフリーホッパー）；Ｄｉａｐｈｎｏｃｏｒｉｓ  ｃｈｌｏｒｉｏｎｉｓ  Ｓａｙ（ハニーロカストプラントバグ）；Ｌａｂｏｐｉｄｉｃｏｌａ  ａｌｌｉｉ  Ｋｎｉｇｈｔ（オニオンプラントバグ）；Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ  ｓｅｒｉａｔｕｓ  Ｒｅｕｔｅｒ（コットンフリーホッパー）；Ａｄｅｌｐｈｏｃｏｒｉｓ  ｒａｐｉｄｕｓ  Ｓａｙ（ラピッドプラントバグ）；Ｐｏｅｃｉｌｏｃａｐｓｕｓ  ｌｉｎｅａｔｕｓ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（フォーラインドプラントバグ）；Ｎｙｓｉｕｓ  ｅｒｉｃａｅ  Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ（フォールスチンチバグ）；Ｎｙｓｉｕｓ  ｒａｐｈａｎｕｓ  Ｈｏｗａｒｄ（フォールスチンチバグ）；Ｎｅｚａｒａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（サザングリーンスティンクバグ）；Ｅｕｒｙｇａｓｔｅｒ  ｓｐｐ．；Ｃｏｒｅｉｄａｅ  ｓｐｐ．；Ｐｙｒｒｈｏｃｏｒｉｄａｅ  ｓｐｐ．；Ｔｉｎｉｄａｅ  ｓｐｐ．；Ｂｌｏｓｔｏｍａｔｉｄａｅ  ｓｐｐ．；Ｒｅｄｕｖｉｉｄａｅ  ｓｐｐ．ａｎｄ  Ｃｉｍｉｃｉｄａｅ  ｓｐｐ．など）。
【０３８０】
以下の成虫および幼虫：Ａｃａｒｉ目（ダニ）（Ａｃｅｒｉａ  ｔｏｓｉｃｈｅｌｌａ  Ｋｅｉｆｅｒ（ウィートカールマイト）；Ｐｅｔｒｏｂｉａ  ｌａｔｅｎｓ  Ｍｕｌｌｅｒ（ホモノハダニ）；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｉｄａｅ科のハダニおよびアカハダニ：Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ  ｕｌｍｉ  Ｋｏｃｈ（リンゴハダニ）；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ  Ｋｏｃｈ（ツースポッティッドスパイダーマイト）；（Ｔ．ｍｃｄａｎｉｅｌｉ  ＭｃＧｒｅｇｏｒ（マクダニエルマイト）；Ｔ．ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ  Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ（カルミンスパイダーマイト）；Ｔ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ  Ｕｇａｒｏｖ  ＆  Ｎｉｋｏｌｓｋｉ（ストロベリースパイダーマイト）；Ｔｅｎｕｉｐａｌｐｉｄａｅ科のフラットマイト：Ｂｒｅｖｉｐａｌｐｕｓ  ｌｅｗｉｓｉ  ＭｃＧｒｅｇｏｒ（オンシツヒメハダニ）；Ｅｒｉｏｐｈｙｉｄａｅ科のサビダニおよびバドマイト、他のフォイラーフィーディングマイト、ならびにヒトおよび動物の健康に重要なダニ（すなわち、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｔｉｄａｅ科のイエダニ、Ｄｅｍｏｄｉｃｉｄａｅ科のニキビダニ、Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｉｄａｅ科の穀物ダニ、Ｉｘｏｄｉｄａｅ目のマダニ：Ｉｘｏｄｅｓ  ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ  Ｓａｙ（シカダニ）；Ｉ．ｈｏｌｏｃｙｃｌｕｓ  Ｎｅｕｍａｎｎ（オーストラリアンパラレシスチック）；Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  Ｓａｙ（アメリカイヌカクマダニ）；Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（アメリカキララマダニ）、ならびにＰｓｏｒｏｐｔｉｄａｅ科、Ｐｙｅｍｏｔｉｄａｅ科、およびＳａｒｃｏｐｔｉｄａｅ科のキュウセンヒゼンダニなど）。
【０３８１】
Ｔｈｙｓａｎｕｒａ目の害虫（Ｌｅｐｉｓｍａ  ｓａｃｃｈａｒｉｎａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（セイヨウシミ）；Ｔｈｅｒｍｏｂｉａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ  Ｐａｃｋａｒｄ（マダラシミ）など）。
【０３８２】
さらなる節足動物の有害生物としては、以下が挙げられる：Ａｒａｎｅａｅ目のクモ（Ｌｏｘｏｓｃｅｌｅｓ  ｒｅｃｌｕｓａ  Ｇｅｒｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍｕｌａｉｋ（ドクイトグモ）およびＬａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｍａｃｔａｎｓ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（クロゴケグモ）など）およびＳｃｕｔｉｇｅｒｏｍｏｒｐｈａ目のムカデ（Ｓｃｕｔｉｇｅｒａ  ｃｏｌｅｏｐｔｒａｔａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ゲジ）など）。
【０３８３】
カメムシおよび他の関連する昆虫の上科としては、限定されないが、以下が挙げられる：Ｐｅｎｔａｔｏｍｉｄａｅ科に属する種（Ｎｅｚａｒａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ、Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａ  ｈａｌｙｓ、Ｐｉｅｚｏｄｏｒｕｓ  ｇｕｉｌｄｉｎｉ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｓｅｒｖｕｓ、Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｈｅｒｏｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｔｒｉｓｔｉｇｍｕｓ、Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ  ｆｕｒｃａｔｕｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ  ｍｅｌａｃａｎｔｈｕｓ、およびＢａｇｒａｄａ  ｈｉｌａｒｉｓ（Ｂａｇｒａｄａ  Ｂｕｇ））、Ｐｌａｔａｓｐｉｄａｅ科に属する種（Ｍｅｇａｃｏｐｔａ  ｃｒｉｂｒａｒｉａ−マルカメムシ）およびＣｙｄｎｉｄａｅ科に属する種（Ｓｃａｐｔｏｃｏｒｉｓ  ｃａｓｔａｎｅａルートスティンクバグ）、ならびにＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａに属する種（限定されないが、以下が挙げられる：コナガ（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ  Ｂｏｄｄｉｅ）；ソイビーンルーパー（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ  Ｗａｌｋｅｒ）およびハッショウマメイモムシ（例えば、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ  Ｈｕｂｎｅｒ））。
【０３８４】
線虫としては、根瘤線虫、シスト線虫、および病変線虫などの寄生線虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｐｐ．、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｓｐｐ．ａｎｄ  Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｓｐｐ．が挙げられる）；特に、シスト線虫のメンバー（限定されないが、以下が挙げられる：Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ（ダイズシストセンチュウ）；Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｃｈａｃｈｔｉｉ（テンサイシストセンチュウ）；Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ａｖｅｎａｅ（ムギシストセンチュウ）およびＧｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓおよびＧｌｏｂｏｄｅｒａ  ｐａｉｌｉｄａ（ジャガイモシストセンチュウ））が挙げられる。病変線虫としては、Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｓｐｐ．が挙げられる。
【０３８５】
農薬および本開示の微生物を含む殺有害生物組成物
【０３８６】
前述のように、本明細書中に教示の任意の微生物を含み得る本開示の農業組成物は、時折、１またはそれを超える農薬と組み合わせられる。農薬としては、除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤などを挙げることができる。
【０３８７】
いくつかの実施形態では、農薬／微生物組成物を、組成物の形態で付与することができ、耕作地または処理すべき植物に、他の化合物と同時または連続して付与することができる。これらの化合物は、肥料、除草薬、抗凍結剤、界面活性剤、界面活性物質、殺有害生物石鹸、ドルマントオイル、ポリマー、および／または１回の付与後に標的領域の長期間投与可能な持続放出性または生分解性の担体製剤であり得る。また、これらの化合物は、必要に応じて、製剤分野で慣習的に使用されているさらなる農業的に許容され得る担体、界面活性剤、または付与を促進するアジュバントを含む、選択的な除草剤、化学殺虫剤、殺ウイルス剤、殺微生物剤、殺アメーバ剤、農薬、殺真菌剤、殺細菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤、またはこれらの調製物のうちのいくつかの混合物であり得る。適切な担体（すなわち、農業的に許容され得る担体）およびアジュバントは、固体または液体であり得、処方テクノロジーで通常使用されている物質（例えば、天然または再生された鉱物、溶媒、分散物質、湿潤剤、固着剤、粘着付与剤、結合剤、または肥料）に相当する。同様に、製剤は、餌に調製され得るか、殺有害生物製剤の標的有害生物に摂食または摂取させるための有害生物トラップに作出され得る。
【０３８８】
本開示の微生物と組み合わせることができる例示的な化学的組成物としては、以下が挙げられる：
【０３８９】
果実／野菜除草剤：アトラジン、ブロマシル、ジウロン、グリホサート、リヌロン、メトリブジン、シマジン、トリフルラリン、フルアジホップ、グルホシネート、ハロ・スルフロン・ゴワン、パラコート、プロピザミド、セトキシジム、ブタフェナシル、ハロスルフロン、インダジフラム；果実／野菜殺虫剤：アルジカルブ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、カルバリル、カルボフラン、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、ダイアジノン、マラチオン、アバメクチン、シフルトリン／ベータシフルトリン、エスフェンバレラート、ランブダ−シハロトリン、アセキノシル、ビフェナゼート、メトキシフェノジド、ノバルロン、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、フルアクリピリム、トルフェンピラド、クロチアニジン、スピロジクロフェン、γ−シハロトリン、スピロメシフェン、スピノサド、リナキシピル、シアジピル、スピノテラム、トリフルムロン、スピロテトラマト、イミダクロプリド、フルベンジアミド、チオジカルブ、メタフルミゾン、スルホキサフロール、シフルメトフェン、シアノピラフェン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、スピノトラム、チオジカルブ、フロニカミド、メチオカルブ、エマメクチン安息香酸塩、インドキサカルブ、ホルチアザート、フェナミホス、カデュサホス、ピリプロキシフェン、フェンブタチンオキシド、ヘキシチアゾクス、メトミル、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２、２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン；果実野菜殺真菌剤：カルベンダジム、クロロタロニル、ＥＢＤＣ、サルファー、チオファネート−メチル、アゾキシストロビン、シモキサニル、フルアジナム、ホセチル、イプロジオン、クレソキシム−メチル、メタラキシル／メフェノキサム、トリフロキシストロビン、エタボキサム、イプロバリカルブ、トリフロキシストロビン、フェンヘキサミド、オキスポコナゾールフマル酸塩、シアゾファミド、フェナミドン、ゾキサミド、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、シフルフェナミド、ボスカリド；
【０３９０】
穀類除草剤：イソプロツロン、ブロモキシニル、ロキシニル、フェノキシ類、クロルスルフロン、クロジナホップ、ジクロホップ、ジフルフェニカン、フェノキサプロップ、フロラスラム、フルオロキシピル、メトスルフロン、トリアスルフロン、フルカルバゾン、ヨードスルフロン、プロポキシカルバゾン、ピコリン−アフェン、メソスルフロン、ベフルブタミド、ピノキサデン、アミドスルフロン、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロン、フルピルスルフロン、スルホスルフロン、ピラスルホトール、ピロクススラム、フルフェナセット、トラルコキシジム、ピロキサスルホン；穀類殺真菌剤：カルベンダジム、クロロタロニル、アゾキシストロビン、シプロコナゾール、シプロジニル、フェンプロピモルフ、エポキシコナゾール、クレソキシム−メチル、キノキシフェン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、シメコナゾール、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、ジモキシストロビン、プロチオコナゾール、フルオキサストロビン；穀類殺虫剤：ジメトアート、ランブダ−シハロトリン、デルタメトリン、α−シペルメトリン、β−シフルトリン、ビフェントリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、クロルフィリホス、メタミドホス、オキシデメソンメチル、ピリミカルブ、メチオカルブ；
【０３９１】
メイズ除草剤：アトラジン、アラクロル、ブロモキシニル、アセトクロル、ジカンバ、クロピラリド、Ｓ−ジメテナミド、グルホシネート、グリホサート、イソキサフルトール、Ｓ−メトラクロル、メソトリオン、ニコスルフロン、プリミスルフロン、リムスルフロン、スルコトリオン、ホラムスルフロン、トプラメゾン、テンボトリオン、サフルフェナシル、チエンカルバゾン、フルフェナセット、ピロキサスルホン；メイズ殺虫剤：カルボフラン、クロルピリホス、ビフェントリン、フィプロニル、イミダクロプリド、ランブダ−シハロトリン、テフルトリン、テルブホス、チアメトキサム、クロチアニジン、スピロメシフェン、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、デルタメトリン、チオジカルブ、β−シフルトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、ルフェヌロン、トリフルモロン、テフルトリン、テブピリム−ホス、エチプロール、シアジピル、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、アベルメクチン、メチオカルブ、スピロジクロフェン、スピロテトラマト；メイズ殺真菌剤：フェニトロパン、チラム、プロチオコナゾール、テブコナゾール、トリフロキシストロビン；
【０３９２】
イネ除草剤：ブタクロール、プロパニル、アジムスルフロン、ベンスルフロン、シアロ−フォプ、ダイムロン、フェントラザミド、イマゾスルフロン、メフェナセット、オキサジクロメフォン、ピラゾスルフロン、ピリブチカルブ、キンクロラック、チオベンカルブ、インダノファン、フルフェナセット、フェントラザミド、ハロスルフロン、オキサジクロメフォン、ベンゾビシクロン、ピリフタリド、ペノクスラム、ビスピリバック、オキサジアルギル、エトキシスルフロン、プレチラクロール、メソトリオン、テフリルトリオン、オキサジアゾン、フェノキサプロップ、ピリミスルファン；イネ殺虫剤：ダイアジノン、フェニトロチオン、フェノブカルブ、モノクロトホス、ベンフラカルブ、ブプロフェジン、ジノテフラン、フィプロニル、イミダクロプリド、イソプロカルブ、チアクロプリド、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、クロチアニジン、エチプロール、フルベンジアミド、リナキシピル、デルタメトリン、アセタミプリド、チアメトキサム、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、シペルメトリン、クロルピリホス、カルタップ、メタミドホス、エトフェンプロックス、トリアゾホス、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、カルボフラン、ベンフラカルブ；イネ殺真菌剤：チオファネート−メチル、アゾキシストロビン、カルプロパミド、エジフェンホス、フェリムゾン、イプロベンホス、イソプロチオラン、ペンシクロン、プロベナゾール、ピロキロン、トリシクラゾール、トリフロキシストロビン、ジクロシメット、フェノキサニル、シメコナゾール、チアジニル；
【０３９３】
ワタ除草剤：ジウロン、フルオメツロン、ＭＳＭＡ、オキシフルオルフェン、プロメトリン、トリフルラリン、カルフェントラゾン、クレトジム、フルアジホップ−ブチル、グリホサート、ノルフルラゾン、ペンジメタリン、ピリチオバック−ナトリウム、トリフロキシスルフロン、テプラロキシジム、グルホシネート、フルミオキサジン、チジアズロン；ワタ殺虫剤：アセフェート、アルジカルブ、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、マラチオン、モノクロトホス、アバメクチン、アセタミプリド、エマメクチン安息香酸塩、イミダクロプリド、インドキサカルブ、ランブダ−シハロトリン、スピノサド、チオジカルブ、γ−シハロトリン、スピロメシフェン、ピリダリル、フロニカミド、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、β−シフルトリン、スピロテトラマト、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、γシハロトリン、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、チオジカルブ、アベルメクチン、フロニカミド、ピリダリル、スピロメシフェン、スルホキサフロール、プロフェノホス、トリアゾホス、エンドスルファン；ワタ殺真菌剤：エトリジアゾール、メタラキシル、キントゼン；
【０３９４】
ダイズ除草剤：アラクロル、ベンタゾン、トリフルラリン、クロリムロンエチル、クロランスラム−メチル、フェノキサプロップ、ホメサフェン、フルアジホップ、グリホサート、イマザモクス、イマザキン、イマゼタピル、（Ｓ−）メトラクロル、メトリブジン、ペンジメタリン、テプラロキシジム、グルホシネート；ダイズ殺虫剤：ランブダ−シハロトリン、メトミル、パラチオン、チオカルブ、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルトリン、γおよびランブダシハロトリン、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、β−シフルトリン；ダイズ殺真菌剤：アゾキシストロビン、シプロコナゾール、エポキシコナゾール、フルトリアホール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、プロチオコナゾール、テトラコナゾール；
【０３９５】
テンサイ除草剤：クロリダゾン、デスメジファム、エトフメサート、フェンメジファム、トリアラート、クロピラリド、フルアジホップ、レナシル、メタミトロン、キンメラック、シクロキシジム、トリフルスルフロン、テプラロキシジム、キザロホップ；テンサイ殺虫剤：イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、デルタメトリン、β−シフルトリン、γ／ランブダシハロトリン、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、テフルトリン、リナキシピル、シアキシピル、フィプロニル、カルボフラン；
【０３９６】
キャノーラ除草剤：クロピラリド、ジクロホップ、フルアジホップ、グルホシネート、グリホサート、メタザクロル、トリフルラリン  エタメトスルフロン、キンメラック、キザロホップ、クレトジム、テプラロキシジム；キャノーラ殺真菌剤：アゾキシストロビン、カルベンダジム、フルジオキソニル、イプロジオン、プロクロラズ、ビンクロゾリン；キャノーラ殺虫剤：カルボフランオルガノホスフェート、ピレスロイド、チアクロプリド、デルタメトリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ジネト−フラン、β−シフルトリン、γおよびランブダシハロトリン、τ−フルバレリエート、エチプロール、スピノサド、スピノトラム、フルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン。
【０３９７】
殺虫剤および本開示の微生物を含む殺虫組成物
【０３９８】
前述のように、本明細書中に教示の任意の微生物を含み得る本開示の農業組成物は、時折、１またはそれを超える殺虫剤と組み合わせられる。
【０３９９】
いくつかの実施形態では、殺虫組成物を、本明細書中に記載の組成物中に含めてもよく、植物（複数可）またはその一部（複数可）に、他の化合物と同時または連続して付与することができる。殺虫剤としては、炭酸アンモニウム、ケイ酸カリウム水溶液、ホウ酸、硫酸銅、元素硫黄、石灰硫黄合剤、スクロースオクタノアートエステル、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２、２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、アバメクチン、ノテノン、フェナザキン、フェンピロキシメート、ピリダベン、ピリメディフェン、テブフェンピラド、トルフェンピラド、アセフェート、エマメクチン安息香酸塩、レピメクチン、ミルベメクチン、ヒドロプレン（ｈｄｒｏｐｒｅｎｅ）、キノプレン、メトプレン、フェノキシカルブ、ピリプロキシフェン、臭化アルキル（ｍｅｔｈｒｙｌ  ｂｒｏｍｉｄｅ）および他のハロゲン化アルキル、フルフリルフルオリド、クロロピクリン、ホウ砂、八ホウ酸二ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、メタホウ酸ナトリウム、吐酒石、ダゾメット、メタム、ピメトロジン、ピリフルキナゾン、フロフェンテジン、ジフロビダジン、ヘキシチアゾクス、ビフェナゼート、チアメトキサム、イミダクロプリド、フェンピロキシメート、アザジラクチン、ペルメトリン、エスフェンバレラート、アセタミプリド、ビフェントリン、インドキサカルブ、アザジラクチン、ピレトリン、イミダクロプリド、β−シフルトリン、スルホテップ、テブピリムホス、テメホス、テルブホス、テトラクロロビンホス、チオメトン、トリアゾホス、アラニカルブ、アルジカルブ、ベンジオカルブ、ベンフルラカルブ、ブトカルボキシム、ブトキシカルボキシム、カルバリル、カルボフラン、カルボスルファン、エチオフェンカルブ、フェノブカルブ、ホルメタナート、フラチオカルブ、イソプロカルブ、メチオカルブ、メチミル、メトルカルブ、オキサミル、プリミカルブ、プロポクスル、チオジカルブ、チオファノックス、トリアザマート、トリメタカルブ、ＸＭＣ、キシリルカルブ、アセフェート、アザメチホス、アジンホス−エチル、アジンホス−メチル、カズサホス、クロロエトキシフォックス、トリクロルホン、バミドチオン、クロルダン、エンドスルファン、エチプロール、フィプロニル、アクリナトリン、アレトリン、ビフェントリン、ビオアレトリン、ビオアレテリン  Ｘ−シクロペンテニル、ビオレスメトリン、シクロトリン、シフルトリン、シハロトリン、シペルメトリン、シフェノトリン［（１Ｒ）−ｔｒａｎｓ−異性体］、デルタメトリン、エンペントリン［（ＥＺ）−（１Ｒ）−異性体］、エスフェンバレラート、エトフェンプロックス、フェンプロパトリン、フェンバレラート、フルシトリナート、フルメトリン、ハルフェンプロックス、カダトリン、フェノトリン［（１Ｒ）−ｔｒａｎｓ−異性体］  プラレトリン、ピレトリン（除虫菊）、レスメトリン、シラフルオフェン、テフルトリン、テトラメトリン、テトラメトリン［（１Ｒ）−異性体］、トラロメトリン、トランスフルトリン、α−シペルメトリン、β−シフルトリン、β−シペルメトリン、ｄ−ｃｉｓ−ｔｒａｎｓアレトリン、ｄ−ｔｒａｎｓアレトリン、γ−シハロトリン、λ−シハロトリン、τ−���ルバリナート、θ−シペルメトリン、ζ−シペルメトリン、メトキシクロル、ニコチン、スルホキサフロール、アセタミプリド、クロチアニジン、ジノテフラン、イミダクロプリド、ニテンピラム、チアクロプリド、チアメトキサン、テブプリムホス、β−シフルトリン、クロチアニジン、フロニカミド、ヒドラメチルノン、アミトラズ、フルベンジアミド、ブロラントラニプロール、ランブダシハロトリン、スピノサド、γシハロトリン、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ、トウガラシオレオレジン抽出物、ニンニク油、カルバリル、クロルピリホス、スルホキサフロール、ランブダシハロトリン、クロルフェンビンホス、クロルメホス、クロルピリホス、クロルピリホス−メチル、クマホス、シアノホス、デメトン−Ｓ−メチル、ダイアジノン、ジクロルボス／ＤＤＶＰ、ジクロトホス、ジメトアート、ジメチルビンホス、ジスルホトン、ＥＰＮ、エチオン、エトプロホス、ファムフル、フェナミホス、フェニトロチオン、フェンチオン、ホスチアゼート、ヘプテノホス、イミシアホス、イソフェンホス、イソプロピルＯ−（メトキシアミノチオ−ホスホリル）サリチラート、イソキサチオン、マラチオン、メカルバム、メタミドホス、メチダチオン、メビンホス、モノクロトホス、ナレド、オメトアート、オキシデメトン−メチル、パラチオン、パラチオン−メチル、フェントエート、ホレート、ホサロン、ホスメット、ホスファミドン、ホキシム、ピリミホス−メチル、プロフェノホス、プロペタムホス、プロチオホス、ピラクロホス、ピリダフェンチオン、キナルホスフルアクリピリム、テブフェノジド、クロルアントラニリプロール、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓ．Ｋｕｒｓｔａｋｉ、テルブホス、鉱油、フェンプロパトリン、メタルデヒド、デルタメトリン、ダイアジノン、ジメトアート、ジフルベンズロン、ピリプロキシフェン、ローズマリー油（ｒｅｏｓｅｍａｒｙ  ｏｉｌ）、ペパーミント油、グラニオール、アザジラクチン、ピペロニルブトキシド、シアントラニリプロール、αシペルメトリン、テフルトリン、ピメトロジン、マラチオン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ、ジコホール、ブロモプロピラート、ベンゾキシマート、アザジラクチン、フロニカミド、ダイズ油、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｂｔｓｕｇａｅ菌株ＰＲＡＡ４−１、ζシペルメトリン、ホスメット、メトキシフェノジド、パラフィン系オイル、スピロテトラマト、メトミル、Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ菌株Ｆ５２、エトプロップ、テトラジホン、プロパルギット、フェンブタチンオキシド、アゾシクロチン、シヘキサチン、ジアフェンチウロン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、エトキサゾール、フルピラジフロン、アザジラクチン、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ、シフルメトフェン、アザジラクチン、キノメチオナート（ｃｈｉｎｏｍｅｔｈｉｏｎａｔ）、アセフェート、Ｉｓａｒｉａ  ｆｕｍｏｓｏｒｏｓｅａ  Ａｐｏｐｋａ菌株９７、テトラホウ酸ナトリウム十水和物、エマメクチン安息香酸塩、クリオライト、スピネトラム、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ａｍｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓ抽出物��ノバルロン、ジノテフラン、カルバリル、アセキノシル、フルピラジフロン、リン酸鉄、カオリン、ブプロフェジン、シロマジン、クロマフェノジド、ハロフェノジド、メトキシフェノジド、テブフェノジド、ビストリフルロン、クロルフルアズロン、ジフルベンズロン、フルシクロクスロン、フルフェノクスロン、ヘキサフルムロン、ルフェヌロン、ノカルロン、ノビフルムロン、テフルベンズロン、トリフルムロン、ベンスルタップ、カルタップ塩酸塩、チオシクラム、チオスルタップ−ナトリウム、ＤＮＯＣ、クロルフェナピル、スルフラミド、ホレート、トルフェンピラド、スルホキサフロール、ニーム油、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ菌株ＳＡ−１０、シロマジン、熱殺菌Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ．、シアントラニリプロール、シエノピラフェン、シフルメトフェン、シアン化ナトリウム、シアン化カリウム、シアン化カルシウム、リン化アルミニウム、リン化カルシウム、ホスフィン、リン化亜鉛、スピロジクロフェン（ｓｐｒｉｏｄｉｃｌｏｆｅｎ）、スピロメシフェン、スピロテトラマト、メタフルミゾン、フルベンジアミド、ピフルブミド、オキサミル、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｉｚａｗａｉ、エトキサゾール、およびエスフェンバレラートが挙げられる。
表９：種々の作用様式に関連し、本開示の微生物と組み合わせることができる殺虫剤の例
【表９−１】
2021530984.tif 000016
【表９−２】
2021530984.tif 000017
【表９−３】
2021530984.tif 000018
【表９−４】
2021530984.tif 000019
表１０：本開示の微生物と組み合わせることができる農薬リストの例
【表１０−１】
2021530984.tif 000020
【表１０−２】
2021530984.tif 000021
【表１０−３】
2021530984.tif 000022
【表１０−４】
2021530984.tif 000023
【表１０−５】
2021530984.tif 000024
【表１０−６】
2021530984.tif 000025
【表１０−７】
2021530984.tif 000026
【表１０−８】
2021530984.tif 000027
【表１０−９】
2021530984.tif 000028
【表１０−１０】
2021530984.tif 000029
【表１０−１１】
2021530984.tif 000030
【表１０−１２】
2021530984.tif 000031
【表１０−１３】
2021530984.tif 000032
【表１０−１４】
2021530984.tif 000033
【表１０−１５】
2021530984.tif 000034
【表１０−１６】
2021530984.tif 000035
【表１０−１７】
2021530984.tif 000036
【表１０−１８】
2021530984.tif 000037
【０４００】
殺虫剤としては、協力剤または活性化因子であって、それら自体は有毒でも殺虫性もないと見なされるが、殺虫剤と協力するか、殺虫剤の活性を増強するために殺虫剤と共に使用される材料である協力剤または活性化因子も挙げられる。協力剤（ｓｙｎｇｅｒｇｉｓｔ）または活性化因子としては、ピペロニルブトキシドが挙げられる。
【０４０１】
バイオラショナル農薬
【０４０２】
殺虫剤は、バイオラショナルであり得るか、バイオ農薬または生物農薬としても公知であり得る。バイオラショナルは、特定の標的有害生物（複数可）（例えば、昆虫、雑草、植物病（線虫が含まれる）、および脊椎動物の有害生物）に有害または致死的に作用し、固有の作用様式を有し、ヒト、栽培植物、および家畜に無害であり、野生動物および環境に対する有害作用がほとんど無いか全く無い天然起源の任意の物質（または天然起源の物質に類似した人工物質）を指す。
【０４０３】
バイオラショナル殺虫剤（またはバイオ農薬もしくは生物農薬）を、以下のようにグループ分けすることができる：（１）生化学物質（ホルモン、酵素、フェロモン、および天然作用因子（昆虫および植物の成長調節物質など））、（２）微生物（ウイルス、細菌、真菌、原生動物、および線虫）、または（３）植物導入保護剤（ＰＩＰ）−主に、トランスジェニック植物（例えば、Ｂｔトウモロコシ）。
【０４０４】
バイオ農薬、すなわち、生物農薬としては、広義には、生きている微小生物または天然物から製造され、植物有害生物の防除のために販売されている薬剤が含まれ得る。バイオ農薬は、以下であり得る：微小生物、生化学物質、および信号化学物質。バイオ農薬としては、ペプチド、タンパク質、および核酸（二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、およびヘアピンＤＮＡまたはヘアピンＲＮＡなど）も挙げられ得る。
【０４０５】
細菌、真菌、卵菌、ウイルス、および原生動物は全て、害虫の生物学的防除のために使用される。最も広く使用されている微生物バイオ農薬は、昆虫病原性細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）であり、これは、細菌胞子の形成中に、感受性を示す昆虫によって消費された場合に腸細胞を溶解することができるタンパク質結晶（Ｂｔδ−内毒素）を産生する。微生物Ｂｔバイオ農薬は、発酵タンク中で大量生産され、噴霧可能な製品として製剤化される細菌胞子およびδ−内毒素結晶からなる。Ｂｔは、脊椎動物に有害ではなく、ヒトに安全であり、生物および環境に有益である。したがって、Ｂｔスプレーは、選択性レベルおよび安全性レベルが高いことが望ましいと見なされる場合や、合成化学殺虫剤耐性に問題がある場合の、果実作物および野菜作物に対する有害生物の管理のための成長中の戦略である。また、Ｂｔスプレーは、メイズ、ダイズ、およびワタなどの商品作物に使用されているが、植物の遺伝子改変の出現で、農業従事者は、Ｂｔトランスジェニック作物品種の生産を増加させている。
【０４０６】
他の微生物殺虫剤としては、昆虫病原性バキュロウイルスに基づいた製品が挙げられる。節足動物に病原性を示すバキュロウイルスは、ウイルスファミリーに属し、ヌクレオカプシドにパッケージングされた巨大な共有結合閉環状の二本鎖ＤＮＡゲノムを保有する。Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ目、およびＤｉｐｔｅｒａ目の昆虫から７００を超えるバキュロウイルスが同定されている。バキュロウイルスは、通常、その宿主昆虫に対する特異性が高いので、環境、ヒト、他の植物、および有用生物に対して安全である。異なる害虫を防除するために、世界で５０を超えるバキュロウイルス製品が使用されている。米国および欧州では、Ｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ顆粒ウイルス（ＣｐＧＶ）は、リンゴ用のコドリンガに対する大量放飼用バイオ農薬として使用されている。米国における最大のリンゴ生産者であるワシントン州では、１３％のリンゴ作物に対してＣｐＧＶを使用している。ブラジルでは、ダイズ毛虫Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓの核多角体ウイルスを、１９９０年代中頃に４００万ｈａ（およそ３５％）までのダイズ作物に使用していた。Ｇｅｍｓｔａｒ（登録商標）（Ｃｅｒｔｉｓ  ＵＳＡ）などのウイルスは、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ種およびＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ種の幼虫の防除に利用可能である。
【０４０７】
少なくとも１７０種の昆虫病原性真菌に基づいた異なるバイオ農薬製品が、温室作物、果実、および露地野菜、ならびに商品作物の少なくとも５つの昆虫目およびダニ目用に開発されている。大部分の製品は、子嚢菌類Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａまたはＭｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅに基づく。また、Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅは、アフリカおよびオーストラリアにおけるイナゴおよびバッタ有害生物の防除のために開発されており、イナゴ管理用として国際連合食糧農業機関（ＦＡＯ）で推奨されている。
【０４０８】
合衆国で登録されているいくつかの微生物農薬は、Ｋａｂａｌｕｋら．２０１０の表１６（Ｋａｂａｌｕｋ，Ｊ．Ｔ．ら．（ｅｄ．）．２０１０．Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  Ｊｕｒｉｓｄｉｃｔｉｏｎｓ  Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．ＩＯＢＣ  Ｇｌｏｂａｌ．９９ｐｐ．）に列挙されており、選択国で登録された微生物農薬は、Ｈｏｅｓｃｈｌｅ−Ｚｅｌｅｄｏｎら．２０１３の付録４（Ｈｏｅｓｃｈｌｅ−Ｚｅｌｅｄｏｎ，Ｉ．，Ｐ．Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｋｕｍａｒ．（２０１３）．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ．ＳＰ−ＩＰＭ  Ｓｅｃｒｅｔａｒｉａｔ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＩＩＴＡ），Ｉｂａｄａｎ，Ｎｉｇｅｒｉａ．４３  ｐｐ．）に列挙されており、これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０４０９】
植物は、草食動物からの摂食を阻止する多種多様な二次代謝産物を産生する。これらの二次代謝産物のいくつかを、バイオ農薬として使用することができる。バイオ農薬としては、例えば、ピレトリンが挙げられ、これは、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｃｉｎｅｒａｒｉａｅｆｏｌｉｕｍによって産生される即効性の殺虫化合物である。ピレトリンは哺乳動物への毒性が低いが、散布後急速に分解される。この持続性の短さから、合成ピレトリン（ピレスロイド）の開発が急がれた。最も広く使用されている植物性化合物はニーム油であり、これは、Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ  ｉｎｄｉｃａの種子から抽出した殺虫化合物質である。土壌放線菌によって合成された二次代謝産物に基づいた２つの有効性の高い農薬が利用できるが、これらは、規制当局によってあたかも合成化学農薬であるかのような評価を受けている。スピノサドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｉｎｏｓａ由来の２つのマクロライド化合物の混合物である。これは哺乳動物に対する毒性が非常に低く、残渣は圃場で迅速に分解される。農業従事者および栽培者は、１９９７年のその導入後から広く使用してきたが、ミカンキイロアザミウマなどのいくつかの重要な有害生物で既に耐性が生じている。アバメクチンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓによって産生される大環状ラクトン化合物である。これは、ある範囲の有害生物種に対して有効であるが、これもまた、例えば、ハダニ科のダニで耐性が生じている。
【０４１０】
いくつかの生物由来のペプチドおよびタンパク質が、殺有害生物性を有することが見出されている。おそらく最も突出しているのは、クモ毒液由来のペプチドである（Ｋｉｎｇ，Ｇ．Ｆ．ａｎｄ  Ｈａｒｄｙ，Ｍ．Ｃ．（２０１３）Ｓｐｉｄｅｒ−ｖｅｎｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｎｓｅｃｔ  ｐｅｓｔｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．５８：４７５−４９６）。クモ毒液ペプチドにおけるジスルフィド結合の固有の配置により、プロテアーゼ耐性が極めて高い。結果として、これらのペプチドは、昆虫の腸内および血リンパ内での安定性が高く、これらの多くは経口で有効である。このペプチドは、昆虫神経系における広範な受容体およびイオンチャネルを標的にする。殺虫ペプチドの他の例としては、以下が挙げられる：電位開口型Ｎａ＋チャネルに作用するイソギンチャク毒液（Ｂｏｓｍａｎｓ，Ｆ．ａｎｄ  Ｔｙｔｇａｔ，Ｊ．（２００７）Ｓｅａ  ａｎｅｍｏｎｅ  ｖｅｎｏｍ  ａｓ  ａ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｃｔｉｎｇ  ｏｎ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  Ｎａ＋  ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｔｏｘｉｃｏｎ．４９（４）：５５０−５６０）；いくつかの害虫（カ、いくつかのアブラムシ、および穀類のゾウムシなど）に致死作用を有するマメ科植物の種子由来のＰＡ１ｂ（エンドウマメアルブミン１、サブユニットｂ）ペプチド（Ｅｙｒａｕｄ，Ｖ．ら．（２０１３）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｙｓｔｉｎｅ  Ｋｎｏｔ  Ｂｉｏｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ  ＰＡ１ｂ（Ｐｅａ  Ａｌｂｕｍｉｎ  １  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ｂ）．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（１２）：ｅ８１６１９）；および受容昆虫内のＣａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）ウレアーゼの酵素加水分解によって生成される内部１０ｋＤａペプチド（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ，Ａ．Ｈ．Ｓ．，ら（２０１４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｊａｂｕｒｅｔｏｘ，ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｊａｃｋ  ｂｅａｎ（Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）ｕｒｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １８４０：９３５−９４４）。市販のペプチド殺虫剤の例としては、Ｓｐｅａｒ（商標）−Ｔ（温室内での野菜および観葉植物におけるアザミウマの処理用）、Ｓｐｅａｒ（商標）−Ｐ（コロラドハムシの防除用）、およびＳｐｅａｒ（商標）−Ｃ（鱗翅目の有害生物からの作物の防御用）（Ｖｅｓｔａｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）が含まれる。副芽胞結晶毒素（ＰＣ）と呼ばれるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｍｂｙｓｅｐｔｉｃｕｓ由来の新規の殺虫タンパク質は、カイコおよびＣｒｙ１Ａｃ耐性Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ菌株に対して経口病原性活性および致死性を示す（Ｌｉｎ，Ｐ．ら（２０１５）ＰＣ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｏｒａｌ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｍｂｙｓｅｐｔｉｃｕｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｈｏｓｔ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｖｉａ  ＡＰＮ  ａｎｄ  ＢｔＲ−１７５．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５：１１１０１）。
【０４１１】
信号化学物質は、同種または異種の個体の挙動を変化させるある生物によって産生される化学信号である。作物防御のために最も広く使用されている信号化学物質は、昆虫性フェロモンであり、これらのうちのいくつかは、現在、合成することができ、大量捕獲、誘引殺虫システム、および交尾妨害によるモニタリングまたは有害生物防除のために使用されている。世界的に、交尾妨害は、６６０，０００ｈａで利用されており、果樹園の作物で特に有用である。
【０４１２】
本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック殺虫形質」は、１またはそれを超える有害生物に有害な核酸またはポリペプチドを発現するように遺伝子操作されている植物が示す形質を指す。１つの実施形態では、本開示の植物は、１またはそれを超える本開示の有害生物のうちのいずれかからの付着および／または寄生に耐性を示す。１つの実施形態では、この形質は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来の植物性殺虫タンパク質（ＶＩＰ）、植物由来のレクチンおよびプロテイナーゼの阻害剤、テルペノイド、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．由来のコレステロールオキシダーゼ、昆虫キチナーゼおよび真菌キチン分解酵素、細菌殺虫タンパク質および初期認識耐性遺伝子の発現を含む。別の実施形態では、この形質は、有害生物に有毒なＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓタンパク質の発現を含む。１つの実施形態では、Ｂｔタンパク質は、Ｃｒｙタンパク質（結晶タンパク質）である。Ｂｔ作物としては、Ｂｔトウモロコシ、Ｂｔワタ、およびＢｔダイズが挙げられる。Ｂｔ毒素は、Ｃｒｙファミリーに由来し得（例えば、Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅら，１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：８０７−８１２を参照のこと）、これらは、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、およびＤｉｐｔｅｒａに対して特に有効である。
【０４１３】
Ｂｔ  Ｃｒｙ毒素およびＣｙｔ毒素は、細菌の宿主の細胞膜に挿入するか、細胞膜を横切って移動するために高次構造の変化を受ける水溶性タンパク質として分泌される膜孔形成毒素（ＰＦＴ）として公知の細菌毒素クラスに属する。ＰＦＴには、以下の２つの主な群が存在する：（ｉ）α−ヘリックス領域が膜貫通孔を形成するα−ヘリックス毒素、および（ｉｉ）各単量体由来のβシートヘアピンから構成されるβ−バレルの形成によって膜に挿入されるβ−バレル毒素。Ｐａｒｋｅｒ  ＭＷ，Ｆｅｉｌ  ＳＣ，“Ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏｘｉｎｓ：ｆｒｏｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５  Ｍａｙ；８８（１）：９１−１４２を参照のこと。ＰＦＴの第１のクラスとしては、コリシン、外毒素Ａ、ジフテリア毒素などの毒素、また、Ｃｒｙ３ドメイン毒素が挙げられる。他方では、アエロリジン、α−ヘモリシン、炭疽防御抗原、パーフリンゴリシンＯとしてのコレステロール依存性毒素、およびＣｙｔ毒素は、β−バレル毒素に属する（同上）。一般に、ＰＦＴ産生細菌はその毒素を分泌し、これらの毒素は、宿主細胞表面に存在する特定の受容体と相互作用する。ほとんどの場合、ＰＦＴは、受容体結合後に宿主プロテアーゼによって活性化され、挿入構成要素であるオリゴマー構造の形成が誘導される。最後に、ほとんどの場合、タンパク質のモルテン・グロビュール状態を誘導するｐＨの低下によって膜挿入が誘発される（同上）。
【０４１４】
Ｂｔ  Ｃｒｙタンパク質を産生するトランスジェニック作物が開発されたことで、化学殺虫剤の代わりに環境に優しい代替物が用いられている。トランスジェニック植物では、Ｃｒｙ毒素が継続的に産生され、この毒素によって分解ならびに昆虫が咀嚼や穿孔に至ることから防御される。植物におけるＣｒｙタンパク質産生は、植物固有のコドン使用頻度を用いたｃｒｙ遺伝子の操作、推定スプライシングシグナル配列の除去およびプロトキシンのカルボキシ末端領域の欠失によって改良されている。Ｓｃｈｕｌｅｒ  ＴＨ，ら，“Ｉｎｓｅｃｔ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ，”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８；１６：１６８−１７５を参照のこと。昆虫耐性作物を使用することで、これらのトランスジェニック作物が植栽される耕作地の化学農薬の使用が著しく減少した。Ｑａｉｍ  Ｍ，Ｚｉｌｂｅｒｍａｎ  Ｄ，“Ｙｉｅｌｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｒｏｐｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３  Ｆｅｂ  ７；２９９（５６０８）：９００−２を参照のこと。
【０４１５】
公知のＣｒｙタンパク質としては、以下が挙げられる：限定されないが、以下が挙げられるδ−内毒素：δ−内毒素遺伝子のＣｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ４、Ｃｒｙ５、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１０、Ｃｒｙ１１、Ｃｒｙ１２、Ｃｒｙ１３、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ１６、Ｃｒｙ１７、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ１９、Ｃｒｙ２０、Ｃｒｙ２１、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ２４、Ｃｒｙ２５、Ｃｒｙ２６、Ｃｒｙ２７、Ｃｒｙ２８、Ｃｒｙ２９、Ｃｒｙ３０、Ｃｒｙ３１、Ｃｒｙ３２、Ｃｒｙ３３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ３８、Ｃｒｙ３９、Ｃｒｙ４０、Ｃｒｙ４１、Ｃｒｙ４２、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ４４、Ｃｒｙ４５、Ｃｒｙ４６、Ｃｒｙ４７、Ｃｒｙ４９、Ｃｒｙ５１、Ｃｒｙ５２、Ｃｒｙ５３、Ｃｒｙ５４、Ｃｒｙ５５、Ｃｒｙ５６、Ｃｒｙ５７、Ｃｒｙ５８、Ｃｒｙ５９．Ｃｒｙ６０、Ｃｒｙ６１、Ｃｒｙ６２、Ｃｒｙ６３、Ｃｒｙ６４、Ｃｒｙ６５、Ｃｒｙ６６、Ｃｒｙ６７、Ｃｒｙ６８、Ｃｒｙ６９、Ｃｒｙ７０、およびＣｒｙ７１クラスならびにＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの細胞溶解性ｃｙｔｌおよびｃｙｔ２遺伝子。
【０４１６】
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ殺虫タンパク質のこれらのクラスのメンバーとしては、限定されないが、以下が挙げられる：Ｃｒｙ１Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３５３）；Ｃｒｙ１Ａａ２（アクセッション番号アクセッション番号ＡＡＡ２２５５２）；Ｃｒｙ１Ａａ３（アクセッション番号ＢＡＡ００２５７）；Ｃｒｙ１Ａａ４（アクセッション番号ＣＡＡ３１８８６）；Ｃｒｙ１Ａａ５（アクセッション番号ＢＡＡ０４４６８）；Ｃｒｙ１Ａａ６（アクセッション番号ＡＡＡ８６２６５）；Ｃｒｙ１Ａａ７（アクセッション番号ＡＡＤ４６１３９）；Ｃｒｙ１Ａａ８（アクセッション番号１２６１４９）；Ｃｒｙ１Ａａ９（アクセッション番号ＢＡＡ７７２１３）；Ｃｒｙ１Ａａ１０（アクセッション番号ＡＡＤ５５３８２）；Ｃｒｙ１Ａａ１１（アクセッション番号ＣＡＡ７０８５６）；Ｃｒｙ１Ａａ１２（アクセッション番号ＡＡＰ８０１４６）；Ｃｒｙ１Ａａ１３（アクセッション番号ＡＡＭ４４３０５）；Ｃｒｙ１Ａａ１４（アクセッション番号ＡＡＰ４０６３９）；Ｃｒｙ１Ａａ１５（アクセッション番号ＡＡＹ６６９９３）；Ｃｒｙ１Ａａ１６（アクセッション番号ＨＱ４３９７７６）；Ｃｒｙ１Ａａ１７（アクセッション番号ＨＱ４３９７８８）；Ｃｒｙ１Ａａ１８（アクセッション番号ＨＱ４３９７９０）；Ｃｒｙ１Ａａ１９（アクセッション番号ＨＱ６８５１２１）；Ｃｒｙ１Ａａ２０（アクセッション番号ＪＦ３４０１５６）；Ｃｒｙ１Ａａ２１（アクセッション番号ＪＮ６５１４９６）；Ｃｒｙ１Ａａ２２（アクセッション番号ＫＣ１５８２２３）；Ｃｒｙ１Ａｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３０）；Ｃｒｙ１Ａｂ２（アクセッション番号ＡＡＡ２２６１３）；Ｃｒｙ１Ａｂ３（アクセッション番号ＡＡＡ２２５６１）；Ｃｒｙ１Ａｂ４（アクセッション番号ＢＡＡ０００７１）；Ｃｒｙ１Ａｂ５（アクセッション番号ＣＡＡ２８４０５）；Ｃｒｙ１Ａｂ６（アクセッション番号ＡＡＡ２２４２０）；Ｃｒｙ１Ａｂ７（アクセッション番号ＣＡＡ３１６２０）；Ｃｒｙ１Ａｂ８（アクセッション番号ＡＡＡ２２５５１）；Ｃｒｙ１Ａｂ９（アクセッション番号ＣＡＡ３８７０１）；Ｃｒｙ１Ａｂ１０（アクセッション番号Ａ２９１２５）；Ｃｒｙ１Ａｂ１１（アクセッション番号Ｉ１２４１９）；Ｃｒｙ１Ａｂ１２（アクセッション番号ＡＡＣ６４００３）；Ｃｒｙ１Ａｂ１３（アクセッション番号ＡＡＮ７６４９４）；Ｃｒｙ１Ａｂ１４（アクセッション番号ＡＡＧ１６８７７）；Ｃｒｙ１Ａｂ１５（アクセッション番号ＡＡ０１３３０２）；Ｃｒｙ１Ａｂ１６（アクセッション番号ＡＡＫ５５５４６）；Ｃｒｙ１Ａｂ１７（アクセッション番号ＡＡＴ４６４１５）；Ｃｒｙ１Ａｂ１８（アクセッション番号ＡＡＱ８８２５９）；Ｃｒｙ１Ａｂ１９（アクセッション番号ＡＡＷ３１７６１）；Ｃｒｙ１Ａｂ２０（アクセッション番号ＡＢＢ７２４６０）；Ｃｒｙ１Ａｂ２１（アクセッション番号ＡＢＳ１８３８４）；Ｃｒｙ１Ａｂ２２（アクセッション番号ＡＢＷ８７３２０）；Ｃｒｙ１Ａｂ２３（アクセッション番号ＨＱ４３９７７７）；Ｃｒｙ１Ａｂ２４（アクセッション番号ＨＱ４３９７７８）；Ｃｒｙ１Ａｂ２５（アクセッション番号ＨＱ６８５１２２）；Ｃｒｙ１Ａｂ２６（アクセッション番号ＨＱ８４７７２９）；Ｃｒｙ１Ａｂ２７（アクセッション番号ＪＮ１３５２４９）；Ｃｒｙ１Ａｂ２８（アクセッション番号ＪＮ１３５２５０）；Ｃｒｙ１Ａｂ２９（アクセッション番号ＪＮ１３５２５１）；Ｃｒｙ１Ａｂ３０（アクセッション番号ＪＮ１３５２５２）；Ｃｒｙ１Ａｂ３１（アクセッション番号ＪＮ１３５２５３）；Ｃｒｙ１Ａｂ３２（アクセッション番号ＪＮ１３５２５４）；Ｃｒｙ１Ａｂ３３（アクセッション番号ＡＡＳ９３７９８）；Ｃｒｙ１Ａｂ３４（アクセッション番号ＫＣ１５６６６８）；Ｃｒｙ１Ａｂ様（アクセッション番号ＡＡＫ１４３３６）；Ｃｒｙ１Ａｂ様（アクセッション番号ＡＡＫ１４３３７）；Ｃｒｙ１Ａｂ様（アクセッション番号ＡＡＫ１４３３８）；Ｃｒｙ１Ａｂ様（アクセッション番号ＡＢＧ８８８５８）；Ｃｒｙ１Ａｃ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３１）；Ｃｒｙ１Ａｃ２（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３８）；Ｃｒｙ１Ａｃ３（アクセッション番号ＣＡＡ３８０９８）；Ｃｒｙ１Ａｃ４（アクセッション番号ＡＡＡ７３０７７）；Ｃｒｙ１Ａｃ５（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３９）；Ｃｒｙ１Ａｃ６（アクセッション番号ＡＡＡ８６２６６）；Ｃｒｙ１Ａｃ７（アクセッション番号ＡＡＢ４６９８９）；Ｃｒｙ１Ａｃ８（アクセッション番号ＡＡＣ４４８４１）；Ｃｒｙ１Ａｃ９（アクセッション番号ＡＡＢ４９７６８）；Ｃｒｙ１Ａｃ１０（アクセッション番号ＣＡＡ０５５０５）；Ｃｒｙ１Ａｃ１１（アクセッション番号ＣＡＡ１０２７０）；Ｃｒｙ１Ａｃ１２（アクセッション番号Ｉ１２４１８）；Ｃｒｙ１Ａｃ１３（アクセッション番号ＡＡＤ３８７０１）；Ｃｒｙ１Ａｃ１４（アクセッション番号ＡＡＱ０６６０７）；Ｃｒｙ１Ａｃ１５（アクセッション番号ＡＡＮ０７７８８）；Ｃｒｙ１Ａｃ１６（アクセッション番号ＡＡＵ８７０３７）；Ｃｒｙ１Ａｃ１７（アクセッション番号ＡＡＸ１８７０４）；Ｃｒｙ１Ａｃ１８（アクセッション番号ＡＡＹ８８３４７）；Ｃｒｙ１Ａｃ１９（アクセッション番号ＡＢＤ３７０５３）；Ｃｒｙ１Ａｃ２０（アクセッション番号ＡＢＢ８９０４６）；Ｃｒｙ１Ａｃ２１（アクセッション番号ＡＡＹ６６９９２）；Ｃｒｙ１Ａｃ２２（アクセッション番号ＡＢＺ０１８３６）；Ｃｒｙ１Ａｃ２３（アクセッション番号ＣＡＱ３０４３１）；Ｃｒｙ１Ａｃ２４（アクセッション番号ＡＢＬ０１５３５）；Ｃｒｙ１Ａｃ２５（アクセッション番号ＦＪ５１３３２４）；Ｃｒｙ１Ａｃ２６（アクセッション番号ＦＪ６１７４４６）；Ｃｒｙ１Ａｃ２７（アクセッション番号ＦＪ６１７４４７）；Ｃｒｙ１Ａｃ２８（アクセッション番号ＡＣＭ９０３１９）；Ｃｒｙ１Ａｃ２９（アクセッション番号ＤＱ４３８９４１）；Ｃｒｙ１Ａｃ３０（アクセッション番号ＧＱ２２７５０７）；Ｃｒｙ１Ａｃ３１（アクセッション番号ＧＵ４４６６７４）；Ｃｒｙ１Ａｃ３２（アクセッション番号ＨＭ０６１０８１）；Ｃｒｙ１Ａｃ３３（アクセッション番号ＧＱ８６６９１３）；Ｃｒｙ１Ａｃ３４（アクセッション番号ＨＱ２３０３６４）；Ｃｒｙ１Ａｃ３５（アクセッション番号ＪＦ３４０１５７）；Ｃｒｙ１Ａｃ３６（アクセッション番号ＪＮ３８７１３７）；Ｃｒｙ１Ａｃ３７（アクセッション番号ＪＱ３１７６８５）；Ｃｒｙ１Ａｄ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４０）；Ｃｒｙ１Ａｄ２（アクセッション番号ＣＡＡ０１８８０）；Ｃｒｙ１Ａｅ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２４１０）；Ｃｒｙ１Ａｆ１（アクセッション番号ＡＡＢ８２７４９）；Ｃｒｙ１Ａｇ１（アクセッション番号ＡＡＤ４６１３７）；Ｃｒｙ１Ａｈ１（アクセッション番号ＡＡＱ１４３２６）；Ｃｒｙ１Ａｈ２（アクセッション番号ＡＢＢ７６６６４）；Ｃｒｙ１Ａｈ３（アクセッション番号ＨＱ４３９７７９）；Ｃｒｙ１Ａｉ１（アクセッション番号ＡＡ０３９７１９）；Ｃｒｙ１Ａｉ２（アクセッション番号ＨＱ４３９７８０）；Ｃｒｙ１Ａ様（アクセッション番号ＡＡＫ１４３３９）；Ｃｒｙ１Ｂａ１（アクセッション番号ＣＡＡ２９８９８）；Ｃｒｙ１Ｂａ２（アクセッション番号ＣＡＡ６５００３）；Ｃｒｙ１Ｂａ３（アクセッション番号ＡＡＫ６３２５１）；Ｃｒｙ１Ｂａ４（アクセッション番号ＡＡＫ５１０８４）；Ｃｒｙ１Ｂａ５（アクセッション番号ＡＢ０２０８９４）；Ｃｒｙ１Ｂａ６（アクセッション番号ＡＢＬ６０９２１）；Ｃｒｙ１Ｂａ７（アクセッション番号ＨＱ４３９７８１）；Ｃｒｙ１Ｂｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４４）；Ｃｒｙ１Ｂｂ２（アクセッション番号ＨＱ４３９７８２）；Ｃｒｙ１Ｂｃ１（アクセッション番号ＣＡＡ８６５６８）；Ｃｒｙ１Ｂｄ１（アクセッション番号ＡＡＤ１０２９２）；Ｃｒｙ１Ｂｄ２（アクセッション番号ＡＡＭ９３４９６）；Ｃｒｙ１Ｂｅ１（アクセッション番号ＡＡＣ３２８５０）；Ｃｒｙ１Ｂｅ２（アクセッション番号ＡＡＱ５２３８７）；Ｃｒｙ１Ｂｅ３（アクセッション番号ＡＣＶ９６７２０）；Ｃｒｙ１Ｂｅ４（アクセッション番号ＨＭ０７００２６）；Ｃｒｙ１Ｂｆ１（アクセッション番号ＣＡＣ５０７７８）；Ｃｒｙ１Ｂｆ２（アクセッション番号ＡＡＱ５２３８０）；Ｃｒｙ１Ｂｇ１（アクセッション番号ＡＡ０３９７２０）；Ｃｒｙ１Ｂｈ１（アクセッション番号ＨＱ５８９３３１）；Ｃｒｙ１Ｂｉ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７００）；Ｃｒｙ１Ｃａ１（アクセッション番号ＣＡＡ３０３９６）；Ｃｒｙ１Ｃａ２（アクセッション番号ＣＡＡ３１９５１）；Ｃｒｙ１Ｃａ３（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４３）；Ｃｒｙ１Ｃａ４（アクセッション番号ＣＡＡ０１８８６）；Ｃｒｙ１Ｃａ５（アクセッション番号ＣＡＡ６５４５７）；Ｃｒｙ１Ｃａ６［１］（アクセッション番号ＡＡＦ３７２２４）；Ｃｒｙ１Ｃａ７（アクセッション番号ＡＡＧ５０４３８）；Ｃｒｙ１Ｃａ８（アクセッション番号ＡＡＭ００２６４）；Ｃｒｙ１Ｃａ９（アクセッション番号ＡＡＬ７９３６２）；Ｃｒｙ１Ｃａ１０（アクセッション番号ＡＡＮ１６４６２）；Ｃｒｙ１Ｃａ１１（アクセッション番号ＡＡＸ５３０９４）；Ｃｒｙ１Ｃａ１２（アクセッション番号ＨＭ０７００２７）；Ｃｒｙ１Ｃａ１３（アクセッション番号ＨＱ４１２６２１）；Ｃｒｙ１Ｃａ１４（アクセッション番号ＪＮ６５１４９３）；Ｃｒｙ１Ｃｂ１（アクセッション番号Ｍ９７８８０）；Ｃｒｙ１Ｃｂ２（アクセッション番号ＡＡＧ３５４０９）；Ｃｒｙ１Ｃｂ３（アクセッション番号ＡＣＤ５０８９４）；Ｃｒｙ１Ｃｂ様（アクセッション番号ＡＡＸ６３９０１）；Ｃｒｙ１Ｄａ１（アクセッション番号ＣＡＡ３８０９９）；Ｃｒｙ１Ｄａ２（アクセッション番号Ｉ７６４１５）；Ｃｒｙ１Ｄａ３（アクセッション番号ＨＱ４３９７８４）；Ｃｒｙ１Ｄｂ１（アクセッション番号ＣＡＡ８０２３４）；Ｃｒｙ１Ｄｂ２（アクセッション番号ＡＡＫ４８９３７）；Ｃｒｙ１Ｄｃ１（アクセッション番号ＡＢＫ３５０７４）；Ｃｒｙ１Ｅａ１（アクセッション番号ＣＡＡ３７９３３）；Ｃｒｙ１Ｅａ２（アクセッション番号ＣＡＡ３９６０９）；Ｃｒｙ１Ｅａ３（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４５）；Ｃｒｙ１Ｅａ４（アクセッション番号ＡＡＤ０４７３２）；Ｃｒｙ１Ｅａ５（アクセッション番号Ａ１５５３５）；Ｃｒｙ１Ｅａ６（アクセッション番号ＡＡＬ５０３３０）；Ｃｒｙ１Ｅａ７（アクセッション番号ＡＡＷ７２９３６）；Ｃｒｙ１Ｅａ８（アクセッション番号ＡＢＸ１１２５８）；Ｃｒｙ１Ｅａ９（アクセッション番号ＨＱ４３９７８５）；Ｃｒｙ１Ｅａ１０（アクセッション番号ＡＤＲ００３９８）；Ｃｒｙ１Ｅａ１１（アクセッション番号ＪＱ６５２４５６）；Ｃｒｙ１Ｅｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４６）；Ｃｒｙ１Ｆａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４８）；Ｃｒｙ１Ｆａ２（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４７）；Ｃｒｙ１Ｆａ３（アクセッション番号ＨＭ０７００２８）；Ｃｒｙ１Ｆａ４（アクセッション番号ＨＭ４３９６３８）；Ｃｒｙ１Ｆｂ１（アクセッション番号ＣＡＡ８０２３５）；Ｃｒｙ１Ｆｂ２（アクセッション番号ＢＡＡ２５２９８）；Ｃｒｙ１Ｆｂ３（アクセッション番号ＡＡＦ２１７６７）；Ｃｒｙ１Ｆｂ４（アクセッション番号ＡＡＣ１０６４１）；Ｃｒｙ１Ｆｂ５（アクセッション番号ＡＡ０１３２９５）；Ｃｒｙ１Ｆｂ６（アクセッション番号ＡＣＤ５０８９２）；Ｃｒｙ１Ｆｂ７（アクセッション番号ＡＣＤ５０８９３）；Ｃｒｙ１Ｇａ１（アクセッション番号ＣＡＡ８０２３３）；Ｃｒｙ１Ｇａ２（アクセッション番号ＣＡＡ７０５０６）；Ｃｒｙ１Ｇｂ１（アクセッション番号ＡＡＤ１０２９１）；Ｃｒｙ１Ｇｂ２（アクセッション番号ＡＡ０１３７５６）；Ｃｒｙ１Ｇｃ１（アクセッション番号ＡＡＱ５２３８１）；Ｃｒｙ１Ｈａ１（アクセッション番号ＣＡＡ８０２３６）；Ｃｒｙ１Ｈｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ７９６９４）；Ｃｒｙ１Ｈｂ２（アクセッション番号ＨＱ４３９７８６）；Ｃｒｙ１Ｈ様（アクセッション番号ＡＡＦ０１２１３）
；Ｃｒｙ１Ｉａ１（アクセッション番号ＣＡＡ４４６３３）；Ｃｒｙ１Ｉａ２（アクセッション番号ＡＡＡ２２３５４）；Ｃｒｙ１Ｉａ３（アクセッション番号ＡＡＣ３６９９９）；Ｃｒｙ１Ｉａ４（アクセッション番号ＡＡＢ００９５８）；Ｃｒｙ１Ｉａ５（アクセッション番号ＣＡＡ７０１２４）；Ｃｒｙ１Ｉａ６（アクセッション番号ＡＡＣ２６９１０）；Ｃｒｙ１Ｉａ７（アクセッション番号ＡＡＭ７３５１６）；Ｃｒｙ１Ｉａ８（アクセッション番号ＡＡＫ６６７４２）；Ｃｒｙ１Ｉａ９（アクセッション番号ＡＡＱ０８６１６）；Ｃｒｙ１Ｉａ１０（アクセッション番号ＡＡＰ８６７８２）；Ｃｒｙ１Ｉａ１１（アクセッション番号ＣＡＣ８５９６４）；Ｃｒｙ１Ｉａ１２（アクセッション番号ＡＡＶ５３３９０）；Ｃｒｙ１Ｉａ１３（アクセッション番号ＡＢＦ８３２０２）；Ｃｒｙ１Ｉａ１４（アクセッション番号ＡＣＧ６３８７１）；Ｃｒｙ１Ｉａ１５（アクセッション番号ＦＪ６１７４４５）；Ｃｒｙ１Ｉａ１６（アクセッション番号ＦＪ６１７４４８）；Ｃｒｙ１Ｉａ１７（アクセッション番号ＧＵ９８９１９９）；Ｃｒｙ１Ｉａ１８（アクセッション番号ＡＤＫ２３８０１）；Ｃｒｙ１Ｉａ１９（アクセッション番号ＨＱ４３９７８７）；Ｃｒｙ１Ｉａ２０（アクセッション番号ＪＱ２２８４２６）；Ｃｒｙ１Ｉａ２１（アクセッション番号ＪＱ２２８４２４）；Ｃｒｙ１Ｉａ２２（アクセッション番号ＪＱ２２８４２７）；Ｃｒｙ１Ｉａ２３（アクセッション番号ＪＱ２２８４２８）；Ｃｒｙ１Ｉａ２４（アクセッション番号ＪＱ２２８４２９）；Ｃｒｙ１Ｉａ２５（アクセッション番号ＪＱ２２８４３０）；Ｃｒｙ１Ｉａ２６（アクセッション番号ＪＱ２２８４３１）；Ｃｒｙ１Ｉａ２７（アクセッション番号ＪＱ２２８４３２）；Ｃｒｙ１Ｉａ２８（アクセッション番号ＪＱ２２８４３３）；Ｃｒｙ１Ｉａ２９（アクセッション番号ＪＱ２２８４３４）；Ｃｒｙ１Ｉａ３０（アクセッション番号ＪＱ３１７６８６）；Ｃｒｙ１Ｉａ３１（アクセッション番号ＪＸ９４４０３８）；Ｃｒｙ１Ｉａ３２（アクセッション番号ＪＸ９４４０３９）；Ｃｒｙ１Ｉａ３３（アクセッション番号ＪＸ９４４０４０）；Ｃｒｙ１Ｉｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ８２１１４）；Ｃｒｙ１Ｉｂ２（アクセッション番号ＡＢＷ８８０１９）；Ｃｒｙ１Ｉｂ３（アクセッション番号ＡＣＤ７５５１５）；Ｃｒｙ１Ｉｂ４（アクセッション番号ＨＭ０５１２２７）；Ｃｒｙ１Ｉｂ５（アクセッション番号ＨＭ０７００２８）；Ｃｒｙ１Ｉｂ６（アクセッション番号ＡＤＫ３８５７９）；Ｃｒｙ１Ｉｂ７（アクセッション番号ＪＮ５７１７４０）；Ｃｒｙ１Ｉｂ８（アクセッション番号ＪＮ６７５７１４）；Ｃｒｙ１Ｉｂ９（アクセッション番号ＪＮ６７５７１５）；Ｃｒｙ１Ｉｂ１０（アクセッション番号ＪＮ６７５７１６）；Ｃｒｙ１Ｉｂ１１（アクセッション番号ＪＱ２２８４２３）；Ｃｒｙ１Ｉｃ１（アクセッション番号ＡＡＣ６２９３３）；Ｃｒｙ１Ｉｃ２（アクセッション番号ＡＡＥ７１６９１）；Ｃｒｙ１Ｉｄ１（アクセッション番号ＡＡＤ４４３６６）；Ｃｒｙ１Ｉｄ２（アクセッション番号ＪＱ２２８４２２）；Ｃｒｙ１Ｉｅ１（アクセッション番号ＡＡＧ４３５２６）；Ｃｒｙ１Ｉｅ２（アクセッション番号ＨＭ４３９６３６）；Ｃｒｙ１Ｉｅ３（アクセッション番号ＫＣ１５６６４７）；Ｃｒｙ１Ｉｅ４（アクセッション番号ＫＣ１５６６８１）；Ｃｒｙ１Ｉｆ１（アクセッション番号ＡＡＱ５２３８２）；Ｃｒｙ１Ｉｇ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７０１）；Ｃｒｙ１Ｉ様（アクセッション番号ＡＡＣ３１０９４）；Ｃｒｙ１Ｉ様（アクセッション番号ＡＢＧ８８８５９）；Ｃｒｙ１Ｊａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４１）；Ｃｒｙ１Ｊａ２（アクセッション番号ＨＭ０７００３０）；Ｃｒｙ１Ｊａ３（アクセッション番号ＪＱ２２８４２５）；Ｃｒｙ１Ｊｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ９８９５９）；Ｃｒｙ１Ｊｃ１（アクセッション番号ＡＡＣ３１０９２）；Ｃｒｙ１Ｊｃ２（アクセッション番号ＡＡＱ５２３７２）；Ｃｒｙ１Ｊｄ１（アクセッション番号ＣＡＣ５０７７９）；Ｃｒｙ１Ｋａ１（アクセッション番号ＡＡＢ００３７６）；Ｃｒｙ１Ｋａ２（アクセッション番号ＨＱ４３９７８３）；Ｃｒｙ１Ｌａ１（アクセッション番号ＡＡＳ６０１９１）；Ｃｒｙ１Ｌａ２（アクセッション番号ＨＭ０７００３１）；Ｃｒｙ１Ｍａ１（アクセッション番号ＦＪ８８４０６７）；Ｃｒｙ１Ｍａ２（アクセッション番号ＫＣ１５６６５９）；Ｃｒｙ１Ｎａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６４８）；Ｃｒｙ１Ｎｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６７８）；Ｃｒｙ１様（アクセッション番号ＡＡＣ３１０９１）；Ｃｒｙ２Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３５）；Ｃｒｙ２Ａａ２（アクセッション番号ＡＡＡ８３５１６）；Ｃｒｙ２Ａａ３（アクセッション番号Ｄ８６０６４）；Ｃｒｙ２Ａａ４（アクセッション番号ＡＡＣ０４８６７）；Ｃｒｙ２Ａａ５（アクセッション番号ＣＡＡ１０６７１）；Ｃｒｙ２Ａａ６（アクセッション番号ＣＡＡ１０６７２）；Ｃｒｙ２Ａａ７（アクセッション番号ＣＡＡ１０６７０）；Ｃｒｙ２Ａａ８（アクセッション番号ＡＡ０１３７３４）；Ｃｒｙ２Ａａ９（アクセッション番号ＡＡ０１３７５０）；Ｃｒｙ２Ａａ１０（アクセッション番号ＡＡＱ０４２６３）；Ｃｒｙ２Ａａ１１（アクセッション番号ＡＡＱ５２３８４）；Ｃｒｙ２Ａａ１２（アクセッション番号ＡＢ１８３６７１）；Ｃｒｙ２Ａａ１３（アクセッション番号ＡＢＬ０１５３６）；Ｃｒｙ２Ａａ１４（アクセッション番号ＡＣＦ０４９３９）；Ｃｒｙ２Ａａ１５（アクセッション番号ＪＮ４２６９４７）；Ｃｒｙ２Ａｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３４２）；Ｃｒｙ２Ａｂ２（アクセッション番号ＣＡＡ３９０７５）；Ｃｒｙ２Ａｂ３（アクセッション番号ＡＡＧ３６７６２）；Ｃｒｙ２Ａｂ４（アクセッション番号ＡＡ０１３２９６）；Ｃｒｙ２Ａｂ５（アクセッション番号ＡＡＱ０４６０９）；Ｃｒｙ２Ａｂ６（アクセッション番号ＡＡＰ５９４５７）；Ｃｒｙ２Ａｂ７（アクセッション番号ＡＡＺ６６３４７）；Ｃｒｙ２Ａｂ８（アクセッション番号ＡＢＣ９５９９６）；Ｃｒｙ２Ａｂ９（アクセッション番号ＡＢＣ７４９６８）；Ｃｒｙ２Ａｂ１０（アクセッション番号ＥＦ１５７３０６）；Ｃｒｙ２Ａｂ１１（アクセッション番号ＣＡＭ８４５７５）；Ｃｒｙ２Ａｂ１２（アクセッション番号ＡＢＭ２１７６４）；Ｃｒｙ２Ａｂ１３（アクセッション番号ＡＣＧ７６１２０）；Ｃｒｙ２Ａｂ１４（アクセッション番号ＡＣＧ７６１２１）；Ｃｒｙ２Ａｂ１５（アクセッション番号ＨＭ０３７１２６）；Ｃｒｙ２Ａｂ１６（アクセッション番号ＧＱ８６６９１４）；Ｃｒｙ２Ａｂ１７（アクセッション番号ＨＱ４３９７８９）；Ｃｒｙ２Ａｂ１８（アクセッション番号ＪＮ１３５２５５）；Ｃｒｙ２Ａｂ１９（アクセッション番号ＪＮ１３５２５６）；Ｃｒｙ２Ａｂ２０（アクセッション番号ＪＮ１３５２５７）；Ｃｒｙ２Ａｂ２１（アクセッション番号ＪＮ１３５２５８）；Ｃｒｙ２Ａｂ２２（アクセッション番号ＪＮ１３５２５９）；Ｃｒｙ２Ａｂ２３（アクセッション番号ＪＮ１３５２６０）；Ｃｒｙ２Ａｂ２４（アクセッション番号ＪＮ１３５２６１）；Ｃｒｙ２Ａｂ２５（アクセッション番号ＪＮ４１５４８５）；Ｃｒｙ２Ａｂ２６（アクセッション番号ＪＮ４２６９４６）；Ｃｒｙ２Ａｂ２７（アクセッション番号ＪＮ４１５７６４）；Ｃｒｙ２Ａｂ２８（アクセッション番号ＪＮ６５１４９４）；Ｃｒｙ２Ａｃ１（アクセッション番号ＣＡＡ４０５３６）；Ｃｒｙ２Ａｃ２（アクセッション番号ＡＡＧ３５４１０）；Ｃｒｙ２Ａｃ３（アクセッション番号ＡＡＱ５２３８５）；Ｃｒｙ２Ａｃ４（アクセッション番号ＡＢＣ９５９９７）；Ｃｒｙ２Ａｃ５（アクセッション番号ＡＢＣ７４９６９）；Ｃｒｙ２Ａｃ６（アクセッション番号ＡＢＣ７４７９３）；Ｃｒｙ２Ａｃ７（アクセッション番号ＣＡＬ１８６９０）；Ｃｒｙ２Ａｃ８（アクセッション番号ＣＡＭ０９３２５）；Ｃｒｙ２Ａｃ９（アクセッション番号ＣＡＭ０９３２６）；Ｃｒｙ２Ａｃ１０（アクセッション番号ＡＢＮ１５１０４）；Ｃｒｙ２Ａｃ１１（アクセッション番号ＣＡＭ８３８９５）；Ｃｒｙ２Ａｃ１２（アクセッション番号ＣＡＭ８３８９６）；Ｃｒｙ２Ａｄ１（アクセッション番号ＡＡＦ０９５８３）；Ｃｒｙ２Ａｄ２（アクセッション番号ＡＢＣ８６９２７）；Ｃｒｙ２Ａｄ３（アクセッション番号ＣＡＫ２９５０４）；Ｃｒｙ２Ａｄ４（アクセッション番号ＣＡＭ３２３３１）；Ｃｒｙ２Ａｄ５（アクセッション番号ＣＡ０７８７３９）；Ｃｒｙ２Ａｅ１（アクセッション番号ＡＡＱ５２３６２）；Ｃｒｙ２Ａｆ１（アクセッション番号ＡＢ０３０５１９）；Ｃｒｙ２Ａｆ２（アクセッション番号ＧＱ８６６９１５）；Ｃｒｙ２Ａｇ１（アクセッション番号ＡＣＨ９１６１０）；Ｃｒｙ２Ａｈ１（アクセッション番号ＥＵ９３９４５３）；Ｃｒｙ２Ａｈ２（アクセッション番号ＡＣＬ８０６６５）；Ｃｒｙ２Ａｈ３（アクセッション番号ＧＵ０７３３８０）；Ｃｒｙ２Ａｈ４（アクセッション番号ＫＣ１５６７０２）；Ｃｒｙ２Ａｉ１（アクセッション番号ＦＪ７８８３８８）；Ｃｒｙ２Ａｊ（アクセッション番号）；Ｃｒｙ２Ａｋ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６６０）；Ｃｒｙ２Ｂａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６５８）；Ｃｒｙ３Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３６）；Ｃｒｙ３Ａａ２（アクセッション番号ＡＡＡ２２５４１）；Ｃｒｙ３Ａａ３（アクセッション番号ＣＡＡ６８４８２）；Ｃｒｙ３Ａａ４（アクセッション番号ＡＡＡ２２５４２）；Ｃｒｙ３Ａａ５（アクセッション番号ＡＡＡ５０２５５）；Ｃｒｙ３Ａａ６（アクセッション番号ＡＡＣ４３２６６）；Ｃｒｙ３Ａａ７（アクセッション番号ＣＡＢ４１４１１）；Ｃｒｙ３Ａａ８（アクセッション番号ＡＡＳ７９４８７）；Ｃｒｙ３Ａａ９（アクセッション番号ＡＡＷ０５６５９）；Ｃｒｙ３Ａａ１０（アクセッション番号ＡＡＵ２９４１１）；Ｃｒｙ３Ａａ１１（アクセッション番号ＡＡＷ８２８７２）；Ｃｒｙ３Ａａ１２（アクセッション番号ＡＢＹ４９１３６）；Ｃｒｙ３Ｂａ１（アクセッション番号ＣＡＡ３４９８３）；Ｃｒｙ３Ｂａ２（アクセッション番号ＣＡＡ００６４５）；Ｃｒｙ３Ｂａ３（アクセッション番号ＪＱ３９７３２７）；Ｃｒｙ３Ｂｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３４）；Ｃｒｙ３Ｂｂ２（アクセッション番号ＡＡＡ７４１９８）；Ｃｒｙ３Ｂｂ３（アクセッション番号Ｉ１５４７５）；Ｃｒｙ３Ｃａ１（アクセッション番号ＣＡＡ４２４６９）；Ｃｒｙ４Ａａ１（アクセッション番号ＣＡＡ６８４８５）；Ｃｒｙ４Ａａ２（アクセッション番号ＢＡＡ００１７９）；Ｃｒｙ４Ａａ３（アクセッション番号ＣＡＤ３０１４８）；Ｃｒｙ４Ａａ４（アクセッション番号ＡＦＢ１８３１７）；Ｃｒｙ４Ａ様（アクセッション番号ＡＡＹ９６３２１）；Ｃｒｙ４Ｂａ１（アクセッション番号ＣＡＡ３０３１２）；Ｃｒｙ４Ｂａ２（アクセッション番号ＣＡＡ３０１１４）；Ｃｒｙ４Ｂａ３（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３７）；Ｃｒｙ４Ｂａ４（アクセッション番号ＢＡＡ００１７８）；Ｃｒｙ４Ｂａ５（アクセッション番号ＣＡＤ３００９５）；Ｃｒｙ４Ｂａ様（アクセッション番号ＡＢＣ４７６８６）；Ｃｒｙ４Ｃａ１（アクセッション番号ＥＵ６４６２０２）；Ｃｒｙ４Ｃｂ１（アクセッション番号ＦＪ４０３２０８）；Ｃｒｙ４Ｃｂ２（アクセッション番号ＦＪ５９７６２２）；Ｃｒｙ４Ｃｃ１（アクセッション番号ＦＪ４０３２０７）；Ｃｒｙ５Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ６７６９４）；Ｃｒｙ５Ａｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ６７６９３）；Ｃｒｙ５Ａｃ１（アクセッション番号Ｉ３４５４３）；Ｃｒｙ５Ａｄ１（アクセッション番号ＡＢＱ８２０８７）；Ｃｒｙ５Ｂａ１（アクセッション番号ＡＡＡ６８５９８）；Ｃｒｙ５Ｂａ２（アクセッション番号ＡＢＷ８８９３１）；Ｃｒｙ５Ｂａ３（アクセッション番号ＡＦＪ０４４１７）；Ｃｒｙ５Ｃａ１（アクセッション番号ＨＭ４６１８６９）；Ｃｒｙ５Ｃａ２（アクセッション番号ＺＰ＿０４１２３４２６）；Ｃｒｙ５Ｄａ１（アクセッション番号ＨＭ４６１８７０）；Ｃｒｙ５
Ｄａ２（アクセッション番号ＺＰ＿０４１２３９８０）；Ｃｒｙ５Ｅａ１（アクセッション番号ＨＭ４８５５８０）；Ｃｒｙ５Ｅａ２（アクセッション番号ＺＰ＿０４１２４０３８）；Ｃｒｙ６Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３５７）；Ｃｒｙ６Ａａ２（アクセッション番号ＡＡＭ４６８４９）；Ｃｒｙ６Ａａ３（アクセッション番号ＡＢＨ０３３７７）；Ｃｒｙ６Ｂａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３５８）；Ｃｒｙ７  Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３５１）；Ｃｒｙ７Ａｂ１（アクセッション番号ＡＡＡ２１１２０）；Ｃｒｙ７Ａｂ２（アクセッション番号ＡＡＡ２１１２１）；Ｃｒｙ７Ａｂ３（アクセッション番号ＡＢＸ２４５２２）；Ｃｒｙ７  Ａｂ４（アクセッション番号ＥＵ３８０６７８）；Ｃｒｙ７  Ａｂ５（アクセッション番号ＡＢＸ７９５５５）；Ｃｒｙ７  Ａｂ６（アクセッション番号ＡＣＩ４４００５）；Ｃｒｙ７  Ａｂ７（アクセッション番号ＡＤＢ８９２１６）；Ｃｒｙ７  Ａｂ８（アクセッション番号ＧＵ１４５２９９）；Ｃｒｙ７Ａｂ９（アクセッション番号ＡＤＤ９２５７２）；Ｃｒｙ７Ｂａ１（アクセッション番号ＡＢＢ７０８１７）；Ｃｒｙ７Ｂｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６５３）；Ｃｒｙ７Ｃａ１（アクセッション番号ＡＢＲ６７８６３）；Ｃｒｙ７Ｃｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６９８）；Ｃｒｙ７Ｄａ１（アクセッション番号ＡＣＱ９９５４７）；Ｃｒｙ７Ｄａ２（アクセッション番号ＨＭ５７２２３６）；Ｃｒｙ７Ｄａ３（アクセッション番号ＫＣ１５６６７９）；Ｃｒｙ７Ｅａ１（アクセッション番号ＨＭ０３５０８６）；Ｃｒｙ７Ｅａ２（アクセッション番号ＨＭ１３２１２４）；Ｃｒｙ７Ｅａ３（アクセッション番号ＥＥＭ１９４０３）；Ｃｒｙ７Ｆａ１（アクセッション番号ＨＭ０３５０８８）；Ｃｒｙ７Ｆａ２（アクセッション番号ＥＥＭ１９０９０）；Ｃｒｙ７Ｆｂ１（アクセッション番号ＨＭ５７２２３５）；Ｃｒｙ７Ｆｂ２（アクセッション番号ＫＣ１５６６８２）；Ｃｒｙ７Ｇａ１（アクセッション番号ＨＭ５７２２３７）；Ｃｒｙ７Ｇａ２（アクセッション番号ＫＣ１５６６６９）；Ｃｒｙ７Ｇｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６５０）；Ｃｒｙ７Ｇｃ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６５４）；Ｃｒｙ７Ｇｄ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６９７）；Ｃｒｙ７Ｈａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６５１）；Ｃｒｙ７Ｉａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６６５）；Ｃｒｙ７Ｊａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６７１）；Ｃｒｙ７Ｋａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６８０）；Ｃｒｙ７Ｋｂ１（アクセッション番号ＢＡＭ９９３０６）；Ｃｒｙ７Ｌａ１（アクセッション番号ＢＡＭ９９３０７）；Ｃｒｙ８Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２１１１７）；Ｃｒｙ８Ａｂ１（アクセッション番号ＥＵ０４４８３０）；Ｃｒｙ８Ａｃ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６６２）；Ｃｒｙ８Ａｄ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６８４）；Ｃｒｙ８Ｂａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２１１１８）；Ｃｒｙ８Ｂｂ１（アクセッション番号ＣＡＤ５７５４２）；Ｃｒｙ８Ｂｃ１（アクセッション番号ＣＡＤ５７５４３）；Ｃｒｙ８Ｃａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２１１１９）；Ｃｒｙ８Ｃａ２（アクセッション番号ＡＡＲ９８７８３）；Ｃｒｙ８Ｃａ３（アクセッション番号ＥＵ６２５３４９）；Ｃｒｙ８Ｃａ４（アクセッション番号ＡＤＢ５４８２６）；Ｃｒｙ８Ｄａ１（アクセッション番号ＢＡＣ０７２２６）；Ｃｒｙ８Ｄａ２（アクセッション番号ＢＤ１３３５７４）；Ｃｒｙ８Ｄａ３（アクセッション番号ＢＤ１３３５７５）；Ｃｒｙ８Ｄｂ１（アクセッション番号ＢＡＦ９３４８３）；Ｃｒｙ８Ｅａ１（アクセッション番号ＡＡＱ７３４７０）；Ｃｒｙ８Ｅａ２（アクセッション番号ＥＵ０４７５９７）；Ｃｒｙ８Ｅａ３（アクセッション番号ＫＣ８５５２１６）；Ｃｒｙ８Ｆａ１（アクセッション番号ＡＡＴ４８６９０）；Ｃｒｙ８Ｆａ２（アクセッション番号ＨＱ１７４２０８）；Ｃｒｙ８Ｆａ３（アクセッション番号ＡＦＨ７８１０９）；Ｃｒｙ８Ｇａ１（アクセッション番号ＡＡＴ４６０７３）；Ｃｒｙ８Ｇａ２（アクセッション番号ＡＢＣ４２０４３）；Ｃｒｙ８Ｇａ３（アクセッション番号ＦＪ１９８０７２）；Ｃｒｙ８Ｈａ１（アクセッション番号ＡＡＷ８１０３２）；Ｃｒｙ８Ｉａ１（アクセッション番号ＥＵ３８１０４４）；Ｃｒｙ８Ｉａ２（アクセッション番号ＧＵ０７３３８１）；Ｃｒｙ８Ｉａ３（アクセッション番号ＨＭ０４４６６４）；Ｃｒｙ８Ｉａ４（アクセッション番号ＫＣ１５６６７４）；Ｃｒｙ８Ｉｂ１（アクセッション番号ＧＵ３２５７７２）；Ｃｒｙ８Ｉｂ２（アクセッション番号ＫＣ１５６６７７）；Ｃｒｙ８Ｊａ１（アクセッション番号ＥＵ６２５３４８）；Ｃｒｙ８Ｋａ１（アクセッション番号ＦＪ４２２５５８）；Ｃｒｙ８Ｋａ２（アクセッション番号ＡＣＮ８７２６２）；Ｃｒｙ８Ｋｂ１（アクセッション番号ＨＭ１２３７５８）；Ｃｒｙ８Ｋｂ２（アクセッション番号ＫＣ１５６６７５）；Ｃｒｙ８Ｌａ１（アクセッション番号ＧＵ３２５７７１）；Ｃｒｙ８Ｍａ１（アクセッション番号ＨＭ０４４６６５）；Ｃｒｙ８Ｍａ２（アクセッション番号ＥＥＭ８６５５１）；Ｃｒｙ８Ｍａ３（アクセッション番号ＨＭ２１０５７４）；Ｃｒｙ８Ｎａ１（アクセッション番号ＨＭ６４０９３９）；Ｃｒｙ８Ｐａ１（アクセッション番号ＨＱ３８８４１５）；Ｃｒｙ８Ｑａ１（アクセッション番号ＨＱ４４１１６６）；Ｃｒｙ８Ｑａ２（アクセッション番号ＫＣ１５２４６８）；Ｃｒｙ８Ｒａ１（アクセッション番号ＡＦＰ８７５４８）；Ｃｒｙ８Ｓａ１（アクセッション番号ＪＱ７４０５９９）；Ｃｒｙ８Ｔａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６７３）；Ｃｒｙ８様（アクセッション番号ＦＪ７７０５７１）；Ｃｒｙ８様（アクセッション番号ＡＢＳ５３００３）；Ｃｒｙ９Ａａ１（アクセッション番号ＣＡＡ４１１２２）；Ｃｒｙ９Ａａ２（アクセッション番号ＣＡＡ４１４２５）；Ｃｒｙ９Ａａ３（アクセッション番号ＧＱ２４９２９３）；Ｃｒｙ９Ａａ４（アクセッション番号ＧＱ２４９２９４）；Ｃｒｙ９Ａａ５（アクセッション番号ＪＸ１７４１１０）；Ｃｒｙ９Ａａ様（アクセッション番号ＡＡＱ５２３７６）；Ｃｒｙ９Ｂａ１（アクセッション番号ＣＡＡ５２９２７）；Ｃｒｙ９Ｂａ２（アクセッション番号ＧＵ２９９５２２）；Ｃｒｙ９Ｂｂ１（アクセッション番号ＡＡＶ２８７１６）；Ｃｒｙ９Ｃａ１（アクセッション番号ＣＡＡ８５７６４）；Ｃｒｙ９Ｃａ２（アクセッション番号ＡＡＱ５２３７５）；Ｃｒｙ９Ｄａ１（アクセッション番号ＢＡＡ１９９４８）；Ｃｒｙ９Ｄａ２（アクセッション番号ＡＡＢ９７９２３）；Ｃｒｙ９Ｄａ３（アクセッション番号ＧＱ２４９２９３）；Ｃｒｙ９Ｄａ４（アクセッション番号ＧＱ２４９２９７）；Ｃｒｙ９Ｄｂ１（アクセッション番号ＡＡＸ７８４３９）；Ｃｒｙ９Ｄｃ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６８３）；Ｃｒｙ９Ｅａ１（アクセッション番号ＢＡＡ３４９０８）；Ｃｒｙ９Ｅａ２（アクセッション番号ＡＡ０１２９０８）；Ｃｒｙ９Ｅａ３（アクセッション番号ＡＢＭ２１７６５）；Ｃｒｙ９Ｅａ４（アクセッション番号ＡＣＥ８８２６７）；Ｃｒｙ９Ｅａ５（アクセッション番号ＡＣＦ０４７４３）；Ｃｒｙ９Ｅａ６（アクセッション番号ＡＣＧ６３８７２）；Ｃｒｙ９Ｅａ７（アクセッション番号ＦＪ３８０９２７）；Ｃｒｙ９Ｅａ８（アクセッション番号ＧＱ２４９２９２）；Ｃｒｙ９Ｅａ９（アクセッション番号ＪＮ６５１４９５）；Ｃｒｙ９Ｅｂ１（アクセッション番号ＣＡＣ５０７８０）；Ｃｒｙ９Ｅｂ２（アクセッション番号ＧＱ２４９２９８）；Ｃｒｙ９Ｅｂ３（アクセッション番号ＫＣ１５６６４６）；Ｃｒｙ９Ｅｃ１（アクセッション番号ＡＡＣ６３３６６）；Ｃｒｙ９Ｅｄ１（アクセッション番号ＡＡＸ７８４４０）；Ｃｒｙ９Ｅｅ１（アクセッション番号ＧＱ２４９２９６）；Ｃｒｙ９Ｅｅ２（アクセッション番号ＫＣ１５６６６４）；Ｃｒｙ９Ｆａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６９２）；Ｃｒｙ９Ｇａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６９９）；Ｃｒｙ９様（アクセッション番号ＡＡＣ６３３６６）；Ｃｒｙ１０Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２６１４）；Ｃｒｙ１０Ａａ２（アクセッション番号Ｅ００６１４）；Ｃｒｙ１０Ａａ３（アクセッション番号ＣＡＤ３００９８）；Ｃｒｙ１０Ａａ４（アクセッション番号ＡＦＢ１８３１８）；Ｃｒｙ１０Ａ様（アクセッション番号ＤＱ１６７５７８）；Ｃｒｙ１  １Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３５２）；Ｃｒｙ１  １Ａａ２（アクセッション番号ＡＡＡ２２６１１）；Ｃｒｙ１１Ａａ３（アクセッション番号ＣＡＤ３００８１）；Ｃｒｙ１１Ａａ４（アクセッション番号ＡＦＢ１８３１９）；Ｃｒｙ１１Ａａ様（アクセッション番号ＤＱ１６６５３１）；Ｃｒｙ１１Ｂａ１（アクセッション番号ＣＡＡ６０５０４）；Ｃｒｙ１１Ｂｂ１（アクセッション番号ＡＡＣ９７１６２）；Ｃｒｙ１１Ｂｂ２（アクセッション番号ＨＭ０６８６１５）；Ｃｒｙ１２Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３５５）；Ｃｒｙ１３Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３５６）；Ｃｒｙ１４Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２１５１６）；Ｃｒｙ１４Ａｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６５２）；Ｃｒｙ１５Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＡ２２３３３）；Ｃｒｙ１６Ａａ１（アクセッション番号ＣＡＡ６３８６０）；Ｃｒｙ１７Ａａ１（アクセッション番号ＣＡＡ６７８４１）；Ｃｒｙ１８Ａａ１（アクセッション番号ＣＡＡ６７５０６）；Ｃｒｙ１８Ｂａ１（アクセッション番号ＡＡＦ８９６６７）；Ｃｒｙ１８Ｃａ１（アクセッション番号ＡＡＦ８９６６８）；Ｃｒｙ１９Ａａ１（アクセッション番号ＣＡＡ６８��７５）；Ｃｒｙ１９Ｂａ１（アクセッション番号ＢＡＡ３２３９７）；Ｃｒｙ１９Ｃａ１（アクセッション番号ＡＦＭ３７５７２）；Ｃｒｙ２０Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＢ９３４７６）；Ｃｒｙ２０Ｂａ１（アクセッション番号ＡＣＳ９３６０１）；Ｃｒｙ２０Ｂａ２（アクセッション番号ＫＣ１５６６９４）；Ｃｒｙ２０様（アクセッション番号ＧＱ１４４３３３）；Ｃｒｙ２１Ａａ１（アクセッション番号Ｉ３２９３２）；Ｃｒｙ２１Ａａ２（アクセッション番号Ｉ６６４７７）；Ｃｒｙ２１Ｂａ１（アクセッション番号ＢＡＣ０６４８４）；Ｃｒｙ２１Ｃａ１（アクセッション番号ＪＦ５２１５７７）；Ｃｒｙ２１Ｃａ２（アクセッション番号ＫＣ１５６６８７）；Ｃｒｙ２１Ｄａ１（アクセッション番号ＪＦ５２１５７８）；Ｃｒｙ２２Ａａ１（アクセッション番号Ｉ３４５４７）；Ｃｒｙ２２Ａａ２（アクセッション番号ＣＡＤ４３５７９）；Ｃｒｙ２２Ａａ３（アクセッション番号ＡＣＤ９３２１１）；Ｃｒｙ２２Ａｂ１（アクセッション番号ＡＡＫ５０４５６）；Ｃｒｙ２２Ａｂ２（アクセッション番号ＣＡＤ４３５７７）；Ｃｒｙ２２Ｂａ１（アクセッション番号ＣＡＤ４３５７８）；Ｃｒｙ２２Ｂｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６７２）；Ｃｒｙ２３Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＦ７６３７５）；Ｃｒｙ２４Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＣ６１８９１）；Ｃｒｙ２４Ｂａ１（アクセッション番号ＢＡＤ３２６５７）；Ｃｒｙ２４Ｃａ１（アクセッション番号ＣＡＪ４３６００）；Ｃｒｙ２５Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＣ６１８９２）；Ｃｒｙ２６Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＤ２５０７５）；Ｃｒｙ２７Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＡ８２７９６）；Ｃｒｙ２８Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＤ２４１８９）；Ｃｒｙ２８Ａａ２（アクセッション番号ＡＡＧ００２３５）；Ｃｒｙ２９Ａａ１（アクセッション番号ＣＡＣ８０９８５）；Ｃｒｙ３０Ａａ１（アクセッション番号ＣＡＣ８０９８６）；Ｃｒｙ３０Ｂａ１（アクセッション番号ＢＡＤ０００５２）；Ｃｒｙ３０Ｃａ１（アクセッション番号ＢＡＤ６７１５７）；Ｃｒｙ３０Ｃａ２（アクセッション番号ＡＣＵ２４７８１）；Ｃｒｙ３０Ｄａ１（アクセッション番号ＥＦ０９５９５５）；Ｃｒｙ３０Ｄｂ１（アクセッション番号ＢＡＥ８００８８）；Ｃｒｙ３０Ｅａ１（アクセッション番号ＡＣＣ９５４４５）；Ｃｒｙ３０Ｅａ２（アクセッション番号Ｆ
Ｊ４９９３８９）；Ｃｒｙ３０Ｆａ１（アクセッション番号ＡＣＩ２２６２５）；Ｃｒｙ３０Ｇａ１（アクセッション番号ＡＣＧ６００２０）；Ｃｒｙ３０Ｇａ２（アクセッション番号ＨＱ６３８２１７）；Ｃｒｙ３１Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＢ１１７５７）；Ｃｒｙ３１Ａａ２（アクセッション番号ＡＡＬ８７４５８）；Ｃｒｙ３１Ａａ３（アクセッション番号ＢＡＥ７９８０８）；Ｃｒｙ３１Ａａ４（アクセッション番号ＢＡＦ３２５７１）；Ｃｒｙ３１Ａａ５（アクセッション番号ＢＡＦ３２５７２）；Ｃｒｙ３１Ａａ６（アクセッション番号ＢＡ１４４０２６）；Ｃｒｙ３１Ａｂ１（アクセッション番号ＢＡＥ７９８０９）；Ｃｒｙ３１Ａｂ２（アクセッション番号ＢＡＦ３２５７０）；Ｃｒｙ３１Ａｃ１（アクセッション番号ＢＡＦ３４３６８）；Ｃｒｙ３１Ａｃ２（アクセッション番号ＡＢ７３１６００）；Ｃｒｙ３１Ａｄ１（アクセッション番号ＢＡ１４４０２２）；Ｃｒｙ３２Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＧ３６７１１）；Ｃｒｙ３２Ａａ２（アクセッション番号ＧＵ０６３８４９）；Ｃｒｙ３２Ａｂ１（アクセッション番号ＧＵ０６３８５０）；Ｃｒｙ３２Ｂａ１（アクセッション番号ＢＡＢ７８６０１）；Ｃｒｙ３２Ｃａ１（アクセッション番号ＢＡＢ７８６０２）；Ｃｒｙ３２Ｃｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７０８）；Ｃｒｙ３２Ｄａ１（アクセッション番号ＢＡＢ７８６０３）；Ｃｒｙ３２Ｅａ１（アクセッション番号ＧＵ３２４２７４）；Ｃｒｙ３２Ｅａ２（アクセッション番号ＫＣ１５６６８６）；Ｃｒｙ３２Ｅｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６６３）；Ｃｒｙ３２Ｆａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６５６）；Ｃｒｙ３２Ｇａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６５７）；Ｃｒｙ３２Ｈａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６６１）；Ｃｒｙ３２Ｈｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６６６）；Ｃｒｙ３２Ｉａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６６７）；Ｃｒｙ３２Ｊａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６８５）；Ｃｒｙ３２Ｋａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６８８）；Ｃｒｙ３２Ｌａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６８９）；Ｃｒｙ３２Ｍａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６９０）；Ｃｒｙ３２Ｍｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７０４）；Ｃｒｙ３２Ｎａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６９１）；Ｃｒｙ３２Ｏａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７０３）；Ｃｒｙ３２Ｐａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７０５）；Ｃｒｙ３２Ｑａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７０６）；Ｃｒｙ３２Ｒａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７０７）；Ｃｒｙ３２Ｓａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７０９）；Ｃｒｙ３２Ｔａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６７１０）；Ｃｒｙ３２Ｕａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６５５）；Ｃｒｙ３３Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＬ２６８７１）；Ｃｒｙ３４Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＧ５０３４１）；Ｃｒｙ３４Ａａ２（アクセッション番号ＡＡＫ６４５６０）；Ｃｒｙ３４Ａａ３（アクセッション番号ＡＡＴ２９０３２）；Ｃｒｙ３４Ａａ４（アクセッション番号ＡＡＴ２９０３０）；Ｃｒｙ３４Ａｂ１（アクセッション番号ＡＡＧ４１６７１）；Ｃｒｙ３４Ａｃ１（アクセッション番号ＡＡＧ５０１１８）；Ｃｒｙ３４Ａｃ２（アクセッション番号ＡＡＫ６４５６２）；Ｃｒｙ３４Ａｃ３（アクセッション番号ＡＡＴ２９０２９）；Ｃｒｙ３４Ｂａ１（アクセッション番号ＡＡＫ６４５６５）；Ｃｒｙ３４Ｂａ２（アクセッション番号ＡＡＴ２９０３３）；Ｃｒｙ３４Ｂａ３（アクセッション番号ＡＡＴ２９０３１）；Ｃｒｙ３５Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＧ５０３４２）；Ｃｒｙ３５Ａａ２（アクセッション番号ＡＡＫ６４５６１）；Ｃｒｙ３５Ａａ３（アクセッション番号ＡＡＴ２９０２８）；Ｃｒｙ３５Ａａ４（アクセッション番号ＡＡＴ２９０２５）；Ｃｒｙ３５Ａｂ１（アクセッション番号ＡＡＧ４１６７２）；Ｃｒｙ３５Ａｂ２（アクセッション番号ＡＡＫ６４５６３）；Ｃｒｙ３５Ａｂ３（アクセッション番号ＡＹ５３６８９１）；Ｃｒｙ３５Ａｃ１（アクセッション番号ＡＡＧ５０１１７）；Ｃｒｙ３５Ｂａ１（アクセッション番号ＡＡＫ６４５６６）；Ｃｒｙ３５Ｂａ２（アクセッション番号ＡＡＴ２９０２７）；Ｃｒｙ３５Ｂａ３（アクセッション番号ＡＡＴ２９０２６）；Ｃｒｙ３６Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＫ６４５５８）；Ｃｒｙ３７  Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＦ７６３７６）；Ｃｒｙ３８Ａａ１（アクセッション番号ＡＡＫ６４５５９）；Ｃｒｙ３９Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＢ７２０１６）；Ｃｒｙ４０Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＢ７２０１８）；Ｃｒｙ４０Ｂａ１（アクセッション番号ＢＡＣ７７６４８）；Ｃｒｙ４０Ｃａ１（アクセッション番号ＥＵ３８１０４５）；Ｃｒｙ４０Ｄａ１（アクセッション番号ＡＣＦ１５１９９）；Ｃｒｙ４１Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＤ３５１５７）；Ｃｒｙ４１Ａｂ１（アクセッション番号ＢＡＤ３５１６３）；Ｃｒｙ４１Ｂａ１（アクセッション番号ＨＭ４６１８７１）；Ｃｒｙ４１Ｂａ２（アクセッション番号ＺＰ＿０４０９９６５２）；Ｃｒｙ４２Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＤ３５１６６）；Ｃｒｙ４３Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＤ１５３０１）；Ｃｒｙ４３Ａａ２（アクセッション番号ＢＡＤ９５４７４）；Ｃｒｙ４３Ｂａ１（アクセッション番号ＢＡＤ１５３０３）；Ｃｒｙ４３Ｃａ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６７６）；Ｃｒｙ４３Ｃｂ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６９５）；Ｃｒｙ４３Ｃｃ１（アクセッション番号ＫＣ１５６６９６）；Ｃｒｙ４３様（アクセッション番号ＢＡＤ１５３０５）；Ｃｒｙ４４Ａａ（アクセッション番号ＢＡＤ０８５３２）；Ｃｒｙ４５Ａａ（アクセッション番号ＢＡＤ２２５７７）；Ｃｒｙ４６Ａａ（アクセッション番号ＢＡＣ７９０１０）；Ｃｒｙ４６Ａａ２（アクセッション番号ＢＡＧ６８９０６）；Ｃｒｙ４６Ａｂ（アクセッション番号ＢＡＤ３５１７０）；Ｃｒｙ４７  Ａａ（アクセッション番号ＡＡＹ２４６９５）；Ｃｒｙ４８Ａａ（アクセッション番号ＣＡＪ１８３５１）；Ｃｒｙ４８Ａａ２（アクセッション番号ＣＡＪ８６５４５）；Ｃｒｙ４８Ａａ３（アクセッション番号ＣＡＪ８６５４６）；Ｃｒｙ４８Ａｂ（アクセッション番号ＣＡＪ８６５４８）；Ｃｒｙ４８Ａｂ２（アクセッション番号ＣＡＪ８６５４９）；Ｃｒｙ４９Ａａ（アクセッション番号ＣＡＨ５６５４１）；Ｃｒｙ４９Ａａ２（ア��セッション番号ＣＡＪ８６５４１）；Ｃｒｙ４９Ａａ３（アクセッション番号ＣＡＪ８６５４３）；Ｃｒｙ４９Ａａ４（アクセッション番号ＣＡＪ８６５４４）；Ｃｒｙ４９Ａｂ１（アクセッション番号ＣＡＪ８６５４２）；Ｃｒｙ５０Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＥ８６９９９）；Ｃｒｙ５０Ｂａ１（アクセッション番号ＧＵ４４６６７５）；Ｃｒｙ５０Ｂａ２（アクセッション番号ＧＵ４４６６７６）；Ｃｒｙ５１Ａａ１（アクセッション番号ＡＢ１１４４４４）；Ｃｒｙ５１Ａａ２（アクセッション番号ＧＵ５７０６９７）；Ｃｒｙ５２Ａａ１（アクセッション番号ＥＦ６１３４８９）；Ｃｒｙ５２Ｂａ１（アクセッション番号ＦＪ３６１７６０）；Ｃｒｙ５３Ａａ１（アクセッション番号ＥＦ６３３４７６）；Ｃｒｙ５３Ａｂ１（アクセッション番号ＦＪ３６１７５９）；Ｃｒｙ５４Ａａ１（アクセッション番号ＡＣＡ５２１９４）；Ｃｒｙ５４Ａａ２（アクセッション番号ＧＱ１４０３４９）；Ｃｒｙ５４Ｂａ１（アクセッション番号ＧＵ４４６６７７）；Ｃｒｙ５５Ａａ１（アクセッション番号ＡＢＷ８８９３２）；Ｃｒｙ５４Ａｂ１（アクセッション番号ＪＱ９１６９０８）；Ｃｒｙ５５Ａａ２（アクセッション番号ＡＡＥ３３５２６）；Ｃｒｙ５６Ａａ１（アクセッション番号ＡＣＵ５７４９９）；Ｃｒｙ５６Ａａ２（アクセッション番号ＧＱ４８３５１２）；Ｃｒｙ５６Ａａ３（アクセッション番号ＪＸ０２５５６７）；Ｃｒｙ５７Ａａ１（アクセッション番号ＡＮＣ８７２６１）；Ｃｒｙ５８Ａａ１（アクセッション番号ＡＮＣ８７２６０）；Ｃｒｙ５９Ｂａ１（アクセッション番号ＪＮ７９０６４７）；Ｃｒｙ５９Ａａ１（アクセッション番号ＡＣＲ４３７５８）；Ｃｒｙ６０Ａａ１（アクセッション番号ＡＣＵ２４７８２）；Ｃｒｙ６０Ａａ２（アクセッション番号ＥＡ０５７２５４）；Ｃｒｙ６０Ａａ３（アクセッション番号ＥＥＭ９９２７８）；Ｃｒｙ６０Ｂａ１（アクセッション番号ＧＵ８１０８１８）；Ｃｒｙ６０Ｂａ２（アクセッション番号ＥＡ０５７２５３）；Ｃｒｙ６０Ｂａ３（アクセッション番号ＥＥＭ９９２７９）；Ｃｒｙ６１Ａａ１（アクセッション番号ＨＭ０３５０８７）；Ｃｒｙ６１Ａａ２（アクセッション番号ＨＭ１３２１２５）；Ｃｒｙ６１Ａａ３（アクセッション番号ＥＥＭ１９３０８）；Ｃｒｙ６２Ａａ１（アクセッション番号ＨＭ０５４５０９）；Ｃｒｙ６３Ａａ１（アクセッション番号ＢＡ１４４０２８）；Ｃｒｙ６４Ａａ１（アクセッション番号ＢＡＪ０５３９７）；Ｃｒｙ６５Ａａ１（アクセッション番号ＨＭ４６１８６８）；Ｃｒｙ６５Ａａ２（アクセッション番号ＺＰ＿０４１２３８３８）；Ｃｒｙ６６Ａａ１（アクセッション番号ＨＭ４８５５８１）；Ｃｒｙ６６Ａａ２（アクセッション番号ＺＰ＿０４０９９９４５）；Ｃｒｙ６７Ａａ１（アクセッション番号ＨＭ４８５５８２）；Ｃｒｙ６７Ａａ２（アクセッション番号ＺＰ＿０４１４８８８２）；Ｃｒｙ６８Ａａ１（アクセッション番号ＨＱ１１３１１４）；Ｃｒｙ６９Ａａ１（アクセッション番号ＨＱ４０１００６）；Ｃｒｙ６９Ａａ２（アクセッション番号ＪＱ８２１３８８）；Ｃｒｙ６９Ａｂ１（アクセッション番号ＪＮ２０９９５７）；Ｃｒｙ７０Ａａ１（アクセッション番号ＪＮ６４��７８１）；Ｃｒｙ７０Ｂａ１（アクセッション番号ＡＤ０５１０７０）；Ｃｒｙ７０Ｂｂ１（アクセッション番号ＥＥＬ６７２７６）；Ｃｒｙ７１Ａａ１（アクセッション番号ＪＸ０２５５６８）；Ｃｒｙ７２Ａａ１（アクセッション番号ＪＸ０２５５６９）；Ｃｙｔ１Ａａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０３１８２）；Ｃｙｔ１Ａｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９８７９３）；Ｃｙｔ１Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３７１９６）；Ｃｙｔ２Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ１４１４７）；およびＣｙｔ２Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ５２０４３）。
【０４１７】
また、δ−内毒素の例としては、限定されないが、以下が挙げられる：米国特許第５，８８０，２７５号、同第７，８５８，８４９号、同第８，５３０，４１１号、同第８，５７５，４３３号、および同第８，６８６，２３３号のＣｒｙ１Ａタンパク質；米国特許第８，３０４，６０４号、同第８，３０４，６０５、および同第８，４７６，２２６号のＤＩＧ−３毒素またはＤＩＧ−１１毒素（ｃｒｙタンパク質（Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ３Ａなど）のａ−ヘリックス１および／またはａ−ヘリックス２バリアントのＮ末端欠失）；米国特許出願第１０／５２５，３１８号のＣｒｙ１Ｂ；米国特許第６，０３３，８７４号のＣｒｙ１Ｃ；米国特許第５，１８８，９６０号および同第６，２１８，１８８号のＣｒｙ１Ｆ；米国特許第７，０７０、９８２号；同第６，９６２，７０５号、および同第６，７１３，０６３号のＣｒｙ１Ａ／Ｆキメラ）；米国特許第７，０６４，２４９号のＣｒｙ２タンパク質（Ｃｒｙ２Ａｂタンパク質など））；少なくとも２つの異なるＣｒｙタンパク質の可変領域と保存ブロックとの固有の組合せの融合によって作出されたＣｒｙ３Ａタンパク質（制限されないが、操作されたハイブリッド殺虫タンパク質（ｅＨＩＰ）が挙げられる）（米国特許出願公開第２０１０／００１７９１４）；Ｃｒｙ４タンパク質；Ｃｒｙ５タンパク質；Ｃｒｙ６タンパク質；米国特許第７，３２９，７３６号、同第７，４４９，５５２号、同第７，８０３，９４３号、同第７，４７６，７８１号、同第７，１０５，３３２、７，３７８，４９９号、および同第７，４６２，７６０号のＣｒｙ８タンパク質；Ｃｒｙ９Ａ、Ｃｒｙ９Ｂ、Ｃｒｙ９Ｃ、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ９Ｅ、およびＣｒｙ９Ｆファミリーのメンバー（米国特許第８，８０２，９３３号のＣｒｙ９Ｄタンパク質および米国特許第８，８０２，９３４号のＣｒｙ９Ｂタンパク質が挙げられる）などのＣｒｙ９タンパク質；Ｎａｉｍｏｖ，ら，（２００８），“Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，”７４：７１４５−７１５１のＣｒｙ１５タンパク質；米国特許第６，１２７，１８０号、同第６，６２４，１４５、および同第６，３４０，５９３号のＣｒｙ２２、Ｃｒｙ３４Ａｂ１タンパク質；米国特許第６，２４８，５３５号、同第６，３２６，３５１号、同第６，３９９，３３０号、同第６，９４９，６２６号、同第７，３８５，１０７号、および同第７，５０４，２２９号のＣｒｙＥＴ３３およびｃｒｙＥＴ３４タンパク質；米国特許出願公開第２００６／０１９１０３４号、同第２０１２／０２７８９５４号、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１３９００４号のＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４ホモログ；米国特許第６，０８３，４９９号、同第６，５４８，２９１、および同第６，３４０，５９３号のＣｒｙ３５Ａｂ１タンパク質；Ｃｒｙ４６タンパク質、Ｃｒｙ５１タンパク質、Ｃｒｙ二成分毒素；ＴＩＣ９０１または関連毒素；米国特許出願公開第２００８／０２９５２０７号のＴＩＣ８０７；ＰＣＴＵＳ２００６／０３３８６７号のＥＴ２９、ＥＴ３７、ＴＩＣ８０９、ＴＩＣ８１０、ＴＩＣ８１２、ＴＩＣ１２７、ＴＩＣ１２８；米国特許第８，５１３，４９４号のＴＩＣ８５３毒素、米国特許���８，２３６，７５７号のＡＸＭＩ−０２７、ＡＸＭＩ−０３６、およびＡＸＭＩ−０３８；米国特許第７，９２３，６０２号のＡＸＭＩ−０３１、ＡＸＭＩ−０３９、ＡＸＭＩ−０４０、ＡＸＭＩ−０４９；ＷＯ２００６／０８３８９１号のＡＸＭＩ−０１８、ＡＸＭＩ−０２０、およびＡＸＭＩ−０２１；ＷＯ２００５／０３８０３２号のＡＸＭＩ−０１０；ＷＯ２００５／０２１５８５号のＡＸＭＩ−００３；米国特許出願公開第２００４／０２５０３１１号のＡＸＭＩ−００８；米国特許出願公開第２００４／０２１６１８６号のＡＸＭＩ−００６；米国特許出願公開第２００４／０２１０９６５号のＡＸＭＩ−００７；米国特許出願公開第２００４／０２１０９６４号ＡＸＭＩ−００９；米国特許出願公開第２００４／０１９７９１７号のＡＸＭＩ−０１４；米国特許出願公開第２００４／０１９７９１６号のＡＸＭＩ−００４；ＷＯ２００６／１１９４５７号のＡＸＭＩ−０２８およびＡＸＭＩ−０２９；ＷＯ２００４／０７４４６２号のＡＸＭＩ−００７、ＡＸＭＩ−００８、ＡＸＭＩ−００８０ｒｆ２、ＡＸＭＩ−００９、ＡＸＭＩ−０１４、およびＡＸＭＩ−００４；米国特許第８，０８４，４１６号のＡＸＭＩ−１５０；米国特許出願公開第２０１１／００２３１８４号のＡＸＭＩ−２０５；米国特許出願公開第２０１１／０２６３４８８号のＡＸＭＩ−０１１、ＡＸＭＩ−０１２、ＡＸＭＩ−０１３、ＡＸＭＩ−０１５、ＡＸＭＩ−０１９、ＡＸＭＩ−０４４、ＡＸＭＩ−０３７、ＡＸＭＩ−０４３、ＡＸＭＩ−０３３、ＡＸＭＩ−０３４、ＡＸＭＩ−０２２、ＡＸＭＩ−０２３、ＡＸＭＩ−０４１、ＡＸＭＩ−０６３、およびＡＸＭＩ−０６４；米国特許出願公開第２０１０／０１９７５９２号のＡＸＭＩ−Ｒ１および関連タンパク質；ＷＯ２０１１／１０３２４８号のＡＸＭＩ２２１Ｚ、ＡＸＭＩ２２２ｚ、ＡＸＭＩ２２３ｚ、ＡＸＭＩ２２４ｚ、およびＡＸＭＩ２２５ｚ；ＷＯ２０１１／１０３２４７号および米国特許第８，７５９，６１９号のＡＸＭＩ２１８、ＡＸＭＩ２１９、ＡＸＭＩ２２０、ＡＸＭＩ２２６、ＡＸＭＩ２２７、ＡＸＭＩ２２８、ＡＸＭＩ２２９、ＡＸＭＩ２３０、およびＡＸＭＩ２３１；米国特許第８，３３４，４３１号のＡＸＭＩ−１１５、ＡＸＭＩ−１１３、ＡＸＭＩ−００５、ＡＸＭＩ−１６３、およびＡＸＭＩ−１８４；米国特許出願公開第２０１０／０２９８２１１号のＡＸＭＩ−００１、ＡＸＭＩ−００２、ＡＸＭＩ−０３０、ＡＸＭＩ−０３５、およびＡＸＭＩ−０４５；米国特許出願公開第２００９／０１４４８５２号のＡＸＭＩ−０６６およびＡＸＭＩ−０７６；米国特許第８，３１８，９００号のＡＸＭＩ１２８、ＡＸＭＩ１３０、ＡＸＭＩ１３１、ＡＸＭＩ１３３、ＡＸＭＩ１４０、ＡＸＭＩ１４１、ＡＸＭＩ１４２、ＡＸＭＩ１４３、ＡＸＭＩ１４４、ＡＸＭＩ１４６、ＡＸＭＩ１４８、ＡＸＭＩ１４９、ＡＸＭＩ１５２、ＡＸＭＩ１５３、ＡＸＭＩ１５４、ＡＸＭＩ１５５、ＡＸＭＩ１５６、ＡＸＭＩ１５７、ＡＸＭＩ１５８、ＡＸＭＩ１６２、ＡＸＭＩ１６５、ＡＸＭＩ１６６、ＡＸＭＩ１６７、ＡＸＭＩ１６８、ＡＸＭＩ１６９、ＡＸＭＩ１７０、ＡＸＭＩ１７１、ＡＸＭＩ１７２、ＡＸＭＩ１７３、ＡＸＭＩ１７４、ＡＸＭＩ１７５、ＡＸＭＩ���７６、ＡＸＭＩ１７７、ＡＸＭＩ１７８、ＡＸＭＩ１７９、ＡＸＭＩ１８０、ＡＸＭＩ１８１、ＡＸＭＩ１８２、ＡＸＭＩ１８５、ＡＸＭＩ１８６、ＡＸＭＩ１８７、ＡＸＭＩ１８８、ＡＸＭＩ１８９；米国特許出願公開第２０１０／０００５５４３号のＡＸＭＩ０７９、ＡＸＭＩ０８０、ＡＸＭＩ０８１、ＡＸＭＩ０８２、ＡＸＭＩ０９１、ＡＸＭＩ０９２、ＡＸＭＩ０９６、ＡＸＭＩ０９７、ＡＸＭＩ０９８、ＡＸＭＩ０９９、ＡＸＭＩ１００、ＡＸＭＩ１０１、ＡＸＭＩ１０２、ＡＸＭＩ１０３、ＡＸＭＩ１０４、ＡＸＭＩ１０７、ＡＸＭＩ１０８、ＡＸＭＩ１０９、ＡＸＭＩ１１０、ＡＸＭＩ１１１、ＡＸＭＩ１１２、ＡＸＭＩ１１４、ＡＸＭＩ１１６、ＡＸＭＩ１１７、ＡＸＭＩ１１８、ＡＸＭＩ１１９、ＡＸＭＩ１２０、ＡＸＭＩ１２１、ＡＸＭＩ１２２、ＡＸＭＩ１２３、ＡＸＭＩ１２４、ＡＸＭＩ１２５７、ＡＸＭＩ１２６８、ＡＸＭＩ１２７、ＡＸＭＩ１２９、ＡＸＭＩ１６４、ＡＸＭＩ１５１、ＡＸＭＩ１６１、ＡＸＭＩ１８３、ＡＸＭＩ１３２、ＡＸＭＩ１３８、ＡＸＭＩ１３７、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４０２２３５９８号のＡＸＭＩ２７０、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４０２２３５９９号のＡＸＭＩ２７９、ｃｒｙタンパク質（米国特許第８，３１９，０１９号の改変タンパク質分解部位を有するＣｒｙ１ＡおよびＣｒｙ３Ａなど）；米国特許出願公開第２０１１／００６４７１０のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株ＶＢＴＳ  ２５２８由来のＣｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ２Ａａ、およびＣｒｙ１Ｃａ毒素タンパク質。他のＣｒｙタンパク質が当業者に周知である。Ｎ．Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ，ら，“Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，”（１９９８）Ｖｏｌ  ６２：８０７−８１３を参照のこと；ｗｗｗ．ｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｉｎｆｏ／のＮ．Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ，ら，“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”（２０１６）も参照のこと。
【０４１８】
トランスジェニック植物形質としてのＣｒｙタンパク質の使用は、当業者に周知であり、Ｃｒｙ−トランスジェニック植物（制限されないが、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａｃ＋Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ｆａ２、Ｃｒｙ１Ｆ＋Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ３Ａ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ３Ｂｂ１、Ｃｒｙ３４Ａｂ１、Ｃｒｙ３５Ａｂ１、Ｖｉｐ３Ａ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ９ｃ、およびＣＢＩ−Ｂｔを発現する植物が挙げられる）は、規制当局から承認されている。Ｓａｎａｈｕｊａら，“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：ａ  ｃｅｎｔｕｒｙ  ｏｆ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”（２０１１）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ａｐｒｉｌ  ９（３）：２８３−３００およびｃｅｒａ−ｇｍｃ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ａｃｔｉｏｎ＝ｇｍ＿ｃｒｏｐ＿ｄａｔａｂａｓｅ（先頭に「ｗｗｗ」を付けたワールド・ワイド・ウェブでアクセス可能）のＣＥＲＡ（２０１０）ＧＭ  Ｃｒｏｐ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｒｉｓｋ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＣＥＲＡ），ＩＬＳＩ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．）を参照のこと。また、以下などの当業者に周知の１つを超える殺有害生物タンパク質を植物内で発現させることができる：Ｖｉｐ３ＡｂおよびＣｒｙ１Ｆａ（ＵＳ２０１２／０３１７６８２）；Ｃｒｙ１ＢＥおよびＣｒｙ１Ｆ（ＵＳ２０１２／０３１１７４６）；Ｃｒｙ１ＣＡおよびＣｒｙ１ＡＢ（ＵＳ２０１２／０３１１７４５）；Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙＣａ（ＵＳ２０１２／０３１７６８１）；Ｃｒｙ１ＤＡおよびＣｒｙ１ＢＥ（ＵＳ２０１２／０３３１５９０）；Ｃｒｙ１ＤＡおよびＣｒｙ１Ｆａ（ＵＳ２０１２／０３３１５８９）；Ｃｒｙ１ＡＢおよびＣｒｙ１ＢＥ（ＵＳ２０１２／０３２４６０６）；Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ２ＡａならびにＣｒｙ１１およびＣｒｙ１Ｅ（ＵＳ２０１２／０３２４６０５）；Ｃｒｙ３４Ａｂ／３５ＡｂおよびＣｒｙ６Ａａ（ＵＳ２０１３０１６７２６９）；Ｃｒｙ３４Ａｂ／ＶＣｒｙ３５ＡｂおよびＣｒｙ３Ａａ（ＵＳ２０１３０１６７２６８）；Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｆ（ＵＳ２０１４０１８２０１８）；ならびにＣｒｙ３ＡおよびＣｒｙ１ＡｂまたはＶｉｐ３Ａａ（ＵＳ２０１３０１１６１７０）。また、殺有害生物タンパク質としては、殺虫リパーゼ（米国特許第７，４９１，８６９号の脂質アシルヒドロラーゼ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどに由来するコレステロールオキシダーゼ（Ｐｕｒｃｅｌｌら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １５：１４０６−１４１３）が挙げられる）が挙げられる。
【０４１９】
また、殺有害生物タンパク質としては、ＶＩＰ（植物性殺虫タンパク質）毒素が挙げられる。昆虫病原性細菌は、封入体内または副芽胞結晶内に蓄積される殺虫タンパク質（前述のＣｒｙおよびＣｙｔタンパク質など）および培養培地に分泌される殺虫タンパク質を産生する。後者には、Ｖｉｐタンパク質があり、このタンパク質は、そのアミノ酸同一性に従って４つのファミリーに分類される。Ｖｉｐ１およびＶｉｐ２タンパク質は二成分毒素として作用し、ＣｏｌｅｏｐｔｅｒａおよびＨｅｍｉｐｔｅｒａのいくつかのメンバーに有毒である。Ｖｉｐ１成分は昆虫の中腸膜内の受容体に結合すると考えられており、Ｖｉｐ２成分は、細胞に侵入し、細胞でアクチンに対するそのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を示して、マイクロフィラメント形成を妨害する。Ｖｉｐ３は、Ｖｉｐ１またはＶｉｐ２と配列が類似しておらず、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの多種多様なメンバーに有毒である。その作用様式は、Ｖｉｐ３Ａタンパク質がＣｒｙタンパク質と結合部位を共有しないにも関わらず、タンパク質分解活性化、中腸上皮膜への結合、および穿孔形成に関して、Ｃｒｙタンパク質の作用様式と類似することが示されている。後者の性質により、Ｖｉｐタンパク質は、昆虫耐性を妨害するか遅延させ、殺虫範囲を広げるために、トランスジェニック植物（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ処理作物（Ｂｔ作物））中でＣｒｙタンパク質と組み合わせるのに良好な候補である。Ｃｒｙタンパク質と組み合わせたＶｉｐ３Ａａタンパク質を発現するＢｔワタおよびＢｔメイズには、商業的に栽培される品種が存在する。ごく最近に報告されたＶｉｐ４ファミリーについては、標的昆虫は依然として見出されていない。Ｃｈａｋｒｏｕｎら，“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｖｉｐ）ｆｒｏｍ  Ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．２０１６  Ｍａｒ  ２；８０（２）：３２９−５０を参照のこと。ＶＩＰは、米国特許第５，８７７，０１２号、同第６，１０７，２７９号、同第６，１３７，０３３号、同第７，２４４，８２０号、同第７，６１５，６８６号、および同第８，２３７，０２０号などに見出され得る。他のＶＩＰタンパク質が当業者に周知である（ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／ｖｉｐ．ｈｔｍｌ（先頭に「ｗｗｗ」を付けたワールド・ワイド・ウェブでアクセス可能）を参照のこと）。
【０４２０】
また、殺有害生物タンパク質としては、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ、およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓなどの生物から得ることができる毒素複合体（ＴＣ）タンパク質が挙げられる（米国特許第７，４９１，６９８号および同第８，０８４，４１８を参照のこと）。いくつかのＴＣタンパク質は「独立型」殺虫活性を有し、他のＴＣタンパク質は、同一の所与の生物によって産生される独立型毒素の活性を増強する。「独立型」ＴＣタンパク質（例えば、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ、またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ由来）の毒性を、異なる属の供給生物由来の１またはそれを超えるＴＣタンパク質「増強物質」によって増強することができる。ＴＣタンパク質には、３つの主なタイプが存在する。本明細書中で言及する場合、クラスＡタンパク質（「タンパク質Ａ」）は、独立型毒素である。クラスＢタンパク質（「タンパク質Ｂ」）およびクラスＣタンパク質（「タンパク質Ｃ」）は、クラスＡタンパク質の毒性を増強する。クラスＡタンパク質の例は、ＴｃｂＡ、ＴｃｄＡ、ＸｐｔＡ１、およびＸｐｔＡ２である。クラスＢタンパク質の例は、ＴｃａＣ、ＴｃｄＢ、ＸｐｔＢ１Ｘｂ、およびＸｐｔＣ１  Ｗｉである。クラスＣタンパク質の例は、ＴｃｃＣ、ＸｐｔＣ１Ｘｂ、およびＸｐｔＢ１  Ｗｉである。また、殺有害生物タンパク質としては、クモ、ヘビ、およびサソリの毒液タンパク質が挙げられる。クモ毒液ペプチドの例としては、制限されないが、リコトシキシン−１ペプチドおよびその変異体（米国特許第８，３３４，３６６）が挙げられる。
【０４２１】
いくつかの現在登録されているＰＩＰを、表１１に列挙する。また、トランスジェニック植物は、昆虫遺伝子に指向するｄｓＲＮＡを発現するように操作されている（Ｂａｕｍ，Ｊ．Ａ．ら（２００７）Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｐｅｓｔｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：１３２２−１３２６；Ｍａｏ，Ｙ．Ｂ．ら（２００７）Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ａ  ｃｏｔｔｏｎ  ｂｏｌｌｗｏｒｍ  Ｐ４５０  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ｐｌａｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＲＮＡｉ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｌａｒｖａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｇｏｓｓｙｐｏｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：１３０７−１３１３）。有害生物がトランスジェニック植物を摂食することによって有害生物内にＲＮＡ干渉を誘発することができる。したがって、有害生物が摂食すると、有害生物が傷害を受けるか死滅する。
表１１：本開示の微生物と組み合わせることができる植物導入保護剤の例のリスト
【表１１−１】
2021530984.tif 000038
【表１１−２】
2021530984.tif 000039
【表１１−３】
2021530984.tif 000040
【表１１−４】
2021530984.tif 000041
【表１１−５】
2021530984.tif 000042
【表１１−６】
2021530984.tif 000043
【表１１−７】
2021530984.tif 000044
【表１１−８】
2021530984.tif 000045
【表１１−９】
2021530984.tif 000046
【表１１−１０】
2021530984.tif 000047
【表１１−１１】
2021530984.tif 000048
【０４２２】
いくつかの実施形態では、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の農薬を、任意の１またはそれを超える本開示の微生物と共に利用することができ、植物またはその一部（種子が挙げられる）に付与することができる。
【０４２３】
除草剤
前述のように、本明細書中に教示の任意の微生物を含み得る本開示の農業組成物は、時折、１またはそれを超える除草剤と組み合わせられる。
【０４２４】
本明細書中に記載の方法にしたがって産生された細菌または細菌集団を含み、そして／または本明細書中に記載の特徴を有する組成物は、１またはそれを超える除草剤をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、除草組成物は、植物および／または植物の一部に付与される。いくつかの実施形態では、除草組成物を、本明細書中に記載の組成物中に含めてもよく、植物（複数可）またはその一部（複数可）に、他の化合物と同時または連続して付与することができる。
【０４２５】
除草剤としては、２，４−Ｄ、２，４−ＤＢ、アセトクロル、アシフルオルフェン、アラクロル、アメトリン、アトラジン、アミノピラリド、ベネフィン、ベンスルフロン、ベンスリド、ベンタゾン、ビシクロピロン、ブロマシル、ブロモキシニル、ブチラート、カルフェントラゾン、クロリムロン、クロルスルフロン、クレトジム、クロマゾン、クロピラリド、クロランスラム、シクロアート、ＤＣＰＡ、デスメジファム、ジカンバ、ジクロベニル、ジクロホップ、ジクロスラム、ジフルフェンゾピル、ジメテナミド、ジクワット、ジウロン、ＤＳＭＡ、エンドタール、ＥＰＴＣ、エタルフルラリン、エトフメサート、フェノキサプロップ、フルアジホップ−Ｐ、フルカルブゾン、フルフェナセット、フルメツラム、フルミクロラック、フルミオキサジン、フルオメツロン、フルロキシピル、ホメサフェン、ホラムスルフロン、グルホシネート、グリホサート、ハロスルフロン、ヘキサジノン、イマザメタベンズ、イマザモクス、イマザピク、イマザキン、イマゼタピル、イソキサフルトール、ラクトフェン、リヌロン、ＭＣＰＡ、ＭＣＰＢ、メソトリオン、メトラクロル−ｓ、メトリブジン、インダジフラム、メトスルフロン、モリネート、ＭＳＭＡ、ナプロパミド、ナプタラム、ニコスルフロン、ノルフルラゾン、オリザリン、オキサジアゾン、オキシフルオルフェン、パラコート、ペラルゴン酸、ペンジメタリン、フェンメジファム、ピクロラム、プリミスルフロン、プロジアミン、プロメトリン、プロナミド、プロパニル、プロスルフロン、ピラゾン、ピリチオアク、キンクロラック、キザロホップ、リムスルフロン、Ｓ−メトラクロル、セトキシジム、シデュロン、シマジン、スルフェントラゾン、スルホメツロン、スルホスルフロン、テブチウロン、テンボトリオン、テルバシル、チアゾピル、チフェンスルフロン、チオベンカルブ、トプラメゾン、トラルコキシジム、トリアラート、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリクロピル、トリフルラリン、およびトリフルスルフロンが挙げられる。
【０４２６】
いくつかの実施形態では、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の除草剤を、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の植物またはその一部と共に利用することができる。
【０４２７】
除草製品としては、ＣＯＲＶＵＳ、ＢＡＬＡＮＣＥ  ＦＬＥＸＸ、ＣＡＰＲＥＮＯ、ＤＩＦＬＥＸＸ、ＬＩＢＥＲＴＹ、ＬＡＵＤＩＳ、ＡＵＴＵＭＮ  ＳＵＰＥＲ、およびＤＩＦＬＥＸＸ  ＤＵＯが挙げられ得る。
【０４２８】
いくつかの実施形態では、以下の表１２中に記載の任意の１またはそれを超える除草剤を、任意の１またはそれを超える本明細書中に教示の微生物と共に利用してよく、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の植物またはその一部に付与することができる。
表１２：本開示の微生物と組み合わせることができる除草剤の例のリスト
【表１２−１】
2021530984.tif 000049
【表１２−２】
2021530984.tif 000050
【表１２−３】
2021530984.tif 000051
【０４２９】
殺真菌剤
殺真菌剤
前述のように、本明細書中に教示の任意の微生物を含み得る本開示の農業組成物は、時折、１またはそれを超える殺真菌剤と組み合わせられる。
【０４３０】
本明細書中に記載の方法により産生される細菌または細菌集団を含み、そして／または本明細書中に記載のような特徴を有する組成物は、１またはそれを超える殺真菌剤をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、殺真菌組成物を、本明細書中に記載の組成物中に含めてもよく、植物（複数可）またはその一部（複数可）に、他の化合物と同時または連続して付与することができる。殺真菌剤としては、アゾキシストロビン、カプタン、カルボキシン、エタボキサム、フルジオキソニル、メフェノキサム、フルジオキソニル、チアベンダゾール、チアベンダズ、イプコナゾール、マンコゼブ、シアゾファミド、ゾキサミド、メタラキシル、ＰＣＮＢ、メタコナゾール、ピラクロストロビン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株ＱＳＴ  ７１３、セダキサン、チアメトキサム、フルジオキソニル、チラム、トルクロホス−メチル、トリフロキシストロビン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株ＭＢＩ  ６００、ピラクロストロビン、フルオキサストロビン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ菌株ＱＳＴ  ２８０８、クロロタロニル、銅、フルトリアホール、フルキサピロキサド、マンコゼブ、グルジオキソニル、ペンチオピラド、トリアゾール、プロピコナオゾール、プロチオコナゾール、テブコナゾール、フルオキサストロビン、ピラクロストロビン、ピコキシストロビン、クオールス、テトラコナゾール、トリフロキシストロビン、シプロコナゾール、フルトリアホール、ＳＤＨＩ、ＥＢＤＣ、セダキサン、ＭＡＸＩＭ  ＱＵＡＴＴＲＯ（グルジオキソニル、メフェノキサム、アゾキシストロビン、およびチアベンダズ）、ＲＡＸＩＬ（テブコナゾール、プロチオコナゾール、メタラキシル、およびエトキシル化獣脂アルキルアミン）、およびベンゾビンジフルピルが挙げられる。
【０４３１】
いくつかの実施形態では、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の殺真菌剤を、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の植物またはその一部と共に利用してよい。
【０４３２】
殺線虫剤
前述のように、本明細書中に教示の任意の微生物を含み得る本開示の農業組成物は、時折、１またはそれを超える殺線虫剤と組み合わせられる。
【０４３３】
本明細書中に記載の方法により産生される細菌または細菌集団を含み、そして／または本明細書中に記載のような特徴を有する組成物は、１またはそれを超える殺線虫剤をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、殺線虫組成物を、本明細書中に記載の組成物中に含めてもよく、植物（複数可）またはその一部（複数可）に、他の化合物と同時または連続して付与することができる。殺線虫剤は、Ｄ−Ｄ、１，３−ジクロロプロペン、エチレンジブロミド、１，２−ジブロモ−３−クロロプロパン、臭化メチル、クロロピクリン、メタムナトリウム、ダゾメット、メチルイソチオシアナート、テトラチオ炭酸ナトリウム、アルジカルブ、アルドキシカルブ、カルボフラン、オキサミル、エトプロップ、フェナミホス、カズサホス、ホスチアゼート、テルブホス、フェンスルホチオン、ホレート、ＤｉＴｅｒａ、クランドサン、シンコシン、ヨウ化メチル、プロパルギルブロミド、２，５−ジヒドロキシメチル−３，４−ジヒドロキシピロリジン（ＤＭＤＰ）、任意の１またはそれを超えるアベルメクチン、アジ化ナトリウム、フルフラール、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ、アバメクトリン、チアメトキサム、フルジオキソニル、クロチアンジン、サリチル酸、およびベンゾ−（１，２，３）−チアジアゾール−７−カルボチオ酸Ｓ−メチルエステルから選択してよい。
【０４３４】
いくつかの実施形態では、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の殺線虫剤を、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の植物またはその一部と共に利用してよい。
【０４３５】
いくつかの実施形態では、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の殺線虫剤、殺真菌剤、除草剤、殺虫剤、および／または農薬を、任意の１またはそれを超える本明細書中に記載の植物またはその一部と共に利用してよい。
【０４３６】
肥料、窒素安定剤、およびウレアーゼ阻害剤
【０４３７】
前述のように、本明細書中に教示の任意の微生物を含み得る本開示の農業組成物は、時折、１またはそれを超える肥料、窒素安定剤、またはウレアーゼ阻害剤と組み合わせられる。
【０４３８】
いくつかの実施形態では、肥料は、本開示（ｄｉｓｃｏｓｕｒｅ）の方法および細菌と組み合わせて使用される。肥料としては、とりわけ、無水アンモニア、尿素、硝酸アンモニウム、および尿素−硝酸アンモニウム（ＵＡＮ）組成物が挙げられる。いくつかの実施形態では、芽出し肥および／または根付け肥を、本開示の方法および細菌と組み合わせて使用する。
【０４３９】
いくつかの実施形態では、窒素安定剤を、本開示の方法および細菌と組み合わせて使用する。窒素安定剤としては、ニトラピリン、２−クロロ−６−（トリクロロメチル）ピリジン、Ｎ−ＳＥＲＶＥ  ２４、ＩＮＳＴＩＮＣＴ、ジシアンジアミド（ＤＣＤ）が挙げられる。
【０４４０】
いくつかの実施形態では、ウレアーゼ阻害剤を、本開示の方法および細菌と組み合わせて使用する。ウレアーゼ阻害剤としては、Ｎ−（ｎ−ブチル）−チオリン酸トリアミド（ＮＢＰＴ）、ＡＧＲＯＴＡＩＮ、ＡＧＲＯＴＡＩＮ  ＰＬＵＳ、およびＡＧＲＯＴＡＩＮ  ＰＬＵＳ  ＳＣが挙げられる。さらに、本開示は、ＡＧＲＯＴＡＩＮ  ＡＤＶＡＮＣＥＤ  １．０、ＡＧＲＯＴＡＩＮ  ＤＲＩ−ＭＡＸＸ、およびＡＧＲＯＴＡＩＮ  ＵＬＴＲＡの利用を企図する。
【０４４１】
さらに、安定化形態の肥料を使用することができる。例えば、安定化形態の肥料は、安定化された尿素系顆粒中に４６％の窒素を含むＳＵＰＥＲ  Ｕであり、ＳＵＰＥＲＵは、ウレアーゼならびに脱窒、浸出、および揮発から保護するための硝化阻害剤を含む。ＮＩＴＡＭＩＮなどの安定化された葉面を標的にする肥料を使用しても良い。
【０４４２】
芽出し肥料は、トウモロコシ圃場で一般的に使用される。芽出し肥は、植栽時に種子と共に数ポンドの栄養素を付与することを含む。芽出し肥は、実生の活力を増大させるために使用される。
【０４４３】
本明細書中で使用され得る遅滞放出または制御放出される肥料は、以下を必要とする：基準となる「栄養素が迅速に利用可能な肥料」（硝酸アンモニウムまたは尿素、リン酸アンモニウムまたは塩化カリウムなど）よりも付与後の植物の取り込みおよび使用が遅延するか、植物が利用できる期間が有意に長い形態の植物栄養素を含む肥料。そのような最初の利用の遅延または連続利用可能期間の延長は、様々な機序によって生じ得る。これらの機序としては、半透性コーティング、吸蔵、タンパク質材料、または他の化学的形態、水溶性低分子量化合物の加水分解の遅延、または他の未知の手段による材料の水溶性の調節が挙げられる。
【０４４４】
本明細書中で使用され得る安定化窒素肥料は、以下を必要とする：窒素安定剤が添加されている肥料。窒素安定剤は、肥料に添加される物質であり、土壌中の肥料の窒素成分を尿素のＮまたはアンモニアのＮ形態に維持する時間を延長する。
【０４４５】
本明細書中で使用され得る硝化阻害剤は、以下を必要とする：アンモニアのＮから硝酸のＮへの生物学的酸化を阻害する物質。いくつかの例としては、以下が挙げられる：（１）２−クロロ−６−（トリクロロメチル−ピリジン）、一般名Ｎｉｔｒａｐｙｒｉｎ、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ製造；（２）４−アミノ−１，２，４−６−トリアゾール−ＨＣｌ、一般名ＡＴＣ、Ｉｓｈｉｈａｄａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製造；（３）２，４−ジアミノ−６−トリクロロ−メチルトリアジン、一般名ＣＩ−１５８０、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ製造；（４）ジシアンジアミド、一般名ＤＣＤ、Ｓｈｏｗａ  Ｄｅｎｋｏ製造；（５）チオ尿素、一般名ＴＵ、Ｎｉｔｔｏ  Ｒｙｕｓｏ製造；（６）１−メルカプト−１，２，４−トリアゾール、一般名ＭＴ、Ｎｉｐｐｏｎ製造；（７）２−アミノ−４−クロロ−６−メチル−ピラミジン、一般名ＡＭ、Ｍｉｔｓｕｉ  Ｔｏａｔｓｕ製造；（８）３，４−ジメチルピラゾールホスファート（ＤＭＰＰ）、ＢＡＳＦ製造；（９）１−アミド−２−チオ尿素（ＡＳＵ）、Ｎｉｔｔｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄ．製造；（１０）アンモニウムチオサルファート（ＡＴＳ）；（１１）１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（ＨＰＬＣ）；（１２）５−エチレンオキシド−３−トリクロロ−メチル（ｍｅｔｈｌｙ）１，２，４−チオジアゾール（Ｔｅｒｒａｚｏｌｅ）、Ｏｌｉｎ  Ｍａｔｈｉｅｓｏｎ製造；（１３）３−メチルピラゾール（３−ＭＰ）；（１４）１−カルバモイル（ｃａｒｂａｍｏｙｌｅ）−３−メチル−ピラゾール（ＣＭＰ）；（１５）Ｎｅｅｍ；および（１６）ＤＭＰＰ。
【０４４６】
本明細書中で使用され得るウレアーゼ阻害剤は、以下を必要とする：酵素ウレアーゼによる尿素に対する加水分解作用を阻害する物質。何千もの化学物質が土壌ウレアーゼ阻害剤と評価されている（Ｋｉｓｓ  ａｎｄ  Ｓｉｍｉｈａｉａｎ，２００２）。しかしながら、試験された多数の化合物のうちで、無毒性で、低濃度で有効であり、安定であり、尿素と適合し（固体および溶液）、土壌で分解し、安価であるという必要条件を満たすものはほんの一部にすぎない。ウレアーゼ阻害剤を、その構造および酵素ウレアーゼとの想定される相互作用にしたがって分類することができる（Ｗａｔｓｏｎ，２０００，２００５）。ウレアーゼ阻害剤には、以下の４つの主なクラスが提唱されている：（ａ）スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）基と相互作用する試薬（スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）試薬）、（ｂ）ヒドロキサマート、（ｃ）農業作物保護化学物質、および（ｄ）尿素および関連化合物の構造類似体。Ｎ−（ｎ−ブチル）チオリン酸トリアミド（ＮＢＰＴ）、フェニルホスホロジアミダート（ＰＰＤ／ＰＰＤＡ）、およびヒドロキノンは、おそらく最も徹底的に研究されたウレアーゼ阻害剤である（Ｋｉｓｓ  ａｎｄ  Ｓｉｍｉｈａｉａｎ，２００２）。Ｎ−（２−ニトロフェニル）リン酸トリアミド（２−ＮＰＴ）およびチオ硫酸ジアンモニウム（ＡＴＳ）を用いた研究および実用性試験も行われている。有機リン化合物は、尿素の構造類似体であり、酵素の活性部位を遮断するウレアーゼ活性の最も有効な阻害剤のうちのいくつかである（Ｗａｔｓｏｎ，２００５）。
【０４４７】
トウモロコシのための種子殺虫処理（ＩＳＴ）
【０４４８】
トウモロコシ種子処理は、通常、以下の３つの範囲の有害生物を標的にする：線虫、実生の病害真菌、および昆虫。
【０４４９】
殺虫剤による種子処理は、通常、種子処理パッケージの主な構成要素である。今日利用可能なほとんどのトウモロコシ種子は、殺真菌剤および殺虫剤を含む基本パッケージが付属している。いくつかの態様では、種子処理のための殺虫剤の選択肢としては、ＰＯＮＣＨＯ（クロチアニジン）、ＣＲＵＩＳＥＲ／ＣＲＵＩＳＥＲ  ＥＸＴＲＥＭＥ（チアメトキサム）、およびＧＡＵＣＨＯ（イミダクロプリド）が挙げられる。これら３つの製品は全て、ネオニコチノイド化学物質である。２５０（．２５ｍｇ  ＡＩ／種子）の割合のＣＲＵＩＳＥＲおよびＰＯＮＣＨＯは、トウモロコシに利用可能な最も一般的な基本オプションのうちのいくつかである。いくつかの態様では、処置のための殺虫剤の選択肢としては、ＣＲＵＩＳＥＲ２５０チアメトキサム、ＣＲＵＩＳＥＲ２５０（チアメトキサム）＋ＬＵＭＩＶＩＡ（クロルアントラニリプロール）、ＣＲＵＩＳＥＲ５００（チアメトキサム）、およびＰＯＮＣＨＯ  ＶＯＴＩＶＯ１２５０（クロチアニジンおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ  Ｉ−１５８２）が挙げられる。
【０４５０】
Ｐｉｏｎｅｅｒの基本的な殺虫剤種子処理パッケージは、ＣＲＵＩＳＥＲ２５０からなり、ＰＯＮＣＨＯ／ＶＯＴＩＶＯ１２５０も併用できる。ＶＯＴＩＶＯは、線虫から防御する生物剤である。
【０４５１】
トウモロコシ、ダイズ、およびワタを含むＭｏｎｓａｎｔｏの製品は、ＡＣＣＥＬＥＲＯＮ処理アンブレラに分類される。Ｄｅｋａｌｂトウモロコシ種子は、ＰＯＮＣＨＯ２５０が標準で付属している。また、生産者は、ＰＯＮＣＨＯ／ＶＯＴＩＶＯにアップグレードする選択肢もあり、その場合、ＰＯＮＣＨＯを５００の割合で付与する。
【０４５２】
Ａｇｒｉｓｕｒｅ、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｈａｒｖｅｓｔ、およびＧａｒｓｔは、殺真菌剤およびＣＲＵＩＳＥＲ２５０を含む基本パッケージを有する。ＡＶＩＣＴＡ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｏｒｎも利用可能であり；これは、ＣＲＵＩＳＥＲ５００、殺真菌剤、および線虫防御剤を含む。ＣＲＵＩＳＥＲ  ＥＸＴＲＥＭＥは、種子処理パッケージとして利用可能な別の選択肢である；しかしながら、ＣＲＵＩＳＥＲの量は従来のＣＲＵＩＳＥＲ種子処理と同一である（すなわち、２５０、５００、または１２５０）。
【０４５３】
別の選択肢は、利用可能な最小限の殺虫剤での処理を購入し、最終段階で業者に種子の処理を依頼することである。
【０４５４】
市販のトウモロコシ用のＩＳＴを、以下の表１３に列挙し、前述のＩＳＴは、本明細書に教示の１またはそれを超える微生物と組み合わせることができる。
表１３：本開示の微生物と組み合わせることができる種子処理（ＩＳＴを含む）の例のリスト
【表１３−１】
2021530984.tif 000052
【表１３−２】
2021530984.tif 000053
【表１３−３】
2021530984.tif 000054
【表１３−４】
2021530984.tif 000055
【表１３−５】
2021530984.tif 000056
Ｆ＝殺真菌剤；Ｉ＝殺虫剤；Ｎ＝殺線虫剤；Ｐ＝植物成長調節物質
【０４５５】
作物に対する細菌集団の付与
本明細書中に記載されている細菌または細菌集団の組成物は、植溝で、タルク中でまたは種子処理剤として付与することができる。組成物は、バルク、ミニバルク、袋、またはタルク中の種子パッケージに付与することができる。
【０４５６】
植栽者は、処理された種子を植栽し、従来の様式に従って２条で、または耕うんを必要としない様式で作物を栽培することができる。種子は、コントロールホッパーまたは個別のホッパーを使用して散布することができる。また、種子は、加圧空気を使用してまたは手作業で散布することができる。種子配置は、可変作業技術を使用して実施することができる。さらに、本明細書中に記載されている細菌または細菌集団を、可変作業技術を使用して付与してよい。いくつかの例では、細菌は、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、モロコシ、ジャガイモ、イネ、野菜、穀類、擬似穀類の種子、および脂肪種子に付与することができる。穀類の例としては、オオムギ、フォニオ、オート麦、パルマーグラス、ライ麦、トウジンビエ、モロコシ、スペルトコムギ、テフ、ライコムギ、およびコムギが挙げられ得る。擬似穀類の例としては、ブレッドナッツ、ソバ、ガマ、チーア、亜麻、アマランス子実、ハンザ、キノア、およびゴマを挙げるられ得る。いくつかの例では、種子は、遺伝子改変生物（ＧＭＯ）、非ＧＭＯ、有機的なもの、または従来のものであり得る。
【０４５７】
マイクロ肥料、ＰＧＲ、除草剤、殺虫剤、および殺真菌剤などの添加剤を追加で使用して、作物を処理することができる。添加剤の例としては、作物保護剤（殺虫剤、殺線虫剤、殺真菌剤など）、増強剤（着色剤、ポリマー、植込錠、下塗剤、および消毒剤など）、および他の薬剤（接種剤、ＰＧＲ、軟化剤、および微量栄養素など）が挙げられる。ＰＧＲは、根成長、開花、または茎伸長に影響を及ぼす天然または合成の植物ホルモンであり得る。ＰＧＲとしては、オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、エチレン、およびアブシジン酸（ＡＢＡ）を挙げることができる。
【０４５８】
組成物は、液体肥料と組み合わせて植溝で付与することができる。いくつかの例では、液体肥料は、タンクに保持してもよい。ＮＰＫ肥料は、ナトリウム、亜リン酸、およびカリウムという主要栄養素を含む。
【０４５９】
組成物は、植物成長の促進、葉中の高葉緑素含有量の維持、果実または種子数の増加、および果実または種子単位重量の増加などの、植物形質を改善させることができる。本開示の方法は、様々な望ましい形質のうちの１つまたは複数を導入または改善させるために用いることができる。導入または改善される形質の例としては、以下が挙げられる：根バイオマス、根長、植物丈、苗条長、葉数、水利用効率、全体的バイオマス、収穫高、果実サイズ、穀粒サイズ、光合成速度、干ばつ耐性、耐熱性、耐塩性、低窒素ストレスへの耐性、窒素使用効率、線虫ストレス耐性、真菌病原体耐性、細菌病原体耐性、ウイルス病原体耐性、代謝物のレベル、代謝物のレベルの調整、プロテオーム発現。植物丈、全体的バイオマス、根および／または苗条バイオマス、種子発芽、実生生存、光合成効率、蒸散率、種子／果実数または質量、植物穀物または果実の収穫高、葉葉緑素含有量、光合成速度、根長、またはそれらの任意の組合せを含む望ましい形質を使用して、成長を測定することができ、同一条件下で栽培された基準農業植物（例えば、導入および／または改善された形質を有していない植物）の成長速度と比較することができる。いくつかの例では、植物丈、全体的バイオマス、根および／または苗条バイオマス、種子発芽、実生生存、光合成効率、蒸散率、種子／果実数または質量、植物穀物または果実収穫高、葉葉緑素含有量、光合成速度、根長、またはそれらの任意の組合せを含む望ましい形質を使用して、成長を測定することができ、類似条件下で栽培された基準農業植物（例えば、導入されたおよび／または改善された形質を有していない植物）の成長速度と比較することができる。
【０４６０】
宿主植物の農学的形質としては、限定されないが、以下が挙げられ得る：油含有量の変更、タンパク質含有量の変更、種子炭水化物組成の変更、種子油組成の変更、および種子タンパク質組成の変更、化学物質耐性、耐寒性、老化遅延、病害耐性、干ばつ耐性、穂重、成長改善、健康増強（ｈｅａｌｔｈ  ｅ４ｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）、耐熱性、除草剤耐性、草食動物耐性、窒素固定の改善、窒素利用の改善、根アーキテクチャーの改善、水使用効率の改善、バイオマスの増加、根長の増加、種子重量の増加、苗条長さの増加、収穫高の増加、水制限条件下での収穫高の増加、穀粒質量、穀粒水分含有量、金属耐性、穂数、１穂当たりの穀粒数、さや数、栄養増強、病原体耐性、害虫耐性、光合成能力の改善、塩分耐性、緑維持、活力改善、成熟種子の乾燥重量の増加、成熟種子の生重量の増加、１植物当たりの成熟種子数の増加、葉緑素含有量の増加、１植物当たりのさや数の増加、１植物当たりのさや長の増加、１植物当たりのしおれた葉の数の減少、１植物当たりの重度にしおれた葉の数の減少、および１植物当たりのしおれていない葉の数の増加、前述の種子処理剤製剤を用いずに種子から成長させた同系統植物と比較した、代謝物質レベルの検出可能なモジュレーション、転写物レベルの検出可能なモジュレーション、およびプロテオームの検出可能なモジュレーション。
【０４６１】
いくつかの場合では、接種される植物の植物要素と同じ種の植物から単離された細菌または細菌集団を植物に接種する。例えば、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（トウモロコシ）の１つの品種に通常見出される細菌または細菌集団を、その天然の状態では前述の細菌および細菌集団を欠如するＺｅａ  ｍａｙｓの別の品種の植物の植物要素に付随させる。１つの実施形態では、細菌および細菌集団は、接種される植物の植物要素と関連する植物種に属する植物に由来する。例えば、Ｚｅａ  ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ  Ｉｌｔｉｓら（ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉａｌ  ｔｅｏｓｉｎｔｅ）に通常見出される細菌および細菌集団を、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（トウモロコシ）に付与するか、またはその逆である。いくつかの場合では、接種される植物の植物要素とは異種である細菌および細菌集団を植物に接種する。１つの実施形態では、細菌および細菌集団は、別の種の植物に由来する。例えば、通常は双子葉植物に見出される細菌および細菌集団を、単子葉植物に付与するか（例えば、ダイズ由来細菌および細菌集団をトウモロコシに接種する）、またはその逆である。他の場合では、植物に接種しようとする細菌および細菌集団は、接種されている植物の関連種に由来する。１つの実施形態では、細菌および細菌集団は、関連分類群に、例えば関連種に由来する。別の種の植物は、農業植物であってもよい。別の実施形態では、細菌および細菌集団は、任意の宿主植物要素に接種されるように設計された組成物の一部分である。
【０４６２】
いくつかの例では、細菌または細菌集団は外因性であり、細菌および細菌集団は、接種される植物とは異なる植物から単離される。例えば、１つの実施形態では、細菌または細菌集団は、接種される植物と同じ種の異なる植物から単離することができる。いくつかの場合では、細菌または細菌集団は、接種される植物に付随する種から単離することができる。
【０４６３】
いくつかの例では、本明細書中に記載の細菌および細菌集団は、１つの組織タイプから別のタイプへと移動させることが可能である。例えば、種子の外側にコーティングした後の植物の成熟組織内での細菌および細菌集団の本開示の検出および単離により、種子外側から成熟中の植物の栄養組織内へと移動するそれらの能力が実証される。したがって、１つの実施形態では、細菌の集団および細菌集団は、種子外側から植物の栄養組織内へと移動することが可能である。１つの実施形態では、植物の種子にコーティングされた細菌および細菌集団は、種子が植物状態へと発芽すると、植物の異なる組織へと局在化することが可能である。例えば、細菌および細菌集団は、根、不定根、種子根、根毛、苗条、葉、花、芽、房、分裂組織、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、果実、走根、根茎、根粒、塊茎、毛状突起、孔辺細胞、排水組織、花弁、がく片、穎、軸、維管束形成層、師部、および木部を含む植物の組織のいずれか１つに局在化することが可能であり得る。１つの実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の根および／または根毛に局在化することが可能である。別の実施形態では、細菌および細菌集団は、光合成組織、例えば、植物の葉および苗条に局在化することが可能である。他の場合では、細菌および細菌集団は、植物の維管束組織、例えば、木部および師部に局在化される。さらに別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の生殖組織（花、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、果実）に局在化することが可能である。別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の根、苗条、葉、および生殖組織に局在化することが可能である。さらに別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の果実または種子組織にコロニー化する。さらに別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の表面に存在する（すなわち、その存在は、植物外側、または植物のエピスフィアに検出可能に存在する）ように、植物にコロニー化することができる。さらなる他の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の実質的に全てまたは全ての組織に局在化することが可能である。ある特定の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の根に局在化されない。他の場合では、細菌および細菌集団は、植物の光合成組織に局在化されない。
【０４６４】
また、組成物の有効性は、作物の相対的成熟度または作物発熱単位（ＣＨＵ）を測定することにより評価することができる。例えば、細菌集団をトウモロコシに付与することができ、トウモロコシ成長を、トウモロコシ穀粒の相対的成熟度、またはトウモロコシ穀粒が最大重量になる時間により評価することができる。また、作物発熱単位（ＣＨＵ）を使用して、トウモロコシ作物の成熟度を予測することができる。ＣＨＵは、作物が成長する際の一日の最高温度を測定することにより熱蓄積量を決定する。
【０４６５】
例では、細菌は、根、不定根、種子根、根毛、苗条、葉、花、芽、房、分裂組織、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、果実、走根、根茎、根粒、塊茎、毛状突起、孔辺細胞、排水組織、花弁、がく片、穎、軸、維管束形成層、師部、および木部を含む植物の組織のいずれか１つに局在化してもよい。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、光合成組織、例えば、植物の葉および苗条に局在化することが可能である。他の場合では、細菌および細菌集団は、植物の維管束組織、例えば、木部および師部に局在化される。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の生殖組織（花、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、または果実）に局在化することが可能である。別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の根、苗条、葉、および生殖組織に局在化することが可能である。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の果実または種子組織にコロニー化する。さらに別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の表面に存在するように、植物にコロニー化することができる。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の実質的に全てまたは全ての組織に局在化することが可能である。ある特定の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の根に局在化されない。他の場合では、細菌および細菌集団は、植物の光合成組織に局在化されない。
【０４６６】
作物に付与される細菌組成物の有効性は、限定されないが、植栽率、播種活力、根の強度、干ばつ耐性、植物丈、ドライダウン、および検査重量を含む、作物成長の種々の特徴を測定することにより評価することができる。
【０４６７】
植物種
本明細書中に記載の方法および細菌は、Ｈｏｒｄｅｕｍ属、Ｏｒｙｚａ属、Ｚｅａ属、およびＴｒｉｔｉｃｅａｅ属の植物などの様々な植物のいずれにも適切である。適切な植物の他の非限定的な例としては、コケ類、地衣類、および藻類が挙げられる。いくつかの場合では、食用作物、繊維作物、油用作物、森林またはパルプおよび製紙業の植物、バイオ燃料生産用の原料、および／または観賞植物などの植物は、経済的、社会的、および／または環境的な価値を有する。いくつかの例では、植物は、穀物、小麦粉、デンプン、シロップ、粗挽き粉、油、フィルム、パッケージング、栄養補給製品、パルプ、動物飼料、魚飼料、工業化学用のバルク剤、シリアル製品、加工ヒト用食品、糖、アルコール、および／またはタンパク質などの経済的に価値のある製品を生産するために使用され得る。作物植物の非限定的な例としては、メイズ、イネ、コムギ、オオムギ、モロコシ、雑穀、オートムギ、ライコムギ、ソバ、スイートコーン、サトウキビ、タマネギ、トマト、イチゴ、およびアスパラガスが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の方法および細菌は、種々のそのトランスジェニック植物、非トランスジェニック植物、およびハイブリッド植物のうちのいずれかに適切である。
【０４６８】
いくつかの例では、本明細書中に開示の方法および組成物を使用して得ることができるかまたは改善させることができる植物としては、農業、園芸、バイオ燃料分子および他の化学物質を生産するためのバイオマス、ならびに／または林業に重要であるかまたは興味深い植物を挙げることができる。それらの植物のいくつかの例としては、パイナップル、バナナ、ココナッツ、ユリ、グラスピー、およびイネ科植物；ならびに、例えば、エンドウ、アルファルファ、オオブドウホオズキ、メロン、ヒヨコマメ、チコリー、クローバ、ケール、レンズマメ、ダイズ、タバコ、ジャガイモ、サツマイモ、ダイコン、キャベツ、アブラナ、リンゴの木、ブドウ、ワタ、ヒマワリ、シロイヌナズナ、キャノーラ、柑橘類（オレンジ、マンダリン、キンカン、レモン、ライム、グレープフルーツ、タンジェリン、タンジェロ、シトロン、およびザボンを含む）、コショウ、豆、レタス、Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ（スイッチグラス）、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ（モロコシ、スーダン）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ（ススキ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐ．（エネルギーケーン）、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ（ポプラ）、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（トウモロコシ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（ダイズ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（キャノーラ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ（コムギ）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ（ワタ）、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（イネ）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（テンサイ）、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ（トウジンヒエ）、Ｐａｎｉｃｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｓｐｐ．、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．、Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ（ライ麦）、Ｓａｌｉｘ  ｓｐｐ．（ヤナギ）、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐ．（ユーカリ）、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ  ｓｐｐ．（ｔｒｉｔｉｃｕｍ−２５  コムギ×ライ麦）、タケ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ）、Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ（ジャトロファ）、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（キャスター）、Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ（アブラヤシ）、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ（ナツメヤシ）、Ａｒｃｈｏｎｔｏｐｈｏｅｎｉｘ  ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａｎａ（ユスラヤシ）、Ｓｙａｇｒｕｓ  ｒｏｍａｎｚｏｆｆｉａｎａ（ジョウオウヤシ）、Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（亜麻）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（キャッサバ（ｃａｓｓａｙａ））、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｌｉｖａ（レタス）、Ｍｕｓａ  ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ（バナナ）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ（ブロッコリ、カリフラワー、メキャベツ）、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（茶）、Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ（イチゴ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ（ココア）、Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ（コーヒー）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（ブドウ）、Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ（パイナップル）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｍ（トウガラシおよびアマトウガラシ）、Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ（タマネギ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ（メロン）、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ（キュウリ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ（カボチャ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ（カボチャ）、Ｓｐｉｎａｃｅａ  ｏｌｅｒａｃｅａ（ホウレンソウ）、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ（スイカ）、Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ（オクラ）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ（ナス）、Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ（ケシ）、Ｐａｐａｖｅｒ  ｏｒｉｅｎｔａｌｅ、Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａ、Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ、Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｌｉｖａ、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｕｍｉｎａｔｅ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ、Ｖｉｎｃａ  ｒｏｓｅａ、Ｃｉｎｃｈｏｎａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｃｏｉｃｈｉｃｕｍ  ａｕｔｕｍｎａｌｅ、Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｌａｎａｔａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ５  ｓｐｐ．、Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、Ａｔｒｏｐａ  ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ、Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｏｍｏｎｉｕｍ、Ｂｅｒｂｅｒｉｓ  ｓｐｐ．、Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ  ｓｐｐ．、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｉｎｉｃａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｐｐ．、Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ  ｃｏｃａ、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｗｏｒｎｏｒｉｉ、Ｓｃｏｐｏｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ  ｓｅｒｒａｔｕｍ（Ｈｕｐｅｒｚｉａ  ｓｅｒｒａｔａ）、Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｒａｕｗｏｌｆｉａ  ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ、Ｒａｕｗｏｌｆｉａ  ｓｐｐ．、Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ、Ｃｏｌｅｕｓ  ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ、Ｔａｎａｃｅｔｕｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ（グアユール）、Ｈｅｖｅａ  ｓｐｐ．（ゴム）、Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ（ミント）、Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ（ミント）、Ｂｉｘａ  ｏｒｅｌｌａｎａ、Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｒｏｓａ  ｓｐｐ．（バラ）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ（カーネーション）、Ｐｅｔｕｎｉａ  ｓｐｐ．（ペチュニア）、Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ（ポインセチア）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）、Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ（ルピナス）、Ｕｎｉｏｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（オート麦）、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ）、およびＬｏｌｉｕｍ  ｓｐｐ．（ライ麦）などの双子葉植物を挙げることができる。
【０４６９】
いくつかの例では、単子葉植物を使用することができる。単子葉植物は、Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ、Ａｒａｌｅｓ、Ａｒｅｃａｌｅｓ、Ｂｒｏｍｅｌｉａｌｅｓ、Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ、Ｃｙｃｌａｎｔｈａｌｅｓ、Ｃｙｐｅｒａｌｅｓ、Ｅｒｉｏｃａｕｌａｌｅｓ、Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｌｅｓ、Ｊｕｎｃａｌｅｓ、Ｌｉｌｌｉａｌｅｓ、Ｎａｊａｄａｌｅｓ、Ｏｒｃｈｉｄａｌｅｓ、Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ、Ｐｏａｌｅｓ、Ｒｅｓｔｉｏｎａｌｅｓ、Ｔｒｉｕｒｉｄａｌｅｓ、Ｔｙｐｈａｌｅｓ、およびＺｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ目に属する。Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅの綱に属する植物は、Ｃｙｃａｄａｌｅｓ、Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ、Ｇｎｅｔａｌｅｓ、およびＰｉｎａｌｅｓである。いくつかの例では、単子葉植物は、メイズ、イネ、コムギ、オオムギ、およびサトウキビからなる群から選択することができる。
【０４７０】
いくつかの例では、Ａｒｉｓｔｏｃｈｉａｌｅｓ、Ａｓｔｅｒａｌｅｓ、Ｂａｔａｌｅｓ、Ｃａｍｐａｎｕｌａｌｅｓ、Ｃａｐｐａｒａｌｅｓ、Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ、Ｃａｓｕａｒｉｎａｌｅｓ、Ｃｅｌａｓｔｒａｌｅｓ、Ｃｏｒｎａｌｅｓ、Ｄｉａｐｅｎｓａｌｅｓ、Ｄｉｌｌｅｎｉａｌｅｓ、Ｄｉｐｓａｃａｌｅｓ、Ｅｂｅｎａｌｅｓ、Ｅｒｉｃａｌｅｓ、Ｅｕｃｏｍｉａｌｅｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ、Ｆａｂａｌｅｓ、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ、Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ、Ｈａｌｏｒａｇａｌｅｓ、Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｌｅｓ、Ｍｉｄｄｌｅｓ、Ｊｕｇｌａｎｄａｌｅｓ、Ｌａｍｉａｌｅｓ、Ｌａｕｒａｌｅｓ、Ｌｅｃｙｔｈｉｄａｌｅｓ、Ｌｅｉｔｎｅｒｉａｌｅｓ、Ｍａｇｎｉｏｌａｌｅｓ、Ｍａｌｖａｌｅｓ、Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ、Ｍｙｒｔａｌｅｓ、Ｎｙｍｐｈａｅａｌｅｓ、Ｐａｐｅｖｅｒａｌｅｓ、Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ、Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｌｅｓ、Ｐｌｕｍｂ  ａｇｉｎａｌｅｓ、Ｐｏｄｏｓｔｅｍａｌｅｓ、Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ、Ｐｏｌｙｇａｌａｌｅｓ、Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ、Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ、Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ、Ｒａｆｆｌｅｓｉａｌｅｓ、Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ、Ｒｈａｍｎａｌｅｓ、Ｒｏｓａｌｅｓ、Ｒｕｂｉａｌｅｓ、Ｓａｌｉｃａｌｅｓ、Ｓａｎｔａｌｅｓ、Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ、Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ、Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｌｅｓ、Ｔｈｅａｌｅｓ、Ｔｒｏｃｈｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ、Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ、Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ、およびＶｉｏｌａｔｅｓの目に属するものを含む双子葉植物を使用することができる。いくつかの例では、双子葉植物は、ワタ、ダイズ、コショウ、およびトマトからなる群から選択することができる。
【０４７１】
いくつかの場合では、改善される植物は、実験条件に容易に適合しない。例えば、作物植物は、十分に成長するのに時間が長くかかり過ぎるため、改善された形質を複数の繰り返しで連続的に評価することが実際上できない場合がある。したがって、細菌が最初に単離される第１の植物および／または遺伝子操作した細菌を付与する複数の植物は、所望の条件下での評価をより行い易い植物などのモデル植物であってもよい。モデル植物の非限定的な例としては、Ｓｅｔａｒｉａ属、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ属、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属が挙げられる。その後、モデル植物を使用して本開示の方法により単離された細菌の能力を、別のタイプの植物（例えば、作物植物）に付与して、改善された形質の付与を確認することができる。
【０４７２】
本明細書に開示されている方法により改善させることができる形質としては、例えば、成長速度、植物丈、重量、色、味、臭い、植物による１またはそれを超える化合物（例えば、代謝物、タンパク質、薬物、炭水化物、油、および任意の他の化合物を含む）の産生の変化を含む植物の任意の観察可能な特徴が挙げられる。遺伝子型情報に基づいて植物を選択することも起想される（例えば、細菌に応答した植物遺伝子発現のパターンを含むこと、または窒素固定の増加に関連するものなどの遺伝子マーカーの存在を同定すること）。また、植物は、ある特定の特徴または形質（望ましい特徴または形質など）の存在ではなく、ある特定の特徴または形質（望ましくない特徴または形質など）の非存在、抑制、または阻害に基づいて選択してもよい。
【０４７３】
非遺伝子改変メイズ
【０４７４】
本明細書中に記載の方法および細菌は、種々の非遺伝子改変メイズ植物またはその一部のいずれかに適切である。いくつかの態様では、トウモロコシは有機栽培される。さらに、本明細書中に記載の方法および細菌は、以下の非遺伝子改変のハイブリッド、品種、系統などのいずれかに適切である。いくつかの実施形態では、トウモロコシ品種は、一般に、以下の６つのカテゴリーに分類される：スイートコーン、フリントコーン、ポップコーン、デントコーン、ポッドコーン、およびフラワーコーン。
【０４７５】
スイートコーン
イエローｓｕ品種としては、Ｅａｒｌｉｖｅｅ、Ｅａｒｌｙ  Ｓｕｎｇｌｏｗ、Ｓｕｎｄａｎｃｅ、Ｅａｒｌｙ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｂａｎｔａｍ、Ｉｏｃｈｉｅｆ、Ｍｅｒｉｔ、Ｊｕｂｉｌｅｅ、およびＧｏｌｄｅｎ  Ｃｒｏｓｓ  Ｂａｎｔａｍが含まれる。ホワイトｓｕ品種としては、Ｔｒｕｅ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ、Ｃｏｕｎｔｒｙ  Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｑｕｅｅｎ、およびＳｔｏｗｅｌｌ’ｓ  Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎが挙げられる。バイカラーｓｕ品種としては、Ｓｕｇａｒ＆Ｇｏｌｄ、Ｑｕｉｃｋｉｅ、Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｂｕｔｔｅｒ＆Ｓｕｇａｒ、Ｓｕｇａｒ  Ｄｏｔｓ、Ｈｏｎｅｙ＆Ｃｒｅａｍが挙げられる。マルチカラーｓｕ品種としては、Ｈｏｏｋｅｒｓ、Ｔｒｉｐｌｅ  Ｐｌａｙ、Ｐａｉｎｔｅｄ  Ｈｉｌｌ、Ｂｌａｃｋ  Ｍｅｘｉｃａｎ／Ａｚｔｅｃが挙げられる。
【０４７６】
イエローｓｅ品種としては、Ｂｕｔｔｅｒｇｏｌｄ、Ｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ、Ｓｐｒｉｎｇ  Ｔｒｅａｔ、Ｓｕｇａｒ  Ｂｕｎｓ、Ｃｏｌｏｒｏｗ、Ｋａｎｄｙ  Ｋｉｎｇ、Ｂｏｄａｃｉｏｕｓ  Ｒ／Ｍ、Ｔｕｘｅｄｏ、Ｉｎｃｒｅｄｉｂｌｅ、Ｍｅｒｌｉｎ、Ｍｉｒａｃｌｅ、およびＫａｎｄｙ  Ｋｏｒｎ  ＥＨが挙げられる。ホワイトｓｅ品種としては、Ｓｐｒｉｎｇ  Ｓｎｏｗ、Ｓｕｇａｒ  Ｐｅａｒｌ、Ｗｈｉｔｅｏｕｔ、Ｃｌｏｕｄ  Ｎｉｎｅ、Ａｌｐｉｎｅ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｋｉｎｇ、およびＡｒｇｅｎｔが挙げられる。バイカラーｓｅ品種としては、Ｓｕｇａｒ  Ｂａｂｙ、Ｆｌｅｅｔ、Ｂｏｎ  Ｊｏｕｒ、Ｔｒｉｎｉｔｙ、Ｂｉ−Ｌｉｃｉｏｕｓ、Ｔｅｍｐｔａｔｉｏｎ、Ｌｕｓｃｉｏｕｓ、Ａｍｂｒｏｓｉａ、Ａｃｃｏｒｄ、Ｂｒｏｃａｄｅ、Ｌａｎｃｅｌｏｔ、Ｐｒｅｃｉｏｕｓ  Ｇｅｍ、Ｐｅａｃｈｅｓ  ａｎｄ  Ｃｒｅａｍ  Ｍｉｄ  ＥＨ、およびＤｅｌｅｃｔａｂｌｅ  Ｒ／Ｍが挙げられる。マルチカラーｓｅ品種としては、Ｒｕｂｙ  Ｑｕｅｅｎが挙げられる。
【０４７７】
イエローｓｈ２品種としては、Ｅｘｔｒａ  Ｅａｒｌｙ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｗｅｅｔ、Ｔａｋｅｏｆｆ、Ｅａｒｌｙ  Ｘｔｒａ  Ｓｗｅｅｔ、Ｒａｖｅｌｉｎｅ、Ｓｕｍｍｅｒ  Ｓｗｅｅｔ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｋｒｉｓｐｙ  Ｋｉｎｇ、Ｇａｒｒｉｓｏｎ、Ｉｌｌｉｎｉ  Ｇｏｌｄ、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｒ、Ｐａｓｓｉｏｎ、Ｅｘｃｅｌ、Ｊｕｂｉｌｅｅ  ＳｕｐｅｒＳｗｅｅｔ、Ｉｌｌｉｎｉ  Ｘｔｒａ  Ｓｗｅｅｔ、およびＣｒｉｓｐ  ‘Ｎ  Ｓｗｅｅｔが挙げられる。ホワイトｓｈ２品種としては、Ｓｕｍｍｅｒ  Ｓｗｅｅｔ  Ｗｈｉｔｅ、Ｔａｈｏｅ、Ａｓｐｅｎ、Ｔｒｅａｓｕｒｅ、Ｈｏｗ  Ｓｗｅｅｔ  Ｉｔ  Ｉｓ、およびＣａｍｅｌｏｔが挙げられる。バイカラーｓｈ２品種としては、Ｓｕｍｍｅｒ  Ｓｗｅｅｔ  Ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｒａｄｉａｎｃｅ、Ｈｏｎｅｙ  ‘Ｎ  Ｐｅａｒｌ、Ａｌｏｈａ、Ｄａｚｚｌｅ、Ｈｕｄｓｏｎ、およびＰｈｅｎｏｍｅｎａｌが挙げられる。
【０４７８】
イエローｓｙ品種としては、Ａｐｐｌａｕｓｅ、Ｉｎｆｅｒｎｏ、Ｈｏｎｅｙｔｒｅａｔ、およびＨｏｎｅｙ  Ｓｅｌｅｃｔが挙げられる。ホワイトｓｙ品種としては、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｄｕｃｈｅｓｓ、Ｃｉｎｄｅｒｅｌｌａ、Ｍａｔｔａｐｏｉｓｅｔｔ、Ａｖａｌｏｎ、およびＣａｐｔｉｖａｔｅが挙げられる。バイカラーｓｙ品種としては、Ｐａｙ  Ｄｉｒｔ、Ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ、Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ、Ｃｈａｒｉｓｍａ、Ｓｙｎｅｒｇｙ、Ｍｏｎｔａｕｋ、Ｋｒｉｓｔｉｎｅ、Ｓｅｒｅｎｄｉｐｉｔｙ／Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ、およびＣａｍｅｏが挙げられる。
【０４７９】
イエロー強甘味種としては、Ｘｔｒａ−Ｔｅｎｄｅｒ  １ｄｄＡ、Ｘｔｒａ−Ｔｅｎｄｅｒ  １１ｄｄ、Ｍｉｒａｉ  １３１Ｙ、Ｍｉｒａｉ  １３０Ｙ、Ｖｉｓｉｏｎ、およびＭｉｒａｉ  ００２が挙げられる。ホワイト強甘味種としては、Ｘｔｒａ−Ｔｅｎｄｅｒ  ３ｄｄａ、Ｘｔｒａ−Ｔｅｎｄｅｒ  ３１ｄｄ、Ｍｉｒａｉ  ４２１Ｗ、ＸＴＨ  ３６７３、およびＤｅｖｏｔｉｏｎが挙げられる。バイカラー強甘味種としては、Ｘｔｒａ−Ｔｅｎｄｅｒ  ２ｄｄａ、Ｘｔｒａ−Ｔｅｎｄｅｒ  ２１ｄｄ、Ｋｉｃｋｏｆｆ  ＸＲ、Ｍｉｒａｉ  ３０８ＢＣ、Ａｎｔｈｅｍ  ＸＲ、Ｍｉｒａｉ  ３３６ＢＣ、Ｆａｎｔａｓｔｉｃ  ＸＲ、Ｔｒｉｕｍｐｈ、Ｍｉｒａｉ  ３０１ＢＣ、Ｓｔｅｌｌａｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｒｅａｍ、Ｍｉｒａｉ  ３５０ＢＣ、およびＯｂｓｅｓｓｉｏｎが挙げられる。
【０４８０】
フリントコーン
【０４８１】
フリントコーン品種としては、Ｂｒｏｎｚｅ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｃａｎｄｙ  Ｒｅｄ  Ｆｌｉｎｔ、Ｆｌｏｒｉａｎｉ  Ｒｅｄ  Ｆｌｉｎｔ、Ｇｌａｓｓ  Ｇｅｍ、Ｉｎｄｉａｎ  Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ（Ｒａｉｎｂｏｗ）、Ｍａｎｄａｎ  Ｒｅｄ  Ｆｌｏｕｒ、Ｐａｉｎｔｅｄ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ、Ｐｅｔｍｅｃｋｙ、Ｃｈｅｒｏｋｅｅ  Ｗｈｉｔｅ  Ｆｌｏｕｒが挙げられる。
【０４８２】
ポップコーン
【０４８３】
ポップコーン品種としては、Ｍｏｎａｒｃｈ  Ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ、Ｙｅｌｌｏｗ  Ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ、Ｍｉｄｎｉｇｈｔ  Ｂｌｕｅ、Ｒｕｂｙ  Ｒｅｄ、Ｍｉｘｅｄ  Ｂａｂｙ  Ｒｉｃｅ、Ｑｕｅｅｎ  Ｍａｕｖｅ、Ｍｕｓｈｒｏｏｍ  Ｆｌａｋｅ、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ、Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｂｌｕｅ  Ｓｈａｍａｎ、Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  Ｃｏｌｏｒｅｄ、Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  Ｐｉｎｋ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｄｕｔｃｈ  Ｂｕｔｔｅｒ  Ｆｌａｖｏｒ、およびＲｅｄ  Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙが挙げられる。
【０４８４】
デントコーン
【０４８５】
デントコーン品種としては、Ｂｌｏｏｄｙ  Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｂｌｕｅ  Ｃｌａｒａｇｅ、Ｏｈｉｏ  Ｂｌｕｅ  Ｃｌａｒａｇｅ、Ｃｈｅｒｏｋｅｅ  Ｗｈｉｔｅ  Ｅａｇｌｅ、Ｈｉｃｋｏｒｙ  Ｃａｎｅ、Ｈｉｃｋｏｒｙ  Ｋｉｎｇ、Ｊｅｌｌｉｃｏｒｓｅ  Ｔｗｉｎ、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｒａｉｎｂｏｗ、Ｄａｙｍｏｎ  Ｍｏｒｇａｎ’ｓ  Ｋｎｔ．Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｌｅａｍｉｎｇ、Ｌｅａｍｉｎｇ’ｓ  Ｙｅｌｌｏｗ、ＭｃＣｏｒｍａｃｋ’ｓ  Ｂｌｕｅ  Ｇｉａｎｔ、Ｎｅａｌ  Ｐａｙｍａｓｔｅｒ、Ｐｕｎｇｏ  Ｃｒｅｅｋ  Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｒｅｉｄ’ｓ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｄｅｎｔ、Ｒｏｔｔｅｎ  Ｃｌａｒａｇｅ、およびＴｅｎｎｅｓｓｅｅ  Ｒｅｄ  Ｃｏｂが挙げられる。
【０４８６】
いくつかの実施形態では、トウモロコシ品種としては、Ｐ１６１８Ｗ、Ｐ１３０６Ｗ、Ｐ１３４５、Ｐ１１５１、Ｐ１１９７、Ｐ０５７４、Ｐ０５８９、およびＰ０１５７が挙げられる。Ｗ＝ホワイトコーン。
【０４８７】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の方法および細菌は、本明細書中に記載のメイズ品種の任意のハイブリッドに適切である。
【０４８８】
遺伝子改変メイズ
本明細書中に記載の方法および細菌は、遺伝子改変メイズ植物またはその一部の任意のハイブリッド、品種、系統などに適切である。
【０４８９】
さらに、本明細書中に記載の方法および細菌は、１またはそれを超える国で承認されている任意の以下の遺伝子改変メイズイベントに適切である：３２１３８（３２１３８  ＳＰＴ  Ｍａｉｎｔａｉｎｅｒ）、３２７２（ＥＮＯＧＥＮ）、３２７２×Ｂｔ１１、３２７２×ｂｔ１１×ＧＡ２１、３２７２×Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４、３２７２×Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、３２７２×Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７×ＧＡ２１、３２７２×ＧＡ２１、３２７２×ＭＩＲ６０４、３２７２×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、４１１４、５３０７（ＡＧＲＩＳＵＲＥ  Ｄｕｒａｃａｄｅ）、５３０７×ＧＡ２１、５３０７×ＭＩＲ６０４×Ｂｔ１１×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ  Ｄｕｒａｃａｄｅ  ５１２２）、５３０７×ＭＩＲ６０４×Ｂｔ１１×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１×ＭＩＲ１６２（ＡＧＲＩＳＵＲＥ  Ｄｕｒａｃａｄｅ  ５２２２）、５９１２２（ＨＥＲＣＵＬＥＸ  ＲＷ）、５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、５９１２２×ＧＡ２１、５９１２２×ＭＩＲ６０４、５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７、５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、５９１２２×ＭＯＮ８１０、５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４、５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３、５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３×ＭＩＲ６０４、５９１２２×ＭＯＮ８８０１７、５９１２２×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、５９１２２×ＮＫ６０３（Ｈｅｒｃｕｌｅｘ  ＲＷ  ＲＯＵＮＤＵＰ  ＲＥＡＤＹ  ２）、５９１２２×ＮＫ６０３×ＭＩＲ６０４、５９１２２×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、６７６、６７８、６８０、３７５１  ＩＲ、９８１４０、９８１４０×５９１２２、９８１４０×ＴＣ１５０７、９８１４０×ＴＣ１５０７×５９１２２、Ｂｔ１０（Ｂｔ１０）、Ｂｔ１１［Ｘ４３３４ＣＢＲ、Ｘ４７３４ＣＢＲ］（ＡＧＲＩＳＵＲＥ  ＣＢ／ＬＬ）、Ｂｔ１１×５３０７、Ｂｔ１１×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×５９１２２×ＭＩＲ６０４、Ｂｒ１１×５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７、Ｍ５３、Ｍ５６、ＤＡＳ−５９１２２−７、Ｂｔ１１×５９１２２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×５９１２２×ＴＣ１５０７、ＴＣ１５０７×ＤＡＳ−５９１２２−７、Ｂｔ１１×５９１２２×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ  ＧＴ／ＣＢ／ＬＬ）、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２（ＡＧＲＩＳＵＲＥ  Ｖｉｐｔｅｒａ  ２１００）、ＢＴ１１×ＭＩＲ１６２×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ  Ｖｉｐｔｅｒａ  ３１１０）、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４（ＡＧＲＩＳＵＲＥ  Ｖｉｐｔｅｒａ  ３１００）、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ  Ｖｉｐｔｅｒａ  ３１１１／ＡＧＲＩＳＵＲＥ  Ｖｉｐｔｅｒａ  ４）、Ｂｔ１１、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＭＯＮ８９０３４×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＯＮ８９０３４、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＭＯＮ８９０３４×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＲ１６２×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ  Ｖｉｐｔｅｒａ  ３２２０）、ＢＴ１１×ＭＩＲ６０４（Ａｇｒｉｓｕｒｅ  ＢＣ／ＬＬ／ＲＷ）、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×５３０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７、Ｂｔ１１×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＭＯＮ８９ＯＥ３４×ＧＡ２１、Ｂｔ１１×ＴＣ１５０７、Ｂｔ１１×ＴＣ１５０７×５３０７、Ｂｔ１１×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、Ｂｔ１７６［１７６］（ＮａｔｕｒＧａｒｄ  ＫｎｏｃｋＯｕｔ／Ｍａｘｉｍｉｚｅｒ）、ＢＶＬＡ４３０１０１、ＣＢＨ−３５１（ＳＴＡＲＬＩＮＫ  Ｍａｉｚｅ）、ＤＡＳ４０２７８（ＥＮＬＩＳＴ  Ｍａｉｚｅ）、ＤＡＳ４０２７８×ＮＫ６０３、ＤＢＴ４１８（Ｂｔ  Ｘｔｒａ  Ｍａｉｚｅ）、ＤＬＬ２５［Ｂ１６］、ＧＡ２１（ＲＯＵＮＤＵＰ  ＲＥＡＤＹ  Ｍａｉｚｅ／ＡＧＲＩＳＵＲＥ  ＧＴ）、ＧＡ２１×ＭＯＮ８１０（ＲＯＵＮＤＵＰ  ＲＥＡＤＹ  Ｙｉｅｌｄｇａｒｄ  Ｍａｉｚｅ）、ＧＡ２１×Ｔ２５、ＨＣＥＭ４８５、ＬＹ０３８（ＭＡＶＥＲＡ  Ｍａｉｚｅ）、ＬＹ０３８×ＭＯＮ８１０（ＭＡＶＥＲＡ  Ｙｉｅｌｄｇａｒｄ  Ｍａｉｚｅ）、ＭＩＲ１６２（ＡＧＲＩＳＵＲＥ  Ｖｉｐｔｅｒａ）、ＭＩＲ１６２×５３０７、ＭＩＲ１６２×５３０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×５３０７、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×５３０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＭＯＮ８９ＯＥ３４、ＭＩＲ１６２×ＮＫ６０３、ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７、ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７×５３０７、ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７×５３０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ１６２×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ６０４（ＡＧＲＩＳＵＲＥ  ＲＷ）、ＭＩＲ６０４×５３０７、ＭＩＲ６０４×５３０７×ＧＡ２１、ＭＩＲ６０４×ＧＡ２１（ＡＧＲＩＳＵＲＥ  ＧＴ／ＲＷ）、ＭＩＲ６０４×ＮＫ６０３、ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７、ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７、ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×５３０７  ｘＧＡ２１、ＭＩＲ６０４×ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、ＭＯＮ８０１［ＭＯＮ８０１００］、ＭＯＮ８０２、ＭＯＮ８０９、ＭＯＮ８１０（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ、ＭＡＩＺＥＧＡＲＤ）、ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ１６２、ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ１６２×ＮＫ６０３、ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４、ＭＯＮ８１０×ＭＯＮ８８０１７（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ  ＶＴ  Ｔｒｉｐｌｅ）、ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３×ＭＩＲ６０４、ＭＯ��８３２（ＲＯＵＮＤＵＰ  ＲＥＡＤＹ  Ｍａｉｚｅ）、ＭＯＮ８６３（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ  Ｒｏｏｔｗｏｒｍ  ＲＷ、ＭＡＸＧＡＲＤ）、ＭＯＮ８６３×ＭＯＮ８１０（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ  Ｐｌｕｓ）、ＭＯＮ８６３×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ  Ｐｌｕｓ  ｗｉｔｈ  ＲＲ）、ＭＯＮ８６３×ＮＫ６０３（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ  ＲＷ＋ＲＲ）、ＭＯＮ８７４０３、ＭＯＮ８７４１１、ＭＯＮ８７４１９、ＭＯＮ８７４２７（ＲＯＵＮＤＵＰ  ＲＥＡＤＹ  Ｍａｉｚｅ）、ＭＯＮ８７４２７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８８０１７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＭＩＲ１６２×ＭＯＮ８７４１１、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８８０１７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＮＫ６０３、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８７４１１×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８７４１１×５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９ＯＥ３４×ＭＩＲ１６２×ＮＫ６０３、ＭＯＮ８７４２７×ＭＯＮ８９ＯＥ３４×ＴＣ１５ＯＥ７×ＭＯＮ８８ＯＥ１７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＴＣ１５０７、ＭＯＮ８７４２７×ＴＣ１５０７×５９１２２、ＭＯＮ８７４２７×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４２７×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７×５９１２２、ＭＯＮ８７４６０（ＧＥＮＵＩＴＹ  ＤＲＯＵＧＨＴＧＡＲＤ）、ＭＯＮ８７４６０×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４６０×ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８７４６０×ＭＯＮ８９０３４×ＮＫ６０３、ＭＯＮ８７４６０×ＮＫ６０３、ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４、ＭＯＮ８９０３４×５９１２２、ＭＯＮ８９０３４×５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×５９１２２×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８９０３４×５９１２２×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８７４６０、ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８８０１７（ＧＥＮＵＩＴＹ  ＶＴ  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｐｒｏ）、ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＮＫ６０３（ＧＥＮＵＩＴＹ  ＶＴ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｐｒｏ）、ＭＯＮ８９０３４×ＮＫ６０３×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×５９１２２、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７×５９１２２（ＧＥＮＵＩＴＹ  ＳＭＡＲＴＳＴＡＸ）、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７×５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３（ＰＯＷＥＲ  ＣＯＲＥ）、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３×ＭＩＲ１６２、ＭＯＮ８９０３４×ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３×ＭＩＲ１６２×ＤＡＳ４０２７８、ＭＯＮ８９ＯＥ３４×ＧＡ２１、ＭＳ３（ＩＮＶＩＧＯＲ  Ｍａｉｚｅ）、ＭＳ６（ＩＮＶＩＧＯＲ  Ｍａｉｚｅ）、ＭＺＨＧ０ＪＧ、ＭＺＩＲ０９８、ＮＫ６０３（ＲＯＵＮＤＵＰ  ＲＥＡＤＹ  ２  Ｍａｉｚｅ）、ＮＫ６０３×ＭＯＮ８１０×４１１４×ＭＩＲ６０４、ＮＫ６０３×ＭＯＮ８１０（ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ  ＣＢ＋ＲＲ）、ＮＫ６０３×Ｔ２５（ＲＯＵＮＤＵＰ  ＲＥＡＤＹ  ＬＩＢＥＲＴＹ  ＬＩＮＫ  Ｍａｉｚｅ）、Ｔ１４（ＬＩＢＥＲＴＹ  ＬＩＮＫ  Ｍａｉｚｅ）、Ｔ２５（ＬＩＢＥＲＴＹ  ＬＩＮＫ  Ｍａｉｚｅ）、Ｔ２５×ＭＯＮ８１０（ＬＩＢＥＲＴＹ  ＬＩＮＫ  ＹＩＥＬＤＧＡＲＤ  Ｍａｉｚｅ）、ＴＣ１５０７（ＨＥＲＣＵＬＥＸ  Ｉ、ＨＥＲＣＵＬＥＸ  ＣＢ）、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４×ＮＫ６０３（ＯＰＴＩＭＵＭ  ＩＮＴＲＡＳＥＣＴ  ＸＴＲＥＭＥ）、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４×ＮＫ６０３、ＴＣ１５０７×５３０７、ＴＣ１５０７×５３０７×ＧＡ２１、ＴＣ１５０７×５９１２２（ＨＥＲＣＵＬＥＸ  ＸＴＲＡ）、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＤＡＳ４０２７８、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８１０、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３（ＯＰＴＩＭＵＭ  ＩＮＴＲＡＳＥＣＴ  ＸＴＲＡ）、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８８０１７、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＮＫ６０３（ＨＥＲＣＵＬＥＸ  ＸＴＲＡ  ＲＲ）、ＴＣ１５０７×５９１２２×ＮＫ６０３×ＭＩＲ６０４、ＴＣ１５０７×ＤＡＳ４０２７８、ＴＣ１５０７×ＧＡ２１、ＴＣ１５０
７×ＭＩＲ１６２×ＮＫ６０３、ＴＣ１５０７×ＭＩＲ６０４×ＮＫ６０３（ＯＰＴＩＭＵＭ  ＴＲＩＳＥＣＴ）、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ１６２、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ１６２×ＮＫ６０３、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＭＩＲ６０４、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３（ＯＰＴＩＭＵＭ  ＩＮＴＲＡＳＥＣＴ）、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８１０×ＮＫ６０３×ＭＩＲ６０４、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７、ＴＣ１５０７×ＭＯＮ８８０１７×ＤＡＳ４０２７８、ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３（ＨＥＲＣＵＬＥＸ  Ｉ  ＲＲ）、ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３×ＤＡＳ４０２７８、ＴＣ６２７５、およびＶＣＯ−０１９８１−５。
【０４９０】
さらなる遺伝子改変植物
【０４９１】
本明細書中に記載の方法および細菌は、任意の種々の遺伝子改変植物またはその一部に適切である。
【０４９２】
さらに、本明細書中に記載の方法および細菌は、１またはそれを超える国で承認されている任意の以下の遺伝子改変植物イベントに適切である。
表１４：本開示の微生物と組み合わせることができるイネ形質
【表１４】
2021530984.tif 000057
表１５：本開示の微生物と組み合わせることができるアルファルファ形質
【表１５】
2021530984.tif 000058
表１６：本開示の微生物と組み合わせることができるコムギ形質
【表１６】
2021530984.tif 000059
表１７：本開示の微生物と組み合わせることができるヒマワリ形質
【表１７】
2021530984.tif 000060
表１８：本開示の微生物と組み合わせることができるダイズ形質
【表１８−１】
2021530984.tif 000061
【表１８−２】
2021530984.tif 000062
表１９：本開示の微生物と組み合わせることができるトウモロコシ形質
【表１９−１】
2021530984.tif 000063
【表１９−２】
2021530984.tif 000064
【表１９−３】
2021530984.tif 000065
【表１９−４】
2021530984.tif 000066
【表１９−５】
2021530984.tif 000067
【表１９−６】
2021530984.tif 000068
【表１９−７】
2021530984.tif 000069
【表１９−８】
2021530984.tif 000070
【表１９−９】
2021530984.tif 000071
【表１９−１０】
2021530984.tif 000072
【表１９−１１】
2021530984.tif 000073
【表１９−１２】
2021530984.tif 000074
【表１９−１３】
2021530984.tif 000075
【表１９−１４】
2021530984.tif 000076
【０４９３】
以下は表１９中の略語の定義である。ＡＭ−ＹＧＣＢ、ＨＸ１、ＬＬ、ＲＲ２を用いたＯＰＴＩＭＵＭ  ＡＣＲＥＭＡＸ害虫防御システム。ＡＭＴ−ＲＷ、ＹＧＣＢ、ＨＸ１、ＬＬ、ＲＲ２を用いたＯＰＴＩＭＵＭ  ＡＣＲＥＭＡＸ  ＴＲＩＳＥＣＴ害虫防御システム。ＡＭＸＴ−（ＯＰＴＩＭＵＭ  ＡＣＲＥＭＡＸ  ＸＴｒｅｍｅ）。ＨＸＸ−ＨＥＲＣＵＬＥＸ  ＸＴＲＡは、ＨｅｒｃｕｌｅｘＩ遺伝子およびＨｅｒｃｕｌｅｘＲＷ遺伝子を含む。ＨＸ１−セイヨウアワノメイガ、サウスウェスタンコーンボーラー、タマナヤガ、ツマジロクサヨトウ、ウエスタンビーンカットワーム、モロコシマダラメイガ、サザンコーンストークボーラー、およびサトウキビメイガから防御し；アメリカタバコガを抑制するＨＥＲＣＵＬＥＸ  Ｉ昆虫防御遺伝子を含む。ＬＬ−ＬＩＢＥＲＴＹ除草剤耐性のためのＬＩＢＥＲＴＹＬＩＮＫ遺伝子を含む。ＲＲ２−ラベルの指示にしたがって付与したときにラベルのグリホサート除草剤の過剰付与に対する安全性を作物に提供するＲＯＵＮＤＵＰ  ＲＥＡＤＹ  Ｃｏｒｎ２形質を含む。ＹＧＣＢ−セイヨウアワノメイガ、サウスウェスタンコーンボーラー、およびサザンコーンストークボーラーに対する高レベルの抵抗性；アメリカタバコガおよび一般的なストークボーラーに対する中程度の抵抗性；およびツマジロクサヨトウに対する平均を超える抵抗性を付与するＹＩＥＬＤＧＡＲＤ  Ｃｏｒｎ  Ｂｏｒｅｒ遺伝子を含む。ＲＷ−ＡＧＲＩＳＵＲＥルートワーム抵抗性形質を含む。Ｑ−感受性を示すセイヨウアワノメイガ、サウスウェスタンコーンボーラー、タマナヤガ、ツマジロクサヨトウ、モロコシマダラメイガ、サザンコーンストークボーラー、ストークボーラー、サトウキビメイガ、およびアメリカタバコガから防御するか抑制し；また、感受性を示すウェスタンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム、およびメキシカンコーンルートワームに原因する幼虫被害から防御し；（１）Ｃｒｙ１Ｆタンパク質およびＣｒｙ３４ａｂ１タンパク質およびＣｒｙ３５ａｂ１タンパク質を産生するＨＥＲＣＵＬＥＸ  ＸＴＲＡ昆虫防御遺伝子、（２）ｍＣｒｙ３Ａタンパク質を産生する遺伝子を含むＡＧＲＩＳＵＲＥ  ＲＷ形質、および（３）Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質を産生するＹＩＥＬＤＧＡＲＤ  Ｃｏｒｎ  Ｂｏｒｅｒ遺伝子を含む。
【０４９４】
農業組成物の付与の濃度および速度
【０４９５】
上記のように、教示される微生物を含む本開示の農業組成物は、数多くの様式で植物に付与することができる。２つの特定の態様では、本開示は、インファロー処理剤または種子処理剤を企図する。
【０４９６】
種子処理剤の実施形態の場合、本開示の微生物は、様々な濃度で種子上に存在することができる。例えば、微生物は、１種子当たり：１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、またはそれを超えるｃｆｕ濃度で種子処理剤に見出すことができる。特定の態様では、種子処理剤組成物は、１種子当たり約１×１０４〜約１×１０８ｃｆｕを含む。他の特定の態様では、種子処理剤組成物は、１種子当たり約１×１０５〜約１×１０７ｃｆｕを含む。他の態様では、種子処理剤組成物は、１種子当たり約１×１０６ｃｆｕを含む。
【０４９７】
合衆国では、トウモロコシ作付面積の約１０％は、１エーカー当たり約３６，０００種子を超える種子密度で植栽され、トウモロコシ作付面積の１／３は、１エーカー当たり約３３，０００〜３６，０００種子の種子密度で植栽され、トウモロコシ作付面積の１／３は、１エーカー当たり約３０，０００〜３３，０００種子の種子密度で植栽され、残りの作付面積は、様々である。ｗｗｗ．ｐｉｏｎｅｅｒ．ｃｏｍ／ｈｏｍｅ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ａｇｒｏｎｏｍｙ／ｌｉｂｒａｒｙ／ｃｏｒｎ−ｓｅｅｄｉｎｇ−ｒａｔｅ−ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ／で入手可能であるＳｔｅｖｅ  Ｂｕｔｚｅｎ著「Ｃｏｒｎ  Ｓｅｅｄｉｎｇ  Ｒａｔｅ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ」を参照のこと。
【０４９８】
下記の表２０では、企図されている種子処理剤実施形態における１種子当たりの種々のｃｆｕ濃度（行）および種々の種子作付け植栽密度（第１のカラム：１５Ｋ〜４１Ｋ）を使用して、１エーカー当たりのｃｆｕの合計量を算出しており、これが、種々の農業シナリオで使用されることになる（すなわち、１種子当たりの種子処理剤濃度×１エーカー当たりの植栽種子密度）。したがって、１種子当たり１×１０６ｃｆｕで種子処理剤を使用し、１エーカー当たり３０，０００種子を植栽する場合、１エーカー当たりの総ｃｆｕ含有量は、３×１０１０（すなわち、３０Ｋ＊１×１０６）であろう。
表２０：種子処理剤実施形態の１エーカー当たりの総ＣＦＵの計算
【表２０−１】
2021530984.tif 000077
【表２０−２】
2021530984.tif 000078
【０４９９】
インファロー実施形態の場合、本開示の微生物は、１×１０６、３．２０×１０１０、１．６０×１０１１、３．２０×１０１１、８．０×１０１１、１．６×１０１２、３．２０×１０１２、またはそれを超える１エーカー当たりのｃｆｕ濃度で付与することができる。したがって、態様では、液体インファロー組成物は、１エーカー当たり約１×１０６〜約３×１０１２ｃｆｕの濃度で付与することができる。
【０５００】
いくつかの態様では、インファロー組成物は、液体製剤に含まれる。液体インファロー実施形態では、微生物は、１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、またはそれを超える１ミリリットル当たりのｃｆｕ濃度で存在していてもよい。ある特定の態様では、液体インファロー組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０６〜約１×１０１１ｃｆｕの濃度の微生物を含む。他の態様では、液体インファロー組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０７〜約１×１０１０ｃｆｕの濃度の微生物を含む。他の態様では、液体インファロー組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０８〜約１×１０９ｃｆｕの濃度の微生物を含む。他の態様では、液体インファロー組成物は、１ミリリットル当たり最大約１×１０１３ｃｆｕの濃度の微生物を含む。
【０５０１】
候補微生物のトランスクリプトームプロファイリング
【０５０２】
本発明者らによる以前の作業には、環境窒素の存在下で活性なプロモーターを同定するために、菌株ＣＩ０１０のトランスクリプトームプロファイリングが必要であった。菌株ＣＩ０１０を、１０ｍＭグルタミンで補充された無窒素特定培地で培養した。これら培養から全ＲＮＡを抽出し（ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙキット）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（ＳｅｑＭａｔｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ  ＣＡ）によりＲＮＡｓｅｑ配列決定に供した。配列決定リードを、Ｇｅｎｅｉｏｕｓを使用してＣＩ０１０ゲノムデータにマッピングし、近位転写プロモーターの調節下で高度に発現された遺伝子を同定した。
【０５０３】
表２１〜２３は、全ＲＮＡのＲＮＡＳｅｑ配列決定により測定された、遺伝子およびそれらの相対的発現レベルを列挙している。ｎｉｆ経路、窒素利用関連経路、または所望の発現レベルを有する他の遺伝子の変異誘発に使用するための近位プロモーターの配列を記録している。
表２１
【表２１−１】
2021530984.tif 000079
【表２１−２】
2021530984.tif 000080
表２２
【表２２】
2021530984.tif 000081
表２３
【表２３】
2021530984.tif 000082
表２４：菌株の表
【表２４−１】
2021530984.tif 000083
【表２４−２】
2021530984.tif 000084
【表２４−３】
2021530984.tif 000085
【実施例】
【０５０４】
実施例
以下の実施例は、本開示の種々の実施形態を示すために記載しており、いかなる様式においても本開示を制限することを意図しない。特許請求の範囲によって定義される本開示の意図の範囲内に含まれる変更および他の用途が、当業者に認識されるであろう。
【０５０５】
実施例１：微生物リモデリング誘導−農業用微生物種の合理的改善のためのプラットフォーム
微生物リモデリング誘導（ＧＭＲ）プラットフォームの実施形態の概要の例を、図１Ａの略図中にまとめることができる。
【０５０６】
図１Ａは、マイクロバイオームの構成要素を最初に特徴づけることができ、（例えば、適切なコロニー化特徴を有する微生物を見出すために）目的の種を同定することを示す。
【０５０７】
目的の種の代謝をマッピングし、遺伝的特質に関連付けることができる。例えば、微生物の窒素固定経路を特徴づけることができる。特徴づけられる経路を、ある範囲の環境条件下で試験することができる。例えば、微生物がその環境における種々のレベルの外因性窒素の存在下で大気窒素を固定する能力を試験することができる。窒素の代謝は、ＡｍｔＢトランスポーターによる根圏から細菌のサイトゾル内へのアンモニア（ＮＨ４＋）の進入が関与し得る。アンモニアおよびＬ−グルタメート（Ｌ−Ｇｌｕ）は、グルタミン合成酵素およびＡＴＰによりグルタミンへと触媒される。グルタミンは、細菌バイオマスを形成させることができ、また、ｎｉｆオペロンの発現を阻害することができる（すなわち、グルタミンは、微生物に大気窒素を固定してアンモニアを排出させたい場合の競合力であり得る）。窒素固定経路は、本明細書の前のセクションに極めて詳細に特徴づけられている。
【０５０８】
その後、コンジュゲーションおよび組換え、化学的変異誘発、適応進化、および遺伝子編集が挙げられるが、これらに限定されない方法を使用して、標的化非属間ゲノム変更を微生物のゲノムに導入することができる。標的化非属間ゲノム変更は、ゲノムの挿入、破壊、欠失、変更、撹乱、改変などを含むことができる。
【０５０９】
次いで、リモデリングされた基本的な遺伝子型に起因する所望の表現型を含む誘導体のリモデリングされた微生物を使用して、作物に接種する。
【０５１０】
本開示は、一定の実施形態では、大気窒素を固定し、そのような窒素を植物に供給することができる非属間のリモデリングされた微生物を提供する。態様では、これらの非属間のリモデリングされた微生物は、外因性窒素の存在下でさえも大気窒素を固定することができる。
【０５１１】
図１Ｂは、マイクロバイオームの測定工程の拡大図を示す。いくつかの実施形態では、本開示は、所望のコロニー化の特徴を有する微生物種を見出し、次いで、その後のリモデリングプロセスでこれらの種を利用する。
【０５１２】
前述の微生物リモデリング誘導（ＧＭＲ）プラットフォームを、ここに、より具体的に記載するであろう。
【０５１３】
態様では、ＧＭＲプラットフォームは、以下の工程を含む：
【０５１４】
Ａ．単離−目的の作物の土壌、根圏、表面などから微生物を得ること；
【０５１５】
Ｂ．特徴づけ−単離された微生物を、目的の遺伝子型／表現型（例えば、ゲノム配列、コロニー化能力、窒素固定活性、Ｐの可溶化能力、目的の代謝産物の排出、植物促進化合物の排出など）について特徴づけることを含む。
【０５１６】
Ｃ．順化−微生物の非属間遺伝子改変のための分子プロトコールを開発すること；
【０５１７】
Ｄ．非属間操作キャンペーンおよび最適化−重要経路の遺伝子（例えば、コロニー化関連遺伝子、窒素固定／同化遺伝子、Ｐ可溶化遺伝子）が改変された誘導体の非属間微生物菌株の生成；
【０５１８】
Ｅ．分析−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、ＡＲＡアッセイ）およびｉｎ  ｐｌａｎｔａ（例えば、コロニー化アッセイ）の両方で目的の表現型について誘導された非属間菌株を評価すること。
【０５１９】
Ｆ．操作キャンペーン／分析の反復−微生物菌株をさらに改善するための工程ＤおよびＥの反復。
【０５２０】
各ＧＭＲプラットフォームプロセス工程を、ここで、以下に詳述するであろう。
【０５２１】
Ａ．微生物の単離
【０５２２】
１．土壌試料を得る
【０５２３】
微生物を、土壌および／または植物の根から単離するであろう。１つの例では、植物を、小型の鉢に入れて実験室または温室で成長させるであろう。土壌試料を、種々の農業地域から得るであろう。例えば、多様なテクスチャ特徴を有する土壌（ローム（例えば、泥炭粘土ローム、砂質ローム）、粘土質の土（例えば、重粘土、シルト質粘土）、砂質土、シルト質土、泥炭土、および白亜質土などが挙げられる）を収集することができる。
【０５２４】
２．ベイト植物の成長
【０５２５】
ベイト植物（目的の植物）（例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、雑穀、ダイズ、野菜、果実など）の種子を各土壌型に植栽するであろう。１つの例では、異なる品種のベイト植物を、種々の土壌型に植栽するであろう。例えば、目的の植物がトウモロコシである場合、異なる品種のトウモロコシ（圃場トウモロコシ、スイートコーン、ヘリテージコーンなど）の種子を、上記の種々の土壌型に植栽するであろう。
【０５２６】
３．土壌および／または根試料の採取ならびに適切な培地上へのプレーティング
【０５２７】
数週間（例えば、２〜４週間）成長させた後に、植物を引き抜くことによって植物を収穫するであろう。実験室／温室で植物を成長させる代わりに、目的の植物の土壌および／または根を、異なる土壌型を有する圃場から直接採取することができる。
【０５２８】
根圏微生物および着生菌を単離するために、根の損傷を回避するために土壌を蒸留水でぬらすか、手作業で土壌を穏やかにほぐすことによって、植物を穏やかに取り出すであろう。より大きな土壌粒子が存在する場合、これらの粒子を、流れのない蒸留水に根を浸漬し、そして／または根を穏やかに振ることによって除去するであろう。根を切断し、根に固着している土壌のスラリーを、少量の蒸留水を有するプレートまたはチューブ中に根を入れ、振盪機上でプレート／チューブを穏やかに浸透するか、チューブを低速で遠心分離することによって調製するであろう。このスラリーを、上記のように処理するであろう。
【０５２９】
内部寄生菌を単離するために、根表面の過剰な土壌を脱イオン水で除去するであろう。土壌を除去した後、植物を表面滅菌し、滅菌水で入念にすすぐであろう。洗浄された、１ｃｍ区画の根を植物から切除し、３ｍｍの鋼鉄ビーズを含有するリン酸緩衝生理食塩水に入れるであろう。Ｑｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩで溶液を激しく振とうすることにより、スラリーを生成するであろう。
【０５３０】
土壌および／または根スラリーを、単離すべき微生物の所望の植物に有利な形質に応じた種々の方法で処理することができる。例えば、土壌および根のスラリーを希釈し、種々のタイプのスクリーニング培地上に接種して、根圏性微生物、内部寄生性微生物、着生性微生物、および他の植物付随微生物を単離することができる。例えば、所望の植物に有利な形質が窒素固定である場合、土壌／根スラリーを、無窒素培地（例えば、Ｎｆｂ寒天培地）上にプレートして、窒素固定微生物を単離するであろう。同様に、リン溶解細菌（ＰＳＢ）を単離するために、唯一のリン供給源としてリン酸カルシウムを含む培地を使用することができる。ＰＳＢは、リン酸カルシウムを溶解し、より大量のリンを同化して放出する。この反応は、植物上にハローまたは透明帯として出現し、最初のＰＳＢ単離工程として使用することができる。
【０５３１】
４．コロニーの選別、培養物の精製、目的の遺伝子の存在についてのスクリーニング
【０５３２】
工程Ａ３で得た微生物集団を画線して単一コロニー（純粋な培養物）を得た。純粋培養物の一部を、適切な培地（例えば、Ｒ２Ａとグリセロールの混合物）に再懸濁し、ＰＣＲ分析に供して１または複数の目的の遺伝子の存在についてスクリーニングする。例えば、窒素固定細菌（ジアゾトロフ）を同定するために、単離した微生物の精製培養物をＰＣＲ分析に供して、大気窒素の、生命体に利用可能な窒素形態への固定に関与する酵素をコードするｎｉｆ遺伝子の存在を検出することができる。
【０５３３】
５．精製培養物の保管
【０５３４】
単離菌株の精製培養物を、さらなる参照および分析のために、例えば、−８０℃で保存するであろう。
【０５３５】
Ｂ．単離した微生物の特徴づけ
【０５３６】
１．系統学的特徴づけおよび全ゲノム配列決定
【０５３７】
単離した微生物を、系統学的特徴づけ（属および種の割り付け）のために分析し、微生物の全ゲノムを配列決定するであろう。
【０５３８】
系統学的特徴づけのために、単離した微生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡを、系統学的同一性を得るために縮重１６Ｓ  ｒＤＮＡプライマーを使用して配列決定するであろう。１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列のリードをデータベースにマッピングして、最初に単離した微生物の属名、種名、および菌株名を割り付けるであろう。全ゲノム配列決定を、微生物に系統学的な属／種を割り付けるための最終工程として使用する。
【０５３９】
単離した微生物の全ゲノムを配列決定して、重要経路を同定するであろう。全ゲノム配列決定のために、ゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡ単離キット（例えば、ＱＩＡＧＥＮのＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキット）を使用して単離し、総ＤＮＡライブラリーを、当該分野で公知の方法を使用して調製するであろう。全ゲノムを、当該分野で公知のハイスループット配列決定（次世代配列決定とも呼ばれる）法を使用して配列決定するであろう。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｈｅ、およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、総ＤＮＡライブラリーを調製し、全ゲノム配列決定を行うために使用することができる全ゲノム配列決定ツールを提供している。
【０５４０】
各単離した菌株の全ゲノム配列を、アセンブリし；目的の遺伝子を同定し；注釈づけし；リモデリングのための潜在的な標的として記録するであろう。全ゲノム配列を、データベース内に保存するであろう。
【０５４１】
２．温室における宿主植物のコロニー化についての微生物のアッセイ
【０５４２】
単離された微生物を、温室における宿主植物のコロニー化について特徴づけるであろう。このために、所望の宿主植物（例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、ダイズ）の種子に、単離した微生物の培養物を個別または組み合わせて接種し、土壌に植栽するであろう。あるいは、個別または組合せの単離した微生物の培養物を、根上の土壌に直接接種することによって、宿主植物の根に付与することができる。微生物のコロニー化可能性を、例えば、以下により詳細に記載した定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法を使用してアッセイするであろう。
【０５４３】
３．小規模圃場試験における宿主植物のコロニー化についての微生物のアッセイおよびコロニー化した根試料からのＲＮＡの単離（ＣＡＴ試験）
【０５４４】
単離した微生物を、小規模圃場試験における所望の宿主植物のコロニー化について評価するであろう。さらに、ＲＮＡをコロニー化根試料から単離して、圃場環境における菌株についてのトランスクリプトームデータを得るであろう。これらの小規模圃場試験によって圃場環境における菌株のコロニー化および転写物のデータが提供されるので、これらの試験を、本明細書中で、ＣＡＴ（コロニー化および転写物）試験と称する。
【０５４５】
これらの試験のために、宿主植物（例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、ダイズ）の種子に、単離した微生物の培養物を個別または組み合わせて使用して接種し、土壌に植栽するであろう。あるいは、個別または組合せの単離した微生物の培養物を、根上の土壌に直接接種することによって、宿主植物の根に付与することができる。ＣＡＴ試験を、種々の土壌中および／または種々の温度および／または水分条件下で実施して、コロニー化可能性を評価し、種々の土壌型および環境条件における微生物のトランスクリプトームプロフィールを得ることができる。
【０５４６】
接種された微生物（複数可）による宿主植物の根のコロニー化を、例えば、下記のｑＰＣＲ法を使用して評価するであろう。
【０５４７】
１つのプロトコールでは、単離した微生物のコロニー化可能性を、以下の通り評価した。トウモロコシ種子を植栽した１日後に、１ｍｌの微生物の一晩培養物（ＳＯＢ培地）で、種子が位置していたまさしくそのスポットを浸した。この一晩培養物の１ｍＬは、約１０９ｃｆｕとほぼ等しく、使用されている菌株に応じて互いに３倍以内で変動した。各実生を、２．５ｍＭまたは０．２５ｍＭのいずれかの硝酸アンモニウムを補充した５０ｍＬ改変ホーグランド溶液で週３回施肥した。植栽した４週間後、ＤＮＡを抽出するために根試料を収集した。加圧水噴霧を使用して土壌残屑を洗い流した。その後、ＱＩＡＧＥＮ  Ｔｉｓｓｕｅｌｙｚｅｒを使用して、これら組織試料をホモジナイズしてから、推奨プロトコールに従ってＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ＤＮＡを抽出した。微生物のゲノムの各々の遺伝子座に特異的であるように設計した（ＮＣＢＩのＰｒｉｍｅｒ  ＢＬＡＳＴを使用して）プライマーを使用し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３００５Ｐ  ＲＴ−ＰＣＲを使用して、これらＤＮＡ抽出物のｑＰＣＲアッセイを実施した。
【０５４８】
微生物のコロニー化可能性を反映する微生物のゲノムコピーの存在について定量した。微生物種の同一性を、ＰＣＲ増幅産物を配列決定することによって確認した。
【０５４９】
さらに、ＲＮＡを、コロニー化した根および／または土壌試料から単離し、配列決定するであろう。
【０５５０】
ＤＮＡプロフィールと異なり、ＲＮＡプロフィールは、環境条件に応じて変動する。したがって、コロニー化された根および／または土壌から単離したＲＮＡの配列決定は、根圏におけるｉｎ  ｐｌａｎｔａでの遺伝子の転写活性を反映するであろう。
【０５５１】
ＲＮＡを、コロニー化した根および／または土壌試料から異なる時点で単離して、これらの時点でのコロニー化した微生物のＲＮＡプロフィールの変化を分析することができる。
【０５５２】
例えば、ＲＮＡを、圃場への施肥直後および圃場への施肥から数週間後にコロニー化した根および／または土壌試料から単離し、配列決定して、対応する転写プロフィールを生成することができる。
【０５５３】
同様に、ＲＮＡ配列決定を、高リン酸塩条件下および低リン酸塩条件下で実施して、これらの条件下でどの遺伝子の転写が活性であり、または抑制されるのかを理解することができる。
【０５５４】
トランスクリプトーム／ＲＮＡ配列決定法は、当該分野で公知である。簡潔に述べれば、総ＲＮＡを、単離した微生物の精製培養物から単離し；逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを調製し；ｃＤＮＡを、上記のハイスループット配列決定ツールを使用して配列決定するであろう。
【０５５５】
トランスクリプトーム分析由来の配列決定のリードをゲノム配列にマッピングし、目的の遺伝子の転写プロモーターを同定することができる。
【０５５６】
４．単離した微生物の植物に有利な活性のアッセイ
【０５５７】
単離した微生物の植物に有利な活性を評価するであろう。
【０５５８】
例えば、窒素固定微生物を、アセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）を使用して窒素固定活性についてアッセイするか、リン溶解微生物をリン酸塩可溶化についてアッセイするであろう。目的の任意のパラメーターを利用し、そのようなパラメーターに適切なアッセイを開発することができる。例えば、アッセイは、コロニー化の測定基準のための成長曲線およびインドール酢酸（ＩＡＡ）またはジベレリンのような植物ホルモンの産生のためのアッセイを含み得る。目的の任意の植物に有利な活性についてのアッセイを開発することができる。
【０５５９】
この工程は、目的の表現型を確認し、任意の偽陽性を排除するであろう。
【０５６０】
５．単離した微生物由来の潜在的候補の選択
【０５６１】
上記工程で生成したデータを使用して、さらなる開発のための微生物を選択するであろう。例えば、コロニー化可能性、植物に有利な活性、ならびに／または関連するＤＮＡおよびＲＮＡのプロフィールの所望の組合せを示す微生物を、実証およびモデリングのために選択するであろう。
【０５６２】
Ｃ．選択した微生物の順化
【０５６３】
選択した微生物を順化するであろう；ここで、順化は、微生物を遺伝的に追跡可能かつ同定可能な形態に変換するであろう。
【０５６４】
１．抗生物質感受性についての試験
【０５６５】
微生物を順化するための１つの方法は、抗生物質耐性を有する微生物に操作することである。このために、野生型微生物菌株を、種々の抗生物質に対する感受性について試験するであろう。菌株が抗生物質に耐性を示す場合、抗生物質は、菌株をリモデリングするための遺伝的ツール／ベクターで用いるための良好な候補であり得る。
【０５６６】
２．ベクターの設計および構築
【０５６７】
選択した微生物（宿主微生物）を順化するための、複製に条件を有するベクター（例えば、自殺プラスミド）を構築するであろう。例えば、適切な抗生物質耐性マーカー、対抗選択マーカー、ドナー微生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）の維持のための複製起点、蛍光によって挿入についてスクリーニングするための蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、およびＣＦＰなど）をコードする遺伝子、宿主微生物へのコンジュゲーションのための移入起点、および所望の遺伝子変異を有する宿主ゲノムに対するホモロジーアームを含むポリヌクレオチド配列を含む自殺プラスミドを構築するであろう。ベクターは、ＳｃｅＩ部位および他のさらなるエレメントを含んでよい。
【０５６８】
例示的な抗生物質耐性マーカーとしては、アンピシリン耐性マーカー、カナマイシン耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性マーカー、エリスロマイシン耐性マーカー、ストレプトマイシン耐性マーカー、スペクチノマイシン耐性マーカーなどが挙げられる。例示的な対抗選択マーカーとしては、ｓａｃＢ、ｒｐｓＬ、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅＳ、ｔｈｙＡ、ｌａｃＹ、ｇａｔａ−１、ｃｃｄＢなどが挙げられる。
【０５６９】
３．ドナー微生物の生成
【０５７０】
１つのプロトコールでは、適切な抗生物質耐性マーカー、対抗選択マーカー、ｐｉｒ複製開始遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＳＴ１８の保持のためのλｐｉｒ  複製起点、蛍光によって挿入についてスクリーニングするための緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子、宿主微生物へのコンジュゲーションのための移入起点、および所望の遺伝子変異を有する宿主ゲノムに対するホモロジーアームを含むポリヌクレオチド配列（例えば、非相同の位置への挿入のための微生物自体のゲノム内部のプロモーター）を含む自殺プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＴ１８（アミノレブリン酸ＡＬＡの栄養要求株）に形質転換して、ドナー微生物を生成するであろう。
【０５７１】
４．ドナー微生物の宿主微生物との混合
【０５７２】
ドナー微生物を宿主微生物（工程Ｂ５由来の選択した候補微生物）と混合して、宿主ゲノムにプラスミドをコンジュゲーションによって組み込むであろう。ドナー微生物と宿主微生物の混合物を、抗生物質を含むが、ＡＬＡを含まない培地にプレートするであろう。自殺プラスミドは、ドナー微生物（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＴ１８）中で複製することができるが、宿主中では複製できない。したがって、ドナー微生物および宿主微生物を含む混合物を、抗生物質を含むが、ＡＬＡを含まない培地にプレートする場合、ゲノムにプラスミドを組み込んだ宿主細胞のみが、培地上で増殖し、コロニーを形成することができるであろう。ドナー微生物は、ＡＬＡが存在しないと増殖しないであろう。
【０５７３】
５．ベクター組み込みの確認
【０５７４】
宿主微生物の意図する遺伝子座への蛍光タンパク質マーカー、抗生物質耐性マーカー、対抗選択マーカーなどを含む自殺プラスミドの適切な組み込みを、プレート上のコロニーの蛍光およびコロニーＰＣＲの使用によって確認するであろう。
【０５７５】
６．画線による組み込みコロニーの確認
【０５７６】
宿主微生物における第２ラウンドの相同組換えでは、プラスミドバックボーンをループアウト（除去）し、それにより、ある特定の割合の宿主微生物の宿主ゲノムに組み込まれた所望の遺伝子変異（例えば、非相同の位置への挿入のための微生物自体のゲノム内部のプロモーター）が残される一方で、ある特定の割合の宿主微生物が野生型に戻るであろう。
【０５７７】
プラスミドバックボーンがループアウトされている（したがって、対抗選択マーカーがループアウトされている）宿主微生物のコロニーを、適切な培地上でコロニーを増殖させることによって選択することができる。
【０５７８】
例えば、ｓａｃＢを対抗選択マーカーとして使用する場合、プラスミドバックボーンの喪失に起因するこのマーカーの喪失を、スクロースを含む培地上でコロニーを増殖させることによって試験するであろう（ｓａｃＢはスクロース感受性を付与する）。この培地上で増殖するコロニーは、ｓａｃＢマーカーおよびプラスミドバックボーンを喪失しており、所望の遺伝子変異を含むか、野生型に戻っているであろう。または、これらのコロニーは、蛍光タンパク質マーカーの喪失に起因して、プレート上で蛍光を発しないであろう。
【０５７９】
いくつかの分離株では、ｓａｃＢまたは他の対抗選択マーカーは、スクロースに対する完全な感受性または他の対抗選択機序を付与せず、首尾の良いループアウトを単離するために多数のコロニーをスクリーニングする必要がある。これらの場合、宿主細胞内で独立して複製し、組み込まれた自殺プラスミドバックボーン中の部位を認識する制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｃｅＩ）を発現する「ヘルパープラスミド」の使用によってループアウトを補助してもよい。自殺プラスミドが組み込まれた菌株を、抗生物質耐性マーカー、宿主菌株と適合する複製起点、および制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターによって調節されるヘルパープラスミドで形質転換する。制限エンドヌクレアーゼによって組み込まれたプラスミドバックボーン中に誘導された二本鎖分解物は、相同組換えを促進して自殺プラスミドをループアウトする。これにより、対抗選択プレート上でのコロニーのループアウト数が増加し、所望の変異を含むコロニーを見出すためにスクリーニングを必要とするコロニー数が減少する。次いで、プラスミドを抗生物質選択することなく培養および連続継代することによって菌株からヘルパープラスミドが除去される。継代培養物を単一コロニーについて画線し、コロニーを選別し、ヘルパープラスミドの選択のために使用された抗生物質に対する感受性について、コロニーＰＣＲによって確認されたプラスミドの非存在についてもスクリーニングする。最後に、ゲノムを配列決定し、ヘルパープラスミドＤＮＡの非存在を、Ｄ６に記載のように確認する。
【０５８０】
７．コロニーＰＣＲによる遺伝子変異の組み込みの確認
【０５８１】
スクロース含有培地（または使用した対抗選択マーカー（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｄ）に応じた他の適切な培地）上でより良好に増殖したコロニーを選別し、意図する遺伝子座での遺伝子変異の存在を、コロニーＰＣＲを使用したコロニーのスクリーニングによって確認するであろう。
【０５８２】
この実施例は、微生物の順化および微生物への遺伝子変異の導入のための１つのプロトコールを記載しているが、当業者は、当該分野で公知の種々の他の技術（ポリメラーゼ連鎖反応変異誘発、オリゴヌクレオチド誘導変異誘発、飽和変異誘発、断片シャフリング変異誘発、相同組換え、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮＳ、ＣＲＩＳＰＲシステム（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）、化学的変異誘発、およびこれらの組合せなど）を使用して、選択した微生物に遺伝子変異を導入することができることを理解するであろう。
【０５８３】
８．工程Ｃ２〜Ｃ７の反復
【０５８４】
工程Ｃ２〜Ｃ７のうちのいずれかが意図する結果を提供することができない場合、宿主微生物への所望の遺伝子変異およびマーカーの組み込みを容易にするための異なるエレメントを含み得る代替ベクターが設計されるように前述の工程を繰り返すであろう。
【０５８５】
９．標準操作手順（ＳＯＰ）の創出
【０５８６】
所与の菌株について工程Ｃ２〜Ｃ７を一貫して再現できる時点で、前述の工程を使用して、前述の菌株およびベクターのための標準操作手順（ＳＯＰ）を創出するであろう。このＳＯＰを使用して、微生物の他の植物に有益な形質を改善することができる。
【０５８７】
Ｄ．非属間操作キャンペーンおよび最適化
【０５８８】
１．最適化のための遺伝子標的の同定
【０５８９】
選択した微生物を、植物に有利な活性の性能が改善されるように操作／リモデリングするであろう。このために、植物に有利な活性を改善するための遺伝子標的を同定するであろう。
【０５９０】
遺伝子標的を、種々の方法で同定することができる。例えば、単離した微生物の全ゲノム配列決定から遺伝子を注釈づける一方で、目的の遺伝子を同定することができる。これらの遺伝子を、文献検索によって同定することができる。例えば、窒素固定に関与する遺伝子は、文献中で公知である。これらの公知の遺伝子を、遺伝子変異の導入のための標的として使用することができる。遺伝子標的を、工程Ｂ３（コロニー化のための小規模圃場試験）で得たＲＮＡ配列決定データに基づくか、以下の工程に記載のＲＮＡ配列決定の実施によって同定することもできる。
【０５９１】
２．プロモーター交換のためのプロモーターの選択
【０５９２】
植物に有利な活性の改善に望ましい遺伝子変異は、標的遺伝子のネイティブプロモーターを、微生物のゲノム内部のより強力であるか、より弱いプロモーター（ネイティブプロモーターと比較した場合）、または制御が異なるプロモーター（例えば、Ｎ独立性）と置換するプロモーター交換を含むことができる。標的遺伝子が発現すると植物に有利な活性が増大する場合（例えば、発現すると微生物における窒素固定を増強するｎｉｆＡ）、プロモーター交換に望ましいプロモーターは、（標的遺伝子のネイティブプロモーターと比較して）強力なプロモーターであり、ネイティブプロモーターと比較して標的遺伝子の発現レベルをさらに増大させるであろう。標的遺伝子が発現すると植物に有利な活性が減少する場合（例えば、窒素固定を下方制御するｎｉｆＬ）、プロモーター交換に望ましいプロモーターは、（標的遺伝子のネイティブプロモーターと比較して）弱いプロモーターであり、ネイティブプロモーターと比較して標的遺伝子の発現レベルを実質的に低下させるであろう。プロモーターを遺伝子に挿入して、遺伝子発現を「ノックアウト」することができると同時に、下流遺伝子の発現を上方制御することができる。
【０５９３】
プロモーター交換のためのプロモーターを、ＲＮＡ配列決定データに基づいて選択することができる。例えば、ＲＮＡ配列決定データを使用して、強いプロモーターおよび弱いプロモーター（すなわち、構成性に活性なプロモーター対誘導性プロモーター）を同定することができる。
【０５９４】
例えば、窒素固定経路における強いプロモーターおよび弱いプロモーター（すなわち、構成性に活性なプロモーター対誘導性プロモーター）を同定するために、選択した微生物を、窒素枯渇条件および窒素充足条件下にてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し；微生物のＲＮＡを、これらの培養物から単離し；配列決定するであろう。
【０５９５】
１つのプロトコールでは、窒素枯渇条件および窒素充足条件下での微生物のＲＮＡプロフィールを比較し、所望の転写レベルを有する活性プロモーターを同定するであろう。これらのプロモーターを、弱いプロモーターを交換するように選択することができる。
【０５９６】
プロモーターを、宿主植物根圏におけるｉｎ  ｐｌａｎｔａでの微生物のＲＮＡプロフィールを反映する工程Ｂ３で得たＲＮＡ配列決定データを使用して選択することもできる。
【０５９７】
種々の条件下でのＲＮＡ配列決定により、以下のプロモーターの選択が可能である：ａ）施肥圃場条件における宿主植物の成長周期中に根圏で活性なプロモーター、ｂ）関連ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件においても活性であるので、迅速にスクリーニングすることができるプロモーター。
【０５９８】
例示的プロトコールでは、コロニー化アッセイ（例えば、工程Ｂ３）由来のｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ＲＮＡ配列決定データを使用して、単離した微生物における遺伝子の発現レベルを測定する。１つの実施形態では、遺伝子発現レベルを、１００万のマッピングされたリードあたりのキロベースあたりのリード（ＲＰＫＭ）として計算する。種々の遺伝子の発現レベルを標的遺伝子の発現レベルと比較し、標的遺伝子と比較して最高または最低の発現レベルを示す種々の遺伝子と関連する少なくとも上位１０、２０、３０、４０、５０、６０、または７０のプロモーターを、プロモーター交換の有力な候補として選択する。したがって、標的遺伝子のと比較して種々の遺伝子の発現レベルを観察し、次いで、標的（または標準）遺伝子と比較して発現の増加を実証している遺伝子を選択し、前述の遺伝子に関連するプロモーターを見出す。
【０５９９】
例えば、標的遺伝子がｎｉｆＡの上方制御である場合、ｎｉｆＡと比較して最高レベルの発現を示す遺伝子の最初の１０、２０、３０、４０、５０、または６０のプロモーターを、プロモーター交換の有力候補として選択する。
【０６００】
これらの候補を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ配列決定データに基づいてさらに絞り込むことができる。例えば、標的遺伝子としてのｎｉｆＡについて、ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ＲＮＡ配列決定データに基づいて選択したプロモーターの有力候補を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの窒素枯渇条件対窒素充足条件下でｎｉｆＡと比較して遺伝子発現レベルが類似するか増大したプロモーターを選択することによって、さらに選択する。
【０６０１】
この工程で選択されたプロモーターセットを使用して、標的遺伝子のネイティブプロモーター（例えば、ｎｉｆＡ）を交換する。交換されたプロモーターを有するリモデリングされた菌株を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで試験し；活性が予想より低い菌株を排除し；予想される活性を有するか、活性が予想より高い菌株を圃場で試験する。プロモーター選択サイクルを、リモデリングされた菌株に対して繰り返して、その植物に有利な活性をさらに改善することができる。
【０６０２】
窒素固定形質を改善するためにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ菌株ＣＩ１３７由来のｉｎ  ｐｌａｎｔａおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ配列決定データに基づいて実施した例示的なプロモーター交換試験をここに記載する。ＣＩ１３７を、０ｍＭおよび５ｍＭのグルタミン濃度でのＡＲＡアッセイで分析し、ＲＮＡをこれらのＡＲＡ試料から抽出した。ＲＮＡをＮｅｘｔＳｅｑによって配列決定し、１つの試料由来のリードのサブセットをＣＩ１３７ゲノムにマッピングした（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ配列決定データ）。ＣＩ１３７についてのコロニー化および活性アッセイ（例えば、工程Ｂ３）においてＶ５期のトウモロコシ植物の根からＲＮＡを抽出した。６つの植物由来の試料をプールし；プールした試料由来のＲＮＡを、ＮｅｘｔＳｅｑを使用して配列決定し、リードをＣＩ１３７ゲノム（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ＲＮＡ配列決定データ）にマッピングした。２×１０８個の総リードのうち、７×１０４リードをＣＩ１３７にマッピングした。ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ＲＮＡ配列決定データを使用して、ｉｎ  ｐｌａｎｔａでの発現レベル順に遺伝子を順位付けし、発現レベルをネイティブｎｉｆＡ発現レベルと比較した。ネイティブｎｉｆＡ発現レベルと比較して（遺伝子発現に基づいて）最高の発現レベルを示した最初の４０プロモーターを選択した。これらの４０プロモーターを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ配列決定データに基づいてさらに絞り込み、ｎｉｆＡと比較してｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現レベルが増加したか類似するプロモーターを選択した。プロモーターの最終リストは１７プロモーターを含んでおり、ほとんどのプロモーターの２バージョンを使用してプロモーター交換変異体を生成した；したがって、合計で３０プロモーターを試験した。ｎｉｆＬが部分的または完全に欠失し、３０プロモーターが挿入された一連のＣＩ１３７変異体（ΔｎｉｆＬ：：Ｐｒｍ）の生成を試みた。３０変異体のうち２８変異体が首尾よく生成された。ΔｎｉｆＬ：：Ｐｒｍ変異体を、０ｍＭおよび５ｍＭのグルタミン濃度でのＡＲＡアッセイで分析し、ＲＮＡをこれらのＡＲＡ試料から抽出した。いくつかの変異体は、予想されるＡＲＡ活性またはＷＴ  ＣＩ１３７菌株と比較して低いＡＲＡ活性を示した。予想より高いＡＲＡ活性を示した変異体は少数であった。
【０６０３】
当業者は、上記の実施例から、ｉｎ  ｐｌａｎｔａおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ配列決定データを使用してプロモーター交換用のプロモーターを選択することができる一方で、プロモーター選択工程が全く予測不可能であり、多くの課題を抱えていることを認識するであろう。
【０６０４】
例えば、ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ＲＮＡ配列決定は、主に、高発現の遺伝子を明らかにする；しかしながら、遺伝子発現の軽微な相違および／または発現レベルの低い遺伝子を検出することは困難である。例えば、いくつかのｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ＲＮＡ配列決定試験では、微生物ゲノム由来の約５０００個の遺伝子からたった約４０個の遺伝子しか検出しなかった。したがって、ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ＲＮＡ配列決定技術は、大量に発現された遺伝子およびその対応するプロモーターを同定するのに有用である；しかしながら、この技術は、低発現遺伝子および対応するプロモーターならびに遺伝子発現間の小さな相違を同定するのは困難である。
【０６０５】
さらに、ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ＲＮＡプロフィールは、微生物が単離された時点の遺伝子の状態を反映する；しかしながら、圃場条件の僅かな変化が、根圏性／着生性／内部寄生性微生物のＲＮＡプロフィールを実質的に変化させ得る。したがって、リモデリングされた菌株をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび圃場で試験したときに、１つの圃場試験のＲＮＡ配列決定データに基づいて選択されたプロモーターが、標的遺伝子を所望のレベルで発現させるかどうかを事前に予想することは困難である。
【０６０６】
さらに、ｉｎ  ｐｌａｎｔａ評価は、多大な時間および資源を必要とする；したがって、ｉｎ  ｐｌａｎｔａ実験を、頻繁に実施し、そして／または迅速または容易に繰り返すことはできない。他方では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ配列決定は比較的迅速かつ容易に実施することができるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件は圃場条件を模倣しておらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで高活性を示し得るプロモーターはｉｎ  ｐｌａｎｔａで類似の活性を示さない可能性がある。
【０６０７】
さらに、プロモーターは、新規の状況で予想通りに挙動しないことが多い。したがって、ｉｎ  ｐｌａｎｔａおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ配列決定データは、せいぜいプロモーターセクションでの出発点としては役立ち得る；しかしながら、圃場で標的遺伝子を所望のレベルで発現させる任意の特定のプロモーターに行き着くことは、いくつかの例では、予想不可能である。
【０６０８】
プロモーターセクションの工程における別の制限は、利用可能なプロモーターの数である。本発明の目的の１つが非トランスジェニック微生物を提供することであるので；プロモーター交換のためのプロモーターを、微生物のゲノム内部、すなわち、属内部から選択する必要がある。したがって、トランスジェニック手法と異なり、本プロセスは、論文に記載することができないだけでなく、異なる宿主生物由来の十分に特徴づけられたトランスジェニックプロモーターを見出す／使用することもできない。
【０６０９】
別の制約は、プロモーターが所望の成長期にｉｎ  ｐｌａｎｔａで活性でなければならないことである。例えば、植物において窒素が最も必要であるのは、一般に、成長期間の後期（例えば、栄養成長の後期および生殖成長の初期）である。例えば、トウモロコシでは、窒素取り込みは、Ｖ６期（第６葉期）からＲ１（生殖成長期１）期の間が最も高い。したがって、トウモロコシのＶ６期からＲ１期の間の窒素利用を増加させるために、リモデリングされた微生物は、トウモロコシ生活環のこれらの期間に最も高い窒素固定活性を示さなければならない。したがって、トウモロコシの栄養成長の後期および生殖成長の初期の間にｉｎ  ｐｌａｎｔａで活性なプロモーターを選択する必要がある。この制約は、プロモーター交換で試験することができるプロモーター数が減少するだけでなく、プロモーター選択工程を予測不可能にする。上記で考察されるように、理由の一部として、小規模圃場試験（例えば、工程Ｂ３）由来のＲＮＡ配列決定データを使用して、所望の成長期にｉｎ  ｐｌａｎｔａで活性なプロモーターを同定することができるが、ＲＮＡデータは試料採取時の圃場条件（例えば、土壌のタイプ、土壌中の水レベル、利用可能な窒素レベルなど）に基づくことにより、予測不可能になる。当業者が理解するように、圃場条件は、同一圃場内で経時的に変化し得、また、種々の圃場で実質的に変化し得る。したがって、ある圃場条件下で選択したプロモーターは、別の圃場条件下で予想通りに挙動しない場合がある。同様に、選択したプロモーターは、交換後に予想通りに挙動しない場合がある。したがって、選択したプロモーターが目的の植物の所望の成長期にｉｎ  ｐｌａｎｔａで活性であるかどうかを事前に予測することは困難である。
【０６１０】
３．非属間遺伝子変異の設計
【０６１１】
工程Ｄ１（遺伝子標的の同定）およびＤ２（プロモーター交換のためのプロモーターの同定）に基づいて、非属間遺伝子変異を設計するであろう。
【０６１２】
用語「非属間」は、宿主に導入されるべき遺伝子変異が宿主の属外由来の核酸配列を含まない（すなわち、トランスジェニックＤＮＡが存在しない）ことを示す。宿主微生物に遺伝子変異を導入するためにベクターおよび／または他の遺伝子ツールが使用されるにもかかわらず、本開示の方法は、宿主微生物に導入されたバックボーンベクター配列または他の遺伝子ツールをループアウト（除去）して、宿主ゲノム内に所望の遺伝子変異のみが残される工程を含む。したがって、得られた微生物は非トランスジェニックである。
【０６１３】
例示的な非属間遺伝子変異としては、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を改善し得る目的の遺伝子の変異；目的の遺伝子の発現を増加させるために目的の遺伝子の内因性プロモーターと置換することができる構成性に活性なプロモーター；目的の遺伝子を不活化する変異；および非相同の位置への宿主ゲノム内部由来のプロモーターの挿入（例えば、ある遺伝子を不活化し、下流遺伝子を下方制御する、前述の遺伝子へのプロモーターの挿入）などが挙げられる。変異は、点変異、挿入、および／または欠失（遺伝子の完全な欠失または部分的な欠失）であり得る。例えば、１つのプロトコールでは、宿主微生物の窒素固定活性を改善するために、所望の遺伝子変異は、ｎｉｆＬ遺伝子（窒素固定経路の負の制御因子）の変異を不活化することを含み、そして／またはｎｉｆＨ遺伝子の内因性プロモーター（大気窒素を固定するための重要な反応を触媒するニトロゲナーゼ鉄タンパク質）を、ｎｉｆＨ遺伝子発現を構成性に駆動する構成性に活性なプロモーターと置換することを含み得る。
【０６１４】
４．非属間誘導体菌株の生成
【０６１５】
非属間遺伝子変異の設計後、工程Ｃ２〜Ｃ７を実施して、非属間誘導体菌株（すなわち、リモデリングされた微生物）を生成するであろう。
【０６１６】
５．リモデリングされた微生物の精製培養物の保管
【０６１７】
リモデリングされた微生物の精製培養物を、下記の全ゲノム配列決定のためにｇＤＮＡを抽出することができるようにバンクに保存するであろう。
【０６１８】
６．所望の遺伝子変異の存在の確認
【０６１９】
リモデリングされた微生物のゲノムＤＮＡを抽出し、前述の方法を使用してゲノムＤＮＡに対して全ゲノム配列決定を行うであろう。得られたリードを、ＬＩＭＳに以前に保存したリードにマッピングして、以下を確認するであろう：ａ）所望の遺伝子変異の存在、およびｂ）リモデリングされた微生物を生成するために使用したベクター配列（例えば、プラスミドバックボーンまたはヘルパープラスミド配列）にマッピングされたリードが完全に存在しないこと。
【０６２０】
この工程は、ベクターバックボーン（例えば、自殺プラスミド）ループアウト法後に菌株に残存し得る非宿主属のＤＮＡ（トランスジェニックＤＮＡ）を高感度に検出可能であり、遺伝子変異などの偶発性のオフターゲット挿入を調節することができる。
【０６２１】
Ｅ．リモデリングされた微生物の分析
【０６２２】
１．植物に有利な活性の分析
【０６２３】
リモデリングされた微生物の植物に有利な活性および成長速度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するであろう。
【０６２４】
例えば、窒素固定機能の改善のためにリモデリングされた菌株を、アセチレン還元アッセイ、アンモニウム排出アッセイなどによって窒素固定活性および適応度について評価するであろう。
【０６２５】
リン酸塩可溶化の改善のためにリモデリングされた菌株を、リン酸塩可溶化活性について評価するであろう。
【０６２６】
この工程により、リモデリングされた菌株を目的の表現型についてミディアムスループットからハイスループットで迅速にスクリーニング可能である。
【０６２７】
２．コロニー化および変化した遺伝子の転写の分析
【０６２８】
リモデリングされた菌株を、Ｂ３に記載の工程を使用して、温室または圃場のいずれかで宿主植物のコロニー化について評価するであろう。さらに、ＲＮＡを、コロニー化した根および／または土壌試料から単離し、配列決定して標的遺伝子の転写活性を分析するであろう。標的遺伝子は、導入された遺伝子変異を含む遺伝子を含み、微生物の植物に有益な形質で役割を果たす他の遺伝子も含んでよい。
【０６２９】
例えば、遺伝子（ｎｉｆ遺伝子）のクラスターは、微生物の窒素固定活性を調節する。上記のプロトコールを使用して、遺伝子変異を、ｎｉｆ遺伝子のうちの１つに導入することができ（例えば、プロモーター挿入）、それに対して、ｎｉｆクラスター中の他の遺伝子は、内因性形態である（すなわち、これらの遺伝子配列および／またはプロモーター領域は変化しない）。ＲＮＡ配列決定データを、遺伝子変異を含むｎｉｆ遺伝子の転写活性について分析し、また、直接変化していない他のｎｉｆ遺伝子について、挿入された遺伝子の変化によって分析することもできるが、導入遺伝子の変化に影響を受け得る。
【０６３０】
この工程は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで上位の菌株の根圏における適応度を決定可能であり、変化した遺伝子の転写活性をｉｎ  ｐｌａｎｔａで測定可能である。
【０６３１】
Ｆ．操作キャンペーン／分析の反復
【０６３２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析およびｉｎ  ｐｌａｎｔａ分析（工程Ｅ１およびＥ２）由来のデータを使用して、有利な変異の掛け合わせを反復するであろう。
【０６３３】
さらに、上記の工程Ａ〜Ｅを繰り返して、微生物の植物に有利な形質を微調整することができる。例えば、第１ラウンドで、モデリングした微生物菌株を使用して植物に接種し；数週間成長させた後に収穫し；土壌および／または植物の根由来の微生物を単離するであろう。植物に有利な活性およびコロニー化可能性が改善された微生物を選択するために、単離した微生物の機能活性（植物に有利な形質およびコロニー化可能性）ならびにＤＮＡおよびＲＮＡプロフィールを特徴づけるであろう。選択した微生物を、植物に有利な活性がさらに改善されるようにリモデリングするであろう。リモデリングされた微生物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｐｌａｎｔａで機能活性（植物に有利な形質およびコロニー化可能性）およびＲＮＡプロフィールについてスクリーニングし、上位の菌株を選択するであろう。必要に応じて、工程Ａ〜Ｅを繰り返して、第２ラウンド由来のリモデリングされた微生物の植物に有利な活性をさらに改善することができる。１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超えるラウンド数でプロセスを繰り返すことができる。
【０６３４】
上記工程の例を、以下の表Ａに要約する。
表Ａ：微生物リモデリング誘導プラットフォームの実施形態の概要
【表Ａ−１】
2021530984.tif 000086
【表Ａ−２】
2021530984.tif 000087
【表Ａ−３】
2021530984.tif 000088
【表Ａ−４】
2021530984.tif 000089
【０６３５】
農業用の生物製剤を作出するための伝統的な手法は、その方法に固有の欠点がある
【０６３６】
野生型（ＷＴ）微生物の純粋なバイオプロスペクティングやトランスジェニック手法と異なり、ＧＭＲは、微生物内の重要な制御ネットワークを非属間で遺伝的に最適化可能であり、それにより、ＷＴ微生物より植物に有益な表現型が改善されるが、トランスジェニック手法に関連するリスク（例えば、予測不可能な遺伝子機能、公的懸念）を持たない。教示したＧＭＲプラットフォームと比較していくつかの欠点を有する、問題のある「伝統的なバイオプロスペクティング」手法の描写については、図１Ｃを参照のこと。
【０６３７】
農業用微生物の他の開発方法は、圃場規模では失敗することが多い大規模な研究室での開発、または根底にある機序／植物−微生物相互作用の理解のない大規模な温室試験もしくは「フィールドファースト」試験のいずれかに注目している。教示したＧＭＲプラットフォームと比較していくつかの欠点を有する、問題のある「バイオプロスペクティングへのフィールドファースト手法」システムの描写については、図１Ｄを参照のこと。
【０６３８】
ＧＭＲプラットフォームは、これらの問題を多数の方法で解決する
【０６３９】
ＧＭＲプラットフォームの強みの１つは、標的作物にとって鍵となる生理学的に重要な時期に活性であり、特定の農業的に関連する環境条件下でも活性である活性プロモーターの同定である。
【０６４０】
説明されてきたように、窒素固定状況において、ＧＭＲプラットフォームは、高外因性窒素の環境条件下で活性な微生物プロモーター配列を同定することができ、それにより、リモデリングされた微生物は、現代農業の条植え作物条件下および標的作物が窒素固定を最も必要とするときに大気窒素を固定し、窒素を送達することが可能である。トウモロコシの成長周期中の植物が窒素を最も必要とする時点の描写については、図１Ｅを参照のこと。教示したＧＭＲプラットフォームは、窒素が必要とされる時期に窒素をトウモロコシ植物に供給し、また、土壌環境において外因性窒素が存在する場合でさえもそのような窒素を送達するリモデリングされた微生物を作出することができる。
【０６４１】
これらのプロモーターを、根圏ＲＮＡ配列決定および微生物ゲノム配列へのリードのマッピングによって同定することができ、重要経路を、植物の成長周期の重要な時期にオンまたはオフされるように「再プログラミング」することができる。さらに、最適化された微生物の全ゲノム配列決定および事前に形質転換された配列へのマッピングにより、本方法は、プラスミドＤＮＡのオフターゲット挿入（ＰＣＲまたは抗生物質耐性などによって検出されない低レベルのプラスミドの保持）によるトランスジェニック配列の圃場への偶発的放出を確実になくすことができる。
【０６４２】
ＧＭＲプラットフォームは、実験室および植物環境において微生物を反復して評価し、それにより、実験室条件のみよりもむしろ温室および圃場条件において頑強な微生物を得ることによって、これらの手法を組み合わせている。
【０６４３】
教示のＧＭＲプラットフォームの種々の態様および実施形態を、図１Ｆ〜１Ｉに見出すことができる。ＧＭＲプラットフォームは、植物に有益な性質（例えば、窒素固定）を保有するリモデリングされた微生物を誘導／作出／産生する。
【０６４４】
伝統的なバイオプロスペクティング法は、前述の性質を有する微生物を産生することができない。
【０６４５】
窒素固定のためにリモデリングされた微生物の性質
【０６４６】
窒素固定のための微生物リモデリングの文脈では、リモデリングされた微生物が所有し得る性質はいくつか存在する。例えば、図１Ｊは、本開示のリモデリングされた微生物が所有することができる５つの性質を示す。
【０６４７】
さらに、実施例２に見られるように、本発明者らは、ＧＭＲプラットフォームを利用して、環境中に外因性窒素が存在する条件下でさえも、大気窒素を固定し、前述の窒素をトウモロコシ植物に送達することができるリモデリングされた非属間細菌（すなわち、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ）を産生した。リモデリングプロセスが、首尾よく、（１）内因性窒素制御からｎｉｆＡ発現を分離し；（２）固定された窒素の同化および排出を改善したことを示す図１Ｋ〜Ｍを参照のこと。
【０６４８】
これらのリモデリングされた微生物は、最終的に、トウモロコシ作物に付与したときにトウモロコシの収穫高を改善する。図１Ｎを参照のこと。
【０６４９】
ＧＭＲプラットフォームは、窒素の固定および送達への手法を提供し、環境負荷懸念を解決する
【０６５０】
前に説明した通り、工業的ハーバー・ボッシュ法によって生産された窒素肥料は、標的作物によって十分に利用されない。雨、流出、熱、揮発、および土壌マイクロバイオームが散布した化学肥料を分解する。これは浪費に等しいだけでなく、収穫高と引き換えに汚染を増大させる。この目的のために、国際連合の算出によると、作物が肥料を利用できる前にほぼ８０％の肥料が喪失される。したがって、現代の農業用肥料の生産および送達は、環境に有害なだけでなく、極めて非効率である。施肥不足の圃場、過剰に施肥された圃場、および環境に有害な窒素流出をもたらす現在の窒素送達システムの非効率さを示す図１Ｏを参照のこと。
【０６５１】
このＧＭＲプラットフォームおよび得られるリモデリングされた微生物は、窒素の固定および植物への送達への良好な手法を提供する。以下の実施例に認められるように、本開示の非属間のリモデリングされた微生物は、トウモロコシ植物の根にコロニー化し、外因性窒素の存在下でさえも、固定化した大気窒素を前述のトウモロコシ植物に強制的に供給することができる。教示のＧＭＲプラットフォームによって可能なこの窒素の固定および送達システムは、現代の農業をより環境上持続可能なシステムに変換するのに役立つであろう。
【０６５２】
実施例２：微生物リモデリング誘導−窒素固定を合理的に改善するための例示的な実施形態
多様な窒素固定細菌を、農業土壌を含む自然界に見出すことができる。しかしながら、作物に十分な窒素を提供して肥料使用の減少を可能にする微生物の能力は、施肥土壌ではニトロゲナーゼ遺伝子が抑制されること、ならびに作物根と緊密に付随する存在量が低いことにより制限される場合がある。重要な商品作物と緊密に付随する微生物の同定、単離、および品種改良は、窒素感知および窒素固定を関連付ける制御ネットワークを破壊または改善させ、作物に付随する微生物による著しい窒素寄与を開放する可能性がある。この目的のため、トウモロコシの根系に付随し、コロニー化する窒素固定微生物を同定した。この工程は、図１Ａおよび図１Ｂに示した「マイクロバイオーム組成を測定する」に対応する。
【０６５３】
農学的に関連する土壌で栽培されたトウモロコシ植物の根試料を収集し、根圏および内圏から微生物集団を抽出した。これらの試料からゲノムＤＮＡを抽出し、その後１６Ｓアンプリコンを配列決定して、共同体組成をプロファイリングした。
【０６５４】
Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ微生物（菌株ＰＢＣ６．１）を単離し、１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび全ゲノム配列決定により分類した。これは、根付随微生物叢のほぼ２１％の存在量までコロニー化することができる特に興味深い窒素固定菌である（図２）。外因性窒素に対する菌株感受性を評価するため、純粋培養での窒素固定割合を、古典的アセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）で、グルタミン添加補充レベルを変えて測定した。この種は、無窒素培地にて高レベルの窒素固定活性を示したが、外因性固定窒素は、ｎｉｆ遺伝子発現およびニトロゲナーゼ活性を抑制した（菌株ＰＢＣ６．１、図３Ｃ、図３Ｄ）。加えて、窒素固定条件で増殖したＰＢＣ６．１の上清に放出されたアンモニアを測定したところ、非常に少量の固定窒素放出しか検出することができなかった（図３Ｅ）。
【０６５５】
本発明者らは、ＰＢＣ６．１が、固定窒素の存在下で最適なニトロゲナーゼ発現およびアンモニア放出を可能にするように窒素代謝を調節する制御ネットワークをリモデリングすれば、施肥圃場において固定窒素の重要な寄与菌になり得ると仮定した。
【０６５６】
導入遺伝子または合成制御エレメントを挿入せずに（非属間様式での基礎遺伝子アーキテクチャーのリモデリングの結果として）幅広い表現型リモデリングを可能にするためには、十分な遺伝的多様性が、ＰＢＣ６．１ゲノム内に存在しなければならない。単離された菌株は、少なくとも５．４Ｍｂｐのゲノムおよび標準的窒素固定遺伝子クラスターを有する。ＰＢＣ６．１の関連窒素代謝経路は、窒素固定のモデル生物であるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ  ｍ５ａｌの窒素代謝経路に類似している。
【０６５７】
特に、高い外因性固定窒素濃度において、窒素固定およびその後の宿主植物への移入を増大させることができるいくつかの遺伝子制御ネットワーク連結点を同定した（図３Ａ）。ｎｉｆＬＡオペロンは、ＮｉｆＡによる転写活性化ならびにＮｉｆＬによるＮｉｆＡの窒素および酸素依存性抑制を介してｎｉｆクラスターの残りを直接的に制御する。ｎｉｆＬの破壊は、酸素および外因性固定窒素の両方の存在下でＮｉｆＡの阻害を消失させ、ｎｉｆ発現を改善させることができる。さらに、窒素非依存性プロモーターの調節下でのｎｉｆＡの発現は、ニトロゲナーゼ生合成を、ＮｔｒＢ／ＮｔｒＣ窒素感知複合体による制御から切り離すことができる。
【０６５８】
微生物による、グルタミン合成酵素（ＧＳ）による固定窒素のグルタミンへの同化は、２ドメインアデニリルトランスフェラーゼ（ＡＴａｓｅ）酵素ＧｌｎＥによって、ＧＳのアデニリル化および脱アデニル化を介して活性をそれぞれ減弱および回復させることにより可逆的に制御される。ＧｌｎＥタンパク質を短縮してそのアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠失させると、グルタミン合成酵素が構成性にアデニリル化され、それにより、微生物によるアンモニア同化を制限し、細胞内および細胞外アンモニアを増加させることができる。
【０６５９】
最後に、アンモニア取込みを担うトランスポーターであるＡｍｔＢの発現を低下させると、細胞外アンモニアを増加させることができる。
【０６６０】
導入遺伝子を使用せずに合理的に設計された微生物表現型を生成するために、以下の２つの手法を用いて、微生物の基礎遺伝子アーキテクチャーをリモデリングした：（１）タンパク質ドメインをコードするゲノム配列または全ゲノムのマーカー無し欠失を作出すること、および（２）ゲノム内プロモーター再編成により制御ネットワークを書き換えること。
【０６６１】
反復リモデリングプロセスにより、ＰＢＣ６．１のいくつかの非トランスジェニック誘導体菌株を生成した（表２５）。
表２５：この研究で使用した単離された誘導体Ｋ．ｓａｃｃｈａｒｉ菌株のリスト。Ｐｒｍ、ＰＢＣ６．１ゲノムに由来するプロモーター配列；ΔｇｌｎＥＡＲ１およびΔｇｌｎＥＡＲ２、アデニリル除去ドメイン配列を除去したｇｌｎＥ遺伝子の異なる短縮型。
【表２５】
2021530984.tif 000090
【０６６２】
いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実施して、誘導体菌株の特定の表現型を特徴付けた。ＡＲＡを使用して、外因性窒素に対する菌株感受性を評価し、ここで、ＰＢＣ６．１は、高グルタミン濃度でニトロゲナーゼ活性の抑制を示した（図３Ｄ）。対照的に、ほとんどの誘導体菌株は、抑制解除された表現型を示し、高グルタミン濃度で観察されたアセチレン還元のレベルは様々であった。ｑＰＣＲにより分析した試料中のｎｉｆＡ転写速度は、アセチレン還元速度と良好に相関し（図４）、ｎｉｆＬ破壊およびｎｉｆＡを駆動する窒素非依存性プロモーターの挿入が、ｎｉｆクラスター抑制解除に結び付き得るという仮説が支持された。
【０６６３】
変更されたＧｌｎＥまたはＡｍｔＢ活性を有する菌株は、野生型またはこれらの変異を有していない誘導体菌株と比較して、顕著に増加したアンモニウム排出速度を示し（図３Ｅ）、アンモニアの同化および再取込みに対するこれらの遺伝子型の効果が示された。
【０６６４】
２つの実験を実施して、ＰＢＣ６．１誘導体（リモデリングされた微生物）とトウモロコシ植物との相互作用を研究し、植物組織内への固定窒素の組込みを定量化した。まず、微生物窒素固定の割合を、温室研究にて同位体トレーサーを使用して定量化した。簡潔に述べれば、植物を１５Ｎ標識肥料を用いて栽培し、植物組織における１５Ｎの希釈濃度は、微生物からの固定窒素の寄与を示す。トウモロコシ実生に、選択された微生物菌株を接種し、植物をＶ６成長段階まで栽培した。その後、植物を解体して、微生物コロニー化および遺伝子発現の測定、ならびに同位体比質量分析法（ＩＲＭＳ）による植物組織中の１５Ｎ／１４Ｎ比の測定を可能にした。地上部分組織の分析は、植物窒素レベルに対するＰＢＣ６．３８の寄与が少なく有意ではなく、ＰＢＣ６．９４の寄与は有意であった（ｐ＝０．０１１）ことを示した。地上トウモロコシ葉に見出された窒素のおよそ２０％が、ＰＢＣ６．９４により産生され、残りは種子、ポッティングミックス、または他の土壌伝播性微生物による「バックグラウンド」固定に由来していた（図５Ｃ）。これは、本発明者らの微生物品種改良およびリモデリングのパイプラインが、窒素肥料の存在下で植物に対して著しい窒素寄与を行うことが可能なリモデリングされた菌株を生成することができることを示す。植物組織内での微生物転写を測定し、ｎｉｆ遺伝子クラスターの発現は、リモデリングされた誘導体菌株では観察されたが、野生型菌株では観察されず（図５Ｂ）、ＢＮＦが施肥条件で作物に寄与するためには、ｎｉｆ抑制解除が重要であることが示された。ｑＰＣＲにより測定された根コロニー化は、コロニー化密度が、試験した菌株の各々で異なることを実証した（図５Ａ）。ＰＢＣ６．３８とＰＢＣ６．９４との間には、コロニー化に５０倍の差があることが観察された。この差異は、ＰＢＣ６．９４が、高レベルの固定および排出の結果として、ＰＢＣ６．３８よりも根圏での適応度が低減されたことを示すものであり得る。
【０６６５】
方法
培地
最少培地は、２５ｇのＮａ２ＨＰＯ４、０．１ｇのＣａＣＬ２−２Ｈ２Ｏ、３ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇのＮａＣ１、２．９ｍｇのＦｅＣｌ３、０．２５ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、および２０ｇのスクロースを含む（１リットル当たり）。増殖培地は、１リットル当たり５０ｍｌの２００ｍＭグルタミンを補足した最少培地であると規定される。
【０６６６】
ジアゾトロフの単離
トウモロコシ実生を、２２℃（夜間）から２６℃（日中）までに制御された温室環境で種子（ＤＫＣ  ６６−４０，ＤｅＫａｌｂ，ＩＬ）から２週間成長させ、Ｓａｎ  Ｊｏａｑｕｉｎ  Ｃｏｕｎｔｙ、ＣＡから収集された土壌中で１６時間光サイクルに曝露した。根を収穫し、無菌脱イオン水で洗浄して、バルク土壌を除去した。根組織を、ｔｉｓｓｕｅ  ｌｙｓｅｒ（ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ，Ｑｉａｇｅｎ  Ｐ／Ｎ  ８５３００）で２ｍｍステンレス鋼ビーズを用いて、設定３０で３分間ホモジナイズし、試料を１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、組織を根付随細菌から分離した。上清を、２つの画分に分割し、１つを１６Ｓ  ｒＲＮＡアンプリコン配列決定によるマイクロバイオームの特徴付けに使用し、残りの画分を希釈し、１．５％寒天を補足した無窒素ブロス（ＮｆＢ）培地にプレーティングした。プレートを、３０℃で５〜７日間にわたってインキュベートした。出現したコロニーを、ｎｉｆＨ遺伝子の存在に関して、プライマーＵｅｄａ１９ｆおよびＵｅｄａ４０６ｒを用いたコロニーＰＣＲにより試験した。ｎｉｆＨコロニーＰＣＲが陽性である菌株からゲノムＤＮＡを単離し（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，カタログ番号５１３０６，ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、配列決定した（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ｖ３，ＳｅｑＭａｔｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）。配列を組み立てて注釈を付けた後、窒素固定遺伝子クラスターを含む分離株を、下流研究に使用した。
【０６６７】
単離実生のマイクロバイオームプロファイリング
ゲノムＤＮＡを、ＺＲ−９６ゲノムＤＮＡ  Ｉキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐ／Ｎ  Ｄ３０１１）を使用して根付随細菌から単離し、７９９ｆおよび１１１４ｒを標的とするｎｅｘｔｅｒａバーコード付きプライマーを使用して、１６Ｓ  ｒＲＮＡアンプリコンを生成した。アンプリコンライブラリーを精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ｖ３プラットフォーム（ＳｅｑＭａｔｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）で配列決定した。読取りは、Ｋｒａｋｅｎを使用し、ｍｉｎｉｋｒａｋｅｎデータベースを使用して、分類学的に分類した（図２）。
【０６６８】
アセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）
アセチレン還元アッセイの変法を使用して、純粋培養条件におけるニトロゲナーゼ活性を測定した。菌株を、ＳＯＢ（ＲＰＩ，Ｐ／Ｎ  Ｓ２５０４０−１０００）中で２４時間３０℃にて２００ＲＰＭで振盪して単一のコロニーから増殖させ、その後１：２５で増殖培地にて継代培養し、２４時間にわたって好気的に増殖させた（３０℃、２００ＲＰＭ）。その後、１ｍｌの最少培地培養物を、気密性Ｈｕｎｇａｔｅチューブ中の０〜１０ｍＭグルタミンを補足した４ｍｌの最少培地に添加し、４時間にわたって嫌気的に増殖させた（３０℃、２００ＲＰＭ）。１０％ヘッドスペースを取り出し、その後注射により等容積のアセチレンと入れ替え、１時間にわたってインキュベーションを継続した。続いて、２ｍｌのヘッドスペースを気密シリンジで取り出し、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ６８５０ガスクロマトグラフを使用して、エチレン産生を定量化した。
【０６６９】
アンモニウム排出アッセイ
アンモニア形態の固定窒素の排出を、嫌気性バイオリアクターでのバッチ発酵を使用して測定した。菌株を、９６ウェルＤｅｅｐＷｅｌｌプレートの１ｍｌ／ウェルＳＯＢで単一コロニーから増殖させた。プレートを、３０℃にて２４時間２００ＲＰＭで振盪してインキュベートし、その後１ｍｌ／ウェルの増殖培地を含む新たなプレートに１：２５希釈した。細胞を、２４時間（３０℃、２００ＲＰＭ）でインキュベートし、その後、最少培地を含む新たなプレートに１：１０希釈した。プレートを、＞９８．５％窒素、１．２〜１．５％水素、および＜３０ｐｐＭ酸素の混合気体を有する嫌気性チャンバーに移し、室温で６６〜７０時間にわたって１３５０ＲＰＭでインキュベートした。初期培養バイオマスを、５９０ｎｍの光学濃度を測定することにより最終バイオマスと比較した。その後、細胞を遠心分離により分離し、リアクターブロスの上清を、Ｍｅｇａｚｙｍｅアンモニアアッセイキット（Ｐ／Ｎ  Ｋ−ＡＭＩＡＲ）を使用して、遊離アンモニアについてアッセイし、各時点でバイオマスに対して正規化した。
【０６７０】
根付随マイクロバイオームの抽出
根を穏やかに振って、固着していない粒子を除去し、根系を分離し、ＲＮＡ安定化溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｐ／Ｎ  ＡＭ７０２１）に３０分間浸漬した。その後、根を、無菌脱イオン水で手短にすすいだ。試料を、ｔｉｓｓｕｅ  ｌｙｓｅｒ（ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐ／Ｎ  ８５３００）で１／２インチステンレス鋼ボールベアリングを用いたビーズビーティングを使用して２ｍｌの溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ  Ｐ／Ｎ  ７９２１６）中でホモジナイズした。ＺＲ−９６  Ｑｕｉｃｋ−ｇＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐ／Ｎ  Ｄ３０１０）を用いてゲノムＤＮＡ抽出を実施し、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｐ／Ｎ  ７４１０４）を使用してＲＮＡ抽出を実施した。
【０６７１】
根コロニー化アッセイ
植栽４日後に、１ｍｌの細菌一晩培養物（およそ１０９ｃｆｕ）を、植栽した種子の上方の土壌に付与した。実生に、０．５ｍＭ硝酸アンモニウムを補足した２５ｍｌの改変Ｈｏａｇｌａｎｄ溶液を週３回施肥した。植栽４週間後に、根試料を収集し、全ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。根コロニー化を、野生型または誘導体菌株ゲノムのいずれかの固有領域を増幅するように設計されたプライマーによるｑＰＣＲを使用して定量化した。ＱＰＣＲ反応効率を、標的ゲノムに由来する既知量のｇＤＮＡから生成された標準曲線を使用して測定した。データを、組織重量および抽出容積を使用して、生重量１ｇ当たりのゲノムコピー数に対して正規化した。各実験で、コロニー化数を未処理対照実生と比較した。
【０６７２】
Ｉｎ  Ｐｌａｎｔａ  トランスクリプトミクス
根付随微生物の転写プロファイリングを、成長させた実生で測定し、根コロニー化アッセイに記載されているように処理した。精製ＲＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォーム（ＳｅｑＭａｔｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用して配列決定した。読取りを、「−−ｖｅｒｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ−ｌｏｃａｌ」パラメータおよび最低アラインメントスコア３０を使用したｂｏｗｔｉｅ２を使用して、接種した菌株のゲノムにマッピングした。ゲノムにわたる網羅範囲を、ｓａｍｔｏｏｌｓを使用して算出した。網羅範囲の差異を、ハウスキーピング遺伝子発現に対して正規化し、Ｃｉｒｃｏｓを使用してゲノムにわたって、およびＤＮＡｐｌｏｔｌｉｂを使用してｎｉｆ遺伝子クラスターにわたって視覚化した。加えて、ｉｎ  ｐｌａｎｔａ転写プロファイルを、標的化Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析により定量化した。精製ＲＮＡを、ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｓｐｒｉｎｔ（Ｃｏｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）で処理した。
【０６７３】
１５Ｎ希釈温室研究
１５Ｎ肥料希釈実験を実施して、最適化菌株活性をｉｎ  ｐｌａｎｔａで評価した。最小限のバックグラウンドＮを含む植栽媒体を、バーミキュライトおよび水洗砂（ＤＩ  Ｈ２Ｏで５回リンスした）の混合物を使用して調製した。砂混合物を、１２２℃で１時間オートクレーブし、およそ６００ｇを４０立方インチ（６５６ｍＬ）のポットに量り取り、それを無菌ＤＩ  Ｈ２Ｏで飽和させ、植栽前に２４時間排水させた。トウモロコシ種子（ＤＫＣ６６−４０）を、０．６２５％次亜塩素酸ナトリウム中で１０分間表面滅菌し、その後、滅菌蒸留水で５回リンスし、１ｃｍの深さに植栽した。植物を、平均して２２℃（夜間）〜２６℃（日中）の室温にて１６時間日長で４週間にわたって蛍光灯下で維持した。
【０６７４】
植栽５日後、１ｍｌの細胞懸濁物を出現しつつある子葉鞘に直接浸して、実生に接種した。接種物は、ＳＯＢでの５ｍｌ一晩培養物から調製した。一晩培養物を遠沈し、５ｍｌのＰＢＳに２回再懸濁して、残留ＳＯＢを除去してから、最終的に１．０のＯＤに希釈した（およそ１０９ＣＦＵ／ｍｌ）。対照植物を、無菌ＰＢＳで処理し、各処理物（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を１０個の重複植物に付与した。
【０６７５】
植栽の５、９、１４、および１９日後に２％１５Ｎ富化２ｍＭ  ＫＮＯ３を含む２５ｍｌ肥料溶液を植物に施肥し、植栽の７、１２、１６、および１８日後にＫＮＯ３を含まない同じ溶液で施肥した。肥料溶液は、３ｍｍｏｌ  ＣａＣｌ２、０．５ｍｍｏｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２ｍｍｏｌ  ＭｇＳＯ４、１７．９μｍｏｌ  ＦｅＳＯ４、２．８６ｍｇ  Ｈ３ＢＯ３、１．８１ｍｇ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．２２ｍｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５１μｇ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１２ｍｇ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、および０．１４ｎｍｏｌ  ＮｉＣｌ２を含んでいた（１リットル当たり）。ポットは全て、必要に応じて無菌ＤＩ  Ｈ２Ｏで灌水して、流出のない一貫した土壌水分を維持した。
【０６７６】
４週間で植物を収穫し、最も低い節で分離して、根ｇＤＮＡおよびＲＮＡ抽出ならびにＩＲＭＳ用地上部分組織の試料とした。地上部分組織を、必要に応じて拭いて砂を除去し、全体を紙袋に入れ、６０℃で少なくとも７２時間乾燥させた。完全に乾燥したら、全地上部分組織をビーズビーティングでホモジナイズし、ＭＢＬ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｔｈｅ  Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｏｏｄｓ  Ｈｏｌｅ，ＭＡ）が、５〜７ｍｇの試料を、δ１５Ｎの同位体比質量分析法（ＩＲＭＳ）で分析した。ＮＤＦＡパーセントは下記式を使用して算出した：％ＮＤＦＡ＝（ＵＴＣのδ１５Ｎの平均−試料のδ１５Ｎ）／（ＵＴＣのδ１５Ｎの平均）×１００。
【０６７７】
実施例３：本開示のリモデリングされた微生物による圃場試験−２０１６年夏
様々な窒素レジメ下におけるトウモロコシ成長および生産性に対する本開示のリモデリングされた菌株の有効性を評価するため、圃場試験を実施した。
【０６７８】
試験は、（１）６つの菌株＋対照の７つのサブプロット処理で実施した−４つの主プロットは、現地検証された０、１５、８５、および１００％の対窒素最大収益（ＭＲＴＮ）を含んでいた。対照（ＵＴＣのみ）は、１０個の１００％ＭＲＴＮ＋５、１０、または１５ポンドで実施した。処理は、４つの反復物を有していた。
【０６７９】
トウモロコシのプロット（最小）は、長さ３０フィートの４条であり、１栽培地当たり１２４プロットであった。観察は全て、プロットの中央２条から得、破壊的試料採取は全て、外側の条から得た。種子試料は、使用前の１．５〜２時間まで冷蔵した。
【０６８０】
現地農作業：種子は、従来の殺真菌剤および殺虫剤処理をしていない市販トウモロコシであった。種子処理剤は全て、均一性を担保するために１人の種子処理専門家により付与された。植栽日付、播種割合、雑草／昆虫管理などは、現地農作業に従った。殺真菌剤付与を除いて、標準的管理実務に従った。
【０６８１】
土壌特徴付け：土性および土壌肥沃度を評価した。各反復物の土壌試料を予め植栽して、５０ｌｂ／Ａｃよりも低い残留硝酸塩レベルを保証した。０ｃｍから３０ｃｍまでの土壌コアを採取した。土壌を、ｐＨ、ＣＥＣ、ＫおよびＰの総量についてさらに特徴付けた。
【０６８２】
評価：初期植物集団を、１４日の植栽後日数（ＤＡＰ）／エーカーで評価し、さらに以下について評価した：（１）活力（１〜１０のスケール、Ｗ／１０＝優秀）１４ＤＡＰおよびＶ１０；（２）プロットに症状が明らかになった際は常に病害ランクを記録する；（３）プロットに倒伏が生じた場合は、倒伏のあらゆる差異を記録する；（４）標準的水分率に調整された収穫高（Ｂｕ／エーカー）；（５）重量を試験する；および（６）穀物水分率。
【０６８３】
試料採取要件：３つの時点（試験開始前、Ｖ１０〜ＶＴ、収穫１週後）で土壌を試料採取した。６つの栽培地全ておよびプロット全てを、１試料当たり１０グラムで試料採取した（１２４プロット×３時点×６栽培地）。
【０６８４】
コロニー化試料採取：コロニー化試料を、５つの栽培地では２つの時点（Ｖ１０およびＶＴ）で、および６つの時点（Ｖ４、Ｖ８、Ｖ１０、ＶＴ、Ｒ５、および収穫後）で収集した。試料は、以下のように収集した：（１）０％〜１００％ＭＲＴＮは、１栽培地当たり６０プロット；（２）外側の条から無作為に選択された１プロット当たり４つの植物；（３）５グラムの根、８インチの茎、および上部３枚の葉。袋詰めし、各々に個別に識別子を割り当て、１プロット当たり１２／袋；（４）５つの栽培地（６０プロット×２時点×１２袋／プロット）；および１つの栽培地（６０プロット×６時点×１２袋／プロット）。
【０６８５】
正規化差植生指数（ＮＤＶＩ）を、２つの時点（Ｖ４〜Ｖ６およびＶＴ）にて、Ｇｒｅｅｎｓｅｅｋｅｒ機器を使用して決定した。６つの栽培地全てで各プロットを評価した（１２４プロット×２時点×６栽培地）。
【０６８６】
最も良好に処理差異を示した１つの栽培地の根分析を、Ｗｉｎ  Ｒｈｉｚｏを用いて実施した。１プロット当たり１０個の植物を、無作為に試料採取し（各外側条の隣接する５個；Ｖ３〜Ｖ４段階の植物が好ましかった）、穏やかに洗浄して、できるだけ合理的に泥を除去した。１０個の根をビニール袋に入れ、ラベルを付けた。ＷｉｎＲｈｉｚｏ  Ｒｏｏｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓで分析した。
【０６８７】
６箇所の栽培地全てにおいてＲ２〜Ｒ５の茎の特徴を測定した。１プロット当たり１０個の植物の６インチの高さの茎直径を記録し、６インチマークよりも上方の最初の節間の高さも記録した。１０個の植物をモニタリングした；２つの内側条の中央から連続５個の植物。６箇所の栽培地を評価した（１２４プロット×２測定×６栽培地）。
【０６８８】
組織硝酸塩を、全てのプロットおよび全ての栽培地で分析した。トウモロコシがブラックレイヤーを形成した１〜３週後に、土壌の上方６インチから始まる茎の８インチ区画の葉鞘を取り出した。全ての栽培地およびプロットを評価した（６栽培地×１２４プロット）。
【０６８９】
以下の天候データを、植栽から収穫までの全ての栽培地で記録した：１日の最高および最低温度、播種時の土壌温度、１日の降雨量＋灌水（該当する場合）、ならびに過度の雨、風、低温、または高温などのあらゆる異常気象。
【０６９０】
６箇所の栽培値全てにわたる収穫高データを表２６に示す。窒素比率は、収穫高に有意な影響を示したが、菌株はどの窒素比率でも影響を示さなかった。しかしながら、最低の窒素比率では、菌株ＣＩ００６、ＣＭ０２９、およびＣＩ０１９は、ＵＴＣよりも数的に４〜６ｂｕ／エーカーだけ収穫高が高かった。また、菌株ＣＭ０２９、ＣＩ０１９、およびＣＭ０８１による収穫高は、１５％ＭＲＴＮでは、２〜４ｂｕ／エーカーだけ数的に増加した。
表２６：６箇所の栽培地全体にわたる収穫高データ
【表２６−１】
2021530984.tif 000091
【表２６−２】
2021530984.tif 000092
【０６９１】
別の分析手法を表２７に示す。この表には、窒素に対する応答が最も大きかった４箇所の栽培地が含まれており、窒素に対する応答が最も大きかったことは、利用可能な残留窒素が最も低かったことを示唆する。この手法は、窒素比率が収穫高に有意な影響を及ぼし、菌株は全ての窒素比率にわたって平均すると影響を及ぼさなかったという評価を変更しない。しかしながら、全ての菌株では、Ｎ比率が最も低い場合に数値的収穫高がより顕著に有利であり、特にＣＩ００６、ＣＭ０２９、およびＣＭ０２９／ＣＭ０８１では、収穫高が８から１０ｂｕ／エーカーまで増加した。１５％ＭＲＴＮでは、菌株ＣＭ０８１は、収穫高がＵＴＣよりも５ｂｕだけ多かった。
表２７：４箇所の栽培地にわたる収穫高データ
４箇所の栽培地平均−ＳＧＳ、ＡｇＩｄｅａ、Ｂｅｎｎｅｔｔ、ＲＦＲ
【表２７−１】
2021530984.tif 000093
【表２７−２】
2021530984.tif 000094
【０６９２】
また、圃場試験の結果を、図９〜１５に示す。結果は、本開示の微生物が、植物収穫高を増加させることができることを示しており、これは、教示される微生物が、重要な農業作物、すなわちトウモロコシ中で窒素固定を増加させることができることを示している。
【０６９３】
圃場に基づく結果から、選択された微生物菌株のゲノムを非属間的に改変して、前述の操作された菌株を作物に付与した場合に圃場設定にて農業的に関連する結果を得るのに開示の方法が有効であることがさらに確認される。
【０６９４】
図６は、菌株ＣＩ００６（ＷＴ  Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ）に由来する改変菌株の系統を示す。圃場データは、ＣＩ００６  ＷＴ菌株の操作された誘導体、すなわちＣＭ０２９が、圃場設定にて数的に関連する結果をもたらすことができることを実証している。例えば、表２６は、ＣＭ０２９が、０％ＭＲＴＮでは、１４１．２ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１４７．０ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（５．８ｂｕ／エーカーの増加）。また、表２６は、ＣＭ０２９が、１５％ＭＲＴＮでは、１６５．１ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１６７．３ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（２．２ｂｕ／エーカーの増加）。表２７は、これらの結果を支持し、ＣＭ０２９が、０％ＭＲＴＮでは、１３１．９ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１４０．７ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（８．８ｂｕ／エーカーの増加）。また、表２７は、ＣＭ０２９が、１５％ＭＲＴＮでは、１６１．３ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１６４．１ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（２．８ｂｕ／エーカーの増加）。
【０６９５】
図７は、菌株ＣＩ０１９（ＷＴ  Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）に由来する改変菌株の系統を示す。圃場データは、ＣＩ０１９  ＷＴ菌株の操作された誘導体、すなわちＣＭ０８１が、圃場設定にて数的に関連する結果をもたらすことができることを実証している。例えば、表２６は、ＣＭ０８１が、１５％ＭＲＴＮでは、１６５．１ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１６９．３ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（４．２ｂｕ／エーカーの増加）。表２７は、これらの結果を支持し、ＣＭ０８１が、０％ＭＲＴＮでは、１３１．９ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１３６．３ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（４．４ｂｕ／エーカーの増加）。また、表２７は、ＣＭ０８１が、１５％ＭＲＴＮでは、１６１．３ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１６６．８ｂｕ／エーカーの収穫高であったことを示す（５．５ｂｕ／エーカーの増加）。
【０６９６】
さらに、表２７では、ＣＭ０２９／ＣＭ０８１の組合せが、０％ＭＲＴＮにて、１３１．９ｂｕ／エーカーの未処理対照と比較して、１４１．４ｂｕ／エーカーの収穫高であったこと（９．５ｂｕ／エーカーの増加）を理解することができる。
【０６９７】
実施例４：本開示のリモデリングされた微生物による圃場試験−２０１７年夏
様々な窒素レジメ下におけるトウモロコシ成長および生産性に対する本開示のリモデリングされた菌株の有効性を評価するため、圃場試験を実施した。下記の圃場データは、本開示の非属間微生物が、大気窒素を固定し、前述の窒素を植物に送達し、窒素制限環境ならびに非窒素制限環境の両方で収穫高の増加をもたらすことができることを実証している。
【０６９８】
試験は、合衆国の７箇所の栽培地で実施し、６箇所は、地理的に多様な米国中西部の栽培地であった。肥料処理には５つの窒素レジメを使用した：サイト／地域の標準農作業の１００％、１００％−２５ポンド、１００％−５０ポンド、１００％−７５ポンド、および０％；全て１エーカー当たり。１００％レジメの１エーカー当たりの窒素のポンド数は、サイト／地域の標準農作業に依存した。前述の窒素レジメは、１エーカー当たり約１５３ポンドから１エーカー当たり約１８０ポンドまでの範囲であり、平均で１エーカー当たり約１６４ポンドの窒素であった。
【０６９９】
各肥料レジメ内には、１４の処理を行った。各レジメでは、６つの反復物を有し、分割プロットデザインを使用した。以下の１４の処理が含まれていた：１２の異なる微生物、主プロットと同じ肥料割合の１つのＵＴＣ、および１００％の窒素を有する１つのＵＴＣ。１００％窒素レジメでは、第２のＵＴＣは、１００＋２５ポンドである。
【０７００】
トウモロコシのプロットは、最低で、長さ３０フィートの４条であり（条間は３０インチ）、１栽培地当たり４２０プロットであった。観察は全て、別様の記載がない限り、植物の中央２条から得、破壊的試料採取は全て、外側の条から得た。種子試料は、使用前の１．５〜２時間まで冷蔵した。
【０７０１】
現地農作業：種子は、市販の種子処理剤が付与された市販のトウモロコシであり、生物学的な同時付与を受けていなかった。播種比率、植栽日時、雑草／昆虫管理、収穫時期、および他の標準的管理実務は、殺真菌剤付与（必要な場合）を除き、その地域の現地農作業の基準に従った。
【０７０２】
微生物付与：微生物を、通常の化学処理を既に受けた種子への種子処理において、種子に付与した。微生物を含む発酵ブロスで種子をコーティングした。
【０７０３】
土壌特徴付け：土性および土壌肥沃度を評価した。標準的な土壌試料採取手順を使用し、試料は、０〜３０ｃｍおよび３０〜６０ｃｍの深さの土壌コアを含んでいた。標準的な土壌試料採取は、硝酸性窒素、アンモニウム窒素、総窒素、有機物、およびＣＥＣの決定を含んでいた。標準的な土壌試料採取は、ｐＨ、総カリウム量、および総亜リン酸量の決定をさらに含んでいた。窒素肥料レベルを決定するため、０〜１２インチ、可能であれば１２インチから２４インチの土壌領域が硝酸性窒素用に確実に採取されるように、各栽培地の植栽前土壌試料を採取した。
【０７０４】
植栽および施肥前に、２ｍｌの土壌試料を、０から６〜１２インチまでＵＴＣから収集した。１窒素領域当たり１反復物当たり１つの試料を、条の中間を使用して収集した。（５つの肥料レジメ×６反復物＝３０個の土壌試料）。
【０７０５】
植栽後（Ｖ４〜Ｖ６）、２ｍｌ土壌試料を、０から６〜１２インチまでＵＴＣから収集した。１窒素領域当たり１反復物当たり１つの試料を、条の中間を使用して収集した。（５つの肥料レジメ×６反復物＝３０個の土壌試料）。
【０７０６】
収穫後（Ｖ４〜Ｖ６）、２ｍｌ土壌試料を、０から６〜１２インチまでＵＴＣから収集した。１窒素領域当たり１反復物当たり１つの試料を、条の中間を使用して収集した。追加の収穫後土壌試料を、ＵＴＣの０〜１２インチから、および潜在的にＵＴＣの１２〜２４インチから収集した（５つの肥料レジメ×６反復物＝３０個の土壌試料）。
【０７０７】
全ての肥料レジメで０〜１２インチおよび１２〜２４インチのＶ６〜Ｖ１０土壌試料を各肥料レジメから得た（１００％および１００％＋２５ｌｂの処理を除く［１００％ブロック］）。（５つの肥料レジメ×２つの深さ＝１栽培地当たり１０個の試料）。
【０７０８】
全ての肥料レジメで０〜１２インチおよび１２〜２４インチの収穫後土壌試料を、各肥料レジメから得た（１００％および１００％＋２５ｌｂの処理を除く［１００％ブロック］）。（５つの肥料レジメ×２つの深さ＝１栽培地当たり１０個の試料）。
【０７０９】
評価：初期植物集団を、約５０％ＵＴＣで評価し、最終植物集団を、収穫前に評価した。評価は、（１）可能であれば温度（温度プローブ）；（２）Ｖ４およびＶ８〜Ｖ１０での活力（１〜１０のスケール、１０＝優秀）；（３）Ｖ８〜Ｖ１０およびＶ１４での植物丈；（４）標準水分率に調整された収穫高（ブッシェル／エーカー）；（５）重量の試験；（６）穀物水分率；（７）ブラックレイヤーでの茎硝酸塩試験（４２０プロット×７栽培地）；（８）Ｖ４〜Ｖ６における０％および１００％肥料のジップロック（登録商標）袋中の１プロット当たり１植物のコロニー化（１植物×１４処理×６反復物×２肥料レジメ＝１６８植物）；（９）Ｖ４〜Ｖ６における０％および１００％肥料のジップロック（登録商標）袋中の１プロット当たり１植物のトランスクリプトミクス（１植物×１４処理×６反復物×２肥料レジメ＝１６８植物）；（１０）Ｇｒｅｅｎｓｅｅｋｅｒ機器を使用して２時点（Ｖ４〜Ｖ６およびＶＴ）で７箇所の栽培地全ての各プロットを評価するための正規化差植生指数（ＮＤＶＩ）または正規化差レッドエッジ（ＮＤＲＥ）の決定（４２０プロット×２時点×７栽培地＝５，８８０データポイント）；（１１）１０植物／プロットの６インチの高さの茎直径を記録し、６インチマークよりも上方の最初の節間の長さを記録し、１０植物（２つの内側条の中央からの連続５つの植物）をモニターすることにより、７箇所の栽培地全てにてＲ２〜Ｒ５で測定した茎特徴（４２０プロット×１０植物×７栽培地＝２９，４００データポイント）を含んでいた。
【０７１０】
モニタリングスケジュール：Ｖ３〜Ｖ４の段階で実施者が全ての試験地を訪れて、処理に対する初期季節応答を評価し、生殖成長段階中に成熟度をモニタリングした。現地協力者が、継続的に研究試験地を訪れた。
【０７１１】
天候情報：植栽から収穫までにわたって天候データを収集した。天候データは、１日最低および最高温度；播種時の土壌温度；１日の降雨量＋灌水（該当する場合）；ならびに過度の風、雨、低温、高温などの異常な気象事象で構成されていた。
【０７１２】
データ報告：上記に示されているデータを含めて、圃場試験は、土性；条間隔；プロットサイズ；灌水；耕うん；以前の作物；播種比率；植物集団；供給源、割合、タイミング、および配置を含む季節性の肥料投入；収穫面積、手作業または機械などによる収穫方法、ならびに使用される測定ツール（秤、収穫高モニターなど）を含むデータポイントを生成した。
【０７１３】
結果：前述の圃場試験の選択された結果を、図１６および図１７に報告している。
【０７１４】
図１６では、本開示の微生物（すなわち、６−４０３）が、野生型菌株（ＷＴ）よりも高い収穫高をもたらし、未処理対照（ＵＴＣ）よりも高い収穫高をもたらしたことがわかる。「−２５ｌｂ  Ｎ」処理では、その地域の標準的農作業よりも１エーカー当たり２５ｌｂ少ないＮが使用される。「１００％Ｎ」ＵＴＣ処理は、その地域の標準的農作業を示すことが意図されており、Ｎの標準的使用の１００％が、農業従事者により配置される。微生物「６−４０３」は、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託され、表１に見出すことができる。これは変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ（ＣＭ０３７とも呼ばれる）であり、ＣＩ００６  ＷＴに由来する後代変異体菌株である。
【０７１５】
図１７では、得られた収穫高の結果は、本開示のリモデリングされた微生物が、栽培地全体にわたって一貫して性能を発揮することを実証している。さらに、収穫高の結果は、本開示の微生物が、窒素ストレス環境（すなわち、窒素制限環境）ならびに十分な窒素供給を有する環境（すなわち、非窒素制限条件）の両方で良好な性能を発揮することを実証している。微生物「６−８８１」（ＣＭ０９４、ＰＢＣ６．９４としても知られている）は、ＣＩ００６  ＷＴに由来する後代変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託され、表１に見出すことができる。微生物「１３７−１０３４」は、ＣＩ１３７  ＷＴに由来する後代変異体Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託され、表１に見出すことができる。微生物「１３７−１０３６」は、ＣＩ１３７  ＷＴに由来する後代変異体Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託され、表１に見出すことができる。微生物「６−４０４」（ＣＭ３８、ＰＢＣ６．３８としても知られている）は、ＣＩ００６  ＷＴに由来する後代変異体Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ菌株であり、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託され、表１に見出すことができる。
【０７１６】
実施例５：農業システムに有益な非属間のリモデリングされた微生物の属
本開示のリモデリングされた微生物を、一季節にわたって１エーカーで産生された窒素産生量について、相互に評価および比較した。図８、図２４、および図２５を参照のこと。
【０７１７】
本発明者らは、操作された非属間微生物の集団が現代の条植え作物の農業システムに有益であるためには、微生物の集団は、１季節当たり１エーカー当たり少なくとも１ポンドまたはそれを超える窒素を産生する必要があるという仮説を立てている。
【０７１８】
そのためには、本発明者らは、驚くべきことに、とりわけ、非マメ科作物の収穫高の増加；および／または外因性窒素の付与の際の農業従事者への依存の低減；および／または非窒素制限環境下でさえも、１季節当たり１エーカー当たり少なくとも１ポンドの窒素を産生する能力に寄与することができる機能的な微生物の属を発見した。前述の属は、コロニー化能力×１時間当たり１微生物当たりのＮ産生量（ｍｍｏｌ）の積により規定される（すなわち、図８、２４、および２５の分割線）。
【０７１９】
図８、２４、および２５に関して、本開示の微生物を使用したある特定のデータを、本開示の微生物により１エーカー−季節当たりの送達された窒素のポンドのヒートマップを示すために集計した。そられは、窒素／微生物−時間のｍｍｏｌにより、生重量１ｇ当たりの微生物の関数として記録されている。大きい方の画像を横切る細線の下方は、１エーカー−季節当たり１ポンド未満の窒素を送達する微生物であり、この線の上方は、１エーカー−季節当たり１ポンドを超える窒素を送達する微生物である。
【０７２０】
圃場データおよび野生型コロニー化ヒートマップ：図８のヒートマップに使用されている微生物を、トウモロコシでのＮ産生についてアッセイした。ＷＴ菌株ＣＩ００６およびＣＩ０１９の場合、トウモロコシ根コロニー化データは、単一の圃場現場から得た。残りの菌株の場合、コロニー化は、ＷＴ圃場レベルと同じであると仮定した。Ｎ固定活性は、５ｍＭグルタミンでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＡアッセイを使用して決定した。図８のヒートマップの下にある表は、ヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ  ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ  Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ  Ｎ／微生物  時間）を示している。
【０７２１】
圃場データヒートマップ：図２４のヒートマップに使用されているデータは、圃場条件におけるトウモロコシでのＮ産生をアッセイした微生物菌株に由来する。各点は、単一の圃場現場からのトウモロコシ根コロニー化データを使用した、微生物により産生されたｌｂ  Ｎ／エーカーを表わす。Ｎ固定活性は、グルタミンまたはリン酸アンモニウムの形態の５ｍＭ  Ｎでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＡアッセイを使用して決定した。下記の表２８は、図２４のヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ  ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ  Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ  Ｎ／微生物  時間）を示している。
【０７２２】
温室および実験室データヒートマップ：図２５のヒートマップに使用されているデータは、実験室および温室条件におけるトウモロコシでのＮ産生をアッセイした微生物菌株に由来する。各点は、単一の菌株により産生されたｌｂ  Ｎ／エーカーを表わす。白色点は、トウモロコシ根コロニー化データが温室条件で収集された菌株を表わす。黒色点は、トウモロコシ根コロニー化レベルが、野生型親菌株の平均圃場トウモロコシ根コロニー化レベルから導き出されている変異体菌株を表わす。斜線付き点は、平均圃場トウモロコシ根コロニー化レベルの野生型親菌株を表わす。全ての場合で、Ｎ固定活性は、グルタミンまたはリン酸アンモニウムの形態の５ｍＭ  Ｎでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＡアッセイにより決定した。下記の表２９は、図２５のヒートマップに示されている各微生物の生重量１グラム当たりの正確なＣＦＵ（ＣＦＵ／ｇ  ｆｗ）と共に、１時間当たり１微生物当たりの産生されたｍｍｏｌ  Ｎの正確な値（ｍｍｏｌ  Ｎ／微生物  時間）を示す。
表２８：図２４−圃場データヒートマップ
【表２８】
2021530984.tif 000095
表２９：図２５−温室および実験室データヒートマップ
【表２９】
2021530984.tif 000096
【０７２３】
結論：図８、２４、２５ならびに表２８および２９のデータは、記載されている属の１ダースを超える代表的なメンバーを示す（すなわち、図中の線の右側の微生物）。さらに、これら多数の代表的なメンバーは、多様な一連の分類学的属に由来し、それらは、上記の表２８および２９に見出すことができる。またさらに、本発明者らは、微生物の多くに見出される構造／機能関連性を示す多数の遺伝子属性を発見した。これらの遺伝子関連性は、本発明者らにより導入された遺伝子改変（窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子または非コードポリヌクレオチドに少なくとも１つの遺伝子変異を導入することが挙げられる）を示す本開示の多数の表に見出すことができる。
【０７２４】
したがって、新たに発見された属は、（１）ロバストなデータセット、（２）１ダースを超える代表的なメンバー、（３）多様な分類学的属に由来するメンバー、および（４）属メンバーの基本的な遺伝子アーキテクチャーにおいて構造／機能関連性を規定する遺伝子改変のクラスにより支持される。
【０７２５】
実施例６：非属間のリモデリングされた微生物を検出するための方法およびアッセイ
本開示は、種々の前述の実施例で使用された微生物の検出に有用なプライマー、プローブ、およびアッセイを教示する。アッセイは、誘導／変異非属間リモデリング微生物の非天然ヌクレオチド「ジャンクション」配列を検出することができる。これらの天然に存在しないヌクレオチドジャンクションを、微生物における特定の遺伝子変更の存在を示す特徴のタイプとして使用することができる。
【０７２６】
本技法は、固有に設計されたプライマーおよびプローブを含む特化した定量的ＰＣＲ法を使用することにより、これらの天然に存在しないヌクレオチドジャンクションを検出することができる。プローブは、天然に存在しないヌクレオチドジャンクション配列に結合し得る。すなわち、プローブがその相補的配列とハイブリダイゼーションした後でのみ検出が可能である蛍光レポーターで標識されているオリゴヌクレオチドで構成される配列特異的ＤＮＡプローブを使用することができる。この定量的な方法では、天然に存在しないヌクレオチドジャンクションのみが、教示されるプライマーにより増幅されることになり、結果的に、非特異的色素または特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用のいずれかにより検出することができることが保証され得る。この方法の別の態様は、プライマーがジャンクション配列のいずれかの側に隣接するようにプライマーを選択することであり、したがって、増幅反応が生じる場合、前述のジャンクション配列が存在する。
【０７２７】
したがって、ゲノムＤＮＡを試料から抽出し、ｑＰＣＲの使用により本開示の微生物の存在を定量化するために使用することができる。ｑＰＣＲ反応に使用されるプライマーは、野生型ゲノムの固有領域または操作された非属間変異体菌株の固有領域を増幅するように、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｂｌａｓｔ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ−ｂｌａｓｔ／）により設計されたプライマーであり得る。ｑＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＥＲ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｐ／Ｎ１１７６２１００）キットを使用し、順方向および逆方向増幅プライマーのみを使用して実施することができ、あるいは、Ｋａｐａ  Ｐｒｏｂｅ  Ｆｏｒｃｅキット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐ／Ｎ  ＫＫ４３０１）を、増幅プライマー、ならびに５’末端のＦＡＭ色素標識、内部ＺＥＮクエンチャー、ならびに３’末端の副溝結合剤および蛍光クエンチャーを含むＴａｑＭａｎプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて使用してもよい。
【０７２８】
ある特定のプライマー、プローブ、および非天然ジャンクション配列（ｑＰＣＲ法で使用することができる）は、下記の表３０に列挙されている。具体的には、ノンネイティブジャンクション配列は、配列番号３７２〜４０５および４２５〜４５７に見出すことができる
表３０：微生物検出
【表３０−１】
2021530984.tif 000097
【表３０−２】
2021530984.tif 000098
【表３０−３】
2021530984.tif 000099
【表３０−４】
2021530984.tif 000100
【表３０−５】
2021530984.tif 000101
【表３０−６】
2021530984.tif 000102
【表３０−７】
2021530984.tif 000103
【表３０−８】
2021530984.tif 000104
【表３０−９】
2021530984.tif 000105
【表３０−１０】
2021530984.tif 000106
【表３０−１１】
2021530984.tif 000107
【表３０−１２】
2021530984.tif 000108
【表３０−１３】
2021530984.tif 000109
【表３０−１４】
2021530984.tif 000110
【表３０−１５】
2021530984.tif 000111
【表３０−１６】
2021530984.tif 000112
【表３０−１７】
2021530984.tif 000113
【表３０−１８】
2021530984.tif 000114
【表３０−１９】
2021530984.tif 000115
【表３０−２０】
2021530984.tif 000116
【表３０−２１】
2021530984.tif 000117
【表３０−２２】
2021530984.tif 000118
【表３０−２３】
2021530984.tif 000119
【表３０−２４】
2021530984.tif 000120
【表３０−２５】
2021530984.tif 000121
【表３０−２６】
2021530984.tif 000122
【表３０−２７】
2021530984.tif 000123
【表３０−２８】
2021530984.tif 000124
【表３０−２９】
2021530984.tif 000125
【表３０−３０】
2021530984.tif 000126
【表３０−３１】
2021530984.tif 000127
【表３０−３２】
2021530984.tif 000128
【表３０−３３】
2021530984.tif 000129
【表３０−３４】
2021530984.tif 000130
【表３０−３５】
2021530984.tif 000131
【表３０−３６】
2021530984.tif 000132
【表３０−３７】
2021530984.tif 000133
【表３０−３８】
2021530984.tif 000134
【表３０−３９】
2021530984.tif 000135
【表３０−４０】
2021530984.tif 000136
【表３０−４１】
2021530984.tif 000137
【表３０−４２】
2021530984.tif 000138
表３１：ＷＴおよびリモデリングされた非属間微生物
【表３１−１】
2021530984.tif 000139
【表３１−２】
2021530984.tif 000140
表３２：リモデリングされた非属間微生物
【表３２−１】
2021530984.tif 000141
【表３２−２】
2021530984.tif 000142
【表３２−３】
2021530984.tif 000143
【表３２−４】
2021530984.tif 000144
【表３２−５】
2021530984.tif 000145
【表３２−６】
2021530984.tif 000146
【表３２−７】
2021530984.tif 000147
【表３２−８】
2021530984.tif 000148
【表３２−９】
2021530984.tif 000149
【表３２−１０】
2021530984.tif 000150
【表３２−１１】
2021530984.tif 000151
【表３２−１２】
2021530984.tif 000152
【表３２−１３】
2021530984.tif 000153
【表３２−１４】
2021530984.tif 000154
【表３２−１５】
2021530984.tif 000155
【表３２−１６】
2021530984.tif 000156
【表３２−１７】
2021530984.tif 000157
【表３２−１８】
2021530984.tif 000158
【表３２−１９】
2021530984.tif 000159
【表３２−２０】
2021530984.tif 000160
【表３２−２１】
2021530984.tif 000161
【０７２９】
実施例７：環境を保護する側条施肥および耐候性窒素
トウモロコシ、コムギ、およびイネなどの穀物の持続可能な産生には、いくつかの窒素源の付与が必要である。栽培者は、いくつかの形態の植物が使用することができる窒素を付与する。畜産が盛んな地域では、家畜糞がトウモロコシ作物の窒素要求のかなりの部分を満たすことができる。有機形態の窒素を利用できない場合、液体（ＮＨ３）として加圧下で保持された気体の形態、硝酸アンモニウムまたは尿素などの乾燥製剤、または尿素と硝安の組み合わせ（ＵＡＮ）などの液体製剤のいずれかの市販の窒素肥料。
【０７３０】
窒素をトウモロコシに付与する時期は、いくつかの要因に依存する。これらのうちの第１の要因は、地方または国の規制であり得る。栽培者が窒素付与を選択するときに影響を受け得る他の要因は、栽培植物周囲の不確定要素に起因する秋（多くの地域における依然として一般的な付与タイミング）の圃場作業条件、春の気候、ならびに植栽条件および運用規模であろう。
【０７３１】
栽培者は、前に栽培した作物を除去した後の秋に窒素を付与し得る。この付与タイミングは、一般的であるが、秋に付与できるポンド数または秋の付与自体を制限することを求める規制当局の指摘を受ける。秋に付与しない場合、栽培者は、通常、トウモロコシ作物の植栽前、作物の出芽後、または分割施肥と呼ばれる前述の２つの組み合わせで窒素を付与するであろう。
【０７３２】
前述の窒素送達レジメのうちのいずれかでは、通常はＶ４〜Ｖ６期に行う第２の窒素付与は、側条付与と呼ばれる。窒素の側条付与は、しばしば、条の間に付与する。
【０７３３】
窒素分子が土壌に存在する時点での窒素分子の不安定性のために、研究において、トウモロコシ作物が窒素を必要とする時期に近づけて栽培者が窒素を付与することができる場合、作物だけでなく、環境にも大きな利益があることが実証されている。窒素の利用効率は増加しており、これは、ブッシェルを産生するための窒素のポンド数の低下を意味する。
【０７３４】
側条施肥には、危険がないわけではない。確実に栽培者の田畑の全てに適時に施肥することはできない。これらのリスクは、運用規模が大きくなるにつれて、そして、気候の潜在的な変化によって圃場作業に適切な日数の予測が不十分になるにつれて増大する。
【０７３５】
マメ科植物（主に、ダイズ）が市販の肥料の使用の代わりとしているのは、自然界に存在する生物学的窒素固定（ＢＮＦ）システムである。これらのシステムは、基質の使用および効率が異なる３つのタイプのうちの１つに分類される。図２６を参照のこと。
【０７３６】
作物に必要な窒素の大部分が植物との共生関係によって満たされる例は、ダイズまたはアルファルファの場合であろう。これらは、作物が必要とする窒素を満たすのにほぼ十分に窒素分子（Ｎ２）を変換することが可能である。ダイズの場合、多くの農業従事者は植栽時にＲｈｉｚｏｂｉｕｍを付与するが、いくつかのＲｈｉｚｏｂｉｕｍはほとんどの土壌に遍在しており、これらの集団は何年も土壌中で生存することが可能である。
【０７３７】
トウモロコシ、イネ、またはコムギなどの穀類の根に付随することによってＮ２をＮＨ３に変換することができると考えられる微生物を産生できれば、これは、革命的なことであり、ダイズにおけるＢＮＦと等価であろう。前述の両方が実用されると旬の成長中の植物に窒素を適宜送達することが可能であるので、側条施肥の代わりにしてもよい。穀類のためのＢＮＦは、栽培者の側条施肥に関連するリスクを低下させることが可能であろう。これらのリスクとしては、時期を逃した付与に起因する収穫高の減少、窒素の必要なときの費用の変動、付与費用、および脱窒または浸出による喪失につながる環境条件において長年にわたって窒素利用能を一定に保つことが挙げられる。また、穀類のためのＢＮＦは、使用が容易で圃場通過が減少するので、特定の窒素付与の価値を創出するであろう。
【０７３８】
以下の表Ｂからわかるように、秋季および春季の窒素付与ストラテジーは、常に側条施肥を使用する。分割付与も側条施肥を特徴とする。現行技術である側条施肥は、土壌を圧縮するトラクターによって付与されるエネルギー集約型の機械的過程である。しばしば、Ｖ４〜Ｖ６期に、さらなる窒素が側条施肥として提供される。
【０７３９】
開示のモデリングされた窒素固定細菌は、植物の根系と緊密に付随して生存し、植物に窒素を「強制的に供給する（ｓｐｏｏｎｆｅｅｄ）」ので、これらの細菌は、側条施肥の実施を排除することが可能である。
表Ｂ：現行の窒素付与タイミングの実施項目と提案される微生物導入の実施項目の比較
【表Ｂ−１】
2021530984.tif 000162
【表Ｂ−２】
2021530984.tif 000163
【表Ｂ−３】
2021530984.tif 000164
【０７４０】
したがって、表Ｂからわかるように、本開示は、大気窒素を固定し、かかる窒素をトウモロコシの成長周期の全期間にわたってトウモロコシ植物に送達させることができる非属間のリモデリングされた細菌から構成される「環境を保護する側条施肥」を農業従事者が利用できることによる、伝統的な合成肥料での側条施肥の代替手段を提供する。
【０７４１】
実施例８：時間および空間を標的にした動的窒素送達のための微生物リモデリングシステム
本開示の微生物は、トウモロコシにコロニー化し、トウモロコシの生活環の生理学的に関連する期間に、固定窒素をトウモロコシに供給することができる非属間のリモデリングされた微生物を開発するために、以下の特徴のうちの１つまたは複数を用いて操作されている。
【０７４２】
これらの遺伝子改変は、いくつかの態様では、前に、とりわけ、実施例２〜６で考察されている。以下に詳述する微生物モデリング誘導（ＧＭＲ）キャンペーンの構成要素を提供するために、遺伝子改変を再度考察する。
【０７４３】
特徴：ニトロゲナーゼ発現−ｎｉｆＬの欠失およびｎｉｆＡの上流へのプロモーター挿入。
【０７４４】
ＮｉｆＡは、微生物が利用できる固定窒素が不十分である場合にｎｉｆ遺伝子複合体を活性化し、窒素固定を駆動する。ＮｉｆＬは、微生物が利用できる固定Ｎが十分に存在する場合にＮｉｆＡを阻害する。ｎｉｆＬ遺伝子およびｎｉｆＡ遺伝子は、オペロン内に存在し、ｎｉｆＬ上流の同一のプロモーターによって駆動され、このプロモーターは、窒素が不十分な条件において活性化され、窒素が十分な条件において抑制される（図１、Ｄｉｘｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｈｎ  ２００４）。この特徴において、本発明者らは、ｎｉｆＬコード配列のほとんどを欠失させ、野生型菌株のゲノム内の他の場所に天然に存在し、本発明者らによって窒素充足条件において高度に発現されることが認められた構成性プロモーターと置換した。これにより、ＮｉｆＡを、施肥圃場などの窒素充足条件において発現し、かつ活性化することが可能である。
【０７４５】
特徴：ニトロゲナーゼ発現−シグマ因子５４の利用可能性を増大させるためのｒｐｏＮ遺伝子のプロモーター交換
【０７４６】
シグマ因子は原核生物遺伝子の転写開始に必要であり、時折、特定のシグマ因子は、共通の制御ネットワーク中の遺伝子群の転写を開始させる。ｒｐｏＮ遺伝子によってコードされるシグマ５４（σ５４）は、窒素代謝に関与する多数の遺伝子（ｎｉｆクラスターおよび窒素同化遺伝子が挙げられる）の転写を担う（Ｋｌｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｆｒｅｅ−Ｌｉｖｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（Ｖｏｌ．２）．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／１−４０２０−２１７９−８）。ｎｉｆＡが窒素充足条件で活性な強力プロモーターによって制御される菌株では、ｎｉｆ遺伝子の転写を開始させるためのσ５４の利用可能性は、制限されるようになり得る。この特徴において、ｒｐｏＮ遺伝子のプロモーターを、前述の遺伝子のすぐ上流の遺伝子間配列を欠失することによって破壊した。欠失された配列を、野生型菌株のゲノム内の他の場所に天然に存在し、本発明者らによって窒素充足条件において高度に発現されることが認められた異なるプロモーターと置換した。これによりσ５４発現が増加し、ｎｉｆＡを高発現する菌株における転写開始の任意の制限が軽減される。
【０７４７】
特徴：窒素同化−ＧｌｎＥのアデニリル除去ドメインの欠失
【０７４８】
固定窒素は、主に、微生物のグルタミン合成酵素／グルタミンオキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＳ−ＧＯＧＡＴ）経路によって同化される。得られた細胞内のグルタミンおよびグルタミン酸のプールは窒素代謝を調節し、グルタミン酸は生合成のための主な窒素プールとして役立ち、グルタミンは窒素状態のためのシグナル伝達分子として役立つ。ｇｌｎＥ遺伝子は、グルタミンの細胞内レベルに応答してグルタミン合成酵素（ＧＳ）の活性を制御するグルタミン合成酵素であるアデニリルトランスフェラーゼまたはグルタミン−アンモニア−リガーゼアデニリルトランスフェラーゼとして公知の酵素をコードする。ＧｌｎＥタンパク質は、独立した個別の酵素活性を有する以下の２つのドメインからなる：ＧＳタンパク質にアデニリル基を共有結合によって修飾させ、したがって、ＧＳ活性を低下させるアデニリルトランスフェラーゼ（ＡＴａｓｅ）ドメイン；およびＧＳからアデニリル基を除去し、したがって、その活性を増加させるアデニリル除去（ＡＲ）ドメイン。Ｃｌａｎｃｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）は、ＡＲドメインを除去するために大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＧｌｎＥタンパク質の短縮するとＡＴａｓｅ活性を保持するタンパク質が発現されることを示した。この特徴において、本発明者らは、ＧｌｎＥのＡＲドメインのＮ末端を欠失させ、それにより、ＡＲ活性を欠くがＡＴａｓｅドメインを機能的に発現する菌株を得た。これにより、活性が減弱された構成性にアデニル化されたＧＳが得られ、アンモニウムの同化および細胞からのアンモニウムの排出が減少する。
【０７４９】
特徴：窒素同化−ＧＳをコードする遺伝子の転写および／または翻訳速度の低下
【０７５０】
ＧＳ酵素をコードするｇｌｎＡ遺伝子は、窒素枯渇下で活性化され、そして窒素充足条件下で抑制されるプロモーターによって調節される（Ｖａｎ  Ｈｅｅｓｗｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。この特徴において、細胞内のＧＳ酵素量は、２つの方法のうちの少なくとも１つ（または１つの細胞への以下の２つの方法の組み合わせ）において減少した。第１に、グルタミン合成酵素（ＧＳ）をコードするｇｌｎＡ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの「Ａ」を、「Ｇ」に変化させた。ｇｌｎＡ遺伝子の残部およびＧＳタンパク質配列は変更しないままであった。得られたＧＴＧ開始コドンは、ｇｌｎＡ転写物の翻訳開始速度が低下し、それにより、ＧＳの細胞内レベルが低下するとの仮説が立てられる。第２に、ｇｌｎＡ遺伝子の上流のプロモーターを、前述の遺伝子のすぐ上流の遺伝子間配列を欠失することによって破壊した。欠失配列を、窒素の状態と無関係に非常に低レベルで構成性に発現される、ｇｌｎＤ遺伝子、ｇｌｎＥ遺伝子、またはｇｌｎＢ遺伝子のプロモーターと置換した（Ｖａｎ  Ｈｅｅｓｗｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３）。これにより、ｇｌｎＡの転写レベルは低下し、したがって、細胞内のＧＳレベルが低下する。前述のように、以前の２つのシナリオ（開始コドンの変更およびプロモーター破壊）を、宿主で組み合わせることができる。細胞内でＧＳ活性が低下すると、窒素固定によって産生されるアンモニウムの細菌同化が減少し、それにより、細菌細胞外にアンモニウムが排出され、窒素が植物への取り込みにより利用されやすくなる（Ｏｒｔｉｚ−Ｍａｒｑｕｅｚ，Ｊ．Ｃ．Ｆ．，Ｄｏ  Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ，Ｍ．，＆  Ｃｕｒａｔｔｉ，Ｌ．（２０１４）“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｏｒ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｉｘｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｅｓ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，”Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２３，１−１１．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｂｅｎ．２０１４．０３．００２）。
【０７５１】
特徴：窒素同化−グルタミナーゼ活性を増加させるためのｇｌｓＡ２遺伝子のプロモーター交換
【０７５２】
グルタミナーゼ酵素は、グルタミンからのアンモニウムの放出を触媒し、細胞内グルタミンプールの調節において重要な役割を果たし得る（Ｖａｎ  Ｈｅｅｓｗｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。この特徴において、グルタミナーゼをコードするｇｌｓＡ２遺伝子を、前述の遺伝子のすぐ上流の配列を欠失させ、窒素充足条件において高発現するゲノム内の他の場所に天然に存在する異なるプロモーターと置換することによって上方制御した。これにより、細胞内のグルタミナーゼ酵素発現が増加し、それによってグルタミンプールからアンモニウムが放出され、したがって、細胞からのアンモニウム排出が増加する。
【０７５３】
特徴：アンモニウム排出−ａｍｔＢ検出
【０７５４】
ａｍｔＢ遺伝子は、細胞外間隙から細胞内部へアンモニウムを輸送するように機能する輸送タンパク質をコードする。窒素固定細菌において、ＡｍｔＢタンパク質は、窒素固定中に細胞から受動拡散される任意のアンモニウムが細胞内に戻されるように輸送され、したがって、固定窒素の喪失が防止されることを確実にするように機能すると考えられている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。この特徴において、ａｍｔＢコード配列を欠失させ、それにより最終的に細胞からアンモニウムが拡散され、したがって、アンモニウム排出が増加する（Ｂａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。ａｍｔＢプロモーターはインタクトなままであった。
【０７５５】
特徴：頑強性およびコロニー化−細菌セルロース産生を増加させるためのｂｃｓＩＩオペロンおよびｂｃｓＩＩＩオペロンのプロモーター交換
【０７５６】
細菌セルロース生合成は、根への付着および根表面上のバイオフィルム形成の両方のための重要な要因である（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。ｂｃｓＩＩオペロンおよびｂｃｓＩＩＩオペロンの各々は、細菌セルロース生合成に関与する遺伝子群をコードする（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。この特徴において、ｂｃｓＩＩオペロンのネイティブプロモーターを、前述のオペロン中の第１の遺伝子の上流の遺伝子間領域を欠失させ、野生型菌株のゲノム内の他の場所に天然に存在し、本発明者らによって窒素充足条件において高度に発現されることが認められた異なるプロモーターと置換することによって破壊した。これにより、施肥圃場環境におけるｂｃｓＩＩオペロンの発現が増加し、それにより、細菌セルロース産生が増加し、したがって、トウモロコシ根に付着する。
【０７５７】
特徴：ポリガラクツロナーゼ産生を増加させるためのｐｅｈＡオペロンのプロモーター交換
【０７５８】
ポリガラクツロナーゼは、非節形成細菌による植物根のコロニー化に重要な要因とされている（Ｃｏｍｐａｎｔ，Ｓ．，Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｃ．，＆  Ｓｅｓｓｉｔｓｃｈ，Ａ．（２０１０），“Ｐｌａｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｈｉｚｏ−  ａｎｄ  ｅｎｄｏｓｐｈｅｒｅ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ：Ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ，ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，”Ｓｏｉｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２（５），６６９−６７８．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｏｉｌｂｉｏ．２００９．１１．０２４）。
【０７５９】
ｐｅｈＡ遺伝子は、２つの特徴づけられていないタンパク質コード領域を有するオペロン内のポリガラクツロナーゼをコードし、前述のオペロンの下流末端にｐｅｈＡが存在する。この特徴において、ｐｅｈＡオペロンのプロモーターを、前述のオペロン中の第１の遺伝子のすぐ上流の配列を欠失させることによって破壊した。欠失された配列を、野生型菌株のゲノム内の他の場所に天然に存在し、本発明者らによって窒素充足条件において高度に発現されることが認められた異なるプロモーターと置換した。これにより、施肥圃場環境におけるＰｅｈＡポリガラクツロナーゼタンパク質の発現が増加し、それにより、微生物によるトウモロコシ根のコロニー化が強化される。
【０７６０】
特徴：頑強性およびコロニー化−アドヘシン発現を増加させるためのｆｈａＢ遺伝子のプロモーター交換
【０７６１】
凝集素などの細菌表面アドヘシンは、植物根上の付着、コロニー、およびバイオフィルムの形成に関与している（Ｄａｎｈｏｒｎ，Ｔ．，＆  Ｆｕｑｕａ，Ｃ．（２００７），“Ｂｉｏｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｌａｎｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６１，４０１−４２２．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｍｉｃｒｏ．６１．０８０７０６．０９３３１６）。
【０７６２】
ｆｈａＢ遺伝子は、繊維状赤血球凝集素タンパク質をコードする。この特徴において、ｆｈａＢ遺伝子のプロモーターを、前述の遺伝子のすぐ上流の遺伝子間配列を欠失することによって破壊した。欠失された配列を、野生型菌株のゲノム内の他の場所に天然に存在し、本発明者らによって窒素充足条件において高度に発現されることが認められた異なるプロモーターと置換した。これにより、血球凝集素タンパク質の発現が増加し、それにより、根への付着およびコロニー化が増加する。
【０７６３】
特徴：頑強性およびコロニー化−有機酸トランスポーターの発現を増加させるためのｄｃｔＡ遺伝子のプロモーター交換
【０７６４】
根圏コロニー化を成功させるためには、細菌は、有機酸などの根滲出液中に見いだされる炭素源を利用する能力を持たなければならない。遺伝子ｄｃｔＡは、根圏細菌における有効なコロニー化に必要であり、外因性窒素に応答して抑制されることが示されている有機酸トランスポーターをコードする（Ｎａｍ，Ｈ．Ｓ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｙａｎｇ，Ｋ．Ｙ．，Ｃｈｏ，Ｂ．Ｈ．，＆  Ｋｉｍ，Ｙ．Ｃ．（２００６），“Ｔｈｅ  ｄｃｔＡ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  Ｏ６  ｉｓ  ｕｎｄｅｒ  ＲｐｏＮ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｒｏｏｔ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，”ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２５６（１），９８−１０４．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊ．１５７４−６９６８．２００６．０００９２．ｘ）。この特徴において、ｄｃｔＡ遺伝子のプロモーターを、前述の遺伝子のすぐ上流の遺伝子間配列を欠失することによって破壊した。欠失された配列を、野生型菌株のゲノム内の他の場所に天然に存在し、本発明者らによって窒素充足条件において根圏中で高度に発現されることが認められた異なるプロモーターと置換した。これにより、ＤｃｔＡトランスポーターの発現が増加し、根滲出液の炭素利用が強化され、したがって、施肥圃場環境における頑強性が改善される。
【０７６５】
特徴：頑強性およびコロニー化−バイオフィルム形成を促進するためのＰｈｏＢ遺伝子のプロモーター交換
【０７６６】
根圏細菌において、ＰｈｏＲ−ＰｈｏＢ  ２成分系は、リン制限に対する応答を媒介し、植物根上のコロニーおよびバイオフィルムの形成に関連している（Ｄａｎｈｏｒｎ  ａｎｄ  Ｆｕｑｕａ  ２００７）。この特徴において、ｐｈｏＢ１遺伝子のプロモーターを、前述の遺伝子のすぐ上流の遺伝子間配列を欠失することによって破壊した。欠失された配列を、野生型菌株のゲノム内の他の場所に天然に存在し、本発明者らによって窒素充足条件において根圏中で高度に発現されることが認められた異なるプロモーターと置換した。これにより、ＰｈｏＲ−ＰｈｏＢ系のＰｈｏＢ成分の発現が増加し、それにより、根上のコロニーおよびバイオフィルムの形成が強化される。
【０７６７】
特徴：代謝と制御ネットワークの相関−ストレス応答に影響を与えるための窒素シグナル伝達の変更
【０７６８】
ＧｌｎＤは、細胞における中心的な窒素感知酵素である。ＧｌｎＤタンパク質は、以下の３つのドメインからなる：ウリジリル−トランスフェラーゼ（ＵＴａｓｅ）ドメイン、（ＵＲ）ウリジリル除去ドメイン、およびグルタミン結合ＡＣＴドメイン。窒素過剰条件では、細胞内グルタミンはＧｌｎＤのＡＣＴドメインに結合し、それにより、ＵＴａｓｅドメインがＰＩＩタンパク質であるＧｌｎＢおよびＧｌｎＫをウリジリル化し、それにより、制御カスケードが窒素の固定および同化に関与する遺伝子を上方制御する。窒素欠乏条件では、グルタミンはＧｌｎＤのＡＣＴドメインに結合するために利用できず、それにより、ＵＲドメインがＧｌｎＫおよびＧｌｎＢを脱ウリジリル化し、それにより、窒素の同化および抑制に関与する遺伝子が抑制される。これらのＰＩＩ制御カスケードは、いくつかの経路（ジアゾトロフにおける窒素欠乏ストレス応答、窒素同化、および窒素固定が挙げられる）を制御する（Ｄｉｘｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｈｎ  ２００４；ｖａｎ  Ｈｅｅｓｗｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。この特徴において、ストレス応答を引き起こす窒素欠乏シグナルの伝達を変更するために、ＵＴａｓｅドメイン、ＵＲドメイン、ＡＣＴドメイン、またはＧｌｎＤタンパク質をコードする全遺伝子のいずれかを改変した。
【０７６９】
特徴：代謝と制御ネットワークの相関−ｇｌｇＡグリコーゲン合成酵素遺伝子の欠失
【０７７０】
窒素固定が非常にエネルギーを消費する過程であるので、細胞内のＡＴＰの利用可能性によって制限されると考えられている。したがって、エネルギー貯蔵経路から酸化的リン酸化へ炭素が転換されるとジアゾトロフにおける窒素固定を強化できるとの仮説が立てられている（Ｇｌｉｃｋ  ２０１２）。ある研究において、グリコーゲン合成酵素をコードするｇｌｇＡ遺伝子を欠失させると、マメ科植物−Ｒｈｉｚｏｂｉａ共生における窒素固定が強化されることが示唆された（Ｍａｒｒｏｑｕｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。この特徴において、グリコーゲン合成を無効にするために、全ｇｌｇＡ遺伝子を欠失させた。ｇｌｇＡ遺伝子を欠失させると、窒素欠乏条件および窒素充足条件の両方における窒素固定レベルが増加する。
【０７７１】
遺伝子の特徴を利用したＧＭＲキャンペーン
【０７７２】
本開示の微生物を、前述の特徴のうちの１つまたは複数を含むように操作した。ＧＭＲキャンペーンの全体的な目的は、栽培季節の全期にわたってトウモロコシ植物が必要とする全ての窒素を供給することができる微生物を開発することである。図２７では、本発明者らは、窒素固定微生物がトウモロコシ植物に栽培季節にわたって必要とする全ての窒素を供給するためには、したがって、合成肥料を完全に取り替えるるためには、微生物（集合体として）が約２００ポンドの窒素／エーカーを産生する必要があると算出した。また、図２７は、菌株ＰＢＣ  １３７−１０３６（すなわち、リモデリングされたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ）が約２０ポンドの窒素／エーカーを供給することを示す。
【０７７３】
仮出願の図２８は、本出願で更新されている。具体的には、本出願の図２８Ａは、仮出願の図２８と同一であり、本出願の図２８Ｂは、ＰＢＣ  １３７−３８９０（さらにリモデリングされたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａの菌株）によって産生された窒素を新規に示している。図２８Ａは、肥料を本開示のりモデリングされた微生物と置換することができるシナリオを提供する。上の図２７に記載のように、破線は、トウモロコシの窒素必要量（約２００ポンド／エーカー）である。実線は、すでに考察しているように、リモデリングされた１３７−１０３６菌株によって供給することができる現在の窒素量（約２０ポンド／エーカー）である。図２８Ａの灰色の影をつけた楕円形の「Ａ」シナリオでは、本発明者らは、１３７−１０３６菌株の活性が５倍に増加すると予想している（これを達成するためのＧＭＲキャンペーンストラテジーについては、図２９を参照のこと）。図２８Ａの灰色の影をつけた楕円形の「Ｂ」シナリオでは、本発明者らは、１３７−１０３６菌株のコロニー化プロフィールを補完する特定のコロニー化プロフィールを有し、成長周期の後期の植物に窒素を供給するリモデリングされた微生物を利用することを予想している。仮出願の出願以来、本発明者らは、ＧＭＲキャンペーンによって１３７−１０３６菌株の窒素産生活動の改善を成功させ続けている。具体的には、図２８Ｂは、本出願に記載のＧＭＲキャンペーンを使用することによって得たさらにリモデリングされた１３７−１０３６菌株である菌株１３７−３８９０によって産生された窒素を示す。図２８Ｂに示すように、１３７−３８９０の窒素産生活動は、１３７−１０３６と比較して実質的に改善されている。
【０７７４】
仮出願の図２９は、本出願で更新されている。具体的には、本出願の図２９Ａは、仮出願の図２９と同一であり、本出願の図２９Ｂは、仮出願の出願以来、特徴Ｆ２およびＦ３をＰＢＣ１３７（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ）に組み込んだ後の予測Ｎ産生量（Ｎのｌｂｓ数／エーカー）を新規に示している。
【０７７５】
図２９Ａの左のパネルでは、実施例２でも考察しているＰＢＣ６．１（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ）についての過去のＧＭＲキャンペーンに関して考察した特徴（すなわち、非属間の遺伝子の改変）を示す。図２９Ａの左のパネルに見られるように、予測Ｎ産生量（Ｎのｌｂｓ数／エーカー）は、各々のさらなる特徴が微生物菌株で操作された場合に増加した。
【０７７６】
図２９Ａの左のパネルに示すＰＢＣ６．１についての過去のＧＭＲキャンペーンに加えて、ＧＭＲキャンペーンをＰＢＣ１３７（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ）について実施する予定であることも理解できる（図２９Ａの右のパネル）。仮出願が出願された時点で、ニトロゲナーゼ発現の特徴（Ｆ１）を宿主菌株で操作し、特徴２〜６が実行される予定であった。これらの各々の特徴のＮ産生量（Ｎのｌｂｓ数／エーカー）に対する予測される寄与を、仮出願において、仮出願の図２９（右のパネル）（ここでは、図２９Ａ）に破線の棒グラフで示した。これらの予測を、仮出願の図２９の左のパネルに示したＰＢＣ６．１の過去のＧＭＲキャンペーンの由来のデータによって示した。図２８Ａの灰色の影をつけた楕円形のシナリオ「Ａ」に見られるように、ＰＢＣ１３７においてＧＭＲキャンペーンが完了した時点で、非属間のリモデリングされた菌株（田畑中の全微生物／コロニー化植物を考慮した集合体として）が、トウモロコシ植物の成長周期の初期にわたるトウモロコシ植物のほぼ全ての窒素必要量を供給することができるであろう。さらに、仮出願の図３０（ここでは図３０Ａである）では、同一の予測が示され、仮出願時点で設定した付与可能な特徴に対する窒素産生の増加予測をマッピングした。仮出願の出願以来、本発明者らは、特徴Ｆ２〜Ｆ６を宿主菌株で操作する作業を続けている。本出願の出願時点で、特徴Ｆ２（窒素同化）およびＦ３（アンモニウム排出）を、ＰＢＣ１３７宿主菌株で操作していた。図２９Ｂの右のパネルは、特徴Ｆ１〜Ｆ３の組み込みの際のリモデリングされた菌株によるＮ産生量を示す。図２９Ｂの右のパネルからわかるように、Ｎ産生量（Ｎのｌｂｓ数／エーカー）は、各々のさらなる特徴が微生物菌株で操作された場合に増加した。図３０Ｂは、特徴Ｆ１（ニトロゲナーゼ発現）、Ｆ２（窒素同化）、およびＦ３（アンモニウム排出）が組み込まれた時点でのＰＢＣ１３７のリモデリングされた菌株によるＮのｍｍｏｌ／ＣＦＵ／時間としてのＮ産生量を示す。
【０７７７】
特徴Ｆ１〜Ｆ３を組み込むためにＰＢＣ１３７  ＷＴ菌株に行った変異を、以下の表３３にまとめている。
表３３：単離された誘導体ＰＢＣ１３７菌株のリスト
【表３３−１】
2021530984.tif 000165
【表３３−２】
2021530984.tif 000166
【０７７８】
【０７７９】
ケースＩ：菌株１３７−１０３６由来の１７ｌｂｓのＮを提供する現在のＧｅｎ１微生物
【０７８０】
図３１は、前に考察した１３７−１０３６の非属間のリモデリングされた微生物のコロニー化１〜１３０日および総ＣＦＵ／エーカーを示す。記載のように、この微生物は、約２０ポンドの窒素／エーカー（集合体として）（１７ポンド）を産生する。リモデリングされた１３７−１０３６微生物は、以下の活性を有する：５．４９Ｅ−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間または４．０７Ｅ−１６ポンドのＮ／ＣＦＵ／日。
【０７８１】
ケースＩＩ：Ｎ必要量の最初の半分を提供するために活性を５倍改善した後の現在のＧｅｎ１微生物菌株１３７−１０３６
【０７８２】
図３２は、前に考察された提案された非属間のリモデリングされた微生物（１３７−１０３６の子孫、提案された遺伝子変更の特徴については、図２９および図３０を参照のこと）のコロニー化１〜１３０日および総ＣＦＵ／エーカーを示す。記載のように、この微生物は、約１００ポンドの窒素／エーカー（集合体として）を産生すると予測される（シナリオ「Ａ」）。リモデリングされた１３７−１０３６子孫微生物は、以下の活性を有することを目標にする：２．７５Ｅ−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間または２．０３Ｅ−１５ポンドのＮ／ＣＦＵ／日。前述のように、仮出願の出願以来、特徴Ｆ２およびＦ３を組み込み、特徴Ｆ１〜Ｆ３を有するリモデリングされた菌株１３７−３８９０の活性は、４．０３Ｅ−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間である。
【０７８３】
ケースＩＩＩ：活性が５倍に改善された後期にコロニー化する微生物
【０７８４】
図３３は、１３７−１０３６微生物を補完するコロニー化プロフィールを有する提案された非属間のリモデリングされた微生物のコロニー化１〜１３０日および総ＣＦＵ／エーカーを示す。記載のように、この微生物は、約１００ポンドの窒素／エーカー（集合体として）（図２８中のシナリオ「Ｂ」）を産生すると予測され、１３７−１０３６微生物が減少し始めるのとほぼ同時にコロニー化を開始するはずである。微生物は、以下の活性を有することを目標にする：２．７５Ｅ−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間または２．０３Ｅ−１５ポンドのＮ／ＣＦＵ／日。
【０７８５】
図３４は、上のパネル中の１３７−１０３６のコロニー化プロフィールおよび下のパネル中のより後期／補完コロニー化動態を有する微生物のコロニー化プロフィールを提供する。
【０７８６】
ケースＩＶ：ケースＩＩおよびＩＩＩ由来の微生物をコンソーシアに組み合わせるか、示したコロニー化プロフィールおよび記載の活性を有する単一の微生物を見出してリモデリングする
【０７８７】
図３５は、以下の２つのシナリオを示す：（１）上で説明したケースＩＩおよびケースＩＩＩに示したコロニー化プロフィールを有する非属間のリモデリングされた微生物の提案したコンソーシアのコロニー化１〜１３０日および総ＣＦＵ／エーカー、または（２）示したコロニー化プロフィールを有する提案した単一の非属間のリモデリングされた微生物のコロニー化１〜１３０日および総ＣＦＵ／エーカー。微生物（２つの微生物のコンソーシアまたは単一の微生物）は、以下の活性を有することを目標にする：２．７５Ｅ−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間または２．０３Ｅ−１５ポンドのＮ／ＣＦＵ／日。
実施例９：トウモロコシ根域において空間コロニー化パターンが異なる微生物を利用したＧＭＲキャンペーン
【０７８８】
前述の実施例８に記載のように、本開示は、農業従事者が伝統的な合成肥料送達の完全な代用とすることを探求するＧＭＲキャンペーンを提供する。上記の実施例７で考察した「環境を保護する側条施肥」は、農業従事者が必要なときに窒素を供給する必要がなく、ＢＮＦ製品を穀類に供給する最終目標に向けた一歩である。
【０７８９】
穀類に適したＢＮＦ製品であるように微生物をリモデリングするために、微生物が、トウモロコシ植物の成長周期の生理学的に関連する期間にトウモロコシ植物にコロニー化し、かつ前述のトウモロコシ植物に十分な程度までコロニー化することが最良である。
【０７９０】
本発明者らは、驚くべきことに、所望の空間コロニー化パターンを有する機能的微生物属を発見し、前述のパターンを有することが、この微生物群をＧＭＲキャンペーンに特に有用にしている。
【０７９１】
図３６は、本研究で利用した一般的な実験デザインを示し、このデザインには、１０週間にわたってトウモロコシからコロニー化および転写物の試料の採取が必要であった。これらの試料により、微生物のコロニー化能力および微生物の活性の計算が可能であった。図３７および図３８は、本実験で利用した試料採取スキームの態様を視覚的に示し、これにより、「標準」種子節根試料とより「末梢の」根試料との間のコロニー化パターンを区別可能である。
【０７９２】
図３９に見られるように、ＷＴ１３７（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ）、０１９（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、および００６（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ）の全てが類似のコロニー化パターンを有し、このコロニー化パターンは、より後期の週に向かってコロニー化が急降下することを実証している。このパターンは各菌株のリモデリングされた形態にも現れ、グラフの右側に示される。
【０７９３】
図４０は、トウモロコシ根を試料採取するために利用した実験スキームを示す。プロット：各四角は時点であり、Ｙ軸は距離であり、Ｘ軸は節である。標準試料を、常に、成長点と共に採取した。末梢部および中間部の試料は週毎に変化したが、一貫性があるように試みた。
【０７９４】
図４１は、本実験由来の全ての結果を示し、図４０の試料採取スキームで取得した全てのデータを利用し、平均値を求めている。図４１に見られるように、菌株１３７は、菌株６または菌株１９よりも末梢の根でより高いコロニー化を維持する。「標準試料」は、他の根の位置由来の試料と比較するときのこの菌株の最も代表的な試料であった。
【０７９５】
実施例１０：リモデリングされた微生物によってトウモロコシ植栽密度を高くすることが可能である
１９３０年代以来、トウモロコシ収穫高は著しく増加しており、これは、遺伝子の改善および作物管理の向上に拠るところが大きい。穀物収穫高は、１エーカー当たりの植物数、１植物あたりの穀粒数、および穀粒あたりの重量の積である。穀物収穫高の３つの構成要素のうち、１エーカー当たりの植物数は、農業従事者に最も直接的に調節される要因である。穀粒数および穀粒重量を、適切な肥料分、雑草、有害生物、および植物の健康状態を最適にするための病害管理によって間接的に管理することができ、気候も主な役割を果たす。現在、米国における平均トウモロコシ植栽密度は、３２，０００植物／エーカー弱であり、１９６０年代から４００植物／エーカー／年で増加している。
【０７９６】
しかしながら、植栽集団が増加の一途をたどることにより、栄養素を獲得するために利用可能な根系が小さくなり、かつ拡大しなくなる。正確な供給源および比率を使用して適時に根域に直接栄養素を与えると、根が栄養素を取り込んで利用する確率が上がる。
【０７９７】
この播種速度、条間隔、および製品配置の理解を、栄養管理に正しい供給源の付与、正しい速度での付与、正しいタイミングでの付与、および正しい場所への付与などの進歩した肥料分管理実務と結びつけることは穀物収穫高およびより高い植栽密度での植栽効率を最大にするのに重要である。
【０７９８】
本開示の微生物は、植物と緊密に付随して（すなわち、根表面に）生存し、容易に利用可能な固定大気窒素の供給源を植物に持続的に提供するので、前述の微生物によってトウモロコシ作物をより密に植栽することが可能である。
【０７９９】
本開示の穀類のためのＢＮＦ供給源の教示は、圃場内の全ての植物に成長期にわたって植物の根系に窒素源が容易に送達されるので、土地により密に植栽できるツールを農業従事者に提供するであろう。この窒素送達タイプは、窒素に必要なときの「側条施肥」を付与する必要がないだけでなく、１エーカー当たりの植栽密度の増加に起因する１エーカー当たりの収穫高の増加を農業従事者が実現することもできるであろう。
【０８００】
実施例１１：リモデリングされた微生物によってトウモロコシ作物の圃場内変動を減少させることができる
本発明者らは、本開示の微生物が窒素をより一定かつ均一に送達させることによって収穫高の安定性を改善することができるとさらに判断した。本開示の微生物は、前述の微生物に暴露されたトウモロコシ作物の圃場内変動を減少させることができ、それにより、農業従事者の収穫高の安定性が改善されるようになる。
【０８０１】
ＮＤＶＩ圃場試験の実験プロトコール
【０８０２】
正規化差植生指数の測定値をモニタリングするために、トウモロコシ植栽の約１．５ヶ月後に、衛生画像診断によってＮＤＶＩを測定した。ＮＤＶＩを、植生によって反射される可視光および近赤外光から計算する。リモデリングされた微生物１３７−１０３６を、トウモロコシを処理するために付与した（すなわち、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託され、とりわけ、表１中に見出すことができるリモデリングされたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ）。
【０８０３】
圃場実験の結果を示す図４２に関して、健康な植生は、この植生に当たった可視光のほとんどを吸収し、近赤外光の大部分を反射する。植生が不健康であるか散在する場合、可視光をより多く反射し、近赤外光の反射はより少ない。
【０８０４】
図４２に示す２つのプロットにおいて、開示の微生物（１３７−１０３６）を、「ピン」（左パネル）および「クロスマーク」（右パネル）で境界を画定した圃場領域のプロットに付与した。また、処置領域を、四角形の境界線を使用して示している。両方の場合（図４２の左および右のパネル）、１３７−１０３６微生物で処置していない領域と比較して、全処置領域にわたってＮＤＶＩの測定値がより一定であった。
【０８０５】
未処理圃場と比較して、本開示のリモデリングされた菌株（１３７−１０３６菌株）で処理した圃場について圃場変動性の減少を示す圃場試験由来のトウモロコシの平均収穫高に関するデータを、以下の表３４に示す。
表３４
【表３４】
2021530984.tif 000167
【０８０６】
表３４中のデータは、未処理圃場（チェック）とＰｒｏｖｅＮ（１３７−１０３６菌株）処理圃場（ＰＢＭ）を比較した５つの異なる位置由来の平均である。未処理／チェック圃場を、本開示の微生物で処理せず、外因性Ｎを付与した。ＰＢＭ圃場を、開示の微生物で処理したが、側条施肥を付与しなかった。表３４に示すように、ＰＢＭ圃場は側条施肥の必要量が３５ｌｂｓ減少し（第１のカラム）；同時に、ＰＢＭ圃場および未処理圃場由来の平均収穫高は類似していた。ＰＢＭ圃場から得た平均収穫高の標準偏差は、チェックより相当に低かった（１６．５対１９．９ブッシェル／エーカー（ｂｐａ））。ＰＢＭ処理圃場の標準偏差がより小さいことは、対照圃場と比較して植生がより均一で不均一性が低下していることを示し、これは図４２に示すＮＤＶＩデータと一致している。
【０８０７】
実施例１２：トウモロコシ圃場における耕作困難な土壌タイプにわたって窒素産生が持続可能な微生物による窒素送達
本発明者らは、種々の土壌タイプおよび条件にわたる本開示の窒素産生微生物の性能についての一連の評価において、伝統的なＮ肥料があまり有効ではない耕作困難土壌タイプにおいてさえも、微生物がトウモロコシ根に一貫してコロニー化し、トウモロコシ植物にＮを供給すると判断した。本研究では、米国の１３州にわたる気候変動条件において４７種の異なる土壌タイプを評価し、評価した土壌タイプおよび気候条件の全てにおいて微生物が成長することが明らかとなった。本研究では、砂含有率が高い土壌は、「耕作困難」または「問題の多い」土壌タイプと見なし（栽培者がこれらの土壌タイプ（ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｃｏｉｌｓ）において窒素を急速に喪失し得るため）、それに対して、砂含有率が低い土壌を「典型的な」または「問題のない」土壌タイプと見なした。４７種の評価した土壌タイプの砂含有率（％）を測定した；これらのうちの５種が砂含有率が非常に高いことが認められた。具体的には、４７種の評価した土壌タイプのうちの５種の平均砂含有率が約５０．９０％であり、「耕作困難」または「問題の多い」土壌タイプと見なされ、平均砂含有率が約２６．６４％の残りの土壌タイプが「典型的な」または「問題のない」土壌タイプと見なされた。５種の耕作困難土壌タイプの各砂含有率を、表３５に列挙する。
【０８０８】
栽培者は、典型的には、豪雨および／または耕作困難土壌タイプにおいて窒素を喪失する。微生物は、種々の耕作困難土壌タイプで、さらに、豪雨に曝された土壌で強力な性能を示した。
【０８０９】
本開示のリモデリングされた微生物で処理した耕作困難土壌タイプについての、リモデリングされた微生物で処理されていない同一の土壌タイプと比較したトウモロコシ収穫高の改善を示す圃場試験由来のデータを、以下の表３５にまとめている。表３５中のカラム「Ｐｉｖｏｔ収穫高」は、本開示のリモデリングされた菌株で処理した耕作困難土壌タイプの圃場由来の収穫高を示す。耕作困難土壌タイプについて、リモデリングされた微生物は、化学窒素肥料のみを使用した類似の条件における圃場に対して平均約１７ブッシェル／エーカーを生じた。典型的な土壌および気候条件下において微生物を付与すると、微生物を使用しない圃場と比較して約７．７ブッシェル／エーカー有利であるので、耕作困難土壌タイプおよび豪雨に曝された土壌におけるこの優れた収穫高の改善は驚くべきことである。
【０８１０】
本発明の微生物を利用することにより、この微生物を使用する栽培者の化学肥料の必要性が減少し、投資が還元される一方で、化学肥料の使用に典型的に関連する複雑さおよびリスクが軽減する。
【０８１１】
ＮＤＶＩによって測定した場合の圃場内変動の低下に関して実施例１１に示すように、広範な土壌タイプにわたる性能改善を示す実施例１２の現在のデータは、本明細書中に教示の微生物が収穫高の予測に役立ち、農業従事者の圃場全体の収穫高不均一性を減少させることができることをさらに示す。
【０８１２】
農業従事者が、通常は収穫高が低くなりやすい田畑でさえも、農業従事者の耕作地の全域で比較的均一な収穫高の獲得を実現することができることは、当該分野において劇的な一歩である。農業従事者は、現在、さらに信頼できる収穫高の予測が可能であり、伝統的に性能が低かった土地の価値を実感することができるであろう。
表３５：
【表３５】
2021530984.tif 000168
【０８１３】
実施例１３：微生物菌株の活性の改善
この実施例では、実施例１に記載の工程Ａ〜Ｆを使用して、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ野生型（ＷＴ）菌株ＣＩ１３７のいくつかの非トランスジェニック誘導体菌株を生成した。第１に、実施例１の工程Ａ〜Ｃに記載の手法を使用して、ＷＴ菌株ＣＩ１３７を、根圏から単離し、特徴づけ、および順化した。
【０８１４】
次いで、実施例１の工程Ｄ〜Ｆに記載の手法を使用して、ＣＩ１３７の窒素固定形質は、導入遺伝子を使用せずに合理的に改善された。ＷＴ菌株の窒素固定形質を改善することができるかどうかを試験するために、本出願の至る所に記載の窒素固定に関与する種々の遺伝子を、非属間変異を操作するために標的にし、操作された／リモデリングされた微生物を窒素固定について分析し、さらなる改善によって窒素固定能を得ることができるかどうかを試験するために操作および分析工程を反復した。この反復手法を使用して、有利な変異を掛け合わせて、窒素固定能力を増加させた。
【０８１５】
窒素固定を改善したリモデリングされたＣＩ１３７菌株を生成するためのこの反復リモデリング過程によって作製した非属間変異を、以下の表３６にまとめている。リモデリングされた菌株の窒素固定形質の段階的改善を、図４３に示す。
表３６：１３７菌株および変異の説明
【表３６−１】
2021530984.tif 000169
【表３６−２】
2021530984.tif 000170
【表３６−３】
2021530984.tif 000171
【０８１６】
表３７に示した特徴セットは、Ｆ０、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、およびＦ６を列挙している図２９中の特徴リストに対応している。これらの特徴が得られると、圃場における外因性窒素使用の軽減を容易にするか、圃場における外因性窒素使用を完全に置換することを目標とする菌株の改善に到達する。表３７中に列挙した菌株によって示される窒素固定の改善を、図４３に示す。
表３７：改変細胞におけるアンモニウム排出
【表３７】
2021530984.tif 000172
【０８１７】
本開示の番号を付けた実施形態
【０８１８】
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の番号を付けた実施形態について記載している：
１．固定大気窒素を穀物用植物に提供する方法であって、
ａ．各々が少なくとも約５．４９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する複数の非属間のリモデリングされた細菌を所定位置に提供する工程；および
ｂ．前述の位置に複数の穀物用植物を提供する工程
を含み、
ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が前述の複数の穀物用植物の根表面にコロニー化して、前述の穀物用植物に固定Ｎを供給し、ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、方法。
２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、実施形態１に記載の方法。
３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約４．０３×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、実施形態１または２のいずれか１つに記載の方法。
４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前述の複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約２５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前述の複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約５０ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前述の複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約７５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法。
７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前述の複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１００ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の方法。
８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、図３１、３２、３３、３４、または３５に従った全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で、前述の複数の穀物用植物の根表面にコロニー化する、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約２０日間、前述の複数の穀物用植物の根表面にコロニー化する、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の方法。
１０．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約３０日間、前述の複数の穀物用植物の根表面にコロニー化する、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約６０日間、前述の複数の穀物用植物の根表面にコロニー化する、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前述の複数の穀物用植物の末梢根の根表面に、前述の細菌が他の根にコロニー化するのと同様に、等しくコロニー化する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前述の複数の穀物用植物の末梢根の根表面に、前述の細菌が他の根にコロニー化する程度よりも高い程度にコロニー化する、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌および穀物用植物が付与された後に、外因性窒素が前述の位置に付与されない、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌および穀物用植物が付与された後に、外因性窒素を含む側条施肥が前述の位置に付与されない、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．工程ａ）およびｂ）の前に、外因性窒素を前述の位置に付与する工程をさらに含む、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．工程ａ）およびｂ）の前に、外因性窒素を前述の位置に付与し、工程ａ）およびｂ）の後に外因性窒素を前述の位置に付与しない工程をさらに含む、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．前述の穀物用植物が、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、モロコシ、雑穀、オートムギ、ライ麦、またはライコムギである、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．前述の穀物用植物がトウモロコシ植物であり、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＶＴ期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．前述の穀物用植物がトウモロコシ植物であり、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＲ１期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．前述の穀物用植物がトウモロコシ植物であり、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＲ６期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前述の細菌に暴露された複数の穀物用植物のうちの個別の前述の穀物用植物中に１％またはそれを超える前述の固定窒素を産生する、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、外因性窒素の存在下で大気窒素を固定することができる、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前述の窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された導入調節配列を含む、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前述の窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子を含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、実施形態１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子；アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子；変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子；およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子および変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、実施形態１〜３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、菌体外多糖産生、エンドポリガラクツロナーゼ（ｅｎｄｏ−ｐｏｌｙｇａｌａｔｕｒｏｎａｓｅ）産生、トレハロース産生、およびグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態１〜３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態１〜３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、少なくとも２つの異なる細菌種を含む、実施形態１〜３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、同種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、実施形態１〜３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、着生性または根圏性である、実施形態１〜３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、実施形態１〜４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、実施形態１〜４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９５％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、実施形態１〜４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９９％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、実施形態１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列を有する細菌を含む、実施形態１〜４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．必要なときに外因性窒素付与を追加する必要のない、固定大気窒素をトウモロコシ植物に提供する方法であって、
ａ．各々が少なくとも約５．４９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する複数の非属間のリモデリングされた細菌を所定位置に提供する工程；および
ｂ．前述の位置に複数のトウモロコシ植物を提供する工程
を含み、
ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化して、前述のトウモロコシ植物に固定Ｎを供給し、ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生し、ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が付与された後に、外因性窒素が前述の位置に付与されない、方法。
４７．外因性窒素が側条施肥として付与されない、実施形態４６に記載の方法。
４８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、実施形態４６または４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約４．０３×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、実施形態４６〜４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前述の複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約２５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態４６〜４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前述の複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約５０ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態４６〜５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前述の複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約７５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態４６〜５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前述の複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１００ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態４６〜５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、図３１、３２、３３、３４、または３５に従った全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で、前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、実施形態４６〜５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約２０日間、前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、実施形態４６〜５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約３０日間、前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、実施形態４６〜５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約６０日間、前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、実施形態４６〜５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前述の複数のトウモロコシ植物の末梢根の根表面に、前述の細菌が他の根にコロニー化するのと同様に、等しくコロニー化する、実施形態４６〜５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前述の複数のトウモロコシ植物の末梢根の根表面に、前述の細菌が他の根にコロニー化する程度よりも高い程度にコロニー化する、実施形態４６〜５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．工程ａ）およびｂ）の前に、外因性窒素を前述の位置に付与する工程をさらに含む、実施形態４６〜５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＶＴ期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態４６〜６０のいずれか１つに記載の方法。
６２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＲ１期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態４６〜６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＲ６期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態４６〜６２のいずれか１つに記載の方法。
６４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前述の細菌に暴露された複数のトウモロコシ植物のうちの個別のトウモロコシ植物中に１％またはそれを超える前述の固定窒素を産生する、実施形態４６〜６３のいずれか１つに記載の方法。
６５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、外因性窒素の存在下で大気窒素を固定することができる、実施形態４６〜６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態４６〜６５のいずれか１つに記載の方法。
６７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前述の窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された導入調節配列を含む、実施形態４６〜６６のいずれか１つに記載の方法。
６８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前述の窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む、実施形態４６〜６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態４６〜６８のいずれか１つに記載の方法。
７０．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態４６〜６９のいずれか１つに記載の方法。
７１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子を含む、実施形態４６〜７０のいずれか１つに記載の方法。
７２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、実施形態４６〜７１のいずれか１つに記載の方法。
７３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、実施形態４６〜７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子；アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子；変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子；およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、実施形態４６〜７３のいずれか１つに記載の方法。
７５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、実施形態４６〜７４のいずれか１つに記載の方法。
７６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子および変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、実施形態４６〜７５のいずれか１つに記載の方法。
７７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、菌体外多糖産生、エンドポリガラクツロナーゼ（ｅｎｄｏ−ｐｏｌｙｇａｌａｔｕｒｏｎａｓｅ）産生、トレハロース産生、およびグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態４６〜７６のいずれか１つに記載の方法。
７８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態４６〜７７のいずれか１つに記載の方法。
７９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、少なくとも２つの異なる細菌種を含む、実施形態４６〜７８のいずれか１つに記載の方法。
８０．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、同種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、実施形態４６〜７９のいずれか１つに記載の方法。
８１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、実施形態４６〜８０のいずれか１つに記載の方法。
８２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、着生性または根圏性である、実施形態４６〜８１のいずれか１つに記載の方法。
８３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、実施形態４６〜８２のいずれか１つに記載の方法。
８４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、実施形態４６〜８３のいずれか１つに記載の方法。
８５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９５％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、実施形態４６〜８４のいずれか１つに記載の方法。
８６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９９％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、実施形態４６〜８５のいずれか１つに記載の方法。
８７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列を有する細菌を含む、実施形態４６〜８６のいずれか１つに記載の方法。
８８．１エーカーあたりのトウモロコシ収穫高を増加させる方法であって、
ａ．各々が少なくとも約５．４９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する複数の非属間のリモデリングされた細菌を所定位置に提供する工程；および
ｂ．前述の位置に複数のトウモロコシ植物を少なくとも３５，０００種子／エーカーの密度で提供する工程
を含み、
ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化して、前述のトウモロコシ植物に固定Ｎを供給し、ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生し、ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が付与された後に、外因性窒素が前述の位置に付与されない、方法。
８９．外因性窒素が側条施肥として付与されない、実施形態８８に記載の方法。
９０．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、実施形態８８または８９のいずれか１つに記載の方法。
９１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約４．０３×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、実施形態８８〜９０のいずれか１つに記載の方法。
９２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前述の複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約２５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態８８〜９１のいずれか１つに記載の方法。
９３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前述の複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約５０ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態８８〜９２のいずれか１つに記載の方法。
９４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前述の複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約７５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態８８〜９３のいずれか１つに記載の方法。
９５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生し、ここで、前述の複数の細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１００ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態８８〜９４のいずれか１つに記載の方法。
９６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、図３１、３２、３３、３４、または３５に従った全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で、前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、実施形態８８〜９５のいずれか１つに記載の方法。
９７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約２０日間、前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、実施形態８８〜９６のいずれか１つに記載の方法。
９８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約３０日間、前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、実施形態８８〜９７のいずれか１つに記載の方法。
９９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約６０日間、前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、実施形態８８〜９８のいずれか１つに記載の方法。
１００．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前述の複数のトウモロコシ植物の末梢根の根表面に、前述の細菌が他の根にコロニー化するのと同様に、等しくコロニー化する、実施形態８８〜９９のいずれか１つに記載の方法。
１０１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前述の複数のトウモロコシ植物の末梢根の根表面に、前述の細菌が他の根にコロニー化する程度よりも高い程度にコロニー化する、実施形態８８〜１００のいずれか１つに記載の方法。
１０２．工程ａ）およびｂ）の前に、外因性窒素を前述の位置に付与する工程をさらに含む、実施形態８８〜１０１のいずれか１つに記載の方法。
１０３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＶＴ期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態８８〜１０２のいずれか１つに記載の方法。
１０４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＲ１期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態８８〜１０３のいずれか１つに記載の方法。
１０５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＲ６期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態８８〜１０４のいずれか１つに記載の方法。
１０６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前述の細菌に暴露された複数のトウモロコシ植物のうちの個別のトウモロコシ植物中に１％またはそれを超える前述の固定窒素を産生する、実施形態８８〜１０５のいずれか１つに記載の方法。
１０７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、外因性窒素の存在下で大気窒素を固定することができる、実施形態８８〜１０６のいずれか１つに記載の方法。
１０８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態８８〜１０７のいずれか１つに記載の方法。
１０９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前述の窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された導入調節配列を含む、実施形態８８〜１０８のいずれか１つに記載の方法。
１１０．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前述の窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む、実施形態８８〜１０９のいずれか１つに記載の方法。
１１１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態８８〜１１０のいずれか１つに記載の方法。
１１２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態８８〜１１１のいずれか１つに記載の方法。
１１３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子を含む、実施形態８８〜１１２のいずれか１つに記載の方法。
１１４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、実施形態８８〜１１３のいずれか１つに記載の方法。
１１５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、実施形態８８〜１１４のいずれか１つに記載の方法。
１１６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子；アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子；変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子；およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、実施形態８８〜１１５のいずれか１つに記載の方法。
１１７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、実施形態８８〜１１６のいずれか１つに記載の方法。
１１８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子および変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、実施形態８８〜１１７のいずれか１つに記載の方法。
１１９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、菌体外多糖産生、エンドポリガラクツロナーゼ（ｅｎｄｏ−ｐｏｌｙｇａｌａｔｕｒｏｎａｓｅ）産生、トレハロース産生、およびグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態８８〜１１８のいずれか１つに記載の方法。
１２０．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態８８〜１１９のいずれか１つに記載の方法。
１２１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、少なくとも２つの異なる細菌種を含む、実施形態８８〜１２０のいずれか１つに記載の方法。
１２２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、同種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、実施形態８８〜１２１のいずれか１つに記載の方法。
１２３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、実施形態８８〜１２２のいずれか１つに記載の方法。
１２４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、着生性または根圏性である、実施形態８８〜１２３のいずれか１つに記載の方法。
１２５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、実施形態８８〜１２４のいずれか１つに記載の方法。
１２６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、実施形態８８〜１２５のいずれか１つに記載の方法。
１２７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９５％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、実施形態８８〜１２６のいずれか１つに記載の方法。
１２８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９９％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、実施形態８８〜１２７のいずれか１つに記載の方法。
１２９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列を有する細菌を含む、実施形態８８〜１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３０．農耕困難土壌における１エーカー当たりのトウモロコシ収穫高を増加させる方法であって、
ａ．農耕困難土壌中に存在する所定位置に、各々が少なくとも約５．４９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する複数の非属間のリモデリングされた細菌を提供する工程；および
ｂ．農耕困難土壌中に存在する前述の位置に複数のトウモロコシ植物を提供する工程
を含み、
ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化して、前述のトウモロコシ植物に固定Ｎを供給し、
ここで、前述の農耕困難土壌が、少なくとも約３０％の砂を含む土壌を含み、
ここで、対照とされる複数のトウモロコシ植物を前述の位置に提供したときの前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、前述の複数のトウモロコシ植物が、少なくとも１ブッシェル／エーカーの収穫高の増加を達成する、方法。
１３１．前述の農耕困難土壌が、少なくとも約４０％の砂を含む、実施形態１３０に記載の方法。
１３２．前述の農耕困難土壌が、少なくとも約５０％の砂を含む、実施形態１３０〜１３１のいずれか１つに記載の方法。
１３３．前述の農耕困難土壌が、約３０％未満のシルトを含む、実施形態１３０〜１３２のいずれか１つに記載の方法。
１３４．前述の農耕困難土壌が、約２０％未満の粘土を含む、実施形態１３０〜１３３のいずれか１つに記載の方法。
１３５．前述の農耕困難土壌のｐＨが約５〜約８である、実施形態１３０〜１３４のいずれか１つに記載の方法。
１３６．前述の農耕困難土壌のｐＨが約６．８である、実施形態１３０〜１３５のいずれか１つに記載の方法。
１３７．前述の農耕困難土壌の有機物含有量が約０．４０〜約２．８である、実施形態１３０〜１３６のいずれか１つに記載の方法。
１３８．前述の農耕困難土壌の有機物含有量が約１．４２である、実施形態１３０〜１３７のいずれか１つに記載の方法。
１３９．前述の農耕困難土壌が、砂質ロームまたはローム土である、実施形態１３０〜１３８のいずれか１つに記載の方法。
１４０．前述の農耕困難土壌が、前述の土壌の変数のうちの少なくとも１つを表３５に列挙した近似量で含む、実施形態１３０〜１３９のいずれか１つに記載の方法。
１４１．前述の複数のトウモロコシ植物が、対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、少なくとも５ブッシェル／エーカーの収穫高の増加を達成する、実施形態１３０〜１４０のいずれか１つに記載の方法。
１４２．前述の複数のトウモロコシ植物が、対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、少なくとも１０ブッシェル／エーカーの収穫高の増加を達成する、実施形態１３０〜１４１のいずれか１つに記載の方法。
１４３．前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物が、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物が植栽された後に、前述の植物に付与された外因性窒素を有する、実施形態１３０〜１４２のいずれか１つに記載の方法。
１４４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に、外因性窒素が前述の位置に付与されない、実施形態１３０〜１４３のいずれか１つに記載の方法。
１４５．前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物が、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌を用いずに前述の位置に提供される、実施形態１３０〜１４４のいずれか１つに記載の方法。
１４６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に前述の位置に外因性窒素が付与されないが、対照とされる複数のトウモロコシ植物には外因性窒素が付与され、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物は、複数の非属間のリモデリングされた細菌を提供されない、実施形態１３０〜１４５のいずれか１つに記載の方法。
１４７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に前述の位置に外因性窒素が付与されないが、対照とされる複数のトウモロコシ植物には外因性窒素が付与され、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物は、複数の非属間のリモデリングされた細菌を提供されず、ここで、前述のリモデリングされた細菌を用いた前述の複数のトウモロコシ植物が、前述のリモデリングされた細菌を用いない前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、少なくとも約１７ブッシェル／エーカーの収穫高の増加を達成する、実施形態１３０〜１４６のいずれか１つに記載の方法。
１４８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１３０〜１４７のいずれか１つに記載の方法。
１４９．外因性窒素が側条施肥として付与されない、実施形態１３０〜１４８のいずれか１つに記載の方法。
１５０．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、実施形態１３０〜１４９のいずれか１つに記載の方法。
１５１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約４．０３×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、実施形態１３０〜１５０のいずれか１つに記載の方法。
１５２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約２５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１３０〜１５１のいずれか１つに記載の方法。
１５３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約５０ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１３０〜１５２のいずれか１つに記載の方法。
１５４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約７５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１３０〜１５３のいずれか１つに記載の方法。
１５５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１００ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１３０〜１５４のいずれか１つに記載の方法。
１５６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、図３１、３２、３３、３４、または３５に従った全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で、前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、実施形態１３０〜１５５のいずれか１つに記載の方法。
１５７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約２０日間、前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、実施形態１３０〜１５６のいずれか１つに記載の方法。
１５８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約３０日間、前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、実施形態１３０〜１５７のいずれか１つに記載の方法。
１５９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約６０日間、前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、実施形態１３０〜１５８のいずれか１つに記載の方法。
１６０．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前述の複数のトウモロコシ植物の末梢根の根表面に、前述の細菌が他の根にコロニー化するのと同様に、等しくコロニー化する、実施形態１３０〜１５９のいずれか１つに記載の方法。
１６１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前述の複数のトウモロコシ植物の末梢根の根表面に、前述の細菌が他の根にコロニー化する程度よりも高い程度にコロニー化する、実施形態１３０〜１６０のいずれか１つに記載の方法。
１６２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＶＴ期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１３０〜１６１のいずれか１つに記載の方法。
１６３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＲ１期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１３０〜１６２のいずれか１つに記載の方法。
１６４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＲ６期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１３０〜１６３のいずれか１つに記載の方法。
１６５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前述の細菌に暴露された複数のトウモロコシ植物のうちの個別のトウモロコシ植物中に１％またはそれを超える前述の固定窒素を産生する、実施形態１３０〜１６４のいずれか１つに記載の方法。
１６６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、外因性窒素の存在下で大気窒素を固定することができる、実施形態１３０〜１６５のいずれか１つに記載の方法。
１６７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態１３０〜１６６のいずれか１つに記載の方法。
１６８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前述の窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された導入調節配列を含む、実施形態１３０〜１６７のいずれか１つに記載の方法。
１６９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前述の窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む、実施形態１３０〜１６８のいずれか１つに記載の方法。
１７０．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態１３０〜１６９のいずれか１つに記載の方法。
１７１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態１３０〜１７０のいずれか１つに記載の方法。
１７２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子を含む、実施形態１３０〜１７１のいずれか１つに記載の方法。
１７３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、実施形態１３０〜１７２のいずれか１つに記載の方法。
１７４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、実施形態１３０〜１７３のいずれか１つに記載の方法。
１７５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子；アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子；変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子；およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、実施形態１３０〜１７４のいずれか１つに記載の方法。
１７６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、実施形態１３０〜１７５のいずれか１つに記載の方法。
１７７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子および変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、実施形態１３０〜１７６のいずれか１つに記載の方法。
１７８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、菌体外多糖産生、エンドポリガラクツロナーゼ（ｅｎｄｏ−ｐｏｌｙｇａｌａｔｕｒｏｎａｓｅ）産生、トレハロース産生、およびグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態１３０〜１７７のいずれか１つに記載の方法。
１７９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態１３０〜１７８のいずれか１つに記載の方法。
１８０．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、少なくとも２つの異なる細菌種を含む、実施形態１３０〜１７９のいずれか１つに記載の方法。
１８１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、同種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、実施形態１３０〜１８０のいずれか１つに記載の方法。
１８２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、実施形態１３０〜１８１のいずれか１つに記載の方法。
１８３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、着生性または根圏性である、実施形態１３０〜１８２のいずれか１つに記載の方法。
１８４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、実施形態１３０〜１８３のいずれか１つに記載の方法。
１８５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、実施形態１３０〜１８４のいずれか１つに記載の方法。
１８６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９５％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、実施形態１３０〜１８５のいずれか１つに記載の方法。
１８７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９９％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、実施形態１３０〜１８６のいずれか１つに記載の方法。
１８８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列を有する細菌を含む、実施形態１３０〜１８７のいずれか１つに記載の方法。
１８９．１エーカー当たりのトウモロコシ収穫高の圃場内変動を減少させる方法であって、
ａ．各々が少なくとも約５．４９×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する複数の非属間のリモデリングされた細菌を所定位置に提供する工程；および
ｂ．前述の位置に複数のトウモロコシ植物を提供する工程
を含み、
ここで、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化して、前述のトウモロコシ植物に固定Ｎを供給し、
ここで、ブッシェル／エーカーで測定した場合の前述の位置にわたって測定したトウモロコシ平均収穫高の標準偏差が、対照とされる複数のトウモロコシ植物を前述の位置に提供したときの前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、前述の非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化した前述の複数のトウモロコシ植物で低い、方法。
１９０．前述の非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化した複数のトウモロコシ植物の前述の標準偏差が、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物と比較した場合、１９ブッシェル／エーカー未満であり、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物は、非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化していない、実施形態１８９に記載の方法。
１９１．前述の非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化した前述の複数のトウモロコシ植物の間の収穫高が、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物の収穫高の１〜１０％以内であり、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物は、非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化していない、実施形態１８９〜１９０のいずれか１つに記載の方法。
１９２．前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物が、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物が植栽された後に、前述の植物に付与された外因性窒素を有する、実施形態１８９〜１９１のいずれか１つに記載の方法。
１９３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に、外因性窒素が前述の位置に付与されない、実施形態１８９〜１９２のいずれか１つに記載の方法。
１９４．前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物が、前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌を用いずに前述の位置に提供される、実施形態１８９〜１９３のいずれか１つに記載の方法。
１９５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に前述の位置に外因性窒素が付与されないが、対照とされる複数のトウモロコシ植物には外因性窒素が付与され、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物は、複数の非属間のリモデリングされた細菌を提供されない、実施形態１８９〜１９４のいずれか１つに記載の方法。
１９６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌およびトウモロコシ植物が供給された後に前述の位置に外因性窒素が付与されないが、対照とされる複数のトウモロコシ植物には外因性窒素が付与され、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物は、複数の非属間のリモデリングされた細菌を提供されず、ここで、前述の非属間のリモデリングされた細菌がコロニー化した前述の複数のトウモロコシ植物の間の収穫高が、前述の対照とされる複数のトウモロコシ植物の収穫高の１〜１０％以内である、実施形態１８９〜１９５のいずれか１つに記載の方法。
１９７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１８９〜１９６のいずれか１つに記載の方法。
１９８．外因性窒素が側条施肥として付与されない、実施形態１８９〜１９７のいずれか１つに記載の方法。
１９９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約２．７５×１０−１２ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、実施形態１８９〜１９８のいずれか１つに記載の方法。
２００．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各々が、少なくとも約４．０３×１０−１３ｍｍｏｌのＮ／ＣＦＵ／時間の固定Ｎを産生する、実施形態１８９〜１９９のいずれか１つに記載の方法。
２０１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約２５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１８９〜２００のいずれか１つに記載の方法。
２０２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約５０ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１８９〜２０１のいずれか１つに記載の方法。
２０３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約７５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１８９〜２０２のいずれか１つに記載の方法。
２０４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、少なくとも約１０日間〜約６０日間にわたって少なくとも約１００ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１８９〜２０３のいずれか１つに記載の方法。
２０５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、図３１、３２、３３、３４、または３５に従った全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で、前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、実施形態１８９〜２０４のいずれか１つに記載の方法。
２０６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約２０日間、前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、実施形態１８９〜２０５のいずれか１つに記載の方法。
２０７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約３０日間、前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、実施形態１８９〜２０６のいずれか１つに記載の方法。
２０８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、約５×１０１３の全集合体ＣＦＵ／エーカー濃度で少なくとも約６０日間、前述の複数のトウモロコシ植物の根表面にコロニー化する、実施形態１８９〜２０７のいずれか１つに記載の方法。
２０９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前述の複数のトウモロコシ植物の末梢根の根表面に、前述の細菌が他の根にコロニー化するのと同様に、等しくコロニー化する、実施形態１８９〜２０８のいずれか１つに記載の方法。
２１０．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前述の複数のトウモロコシ植物の末梢根の根表面に、前述の細菌が他の根にコロニー化する程度よりも高い程度にコロニー化する、実施形態１８９〜２０９のいずれか１つに記載の方法。
２１１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＶＴ期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１８９〜２１０のいずれか１つに記載の方法。
２１２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＲ１期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１８９〜２１１のいずれか１つに記載の方法。
２１３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、集合体として、前述のトウモロコシ植物のＲ６期前に少なくとも約１５ポンドの固定Ｎ／エーカーを産生する、実施形態１８９〜２１２のいずれか１つに記載の方法。
２１４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、前述の細菌に暴露された複数のトウモロコシ植物のうちの個別のトウモロコシ植物中に１％またはそれを超える前述の固定窒素を産生する、実施形態１８９〜２１３のいずれか１つに記載の方法。
２１５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、外因性窒素の存在下で大気窒素を固定することができる、実施形態１８９〜２１４のいずれか１つに記載の方法。
２１６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態１８９〜２１５のいずれか１つに記載の方法。
２１７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前述の窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された導入調節配列を含む、実施形態１８９〜２１６のいずれか１つに記載の方法。
２１８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、前述の窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む、実施形態１８９〜２１７のいずれか１つに記載の方法。
２１９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＱ、ニトロゲナーゼ酵素の生合成と関連する遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態１８９〜２１８のいずれか１つに記載の方法。
２２０．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす、窒素固定または同化遺伝子制御ネットワークの少なくとも１つの遺伝子、すなわち非コードポリヌクレオチドに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態１８９〜２１９のいずれか１つに記載の方法。
２２１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子を含む、実施形態１８９〜２２０のいずれか１つに記載の方法。
２２２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、実施形態１８９〜２２１のいずれか１つに記載の方法。
２２３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、実施形態１８９〜２２２のいずれか１つに記載の方法。
２２４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子；アデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子；変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子；およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、実施形態１８９〜２２３のいずれか１つに記載の方法。
２２５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子を含む、実施形態１８９〜２２４のいずれか１つに記載の方法。
２２６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、変異ｎｉｆＬ遺伝子であって、前述のｎｉｆＬ遺伝子に挿入された異種プロモーターを含むように変更されている、変異ｎｉｆＬ遺伝子およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインを欠如する短縮ＧｌｎＥタンパク質をもたらす変異ｇｌｎＥ遺伝子および変異ａｍｔＢ遺伝子であって、前述のａｍｔＢ遺伝子の発現を欠如させる、変異ａｍｔＢ遺伝子を含む、実施形態１８９〜２２５のいずれか１つに記載の方法。
２２７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、菌体外多糖産生、エンドポリガラクツロナーゼ（ｅｎｄｏ−ｐｏｌｙｇａｌａｔｕｒｏｎａｓｅ）産生、トレハロース産生、およびグルタミン変換からなる群から選択される経路に関与する遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態１８９〜２２６のいずれか１つに記載の方法。
２２８．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌の各メンバーが、ｂｃｓｉｉ、ｂｃｓｉｉｉ、ｙｊｂＥ、ｆｈａＢ、ｐｅｈＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、ｇｌｓＡ２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子に導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含む、実施形態１８９〜２２７のいずれか１つに記載の方法。
２２９．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、少なくとも２つの異なる細菌種を含む、実施形態１８９〜２２８のいずれか１つに記載の方法。
２３０．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、同種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、実施形態１８９〜２２９のいずれか１つに記載の方法。
２３１．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｉｒｉｔｉｎｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、実施形態１８９〜２３０のいずれか１つに記載の方法。
２３２．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、着生性または根圏性である、実施形態１８９〜２３１のいずれか１つに記載の方法。
２３３．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、ＮＣＭＡ２０１７０１００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００４として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００３として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７０８００２として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００１として寄託された細菌、ＮＣＭＡ２０１７１２００２として寄託された細菌、およびこれらの組み合わせから選択される細菌を含む、実施形態１８９〜２３２のいずれか１つに記載の方法。
２３４．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、実施形態１８９〜２３３のいずれか１つに記載の方法。
２３５．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９５％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、実施形態１８９〜２３４のいずれか１つに記載の方法。
２３６．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列と少なくとも約９９％の配列同一性を共有する核酸配列を有する細菌を含む、実施形態１８９〜２３５のいずれか１つに記載の方法。
２３７．前述の複数の非属間のリモデリングされた細菌が、配列番号１７７〜２６０、２９６〜３０３、および４５８〜４６９から選択される核酸配列を有する細菌を含む、実施形態１８９〜２３６のいずれか１つに記載の方法。
【０８１９】
本開示の好ましい実施形態を本明細書中に示し、説明しているが、かかる実施形態をほんの一例として提供していることが当業者に明らかであろう。当業者であるならば、本開示を逸脱することなく、多数の変形形態、変更形態、および置換形態を思いつくであろう。本開示の実施において、本明細書中に記載の開示の実施形態の種々の代替形態を使用することができると理解すべきである。以下のクレームは、本開示の範囲を定義しており、これらのクレームおよびその均等物の範囲内の方法および構造物がクレームの対象とされることが意図される。
【０８２０】
参照による援用
【０８２１】
本明細書中に引用された全ての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、全ての目的のためにその全体が参考として援用される。しかしながら、本明細書中に引用された任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、前述の文献が有効な先行技術を構成することや、任意の国家の周知の一般的知識の一部を形成することの承認や示唆の任意の形態と見なされず、また見なされないものとする。さらに、２０１８年５月２２日に発行された、発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｉｔｓ」の米国特許第９，９７５，８１７号は、本明細書中で参考として援用される。さらに、２０１８年１月１２日に発行された、発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｉｔｓ」のＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１３６７１号は、本明細書中で参考として援用される。
【図１−１】
2021530984.tif 000173
【図１−２】
2021530984.tif 000174
【図１−３】
2021530984.tif 000175
【図１−４】
2021530984.tif 000176
【図１−５】
2021530984.tif 000177
【図１−６】
2021530984.tif 000178
【図１−７】
2021530984.tif 000179
【図１−８】
2021530984.tif 000180
【図１−９】
2021530984.tif 000181
【図１−１０】
2021530984.tif 000182
【図１−１１】
2021530984.tif 000183
【図１−１２】
2021530984.tif 000184
【図１−１３】
2021530984.tif 000185
【図１−１４】
2021530984.tif 000186
【図１−１５】
2021530984.tif 000187
【図２】
2021530984.tif 000188
【図３】
2021530984.tif 000189
【図４】
2021530984.tif 000190
【図５】
2021530984.tif 000191
【図６】
2021530984.tif 000192
【図７】
2021530984.tif 000193
【図８】
2021530984.tif 000194
【図９】
2021530984.tif 000195
【図１０】
2021530984.tif 000196
【図１１】
2021530984.tif 000197
【図１２】
2021530984.tif 000198
【図１３】
2021530984.tif 000199
【図１４】
2021530984.tif 000200
【図１５】
2021530984.tif 000201
【図１６】
2021530984.tif 000202
【図１７】
2021530984.tif 000203
【図１８】
2021530984.tif 000204
【図１９】
2021530984.tif 000205
【図２０】
2021530984.tif 000206
【図２１】
2021530984.tif 000207
【図２２】
2021530984.tif 000208
【図２３】
2021530984.tif 000209
【図２４】
2021530984.tif 000210
【図２５】
2021530984.tif 000211
【図２６】
2021530984.tif 000212
【図２７】
2021530984.tif 000213
【図２８−１】
2021530984.tif 000214
【図２８−２】
2021530984.tif 000215
【図２９−１】
2021530984.tif 000216
【図２９−２】
2021530984.tif 000217
【図３０−１】
2021530984.tif 000218
【図３０−２】
2021530984.tif 000219
【図３１】
2021530984.tif 000220
【図３２】
2021530984.tif 000221
【図３３】
2021530984.tif 000222
【図３４】
2021530984.tif 000223
【図３５】
2021530984.tif 000224
【図３６】
2021530984.tif 000225
【図３７】
2021530984.tif 000226
【図３８】
2021530984.tif 000227
【図３９】
2021530984.tif 000228
【図４０】
2021530984.tif 000229
【図４１】
2021530984.tif 000230
【図４２】
2021530984.tif 000231
【図４３】
2021530984.tif 000232
【配列表】
2021530984000001.app
【国際調査報告】
2021530984.tif 000233
2021530984.tif 000234
2021530984.tif 000235
2021530984.tif 000236
2021530984.tif 000237
2021530984.tif 000238
2021530984.tif 000239