(57)【要約】  本発明は、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合する新規抗体、及びがんの処置におけるその使用を提供する。本発明は、そのような抗体を含む新規の二重特異性抗体、及びがんの処置におけるその使用をさらに提供する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２ｃ）に特異的に結合する抗体であって、
ａ．配列番号１１、１９、２６、３３、４１、４８、５２、５７、６０、６２、６４、６５、６７、６９、７１、若しくは７３に示す、重鎖可変（ＶＨ）配列のＶＨ相補性決定領域１（ＶＨ  ＣＤＲ１）、ＶＨ相補性決定領域２（ＶＨ  ＣＤＲ２）及びＶＨ相補性決定領域３（ＶＨ  ＣＤＲ３）を含むＶＨ領域、並びに／又は
ｂ．配列番号９２、１００、１０４、１０６、１１２、１１９、１２５、１２９、１３４、１３６、１３７、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１５０、１５２、１５６、１５８、１６０、１６２、１６６、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、若しくは１７５に示す、軽鎖可変（ＶＬ）配列のＶＬ相補性決定領域１（ＶＬ  ＣＤＲ１）、ＶＬ相補性決定領域２（ＶＬ  ＣＤＲ２）及びＶＬ相補性決定領域３（ＶＬ  ＣＤＲ３）を含むＶＬ領域
を含む、前記抗体。
【請求項２】
ｃ．前記ＶＨ領域が、（ｉ）配列番号１２、２０、２７、３４、４２、７４、２５７、２５８、２５９、２６０、若しくは２６１の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号１３、２１、２８、３５、４３、５３、６６、６８、７０、７２、７５、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、若しくは２６７の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４、２２、２９、３６、若しくは４４の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含み、並びに／又は
ｄ．前記ＶＬ領域が、（ｉ）配列番号９３、１０１、１０５、１０７、１１３、１２０、１４８、１５３、１６３、若しくは１６７の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号７８、９４、１０２、１０８、１１４、１４１、１４４、１４６、１４９、１５１、１５７、１５９、１６１、１６４、若しくは１６８の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９５、１０９、１１５、１２１、１４２、１５４、１６５、若しくは１６９の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ａ．前記ＶＨ領域が、（ｉ）配列番号７４若しくは２５９の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号７５若しくは２６７の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２９の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含み、並びに／又は
ｂ．前記ＶＬ領域が、（ｉ）配列番号１４８の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号１４９の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４２の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
ｅ．前記ＶＨ領域が、配列番号１１、１９、２６、３３、４１、４８、５２、５７、６０、６２、６４、６５、６７、６９、７１、若しくは７３の配列を含む、及び／又は
ｆ．前記ＶＬ領域が、配列番号９２、１００、１０４、１０６、１１２、１１９、１２５、１２９、１３４、１３６、１３７、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１５０、１５２、１５６、１５８、１６０、１６２、１６６、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、若しくは１７５の配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体
【請求項５】
前記ＶＨ領域が配列番号７３の配列を含み、前記ＶＬ領域が配列番号１４７の配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
前記ＶＨ領域が、配列番号７３の配列、又はＣＤＲ領域内にない残基に１個又は数個の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、及び／或いは前記ＶＬ領域が、配列番号１４７の配列、又はＣＤＲ領域内にないアミノ酸に１個又は数個の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
ａ．配列ＲＡＳＥＳＶ−ＸＬ１．３０−ＸＬ１．３０ａ−ＹＧ−ＸＬ１．３０ｄ−ＳＬＬＱを有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号１４９に記載される配列を有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ２、
ｃ．配列番号１４２に記載される配列を有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ３、
ｄ．配列ＧＦＴＦＳ−ＸＨ１．３１−ＸＨ１．３２−ＷＭＨを有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ１、
ｅ．配列ＥＩＫ−ＸＨ２．５２Ａ−ＸＨ２．５３−ＸＨ２．５４−ＸＨ２．５５−ＸＨ２．５６−ＸＨ２．５７−ＮＶＨＥＫＦＫＤを有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ２、及び
ｆ．配列Ｔ−ＸＨ３．９６−ＸＨ３．９７−ＸＨ３．９８−ＸＨ３．９９−ＸＨ３．１００−Ｇ−ＸＨ３．１００Ｂ−ＷＦ−ＸＨ３．１００Ｅ−ＸＨ３．１０１−Ｖを有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ３
を含むＧＵＣＹ２ｃに結合する、抗体。
【請求項８】
ａ．ＸＬ１．３０が、Ｄ、Ｎ、又はＳであり、
ｂ．ＸＬ１．３０ａが、Ｙ、Ｗ、又はＩであり、
ｃ．ＸＬ１．３０ｄが、Ｔ、Ｓ、又はＨであり、
ｄ．ＸＨ１．３１が、Ｓ、Ｒ、Ｗ、Ｙ、Ａ、Ｈ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｇ、又はＶであり、
ｅ．ＸＨ１．３２が、Ｙ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｋ、Ｐ、Ｉ、Ｎ、Ｍ、Ｖ、又はＳであり、
ｆ．ＸＨ２．５２Ａが、Ｐ、Ｔ、又はＶであり、
ｇ．ＸＨ２．５３が、Ｓ、Ａ、Ｌ、又はＲであり、
ｈ．ＸＨ２．５４が、Ｎ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｔ、又はＩであり、
ｉ．ＸＨ２．５５が、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｙ、Ｇ、Ｌ、Ａ、Ｍ、Ｓ、Ｈ、Ｄ、又はＱであり、
ｊ．ＸＨ２．５６が、Ｌ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｎ、又はＨであり、
ｋ．ＸＨ２．５７が、Ｔ、Ｍ、Ｓ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、又はＶであり、
ｌ．ＸＨ３．９６が、Ｉ、Ｆ、又はＫであり、
ｍ．ＸＨ３．９７が、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、又はＡであり、
ｎ．ＸＨ３．９８が、Ｔ、Ｎ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、又はＩであり、
ｏ．ＸＨ３．９９が、Ｔ、Ｋ、Ｌ、Ｗ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｐ、Ｎ、又はＲであり、
ｐ．ＸＨ３．１００が、Ｅ、Ｇ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｙ、Ｌ、又はＭであり、
ｑ．ＸＨ３．１００Ｂが、Ｙ又はＨであり、
ｒ．ＸＨ３．１００Ｅが、Ｆ又はＬであり、
ｓ．ＸＨ３．１０１が、Ｄ、Ｙ、Ｅ、又はＳである、
請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）フラグメント、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント、モノクローナル抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体、二重特異性ヘテロ二量体二特異性抗体二重特異性ヘテロ二量体ＩｇＧ、ポリクローナル抗体、標識抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及びそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
ヒト又はヒト化ＶＨフレームワーク、及びヒト又はヒト化ＶＬフレームワークをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記ＶＨフレームワークが、配列番号５、６、７、８、１５、１６、１７、１８、２３、２４、２５、３０、３１、３２、３７、３８、３９、４０、４５、４６、４７、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５８、５９、６１、又は６３の配列を含み、及び／又は前記ＶＬフレームワークが、配列番号８０、８１、８２、８３、８６、８７、８８、８９、９６、９７、９８、９９、１０３、１１０、１１１、１１６、１１７、１１８、１２２、１２３、１２４、１２６、１２７、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３９、又は１５５の配列を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
ＧＵＣＹ２ｃ細胞外ドメインのエピトープに結合し、前記エピトープが、配列番号４０６のアミノ酸残基Ｒ７３、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｔ７６、Ｅ７８、Ｇ７９、Ｌ８０、Ｌ８２、Ｌ８３、Ｒ８４、又はＩ８６から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含む、単離ヒトモノクローナル抗体。
【請求項１３】
前記エピトープが、配列番号４０６のアミノ酸残基Ｒ７３、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｔ７６、Ｅ７８、Ｇ７９、Ｌ８０、Ｌ８２、Ｌ８３、Ｒ８４、又はＩ８６から選択される少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個のアミノ酸残基を含む、請求項１２に記載の単離ヒトモノクローナル抗体。
【請求項１４】
前記エピトープが、配列番号４０６のアミノ酸残基Ｒ７３、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｔ７６、Ｅ７８、Ｇ７９、Ｌ８０、Ｌ８２、Ｌ８３、Ｒ８４、又はＩ８６を含む、請求項１２に記載の単離ヒトモノクローナル抗体。
【請求項１５】
前記エピトープが、配列番号４０６により記載される配列を有するアミノ酸を含む、請求項１２に記載の単離ヒトモノクローナル抗体。
【請求項１６】
前記エピトープが機能性エピトープである、請求項１２に記載の単離ヒトモノクローナル抗体。
【請求項１７】
前記単離ヒト抗体と前記ＧＵＣＹ２ｃエピトープアミノ酸との接触が、結晶学により決定して３．８オングストローム内のものである、請求項１２に記載の単離ヒトモノクローナル抗体。
【請求項１８】
前記抗体が二重特異性抗体である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
ＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３に特異的に結合し、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む、二重特異性抗体。
【請求項２０】
ａ．前記第１のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ＧＵＣＹ２ｃ抗体のＶＬ領域（ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ）及びＣＤ３抗体のＶＨ領域（ＣＤ３  ＶＨ）を含む、ドメイン１と、
ｉｉ．第１のヘテロ二量体促進ドメインと
を含み、
ｂ．前記第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ＣＤ３抗体のＶＬ領域（ＣＤ  ＶＬ）及びＧＵＣＹ２ｃ抗体のＶＨ領域（ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ）を含む、ドメイン２と、
ｉｉ．第２のヘテロ二量体促進ドメインと
を含み、
前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及び前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨが、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合するドメインを形成し、前記ＣＤ３  ＶＬ及び前記ＣＤ３  ＶＨが、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを形成する、請求項１９に記載の二重特異性抗体。
【請求項２１】
ａ．前記第１のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ＣＤ３  ＶＬ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨを含む、ドメイン１と、
ｉｉ．第１のヘテロ二量体促進ドメインと
を含み、
ｂ．前記第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及びＣＤ３  ＶＨを含むドメイン２と、
ｉｉ．第２のヘテロ二量体促進ドメインと
を含み、
前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及び前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨが、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合するドメインを形成し、前記ＣＤ３  ＶＬ及び前記ＣＤ３  ＶＨが、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを形成する、請求項１９に記載の二重特異性抗体。
【請求項２２】
ａ．前記第１のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ及びＣＤ３  ＶＬを含むドメイン１と、
ｉｉ．第１のヘテロ二量体促進ドメインと
を含み、
ｂ．前記第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ＣＤ３  ＶＨ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬを含む、ドメイン２と、
ｉｉ．第２のヘテロ二量体促進ドメインと
を含み、
前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及び前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨが、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合するドメインを形成し、前記ＣＤ３  ＶＬ及び前記ＣＤ３  ＶＨが、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを形成する、請求項１９に記載の二重特異性抗体。
【請求項２３】
ａ．前記第１のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ＣＤ３  ＶＨ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬを含む、ドメイン１と、
ｉｉ．第１のヘテロ二量体促進ドメインと
を含み、
ｂ．前記第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ及びＣＤ３  ＶＬを含むドメイン２と、
ｉｉ．第２のヘテロ二量体促進ドメインと、
を含み、
前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及び前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨが、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合するドメインを形成し、前記ＣＤ３  ＶＬ及び前記ＣＤ３  ＶＨが、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを形成する、請求項１９に記載の二重特異性抗体。
【請求項２４】
前記第１のヘテロ二量体促進ドメイン及び前記第２のヘテロ二量体促進ドメインが、それぞれ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域を含み、前記ＣＨ２ドメイン及び／又は前記ＣＨ３のそれぞれのアミノ酸配列が、野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１個のアミノ酸修飾を含んで、ノブ又はホールを形成する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２５】
前記第１のヘテロ二量体促進ドメイン及び前記第２のヘテロ二量体促進ドメインが、両方ともノブではないか、若しくは両方ともホールではなく、及び／又は前記第１のヘテロ二量体促進ドメイン及び前記第２のヘテロ二量体促進ドメインが、ＩｇＧ免疫グロブリンＦｃ領域を形成する、請求項２４に記載の二重特異性抗体。
【請求項２６】
前記第１のヘテロ二量体促進ドメインの前記ＣＨ３ドメインが、ノブが形成されるように、変異Ｙ３４９Ｃ及び／又はＴ３６６Ｗを含み、前記第２のヘテロ二量体促進ドメインの前記ＣＨ３ドメインが、ホールが形成されるように、変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及び／又はＹ４０７Ｖを含む（ＥＵ指標に準じた番号付け）、請求項２５に記載の二重特異性抗体。
【請求項２７】
前記第１のヘテロ二量体促進ドメインの前記ＣＨ２ドメイン及び前記第２のヘテロ二量体促進ドメインの前記ＣＨ２ドメインが、それぞれ、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／又はＧ２３７Ａを含む（ＥＵ指標に準じた番号付け）、請求項２６に記載の二重特異性抗体。
【請求項２８】
前記第１のヘテロ二量体促進ドメインが、ノブが形成されるように、配列番号１８８の配列を含み、前記第２のヘテロ二量体促進ドメインが、ホールが形成されるように、配列番号１８９の配列を含む、請求項２７に記載の二重特異性抗体。
【請求項２９】
前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及び前記ＣＤ３  ＶＨが、グリシン−セリンリンカーにより連結しており、前記ＣＤ３  ＶＬ及び前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨが、グリシン−セリンリンカーにより連結している、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項３０】
前記グリシン−セリンリンカーが、配列番号１９０の配列を含むリンカー１である、請求項２９に記載の二重特異性抗体。
【請求項３１】
前記グリシン−セリンリンカーが、配列番号１９１の配列を含むリンカー２である、請求項２９に記載の二重特異性抗体。
【請求項３２】
ドメイン１が、システインリンカーを介して前記第１のヘテロ二量体促進ドメインに共有結合しており、ドメイン２が、システインリンカーを介して前記第２のヘテロ二量体促進ドメインに共有結合しており、前記システインリンカーが少なくとも５個のアミノ酸を含む、請求項２０〜３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項３３】
前記システインリンリンカーが、配列番号１９２の配列を含むリンカー３である、請求項３２に記載の二重特異性抗体。
【請求項３４】
第１のポリペプチド鎖が、少なくとも１個のジスルフィド結合により前記第２のポリペプチド鎖に共有結合している、請求項１９〜３３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項３５】
前記少なくとも１個のジスルフィド結合が、前記第１のポリペプチド鎖のリンカー３と前記第２のポリペプチド鎖のリンカー３との間に形成される、請求項３４に記載の二重特異性抗体。
【請求項３６】
前記少なくとも１個のジスルフィド結合が、前記第１のヘテロ二量体促進ドメインと前記第２のヘテロ二量体促進ドメインとの間に形成される、請求項３４又は３５に記載の二重特異性抗体。
【請求項３７】
それぞれのジスルフィド結合が、２個のシステイン残基を連結することによって形成される、請求項３５又は３６に記載の二重特異性抗体。
【請求項３８】
ａ．ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬのＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号９２、１００、１０４、１０６、１１２、１１９、１２５、１２９、１３４、１３６、１３７、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１５０、１５２、１５６、１５８、１６０、１６２、１６６、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、若しくは１７５に示す配列を含み、
ｂ．ＣＤ３  ＶＨのＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ２、及びＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号１、９、若しくは２７３により示される配列を含み、
ｃ．ＣＤ３  ＶＬのＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号７６、８４、９０、２７４、２７５、若しくは２７６により示される配列を含み、並びに／又は
ｄ．ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨのＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ２、及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号１１、１９、２６、３３、４１、４８、５２、５７、６０、６２、６４、６５、６７、６９、７１、若しくは７３により示される配列を含む、請求項１８〜３７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項３９】
ａ．前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ１が、配列番号９３、１０１、１０５、１０７、１１３、１２０、１４８、１５３、１６３、若しくは１６７の配列を含み、前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ２が、配列番号７８、９４、１０２、１０８、１１４、１４１、１４４、１４６、１４９、１５１、１５７、１５９、１６１、１６４、若しくは１６８の配列を含み、前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号９５、１０９、１１５、１２１、１４２、１５４、１６５、若しくは１６９の配列を含み、
ｂ．前記ＣＤＲ３  ＶＨ  ＣＤＲ１が、配列番号２、２６８、若しくは２７７の配列を含み、前記ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ２が、配列番号３、１０、２６９、若しくは２７０の配列を含み、前記ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号４の配列を含み、
ｃ．前記ＣＤＲ３  ＶＬ  ＣＤＲ１が、配列番号７７、８５、９１、２７８、２７９、若しくは２８０の配列を含み、前記ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ２が、配列番号７８若しくは２８１の配列を含み、前記ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号７９の配列を含み、
ｄ．前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ１が、配列番号１２、２０、２７、３４、４２、７４、２５７、２５８、２５９、２６０、若しくは２６１の配列を含み、前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ２が、配列番号１３、２１、２８、３５、４３、５３、６６、６８、７０、７２、７５、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、若しくは２６７の配列を含み、前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号１４、２２、２９、３６、若しくは４４の配列を含む、
請求項３８に記載の二重特異性抗体。
【請求項４０】
ａ．前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ１が、配列番号７４又は３５９の配列を含み、
ｂ．前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ２が、配列番号７５又は２６７の配列を含み、
ｃ．前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号２９の配列を含み、
ｄ．前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ１が、配列番号１４８の配列を含み、
ｅ．前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ２が、配列番号１４９の配列を含み、
ｆ．前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号１４２の配列を含む、
請求項３９に記載の二重特異性抗体。
【請求項４１】
ａ．前記ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ１が、配列番号２又は２６８の配列を含み、
ｂ．前記ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ２が、配列番号１０又は２７０の配列を含み、
ｃ．前記ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号４の配列を含み、
ｄ．前記ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ１が、配列番号９１の配列を含み、
ｅ．前記ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ２が、配列番号７８の配列を含み、
ｆ．前記ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号７９の配列を含む、
請求項３９又は４０に記載の二重特異性抗体。
【請求項４２】
ａ．前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬが、配列番号９２、１００、１０４、１０６、１１２、１１９、１２５、１２９、１３４、１３６、１３７、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１５０、１５２、１５６、１５８、１６０、１６２、１６６、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、若しくは１７５に示す配列を含み、
ｂ．前記ＣＤ３  ＶＨが、配列番号１又は９により示される配列を含み、
ｃ．前記ＣＤ３  ＶＬが、配列番号７６、８４、又は９０により示される配列を含み、
ｄ．前記ＧＵＣＹ２ｃが、配列番号１１、１９、２６、３３、４１、４８、５２、５７、６０、６２、６４、６５、６７、６９、７１、又は７３により示される配列を含む、
請求項１９〜４１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項４３】
ａ．前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ領域が、配列番号７３の配列を含み、
ｂ．前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ領域が、配列番号１４７の配列を含む、
請求項４２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４４】
ａ．前記ＣＤ３  ＶＨ領域が、配列番号９の配列を含み、
ｂ．前記ＣＤ３  ＶＬ領域が、配列番号９０の配列を含む、
請求項４２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４５】
ａ．配列ＲＡＳＥＳＶ−ＸＬ１．３０−ＸＬ１．３０ａ−ＹＧ−ＸＬ１．３０ｄ−ＳＬＬＱを有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ１、
ｂ．配列番号１４９に記載される配列を有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ２、
ｃ．配列番号１４２に記載される配列を有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ３、
ｄ．配列ＧＦＴＦＳ−ＸＨ１．３１−ＸＨ１．３２−ＷＭＨを有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ１、
ｅ．配列ＥＩＫ−ＸＨ２．５２Ａ−ＸＨ２．５３−ＸＨ２．５４−ＸＨ２．５５−ＸＨ２．５６−ＸＨ２．５７−ＮＶＨＥＫＦＫＤを有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ２、及び
ｆ．配列Ｔ−ＸＨ３．９６−ＸＨ３．９７−ＸＨ３．９８−ＸＨ３．９９−ＸＨ３．１００−Ｇ−ＸＨ３．１００Ｂ−ＷＦ−ＸＨ３．１００Ｅ−ＸＨ３．１０１−Ｖを有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ３
を含む、請求項１８〜３７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項４６】
ａ．ＸＬ１．３０が、Ｄ、Ｎ、又はＳであり、
ｂ．ＸＬ１．３０ａが、Ｙ、Ｗ、又はＩであり、
ｃ．ＸＬ１．３０ｄが、Ｔ、Ｓ、又はＨであり、
ｄ．ＸＨ１．３１が、Ｓ、Ｒ、Ｗ、Ｙ、Ａ、Ｈ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｇ、又はＶであり、
ｅ．ＸＨ１．３２が、Ｙ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｋ、Ｐ、Ｉ、Ｎ、Ｍ、Ｖ、又はＳであり、
ｆ．ＸＨ２．５２Ａが、Ｐ、Ｔ、又はＶであり、
ｇ．ＸＨ２．５３が、Ｓ、Ａ、Ｌ、又はＲであり、
ｈ．ＸＨ２．５４が、Ｎ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｔ、又はＩであり、
ｉ．ＸＨ２．５５が、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｙ、Ｇ、Ｌ、Ａ、Ｍ、Ｓ、Ｈ、Ｄ、又はＱであり、
ｊ．ＸＨ２．５６が、Ｌ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｎ、又はＨであり、
ｋ．ＸＨ２．５７が、Ｔ、Ｍ、Ｓ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、又はＶであり、
ｌ．ＸＨ３．９６が、Ｉ、Ｆ、又はＫであり、
ｍ．ＸＨ３．９７が、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、又はＡであり、
ｎ．ＸＨ３．９８が、Ｔ、Ｎ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、又はＩであり、
ｏ．ＸＨ３．９９が、Ｔ、Ｋ、Ｌ、Ｗ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｐ、Ｎ、又はＲであり、
ｐ．ＸＨ３．１００が、Ｅ、Ｇ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｙ、Ｌ、又はＭであり、
ｑ．ＸＨ３．１００Ｂが、Ｙ又はＨであり、
ｒ．ＸＨ３．１００Ｅが、Ｆ又はＬであり、
ｓ．ＸＨ３．１０１が、Ｄ、Ｙ、Ｅ、又はＳである、
請求項４５に記載の抗体。
【請求項４７】
前記抗体が、ＧＵＣＹ２ｃ細胞外ドメインのエピトープに結合し、前記エピトープが、配列番号４０６のアミノ酸残基Ｒ７３、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｔ７６、Ｅ７８、Ｇ７９、Ｌ８０、Ｌ８２、Ｌ８３、Ｒ８４、又はＩ８６から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含む、請求項１８〜３７、４５、又は４６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項４８】
前記エピトープが、配列番号４０６のアミノ酸残基Ｒ７３、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｔ７６、Ｅ７８、Ｇ７９、Ｌ８０、Ｌ８２、Ｌ８３、Ｒ８４、又はＩ８６から選択される少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個のアミノ酸残基を含む、請求項４７に記載の単離ヒトモノクローナル抗体。
【請求項４９】
前記エピトープが、配列番号４０６のアミノ酸残基Ｒ７３、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｔ７６、Ｅ７８、Ｇ７９、Ｌ８０、Ｌ８２、Ｌ８３、Ｒ８４、又はＩ８６を含む、請求項４７に記載の単離ヒトモノクローナル抗体。
【請求項５０】
前記エピトープが、配列番号４０６により記載される配列を有するアミノ酸を含む、請求項４７に記載の単離ヒトモノクローナル抗体。
【請求項５１】
前記エピトープが機能性エピトープである、請求項４７に記載の単離ヒトモノクローナル抗体。
【請求項５２】
前記単離ヒトモノクローナル抗体と前記ＧＵＣＹ２ｃエピトープアミノ酸の接触が、結晶学により決定して３．８オングストローム内のものである、請求項４７に記載の単離ヒトモノクローナル抗体。
【請求項５３】
ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合し、請求項１８〜５２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と結合を競合する、二重特異性抗体。
【請求項５４】
ＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３に特異的に結合し、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体であって、
ａ．前記第１のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、以下の順番で以下の領域：
ＧＵＣＹ２ｃ抗体のＶＬ（ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ）（配列番号１４７）−リンカー１（配列番号１９０）−ＣＤ３抗体のＶＨ（ＣＤ３  ＶＨ）（配列番号９）−リンカー３（配列番号１９２）−第１のヘテロ二量体促進ドメイン（配列番号１８８）を含み、
ｂ．前記第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、以下の順番で以下の領域：
ＣＤ３抗体のＶＬ（ＣＤ３  ＶＬ）（配列番号９０）−リンカー２（配列番号１９１）−ＧＵＣＹ２ｃ抗体のＶＨ（ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ）（配列番号７３）−リンカー３（配列番号１９２）−第２のヘテロ二量体促進ドメイン（配列番号１８９）を含む、
前記二重特異性抗体。
【請求項５５】
前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及び前記ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨが、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合するドメインを形成し、前記ＣＤ３  ＶＬ及び前記ＣＤ３  ＶＨが、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを形成し、前記第１のポリペプチド鎖のリンカー３及び前記第２のポリペプチド鎖のリンカー３が、２個のジスルフィド結合により互いに共有結合しており、前記第１のヘテロ二量体促進ドメイン及び前記第２のヘテロ二量体促進ドメインが、それぞれ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、前記第１のヘテロ二量体促進ドメインの前記ＣＨ３ドメインが、ノブを形成し、前記第２のヘテロ二量体促進ドメインの前記ＣＨ３ドメインが、ホールを形成し、少なくとも１個のジスルフィド結合が、前記第１のヘテロ二量体促進ドメインの前記ＣＨ３ドメインと前記第２のヘテロ二量体促進ドメインの前記ＣＨ３ドメインとの間に形成される、請求項５４に記載の二重特異性抗体。
【請求項５６】
ヒト又はヒト化ＶＨフレームワーク、及びヒト又はヒト化ＶＬフレームワークをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１８〜５５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５７】
前記抗体又は前記二重特異性抗体がヒト化抗体である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１８〜５５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５８】
前記ＶＨフレームワークが、配列番号５、６、７、８、１５、１６、１７、１８、２３、２４、２５、３０、３１、３２、３７、３８、３９、４０、４５、４６、４７、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５８、５９、６１、若しくは６３の配列を含み、及び／又は前記ＶＬフレームワークが、配列番号８０、８１、８２、８３、８６、８７、８８、８９、９６、９７、９８、９９、１０３、１１０、１１１、１１６、１１７、１１８、１２２、１２３、１２４、１２６、１２７、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３９、若しくは１５５の配列を含む、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５９】
ＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３に特異的に結合し、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、前記第１のポリペプチド鎖が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２４９４４の発現ベクターにより産生され、前記第２のポリペプチド鎖が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２４９４３の発現ベクターにより産生される、二重特異性抗体。
【請求項６０】
第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、前記第１のポリペプチド鎖が、配列番号２１６の配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖が、配列番号２２０の配列を含む、ＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３に特異的に結合することができる二重特異性抗体。
【請求項６１】
前記第１及び第２のポリペプチド鎖が、少なくとも１個のジスルフィド結合により互いに共有結合している、請求項１９から６０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６２】
前記抗体又は二重特異性抗体が、
ａ．ヒトＧＵＣＹ２ｃの細胞外ドメインに結合する、
ｂ．３０分〜１００日の延長された血清及び腫瘍半減期を実証する、及び／又は
ｃ．増加したＧＵＣＹ２ｃ発現レベル又は増加した受容体密度レベルの存在下で０．０００１ｎＭ〜１００ｎＭの低いＥＣ５０値を実証する、
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１８から６１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６３】
治療有効量の請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１８から６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項６４】
ＧＵＣＹ２ｃ関連障害の処置を必要とする患者においてＧＵＣＹ２ｃ関連障害を処置する方法であって、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体、請求項１８から６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、又は請求項６３に記載の医薬組成物を前記患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項６５】
前記ＧＵＣＹ２ｃ関連障害が、がんである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記がんが、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、虫垂、胆管、及び膵臓からなる群から選択される消化器系のがんである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ＧＵＣＹ２ｃ関連障害の処置を必要とする患者においてＧＵＣＹ２ｃ関連障害を処置する方法であって、請求項１８から６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、又は請求項６３に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含み、細胞障害性Ｔ細胞溶解性反応が活性化される、方法。
【請求項６８】
治療での使用のための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体、請求項１８から６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、又は請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
治療での使用のための医薬の製造における、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１８から６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７０】
前記治療が、ＧＵＣＹ２ｃ関連障害の処置を含む、請求項６９に記載の抗体又は二重特異性抗体。
【請求項７１】
前記ＧＵＣＹ２ｃ関連障害が、がんである、請求項７０に記載の抗体又は二重特異性抗体。
【請求項７２】
前記がんが、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、虫垂、胆管、及び膵臓からなる群から選択される消化器系のがんである、請求項７１に記載の抗体又は二重特異性抗体。
【請求項７３】
前記治療が、細胞溶解性Ｔ細胞反応を活性化する、請求項６８から７２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７４】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１８から６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項７５】
請求項７４に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項７６】
請求項７５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項７７】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１８から６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を組換え的に産生する、請求項７６に記載の宿主細胞。
【請求項７８】
前記宿主細胞が、細菌細胞株、哺乳類細胞株、昆虫細胞株、及び酵母細胞株からなる群から選択される、請求項７６又は７７に記載の宿主細胞。
【請求項７９】
前記哺乳類細胞株がＣＨＯ細胞株である、請求項７８に記載の宿主細胞。
【請求項８０】
抗体又は二重特異性抗体を産生する方法であって、請求項７６から７９のいずれか一項に記載の宿主細胞を、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１８から６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を産生する結果を生じる条件下で培養する工程と、前記抗体又は前記二重特異性抗体を前記培養上清から精製する工程とを含む、方法。
【請求項８１】
ＧＵＣＹ２ｃ関連障害を処置する医薬の製造における、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体、請求項１８から６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項６３に記載の医薬組成物、請求項７４に記載のポリヌクレオチド、請求項７５に記載のベクター、又は請求項７６から７９のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用。
【請求項８２】
ＧＵＣＹ２ｃ関連障害の処置に使用される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体、請求項１８から６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、又は請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項８３】
前記ＧＵＣＹ２ｃ関連障害が、がんであり、任意選択で、前記がんが、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、虫垂、胆管、及び膵臓からなる群から選択される消化器系のがんである、請求項８２に記載の使用のための抗体、二重特異性抗体、又は医薬組成物。
【請求項８４】
前記処置が細胞溶解性Ｔ細胞反応を活性化する、請求項８２又は８３に記載の使用のための抗体、二重特異性抗体、又は医薬組成物。
【請求項８５】
ＧＵＣＹ２ｃ関連障害の処置に使用される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体、請求項１８から６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項６３に記載の医薬組成物、請求項７４に記載のポリヌクレオチド、請求項７５に記載のベクター、又は請求項７６から７９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項８６】
請求項１８〜６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と第２の治療剤とを含む、組成物。
【請求項８７】
対象においてがんを処置する方法であって、請求項８６に記載の組成物を含む併用療法を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項８８】
請求項１８から６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と止痢剤とを含む、組成物。
【請求項８９】
対象においてがんを処置する方法であって、請求項８８に記載の組成物を含む併用療法を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項９０】
ＧＵＣＹ２ｃ関連障害を処置する医薬の製造における、請求項８６又は８８に記載の組成物の使用。
【請求項９１】
ＧＵＣＹ２ｃ関連障害の処置に使用される、請求項８６又は８８に記載の組成物。
【請求項９２】
前記ＧＵＣＹ２ｃ関連障害が、がんであり、任意選択で、前記がんが、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、虫垂、胆管、及び膵臓からなる群から選択される消化器系のがんである、請求項９０又は９１に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
この出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に出願されており、．ｔｘｔフォーマットの電子的に提出された配列表を含む。この．ｔｘｔファイルは、２０１９年５月１４日に作成されてサイズが７３８ＫＢである「ＰＣ７２３７７−ＰＲＶ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５＿０５１４２０１９．ｔｘｔ」というタイトルの配列表を含む。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の分野
本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ（グアニリルシクラーゼＣ）及び／又はＣＤ３（分化抗原群（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）３）に特異的に結合する抗体、例えば、完全長抗体又はその抗原結合フラグメントに関連する。本発明は、ＣＤ３及び腫瘍細胞抗原に特異的に結合する二重特異性抗体（例えば、ＣＤ３及びＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合する二重特異性抗体）にさらに関する。本発明は、関連分子、例えばそのような抗体又は二重特異性抗体をコードする核酸、組成物、及び関連方法、例えば、そのような抗体及び二重特異性抗体を産生及び精製する方法、並びに診断薬及び治療薬におけるこれらの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、世界中で第１位の死因であり、毎年７百万件を超える死亡がある。がんの死亡率は、原発性腫瘍が遠位部位へ拡散して転移を形成し、最終的に死をもたらすことに、ほぼ普遍的に関連している。これは、食道、胃、結腸、及び直腸の腺癌を含む胃腸がんに特に当てはまる。結腸直腸がん（ＣＲＣ）は、依然として４番目に多く診断されるがんであり、米国においてがんの死亡原因の第２位である（Ｓｉｅｇｅｌ  ＲＬ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＫＤ，Ｊｅｍａｌ  Ａ．Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１６．ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．，６６：７−３０，２０１６）。世界中で、結腸直腸がんでは、１年当たり１２０万件の新たな症例があり、６００，０００人の死亡者がいる（Ｂｒｅｎｎｅｒ  Ｈ，Ｋｌｏｏｒ  Ｍ，Ｐｏｘ  ＣＰ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｌａｎｃｅｔ，３８３：１４９０−５０２，２０１４）。
【０００３】
グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２ｃ）（ＳＴＡＲ、ＳＴ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＵＣ２Ｃ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＧＣ−Ｃ、及びＧＣＣとしても公知である）は、腸液、電解質恒常性、及び細胞繁殖の維持に機能する膜貫通細胞表面受容体である（Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：３０１８−３０２０，２００３；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３９：４６３−４６６，１９９７；Ｐｉｔａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：２６９５−２６９９，２００３）；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−００４９６３及びＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＮＰ−００４９５４）。この機能は、グアニリン（Ｗｉｅｇａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３１１：１５０−１５４，１９９２）及びウログアニリン（Ｈａｍｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９（２２）：１０４６４−１０４６８，１９９３）の結合を介して媒介される。ＧＵＣＹ２ｃは、大腸菌、並びに他の感染性生物により産生されるペプチドである熱安定性腸内毒素（ＳＴ）のための受容体でもある（Ｒａｏ，Ｍ．Ｃ．Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．１１２：７４−９３，１９８５；Ｋｎｏｏｐ  Ｆ．Ｃ．ａｎｄ  Ｏｗｅｎｓ，Ｍ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８：６７−７２，１９９２）。ＧＵＣＹ２ｃへのＳＴの結合は、シグナルカスケードを活性化し、結果として腸疾患、例えば下痢を生じる。
【０００４】
ＧＵＣＹ２ｃは、結腸直腸がん、膵がん、胃がん、肝がん、及び食道がんを含むがんに関与するタンパク質であることが特徴づけられている（Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ３９：１７１−１８１，１９９６；Ｂｕｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４１：１６１８−１６２７，２００５；Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０７：１６５３−１６６１，１９９４；Ｕｒｂａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２４５：２９−３６，１９９５）。
【０００５】
細胞表面タンパク質として、ＧＵＣＹ２ｃは、抗体又はリガンドなどの受容体結合タンパク質の治療用標的の機能を果たすことができる。ＧＵＣＹ２ｃは、小腸、大腸、及び直腸の粘膜を裏打ちする上皮細胞の頂端側に発現する（Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ３９：１７１−１８１，１９９６）。ＧＵＣＹ２ｃ発現は、腸内上皮細胞の新生物トランスフォーメーションによって維持され、全ての原発性及び転移性結腸直腸腫瘍に発現している（Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｂｕｃ  ｅｔ  ａｌ．；Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。ＧＵＣＹ２ｃ発現は食道細胞においても検出されており、バレット食道、食道がん、及び胃がんと診断されている。
【０００６】
転移結腸直腸がん細胞を特異的に標的すること、及び特異的に結合することができる、分子及び／又は組成物の必要性が依然として存在する。結腸直腸がんを患っていると疑われる個体、とりわけ結腸直腸がん細胞の転移を患っていると疑われる個体を処置する改善された方法の必要性が存在する。
【０００７】
腫瘍細胞の死滅を媒介するＴ細胞の動員が可能な二重特異性抗体を生じるために、様々な戦略が開発されてきた。そのような二重特異性抗体は、腫瘍細胞とヒト免疫系のエフェクター細胞（ＮＫ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、又は顆粒球）との間に架橋を作製することができ、したがって、腫瘍細胞の特異的死滅を可能にする。そのような二重特異性抗体は、治療用途にとって、例えば、腫瘍の処置についての治療思想にとって好ましいことが証明されているが、極めて強力で特異的な方法によりＧＵＣＹ２ｃ陽性腫瘍細胞を標的にする二重特異性抗体の必要性が、依然として存在する。そのような分子は、ＧＩ悪性腫瘍、がんの処置、及び細胞におけるＧＵＣＹ２ｃの検出において治療剤として有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、二重特異性抗体を含む抗体を提供し、これらの抗体はＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合する。本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３に結合することができる二重特異性抗体をさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一側面において、本発明は、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２ｃ）に特異的に結合する抗体を提供し、この抗体は、（ａ）配列番号１１、１９、２６、３３、４１、４８、５２、５７、６０、６２、６４、６５、６７、６９、７１、若しくは７３に示す、重鎖可変（ＶＨ）配列のＶＨ相補性決定領域１（ＶＨ  ＣＤＲ１）、ＶＨ相補性決定領域２（ＶＨ  ＣＤＲ２）及びＶＨ相補性決定領域３（ＶＨ  ＣＤＲ３）を含むＶＨ領域、並びに／又は（ｂ）配列番号９２、１００、１０４、１０６、１１２、１１９、１２５、１２９、１３４、１３６、１３７、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１５０、１５２、１５６、１５８、１６０、１６２、１６６、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、若しくは１７５に示す、軽鎖可変（ＶＬ）配列のＶＬ相補性決定領域１（ＶＬ  ＣＤＲ１）、ＶＬ相補性決定領域２（ＶＬ  ＣＤＲ２）及びＶＬ相補性決定領域３（ＶＬ  ＣＤＲ３）を含むＶＬ領域を含む。
【００１０】
一態様において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合する抗体を提供し、この抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１２、２０、２７、３４、４２、７４、２５７、２５８、２５９、２６０、若しくは２６１の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号１３、２１、２８、３５、４３、５３、６６、６８、７０、７２、７５、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、若しくは２６７の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４、２２、２９、３６、若しくは４４の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、並びに／又は（ｂ）（ｉ）配列番号９３、１０１、１０５、１０７、１１３、１２０、１４８、１５３、１６３、若しくは１６７の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号７８、９４、１０２、１０８、１１４、１４１、１４４、１４６、１４９、１５１、１５７、１５９、１６１、１６４、若しくは１６８の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９５、１０９、１１５、１２１、１４２、１５４、１６５、若しくは１６９の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
【００１１】
一態様において、本発明は、（ａ）ＶＨ領域が、（ｉ）配列番号７４の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号７５の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２９の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含み、並びに／又は（ｂ）ＶＬ領域が、（ｉ）配列番号１４８の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号１４９の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４２の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、抗体を提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、（ａ）ＶＨ領域が、配列番号１１、１９、２６、３３、４１、４８、５２、５７、６０、６２、６４、６５、６７、６９、７１、若しくは７３を含む、及び／又は（ｂ）ＶＬ領域が、配列番号９２、１００、１０４、１０６、１１２、１１９、１２５、１２９、１３４、１３６、１３７、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１５０、１５２、１５６、１５８、１６０、１６２、１６６、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、若しくは１７５を含む、抗体を提供する。
【００１３】
なお別の態様において、本発明は、ＶＨ領域が配列番号７３の配列を含み、ＶＬ領域が配列番号１４７の配列を含む、抗体を提供する。
一態様において、本発明は、ＶＨ領域が、配列番号７３の配列、又はＶＨ領域内にない残基に１個又は数個の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、及び／或いはＶＬ領域が、配列番号１４７の配列、又はＶＬ領域内にないアミノ酸に１個又は数個の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、抗体を提供する。
【００１４】
一態様において、本発明は、配列ＲＡＳＥＳＶ−ＸＬ１．３０−ＸＬ１．３０ａ−ＹＧ−ＸＬ１．３０ｄ−ＳＬＬＱを有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１４９に記載される配列を有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ２、配列番号１４２に記載される配列を有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ３、配列ＧＦＴＦＳ−ＸＨ１．３１−ＸＨ１．３２−ＷＭＨを有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ１、配列ＥＩＫ−ＸＨ２．５２Ａ−ＸＨ２．５３−ＸＨ２．５４−ＸＨ２．５５−ＸＨ２．５６−ＸＨ２．５７−ＮＶＨＥＫＦＫＤを有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列Ｔ−ＸＨ３．９６−ＸＨ３．９７−ＸＨ３．９８−ＸＨ３．９９−ＸＨ３．１００−Ｇ−ＸＨ３．１００Ｂ−ＷＦ−ＸＨ３．１００Ｅ−ＸＨ３．１０１−Ｖを有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ３を含むＧＵＣＹ２ｃに結合する抗体を提供し、ここで、ＸＬ１．３０、ＸＬ１．３０ａ、ＸＬ１．３０ｄ、ＸＨ１．３１、ＸＨ１．３２、ＸＨ２．５２Ａ、ＸＨ２．５３、ＸＨ２．５４、ＸＨ２．５５、ＸＨ２．５６、ＸＨ２．５７、ＸＨ３．９６、ＸＨ３．９７、ＸＨ３．９８、ＸＨ３．９９、ＸＨ３．１００、ＸＨ３．１００Ｂ、ＸＨ３．１００Ｅ、及びＸＨ３．１０１のそれぞれは、独立して、表４２Ａ及び４２Ｂの第４及び５列のアミノ酸残基である。
【００１５】
一側面において、ＸＬ１．３０は、Ｄ、Ｎ、又はＳであり、ＸＬ１．３０ａは、Ｙ、Ｗ、又はＩであり、ＸＬ１．３０ｄは、Ｔ、Ｓ、又はＨであり、ＸＨ１．３１は、Ｓ、Ｒ、Ｗ、Ｙ、Ａ、Ｈ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｇ、又はＶであり、ＸＨ１．３２は、Ｙ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｋ、Ｐ、Ｉ、Ｎ、Ｍ、Ｖ、又はＳであり、ＸＨ２．５２Ａは、Ｐ、Ｔ、又はＶであり、ＸＨ２．５３は、Ｓ、Ａ、Ｌ、又はＲであり、ＸＨ２．５４は、Ｎ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｔ、又はＩであり、ＸＨ２．５５は、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｙ、Ｇ、Ｌ、Ａ、Ｍ、Ｓ、Ｈ、Ｄ、又はＱであり、ＸＨ２．５６は、Ｌ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｎ、又はＨであり、ＸＨ２．５７は、Ｔ、Ｍ、Ｓ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、又はＶであり、ＸＨ３．９６は、Ｉ、Ｆ、又はＫであり、ＸＨ３．９７は、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、又はＡであり、ＸＨ３．９８は、Ｔ、Ｎ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、又はＩであり、ＸＨ３．９９は、Ｔ、Ｋ、Ｌ、Ｗ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｐ、Ｎ、又はＲであり、ＸＨ３．１００は、Ｅ、Ｇ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｙ、Ｌ、又はＭであり、ＸＨ３．１００Ｂは、Ｙ又はＨであり、ＸＨ３．１００Ｅは、Ｆ又はＬであり、ＸＨ３．１０１は、Ｄ、Ｙ、Ｅ、又はＳである。
【００１６】
一態様において、本発明は抗体を提供し、この抗体は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）フラグメント、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント、モノクローナル抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体、二重特異性ヘテロ二量体二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、二重特異性ヘテロ二量体ＩｇＧ、ポリクローナル抗体、標識抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及びそれらのフラグメントからなる群から選択される。
【００１７】
別の態様において、本発明の抗体は、ヒト又はヒト化ＶＨフレームワーク、及びヒト又はヒト化ＶＬフレームワークをさらに含む。一部の態様において、ＶＨフレームワークは、配列番号５、６、７、８、１５、１６、１７、１８、２３、２４、２５、３０、３１、３２、３７、３８、３９、４０、４５、４６、４７、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５８、５９、６１、又は６３の配列を含む、及び／又はＶＬフレームワークは、配列番号８０、８１、８２、８３、８６、８７、８８、８９、９６、９７、９８、９９、１０３、１１０、１１１、１１６、１１７、１１８、１２２、１２３、１２４、１２６、１２７、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３９、又は１５５の配列を含む。
【００１８】
別の態様において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ細胞外ドメインのエピトープに結合する単離ヒトモノクローナル抗体を提供し、このエピトープは、配列番号４０６のアミノ酸残基Ｒ７３、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｔ７６、Ｅ７８、Ｇ７９、Ｌ８０、Ｌ８２、Ｌ８３、Ｒ８４、又はＩ８６から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含む。
【００１９】
一側面において、エピトープは、配列番号４０６のアミノ酸残基Ｒ７３、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｔ７６、Ｅ７８、Ｇ７９、Ｌ８０、Ｌ８２、Ｌ８３、Ｒ８４、又はＩ８６から選択される少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個のアミノ酸残基を含む。別の側面において、エピトープは、配列番号４０６のアミノ酸残基Ｒ７３、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｔ７６、Ｅ７８、Ｇ７９、Ｌ８０、Ｌ８２、Ｌ８３、Ｒ８４、又はＩ８６を含む。さらなる側面において、エピトープは、配列番号４０６に記載される配列を有するアミノ酸を含む。さらなる側面において、エピトープは機能性エピトープである。
【００２０】
別の側面において、単離ヒト抗体とＧＵＣＹ２ｃエピトープアミノ酸の接触は、結晶学により決定して３．８オングストローム内のものである。本明細書に使用されるとき、「３．８オングストローム内」とは、接触が３．８オングストローム以下であることを意味する。
【００２１】
一側面において、本発明の抗体は二重特異性抗体である。別の側面において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体を提供し、この二重特異性抗体は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む。
【００２２】
一態様において、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＧＵＣＹ２ｃ抗体のＶＬ（ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ）及びＣＤ３抗体のＶＨ（ＣＤ３  ＶＨ）を含む、ドメイン１と、（ｉｉ）第１のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＣＤ３抗体のＶＬ（ＣＤ３  ＶＬ）及びＧＵＣＹ２ｃ抗体のＶＨ（ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ）を含む、ドメイン２と、（ｉｉ）第２のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨは、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合するドメインを形成し、ＣＤ３  ＶＬ及びＣＤ３  ＶＨは、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを形成する。
【００２３】
別の態様において、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＣＤ３  ＶＬ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨを含む、ドメイン１と、（ｉｉ）第１のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及びＣＤ３  ＶＨを含む、ドメイン２と、（ｉｉ）第２のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨは、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合するドメインを形成し、ＣＤ３  ＶＬ及びＣＤ３  ＶＨは、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを形成する。
【００２４】
別の態様において、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ及びＣＤ３  ＶＬを含む、ドメイン１と、（ｉｉ）第１のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＣＤ３  ＶＨ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬを含む、ドメイン２と、（ｉｉ）第２のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬは、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合するドメインを形成し、ＣＤ３  ＶＨ及びＣＤ３  ＶＬは、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを形成する。
【００２５】
さらなる態様において、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＣＤ３  ＶＨ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬを含む、ドメイン１と、（ｉｉ）第１のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ及びＣＤ３  ＶＬを含む、ドメイン２と、（ｉｉ）第２のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨは、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合するドメインを形成し、ＣＤ３  ＶＬ及びＣＤ３  ＶＨは、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを形成する。
【００２６】
前述のそれぞれの一部の態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメイン及び第２のヘテロ二量体促進ドメインは、それぞれＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインのそれぞれのアミノ酸配列は、ヘテロ二量体化を駆動するため、及び／又は二重特異性抗体を安定化するために修飾される。
【００２７】
一部のそのような態様において、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、少なくとも１個のアミノ酸修飾を含み、（ａ）第１のヘテロ二量体促進ドメインのＣＨ３ドメインはノブ（ｋｎｏｂ）を形成し、（ｂ）第２のヘテロ二量体促進ドメインのＣＨ３ドメインはホール（ｈｏｌｅ）を形成する。
【００２８】
別のそのような態様では、第１のヘテロ二量体促進ドメインのＣＨ３ドメインは、変異Ｙ３４９Ｃ及び／又はＴ３６６Ｗを含み、第２のヘテロ二量体促進ドメインのＣＨ３ドメインは、変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及び／又はＹ４０７Ｖを含む（ＥＵインデックスに従うナンバリング）。
【００２９】
前述のそれぞれの特定の態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１８８の配列を含み、第２のヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１８９の配列を含む。
【００３０】
追加の態様において、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及びＣＤ３  ＶＨは、グリシン−セリンリンカーにより連結しており、ＣＤ３  ＶＬ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨは、グリシン−セリンリンカーにより連結している。一部のそのような態様において、グリシン−セリンリンカーは、配列番号１９０の配列を含むリンカー１である。他の態様において、グリシン−セリンリンカーは、配列番号１９１の配列を含むリンカー２である。
【００３１】
前述のそれぞれのさらなる態様において、ドメイン１は、システインリンカーを介して第１のヘテロ二量体促進ドメインに共有結合しており、ドメイン２は、システインリンカーを介して第２のヘテロ二量体促進ドメインに共有結合しており、システインリンカーは、少なくとも５個のアミノ酸を含む。一部のそのような態様において、システインリンカーは、配列番号１９２の配列を含むリンカー３である。
【００３２】
一部の態様において、第１のポリペプチド鎖は、少なくとも１個のジスルフィド結合により第２のポリペプチド鎖に共有結合している。一部のそのような態様では、少なくとも１個のジスルフィド結合が、第１のポリペプチド鎖のリンカー３と第２のポリペプチド鎖のリンカー３との間に形成される。別のそのような態様では、少なくとも１個のジスルフィド結合が、第１のヘテロ二量体促進ドメインと第２のヘテロ二量体促進ドメインとの間に形成される。特定の態様において、それぞれのジスルフィド結合は、２個のシステイン残基を連結することによって形成される。
【００３３】
前述のいずれかのさらなる態様において、本発明の二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１２、２０、２７、３４、４２、７４、２５７、２５８、２５９、２６０、又は２６１の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１３、２１、２８、３５、４３、５３、６６、６８、７０、７２、７５、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、又は２６７の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１４、２２、２９、３６、又は４４の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号９３、１０１、１０５、１０７、１１３、１２０、１４８、１５３、１６３、又は１６７の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７８、９４、１０２、１０８、１１４、１４１、１４４、１４６、１４９、１５１、１５７、１５９、１６１、１６４、又は１６８の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号９５、１０９、１１５、１２１、１４２、１５４、１６５、又は１６９の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【００３４】
特定の態様において、本発明の二重特異性抗体は、（ａ）配列番号７４又は２５９の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号７５又は２６７の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２９の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号１４８の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１４９の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号１４２の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【００３５】
特定の態様において、二重特異性抗体は、（ａ）配列番号７３の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ領域、及び（ｂ）配列番号１４７に示す配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ領域を含む。
【００３６】
追加の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２、２６８、又は２７７の配列を含むＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号３、１０、２６９、又は２７０の配列を含むＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４の配列を含むＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号７７、８５、９１、２７８、２７９、又は２８０の配列を含むＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７８又は２８１を含むＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号７９の配列を含むＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ３を含む二重特異性抗体を提供する。
【００３７】
特定の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２又は２６８の配列を含むＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１０又は２７０の配列を含むＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４の配列を含むＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号９１の配列を含むＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７８の配列を含むＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号７９の配列を含むＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ３を含む二重特異性抗体を提供する。
【００３８】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１、９、又は２７３の配列を含むＣＤ３  ＶＨ領域、及び（ｂ）配列番号７６、８４、９０、２７４、２７５、又は２７６の配列を含むＣＤ３  ＶＬ領域を含む二重特異性抗体を提供する。特定の態様において、本発明の二重特異性抗体は、（ａ）配列番号９の配列を含むＣＤ３  ＶＨ領域、及び（ｂ）配列番号９０の配列を含むＣＤ３  ＶＬ領域を含む。
【００３９】
一態様において、本発明は、配列ＲＡＳＥＳＶ−ＸＬ１．３０−ＸＬ１．３０ａ−ＹＧ−ＸＬ１．３０ｄ−ＳＬＬＱを有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１４９に記載される配列を有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ２、配列番号１４２に記載される配列を有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ３、配列ＧＦＴＦＳ−ＸＨ１．３１−ＸＨ１．３２−ＷＭＨを有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ１、配列ＥＩＫ−ＸＨ２．５２Ａ−ＸＨ２．５３−ＸＨ２．５４−ＸＨ２．５５−ＸＨ２．５６−ＸＨ２．５７−ＮＶＨＥＫＦＫＤを有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列Ｔ−ＸＨ３．９６−ＸＨ３．９７−ＸＨ３．９８−ＸＨ３．９９−ＸＨ３．１００−Ｇ−ＸＨ３．１００Ｂ−ＷＦ−ＸＨ３．１００Ｅ−ＸＨ３．１０１−Ｖを有するアミノ酸を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ３を含む二重特異性抗体を提供し、ここで、ＸＬ１．３０、ＸＬ１．３０ａ、ＸＬ１．３０ｄ、ＸＨ１．３１、ＸＨ１．３２、ＸＨ２．５２Ａ、ＸＨ２．５３、ＸＨ２．５４、ＸＨ２．５５、ＸＨ２．５６、ＸＨ２．５７、ＸＨ３．９６、ＸＨ３．９７、ＸＨ３．９８、ＸＨ３．９９、ＸＨ３．１００、ＸＨ３．１００Ｂ、ＸＨ３．１００Ｅ、及びＸＨ３．１０１のそれぞれは、独立して、表４２Ａ及び４２Ｂの第４及び５列のアミノ酸残基である。
【００４０】
一側面において、ＸＬ１．３０は、Ｄ、Ｎ、又はＳであり、ＸＬ１．３０ａは、Ｙ、Ｗ、又はＩであり、ＸＬ１．３０ｄは、Ｔ、Ｓ、又はＨであり、ＸＨ１．３１は、Ｓ、Ｒ、Ｗ、Ｙ、Ａ、Ｈ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｇ、又はＶであり、ＸＨ１．３２は、Ｙ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、Ｋ、Ｐ、Ｉ、Ｎ、Ｍ、Ｖ、又はＳであり、ＸＨ２．５２Ａは、Ｐ、Ｔ、又はＶであり、ＸＨ２．５３は、Ｓ、Ａ、Ｌ、又はＲであり、ＸＨ２．５４は、Ｎ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｔ、又はＩであり、ＸＨ２．５５は、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｙ、Ｇ、Ｌ、Ａ、Ｍ、Ｓ、Ｈ、Ｄ、又はＱであり、ＸＨ２．５６は、Ｌ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｎ、又はＨであり、ＸＨ２．５７は、Ｔ、Ｍ、Ｓ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、又はＶであり、ＸＨ３．９６は、Ｉ、Ｆ、又はＫであり、ＸＨ３．９７は、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、又はＡであり、ＸＨ３．９８は、Ｔ、Ｎ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、又はＩであり、ＸＨ３．９９は、Ｔ、Ｋ、Ｌ、Ｗ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｐ、Ｎ、又はＲであり、ＸＨ３．１００は、Ｅ、Ｇ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｙ、Ｌ、又はＭであり、ＸＨ３．１００Ｂは、Ｙ又はＨであり、ＸＨ３．１００Ｅは、Ｆ又はＬであり、ＸＨ３．１０１は、Ｄ、Ｙ、Ｅ、又はＳである。
【００４１】
別の態様において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ細胞外ドメインのエピトープに結合する二重特異性抗体を提供し、このエピトープは、配列番号４０６のアミノ酸残基Ｒ７３、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｔ７６、Ｅ７８、Ｇ７９、Ｌ８０、Ｌ８２、Ｌ８３、Ｒ８４、又はＩ８６から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含む。
【００４２】
一側面において、エピトープは、配列番号４０６のアミノ酸残基Ｒ７３、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｔ７６、Ｅ７８、Ｇ７９、Ｌ８０、Ｌ８２、Ｌ８３、Ｒ８４、又はＩ８６から選択される少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個のアミノ酸残基を含む。別の側面において、エピトープは、配列番号４０６のアミノ酸残基Ｒ７３、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｔ７６、Ｅ７８、Ｇ７９、Ｌ８０、Ｌ８２、Ｌ８３、Ｒ８４、又はＩ８６を含む。さらなる側面において、エピトープは、配列番号４０６に記載される配列を有するアミノ酸を含む。さらなる側面において、エピトープは機能性エピトープである。
【００４３】
別の側面において、単離ヒト抗体とＧＵＣＹ２ｃエピトープアミノ酸の接触は、結晶学により決定して３．８オングストローム内のものである。
一側面において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合し、本明細書に開示されている二重特異性抗体と結合を競合する二重特異性抗体を提供する。
【００４４】
一側面において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体を提供し、この二重特異性抗体は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、以下の順番で以下の領域：ＧＵＣＹ２ｃ抗体のＶＬ（ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ）（配列番号１４７）−リンカー１（配列番号１９０）−ＣＤ３抗体のＶＨ（ＣＤ３  ＶＨ）（配列番号９）−リンカー３（配列番号１９２）−第１のヘテロ二量体促進ドメイン（配列番号１８８）を含み、（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、以下の順番で以下の領域：ＣＤ３抗体のＶＬ（ＣＤ３  ＶＬ）（配列番号９０）−リンカー２（配列番号１９１）−ＧＵＣＹ２ｃ抗体のＶＨ（ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ）（配列番号７３）−リンカー３（配列番号１９２）−第２のヘテロ二量体促進ドメイン（配列番号１８９）を含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨは、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合するドメインを形成し、ＣＤ３  ＶＬ及びＣＤ３  ＶＨは、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを形成し、第１のポリペプチド鎖のリンカー３及び第２のポリペプチド鎖のリンカー３は、２個のジスルフィド結合により互いに共有結合しており、第１のヘテロ二量体促進ドメイン及び第２のヘテロ二量体促進ドメインは、それぞれＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、第１のヘテロ二量体促進ドメインのＣＨ３ドメインは、ノブを形成し、第２のヘテロ二量体促進ドメインのＣＨ３ドメインは、ホールを形成し、少なくとも１個のジスルフィド結合が、第１のヘテロ二量体促進ドメインのＣＨ３ドメインと第２のヘテロ二量体促進ドメインのＣＨ３ドメインとの間に形成される。
【００４５】
一部の態様において、本発明は、ヒト又はヒト化ＶＨフレームワーク、及びヒト又はヒト化ＶＬフレームワークをさらに含む二重特異性抗体を提供する。一部のそのような態様において、二重特異性抗体はヒト化抗体である。特定の態様において、ＶＨフレームワークは、配列番号５、６、７、８、１５、１６、１７、１８、２３、２４、２５、３０、３１、３２、３７、３８、３９、４０、４５、４６、４７、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５８、５９、６１、又は６３の配列を含む、及び／又はＶＬフレームワークは、配列番号８０、８１、８２、８３、８６、８７、８８、８９、９６、９７、９８、９９、１０３、１１０、１１１、１１６、１１７、１１８、１２２、１２３、１２４、１２６、１２７、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３９、又は１５５の配列を含む。
【００４６】
一側面において、本発明の二重特異性抗体は、ＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３に特異的に結合し、この二重特異性抗体は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２４９４４の発現ベクターにより産生され、第２のポリペプチド鎖は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２４９４３の発現ベクターにより産生される。
【００４７】
特定の態様において、本発明の抗体又は二重特異性抗体は、（ａ）ヒトＧＵＣＹ２ｃの細胞外ドメインに結合する、（ｂ）３０分〜１００日の延長された血清及び腫瘍半減期を実証する、並びに／又は（ｃ）増加したＧＵＣＹ２ｃ発現レベル若しくは増加した受容体密度レベルの存在下で０．０００１ｎＭ〜１００ｎＭの低いＥＣ５０値を実証する。
【００４８】
本発明は、治療有効量の本明細書に開示されている抗体又は二重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物をさらに提供する。
別の側面において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ関連障害の処置を必要とする患者においてＧＵＣＹ２ｃ関連障害を処置する方法であって、本発明のＧＵＣＹ２ｃ抗体を患者に投与することを含む方法を提供する。本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ関連障害の処置を必要とする患者においてＧＵＣＹ２ｃ関連障害を処置する方法であって、本発明の二重特異性抗体を患者に投与することを含む方法も提供する。本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ関連障害の処置を必要とする患者においてＧＵＣＹ２ｃ関連障害を処置する方法であって、本明細書に開示されているＧＵＣＹ２ｃ抗体又は二重特異性抗体を含む医薬組成物を患者に投与することを含む方法をさらに提供する。一部のそのような態様において、ＧＵＣＹ２ｃ関連障害は、がんである。特定の態様において、がんは、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、虫垂、胆管、及び膵臓からなる群から選択される消化器系のがんである。
【００４９】
本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ関連障害の処置を必要とする患者においてＧＵＣＹ２ｃ関連障害を処置する方法であって、本明細書に開示されている二重特異性抗体、又は本明細書に開示されている二重特異性抗体を含む医薬組成物を患者に投与することを含み、細胞溶解性Ｔ細胞反応が活性化される方法をさらに提供する。
【００５０】
一側面において、本発明は、治療での使用のための、本明細書に開示されている抗体、二重特異性抗体、又は医薬組成物を提供する。本発明は、治療での使用のための医薬の製造における使用のための、本明細書に開示されている抗体又は二重特異性抗体をさらに提供する。一部の態様において、治療はＧＵＣＹ２ｃ関連障害の処置である。特定の態様において、ＧＵＣＹ２ｃ関連障害は、がんである。一部の態様において、がんは、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、虫垂、胆管、及び膵臓からなる群から選択される消化器系のがんである。特定の態様において、治療は細胞溶解性Ｔ細胞反応を活性化する。
【００５１】
一側面において、本発明は、本明細書に開示されている抗体又は二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。別の態様において、本発明は、本明細書に開示されているポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。なお別の態様において、本発明は、本明細書に開示されているベクターを含む宿主細胞を提供する。一部のそのような態様において、宿主細胞は、本明細書に開示されている抗体又は二重特異性抗体を組換え的に産生する。特定の態様において、宿主細胞は、細菌細胞株、哺乳類細胞株、昆虫細胞株及び酵母細胞株からなる群から選択される。特定の態様において、哺乳類細胞株はＣＨＯ細胞株である。一態様において、抗体又は二重特異性抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ無細胞タンパク質合成系を使用して産生される。
【００５２】
一側面において、本発明は、本明細書に開示されているＧＵＣＹ２ｃ抗体又は二重特異性抗体を産生する方法であって、宿主細胞を、本明細書に開示されているＧＵＣＹ２ｃ抗体又は二重特異性抗体を産生する結果を生じる条件下で培養すること、及び抗体又は二重特異性抗体を培養上清から精製することを含む方法を提供する。
【００５３】
別の側面において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ関連障害を処置する医薬の製造における、本明細書に開示されているＧＵＣＹ２ｃ抗体、二重特異性抗体、医薬組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、又は宿主細胞の使用を提供する。
【００５４】
別の態様において、本発明は、本発明の二重特異性抗体と第２の治療剤とを含む組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明の二重特異性抗体と止痢剤とを含む組成物を提供する。
【００５５】
一側面において、止痢剤には、次没食子酸ビスマス、ラクトバチルス・アシドフィルス、サッカロマイセス・ブラウディ、ロペラミド／シメチコン、アトロピン／ジフェノキシラート、アトロピン／ジフェノキシン、サッカロマイセス・ブラウディｌｙｏ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ロペラミド、次サリチル酸ビスマス、ラクトバチルス・アシドフィルス／ラクトバチルス・ブルガリクス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス、アタパルジャイト、クロフェレマー、フルオロキノロン、抗生物質、又はオクトレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
別の側面において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ関連障害を処置する医薬の製造における、本明細書に開示されているＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体及び止痢剤を含む組成物の使用を提供する。
【００５７】
他の態様は、詳細な説明の概要から明らかになるであろう。本発明の側面又は態様が、Ｍａｒｋｕｓｈ群又は選択肢の他のグループ化の観点で説明されている場合には、本発明は、全体として列挙されている群全体だけでなく、群の各々メンバーを個別に、及び主要群の全ての可能な部分群、並びに群メンバーの内の１つ又は複数が存在しない主要群も包含する。本発明はまた、特許請求されている本発明における群メンバーの内のいずれかの１つ又は複数の明示的な除外も想定する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１Ａ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄは、「ノブ−イン−ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」会合を介して会合するように最適化されたＦｃ鎖を含む第１のヘテロ二量体促進ドメイン及び第２のヘテロ二量体促進ドメインを有する、ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の、４つの代替表示の略図を描写する。
【図１Ｂ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄは、「ノブ−イン−ホール」会合を介して会合するように最適化されたＦｃ鎖を含む第１のヘテロ二量体促進ドメイン及び第２のヘテロ二量体促進ドメインを有する、ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の、４つの代替表示の略図を描写する。
【図１Ｃ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄは、「ノブ−イン−ホール」会合を介して会合するように最適化されたＦｃ鎖を含む第１のヘテロ二量体促進ドメイン及び第２のヘテロ二量体促進ドメインを有する、ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の、４つの代替表示の略図を描写する。
【図１Ｄ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄは、「ノブ−イン−ホール」会合を介して会合するように最適化されたＦｃ鎖を含む第１のヘテロ二量体促進ドメイン及び第２のヘテロ二量体促進ドメインを有する、ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の、４つの代替表示の略図を描写する。
【図２Ａ】フローサイトメトリーベースアッセイを使用した、Ｔ８４腫瘍細胞への（Ａ）ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４７及び（Ｂ）ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８二重特異性抗体の結合を描写する。
【図２Ｂ】フローサイトメトリーベースアッセイを使用した、Ｔ８４腫瘍細胞への（Ａ）ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４７及び（Ｂ）ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８二重特異性抗体の結合を描写する。
【図３Ａ】ナイーブヒトＴ細胞への（Ａ）ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４７及び（Ｂ）ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８二重特異性抗体の結合を決定する、フローサイトメトリーベースアッセイを描写する。
【図３Ｂ】ナイーブヒトＴ細胞への（Ａ）ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４７及び（Ｂ）ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８二重特異性抗体の結合を決定する、フローサイトメトリーベースアッセイを描写する。
【図４Ａ】ナイーブヒトＴ細胞を動員して、Ｔ８４腫瘍細胞に細胞死滅を誘導するＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８及びＧＵＣＹ２Ｃ−０２４７を描写する。
【図４Ｂ】ＧＵＣＹ２ｃ発現腫瘍細胞株ＬＳ１０３４に見られるＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８媒介細胞障害性Ｔ細胞活性を描写する。
【図４Ｃ】ＧＵＣＹ２ｃ発現腫瘍細胞株ＬＳ１７４Ｔに見られるＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８媒介細胞障害性Ｔ細胞活性を描写する。
【図４Ｄ】ＧＵＣＹ２ｃ陰性細胞株においてＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８の活性が観察されないことを描写する。
【図５Ａ】図５Ａ〜５ＦはＧＵＣＹ２ｃ発現Ｔ８４細胞へのナイーブヒトＴ細胞のＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８媒介動員により誘導されるサイトカイン放出のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析を描写する。Ｌｕｍｉｎｅｘベースアッセイは、ヒトＩＦＮガンマ（図５Ａ）、ＩＬ１０（図５Ｂ）、ＩＬ２（図５Ｃ）、ＩＬ４（図５Ｄ）、ＩＬ６（図５Ｅ）及びＴＮＦアルファ（図５Ｆ）の上方制御を示した。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５ＦはＧＵＣＹ２ｃ発現Ｔ８４細胞へのナイーブヒトＴ細胞のＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８媒介動員により誘導されるサイトカイン放出のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析を描写する。Ｌｕｍｉｎｅｘベースアッセイは、ヒトＩＦＮガンマ（図５Ａ）、ＩＬ１０（図５Ｂ）、ＩＬ２（図５Ｃ）、ＩＬ４（図５Ｄ）、ＩＬ６（図５Ｅ）及びＴＮＦアルファ（図５Ｆ）の上方制御を示した。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５ＦはＧＵＣＹ２ｃ発現Ｔ８４細胞へのナイーブヒトＴ細胞のＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８媒介動員により誘導されるサイトカイン放出のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析を描写する。Ｌｕｍｉｎｅｘベースアッセイは、ヒトＩＦＮガンマ（図５Ａ）、ＩＬ１０（図５Ｂ）、ＩＬ２（図５Ｃ）、ＩＬ４（図５Ｄ）、ＩＬ６（図５Ｅ）及びＴＮＦアルファ（図５Ｆ）の上方制御を示した。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５ＦはＧＵＣＹ２ｃ発現Ｔ８４細胞へのナイーブヒトＴ細胞のＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８媒介動員により誘導されるサイトカイン放出のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析を描写する。Ｌｕｍｉｎｅｘベースアッセイは、ヒトＩＦＮガンマ（図５Ａ）、ＩＬ１０（図５Ｂ）、ＩＬ２（図５Ｃ）、ＩＬ４（図５Ｄ）、ＩＬ６（図５Ｅ）及びＴＮＦアルファ（図５Ｆ）の上方制御を示した。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５ＦはＧＵＣＹ２ｃ発現Ｔ８４細胞へのナイーブヒトＴ細胞のＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８媒介動員により誘導されるサイトカイン放出のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析を描写する。Ｌｕｍｉｎｅｘベースアッセイは、ヒトＩＦＮガンマ（図５Ａ）、ＩＬ１０（図５Ｂ）、ＩＬ２（図５Ｃ）、ＩＬ４（図５Ｄ）、ＩＬ６（図５Ｅ）及びＴＮＦアルファ（図５Ｆ）の上方制御を示した。
【図５Ｆ】図５Ａ〜５ＦはＧＵＣＹ２ｃ発現Ｔ８４細胞へのナイーブヒトＴ細胞のＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８媒介動員により誘導されるサイトカイン放出のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析を描写する。Ｌｕｍｉｎｅｘベースアッセイは、ヒトＩＦＮガンマ（図５Ａ）、ＩＬ１０（図５Ｂ）、ＩＬ２（図５Ｃ）、ＩＬ４（図５Ｄ）、ＩＬ６（図５Ｅ）及びＴＮＦアルファ（図５Ｆ）の上方制御を示した。
【図６】養子移入モデルにおける、Ｔ８４結腸直腸癌細胞株異種移植片腫瘍に対するＧＵＣＹ２Ｃ−０２４７による用量依存性の腫瘍増殖阻害を描写する。
【図７】養子移入モデルにおける、ＨＴ５５結腸直腸癌細胞株異種移植片腫瘍に対するＧＵＣＹ２Ｃ−０２４７による用量依存性の腫瘍増殖阻害を描写する。
【図８】養子移入モデルにおける、ＨＴ５５結腸直腸癌細胞株異種移植片腫瘍に対するＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８による用量依存性の腫瘍増殖阻害を描写する。
【図９】養子移入モデルにおける、結腸直腸癌ＬＳ１０３４細胞株異種移植片腫瘍に対するＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体のＧＵＣＹ２Ｃ−０２４７及びＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８による用量依存性の腫瘍増殖阻害を描写する。
【図１０】養子移入モデルにおける、結腸直腸癌ＬＳ１０３４細胞株異種移植片腫瘍に対するＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体のＧＵＣＹ２Ｃ−００７４、ＧＵＣＹ２Ｃ−００９８、及びＧＵＣＹ２Ｃ−０１０５による腫瘍増殖阻害を描写する。
【図１１】養子移入モデルにおける、ＰＤＸ−ＣＲＸ−１１２０１結腸直腸癌患者由来異種移植片腫瘍に対するＧＵＣＹ２Ｃ−００９８による用量依存性の腫瘍増殖阻害を描写する。
【図１２】養子移入モデルにおける、ＰＤＸ−ＣＲＸ−１１２０１結腸直腸癌患者由来異種移植片腫瘍に対するＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８による用量依存性の腫瘍増殖阻害を描写する。
【図１３】養子移入モデルにおける、ＰＤＸ−ＣＲＸ−１１２０１結腸直腸癌患者由来異種移植片腫瘍に対するＧＵＣＹ２Ｃ−０２４０による腫瘍増殖阻害を描写する。
【図１４】養子移入モデルにおける、ＰＤＸ−ＣＲＸ−１２２１３結腸直腸癌患者由来異種移植片腫瘍に対するＧＵＣＹ２Ｃ−００９８腫瘍増殖阻害による腫瘍増殖阻害を描写する。
【図１５】養子移入モデルにおける、ＰＤＸ−ＣＲＸ−２４２２５結腸直腸癌患者由来異種移植片腫瘍に対するＧＵＣＹ２Ｃ−０２４７による腫瘍増殖阻害を描写する。
【図１６】Ｔ８４細胞におけるＧＵＣＹ２ｃ−ＣＤ３二重特異性剤のｃＧＭＰ誘導及び中和能の特徴づけを描写する。
【図１７】精製した後のＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８のＬＣ／ＭＳ分析を描写する。
【図１８】抗ＣＤ３バリアントとの抗ＧＵＣＹ２Ｃ二重特異性Ｔ細胞媒介性細胞障害を描写する。異なるＣＤ３バリアントとの抗ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性剤は、ナイーブヒトＴ細胞を動員して、Ｔ８４腫瘍細胞に細胞死滅を誘導する。
【図１９】ＧＵＣＹ２ｃ  ＥＣＤペプチド競合ＤＥＬＦＩＡ  ＥＬＩＳＡを描写する。
【図２０】抗体ＭＳ２０を用いた競合ＤＥＬＦＩＡ  ＥＬＩＳＡを描写する。
【図２１】結晶学によるＧＵＣＹ２ｃペプチドとＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８ｓｃＦｖペプチドとの結合面の詳細を描写する。
【図２２】約７０Åで隔てられ、分子の反対側に互いに真向かいに配置されていることを示す、ＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性抗体における２個の抗原結合部位の結晶構造を描写する。
【図２３】ＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性剤との組み合わせによる相加的な腫瘍増殖阻害を示す、抗ＶＥＧＦ及びアキシチニブとの組み合わせ研究の結果を描写する。
【図２４】ＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性剤との組み合わせによる相加的な腫瘍増殖阻害を示す、抗ＰＤ１との組み合わせ研究の結果を描写する。
【図２５】ＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性剤との組み合わせによる相加的な腫瘍増殖阻害を示す、抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせ研究の結果を描写する。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本明細書に開示されている発明は、ＧＵＣＹ２ｃ（例えば、ヒトＧＵＣＹ２ｃ、マウスＧＵＣＹ２ｃ、ラットＧＵＣＹ２ｃ、カニクイザルＧＵＣＹ２ｃ）に特異的に結合する抗体を提供する。さらに、本明細書に開示されている発明は、ＣＤ３（例えば、ヒトＣＤ３）及び腫瘍抗原（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ）に特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。本発明は、これらの抗体をコードするポリヌクレオチド、これらの抗体を含む組成物、並びにこれらの抗体を作製及び使用する方法も提供する。本発明は、本明細書に記載される抗体（例えば、ＧＵＣＹ２、ＣＤ３、又は二重特異性抗体）を使用して、がんなどＧＵＣＹ２ｃ発現に関連する状態を対象において処置する方法をさらに提供する。
全体的な技術
本発明の実行は、別途指示されていない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学（これらは当分野の技術内である）の従来技術を採用するであろう。そのような技術は文献で十分に説明されており、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ及びＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，及びＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編，１９９３〜１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ及びＣ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他編，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ他編，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ他編，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ及びＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ及びＣ．Ｄｅａｎ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ及びＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ及びＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）で十分に説明されている。場合によっては、一般的に理解されている��味を有する用語が、明確さのために及び／又は容易な参照のために本明細書で定義されており、本明細書でのそのような定義の包含は、当分野で一般に理解されるものとの実質的な相違を表すと必ずしも解釈されるべきではない。
【００６０】
これより、本発明を、下記の定義及び例を使用して参照により詳細に説明する。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物（そのような特許及び刊行物で開示されている全ての配列を含む）は、参照により明示的に組み込まれる。
定義
概して、別途定義されない限り、本明細書で使用されている当分野の全ての用語、表記、及び他の科学用語若しくは専門用語は、本発明が関連する分野の当業者により一般に理解されている意味を有することが意図されている。例えば、用語「及び／又は」は、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」等の語句で使用される場合、Ａ及びＢの両方；Ａ又はＢ；Ａ（単独）；並びにＢ（単独）を含むように意図されている。同様に、用語「及び／又は」は、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」等の語句で使用される場合、下記の態様のそれぞれを包含するように意図されている：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。
【００６１】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に指示しない限り、その対応する複数の参照を含む。
本明細書で使用される場合、数値範囲には、この範囲を画定する数値が含まれる。
【００６２】
用語「約」、「およそ」、及び同類のものは、数値のリスト又は範囲に先行する場合には、このリスト又は範囲の各個々の値が、この用語に直前に先行されたかのように、リスト又は範囲の各個々の値を独立して指す。これらの用語は、これらが指す値が、正確であるか、この値に近似しているか、又はこの値に類似していることを意味する。例えば、いくつかの態様では、約又はおよその特定の値は、この値の９９％、９５％、又は９０％の値を示し得る。一例として、「約１００」の表現は、９９及び１０１、並びに間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５等）を含む。別の例として、温度が７０℃である場合には、「約」又は「およそ」７０℃は、６９℃、６６℃、又は６３℃に相当し得る。これらは単なる例示であることを理解しなければならない。
【００６３】
本明細書に使用されるとき、「３．８オングストローム内」とは、結晶学により決定して、接触が３．８オングストローム以下であることを意味する。
本明細書で使用される場合、核酸を５’から３’の方向で左から右へと記載し、アミノ酸配列をアミノからカルボキシの方向で左から右へとそれぞれ記載する。当業者は、当分野の定義及び用語に関して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，１  ９８９及びＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ他，１９９３に特に向けられている。本発明は、説明されている特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されないことを理解すべきであり、なぜならば、これらは変わり得るからである。
【００６４】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、任意の長さ（好ましくは比較的短い（例えば１０〜１００個のアミノ酸））のアミノ酸の鎖を指すために本明細書で互換的に使用される。この鎖は、直鎖であってもよいし分枝していてもよく、改変アミノ酸を含んでもよいし、及び／又は非アミノ酸で中断されていてもよい。この用語はまた、天然に又は介入により改変；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識成分との共役等のあらゆる他の操作若しくは改変されているアミノ酸鎖も包含する。この定義に同様に含まれるのは、例えば、アミノ酸の１種又は複数種の類似体（例えば非天然アミノ酸等を含む）を含むポリペプチド、及び当分野で公知の他の改変である。ポリペプチドは、単一の鎖として又は関連する鎖として生じ得ることが理解される。好ましくは、哺乳類ポリペプチド（元々は哺乳類生物に由来したポリペプチド）が使用され、より好ましくは、培地に直接分泌されるものが使用される。
【００６５】
「抗体」とは、免疫グロブリン分子であって、この免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して標的（例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等）に特異的に結合し得る免疫グロブリン分子のことである。本明細書で使用される場合、この用語は下記を包含する：ポリクローナル、モノクローナル抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二機能性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体、二重特異性ヘテロ二量体性二特異性抗体、二重特異性ヘテロ二量体性ＩｇＧ、標識抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及びこれらのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、及びドメイン抗体（例えば、サメ及びラクダ抗体を含む）、抗体を含む融合タンパク質、並びに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変配置。抗体として、ＩｇＧ、ＩｇＡ、若しくはＩｇＭ（又はこれらのサブクラス）等の任意のクラスの抗体が挙げられるが、この抗体は、任意の特定のクラスである必要はない。重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは様々なクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在しており、これらの内のいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス（アイソタイプ）にさらに分類され得る。免疫グロブリンの様々なクラスに対応する重鎖可変領域はそれぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれている。免疫グロブリンの様々なクラスのサブユニット構造及び三次元配置は、周知である。本発明はまた、他の非抗体分子タンパク質ベースの足場である「抗体類似体」も含み、例えば、ＣＤＲを使用して特定の抗原結合をもたらす融合タンパク質及び／又は免疫コンジュゲートも含む。本発明の抗体は、任意の種（例えば、限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、及びウシ）に由来し得る。
【００６６】
用語「抗体」は、ジスルフィド結合により相互に連結されている４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖、及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにこの多量体（例えばＩｇＭ）をさらに含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣ  ＶＲ又はＶＨと省略されている）と、重鎖定常領域とを含む。抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域を単独で又は組み合わせて指す。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメインは、ヒンジ領域により連結されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣ  ＶＲ又はＶＬと省略されている）と、軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化され得、このＣＤＲには、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が組み入れられている。各ＶＨ及びＶＬは、下記の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置されている、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明の様々な態様では、ＣＤ３抗体（又はこの抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよいし、天然に又は人工的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲのサイドバイサイド分析に基づいて定義され得る。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲにより近接して互いに保持され、他の鎖からのＣＤＲは、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。
【００６７】
用語「抗原結合フラグメント」若しくは「抗体フラグメント」又は「抗原結合部分」は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又は複数のフラグメントを指す。抗体の用語「抗原結合フラグメント」に包含される結合フラグメントの例として、下記が挙げられる：（ｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／若しくは抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は完全長抗体若しくは抗体フラグメント（例えばＶＨドメイン及び／若しくはＶＬドメイン）に由来するＶＨ／ＶＬの対；（ｉｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）ヒンジ領域の一部を有する、本質的にＦａｂであるＦＡｂ’フラグメント（例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ編，３．ｓｕｐ．ｒｄ  ｅｄ．１９９３；（ｉｖ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結されている２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｖ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｖｉ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖｉｉ）ＶＬ及びＶＨ領域が対形成して一価の分子を形成する単一タンパク質鎖である一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｂｉｒｄ他（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６；及びＨｕｓｔｏｎ他（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３）；（ｖｉｉｉ）ＶＨ−ＶＬ対を安定化させるように設計されている分子間ジスルフィド結合を有するＦｖであるジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）；（ｉｘ）重鎖の可変ドメインで構成されており、軽鎖を欠いている単一可変ドメイン抗体（ｓｄＡｂ又はｄＡｂ）フラグメント（例えば、Ｗａｒｄ他（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６）；（ｘ）相補性決定領域（ＣＤＲ）；並びにこれらのあらゆる誘導体。
【００６８】
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合フラグメント」は、少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。この可変ドメインは、任意のサイズ又はアミノ酸組成であり得、一般には、１つ又は複数のフレームワーク配列に隣接しているか又はこのフレームワーク配列とのフレーム内に存在する少なくとも１つのＣＤＲを含むであろう。本明細書で使用される場合、「抗体の抗原結合フラグメント」は、互いに非共有結合的会合で、及び／又は（例えばジスルフィド結合による）１つ若しくは複数の単量体ＶＨ若しくはＶＬ領域との非共有結合的会合で、下記で列挙される可変領域及び定常ドメインの配置の内のいずれかのホモ二量体若しくはヘテロ二量体（又は他の多量体）を含み得る。例えば、この可変領域は二量体であり得、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ、又はＶＬ−ＶＬ二量体を含み得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内で見出され得る可変及び定常ドメインの配置として、下記が挙げられる：ＶＨ−ＣＨ１；ＶＨ−ＣＨ２；ＶＨ−ＣＨ３；ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２；ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；ＶＨ−ＶＬ−ＣＬ、ＶＨ−ＶＬ−ＣＨ１、ＶＨ−ＶＬ−ＣＨ２；ＶＨ−ＣＬ；ＶＬ−ＣＨ１；ＶＬ−ＣＨ２；ＶＬ−ＣＨ３；ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２；ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；及びＶＬ−ＣＬ。この可変及び定常ドメインは、互いに直接連結されていてもよいし、完全な又は部分的なヒンジ又はリンカー領域により連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子中の隣接する可変領域及び／又は定常ドメインの間に柔軟性の又は半柔軟性の連結を生じる少なくとも２個（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個、又はより多く）のアミノ酸からなり得る。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」は、ポリペプチド（例えば抗体）の任意の領域であって、目的の分子（例えば、抗原、リガンド、受容体、基質、又は阻害物質）への選択的結合に関与する領域を含む。例示的な結合ドメインとして、抗体可変領域、受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、及び酵素ドメインが挙げられる。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「ヒトアクセプターフレームワーク」とは、下記で定義するヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークのことである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」ヒトアクセプターフレームワークは、それらと同一のアミノ酸配列を含んでもよいし、アミノ酸配列の改変を含んでもよい。いくつかの態様では、アミノ酸改変の数は、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、又は２個以下である。いくつかの態様では、ＶＬヒトアクセプターフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「親和性成熟」抗体は、そのような改変を持たない親抗体と比較して、１つ又は複数の可変領域（ＣＤＲ及びＦＲを含むにおいて１つ又は複数の改変を有する抗体を指し、そのような改変により、抗原に対する抗体の親和性が改善される。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ鎖」、及び類似の用語は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。ＩｇＧのＦｃ領域は、２つの定常ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、通常、ＥＵ  Ｉｎｄｅｘのナンバリングシステムに従ってアミノ酸２３１からアミノ酸３４０まで延びているか、又はＫａｂａｔのナンバリングシステムに従ってアミノ酸２４４からアミノ酸３６０まで延びている。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは、通常、ＥＵインデックスのナンバリングシステムに従ってアミノ酸３４１から４４７まで延びているか、又はＫａｂａｔのナンバリングシステムに従ってアミノ酸３６１からアミノ酸４７８まで延びている。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン（「Ｃγ２」ドメインとも称される）は、別のドメインと密接に対形成しないという点でユニークである。正確に言うと、インタクトな天然ＩｇＧの２つのＣＨ２ドメインの間には、２つのＮ連結された分枝炭水化物鎖が介在している。Ｆｃ領域は、天然Ｆｃ配列を含んでもよいし、バリアントＦｃ配列を含んでもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ配列の境界は変動する可能性があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ配列は、通常、約Ｃｙｓ２２６位又は約Ｐｒｏ２３０位でのアミノ酸残基からこのＦｃ配列のカルボキシル末端まで伸びるように定義される。別途本明細書で指定しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域のアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ他，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１で説明されているようなＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
【００７３】
ある特定の態様では、Ｆｃ鎖は、パパイン開裂部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まり、抗体のＣ末端で終わる。したがって、完全なＦｃ鎖は、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。ある特定の態様では、Ｆｃ鎖は、下記の内の少なくとも１つを含む：ヒンジ（例えば、上部、中央、及び／若しくは下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、又はこれらのバリアント、一部、若しくはフラグメント。ある特定の態様では、Ｆｃドメインは、完全なＦｃ鎖（即ち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン）を含む。ある特定の態様では、Ｆｃ鎖は、ＣＨ３ドメイン（又はその一部）に融合したヒンジドメイン（又はその一部）を含む。ある特定の態様では、Ｆｃ鎖は、ＣＨ３ドメイン（又はその一部）に融合したＣＨ２ドメイン（又はその一部）を含む。ある特定の態様では、Ｆｃ鎖は、ＣＨ３ドメイン又はその一部からなる。ある特定の態様では、Ｆｃ鎖は、ヒンジドメイン（又はその一部）及びＣＨ３ドメイン（又はその一部）からなる。ある特定の態様では、Ｆｃ鎖は、ＣＨ２ドメイン（又はその一部）及びＣＨ３ドメインからなる。ある特定の態様では、Ｆｃ鎖は、ヒンジドメイン（又はその一部）及びＣＨ２ドメイン（又はその一部）からなる。ある特定の態様では、Ｆｃ鎖は、少なくともＣＨ２ドメインの一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全て又は一部）を欠いている。Ｆｃ鎖は、本明細書では概して、免疫グロブリン重鎖のＦｃ鎖の全て又は一部を含むポリペプチドを指す。これとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＨＩ、ヒンジ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメインの全体を含むポリペプチド、並びに例えば、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインのみを含むそのようなペプチドのフラグメント。Ｆｃ鎖は、任意の種及び／又は任意のサブタイプの免疫グロブリン（例えば、限定されないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体）に由来し得る。Ｆｃドメインは、天然のＦｃ及びＦｃバリアント分子を包含する。Ｆｃバリアント及び天然Ｆｃ’ｓと同様に、用語Ｆｃ鎖は、抗体全体から消化されたか又は他の手段により作製された単量体又は多量体形態の分子を含む。いくつかの態様では、Ｆｃ鎖は、ジスルフィドにより互いに保持された両方の重鎖のカルボキシ末端部分を含む。ある特定の態様では、Ｆｃ鎖は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインからなる。
【００７４】
当分野で使用される場合、「Ｆｃ受容体」及び「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明する。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＩＩＩサブクラスの受容体（これらの受容体の対立遺伝子バリアント及び交互にスプライスされた形態を含む）が挙げられる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれており、これらは同様のアミノ酸配列を有するが、このアミノ酸配列の細胞質ドメインが主に異なる。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：４５７〜９２，１９９１；Ｃａｐｅｌ他，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４：２５〜３４，１９９４；及びｄｅ  Ｈａａｓ他，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１２６：３３０〜４１，１９９５で概説されている。「ＦｃＲ」には、母系ＩｇＧの胎児への移行に関与する新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１７：５８７，１９７６；及びＫｉｍ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４９，１９９４）。
【００７５】
「天然配列Ｆｃ領域」又は「野生型Ｆｃ領域」は、自然界で見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「野生型」ヒトＩｇＧ  Ｆｃは、ヒト集団内で天然に生じるアミノ酸の配列を意味する。当然のことながら、Ｆｃ配列が個体間でわずかに異なり得るのと同様に、野生型配列に対して１つ又は複数の変更が起こり得、この変更が本発明の範囲内に依然として留まり得る。例えば、Ｆｃ領域は、本発明とは関連していないさらなる変更（例えば、グリコシル化部位での変異、非天然アミノ酸の包含、又は「ノブインホール」変異）を含み得る。
【００７６】
「バリアントＦｃ領域」又は「バリアントＦｃ鎖」は、少なくとも１つのアミノ酸改変により天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むが、この天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持する。いくつかの態様では、バリアントＦｃ鎖は、天然配列Ｆｃ鎖又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１個のアミノ酸置換を有し、例えば、天然配列Ｆｃ鎖又は親ポリペプチドのＦｃ鎖において、約１〜約１０個のアミノ酸置換を有し、好ましくは約１〜約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書におけるバリアントＦｃ鎖は、好ましくは、天然配列Ｆｃ鎖及び／又は親ポリペプチドのＦｃ鎖と少なくとも約８０％の配列同一性を有し、最も好ましくは、これらと少なくとも約９０％の配列同一性を有し、より好ましくは、これらと少なくとも約９５％の、少なくとも約９６％の、少なくとも約９７％の、少なくとも約９８％の、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。
【００７７】
本明細書で使用される場合、用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ鎖（天然配列Ｆｃ鎖又はアミノ酸配列バリアントＦｃ鎖）に起因する生物学的活性を指し、抗体のアイソタイプにより異なる。抗体エフェクター機能の例として、下記が挙げられる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御；並びにＢ細胞活性化。そのようなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ鎖が結合ドメイン（例えば抗体可変領域）と結合することを必要としており、そのような抗体エフェクター機能を評価するための当分野で公知の様々なアッセイを使用して評価し得る。エフェクター機能の例示的な測定は、Ｆｃγ３及び／又はＣ１ｑ結合による。
【００７８】
抗体のエフェクター機能はＦｃ鎖の配列により決定され、この鎖はまた、ある特定のタイプの細胞上で見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）により認識される部分でもある。
いくつかの態様では、Ｆｃポリペプチドは、野生型ヒンジ配列の一部又は全てを（一般にはそのＮ末端で）含む。いくつかの態様では、Ｆｃポリペプチドは、機能性又は野生型ヒンジ配列を含まない。
【００７９】
「ヒンジ領域」、「ヒンジ配列」、及びこれらのバリエーションは、本明細書で使用される場合、例えば、Ｊａｎｅｗａｙ他，ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，ＮＹ（第４版，１９９９）；Ｂｌｏｏｍ他，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６：４０７〜４１５，１９９７；及びＨｕｍｐｈｒｅｙｓ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０９：１９３〜２０２，１９９７で説明されている当分野で公知の意味を含む。
【００８０】
「免疫グロブリン様ヒンジ領域」、「免疫グロブリン様ヒンジ配列」、又はこれらのバリエーションは、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン様又は抗体様分子（例えば免疫付着因子）のヒンジ領域及びヒンジ配列を指す。いくつかの態様では、免疫グロブリン様ヒンジ領域は、任意のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４サブタイプに由来し得るか、又はＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、若しくはＩｇＭに由来し得、これらのキメラ形態を含み、例えばキメラＩｇＧａ／２ヒンジ領域を含む。
【００８１】
いくつかの態様では、ヒンジ領域は、ＥＵインデックスのナンバリングシステムに従ってアミノ酸２１６からアミノ酸２３０まで延びるヒトＩｇＧ１サブタイプに由来し得るか、又はＫａｂａｔのナンバリングシステムに従ってアミノ酸２２６からアミノ酸２４３まで延びるヒトＩｇＧ１サブタイプに由来し得る。いくつかの態様では、この配列はＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１８６）であり得る。当業者は、ＩｇＧ分子の様々なドメインに対応する正確なアミノ酸の理解に差があり得る。そのため、上記で概説したドメインのＮ末端又はＣ末端は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、さらには１０個のアミノ酸だけ延びていてもよいし短くてもよい。
【００８２】
いくつかの態様では、ヒンジ領域は、１つ又は複数のアミノ酸が変異していてもよい。いくつかの態様では、ヒンジ領域は、トランケートされて完全ヒンジ領域の一部のみを含んでもよい。いくつかの態様では、ヒンジ領域は、ヒンジ領域の最後の５個のアミノ酸のみを含んでもよい。
【００８３】
本明細書で使用される場合、用語「連結されている」、「融合している」、「融合」、「共有結合している」、「共有結合的に連結されている」、及び「遺伝学的に融合している」は、互換的に使用される。これらの用語は、化学的共役又は組換え手段等のあらゆる手段による２種以上の要素又は成分の接合を指す。本明細書で使用される場合、用語「共有結合している」は、特定の部分が、互いに直接的に共有結合しているか、又は連結ペプチド若しくは連結部分等の介在する部分を介して互いに間接的に供給結合的に接合されていることを意味する。好ましい態様では、部分は共有結合的に融合している。共有結合的連結の１種は、ペプチド結合である。（例えばヘテロ二官能性架橋剤を使用する）化学的共役の方法は、当分野で公知である。融合した部分はまた、遺伝学的に融合していてもよい。本明細書で使用される場合、用語「遺伝学的に融合している（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｆｕｓｅｄ）」、「遺伝学的に連結されている」、又は「遺伝学的に融合している（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｆｕｓｅｄ）」は、タンパク質、ポリペプチド、又はフラグメントをコードする単一のポリヌクレオチド分子の遺伝学的発現を介した個々のペプチド骨格による２つ以上のタンパク質、ポリペプチド、又はこれらのフラグメントの共線的な共有結合的連結又は付着を指す。そのような遺伝学的融合により、単一の連続した遺伝子配列の発現がもたらされる。好ましい遺伝学的融合はインフレームであり、即ち、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、元々のＯＲＦの正確なリーディングフレームを維持する方法で、連続するより長いＯＲＦを形成するように融合する。そのため、生じる組換え融合タンパク質は、元々のＯＲＦによりコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のタンパク質セグメントを含む単一のポリペプチドである（このセグメントは、天然では通常、そのように接合されない）。この場合、この単一のポリペプチドは処理中に開裂され、２本のポリペプチド鎖を含む二量体分子が得られる。
【００８４】
本明細書で使用される場合、用語「改変」は、ポリペプチド配列中でのアミノ酸の置換、挿入、及び／若しくは欠失、タンパク質に化学的に連結される部位に対する変更、又はタンパク質（例えば抗体）の機能の改変を指す。例えば、改変は、抗体の機能の変更であってもよいし、タンパク質に付着する炭水化物構造の変更であってもよい。本明細書で使用される場合、「アミノ酸改変」は、抗体中の１つ又は複数のアミノ酸残基の変異（置換）、挿入（付加）、又は欠失を指す。用語「アミノ酸変異」は、少なくとも１つの既存のアミノ酸残基の、別の異なるアミノ酸残基（例えば、置き換わるアミノ酸残基）による置換を示す。用語「アミノ酸欠失」は、アミノ酸配列中の所定の位置での少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指す。例えば、変異Ｌ２３４Ａは、抗体Ｆｃ領域中における２３４位でのアミノ酸残基リジンがアミノ酸残基アラニンで置換されていること（アラニンによるリジンの置換）を示す（ＥＵインデックスナンバリングシステムに従うナンバリング）。「天然に存在するアミノ酸残基」は、下記からなる群からのアミノ酸残基を指す：アラニン（３文字コード：Ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｉｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｈｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。このファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルアミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「非必須」アミノ酸残基とは、生物学的活性を消失させることなく又は実質的に変更することなく、結合剤（例えば抗体）の野生型配列から変更され得る残基のことであるが、「必須」アミノ酸残基は、そのような変化をもたらす。抗体において、必須アミノ酸残基は、特異性決定残基（ＳＤＲ）であり得る。
【００８７】
用語「薬剤」は、本明細書では、生体高分子、生体材料から作られた抽出物、生体高分子の混合物、化合物、化合物の混合物、並びに／又は化合物及び生体高分子の混合物を示すために使用される。用語「治療薬」は、生物学的活性を有する薬剤を指す。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、この集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る、起こり得る天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。さらには、典型的には様々な決定基（エピトープ）に向けられる様々な抗体が挙げられるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられる。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈してはならない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５で最初に説明されたハイブリドーマ法により作製し得るか、又は例えば米国特許第４，８１６，５６７号明細書で説明されている組換えＤＮＡ法により作製し得る。モノクローナル抗体を、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４，１９９０で説明されている技術を使用して生成されるファージライブラリーからも単離し得る。
【００８９】
本発明の抗体は、「ヒト化抗体」であり得る。本明細書で使用される場合、「ヒト化」抗体は、非ヒト（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、又は他の哺乳類）抗体の形態であって、非ヒトである供給源から導入された１つ又は複数のアミノ酸残基を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はこれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、若しくは抗体の他の抗原結合配列）である非ヒト抗体の形態を指す。この非ヒトアミノ酸残基は「インポート」残基と称されることが多く、このインポート残基は、典型的には「インポート」可変ドメインから取られる。インポート残基、配列、又は抗体は、所望の親和性及び／若しくは特異性を有するか、又は本明細書で考察されている他の所望の抗体の生物学的活性を有する。
【００９０】
好ましくは、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、このレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体；例えば、マウス、ラット、又はウサギ）のＣＤＲ由来の残基に置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合では、このヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体でもインポートされたＣＤＲ又はフレームワーク配列でも見出されないが抗体の性能をさらに精密にさせて最適化するために含まれる残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの（典型的には２つの）可変領域の実質的に全てを含み、この可変領域でのＣＤＲ領域の全て又は実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものに対応する。最適には、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部も含み、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含む。好ましいものは、国際公開第９９／５８５７２号パンフレットで説明されているように改変されているＦｃ鎖を有する抗体である。ヒト化抗体の他の形態は、元々の抗体に関して変更されている１つ又は複数のＣＤＲ（ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、又はＣＤＲ  Ｈ３）を有し、このＣＤＲはまた、元々の抗体由来の１つ又は複数のＣＤＲに「由来する」１つ又は複数のＣＤＲとも称される。ヒト化は、本明細書で使用される場合、脱免疫化抗体を含むように意図されている。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体、及び／又は当業者公知の若しくは本明細書で開示されているヒト抗体を製造するための技術の内のいずれかを使用して作製されている抗体を意味する。したがって、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むように意図されている。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲ（特にＣＤＲ３）において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的変異誘発により導入されるか又はインビボでの体細胞変異により導入される変異）を含み得る。ヒト抗体のこの定義には、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチド又は少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。そのような一例は、マウス軽鎖ポリペプチド及びヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。ヒト抗体を、当分野で公知の様々な技術を使用して製造し得る。一態様では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、このファージライブラリーはヒト抗体を発現する（Ｖａｕｇｈａｎ他，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０９〜３１４，１９９６；Ｓｈｅｅｔｓ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６１５７〜６１６２，１９９８；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１，１９９１；Ｍａｒｋｓ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１，１９９１）。ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座が内因性遺伝子座の代わりに遺伝子導入されている動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的に又は完全に不活性化されているマウス）の免疫化によっても製造し得る。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；及び同第５，６６１，０１６号明細書で説明されている。或いは、ヒト抗体を、標的抗原に対して抗体を産生するヒトＢ細胞リンパ球を不死化することにより調製し得る（そのようなＢリンパ球は、個体から回収されてもよいし、ｃＤＮＡの単一細胞クローニングから回収されてもよいし、インビトロで免疫化されていてもよい）。例えば、Ｃｏｌｅ他，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，７７頁，１９８５；Ｂｏｅｒｎｅｒ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６〜９５，１９９１；及び米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照されたい。
【００９２】
本発明のヒト抗体は、ヒンジ不均一性と関連する少なくとも２種の形態で存在し得る。例えば、免疫グロブリン分子は、およそ１５０〜１６０ｋＤａの安定した４つの鎖構築物を含み、この構築物では、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合により一緒に保持される。或いは、この二量体は、鎖間ジスルフィド結合により連結されておらず、共有結合的に連結された軽鎖及び重鎖で構成されている約７５〜８０ｋＤａの分子が形成されている（半抗体）。
【００９３】
本明細書で使用される場合、用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段により調製されたか、発現されたか、作製されたか、又は単離された全てのヒト抗体を含むように意図されており、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体（下記でさらに説明する）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（下記でさらに説明する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ他（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７〜６２９５を参照されたい）、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製されたか、発現された、作製されたか、若しくは単離された抗体を含むように意図されている。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する。しかしながら、ある特定の態様では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロでの変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックな動物を使用する場合には、インビボでの体細胞変異誘発）を受け、そのため、この組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨ及びＶＬ配列に由来し、関連するがインビボでのヒト抗体生殖系列レパートリーには天然には存在し得ない配列である。
【００９４】
本発明の抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか又は特定の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか又は相同であるが、これらの鎖の残余が、別の種に由来するか又は別の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体、並びにそのような抗体のフラグメント（但し、このフラグメントは所望の生物学的活性を示す）であり得る（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１〜６８５５，１９８４）。本明細書での目的のキメラ抗体として、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿等）に由来する可変領域抗原結合配列とヒト定常領域配列とを含む霊長類化抗体が挙げられる。
【００９５】
「一価抗体」は、１つの分子当たり１つの抗原結合部位を含む（例えばＩｇＧ又はＦａｂ）。ある場合では、一価抗体は、複数の抗原結合部位を有し得るが、これらの結合部位は異なる抗原由来である。
【００９６】
「単一特異性抗体」は、１つの分子当たり２つの同一の抗原結合部位を含む抗体又は抗体調製物（例えばＩｇＧ）であって、これら２つの結合部位が抗原上の同一のエピトープに結合する抗体又は抗体調製物を指す。そのため、これらの結合部位は、１つの抗原分子への結合で互いに競合する。この用語には、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」が含まれる。天然で見出されるほとんどの抗体は、単一特異性である。ある場合では、単一特異性抗体はまた、一価抗体でもあり得る（例えばＦａｂ）。
【００９７】
「二価抗体」は、分子１個当たり２個の抗原結合部位を含む（例えば、ＩｇＧ）。一部の場合において、２個の結合部位は、同じ抗原特異性を有する。しかし、二価抗体は二重特異性であり得る。
【００９８】
本明細書に使用されるとき、「二重特異性抗体」、「両特異性（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体」、「二機能性抗体」、「ヘテロ多量体」、「ヘテロ多量体複合体」、「二重特異性ヘテロ二量体二特異性抗体」、又は「ヘテロ多量体ポリペプチド」は、少なくとも第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む分子であり、第２のポリペプチドは、第１のポリペプチドと少なくとも１個のアミノ酸残基によってアミノ酸配列が異なる。場合によっては、二重特異性は、２つの異なる重鎖領域及び軽鎖領域を有する人工ハイブリッド抗体である。好ましくは、二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるリガンド、抗原、又は結合部位に対する結合特異性を有する。したがって、二重特異性抗体は、２種の異なる抗原に同時に結合し得る。二重特異性抗体の２つの抗原結合部位は、２種の異なるエピトープに結合し、これらのエピトープは、同一の又は異なるタンパク質標的（例えば腫瘍標的）上に存在し得る。
【００９９】
「標的抗原」、「標的細胞抗原」、「腫瘍抗原」、又は「腫瘍特異的抗原」は、本明細書で使用される場合、標的細胞の表面上で提示される抗原決定基を指し、例えば、癌細胞又は腫瘍間質の細胞などの腫瘍中の細胞を指す。
【０１００】
用語「変異荷重（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｌｏａｄ）」、「変異荷重（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｌｏａｄ）」、「変異負荷（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｂｕｒｄｅｎ）」、及び「変異負荷（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｕｒｄｅｎ）」は、本明細書では互換的に使用される。腫瘍変異荷重は、腫瘍ゲノム内での変異の数の尺度であり、腫瘍ゲノムの１つのコード領域当たりの変異の総数として定義される。腫瘍型内での変異負荷には大きなばらつきがあり、ほんの数個から数千個の変異の範囲である（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ  ＬＢ他，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３；５００（７４６３）：４１５〜４２１；Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＭＳ他，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３；４９９：２１４〜２１８；Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３；３３９：１５４６〜１５５８。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」の第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖は、少なくとも１つの抗体ＶＬ及び１つの抗体ＶＨ領域又はこれらのフラグメントを含み、両方の抗体結合ドメインは単一のポリペプチド鎖内で含まれ、各ポリペプチド鎖中のＶＬ及びＶＨ領域は異なる抗体に由来する。
【０１０２】
二重特異性抗体、両特異性抗体、二機能性抗体、ヘテロ多量体、ヘテロ多量体複合体、二重特異性ヘテロ二量体二特異性抗体、又はヘテロ多量体ポリペプチドは、高次三次構造を形成することができ、第１及び第２のポリペプチドに加えて他のポリペプチドが存在する。ヘテロ多量体のポリペプチドは、非ペプチド共有結合（例えば、ジスルフィド結合）により、並びに／又は非共有相互作用（例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、及び／若しくは疎水性相互作用）により互いに相互作用し得る。
【０１０３】
二重特異性抗体、両特異性抗体、二機能性抗体、ヘテロ多量体、ヘテロ多量体複合体、二重特異性ヘテロ二量体二特異性抗体、又はヘテロ多量体ポリペプチドは、Ｖ領域の鎖内ではなく鎖間の対形成が達成されるように、ＶＨとＶＬの領域の間に短いリンカー（例えば、約３〜１０個の残基）を用いてｓＦｖフラグメントを構築して、二価フラグメント、即ち、２個の抗原結合部位を有するフラグメントを生じることによって調製され得る。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）に由来し得る。二特異性抗体は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８，１９９３でより完全に説明されている。二重特異性抗体は、２つの抗体のＶＨ及びＶＬ領域が異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「クロスオーバー」ｓＦｖフラグメントのヘテロ二量体である。
【０１０４】
本明細書に使用されるとき、「単離抗体」は、自然環境の少なくとも１個の成分から確認され、分離及び／又は回収された抗体である。例えば、生物の少なくとも１種の成分から、又はこの抗体が天然に存在するか若しくは天然に産生される組織若しくは細胞から分離されているか若しくは取り出されている抗体は、本発明の目的のための「単離抗体」である。単離抗体には、生体内原位置にある（ｉｎ  ｓｉｔｕ）組換え細胞内の抗体も含まれる。単離抗体は、少なくとも１回の精製又は単離工程を受けている抗体である。ある特定の態様によると、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まないことがある。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、用語「連結されている」又は「連結」は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の直接的なペプチド結合連結を指すか、又は第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間でこれらにペプチド結合している第３のアミノ酸配列を含む連結を指す。例えば、一方のアミノ酸配列のＣ末端に結合しており、他方のアミノ酸配列のＮ末端に結合しているリンカーペプチド。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、用語「リンカー」は、２個以上のアミノ酸の長さのアミノ酸配列を指す。リンカーは、中性又は非極性アミノ酸からなり得る。リンカーは、例えば２〜１００個のアミノ酸の長さであり得、例えば、２〜５０個のアミノ酸の長さであり得、例えば、３個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、又は５０個のアミノ酸の長さであり得る。リンカーは、例えば自己開裂又は酵素的若しくは化学的開裂により、「開裂可能」であり得る。アミノ鎖配列中の開裂部位、並びにそのような部位で開裂する酵素及び化学物質は、当分野で周知であり、本明細書でも説明されている。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、用語「ジスルフィド結合」又は「システイン−システインジスルフィド結合」は、システインの硫黄原子が酸化されてジスルフィド結合を形成する２つシステインの間の共有結合的相互作用を指す。ジスルフィド結合の平均結合エネルギーは、水素結合の場合の１〜２ｋｃａｌ／ｍｏｌと比較して約６０ｋｃａｌ／ｍｏｌである。本発明の文脈において、ジスルフィド結合を形成するシステインは一本鎖抗体のフレームワーク領域内に存在し、この抗体の高次構造を安定化させるのに役立つ。システイン残基は、分子内で安定化ジスルフィド結合を作り得るように、例えば部位特異的変異誘発により導入され得る。
【０１０８】
「ノブインホール命名」は、「突起及び空洞」命名と類似しており、互換的に使用され得る。
「突起」又は「ノブ」は、少なくとも１つのアミノ酸側鎖であって、第１のポリペプチドの界面から突出しており、したがって、ヘテロ二量体を安定化させ、それにより例えばホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成を有利にするによう、隣接する界面（即ち、第２のポリペプチドの界面）中の代償性空洞中に配置可能であるアミノ酸側鎖を指す。この突起は、元々の界面中に存在していてもよいし、（例えば、この界面をコードする核酸を変更することにより）合成により導入されてもよい。通常、第１のポリペプチドの界面をコードする核酸は、この突起をコードするように変更される。これを達成するため、第１のポリペプチドの界面にある少なくとも１個の元々のアミノ酸残基をコードする核酸が、元々のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有する少なくとも１個のインポートアミノ酸残基をコードする核酸に置き換えられる。置き換えられる元々の残基の数の上限は、第１のポリペプチドの界面中の残基の総数である。突起の形成のためのある特定のインポート残基は、一般に、天然に存在するアミノ酸残基であり、好ましくは、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）から選択される。
【０１０９】
突起又はノブは空洞又は孔の中で「位置決め可能」であり、このことは、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドそれぞれの界面上の突起及び空洞の空間的位置、並びに突起及び空洞のサイズが、この界面での第１及び第２のポリペプチドの正常な関連を顕著に乱すことなく突起が空洞中に位置し得るようなものであることを意味する。フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）等の突起は、典型的には界面の軸から垂直には伸びていないことから、突起の対応する空洞とのアラインメントは、Ｘ線結晶学又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）により得られるもの等の３次元構造に基づいて突起／空洞対をモデル化することに依存している。このことを、当分野で広く許容されている技術を使用して達成し得る。
【０１１０】
「空洞」又は「孔」は、少なくとも１つのアミノ酸側鎖であって、第２のポリペプチドの界面から陥没しており、したがって第１のポリペプチドの隣接する界面上の対応する突起を収容するアミノ酸側鎖を指す。この空洞は、元々の界面中に存在していてもよいし、（例えば、この界面をコードする核酸を変更することにより）合成により導入されてもよい。通常、第２のポリペプチドの界面をコードする核酸は、この空洞をコードするように変更される。これを達成するため、第２のポリペプチドの界面にある少なくとも１個の元々のアミノ酸残基をコードする核酸が、元々のアミノ酸残基より小さい側鎖体積を有する少なくとも１個の「インポート」アミノ酸残基をコードするＤＮＡに置き換えられる。置き換えられる元々の残基の数の上限は、第２のポリペプチドの界面中の残基の総数である。空洞の形成のためのある特定のインポート残基は、通常、天然に存在するアミノ酸残基であり、好ましくは、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）から選択される。
【０１１１】
用語「界面」、「界面残基」、「界面アミノ酸」、「接触残基」、又は「接触アミノ酸」は、本明細書に使用されるとき、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの接触に関与し得るドメインに存在する任意のアミノ酸残基を典型的に指す。
【０１１２】
「元々のアミノ酸」残基は、元々の残基より小さい又は大きな側鎖体積を有することができる「インポートアミノ酸」残基に置き換えられるものである。インポートアミノ酸残基は、天然に存在するか又は天然には存在しないアミノ酸残基であり得るが、好ましくは前者である。「天然に存在する」アミノ酸残基とは、遺伝子コードによりコードされる残基のことである。「天然には存在しない」アミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされないがポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基に共有結合し得る残基を意味する。天然には存在しないアミノ酸残基の例は、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、及び例えばＥｌｌｍａｎ他，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１〜３３６（１９９１）で説明されているもの等の他のアミノ酸残基類似体である。一部の態様において、本発明の方法は、少なくとも１個の元々のアミノ酸残基を置き換えることを伴ってもよいが、１個を超える元々のアミノ酸残基が置き換えられてもよい。通常、第１又は第２のポリペプチドの界面中の全残基以下が、置き換えられる元々のアミノ酸残基を含み得る。
【０１１３】
用語「競合する」は、抗体に関して本明細書で使用される場合、第１の抗体又はその抗原結合フラグメント（若しくは一部）が、第２の抗体又はその抗原結合部分の結合と十分に類似する方法でエピトープに結合し、そのため、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下では、第１の抗体とその同種エピトープとの結合の結果が検出できるほどに減少することを意味する。第２の抗体のそのエピトープへの結合も第１の抗体の存在下で検出できるほどに減少するという選択肢も可能であるが、必ずしもそうではない。即ち、第１の抗体は、第２の抗体が第１の抗体のそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく、第２の抗体のそのエピトープへの結合を阻害し得る。しかしながら、各抗体が他の抗体とその同種のエピトープ又はリガンドとの結合を、同程度まで、より大きい程度まで、又はより低い程度まで検出できるほどに阻害する場合、抗体は、それぞれのエピトープの結合に関して互いに「交差競合する」と言われる。競合及び交差競合抗体の両方が、本発明に包含される。そのような競合又は交差競合が起こるメカニズム（例えば、立体障害、高次構造変化、又は共通エピトープ若しくはその一部への結合）にもかかわらず、当業者は、本明細書で提供される教示に基づいて、そのような競合及び／又は交差競合抗体が包含され、本明細書で開示されている方法に有用であり得ることを認識するであろう。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上の結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を指す。目的の分子のＡＤＣＣ活性を、インビトロでのＡＤＣＣアッセイ（例えば、米国特許第５，５００，３６２号明細書又は同第５，８２１，３３７号明細書で説明されているもの）を使用して評価し得る。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又はＮＫ細胞が挙げられる。或いは、又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ他，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），９５：６５２〜６５６，１９９８で説明されているもの等の動物モデルにおいて、インビボで評価してもよい。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的の溶解を指す。補体活性化経路は、補体系の第１の構成要素（Ｃ１ｑ）の、同種抗原と複合体を形成した分子（例えば抗体）への結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３，１９９６で説明されているＣＤＣアッセイを実施し得る。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、用語「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、及び類似の用語は、抗原（例えばエピトープ又は免疫複合体）に特異的に結合するが別の分子には特異的に結合しない分子（例えば結合ドメイン）を指す。抗原に特異的に結合する分子は、当分野で公知のアッセイ（例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、又は他のアッセイ）により決定した場合により低い親和性で、他のペプチド又はポリペプチドに結合してもよい。好ましくは、抗原に特異的に結合する分子は、他のタンパク質と交差反応しない。
【０１１７】
適切な「中程度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液による予備洗浄；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣ、一晩でのハイブリダイズ；続いて、０．１％  ＳＤＳを含む２×、０．５×、及び０．２Ｘ  ＳＳＣのそれぞれによる２０分にわたる６５℃での２回の洗浄を含む。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「高度にストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェンシー条件」とは、下記のことである：（１）洗浄のために、低イオン強度及び高温を用いるもの（例えば、５０℃での、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム）；（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミド等の変性剤を用いるもの（例えば、４２℃での５０％（体積／体積）ホルムアミド及び０．１％  ウシ血清アルブミン／０．１％  Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％  ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）；又は（３）４２℃で、５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％  ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％  ＳＤＳ、及び１０％  硫酸デキストランを用い、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）により４２℃で洗浄し、次いで５５℃で５０％  ホルムアミドにより洗浄し、続いて、５５℃で、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄するもの。当業者は、プローブ長及び同類のもの等の因子に対応するために、必要に応じて温度、イオン強度等を調整する方法を認識するであろう。
【０１１９】
結合タンパク質、結合ドメイン、ＣＤＲ、又は抗体（本明細書で広義に定義されているもの）を、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両方の蓄積、ＡｂＭ、接触、Ｎｏｒｔｈ、及び／又は当分野で周知の高次構造定義若しくはＣＤＲ決定の任意の方法に従って同定し得る。例えば、Ｋａｂａｔ他，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版（超可変領域）；Ｃｈｏｔｈｉａ他，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７〜８８３，１９８９（構造的ループ構造）を参照されたい。ＣＤＲを構成する特定の抗体中のアミノ酸残基の同一性を、当分野で周知の方法を使用して決定し得る。ＣＤＲのＡｂＭ定義は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの妥協案であり、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を使用する。ＣＤＲの「接触」定義は、ＭａｃＣａｌｌｕｍ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２〜７４５，１９９６で記載されている抗原接触の観察に基づく。ＣＤＲの「高次構造」定義は、抗原結合にエンタルピー的に寄与する残基に基づく（例えば、Ｍａｋａｂｅ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８３：１１５６〜１１６６，２００８を参照されたい）。Ｎｏｒｔｈは、ＣＤＲ定義の異なる好ましいセットを使用して、基準のＣＤＲ高次構造を同定している（Ｎｏｒｔｈ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０６：２２８〜２５６，２０１１）。本明細書ではＣＤＲの「高次構造定義」と称される別のアプローチでは、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的に寄与する残基として同定され得る（Ｍａｋａｂｅ他，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：１１５６〜１１６６，２００８）。他のＣＤＲ境界の定義は、上記のアプローチの内の１つに厳密に従わない場合があるにもかかわらず、特定の残基若しくは残基の群又はさらにはＣＤＲ全体が抗原結合に有意な影響を及ぼさないという予測又は実験的知見を考慮して短縮されていてもよいし延長されていてもよいが、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲの少なくとも一部と重複するであろう。本明細書で使用される場合、ＣＤＲは、アプローチの組み合わせ等の当分野で公知の任意のアプローチにより定義されたＣＤＲを指し得る。本明細書で使用される方法は、これらのアプローチの内のいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用し得る。複数のＣＤＲを含む任意の所与の態様の場合、ＣＤＲ（又は抗体の他の残基）は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張（Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの組み合わせ）、Ｎｏｒｔｈ、拡張、ＡｂＭ、接触、及び／又は高次構造定義の内のいずれかに従って定義され得る。
【０１２０】
可変ドメイン中の残基は、Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされ、Ｋａｂａｔは、抗体の編集物の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域に使用されるナンバリングシステムである。Ｋａｂａｔ他，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１を参照されたい。このナンバリングシステムを使用することにより、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変領域のＦＲ又はＣＤＲへの短縮又はこれらへの挿入に対応するより少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変領域は、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）、並びに重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ）を含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリングがされた配列との抗体の配列の相同性の領域でのアラインメントにより、所与の抗体に関して決定され得る。Ｋａｂａｔナンバリングを割り当てるための様々なアルゴリズムが利用可能である。本明細書では、Ａｂｙｓｉｓ  （ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ）のバージョン２．３．３．リリースで実装されたアルゴリズムを使用して、可変領域ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＬ  ＣＤＲ３、ＶＨ  ＣＤＲ２、及びＶＨ  ＣＤＲ３へのＫａｂａｔナンバリングの割り当てを行った。ＡｂＭの定義がＶＨ  ＣＤＲ１に使用された。抗体での特定のアミノ酸残基の位置をまた、Ｋａｂａｔに従ってナンバリングし得る。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、用語「ファージディスプレイライブラリー」は、バクテリオファージの集団を指し、このバクテリオファージの各々は、表面タンパク質にインフレームで組換えにより融合した外来性ｃＤＮＡを含む。ファージは、その表面上でｃＤＮＡによりコードされる外来性タンパク質を提示する。細菌宿主（典型的には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））での複製の後、目的の外来性ｃＤＮＡを含むファージを、このファージ表面上での外来性タンパク質の発現により選択する。
【０１２２】
用語「エピトープ」は、パラトープとして公知の抗体の抗原結合領域の内の１つ又は複数で抗体により認識され得る、抗体と接触し得る、及び／又は抗体と結合し得る分子の部分を指す。単一の抗原は複数のエピトープを有し得る。そのため、様々な抗体が、抗原上の様々な領域に結合し得、様々な生物学的効果を有し得る。エピトープは、アミノ酸又は糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面グループからなることが多く、特異的な三次元構造特性及び特異的な電荷特性を有する。本明細書で使用される場合、エピトープは、高次構造であってもよいし線状であってもよい。高次構造的エピトープは、線状ポリペプチド鎖の様々なセグメント由来のアミノ酸を空間的に並置することにより生じる。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基により生じたものである。ある特定の態様では、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、又はスルホニル基の部分を含み得る。
【０１２３】
用語「抗原性エピトープ」は、本明細書で使用される場合、当分野で周知の任意の方法により（例えば従来のイムノアッセイにより）決定した場合に、抗体が特異的に結合し得るポリペプチドの一部として定義される。「非線状エピトープ」又は「高次構造的エピトープ」は、エピトープに特異的な抗体が結合する抗原性タンパク質内の不連続なポリペプチド（又はアミノ酸）を含む。抗原上の所望のエピトープが決定されると、例えば本明細書で説明されている技術を使用して、このエピトープに対する抗体を生成し得る。
【０１２４】
用語「特異的結合」又は「特異的に結合する」は、抗体とタンパク質又はペプチドとの相互作用に関して使用される場合、タンパク質上の特定の構造（即ち、抗原性決定因子又はエピトープ）の存在に依存する相互作用を指し、換言すると、抗体は、一般的のタンパク質ではなく特定のタンパク質構造を認識して結合している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合には、標識「Ａ」及びこの抗体を含む反応における、エピトープＡ（又は遊離の標識されていないＡ）を含むタンパク質の存在により、この抗体に結合する標識Ａの量が減少する。
【０１２５】
ある特定の態様では、「特異的に結合する」は、例えば、抗体が約０．１ｎＭ以下（より通常は約１μＭ未満）のＫＤでタンパク質に結合することを意味する。ある特定の態様では、「特異的に結合する」は、抗体が、時には少なくとも約０．１μＭ以下のＫＤで標的に結合し、他の時には少なくとも約０．０１μＭ以下のＫＤで標的に結合し、他の時には少なくとも約１ｎＭ以下のＫＤで標的に結合することを意味する。様々な種での相同タンパク質間の配列同一性のために、特異的結合は、複数の種でのタンパク質（例えばヒトＧＵＣＹ２ｃ及びマウスＧＵＣＹ２ｃ）を認識する抗体を含み得る。同様に、様々なタンパク質のポリペプチド配列のある特定の領域内での相同性のために、特異的結合は、複数種のタンパク質を認識する抗体を含み得る。ある特定の態様では、第１の標的に特異的に結合する抗体又は結合部分は、第２の標的に特異的に結合してもよいし特異的に結合しなくてもよいことが理解される。したがって、「特異的結合」は、排他的結合（即ち、単一標的への結合）を（含み得るが）必ずしも必要としない。そのため、抗体は、いくつかの態様では、複数種の標的に特異的に結合し得る。ある特定の態様では、複数の標的は、抗体上の同一の抗原結合部位に結合し得る。例えば、抗体は、ある特定の場合には、２つの同一の抗原結合部位を含み得、これらの各々は、２種以上のタンパク質上の同一のエピトープに特異的に結合する。ある特定の代替的な態様では、抗体は多重特異性であり得、特異性が異なる少なくとも２つの抗原結合部位を含み得る。非限定的な例として、二重特異性抗体は、１種のタンパク質（例えばヒトＣＤ３）上のエピトープを認識する１つの抗原結合部位を含み得、第２のタンパク質上の異なるエピトープを認識する第２の異なる抗原結合部位をさらに含み得る。一般に、結合への言及は特異的結合を意味するが、必ずしもそうではない。
【０１２６】
抗原に特異的に結合する抗体は、当分野で公知のアッセイ（例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、又は他のアッセイ）により決定した場合に、より低い親和性で他のペプチド又はポリペプチドに結合し得る。好ましくは、抗原に特異的に結合する抗体は、他のタンパク質と交差反応しない。
【０１２７】
用語「非特異的結合」又は「バックグラウンド結合」は、抗体とタンパク質又はペプチドとの相互作用に関して使用される場合、特定の構造の存在に依存しない相互作用を指す（即ち、抗体は、エピトープ等の特定の構造ではなく一般のタンパク質に結合している）。
【０１２８】
用語「Ｋｏｎ」又は「Ｋａ」は、本明細書で使用される場合、抗原への抗体の会合に関する速度定数を指す。具体的には、速度定数（ｋｏｎ／ｋａ及びｋｏｆｆ／ｋｄ）並びに平衡解離定数は、全抗体（即ち二価）及び単量体ＧＵＣＹ２ｃタンパク質を使用して測定される。
【０１２９】
用語「ｋｏｆｆ」又は「ｋｄ」は、本明細書で使用される場合、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関する速度定数を指す。
用語「ＫＤ」は、本明細書で使用される場合、抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指す。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、用語「結合親和性」は、一般に、分子（例えば抗体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合的な相互作用の合計の強さを指す。別途示さない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する内在性結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（ＫＤ）で表され得る。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（ＫＤ）で表され得る。例えば、Ｋｄは、約２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、又はより高い値であり得る。親和性を、本明細書で説明されているもの等の当分野で公知の一般的な方法により測定し得る。低親和性抗体は、一般に、抗原とゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般に、より速く抗原に結合し、より長く結合し続ける傾向がある。結合親和性を測定するための様々な方法が当分野で知られており、これらの内のいずれかを、本発明の目的のために使用し得る。特に、用語「結合親和性」は、特定の抗原−抗体相互作用の解離速度を指すことが意図されている。ＫＤは、「オフ速度（ｋｏｆｆ）」とも呼ばれる解離速度と、会合速度（即ち「オン速度（ｋｏｎ）」）との比率である。そのため、ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎと等しく、モル濃度（Ｍ）で表される。したがって、ＫＤが小さいほど結合の親和性がより強いということになる。したがって、１μＭのＫＤは、１ｎＭのＫＤと比較して弱い結合親和性を示す。抗体のＫＤ値を、当分野で十分に確立されている方法を使用して決定し得る。抗体のＫＤを決定するための１つの方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用することにより、典型的には、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム等のバイオセンサシステムを使用することによる。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）キネティック分析は、表面上に分子（例えば、エピトープ結合ドメインを含む分子）が固定されているチップからの抗原の結合及び解離を分析することを含む。抗体のＫＤを決定するための別の方法は、バイオレイヤー干渉法を使用することにより、典型的にはＯＣＴＥＴ（登録商標）技術（Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅシステム、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用することによる。
【０１３１】
本発明の二重特異性抗体、例えば、抗体、フラグメント、又はこれらに誘導体に関する「生物学的活性な」、「生物学的活性」、及び「生物学的特性」は、別途指定される場合を除き、生物学的分子に結合する能力を有することを意味する。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」及び「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の組み合わせ又はハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、並びにＤＮＡ又はＲＮＡ分子の類似体を含む。そのような類似体を、例えばヌクレオチド類似体（イノシン又はトリチル化塩基が挙げられるが、これらに限定されない）を使用して生成し得る。そのような類似体はまた、この分子に有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性、又は細胞膜を横断する能力の増加）を付与する改変骨格を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子も含み得る。核酸配列又はヌクレオチド配列は、一本鎖であり得、二本鎖であり得、一本鎖及び二本鎖部分の両方を含んでもよく、三本鎖部分を含んでもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【０１３３】
本発明はまた、本発明の抗体（例えば、この抗体のポリペプチド及び結合領域）をコードするポリヌクレオチドも含む。当分野で公知の任意の方法により、本発明の分子をコードするポリヌクレオチドを得ることができ、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。
【０１３４】
本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、下記を含んでもよい：バリアントのコード配列のみ、バリアントのコード配列及び追加のコード配列（例えば、機能性ポリペプチド、又はシグナル、又は分泌配列、又は前駆タンパク質配列）；抗体のコード配列及び非コード配列（例えば、この抗体のコード配列のイントロン又は非コード配列５’及び／若しくは３’）。用語「抗体をコードするポリヌクレオチド」は、バリアントの追加のコード配列を含むポリヌクレオチドを包含するが、追加のコード及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドも包含する。当分野では、特定の宿主細胞／発現系に最適化されているポリヌクレオチド配列を、所望のタンパク質のアミノ酸配列から容易に得ることができることが知られている（ＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）ＡＧ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙを参照されたい）。
【０１３５】
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、追加の保存的又は非必須アミノ酸置換を有することがあり、ポリペプチド機能に対して実質的な影響を有さない。特定の置換が許容されるかどうかを、即ち、結合活性等の所望の生物学的特性に悪影響を及ぼさないかどうかを、Ｂｏｗｉｅ，ＪＵ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６〜１３１０，１９９０又はＰａｄｌａｎ他，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３〜１３９，１９９５で説明されているように決定し得る。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、元々の環境（例えば、天然に存在する場合には天然環境）から取り出されている物質を指す。例えば、生きている動物中に存在する天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、天然系で共存する物質の一部又は全てから分離されている同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、及び／又はそのようなポリヌクレオチド若しくはポリペプチドは、このポリヌクレオチド若しくはポリペプチドを含む単離細胞若しくは培養細胞を含む組成物（例えば混合物、溶液、若しくは懸濁液）の一部であり得、このベクター又は組成物はその天然環境の一部ではないという点で、依然として単離されている。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、用語「レプリコン」は、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律的単位として機能する任意の遺伝学的エレメント（例えば、プラスミド、染色体、又はウイルス）を指す。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結されている」は、説明されている成分が、その意図された様式で機能することを可能にする関係にある状況を指す。例えば、コード配列に「作動可能に連結されている」制御配列は、このコード配列の発現がこの制御配列に適切か又は適合した条件下で達成されるような様式で連結されている。一般に、「作動可能に連結されている」は、連結されているＤＮＡ配列が連続していることを意味しており、分泌リーダーの場合には、連続しており、読み取り段階にある。しかしながら、エンハンサーは、必ずしも連続してはいない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを、従来の慣例に従って使用する。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、宿主細胞中で目的の１種又は複数種の遺伝子又は配列を送達し得、好ましくは発現し得る構築物を意味する。ベクターの例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ウイルスベクター、裸のＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性縮合剤と関連するＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されているＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、及び産生細胞等のある特定の真核細胞。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、用語「発現制御配列」又は「制御配列」は、連結されているコード配列の発現を達成するのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる。例えば、原核生物では、そのような制御配列として、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、及びターミネーターが挙げられ、場合によってはエンハンサーが挙げられる。そのため、用語「制御配列」は、存在が発現に必要である最小限の全ての構成要素を含むことが意図されており、存在が有利である追加の成分（例えばリーダー配列）も含んでもよい。
【０１４１】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入物の組込みのためにベクターのレシピエントであり得るか又はレシピエントである個々の細胞又は細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、この子孫は、天然の、偶発的変異、又は意図的変異に起因して、元々の親細胞と（形態的に又はゲノムＤＮＡ相補で）必ずしも完全に同一ではない場合がある。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドによりインビボでトランスフェクトされた細胞を含む。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「哺乳類細胞」は、ヒト、ラット、マウス、モルモット、チンパンジー、又はマカク等の哺乳類に由来する細胞への言及を含む。この細胞は、インビボで培養されてもよいしインビトロで培養されてもよい。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、用語「精製された生成物」は、この生成物が通常関連する細胞成分から及び／又は目的のサンプル中に存在し得る他のタイプの細胞から単離されている生成物の調製物を指す。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋」は、少なくとも５０％純粋（即ち、夾雑物を含まない）であり、より好ましくは少なくとも９０％純粋であり、より好ましくは少なくとも９５％純粋であり、さらにより好ましくは少なくとも９８％純粋であり、最も好ましくは少なくとも９９％純粋である物質を指す。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、用語「癌」又は「がんに由来する」は、典型的には、細胞の異常な制御されていない増殖の結果として生じる制御されていない細胞の増殖、新生物、又は腫瘍を特徴とする哺乳類の生理学的状態を指すか、又は説明する。いくつかの側面では、癌は、局所に留まっている、転移を伴わない悪性原発腫瘍を指す。他の側面では、癌は、隣接する身体の構造に浸潤して破壊し、遠位の部位まで広がっている悪性腫瘍を指す。いくつかの側面では、癌は、特定の癌抗原と関連している。がんの例には、口腔及び咽頭、消化器系（例えば、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、虫垂、胆管、及び膵臓）、又は内分泌系のがんが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の態様において、消化器系のがんは、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、虫垂、胆管、及び膵臓のがんである。
【０１４６】
本明細書に使用されるとき、用語「食道がん」は、食道がんを食道の細胞のがんにより特徴づけられる医学的状態と定義する、十分に認められた医学的定義を含むことが意図される。食道がんの例には、腺癌、扁平上皮癌、絨毛癌、リンパ腫、肉腫、及び小細胞がんが含まれる。
【０１４７】
「胃腸」（ＧＩ）がんは、消化器系に影響を与えるがんの群についての用語である。本明細書に使用されるとき、用語「胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）」又は「胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）」は、胃がんを胃の細胞のがんにより特徴づけられる医学的状態と定義する、十分に認められた医学的定義を含むことが意図される。特に、胃がんは、悪性腫瘍細胞が胃の裏層内に形成される疾患である。胃がんは、胃の任意の部分に発生することができ、胃の全体にわたって、並びに他の臓器に、特に食道、肺及び肝臓に拡散することがある。
【０１４８】
本明細書に使用されるとき、用語「結腸直腸がん」又は「腸がん」は、結腸直腸がんを小腸の下側の腸管（即ち、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ字結腸を含む大腸（結腸）及び直腸）の細胞のがんにより特徴づけられる医学的状態と定義する、十分に認められた医学的定義を含むことが意図される。加えて、本明細書に使用されるとき、用語「結腸直腸がん」は、十二指腸、並びに小腸（空腸及び回腸）の細胞のがんにより特徴づけられる医学的状態をさらに含むことが意図される。本明細書に使用される結腸直腸がんの定義は、一般的な医学的定義より広義であるが、十二指腸及び小腸の細胞もＧＵＣＹ２ｃを含有するのでこのように提示される。
【０１４９】
本明細書に使用されるとき、用語「悪性腫瘍細胞」又は「悪性腫瘍」は、侵襲性である及び／又は、転移する可能性がある腫瘍又は腫瘍細胞、即ち、癌細胞を指す。
本明細書に使用されるとき、用語「処置する」、「処置すること」、又は「処置」は、有益な又は所望の臨床結果を得る手法である。本発明の目的において、処置とは、ＧＵＣＹ２ｃ抗体分子（例えば、ＧＵＣＹ２ｃモノクローナル抗体又はＧＵＣＹ２ｃ二重特異性若しくは多重特異性抗体）を対象に、例えば患者に投与することと定義される。そのような投与は、例えば、対象に直接投与すること、又は対象から単離された組織若しくは細胞に適用し、対象に戻すことであり得る。ＧＵＣＹ２ｃ抗体分子を、単独で又は１種若しくは複数種の薬剤との組み合わせで投与し得る。処置は、障害、障害の症状、又は障害に向かう素因（例えば癌）を治療する（ｃｕｒｅ）、治癒させる、緩和する、変える、治療する（ｒｅｍｅｄｙ）、寛解させる、軽減する、改善する、又は影響を及ぼすことであり得る。一部の態様において、処置は、以下のうちの任意の１つ以上によって有用である。（ａ）対象における悪性腫瘍細胞発現ＧＵＣＹ２ｃに関連する状態（例えば、結腸直腸がん（ＣＲＣ）などの胃腸関連がん）の１つ以上の症状を処置、予防又は改善すること、（ｂ）悪性腫瘍発現ＧＵＣＹ２ｃを有する対象において腫瘍増殖又は進行を阻害すること、（ｃ）ＧＵＣＹ２ｃを発現する１個以上の悪性腫瘍細胞を有する対象において、ＧＵＣＹ２ｃを発現するがん（悪性腫瘍）細胞の転移を阻害すること、（ｄ）ＧＵＣＹ２ｃを発現する腫瘍の退縮（例えば、長期退縮）を誘導すること、（ｅ）ＧＵＣＹ２ｃを発現する悪性腫瘍細胞に細胞障害活性を発揮すること、（ｆ）ＧＵＣＹ２ｃ関連障害を有する対象の無増悪生存期間を延ばすこと、（ｇ）ＧＵＣＹ２ｃ関連障害を有する対象の全生存期間を延ばすこと、（ｈ）ＧＵＣＹ２ｃ関連障害を有する対象における追加の化学療法又は細胞障害剤の使用を減少させること、（ｉ）ＧＵＣＹ２ｃ関連障害を有する対象において腫瘍負荷を減少させること、又は（ｊ）ＧＵＣＹ２ｃとまだ同定されていない他の因子との相互作用をブロックすること。理論に拘束されることを望まないが、処置により、インビトロ又はインビボでの細胞の阻害、切除、若しくは死滅が引き起こされるか、又は障害（例えば、癌等の本明細書で説明されている障害）を媒介する細胞（例えば異常細胞）の能力の別の方法による低下が引き起こされると考えられる。
【０１５０】
「止痢剤」は、本明細書に使用されるとき、下痢を中止又は緩徐する薬を意味する。ラクトース、アルコール、高浸透圧製品の中止を伴った液体投与を含むことがある支持ケアに加えて、これらの止痢剤は、ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性剤と同時に又は組み合わせて投与され得る。止痢剤には、次没食子酸ビスマス、ラクトバチルス・アシドフィルス、サッカロマイセス・ブラウディ、ロペラミド／シメチコン、アトロピン／ジフェノキシラート、アトロピン／ジフェノキシン、サッカロマイセス・ブラウディｌｙｏ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ロペラミド、次サリチル酸ビスマス、ラクトバチルス・アシドフィルス／ラクトバチルス・ブルガリクス、ラクトバチルス・ラムノサス、アタパルジャイト、クロフェレマー、フルオロキノロン、抗生物質、又はオクトレオチドが含まれるが、これらに限定されない。Ｂｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｉａｒｒｈｅａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４：２９１８−２９２６，２００４を参照すること。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、特定の処置のレシピエントとなるべきあらゆる動物（例えば哺乳類；例えば、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、及び同類のも）を含むように意図されている。例えば、対象は、癌を有する患者（例えば、ヒト患者又は動物患者）であり得る。典型的には、用語「対象」、「個体」、及び「患者」は、ヒト対象に関連して本明細書では互換的に使用される。
【０１５２】
本発明の「非ヒト動物」は、特に断りのない限り、全ての非ヒト脊椎動物を含み、例えば非ヒト哺乳類及び非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類、マウス、ラット、ウサギ、又はヤギ等を含む。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、ヒト等の動物での使用のために、連邦政府若しくは州政府の規制機関により承認されている（若しくは承認可能）か又は米国薬局方若しくは他の一般的に承認された薬局方に列挙されている製品又は化合物を指す。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される賦形剤、担体、若しくはアジュバント」、又は「許容される医薬担体」は、本開示の少なくとも１種の抗体と一緒に対象に投与され得、この抗体の活性を破壊しない賦形剤、担体、又はアジュバントを指す。この賦形剤、担体、又はアジュバントは、治療効果を送達するのに十分な用量の抗体と共に投与される場合には、無毒であるべきである。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、用語「寛解させる」は、本発明の抗体分子を投与しない場合と比較して、１種又は複数種の症状の軽減又は改善を意味する。「寛解させる」はまた、症状の持続期間の短縮又は減少も含む。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、及び「予防」は、予防又は治療薬の投与の結果としての対象の障害の１種又は複数種の症状の再発又は発症の予防を指す。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、「有効な量」、「治療上有効な量」、「治療上十分な量」、又は「有効な投与量」は、疾患、障害若しくは副作用の予防、治癒、寛解、処置、若しくは管理において、又は疾患若しくは障害の進行速度の低下において、又は本明細書で説明されているような障害を有する対象の状態のそのような処置がない場合に予想されるものを超える延長、治療、緩和、軽減、若しくは改善において、対象への単一の又は複数回の用量の投与時に有効な又は十分な治療薬の任意の量を指す。この用語はまた、正常な生理学的機能を向上させるのに有効な範囲の量も含む。有効な量は、１種又は複数種の治療薬の投与の文脈で考慮され得、１種又は複数種の他の薬剤との組み合わせで、望ましい結果であり得るか又は達成される場合には、単一の薬剤は有効な量で投与されると考えられ得る。
【０１５８】
本明細書に使用されるとき、腫瘍又はがんの「増殖を阻害する」とは、増殖及び／又は転移を緩徐、中断、阻止、又は中止することを指し、必ずしも腫瘍増殖の完全な排除を示すとは限らない。
【０１５９】
力価とは、所与の強度の効果を生じるのに必要な量に関して表される治療薬の活性の尺度のことである。比較的高い力価の薬剤は、低濃度で比較的小さい反応を引き起こす比較的低い力価の薬剤と比較して、低濃度でより高い反応を引き起こす。力価は、親和性及び有効性の関数である。有効性は、標的リガンドへの結合時に生物学的反応を引き起こす治療薬の能力と、この反応の定量的な大きさとを指す。本明細書で使用される場合、用語「半数効果濃度（ＥＣ５０）」は、指定の暴露時間後にベースラインと最大との間の中間で反応を引き起こす治療薬の濃度を指す。治療薬は、阻害又は刺激を引き起こし得る。ＥＣ５０値は、力価の指標として一般に使用されており、本明細書で使用される。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、「併用療法」又は「と組み合わせた」投与は、複数種の予防及び／又は治療剤の使用を指す。用語「併用療法」又は「組み合わせ」の使用は、予防及び／又は治療剤が障害を有する対象に投与される順序を制限しない。換言すると、併用療法は、治療剤で別々に、逐次に、又は同時に処置することにより行われ得る。「逐次投与の」場合、最初に投与される薬剤は、２番目の薬剤が投与されたか又は対象中で活性になる場合に、対象に何らかの生理学的効果を発揮し得る。
【０１６１】
用語「同時投与」は、予防及び／又は治療剤の投与と関連して本明細書で使用される場合、個々の薬剤が同時に対象内で存在するような薬剤の投与を指す。同時投与は、分子を単一組成物に配合することにより影響を及ぼされてもよいし、別々の組成物を同時に又は同様の時間に投与することで達成されてもよい。逐次投与は、必要に応じて任意の順序であり得る。
【０１６２】
本明細書に使用されるとき、「ＧＵＣＹ２ｃ」は、哺乳類グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２ｃ）、好ましくはヒトＧＵＣＹ２ｃタンパク質を指す。用語「ＧＵＣＹ２ｃ」は、用語「ＧＵＣＹ２Ｃ」と交換可能に使用され得る。ヒトＧＵＣＹ２ｃのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−００４９６３により開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ヒトＧＵＣＹ２ｃのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−００４９５４により開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６３】
典型的には、天然に生じる対立遺伝子バリアントは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−００４９５４に記載されるタンパク質に少なくとも９５％、９７％、又は９９％の同一性のあるアミノ酸配列を有する。ＧＵＣＹ２ｃタンパク質は、膜貫通細胞表面受容体タンパク質であることが特徴づけられており、腸液、電解質恒常性、及び細胞繁殖の維持に重要な役割を果たすと考えられている。
【０１６４】
本明細書に使用されるとき、「ＧＵＣＹ２ｃに結合する抗体」、「ＧＵＣＹ２ｃを認識する抗体」、「抗ＧＵＣＹ２ｃ抗体」、「抗ＧＵＣＹ２ｃ抗体分子」、又は「ＧＵＣＹ２ｃ抗体」は、抗体（本明細書に定義されている）の少なくとも１個の結合ドメインと、抗ＧＵＣＹ２ｃ抗体（本出願に定義されている）の少なくとも１個の結合ドメインとを組み合わせる分子を含む。本発明のＧＵＣＹ２ｃ抗体分子には、ＧＵＣＹ２ｃ、例えば、ヒトＧＵＣＹ２ｃ、マウスＧＵＣＹ２ｃ、ラットＧＵＣＹ２ｃ、カニクイザルＧＵＣＹ２ｃと相互作用する又はこれらを認識する、例えばこれらに結合する（例えば、特異的に結合する）抗体及びその抗原結合フラグメントが含まれる。
【０１６５】
用語「分化抗原群３」又は「ＣＤ３」は、歴史的にＴ３複合体として公知の多量体タンパク質複合体を指し、４個の特有のポリペプチド鎖、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、デルタ（δ）、及びゼータ（ζ）から構成され、３対の二量体（εγ、εδ、ζζ）として組み立てられ、機能する。ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と非共有結合的に会合して（Ｓｍｉｔｈ−Ｇａｒｖｉｎ他，２００９）Ｔリンパ球中の活性化シグナルを生じるＴ細胞共受容体として機能する。ＣＤ３タンパク質複合体は、Ｔ細胞系統の決定的な特徴であり、したがって、ＣＤ３抗体はＴ細胞マーカーとして効果的に使用され得る（Ｃｈｅｔｔｙ  ａｎｄ  Ｇａｔｔｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １７２，４，３０３−３０１（１９９４））。ＣＤ３抗体は、内因性リンホカイン産生の活性化を介して細胞傷害性Ｔ細胞の生成を誘発し、腫瘍標的を選択的に死滅し得ることがよく知られている（Ｙｕｎ他，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：４７７０〜４７７４，１９８９）。
【０１６６】
より具体的には、Ｔ細胞は、抗原特異的な免疫反応を誘導することができるＴＣＲ複合体を発現する（Ｓｍｉｔｈ−Ｇａｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕｌａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２７：１，５９１−６１９（２００９））。抗原は、免疫反応を刺激し得る、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞により発現されるペプチドである。細胞内で発現された抗原は、主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）分子に結合して表面に運ばれ、この表面でＴ細胞に曝露される。抗原との複合体におけるＭＨＣクラスＩに対するＴＣＲの結合親和性が十分である場合には、免疫シナプスの形成が開始される。免疫シナプスを介するシグナル伝達は、εδ、εγ、及びζζ二量体を形成するＣＤ３共受容体を介して媒介される。これらの二量体はＴＣＲと会合して、Ｔリンパ球中で活性化シグナルを生じさせる。このシグナル伝達カスケードは、抗原を発現する細胞のＴ細胞媒介性死滅を導く。細胞傷害は、Ｔ細胞から標的細胞へのグランザイムＢ及びパーフォリンの放出及び移動により媒介される。
【０１６７】
本明細書に使用されるとき、「ＣＤ３に結合する抗体」、「ＣＤ３を認識する抗体」、「抗ＣＤ３抗体」、「ＣＤ３抗体分子」、又は「ＣＤ３抗体」には、単一のＣＤ３サブユニット（例えば、イプシロン、デルタ、ガンマ、又はゼータ）を特異的に認識する抗体及びその抗原結合フラグメント、並びに２つのＣＤ３サブユニットの二量体複合体（例えば、ガンマ／イプシロン、デルタ／イプシロン、及びゼータ／ゼータＣＤ３二量体）を特異的に認識する抗体及びその抗原結合フラグメントが含まれる。ヒトＣＤ３イプシロンは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００７３３により示されている。本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、可溶性ＣＤ３及び／又は細胞表面発現ＣＤ３に結合することができる。可溶性ＣＤ３には、未変性ＣＤ３タンパク質、並びに組換えＣＤ３タンパク質バリアント、例えば、単量体及び二量体ＣＤ３構築物が含まれ、これらは膜貫通ドメインが欠如している、そうでなければ細胞膜と会合していない。
【０１６８】
ＣＤ３に対する抗体は、Ｔリンパ球中で活性化シグナルを生じ得る。他のＴ細胞活性化リガンド（例えば、限定されないが、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ２７）も使用し得る。
【０１６９】
ＣＤ３二重特異性抗体は、ＭＨＣ−ペプチド／ＴＣＲ結合の必要性を回避し、代わりにＴ細胞を動員して、細胞表面抗原を発現する細胞を標的にする。一群の二重特異性剤は、腫瘍会合細胞表面抗原に結合し、他の群は、Ｔ細胞のＴＣＲ複合体の一部であるＣＤ３タンパク質に結合する。二重特異性抗体を介したＴ細胞のＣＤ３及び腫瘍細胞の標的抗原の共結合（ｃｏ−ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、細胞障害性反応をもたらす。したがって、理論に束縛されることなく、本発明の二重特異性抗体は、Ｔ細胞が、複合体のＴＣＲ及びＭＨＣクラスＩと抗原との相互作用の必要性を回避することを可能にし、代わりに、Ｔ細胞に発現されたＣＤ３（例えば、ＣＤ３イプシロン）と腫瘍に発現されたＧＵＣＹ２ｃの直接共結合を介して、Ｔ細胞を標的細胞に向け直すと考えられる。
【０１７０】
本明細書に使用されるとき、用語「ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体」は、所望分子を発現している腫瘍細胞を標的にすることによって、がん細胞を対象のＴ細胞が死滅させることを利用するように設計された分子を指す。ある特定の態様において、所望の分子はヒトＧＵＣＹ２ｃである。一部の態様において、ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、２個のＦｖドメインを含む。一部の態様において、ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、ＧＵＣＹ２ｃに向けられた第１のＦｖドメイン及びＣＤ３に向けられた第２のＦｖドメインを含む。ＦｖドメインはｓｃＦｖドメインであり得る。
【０１７１】
本明細書に使用されるとき、「第１のポリペプチド」は、第２のポリペプチドと会合する任意のポリペプチドである。第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは、界面で出会う。界面に加えて、第１のポリペプチドは、「結合ドメイン」（例えば、抗体可変ドメイン、受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン若しくは酵素ドメイン）、又はＣＨ２、ＣＨ１及びＣＬドメインを含む抗体定常ドメイン（若しくは、その一部）などの１個以上の追加のドメインを含むことができる。通常は、第１のポリペプチドは、抗体から誘導される少なくとも１個のドメインを含む。このドメインは、都合よくは、抗体のＣＨ３ドメインなどの定常ドメインであり、第１のポリペプチドの界面を形成することができる。例示的な第１のポリペプチドには、抗体重鎖ポリペプチド、抗体定常ドメインと異種ポリペプチドの結合ドメインとを結合するキメラ、受容体ポリペプチド、リガンドポリペプチド、及び抗体可変ドメインポリペプチド（例えば、二重特異性抗体）が含まれる。
【０１７２】
界面に加えて、第２のポリペプチドは、「結合ドメイン」（例えば、抗体可変ドメイン、受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン若しくは酵素ドメイン）、又はＣＨ２、ＣＨ１及びＣＬドメインを含む抗体定常ドメイン（若しくは、その一部）などの追加のドメインを含むことができる。通常は、第２のポリペプチドは、抗体から誘導される少なくとも１個のドメインを含む。このドメインは、都合よくは、抗体のＣＨ３ドメインなどの定常領域であり、第２のポリペプチドの界面を形成することができる。例示的な第２のポリペプチドには、抗体重鎖ポリペプチド、抗体定常ドメインと異種ポリペプチドの結合ドメインとを結合するキメラ、及び抗体可変ドメインポリペプチド（例えば、二重特異性抗体）が含まれる。
【０１７３】
本明細書で使用される場合、用語「複合体」又は「複合体を形成している」は、ペプチド結合ではない結合及び／又は力（例えば、ファンデルワールス、疎水性、親水性力）を介して互いに相互作用する２つ以上の分子の会合を指す。一態様では、複合体はヘテロ多量体である。用語「タンパク質複合体」又は「ポリペプチド複合体」は、本明細書で使用される場合、タンパク質複合体中のタンパク質に共役した非タンパク質実体を有する複合体（例えば、限定されないが、毒素又は検出剤等の化学分子）を含むことを理解すべきである。
【０１７４】
本発明の実施又は試験では、本明細書で説明されているものと同類の又は等価のあらゆる材料及び方法を使用し得るが、好ましい材料及び方法をこれより説明する。
材料及び方法
モノクローナル抗体を製造するための従来のハイブリドーマ法、抗体（例えばキメラ抗体（例えばヒト化抗体））を製造するための組換え技術、トランスジェニック動物での抗体産生、及び「完全ヒト」抗体を調製するための最近説明されているファージディスプレイ技術を含む、抗体の製造のための様々な技術が説明されている。これらの技術を、下記で簡潔に説明する。
【０１７５】
目的の抗体に対するポリクローナル抗体を、一般に、抗原とアジュバントとの複数回の皮下（ｓｃ）注射又は腹腔内（ｉｐ）注射により、動物中で産生させ得る。抗原（又は標的アミノ酸配列を含むフラグメント）を、二官能性又は誘導体化薬剤（例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した共役）、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する））を使用して、免疫化する種において免疫原性であるタンパク質（例えば、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害物質）に共役させ得る。動物を、免疫原性の共役体又は誘導体に対して免疫化し、数週間後に、この動物を、複数部位での皮下注射により追加免疫する。７〜１４日後に、この動物を出血させ、血清を抗体価に関してアッセイする。動物を、この力価のプラトーまで追加免疫する。好ましくは、この動物を、同一抗原の共役体で追加免疫するが、異なるタンパク質及び／又は異なる架橋剤に共役させる。共役体を、タンパク質融合としての組換え細胞培養でも製造し得る。同様に、ミョウバン等の凝集剤を使用して、免疫反応を増強する。
【０１７６】
モノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５により最初に説明されたハイブリドーマ法を使用して、実質的に同種の抗体の集団から得ることができ、又は組換えＤＮＡ法（Ｃａｂｉｌｌｙ他、米国特許第４，８１６，５６７号明細書）により製造してもよい。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物を、本明細書の上記で説明されているように免疫化して、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか又は産生し得るリンパ球を誘発する。或いは、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。次いで、リンパ球を、ポリエチレングルコール等の適切な融剤を使用して骨髄細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。そのようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、未融合の親骨髄細胞の増殖又は生存を阻害する１種又は複数種の物質を好ましくは含む適切な培養培地に播種して増殖させる。加えて、このハイブリドーマ細胞を、動物中において腹水腫瘍としてインビボで増殖させてもよい。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシラパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィー）により、培養培地、腹水、又は血清から適切に分離する。
【０１７７】
抗体、抗体の抗原結合フラグメント、又は任意の抗体構築物の発現を、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／Ｏ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のような適切な原核又は真核宿主細胞で実施し得、この細胞（細胞培養上清、条件付き細胞培養上清、細胞溶解物、又は清澄化バルク）から、分泌された抗体を回収して収集する。抗体を産生する一般的な方法は、当分野で周知であり、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７：１８３〜２０２，１９９９；Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．他，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８：２７１〜２８２，１９８６；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，ＭｏＩ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１５１〜１６０，２０００；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．４８：８７０〜８８０，１９９８の総説で説明されている。特定の態様では、細胞培養物は哺乳類細胞培養物であり、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物である。
【０１７８】
様々な態様において、単離又は回収された抗体は、当該技術に既知の慣用のクロマトグラフィー法を使用して、追加の精製工程を受けることがある。具体的には、精製方法は、下記を含むように企図されるが、これらに限定されない：親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、アニオン交換クロマトグラフィー又はカチオン交換クロマトグラフィー）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシラパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、及び／又は透析。これらの中でも、好ましい精製方法は、プロテインＡクロマトグラフィーを使用することである。親和性リガンドが付着しているマトリックスは、ほとんどの場合はアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。
【０１７９】
抗体精製のための他の技術（例えば、イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相高圧クロマトグラフィー、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）によるクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）によるクロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＡ−ＰＡＧＥを使用する電気泳動、及び硫酸アンモニウム沈殿も、当分野で公知である。上記の精製方法のリストは本質的に例示にすぎず、限定的な列挙であることは意図されていない。
【０１８０】
或いは、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを免疫化時に産生可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を製造することが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖連結領域（Ｊ．ｓｕｂ．Ｈ）遺伝子のホモ接合欠失は内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが説明されている。そのような生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの導入により、抗原チャレンジにヒト抗体が産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１〜２５５；１９９３、及びＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ他，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５〜２５８，１９９３）を参照されたい。
【０１８１】
いくつかの態様では、本発明の抗体を、抗原に対する高い親和性及び他の有利な生物学的特性を保持したままヒト化し得る。非ヒト抗体のヒト化方法は、当分野で周知である。齧歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することより、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法に従ってヒト化を本質的に実施し得る（Ｊｏｎｅｓ他，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６，１９８８）。したがって、そのようなヒト化抗体はキメラ抗体であり（Ｃａｂｉｌｌｙ、上記参照）、インタクトなヒト可変ドメインと比べて実質的に少ないものが、非ヒト種由来の対応する配列に置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、ヒト抗体であって、いくつかのＣＤＲ残基、及び場合によってはいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体の類似部位由来の残基に置換されている、ヒト抗体である。抗体は、抗原に対する高い親和性及び他の有利な生物学的特性を保持したままヒト化されることが重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によれば、ヒト化抗体を、親配列及びヒト化配列の３次元モデルを使用する親配列及び様々な概念的ヒト化生成物の分析プロセスにより調製する。３次元免疫グロブリンモデルは、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定上の３次元立体配置構造を説明し、表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析が可能になり、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増加等の所望の抗体特性が達成されるように、コンセンサス配列及びインポート配列からＦＲ残基を選択して組み合わせ得る。さらなる詳細に関しては、１９９２年１２月２３日に公開された国際公開第９２／２２６５３号パンフレットを参照されたい。
【０１８２】
本発明の抗体を、当分野で公知の様々なファージディスプレイ法を使用しても生成し得る。ファージディスプレイ法では、機能性抗体ドメインは、これをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上で提示される。特定の態様では、そのようなファージを利用して、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウス）から発現された抗原結合ドメイン（例えば、Ｆａｂ及びＦｖ、又はジスルフィド結合安定化Ｆｖ）を提示し得る。例えば、標識抗原を使用するか、又は固体表面若しくはビーズに結合したか若しくは捕獲された抗原を使用して、目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、抗原により選択し得るか又は同定し得る。この方法で使用されるファージは、典型的には、ｆｄ及びＭ１３等の繊維状ファージである。抗原結合ドメインは、ファージの遺伝子ＩＩＩタンパク質又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えにより融合したタンパク質として発現される。本発明の免疫グロブリン又はそのフラグメントを製造するために使用され得るファージディスプレイ法の例として、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ他，“Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｏｆ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８２：４１〜５０，１９９５で開示されているものが挙げられる。
【０１８３】
複数種のＩｇＧアイソタイプ及びそのドメインの機能的特性は、当分野で周知である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のアミノ酸配列は、当分野で公知である。本発明の方法での使用のための特定のＩｇＧアイソタイプからの２つ以上のドメインの選択及び／又は組み合わせは、ＦｃγＲに対する親和性等の親アイソタイプの任意の公知のパラメータに基づき得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＢへの限定的な結合を示すか又は結合を示さないＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４）からの領域又はドメインの使用により、活性化受容体への結合が最大化され、阻害性受容体への結合が最小化されるように二重特異性抗体が設計されることが望ましい特定の用途が見出され得る。同様に、Ｃ１ｑ又はＦｃγＲＩＩＩＡに優先的に結合することが知られているＩｇＧアイソタイプ（例えばＩｇＧ３）からのＦｃ鎖又はドメインの使用を、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強することが当分野で知られているＦｃアミノ酸改変と組み合わせて、エフェクター機能活性（例えば、補体活性化又はＡＤＣＣ）が最大化されるように二重特異性抗体を設計し得る。同様の方法で、ＩｇＧアイソタイプのＦｃ鎖又はドメインにおいて、Ｆｃ鎖のエフェクター機能を最小化するか又は排除する変異が行われ得る。
【０１８４】
発見プロセスの間に、抗体の生成及びキャラクタリゼーションにより、望ましいエピトープに関する情報が解明され得る。次いで、この情報から、同一のエピトープへの結合に関して抗体を競合的にスクリーニングし得る。このことを達成するためのアプローチは、互いに競合するか又は交差競合する抗体を発見するために競合及び交差競合研究を実行することである（例えば、複数種の抗体が、抗原への結合に関して競合する）。一方法は、抗体が結合するエピトープを同定すること（即ち「エピトープマッピング」）である。タンパク質上のエピトープの位置をマッピングしてキャラクタライズするための多くの方法が当分野で公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９９の第１１章で説明されているような抗体−抗原複合体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子フラグメント発現アッセイ、及び合成ペプチドベースのアッセイが挙げられる。さらなる例では、エピトープマッピングを使用して、抗体が結合する配列を決定し得る。エピトープマッピングは様々な供給源から市販されており、例えばＰｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ  １５，８２１９  ＰＨ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から市販されている。さらなる例では、抗原結合ドメインの変異誘発、ドメインスワッピング実験、及びアラニン走査変異誘発を実施して、エピトープ結合に必要な、十分な、及び／又は必須の残基を同定し得る。抗原結合ドメイン相互作用の結合親和性及びオフレートを、競合結合アッセイにより決定し得る。競合結合アッセイの一例は、標識抗原のインキュベーション及び標識抗原に結合した分子の検出を含むラジオイムノアッセイである。抗原に対する本発明の分子の親和性及び結合オフレートを、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析により飽和データから決定し得る。
【０１８５】
抗原に対する本発明の抗体の親和性及び結合特性は、抗原結合ドメインに関して当分野で公知のインビトロアッセイ（生化学的又は免疫学的ベースのアッセイ；例えば、限定されないが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、バイオレイヤー干渉法、又は免疫沈降アッセイ）を使用して最初に決定し得る。本発明の分子は、インビトロベースのアッセイでのものと同様のインビボモデルでの結合特性（例えば、本明細書で説明されているもの及び開示されているもの）を有し得る。しかしながら、本発明は、インビトロベースのアッセイでは所望の表現型を示さないがインビボでは所望の表現型を示す本発明の分子を除外しない。
【０１８６】
任意選択の二重特異性抗体のフォーマットは、二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ（登録商標））タンパク質としても公知の、共有結合的に連結されている二重特異性ヘテロ二量体二特異性抗体に基づいたＦｖ誘導戦略であり、例えば、米国特許公開第２００７／０００４９０９号、同第２００９／００６０９１０号及び同第２０１０／０１７４０５３号に記載される。
【０１８７】
本発明の分子（即ち結合ドメイン）をコードする核酸配列が得られると、この分子の産生のためのベクターを、当分野で周知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術により製造し得る。
【０１８８】
本発明の抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、抗体コード配列に作動可能に連結された発現制御ポリヌクレオチド配列（例えば、当分野で公知の天然に会合した又は異種プロモーター領域）を含み得る。発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換し得るか又はトランスフェクトし得るベクター中の真核プロモーター系であり得るが、原核宿主用の制御配列も使用し得る。ベクターが適切な宿主細胞株に組み込まれると、この宿主細胞を、ヌクレオチド配列の発現に適した条件下で増殖させ、所望される場合には、抗体の回収及び精製のために増殖させる。真核細胞株として、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換されたＢ細胞、又はヒト胚腎細胞株が挙げられる。
【０１８９】
一態様では、本発明の抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）単離して配列決定する。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。単離すると、ＤＮＡを発現ベクターに入れ得、次いで、このベクターを宿主細胞（例えば、サルＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、又は他の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞）にトランスフェクトして、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を得る。このＤＮＡを、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖の定常ドメインのコード配列に置換することによっても改変し得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１，１９８４）。このようにして、本明細書の抗抗原モノクローナル抗体の結合特異性を有するキメラ抗体が調製される。
【０１９０】
細胞表面タンパク質として、ＧＵＣＹ２ｃは、抗体又はリガンドなどの受容体結合タンパク質の治療用標的の機能を果たすことができる。正常な腸組織において、ＧＵＣＹ２ｃは、管腔環境と血管区画の間にバリアを形成する上皮細胞密着接合の頂端側に発現する（Ａｌｍｅｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８：８６５−８７３，１９９３；及びＧｕａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  ３２：１０１７−１０２６，１９８７）。このように、ＧＵＣＹ２ｃ結合タンパク質治療薬の全身静脈内投与は、正常な細胞に存在する腸内ＧＵＣＹ２ｃ受容体に最小限の影響を与え、一方で、悪性若しくは転移性結腸がん細胞、腸外若しくは転移性結腸腫瘍、食道腫瘍若しくは胃腫瘍、又は胃食道接合部の腺癌を含む、胃腸系の新生物細胞に到達することができる。加えて、ＧＵＣＹ２ｃは、リガンド結合によるエンドサイトーシスにより媒介されて、受容体を介して内部移行する（Ｂｕｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４１：１６１８−１６２７，２００５；Ｕｒｂａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２４５：２９−３６，１９９５）。
【０１９１】
ＧＵＣＹ２ｃの組織特異的発現及び例えば胃腸起源のがん（例えば、結腸がん、胃がん、又は食道がん）との会合を利用して、この疾患の診断マーカーとしてのＧＵＣＹ２ｃの使用を可能にする（Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ３９：１７１−１８１，１９９６；Ｂｕｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４１：１６１８−１６２７，２００５）。
【０１９２】
本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ（例えば、ヒトＧＵＣＹ２ｃ（例えば、受入番号ＮＰ＿００４９５４．２の誘導体である配列番号２２４））に結合する抗体を提供し、以下のうちの任意の１つ以上によって有用である。（ａ）対象における悪性腫瘍細胞発現ＧＵＣＹ２ｃに関連する状態（例えば、結腸直腸がん（ＣＲＣ）などの胃腸関連がん）の１つ以上の症状を処置、予防又は改善すること、（ｂ）悪性腫瘍発現ＧＵＣＹ２ｃを有する対象において腫瘍増殖又は進行を阻害すること、（ｃ）ＧＵＣＹ２ｃを発現する１個以上の悪性腫瘍細胞を有する対象において、ＧＵＣＹ２ｃを発現するがん（悪性腫瘍）細胞の転移を阻害すること、（ｄ）ＧＵＣＹ２ｃを発現する腫瘍の退縮（例えば、長期退縮）を誘導すること、（ｅ）ＧＵＣＹ２ｃを発現する悪性腫瘍細胞に細胞障害活性を発揮すること、（ｆ）ＧＵＣＹ２ｃ関連障害を有する対象の無増悪生存期間を増加すること、（ｇ）ＧＵＣＹ２ｃ関連障害を有する対象の全体的な生存期間を増加すること、（ｈ）ＧＵＣＹ２ｃ関連障害を有する対象における追加の化学療法剤又は細胞障害剤の使用を低減すること、（ｉ）ＧＵＣＹ２ｃ関連障害を有する対象において腫瘍量を低減すること、又は（ｊ）ＧＵＣＹ２ｃと未だ確認されていない他の因子との相互作用を遮断すること。
【０１９３】
一側面では、（ａ）配列番号１１、１９、２６、３３、４１、４８、５２、５７、６０、６２、６４、６５、６７、６９、７１、若しくは７３に示す、重鎖可変（ＶＨ）配列のＶＨ相補性決定領域１（ＶＨ  ＣＤＲ１）、ＶＨ相補性決定領域２（ＶＨ  ＣＤＲ２）及びＶＨ相補性決定領域３（ＶＨ  ＣＤＲ３）を含むＶＨ領域、並びに／又は（ｂ）配列番号９２、１００、１０４、１０６、１１２、１１９、１２５、１２９、１３４、１３６、１３７、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１５０、１５２、１５６、１５８、１６０、１６２、１６６、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、若しくは１７５に示す、軽鎖可変（ＶＬ）配列のＶＬ相補性決定領域１（ＶＬ  ＣＤＲ１）、ＶＬ相補性決定領域２（ＶＬ  ＣＤＲ２）及びＶＬ相補性決定領域３（ＶＬ  ＣＤＲ３）を含むＶＬ領域を含む抗体が提供される。
【０１９４】
別の側面では、表１に列挙されている部分重鎖配列のいずれか１個及び／又は部分軽鎖配列のいずれか１個を有する抗体が提供される。一態様において、本発明は、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域を含む抗体を提供し、（ａ）ＶＨ領域は、配列番号１１、１９、２６、３３、４１、４８、５２、５７、６０、６２、６４、６５、６７、６９、７１、若しくは７３を含む、及び／又は（ｂ）ＶＬ領域は、配列番号配列番号９２、１００、１０４、１０６、１１２、１１９、１２５、１２９、１３４、１３６、１３７、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１５０、１５２、１５６、１５８、１６０、１６２、１６６、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、若しくは１７５を含む。
【０１９５】
【表１−１】
2021525080.tif 000003
【０１９６】
【表１−２】
2021525080.tif 000004
【０１９７】
【表１−３】
2021525080.tif 000005
【０１９８】
【表１−４】
2021525080.tif 000006
【０１９９】
【表１−５】
2021525080.tif 000007
【０２００】
表１において、下線を引いた配列は、Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲ配列であり、太字はＣｈｏｔｈｉａに従ったＣＤＲ配列である。ＡｂＭの定義がＶＨ  ＣＤＲ１に使用された。
本発明はまた、ＧＵＣＹ２ｃに対する抗体のＣＤＲ部分も提供する。ＣＤＲ接触領域は、抗原に対して抗体に特異性を付与する抗体の領域である。一般に、ＣＤＲ接触領域は、抗体が特定の抗原に結合するのに適したループ構造を維持するために拘束されているＣＤＲ及びバーニアゾーンにおける残基位置を含む。例えば、Ｍａｋａｂｅ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８３：１１５６〜１１６６，２００７を参照されたい。ＣＤＲ領域の決定は、十分に当分野の技術内である。Ａｂｙｓｉｓのバージョン２．３．３リリースで実行されたアルゴリズム（ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ）を本明細書に使用して、Ｋａｂａｔ番号付けを可変領域の、ＶＨ  ＣＤＲ１を除いて、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＬ  ＣＤＲ３、ＶＨ  ＣＤＲ２、及びＶＨ  ＣＤＲ３に割り当てた。ＡｂＭの定義がＶＨ  ＣＤＲ１に使用された。
【０２０１】
一側面では、表２に列挙されているＶＨ  ＣＤＲ配列のいずれか１個及び／又はＶＬ  ＣＤＲ配列のいずれか１個を有する抗体が提供される。一側面において、本発明は、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２ｃ）に特異的に結合する抗体を提供し、この抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１２、２０、２７、３４、４２、７４、２５７、２５８、２５９、２６０、若しくは２６１を含む重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域１（ＶＨ  ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号１３、２１、２８、３５、４３、５３、６６、６８、７０、７２、７５、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、若しくは２６７を含むＶＨ相補性決定領域２（ＶＨ  ＣＤＲ２）、及び（ｉｉｉ）配列番号１４、２２、２９、３６、若しくは４４を含むＶＨ相補性決定領域３（ＶＨ  ＣＤＲ３）を含むＶＨ領域、並びに／又は（ｂ）（ｉ）配列番号９３、１０１、１０５、１０７、１１３、１２０、１４８、１５３、１６３、若しくは１６７を含む軽鎖可変（ＶＬ）相補性決定領域１（ＶＬ  ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号７８、９４、１０２、１０８、１１４、１４１、１４４、１４６、１４９、１５１、１５７、１５９、１６１、１６４、若しくは１６８を含むＶＬ相補性決定領域２（ＶＬ  ＣＤＲ２）、及び（ｉｉｉ）配列番号９５、１０９、１１５、１２１、１４２、１５４、１６５、若しくは１６９を含むＶＨ相補性決定領域３（ＶＬ  ＣＤＲ３）を含むＶＬ領域を含む。
【０２０２】
特定の態様において、本発明は、（ａ）ＶＨ領域が、（ｉ）配列番号７４若しくは２５９の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号７５又は２６７の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２９の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含み、並びに／又は（ｂ）ＶＬ領域が、（ｉ）配列番号１４８の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号１４９の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４２の配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、抗体を提供する。
【０２０３】
【表２−１】
2021525080.tif 000008
【０２０４】
【表２−２】
2021525080.tif 000009
【０２０５】
【表２−３】
2021525080.tif 000010
【０２０６】
【表２−４】
2021525080.tif 000011
【０２０７】
【表２−５】
2021525080.tif 000012
【０２０８】
一側面では、表３に列挙されている部分軽鎖配列のいずれか１個及び／又は部分重鎖配列のいずれか１個を有する抗体が提供される。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する単離抗体、又はその抗原結合フラグメントが提供され、この抗体は、配列番号１、９、若しくは２７３に示すＶＨ配列のＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、及びＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、並びに／又は配列番号７６、８４、９０、２７４、２７５、若しくは２７６に示すＶＬ配列のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
【０２０９】
【表３】
2021525080.tif 000013
【０２１０】
表３において、下線を引いた配列は、Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲ配列であり、太字はＣｈｏｔｈｉａに従ったＣＤＲ配列である。ＡｂＭの定義がＶＨ  ＣＤＲ１に使用された。
表４は、本明細書に提供されるＣＤ３抗体のＣＤＲ配列の例を提供する。
【０２１１】
【表４−１】
2021525080.tif 000014
【０２１２】
【表４−２】
2021525080.tif 000015
【０２１３】
一態様において、本発明は、（ａ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ１が、配列番号９３、１０１、１０５、１０７、１１３、１２０、１４８、１５３、１６３、又は１６７の配列を含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ２が、配列番号７８、９４、１０２、１０８、１１４、１４１、１４４、１４６、１４９、１５１、１５７、１５９、１６１、１６４、又は１６８の配列を含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号９５、１０９、１１５、１２１、１４２、１５４、１６５、又は１６９の配列を含み、（ｂ）ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ１が、配列番号２、２６８、又は２７７の配列を含み、ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ２が、配列番号３、１０、２６９、又は２７０の配列を含み、ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号４の配列を含み、（ｃ）ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ１が、配列番号７７、８５、９１、２７８、２７９、又は２８０の配列を含み、ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ２が、配列番号７８又は２８１の配列を含み、ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号７９の配列を含み、（ｄ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ１が、配列番号１２、２０、２７、３４、４２、７４、２５７、２５８、２５９、２６０、又は２６１の配列を含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ２が、配列番号１３、２１、２８、３５、４３、５３、６６、６８、７０、７２、７５、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、又は２６７の配列を含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号１４、２２、２９、３６、又は４４の配列を含む、二重特異性抗体を提供する。
【０２１４】
一部のそのような態様において、本発明は、（ａ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ１が、配列番号７４又は２５９の配列を含み、（ｂ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ２が、配列番号７５又は２６７の配列を含み、（ｃ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号２９の配列を含み、（ｄ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ１が、配列番号１４８の配列を含み、（ｅ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ２が、配列番号１４９の配列を含み、（ｆ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号１４２の配列を含む、二重特異性抗体を提供する。
【０２１５】
前述のそれぞれのさらなる態様において、本発明は、（ａ）ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ１が、配列番号２，２６８、又は２７７の配列を含み、（ｂ）ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ２が、配列番号１０又は２７０の配列を含み、（ｃ）ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号４の配列を含み、（ｄ）ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ１が、配列番号９１、２７８、２７９、又は２８０の配列を含み、（ｅ）ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ２が、配列番号７８又は２８１の配列を含み、（ｆ）ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号７９の配列を含む、二重特異性抗体を提供する。
【０２１６】
特定の態様において、本発明は、本明細書、並びに表５、表３７Ａ及び表３７Ｂに記載される抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ＣＤ３−０００１、ＣＤ３−０００４、ＣＤ３−０００６、ＧＵＣＹ２Ｃ−００７４、ＧＵＣＹ２Ｃ−００７７、ＧＵＣＹ２Ｃ−００７８、ＧＵＣＹ２Ｃ−００９８、ＧＵＣＹ２Ｃ−０１０４、ＧＵＣＹ２Ｃ−０１０５、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４０、ＧＵＣＹ２Ｃ−０３１５、ＧＵＣＹ２Ｃ−０１７９、ＧＵＣＹ２Ｃ−０１９３、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２１０、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２１２、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４７、ＧＵＣＹ２Ｃ−１１８６、ＧＵＣＹ２Ｃ−１４６７、ＧＵＣＹ２Ｃ−１４７８、ＧＵＣＹ２Ｃ−１４８１、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５１２、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５１８、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５２６、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５２７、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５３８、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５５４、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５５５、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５５６、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５５７、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５９０、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５９１、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５９２、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８、ｈｕＩＧＨＶ３−７、ｈｕＩＧＫＶ１−３９、ＧＵＣＹ２Ｃ−０４０５、ＧＵＣＹ２Ｃ−０４８６、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６４０、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２５０、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６７８、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６７９、又はＧＵＣＹ２Ｃ−１６８０が含まれる。
【０２１７】
本明細書に詳述されている配列は、ＧＵＣＹ２ｃ抗体、ＣＤ３抗体、及びＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体を記載する。一部の態様において、これらの抗体は、これらのクローンＩＤ（例えば、ＧＵＣＹ２Ｃ−００９８）により参照される。これらのクローンＩＤは、成熟抗体（例えば、ＩｇＧ又はＣＤ３二重特異性抗体）を指すために使用され得る。クローンＩＤは、この抗体に見出される独自のＶＨ又はＶＬ領域を指すこともできる。ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体を表すクローンＩＤ（例えば、ＧＵＣＹ２Ｃ−００９８）には、成熟タンパク質に組み込まれる独自の抗ＣＤ３抗体領域（例えば、ＶＬ及び／又はＶＨ領域）もあり得る。表５は、抗体及びその成熟タンパク質に存在する抗ＣＤ３領域（存在する場合）のフォーマットを示す。表３７Ａ及び３７Ｂは、これらの成熟ＧＵＣＹ２ｃ抗体、抗ＣＤ３  ＩｇＧ、及びＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の構成配列をさらに示す。
【０２１８】
【表５−１】
2021525080.tif 000016
【０２１９】
【表５−２】
2021525080.tif 000017
【０２２０】
本明細書に提供されるＣＤ３抗体のある特定のものは、複数の名称で参照され得る。例えば、ＣＤ３−０００１は、２Ｂ５ｖ１又はｈ２Ｂ５ｖ１と参照され得、ＣＤ３−０００４は、２Ｂ４又はｈ２Ｂ４と参照され得、ＣＤ３−０００６は、２Ｂ５ｖ６又はｈ２Ｂ５ｖ６と参照され得る。
【０２２１】
本明細書に提供されるＣＤ３抗体のある特定のものには、ＣＤ３−０００６のバリアント（２Ｂ５ｖ６又はｈ２Ｂ５ｖ６とも呼ばれる）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＣＤ３−０００６のバリアントには、２Ｂ５−１０３８、２Ｂ５−１０３９、及び２Ｂ５−１０４０が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２２】
ＧＵＣＹ２ｃ（例えばヒトＧＵＣＹ２ｃ（例えば、配列番号２２４、２３０若しくは２３２）、又はＣＤ３（配列番号２４２））に対する、本明細書で説明されている抗体の結合親和性（ＫＤ）は、約０．００１ｎＭ〜約６５００ｎＭであり得る。いくつかの態様では、この結合親和性は、６５００ｎＭ、６０００ｎＭ、５５００ｎＭ、４５００ｎＭ、４０００ｎＭ、３５００ｎＭ、３０００ｎＭ、２５００ｎＭ、２０００ｎＭ、１５００ｎＭ、１０００ｎＭ、７５０ｎＭ、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１９ｎＭ、１７ｎＭ、１６ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、７．５ｎＭ、７ｎＭ、６．５ｎＭ、６ｎＭ、５．５ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００２ｎＭ、又は０．００１ｎＭの内のほぼいずれかである。いくつかの態様では、この結合親和性は、６５００ｎＭ、６０００ｎＭ、５５００ｎＭ、５０００ｎＭ、４０００ｎＭ、３０００ｎＭ、２０００ｎＭ、１０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、７．５ｎＭ、７ｎＭ、６．５ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４．５ｎＭ、４ｎＭ、３．５ｎＭ、３ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ、１．５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０１ｎＭ、又はより低いｎＭの内のほぼいずれか未満である。ある特定の態様において、抗体は、約８０〜約２００ｐＭ、好ましくは、約１００〜約１５０ｐＭのＫＤを有する
一部の態様において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ及び／又はＣＤ３に結合する抗体を提供し、本明細書に記載される抗体と競合し、ＣＤ３−０００１、ＣＤ３−０００４、ＣＤ３−０００６、ＧＵＣＹ２Ｃ−００７４、ＧＵＣＹ２Ｃ−００７７、ＧＵＣＹ２Ｃ−００７８、ＧＵＣＹ２Ｃ−００９８、ＧＵＣＹ２Ｃ−０１０４、ＧＵＣＹ２Ｃ−０１０５、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４０、ＧＵＣＹ２Ｃ−０３１５、ＧＵＣＹ２Ｃ−０１７９、ＧＵＣＹ２Ｃ−０１９３、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２１０、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２１２、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４７、ＧＵＣＹ２Ｃ−１１８６、ＧＵＣＹ２Ｃ−１４６７、ＧＵＣＹ２Ｃ−１４７８、ＧＵＣＹ２Ｃ−１４８１、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５１２、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５１８、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５２６、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５２７、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５３８、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５５４、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５５５、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５５６、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５５７、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５９０、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５９１、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５９２、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８、ｈｕＩＧＨＶ３−７、ｈｕＩＧＫＶ１−３９、ＧＵＣＹ２Ｃ−０４０５、ＧＵＣＹ２Ｃ−０４８６、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６４０、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２５０、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６７８、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６７９、及びＧＵＣＹ２Ｃ−１６８０（表５）が含まれる。
【０２２３】
一側面において、表６に列挙されているフレームワーク領域配列のうちの任意の１個を有する抗体が提供される。一部の態様において、本発明は、ヒト又はヒト化ＶＨフレームワーク及びヒト又はヒト化ＶＬフレームワークをさらに含む、本明細書に記載される抗体を提供する。一部のそのような態様において、ＶＨフレームワークは、配列番号５、６、７、８、１５、１６、１７、１８、２３、２４、２５、３０、３１、３２、３７、３８、３９、４０、４５、４６、４７、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５８、５９、６１、又は６３の配列を含む、及び／又はＶＬフレームワークは、配列番号８０、８１、８２、８３、８６、８７、８８、８９、９６、９７、９８、９９、１０３、１１０、１１１、１１６、１１７、１１８、１２２、１２３、１２４、１２６、１２７、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３９、又は１５５の配列を含む。
【０２２４】
【表６−１】
2021525080.tif 000018
【０２２５】
【表６−２】
2021525080.tif 000019
【０２２６】
【表６−３】
2021525080.tif 000020
【０２２７】
【表６−４】
2021525080.tif 000021
【０２２８】
一態様において、本発明は、ＶＨ領域が、配列番号７３の配列、又はＣＤＲ領域内にない残基に１個又は数個の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、及び／或いはＶＬ領域が、配列番号１４７の配列、又はＣＤＲ領域内にないアミノ酸に１個又は数個の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、抗体を提供する。
【０２２９】
一側面において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体を提供し、この二重特異性抗体は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む。一態様において、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２１６及び２２０の１つ以上に記載されるアミノ酸配列を含む。別の態様において、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２１６及び２２０の１つ以上に記載されるアミノ酸配列を含む。好ましい態様において、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２１６のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２２０のアミノ酸配列を含む。一部のそのような態様において、ＧＵＣＹ２ｃのエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合することができる二重特異性抗体は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２１６の配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２２０の配列を含む。一態様において、第２のポリペプチド鎖は、界面を介して第１のポリペプチドに会合する任意のポリペプチドである。
【０２３０】
そのような一態様において、本発明は、（ａ）第１のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＧＵＣＹ２ｃ抗体のＶＬ（ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ）及びＣＤ３抗体のＶＨ（ＣＤ３  ＶＨ）を含む、ドメイン１と、（ｉｉ）第１のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、（ｂ）第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）抗ＣＤ３抗体のＶＬ（ＣＤ３  ＶＬ）及びＧＵＣＹ２ｃ抗体のＶＨ（ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ）を含む、ドメイン２と、（ｉｉ）第２のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨが、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合するドメインを形成し、ＣＤ３  ＶＬ及びＣＤ３  ＶＨが、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを形成する、二重特異性抗体を提供する。
【０２３１】
別のそのような態様において、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＣＤ３  ＶＬ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨを含む、ドメイン１と、（ｉｉ）第１のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及びＣＤ３  ＶＨを含む、ドメイン２と、（ｉｉ）第２のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨは、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合するドメインを形成し、ＣＤ３  ＶＬ及びＣＤ３  ＶＨは、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを形成する。
【０２３２】
なお別のそのような態様において、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ及びＣＤ３  ＶＬを含む、ドメイン１と、（ｉｉ）第１のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＣＤ３  ＶＨ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬを含む、ドメイン２と、（ｉｉ）第２のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬは、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合するドメインを形成し、ＣＤ３  ＶＨ及びＣＤ３  ＶＬは、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを形成する。
【０２３３】
さらなる態様において、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＣＤ３  ＶＨ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬを含む、ドメイン１と、（ｉｉ）第１のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ及びＣＤ３  ＶＬを含む、ドメイン２と、（ｉｉ）第２のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨは、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合するドメインを形成し、ＣＤ３  ＶＬ及びＣＤ３  ＶＨは、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを形成する。
【０２３４】
本発明は、本発明の抗体をコードする単離ポリヌクレオチド、並びにポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞も提供する。一側面において、ポリヌクレオチドは、表１〜７及び３８に列挙されている、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ＣＤＲ領域、フレームワーク領域、ノブ及びホールＦｃ鎖、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、抗体のＣＤ３−０００１、ＣＤ３−０００４、ＣＤ３−０００６、ＧＵＣＹ２Ｃ−００７４、ＧＵＣＹ２Ｃ−００７７、ＧＵＣＹ２Ｃ−００７８、ＧＵＣＹ２Ｃ−００９８、ＧＵＣＹ２Ｃ−０１０４、ＧＵＣＹ２Ｃ−０１０５、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４０、ＧＵＣＹ２Ｃ−０３１５、ＧＵＣＹ２Ｃ−０１７９、ＧＵＣＹ２Ｃ−０１９３、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２１０、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２１２、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４７、ＧＵＣＹ２Ｃ−１１８６、ＧＵＣＹ２Ｃ−１４６７、ＧＵＣＹ２Ｃ−１４７８、ＧＵＣＹ２Ｃ−１４８１、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５１２、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５１８、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５２６、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５２７、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５３８、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５５４、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５５５、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５５６、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５５７、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５９０、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５９１、ＧＵＣＹ２Ｃ−１５９２、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８、ｈｕＩＧＨＶ３−７、ｈｕＩＧＫＶ１−３９、ＧＵＣＹ２Ｃ−０４０５、ＧＵＣＹ２Ｃ−０４８６、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６４０、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２５０、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６７８、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６７９、又はＧＵＣＹ２Ｃ−１６８０のいずれかをコードする配列を含む。
【０２３５】
目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞中のベクターで維持され得、次いで、この宿主細胞を、将来の使用のために拡大させて凍結し得る。ベクター（発現ベクターを含む）及び宿主細胞を、本明細書でさらに説明する。
【０２３６】
本発明は、本発明の抗体の１個以上のフラグメント又は領域を含む融合タンパク質も包含する。一態様では、配列番号７６、８４、９０、９２、１００、１０４、１０６、１１２、１１９、１２５、１２９、１３４、１３６、１３７、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１５０、１５２、１５６、１５８、１６０、１６２、１６６、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、２７４、２７５、若しくは２７６に示した可変軽鎖領域の少なくとも１０個の近接アミノ酸、並びに／又は配列番号１、９、１１、１９、２６、３３、４１、４８、５２、５７、６０、６２、６４、６５、６７、６９、７１、７３、若しくは２７３に示した可変重鎖領域の少なくとも１０個の近接アミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。他の態様では、可変軽鎖領域の少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、若しくは少なくとも約３０個の近接アミノ酸、並びに／又は可変重鎖領域の少なくとも１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、若しくは少なくとも約３０個の近接アミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の態様において、融合ポリペプチドは、配列番号７３及び１４７、６９及び１４７、６０及び１３８、４８及び１２５、又は２６及び１０６のうちから選択される配列対のいずれかに示した軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含む。別の態様において、融合ポリペプチドは１個以上のＣＤＲを含む。なお他の態様において、融合ポリペプチドはＣＤＲ  Ｈ３（ＶＨ  ＣＤＲ３）及び／又はＣＤＲ  Ｌ３（ＶＬ  ＣＤＲ３）を含む。本発明の目的において、融合タンパク質は、１個以上の抗体、及び未変性分子に結合してない別のアミノ酸配列、例えば、異種配列又は別の領域の相同配列を含有する。例示的な異種配列には、ＦＬＡＧタグ又は６Ｈｉｓタグなどのタグが含まれるが、これらに限定されない。タグは当該技術において周知である。融合ポリペプチドは、当分野で公知の方法、例えば、合成又は組換えにより作り出すことができる。典型的には、本発明の融合タンパク質は、本明細書に記載される組換え方法を使用して、本発明の融合タンパク質をコードする発現ポリヌクレオチドを調製することによって作製されるが、本発明の融合タンパク質は、例えば、化学合成を含む当分野で公知の他の方法により調製することもできる。
【０２３７】
本発明はまた、本発明の抗体のｓｃＦｖも包含する。一本鎖可変領域フラグメントを、短い連結ペプチドを使用して軽鎖及び／又は重鎖可変領域を連結することにより製造する（Ｂｉｒｄ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６，１９８８）。連結ペプチドの例は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１９３）であり、一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端との間のおよそ３．５ｎｍを架橋する。他の配列のリンカーも設計されて使用されている（Ｂｉｒｄ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６，１９８８）。リンカーは、短くて柔軟なポリペプチドであるべきであり、好ましくは約２０個未満のアミノ酸残基で構成されている。次いで、リンカーを、薬剤の付着又は固体支持体への付着等の付加的な機能のために改変し得る。一本鎖バリアントを、組換えにより又は合成により製造し得る。ｓｃＦｖの合成による製造の場合には、自動合成装置を使用し得る。ｓｃＦｖの組換えによる製造の場合には、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドを、適切な宿主細胞（真核生物（例えば、酵母、植物、昆虫、又は哺乳類の細胞）又は原核生物（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））のいずれか）に導入し得る。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドのライゲーション等のルーチン的な操作により製造し得る。生じたｓｃＦｖを、当分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を使用して単離し得る。
【０２３８】
他の形態の一本鎖抗体、例えば、二特異性抗体又はミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）も包含される。二特異性抗体は、重鎖可変（ＶＨ）及び軽鎖可変（ＶＬ）領域が一本鎖ポリペプチドに発現しているが、同じ鎖の２個のドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって、ドメインに別の鎖の相補性ドメインと対形成させ、２個の抗原結合部位を作り出している、二価二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８，１９９３；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３，１９９４を参照すること）。ミニ抗体は、免疫グロブリン分子のヒンジ領域及びＣＨ３ドメインに融合している未変性抗体のＶＬ及びＶＨ領域を含む。例えば、米国特許第５，８３７，８２１号を参照すること。
【０２３９】
一側面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。一部の態様において、組成物は、本明細書に記載される抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。なお他の態様において、組成物は、（ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８の第１のポリペプチド鎖をコードする）配列番号２４６に示したポリヌクレオチド及び（ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８の第２のポリペプチド鎖をコードする）配列番号２４７に示したポリヌクレオチドのいずれか又は両方を含む。発現ベクター、及びポリヌクレオチド組成物の投与が、本明細書においてさらに記載される。
【０２４０】
いずれかのそのような配列に相補的なポリヌクレオチドも、本発明に包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード又はアンチセンス）であってもよいし二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、又は合成）であってもよいしＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子として、成熟及び未成熟ｍＲＮＡが挙げられ、例えば、前駆体ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）又は異種核ｍＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）、及び成熟ｍＲＮＡが挙げられる。本発明のポリヌクレオチド内には追加のコード又は非コード配列が存在し得るが、必ずしも存在せず、ポリヌクレオチドは、他の分子及び／又は支持物質に連結され得るが、必ずしも連結されない。
【０２４１】
ポリヌクレオチドは、天然配列（即ち、抗体又はその一部をコードする内在性配列）を含んでもよいし、そのような配列のバリアントを含んでもよい。ポリヌクレオチドバリアントは、コードされているポリヌクレオチドの免疫反応性が天然免疫反応性分子と比較して減少しないように、１つ又は複数の置換、付加、欠失、及び／又は挿入を含む。コードされているポリヌクレオチドの免疫反応性への効果を、一般に、本明細書で説明されているように評価し得る。バリアントは、天然抗体又はその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して好ましくは少なくとも約７０％の同一性を示し、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性を示し、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示し、最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示す。
【０２４２】
２種のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列は、下記で説明するように最大の対応のためにアラインされた際に、これら２種の配列のヌクレオチド又はアミノ酸の配列が同じである場合には、「同一」であると言われる。２種の配列間の比較を、典型的には、比較ウィンドウ全体にわたり配列を比較して配列類似性の局所領域を特定して比較することにより実施する。「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用される場合、少なくとも約２０箇所の、通常は３０〜約７５箇所の又は４０〜約５０箇所の連続位置のセグメントを指し、このセグメントでは、配列と同数の連続位置の参照配列とを、これら２種の配列が最適にアラインされた後に比較し得る。
【０２４３】
比較に最適な配列アラインメントを、デフォルトパラメータを使用して、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイートにおけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用することにより実行し得る。好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０箇所の位置での比較ウィンドウ全体にわたり２種の最適にアラインされた配列を比較することにより決定され、この比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の部分は、これら２種の配列の最適なアラインメントのための参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較した場合に、２０％以下の、通常は５〜１５％又は１０〜１２％の付加又は欠失（即ちギャップ）を含んでもよい。このパーセンテージは、両方の配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が発生する位置の数を決定して一致する位置の数を求め、この一致する位置の数を参照配列中の位置の総数（即ちウィンドウのサイズ）で除算し、この結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを求めることにより算出される。
【０２４４】
同様に、又は或いは、バリアントは、天然遺伝子又はその一部若しくは相補体と実質的に相同であり得る。そのようなポリヌクレオチドバリアントは、天然抗体（又は相補配列）をコードする天然に存在するＤＮＡ配列に、適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る。
【０２４５】
遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書で説明されているポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者に認識されるであろう。これらのポリヌクレオチドの内のいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対する最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドンの使用法の違いに起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明により特に企図される。さらに、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１つ又は複数の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加、及び／又は置換）の結果として変更される内在性遺伝子である。生じたｍＲＮＡ及びタンパク質は、構造又は機能が変更されていてもよいが、必ずしも変更されていない。対立遺伝子を、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅、及び／又はデータベースの配列との比較）を使用して同定し得る。
【０２４６】
一側面では、本発明は、本明細書で説明されているポリヌクレオチドの内のいずれかを製造する方法を提供する。例えば、本発明のポリヌクレオチドを、化学合成、組換え法、又はＰＣＲを使用して得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当分野で周知であり、本明細書で詳細に説明する必要はない。当業者は、本明細書で提供される配列、及び市販のＤＮＡ合成装置を使用して、所望のＤＮＡ配列を製造し得る。
【０２４７】
組換え法を使用してポリヌクレオチドを調製する場合には、本明細書でさらに考察するように、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクターに導入し得、次いで、このベクターを、複製及び増幅に適した宿主細胞に導入し得る。ポリヌクレオチドを、当分野で公知の任意の手段により宿主細胞に挿入し得る。細胞を、直接取り込みによる外来性ポリヌクレオチドの導入、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ交配、又はエレクトロポレーションにより形質転換する。導入されると、この外来性ポリヌクレオチドは、非統合ベクター（例えばプラスミド）として細胞内で維持され得るか、又は宿主細胞ゲノムに統合され得る。そのようにして増幅されたポリヌクレオチドを、当分野で周知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，１９８９）により宿主細胞から単離し得る。
【０２４８】
或いは、ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の複製を可能にする。ＰＣＲ技術は当分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号明細書、同第４，８００，１５９号明細書、同第４，７５４，０６５号明細書、及び同第４，６８３，２０２号明細書、並びにＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓ他編，Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９４で説明されている。
【０２４９】
ＲＮＡを、適切なベクター中の単離ＤＮＡを使用し、この単離ＤＮＡを適切な宿主細胞に挿入することにより得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡへと転写されると、次いで、このＲＮＡを、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ他，１９８９，上記参照に記載されている当業者に周知の方法を使用して単離し得る。
【０２５０】
適切なクローニングベクターを、標準的な技術に従って構築してもよいし、当分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択してもよい。選択されるクローニングベクターは、使用されることが意図されている宿主細胞に応じて異なり得るが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一標的を有する場合があり、及び／又はベクターを含むクローンの選択で使用され得るマーカーのための遺伝子を持つ場合がある。適切な例として、プラスミド及び細菌ウイルス（例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えばｐＢＳ  ＳＫ＋）及びその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ）、並びにシャトルベクター（例えば、ｐＳＡ３及びｐＡＴ２８）が挙げられる。これらの及び多くの他のクローニングベクターが、商業的ベンダー（例えば、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手可能である。
【０２５１】
発現ベクターは、一般に、本発明に係るポリヌクレオチドを含む複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソームとして又は染色体ＤＮＡの不可欠な一部として宿主細胞中で複製可能でなければならないことが暗示されている。適切な発現ベクターとして、プラスミド、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、コスミド、及び国際公開第８７／０４４６２号パンフレットで開示されている発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの構成要素として、一般に、下記の内の１つ又は複数が挙げられ得るが、これらに限定されない：シグナル配列；複製起点；１種又は複数種のマーカー遺伝子；適切な転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、及びターミネーター）。発現（即ち翻訳）のためには、１種又は複数種の翻訳制御エレメント（例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、及び停止コドン）も通常は必要とされる。
【０２５２】
目的のポリヌクレオチドを含むベクターを、多くの適切な手段（例えば、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、又は他の物質を利用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；及び感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルス等の感染因子である場合））の内のいずれかにより宿主細胞に導入し得る。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は、宿主細胞の特徴に依存することが多い。
【０２５３】
目的の抗体、ポリペプチド、又はタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的のために、異種ＤＮＡを過剰発現し得る任意の宿主細胞を使用し得る。哺乳類宿主細胞の非限定的な例として、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、及びＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。国際公開第８７／０４４６２号パンフレットも参照されたい。適切な非哺乳類宿主細胞として、原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ））、及び酵母（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）；又はＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））が挙げられる。好ましくは、宿主細胞は、対応する内在性抗体又はタンパク質ＧＵＣＹ２ｃ又はＧＵＣＹ２ｃドメイン（例えば、ドメイン１〜４）の場合と比べて約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、さらにより好ましくは２０倍高いレベルでｃＤＮＡを発現し、イムノアッセイ又はＦＡＣＳにより達成される。目的の抗体又はタンパク質を過剰発現する細胞を同定し得る。
【０２５４】
一側面では、ＧＵＣＹ２ｃ抗体分子は、例えば、ピコモルからマイクロモル親和性範囲（好ましくは、ピコモルから低ナノモルの範囲）の直接結合又は競合結合アッセイにより測定した場合に、ＧＵＣＹ２ｃに対する親和性を有する。
【０２５５】
二重特異性抗体は、本明細書に開示されている抗体を使用して調製され得る。二重特異性抗体を製造する方法は、当分野で公知である（例えば、Ｓｕｒｅｓｈ他，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０，１９８６を参照されたい）。伝統的に、二重特異性抗体の組換えによる製造は、２種の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づいており、これら２種の重鎖は特異性が異なっていた（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５，５３７〜５３９，１９８３）。
【０２５６】
別の態様において、本明細書に記載される二重特異性抗体は、ヘテロ二量体タンパク質の抗体可変領域が、ヒト免疫エフェクター細胞に配置されているエフェクター抗原（例えば、ＣＤ３抗原）に特異的に結合することによりヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することができ、ヘテロ二量体タンパク質の第２の抗体可変領域が、標的抗原に特異的に結合することができる、完全長ヒト抗体を含む。いくつかの態様では、このヒト抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプを有する。いくつかの態様では、このヘテロ二量体タンパク質は、免疫学的に不活性なＦｃ鎖を含む。
【０２５７】
ヒト免疫エフェクター細胞は、当分野で公知の様々な免疫エフェクター細胞の内のいずれかであり得る。例えば、免疫エフェクター細胞は、ヒトリンパ球細胞系統のメンバー（例えば、限定されないが、Ｔ細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）であり得る。免疫エフェクター細胞はまた、例えば、限定されないが、ヒト骨髄系統のメンバー（例えば、限定されないが、単球、好中性顆粒球、及び樹状細胞）でもあり得る。そのような免疫エフェクター細胞は、エフェクター抗原の結合による活性化の際に、標的細胞に対する細胞傷害若しくはアポトーシス効果、又は他の所望の効果のいずれかを有し得る。
【０２５８】
エフェクター抗原は、ヒト免疫エフェクター細胞上に発現される抗原（例えば、タンパク質又はポリペプチド）である。ヘテロ二量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体性抗体又は二重特異性抗体）により結合され得るエフェクター抗原の例として、ヒトＣＤ３（又は、ＣＤ３（分化抗原群）複合体）、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２５、ＣＤ６４、及びＣＤ８９が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５９】
標的細胞は、ヒトに対してネイティブであるか又は外来性である細胞であり得る。ネイティブ標的細胞では、この細胞は、形質転換されて悪性細胞であってもよいし、病理的に改変されていてもよい（例えば、ウイルス、変形体、又はバクタリアが感染したネイティブ標的細胞）。外来性標的細胞では、この細胞は、細菌、変形体、又はウイルス等の侵入病原体である。
【０２６０】
標的抗原は、疾患状態（例えば、炎症性疾患、繁殖性疾患（例えば、がん）、免疫障害、神経疾患、神経変性疾患、自己免疫疾患、感染症（例えば、ウイルス感染若しくは寄生虫感染）、アレルギー反応、移植片対宿主病、又は宿主対移植片病）の標的細胞に発現する。標的抗原は、エフェクター抗原ではない。標的抗原の例には、ＧＵＣＹ２ｃ、ＢＣＭＡ、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＣＣＲ５（ケモカイン受容体タイプ５）、ＣＤ１９、ＨＥＲ（ヒト上皮増殖因子受容体）−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＣＩｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、フコシルＧＭ１、Ｐｏｌｙ  ＳＡ、ＧＤ２、カルボアンヒドラーゼ（Ｃａｒｂｏａｎｈｙｄｒａｓｅ）ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｈｈ（ソニックヘッジホッグ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原、（膜結合）ＩｇＥ、ＭＣＳＰ（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−アルファ前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ（ｃａｄｈｅｒｉｎ  ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカー、ＭＩＳ（ミュラー管阻害サブスタンス（Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ））受容体タイプＩＩ、ｓＴｎ（シアル酸付加Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＬＧ、ＳＡＳ、及びＣＤ６３が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６１】
一態様において、本発明は、（ａ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬのＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号９２、１００、１０４、１０６、１１２、１１９、１２５、１２９、１３４、１３６、１３７、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１５０、１５２、１５６、１５８、１６０、１６２、１６６、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、若しくは１７５に示した配列を含み、（ｂ）ＣＤ３  ＶＨのＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ２、及びＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号１、９、若しくは２７３に示した配列を含み、（ｃ）ＣＤ３  ＶＬのＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号７６、８４、９０、２７４、２７５、若しくは２７６に示した配列を含み、及び／又は（ｄ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨのＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ２、及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号１１、１９、２６、３３、４１、４８、５２、５７、６０、６２、６４、６５、６７、６９、７１、若しくは７３に示した配列を含む、二重特異性抗体を提供する。
【０２６２】
特定の態様において、本発明は、（ａ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ領域が配列番号７３の配列を含み、（ｂ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ領域が配列番号１４７の配列を含む二重特異性抗体を提供する。
【０２６３】
一部の態様において、本発明は、（ａ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ１が、配列番号９３、１０１、１０５、１０７、１１３、１２０、１４８、１５３、１６３、又は１６７の配列を含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ２が、配列番号７８、９４、１０２、１０８、１１４、１４１、１４４、１４６、１４９、１５１、１５７、１５９、１６１、１６４、又は１６８の配列を含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号９５、１０９、１１５、１２１、１４２、１５４、１６５、又は１６９の配列を含み、（ｂ）ＣＤＲ３  ＶＨ  ＣＤＲ１が、配列番号２、２６８、又は２７７の配列を含み、ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ２が、配列番号３、１０、２６９、又は２７０の配列を含み、ＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号４の配列を含み、（ｃ）ＣＤＲ３  ＶＬ  ＣＤＲ１が、配列番号７７、８５、９１、２７８、２７９、又は２８０の配列を含み、ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ２が、配列番号７８又は２８１の配列を含み、ＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号７９の配列を含み、（ｄ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ１が、配列番号１２、２０、２７、３４、４２、７４、２５７、２５８、２５９、２６０、又は２６１の配列を含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ２が、配列番号１３、２１、２８、３５、４３、５３、６６、６８、７０、７２、７５、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、又は２６７の配列を含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号１４、２２、２９、３６、又は４４の配列を含む、二重特異性抗体を提供する。
【０２６４】
一部の態様において、本発明に有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その変異体、抗体タンパク質（例えば、ドメイン抗体）を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、並びに要求される特異性の抗原認識部位を含む、任意の他の修飾立体配置の免疫グロブリン分子であり、抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント及び共有結合的に修飾された抗体が含まれる。抗体は、ネズミ、ラット、ヒト、又は任意の他の起源（キメラ若しくはヒト化抗体を含む）のものであり得る。
【０２６５】
一部の態様において、本明細書に記載されるＧＵＣＹ２ｃ又はＣＤ３抗体は、モノクローナル抗体である。例えば、ＧＵＣＹ２ｃ又はＣＤ３抗体は、ヒト化モノクローナル抗体又はキメラモノクローナル抗体である。
【０２６６】
本発明は、Ｆｃ鎖若しくはドメイン、又はこれらの一部分を含む二重特異性抗体を包含する。いくつかの態様では、Ｆｃ鎖又はその一部は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ鎖の１つ又は複数の定常ドメイン（例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン）を含む。別の態様では、本発明は、Ｆｃ鎖又はその一部を含む分子を包含し、このＦｃ鎖又はその一部は、同等の野生型Ｆｃ鎖又はその一部と比較して、少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば置換）を含む。バリアントＦｃ領域は、当分野で周知であり、当分野で周知の結合活性アッセイ又はエフェクター機能アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ分析、又はＡＤＣＣ）の内のいずれかでアッセイした場合に、このバリアントＦｃ領域を含む抗体の表現型を変更するために主に使用される。そのようなバリアントＦｃ鎖又はその一部は、Ｆｃ鎖又は一部を含む本発明の二重特異性抗体により示される血漿半減期及び安定性を延長し得る。別の態様では、本発明は、当分野で公知の任意のＦｃバリアントの使用を包含する。
【０２６７】
一態様において、１つ又は複数の修飾がＦｃ鎖のアミノ酸に実行されて、このＦｃ鎖（ひいては本発明の二重特異性抗体分子）の１種又は複数種のＦｃγＲ受容体に対する親和性及び結合活性低下させる。具体的な態様では、本発明は、バリアントＦｃ鎖又はその一部を含む二重特異性抗体であって、このバリアントＦｃ鎖は、バリアントＦｃ領域が１つのＦＣγＲ（このＦｃγＲはＦＣγＲＩＩＩＡである）にのみ結合する野生型Ｆｃ鎖と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、二重特異性抗体を包含する。別の具体的な態様では、本発明は、バリアントＦｃ鎖又はその一部を含む二重特異性抗体であって、このバリアントＦｃ鎖は、バリアントＦｃ領域が１つのＦＣγＲ（このＦｃγＲはＦＣγＲＩＩＡである）にのみ結合する野生型Ｆｃ鎖と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、二重特異性抗体を包含する。別の具体的な態様では、本発明は、バリアントＦｃ鎖又はその一部を含む二重特異性抗体であって、このバリアントＦｃ鎖は、バリアントＦｃ鎖が１つのＦＣγＲ（このＦｃγＲはＦＣγＲＩＩＢである）にのみ結合する野生型Ｆｃ鎖と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、二重特異性抗体を包含する。別の態様では、本発明は、バリアントＦｃを含む分子であって、このバリアントは、当業者公知の方法及び本明細書で説明されている方法を使用して測定した場合に、Ｆｃ鎖を含まないか又は野生型Ｆｃ鎖を含む分子と比較して、ＡＤＣＣ活性（若しくは他のエフェクター機能）の低下及び／又はＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）への結合の増加をもたらすか又は媒介する、分子を包含する。
【０２６８】
本発明はまた、２種以上のＩｇＧアイソタイプ由来のドメイン又は領域を含むＦｃ領域の使用を包含する。当分野で公知であるように、Ｆｃ領域のアミノ酸改変は、Ｆｃにより媒介されるエフェクター機能及び／又は結合活性に大いに影響を及ぼし得る。しかしながら、機能的特性におけるこの変更は、選択されたＩｇＧアイソタイプの文脈で実行される場合に、さらに精密にされ得る、及び／又は操作され得る。同様に、アイソタイプＦｃの天然の特性は、１つ又は複数のアミノ酸改変により操作され得る。複数のＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）は、それらのヒンジ及び／又はＦｃ領域のアミノ酸配列の差異に起因して、異なる物理的及び機能的特性（例えば、血清半減期、補体固定、ＦｃγＲ結合親和性、及びエフェクター機能活性（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ））を示す。
【０２６９】
一態様では、アミノ酸改変及びＩｇＧ  Ｆｃ領域は、所望の特性を有する二重特異性抗体を設計するために、これらのそれぞれの別々の結合及び／又はエフェクター機能活性に基づいて独立して選択される。特定の態様では、アミノ酸改変及びＩｇＧヒンジ／Ｆｃ領域は、本明細書で説明されているか又はＩｇＧ１の文脈において当分野で公知である結合及び／又はエフェクター機能活性に関して個別にアッセイされている。一態様では、アミノ酸改変及びＩｇＧヒンジ／Ｆｃ領域は、類似の機能性（例えば、二重特異性抗体又は他のＦｃ含有分子（例えば及び免疫グロブリン）の文脈におけるＡＤＣＣ活性（若しくは他のエフェクター機能）の低下、及び／又はＦｃγＲＩＩＢへの結合の増加）を示す。別の態様では、本発明は、当分野で公知のアミノ酸改変の組み合わせと、新規の特性（この特性は、改変及び／又は領域が本明細書で説明されているように独立してアッセイされた場合には検出可能ではなかった）を示す選択されたＩｇＧ領域とを含むバリアントＦｃ領域を包含する。
【０２７０】
一部の態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメイン及び第２のヘテロ二量体促進ドメインは、それぞれ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域を含み、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３のそれぞれのアミノ酸配列は、野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１個のアミノ酸修飾を含んで、ノブ又はホールを形成する。
【０２７１】
いくつかの態様では、第１のヘテロ二量体促進ドメイン及び第２のヘテロ二量体促進ドメインはそれぞれ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインのそれぞれ及び／又はＣＨ３ドメインのそれぞれのアミノ酸配列は、ヘテロ二量体化を駆動するように及び／又は二重特異性抗体を安定化させるように改変されている。
【０２７２】
一部のそのような態様において、本発明の二重特異性抗体は、第１のポリペプチド鎖の第１のヘテロ二量体促進ドメイン及び第２のポリペプチド鎖の第２のヘテロ二量体促進ドメインを含む。まとめると、第１及び第２のヘテロ二量体促進ドメインは、ヘテロ二量体化を駆動し、並びに／又は（例えば、相補的なヘテロ二量体促進ドメイン上のノブ及びホールの相互作用により）二重特異性抗体を安定化し、並びに／又は二重特異性抗体を安定化させるのに役立つ。
【０２７３】
一部の態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメイン及び前記第２のヘテロ二量体促進ドメインは、両方ともノブではないか、若しくは両方ともホールではなく、及び／又は第１のヘテロ二量体促進ドメイン及び前記第２のヘテロ二量体促進ドメインは、ＩｇＧ免疫グロブリンＦｃ領域を形成する。
【０２７４】
いくつかの態様では、第１のヘテロ二量体促進ドメインは、ノブ（突起）又はホール（空洞）のいずれかを含むように改変されているＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを有するＦｃ鎖を含み得る。いくつかのそのような態様では、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、（ａ）第１のヘテロ二量体促進ドメインのＣＨ３ドメインはノブを形成し、（ｂ）第２のヘテロ二量体促進ドメインのＣＨ３ドメインはホールを形成する。別のそのような態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインのＣＨ３ドメインは、ノブが形成されるように、変異Ｙ３４９Ｃ及び／又はＴ３６６Ｗを含み、第２のヘテロ二量体促進ドメインのＣＨ３ドメインは、ホールが形成されるように、変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及び／又はＹ４０７Ｖを含む（ＥＵ指標に準じた番号付け）。一部の特定の態様において、変異は低減されたエフェクター機能をもたらす。
【０２７５】
一部の態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインは、第２のヘテロ二量体促進ドメインが、ホール（空洞）を含むように修飾されたＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含む場合、配列番号１８８の配列を含むノブ（突出部）を含むように修飾されたＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含むことができる。別の態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインは、第２のヘテロ二量体促進ドメインが、ノブ（突出部）を含むように修飾されたＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含む場合にはホール（空洞）を含むことができる。前述のそれぞれの特定の態様において、第１のヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１８８の配列を含んで、ノブを形成し、第２のヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１８９の配列を含んで、ホールを形成する。表７は、本明細書に記載されるノブ及びホールＦｃ鎖、並びに様々なＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３抗体を有するＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体（配列番号１９６、１９７、１９９、２００、２０２、２０３、２０５、２０６、２１０、２１１、２１６、２１７、２１９、２２０、２４８、２４９、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６及び２８７）を提供する。
【０２７６】
【表７−１】
2021525080.tif 000022
【０２７７】
【表７−２】
2021525080.tif 000023
【０２７８】
【表７−３】
2021525080.tif 000024
【０２７９】
【表７−４】
2021525080.tif 000025
【０２８０】
【表７−５】
2021525080.tif 000026
【０２８１】
ＧＵＣＹ２ｃ又はＣＤ３に対する抗体の結合親和性を決定する一つの方法は、この抗体の単機能Ｆａｂフラグメントの結合親和性を測定することによる。単機能Ｆａｂフラグメントを得るために、抗体（例えばＩｇＧ）を、パパインにより開裂し得るか、又は組換えにより発現させ得る。抗体のＧＵＣＹ２ｃ  Ｆａｂフラグメントの親和性を、予め固定されたストレプトアビジンセンサーチップ（ＳＡ）を備えているか、又はＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５体積／体積％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）を使用する抗マウスＦｃ若しくは抗ヒトＦｃを備えている表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標），ＩＮＣ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）により決定し得る。ビオチン化又はＦｃ融合ヒトＧＵＣＹ２ｃを、０．５μｇ／ｍＬ未満の濃度までＨＢＳ−ＥＰバッファーで希釈し、可変の接触時間を使用して個々のチップチャネルに注入して、抗原密度の２つの範囲（詳細な速度論的研究のための５０〜２００反応単位（ＲＵ）、又はスクリーニングアッセイのための８００〜１，０００ＲＵ）を達成し得る。再生研究は、２５体積／体積％のエタノール中の２５ｍＭ  ＮａＯＨが、２００回の注入にわたり、チップ上のＧＵＣＹ２ｃの活性を維持しつつ、結合しているＦａｂを効果的に除去することを示した。典型的には、精製済Ｆａｂ試料の連続希釈（０．１〜１０×の推定ＫＤの濃度にわたる）を、１００μＬ／分で１分にわたり注入し、２時間までの解離時間を可能にする。Ｆａｂタンパク質の濃度を、標準として公知の濃度（アミノ酸分析により決定する）のＦａｂを使用するＥＬＩＳＡ及び／又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により決定する。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを使用して、１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｏｓ，Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６．９９〜１１０，１９９４）にデータを全体的に適合させることにより、速度論的な会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を同時に得る。平衡解離定数（ＫＤ）値を、Ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出する。このプロトコルは、任意のＧＵＣＹ２ｃ（例えば、ヒトＧＵＣＹ２ｃ、別の哺乳類のＧＵＣＹ２ｃ（例えば、マウスＧＵＣＹ２ｃ、ラットＧＵＣＹ２ｃ、又は霊長類ＧＵＣＹ２ｃ））、及び異なる形態のＧＵＣＹ２ｃ（例えばグリコシル化ＧＵＣＹ２ｃ）への抗体の結合親和性の決定での使用に適している。抗体の結合親和性を、一般には２５℃で測定するが、３７℃でも測定し得る。
【０２８２】
本明細書で説明されている抗体を、当分野で公知の任意の方法により製造し得る。ハイブリドーマ細胞株の製造の場合、宿主動物の免疫化の経路及びスケジュールは、一般に、本明細書でさらに説明されているように、抗体刺激及び産生のための確立されている従来の技術に従う。ヒト及びマウス抗体の製造のための一般的な技術は、当分野で公知である、及び／又は本明細書で説明されている。
【０２８３】
ヒトを含む任意の哺乳類対象又はこの対象由来の抗体産生細胞を、ヒト及びハイブリドーマ細胞株を含む哺乳類の産生の基礎として機能するように操作し得ることが企図されている。典型的には、宿主細胞に、例えば本明細書で説明されているような免疫原のある量を、腹腔内、筋肉内、経口、皮下、足底内、及び／又は皮内で接種する。
【０２８４】
ハイブリドーマを、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７，１９７５の一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を使用して、リンパ球及び不死化骨髄腫細胞から調製し得るか、又はＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．他，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，１８：３７７〜３８１，１９８２により改変されているように調製し得る。利用可能な骨髄腫系統（例えば、限定されないが、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、及びＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡからのもの）を、ハイブリダイゼーションで使用し得る。一般に、この技術は、ポリエチレングリコール等のフソゲンを使用するか又は当業者に周知の電気的手段による骨髄腫細胞及びリンパ球系細胞の融合を含む。融合後、融合培地から細胞を分離し、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地等の選択増殖培地で増殖させて、ハイブリダイズしていない親細胞を排除する。本明細書で説明されている培地の内のいずれか（血清が補充されているか又は補充されていない）を、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの培養に使用し得る。細胞融合技術の別の代替として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して、本発明のモノクローナル抗体を産生させ得る。ハイブリドーマを、必要に応じて拡大させてサブクローニングし、上清を、従来のイムノアッセイ手順（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、又は蛍光イムノアッセイ）により、抗免疫原活性に関してアッセイする。
【０２８５】
抗体の供給源として使用され得るハイブリドーマは、全ての誘導体、ＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又はこれらの一部に特異的なモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマの後代細胞を包含する。
【０２８６】
そのような抗体を産生するハイブリドーマを、公知の手順を使用して、インビトロで又はインビボで増殖させ得る。モノクローナル抗体を、必要に応じて、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、及び限外ろ過）により、培養培地又は体液から単離し得る。望ましくない活性（存在する場合）を、例えば、固相に付着した免疫原からなる吸着剤上で調製物を流し、この免疫原から所望の抗体を溶出させるか又は放出することにより除去し得る。二機能性又は誘導体化剤（例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した共役）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ１Ｎ＝Ｃ−ＮＲ（Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基））を使用する、ヒトＧＵＣＹ２ｃ若しくはヒトＣＤ３によるか、又は免疫化される種において免疫原性であるタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害剤）に共役した標的アミノ酸配列を含むフラグメントによる宿主動物の免疫化により、抗体（例えばモノクローナル抗体）の集団を得ることができる。
【０２８７】
必要に応じて、目的の抗体（モノクローナル又はポリクローナル）を配列決定し得、次いで、ポリヌクレオチド配列を、発現又は増殖のためのベクターにクローニングし得る。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞中においてベクター中で維持され得、次いで、この宿主細胞を拡大し、将来の使用のために凍結し得る。細胞培養での組換えモノクローナル抗体の産生を、当分野で公知の手段により、Ｂ細胞からの抗体遺伝子のクローニンにより実行し得る。例えば、Ｔｉｌｌｅｒ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３２９，１１２，２００８；米国特許第７，３１４，６２２号明細書を参照されたい。
【０２８８】
代替では、ポリヌクレオチド配列を、抗体をヒト化するための又は抗体の親和性若しくは他の特性を改善するための遺伝子操作に使用し得る。例えば、ヒトでの臨床試験及び処置で抗体を使用する場合には、免疫反応を回避するために、定常領域を、ヒト定常領域により似ているように設計し得る。抗体配列を遺伝子操作してＧＵＣＹ２ｃ又はＣＤ３へのより大きな親和性を得ること、及びＧＵＣＹ２ｃの阻害により大きな効力を得ることが望ましいことがある。
【０２８９】
４つの一般的な工程を経て、モノクローナル抗体をヒト化する。これらの工程は、（１）出発抗体の軽及び重可変領域のヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定すること、（２）ヒト化抗体を設計すること、即ち、ヒト化プロセスの最中に使用する抗体フレームワーク領域を決定すること、（３）実際のヒト化の方法論／技術、並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；同第５，８０７，７１５号明細書；同第５，８６６，６９２号明細書；同第６，３３１，４１５号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，６９３，７６１号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；及び同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい。
【０２９０】
非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を含む多くのヒト化抗体分子（例えば、齧歯類又は改変齧歯類Ｖ領域と、このＶ領域と関連する、ヒト定常領域に融合したＣＤＲとを有するキメラ抗体）が説明されている。例えば、Ｗｉｎｔｅｒ他，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３〜２９９，１９９１、Ｌｏｂｕｇｌｉｏ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２２０〜４２２４，１９８９、Ｓｈａｗ他，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４〜４５３８，１９８７、及びＢｒｏｗｎ他，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７〜３５８３，１９８７を参照されたい。他の文献では、適切なヒト抗体定常領域との融合に先立ってヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）に移植された齧歯類ＣＤＲが説明されている。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７，１９８８、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６，１９８８、及びＪｏｎｅｓ他，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５，１９８６を参照されたい。別の参考文献では、組換えにより操作された齧歯類フレームワーク領域により支持されている齧歯類ＣＤＲが説明されている。例えば、欧州特許第０５１９５９６号明細書を参照されたい。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの分子の治療的適応の持続期間及び有効性を制限する齧歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的反応を最小限に抑えるように設計されている。例えば、抗体定常領域を、免疫学的に不活性である（例えば、補体溶解を誘発しない）ように設計し得る。例えば、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１及び英国出願第９８０９９５１．８号明細書を参照されたい。同様に利用され得る抗体をヒト化する他の方法が、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：２４７１〜２４７６，１９９１、並びに米国特許第６，１８０，３７７号明細書；同第６，０５４，２９７号明細書；同第５，９９７，８６７号明細書；同第５，８６６，６９２号明細書；同第６，２１０，６７１号明細書；同第６，３５０，８６１号明細書；並びに国際公開第０１／２７１６０号パンフレットで開示されている。
【０２９１】
上記に考察されたヒト化抗体に関する一般原則は、例えば、イヌ、ネコ、霊長類、ブタ及びウシへの使用に抗体のカスタマイズにも適用可能である。さらに、本明細書で説明されている抗体のヒト化の１つ又は複数の側面が組み合わされ得る（例えば、ＣＤＲ移植、フレームワーク変異、及びＣＤＲ変異）。
【０２９２】
一バリエーションでは、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作されている市販のマウスを使用することにより、完全ヒト抗体を得ることができる。より望ましい（例えば完全ヒト抗体）又はより頑強な免疫反応を生じるように設計されているトランスジェニック動物を、ヒト化又はヒト抗体の生成にも使用し得る。そのような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）、並びにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）及びＴＣ  Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
【０２９３】
代替では、抗体を、当分野で公知の任意の方法を使用して、組換えにより製造して発現させ得る。別の代替では、抗体を、ファージディスプレイ技術により組換え的に製造し得る。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書；同第５，５８０，７１７号明細書；同第５，７３３，７４３号明細書；及び同第６，２６５，１５０号明細書；並びにＷｉｎｔｅｒ他，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３〜４５５，１９９４を参照されたい。或いは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５３，１９９０）を使用して、免疫化されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体及び抗体フラグメントをインビトロで製造し得る。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージの主要な又はマイナーなコートタンパク質遺伝子（例えば、Ｍ１３又はｆｄ）にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上で機能的抗体フラグメントとして提示される。糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮコピーを含むことから、抗体の機能的特性に基づく選択は、その特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択にもつながる。そのため、このファージは、Ｂ細胞の特性の内のいくつかを模倣する。ファージディスプレイを様々なフォーマットで実施し得、概説に関して、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．及びＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４〜５７１，１９９３を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイに使用し得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ他，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８，１９９１では、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムコンビナトリアルライブラリー由来の抗オキサゾロン抗体の多様なアレイが単離された。非免疫化ヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築し得、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を、Ｍａｒｋ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７，１９９１又はＧｒｉｆｆｉｔｈ他，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５〜７３４，１９９３により説明されている技術に本質的に従って単離し得る。天然の免疫反応では、抗体遺伝子は、高い割合で変異を蓄積する（体細胞の超変異）。導入される変化の内のいくつかは、より高い親和性を付与し、親和性が高い表面免疫グロブリンを提示するＢ細胞が優先的に複製され、後続の抗原チャレンジの最中に差別化される。この天然のプロセスを、「鎖シャフリング」として公知の技術を利用することにより模倣し得る（Ｍａｒｋｓ他，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９〜７８３，１９９２）。この方法では、重鎖及び軽鎖Ｖ領域遺伝子を、非免疫化ドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に存在するバリアント（レパートリー）のレパートリーに連続的に置き換えることにより、ファージディスプレイにより得られた「一次」ヒト抗体の親和性を改善し得る。この技術は、ｐＭ〜ｎＭの範囲の親和性を有する抗体及び抗体フラグメントの製造を可能にする。非常に大きなファージ抗体レパートリー（全てのライブラ���ーの母」としても公知である）を製造するための戦略が、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５〜２２６６，１９９３により説明されている。同様に、遺伝子シャフリングを使用して齧歯類抗体からヒト抗体を誘導し得、このヒト抗体は、出発の齧歯類抗体に類似の親和性及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも称されるこの方法によれば、ファージディスプレイ技術により得られた齧歯類抗体の重鎖及び軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーに置き換えて、齧歯類−ヒトキメラを作製する。抗原による選択により、機能的な抗原結合部位を回復し得るヒト可変領域が単離され、即ち、エピトープがパートナーの選択を支配する（インプリントする）。残余の齧歯類Ｖドメインを置き換えるためにこのプロセスを繰り返す場合には、ヒト抗体が得られる（国際公開第９３／０６２１３号パンフレットを参照されたい）。ＣＤＲ移植による齧歯類抗体の従来のヒト化とは異なり、この技術は、齧歯類起源のフレームワークもＣＤＲ残基も有しない完全ヒト抗体を提供する。
【０２９４】
抗体を、最初に抗体と抗体産生細胞とを宿主動物から単離し、遺伝子配列を得、この遺伝子配列を使用して、宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）中で組換えにより抗体を発現させることにより、組換え的に製造し得る。利用し得る別の方法は、植物（例えばタバコ）又はトランスジェニックミルクにおいて抗体配列を発現させることである。植物又はミルクにおいて組換えにより抗体を発現させる方法は、開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓ他，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２７５６，２００１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．及びＤ．Ｈｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５，１９９５；並びにＰｏｌｌｏｃｋ他，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１４７，１９９９を参照されたい。抗体の誘導体（例えば、ヒト化、一本鎖等）を製造する方法は、当分野で公知である。
【０２９５】
同様に、イムノアッセイ、及び蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）等のフローサイトメトリーソーティング技術を利用して、ＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は目的の抗原に特異的な抗体を単離し得る。
【０２９６】
本明細書で説明されている抗体は、多くの異なる固相の支持体又は担体に結合し得る。そのような支持体は、活性であり得る、及び／又は不活性であり得る。周知の支持体として、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、並びにマグネタイトが挙げられる。この支持体の性質は、本発明の目的のために、可溶性か又は不溶性であり得る。当業者は、抗体の結合に適した他の支持体を知っているか、又は日常的な実験を使用して、そのようなものを確認し得るであろう。いくつかの態様では、この支持体は、心筋を標的とする部分を含む。
【０２９７】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離して配列決定する。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。単離すると、ＤＮＡを、発現ベクター（例えば、国際公開第８７／０４４６２号パンフレットで開示されている発現ベクター）に入れることができ、次いで、この発現ベクターを、他の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、又は骨髄腫細胞）にトランスフェクトして、この組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成が得られる。例えば、国際公開第８７／０４４６２号パンフレットを参照されたい。このＤＮＡを、例えば、相同マウス配列の代わりにヒトの重鎖及び軽鎖定常領域のコード配列を置き換えることにより改変してもよいし（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１，１９８４）、免疫グロブリンコード配列と、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全て又は一部とを供給結合的に連結することにより改変してもよい。そのようにして、本明細書のモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体を調製する。
【０２９８】
本明細書に記載されるＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原抗体は、当該技術に既知の方法を使用して確認する又は特徴づけることができ、それによって、ＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原発現レベルの低減が検出及び／又は測定される。いくつかの態様では、ＧＵＣＹ２ｃと共に候補薬剤をインキュベートし、結合及び／又はＧＵＣＹ２ｃ発現レベルの付随する低下をモニタリングすることにより、ＧＵＣＹ２ｃ抗体を同定する。結合アッセイを、精製済ＧＵＣＹ２ｃポリペプチドにより実施してもよいし、ＧＵＣＹ２ｃポリペプチドを天然に発現するか又は発現するようにトランスフェクトされた細胞により実施してもよい。一態様では、この結合アッセイは競合的結合アッセイであり、ＧＵＣＹ２ｃ結合に関して公知のＧＵＣＹ２ｃ抗体と競合する候補抗体の能力を評価する。このアッセイを、ＥＬＩＳＡフォーマット等の様々なフォーマットで実施し得る。
【０２９９】
最初の同定に続いて、候補ＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原抗体の活性を、標的とする生物学的活性を試験することが知られているバイオアッセイにより、さらに確認して精密にし得る。或いは、バイオアッセイを使用して、候補を直接スクリーニングし得る。抗体を同定する及びキャラクタライズする方法の内のいくつかを、実施例で詳細に説明する。
【０３００】
ＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原抗体を、当分野で周知の方法を使用してキャラクタライズし得る。例えば、一方法は、結合するエピトープを同定すること（即ち、エピトープマッピング）である。当分野では、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングしてキャラクタライズするための多くの方法が公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９の第１１章で説明されているように、抗体−抗原複合体の結晶構造を解明すること、競合アッセイ、遺伝子フラグメント発現アッセイ、及び合成ペプチドベースのアッセイが挙げられる。追加の例では、エピトープマッピングを使用して、抗体が結合する配列を決定し得る。エピトープマッピングは、様々な供給源（例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ  １５，８２１９  ＰＨ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））から市販されている。エピトープは、線状エピトープであり得る（即ち、アミノ酸の単一ストレッチに含まれる）か、又は必ずしも単一ストレッチに含まれなくてもよいアミノ酸の３次元的な相互作用により形成された高次構造エピトープであり得る。様々な長さ（例えば、少なくとも４〜６個のアミノ酸の長さ）のペプチドを単離し得るか又は（例えば組換えにより）合成し得、ＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原抗体との結合アッセイに使用し得る。別の例では、ＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原抗体が結合するエピトープを、ＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原配列に由来する重複ペプチドを使用し、ＧＵＣＹ２ｃ抗体、ＣＤ３抗体又は他の抗原抗体による結合を決定することにより、体系的なスクリーニングで決定し得る。遺伝子フラグメント発現アッセイによれば、ＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原をコードするオープンリーディングフレームを、無作為に断片化するか、又は特定の遺伝子構築により断片化し、発現されたＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原のフラグメントと、試験する抗体との反応性を決定する。この遺伝子フラグメントを、例えばＰＣＲにより製造し得、次いで、放射性アミノ酸の存在下にて、インビトロで転写してタンパク質へと翻訳し得る。次いで、放射標識したＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原フラグメントへの抗体の結合を、免疫沈降及びゲル電気泳動により決定する。同様に、ある特定のエピトープを、ファージ粒子の表面上で提示されるランダムペプチド配列の大きなライブラリー（ファージライブラリー）を使用することにより同定し得る。或いは、重複ペプチドフラグメントの規定のライブラリーを、簡単な結合アッセイにおいて、試験抗体への結合に関して試験し得る。追加の例では、抗原結合ドメインの変異誘発、ドメインスワッピング実験、及びアラニンスキャニング変異誘発を実施して、エピトープ結合に必要な、十分な、及び／又は必須の残基を同定し得る。例えば、ドメインスワッピング実験を、変異体ＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原を使用して実施し得、この実験では、ＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原タンパク質の様々なフラグメントが、別の種（例えばマウス）由来のＧＵＣＹ２ｃからの配列か又は近縁であるが抗原的には異なるタンパク質（例えばＴｒｏｐ−１）からの配列に置き換えられている（スワップされている）。変異体ＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原への抗体の結合を評価することにより、抗体結合に対する特定のＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原フラグメントの重要性を評価し得る。
【０３０１】
ＧＵＣＹ２ｃ抗体、ＣＤ３抗体又は他の抗原抗体をキャラクタライズするために使用され得るさらに別の方法は、同一の抗原（即ち、ＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原の様々なフラグメント）に結合することが知られている他の抗体との競合アッセイを使用して、ＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原抗体がそれぞれ他の抗体と同一のエピトープに結合するかどうかを決定する。競合アッセイは当業者に周知である。
【０３０２】
発現ベクターを使用して、ＧＵＣＹ２ｃ、ＣＤ３、又は他の抗原抗体の発現を指示し得る。当業者は、インビボでの外来性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与を熟知している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号明細書；同第６，４１３，９４２号明細書；及び同第６，３７６，４７１号明細書を参照されたい。発現ベクターの投与として、局所（ｌｏｃａｌ）投与又は全身投与（例えば、注射、経口投与、粒子銃、若しくはカテーテル投与）、及び外用（ｔｏｐｉｃａｌ）投与が挙げられる。別の態様では、発現ベクターを、交感神経幹若しくは神経節に直接投与するか、又は冠動脈、心房、心室、若しくは心膜に直接投与する。
【０３０３】
発現ベクター又はサブゲノムポリヌクレオチドを含む治療組成物の標的送達も使用し得る。受容体媒介性ＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓ他，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１：２０２，１９９３；Ｃｈｉｏｕ他，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編，１９９４；Ｗｕ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：６２１，１９８８；Ｗｕ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：５４２，１９９４；Ｚｅｎｋｅ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：３６５５，１９９０；及びＷｕ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：３３８，１９９１で説明されている。ポリヌクレオチドを含む治療組成物を、遺伝子治療プロトコルにおける局所投与のために、ＤＮＡ  約１００ｎｇ〜約２００ｎｇの範囲で投与する。遺伝子治療プロトコルの最中に、約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、及び約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲も使用し得る。治療用のポリヌクレオチド及びポリペプチドを、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達し得る。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス又は非ウイルス起源であり得る（一般には、Ｊｏｌｌｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１：５１，１９９４；Ｋｉｍｕｒａ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，５：８４５，１９９４；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１：１８５，１９９５；及びＫａｐｌｉｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６：１４８，１９９４を参照されたい）。そのようなコード配列の発現を、内在性の哺乳類又は異種プロモーターを使用して誘発し得る。このコード配列の発現は、構成的であり得るか、又は調節され得る。
【０３０４】
所望のポリヌクレオチドの送達のための及び所望の細胞中での発現のためのウイルスベースのベクターは、当分野で周知である。例示的なウイルスベースのビヒクルとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：組換えレトロウイルス（例えば、国際公開第９０／０７９３６号パンフレット；同第９４／０３６２２号パンフレット；同第９３／２５６９８号パンフレット；同第９３／２５２３４号パンフレット；同第９３／１１２３０号パンフレット；同第９３／１０２１８号パンフレット；同第９１／０２８０５号パンフレット；米国特許第５，２１９，７４０号明細書及び同第４，７７７，１２７号明細書；英国特許第２，２００，６５１号明細書；並びに欧州特許第ＥＰ０３４５２４２号明細書を参照されたい）、アルファウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、及びベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、並びにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、国際公開第９４／１２６４９号パンフレット、同第９３／０３７６９号パンフレット；同第９３／１９１９１号パンフレット；同第９４／２８９３８号パンフレット；同第９５／１１９８４号パンフレット、及び同第９５／００６５５号パンフレット）。Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１４７，１９９２で説明されているような死滅したアデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与も利用し得る。
【０３０５】
非ウイルス送達のビヒクル及び方法も利用し得、下記が挙げられるが、これらに限定されない：死滅したアデノウイルス単独に連結されたか又は連結されていないポリカチオン性濃縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１４７，１９９２を参照されたい）；リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１６９８５，１９８９を参照されたい）；真核細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号明細書；国際公開第９５／０７９９４号パンフレット；同第９６／１７０７２号パンフレット；同第９５／３０７６３号パンフレット；及び同第９７／４２３３８号パンフレットを参照されたい）、並びに核電荷の中和又は細胞膜との融合。裸のＤＮＡも利用し得る。例示的な裸のＤＮＡ導入法が、国際公開第９０／１１０９２号パンフレット及び米国特許第５，５８０，８５９号明細書で説明されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームが、米国特許第５，４２２，１２０号明細書；国際公開第９５／１３７９６号パンフレット；同第９４／２３６９７号パンフレット；同第９１／１４４４５号パンフレット；及び欧州特許第０５２４９６８号明細書で説明されている。さらなるアプローチが、Ｐｈｉｌｉｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４：２４１１，１９９４及びＷｏｆｆｅｎｄｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：１５８１，１９９４で説明されている。
【０３０６】
いくつかの態様では、本発明は、本明細書で説明されている本発明の抗体を含むか又は本方法により製造された抗体を含み、本明細書で説明されている特徴を有する組成物（例えば医薬組成物）を包含する。本明細書で使用される場合、医薬組成物は、ＧＵＣＹ２ｃに結合する１種若しくは複数種の抗体、ＣＤ３及びＧＵＣＹ２ｃ腫瘍抗原に結合する１種若しくは複数種の二重特異性抗体、及び／又は１種若しくは複数種のこれらの抗体をコードする配列を含む１種若しくは複数種のポリヌクレオチドを含み得る。これらの組成物は、当分野で周知である適切な賦形剤（例えば、バッファー等の薬学的に許容される賦形剤）をさらに含み得る。
【０３０７】
本発明は、これらの抗体のいずれかを作製する方法も提供する。本発明の抗体は、当該技術に既知の手順により作製されうる。ポリペプチドは、上記に記載された組換え方法（即ち、単一若しくは融合ポリペプチド）により又は化学合成により、抗体のタンパク質分解又は他の変性によって産生されうる。抗体のポリペプチド、とりわけ、約５０個までのアミノ酸の短いポリペプチドは、化学合成によって都合よく作製される。化学合成の方法は、当該技術において公知であり、市販のものがある。例えば、抗体は、固相法を用いる自動ポリペプチド合成機により産生されうる。米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、及び同第６，３３１，４１５号も参照すること。
【０３０８】
２個の共有結合抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲内である。そのような抗体は、免疫系細胞が不要な細胞を標的にするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、並びにＨＩＶ感染の処置のために（ＰＣＴ公開第９１／００３６０号及び同第９２／２００３７３号、及びヨーロッパ特許公開第０３０８９号）使用されてきた。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋方法を使用して作製されうる。適切な架橋剤及び技術は当該技術において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に記載される。
【０３０９】
キメラ又はハイブリッド抗体もまた、架橋剤を含むもの等の合成タンパク質化学の公知の方法を使用して、インビボで調製し得る。例えば、免疫毒素を、ジスルフィド交換反応を使用して構築してもよいし、チオエーテル結合を形成することにより構築してもよい。この目的に適した薬剤の例として、イミノチオレート、及びメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【０３１０】
組換えヒト化抗体では、Ｆｃγ部分を、Ｆｃγ受容体と補体及び免疫系との相互作用を回避するように改変し得る。そのような抗体の調製のための技術が、国際公開第９９／５８５７２号パンフレットで説明されている。例えば、抗体を臨床試験及びヒトでの処置で使用する場合には、免疫反応を回避するために、定常領域を、ヒト定常領域により似ているように設計し得る。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号明細書及び同第５，８６６，６９２号明細書を参照されたい。
【０３１１】
本明細書に開示されているＧＵＣＹ２ｃ抗体及びＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、抗体が誘導された対応する生殖細胞系列配列と比較して、重及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域に１個以上のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含むことがある。そのような変異を、本明細書で開示されているアミノ酸配列と、例えば公的な抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列とを比較することにより、容易に確認し得る。本発明は、本明細書で開示されているアミノ酸配列の内のいずれかに由来する抗体及びその抗原結合フラグメントであって、１つ又は複数のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の１つ又は複数のアミノ酸は、この抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基に変異しているか、又は別のヒト生殖系列配列の対応する残基に変異しているか、又は対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に変異している（そのような配列変化は、本明細書では、まとめて「生殖系列変異」と称される）、抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。当業者は、本明細書で開示されている重鎖及び軽鎖可変領域配列から出発して、１つ若しくは複数の個々の生殖系列変異又はこれらの組み合わせを含む多数の抗体及び抗原結合フラグメントを容易に製造し得る。ある特定の態様では、ＶＨ及び／又はＶＬドメイン内のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基の全てが、この抗体が由来した元々の生殖系列配列で見出される残基に変異により戻っている。他の態様では、ある特定の残基のみが元の生殖細胞系列配列に戻るように変異され、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸の範囲内若しくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸の範囲内にのみ変異残基が見出される、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２若しくはＣＤＲ３の範囲内にのみ変異残基が見出される。他の態様では、１個以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基が、異なる生殖細胞系列配列（即ち、抗体が元々誘導された生殖細胞系列配列と異なる生殖細胞系列配列）の対応する残基に変異される。
【０３１２】
さらに、本発明の抗体は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含み得、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基に変異しているが、元々の生殖系列とは異なるある特定の他の残基は、維持されているか、又は異なる生殖系列配列の対応する残基に変異している。得られると、１つ又は複数の生殖系列変異を含む抗体及び抗原結合フラグメントを、１つ又は複数の所望の特性（例えば、結合特異性の改善、結合親和性の増加、アンタゴニストの又はアゴニストの生物学的特性の改善又は増強（場合による）、免疫原性の減少等）に関して容易に試験し得る。このようにして一般的に得られた抗体及び抗原結合フラグメントは、本発明に包含される。
【０３１３】
本発明は、１個以上の保存的置換を有する本明細書に開示されているＨＣ  ＶＲ、ＬＣ  ＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む、ＧＵＣＹ２ｃ抗体及びＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体も含む。例えば、本発明は、本明細書で開示されているように、ＨＣ  ＶＲ、ＬＣ  ＶＲ、及び／又はＣＤＲのアミノ酸配列の内のいずれかに対して例えば１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下等の保存的アミノ酸置換を有するＨＣ  ＶＲ、ＬＣ  ＶＲ、及び／又はＣＤＲのアミノ酸配列を有するＧＵＣＹ２ｃ抗体及びＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体を含む。
【０３１４】
したがって、本発明は、本明細書で説明されている本発明のバリアントの抗体及びポリペプチド（例えば、それらの特性に有意な影響を及ぼさない機能的に等価な抗体、並びに活性及び／又は親和性が増強しているか又は減少しているバリアント）に対する改変を包含する。例えば、アミノ酸配列を変異させて、ＧＵＣＹ２ｃ及び／又はＣＤ３に対する所望の結合親和性を有する抗体を得ることができる。ポリペプチドの改変は、当分野では日常的に行われており、本明細書で詳細に説明する必要はない。改変ポリペプチドの例として、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性を有意に有害に変化させないか若しくはそのリガンドに対するポリペプチドの親和性を成熟させる（増強する）アミノ酸の１つ若しくは複数の欠失若しくは付加、又は化学的類似体の使用が挙げられる。
【０３１５】
アミノ酸配列の挿入として、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一の又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、又はエピトープタグに融合した抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとして、血液循環中での抗体の半減期を増加させる酵素又はポリペプチドの、この抗体のＮ又はＣ末端への融合が挙げられる。
【０３１６】
置換バリアントは、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されており、その場所に異なる残基が挿入されている。置換変異誘発の最も興味深い部位として、超可変領域が挙げられるが、ＦＲ変更も企図される。保存的置換を、「保存的置換」の見出しの下で表８に示す。そのような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合には、表８において「例示的置換」と呼ばれるか又はアミノ酸クラスに関連して下記でさらに説明する複数の実質的変化を導入して産物をスクリーニングし得る。
【０３１７】
【表８】
2021525080.tif 000027
【０３１８】
抗体の生物学的特性における実質的な改変は、（ａ）置換の領域中のポリペプチド骨格の構造（例えば、シート若しくはヘリカル高次構造）、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖のかさ高さの維持に対する効果が有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然に存在するアミノ酸残基は、下記の共通の側鎖特性に基づいて群に分けられる：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）電荷を有しない極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性（負に荷電している）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性（正に荷電している）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
【０３１９】
非保存的置換は、これらのクラスの内の１つのメンバーを別のクラスに交換することにより行われる。
抗体の適切な高次構造の維持に関与しない任意のシステイン残基も、一般にはセリンで置換されて、この分子の酸化安定性を改善して異常な架橋を妨げ得る。逆に、特に、抗体が、Ｆｖフラグメント等の抗体フラグメントである場合には、この抗体にシステイン結合を付加して、この抗体の安定性を改善し得る。
【０３２０】
アミノ酸改変は、１つ又は複数のアミノ酸の変更又は改変から可変領域等の領域の完全な再設計にまで及び得る。可変領域での変更は、結合親和性及び／又は特異性を変更し得る。いくつかの態様では、１〜５個以下の保存的アミノ酸置換を、ＣＤＲドメイン内で行う。他の態様では、１〜３個以下の保存的アミノ酸置換を、ＣＤＲドメイン内で行う。さらに他の態様では、ＣＤＲドメインは、ＶＨ  ＣＤＲ３及び／又はＶＬ  ＣＤＲ３である。
【０３２１】
改変として、グリコシル化及び非グリコシル化ポリペプチド、並びに他の翻訳後改変（例えば、様々な糖によるグリコシル化、アセチル化、及びリン酸化）を有するポリペプチドも挙げられる。抗体は、その定常領域中における保存位置でグリコシル化される（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ及びＬｕｎｄ，Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１１１〜１２８，１９９７；Ｗｒｉｇｈｔ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ，ＴｉｂＴＥＣＨ  １５：２６〜３２，１９９７）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄ他，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１〜１３１８，１９９６；Ｗｉｔｔｗｅ及びＨｏｗａｒｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４１７５〜４１８０，１９９０）と、糖タンパク質の部分間の分子内相互作用とに影響を及ぼし、このことは、糖タンパク質の高次構造と提示された３次元表面とに影響を及ぼし得る（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ及びＬｕｎｄ，上記参照；Ｗｙｓｓ及びＷａｇｎｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４０９４１６，１９９６）。オリゴ糖はまた、特異的な認識構造に基づいて、所与の糖タンパク質の標的をある特定の分子に定めるのにも役立ち得る。抗体のグリコシル化はまた、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすとも報告されている。特に、２分ＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）の発現がテトラサイクリンにより調節されているＣＨＯ細胞は、ＡＤＣＣ活性が改善されていると報告された（Ｕｍａｎａ他，Ｍａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６〜１８０，１９９９）。
【０３２２】
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ連結又はＯ連結のいずれかである。Ｎ連結は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、及びアスパラギン−Ｘ−システイン（Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、このアスパラギン側鎖へのこの炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。そのため、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。Ｏ連結グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的には、セリン又はスレオニン）への糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの内の１つの付着を指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリシンも使用し得る。
【０３２３】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、抗体が上記のトリペプチド配列の内の１つ又は複数を含む（Ｎ連結グリコシル化部位の場合）ようにアミノ酸配列を変更することにより、簡便に達成される。この変更を、元々の抗体の配列への１つ又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加又はこれらの残基への置換（Ｏ連結グリコシル化部位の場合）によっても行い得る。
【０３２４】
抗体のグリコシル化パターンはまた、基本となるヌクレオチド配列を変更することなく変更し得る。グリコシル化は、抗体を発現するために使用される宿主細胞に主に依存する。潜在的な治療薬としての組換え糖タンパク質（例えば抗体）の発現に使用される細胞型は、希にネイティブ細胞であることから、抗体のグリコシル化パターンの変動が予想され得る（例えば、Ｈｓｅ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９０６２〜９０７０，１９９７）を参照されたい）。
【０３２５】
宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換えによる産生の最中のグリコシル化に影響を及ぼす因子として、増殖形式、培地製剤、培養密度、酸素化、ｐＨ、精製スキーム、及び同類のものが挙げられる。特定の宿主生物において達成されるグリコシル化パターンを変更するために、様々な方法（例えば、オリゴ糖産生に関与するある特定の酵素の導入又は過剰発現）が提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号明細書；同第５，５１０，２６１号明細書、及び同第５，２７８，２９９号明細書）。グリコシル化、又はある特定のタイプのグリコシル化を、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を使用して、糖タンパク質から酵素的に除去し得る。加えて、組換え宿主細胞を、ある特定のタイプの多糖のプロセシングを欠くように遺伝子操作し得る。これらの及び類似の技術は、当分野で周知である。
【０３２６】
他の改変方法として、当分野で公知のカップリング技術（例えば、限定されないが、酵素的手段、酸化的置換、及びキレート化）を使用することが挙げられる。例えばイムノアッセイ用の標識の付着のために、改変を使用し得る。改変ポリペプチドを、当分野で確立されている手順を使用して製造し、当分野で公知の標準的なアッセイ（この内の一部を、下記で及び実施例で説明する）を使用してスクリーニングし得る。
【０３２７】
本発明のいくつかの態様では、抗体は、改変定常領域（例えば、ヒトＦｃガンマ受容体に対する親和性が増加している定常領域）を含み、免疫学的に不活性であるか若しくは部分的に不活性である（例えば、補体媒介性溶解を誘発しないか、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しないか、若しくはマクロファージを活性化しない）か、又は下記の内のいずれか１つ若しくは複数での活性を（非改変抗体と比較して）低下させる：補体媒介性溶解の誘発、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の刺激、若しくはミクログリアの活性化。定常領域の様々な改変を使用して、エフェクター機能の最適なレベル及び／又は組み合わせを達成し得る。例えば、Ｍｏｒｇａｎ他，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９〜３２４，１９９５；Ｌｕｎｄ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５７：４９６３〜９  １５７：４９６３〜４９６９，１９９６；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６４：４１７８〜４１８４，２０００；Ｔａｏ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３：２５９５〜２６０１，１９８９；及びＪｅｆｆｅｒｉｓ他，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６３：５９〜７６，１９９８を参照されたい。いくつかの態様では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９：２６１３〜２６２４，１９９９；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；及び／又は英国出願第９８０９９５１．８号明細書で説明されているように改変されている。さらに他の態様では、定常領域は、Ｎ−連結グリコシル化用にグリコシル化されている。いくつかの態様では、定常領域は、この定常領域中のＮ−グリコシル化認識配列の一部であるグリコシル化アミノ酸残基又は隣接する残基を改変することにより、Ｎ連結グリコシル化用にグリコシル化される。例えば、Ｎグリコシル化部位Ｎ２９７は、Ａ、Ｑ、Ｋ、又はＨに変異され得る。Ｔａｏ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３：２５９５〜２６０１，１９８９；及びＪｅｆｆｅｒｉｓ他，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６３：５９〜７６，１９９８を参照されたい。いくつかの態様では、定常領域は、Ｎ連結グリコシル化用にグリコシル化されている。定常領域は、酵素的に（例えば、酵素ＰＮＧアーゼによる炭水化物の除去）又はグリコシル化欠損宿主細胞中での発現により、Ｎ連結グリコシル化用にグリコシル化され得る。
【０３２８】
他の抗体改変として、国際公開第９９／５８５７２号パンフレットで説明されているように改変されている抗体が挙げられる。この抗体は、標的分子に指向される結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域の全て又は一部に対して実質的に相同なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。この抗体は、標的の顕著な補体依存性溶解又は細胞媒介性破壊を誘発することなく、標的分子に結合し得る。いくつかの態様では、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎ及び／又はＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合し得る。これらは、典型的には、２種以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。このようにして改変された抗体は、従来の抗体療法に対する炎症及び他の有害反応を回避するための習慣的な抗体療法での使用に特に適している。
【０３２９】
本発明は、親和性成熟態様を含む。例えば、親和性成熟抗体を、当分野で公知の手順（Ｍａｒｋｓ他，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９〜７８３，１９９２；Ｂａｒｂａｓ他，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１：３８０９〜３８１３，１９９４；Ｓｃｈｉｅｒ他，Ｇｅｎｅ，１６９：１４７〜１５５，１９９５；Ｙｅｌｔｏｎ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：１９９４〜２００４，１９９５；Ｊａｃｋｓｏｎ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４（７）：３３１０〜９，１９９５，Ｈａｗｋｉｎｓ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９〜８９６，１９９２；及び国際公開第０４／０５８１８４号パンフレット）により製造し得る。
【０３３０】
抗体の親和性の調整及びＣＤＲのキャラクタライズに、下記の方法を使用し得る。「ライブラリースキャニング変異誘発」と呼ばれる、抗体のＣＤＲをキャラクタライズする及び／又はペプチド（例えば抗体）の結合親和性を変更する（例えば改善する）一方法。一般に、ライブラリースキャニング変異誘発は、下記のように作用する。当分野で認識されている方法を使用して、ＣＤＲ中の１箇所又は複数箇所のアミノ酸位置を、２種以上（例えば、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、又は２０種）のアミノ酸に置き換える。これにより、クローンの小さいライブラリー（いくつかの態様では、分析するアミノ酸位置毎に１種）が生成され、（全ての位置で２種以上のアミノ酸が置換される場合には）それぞれが２種以上のメンバーの複雑性を有する。一般に、このライブラリーはまた、天然（未置換）アミノ酸を含むクローンも含む。各ライブリライからの少数のクローン（例えば、約２０〜８０個のクローン（ライブラリーの複雑性に依存する）を、標的ポリペプチド（又は他の結合標的）への結合親和性に関してスクリーニングし、結合が、増加した候補、同一の候補、減少した候補、又は結合しない候補を同定する。結合親和性を決定する方法は、当分野で周知である。結合親和性を、約２倍以上の結合親和性の差異を検出するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）表面プラズモン共鳴分析を使用して決定し得る。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）は、出発の抗体が比較的高い親和性（例えば、約１０ｎＭ以下のＫＤ）で既に結合している場合に、特に有用である。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）表面プラズモン共鳴を使用するスクリーニングを、本明細書の実施例で説明する。
【０３３１】
結合親和性を、Ｋｉｎｅｘａ  Ｂｉｏｃｅｎｓｏｒ、シンチレーション近似アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮイムノアッセイ（ＩＧＥＮ）、蛍光消光、蛍光転移、及び／又は酵母ディスプレイを使用して決定し得る。結合親和性を、適切なバイオアッセイを使用してもスクリーニングし得る。
【０３３２】
いくつかの態様では、ＣＤＲ中の全てのアミノ酸位置を、当分野で認識されている変異誘発方法（この内のいくつかは、本明細書で説明されている）を使用して、２０種全ての天然アミノ酸に置き換える（いくつかの態様では、１回に１種）。これにより、クローンの小さいライブラリー（いくつかの態様では、分析するアミノ酸位置毎に１つ）が生成され、（全ての位置で２０種全てのアミノ酸が置換される場合には）それぞれが２０種のメンバーの複雑性を有する。
【０３３３】
いくつかの態様では、スクリーニングするライブラリーは、同一のＣＤＲ中に存在してもよいし２つ以上のＣＤＲ中に存在してもよい、２箇所以上の位置で置換を含む。そのため、このライブラリーは、１つのＣＤＲ中の２箇所以上の位置で置換を含んでもよい。このライブラリーは、２つ以上のＣＤＲ中の２箇所以上の位置で置換を含んでもよい。このライブラリーは、３箇所、４箇所、５箇所、又はより多くの位置で置換を含んでもよく、前記位置は、２個、３個、４個、５個、又は６個のＣＤＲで見出される。この置換を、低重複コドンを使用して作製し得る。例えば、Ｂａｌｉｎｔ他，Ｇｅｎｅ  １３７（１）：１０９〜１８，１９９３の表２を参照されたい。
【０３３４】
結合が改善されている候補を配列決定し得、それにより、親和性が改善されるＣＤＲ置換変異体（「改善」置換とも呼ばれる）が同定される。結合する候補も配列決定し得、それにより、結合を保持するＣＤＲ置換が同定される。
【０３３５】
多数回のラウンドのスクリーニングを実施し得る。例えば、結合が改善されている候補（それぞれ、１つ又は複数のＣＤＲの１箇所又は複数箇所の位置でアミノ酸置換を含む）はまた、それぞれの改善ＣＤＲ位置（即ち、置換変異体が結合の改善を示したＣＤＲ中のアミノ酸位置）で少なくとも元々及び置換アミノ酸を含む第２のライブラリーの設計にも有用である。このライブラリーの調製とスクリーニング又は選択とを、下記でさらに考察する。
【０３３６】
ライブラリースキャニング変異誘発はまた、結合が改善された、結合が同一の、結合が減少した、又は結合しないクローンの頻度が、抗体−抗原複合体の安定性に関する各アミノ酸位置の重要性についての情報も提供する限りにおいて、ＣＤＲをキャラクタライズするための手段も提供する。例えば、ＣＤＲのある位置が、２０種全てのアミノ酸に変化した際に結合を保持する場合には、この位置は、抗原結合に必要とされる可能性が低い位置と同定される。逆に、ＣＤＲのある位置が、ごく小さいパーセンテージの置換でのみ結合を保持する場合には、この位置は、ＣＤＲ機能に重要な位置と同定される。そのため、ライブラリースキャニング変異誘発方法は、多くの異なるアミノ酸（２０種全てのアミノ酸を含む）に変化し得るＣＤＲ中の位置と、変化し得ないか又は少しのアミノ酸にのみ変化し得るＣＤＲ中の位置とに関する情報をもたらす。
【０３３７】
親和性が改善されている候補を、第２のライブラリーで組み合わせ得、この第２のライブラリーは、その位置で改善アミノ酸、元々のアミノ酸を含み、所望されているか又は所望のスクリーニング法若しくは選択法を使用して可能になるライブラリーの複雑性に依存して、この位置での追加の置換をさらに含み得る。加えて、必要に応じて、隣接するアミノ酸位置を、少なくとも２種以上のアミノ酸に無作為化し得る。隣接するアミノ酸の無作為化は、変異体ＣＤＲにおける追加の高次構造柔軟性を許容し得、そのため、多数の改善的変異の導入が許容され得るか、又は促進され得る。このライブラリーはまた、１回目のラウンドのスクリーニングでは親和性の改善を示さなかった位置での置換も含み得る。
【０３３８】
第２のライブラリーを、当分野で公知の任意の方法（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）表面プラズモン共鳴分析を使用するスクリーニング、並びに選択に関して当分野で公知の任意の方法（ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、及びリボソームディスプレイを含む）を使用する選択）を使用して、結合親和性が改善されている及び／又は変更されているライブラリーメンバーに関してスクリーニングするか、又は選択する。
【０３３９】
本発明は、固体支持体（例えば、ビオチン又はアビジン）へのカップリングを容易にする、薬剤にコンジュゲート（例えば、連結）した抗体を含む組成物も提供する。簡素化のため、これらの方法が本明細書に記載されるＧＵＣＹ２ｃ抗体の態様のいずれかに当てはまるという理解のもとに、参照は一般に抗体に対して行われる。コンジュゲーションは、本明細書に記載されるこれらの成分を連結することを一般に指す。連結（一般に、これらの成分を少なくとも投与のために近接会合に固定すること）は、あらゆる方法によって達成されうる。例えば、薬剤と抗体との直接的な反応は、互いに反応することができる置換基をそれぞれ有する場合に可能である。例えば、一方のアミノ酸又はスルフヒドリル基などの求核基は、他方の無水物若しくは酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基と、又は良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応することが可能であり得る。
【０３４０】
ある特定の態様では、第１の工程として、第１及び第２のポリペプチド（及び二重特異性抗体を形成する任意の追加のポリペプチド）が選択される。通常、これらのポリペプチドをコードする核酸は単離される必要があり、それによって、本明細書に定義されているノブ若しくはホール、又は両方をコードするように変更されうる。しかし、変異は、合成方法を使用して、例えば、ペプチド合成機を使用して導入され得る。また、置換残基が非天然に生じる残基である場には、Ｎｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａの方法が、そのような置換を有するポリペプチドを作製するために利用可能である。加えて、二重特異性抗体の一部分は、細胞培養において組換え的に作製され、分子の他の部分は、上記に記述された技術を使用して作製される。
【０３４１】
抗体を単離する及び二重特異性抗体を調製する技術は、以下のとおりである。しかし、二重特異性抗体は当該技術に既知の技術を使用して他のポリペプチドから形成され得ること、又は他のポリペプチドを組み込むことができることが理解される。例えば、目的のポリペプチド（例えば、リガンド、受容体、又は酵素）をコードする核酸を、このポリペプチドｍＲＮＡを保有し、検出可能なレベルで発現すると考えられている組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから単離し得る。ライブラリーを、目的の遺伝子又はこの遺伝によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（例えば、約２０〜８０個の塩基の抗体又はオリゴヌクレオチド）でスクリーニングする。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）の第１０〜１２章で説明されているような標準的手順を使用して実行し得る。
【０３４２】
前述のように、二重特異性抗体は、２本以上のポリペプチド鎖の複合体を指し、それぞれは、少なくとも１つの抗体ＶＬ領域及び１つの抗体ＶＨ領域又はこれらのフラグメントを含み、それぞれのポリペプチド鎖中のＶＬ及びＶＨ領域は異なる抗体由来である。特定の側面では、二重特異性抗体は、ＶＬ及びＶＨ領域の両方を含むポリペプチド鎖の二量体又は四量体を含む。多量体タンパク質を構成する個々のポリペプチド鎖は、鎖間ジスルフィド結合により多量体の少なくとも１つの他のポリペプチドに共有結合的に連結され得る。
【０３４３】
本発明の二重特異性抗体は、Ｔ細胞（ＣＤ３）と腫瘍細胞（ＧＵＣＹ２ｃ）を同時に標的にし、ＧＵＣＹ２ｃを発現する腫瘍細胞に対してＴ細胞細胞障害性を向け、活性化させることに成功している。
【０３４４】
二重特異性抗体のそれぞれのポリペプチド鎖は、ＶＬ領域及びＶＨ領域を含み、これらはリンカーにより共有結合的に連結されていてもよく、リンカーは、抗体結合ドメインの自己集合が束縛されるようにグリシン及びセリン残基を含むグリシン−セリンリンカーである。特定の態様において、グリシン−セリンリンカーは、配列番号１９０の配列を含むリンカー１である。加えて、各ポリペプチド鎖はヘテロ二量体ドメインを含み、このヘテロ二量体ドメインは、複数のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化及び／又は安定化を促進し、異なるポリペプチド鎖のホモ二量体化の確率を低下させる。このヘテロ二量体化ドメインは、ポリペプチド鎖のＮ末端に位置していてもよいし、Ｃ末端に位置していてもよい。このヘテロ二量体化ドメインは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、又はより多くのアミノ酸残基の長さであるシステインリンカー（リンカー３）を含み得る。ポリペプチド鎖の内の２つの相互作用は、２つのＶＬ／ＶＨ対形成を生じ得、２つのエピトープ結合ドメイン（即ち２価分子）が形成される。ＶＨ若しくはＶＬ領域のいずれも、ポリペプチド鎖内の任意の位置に制限されず、即ち、アミノ末端若しくはカルボキシ末端に制限されず、又はこれらの領域は、互いに相対的な位置に制限されず、即ち、ＶＬ領域はＶＨ領域に対してＮ末端であり得、逆もまた同様である。唯一の制限は、機能的二重特異性抗体を形成するために、相補的なポリペプチド鎖が利用可能であることである。ＶＬ及びＶＨ領域が、異なる抗原に特異的な抗体に由来する場合には、機能的二重特異性抗体の形成は、２つの異なるポリペプチド鎖の相互作用（即ち、ヘテロ二量体の形成）を必要とする。対照的に、２つの異なるポリペプチド鎖が、例えば組換え発現系で、自由に相互作用する場合には、一方は、ＶＬＡ及びＶＨＢ（Ａは第１のエピトープであり、Ｂは第２のエピトープである）を含み、他方は、ＶＬＢ及びＶＨＡを含み、２つ異なる結合部位は、ＶＬＡ−ＶＨＡ及びＶＬＢ−ＶＨＦに由来し得る。全ての二重特異性抗体ポリペプチド鎖対に関して、２つの鎖のミスアラインメント又は誤結合が起こり得る（例えば、ＶＬ−ＶＬ又はＶＨーＶＨ領域の相互作用）。しかしながら、機能的二重特異性抗体の精製は、当分野で公知であるか又は本明細書で例示される任意の親和性ベースの方法（例えば親和性クロマトグラフィー）を使用して、適切に二量体化された結合部位の免疫特異性に基づいて容易に管理される。
【０３４５】
一態様では、二重特異性抗体のポリペプチド鎖は、様々なリンカー及びペプチドを含み得る。このリンカー及びペプチドは、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又はより多くのアミノ酸であり得る。一部の態様において、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及びＣＤ３  ＶＨは、リンカー１又はリンカー２により連結しており、ＣＤ３  ＶＬ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨは、リンカー１又はリンカー２により連結している。一部のそのような態様において、リンカー１は、配列番号１９０の配列を含む。他の態様において、リンカー２は、配列番号１９１の配列を含む。
【０３４６】
いくつかの態様では、ドメイン１は、システインリンカーを介して第１のヘテロ二量体促進ドメインに共有結合しており、ドメイン２は、システインリンカーを介して第２のヘテロ二量体促進ドメインに共有結合している。システインリンカーはそれぞれ、分子内ジスルフィド結合を可能にするために、少なくとも１つのシステイン残基を含む。上記のそれぞれのさらなる態様では、システインリンカーは、少なくとも５個のアミノ酸を含む。一部のそのような態様において、システインリンカーは、配列番号１９２の配列を含むリンカー３である。
【０３４７】
いくつかの態様では、第１のポリペプチド鎖は、少なくとも１つのジスルフィド結合により第２のポリペプチド鎖に共有結合している。いくつかのそのような態様では、第１のポリペプチド鎖のリンカー３と第２のポリペプチド鎖のリンカー３との間には、少なくとも１つのジスルフィド結合が形成されている。別のそのような態様では、第１のヘテロ二量体促進ドメインと第２のヘテロ二量体促進ドメインとの間には、少なくとも１つのジスルフィド結合が形成されている。特定の態様では、各ジスルフィド結合は、２つのシステイン残基を連結することにより形成されている。
【０３４８】
本発明の二重特異性抗体は、２種の別々の異なるエピトープに同時に結合し得る。ある特定の態様では、少なくとも１つのエピトープ結合部位は、免疫エフェクター細胞上で発現される（例えばＴ細胞リンパ球上で発現される）ＣＤ３決定基に特異的である。一態様では、この二重特異性抗体分子は、エフェクター細胞決定基に結合してエフェクター細胞も活性化する。
【０３４９】
特定の態様では、本発明の二重特異性抗体は、（ａ）ヒトＧＵＣＹ２ｃの細胞外ドメインに結合し、（ｂ）３０分から１００日の延長された血清及び腫瘍半減期を示し、並びに／又は（ｃ）ＧＵＣＹ２ｃ発現レベルの上昇若しくは受容体密度レベルの上昇の存在下で、０．０００１ｎＭ〜１００ｎＭの比較的低いＥＣ５０値を示す。
【０３５０】
一態様において、エピトープ結合ドメインは、乳がん、卵巣がん、甲状腺がん、前立腺がん、子宮頸がん、肺がん（非小細胞肺がん及び小細胞肺がんが含まれるが、これらに限定されない）、膀胱がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、精巣がん、及び神経膠芽腫に関連する、ＧＵＣＹ２ｃ腫瘍関連抗原に結合することができる。ある特定の態様において、がんは、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、虫垂、胆管、及び膵臓からなる群から選択される消化器系のがんである。特定の態様において、治療は細胞溶解性Ｔ細胞反応を活性化する。
【０３５１】
本発明の二重特異性抗体は、一般に免疫グロブリン又は抗体から誘導される抗原結合ドメインを含む。本発明の方法に使用される結合ドメインが誘導される抗体は、鳥類及び哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ネズミ、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、又はニワトリ）を含む任意の動物源からのものであり得る。好ましくは、抗体は、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体である。
【０３５２】
本発明の二重特異性抗体は、様々な方法によって特徴づけることができる。特に、本発明の分子は、抗原に免疫特異的に結合する能力についてアッセイされ得る。次いで、抗原に免疫特異的に結合することが確認された分子は、抗原への特異性及び親和性についてアッセイされ得る。
【０３５３】
本発明の二重特異性抗体は、ｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質合成及び結合タンパク質をコードする核酸の組換え発現を含む、当分野で周知の様々な方法を使用して産生され得る。所望の核酸配列を、組換え法（例えば、所望のポリヌクレオチドの以前に調製されたバリアントのＰＣＲ変異誘発）により、又は固相ＤＮＡ合成により製造し得る。通常は、組換え発現方法を使用する。一側面において、本発明は、ＣＤ３  ＶＨ及び／又はＶＬをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供し、別の側面において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ及び／又はＶＬをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。遺伝子コードの縮重のために、様々な核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードし、本発明は、本明細書で説明されている結合タンパク質をコードする全ての核酸を含む。
【０３５４】
本発明の二重特異性抗体は、ＩｇＧのＦｃドメインに融合している標的抗原及びＣＤ３に結合する２個のｓｃＦｖドメインを含むことができる。本発明の一態様において、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合しているＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３イプシロンに結合する２個のｓｃＦｖドメインを含むことができる。特に、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄは、ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の４つの代替的表示を示す。二重特異性抗体は、第１のヘテロ二量体促進及び第２のヘテロ二量体促進ドメインを含む。第１のヘテロ二量体促進及び第２のヘテロ二量体促進ドメインは、それぞれ、免疫グロブリンＦＣ領域のＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを含むことができ、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインは変更されて、ノブ（突出部）又はホール（空洞）を含む。二重特異性抗体のＦｃ部分への修飾が下記に記載される。
【０３５５】
本発明の一側面において、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄに示した二重特異性抗体は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む。
一側面において、本発明は、（ａ）第１のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＧＵＣＹ２ｃ抗体のＶＬ（ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ）及びＣＤ３抗体のＶＨ（ＣＤ３  ＶＨ）を含む、ドメイン１と、（ｉｉ）第１のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、（ｂ）第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）抗ＣＤ３抗体のＶＬ（ＣＤ３  ＶＬ）及びＧＵＣＹ２ｃ抗体のＶＨ（ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ）を含む、ドメイン２と、（ｉｉ）第２のヘテロ二量体促進ドメインとを含む、本明細書にさらに記載される二重特異性抗体を提供する。
【０３５６】
別の側面において、本発明は、（ａ）第１のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＣＤ３  ＶＬ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨを含む、ドメイン１と、（ｉｉ）第１のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、（ｂ）第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及びＣＤ３  ＶＨを含む、ドメイン２と、（ｉｉ）第２のヘテロ二量体促進ドメインとを含む、本明細書に記載される二重特異性抗体を提供する。
【０３５７】
なお別の側面において、本発明は、（ａ）第１のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ及びＣＤ３  ＶＬを含む、ドメイン１と、（ｉｉ）第１のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、（ｂ）第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＣＤ３  ＶＨ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬを含む、ドメイン２と、（ｉｉ）第２のヘテロ二量体促進ドメインとを含む、本明細書に記載される二重特異性抗体を提供する。
【０３５８】
別の側面において、本発明は、（ａ）第１のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＣＤ３  ＶＨ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬを含む、ドメイン１と、（ｉｉ）第１のヘテロ二量体促進ドメインとを含み、（ｂ）第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ及びＣＤ３  ＶＬを含む、ドメイン２と、（ｉｉ）第２のヘテロ二量体促進ドメインとを含む、本明細書に記載される二重特異性抗体を提供する。
【０３５９】
前述の一部の態様において、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨは、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合するドメインを形成し、ＣＤ３  ＶＬ及びＣＤ３  ＶＨは、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを形成する。
【０３６０】
前述のいずれかのさらなる態様において、本発明の二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１２、２０、２７、３４、４２、７４、２５７、２５８、２５９、２６０、又は２６１の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１３、２１、２８、３５、４３、５３、６６、６８、７０、７２、７５、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、又は２６７の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１４、２２、２９、３６、又は４４の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号９３、１０１、１０５、１０７、１１３、１２０、１４８、１５３、１６３、又は１６７の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７８、９４、１０２、１０８、１１４、１４１、１４４、１４６、１４９、１５１、１５７、１５９、１６１、１６４、又は１６８の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号９５、１０９、１１５、１２１、１４２、１５４、１６５、又は１６９の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０３６１】
特定の態様において、本発明の二重特異性抗体は、（ａ）配列番号７４の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号７５の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２９の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ  ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号１４８の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１４９の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号１４２の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０３６２】
特定の態様において、二重特異性抗体は、（ａ）配列番号７３の配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ領域、及び（ｂ）配列番号１４７に示す配列を含むＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ領域を含む。
【０３６３】
追加の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２の配列を含むＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号３又は１０の配列を含むＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４の配列を含むＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号７７、８５、又は９１の配列を含むＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７８を含むＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号７９の配列を含むＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ３を含む二重特異性抗体を提供する。
【０３６４】
特定の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２の配列を含むＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１０の配列を含むＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４の配列を含むＣＤ３  ＶＨ  ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号９１の配列を含むＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７８の配列を含むＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号７９の配列を含むＣＤ３  ＶＬ  ＣＤＲ３を含む二重特異性抗体を提供する。
【０３６５】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１、９、又は２７３の配列を含むＣＤ３  ＶＨ領域、及び（ｂ）配列番号７６、８４、９０、２７５、２７５、又は２７６の配列を含むＣＤ３  ＶＬ領域を含む二重特異性抗体を提供する。特定の態様において、本発明の二重特異性抗体は、（ａ）配列番９の配列を含むＣＤ３  ＶＨ領域、及び（ｂ）配列番号９０の配列を含むＣＤ３  ＶＬ領域を含む。
【０３６６】
本発明の別の側面において、リンカー３は、少なくとも１個のグリシン残基が下側ヒンジ領域に先行している配列ＧＣＰＰＣＰ（配列番号１９２）を有する切断ヒトＩｇＧ１下側ヒンジ領域を含むことができる。
【０３６７】
一側面において、第１のヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１８８、１９６、１９９、２０２、２０５、２１０、２１６、２４８、２８２、２８４、若しくは２８６の配列を含むノブＦｃ鎖（突出部）、又は配列番号１８９、１９７、２００、２０３、２０６、２１１、２１７、２２０、２４９、２８３、２８５、若しくは２８７の配列を含むホールＦｃ鎖（空洞）のいずれかを含むように変更されたＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを有するＦｃ鎖を含むことができる。別の側面において、第２のヘテロ二量体促進ドメインは、そのような第１のヘテロ二量体領域がホールＦｃ鎖（空洞）を含む場合、配列番号１８８、１９６、１９９、２０２、２０５、２１０、２１６、２４８、２８２、２８４、若しくは２８６の配列を含むノブＦｃ鎖（突出部）、又はそのような第１のヘテロ二量体領域がノブＦｃ鎖（突出部）を含む場合、配列番号１８９、１９７、２００、２０３、２０６、２１１、２１７、２２０、２４９、２８３、２８５、若しくは２８７の配列を含むホールＦｃ鎖（空洞）のいずれかを含むように変更されたＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを有するＦｃ鎖を含むことができる（表７）。
【０３６８】
表９は、本明細書に記載される様々なＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３抗体を有する二重特異性抗体の第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖の核酸配列を提供する。配列番号２４６及び２４７は、本明細書に使用される対応するヌクレオチド配列を提供する。
【０３６９】
【表９】
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【０３７０】
ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２〜ＣＨ３でのエフェクターヌル変異
ヒトＩｇＧ１のＦｃ鎖を、標準的なプライマーにより方向付けられるＰＣＲ変異誘発を使用して、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ（配列番号１８７、ＥＵインデックスに従うナンバリング）を導入するように改変して、エフェクター機能ヌル表現型をもたらすＦｃγＲＩＩＩへの結合に起因してエフェクター機能をオブラートした（ｏｂｌａｔｅ）（Ｃａｎｆｉｅｌｄ他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ（１９９１）１７３：１４８３〜１４９１；Ｓｈｉｅｌｄｓ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６：６５９１〜６０４）。
ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２〜ＣＨ３でのノブインホール変異
ノブインホールは、ヘテロ二量体化のために抗体重鎖ホモ二量体を設計するための当分野で公知の効果的な設計戦略である。このアプローチでは、「ノブ」バリアントを、ＩｇＧ１のＦｃ鎖の１つの鎖における小さいアミノ酸のより大きいアミノ酸への置き換え（例えば、Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ；ＥＵインデックスに従うナンバリング）により得た。「ノブ」を、大きい残基のより小さい残基への置き換え（例えば、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ；ＥＵインデックスに従うナンバリング）により生じるＦｃ鎖の相補鎖のＣＨ３ドメイン中の「ホール」に挿入されるように設計した。
【０３７１】
いくつかの態様では、相補的変異を、生じたＦｃ鎖のヘテロ二量体化を導くために導入し、その結果、各Ｆｃ鎖は、表１０に記載されているように、ノブ（若しくは突起）Ｆｃ鎖のための変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ（配列番号１８８）又はホール（若しくは空洞）Ｆｃ鎖のための変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（配列番号１８９）の１つのセットを保有するであろう。適切な哺乳動物宿主に共トランスフェクトされると、例えば配列番号２４６及び２４７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡにより、主に、１つのホール（又は空洞）Ｆｃ鎖と会合した１つのノブ（又は突起）Ｆｃ鎖を有する二重特異性抗体であるＦｃドメインが産生される。
【０３７２】
【表１０】
2021525080.tif 000029
【０３７３】
本発明のＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、熱安定性試験において凝集に対して安定であり、ヒトＣＤ３及びＧＵＣＹ２ｃの両方を標的とする強力な二重特異性抗体−Ｆｃ融合体である。ノブインホールＦｃドメインは、ＣＨＯ細胞中での発現の改善及び精製の改善を可能にし、その結果、所望のヘテロ二量体が高純度で得られる。Ｆｃドメイン内で設計された変異はＦｃγＲ結合を抑止し、そのためＡＤＣＣにより媒介されるＴ細胞の枯渇が潜在的に回避される。さらに、二重特異性抗体へのＦｃドメインの組込みは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により示すと、分子の安定性を増強している。
【０３７４】
二重特異性抗体を、鎖間ジスルフィド結合を形成するために、本発明の別のポリペプチド鎖上のカウンターパートのシステイン残基と相互作用し得る少なくとも１つのシステイン残基を含むように設計し得る。鎖間ジスルフィド結合は、二重特異性抗体を安定化させるのに役立ち得、組換え系における発現及び回収を改善し、安定しており、一貫した製剤をもたらし、並びに単離された及び／又は精製されたインビボでの生成物の安定性を改善する。システイン残基は、ポリペプチド鎖の任意の部分において、単一のアミノ酸として又はより大きいアミノ酸配列（例えばヒンジ領域）の一部として導入され得る。特定の側面では、少なくとも１つのシステイン残基は、ポリペプチド鎖のＣ末端に存在するように設計されている。
【０３７５】
一側面において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合し、本明細書に開示されている二重特異性抗体と結合を競合する二重特異性抗体を提供する。一部のそのような態様において、二重特異性抗体は、ＧＵＣＹ２ｃのエピトープに特異的に結合する。
【０３７６】
一側面において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体を提供し、この二重特異性抗体は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、以下の順番で以下の領域：抗ＧＵＣＹ２ｃ抗体のＶＬ（ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ）（配列番号１４７）−リンカー１（配列番号１９０）−抗ＣＤ３抗体のＶＨ（ＣＤ３  ＶＨ）（配列番号９）−リンカー３（配列番号１９２）−第１のヘテロ二量体促進ドメイン（配列番号１８８）を含み、（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、以下の順番で以下の領域：抗ＣＤ３抗体のＶＬ（ＣＤ３  ＶＬ）（配列番号９０）−リンカー２（配列番号１９１）抗ＧＵＣＹ２ｃ抗体のＶＨ（ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ）（配列番号７３）−リンカー３（配列番号１９２）−第２のヘテロ二量体促進ドメイン（配列番号１８９）を含む。
【０３７７】
別の側面において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体を提供し、この二重特異性抗体は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、以下の順番で以下の領域：抗ＧＵＣＹ２ｃ抗体のＶＬ（ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ）（配列番号１４７）−リンカー１（配列番号１９０）−抗ＣＤ３抗体のＶＨ（ＣＤ３  ＶＨ）（配列番号９）−リンカー３（配列番号１９２）−第１のヘテロ二量体促進ドメイン（配列番号１８８）を含み、（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、以下の順番で以下の領域：抗ＣＤ３抗体のＶＬ（ＣＤ３  ＶＬ）（配列番号９０）−リンカー２（配列番号１９１）−抗ＧＵＣＹ２ｃ抗体のＶＨ（ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ）（配列番号７３）−リンカー３（配列番号１９２）−第２のヘテロ二量体促進ドメイン（配列番号１８９）を含み、ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ及びＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨは、ＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合するドメインを形成し、ＣＤ３  ＶＬ及びＣＤ３  ＶＨは、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを形成し、第１のポリペプチド鎖のリンカー３及び第２のポリペプチド鎖のリンカー３は、２個のジスルフィド結合により互いに共有結合しており、第１のヘテロ二量体促進ドメイン及び第２のヘテロ二量体促進ドメインは、それぞれＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、第１のヘテロ二量体促進ドメインのＣＨ３ドメインは、ノブを形成し、第２のヘテロ二量体促進ドメインのＣＨ３ドメインは、ホールを形成し、少なくとも１個のジスルフィド結合が、第１のヘテロ二量体促進ドメインのＣＨ３ドメインと第２のヘテロ二量体促進ドメインのＣＨ３ドメインとの間に形成される。
【０３７８】
一部のそのような態様において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃのエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
一部の態様において、本発明は、ヒト又はヒト化ＶＨフレームワーク、及びヒト又はヒト化ＶＬフレームワークをさらに含む二重特異性抗体を提供する。一部のそのような態様において、二重特異性抗体はヒト化抗体である。特定の態様において、ＶＨフレームワークは、配列番号５、６、７、８、１５、１６、１７、１８、２３、２４、２５、３０、３１、３２、３７、３８、３９、４０、４５、４６、４７、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５８、５９、６１、又は６３の配列を含む、及び／又はＶＬフレームワークは、配列番号８０、８１、８２、８３、８６、８７、８８、８９、９６、９７、９８、９９、１０３、１１０、１１１、１１６、１１７、１１８、１２２、１２３、１２４、１２６、１２７、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３９、又は１５５の配列を含む。
【０３７９】
一側面において、本発明の二重特異性抗体は、ＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３に特異的に結合し、この二重特異性抗体は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２４９４４の発現ベクターにより産生され、第２のポリペプチド鎖は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２４９４３の発現ベクターにより産生される。
【０３８０】
一側面において、本発明は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖が、配列番号２１６の配列を含み、第２のポリペプチド鎖が、配列番号２２０の配列を含む、ＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３に特異的に結合することができる二重特異性抗体を提供する。
【０３８１】
一部のそのような態様において、本発明は、第１及び第２のポリペプチド鎖が、少なくとも１個のジスルフィド結合により互いに共有結合している、二重特異性抗体を提供する。
【０３８２】
本発明は、治療有効量の本明細書に開示されている抗体又は二重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物をさらに提供する。
本発明は、対象においてがんを処置、予防、又は管理するための方法及び組成物を包含し、治療有効量の、本発明により改変された抗体又は二重特異性抗体を対象に投与することを含み、この分子はがん抗原にさらに結合する。本発明の分子は、原発性腫瘍及びがん細胞の転移の予防、阻害、増殖の低減、及び／又は退縮に特に有用であり得る。特定の作用機序に拘束されることは意図されていないが、本発明の分子は、腫瘍クリアランス、腫瘍縮小、又はこれらの組み合わせをもたらし得るエフェクター機能を媒介し得る。
【０３８３】
本発明の抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性）は、治療処置方法及び診断処置方法が含まれるが、これらに限定されない様々な用途に有用である。
【０３８４】
一側面において、本発明は、対象のＧＵＣＹ２ｃ発現に関連する状態を処置する方法を提供する。一部の態様において、対象のＧＵＣＹ２ｃ発現に関連する状態を処置する方法は、本明細書に記載されるＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体を含む有効量の組成物（例えば、医薬組成物）を、必要とする対象に投与することを含む。ＧＵＣＹ２ｃ発現に関連する状態には、通常ではない（ａｂｎｏｒｍａｌ）ＧＵＣＹ２ｃ発現、変更された又は異常なＧＵＣＹ２ｃ発現、ＧＵＣＹ２ｃを発現する悪性腫瘍細胞、及び繁殖性障害（例えば、がん）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３８５】
したがって、本発明は、二重特異性抗体を改変して、ＧＵＣＹ２ｃ抗原及びＣＤ３抗原をＴ細胞に免疫特異的に認識させることにより、ＧＵＣＹ２ｃ抗原により特徴づけられるがんを治療する方法を提供する。本発明により改変された二重特異性抗体は、抗ＣＤ３誘導活性化キラーＴ細胞による細胞障害活性を有するので、がんの予防又は処置のために有用である。
【０３８６】
特定の態様において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ関連障害の処置を必要とする患者においてＧＵＣＹ２ｃ関連障害を処置する方法であって、本明細書に開示されているＧＵＣＹ２ｃ抗体を患者に投与することを含む方法を提供する。本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ関連障害の処置を必要とする患者においてＧＵＣＹ２ｃ関連障害を処置する方法であって、本発明の二重特異性抗体を患者に投与することを含む方法も提供する。
【０３８７】
本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ関連障害の処置を必要とする患者においてＧＵＣＹ２ｃ関連障害を処置する方法であって、本明細書に開示されているＧＵＣＹ２ｃ抗体又は二重特異性抗体を含む医薬組成物を患者に投与することを含む方法をさらに提供する。一部のそのような態様において、ＧＵＣＹ２ｃ関連障害は、がんである。特定の態様では、癌は、乳房、卵巣、甲状腺、前立腺、子宮頸部、肺（非小細胞肺癌及び小細胞肺癌を含む）、膀胱、子宮内膜、頭頸部、精巣、又は神経膠芽腫の癌である。ある特定の態様において、がんは、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、虫垂、胆管、及び膵臓からなる群から選択される消化器系のがんである。特定の態様において、治療は細胞溶解性Ｔ細胞反応を活性化する。
【０３８８】
一側面において、本発明は、治療での使用のための、本明細書に開示されている抗体、二重特異性抗体、又は医薬組成物を提供する。特定の態様において、本発明は、本明細書に定義されているがんを処置する方法における使用のための、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体も提供する。
【０３８９】
本発明は、治療での使用のための医薬の製造における使用のための、本明細書に開示されている抗体又は二重特異性抗体をさらに提供する。一部の態様において、治療はＧＵＣＹ２ｃ関連障害の処置である。特定の態様において、ＧＵＣＹ２ｃ関連障害は、がんである。いくつかの態様では、癌は、乳房、卵巣、甲状腺、前立腺、子宮頸部、肺（非小細胞肺癌及び小細胞肺癌を含む）、膀胱、子宮内膜、頭頸部、精巣、及び神経膠芽腫の癌からなる群から選択される。ある特定の態様において、がんは、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、虫垂、胆管、及び膵臓からなる群から選択される消化器系のがんである。特定の態様において、治療は細胞溶解性Ｔ細胞反応を活性化する。
【０３９０】
一側面では、本発明は、本明細書で開示されている抗体又は二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、本発明は、本明細書で開示されているポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。なお別の態様において、本発明は、本明細書に開示されているベクターによりトランスフォーム又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。一部のそのような態様において、宿主細胞は、本明細書に開示されている抗体又は二重特異性抗体を組換え的に産生する。特定の態様において、宿主細胞は、細菌細胞株、哺乳類細胞株、昆虫細胞株及び酵母細胞株からなる群から選択される。特定の実施側面において、哺乳類細胞株はＣＨＯ細胞株である。一態様において、抗体又は二重特異性抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ無細胞タンパク質合成系を使用して産生される。
【０３９１】
一側面では、がんの処置を必要とする対象において、処置する方法であって、ａ）本明細書に記載される二重特異性抗体を準備すること、及びｂ）この二重特異性抗体をこの患者に投与することを含む方法が提供される。一部の態様では、対象において腫瘍抗原を発現する悪性腫瘍細胞に関連する状態を処置する方法であって、ａ）本明細書に記載される抗体を準備すること、及びｂ）本明細書に記載される抗体を含む有効量の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。処置されるがんの例には、食道がん、胃がん、小腸がん、結腸がん、直腸がん、肛門がん、肝がん、胆嚢がん、虫垂がん、胆管がん、及び膵がんが含まれるが、これらに限定されない。したがって、本明細書に記載される組成物及び方法は、上記に列挙された原発性及び転移性のがんに対して処置、画像化、検出、及びワクチン接種するために使用され得る。
【０３９２】
一部の態様では、ＧＵＣＹ２ｃを発現する悪性腫瘍細胞を有する対象において腫瘍増殖又は進行を阻害する方法であって、本明細書に記載されるＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体を含む有効量の組成物を、必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。他の態様では、対象においてＧＵＣＹ２ｃを発現する転移細胞を阻害する方法であって、本明細書に記載されるＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体を含む有効量の組成物を、必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。他の態様では、提供されるのは、対象において悪性腫瘍の腫瘍退縮を誘発する方法であって、本明細書で説明されているＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体を含む組成物の有効な量をこの必要な対象に投与する工程を含む方法である。
【０３９３】
特定の側面では、本発明のＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、本発明の抗体又は二重特異性抗体の非存在下での癌細胞の増殖と比較して、癌細胞の増殖を少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、又は少なくとも１０％阻害するか、又は減少させる。
【０３９４】
特定の側面では、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、本発明の抗体又は二重特性抗体の非存在下の場合と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％良好に、細胞を死滅させるか、又は癌細胞の増殖を減少させる。
【０３９５】
一態様では、対象において自己免疫障害を処置する方法であって、本明細書に記載されるＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体を含む有効量の組成物を、必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。
【０３９６】
本明細書に使用されるとき、自己免疫障害には、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、糖尿病（Ｉ型）、セリアック病、無ガンマグロブリン血症、自己免疫性腸症、自己免疫性肝炎、クローン病、胃腸の類天疱瘡（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、多発性筋炎、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、及び血管炎が含まれるが、これらに限定されない。
【０３９７】
一側面において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ発現に関連する状態（例えば、がん）の処置を必要とする対象において、処置するために、本明細書に記載される抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）を含む有効量の組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。一態様では、ＧＵＣＹ２ｃを発現する悪性腫瘍細胞を有する対象において腫瘍増殖又は進行を阻害するために、本明細書に記載される抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）を含む有効量の組成物（例えば、医薬組成物）が提供される。一部の態様では、ＧＵＣＹ２ｃを発現する悪性腫瘍細胞の転移の阻害を必要とする患者においてそれを阻害するために、本明細書に記載される抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）を含む有効量の組成物（例えば、医薬組成物）が提供される。一部の態様では、本明細書に記載される抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）を含む有効量の組成物（例えば、医薬組成物）が提供される。
【０３９８】
別の側面において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ発現に関連する状態（例えば、がん）の処置を必要とする対象において、処置での使用のために、本明細書に記載される抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＹ２ｃ二重特異性抗体）を提供する。一部の態様では、ＧＵＣＹ２ｃを発現する悪性腫瘍細胞を有する対象において腫瘍増殖又は進行を阻害するために、本明細書に記載される抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）が提供される。一部の態様では、ＧＵＣＹ２ｃを発現する悪性腫瘍細胞の転移の阻害を必要とする患者においてそれを阻害するために、本明細書に記載される抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）が提供される。一部の態様では、ＧＵＣＹ２ｃを発現する悪性腫瘍細胞を有する対象において腫瘍退縮を誘導するために、本明細書に記載される抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）が提供される。
【０３９９】
別の側面において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ発現に関連する状態（例えば、がん）を処置するための医薬の製造における、本明細書に記載される抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）の使用を提供する。一部の態様では、腫瘍増殖又は進行を阻害するための医薬の製造における、本明細書に記載される抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）の使用が提供される。一部の態様では、ＧＵＣＹ２ｃを発現する悪性腫瘍細胞の転移を阻害するための医薬の製造における、本明細書に記載される抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）の使用が提供される。一部の態様では、腫瘍退縮を誘導するための医薬の製造における、本明細書に記載される抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）の使用が提供される。
【０４００】
別の側面では、ＧＵＣＹ２ｃ発現に関連する状態を検出、診断、及び／又はモニタリングする方法が提供される。例えば、本明細書に記載される抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）は、画像化剤及び酵素基質標識などの検出可能な部分で標識され得る。本明細書に記載される抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化（例えば、ＰＥＴ若しくはＳＰＥＣＴ）、又は染色試薬などのｉｎ  ｖｉｖｏ診断アッセイに使用することもできる。
【０４０１】
したがって、Ｔ細胞を腫瘍特異的抗原に向け直すことに加えて、本発明のＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、表面に腫瘍を発現する細胞に、他の診断又は治療剤を運搬するために使用することができる。このように、二重特異性抗体は、直接的に、又は例えばリンカーを介して間接的に薬物に結合され得、それによって、腫瘍を担持する細胞に直接送達される。治療剤には、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸若しくは誘導体、糖タンパク質、放射性同位体、脂質、炭水化物、又は組換えウイルスが含まれるが、これらに限定されない。核酸診断又は治療剤には、アンチセンス核酸、単又は二重鎖ＤＮＡと共有架橋する誘導体化オリゴヌクレオチド、及び三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ｔｒｉｐｌｅｘ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０４０２】
或いは、本発明の二重特異性抗体に連結している診断又は治療剤は、循環系への直接の曝露から好ましくは遮蔽されている薬物、核酸（例えば、アンチセンス核酸）又は別の治療剤などの治療剤を含有する、リポソーム又はミセルなどのカプセル化系であり得る。抗体に結合しているリポソームを調製する方法は、当業者に周知である。例えば、米国特許第４，９５７，７３５号及びＣｏｎｎｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．２８：３４１−３６５（１９８５）を参照すること。
【０４０３】
いくつかの態様では、本明細書で説明されている方法は、追加の治療形態で対象を処置する工程をさらに含む。いくつかの態様では、この追加の治療形態は、追加の抗癌療法（例えば、限定されないが、化学療法、放射線、手術、ホルモン療法、及び／又は追加の免疫療法）である。
【０４０４】
本発明は、本発明の分子を、癌の処置又は予防のための当業者公知の他の治療（例えば、限定されないが、現在の標準的な及び実験的な化学療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、又は手術）と組み合わせて投与することをさらに包含する。いくつかの側面では、本発明の分子を、癌の処置及び／又は予防のための当業者公知の１種又は複数種の薬剤、治療用抗体、又は他の薬剤の治療上又は予防上有効な量と組み合わせて投与し得る。
【０４０５】
したがって、癌を処置する方法は、化学療法剤と組み合わせて、本発明の抗体又は二重特異性抗体の有効な量を、癌の処置が必要な対象に投与する工程を含む。そのような組み合わせ処置は、別個、順次、又は同時に投与され得る。適切な化学療法剤には、ベバシズマブ、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍｂ）、シロリムス、パニツムマブ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン、チボザニブ、イリノテカン、オキサリプラチン、シスプラチン、トリフルリジン、チピラシル、ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉ）、ゲムシタビン、及び／又はエルロチニブ塩酸塩などの少なくとも１つの追加の薬剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０４０６】
本明細書で提供される投与量及び投与頻度は、治療上有効及び予防上有効という用語に包含される。投与量及び頻度は、投与される特定の治療又は予防剤、がんの重症度及びタイプ、投与経路、並びに患者の年齢、体重、反応及び過去の病歴に応じて、それぞれの患者に特異的な因子によりさらに変わり得る。適切なレジメンは、そのような因子を考慮することにより、例えば文献で報告されており及びＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（第５６版、２００２）で推奨されている投与量に従うことにより、当業者によって選択され得る。
【０４０７】
本発明の抗体又は二重特異性抗体は、選択された投与様式及び薬学的に許容される希釈剤又は賦形剤、例えば、緩衝剤、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定剤、担体などに適しているように処方される、投与用医薬組成物の形態であり得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．，第１８版、１９９５は、専門家に一般的に知られている製剤化技術の概要を提供する。
【０４０８】
これらの医薬組成物を、癌を処置することが一般に意図されている目的を達成する当分野で公知の任意の手段により投与し得る。投与経路は、本明細書に定義される非経口であってもよく、経食道的、腫瘍内、経結腸内視鏡的（ｔｒａｎｓｃｏｌｏｎｏｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ）、経皮的、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、及び静脈内注射及び注入が含まれるが、これらに限定されない投与様式が参照される。本発明の分子（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体、ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体、医薬組成物）の投与及び投薬（ｄｏｓｉｎｇ）の方法は、戦うべき疾患のタイプ、適切な場には、その病期、制御される抗原、存在する場合には同時処置の種類、処置の頻度、望ましい効果の性質、また、患者の体重、年齢、健康、食事及び性別によって左右される。そのため、実施に採用される投与レジメンは大きく変わり得、したがって、本明細書に記載される投与レジメンから逸脱し得る。
【０４０９】
本発明の抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）の様々な製剤を投与に使用することができる。一部の態様において、抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）は、未希釈で投与され得る。一部の態様において、抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）及び薬学的に許容される賦形剤は、様々な製剤の中にあり得る。薬学的に許容される賦形剤は当分野で公知であり、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形状又は一貫性を付与し得るか、又は希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤として、安定化剤、湿潤剤及び乳化剤、モル浸透圧濃度を変更するための塩、封入剤、バッファー、及び皮膚浸透促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。賦形剤、並びに非経口の及び経口の薬物送達のための製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２１版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００５に記載されている。
【０４１０】
いくつかの態様では、これらの薬剤を、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内等）による投与用に製剤化する。したがって、これらの薬剤を、薬学的に許容されるビヒクル（例えば、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液、及び同類のもの）と組み合わせ得る。特定の投与レジメン（即ち、用量、タイミング、及び反復）は、特定の個体及びその個体の病歴に依存するであろう。
【０４１１】
本明細書で説明されている抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）を、任意の好適な方法（例えば、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内等））を使用して投与することができる。本明細書で説明されているように、抗体（例えば、モノクローナル抗体又は二重特異性抗体）を、吸入によっても投与する。一般に、本発明の抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）の投与のために、投与量は、処置される宿主及び特定の投与様式に依存する。一態様では、本発明の抗体の用量範囲は、約０．００１μｇ／体重ｋｇ〜約２０，０００μｇ／体重ｋｇであるであろう。用語「体重」は、患者が処置されている際に適用される。単離細胞が処置されている場合には、「体重」は、本明細書で使用される場合、「全細胞体重」を指す。用語「全体重」は、単離細胞及び患者処置の両方に適用するために使用され得る。全ての濃度及び処置レベルは、本出願では、「体重」、又は単に「ｋｇ」で表され、類似の「全細胞体重」及び「全体重」濃度をカバーするとも考えられる。しかしながら、当業者は、様々な投与量範囲（例えば、０．０１μｇ／体重ｋｇ〜２０，０００μｇ／体重ｋｇ、０．０２μｇ／体重ｋｇ〜１５，０００μｇ／体重ｋｇ、０．０３μｇ／体重ｋｇ〜１０，０００μｇ／体重ｋｇ、０．０４μｇ／体重ｋｇ〜５，０００μｇ／体重ｋｇ、０．０５μｇ／体重ｋｇ〜２，５００μｇ／体重ｋｇ、０．０６μｇ／体重ｋｇ〜１，０００μｇ／体重ｋｇ、０．０７μｇ／体重ｋｇ〜５００μｇ／体重ｋｇ、０．０８μｇ／体重ｋｇ〜４００μｇ／体重ｋｇ、０．０９μｇ／体重ｋｇ〜２００μｇ／体重ｋｇ、又は０．１μｇ／体重ｋｇ〜１００μｇ／体重ｋｇ）の有用性を認識するであろう。さらに、当業者は、様々な異なる投与量レベル（例えば、０．０００１μｇ／ｋｇ、０．０００２μｇ／ｋｇ、０．０００３μｇ／ｋｇ、０．０００４μｇ／ｋｇ、０．００５μｇ／ｋｇ、０．０００７μｇ／ｋｇ、０．００１μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ、１．０μｇ／ｋｇ、１．５μｇ／ｋｇ、２．０μｇ／ｋｇ、５．０μｇ／ｋｇ、１０．０μｇ／ｋｇ、１５．０μｇ／ｋｇ、３０．０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２０μｇ／ｋｇ、１４０μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、１６０μｇ／ｋｇ、１８０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２５μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、２７５μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３２５μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、３７５μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、及び／又は３０ｍｇ／ｋｇ）が使用されることを認識するであろう。これらの投与量は全て例示的であり、これらの点の間のあらゆる投与量も、本発明で使用されることが予想される。上記の投与量範囲又は投与量レベルの内のいずれかを、本発明の抗体に採用し得る。状態に応じて、数日以上にわたり投与を反復する場合には、症状の所望の抑制が起こるまで��又は十分な治療レベルが達成されるまで（例えば、腫瘍の増殖／進行又は癌細胞の転移の阻害又は遅延が達成されるまで）、処置が持続される。
【０４１２】
専門家が達成することを望む薬物動態崩壊のパターンに応じて、他の投与レジメンも有用であり得る。一態様では、本発明の抗体を、最初のプライミング用量で投与し、続いて、より高い及び／又は連続的な実質的に一定の投与量で投与する。いくつかの態様では、１週間に１〜４回の投与が企図されている。他の態様では、１ヶ月に１回、又は２ヶ月毎に若しくは３ヶ月毎に１回の投与が企図されている。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる。投与レジメン（抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）を含む）は、経時的に変わり得る。
【０４１３】
本発明の目的のために、抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）の適切な投与量は、採用される抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）又はその組成物、処置される症状の種類及び重症度、この薬剤を治療目的で投与するかどうか、これまでの治療、患者の臨床歴及びこの薬剤に対する反応、投与された薬剤に関する患者のクリアランス率、並びに主治医の裁量に依存するであろう。典型的には、臨床医は、所望の結果が達成される投与量に達するまで抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）を投与するであろう。用量及び／又は頻度は、処置の過程中に変わり得る。半減期等の経験的な考慮は、一般に、投与量の決定に寄与するであろう。例えば、ヒト免疫系に適合する抗体（例えば、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体）を使用して、抗体の半減期を延長し得、抗体が宿主の免疫系に攻撃されることを防止し得る。投与頻度は、決定されて治療の過程中に調整され得、一般には、処置、並びに／又は症状の抑制及び／若しくは寛解及び／若しくは遅延（例えば腫瘍増殖の阻害若しくは遅延）等に基づいているが、必ずしもそうではない。或いは、抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）の持続的連続放出製剤が適切であり得る。持続的放出を達成するための様々な製剤及び装置が、当分野で知られている。
【０４１４】
一態様では、抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）の投与量を、抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）の１回又は複数回の投与を受けている個体において経験的に決定し得る。個体は、抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）の漸増的な投与量が投与される。有効性を評価するために、疾患の指標を追跡し得る。
【０４１５】
ある特定の態様では、抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）の投与により、下記からなる群から選択される少なくとも１つの効果がもたらされる：腫瘍増殖の阻害、腫瘍退縮、腫瘍サイズの減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍増殖の遅延、アブスコパル効果、腫瘍転移の阻害、経時的な転移性病変の減少、化学療法又は細胞傷害剤の使用の減少、腫瘍負荷の減少、無増悪生存率の増加、全生存率の増加、完全奏効、部分奏効、及び疾患の安定。
【０４１６】
本発明の方法に従う抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的であるか予防的であるか、及び当業者公知の他の因子に応じて、連続的であり得るか、又は断続的であり得る。抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）の投与は、予め選択された期間にわたり本質的に連続的であってもよいし、一連の間隔を置いた投与であってもよい。
【０４１７】
いくつかの態様では、複数種の抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）が存在してもよい。少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種の異なる、又はより多くの抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）が存在し得る。一般に、これらの抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）は、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有してもよい。例えば、下記の抗体の内の１つ又は複数を使用してもよい：ＧＵＣＹ２ｃ又はＣＤ３上の１つのエピトープを対象とする第１のＧＵＣＹ２ｃ又はＣＤ３抗体、及びＧＵＣＹ２ｃ又はＣＤ３上の異なるエピトープを対象とする第２のＧＵＣＹ２ｃ又はＣＤ３抗体。
【０４１８】
本発明に従って使用される本抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）の治療用製剤を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、所望の程度の純度を有する抗体と、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２１版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００５）とを混合することにより、貯蔵用に調製する。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、採用される投与量及び濃度にてレシピエントに対して無毒であり、下記を含み得る：バッファー、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；塩、例えば塩化ナトリウム；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸及びメチオニン；保存料（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール、若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル若しくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン；単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、若しくはデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；並びに／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。
【０４１９】
本抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）を含むリポソームを、当分野で公知の方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８，１９８５；Ｈｗａｎｇ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０，１９８０；並びに米国特許第４，４８５，０４５号明細書及び同第４，５４４，５４５号明細書で説明されている）により調製する。循環時間が増強されているリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号明細書で開示されている。特に有用なリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物による逆相蒸発法によって生成し得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを得るために、細孔サイズが定義されているフィルタを通して押し出される。
【０４２０】
活性成分はまた、それぞれ、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）又はマクロエマルションにおいて、例えば、コアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル（例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）に封入され得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２１版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００５で開示されている。
【０４２１】
徐放性調製物も調製し得る。徐放性調製物の適切な例として、本抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品（例えば、フィルム又はマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの例として、下記が挙げられる：ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又は’ポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸及び７エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性のエチレン−酢酸ビニル、分解性の乳酸−グリコール酸のコポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸リュープロリドで構成された注射可能なマイクロスフェア）、ショ糖アセテートイソブチレート、並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸。
【０４２２】
インビボでの投与に使用する製剤は、無菌でなければならない。このことは、例えば、無菌フィルタ膜を通したろ過により、容易に達成される。治療用抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器（例えば、皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用溶液のバッグ又はバイアル）に入れられる。
【０４２３】
本発明に係る組成物は、経口投与、非経口投与、又は直腸投与のための単位剤形（例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、溶液剤、又は懸濁液剤、又は座薬）であってもよいし、吸入又は吹送による投与のための単位剤形であってもよい。
【０４２４】
錠剤等の固体組成物を調製するために、主要な活性成分を、医薬担体（例えば、従来の錠剤化成分、例えば、コーンスターチ、乳糖、ショ糖、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、又はガム）及び他の医薬希釈剤（例えば水）と混合して、本発明の化合物又はその非毒性の薬学的に許容される塩の均質混合物を含む固体の予備処方組成物を形成する。この予備処方組成物を均質と呼ぶ場合には、活性成分が組成物全体にわたり等しく分散されており、その結果、この組成物は、錠剤、丸剤、及びカプセル剤等の等しく有効な単位剤形に容易に再分割され得ることを意味する。次いで、この固体の予備処方組成物を、本発明の活性成分０．１〜約５００ｍｇを含む上記で説明した種類の単位剤形に再分割する。この新規組成物の錠剤又は丸剤を、コーティングするか又は他の方法で配合して、持続性作用という利点を付与する剤形を得ることができる。例えば、この錠剤又は丸剤は、内側の投与及び外側の投与成分を含み得、後者は、前者を覆うエンベロープの形態である。これら２種の成分を、胃中での崩壊に対して耐性を示すのに役立ち、内側の成分が十二指腸を無傷で通過するか又は遅れて放出されることを可能にする腸溶層で分離し得る。そのような腸溶層又はコーティングに様々な材料を使用し得、そのような材料として、多くの高分子酸、及び高分子酸とシェラック、セチルアルコール、及びセルロースアセテート等の材料との混合物が挙げられる。
【０４２５】
適切な界面活性剤として、特に、ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０、又は８５）及び他のソルビタン（例えば、Ｓｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０、又は８５）等の非イオン性の薬剤が挙げられる。界面活性剤を含む組成物は、好都合には０．０５〜５％の界面活性剤を含み、０．１〜２．５％であり得る。必要に応じて、他の成分（例えば、マンニトール、又は他の薬学的に許容されるビヒクル）を添加してもよいことが認識されるであろう。
【０４２６】
適切な乳剤は、市販の脂肪乳剤、例えば、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）、及びＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）を使用して調製することができる。活性成分は、プレミックス乳剤組成物に溶解されるか、或いは油（例えば、ダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油、又はアーモンド油）に溶解され、リン脂質（例えば、タマゴリン脂質、ダイズリン脂質、又はダイズレシチン）及び水と混合して乳剤が形成され得る。他の成分、例えば、グリセロール又はグルコースを加えて、乳剤の張度を調整できることが理解される。適切な乳剤は、典型的には、２０％まで、例えば５〜２０％の油を含有する。脂肪乳剤は、０．１〜１．０μｍ、特に０．１〜０．５μｍの脂肪液滴を含み、５．５〜８．０の範囲のｐＨを有することができる。
【０４２７】
乳剤組成物は、抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体、若しくはＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）と又はその成分（ダイズ油、タマゴリン脂質、グリセロール、及び水）と混合することによって調製され得る。
【０４２８】
吸入又は通気用の組成物には、薬学的に許容される水性若しくは有機溶媒、又はそれらの混合物中の液剤及び懸濁剤、並びに散剤が含まれる。脂質又は固体組成物は、上記に記載された適切な薬学的に許容される賦形剤を含有することができる。一部の態様において、組成物は、局所又は全身効果のために口又は鼻呼吸経路により投与される。好ましくは滅菌の薬学的に許容される溶媒中の組成物は、ガスの使用により噴霧され得る。噴霧液剤は、噴霧器から直接吸引することができる、又は噴霧器をフェースマスク、テント、若しくは間欠的陽圧呼吸機に接続することができる。液剤、懸濁剤、又は散剤組成物は、好ましくは、適切な方法により製剤を送達する装置から経口的又は経鼻的に投与され得る。
【０４２９】
本発明の範囲内の組成物には、抗体（ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）が、がんを処置する所望の医学効果を達成するのに有効な量で存在する、全ての組成物が含まれる。個々のニーズは患者によって異なり得るが、全ての成分の有効な量の最適な範囲の決定は、通常の技術を有する臨床医の能力の範囲内である。
【０４３０】
そのような組成物の例、及び製剤化の方法も、前のセクション及び下記に記載される。一部の態様において、組成物は、１個以上の抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）を含む。一部の態様において、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である。一部の態様において、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、所望の免疫反応、例えば、抗体媒介性溶解又はＡＤＣＣを誘発することができる定常領域を含む。他の態様において、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、不要な又は望ましくない免疫反応、例えば、抗体媒介性溶解又はＡＤＣＣを誘発しない定常領域を含む。
【０４３１】
組成物は、１個を超える抗体（例えば、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体）、例えば、ＧＵＣＹ２ｃ又はＣＤ３及びＧＵＣＹ２ｃの異なるエピトープを認識するＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の混合物を含み得ることが理解される。他の例示的な組成物は、ＧＵＣＹ２ｃ抗体、ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の同じエピトープ若しくは異なる種を認識する、又はＧＵＣＹ２ｃ（例えば、ヒトＧＵＣＹ２ｃＡ）、若しくはＣＤ３及びＧＵＣＹ２ｃ（ヒトＣＤ３及びＧＵＣＹ２ｃ）の異なるエピトープに結合する、１個を超えるＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体を含む。
【０４３２】
いくつかの態様では、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体を、１種又は複数種の追加の治療薬の投与と組み合わせて投与し得る。これらとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：生物学的製剤及び／又は化学療法剤の投与、例えば、限定されないが、ワクチン、ＣＡＲ−Ｔ細胞ベースの治療、放射酸治療、サイトカイン治療、ＣＤ３二重特異性抗体、他の免疫抑制経路の阻害剤、血管新生の阻害剤、Ｔ細胞活性化剤、代謝経路の阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、アデノシン経路の阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、限定されないが、Ｉｎｌｙｔａ、ＡＬＫ阻害剤及びスニチニブ、ＢＲＡＦ阻害剤、エピジェネティック改変剤、ＩＤＯ１阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ＳＴＡＴ阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、生物学的製剤（例えば、限定されないが、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、他の増殖因子受容体、ＣＤ４０、ＣＤ−４０Ｌ、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、ＴＩＧＩＴ、及びＩＣＯＳに対する抗体）、免疫原性剤（例えば、弱毒化された癌細胞、腫瘍抗原、腫瘍由来抗原又は核酸を瞬間適用された抗原提示細胞（例えば樹状細胞）、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮα２、ＧＭ−ＣＳＦ）、ＧＭ−ＳＣＦが挙げられるがこれに限定されない免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞）。
【０４３３】
生物学的製剤の例として、治療用抗体、免疫調節剤、及び治療用免疫細胞が挙げられる。
治療用抗体は、様々な異なる抗原に対する特異性を有し得る。例えば、治療用抗体は、抗原へのこの抗体の結合がこの抗原を発現する細胞の死滅を促進するような腫瘍関連抗原を対象とし得る。他の例では、治療用抗体は、この抗体の結合が、抗原を発現する細胞の活性の下方制御を防止する（それにより、この抗原を発現する細胞の活性を促進する）ような、免疫細胞上の抗原（例えばＰＤ−１）を対象とし得る。いくつかの状況下では、治療用抗体は、複数の異なるメカニズムを介して機能し得る（例えば、ｉ）抗原を発現する細胞の死滅を促進すること、及びｉｉ）抗原が、この抗原を発現する細胞と接触する免疫細胞の活性の下方制御を引き起こすことを防止することの両方であり得る）。
【０４３４】
治療用抗体は、例えば、下記に列挙する抗原を対象とし得る。いくつかの抗原に関しては、この抗原を対象とする例示的な抗体も下記で含まれる（この抗原の後の角括弧／丸括弧内）。下記の抗原は、本明細書では「標的抗原」又は同類のものとも称され得る。この治療用抗体の標的抗原として、本明細書では、例えば下記が挙げられる：４−１ＢＢ（例えばウトミルマブ（ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ））；５Ｔ４；Ａ３３；アルファ−葉酸受容体１（例えばミルベツキシマブソラブタンシン（ｍｉｒｖｅｔｕｘｉｍａｂ  ｓｏｒａｖｔａｎｓｉｎｅ））；Ａｌｋ−１；ＢＣＭＡ［例えばＰＦ−０６８６３１３５（米国特許第ＵＳ９９６９８０９号明細書を参照されたい）］；ＢＴＮ１Ａ１（例えば国際公開第２０１８２２２６８９号パンフレットを参照されたい）；ＣＡ−１２５（例えばアバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ））；カルボアンヒドラーゼＩＸ；ＣＣＲ２；ＣＣＲ４（例えばモガムリズマブ）；ＣＣＲ５（例えばレロンリマブ（ｌｅｒｏｎｌｉｍａｂ））；ＣＣＲ８；ＣＤ３［例えばブリナツモマブ（ＣＤ３／ＣＤ１９二重特異性）、ＰＦ−０６６７１００８（ＣＤ３／Ｐ−カドヘリン二重特異性）、ＰＦ−０６８６３１３５（ＣＤ３／ＢＣＭＡ二重特異性）、ＣＤ１９（例えばブリナツモマブ、ＭＯＲ２０８）；ＣＤ２０（例えば、イブリツモマブチウキセタン、オビヌツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ウブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ））；ＣＤ２２（イノツズマブオゾガマイシン、モキセツモマブパスドトクス）；ＣＤ２５；ＣＤ２８；ＣＤ３０（例えばブレンツキシマブベドチン）；ＣＤ３３（例えばゲムツズマブオゾガマイシン）；ＣＤ３８（例えば、ダラツムマブ、イサツキシマブ）、ＣＤ４０；ＣＤ−４０Ｌ；ＣＤ４４ｖ６；ＣＤ４７；ＣＤ５２（例えばアレムツズマブ）；ＣＤ６３；ＣＤ７９（例えばポラツズマブベドチン）；ＣＤ８０；ＣＤ１２３；ＣＤ２７６／Ｂ７−Ｈ３（例えばオンブルタマブ（ｏｍｂｕｒｔａｍａｂ））；ＣＤＨ１７；ＣＥＡ；ＣｌｈＣＧ；ＣＴＬＡ−４（例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ），ＣＸＣＲ４；デスモグレイン４；ＤＬＬ３（例えばロバルピツズマブテシリン）；ＤＬＬ４；Ｅ−カドヘリン；ＥＤＡ；ＥＤＢ；ＥＦＮＡ４；ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブ、デパツキシズマブマホドチン、ネシツムマブ、パニツムマブ）；ＥＧＦＲｖＩＩＩ；エンドシアリン；ＥｐＣＡＭ（例えばオポルツズマブモナトクス）；ＦＡＰ；胎児アセチルコリン受容体；ＦＬＴ３（例えば国際公開第２０１８／２２０５８４号パンフレットを参照されたい）；ＧＤ２（例えば、ジヌツキシマブ、３Ｆ８）；ＧＤ３；ＧＩＴＲ；ＧｌｏｂｏＨ；ＧＭ１；ＧＭ２；ＧＵＣＹ２Ｃ（例えばＰＦ−０７０６２１１９）；ＨＥＲ２／ｎｅｕ［例えば、マルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、ペルツズマブ、トラスツズマブ；アド−トラスツズマブエムタンシン、トラスツズマブデュオカルマジン、ＰＦ−０６８０４１０３（米国特許第８８２８４０１号明細書を参照されたい）］；ＨＥＲ３；ＨＥＲ４；ＩＣＯＳ；ＩＬ−１０；ＩＴＧ−ＡｖＢ６；ＬＡＧ−３（例えばレラトリマブ（ｒｅｌａｔｌｉｍａｂ））；ルイス−Ｙ；ＬＧ；Ｌｙ−６；Ｍ−ＣＳＦ���例えばＰＤ−０３６０３２４（米国特許第７３２６４１４号明細書を参照されたい）］；ＭＣＳＰ；メソテリン；ＭＵＣ１；ＭＵＣ２；ＭＵＣ３；ＭＵＣ４；ＭＵＣ５ＡＣ；ＭＵＣ５Ｂ；ＭＵＣ７；ＭＵＣ１６；ノッチ１；ノッチ３；ネクチン−４（例えばエンホルツマブベドチン）；ＯＸ４０［例えばＰＦ−０４５１８６００（米国特許第７９６０５１５号明細書を参照されたい）］；Ｐ−カドヘリン［例えばＰＦ−０６６７１００８（国際公開第２０１６／００１８１０号パンフレットを参照されたい）］；ＰＣＤＨＢ２；ＰＤ−１［例えば、ＢＣＤ−１００、カムレリズマブ、セミプリマブ、ゲノリムズマブ（ｇｅｎｏｌｉｍｚｕｍａｂ）（ＣＢＴ−５０１）、ＭＥＤＩ０６８０、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ＲＮ８８８（国際公開第２０１６／０９２４１９号パンフレットを参照されたい）、シンチリマブ、スパルタリズマブ、ＳＴＩ−Ａ１１１０、チスレリズマブ、ＴＳＲ−０４２］；ＰＤ−Ｌ１（例えば、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５）、又はＬＹ３３０００５４）；ＰＤＧＦＲＡ（例えばオララツマブ）；形質細胞抗原；ポリＳＡ；ＰＳＣＡ；ＰＳＭＡ；ＰＴＫ７［例えばＰＦ−０６６４７０２０（米国特許第９４０９９９５号明細書を参照されたい）］；Ｒｏｒ１；ＳＡＳ；ＳＣＲｘ６；ＳＬＡＭＦ７（例えばエロツズマブ）；ＳＨＨ；ＳＩＲＰａ（例えば、ＥＤ９、Ｅｆｆｉ−ＤＥＭ）；ＳＴＥＡＰ；ＴＧＦ−ベータ；ＴＩＧＩＴ；ＴＩＭ−３；ＴＭＰＲＳＳ３；ＴＮＦ−アルファ前駆体；ＴＲＯＰ−２（例えばサシツズマブゴビテカン）；ＴＳＰＡＮ８；ＶＥＧＦ（例えば、ベバシズマブ、ブロルシズマブ）；ＶＥＧＦＲ１（例えばラニビズマブ）；ＶＥＧＦＲ２（例えば、ラムシルマブ、ラニビズマブ）；Ｗｕｅ−１。
【０４３５】
治療用抗体は、任意の適切な形式を有し得る。例えば、治療用抗体は、本明細書の他の箇所で説明されている任意の形式を有し得る。いくつかの態様では、治療用抗体は、裸の抗体であり得る。いくつかの態様では、治療用抗体は、薬物／薬剤に連結され得る（「抗体−薬物複合体」（ＡＤＣ）としても公知である）。いくつかの態様では、特定の抗原に対する治療用抗体は、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）に組み込まれ得る。
【０４３６】
いくつかの態様では、ある抗原を対象とする抗体は、薬物／薬剤に共役され得る。連結された抗体−薬物分子はまた、「抗体−薬物複合体」（ＡＤＣ）とも称される。薬物／薬剤は、直接的に又はリンカーにより間接的に、抗体に連結され得る。最も一般的は、毒性薬物は、それぞれの抗原へのＡＤＣの結合がこの抗原を発現する細胞の死滅を促進するように、抗体に連結されている。例えば、毒性薬物に連結されているＡＤＣは、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の死滅を促進するためにこの腫瘍関連抗原を標的するのに特に有用である。他の態様では、抗体に連結され得る薬剤は、例えば、免疫調節剤（例えば、ＡＤＣの近傍での免疫細胞の活性を調節するためのもの）であってもよいし、造影剤（例えば、対象中の又は対象由来の生物学的サンプル中のＡＤＣの撮影を容易にするためのもの）であってもよいし、抗体の血清半減期又は生物活性を増加させるための薬剤であってもよい。
【０４３７】
細胞傷害剤又は他の治療薬を抗体に共役させる方法は、様々な刊行物で説明されている。例えば、化学的修飾を、リジン側鎖アミンを介して、又は共役反応が起こる鎖間ジスルフィド結合を還元させることにより活性化されたシステインスルフヒドリル基を介して、抗体中で行い得る。例えば、Ｔａｎａｋａ他，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５７９：２０９２〜２０９６，２００５、及びＧｅｎｔｌｅ他，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１５：６５８〜６６３，２００４を参照されたい。定義された化学量論での特異的薬物共役のために抗体の特定の部位で操作された反応性システイン残基も説明されている。例えば、Ｊｕｎｕｔｕｌａ他，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２６：９２５〜９３２，２００８を参照されたい。トランスグルタミナーゼ及びアミン（例えば、反応性アミンを含むか又は反応性アミンに付着した細胞傷害剤）の存在下でのポリペプチド操作による、アシルドナーグルタミン含有タグ又は反応性（即ち、アシルドナーとして共役結合を形成する能力）の内在性グルタミンを使用する共役も、国際公開第２０１２／０５９８８２号パンフレット及び同第２０１５０１５４４８号パンフレットで説明されている。いくつかの態様では、ＡＤＣは、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６１６６６２９号パンフレットに記載されているＡＤＣの特徴又は特性の内のいずれかを有し得る。
【０４３８】
ＡＤＣ形式で抗体に連結され得る薬物／薬剤として、例えば、細胞傷害剤、免疫調節剤、造影剤、治療用タンパク質、生体高分子、又はオリゴヌクレオチドが挙げられ得る。
ＡＤＣに組み込まれ得る例示的な細胞傷害剤として、下記が挙げられる：アントラサイクリン、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、ドラスタチン、コンブレタスタチン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、インドリノ−ベンゾジアゼピン二量体、エンジイン、ゲルダナマイシン、メイタンシン、ピューロマイシン、タキサン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ツブリシン、ヘミアスターリン、スプリセオスタチン、プラジエノライド（ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ）、及びこれらの立体異性体、同配体、類似体、又は誘導体。
【０４３９】
ＡＤＣに組み込まれ得る例示的な免疫調節剤として、下記が挙げられる：ガンシクロビル、エタネルセプト、タクロリムス、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキシトレート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘｔｒａｔｅ）、グルココルチコイド及びその類似体、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンパ毒素、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、造血因子、インターロイキン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、及びＩＬ−２１）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、インターフェロン（例えば、インターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−ガンマ）、「Ｓ１因子」と指定された幹細胞増殖因子、エリスロポエチン及びトロンボポエチン、又はこれらの組み合わせ。
【０４４０】
ＡＤＣに含まれる例示的な造影剤として、フルオレセイン、ローダミン、ランタニド蛍光体、及びこれらの誘導体、又はキレート剤に結合した放射性同位体が挙げられる。フルオロフォアの例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（例えば５−ＦＩＴＣ）、フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）（例えば５−ＦＡＭ）、エオシン、カルボキシフルオレセイン、エリスロシン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（例えば、Ａｌｅｘａ  ３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６４７、６６０、６８０、７００、又は７５０）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）（例えば５，−ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、及びスルホローダミン（ＳＲ）（例えばＳＲ１０１）。キレート剤の例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン、１−グルタル酸−４，７−酢酸（デフェロキサミン）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、及び１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）（ＢＡＰＴＡ）。
【０４４１】
ＡＤＣに含まれ得る例示的な治療用タンパク質として、毒素、ホルモン、酵素、及び増殖因子が挙げられる。
ＡＤＣに組み込まれ得る例示的な生体適合性ポリマーとして、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体、及び双性イオン含有生体適合性ポリマー（例えばホスホリルコリン含有ポリマー）が挙げられる。
【０４４２】
ＡＤＣに組み込まれ得る例示的な生体適合性ポリマーとして、アンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
いくつかの態様では、本明細書で提供される抗原を対象とする抗体は、二重特異性分子に組み込まれ得る。二重特異性抗体は、少なくとも２種の異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。
【０４４３】
免疫調節剤として、対象の免疫反応を刺激し得る様々な異なる分子型（例えば、パターン認識受容体（ＰＲＰ）アゴニスト、免疫刺激性サイトカイン、及び癌ワクチン）が挙げられる。
【０４４４】
パターン認識受容体（ＰＲＰ）は、免疫系の細胞により発現され、病原体及び／又は細胞の損傷若しくは死滅と関連する様々な分子を認識する受容体である。ＰＲＰは、自然免疫反応及び適応免疫免疫反応の両方に関与する。ＰＲＰアゴニストを使用して、対象の免疫反応を刺激し得る。複数のクラスのＰＲＰ分子（例えば、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）様受容体（ＮＬＲ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、及びインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＮＧ）タンパク質）が存在する。
【０４４５】
用語「ＴＬＲ」及び「ｔｏｌｌ様受容体」は、あらゆるｔｏｌｌ様受容体を指す。ｔｏｌｌ様受容体は、免疫反応の活性化に関与する受容体である。ＴＬＲは、例えば、微生物で発現される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、及び死滅したか又は死滅する細胞から放出される内因性の損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を認識する。
【０４４６】
ＴＬＲを活性化する（及びそれにより免疫反応を活性化する）分子は、本明細書では「ＴＬＲアゴニスト」と称される。ＴＬＲアゴニストとして、例えば、小分子（例えば、分子量が約１０００ダルトン未満である有機分子）、並びに大分子（例えば、オリゴヌクレオチド及びタンパク質）が挙げられ得る。いくつかのＴＬＲアゴニストは、単一のタイプのＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ３又はＴＬＲ９）に特異的であり、いくつかのＴＬＲアゴニストは、２種以上のタイプのＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８の両方）を活性化する。
【０４４７】
本明細書で提供される例示的なＴＬＲアゴニストとして、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９のアゴニストが挙げられる。
【０４４８】
例示的な小分子ＴＬＲアゴニストとして、例えば、下記で開示されているものが挙げられる：米国特許第４，６８９，３３８号明細書；同第４，９２９，６２４号明細書；同第５，２６６，５７５号明細書；同第５，２６８，３７６号明細書；同第５，３４６，９０５号明細書；同第５，３５２，７８４号明細書；同第５，３８９，６４０号明細書；同第５，４４６，１５３号明細書；同第５，４８２，９３６号明細書；同第５，７５６，７４７号明細書；同第６，１１０，９２９号明細書；同第６，１９４，４２５号明細書；同第６，３３１，５３９号明細書；同第６，３７６，６６９号明細書；同第６，４５１，８１０号明細書；同第６，５２５，０６４号明細書；同第６，５４１，４８５号明細書；同第６，５４５，０１６号明細書；同第６，５４５，０１７号明細書；同第６，５７３，２７３号明細書；同第６，６５６，９３８号明細書；同第６，６６０，７３５号明細書；同第６，６６０，７４７号明細書；同第６，６６４，２６０号明細書；同第６，６６４，２６４号明細書；同第６，６６４，２６５号明細書；同第６，６６７，３１２号明細書；同第６，６７０，３７２号明細書；同第６，６７７，３４７号明細書；同第６，６７７，３４８号明細書；同第６，６７７，３４９号明細書；同第６，６８３，０８８号明細書；同第６，７５６，３８２号明細書；同第６，７９７，７１８号明細書；同第６，８１８，６５０号明細書；及び同第７，７０９１，２１４号明細書；米国特許出願公開第２００４／００９１４９１号明細書、同第２００４／０１７６３６７号明細書、及び同第２００６／０１００２２９号明細書；並びに国際公開第２００５／１８５５１号パンフレット、同第２００５／１８５５６号パンフレット、同第２００５／２０９９９号パンフレット、同第２００５／０３２４８４号パンフレット、同第２００５／０４８９３３号パンフレット、同第２００５／０４８９４５号パンフレット、同第２００５／０５１３１７号パンフレット、同第２００５／０５１３２４号パンフレット、同第２００５／０６６１６９号パンフレット、同第２００５／０６６１７０号パンフレット、同第２００５／０６６１７２号パンフレット、同第２００５／０７６７８３号パンフレット、同第２００５／０７９１９５号パンフレット、同第２００５／０９４５３１号パンフレット、同第２００５／１２３０７９号パンフレット、同第２００５／１２３０８０号パンフレット、同第２００６／００９８２６号パンフレット、同第２００６／００９８３２号パンフレット、同第２００６／０２６７６０号パンフレット、同第２００６／０２８４５１号パンフレット、同第２００６／０２８５４５号パンフレット、同第２００６／０２８９６２号パンフレット、同第２００６／０２９１１５号パンフレット、同第２００６／０３８９２３号パンフレット、同第２００６／０６５２８０号パンフレット、同第２００６／０７４００３号パンフレット、同第２００６／０８３４４０号パンフレット、同第２００６／０８６４４９号パンフレット、同第２００６／０９１３９４号パンフレット、同第２００６／０８６６３３号パンフレット、同第２００６／０８６６３４号パンフレット、同第２００６／０９１５６７号パンフレット、同第２００６／０９１５６８号パンフレット、同第２００６／０９１６４７号パンフレット、同第２００６／０９３５１４号パンフレット、同第２００６／０９８８５２号パンフレット。
【０４４９】
小分子ＴＬＲアゴニストの追加の例として、下記が挙げられる：ある特定のプリン誘導体（例えば、米国特許第６，３７６，５０１号明細書及び同第６，０２８，０７６号明細書で説明されているもの）、ある特定のイミダゾキノリンアミド誘導体（例えば、米国特許第６，０６９，１４９号明細書で説明されているもの）、ある特定のイミダゾピリジン誘導体（例えば、米国特許第６，５１８，２６５号明細書で説明されているもの）、ある特定のベンズイミダゾール誘導体（例えば、米国特許第６，３８７，９３８号明細書で説明されているもの）、５員の窒素含有複素環に融合した４−アミノピリミジンのある特定の誘導体（例えば、米国特許第６，３７６，５０１号明細書；同第６，０２８，０７６号明細書、及び同第６，３２９，３８１号明細書；並びに国際公開第０２／０８９０５号パンフレットで説明されているアデニン誘導体）、並びにある特定の３−ベータ−Ｄ−リボフラノシルチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン誘導体（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１９９４６１号明細書で説明されているもの）、並びにある特定の小分子免疫増強因子化合物（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１３６０６５号明細書で説明されているもの）。
【０４５０】
例示的な大分子ＴＬＲアゴニストとして、オリゴヌクレオチド配列が挙げられる。いくつかのＴＬＲアゴニストオリゴヌクレオチド配列は、シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含み、例えば、米国特許第６，１９４，３８８号明細書；同第６，２０７，６４６号明細書；同第６，２３９，１１６号明細書；同第６，３３９，０６８号明細書；及び同第６，４０６，７０５号明細書で説明されている。いくつかのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとして、例えば米国特許第６，４２６，３３４号明細書及び同第６，４７６，０００号明細書で説明されているもの等の合成免疫調節構造モチールが挙げられ得る。他のＴＬＲアゴニストヌクレオチド配列はＣｐＧ配列を欠いており、例えば国際公開第００／７５３０４号パンフレットで説明されている。さらに他のＴＬＲアゴニストヌクレオチド配列として、グアノシン及びウリジンリッチ一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＭＮＡ）が挙げられ、例えば、Ｈｅｉｌ  ｅｔ  ａｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第３０３巻，１５２６〜１５２９頁，２００４年３月５日で説明されているものが挙げられる。
【０４５１】
他のＴＬＲアゴニストとして、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）等の生物学的分子が挙げられ、例えば、米国特許６，１１３，９１８号明細書；同第６，３０３，３４７号明細書；同第６，５２５，０２８号明細書；及び同第６，６４９，１７２号明細書で説明されている。
【０４５２】
ＴＬＲアゴニストとして、複数の異なるタイプのＴＬＲ受容体を活性化し得る、不活性化された病原体又はその画分も挙げられる。例示的な病原体由来ＴＬＲアゴニストとして、ＢＣＧ、マイコバクテリム・オブエンセ（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｂｕｅｎｓｅ）抽出物、タリモジーンラハーパレプベック（Ｔ−Ｖｅｃ）（ＨＳＶ−１に由来する）、及びＰｅｘａ−Ｖｅｃ（ワクチンウイルスに由来する）が挙げられる。
【０４５３】
いくつかの態様では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲに特異的に結合するアゴニスト抗体であり得る。
下記に、様々なＴＬＲ及びＴＬＲアゴニストを簡単に説明する。特定のＴＬＲに対する下記のＴＬＲアゴニストの列挙は、所与のＴＬＲアゴニストが必ずそのＴＬＲのみを活性化することを示すと解釈すべきではない（例えば、ある特定の分子は、複数のタイプのＴＬＲを活性化し得るか、又は複数のクラスのＰＲＲを活性化し得る）。例えば、例示的なＴＬＲ４アゴニストとして下記で提供されるいくつかの分子はまた、ＴＬＲ５アゴニストでもあり得る。
【０４５４】
用語「ＴＬＲ１」及び「ｔｏｌｌ様受容体１」は、ＴＬＲ１受容体のあらゆる形態、並びにＴＬＲ１の活性の少なくとも一部を保持するバリアント、アイソフォーム、及び種相同体を指す。例えばヒトＴＬＲ１への具体的な言及により、そうではないことが示されない限り、ＴＬＲ１は、全ての哺乳類種の天然配列ＴＬＲ１（例えば、ヒト、サル、及びマウス）を含む。例示的な一ヒトＴＬＲ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．Ｑ１５３９９で提供される。
【０４５５】
「ＴＬＲ１アゴニスト」は、本明細書で使用される場合、ＴＬＲ１への結合時に、（１）ＴＬＲ１を刺激するか若しくは活性化するあらゆる分子、（２）ＴＬＲ１の活性、機能、若しくは存在を増強するか、増加させるか、促進するか、誘導するか、若しくは延長させるあらゆる分子、又は（３）ＴＬＲ１の発現を増強するか、増加させるか、促進するか、若しくは誘発するあらゆる分子を意味する。本発明の処置方法、薬物、及び使用の内のいずれかで有用なＴＬＲ１アゴニストとして、例えば、ＴＬＲ１に結合する細菌リポタンパク質及びその誘導体が挙げられる。
【０４５６】
本発明の処置方法、薬物、及び使用で有用なＴＬＲ１アゴニストの例として、例えば下記が挙げられる：細菌リポタンパク質及びその誘導体、例えば、ＳＰＭ−１０５（オートクレーブされたマイコバクテリアに由来する）、ＯＭ−１７４（脂質Ａ誘導体）、ＯｍｐＳ１（サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）由来のポリン）、ＯｍｐＳ１（サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）由来のポリン）、ＯｓｐＡ（ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）由来）、ＭＡＬＰ−２（マイコプラズママクロファージ活性化リポペプチド−２ｋＤ）、ＳＴＦ（可溶性結核因子）、ＣＵ−Ｔ１２−９、ジプロボシム（Ｄｉｐｒｏｖｏｃｉｍ）、細胞壁成分に由来するリポペプチド、例えば、ＰＡＭ２ＣＳＫ４、ＰＡＭ３ＣＳＫ４、及びＰＡＭ３Ｃｙｓ。
【０４５７】
ＴＬＲ１はＴＬＲ２とヘテロ二量体を形成し得、したがって、多くのＴＬＲ１アゴニストはまた、ＴＬＲ２アゴニストでもある。
用語「ＴＲＬ２」及び「ｔｏｌｌ様受容体２」は、ＴＬＲ２受容体のあらゆる形態、並びにＴＬＲ２の活性の少なくとも一部を保持するバリアント、アイソフォーム、及び種相同体を指す。例えばヒトＴＬＲ２への具体的な言及により、そうではないことが示されない限り、ＴＬＲ２は、全ての哺乳類種の天然配列ＴＬＲ２（例えば、ヒト、サル、及びマウス）を含む。例示的な一ヒトＴＬＲ２は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．Ｏ６０６０３で提供される。
【０４５８】
「ＴＬＲ２アゴニスト」は、本明細書で使用される場合、ＴＬＲ２への結合時に、（１）ＴＬＲ２を刺激するか若しくは活性化するあらゆる分子、（２）ＴＬＲ２の活性、機能、若しくは存在を増強するか、増加させるか、促進するか、誘導するか、若しくは延長させるあらゆる分子、又は（３）ＴＬＲ２の発現を増強するか、増加させるか、促進するか、若しくは誘発するあらゆる分子を意味する。本発明の処置方法、薬物、及び使用の内のいずれかで有用なＴＬＲ２アゴニストとして、例えば、ＴＬＲ２に結合する細菌リポタンパク質及びその誘導体が挙げられる。
【０４５９】
本発明の処置方法、薬物、及び使用で有用なＴＬＲ２アゴニストの例として、例えば下記が挙げられる：細菌リポタンパク質（例えば脱アシル化リポタンパク質）及びその誘導体、例えば、ＳＰＭ−１０５（オートクレーブされたマイコバクテリアに由来する）、ＯＭ−１７４（脂質Ａ誘導体）、ＯｍｐＳ１（サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）由来のポリン）、ＯｍｐＳ１（サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）由来のポリン）、ＯｓｐＡ（ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）由来）、ＭＡＬＰ−２（マイコプラズママクロファージ活性化リポペプチド−２ｋＤ）、ＳＴＦ（可溶性結核因子）、ＣＵ−Ｔ１２−９、ジプロボシム、アンプリバント（Ａｍｐｌｉｖａｎｔ）、細胞壁成分に由来するリポペプチド、例えば、ＰＡＭ２ＣＳＫ４、ＰＡＭ３ＣＳＫ４、及びＰＡＭ３Ｃｙｓ。
【０４６０】
ＴＬＲ２はＴＬＲ１又はＴＬＲ６とヘテロ二量体を形成し得、したがって、多くのＴＬＲ２アゴニストはまた、ＴＬＲ１アゴニスト又はＴＬＲ６でもある。
用語「ＴＲＬ３」及び「ｔｏｌｌ様受容体３」は、ＴＬＲ３受容体のあらゆる形態、並びにＴＬＲ３の活性の少なくとも一部を保持するバリアント、アイソフォーム、及び種相同体を指す。例えばヒトＴＬＲ３への具体的な言及により、そうではないことが示されない限り、ＴＬＲ３は、全ての哺乳類種の天然配列ＴＬＲ３（例えば、ヒト、サル、及びマウス）を含む。例示的な一ヒトＴＬＲ３は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．Ｏ１５４５５で提供される。
【０４６１】
「ＴＬＲ３アゴニスト」は、本明細書で使用される場合、ＴＬＲ３への結合時に、（１）ＴＬＲ３を刺激するか若しくは活性化するあらゆる分子、（２）ＴＬＲ３の活性、機能、若しくは存在を増強するか、増加させるか、促進するか、誘導するか、若しくは延長させるあらゆる分子、又は（３）ＴＬＲ３の発現を増強するか、増加させるか、促進するか、若しくは誘発するあらゆる分子を意味する。本発明の処置方法、薬物、及び使用の内のいずれかで有用なＴＬＲ３アゴニストとして、例えば、ＴＬＲ３に結合する核酸リガンドが挙げられる。
【０４６２】
本発明の処置方法、薬物、及び使用で有用なＴＬＲ３アゴニストの例として、下記が挙げられる：合成ｄｓＲＮＡ、ポリイノシン−ポリシチジル酸［「ポリ（Ｉ：Ｃ）」］（例えば、高分子量（ＨＭＷ）調製物及び低分子量（ＬＭＷ）調製物でＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手可能）、ポリアデニル−ポリウリジル酸［「ポリ（Ａ：Ｕ）」］（例えばＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手可能）、ポリＩＣＬＣ（Ｌｅｖｙ他，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，第１３２巻，第４号，４３４〜４３９頁，１９７５を参照されたい）、アンプリジェン（Ｊａｓａｎｉ他，Ｖａｃｃｉｎｅ，第２７巻，第２５〜２６号，３４０１〜３４０４頁，２００９を参照されたい）、ヒルトノール（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ）、リンタトリモド（Ｒｉｎｔａｔｏｌｉｍｏｄ）、及びＲＧＣ１００（Ｎａｕｍａｎｎ他，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２０１３巻，論文ＩＤ  ２８３６４９を参照されたい）。
【０４６３】
用語「ＴＲＬ４」及び「ｔｏｌｌ様受容体４」は、ＴＬＲ４受容体のあらゆる形態、並びにＴＬＲ４の活性の少なくとも一部を保持するバリアント、アイソフォーム、及び種相同体を指す。例えばヒトＴＬＲ４への具体的な言及により、そうではないことが示されない限り、ＴＬＲ４は、全ての哺乳類種の天然配列ＴＬＲ４（例えば、ヒト、サル、及びマウス）を含む。例示的な一ヒトＴＬＲ４は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．Ｏ００２０６で提供される。
【０４６４】
「ＴＬＲ４アゴニスト」は、本明細書で使用される場合、ＴＬＲ４への結合時に、（１）ＴＬＲ４を刺激するか若しくは活性化するあらゆる分子、（２）ＴＬＲ４の活性、機能、若しくは存在を増強するか、増加させるか、促進するか、誘導するか、若しくは延長させるあらゆる分子、又は（３）ＴＬＲ４の発現を増強するか、増加させるか、促進するか、若しくは誘発するあらゆる分子を意味する。本発明の処置方法、薬物、及び使用の内のいずれかで有用なＴＬＲ４アゴニストとして、例えば、ＴＬＲ４に結合する細菌リポ多糖（ＬＰＳ）及びその誘導体が挙げられる。
【０４６５】
本発明の処置方法、薬物、及び使用で有用なＴＬＲ４アゴニストの例として、例えば下記が挙げられる：細菌リポ多糖（ＬＰＳ）及びその誘導体、例えば、Ｂ：０１１１（Ｓｉｇｍａ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ）、ＧＬＡ−ＡＱ、Ｇ１００、ＡＳ１５、ＡＳＯ２、ＧＳＫ１５７２９３２Ａ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，ＵＫ）。
【０４６６】
用語「ＴＲＬ５」及び「ｔｏｌｌ様受容体５」は、ＴＬＲ５受容体のあらゆる形態、並びにＴＬＲ５の活性の少なくとも一部を保持するバリアント、アイソフォーム、及び種相同体を指す。例えばヒトＴＬＲ５への具体的な言及により、そうではないことが示されない限り、ＴＬＲ５は、全ての哺乳類種の天然配列ＴＬＲ５（例えば、ヒト、サル、及びマウス）を含む。例示的な一ヒトＴＬＲ５は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．Ｏ６０６０２で提供される。
【０４６７】
「ＴＬＲ５アゴニスト」は、本明細書で使用される場合、ＴＬＲ５への結合時に、（１）ＴＬＲ５を刺激するか若しくは活性化するあらゆる分子、（２）ＴＬＲ５の活性、機能、若しくは存在を増強するか、増加させるか、促進するか、誘導するか、若しくは延長させるあらゆる分子、又は（３）ＴＬＲ５の発現を増強するか、増加させるか、促進するか、若しくは誘発するあらゆる分子を意味する。本発明の処置方法、薬物、及び使用の内のいずれかで有用なＴＬＲ５アゴニストとして、例えば、ＴＬＲ５に結合する細菌フラゲリン及びその誘導体が挙げられる。
【０４６８】
本発明の処置方法、薬物、及び使用で有用なＴＬＲ５アゴニストの例として、例えば下記が挙げられる：Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から精製された細菌フラゲリン、Ｐ．アエルギノザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）から精製されたフラゲリン、Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）から精製されたフラゲリン、及び組換えフラゲリン（全てＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手可能）、エントリモド（ＣＢＬＢ５０２；薬理学的に最適化されたフラゲリン誘導体）。
【０４６９】
用語「ＴＲＬ６」及び「ｔｏｌｌ様受容体６」は、ＴＬＲ６受容体のあらゆる形態、並びにＴＬＲ６の活性の少なくとも一部を保持するバリアント、アイソフォーム、及び種相同体を指す。例えばヒトＴＬＲ６への具体的な言及により、そうではないことが示されない限り、ＴＬＲ６は、全ての哺乳類種の天然配列ＴＬＲ６（例えば、ヒト、サル、及びマウス）を含む。例示的な一ヒトＴＬＲ６は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．Ｑ９Ｙ２Ｃ９で提供される。
【０４７０】
「ＴＬＲ６アゴニスト」は、本明細書で使用される場合、ＴＬＲ６への結合時に、（１）ＴＬＲ６を刺激するか若しくは活性化するあらゆる分子、（２）ＴＬＲ６の活性、機能、若しくは存在を増強するか、増加させるか、促進するか、誘導するか、若しくは延長させるあらゆる分子、又は（３）ＴＬＲ６の発現を増強するか、増加させるか、促進するか、若しくは誘発するあらゆる分子を意味する。本発明の処置方法、薬物、及び使用の内のいずれかで有用なＴＬＲ６アゴニストとして、例えば、ＴＬＲ６に結合する細菌リポペプチド及びその誘導体が挙げられる。
【０４７１】
本発明の処置方法、薬物、及び使用で有用なＴＬＲ６アゴニストの例として、例えば、上記に記載したＴＬＲ２アゴニストの多くが挙げられ、なぜならば、ＴＬＲ２及びＴＬＲ６はヘテロ二量体を形成し得るからである。ＴＬＲ６はまた、ＴＬＲ４ともヘテロ二量体を形成し得、ＴＬＲ６アゴニストとして、上記に記載した様々なＴＬＲ４アゴニストが挙げられ得る。
【０４７２】
用語「ＴＲＬ７」及び「ｔｏｌｌ様受容体７」は、ＴＬＲ７受容体のあらゆる形態、並びにＴＬＲ７の活性の少なくとも一部を保持するバリアント、アイソフォーム、及び種相同体を指す。例えばヒトＴＬＲ７への具体的な言及により、そうではないことが示されない限り、ＴＬＲ７は、全ての哺乳類種の天然配列ＴＬＲ７（例えば、ヒト、サル、及びマウス）を含む。例示的な一ヒトＴＬＲ７は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．Ｑ９ＮＹＫ１で提供される。
【０４７３】
「ＴＬＲ７アゴニスト」は、本明細書で使用される場合、ＴＬＲ７への結合時に、（１）ＴＬＲ７を刺激するか若しくは活性化するあらゆる分子、（２）ＴＬＲ７の活性、機能、若しくは存在を増強するか、増加させるか、促進するか、誘導するか、若しくは延長させるあらゆる分子、又は（３）ＴＬＲ７の発現を増強するか、増加させるか、促進するか、若しくは誘発するあらゆる分子を意味する。本発明の処置方法、薬物、及び使用の内のいずれかで有用なＴＬＲ７アゴニストとして、例えば、ＴＬＲ７に結合する核酸リガンドが挙げられる。
【０４７４】
本発明の処置方法、薬物、及び使用で有用なＴＬＲ７アゴニストの例として、下記が挙げられる：組換え一本鎖（「ｓｓ」）ＲＮＡ、イミダゾキノリン化合物、例えば、イミキモド（Ｒ８３７）、ガーディキモド、及びレシキモド（Ｒ８４８）；ロキソリビン（７−アリル−７，８−ジヒドロ−８−オキソ−グアノシン）及び関連化合物；７−チア−８−オキソグアノシン、７−デアザグアノシン、及び関連グアノシン類似体；ＡＮＡ９７５（Ａｎａｄｙｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）及び関連化合物；ＳＭ−３６０３２０（Ｓｕｍｉｍｏｔｏ）；３Ｍ−０１、３Ｍ−０３、３Ｍ−８５２、及び３Ｍ−Ｓ−３４２４０（３Ｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＧＳＫ２２４５０３５（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；８−オキソアデニン分子）、ＡＺＤ８８４８（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；８−オキソアデニン分子）、ＭＥＤＩ９１９７（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ；以前は３Ｍ−０５２）、ｓｓＲＮＡ４０、並びにアデノシン類似体、例えばＵＣ−１Ｖ１５０（Ｊｉｎ他，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ（２００６）１６：４５５９〜４５６３、化合物４）。多くのＴＬＲ７アゴニストはまた、ＴＬＲ８アゴニストでもある。
【０４７５】
用語「ＴＲＬ８」及び「ｔｏｌｌ様受容体８」は、ＴＬＲ８受容体のあらゆる形態、並びにＴＬＲ８の活性の少なくとも一部を保持するバリアント、アイソフォーム、及び種相同体を指す。例えばヒトＴＬＲ８への具体的な言及により、そうではないことが示されない限り、ＴＬＲ８は、全ての哺乳類種の天然配列ＴＬＲ８（例えば、ヒト、サル、及びマウス）を含む。例示的な一ヒトＴＬＲ８は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．Ｑ９ＮＲ９７で提供される。
【０４７６】
「ＴＬＲ８アゴニスト」は、本明細書で使用される場合、ＴＬＲ８への結合時に、（１）ＴＬＲ８を刺激するか若しくは活性化するあらゆる分子、（２）ＴＬＲ８の活性、機能、若しくは存在を増強するか、増加させるか、促進するか、誘導するか、若しくは延長させるあらゆる分子、又は（３）ＴＬＲ８の発現を増強するか、増加させるか、促進するか、若しくは誘発するあらゆる分子を意味する。本発明の処置方法、薬物、及び使用の内のいずれかで有用なＴＬＲ８アゴニストとして、例えば、ＴＬＲ８に結合する核酸リガンドが挙げられる。
【０４７７】
本発明の処置方法、薬物、及び使用で有用なＴＬＲ８アゴニストの例として、例えば下記が挙げられる：組換え一本鎖ｓｓＲＮＡ、イミキモド（Ｒ８３７）、ガーディキモド、レシキモド（Ｒ８４８）、３Ｍ−０１、３Ｍ−０３、３Ｍ−８５２、及び３Ｍ−Ｓ−３４２４０（３Ｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＧＳＫ２２４５０３５（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；８−オキソアデニン分子）、ＡＺＤ８８４８（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；８−オキソアデニン分子）、ＭＥＤＩ９１９７（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ；以前は３Ｍ−０５２）、ポリ−Ｇ１０、モトリモド（Ｍｏｔｏｌｉｍｏｄ）、並びに上記に記載した様々なＴＬＲ７アゴニスト（既に言及したように、多くのＴＬＲ７アゴニストはまた、ＴＬＲ８アゴニストでもある）。
【０４７８】
用語「ＴＲＬ９」及び「ｔｏｌｌ様受容体９」は、ＴＬＲ９受容体のあらゆる形態、並びにＴＬＲ９の活性の少なくとも一部を保持するバリアント、アイソフォーム、及び種相同体を指す。例えばヒトＴＬＲ９への具体的な言及により、そうではないことが示されない限り、ＴＬＲ９は、全ての哺乳類種の天然配列ＴＬＲ９（例えば、ヒト、サル、及びマウス）を含む。例示的な一ヒトＴＬＲ９は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．Ｑ９ＮＲ９６で提供される。
【０４７９】
「ＴＬＲ９アゴニスト」は、本明細書で使用される場合、ＴＬＲ９への結合時に、（１）ＴＬＲ９を刺激するか若しくは活性化するあらゆる分子、（２）ＴＬＲ９の活性、機能、若しくは存在を増強するか、増加させるか、促進するか、誘導するか、若しくは延長させるあらゆる分子、又は（３）ＴＬＲ９の発現を増強するか、増加させるか、促進するか、若しくは誘発するあらゆる分子を意味する。本発明の処置方法、薬物、及び使用の内のいずれかで有用なＴＬＲ９アゴニストとして、例えば、ＴＬＲ９に結合する核酸リガンドが挙げられる。
【０４８０】
本発明の処置方法、薬物、及び使用で有用なＴＬＲ９アゴニストの例として、下記が挙げられる：非メチル化ＣｐＧ含有ＤＮＡ、免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、例えばＣｐＧ含有ＯＤＮ、例えば、ＣｐＧ２４５５５、ＣｐＧ１０１０３、ＣｐＧ７９０９（ＰＦ−３５１２６７６／アガトリモド（ａｇａｔｏｌｉｍｏｄ））、ＣｐＧ１０１８、ＡＺＤ１４１９、ＯＤＮ２２１６、ＭＧＮ１７０３、ＳＤ−１０１、１０１８ＩＳＳ、及びＣＭＰ−００１。ＴＬＲ９アゴニストとして、合成シトシン−ホスフェート−２’−デオキシ−７−デアザグアノシンジヌクレオチド（ＣｐＲ）（Ｈｙｂｒｉｄｏｎ，Ｉｎｃ．）を含むヌクレオチド配列、ｄＳＬＩＭ−３０Ｌ１、及び免疫グロブリン−ＤＮＡ複合体も挙げられる。例示的なＴＬＲ９アゴニストが、国際公開第２００３／０１５７１１号パンフレット、同第２００４／０１６８０５号パンフレット、同第２００９／０２２２１５号パンフレット、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１５７０、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１９７９１、並びに米国特許第８５５２１６５号明細書、同第６１９４３８８号明細書、及び同第６２３９１１６号明細書（それぞれは、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）で開示されている。
【０４８１】
ＲＬＲとして、例えばｄｓＲＮＡを検出する様々な細胞質ＰＲＲが挙げられる。ＲＬＲの例として、例えば、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、メラノーマ分化関連遺伝子５（ＭＤＡ−５）、及びＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２（ＬＧＰ２）が挙げられる。
【０４８２】
「ＲＬＲアゴニスト」は、本明細書で使用される場合、ＲＬＲへの結合時に、（１）ＲＬＲを刺激するか若しくは活性化するあらゆる分子、（２）ＲＬＲの活性、機能、若しくは存在を増強するか、増加させるか、促進するか、誘導するか、若しくは延長させるあらゆる分子、又は（３）ＲＬＲの発現を増強するか、増加させるか、促進するか、若しくは誘発するあらゆる分子を意味する。本発明の処置方法、薬物、及び使用の内のいずれかで有用なＲＬＲアゴニストとして、例えば、ＲＬＲに結合する核酸及びその誘導体、並びにＲＬＲに特異的に結合するアゴニストモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が挙げられる。
【０４８３】
本発明の処置方法、薬物、及び使用で有用なＲＬＲアゴニストの例として、例えば下記が挙げられる：キャップのない５’トリホスフェートを有する短い二本鎖ＲＮＡ（ＲＩＧ−Ｉアゴニスト）；ポリＩ：Ｃ（ＭＤＡ−５アゴニスト）、及びＢＯ−１１２（ＭＤＡ−Ａアゴニスト）。
【０４８４】
ＮＬＲとして、例えば損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）分子を検出する様々なＰＲＲが挙げられる。ＮＬＲとして、サブファミリＮＬＲＡ−Ａ、ＮＬＲＢ−Ｂ、ＮＬＲＣ−Ｃ、及びＮＬＲＰ−Ｐが挙げられる。ＮＬＲの例として、例えば、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ＮＡＩＰ、ＮＬＲＣ４、及びＮＬＲＰ３が挙げられる。
【０４８５】
「ＮＬＲアゴニスト」は、本明細書で使用される場合、ＮＬＲへの結合時に、（１）ＮＬＲを刺激するか若しくは活性化するあらゆる分子、（２）ＮＬＲの活性、機能、若しくは存在を増強するか、増加させるか、促進するか、誘導するか、若しくは延長させるあらゆる分子、又は（３）ＮＬＲの発現を増強するか、増加させるか、促進するか、若しくは誘発するあらゆる分子を意味する。本発明の処置方法、薬物、及び使用の内のいずれかで有用なＮＬＲアゴニストとして、例えば、ＮＬＲに結合するＤＡＭＰ及びその誘導体、並びにＮＬＲに特異的に結合するアゴニストモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が挙げられる。
【０４８６】
本発明の処置方法、薬物、及び使用で有用なＮＬＲアゴニストの例として、例えば、リポソームムラミルトリペプチド／ミファムルチド（ＮＯＤ２アゴニスト）が挙げられる。
ＣＬＲとして、例えば炭水化物及び糖タンパク質を検出する様々なＰＲＲが挙げられる。ＣＬＲとして、膜貫通ＣＬＲ及び分泌ＣＬＲの両方が挙げられる。ＣＬＲの例として、例えば、ＤＥＣ−２０５／ＣＤ２０５、マクロファージマンノース受容体（ＮＭＲ）、デクチン−１、デクチン−２、ミンクル、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＮＧＲ−１、及びマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）が挙げられる。
【０４８７】
「ＣＬＲアゴニスト」は、本明細書で使用される場合、ＣＬＲへの結合時に、（１）ＣＬＲを刺激するか若しくは活性化するあらゆる分子、（２）ＣＬＲの活性、機能、若しくは存在を増強するか、増加させるか、促進するか、誘導するか、若しくは延長させるあらゆる分子、又は（３）ＣＬＲの発現を増強するか、増加させるか、促進するか、若しくは誘発するあらゆる分子を意味する。本発明の処置方法、薬物、及び使用の内のいずれかで有用なＣＬＲアゴニストとして、例えば、ＣＬＲに結合する炭水化物及びその誘導体、並びにＣＬＲに特異的に結合するアゴニストモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が挙げられる。
【０４８８】
本発明の処置方法、薬物、及び使用で有用なＣＬＲアゴニストの例として、例えば、ＭＤ画分（グリフォラ・フロンドサ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）由来の精製済可溶性ベータ−グルカン抽出物）、及びインプライムＰＧＧ（酵母由来のベータ１，３／１，６−グルカンＰＡＭＰ）が挙げられる。
【０４８９】
ＳＴＩＮＧタンパク質は、１型インターフェロンシグナル伝達における細胞質ＤＮＡセンサー及びアダプタータンパク質の両方として機能する。用語「ＳＴＩＮＧ」及び「インターフェロン遺伝子刺激因子」は、ＳＴＩＮＧタンパク質のあらゆる形態、並びにＳＴＩＮＧの活性の少なくとも一部を保持するバリアント、アイソフォーム、及び種相同体を指す。例えばヒトＳＴＩＮＧへの具体的な言及により、そうではないことが示されない限り、ＳＴＩＮＧは、全ての哺乳類種の天然配列ＳＴＩＮＧ（例えば、ヒト、サル、及びマウス）を含む。例示的な一ヒトＴＬＲ９は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．Ｑ８６ＷＶ６で提供される。ＳＴＩＮＧはまた、ＴＭＥＭ１７３としても公知である。
【０４９０】
「ＳＴＩＮＧアゴニスト」は、本明細書で使用される場合、ＴＬＲ９への結合時に、（１）ＳＴＩＮＧを刺激するか若しくは活性化するあらゆる分子、（２）ＳＴＩＮＧの活性、機能、若しくは存在を増強するか、増加させるか、促進するか、誘導するか、若しくは延長させるあらゆる分子、又は（３）ＳＴＩＮＧの発現を増強するか、増加させるか、促進するか、若しくは誘発するあらゆる分子を意味する。本発明の処置方法、薬物、及び使用の内のいずれかで有用なＳＴＩＮＧアゴニストとして、例えば、ＳＴＩＮＧに結合する核酸リガンドが挙げられる。
【０４９１】
本発明の処置方法、薬物、及び使用で有用なＳＴＩＮＧアゴニストの例として、下記が挙げられる：様々な免疫賦活性核酸、例えば、合成二本鎖ＤＮＡ、環状ジ−ＧＮＰ、環状ＧＭＰ−ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）、合成環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、例えば、ＭＫ−１４５４及びＡＤＵ−Ｓ１００（ＭＩＷ８１５）、並びに小分子、例えばＰ０−４２４。
【０４９２】
他のＰＲＲとして、例えば、ＩＦＮ調節因子のＤＮＡ依存性活性化因子（ＤＡＩ）、及びアブセントインメラノーマ２（Ａｂｓｅｎｔ  ｉｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  ２）（ＡＩＭ２）が挙げられる。
【０４９３】
免疫刺激性サイトカインとして、免疫反応を刺激する様々なシグナル伝達タンパク質が挙げられ、例えば、インターフェロン、インターロイキン、及び造血成長因子が挙げられる。
【０４９４】
例示的な免疫刺激性サイトカインとして、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ；ＩＬ−２（例えばデニロイキンジフチトクス）、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、及びＴＮＦ−アルファが挙げられる。
【０４９５】
免疫刺激性サイトカインは、任意の適切な形式を有し得る。いくつかの態様では、免疫刺激性サイトカインは、野生型サイトカインの組換えバージョンであり得る。いくつかの態様では、免疫刺激性サイトカインは、対応する野生型サイトカインと比較した場合に１つ又は複数のアミノ酸の変化を有する変異タンパク質であり得る。いくつかの態様では、免疫刺激性サイトカインは、サイトカインと、少なくとも１種の他の機能性タンパク質（例えば抗体）とを含むキメラタンパク質に組み込まれ得る。いくつかの態様では、免疫刺激性サイトカインは、薬物／薬剤（例えば、可能なＡＤＣ成分として本明細書の他の箇所で説明されている任意の薬物／薬剤）に共有結合的に連結され得る。
【０４９６】
癌ワクチンとして、腫瘍関連抗原を含み（又は、対象において腫瘍関連抗原を生成するために使用され得）、そのため、腫瘍関連抗原を含む腫瘍細胞を対象とする対象における免疫反応を誘発するために使用され得る様々な組成物が挙げられる。
【０４９７】
癌ワクチンに含まれ得る例示的な物質として、弱毒化された癌細胞、腫瘍抗原、腫瘍由来抗原又は腫瘍関連抗原をコードする核酸を瞬間適用された樹状細胞等の抗原提示細胞が挙げられる。いくつかの態様では、癌ワクチンは、患者自身の癌細胞で調製され得る。いくつかの態様では、癌ワクチンは、患者自身の癌細胞由来ではない生物学的物質で調製され得る。
【０４９８】
癌ワクチンとして、例えば、シプルセル−Ｔ（ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ）及びタリモジェンラヘルパレプベク（ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ）（Ｔ−ＶＥＣ）が挙げられる。
【０４９９】
免疫細胞療法は、癌細胞を標的とし得る免疫細胞で患者を処置することを含む。免疫細胞療法は、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及びキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む。
【０５００】
化学療法剤の例として、下記が挙げられる：アルキル化剤、例えば、チオテパ及びシクロホスファミド；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；エチレンイミン及びメチルアラメラミン、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチロロメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（例えば、合成類似体トポテカン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例えば、そのアドゼレシン、カルゼルシン、及びビゼレシン合成類似体）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例えば、合成類似体ＫＷ−２１８９及びＣＢＩ−ＴＭＩ）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特にカリチアマイシンガンマ１Ｉ及びカリチアマイシンｐｈｉＩ１、例えばＡｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照されたい；ダイネミシン、例えば、ダイネミシンＡ；ビスフォスフォネート、例えばクロドロネート；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチンクロモフォア、及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（例えば、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシン）、ペグ化リポソームドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；マイタンシノイド、例えば、マイタンシン及びアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメト（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポロフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ  Ａ）、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「アラ−Ｃ］）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナ類似体、例えば、シスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＥＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；カペシタビン；並びに上記の内のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体。同様に挙げられるのは、下記である；抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭ）等の腫瘍に対するホルモン作用を調製するか又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）；副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール、エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール、レトロゾール、及びアナストラゾール；並びに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプ��リド、及びゴセレリン；ＫＲＡＳ阻害剤；ＭＣＴ４阻害剤；ＭＡＴ２ａ阻害剤；チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、スニチニブ、アキシチニブ；ａｌｋ／ｃ−Ｍｅｔ／ＲＯＳ阻害剤、例えば、クリゾチニブ、ロルラチニブ；ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、テムシロリムス、ゲダトリシブ；ｓｒｃ／ａｂｌ阻害剤、例えばボスチニブ；サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤、例えば、パルボシクリブ、ＰＦ−０６８７３６００；ｅｆｂ阻害剤、例えばダコミチニブ；ＰＡＲＰ阻害剤、例えばタラゾパリブ；ＳＭＯ阻害剤、例えば、グラスデギブ、ＰＦ−５２７４８５７；ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤、例えばＰＦ−０６７４７７７５；ＥＺＨ２阻害剤、例えばＰＦ−０６８２１４９７；ＰＲＭＴ５阻害剤、例えばＰＦ−０６９３９９９９；ＴＧＦＲβｒ１阻害剤、例えばＰＦ−０６９５２２２９；並びに上記の内のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体。具体的な態様では、そのような追加の治療薬は、ベバシズマブ、セツキシマブ、シロリムス、パニツムマブ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン、チボザニブ、イリノテカン、オキサリプラチン、シスプラチン、トリフルリジン、チピラシル、ロイコボリン、ゲムシタビン、レゴラフェニブ、又は塩酸エルロチニブである。
【０５０１】
いくつかの態様では、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、免疫チェックポイント調節因子又は同時刺激因子を標的とする１種又は複数種の他の治療薬と共に使用され、この他の治療薬として、例えば、限定されないが、下記を標的とする薬剤である：ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ８、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２、ＣＤ４７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ２２６、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＭ１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ４、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｈ１）、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、４−ＢＢＬ、ＤＲ３、ＴＬ１Ａ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０）、ＳＬＡＭＦ２（ＣＤ４８）、ＳＬＡＭＦ３（ＣＤ２２９）、ＳＬＡＭＦ４（２Ｂ４、ＣＤ２４４）、ＳＬＡＭＦ５（ＣＤ８４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ）、ＳＬＡＭＣＦ７（ＣＳ１）、ＳＬＡＭＦ８（ＢＬＡＭＥ）、ＳＬＡＭＦ９（ＣＤ２Ｆ）、ＣＤ２８、ＣＥＡＣＡＭ１（ＣＤ６６ａ）、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１−３ＡＳ  ＣＥＡＣＡＭ３Ｃ２、ＣＥＡＣＡＭ１−１５、ＰＳＧ１−１１、ＣＥＡＣＡＭ１−４Ｃ１、ＣＥＡＣＡＭ１−４Ｓ、ＣＥＡＣＡＭ１−４Ｌ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＣＣＲ２、ＣＤ３９−ＣＤ７３−アデノシン経路（Ａ２ＡＲ）、ＢＴＫｓ、ＴＩＫｓ、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＣＲ５、ＣＳＦ−１、又は自然免疫反応調節因子。
【０５０２】
いくつかの態様では、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、例えば下記と共に使用される：抗ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト抗体、例えばイピリムマブ；抗ＬＡＧ−３アンタゴニスト抗体、例えばＢＭＳ−９８６０１６及びＩＭＰ７０１；抗ＴＩＭ−３アンタゴニスト抗体；抗Ｂ７−Ｈ３アンタゴニスト抗体、例えばＭＧＡ２７１；抗ＶＩＳＴＡアンタゴニスト抗体；抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体；抗体；抗ＣＤ８０抗体；抗ＣＤ８６抗体；抗Ｂ７−Ｈ４アンタゴニスト抗体；抗ＩＣＯＳアゴニスト抗体；抗ＣＤ２８アゴニスト抗体；自然免疫反応調節因子（例えば、ＴＬＲ、ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ）、並びにＩＤＯ阻害剤。
【０５０３】
一部の態様において、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、ＯＸ４０アゴニスト、例えば、抗ＯＸ−４０アゴニスト抗体と一緒に使用される。一部の態様において、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、例えば、限定されることなくＴＲＸ５１８と一緒に使用される。一部の態様において、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、ＩＤＯ阻害剤と一緒に使用される。一部の態様において、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、サイトカイン療法、例えば、限定されることなく、ＩＬ−１５、ＣＳＦ−１、ＭＣＳＦ−１などと一緒に使用される。
【０５０４】
いくつかの態様では、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、１種又は複数種の他の治療用抗体（例えば、限定されないが、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ５２、又はＣＣＲ４を標的とする抗体）と共に使用される。
【０５０５】
ある特定の態様では、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体組成物は、少なくとも１種の追加の薬剤（例えば、ベバシズマブ、セツキシマブ、シロリムス、パニツムマブ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン、チボザニブ、イリノテカン、オキサリプラチン、シスプラチン、トリフルリジン、チピラシル、ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉ）、ゲムシタビン、及び塩酸エルロチニブ）を含む。
【０５０６】
いくつかの態様では、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体療法を、数分から数週間の範囲の間隔で、他の薬剤処置と併用してもよいし、他の薬剤処置の前又は後に順次施してもよい。他の薬剤及び／又はタンパク質若しくはポリヌクレオチドを別々に投与する態様では、一般に、本発明の薬剤及び組成物が依然として対象に対して有利な複合効果を発揮し得るように、各送達の間に有意な期間が終了しないことが確実にされるであろう。そのような場合では、両方のモダリティが互いに約１２〜２４時間以内に施され得、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に施され得ることが企図される。しかしながら、いくつかの状況では、それぞれの投与の間に数日（２日、３日、４日、５日、６日、又は７日）〜数週間（１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、又は８週間）が経過する場合には、投与期間を大幅に延ばすことが望ましい場合がある。
【０５０７】
一部の態様において、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体組成物は、外科手術、放射線療法、化学療法、標的療法、免疫療法、ホルモン療法、血管新生阻害、及び緩和ケアからなる群から選択される伝統的な療法をさらに含む処置レジメンと組み合わされる。
【０５０８】
本発明で使用される組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤をさらに含み得る（レジメン：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２１版，２００５，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＷｉｌｋｉｎｓ編，Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ）。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、本投与量及び本濃度ではレシピエントに対して無毒であり、下記を含み得る：バッファー、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸及びメチオニン；保存料（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチル若しくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン；単糖、二糖、及びその他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、若しくはデキストラン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；並びに／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。薬学的に許容される賦形剤が、本明細書でさらに説明されている。
【０５０９】
一側面において、本発明は、本明細書に開示されている抗ＧＵＣＹ２ｃ抗体又は二重特異性抗体を産生する方法であって、宿主細胞を、本明細書に開示されている抗ＧＵＣＹ２ｃ抗体又は二重特異性抗体を産生する結果を生じる条件下で培養すること、及び抗体又は二重特異性抗体を培養から精製することを含む方法を提供する。
【０５１０】
別の側面において、本発明は、ＧＵＣＹ２ｃ関連障害を検出、診断、及び／又は処置する医薬の製造における、本明細書に開示されている抗ＧＵＣＹ２ｃ抗体、二重特異性抗体、医薬組成物、ポリヌクレオチド、上清、ベクター、又は宿主細胞の使用を提供する。
【０５１１】
本発明のさらなる側面は、本明細書の上記で開示されているＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体と、本明細書で説明されている本発明の方法の内のいずれかに従う使用のための指示書とを含むキットである。一般に、この指示書は、上記で説明されている治療的処置のためのＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の投与の説明を含む。このキットは、本明細書で開示されている任意の医薬組成物を含む。この医薬組成物及び他の試薬は、任意の便利な形態（例えば、溶液又は粉末の形態）で、このキット中に存在し得る。
【０５１２】
別の側面では、キットは、１つ又は複数の容器中に、癌の処置に有用な１種又は複数種の他の予防又は治療薬をさらに含む。一態様では、この他の予防又は治療薬は、化学療法剤である。他の側面では、この予防又は治療薬は、生物学的治療薬又はホルモン治療薬である。
【０５１３】
本発明の医薬組成物、予防、又は治療薬のいくつかの側面を、好ましくは、ヒトでの使用に先立って、所望の治療活性に関して、インビトロで、細胞培養系で、及び動物モデル生物（例えば、齧歯類動物モデル系）で試験する。
【０５１４】
本発明の予防及び／又は治療プロトコルの毒性及び有効性を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死の用量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療上有効な用量）を決定するために、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順により決定し得る。毒性と治療効果と間の用量比は治療指標であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表され得る。大きな治療指標を示す予防及び／又は治療薬が好ましい。
【０５１５】
さらに、当業者公知の任意のアッセイを使用して、癌の処置又は予防のために本明細書で開示されている療法又は併用療法の予防上の及び／又は治療上の有用性を評価し得る。
本明細書で説明されているＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の使用に関する指示書は、一般に、意図された処置のための投与量、投与スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量であってもよいし、バルクパッケージ（例えばマルチ用量パッケージ）であってもよいし、副単位用量（ｓｕｂ−ｕｎｉｔ  ｄｏｓｅ）であってもよい。本発明のキットに供給される指示書は、典型的には、ラベル上の又はパッケージ挿入物（例えば、このキットに含まれる紙シート）上の書面での指示書であるが、機械可読の指示書（例えば、磁気又は光学保存ディスクで運ばれる指示書）も許容される。
【０５１６】
本発明のキットは、適切な包装に入っている。適切な包装として、対象への医薬組成物の投与での使用のための各医薬組成物及び他の含まれる試薬（例えば、バッファー、平衡塩溶液等）のためのバイアル、アンプル、チューブ、ボトル、ジャー、可撓性包装（例えば、密封されたマイラ又はプラスチック袋）、及び同類のものが挙げられるが、これらに限定されない。同様に企図されるのは、特定のデバイス（例えば、吸入器、経鼻投与デバイス（例えば噴霧器）、又はミニポンプ等の輸液デバイス）との組み合わせでの使用のためのパッケージである。キットは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針より穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液袋又はバイアルであり得る）。同様に、容器は、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針より穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液袋又はバイアルであり得る）。この組成物中の少なくとも１種の活性剤は、ＧＵＣＹ２ｃ抗体又はＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体である。容器は、第２の薬学的に活性な薬剤をさらに含み得る。
【０５１７】
通常、このキットは、容器と、この容器上の又はこの容器と関連するラベル又はパッケージ挿入物とを含む。
生物学的寄託
本発明の代表的な物質を、２０１８年２月１３日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９，ＵＳＡに寄託した。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２４９４３を有するベクターＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８鎖Ａ（ＶＨ−ホール  配列番号２２０）は、二重特異性抗体ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８のＶＨ−ホール鎖をコードするＤＮＡインサート（配列番号２４７）を含み、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２４９４４を有するベクターＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８鎖Ｂ（ＶＬ−ノブ  配列番号２１６）は、二重特異性抗体ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８のＶＬ−ノブ鎖をコードするＤＮＡインサート（配列番号２４６）を含む。
【０５１８】
この寄託を、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条項及びその下の規則（ブダペスト条約）の規定に基づいて行った。これにより、寄託日から３０年にわたり、この寄託物の生存可能な培養物の維持が保証される。この寄託物は、ブダペスト条約の条項の下で、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間の同意を条件として、ＡＴＣＣによって利用可能にされることになり、この同意は、関係する米国特許の発行の後、又はいずれか早くなる任意の米国若しくは外国特許出願が公衆に公開された後、公衆に寄託物の培養物の子孫の永続的及び非限定的な利用可能性を保証し、米国特許法第１２２条及びそれに準じた長官規則（８８６ＯＧ６３８を特に参照して連邦規則法典第３７巻第１．１４条を含む）に従って権利を与えられていると米国特許商標庁長官によって判定された者への子孫の利用可能性を保証するものである。
【０５１９】
本願の譲受人は、寄託中の物質の培養物が、適切な条件下で培養された際に死滅するか又は失われるか又は破壊された場合に、この物質を、別の同じものと通知時に即座に置き換えることに同意した。寄託した物質の利用可能性は、任意の政府の権限下でその特許法に従って与えられた権利に違反して本発明を実施するライセンスとして解釈されるべきでない。
【０５２０】
本発明を実行するための特定の側面の下記の実施例は、例示の目的のみで提供され、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【実施例】
【０５２１】
実施例１：マウスＧＵＣＹ２ｃ抗体の免疫化及びハイブリドーマ生成
表面にヒトＧＵＣＹ２ｃを過剰発現する組換えヒトＧＵＣＹ２ｃタンパク質免疫原又は細胞（配列番号２２４）を、ハイブリドーマの生成のためにＢａｌｂ／ｃマウスに注射した。８週齢雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ヒトＧＵＣＹ２ｃを発現する可溶性ｈｕＧＵＣＹ２ｃ−ｍｌｇＧ２ａタンパク質又は３００．１９細胞株（配列番号２２４／２２５）で免疫化した。ｈｕＧＵＣＹ２ｃ組換えタンパク質でマウスを免疫化するため、動物にＲＩＭＭＳプロトコル（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ．１９９７．１６：３８１−３８９）に従って投薬した。簡潔には、マウスを組換えヒトＧＵＣＹ２ｃマウスＩｇＧ２ａ−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号２３０）で皮下注射により２週間にわたって免疫化した。使用したアジュバントは、フロイント完全及び不完全アジュバントであった。細胞ベース免疫化では、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ヒトＧＵＣＹ２ｃを過剰発現している５×１０６個の３００．１９細胞で、アジュバントを用いることなくｉ．ｐ．注射により１週間に２回、１ヶ月にわたって免疫化した。マウスＧＵＣＹ２ｃ抗体の力価を決定するために、試験出血を免疫化動物から収集し、ＧＵＣＹ２ｃ特異的力価を、組換えヒトＧＵＣＹ２ｃ−ｍｌｇＧ２ａ−Ｆｃ（配列番号２３０）及びカニクイザルＧＵＣＹ２ｃ−ｍｌｇＧ２ａ−Ｆｃ（配列番号２３４）の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により検査した。最高のＧＵＣＹ２ｃ力価を有する動物をハイブリドーマ産生のために選択した。可溶性組換えタンパク質免疫化マウスでは、ＬＮリンパ球及び脾細胞を融合に使用し、一方、脾細胞のみを、３００．１９／ｈＧＵＣＹ２ｃで免疫化したマウスでの融合に使用した。ハイブリドーマ産生では、脾細胞及び／又はリンパ節のリンパ球を、ＰＥＧを使用して１：１比でＰ３Ｘ黒色腫と融合した。融合細胞を、ＨＡＴの存在下で７日間選択し、その後、ハイブリドーマを、スクリーニングする前にＨＴ含有培地に維持した。抗ｈｕＧＵＣＹ２ｃ特異的ハイブリドーマを確認するため、ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡによりＩｇＧ抗ｈｕＧＵＣＹ２ｃ反応性についてスクリーニングした。次いで、潜在的な抗ＧＵＣＹ２ｃハイブリドーマをまとめて、ＧＵＣＹ２ｃを発現するトランスフェクト３００．１９細胞株及び原発性腫瘍株での細胞表面ヒト及びｃｙｎｏＧＵＣＹ２ｃの反応性について分析した。簡潔には、様々なＧＵＣＹ２ｃタンパク質（配列番号２２４、２２６、及び２２８）を発現する３００．１９細胞株を、１日目に滅菌９６ウェル組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に４×１０４細胞／ウェルで接種し、コンフルエント単層が観察されるまで３７℃／５％ＣＯ２で１〜２日間インキュベートした。細胞をＰＢＳ＋Ｃａ２＋及びＭｇ２＋で４回洗浄し、３％ミルク／１％ＢＡＳ／ＰＢＳ＋Ｃａ２＋及びＭｇ２＋により室温で１時間遮断した。連続希釈（遮断緩衝剤で１：３）した試料をプレートに適用した。プレートを、ＰＢＳ＋Ｃａ２＋及びＭｇ２＋で洗浄する前に、室温で２時間インキュベートした。次いで、遮断緩衝剤で希釈（１：４，０００）したＨＲＰコンジュゲート二次抗体のヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を適用し、細胞と共に１時間インキュベートした。プレートを、ＴＭＢ基質溶液で１０分間現像する前に、ＰＢＳ＋Ｃａ２＋及びＭｇ２＋で洗浄し、次いで０．８１ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させた。Ｏ．Ｄ．４５０ｎＭでの吸光度を測定し、データをプロットし、マイクロソフトエクセル及びＧｒａｐｈｐａｄ−Ｐｒｉｓｍソフトウェアで分析した。ヒト及びカニクイザルＧＵＣＹ２ｃに特異的に結合したハイブリドーマを確認した。
【０５２２】
実施例２：フローサイトメトリー及び免疫組織化学アッセイにおける抗ＧＵＣＹ２ｃハイブリドーマ抗体の結合
抗ＧＵＣＹ２ｃハイブリドーマ抗体を、Ｔ８４及びＨＴ５５腫瘍細胞のヒトＧＵＣＹ２ｃへの細胞表面結合についてフローサイトメトリーによりスクリーニングした。ＴＨ２９細胞を陰性対照として使用した。細胞を細胞解離緩衝剤（Ｓｉｇｍａ）で解離し、ＰＢＳ＋３％ＢＳＡにより氷上で遮断した。細胞を一次抗体により氷上で１時間染色し、次いで冷ＰＢＳで洗浄した。１０μｇ／ｍｌの二次抗体（ＰＥコンジュゲート抗マウス二次、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を氷上で１時間添加した。細胞を再び冷ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、生／死識別のためにＤＡＰＩで染色し、ＢＤ  ＬＳＲＩＩ  ＦｏｒｔｅｓｓａによりＧＵＣＹ２ｃ結合について分析した。ＧＵＣＹ２ｃ発現細胞株（Ｔ８８及びＨＴ５５）への特異的結合を示す、並びにＧＵＣＹ２ｃ陰性細胞（ＨＴ２９）への結合を示さない、いくつかのクローンを確認した。
【０５２３】
ＧＵＣＹ２ｃに対して免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスのハイブリドーマを、ホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレットにおいて、免疫反応性について試験した。このスクリーニングで生成した細胞ペレットは、３００．１９親細胞、マウス、カニクイザル又はヒトＧＵＣＹ２ｃを過剰発現する３００．１９細胞、高い内在レベルでＧＵＣＹ２ｃを発現するヒト結腸直腸がん細胞株（Ｔ８４）、及びＧＵＣＹ２ｃ発現が陰性であるヒト結腸直腸がん細胞株（ＨＴ２９）から構成される。細胞株を１０％中性緩衝ホルマリン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２４時間固定し、３００×ｇで４分間（ｍ）遠心分離して、ペレットにした。ホルマリンを取り除き、細胞ペレットを、５０℃に予め温めたＨｉｓｔｏｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に穏やかに再懸濁した。Ｈｉｓｔｏｇｅｌに包埋した細胞ペレットを、ＶＩＰ自動組織処理機（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）により一晩処理する前に、４℃で１〜２時間冷却した。処理した細胞ペレットをパラフィンに包埋した。細胞マイクロアレイの５ミクロン切片を切断し、水浴に移し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｅｘｃｅｌｌ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ）に設置した。スライドを一晩かけて乾燥した。組織切片を脱パラフィン化及び再水和した後、熱誘導エピトープ賦活化（ｈｅａｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を、Ｒｅｔｒｉｅｖｅｒ２１００プレッシャークッカー（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、ｐＨ９．５のＢｏｒｇ  Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ緩衝剤（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）又はｐＨ６．０のクエン酸緩衝剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施し、続いて室温（ＲＴ）に冷却した。内在性ペルオキシダーゼ活性をＰｅｒｏｘｉｄａｚｅｄ  １（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）により１０分間不活性化した。非特異的タンパク質相互作用をＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｐｕｎｉｓｈｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）で１０分間遮断した。各ハイブリドーマを、両方とも熱誘導エピトープ賦活化の条件下で、希釈することなく１時間インキュベートした。切片をＴＢＳですすぎ、ハイブリドーマ結合をＥｎｖｉｓｉｏｎ＋  Ｍｏｕｓｅ  ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）で３０分間検出した。スライドをＴＢＳですすぎ、免疫反応性をＢｅｔａｚｏｉｄ  ＤＡＢ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）で５分間現像し、続いて蒸留水ですすいだ。免疫染色切片をＣＡＴヘマトキシリン（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）で短時間対比染色し、水道水で洗浄し、段階的なアルコールで脱水し、キシレンで透明にし、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＦｉｓｈｅｒＣｈｅｍｉｃａｌｓ）をカバースリップで覆った。獣医病理学者が免疫反応性について判定することによって、スライドを評価した。ヒト、カニクイザル及びマウスＧＵＣＹ２ｃへの免疫反応性を有するクローンを、このスクリーニングにより確認した。
【０５２４】
フローサイトメトリーによる抗ＧＵＣＹ２ｃハイブリドーマ抗体結合及び免疫組織化学（ＩＨＣ）の結果を表１１に示す。
【０５２５】
【表１１】
2021525080.tif 000030
【０５２６】
実施例３：細胞株におけるＧＵＣＹ２ｃ発現レベルの定量化
細胞株におけるＧＵＣＹ２ｃ受容体密度を、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１：１比でコンジュゲートしたＧＵＣＹ２ｃ−９Ｈ３クローンを使用して測定した。１×１０５個の細胞を、飽和結合について、１０ｕｇ／ｍｌのＰＥ標識抗ＧＵＣＹ２ｃ  ｍＡｂで染色した。細胞を洗浄し、ＤＡＰＩを有するＦＡＣＳ緩衝剤に再懸濁し、ＦＡＣＳ  ＤｉｖａソフトウェアによりＢＤ  ＬＳＲＩＩ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して獲得した。ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ  ＰＥ標識ビーズ（ＢＤ）を同じ獲得ＰＥ電圧設定で使用して、幾何平均ＰＥ蛍光強度に基づいて細胞１個当たりのＰＥ標識抗体の数（ＡＢＣ）を計算した。ヒト腫瘍細胞株のＧＵＣＹ２ｃ受容体密度の測定値を表１２に示す。ＧＵＣＹ２ｃの受容体密度を有する細胞株をこのアッセイで特徴づけ、続くアッセイ（例えば、細胞障害性アッセイ）に使用して、ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の機能活性を評価した。
【０５２７】
【表１２】
2021525080.tif 000031
【０５２８】
実施例４：抗ＧＵＣＹ２ｃハイブリドーマ抗体のクローニング及び配列決定
確認された細胞表面結合活性を有するハイブリドーマ上清を、マウスＩｇＧ１フォーマットにサブクローン化した。ＲＮＡを抽出し、発現した抗体の可変（Ｖ）領域ＤＮＡ配列を、下記に記載されるように、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）クローニングを介して得た。
【０５２９】
１〜５百万のサブクローン化ハイブリドーマ細胞を、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットにより、全ＲＮＡ単離のためにホモジナイズした。次いで、第１鎖のｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して産生した。続いて、抗ＧＵＣＹ２ｃ  ＩｇＧの可変領域の二本鎖ｃＤＮＡを生成し、下記に記載されるように、マウスＩｇＧ重鎖（ＩＧｇ１、ＩＧｇ２ａ、ＩＧｇ２ｂ）及び軽鎖（カッパ又はラムダ）定常領域からのプライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲサイクリング条件は、１サイクルを９５℃で１分間、２５サイクルを９５℃で１分間、６３℃で１分間及び７２℃で１分間であった。得られたＲＴ−ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローンし、配列決定した。
【０５３０】
可変ドメインの残基にＫａｂａｔに従って番号を付け、これは、抗体の編集のための重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムである（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又は挿入に対応して、より少ない又は追加のアミノ酸を含有することができる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろに単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従って、残基５２ａ）、並びに重鎖フレームワーク（ＦＲ）残基８２の後ろに挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔに従って、残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃ）を含むことができる。残基のＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列の相同性の領域を、「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列と整列させることにより、所定の抗体において決定されうる。Ｋａｂａｔ番号付けを割り当てるために様々なアルゴリズムが利用可能である。Ａｂｙｓｉｓのバージョン２．３．３リリースで実行されたアルゴリズム（ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ）を本明細書に使用して、Ｋａｂａｔ番号付けが可変領域のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＬ  ＣＤＲ３、ＶＨ  ＣＤＲ２、及びＶＨ  ＣＤＲ３に割り当てられる。ＡｂＭの定義がＶＨ  ＣＤＲ１に使用される。ＦＲ残基は、ＣＤＲ残基以外の抗体可変ドメイン残基である。ＶＨ又はＶＬドメインフレームワークは、４つのフレームワークサブ領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を、以下の構造のようにＣＤＲが散剤して含む：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。
【０５３１】
マウスＶ領域及び修飾ヒトＩｇＧ定常（ｈＩｇＧ１）領域を有するキメラＴ細胞二重特異性タンパク質を、以下のように生成した。親マウスＴＯＰＯベクターのＶ領域ｃＤＮＡを、ＧＣＰＰＣＰ（配列番号１９２）などのシステインリンカー（リンカー３）、及び「ノブ」Ｆｃ鎖（配列番号１８８）又は「ホール」Ｆｃ鎖（配列番号１８９）のいずれかをそれぞれ有する第１及び第２のヘテロ二量体促進ドメインから構成される哺乳類発現ベクターにサブクローンした。この場合、マウス抗ＧＵＣＹ２ｃ可変重（ＶＨ）領域（配列番号１１、１９、２６、３３、及び４１）を、リンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１９０）、その後に続く、「ホール」Ｆｃ鎖（配列番号１８９）に接続している別のリンカーＧＣＰＰＣＰ（配列番号１９２）により分離されているヒト抗ＣＤ３可変軽（ＶＬ）領域（配列番号８４）を有するフレームに融合させた。マウス抗ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＬ領域（配列番号９２、１００、１０４、１０６、１１２、及び１１９）を、リンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１９０）、ヒト抗ＣＤ３  ＶＨ領域（配列番号１）、その後に続くリンカーＧＣＰＰＣＰ（配列番号１９２）及び「ノブ」Ｆｃ鎖（配列番号１８８）を有するフレームに融合させた。フラグメントを、等温アセンブリ（ｉｓｏ−ｔｈｅｒｍａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）（ＩＴＡ）クローニングのため、デスティネーションベクター（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）と相同性を共有する１５−２５ヌクレオチドオーバーハングを組み込むプライマーを用いて標準的ＰＣＲにより増幅した。フラグメントを、Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ＩＴＡクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、上記の直線化ベクターに組換えた。
【０５３２】
次いでライゲーションを、コンピテント大腸菌ＤＨ５α（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にトランスフォームし、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するアガロースプレートにおいて３７℃で一晩増殖させた。コロニーをカウントし、取り出し、ＹＴ−ブロス＋１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンで一晩増殖させ、標準的な方法を使用してＤＮＡを単離した。次いで、全てのＤＮＡ構築物を、哺乳類細胞発現の前に、従来の配列決定方法を使用して両方の鎖の配列を決定した。
【０５３３】
実施例５：キメラＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の発現及び精製
相補的な構築物のペア（各鎖１２．５μｇ）を、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、１００万個の細胞／ｍｌのＨＥＫ２９３細胞を含む２５ｍＬの対数期培養物に共トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒを添加し、収集前に細胞をさらに４〜５日間増殖させた。次いで、消費された培養物を回収し、遠心分離して細胞残屑を除去し、次いで２０μフィルタに通した。
【０５３４】
次いで、ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体を含有する清澄化条件培地を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。試料を、リキッドハンドラー（Ｔｅｃａｎ）を使用して、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）充填済０．４５ｍＬマクロカラム（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）に装填した。結合したタンパク質をＰＢＳ、ｐＨ７．２で洗浄し、次いで、２０ｍＭのクエン酸、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ３．５で溶出し、２Ｍのトリス、ｐＨ８．０で中和した。次いで、試料を、Ｇ２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘドリップカラム（ｄｒｉｐ  ｃｏｌｕｍｎ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造会社の方法に従って使用して、ＰＢＳ  ｐＨ７．２に脱塩した。精製されたタンパク質を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣのＭａｂ  ＨＴＰカラム（Ｔｏｓｈｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を有する分析サイズ排除クロマトグラフィーを製造会社のプロトコルに従って使用して、純度について分析した。濃度を、マイクロ分光光度計（Ｔｒｉｎｅａｎ）を使用してＯＤ２８０ｎｍで測定することによって決定した。
【０５３５】
実施例６：組換えタンパク質結合分析
タンパク質を、組換えヒト、カニクイザル及びマウスタンパク質への結合についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。精製されたヒト、カニクイザル、ネズミＧＵＣＹ２ｃ  ＥＤＣ、又はヒトＣＤ３イプシロン−デルタタンパク質を、Ｎｕｎｃ−Ｍａｘｉｓｏｒｂ  ３８４−ウェルＥＬＩＳＡプレートに、２０μのＰＢＳ−ＣＭＦ（カルシウム及びマグネシウム無含有）中の１μｇ／ｍｌにより４℃でコーティングした。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ２０の３×で洗浄し、室温で振とうしながらＰＢＳ＋３％ミルクで１時間遮断した。遮断溶液を除去し、遮断液で連続希釈した試料を加え、室温で振とうしながら１時間インキュベートした。プレートを前記と同様に３×で洗浄し、二次抗体（ヤギ抗ｈｕ  ＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ  −  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌ２０４７−０５、１：５０００；ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ  −  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１：４，０００に希釈；又はマウス抗ペンタＨＩＳ−ＨＲＰ、Ｑｉａｇｅｎ、１：１０００）を加え、続いて室温で１時間振とうした。プレートを前記と同様に洗浄し、シグナルを、ＴＭＢを使用して現像し、反応をＨ２ＳＯ４で停止させ、吸光をＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により４５０ｎｍで読み取った。ＴＭＢ／Ｈ２ＳＯ４の代わりに代替的な検出方法も定期的に用いた。一次の添加及び洗浄の後、ＤＥＬＦＩＡアッセイバッファー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １２４４−３３０）に１：１０００で希釈した抗ヒトＩｇＧユーロピウム共役体（Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥＵ−Ｎ１）をウェル１つ当たり２０μｌで加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを１×ＤＥＬＦＩＡ洗浄溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １２４４−１１４）で３回洗浄し、１ウェル当たり２０μｌの増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １２４４−１０５）を加え、３０分間インキュベートした。次いで、時間分解蛍光（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を、ＥｎＶｉｓｏｎ（登録商標）プレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造会社の方法に従って使用して、３２０及び６１５ｎｍで測定した。
【０５３６】
ＧＵＣＹ２ｃ及びＣＤ３の両方への二重特異性結合を試験するため、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。ヒトＣＤ３イプシロン−デルタ（配列番号２４２）を、Ｎｕｎｃ−Ｍａｘｉｓｏｒｂ  ３８４−ウェルＥＬＩＳＡプレートに、２０μのＰＢＳ−ＣＭＦ（カルシウム及びマグネシウム無含有）中の１μｇ／ｍｌにより４℃でコーティングした。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ２０の３×で洗浄し、室温で振とうしながらＰＢＳ＋３％ミルクで１時間遮断した。遮断溶液を除去し、遮断液で連続希釈した試料を加え、室温で振とうしながら１時間インキュベートした。プレートを前記と同様に３×で洗浄し、精製されたヒト、カニクイザル、又はネズミＧＵＣＹ２ｃ  ＥＤＣ−マウスＩｇＧ２ａ  ＦＣ融合タンパク質をプレートに、１μｇ／ｍｌで加え、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。プレートを前記と同様に３×で洗浄し、二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ  −  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１：４，０００に希釈）を加え、続いて室温で１時間振とうした。プレートを前記と同様に洗浄し、シグナルを、ＴＭＢを使用して現像し、反応をＨ２ＳＯ４で停止させ、吸光をＥｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により４５０ｎｍで読み取った。ＴＭＢ／Ｈ２ＳＯ４の代わりに代替的な検出方法も定期的に用いた。精製されたヒト、カニクイザル、又はネズミＧＵＣＹ２ｃ  ＥＣＤ−マウスＩｇＧ２ａ  ＦＣ融合タンパク質の添加及び洗浄の後、ＤＥＬＦＩＡアッセイバッファー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １２４４−３３０）に１：１０００で希釈した抗ｍｕ−ＩｇＧユーロピウム共役体（Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥＵ−Ｎ１）をウェル１つ当たり２０μｌで加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＤＥＬＦＩＡ洗浄バッファーにより３×で洗浄し、２０μｌの増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ１２４４−１０５）と共に３０分間インキュベートした。次いで、時間分解蛍光を、ＥｎＶｉｓｏｎ（登録商標）プレートリーダーを製造会社の方法に従って使用して、３２４０及び６１５ｎｍで測定した。キメラＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体を、組換えヒトＧＵＣＹ２ｃ及びヒトＣＤ３イプシロンへの結合活性について、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。上位６ヒットが、低又はサブｎｍの二重結合活性を実証した（表１３）。
【０５３７】
【表１３】
2021525080.tif 000032
【０５３８】
実施例７：二重特異性抗体媒介Ｔ細胞活性
Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１７７（Ｓｉｇｍａ）を使用して、健康なドナー血液からヒトＰＢＭＣを単離した。Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＴ細胞富化キットを使用して、ＰＢＭＣからナイーブＴ細胞を単離した（Ｔ細胞の負の選択）。ルシフェラーゼ発現構築物でトランスフェクトされたＴ８４ヒト腫瘍細胞を発現するＧＵＣＹ２ｃを、Ｒ１０培地（ＲＰＭＩ、１０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ、３ｍｌの４５％グルコース）に再懸濁した。Ｔ細胞もＲ１０培地に再懸濁し、１０：１又は５：１のいずれかのエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ比）でＴ８４細胞に加えた。細胞を、ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体又は陰性対照ＣＤ３二重特異性剤の連続希釈で処理し、３７℃で４８時間インキュベートし、その後、Ｖｉｃｏｔｏｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、ｎｅｏｌｉｔｅ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の使用によりルシフェラーゼシグナルを測定した。ＥＣ５０値を、４パラメータ非線形回帰分析を使用してＧｒａｐｈｐａｄ  ＰＲＩＳＭで算出した。標的陰性のＨＣＴ１１６細胞又はＨＴ２９細胞は、いかなるＧＵＣＹ２ｃ二重特異性媒介性細胞傷害性も示さなかった。キメラＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）を用いた細胞死滅アッセイの結果を、表１４に示す。全てのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体が、ＧＵＣＹ２ｃ陽性細胞の特異的で強力なＴ細胞依存性細胞死滅を示した。
【０５３９】
【表１４】
2021525080.tif 000033
【０５４０】
ヒト化ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体（Ｅ：Ｔ比＝５：１）を用いた細胞死滅アッセイの結果を、表１５に示す。全ての二重特異性抗体が、ＧＵＣＹ２ｃ陽性細胞にＴ細胞依存性細胞障害性を示した。
【０５４１】
【表１５】
2021525080.tif 000034
【０５４２】
実施例８：Ｏｃｔｅｔによるエピトープビニング（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｂｉｎｎｉｇ）
二重特異性タンパク質のＧＵＣＹ２Ｃ−００７４、−００７７、−０１０４、−０１０５及び−００９８を、ＯｃｔｅｔＲＥＤ  ３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）によるタンデムビニングアッセイを使用して、ヒトＧＵＣＹ２ｃ（配列番号２２４）への競合及び非競合結合につて評価した。Ｏｃｔｅｔアッセイを室温で実施した。ビオチン化ヒトＧＵＣＹ２ｃを、カルシウム及びマグネシウム無含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（１８−５０２０、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）により製造会社の方法に従って捕捉した。二重特異性タンパク質をＰＢＳで３００ｎＭに希釈したＧＵＣＹ２ｃコーティングバイオセンサーを第１の二重特異性タンパク質に３００秒間にわたって漬け、次いで、第２の二重特異性タンパク質に３００秒間にわたって漬けた。それぞれの二重特異性抗体を、この対組み合わせ方法によって試験した。ヒトＧＵＣＹ２ｃの同じ結合領域で競合する二重特異性抗体を、単一のビンにグループ分けした。キメラＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体のＯｃｔｅｔによるエピトープビニングは、抗ＧＵＣＹ２ｃ結合ドメインにより認識される特有のエピトープ群を実証した（表１６）。＋符号は、競合エピトープを示し、＋／−符号は、エピトープの部分的重複を示し、−符号は、非競合エピトープを示し、ＮＴは、比較分析が試験されなかったことを示す。
【０５４３】
【表１６】
2021525080.tif 000035
【０５４４】
実施例９：マウスＧＵＣＹ２ｃ抗体結合ドメインのヒト化
マウスＧＵＣＹ２ｃ可変領域のヒト化は、ＣＤＲグラフト戦略を使用して実施した。重鎖にヒト受容体フレームワークのＶＨ３−７（配列番号１７６）及び軽鎖にＶＫ１−３９（配列番号１８０）を含有し、抗ＧＵＣＹ２ｃ相補性決定領域（ＣＤＲ）ドナー配列を有する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、軽鎖にヒトＩｇＧ１−３ｍ定常領域又はヒトカッパのいずれかを含有するベクターに合成した。重鎖ベクターを、ＣＨ１領域（配列番号１８５）、ヒンジ領域（配列番号１８６）、並びにエフェクター機能変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２４７Ａ（配列番号１８７、ＥＵ指標に従った番号付け）を含むＣＨ２−ＣＨ３領域から構成した。軽鎖ベクターを、カッパＣＬドメイン（配列番号１８４）から構成した。ＶＨ及びＶＬ領域の両方のフレームワーク領域におけるマウス配列への逆変異を導入し、結合活性の完全な回復について評価した。ヒト受容体フレームワークのＶＨ及びＶＬ領域、親マウスクローン、並びに完全活性ヒト化バリアントの整列を、クローンＧＵＣＹ２Ｃ−００９８について下記の表１７Ａ、１７Ｂ、１８Ａ、及び１８Ｂに示す。
【０５４５】
ＶＨ及びＶＬ領域の両方のフレームワーク領域におけるマウス配列への逆変異を導入し、結合活性の完全な回復について評価した。ヒト受容体フレームワークのＶＨ及びＶＬ領域、親マウスクローン、並びに完全活性ヒト化バリアントＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１の整列を、クローンＧＵＣＹ２Ｃ−００９８について下記の表１７Ａ及び１７Ｂに示す。
【０５４６】
【表１７】
2021525080.tif 000036
【０５４７】
【表１８】
2021525080.tif 000037
【０５４８】
ヒト受容体フレームワークのＶＬ領域、親マウスクローン、並びに完全ヒト化バリアントの整列を、クローンＧＵＣＹ２Ｃ−００９８について表１８Ａ及び１８Ｂに示す。Ｋａｂａｔ番号付けに基づいたＣＤＲには下線が引かれている。太字は、完全ヒト化クローンに存在する元の非ヒト生殖系列アミノ酸を表す。
【０５４９】
【表１９】
2021525080.tif 000038
【０５５０】
【表２０】
2021525080.tif 000039
【０５５１】
表１９は、ヒトＩｇＧ１としてヒト化抗ＧＵＣＹ２ｃ結合ドメインが、組換えＧＵＣＹ２ｃタンパク質に対する結合保持をＥＬＩＳＡにより実証していることを示す。
【０５５２】
【表２１】
2021525080.tif 000040
【０５５３】
表２０は、ＣＤ３二重特異性抗体としてヒト化ＧＵＣＹ２ｃ結合ドメインが、組換えＧＵＣＹ２ｃ及びヒトＣＤ３タンパク質に対する同時の結合保持を実証していることを示す。ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４０は、ヒト化ＣＤ３二重特異性抗体型のＧＵＣＹ２Ｃ−０１１６ＩｇＧである。ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４７及びＧＵＣＹ２Ｃ−０２５０は、異なる抗ＣＤ３可変領域を有するＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１のヒト化ＣＤ３二重特異性抗体である。
【０５５４】
【表２２】
2021525080.tif 000041
【０５５５】
実施例１０：ファージディスプレイを使用したＧＵＣＹ２Ｃ結合ドメインのさらなるヒト化及び最適化
ある特定の態様において、置換は、ＣＤＲ残基が対応するヒト生殖系列残基に置き換えられて、抗体のヒトアミノ酸含有量を増加し、可能な免疫原性を低減する、ヒト生殖系列の置換である。例えば、ヒト生殖系列ＶＨ３−７フレームワークが使用され、例示的な抗体ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１である場合、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１抗体のＶＨ  ＣＤＲ（配列番号２７）１及びヒト生殖系列ＶＨ３−７は、表２１の通りである（Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用し、ＶＨ  ＣＤＲ１はＡｂＭ定義である）。
【０５５６】
【表２３】
2021525080.tif 000042
【０５５７】
位置２６、２８、２９、３１、３２、３３及び３４では、ヒト生殖系列残基及び対応するＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１残基は同じであり、生殖系列の置換は可能ではない。位置２７、３０及び３５（太字及び下線付き）では、ヒト生殖系列残基及び対応するＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１残基は異なっている。これらの位置のＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１の残基を対応するヒト生殖系列ＶＨ３−７残基に置き換えて、ヒト残基含有量をさらに増加させることができる。
【０５５８】
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト生殖系列ＶＨフレームワーク配列を含むＶＨフレームワークを含むことができる。ＶＨフレームワーク配列は、ヒトＶＨ３生殖系列、ＶＨ１生殖系列、ＶＨ５生殖系列、又はＶＨ４生殖系列からのものであり得る。好ましいヒト生殖系列重鎖フレームワークは、ＶＨ１、ＶＨ３、又はＶＨ５生殖系列から誘導されたフレームワークである。例えば、以下の生殖系列のＶＨフレームワークを使用することができる：ＩＧＨＶＣＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−７、又はＩＧＨＶ１−６９（生殖系列の名称はＩＭＧＴの生殖系列の定義に基づいている）。好ましいヒト生殖系列軽鎖フレームワークは、ＶΚ又はＶλ生殖系列から誘導されたフレームワークである。例えば、以下の生殖系列のＶＬフレームワークを使用することができる：ＩＧＫＶ１−３９又はＩＧＫＶ３−２０（生殖系列の名称はＩＭＧＴの生殖系列の定義に基づいている）。代替的又は追加的に、フレームワーク配列は、ヒトＶλ１コンセンサス配列、ＶΚ１コンセンサス配列、ＶΚ２コンセンサス配列、ＶΚ３コンセンサス配列、ＶＨ３生殖系列コンセンサス配列、ＶＨ１生殖系列コンセンサス配列、ＶＨ５生殖系列コンセンサス配列、又はＶＨ４生殖系列コンセンサス配列のフレーム等の、ヒト生殖系列コンセンサスフレームワーク配列であり得る。ヒト生殖系列フレームワークの配列は、様々な公的データベース、例えば、Ｖベース、ＩＭＧＴ、ＮＣＢＩ、又はＡｂｙｓｉｓから入手可能である。
【０５５９】
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト生殖系列ＶＬフレームワーク配列を含むＶＬフレームワークを含むことができる。ＶＬフレームワークは、１個以上のアミノ酸置換、付加、又は欠失を含むことができ、同時に、ＶＬフレームワークが誘導された生殖系列と機能的及び構造的類似性を依然として保持することができる。一部の側面において、ＶＬフレームワークは、ヒト生殖系列ＶＬフレームワーク配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性がある。一部の側面において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト生殖系列ＶＬフレームワーク配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のアミノ酸置換、付加、又は欠失を含むＶＬフレームワークを含む。
【０５６０】
ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ＤＰＫ９（ＩＭＧＴ名称：ＩＧＫＶ１−３９）のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ＤＰＫ１２（ＩＭＧＴ名称：ＩＧＫＶ２Ｄ−２９）のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ＤＰＫ１８（ＩＭＧＴ名称：ＩＧＫＶ２−３０）のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ＤＰＫ２４（ＩＭＧＴ名称：ＩＧＫＶ４−１）のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ＨＫ１０２＿Ｖ１（ＩＭＧＴ名称：ＩＧＫＶ１−５）のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ＤＰＫ１（ＩＭＧＴ名称：ＩＧＫＶ１−３３）のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ＤＰＫ８（ＩＭＧＴ名称：ＩＧＫＶ１−９）のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ＤＰＫ３（ＩＭＧＴ名称：ＩＧＫＶ１−６）のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ＤＰＫ２１（ＩＭＧＴ名称：ＩＧＫＶ３−１５）のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、Ｖｇ＿３８Ｋ（ＩＭＧＴ名称：ＩＧＫＶ３−１１）のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ＤＰＫ２２（ＩＭＧＴ名称：ＩＧＫＶ３−２０）のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ＤＰＫ１５（ＩＭＧＴ名称：ＩＧＫＶ２−２８）のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ＤＰＬ１６（ＩＭＧＴ名称：ＩＧＬＶ３−１９）のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ＤＰＬ８（ＩＭＧＴ名称：ＩＧＬＶ１−４０）のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、Ｖ１−２２（ＩＭＧＴ名称：ＩＧＬＶ６−５７）のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ヒトＶλコンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ヒトＶλ１コンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ヒトＶλ３コンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ヒトＶλコンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ヒトＶλ１コンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ヒトＶΚ２コンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、ヒトＶλ３コンセンサス配列のフレームワークであり得る。
【０５６１】
増強２成分置換（ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  ｂｉｎａｒｙ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）によるＧＵＣＹ２ｃ抗体のパラトープ決定
重要なＣＤＲ残基を決定する方法は記載されており、それにより機能性抗体バリアントが、ＣＤＲ−Ｈ３を除いて、各ＣＤＲ位のヒト生殖系列残基又は対応する齧歯類残基のいずれかを含有するライブラリーから選択される（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１１２（５０）：１５３５４−１５３５９）。ファージｓｃＦｖライブラリーを構築し、ここでは、ヒト生殖系列（ＶＨ３−７／ＶＫ１−３９）と異なるＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１のＶＨ  ＣＤＲ３を除いて全てのＣＤＲ位置を、その位置で、およそ５０％のクローンがマウスＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１アミノ酸をコードし、およそ５０％がヒト生殖系列アミノ酸をコードするようにランダム化した（表１７Ａ、１７Ｂ、１８Ａ及び１８Ｂ）。ライブラリーを準備し、下記に記載されるように、ヒトＧＵＣＹ２ｃ（配列番号２３２）に対して３〜４ラウンドの選択に付した。ＧＵＣＹ２ｃへの結合を保持したクローンを回収し、これらの配列を決定した。
【０５６２】
この実験から、ヒト配列が、およそ２０％未満の結合クローンで観察された位置を、必須マウス残基と定義した。マウス残基は、優先的に２５位置（Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、重鎖残基Ｈ３５、Ｅ５０、Ｐ５２ａ、Ｓ５３、Ｎ５４、Ｇ５５、Ｌ５６、Ｔ５７、Ｎ５８、Ｉ６０、Ｅ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、及びＮ６５、軽鎖残基Ｅ２７、Ｖ２９、Ｄ３０、Ｌ３２、Ｍ３３、Ｑ３４、Ｎ５３、Ｅ５５、Ｔ９１、Ｒ９２、及びＫ９３であり、ＡｂＭ定義がＶＨ  ＣＤＲ１に使用され、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムがＶＬ  ＣＤＲ１に使用される）で保持され、ヒト生殖系列残基によるこれらの残基の置き換えには強い不利益があることを示した。マウス及びヒト残基は、重鎖残基２７（Ｆ／Ｙ）及び３０（Ｓ／Ｔ）、並びに軽鎖残基５４（Ｌ／Ｖ）及び９４（Ａ／Ｖ）（Ｋａｂａｔ番号付けシステムに準じ、ＡｂＭ定義がＶＨ  ＣＤＲ１に使用される）において類似した頻度（２０％を超えるヒト含有量と定義される）が見出され、これらの位置のマウス配列が重要ではないことを示した。
【０５６３】
加えて、マウスアミノ酸への逆変異を以前に必要としたフレームワーク（ＦＷ）残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って、重鎖位置Ｉ４８及びＧ４９）を、増強２成分置換戦略に含めた。ファージ選択及びスクリーニングの後、重鎖フレームワーク位置４８のヒトアミノ酸配列が、その時点でおよそ１０％観察され、逆変異が好ましいことを示唆した。重鎖位置４９は、その時点でマウスアミノ酸残基を１００％含有し、この逆変異が必須であることを示唆した。増強２成分置換後の、ＣＤＲ又はＦＷ位置のマウス又はヒトアミノ酸配列の頻度を、表２２に示す。表２２は、増強２成分置換により試験した、ＧＵＣＹ２Ｃ−００９８  ＣＤＲ位置へのヒトアミノ酸の組込みの頻度を実証している（Ｋａｂａｔ番号付けシステムが使用され、ＡｂＭ定義がＶＨ  ＣＤＲ１に使用され、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けがＶＬ  ＣＤＲ１に使用される）。
【０５６４】
【表２４】
2021525080.tif 000043
【０５６５】
抗ＧＵＣＹ２ｃ結合ドメインのさらなる最適化
改善された安定性を有する抗ＧＵＣＹ２ｃのバリアントを、以下の手順により単離した。ヒト化クローンＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１のＶＨ及びＶＬ領域（配列番号６０及び１３７）を、Ｃ末端Ｈｉｓ６及びｃ−ｍｙｃタグを含有するファージ発現ベクター（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ）に、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）として合成したランダム変異を、ＮＮＫソフトランダム化により（以前に米国特許第９，８８４，９２１号に記載された方法を使用して）ＶＨ及びＶＬ  ＣＤＲドメインに導入した。一度に１個のＣＤＲ残基を選択的に変異するように設計されたオリゴを、ベンダー（ＩＤＴ）において合成し、次いで、以前に記載された方法（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１１２（５０）：１５３５４−１５３５９）を使用して、核酸テンプレートに変化を導入することに使用した。可能なＮＧアスパラギン脱アミド化部位を除去している（Ｃｈｅｌｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７７（１８）：６００４−６０１１，２００５）、翻訳後修飾の可能な部位（重鎖Ｇ５５Ｅ）を排除するように設計された変異も、オリゴ設計に組み込んだ。変異クローンを取り出し、配列決定するために送り、変異頻度を評価した。次いで、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１の変異誘発ＶＨ及びＶＬ  ＣＤＲバリアント（配列番号６０及び１３７）を含有するこれらのファージ発現ベクターを、ファージディスプレイの小さなサブライブラリーにプールした。
【０５６６】
組換えヒト、カニクイザル、及びネズミＧＵＣＹ２ｃタンパク質を、選択、その後のスクリーニングの工程に使用した（配列番号２３０、２３２、２３４、２３６、２３８及び２４０）。ビオチン化タンパク質を伴う選択では、上記に記載されたファージプール及び磁気ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０ストレプトアビジン）のアリコートを、別々に、ロータリーミキサー（２０ｒｐｍ）において、３％ミルク／ＰＢＳにより室温、６０℃、又は６５℃で１時間にわたって遮断した。異なる温度でインキュベートした後、遮断したファージプールを４０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、上清を新たな管に移し、６％遮断バッファーと混合した。遮断されたファージを、過剰モル濃度の非選択試薬（ｄｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）（即ち、標的無含有ストレプトアビジンビーズ、二本鎖ｓＤＮＤ、インスリン、及び／又は膜抽出試薬）と共にインキュベートし、ロータリーシェーカー（２０ｒｐｍ）により室温で１時間にわたってインキュベートし、遮断したストレプトアビジン磁気ビーズと混合し、さらに１時間インキュベートした。非選択ライブラリーを、磁気分離機を使用してビーズをペレット化することによって収集した。Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ磁気精製機器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ  ＮＪ，ＵＳＡ）を使用して、ビオチン化選択抗原（表２３に示されている様々な濃度）を、非選択ファージライブラリーと共に、９６ディープウェルプレート（ｄｅｅｐ  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）において定期的に混合しながら室温で１時間にわたってインキュベートした。ビーズを、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ機器の磁気分離機を使用して分離し、別個の９６ディープウェルプレートにおいてＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で４回及びＰＢＳで３回洗浄した。結合したファージを、新たな９６ウェルプレートにおいて１００ｍＭのトリエチルアミン（ＴＥＡ）と共に８分間にわたってインキュベートすることによって溶出し、続いて磁気ビーズから分離した。溶出されたファージを、２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で中和した。抗ＧＵＣＹ２ｃ結合ドメイン最適化のためのファージ選択条件の例を、表２３に示す。表２３は、ファージディスプレイに使用した選択条件も示す。Ｄｓｌｘｎは、使用した非選択条件を意味する。ＳＡ＝ストレプトアビジンであり、Ｄ＝ＤＮＡであり、Ｉ＝インスリンであり、Ｍ＝膜抽出タンパク質である。Ｔｈｅｒｍは、試薬とのインキュベーションの前に実施したサーマルインキュベーション（ｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）を表す。
【０５６７】
【表２５】
2021525080.tif 000044
【０５６８】
溶出されたファージを、中期対数期（約０．５のＯＤ６００に対応する）に増殖させた大腸菌ＥＲ２７３８培養物の１０ｍｌを感染させることに使用した。細菌を、１５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間かけてファージに感染させ、遠心分離工程で濃縮し、２％グルコース及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×ＹＴ寒天バイオアッセイプレート（２×ＹＴＡＧ）で平板培養した。インプット又はアウトプットファージのいずれかに感染させた大腸菌培養物の様々な希釈も２×ＹＴＡＧ寒天で平板培養して、ファージ力価を決定した。３０℃で一晩増殖させた後、１０ｍｌの２×ＹＴＡＧ培地を各バイオアッセイプレートに加え、細胞を、菌叢を掻きとることによって再懸濁した。グリセロールを、この細胞懸濁液に加えて、最終濃度の１７％にして、さらに使用するまでアリコートにより−８０℃で保存した。次の選択ラウンドでファージをレスキューするため、１００μｌのこの細胞懸濁液を使用して、２０ｍｌの２×ＹＴＡＧ培地に接種し、これを３７℃（３００ｒｐｍ）で増殖させて、０３〜０．５のＯＤ６００にした。次いで細胞を３．３μｌのＭＫ１３Ｋ０７ヘルパーファージで重複感染させ、３７℃（１５０ｒｐｍ）で１時間にわたってインキュベートした。次いで、細胞を遠心分離し、ペレットを、カナマイシン／無グルコース含有培地（５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを有する２×ＹＴ）に再懸濁した。この培養物を３０℃（３００ｒｐｍ）で一晩増殖させた。ファージを遠心分離後に上清から採取し、上記に記載された次の選択ラウンドに直ぐに使用できるようにした。
【０５６９】
ＥＬＩＳＡに使用される粗ペリプラズム物質の調製
ｓｃＦｖを、使用された増殖条件に応じて、ファージ粒子の表面又は細菌ペリプラズム腔（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｓｐａｃｅ）中の溶液のいずれかに発現させることができる。ペリプラズムへのｓｃＦｖの放出を誘導するため、０．１％のグルコース／１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを有する２×  ＹＴ培地を含有する９６ディープウェルプレートに、ＱＰｉｘコロニーピッカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、解凍グリセロール貯蔵液（ウェル１個当たり１個のクローン）を接種し、３７℃（９９９ｒｐｍ）で約４時間にわたって増殖させた。培養物を、０．０２ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧにより誘導し、３０℃（９９９ｒｐｍ）で一晩増殖させた。細菌ペリプラズムの含有物（ペリプレップ（ｐｅｒｉｐｒｅｐ））を浸透ショックにより放出した。簡潔には、プレートを遠心分離し、ペレットを１５０μｌのＴＥＳペリプラズムバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％のスクロース、ｐＨ７．４）に再懸濁し、続いて１５０μｌの１：５のＴＥＳ：水を加え、氷上で３０分間インキュベートした。プレートを４０００ＲＰＭで２０分間遠心分離し、ｓｃＦＶ含有上清を採取した。
【０５７０】
競合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ−Ｍａｘｉｓｏｒｂ  ４６０３７２）を、ＰＢＳバッファー中の目的の抗原の１μｇ／ｍＬにより４℃で一晩かけてコーティングした。コーティング溶液を廃棄し、次いでプレートウェル１個当たり７０μＬのＰＢＳ−３％ＢＳＡにより室温で２時間かけて遮断した。遮断溶液を廃棄し、ペリプレップとしての未知の試料又は精製タンパク質（所定の希釈、典型的には、１：５）及び所望の濃度（典型的には、ＥＣ５０〜ＥＣ８０）の純粋な親抗体の混合物である一次抗体の２０μＬ。プレートを、ゆっくりと振とうしながら室温で２時間インキュベートした。プレートを、ウェル１個当たり１００μｌの洗浄バッファー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １２４４−１１４）で５回洗浄し、Ｄｅｌｉｆａアッセイバッファー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １２４４−１１１）にストレプトアビジン−ユーロピウム又は抗ヒトＩｇＧでは１：１０００で希釈した、抗マウスＩｇＧでは１：５００に希釈した、二次ユーロピウム共役体の２０μｌと共に１時間にわたってインキュベートした。プレートを前記のように５回洗浄し、２０μｌの増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １２４４−１０５）と共に３０分間インキュベートした。次いで、時間分解蛍光を、ＥｎＶｉｓｏｎ（登録商標）プレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造会社の方法に従って使用して、３２０及び６１５ｎｍで測定した。
【０５７１】
ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ＩｇＧ及び二重特異性抗体へのｓｃＦｖの変換
所望の挙動を実証しているｓｃＦｖを、ｓｃＦｖ−Ｆｃへのサブクローン化のために選択し、ここでヒトＩＧｇ１のＦｃドメインをｓｃＦｖの３’末端に結合した。簡潔には、フラグメントを、５’増幅にＢｓｓＨＩＩ及び３’増幅にＢｃｌＩのプライマーを用いた標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増殖させた。フラグメントを、対応する制限酵素により製造会社の仕様書（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に従って切断した。抗ＧＵＣＹ２ｃ  ｓｃＦｖ−Ｆｃアンプリコンをゲル精製し（Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含有するＰｆｉｚｅｒ所有のプレカット（ｐｒｅ−ｃｕｔ）哺乳類発現ベクターに括りつけた。ｓｃＦｖ−Ｆｃ構築物を大腸菌にトランスフォームし、前記のように配列決定した。次いで、配列検証発現ベクターを、以前に記載されたように、ＨＥＫ２９３細胞における一過性哺乳類発現に使用した。試料を、以前に記載されたように、プロテインＡアフィニティーキャプチャーを使用して精製し、続いてバッファーをＰＢＳに交換した。次いで精製された試料を、組換えＧＵＣＹ２ｃタンパク質結合活性について及び安定性についてスクリーニングした。ｓｃＦｖ−Ｆｃ配列の例は、ＧＵＣＹ２Ｃ−０４０５（配列番号２１３）である。このフォーマットは、グリシンセリンリンカー（配列番号１９３）であるリンカー４で接続されているＶＨ−ＶＬ方向のｓｃＦｖから構成される。ＶＨ−ＶＬは、２個のリンカー配列のリンカー５（配列番号１９４）及びリンカー６（配列番号１９５）を使用して、修飾ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（配列番号１８７）に接続されている。
【０５７２】
最適化ｓｃＦｖも、以前に記載されたように、ヒトＩｇＧ１及びＴ細胞二重特異性フォーマットにサブクローンした。可変領域遺伝子特異性プライマーを、前記のようにＩＴＡクローニングのために設計した。
【０５７３】
実施例１１：最適化ＧＵＣＹ２ｃ抗体の表面プラズモン共鳴
最適化ＧＵＣＹ２ｃ抗体を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）８Ｋ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して表面プラズモン共鳴により結合について評価した。ＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐを使用して、抗ヒトＦｃ（ＧＥ  ＢＲ−１００８−３９）を最初に、製造会社のプロトコルに従ってコーティングした。ヒト抗ＧＵＣＹ２ｃ  ＩｇＧに、ハンクス緩衝食塩水（ＨＢＣ）−ＥＰ＋、ｐＨ＝７．４中においてチップを０．５ｕｇ／ｍＬ、１０ｕＬ／分で３０秒間実施した。次に、４５０ｎＭ、１５０ｎＭ及び５０ｎＭの濃度のヒトＧＵＣＹ２ｃタンパク質（配列番号２２４）に、チップを５０ｕＬ／分で５４秒間実施することにより会合させ、次いで３００秒間解離させた。チップを、それぞれの実施の間に、３×の３Ｍ  ＭｇＣｌ２により５℃で３０秒間にわたって再生した。ヒトＩｇＧ１フォーマットの最適化抗ＧＵＣＹ２ｃ結合ドメインのヒトＧＵＣＹ２ｃ組換えタンパク質へのＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合親和性（ＫＤ、ｎＭ）を表２４に示す。いくつかの最適化ＧＵＣＹ２ｃ結合ドメイン、例えば、ＧＵＣＹ２Ｃ−０４８６（配列番号２１４及び２１５）は、親非最適化結合ドメイン（ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１）と比較して、改善された結合親和性を示す。
【０５７４】
【表２６】
2021525080.tif 000045
【０５７５】
実施例１２：熱誘発結合アッセイ（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙ）
最適化バリアントの改善された熱安定性を評価するため、最適化ファージクローン（上記に記載された）又は精製タンパク質のいずれかのペリプラズム調製物を、ＰＣＲブロックにおいて上昇温度で熱誘発した後の結合活性について評価した。Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ３８４ウェルホワイトＥＬＩＳＡプレート（７８１０７４）を、コーティングバッファー（２５ｍＭのＮａ２ＣＯ３、７５ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中の標的タンパク質の１μｇ／ｍｌにより４℃でコーティングした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ２０で３回洗浄し、次いで遮断バッファー（ＰＢＳ＋３％ミルク）により振とうしながら室温で１時間にわたって遮断した。別個に、ペリプラズム調製物又は精製タンパク質の希釈プレートを、遮断バッファー中において、１：１０のペリプラズム調製物又は１μｇ／ｍｌ（ＥＣ８０）の組換えタンパク質結合のいずれかにより室温で調製し、１００μｌを９６ウェルＰｃＲプレートに移した。次いで１００μｌの希釈試料を含有するＰＣＲプレートを、所望の温度（一般に、５５℃〜７５℃）で３０分間加熱した。プレートを室温で１５分間冷まし、次いで４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。遮断したＥＬＩＳＡプレートを空にして、２０μｌの熱誘発タンパク質上清をウェル毎に加え、次いで振とうしながら室温で１時間インキュベートした。プレートを前記と同様に３回洗浄し、ＤＥＬＦＩＡアッセイバッファー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １２４４−３３０）に１：１０００で希釈した、抗６×ＨＩＳ−ユーロピウム試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥＵ−Ｎ１）又は抗ヒトＩｇＧ−ユーロピウム共役体試薬タンパク質（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥＵ−Ｎ１）の２０μｌをウェル毎に加え、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。プレートを１×ＤＥＬＦＩＡ洗浄溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １２４４−１１４）で３回洗浄し、２０μｌの増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １２４４−１０５）をウェル毎に加え、３０分間インキュベートした。プレートを、製造会社の方法に従ってＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにより最初にＯＤ３２０、次いでＯＤ６１５で時間分解蛍光について読み取った。５０％の活性が保持される温度をＴ５０として報告する。ｓｃＦｖ−Ｆｃの安定性最適化ＧＵＣＹ２ｃ結合ドメインについての熱結合アッセイは、非最適化親クローンＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１（ここでは、ｓｃＦｖ−ＦｃフォーマットのＧＵＣＹ２Ｃ−０２９５）と比較して、上昇温度でインキュベートした後に改善された熱安定性を実証した（表２５Ａ及び２５Ｂ）。
【０５７６】
表２５Ａ及び２５Ｂは、増加温度での最適化ＧＵＣＹ２ｃ結合ドメイン（ｓｃＦｖ−Ｆｃタンパク質として）の時間分解蛍光（ＴＲＦ）を示す。Ｔ５０値は、クローンが５０％の結合活性を保持する温度を表す。
【０５７７】
【表２７】
2021525080.tif 000046
【０５７８】
【表２８】
2021525080.tif 000047
【０５７９】
改善された熱安定性を示すＧＵＣＹ２ｃ抗体クローンのアミノ酸配列を、親クローンＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１（ＶＨ配列番号６０及びＶＬ配列番号１３７）と比較した。改善された安定性をもたらすＶＨ  ＣＤＲ中のアミノ酸含有量の変化を、表２６Ａに示す。位置５９、６０、６１及び６２における変化は、安定性対して最大の影響を有し、安定性における最大の変化と相関すると思われる（Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従い、ＶＨ  ＣＤＲ１ではＡｂＭ定義を使用する）。
【０５８０】
【表２９】
2021525080.tif 000048
【０５８１】
改善された安定性をもたらすＶＬ  ＣＤＲ中のアミノ酸含有量の変化を、表２６Ｂに示す（Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けシステムをＶＬ  ＣＤＲ１に使用し、Ｋａｂａｔ番号付けシステムをＶＬ  ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に使用した）。ＶＬ  ＣＤＲ２の位置５３、５４、５５及びＶＬ  ＣＤＲ３の位置９３、９４における変化は、安定性対して最大の影響を有し、安定性における最大の変化と相関すると思われる。
【０５８２】
【表３０】
2021525080.tif 000049
【０５８３】
実施例１３：最適化ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の組換えタンパク質結合
最適化抗ＧＵＣＹ２ｃ結合ドメインを、以前に記載されたＤＥＬＦＩＡ方法を使用して、ヒトＧＵＣＹ２ｃ（配列番号２２４）及びヒトＣＤ３（配列番号２４２）への室温及び６０℃での組換えタンパク質同時結合について二重特異性フォーマットで評価した。最適化二重特異性抗体を、以前に記載されたＤＥＬＦＩＡ方法を使用して、ヒトＧＵＣＹ２ｃ（配列番号２３２３）及びカニクイザルＧＵＣＹ２ｃ（配列番号２３６）への室温及び６０℃での直接結合についても評価した。ヒトＧＵＣＹ２ｃ及びヒトＣＤ３への最適化ＧＵＣＹ２ｃ二重特性抗体の二重結合を、表２７に示す。ＧＵＣＹ２Ｃ−１４７８等の最適化ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、室温及び６０℃の両方で強い結合を示す。
【０５８４】
【表３１】
2021525080.tif 000050
【０５８５】
ヒト及びカニクイザルＧＵＣＹ２ｃへの最適化ＧＵＣＹ２ｃ二重特性抗体の直接結合の結果を、表２８に示す。ＧＵＣＹ２Ｃ−１４７８等の最適化ＣＤ３−ＧＵＣＹ２Ｃ二重特異性抗体は、ヒト及びｃｙｎｏＧＵＣＹ２ｃの両方に室温で強い結合を実証し、一方で、６０℃でインキュベートした後には結合シグナルにいくらかの損失を示している。
【０５８６】
【表３２】
2021525080.tif 000051
【０５８７】
実施例１４：フローサイトメトリーによるＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の細胞結合
最適化ＣＤ３二重特異性抗体を、以前に記載されたフローサイトメトリーの方法を使用して、Ｔ８４細胞におけるＧＵＣＹ２ｃへの及び新たなヒト抹消血単球（ＰＢＭＣ）から精製されたナイーブヒトＴ細胞におけるヒトＣＤ３への細胞表面結合について滴定した。ヒト化及び最適化ＧＵＣＹ２ｃクローンのＧＵＣＹ２Ｃ−０２４７及びＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８は、ヒトＧＵＣＹ２ｃを発現するＴ８４細胞への低／サブｎＭの結合親和性を実証した（図２Ａ及び２Ｂ）。ヒト化及び最適化ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体を、フローサイトメトリーによりＣＤ３細胞表面結合についても評価し（図３Ａ及び３Ｂ）、ナイーブヒトＴ細胞への低から中ｎＭの結合親和性を示した。
【０５８８】
実施例１５：ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の免疫原性危険回避（ｄｅ−ｒｉｓｋｉｎｇ）
一部の治療用タンパク質が患者に投与されると、不要な免疫反応、例えば、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の生成が、薬物の有効性に影響を与え、患者に安全性の問題を引き起こす（Ｙｉｎ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｊｕｎ；２９５（２）：１１８−２６，２０１５）。ＡＤＡは、２つの群：治療用タンパク質の薬理学的活性を阻害するかに応じて、中和ＡＤＡ（ＮＡｂ）又は非中和ＡＤＡ（非ＮＡｂ）に分類することができる（Ｙｉｎ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｊｕｎ；２９５（２）：１１８−２６，２０１５）。ＮＡｂ及び非ＮＡｂが低減された薬物の有効性に寄与し得る２つの可能な機構がある。第１には、ＮＡｂは、標的分子への治療用タンパク質の結合を直接遮断し、したがって治療有効性を低減する（Ｙｉｎ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｊｕｎ；２９５（２）：１１８−２６，２０１５）。第２には、ＮＡｂ及び非ＮＡｂは、ＴＰＰの薬力学（ＰＫ）に影響を及ぼすクリアランスの増加に寄与することがあり、したがって薬物の有効性を妨げる（Ｙｉｎ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｊｕｎ；２９５（２）：１１８−２６，２０１５）。治療用タンパク質に対する免疫原性は、Ｔ細胞依存性及びＴ細胞非依存性の両方の経路で生成され得る。Ｔ細胞依存性経路では、Ｔ細胞は、抗原提示細胞における主要な組織適合性複合体クラスＩＩ分子（ＭＨＣ  ＩＩ）により提示された治療用タンパク質誘導抗原ペプチドを認識することによって活性化される。次いで、活性化されたＴ細胞はＢ細胞を刺激して、治療用タンパク質特異的ＡＤＡを生成する（Ｙｉｎ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｊｕｎ；２９５（２）：１１８−２６，２０１５）。Ｔ細胞依存性反応から発生する免疫原性の可能性を最小限にするため、下記に記載されるコンピューター方法を使用して、ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体配列の抗原可能性を低減する努力が払われた。
【０５８９】
配列を、２つのプロトコル（下記に詳述される）を使用して分析して、可能なＴ細胞エピトープを同定した。いずれかのプロトコルにおいて本明細書に記載される規則によってフラグ付けされた任意の配列は、エピトープとみなされた。本明細書は、主にアミノ酸９−ｍｅｒのレベルの配列を検査する。
【０５９０】
方法１：配列をＩＳＰＲＩソフトウェアパッケージによるＥｐｉＭａｔｒｉｘ分析にかけた（ＩＳＰＲＩ  ｖ１．８．０，ＥｐｉＶａｘ  Ｉｎｃ．，Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，ＲＩ（２０１７）；Ｓｃｈａｆｅｒ  ＪＲＡ，Ｊｅｓｄａｌｅ  ＢＭ，Ｇｅｏｒｇｅ  ＪＡ，Ｋｏｕｔｔａｂ  ＮＭ，Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ＡＳ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｅｌｌ−ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＨＩＶ−１  ｌｉｇａｎｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍａｔｒｉｘ−ｂａｓｅｄ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ，ＥｐｉＭａｔｒｉｘ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １６（１９），１８８０−８４，１９９８）。生の結果は、８個の異なるＨＬＡタイプに対する各９−ｍｅｒアミノ酸フラグメントの結合可能性のランク付けを提供する。このように、各９−ｍｅｒにつき８個の推定（「観察」）がある。９−ｍｅｒは、配列のそれぞれ個別の直鎖番号付け位置から出発して生成される（このように、同じ９−ｍｅｒが同じ配列に１回を超えて発生することが可能である）。任意の４個の観察が、９−ｍｅｒが上位５％の結合剤であること（少なくとも４個のＨＬＡタイプにおいて上位５％の結合剤であると推定されることを意味する）を示す場合、９−ｍｅｒは推定エピトープ（「エピトープ」）であるとみなされる。或いは８個の推定のうちの任意の１個が、９−ｍｅｒが上位１％の結合剤であることを示す場合、この９−ｍｅｒも、推定エピトープであるとみなされる。
【０５９１】
方法２：配列を、ＭＨＣ−ＩＩ結合コンセンサス方法を使用して分析にかけた（Ｗａｎｇ  Ｐ，Ｓｉｄｎｅｙ  Ｊ，Ｋｉｍ  Ｙ，Ｓｅｔｔｅ  Ａ，Ｌｕｎｄ  Ｏ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｍ，Ｐｅｔｅｒｓ  Ｂ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＨＬＡ  ＤＲ，ＤＰ  ａｎｄ  ＤＱ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １１：５６８，２０１０；Ｗａｎｇ  Ｐ，Ｓｉｄｎｅｙ  Ｊ，Ｄｏｗ  Ｃ，Ｍｏｔｈｅ  Ｂ，Ｓｅｔｔｅ  Ａ，Ｐｅｔｅｒｓ  Ｂ．Ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．４（４），ｅ１００００４８，２００８  ｉｎ  ＩＥＤＢ（Ｖｉｔａ  Ｒ，Ｏｖｅｒｔｏｎ  ＪＡ，Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ  ＪＡ，Ｐｏｎｏｍａｒｅｎｋｏ  Ｊ，Ｃｌａｒｋ  ＪＤ，Ｃａｎｔｒｅｌｌ  ＪＲ，Ｗｈｅｅｌｅｒ  ＤＫ，Ｇａｂｂａｒｄ  ＪＬ，Ｈｉｘ  Ｄ，Ｓｅｔｔｅ  Ａ，Ｐｅｔｅｒｓ  Ｂ．Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＥＤＢ）３．０．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｊａｎ  ２８（４３），Ｄ４０５−１２，２０１５；ＩＥＤＢ  ＭＨＣ−ＩＩ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）。
【０５９２】
ソフトウェアのアウトプットは、１５−ｍｅｒによる結果を用意する。コンセンサススコア及びパーセンタイルランク付けが、１５−ｍｅｒとＨＬＡタイプのそれぞれの組み合わせに提供される。しかし、それぞれの１５−ｍｅｒのコンセンサスが誘導される個別のスコアは、１５−ｍｅｒに見出されるある特定の９−ｍｅｒのランク付けであり、コンセンサスに使用されるそれぞれの方法は、１５−ｍｅｒ内の９−ｍｅｒのパーセンタイルランクを報告し、全体的な１５−ｍｅｒの値として取られるコンセンサスは、中央値スコアを有する９−ｍｅｒの推定である。本発明者たちは、９−ｍｅｒが、（ａ）１５−ｍｅｒを代表するコンセンサスとして選択される場合、及び（ｂ）考慮されるＨＬＡタイプにおいて上位１０％の結合剤のパーセンタイルランク付けを有する場合、並びに判定基準（ａ）及び（ｂ）が、同じ９−ｍｅｒの３個以上の独特のＨＬＡタイプに発生する場合（即ち、３個の観察）、９−ｍｅｒをエピトープと分類する。考慮されるＨＬＡタイプは、ＤＲＢ１＊０１、１＊０３、１＊０４、１＊０７、１＊０８、１＊１１、１＊１３、及び１＊１５であり、これらは、標準的なＩＳＰＲＩ／ＥｐｉＭａｔｒｉｘレポートにおいて同じＨＬＡタイプである。このように、この方法の主なアウトプットは、１５−ｍｅｒのランク付けであるが、本発明たちは、方法１のとの比較の容易さのため、推定９−ｍｅｒエピトープのリストを得るようにデータを解釈し直す。
【０５９３】
本発明たちは、それぞれのエピトープを生殖系列又は非生殖系列のエピトープに分類した。抗体では、それぞれのエピトープを抗体内の位置（ＣＤＲ又は非ＣＤＲ）に基づいてさらに分類した。ＩＭＧＴ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）から得たヒトＶドメインの配列を選別して、偽遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と注釈した生殖系列を除去した。残りの配列に見出される任意の推定９−ｍｅｒエピトープは、生殖系列エピトープとみなされた。Ｊ若しくはＣ領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む）、又はこれらに領域間の接合部に見出されるエピトープも、生殖系列エピトープと分類した。そうでなければ、エピトープは非生殖系列エピトープと分類される。ＣＤＲ定義は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに基づき（Ｋａｂａｔ  ＥＡ，Ｗｕ  ＴＴ，Ｐｅｒｒｙ  ＨＭ，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  ＫＳ，Ｆｏｅｌｌｅｒ  Ｃ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，１９９１）、ここでＣＤＲは、以下の残基：ＶＨ  ＣＤＲ１（Ｈ３５ＡからＨ３６まで等であるが、Ｈ３６を含めない挿入を含むＨ２６〜Ｈ３５）、ＶＨ  ＣＤＲ２（Ｈ５０〜Ｈ６５（Ｈ６５を含める））、ＶＨ  ＣＤＲ３（Ｈ９５〜Ｈ１０２（Ｈ１０２を含める）、ＶＬ  ＣＤＲ１（Ｌ２４〜Ｌ３４（Ｌ３４を含める））、ＶＬ  ＣＤＲ２（Ｌ５４〜Ｌ５６（Ｌ５６を含める））、ＶＬ  ＣＤＲ３（Ｌ８９〜Ｌ９７（Ｌ９７を含める））を含むことが定義される。推定９−ｍｅｒエピトープは、そのアミノ酸のいずれか１個がＣＤＲ領域の一部である場合、ＣＤＲエピトープである。ＶＨ  ＣＤＲ１のために本発明者たちが選択した出発位置（Ｈ２６）は、Ｋａｂａｔ注釈を使用する他の一部の文献と異なる。
【０５９４】
個別の鎖又は抗体のＶＨ及びＶＬドメインの対形成では、全体的なスコアは、それぞれ個別の構成要素９−ｍｅｒを合計することにより、以下のように算出され得る。９−ｍｅｒとＨＬＡタイプ（「観察」）の個別の組み合わせが、９−ｍｅｒがエピトープであるかに関わらず、全て検査される。特定の観察が、ペプチドが所定のＨＬＡタイプの上位５％の結合剤であることを示す場合、この観察のＥｐｉＭａｔｒｉｘ  Ｚスコアを、タンパク質配列全体に関連する積算合計（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｔｏｔａｌ）に加える。検査した観察の総数も記録する。唯一の例外は、ＩＳＰＲＩにより「Ｔ−レジトープ（ｒｅｇｉｔｏｐｅ）」と同定された９−ｍｅｒの全ての観察が、ＥｐｉＭａｔｒｉｘのゼロスコアを有すると想定されるものである。積算合計では、ベースラインスコアの０．０５＊２．２２４８を、それぞれの観察（Ｔ−レジトープを含む）から差し引く。最終スコアを以下のように計算する。
【０５９５】
Ｔ−レジトープ調整スコア＝（積算合計）＊１０００／（観察の数）
低スコアは、低い推定免疫原性の可能性を示す。
スコアは、ＩＳＰＲＩ／ＥｐｉＭａｔｒｉｘによる推定のみを含み、ＩＥＤＢによる情報を含まない。したがって、ＩＳＰＲＩではなく、ＩＥＤＢにより推定される任意の強力なＨＬＡ結合剤は、スコアに寄与しない。理論としては、ＥｐｉＭａｔｒｉｘも同じ配列を結合剤の可能性があると推定しない場合、配列は多くのＩＥＤＢ推定ＨＬＡ結合剤を含有し、依然として好ましいＴ−レジトープ調整スコアを有することができる。
【０５９６】
非最適化及び最適化ＧＵＣＹ２ｃ  ＶＨ及びＶＬ領域と、生殖系列との整列。太字の残基は、上記のコンピューター方法を使用して決定された、Ｔ細胞エピトープホットスポットを表す。ある特定の態様において、置換は、ＣＤＲ残基が対応するヒト生殖系列残基に置き換えられて、抗体のヒトアミノ酸含有量を増加し、可能な免疫原性を低減する、ヒト生殖系列の置換である（以前に記載される）。他の態様において、置換は、抗体の免疫原性の可能性を低減し、且つ抗体の結合特性を破壊しない別のアミノ酸である。
【０５９７】
例えば、ヒト生殖系列ＶＨ３−７フレームワークが例示的な抗体ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１と共に使用される場合、ＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１（配列番号２８１）及びヒト生殖系列ＶＨ３−７（配列番号１７３）のＶＨ  ＣＤＲ２は、下記の表２９の通りである（Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用する）。
【０５９８】
【表３３】
2021525080.tif 000052
【０５９９】
位置５１、５２、５９及び６４では、ヒト生殖系列残基及び対応するＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１残基は同じであり、生殖系列の置換は可能ではない。位置５０、５２Ａ、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６１、６２、６３及び６５（太字）では、ヒト生殖系列残基及び対応するＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１残基は異なっている。コンピューターＴ細胞エピトープ評価がＧＵＣＹ２Ｃ−０２４１配列に実施される場合、可能なペプチド配列が同定される（下線付き）。次いで、これらを、両方ともＴ細胞エピトープスコアの＞１０を有する非ヒト生殖系列含有量及び残基についてさらに分析し、非ヒト生殖系列であると、変異誘発の標的になる（上記に太字及び下線付きで示す）ソフトランダム化変異誘発（ｓｏｆｔ  ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（以前に米国特許第９，８８４，９２１号に記載された方法）を使用して、これらの残基を変異させ、保持された結合活性及び保持された安定性について試験した。
【０６００】
実施例１６：最適化ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体のＴ細胞媒介細胞死滅活性
最適化ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体を、以前に記載されたように、腫瘍細胞のＴ細胞媒介細胞障害性について評価した。最適化ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、Ｔ８４腫瘍細胞に対する、Ｔ細胞の改善された効率的なＴ細胞媒介死滅を実証した。ヒト化ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体（Ｅ：Ｔ比＝５：１）を用いた細胞死滅アッセイの結果を、表３０及び図４Ａ〜４Ｄに示す。
【０６０１】
【表３４】
2021525080.tif 000053
【０６０２】
実施例１７：示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析
タンパク質を、４００μｌの体積で０．６ｍｇ／ｍｌまでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で希釈した。ＰＢＳを、参照細胞におけるバッファーブランクとして使用した。ＰＢＳは、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、及び１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４を含んだ（ｐＨ７．２）。試料を、オートサンプラを備えたＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）の試料トレイに分注した。試料を、１０℃で５分にわたり平衡化し、次いで、１時間当たり１００℃の速度で１１０℃まで走査した。１６秒のフィルタリング期間を選択した。生データをベースライン補正し、タンパク質濃度を正規化した。Ｏｒｉｇｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ７．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、適切な転移数でデータをＭＮ２−Ｓｔａｔｅ  Ｍｏｄｅｌにフィットさせた。ｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットの最適化抗ＧＵＣＹ２ｃ結合ドメインの示差走査熱量測定の結果を、表３１に示す。最適化クローンは、非最適化親クローンのＧＵＣＹ２Ｃ−０２４７と比較して、改善されたアンフォールディング温度（Ｔｍ１）を示した（ここでは、ｓｃＦｖ−ＦｃフォーマットのＧＵＣＹ２Ｃ−０２９５）。
【０６０３】
【表３５】
2021525080.tif 000054
【０６０４】
実施例１８：ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
ヒトＧＵＣＹ２ｃ（配列番号２２４）、ｃｙｎｏＧＵＣＹ２ｃ（配列番号２３６）及びネズミＧＵＣＹ２Ｃ（配列番号２４０）へのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を回収速度の１０Ｈｚにより２５℃及び３７℃で使用して決定した。ヒトＧＵＣＹ２ｃ、ｃｙｎｏＧＵＣＹ２ｃ及びマウスＧＵＣＹ２ｃを、アミンカップリングキット（ＢＲ１０００５０，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造会社のプロトコルに従って使用して、ＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ（ＢＲ１００５３０，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の表面の３個の異なるフローセルに直接固定化した。ヒト、ｃｙｎｏ及びマウスＧＵＣＹ２ｃの最終固定化レベルは、それぞれ、１４２共鳴単位（ＲＵ）、６１ＲＵ及び２０１ＲＵであった。フローセル１を参照フローセルとして使用した。４５０ｎＭ〜５．５６ｎＭの範囲の濃度のＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の連続三倍希釈を、センサーの表面に５０μｌ／分の流速で５２秒間注入した。解離を４００秒にわたってモニターし、表面を１０ｍＭのグリセリン、ｐＨ２．１で再生した。処理（ｒｕｎｎｉｎｇ）及び試料バッファーは、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＰ−２０（ＨＢＳ−ＥＰ＋）であった。データを二重に参照した。結合親和性及び速度定数は、得られたセンサーグラムデータを、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により１：１ラングミュアモデルに当てはめることによって決定した。ヒトＣＤ３（配列番号２４２）及びｃｙｎｏＣＤ３（配列番号２４４）へのＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を回収速度の１０Ｈｚにより２５℃及び３７℃で使用して決定した。ヒトＣＤ３及びｃｙｎｏＣＤ３を、製造会社のプロトコルに従ってＨｉｓ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（２８９９５０５６，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ（ＢＲ１０００５０，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）表面の３個の異なるフローセルで捕捉した。ヒトＣＤ３（配列番号２４２）の捕捉レベルは、フローセル２及び３ではそれぞれ８共鳴単位（ＲＵ）及び１６ＲＵであり、１０ＲＵのｃｙｎｏＣＤ３がフローセル４に捕捉された。フローセル１を参照として使用した。１００ｎＭ〜３．７ｎＭの範囲の濃度のＧＵＣＹ２ｃ二重特異性タンパク質の連続三倍希釈を、センサーの表面に５０μｌ／分の流速で５５秒間注入した。解離を３００秒にわたってモニターし、表面を１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５で再生した。処理及び試料バッファーは、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＰ−２０（ＨＢＳ−ＥＰ＋）であった。データを二重に参照した。結合親和性及び速度定数は、得られたセンサーグラムデータを、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により１：１ラングミュアモデルに当てはめることによって決定した。アッセイ配置及び温度を含む異なる条件下でのヒト、ｃｙｎｏ及びマウスＧＵＣＹ２ｃへのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合分析の結果を、表３２Ａ〜３２Ｊに示す。ヒト化及び最適化ＧＵＣＹ２Ｃ結合ドメインは、二重特異性抗体としてＧＵＣＹ２Ｃ及びＣＤ３への保持又は改善された結合を示す。一部の場合において、上昇した温度（３７℃）では、結合親和性の減少が観察された。
【０６０５】
表３２Ａは、ヒトＧＵＣＹ２ｃへのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合力学を示す。使用した捕捉方法は、２５℃での抗ヒトＩｇＧ捕捉であった。
【０６０６】
【表３６】
2021525080.tif 000055
【０６０７】
表３２Ｂは、ヒトＧＵＣＹ２ｃへのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合力学を示す。使用した捕捉方法は、２５℃での直接固定化であった。
【０６０８】
【表３７】
2021525080.tif 000056
【０６０９】
表３２Ｃは、ヒトＧＵＣＹ２ｃへのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合力学を示す。使用した捕捉方法は、３７℃での直接固定化であった。
【０６１０】
【表３８】
2021525080.tif 000057
【０６１１】
表３２Ｄは、ｃｙｎｏＧＵＣＹ２ｃへのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合力学を示す。使用した捕捉方法は、２５℃での抗ヒトＩｇＧ捕捉であった。
【０６１２】
【表３９】
2021525080.tif 000058
【０６１３】
表３２Ｅは、ｃｙｎｏＧＵＣＹ２ｃへのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合力学を示す。使用した捕捉方法は、２５℃での直接固定化であった。
【０６１４】
【表４０】
2021525080.tif 000059
【０６１５】
表３２Ｆは、ｃｙｎｏＧＵＣＹ２ｃへのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合力学を示す。使用した捕捉方法は、３７℃での直接固定化であった。
【０６１６】
【表４１】
2021525080.tif 000060
【０６１７】
表３２Ｈは、ネズミＧＵＣＹ２ｃへのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合力学を示す。使用した捕捉方法は、２５℃での抗ヒトＩｇＧ捕捉であった。
【０６１８】
【表４２】
2021525080.tif 000061
【０６１９】
表３２Ｉは、ネズミＧＵＣＹ２ｃへのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合力学を示す。使用した捕捉方法は、２５℃での直接固定化であった。
【０６２０】
【表４３】
2021525080.tif 000062
【０６２１】
表３２Ｊは、ネズミＧＵＣＹ２ｃへのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合力学を示す。使用した捕捉方法は、３７℃での直接固定化であった。
【０６２２】
【表４４】
2021525080.tif 000063
【０６２３】
表３３Ａ〜３３Ｆは、アッセイ配置及び温度を含む異なる条件下でのヒト及びｃｙｎｏＣＤ３へのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合分析を示す。
【０６２４】
表３３Ａは、ヒトＣＤ３タンパク質へのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合力学を示す。使用した捕捉方法は、２５℃での抗ヒトＩｇＧ捕捉であった。
【０６２５】
【表４５】
2021525080.tif 000064
【０６２６】
表３３Ｂは、ヒトＣＤ３へのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合力学を示す。使用した捕捉方法は、２５℃での抗Ｈｉｓであった。
【０６２７】
【表４６】
2021525080.tif 000065
【０６２８】
表３３Ｃは、ヒトＣＤ３へのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合力学を示す。使用した捕捉方法は、２５℃での抗Ｈｉｓであった。
【０６２９】
【表４７】
2021525080.tif 000066
【０６３０】
表３３Ｄは、ｃｙｎｏＣＤ３へのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合力学を示す。使用した捕捉方法は、２５℃での抗Ｈｉｓであった。
【０６３１】
【表４８】
2021525080.tif 000067
【０６３２】
表３３Ｅは、ｃｙｎｏＣＤ３へのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合力学を示す。使用した捕捉方法は、２５℃での抗Ｈｉｓであった。
【０６３３】
【表４９】
2021525080.tif 000068
【０６３４】
表３３Ｆは、ｃｙｎｏＣＤ３へのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の結合力学を示す。使用した捕捉方法は、２５℃での抗Ｈｉｓであった。
【０６３５】
【表５０】
2021525080.tif 000069
【０６３６】
実施例１９：ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体のインビトロサイトカイン放出測定
Ｔ８４細胞をＴ細胞（５：１のＥ：Ｔ比）及びＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８により異なる用量で処理した。上清を様々な時点（２４時間、４８時間、９６時間）で採取し、製造業者のガイドラインに従って多重Ｌｕｍｎｉｎｅｘアッセイを使用して分析し、ｘＰＯＮＥＮＴソフトウェアを備えたＬｕｍｉｎｅｘ  ２００で読み取った。測定したサイトカインは、ヒトＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＴＮＦ−アルファであった。図５Ａ〜５Ｆは、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８のサイトカイン放出プロファイルを例示する。これらのサイトカインは、Ｔ細胞の存在下でＴ８４細胞のＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８処理により上方制御され、ＧＵＣＹ２ｃ発現細胞におけるＴ細胞媒介ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体活性の機構を支持している。
【０６３７】
実施例２０：ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体媒介活性のインビボ評価
ヒトＰＢＭＣを、培地（Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（Ｌｏｎｚａ）、５％ヒト血清アルブミン（Ｇｅｍｉｎｉ  ＃１００−３１８）、１％Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ、０．０１ｍＭの２−メルカプトエタノール）に、１ｍｌ当たりおよそ５百万個の細胞で解凍した。細胞を遠心沈殿し（ｓｐｕｎ  ｄｏｗｎ）、Ｒｏｂｏｓｅｐバッファー（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１ｍｌ当たり５千万個の細胞の濃度で再懸濁した。Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞豊富化キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離した。Ｔ細胞を、ヒトＴ細胞活性化／拡大キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、活性化及び拡大した。２日目に、Ｔ細胞を、拡大のためにＧ−Ｒｅｘ細胞培養デバイスに移しＩＬ−２（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を培地に加え、２日後に補充した。Ｔ細胞を、活性化／拡大の１週間後に採取した。採取時に、ビーズを磁石により取り出し、細胞をインビボ接種のためにＤＰＢＳに１×１０７細胞／ｍＬで再懸濁した。
【０６３８】
異種移植片研究では、ＮＳＧマウスに、結腸直腸腫瘍細胞株（Ｔ８４、Ｈ５５、ＬＳ１０３４）又は患者由来異種移植（ＰＤＸ−ＣＲＸ−１１２０１、ＰＤＸ−ＣＲＸ−１２２１３、ＰＤＸ−ＣＲＸ−２４２２５）フラグメントのいずれかを側腹部の皮下に接種した。
【０６３９】
腫瘍測定を、デジタルＶｅｒｎｉｅｒカリパスを使用して収集し、量は、改変楕円式（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄ  ｆｏｒｍｕｌａ）の１／２×長さ×幅２を使用して算出した。マウスを無作為化し、腫瘍サイズの１５０〜２００ｍｍ３で段階分けした。ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性剤、陰性対照二重特異性剤又はビヒクルの初期用量を０日目に動物の投与し、２百万個の培養Ｔ細胞を翌日に接種した。マウスには、０．２ｍＬのボーラス注射を毎週、５回まで投薬し、全ての化合物及びＴ細胞投与は、各動物の尾の側面静脈を介した静脈内によるものであった。腫瘍測定値は、移植片対宿主反応の兆候を連続的にモニタリングしながら、１週間に２回収集した（図６〜１５）。全てのＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、細胞株移植片及び患者由来移植片モデルの両方に用量依存性Ｔ細胞媒介抗腫瘍活性を示した。
【０６４０】
実施例２１：可能性なＧＵＣＹ２ｃ経路調節活性についてＧＵＣＹ２ｃ−ＣＤ３二重特異性剤を特徴づける環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）アッセイ
ＧＵＣＹ２ｃ経路刺激に反応したＴ８４細胞による環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）産生を試験するため、２×１０６個のＴ８４細胞を２４ウェルプレートに一晩平板培養した。細胞を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＤＭＥＭで洗浄し、５０ＭのＨＥＰＥＳ呼び１ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含有するＤＭＥＭで１５分間処理した。次いで細胞を、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８又は陰性対照二重特異性剤のいずれかにより、０．１〜９９μＭの範囲の濃度で処理した。陽性対照として、ＧＵＣＹ２ｃアゴニストのエンテロトキシンＳＴｐ（ＢＡＣＨＥＭ）（０．０２〜１５μＭ）を４５分間加えた。粒子を遠心分離により除去し、２００μｌの上清を、ｃＧＭＰ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造会社のガイドラインに従って使用するｃＧＭＰ産生のアッセイに使用した。ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８の可能な中和活性を評価するため、０．２μＭのＳＴｐを同じ範囲の上記記載のＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８又は陰性対照二重特異性剤に４５分間加え、上清をｃＧＭＰレベルで同時に分析した。
【０６４１】
ＧＵＣＹ２ｃ経路活性を、ｃＧＭＰ産生を測定することにより、Ｔ８４細胞で評価した。ＧＵＣＹ２ｃ経路のアゴニスト細菌エンテロトキシンＳＴｐが用量依存的にｃＧＭＰを増加したが、ｃＧＭＰ産生は、増量濃度のＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８の添加によって増強されなかった。加えて、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８は、０．２μＭのＳＴｐにより誘導されたｃＧＭＰ産生に影響を与えなかった（図１６）。これらの知見は、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８がＧＵＣＹ２ｃ経路のアゴニストではないこと及びリガンドの存在下でＧＵＣＹ２ｃ経路機能を中和しないことを示している。
【０６４２】
実施例２２：ＤＮＡ及びインスリン多特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）ＥＬＩＳＡ
標的以外の分子への抗体の非特異的結合は、インビボにおける急速なクリアランスの機構であることが提案されている（Ｈｏｅｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＭＡｂｓ  ４（６）：７５３−７６０）。そのような多特異性非標的結合の証拠は、膜調製物（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌｅｃｔ．２６（１０）：６６３−７０，２０１３）、バキュロウイルス粒子（Ｈｏｅｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ４，７５３−７６０，（２０１２））、又はＤＮＡ、インスリン及びヘパリン等の陰性荷電物質（Ｔｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２９（１−２）：１１２−１２４，２００８）への結合の測定によって得ることができる。ＤＮＡ及びインスリンのＥＬＩＳＡには、ループス患者の低親和性自己抗体を検出するために元々開発された低ストリンジェンシープロトコルを使用した（Ｔｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２９，１１２，２００８；米国特許第７，３１４，６２２号）。
【０６４３】
３８４ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を、ＰＢＳ、ｐＨ７．５中のＤＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）及びインスリン（５μｇ／ｍｌ）により４℃で一晩コーティングした。Ｔｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２９，１１２，２００８；米国特許第７，３１４，６２２号に記載されたアッセイに適合させたＥＬＩＳＡを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｊａｎｕｓリキッドハンドリングロボット（ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｒｏｂｏｔ）により実施した。ウェルを水で洗浄し、室温で１時間にわたりＰｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ＥＬＩＳＡバッファー（ＰＥＢ；０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）５０μｌでブロックし、水で３回すすいだ。このウェルに、２５ｕｌで連続希釈したｍＡｂを４重で添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。プレートを水で３回洗浄し、各ウェルに、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）に共役した１０ｎｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）２５μｌを添加した。プレートを室温で１時間にわたりインキュベートし、８０μｌの水で３回洗浄し、２５μｌのＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を各ウェルに添加した。各ウェルに０．１８Ｍオルトリン酸の２５μｌを添加することにより、６分後に反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。ＤＮＡ及びインスリン結合スコアを、バッファーを含むウェルのシグナルに対する１０μｇ／ｍｌでの抗体のＥＬＩＳＡシグナルの比として算出した。表３４は、ＤＮＡ及びインスリン結合ＥＬＩＳＡを使用したＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体の多特異性分析を示す。最適化二重特性抗体は、非特異的結合について低い可能性を示す。
【０６４４】
【表５１】
2021525080.tif 000070
【０６４５】
実施例２３：親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法（ＡＣ−ＳＩＮＳ）
抗体及び抗体様タンパク質はそれ自体と、特に増加した濃度で相互作用する可能性を有する。この自己相互作用は、薬物開発の際に処方に関連して粘稠度の問題、並びにクリアランスの際にリスクの増加をもたらし得る（Ａｖｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ，２０１８，Ｖｏｌ．０，ＮＯ．０，１−１２）。親和性結合自己相互作用ナノ粒子分光法アッセイは、自己相互作用を測定し、高い粘稠度及び可能性のある不十分な薬力学的特性の予測を助けるために使用される。
【０６４６】
ＡＣ−ＳＩＮＳアッセイを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｊａｎｕｓ液体取扱ロボットで、３８４ウェル形式で標準化した。２０ｎｍの金ナノ粒子（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．，＃１５７０５）を、８０％ヤギ抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．＃１０９−００５−０９）及び２０％非特異的ヤギポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．＃００５−０００−００３）の混合物で被覆し、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．３にバッファー交換して０．４ｍｇ／ｍｌまで希釈した。室温での１時間のインキュベーション後、金ナノ粒子上の非占有部位を、チオール化ポリエチレングリコール（２ｋＤ）でブロックした。次いで、この被覆ナノ粒子を、シリンジフィルタを使用して１０倍に濃縮し、１０μｌを、ＰＢＳ  ｐＨ７．２中の０．０５ｍｇ／ｍｌでｍＡｂ  １００μｌに添加した。この被覆ナノ粒子を、９６ウェルポリプロピレンプレート中で２時間にわたり目的の抗体と共にインキュベートし、次いで３８４ウェルポリスチレンプレートに移してＴｅｃａｎ  Ｍ１０００分光光度計で読み取った。吸光度を、２ｎｍ増加で４５０〜６５０から読み取り、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌマクロを使用して、最大吸光度を特定し、データを平滑化し、二次多項式を使用してデータをフィットさせた。平均ブランク（ＰＢＳバッファーのみ）の平滑化された最大吸光度を、抗体試料の平滑化された最大吸光度から減算して、抗体ＡＣ−ＳＩＮＳスコアを決定した。表３５は、自己相互作用及び非特異性に低い可能性を示す、最適化ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体のＡＣ−ＳＮＳ非特異性アッセイを示す。
【０６４７】
【表５２】
2021525080.tif 000071
【０６４８】
実施例２４：ＧＵＣＹ２ｃ−１６０８二重特異性抗体の安定細胞株の生成、発現及び精製
ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８二重特異性抗体をコードする２個の鎖を、ＣＨＯ細胞ゲノムへの単一部位組込み（ＳＳＩ）（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ．，３１：１６４５−１６５６，２０１５）のための二重プロモーター及び組換え部位を含有する哺乳類発現ベクターｐＲＹ１９−ＧＡ−Ｑにクローンした。ＳＳＩは、高度に安定した遺伝子発現が知られている公知の染色体位置での組換えベースカセット交換を使用する、目的の遺伝子の挿入に依存している。ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８ホール及びＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８ノブ構築物を、カセット１及び２の発現ベクターにそれぞれクローンした。得られたＧＵＣＹ２ｃ−１６０８プラスミドを、目的の遺伝子を含むｐＲＹ１９ベクターによるエレクトロポレーションによりＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ  １０Ｅ９細胞にトランスフェクトし、続いて、ハイグロマイシン−Ｂ及びガンシクロビルを使用して正の及び負の選択圧をかけた。このＣＨＯプールは、３週間の回復期を経た。観測した生存率が９０％超えた場合には、将来の研究のために細胞バンクを生成した。次いで、確立されたＣＨＯプールを、１Ｌスケールで、ＣＤ−ＣＨＯ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中において１２日間のフェドバッチプラットフォーム発現プロセスに供した。１２日間の処理の終了時には、細胞を３０００×ｇで１０分間遠心分離し、続いて、０．２ｕｍＰＥＳボトルトップフィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｏｎｅｏｎｔａ，ＮＹ）を使用して条件培地を滅菌濾過した。加えて、安定ＣＨＯプールを１０Ｌの制御揺動バイオリアクター（Ｆｉｎｅｓｓｅ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で（ｓｃａｌｅｄ）調整した。ＣＨＯプールを、合成飼料（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆｅｅｄｓ）を含む１２日間給餌バッチでＰｆｉｚｅｒ所有培地に増殖させて、培養生存度を維持した。完了したとき、培養物を、５０．８ｃｍ（２０インチ）の５ｕｍ  Ｐａｌｌ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ＩＩ、続く２５．４ｃｍ（１０インチ）の０．２ｕｍ  Ｐａｌｌ  Ｓｕｐｏｒ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）から構成されるフィルタトレイン（ｔｉｌｔｅｒ  ｔｒａｉｎ）を使用してデプス濾過（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒｅｄ）した。力価を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して評価した。次いでタンパク質精製を、プロテインＡクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを含む当該技術に既知の技術を利用して実施した。安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞プールからのＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８のタンパク質発現力価を、表３６に示す。ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８クローンプールの発現力価は、０．４８〜０．８４グラム／リットルの発現レベルを示した。
【０６４９】
【表５３】
2021525080.tif 000072
【０６５０】
実施例２５：ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８二重特異性抗体の質量分析
ＬＣ／ＭＳ分析を実施して、正確に対形成されたＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８精製二重特異性抗体の生成を確認した。二重特異性分子の分子量は、特有のアミノ酸配列によって定義され、的確な分子量決定は正確に対形成されたＧＵＣＹ２Ｃ二重特異性分子の存在の証拠を提供する。簡潔には、ＣＤ３−ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性試料を、Ｂｒｕｋｅｒ  ｍａＸｉｓ  ＩＩ  Ｑ−ＴｏＦ質量分析計に結合したＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  ＨＰＬＣのＬＣ／ＭＳ分析により分析した。被分析物をＳＭＴ  ＳＡＭ  Ｃ２カラム（２．１ｍｍ×１００ｍｍ、８０℃に維持）に装填し、バッファーＢ（０．０５％のトリフルオロ酢酸を伴った、８０％の１−プロパノール、２０％のアセトニトリル）及びバッファーＣ（０．０５％のトリフルオロ酢酸を伴った、１００％のアセトニトリル）を、３００μｌ／分の流速で三次勾配（１９％Ｂ及び４％Ｃの傾斜を５分間、２２％Ｂ及び１６％Ｃの傾斜を２０分間、０％Ｂ及び９８％Ｃの傾斜を１０分間）を使用して溶出した。質量分析による検出を、キャピラリー電圧設定の３．５ｋＶによりポジティブモードで実施した。データ分析を、Ｃｏｍｐａｓｓ  ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ  ｖ４．２のＭａｘＥｎｔ  １解析により実施した。図１７は、最終精製ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８二重特異性抗体の推定分子量での純度を示す。
【０６５１】
実施例２６：配列
表３７Ａ及び３７Ｂは、本明細書に考察されている抗体又は抗体フラグメントの配列番号の要約を提供する。表３７Ａは、ＶＨ  ＣＤＲ１の配列にＡＢＭ番号付けシステムを使用する。表３７Ａは、ＶＨ  ＣＤＲ２を含む他の全ての配列にＫａｂａｔ番号付けシステムを使用する。
【０６５２】
【表５４】
2021525080.tif 000073
【０６５３】
【表５５】
2021525080.tif 000074
【０６５４】
表３８は、本明細書に参照された配列を提供する。
【０６５５】
【表５６−１】
2021525080.tif 000075
【０６５６】
【表５６−２】
2021525080.tif 000076
【０６５７】
【表５６−３】
2021525080.tif 000077
【０６５８】
【表５６−４】
2021525080.tif 000078
【０６５９】
【表５６−５】
2021525080.tif 000079
【０６６０】
【表５６−６】
2021525080.tif 000080
【０６６１】
【表５６−７】
2021525080.tif 000081
【０６６２】
【表５６−８】
2021525080.tif 000082
【０６６３】
【表５６−９】
2021525080.tif 000083
【０６６４】
【表５６−１０】
2021525080.tif 000084
【０６６５】
【表５６−１１】
2021525080.tif 000085
【０６６６】
【表５６−１２】
2021525080.tif 000086
【０６６７】
【表５６−１３】
2021525080.tif 000087
【０６６８】
【表５６−１４】
2021525080.tif 000088
【０６６９】
【表５６−１５】
2021525080.tif 000089
【０６７０】
【表５６−１６】
2021525080.tif 000090
【０６７１】
【表５６−１７】
2021525080.tif 000091
【０６７２】
【表５６−１８】
2021525080.tif 000092
【０６７３】
【表５６−１９】
2021525080.tif 000093
【０６７４】
【表５６−２０】
2021525080.tif 000094
【０６７５】
【表５６−２１】
2021525080.tif 000095
【０６７６】
【表５６−２２】
2021525080.tif 000096
【０６７７】
【表５６−２３】
2021525080.tif 000097
【０６７８】
【表５６−２４】
2021525080.tif 000098
【０６７９】
【表５６−２５】
2021525080.tif 000099
【０６８０】
【表５６−２６】
2021525080.tif 000100
【０６８１】
【表５６−２７】
2021525080.tif 000101
【０６８２】
【表５６−２８】
2021525080.tif 000102
【０６８３】
【表５６−２９】
2021525080.tif 000103
【０６８４】
【表５６−３０】
2021525080.tif 000104
【０６８５】
【表５６−３１】
2021525080.tif 000105
【０６８６】
【表５６−３２】
2021525080.tif 000106
【０６８７】
【表５６−３３】
2021525080.tif 000107
【０６８８】
【表５６−３４】
2021525080.tif 000108
【０６８９】
【表５６−３５】
2021525080.tif 000109
【０６９０】
【表５６−３６】
2021525080.tif 000110
【０６９１】
【表５６−３７】
2021525080.tif 000111
【０６９２】
【表５６−３８】
2021525080.tif 000112
【０６９３】
【表５６−３９】
2021525080.tif 000113
【０６９４】
【表５６−４０】
2021525080.tif 000114
【０６９５】
【表５６−４１】
2021525080.tif 000115
【０６９６】
【表５６−４２】
2021525080.tif 000116
【０６９７】
【表５６−４３】
2021525080.tif 000117
【０６９８】
【表５６−４４】
2021525080.tif 000118
【０６９９】
【表５６−４５】
2021525080.tif 000119
【０７００】
【表５６−４６】
2021525080.tif 000120
【０７０１】
【表５６−４７】
2021525080.tif 000121
【０７０２】
【表５６−４８】
2021525080.tif 000122
【０７０３】
【表５６−４９】
2021525080.tif 000123
【０７０４】
【表５６−５０】
2021525080.tif 000124
【０７０５】
【表５６−５１】
2021525080.tif 000125
【０７０６】
【表５６−５２】
2021525080.tif 000126
【０７０７】
【表５６−５３】
2021525080.tif 000127
【０７０８】
【表５６−５４】
2021525080.tif 000128
【０７０９】
【表５６−５５】
2021525080.tif 000129
【０７１０】
【表５６−５６】
2021525080.tif 000130
【０７１１】
【表５６−５７】
2021525080.tif 000131
【０７１２】
【表５６−５８】
2021525080.tif 000132
【０７１３】
本発明の抗体配列は、Ａｂｙｓｉｓ  ＡｂＭを使用して番号付けられている。Ａｂｙｓｉｓ  ＡｂＭ番号付けシステムは、Ｋａｂａｔ番号付けを割り当て、ＣＤＲ  Ｈ１を除いて、Ｋｏｂａｔ規則に従って各ＣＤＲの開始及び終了を決定する。ＣＤＲ  Ｈ１は、ＡｂＭ定義に従って決定される。
【０７１４】
実施例２７：３種の抗ＣＤ３バリアントが、ＧＵＣＹ２Ｃ−ＣＤ３二重特異性抗体の親和性及び細胞傷害性の改善を示す
２Ｂ５ｖ６に由来する３種の抗ＣＤ３バリアント２Ｂ５−１０３８（配列番号２７３及び２７４）、２Ｂ５−１０３９（配列番号２７３及び２７５）、並びに２Ｂ５−１０４０（配列番号２７３及び２７６）を、本明細書の上記で説明した標準的なクローニング、発現、及び精製技術を使用して、図１に示す配置の内の１つで、抗腫瘍ＧＵＣＹ２ｃ抗体配列と対を形成する二重特異性二特異性抗体−Ｆｃ分子に再設定した。表３９に示す得られた二重特異性抗体を、Ｔ細胞リターゲティングアッセイを使用してインビトロでの細胞傷害性に関して試験し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して結合親和性に関して試験し、ＡＣ−ＳＩＮにより非特異性に関して試験した。免疫原性リスクを、潜在的なＴ細胞エピトープのコンピューター予測に関してＥｐｉｖａｘ  Ｔｏｏｌにより評価した。インタクトな質量分析データは、全ての二重特異性が正しい対形成を有しており１００％ヘテロ二量体であることを示す。表３９は、３種全ての二重特異性は、（１）抗ＣＤ３  ２Ｂ５ｖ６と対形成している対照二重特異性ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８と比較した場合に、インビトロでの細胞傷害性アッセイにおいて約２倍強力であり（図１８）；（２）細胞傷害性活性と一致するＳＰＲによる組換えヒトＣＤ３への結合親和性を有しており；（３）対照を超えて改善されている免疫原性スコアを有しており；（４）ＡＣ−ＳＩＮが対照二重特異性ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８と同一に維持されていることを示す。
【０７１５】
【表５７】
2021525080.tif 000133
【０７１６】
実施例２８：抗ＧＵＣＹ２ｃ抗体結合ドメインの親和性成熟
ＧＵＣＹ２ｃへの抗ＧＵＣＹ２ｃ抗体結合ドメインの親和性を増加するため、ファージディスプレイ手法を取った。４個のファージディスプレイライブラリーを、以前に記述された方法を使用して設計及び産生した。ライブラリーを、抗ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８（配列番号２２１）のＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２及びＨ３、並びにＣＤＲ  Ｌ１への変異の導入によって生成した。ファージディスプレイを以前に記載されたようにレスキューし、表４０に概説された競合選択戦略を使用して選択した。ラウンド１では、ファージを、ビオチン化ヒトＧＵＣＹ２ｃ（５ｎＭ、配列番号２３２）と複合体形成したストレプトアビジンビーズと共にインキュベートした。３回洗浄した後、１００倍過剰非ビオチン化抗原（５００ｎＭ）を反応に添加し、混合物を４℃で一晩回転させた。翌日にビーズを洗浄して、ビーズから解離したファージを除去し、残った結合ファージを、ＴＥＡを使用して溶出した。ラウンド２では、選択を、０．５ｎＭの抗原に対して任意の競合を伴うことなく上記と同様に繰り返した。コロニーを取り出し、ペリプラズム調製物を以前に記載されたように生成した。コロニーを、以前に記載された競合ＥＬＩＳＡを使用して、改善された結合活性についてスクリーニングした。親と比較して改善された結合を示すコロニーを、さらなる分析のために選択した。スクリーニングした後、ＤＮＡ配列決定を、トップクローンに対して、以前に記載されたように実施して、改善されたＧＵＣＹ２ｃ結合活性に寄与する変異を同定した。
【０７１７】
初期親和性成熟ライブラリーを選択の後、トップヒットのＣＤＲ領域を新たなライブラリーと組み合わせ、追加のファージディスプレイ選択を表４１に概説されたように実施した。ラウンド１の選択を、０．５ｎＭビオチン化抗原を使用した以外は、上記に記載されたように初期親和性ライブラリー選択において実行した。各ライブラリーには、選択前のファージが６５℃でのインキュベーションで負荷を受けた又は受けていない、２個のラウンド２の選択ブランチがあった。ファージ選択の後、コロニーを取り出し、ペリプラズム調製物を以前に記載されたように生成した。コロニーを、以前に記載された競合ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。スクリーニングした後、ＤＮＡ配列決定をトップクローンに対して実施して、改善されたＧＵＣＹ２ｃ結合活性に寄与する変異を同定した。表４０及び４１は、親和性成熟ライブラリーに使用されるファージディスプレイ選択戦略を示す（Ｃ＝ライブラリー、Ｒ＝ラウンド、Ｄｓｌｘｎ＝非選択条件、Ｔｈｅｒｍ＝熱条件、ＳＡ＝ストレプトアビジン、Ｄ＝ＤＮＡ、Ｉ＝インスリン、Ｍ＝膜抽出物）。
【０７１８】
【表５８】
2021525080.tif 000134
【０７１９】
【表５９】
2021525080.tif 000135
【０７２０】
ペリプレップ競合ＥＬＩＳＡにより改善された親和性を示すＧＵＣＹ２ｃ抗体クローンのアミノ酸配列を、親クローンＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８（ＶＨ配列番号７３及びＶＬ配列番号１４７）と比較した。改善された安定性をもたらすＶＨ  ＣＤＲ中のアミノ酸含有量の変化を、表４２Ａに示す。位置５４、５５、５６、９７及び９９における変化は、親和性に最大の影響を有し、時間分解蛍光における最大の変化と相関すると思われる（Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従い、ＶＨ  ＣＤＲ１ではＡｂＭ定義を使用する）。
【０７２１】
【表６０】
2021525080.tif 000136
【０７２２】
ペリプレップ競合ＥＬＩＳＡにより改善された親和性をもたらすＶＬ  ＣＤＲにおけるアミノ酸含有量の変化が、表４２Ｂに示されている（Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けシステムをＶＬ  ＣＤＲ１に使用した）。ＶＬ  ＣＤＲ１の位置３０、３０ａ及び３０ｄにおける変化は、親和性に最大の影響を有し、時間分解蛍光における最大の変化と相関すると思われる。
【０７２３】
【表６１】
2021525080.tif 000137
【０７２４】
ペリプラズム調製物としてｓｃＦｖフォーマットでスクリーニングした後、トップクローンのＶＨ及びＶＬ配列を、完全ヒトＩｇＧ１／カッパフォーマットにクローンした。ＶＨ及びＶＬ遺伝子をファージベクターからＰＣＲ増幅し、以前に記載された分子生物学技術を使用して、ヒトＩｇＧ１及びヒトカッパベクターにサブクローンした。次いでヒトＩｇＧ１型のこれらのトップ親和性成熟クローンを、一時的に発現させ、同様に以前に記載された方法を使用して精製した。次いで精製されたタンパク質を、ヒトＧＵＣＹ２ｃ組換えタンパク質（配列番号２３２）に対して前記と同様に表面プラズモン共鳴により分析した。表４３は、ＩｇＧ形態の親ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８（ＧＵＣＹ２ｃ−１６４０、配列番号２１４及び２２３）と比較した親和性成熟クローンのオンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）（ｋａ）、オフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（ｋｄ）及び平衡定数（ＫＤ）を示す。いくつかのバリアントは、親抗体と比較して３．４倍まで改善された親和性を示す。表４４は、これらの親和性成熟型のＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８の完全ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を示す。
【０７２５】
【表６２】
2021525080.tif 000138
【０７２６】
【表６３−１】
2021525080.tif 000139
【０７２７】
【表６３−２】
2021525080.tif 000140
【０７２８】
実施例２９：ＧＵＣＹ２Ｃ細胞外ドメインのペプチドマッピングによるエピトープ決定
ペプチドマッピングを実施して、リードＧＵＣＹ２ｃ抗体が結合するＧＵＣＹ２ｃ細胞外ドメイン（ＥＤＣ）のエピトープを決定した。この手法では、１５ａａが重複している２０−ｍｅｒペプチドを生成し、アミノ酸１〜４４０からなるＧＵＣＹ２ｃの膜ドメインへの細胞外ドメイン全体を網羅する（表４５）。ペプチドは、凍結乾燥フォーマットのアレイ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｇａｒｄｎｅｒ  ＭＡ）として合成及び提供された。アレイをアセトニトリルにより１００μｇ／ｍｌに再構成し、次いで、炭酸／重炭酸ナトリウムバッファーで２０μ／ｍｌにさらに希釈した。次いで精製抗体又はＧＵＣＹ２ｃ−ＣＤ３二重特異性剤を、以前に考察されたＤｅｌｆｉａ  ＥＬＩＳＡ方法を使用し、希釈ペプチドを標的抗原として用いて、異なるペプチドに対する結合についてＤｅｌｆｉａ  ＥＬＩＳＡにより試験した。ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８は、時間分解蛍光（ＴＲＦ）により測定すると、ペプチド１９及び２０（配列番号３３４及び３３５）に強い結合を示した。全てのペプチドに対するＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８のＴＲＦ結合データを表４５に示す。配列ＮＳＧＤＣＲＳＳＴＣＥＧＬＤＬＬＲＫＩＳＮＡＱＲＭ（配列番号４０５）が、これらのペプチドによってスパンされる。ペプチドのうちで重複している領域はＲＳＳＴＣＥＧＬＤＬＬＲＫＩＳ（配列番号４０６）であり、領域内のエピトープを示している。
【０７２９】
【表６４−１】
2021525080.tif 000141
【０７３０】
【表６４−２】
2021525080.tif 000142
【０７３１】
【表６４−３】
2021525080.tif 000143
【０７３２】
次いでＧＵＣＹ２ｃペプチド１９（配列番号３３４）を、以前に記載された方法を使用して競合ＤＥＬＦＩＡ  ＥＬＩＳＡにより完全細胞外ドメインと競合させ、完全細胞外ドメインと有効に競合することを示した（図１９）。このことは、ペプチド１９（配列番号３３４）が、ＧＵＣＹ２Ｃ１−６０８が完全ＧＵＣＹ２ｃ細胞外ドメインに結合する特異的エピトープを含むことを示唆している。
【０７３３】
ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８は抗体ＭＳ２０と異なるＧＵＣＹ２ｃ  ＥＣＤエピトープに結合する
ＧＵＣＹ２ｃ細胞外ドメインに結合するＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８を、また公知の抗ＧＵＣＹ２ｃ抗体と比較した。米国特許出願第２０１３／３１５９２３号に開示された抗体ＭＳ２０は、報告されているペプチドを有さなかった。この抗体をＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８と比較するため、以前に記載されたＤｅｌｆｉａ競合ＥＬＩＳＡの改変方法を使用して、競合Ｄｅｌｆｉａ  ＥＬＩＳＡを実施した。ここでは、ヒトＧＵＣＹ２ｃタンパク質（配列番号２３２）を前記と同様にプレートにコーティングした。ＧＵＣＹ２Ｃ−１６４０（ＩｇＧ型のＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８、配列番号２１４及び２２３）又はＭＳ２０抗体を、２０μｇ／ｍｌから出発して連続希釈し、次いでウサギキメラＩｇＧ型のＧＵＣＹ２Ｃ−００９８（配列番号４４０及び４４１、ウサギ定常ドメインに縮合した配列番号２６及び１０６から構成される）と２５０ｎｇ／ｍｌで組み合わせた（ＥＣ５０値を別個に決定した）。プレートを前記のように洗浄し、１：１０００に希釈した二次抗ウサギユーロピウム抗体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を検出のために添加した。ＴＲＦシグナルを前記のように検出した。ＴＲＦシグナルの減少は、ウサギキメラ型のＧＵＣＹ２Ｃ−００９８がヒトＧＵＣＹ２ｃへの結合によって置き換えられるので、競合結合を示している。予想されたように、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６４０は、ウサギキメラ型のＧＵＣＹ２Ｃ−００９８を置き換え、一方で、ＭＳ２０は置き換えない（図２０）。したがって、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８はＭＳ２０抗体と異なるＧＵＣＹ２ｃ  ＥＣＤエピトープに結合する。
【０７３４】
実施例３０：ＧＵＣＹ２ｃ−１６０８は抗体５Ｆ９と異なるＧＵＣＹ２ｃ  ＥＣＤエピトープに結合する
米国特許出願第２０１１／０１１０９３６号に記載された抗体は、本明細書下記に記載されているように、ペプチド１９（配列番号３３４）のＧＵＣＹ２ｃ  ＥＣＤの異なるエピトープ配列に結合すると報告された。
【０７３５】
ヒト、ラット及びニワトリＧＵＣＹ２ｃ（それぞれ、ＣＩＤ１８１４、１８１５及び１８１８）を発現する３×１０ｅ６細胞、点変異体ＣＩＤ１９４１−１９５０、「パッチ（ｐａｔｃｈ）」変異体ＣＩＤ１８６８−１８７３（ニワトリＧＵＣＹ２ｃの同等の位置のアミノ酸残基により置き換えられている２〜５個のヒトＧＵＣＹ２ｃアミノ酸残基からなるパッチ変異体）、又はヒトニワトリＧＵＣＹ２ｃキメラＣＩＤ１８７４−１８８１（ニワトリＧＵＣＹ２ｃ残基により置換されている＞５個のヒトＧＵＣＹ２ｃアミノ酸）、又は確証的逆キメラＣＩＤ１９３９及び１９４０（ヒトＧＵＣＹ２ｃ残基により置換されている＞５個のニワトリＧＵＣＹ２ｃアミノ酸）、又は陰性対照ＣＩＤ１４３１（ＧＵＣＹ２配列を含まないが、酵母菌表面に発現された他の構築物と同じエピトープタグを有する陰性対照構築物）を、９６ウェルプレートのウェル毎に添加した。細胞を、抗Ｖ５（Ａｂｃａｍ  ２７６７１）抗体、一価若しくは二価抗ＧＵＣＹ２ｃ抗体、抗体ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８、又は抗体５Ｆ９抗体（米国特許出願第２０１１／０１１０９３６号に記載されているＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ抗体）と共に、室温で１時間にわたってインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡバッファーで３回洗浄した。次いで細胞を、ＰＥ共役抗マウスＩｇＧ、又はＰＥ共役抗ヒトＩｇＧ、又はＰＥ共役抗ＨＡ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  １３０−０９２−２５７）と共に、暗所において４℃で３０分間にわたってインキュベートした。細胞をＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡバッファーで３回洗浄し、次いでフローサイトメーターで分析した。
【０７３６】
細胞に結合する抗ＧＵＣＹ２ｃ抗体のＭＦＩ（蛍光強度中央値（ｍｅｄｉａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ））を、抗タグ抗体のＭＦＩで測定した細胞表面の発現に正規化した。全ての細胞が、発現正規化によって細胞表面にＶ５及びＨＡを発現した。表４６は、各ＧＵＣＹ２ｃ構築物への抗ＧＵＣＹ２ｃ抗体の正規化相対結合を示す。抗ＧＵＣＹ２ｃ  Ａｂに結合しないキメラ（ＣＩＤ１９３９及びＣＩＤ１９４０を除く）、点変異体及びパッチ変異体は、これらの構築物において変化したＧＵＣＹ２ｃ残基が抗体への結合のために重要であることを示している。逆キメラＣＩＤ１９３９及びＣＩＤ１９４０への、抗体５Ｆ９ではなくＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８の結合の回復は、抗体ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８がＧＵＣＹ２ｃ（配列番号２２４）の残基６８〜８７に結合することを確認し、抗体５Ｆ９の結合部位が抗体ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８の結合部位と重複しないことを示す。
【０７３７】
【表６５−１】
2021525080.tif 000144
【０７３８】
【表６５−２】
2021525080.tif 000145
【０７３９】
実施例３１：抗ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８ｓｃＦｖ＋ＧＵＣＹ２ｃペプチド複合体の結晶化及び構造決定
結晶化の試験では、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８ｓｃＦｖ（配列番号４０９）及びＧＵＣＹ２ｃ−ＥＣＤペプチド番号１９  ６８ＮＳＧＤＣＲＳＳＴＣＥＧＬＤＬＬＲＫＩＳ８７（配列番号３３４）の複合体を１：１．２モル比で形成し、ＴＢＳを含有するタンパク質溶液によりｐＨ７．５で８．８ｍｇ／ｍｌに濃縮した。結晶は、２０％のＰＥＧ３３５０、２００ｍＭの硫酸リチウム、ビス−トリス、ｐＨ５．５を含有する条件により懸滴蒸気拡散（ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ  ｖａｐｏｒ−ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）法によって得た。棒状結晶は、単斜空間群＝Ｐ２１２１２１と一致した対称を有し、細胞パラメータは、ａ＝７０．６８Å、ｂ＝８０．５７Å、ｃ＝９０．７Åであり、結晶非対称単位にＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８ｓｃＦｖペプチド複合体の２個のコピーを有する。結晶を、２０％のエチレングリコールを含有する貯蔵溶液を使用して凍結保護し、液体窒素で急速冷凍した。１．６Åの解像度に設定したデータを、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＡＰＳ）においてＩＭＣＡビームライン１７−ＩＤにより単一の冷凍結晶から収集した。データを処理し、オートＰＲＯＣを使用して基準化し、最終データセットは７１．４％の完全性であった。
【０７４０】
構造を、抗ＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性剤の構造から得た一本鎖Ｆｖフラグメントから出発して、ＰＨＡＳＥＲによる分子置き換えにより解明した（図２２）。ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８ｓｃＦｖの２個のコピーを検索することにより、解決策を得た。ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８ｓｃＦｖの２個のコピーをモデルとして用いて算出して得られた電子密度マップは、それぞれＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８ｓｃＦｖの対応するコピーに結合している２個のペプチドの余剰電子密度を明白に示した。
【０７４１】
ＣＯＯＴを使用した手動調整及びモデル再構築、並びにオートＢＵＳＴＥＲを使用した結晶精密化のいくつかの反復ラウンドは、結晶Ｒｗｏｒｋの１９．７％及びＲｆｒｅｅの２１．７％を有するＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８ｓｃＦｖ＋ペプチドの最終モデルを生じ、ここで、Ｒｗｏｒｋ＝｜｜Ｆｏｂｓ｜−｜Ｆｃａｌｃ｜｜／｜Ｆｏｂｓ｜であり、ＲｆｒｅｅはＲｗｏｒｋと同等であるが、精密化過程で省かれたものを反映する無作為に選択された５％が算定されている。
【０７４２】
Ａ．ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８ｓｃＦｖペプチド構造の説明
１７残基長のＧＵＣＹ２ｃペプチドは、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８ｓｃＦｖのＣＤＲ領域への結合に際してαヘリックス立体配置にほぼ適合している（図２１）。αヘリックスは、ペプチドのＮ末端にＳＳ結合で束縛されているジスルフィドである。相互作用下にある全結合界面面積は約１，３２０Å２であり、これは、わずか１７アミノ酸残基長のフラグメントにとって驚くほど大きなものである。結合界面は主に疎水性であり、いくつかの特定の有極接点を中央に有し、水素結合接点をその周辺に有する（図２１）。
【０７４３】
ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８ｓｃＦｖと３．８Å範囲内にある結合エピトープ接点は、ペプチド配列：６８ＮＳＧＤＣＲＳＳＴＣＥＧＬＤＬＬＲＫＩＳ８７の下線付き残基により定義され、表４７に列挙されている。結合界面の＞７５％の表面積を占めるアミノ酸は、太字で強調されている。ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８ｓｃＦｖの結合パラトープは、５個のＣＤＲ領域：ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１及びＣＤＲ−Ｌ３により画定されている。３．８Å範囲内の接点に関与しているＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８ｓｃＦｖ（パラトープ）及びＧＵＣＹ２ｃペプチド（エピトープ）のアミノ酸が、表４８に列挙されている。
【０７４４】
【表６６】
2021525080.tif 000146
【０７４５】
【表６７】
2021525080.tif 000147
【０７４６】
Ｂ．抗ＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性剤の結晶化及び構造決定
結晶化試験では、修飾型のＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８を、各ＶＬ−ＶＨサブユニット鎖のＣ末端でＨｉｓ６タグ又はＦＬＡＧタグのいずれかを用いて生成して、精製を助けた。結晶学のためにＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性抗体を、ＧＵＣＹ２Ｃ−１６３７  ＶＨ（配列番号４０７）及びＧＵＣＹ２Ｃ−１６３７  ＶＬ（配列番号４０８）の配列を使用して生成した。構築物を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３ＨＥＫ細胞に上記に記載されたように一時的にトランスフェクトした。条件培地を採取した後、ＴＢＳで予備平衡した２．５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ樹脂を、オービタルミキサーによりタンパク質に４℃で１時間にわたってバッチ結合させた。次いで、樹脂を収集し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカラム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）に入れた。先ず樹脂をバッファーＡ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８．０）でベースラインに洗浄し、次いで、２０ｍＭのイミダゾールを補充したバッファーＡの５ＣＶで洗浄し、最後にバッファーＡ＋２５０ｍＭのイミダゾールで溶出した。最高純度のフラクションをプールし、１０ｋＤのＭＷＣＯを有する３０ｍｌのカセットを４℃で２時間にわたり使用して、ＰＢＳに透析した。次いで、透析タンパク質を抗ＦＬＡＧクロマトグラフィーによりさらに精製した。４０ｍＬの抗ＦＬＡＧ  Ｍ２樹脂（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）をＴＢＳで予備平衡し、１．４Ｌ条件培地に４℃で一晩バッチ結合させた。次いで、樹脂を収集し、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２クロマトグラフィーのためにカラムに充填し、ＴＢＳ（２０ＣＶ）でベースラインに洗浄し、最初に０．１ＭのＦＬＡＧペプチドバッファーで溶出し、最後に０．１Ｍのグリシン、ｐＨ３．０で溶出した。溶出されたタンパク質を、１０％の１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で直ぐに中和した。次いで、最高純度のフラクションをプールし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製し、ＴＢＳに保存した。
【０７４７】
結晶化試験では、精製Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ型のＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８を、ＴＢＳを含有するｐＨ７．５のタンパク質溶液で１２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。結晶は、１Ｍのマロン酸ナトリウム、ｐＨ６、２％エチレンイミンポリマーを含有する条件により懸滴蒸気拡散法によって得た。結晶は、六方空間群＝Ｐ３２２１と一致した対称を有し、細胞パラメータは、ａ＝ｂ＝１１９．５５Å及びｃ＝１２１．８５Åであり、結晶非対称単位に二特異性抗体の１個のコピーを有する。結晶を、２．８Ｍのマロン酸ナトリウム、ｐＨ６を含有する貯蔵溶液を使用して凍結保護し、液体窒素で急速冷凍した。２．０３Åの解像度に設定したデータを、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＡＰＳ）においてＩＭＣＡビームライン１７−ＩＤにより単一の冷凍結晶から収集した。データを処理し、オートＰＲＯＣを使用して基準化し、最終データセットは４９．３％の完全性であった。
【０７４８】
構造を、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＰＤＢエントリ１ｍｏｅから調製した一本鎖Ｆｖフラグメントモデルから出発して、ＰＨＡＳＥＲによる分子置き換えにより解明した。解決策は、二特異性抗体分子の４個のサブユニットをそれぞれ別々に検索することによって得た。ＣＯＯＴを使用した手動調整及びモデル再構築、並びにオートＢＵＳＴＥＲを使用した結晶精密化のいくつかの反復ラウンドは、結晶Ｒｗｏｒｋの１９．１％及びＲｆｒｅｅの２０．８％を有する二特異性抗体の最終モデルを生じ、ここで、Ｒｗｏｒｋ＝｜｜Ｆｏｂｓ｜−｜Ｆｃａｌｃ｜｜／｜Ｆｏｂｓ｜であり、ＲｆｒｅｅはＲｗｏｒｋと同等であるが、精密化過程で省かれたものを反映する無作為に選択された５％が算定されている。
【０７４９】
Ｃ．抗ＧＵＣＹ２Ｃ−ＣＤ３二特異性抗体構造の説明
ＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性抗体の２個の抗原結合部位は、約７０Åで隔てられ、分子の反対側に互いに真向かいに配置されている（図２２）。抗ＣＤ３  ＣＤＲ及び抗ＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤＲ領域は、両方ともサブユニット界面から離れて位置している。
【０７５０】
実施例３２：抗ＶＥＧＦ−Ａ  ｍＡＢ及びアキシチニブと組み合わせたＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性剤のインビボ評価
ヒトＰＢＭＣを、培地（Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（Ｌｏｎｚａ）、５％ヒト血清アルブミン（Ｇｅｍｉｎｉ  ＃１００−３１８）、１％Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ、０．０１ｍＭの２−メルカプトエタノール）に、１ｍｌ当たりおよそ５百万個の細胞で解凍した。細胞を遠心沈殿し、Ｒｏｂｏｓｅｐバッファー（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１ｍｌ当たり５千万個の細胞の濃度で再懸濁した。Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞豊富化キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離した。Ｔ細胞を、ヒトＴ細胞活性化／拡大キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、活性化及び拡大した。２日目に、Ｔ細胞を、拡大のためにＧ−Ｒｅｘ細胞培養デバイスに移し、ＩＬ−２（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を培地に加え、２日後に補充した。Ｔ細胞を、活性化／拡大の１週間後に採取した。採取時に、ビーズを磁石により取り出し、細胞をインビボ接種のためにＤＰＢＳに１×１０７細胞／ｍＬで再懸濁した。
【０７５１】
ＮＳＧマウスに、結腸直腸親由来異種移植片ＰＤＸ−ＣＲＸ−１１２０１フラグメントを側腹部の皮下に接種した。腫瘍測定値を、デジタルＶｅｒｎｉｅｒカリパスを使用して収集し、量は、改変楕円式の１／２×長さ×幅２を使用して算出した。マウスを無作為化し、腫瘍サイズの１５０〜２００ｍｍ３で段階分けした。ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性剤（ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８）、陰性対照二重特異性剤又はビヒクルの初期用量を０日目に動物の投与し、２百万個の培養Ｔ細胞を翌日に接種した。マウスには、０．２ｍＬのボーラス注射を毎週、３回まで投薬し、全ての化合物及びＴ細胞投与は、各動物の尾静脈を介した静脈内によるものであった。組み合わせた薬剤を０日目から出発して投与した。抗ＶＥＧＦ−ｍＡｂ（Ｇ６−３１）を３日毎に４回まで、尾静脈を介して静脈内投与した。アキシチニブを１日２回、１４日間まで胃管栄養法により投与した。腫瘍測定値は、移植片対宿主反応の兆候を連続的にモニタリングしながら、１週間に２回収集した。
【０７５２】
０．０５ｍｇ／ｋｇで投与されたＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性剤は、ＰＤＸ−１１２０１養子移入モデルで部分的な抗腫瘍反応を有した。抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ及びアキシチニブも、それぞれ単独で５ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇにより投与したとき、このモデルにおいて部分的な抗腫瘍反応を有した。ＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性剤と、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ又はアキシチニブのいずれかとの組み合わせは、完全な腫瘍阻害を示す追加的な抗腫瘍反応を生じた。
【０７５３】
ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８は、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂとの組み合わせにより、またアキシチニブとの組み合わせでも、養子Ｔ細胞移入を有するＰＤＸ−ＣＲＸ−１１２０１結腸直腸癌患者由来異種移植片モデルにおいて、増強された腫瘍増殖阻害を示す。
【０７５４】
実施例３３：抗ＰＤ１と組み合わせたＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性剤のインビボ評価
ヒトＰＢＭＣを、培地（Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（Ｌｏｎｚａ）、５％ヒト血清アルブミン（Ｇｅｍｉｎｉ  ＃１００−３１８）、１％Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ、０．０１ｍＭの２−メルカプトエタノール）に、１ｍｌ当たりおよそ５百万個の細胞で解凍した。細胞を遠心沈殿し、Ｒｏｂｏｓｅｐバッファー（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１ｍｌ当たり５千万個の細胞の濃度で再懸濁した。Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞豊富化キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離した。Ｔ細胞を、ヒトＴ細胞活性化／拡大キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、活性化及び拡大した。２日目に、Ｔ細胞を、拡大のためにＧ−Ｒｅｘ細胞培養デバイスに移し、ＩＬ−２（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を培地に加え、２日後に補充した。Ｔ細胞を、活性化／拡大の１週間後に採取した。採取時に、ビーズを磁石により取り出し、細胞をインビボ接種のためにＤＰＢＳに１×１０７細胞／ｍＬで再懸濁した。
【０７５５】
ＮＳＧマウスに、結腸直腸がん細胞株ＬＳ１０３４細胞を側腹部の皮下に接種した。腫瘍測定値を、デジタルＶｅｒｎｉｅｒカリパスを使用して収集し、量は、改変楕円式の１／２×長さ×幅２を使用して算出した。マウスを無作為化し、腫瘍サイズの１５０〜２００ｍｍ３で段階分けした。ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性剤（ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８）の０．０３ｍｇ／ｋｇ、陰性対照二重特異性剤の０．１ｍｇ／ｋｇ、抗ＰＤ１（ペムブロリズマブバイオシミラー（ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ）Ｄ２６５Ａ  ｈｌｇＧ１ａ  Ｆｃエフェクター機能変異体）の５ｍｇ／ｋｇ又はビヒクルの初期用量を０日目に動物に投与し、２百万個の培養Ｔ細胞を翌日に接種した。マウスには、０．２ｍＬのボーラス注射を毎週、３回まで投薬し、全ての化合物及びＴ細胞投与は、各動物の尾の側面静脈を介した静脈内によるものであった。腫瘍測定値は、移植片対宿主反応の兆候を連続的にモニタリングしながら、１週間に２回収集した。
【０７５６】
０．０３ｍｇ／ｋｇで投与されたＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性剤は、ＬＳ１０３４養子移入モデルで部分的な抗腫瘍反応を有した。抗ＰＤ−１は、１０ｍｇ／ｋｇで投与されたとき、このモデルにおいて抗腫瘍反応を有さなかった。ＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性剤と抗ＰＤ−１の組み合わせは、追加的な抗腫瘍反応を生じた（図２４）。
【０７５７】
ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８は、抗ＰＤ１  ｍＡｂとの組み合わせにより、養子Ｔ細胞移入を有するＬＳ１０３４結腸直腸癌細胞株由来異種移植片モデルにおいて、増強された腫瘍増殖阻害を示す。
【０７５８】
実施例３４：抗ＰＤＬ１と組み合わせたＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性剤のインビボ評価
ヒトＰＢＭＣを、培地（Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（Ｌｏｎｚａ）、５％ヒト血清アルブミン（Ｇｅｍｉｎｉ  ＃１００−３１８）、１％Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ、０．０１ｍＭの２−メルカプトエタノール）に、１ｍｌ当たりおよそ５百万個の細胞で解凍した。細胞を遠心沈殿し、Ｒｏｂｏｓｅｐバッファー（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１ｍｌ当たり５千万個の細胞の濃度で再懸濁した。Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞豊富化キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離した。Ｔ細胞を、ヒトＴ細胞活性化／拡大キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、活性化及び拡大した。２日目に、Ｔ細胞を、拡大のためにＧ−Ｒｅｘ細胞培養デバイスに移し、ＩＬ−２（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を培地に加え、２日後に補充した。Ｔ細胞を、活性化／拡大の１週間後に採取した。採取時に、ビーズを磁石により取り出し、細胞をインビボ接種のためにＤＰＢＳに１×１０７細胞／ｍＬで再懸濁した。
【０７５９】
ＮＳＧマウスに、結腸直腸がん細胞株ＬＳ１０３４細胞を側腹部の皮下に接種した。腫瘍測定を、デジタルＶｅｒｎｉｅｒカリパスを使用して収集し、量は、改変楕円式の１／２×長さ×幅２を使用して算出した。マウスを無作為化し、腫瘍サイズの１５０〜２００ｍｍ３で段階分けした。ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性剤（ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８）の０．０３ｍｇ／ｋｇ又は陰性対照二重特異性剤の０．１ｍｇ／ｋｇ又はビヒクルの初期用量を０日目に動物の投与し、２百万個の培養Ｔ細胞を翌日に接種した。マウスには、０．２ｍＬのボーラス注射を毎週、３回まで投薬し、全ての化合物及びＴ細胞投与は、各動物の尾の側面静脈を介した静脈内によるものであった。抗ＰＤＬ−１を、０日目から出発して、３日毎に６回まで静脈内投与した。腫瘍測定値は、移植片対宿主反応の兆候を連続的にモニタリングしながら、１週間に２回収集した。
【０７６０】
０．０３ｍｇ／ｋｇで投与されたＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性剤は、ＬＳ１０３４養子移入モデルで部分的な抗腫瘍反応を有した。抗ＰＤ−Ｌ１は、１０ｍｇ／ｋｇで投与されたとき、このモデルにおいて抗腫瘍反応を有さなかった。ＧＵＣＹ２ｃ  ＣＤ３二重特異性剤と抗ＰＤ−Ｌ１の組み合わせは、追加的な抗腫瘍反応を生じた（図２５）。
【０７６１】
ＧＵＣＹ２Ｃ−１６０８は、抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂとの組み合わせにより、養子Ｔ細胞移入を有するＬＳ１０３４結腸直腸癌細胞株由来異種移植片モデルにおいて、増強された腫瘍増殖阻害を示す。
【０７６２】
実施例３５：進行性胃腸腫瘍を有する患者におけるＧＵＣＹ２ｃ−１６０８二重特異性抗体の安全性、耐容性、薬物動態、薬力学及び抗腫瘍活性を評価する第１相用量増大及び拡大研究
この実施例は、ＧＵＣＹ２ｃ−１６０８二重特異性抗体の第１相、非盲検、多施設、多用量、安全性、ＰＫ及びＰＤ研究を記載する。この研究は、単剤としての用量増加及び組み合わせ（抗ＰＤ−１又は抗ＶＥＧＦのいずれか）における用量知見（それぞれ、パート１Ａ及び１Ｂ）、続いて用量拡大（パート２）の２つのパートを含む。臨床利益を提供することが知られているレジメンの候補ではない結腸直腸、胃及び食道腺癌を含む進行性／転移性胃腸腫瘍を有する患者の連続コホートは、研究のパート１Ａにおいて増大量のＧＵＣＹ２ｃ−１６０８二重特異性抗体を受ける。パート１Ｂでは、ＧＵＣＹ２ｃ−１６０８二重特異性抗体の組み合わせ（抗ＰＤ−１又は抗ＶＥＧＦのいずれか）による用量知見評価を、進行性／転移性結腸直腸、胃及び食道腺癌を有する患者において行う。パート２（用量拡大相）は、以前に処置された結腸直腸腺癌を有する患者における単剤療法又は組み合わせ（抗ＰＤ−１又は抗ＶＥＧＦのいずれか）のいずれかとしてパート１（用量増大相）から選択された、推奨第２相用量（ＲＰ２Ｄ）を評価する。これらの患者において一対の腫瘍生検材料を必要とするバイオマーカーコホートは、最大耐容用量（ＭＴＤ）が近づいている、又はＲＰ２Ｄ／ＭＴＤにあり、パート２の用量拡大群のサブセット内にあるときに、パート１Ａ及び１Ｂに発生し得る。
【０７６３】
ＧＵＣＹ２ｃ−１６０８の増大用量は、２１日サイクルにより毎週皮下（ＳＣ）注射で投与される。提案される出発ＳＣ用量は０．６μｇ／ｋｇである。
ＧＵＣＹ２ｃ−１６０８  ＲＰ２Ｄ／ＭＴＤを単剤療法として決定すると、パート１Ｂ用量コホートは、組み合わせ（抗ＰＤ−１又は抗ＶＥＧＦのいずれか）によるこの用量レベルの安全性、耐容性及び予備抗腫瘍活性についての探求を開始する。用量拡大相（パート２）は、進行性／転移性結腸直腸腺癌を有する患者において、単剤療法による及び組み合わせ薬剤（抗ＰＤ−１又は抗ＶＥＧＦのいずれか）を伴うＧＵＣＹ２ｃ−１６０８のＲＰ２Ｄを評価する。
【０７６４】
また、新たな用量レベルに登録した初期患者（即ち、初期用量制限毒性（ＤＬＴ）評価に寄与する患者）のそれぞれに投与した最初の用量から、最低７２時間の間隔を置く。全ての患者を、入院患者として、パート１の第１サイクルの１日目（Ｃ１Ｄ１）の最初のＳＣ用量から少なくとも４８時間以上にわたって観察する。
【０７６５】
ＧＵＣＹ２ｃ−１６０８による処置は、研究者及びメディカルモニター（ｍｅｄｉｃａｌ  ｍｏｎｉｔｏｒ）が、個人のベネフィット／リスク評価に基づいて疾患進行を超えた処置に同意しない限り、疾患の進行、患者の拒否又は耐容不能な毒性のうちのいずれか早いほうが発生するまで続行される。
【０７６６】
ＩＶ用量投与による代替的投薬レジメン
ＳＣ投与を有する用量増大コホートの利用可能な新たに明らかになりつつある臨床データ（安全性／耐容性、ＰＫ、ＰＤ他を含む）に基づいて、静脈内（ＩＶ）投与を評価すことができる。
【０７６７】
後に続くより高いレベルの用量投与を可能にする初期刺激用量の評価を、この研究において開始することができる。
用量増大の基準
投与コホートでは、初期用量レベルを表４９に提示し、中間用量を臨床知見に基づいて評価することができる。ＳＣ投与コホートでは、初期用量増大の際に、最大用量増加は、２５０％までであるが、ＤＬＴを観察した後では１００％以下に調整される。
【０７６８】
【表６８】
2021525080.tif 000148
【０７６９】
用量増大は、停止基準が当業者による決定に合致したときに停止する。
研究のパート１ＡはＳＣ用量レジメンのＭＴＤを決定することが目的であるが、投薬レジメンがＩＶに変更される場合、ＭＴＤは、ＩＶ用量投与について決定される。用量初期刺激の導入がＩＶに必要である場合、ＭＴＤは初期刺激用量レジメンを伴うＩＶについて決定される。
【０７７０】
パート１Ｂは、組み合わせ薬剤（抗ＰＤ−１又は抗ＶＥＧＦのいずれか）を伴うＧＵＣＹ２ｃ−１６０８のＭＴＤを決定することが目的である。
ＲＰ２Ｄは、第１相研究の結果に基づいてさらなる研究にために選択される用量である。
【０７７１】
患者の選択
用量増大（パート１Ａ及び１Ｂ）：標準療法に抵抗性のある又は標準療法が利用可能ではない進行性／転移性結腸直腸、胃又は食道腺癌の組織学的又は細胞学的診断。
【０７７２】
用量拡大（パート２）：標準療法に抵抗性のある又は標準療法が利用可能ではない、ＲＥＣＩＳＴバージョン１．１により定義された、以前に照射されていない少なくとも１個の測定可能な病変を有する以前に処置された結腸直腸腺癌の組織学的又は細胞学的診断。
【０７７３】
サイトカイン放出症候群の管理
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の管理及び改定ＣＲＳグレード付けシステムは、Ｄ．Ｗ．Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｂｌｏｏｄ  １２４（２０１４）１８８−１９５を適合させている。
【０７７４】
抗ＩＬ６の投与：１時間にわたる４ｍｇ／ｋｇが考慮され、２４〜４８時間以内に臨床的改善がなければ、第２の用量が投与される。
本明細書に引用される全ての特許、特許出願及び出版物の開示は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０７７５】
均等物
本発明は特定の態様を参照しながら開示されているが、本発明の他の態様及び変形が、本発明の真の精神及び範囲を逸脱することなく当業者により考案され得ることが明白である。本発明の主題は、本明細書に開示されている様々な要素、特徴、機能及び／又は特性の組み合わせ及び副組み合わせが含まれる、これら他の態様及び変形を全て含む。以下の特許請求の範囲は、新規及び非自明と考慮されるある特定の組み合わせ及び副組み合わせを特に指摘する。特徴、機能、要素及び／又は特性の他の組み合わせ及び副組み合わせに具体化されている発明は、本出願、本出願の優先権を主張する出願、又は関連する出願において主張され得る。そのような主張は、異なる発明又は同じ発明に向けられていても、元の主張と比較して広い、狭い、同等の、又は異なる範囲であっても、本開示の発明の主題の範囲内に含まれると考慮される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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