(57)【要約】本発明は、昆虫の角膜設計に基づく有利な機能性を有するインビトロ・ナノコーティング、およびこのようなナノコーティングの製造方法に関する。本発明は、特に、角膜タンパク質レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質と、相補的な脂質と、の混合物を主材料とするインビトロ・ナノコーティングに関する。さらに、本発明は、組換えタンパク質と市販の脂質からこのようなナノコーティングを製造する単純な方法に関する。
2021525727.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コーティングされた面の形成方法であって、
ｉ．レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質を含むタンパク質溶液を用意し、
ｉｉ．１つまたは複数の脂質を含む乳濁液または懸濁液を用意し、
ｉｉｉ．前記タンパク質溶液と、前記乳濁液または懸濁液と、を混合して液体混合物を提供し、
ｉｖ．前記液体混合物を表面に付け、
ｖ．前記表面を乾燥させてコーティングされた面を提供するステップをそれぞれ含むことを特徴とするコーティングされた面の形成方法。
【請求項２】
レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質は、双翅目に属する昆虫に由来することを特徴とする請求項１に記載のコーティングされた面の形成方法。
【請求項３】
前記昆虫は、ショウジョウバエ属に属することを特徴とする請求項２に記載のコーティングされた面の形成方法。
【請求項４】
前記昆虫は、キイロショウジョウバエであることを特徴とする請求項２または請求項３に記載のコーティングされた面の形成方法。
【請求項５】
レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質は、組換え型レチニン、組換え型レチニン様タンパク質、または組換え型角質タンパク質であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のコーティングされた面の形成方法。
【請求項６】
前記タンパク質溶液は、レチニンまたはレチニン様タンパク質を含むことを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のコーティングされた面の形成方法。
【請求項７】
レチニンまたはレチニン様タンパク質が、
ｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、
ｉｉ．（ｉ）の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項６に記載のコーティングされた面の形成方法。
【請求項８】
レチニンまたはレチニン様タンパク質が、
ｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と、
ｉｉ．（ｉ）の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項６に記載のコーティングされた面の形成方法。
【請求項９】
レチニンまたはレチニン様タンパク質が、
ｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と、
ｉｉ．（ｉ）の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項６に記載のコーティングされた面の形成方法。
【請求項１０】
前記１つまたは複数の脂質が、少なくとも１０個の炭素原子、例えば、少なくとも１２個の炭素原子、少なくとも１５個の炭素原子、少なくとも２０個の炭素原子、少なくとも２５個の炭素原子、少なくとも３０個の炭素原子を含む、１つまたは複数の炭素鎖を含む分子であることを特徴とする請求項１から請求項９のいずれか１項に記載のコーティングされた面の形成方法。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の脂質がワックスであることを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載のコーティングされた面の形成方法。
【請求項１２】
ワックスが、カルナウバロウ、ミツロウ、パラフィンワックス、ラノリンワックス、シナロウ、セラックロウ、鯨ろう、ベーベリーワックス、カンデリラワックス、キャスターワックス、エスパルトワックス、ジャパンワックス、オーリクリーワックス、ソイワックス、ククイノキワックス、セレシンワックス、モンタンワックス、オゾケライト、ピートワックス、マイクロクリスタリンワックス、これらの個々の成分および派生物、およびこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載のコーティングされた面の形成方法。
【請求項１３】
レチニンまたはレチニン様タンパク質が、タンパク質ファミリーのＰＦＡＭデータベースにおいて、ＰＦ０４５２７と称される共通のレチニンＣドメインであって、タンパク質のＩｎｔｅｒＰｒｏデータベースにおいて、ＩＰＲ００７６１４と称されるレチニン様ドメインとしても知られている、共通のレチニンＣドメインを含むことを特徴とする請求項６に記載のコーティングされた面の形成方法。
【請求項１４】
レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質と、１つまたは複数の脂質と、を含むことを特徴とするコーティングされた面。
【請求項１５】
レチニンまたはレチニン様タンパク質が、
ｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、
ｉｉ．（ｉ）の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１４に記載のコーティングされた面。
【請求項１６】
前記面が、昆虫の表面でなく、好ましくは、昆虫の眼の表面でないことを特徴とする請求項１４または請求項１５に記載のコーティングされた面。
【請求項１７】
前記面が、天然に形成される表面でないことを特徴とする請求項１４または請求項１５に記載のコーティングされた面。
【請求項１８】
前記面が、ガラス、金属、プラスチック、ポリマー、シリコン、鉱物、紙、およびコンクリートからなる群から選択される１つまたは複数の材料からなることを特徴とする請求項１４から請求項１７のいずれか１項に記載のコーティングされた面。
【請求項１９】
コンタクトレンズ、ガラス含有面、ディスプレイ、ソーラーパネル、芸術的な絵画、生物学的移植片、および電線を含む群から選択されるコーティングされた製品を提供するための、請求項１４から請求項１８のいずれか１項に記載のコーティングされた面の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、昆虫の角膜設計に基づく有利な機能を有するインビトロ・ナノコーティングおよびこのようなナノコーティングの製造方法に関する。本発明は、特に、角膜タンパク質レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質と、相補的な脂質と、の混合物に基づくインビトロ・ナノコーティングに関する。本発明は、さらに、このようなナノコーティングを組換えタンパク質と市販の脂質から製造する単純な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業界では、顧客が要求する有利な特性を有する製品を提供するために、種々の製品に機能性コーティングが多用されている。コーティングは、付着性（例えば、こびりつかない特性、遊離性）光学的特性（例えば、（低）反射率、ＵＶ吸収率）、触媒作用（例えば、自己清浄性）、保護作用（例えば、封止、耐食性、抗菌性）磁気的特性（例えば、メディアディスク、大量輸送乗車券）、電気的特性（例えば、導電性、絶縁性）などの特性を変更するために使用することができる。従って、コーティングの応用範囲は広範にわたり、新しくて面白い機能性を有するコーティングの形成に適した新規技術の導入とともに、コーティングの種類が急速に増加している。
【０００３】
コーティングが特定の有利な機能的特性をどのように高めるかを理解する鍵は、とりわけコーティングの個々の成分および表面におけるこれらの成分の相互に関連する組織にある。このようなコーティングの多くは、ナノスケールの組織を有し、ナノコーティングと呼ぶことができる。ナノテクノロジーの進歩とともに、ナノ構造の特性を明らかにする多くの新規の手段が開発された。従って、今日産業界では、ナノ構造を有する人工面（すなわち、ナノコーティング）は広く利用されている。
【０００４】
ナノコーティングは、化学蒸着、物理蒸着、および他の化学的、電気化学的技術などの多岐にわたる技術によって形成される。特許文献１は、リトグラフ技術を使用した反射防止ガラス基体の製造を開示している。反射防止面は、撥液性および自己清浄性を向上させるために、パラフィンロウなどの疎水性材料でコーティングすることができる。
【０００５】
特許文献１およびナノコーティングの形成に使用可能なその他の方法の共通点は、過酷な物理的処理（例えば、リトグラフィー、エッチングなど）または有毒化学物質の塗布を伴うことである。しかし、このような種類の従来のコーティングプロトコルは、耐性が高い表面材料にしか適用できない。これに対し、例えば、大部分の生物医学的用途や柔らかい物質からなる材料のコーティングのように、過酷な処理によって損傷を受けやすく、穏和な条件が要求される用途もある。さらに、多くの従来のコーティング技術は、多くの労力を要するとともに、ハイテクの高額な設備を必要とする。このような制限は、過酷な物理的および／または化学的処理に耐性がない表面を含む、全ての種類の表面に適した生体適合性ナノコーティングの開発を大きく妨げている。
【０００６】
よって、生体適合性インビトロ・ナノコーティングを形成する改善された方法が求められている。特に、全ての種類の表面に適したインビトロ・ナノコーティングのより穏和でスループットが高い形成方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許公開第２００９／０２３１７１４号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nanoscale, 2015,7, 5922-5946
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、反射防止や湿潤防止などの有利な機能性を有するインビトロ・ナノコーティングの形成方法に関する。好ましくは、ナノコーティングの形成には、生体適合性および穏和な試薬のみが使用され、これにより、従来の過酷な物理的または化学的処理で処理できなかった材料のコーティングにナノコーティング技術が適用可能となる。よって、提案される方法は、コンタクトレンズなどの脆弱な表面にも新規の機能性を付与する用途の広い手段である。
【００１０】
従って、本発明の目的は、過酷な物理的および／または化学的処理に耐性のない表面を含む全ての種類の表面に適した穏和な条件を使用する方法などの、生体適合性インビトロ・ナノコーティングを形成する改善された方法を提供することに関する。
【００１１】
本発明の目的は、特に、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質と、１つまたは複数の脂質と、を含むナノコーティングであって、反射防止および／または湿潤防止などの１つまたは複数の特性を製品に付与するために使用可能なナノコーティングを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本発明の一態様は、コーティングされた面の形成方法に関し、この方法は、
ｉ．レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質を含むタンパク質溶液を用意し、
ｉｉ．１つまたは複数の脂質を含む乳濁液または懸濁液を用意し、
ｉｉｉ．上記タンパク質溶液と、上記乳濁液または懸濁液と、を混合して液体混合物を提供し、
ｉｖ．上記液体混合物を表面に付け、
ｖ．上記表面を乾燥させてコーティングされた面を提供するステップをそれぞれ含む。
【００１３】
本発明の他の態様は、コーティングされた面であって、
・レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質を含むタンパク質溶液と、
・１つまたは複数の脂質を含む乳濁液または懸濁液と、
を混合して液体混合物を提供し、
上記面に上記液体混合物を付け、続いて上記面を乾燥させることによって得られるコーティングされた面に関する。
【００１４】
本発明のさらに他の態様は、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質と、１つまたは複数の脂質と、を含むコーティングされた面を提供することに関する。
【００１５】
本発明のまた他の態様は、コンタクトレンズ、ガラス含有面、ディスプレイ、ソーラーパネル、芸術的な絵画、生物学的移植片、および電線からなる群から選択されるコーティングされた製品を提供するための、本明細書に記載のコーティングされた面の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】キイロショウジョウバエの角膜型ナノコーティングを示している。ショウジョウバエの頭部の肉眼の画像から個別の単眼レンズを覆う単体ニップル型ナノ構造の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）の解像度まで拡大率を段階的にあげた画像を示している。
【図２ａ−ｈ】図２は、角膜型ナノコーティングの形成に要求されるタンパク質としてレチニンの特定を示している。図２ａは、眼の物質を網膜（左側、細長い）と角膜（右側、丸い）に分離する模式図を示している。図２ｂは、洗浄処理前の野生型ショウジョウバエの角膜面のＡＦＭ解析を示している。図２ｃは、洗浄処理後の野生型ショウジョウバエの角膜面のＡＦＭ解析を示している。図２ｄは、網膜と角膜の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。矢印で示す角膜特有の主要なタンパク質バンドがペプチド質量分析によって特定された。分子量のスタンダードをゲルの左側に示している。図２ｅは、レチニンのためにノックダウンされたＲＮＡ干渉誘導による変異角膜のＡＦＭ解析を示している。図２ｆは、野生型および異なるノックダウン表現型のニップルナノ構造の高さを示している。図２ｇは、野生型および異なるノックダウン表現型のニップルナノ構造の直径を示している。図２ｈは、野生型および異なるノックダウン表現型のニップルナノ構造の半分の高さの二乗(square on the half-height)を示している。データは、平均値±標準偏差（ＳＤ）を示しており、ｎ＝５０、異なる領域を解析している。コントロール野生型の遺伝子型からの統計的に有意な差をスチューデント検定により評価した（“＊”は、Ｐ値≦０．０５を意味し、“＊＊”は、Ｐ値≦０．０１を意味し、“＊＊＊”は、Ｐ値≦０．００１を意味し、“＊＊＊＊”は、平均Ｐ値≦０．０００１を意味する）。
【図２ｉ】異なるレチニン遺伝子型のハエの頭部の、レチニンノックダウン（UAS-RNAi-レチニン; GMR-Gal4）、３つのコントロール系統(オレゴンR-C, UAS-RNAi-レチニンおよびGMR-Gal4)、および３つの過剰発現系統(UAS-レチニン/+; GMR-Gal4/+, UAS-レチニン/UAS-レチニン; GMR-Gal4/GMR-Gal4 およびspa-Gal4/spa-Gal4; UAS-レチニン/UAS-レチニン; GMR-Gal4/GMR-Gal4）のレチニンタンパク質レベルを示している。
【図３ａ−ｂ】図３は、レチニンの発現がショウジョウバエ属の角膜ナノ構造の秩序およびパターン形成を制御していることを示している。図３ａでは、ショウジョウバエ属の１４種の角膜型ナノコーティングの分析によって、例えば、クロショウジョウバエ（上のパネル）に見られるキイロショウジョウバエ様ニップルのみ型、および、例えば、オウトウショウジョウバエ（下のパネル）に見られるニップル−リッジ型の２つの主要な型が明らかになっている。図３ｂでは、異なるショウジョウバエの種における角膜のレチニン含有量は、ニップルのみナノ構造（左側、薄い灰色）からニップル−リッジナノコーティング（右側、濃い灰色）への形態の移行に相関している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび濃度測定分析のための異なる角膜標本の番号は、バーに記載されている。各ショウジョウバエ属の少なくとも２つの異なる固体について、３００〜４００のニップル様ナノ構造をそれぞれ含む少なくとも３つの領域をＡＦＭによって分析した。データは、平均±標準誤差として示されている。ニップルのみ群とニップル−リッジ群とのレチニン角膜成分含有量の差の統計上の有意性を、２元配置分散分析（“＊＊＊”は、Ｐ値≦０．００１を意味する）によって評価している。
【図３ｃ】ショウジョウバエ属のショウジョウバエのレチニンを示している。異なるショウジョウバエの種の角膜標本のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、全ての種に含まれ、質量分析でレチニンとして特定される約２５ｋＤａのタンパク質を含む主要なタンパク質の類似パターンが明らかになっている。
【図４ａ−ｇ】図４は、ワックス合成経路の酵素が、キイロショウジョウバエの角膜ナノ構造の秩序およびパターン形成を制御していることを示している。図４ａは、必要な酵素およびワックス合成経路の模式図を示している。図４ｂは、ＣＧ５３２６ノックダウン（ｋ／ｄ）角膜のＡＦＭ画像（３×３μｍ）である。図４ｃは、ＣＧ５３２６過剰発現（ｏ／ｅ）角膜のＡＦＭ画像（３×３μｍ）である。図４ｄは、コントロール角膜のＡＦＭ画像（３×３μｍ）である。図４ｅは、ＣＧ１９４２変異（ｍｕｔ）角膜のＡＦＭ画像（３×３μｍ）である。図４ｆは、野生型、レチニンノックダウン、ＣＧ５３２６過剰発現表現型、並びにＣＧ５３２６発現の下方制御によるレチニンノックダウン表現型のレスキューのニップルナノ構造の高さを数量化して示している。図４ｇは、野生型、レチニンノックダウン、ＣＧ５３２６過剰発現表現型、並びにＣＧ５３２６発現の下方制御によるレチニンノックダウン表現型のレスキューのニップルナノ構造の直径を数量化して示している。
【図４ｈ】ニップルナノ構造の高さを数量化して示しており、（ｉ）レチニン過剰発現およびＣＧ５３２６過剰発現の表現型（左から３番目の柱）および（ｉｉ）レチニンノックダウンおよびＣＧ５３２６過剰発現の表現型（右から２番目の柱）が追加で示されている。データは、平均±ＳＤで示されており、ｎ＝５０、異なる領域が分析された。コントロールの野生型遺伝子型との差の統計学的有意性をｔ−ｔｅｓｔによって評価した（“＊＊”は、Ｐ値≦０．０１を意味し、“＊＊＊”は、Ｐ値≦０．００１を意味し、“＊＊＊＊”は、Ｐ値≦０．０００１を意味する）。
【図５ａ−ｅ】図５は、インビトロのレチニンタンパク質およびワックスの直接的な相互作用によるナノ構造コーティングの形成を示している。図５ａは、ドットブロット分析によるレチニンと異なるワックスとの直接的な相互作用を示している。図５ｂは、高さが約２０ｎｍの内部組織および基層を示す、ナノコーティングの引っ掻いた先端部（左側）のＡＦＭによる断面を示している。図５ｃは、レチニン溶液の層を設けた後の試料のＡＦＭ画像（４×４μｍ）を示している。図５ｄは、レチニン溶液とワックス乳濁液の混合物の層を設けた後の試料のＡＦＭ画像（４×４μｍ）を示している。図５ｅは、ワックス乳濁液の層を設けた後の試料のＡＦＭ画像（４×４μｍ）を示している。
【図５ｆ−ｈ】図５ｆは、レチニンとの混合にパラフィン（左側）またはミツロウ（右側）を使用して得られたナノコーティング面のＡＦＭ画像（３×３μｍ）を示している。図５ｇは、異なる油／ワックス乳濁液２０μｌ（左から右にオリーブ油、ラノリンワックス、パラフィン、ミツロウ、カルナウバロウ）でコーティングし、洗浄および乾燥し、ＰＢＳのレチニンタンパク質溶液（０．６ｍｇ／ｍｌ）の混合溶液で覆われた、異なるナノコーティングのＡＦＭ画像（３×３μｍ）を示している。図５ｈは、カルナウバロウをレチニン（左側）またはコントロールタンパク質としてＢＳＡ（右側）と混合して得られたナノコーティング面のＡＦＭ画像（３×３μｍ）を示している。
【図６ａ−ｂ】図６は、人工ナノコーティングの機能性を示している。図６ａは、人工ナノコーティングおよびコントロール試料（ガラス）の異なる面について測定された反射スペクトル（３００〜７５０ｎｍ）の比率である。点線は、スペクトルにわたる比率１．０（コントロールとの反射の差がない）を示している。図６ｂは、異なる試料の接触角を示しており、コントロール（ガラス、ワックスガラス）とナノコーティングの３つの異なる試料に水滴が乗った図である。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝６として示している。
【図７ａ−ｌ】図７は、異なるパラメータで形成されたインビトロ・ナノコーティングのＡＦＭ画像（ＡＦＭ画像の寸法は２×２μｍ）である。図７ａ〜図７ｄは、異なるレチニン対ワックス比率および異なる湿度で形成されたインビトロ・ナノコーティングのＡＦＭ画像である。図７ｅは、ＢＳＡとラノリンを混合して形成されたインビトロ・ナノコーティングのＡＦＭ画像である。図７ｆ〜図７ｈは、異なる反復プロトコルで形成されたナノコーティングのＡＦＭ画像である。図７ｉは、レチニン溶液とラノリン乳濁液を混合して形成されたインビトロ・ナノコーティングのＡＦＭ画像である。図７ｊは、レチニン溶液とミツロウ乳濁液を混合して形成されたインビトロ・ナノコーティングのＡＦＭ画像である。図７ｋは、レチニン溶液とパラフィン乳濁液を混合して形成されたインビトロ・ナノコーティングのＡＦＭ画像である。図７ｌは、レチニン溶液とカルナウバロウ乳濁液を混合して形成されたインビトロ・ナノコーティングのＡＦＭ画像である。
【図８】レチニン溶液とオリーブ油乳濁液の混合物で形成されたインビトロ・ナノコーティングのＡＦＭ画像である（ＡＦＭ画像の寸法は２×２μｍ）。
【図９】本明細書に記載したインビトロ・ナノコーティングおよび既知の他のナノコーティングの概要を示す。ナノコーティングが次の特性、（ｉ）「三次元形状」、つまり、ナノコーティングが三次元形状を有する面に容易に使用できるか、（ｉｉ）「大規模面」、つまり、ナノコーティングを大きい面に使用できるか、（ｉｉｉ）「工程の非複雑性」、つまり、ナノコーティングの形成が先端的および専門の設備を必要とするか、（ｉｖ）「腐食性／毒性を有する化学薬品なし」、つまり、環境を損なわずにナノコーティングを形成できるか、「改良が容易」、つまり、ナノコーティングを種々の用途に容易に適用できるか、（ｖ）「生分解性」、つまり、ナノコーティングの成分を自然界で分解できるか、を有するか否かを示している。図９に記載のリストの方法は、非特許文献１に基づいている。
【図１０ａ−ｅ】図１０は、ＣＰＲ１０およびＣＧ１３０５９の角質タンパク質によるナノコーティングの形成を示している。図１０ａは、キイロショウジョウバエの網膜および角膜の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。図１０ｂは、ガンビアハマダラカの網膜および角膜の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。ペプチド質量分析によって角膜特有の主要タンパク質バンドが特定された。分子量のスタンダードがゲルの右側に示されている。レチニンおよびＣＰＲ１０にラベルが付けられている。図１０ｃは、ＣＰＲ１０タンパク質から得られたナノ構造について測定した透過スペクトルを示している。透過率の理論上の最大値は１０４％である。図１０ｄは、ナノ構造の形成を示すラノリンワックスおよびＣＧ１３０５９タンパク質を使用した試料のＡＦＭ画像（３×３μｍ）である。図１０ｅは、ナノ構造の形成を示すラノリンワックスおよびＣＰＲ１０タンパク質を使用した試料のＡＦＭ画像（３×３μｍ）である。
【００１７】
本発明について、以下でより詳細に説明していく。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
［定義］
本発明を詳細に説明する前に、以下の用語および約束事を最初に定義する。
【００１９】
［コーティング］
本明細書では、「コーティング」とは、物体の表面にわたって延在する被覆を意味する。コーティングは、物体を全体的または部分的に覆うことができる。
【００２０】
コーティングは、物体に、反射防止、湿潤防止、抗菌性、自己清浄性、防氷、および細胞および／または組織の付着および／または増殖および／または分化の制御を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の有利な機能的特性を提供することができる。
【００２１】
本明細書では、「コーティング」および「ナノコーティング」という用語は互換性がある。
【００２２】
［表面］
本明細書では、「表面」とは、コーティングを施すことができる物体のあらゆる外側層を意味する。表面は、（例えば、平ら、球状、細長い、円柱状などの）あらゆる形態を有してもよく、ガラス、金属、プラスチック、ポリマー、シリコン(silicon)、鉱物、紙、コンクリートを含むがこれらに限定されない材料から構成されていてもよい。表面は、材料の組合せから構成されていてもよい。
【００２３】
表面は、本明細書に記載のナノコーティングの恩恵を受けうる全ての種類の製品の一部であってもよい。よって、表面は、コンタクトレンズ、ガラス含有面、ディスプレイ、ソーラーパネル、芸術的な絵画、生物学的移植片、建設材料、および電線を含むがこれらに限定されない製品の外側層であってもよい。
【００２４】
［溶液］
本明細書では、「溶液」とは、溶媒と溶媒に完全に溶解した種々の成分からなる媒体を意味する。よって、溶液は、分散した固体材料を含まず、すなわち、懸濁液ではない。また、溶液は、液体に混ざらない他の成分を含まず、すなわち、溶液は乳濁液ではない。
【００２５】
［レチニンまたはレチニン様タンパク質］
本明細書では、「レチニン(retinin)またはレチニン様タンパク質」とは、種々の昆虫の眼または角膜に含まれるタンパク質を意味し、好ましくは、レチニンＣドメインとして知られている保存領域を有する。しかし、「レチニン様タンパク質」は、レチニンＣドメインを含まず、アミノ酸配列の残りの部分がレチニン配列の中間部およびＣ末端部に類似する（シグナルペプチド配列を除く）タンパク質も含む。レチニンＣドメインは、タンパク質ファミリーのＰＦＡＭデータベースにおいて、ＰＦ０４５２７と称され、タンパク質のＩｎｔｅｒＰｒｏデータベースにおいて、ＩＰＲ００７６１４と称されるレチニン様ドメインとしても知られている。
【００２６】
本明細書では、「レチニンまたはレチニン様タンパク質」とは、共通のレチニンＣドメイン領域またはタンパク質の他の領域において所定の程度の相同性を有するものも許容する。従って、タンパク質のアミノ酸配列は、上述した配列から外れ、ここで説明するレチニンまたはレチニン様タンパク質とは異なりうる。
【００２７】
［角質タンパク質］
本明細書では、角質タンパク質は、節足動物（以下では昆虫と称する）の外骨格に含まれるタンパク質である。角質または角皮は、多くの無脊椎動物、特に節足動物の表皮の外の多層構造体であり、この多層構造体内に外骨格が形成される。よって、角質タンパク質は、節足動物の外皮の主要部分を構成する。外皮は、皮膚、穀皮、殻、皮など、生物または臓器の自然の覆いである。従って、外皮は、昆虫の外骨格の多くの物質を含んでいる。
【００２８】
［乳濁液］
本明細書では、「乳濁液」とは、通常の状態では混ざり合わない、少なくとも２つの液体の混合物を意味する。乳濁液は、一方の液体、すなわち分散相が、他方の液体中、すなわち連続相中に分散した二相系である。分散相は、液滴として存在しうる。
【００２９】
典型的な乳濁液は、油が分散相であり、水が連続相である水中油、または水が分散相であり、油が連続相である油中水のような古典的な二相系である。しかし、水中油中水乳濁液や油中水中油乳濁液などの多重乳濁液でもよい。
【００３０】
乳濁液の成分は、上述した水と油に限定されず、他の液体でもよい。よって、本明細書では、脂質を乳濁液の成分とすることができる。
【００３１】
乳濁液の安定化のために乳化剤を使用してもよい。典型的な乳化剤は、極性部分と非極性部分を有する化合物であり、表面活性物質および界面活性剤を含むがこれらに限定されない。
【００３２】
［懸濁液］
本明細書では、「懸濁液」とは、溶媒に懸濁した固体粒子（すなわち、溶質）を含む混合物を意味する。
【００３３】
懸濁液は、溶質が沈降する充分な大きさである古典的な懸濁液、または溶質（または、コロイド）がすぐに沈降しない大きさの粒子であるコロイド懸濁液とすることができる。古典的な懸濁液では、粒子は典型的に１μｍより大きく、コロイド懸濁液では、粒子は典型的にナノメートルスケール、すなわち、１〜１０００ｎｍである。
【００３４】
［脂質］
本明細書では、「脂質」とは、非極性溶媒に溶解し、水には簡単に溶解しない疎水性または両親媒性の分子を意味する。脂質は、ワックス、脂肪、油、ステロール、リン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドを含むがこれらに限定されない。
【００３５】
一般に、油は室温で液体の脂質であり、脂肪は室温で固体の脂質である。
【００３６】
［ワックス］
本明細書では、「ワックス」とは、室温付近で親油性で展延性を有する固体である化合物を意味する。従って、ワックスは、室温において圧縮応力下で非常に変形しやすい。ワックスは、典型的に４０℃より高い融点を有する。
【００３７】
ワックスは、特有のなめらかな光沢を有する溶解可能な油性および粘性の、液体から固体の物質であり、自然由来または合成したものであってもよく、自然材料または合成材料から得ることができる。
【００３８】
ワックスは、非極性溶媒に溶解するが水に溶解しない疎水性または両親媒性の高級アルカンを含む。ワックスは、脂肪酸、アルコール、不飽和結合、芳香族化合物、アミド、ケトン、アルデヒドを含むがこれらに限定されない種々の官能基を含みうる。
【００３９】
具体的には、多くのワックスは、脂肪酸エステルを含む。このようなワックスは、エステル結合によってアルコールと結合した脂肪酸によって形成される。
【００４０】
これに対し、パラフィンロウは、官能基のない長鎖炭化水素の混合物を含むワックスの例である。
【００４１】
［昆虫］
本明細書では、「昆虫」とは、昆虫綱の亜綱である有翅亜綱の動物を意味する。有翅亜綱は、翅を有する全ての昆虫を含む。
【００４２】
より詳細には、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質は、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質を提供するのに適した有翅亜綱に含まれるあらゆる動物から得ることができる。同様に、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質は、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質を含む有翅亜綱に含まれるあらゆる動物のアミノ酸（または初期段階では核酸）に基づく組換えタンパク質として提供されうる。
【００４３】
［組換え］
本明細書では、タンパク質に関して「組換え」という場合は、タンパク質が組換え（例えば、微生物、昆虫、または哺乳類の）発現系に由来するという意味である。
【００４４】
［配列相同性］
本明細書では、「配列相同性」とは、ヌクレオチド、塩基、またはアミノ酸のそれぞれのレベルにおける遺伝子やタンパク質の間の配列の相同性として定義される。具体的には、ＤＮＡとＲＮＡの配列は、ＤＮＡ配列の転写物が同一のＲＮＡ配列に転写されれば同一であると見なされる。
【００４５】
従って、本明細書では、「配列相同性」とは、アミノ酸レベルでのタンパク質の同一性の尺度であり、ヌクレオチドレベルでの核酸の同一性の尺度である。タンパク質の配列相同性は、配列が整列しているときに各配列の所定位置におけるアミノ酸配列を比較することによって判定することができる。同様に、核酸の配列相同性も、配列が整列しているときに各配列の所定位置におけるヌクレオチド配列を比較することによって判定することができる。
【００４６】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の相同性の割合を判定するには、最適な比較のために配列を整列させる（例えば、第２のアミノ酸配列または核酸配列と最適に整列するように、第１のアミノ酸配列または核酸配列にギャップを挿入することができる）。その後、対応するアミノ酸位置または核酸位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合は、その位置において分子は同一である。２つの配列の相同性の割合は、配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重なる位置）×１００）。一実施形態では、２つの配列の長さは同じである。
【００４７】
他の実施形態では、２つの配列の長さは異なり、ギャップは異なる位置として認識される。手動で配列を整列させて、同一のアミノ酸の数を数えることができる。あるいは、相同性の割合を判定するための二つの配列の整列は、数学的なアルゴリズムを用いて行うことができる。このようなアルゴリズムは、１９９０年にアルトシュル等によって開発されたＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。本発明の核酸分子と相同性を有するヌクレオチドアラインメントを得るためのＢＬＡＳＴによるヌクレオチドのサーチは、ＮＢＬＡＳＴプログラムにおいて、スコア＝１００、文字列長さ＝１２で実行することができる。本発明のタンパク質分子と相同性を有するアミノ酸配列を得るためのＢＬＡＳＴによるタンパク質のサーチは、ＸＢＬＡＳＴプログラムにおいて、スコア＝５０、文字列長さ＝３で実行することができる。
【００４８】
比較のためにキャップを含むアラインメントを得るには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。代わりに、繰返しサーチを実行するために、分子の間の遠い関連性を検出するＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用することもできる。ＮＢＬＡＳＴ、ＸＢＬＡＳＴ、およびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメータを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。また、配列相同性は、ＢＬＡＳＴプログラムによってＥＭＢＬデータベース(www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST)内で配列を整列した後に計算することができる。一般に、例えば、「スコアマトリックス」および「ギャップペナルティ」に関するデフォルトの設定をアラインメントに使用してもよい。本明細書では、ＢＬＡＳＴＮおよびＰＳＩ  ＢＬＡＳＴのデフォルト設定が有利でありうる。
【００４９】
２つの配列間の相同性の割合は、上述と同様の技術を使用して判定することができ、ギャップは挿入してもしなくてもよい。相同性の割合を計算するときは、完全な一致のみを数える。従って、本発明の実施形態は、配列にある程度の配列多様性のある配列に関する。
【００５０】
［インビトロ・ナノコーティングの形成方法］
製品の製造に理想的な材料は、必ずしも所望の表面特性を有していない。このような例は、滑りやすい床材、劣化しやすい材料、過度に反射するガラスなどを含む。機能性コーティングは、このような材料の表面特性を変更し、特性の難点を改善するために施すことができる。ナノ構造のコーティングは、減摩性、耐熱性、化学的不活性、自己清浄性、保護効果などの新しい特性を有する製品を設計するために使用されてきた。しかし、このようなナノコーティングの共通点は、過酷な処理を使用して形成され、過酷な処理によって損傷を受けやすい柔らかい物質からなる材料に適合しないことである。
【００５１】
本発明は、過酷な処理によって損傷を受けやすい柔らかい物質からなる材料を含む、全ての種類の表面のためのインビトロ・コーティングのための手段を提供することである。よって、本発明は、生物試薬を使用して穏和な条件で天然または人工の表面に機能性ナノコーティングを形成する単純でかつ安価な方法に関する。
【００５２】
本発明の発明者は、陸生節足動物が角膜の表面に精巧なナノコーティングを有していることに注目した。このようなナノコーティングは、反射防止機能（および潜在的に湿潤防止、殺菌、汚れ除去）を提供し、異なる節足動物でナノスケールの放物状の突起（ニップル）、リッジ、メイズ、くぼみ、またはこれらの形状の種々の変形によって構築される。発明者は、このような知見に基づいて、天然のナノコーティングをインビトロの環境で再現する目的で、このナノコーティングを形成するための主要成分を明らかにすることに着手した。
【００５３】
発明者は、陸生節足動物のナノコーティングが、異なる拡散特性および／または疎水性を有し、拮抗的に作用する２つの化学物質から構成されているという仮設を立てた。ショウジョウバエをモデル昆虫として使用し、角膜タンパク質レチニンと脂質の組合せが天然ナノコーティングの形成に必要な最低限の成分として特定された。昆虫の角質タンパク質も、この点に関してレチニンと同様に機能することがわかった。
【００５４】
発明者は、驚くことに、例えば、レチニンと市販の脂質の混合によって、このようなナノコーティングを人工の面上に再現できることを発見した。この方法は、混合手順を変えることで、異なる機能性を有する多様なナノコーティングを形成するために使用できる。重要なことは、生体模倣のナノコーティングが穏和な条件で形成され、容易に入手可能な天然の試薬を使用することである。
【００５５】
従って、本発明の一態様は、コーティングされた面の形成方法に関し、この方法は、
ｉ．レチニンまたはレチニン様タンパク質を含むタンパク質溶液を用意し、
ｉｉ．１つまたは複数の脂質を含む乳濁液または懸濁液を用意し、
ｉｉｉ．上記タンパク質溶液と、上記乳濁液または懸濁液と、を混合して液体混合物を提供し、
ｉｖ．上記液体混合物を表面に付け、
ｖ．上記表面を乾燥させてコーティングされた面を提供するステップをそれぞれ含む。
【００５６】
本発明の他の態様は、コーティングされた面の形成方法に関し、この方法は、
ｉ．レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質を含むタンパク質溶液を用意し、
ｉｉ．１つまたは複数の脂質を含む乳濁液または懸濁液を用意し、
ｉｉｉ．上記タンパク質溶液と、上記乳濁液または懸濁液と、を混合して液体混合物を提供し、
ｉｖ．上記液体混合物を表面に付け、
ｖ．上記表面を乾燥させてコーティングされた面を提供するステップをそれぞれ含む。
【００５７】
この態様の好適実施形態では、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質は、レチニン、レチニン様タンパク質、および角質タンパク質からなる群から選択されると表現することもできる。好ましくは、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質は、レチニンまたはレチニン様タンパク質である。タンパク質溶液は、これら３種類のタンパク質の混合物を含むこともできる。
【００５８】
角質タンパク質は、自然界の動物相全体にわたってみられ、節足動物（以下では昆虫と称する）の角質タンパク質を含むがこれに限定されない。このようなタンパク質は、昆虫を含む節足動物の外骨格の表面に含まれているので、好ましくは昆虫角質タンパク質とすることができる。
【００５９】
他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質が、節足動物または昆虫に由来し、ワックスなどの脂質に物理的に結合可能である方法に関する。本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質が、分泌シグナルペプチドを含むとともに、または１０ｋＤａ〜３５ｋＤａの範囲の大きさを有する方法に関する。
【００６０】
レチニンは、発現が昆虫の角膜に限定されるタンパク質である。レチニンは、機能性が不明のレチニンＣドメインを有する小昆虫タンパク質の群に含まれる。昆虫は多様な動物の群を含むが、レチニンタンパク質は、今日までにゲノムが配列決定された（例えば、ＥＭＢＬ−ＥＢＩのＰＦＡＭデータベース参照）多くの異なる目の昆虫に含まれていると予測される。
【００６１】
従って、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質が、双翅目に属する昆虫に由来する方法に関する。
【００６２】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、昆虫が、ショウジョウバエ科、カ科、クロバエ科、ノミバエ科、ミバエ科、チョウバエ科、イエバエ科、ユスリカ科、チスイケヨソイカ科、およびグロッシナ科からなる群から選択される科に属する方法に関する。
【００６３】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、昆虫が、ショウジョウバエ属、ハマダラカ属、イエカ属、ヤブカ属、ウェオミヤ属、キンバエ属、メガセリア属、バクトロセラ属、ルツォミヤ属、サシチョウバエ属、イエバエ属、サシバエ属、ウミユスリカ属、チスイケヨソイカ属、ミバエ属、およびグロシナ属からなる群から選択される属に属する方法に関する。
【００６４】
本発明のさらに他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、昆虫は、キイロショウジョウバエ(D. melanogaster)、クロショウジョウバエ(D. virilis)、ヒョウモンショウジョウバエ(D. busckii)、キリシマキノコショウジョウバエ(D. erecta)、オナジショウジョウバエ(D. simulans)、ヤクバショウジョウバエ(D. yakuba)、セイシェルショウジョウバエ(D. sechellia)、ニセウスグロショウジョウバエ(D. pseudoobscura)、アナナスショウジョウバエ(D. ananassae)、ドロソフィラ・ペルシミリス(D. persimilis)、オウトウショウジョウバエ(D. suzukii)、ドロソフィラ・グリムスハウイ(D. grimshawi)、ドロソフィラ・ウィリストニ(D. willistoni)、ドロソフィラ・モヤウェンシス(D. mojavensis)、ドロソフィラ・フィクスピラ(D. ficusphila)、ガンビアハマダラカ(Anopheles gambiae)、アノフェレス・ダルリング(Anopheles darling)、シナハマダラカ(Anopheles sinensis)、アノフェレス・アクアサリス(Anopheles aquasalis)、アノフェレス・アルビマヌス(Anopheles albimanus)、アラビアハマダラカ(Anopheles arabiensis)、アノフェレス・アトロパルウス(Anopheles atroparvus)、アノフェレス・クリステュイ(Anopheles christyi)、アノフェレス・コルッズィイ(Anopheles coluzzii)、アノフェレス・クリキファキエス(Anopheles culicifacies)、アノフェレス・ディルス(Anopheles dirus)、アノフェレス・エピロティクス(Anopheles epiroticus)、アノフェレス・ファラウティ(Anopheles farauti)、アノフェレス・フネストゥス(Anopheles funestus)、アノフェレス・アクラトゥス(Anopheles maculatus)、アノフェレス・メラス(Anopheles melas)、アノフェレス・メルス(Anopheles merus)、コガタハマダラカ(Anopheles minimus)、アノフェレス・クワドリアンヌラトゥス(Anopheles quadriannulatus)、ステフェンスハマダラカ(Anopheles stephensi)、クレクス・クウィンクウェファスキアトゥス(Culex quinquefasciatus)、ネッタイシマカ(Aedes aegipty)、ヒトスジシマカ(Aedes albopictus)、ウィエオミヤ・スミティイ(Wyeomiya smithii)、ルキリア・クプリナ(Lucilia cuprina)、メガセリア・スカラリス(Megaselia scalaris)、バクトロケラ・ククルビタエ(Bactrocera cucurbitae)、バクトロケラ・ラティフロンス(Bactroteca latifrons)、バクトロケラ・ドルサリス(Bactrocera dorsalis)、ルッゾミヤ・ロンギパルシス(Lutzomiya longipalsis)、フレボトムス・パパタシ(Phlebotomus papatasi)、イエバエ(Musca domestica)、サシバエ(Stomoxys calcitrans)、クルニオ・マリヌス(Clunio marinus)、コレトレッラ・アッペンディクラタ(Corethrella appendiculata)、チチュウカイミバエ(Ceratitis capitate)、グロッシナ・ブレウィパルピス(Glossina brevipalpis)、グロッシナ・フスキペス(Glossina fuscipes)、グロッシナ・パッリディペス(Glossina pallidipes)、グロッシナ・パルパリス(Glossina palpalis)、グロッシナ・モルシタンス(Glossina morsitans)およびグロッシナ・アウステニ(Glossina austeni)からなる群から選択される種である方法に関する。
【００６５】
ガンビアハマダラカでは、眼でみつかったタンパク質ＣＰＲ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）が、ナノ構造の形成に関与するレチニン様タンパク質として特定された。本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、昆虫がガンビアハマダラカである方法に関する。
【００６６】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質が、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と、
（ｉｉ）（ｉ）の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列、例えば、（ｉ）の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、から選択されるアミノ酸配列を有する方法に関する。
【００６７】
（ｉｉ）に基づくアミノ酸配列を有するレチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質は、本明細書に記載のナノコーティングを形成する能力を有する。
【００６８】
徹底的に研究された昆虫の属は、ショウジョウバエ属であり、特に、多くの基礎的な調査研究のモデルとなってきたキイロショウジョウバエである。ここでは、ショウジョウバエ属に含まれる種の大きな群のプロテオミクス性質決定によって、レチニンタンパク質を含む、キイロショウジョウバエのタンパク質成分に類似するタンパク質成分が明らかになった。このような発見は、レチニンが種々の昆虫に含まれている重要な構造タンパク質であるという考えを支持する。
【００６９】
従って、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、昆虫がショウジョウバエ属に属する方法に関する。
【００７０】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、昆虫が、キイロショウジョウバエ、クロショウジョウバエ、ヒョウモンショウジョウバエ、キリシマキノコショウジョウバエ、オナジショウジョウバエ、ヤクバショウジョウバエ、セイシェルショウジョウバエ、ニセウスグロショウジョウバエ、アナナスショウジョウバエ、ドロソフィラ・ペルシミリス、オウトウショウジョウバエ、ドロソフィラ・グリムスハウイ、ドロソフィラ・ウィリストニ、ドロソフィラ・モヤウェンシス、およびドロソフィラ・フィクスピラからなる群から選択される種である方法に関する。
【００７１】
本発明の好適実施形態は、本明細書に記載の方法であって、昆虫がキイロショウジョウバエである方法に関する。
【００７２】
ショウジョウバエ属の種では、多数のレチニン様遺伝子が染色体の腕３Ｌの同じ遺伝子座にあり、最近起きた重複イベントを示唆している。ショウジョウバエ遺伝子発現アトラス(FlyAtlas)で入手可能なデータは、この集団において、レチニン様遺伝子が、レチニンが多く発現する眼とは別の組織でも発現することを示している。これらの多くは、レチニンＣドメインをコードし、ＣＧ１３０４４、ＣＧ１３０６２、ＣＧ１３０４０、ＣＧ４９６２、ＣＧ１３０４１、ＣＧ１３０４２、ＣＧ１３０４３、ＣＧ１３０６０、ＣＧ４９８２、およびＣＧ１３０６３を含むがこれらに限定されない。よって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニンまたはレチニン様タンパク質が、ＣＧ１３０４４、ＣＧ１３０６２、ＣＧ１３０４０、ＣＧ４９６２、ＣＧ１３０４１、ＣＧ１３０４２、ＣＧ１３０４３、ＣＧ１３０６０、ＣＧ４９８２、およびＣＧ１３０６３からなる群から選択される方法に関する。
【００７３】
さらに、キイロショウジョウバエでは、タンパク質ＣＧ１３０５９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）がナノ構造の形成に関与するレチニン様タンパク質として特定された。
【００７４】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニンまたはレチニン様タンパク質が、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９と、
（ｉｉ）（ｉ）の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列、例えば、（ｉ）の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、から選択されるアミノ酸配列を有する方法に関する。
【００７５】
（ｉｉ）に基づくアミノ酸配列を有するレチニンまたはレチニン様タンパク質は、本明細書に記載のナノコーティングを形成する能力を有する。
【００７６】
本発明の一態様は、コーティングされた面の形成方法に関し、この方法は、
ｉ．ＣＰＲ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）またはＣＧ１３０５９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を含むタンパク質溶液を用意し、
ｉｉ．１つまたは複数の脂質を含む乳濁液または懸濁液を用意し、
ｉｉｉ．上記タンパク質溶液と上記乳濁液または懸濁液を混合して液体混合物を提供し、
ｉｖ．上記液体混合物を表面に付け、
ｖ．上記表面を乾燥させてコーティングされた面を提供するステップをそれぞれ含む。
【００７７】
本発明の他の態様は、ＣＰＲ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）またはＣＧ１３０５９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）と、１つまたは複数の脂質と、を含むコーティングされた面に関する。
【００７８】
本発明の追加の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質が、有翅亜綱に属する昆虫に由来する方法に関する。
【００７９】
本明細書に記載のように、発明者は、昆虫の角膜ナノ構造の分子機構および構成成分を特定した。ナノコーティングの生物学的成分が与えられた上で、本発明の目的は、角膜型ナノコーティングの製造のための単純で安価なプロトコルを確立することである。
【００８０】
適切な発現系におけるレチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質の組換え発現、および続く組換えタンパク質の精製によって、組換え型のレチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質の比較的大きい生産量を得ることができる。このプロトコルは、大腸菌組換えタンパク質の発現や標準的なＮｉ−ＮＴＡ精製などの周知技術に基づいており、先端的で高額な設備を必要とせずに容易に利用することができる。
【００８１】
従って、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質が、組換え型のレチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質である方法に関する。
【００８２】
同様に、ナノコーティングの第２の成分である脂質は、市販の既製品として比較的安価で購入できる多くの異なる種類のものが容易に入手可能である。よって、本明細書に記載の方法は、（ｉ）プロトコルが一連の混合、洗浄、乾燥のステップに基づいているため単純であり、（ｉｉ）２つの主要な成分が多額の投資を必要とせずに豊富な量で調達できるため安価である。さらに、角膜型ナノコーティングの単純な製法により、エッチングやリトグラフ技術などの従来技術の通常の生産率を超える生産率で、（反射防止）コーティングされた面を高いスループットで生産することが容易になる。
【００８３】
発明者は、理論に縛られることなく、角膜型ナノコーティングの形成におけるレチニンの重要性は、種々の昆虫のレチニンおよびレチニン様タンパク質に共通のレチニンＣドメインに関連しているという仮設を立てた。
【００８４】
従って、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニンまたはレチニン様タンパク質がタンパク質ファミリーのＰＦＡＭデータベースにおいてＰＦ０４５２７と称され、タンパク質のＩｎｔｅｒＰｒｏデータベースにおいて、ＩＰＲ００７６１４と称されるレチニン様ドメインとしても知られている、共通のレチニンＣドメインを含む方法に関する。
【００８５】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニンまたはレチニン様タンパク質が、
ｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、
ｉｉ．（ｉ）の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、から選択されるアミノ酸配列を有する方法に関する。
【００８６】
本発明のさらに他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニンまたはレチニン様タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によって規定されるアミノ酸配列を有する方法に関する。
【００８７】
本発明のさらに他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニンまたはレチニン様タンパク質が、
ｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と、
ｉｉ．（ｉ）の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、から選択されるアミノ酸配列を有する方法に関する。
【００８８】
本発明のまた他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニンまたはレチニン様タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２によって規定されるアミノ酸配列を有する方法に関する。
【００８９】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニンまたはレチニン様タンパク質が、
ｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と、
ｉｉ．（ｉ）の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、から選択されるアミノ酸配列を有する方法に関する。
【００９０】
本発明のさらに他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニンまたはレチニン様タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって規定されるアミノ酸配列を有する方法に関する。
【００９１】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニンまたはレチニン様タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する方法に関する。
【００９２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも８０％の配列相当性を有するアミノ酸配列を有するレチニンまたはレチニン様タンパク質は、本明細書に記載のナノコーティングを形成する能力を有する。
【００９３】
本発明のさらに他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニンまたはレチニン様タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって表されるアミノ酸配列から選択される。
【００９４】
本明細書に記載のナノコーティングは、表面に形成されたナノパターンによって直接得られる特性をコーティングされた面に提供し、このような特性は、例えば、反射防止や湿潤防止などである。しかし、組換え型のレチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質の修飾によって、コーティングされた面に追加の特性を付与することができる。従って、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質の組換え体の製造の前に、所望の機能性を得るためにタンパク質の修飾を設計する設計段階を含むことができる。タンパク質の修飾は、当業者に周知の標準的な分子生物学技術を使用して実行可能である。
【００９５】
よって、本発明の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質が１つまたは複数の修飾を含む方法に関する。
【００９６】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、１つまたは複数の修飾が、蛍光標識、放射性標識、金属捕獲成分、抗体結合部位、酵素結合部位からなる群から選択される方法に関する。
【００９７】
本発明のタンパク質は、本明細書に記載のように、例えば、細菌内での組換え発現によって容易に得られる。ナノコーティングの効率的な形成には、比較的低濃度のタンパク質しか要求されない。材料の消費量が少ないので、コストを最低限に抑えることができる。
【００９８】
よって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、タンパク質溶液におけるレチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質の濃度が、０．１ｍｇ／ｍＬ〜２．０ｍｇ／ｍＬであり、例えば、０．２ｍｇ／ｍＬ〜１．５ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ〜０．８ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ〜０．７ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、０．６ｍｇ／ｍＬである。
【００９９】
タンパク質溶液の溶媒、すなわち、脂質を含む乳濁液、または懸濁液は、好適なナノコーティングを形成するために調整することができる。溶媒は、例えば、ナノコーティングの主要成分の安定性および相互作用を制御するために塩を含みうる。
【０１００】
従って、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、タンパク質溶液および／または乳濁液または懸濁液が水溶液に含まれる方法に関する。
【０１０１】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、水溶液は、生理食塩水などの少なくとも１つの塩を含む溶液である方法に関する。
【０１０２】
本発明のまた他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、水溶液は、ＴＲＩＳ、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、およびＰＩＰＥＳからなる群から選択される緩衝系を含む方法に関する。
【０１０３】
タンパク質と並んで、ナノコーティングを形成する第２の主要成分は脂質である。脂質は、疎水性または両親媒性の分子であり、例えば、ワックス、脂肪、油、ステロール、リン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドを含む。
【０１０４】
よって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、１つまたは複数の脂質が、ワックス、脂肪、油、ステロール、リン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドからなる群から選択される方法に関する。
【０１０５】
多くの脂質の特徴は、脂質に疎水性の性質を少なくとも部分的に付与する１つまたは複数の長い炭素鎖を含むことである。脂質の疎水性は、脂質の溶液における分散およびレチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質との相互作用を決定する。発明者は、理論に縛られることなく、脂質の炭素鎖の長さがナノコーティングの形態、そして潜在的に結果として得られる機能性に影響を与えるという仮設を立てた。
【０１０６】
よって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、１つまたは複数の脂質が、少なくとも１０個の炭素原子、例えば、少なくとも１２個の炭素原子、少なくとも１５個の炭素原子、少なくとも２０個の炭素原子、少なくとも２５個の炭素原子、少なくとも３０個の炭素原子を含む、１つまたは複数の炭素鎖を含む分子である方法に関する。
【０１０７】
ワックスの展延性を有する物質は、非極性溶媒に溶解するが水に溶解しない疎水性または両親媒性の高級アルカンを含む。ワックスは、典型的に官能基を含むあるいは含まない長鎖炭化水素の混合物である。この脂質の群は、本発明のタンパク質と組み合わせた場合に高度に構造化されたナノコーティングを形成する。
【０１０８】
従って、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、１つまたは複数の脂質がワックスである方法に関する。
【０１０９】
ワックスは、多くの原料から得られ、大部分のワックスが市販品として容易に入手できる。
【０１１０】
よって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、ワックスが植物性ワックス、動物性ワックス、石油系ワックス、鉱物系ワックス、および合成ワックスからなる群から選択される方法に関する。
【０１１１】
植物性ワックスは、カルナウバ(carnauba)、クエリクリー(quericury)、ヤシ(palm)、ラフィア(raffia)、ココア(cocoa)、カンデリラ(candelilla)、リンバ(rhimba)、オコクシエラ(ocoxilla)、バナナ(banana)、エスパルト(esparto)、亜麻(flax)、麻(hemp)、綿実(cottonseed)、カポック(kapok)、サトウキビ(sugar cane)、バナブーリーフ(banaboo leaf)、ベーベリー(bayberry)、ウクーバ(ucuhuba)、ジャパン(japan)、カカオバター(cocoa butter)、ファイバー(fiber)、ヨシ(reed)、コダング(godang)、およびブラノフォア(blanophore)のワックスを含むが、これらに限定されない。動物性ワックスは、ラノリン、鯨ろう、ミツロウ、ステアリン酸、シナロウ、およびセラックロウを含むが、これらに限定されない。石油系ワックスは、マイクロクリスタリンワックス、モンタンワックス、およびピートワックスを含むが、これらに限定されない。鉱物系ワックスは、オゾケライト、パラフィン、セレシン、およびペトロラタムを含むが、これらに限定されない。合成ワックスは、脂肪酸、脂肪アルコール、高原子価のアルコールおよび脂肪酸のエステル、グリセロールエステル、グリコールのモノ−およびジ−脂肪酸エステル、水素添加および水素部分添加の脂肪油、およびポリグリコールを含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、ワックスが、カルナウバロウ、ミツロウ、パラフィンワックス、ラノリンワックス、シナロウ、セラックロウ、鯨ろう、ベーベリーワックス、カンデリラワックス、キャスターワックス、エスパルトワックス、ジャパンワックス、オーリクリーワックス、ソイワックス、ククイノキワックス、セレシンワックス、モンタンワックス、オゾケライト、ピートワックス、マイクロクリスタリンワックス、これらの個々の成分および派生物、およびこれらの組合せからなる群から選択される方法に関する。
【０１１３】
本発明の好適実施形態は、本明細書に記載の方法であって、ワックスが、ラノリンワックス、パラフィンワックス、ミツロウ、およびカルナウバロウからなる群から選択される方法に関する。
【０１１４】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、１つまたは複数の脂質が、オリーブ油、グレープシード油、パーム油、ヤシ油、トウモロコシ油、ナタネ油、ゴマ油、ダイズ油、およびヒマワリ油からなる群から選択される油である方法に関する。
【０１１５】
本発明の好適実施形態は、本明細書に記載の方法であって、油がオリーブ油である方法に関する。
【０１１６】
脂肪は、３つの脂肪酸の鎖とグリセロールアルコールのエステルである。従って、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、１つまたは複数の脂質が、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライジン酸、α−リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される脂肪酸を含む脂肪である方法に関する。
【０１１７】
ナノコーティングの形成および最終形態は、種々のプロトコルパラメータの影響を受ける可能性があり、このようなプロトコルパラメータは、均質のナノコーティングを形成するように調整することができる、
【０１１８】
よって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、乳濁液または懸濁液のｐＨが、５〜１１の範囲内、例えば、７〜１０．５、８〜１０、８．５〜９．５であり、好ましくは約９である方法に関する。
【０１１９】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、乳濁液または懸濁液に含まれる脂質の滴が５００ｎｍより小さい直径を有する方法に関する。
【０１２０】
本発明のさらに他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、タンパク質溶液対乳濁液または懸濁液の割合（ｖｏｌ／ｖｏｌ）が、１：１〜１：１０の範囲内、例えば、１：２〜１：５、好ましくは１：３である方法に関する。
【０１２１】
本発明のまた他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、タンパク質溶液５μＬが乳濁液または懸濁液１５μＬと混合される方法に関する。
【０１２２】
本発明のさらに他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、付けることが０〜５０℃の範囲の温度、例えば、１０〜４０℃、１５〜３５℃、２０〜３０℃、好ましくは２５℃の温度で実施される方法に関する。
【０１２３】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、付けることが１０〜９０％の範囲の湿度、例えば、３５〜７５％、４０〜７０％、４５〜６５％、好ましくは５０％の湿度で実施される方法に関する。
【０１２４】
本発明のさらに他の実施形態は、本発明に記載の方法であって、表面を少なくとも５分間乾燥させ、例えば、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、好ましくは約２０分間乾燥させる方法に関する。
【０１２５】
本明細書に記載のプロトコルは、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質と脂質を含む液体混合物が付着可能なあらゆる面への使用に適している。よって、広範囲の材料から形成された製品が本明細書に記載のナノコーティングの恩恵を受けうる。コンタクトレンズ、サングラス、ディスプレイ、およびソーラパネルは、全て反射防止や吸光度などを調整するために光学的コーティングが広く使用される製品の例である。ナノコーティングに適した製品の他の群は、生物学的移植片であり、ナノコーティングは、移植片上におけるインビボ細胞および／または組織の付着、増殖、および分化を規制することができる。細胞および／または組織の付着、増殖、および分化の規制は、表面のナノコーティングおよび適切な研究室プロトコルによってインビトロでも実現することができる。特に、骨や軟骨の細胞および／または組織、並びに種々の種類の幹細胞などの細胞および／または組織の付着、増殖、および分化の規制は、本明細書に記載の方法によって恩恵を受ける用途である。これらの製品には、上述した幅広い材料が使用される。
【０１２６】
よって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、表面がガラス、金属、プラスチック、ポリマー、シリコン、鉱物、紙およびコンクリートからなる群から選択される１つまたは複数の材料から構成される方法に関する。
【０１２７】
本発明の好適実施形態は、本明細書に記載の方法であって、表面がガラスである方法に関する。
【０１２８】
いくつかの用途では、ナノコーティングの成分および対象の面によって、洗浄、乾燥、および表面への材料の付着などの追加の工程を含むようにプロトコルを拡張することが好ましい。
【０１２９】
従って、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、
ｖｉ．表面の洗浄、および
ｖｉｉ．表面の再度の乾燥、の追加のステップをさらに含む方法に関する。
【０１３０】
追加の洗浄／乾燥の利点は、より均質のナノコーティングおよびタンパク質と脂質を含む液体混合物の非結合残留成分の除去を含む。表面の洗浄に使用される溶剤は、好ましくは水またはアルコールなどの水溶性の溶剤である。
【０１３１】
よって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法であって、洗浄の溶剤が、水溶液、エタノール、および極性溶剤からなる群から選択される方法に関する。
【０１３２】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、洗浄に使用される溶剤が水である方法に関する。
【０１３３】
本発明のさらに他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、コーティングされる面に２回以上繰り返し実施される方法に関する。
【０１３４】
本発明のまた他の実施形態は、本明細書に記載の方法であって、乳濁液または懸濁液を含まない液体混合物を使用して繰り返し実施される方法に関する。
【０１３５】
発明者は、驚くべきことに、角膜型ナノコーティングが、単に２つの単純な成分を混合することによってインビトロで再合成できることを発見した。レチニンおよび脂質が、角膜型ナノ構造の形成および多様性を調整する２つの重要な成分である。インビトロ・ナノコーティングは、天然の昆虫ナノコーティングに類似しており、安定性および反射防止や湿潤防止などの機能性の両方を示す。
【０１３６】
従って、本発明の一態様は、コーティングされた面であって、
・レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質を含むタンパク質溶液と、
・１つまたは複数の脂質を含む乳濁液または懸濁液と、
を混合して液体混合物を提供し、
上記面に上記液体混合物を付け、続いて上記面を乾燥させることによって得られるコーティングされた面に関する。
【０１３７】
よって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の方法によって得ること可能なコーティングされた面に関する。本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の方法によって得られるコーティングされた面に関する。
【０１３８】
本発明の他の態様は、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質と、１つまたは複数の脂質と、を含むコーティングされた面に関する。
【０１３９】
レチニンおよび角質タンパク質は、今日までにゲノムが配列決定された双翅目などの多くの異なる目の昆虫に含まれることが予測される。さらに、レチニンは、ショウジョウバエ科の異なる属（例えば、ＥＭＢＬ−ＥＢＩのＰＦＡＭデータベース参照）に広範に含まれている。
【０１４０】
よって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質が、ドロソフィラ属、アノフェレス属、クレクス属、アエデス属、ウィエオミヤ属、ルキリア属、メガセリア属、バクトロケラ属、ルッゾミア属、フレボトムス属、ムスカ属、ストモクスュス属、クルニオ属、コルトレッラ属、ケラティティヌ属、およびグロッシナ属からなる群から選択される属に属する昆虫に由来するコーティングされた面に関する。
【０１４１】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、昆虫がドロソフィラ属に属するコーティングされた面に関する。
【０１４２】
本発明の好適実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、昆虫が、キイロショウジョウバエ、クロショウジョウバエ、ヒョウモンショウジョウバエ、キリシマキノコショウジョウバエ、オナジショウジョウバエ、ヤクバショウジョウバエ、セイシェルショウジョウバエ、ニセウスグロショウジョウバエ、アナナスショウジョウバエ、ドロソフィラ・ペルシミリス、オウトウショウジョウバエ、ドロソフィラ・グリムスハウイ、ドロソフィラ・ウィリストニ、ドロソフィラ・モヤウェンシス、およびドロソフィラ・フィクスピラからなる群から選択される種であるコーティングされた面に関する。
【０１４３】
上述したように、充分な量のタンパク質は、タンパク質の組換え発現によって容易かつ確実に入手できる。充分な量のレチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質を得るために、特定の発現系は必要ない。ここでは、プラスミド発現ベクターを使用して大腸菌でレチニンの発現を例示しているが、当業者であれば他の適切な発現系を代用することができるであろう。タンパク質は、共通のレチニンＣドメイン領域またはタンパク質の他の領域においてある程度の相同性を有するため、組換え発現は汎用性がある。
【０１４４】
従って、本発明の一実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質が、組換え型レチニン、組換え型レチニン様タンパク質、または組換え型角質タンパク質であるコーティングされた面に関する。
【０１４５】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、レチニンまたはレチニン様タンパク質が、
ｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、
ｉｉ．（ｉ）の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、から選択されるアミノ酸配列を有するコーティングされた面に関する。
【０１４６】
本発明のさらに他の実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、レチニンまたはレチニン様タンパク質が、
ｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と、
ｉｉ．（ｉ）の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、から選択されるアミノ酸配列を有するコーティングされた面に関する。
【０１４７】
本発明のまた他の実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、レチニンまたはレチニン様タンパク質が、
ｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と、
ｉｉ．（ｉ）の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、から選択されるアミノ酸配列を有するコーティングされた面に関する。
【０１４８】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、レチニンまたはレチニン様タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも８０％の配列相同性を有する、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するコーティングされた面に関する。
【０１４９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するレチニンまたはレチニン様タンパク質は、本明細書に記載のナノコーティングを形成する能力を有する。
【０１５０】
上述したように、発明者は、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質と拮抗して相互に作用する、角膜型ナノコーティングの第２の成分として脂質を特定した。脂質は、疎水性または両親媒性の分子であり、例えば、ワックス、脂肪、油、ステロール、リン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドを含む。脂質の共通の特性は、長鎖炭化水素を含むことであり、ワックスの部分群は、多くの場合長鎖炭化水素の混合物を含む。
【０１５１】
よって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、１つまたは複数の脂質が、少なくとも１０個の炭素原子、例えば少なくとも１２個の炭素原子、少なくとも１５個の炭素原子、少なくとも２０個の炭素原子、少なくとも２５個の炭素原子、少なくとも３０個の炭素原子をそれぞれ含む１つまたは複数の炭素鎖を含む分子であるコーティングされた面に関する。
【０１５２】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、１つまたは複数の脂質がワックスであるコーティングされた面に関する。
【０１５３】
本発明のさらに他の実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、ワックスが、植物性ワックス、動物性ワックス、石油系ワックス、鉱物系ワックス、および合成ワックスからなる群から選択されるコーティングされた面に関する。
【０１５４】
本発明のまた他の実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、ワックスが、カルナウバロウ、ミツロウ、パラフィンワックス、ラノリンワックス、シナロウ、セラックロウ、鯨ろう、ベーベリーワックス、カンデリラワックス、キャスターワックス、エスパルトワックス、ジャパンワックス、オーリクリーワックス、ソイワックス、ククイノキワックス、セレシンワックス、モンタンワックス、オゾケライト、ピートワックス、マイクロクリスタリンワックス、これらの個々の成分および派生物、およびこれらの組合せからなる群から選択されるコーティングされた面に関する。
【０１５５】
コーティングされる面の材料は、製品の性質に大きく依存する。製品によっては、硬い材料、湾曲した材料、弾性のある材料、または透明な材料を要し、使用される材料が間接的に決定される。本明細書に記載のコーティングされた面は、特定の材料の群には限定されず、ナノコーティングを構成するナノ構造のパターンは、例えば、平らな形状や硬い材料などに制限されうるいくつかの従来のコーティング形成技術に対して、あらゆる材料および形状に形成可能である。
【０１５６】
よって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、表面がガラス、金属、プラスチック、ポリマー、シリコン、鉱物、紙およびコンクリートからなる群から選択される１つまたは複数の材料から構成されるコーティングされた面に関する。
【０１５７】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、レチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質と、１つまたは複数の脂質と、がナノ構造のパターンで設けられているコーティングされた面に関する。
【０１５８】
スループットが高い産業用途のために、天然の面を採取することはできない。本明細書では、複雑でない処理によって容易に形成可能で、かつ高い汎用性で大規模な表面改良を可能とする天然でないコーティングされた面が開示されている。本明細書に記載のナノコーティングは、選択された昆虫の眼の角膜表面に天然に形成される対応するナノコーティングと同じ有利な機能性、例えば、反射防止などを提供する。
【０１５９】
従って、本発明の一実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、上記面が、昆虫の眼の表面でないコーティングされた面に関する。
【０１６０】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、上記面が、昆虫の表面でないコーティングされた面に関する。
【０１６１】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、上記面が、節足動物の表面でないコーティングされた面に関する。
【０１６２】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、上記面が、天然の面でないコーティングされた面に関する。
【０１６３】
ナノコーティングのナノ構造のパターンは、ニップル様突出部のアレイを含む。個々のニップル様ナノ構造は、ニップル様突出部のパッキングの秩序度により、ある閾値において融合して細長いリッジを形成し得る。ナノパターンの形態は、各種のレチニン発現レベルと相関し、ニップル−リッジの種は、ニップルのみの種よりも角膜に含まれるレチニンが非常に多い（図３ｂ参照）。この形態の変化は、得られるナノコーティングの機能性を変更するために使用することができる。
【０１６４】
従って、本発明の一実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、ナノ構造のパターンが、突出部および／またはリッジによって構成されているコーティングされた面に関する。
【０１６５】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、突出部がリッジによって連結されているコーティングされた面に関する。
【０１６６】
本発明のさらに他の実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、突出部の幅が２００〜４００ｎｍであり、突出部の高さが２０〜１００ｎｍであるコーティングされた面に関する。
【０１６７】
例えば、メイズ様、くぼみ状のパターンを含む、他の種類の昆虫角膜型ナノコーティングも開示されている。このようなナノコーティングには、例えば、反射防止などの機能的な役割が与えられている。（ｉ）レチニンまたはレチニン様タンパク質のレベル、（ｉｉ）レチニンまたはレチニン様タンパク質の正確な配列、（ｉｉｉ）混合された脂質の比率および種類、および／または（ｉｖ）正確な混合条件の変更により、本明細書に記載の方法を使用して有用な用途を有する他の天然ナノコーティングもインビトロで再現することができると考えられる。
【０１６８】
ナノコーティングは、１つまたは複数の修飾によってさらに機能を持たせることができる。コーティングされた面の修飾は、ナノコーティングの表面に直接位置および／または付着していてもよいし、ナノコーティングの一部として配置および／または付着していてもよい。よって、修飾は、ナノコーティングの１つの成分の一部、例えば、組換え型のレチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質の一部についてであってもよい。
【０１６９】
よって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、コーティングされた面が、蛍光標識、放射性標識、表面結合金属、抗体、および酵素からなる群から選択される１つまたは複数の修飾をさらに含むコーティングされた面に関する。
【０１７０】
コーティングされた面は、機能性表面を使用する産業において広い適用性を有し、このような機能性表面は、例えば、コンタクトレンズ、ガラス含有面、ディスプレイ、ソーラーパネル、芸術的な絵画、生物学的移植片、および電線で使用される。表面の機能化の要件は、上述の製品の種類の多様性からわかるように異なる要求に基づいている。よって、（ｉ）多様な機能性の組合せを提供するために本技術を改良することができ、（ｉｉ）広範な製品に本技術を適用することができることが重要である。
【０１７１】
従って、本発明の一実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、反射防止、湿潤防止、抗菌性、自己清浄性、防氷、および細胞および／または組織の付着および／または増殖および／または分化の制御からなる群から選択される１つまたは複数の特性を有するコーティングされた面に関する。
【０１７２】
本発明の好適実施形態は、本明細書に記載のコーティングされた面であって、反射防止特性および湿潤防止特性を有するコーティングされた面に関する。
【０１７３】
本明細書で説明する表面ナノコーティングは、骨や軟骨の細胞および／または組織、並びに種々の種類の幹細胞などの細胞および／または組織の付着および／または増殖および／または分化の制御のために使用できる。よって、コーティングされた面は、組織の再生などを容易にするために生物学的移植片に設けたり、人工組織や人工臓器の再建のためのインビトロ組織工学装置の一部としたりすることができる。
【０１７４】
ナノコーティングは、（ｉ）レチニン、レチニン様タンパク質または角質タンパク質および（ｉｉ）脂質の二つの主要成分を含む単純な液体混合物を主材料とする。液体混合物は、コーティングされた面に新たな機能性を与えるように表面に容易に施すことができる。
【０１７５】
従って、本発明の一実施形態は、物体の表面をコーティングするためにレチニン、レチニン様タンパク質、または角質タンパク質と、脂質と、の混合物を使用することに関する。この物体（または製品）は、本明細書に記載のように、ナノコーティングが付着するあらゆる種類の物体とすることができる。好ましくは、物体は、コンタクトレンズまたは生物学的移植片である。
【０１７６】
本発明の形態は、コンタクトレンズ、ガラス含有面、ディスプレイ、ソーラーパネル、芸術的な絵画、生物学的移植片、および電線からなる群から選択されるコーティングされた製品を提供するための、本明細書に記載のコーティングされた面の使用に関する。
【０１７７】
本発明の好適実施形態は、本明細書に記載の使用であって、コーティングされた製品がコンタクトレンズである使用に関する。
【０１７８】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の使用であって、コーティングされた製品が、反射防止、湿潤防止、抗菌性、自己清浄性、防氷、および細胞および／または組織の付着および／または増殖および／または分化の制御からなる群から選択される１つまたは複数の特性を有する使用に関する。
【０１７９】
本発明の好適実施形態は、本明細書に記載の使用であって、コーティングされた製品が反射防止特性を有する使用に関する。
【０１８０】
本発明の１つの態様に関して説明した実施形態および特徴は、本発明の他の態様にも適用されることに留意されたい。
【０１８１】
続いて、以下の限定的でない実施例において本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【０１８２】
［試料の形成方法および分析］
ショウジョウバエの培養および遺伝子操作
この研究では、以下のショウジョウバエの系統が使用された。オレゴンＲ−Ｃ(Oregon R-C)（野生型コントロールとして）、ＧＭＲ−Ｇａｌ４、ｓｐａ−Ｇａｌ４、φＸ−２２Ａ（生殖系の形質転換のため）、ＣＧ１９４２ｆ０３８９６（ストック#18707、アシル転移酵素変異体）−ブルーミントン・ドロソフィラ・ストックセンターより取得、ＵＡＳ−ＲＮＡｉ−Ｃｒｙｓ(37736GD)、ＵＡＳ−ＲＮＡｉ−レチニン(102711KK)、ＵＡＳ−ＲＮＡｉ−Ｃｐｒ７２Ｅｃ(29452GD)、ＵＡＳ−ＲＮＡｉ−ＣＧ２７８１(48139GD)、ＵＡＳ−ＲＮＡｉ−ＣＧ３１５２３(45226GD)、ＵＡＳ−ＲＮＡｉ−ボールドスポット(47521GD)、ＵＡＳ−ＲＮＡｉ−ＣＧ３３１１０(29689GD)、ＵＡＳ−ＲＮＡｉ−ＣＧ５３２６(47681GD)、およびＵＡＳ−ＲＮＡｉ−ＣＧ３１５２２(37329GD)系統−ウィーン・ドロソフィラ・リソースセンターより取得、ＵＡＳ−ＣＧ５３２６（ストック#1245）−ＦｌｙＯＲＦ（チューリッヒＯＲＦｅｏｍｅプロジェクト）より取得。キイロショウジョウバエは、従来のハエ飼畜ガイドラインに沿って２５℃で飼育された。
【０１８３】
レチニンのｃＤＮＡ(DGRC RH08687)は、ＥａｇＩおよびＢｓｐ１２０Ｉ部位で切断され、ｐＵＡＳＴａｔｔＢプラスミドのＮｏｔＩ部位にサブクローニングされ、続いてベクター特異的プライマ、ＧＴＡＡＣＣＡＧＣＡＡＣＣＡＡＧＴＡ（順方向プライマ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）およびＧＴＣＣＡＡＴＴＡＴＧＴＣＡＣＡＣＣ（逆方向プライマ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を使用して、作成された導入遺伝子の配列決定がなされた。コンストラクトは、染色体の腕２ＬにａｔｔＰランディング部位があるφＸ−２２Ａ系統の部位特異的生殖系形質転換を通して、遺伝子導入ＵＡＳ−レチニン系列の作成に使用された。
【０１８４】
次の非キイロショウジョウバエのショウジョウバエのストックである、ニセウスグロショウジョウバエ(ストック#14011-0121.00)、オナジショウジョウバエ(14021-0251.001)、クロショウジョウバエ(15010-1051.00)、キリシマキノコショウジョウバエ(14021-0224.00)、アナナスショウジョウバエ(14024-0371.00)、ドロソフィラ・モヤウェンシス(15081-1352.01)、ヤクバショウジョウバエ(14021-0261.00)、ドロソフィラ・グリムスハウイ(15287-2541.00)、ドロソフィラ・ペルシミリス(14011-0111.01)、セイシェルショウジョウバエ(14021-0248.03)、オウトウショウジョウバエ(14023-0311.00)、ドロソフィラ・ウィリストニ(14030-0811.00)、ヒョウモンショウジョウバエ(13000-0081.00)は、カリフォルニア大学のサンディエゴ・ドロソフィラ・ストックセンターから取得した。
【０１８５】
［角膜および網膜の試料の形成および分析］
角膜および網膜の試料は、切断したショウジョウバエの成体の頭部からメスで眼を切り取ることによって形成した。網膜材料は、固定化した試料から洗浄および非常に優しい細心のスクラッチングによって水滴として除去した。分離後、角膜材料は、さらに水で３回洗浄した。角膜および網膜の試料は、２０個の眼の材料から収集した。これらの試料は、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する前に、試料用緩衝液（62.5mM Tris-HCl pH 6.8; 10%グリセリン; 2% SDS; 1% β-メルカプトエタノール; 微量のブロモフェノールブルー）で１５分間煮沸した。
【０１８６】
［質量分析］
ゲル内のトリプシン消化および質量分析を、コンスタンツ大学（ドイツ）のプロテオミクス施設で行った。非キイロショウジョウバエの種におけるレチニンの特定は、ローザンヌ大学（スイス）のタンパク質分析施設で行った。
【０１８７】
［原子間力顕微鏡観察（ＡＦＭ）］
ＡＦＭでは、上述のように形成された試料を両面テープによってカバーガラスに取り付けた。顕微鏡観察は、ＮＴｅｇｒａ−Ｐｒｉｍａ顕微鏡（ロシア、ゼレノグラード所在のＮＴ−ＭＤＴ社）による、カンチレバーＮＳＧ１１（ＮＴ−ＭＤＴ社）を使用した接触式および半接触式の方法、およびＪＰＫ  ＮａｎｏＷｉｚａｒｄ  ＩＩ（ドイツ、ベルリン所在のＪＰＫ社）による、ＡＣモードでのカンチレバーＴａｐ３００ＡＩ−Ｇ（バジェットセンサー社）(Budget Sensors)を使用した方法によって行った。
【０１８８】
［レチニンの精製およびポリクローナル抗レチニンウサギ抗体の作成］
シグナルペプチドのコード配列（アミノ酸１−２１）を含まない切断レチニン配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を、次のプライマ、ＣＴＧＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＧＡＧＧＡＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＴＧＧＣＣＣＴＣ（順方向プライマ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、およびＣＴＧＴＴＧＡＣＴＣＧＡＧＣＣＴＴＡＧＴＴＧＣＧＧＡＴＧＡＧＡＡＣＣＡＣＴＣＧ（逆方向プライマ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）によって、ｐＵＡＳＴａｔｔＢ−レチニンプラスミドから増殖した。順方向プライマは、レチニンのＮ末端に付与されたＲＧＳＨｉｓタグのコード配列を含む。ＰＣＲ産物は、ｐＥＴ２３ｂのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にサブクローニングし、得られたプラスミドをイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の誘導による組換え発現のために、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉTM（ノバゲン社）(Novagen)の大腸菌株に形質転換した。菌体は、フレンチプレス（コンスタントシステムズ社）(Constant Systems LTD)によって溶解された。ＲＧＳＨｉｓ−レチニンタンパク質は、製造者の推奨に従って、ＨｉｓＰｕｒTMＮｉ−ＮＴＡ樹脂（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）(ThermoFisher scientific)を使用して精製され、ユーロジェンテックＳ．Ａ．社（Eurogentec S.A.）（ベルギー、スラン、リェージュ・サイエンスパーク所在）のポリクローナル抗レチニンウサギ抗血清を形成するために使用された。ウエスタンブロットで、抗レチニン抗血清を１：２００に希釈して使用した。α−チューブリンの抗体(GTX102079、ルツェルン−ケム社(Lucerna-chem))がローディング・コントロールを調べるために使用された。コントロール実験でＲＧＳＨｉｓタグレチニンを特定するために、α−ＲＧＳＨｉｓタグ(QIAexpress、キアゲン社(QIAGEN))の抗体が使用された。
【実施例２】
【０１８９】
［インビトロ・ナノコーティングの主要成分としてレチニンを特定］
野生型のキイロショウジョウバエの成体の角膜と網膜の試料を個別に作成した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、ショウジョウバエの角膜には豊富に含まれるが下に位置する網膜には豊富に含まれない主要なタンパク質バンドが特定された（図２ａ、図２ｄ）。質量分析によって、これらのバンドで次の主要タンパク質、クリスタリン（Ｃｒｙｓ）、角質タンパク質７２Ｅｃ（Ｃｐｒ７２Ｅｃ）、およびレチニンに対応するペプチドが特定された。約２５ｋＤａで遊走するレチニン（予測分子量（ＭＷ）＝２０．０ｋＤａ）が、ロワーバンドで見られた主要タンパク質であったが、分析された他のバンドではＣｒｙｓ（予測ＭＷ＝５５．９ｋＤａ）およびＣｐｒ７２Ｅｃ（予測ＭＷ＝５０．６ｋＤａ）のペプチドが主要なシグナルを提供し、角膜におけるこれらのタンパク質の広い架橋結合および試料作成時における部分的な分解が示唆された（図２ｄ）。これらの試料で確認された微量タンパク質は、アルコール脱水素酵素、エノラーゼ、およびトリオースリン酸イソメラーゼなどの特定の代謝酵素、並びに下に位置する網膜相から混入したタンパク質に対応する。眼の表面に存在する代謝酵素は、腐敗および発酵した果物を主食とするショウジョウバエであるキイロショウジョウバエの生態への適応によるかもしれないが、Ｃｒｙｓ（ドロソクリスタリンとも称される）、Ｃｐｒ７２Ｅｃ、およびレチニンは構造タンパク質である。
【０１９０】
これらの角膜タンパク質がナノコーティングの形成に貢献する可能性を分析するために、ショウジョウバエ遺伝学を用いて、対応するＵＡＳ−ＲＮＡｉコンストラクトを操作するためにＧＭＲ−Ｇａｌ４を使用して、昆虫の眼に含まれるタンパク質を１つずつ下方制御した。変異した角質のＡＦＭ分析により、レチニンの下方制御によって引き起こされたナノ構造における顕著な欠陥が明らかになった（図２ｅ〜図２ｈ）一方で、ＣｒｙｓおよびＣｐｒ７２Ｅｃの下方制御によってもたらされた形質はより軽度のものであった（図２ｆ〜図２ｈ）。レチニンの下方制御の程度を評価するために、このタンパク質に対する抗体を作成し、レチニン−標的ＲＮＡｉコンストラクトの眼に限定された発現時におけるレチニンのレベルの大きな減少を確認した（図２ｉ）。
【０１９１】
［結論］
データにより、昆虫角膜ナノ構造の主要タンパク質成分としてレチニンが特定され、レチニンの下方制御は、ナノ構造の形成に重大な欠陥を引き起こすことがわかった。
【実施例３】
【０１９２】
［ショウジョウバエ属の角膜ナノ構造の秩序およびパターン形成においてレチニンが中心的な役割を果たしている］
ショウジョウバエの異なる種において、タンパク質発現レベルと角膜ナノパターンを相関させることによって、ナノ構造の形成におけるレチニンの役割を調べた。レチニンの重要性を評価するために、他の１３種のショウジョウバエの角膜のプロテオミクス性質決定を行い、タンパク質組成がキイロショウジョウバエと類似することを明らかにした。
【０１９３】
ショウジョウバエ属の１４種の角膜型ナノコーティングのＡＦＭ分析によって、この昆虫群に存在する２つの主な形式のナノコーティングが明らかになった。これらは、キイロショウジョウバエのように単体ニップル型ナノ構造を有するものと、このようなナノ構造が部分的にリッジに融合するものであり、前者は、クロショウジョウバエ、ヒョウモンショウジョウバエ、キリシマキノコショウジョウバエ、オナジショウジョウバエ、ヤクバショウジョウバエ、およびセイシェルショウジョウバエにも見られ、後者は、ニセウスグロショウジョウバエ、アナナスショウジョウバエ、ドロソフィラ・ペルシミリス、オウトウショウジョウバエ、ドロソフィラ・グリムスハウイ、およびドロソフィラ・ウィリストニに見られた（図３ａ、図３ｂ）。ニップル−リッジの種がニップルのみの種（図３ｂ）よりもかなり多くのレチニンを含むため、これらの種では、形態学的な種とレチニンの発現レベルとの間に強い相関性があった（図３ｂ）。また、レチニン発現レベルと個別のナノ構造のパッキングの秩序度との間に相関性があった。
【０１９４】
［結論］
実験により、キイロショウジョウバエだけでなく、ショウジョウバエ属全体において、レチニンが昆虫角膜ナノ構造の形成で重要な役割を果たすことが実証された。データは、レチニンのレベルが結果的に生じるナノパターンに影響を与えることを示し、混合方法を変更することによって多様なナノコーティングの形成が可能であるという考えを支持する。
【実施例４】
【０１９５】
［インビトロ・ナノコーティングの主要成分として脂質を特定］
ナノ構造パターンの潜在的な第２のモルフォゲンを特定するために、発明者はショウジョウバエ角膜におけるワックス生合成経路にターゲットを絞った。
【０１９６】
ワックス生合成経路の特性は、これまで節足動物では明らかにされていない。まず、哺乳類のワックス合成経路における２つの酵素、（ｉ）長鎖脂肪酸を極長鎖脂肪酸に転換する伸長酵素と、（ｉｉ）長鎖アシル−ＣｏＡと長鎖アルコールから長鎖エステルワックスを作るアシル転移酵素（図４ａ）、のショウジョウバエ相同体を調べた。頭部組織または／および特に眼において、伸長酵素の６つのショウジョウバエ相同体が高い発現レベルで特定され、これらは、５つの機能未知の遺伝子(CG2781、CG31523、CG31522、CG33110、CG5326)と周知の遺伝子(CG3971ボールズスポット(Baldspot))である。ＧＭＲ−Ｇａｌ４ドライバを使用したＲＮＡｉが媒介する眼の各遺伝子の下方制御により、レチニンの過剰発現と同様にＣＧ５３２６のノックダウンが単体のニップルのリッジへの融合を誘発し、他の伸長酵素相同体のロックダウンはこのような融合を誘発しないことが明らかになった（図４ｂ）。相反して、ｓｐａ−Ｇａｌ４によるＣＧ５３２６の過剰発現は、レチニンのノックダウンと同様にニップルの印象的な縮小を誘発した（図４ｃ）。ナノ構造形態は、図４ｆ〜図４ｇおよび図４ｈで数量化されている。よって、ＣＧ５３２６は、哺乳類の伸長酵素のショウジョウバエのオルソログとして機能し、昆虫角膜ナノ構造の形成に明らかに影響を及ぼす。
【０１９７】
哺乳類のワックス生合成経路の第２の酵素については、ショウジョウバエＣＧ１９４２が哺乳類のアシル転移酵素（長鎖アルコールＯ−脂肪酸アシル転移酵素ＡＷＡＴ１およびＡＷＡＴ２）の唯一のオルソログとして特定された。注目すべきことに、この機能未知の遺伝子の機能喪失型の変異は、ＣＧ５３２６の下方制御やレチニンの過剰発現と同様に、ニップル−リッジ形質転換（図４ｅ）を誘発した。
【０１９８】
［結論］
データは、脂質がナノ構造パターンの第２のモルフォゲンということができ、少なくとも昆虫角膜ナノ構造の形成において少なくとも重要な役割を果たすことを示す。
【実施例５】
【０１９９】
［レチニンと異なる脂質によるインビトロ・ナノコーティングの形成］
インビトロ・ナノコーティングを形成する可能性は、一方で、組換えによって作成されたレチニンまたは同様の大きさの無関係のタンパク質であるＤｈｉｔをコントロールとして使用し、他方で、市販のワックスの組合せ（ラノリン、パラフィン、ミツロウ、およびカルナウバ）を使用して、最初にドットブロットアッセイによって検証された。これにより、細菌による組換えレチニンの低コスト製造のロバスト生産ラインが確立された（実施例１参照）。組換えレチニンは、清浄な溶解性タンパク質として作成される。
【０２００】
［ワックス乳濁液の作成］
各ワックス４ｇ（パラフィン、ミツロウ、カルナウバロウ＃１（アルドリッチ・ケミストリー社(Aldrich chemistry)およびラノリン（シグマ社）(Sigma)）が１０％ＳＤＳ溶液を４０ｍｌ含む異なる管に加えられ、水浴(AL 04-04、アドバンテージ−ラボ社(Advantage-Lab))で２時間にわたって８０℃で超音波処理された。２４時間にわたって２５℃で保温後、ワックスのナノ液滴を豊富に含む上部をＰＢＳ溶液で１０倍に希釈し、４８時間にわたって２５℃で保温した。５００ｎｍより大きいワックスの液滴を豊富に含むこの溶液の上部は捨てた。６００ｎｍの波長において溶液の光学濃度が０．５ＡＥに達するまで、最下部を約１０倍のＰＢＳに溶解させた。これらの乳濁液は、２５℃で安定していた。
【０２０１】
［レチニンタンパク質とワックスとの特異的な相互作用の特定］
各ワックス乳濁液を３μｌ含む液滴を５０℃でニトロセルロース上で乾燥させ、３．５％の無脂肪乳粉末溶液を含むＰＢＳで一晩ブロッキングした。このステップの後、ニトロセルロースを２つの部分に分け、第１の部分をレチニン（１．２μｇ／ｍｌ）を加えた３．５％の無脂肪乳粉末溶液を含むＰＢＳで１時間保温し、第２の部分をＤｈｉｔタンパク質（１．２μｇ／ｍｌ）を加えた３．５％の無脂肪乳粉末溶液を含むＰＢＳで１時間保温した。両方の部分は、ＰＢＳによって３回洗浄し、３．５％の無脂肪乳粉末溶液を含むＰＢＳで１時間ブロッキングした。その後、ウエスタンブロットの標準的プロトコルをα−ＲＧＳＨｉｓタグ(QIAexpress、キアゲン社)の抗体と共に使用した。
【０２０２】
ドットブロットアッセイは、コントロールタンパク質Ｄｈｉｔがワックスと相互作用する能力を有しておらず、一方で、レチニンはワックスと非常に効率的に結合し（図５ａ）、明白な物理的相互作用を示すことを立証した。
【０２０３】
インビトロで角膜ナノ構造を再合成するために、組換えレチニンおよび市販のワックスを混合した。驚くことに、２つの成分をガラス面に層状に設けると規則正しいナノコーティング（図５ｄ）が形成された一方で、レチニン単独（図５ｃ）またはワックス単独（図５ｅ）だと効果がなかった。規則正しいナノコーティングがレチニンと脂質の混合によって形成可能であるという知見は、レチニンをパラフィンまたはミツロウと混合することによって確認された（図５ｆ）。種々の脂質によって形成されるナノコーティングの他の例は、図５ｇに記載されてる（左から右に、オリーブ油、ラノリンワックス、パラフィン、ミツロウ、カルナウバロウ）。さらに、非レチニン様分子であるＢＳＡとカルナウバロウとの混合は、レチニンとカルナウバロウを混合した場合（図５ｈ、右）に比べて、結果として規則正しいナノコーティングを形成しなかった（図５ｈ、左側）。
【０２０４】
インビトロ・ナノコーティングの効率的な形成を可能にする例示的なプロトコルは、以下の通りである。レチニン溶液（０．６ｍｇ／ｍｌ）５μｌと、カルナウバロウ乳濁液（ｐＨ＝９．０）１５μｌと、を含む混合溶液を、カバーガラスの１ｃｍ２の範囲に均一に施し、（湿度５０〜６０％で）２０分以内に乾燥させ、水ですすぎ、再度乾燥させる。続いて、レチニン溶液２０μｌを先にコーティングした面に均一に施し、乾燥させ、水ですすぎ、再度乾燥させる。結果として、典型的な寸法が約幅２００ｎｍ、高さ５０ｎｍのナノ構造（図５ｄ）を有するナノコーティングが得られた。これらの寸法は、元のショウジョウバエ角膜型ナノコーティングと同等である（図１）。
【０２０５】
［結論］
実験は、組換えレチニンと脂質のみを使用してインビトロ・ナノコーティングの形成が可能であえることを立証する。
【実施例６】
【０２０６】
［インビトロ・ナノコーティングの機能性］
ナノコーティングの有利な特性を検証した。特に、反射率および水和性を以下のように調べた。
【０２０７】
［反射率の測定］
ＪＡＳＣＯ  ＭＳＶ−３７０ミクロ分光光度計、すなわち非分散形シュワルツシルド対物レンズおよび開口部を反射ジオメトリで使用して、対象領域を３００×３００μｍの領域に設定した。スペクトル領域は、ＵＶスペクトル（３００ｎｍ）から赤外線（７５０ｎｍ）までである。データは、２つの試料の間のスペクトル比（Ｒ（対象）／Ｒ（ガラス））を可視化するために使用された。
【０２０８】
［水和性の検証］
測定は、デジカメを使用して行った。水５μｌの液滴を試料面の上に配置し、Ｇｗｙｄｄｉｏｎソフトウェアを使用して画像を取り込んで分析した。接触角は、液滴の両側から測定した。
【０２０９】
インビトロ・ナノコーティングは、視距離にわたる反射防止機能（図６ａ）、および湿潤防止機能（図６ｂ）の両方を有していた。
【０２１０】
［結論］
この実験は、インビトロ・ナノコーティングが、反射防止や湿潤防止などの有利な特性を有しており、天然または人工の面に新たな特性を付与するためにこれらの面に施すことができることを示す。さらに、インビトロ・ナノコーティングは、他の既存のナノコーティングに比べていくつもの追加の利点を有する。これは、図９に概略的に示されている。
【実施例７】
【０２１１】
［インビトロ・ナノコーティング形成のためのパラメータの検証］
方法とインビトロ・ナノコーティングプロトコルの汎用性を検証するために、ｉ）ワックスの種類、ｉｉ）レチニン／ワックス比、ｉｉｉ）洗浄前の保温時間、ｉｖ）保温温度などのパラメータが変更された（図７）。
【０２１２】
ＴＢＳに混ぜたレチニン溶液（０．６ｍｇ／ｍｌ）と、異なる比率（図７ａ〜図７ｃ）のワックス乳濁液と、の混合溶液２０μｌをカバーガラスの１ｃｍ２の範囲に均等に施して２０分間（５０〜６０％の湿度で）乾燥させ、水で洗浄して再度乾燥させた。いくつかの実験では、間に洗浄ステップを挟んで（図７ｇ〜図７ｌ）または間に洗浄ステップを挟まないで（図７ｆ）、このプロトコルを２回（図７ｆ、図７ｇ、図７ｉ〜図７ｌ）または３回（図７ｈ）繰り返した。レチニン溶液と異なるワックス乳濁液（ラノリン（ｉ）、ミツロウ（ｊ）、パラフィン（ｋ）、またはカルナウバロウ（ｌ））との混合物を使用した。すべてのプロトコルによって、再合成インビトロ・ナノコーティングが形成された。
【０２１３】
［結論］
この実験は、異なる用途で有用な適切に再合成された多様なパターンを形成するために、異なるプロトコル（例えば、異なる比率、洗浄するか否か、１回、２回、または３回の反復回数、または異なるワックス）が使用可能であることを示す。
【実施例８】
【０２１４】
［レチニンとオリーブ油の混合によるインビトロ・ナノコーティングの形成］
インビトロ・ナノコーティングが多様な脂質を使用して形成可能であることを確認するためにオリーブ油の乳濁液を含むナノコーティングを形成した（図８）。オリーブ油は、耕作法、産地、抽出法などによって変動する一分類の脂肪酸のトリグリセリドエステルの混合物から構成される。主な脂肪酸はオレイン酸であり、相当量のリノール酸とパルミチン酸も含まれる。オリーブ油の他の成分は、当業者であればわかるであろう。
【０２１５】
レチニン溶液（０．６ｍｇ／ｍｌ）１５μｌと、オリーブ油乳濁液（ｐＨ＝９）５μｌの混合溶液をカバーグラスの１ｃｍ２の範囲に均等に施し、２０分間以内に（５０〜６０％の湿度で）乾燥させ、水で洗浄して再度乾燥させた。第２のステップでは、同じ溶液をこの面に均等に施し、乾燥させて、水で洗浄し、再度乾燥させた。この工程によって、再合成インビトロ・ナノコーティング（図８）が形成された。
【０２１６】
［結論］
この実験は、インビトロ・ナノコーティングが、ここではオリーブ油として例示された、多様な脂質から形成可能であることを示す。
【実施例９】
【０２１７】
［他のタンパク質を用いたインビトロ・ナノコーティングの形成］
多様なタンパク質を使用してインビトロ・ナノコーティングを形成できることを確認するために、ＣＧ１３０５９およびＣＰＲ１０を含むナノコーティングを形成した（図１０）。ＣＧ１３０５９は、キイロショウジョウバエに含まれるタンパク質であり、ＣＰＲ１０は、ガンビアハマダラカに含まれるタンパク質である（図１０ａ〜図１０ｂ）。
【０２１８】
ＰＢＳのタンパク質溶液（０．６ｍｇ／ｍｌ）と、異なる比率のラノリン乳濁液（ＣＧ１３０５９では３：１７；ＣＰＲ１０では１：１）と、の混合溶液２０μｌをカバーガラスの１ｃｍ２の範囲に均等に施して２０分間（５０〜６０％の湿度で）乾燥させ、水で洗浄し、再度乾燥させた。この工程によって、再合成されたインビトロ・ナノコーティングが形成された（図１０ｄ〜図１０ｅ）。ＣＰＲ１０とラノリンワックスによって形成されたインビトロ・ナノコーティングは、信頼性の高い反射防止性能を示した（図１０ｃ）。
【０２１９】
［結論］
この実験は、ＣＧ１３０５９およびＣＰＲ１０として例示した、角質タンパク質を含む多様なタンパク質からインビトロ・ナノコーティングを形成することができることを示す。
【図１】
2021525727.tif 000003
【図２ａ−ｈ】
2021525727.tif 000004
【図２ｉ】
2021525727.tif 000005
【図３ａ−ｂ】
2021525727.tif 000006
【図３ｃ】
2021525727.tif 000007
【図４ａ−ｇ】
2021525727.tif 000008
【図４ｈ】
2021525727.tif 000009
【図５ａ−ｅ】
2021525727.tif 000010
【図５ｆ−ｈ】
2021525727.tif 000011
【図６ａ−ｂ】
2021525727.tif 000012
【図７ａ−ｌ】
2021525727.tif 000013
【図８】
2021525727.tif 000014
【図９】
2021525727.tif 000015
【図１０ａ−ｅ】
2021525727.tif 000016
【国際調査報告】
2021525727.tif 000017
2021525727.tif 000018
2021525727.tif 000019
2021525727.tif 000020