(57)【要約】様々な態様及び実施形態では、本発明は、低級グリコシル化中間体から高度なグリコシル化産物を産生するための微生物細胞及び方法を提供する。微生物細胞は、中間体のグリコシル化のために、細胞質中に１つ以上のＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ酵素を発現する。中間体を含む植物抽出物またはその画分とともに微生物株をインキュベートする場合、これらのグリコシル化中間体は、細胞によるさらなるグリコシル化のために利用可能であり、高度なグリコシル化産物は培地及び／または微生物細胞から回収することができる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシド中間体からグリコシル化産物を産生するための方法であって、
１つ以上のＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ酵素を細胞内で発現する微生物細胞を提供することと、
微生物株を前記グリコシド中間体と一緒にインキュベートすることと、
前記グリコシル化産物を回収することと、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記グリコシド中間体が、植物抽出物またはその画分として提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記グリコシド中間体が、任意選択的に、グリコシル化テルペノイド、グリコシル化フラボノイド、グリコシル化カンナビノイド、グリコシル化ポリケチド、グリコシル化スチルベノイド、及びグリコシル化ポリフェノールから選択される、グリコシル化二次代謝産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記グリコシド中間体が、グリコシル化テルペノイドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記グリコシド中間体が、ステビオールグリコシドまたはモグロシドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記グリコシド中間体が、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのグリコシル基を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記グリコシル基が、独立して、グルコシル、ガラクトシル、マンノシル、キシロシル、及びラムノシル基から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記グリコシル化産物が、少なくとも５つのグリコシル基、または少なくとも６つのグリコシル基を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記グリコシル化産物が、７つ、８つ、または９つのグリコシル基を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記産物の生合成が、前記微生物細胞内の前記中間体の少なくとも２つのグリコシル化反応を伴う、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記グリコシド中間体が、ステビア葉抽出物由来のステビオールグリコシドである、請求項１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステビオールグリコシド中間体が、ステビオシド、ステビオ−ルビオシド、レバウジオシドＡ、ズルコシドＡ、ズルコシドＢ、レバウジオシドＣ、及びレバウジオシドＦのうちの１つ以上を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抽出物が、顕著な成分として、ステビオシド、ステビオ−ルビオシド、及びレバウジオシドＡを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記グリコシル化産物がＲｅｂＭを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記グリコシル化産物が、ＲｅｂＫ、ＲｅｂＣ＋１、及び／またはＲｅｂＣ＋２を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物細胞が細菌細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細菌細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細菌細胞が、以下の遺伝子修飾：ｕｓｈＡ及びｇａｌＥＴＫＭが欠失する、不活性化される、または発現において減少すること、ｐｇｉが欠失する、不活性化される、または発現において減少すること、ならびにｐｇｍ及びｇａｌＵが過剰発現すること、を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記微生物細胞が酵母細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｐｈａｆｆｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ属、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属、またはＹａｒｒｏｗｉａ属である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉ、またはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記微生物細胞が、配列番号１〜４５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む１つ以上のＵＧＴ酵素またはその誘導体を発現する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記微生物細胞が、１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素が、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１、ＭｂＵＧＴ１−３、ＭｂＵＧＴ１−３＿１、ＭｂＵＧＴ１−３＿１．５、ＭｂＵＧＴ１−３＿２、及びそれらの誘導体から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素が、Ｌ２００Ａ置換を含むＳｒＵＧＴ７６Ｇ１である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素が、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記微生物細胞が、１−２’グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記１−２’グリコシル化ＵＧＴ酵素が、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ１、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、ＯｓＵＧＴ１−２、ＭｂＵＧＴ１，２、ＭｂＵＧＴ１，２．２、及びそれらの誘導体から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記微生物細胞が、Ｃ１３  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｃ１３  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素が、ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２またはその誘導体であり、任意選択的にＰ２１５Ｔ置換を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記微生物細胞が、Ｃ１９  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｃ１９  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素が、ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１、ＭｂＵＧＴｃ１９、またはその誘導体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記微生物細胞が、１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素及び１−２’グリコシル化ＵＧＴ酵素、ならびに任意選択的に、Ｃ１３  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵及びＣ１９  Ｏ−グリコシル化酵素を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記微生物細胞が、１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素、１−２’グリコシル化ＵＧＴ酵素、Ｃ１９  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素、及びＣ１３  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記微生物細胞が、ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２またはその誘導体；ＭｂＵＧＴ１，２またはその誘導体；ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１またはその誘導体；ならびにＳｒＵＧＴ７６Ｇ１またはその誘導体、ＭｂＵＧＴ１−３＿１またはその誘導体、ＭｂＵＧＴ１−３＿１．５またはその誘導体、及びＭｂＵＧＴ１−３＿２またはその誘導体から選択される酵素を発現する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＵＧＴ酵素が、前記微生物細胞の染色体に組み込まれる、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＵＧＴ酵素が、染色体外で発現される、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記微生物細胞が、ＵＤＰ−グルコース利用能を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記微生物細胞が、ＵＤＰ−グルコースを消費する酵素をコードする遺伝子の欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記微生物細胞が、ｕｓｈＡもしくはそのオーソログ、及び／またはｇａｌＥ、ｇａｌＴ、ｇａｌＫ、及びｇａｌＭのうちの１つ以上もしくはオーソログの欠失、不活性化、もしくは減少した活性を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ｇａｌＥＴＫＭ遺伝子が、不活性化される、欠失する、または発現において減少する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記微生物細胞が、ｏｔｓＡ（トレハロース−６−リン酸シンターゼ）もしくはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記微生物細胞が、ｕｇｄ（ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ）もしくはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記微生物細胞が、ｗａａＧ、ｗａａＯ、ｗａａＪ、ｙｆｄＧ、ｙｆｄＩ、及び／またはｗｃａＪ、またはそのオーソログ（複数可）の欠失、不活性化、または減少した発現を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記微生物細胞が、ｐｇｉ（グルコース−６リン酸イソメラーゼ）もしくはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記微生物細胞が、任意選択的に、ｐｇｍ（ホスホグルコムターゼ）及び／またはｇａｌＵ（ＵＴＰ−グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ）、またはそのオーソログもしくはその誘導体である、グルコース−６−リン酸をＵＤＰ−グルコースに変換することに関与する酵素をコードする１つ以上の遺伝子の過剰発現または増加した活性を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記微生物細胞が、ｙｃｊＵ（β−ホスホグルコムターゼ）及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ｕｇｐＡ、またはそのオーソログもしくはその誘導体の過剰発現または増加した活性もしくは発現を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記微生物細胞が、任意選択的に、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｚｗｆまたはその相同体もしくは操作された誘導体の過剰発現または活性である、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）への流動を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
前記微生物細胞が、任意選択的に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇａｌＰ及びＥ．ｃｏｌｉ  ｇｌｋ（グルコキナーゼ）、または代替的に、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ｇｌｆ及びＥ．ｃｏｌｉ  ｇｌｋ、またはその相同体、オーソログ、もしくは操作された誘導体の増加した発現もしくは活性を含む、グルコース輸送を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
前記微生物細胞が、任意選択的に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｙｒＨ（ＵＭＰキナーゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｍｋ（シチジル酸キナーゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｄｋ（アデニル酸キナーゼ）、もしくはＥ．ｃｏｌｉ  ｎｄｋ（ヌクレオシド二リン酸キナーゼ）、またはこれらの酵素の相同体、オーソログ、もしくは操作された誘導体の増加した発現または活性を含む、ＵＴＰ産生及びリサイクルを増加させる１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５３】
前記微生物細胞が、任意選択的に、ｕｐｐ（ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ｐｙｒＨ（ＵＭＰキナーゼ）、及びｃｍｋ（シチジルレートキナーゼ）、またはその相同体もしくは操作された誘導体の過剰発現もしくは増加した活性、または、ｄｃｔＡ（Ｃ４ジカルボキシレート／オロレート：Ｈ＋シンポーター）、ｐｙｒＥ（オロレートホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ｐｙｒＨ（ＵＭＰキナーゼ）、及びｃｍｋ（シチジルレートキナーゼ）、またはその相同体もしくは操作された誘導体の過剰発現もしくは増加した活性を含む、ＵＤＰ産生を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５４】
前記微生物細胞が、任意選択的に、ｓｇｒＳ小制御ＲＮＡの欠失、不活性化、または減少した発現を含む、グルコース取り込みの除去または調節を減少させるための１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５５】
前記微生物細胞が、任意選択的に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｇｐ（グルコース−１−ホスファターゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｉｈＸ（α−Ｄ−グルコース−１−リン酸ホスファターゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｂｉＶ（糖ホスファターゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｉｄＡ（糖ホスファターゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｉｇＬ（リン糖ホスファターゼ）、及びＥ．ｃｏｌｉ  ｐｈｏＡ（アルカリホスファターゼ）、またはそのオーソログのうちの１つ以上の欠失、不活性化、または減少した発現または活性を含む、グルコース−１−リン酸の脱リン酸化を減少させる１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５６】
前記微生物細胞が、任意選択的に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｆｆＨ（ｄＴＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ）及びＥ．ｃｏｌｉ  ｒｆｂＡ（ｄＴＤＰグルコースピロホスホリラーゼ）、またはそのオーソログのうちの１つ以上の欠失、不活性化、または減少した発現もしくは活性を含む、グルコース−１−リン酸のＴＤＰ−グルコースへの変換を減少させる１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５７】
前記微生物細胞が、任意選択的に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇｉｇＣ（グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ）またはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した発現もしくは活性を含む、グルコース−１−リン酸のＡＤＰ−グルコースへの変換を減少させる１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５８】
前記微生物細胞が、以下の前記遺伝子修飾：ｕｓｈＡ及びｇａｌＥＴＫＭが、欠失する、不活性化される、または発現において減少すること、ｐｇｉが、欠失する、不活性化される、または発現において減少すること、ｐｇｍ及びｇａｌＵが過剰発現すること、を含む細菌細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５９】
前記微生物細胞が、前記グリコシド中間体（複数可）を前記細胞内に輸送する内因性輸送タンパク質を発現する、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記微生物細胞が、前記グリコシド中間体（複数可）を前記細胞内に輸送する組換え輸送タンパク質を過剰発現する、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記微生物株が、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｃｒＡＤ、ｘｙｌＥ、ａｓｃＦ、ｂｇｌＦ、ｃｈｂＡ、ｐｔｓＧ／ｃｒｒ、ｗｚｘＥ、ｒｆｂＸ、またはそのオーソログもしくはその誘導体から選択される輸送タンパク質を発現する、請求項５９または６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記微生物細胞が、前記細胞の外にグリコシル化産物を輸送する内因性のまたは組換えトランスポーターを発現する、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記方法が、グリコシド中間体からグリコシル化産物への少なくとも４０重量％の変換をもたらす、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記方法が、グリコシド中間体からグリコシル化産物への少なくとも５０重量％の変換をもたらす、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記方法が、グリコシド中間体からグリコシル化産物への少なくとも７５重量％の変換をもたらす、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
少なくとも５：１のＲｅｂＭ対ＲｅｂＤの比が、前記グリコシル化産物として回収される、請求項１〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記方法が、バッチ発酵、連続発酵、または半連続発酵によって行われる、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記方法が、フィードバッチ発酵によって行われる、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記グリコシド中間体が、前記細胞で約７２時間以下インキュベートされる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
微生物細胞であって、
細胞内発現のためのＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素（複数可）をコードする１つ以上の組換え遺伝子と、
ＵＤＰ−グルコースの利用性を増加させる１つ以上の遺伝子修飾と、を含む、前記微生物細胞。
【請求項７１】
前記微生物細胞が、供給されたグリコシド中間体をグリコシル化産物に変換する、請求項７０に記載の微生物細胞。
【請求項７２】
前記微生物細胞が細菌細胞である、請求項７１に記載の微生物細胞。
【請求項７３】
前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属である、請求項７２に記載の微生物細胞。
【請求項７４】
前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａから選択される、請求項７３に記載の微生物細胞。
【請求項７５】
前記細菌細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項７４に記載の微生物細胞。
【請求項７６】
前記細菌細胞が、以下の前記遺伝子修飾：ｕｓｈＡ及びｇａｌＥＴＫＭが、欠失する、不活性化される、または発現において減少すること、ｐｇｉが、欠失する、不活性化される、または発現において減少すること、ならびにｐｇｍ及びｇａｌＵが過剰発現すること、を含む、請求項７５に記載の微生物細胞。
【請求項７７】
前記微生物細胞が酵母細胞である、請求項７０に記載の微生物細胞。
【請求項７８】
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｐｈａｆｆｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ属、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅ属、またはＹａｒｒｏｗｉａ属である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉ、及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａから選択される、請求項７８に記載の微生物細胞。
【請求項８０】
前記微生物細胞が、グリコシド中間体を産生する植物生合成経路を発現しない、請求項７０〜７９のいずれか１項に記載の微生物細胞。
【請求項８１】
前記微生物細胞が、前記細胞にグリコシド中間体を輸送する内因性のまたは組換え輸送タンパク質を発現する、請求項７０〜８０のいずれか１項に記載の微生物細胞。
【請求項８２】
前記微生物細胞が、任意選択的に、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１、ＭｂＵＧＴ１−３、ＭｂＵＧＴ１−３＿１、ＭｂＵＧＴ１−３＿１．５、ＭｂＵＧＴ１−３＿２、またはそれらの誘導体から選択される、１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する、請求項７０〜８１のいずれか１項に記載の微生物細胞。
【請求項８３】
前記微生物細胞が、任意選択的に、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ１、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、ＯｓＵＧＴ１−２、ＭｂＵＧＴ１，２、ＭｂＵＧＴ１，２．２、及びその誘導体から選択される、１−２’グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する、請求項８２に記載の微生物細胞。
【請求項８４】
前記微生物細胞が、任意選択的に、ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２及びその誘導体から選択されるＣ１３  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する、請求項８３のいずれか１項に記載の微生物細胞。
【請求項８５】
前記微生物細胞が、任意選択的に、ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１、ＭｂＵＧＴｃ１９、及びその誘導体から選択されるＣ１９  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する、請求項８４に記載の微生物細胞。
【請求項８６】
前記微生物細胞が、１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素、１−２’グリコシル化ＵＧＴ酵素、Ｃ１９  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素、及びＣ１３  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する、請求項８２に記載の微生物細胞。
【請求項８７】
前記微生物細胞が、ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２またはその誘導体、ＭｂＵＧＴ１，２またはその誘導体、ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１またはその誘導体、及びＳｒＵＧＴ７６Ｇ１またはその誘導体を発現する、請求項８６に記載の微生物細胞。
【請求項８８】
前記ＵＧＴ酵素が、前記微生物細胞の染色体に組み込まれる、請求項８６または８７に記載の微生物細胞。
【請求項８９】
前記ＵＧＴ酵素が染色体外で発現される、請求項８６または８７に記載の微生物細胞。
【請求項９０】
前記微生物細胞が、ＵＤＰ−グルコースを消費する酵素をコードする遺伝子の欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、請求項７０に記載の微生物細胞。
【請求項９１】
前記微生物細胞が、ｕｓｈＡもしくはそのオーソログ、及び／またはｇａｌＥ、ｇａｌＴ、ｇａｌＫ、及びｇａｌＭのうちの１つ以上もしくはオーソログの欠失、不活性化、もしくは減少した活性を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
ｇａｌＥＴＫＭ遺伝子が、不活性化される、欠失する、または発現において減少する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記微生物細胞が、ｏｔｓＡ（トレハロース−６−リン酸シンターゼ）もしくはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項９４】
前記微生物細胞が、ｕｇｄ（ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ）もしくはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項９５】
前記微生物細胞が、ｗａａＧ、ｗａａＯ、ｗａａＪ、ｙｆｄＧ、ｙｆｄＩ、及び／またはｗｃａＪ、またはそのオトログ（複数可）の欠失、不活性化、または減少した発現を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項９６】
前記微生物細胞が、ｐｇｉ（グルコース−６リン酸イソメラーゼ）もしくはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項９７】
前記微生物細胞が、任意選択的に、ｐｇｍ（ホスホグルコムターゼ）及び／またはｇａｌＵ（ＵＴＰ−グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ）、またはそのオーソログもしくは誘導体である、グルコース−６−リン酸をＵＤＰ−グルコースに変換することに関与する酵素をコードする１つ以上の遺伝子の過剰発現または増加した活性を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項９８】
前記微生物細胞が、ｙｃｊＵ（β−ホスホグルコムターゼ）及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ｕｇｐＡ、またはそのオーソログもしくは誘導体の過剰発現もしくは増加した活性もしくは発現を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項９９】
前記微生物細胞が、任意選択的に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｚｗｆまたはその相同体もしくはその操作された誘導体の過剰発現または増加した活性である、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）への流動を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項１００】
前記微生物細胞が、任意選択的に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇａｌＰ及びＥ．ｃｏｌｉ  ｇｌｋ（グルコキナーゼ）、または代替的に、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ｇｌｆ及びＥ．ｃｏｌｉ  ｇｌｋ、またはこれらの遺伝子の相同体、オーソログ、もしくは操作された誘導体の増加した発現もしくは活性を含む、グルコース輸送を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項１０１】
前記微生物細胞が、任意選択的に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｙｒＨ（ＵＭＰキナーゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｍｋ（シチジル酸キナーゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｄｋ（アデニル酸キナーゼ）、もしくはＥ．ｃｏｌｉ  ｎｄｋ（ヌクレオシド二リン酸キナーゼ）、またはこれらの酵素の相同体、オーソログ、もしくは操作された誘導体の増加した発現または活性を含む、ＵＴＰ産生及びリサイクルを増加させる１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項１０２】
前記微生物細胞が、任意選択的に、ｕｐｐ（ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ｐｙｒＨ（ＵＭＰキナーゼ）、及びｃｍｋ（シチジルレートキナーゼ）、またはその相同体もしくはその操作された誘導体の過剰発現もしくは増加した活性、または、ｄｃｔＡ（Ｃ４ジカルボキシレート／オロレート：Ｈ＋シンポーター）、ｐｙｒＥ（オロレートホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ｐｙｒＨ（ＵＭＰキナーゼ）及びｃｍｋ（シチジルレートキナーゼ）、またはその相同体もしくはその操作された誘導体の過剰発現もしくは増加した活性を含む、ＵＤＰ産生を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項１０３】
前記微生物細胞が、任意選択的に、ｓｇｒＳ小制御ＲＮＡの欠失、不活性化、または減少した発現を含む、グルコース取り込みの除去または調節を減少させるための１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項１０４】
前記微生物細胞が、任意選択的に、前記微生物細胞におけるＥ．ｃｏｌｉ  ａｇｐ（グルコース−１−ホスファターゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｉｈＸ（α−Ｄ−グルコース−１−リン酸ホスファターゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｂｉＶ（糖ホスファターゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｉｄＡ（糖ホスファターゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｉｇＬ（リン糖ホスファターゼ）、及びＥ．ｃｏｌｉ  ｐｈｏＡ（アルカリホスファターゼ）、またはそのオーソログのうちの１つ以上の欠失、不活性化、または減少した発現もしくは活性を含む、グルコース−１−リン酸の脱リン酸化を減少させる１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項１０５】
前記微生物細胞が、任意選択的に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｆｆＨ（ｄＴＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ）及びＥ．ｃｏｌｉ  ｒｆｂＡ（ｄＴＤＰグルコースピロホスホリラーゼ）、またはそのオーソログのうちの１つ以上の欠失、不活性化、または減少した発現もしくは活性を含む、グルコース−１−リン酸のＴＤＰ−グルコースへの変換を減少させる１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項１０６】
前記微生物細胞が、任意選択的に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇｉｇＣ（グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ）またはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した発現もしくは活性を含む、グルコース−１−リン酸のＡＤＰ−グルコースへの変換を減少させる１つ以上の遺伝子修飾を有する、請求項７０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本願は、２０１８年７月１６日に出願された米国仮出願第６２／６９８，６１７号に対する優先権及びその利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
小分子のグリコシルトランスフェラーゼは、植物界の大きな多遺伝子ファミリーによってコードされる。これらの酵素は、ヌクレオチド糖から広範囲の二次代謝産物に糖を移し、それによって受容体分子の物理的及び化学的特性を変化させる。例えば、ステビオールグリコシドは、南米の特定の地域に自生するアステラ科（コンポジタ科）ファミリーの多年生低木であるステビア・レボジアナ・ベルトーニ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ）の葉に見られる化合物のクラスである。それらは、構造的に、Ｃ１３位及びＣ１９位における炭水化物残基の存在によって異なる、単一の塩基、ステビオールによって特徴付けられる。これらは、ステビアの葉に蓄積され、総乾燥重量の約１０％〜２０％を構成する。乾燥重量基準では、ステビアの葉に見られる４つの主要なグリコシドは、典型的には、ステビオシド（９．１％）、レバウジオシドＡ（３．８％）、レバウジオシドＣ（０．６〜１．０％）及びズルコシドＡ（０．３％）を含む。他のステビオールグリコシドは、レバウジオシドＢ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、及びＯ、ズルコシドＢ、ステビオールビオシド、及びルブシドを含む、少量または微量で存在する。
【０００３】
少量のグリコシル化産物レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）は、スクロースよりも約２００〜３５０倍強力であると推定され、わずかに苦味または甘草の後味を有する清潔で甘い味を有すると記載される。Ｐｒａｋａｓｈ  Ｉ．ら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｔｅｖｉａ  Ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ：Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ  Ｍ，Ｆｏｏｄｓ  ３（１），１６２−１７５（２０１４）。ＲｅｂＭはグローバルな食品業界にとって非常に関心があるが、ステビアの抽出物の普及率が低いため、その合成に革新的なプロセスが必要である。
【０００４】
天然植物抽出物の副産物である高値グリコシドを製造するための経済的な方法の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００５】
様々な態様及び実施形態では、本発明は、微生物細胞、及び低グリコシル化中間体から高度なグリコシル化産物を産生するための方法を提供する。微生物細胞は、中間体のグリコシル化のための１つ以上のＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼを発現する。グリコシド中間体を含む植物抽出物またはその画分とともに微生物株をインキュベートする場合、これらの中間体は、微生物細胞によるさらなるグリコシル化のために利用可能である。様々な実施形態では、高度なグリコシル化産物は、培地及び／または微生物細胞から回収される。
【０００６】
グリコシド中間体は、とりわけ、グリコシル化テルペノイド、フラボノイド、カンナビノイド、ポリケチド、スチルベノイド、及びポリフェノールを含む植物抽出物中に天然に見られるものなどの任意のグリコシル化二次代謝産物でよい。いくつかの実施形態では、グリコシル化中間体はステビオールグリコシドまたはモグロシドなどのグリコシル化テルペノイドであり、甘味料として使用され得る。いくつかの実施形態では、産物の生合成は、微生物細胞におけるグリコシド中間体の少なくとも２つのグリコシル化反応を伴う。
【０００７】
いくつかの実施形態では、グリコシド中間体はステビア葉抽出物由来である。例えば、ＲｅｂＭ及び他の高度なグリコシル化産物は、とりわけ、ステビオシド、ステビオ−ルビオシド、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、及びレバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）などのステビオールグリコシド中間体から生合成され得る。微生物細胞は、より低い値の中間体のグリコシル化のために、細胞質中に１つ以上のＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ酵素を発現する。ステビオールグリコシド中間体を含むステビア葉抽出物またはその画分とともに微生物株をインキュベートする場合、これらの中間体は、さらなるグリコシル化のために細胞に利用可能であり、これらの産物は、培地及及び／または微生物細胞から回収することができる。したがって、このプロセスは、ステビア葉抽出物中に高度な中間体、すなわち、１〜５個のグリコシル化を有するステビオールグリコシド（ならびにいくつかの実施形態では、アグリコンコア、ステビオール）を使用する。ステビア葉抽出物からの高度な中間体は、既存のステビオールグリコシドの工業的抽出物から容易に入手可能である。
【０００８】
様々な実施形態では、微生物細胞は、グリコシド中間体をグリコシル化する少なくとも１つ、または少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つのＵＧＴ酵素を発現し、表１に列挙されるもの、及び本明細書において配列番号１〜４５として提供されるもの、ならびにそれらの誘導体から選択され得る。様々な実施形態では、ＵＧＴ酵素は、独立して、１−２’グリコシル化ＵＧＴ酵素、１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素、及びＯ−グリコシル化ＵＧＴ酵素から選択される。様々な実施形態では、これらの酵素は、膜転座または分泌シグナルを含有しないという点で、細胞内で発現される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、特にステビア葉抽出物中のステビオールグリコシド中間体のグリコシル化に関して、微生物細胞は、１３−Ｏ  ＵＧＴグリコシル化酵素、１９−Ｏ  ＵＧＴグリコシル化酵素、１−２’ＵＧＴグリコシル化酵素、及び１−３’ＵＧＴグリコシル化酵素などの４つのＵＧＴ酵素を発現する。
【００１０】
様々な実施形態では、微生物細胞は１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する。例えば、１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素は、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１、ＭｂＵＧＴ１−３、及びその誘導体（例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１＿Ｌ２００ＡまたはＭｂＵＧＴ１−３＿１、ＭｂＵＧＴ１−３＿１．５、またはＭｂＵＧＴ１−３＿２）から選択され得る。
【００１１】
これら及び他の実施形態では、微生物細胞は、１−２’グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する。例えば、１−２’グリコシル化ＵＧＴ酵素は、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ１、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、ＯｓＵＧＴ１−２、ＭｂＵＧＴ１，２、ＭｂＵＧＴ１，２．２、及びそれらの誘導体から選択され得る。
【００１２】
これらまたは他の実施形態では、微生物細胞は、Ｃ１３  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する。例えば、Ｃ１３  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素は、ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２及びその誘導体（例えば、ＭｂＵＧＴＣ１３）から選択され得る。
【００１３】
これらまたは他の実施形態では、微生物細胞は、Ｃ１９  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する。例えば、Ｃ１９  Ｏ−グリコシル化酵素は、ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１、ＭｂＵＧＴｃ１９、及びその誘導体（例えば、ＭｂＵＧＴｃ１９−２）から選択され得る。
【００１４】
全細胞変換は、細胞内で発現される酵素が外部供給基質（例えば、グリコシル化中間体）に作用し、細胞がＵＤＰ−グルコース補因子再生を提供することを必要とする。これは、外因性ＵＤＰ−グルコース供給、またはＵＤＰ−グルコース前駆体、またはＵＤＰ−グルコース再生機構、またはＵＤＰ−グルコース再生酵素システムを必要とする、細胞外で精製または分泌される酵素に依存するプロセスとは対照的である。本発明の実施形態では、触媒作用（グリコシル化）は、生きた微生物細胞を用いて行われる。ＵＤＰ−グルコース補因子リサイクルは、追加の外部提供酵素または基質供給を必要とせずに、天然の細胞代謝を使用して行われる。
【００１５】
本開示によれば、微生物細胞に対する遺伝子修飾は、細胞内発現酵素によるさらなるグリコシド化のためにグリコシド中間体が利用可能であることを可能にする。いくつかの実施形態では、溶解細胞から抽出されるのとは対照的に、高度なグリコシル化産物を培地から回収することができる。いくつかの実施形態では、微生物細胞はＵＤＰ−グルコース利用能を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を有する。いくつかの実施形態では、理論に拘束されることを望むものではないが、これらの修飾はまた、グルコース利用能について細胞にストレスを与えることがあり、グリコシド中間体を細胞に移入するための内因性トランスポーターの発現の増加につながる。いくつかの実施形態では、理論によって拘束されることを望むものではないが、細胞は遺伝子修飾または培地成分を通して透過性にされ、産物及び基質の受動的拡散を可能にする。
【００１６】
様々な実施形態では、微生物細胞は、（例えば、親微生物株と比較して）１つ以上の内因性トランスポーターの過剰発現を有するか、またはある特定の実施形態では、組換え及び／または操作された輸送タンパク質を発現するように修飾される。いくつかの実施形態では、微生物細胞は、内因性輸送タンパク質またはその誘導体の１つ以上の追加のコピーを発現する。例えば、輸送タンパク質の発現または活性は、ＲｅｂＭ及び／またはＲｅｂＤ、ならびに他の高度なグリコシル化産物などの産物を移出しながら、ステビオールグリコシド基質（例えば、ステビオシド、ステビオールビオシド、ＲｅｂＡ、及び／またはＲｅｂＣのうちの１つ以上）の細胞への輸送を増加させるように修飾され得る。微生物細胞における変化した活性または基質特異性のために過剰発現または操作され得る例示的な輸送タンパク質としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｃｒＡＤ、ｘｙｌＥ、ａｓｃＦ、ｂｇｌＦ、ｃｈｂＡ、ｐｔｓＧ／ｃｒｒ、ｗｚｘＥ、ｒｆｂＸ、ならびにそのオーソログまたは誘導体が挙げられる。他の輸送タンパク質は、所望のグリコシド中間体を輸送する細菌または内因性輸送タンパク質から選択されるものを含む。例えば、トランスポーターは、宿主種、または別の細菌もしくは酵母種由来であってもよく、特定のグリコシド中間体または産物に対するその親和性を調節するように操作されてもよい。
【００１７】
様々な実施形態では、本方法は、グリコシド中間体の所望の産物への少なくとも４０％の変換、もしくは少なくとも５０％の変換、または少なくとも７５％の変換（例えば、ステビオシド、ステビオールビオシド、及びＲｅｂＡのＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、ならびに／または他の高度にグリコシル化されたリバウジオシドへの変換）をもたらす。ＲｅｂＭの生産において、製品プロファイルはＲｅｂＤよりもＲｅｂＭを強く好む可能性がある。
【００１８】
本方法は、バッチ発酵、フィードバッチ発酵、連続発酵、または半連続発酵によって行うことができる。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、約７２時間未満、またはいくつかの実施形態では、約４８時間未満、もしくは約２４時間未満のインキュベーション時間でバッチ発酵によって行われる。
【００１９】
いくつかの態様では、本発明は、ＲｅｂＭなどの高度なステビオールグリコシドを含む産物を作製するための方法を提供する。本方法は、標的ステビオールグリコシドを、食品、飲料、口腔ケア製品、甘味料、香味剤、または他の製品などの製品に組み込むことを含む。いくつかの態様では、本発明は、複数の高強度甘味料、例えば、ステビオールグリコシド、モグロシド、スクラロース、アスパルテーム、ネオテーム、アドバンタム、アセスルファムカリウム、サッカリン、シクラメート、ネオヘスペリジンジヒドロチャルコン、グネチホリンＥ、及び／またはピシアタノール４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドのうちの２つ以上を含む甘味料組成物の作製方法を提供する。
【００２０】
本発明の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＲｅｂＭの構造。ステビオール骨格（ジテルペノイド）をボックス化して示す。ＲｅｂＭは、６つのグリコシル化を含む：（１）Ｃ１３  Ｏ−グリコシル化、（２）Ｃ１３  １−２’グリコシル化、（３）Ｃ１３  １−３’グリコシル化、（４）Ｃ１９  Ｏ−グリコシル化、（５）Ｃ１９  １−２’グリコシル化、及び（６）Ｃ１９  １−３’グリコシル化。
【図２】ステビオール及びステビオールグリコシド中間体に対するＵＧＴ酵素の作用によって産生されるグリコシル化産物。
【図３】ラムノースを含有するステビオールグリコシド中間体に対するＵＧＴ酵素の作用によって産生されるグリコシル化産物。
【図４】ステビオールビオシドのＲｅｂＭへの変換。ＲｅｂＭ経路における５つの主要な化合物について、ＵＧＴ酵素を欠く対照株におけるこれらの化合物の総濃度と比較して、化合物濃度が示される。株を０．２ｍＭのステビオ−ルビオシドに供給し、基質とともに４８時間インキュベートしてから抽出した。株３及び４は、ステビオ−ルビオシドの転換を示さず、一方、株５は、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭへの実質的な転換を示す。
【図５】ステビオシド及びＲｅｂＡのＲｅｂＭへの変換。葉抽出物、ステビオシド及びＲｅｂＡ中で見出される２つの市販の中間体のＲｅｂＭへの生物変換は、株１〜５を使用して示される。ステビオールコアの生物学的変換も示される。値は、全ステビオールグリコシド組成物のパーセンテージとして報告される。全ての株によるステビオールのＲｅｂＭへの転換は、全ての株がＲｅｂＭ形成可能であることを示す。ステビオ−ルビオシドの場合と同様に、ステビオシド及びＲｅｂＡの両方がＲｅｂＭに変換されるが、株５においてのみ変換される。ステビオシド及びＲｅｂＡからの転換の場合、ＲｅｂＤ：ＲｅｂＭの比はＲｅｂＭ（１：２０）を強く有利にする。
【図６】９６ウェルプレートにおけるステビオールグリコシドの生物変換。ＲｅｂＭ経路における５つの主要な化合物について、ＵＧＴ酵素を発現させたまたは発現させていない化合物濃度が示されている。株に０．５ｇ／Ｌのステビオシド／ＲｅｂＡ葉抽出物を供給し、試料採取前に４８時間基質とともにインキュベートした。
【図７】バイオリアクタースケールでのステビオシド／ＲｅｂＡ葉抽出物の生物変換。ＲｅｂＭ経路における５つの主要な化合物について、培地中の化合物濃度を発酵にわたる様々な時点でサンプリングした。株に２ｇ／Ｌのステビオシド／ＲｅｂＡ葉抽出物に供給し、合計３０時間基質とともにインキュベートした。
【図８】ＵＤＰ−グルコースへの天然Ｅ．ｃｏｌｉ流量を増加させるための遺伝子修飾。代謝産物：Ｇ６Ｐ、グルコース−６−リン酸；Ｇ１Ｐ、グルコース−１−リン酸；６ＰＧＬ、６−ホスホグルコン−１，５−ラクトン；６ＰＧ、６−ホスホグルコン酸；Ｒ５Ｐ、リボース−５−リン酸；ＰＲＰＰ、５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸；ＵＭＰ、ウリジン一リン酸；ＵＤＰ、ウリジン二リン酸；ＵＴＰ、ウリジン三リン酸；ＵＤＰ−Ｇｌｕ、ＵＤＰ−グルコース；ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＵＤＰ−ガラクトース；ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン；ＣＴＰ、シチジン三リン酸；ｄＵＤＰ、デオキシウリジン二リン酸；ＲｅｂＡ、レバウジオシドＡ；ＲｅｂＭ、レバウジオシドＭ。酵素：１．ｇｌｋ、グルコキナーゼ；２．ｐｇｉ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ；３．ｚｗｆ、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ；４．ｐｇｌ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ；５．ｅｄｄ、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ；６．ｇｎｄ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ；７．ｒｐｉＡ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、またはｒｐｅ、リブロース−リン酸３−エピメラーゼ；８．ｐｒｓ、リボース−リン酸ジホスホキナーゼ；９．ｐｙｒＥＦ、オロレートホスホリボシルトランスフェラーゼ及びオロチジン−５’リン酸デカルボキシラーゼ；１０．ｐｙｒＫ、ウリジレートキナーゼ；１１．ｎｄｋ、ＵＤＰキナーゼ；１２．ｍｕｒＧ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；１３．ｎｒｄＡＢＥＦ、リボヌクレオシド−ジホスホレダクターゼ；１４．ｐｙｒＧ、ＣＴＰシンターゼ；１５．ｐｇｍ、ホスホグルコムターゼ；１６．ｇａｌＵ、Ｕ−ＤＰ−グルコスホスホリラーゼ；１７．ｇａｌＥＴＫＭ、ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ／ガラクトーゼ−１−リン酸ウリジルイルトランスフェラーゼ／ガラクトキナーゼ／ガラクトース−１−エピメラーゼ；１８．ｕｓｈＡ、５’−ヌクレオチダーゼ／ＵＤＰ−糖ヒドロラーゼ；１９．ＵＧＴ、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ。概略図は、株１から株５につながる連続ゲノム修飾を例示する。株１は、塩基性Ｅ．ｃｏｌｉ株である。株２は、１７の欠失を有し、株３は１８の付加欠失を有する。株４は、２を欠失させることによって株３から構築された。株５は、１５及び１６を過剰発現することによって株４から構築された。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
様々な態様及び実施形態では、本発明は、微生物細胞及び低グリコシル化中間体から高度なグリコシル化産物を産生するための方法を提供する。様々な実施形態では、微生物細胞は、中間体のグリコシル化のための１つ以上のＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ酵素（例えば、細胞内）を発現する。様々な実施形態では、微生物細胞は、ＵＤＰ−グルコースの利用可能性を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を有する。微生物株を（例えば、植物抽出物またはその画分由来の）グリコシド中間体とともにインキュベートする場合、これらのグリコシド中間体は、細胞内発現グリコシルトランスフェラーゼ酵素によるさらなるグリコシル化のために細胞に利用可能である。いくつかの実施形態では、高度なグリコシル化産物は、培地から回収され得るか、またはいくつかの実施形態では、培地及び微生物細胞から回収される。
【００２３】
グリコシド中間体は、とりわけ、グリコシル化テルペノイド、グリコシル化フラボノイド、グリコシル化カンナビノイド、グリコシル化ポリケチド、グリコシル化スチルベノイド、及びグリコシル化ポリフェノールを含む植物抽出物中に天然に見られるものなどの任意のグリコシル化二次代謝産物であり得る。いくつかの実施形態では、グリコシド中間体は、ステビオールグリコシドまたはモグロシドなどのグリコシル化テルペノイドである。いくつかの実施形態では、グリコシド中間体は、とりわけ、グルコシル、ガラクトシル、マンノシル、キシロシル、及びラムノシル基から選択されるグリコシル基を含む、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのグリコシル基を有する。様々な実施形態では、グリコシル化産物は、少なくとも４つのグリコシル基、または少なくとも５つのグリコシル基、または少なくとも６つのグリコシル基を有する。他の実施形態では、産物は、７つ、８つ、９つ、またはそれ以上のグリコシル基を有する。いくつかの実施形態では、産物の生合成は、微生物細胞による中間体の少なくとも２つのグリコシル化を伴う。
【００２４】
いくつかの実施形態では、グリコシド中間体は、ステビア葉抽出物由来である。例えば、５つ、６つ、またはそれ以上のグリコシル化（ＲｅｂＤまたはＲｅｂＭなど）を有するステビオールグリコシドは、とりわけ、ステビオシド、ステビオ−ルビオシド、レバウジオシドＡ、ズルコシドＡ、ズルコシドＢ、レバウジオシドＣ、及びレバウジオシドＦなどのステビオールグリコシド中間体から生合成され得る。微生物細胞は、これらの低い値の前駆体のグリコシル化のための１つ以上のＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ酵素を発現する。ステビオールグリコシド中間体を含むステビア葉抽出物またはその画分と一緒に微生物株をインキュベートする場合、これらの中間体は、培地及び／または微生物細胞から回収され得るＲｅｂＤもしくはＲｅｂＭ、または他の高度なグリコシル化産物（例えば、ＲｅｂＩ）へのさらなるグリコシル化のために利用可能である。
【００２５】
様々な実施形態では、ＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、酵素が膜転座または分泌ペプチドまたはドメインを有しないという点で「細胞内」に発現される。したがって、ＵＧＴ酵素の発現は細胞質内で行われ、これらの酵素は分泌または輸送シグナルを介して細胞外に向けられない。様々な実施形態では、ＵＧＴ酵素は、膜アンカードメインを含まない。つまり、様々な実施形態では、ＵＧＴ酵素は、膜貫通ドメインを含まない。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本プロセスは、ステビア葉抽出物中の高度な中間体、すなわち、ステビオール（アグリコーン中間体）及び１〜５つのグリコシル化を有するステビオールグリコシドを使用し、これらはさらなるグリコシル化のために微生物細胞に利用可能である。ステビア葉抽出物からの高度な中間体は、既存のステビオールグリコシドの工業的抽出物から容易に入手可能である。表２に示すように、葉抽出物は、主に経路中間体ステビオシド及びレバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）を含有し得る。様々な実施形態では、ステビア葉抽出物は、ステビオールグリコシドの抽出物である。いくつかの実施形態では、抽出物は、顕著な成分としてステビオシド、ステビオ−ルビオシド、及びレバウジオシドＡのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、抽出物はズルコシドＡ、ズルコシドＢ、ＲｅｂＣ及び／またはＲｅｂＦのうちの１つ以上を顕著な成分として含む。顕著な成分は、概して、抽出物またはその画分中のステビオールグリコシドの少なくとも約１０％を構成するが、いくつかの実施形態では、抽出物またはその画分中のステビオールグリコシドの少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％を構成することがある。
【００２７】
ＲｅｂＭを図１に示す。ＲｅｂＭは、ステビオールコアの６つのグリコシル化を含有する：（１）Ｃ１３  Ｏ−グリコシル化、（２）Ｃ１３  １−２’グリコシル化、（３）Ｃ１３  １−３’グリコシル化、（４）Ｃ１９  Ｏ−グリコシル化、（５）Ｃ１９  １−２’グリコシル化、及び（６）Ｃ１９  １−３’グリコシル化。様々なグリコシル化産物が可能であるが（図２）、ＲｅｂＭは、４つのＵＧＴ酵素の作用を通じてステビオールから合成することができ、ＵＧＴグリコシル化酵素はそれぞれ、いくつかの基質に作用することができる。例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２及びＯｓＵＧＴ１−２の両方は、（Ｃ１３での作用によって）ステビオールモノシドからステビオ−ルビオシドを産生し、ならびに（Ｃ１９での作用によって）ＲｅｂＡからのＲｅｂＤを産生することができる１−２’グリコシル化酵素である。さらに、ＵＧＴ７６Ｇ１は、（Ｃ１３での作用によって）ステビオシドからＲｅｂＡを産生し、ならびに（Ｃ１９での作用によって）ＲｅｂＤからＲｅｂＭを産生することができる１−３’グリコシル化酵素である。
【００２８】
（ＲｅｂＭの生合成を含む）ステビオール及びステビオールグリコシドのグリコシル化のためのＵＧＴ酵素は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第２０１７／０３３２６７３号に開示される。例示的なＵＧＴ酵素は、以下の表１に列挙される（参照特許出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【表１】
2021530228.tif 000003
【００２９】
例示的なＵＧＴ酵素のアミノ酸配列は、本開示によって、配列番号１〜１７として提供される。配列番号１は、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ８５Ｃ２である。配列番号１３は、Ｐ２１５Ｔ置換を有するＳｒＵＧＴ８５Ｃ２であり、及び安定性を増加させるための第２の位置におけるＡｌａの挿入有する。配列番号２は、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ７４Ｇ１（第２の位置にＡｌａの挿入を有する）である。配列番号８及び１２は、ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１（ＭｂＵＧＴＣ１９及びＭｂＵＧＴＣ１９−２）に基づく環状変異体である。配列番号３は、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ７６Ｇ１である。１−３’グリコシル化活性を有する環状変異体は、配列番号１０（ＭｂＵＧＴ１−３）、ならびに配列番号１５、１６、及び１７（それぞれ、ＭｂＵＧＴ１−３＿１、ＭｂＵＧＴ１−３＿１．５、及びＭｂＵＧＴ１−３＿２）として開示される。Ｌ２００Ａ置換を有し、２位にＡｌａを有するＵＧＴ７６Ｇ１は、配列番号１４として開示される。Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ９１Ｄ１、ＵＧＴ９１Ｄ２、及びＵＧＴ９１Ｄ２ｅは、配列番号４、５、及び６として開示される。Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＵＧＴ１−２は、配列番号７として開示される。ＭｂＵＧＴ１，２及びＭｂＵＧＴ１，２．２は、１−２’グリコシル化活性を有する環状変異酵素である（配列番号９及び１１）。
【００３０】
さらなるＵＧＴ酵素は、Ｓｉｒａｉｔｉａ  ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ（モンクフルーツ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ（ツルレイシ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖａ（キュウリ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ（スクワッシュ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ（スクワッシュ、カボチャ）、Ｐｒｕｎｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａ（ピーチ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ（カカオ）、Ｃｏｒｃｈｏｒｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｒｉｓ（白ジュート）、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｊｕｊｕｂｅ（ベニナツメ）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（ブドウの木）、Ｊｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａ（クルミ）、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（ゴムの木）、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（キャッサバ）、Ｃｅｐｈａｌｏｔｕｓ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｉｓ（食虫植物）、及びＣｏｆｆｅａ  Ａｒａｂｉｃａ（コーヒー）の種から配列番号１８〜４６として提供される。ＵＧＴ酵素は、所望の産物及び利用可能な中間体に基づいて選択及び任意選択的に操作することができる。
【００３１】
様々な実施形態では、微生物細胞は、少なくとも１つ、または少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つのＵＧＴ酵素を発現する。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ酵素はステビオールグリコシド基質（表２に列挙されるものを含む）をグリコシル化する。いくつかの実施形態では、微生物細胞は、ステビオールグリコシド中間体をグリコシル化する４つのＵＧＴ酵素、例えば１３−Ｏ  ＵＧＴグリコシル化酵素、１９−Ｏ  ＵＧＴグリコシル化酵素、１−２’ＵＧＴグリコシル化酵素、及び１−３’ＵＧＴグリコシル化酵素を発現する。ステビア葉のグリコシル化中間体に対するこれらの一般的なクラスのＵＧＴ酵素の作用を図２及び図３に示す。
【００３２】
様々な実施形態では、微生物細胞は、１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する。例えば、１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素は、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１、ＭｂＵＧＴ１−３＿１、ＭｂＵＧＴ１−３＿１．５、及びＭｂＵＧＴ１−３＿２、ならびにそれらの誘導体から選択され得る。
【００３３】
これら及び他の実施形態では、微生物細胞は、１−２’グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する。例えば、１−２’グリコシル化ＵＧＴ酵素は、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ１、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、ＯｓＵＧＴ１−２、ＭｂＵＧＴ１，２、ＭｂＵＧＴ１，２．２、及びそれらの誘導体から選択され得る。
【００３４】
これらまたは他の実施形態では、微生物細胞は、Ｃ１３  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する。例えば、Ｃ１３  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素は、ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２及びその誘導体（例えば、ＭｂＵＧＴＣ１３）から選択され得る。
【００３５】
これらまたは他の実施形態では、微生物細胞は、Ｃ１９  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する。例えば、Ｃ１９  Ｏ−グリコシル化酵素は、ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１、ＭｂＵＧＴｃ１９、及びその誘導体（例えば、ＭｂＵＧＴｃ１９−２）から選択され得る。
【００３６】
これらまたは他の実施形態では、微生物細胞は、１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素及び１−２’グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する。いくつかの実施形態では、微生物細胞は、１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素、１−２’グリコシル化ＵＧＴ酵素、及びＣ１３  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する。いくつかの実施形態では、微生物細胞は、１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素、１−２’グリコシル化ＵＧＴ酵素、Ｃ１９  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素、及びＣ１９  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する。いくつかの実施形態では、微生物細胞は、１−３’グリコシル化ＵＧＴ酵素、１−２’グリコシル化ＵＧＴ酵素、Ｃ１９  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素、及びＣ１３  Ｏ−グリコシル化ＵＧＴ酵素を発現する。いくつかの実施形態では、微生物細胞は、ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２もしくはその誘導体（例えば、ＭｂＵＧＴＣ１３）、ＭｂＵＧＴ１，２．２もしくはその誘導体、ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１もしくはその誘導体（例えば、ＭｂＵＧＴｃ１９もしくはＭｂＵＧＴｃ１９−２）、及びＳｒＵＧＴ７６Ｇ１もしくはＭｂＵＧＴ１−３＿１もしくはその誘導体（例えば、７６Ｇ１＿Ｌ２００Ａ、ＭｂＵＧＴ１−３＿１．５、もしくはＭｂＵＧＴ１−３＿２）を発現する。理論に拘束されるものではないが、操作されたＵＧＴ酵素は、ＲｅｂＭ（ならびにより高いグリコシル化産物）への増加した炭素流量を提供し得、特に、より低いグリコシル化中間体上での活性を実質的に損失することなく、より大きな基質をより良好に収容することができる基質結合ポケットに起因し得る。これらの実施形態では、ＵＧＴ酵素（１−３’及び１−２’グリコシル化ＵＧＴ酵素など）は、ＲｅｂＡまたはＲｅｂＤなどのより高度にグリコシル化されたステビオール基質を有する増加した活性速度（例えば、基質結合速度及びターンオーバー）を有し得る。
【００３７】
ＵＧＴ酵素の誘導体は、一般に、配列番号１〜４６のうちの１つ以上に対して、少なくとも約５０％同一性、少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約８５％同一性、もしくは少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性、または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、誘導体は、配列番号１〜４６のうちの１つに関して１〜２０または１〜１０、または１〜５個のアミノ酸修飾（独立して、アミノ酸の置換、挿入、及び欠失から選択される）を有する。いくつかの実施形態では、例えば、ステビオールグリコシド中間体からのＲｅｂＭ及び他の高度なステビオールグリコシド（例えば、少なくとも５個のグリコシル基を有する）の産生に関して、これらのＵＧＴ酵素の誘導体は、配列番号１〜１７のうちの１つ以上に対して、少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、もしくは少なくとも約９０％の同一性、もしくは少なくとも約９５％の同一性、または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、誘導体は、配列番号１〜１７のうちの１つに関して、１〜２０または１〜１０、または１〜５個のアミノ酸修飾（独立して、アミノ酸の置換、挿入、及び欠失から選択される）を有する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、微生物細胞は、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む１−３’ＵＧＴ酵素を発現する。いくつかの実施形態では、１−３’ＵＧＴは、配列番号：１５、１６、または１７と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、１−３’ＵＧＴ酵素のアミノ酸配列は、配列番号１５、１６、もしくは１７と少なくとも約８５％同一、または配列番号１５、１６、もしくは１７と少なくとも約９０％同一、または配列番号１５、１６、もしくは１７と少なくとも約９５％同一、または配列番号１５、１６、もしくは１７と少なくとも約９８％同一である。いくつかの実施形態では、１−３’ＵＧＴ酵素のアミノ酸配列は、配列番号１５、１６、または１７のアミノ酸を含む。
【００３９】
例えば、アミノ酸配列は、アミノ酸配列番号１５、１６、または１７に関して、独立して、置換、欠失、及び挿入から選択される１〜２０個のアミノ酸修飾を有し得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号１５、１６、または１７のアミノ酸配列に関して、独立して、置換、欠失、及び挿入から選択される１〜１０個（例えば、１〜５個）のアミノ酸修飾を有する。配列番号１５、１６、または１７のアミノ酸配列へのアミノ酸修飾は、利用可能な酵素構造、及び相同性モデルの構築によって誘導することができる。例示的構造は、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ  ＵＧＴ８５Ｈ２−ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ（ｉｓｏ）Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｊ．ｏｆ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７０．５（２００７）：９５１−９６３に記載されている。公的に入手可能な結晶構造（例えば、ＰＤＢエントリ：２ＰＱ６）を使用して、アミノ酸修飾を通知し得る。例えば、１つ以上のアミノ酸修飾が活性部位または活性部位の近傍で行われ、基質の結合を改善する、及び／または触媒側鎖を有するこれらの基質の反応幾何学的形状を改善することができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、１−３’ＵＧＴ酵素は、配列番号３の２９位、２００位、３５７位、及び４１４位（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａＵＧＴ７６Ｇ１）に対応する位置にアミノ酸置換を含む。これらの位置での置換は、配列番号１５及び１７の酵素（それぞれ、配列番号１５の１８３位、３５４位、５４位、及び１１１位）に含まれ、活性の劇的な改善をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、配列番号１５の１８３位、３５４位、５４位、及び１１１位に対応する位置におけるアミノ酸の同一性は、他の位置におけるさらなる修飾を可能にする。例えば、いくつかの実施形態では、１−３’ＵＧＴ酵素は、配列番号１５または１７のアミノ酸配列と少なくとも約６０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＵＧＴ酵素は、配列番号１５の５４位に対応する位置にグリシン（Ｇ）またはトレオニン（Ｔ）、配列番号１５の１１１位に対応する位置にロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）、配列番号１５の１８３位に対応する位置にメチオニン（Ｍ）またはロイシン（Ｌ）、及び配列番号１５の３５４位に対応する位置にアラニン（Ａ）、またはグリシン（Ｇ）、またはセリン（Ｓ）を含む。いくつかの実施形態では、１−３’ＵＧＴ酵素は、配列番号１５の１８３位に対応する位置にメチオニン（Ｍ）を含む。いくつかの実施形態では、１−３’ＵＧＴ酵素は、配列番号１５の５４位に対応する位置にグリシン（Ｇ）を含む。いくつかの実施形態では、１−３’ＵＧＴ酵素は、配列番号１５の１１１位に対応する位置にロイシン（Ｌ）を含む。いくつかの実施形態では、１−３’ＵＧＴは、配列番号１５の１８３位に対応する位置にメチオニン（Ｍ）、配列番号１５の５４位に対応する位置にグリシン（Ｇ）、及び配列番号１５の１１１位に対応する位置にロイシン（Ｌ）のうちの２つまたは３つを有する。これらの修飾は、酵素の活性を実質的に改善することができる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、１−３’ＵＧＴ酵素は、配列番号１５の１５５位に対応する位置の後に、５〜約１５個のアミノ酸、例えば６〜１２個のアミノ酸、または約６もしくは約１１個のアミノ酸の挿入を含む。いくつかの実施形態では、挿入は、主にグリシン及びセリン残基である可撓性でかつ親水性の配列である。いくつかの実施形態では、配列は、ＧＳＧＧＳＧ（配列番号４７）またはＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号４８）である。
【００４２】
様々な実施形態では、１−３’ＵＧＴ酵素は、ＵＧＴ７６Ｇ１−Ｌ２００Ａ（配列番号１４）と比較して、ステビオシドのＲｅｂＡへの変換の改善、及びＲｅｂＤのＲｅｂＭへの変換の改善を示す。この改善された変換は、ステビオシドまたはＲｅｂＤ基質が１−３’ＵＧＴ酵素を発現する微生物細胞に供給される生物変換アッセイにおいて示される。改善された変換は、組換え発現された１−３’ＵＧＴを含有する細胞溶解物との反応において、または精製もしくは部分的に精製された１−３’ＵＧＴとのインビトロ反応において実証され得る。
【００４３】
酵素のアミノ酸配列への変化は、その活性を変化させることができるか、または測定可能な効果を有しない。測定可能な効果を伴わないサイレント変化は、多くの場合、活性部位及び基質結合部位から離れて位置する溶媒曝露表面上の保存的置換及び小さな挿入または欠失である。対照的に、酵素活性は、非保存的置換、大きな挿入または欠失、ならびに活性部位、基質結合部位内、及びタンパク質折り畳みまたは立体配座に重要な埋設位置における変化によって影響を受ける可能性が高い。酵素活性を変化させる変化は、反応速度を増加もしくは減少させるか、または特定の基質に対する親和性もしくは特異性を増加もしくは減少させ得る。例えば、基質結合部位のサイズを増加させる変化は、酵素がより大きな基質に作用することを可能にすることがあり、基質上の標的部位により近い触媒アミノ酸側鎖を位置決めする変化は、酵素速度を増加させ得る。
【００４４】
酵素の三次元構造、及び関連する活性部位、基質結合部位、及び他の相互作用部位の位置に関する知識は、誘導体の合理的な設計を容易にし、特定の変化の表現型に対する機械的洞察を提供することができる。植物ＵＧＴは、比較的低いアミノ酸配列同一性を有する一方で、高度に保存された二次及び三次構造を共有する。Ｏｓｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ＵＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７０（２００９）３２５−３４７。ＵＧＴの糖受容体及び糖ドナー基質は、Ｎ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間に形成される切断部に収容される。一次配列のいくつかの領域は、構造的に保存されたドメイン、ならびにそれらのアミノ酸配列及び配列長に関して異なるループ領域を含む基質結合ポケットの形成に寄与する。
【００４５】
ＵＧＴ誘導体の構築は、既知の構造と比較して、相同性モデリングに基づいて誘導することができる。例えば、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１＿Ｌ２００Ａの結晶構造解析及びＳｒＵＧＴ７６Ｇ１のＭｂＵＧＴ３−１＿１へのアミノ酸配列アラインメントに基づいて、ステビオシドのステビオールコアがＭｂＵＧＴ３−１＿１の以下の残基：Ｉ２４４、Ｌ２８０、Ｗ３５１、Ａ３５４、Ｉ３５７、Ｍ３６２、及びＴ４３８に近い（４Å以内）と予測される。さらに、Ｃ１９  １−２グリコシル化は、Ｔ４３８に近い（４Å以内）と予測される。ＲｅｂＤのステビオールコアは、ＭｂＵＧＴ３−１＿１の以下の疎水性側鎖：Ｌ２３９、Ｍ２４２、Ｉ２４４、Ｌ２８０、Ｉ３５３、Ａ３５４、及びＩ３５７に近い（４Å以内）と予測される。Ｃ１３  １−２’グリコシル化は、ＭｂＵＧＴ３−１＿１の以下の水素結合側鎖：Ｓ３０１及びＤ７７に近い（４Å以内）と予測される。ＭｂＵＧＴ３−１＿１のＶ３４１−Ｑ３５２及びＫ３５５−Ａ３６７螺旋の位置決め及びアミノ酸含有量は、Ｌ２００Ａに対応する変異がこれらの螺旋間のループにあるため、触媒作用に重要である場合がある。ＭｂＵＧＴ３−１＿１の位置Ｌ７６及び／またはＤ７７は、ステビオシドのＣ１３グリコシル化と相互作用し得る。
【００４６】
ＵＧＴ酵素のうちの１つ以上のアミノ酸配列は、細胞のターンオーバーを減少させるために２位に挿入または置換されたアラニンを任意選択的に含むことができる。様々な実施形態では、１つ以上のＵＧＴ酵素は、インビボでさらなる安定性を提供するために、２位に挿入または置換されたアラニンアミノ酸残基を含む。
【００４７】
アミノ酸配列の同一性、すなわち、配列同一性のパーセンテージは、配列アラインメントを介して決定することができる。かかるアライメントは、いくつかの既知のアルゴリズム、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ５８７３−５８７７）、ｈｍｍａｌｉｇｎ（ＨＭＭＥＲパッケージ）またはＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．＆  Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，４６７３−８０）に記載のアルゴリズムなどで実行することができる。配列同一性（配列マッチング）の等級は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴ、またはＢｌａｓｔＺ（またはＢｌａｓｔＸ）を使用して計算され得る。同様のアルゴリズムが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰプログラムに挿入されている。ＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質アラインメントを行うことができる。比較目的でギャップのあるアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載のように利用される。ＢＬＡＳＴ及びギャップのあるＢＬＡＳＴプログラムの利用時には、それぞれのプログラムの初期設定パラメータが使用される。
【００４８】
ＵＧＴ酵素は、微生物細胞の染色体に組み込まれてもよく、あるいは染色体外で発現されてもよい。例えば、ＵＧＴ酵素は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）または酵母人工染色体（ＹＡＣ）から発現され得る。
【００４９】
ＵＧＴ酵素の発現は、例えば、遺伝子モジュール（例えば、オペロン）またはＵＧＴ酵素の独立した発現を使用して、最適な活性のために調整され得る。例えば、異なる強度（例えば、強力、中間、または弱い）を有する誘導性または構成的プロモーターなどのプロモーターの選択によって、遺伝子またはオペロンの発現を調節することができる。異なる強度のプロモーターのいくつかの非限定的な例としては、Ｔｒｃ、Ｔ５、及びＴ７が挙げられる。加えて、遺伝子またはオペロンの発現は、細胞内の遺伝子またはオペロンのコピー数の操作によって調節することができる。いくつかの実施形態では、細胞は各ＵＧＴ酵素の単一コピーを発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子またはオペロンの発現は、モジュール内の遺伝子の順序を操作することによって調節され得、最初に転写される遺伝子は、概してより高いレベルで発現される。いくつかの実施形態では、遺伝子またはオペロンの発現は、１つ以上の遺伝子またはオペロンを染色体に組み込むことによって調節される。
【００５０】
ＵＧＴ発現の最適化は、適切なプロモーター及びリボソーム結合部位の選択によっても達成することができる。いくつかの実施形態では、これは、高コピー数プラスミドもしくは単一コピー数プラスミド、または低コピー数プラスミドもしくは中コピー数プラスミドの選択を含み得る。転写終結のステップは、ステムループなどの構造の導入または排除によって、遺伝子発現の調節のために標的化することもできる。
【００５１】
全細胞変換には、発現酵素（例えば、細胞内発現酵素）によるグリコシル化のために基質（例えば、グリコシド中間体）が細胞に利用可能であり、好ましくは産物を細胞外培地から抽出することができることが必要である。細胞がＵＤＰ−グルコース補因子再生を提供するため、全細胞系には利点がある。これは、外因性ＵＤＰ−グルコース供給、またはＵＤＰ−グルコース前駆体、またはＵＤＰ−グルコース再生機構、またはＵＤＰ−グルコース再生酵素系を必要とする、細胞溶解または細胞外分泌からの酵素を使用するプロセスとは対照的である。本発明の実施形態では、生きた微生物細胞で触媒作用（グリコシル化）を行い、ＵＤＰ−グルコース補因子リサイクルは、ＵＤＰ−グルコース再生のために酵素供給または基質供給を必要とせずに細胞代謝を使用して行われる。
【００５２】
ＵＳ  ２０１７／０３３２６７３は、ＭＥＰ経路酵素を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ株、ならびにグルコースからのＲｅｂＭの産生を駆動する下流ステビオール生合成経路、及びＵＧＴ酵素を記載する。しかしながら、これらの株は、ＲｅｂＭに供給されたステビオールグリコシド中間体の生体触媒作用を行わず、これは、宿主細胞がステビオールグリコシド基質にアクセスすることができないことに部分的に起因し得る。本開示によれば、微生物細胞に対する遺伝子修飾は、グリコシル化中間体が細胞系全体でさらなるグリコシル化のために利用可能であることを可能にする。さらに、産物は、細胞外培地から回収することができ、これは、産物の下流精製及び処理を容易にする。
【００５３】
いくつかの実施形態では、微生物細胞はＵＤＰ−グルコース利用能を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を有する。いくつかの実施形態では、理論に拘束されることを望むものではないが、これらの修飾はまた、グルコース利用能について細胞にストレスを与え得、ステビオールグリコシドを細胞に移入するための内因性トランスポーターの発現の増加につながる。指数関数的に増殖するＥ．ｃｏｌｉにおける野生型ＵＤＰ−グルコースレベルは、約２．５ｍＭである（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＢＤ，  Ｋｉｍｂａｌｌ  ＥＨ，Ｇａｏ  Ｍ，Ｏｓｔｅｒｈｏｕｔ  Ｒ，Ｖａｎ  ｄｉｅｎ  ＳＪ，Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＪＤ．Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｃｃｕｐａｎｃｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００９；５（８）：５９３−９）。いくつかの実施形態では、宿主細胞に対する遺伝子修飾は、指数関数的に増殖する細胞（例えば、ＵＧＴ酵素の組換え発現を有しない細胞）において、ＵＤＰ−グルコースを、例えば、少なくとも５ｍＭ、または少なくとも１０ｍＭに増加させるように操作される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、微生物細胞は、ＵＤＰ−グルコースを消費する酵素をコードする遺伝子の欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する。例えば、微生物細胞は、微生物種におけるｕｓｈＡ（ＵＤＰ−糖ヒドロラーゼ）及び／またはＧａｌＥ、ｇａｌＴ、ｇａｌＫ、及びｇａｌＭ（ＵＤＰ−グルコースからのＵＤＰ−ガラクトース生合成に関与する）のうちの１つ以上、もしくはそのオーソログの欠失、不活性化、もしくは減少した活性を有し得る。いくつかの実施形態では、ｇａｌＥＴＫＭ遺伝子は、不活性化される、欠失する、または発現において実質的に減少する。あるいはまたは加えて、微生物細胞は、微生物種におけるＥ．ｃｏｌｉ  ｏｔｓＡ（トレハロース−６−リン酸シンターゼ）、またはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する。あるいはまたは加えて、微生物細胞は、微生物種におけるＥ．ｃｏｌｉ  ｕｇｄ（ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ）、またはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する。ＯｔｓＡ及びｕｇｄの活性を減少させるまたは排除することは、トレハロースまたはＵＤＰ−グルクロニン酸塩に対するＵＤＰ−グルコースシンクをそれぞれ除去または減少させることができる。
【００５５】
還元または除去することができる他のＵＤＰ−グルコースシンクには、脂質グリコシル化及びＬＰＳ生合成に関与する遺伝子、ならびにウンデカプレニル二リン酸（ＵＰＰ）のグリコシル化に関与する遺伝子の活性または発現を除去または減少させることが含まれる。糖鎖化脂質またはＬＰＳ生合成に関与する遺伝子としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｗａａＧ（リポ多糖グルコシルトランスフェラーゼ１）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｗａａＯ（ＵＤＰ−Ｄ−グルコース：（グルコシル）ＬＰＳ  α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼ））、及びＥ．ｃｏｌｉ  ｗａａＪ（ＵＤＰ−グルコース：（グリコシル）ＬＰＳ  α−１，２−グルコシルトランスフェラーゼ）が挙げられる。ウンデカプレニル二リン酸（ＵＰＰ）のグリコシル化に関与する遺伝子としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｆｄＧ（推定バクトプレノール結合グルコーストランスロケーゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｆｄＨ（バクトプレノールグルコシルトランスフェラーゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｆｄＩ（血清型特異的グルコシルトランスフェラーゼ）、及びＥ．ｃｏｌｉ  ｗｃａＪ（アンデカプレニルリン酸グルコースホスホトランスフェラーゼ）が挙げられる。これらの遺伝子産物（または微生物細胞内の対応するオーソログ）のうちの１つ以上の活性または発現の欠失、不活性化、または減少は、ＵＤＰ−グルコース利用能を増加させ得る。
【００５６】
これらまたは他の実施形態では、微生物細胞は、ＵＤＰ−グルコースの前駆体を消費する酵素をコードする遺伝子の欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する。例えば、いくつかの実施形態では、微生物細胞は、宿主細胞の微生物種におけるｐｇｉ（グルコース−６リン酸イソメラーゼ）、またはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した活性もしくは発現を有する。
【００５７】
これらまたは他の実施形態では、細胞は、グルコース−６−リン酸をＵＤＰ−グルコースに変換することに関与する酵素をコードする１つ以上の遺伝子の過剰発現または増加した活性を有する。例えば、ｐｇｍ（ホスホグルコムターゼ）及び／またはｇａｌＵ（ＵＴＰ−グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ）（またはそのオーソログもしくは誘導体）を過剰発現させることができるか、または酵素生産性を増加させるように修飾することができる。あるいは、または加えて、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換するＥ．ｃｏｌｉ  ｙｃｊＵ（β−ホスホグルコムターゼ）、及びグルコース−１−リン酸をＵＤＰに変換するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ｕｇｐＡ、またはこれらの酵素のオーソログもしくは誘導体は、過剰発現され得るか、または酵素生産性を増加させるように修飾され得る。
【００５８】
あるいは、または加えて、微生物細胞は、ＮＡＤＰ＋依存性グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼであるＥ．ｃｏｌｉ  ｚｗｆ（またはその相同体もしくは操作された誘導体）の過剰発現または活性の増加などの、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）への流動を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を有する。
【００５９】
あるいは、または加えて、微生物細胞は、グルコース輸送を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を有する。かかる修飾には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇａｌＰ（ガラクトース：Ｈ＋シンポーター）及びＥ．ｃｏｌｉ  ｇｌｋ（グルコキナーゼ）、または代替的に、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ｇｌｆ及びＥ．ｃｏｌｉ  ｇｌｋ、またはこれらの遺伝子の相同体、オーソログ、または操作された誘導体の増加した発現または活性が含まれる。
【００６０】
あるいは、または加えて、微生物細胞は、ＵＴＰ産生及びリサイクルを増加させる１つ以上の遺伝子修飾を有する。かかる修飾には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｙｒＨ（ＵＭＰキナーゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｍｋ（シチジル酸キナーゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｄｋ（アデニル酸キナーゼ）、もしくはＥ．ｃｏｌｉ  ｎｄｋ（ヌクレオシド二リン酸キナーゼ）、またはこれらの酵素の相同体、オーソログもしくは操作された増加した誘導体の発現または活性が含まれる。
【００６１】
あるいは、または加えて、微生物細胞は、ＵＤＰ産生を増加させる１つ以上の遺伝子修飾を有する。そのような修飾には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｕｐｐ（ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｄｃｔＡ（Ｃ４ジカルボキシレート／オロレート：Ｈ＋シポーター）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｙｒＥ（オロレートホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びＥ．ｃｏｌｉ  ｐｙｒＦ（オロチジン−５’−リン酸脱カルボキシラーゼ）のうちの１つ以上の過剰発現または増加した活性が含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、微生物細胞は、そのｕｐｐ、ｐｙｒＨ及びｃｍｋ、または相同体もしくは操作された誘導体を過剰発現するか、またはその活性の増加を有する。代替的に、微生物細胞は、ｄｃｔＡ、ｐｙｒｅ、ｐｙｒＨ及びｃｍｋ、またはその相同体もしくは操作された誘導体の活性を過剰発現するか、または増加させた。
【００６２】
あるいはまたは加えて、微生物細胞は、グルコース取り込みの除去または調節を減少させるための１つ以上の遺伝子修飾を有し得る。例えば、微生物細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける小さな調節ＲＮＡであるｓｇｒＳの欠失、不活性化、または減少した発現を有し得る。
【００６３】
あるいはまたは加えて、微生物細胞は、グルコース−１−リン酸の脱リン酸化を減少させる１つ以上の遺伝子修飾を有し得る。例示的な修飾としては、微生物細胞におけるＥ．ｃｏｌｉ  ａｇｐ（グルコース−１−ホスファターゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｉｈＸ（α−Ｄ−グルコース−１−リン酸ホスファターゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｂｉＶ（糖ホスファターゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｉｄＡ（糖ホスファターゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｙｉｇＬ（ホスホスガールホスファターゼ）、及びＥ．ｃｏｌｉ  ｐｈｏＡ（アルカリホスファターゼ）、またはそのオーソログのうちの１つ以上の欠失、不活性化、または減少した発現もしくは活性が挙げられる。
【００６４】
あるいはまたは加えて、微生物細胞は、グルコース−１−リン酸のＴＤＰ−グルコースへの変換を減少させる１つ以上の遺伝子修飾を有し得る。例示的な修飾としては、微生物細胞におけるＥ．ｃｏｌｉ  ｒｆｆＨ（ｄＴＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ）及びＥ．ｃｏｌｉ  ｒｆｂＡ（ｄＴＤＰグルコースピロホスホリラーゼ）、またはそのオーソログのうちの１つ以上の欠失、不活性化、または減少した発現もしくは活性が挙げられる。
【００６５】
あるいはまたは加えて、微生物細胞は、グルコース−１−リン酸のＡＤＰ−グルコースへの変換を減少させる１つ以上の遺伝子修飾を有し得る。例示的な修飾としては、微生物細胞におけるＥ．ｃｏｌｉ  ｇｉｇＣ（グルコース−１−リン酸アデニルトランスフェラーゼ）、またはそのオーソログの欠失、不活性化、または減少した発現もしくは活性が挙げられる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、微生物細胞は、遺伝子修飾：ｕｓｈＡ及びｇａｌＥＴＫＭが欠失する、不活性化される、または発現において減少すること、ｐｇｉが欠失する、不活性化される、または発現において減少すること、ならびにｐｇｍ及びｇａｌＵが過剰発現するかまたは相補的であること、を含む細菌細胞である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、内因性遺伝子は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変更することによって酵素活性を不活性化もしくは減少させるか、または発現制御配列を編集することによって発現を減少させるかのいずれかのために編集される。編集は、内因性プロモーター、リボソーム結合配列、もしくは他の発現制御配列を修飾することができ、及び／またはいくつかの実施形態では、遺伝子調節におけるトランス作用因子及び／またはシス作用因子を修飾することができる。ゲノム編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集技術、または亜鉛フィンガーヌクレアーゼ及びＴＡＬＥＮを用いた同様の技術を使用して行われ得る。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子は相同組換えによって置き換えられる。
【００６８】
様々な実施形態における微生物細胞は、前駆体の産生のための組換え生合成経路を発現しない（例えば、１つ以上の植物酵素を含む）。例えば、本発明の実施形態に従ってＲｅｂＭ（及び他の高度なグリコシル化産物）を産生する微生物細胞については、ＲｅｂＭ及び他の高度なグリコシル化産物の産生がステビオールグリコシド中間体を細胞に供給することに依存するように、コパリルシンターゼ、カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ及び／またはカウレノイン酸ヒドロキシラーゼなどのステビオール生合成経路を発現しない。
【００６９】
様々な実施形態では、微生物細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属から選択される細菌である。いくつかの実施形態では、細菌種は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａから選択される。いくつかの実施形態では、細菌細胞はＥ．ｃｏｌｉである。
【００７０】
他の実施形態では、細胞は、酵母細胞などの真菌細胞であり、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｐｈａｆｆｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ属、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、及び工業用多倍体酵母株である。一実施形態では、酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、またはＹａｒｒｏｗｉａの種であってもよい。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、さらなるグリコシル化のためにグリコシド中間体を細胞に移入する１つ以上の細菌トランスポーターまたはその誘導体を発現する。
【００７１】
様々な実施形態では、微生物細胞は、（例えば、親微生物株と比較して）１つ以上の内因性トランスポーターの過剰発現を有するか、またはある特定の実施形態では、組換え及び／または操作された輸送タンパク質を発現するように修飾される。いくつかの実施形態では、微生物細胞は、内因性輸送タンパク質またはその誘導体の１つ以上の追加のコピーを発現する。例えば、輸送タンパク質の発現または活性は、ＲｅｂＭ及び／またはＲｅｂＤ、および／または他の高度なグリコシル化ステビオールグリコシドなどの産物を移出しながら、ステビオールグリコシド中間体（例えば、ステビオシド、ステビオシド、及びＲｅｂＡのうちの１つ以上）の細胞への輸送を増加させるように修飾され得る。
【００７２】
微生物細胞における変化した活性または基質特異性のために過剰発現または操作され得る例示的な輸送タンパク質としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｃｒＡＤ、ｘｙｌＥ、ａｓｃＦ、ｂｇｌＦ、ｃｈｂＡ、ｐｔｓＧ／ｃｒｒ、ｗｚｘＥ、ｒｆｂＸ、ならびにそのオーソログまたは誘導体が挙げられる。これらのタンパク質の誘導体及びオーソログは、一般に、Ｅ．ｃｏｌｉ輸送タンパク質に対して、少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％同一性、少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約８５％同一性、もしくは少なくとも約９０％同一性、もしくは少なくとも約９５％同一性、または少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７３】
ａｃｒＡＤは、Ａｉｒｅｓ  ＪＲ及びＮｉｋａｉｄｏ  Ｈ．に記載されているＥ．ｃｏｌｉ多剤流出ポンプであり、アミノグリコシドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００５；１８７（６）：１９２３−９のＡｃｒＤ多剤流出トランスポーターによって、ペリプラズム及び細胞質の両方から捕捉される。さらに、相同体構造は、Ｙｕ，ＥＷ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｒｕｇ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡｃｒＢ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｅｆｆｌｕｘ  ｐｕｍｐ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３；３００（５６２１）：９７６−８０に記載されている。
【００７４】
ｘｙｌＥは、グルコーストランスポーターと相同性を有するＥ．ｃｏｌｉキシローストランスポーターである。ｘｙｌＥは、Ｓｕｍｉｙａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  Ｄ−ｘｙｌｏｓｅ，ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｘｙｌＦ，ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｒｅｃｅｐｔ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  １９９５；３（２）：１１７−２８に記載され、Ｓｕｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ＧＬＵＴ−１−４，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１２；４９０（７４２０）：３６１−６によって記載された構造を有する。
ａｓｃＦは、Ｈａｌｌ  ＢＧ及びＸｕ  Ｌ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒｙｐｔｉｃ  ａｓｃ  ｏｐｅｒｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１９９２；９（４）：６８８−７０６によって記載される。ａｓｃオペロンは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるセロビオース代謝において役割を果たすことが考えられる。
【００７５】
ｂｇｌＦは、Ｓｃｈｎｅｔｚ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｄｏｍａｉｎ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ａｎｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５（２３）：１３４６４−７１によって記載される。相同性構造は、Ｈｅｒｚｂｅｒｇ  Ｏ．，Ａｎ  ａｔｏｍｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｇｒｏｕｐ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２；２７６（３４）：２４８１９−２３によって記載される。ｂｇｌＦは、ベータ−グリコシドの輸送及びホスホリル化を触媒する。
【００７６】
ｃｈｂａは、Ｋｅｙｈａｎｉ  ＮＯ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ／ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ，Ｎ’−ｄｉａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＩＩＢ（Ｃｈｂ）ａｎｄ  ｏｆ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＩＩＡ（Ｃｈｂ）  ａｎｄ  ＩＩＢ（Ｃｈｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００；２７５（４２）：３３１０２−９に記載され、Ｔａｎｇ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ＩＩＡ（Ｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ）  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｎ，Ｎ’−ｄｉａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ  ｂｒａｎｃｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００５；２８０（１２）：１１７７０−８０に記載された構造を有する。ホスホエノールピルビン酸塩依存性糖ホスホトランスフェラーゼシステム（糖ＰＴＳ）は、細胞膜を横切るそれらのトランスロケーションと同時に入ってくる糖基質のリン酸化を触媒する主要な炭水化物活性輸送システムである。
【００７７】
ｐｔｓＧは、ホスホトランスフェラーゼ輸送系（ＰＴＳ）のグルコース特異的透過酵素をコードし、Ｍｅｉｎｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＩＧＩｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｆｏｒｍｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８；２６３（２６）：１２９８６−９３に記載されている。構造は、Ｃａｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ−ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩＡＧｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ＩＩＣＢＧｌｕｃｏｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３；２７８（２７）：２５１９１−２０６に記載されている。
【００７８】
ｗｚｘＥ及び分子輸送におけるその役割は、Ｒｉｃｋ  ＰＤ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｔｈｅ  ｗｚｘＥ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｂｉｌａｙｅｒ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｔｒｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｌｉｐｉｄ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｍｍｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３；２７８（１９）：１６５３４−４２に記載されている。
【００７９】
ｒｆｂｘは、Ｈｏｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｏｕｒ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｗｚｘ  ｆｌｉｐｐａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｉｐｉｄ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２０１８；２００（１）に記載されている。
【００８０】
他の輸送タンパク質としては、所望のグリコシド中間体を細胞内に輸送する、及び／または所望の産物を細胞から輸送する細菌性または内因性輸送タンパク質から選択されるものが挙げられる。例えば、トランスポーターは、宿主種、または別の細菌もしくは酵母種由来であってもよく、特定のグリコシド中間体または産物に対するその親和性を調節するように操作されてもよい。例えば、宿主細胞は、ａｍｐＧ、ａｒａＥ、ａｒａＪ、ｂｃｒ、ｃｙｎＸ、ｅｍｒＡ、ｅｍｒＢ、ｅｍｒＤ、ｅｍｒＥ、ｅｍｒＫ、ｅｍｒＹ、ｅｎｔＳ、ｅｘｕＴ、ｆｓｒ、ｆｕｃＰ、ｇａｌＰ、ｇａｒＰ、ｇｌｐＴ、ｇｕｄＰ、ｇｕｄＴ、ｈｃａＴ、ｈｓｒＡ、ｋｇｔＰ、ｌａｃＹ、ｌｇｏＴ、ｌｐｌＴ、ｌｐｔＡ、ｌｐｔＢ、ｌｐｔＣ、ｌｐｔＤ、ｌｐｔＥ、ｌｐｔＦ、ｌｐｔＧ、ｍｄｆＡ、ｍｄｔＤ、ｍｄｔＧ、ｍｄｔＨ、ｍｄｔＭ、ｍｄｔＬ、ｍｈｐＴ、ｍｓｂＡ、ｎａｎＴ、ｎａｒＫ、ｎａｒＵ、ｎｅｐＩ、ｎｉｍＴ、ｎｕｐＧ、ｐｒｏＰ、ｓｅｔＡ、ｓｅｔＢ、ｓｅｔＣ、ｓｈｉＡ、ｔｆａＰ、ｔｏｌＣ、ｔｓｇＡ、ｕｈｐＴ、ｘａｐＢ、ｘｙｌＥ、ｙａａＵ、ｙａｊＲ、ｙｂｊＪ、ｙｃａＤ、ｙｄｅＡ、ｙｄｅＦ、ｙｄｆＪ、ｙｄｈＣ、ｙｄｈＰ、ｙｄｊＥ、ｙｄｊＫ、ｙｄｉＭ、ｙｄｉＮ、ｙｅｂＱ、ｙｄｃＯ、ｙｅｇＴ、ｙｆａＶ、ｙｆｃＪ、ｙｇａＹ、ｙｇｃＥ、ｙｇｃＳ、ｙｈｈＳ、ｙｈｊＥ、ｙｈｊＸ、ｙｉｄＴ、ｙｉｈＮ、ｙｊｈＢ、及びｙｎｆＭから選択されるＥ．ｃｏｌｉトランスポーターと少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％同一であるとトランスポーターを過剰発現する。いくつかの実施形態では、トランスポーターは、Ｅ．ｃｏｌｉトランスポーターと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％同一である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、微生物細胞は、酵母、真菌、または植物細胞などの真核生物細胞由来のトランスポーターと少なくとも５０％同一の輸送タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、輸送タンパク質は、ＡＢＣファミリートランスポーターであり、任意選択的に、サブクラスＰＤＲ（多剤耐性）トランスポーター、ＭＤＲ（多剤耐性）トランスポーター、ＭＦＳファミリー（主要なファシリテータースーパーファミリー）トランスポーター、またはＳＷＥＥＴ（別名ＰＱ−ループ、唾液、またはＭｔＮ３ファミリー）ファミリートランスポーターのうちのいずれかである。他の実施形態では、輸送タンパク質は、ＡＡＡＰ、ＳｕｌＰ、ＬＣＴ、ＡＰＣ、ＭＯＰ、ＺＩＰ、ＭＰＴ、ＶＩＣ、ＣＰＡ２、ＴｈｒＥ、ＯＰＴ、Ｔｒｋ、ＢＡＳＳ、ＤＭＴ、ＭＣ、ＡＥＣ、Ａｍｔ、Ｎｒａｍｐ、ＴＲＰ−ＣＣ、ＡＣＲ３、ＮＣＳ１、ＰｉＴ、ＡｒｓＡＢ、ＩＩＳＰ、ＧＵＰ、ＭＩＴ、Ｃｔｒ、及びＣＤＦから選択されるものである。
【００８２】
いくつかの実施形態では、トランスポーターは、一般に複数のサブユニットを含むＡＢＣファミリー輸送タンパク質（別名ＴＰ結合カセットトランスポーター）であり、そのうちの１つまたは２つは膜貫通タンパク質であり、そのうちの１つまたは２つは膜関連ＡＴＰａｓｅである。ＡＴＰａｓｅサブユニットは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合及び加水分解のエネルギーを利用して、基質の取り込みまたは移出のいずれかのために、膜を横切る様々な基質のトランスロケーションにエネルギーを供給する。ＡＢＣファミリートランスポーターは、以下、ＡＢＣＡ、ＡＢＣＢ、ＡＢＣＣ、ＡＢＣＤ、ＡＢＣＥ、ＡＢＣＦ、及びＡＢＣＧを含むがこれらに限定されない任意のサブクラスのものでよい。
【００８３】
いくつかの実施形態では、輸送タンパク質は、化学浸透圧イオン勾配に応答して小溶質を輸送することができる単一ポリペプチド二次担体であるＭＦＳファミリー輸送タンパク質（別名主要ファシリテータースーパーファミリー）である。ＭＦＳ輸送タンパク質によって輸送される化合物としては、単糖類、オリゴ糖、イノシトール、薬物、アミノ酸、ヌクレオシド、有機リン酸エステル、クレブスサイクル代謝産物、ならびに多種多様な有機及び無機アニオン及びカチオンが挙げられる。例として、ＭＦＳ輸送タンパク質としては、ＸｙｌＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）、ＱａｃＡ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来）、Ｂｍｒ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来）、ＵｈｐＴ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）、ＬａｃＹ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）、ＦｕｃＰ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）、及びＥｘｔＵ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）が挙げられる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、トランスポーターは、糖トランスポーターのファミリー及びＴＯＧスーパーファミリーのメンバーである輸送タンパク質（別名ＰＱループ、唾液またはＭｔＮ３ファミリー）のＳＷＥＥＴ（糖は最終的に移出トランスポーターとなる）ファミリーである。ＳＷＥＥＴの真核生物ファミリーメンバーは、３＋１＋３反復配置で７つの膜貫通セグメント（ＴＭＳ）を有する。例として、ＳＷＥＥＴトランスポータータンパク質は、ＳＷＥＥＴ１、ＳＷＥＥＴ２、ＳＷＥＥＴ９、ＳＷＥＥＴ１２、ＳＷＥＥＴ１３、及びＳＷＥＥＴ１４を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、輸送タンパク質はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからの輸送タンパク質と少なくとも５０％同一である。いくつかの実施形態では、トランスポーターは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅトランスポーターと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％同一である。例示的なＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ輸送タンパク質としては、ＡＣ１、ＡＤＰ１、ＡＮＴ１、ＡＱＲ１、ＡＱＹ３、ＡＲＮ１、ＡＲＮ２、ＡＲＲ３、ＡＴＧ２２、ＡＴＰ４、ＡＴＰ７、ＡＴＰ１９、ＡＴＲ１、ＡＴＸ２、ＡＵＳ１、ＡＶＴ３、ＡＶＴ５、ＡＶＴ６、ＡＶＴ７、ＡＺＲ１、ＣＡＦ１６、ＣＣＨ１、ＣＯＴ１、ＣＲＣ１、ＣＴＲ３、ＤＡＬ４、ＤＮＦ１、ＤＮＦ２、ＤＴＲ１、ＤＵＲ３、ＥＣＭ３、ＥＣＭ２７、ＥＮＢ１、ＥＲＳ１、ＦＥＮ２、ＦＬＲ１、ＦＳＦ１、ＦＵＲ４、ＧＡＰ１、ＧＥＴ３、ＧＥＸ２、ＧＧＣ１、ＧＵＰ１、ＨＯＬ１、ＨＣＴ１０、ＨＸＴ３、ＨＸＴ５、ＨＸＴ８、ＨＸＴ９、ＨＸＴ１１、ＨＸＴ１５、ＫＨＡ１、ＩＴＲ１、ＬＥＵ５、ＬＹＰ１、ＭＣＨ１、ＭＣＨ５、ＭＤＬ２、ＭＭＥ１、ＭＮＲ２、ＭＰＨ２、ＭＰＨ３、ＭＲＳ２、ＭＲＳ３、ＭＴＭ１、ＭＵＰ３、ＮＦＴ１、ＯＡＣ１、ＯＤＣ２、ＯＰＴ１、ＯＲＴ１、ＰＣＡ１、ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＤＲ５、ＰＤＲ８、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１１、ＰＤＲ１２、ＰＤＲ１５、ＰＤＲ１８、ＰＤＲＩ、ＰＤＲＩ１、ＰＥＴ８、ＰＨＯ８９、ＰＩＣ２、ＰＭＡ２、ＰＭＣ１、ＰＭＲ１、ＰＲＭ１０、ＰＵＴ４、ＱＤＲ１、ＱＤＲ２、ＱＤＲ３、ＲＣＨ１、ＳＡＬ１、ＳＡＭ３、ＳＢＨ２、ＳＥＯ１、ＳＧＥ１、ＳＩＴ１、ＳＬＹ４１、ＳＭＦ１、ＳＮＦ３、ＳＮＱ２、ＳＰＦ１、ＳＲＰ１０１、ＳＳＵ１、ＳＴＥ６、ＳＴＬ１、ＳＵＬ１、ＴＡＴ２、ＴＨＩ７、ＴＨＩ７３、ＴＩＭ８、ＴＩＭ１３、ＴＯＫ１、ＴＯＭ７、ＴＯＭ７０、ＴＰＮ１、ＴＰＯ１、ＴＰＯ２、ＴＰＯ３、ＴＰＯ４、ＴＲＫ２、ＵＧＡ４、ＶＢＡ３、ＶＢＡ５、ＶＣＸ１、ＶＭＡ１、ＶＭＡ３、ＶＭＡ４、ＶＭＡ６、ＶＭＲ１、ＶＰＳ７３、ＹＥＡ６、ＹＨＫ８、ＹＩＡ６、ＹＭＣ１、ＹＭＤ８、ＹＯＲ１、ＹＰＫ９、ＹＶＣ１、ＺＲＴ１、ＹＢＲ２４１Ｃ、ＹＢＲ２８７Ｗ、ＹＤＲ０６１Ｗ、ＹＤＲ３３８Ｃ、ＹＦＲ０４５Ｗ、ＹＧＬ１１４Ｗ、ＹＧＲ１２５Ｗ、ＹＩＬ１６６Ｃ、ＹＫＬ０５０Ｃ、ＹＭＲ２５３Ｃ、ＹＭＲ２７９Ｃ、ＹＮＬ０９５Ｃ、ＹＯＬ０７５Ｃ、ＹＰＲ００３Ｃ、及びＹＰＲ０１１Ｃが挙げられる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ輸送タンパク質は、ＡＤＰ１、ＡＱＲ１、ＡＲＮ１、ＡＲＮ２、ＡＴＲ１、ＡＵＳ１、ＡＺＲ１、ＤＡＬ４、ＤＴＲ１、ＥＮＢ１、ＦＬＲ１、ＧＥＸ２、ＨＯＬ１、ＨＸＴ３、ＨＸＴ８、ＨＸＴ１１、ＮＦＴ１、ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＤＲ５、ＰＤＲ８、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１１、ＰＤＲ１２、ＰＤＲ１５、ＰＤＲ１８、ＱＤＲ１、ＱＤＲ２、ＱＤＲ３、ＳＥＯ１、ＳＧＥ１、ＳＩＴ１、ＳＮＱ２、ＳＳＵ１、ＳＴＥ６、ＴＨＩ７、ＴＨＩ７３、ＴＩＭ８、ＴＰＮ１、ＴＰＯ１、ＴＰＯ２、ＴＰＯ３、ＴＰＯ４、ＹＨＫ８、ＹＭＤ８、ＹＯＲ１、及びＹＶＣ１のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ輸送タンパク質は、ＦＬＲ１、ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＤＲ５、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１５、ＳＮＱ２、ＴＰＯ１、及びＹＯＲ１のうちの１つ以上から選択される。
【００８７】
いくつかの実施形態では、トランスポーターは、ＸＰ＿０１３７０６１１６．１（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ由来）、ＮＰ＿００１２８８９４１．１（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ由来）、ＮＥＣ１（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ由来）、及びＳＷＥＥＴ１３（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｕｒａｒｔｕ由来）と、少なくとも５０％、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、または少なくとも９０％もしくは９５％同一である。
【００８８】
ＲｅｂＭの生合成に関する様々な実施形態では、本方法は、ステビオシド、ステビオ−ルビオシド、及びＲｅｂＡのＲｅｂＭへの少なくとも４０％の変換、または少なくとも５０％の変換、または少なくとも７５％の変換をもたらす。いくつかの実施形態では、ＲｅｂＭ対ＲｅｂＤの比は、少なくとも２：１、または少なくとも４：１、または少なくとも６：１、または少なくとも８：１、または少なくとも９：１、または少なくとも１０：１、または少なくとも１５：１、または少なくとも２０：１である。
【００８９】
本方法は、バッチ発酵、フィードバッチ発酵、連続発酵、または半連続発酵によって行うことができる。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、約７２時間未満、またはいくつかの実施形態では、約４８時間未満、または約２４時間未満のインキュベーション時間でバッチ発酵またはフィードバッチ発酵によって行われる。
【００９０】
天然ＵＧＴ酵素は、概して植物酵素（多くの場合、２０〜２４℃の範囲の最適温度を有する）であるか、または植物酵素に由来するが、いくつかの実施形態では、本開示は、微生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞）における高収率でのグリコシル化産物の産生を可能にし、約２４℃以上、例えば、約２４℃〜約３７℃、または約２７℃〜約３７℃、または約３０℃〜約３７℃の温度での酵素生産性を有する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、増殖または産生相培地は、増殖または生存率に著しい影響を及ぼすことなく、細胞透過性を増強するのに十分な量で１つ以上の洗剤を含有し得る。例示的な洗剤は、とりわけ、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及びＳＤＳを含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本プロセスは大規模生産に対して拡張可能である。例えば、いくつかの実施形態では、培養物のサイズは、少なくとも約１００Ｌ、少なくとも約２００Ｌ、少なくとも約５００Ｌ、少なくとも約１，０００Ｌ、または少なくとも約１０，０００Ｌである。
【００９３】
様々な実施形態では、本方法は、細胞培養物または細胞溶解物からグリコシル化産物を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、培養物は、少なくとも約１００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約２００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約５００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約１ｇ／Ｌ、または少なくとも約２ｇ／Ｌ、または少なくとも約５ｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｇ／Ｌ、または少なくとも３０ｇ／Ｌ、または少なくとも４０ｇ／Ｌ、または少なくとも５０ｇ／Ｌのグリコシル化産物を産生し、いくつかの実施形態では、グリコシル化産物は、培養培地から抽出される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、グリコシル化産物（例えばＲｅｂＭ）を培地成分から精製する。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、成長培地を宿主細胞から分離することと、所望のグリコシル化産物（例えば、ＲｅｂＭ）を成長培地から単離することとを含む。いくつかの実施形態では、ＲｅｂＭなどの産物を細胞材料からさらに抽出する。
【００９５】
いくつかの態様では、本発明は、ＲｅｂＭなどのグリコシル化産物を含む産物の製造方法を提供する。本方法は、標的ステビオールグリコシド（本開示に従って産生される）を、食品、飲料、口腔ケア製品、甘味料、香味剤、または他の製品などの製品に組み込むことを含む。本発明に従って調製される精製ステビオールグリコシドは、食品、飲料、テクスチャント（例えば、デンプン、繊維、歯茎、脂肪及び脂肪模倣物、ならびに乳化剤）、薬学的組成物、タバコ製品、栄養補助組成物、経口衛生組成物、ならびに化粧用組成物を含むがこれらに限定されない、様々な製品で使用され得る。ＲｅｂＭを組み合わせて使用することができるフレーバーの非限定的な例としては、ライム、レモン、オレンジ、フルーツ、バナナ、ブドウ、梨、パイナップル、マンゴー、ビターアーモンド、コーラ、シナモン、砂糖、綿菓子、及びバニラフレーバーが挙げられる。他の食品成分の非限定的な例としては、フレーバー、酸味料、及びアミノ酸、着色剤、増粘剤、修飾デンプン、ガム、テクスチャライザー、防腐剤、酸化防止剤、乳化剤、安定剤、増粘剤、及びゲル化剤が挙げられる。
【００９６】
いくつかの態様では、本発明は、複数の高強度甘味料を含む甘味料製品の製造方法を提供し、前記複数は、ステビオールグリコシド、モグロシド、スクラロース、アスパルテーム、ネオタム、アドバンタム、アセスルファムカリウム、サッカリン、シクラメート、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、グネチホリンＥ、及び／またはピシアタノール４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドのうちの２つ以上を含む。本方法は、甘味料製品を食品、飲料、口腔ケア製品、甘味料、香味剤、または上記のものを含む他の製品に組み込むことをさらに含んでよい。
【００９７】
ＲｅｂＭなどの標的ステビオールグリコシド、及びそれらを含む甘味料組成物は、様々な生理学的活性物質または機能性成分と併用され得る。機能性成分は、概して、カロテノイド、食物繊維、脂肪酸、サポニン、酸化防止剤、栄養補助食品、フラボノイド、イソチオシアネート、フェノール、植物ステロール及びスタノール（フィトステロール及びフィトスタノール）；ポリオール；プレバイオティクス、プロバイオティクス；フィトエストロゲン；大豆タンパク質；硫化物／チオール；アミノ酸；タンパク質；ビタミン；及びミネラルなどのカテゴリーに分類される。機能性成分はまた、心血管、コレステロール低減、及び抗炎症作用などのそれらの健康上の利点に基づいて分類されてもよい。
【００９８】
さらに、ＲｅｂＭなどの標的ステビオールグリコシド（複数可）、及び本発明に従って得られた甘味料組成物は、高強度甘味料として適用されて、ゼロカロリー、低カロリーまたは糖尿病飲料、ならびに改善された味覚特性を有する食品を製造してもよい。それは、糖類を使用できない飲料、食品、医薬品、及びその他の製品にも使用することができる。加えて、ＲｅｂＭ及び甘味料組成物は、飲料、食品、及びヒトの摂取に専用の他の製品のためだけでなく、改善された特性を有する動物飼料及び飼料にも甘味料として使用することができる。
【００９９】
標的ステビオールグリコシド（複数可）及び甘味料組成物が使用され得る製品の例としては、ウォッカ、ワイン、ビール、酒類、及び日本酒などのアルコール飲料；天然ジュース；清涼飲料水；炭酸飲料；ダイエット飲料；ゼロカロリー飲料；低カロリー飲料及び食品；ヨーグルト飲料；インスタントジュース；インスタントコーヒー；粉末タイプのインスタント飲料；缶詰製品；シロップ；発酵大豆ペースト；醤油；酢；ドレッシング；マヨネーズ；ケチャップ；カレー；スープ；インスタントブイヨン；粉末醤油；粉末酢；ビスケットの種類；ライスビスケット；クラッカー；パン；チョコレート；キャラメル；キャンディ；チューインガム；ゼリー；プリン；プリザーブドフルーツ及び野菜；フレッシュクリーム；ジャム；マーマレード；フラワーペースト；粉ミルク；アイスクリーム；シャーベット；瓶詰めの野菜及び果物；缶詰の茹で豆；甘味のあるソースで煮込んだ肉及び食品；農業用野菜食品；魚介類；ハム；ソーセージ；魚ハム；魚肉ソーセージ；魚ペースト；魚の唐揚げ；魚介類の乾物；冷凍食品；保存海苔、保存肉；タバコ；医薬品；及びその他多数を含むが、これらに限定されない。
【０１００】
食品、飲料、医薬品、化粧品、テーブルトップ製品、及びチューインガムなどの製品の製造中に、混合、捏ねる、溶解、漬け物、透過、浸透、散布、噴霧、注入及び他の方法などの従来の方法を使用してもよい。
【０１０１】
本発明の実施形態は、以下の非限定的な実施例において実証される。
【実施例】
【０１０２】
表２は、３つのバッチのステビア葉抽出物のステビオールグリコシド含有量を示す。ＲｅｂＭへの経路上の２つの中間体、ＲｅｂＡ及びステビオシドは、バッチ中の２つの一次グリコシドである。
【表２】
2021530228.tif 000004
【０１０３】
図４グリコシル化ステビオールグリコシド中間体の生物変換を示す。実験では、０．２ｍＭステビオ−ルビオシドを９６ウェルプレート中の操作されたＥ．ｃｏｌｉ株に供給した。産物形成を４８時間後に検査した。ステビオ−ルビオシドなどの初期中間体でさえも全細胞生物変換が可能であるが、天然のＥ．ｃｏｌｉについては、グリコシル化基質がＵＧＴ酵素に利用可能ではない（株５は実質的な活性を示し、株３及び株４は無視可能な活性を示す）。株の詳細は、図８に記載されている。図４に報告される値は、対照に対する化合物濃度である（各化合物の濃度を空ベクター対照のためのこれらの化合物の総濃度で割る）。株５に含まれる修飾は、ステビオ−ルビオシドのＲｅｂＭへの生物変換を実証する。
【０１０４】
株１〜５のそれぞれは、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、すなわち、４つのＵＧＴ酵、ＭｂＵＧＴＣ１３、ＭｂＵＧＴ１．２＿２、ＭｂＵＧＴｃ１９＿２、及び７６Ｇ１＿Ｌ２００Ａを別々に発現する単一コピープラスミドを含有した。対照は、同じＢＡＣ骨格を含有したが、ＵＧＴ酵素は含有しなかった。
【０１０５】
図８は、ＲｅｂＭ経路におけるＵＧＴの重要な基質であるＵＤＰ−グルコースに対する天然Ｅ．ｃｏｌｉ流量を増加させるための遺伝子修飾を示す。ＵＤＰ−グルコースに対する天然フラックスよりも大きいは、ＵＧＴに利用可能な基質の量を増加させることによって、より大きなＲｅｂＭ形成を可能にし得る。株５をもたらす修飾はまた、供給されたステビオールグリコシドをＲｅｂＭに変換する細胞の能力をもたらす。株２及び３について、ＵＤＰ−グルコース（ｕｓｈＡ、ｇａｌＥＴＫＭ）を消費する酵素を欠失した。株４は、ＵＤＰ−グルコースの前駆体であるグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を消費する酵素（ｐｇｉ）を欠失させることによって株３から構築した。株５は、グルコース−１−リン酸（Ｇ１Ｐ）を介してＧ６ＰをＵＤＰ−グルコース（ｐｇｍ、ｇａｌＵ）に変換するために使用される２つの酵素を過剰発現することによって株４から構築した。
【０１０６】
図５は、葉抽出物、ステビオシド及びＲｅｂＡ中で見出される２つの市販の中間体のＲｅｂＭへの変換を示す。ステビオールコアの生物学的転換も示される。値は、全ステビオールグリコシド組成物のパーセンテージとして報告される。全ての株によるステビオールのＲｅｂＭへの転換は、全ての株がＲｅｂＭ形成可能であることを示す。ステビオ−ルビオシドの場合と同様に、ステビオシド及びＲｅｂＡの両方がＲｅｂＭに変換されるが、株５においてのみ変換される。株５のみがステビオールグリコシドをＵＧＴ酵素に利用可能にする可能性が高い。ステビオシド及びＲｅｂＡからの転換の場合、ＲｅｂＤ：ＲｅｂＭの比はＲｅｂＭ（１：２０）を強く有利にする。ＲｅｂＭを培地に分泌した。
【０１０７】
図６は、９６ウェルプレート中のステビオールグリコシドの生物学的転換を示す。これらの研究のために、７６Ｇ１＿Ｌ２００ＡをＭｂＵＧＴ１−３＿１．５に置き換えた。ＲｅｂＭ経路における５つの主要な化合物について、ＵＧＴ酵素を発現させても発現させなくても化合物濃度が示される。株に０．５ｇ／Ｌのステビオシド／ＲｅｂＡ葉抽出物を供給し、試料採取前に４８時間基質とともにインキュベートした。示されるように、細胞はＲｅｂＭをほぼ排他的に作製し、ＲｅｂＩ及びＲｅｂＤはわずかである。
【０１０８】
株を初期バイオリアクター実験に使用した。具体的には、ＲｅｂＭ産生株を、好適な抗生物質を含むＬＢ（ルリア−ベルターニ）ブロス１０ｍＬを含有する５０ｍＬの遠心チューブ中のワーキングセルバンクから接種した。第１の種子を３７℃で、振盪インキュベーター内で２０時間培養した。２０時間後、次いで、第１の種子を使用して５００ｍＬのエレンマイヤーフラスコに１００ｍＬの発酵培地を接種することによって、第２の種子培養を開始した。この第２の種子を１０時間培養してから、それぞれ１７０ｍＬの発酵培地を含有するバイオリアクターに移した。サンプリングを１０時間毎に実施した。培地中の関連する代謝産物を、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ及びＹＳＩを使用して定量化した。細胞密度を、吸光度６００ｎｍで分光光度計を介して測定した。図７は、バイオリアクタースケールでのステビオシド／ＲｅｂＡ葉抽出物の生体変換を示す。ＲｅｂＭ経路における５つの主要な化合物について、培地中の化合物濃度を発酵にわたる様々な時点でサンプリングした。株を２ｇ／Ｌのステビオシド／ＲｅｂＡ葉抽出物に供給し、合計３０時間基質とともにインキュベートした。図７に示すように、ステビオシド及びＲｅｂＡは経時的に失われ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＩ、及びＲｅｂＤなどの高度なグリコシル化産物の対応する増加とともに失われる。
【０１０９】
ステビオールビオシド、ステビオシド、及びＲｅｂＡなどの経路中間体をＲｅｂＭに変換するＵＧＴ酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞質において発現され、したがって、おそらくトランスポーターの作用または膜透過性の増加を通じて、ＵＧＴ酵素に利用可能になるために中間体を必要とする。
【０１１０】
ステビオールグリコシドは、天然のＥ．ｃｏｌｉ株によって取り込まれない可能性が高い大分子である。これは、株１によるステビオ−ルビオシドのＲｅｂＭへの無視可能な変換を説明するであろう。株１〜４は、早期の非グリコシル化中間体（ステビオール）を取り込んでＲｅｂＭに変換することができ、無視可能な変換の理由が、これらの条件下での経路中間体上のＵＧＴ酵素の不活性ではなく、細胞質へのステビオールグリコシドの取り込みの欠如であることを示唆する。
配列
＞ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］
（配列番号１）
2021530228.tif 000005
＞ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］
（配列番号２）
2021530228.tif 000006
＞ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］
（配列番号３）
2021530228.tif 000007
＞ＳｒＵＧＴ９１Ｄ１［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］
（配列番号４）
2021530228.tif 000008
＞ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］
（配列番号５）
2021530228.tif 000009
＞ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２ｅ［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］
（配列番号６）
2021530228.tif 000010
＞ＯｓＵＧＴ１−２［Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ］
（配列番号７）
2021530228.tif 000011
＞ＭｂＵＧＴＣ１９［円形変異体］
（配列番号８）
2021530228.tif 000012
＞ＭｂＵＧＴ１，２［円形変異体］
（配列番号９）
2021530228.tif 000013
＞ＭｂＵＧＴ１−３［円形変異体］
（配列番号１０）
2021530228.tif 000014
＞ＭｂＵＧＴ１，２．２［円形変異体］
（配列番号１１）
2021530228.tif 000015
＞ＭｂＵＧＴＣ１９−２［円形変異体］
（配列番号１２）
2021530228.tif 000016
＞ＭｂＵＧＴＣ１３（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ８５Ｃ２，Ｐ２１５Ｔ）
（配列番号１３）
2021530228.tif 000017
＞７６Ｇ１＿Ｌ２００Ａ［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ，Ｌ２００Ａ］
（配列番号１４）
2021530228.tif 000018
＞ＭｂＵＧＴ１−３＿１［円形変異体］
（配列番号１５）
2021530228.tif 000019
＞ＭｂＵＧＴ１−３＿１．５［円形変異体］
（配列番号１６）
2021530228.tif 000020
＞ＭｂＵＧＴ１−３＿２［円形変異体］
（配列番号１７）
2021530228.tif 000021
＞ＳｇＵＧＴ７２０−２６９−１（Ｓｉｒａｉｔｉａ  ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）
（配列番号１８）
2021530228.tif 000022
＞ＳｇＵＧＴ９４−２８９−３（Ｓｉｒａｉｔｉａ  ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）
（配列番号１９）
2021530228.tif 000023
＞ＳｇＵＧＴ７４−３４５−２（Ｓｉｒａｉｔｉａ  ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）
（配列番号２０）
2021530228.tif 000024
＞ＳｇＵＧＴ７５−２８１−２（Ｓｉｒａｉｔｉａ  ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）
（配列番号２１）
2021530228.tif 000025
＞ＳｇＵＧＴ７２０−２６９−４（Ｓｉｒａｉｔｉａ  ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）
（配列番号２２）
2021530228.tif 000026
＞ＳｇＵＧＴ９４−２８９−２（Ｓｉｒａｉｔｉａ  ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）
（配列番号２３）
2021530228.tif 000027
＞ＳｇＵＧＴ９４−２８９−１（Ｓｉｒａｉｔｉａ  ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）
（配列番号２４）
2021530228.tif 000028
＞ＸＰ＿０２２１５１４７４．１  ７−デオキシロガン酸グルコシルトランスフェラーゼ様［Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ］
（配列番号２５）
2021530228.tif 000029
＞ＸＰ＿０２２１５１５４６．１  ７−デオキシロガン酸グルコシルトランスフェラー様［Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ］
（配列番号２６）
2021530228.tif 000030
＞ＸＰ＿０２２１５１５１４．１  ７−デオキシロガン酸グルコシルトランスフェラーゼ様［Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ］
（配列番号２７）
2021530228.tif 000031
＞ＸＰ＿００４１４７９３３．２予測：７−デオキシロガン酸グルコシルトランスフェラーゼ様［キュウミスサチブス］
（配列番号２８）
2021530228.tif 000032
＞ＸＰ＿０２２９７８１６４．１  ７−デオキシロガン酸グルコシルトランスフェラーゼ様［Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ］
（配列番号２９）
2021530228.tif 000033
＞ＸＰ＿０２２９５０１２８．１  ７−デオキシログラン酸グルコシルトランスフェラーゼ様［Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ］
（配列番号３０）
2021530228.tif 000034
＞ＸＰ＿０２０４２２４２３．１  ７−デオキシロガン酸グルコシルトランスフェラーゼ［Ｐｒｕｎｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａ］
（配列番号３１）
2021530228.tif 000035
＞ＥＯＹ０７３５１．１  ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ８５Ａ３、推定［Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ］
（配列番号３２）
2021530228.tif 000036
＞ＸＰ＿０２２１５５９７９．１  ベータ−Ｄ−グルコシルクロセチン  ベータ−１，６−グルコシルトランスフェラーゼ様［モモルディカシャランチア］
（配列番号３３）
2021530228.tif 000037
＞ＸＰ＿０２２９８６０８０．１  ベータ−Ｄ−グルコシルクロセチン−ベータ−１，６−グルコシルトランスフェラーゼ様［Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ］
（配列番号３４）
2021530228.tif 000038
＞ＸＰ＿０２２１５６００２．１  ベータ−Ｄ−グルコシルクロセチン−ベータ−１，６−グルコシルトランスフェラーゼ様［Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ］
（配列番号３５）
2021530228.tif 000039
＞ＸＰ＿０２２９４３３２７．１  ベータ−Ｄ−グルコシルクロセチン−ベータ−１，６−グルコシルトランスフェラーゼ様［Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ］
（配列番号３６）
2021530228.tif 000040
＞ＸＰ＿０２２９９６３０７．１  ベータ−Ｄ−グルコシルクロセチン−ベータ−１，６−グルコシルトランスフェラーゼ様［Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ］
（配列番号３７）
2021530228.tif 000041
＞ＸＰ＿０２２９５７６６４．１  ベータ−Ｄ−グルコシルクロセチン−ベータ−１，６−グルコシルトランスフェラーゼ様［Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ］
（配列番号３８）
2021530228.tif 000042
＞ＯＭＯ５７８９２．１  ＵＤＰ−グルクロノシル／ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ［Ｃｏｒｃｈｏｒｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｒｉｓ］
（配列番号３９）
2021530228.tif 000043
＞ＸＰ＿０１５８８６１４１．１予測：ベータ−Ｄ−グルコシルクロセチン−ベータ−１，６−グルコシルトランスフェラーゼ様アイソフォームＸ１［Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｊｕｊｕｂａ］
（配列番号４０）
2021530228.tif 000044
＞ＸＰ＿００２２７１５８７．３予測：ベータ−Ｄ−グルコシルクロセチン−ベータ−１，６−グルコシルトランスフェラーゼ様［Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ］
（配列番号４１）
2021530228.tif 000045
＞ＸＰ＿０１８８４０２０５．１予測：ベータ−Ｄ−グルコシルクロセチン−ベータ−１，６−グルコシルトランスフェラーゼ様［Ｊｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａ］
（配列番号４２）
2021530228.tif 000046
＞ＸＰ＿０２１６５２１７１．１  ベータ−Ｄ−グルコシルクロセチン−ベータ−１，６−グルコシルトランスフェラーゼ様［Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ］
（配列番号４３）
2021530228.tif 000047
＞ＸＰ＿０２１６１９０７３．１ベータ−Ｄ−グルコシルクロセチン−ベータ−１，６−グルコシルトランスフェラーゼ様［マニホットエスクレンタ］
（配列番号４４）
2021530228.tif 000048
＞ＧＡＶ８３７４６．１  ＵＤＰＧＴドメイン含有タンパク質［Ｃｅｐｈａｌｏｔｕｓ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｉｓ］
（配列番号４５）
2021530228.tif 000049
＞コーヒーアラビカＵＧＴ＿１，６
（配列番号４６）
2021530228.tif 000050
＞環状変異体リンカー配列
（配列番号４７）
2021530228.tif 000051
＞環状変異体リンカー配列
（配列番号４８）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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