(57)【要約】  インドキシル硫酸、タンパク質結合尿毒症毒素、単離された抗体及び／又はその抗原結合断片をコード化する単離されたポリヌクレオチドセグメントを特異的認識する単離されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び／又はその抗原結合断片、及びこのような単離された抗‐ＩＳ  ｍＡｂ及び／又はその抗原結合断片のＩＳ関連疾患の治療診断に適用される免疫測定方法、デバイス組成物、及び薬物組成物の作成への用途に関する。
2021523694.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
相補性決定領域（ＣＤＲ）‐Ｈ１、ＣＤＲ‐Ｈ２及びＣＤＲ‐Ｈ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、
可変領域ＣＤＲ‐Ｌ１、ＣＤＲ‐Ｌ２及びＣＤＲ‐Ｌ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、
を備え、
ＣＤＲのアミノ酸配列は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ１、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ２、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ３、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ１、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ２、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ３の１つ又は複数の配列を含む単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記単離された抗体及び／又はその断片は、全長免疫グロブリン分子、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変断片（Ｆｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、多特異的結合分子、又は単離されたヒト、キメラ、ヒト化、合成、組換え抗体及び／又はその抗原結合断片の如何なる組み合わせである請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片。
【請求項３】
体外表面表示システムから、前記単離されたモノクローナル抗体及び／又はその断片を選別する請求項１〜２の何れか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記単離された抗体及び／又はその断片は、化学的に修飾され又は薬学的に許容可能な担体と混合される請求項１〜３の何れか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片を含み、被験者から収集した生物試料におけるインドキシル硫酸を検出し又はその濃度を確定するインドキシル硫酸の検出用の免疫測定法。
【請求項６】
前記生物試料は、血液、血清、血漿、腹水、尿及び生検標本を含む請求項５に記載の免疫測定法。
【請求項７】
前記生物試料は、アルブミンを含む請求項５に記載の免疫測定法。
【請求項８】
請求項１〜４の何れか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片を含むインドキシル硫酸の除去用のデバイス組成物。
【請求項９】
前記単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片は、固相に共役される請求項８に記載のインドキシル硫酸の除去用のデバイス組成物。
【請求項１０】
請求項１〜４の何れか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片を含む被験者におけるインドキシル硫酸の除去又は低減用の薬物組成物。
【請求項１１】
単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片に組み合わせられた医療用吸着剤を更に含む請求項１０に記載の前記被験者におけるインドキシル硫酸の除去又は低減用の薬物組成物。
【請求項１２】
前記医療用吸着剤は、活性炭吸着剤を含む請求項１１に記載の前記被験者におけるインドキシル硫酸の除去又は低減用の薬物組成物。
【請求項１３】
抗インドキシル硫酸の単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合断片をコード化する単離されたポリヌクレオチドセグメントにおいて、前記単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合断片は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示すＶＨドメイン、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示すＶＬドメインの１つ又は複数のポリペプチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドセグメント。
【請求項１４】
抗インドキシル硫酸の単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合断片をコード化する単離されたポリヌクレオチドセグメントにおいて、前記単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合断片は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ１、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ２、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ３、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ１、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ２、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ３の１つ又は複数のポリペプチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドセグメント。
【請求項１５】
エピトープ、及びＬ‐トリプトファン、インドール及び３‐インドール酢酸以外のインドキシル硫酸に対するスキャッチャード結合親和力を有する単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１８年４月１８日に出願された米国仮出願第６２/６５９,２５６号からの優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、尿毒症毒素、インドキシル硫酸（ＩＳ）に対して特異性を持つ抗原結合断片を公開し、より具体的に、ＩＳの特異的認識用の単離されたモノクローナル抗体及び／又は抗原結合断片及びそれらのＩＳ関連疾患の治療診断への用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
尿毒症は、多種の尿毒症毒素が生体内での病的蓄積を特徴とし、且つこのような衰弱性病症により永続的な腎機能喪失を引き起こし、次第にＣＫＤの各段階まで進展し、最終的に生命にかかわる末期腎疾患（ＥＳＲＤ）になる。尿毒症患者は、更に、神経系、消化系、循環系及び骨格系に関わる様々な臨床徴候及び症状（１）を有する。尿毒症及びそれに起因する合併症は、一般的に、透析治療（血液透析及び腹膜透析を含む）により制御されるが、患者が腎不全を発症する場合、電解質がひどく異常となり且つ廃物がすでに危険の程度に溜まるので、患者は、生き続けるために腎移植が必要である。しかしながら、このような治療の選択は、ドナー腎臓の不足、手術関連の死亡リスク及び後での器官拒絶の予防に必要な終生免疫抑制により制限される。
【０００４】
数百種の潜在的な尿毒症毒素が同定されている。前記尿毒症毒素は、それらの物理化学的特性又はそれらの透析における行為によって、（ａ）水溶性の、非タンパク結合性の小化合物（分子量<３００Ｄ、例えば、尿素）、（ｂ）主にペプチドであり、分子量が３００Ｄ〜１２０００Ｄである大きな中分子、及び（ｃ）タンパク質に結合される小化合物という３つの種類に大まかに分けられる（２）。血清タンパク質（例えば、アルブミン）との結合により、これらのタンパク質に結合される化合物の透析クリアランスが制限される。そのため、血液透析を受けた患者において、これらの毒素の平均レベルが次第に累積して正常レベルの１０倍及び２０倍まで達することもある。
【０００５】
ＩＳ及びｐ-クレゾール硫酸塩（ＰＣＳ）は、アルブミンに結合される２つの原型の毒素であり、且つ何れも食物由来のトリプトファン及びチロシンが胃腸管における細菌叢によって発酵されたものである。いくつの群によると、ＣＫＤ患者の一方でのＩＳ及びＰＣＳの血清レベルと他方での全死亡率及び心血管疾患（ＣＶＤ）との間に、病理学的関連性があることが判明される。そのため、ＩＳ及びＰＣＳは、腎機能及び疾患進展を予測するバイオマーカーだけではなく、治療的取扱いのターゲットである可能性もある（３、４）。
【０００６】
ＡＳＴ‐１２０（Ｋｒｅｍｅｚｉｎ、Ｋｕｒｅｈａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ,Ｔｏｋｙｏ,Ｊａｐａｎ）は、経口投与される球形吸着炭であり、様々な小分子の尿毒症毒素を吸着することができる。それは、腸でＩＳの前駆体であるインドールを吸収することで、ＩＳの生合成を抑制する。そのため、血清及び尿におけるＩＳ濃度を間接的に減少させる（５）。ＡＳＴ‐１２０のＣＫＤ進展に対する緩徐化効果を証明するために、前向き無作為化臨床研究を複数回実行したが、まとめて言えば、ＡＳＴ‐１２０を中等度から重度のＣＫＤに罹患している患者に加えるという標準的療法の利益は、これらの試験によるデータによりサポートされない（６、７）。
【０００７】
ＩＳ検出及び測定の分析化学的方法（例えば、液体クロマトグラフ質量分析スペクトル（ＬＣ‐ＭＳ）及び高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ））は、高コストの装置、複雑な試料調製、大試料量を要求するため、大量の生物試料の計測に使用するには適さない（８）。それに対して、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、実行が簡単で、且つ試薬が比較的安価である。複雑な試料前処理を行うことでＥＬＩＳＡ操作を自動的に行うことができるようにして、より精確且つ再現可能な結果、より速い応答時間及びより少ない労働コストを提供する。ＨｏｓｈｉらによりＩＳを定量測定可能な競合的ＥＬＩＳＡ方法が開発されたが、前記方法に用いられるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）９Ａ２Ｆ６の結合活性はウシ又はヒトの血清アルブミンにより抑制される（９、１０）。試料の脱タンパク質化は、実験手順を実行する前に特に好ましく又は要求されることであり、これにより、前記分野の実験室又は産業上の利用可能性に損傷を与える可能性がある。
【０００８】
以上をまとめると、本分野において最近進歩があるが、定性的または定量的免疫測定を改善するための方法が相変わらず実質的に必要とされ、単離された抗ＩＳ  ｍＡｂはなければならない機能性成分である。その同時に、前記免疫測定の実行は、分析される生物試料から一般的に発見される血漿タンパク質（特にアルブミン）に敏感ではない。ＩＳ関連疾患を治療するように被験者からＩＳを効果的に除去するための方法が依然として望まれている。これらの方法は、被験者に有効量の単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを投与し、又は単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを物理的支持体にカップリングすることで、生物試料におけるＩＳを前記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂに互いに接触させるように捕捉及び除去することを含む。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の一態様は、ＩＳに特異的結合され、且つ代替的に「抗ＩＳ  ｍＡｂ」と呼ばれる単離されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び／又はその抗原結合断片を提供する。
【００１０】
さらに、本発明の別の態様は、前述のように、単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片の一部または全部を含む多重特異性結合分子を提供する。
【００１１】
また、インドキシル硫酸を検出して、被験者から収集した生物試料におけるインドキシル硫酸の濃度を確定するための免疫測定法を提供する。
【００１２】
また、インドキシル硫酸を除去するデバイス組成物を提供する。
【００１３】
また、被験者からインドキシル硫酸を除去する薬物組成物を提供する。
【００１４】
また、前述のように、インドキシル硫酸を認識する、単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合断片をコード化するポリヌクレオチドセグメントを提供する。
【００１５】
また、本発明の別の態様は、エピトープ、及びＬ‐トリプトファン、インドール及び３‐インドール酢酸以外のインドキシル硫酸に対するスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）結合親和力を有する単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片を提供する。
【００１６】
前記態様に鑑みて、本発明は、単離されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び／又はその抗原結合断片を提供する。前記単離されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び／又はその抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、を含む。ＶＨドメインは相補性決定領域（ＣＤＲ）‐Ｈ１、ＣＤＲ‐Ｈ２及びＣＤＲ‐Ｈ３を含むが、ＶＬドメインは可変領域ＣＤＲ‐Ｌ１、ＣＤＲ‐Ｌ２及びＣＤＲ‐Ｌ３を含む。一実施形態において、ＣＤＲのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の何れかから選ばれてよいＣＤＲ‐Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の何れかから選ばれてよいＣＤＲ‐Ｈ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の何れかから選ばれてよいＣＤＲ‐Ｈ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の何れかから選ばれてよいＣＤＲ‐Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の何れかから選ばれてよいＣＤＲ‐Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の何れかから選ばれてよいＣＤＲ‐Ｌ３の１つ又は複数の配列を含む。
【００１７】
一実施形態において、単離されたモノクローナル抗体及び/又はその抗原結合断片は、全長免疫グロブリン分子、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変断片（Ｆｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、多特異的結合分子、又は単離されたヒト、キメラ、ヒト化、合成、組換え抗体及び／又はその抗原結合断片の如何なる組み合わせである。
【００１８】
一実施形態において、単離されたモノクローナル抗体及び／又はその断片は、体外表面表示システムから選別できる。
【００１９】
一実施形態において、単離された抗体及び／又はその断片は、化学的に修飾され又は薬学的に許容可能な担体と混合され得る。
【００２０】
他の態様に鑑みて、本発明は、前述のような単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片の一部または全部を含む多特異的結合分子をさらに提供する。
【００２１】
一実施形態において、多特異的結合分子はインドキシル硫酸と特異的に結合する。
【００２２】
他の態様に鑑みて、本発明は、前記のような単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片を含み、被験者から収集した生物試料におけるインドキシル硫酸濃度を確定するインドキシル硫酸の検出用の免疫測定法をさらに提供する。
【００２３】
一実施形態において、生物試料は、血液、血清、血漿、腹水、尿及び生検標本を含む。
【００２４】
一実施形態において、生物試料は、アルブミンを含む。
【００２５】
他の態様に鑑みて、本発明は、前記のような単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片を含む、インドキシル硫酸を除去するデバイス組成物をさらに提供する。
【００２６】
一実施形態において、単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片は、固相に共役される。
【００２７】
他の態様に鑑みて、本発明は、前記のような単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片を含む、被験者におけるインドキシル硫酸の除去又は低減用の薬物組成物をさらに提供する。
【００２８】
一実施形態において、単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片に組み合わせられた医療用吸着剤をさらに含む。
【００２９】
一実施形態において、医療用吸着剤は活性炭吸着剤を含む。
【００３０】
他の態様に鑑みて、本発明は、抗インドキシル硫酸の単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合断片をコード化する単離されたポリヌクレオチドセグメントをさらに提供し、単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合断片は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの１つ又は複数のポリペプチド配列を含む。一実施形態において、ＶＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４として示され、ＶＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９として示される。
【００３１】
他の態様に鑑みて、本発明は、インドキシル硫酸を認識する単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合断片をコード化する単離されたポリヌクレオチドセグメントをさらに提供する。一実施形態において、単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ２、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ３の１つ又は複数のポリペプチド配列を含む。
【００３２】
他の態様に鑑みて、本発明は、更に、エピトープ、及びＬ‐トリプトファン、インドール及び３‐インドール酢酸以外のインドキシル硫酸に対するスキャッチャード結合親和力を有する単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片を提供する。
【００３３】
上記単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片を適用すると、前記単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片がＩＳを特異的認識するので、アルブミンの存在下でのＩＳの検出の感度及びダイナミックレンジの表現が優れ、これにより、様々な用途に用いられることができ、例えば、インドキシル硫酸の検出用の免疫測定法、インドキシル硫酸を除去するデバイス組成物、被験者からインドキシル硫酸を除去する薬物組成物、抗インドキシル硫酸の単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合断片をコード化する単離されたポリヌクレオチドセグメント及びエピトープ及びＬ‐トリプトファン、インドール及び３‐インドール酢酸等以外のインドキシル硫酸に対するスキャッチャード結合親和力を有する単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片に用いられることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
本公開は、下記添付図面を参照して実施形態の下記の詳細な説明を読むことで、より十分に理解される。
【図１Ａ】幾つかの単離された抗ＩＳモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＬＧ３０３のＩＳ‐ＢＳＡに対する滴定曲線を示す。
【図１Ｂ】幾つかの単離された抗ＩＳモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＬＧ３３２のＩＳ‐ＢＳＡに対する滴定曲線を示す。
【図２Ａ】異なる濃度のＩＳの存在下で、幾つかの単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ  ＬＧ３０３及びＬＧ３３２のＩＳ‐ＢＳＡに対するＢ／Ｂ％を表す棒グラフを示す。
【図２Ｂ】異なる濃度のＬ‐トリプトファンの存在下で、幾つかの単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ  ＬＧ３０３及びＬＧ３３２のＩＳ‐ＢＳＡに対するＢ／Ｂ％を表す棒グラフを示す。
【図２Ｃ】異なる濃度のインドールの存在下で、幾つかの単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ  ＬＧ３０３及びＬＧ３３２のＩＳ‐ＢＳＡに対するＢ／Ｂ％を表す棒グラフを示す。
【図２Ｄ】異なる濃度の３‐インドール酢酸の存在下で、幾つかの単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ  ＬＧ３０３及びＬＧ３３２のＩＳ‐ＢＳＡに対するＢ／Ｂ％を表す棒グラフを示す。
【図３】競合ＥＬＩＳＡで単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ  ＬＧ３３２のブランク限界（ＬｏＢ）及び検出限界（ＬｏＤ）を表す標準曲線を示し、連続した濃度のＩＳでＬＧ３３２のＬｏＤ及びＬｏＢを検査する。
【図４】ＣＫＤ動物モデルの実験対策に対するフロー図を示す。
【図５Ａ】テスト動物の腎臓切片のヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）により染色された組織学画像を示す。
【図５Ｂ】テスト動物の心臓切片のヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）により染色された組織学画像を示す。
【図６】コラーゲンを検出するためのテスト動物の腎臓及び心臓切片のシリウスレッドで染色された組織学画像を示す。
【図７】コラーゲンＩＶ型抗体を使用するテスト動物の腎臓及び心臓切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）画像を示す。
【図８】α‐平滑筋アクチン（α‐ＳＭＡ）抗体によって繊維化増大領域を検出するテスト動物の腎臓及び心臓切片のＩＨＣ画像を示す。
【図９】Ｍ３０抗体によって細胞アポトーシスイベントを検出するテスト動物の腎臓及び心臓切片のＩＨＣ画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の実施形態は、以下の詳細な説明により明らかになり、添付図面に合わせて前記詳細な説明を行い、同じ添付図面の符号は同じ素子に関連する。
【００３６】
本明細書で引用される全ての刊行物も、それぞれ個々の刊行物または特許出願が特異的かつ個別に参照により組み入れられると示された場合と同じ程度に参照により本明細書に組み入れられるものとする。組み込まれた参考文献における用語の定義または使用が、本明細書中で提供されるその語の定義と矛盾するかまたは反対である場合、本明細書中で提供されるその語の定義が適用され、参考文献中のその語の定義は適用されない。
【００３７】
本明細書を解釈するために、下記定義が適用され、適当である時に、単数形で用いた用語は複数形を含み、その逆も可能である。詳細な説明全体において、別の定義が述べられる。
【００３８】
本明細書に用いられるように、上下文で不適切ではない限り、「一」、「１つ」、「当該」及び「前記」という用語は、「１つ又は複数の」を表し且つ複数を含むように定義される。
【００３９】
本発明は、慢性腎不全疾患（ＣＫＤ）患者の合併症の尿毒症の診断及び治療におけるタンパク質結合尿毒症毒素であるインドキシル硫酸（ＩＳ）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び／又は断片による検出及び取り除く方法を公開する。診断上の使用については、生物試料におけるＩＳを定性的及び定量的検出するための免疫測定法を提供する。被験者の体内で循環するＩＳを効果的に除去するために、前記被験者に有効用量の抗ＩＳ  ｍＡｂを投与すること、生物試料を抗ＩＳ  ｍＡｂに共役される固相支持体を通過させてＩＳを吸収すること、の２つの対策を採用する。前記生物試料は、血液、血清、血漿、腹水、尿、生検標本等であってよい。被験者から収集したそれらの生物試料が一般的に多種の血漿タンパク質を含むため、上記抗ＩＳ  ｍＡｂの結合活性の性能は、如何なる血漿タンパク質、特に最も豊富なアルブミンにより干渉されるべきではない。ＩＳがＣＫＤ及びいくつかの他の腎臓病を悪化させると考えられるが、本発明の適用は腎臓病学に限定されない。
【００４０】
「被験者」の用語は、ヒト及び非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類及び爬虫類を含む。別記しない限り、「患者」又は「被験者」の用語は、本明細書で交換可能に使用される。
【００４１】
「核酸」の用語は、本明細書において「ポリヌクレオチド」の用語と交換可能に使用され、且つ一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びその重合体を指す。この用語は、合成、天然、及び非天然であり、参照核酸と類似な結合特性を有し、且つ参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される既知のヌクレオチド類似体又は修飾骨格残基又は連結を含有する核酸を含む。このような類似体の例示としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２‐Ｏ‐メチルリボヌクレオチド、ペプチド‐核酸（ＰＮＡ）を含んでよいが、それらに限定されない。
【００４２】
別記しない限り、特定の核酸配列は、明示された配列だけではなく、更に、その保存的修飾された変異体（例えば、縮重コドンの置換）及び相補的配列をも黙示的に含む。具体的に、下記のように、縮重コドンの置換は、１つ又は複数の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基により置換される配列の生成によって達成されることができる。
【００４３】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」の用語は、本明細書で交換可能に使用され、アミノ酸残基の重合体を指すことに用いられる。前記用語は、天然に存在するアミノ酸重合体及び非天然に存在するアミノ酸重合体にだけではなく、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸重合体にも適用される。別記しない限り、特定のポリペプチド配列は、更に、その保存的修飾された変異体を黙示的に含む。
【００４４】
「抗体」の用語とは、完全型免疫グロブリン分子又はその機能的断片である。天然に存在する抗体は、普通、一般的に少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び少なくとも２つの軽（Ｌ）鎖から構成されるテトラマーを含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記する）及び重鎖定常領域からなり、前記重鎖定常領域は一般的に３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）から構成される。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブタイプ）、ＩｇＭ及びＩｇＥを含む任意のアイソタイプであってよい。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。軽鎖は、κ鎖及びλ鎖を含む。ＶＨドメインとＶＬドメインとの組み合わせは一般的に抗原認識を担当し、ＣＨドメインは免疫グロブリンと宿主組織又は因子の結合を媒介することができ、前記宿主組織又は因子は免疫システムの様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む。ＶＨ及びＶＬドメインは、更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域、及びフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的である領域に細分されることができ、前記ＣＤＲと前記ＦＲとは散在して組み入れられる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からアルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と互いに作用する結合ドメインを含む。
【００４５】
「抗体断片」又は「その特異的結合断片」の用語とは、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、Ｆ（ａｂ'）2断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片及びジスルフィド連結したＦｖ断片、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）2（又は二量体抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）とも呼ばれる）、（ｓｃＦｖ）3（又は三量体抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）とも呼ばれる）、（ｓｃＦｖ）4（又は四量体抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）とも呼ばれる）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ミニ抗体、ナノ抗体、及び各抗体断片からなる多重特異性抗体を含む、完全な抗体の構造の全体又は一部であってよい。また、抗体及び／又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗原結合断片からなる多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体又はマウス抗体を指してもよい。
【００４６】
本明細書に用いられるような「抗体薬物複合体（ＡＤＣ）」又は「免疫複合体」の用語とは、抗体又はその抗原結合断片と別の試薬（例えば、化学治療剤、毒素、免疫治療剤、画像化プローブ等）との連結である。連結基は、共有結合、又は例えば、静電力による非共有の相互作用であってよい。抗体薬物複合体を形成するために、本分野の既知の様々なリンカーを使用してよい。また、抗体薬物複合体は、免疫複合体コードするポリヌクレオチドから発現可能な融合タンパク質の形態によって提供されてよい。本明細書で用いられるように、「融合タンパク質」とは、各々のタンパク質（ペプチド及びポリペプチドを含む）を最初にコード化する２つ以上の遺伝子又は遺伝子断片の結合により発生するタンパク質である。融合遺伝子の翻訳により、各元のタンパク質からの機能特性を有する単一タンパク質が発生する。
【００４７】
「単離された」の用語とは、免疫グロブリン、抗体又はポリヌクレオチドが具体的な状況に応じて自然に発生する可能性のある物理環境と異なる物理環境に存在することである。
【００４８】
「エピトープ」又は「抗原決定基部位」は、抗原分子の一部であり、抗体の抗原結合ドメインとの特異性相互作用を担当する。抗原結合ドメインは、１つ又は複数の抗体可変ドメインによって提供されてよい。複数回の組換え及び選別作業によってｍＡｂの単離されたＶＨドメイン及びＶＬドメインから機能的抗原結合性断片を単離させることができる。
【００４９】
「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の用語は、抗体における可変鎖の限定部分であり、前記限定部分において、これらの分子はそれらの特異性抗原に結合される。本公開において、重鎖におけるＣＤＲ領域は一般的にＣＤＲ‐Ｈ１、ＣＤＲ‐Ｈ２及びＣＤＲ‐Ｈ３と呼ばれるが、軽鎖におけるＣＤＲ領域は一般的にＣＤＲ‐Ｌ１、ＣＤＲ‐Ｌ２及びＣＤＲ‐Ｌ３と呼ばれる。それらは、アミノ末端からアルボキシ末端への方向で順に番号付けされる。
【００５０】
本明細書で用いられるように、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」の用語とは、単一分子組成物の抗体分子の製剤である。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和力を表す。
【００５１】
単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片とは、ｃＤＮＡ由来、組換えＲＮＡ由来又は如何なる他の合成由来又はこれらの由来のある組み合わせにより発生するタンパク質又はペプチド、及びこのようなタンパク質及びポリペプチドであり、前記タンパク質及びポリペプチドはその由来又は誘導供給源により、（１）自然界に存在するタンパク質に付随していなく、（２）同じ起源の他のタンパク質を含まなく、例えば、ネズミ類のタンパク質を含まなく、（３）様々な種由来の細胞により発現され、又は（４）自然界に存在しない。
【００５２】
本明細書における「抗ＩＳ  ｍＡｂ」は、特異的結合ＩＳの抗体形態及び／又は断片を表す一般用語である。
【００５３】
また、本発明は、更に、単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ及び／又はその断片の発生方法を提供する。また、上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂは、ＬＧ３０３及びＬＧ３３２の２つの単離されたｍＡｂとして例示され、前記ＬＧ３０３及びＬＧ３３２はそれぞれそれらを分泌する２つのハイブリドーマ細胞株で名付けされる。
【００５４】
また、本発明は、更に、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変（ＶＬ）ドメインから構成される上記抗ＩＳ  ｍＡｂの可変ドメインをコード化するポリヌクレオチド配列を提供する。例えば、抗体ＶＨドメインのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５並びに抗体ＶＬドメインのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０は、それぞれＬＧ３０３及びＬＧ３３２に対応する。
【００５５】
本発明は、更に、上記ポリヌクレオチド配列から翻訳されるアミノ酸配列を提供する。例えば、抗体ＶＨドメインのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４並びに抗体ＶＬドメインのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９は、それぞれＬＧ３０３及びＬＧ３３２に対応する。更に、上記抗体のＶＨドメイン内の相補性決定領域（ＣＤＲ）‐Ｈ１、ＣＤＲ‐Ｈ２及びＣＤＲ‐Ｈ３並びにＶＬドメイン内のＣＤＲ‐Ｌ１、ＣＤＲ‐Ｌ２及びＣＤＲ‐Ｌ３も同定される。
【００５６】
１つの具体的な実施形態において、上記ＣＤＲのＬＧ３０３及びＬＧ３３２に対応するアミノ酸配列については、下記で説明する。それらは、ＣＤＲ‐Ｈ１のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＣＤＲ‐Ｈ２のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＣＤＲ‐Ｈ３のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＣＤＲ‐Ｌ１のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＣＤＲ‐Ｌ２のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＣＤＲ‐Ｌ３のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８である。
【００５７】
「配列同一性百分率」又は「同源性」の用語は、最大の配列同一性百分率を達成させて保存された核酸置換を取り除くするように配列をアラインしてギャップを導入（必要がある場合）した後の、候補配列における参照配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドと同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドの百分率と定義される。手動以外、本分野で知られる局所相同性アルゴリズム又はこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ  Ｐ）によって、比較される配列の最適アラインメントを発生させてもよい。
【００５８】
また、配列表に、下記ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を列記する。
【００５９】
また、本発明は、更に、ＩＳ関連疾患の診断試薬として上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを使用する方法を提供する。
【００６０】
また、本発明は、更に、ＩＳ関連疾患の治療試薬として上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを使用する方法を提供する。
【００６１】
また、本発明は、更に、体外生体液を浄化するためのＩＳ置換試薬として上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを使用する方法を提供する。
【００６２】
また、本発明は、更に、免疫測定法、デバイス組成物又は薬物組成物に上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを使用する方法を提供する。
【００６３】
また、本発明は、更に、前記免疫測定法、デバイス組成物及び薬物組成物の開発方法を提供する。
【００６４】
また、本発明は、更に、生物試料におけるＩＳを定性的及び定量的検出するための上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを含む免疫測定法を提供する。
【００６５】
また、本発明は、更に、上記免疫測定法によってＩＳ関連疾患を診断する方法を提供する。
【００６６】
また、本発明は、更に、被験者のＩＳを体外除去し、又は被験者の生体液の尿毒症の負担を減らすための上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを含むデバイス組成物を提供する。
【００６７】
また、本発明は、更に、有効量の上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを含む薬物組成物を投与することでＩＳを除去し又は尿毒症の負担を減らす方法を提供する。
【００６８】
一実施形態において、上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを免疫測定法又はデバイス組成物に用いる場合、前記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを物理的支持用の固相と共役させてよい。
【００６９】
一実施形態において、前記薬物組成物は、ＣＫＤに付随する腎不全又はＣＶＤのリスクを軽減する必要のある被験者に用いられてよい。
【００７０】
一実施形態において、前記薬物組成物は、経口投与の球形吸着炭、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）、アンジオテンシン受容体遮断剤（ＡＲＢ）及び活性ビタミンＤである他の薬物に組み合わせて使用されてよい。
【００７１】
本明細書に用いられる「デバイス組成物」の用語とは、特定のデバイスで達成するための組成物である。一実施形態において、前記デバイス組成物は、血液透析又は血漿交換システムに結合されてＣＫＤに付随する腎不全又はＣＶＤのリスクを軽減する必要のある被験者に用いられてよい。
【００７２】
一実施形態において、前記デバイス組成物は、第１の浄化画分及び第２の浄化画分に分けられる体外血液を浄化するための装置に結合されてよい。タンパク質に結合される毒素及び／又は血漿に溶解される毒素を除去することで、第２の浄化画分を発生させる。
【００７３】
一実施形態において、測定される生物試料（又は流体）は、血液、血清、血漿、腹水、尿及び生検標本を含む。
【００７４】
一実施形態において、測定される生物試料は、血漿タンパク質、つまりアルブミンを含む。
【００７５】
本公開によるある例示的な実施形態は下記の通りであるが、これらの実施形態は本発明に対する制限として考えられるべきではない。本発明の精神や範囲から逸脱せずに、当業者は、様々な修正や改変を加えることができる。
ＩＳの特異的結合用の組成物
【００７６】
本公開の一実施形態によると、ＩＳ結合分子を提供する。前記実施形態において、結合分子は、ＩＳの特異的認識／結合が可能な単離されたｍＡｂ及び／又はその抗原結合断片（以下、「抗ＩＳ  ｍＡｂ」と呼ばれる）であってよい。前記抗ＩＳ  ｍＡｂは、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み、前記ＶＨドメインは相補性決定領域（ＣＤＲ）‐Ｈ１、ＣＤＲ‐Ｈ２及びＣＤＲ‐Ｈ３を含み、且つ前記ＶＬドメインは可変領域ＣＤＲ‐Ｌ１、ＣＤＲ‐Ｌ２及びＣＤＲ‐Ｌ３を含む。ＣＤＲのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ２、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ３のような配列の１つ又は複数の配列を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、抗ＩＳ  ｍＡｂのＶＨドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４であり、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％（又はその間の如何なる百分率）の同一性を有するように示す如何なる配列であってよい。同様に、いくつかの実施形態において、抗ＩＳ  ｍＡｂのＶＬドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９であり、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％（又はその間の如何なる百分率）の同一性を有するように示す如何なる配列であってよい。
ＩＳの検出や定量及び臨床診断用の免疫測定法
【００７８】
「免疫測定法」の用語とは、試料における分析物を検出する方法であり、前記方法は、試料を前記分析物に特異的結合される抗体に接触させること、及び前記抗体と前記分析物との結合を検出することを含む。本明細書に記載の免疫測定法は、ｍＡｂによる抗原‐抗体反応を利用する様々なタイプの免疫学又は生物学的診断技術に適用されてよい。このような測定方法は、放射免疫測定、免疫組織化学測定、インサイチュハイブリダイゼーション測定、競合結合測定、ウェスタンブロッティング分析及びＥＬＩＳＡ測定を含むが、それらに限定されない。また、このような測定技術は、（ａ）蛍光抗体又は化学的染色方法の使用、前記方法においてｍＡｂと抗原との連結の存在が視覚観察されるように、ｍＡｂは色素（例えば、蛍光色素）で標識され、（ｂ）蛍光色素の代わりに酵素を使用してｍＡｂを標識する酵素‐抗体方法、（ｃ）タンパクで標識された二次抗体によって抗原等の量を計測するＥＬＩＳＡ方法、（ｄ）ｍＡｂを同位体標識する放射免疫測定方法、及び（ｅ）抗原‐抗体反応による凝集反応を利用する免疫沈降法を含む。
【００７９】
本発明は、正常及び異常なレベルの確定を含む、生物試料におけるＩＳレベルを検出するための定量又は定性的免疫測定法に関する。ある実施形態において、生物試料は、血液、血清、血漿、腹水、尿、生検標本等であってよい。また、血漿タンパク質（つまりアルブミン）の存在下で生物試料を分析してよい。別の実施形態において、本発明の提供する免疫測定法は、上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを含み、且つ被験者から収集した生物試料の濃度によって推定される疾患又は疾病の診断に用いられることができる。前記生理病理学的状態又は臨床症状の一例示としては、尿毒症又はＣＫＤであってよい。
ＩＳ除去用のデバイス組成物
【００８０】
本公開の一実施形態によると、ＩＳの除去又は低減用のデバイス組成物を提供する。いくつかの実施形態において、上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを物理的支持用の固相と共役させ、前記固相は、例えば、アガロース、ガラス、プラスチック又は磁性樹脂ビーズ、透析膜及び中空繊維管である。また、単離された抗ＩＳ  ｍＡｂに共役した透析膜又は中空繊維管は、血液透析又は血漿交換システムに結合されてよい。
【００８１】
米国特許第８２０６５９１  Ｂ２号には、患者血液におけるアルブミンに結合される尿毒症毒素の除去方法が説明される。前記方法は、アルブミンに結合される尿毒症毒素が置換物質により置換されるように、置換物質を血液に導入することを含む。その後、血液が患者に戻る前に、体外の腎代替処理によって結合されていない尿毒症毒素を除去する。置換物質は、例えば、上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂである。前記方法は、経口投与の球形吸着炭、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）、アンジオテンシン受容体遮断剤（ＡＲＢ）及び活性ビタミンＤの他の薬物に組み合わせて使用されることが推奨される。
【００８２】
より具体的な実施形態において、還元的アミノ化反応を実行することで抗ＩＳ  ｍＡｂをアガロースビーズにカップリングさせ、ｍＡｂの共役されたビーズを空カラムに充填してＩＳ除去カラムを形成する。蠕動ポンプによって生体液を前記ＩＳ除去カラムを２回通過させる。未処理及び処理された血漿試料に対して定量的な質量スペクトル分析（液体クロマトグラフィ／タンデム質量分析、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ）を行って、ＩＳ除去率を評価する。ＩＳ除去率の百分率（％）は、（[ＩＳ、未処理]- [ＩＳ、既処理]）／[ＩＳ、未処理]×１００％から計算される。
被験者におけるＩＳの除去又は低減用の薬物組成物
【００８３】
本公開の一実施形態によると、被験者におけるＩＳを除去又は低減するための薬物組成物を提供する。抗ＩＳ  ｍＡｂの投与用量及びスケジュールは、ＩＳ関連疾患を治療する臨床分野における当業者により容易に確定されてよい。１種以上の適用において、所望の結果を取得するように、所望の用量を投与してよい。本発明の実施形態による薬物組成物は、単位剤形として提供されてよい。薬物組成物は、投与するための如何なる好適な薬理学的担体で投与されてよい。前記薬物組成物は、ヒト又は動物の患者において尿毒症の病症の予防、緩和、防護又は治愈を達成可能な如何なる形態として投与されてもよい。本発明の実施形態によって使用するために、単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤、及び活性成分としての単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ及び／又はその断片を含む薬物組成物として提供してよい。前記組成物は、ＩＳの細胞毒性又は尿毒症毒素の細胞生物学的受容体への天然結合に拮抗（完全に又は部分的に）する十分量の抗ＩＳ  ｍＡｂを含んでおり、例えば、患者におけるこのような拮抗を要求するアニオントランスポーター（ＯＡＴ）（１０）又は炭化水素受容体（ＡｈＲ）（１１）である。薬物組成物は、上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂの少なくとも１つの単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを含んでよい。また、前記薬物組成物は、経口投与の球形吸着炭、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＲＢ）及び活性ビタミンＤの他の薬物に組み合わせて組み合わせて使用されてよい。いくつかの実践において、前記薬物は、例えば、ＡＳＴ‐１２０のような活性炭吸収剤であってよい。
単離された抗ＩＳ  ｍＡｂの可変領域のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列
【００８４】
本公開の一実施形態によると、更に、上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ及び／又はその抗原結合断片をコード化するポリヌクレオチド配列又はセグメントを提供する。いくつかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のＶＨドメインをコード化するポリヌクレオチド配列とは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すＤＮＡ配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％（又はその間の如何なる百分率）の同一性を共有する如何なるポリヌクレオチド配列である。その同時に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のＶＬドメインをコード化するポリヌクレオチド配列とは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示すＤＮＡ配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％（又はその間の如何なる百分率）の同一性を共有する如何なるポリヌクレオチド配列である。
【００８５】
或いは、前記実施形態の単離された核酸において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のＶＨドメインをコード化するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示す配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％（又はその間の如何なる百分率）の同一性を有するように示す如何なるヌクレオチド配列を含む。その同時に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のＶＬドメインをコード化する核酸断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示す配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％（又はその間の如何なる百分率）の同一性を有するように示す如何なるヌクレオチド配列を含む。
【００８６】
前記実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、前記のようなアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチド配列と基本的に同一である。基本的に同一である配列は、サイレント変異された配列を含む、誘発された配列を含んでもよい。変異は、１つ又は複数のヌクレオチド残基の変更、１つ又は複数のヌクレオチド残基の欠失、又は１つ又は複数の追加ヌクレオチド残基の挿入を含んでよい。核酸コドンの縮重により、基本的に同一である配列は、更に、本明細書の公開したアミノ酸配列における如何なる特定のアミノ酸の位置で同一のアミノ酸をコード化する様々なヌクレオチド配列を含んでよい。抗ＩＳ  ｍＡｂ及び／又はその抗原結合断片をコード化するポリヌクレオチド配列は、本分野における如何なる既知の方法によって取得されてよい。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知されるものであれば、化学合成されたオリゴヌクレオチドから前記抗体をコード化したポリヌクレオチドを組み立ててよい。これは、例えば、抗体をコード化する配列部分を含む重複するオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニール及び連結、及びその後のＰＣＲによる連結されるオリゴヌクレオチドの増幅に関する（１２）。
【００８７】
一般的に、抗ＩＳ  ｍＡｂ及び／又はその抗原結合断片をコード化するポリヌクレオチド配列は発現担体に組換えられてよく、前記発現担体において前記ポリヌクレオチド配列はオープンリーディングフレームのセグメントであってよい。いくつかの実践において、上記実施形態で提供されるように、発現担体を被験者又は宿主細胞に導入してＩＳを特異的認識するタンパク質生産物を発生させる。より詳しくは、前記実施形態のポリヌクレオチドセグメントは組換えＤＮＡ又はＲＮＡであり、且ついくつかの状況において、前記ポリヌクレオチドセグメントは非コード調節素子又は内含子によって単離されてよい。好ましくは、単離された核酸は、ｃＤＮＡ分子である。ｓｃＦｖ遺伝子を作成するために、コード化されたＶＨ及びＶＬのＤＮＡ断片を例えば、コード化されたアミノ酸配列（Ｇｌｙ４‐Ｓｅｒ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）の断片のような別のコード化された可撓性リンカーの断片に操作可能に連結して、ＶＨ配列及びＶＬ配列が連続した単鎖タンパクとして発現できるようにし、ＶＬ領域とＶＨ領域は前記可撓性リンカーによって共役される。ファージディスプレイ技術によって取得した抗体については、ライブラリーの様々なファージクローンからコード化された上記実施形態により提供される抗ＩＳ抗体の単離された核酸（１３）を回収することができる。公開されたポリヌクレオチドは、例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、又は前記抗体を発現する如何なる組織又は細胞から（例えば、発現抗体の選択されたハイブリドーマ細胞から）単離されたｃＤＮＡライブラリーのような如何なる他の好適な核酸供給源から発生してもよい。
【００８８】
いくつかの実施形態において、公開された如何なるポリヌクレオチド配列を発現担体に組み込んで、所望のプロモータの制御で発現してよい。様々なヒト及び動物細胞タイプに発現するための好適な担体は、本分野で既知される。好適な宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ピキアパストリス、ＳＦ９、大腸菌ＢＬ２１及び／又は他のヒト又は非ヒト細胞株を含んでよいが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、培養される細胞が発現担体における前記核酸を発現するたびに、一時的に又は安定的に発現するにも拘らず、本明細書では抗ＩＳ  ｍＡｂ及び／又はその抗原結合断片の発生方法を公開する。
５／６腎摘除（５／６  Ｎｘ）ラットの慢性腎不全疾患（ＣＫＤ）のモデル及び治療
【００８９】
片側尿管閉塞（ＵＵＯ）、ドキソルビシン（ＡＤＲ）腎臓病及び５／６  Ｎｘは、ＣＫＤの代表的な動物モデルである。ＵＵＯモデルは、尿細管を迅速且つ完全的に閉塞して、炎症性浸潤、尿細管細胞のアポトーシス、筋線維芽細胞（線維芽細胞）の活性化、フィブロネクチン及びＩ型コラーゲンの沈着を含む異なる病理学的病期及び繊維化の間の特徴を示す。ＡＤＲ腎臓病は、現在ヒト糸球体疾患の常用のシミュレーションモデルであり、顕性アルブミン尿、尿細管円柱、尿細管崩壊、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ、進行性巣状分節性硬化とも呼ばれる）及び糸球体硬化症、重度の腎間質及び炎症の形成を特徴とする。５／６  Ｎｘモデルは、動脈高血圧症、タンパク尿及び糸球体硬化症を特徴とする。これらの利用可能な実験モデルにおいて、ラットの５／６  Ｎｘは、進行性腎疾患の研究に最も一般的に用いられる。これは、前記実験手順の特徴は、ヒトで観察されたＣＫＤに共通するからである。５／６  Ｎｘは、新しい療法をテストするためにも作成され、臨床に関連していると証明された（１４、１５）。
【００９０】
よくＣＫＤと病理学的に関連する尿細管間質線維症は、持続的炎症性浸潤、細胞骨格タンパクα‐平滑筋アクチン（α‐ＳＭＡ）を発現する筋線維芽細胞の出現に伴う間葉細胞の数の増大、尿細管萎縮及び上皮細胞のアポトーシス、傍尿細管毛細血管の完全な破壊、及び細胞外基質（ＥＣＭ）の溜まりを含む多くの共通特徴を示す（１６）。正常な腎臓において、異なるコラーゲン分子の発生は、区画化されたものであり、尿細管上皮細胞（ＴＥＣ）はＩＶ型コラーゲンを発生させる主要な細胞であり、常駐型線維芽細胞はＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンを発生させる。尿細管間質線維症では、ＥＣＭの拡張は間質コラーゲンの溜まりをマーカーとし、且つ常駐型線維芽細胞はα-ＳＭＡ陽性の筋線維芽細胞に分化転換する。また、一般的に糸球体及び尿細管基底膜に位置するＩＶ型コラーゲンの発現は制限されないようになり、且つ間質にも観察される。カスパーゼ切断サイトケラチン１８（Ｍ３０）の領域差異は、前記サイトケラチンが近位尿細管細胞から放出されて、且つ有足細胞が５／６  Ｎｘラットの腎障害により誘導されるアポトーシスを経過するため、治療スケジュールの薬力学的バイオマーカーと見られてよい。そのため、過剰なＥＣＭの沈着用のＩ型及びＩＶ型コラーゲン、糸球体硬化症評価用のα‐ＳＭＡ及び糸球体細胞のアポトーシス指数用のＭ３０によって組織学的染色及び専門的なＩＨＣ検査を行うことで、抗ＩＳ  ｍＡｂの介入したＩＳ関連の組織萎縮に対する影響を説明すべきである。
【００９１】
上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ及び／又はその抗原結合断片の特性及び具体的な実践を説明するために、以下、幾つかの実施例を示す。
実施例
実施例１：抗原性ＩＳ複合体の調製
【００９２】
ハプテンのＩＳから完全抗原を調製するために、前記ＩＳのカリウム塩（サンタクルス生物技術公司（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を、Ｉｍｊｅｃｔ（商標）Ｂｌｕｅ  Ｃａｒｒｉｅｒ（商標）タンパク（ＢＣＰ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）及びＤＡＤＰＡ（ジアミノジプロピルアミン）により架橋されるセファロースビーズ（ＣａｒｂｏｘｙＬｉｎｋ（商標）カップリングゲル、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）の一連の担体に材料と化学的カップリングさせた。簡単にいうと、１ｍＬのＰＢＳにおける１０ｍｇのＩＳと３つの担体材料を同じ調製（ＰＢＳでは１０ｍｇ／ｍＬである）でそれぞれ試験管において混合させた。前記２ｍＬの混合物に０．２５ｍＬの３７％のホルムアルデヒド又は５０％のグルタルアルデヒドを加えて、５０℃で７２時間インキュベートした（マンニッヒ型反応（１７））。カップリング反応後に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ‐２５樹脂（ＧＥ医療（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））カラムを使用してクロマトグラフィー方法によってＩＳ‐担体タンパク複合体を精製し、またブラッドフォード試薬（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｒｅａｇｅｎｔ）（バイオラド社（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ））によって前記ＩＳ‐担体タンパク複合体の濃度を測定した。ＩＳ‐ＤＡＤＰＡアガロース複合体に対して、カップリングしたゲルビーズを脱イオン水によって３回洗浄し、また５ｍＬのＰＢＳで再溶解した。
実施例２：ハイブリドーマ技術による抗ＩＳ  ｍＡｂの生成
【００９３】
上記のように調製した抗原性ＩＳ複合体を使用し、また２つの免疫経路を採用してマウス（８〜１０週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃ）を免疫化する。その１つの免疫経路は、一般的な腹腔内（ＩＰ）免疫であった。この経路において、ＩＳ‐ＢＣＰ／ＩＳ‐ＢＳＡ複合体（１００μＬのＰＢＳにおいて５０μｇである）又はＩＳ‐ＤＡＤＰＡアガロース複合体（１００μＬ）を、等体積の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ））又は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ、シグマアルドリッチ社）に混合させた。各マウスは、４週間内で、１回目の初回免疫及び３回の追加免疫を含んで４回免疫化された。もう一つの経路は、直接な脾臓免疫であった。まず、３４Ｇの針で５μＬのＰＢＳにおける５μｇのＩＳ‐ＢＣＰ複合体を５匹のマウスの脾臓に注射した。抗原反応の誘発に成功すると、これらのマウスに対して、後で皮下（ＳＣ）注射によってＩＳ‐ＢＣＰ複合体（２００μＬのＩＦＡにおいて５０μｇである）で３回追加免疫した。骨髄腫細胞と融合する前に、ＩＳの結合する脾細胞をＩＳ複合体の被覆された１０ｃｍの培養プレート（Ｎｕｎｃ（商標）、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）に付着させて富化させ、且つISと結合していない脾細胞を培地洗浄で洗い流した。この２つの経路において、毎回の免疫作用の前に、ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリーによってマウスの血清力価を監視し、且つ所望の力価に達すると、ハイブリドーマ選別を行うように、マウスを屠殺した。選別の基準は、単一クローンを構築するように（限界希釈）その上澄液に遊離形ＩＳの分布を認識可能な細胞を採取するが、それらのＩＳ複合体のみを認識するが遊離形ＩＳに対して反応性を有しなく又は未共役の担体に対して反応性を有する細胞破棄すべきであった。単離されたハイブリドーマ細胞株をＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部内に注射して、得られた腹水を収集した。所望の抗体を抽出するように、プロテインＡカラムによるアフィニィークロマトグラフィー（ＧＥ医療）によって収集した腹水を精製した。精製された抗体の最大濃度は、１０ｍｇ／ｍＬであった。
実施例３：競合的ＥＬＩＳＡによるｍＡｂ特異性のテスト
【００９４】
本明細書に記載の競合的ＥＬＩＳＡにおいて、遊離する分析物又は固定の捕集剤を引き受けるように、抗ＩＳ  ｍＡｂ又はＩＳ複合体は、交換可能に使用された。この２つの反応物の指定された作用は、実験設計に依存していた。
【００９５】
遊離する分析物として抗ＩＳ  ｍＡｂを使用する（ＩＳ複合体をマイクロタイタープレートに被覆する）場合、抗マウスＩｇＧ．Ｆｃγ断片の二次抗体（例えば、ＨＲＰ共役のヤギＩｇＧ）をレポーターとして使用してよかった。プレート被覆用のＩＳ複合体の濃度範囲は、５０ｎｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬであった。抗ＩＳ  ｍＡｂは、１０ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの範囲で使用されてよい。
【００９６】
抗ＩＳ  ｍＡｂが捕集剤として固定される場合、標準曲線を作成するように、ＩＳ分析物を酵素レポーターと共役させてよく、つまりこのような状況でＨＲＰであった。被覆は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの間の濃度で効果的に実行されることができる。ＩＳ‐ＨＲＰ複合体は、前節に示されるマンニッヒ型によって付加されて調製されてよく、且つ作業濃度範囲は１０ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬであった。１ｐｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの参照ＩＳ基準物質を使用して、標準曲線を作成してよい。
【００９７】
ｍＡｂ候補物の特異性を予備テストするために、競合的ＥＬＩＳＡにおいて、前記ｍＡｂ候補物のＩＳ、インドール、Ｌ‐トリプトファン及び３‐インドール酢酸（全ての化合物もシグマアルドリッチ社に由来する）に対する活性を比較した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェルを４℃でＩＳ‐ＢＳＡ複合体（０．５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）によって一晩被覆し、３７℃で３００μＬの３％のＢＳＡ含有のＰＢＳＴ（０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含有のＰＢＳ）によって１時間封止した後で、ＰＢＳＴで３回洗浄した。２０μｇ／ｍＬ化合物の加えられた粗精製されたｍＡｂ候補物（１６‐１２８ｎｇ／ｍＬ）の２倍段階希釈列及び上記ブロッキング緩衝液におけるブランク対照を抗原で被覆された各ウェルに加えた。室温下で３０〜６０分間インキュベートした後で、ウェルを吸引して３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、ＰＢＳＴにおいて１：５０００で使用される二次抗体、１００μＬのＨＲＰ共役のヤギＩｇＧ抗マウスＩｇＧ（偉喬生醫公司（Ｌｅａｄｇｅｎｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ））を各ウェルに注いで、室温下で更に３０分間インキュベートした。ＴＭＢ（３,３'，５,５'‐テトラメチルベンジジン）基質溶液（ＫＰＬ）を加えて発色させる前に、各ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した。色が匹敵するレベルに発色すると、０．１Ｎの硫酸を加えることで反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を計測するマイクロタイタープレート（分子計器社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ））によってｍＡｂ候補物の活性を分析した。テスト候補物の相対結合活性の百分率は、Ｂ／Ｂ0×１００％[（混合化合物のウェルの平均吸光度）／（ブランク対照ウェルの平均吸光度）]によって計算した。テスト候補物とＩＳの結合活性がインドール、Ｌ‐トリプトファン及び３‐インドール酢酸における競合物により有意に競合されると、前記テスト候補物（基準：ＢIS／Ｂ0<３０％、Ｂ競合物／Ｂ０>７０％）を選択すべきではなかった。
実施例４：抗ＩＳのｍＡｂの２つ単一クローンの特徴付け
【００９８】
連続した２回のスクリーニングによって、数十種類の候補物から、ＩＳに対して素敵な親和力及び特異性を有する２つのモノクローナル抗体ＬＧ３０３及びＬＧ３３２を選択した。図１Ａ及び図１Ｂに、ＬＧ３０３及びＬＧ３３２の滴定曲線及び推定Ｋｄ（平衡解離定数）を示し、且つこの２つのｍＡｂの何れもＩＳに対するスキャッチャード結合親和力を示した。
【００９９】
マウスｍＡｂアイソタイピングキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ））によってそれらのアイソタイプを同定し、前記キットはそれぞれＬＧ３０３をＩｇＧ１／κに、またＬＧ３３２をＩｇＧ２ａ／κに帰属させた。カップリングされた逆転写ＰＣＲ及びマウスＩｇプライマーセット（メルクミリポア社（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））によって、ハイブリドーマ細胞のｍＲＮＡ抽出物から抗体可変領域の遺伝子配列を解析した。ＬＧ３０３  ＶＨドメインのポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）をポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に翻訳し、且つ前記ポリペプチド配列の３つのＣＤＲ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＣＤＲ‐Ｈ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＣＤＲ‐Ｈ２）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＣＤＲ‐Ｈ３）であった。ＬＧ３０３  ＶＬドメインのポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）をポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に翻訳し、且つ前記ポリペプチド配列の３つのＣＤＲ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（ＣＤＲ‐Ｌ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（ＣＤＲ‐Ｌ２）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８（ＣＤＲ‐Ｌ３）であった。ＬＧ３３２  ＶＨドメインのポリヌクレオチド配列（ＳＥＣ  ＩＤ  ＮＯ：１５）をポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に翻訳し、その中の３つのＣＤＲ領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１（ＣＤＲ‐Ｈ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（ＣＤＲ‐Ｈ２）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３（ＣＤＲ‐Ｈ３）の配列を有していた。ＬＧ３３２  ＶＬドメインのポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）をポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に翻訳し、３つのＣＤＲ領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（ＣＤＲ‐Ｌ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７（ＣＤＲ‐Ｌ２）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８（ＣＤＲ‐Ｌ３）の配列を有していた。
【０１００】
競合的ＥＬＩＳＡによって、精製されたＬＧ３０３  ｍＡｂ及びＬＧ３３２  ｍＡｂ（１００ｎｇ／ｍＬ）の結合特異性を改めて検査し、前記競合的ＥＬＩＳＡは抗ＩＳ  ｍＡｂをプレートに被覆し、ＩＳ‐ＨＲＰ複合体を分析物として使用した。図２Ａ（ＩＳ）、図２Ｂ（Ｌ‐トリプトファン）、図２Ｃ（インドール）及び図２Ｄ（３‐インドール酢酸）には、０．１２５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの濃度の４つの化合物競合でのＬＧ３０３及びＬＧ３３２の結合活性の比較を示した。その結果、ＬＧ３０３及びＬＧ３３２は、ＩＳに対する高特異的結合を有し、Ｌ‐トリプトファン及びその他の代表的な生化学的代謝の生産物に対して有意な反応はなかったことが判明された。
実施例５：生物試料におけるＩＳの検出
【０１０１】
特に干渉する血漿タンパク質が存在する場合、単離された抗ＩＳ  ｍＡｂが生物試料においてその抗原ターゲットを検出できるかを確定するために、異なる濃度のＩＳをヒト血清及び血漿に導入して競合的ＥＬＩＳＡによって評価した。それに対して、ここで、ＬＧ３３２を捕捉抗体として各ウェルの表面に被覆した。図３を参照すると、標準曲線が示され、ＬＧ３３２のＬｏＢ及びＬｏＤが表され、且つそのＬｏＤは約２５．２ｎｇ／ｍＬであった。
【０１０２】
表１にヒト血清及び血漿におけるＬＧ３３２の回収率を表し、前記回収率によると、我々の抗ＩＳ  ｍＡｂの結合活性がヒト血漿タンパク質（例えば、アルブミン）により干渉されないことが判明され、ヒト血漿タンパク質は血流で循環するＩＳを吸収すると考えられていた。
【０１０３】
2021523694.tif 000003
実施例６：生物試料におけるＩＳの除去
【０１０４】
それらが血漿からＩＳを除去できるかを検査するように、ＬＧ３０３及びＬＧ３３２をグリオキサールアガロースゲル（コロイド科学溶液公司の生物科学ビーズ支社（ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｂｅａｄ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ,Ｉｎｃ．））カラムに共役させた。この実施例において、ＩＳを約４０μｇ／ｍＬまでの濃度で２名の健康なドナーからの血漿試料に組み込んで、ＩＳ及びＰＣＳの合計のＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ定量を長庚記念醫院（台湾桃園）の実験医学科（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ,Ｃｈａｎｇ  Ｇｕｎｇ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  （Ｔａｏｙｕａｎ,Ｔａｉｗａｎ））によって行った。表２及び表３を参照すると、ＬＧ３３２は、ＬＧ３０３よりも良好なＩＳ除去率を表した。予期せぬことに、抗ＩＳ  ｍＡｂの治療の後で、別の重要なタンパク質結合尿毒症毒素ＰＣＳの濃度も減らした。ＰＣＳ及びＩＳがヒト血清アルブミンにおける同じ結合部位を競合する（１８）ため、血清アルブミンに結合される殆どのＩＳが抗ＩＳ  ｍＡｂにより置換される場合、この２つの有害物質の間の可能な不明関係は依然として調査中であった。
【０１０５】
2021523694.tif 000004
【０１０６】
2021523694.tif 000005
実施例７：抗ＩＳ  ｍＡｂの５／６  Ｎｘラットモデルでの効果
【０１０７】
上記のように、血液透析は、タンパク質結合尿毒症毒素を効果的に除去できなかった。前記実験動物モデルの多くの病理生理学的特徴がヒトで観察されたＣＫＤの共有するものであるため、５／６  Ｎｘラットにおいて、抗ＩＳ  ｍＡｂの治療用途での潜在力を研究してよかった。そのため、それらは、差異を研究するための好適な被験者と考えられ、前記差異は、例えば、抗ＩＳ  ｍＡｂの腎臓又は他の組織病変の形態に対する影響であった。
【０１０８】
簡単にいうと、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（登録商標）ラット（体重が約３００ｇである）を、健康対照、５／６  Ｎｘ、対照抗体を有する５／６  Ｎｘ、ＬＧ３０３を有する５／６  Ｎｘ、ＬＧ３３２を有する５／６  Ｎｘ  を含む５つの群に分けた。全ての実験は、国立台湾成功大学（台湾台南）の生物化学と分子生物学科（ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｎｇ  Ｋｕｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  （Ｔａｉｎａｎ,Ｔａｉｗａｎ））により行われた。健康対照以外に、全ての動物群については、何れも０週目に腎臓手術を行って一週間休息させた。左腎を露出し、上下両極をポリグリコール酸縫合糸で結紮した後で、右腎摘除を行った。その後、腹膜及び皮膚を縫合して、動物を再びその各々のケージに置いた。ラット群によると、１週目〜５週目の期間中に、ｋｇ体重あたり１０ｍｇの抗体で抗体を週に１回腹腔内注射した。実験終了の時に、動物を過剰なペントタールナトリウムで安楽死させ、左心室にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１Ｍ）を注いでから、ホルムアルデヒド固定液を注入した。腎臓を取り出して、結合組織を取り除いてパラフィンワックスに埋め込んだ。腎臓及び心血管組織の組織学的分析としては、立衆バイオテクノロジー社（台湾台北）（Ｌｉｔｚｕｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．  （Ｔａｉｐｅｉ,Ｔａｉｗａｎ））によってサービスを提供した。
【０１０９】
本発明の一実施形態による動物モデルの実験手順を示すフロー図である図４を参照されたい。図４に示すように、ラットは、５／６  Ｎｘ又は偽対照を受けた。ラットを一週間休息させた後、前記のように、対照マウスＩｇＧ、ＬＧ３０３及びＬＧ３３２を注射した。４２日目（６週目）に、ラットを屠殺し、組織生検標本を収集して分析した。
【０１１０】
テスト動物のヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）により染色された腎臓（図５Ａ）及び心臓（図５Ｂ）の部分を示す図５Ａ〜図５Ｂを参照されたい。図５Ａにおいて、黄色矢印は糸球体硬化症を示し、赤色矢印は尿細管の空胞を示し、薄青色の矢印は間質繊維化を示し、且つ緑色矢印は炎症促進細胞浸潤を示した。図５Ｂにおいて、緑色矢印は心筋細胞の再配列を示し、且つ黄色矢印は免疫細胞浸潤を示した。図５Ａ〜図５Ｂの組織学的結果において、ＬＧ３０３により処理された実験群は他の実験群よりも少ない病理学的変化を示すことが発見された。図５Ａに示すように、５／６  Ｎｘラットは、糸球体硬化症、拡大した尿細管空胞、間質繊維化及び免疫細胞浸潤を罹患していた。対照ＩｇＧ及びＬＧ３３２で治療されるラットにおいて、現象が５／６  Ｎｘラットに類似であった。興味深いことに、ＬＧ３０３が５／６  Ｎｘラットに有益である可能性があることが発見された。本明細書では、炎症促進細胞浸潤及び他の病理学的変化が著しく減らしたことが発見された。また、対照ＩｇＧ及びＬＧ３３２に比べると、ＬＧ３０３で治療された後、心臓再配列が低減した（図５Ｂに示すように）。
【０１１１】
ＬＧ３０３の５／６  Ｎｘラットでの抗繊維化効果を更に同定するように、これらの心臓及び腎臓組織の生検標本をシリウスレッドで染色した。コラーゲン発現模式を観察するように、テスト動物のシリウスレッドで染色された腎臓及び心臓部分を示す図６を参照されたい。ＩＶ型コラーゲン抗体を使用するテスト動物の腎臓及び心臓切片を示すＩＨＣ画像であり、特定のコラーゲン観察を行うように、ＩＶ型コラーゲン抗体によってラットの腎臓及び心臓切片に対してＩＨＣを実行した図７を参照されたい。対照抗体及び健常な擬似の与えられた動物群に比べると、図６及び図７により、抗ＩＳ  ｍＡｂ処理のされたラットはＥＣＭ  Ｉ型コラーゲン及びＩＶ型コラーゲンの発現が減少する趨勢にあることが判明された。図８は、α‐ＳＭＡ抗体を使用するテスト動物の腎臓及び心臓切片を示すＩＨＣ画像であり、前記α‐ＳＭＡ抗体は線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化転換（赤色矢印の指す暗褐色領域）を同定することに用いられる。図８に示すように、抗ＩＳ  ｍＡｂによりα‐ＳＭＡの発現が明らかに減少したが、ＬＧ３０３の性能がＬＧ３３２の性能よりも優れていた。ＬＧ３０３のＬＧ３３２に対する優勢は、図６及び図７で可視化された過剰なコラーゲン沈着に対する活性抑制と一致であった。
【０１１２】
図９は、Ｍ３０抗体を使用したテスト動物における腎障害による腎臓及び心臓病変を示す組織病理図であり、前記Ｍ３０抗体はアポトーシスイベントを検出することに用いられた（赤色矢印により指される）。Ｍ３０の免疫染色によると、心臓ではなく腎臓からの切片のみに、アポトーシス細胞死が同定され、且つ抗ＩＳ  ｍＡｂは糸球体細胞、特に上皮細胞における予期しないアポトーシスの発生を阻止した。一旦、このようなｍＡｂが臨床に適用されると、ＣＫＤ患者の腎機能を保留又は救済することができる。
【０１１３】
まとめて言えば、上記の実験結果は、選ばれたＣＫＤ動物モデルにおいて、単離された抗ＩＳ  ｍＡｂの投与が腎臓及び心臓の細胞に対して顕著な抗繊維化及び抗アポトーシスエフェクターを果たすことを支持する。また、これらの結果は、前途有望であり、特異性ｍＡｂによってＩＳを中和させることで、ＩＳ関連の病理症状を軽減できることも判明した。
【０１１４】
以上、特定の実施形態を参照して本発明について説明してきたが、前記の公開内容に多種の修正、様々な改変及び取り替えを加えることを図っており、且つ理解すべきなのは、いくつかの状況で、説明された本発明の範囲や精神から逸脱せずに、対応的に他の特徴を使用しないで、本発明の実施形態のいくつかの特徴を採用する。そのため、本発明の精神や特許請求の範囲は、上記で説明された例示的な実施形態の説明に限定されるべきではない。
【０１１５】
参照文献
1.Meyer, T. W., and T. H. Hostetter.2007.Uremia.N. Engl.J. Med.357:1316-1325.
2.Vanholder, R., R. De Smet, and N. Lameire.2001.Protein-bound uremic solutes: the forgotten toxins.Kidney Int.Suppl.78:S266-270.
3.Lee, C.-T., C.-C. Kuo, Y.-M. Chen, C.-Y. Hsu, W.-C. Lee, Y.-C. Tsai, H.-Y. Ng, L.-C. Kuo, T. T.-Y. Chiou, Y.-K. Yang, B.-C. Cheng, and J.-B. Chen.2010.Factors associated with blood concentrations of indoxyl sulfate and p-cresol in patients undergoing peritoneal dialysis.Perit.Dial.Int.J. Int.Soc.Perit.Dial.30:456-463.
4.Wu, I.-W., K.-H. Hsu, C.-C. Lee, C.-Y. Sun, H.-J. Hsu, C.-J. Tsai, C.-Y. Tzen, Y.-C. Wang, C.-Y. Lin, and M.-S. Wu.2011. p-Cresyl sulphate and indoxyl sulphate predict progression of chronic kidney disease.Nephrol.Dial.Transpl.Assoc.-Eur.Ren.Assoc.26:938-947.
5.Schulman, G., T. Berl, G. J. Beck, G. Remuzzi, E. Ritz, K. Arita, A. Kato, and M. Shimizu.2015.Randomized Placebo-Controlled EPPIC Trials of AST-120 in CKD.J. Am.Soc.Nephrol.JASN 26:1732-1746.
6.Yamaguchi, J., T. Tanaka, and R. Inagi.2017.Effect of AST-120 in Chronic Kidney Disease Treatment:Still a Controversy Nephron 135:201-206.
7.Lin, C.-N., I.-W. Wu, Y.-F. Huang, S.-Y. Peng, Y.-C. Huang, and H.-C. Ning.2018.Measuring serum total and free indoxyl sulfate and p-cresyl sulfate in chronic kidney disease using UPLC-MS/MS.J. Food Drug Anal.
8.Al Za’abi, M., B. Ali, and M. Al Toubi.2013.HPLC-fluorescence method for measurement of the uremic toxin indoxyl sulfate in plasma.J. Chromatogr.Sci.51:40-43.
9.Hoshi, H., K. Kikuchi, Y. Itoh, and A. Konagai.2015.Indoxyl sulfate measurement method.US20150355171A1.
10.Taki, K., S. Nakamura, M. Miglinas, A. Enomoto, and T. Niwa.2006.Accumulation of indoxyl sulfate in OAT1/3-positive tubular cells in kidneys of patients with chronic renal failure.J. Ren.Nutr.Off.J. Counc.Ren.Nutr.Natl.Kidney Found.16:199-203.
11.Ito, S., M. Osaka, T. Edamatsu, Y. Itoh, and M. Yoshida.2016.Crucial Role of the Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in Indoxyl Sulfate-Induced Vascular Inflammation.J. Atheroscler.Thromb.23:960-975.
12.Essono, S., Y. Frobert, J. Grassi, C. Creminon, and D. Boquet.2003.A general method allowing the design of oligonucleotide primers to amplify the variable regions from immunoglobulin cDNA.J. Immunol.Methods 279:251-266.
13.McCafferty, J., A. D. Griffiths, G. Winter, and D. J. Chiswell.1990.Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains.Nature 348:552-554.
14.Dai, C., L. P. Kiss, and Y. Liu.2008.Animal Models of Kidney Diseases.In Sourcebook of Models for Biomedical Research P. M. Conn, ed. Humana Press, Totowa, NJ.657-664.
15.Yang, H.-C., Y. Zuo, and A. B. Fogo.2010.Models of chronic kidney disease.Drug Discov.Today Dis.Models 7:13-19.
Nangaku, M. 2004.Mechanisms of tubulointerstitial injury in the kidney: final common pathways to end-stage renal failure.Intern.Med.Tokyo Jpn.43:9-17.
17.Miwa, A., M. Yoshioka, A. Shirahata, and Z. Tamura.1977.Preparation of specific antibodies to catecholamines and L-3,4-dihydroxyphenylalanine.I. Preparation of the conjugates.Chem.Pharm.Bull.(Tokyo) 25:1904-1910.
18.Watanabe, H., T. Noguchi, Y. Miyamoto, D. Kadowaki, S. Kotani, M. Nakajima, S. Miyamura, Y. Ishima, M. Otagiri, and T. Maruyama.2012.Interaction between two sulfate-conjugated uremic toxins, p-cresyl sulfate and indoxyl sulfate, during binding with human serum albumin.Drug Metab.Dispos.Biol.Fate Chem.40:1423-1428.
【図１Ａ】
2021523694.tif 000006
【図１Ｂ】
2021523694.tif 000007
【図２Ａ】
2021523694.tif 000008
【図２Ｂ】
2021523694.tif 000009
【図２Ｃ】
2021523694.tif 000010
【図２Ｄ】
2021523694.tif 000011
【図３】
2021523694.tif 000012
【図４】
2021523694.tif 000013
【図５Ａ】
2021523694.tif 000014
【図５Ｂ】
2021523694.tif 000015
【図６】
2021523694.tif 000016
【図７】
2021523694.tif 000017
【図８】
2021523694.tif 000018
【図９】
2021523694.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】令和2年12月15日(2020.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿毒症毒素、インドキシル硫酸（ＩＳ）に対して特異性を持つ抗原結合断片を公開し、より具体的に、ＩＳの特異的認識用の単離されたモノクローナル抗体及び／又は抗原結合断片及びそれらのＩＳ関連疾患の治療診断への用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿毒症は、多種の尿毒症毒素が生体内での病的蓄積を特徴とし、且つこのような衰弱性病症により永続的な腎機能喪失を引き起こし、次第にＣＫＤの各段階まで進展し、最終的に生命にかかわる末期腎疾患（ＥＳＲＤ）になる。尿毒症患者は、更に、神経系、消化系、循環系及び骨格系に関わる様々な臨床徴候及び症状（１）を有する。尿毒症及びそれに起因する合併症は、一般的に、透析治療（血液透析及び腹膜透析を含む）により制御されるが、患者が腎不全を発症する場合、電解質がひどく異常となり且つ廃物がすでに危険の程度に溜まるので、患者は、生き続けるために腎移植が必要である。しかしながら、このような治療の選択は、ドナー腎臓の不足、手術関連の死亡リスク及び後での器官拒絶の予防に必要な終生免疫抑制により制限される。
【０００３】
数百種の潜在的な尿毒症毒素が同定されている。前記尿毒症毒素は、それらの物理化学的特性又はそれらの透析における行為によって、（ａ）水溶性の、非タンパク結合性の小化合物（分子量<３００Ｄ、例えば、尿素）、（ｂ）主にペプチドであり、分子量が３００Ｄ〜１２０００Ｄである大きな中分子、及び（ｃ）タンパク質に結合される小化合物という３つの種類に大まかに分けられる（２）。血清タンパク質（例えば、アルブミン）との結合により、これらのタンパク質に結合される化合物の透析クリアランスが制限される。そのため、血液透析を受けた患者において、これらの毒素の平均レベルが次第に累積して正常レベルの１０倍及び２０倍まで達することもある。
【０００４】
ＩＳ及びｐ-クレゾール硫酸塩（ＰＣＳ）は、アルブミンに結合される２つの原型の毒素であり、且つ何れも食物由来のトリプトファン及びチロシンが胃腸管における細菌叢によって発酵されたものである。いくつの群によると、ＣＫＤ患者の一方でのＩＳ及びＰＣＳの血清レベルと他方での全死亡率及び心血管疾患（ＣＶＤ）との間に、病理学的関連性があることが判明される。そのため、ＩＳ及びＰＣＳは、腎機能及び疾患進展を予測するバイオマーカーだけではなく、治療的取扱いのターゲットである可能性もある（３、４）。
【０００５】
ＡＳＴ‐１２０（Ｋｒｅｍｅｚｉｎ、Ｋｕｒｅｈａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ,Ｔｏｋｙｏ,Ｊａｐａｎ）は、経口投与される球形吸着炭であり、様々な小分子の尿毒症毒素を吸着することができる。それは、腸でＩＳの前駆体であるインドールを吸収することで、ＩＳの生合成を抑制する。そのため、血清及び尿におけるＩＳ濃度を間接的に減少させる（５）。ＡＳＴ‐１２０のＣＫＤ進展に対する緩徐化効果を証明するために、前向き無作為化臨床研究を複数回実行したが、まとめて言えば、ＡＳＴ‐１２０を中等度から重度のＣＫＤに罹患している患者に加えるという標準的療法の利益は、これらの試験によるデータによりサポートされない（６、７）。
【０００６】
ＩＳ検出及び測定の分析化学的方法（例えば、液体クロマトグラフ質量分析スペクトル（ＬＣ‐ＭＳ）及び高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ））は、高コストの装置、複雑な試料調製、大試料量を要求するため、大量の生物試料の計測に使用するには適さない（８）。それに対して、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、実行が簡単で、且つ試薬が比較的安価である。複雑な試料前処理を行うことでＥＬＩＳＡ操作を自動的に行うことができるようにして、より精確且つ再現可能な結果、より速い応答時間及びより少ない労働コストを提供する。ＨｏｓｈｉらによりＩＳを定量測定可能な競合的ＥＬＩＳＡ方法が開発されたが、前記方法に用いられるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）９Ａ２Ｆ６の結合活性はウシ又はヒトの血清アルブミンにより抑制される（９、１０）。試料の脱タンパク質化は、実験手順を実行する前に特に好ましく又は要求されることであり、これにより、前記分野の実験室又は産業上の利用可能性に損傷を与える可能性がある。
【０００７】
以上をまとめると、本分野において最近進歩があるが、定性的または定量的免疫測定を改善するための方法が相変わらず実質的に必要とされ、単離された抗ＩＳ  ｍＡｂはなければならない機能性成分である。その同時に、前記免疫測定の実行は、分析される生物試料から一般的に発見される血漿タンパク質（特にアルブミン）に敏感ではない。ＩＳ関連疾患を治療するように被験者からＩＳを効果的に除去するための方法が依然として望まれている。これらの方法は、被験者に有効量の単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを投与し、又は単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを物理的支持体にカップリングすることで、生物試料におけるＩＳを前記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂに互いに接触させるように捕捉及び除去することを含む。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の一態様は、ＩＳに特異的結合され、且つ代替的に「抗ＩＳ  ｍＡｂ」と呼ばれる単離されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び／又はその抗原結合断片を提供する。
【０００９】
さらに、本発明の別の態様は、前述のように、単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片の一部または全部を含む多重特異性結合分子を提供する。
【００１０】
また、インドキシル硫酸を検出して、被験者から収集した生物試料におけるインドキシル硫酸の濃度を確定するための免疫測定法を提供する。
【００１１】
また、インドキシル硫酸を除去するデバイス組成物を提供する。
【００１２】
また、被験者からインドキシル硫酸を除去する薬物組成物を提供する。
【００１３】
また、前述のように、インドキシル硫酸を認識する、単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合断片をコード化するポリヌクレオチドセグメントを提供する。
【００１４】
また、本発明の別の態様は、エピトープ、及びＬ‐トリプトファン、インドール及び３‐インドール酢酸以外のインドキシル硫酸に対するスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）結合親和力を有する単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片を提供する。
【００１５】
前記態様に鑑みて、本発明は、単離されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び／又はその抗原結合断片を提供する。前記単離されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び／又はその抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、を含む。ＶＨドメインは相補性決定領域（ＣＤＲ）‐Ｈ１、ＣＤＲ‐Ｈ２及びＣＤＲ‐Ｈ３を含むが、ＶＬドメインは可変領域ＣＤＲ‐Ｌ１、ＣＤＲ‐Ｌ２及びＣＤＲ‐Ｌ３を含む。一実施形態において、ＣＤＲのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の何れかから選ばれてよいＣＤＲ‐Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の何れかから選ばれてよいＣＤＲ‐Ｈ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の何れかから選ばれてよいＣＤＲ‐Ｈ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の何れかから選ばれてよいＣＤＲ‐Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の何れかから選ばれてよいＣＤＲ‐Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の何れかから選ばれてよいＣＤＲ‐Ｌ３の１つ又は複数の配列を含む。
【００１６】
一実施形態において、単離されたモノクローナル抗体及び/又はその抗原結合断片は、全長免疫グロブリン分子、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変断片（Ｆｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、多特異的結合分子、又は単離されたヒト、キメラ、ヒト化、合成、組換え抗体及び／又はその抗原結合断片の如何なる組み合わせである。
【００１７】
一実施形態において、単離されたモノクローナル抗体及び／又はその断片は、体外表面表示システムから選別できる。
【００１８】
一実施形態において、単離された抗体及び／又はその断片は、化学的に修飾され又は薬学的に許容可能な担体と混合され得る。
【００１９】
他の態様に鑑みて、本発明は、前述のような単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片の一部または全部を含む多特異的結合分子をさらに提供する。
【００２０】
一実施形態において、多特異的結合分子はインドキシル硫酸と特異的に結合する。
【００２１】
他の態様に鑑みて、本発明は、前記のような単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片を含み、被験者から収集した生物試料におけるインドキシル硫酸濃度を確定するインドキシル硫酸の検出用の免疫測定法をさらに提供する。
【００２２】
一実施形態において、生物試料は、血液、血清、血漿、腹水、尿及び生検標本を含む。
【００２３】
一実施形態において、生物試料は、アルブミンを含む。
【００２４】
他の態様に鑑みて、本発明は、前記のような単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片を含む、インドキシル硫酸を除去するデバイス組成物をさらに提供する。
【００２５】
一実施形態において、単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片は、固相に共役される。
【００２６】
他の態様に鑑みて、本発明は、前記のような単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片を含む、被験者におけるインドキシル硫酸の除去又は低減用の薬物組成物をさらに提供する。
【００２７】
一実施形態において、単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片に組み合わせられた医療用吸着剤をさらに含む。
【００２８】
一実施形態において、医療用吸着剤は活性炭吸着剤を含む。
【００２９】
他の態様に鑑みて、本発明は、抗インドキシル硫酸の単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合断片をコード化する単離されたポリヌクレオチドセグメントをさらに提供し、単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合断片は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの１つ又は複数のポリペプチド配列を含む。一実施形態において、ＶＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４として示され、ＶＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９として示される。
【００３０】
他の態様に鑑みて、本発明は、インドキシル硫酸を認識する単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合断片をコード化する単離されたポリヌクレオチドセグメントをさらに提供する。一実施形態において、単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ２、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ３の１つ又は複数のポリペプチド配列を含む。
【００３１】
他の態様に鑑みて、本発明は、更に、エピトープ、及びＬ‐トリプトファン、インドール及び３‐インドール酢酸以外のインドキシル硫酸に対するスキャッチャード結合親和力を有する単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片を提供する。
【００３２】
上記単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片を適用すると、前記単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片がＩＳを特異的認識するので、アルブミンの存在下でのＩＳの検出の感度及びダイナミックレンジの表現が優れ、これにより、様々な用途に用いられることができ、例えば、インドキシル硫酸の検出用の免疫測定法、及びエピトープ及びＬ‐トリプトファン、インドール及び３‐インドール酢酸等以外のインドキシル硫酸に対するスキャッチャード結合親和力を有する単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片に用いられることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
特許又は願書に少なくとも１つのカラー図面を含む。本特許又は特許出願公開のカラー図面付きのコピーは、請求して必要の費用を払った後で、特許局により提供される。本公開は、下記添付図面を参照して実施形態の下記の詳細な説明を読むことで、より十分に理解される。
【図１Ａ】幾つかの単離された抗ＩＳモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＬＧ３０３のＩＳ‐ＢＳＡに対する滴定曲線を示す。
【図１Ｂ】幾つかの単離された抗ＩＳモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＬＧ３３２のＩＳ‐ＢＳＡに対する滴定曲線を示す。
【図２Ａ】異なる濃度のＩＳの存在下で、幾つかの単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ  ＬＧ３０３及びＬＧ３３２のＩＳ‐ＢＳＡに対するＢ／Ｂ％を表す棒グラフを示す。
【図２Ｂ】異なる濃度のＬ‐トリプトファンの存在下で、幾つかの単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ  ＬＧ３０３及びＬＧ３３２のＩＳ‐ＢＳＡに対するＢ／Ｂ％を表す棒グラフを示す。
【図２Ｃ】異なる濃度のインドールの存在下で、幾つかの単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ  ＬＧ３０３及びＬＧ３３２のＩＳ‐ＢＳＡに対するＢ／Ｂ％を表す棒グラフを示す。
【図２Ｄ】異なる濃度の３‐インドール酢酸の存在下で、幾つかの単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ  ＬＧ３０３及びＬＧ３３２のＩＳ‐ＢＳＡに対するＢ／Ｂ％を表す棒グラフを示す。
【図３】競合ＥＬＩＳＡで単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ  ＬＧ３３２のブランク限界（ＬｏＢ）及び検出限界（ＬｏＤ）を表す標準曲線を示し、連続した濃度のＩＳでＬＧ３３２のＬｏＤ及びＬｏＢを検査する。
【図４】ＣＫＤ動物モデルの実験対策に対するフロー図を示す。
【図５Ａ】テスト動物の腎臓切片のヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）により染色された組織学画像を示す。
【図５Ｂ】テスト動物の心臓切片のヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）により染色された組織学画像を示す。
【図６】コラーゲンを検出するためのテスト動物の腎臓及び心臓切片のシリウスレッドで染色された組織学画像を示す。
【図７】コラーゲンＩＶ型抗体を使用するテスト動物の腎臓及び心臓切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）画像を示す。
【図８】α‐平滑筋アクチン（α‐ＳＭＡ）抗体によって繊維化増大領域を検出するテスト動物の腎臓及び心臓切片のＩＨＣ画像を示す。
【図９】Ｍ３０抗体によって細胞アポトーシスイベントを検出するテスト動物の腎臓及び心臓切片のＩＨＣ画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の実施形態は、以下の詳細な説明により明らかになり、添付図面に合わせて前記詳細な説明を行い、同じ添付図面の符号は同じ素子に関連する。
【００３５】
本明細書で引用される全ての刊行物も、それぞれ個々の刊行物または特許出願が特異的かつ個別に参照により組み入れられると示された場合と同じ程度に参照により本明細書に組み入れられるものとする。組み込まれた参考文献における用語の定義または使用が、本明細書中で提供されるその語の定義と矛盾するかまたは反対である場合、本明細書中で提供されるその語の定義が適用され、参考文献中のその語の定義は適用されない。
【００３６】
本明細書を解釈するために、下記定義が適用され、適当である時に、単数形で用いた用語は複数形を含み、その逆も可能である。詳細な説明全体において、別の定義が述べられる。
【００３７】
本明細書に用いられるように、上下文で不適切ではない限り、「一」、「１つ」、「当該」及び「前記」という用語は、「１つ又は複数の」を表し且つ複数を含むように定義される。
【００３８】
本発明は、慢性腎不全疾患（ＣＫＤ）患者の合併症の尿毒症の診断及び治療におけるタンパク質結合尿毒症毒素であるインドキシル硫酸（ＩＳ）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び／又は断片による検出及び取り除く方法を公開する。診断上の使用については、生物試料におけるＩＳを定性的及び定量的検出するための免疫測定法を提供する。被験者の体内で循環するＩＳを効果的に除去するために、前記被験者に有効用量の抗ＩＳ  ｍＡｂを投与すること、生物試料を抗ＩＳ  ｍＡｂに共役される固相支持体を通過させてＩＳを吸収すること、の２つの対策を採用する。前記生物試料は、血液、血清、血漿、腹水、尿、生検標本等であってよい。被験者から収集したそれらの生物試料が一般的に多種の血漿タンパク質を含むため、上記抗ＩＳ  ｍＡｂの結合活性の性能は、如何なる血漿タンパク質、特に最も豊富なアルブミンにより干渉されるべきではない。ＩＳがＣＫＤ及びいくつかの他の腎臓病を悪化させると考えられるが、本発明の適用は腎臓病学に限定されない。
【００３９】
「被験者」の用語は、ヒト及び非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類及び爬虫類を含む。別記しない限り、「患者」又は「被験者」の用語は、本明細書で交換可能に使用される。
【００４０】
「核酸」の用語は、本明細書において「ポリヌクレオチド」の用語と交換可能に使用され、且つ一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びその重合体を指す。この用語は、合成、天然、及び非天然であり、参照核酸と類似な結合特性を有し、且つ参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される既知のヌクレオチド類似体又は修飾骨格残基又は連結を含有する核酸を含む。このような類似体の例示としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２‐Ｏ‐メチルリボヌクレオチド、ペプチド‐核酸（ＰＮＡ）を含んでよいが、それらに限定されない。
【００４１】
別記しない限り、特定の核酸配列は、明示された配列だけではなく、更に、その保存的修飾された変異体（例えば、縮重コドンの置換）及び相補的配列をも黙示的に含む。具体的に、下記のように、縮重コドンの置換は、１つ又は複数の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基により置換される配列の生成によって達成されることができる。
【００４２】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」の用語は、本明細書で交換可能に使用され、アミノ酸残基の重合体を指すことに用いられる。前記用語は、天然に存在するアミノ酸重合体及び非天然に存在するアミノ酸重合体にだけではなく、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸重合体にも適用される。別記しない限り、特定のポリペプチド配列は、更に、その保存的修飾された変異体を黙示的に含む。
【００４３】
「抗体」の用語とは、完全型免疫グロブリン分子又はその機能的断片である。天然に存在する抗体は、普通、一般的に少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び少なくとも２つの軽（Ｌ）鎖から構成されるテトラマーを含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記する）及び重鎖定常領域からなり、前記重鎖定常領域は一般的に３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）から構成される。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブタイプ）、ＩｇＭ及びＩｇＥを含む任意のアイソタイプであってよい。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。軽鎖は、κ鎖及びλ鎖を含む。ＶＨドメインとＶＬドメインとの組み合わせは一般的に抗原認識を担当し、ＣＨドメインは免疫グロブリンと宿主組織又は因子の結合を媒介することができ、前記宿主組織又は因子は免疫システムの様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む。ＶＨ及びＶＬドメインは、更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域、及びフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的である領域に細分されることができ、前記ＣＤＲと前記ＦＲとは散在して組み入れられる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からアルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と互いに作用する結合ドメインを含む。
【００４４】
「抗体断片」又は「その特異的結合断片」の用語とは、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、Ｆ（ａｂ'）2断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片及びジスルフィド連結したＦｖ断片、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）2（又は二量体抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）とも呼ばれる）、（ｓｃＦｖ）3（又は三量体抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）とも呼ばれる）、（ｓｃＦｖ）4（又は四量体抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）とも呼ばれる）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ミニ抗体、ナノ抗体、及び各抗体断片からなる多重特異性抗体を含む、完全な抗体の構造の全体又は一部であってよい。また、抗体及び／又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗原結合断片からなる多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体又はマウス抗体を指してもよい。
【００４５】
本明細書に用いられるような「抗体薬物複合体（ＡＤＣ）」又は「免疫複合体」の用語とは、抗体又はその抗原結合断片と別の試薬（例えば、化学治療剤、毒素、免疫治療剤、画像化プローブ等）との連結である。連結基は、共有結合、又は例えば、静電力による非共有の相互作用であってよい。抗体薬物複合体を形成するために、本分野の既知の様々なリンカーを使用してよい。また、抗体薬物複合体は、免疫複合体コードするポリヌクレオチドから発現可能な融合タンパク質の形態によって提供されてよい。本明細書で用いられるように、「融合タンパク質」とは、各々のタンパク質（ペプチド及びポリペプチドを含む）を最初にコード化する２つ以上の遺伝子又は遺伝子断片の結合により発生するタンパク質である。融合遺伝子の翻訳により、各元のタンパク質からの機能特性を有する単一タンパク質が発生する。
【００４６】
「単離された」の用語とは、免疫グロブリン、抗体又はポリヌクレオチドが具体的な状況に応じて自然に発生する可能性のある物理環境と異なる物理環境に存在することである。
【００４７】
「エピトープ」又は「抗原決定基部位」は、抗原分子の一部であり、抗体の抗原結合ドメインとの特異性相互作用を担当する。抗原結合ドメインは、１つ又は複数の抗体可変ドメインによって提供されてよい。複数回の組換え及び選別作業によってｍＡｂの単離されたＶＨドメイン及びＶＬドメインから機能的抗原結合性断片を単離させることができる。
【００４８】
「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の用語は、抗体における可変鎖の限定部分であり、前記限定部分において、これらの分子はそれらの特異性抗原に結合される。本公開において、重鎖におけるＣＤＲ領域は一般的にＣＤＲ‐Ｈ１、ＣＤＲ‐Ｈ２及びＣＤＲ‐Ｈ３と呼ばれるが、軽鎖におけるＣＤＲ領域は一般的にＣＤＲ‐Ｌ１、ＣＤＲ‐Ｌ２及びＣＤＲ‐Ｌ３と呼ばれる。それらは、アミノ末端からアルボキシ末端への方向で順に番号付けされる。
【００４９】
本明細書で用いられるように、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」の用語とは、単一分子組成物の抗体分子の製剤である。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和力を表す。
【００５０】
単離されたモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片とは、ｃＤＮＡ由来、組換えＲＮＡ由来又は如何なる他の合成由来又はこれらの由来のある組み合わせにより発生するタンパク質又はペプチド、及びこのようなタンパク質及びポリペプチドであり、前記タンパク質及びポリペプチドはその由来又は誘導供給源により、（１）自然界に存在するタンパク質に付随していなく、（２）同じ起源の他のタンパク質を含まなく、例えば、ネズミ類のタンパク質を含まなく、（３）様々な種由来の細胞により発現され、又は（４）自然界に存在しない。
【００５１】
本明細書における「抗ＩＳ  ｍＡｂ」は、特異的結合ＩＳの抗体形態及び／又は断片を表す一般用語である。
【００５２】
また、本発明は、更に、単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ及び／又はその断片の発生方法を提供する。また、上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂは、ＬＧ３０３及びＬＧ３３２の２つの単離されたｍＡｂとして例示され、前記ＬＧ３０３及びＬＧ３３２はそれぞれそれらを分泌する２つのハイブリドーマ細胞株で名付けされる。
【００５３】
また、本発明は、更に、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変（ＶＬ）ドメインから構成される上記抗ＩＳ  ｍＡｂの可変ドメインをコード化するポリヌクレオチド配列を提供する。例えば、抗体ＶＨドメインのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５並びに抗体ＶＬドメインのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０は、それぞれＬＧ３０３及びＬＧ３３２に対応する。
【００５４】
本発明は、更に、上記ポリヌクレオチド配列から翻訳されるアミノ酸配列を提供する。例えば、抗体ＶＨドメインのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４並びに抗体ＶＬドメインのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９は、それぞれＬＧ３０３及びＬＧ３３２に対応する。更に、上記抗体のＶＨドメイン内の相補性決定領域（ＣＤＲ）‐Ｈ１、ＣＤＲ‐Ｈ２及びＣＤＲ‐Ｈ３並びにＶＬドメイン内のＣＤＲ‐Ｌ１、ＣＤＲ‐Ｌ２及びＣＤＲ‐Ｌ３も同定される。
【００５５】
１つの具体的な実施形態において、上記ＣＤＲのＬＧ３０３及びＬＧ３３２に対応するアミノ酸配列については、下記で説明する。それらは、ＣＤＲ‐Ｈ１のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＣＤＲ‐Ｈ２のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＣＤＲ‐Ｈ３のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＣＤＲ‐Ｌ１のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＣＤＲ‐Ｌ２のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＣＤＲ‐Ｌ３のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８である。
【００５６】
「配列同一性百分率」又は「同源性」の用語は、最大の配列同一性百分率を達成させて保存された核酸置換を取り除くするように配列をアラインしてギャップを導入（必要がある場合）した後の、候補配列における参照配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドと同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドの百分率と定義される。手動以外、本分野で知られる局所相同性アルゴリズム又はこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ  Ｐ）によって、比較される配列の最適アラインメントを発生させてもよい。
【００５７】
また、配列表に、下記ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を列記する。
【００５８】
また、本発明は、更に、ＩＳ関連疾患の診断試薬として上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを使用する方法を提供する。
【００５９】
また、本発明は、更に、ＩＳ関連疾患の治療試薬として上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを使用する方法を提供する。
【００６０】
また、本発明は、更に、体外生体液を浄化するためのＩＳ置換試薬として上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを使用する方法を提供する。
【００６１】
また、本発明は、更に、免疫測定法、デバイス組成物又は薬物組成物に上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを使用する方法を提供する。
【００６２】
また、本発明は、更に、前記免疫測定法、デバイス組成物及び薬物組成物の開発方法を提供する。
【００６３】
また、本発明は、更に、生物試料におけるＩＳを定性的及び定量的検出するための上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを含む免疫測定法を提供する。
【００６４】
また、本発明は、更に、上記免疫測定法によってＩＳ関連疾患を診断する方法を提供する。
【００６５】
また、本発明は、更に、被験者のＩＳを体外除去し、又は被験者の生体液の尿毒症の負担を減らすための上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを含むデバイス組成物を提供する。
【００６６】
また、本発明は、更に、有効量の上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを含む薬物組成物を投与することでＩＳを除去し又は尿毒症の負担を減らす方法を提供する。
【００６７】
一実施形態において、上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを免疫測定法又はデバイス組成物に用いる場合、前記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを物理的支持用の固相と共役させてよい。
【００６８】
一実施形態において、前記薬物組成物は、ＣＫＤに付随する腎不全又はＣＶＤのリスクを軽減する必要のある被験者に用いられてよい。
【００６９】
一実施形態において、前記薬物組成物は、経口投与の球形吸着炭、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）、アンジオテンシン受容体遮断剤（ＡＲＢ）及び活性ビタミンＤである他の薬物に組み合わせて使用されてよい。
【００７０】
本明細書に用いられる「デバイス組成物」の用語とは、特定のデバイスで達成するための組成物である。一実施形態において、前記デバイス組成物は、血液透析又は血漿交換システムに結合されてＣＫＤに付随する腎不全又はＣＶＤのリスクを軽減する必要のある被験者に用いられてよい。
【００７１】
一実施形態において、前記デバイス組成物は、第１の浄化画分及び第２の浄化画分に分けられる体外血液を浄化するための装置に結合されてよい。タンパク質に結合される毒素及び／又は血漿に溶解される毒素を除去することで、第２の浄化画分を発生させる。
【００７２】
一実施形態において、測定される生物試料（又は流体）は、血液、血清、血漿、腹水、尿及び生検標本を含む。
【００７３】
一実施形態において、測定される生物試料は、血漿タンパク質、つまりアルブミンを含む。
【００７４】
本公開によるある例示的な実施形態は下記の通りであるが、これらの実施形態は本発明に対する制限として考えられるべきではない。本発明の精神や範囲から逸脱せずに、当業者は、様々な修正や改変を加えることができる。
ＩＳの特異的結合用の組成物
【００７５】
本公開の一実施形態によると、ＩＳ結合分子を提供する。前記実施形態において、結合分子は、ＩＳの特異的認識／結合が可能な単離されたｍＡｂ及び／又はその抗原結合断片（以下、「抗ＩＳ  ｍＡｂ」と呼ばれる）であってよい。前記抗ＩＳ  ｍＡｂは、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み、前記ＶＨドメインは相補性決定領域（ＣＤＲ）‐Ｈ１、ＣＤＲ‐Ｈ２及びＣＤＲ‐Ｈ３を含み、且つ前記ＶＬドメインは可変領域ＣＤＲ‐Ｌ１、ＣＤＲ‐Ｌ２及びＣＤＲ‐Ｌ３を含む。ＣＤＲのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｈ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ２、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の何れかから選ばれるＣＤＲ‐Ｌ３のような配列の１つ又は複数の配列を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態において、抗ＩＳ  ｍＡｂのＶＨドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４であり、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％（又はその間の如何なる百分率）の同一性を有するように示す如何なる配列であってよい。同様に、いくつかの実施形態において、抗ＩＳ  ｍＡｂのＶＬドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９であり、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％（又はその間の如何なる百分率）の同一性を有するように示す如何なる配列であってよい。
ＩＳの検出や定量及び臨床診断用の免疫測定法
【００７７】
「免疫測定法」の用語とは、試料における分析物を検出する方法であり、前記方法は、試料を前記分析物に特異的結合される抗体に接触させること、及び前記抗体と前記分析物との結合を検出することを含む。本明細書に記載の免疫測定法は、ｍＡｂによる抗原‐抗体反応を利用する様々なタイプの免疫学又は生物学的診断技術に適用されてよい。このような測定方法は、放射免疫測定、免疫組織化学測定、インサイチュハイブリダイゼーション測定、競合結合測定、ウェスタンブロッティング分析及びＥＬＩＳＡ測定を含むが、それらに限定されない。また、このような測定技術は、（ａ）蛍光抗体又は化学的染色方法の使用、前記方法においてｍＡｂと抗原との連結の存在が視覚観察されるように、ｍＡｂは色素（例えば、蛍光色素）で標識され、（ｂ）蛍光色素の代わりに酵素を使用してｍＡｂを標識する酵素‐抗体方法、（ｃ）タンパクで標識された二次抗体によって抗原等の量を計測するＥＬＩＳＡ方法、（ｄ）ｍＡｂを同位体標識する放射免疫測定方法、及び（ｅ）抗原‐抗体反応による凝集反応を利用する免疫沈降法を含む。
【００７８】
本発明は、正常及び異常なレベルの確定を含む、生物試料におけるＩＳレベルを検出するための定量又は定性的免疫測定法に関する。ある実施形態において、生物試料は、血液、血清、血漿、腹水、尿、生検標本等であってよい。また、血漿タンパク質（つまりアルブミン）の存在下で生物試料を分析してよい。別の実施形態において、本発明の提供する免疫測定法は、上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを含み、且つ被験者から収集した生物試料の濃度によって推定される疾患又は疾病の診断に用いられることができる。前記生理病理学的状態又は臨床症状の一例示としては、尿毒症又はＣＫＤであってよい。
ＩＳ除去用のデバイス組成物
【００７９】
本公開の一実施形態によると、ＩＳの除去又は低減用のデバイス組成物を提供する。いくつかの実施形態において、上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを物理的支持用の固相と共役させ、前記固相は、例えば、アガロース、ガラス、プラスチック又は磁性樹脂ビーズ、透析膜及び中空繊維管である。また、単離された抗ＩＳ  ｍＡｂに共役した透析膜又は中空繊維管は、血液透析又は血漿交換システムに結合されてよい。
【００８０】
米国特許第８２０６５９１  Ｂ２号には、患者血液におけるアルブミンに結合される尿毒症毒素の除去方法が説明される。前記方法は、アルブミンに結合される尿毒症毒素が置換物質により置換されるように、置換物質を血液に導入することを含む。その後、血液が患者に戻る前に、体外の腎代替処理によって結合されていない尿毒症毒素を除去する。置換物質は、例えば、上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂである。前記方法は、経口投与の球形吸着炭、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）、アンジオテンシン受容体遮断剤（ＡＲＢ）及び活性ビタミンＤの他の薬物に組み合わせて使用されることが推奨される。
【００８１】
より具体的な実施形態において、還元的アミノ化反応を実行することで抗ＩＳ  ｍＡｂをアガロースビーズにカップリングさせ、ｍＡｂの共役されたビーズを空カラムに充填してＩＳ除去カラムを形成する。蠕動ポンプによって生体液を前記ＩＳ除去カラムを２回通過させる。未処理及び処理された血漿試料に対して定量的な質量スペクトル分析（液体クロマトグラフィ／タンデム質量分析、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ）を行って、ＩＳ除去率を評価する。ＩＳ除去率の百分率（％）は、（[ＩＳ、未処理]‐[ＩＳ、既処理]）／[ＩＳ、未処理×１００％から計算される。
被験者におけるＩＳの除去又は低減用の薬物組成物
【００８２】
本公開の一実施形態によると、被験者におけるＩＳを除去又は低減するための薬物組成物を提供する。抗ＩＳ  ｍＡｂの投与用量及びスケジュールは、ＩＳ関連疾患を治療する臨床分野における当業者により容易に確定されてよい。１種以上の適用において、所望の結果を取得するように、所望の用量を投与してよい。本発明の実施形態による薬物組成物は、単位剤形として提供されてよい。薬物組成物は、投与するための如何なる好適な薬理学的担体で投与されてよい。前記薬物組成物は、ヒト又は動物の患者において尿毒症の病症の予防、緩和、防護又は治愈を達成可能な如何なる形態として投与されてもよい。本発明の実施形態によって使用するために、単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤、及び活性成分としての単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ及び／又はその断片を含む薬物組成物として提供してよい。前記組成物は、ＩＳの細胞毒性又は尿毒症毒素の細胞生物学的受容体への天然結合に拮抗（完全に又は部分的に）する十分量の抗ＩＳ  ｍＡｂを含んでおり、例えば、患者におけるこのような拮抗を要求するアニオントランスポーター（ＯＡＴ）（１０）又は炭化水素受容体（ＡｈＲ）（１１）である。薬物組成物は、上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂの少なくとも１つの単離された抗ＩＳ  ｍＡｂを含んでよい。また、前記薬物組成物は、経口投与の球形吸着炭、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＲＢ）及び活性ビタミンＤの他の薬物に組み合わせて使用されてよい。いくつかの実践において、前記薬物は、例えば、ＡＳＴ‐１２０のような活性炭吸収剤であってよい。
単離された抗ＩＳ  ｍＡｂの可変領域のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列
【００８３】
本公開の一実施形態によると、更に、上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ及び／又はその抗原結合断片をコード化するポリヌクレオチド配列又はセグメントを提供する。いくつかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のＶＨドメインをコード化するポリヌクレオチド配列とは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すＤＮＡ配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％（又はその間の如何なる百分率）の同一性を共有する如何なるポリヌクレオチド配列である。その同時に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のＶＬドメインをコード化するポリヌクレオチド配列とは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示すＤＮＡ配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％（又はその間の如何なる百分率）の同一性を共有する如何なるポリヌクレオチド配列である。
【００８４】
或いは、前記実施形態の単離された核酸において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のＶＨドメインをコード化するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示す配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％（又はその間の如何なる百分率）の同一性を有するように示す如何なるヌクレオチド配列を含む。その同時に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のＶＬドメインをコード化する核酸断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示す配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％（又はその間の如何なる百分率）の同一性を有するように示す如何なるヌクレオチド配列を含む。
【００８５】
前記実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、前記のようなアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチド配列と基本的に同一である。基本的に同一である配列は、サイレント変異された配列を含む、誘発された配列を含んでもよい。変異は、１つ又は複数のヌクレオチド残基の変更、１つ又は複数のヌクレオチド残基の欠失、又は１つ又は複数の追加ヌクレオチド残基の挿入を含んでよい。核酸コドンの縮重により、基本的に同一である配列は、更に、本明細書の公開したアミノ酸配列における如何なる特定のアミノ酸の位置で同一のアミノ酸をコード化する様々なヌクレオチド配列を含んでよい。抗ＩＳ  ｍＡｂ及び／又はその抗原結合断片をコード化するポリヌクレオチド配列は、本分野における如何なる既知の方法によって取得されてよい。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知されるものであれば、化学合成されたオリゴヌクレオチドから前記抗体をコード化したポリヌクレオチドを組み立ててよい。これは、例えば、抗体をコード化する配列部分を含む重複するオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニール及び連結、及びその後のＰＣＲによる連結されるオリゴヌクレオチドの増幅に関する（１２）。
【００８６】
一般的に、抗ＩＳ  ｍＡｂ及び／又はその抗原結合断片をコード化するポリヌクレオチド配列は発現担体に組換えられてよく、前記発現担体において前記ポリヌクレオチド配列はオープンリーディングフレームのセグメントであってよい。いくつかの実践において、上記実施形態で提供されるように、発現担体を被験者又は宿主細胞に導入してＩＳを特異的認識するタンパク質生産物を発生させる。より詳しくは、前記実施形態のポリヌクレオチドセグメントは組換えＤＮＡ又はＲＮＡであり、且ついくつかの状況において、前記ポリヌクレオチドセグメントは非コード調節素子又は内含子によって単離されてよい。好ましくは、単離された核酸は、ｃＤＮＡ分子である。ｓｃＦｖ遺伝子を作成するために、コード化されたＶＨ及びＶＬのＤＮＡ断片を例えば、コード化されたアミノ酸配列（Ｇｌｙ４‐Ｓｅｒ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）の断片のような別のコード化された可撓性リンカーの断片に操作可能に連結して、ＶＨ配列及びＶＬ配列が連続した単鎖タンパクとして発現できるようにし、ＶＬ領域とＶＨ領域は前記可撓性リンカーによって共役される。ファージディスプレイ技術によって取得した抗体については、ライブラリーの様々なファージクローンからコード化された上記実施形態により提供される抗ＩＳ抗体の単離された核酸（１３）を回収することができる。公開されたポリヌクレオチドは、例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、又は前記抗体を発現する如何なる組織又は細胞から（例えば、発現抗体の選択されたハイブリドーマ細胞から）単離されたｃＤＮＡライブラリーのような如何なる他の好適な核酸供給源から発生してもよい。
【００８７】
いくつかの実施形態において、公開された如何なるポリヌクレオチド配列を発現担体に組み込んで、所望のプロモータの制御で発現してよい。様々なヒト及び動物細胞タイプに発現するための好適な担体は、本分野で既知される。好適な宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ピキアパストリス、ＳＦ９、大腸菌ＢＬ２１及び／又は他のヒト又は非ヒト細胞株を含んでよいが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、培養される細胞が発現担体における前記核酸を発現するたびに、一時的に又は安定的に発現するにも拘らず、本明細書では抗ＩＳ  ｍＡｂ及び／又はその抗原結合断片の発生方法を公開する。
５／６腎摘除（５／６  Ｎｘ）ラットの慢性腎不全疾患（ＣＫＤ）のモデル及び治療
【００８８】
片側尿管閉塞（ＵＵＯ）、ドキソルビシン（ＡＤＲ）腎臓病及び５／６  Ｎｘは、ＣＫＤの代表的な動物モデルである。ＵＵＯモデルは、尿細管を迅速且つ完全的に閉塞して、炎症性浸潤、尿細管細胞のアポトーシス、筋線維芽細胞（線維芽細胞）の活性化、フィブロネクチン及びＩ型コラーゲンの沈着を含む異なる病理学的病期及び繊維化の間の特徴を示す。ＡＤＲ腎臓病は、現在ヒト糸球体疾患の常用のシミュレーションモデルであり、顕性アルブミン尿、尿細管円柱、尿細管崩壊、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ、進行性巣状分節性硬化とも呼ばれる）及び糸球体硬化症、重度の腎間質及び炎症の形成を特徴とする。５／６  Ｎｘモデルは、動脈高血圧症、タンパク尿及び糸球体硬化症を特徴とする。これらの利用可能な実験モデルにおいて、ラットの５／６  Ｎｘは、進行性腎疾患の研究に最も一般的に用いられる。これは、前記実験手順の特徴は、ヒトで観察されたＣＫＤに共通するからである。５／６  Ｎｘは、新しい療法をテストするためにも作成され、臨床に関連していると証明された（１４、１５）。
【００８９】
よくＣＫＤと病理学的に関連する尿細管間質線維症は、持続的炎症性浸潤、細胞骨格タンパクα‐平滑筋アクチン（α‐ＳＭＡ）を発現する筋線維芽細胞の出現に伴う間葉細胞の数の増大、尿細管萎縮及び上皮細胞のアポトーシス、傍尿細管毛細血管の完全な破壊、及び細胞外基質（ＥＣＭ）の溜まりを含む多くの共通特徴を示す（１６）。正常な腎臓において、異なるコラーゲン分子の発生は、区画化されたものであり、尿細管上皮細胞（ＴＥＣ）はＩＶ型コラーゲンを発生させる主要な細胞であり、常駐型線維芽細胞はＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンを発生させる。尿細管間質線維症では、ＥＣＭの拡張は間質コラーゲンの溜まりをマーカーとし、且つ常駐型線維芽細胞はα‐ＳＭＡ陽性の筋線維芽細胞に分化転換する。また、一般的に糸球体及び尿細管基底膜に位置するＩＶ型コラーゲンの発現は制限されないようになり、且つ間質にも観察される。カスパーゼ切断サイトケラチン１８（Ｍ３０）の領域差異は、前記サイトケラチンが近位尿細管細胞から放出されて、且つ有足細胞が５／６  Ｎｘラットの腎障害により誘導されるアポトーシスを経過するため、治療スケジュールの薬力学的バイオマーカーと見られてよい。そのため、過剰なＥＣＭの沈着用のＩ型及びＩＶ型コラーゲン、糸球体硬化症評価用のα‐ＳＭＡ及び糸球体細胞のアポトーシス指数用のＭ３０によって組織学的染色及び専門的なＩＨＣ検査を行うことで、抗ＩＳ  ｍＡｂの介入したＩＳ関連の組織萎縮に対する影響を説明すべきである。
【００９０】
上記単離された抗ＩＳ  ｍＡｂ及び／又はその抗原結合断片の特性及び具体的な実践を説明するために、以下、幾つかの実施例を示す。
実施例
実施例１：抗原性ＩＳ複合体の調製
【００９１】
ハプテンのＩＳから完全抗原を調製するために、前記ＩＳのカリウム塩（サンタクルス生物技術公司（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を、Ｉｍｊｅｃｔ（商標）  Ｂｌｕｅ  Ｃａｒｒｉｅｒ（商標）タンパク（ＢＣＰ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）及びＤＡＤＰＡ（ジアミノジプロピルアミン）により架橋されるセファロースビーズ（ＣａｒｂｏｘｙＬｉｎｋ（商標）カップリングゲル、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）の一連の担体に材料と化学的カップリングさせた。簡単にいうと、１ｍＬのＰＢＳにおける１０ｍｇのＩＳと３つの担体材料を同じ調製（ＰＢＳでは１０ｍｇ／ｍＬである）でそれぞれ試験管において混合させた。前記２ｍＬの混合物に０．２５ｍＬの３７％のホルムアルデヒド又は５０％のグルタルアルデヒドを加えて、５０℃で７２時間インキュベートした（マンニッヒ型反応（１７））。カップリング反応後に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ‐２５樹脂（ＧＥ医療（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））カラムを使用してクロマトグラフィー方法によってＩＳ‐担体タンパク複合体を精製し、またブラッドフォード試薬（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｒｅａｇｅｎｔ）（バイオラド社（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ））によって前記ＩＳ‐担体タンパク複合体の濃度を測定した。ＩＳ‐ＤＡＤＰＡアガロース複合体に対して、カップリングしたゲルビーズを脱イオン水によって３回洗浄し、また５ｍＬのＰＢＳで再溶解した。
実施例２：ハイブリドーマ技術による抗ＩＳ  ｍＡｂの生成
【００９２】
上記のように調製した抗原性ＩＳ複合体を使用し、また２つの免疫経路を採用してマウス（８〜１０週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃ）を免疫化する。その１つの免疫経路は、一般的な腹腔内（ＩＰ）免疫であった。この経路において、ＩＳ‐ＢＣＰ／ＩＳ‐ＢＳＡ複合体（１００μＬのＰＢＳにおいて５０μｇである）又はＩＳ‐ＤＡＤＰＡアガロース複合体（１００μＬ）を、等体積の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ））又は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ、シグマアルドリッチ社）に混合させた。各マウスは、４週間内で、１回目の初回免疫及び３回の追加免疫を含んで４回免疫化された。もう一つの経路は、直接な脾臓免疫であった。まず、３４Ｇの針で５μＬのＰＢＳにおける５μｇのＩＳ‐ＢＣＰ複合体を５匹のマウスの脾臓に注射した。抗原反応の誘発に成功すると、これらのマウスに対して、後で皮下（ＳＣ）注射によってＩＳ‐ＢＣＰ複合体（２００μＬのＩＦＡにおいて５０μｇである）で３回追加免疫した。骨髄腫細胞と融合する前に、ＩＳの結合する脾細胞をＩＳ複合体の被覆された１０ｃｍの培養プレート（Ｎｕｎｃ（商標）、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）に付着させて富化させ、且つISと結合していない脾細胞を培地洗浄で洗い流した。この２つの経路において、毎回の免疫作用の前に、ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリーによってマウスの血清力価を監視し、且つ所望の力価に達すると、ハイブリドーマ選別を行うように、マウスを屠殺した。選別の基準は、単一クローンを構築するように（限界希釈）その上澄液に遊離形ＩＳの分布を認識可能な細胞を採取するが、それらのＩＳ複合体のみを認識するが遊離形ＩＳに対して反応性を有しなく又は未共役の担体に対して反応性を有する細胞破棄すべきであった。単離されたハイブリドーマ細胞株をＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部内に注射して、得られた腹水を収集した。所望の抗体を抽出するように、プロテインＡカラムによるアフィニィークロマトグラフィー（ＧＥ医療）によって収集した腹水を精製した。精製された抗体の最大濃度は、１０ｍｇ／ｍＬであった。
実施例３：競合的ＥＬＩＳＡによるｍＡｂ特異性のテスト
【００９３】
本明細書に記載の競合的ＥＬＩＳＡにおいて、遊離する分析物又は固定の捕集剤を引き受けるように、抗ＩＳ  ｍＡｂ又はＩＳ複合体は、交換可能に使用された。この２つの反応物の指定された作用は、実験設計に依存していた。
【００９４】
遊離する分析物として抗ＩＳ  ｍＡｂを使用する（ＩＳ複合体をマイクロタイタープレートに被覆する）場合、抗マウスＩｇＧ．Ｆｃγ断片の二次抗体（例えば、ＨＲＰ共役のヤギＩｇＧ）をレポーターとして使用してよかった。プレート被覆用のＩＳ複合体の濃度範囲は、５０ｎｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬであった。抗ＩＳ  ｍＡｂは、１０ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの範囲で使用されてよい。
【００９５】
抗ＩＳ  ｍＡｂが捕集剤として固定される場合、標準曲線を作成するように、ＩＳ分析物を酵素レポーターと共役させてよく、つまりこのような状況でＨＲＰであった。被覆は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの間の濃度で効果的に実行されることができる。ＩＳ‐ＨＲＰ複合体は、前節に示されるマンニッヒ型によって付加されて調製されてよく、且つ作業濃度範囲は１０ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬであった。１ｐｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの参照ＩＳ基準物質を使用して、標準曲線を作成してよい。
【００９６】
ｍＡｂ候補物の特異性を予備テストするために、競合的ＥＬＩＳＡにおいて、前記ｍＡｂ候補物のＩＳ、インドール、Ｌ‐トリプトファン及び３‐インドール酢酸（全ての化合物もシグマアルドリッチ社に由来する）に対する活性を比較した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェルを４℃でＩＳ‐ＢＳＡ複合体（０．５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）によって一晩被覆し、３７℃で３００μＬの３％のＢＳＡ含有のＰＢＳＴ（０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含有のＰＢＳ）によって１時間封止した後で、ＰＢＳＴで３回洗浄した。２０μｇ／ｍＬ化合物の加えられた粗精製されたｍＡｂ候補物（１６‐１２８ｎｇ／ｍＬ）の２倍段階希釈列及び上記ブロッキング緩衝液におけるブランク対照を抗原で被覆された各ウェルに加えた。室温下で３０〜６０分間インキュベートした後で、ウェルを吸引して３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、ＰＢＳＴにおいて１：５０００で使用される二次抗体、１００μＬのＨＲＰ共役のヤギＩｇＧ抗マウスＩｇＧ（偉喬生醫公司（Ｌｅａｄｇｅｎｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ））を各ウェルに注いで、室温下で更に３０分間インキュベートした。ＴＭＢ（３,３'，５,５'‐テトラメチルベンジジン）基質溶液（ＫＰＬ）を加えて発色させる前に、各ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した。色が匹敵するレベルに発色すると、０．１Ｎの硫酸を加えることで反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を計測するマイクロタイタープレート（分子計器社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ））によってｍＡｂ候補物の活性を分析した。テスト候補物の相対結合活性の百分率は、Ｂ／Ｂ0×１００％[（混合化合物のウェルの平均吸光度）／（ブランク対照ウェルの平均吸光度）]によって計算した。テスト候補物とＩＳの結合活性がインドール、Ｌ‐トリプトファン及び３‐インドール酢酸における競合物により有意に競合されると、前記テスト候補物（基準：ＢIS／Ｂ0<３０％、Ｂ競合物／Ｂ０>７０％）を選択すべきではなかった。
実施例４：抗ＩＳのｍＡｂの２つ単一クローンの特徴付け
【００９７】
連続した２回のスクリーニングによって、数十種類の候補物から、ＩＳに対して素敵な親和力及び特異性を有する２つのモノクローナル抗体ＬＧ３０３及びＬＧ３３２を選択した。図１Ａ及び図１Ｂに、ＬＧ３０３及びＬＧ３３２の滴定曲線及び推定Ｋｄ（平衡解離定数）を示し、且つこの２つのｍＡｂの何れもＩＳに対するスキャッチャード結合親和力を示した。
【００９８】
マウスｍＡｂアイソタイピングキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ））によってそれらのアイソタイプを同定し、前記キットはそれぞれＬＧ３０３をＩｇＧ１／κに、またＬＧ３３２をＩｇＧ２ａ／κに帰属させた。カップリングされた逆転写ＰＣＲ及びマウスＩｇプライマーセット（メルクミリポア社（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））によって、ハイブリドーマ細胞のｍＲＮＡ抽出物から抗体可変領域の遺伝子配列を解析した。ＬＧ３０３  ＶＨドメインのポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）をポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に翻訳し、且つ前記ポリペプチド配列の３つのＣＤＲ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＣＤＲ‐Ｈ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＣＤＲ‐Ｈ２）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＣＤＲ‐Ｈ３）であった。ＬＧ３０３  ＶＬドメインのポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）をポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に翻訳し、且つ前記ポリペプチド配列の３つのＣＤＲ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（ＣＤＲ‐Ｌ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（ＣＤＲ‐Ｌ２）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８（ＣＤＲ‐Ｌ３）であった。ＬＧ３３２  ＶＨドメインのポリヌクレオチド配列（ＳＥＣ  ＩＤ  ＮＯ：１５）をポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に翻訳し、その中の３つのＣＤＲ領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１（ＣＤＲ‐Ｈ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（ＣＤＲ‐Ｈ２）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３（ＣＤＲ‐Ｈ３）の配列を有していた。ＬＧ３３２  ＶＬドメインのポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）をポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に翻訳し、３つのＣＤＲ領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（ＣＤＲ‐Ｌ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７（ＣＤＲ‐Ｌ２）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８（ＣＤＲ‐Ｌ３）の配列を有していた。
【００９９】
競合的ＥＬＩＳＡによって、精製されたＬＧ３０３  ｍＡｂ及びＬＧ３３２  ｍＡｂ（１００ｎｇ／ｍＬ）の結合特異性を改めて検査し、前記競合的ＥＬＩＳＡは抗ＩＳ  ｍＡｂをプレートに被覆し、ＩＳ‐ＨＲＰ複合体を分析物として使用した。図２Ａ（ＩＳ）、図２Ｂ（Ｌ‐トリプトファン）、図２Ｃ（インドール）及び図２Ｄ（３‐インドール酢酸）には、０．１２５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの濃度の４つの化合物競合でのＬＧ３０３及びＬＧ３３２の結合活性の比較を示した。その結果、ＬＧ３０３及びＬＧ３３２は、ＩＳに対する高特異的結合を有し、Ｌ‐トリプトファン及びその他の代表的な生化学的代謝の生産物に対して有意な反応はなかったことが判明された。
実施例５：生物試料におけるＩＳの検出
【０１００】
特に干渉する血漿タンパク質が存在する場合、単離された抗ＩＳ  ｍＡｂが生物試料においてその抗原ターゲットを検出できるかを確定するために、異なる濃度のＩＳをヒト血清及び血漿に導入して競合的ＥＬＩＳＡによって評価した。それに対して、ここで、ＬＧ３３２を捕捉抗体として各ウェルの表面に被覆した。図３を参照すると、標準曲線が示され、ＬＧ３３２のＬｏＢ及びＬｏＤが表され、且つそのＬｏＤは約２５．２ｎｇ／ｍＬであった。
【０１０１】
表１にヒト血清及び血漿におけるＬＧ３３２の回収率を表し、前記回収率によると、我々の抗ＩＳ  ｍＡｂの結合活性がヒト血漿タンパク質（例えば、アルブミン）により干渉されないことが判明され、ヒト血漿タンパク質は血流で循環するＩＳを吸収すると考えられていた。
【０１０２】
2021523694.tif 000020
実施例６：生物試料におけるＩＳの除去
【０１０３】
それらが血漿からＩＳを除去できるかを検査するように、ＬＧ３０３及びＬＧ３３２をグリオキサールアガロースゲル（コロイド科学溶液公司の生物科学ビーズ支社（ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｂｅａｄ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ,Ｉｎｃ．））カラムに共役させた。この実施例において、ＩＳを約４０μｇ／ｍＬまでの濃度で２名の健康なドナーからの血漿試料に組み込んで、ＩＳ及びＰＣＳの合計のＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ定量を長庚記念醫院（台湾桃園）の実験医学科（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ,Ｃｈａｎｇ  Ｇｕｎｇ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  （Ｔａｏｙｕａｎ,Ｔａｉｗａｎ））によって行った。表２及び表３を参照すると、ＬＧ３３２は、ＬＧ３０３よりも良好なＩＳ除去率を表した。予期せぬことに、抗ＩＳ  ｍＡｂの治療の後で、別の重要なタンパク質結合尿毒症毒素ＰＣＳの濃度も減らした。ＰＣＳ及びＩＳがヒト血清アルブミンにおける同じ結合部位を競合する（１８）ため、血清アルブミンに結合される殆どのＩＳが抗ＩＳ  ｍＡｂにより置換される場合、この２つの有害物質の間の可能な不明関係は依然として調査中であった。
【０１０４】
2021523694.tif 000021
【０１０５】
2021523694.tif 000022
実施例７：抗ＩＳ  ｍＡｂの５／６  Ｎｘラットモデルでの効果
【０１０６】
上記のように、血液透析は、タンパク質結合尿毒症毒素を効果的に除去できなかった。前記実験動物モデルの多くの病理生理学的特徴がヒトで観察されたＣＫＤの共有するものであるため、５／６  Ｎｘラットにおいて、抗ＩＳ  ｍＡｂの治療用途での潜在力を研究してよかった。そのため、それらは、差異を研究するための好適な被験者と考えられ、前記差異は、例えば、抗ＩＳ  ｍＡｂの腎臓又は他の組織病変の形態に対する影響であった。
【０１０７】
簡単にいうと、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ(登録商標)ラット（体重が約３００ｇである）を、健康対照、５／６  Ｎｘ、対照抗体を有する５／６  Ｎｘ、ＬＧ３０３を有する５／６  Ｎｘ、ＬＧ３３２を有する５／６  Ｎｘ  を含む５つの群に分けた。全ての実験は、国立台湾成功大学（台湾台南）の生物化学と分子生物学科（ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｎｇ  Ｋｕｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  （Ｔａｉｎａｎ,Ｔａｉｗａｎ））により行われた。健康対照以外に、全ての動物群については、何れも０週目に腎臓手術を行って一週間休息させた。左腎を露出し、上下両極をポリグリコール酸縫合糸で結紮した後で、右腎摘除を行った。その後、腹膜及び皮膚を縫合して、動物を再びその各々のケージに置いた。ラット群によると、１週目〜５週目の期間中に、ｋｇ体重あたり１０ｍｇの抗体で抗体を週に１回腹腔内注射した。実験終了の時に、動物を過剰なペントタールナトリウムで安楽死させ、左心室にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１Ｍ）を注いでから、ホルムアルデヒド固定液を注入した。腎臓を取り出して、結合組織を取り除いてパラフィンワックスに埋め込んだ。腎臓及び心血管組織の組織学的分析としては、立衆バイオテクノロジー社（台湾台北）（Ｌｉｔｚｕｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．  （Ｔａｉｐｅｉ,Ｔａｉｗａｎ））によってサービスを提供した。
【０１０８】
本発明の一実施形態による動物モデルの実験手順を示すフロー図である図４を参照されたい。図４に示すように、ラットは、５／６  Ｎｘ又は偽対照を受けた。ラットを一週間休息させた後、前記のように、対照マウスＩｇＧ、ＬＧ３０３及びＬＧ３３２を注射した。４２日目（６週目）に、ラットを屠殺し、組織生検標本を収集して分析した。
【０１０９】
テスト動物のヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）により染色された腎臓（図５Ａ）及び心臓（図５Ｂ）の部分を示す図５Ａ〜図５Ｂを参照されたい。図５Ａにおいて、黄色矢印は糸球体硬化症を示し、赤色矢印は尿細管の空胞を示し、薄青色の矢印は間質繊維化を示し、且つ緑色矢印は炎症促進細胞浸潤を示した。図５Ｂにおいて、緑色矢印は心筋細胞の再配列を示し、且つ黄色矢印は免疫細胞浸潤を示した。図５Ａ〜図５Ｂの組織学的結果において、ＬＧ３０３により処理された実験群は他の実験群よりも少ない病理学的変化を示すことが発見された。図５Ａに示すように、５／６  Ｎｘラットは、糸球体硬化症、拡大した尿細管空胞、間質繊維化及び免疫細胞浸潤を罹患していた。対照ＩｇＧ及びＬＧ３３２で治療されるラットにおいて、現象が５／６  Ｎｘラットに類似であった。興味深いことに、ＬＧ３０３が５／６  Ｎｘラットに有益である可能性があることが発見された。本明細書では、炎症促進細胞浸潤及び他の病理学的変化が著しく減らしたことが発見された。また、対照ＩｇＧ及びＬＧ３３２に比べると、ＬＧ３０３で治療された後、心臓再配列が低減した（図５Ｂに示すように）。
【０１１０】
ＬＧ３０３の５／６  Ｎｘラットでの抗繊維化効果を更に同定するように、これらの心臓及び腎臓組織の生検標本をシリウスレッドで染色した。コラーゲン発現模式を観察するように、テスト動物のシリウスレッドで染色された腎臓及び心臓部分を示す図６を参照されたい。ＩＶ型コラーゲン抗体を使用するテスト動物の腎臓及び心臓切片を示すＩＨＣ画像であり、特定のコラーゲン観察を行うように、ＩＶ型コラーゲン抗体によってラットの腎臓及び心臓切片に対してＩＨＣを実行した図７を参照されたい。対照抗体及び健常な擬似の与えられた動物群に比べると、図６及び図７により、抗ＩＳ  ｍＡｂ処理のされたラットはＥＣＭ  Ｉ型コラーゲン及びＩＶ型コラーゲンの発現が減少する趨勢にあることが判明された。図８は、α‐ＳＭＡ抗体を使用するテスト動物の腎臓及び心臓切片を示すＩＨＣ画像であり、前記α‐ＳＭＡ抗体は線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化転換（赤色矢印の指す暗褐色領域）を同定することに用いられる。図８に示すように、抗ＩＳ  ｍＡｂによりα‐ＳＭＡの発現が明らかに減少したが、ＬＧ３０３の性能がＬＧ３３２の性能よりも優れていた。ＬＧ３０３のＬＧ３３２に対する優勢は、図６及び図７で可視化された過剰なコラーゲン沈着に対する活性抑制と一致であった。
【０１１１】
図９は、Ｍ３０抗体を使用したテスト動物における腎障害による腎臓及び心臓病変を示す組織病理図であり、前記Ｍ３０抗体はアポトーシスイベントを検出することに用いられた（赤色矢印により指される）。Ｍ３０の免疫染色によると、心臓ではなく腎臓からの切片のみに、アポトーシス細胞死が同定され、且つ抗ＩＳ  ｍＡｂは糸球体細胞、特に上皮細胞における予期しないアポトーシスの発生を阻止した。一旦、このようなｍＡｂが臨床に適用されると、ＣＫＤ患者の腎機能を保留又は救済することができる。
【０１１２】
まとめて言えば、上記の実験結果は、選ばれたＣＫＤ動物モデルにおいて、単離された抗ＩＳ  ｍＡｂの投与が腎臓及び心臓の細胞に対して顕著な抗繊維化及び抗アポトーシスエフェクターを果たすことを支持する。また、これらの結果は、前途有望であり、特異性ｍＡｂによってＩＳを中和させることで、ＩＳ関連の病理症状を軽減できることも判明した。
【０１１３】
以上、特定の実施形態を参照して本発明について説明してきたが、前記の公開内容に多種の修正、様々な改変及び取り替えを加えることを図っており、且つ理解すべきなのは、いくつかの状況で、説明された本発明の範囲や精神から逸脱せずに、対応的に他の特徴を使用しないで、本発明の実施形態のいくつかの特徴を採用する。そのため、本発明の精神や特許請求の範囲は、上記で説明された例示的な実施形態の説明に限定されるべきではない。
【０１１４】
参照文献
1.Meyer, T. W., and T. H. Hostetter.2007.Uremia.N. Engl.J. Med.357:1316-1325.
2.Vanholder, R., R. De Smet, and N. Lameire.2001.Protein-bound uremic solutes: the forgotten toxins.Kidney Int.Suppl.78:S266-270.
3.Lee, C.-T., C.-C. Kuo, Y.-M. Chen, C.-Y. Hsu, W.-C. Lee, Y.-C. Tsai, H.-Y. Ng, L.-C. Kuo, T. T.-Y. Chiou, Y.-K. Yang, B.-C. Cheng, and J.-B. Chen.2010.Factors associated with blood concentrations of indoxyl sulfate and p-cresol in patients undergoing peritoneal dialysis.Perit.Dial.Int.J. Int.Soc.Perit.Dial.30:456-463.
4.Wu, I.-W., K.-H. Hsu, C.-C. Lee, C.-Y. Sun, H.-J. Hsu, C.-J. Tsai, C.-Y. Tzen, Y.-C. Wang, C.-Y. Lin, and M.-S. Wu.2011. p-Cresyl sulphate and indoxyl sulphate predict progression of chronic kidney disease.Nephrol.Dial.Transpl.Assoc.-Eur.Ren.Assoc.26:938-947.
5.Schulman, G., T. Berl, G. J. Beck, G. Remuzzi, E. Ritz, K. Arita, A. Kato, and M. Shimizu.2015.Randomized Placebo-Controlled EPPIC Trials of AST-120 in CKD.J. Am.Soc.Nephrol.JASN 26:1732-1746.
6.Yamaguchi, J., T. Tanaka, and R. Inagi.2017.Effect of AST-120 in Chronic Kidney Disease Treatment:Still a Controversy Nephron 135:201-206.
7.Lin, C.-N., I.-W. Wu, Y.-F. Huang, S.-Y. Peng, Y.-C. Huang, and H.-C. Ning.2018.Measuring serum total and free indoxyl sulfate and p-cresyl sulfate in chronic kidney disease using UPLC-MS/MS.J. Food Drug Anal.
8.Al Za’abi, M., B. Ali, and M. Al Toubi.2013.HPLC-fluorescence method for measurement of the uremic toxin indoxyl sulfate in plasma.J. Chromatogr.Sci.51:40-43.
9.Hoshi, H., K. Kikuchi, Y. Itoh, and A. Konagai.2015.Indoxyl sulfate measurement method.US20150355171A1.
10.Taki, K., S. Nakamura, M. Miglinas, A. Enomoto, and T. Niwa.2006.Accumulation of indoxyl sulfate in OAT1/3-positive tubular cells in kidneys of patients with chronic renal failure.J. Ren.Nutr.Off.J. Counc.Ren.Nutr.Natl.Kidney Found.16:199-203.
11.Ito, S., M. Osaka, T. Edamatsu, Y. Itoh, and M. Yoshida.2016.Crucial Role of the Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in Indoxyl Sulfate-Induced Vascular Inflammation.J. Atheroscler.Thromb.23:960-975.
12.Essono, S., Y. Frobert, J. Grassi, C. Creminon, and D. Boquet.2003.A general method allowing the design of oligonucleotide primers to amplify the variable regions from immunoglobulin cDNA.J. Immunol.Methods 279:251-266.
13.McCafferty, J., A. D. Griffiths, G. Winter, and D. J. Chiswell.1990.Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains.Nature 348:552-554.
14.Dai, C., L. P. Kiss, and Y. Liu.2008.Animal Models of Kidney Diseases.In Sourcebook of Models for Biomedical Research P. M. Conn, ed. Humana Press, Totowa, NJ.657-664.
15.Yang, H.-C., Y. Zuo, and A. B. Fogo.2010.Models of chronic kidney disease.Drug Discov.Today Dis.Models 7:13-19.
Nangaku, M. 2004.Mechanisms of tubulointerstitial injury in the kidney: final common pathways to end-stage renal failure.Intern.Med.Tokyo Jpn.43:9-17.
17.Miwa, A., M. Yoshioka, A. Shirahata, and Z. Tamura.1977.Preparation of specific antibodies to catecholamines and L-3,4-dihydroxyphenylalanine.I. Preparation of the conjugates.Chem.Pharm.Bull.(Tokyo) 25:1904-1910.
18.Watanabe, H., T. Noguchi, Y. Miyamoto, D. Kadowaki, S. Kotani, M. Nakajima, S. Miyamura, Y. Ishima, M. Otagiri, and T. Maruyama.2012.Interaction between two sulfate-conjugated uremic toxins, p-cresyl sulfate and indoxyl sulfate, during binding with human serum albumin.Drug Metab.Dispos.Biol.Fate Chem.40:1423-1428.
【国際調査報告】
2021523694.tif 000023
2021523694.tif 000024
2021523694.tif 000025
2021523694.tif 000026
2021523694.tif 000027