(57)【要約】  本発明は、タンパク質過剰のコンジュゲーション割合の髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の膜小胞コンジュゲートとＧＭ３ガングリオシドとを含む有効成分を含み、リンパ球Ｔ応答及び腫瘍患者の生存に影響を及ぼす骨髄由来抑制細胞の簡便で有意な減少を誘導するので、免疫調節剤として有利な特性を付与するナノ粒子システムに関連する、サイズ、表面電荷及び形態に関する特別な特徴を有する医薬組成物に関する。本発明はさらに、がん、特に骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の増加を有するがん型の治療のための開示される医薬組成物の使用；及びこの組成物でがん患者を治療する方法、及びこの治療を受ける患者を選択する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）とＧＭ３ガングリオシドの疎水性コンジュゲーションによって形成されたナノ粒子を含む、がん患者の免疫応答を免疫調節するための医薬組成物であって、タンパク質−ガングリオシドコンジュゲーション比は１．５：１〜１０：１に及ぶ、上記医薬組成物。
【請求項２】
１５〜２５ｎｍの範囲の粒径の体積の単峰性分布、０．２３０の多分散指数、２５〜４５ｍＶの範囲の公称値を有する負のＺ電位を特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
がんの治療における請求項１又は２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４】
がんを有する患者における骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の免疫調節剤としての請求項１又は２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５】
治療を必要とする対象を治療する方法であって、少なくとも合計４回の投与の間、毎週の頻度で、その後、少なくとも６ヶ月間、隔週又は毎月の維持投与で、ＳＣ、皮内、筋肉内、腫瘍内経路により、又は粘膜表面への直接施用により、請求項１又は２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の医薬組成物による治療を受ける候補としてがんを有する患者を選択する方法であって、
−患者から血液及び／又は腫瘍組織の試料を抽出するステップと、
−血液及び／又は腫瘍組織の試料中のＭＤＳＣのレベルを決定するステップと
を含む、上記方法。
【請求項７】
選択された患者が、血液中の高頻度又は絶対数のＭＤＳＣを有する患者である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
選択された患者が、ＭＤＳＣの浸潤の程度に関して陽性である患者である、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫ナノテクノロジー及び免疫腫瘍学の分野、特にがん及び／又は慢性感染症を有する個体を治療するための免疫調節剤に関する。本発明は特に、これらの個体の骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣｓ）（ＭＤＳＣ）を特異的に妨害し、またＴ細胞応答を回復することに特化したナノ粒子免疫調節剤について記載する。
【背景技術】
【０００２】
近年、患者の生存に大きな影響を及ぼす長期的な客観的反応を誘発する能力を有する免疫チェックポイント阻害抗体（Ａｂｓ）を使用して重要な臨床結果が得られている。免疫系を調節し、腫瘍細胞を破壊する患者の能力を回復するこれらの治療法は、新たな免疫調節剤の設計に特に焦点を当てたがん免疫療法の再生をもたらしている。
【０００３】
しかしながら、新たな免疫調節剤の開発のための重要な標的である、抗腫瘍免疫応答の他の抑制回路が存在する（Ｍａｌｍｂｅｒｇ  Ｋ．Ｊ．ら（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５３（１０）：８７９〜９２）。骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣｓ）は、免疫応答を抑制する能力を有する腫瘍によって動員される主要な細胞集団の１つを構成する（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ  Ａ．ら（２０１０）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２（２）：２３１〜７；Ｃｏｎｄａｍｉｎｅ  Ｔ．ら（２０１１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２（１）：１９〜２５）。特に、総説論文においてＳｈｉｐｐらによって提案されるように、循環ＭＤＳＣの頻度は、多種多様な位置からの腫瘍を有する患者の予後不良の因子である。さらに、これらの集団の循環レベルが高いことは、化学療法、放射線療法、及びさらには抗チェックポイントＡｂｓなどの従来の療法の有益性が低いことと関連している（Ｓｈｉｐｐ  Ｃ．ら（２０１６）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ７３（２１）：４０４３〜６１）。ヒトでは、一般的なコンセンサスとして、ＬＩＮ−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−として定義される初期ＭＤＳＣ（ｅＭＤＳＣ）；ＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ低／−／−として定義される単球性ＭＤＳＣ（ｍＭＤＳＣ）、及びＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＣＤ１４−ＣＤ１５＋（ＣＤ６６ｂ＋）表現型を有する顆粒球性ＭＤＳＣ（ｇＭＤＳＣ）のＭＤＳＣの３つの集団が記載されている（Ｂｒｏｎｔｅ  Ｖ．ら（２０１６）Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ７：１２１５０）。３つの集団全てが腫瘍特異的免疫応答の抑制因子であると考えられている（Ｓｈｉｐｐ  Ｃ．ら（２０１６）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ、Ｓｃｉ  ７３（２１）：４０４３〜６１）。
【０００４】
ＭＤＳＣによって誘導される免疫抑制に対抗するために現在開発されている研究戦略は、（１）数を減少させる、（２）機能に影響を及ぼす、及び（３）分化に影響を及ぼすという３つのアプローチに焦点を当てている。これらの方向で、評価された薬物のいくつかで有望な結果が既に報告されている（Ｎａｊｊａｒ  Ｙ．Ｇ．ら（２０１３）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３（４９）：１〜９）。
【０００５】
ＭＤＳＣを標的とする治療戦略内で本発明に特に関連するのは、ナノ粒子システムに基づく戦略である。ナノ粒子は幅広い用途を提供し、サイズ及び表面特性に応じて、インビボでの挙動が異なることが知られている。例えば、サイズは、排出部位を決定し、表面特性は、接着及び捕捉機序に影響を及ぼす（Ｗｉｌｋｅｒｓｏｎ  Ａ．ら（２０１７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：１８４３〜５７）。この意味で、Ｓｅｒｄａ  Ｒ．Ｅ．によって報告されるように、５００〜２０００ｎｍの範囲の直径を有する粒子システムは注入部位で優先的に捕捉され、リンパ節（ＬＮ）に移動するが、直径２０〜２００ｎｍを有する粒子はＬＮに受動的に排出して、そこで常在細胞と相互作用する（Ｓｅｒｄａ  Ｒ．Ｅ．（２０１３）Ｉｎｔ  Ｊ  ｏｆ  Ｎａｎｏｍｅｄ  ８：１６８３〜１６９６）。
【０００６】
これまでに、ＭＤＳＣに対する効果を有する６つのナノ粒子ベースの戦略のみが記載されているが、その中には、ゲムシタビンを搭載したナノ粒子、ケモカインＣＣＬ２１を搭載したナノ粒子、ＣｐＧを搭載したナノ粒子、全トランス型レチノイン酸を搭載したリポソーム、及びグルカンで設計されたナノ粒子がある（Ｗｉｌｋｅｒｓｏｎ  Ａ．ら（２０１７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：１８４３〜５７）。これらの５つの戦略は、３つの基本的な特性を共有する：ナノ粒子のサイズが３０〜２５０ｎｍの範囲に含まれ、その使用がマウスモデルに限定され、それ自体ＭＤＳＣに対する効果を有さないで粒子を構成するが、生物学的薬剤の担体系である。
【０００７】
ＭＤＳＣに対する効果を有するナノ粒子システムに基づく６番目の戦略は、ＧＭ３ガングリオシドを含有する非常に小さなプロテオリポソーム（ＶＳＳＰ）の使用である。これらの調製物を、本発明に最も近い技術的解決策とみなすことができる。最初に、Ｍｏｌｉｎａらが、米国特許第８，５９１，９１７号明細書で、皮下（ＳＣ）投与されるＶＳＳＰを使用して、対象の免疫応答を刺激する方法を記載している。さらに、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら及びＯｌｉｖｅｒらの研究が、健康な担腫瘍マウス又は化学療法誘発性白血球減少症を有するマウスで、ＶＳＳＰの投与が、脾臓において、ＭＤＳＣと類似の表現型を有するが、抑制能力が著しく減少した細胞の有意な増加を誘導することを実証した（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ａ．ら（２０１１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８６：２６４〜７４；Ｏｌｉｖｅｒ  Ｌ．ら（２０１２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：２９６３〜７２）。他の研究でも、担腫瘍マウスにおけるＶＳＳＰの使用により、腫瘍によって誘導されるＭＤＳＣによる抗原の交差提示が防止され、抗原提示細胞への分化が誘導されることが記載されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ａ．ら（２０１４）Ｊ  ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ２：５）。これらのＶＳＳＰを入手する方法は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）タンパク質のコンジュゲーションを界面活性剤の存在下で過剰のガングリオシドＧＭ３と混合し、次いで、界面活性剤を透析法によって除去することを強調している、米国特許第６，１４９，９２１号明細書でＲｏｄｒｉｇｕｅｚらによって記載されている。さらに、Ｅｓｔｅｖｅｚらが、透析後、より大きな質量及びサイズを有するコンジュゲートを廃棄する超遠心分離工程が行われることを記載している（Ｅｓｔｅｖｅｚ  Ｆ．ら（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：１９０〜７）。
【０００８】
本発明に記載される免疫調節調製物の新規な有効成分も、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）膜小胞とＧＭ３ガングリオシドのコンジュゲートを含む。この調製物は、いずれの技術的解決策にも以前の科学刊行物にもこれまで記載されたことはなかったナノ粒子システムに関連するサイズ、表面電荷及び形態の特定の特性を有している。これらの特性は、この新たな発明に、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ａ．ら及びＯｌｉｖｅｒ  Ｌ．らによって以前記載されたものと比較して、ＭＤＳＣに対する効果の点で、有利で驚くべき性質を提供する。本発明は、好ましくは腫瘍を有する患者を治療するためにＳＣによって投与され、先行技術が教示するものと対照的に、ｇＭＤＳＣｓ及びｍＭＤＳＣｓの好都合で有意な減少を誘導し、Ｔリンパ球の応答及び治療される患者の生存に影響を及ぼす。したがって、本発明の新規性は、腫瘍を有する患者のＭＤＳＣレベルの低下に効果を有する新たな免疫調節剤を提供することからなる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一実施形態は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）とＧＭ３ガングリオシドの疎水性コンジュゲーションによって形成されたナノ粒子を含む、がん患者の免疫応答を免疫調節するための医薬組成物であって、タンパク質−ガングリオシドコンジュゲーション比は１．５：１〜１０：１に及ぶ、医薬組成物である。
【００１０】
特に、前記組成物は、１５〜２５ｎｍの範囲の粒径のサイズの単峰性分布、０．２３０の多分散指数、２５〜４５ｍＶの範囲の公称値を有する負のＺ電位を特徴とする。
【００１１】
特定の実施形態では、本発明は、がんの治療における、特にＭＤＳＣの存在を増加させるがんを有する患者におけるこれらの細胞の免疫調節剤としての、本発明の医薬組成物対象の使用に関する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象を治療する方法であって、少なくとも合計４回の投与の間、毎週の頻度で、その後、少なくとも６ヶ月間、隔週又は毎月の維持投与で、ＳＣ経路、皮内、筋肉内、腫瘍内により、又は粘膜への直接施用により、本発明に記載される医薬組成物を投与するステップを含む方法に関する。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明の目的が、記載される医薬組成物による治療を受ける候補としてがんを有する患者を選択する方法であって、
−患者から血液及び／又は腫瘍組織の試料を抽出するステップと、
−血液及び／又は腫瘍組織の試料中のＭＤＳＣのレベルを決定するステップと
を含む方法である。
【００１４】
血液中の高頻度もしくは高絶対数のＭＤＳＣを有する患者、又は腫瘍組織中のＭＤＳＣの浸潤の程度に関して陽性であると試験された患者が、このような治療の候補とみなされる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
免疫調節組成物
本発明は、循環している又は腫瘍中のＭＤＳＣのレベルが高いがんを有する患者で、循環ＭＤＳＣを有意に減少させる免疫調節システムを提供する。免疫調節システムは、ＭＤＳＣの場合のように、免疫応答の抑制メディエーターのいずれかを排除又は調節することができるものとして定義することができる。
【００１６】
本発明において特許請求される免疫調節対象は、ＧＭ３ガングリオシドに関連するグラム陰性菌、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜から得られるナノ粒子からなる。本発明は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＯＭＰＣを、最初に、撹拌反応器中で、デオキシコール酸ナトリウム（１０〜４０ｍＭ）及びドデシル硫酸ナトリウム（１〜１０ｍＭ）の混合物を含有するトリス−ＨＣｌ緩衝溶液中に１〜３６時間に及ぶ一定時間分散することを確立する。
【００１７】
次に、ＯＭＰＣの添加質量よりも０．６〜１０倍少ない質量のＧＭ３ガングリオシドを添加して、タンパク質：ガングリオシド比が１．５：１〜１０：１になるようにし、撹拌を延長する。ナノ粒子の形成を、１０ｋＤａ〜１００ｋＤａの膜及び１．１５〜１．７５ｂａｒの膜間圧を有する接線流濾過システムの使用を通して達成して、界面活性剤を完全に除去する。限外濾過した残余溶液を１０００００ｇで超遠心分離し、濃縮して、その濃度を０．１〜２ｍｇ／ｍｌのＯＭＰＣの望ましい投与量に調整し、無菌０．２μｍ孔径カプセルでの濾過によって滅菌する。
【００１８】
制御された条件下でのタンパク質の量及び接線流限外濾過の工程に有利な比のタンパク質の質量とガングリオシドのコンジュゲーションにより、ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄと命名した規定の特性を備えた調製物が得られる。粒子の形態、サイズ及び表面電荷密度の分析により、サイズが１５〜２５ｎｍで、２５〜４５ｍＶに及ぶ公称値の負のＺ電位を有する、不均質なナノ粒子製剤の存在が示される。
【００１９】
ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄによる治療のための患者の特定及び／又は選択の方法
ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄが投与される患者を選択するために、腫瘍に対するＴ特異的応答を抑制することができるｇＭＤＳＣ及びｍＭＤＳＣのレベルを決定する。腫瘍の存在によるＭＤＳＣの増加は、循環中又は腫瘍微小環境中のこれらの細胞の異なる亜集団の評価によって決定することができる。さらに、その存在は一定の血漿タンパク質及び循環ＤＮＡの増加を意味する。評価用の試料の供給源には、それだけに限らないが、腫瘍生検、循環血漿タンパク質、腹水及び循環ＤＮＡを含む末梢血試料と腫瘍試料の両方が含まれる。
【００２０】
これらの細胞の増加は、フローサイトメトリー、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法又はポリメラーゼ連鎖反応を使用した診断又は予後アッセイによって決定することができる。他方、病期又は腫瘍位置のためにＭＤＳＣレベルが増加していない患者は、正常な健康なドナーよりもレベルが高いが、同じ病状の患者で観察される相当なレベルに達していない患者である。
【００２１】
患者の血液試料中のＭＤＳＣのレベルの決定は、両集団をＦＳＣ中／高／ＳＳＣ低／高領域内で分析するフローサイトメトリーによって行う。特に、ｇＭＤＳＣ集団では、ＣＤ１１ｂとＣＤ３３のダブルポジティブ集団を選択し、その中でＣＤ６６ｂが陽性で、ＣＤ１４が陰性の亜集団を選択する。ｍＭＤＳＣについては、ＨＬＡ−ＤＲの発現が陰性又は低く、ＣＤ１４が陽性の集団を選択する。これらの結果に基づいて、年齢及び性別が一致した健康なドナーに対する同じ決定に関連して、ＭＤＳＣのレベルを、その頻度又は絶対数に従って、以下のように分類することができる：
−陰性：９５％の信頼度で正常値の平均（Ｍ）＋／−標準偏差によって決定される範囲内の割合及び／又は数の値。
−弱：Ｍに関して、割合及び／又は数の値２Ｍ≦ＭＤＳＣ＜３Ｍ。
−高：割合及び／又は数の値３Ｍ≦ＭＤＳＣ。
【００２２】
血液中に高頻度又は絶対数のＭＤＳＣを有する患者がＶＳＳＰ−ｉＭｏｄで治療される。
【００２３】
腫瘍組織の試料中のＭＤＳＣのレベルを決定するために、ＣＤ３３＋細胞のＩＨＣ技術による測定を使用することができる。この目的のために、組織内のＣＤ３３＋細胞の割合を決定しなければならず、これは以下のように表される：
−陰性：陽性細胞の１０％未満
−陽性／低浸潤ＭＤＳＣ：陽性細胞の１０〜１９％
−陽性／高浸潤ＭＤＳＣ：陽性細胞の２０％超
【００２４】
ＣＤ３３＋細胞による浸潤の程度に関して陽性である限り、その組織型及び病期に応じて、腫瘍がＭＤＳＣを動員すると考えることができる。
【００２５】
治療用途及び治療方法
本発明は、ＭＤＳＣが抗腫瘍免疫応答の必須抑制ノードを構成することが知られている免疫腫瘍学に特有の目的の解決策を確立する、ｇＭＤＳＣ表現型とｍＭＤＳＣ表現型の両方のＭＤＳＣを減少させることに特化した免疫調節組成物を提供する。
【００２６】
一定の腫瘍の進行には、ＭＤＳＣの腫瘍部位への動員が伴い、これに関してはＴ及びＮＫリンパ球の抗腫瘍免疫応答を抑制する特殊な機序が記載されている。本発明は、循環中及び／又は腫瘍中のｇＭＤＳＣ及び／又はｍＭＤＳＣが上昇している患者において、ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄでの治療によってこれらの細胞の数を有意に減少させることができることを提案する。この減少により、これらの患者では、自然な抗腫瘍免疫応答、又は一部の療法によって誘導された免疫応答がＭＤＳＣによって抑制されないことが可能になり、これが治療される患者の生存となる。
【００２７】
本発明のＶＳＳＰ−ｉＭｏｄ免疫調節剤は、ＳＣ、皮内、筋肉内、腫瘍内経路により、又は粘膜への直接施用により患者に導入することができる。
【００２８】
本発明のＶＳＳＰ−ｉＭｏｄ免疫調節剤対象で治療することができるがん型の中には、抗腫瘍免疫応答の免疫抑制機序としてＭＤＳＣを動員することが報告されているがんがある。より具体的には、これらのがんの例としては、黒色腫、前立腺がん、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、肝細胞がん、非小細胞肺がん、慢性リンパ性白血病、食道の扁平上皮がん、ホジキンリンパ腫、腎がん及び乳がんが挙げられる。
【００２９】
ヒトで使用されるＶＳＳＰ−ｉＭｏｄ免疫調節剤の用量範囲は、１００μｇ〜２ｍｇ、好ましくは２００μｇ〜１２００μｇ（ＯＭＰＣ含有量による）である。
【００３０】
前記免疫調節剤は、ＭＤＳＣの急速な減少を達成するために少なくとも合計４回の投与の間、毎週の頻度で、その後、少なくとも６ヶ月間、隔週又は毎月の維持投与で、対象に投与される。この治療は、患者が必要とする限り、慢性的に投与することができる。
【００３１】
本発明を、以下の例及び図面を用いてさらに詳述する。しかしながら、これらの例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。これらの例には、ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄの特定の物理化学的特性、及び治療される患者のＭＤＳＣ含有量の減少に対するその有効性を検証することを可能にする実験の詳細が含まれる。さらに、これらの例は、この減少のＴリンパ球応答ならびに治療される患者の生存に対する影響についても示している。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄ粒子の直径の光子相関分光法による評価を示す図である。
【図２】ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄ粒子のＺ電位の光子相関分光法による評価を示す図である。
【図３】原子間力顕微鏡によるＶＳＳＰ−ｉＭｏｄ粒子の形態の画像である。
【図４Ａ】ｇＭＤＳＣの頻度の転移性腎細胞がん（ｍＲＣＣ）を有する患者におけるＶＳＳＰ−ｉＭｏｄによる治療の効果のフローサイトメトリーによる評価を示す図である。
【図４Ｂ】中央値の上下にｇＭＤＳＣの頻度を有する患者の割合の転移性腎細胞がん（ｍＲＣＣ）を有する患者におけるＶＳＳＰ−ｉＭｏｄによる治療の効果のフローサイトメトリーによる評価を示す図である。
【図５Ａ】ＭＤＳＣがＴＣＤ４＋リンパ球の増殖を抑制する能力に対するＶＳＳＰ−ｉＭｏｄによる治療の効果のフローサイトメトリーによる評価を示す図である。
【図５Ｂ】ＭＤＳＣがＴＣＤ８＋リンパ球の増殖を抑制する能力に対するＶＳＳＰ−ｉＭｏｄによる治療の効果のフローサイトメトリーによる評価を示す図である。
【図６Ａ】中央値の上下にｇＭＤＳＣ頻度を有する患者の頻度及び％に対する、ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄによる治療の効果の乳がんを有する患者におけるフローサイトメトリー評価を示す図である。
【図６Ｂ】中央値の上下にｍＭＤＳＣ頻度を有する患者の頻度及び％に対する、ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄによる治療の効果の乳がんを有する患者におけるフローサイトメトリー評価を示す図である。
【図７】乳がんを有する患者のＴＣＤ８＋リンパ球の絶対数に対するＶＳＳＰ−ｉＭｏｄによる治療の効果のフローサイトメトリーによる決定を示す図である。
【００３３】
例
例１  ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄは規定のサイズ及び表面電荷を有する。
ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄを構成する粒子のサイズ（ｎｍ）及びＺ電位を、光子相関分光法によって測定した。試料を３連で評価し、サイズ及び電位Ｚ値を、それぞれＣＯＮＴＩＮアルゴリズム及びＳｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉアルゴリズムを使用して取得した。図１に示されるように、ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄは、体積分布で１５〜２５ｎｍの範囲の単峰性分布を示し、多分散指数（ＰＤＩ）が０．２３０であり、このことは粒子の不均質な製剤が存在することを意味する。さらに、図２に示されるように、ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄは負のＺ電位を示し、その公称値は２５〜４５ｍＶの範囲であった。
【００３４】
例２  ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄのナノ粒子形態。
ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄの画像を、マルチモード原子間力顕微鏡で取得し、シリコンカンチレバーを使用した。５０μＬの試料を、５０ｍｏｌ／Ｌ塩化ニッケル溶液で事前に官能化したマイカに適用した。マイカに適用する前に、ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄに対するトリス緩衝溶液１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ８．５による１／１０希釈を実施した。図３の画像は、光子相関分光法によって得られた結果と完全に一致する、数十ナノメートル程度の球状性質のナノ粒子構造で構成される不均質な製剤を示している。
【００３５】
例３  ＶＳＳＰはｍＲＣＣを有する患者のＭＤＳＣの頻度及び抑制活性を減少させる。
ｍＲＣＣを有する患者のＭＤＳＣに対するＶＳＳＰ−ｉＭｏｄの効果を評価した。この目的のために、この診断を受けた１５人の患者を、三角筋部にＳＣ経路で投与される４００μｇのＶＳＳＰ−ｉＭｏｄで治療した。合計４回の投与のＶＳＳＰ−ｉＭｏｄを毎週の頻度で、引き続いて６ヶ月の治療が完了するまで毎月の維持投与で投与した。このアッセイでは、ｇＭＤＳＣの頻度をフローサイトメトリーによって評価した。この目的のために、合計２００，０００個の細胞を分析し、総ＰＢＭＣ内のＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ６６ｂ＋／ＣＤ１４−表現型を測定することによって、ｇＭＤＳＣの割合を決定した。対照として、年齢及び性別が一致した１５人の健康なドナーにおけるｇＭＤＳＣの頻度を評価した。図４Ａに見られるように、ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄは、治療開始後２１日又は３回の投与後の患者の循環ｇＭＤＳＣの頻度を減少させた。先行技術は、一定の位置の患者について確立された中央値を下回るｇＭＤＳＣを示す患者が、それを下回るレベルの患者よりも有意に高い生存を有することを教示している（Ｓｈｉｐｐ  Ｃ．ら（２０１６）Ｃｅｌｌ、Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ、Ｓｃｉ．７３（２１）：４０４３〜６１）。中央値の上下にｇＭＤＳＣ頻度を有する患者の割合の分析を図４Ｂに示す。ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄによる治療後に観察することができるように、治療される患者の約２０％のみがＭＤＳＣを高い状態で維持している。この結果は１４７日目又は５ヶ月目以降にも維持され、ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄのこの効果が治療全体を通じて維持されていることを示している。
【００３６】
これらの患者では、ＭＤＳＣに対するＶＳＳＰ−ｉＭｏｄの効果のＴリンパ球の応答についての結果も、フローサイトメトリーによる増殖実験で評価した。前記患者のＰＢＭＣからの合計４０×１０６個の細胞を出発材料として使用した。ＣＤ１１ｂ＋細胞を、ＣＤ１１ｂ特異的Ａｂにコンジュゲートした磁気ビーズを使用して精製した。ＣＤ１１ｂ−陰性画分をＣＦＳＥで標識し、単独で、又はＣＤ１１ｂ＋細胞と５：１の比で９６時間培養した。図５は、ＲＣＣ患者におけるＶＳＳＰ−ｉＭｏｄ投与後０日目及び２１日目のＴリンパ球の相対増殖率を示している。図５Ａに見られるように、ＴＣＤ４＋リンパ球の増殖は２１日目に増加し、これはＴＣＤ８＋リンパ球で観察された効果（図５Ｂ）と同様の効果であり、これはＶＳＳＰ−ｉＭｏｄがＲＣＣ患者におけるＴ細胞増殖のＭＤＳＣ媒介抑制を調節することができることを意味している。
【００３７】
試験に登録された患者の大多数は、プロトコルで確立されるように、治療の最後に良好な生活の質を示し、毎月の免疫化を続けることが決定された。治療の延長により、ｇＭＤＳＣは０日目の中央値未満を維持し、この試験の全患者の生存期間中央値は３７．５ヶ月であった（表１）。この値は、キューバでの現在の基準治療であるインターフェロンで治療された同様の患者について報告された６．６ヶ月の歴史的中央値よりもはるかに高い。さらに、全米総合がんセンターネットワーク（ＮＣＣＮ）のｍＲＣＣの診療ガイドラインは、患者を、メモリアルスローンケタリングがんセンター（ＭＳＫＣＣ）のモデルに従って、予後良好、中等度及び不良として分類している。これらのガイドラインは、血管内皮増殖因子に対する療法で治療されたｍＲＣＣを有する患者が、予後中等度であると診断された患者の場合、中央生存期間が２７ヶ月である一方で、予後良好と診断された患者の７５％が２４ヶ月で生存していると述べている。ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄで得られた値に対するガイドラインに記載されている値の相対的な比較は、ｇＭＤＳＣに対するＶＳＳＰ−ｉＭｏｄの効果が、ＮＣＣＮガイドラインで規定されている標準よりも高い生存をもたらしたことを示している。ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄ試験では、予後良好の患者の１００％が３６ヶ月で生存しており、予後中等度の患者が、中央生存期間４２ヶ月を有した。
【表１】
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【００３８】
例４  ＶＳＳＰは、乳がんを有する患者の単球性表現型及び顆粒球性表現型のＭＤＳＣの頻度を減少させる。
ＭＤＳＣに対するＶＳＳＰ−ｉＭｏｄの効果を、乳がんを有する患者でも評価した。この目的のために、患者が三角筋部にＳＣ経路で３週間にわたって毎週の頻度で４００μｇのＶＳＳＰ−ｉＭｏｄを受ける第０相治療機会（Ｗｉｎｄｏｗ−ｏｆ−Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ）試験を設計した。この治療を、診断と医師が指示した外科手術又は化学療法の標準治療の開始との間に確立された従来の時間に投与した。この試験では、Ｇ−ＭＤＳＣ、ｍＭＤＳＣ及びＣＤ８  Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーによって測定した。合計２００，０００個の細胞を分析し、それぞれ総ＰＢＭＣ内の表現型ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ６６ｂ＋／ＣＤ１４−ｙ  ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１４＋／ＨＬＡ−ＤＲ低／陰を使用して、ｇＭＤＳＣ及びｍＭＤＳＣの割合を決定した。図６Ａに見られるように、ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄは循環ｇＭＤＳＣの頻度を減少させ、これと同じ挙動が２１日間の治療後に患者の循環するｍＭＤＳＣ（図６Ｂ）でも観察された。さらに、中央値の上下にｇＭＤＳＣ及びｍＭＤＳＣの頻度を有する患者の割合の分析は、ＶＳＳＰ−ｉＭｏｄによる治療後、治療される患者の１５％及び０％のみがそれぞれｇＭＤＳＣ及びｍＭＤＳＣを高く維持したことを示している。この治療により、患者の血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度も増加した（図７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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