(57)【要約】本開示は、ＬＹＰＤ３を特異的に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）分子に関し、ＬＹＰＤ３に特異的なＣＡＲ  Ｔ細胞由来エフェクター細胞を含む組成物、ならびにこれらの作製および使用方法も提供する。本発明は、例えば、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）であって、ここで前記ＣＡＲは、（１）ＬＹＰＤ３に特異的に結合する細胞外結合ドメイン；（２）膜貫通ドメイン；および（３）少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供する。
2021530238.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）であって、ここで前記ＣＡＲは、
（１）ＬＹＰＤ３に特異的に結合する細胞外結合ドメイン；
（２）膜貫通ドメイン；および
（３）少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメイン
を含むＣＡＲ。
【請求項２】
前記細胞外結合ドメインは、ＬＹＰＤ３に特異的に結合する単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
前記ｓｃＦｖは、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞レセプターのα鎖、Ｔ細胞レセプターのβ鎖、Ｔ細胞レセプターのζ鎖、ＣＤ３−ε、ＣＤ３−ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４である分子に由来するアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項５】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８に由来するアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項６】
前記膜貫通ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項７】
前記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３−ζ、ＣＤ３−γ、ＣＤ３−δ、ＣＤ３−ε、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＦｃＲ−γ、ＦｃＲ−β、またはＴＣＲ−ζである分子に由来する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項８】
前記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζに由来するアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項９】
前記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項１０】
前記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８に由来するアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項１１】
前記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜７および１０のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項１２】
前記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢに由来するアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項１３】
前記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜７および１２のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項１４】
前記ＣＡＲは、３個の細胞質シグナル伝達ドメインを含み、ここで第１の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８に由来し、第２の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３に由来し、第３の細胞質シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢに由来する、請求項１〜１３のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項１５】
前記第１の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み、前記第２の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み、前記第３の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のＣＡＲ。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載のキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を含む活性化Ｔ細胞の集団。
【請求項１７】
前記活性化Ｔ細胞の集団は、ＬＹＰＤ３を発現するがんの処置のために治療上有効な量で存在する、請求項１６に記載の集団。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれかに記載のＣＡＲを発現する活性化Ｔ細胞の集団、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
前記薬学的に受容可能なキャリアは、活性化Ｔ細胞の集団の維持を支援する、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
少なくとも１つの治療剤をさらに含む、請求項１８または１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれかに記載のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項２２】
ＬＹＰＤ３を発現するがんに罹患している被験体においてＴ細胞応答を誘導する方法であって、ここで前記方法は、前記被験体に、請求項１６もしくは１７に記載の活性化Ｔ細胞の集団または請求項１８〜２０のいずれかに記載の薬学的組成物の治療上有効な量を投与する工程を包含し、ここで前記投与は、前記がんに対する抗腫瘍応答を誘導する、方法。
【請求項２３】
前記がんは、肺がん、頭頚部がん、子宮頚がん、尿路上皮がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、神経芽腫、横紋筋肉腫、白血病、およびリンパ腫からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれかに記載のキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する活性化Ｔ細胞の集団を調製する方法であって、ここで前記方法は、
（１）単離されたＴ細胞を、請求項１〜１５のいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸でトランスフェクトまたは形質導入する工程；および
（２）トランスフェクションまたは形質導入の後に、前記ＣＡＲ発現Ｔ細胞を拡大する工程であって、ここで前記Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ならびに／またはＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体の存在下で培養することによって拡大される工程、
を包含する方法。
【請求項２５】
前記単離されたＴ細胞は、哺乳動物から単離される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物はヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヒトは、ＬＹＰＤ３を発現するがんに罹患している被験体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記単離されたＴ細胞は、ＬＹＰＤ３を発現するがんに罹患している被験体に対して自家である、請求項２４〜２８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１８年７月２０日出願の米国仮特許出願第６２／７００，９４２号（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）に基づく利益を主張する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本開示は、がんを処置する方法を提供する。より詳細には、本開示は、ＬＹＰＤ３を標的とするキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を含む組成物およびＬＹＰＤ３に特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞を含む組成物、ならびにこれらの作製および使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
過去１０年間に、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、血液の種々のがんの成功裡の処置として出現した。この治療ストラテジーは、腫瘍細胞の表面に発現される抗原性分子を選択的に認識し、免疫系活性化、腫瘍細胞クリアランス、および改善された患者の転帰を生じるために、Ｔ細胞のエキソビボ操作を含む。白血病およびリンパ腫の多くのタイプの処置が成功しているが、ＣＡＲ  Ｔ細胞有効性は、固形腫瘍の処置に関しては制限されているままである。１つの固形腫瘍タイプである扁平上皮癌は、頭頚部、食道、肺、膀胱、および子宮頚部に端を発するがんを含み，その大部分は現在、有効な処置がない。
【０００４】
Ｌｙ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有タンパク質３（ＬＹＰＤ３）は、潜在的ＣＡＲ  Ｔ細胞標的として識別されており、ＬＹＰＤ３は、多数の扁平上皮癌サブタイプにおいて発現されている。ＬＹＰＤ３は、機能がほとんど不明の細胞表面タンパク質であるが、以前の研究は、ＬＹＰＤ３を、細胞マトリクス相互作用および腫瘍の進行に関係あるとしていた。重要なことには、ＬＹＰＤ３発現には極性があり、その結果、それは、扁平上皮癌の侵襲的先端部において過剰発現され、従って、標的とされたＬＹＰＤ３の除去は、正常細胞に対する制限された毒性を伴って、強い抗腫瘍特性を有し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
以下の詳細な説明においてさらに記載される概念の選択を紹介するために、要旨が提供される。この要旨は、特許請求される主題の重要なまたは本質的な特徴を識別することは意図されず、特許請求される主題の範囲を限定することにおける一助として使用されることも意図されない。
【０００６】
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、患者のＴ細胞が単離され、実験室において改変され、その結果、その改変されたＴ細胞ががん細胞を攻撃する処置の１タイプである。単離されたＴ細胞は、患者のがん細胞上である特定のタンパク質（すなわち、ＬＹＰＤ３）に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現するように改変される。次いで、多数のＣＡＲ  Ｔ細胞が、実験室において増殖され、上記患者に、代表的には注入によって与えられる。ＣＡＲ  Ｔ細胞療法はまた、キメラ抗原レセプターＴ細胞療法といわれる。
【０００７】
１つの局面において、本開示は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）であって、ここで上記ＣＡＲは、（１）ＬＹＰＤ３に特異的に結合する細胞外結合ドメイン；（２）膜貫通ドメイン；および（３）少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供する。
【０００８】
上記ＣＡＲのある特定の実施形態において、上記細胞外結合ドメインは、ＬＹＰＤ３に特異的に結合する単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。一実施形態において、上記ｓｃＦｖは、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。
【０００９】
上記ＣＡＲのある特定の実施形態において、上記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞レセプターのα鎖、Ｔ細胞レセプターのβ鎖、Ｔ細胞レセプターのζ鎖、ＣＤ３−ε、ＣＤ３−ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４である分子に由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記膜貫通ドメインは、ＣＤ８に由来するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、上記膜貫通ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、上記膜貫通ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
上記ＣＡＲのある特定の実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３−ζ、ＣＤ３−γ、ＣＤ３−δ、ＣＤ３−ε、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＦｃＲ−γ、ＦｃＲ−β、またはＴＣＲ−ζである分子に由来する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζに由来するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８に由来するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢに由来するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲは、３個の細胞質シグナル伝達ドメインを含み、ここで第１の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８に由来し、第２の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３に由来し、第３の細胞質シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢに由来する。一実施形態において、第１の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み、第２の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み、第３の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、第１の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、第２の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、第３の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
別の局面において、本開示は、本明細書で開示されるとおりのキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を含む活性化Ｔ細胞の集団を提供する。ある特定の実施形態において、上記活性化Ｔ細胞の集団は、ＬＹＰＤ３を発現するがんの処置のために治療上有効な量で存在する。
【００１３】
さらに別の局面において、本開示は、本明細書で開示されるとおりのＣＡＲを発現する活性化Ｔ細胞の集団、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。ある特定の実施形態において、上記薬学的に受容可能なキャリアは、上記活性化Ｔ細胞の集団の維持を支援する。上記薬学的組成物のいくつかの実施形態において、上記組成物は、少なくとも１つの治療剤をさらに含む。
【００１４】
別の局面において、本開示は、本明細書で開示されるとおりのＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。
【００１５】
さらに別の局面において、本開示は、ＬＹＰＤ３を発現するがんに罹患している被験体においてＴ細胞応答を誘導する方法であって、ここで上記方法は、上記被験体に、上記活性化Ｔ細胞の集団または本明細書で開示されるとおりの薬学的組成物の治療上有効な量を投与する工程を包含し、ここで上記投与は、上記がんに対する抗腫瘍応答を誘導する方法を提供する。上記方法のある特定の実施形態において、上記がんは、肺がん、頭頚部がん、子宮頚がん、尿路上皮がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、神経芽腫、横紋筋肉腫、白血病、およびリンパ腫からなる群より選択される。
【００１６】
別の局面において、本開示は、本明細書で開示されるとおりのキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する活性化Ｔ細胞の集団を調製する方法であって、ここで上記方法は、（１）単離されたＴ細胞を、本明細書で開示されるとおりのＣＡＲをコードする核酸でトランスフェクトまたは形質導入する工程；および（２）トランスフェクションまたは形質導入の後に、上記ＣＡＲ発現Ｔ細胞を拡大する工程であって、ここで上記Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ならびに／またはＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体の存在下で培養することによって拡大される工程を包含する方法を提供する。ある特定の実施形態において、上記単離されたＴ細胞は、哺乳動物から単離される。一実施形態において、上記哺乳動物はヒトである。ある特定の実施形態において、上記ヒトは、ＬＹＰＤ３を発現するがんに罹患している被験体である。ある特定の実施形態において、上記単離されたＴ細胞は、ＬＹＰＤ３を発現するがんに罹患している被験体に対して自家である。
【００１７】
本開示の別の局面は、本明細書で記載され、例証される全てのものを提供する。
【００１８】
本開示の前述の局面および他の特長は、以下の説明において、添付の図面に関連して解釈されて説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、形質導入されたマウスリンパ球におけるＬＹＰＤ３  ＣＡＲ発現を示すグラフである。
【図２】図２は、Ｌｅｗｉｓ肺がん細胞によるＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化を示すグラフである。
【図３】図３は、Ｌｅｗｉｓ肺がん細胞に対するＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞殺滅有効性を示すグラフである。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｄは、マウス肺がんに対するＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ有効性を示すグラフおよび画像である。（図４Ａ）ＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞投与後の示した時点での個々のＬｅｗｉｓ肺腫瘍サイズのスパイダープロット；（図４Ｂ）（４Ａ）で示した腫瘍の平均容積；（図４Ｃ）解剖後の腫瘍画像；（図４Ｄ）コントロールおよびＬＹＰＤ３  ＣＡＲ群の腫瘍重量（片側ｔ検定）。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｄは、マウス肺がんに対するＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ有効性を示すグラフおよび画像である。（図４Ａ）ＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞投与後の示した時点での個々のＬｅｗｉｓ肺腫瘍サイズのスパイダープロット；（図４Ｂ）（４Ａ）で示した腫瘍の平均容積；（図４Ｃ）解剖後の腫瘍画像；（図４Ｄ）コントロールおよびＬＹＰＤ３  ＣＡＲ群の腫瘍重量（片側ｔ検定）。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｄは、マウス肺がんに対するＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ有効性を示すグラフおよび画像である。（図４Ａ）ＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞投与後の示した時点での個々のＬｅｗｉｓ肺腫瘍サイズのスパイダープロット；（図４Ｂ）（４Ａ）で示した腫瘍の平均容積；（図４Ｃ）解剖後の腫瘍画像；（図４Ｄ）コントロールおよびＬＹＰＤ３  ＣＡＲ群の腫瘍重量（片側ｔ検定）。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｄは、マウス肺がんに対するＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ有効性を示すグラフおよび画像である。（図４Ａ）ＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞投与後の示した時点での個々のＬｅｗｉｓ肺腫瘍サイズのスパイダープロット；（図４Ｂ）（４Ａ）で示した腫瘍の平均容積；（図４Ｃ）解剖後の腫瘍画像；（図４Ｄ）コントロールおよびＬＹＰＤ３  ＣＡＲ群の腫瘍重量（片側ｔ検定）。
【図５】図５は、ＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞投与後に明白な毒性がないことを示すグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、示されるように、ＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の種々の用量での処置後、毎日秤量した。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｄは、ヒトＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞がヒトがん細胞に対して反応性であることを示すグラフおよびＦＡＣＳプロットである。（図６Ａ）ヒトＰＢＭＣにおけるＬＹＰＤ３  ＣＡＲ発現；（図６Ｂ）ＭＣＦ７乳がん細胞に対するＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化；（図６Ｃ）ＭＣＦ７乳がん細胞と共培養した後の、形質導入されていないＴ細胞（６Ｃ）またはＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（図６Ｄ）によるＩＦＮ−γ発現。
【図６−２】図６Ａ〜６Ｄは、ヒトＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞がヒトがん細胞に対して反応性であることを示すグラフおよびＦＡＣＳプロットである。（図６Ａ）ヒトＰＢＭＣにおけるＬＹＰＤ３  ＣＡＲ発現；（図６Ｂ）ＭＣＦ７乳がん細胞に対するＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化；（図６Ｃ）ＭＣＦ７乳がん細胞と共培養した後の、形質導入されていないＴ細胞（６Ｃ）またはＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（図６Ｄ）によるＩＦＮ−γ発現。
【図６−３】図６Ａ〜６Ｄは、ヒトＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞がヒトがん細胞に対して反応性であることを示すグラフおよびＦＡＣＳプロットである。（図６Ａ）ヒトＰＢＭＣにおけるＬＹＰＤ３  ＣＡＲ発現；（図６Ｂ）ＭＣＦ７乳がん細胞に対するＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化；（図６Ｃ）ＭＣＦ７乳がん細胞と共培養した後の、形質導入されていないＴ細胞（６Ｃ）またはＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（図６Ｄ）によるＩＦＮ−γ発現。
【図７】図７は、例示的なＬＹＰＤ３  ＣＡＲ構築物の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
本開示の原理の理解を促進する目的で、ここで好ましい実施形態に対して参照がなされ、具体的文言が、それを記載するために使用される。にもかかわらず、本開示の範囲を限定しないことがそれによって意図され、本開示のこのような変更およびさらなる改変は、本明細書で例証され、本開示が関連する分野の当業者に概ね想起されるとして企図されることが理解される。
【００２１】
冠詞「ａ（１つの、ある）」および「ａｎ（１つの、ある）」は、その冠詞の文法上の対象の１つまたは１より多い（すなわち、少なくとも１）に言及するために、本明細書で使用される。例示によれば、「１つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、少なくとも１つの要素を意味し、１つより多くの要素を含み得る。
【００２２】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」とは、所定の値が、望ましい結果に影響を及ぼすことなく、数値範囲の端点を「わずかに上回る（ｓｌｉｇｈｔｌｙ  ａｂｏｖｅ）」または「わずかに下回る（ｓｌｉｇｈｔｌｙ  ｂｅｌｏｗ）」可能性があるということを提供することによって、その端点に融通性をもたらすために使用される。
【００２３】
本明細書全体を通じて、別段文脈が要求しなければ、語句「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む、包含する、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」およびバリエーション（例えば、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む、包含する、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む、包含する、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」）は、述べられた構成要素、特徴、要素もしくは工程、または構成要素、特徴、要素もしくは工程の群の包含を暗示するが、いかなる他の完全体もしくは工程の、または他の完全体もしくは工程の群の排除をも暗示しないことが理解される。ある特定の要素を「含む、包含する、が挙げられる」、「含む、包含する」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」として記載される実施形態はまた、それらある特定の要素「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」として企図される。
【００２４】
本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書で別段記載されなければ、その範囲内に入る各別個の値に個々に言及する簡略表記法として働くことが意図されるに過ぎず、各別個の値は、それが、本明細書で個々に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。例えば、濃度範囲が、１％〜５０％として述べられる場合、２％〜４０％、１０％〜３０％、または１％〜３％などのような値が、本明細書中で明示的に挙げられていることが意図される。これらは、具体的に何が意図されているかの例に過ぎず、挙げられる最低値と最高値との間ならびにその最高値および最低値を含む数値の全ての考えられる組み合わせが、本開示において明示的に述べられているとみなされるべきである。
【００２５】
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２６】
定義
本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」および／または「治療レジメン（ｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｇｉｍｅｎ）」とは、患者が示すかまたは患者が感受性のあり得る、疾患、障害または生理学的状態に対する応答においてなされる臨床的介入に言及する。処置の目的としては、疾患、障害もしくは状態の症状の緩和もしくは予防、上記疾患、障害もしくは状態の進行もしくは増悪を遅らせるもしくは停止する、および／または上記疾患、障害もしくは状態の寛解が挙げられる。
【００２７】
用語「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」または「治療上有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、有益なまたは望ましい生物学的および／または臨床的結果をもたらすために十分な量に言及する。「有効量」または「治療上有効な量」は、医療従事者の熟練チームによって決定され得、画像検査、生体マーカー検査、またはさらなる検査の使用を含み得る。がんに関しては、治療上有効な量の投与は、がんの転移を予防するか、固形腫瘍のサイズもしくは塊の減少を生じるか、または腫瘍の壊死を生じる。
【００２８】
用語「疾患」とは、本明細書で使用される場合、生物の一部に影響を及ぼす、構造もしくは機能の任意の異常な状態および／または障害が挙げられるが、これらに限定されない。それは、外部因子（例えば、感染性疾患）によって、内部の機能障害（例えば、がん、がんの転移など）によって引き起こされ得る。
【００２９】
当該分野で公知であるように、がんは、一般に、制御されない細胞増殖と考えられる。本発明の組成物および方法は、ＬＹＰＤ３を発現する任意のがん、およびその任意の転移を処置するために使用され得る。例としては、肺がん、頭頚部がん、子宮頚がん、尿路上皮がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、神経芽腫、横紋筋肉腫、白血病、リンパ腫、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、消化器がん、膵臓がん、膠芽腫、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞癌、大腸がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、唾液腺癌、中皮腫、腎臓がん、外陰がん、膵臓がん、甲状腺がん、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、皮膚がん、黒色腫、脳がん、神経芽腫、骨髄腫、種々のタイプの頭頚部がん、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫および末梢性神経上皮腫が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、上記がんは、肺がん、頭頚部がん、子宮頚がん、または尿路上皮がんである。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」および「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」とは、本明細書で交換可能に使用され、ヒトおよび非ヒト動物の両方に言及する。本開示の用語「非ヒト動物（ｎｏｎｈｕｍａｎ  ａｎｉｍａｌ）」としては、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類など）が挙げられる。ある特定の実施形態において、上記被験体は、がんを有すると疑われるか、癌を有するか、または癌に罹患しているヒト患者である。一実施形態において、上記ヒトは、ＬＹＰＤ３を発現するがんを有すると疑われる被験体である。別の実施形態において、上記ヒトは、ＬＹＤ３を発現するがんを有する被験体である。さらに別の実施形態において、上記ヒトは、ＬＹＰＤ３を発現するがんに罹患している被験体である。
【００３１】
用語「キメラ抗原レセプター（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」とは、本明細書で使用される場合、１つのタンパク質上で一緒に天然には一緒に見出されない組み合わせにおいて、細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインを含む細胞表面レセプターとして定義される。これは特に、細胞外ドメインおよび細胞質ドメインが、１つのレセプタータンパク質上で一緒に天然には見出されないレセプターを含む。さらに、上記キメラ抗原レセプターは、天然のＴ細胞リンパ球において発現されるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）とは異なる。
【００３２】
用語「ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ−ｃｅｌｌ）」とは、本明細書で使用される場合、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団の表面上でキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する分子生物学的方法を通じて改変されているＴ細胞またはその集団に言及する。上記ＣＡＲは、Ｔ細胞活性化ドメインの細胞内部分に（例えば、融合物、１またはこれより多くのジスルフィド結合によって連結された別個の鎖として）作動可能に接続されて、発現された所望の標的に対して予め規定された結合特異性を伴う細胞外結合ドメインを有する操作されたポリペプチドである。ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ拘束を迂回することによって、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋サブセットの両方のＣＡＲ操作Ｔ細胞は、再方向付けされた標的細胞認識のために動員され得る。最も一般的なＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ζ）膜貫通および細胞質ドメイン（エンドドメイン）への免疫グロブリン結合機能性の（例えば、モノクローナル抗体に由来する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）としての）融合物である。このような分子は、その標的の免疫グロブリン結合機能性による認識に応答して、ζシグナルの伝達を生じる。しかし、多くの選択肢が存在する。例示によれば、天然のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）αおよびβ単一鎖に由来する抗原認識ドメインは、結合機能性として使用され得る。あるいは、レセプターエクトドメイン（例えば、ＣＤ４エクトドメイン）またはサイトカイン（これは、同族のサイトカインレセプターを有する細胞の認識をもたらす）が、使用され得る。結合機能性に必要とされるのは、特異的様式において、高親和性で所定の標的を結合することだけである。
【００３３】
ある特定の実施形態において、上記ＣＡＲ操作ポリペプチドは、（１）細胞外結合ドメイン、（２）貫通ドメイン、および（３）少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【００３４】
上記細胞外結合ドメインはまた、抗原結合ドメインとして言及され得、目的の抗原（すなわち、ＬＹＰＤ３）に結合する任意のドメインを含み得る。ある特定の実施形態において、上記結合ドメインは、抗体配列、その改変体またはフラグメントを含む。ある特定の実施形態において、上記抗体配列としては、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、またはＣＨ３ドメイン、重鎖、軽鎖、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体、二重特異的抗体、ＣＤＲ、Ｆａｂ領域、Ｆｖ、Ｆｃ領域、またはこれらのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、上記結合ドメインは、レセプターまたはそのリガンド配列もしくはこれらのフラグメントであり得る。ある特定の実施形態において、上記抗原結合ドメインは、腫瘍抗原または腫瘍関連抗原を結合する。一実施形態において、上記細胞外結合ドメインは、ＬＹＰＤ３を特異的に結合する。ある特定の実施形態において、ＬＹＰＤ３を特異的に結合する上記細胞外結合ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、ＬＹＰＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖである。一実施形態において、上記細胞外結合ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、上記細胞外結合ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列からなる。
【００３５】
上記ＣＡＲはまた、膜貫通ドメインを含む。上記膜貫通ドメインは、当該分野で公知の任意の分子に由来するかまたはその分子から得られる任意の膜貫通ドメインであり得る。ある特定の実施形態において、上記膜貫通ドメインは、上記ＣＡＲの細胞外結合ドメインに融合される。上記膜貫通ドメインは、天然のまたは合成の供給源のいずれかに由来し得る。ある特定の実施形態において、上記膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。ある特定の実施形態において、上記膜貫通タンパク質は、Ｔ細胞レセプターのα、β、もしくはζ鎖、ＣＤ３−ε、ＣＤ３−ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４を含むが、これらに限定されない群から選択される。一実施形態において、上記膜貫通ドメインは、ＣＤ８に由来する。ある特定の実施形態において、上記膜貫通ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、上記膜貫通ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、上記膜貫通ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列からなる。
【００３６】
上記ＣＡＲはまた、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含み、そのシグナル伝達ドメインはまた、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または細胞質共刺激シグナル伝達ドメインとして言及され得る。上記細胞質シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担い、抗原へのリンパ球の効率的応答に必要とされる。用語「エフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」とは、細胞の専門の機能に言及する。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。従って、用語「細胞質共刺激シグナル伝達ドメイン（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）」は、上記エフェクター機能シグナルを伝達し、上記細胞に専門化の機能を行うように指向するタンパク質の一部に言及する。細胞内シグナル伝達ドメイン全体が使用され得る場合、多くの場合には、鎖全体を使用する必要はない（すなわち、上記シグナル伝達ドメインが、タンパク質全体に由来し得る）。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮した部分が使用される程度まで、このような短縮化した部分は、その短縮化した部分が上記エフェクター機能シグナルを伝達する限りにおいて、無傷の鎖の代わりに使用され得る。用語、細胞内シグナル伝達ドメインは、上記エフェクター機能シグナルを伝達するために十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮化した部分に由来し得るかまたはその短縮化した部分を含み得る。ある特定の実施形態において、上記細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原レセプター結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）後にシグナル伝達を開始する、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）および共レセプターの細胞質配列から選択される。ある特定の実施形態において、上記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３−ζ、ＣＤ３−γ、ＣＤ３−δ、ＣＤ３−ε、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＦｃＲ−γ、ＦｃＲ−β、およびＴＣＲ−ζを含むが、これらに限定されない群から選択される。一実施形態において、上記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζ、ＣＤ２８、および／または４−１ＢＢに由来する。ある特定の実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζに由来するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる。一実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８に由来するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、上記少なく��も１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態において、少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢに由来するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、上記少なくとも１個の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態において、上記ＣＡＲは、３つの細胞質シグナル伝達ドメインを含み、上記細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ３、および４−１ＢＢに由来する。一実施形態において、第１の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８に由来し、第２の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３に由来し、第３の細胞質シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢに由来する。ある特定の実施形態において、第１の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み、第２の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み、第３の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％  配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、第１の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、第２の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、第３の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、第１の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列からなり、第２の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列からなり、第３の細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列からなる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ）」または「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｂｉｎｄｓ）」とは、抗体／抗原、リガンド／レセプター、核酸／相補的核酸、または他の結合対（例えば、サイトカインに対してサイトカインレセプター）に言及する場合、タンパク質および他の生物製剤の異種集団中のタンパク質の存在を決定する結合反応を示す。従って、指定された条件下では、特定された抗体またはその結合ドメインは、特定の抗原に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質に対して、顕著な量で結合しない。特異的結合はまた、例えば、企図した方法の、その結合する化合物、核酸リガンド、抗体、または抗体の抗原結合部位に由来する結合組成物が、任意の他の結合する化合物との親和性より、しばしば少なくとも２５％大きい、よりしばしば少なくとも５０％大きい、最もしばしば少なくとも１００％（２倍）大きい、概ね少なくとも１０倍大きい、より概ね少なくとも２０倍大きい、および最も概ね少なくとも１００倍大きい親和性でその標的に結合することを意味し得る。
【００３８】
用語「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」とは、この用語がヒト、霊長類、哺乳動物、哺乳動物被験体、動物、獣医学的被験体、プラシーボ被験体、研究用被験体、実験用被験体、細胞、組織、器官、または生物学的流体に適用される場合、上記被験体、細胞、組織、器官、または生物学的流体などへの外因性リガンド、試薬、プラシーボ、低分子、薬学的薬剤、治療剤、診断剤、または組成物の接触に言及するが、これらに限定されない。「投与」はまた、例えば、治療的方法、薬物動態的方法、診断的方法、研究方法、プラシーボ方法、および実験方法に言及し得る。細胞の処理は、上記細胞への試薬の接触、および流体への試薬の接触を包含し、この場合、流体は、上記細胞と接触した状態にある。「投与」はまた、例えば、細胞の、試薬、診断組成物、結合組成物による、または別の細胞による、インビトロおよびエキソビボ処理を包含し得る。投与経路としては、静脈内投与または注入技術が挙げられ得るが、これらに限定されない。注入技術は、針またはカテーテルを経て上記活性化Ｔ細胞の集団の投与を包含し得る。代表的には、注入は、上記活性化Ｔ細胞の集団が、静脈内投与または皮下投与されることを意味する。ある特定の実施形態において、上記活性化Ｔ細胞の集団は、全身投与される。ある特定の実施形態において、上記活性化Ｔ細胞の集団は、静脈内投与される（すなわち、静脈内（ＩＶ）注入によって）。好ましい投与経路は、腹腔内または静脈内である。
【００３９】
用語「弱毒化（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）」および「弱毒化した（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）」とは、宿主に対する毒性を低減するために改変された、細菌、ウイルス、寄生生物、感染性生物、プリオン、細胞、感染性生物の遺伝子などを包含する。上記宿主は、ヒトもしくは動物宿主、または器官、組織、もしくは細胞であり得る。上記ウイルスは、非限定的な例を挙げると、宿主細胞への結合を低減するために、１つの宿主細胞から別の宿主細胞への拡がりを低減するために、弱毒化され得る。弱毒化は、例えば、毒性の徴候（ｉｎｄｉｃｕｍ  ｏｒ  ｉｎｄｉｃｉａ）、ＬＤ５０、器官からのクリアランスの速度、または競合指数を測定することによって評価され得る（例えば、Ａｕｅｒｂｕｃｈら，  （２００１）  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６９：５９５３−５９５７を参照のこと）。一般に、弱毒化は、少なくとも２５％；より一般には少なくとも５０％；最も一般には少なくとも１００％（２倍）；概ね少なくとも５倍；より概ね少なくとも１０倍；最も概ね少なくとも５０倍；しばしば少なくとも１００倍；よりしばしば少なくとも５００倍；および最もしばしば少なくとも１，０００倍；通常は少なくとも５，０００倍；より通常は少なくとも１０，０００倍；および最も通常は少なくとも５０，０００倍；ならびに最もしばしば少なくとも１００，０００倍のＬＤ５０における増大および／またはクリアランス速度における増大を生じる。
【００４０】
ＣＡＲ  Ｔ細胞
本開示は、部分的に、ＣＡＲ  Ｔ細胞由来エフェクター細胞の調製およびレシピエントにおけるその使用に関する。１つの局面において、本開示は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）であって、ＬＹＰＤ３を特異的に結合する細胞外ドメインを有するＣＡＲを発現する活性化Ｔ細胞の集団に関する。ＬＹＰＤ３（ＬＹ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有３）は、Ｃ４．４Ａ、ＧＰＩアンカー転移関連タンパク質Ｃ４．４Ａホモログ（ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４．４Ａ  ｈｏｍｏｌｏｇ）、ＧＰＩアンカー転移関連タンパク質ホモログ（ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ）、ＭＩＧ−Ｃ４、またはマトリゲル誘導性遺伝子Ｃ４タンパク質（ｍａｔｒｉｇｅｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  Ｃ４  ｐｒｏｔｅｉｎ）としても公知である。
【００４１】
本明細書で開示される方法において使用されるＴ細胞は、商業的に利用可能な単離方法を含め、当該分野で公知の方法によって単離され得る（例えば、Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉら，  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｅｎｇｒａｆｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ，  ２０１４；およびＧｈａｓｓｅｍｉら，  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＣＡＲ）  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ，  ２０１８を参照のこと）。Ｔ細胞の供給源としては、末梢血、臍帯血、骨髄、または造血幹細胞の他の供給源が挙げられるが、これらに限定されない。種々の技術が、上記細胞を分離して、所望のＴ細胞を単離または富化するために使用され得る。さらに、Ｔ細胞を拡大するための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉら，  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｅｎｇｒａｆｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ，  ２０１４；およびＧｈａｓｓｅｍｉら，  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＣＡＲ）  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ，  ２０１８を参照のこと）。調節性Ｔ細胞を単離および拡大するための方法はまた、商業的に利用可能である（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  Ｃａｌｉｆ．；  ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，  Ｃａｎａｄａ；  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  Ｃａｌｉｆ．を参照のこと）。いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞は、ＩＬ−２の存在下で培養することによって拡大され得る。ある特定の実施形態において、上記Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体の存在下で培養することによって拡大され得る。いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞は、ＩＬ−２の存在下で培養することによって、ならびに抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体の存在下で培養することによって拡大され得る。
【００４２】
細胞を分離するためのプロトコールとしては、密度勾配遠心分離、細胞密度を改変する粒子への連結、抗体被覆磁性ビーズでの磁性分離、アフィニティクロマトグラフィー；モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合されるかまたはともに使用される細胞傷害性薬剤（補体および細胞毒素が挙げられるが、これらに限定されない）、ならびに固体マトリクス（例えば、プレートまたはチップ）に結合される抗体でのパニング、エルトリエーション、フローサイトメトリー、または任意の他の簡便な技術が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
上記単離されたＴ細胞は、これらが本明細書で開示されるとおりの処置の方法において投与される被験体に対して自家または非自家であり得る。自家細胞は、上記ＣＡＲを含む活性化Ｔ細胞の集団が投与されるべき被験体から単離される。ある特定の実施形態において、自家細胞は、ＣＡＲを組換え発現する上記単離され拡大された細胞が投与されるべき被験体から単離される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、白血球除去法によって得られ得る。ここで白血球は、採られた血液から選択的に除去され、組み換えられ、次いで、ドナー被験体に再度輸液される。あるいは、被験体ではない非自家ドナーに由来する同種異系細胞が使用され得る。非自家ドナーの場合、上記細胞は、当該分野で周知であるように、適切なレベルの適合性を決定するために、タイプ分けされ、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に対してマッチングされる。自家および非自家細胞の両方に関して、上記細胞は、当該分野で周知の方法を使用して、遺伝子操作および／または被験体への投与のために使用され得る準備ができるまで、必要に応じて低温保存され得る。
【００４４】
サイトカイン放出は、有効なＣＡＲ  Ｔ細胞ベースの療法のために、Ｔ細胞活性化および有効性の必要な結論であることから、上記活性化Ｔ細胞のうちの少なくとも一部が１またはこれより多くのサイトカイン（例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γからなる群より選択される１またはこれより多くのサイトカイン）を生成することは好ましい。さらに、上記活性化Ｔ細胞の集団のうちの少なくとも一部は、好ましくは、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＣＤ４０リガンド（ｇｐ３９）、ＣＤ１８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１６／ＣＤ５６、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３／ＴｃＲ、ＣＤ５４、ＬＦＡ−１およびＶＬＡ−４からなる群より選択される１またはこれより多くの表面マーカーを発現する。
【００４５】
治療用組成物
本明細書で記載される細胞組成物は、単独で、または薬学的に受容可能なキャリアとの組み合わせのいずれかにおいて、適切な抗腫瘍応答を誘導するために十分な量で被験体に投与され得る。上記応答は、特異的免疫応答、非特異的免疫応答、特異的および非特異的応答の両方、先天的応答、一次免疫応答、適応免疫、二次免疫応答、記憶免疫応答、免疫細胞活性化、免疫細胞増殖、免疫細胞分化、およびサイトカイン発現を含み得るが、これらに限定されない。
【００４６】
本開示は、ＣＡＲ  Ｔ細胞集団の有効な量を被験体に投与することによって、上記被験体において抗腫瘍免疫を生成する方法を提供する。「有効量」は、本明細書で使用される場合、治療上または予防上の利益を提供する量を意味する。ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染もしくは転移の程度、および患者（被験体）の状態における個々の差異を考慮して、医師によって決定され得る。本明細書で記載されるとおりのＣＡＲを発現する活性化Ｔ細胞の集団を含む薬学的組成物が、１０４〜１０１１  細胞／ｋｇ  体重、好ましくは１０７〜１０１０  細胞／ｋｇ  体重（それら範囲内の全ての整数値を含む）の投与量において投与され得ることが、一般に述べられ得る。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量において多数回投与され得る。上記細胞は、免疫療法において一般に公知である注入技術を使用することによって投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｍｅｄ．  ３１９：  １６７６，  １９８８を参照のこと）。特定の患者にとっての最適な投与量および処置レジメンは、上記患者を、疾患の徴候に関してモニターし、それに応じて上記処置を調節することによって、医療分野の当業者によって容易に決定され得る。
【００４７】
本明細書で記載されるとおりのキメラ抗原レセプターを発現する活性化Ｔ細胞の集団を含む細胞組成物の有効量は、上記活性化Ｔ細胞の集団の用量の１回の投与において与えられ得るが、１用量に制限されない。従って、上記投与は、上記キメラ抗原レセプターを発現する活性化Ｔ細胞の集団の２用量、３用量、４用量、５用量、６用量、７用量、８用量、９用量、１０用量、１１用量、１２用量、１３用量、１４用量、１５用量、１６用量、１７用量、１８用量、１９用量、２０用量、またはこれより多くの用量であり得る。用量の１回より多くの投与が存在する場合、上記用量の投与は、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、またはより多くの分数の時間間隔、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間などの間隔が空けられ得る。時間（ｈｏｕｒ）の文脈において、用語「約」とは、±３０分間以内の任意の時間間隔を意味する。上記用量の投与はまた、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、またはこれより長い時間間隔、およびこれらの任意の組み合わせの時間間隔が空けられ得る。本発明は、時間において等しく空けられる投与間隔に限定されるのではなく、等しくない間隔での投与も包含し得る（例えば、例えば、１日間、４日間、７日間、および２５日間での投与からなる予備刺激スケジュール）。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）」または「薬学的に受容可能な賦形剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」とは、活性化Ｔ細胞の集団と組み合わせた場合、上記Ｔ細胞の集団が生物学的活性を保持することを可能にする任意の物質に言及する。例としては、標準的な薬学的キャリア（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、水、油／水エマルジョンのようなエマルジョン、アミノ酸ベースの緩衝液、または炭酸水素緩衝化溶液、および種々のタイプの湿潤剤）のうちのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、上記キャリアは、被験体に投与される場合に、有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じない。いくつかの実施形態において、上記キャリアを含む薬学的組成物は、発熱物質、ならびに被験体に有害であり得る他の不純物を含まない。薬学的に受容可能なキャリアとしては、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、被覆、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられ得る；これらの使用は、当該分野で周知である。受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、好ましくは、使用される投与量および濃度において不活性であり、緩衝化剤（例えば、リン酸、クエン酸、または他の有機酸）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリド、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンが挙げられる）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。このようなキャリアを含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１８版，  Ａ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，編，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  １９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２１版．  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ２００５を参照のこと）。選択されるキャリアは、および使用されるキャリアの量は、投与様式に依存し得る。
【００４９】
特定の被験体／患者に対する「有効量」は、処置されている状態またはがん、上記被験体の全体的な健康状態、投与の経路および用量、ならびに副作用の重篤度のような要因に依存して変動し得る。処置および診断の方法のガイダンスは、入手可能である（例えば、Ｍａｙｎａｒｄら，  （１９９６）  Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．；  Ｄｅｎｔ  （２００１）  Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ．，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ＵＫを参照のこと）。投与されるべき細胞数の決定は、当業者によって行われ、一部は、がんの範囲および重篤度、ならびにトランスフェクトした細胞が、既存のがんの処置のために投与されているのか、またはがんの予防のために投与されているのかに依存する。上記活性化Ｔ細胞を含む薬学的組成物の調製は、本開示に照らして、当業者に公知である。
【００５０】
本開示のキメラ抗原レセプターを発現する活性化Ｔ細胞の集団は、１用量で、または複数の投与量で投与され得、ここで各用量は、少なくとも１００  細胞／ｋｇ  体重；少なくとも１，０００  細胞／ｋｇ  体重；少なくとも１０，０００  細胞／ｋｇ  体重；少なくとも１００，０００  細胞／ｋｇ  体重；少なくとも１，０００，０００  細胞／ｋｇ  体重；少なくとも１０，０００，０００  細胞／ｋｇ  体重；少なくとも１００，０００，０００  細胞／ｋｇ  体重；少なくとも１×１０９  細胞／ｋｇ  体重；少なくとも１０×１０９  細胞／ｋｇ  体重；少なくとも１００×１０９  細胞／ｋｇ  体重；または少なくとも１×１０１２  細胞／ｋｇ  体重を含む。
【００５１】
例えば、１回／週、２回／週、３回／週、４回／週、５回／週、６回／週、７回／週、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、５週間ごとに１回などの投与スケジュールが使用され得る。上記投与スケジュールは、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、および１２ヶ月までまたはこれより長い合計期間にわたる投与を包含する。
【００５２】
上記の投与スケジュールのサイクルが提供される。上記サイクルは、およそ、例えば、７日ごと；１４日ごと；２１日ごと；２８日ごと；３５日ごと；４２日ごと；４９日ごと；５６日ごと；６３日ごと；７０日ごとなどに反復される。投与しない間隔は、サイクルの間に起こり得、ここで上記間隔は、およそ、例えば、７日間；１４日間；２１日間；２８日間；３５日間；４２日間；４９日間；５６日間；６３日間；７０日間；などであり得る。この文脈において、用語「およそ」とは、±１日、±２日、±３日、±４日、±５日、±６日、または±７日を意味する。
【００５３】
本開示に従うＣＡＲ  Ｔ細胞はまた、１またはこれより多くのさらなる治療剤とともに投与され得る。さらなる治療剤との共投与のための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら，（編）  （２００１）  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  第１０版，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．；  Ｐｏｏｌｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  （編）  （２００１）  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａ．，  Ｐａ．；  Ｃｈａｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ  （編）  （２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａ．，  Ｐａ．）。他の薬剤は、上記被験体の治療レジメン（例えば、他の免疫療法、チェックポイントインヒビター、免疫−腫瘍薬物（ｉｍｍｕｎｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｄｒｕｇ）、標的化薬剤、化学療法、および／または放射線療法）のうちの一部であり得る。本開示の組成物と組み合わせて使用され得る薬剤／治療レジメンの例としては、ＣＴＬＡ−４、  ＰＤ−１、および／もしくはＰＤ−Ｌ１を遮断する薬物、ＣＳＦ−１Ｒインヒビター、ＴＬＲアゴニスト、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アレムツズマブ、アベルマブ、オファツムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、リツキシマブ、デュルバルマブ、サイトカイン療法、インターフェロン、インターフェロン−α、インターロイキン、インターロイキン−２、樹状細胞療法（例えば、Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ）、ＣＨＯＰ、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビノレルビン、ドキソルビシン、ドセタキセル、ブレオマイシン、ダカルバジン、ムスチン、プロカルバジン、プレドニゾロン、エトポシド、シスプラチン、エピルビシン、フォリン酸、およびオキサリプラチンが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の組成物は、上記さらなる治療剤の前に、上記さらなる治療剤と同時に、または上記さらなる治療剤の後に投与され得る。
【００５４】
共投与は、固体における同時の投与をいう必要があるのではなく、むしろ、多数の治療剤の投与が、１つの処置計画の結果である限りにおいて、数時間またはさらには数日、数週間、またはより長く間隔を空けた投与を含み得る。共投与は、本開示のＣＡＲ  Ｔエフェクター細胞を、代わりのＣＡＲ  Ｔ細胞の前に、その後に、または同時に投与することを包含し得る。例示的処置スケジュールにおいて、本開示のＣＡＲ  Ｔエフェクター細胞は、複数日にわたるプロトコールにおける初期用量として、後の投与日に与えられる代替のＣＡＲ  Ｔ細胞とともに与えられ得るか；または代替のＣＡＲ  Ｔ細胞は、複数日にわたるプロトコールにおける初期用量として、後の投与日に与えられる本開示のＣＡＲ  Ｔエフェクター細胞とともに与えられ得る。他方で、代替のＣＡＲ  Ｔ細胞および本開示のＣＡＲ  Ｔエフェクター細胞は、複数日にわたるプロトコールにおいて一日おきに投与され得る。これは、可能な投与プロトコールの限定的リストであることを意味しない。
【００５５】
治療剤の有効量は、概ね少なくとも１０％、より概ね少なくとも２０％、最も概ね少なくとも３０％、代表的には少なくとも４０％、より代表的には少なくとも５０％、最も代表的には少なくとも６０％、しばしば少なくとも７０％、よりしばしば少なくとも８０％、および最もしばしば少なくとも９０％、従来的には少なくとも９５％、より従来的には少なくとも９９％、最も従来的には少なくとも９９．９％、上記がんの症状を減少または改善する量である。例えば、本明細書で開示されるとおりの活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞の集団の投与は、他のがん処置で処置したコントロールもしくは患者、または処置前の同じ患者と比較して、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、約５年、もしくは約１０年、またはより長く、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、腫瘍増殖を低減する。
【００５６】
治療剤の製剤は、例えば、凍結乾燥散剤、スラリー、水性液剤または懸濁物の形態において、生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤と混合することによって、貯蔵のために調製され得る（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら  （２００１）  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．；  Ｇｅｎｎａｒｏ  （２０００）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．；  Ａｖｉｓら（編）  （１９９３）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ；  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）  （１９９０）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｔａｂｌｅｔｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ；  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）  （１９９０）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ；  Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ  （２０００）  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
【００５７】
作製方法
本開示は、本明細書で開示されるとおりのキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する活性化Ｔ細胞の集団を調製する方法であって、ここで上記方法は、（１）単離されたＴ細胞を、本明細書で開示されるとおりのＣＡＲをコードする核酸でトランスフェクトまたは形質導入する工程；および（２）トランスフェクションまたは形質導入の後に、上記ＣＡＲ発現Ｔ細胞を拡大する工程であって、ここで上記Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ならびに／またはＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体の存在下で培養することによって拡大される工程を包含する方法を提供する。ある特定の実施形態において、上記Ｔ細胞は、ＩＬ−２の存在下で培養することによって拡大される。ある特定の実施形態において、上記Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体の存在下で培養することによって拡大される。ある特定の実施形態において、上記Ｔ細胞は、抗ＣＤ２８の存在下で培養することによって拡大される。ある特定の実施形態において、上記Ｔ細胞は、ＩＬ−２、抗ＣＤ３抗体、および抗ＣＤ２８抗体の存在下で培養することによって拡大される。ある特定の実施形態において、上記単離されたＴ細胞は、哺乳動物から単離される。一実施形態において、上記哺乳動物はヒトである。ある特定の実施形態において、上記ヒトは、ＬＹＰＤ３を発現するがんに罹患している被験体である。上記方法の一実施形態において、上記単離されたＴ細胞は、ＬＹＰＤ３を発現するがんに罹患している被験体に対して自家である。
【００５８】
以下の実施例は、例証によって提供されるのであって、限定によって提供されるのではない。
【実施例】
【００５９】
材料および方法
構築物デザイン．  ＬＹＰＤ３−ＣＡＲを発現するＭＰ７１レトロウイルス構築物を、標準的な分子生物学技術を使用して生成した。
【００６０】
細胞株および培地．  ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＬＬＣ細胞、およびＭＣＦ７細胞を、ＡＴＣＣから購入した。匿名のドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｅｍａｃａｒｅから購入した。細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ、ＲＰＭＩ＋１０％  ＦＢＳ、またはＸ−Ｖｉｖｏ＋５％  ヒト血清Ａ／Ｂ中で培養した。
【００６１】
レトロウイルスベクター生成．  レトロウイルスベクターを、標準的なリン酸カルシウム沈殿プロトコールを使用することによって、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって調製した。ウイルス上清を、４８時間で採取し、Ｔ細胞を形質導入するために使用した。
【００６２】
Ｔ細胞形質導入および拡大．  レトロウイルス形質導入の前に、ＰＢＭＣを、Ｔ細胞アクチベータービーズおよびヒトＩＬ−２との培養によって、２日間活性化した。形質導入のために、新鮮に採取したレトロウイルス上清を、３２℃において２時間、２，０００ｇで遠心分離することによって、１５ｍｇ  ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ／ウェルで被覆した組織培養処理していない２４ウェルプレート（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上に遠心分離して載せた。活性化ＰＢＭＣを、上記プレート上に載せ、６００ｇにおいて、３２℃で３０分間、遠心分離した。Ｔ細胞を、３７℃および５％  ＣＯ２においてインキュベートした。培養培地を、２日ごとに補充した。マウスＴ細胞形質導入のために、マウスリンパ球をリンパ節から単離し、プレートに被覆した抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体（４ｍｇ／ｍｌ）および５０ＩＵ／ｍｌ  ヒトＩＬ−２によって、遠心分離して感染させる前に２日間活性化した。
【００６３】
ＣＡＲ染色．  全ての抗体を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。組換えＣＡＲの発現を、形質導入の４日後に、Ｆａｂ染色、続いて、フローサイトメトリーによって検出した。
【００６４】
ＣＤ６９染色．  全ての抗体を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。ＬＹＰＤ３  ＣＡＲ形質導入したＴ細胞またはコントロールの形質導入していないＴ細胞を、標的細胞（図２では、ＬＬＣ、図６ではＭＣＦ７）と一晩共培養した。次いで、Ｔ細胞を集め、フローサイトメトリーによる分析の前に、ＣＤ３抗体およびＣＤ６９抗体で染色した。
【００６５】
インビトロＩＦＮγ生成．  全ての抗体を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。ＬＹＰＤ３  ＣＡＲ形質導入したＴ細胞またはコントロールの形質導入していないＴ細胞を、ＭＣＦ７標的細胞とともに１：２  エクター−対−標的比において一晩共培養した。Ｔ細胞を、ブレフェルジンＡおよびモネンシンで４時間処理し、その後、Ｔ細胞を集め、細胞内ＩＦＮγ発現を、フローサイトメトリーを使用して測定した。生きているＣＤ４＋およびＣＤ８＋  リンパ球ゲーティングストラテジーを使用した。
【００６６】
Ｔ細胞殺滅アッセイ．  マウスＬＹＰＤ３を過剰発現するＬｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）腫瘍細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＣＦＳＥで標識氏、形質導入していないまたはＬＹＰＤ３−ＣＡＲ−Ｔ細胞とともに種々の比において共培養した。生きているＬＬＣ細胞を、フローサイトメトリーによって分析し、Ｔ細胞殺滅有効性を、生きているＬＬＣ細胞の数に基づいて計算した。
【００６７】
インビボ腫瘍接種および処理．  ６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１ｅ６のＬＬＣ細胞を皮下移植した。腫瘍が触知できるようになった場合、シクロホスファミド（３００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。次いで、２４時間後、１０ｅ６の形質導入していないまたはＬＹＰＤ３−ＣＡＲ−Ｔ細胞を、尾静脈を介してマウスに注射した。腫瘍増殖およびマウス体重を、図４に示されるように、研究のエンドポイントに達するまで定期的にモニターした。上記エンドポイントにおいて、全てのＬＬＣ腫瘍を採取し、写真を撮り、秤量した。
【００６８】
実施例１．  ＬＹＰＤ３を発現する扁平上皮がん(ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｎｃｅｒ)細胞のＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞殺滅
ＬＹＰＤ３抗原を発現する扁平上皮がん細胞に対するＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の生成、活性化、および腫瘍殺滅有効性を示す第１のデータが、ここで提供される（図１〜３）。図１は、形質導入したマウスリンパ球におけるＬＹＰＤ３  ＣＡＲ発現を示す。マウスリンパ球は、Ｆａｂ染色によって決定される場合、およそ７７．６％  ＬＹＰＤ３  ＣＡＲ陽性であったことを示す。
【００６９】
図２は、ＣＤ６９活性化によって測定される場合のＬＹＰＤ３陽性Ｌｅｗｉｓ肺がん（ＬＬＣ）細胞によるＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化を詳述する。形質導入していないまたはＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＬＹＰＤ３を過剰発現するように操作したＬＬＣ細胞とともに一晩共培養し、その後、Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによる分析の前に、ＣＤ３抗体およびＣＤ６９抗体で染色した。
【００７０】
図３は、ＬＹＰＤ３陽性腫瘍細胞に対するＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞殺滅有効性を示す。殺滅有効性を、示された比でインキュベートした形質導入していないまたはＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞と一晩共培養した後に存在する、生きたＬＬＣ細胞の数に基づいて計算した。まとめると、これらの３枚の図面は、マウスＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＬＹＰＤ３抗原を有する腫瘍細胞を特異的に認識および殺滅し得ることを示す。
【００７１】
実施例２．  明確な毒性のないＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の前臨床的抗腫瘍有効性
先の実施例は、ＬＹＰＤ３陽性腫瘍細胞に対するマウスＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ刺激および細胞傷害性活性を例証する。これらの所見をがんの治療的処置に適用可能であることを実証するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＬＹＰＤ３を過剰発現するように操作した１ｅ６のＬＬＣ細胞を皮下移植した。腫瘍が一旦触知できるようになった場合、プレコンディショニングのためにシクロホスファミド（３００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。次いで、２４時間後、１０ｅ６の形質導入していないまたはＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、尾静脈を介して注射した。
【００７２】
図４に図示されるように、このＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞療法での肺扁平上皮がん（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）を有するマウスの処置は、個々の腫瘍容積（図４Ａ）および平均腫瘍容積（図４Ｂ）、研究のエンドポイントにおける腫瘍の出現（図４Ｃ）、ならびに上記エンドポイントにおける腫瘍重量（図４Ｄ）によって決定されるように、マウス腫瘍負荷において＞２倍の平均低減を生じた。これらの所見は、マウス肺がんに対するＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の前臨床的有効性を示す。
【００７３】
さらに、毒性研究は、ＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与した動物が、この処置に耐容性があり、正常な体重を保持することを示す（図５）。ＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、明らかな毒性がなく、抗腫瘍有効性を示すことから、これらの細胞は、ＬＹＰＤ３関連がんの処置のための新規な養子Ｔ細胞ベースの治療アプローチを示す。
【００７４】
実施例３．  ヒト乳がんに対するＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の反応性
先の実施例は、ＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＬＹＰＤ３抗原を有するマウス腫瘍細胞を選択的に殺滅し得ることを例証する。その同じプロセスがヒトにおいても保存されるという証拠を提供するために、ヒトＰＢＭＣを、ヒトＬＹＰＤ３  ＣＡＲを発現するように操作した。以下の実施例において、ＬＹＰＤ３を内因的に発現するヒトＭＣＦ７乳がん細胞を、標的細胞として利用した。
【００７５】
図６は、ヒトＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞がヒトがん細胞に対して反応性であることを示すＦＡＣＳを含む。図６Ａは、ヒトＦａｂ染色によって定量されるように、ヒトＰＢＭＣにおける強いＬＹＰＤ３  ＣＡＲ発現を示すのに対して、図６Ｂは、内因性ＬＹＰＤ３を発現するヒトがん細胞によるＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞刺激を詳述する。ＭＣＦ７乳がん細胞とともに一晩共培養した後、ＣＡＲ−Ｔ細胞を集め、フローサイトメトリーによる定量の前に、ＣＤ３抗体およびＣＤ６９抗体で染色した。これらの結果は、マウスＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞（図１〜３）と同様に、ヒトＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＬＹＰＤ３抗原を発現する腫瘍細胞の存在下で活性化されることを示す。
【００７６】
ヒトＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞刺激は、形質導入していないＴ細胞（図６Ｃ）またはＬＹＰＤ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（図６Ｄ）をＭＣＦ７乳がん細胞とともに、１：２  エフェクター−対−標的比で一晩共培養した後にＩＦＮγ発現を示す、図６Ｃおよび６Ｄにおいてさらに詳述される。＜１％  ＩＦＮγ陽性コントロール細胞との比較において、ＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞のうちのおよそ１０．４％が、ＩＦＮγ陽性によって測定されるように、ＭＣＦ７細胞とインキュベートした際に活性化された。
【００７７】
上記の実施例は、先のマウスＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の結果が、ＬＹＰＤ３陽性乳がん細胞に対する応答において強いヒトＣＡＲ−Ｔ細胞活性化によって明らかにされるように、ヒトＴ細胞およびがんに容易に適用され得ることを示す。まとめると、これらの結果は、ＬＹＰＤ３抗原の細胞表現発現を示す種々の腫瘍タイプに対する有望で新たな処置としてＬＹＰＤ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を明らかにする。
【００７８】
配列番号1.  LYPD3-scFvの核酸配列
【化１】
2021530238.tif 000003
配列番号2.  膜貫通ドメインの核酸配列
【化２】
2021530238.tif 000004
配列番号3.  共刺激シグナル伝達ドメインの核酸配列
【化３】
2021530238.tif 000005
配列番号4.  41BB共刺激シグナル伝達ドメインの核酸配列
【化４】
2021530238.tif 000006
配列番号5.  CD3  細胞内シグナル伝達ドメインの核酸配列
【化５−１】
2021530238.tif 000007
【化５−２】
2021530238.tif 000008
配列番号6.  マウスLYPD3  CARの膜貫通ドメインの核酸配列
【化６】
2021530238.tif 000009
配列番号7.  マウスLYPD3  CARのCD28共刺激シグナル伝達ドメインの核酸配列
【化７】
2021530238.tif 000010
配列番号8.  マウスLYPD3  CARの41BB共刺激シグナル伝達ドメインの核酸配列
【化８】
2021530238.tif 000011
配列番号9.  マウスLYPD3  CARのCD3細胞内シグナル伝達ドメインの核酸配列
【化９】
2021530238.tif 000012
配列番号10.  LYPD3-scFvのアミノ酸配列
【化１０】
2021530238.tif 000013
配列番号11.  膜貫通ドメインのアミノ酸配列
【化１１】
2021530238.tif 000014
配列番号12.  CD28共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列
【化１２】
2021530238.tif 000015
配列番号13.  41BB共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列
【化１３】
2021530238.tif 000016
配列番号14.  CD3細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列
【化１４】
2021530238.tif 000017
配列番号15.  マウスLYPD3  CARの膜貫通ドメインのアミノ酸配列
【化１５】
2021530238.tif 000018
配列番号16.  マウスLYPD3  CARのCD28共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列
【化１６】
2021530238.tif 000019
配列番号17.  マウスLYPD3  CARの41BB共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列
【化１７】
2021530238.tif 000020
配列番号18.  マウス  LYPD3  CARのCD3  細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列
【化１８】
2021530238.tif 000021
配列番号19.  NM_014400.3  Homo  sapiens  LY6/PLAURドメイン含有3(LYPD3),  mRNA
【化１９−１】
2021530238.tif 000022
【化１９−２】
2021530238.tif 000023
配列番号20.  NP_055215.2  ly6/PLAURドメイン含有タンパク質3前駆体[Homo  sapiens]
【化２０】
2021530238.tif 000024
【００７９】
本明細書で言及される任意の特許または刊行物は、本発明が関連する分野の当業者のレベルを示す。これらの特許および刊行物は、各個々の刊行物が、参考として援用されることを具体的にかつ個々に示されるのと同程度まで、本明細書に参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先する。
【００８０】
当業者は、本発明が、目的を果たし、言及される目的および利点、ならびにその中に内在するものを得るために十分に適合されることを容易に認識する。本明細書で記載される開示は、好ましい実施形態の現在の代表であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定とは意図されない。その中での変更および他の使用は、当業者に想起され、それは、請求項の範囲によって規定されるとおりの本発明の趣旨の範囲内に包含される。
【００８１】
本明細書で引用される任意の非特許文献または特許文献を含め、任意の参考文献が、先行技術を構成することは、認めない。特に、別段述べられなければ、本明細書中の任意の文献に対する言及は、これらの文献のうちのいずれかが米国または任意の他の国において当該分野での一般的技術常識の一部を形成するという自白を構成しないことが、理解される。上記参考文献の何らかの考察は、それらの著者らが主張することを述べ、出願人は、本明細書で引用される文献のうちのいずれかの正確さおよび適切であることに異議を唱える権利を留保する。本明細書で引用される全ての参考文献は、別段明示的に示されなければ、参考として完全に援用される。任意の定義および／または引用文献中で見出される記載との間で何らかの不一致が存在する場合には、本開示が優先する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2021530238.tif 000029
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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