(57)【要約】本発明は、天然ムスクおよび合成ムスクを結合する嗅覚受容体としてのＯＲ５Ａ２の同定に関する。本発明は、ＯＲ５Ａ２ポリペプチドとニトロムスク、多環式ムスク、大環状ムスクおよび脂環式ムスクとの相互作用を、本発明のＯＲの活性を特異的に調節する剤のスクリーニングアッセイの基礎として使用することを包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列番号１１によって定義される膜貫通ドメイン２〜７を包含する、ＯＲ５Ａ２の中央領域を含むキメラ受容体であって、キメラ受容体は、そのＮ末端がＧタンパク質共役型受容体のＮ末端細胞外部位、膜貫通ドメイン１および細胞内ループ１に融合され；かつそのＣ末端がＧタンパク質共役型受容体の細胞内Ｃ末端エンドに融合されている、キメラ受容体。
【請求項２】
前記Ｇタンパク質共役型受容体が嗅覚受容体である、請求項１に記載のキメラ受容体。
【請求項３】
前記Ｇタンパク質共役型受容体が、配列番号１２で定義されるＯＲ２Ａ５受容体である、請求項１または２に記載のキメラ受容体。
【請求項４】
ＯＲ５Ａ２のモジュレーターを同定するための、請求項１から３までのいずれか１項に記載のキメラ受容体の使用。
【請求項５】
ＯＲ５Ａ２受容体とムスク化合物との間の結合を妨害する剤を同定するための、アミノ酸配列番号１１、または配列番号１１に対して、少なくとも９５％のアミノ酸同一性、好ましくは、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有するポリペプチド配列によって定義される膜貫通ドメイン２〜７を包含するＯＲ５Ａ２の中央領域の使用。
【請求項６】
ＯＲ５Ａ２受容体とムスク化合物との間の結合を妨害する剤を同定するための、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して、少なくとも８０％のアミノ酸同一性、好ましくは、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有するポリペプチド配列によって定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドの使用。
【請求項７】
ＯＲ５Ａ２受容体とムスク化合物との結合を妨害する、剤または１つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法であって、前記方法は以下を含む：
ａ）ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを前記剤またはサンプルと接触させる工程；
ｂ）前記剤またはサンプルの存在下で前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；および
ｃ）前記剤またはサンプルの存在下で測定された活性を、前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドが１つ以上のムスク化合物と接触する反応において測定されたＥＣ５０での活性と比較する工程であって、前記剤またはサンプルは、剤またはサンプルの存在下で測定された活性の量が、ＥＣ５０での前記ムスク化合物によって誘導された量の少なくとも１０％であるときに、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして同定される、工程。
【請求項８】
本明細書に定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤または１つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法であって、前記方法は以下を含む：
ａ）前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを、剤またはサンプルの存在下および剤およびサンプルの非存在下で、本明細書に定義される１種以上のムスク化合物と接触させる工程；および
ｂ）前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程、および
ｃ）剤およびサンプルを含まない前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドおよびムスク化合物を含む反応において測定された前記活性の量を、前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチド、ムスク化合物および前記剤またはサンプルを含む反応において測定された前記活性の量と比較する工程であって、前記剤およびサンプルの非存在下における活性に対する前記剤またはサンプルの存在下における活性の変化が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして、前記剤またはサンプルを同定する工程。
【請求項９】
前記剤およびサンプルの非存在下での活性に対する前記剤またはサンプルの存在下での活性の増加が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を増加させる剤またはサンプルとして前記剤またはサンプルを同定する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記剤およびサンプルの非存在下での活性に対する前記剤またはサンプルの存在下での活性の減少が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を減少させる剤またはサンプルとして前記剤またはサンプルを同定する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤または１つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法であって、前記方法は以下を含む：
ａ）前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを剤またはサンプルと接触させる工程；
ｂ）前記剤またはサンプルと前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドとの結合を測定する工程；および
ｃ）本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物に対する、前記剤またはサンプルとの結合を前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドとのＥＣ５０での結合と比較する工程であって、前記剤またはサンプルの結合量が、そのＥＣ５０で存在する前記ムスク化合物の結合量の少なくとも１０％であるとき、前記剤またはサンプルは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして同定される工程。
【請求項１２】
本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物と本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体との間の相互作用を調節する剤または１つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法であって、前記方法は以下を含む：
ａ）前記ムスク化合物の前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドへの結合を可能にする条件下で、剤またはサンプルの存在下および剤およびサンプルの非存在下で、前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを前記ムスク化合物と接触させる工程；および
ｂ）前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドと前記ムスク化合物の結合を測定する工程であって、剤およびサンプルの非存在下での結合に対する剤またはサンプルの存在下での結合のモジュレーションが、前記剤またはサンプルが、本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物と本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体との間の相互作用を調節する剤またはサンプルとして、前記剤またはサンプルを同定する工程。
【請求項１３】
前記剤およびサンプルの非存在下での結合に対する前記剤またはサンプルの存在下での結合の増加が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の結合を増加させる剤またはサンプルとして前記剤またはサンプルを同定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記剤およびサンプルの非存在下での結合に対する前記剤またはサンプルの存在下での結合の減少が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の結合を減少させる剤またはサンプルとして前記剤またはサンプルを同定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
１つ以上のムスク化合物が、検出可能に標識され、好ましくは、放射性同位体、蛍光体および蛍光消光剤からなる群から選択される部分で標識されている、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
接触が、前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する細胞中、または細胞上で行われる、好ましくは、前記細胞が、ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ）、サル細胞（ＣＯＳ）、一次嗅覚細胞、アフリカツメガエル細胞、昆虫細胞、酵母または細菌から選択される、請求項７〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
測定が、ラベル置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光および蛍光偏光から選択される方法を用いて行われる、請求項７〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体のシグナル伝達活性を測定する工程が、セカンドメッセンジャーのレベルの変化を検出することを含む、請求項７〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
シグナル伝達伝達活性を測定することが、蛍光または発光アッセイ、好ましくはｆｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ４もしくはＦｕｒａ−２；Ｃａ３およびＣａ６キットファミリーもしくはエクオリンを含むＣａ２＋感受性蛍光体を使用することを含む、または前記アッセイがＦＤＳＳまたはＦＬＩＰＲなどの自動化された蛍光または発光リーダーを適用する、請求項７〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
臭気活性化剤、臭気増強剤、または消臭剤を調製する方法であって、以下の工程を含む：
ａ）請求項７〜１９のいずれか１項の方法に従って候補剤を同定する工程、および
ｂ）前記剤を、臭気活性化剤、臭気増強剤または消臭剤として使用するための組成物に添加する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本技術分野は、嗅覚受容体の特性評価に関する。特に、本発明は、嗅覚受容体５サブファミリーＡメンバー２、すなわちＯＲ５Ａ２、および天然ムスクまたは合成ムスクに対応するそのリガンドの同定に関する。本発明は、この受容体（ＯＲ５Ａ２）の活性を活性化、模倣、ブロック、阻害、調節および／または増強することができる化合物を同定するために使用することができるアッセイおよびスクリーニング方法を提供する。
【０００２】
嗅覚受容体
嗅覚受容体（ＯＲ）をコードする遺伝子は、単一の生理学的機能に特化したヒト人体中の遺伝子の最大のファミリー（全ゲノムの３％）を表す。これらのＯＲはＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のスーパーファミリーに属する。ＧＰＣＲは、通常、多くの異なる細胞タイプの表面に位置する膜受容体である。これらの受容体の共通の特徴は、細胞膜内でバレルを形成する７つの膜貫通スパンと、ヘテロ三量体ＧＴＰアーゼと相互作用し、それによって活性化剤が結合してシグナルを伝達する能力にある。
【０００３】
ヒトゲノムでは、嗅覚受容体の特徴的なシグネチャを含む配列が約１，０００個見つかっている。しかし、これらの６０％は非機能性の偽遺伝子をコードしているようで、ヒトには約４００の異なる機能のＯＲタンパク質が残っている。
【０００４】
系統発生解析に基づいて、哺乳類のＯＲは２つの異なるグループ：クラスＩとクラスＩＩに分類される。クラス１のＯＲは、「魚様受容体」とも呼ばれ、魚に見られるＯＲとより密接に関連している均質なグループを形成し、したがって、脊椎動物の進化を通して維持され保存された名残を表すと推定されている。先祖代々のＯＲのこのグループの永続性は、それらが哺乳類の化学的知覚に重要な役割を果たしていることを示唆している。魚様ＯＲとは対照的に、クラス２のＯＲは四肢（tetrapode）脊椎動物で最初に出現し、現在ヒトで知られているＯＲのレパートリーの大部分を形成するまでに拡大した。クラス２のＯＲは、おそらく、空気中の臭気の検出が必要とされる陸上生物への適応を表している。哺乳類では、ＯＲの大部分はクラスＩＩに属するが、哺乳類にもクラスＩのＯＲがある。
【０００５】
臭気知覚のメカニズム
嗅覚受容体は、嗅上皮を構成する小領域の鼻腔上部に位置する特殊な嗅覚ニューロン（ＯＳＮ）で発現している。これらの細胞の一端にある糸状延長部は、その表面にＯＲを含み、臭気成分が溶解している鼻粘液中に浮遊している。反対側の端では、ＯＳＮは、嗅球（嗅覚刺激の統合に専用の脳の小さな領域）に接続するために、頭蓋の基部にある篩骨を横切ってその軸索を拡張する。嗅上皮に散在する数千万のＯＳＮの傑出した特徴は、それぞれがヒトゲノムで利用可能な約４００のＯＲ遺伝子の１つだけを発現しているということである。ＯＳＮでは、ＯＲのトリガーは、ＩＩＩ型アデニル酸シクラーゼを刺激してサイクリックＡＭＰを生成する嗅覚特異的Ｇタンパク質（Ｇａｌｐｈａ−ｏｌｆ）の活性化を促進し、これはセカンドメッセンジャーの役割を果たしている。このメッセンジャーは、ｃＡＭＰゲートされたカチオンチャネルに結合すると、細胞内へのカルシウムの進入を誘導する。カルシウムは、塩化物イオンの排出を促進する別のチャネルを開き、ニューロンの活動電位を誘発して、それぞれの脳領域へ信号を導く。各ＯＲは異なる分子と相互作用することができ、各臭気分子は１つ以上のＯＲを活性化することができる。このように、匂いの知覚は単一のＯＲの単純な活性化に依存するのではなく、複数のＯＲの複数の活性化に依存している。約４００のＯＲのプールでは、可能な組み合わせの数はほぼ無限大であるので、嗅覚システムの優れた識別特性を説明している。
【０００６】
ＯＲを用いた臭気分子の特性評価
培養細胞株は、学術的にも産業的にも関心のある受容体の特徴を明らかにし、研究するために広く利用されてきた。このアプローチとしては、対応する遺伝子を細胞に導入し、その後、その安定的または一過性の過剰発現を促進することが挙げられる。受容体の活性は、機能的アッセイを用いてモニターすることができる。実行容易な機能的アッセイを伴う培養容易な細胞株の使用は、１日あたり数千回の測定が容易になる。典型的には、製薬業界では、非嗅覚受容体上で１日に１００万化合物のライブラリーをテストすることが一般的である。その臭気分子によるＯＲの活性化に伴って細胞内で生じるｃＡＭＰの産生は、（Saito et al., 2004 Cell Vol.119、679-691）に記載されているようなレポーター遺伝子の使用からなる間接的なアプローチによって検出され得る。この遺伝子は、ｃＡＭＰ誘導性プロモーターの制御下に配置され、ｃＡＭＰによる誘導時にのみ発現される。この目的のために異なる遺伝子を使用することができるが、最も一般的な遺伝子の一つは、光産生タンパク質ルシフェラーゼをコードしている。基質であるルシフェリンを切断している間、この酵素は容易に検出され定量化される光を放出する。放出される光の強度は、生成されるルシフェラーゼの量を反映しており、これはｃＡＭＰの増加に比例しており、したがって、受容体の活性に直接関係している。レポーター遺伝子アッセイの利点の一つは、受容体活性化とレポーター産生の間のシグナル増幅に依存していることである。これにより、このアッセイを他の機能的アッセイではほとんど検出されない弱い応答に対して特に敏感にする。
【０００７】
他の機能的アッセイもまた、その臭気リガンドによるＯＲの活性化を実証するために使用されてきた。これらのアッセイの一つは、受容体の活性化時に起こる細胞質カルシウムの増加をモニターすることからなる(Krautwurtz D. et al. 1998. Cell 95, 917-26)。
【０００８】
また、ヒトＯＲ活性化因子の同定も報告されている。脱オルファン化されたヒトＯＲの例は、以下に示される：Fujita Y et al. 2007. J. Recept. Signal. Transduct. Res. 27, 323-34 ; Keller A. et al. 2007. Nature 449, 468-72 ; Matarazzo V. et al. 2005. Chem. Senses 30, 195-207 ; Saito H. et al. 2009. Sci. Signal. 2, 1-14 ; Sanz G. et al. 2005. Chem. Senses 30, 69-80 ; Schmiedeberg K. et al. 2007. J Struct. Biol. 159, 400-12. ; Shirokova E. et al. 2004. J. Biol. Chem. 280, 11807-15.; Spehr M. et al. 2003. Science 299, 2054-58.; Wetzel, K. et al. 1999.  J. Neurosci. 19, 7426-33; WO 2006/094704 ; Shirasu et al. 2014 Neuron 81, 165-78。
【０００９】
受容体のいくつかについて、１つ以上のリガンドが同定されている。同じＯＲを活性化する臭気物質は、アルコール、アルデヒド、エステルなどの異なる臭気物質ファミリーに属し得る(Sanz G. et al. 2005. Chem. Senses 30, 69-80 ;   Saito H. et al. 2009. Sci. Signal. 2, 1-14)。
【００１０】
ムスク
ムスクは、その魅力的な香りと生理作用のため、５０００年以上も前から医薬品やフレグランスとして使用されてきたことが知られている。今日では、ムスク香料は、その暖かで優雅で動物的な香りだけでなく、その定着性により、化粧品や香水業界で広く使用されている。
【００１１】
最初の天然ムスク化合物であるムスコンは、１９０６年にジャコウジカの分泌物中に存在する主要な香りとしてウォルバームによって報告された。ムスコンは、１５員環を持つユニークな大環状ケトン構造を示し、雌を引き付ける特性を持っていることから、ジャコウジカの雄性フェロモンであることが示唆されている。それ以来、ジャコウネコ、ジャコウネズミ、マスカラットなどの動植物からムスクのような香りを持つ化合物が数多く精製されてきた。しかし、これらの種での生理機能については研究されていなかった。
【００１２】
従来、芳香剤の製造に用いられる天然ムスクの主な原料はジャコウジカであった。その希少性と価格の高さから、ジャコウジカの種の保護が問題になるずっと前から（後に優先的な関心事となっている）、天然ジャコウジカを合成ジャコウジカに置き換える動機付けとなっていた。最初の合成ムスク化合物である「ニトロムスク」は１９世紀に偶然に登場した。トリニトロトルエン（ＴＮＴ）のような強力で安全な火薬を手に入れる方法を探していたアルバート・バウアーは、代わりに強力なムスクの匂いのする物質を手に入れた。それ以来、ムスコンの香りを模倣する多くの化合物が合成され、多くの市販製剤のベースノートとして香料に使用されている。これらの化合物は、４つの構造的に多様な化学物質群：ニトロムスク、多環式ムスク、大環状ムスク、および直鎖状／脂環式ムスクの一部である。
【００１３】
ニトロムスクは、技術的に製造が容易なニトロフェニル誘導体に属している。それらは合成ムスクの第一世代であり、１９５０年代まで香水で大量に使用されていた。ニトロムスクとは、一般的に、５つの最も商業的な価値をもつ香りの化合物：ムスクケトン（４−ｔｅｒｔ−ブチル−２，６−ジメチル−３，５−ジニトロアセトフェノン）、ムスクアンブレット（２，６−ジニトロ−３−メトキシ−４−ｔｅｒｔ−ブチルトルエン）、ムスクモスケン（１，１，１，３，３，５−ペンタメチル−４，６−ジニトロ−２Ｈ−インデン）、ムスクチベテン（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３，４，５−トリメチル−２，６−ジニトロベンゼン）およびムスクキシレン（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３，５−ジメチル−２，４，６−トリニトロベンゼン）を指す。このファミリーの中で、ムスクケトンは、シャネルナンバー５などの有名な高価な香水に使用されており、ムスコンによく似ていることから、ムスクの匂いの基準とされていた。１９９５年以降、ムスクアンブレットは、光アレルギー、発がん性および神経毒性のため、欧州連合によって化粧品には法律で禁止された。ムスクチベテンとムスクモスケンの生産は、それらの毒性、生体蓄積性および環境への残留性が懸念され、その結果、これらのムスクの化粧品への使用が欧州連合によって禁止されているため、近年減少している。ムスクケトンとムスクキシレンは、洗剤やハウスクリーニング製品、およびその他の香り付きの非化粧品に添加剤として使用され続けている。ニトロムスクの甘いパウダリーな匂いが消費者に好まれ、伝説的な香りはニトロムスクの上に作られたものもあったため、科学者たちはニトロムスクに代わるものを見つけなければならなかった。
【００１４】
１９５０年代には、石油化学系材料をベースにした多環式ムスクが開発された。構造的には、インダンやテトラリン型のような二環式のコア構造で形成され、その構造は、メチル基、イソプロピル基および／またはｔ−ブチル基を一緒に組み合わせてアセチル基またはピラン環の組み合わせに置換されている。このファミリーの大きな利点は、安定性が高く、香料として機能的に使用するための反応性が低く、ニトロムスクよりも安価であることである。それらの高い固定効果だけでなく、強力なムスクの匂い、甘い、ドライでパウダリーおよび琥珀の匂いがそれらの成功に貢献している。最も広く使用されている多環式ムスクはガラクソリド（Ｇａｌａｘｏｌｉｄｅ）（登録商標）で、次いでトナリド（Ｔｏｎａｌｉｄｅ）（登録商標）で、多環式ムスクグループの中では２大製品で、ＥＵ市場の約９５％を占めている。これらの物質は大量に生産され、消費され、生物学的にも持続性が高いため、今日ではどこにでも存在する物質となっている。実際、これらの物質は、水、血液、母乳、沈殿物、様々な魚種などの生物など、様々な環境サンプルや人間のサンプルから検出される。また、親油性が高く、脂肪組織に蓄積されやすいことから食物連鎖の変形を引き起こす。ニトロムスクに関しては、動物実験やバイオアッセイでガラクソリド（登録商標）がホルモン破壊作用を持つ可能性が示唆されているが、これらの物質の摂取については、皮膚接触だけでなく、安全性についても議論がなされている。
【００１５】
合成ムスク代替品の第三のグループである大環状ムスクは、１９２６年に合成された。これらの分子は天然のムスクに非常に似ており、他の人工ムスクよりも明らかに優れたにおいの特徴を持っている。このクラスのすべてのメンバーは、少なくとも６個以上の炭素（多くの場合１０〜１５個）で構成された単一の環を有する。過去には、製造コストが比較的高かったため、非常に排他的な組成を除き、香水の調合にはあまり使われていなかった。大環状ムスクに関する情報は非常に少ないままだが、これらの化合物はより環境に優しくみえる。さらに、これまでのところ、大環状ムスクが人の健康に悪影響を及ぼすという報告はない。これらの理由から、現在、合成大環状ムスクの世界的な生産量は増加する傾向にある。
【００１６】
脂環式ムスクは、シクロアルキルエステルまたは直鎖状ムスクとして知られているが、前述の他のムスクとは劇的に異なる構造（修飾アルキルエステル）を持つ比較的新しいクラスのムスク化合物である。このクラスの最初の化合物は１９７５年に、フルーツやイチゴの微かな香りを伴う温かみのあるパウダリーでムスクの匂いを有するシクロムスク（Ｃｙｃｌｏｍｕｓｋ）で導入された。この化合物は価格競争力がないため、市場に出回ることはなかった。その１５年後、このクラスの新しい化合物であるヘルベトリド（Ｈｅｌｖｅｔｏｌｉｄｅ）が商業規模で生産された。ロマンドリドは、ヘルベトリドに比べてよりアンブレットでフルーティーさの少ない脂環式ムスクで、その１０年後に登場した。これらのムスクの使用はまだ非常に限られており、いくつかの表層水から検出されている。一般的に、これらのムスクについてはほとんど知られておらず、多環式ムスクと同様の考察がなされている。しかし、さまざまな研究によると、ロマンドリドは容易に生分解性があるため、現在のところ、環境中で検出可能なレベルの直鎖状ムスクが発見されることはないと予想される。
【００１７】
ムスクは、香水のベースノートとして使用される全クラスの香り物質である。合成ニトロと多環式ムスクの使用は、その健康と環境に有害な特性のため、近年では減少したので、それはほとんどすべての香りの組成物に存在する最も一般的に使用される原料のままである。成分のバランスを整え、官能性と暖かさの微妙なタッチを加え、蒸発率を下げるというユニークな特性を持つムスクは、香水業界では欠かせない重要な成分となっている。したがって、新しい生分解性で非毒性のムスクまたはこれらの知覚を高める化合物の開発と同定に対しては現実的なニーズがある。ムスクの知覚を活性化、模倣、ブロック、阻害、調節または増強する化合物を見つけるために、過去にさまざまな戦略／方法が開発されてきた(Akuhara et al. 2016 J Neurosci. 36(16), 4482-91; Shirasu et al. 2014 Neuron 81, 165-78 ; WO 2016/201152A1 ; WO 2015/020158 A1)。これらはいずれも、マウスで同定された２つの嗅覚受容体、ｏｌｆｒ１４４０（ＭＯＲ２１５−１）またはｏｌｆｒ９６（ＭＯＲ２２１−１）、およびそれらのヒトオルソログＯＲ１１Ａ１またはＯＲ５ＡＮ１をムスク特異的受容体として使用することに基づいている。
【発明の概要】
【００１８】
発明の概要
本発明において、驚くべきことに、ＯＲのクラス２に属する嗅覚受容体が、前述の構造的に多様な４つの異なるムスク群によって活性化されることが発見された。これまでのところ、以前に同定されたムスクの受容体のいずれも、４つのグループすべてに対してそのようなレベルの応答性を示していなかった。私たちの日常生活におけるムスクの重要性を考えると、この予想外の発見は、より安全で、生態学的に良性で、調香師および香料会社にとって有用なムスク化合物の同定を可能にするであろう。
【００１９】
本発明は、ニトロムスク、多環式ムスク、大環状ムスクおよび直鎖状ムスクを含むすべての構造的に多様な化学物質群の天然受容体として、ＯＲのクラス２に属する新規な嗅覚受容体（ＯＲ）、すなわちＯＲ５Ａ２（本発明のＯＲ）の同定に関する。好ましくは、ＯＲ５Ａ２は、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対する、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％または８６％のアミノ酸同一性、より好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有する、ポリペプチド配列によって本明細書で定義され、ムスク化合物によって活性化されうる。本発明は、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を活性化、模倣、ブロック、阻害、調節または増強する剤のスクリーニングアッセイの基礎として、これらのＯＲポリペプチドとムスク化合物の相互作用を使用することを包含する。
【００２０】
本発明はさらに、アミノ酸配列番号１１によって定義される膜貫通ドメイン２〜７を包含するＯＲ５Ａ２の中央領域を含むキメラ受容体を提供し、この受容体は、そのＮ末端がＧタンパク質共役型受容体のＮ末端細胞外部位、膜貫通ドメイン１および細胞内ループ１に融合されており；そしてそのＣ末端がＧタンパク質共役型受容体の細胞内Ｃ末端エンドに融合されている。好ましい実施形態では、前記Ｇタンパク質共役型受容体は、嗅覚受容体または配列番号１２で定義されるＯＲ２Ａ５受容体である。また、前記ＯＲ５Ａ２のモジュレーターを同定するためのかかるキメラ受容体の使用、ならびに前記ＯＲ５Ａ２受容体とムスク化合物との間の結合を妨害する剤を同定するための、アミノ酸配列番号１１または配列番号１１に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性、好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を含むポリペプチド配列によって定義される膜貫通ドメイン２〜７を包含するＯＲ５Ａ２の中央領域の使用も提供する。
【００２１】
本発明はまた、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体（配列番号２）またはその受容体の中央領域（膜貫通領域２〜７−配列番号１１）とムスク化合物との相互作用に基づくスクリーニング方法を実行するためのキットを包含する。
【００２２】
本発明は、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤または１つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法を包含し、前記方法は以下を含む：ａ）本明細書で定義されるＯＲポリペプチドを剤またはサンプルに接触させる工程、ＯＲポリペプチドは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体（配列番号２）、その中央領域（配列番号１１）または前記中央領域を含むキメラ受容体（例えば、配列番号１０）のいずれかであり得る；ｂ）前記剤またはサンプルの存在下で、前記ＯＲポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；およびｃ）前記剤またはサンプルの存在下で測定された活性を、前記ＯＲポリペプチドが、前記１つ以上のムスク化合物と接触する反応において測定されたＥＣ５０での活性と比較する工程であって、前記剤またはサンプルは、剤またはサンプルの存在下で測定された活性の量が、ＥＣ５０での前記ムスク化合物によって誘導された量の少なくとも１０％であるときに、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして同定される、工程。
【００２３】
本発明はさらに、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤または１つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法を包含し、前記方法は以下を含む：ａ）前記ＯＲポリペプチドを、剤またはサンプルの存在下および剤およびサンプルの非存在下で、本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物と接触させる工程；およびｂ）本明細書で定義されるＯＲポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、ＯＲポリペプチドは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体（配列番号２）、その中央領域（配列番号１１）または前記中央領域を含むキメラ受容体のいずれかであり得る；およびｃ）前記剤およびサンプルを含まない前記ＯＲポリペプチドとムスク化合物を含む反応において測定された前記活性の量を前記ＯＲポリペプチド、ムスク化合物および前記剤またはサンプルを含む反応において測定された前記活性の量と比較する工程であって、前記剤およびサンプルの非存在下における活性に対する前記剤またはサンプルの存在下における活性の変化が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして、前記剤またはサンプルを同定する工程。
【００２４】
本発明はさらに、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を増加させる剤または１種以上の剤を含むサンプルを同定する方法を包含し、前記方法は以下を含む：ａ）剤またはサンプルの存在下ならびに剤およびサンプルの非存在下で、前記ムスク化合物による前記ＯＲポリペプチドの活性化を可能にする条件下で、本明細書で定義されるＯＲポリペプチドを、本明細書で定義される１種以上のムスク化合物と接触させる工程、ＯＲポリペプチドは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体（配列番号２）、その中央領域（配列番号１１）または前記中央領域を含むキメラ受容体のいずれかであり得る；およびｂ）前記ＯＲポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、前記剤およびサンプルの非存在下での活性に対する前記剤またはサンプルの存在下での活性の変化が、前記剤またはサンプルを本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を増加させる剤またはサンプルとして同定する工程。
【００２５】
本発明はさらに、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を低下させる剤または１種以上の剤を含むサンプルを同定する方法を包含し、前記方法は以下を含む：ａ）剤またはサンプルの存在下および剤およびサンプルの非存在下で、前記ムスク化合物による前記ＯＲポリペプチドの活性化を可能にする条件下で、本明細書で定義されるＯＲポリペプチドを、本明細書で定義される１種以上のムスク化合物と接触させる工程、ＯＲポリペプチドは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体（配列番号２）、その中央領域（配列番号１１）または前記中央領域を含むキメラ受容体のいずれかであり得る；およびｂ）前記ＯＲポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、前記剤およびサンプルの非存在下での活性に対する前記剤またはサンプルの存在下での活性の変化が、前記剤またはサンプルを本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を低下させる剤またはサンプルとして同定する工程。
【００２６】
本発明は、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤または１つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法を包含し、前記方法は、以下を含む：ａ）本明細書で定義されるＯＲポリペプチドを、剤またはサンプルと接触させる工程、ＯＲポリペプチドは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体（配列番号２）、その中央領域（配列番号１１）または前記中央領域を含むキメラ受容体のいずれかであり得る；ｂ）前記剤またはサンプルと前記ＯＲポリペプチドとの結合を測定する工程；、およびｃ）本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物に対する、前記剤またはサンプルとの結合を前記ＯＲポリペプチドとのＥＣ５０での結合と比較する工程であって、前記剤またはサンプルの結合量が、そのＥＣ５０で存在する前記ムスク化合物の結合量の少なくとも１０％であるとき、前記剤またはサンプルは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして同定される工程。
【００２７】
本発明はさらに、本明細書に定義される１つ以上のムスク化合物と本明細書に定義されるＯＲ５Ａ２受容体との間の相互作用を調節する剤または１つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法を包含し、前記方法は以下を含む：ａ）剤またはサンプルの存在下ならびに剤およびサンプルの非存在下、前記ムスク化合物の結合を可能にする条件下で、本明細書に定義されるＯＲポリペプチドを前記ムスク化合物に接触させる工程、ＯＲポリペプチドは、本明細書に定義されるＯＲ５Ａ２受容体（配列番号２）、その中央領域（配列番号：１１）または前記中央領域を含むキメラ受容体のいずれかであり得る；およびｂ）前記ＯＲポリペプチドと前記ムスク化合物との結合を測定する工程であって、剤およびサンプルの非存在下での結合に対する剤またはサンプルの存在下での結合のモジュレーションが、前記剤またはサンプルが、本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物と本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体との間の相互作用を調節する剤またはサンプルとして、前記剤またはサンプルを同定する工程。
【００２８】
本発明によれば、結合方法を使用する場合、１種以上のムスク化合物を検出可能に標識することができる。前記方法において、前記ムスク化合物は、放射性同位体、蛍光体および蛍光消光剤からなる群から選択される部分を用いて検出可能に標識されていてもよい。
【００２９】
先行する方法のいずれかの一実施形態において、接触は、本明細書で定義されるＯＲポリペプチドを発現する細胞内または細胞上で行われ、ＯＲポリペプチドは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体（配列番号２）、その中央領域（配列番号１１）または前記中央領域を構成するキメラ受容体のいずれかであり得る。本発明によれば、前記細胞は、ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ）、サル細胞（ＣＯＳ）、一次嗅覚細胞、アフリカツメガエル細胞、昆虫細胞、酵母または細菌であってもよいが、これらに限定されない。
【００３０】
先行する方法のいずれかの別の実施形態では、接触は、本明細書に定義されるＯＲポリペプチドを含む、合成リポソーム(Tajib et al. 2000年、Nature Biotechnology 18: 649−654、参照により本明細書に組み込まれる）またはウイルス誘発出芽膜中で、またはその上で行われ、該ＯＲポリペプチドは、本明細書に定義されるＯＲ５Ａ２受容体（配列番号２）、その中央領域（配列番号１１）、または前記中央領域を構成するキメラ受容体（ＷＯ０１０２５５１、２００１年、参照により本明細書に組み込まれる）のいずれかであり得る。
【００３１】
先行する方法のいずれかの別の実施形態では、方法は、本明細書で定義されるＯＲポリペプチドを発現する細胞からの膜画分を用いて実施され、該ＯＲポリペプチドは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体（配列番号２）、その中央領域（配列番号１１）、または前記中央領域を構成するキメラ受容体のいずれかであり得る。
【００３２】
先行する方法のいずれかの好ましい実施形態では、方法は、プロテインチップ上で実施される。
【００３３】
先行する方法のいずれか１つの別の好ましい実施形態では、測定は、ラベル置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光、および蛍光偏光から選択される方法を用いて行われる。
【００３４】
先行する方法のいずれかの別の実施形態では、剤は、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、および有機低分子からなる群から選択される。
【００３５】
本発明によれば、機能的アッセイが使用される場合、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体のシグナル伝達活性を測定するステップは、セカンドメッセンジャーのレベルの変化を検出することを含んでもよい。
【００３６】
別の実施形態では、シグナル伝達活性を測定するステップは、グアニンヌクレオチド結合／共役または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、プロテインキナーゼＡ活性ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、カルシウムフラックス、アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、メラノフォアアッセイ、受容体初期化アッセイ、またはレポーター遺伝子発現の測定を含む。Ｇタンパク質の結合／共役または交換を測定する場合、可能な全てのＧαサブユニットのうち、好ましくはＧＴＰ結合タンパク質のＧタンパク質のアルファー−ｏｌｆサブユニット（嗅覚）、Ｇ−ｏｌｆともいう、の挙動を調べる。ヒトＧ−ｏｌｆサブユニットの配列は、アクセッション番号Ｌ１０６６５で以前にＧｅｎｅｂａｎｋに寄託されている。しかしながら、他の種のＧ−ｏｌｆサブユニットを使用し、研究してもよい。
【００３７】
好ましい実施形態では、シグナル伝達活性の測定は、蛍光または発光アッセイを使用することを含む。蛍光アッセイおよび発光アッセイは、ｆｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ４またはＦｕｒａ（分子プローブ）；Ｃａ３およびＣａ６−ｋｉｔファミリー（分子デバイス）、およびエクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）などのＣａ２＋感受性蛍光体の使用を含んでもよい。さらに、前記アッセイは、ＦＤＳＳ（Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ）またはＦＬＩＰＲ（分子デバイス）などの自動化された蛍光または発光リーダーを適用してもよい。
【００３８】
本発明はさらに、細胞内で本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する方法を包含し、前記方法は、ＯＲの活性が調節されるように、本明細書で定義されるムスク化合物または本明細書で定義されるＯＲポリペプチドの活性を調節する剤を前記細胞に送達するステップを含み、ＯＲポリペプチドは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体（配列番号２）、その中央領域（配列番号１１）または前記中央領域を含むキメラ受容体のいずれかであり得る。
【００３９】
先行する方法のいずれか１つの別の実施形態において、方法は、ハイスループットスクリーニング方法である。
【００４０】
先行する方法のいずれか１つの別の実施形態において、前記剤は、化学ライブラリーまたは動物器官抽出物の一部である。
【００４１】
本発明によれば、先行する方法のいずれかによって同定または検出された剤、または前記剤を含む組成物は、新規なムスク化合物を見出すために使用してもよい。あるいは、これらを臭気活性化剤または臭気増強剤の調製に使用してもよい。例えば、ＯＲ活性化剤または増強剤を消臭剤として使用してもよい。ＯＲ活性化剤または増強剤は、既に消臭剤として使用されている香料または香水の製剤に、その効力を強化するために添加してもよい。
【００４２】
本発明はまた、単離されたＯＲポリペプチドとムスク化合物を含む組成物を包含する。
【００４３】
本発明はさらに、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体のシグナル伝達を調節する剤をスクリーニングするためのキットの製造のためのムスク化合物の使用、または臭気活性化剤または臭気増強剤をスクリーニングするためのキットの製造のための本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体と併用するムスク化合物の使用にも関する。
【００４４】
さらに、本発明は、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体のためのリガンドとして、商業的または非商業的に入手可能なムスク化合物の使用を包含する。
【００４５】
本発明はさらに、単離されたＯＲ５Ａ２ポリペプチド、本明細書に定義された１つ以上のムスク化合物、およびそのための包装材料を含むキット；本明細書に定義されたＯＲポリペプチド（本明細書に定義されたＯＲ５Ａ２受容体（配列番号２）、その中央領域（配列番号１１）、または前記中央領域を含むキメラ受容体のいずれかであり得る）をコードする単離されたポリヌクレオチド、１つ以上のムスク化合物、およびそのための包装材料；前記ＯＲポリペプチドを発現する細胞またはその膜、または前記ＯＲポリペプチドを発現する複数の細胞またはその膜、本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物、およびそのための包装材料を含むキットを包含する。前記細胞は、前記ＯＲをコードするポリヌクレオチドで形質転換されてもよい。好ましい実施形態では、前記キットは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体、または前記ＯＲの任意の変異体、および本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物を包含する。
【００４６】
したがって、本発明は、以下の態様を提供する。
【００４７】
態様１．前記ＯＲ５Ａ２受容体と１つ以上のムスク化合物との間の結合を妨害する剤を同定するための、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド配列、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有するポリペプチド配列によって定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドの使用。
【００４８】
態様２．ＯＲ５Ａ２ポリペプチドの活性を調節する、剤または１つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法であって、前記方法は以下を含む：
ａ）ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを前記剤またはサンプルと接触させる工程；
ｂ）前記剤またはサンプルの存在下で前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；および
ｃ）前記剤またはサンプルの存在下で測定された活性を、前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドが１つ以上のムスク化合物と接触する反応において測定されたＥＣ５０での活性と比較する工程であって、前記剤またはサンプルは、剤またはサンプルの存在下で測定された活性の量が、ＥＣ５０での前記ムスク化合物によって誘導された量の少なくとも１０％であるときに、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして同定される、工程。
【００４９】
態様３．本明細書に定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤または１つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法であって、前記方法は以下を含む：
ａ）前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを、剤またはサンプルの存在下および剤およびサンプルの非存在下で、本明細書に定義される１種以上のムスク化合物と接触させる工程；および
ｂ）前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程、および
ｃ）剤およびサンプルを含まない前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドおよびムスク化合物を含む反応において測定された前記活性の量を、前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチド、ムスク化合物および前記剤またはサンプルを含む反応において測定された前記活性の量と比較する工程であって、前記剤およびサンプルの非存在下における活性に対する前記剤またはサンプルの存在下における活性の変化が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして、前記剤またはサンプルを同定する工程。
【００５０】
態様４．前記剤およびサンプルの非存在下での活性に対する前記剤またはサンプルの存在下での活性の増加が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を増加させる剤またはサンプルとして前記剤またはサンプルを同定する、態様３に記載の方法。
【００５１】
態様５．前記剤およびサンプルの非存在下での活性に対する前記剤またはサンプルの存在下での活性の減少が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を減少させる剤またはサンプルとして前記剤またはサンプルを同定する、態様３に記載方法。
【００５２】
態様６．本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤または１つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法であって、前記方法は以下を含む：ａ）前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを剤またはサンプルと接触させる工程；ｂ）前記剤またはサンプルと前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドとの結合を測定する工程；およびｃ）本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物に対する、前記剤またはサンプルとの結合を前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドとのＥＣ５０での結合と比較する工程であって、前記剤またはサンプルの結合量が、そのＥＣ５０で存在する前記ムスク化合物の結合量の少なくとも１０％であるとき、前記剤またはサンプルは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして同定される工程。
【００５３】
態様７．本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物と本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体との間の相互作用を調節する剤または１つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法であって、前記方法は以下を含む：ａ）前記ムスク化合物の前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドへ結合を可能にする条件下、剤またはサンプルの存在下ならびに剤およびサンプルの非存在下で、前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを前記ムスク化合物と接触させる工程；およびｂ）前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドと前記ムスク化合物の結合を測定する工程であって、剤およびサンプルの非存在下での結合に対する剤またはサンプルの存在下での結合のモジュレーションが、前記剤またはサンプルが、本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物と本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体との間の相互作用を調節する剤またはサンプルとして、前記剤またはサンプルを同定する工程。
【００５４】
態様８．前記剤およびサンプルの非存在下での結合に対する前記剤またはサンプルの存在下での結合の増加が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の結合を増加させる剤またはサンプルとして前記剤またはサンプルを同定する、態様７に記載の方法。
【００５５】
態様９．前記剤およびサンプルの非存在下での結合に対する前記剤またはサンプルの存在下での結合の減少が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の結合を減少させる剤またはサンプルとして前記剤またはサンプルを同定する、態様７に記載の方法。
【００５６】
態様１０．１つ以上のムスク化合物が、好ましくは、放射性同位体、蛍光体および蛍光消光剤からなる群から選択される部分で検出可能に標識されている、態様２〜９のいずれか１つに記載の方法。
【００５７】
態様１１．接触が、前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する細胞中、または細胞上で行われる、好ましくは、前記細胞が、ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ）、サル細胞（ＣＯＳ）、一次嗅覚細胞、アフリカツメガエル細胞、昆虫細胞、酵母または細菌から選択される、態様２〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【００５８】
態様１２．接触が、ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを含む合成リポソームまたはウイルス誘導出芽膜中、またはその上で行われる、態様２〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【００５９】
態様１３．方法が、前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する細胞からの膜画分を用いて、またはプロテインチップ上で行われる、態様２〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【００６０】
態様１４．測定が、ラベル置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光および蛍光偏光から選択される方法を用いて行われる、態様２〜１３のいずれか１つに記載の方法。
【００６１】
態様１５．剤が、ペプチド、ポリペプチド、抗体または抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、および有機低分子からなる群から選択される、態様２〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【００６２】
態様１６．本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体のシグナル伝達活性を測定するステップが、セカンドメッセンジャーのレベルの変化を検出することを含む、態様２〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【００６３】
態様１７．シグナリング伝達活性を測定することが、蛍光または発光アッセイを使用すること、好ましくはｆｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ４もしくはＦｕｒａ−２；Ｃａ３およびＣａ６キットファミリーもしくはエクオリンを含むＣａ２＋感受性蛍光体の使用を含む、または前記アッセイがＦＤＳＳまたはＦＬＩＰＲなどの自動化された蛍光または発光リーダーを適用する、態様２〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【００６４】
態様１８．前記方法がハイスループットスクリーニング方法である、態様２〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【００６５】
態様１９．剤が化学ライブラリーまたは動物器官抽出物の一部である、態様２〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【００６６】
態様２０．本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を細胞内で調節する方法であって、前記方法は、ＯＲ５Ａ２の活性が調節されるように、前記細胞にムスク化合物または前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドの活性を調節する剤を送達するステップを含む、方法。
【００６７】
態様２１．臭気活性化剤、臭気増強剤、または消臭剤を調製する方法であって、以下のステップを含む：
ａ）態様３〜２０のいずれか１つの方法に記載の候補剤を同定する工程、および
ｂ）前記剤を、臭気活性化剤、臭気増強剤または消臭剤として使用するための組成物に添加する工程。
【００６８】
態様２２．単離されたＯＲ５Ａ２ポリペプチド、１つ以上のムスク化合物、およびそのための包装材料を含むキット。
【００６９】
態様２３．ＯＲ５Ａ２ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、１つ以上のムスク化合物、およびそのための包装材料を含むキット。
【００７０】
態様２４．前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する細胞もしくはその膜、またはＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する複数の細胞もしくはその膜、本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物、およびそのための包装材料を含むキット。
【００７１】
態様２５．ＯＲ５Ａ２受容体のシグナル伝達を調節する剤をスクリーニングするための、好ましくは、臭気活性化剤、臭気増強剤または消臭剤として使用しうる剤のスクリーニングのための、態様２２〜２４のいずれか１つに記載のキットの使用。
【００７２】
態様２６．ＯＲ５Ａ２受容体のリガンドとしてのムスク化合物の使用。
【００７３】
態様２７．ＯＲ５Ａ２受容体と１つ以上のムスク化合物との相互作用に基づくスクリーニング方法を実行するための、態様２２〜２６のいずれか１つに記載のキットの使用。
【００７４】
態様２８．前記ムスク化合物が、ニトロムスク化合物、直鎖状ムスク化合物、多環式ムスク化合物および大環状ムスク化合物からなる群から選択される、先行する態様のいずれかに記載の使用または方法。
【００７５】
態様２９．前記ニトロムスク化合物および／または前記直鎖状ムスク化合物および／または前記多環式ムスク化合物および／または前記大環状ムスク化合物が、表２に示される分子の群から選択される、態様２８に記載の使用または方法。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１−１】図１：Ａ．４つの構造的に多様なムスク群の代表的な６つの異なるムスク（大環状ムスク：オキサリドＴとセルボライド；多環式ムスク：カシメランとファントライド；ニトロムスク：モスケン、脂環状ムスク：シルコライド）に対応する異なる活性化剤を用いた本発明のＯＲ（すなわちＯＲ５Ａ２、ＯＲ５Ａ２変異体＿１）の濃度反応解析。これらの解析は、「実験手順」に記載されている手順に従って実施した。ｐＥＦＩＢＲＨＯは空ベクターに相当し、コントロールとして使用した。Ｂ．濃度反応解析に用いた様々なムスクの構造（図１Ａ）
【図１−２】図１：Ａ．４つの構造的に多様なムスク群の代表的な６つの異なるムスク（大環状ムスク：オキサリドＴとセルボライド；多環式ムスク：カシメランとファントライド；ニトロムスク：モスケン、脂環状ムスク：シルコライド）に対応する異なる活性化剤を用いた本発明のＯＲ（すなわちＯＲ５Ａ２、ＯＲ５Ａ２変異体＿１）の濃度反応解析。これらの解析は、「実験手順」に記載されている手順に従って実施した。ｐＥＦＩＢＲＨＯは空ベクターに相当し、コントロールとして使用した。Ｂ．濃度反応解析に用いた様々なムスクの構造（図１Ａ）
【図２−１】図２：Ａ．ＯＲ５Ａ２変異体＿１（配列番号２）、ＯＲ５Ａ２変異体＿２（配列番号４）、ＯＲ５ＡＮ１（配列番号７）、ＯＲ１１Ａ１（配列番号８）、およびＯＲ５Ａ１（配列番号９）タンパク質のポリペプチド配列のアラインメントにクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗ２を使用した。黒いボックスは、５つの異なるＯＲにおける同一のヌクレオチドおよび保存されたモチーフを示す。Ｂ．ＯＲ５Ａ２が、いくつかのムスクサブファミリーに応答することが知られている２つの受容体であるＯＲ５ＡＮ１またはＯＲ１１Ａ１よりも、ベータ−イオノンによって活性化される受容体であるＯＲ５Ａ１に近いことを示す距離行列(distance matrix)。
【図２−２】図２：Ａ．ＯＲ５Ａ２変異体＿１（配列番号２）、ＯＲ５Ａ２変異体＿２（配列番号４）、ＯＲ５ＡＮ１（配列番号７）、ＯＲ１１Ａ１（配列番号８）、およびＯＲ５Ａ１（配列番号９）タンパク質のポリペプチド配列のアラインメントにクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗ２を使用した。黒いボックスは、５つの異なるＯＲにおける同一のヌクレオチドおよび保存されたモチーフを示す。Ｂ．ＯＲ５Ａ２が、いくつかのムスクサブファミリーに応答することが知られている２つの受容体であるＯＲ５ＡＮ１またはＯＲ１１Ａ１よりも、ベータ−イオノンによって活性化される受容体であるＯＲ５Ａ１に近いことを示す距離行列(distance matrix)。
【図３】図３：Ａ．記載されたＯＲ５Ａ１の活性化剤であるベータ−イオノンを用いた、本発明のＯＲ（すなわち、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２）、ＯＲ５ＡＮ１、ＯＲ１１Ａ１、およびＯＲ５Ａ１の濃度反応解析。ｐＥＦＩＢＲＨＯは空ベクターに相当し、コントロールとして使用する。結果は、ベータ−イオノンがＯＲ５Ａ１のみを活性化できることを示している。Ｂ．記載されたＯＲ５Ａ１の活性化剤であるエチル−フェンコールを用いた、本発明のＯＲ（すなわち、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２）、ＯＲ５ＡＮ１、ＯＲ１１Ａ１、およびＯＲ５Ａ１の濃度反応解析。ｐＥＦＩＢＲＨＯは空ベクターに相当し、コントロールとして使用する。結果は、エチルフェンコールがＯＲ１１Ａ１のみを活性化できることを示している。
【図４】図４：ＯＲ５Ａ２変異体＿１（配列番号２）およびＯＲ５Ａ２変異体２（配列番号４）のポリペプチド配列アラインメントにＢＬＡＳＴＰを使用する。タンパク質の配列アラインメントは、１つのアミノ酸置換（太字、下線）を示している：プロリン（Ｐ）は、位置１７２でロイシン（Ｌ）に置換されている。
【図５−１】図５：４つの構造的に多様なムスク群の代表的な６つの異なるムスク（ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド（登録商標）、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン）に対応する異なる活性化剤を用いた、本発明のＯＲ（すなわち、ＯＲ５Ａ２変異体＿１）、ＯＲ５Ａ２変異体＿２、および空ベクターｐＥＦＩＢＲＨＯの濃度反応解析。ＯＲ５Ａ２変異体＿１のみ、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。
【図５−２】図５：４つの構造的に多様なムスク群の代表的な６つの異なるムスク（ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド（登録商標）、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン）に対応する異なる活性化剤を用いた、本発明のＯＲ（すなわち、ＯＲ５Ａ２変異体＿１）、ＯＲ５Ａ２変異体＿２、および空ベクターｐＥＦＩＢＲＨＯの濃度反応解析。ＯＲ５Ａ２変異体＿１のみ、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。
【図５−３】図５：４つの構造的に多様なムスク群の代表的な６つの異なるムスク（ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド（登録商標）、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン）に対応する異なる活性化剤を用いた、本発明のＯＲ（すなわち、ＯＲ５Ａ２変異体＿１）、ＯＲ５Ａ２変異体＿２、および空ベクターｐＥＦＩＢＲＨＯの濃度反応解析。ＯＲ５Ａ２変異体＿１のみ、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。
【図５−４】図５：４つの構造的に多様なムスク群の代表的な６つの異なるムスク（ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド（登録商標）、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン）に対応する異なる活性化剤を用いた、本発明のＯＲ（すなわち、ＯＲ５Ａ２変異体＿１）、ＯＲ５Ａ２変異体＿２、および空ベクターｐＥＦＩＢＲＨＯの濃度反応解析。ＯＲ５Ａ２変異体＿１のみ、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。
【図５−５】図５：４つの構造的に多様なムスク群の代表的な６つの異なるムスク（ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド（登録商標）、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン）に対応する異なる活性化剤を用いた、本発明のＯＲ（すなわち、ＯＲ５Ａ２変異体＿１）、ＯＲ５Ａ２変異体＿２、および空ベクターｐＥＦＩＢＲＨＯの濃度反応解析。ＯＲ５Ａ２変異体＿１のみ、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。
【図５−６】図５：４つの構造的に多様なムスク群の代表的な６つの異なるムスク（ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド（登録商標）、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン）に対応する異なる活性化剤を用いた、本発明のＯＲ（すなわち、ＯＲ５Ａ２変異体＿１）、ＯＲ５Ａ２変異体＿２、および空ベクターｐＥＦＩＢＲＨＯの濃度反応解析。ＯＲ５Ａ２変異体＿１のみ、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。
【図６−１】図６：Ａ．ＯＲ５Ａ２変異体＿１（ＯＲ５Ａ２）（配列番号２）およびキメラＯＲ５Ａ２＿変異体  １（配列番号２）タンパク質のポリペプチド配列のアラインメントにＣｌｕｓｔａｌＷ２を使用する。黒いボックスは、異なるＯＲにおける同一のヌクレオチドおよび保存されたモチーフを表す。Ｂ．４つの構造的に多様なムスク群の代表的な６つの異なるムスク（ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド（登録商標）、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン）に対応する異なる活性化剤を用いた、キメラＯＲ５Ａ２＿変異体１およびＯＲ２Ａ５の濃度反応解析。ＯＲ２Ａ５（右パネル）ではなく、キメラＯＲ５Ａ２＿変異体１（左パネル）のみが、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。Ｃ．ＯＲ５Ａ１とＯＲ１１Ａ１の活性化剤として記載されているベータ−イオノンとエチルフェンコールを用いた、キメラＯＲ５Ａ２＿変異体１の濃度反応解析。ｐＥＦＩＢＲＨＯは空ベクターに相当し、コントロールとして使用する。結果は、ベータ−イオノンおよびエチル−フェンコールがキメラＯＲ５Ａ２＿変異体１を活性化することができないことを示している。キメラＯＲ５Ａ２＿変異体１（ｃｆ．配列番号１０）は、本発明のＯＲと同じ特異性を有する。
【図６−２】図６：Ａ．ＯＲ５Ａ２変異体＿１（ＯＲ５Ａ２）（配列番号２）およびキメラＯＲ５Ａ２＿変異体  １（配列番号２）タンパク質のポリペプチド配列のアラインメントにＣｌｕｓｔａｌＷ２を使用する。黒いボックスは、異なるＯＲにおける同一のヌクレオチドおよび保存されたモチーフを表す。Ｂ．４つの構造的に多様なムスク群の代表的な６つの異なるムスク（ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド（登録商標）、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン）に対応する異なる活性化剤を用いた、キメラＯＲ５Ａ２＿変異体１およびＯＲ２Ａ５の濃度反応解析。ＯＲ２Ａ５（右パネル）ではなく、キメラＯＲ５Ａ２＿変異体１（左パネル）のみが、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。Ｃ．ＯＲ５Ａ１とＯＲ１１Ａ１の活性化剤として記載されているベータ−イオノンとエチルフェンコールを用いた、キメラＯＲ５Ａ２＿変異体１の濃度反応解析。ｐＥＦＩＢＲＨＯは空ベクターに相当し、コントロールとして使用する。結果は、ベータ−イオノンおよびエチル−フェンコールがキメラＯＲ５Ａ２＿変異体１を活性化することができないことを示している。キメラＯＲ５Ａ２＿変異体１（ｃｆ．配列番号１０）は、本発明のＯＲと同じ特異性を有する。
【図６−３】図６：Ａ．ＯＲ５Ａ２変異体＿１（ＯＲ５Ａ２）（配列番号２）およびキメラＯＲ５Ａ２＿変異体  １（配列番号２）タンパク質のポリペプチド配列のアラインメントにＣｌｕｓｔａｌＷ２を使用する。黒いボックスは、異なるＯＲにおける同一のヌクレオチドおよび保存されたモチーフを表す。Ｂ．４つの構造的に多様なムスク群の代表的な６つの異なるムスク（ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド（登録商標）、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン）に対応する異なる活性化剤を用いた、キメラＯＲ５Ａ２＿変異体１およびＯＲ２Ａ５の濃度反応解析。ＯＲ２Ａ５（右パネル）ではなく、キメラＯＲ５Ａ２＿変異体１（左パネル）のみが、種々の被験ムスクに対して用量反応曲線を示す。Ｃ．ＯＲ５Ａ１とＯＲ１１Ａ１の活性化剤として記載されているベータ−イオノンとエチルフェンコールを用いた、キメラＯＲ５Ａ２＿変異体１の濃度反応解析。ｐＥＦＩＢＲＨＯは空ベクターに相当し、コントロールとして使用する。結果は、ベータ−イオノンおよびエチル−フェンコールがキメラＯＲ５Ａ２＿変異体１を活性化することができないことを示している。キメラＯＲ５Ａ２＿変異体１（ｃｆ．配列番号１０）は、本発明のＯＲと同じ特異性を有する。
【図７】図７：受容体ＯＲ５Ａ２、ＯＲ５Ａ１、ＯＲ５ＡＮ１およびＯＲ１１Ａ１に対する（Ａ）ムスクアンブレットおよび（Ｂ）モスケンの用量反応曲線。
【図８】図８：受容体ＯＲ５Ａ２、ＯＲ５Ａ１、ＯＲ５ＡＮ１及びＯＲ１１Ａ１に対する（Ａ）シルコライド及び（Ｂ）セレノライドの用量反応曲線。
【図９−１】図９：受容体ＯＲ５Ａ２、ＯＲ５Ａ１、ＯＲ５ＡＮ１およびＯＲ１１Ａ１に対する（Ａ）カシメラン、（Ｂ）フィクサルおよび（Ｃ）ガラクソリド（登録商標）の用量反応曲線。
【図９−２】図９：受容体ＯＲ５Ａ２、ＯＲ５Ａ１、ＯＲ５ＡＮ１およびＯＲ１１Ａ１に対する（Ａ）カシメラン、（Ｂ）フィクサルおよび（Ｃ）ガラクソリド（登録商標）の用量反応曲線。
【図１０−１】図１０：受容体ＯＲ５Ａ２、ＯＲ５Ａ１、ＯＲ５ＡＮ１およびＯＲ１１Ａ１に対する（Ａ）エチレンブラシレート、（Ｂ）アンブレトリドおよび（Ｃ）セルボライドの用量反応曲線。
【図１０−２】図１０：受容体ＯＲ５Ａ２、ＯＲ５Ａ１、ＯＲ５ＡＮ１およびＯＲ１１Ａ１に対する（Ａ）エチレンブラシレート、（Ｂ）アンブレトリドおよび（Ｃ）セルボライドの用量反応曲線。
【００７７】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用される、用語「嗅覚受容体ポリペプチド（ＯＲ）」は、一般に、嗅覚ニューロンによって主に発現されるＧタンパク質共役型受容体ファミリーからのポリペプチドを指す。ＯＲは、臭気分子と相互作用し、臭気信号を伝達する能力を有している可能性がある。
【００７８】
用語「本発明に記載の嗅覚受容体（ＯＲ）」または「本発明に記載の嗅覚受容体ポリペプチド」または「本発明のＯＲ」または「本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体」または「前記ＯＲポリペプチド」は、限定されないが、本明細書で定義されるムスク化合物によって活性化されうる、「配列表」の配列番号２および４で参照されるポリペプチド配列にそれぞれ対応する、「ＯＲ５Ａ２＿変異体＿１」および「ＯＲ５Ａ２＿変異体＿２」などのハプロタイプ変異体を含む嗅覚受容体ファミリー５サブファミリーＡメンバー２を表す。本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体としては、本明細書で定義されるムスク化合物によって活性化される能力を維持する「配列表」の（配列番号２）で表される配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または８６％のアミノ酸同一性、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。前記相同性は、ポリペプチド全体に関連していてもよいし、ＣＤＲドメイン（受容体のリガンド結合ドメイン）などのポリペプチドの一部のみに関連していてもよい。ＰｉｌｐｅｌおよびＬａｎｃｅｔ（Protein Science 8:969-977, 1999）によれば、ＧＰＣＲのＣＤＲドメインは、公表されている適用に従って定義され得る。ＴＭ３−＃４、ＴＭ３−＃８、ＴＭ３−＃１１、ＴＭ３−＃１２、ＴＭ３−＃１５、ＴＭ４−＃１１、ＴＭ４−＃１５、ＴＭ４−＃１９、ＴＭ４−＃２２、ＴＭ４−＃２３、ＴＭ４−＃２６、ＴＭ５−＃３、ＴＭ５−＃６、ＴＭ５−＃７、ＴＭ５−＃１０、ＴＭ５−＃１１、およびＴＭ５−＃１３であり、ここで、ＴＭｘは前記受容体の膜貫通領域を示し、＃は前記領域内のアミノ酸位置を示す。より具体的には、本発明者らは、本明細書で定義されるムスク化合物の特異性にとって特に重要として、ＯＲのＴＭ２〜７を覆う領域を同定している。前記領域は、配列番号１１によって定義される。本発明のＯＲ５Ａ２ポリペプチドと高い同一性を有する変異体の特定の例は、配列番号４で表され、ＯＲ５Ａ２＿変異体＿２として示される。前記用語本発明のＯＲポリペプチドはまた、本明細書で定義される「ＯＲ５Ａ２キメラ受容体またはポリペプチド」を包含する。
【００７９】
本明細書で使用されるように、用語「ＯＲ５Ａ２ポリヌクレオチド」は、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１（ＯＲ５Ａ２変異体１をコードする）または配列番号３（ＯＲ５Ａ２変異体２をコードする）で表される配列に対して、少なくとも８６％以上、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）の核酸同一性を有する。
【００８０】
本明細書で使用されるように、用語「ＯＲ５Ａ２キメラ受容体またはポリペプチド」は、アミノ酸配列番号１１によって定義される膜貫通ドメイン２〜７を包含する、ＯＲ５Ａ２受容体の中央領域を含む受容体、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）の配列同一性を有する配列を意味する。そのようなキメラ受容体は、さらにＧタンパク質共役型受容体、より好ましくは嗅覚受容体の骨格を含むことができる。より好ましくは、そのようなキメラＯＲ５Ａ２受容体は、ＯＲ５Ａ２受容体（配列番号１１）のＴＭ２〜ＴＭ７中央領域を含み、そのＮ末端でＧタンパク質共役型受容体のＮ末端細胞外部位、膜貫通ドメイン１および細胞内ループ１に融合され、そのＣ末端でＧタンパク質受容体の細胞内Ｃ末端エンドに融合されている。前記Ｇタンパク質共役型受容体は、好ましくは嗅覚受容体である。そのようなキメラＯＲ５Ａ２受容体の特定の例は、配列番号１０によって定義される。
【００８１】
本明細書で使用されるように、用語「ＯＲ結合」は、本明細書で定義されるように、ＯＲポリペプチドによる臭気分子の特異的な結合を指す。臭気分子としては、ニトロムスク、大環状ムスク、直鎖状ムスク、多環式ムスクの４つの異なるサブファミリーのムスク化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
本明細書で使用されるように、用語「ＯＲシグナル伝達活性」は、本明細書で定義されるＯＲポリペプチドによるシグナル伝達の開始または伝播を指す。ＯＲシグナル伝達活性は、以下Ｇタンパク質、特にＧ−ｏｌｆ上でのＧＴＰ交換のためのＧＤＰの刺激；アデニル酸シクラーゼ活性の変化；プロテインキナーゼＣの調節；プロテインキナーゼＡの調節；ホスファチジルイノシトール分解（セカンドメッセンジャーであるジアシルグリセロール、およびイノシトール三リン酸を生成する）；細胞内カルシウムフラックス；ＭＡＰキナーゼの活性化；チロシンキナーゼの調節；内在化アッセイ；遺伝子またはレポーター遺伝子活性の調節；またはメラノフォアアッセイ、のうちの１つ以上をアッセイすることによるシグナル伝達カスケードにおける検出可能なステップを測定することによりモニターされる。シグナル伝達カスケードにおける検出可能なステップは、測定可能な活性が、本明細書に記載されたいずれかのＯＲ活性アッセイに対して、ムスク化合物の実質的非存在下で確立されたベースラインより１０％以上、またはそれ以下で変化した場合、開始または媒介されたとみなされる。測定可能な活性は、例えば、ｃＡＭＰまたはジアシルグリセロールレベルの測定のように、直接測定することができる。あるいは、測定可能な活性は、例えばレポーター遺伝子アッセイのように、間接的に測定することができる。これらのアッセイのほとんどについては、キットが市販されている。
【００８３】
本明細書で使用されるように、用語「ムスク化合物」は、雄のジャコウジカによって分泌される強く匂う物質の匂いを連想させる感覚刺激性の性状を有する１つ以上の化合物を指す。前記化合物は、香料のベースノートとして使用される可能性のある香気物質の一群である。
【００８４】
好ましくは、本明細書で定義されるムスク化合物は、以下の化学物質：ニトロムスク、多環式ムスク、大環状ムスク、および直鎖状／脂環式ムスクの４つの構造的に多様なグループの中に入るか、または入らない、合成ムスク化合物、天然ムスク化合物、または商業的に入手可能もしくはまだ商業的に入手可能でないムスク化合物を包含する。
【００８５】
より好ましくは、本明細書で定義されるムスク化合物は、以下の化学物質：ニトロムスク、多環式ムスク、大環状ムスク、および直鎖状／脂環式ムスクの４つの構造的に多様なグループの中に入る、合成ムスク化合物、天然ムスク化合物、または商業的に入手可能もしくはまだ商業的に入手可能でないムスク化合物を包含する。
【００８６】
本明細書で使用されるように、「ニトロムスク」は、ニトロフェニル誘導体に属する。好ましくは、ニトロムスクは、一般に、商業的に関連性の高い５つの香料化合物：ムスクケトン（４−ｔｅｒｔ−ブチル−２，６−ジメチル−３，５−ジニトロアセトフェノン）、ムスクアンブレット（２，６−ジニトロ−３−メトキシ−４−ｔｅｒｔ−ブチルトルエン）、ムスクモスケン（１，１，３，３，５−ペンタメチル−４,６−ジニトロ−２Ｈ−インデン）、ムスクチベテン（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３，４，５−トリメチル−２，６−ジニトロベンゼン）、ムスクキシレン（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３，５−ジメチル−２，４，６−トリニトロベンゼン）を指す。より好ましくは、ニトロムスクは、ムスクケトン（４−ｔｅｒｔ−ブチル−２，６−ジメチル−３，５−ジニトロアセトフェノン）、ムスクアンブレット（２，６−ジニトロ−３−メトキシ−４−ｔｅｒｔ−ブチルトルエン）およびムスクモスケン（１，１，３，３，５−ペンタメチル−４，６−ジニトロ−２Ｈ−インデン）、およびムスクキシロール（１−ｔｅｒｔ−ブチル−３，５−ジメチル−２，４，６−トリニトロベンゼン）を指す。
【００８７】
本明細書で使用されるように、「多環式ムスク」は、アセチル基の組み合わせまたはメチル基、イソプロピル基および／またはｔ−ブチル基を組み合わせたピラン環で置換されたインデン型またはテトラリン型などの二環式のコア構造によって形成される。好ましくは、多環式ムスクとは、クリソライド、トナライド（登録商標）、ファントライド、カシメラン、ガラクソリド（登録商標）、トラセオライド、モキサロン、ベルノライドおよびフィクサルを指す。
【００８８】
本明細書で使用されるように、用語「大環状ムスク」は、６を超える（多くの場合、１０〜１５）の炭素からなる少なくとも１つの環を有する。好ましくは、大環状ムスクは、エチレンブラシレート、エグザルトリドとしても知られるチベトリド、１，１６−ヘキサデカラクトン、エグザルテノン、アニムスクとしても知られるグロバノン、ムスクＲ１、ベルビオーネ、シクロペンタデカノン、ムスコン、シベトン、ムスクＭＣ４、セルボライド、ω−６−ヘキサデセンラクトン、ニルバノリド、イソアンブレトリド、ハバノリド、ムスク７７、およびオキザリドＴを指す。
【００８９】
本明細書で使用されるように、「直鎖状／脂環式ムスク」は、別の意味でシクロアルキルエステルとして知られる、修飾アルキルエステルに対応する構造を有するムスク化合物の一群である。好ましくは、直鎖状ムスクは、シクロペンテニルプロピオネートムスク、セレノライド、シルコライドおよびヘルベトリドを指す。
【００９０】
本明細書で定義される「増強剤」とは、１つ以上の臭気分子によって誘発される臭気の知覚を調節または増強する分子である。増強剤は、前記臭気を伝達するＯＲと相互作用することによって、または受容体の天然リガンドと相互作用することによって作用し得る。本発明の「増強剤」は、アゴニスト、例えば香水に存在するムスクによって誘導される細胞内反応を、少なくとも１０％、好ましくは１５〜２５％、より好ましくは２５〜５０％、最も好ましくは５０〜１００％増加させることができる。本発明に記載の有用な増強剤は、ムスク化合物を介したシグナル伝達に必要なＯＲの少なくとも一部（リガンド結合部位など）に特異的に結合する低分子、アプタマー、フォトアプタマー、修飾天然リガンドなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、活性化剤は揮発性であるか、または適切な溶媒または添加剤と組み合わせて揮発性にすることができる。
【００９１】
本明細書で使用されるように、「アゴニスト」は、受容体に結合し、天然のリガンドまたは別の同定アゴニスト、例えばライブラリーに存在する新規化合物によって誘導される細胞内反応を模倣するリガンドである。
【００９２】
本明細書で使用されるように、「モジュレーター」とは、本発明の受容体の細胞表面発現を増加または減少させる化合物、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２に対するリガンドの結合を増加または減少させる化合物、または受容体に対するリガンドの存在下または非存在下で、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２の活性型によって開始される細胞内反応を増加または減少させる化合物、例えば香水に存在するムスク化合物を指す。モジュレーターは、本明細書で定義されるアゴニスト、または増強剤を含む。モジュレーターは、例えば、低分子、ポリペプチド、ペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、アプタマー、フォトアプタマー、または低分子化合物または有機低分子であり得る。候補となるモジュレーターは、天然または合成化合物であってもよく、例えば、合成低分子、動物、植物、細菌または真菌細胞の抽出物に含まれる化合物、およびそのような細胞からの馴化培地が挙げられる。
【００９３】
本明細書で使用されるように、用語「増加」および「減少」は、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２へのリガンド結合、および／または本発明のＯＲを介した細胞シグナル伝達の少なくとも１０％の量の変化を指す。結合またはシグナル伝達の「増加」または「減少」は、好ましくは、候補モジュレーターの存在下で、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２をリガンドと接触させることに対する反応を測定する。ここで、結合またはシグナル伝達の変化は、候補モジュレーターの非存在下での結合またはシグナル伝達に対する相対的なものである。
【００９４】
本明細書で使用されるように、用語「低分子」は、３００００ダルトン未満、好ましくは２０００または１５００未満、さらに好ましくは１０００未満、最も好ましくは６００ダルトン未満の分子量を有する化合物を指す。「有機低分子」とは、炭素を含む低分子である。
【００９５】
本明細書で使用されるように、用語「変化」、「差」、「減少」または「増加」は、例えば、物質の結合またはシグナル伝達活性または量に適用され、所定のアッセイにおける標準物質に対する結合、シグナル伝達活性、または例えばｍＲＮＡ、ポリペプチドまたはリガンドのレベルの少なくとも１０％の増加または減少を指す。
【００９６】
本明細書で使用されるように、用語「ムスク化合物の本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２への結合を可能にする条件」とは、前記ＯＲがムスク化合物を結合する条件下での例えば、温度、塩濃度、ｐＨおよびタンパク質濃度の条件を指す。正確な結合条件は、例えば、アッセイが生菌細胞を使用するか、細胞の膜画分のみを使用するかなど、アッセイの性質に応じて変わる。
【００９７】
本明細書で使用されるように、用語「剤」は、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸および有機低分子を含む群から選択される分子を指す。
【００９８】
本明細書で使用されるように、用語「サンプル」は、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２への結合またはシグナル伝達活性を調節する剤またはモジュレーター化合物の存在について試験される分子の供給源を指す。サンプルは、環境サンプル、動物、植物、酵母または細菌細胞の天然抽出物、臨床サンプル、合成サンプル、または組換え細胞からのまたは発酵プロセスからの馴化培地であり得る。
【００９９】
本明細書で使用されるように、用語「膜画分」は、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２を含む細胞脂質膜の調製物を指す。本明細書で使用される時、「膜画分」は、非膜関連細胞構成成分の少なくとも一部（すなわち、少なくとも１０％、好ましくはそれ以上）が除去されているという点で、細胞ホモジネートとは異なる。用語「膜関連」は、脂質膜に組み込まれているか、または脂質膜に組み込まれている成分と物理的に関連しているそれらの細胞構成成分を指す。
【０１００】
本明細書で使用されるように、用語「セカンドメッセンジャーアッセイ」は、好ましくは、グアニンヌクレオチド結合もしくは交換、アデニル酸シクラーゼ、細胞内ｃＡＭＰ、細胞内イノシトールリン酸、細胞内ジアシルグリセロール濃度、アラキドン酸濃度、ＭＡＰキナーゼもしくはチロシンキナーゼ、プロテインキナーゼＣ活性またはレポーター遺伝子発現の測定、あるいは当技術分野で知られており、本明細書で定義される方法に記載のエクオリンベースのアッセイを含む。
【０１０１】
本明細書で使用されるように、用語「セカンドメッセンジャー」は、ＧＰＣＲからのシグナルの伝達に関与するＧタンパク質共役型受容体の活性化によって生成された、または濃度が変化するように引き起こされた分子を指す。セカンドメッセンジャーの非限定的な例としては、ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、アラキドン酸放出、イノシトール三リン酸および細胞内カルシウムが挙げられる。用語「セカンドメッセンジャーのレベルの変化」とは、候補モジュレーターの非存在下で実施したアッセイで検出された量に対する、所定のセカンドメッセンジャーの検出されたレベルの少なくとも１０％の増加または減少を指す。
【０１０２】
本明細書で使用されるように、用語「エクオリンベースのアッセイ」は、活性化されたＧＰＣＲによって誘導される細胞内カルシウムフラックスを測定するＧＰＣＲ活性のためのアッセイを指し、ここで、細胞内カルシウムフラックスは、細胞内で発現されたエクオリンの発光によって測定する。
【０１０３】
本明細書で使用されるように、用語「結合」は、分子（例えば、ムスク化合物または抗体などのリガンド）と受容体（例えば、本明細書で定義される本発明のＯＲ５Ａ２）との物理的なアソシエーションを指す。該用語が本明細書で使用される時、ＥＣ５０またはＫｄが１ｍＭ未満、一般的には１ｍＭから１０ｎＭの範囲で起こる場合は、結合は「特異的」であり、例えば、ＥＣ５０またはＫｄが１ｍＭ、５００μＭ、１００μＭ、１０μＭ、９．５μＭ、９μＭ、８．５μＭ、８μＭ、７．５μＭ、７μＭ、６．５μＭ、６μＭ、５．５μＭ、５μＭ、４．５μＭ、４μＭ、３．５μＭ、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、７５０ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭまたは１００ｎＭ以下である場合は、結合は特異的である。
【０１０４】
本明細書で使用されるように、用語「ＥＣ５０」は、ムスク化合物または他のリガンドの結合およびＯＲの機能活性などの所定の活性が、化合物の非存在下で同じアッセイを使用して測定可能なＯＲ活性の最大値の５０％である化合物の濃度を指す。別の言い方をすれば、「ＥＣ５０」は、１００％活性化が、より多くのアゴニストを加えても増加しない活性の量に設定されている場合に、５０％活性化を与える化合物の濃度である。
【０１０５】
本明細書で使用されるように、用語「飽和」は、リガンド濃度のさらなる増加がリガンドの結合またはＯＲ特異的シグナル伝達活性を増加させることができないムスク化合物の濃度を指す。
【０１０６】
本明細書で使用されるように、用語「結合の増加」とは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２の公知または疑わしいモジュレーターを用いた所定のアッセイで検出されたリガンド結合の量が、その公知または疑わしいモジュレーターを欠いたアッセイで検出された結合に対して、少なくとも１０％増加したことを指す。
【０１０７】
本明細書で使用されるように、用語「Ｇタンパク質共役型受容体」または「ＧＰＣＲ」は、７つのアルファーらせん状の膜貫通ドメインを有する膜関連ポリペプチドを指す。機能的なＧＰＣＲは、リガンドまたはアゴニストと関連し、またＧタンパク質と関連し、活性化する。本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２は、ＧＰＣＲのファミリーに属する。
【０１０８】
本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、従来の免疫グロブリン分子、および対象となるポリペプチドの１つとも特異的に反応性を有するそのフラグメントである。抗体は、従来の技術ならびに全体の抗体について以下に記載するのと同様の方法で、有用性をスクリーニングされたフラグメントを用いてフラグメント化することができる。例えば、抗体をペプシンで処理することにより、Ｆ（ａｂ）２フラグメントを生成することができる。得られたＦ（ａｂ）２フラグメントは、ジスルフィド橋を減少させるように処理することにより、Ｆａｂフラグメントを生成することができる。本発明の抗体は、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって付与されるポリペプチドに対する親和性を有する、二重特異性、単鎖およびキメラ化分子およびヒト化分子をさらに含むことが意図される。好ましい実施形態では、抗体はさらに、それに取り付けられた、検出可能なラベル（例えば、ラベルは、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）を含む。抗体、モノクローナルまたはポリクローナル、およびそれらの超可変部分（ＦＡＢ、ＦＡＢ’’など）、ならびに抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、特定の疾患の診断およびモニタリングの分野において特定の産業上の応用を見出す本発明のさらなる態様であり、好ましくは、以下に記載するものである。本発明に記載の阻害剤としては、標識されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、または抗体の超可変部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
本明細書で使用されるように、用語「ＯＲ構成的活性」とは、前記嗅覚受容体に対するリガンドの添加なしに自然発生的に起こる、細胞に発現した嗅覚受容体の測定可能な活性を指す。
【０１１０】
本発明は、１つ以上のムスク化合物が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドと呼ばれる、ヒト鼻上皮に存在する特定のＯＲ５Ａ２嗅覚受容体を活性化することができることを見いだしたことに関する。このＯＲ５Ａ２／ムスク化合物の相互作用は、そのような相互作用およびそれによるＯＲ５Ａ２の機能を調節する剤のスクリーニングアッセイに有用である。このＯＲ５Ａ２／ムスク化合物相互作用はまた、産業に関心を持たれ得るモジュレーター、新規アゴニストの同定を提供する。意外なことに、ＯＲ５Ａ２嗅覚受容体は、本明細書に定義されるムスク化合物のすべての公知のクラスによって活性化され得る唯一のＯＲである。
【０１１１】
ＯＲの活性を調節する剤の同定のためのアッセイ
ＯＲの活性を調節する剤は、前記受容体とムスク化合物との相互作用を利用する多くの方法で同定することができる。例えば、インビトロ、培養細胞上、またはインビボのいずれかで結合したＯＲ５Ａ２／ムスク化合物を再構成する能力は、その結合を調節する剤を同定するための標的を提供する。その後、ＯＲ／ムスク結合のモジュレーターは、結合アッセイまたは前記受容体を介した下流のシグナル伝達を測定する機能的アッセイを使用してスクリーニングすることができる。結合アッセイおよび機能的アッセイの両方とも、ムスク化合物を用いて検証される。
【０１１２】
ＯＲ５Ａ２機能を調節する剤を同定するためにＯＲ５Ａ２／ムスク化合物の相互作用をより直接的に使用する別のアプローチは、候補剤または候補モジュレーターによって誘導されるＯＲ５Ａ２下流シグナル伝達の変化を測定する。これらの機能的アッセイは、単離された細胞膜画分、またはその表面で受容体を発現する細胞において実施することができる。
【０１１３】
以下の記述は、ＯＲ５Ａ２と１つ以上のムスク化合物との相互作用に基づく結合アッセイおよび機能的アッセイの両方の方法を提供する。
【０１１４】
Ａ．ＯＲポリペプチド
本明細書で定義されるＯＲポリペプチドとムスク化合物との相互作用を使用するアッセイは、ＯＲポリペプチドの供給源を必要とする。ヒトＯＲのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、本明細書中の「配列表」に示されている。ヒトＯＲ５Ａ２は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースアクセッション番号ＮＭ＿００１００１９５４．１（配列番号１）、ＮＭ＿００１００１９５４．１：ｃ．５１５Ｃ＞Ｔ（配列番号３）でも入手できる。これらのポリペプチド配列はまた、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースにおいてアクセッション番号Ｑ８ＮＧＩ９，ＶＡＲ＿０２４０９７でそれぞれ記録されている。
【０１１５】
当業者であれば、公知の配列から設計されたプライマーまたはプローブを用い基本的なＰＣＲおよび分子クローニング技術を介して、タンパク質をコードするｍＲＮＡを含むサンプルから容易にＯＲ配列を増幅することができる。また、ＯＲ遺伝子はイントロンレス遺伝子であるため、当業者であればゲノムＤＮＡからＯＲ配列を増幅することができる。
【０１１６】
組換えポリペプチドの発現は当技術分野で周知である。当業者は、真核生物または原核生物細胞における本発明に記載のＯＲポリペプチドの発現のためのベクターおよび発現制御配列を容易に選択することができる。ＯＲポリペプチドは、好ましくは、結合機能またはシグナル伝達機能を有するために、細胞膜または合成リポソームに付随している。細胞膜画分の調製のための方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、Hubbard & Cohn, 1975, J. Cell Biol. 64: 461-479によって報告された方法が参照により本明細書に組み込まれる。ＯＲポリペプチドを含む膜を製造するために、例えば、本発明のＯＲポリペプチドの１つを内因性にまたは組換え的に発現する細胞に、そのような膜単離技術を適用することができる。あるいは、ＯＲポリペプチドは、ポリペプチドのデタージェント溶液を希釈することにより、膜調製物に組み込むことができる（例えば、Salamon et al., 1996, Biophys. J. 71:283-294、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１７】
Ｂ．ムスク化合物
ムスク分子の構造は、当業者にはよく知られている。さらに、当業者であれば、前記構造から等価なムスクを容易に導出することができ、前記等価物が本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドに結合および／または調節することができるかどうかを容易に試験することができる。ムスク化合物は、天然サンプルから単離されてもよいし、化学的に合成されてもよい。
【０１１８】
前記化合物を定量するために使用しうる方法は、ａ）抽出および精製のための方法：溶媒抽出、油抽出、蒸気抽出、ＣＯ２超臨界抽出、液体クロマトグラフィー、蒸留、ガスクロマトグラフィー；ｂ）定量のための方法：ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーおよび質量分析、であってもよいが、これらに限定されない。前記の方法は、当技術分野でよく知られている。
【０１１９】
ムスク化合物は、精製された形態で使用されてもよいし、組成物として使用されてもよい。所定の結合アッセイまたは本発明に記載の機能性アッセイにおいて必要とされるムスクの量は、アッセイによって変わるだろう。所定のアッセイに必要であれば、ムスク化合物は、上で指摘したように、放射性ラベルの組み込みまたは添加によって標識することができる。
【０１２０】
Ｃ．ＯＲ活性のモジュレーターを同定するためのアッセイ
現在知られている４つの構造的に多様な化学物質群のムスク化合物が、クラス２の嗅覚受容体ファミリーに属する、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２のリガンドであるという発見は、前記ＯＲの活性のアゴニストおよびモジュレーターを同定するためのスクリーニングアッセイの開発を可能にする。スクリーニングアッセイは、２つの一般的なアプローチを有するだろう。
【０１２１】
１）前記ＯＲ５Ａ２を発現する細胞、かかる細胞からの膜抽出物、または前記ＯＲ５Ａ２を含む固定化脂質膜を、前記ＯＲ５Ａ２と候補化合物を結合することが知られている本明細書で定義されている１つ以上の標識ムスク化合物に曝露する、リガンド結合アッセイ。インキュベーション後、反応混合物を測定し、標識ムスク化合物が前記ＯＲ５Ａ２に特異的に結合しているかどうかを測定する。標識されたムスク化合物がＯＲ５Ａ２を妨害するか、またはＯＲ５Ａ２から置換する化合物は、モジュレーター、好ましくはＯＲ５Ａ２活性の増強剤として同定することができる。肯定的な化合物について機能分析を実施して、それらがこれらのカテゴリーのうちのどのカテゴリーに適合するかを決定することができる。
【０１２２】
化合物の結合は、競合的結合、非競合的結合および不競合的結合の３つの主要なカテゴリーに分類することができる。競合的結合化合物は、第二の（参照）化合物に似ており、標的分子（ここでは受容体）の同じ結合ポケットに結合する。添加されると、競合的結合化合物は、前記第二の化合物を前記標的から置換させる。非競合的結合化合物は、第二の（参照）化合物と同じ標的分子の結合ポケットには結合しないが、前記第二の化合物の前記標的分子に対する効果と相互作用してもよい。第二の化合物は、非競合的結合化合物の添加時に置換されない。不競合的結合化合物は、第二の化合物が既に結合しているときに標的分子に結合する。協調的結合とは、ある化合物が、参照化合物であってもよい別の化合物の結合を促進することを意味する。協調的効果は、このようにして、前記他の化合物のＫｄの分析に見られる。
【０１２３】
２）本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２のシグナル伝達活性を測定する機能的アッセイ。
アゴニストスクリーニングのために、前記ＯＲ５Ａ２を発現する細胞またはそれらから調製された膜を候補化合物とインキュベートし、前記ＯＲ５Ａ２のシグナル伝達活性を測定する。アッセイは、アゴニストとして本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物を用いて検証され、受容体活性を調節する化合物によって誘導された活性を、ムスク化合物によって誘導された活性と比較する。アゴニストまたは部分アゴニストは、アゴニストまたは部分アゴニストが１００μＭ以下で存在する場合、ムスク化合物の最大活性の少なくとも１０％に対応する最大生物学的活性を有し、好ましくは、ムスク化合物の５０％、７５％、１００％以上の活性、ムスク化合物より２倍、５倍、１０倍以上の活性を有するだろう。
【０１２４】
リガンド結合および置換アッセイ：
ムスク化合物のＯＲポリペプチドへの結合を増強する化合物をスクリーニングするために、細胞内で発現した本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチド、またはそのようなＯＲ５Ａ２ポリペプチドを含む単離した膜を、本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物とともに使用することができる。結合またはムスク化合物の置換を単独で測定するアッセイにおいて同定された場合、化合物は、それらがアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストとして作用するかどうかを決定するために、機能性試験を受けなければならない。
【０１２５】
置換実験のために、前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する細胞（一般に、アッセイあたり２５，０００細胞または膜抽出物１〜１００μｇ）を、結合緩衝液（例えば、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４；１ｍＭ  ＣａＣｌ２；０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）脂肪酸フリー；および０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で、候補モジュレーターの増加する濃度の存在下または非存在下で、標識されたムスク化合物と１．５時間（例えば、２７℃で）インキュベートする。アッセイを検証し、較正するために、標識されていないムスクの増加する濃度を用いた対照競合反応を行うことができる。インキュベーション後、細胞を広範囲に洗浄し、結合した標識ムスク化合物を、所与の標識に適した方法（例えば、シンチレーションカウント、酵素アッセイ、蛍光など）で測定する。候補モジュレーターの存在下で結合した標識されたムスク化合物の量の少なくとも１０％の減少は、候補モジュレーターによる結合の置換を示す。候補モジュレーターは、標識されたムスク化合物の５０％を置換させる場合、本明細書に記載されたこのアッセイまたは他のアッセイにおいて特異的に結合すると考えられる。
【０１２６】
あるいは、結合または結合の置換は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってモニターすることができる。表面プラズモン共鳴アッセイは、水相からのムスク化合物の、センサー上の膜に固定化された前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドへの結合または損失によって生じる固定化センサー近傍の質量の変化によって、２つの分子間の結合を測定する定量的な方法として使用することができる。この質量の変化は、ムスクまたは候補モジュレーターの注入または除去後の時間に対する共鳴単位として測定され、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｅｒ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）を用いて測定される。本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドは、Ｓａｌａｍｏｎらにより記載された方法（Salamon et al., 1996, Biophys J. 71: 283-294; Salamon et al., 2001, Biophys. J. 80: 1557-1567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sci. 24: 213-219、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に従って、薄層脂質膜中でセンサーチップ（例えば、research grade CM5 chip; Biacore AB)上に固定化しうる。Ｓａｒｒｉｏらは、チップ上の脂質層に固定化されたＧＰＣＲ  Ａ（１）アデノシン受容体へのリガンド結合を検出するためにＳＰＲを使用できることを実証した（Sarrio et al., 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5164-5174、参照により本明細書に組み込まれる）。ＳＰＲアッセイにおける前記ＯＲ５Ａ２へのムスクの結合のための条件は、Ｓａｒｒｒｉｏらによって報告された条件を出発点として使用して、当業者によって微調整することができる。
【０１２７】
ＳＰＲは、少なくとも２つの方法で結合のモジュレーターをアッセイすることができる。まず、本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物を、固定化された本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドに予め結合させることができ、次いで、約１０μｌ／分の流速で、１ｎＭから１０００μＭの範囲の濃度、好ましくは約１００μＭで、候補モジュレーターを注入する。結合したムスク化合物の置換を定量化し、モジュレーター結合の検出を可能にする。あるいは、膜結合したムスク化合物は、候補モジュレーターとプレインキュベートし、ムスク化合物でチャレンジすることができる。モジュレーターに曝露された前記ＯＲ５Ａ２に対するムスクの結合が、モジュレーターに事前に曝露されていないチップ上のものと比較して差があることは、結合を示すことになる。いずれのアッセイにおいても、候補モジュレーターの存在下で結合したムスク化合物の量が、候補モジュレーターの非存在下で結合したムスク化合物の量と比較して１０％以上減少することは、候補モジュレーターが前記ＯＲ５Ａ２と前記ムスク化合物との相互作用を阻害していることを示す。Ｂｉａｃｏｒｅシステムは、質量分析、またはガスクロマトグラフィーなどの候補モジュレーターを同定するシステムに接続することができる。
【０１２８】
本明細書で定義されるムスク化合物の本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体への結合の阻害を測定する別の方法は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を使用する。ＦＲＥＴは、蛍光ドナー（Ｄ）の発光スペクトルが蛍光アクセプター（Ａ）の励起スペクトルと重なる場合に、互いに近接した（通常は１００Ａ未満の分離）ＤとＡとの間で起こる量子力学的現象である。試験される分子、例えば、1つ以上のムスク化合物とＯＲ５Ａ２ポリペプチドは、相補的なドナー蛍光体とアクセプター蛍光体のペアで標識されている。ＯＲ５Ａ２／ムスク化合物の相互作用により互いに近接している間、ドナー蛍光体の励起時に放出される蛍光は、分子が結合していないときの励起波長に応答して放出される蛍光とは異なる波長を有することになり、したがって、各波長での放出強度の測定により、結合したポリペプチドと結合していないポリペプチドの定量化を可能にする。標的分子を標識するドナー／アクセプターペアの蛍光体は、当技術分野でよく知られている。
【０１２９】
ＦＲＥＴのバリエーションの一つは、分子間相互作用をモニターするために蛍光消光を使用する。相互作用するペアの一方の分子は蛍光体で標識され、もう一方の分子は蛍光体と近接した状態で蛍光体の蛍光を消光する分子で標識されうる。励起時の蛍光の変化は、蛍光体でタグ付けされた分子と蛍光体：消光ペアのアソシエーションの変化を示している。一般的に、標識されたＯＲ５Ａ２ポリペプチドの蛍光の増加は、消光剤を有するムスク化合物が置換されたことを示している。消光アッセイでは、候補モジュレーターを含むサンプル中の蛍光発光強度が、候補モジュレーターを含まないサンプルと比較して１０％以上増加することは、候補モジュレーターがＯＲ５Ａ２／ムスク化合物の相互作用を阻害していることを示している。
【０１３０】
生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）は、インビボでの分子間相互作用をモニターするためのシステムである。このアッセイは、レニラ・ルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）と、例えば黄色蛍光タンパク質（ＹＰＦ）または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む融合タンパク質間の非放射エネルギー転移に基づいている。ＢＲＥＴシグナルは、セレンテラジン誘導体基質の酸化によって生成される。前記システムは、細胞透過性で毒性のないセレンテラジン誘導体基質ＤｅｅｐＢｌｕｅＣＴＭ（ＤＢＣ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の変異体をアクセプターとして適用してもよい。ドナーとアクセプターが近接している場合、ＤＢＣの触媒分解から生じるエネルギーは、ＲｌｕｃからＧＦＰに転移され、ＧＦＰはその特徴的な波長で蛍光を発するようになる。この方法では、試験した２つの分子間の距離をより長くすることができ、蛍光体の角度に依存しない。
【０１３１】
表面プラズモン共鳴法、ＦＲＥＴ法およびＢＲＥＴ法に加えて、蛍光偏光測定は、ムスク／受容体結合の定量に有用である。蛍光標識された分子の蛍光偏光値は、回転相関時間またはタンブリング速度に依存する。１つ以上の蛍光標識されたムスク化合物と結合したＯＲ５Ａ２によって形成されるようなタンパク質複合体は、複合体化されていない標識されたムスク化合物よりも高い偏光値を有する。ＯＲ５Ａ２／ムスク化合物相互作用の候補モジュレーターを含むことは、候補モジュレーターを含まない混合物と比較して、蛍光偏光の増加（活性化）または減少（阻害）をもたらす、例えば、候補阻害剤がＯＲ５Ａ２とムスク化合物の相互作用を破壊または阻害する場合。蛍光偏光は、ポリペプチドまたはタンパク質複合体の形成を破壊する低分子の同定に好適である。候補モジュレーターを欠いたサンプルにおける蛍光偏光と比較して、候補モジュレーターを含むサンプルにおける蛍光偏光の１０％以上のモジュレーションは、候補モジュレーターがＯＲ５Ａ２／ムスク化合物の相互作用を調節していることを示している。
【０１３２】
ＯＲ５Ａ２／ムスク化合物相互作用をモニターするためのもう一つの代替手段は、バイオセンサーアッセイを使用する。ＩＣＳバイオセンサーは、ＡＭＢＲＩ（Australian Membrane Biotechnology Research Institute; http//www.ambri.com.au/）により説明されている。この技術では、ＯＲやムスク化合物などの分子のアソシエーションは、懸濁膜二重層中のグラマシジンで促進されたイオンチャネルの閉鎖と結びつき、バイオセンサーのアドミタンス（インピーダンスに類似）の測定可能な変化につながる。このアプローチは、アドミタンス変化の６桁の大きさにわたって線形であり、低分子コンビナトリアルライブラリーの大規模で高スループットのスクリーニングに理想的である。候補モジュレーターを含まないサンプルのアドミタンスと比較して、候補モジュレーターを含むサンプルのアドミタンスの１０％以上の変化（増加または減少）は、候補モジュレーターがＯＲ５Ａ２とムスク化合物の相互作用に影響を与えていることを示している。
【０１３３】
酸−タンパク質相互作用のアッセイにおいて、相互作用のモジュレーターは、必ずしも物理的に相互作用するタンパク質のドメインと直接相互作用する必要がない可能性があることに注意することが重要である。モジュレーターが、酸−タンパク質相互作用の部位から離れた場所で相互作用し、例えば、ＯＲ５Ａ２ポリペプチドにおけるコンフォメーション変化を引き起こすことも可能である。このように作用する調節剤（阻害剤またはアゴニスト）は、それにもかかわらず、ＯＲ５Ａ２の活性を調節する剤として興味深い。
【０１３４】
記載された結合アッセイのいずれかは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドに結合する、または１つ以上のムスク化合物の前記ＯＲ５Ａ２への結合に影響を与える、サンプル、例えば組織サンプル中の剤の存在を決定するために使用することができる。そのためには、ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを、サンプルの存在下または非存在下で、１種以上のムスク化合物または別のリガンドと反応させ、前記ムスク化合物またはリガンドの結合を、使用される結合アッセイに適切に測定する。前記ムスク化合物または他のリガンドの結合における１０％以上のモジュレーションは、サンプルがムスク化合物またはリガンドのＯＲ５Ａ２ポリペプチドへの結合を調節する剤を含むことを示す。
【０１３５】
プロテインチップ
本明細書で定義される方法を、プロテインチップに適用してもよい。前記プロテインチップは、スライドガラスまたはニトロセルロース膜であってもよいが、これに限定されない。プロテインチップのためのアレイベースの方法は、当技術分野でよく知られている。タンパク質アレイは、好ましくは、本明細書で定義される１つ以上のＯＲ５Ａ２ポリペプチドまたは前記ＯＲポリペプチドのＴＭ２〜７中央領域などのムスク化合物との結合に関与するフラグメントを含む。プロテインチップは、好ましくは、本明細書で定義される全ての変異体ＯＲ５Ａ２ポリペプチドまたはキメラポリペプチド、またはムスク化合物との結合に関与するそれらのフラグメントを含む。
【０１３６】
受容体活性の機能的アッセイ
機能的アッセイの非網羅的なリストは、このセクションで詳述されている：
ｉ．ＧＴＰａｓｅ／ＧＴＰ結合アッセイ：
ＯＲポリペプチドなどのＧＰＣＲについては、受容体活性の指標は、受容体を含む細胞膜によるＧＴＰの結合である。Traynor and Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol. 47: 848-854（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法では、実質的に、標識されたＧＴＰの膜への結合を測定することによって、膜へのＧタンパク質のカップリングを測定する。ＧＴＰ結合アッセイのために、受容体を発現する細胞から単離した膜を、一般に２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８０ｐＭ  ３５Ｓ−ＧＴＰγＳおよび３μＭ  ＧＤＰを含む緩衝液中でインキュベートする。アッセイ混合物は、所定の温度で一定時間、例えば３０℃で６０分間、インキュベートし、その後ＧＦ／Ｂフィルター上でろ過することにより、結合していない標識ＧＴＰが除去される。結合された、標識されたＧＴＰを、液体シンチレーションカウントによって測定する。ムスク化合物誘発性ＯＲ５Ａ２活性のモジュレーションをアッセイするために、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する細胞から調製した膜を、本明細書で定義される１種以上のムスク化合物と混合し、ＯＲ５Ａ２活性の候補モジュレーターの存在下および非存在下でＧＴＰ結合アッセイを実施する。候補モジュレーターを含むこの種のアッセイにおいて、モジュレーターを含まないアッセイと比較して、シンチレーションカウントによって測定される標識ＧＴＰ結合における１０％以上のモジュレーションは、候補モジュレーターがＯＲ５Ａ２活性を阻害または活性化することを示す。
【０１３７】
同様のＧＴＰ結合アッセイは、アゴニストとして作用する化合物を同定するために、ムスク化合物なしで実施することができる。この場合、ムスク化合物で刺激されたＧＴＰ結合が標準として使用される。化合物が１ｍＭ以下で存在するときに、ムスク化合物によって誘導されるＧＴＰ結合のレベルの少なくとも５０％を誘導し、好ましくはムスク化合物によって誘導されるレベルと同じかそれよりも高いレベルを誘導する場合、化合物はアゴニストとみなされる。
【０１３８】
ＧＴＰａｓｅ活性は、ＯＲポリペプチドを含む膜をガンマ−３２Ｐ−ＧＴＰでインキュベートすることにより測定する。活性ＧＴＰａｓｅは、２０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４中の活性炭の５％懸濁液中の遊離無機ホスフェートの分離によって検出される無機ホスフェートとしてラベルを放出し、その後、シンチレーションカウントを行う。コントロールとしては、候補化合物の潜在的な非特異的効果を除外するために、ＯＲを発現していない細胞（モックトランスフェクトされた）から分離された膜を使用したアッセイが挙げられる。
【０１３９】
ＯＲ５Ａ２−調節されたＧＴＰａｓｅ活性に対する候補モジュレーターの効果をアッセイするために、膜サンプルを、モジュレーターを伴うまたは伴わないでで、本明細書で定義される１種以上のムスク化合物でインキュベートし、次いでＧＴＰａｓｅアッセイを行う。モジュレーターを含まないサンプルと比較して、ＧＴＰ結合またはＧＴＰａｓｅ活性のレベルの１０％以上の変化（増加または減少）は、候補モジュレーターによるムスク化合物のモジュレーションを示す。
【０１４０】
ｉｉ．下流経路活性化アッセイ：
ａ．カルシウムフラックス−エクオリンベースのアッセイ。
エクオリンアッセイは、ＧＰＣＲの活性化によって誘導される細胞内カルシウム放出またはカルシウムフラックス（入口）に対するミトコンドリアまたは細胞質アポエクオリンの応答性を利用する（Stables et al., 1997, Anal. Biochem. 252:115-126; Detheux et al., 2000, J. Exp. Med., 192 1501-1508；その両方が参照により本明細書に組み込まれる）。簡単に説明すると、ＯＲを発現するクローンを、ミトコンドリアまたは細胞質アポエクオリンおよびＧ−アルファ−１６またはＧ−ｏｌｆを共発現するようにトランスフェクトする。細胞を、５μＭセレンテラジンＨまたはその誘導体（分子プローブ）で室温で４時間インキュベートし、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地で洗浄し、０．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁する。次に細胞をテストアゴニストペプチドと混合し、エクオリンによる発光を３０秒間ルミノメーターで記録する。結果は、相対光単位（ＲＬＵ）として表される。コントロールとしては、候補化合物の潜在的な非特異的効果を除外するために、Ｃ３５６を発現していない細胞（モックトランスフェクトされた）から単離された膜を用いたアッセイが挙げられる。
【０１４１】
ＯＲポリペプチドを発現し候補モジュレーターで処理した細胞のサンプルにおける光強度が、ＯＲポリペプチドを発現しているが候補モジュレーターで処理していない細胞のサンプル、またはＯＲポリペプチドを発現していない（モックトランスフェクト細胞）が候補モジュレーターで処理した細胞のサンプルと比較して、１０％以上増加または減少した場合に、エクオリン活性または細胞内カルシウムレベルが「変化」している。
【０１４２】
本明細書で定義されるムスク化合物の非存在下で実施される場合、アッセイは、ＯＲ５Ａ２活性のアゴニストまたはインバースアゴニストを同定するために使用することができる。本明細書で定義されるムスク化合物の存在下でアッセイを行う場合、ＯＲ５Ａ２活性の増強剤をアッセイするために使用することができる。
【０１４３】
１）Ｆｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ４、Ｆｕｒａ２、Ｃａｌｃｉｕｍ３またはＣａｌｃｉｕｍ６ベースのアッセイ。
蛍光ベースのアッセイは、受容体の活性化によって誘発されるカルシウムフラックスを利用する：例えば、ＣＮＧを介したカルシウムの流入または小胞体からのカルシウムの放出のいずれかを利用する。限定されないが、Ｆｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ４およびＦｕｒａ２（分子プローブ）などのいくつかの蛍光体、ならびにＣａｌｃｕｍ３またはＣａｌｃｉｕｍ６キットシリーズ（分子デバイス）は、カルシウムと結合することが知られている。このような蛍光体−カルシウム複合体は、特定の波長で蛍光を発する。これにより、Ｇタンパク質共役型受容体が活性化されると、小胞体から放出されたカルシウムまたはＣＮＧを介して侵入したカルシウムが蛍光体と結合し、特異的な蛍光を発するようになる。ＯＲを過剰発現させた細胞を１〜８μＭの蛍光体溶液で３０〜６０分間、３７℃でインキュベートする。生理食塩水バッファーで完全に洗浄した後、同じバッファーの５０μｌを細胞を含む各ウェルに注ぐ（６〜１５３６）。次にテストアゴニストをそのような負荷された細胞に注入し、ＯＲの活性化は、蛍光測定に続いて行われる。
【０１４４】
本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現し候補モジュレーターで処理された細胞のサンプルにおいて、蛍光強度が、ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現しているが候補モジュレーターで処理されていない細胞のサンプル、またはＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現していない（モックトランスフェクトされた細胞）が候補モジュレーターで処理された細胞のサンプルと比較して、１０％以上増加または減少する場合に、細胞内カルシウムレベルが「変化」している。
【０１４５】
２）脱分極／過分極膜アッセイ（例えばＤｉＢａｃ蛍光体）。
このアッセイの原理は、細胞膜の脱分極に従うことにある。アニオン性プローブＤｉＢＡＣ４（３）は、膜電位に依存して細胞内と細胞外の区画を分割する。膜電位の上昇（脱分極）に伴い、プローブはさらに細胞内に分裂し、その結果、蛍光が増加する。逆に、過分極すると、色素の押し出しにより蛍光が減少する。
【０１４６】
ＤｉＢＡＣ４（３）プローブは４８８ｎｍの波長で励起され、５４０ｎｍの波長で発光する。
【０１４７】
実験当日、グルコースを最終濃度１０ｍＭに、ＤｉＢＡＣ４（３）プローブを最終濃度５μＭになるようにアッセイバッファー（生理食塩水バッファー）に添加する。アッセイバッファーを３７℃で維持する。細胞培養液を取り除き、ＯＲ過剰発現細胞を含む各ウェルを２００μｌの予熱アッセイバッファーで２回すすぐ。ＤｉＢＡＣ４（３）を含むアッセイバッファーを１８０μｌ入れ、細胞を適当な温度で３０分間インキュベートする。３０分間のインキュベーション後、細胞プレートはアッセイの準備ができている。添加前にベースラインを２分間採取する。２０μｌの候補モジュレーターを適切なウェルに添加し、さらに２５分間データを収集する。
【０１４８】
本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現し候補モジュレーターで処理された細胞のサンプルにおいて、蛍光強度が、ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現しているが候補モジュレーターで処理されていない細胞のサンプル、またはＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現していない（モックトランスフェクト細胞）が候補モジュレーターで処理された細胞のサンプルと比較して、１０％以上増加または減少した場合に、膜分極は「変化」している。
【０１４９】
３）メラノフォアアッセイ。メラノフォアアアッセイは、カラーベースのアッセイである。基本的にこのアッセイに使用される細胞は、カエル、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｌａｅｖｉｓ）の皮膚に由来している。これらの不死化細胞にはメラノソームが含まれており、これは暗い色素を含む小器官である。アデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼＣの活性化を引き起こす内因性または組換えＧＰＣＲの活性化は、メラノソームの分散、その結果細胞の黒化につながる。あるいは、アデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼＣを阻害するＧＰＣＲは、細胞を明るくすることにつながる。これにより、セカンドメッセンジャーの濃度を測定するのではなく、細胞の色変化を観察してピンポイントでヒットすることが容易になる。この色の変化は、６５０ｎＭの吸光度を測定するマイクロプレートリーダーまたはビデオイメージングシステムで検査することで容易に定量化することができる。
【０１５０】
ｂ．アデニル酸シクラーゼアッセイ。
アデニル酸シクラーゼ活性のためのアッセイは、Kenimer & Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20: 585-591、に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。そのアッセイは、Solomon et al., 1974, Anal. Biochem. 58: 541-548、によって教示されたアッセイの改変であり、これも参照により本明細書に組み込まれる。簡単に説明すると、１００μｌの反応は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭクレアチンホスフェート（二ナトリウム塩）、クレアチンホスホキナーゼの１０単位（７１μｇのタンパク質）、１ｍＭ  α−３２Ｐ−ＡＴＰ（四ナトリウム塩、２μＣｉ）、０．５ｍＭサイクリックＡＭＰ、Ｇ−３Ｈ標識サイクリックＡＭＰ（約１０，０００ｃｐｍ）、０．５ｍＭ  Ｒｏ２０−１７２４、０．２５％エタノール、および５０〜２００μｇの試験されるタンパク質ホモジネート（すなわち、ＯＲポリペプチドを発現するまたは発現しない、カルボン酸で処理されたまたは処理されていない、候補モジュレーターを含むまたは含まない、細胞からのホモジネート）を含む。反応混合物は、一般に３７℃で６分間インキュベートされる。インキュベーションに続いて、反応混合物は、０．９ｍｌの６％冷トリクロロ酢酸の添加によって脱タンパク化される。チューブを１８００×ｇで２０分間遠心分離し、各上清溶液をＤｏｗｅｘ  ＡＧ５０Ｗ−Ｘ４カラムに添加する。カラムからのｃＡＭＰ画分は、０．１ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の４ｍｌでカウントバイアルに溶出される。アッセイは３回行うべきである。コントロール反応は、ＯＲポリペプチドを発現しない細胞からのタンパク質ホモジネートを使用しても行うべきである。
【０１５１】
アッセイは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する、本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物で処理したか処理していないか、候補モジュレーターを含むか含まない、細胞または細胞の抽出物を用いて行うべきである。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトされた細胞、またはそれらからの抽出物を用いて実施すべきである。
【０１５２】
本発明によれば、ＯＲ５Ａ２活性の候補モジュレーターで処理した細胞から採取したサンプルにおけるアデニル酸シクラーゼ活性が、候補モジュレーターで処理していない細胞の類似サンプル、またはＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現していない（モックトランスフェクト細胞）が候補モジュレーターで処理した細胞のサンプルと比較して、１０％以上増加または減少する場合、アデニル酸シクラーゼ活性が「変化」している。あるいは、参照化合物で処理したサンプルにおけるＯＲ５Ａ２ポリペプチドの候補モジュレーターによる１０％以上の活性の減少を試験してもよい。
【０１５３】
ｃ．ｃＡＭＰアッセイ：
細胞内ｃＡＭＰは、当技術分野で広く知られている方法に従って、ｃＡＭＰラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはｃＡＭＰ結合タンパク質を用いて測定される。例えば、Ｈｏｒｔｏｎ  ＆  Ｂａｘｅｎｄａｌｅ，  １９９５，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４１：  ９１−１０５（参照により本明細書に組み込まれる）には、ｃＡＭＰのためのＲＩＡが記載されている。
【０１５４】
ｃＡＭＰの測定のための多くのキット、例えば、ＬＪＬ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓおよびＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから販売されている高効率蛍光偏光ベースのホモジニアスアッセイなどが市販されている。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的な非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトした細胞の抽出物を用いて実施すべきである。
【０１５５】
アッセイは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する、ムスク化合物で処理したまたは処理していない、候補モジュレーターを含むまたは含まない、細胞または細胞の抽出物を用いて実施すべきである。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトされた細胞またはそれらからの抽出物を用いて実施すべきである。
【０１５６】
本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現し、ＯＲ５Ａ２活性の候補モジュレーターで処理された細胞（またはそのような細胞の抽出物中）において、Ｈｏｒｔｏｎ＆Ｂａｘｅｎｄａｌｅ，１９９５，ｓｕｐｒａのＲＩＡベースのアッセイを使用して検出されるｃＡＭＰのレベルが、候補モジュレーターで処理されていない類似の細胞におけるｃＡＭＰレベルと比較して、少なくとも１０％増加または減少する場合、ｃＡＭＰのレベルが「変化」している。
【０１５７】
ｄ．リン脂質の分解、ＤＡＧ産生およびイノシトール三リン酸レベル：
リン脂質の分解を活性化する受容体は、リン脂質の分解、およびその結果として生じるセカンドメッセンジャーＤＡＧおよび／またはイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の産生をモニターすることによって、公知または疑わしいＯＲのモジュレーターの活性による変化をモニターすることができる。これらのそれぞれを測定する方法は、Ｉａｎ  Ｍ．Ｂｉｒｄによって編集されたPhospholipid Signaling Protocols、Totowa, NJ, Humana Press, 1998,に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。ホスファチジルイノシトール分解のためのアッセイについても記載されているRudolph et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 11824-11831も参照、参照により本明細書に組み込まれる。アッセイは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する、本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物で処理したまたは処理していない、候補モジュレーターを含むまたは含まない、細胞または細胞の抽出物を用いて実施すべきである。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的な非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトされた細胞、またはそれらからの抽出物を用いて実施すべきである。
【０１５８】
本発明によれば、ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現し、１つ以上のムスク化合物の存在下または非存在下で候補モジュレーターで処理された細胞からのサンプルにおいて、ホスファチジルイノシトール分解、およびジアシルグリセロールおよび／またはイノシトール三リン酸のレベルが、候補モジュレーターで処理されていないカルボキシルポリペプチドを発現する細胞からのサンプルで観察されるレベルと比較して、少なくとも１０％増加または減少する場合、「変化」している。
【０１５９】
ｅ．ＰＫＣ活性化アッセイ：
成長因子受容体チロシンキナーゼは、リン脂質およびカルシウムで活性化されたプロテインキナーゼのファミリーであるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化を含む経路を介してシグナル伝達する傾向がある。ＰＫＣの活性化は最終的に、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｊｕｎなどの癌原遺伝子転写因子をコードする遺伝子、プロテアーゼ、コラゲナーゼタイプＩやプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤などのプロテアーゼ阻害剤および細胞内接着分子Ｉ（ＩＣＡＭ  Ｉ）などの接着分子の配列の転写をもたらす。ＰＫＣによって誘導される遺伝子産物の増加を検出するように設計されたアッセイは、ＰＫＣ活性化およびそれによる受容体活性をモニターするために使用することができる。さらに、ＰＫＣを介してシグナルを発する受容体の活性は、ＰＫＣ活性化によって活性化された遺伝子の制御配列によって駆動されるレポーター遺伝子構築物の使用によってモニターすることができる。このタイプのレポーター遺伝子に基づくアッセイは、以下でより詳細に論じられる。
【０１６０】
ＰＫＣ活性のより直接的な測定については、Kikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 13341（参照により本明細書に組み込まれる）の方法を使用することができる。このアッセイは、ＰＫＣ基質ペプチドのリン酸化を測定するものであり、これは、その後、ホスホセルロース紙に結合することによって分離される。このＰＫＣアッセイ系は、精製キナーゼの活性、または粗細胞抽出物中の活性を測定するために使用することができる。プロテインキナーゼＣサンプルは、アッセイ直前に２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／２ｍＭ  ＤＴＴで希釈することができる。
【０１６１】
アッセイの基質は、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質タンパク質（ＭＡＲＣＫＳ）に由来するペプチドＡｃ−ＦＫＫＳＦＫＬ−ＮＨ２（配列番号５）である。このペプチドに対する酵素のＫｍは約５０μＭである。他の塩基性、当技術分野で知られているプロテインキナーゼＣ選択性ペプチドもまた、そのＫｍの少なくとも２〜３倍の濃度で使用することができる。アッセイに必要な補因子としては、カルシウム、マグネシウム、ＡＴＰ、ホスファチジルセリンおよびジアシルグリセロールなどが挙げられる。使用者の意図に応じて、アッセイは、存在するＰＫＣの量（活性化条件）または存在する活性ＰＣＫの量（非活性化条件）を決定するために実施することができる。本発明に記載のほとんどの目的では、活性化できるＰＫＣを測定するのではなく、単離されたときにサンプル中で活性化されているＰＫＣを測定するような、非活性化条件が使用される。非活性化条件については、カルシウムは、ＥＧＴＡを選択して、アッセイにおいて除去される。
【０１６２】
アッセイは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．４、１−２ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ＡＴＰ、〜１μＣｉ  γ−３２Ｐ−ＡＴＰ、１００μｇ／ｍｌペプチド基質（〜１００μＭ）、１４０μＭ／３．８μＭホスファチジルセリン／ジアシルグリセロール膜、および１００μＭカルシウム（または最も好ましくは５００μＭ  ＥＧＴＡ）を含む混合物中で実施される。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＤＴＴで希釈したサンプル４８μｌを最終反応量８０μｌで使用する。反応は３０℃で５〜１０分間行い、その後、１００ｍＭ  ＡＴＰと１００ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶液２５μｌをｐＨ値８．０で添加して反応を停止させる。
【０１６３】
反応停止後、各反応の一部（８５μｌ）をワットマンＰ８１リン酸セルロースフィルター上にスポッティングし、次いで洗浄する：０．４％リン酸５００ｍｌを４回（１回の洗浄につき５−１０分）；および５００ｍｌ  ９５％ＥｔＯＨ中で２−５分間の最終洗浄を行う。結合放射能は、シンチレーションカウントによって測定する。標識されたＡＴＰの比活性（ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）は、Ｐ８１紙に反応のサンプルをスポッティングし、洗浄せずにカウントすることによって決定する。ＰＫＣ活性の単位は、１分間に転移されたホスフェートｎｍｏｌとして定義し、次のように計算する：
【０１６４】
活性は、ユニット（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ）で表される：
＝（ペーパー上のｃｐｍ）ｘ（合計１０５μｌ／８５μｌの斑点）
（アッセイ時間、分）（ＡＴＰの比活性ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）
【０１６５】
代替のアッセイは、ＰａｎＶｅｒａから販売されているＰｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ．＃Ｐ２７４７）を用いて実施することができる。
【０１６６】
アッセイは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する、本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物で処理したか処理していないか、候補モジュレーターを含むか含まない細胞からの抽出物において実施すべきである。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的な非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトされた細胞、またはそれらからの抽出物を用いて実施すべきである。
【０１６７】
本発明によれば、ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現し、候補モジュレーターで処理された細胞からの抽出物における上記のいずれかのアッセイによって測定されたＰＫＣの単位が、候補モジュレーターで処理されていない細胞からの類似のサンプルで行われた反応と比較して、少なくとも１０％増加または減少するときに、ＰＫＣ活性は候補モジュレーターによって「変化」している。
【０１６８】
ｆ．ＰＫＡ活性化アッセイ
ＰＫＡ活性は、市販されているいくつかのキットのいずれか、例えば、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅのＩＭＡＰ  ＰＫＡアッセイキット、またはｐｒｏｍｅｇａのＰｒｏＦｌｕｏｒ  ＰＫＡアッセイキットなどを用いてアッセイすることができる。
【０１６９】
アッセイは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する、本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物で処理したか処理していないか、候補モジュレーターを含むか含まない、細胞または細胞の抽出物を用いて実施すべきである。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的な非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトされた細胞、またはそれらからの抽出物を用いて実施すべきである。
【０１７０】
候補モジュレーターで処理したＯＲポリペプチドを発現する細胞からのサンプルにおけるＰＫＡ活性のレベルが、候補モジュレーターで処理していない類似の細胞からのサンプルにおけるＰＫＡキナーゼ活性と比較して、１０％以上増加または減少した場合、ＰＫＡ活性が「変化」している。
【０１７１】
ｇ．キナーゼアッセイ：
ＭＡＰキナーゼ活性は、市販されているいくつかのキット、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから販売されているｐ３８  ＭＡＰキナーゼアッセイキット（Ｃａｔ  ＃  ９８２０）、またはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから販売されているＦｌａｓｈＰｌａｔｅＴＭ  ＭＡＰキナーゼアッセイキット、のいずれかを用いてアッセイすることができる。
【０１７２】
アッセイは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する、本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物で処理したか処理していないか、候補モジュレーターを含むか含まない、細胞または細胞の抽出物を用いて実施すべきである。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的な非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトされた細胞、またはそれらからの抽出物を用いて実施すべきである。
【０１７３】
本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する、候補モジュレーターで処理した細胞からのサンプルにおけるＭＡＰキナーゼ活性のレベルが、候補モジュレーターで処理していない類似の細胞からのサンプルにおけるＭＡＰキナーゼ活性と比較して、１０％以上増加または減少した場合、ＭＡＰキナーゼ活性が「変化」している。
【０１７４】
公知の合成または天然のチロシンキナーゼ基質および標識ホスフェートを用いたチロシンキナーゼ活性の直接アッセイは、他のタイプのキナーゼ（例えば、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ）の類似のアッセイのようによく知られている。キナーゼアッセイは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する、ムスク化合物で処理したか処理していないか、候補モジュレーターを含むか含まない、細胞から調製した精製キナーゼおよび粗抽出物の両方を用いて行うことができる。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的な非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトされた細胞、またはそれらからの抽出物を用いて実施すべきである。基質は、全長タンパク質または基質を代表する合成ペプチドのいずれかである。Ｐｉｎｎａ＆Ｒｕｚｚｅｎｅ（1996, Biochem. Biophys. Acta 1314. 191-225、参照により本明細書に組み込まれる）は、キナーゼ活性の測定に有用な多数のリン酸化基質部位を列挙している。多くのキナーゼ基質ペプチドが市販されている。特に有用なものの一つは、「Ｓｒｃ関連ペプチド」（ＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡＲＧ（配列番号６）；Ｓｉｇｍａから入手可能、＃Ａ７４３３）であり、これは多くの受容体および非受容体チロシンキナーゼの基質である。以下に記載されるアッセイは、ペプチド基質をフィルターに結合させることを必要とするので、ペプチド基質は、結合を促進するために正味の正電荷を有するべきである。一般に、ペプチド基質は、少なくとも２つの塩基性残基および遊離アミノ末端を有するべきである。反応は一般的に０．７〜１．５ｍＭのペプチド濃度を使用する。
【０１７５】
アッセイは、通常、５Ｘキナーゼバッファー（５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２；アッセイしたキナーゼに応じて、ＭｇＣｌ２の代わりに、またはＭｇＣｌ２に加えてＭｎＣｌ２を使用しうる）５μｌ、１．０ｍＭ  ＡＴＰ（最終濃度０．２ｍＭ）５μｌ、ガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰ（１００−５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、１０ｍＭペプチド基質（最終濃度１．２ｍＭ）３μｌ、テストされるキナーゼを含む細胞抽出物（キナーゼアッセイに使用する細胞抽出物は、ホスファターゼ阻害剤（例えば、０．１−１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム）を含むべきである）及び２５μｌにする水を含む２５μｌの量で実施される。反応は３０℃で行われ、細胞抽出物の添加によって開始される。
【０１７６】
キナーゼ反応を３０秒〜約３０分間行い、次いで氷冷１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を４５μｌ添加する。サンプルをマイクロ遠心分離機で２分間スピンさせ、上清の３５μｌをＷｈａｔｍａｎ  Ｐ８１セルロースホスフェートフィルターサークル上にスポッティングする。フィルターを５００ｍｌの０．５％冷リン酸で３回洗浄し、次いで２００ｍｌのアセトンで１回室温で５分間洗浄する。フィルターを乾燥させ、取り込まれた３２Ｐをシンチレーションカウントによって測定する。キナーゼ反応におけるＡＴＰの比活性（例えば、ｃｐｍ／ｐｍｏｌで）は、反応の少量のサンプル（２〜５μｌ）をＰ８１フィルターサークル上にスポッティングし、洗浄せずに直接計数することによって決定される。キナーゼ反応で得られた１分あたりのカウント数（マイナスブランク）を比活性で割って、反応中に移行したホスフェートのモル数を決定する。
【０１７７】
アッセイは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する、ムスク化合物で処理したか処理していないか、候補モジュレーターを含むか含まない、細胞または細胞からの抽出物を用いて実施されるべきである。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの潜在的な非特異的効果を除外するために、モックトランスフェクトされた細胞、またはそれらからの抽出物を用いて実施すべきである。
【０１７８】
ＯＲポリペプチドを発現する候補モジュレーターで処理した細胞からのサンプルにおけるキナーゼ活性のレベルが、候補モジュレーターで処理していない類似の細胞からのサンプルにおけるチロシンキナーゼ活性と比較して、１０％以上増加または減少した場合、チロシンキナーゼ活性が「変化」している。
【０１７９】
ｈ．下流経路活性化のための転写レポーター：
受容体、例えば本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドへのモジュレーターの結合によって開始される細胞内シグナルは、細胞内イベントのカスケードを動かし、その最終的な結果は、１つ以上の遺伝子の転写および／または翻訳における迅速かつ検出可能な変化である。したがって、受容体の活性は、ＯＲ５Ａ２の活性化に応答する制御配列によって駆動されるレポーター遺伝子の発現を測定することによってモニターすることができる。
【０１８０】
本明細書で使用されるように、「プロモーター」とは、受容体媒介による遺伝子発現の調節に必要な転写制御要素を指し、基底プロモーターだけでなく、受容体調節された発現に必要な任意の増強剤または転写因子結合部位も含む。アゴニスト結合から生じる細胞内シグナルに応答するプロモーターを選択し、選択したプロモーターを、転写、翻訳または最終的な活性が容易に検出可能で測定可能なレポーター遺伝子に操作的にリンクさせることにより、転写ベースのレポーターアッセイは、所定の受容体が活性化されているかどうかの迅速な指示を提供する。
【０１８１】
ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ベータ−ラクタマーゼまたはベータ−ガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子は、それらの産物の検出のためのアッセイと同様に、当技術分野でよく知られている。
【０１８２】
受容体活性をモニターするのに特に適した遺伝子は、「最初期」遺伝子であり、受容体とエフェクタータンパク質またはリガンドとの接触から一般的に数分以内に速やかに誘導される。即時初期遺伝子の転写の誘導は、新しい調節タンパク質の合成を必要としない。リガンド結合に対する迅速な応答性に加えて、レポーター構築物を作るのに有用な好ましい遺伝子の特徴としては：休止期細胞における低発現または検出不可能な発現；一過性であり、新しいタンパク質合成に依存しない誘導；転写のその後の遮断は、新しいタンパク質合成を必要とする；およびこれらの遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、短い半減期を有する、が挙げられる。転写制御エレメントが有用であるためには、転写制御エレメントがこれらの特性をすべて有することが好ましいが、必須ではない。
【０１８３】
ムスク応答性転写レポーター構築物を用いてＯＲ５Ａ２活性をアッセイするために、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを安定的に発現する細胞を、レポーター構築物で安定的にトランスフェクトする。アゴニストをスクリーニングするために、未処理の細胞を候補モジュレーターに曝露するか、または本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物に曝露し、レポーターの発現を測定する。ムスク化合物で処理した培養物は、公知のアゴニストによって誘導される転写のレベルの基準として機能する。いずれのモジュレーターも存在しない場合のレポーター発現と比較して、候補モジュレーターの存在下でのレポーター発現の少なくとも１０％の増加は、候補がＯＲ５Ａ２活性のモジュレーターであることを示す。アゴニストは、ムスク化合物よりも少なくとも多く、好ましくは同量以上のレポーター発現を誘導する。部分的なアゴニストは、ムスクと比較して受容体の活性化が少ないかもしれない。このアプローチはまた、細胞が、ムスク化合物または他のアゴニストの非存在下でレポーターの基礎活性の上昇があるようなレベルで本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現するインバースアゴニストをスクリーニングするために使用することができる。候補モジュレーターの非存在下におけるレポーター活性と比べて、候補モジュレーターの存在下でのレポーター活性の１０％以上の減少は、その化合物がインバースアゴニストであることを示す。
【０１８４】
増強剤をスクリーニングするために、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現し、レポーター構築物を担持する細胞を、候補モジュレーターの存在下および非存在下で、１つ以上のムスク化合物（または他のアゴニスト）に曝露する。候補モジュレーターの非存在下におけるレポーター発現と比べて、候補モジュレーターの存在下でのレポーター発現の１０％以上の増加は、候補モジュレーターがＯＲ５Ａ２活性の増強剤であることを示す。
【０１８５】
転写アッセイのためのコントロールは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現していないがレポーター構築物を担持する細胞、ならびにプロモーターを伴うレポーター構築物がほとんどない細胞が挙げられる。ＯＲ５Ａ２制御転写のモジュレーターとして同定された化合物もまた、それらの活性の特異性およびスペクトルを決定するために、それらが他の調節配列および他の受容体によって駆動される転写に影響を与えるかどうかを決定するために分析すべきである。
【０１８６】
転写レポーターアッセイ、およびほとんどの細胞ベースのアッセイは、ＯＲ５Ａ２活性を調節する化合物の化学物質ライブラリーをスクリーニングするのに好適である。ライブラリーは、例えば、天然の供給源、例えば植物、動物、細菌などからのライブラリーであってもよい。
【０１８７】
本発明による有用な候補モジュレーター
候補モジュレーターは、合成化合物または天然化合物の大規模なライブラリーからスクリーニングすることができる。現在、様々な種類の化合物のランダム合成および指示された合成のために多くの手段が使用されている。合成化合物ライブラリーは、例えば、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，ＮＨ）、およびＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ）など多くの会社から市販されている。希少化学物質ライブラリーは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手可能である。有機低分子のコンビナトリアルライブラリーが利用可能であり、調製することができる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形での天然化合物のライブラリーは、例えば、Ｐａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）またはＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ＮＣ）から入手可能であり、または当技術分野で周知の方法で容易に製造可能である。さらに、天然および合成的に生産されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に修飾される。
【実施例】
【０１８８】
実験手順：
細胞培養および細胞株作製
ＨＥＫ２９３Ｔ−ＲＴＰ１Ａ１／ＲＴＰ２細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｍ１０）を含むミニマムエッセンシャル培地（ＥＭＥＭ、Ｌｏｎｚａ）中で維持した。これらの細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔを、リポフェクタミン２０００を用いて、シャペロンタンパク質ＲＴＰ１Ａ１およびＲＴＰ２の配列およびプロマイシンに対する抵抗性遺伝子を含む発現ベクターでトランスフェクトすることによって生成した。これらの実験で使用した組換え細胞集団は、培地に１０μｇ／ｍｌのプロマイシンを添加して選択し、その後サブクローニングした（ＷＯ２０１４／１９１０４７  Ａ１）。
【０１８９】
臭気分子希釈
臭気分子をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で１モル／リットル（Ｍ）の濃度に希釈してストック溶液を作製した。
【０１９０】
スクリーニング実験のために、臭気分子のストック溶液をＥＭＥＭで希釈し、９６ウェルプレート中にディスポーズした。濃度２ｍＭ、濃度６３２μＭ、濃度２００μＭの被験化合物（１化合物／ウェル）を含むプレートを調製した。
【０１９１】
濃度反応解析のために、９６ウェルプレートにプレートしたＥＭＥＭ中のストック溶液から被験分子の連続希釈液を調製した。
【０１９２】
ルシフェラーゼ測定
最初の脱オルファン化スクリーニングおよび用量反応解析には、ルシフェラーゼをベースとした遺伝子レポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｌｅｉｄｅｎ，オランダ）を用いた。簡単に言うと、細胞をポリ−Ｄ−リジンでコーティングした９６ウェル上にプレート（platted）し、ＣＲＥ−ルシフェラーゼを含むプラスミドと嗅覚受容体を含むプラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクションの１６時間後、培地を、決定された濃度で被験化合物を含む無血清ＥＭＥＭで置換した。３７℃度で４時間インキュベーションした後、細胞を溶解し、ルミネッセンス測定のために処理した。ルミネッセンス発光を記録した。結果は、ルシフェラーゼ活性（相対蛍光単位（ＲＬＵ））として、または１０μＭのアデニル酸シクラーゼ活性化剤フォルスコリンによって誘導された応答のパーセンテージとして表された。空のプラスミドをネガティブコントロールとして使用する。
【０１９３】
実施例１：臭気分子ライブラリーのスクリーニング
本発明のＯＲの活性化剤を同定するために、ムスクおよび他の種類の化合物を含む臭気化合物ライブラリーを使用した。本発明のＯＲについて、一連の８９１の臭気化合物を用いて脱オルファン化キャンペーンを実施した。４つの構造的に異なるグループからのムスクが、８９１の被験臭気物質に含まれていた（表１）。
【０１９４】
各化合物は、３つの異なる濃度（１ｍＭ、３１６μＭ、１００μＭ）で試験した。試験したライブラリーの異なる化合物を、本発明のＯＲを発現する細胞を含む９６ウェルプレート（１分子／ウェル）に同濃度でディスポーズした。試験した化合物の活性は、上記で説明したようにルシフェラーゼ活性を用いて測定した。試験した化合物によって誘導されたルシフェラーゼ活性の中央値および関連する標準偏差を決定した。暫定的に活性な化合物（ヒット）は、中央値＋２標準偏差以上のルシフェラーゼ活性を誘導する化合物として定義した。
【０１９５】
これらの実験条件において、被験ＯＲ（本発明のＯＲに対応するもの、すなわち、ＯＲ５Ａ２、特にＯＲ５Ａ２＿変異体１）は、したがって、異なるムスク：セレノライド、エチレンブラキシレート、およびマラキソンに特異的かつ排他的に反応することが判明した。表１は、本発明のＯＲの脱オルファン化のために被験臭気化合物の完全なリストを要約している。結果は、８９１の被験化合物のうち、大環状ムスク、多環式ムスク、ニトロムスクおよび直鎖状ムスクのみが本発明のＯＲを活性化することを明確に示している。ＯＲ５Ａ２が以前に２つの異なる出版物(Shirasu et al. 2014 Neuron 81, 165-78; Figure 5F supplemental, Sato-Akuhara N et al. 2016 J Neurosci. 36(16), 4482-91)によってムスク特異的受容体としては除外されていたので、この結果はすべて驚くべきことである。
【０１９６】
実施例２：ムスクのリガンド−ＯＲ相互作用の濃度反応解析
前述のヒットを検証するために、ルシフェラーゼベースのレポーターアッセイを用いた濃度反応解析を、ＯＲ５Ａ２＿変異体１上で１ｍＭから３１６ｎＭまでのヒット分子の半対数の連続希釈を用いて達成した。これらの解析において、我々はまた、以前にムスク特異的受容体として記載されたＯＲ５ＡＮ１（配列番号７）(WO 2015/020158 A1, Shirasu et al. 2014 Neuron 81, 165-78, Sato-Akuhara N et al. 2016 J Neurosci. 36(16), 4482-91)およびＯＲ１１Ａ１（配列番号８）（ＷＯ２０１６／２０１１５２  Ａ１）を挙げた。系統解析により、ＯＲ５Ａ２と最も類似するＯＲ遺伝子は、核酸同一性７１％、アミノ酸同一性６７％のＯＲ５Ａ１（配列番号９）であることが判明した（図２Ａ−Ｂ）。したがって、ＯＲ５Ａ１は解析に含まれていた。以前に記載した４つの構造的に異なる化学グループからの３５のムスク化合物を、濃度反応分析において試験した（表２）。各実験において、空ベクターをネガティブコントロール（ｐＥＦＩＢＲＨＯ）として使用した。ムスク化合物を用いた代表的な濃度反応曲線を図１Ａに示す。図１Ｂはそれらの構造を示す。計算されたＥＣ５０を含む完全な結果を表２に示す；灰色のボックスはネガティブ実験を表し、試験後に活性化しなかった。
【０１９７】
例として、受容体ＯＲ５Ａ２、ＯＲ５Ａ１、ＯＲ５ＡＮ１、ＯＲ１１Ａ１に対する（Ａ）ムスクアンブレットと（Ｂ）モスケンの濃度反応曲線を図７に示す。受容体ＯＲ５Ａ２、ＯＲ５Ａ１、ＯＲ５ＡＮ１およびＯＲ１１Ａ１に対する（Ａ）シルコライドおよび（Ｂ）セレノライドの濃度反応曲線を図８に示す。受容体ＯＲ５Ａ２、ＯＲ５Ａ１、ＯＲ５ＡＮ１およびＯＲ１１Ａ１に対する（Ａ）カシメラン、（Ｂ）フィクサルおよび（Ｃ）ガラクソリドの濃度反応曲線を図９に示す。受容体ＯＲ５Ａ２、ＯＲ５Ａ１、ＯＲ５ＡＮ１及びＯＲ１１Ａ１に対する（Ａ）エチレンブラシレート、（Ｂ）アンブレトリド及び（Ｃ）セルボライドの濃度反応曲線を図１０に示す。
【０１９８】
本発明のＯＲ（すなわちＯＲ５Ａ２）は、前記４化合物群に属するムスク化合物によって活性化されることが観察された。ＯＲ５Ａ２の最も近いパラログであるＯＲ５Ａ１は、試験したいずれのムスク化合物によっても活性化されなかった。さらに、ムスク特異的なＯＲ（ＯＲ５ＡＮ１とＯＲ１１Ａ１）は、主にニトロムスクと大環状ムスク、または多環式ムスクとニトロムスクにそれぞれ反応した（表２）。試験したムスク化合物はいずれもＯＲ５ＡＮ１のみを活性化することができなかった。さらに、我々の結果は、本発明のＯＲ（すなわちＯＲ５Ａ２）が、より環境に優しいことが知られている直鎖状ムスクファミリーによって活性化された唯一のＯＲであることを示している。
【０１９９】
したがって、本発明のＯＲは、あらゆるタイプのムスクの知覚に関与しており、ムスクの香りの知覚を活性化、模倣、ブロック、阻害、調節および／または増強する化合物を同定するための貴重な候補受容体を構成している。
【０２００】
実施例３：ＯＲ１１Ａ１およびＯＲ５Ａ１特異的リガンド−ＯＲ相互作用の用量反応解析
アミノ酸配列のアラインメントにより、ＯＲ５Ａ１とＯＲ５Ａ２は６７％、ＯＲ５ＡＮ１は５８％、ＯＲ１１Ａ１は４１％の同一性を示した（図２  Ａ−Ｂ）。パラロジが機能性および選択性をどの程度予測するかという疑問にさらに取り組むために、ＯＲ５Ａ１およびＯＲ１１Ａ１の２つのよく知られたアゴニストであるベータ−イオノンおよび２−エチルフェンコールに対するこれらのＯＲの応答を、それぞれ比較した(Jaeger et al., 2013; Adipietro et al., 2012)。これらの化合物を、以前に記載したように、ルシフェラーゼアッセイにおける濃度反応分析において試験した。各実験において、空ベクターをネガティブコントロール（ｐＥＦＩＢＲＨＯ）として使用した。代表的な濃度反応曲線を図３Ａ−Ｂに示す。
【０２０１】
ＯＲ５Ａ２の最も近いパラログであるＯＲ５Ａ１とＯＲ１１Ａ１の両方が、それ自身のコグナートアゴニストによって活性化されていることが観察された。逆に、これらの実験条件では、本発明のＯＲ（すなわちＯＲ５Ａ２）およびＯＲ５ＡＮ１は、ベータ−イオノンによっても２エチル−フェンコールによっても刺激されず、両方とも空ベクターと同様の濃度応答曲線を示した。
【０２０２】
これらの結果から、ＯＲ５Ａ１とＯＲ５Ａ２は、同じサブファミリーのメンバーでありながら、異なるアゴニスト特異性（ベータ−イオノンとムスク）を示し、アミノ酸の類似性は、パラログ間のＯＲ選択性と機能性をロバストに予測しないことを示している。
【０２０３】
実施例４：リガンド−ＯＲハプロタイプ相互作用の用量反応解析
ＯＲ遺伝子は非常に可変性が高く、多くの対立遺伝子が人によって嗅覚の違いをもたらす。これらの違いは、例えばヌクレオチド多型のような遺伝的変異に起因しうる。ＨＯＲＤＥデータベース(The Human Olfactory Data Explorer, https://genome.weizmann.ac.il/horde/)を用いて、本発明のＯＲの５つのタンパク質変異体（ハプロタイプ）（すなわち、ＯＲ５Ａ２、ＯＲ５Ａ２変異体＿１）が集団で同定されたことを見出した。７９，７２％の頻度で存在する最も頻度の高いハプロタイプは、先の実施例で使用されたもの（ＯＲ５Ａ２−変異体＿１；配列番号１）であり、ムスク化合物に感受性である。１６，５９％の頻度で存在する第二のハプロタイプは、１７２の位置でのプロリンからロイシンへの置換をコードする（Ｐ１７２Ｌ、ＯＲ５Ａ２＿変異体２；配列番号３）。２つのハプロタイプを合わせると、この２つのハプロタイプは集団の９６％以上で発現している。２つのハプロタイプのアミノ酸配列を図４に示す。
【０２０４】
置換がムスク感受性に影響を与えうるかどうかをテストするために、ＯＲ５Ａ２の両方の変異体をトランスフェクションした後、ルシフェラーゼアッセイを先に記載したように行った。細胞を、先に説明した４つの構造的に異なるグループからのムスク化合物の半対数の連続希釈液で処理した。各実験において、空ベクターをネガティブコントロール（ｐＥＦＩＢＲＨＯ）として使用した。代表的な濃度反応曲線を図５に示す。
【０２０５】
これらの実験結果は、本発明の受容体の他のハプロタイプとは異なり、ＯＲ５Ａ２＿変異体２がムスク化合物（ムスクキシレン、セレノライド、ガラクソリド（登録商標）、ベルビオーネ、カシメラン、ムスクケトン）によって活性化されないことを示している。これらの実験において、ＯＲ５Ａ２＿変異体１は、実施例２で得られたものと同様の濃度反応曲線を示す。全体として、これらの観察は、位置１７２（Ｐ１７２Ｌ）の置換を有するハプロタイプが、ムスク化合物によって活性化される能力を失うことを明確に示唆している。この観察は、異なる研究が、これまでのところ、本発明のＯＲをムスク受容体として除外している理由を説明し得る(Shirasu et al. 2014 Neuron 81, 165-78; Figure 5F supplemental, Sato-Akuhara N et al. 2016 J Neurosci. 36(16), 4482-91)。
【０２０６】
実施例５：リガンド−キメラ型＿ＯＲ５Ａ２変異体１相互作用の用量反応解析
１９９８年、クラオトヴルストらは、嗅覚受容体のリガンド特異性および構造機能関係を研究するためのモデルシステムを提供した(Krautwurst et al., 1998 Cell 95, 917-26)。彼らは、嗅覚受容体によるリガンド認識は、膜貫通ドメイン２（ＴＭ２）から膜貫通ドメイン７（ＴＭ７）に向かうタンパク質領域によって大部分が付与されていることを示した。その発表に基づき、嗅覚受容体ＯＲ２Ａ５（配列番号１２参照）のＮ末端およびＣ末端配列を挟んだＯＲ５Ａ２＿変異体１のＴＭ２−ＴＭ７アミノ酸配列を含むキメラＯＲ５Ａ２＿変異体１嗅覚受容体を作製した。このキメラＯＲ５Ａ２＿変異体１受容体は、ネイティブのＯＲ５Ａ２＿変異体１受容体と８６％の同一性を共有していた（図６Ａおよび配列番号１０）。
【０２０７】
アミノ酸置換がムスクの感受性および特異性に影響を与え得るかどうか、およびクラオトヴルストのモデルを検証するために、キメラ型ＯＲ５Ａ２＿変異体１をトランスフェクションした後、ルシフェラーゼアッセイを前記のように行った。細胞を、先に記載した４つの構造的に異なるグループからのムスク化合物の半対数の連続希釈液で処理した。
【０２０８】
各実験において、空ベクターをネガティブコントロール（ｐＥＦＩＢＲＨＯ）として使用した。さらに、これらの細胞を、起源のＯＲ５Ａ２受容体を活性化することができない２つの化合物であるベータ−イオノンおよび２エチル−フェンコールで処理した（図２Ａ−Ｂ参照）。代表的な濃度反応曲線を図６Ｂ−Ｃに示す。
【０２０９】
これらの結果から、キメラＯＲ５Ａ２＿変異体１は、８６％の同一性しか共有していないにもかかわらず、テストしたすべてのタイプのムスクに反応することが示されている。さらに、キメラＯＲ５Ａ２＿変異体１はベータ−イオノンや２エチルフェンコールによって活性化されないことから、このキメラ受容体はＯＲ５Ａ２受容体と同じ特異性を持ち、ムスクの香りの知覚を活性化、模倣、ブロック、阻害、調節、および／または増強する化合物を同定するための貴重な候補受容体であることが示された。
【０２１０】
【表１−１】
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【０２１１】
【表１−２】
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【０２１２】
【表１−３】
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【０２１３】
【表１−４】
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【０２１４】
【表１−５】
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【０２１５】
【表２−１】
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【０２１６】
【表２−２】
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【０２１７】
【表２−３】
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【０２１８】
【表２−４】
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【０２１９】
【表２−５】
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【０２２０】
【表２−６】
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【０２２１】
【表２−７】
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【０２２２】
【表２−８】
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【０２２３】
【表２−９】
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【０２２４】
【表２−１０】
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【０２２５】
【表２−１１】
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【０２２６】
【表２−１２】
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【０２２７】
【表３−１】
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【０２２８】
【表３−２】
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【０２２９】
【表３−３】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月29日(2019.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＲ５Ａ２受容体とムスク化合物との間の結合を妨害する剤を同定するための、アミノ酸配列番号１１によって定義される膜貫通ドメイン２〜７を包含する、ＯＲ５Ａ２の中央領域を含むキメラ受容体の使用であって、キメラ受容体は、そのＮ末端がＧタンパク質共役型受容体のＮ末端細胞外部位、膜貫通ドメイン１および細胞内ループ１に融合され；かつそのＣ末端がＧタンパク質共役型受容体の細胞内Ｃ末端エンドに融合され、好ましくはムスク化合物が、ニトロムスク、大環状ムスク、多環式ムスクおよび直鎖状ムスクのファミリーから選択される、使用。
【請求項２】
前記Ｇタンパク質共役型受容体が嗅覚受容体である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記Ｇタンパク質共役型受容体が、配列番号１２で定義されるＯＲ２Ａ５受容体であり、それにより配列番号１０で定義されるキメラ受容体が得られる、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
ＯＲ５Ａ２受容体とムスク化合物との間の結合を妨害する剤を同定するための、アミノ酸配列番号１１、または配列番号１１に対して、少なくとも９５％のアミノ酸同一性、好ましくは、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有するポリペプチド配列、ただし前記ポリペプチドは、配列番号１１に対して、少なくとも９５％のアミノ酸同一性、好ましくは、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有する前記ポリペプチド配列の位置１１４にプロリンを有する、によって定義される膜貫通ドメイン２〜７を包含するＯＲ５Ａ２の中央領域の使用であって、好ましくはムスク化合物が、ニトロムスク、大環状ムスク、多環式ムスクおよび直鎖状ムスクのファミリーから選択される、使用。
【請求項５】
ＯＲ５Ａ２受容体とムスク化合物との間の結合を妨害する剤を同定するための、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有するポリペプチド配列、ただし前記ポリペプチドは、配列番号２に対して、少なくとも９５％のアミノ酸同一性、好ましくは、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有する前記ポリペプチド配列の位置１７２にプロリンを有する、によって定義されるＯＲ５Ａ２ポリペプチドの使用であって、好ましくはムスク化合物が、ニトロムスク、大環状ムスク、多環式ムスクおよび直鎖状ムスクのファミリーから選択される、使用。
【請求項６】
ＯＲ５Ａ２受容体とムスク化合物との結合を妨害する、剤または１つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法であって、前記方法は以下を含む：
ａ）ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを前記剤またはサンプルと接触させる工程であって、ＯＲ５Ａ２ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有するポリペプチド配列、ただし前記ポリペプチドは、配列番号２に対して、少なくとも９５％のアミノ酸同一性、好ましくは、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有する前記ポリペプチド配列の位置１７２にプロリンを有する、によって定義される；
ｂ）前記剤またはサンプルの存在下で前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；および
ｃ）前記剤またはサンプルの存在下で測定された活性を、前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドが１つ以上のムスク化合物と接触する反応において測定されたＥＣ５０での活性と比較する工程であって、前記剤またはサンプルは、剤またはサンプルの存在下で測定された活性の量が、ＥＣ５０での前記ムスク化合物によって誘導された量の少なくとも１０％であるときに、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして同定される、工程。
【請求項７】
ＯＲ５Ａ２受容体ポリペプチドの活性を調節する剤または１つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法であって、ＯＲ５Ａ２受容体ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有するポリペプチド配列、ただし前記ポリペプチドは、配列番号２に対して、少なくとも９５％のアミノ酸同一性、好ましくは、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有する前記ポリペプチド配列の位置１７２にプロリンを有する、によって定義され、前記方法は以下を含む：
ａ）前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを、剤またはサンプルの存在下および剤およびサンプルの非存在下で、本明細書に定義される１種以上のムスク化合物と接触させる工程；および
ｂ）前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程、および
ｃ）剤およびサンプルを含まない前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドおよびムスク化合物を含む反応において測定された前記活性の量を、前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチド、ムスク化合物および前記剤またはサンプルを含む反応において測定された前記活性の量と比較する工程であって、前記剤およびサンプルの非存在下における活性に対する前記剤またはサンプルの存在下における活性の変化が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして、前記剤またはサンプルを同定する工程。
【請求項８】
前記剤およびサンプルの非存在下での活性に対する前記剤またはサンプルの存在下での活性の増加が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を増加させる剤またはサンプルとして前記剤またはサンプルを同定する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記剤およびサンプルの非存在下での活性に対する前記剤またはサンプルの存在下での活性の減少が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を減少させる剤またはサンプルとして前記剤またはサンプルを同定する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＯＲ５Ａ２受容体ポリペプチドの活性を調節する剤または１つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法であって、ＯＲ５Ａ２受容体ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有するポリペプチド配列、ただし前記ポリペプチドは、配列番号２に対して、少なくとも９５％のアミノ酸同一性、好ましくは、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有する前記ポリペプチド配列の位置１７２にプロリンを有する、によって定義され、前記方法は以下を含む：
ａ）前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを剤またはサンプルと接触させる工程；
ｂ）前記剤またはサンプルと前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドとの結合を測定する工程；および
ｃ）本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物に対する、前記剤またはサンプルとの結合を前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドとのＥＣ５０での結合と比較する工程であって、前記剤またはサンプルの結合量が、そのＥＣ５０で存在する前記ムスク化合物の結合量の少なくとも１０％であるとき、前記剤またはサンプルは、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の活性を調節する剤またはサンプルとして同定される工程。
【請求項１１】
本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物とＯＲ５Ａ２受容体ポリペプチドとの間の相互作用を調節する剤または１つ以上の剤を含むサンプルを同定する方法であって、ＯＲ５Ａ２受容体ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有するポリペプチド配列、ただし前記ポリペプチドは、配列番号２に対して、少なくとも９５％のアミノ酸同一性、好ましくは、９６％、９７％、９８％、９９％以上（１００％を含む）のアミノ酸同一性を有する前記ポリペプチド配列の位置１７２にプロリンを有する、によって定義され、前記方法は以下を含む：
ａ）前記ムスク化合物の前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドへの結合を可能にする条件下で、剤またはサンプルの存在下および剤およびサンプルの非存在下で、前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを前記ムスク化合物と接触させる工程；および
ｂ）前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドと前記ムスク化合物の結合を測定する工程であって、剤およびサンプルの非存在下での結合に対する剤またはサンプルの存在下での結合のモジュレーションが、前記剤またはサンプルが、本明細書で定義される１つ以上のムスク化合物と本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体との間の相互作用を調節する剤またはサンプルとして、前記剤またはサンプルを同定する工程。
【請求項１２】
前記剤およびサンプルの非存在下での結合に対する前記剤またはサンプルの存在下での結合の増加が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の結合を増加させる剤またはサンプルとして前記剤またはサンプルを同定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記剤およびサンプルの非存在下での結合に対する前記剤またはサンプルの存在下での結合の減少が、本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体の結合を減少させる剤またはサンプルとして前記剤またはサンプルを同定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
１つ以上のムスク化合物が、検出可能に標識され、好ましくは、放射性同位体、蛍光体、および蛍光消光剤からなる群から選択される部分で標識されている、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
接触が、前記ＯＲ５Ａ２ポリペプチドを発現する細胞中、または細胞上で行われる、好ましくは、前記細胞が、ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ）、サル細胞（ＣＯＳ）、一次嗅覚細胞、アフリカツメガエル細胞、昆虫細胞、酵母または細菌から選択される、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
測定が、ラベル置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光および蛍光偏光から選択される方法を用いて行われる、請求項６〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
本明細書で定義されるＯＲ５Ａ２受容体のシグナル伝達活性を測定する工程が、セカンドメッセンジャーのレベルの変化を検出することを含む、請求項６〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
シグナル伝達活性を測定することが、蛍光または発光アッセイ、好ましくはｆｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ４もしくはＦｕｒａ−２；Ｃａ３およびＣａ６キットファミリーもしくはエクオリンを含むＣａ２＋感受性蛍光体を使用することを含む、または前記アッセイがＦＤＳＳまたはＦＬＩＰＲなどの自動化された蛍光または発光リーダーを適用する、請求項６〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＯＲ５Ａ２受容体（配列番号１２）の骨格に挿入されたＯＲ５Ａ２受容体の膜貫通ドメイン２７（配列番号１１）を含む、配列番号１０で定義されるキメラ受容体。
【国際調査報告】
2021505566.tif 000043
2021505566.tif 000044
2021505566.tif 000045
2021505566.tif 000046
2021505566.tif 000047