(57)【要約】  本発明は、皮膚障壁機能異常の改善用化粧料組成物、皮膚障壁機能異常の予防又は治療用薬学的組成物、皮膚障壁機能異常の予防又は改善用医薬部外品組成物、皮膚障壁機能異常の改善方法、及び皮膚障壁機能異常の予防又は治療方法に関する。  本発明によれば、ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル又はベタインは、ｍＴＯＲ経路とは独立して、角質形成細胞においてオートファジー活性を促進し、表皮のターンオーバーを促進することにより、表皮の厚さを増加させ、障壁機能を改善することができ、老化による表皮層の劣化を防止することができる。
2021519769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシ桂皮酸（hydroxycinnamic acid）、酢酸イソアミル（isoamyl acetate）及びベタイン（betaine）からなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその許容される塩を有効成分として含む、皮膚障壁機能異常の改善用化粧料組成物。
【請求項２】
前記皮膚障壁機能異常は、皮膚表皮層の劣化、皮膚炎症及び皮膚乾燥症からなる群から選択される少なくともいずれか１つである、請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項３】
前記ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル又はベタインは、前記化粧料組成物の総重量に対して０．０００１重量％〜１０重量％の量で含まれるものである、請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項４】
前記組成物は、溶液、外用軟膏、クリーム、フォーム、栄養化粧水、柔軟化粧水、パック、柔軟水、メイクアップベース、エッセンス、液体洗浄料、入浴剤、サンスクリーンクリーム、サンオイル、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、パッチ及びスプレーからなる群から選択される剤形を有する、請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項５】
前記皮膚障壁機能異常の改善は、角質形成細胞のオートファジーを促進することにより行われるものである、請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項６】
前記オートファジーは、ｍＴＯＲ（mammalin target of rapamycin）経路とは独立していることを特徴とする、請求項５に記載の化粧料組成物。
【請求項７】
前記化粧料組成物は、ＬＣ３（light Chain 3）の量を増加させることを特徴とする、請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項８】
前記皮膚障壁機能異常の改善は、皮膚の表皮層の厚さを増加させることにより行われるものである、請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項９】
ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、皮膚障壁機能異常の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項１０】
前記ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル又はベタインは、前記薬学的組成物の総重量に対して０．０００１重量％〜１０重量％の量で含まれるものである、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、皮膚障壁機能異常の予防又は改善用医薬部外品組成物。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の化粧料組成物を個体の皮膚に塗布するステップを含む、皮膚障壁機能異常の改善方法。
【請求項１３】
請求項９又は１０に記載の薬学的組成物を、ヒトを除く個体に投与するか、ヒトを除く個体の皮膚に塗布するステップを含む、皮膚障壁機能異常の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚障壁機能異常の改善用化粧料組成物、皮膚障壁機能異常の予防又は治療用薬学的組成物、皮膚障壁機能異常の予防又は改善用医薬部外品組成物、皮膚障壁機能異常の改善方法、及び皮膚障壁機能異常の予防又は治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮（epidermis）は、外部の環境に常に接する組織であり、主に外部の物理的損傷及び化学物質から人体を保護し、細菌、カビ、ウイルスなどの皮膚への侵入や水分の損失を防止する保護障壁の役割を果たす。表皮は、基底層、有棘層、顆粒層、及び最外層である角質層からなり、角質層は順次剥がれ落ちるが、基底膜に位置する角質形成細胞が非対称に分裂して表皮の外側に分化することにより、表皮の構造的、機能的恒常性が維持される。近年、環境汚染などの理由により強い紫外線に晒される機会が増加しているだけでなく、微細塵などによる炎症反応、障壁機能の劣化、及びそれによる皮膚の水分損失が増加するにつれて、皮膚の老化が加速化しており、皮膚損傷に関する疾病の発生率が増加する傾向にある（特許文献１）。
【０００３】
オートファジー（autophagy）は、細胞内にストレス要因が過度に発生したり、細胞内のエネルギー源が枯渇したときに、老朽又は損傷した細胞内物質及び器官を分解することにより損傷物質を除去し、エネルギーを再生産する機序であり、多くの上皮組織だけでなく、表皮においてもオートファジーの活性が観察される。様々な報告によれば、オートファジーは、表皮層の恒常性を維持し、好適な皮膚障壁機能を発揮するために必須の作用であり、特に表皮層のウイルス感染、紫外線による炎症反応、メラノソーム（melanosome）伝達及び角質形成細胞の分化に重要な役割を果たし、角質形成細胞が角質層に最終分化する際にミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、核などを除去するのに決定的な役割を果たす。近年、様々な研究において、老化が進むほど、又は老化を加速化させるほど、細胞内のオートファジー活性が急激に減少することが報告されており、オートファジーを抑制すると、細胞内に老化したミトコンドリアや構造が変化したタンパク質などが過度に蓄積され、細胞内のフリーラジカル及び酸化ストレスが増加し、最終的にはアポトーシスが増加し、老化が促進されることになる。
【０００４】
ＬＣ３（Light Chain 3）は、オートファジーの際にその量が増加するタンパク質であり、それらはオートファジー中に転写後修飾の過程を経る。ｐｒｏ−ＬＣ３として翻訳されると、ａｔｇ４（autophagy-related protein 4）によりＣ末端の２２番目のアミノ酸が切断されて細胞質形態のＬＣ３−Ｉが生成され、オートファジー中にＬＣ３−Ｉがａｔｇ３及びａｔｇ７の関与するユビキチン様システムでｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＰＥ）により脂質化（lipidation）されてＬＣ３−ＩＩに変換されることにより、ＬＣ３がオートファゴソームに結合される。
【０００５】
ｍＴＯＲ（mammalian target of rapamycin）は、ｓｅｒ／ｔｈｒ ｋｉｎａｓｅによりＡＴＰ及びアミノ酸の変化に反応し、栄養分の利用可能性と細胞成長のバランスを取る役割を果たすことが知られている。十分な栄養分が供給される環境において、ｍＴＯＲは、ｃｌａｓｓ Ｉ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路を介してリン酸化され、その後ｐ７０Ｓ６ ｋｉｎａｓｅにより陽性シグナルを伝達し、ｅＩＦ４Ｅ阻害剤である４Ｅ−ＢＰ１の不活性化に関与することにより、特定ｍＲＮＡ群の翻訳を引き起こすと共にオートファジーを抑制する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２０１５−００４３０２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明においては、老化又は外部刺激により減少するオートファジーを活性化させて表皮分化を促進し、障壁機能を改善するために、天然物由来の単一化合物ライブラリーから角質形成細胞のオートファジー活性を促進する化合物を探索し、ヒドロキシ桂皮酸（hydroxycinnamic acid）、酢酸イソアミル（isoamyl acetate）、ベタイン（betaine）を見出した。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験に基づいて、３Ｄ人工皮膚モデル（skin model）においてオートファジー活性を促進し、表皮層の厚さを増加させる効能を確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ヒドロキシ桂皮酸（hydroxycinnamic acid）、酢酸イソアミル（isoamyl acetate）及びベタイン（betaine）からなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその許容される塩を有効成分として含む、皮膚障壁機能異常の改善用化粧料組成物を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、皮膚障壁機能異常の予防又は治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本発明は、ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、皮膚障壁機能異常の予防又は改善用医薬部外品組成物を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに、本発明は、前記化粧料組成物を個体の皮膚に塗布するステップを含む、皮膚障壁機能異常の改善方法を提供することを目的とする。
【００１２】
さらに、本発明は、前記薬学的組成物を、ヒトを除く個体に投与するか、ヒトを除く個体の皮膚に塗布するステップを含む、皮膚障壁機能異常の予防又は治療方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル又はベタインは、ｍＴＯＲ経路とは独立して、角質形成細胞においてオートファジー活性を促進し、表皮のターンオーバーを促進することにより、表皮の厚さを増加させ、障壁機能を改善することができ、老化による表皮層の劣化を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】角質形成細胞内のオートファジーの活性化素材をスクリーニングした結果を示す図である。具体的には、図１のＡは、様々な天然物由来の単一化合物ライブラリーにおいて細胞質内のＧＦＰ−ＬＣ３の点（puncta）状の小胞体が増加した細胞数を比較した結果を示す図である。図１のＢは、ＧＦＰ−ＬＣ３ベクターが導入されたＨａＣａＴ細胞を無処理（ＮＴ）で、又はヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミルもしくはベタインで処理して蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図２】ベタインの細胞毒性及び角質形成細胞内のオートファジーを促進させるか否かを確認した結果を示す図である。具体的には、図２のＡは、各濃度のベタイン処理による細胞毒性を確認した結果を示す図であり、図２のＢ、Ｃは、各濃度、各時間のベタイン処理によるＬＣ３−ＩＩの増加を示す図である。
【図３】ベタインによるオートファゴソームの増加機序を確認した実験結果を示す図である。
【図４】ｍＴＯＲ経路とは独立したオートファジー活性化機序を確認した実験結果を示す図である。
【図５ａ】３Ｄ人工皮膚モデルにおける表皮内の分化促進効果を確認した結果を示す図である。具体的には、３Ｄ人工皮膚モデルにおいて、クリーム剤形の各濃度のベタイン処理によりオートファジーが促進されるか否かを確認した結果を示す図である。
【図５ｂ】３Ｄ人工皮膚モデルにおける表皮内の分化促進効果を確認した結果を示す図である。具体的には、３Ｄ人工皮膚モデルにおいて、クリーム剤形の各濃度のヒドロキシ桂皮酸処理によりオートファジーが促進されるか否かを確認した結果を示す図である。
【図５ｃ】３Ｄ人工皮膚モデルにおける表皮内の分化促進効果を確認した結果を示す図である。具体的には、３Ｄ人工皮膚モデルにおいて、クリーム剤形の各濃度の酢酸イソアミル処理によりオートファジーが促進されるか否かを確認した結果を示す図である。
【図５ｄ】３Ｄ人工皮膚モデルにおいて表皮の厚さを増加させるか否かを確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、これらを具体的に説明する。なお、本発明で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。
【００１６】
前記目的を達成するための本発明の一態様は、ヒドロキシ桂皮酸（hydroxycinnamic acid）、酢酸イソアミル（isoamyl acetate）及びベタイン（betaine）からなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその許容される塩を有効成分として含む、皮膚障壁機能異常の改善用化粧料組成物を提供する。前記化粧料組成物は、ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択されるものの２つ以上の組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
前記化粧料組成物に含まれるヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその許容される塩は、角質形成細胞においてオートファジー活性を促進し、表皮のターンオーバーを促進することにより、表皮の厚さを増加させ、障壁機能を改善することができ、老化による表皮層の劣化を防止することができる。
【００１８】
本発明の一実験例においては、ＧＦＰ−ＬＣ３ベクターが導入されたＨａＣａＴ細胞を、オートファジーを促進するものと予想される候補化合物で処理し、その後各細胞においてＧＦＰ−ＬＣ３の点（puncta）状の小胞体が増加した細胞数を比較した。その結果、ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル、ベタインで処理すると、ＧＦＰ−ＬＣ３の点状の小胞体が増加した細胞の割合がそれぞれ２０．８％、１６．４％、２５％であり、他の化合物に比べて著しく高いことが確認された。よって、ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその許容される塩は、角質形成細胞内のオートファジーの活性化及び皮膚障壁機能の改善のための化合物の素材として活用できることが確認された。
【００１９】
本発明における「ヒドロキシ桂皮酸（hydroxycinnamic acid, Ｃ９Ｈ８Ｏ３）」は、異性体の形態によってクマル酸（coumaric acid, trans-hydroxycinnamic acid）又はクマリン酸（coumarinic acid, cis-hydroxycinnamic acid）と呼ばれ、天然のものはトランス形態のクマル酸である。前記クマル酸は、クマリン酸より安定した形態であり、無色の針状結晶を形成する。熱水とエタノールに溶解しやすく、融点は２０８℃である。
【００２０】
本発明における「酢酸イソアミル（isoamyl acetate, Ｃ７Ｈ１４Ｏ２）」は、酢酸イソペンチル（isopentyl acetate）とも呼ばれ、透明な液体状のバナナの香りのする着香料として知られている。水に溶解しにくく、アルコール及び有機溶媒に溶解し、比重は０．８６８〜０．８７８であり、沸点は１４２℃である。
【００２１】
本発明における「ベタイン（betaine）」とは、化学式Ｃ５Ｈ１１ＮＯ２のトリメチルグリシン（trimethylglycine, TMG）を意味し、生体内のミトコンドリアにおいてコリンの非可逆的な酸化過程で合成される。グリシンの窒素原子に結合されたメチル基を転移させることによりメチオニンを合成するのに必須であるので、一般の食習慣では摂取量が少なくなりがちなメチオニンの補充剤として多く用いられる。また、ベタインは、目や皮膚への刺激を低減する効果があり、特殊な両性（zwitterionic）の電磁的特性を有する。
【００２２】
本発明における「皮膚」とは、動物の体表を覆う組織を意味し、顔や体などの体表を覆う組織だけでなく、頭皮や毛髪をも含む最広義の概念である。なお、本明細書における皮膚には、生体皮膚だけでなく、生体皮膚の状態を再現した人工皮膚や皮膚レプリカも含まれる。
【００２３】
本発明における「皮膚障壁機能」とは、皮膚、特に表皮の角質層が外部への水分の流出を防止したり、外部からの物質の出入りを調節するなど、外部との遮断層の役割を果たす各機能を意味するが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本発明における「皮膚障壁機能異常」とは、前記皮膚障壁機能が低下又は損傷した状態だけでなく、低下又は損傷する恐れのある状態、及びそれを予防する必要のある各状態を意味し、具体的な症状の種類や程度に制限はない。より具体的には、前記皮膚障壁機能異常には、紫外線、微細塵などの外部刺激による炎症反応、老化による表皮層の劣化などが全て含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
よって、本発明における「改善」とは、皮膚障壁機能が低下又は損傷した状態、損傷する恐れのある状態、及びそれを予防する必要のある状態から逸脱させるあらゆる行為を意味するが、これらに限定されるものではない。より具体的には、前記改善には、外部刺激又は老化により減少する表皮角質形成細胞のオートファジーを活性化することにより、表皮分化を誘導すると共に、表皮のターンオーバーを促進し、結果として表皮の障壁機能を回復させ、老化を防止する行為が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
本発明における「ターンオーバー（turn-over）」とは、真皮層で作られた新たな細胞が角質層まで押し上げられて死んだ細胞となって剥がれ落ち、再び基底層で新たな細胞が生まれる過程を意味し、部位や年齢によって異なるものの、正常な皮膚における表皮のターンオーバー期間は４週間〜６週間であるが、これらに限定されるものではない。本発明の組成物によれば、表皮角質形成細胞のオートファジーを活性化することにより、表皮のターンオーバーを促進することができ、その表皮のターンオーバー促進により皮膚障壁機能の異常を改善することができる。
【００２７】
本発明における前記「化粧料組成物」は、溶液、外用軟膏、クリーム、フォーム、栄養化粧水、柔軟化粧水、パック、柔軟水、乳液、メイクアップベース、エッセンス、液体洗浄料、入浴剤、サンスクリーンクリーム、サンオイル、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、パッチ及びスプレーからなる群から選択される剤形に製造することができるが、これらに限定されるものではない。具体的には、本発明の前記化粧料組成物は、外用軟膏、ローションなどの半固形製剤に製造することが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
また、本発明の前記化粧料組成物は、一般の皮膚化粧料に配合される化粧品学的に許容される担体を１種以上さらに含んでもよく、通常の成分として、例えば油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート剤、色素、防腐剤、香料などを適宜配合してもよいが、これらに限定されるものではない。本発明の化粧料組成物に含まれる化粧品学的に許容される担体は、剤形によって様々である。
【００２９】
本発明の剤形が軟膏、ペースト、クリーム又はゲルの場合は、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛などを用いることができるが、これらに限定されるものではない。これらは単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３０】
本発明の剤形がパウダー又はスプレーの場合は、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリアミドパウダーなどを用いることができ、特にスプレーの場合は、さらにハイドロクロロフルオロカーボン、プロパン／ブタン又はジメチルエーテルなどの推進剤を用いることができるが、これらに限定されるものではない。これらは単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３１】
本発明の剤形が溶液又は乳濁液の場合は、担体成分として、溶媒、可溶化剤、乳濁化剤などを用いることができ、例えば水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイルなどを用いることができ、特に綿実油、ピーナッツオイル、トウモロコシ胚種油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油、グリセリン脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタンの脂肪酸エステルを用いることができるが、これらに限定されるものではない。これらは単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３２】
本発明の剤形が懸濁液の場合は、担体成分として、水、エタノール、プロピレングリコールなどの液状の希釈剤や、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、ポリオキシエチレンソルビタンエステルなどの懸濁剤や、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、アガー、トラガカントなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。これらは単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３３】
本発明の剤形が石鹸の場合は、担体成分として、脂肪酸のアルカリ金属塩、脂肪酸ヘミエステル塩、脂肪酸タンパク質加水分解物、イセチオン酸塩、ラノリン誘導体、脂肪族アルコール、植物性油、グリセリン、糖などを用いることができるが、これらに限定されるものではない。これらは単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３４】
本発明の前記化粧料組成物において、前記ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその許容される塩は、前記化粧料組成物の総重量に対して、好ましくは０．０００１重量％〜１０重量％の量で含まれ、より好ましくは０．０００５重量％〜１０重量％の量で含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
前記化粧料組成物に含まれるヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその許容される塩は、表皮分化を誘導することができる。
【００３６】
前記化粧料組成物によれば、角質形成細胞のオートファジーを促進することにより表皮分化を誘導又は促進することができ、そうすることにより皮膚障壁の機能を改善することができる。
【００３７】
本発明における「表皮（epidermis）」とは、動物体の表面を覆う皮膚の上皮組織であり、外部の環境に常に接しており、主に外部の物理的損傷及び化学物質から人体を保護し、細菌、カビ、ウイルスなどの皮膚への侵入や水分の損失を防止する保護障壁の役割を果たすものを意味する。
【００３８】
本発明における「表皮分化」とは、皮膚の構造のうち最も外側に存在する表皮細胞が基底細胞、有棘細砲、顆粒細胞、角質細胞の４段階を経る過程を意味し、これは遺伝子発現の変化により様々なタンパク質が時期に応じて発現し、それに伴って各細胞周期の変化及び顕著な細胞形状の変化が生じる過程である。前記化粧料組成物によれば、表皮分化を誘導又は促進することにより、皮膚障壁機能を生成、維持したり、皮膚障壁機能異常を改善することができる。
【００３９】
前記化粧料組成物に含まれるヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその許容される塩は、角質形成細胞のオートファジーを促進することができる。
【００４０】
本発明における「角質形成細胞」とは、表皮の主要構成細胞に分裂し、その後上に移動しながら分化を起こし、最終分化過程を経て分裂及び分化により皮膚障壁を生成する役割を果たす細胞を意味する。
【００４１】
前記化粧料組成物に含まれるヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその許容される塩は、ＬＣ３の量を増加させることができる。また、前記化粧料組成物は、ＬＣ３−Ｉ又はＬＣ３−ＩＩの量を増加させることができる。
【００４２】
前記化粧料組成物に含まれるヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその許容される塩は、ｍＴＯＲ経路とは独立して、角質形成細胞においてオートファジーを促進することができる。
【００４３】
前記オートファジーの活性を促進することにより、ＬＣ３−ＩＩタンパク質の産生を増加させ、結果として皮膚障壁機能異常を改善することができ、老化による表皮層の劣化を防止することができる。
【００４４】
本発明における「オートファジー（autophagy）」は、細胞内にストレス要因が過度に発生したり、細胞内のエネルギー源が枯渇したときに、老朽又は損傷した細胞内物質及び器官を分解することにより損傷物質を除去し、エネルギーを再生産する機序であり、多くの上皮組織だけでなく、表皮においてもオートファジーの活性が観察される。オートファジーは、表皮層の恒常性を維持し、好適な皮膚障壁機能を発揮するために必須の作用であり、特に表皮層のウイルス感染、紫外線による炎症反応、メラノソーム（melanosome）伝達及び角質形成細胞の分化に重要な役割を果たし、角質形成細胞が角質層に最終分化する際にミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、核などを除去するのに決定的な役割を果たす。老化が進むほど、又は老化を加速化させるほど、細胞内のオートファジー活性が急激に減少することが報告されており、オートファジーを抑制すると、細胞内に老化したミトコンドリアや構造が変化したタンパク質などが過度に蓄積され、細胞内のフリーラジカル及び酸化ストレスが増加し、最終的にはアポトーシスが増加し、老化が促進されることになる。
【００４５】
前記オートファジーは、リソソームを介して生じるものであってもよい。
【００４６】
本発明の一具体例においては、ベタインによるオートファゴソームの合成促進がリソソームの機能的欠陥による問題でないことを確認するために、ベタインとリソソーム活性阻害剤で処理したところ、ベタインにより形成されるオートファゴソームはリソソームを介した分解過程において生じることが確認された。
【００４７】
本発明における「ＬＣ３（Light Chain 3）」、「微小管関連タンパク質（Microtubule-associated proteins）」又は「微小管関連タンパク質軽鎖３（Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B）」は、オートファジーの際にその量が増加するタンパク質であり、それらはオートファジー中に転写後修飾の過程を経る。ｐｒｏ−ＬＣ３として翻訳されると、ａｔｇ４（autophagy-related protein 4）によりＣ末端の２２番目のアミノ酸が切断されて細胞質性形態のＬＣ３−Ｉが生成され、オートファジー中にＬＣ３−Ｉがａｔｇ３及びａｔｇ７の関与するユビキチン様システムでｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＰＥ）により脂質化（lipidation）されてＬＣ３−ＩＩに変換されることにより、ＬＣ３がオートファゴソームに結合される。
【００４８】
本発明の一実験例において、ＨａＣａＴ細胞を各濃度のベタインで処理したところ、濃度が増加するにつれてＬＣ３−ＩＩの量が増加することが確認され、処理時間に依存してＬＣ３−ＩＩの量が増加し、２４時間経過後に最も多く変換されることが確認された。よって、ベタインによる角質形成細胞のオートファジーを促進し、表皮分化を誘導すると共に、表皮層のターンオーバーを促進することにより、表皮の障壁機能が改善されることが確認された。
【００４９】
本発明における「ｐ６２」又は「ｓｅｑｕｅｓｔｏｓｏｍｅ １（ＳＱＳＴＭ１）」は、オートファジーが起こることによって分解されるタンパク質であり、ユビキチン結合部位を有するのでユビキチン化されたタンパク質に結合することができ、ユビキチン化タンパク質−ｐ６２オリゴマー複合体を形成し、オートファゴソームに結合されたＬＣ３に結合するので、最終的にｐ６２を含むオートファゴソーム内のタンパク質と細胞器官がリソソーム内で分解されるようにすることができる。前記ｐ６２は、オートファジーにより分解されるタンパク質であり、本発明の一具体例においては、ベタインのオートファジーによる分解過程でリソソームにより基質分解が正常に行われていることがｐ６２（ＳＱＳＴＭ１）タンパク質の減少により確認された。
【００５０】
本発明における「ｍＴＯＲ（mammalian target of rapamycin）」は、ｓｅｒ／ｔｈｒ ｋｉｎａｓｅによりＡＴＰ及びアミノ酸の変化に反応し、栄養分の利用可能性と細胞成長のバランスを取る役割を果たすことが知られている。十分な栄養分が供給される環境において、ｍＴＯＲは、ｃｌａｓｓ Ｉ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路を介してリン酸化され、その後ｐ７０Ｓ６ ｋｉｎａｓｅにより陽性シグナルを伝達し、ｅＩＦ４Ｅ阻害剤である４Ｅ−ＢＰ１の不活性化に関与することにより、特定ｍＲＮＡ群の翻訳を引き起こすと共にオートファジーを抑制する。
【００５１】
本発明の一実験例においては、ベタインによりオートファジーが促進される機序を探索し、関連上流シグナル調節因子を解明するために、ＨａＣａＴ細胞をベタインで処理し、その後ＡＫＴ−ｍＴＯＲ−Ｓ６経路のリン酸化の程度を測定した。その結果、ＨａＣａＴ細胞においてベタイン処理によるｍＴＯＲシグナルの有意な差は認められなかったので、ベタインによる角質形成細胞内のオートファジーの促進がｍＴＯＲシグナルとは独立して起こることが確認された。
【００５２】
前記化粧料組成物に含まれるヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその許容される塩は、表皮内の組織においてオートファジーを促進することができるので、表皮の厚さを増加させ、障壁機能を改善することができ、老化による表皮層の劣化を防止することができる。前記表皮の厚さの増加は角化と混用されてもよい。
【００５３】
本発明における「角化（keratinization）」とは、表皮分化の最後のステップであり、角質層が形成されることを意味する。
【００５４】
本発明の一実験例においては、人工皮膚モデルで各濃度のヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタイン処理によるＬＣ３−ＩＩ生成の程度及び表皮の厚さが増加するか否かを確認したところ、ＬＣ３−ＩＩ生成の増加からオートファジーが増加することが確認された。また、人工皮膚組織を染色して表皮の厚さの変化を測定したところ、ベタイン１％の処理により表皮の厚さが対照群に比べて１９％増加し、ヒドロキシ桂皮酸１％の処理により４２％増加し、酢酸イソアミル１％の処理により３７％増加することが確認された。よって、ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインは、角質形成細胞のオートファジーを促進し、表皮分化を誘導すると共に、表皮層のターンオーバーを促進することにより、表皮の障壁機能を改善することが確認された（実験例５及び図５ａ、図５ｂ、図５ｃ、図５ｄ参照）。
【００５５】
前記目的を達成するための本発明の他の態様は、前記化粧料組成物を個体の皮膚に塗布するステップを含む、皮膚障壁機能異常の改善方法を提供する。前記化粧料組成物、皮膚障壁機能、皮膚障壁機能異常及び改善については前述した通りである。
【００５６】
本発明における「個体」とは、マウス、家畜、ヒトなどを含む哺乳動物をはじめとするあらゆる動物を意味するが、これらに限定されるものではない。また、本発明における「塗布」とは、任意の適切な方法で個体の皮膚に本発明の前記組成物を接触させることを意味し、そうすることにより当該組成物を皮膚の内部に吸収させることを目的とするあらゆる行為が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
前記目的を達成するための本発明のさらに他の態様は、ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、皮膚障壁機能異常の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。前記薬学的組成物は、ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択されるものの２つ以上の組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されるものではない。前記ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル、ベタイン、皮膚障壁機能及び皮膚障壁機能異常については前述した通りである。
【００５８】
本発明における「予防」とは、本発明の前記薬学的組成物を個体に投与したり、個体の皮膚に塗布することにより、皮膚障壁機能異常を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味する。
【００５９】
本発明における「治療」とは、前記薬学的組成物を個体に投与したり、個体の皮膚に塗布することにより、皮膚障壁機能異常の症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。
【００６０】
前記薬学的組成物は、皮膚障壁機能異常に該当する、紫外線、微細塵などの外部刺激による炎症反応、老化による表皮層の劣化などを治療又は予防することができる。また、前記皮膚障壁機能異常から誘発される皮膚疾患を予防又は治療することができる。
【００６１】
前記皮膚疾患は、皮膚系統に影響を及ぼす病気であり、前記皮膚系統には、人体の全表面が含まれ、皮膚、毛、手足の爪並びに関連する筋肉及び分泌腺が含まれる。
【００６２】
前記皮膚疾患の一具体例として、アトピー性皮膚炎（atopic dermatitis）、皮膚乾燥症（xeroderma）、乾癬（psoriasis）、魚鱗癬（ichthyosis）、接触性皮膚炎、扁平苔癬（lichen planus）、粃糠疹（pityriasis）、湿疹、にきびなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６３】
本発明における「薬学的組成物」は、ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含むと共に、薬学的組成物の製造に通常用いられる適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含んでもよい。
【００６４】
具体的には、前記薬学的組成物は、それぞれ通常の方法で散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エアゾール剤などの経口剤形、外用剤、滅菌注射溶液などの形態に剤形化して用いられてもよく、組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらは単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００６５】
本発明の前記薬学的組成物を製剤化する場合は、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製されてもよい。
【００６６】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれてもよく、これらの固形製剤は、少なくとも１つの賦形剤、例えばデンプン、炭酸カルシウム（calcium carbonate）、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混合して調製されてもよい。また、通常の賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤も用いられてもよい。経口投与のための液体製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられ、通常用いられる通常の希釈剤である水、流動パラフィン以外にも種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが用いられてもよい。
【００６７】
非経口投与のための製剤としては、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、外用剤などが挙げられる。前記非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが用いられる。
【００６８】
本発明の前記薬学的組成物は、外用軟膏、ローションなどの半固形製剤に製造することが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
本発明の前記薬学的組成物の薬学的有効量、有効投与量は、前記薬学的組成物の製剤化方法、投与方法、投与時間及び／又は投与経路などにより異なり、前記薬学的組成物の投与で達成しようとする反応の種類と程度、投与対象となる個体の種類、年齢、体重、一般的な健康状態、疾病の症状や程度、性別、食餌、排泄、当該個体に同時又は異時に共に用いられる薬物、その他組成物の成分などをはじめとする様々な因子及び医薬分野で周知の類似の因子に応じて異なり、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定、処方することができる。
【００７０】
本発明の前記薬学的組成物の投与は、１日１回投与してもよく、用量を数回に分けて投与してもよい。よって、前記投与量は、いかなる面においても本発明を限定するものではない。
【００７１】
本発明の前記薬学的組成物の投与経路及び投与方法は、それぞれ独立したものであってもよく、その方法が特に限定されるものではなく、目的とする当該部位に前記薬学的組成物を送達できるものであれば任意の投与経路及び投与方法を用いることができる。前記薬学的組成物は、経口投与又は非経口投与方法で投与することができるが、非経口投与方法で投与することが好ましい。
【００７２】
前記非経口投与方法としては、例えば静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経皮投与、皮下投与などを用いることができ、前記組成物を疾患部位に塗布、噴霧、吸入する方法も用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
本発明の前記薬学的組成物は、非経口投与のうち経皮投与で投与することがより好ましく、前記薬学的組成物を個体の皮膚に塗布する局所投与（topical application）方法で投与することがさらに好ましい。
【００７４】
前記目的を達成するための本発明のさらに他の態様は、前記薬学的組成物を、ヒトを除く個体に投与するか、ヒトを除く個体の皮膚に塗布するステップを含む、皮膚障壁機能異常の予防又は治療方法を提供する。前記薬学的組成物、皮膚障壁機能、皮膚障壁機能異常、予防及び治療については前述した通りである。前記個体及び塗布についても前述した通りである。
【００７５】
前記目的を達成するための本発明のさらに他の態様は、ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、皮膚障壁機能異常の予防又は改善用医薬部外品組成物を提供する。前記医薬部外品組成物は、ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択されるものの２つ以上の組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されるものではない。前記医薬部外品組成物、皮膚障壁機能、皮膚障壁機能異常、予防及び改善については前述した通りである。
【００７６】
本発明における「医薬部外品組成物」は、ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインからなる群から選択される少なくとも１つの化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含むと共に、必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含んでもよい。前記薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤は、本発明の効果を損なわない限り限定されるものではなく、例えば充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが挙げられる。
【００７７】
本発明の前記医薬部外品組成物としては、消毒清潔剤、シャワーフォーム、軟膏液、ウェットティッシュ、コーティング剤などが挙げられ、外用軟膏、ローションなどの半固形製剤に製造することが好ましいが、これらに限定されるものではない。前記医薬部外品の製剤化方法、用量、利用方法、構成成分などは技術分野で公知の通常の技術から適宜選択される。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例及び実験例を挙げて本発明の構成及び効果をより詳細に説明する。これらの実施例及び実験例はあくまで本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７９】
試薬及び機器
ベタイン（Sigma, USA）をＤＭＳＯに溶解して実験に用いた。実験に用いたリソソーム活性の選択的阻害剤ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１（ｂ１７９３）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（USA）社から購入し、一次抗体（primary antibody）ＡＫＴ（９２７２Ｓ）、ｐ−ＡＫＴ（ｓｅｒ４７３）（９２７１Ｓ）、ｐ−Ｓ６（ｓｅｒ２４０／２４４）（２２１５）、Ｓ６（２２１７）はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（USA）から、ＬＣ３Ｂ（ＮＢ１００−２２２０）はＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（USA）から、ｐ６２ ＳＱＳＴＭ１（Ｄ−３）（ｓｃ−２８３５９）、α−Ｔｕｂｕｌｉｎ（ｓｃ−８０３５）はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入して用いた。
【実施例２】
【００８０】
表皮細胞の培養
本実験に用いるヒト皮膚由来の角質形成細胞（NHEK-Neo, Neonatal Normal Human Epidermal Keratinocytes）は、Ｌｏｎｚａ（１９２９０７）（USA）から購入し、ＫＧＭ−Ｇｏｌｄ ｍｅｄｉｕｍ（Lonza, USA）に１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ５０Ｕ／ｍＬ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ５０μｇ／ｍＬを添加した培養液条件で培養した。ヒト角質形成細胞株であるＨａＣａＴ（Human keratinocyte cell line）は、１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ５０Ｕ／ｍＬ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ５０μｇ／ｍＬ及び０．０１ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＤＭＥＭ（Gibco, USA）培地において、３７℃、５％、ＣＯ２の条件で培養した。細胞が培養用フラスコの７０〜８０％まで成長したら継代培養した。
【実施例３】
【００８１】
ＧＦＰ−ＬＣ３ベクターの導入及びＬＣ３の点（puncta）の定量
ＧＦＰ（green fluorescence protein）が結合された微小管関連タンパク質１軽鎖３（ＬＣ３）発現ベクター（Cell Biolabs, USA）をＨａＣａＴ細胞に遺伝子転移試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Invitrogen, USA）により導入し、１０％ ＦＢＳを含む条件で１２時間培養し、その後培地を、天然物由来の単一化合物ライブラリーから探索された、オートファジーを促進するものと予想される各濃度の候補化合物で処理し、次いで蛍光顕微鏡（Fluorescence microscopy）（Leica Microsystems, USA）で評価した。オートファジーの誘導を定量化するために、蛍光顕微鏡を用いて、点状のオートファゴソームが形成された（punctae＝5）１００個のＧＦＰ陽性細胞をカウントした。
【実施例４】
【００８２】
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析法
ＨａＣａＴ細胞を６０ｍｍ ｐｌａｔｅに８×１０５ ｃｅｌｌｓの濃度で接種し、翌日にヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインでそれぞれ処理し、その後細胞を５Υ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに溶出させてタンパク質を得た。遠心分離してｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓを除去し、ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Pierce, USA）を用いて定量した。細胞抽出タンパク質を４〜１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌ（Bio-Rad, USA）により分離し、ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Life Technologies, New Zealand）に転移させた。３％ ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒにＭｅｍｂｒａｎｅを１時間ｂｌｏｃｋｉｎｇし、その後一次抗体を含む緩衝液に４℃で１日間反応させた。ＭｅｍｂｒａｎｅをＴＢＳＴで洗浄し、次いでｐｅｒｏｘｉｄａｓｅが結合された二次抗体と反応させ、その後ｅｎｈａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（Amersham, UK）を用いて発色させ、Ｆｕｓｉｏｎ ＦＸ ５ ｉｍａｇｅ ｓｙｓｔｅｍ（Vilber Lourmat, France）でｉｍｍｕｎｅ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｂａｎｄを確認した。
【実施例５】
【００８３】
３Ｄ人工皮膚組織の培養
Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｍｏｄｅｌ（Neoderm-E, Tego Science, Korea）を６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、２ｍＬのｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉａ（Tego Science, Korea）に２４時間安定化させ、その後各濃度のヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル又はベタインを含むクリーム剤形を人工皮膚上に塗布した。２４時間培養し、その後Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で人工皮膚上に塗布されたヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインのクリームを洗浄し、次いでｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ThermoFisher Scientific, USA）を含むＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ ＮＰ−４０）でｓｏｎｉｃａｔｉｏｎして組織を破砕した。組織抽出タンパク質をｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析することにより、組織内の角質形成細胞におけるオートファジーの活性度を分析した。人工皮膚上にヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタイン１％のクリームを塗布し、１週間後にＨ＆Ｅ染色により表皮の厚さが増加するか否かを確認した。
【実施例６】
【００８４】
統計的分析
実験結果の差における統計的有意性を独立した分散分析法により評価し、確率値を独立したＴテストにより算出した。ｐ−ｖａｌｕｅが０．０５未満であれば、統計的に有意であると判定した。
【００８５】
実験例１：角質形成細胞内のオートファジーの活性化素材のスクリーニング
老化又は外部刺激により減少するオートファジーを活性化させて表皮分化を促進し、障壁機能を改善するために、天然物由来の単一化合物ライブラリーから角質形成細胞のオートファジー活性を促進する化合物を検索した。具体的には、実施例３の方法のように、ＧＦＰ−ＬＣ３ベクターが導入されたＨａＣａＴ細胞を、オートファジーを促進するものと予想される候補化合物で処理し、その後各細胞においてオートファジーが誘導されると膜結合形態に変換されるＬＣ３にＧＦＰが結合して細胞質内のＧＦＰ−ＬＣ３の点（puncta）状の小胞体が増加した細胞数を比較した。その結果、ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル、ベタインで処理すると、ＧＦＰ−ＬＣ３の点状の小胞体が増加した細胞の割合がそれぞれ２０．８％、１６．４％、２５％になることが確認された（ベタイン処理において、ＧＦＰ−ＬＣ３の点状の小胞体が増加した細胞数が無処理群に比べて約１８．７５％増加することが確認された）。よって、ヒドロキシ桂皮酸、酢酸イソアミル及びベタインは、角質形成細胞内のオートファジーの活性化のための化合物素材として活用できることが確認された。
【００８６】
実験例２：ベタインの角質形成細胞に対する細胞毒性及び角質形成細胞内のオートファジー促進効能の確認
ベタインの角質形成細胞に対する細胞毒性の有無を確認し、実験例１の結果を確認するために、オートファゴソーム（autophagosome）の二重膜間に入って変換されたＬＣ３−ＩＩの生成の程度を実施例４のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析法で分析した。その結果、ＨａＣａＴ細胞を１０、５０、１００μｇ／ｍＬのベタインで処理した場合、どの濃度においても細胞毒性が現れなかった（図２のＡ）。次に、前記濃度のベタインで処理した場合、濃度が増加するにつれてＬＣ３−ＩＩの量が増加することが確認された（図２のＢ）。また、５０μｇ／ｍＬのベタインで処理して各時間のＬＣ３−ＩＩ変換量を観察したところ、６時間経過後までは有意な増加が確認されなかったが、１２時間経過後から増加し始め、２４時間経過後に最も多く変換されることが確認された。
【００８７】
よって、ベタインによる角質形成細胞のオートファジー促進効果がベタインの処理濃度及び時間に依存して増加するので、表皮分化を誘導すると共に、表皮層のターンオーバーを促進することにより、表皮の障壁機能が改善されることが確認された。
【００８８】
実験例３：ベタインによりオートファゴソーム合成が促進されるか否かの確認
オートファゴソームの細胞内での増加の原因は大きく２つに分けられる。すなわち、１）オートファゴソーム生成に関する様々なシグナル伝達経路の活性化により、又は２）オートファゴソームは最終的にリソソームに融合し、小胞体内のタンパク質が分解されてリサイクルされるが、リソソームの機能的欠陥による分解過程の問題により蓄積される。よって、ベタイン処理によるオートファゴソームの増加がどのような機序により生じるのかを解明するために、リソソーム活性阻害剤として知られているｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１（Ｂａｆ．Ａ１）とベタインで処理し、ＬＣ３−ＩＩの生成の程度をｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析法により確認した。その結果、ベタインの単独処理の場合より、ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１とベタインで処理した場合にＬＣ３−ＩＩの量がより増加することが観察されたので、ベタインにより形成されるオートファゴソームはリソソームを介した分解過程が正常に行われていることが確認された（図３）。また、オートファジーにより分解されることが知られているｐ６２／ＳＱＳＴＭ１（ｐ６２）タンパク質もベタイン処理により量が減少することが確認されたので、リソソームによる基質分解が正常に行われていることが確認された。
【００８９】
よって、ベタインによるオートファジーの促進は、オートファゴソームの分解の停滞ではなく、オートファゴソーム生成に関する様々なシグナル伝達経路の活性化によるものであることが確認された。
【００９０】
実験例４：ｍＴＯＲ経路とは独立したオートファジー活性化機序の確認
先行研究において、ｂｅｔａｉｎｅ−ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＢＨＭＴ）によりベタインに依存してｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅの量が減少することが報告されており、ある研究において、ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅがオートファジー抑制酵素であるｍＴＯＲＣ１の活性を促進することが報告されている。よって、ベタインによりオートファジーが促進される機序を探索するために、関連上流シグナル調節因子を解明する実験を行った。具体的には、ベタイン処理によりｍＴＯＲＣ１の活性が調節されるか否かを調べるために、ＨａＣａＴ細胞株をベタインで処理し、その後ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析法によりＡＫＴ−ｍＴＯＲ−Ｓ６経路のリン酸化の程度を確認した。
【００９１】
その結果、ＨａＣａＴ細胞においてベタイン処理によるｍＴＯＲシグナルの有意な差は認められなかったので、ベタインによる角質形成細胞内のオートファジーの促進がｍＴＯＲシグナルとは独立して起こることが確認された（図４）。
【００９２】
実験例５：３Ｄ人工皮膚モデルにおける表皮内の分化促進効果及び表皮の厚さ増加効果の確認
ベタイン、ヒドロキシ桂皮酸及び酢酸イソアミルのオートファジー促進効能により表皮内の分化が促進されるか否かを確認するために、実施例５のように、３Ｄ人工皮膚モデル（skin model）を用いた。ベタイン１％、３％、５％、ヒドロキシ桂皮酸０．１％、０．５％、１％、酢酸イソアミル０．１％、０．５％、１％をクリーム剤形に作製して角質上に塗布し、２４時間後にｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析法によりＬＣ３−ＩＩの生成の程度を測定し、表皮内のオートファジーが促進されたか否かを確認した。
【００９３】
実験の結果、ベタイン１％、ヒドロキシ桂皮酸１％、酢酸イソアミル１％の処理によりオートファジーが増加した（図５ａ、図５ｂ、図５ｃ参照）。次に、ベタイン１％、ヒドロキシ桂皮酸１％、酢酸イソアミル１％のクリームを人工皮膚に塗布し、その後人工皮膚組織をＦｏｎｔａｎａ−Ｍａｓｓｏｎ染色して表皮の厚さの変化を測定した。その結果、表１及び図５ｄから分かるように、ベタイン１％の処理により表皮の厚さが対照群に比べて１９％増加し、ヒドロキシ桂皮酸１％の処理により４２％増加し、酢酸イソアミル１％の処理により３７％増加することが確認された。
【００９４】
【表１】
2021519769.tif 000003
【００９５】
よって、ベタイン、ヒドロキシ桂皮酸及び酢酸イソアミルは、角質形成細胞のオートファジーを促進し、表皮分化を誘導すると共に、表皮層のターンオーバーを促進することにより、表皮の障壁機能を改善することが確認された。
【００９６】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【図１】
2021519769.tif 000004
【図２】
2021519769.tif 000005
【図３】
2021519769.tif 000006
【図４】
2021519769.tif 000007
【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
2021519769.tif 000011
【国際調査報告】
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