(57)【要約】  本発明は、膀胱がんのための新規ＤＮＡメチル化マーカーを使用して膀胱がんの存在またはリスクを検出するための方法およびそのような方法に有用なキットオブパーツに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するとして、または膀胱がんを発症するリスクがあるとして個体を分類する方法であって、
前記個体由来の尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定し、
前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択され、
前記ＤＮＡメチル化に基づいて前記個体を分類する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記ＤＮＡメチル化を少なくとも第１および第２の基準値と比較し、
前記比較に基づいて前記個体を分類する、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、
前記尿試料は、完全な尿試料を含むか、または尿から単離された細胞もしくはＤＮＡを含む、方法。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法において、
少なくともＧＨＳＲおよびＭＡＬのプロモーター領域のＤＮＡメチル化が決定される、方法。
【請求項５】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法において、
・  少なくともＧＨＳＲおよびＦＡＭ１９Ａ４、
・  少なくともＧＨＳＲおよびＰＨＡＣＴＲ３、
・  少なくともＧＨＳＲおよびＰＲＤＭ１４、
・  少なくともＧＨＳＲおよびＳＳＴ、
・  少なくともＧＨＳＲおよびｍｉＲ−１２９、
・  少なくともＧＨＳＲおよびｍｉＲ−１４８、
・  少なくともＧＨＳＲおよびｍｉＲ−９３５、
・  少なくともＳＳＴおよびＭＡＬ、または
・  少なくともＳＳＴおよびＰＲＤＭ１４
のプロモーター領域のＤＮＡメチル化が決定される、方法。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法において、
−  ＤＮＡを単離し、
−  単離されたＤＮＡを亜硫酸水素塩により処理し、
−  定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を実施する
、方法。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法において、
前記膀胱がんが、筋層非浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ）または筋層浸潤性膀胱がん（ＭＩＢＣ）である、方法。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法において、
前記尿試料が、保存料、好ましくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、および／または抗生物質により処理されている、方法。
【請求項９】
個体由来の尿試料を型に分ける方法であって、
前記個体由来の尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定し、
前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択され、
ＤＮＡメチル化に基づいて前記尿試料を型に分ける、方法。
【請求項１０】
個体についての治療戦略を決定する方法であって、
前記個体由来の尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定し、
前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択され、
決定したＤＮＡメチル化が、前記個体が膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するか、または膀胱がんを有するリスクがあることを示す場合、前記個体についての治療戦略を決定する、方法。
【請求項１１】
少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化を検出するための手段を含むキットオブパーツであって、
前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択される、キットオブパーツ。
【請求項１２】
膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するとして、または膀胱がんを発症するリスクがあるとして個体を分類するための、請求項１１に記載のキットオブパーツの使用。
【請求項１３】
保存料、好ましくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と、任意選択で抗生物質とを含む、１つもしくは複数の遺伝子またはそれらのプロモーター領域のＤＮＡメチル化の分析のための尿試料の使用。
【請求項１４】
請求項１３に記載の使用において、
前記尿試料が前記分析の前に少なくとも１週間保存される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はがん診断の分野に関する。特に、本発明は、膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するとして、または膀胱がんを発症するリスクがあるとして個体を分類する方法および手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
膀胱がん（ＢＣ）は西欧諸国において最も一般的ながんの１つである。大多数の症例において、それは筋層非浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ）として現れる。これらの腫瘍において、再発率は高く、５年確率は３１〜７８％の範囲である。（再発）ＢＣの診断に対する現在のゴールドスタンダードは、ほとんどのがんを検出する軟性膀胱鏡検査（flexible cystoscopy）であるが、侵襲的手順である。さらに、膀胱鏡検査は術者に依存しており、医療経済に大きな負担をかけている。尿細胞診は非侵襲的であるが、低悪性度の腫瘍に対する感度は低い。さらに、細胞診の診断価値は病理医の専門知識に依存する。
【０００３】
プロモーターのメチル化による腫瘍抑制遺伝子サイレンシングは腫瘍形成において立証された現象である。Ｃｈａｎら（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００２）などの先行研究は、ＢＣ患者におけるそれらの診断可能性について尿中の異常なＤＮＡプロモーターのメチル化を分析している。タンパク質コード遺伝子のいくつかの尿メチル化マーカーは同定されており、感度は５２〜１００％、特異度は０〜１００％の範囲である。しかしながら、メチル化パネルのいずれも、膀胱鏡検査の数を低減させるために臨床診断においてまだ実行されていない。これは主に低ステージおよび低悪性度の腫瘍についての診断精度が低いためである（Ｃｈｏｕら、２０１５、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ）。
【０００４】
当該技術分野において、膀胱がんの全てのステージおよび悪性度に対して高い診断精度を有する非侵襲性の客観的な試験についての必要性が存在している。このような試験は、患者の負担を最小限に抑え、医療費を削減する。このような試験は、膀胱鏡検査の数をさらに減少させ、それによってＢＣ患者の生活の質を改善することができる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、（再発）膀胱がんの診断および予後のために使用され得る過剰メチル化マーカーの新規および改善された組合せを提供することである。これらの新規マーカーは高い感度および特異度で診断または予後を可能にする。
【０００６】
したがって、一つの態様では、本発明は、膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するとして、または膀胱がんを発症するリスクがあるとして個体を分類する方法であって、前記個体由来の尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択されることと、前記ＤＮＡメチル化に基づいて前記個体を分類することとを含む、方法を提供する。
【０００７】
さらなる態様では、本発明は、個体由来の尿試料を型に分ける方法であって、前記個体由来の尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択されることと、ＤＮＡメチル化に基づいて前記尿試料を型に分けることとを含む、方法を提供する。
【０００８】
さらなる態様では、本発明は、個体由来の尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択されることを含む方法を提供する。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、個体についての治療戦略を決定する方法であって、前記個体由来の尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択されることと、決定したＤＮＡメチル化が、前記個体が膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するか、または膀胱がんを有するリスクがあることを示す場合、前記個体についての治療戦略を決定することとを含む、方法を提供する。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、治療を必要とする個体を治療する方法であって、前記個体由来の尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択されることと、決定したＤＮＡメチル化が、前記個体が膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するか、または膀胱がんを有するリスクがあることを示す場合、前記個体を膀胱がん治療に供することとを含む、方法を提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、個体における膀胱がんの治療および／または進行をモニタリングする方法であって、第１の時点および第２の時点において本発明による方法を用いてＤＮＡメチル化を決定することを含む、方法を提供する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化を検出するための手段を含むキットオブパーツであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択される、キットオブパーツを提供する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するとして、または膀胱がんを発症するリスクがあるとして個体を分類するための、本発明によるキットオブパーツの使用を提供する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、保存料、好ましくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と、任意選択で抗生物質とを含む、１つもしくは複数の遺伝子またはそれらのプロモーター領域のＤＮＡメチル化の分析のための尿試料の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明者らは、定量的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、プロモーター領域が膀胱がん患者の尿試料中で有意に過剰メチル化された１０個の遺伝子を同定した。これらのマーカーの少なくとも２つの組合せの使用は、特に高い特異度および感度で膀胱がんの発生の予測を可能にすることをさらに見出した。さらに、膀胱がんを診断するための遺伝子マーカーを使用する、知られている方法とは対照的に、本発明の方法は膀胱がんのあらゆるステージまたは悪性度の診断を可能にする。これは、同じマーカーおよびそれ故同じ試験が、膀胱がんの全ての悪性度およびステージについての診断または予後のために使用され得るという利点を有する。膀胱がんの全ての悪性度およびステージを含めるために異なる遺伝子マーカーまたは遺伝子マーカーの組合せを使用することはもはや必要ではない。
【００１６】
第１の態様では、したがって、本発明は、膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するとして、または膀胱がんを発症するリスクがあるとして個体を分類するための方法であって、前記個体由来の尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択されることと、前記ＤＮＡメチル化に基づいて前記個体を分類することとを含む、方法を提供する。表１は、遺伝子、それらのフルネームおよびＲｅｆＳｅｑ  ＩＤを示す。遺伝子のプロモーター領域は図９に示される。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「膀胱がん」という用語は、膀胱のいずれかの種類のがんを指す。膀胱がんはＴＮＭシステムに従ってステージに分けることができる。このシステムでは、文字にがんを説明するための番号が割り当てられている：
・  Ｔａ：乳頭状非浸潤性腫瘍（non-invasive papillary tumour）。
・  Ｔｉｓ：上皮内癌（carcinoma in-situ）。
・  Ｔ１：腫瘍は上皮下結合組織に浸潤しているが、膀胱壁の筋肉に浸潤していない。
・  Ｔ２．膀胱壁の筋肉に浸潤しているが、まだ膀胱に制限されている腫瘍。
・  Ｔ３．腫瘍は膀胱壁を通って膀胱周囲組織まで広がっている。
・  Ｔ４．腫瘍は骨盤壁、精嚢または子宮などの近くの構造に浸潤している。
・  Ｎ０〜Ｎ３．所属リンパ節転移の不在または存在を示す。
・  Ｍ０〜Ｍ１  遠隔転移の不在または存在を示す。
膀胱がんの等級付けとは、正常細胞と比較して顕微鏡下でがん細胞がどのように見えるかを指す（腫瘍細胞の分化）。
・  悪性度１：高分化型
・  悪性度２：中分化型
・  悪性度３：低分化型。
さらに、膀胱がん細胞はまた、低悪性度および高悪性度とも称される。経尿道的切除術ならびに／または補助的膀胱内化学療法および免疫療法薬点滴などの膀胱内治療にもかかわらず、一次治療後の膀胱がんの再発率は高い。
【００１８】
本発明の方法のいずれか１つにより診断され、決定され、型に分けられるなどの膀胱がんは、筋層非浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ）および筋層浸潤性膀胱がん（ＭＩＢＣ）であり得る。ＮＭＩＢＣとは、ステージＴａ、ＴｉｓおよびＴ１腫瘍を指す。ＭＩＢＣはステージＴ２、Ｔ３およびＴ４の腫瘍を包含する。好ましい実施形態では、膀胱がんはＮＭＩＢＣである。
【００１９】
本発明の方法により診断され、決定され、型に分けられるなどの膀胱がんはさらに、原発腫瘍または再発膀胱がんであり得る。好ましい実施形態では、膀胱がんは原発腫瘍である。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「再発膀胱がん」という用語は、既存の膀胱がんを除去するための介入、典型的に外科的介入の後、再発した膀胱がんの形態を指す。
【００２１】
現在公知の尿ベースの試験は、膀胱鏡検査に取って代わることはできなかった。これは主に低ステージおよび低悪性度の腫瘍についての診断精度が低いためである。本発明者らは、本明細書に記載されている２つの過剰メチル化マーカーの組合せ、特にＧＨＳＲおよびＭＡＬの組合せの診断性能が、驚くべきことに、悪性度またはＴ−ステージに依存しないことを見出した。悪性度１〜２の腫瘍は９３％の感度で検出され、一方、悪性度３の腫瘍は９４％の感度で検出された。同様に、Ｔａ〜Ｔ１の腫瘍は９５％の感度で検出され、ステージＴ２〜Ｔ４の腫瘍は９２％の感度で検出された。これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つ（「陽性と信じられる（ｂｅｌｉｅｖｅ−ｔｈｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」）の陽性ＤＮＡメチル化は、特に高い９２％の感度（９５％信頼区間（ＣＩ）：８６〜９９）および８５％の特異度（９５％ＣＩ：７６〜９４）を生じた。
【００２２】
本発明の方法は、少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含む。特に、ゲノムＤＮＡのＤＮＡメチル化が決定される。
【００２３】
好ましくは、これらの遺伝子および／またはそれらのプロモーター領域の過剰メチル化は、個体が膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有する可能性が高いか、または将来膀胱がんを発症するリスクが高いことを示す。本明細書で使用される場合、「過剰メチル化」という用語は、関連遺伝子配列（例えば、ＧＨＳＲおよびＭＡＬプロモーター領域）における通常メチル化されていない位置でのシトシンの任意のメチル化を指す。
【００２４】
好ましくは、少なくとも２つの遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化または過剰メチル化が決定される。本発明のさらに好ましい実施形態では、ＤＮＡメチル化または過剰メチル化は、少なくとも２つの遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧリッチ配列において検出される。図９は、遺伝子のプロモーター領域およびＣｐＧリッチ配列を示す。
【００２５】
本発明によれば、少なくとも２つの遺伝子および／またはそれらのプロモーター領域のＤＮＡメチル化が決定され、少なくとも２つの遺伝子は、成長ホルモン分泌促進物質受容体（ＧＨＳＲ）、ミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）、配列類似性１９メンバーＡ４を有するファミリー（ＦＡＭ１９Ａ４）、ホスファターゼおよびアクチン調節因子３（ＰＨＡＣＴＲ３）、ＰＲドメイン含有タンパク質１４（ＰＲＤＭ１４）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、小脳タンパク質１のジンクフィンガー（ＺＩＣ１）、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−９３５からなる群から選択される。
【００２６】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＧＨＳＲもしくはそのプロモーター領域またはＭＡＬもしくはそのプロモーター領域ならびにＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択される第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含む。さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＧＨＳＲまたはそのプロモーター領域ならびにＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択される第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定するステップを含む。実施例に示されるように、全てのこれらの組合せは８０％を超える特に高い感度を有する。本発明の方法は、これらの２つの遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含むことが好ましい。
【００２７】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＧＨＳＲまたはそのプロモーター領域およびＭＡＬまたはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含む。これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は、特に高い９２％の感度（９５％信頼区間（ＣＩ）：８６〜９９）および８５％の特異度（９５％ＣＩ：７６〜９４）を生じた。さらに、ＧＨＳＲおよびＭＡＬの組合せの診断性能は悪性度またはＴ−ステージに依存しない。驚くべきことに、全ての腫瘍悪性度ならびに原発腫瘍および再発がんの両方についての感度は、いずれかの個々のマーカーにより達成され得るものよりも高い。悪性度１〜２の腫瘍は９３％の感度で検出され、一方、悪性度３の腫瘍は９４％の感度で検出された。Ｔａ〜Ｔ１の腫瘍は９５％の感度で検出され、ステージＴ２〜Ｔ４の腫瘍は９２％の感度で検出された。本発明の方法は、これらの２つの遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含むことが好ましい。
【００２８】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＳＳＴまたはそのプロモーター領域およびＭＡＬまたはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含む。これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は、特に高い９２％の感度および７９％の特異度を生じた。本発明の方法は、これらの２つの遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含むことが好ましい。
【００２９】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＧＨＳＲまたはそのプロモーター領域およびＳＳＴまたはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含む。これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は、特に高い９７％の感度および７９％の特異度を生じた。本発明の方法は、これらの２つの遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含むことが好ましい。
【００３０】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＧＨＳＲまたはそのプロモーター領域およびｍｉＲ１２９またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含む。これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は、特に高い８７％の感度および８８％の特異度を生じた。本発明の方法は、これらの２つの遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含むことが好ましい。
【００３１】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＧＨＳＲまたはそのプロモーター領域およびｍｉＲ９３５またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含む。これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は、特に高い８７％の感度および８７％の特異度を生じた。本発明の方法は、これらの２つの遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含むことが好ましい。
【００３２】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＧＨＳＲまたはそのプロモーター領域およびｍｉＲ１４８またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含む。これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は、特に高い８７％の感度および７１％の特異度を生じた。本発明の方法は、これらの２つの遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含むことが好ましい。
【００３３】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＧＨＳＲまたはそのプロモーター領域およびＦＡＭ１９Ａ４またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含む。これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は、特に高い８６％の感度および８８％の特異度を生じた。本発明の方法は、これらの２つの遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含むことが好ましい。
【００３４】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＧＨＳＲまたはそのプロモーター領域およびＰＨＡＣＴＲ３またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含む。これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は、特に高い８６％の感度および８２％の特異度を生じた。本発明の方法は、これらの２つの遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定するステップを含むことが好ましい。
【００３５】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＧＨＳＲまたはそのプロモーター領域およびＰＲＤＭ１４またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含む。これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は、特に高い８６％の感度および８５％の特異度を生じた。本発明の方法は、これらの２つの遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定するステップを含むことが好ましい。
【００３６】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＰＲＤＭ１４またはそのプロモーター領域およびＳＳＴまたはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含む。これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は、特に高い８６％の感度および７８％の特異度を生じた。本発明の方法は、これらの２つの遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定するステップを含むことが好ましい。
【００３７】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、以下のＤＮＡメチル化を決定することを含む：
・  ＧＨＳＲもしくはそのプロモーター領域およびＺＩＣ１もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は８４％の高い平均感度および８４％の特異度を有する、または
・  ＭＡＬもしくはそのプロモーター領域およびＦＡＭ１９Ａ４もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は７６％の高い平均感度および９２％の特異度を有する、または
・  ＭＡＬもしくはそのプロモーター領域およびＰＨＡＣＴＲ３もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は７８％の高い平均感度および８６％の特異度を有する、または
・  ＭＡＬもしくはそのプロモーター領域およびＰＲＤＭ１４もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は８３％の高い平均感度および８８％の特異度を有する、または
・  ＭＡＬもしくはそのプロモーター領域およびＺＩＣ１もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は８１％の高い平均感度および８８％の特異度を有する、または
・  ＭＡＬもしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−１２９もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は７３％の高い平均感度および９２％の特異度を有する、または
・  ＭＡＬもしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−１４８もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は８０％の高い平均感度および７４％の特異度を有する、または
・  ＭＡＬもしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−９３５もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は８３％の高い平均感度および８８％の特異度を有する、または
・  ＦＡＭ１９Ａ４もしくはそのプロモーター領域およびＰＨＡＣＴＲ３もしくはそのプロモーター領域、または
・  ＦＡＭ１９Ａ４もしくはそのプロモーター領域およびＰＲＤＭ１４もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は７５％の高い平均感度および９０％の特異度を有する、または
・  ＦＡＭ１９Ａ４もしくはそのプロモーター領域およびＳＳＴもしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は８２％の高い平均感度および８１％の特異度を有する、または
・  ＦＡＭ１９Ａ４もしくはそのプロモーター領域およびＺＩＣ１もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は７５％の高い平均感度および９０％の特異度を有する、または
・  ＰＨＡＣＴＲ３もしくはそのプロモーター領域およびＰＲＤＭ１４もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は７９％の高い平均感度および８３％の特異度を有する、または
・  ＰＨＡＣＴＲ３もしくはそのプロモーター領域およびＳＳＴもしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は８２％の高い平均感度および７５％の特異度を有する、または
・  ＰＨＡＣＴＲ３もしくはそのプロモーター領域およびＺＩＣ１もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は７６％の高い平均感度および８４％の特異度を有する、または
・  ＰＲＤＭ１４もしくはそのプロモーター領域およびＺＩＣ１もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は８２％の高い平均感度および８８％の特異度を有する、または
・  ＰＲＤＭ１４もしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−１２９もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は７７％の高い平均感度および９０％の特異度を有する、または
・  ＰＲＤＭ１４もしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−１４８もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は８０％の高い平均感度および７２％の特異度を有する、または
・  ＰＲＤＭ１４もしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−９３５もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は８２％の高い平均感度および８５％の特異度を有する、または
・  ＳＳＴもしくはそのプロモーター領域およびＺＩＣ１もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は８０％の高い平均感度および７７％の特異度を有する、または
・  ＳＳＴもしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−１２９もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は８２％の高い平均感度および８１％の特異度を有する、または
・  ＳＳＴもしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−１４８もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は７８％の高い平均感度および６５％の特異度を有する、または
・  ＳＳＴもしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−９３５もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は８１％の高い平均感度および８０％の特異度を有する、または
・  ＺＩＣ１もしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−１２９もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は７４％の高い平均感度および９０％の特異度を有する、または
・  ＺＩＣ１もしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−１４８もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は７７％の高い平均感度および７４％の特異度を有する、または
・  ＺＩＣ１もしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−９３５もしくはそのプロモーター領域、これらの２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化は７７％の高い平均感度および８６％の特異度を有する。
本発明の方法は、上記に示した遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することを含むことが好ましい。
【００３８】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、以下のＤＮＡメチル化を決定することを含む：
・  ＦＡＭ１９Ａ４もしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−１２９もしくはそのプロモーター領域、または
・  ＦＡＭ１９Ａ４もしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−１４８もしくはそのプロモーター領域、または
・  ＦＡＭ１９Ａ４もしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−９３５もしくはそのプロモーター領域、または
・  ＰＨＡＣＴＲ３もしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−１２９もしくはそのプロモーター領域、または
・  ＰＨＡＣＴＲ３もしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−１４８もしくはそのプロモーター領域、または
・  ＰＨＡＣＴＲ３もしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−９３５もしくはそのプロモーター領域、または
・  ｍｉＲ−１２９もしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−１４８もしくはそのプロモーター領域、または
・  ｍｉＲ−１２９もしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−９３５もしくはそのプロモーター領域、または
・  ｍｉＲ−１４８もしくはそのプロモーター領域およびｍｉＲ−９３５もしくはそのプロモーター領域。
本発明の方法は、上記に示した遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定するステップを含むことが好ましい。
【００３９】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択される、少なくとも３つの遺伝子、またはそれらのプロモーター領域、より好ましくは、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択される、少なくとも４つの遺伝子、より好ましくは少なくとも５つの遺伝子、より好ましくは少なくとも６つの遺伝子、より好ましくは少なくとも７つの遺伝子、より好ましくは少なくとも８つの遺伝子、より好ましくは少なくとも９つの遺伝子、またはそれらのプロモーター領域のＤＮＡメチル化または過剰メチル化を決定することを含む。さらに好ましくは少なくともＧＨＳＲもしくはそのプロモーター領域またはＭＡＬもしくはそのプロモーター領域、最も好ましくは少なくともＧＨＳＲもしくはそのプロモーター領域およびＭＡＬもしくはプロモーター領域のＤＮＡメチル化または過剰メチル化が決定される。特に好ましい実施形態では、少なくともＧＨＳＲのプロモーター領域およびＭＡＬのプロモーター領域のＤＮＡメチル化または過剰メチル化が決定される。
【００４０】
【表１】
2021530214.tif 000002
【００４１】
ＤＮＡは尿試料から単離されることが好ましい。より好ましくは、ゲノムＤＮＡが単離される。尿からＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを単離するための方法は当該技術分野においてよく知られている。例として、Ｑｕｉｃｋ−ＤＮＡ（商標）Ｕｒｉｎｅ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用することができる。
【００４２】
ＤＮＡメチル化または過剰メチル化を決定する方法は当該技術分野においてよく知られている。例えば、以下の方法が適しており、当業者によく知られている。
・  ＣｐＧジヌクレオチドの非メチル化シトシンをウラシルまたはＵｐＧに変換するＤＮＡとの亜硫酸水素ナトリウムの化学反応、その後の従来のＰＣＲに基づく、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）または定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）。しかし、メチル化されたシトシンはこのプロセスにおいて変換されず、目的のＣｐＧ部位を覆うようにプライマーが設計され、メチル化されているか、またはメチル化されていないとしてメチル化状態を決定することが可能になる。例として、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、単離されたＤＮＡを変換するために使用することができる。
・  ＤＮＡメチル化のハイスループットゲノムワイド分析である、ＢＳ−Ｓｅｑとしても知られている、全ゲノム亜硫酸水素塩シークエンシング。これは、ゲノムＤＮＡの上述の亜硫酸水素ナトリウム変換に基づき、次いで次世代シークエンシングプラットフォームにおいて配列決定される。得られた配列は、参照ゲノムに対して再びアラインされ、非メチル化シトシンのウラシルへの変換によって生じるミスマッチに基づいてＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態が決定される。
・  メチル化および非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ部位を認識し、切断する制限酵素の分別能力に基づく、ＨＥＬＰアッセイ。
・  ＭｅＣＰ２のようなＤＮＡメチル化関連タンパク質に結合する商業的に調製される抗体の能力に基づく、チップ・オン・チップアッセイ（ＣｈＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ  ａｓｓａｙ）。
・  メチル化および非メチル化ＣｐＧ部位の制限酵素の分別認識に基づく、複雑で現在ではまれにしか使用されないアッセイである、制限ランドマークゲノムスキャニング。このアッセイは概念がＨＥＬＰアッセイと類似している。
・  クロマチン免疫沈降と類似しているメチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）、免疫沈降は、ＤＮＡマイクロアレイ（ＭｅＤＩＰ−チップ）またはＤＮＡシークエンシング（ＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ）などのＤＮＡ検出法に入力するためにメチル化ＤＮＡ断片を単離するために使用される。
・  亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡのパイロシークエンシング。これは、選択した遺伝子をＰＣＲするための通常のフォワードプライマーしかしビオチン化（ｂｉｏｔｅｎｙｌａｔｅｄ）リバースプライマーによって作製されたアンプリコンのシークエンシングである。次いでパイロシークエンサーにより、ＤＮＡを変性させ、使用者によって与えられたシークエンスに従って混合するために一度に１つのヌクレオチドを加えることによって試料を分析する。ミスマッチがある場合、それは記録され、ミスマッチが存在するＤＮＡのパーセンテージが注記される。これにより、使用者にＣｐＧアイランドごとのメチル化のパーセンテージが与えられる。
・  ＤＮＡアデニンメチルトランスフェラーゼ活性のための分子破壊光アッセイ−フルオロフォアおよびクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドにおける完全にメチル化された（アデニンメチル化）ＧＡＴＣ部位に対する制限酵素ＤｐｎＩの特異度に依存するアッセイ。アデニンメチルトランスフェラーゼはオリゴヌクレオチドをメチル化し、それをＤｐｎＩに対する基質にする。ＤｐｎＩによるオリゴヌクレオチドの切断は蛍光の増加を引き起こす。
・  メチル感受性サザンブロッティングはＨＥＬＰアッセイと類似しているが、制限消化を使用してメチル化における遺伝子特異的差異をプローブするためにサザンブロッティング技術を使用する。この技術は、プローブに対する結合部位付近の局所的なメチル化を評価するために使用される。
・  メチル化感受性制限酵素によって消化されたＤＮＡのゲノムワイドシークエンシングのようなメチル化ＤＮＡシークエンシング。
・  ナノテクノロジーまたはラボ・オン・チップ分析（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用したＤＮＡメチル化分析。
【００４３】
１つの好ましい実施形態では、ＤＮＡメチル化が決定される本発明の方法は、ＤＮＡ、好ましくはゲノムＤＮＡを単離するステップと、前記単離されたＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理するステップと、定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を実施するステップとを含む。
【００４４】
本発明の方法では、ＤＮＡメチル化または過剰メチル化は尿試料中で決定される。１つの好ましい実施形態では、尿試料は完全な尿試料である。本明細書で使用される場合、「完全な尿試料」は、尿中に存在する全ての成分が試料中に存在し、成分が試料に加えられてもよいが、成分の精製も単離も行われていないことを意味する。別の好ましい実施形態では、尿試料は尿から単離された細胞を含む。本明細書で使用される場合、「尿から単離された細胞を含む試料」は、試料が、尿由来の無細胞核酸、特にＤＮＡを含有しないことを意味する。代替として、尿由来の無細胞ＤＮＡまたは全ＤＮＡが使用されてもよい。尿由来の全ＤＮＡとは、細胞内ＤＮＡおよび無細胞ＤＮＡの両方の全体を指す。
【００４５】
尿の貯蔵はＤＮＡの質、およびその結果としてＤＮＡメチル化の決定に影響を与え得る。一実施形態では、したがって、試料の採取から１日以内などの、新鮮な尿試料が本発明の方法において使用される。しかしながら、室温にて保存されているか、または例えば４℃もしくは−２０℃にて冷却もしくは凍結されている尿試料を使用することも可能である。実施例２に示されるように、本発明者らは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの保存料を添加すると、尿試料が７日の期間の間、室温にて保存される場合、良好なＤＮＡ収率が得られることを見出した。さらに、ペニシリン／ストレプトマイシンの添加はメチル化ＤＮＡ分析に悪影響を及ぼさなかったことが見出された。それ故、このような抗生物質は細菌汚染を阻止するために尿試料中で使用され得る。したがって、本発明の方法において使用される尿試料は、好ましくは、保存料および／または抗生物質により処理される。例えば、Ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈによって市販されているもの（尿調整緩衝液）などの他のＤＮＡ保存手段および方法もまた、可能である。保存料は好ましくはＥＤＴＡである。抗生物質は、好ましくは、ペニシリン、ストレプトマイシンまたはそれらの組合せである。好ましい実施形態では、尿試料はＤＮＡメチル化または過剰メチル化を決定する前に少なくとも１週間保存される。試料は、半日、１日、２日または３日間などの、前記少なくとも１週間の少なくとも一部の間、好ましくは４℃を超える温度、より好ましくは室温にて保存される。その後、尿試料は、例えば、４℃、−２０℃または−８０℃にて保存されてもよい。一実施形態では、尿試料はＤＮＡメチル化を決定する前に室温にて少なくとも１週間保存される。本明細書で使用される場合、「室温」は約１６℃〜約２５℃の範囲の温度として定義される。
【００４６】
本発明はまた、１つもしくは複数の遺伝子またはそれらのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を分析するための保存料を含む尿試料の使用を提供する。保存料は好ましくはＥＤＴＡ、または別のキレート剤である。任意選択により、尿試料は少なくとも１つの抗生物質をさらに含む。少なくとも１つの抗生物質は好ましくは、ペニシリン、ストレプトマイシンまたはそれらの組合せである。好ましい実施形態では、尿試料は、前記分析を実施する前に少なくとも１日間、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日、より好ましくは少なくとも２日、より好ましくは少なくとも３日、より好ましくは少なくとも４日、例えば、約５日、約６日または約７日間保存される。１つの好ましい実施形態では、尿試料は、ＤＮＡメチル化分析を実施する前に少なくとも１週間保存される。さらに好ましい実施形態では、尿試料は、ＤＮＡメチル化分析を実施する前に１日から８日の間保存される。試料は、前記少なくとも１日の少なくとも一部の間、例えば、半日、１日、２日または３日の間、好ましく４℃を超える温度、より好ましくは室温にて保存される。その後、尿試料は、例えば、４℃、−２０℃または−８０℃にて保存され得る。一実施形態では、尿試料は、ＤＮＡメチル化を決定する前に室温にて少なくとも１週間保存される。
【００４７】
一実施形態では、本発明は、前記個体由来の尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を分析するための保存料を含む尿試料の使用であって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５、好ましくは少なくともＧＨＳＲおよびＭＡＬまたはこれらの遺伝子のプロモーター領域、より好ましくはＧＨＳＲのプロモーター領域およびＭＡＬのプロモーター領域からなる群から選択される、使用を提供する。
【００４８】
好ましくは、前記少なくとも２つの遺伝子および／またはそれらのプロモーター領域のＤＮＡメチル化は参照と比較され、前記個体は前記比較に基づいて分類される。少なくとも２つの遺伝子またはそれらのプロモーター領域のＤＮＡメチル化または過剰メチル化は好ましくは少なくとも第１および第２の基準値と比較される。好ましくは、基準値は、膀胱がんに罹患しているか、または膀胱がんを発症するリスクがある個体から得られたものでない試料中で決定された同じ遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化である。一実施形態では、個体は健常な個体である。本明細書で使用される場合、「健常な個体」は、膀胱がんに罹患していない、好ましくはいずれのがんにも罹患していない個体である。このような健常な個体は、一実施形態では、良性血尿対照であり得る。あるいは、基準値は、膀胱がんに罹患している個体から得られた試料中で決定された同じ遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化である。基準値を決定するための適切な試料には、個体由来尿試料および複数の個体由来のプールされた尿試料が含まれ、個体は健常な個体または膀胱がんに罹患している個体のいずれかである。さらに、基準値は、個体由来の複数の尿試料または個体由来の複数のプールされた尿試料中のＤＮＡメチル化決定の平均であってもよく、個体は健常な個体または膀胱がんに罹患している個体のいずれかである。
【００４９】
第１および第２の基準値が健常な個体由来の１つまたは複数の尿試料中の関連遺伝子またはプロモーター領域のＤＮＡメチル化に基づく場合、前記基準値より高い前記個体由来の前記試料中の前記少なくとも２つの遺伝子のＤＮＡメチル化は、前記個体が膀胱がんに罹患しているか、または膀胱がんを発症するリスクがあることを示す。第１および第２の基準値が膀胱がんに罹患している個体由来の１つまたは複数の尿試料中の関連遺伝子またはプロモーター領域のＤＮＡメチル化に基づく場合、前記基準値と類似しているか、または前記基準値より高い前記個体由来の前記試料中の前記少なくとも２つの遺伝子のＤＮＡメチル化は、前記個体が膀胱がんに罹患しているか、または膀胱がんを発症するリスクがあることを示す。
【００５０】
ＤＮＡメチル化が基準値よりも高いか、または基準値と類似しているか否かは、当該技術分野において適切かつよく知られている統計的方法を使用して決定することができ、一般に、ランダム変動による変化では５パーセント未満の可能性の確率値が用いられる。有意とみなされる増加または類似の量を決定することは十分に当業者の能力の範囲内である。好ましくは、「より高い」は、基準値より少なくとも２０、少なくとも４０、または少なくとも５０％高い。好ましくは、「類似している」は、決定されたＤＮＡメチル化と基準値との間で多くても２０％の差、より好ましくは多くても１０％の差である。
【００５１】
個体由来の尿試料を型に分けるための方法であって、前記個体由来の尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択されることと、ＤＮＡメチル化に基づいて前記尿試料を型に分けることとを含む方法もまた提供される。型に分けることは、試料中のＤＮＡ、好ましくはゲノムＤＮＡのメチル化を決定することを好ましくは含む。好ましくは、ＤＮＡメチル化に基づいて前記尿試料を型に分けることは、ＤＮＡ過剰メチル化、好ましくは少なくとも２つの遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡ過剰メチル化が試料中に存在するか否かを決定することを含む。特に好ましい実施形態では、少なくともＧＨＳＲおよびＭＡＬのプロモーター領域のＤＮＡメチル化が決定される。遺伝子またはそのプロモーター領域の他の好ましい組合せは本明細書上記に示されている。
【００５２】
個体由来の尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択されることを含む方法もまた提供される。好ましくは、このような方法は、ＤＮＡ過剰メチル化、好ましくは少なくとも２つの遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡ過剰メチル化が試料中に存在するか否かを決定することを含む。特に好ましい実施形態では、少なくともＧＨＳＲおよびＭＡＬのプロモーター領域のＤＮＡメチル化が決定される。遺伝子またはそのプロモーター領域の他の好ましい組合せは本明細書上記に示されている。ある特定の組合せの感度および／または特異度についての値は表９および表１０に見出され得る。組合せは、表９および１０に示される感度および特異度スコアの合計に基づいてランク付けされ得る。
【００５３】
本明細書に開示されている方法は、膀胱がんを有するか、または膀胱がんを発症するリスクがある個体を分類する。好ましくは、この方法は、個体が膀胱がんに罹患しているか、または罹患していないかのいずれかの可能性を予測する。膀胱がんのステージおよび悪性度ならびに患者の年齢および他の健康状態などの他の要因に応じて、治療選択肢には、手術、膀胱内療法、化学療法、放射線療法および免疫療法、または前記治療選択肢の１つもしくは複数の組合せが含まれ得る。したがって、個体についての治療スケジュールを決定するための方法であって、本明細書に開示されている本発明による方法を使用して、個体が膀胱がんを有するか、または膀胱がんを発症するリスクがあるかどうかを決定することを含む方法もまた提供される。個体が膀胱がんを有するか、または膀胱がんを発症するリスクがあるが決定される場合、個体が治療され得るかどうか、および個体がどのように治療され得るかが決定され得る。好ましくは、このような治療は、手術、膀胱内療法、化学療法、放射線療法、免疫療法またはそれらの組合せを含む。
【００５４】
したがって、個体についての治療戦略を決定するための方法であって、前記個体由来の尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択されることと、決定したＤＮＡメチル化が、前記個体が膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するか、または膀胱がんを有するリスクがあることを示す場合、前記個体についての治療戦略を決定するステップこととを含む、方法が提供される。
【００５５】
治療を必要とする個体を治療する方法であって、前記個体由来の尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択されることと、決定したＤＮＡメチル化が、前記個体が膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するか、または膀胱がんを有するリスクがあることを示す場合、前記個体を膀胱がん治療に供することとを含む、方法もまた提供される。
【００５６】
任意選択により、治療戦略を決定するため、または個体を治療するための本発明の方法は、膀胱がんの悪性度またはステージを決定することを含む。膀胱がんの悪性度および／またはステージを決定するための適切な方法には、１つまたは複数の生検を取得すること、および分析すること、ならびに例えば、ＣＴ、ＭＲＩ、ｘ線、ＰＥＴスキャンなどを使用して膀胱がんを画像化することが含まれる。医師または他の医療従事者は、手術、膀胱内療法、化学療法、放射線療法および免疫療法、または前記治療選択肢の１つもしくは複数の組合せなどの適切な治療選択肢を容易に決定することができる。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」および「治療している」という用語は、疾患もしくは障害、またはその１つもしくは複数の症状、特に本明細書に記載されている膀胱がんの発症を逆転させ、軽減させ、遅延させるか、または進行を阻害することを指す。一部の実施形態では、治療は、１つまたは複数の症状が発症した後に施され得る。他の実施形態では、治療は、ＤＮＡメチル化または過剰メチル化が、個体ががんに罹患しているか、または罹患するリスクがあるが、個体がまだ症状を経験していないことを示した後、症状の不在下で施されてもよい。治療はまた、症状が解消した後、例えば、それらの再発を阻止するか、または遅延させるために継続されてもよい。
【００５８】
本発明はまた、個体における膀胱がんの治療および／または進行をモニタリングするための方法であって、第１の時点および第２の時点において本発明による方法を用いてＤＮＡメチル化を決定することを含む、方法を提供する。この実施形態では、前記個体は、膀胱がんを有すると以前に診断されているか、または第１の時点において膀胱がんを有すると分類されている。好ましい実施形態では、前記個体は、第１の時点と第２の時点との間に膀胱がんについての治療を受けている。第１の時点および第２の時点におけるＤＮＡメチル化が比較されることがさらに好ましい。第１の時点と第２の時点との間、かつ好ましくは膀胱がんについての治療を受けた後のＤＮＡメチル化の減少は、その療法が膀胱がんを治療するのに成功していることを示す。同様に、第１の時点におけるＤＮＡメチル化の存在および第２の時点における、かつ好ましくは膀胱がんについての治療を受けた後のＤＮＡメチル化の不在は、その療法が膀胱がんを治療するのに成功していることを示す。
【００５９】
個体の尿試料中の膀胱がんまたは再発膀胱がんを同定するための方法であって、前記尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化の存在を検出することであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択されることと、前記少なくとも第１および第２の遺伝子またはプロモーター領域のＤＮＡメチル化が検出される場合、膀胱がんまたは再発膀胱がんを同定することとを含む方法もまた提供される。この方法は、膀胱がんまたは再発膀胱がんの存在または不在を同定することを含んでもよい。前記少なくとも第１および第２の遺伝子もしくはプロモーター領域のＤＮＡメチル化が検出される場合、膀胱がんもしくは再発膀胱がんの存在が同定され、または、前記少なくとも第１および第２の遺伝子もしくはプロモーター領域のＤＮＡメチル化が検出されない場合、膀胱がんおよび再発膀胱がんの不在が同定される。
【００６０】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、個体、好ましくは膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有する疑いがあるか、または膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するリスクがある疑いがある個体由来の尿試料を取得することまたは提供することを含む。
【００６１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、尿試料から、ＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡを単離することを含む。
【００６２】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、単離されたＤＮＡの亜硫酸水素塩処理を実施することを含む。
【００６３】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、亜硫酸水素塩により処理したＤＮＡを増幅させることを含む。
【００６４】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、単離されたＤＮＡを、前記少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定するための手段と接触させることを含む。前記第１および第２の遺伝子は、好ましくはＧＨＳＲおよびＭＡＬを含む。好ましくは前記手段は、ＧＨＳＲプロモーター領域およびＭＡＬプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定するためのものである。前記手段は好ましくはメチル化ＤＮＡを検出するためのプライマーと、任意選択でプローブとを含む。好ましいプライマーおよびプローブの配列を表２に示す。
【００６５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、ＧＨＳＲプロモーター領域のＤＮＡ過剰メチル化を検出することを含む。
【００６６】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、ＭＡＬプロモーター領域のＤＮＡ過剰メチル化を検出することを含む。
【００６７】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、膀胱がんまたは再発膀胱がんが同定される場合、個体の治療を開始することを含む。
【００６８】
【表２】
2021530214.tif 000003
【００６９】
一実施形態では、したがって本発明は、個体の尿試料中の膀胱がんまたは再発膀胱がんを同定する方法であって、
−  前記個体の尿試料を取得することまたは提供することと、
−  尿試料から、ＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡを単離することと、
−  単離されたＤＮＡを、前記尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定するための手段と接触させることであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択されることと、
−  前記少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化の存在を検出することと、
−  前記少なくとも第１および第２の遺伝子もしくはプロモーター領域のＤＮＡメチル化が検出される場合、膀胱がんもしくは再発膀胱がんを同定すること、または、前記少なくとも第１および第２の遺伝子もしくはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化が検出されない場合、膀胱がんもしくは再発膀胱がんの不在を同定するステップと
を含む、方法を提供する。
【００７０】
本発明はまた、膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するか、または膀胱がんを発症するリスクがあるとして個体を分類する方法であって、
−  前記個体の尿試料を取得することまたは提供することと、
−  尿試料から、ＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡを単離するステップと、
−  単離されたＤＮＡを、前記尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定するための手段と接触させることであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択されることと、
−  前記少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することと、
−  前記ＤＮＡメチル化に基づいて前記個体を分類することと
を含む、方法も提供する。
【００７１】
本発明はまた、個体由来の尿試料を型に分けるための方法であって、
−  前記個体の尿試料を取得することまたは提供することと、
−  尿試料から、ＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡを単離することと、
−  単離されたＤＮＡを、前記尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定するための手段と接触させることであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択されることと、
−  前記少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を検出することと、
−  ＤＮＡメチル化に基づいて前記尿試料を型に分けることと
を含む、方法も提供する。
【００７２】
本発明はまた、治療を必要とする個体を治療するための方法であって、
−  前記個体の尿試料を取得することまたは提供することと、
−  尿試料から、ＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡを単離することと、
−  単離されたＤＮＡを、前記尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定するための手段と接触させることであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択されることと、
−  前記少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を検出することと、
−  検出したＤＮＡメチル化が、前記個体が膀胱がんまたは再発膀胱がんを有することを示す場合、前記個体を膀胱がん治療に供することと
を含む、方法も提供する。
【００７３】
本発明はまた、少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化を検出するための手段を含むキットオブパーツ（kit of parts）であって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択される、キットオブパーツを提供する。そのようなキットは、以下の構成要素：尿を採取するための容器、保存料および／または１つもしくは複数の抗生物質で充填された容器、ならびに分析のための試験管、のうちの１つまたは複数を含んでもよい。ＤＮＡメチル化を検出するための前記手段は、プライマー、および任意選択で本明細書に開示されている遺伝子もしくはそれらのプロモーター領域のＭＳＰもしくはｑＭＳＰに適したプローブ、好ましくは本明細書に記載されているプライマー、ならびに／またはメチル化感受性制限酵素を含んでもよい。好ましくは、前記手段は、ＧＨＳＲプロモーターおよびＭＡＬプロモーターのＤＮＡメチル化を決定するのに適したプライマーを含む。ＤＮＡメチル化を検出するための前記手段は、ＤＮＡ、好ましくはゲノムＤＮＡを単離するための手段、および／または単離されたＤＮＡを変換するための亜硫酸水素塩をさらに含んでもよい。
【００７４】
本発明に従って、膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するとして、または膀胱がんを発症するリスクがあるとして個体を分類する方法において使用するための本発明によるキットオブパーツもまた提供される。
【００７５】
膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するとして、または膀胱がんを発症するリスクがあるとして個体を分類するため、個体由来の尿試料を型に分けるため、あるいは個体についての治療戦略を決定するための本発明によるキットオブパーツの使用もまた提供される。好ましくは、前記の個体を分類すること、尿試料を型に分けることまたは治療戦略を決定することは、本明細書に開示されている本発明による方法を用いて実施される。
【００７６】
本発明に従って、膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するとして、または膀胱がんを発症するリスクがあるとして個体を分類することは、好ましくは、膀胱がんもしくは再発膀胱がんの存在について、または膀胱がんを発症するリスクについてのさらなる診断試験を含む。１つのこのようなさらなる試験は、好ましくは、個体の膀胱由来の生検を後で分析するか、または分析しない膀胱鏡検査を含む。さらなる診断により、膀胱がんの存在または不在を確認することができる。
【００７７】
尿は、疾患を有する個体の存在について集団をスクリーニングするために使用され得る。非侵襲的な採取は魅力的な特徴の１つである。尿の診断は、がんを含む種々の疾患に対して提案されている。尿は、例えば、膀胱がんを検出するために使用される。大規模なスクリーニングまたは膀胱がんのリスクがある患者（例えば、血尿を有する患者）のスクリーニングは典型的に最初のステップである。「陽性」と試験された個体は典型的に１つまたは複数のさらなる確認診断法によりさらに試験される。一実施形態では、したがって本発明は、膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するか、または膀胱がんを発症するリスクがある個体の存在について集団をスクリーニングする方法であって、前記集団における個体由来の尿試料中の少なくとも第１の遺伝子またはそのプロモーター領域および第２の遺伝子またはそのプロモーター領域のＤＮＡメチル化を決定することであって、前記遺伝子が、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５からなる群から選択されることと、前記ＤＮＡメチル化に基づいて膀胱がんもしくは再発膀胱がんを有するとして、または膀胱がんを発症するリスクがあるとして前記集団の前記個体を分類することとを含む方法を提供する。このような方法を用いて陽性と試験された個体は、膀胱生検を後で分析するかまたは分析しない、好ましくは膀胱鏡検査による膀胱がんについてのさらなる診断試験により、好ましくはさらに試験される。
【００７８】
分析の非侵襲的特性はまた、本発明の方法を、膀胱がんについて治療されるか、もしくは治療されている個体を追跡して治療の効果を決定するか、または非侵襲的手法において腫瘍の再発のリスクを決定するのに適したものにする。膀胱がんの治療後、フォローアップ環境において陽性と試験された患者は、膀胱生検を後で分析するかまたは分析しない、好ましくは膀胱鏡検査による膀胱がんについてのさらなる診断試験により試験される。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「含む」およびその活用形は、その非限定的な意味で使用され、この単語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目は除外されないことを意味し、さらに、「からなる」という動詞は、本明細書に定義される化合物または補助化合物が、具体的に特定されているもの以外の、本発明の特有の特性を変化させないさらなる成分を含んでいてもよいことを意味する「から本質的になる」に置き換えられる場合がある。
【００８０】
冠詞「一つの（ａ）」および「一つの（ａｎ）」は、冠詞の文法的目的語の１つまたは１つより多い（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「要素」は１つの要素または１つより多い要素を意味する。
【００８１】
数値と関連して使用される場合、「およそ」または「約」という単語（およそ１０、約１０）は好ましくは、その値が、その値である１０より１％多いかまたは少ない所与の値であり得ることを意味する。
【００８２】
「個体」という用語は、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯動物などを含む、哺乳動物などの任意の動物を指す。好ましい実施形態では、個体はヒト個体である。
【００８３】
特徴は、明確さおよび簡潔な説明の目的のために本発明の同じまたは別の態様または実施形態の一部として本明細書に記載され得る。本発明の範囲は、同じまたは別の実施形態の一部として本明細書に記載されている特徴の全てまたは一部の組合せを有する実施形態を含んでもよいことは当業者によって理解されるであろう。
【００８４】
本発明は、以下の非限定的な実施例においてより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１−１】図１は、対照（青色）および膀胱がん患者（橙色）におけるｌｏｇ２変換Ｃｔ比（ｙ軸）によって表される１４個全てのマーカー（ＣＡＤＭ１、ＦＡＭ１９Ａ４、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２４−２、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１８１およびｍｉＲ−９３５）のメチル化レベルを示す箱ひげ図である。Ｐ値はマン・ホイットニーのＵ検定を使用して計算した。
【図１−２】図１は、対照（青色）および膀胱がん患者（橙色）におけるｌｏｇ２変換Ｃｔ比（ｙ軸）によって表される１４個全てのマーカー（ＣＡＤＭ１、ＦＡＭ１９Ａ４、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２４−２、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１８１およびｍｉＲ−９３５）のメチル化レベルを示す箱ひげ図である。Ｐ値はマン・ホイットニーのＵ検定を使用して計算した。
【図１−３】図１は、対照（青色）および膀胱がん患者（橙色）におけるｌｏｇ２変換Ｃｔ比（ｙ軸）によって表される１４個全てのマーカー（ＣＡＤＭ１、ＦＡＭ１９Ａ４、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２４−２、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１８１およびｍｉＲ−９３５）のメチル化レベルを示す箱ひげ図である。Ｐ値はマン・ホイットニーのＵ検定を使用して計算した。
【図２ａ】図２は、膀胱がんの診断について最大の曲線下面積（ＡＵＣ）を有することが証明される、ＧＨＳＲ（ａ）、ＭＡＬ（ｂ）、ＰＲＤＭ１４（ｃ）およびＳＳＴ（ｄ）のサイクル閾値（ＣＴ）比の値を使用した受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線の図である。
【図２ｂ】図２は、膀胱がんの診断について最大の曲線下面積（ＡＵＣ）を有することが証明される、ＧＨＳＲ（ａ）、ＭＡＬ（ｂ）、ＰＲＤＭ１４（ｃ）およびＳＳＴ（ｄ）のサイクル閾値（ＣＴ）比の値を使用した受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線の図である。
【図２ｃ】図２は、膀胱がんの診断について最大の曲線下面積（ＡＵＣ）を有することが証明される、ＧＨＳＲ（ａ）、ＭＡＬ（ｂ）、ＰＲＤＭ１４（ｃ）およびＳＳＴ（ｄ）のサイクル閾値（ＣＴ）比の値を使用した受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線の図である。
【図２ｄ】図２は、膀胱がんの診断について最大の曲線下面積（ＡＵＣ）を有することが証明される、ＧＨＳＲ（ａ）、ＭＡＬ（ｂ）、ＰＲＤＭ１４（ｃ）およびＳＳＴ（ｄ）のサイクル閾値（ＣＴ）比の値を使用した受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線の図である。
【図３】膀胱がんの診断について最大曲線下面積を有する４つ（ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＰＲＤＭ、およびＳＳＴ）を除く全てのマーカーのサイクル閾値（ＣＴ）比の値を使用した受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線の図である。
【図４】正常な膀胱組織（ｎ＝１０、青色）および膀胱がん組織（ｎ＝２１、橙色）におけるｌｏ２変換Ｃｔ比（ｙ軸）によって表されるＧＨＳＲおよびＭＡＬのメチル化レベルを示す箱ひげ図である。ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸、ＲＴ＝室温  Ｐｅｎｓｔｒｅｐ＝ペニシリンストレプトマイシン。
【図５−１】図５は、ボランティア（ｎ＝３）および患者（非小細胞肺がんｎ＝１０、膀胱がん、ｎ＝１０）における試料の取扱いの概略図である。ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸、ＲＴ＝室温  Ｐｅｎｓｔｒｅｐ＝ペニシリンストレプトマイシン。
【図５−２】図５は、ボランティア（ｎ＝３）および患者（非小細胞肺がんｎ＝１０、膀胱がん、ｎ＝１０）における試料の取扱いの概略図である。ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸、ＲＴ＝室温  Ｐｅｎｓｔｒｅｐ＝ペニシリンストレプトマイシン。
【図６】保存剤を用いておよび用いずに、室温、４℃、−２０℃および−８０℃で尿を保存した後のｔ＝０と比較したβ−アクチン（ＡＣＴＢ）の平均ｌｏｇ倍率変化によって測定した亜硫酸水素塩により修飾したＤＮＡのＤＮＡ収率の図である。エラーバーは、異なるドナーに由来する３つの尿試料の間の標準偏差を表す。ＲＴ＝室温、ＡＣＴＢ＝β−アクチン、Ｐｅｎｓｔｒｅｐ＝ペニシリンストレプトマイシン、ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸。
【図７】保存剤を用いておよび用いずに、７日後、室温および４℃で保存した尿試料に由来するＤＮＡ完全性（integrity）の図である。ＤＮＡ完全性は、０日と比較した種々の条件におけるβ−アクチン（ＡＣＴＢ）発現のｌｏｇ倍率変化によって測定した。室温でのＤＮＡ完全性の事後分析の結果は表１２に見出され得る。ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸、ＰＳ＝ペニシリンストレプトマイシン。
【図８−１】図８は、室温および４℃で種々の保存剤（添加剤）を用いたまたは用いていない、β−アクチン（ＡＣＴＢ）のΔＣＴとメチル化ＲＡＳＳＦ１ＡのΔＣＴとの間の相関を示す相関プロットの図である。外れ値はＡ〜Ｅでマークされている。ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸、ＡＣＴＢ＝β−アクチン、Ｐｅｎ  ｓｔｒｅｐ＝ペニシリンストレプトマイシン。
【図８−２】図８は、室温および４℃で種々の保存剤（添加剤）を用いたまたは用いていない、β−アクチン（ＡＣＴＢ）のΔＣＴとメチル化ＲＡＳＳＦ１ＡのΔＣＴとの間の相関を示す相関プロットの図である。外れ値はＡ〜Ｅでマークされている。ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸、ＡＣＴＢ＝β−アクチン、Ｐｅｎ  ｓｔｒｅｐ＝ペニシリンストレプトマイシン。
【図９Ａ】図９は、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５のプロモーター配列、ＣｐＧリッチ配列およびエクソン１（の一部）の図である。エクソン１は大文字である。ＣｐＧリッチ配列を含有するプロモーター配列は小文字である。ＣｐＧリッチ領域、またはＣｐＧアイランドは灰色で網かけされている。
【図９Ｂ】図９は、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５のプロモーター配列、ＣｐＧリッチ配列およびエクソン１（の一部）の図である。エクソン１は大文字である。ＣｐＧリッチ配列を含有するプロモーター配列は小文字である。ＣｐＧリッチ領域、またはＣｐＧアイランドは灰色で網かけされている。
【図９Ｃ】図９は、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５のプロモーター配列、ＣｐＧリッチ配列およびエクソン１（の一部）の図である。エクソン１は大文字である。ＣｐＧリッチ配列を含有するプロモーター配列は小文字である。ＣｐＧリッチ領域、またはＣｐＧアイランドは灰色で網かけされている。
【図９Ｄ】図９は、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５のプロモーター配列、ＣｐＧリッチ配列およびエクソン１（の一部）の図である。エクソン１は大文字である。ＣｐＧリッチ配列を含有するプロモーター配列は小文字である。ＣｐＧリッチ領域、またはＣｐＧアイランドは灰色で網かけされている。
【図９Ｅ】図９は、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５のプロモーター配列、ＣｐＧリッチ配列およびエクソン１（の一部）の図である。エクソン１は大文字である。ＣｐＧリッチ配列を含有するプロモーター配列は小文字である。ＣｐＧリッチ領域、またはＣｐＧアイランドは灰色で網かけされている。
【図９Ｆ】図９は、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５のプロモーター配列、ＣｐＧリッチ配列およびエクソン１（の一部）の図である。エクソン１は大文字である。ＣｐＧリッチ配列を含有するプロモーター配列は小文字である。ＣｐＧリッチ領域、またはＣｐＧアイランドは灰色で網かけされている。
【図９Ｇ】図９は、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５のプロモーター配列、ＣｐＧリッチ配列およびエクソン１（の一部）の図である。エクソン１は大文字である。ＣｐＧリッチ配列を含有するプロモーター配列は小文字である。ＣｐＧリッチ領域、またはＣｐＧアイランドは灰色で網かけされている。
【図９Ｈ】図９は、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５のプロモーター配列、ＣｐＧリッチ配列およびエクソン１（の一部）の図である。エクソン１は大文字である。ＣｐＧリッチ配列を含有するプロモーター配列は小文字である。ＣｐＧリッチ領域、またはＣｐＧアイランドは灰色で網かけされている。
【図９Ｉ】図９は、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５のプロモーター配列、ＣｐＧリッチ配列およびエクソン１（の一部）の図である。エクソン１は大文字である。ＣｐＧリッチ配列を含有するプロモーター配列は小文字である。ＣｐＧリッチ領域、またはＣｐＧアイランドは灰色で網かけされている。
【図９Ｊ】図９は、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５のプロモーター配列、ＣｐＧリッチ配列およびエクソン１（の一部）の図である。エクソン１は大文字である。ＣｐＧリッチ配列を含有するプロモーター配列は小文字である。ＣｐＧリッチ領域、またはＣｐＧアイランドは灰色で網かけされている。
【実施例】
【００８６】
実施例１  尿中の膀胱がんの診断についてのメチル化シグネチャー
材料および方法
患者および尿試料
本研究では合計１４７の尿試料を使用し、そのうちの７２の尿試料はＢＣ患者由来であり、残りの７５の尿試料は対照として尿路悪性腫瘍の病歴がない患者から採取した。対照は年齢および性別を一致させた。２人の患者および２つの対照はｑＭＳＰ分析について不十分なＤＮＡの品質に基づいて除外した（ｑＭＳＰの節を参照のこと）。有効なｑＭＳＰ結果を有する７３人のＢＣ患者の患者特性を表３に示す。ＢＣ試料のうち、ほとんどの患者はＮＭＩＢＣ（６３％）を有し、ほとんどは悪性度３の腫瘍（５３％）であり、大部分が原発腫瘍（６４％）から構成された。２０１４年１０月から２０１７年１０月の間にＶＵ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの泌尿器科（ｎ＝４９）においてＢＣ患者の試料を採取した。膀胱鏡検査前または経尿道的膀胱腫瘍切除術（ＴＵＲＢＴ）前に尿試料を採取し、採取後４時間以内に−８０℃で保存した。
全ての参加者から書面によるインフォームドコンセントを取得し、研究プロトコールはＶＵ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの医療倫理委員会（２０１６．４２５）によって承認された。さらに、７５人の対照および２３人のＢＣ患者由来の尿検体（バイオバンクから回収した）、ならびに１０例の非悪性膀胱がんおよび２１例の膀胱がんの組織検体（病理学アーカイブから回収した）を、オランダのＴｈｅ  Ｃｏｄｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｅｒ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｅｄｅｒａ．ｏｒｇ／）に従って使用した。
【００８７】
ＤＮＡ単離および亜硫酸水素塩変換
ゲノムＤＮＡを、製造業者のプロトコールに従ってＱｕｉｃｋ−ＤＮＡ（商標）Ｕｒｉｎｅ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して２〜４０ｍＬの完全な尿（最初の容積に依存する）から抽出した。単離したＤＮＡを、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して亜硫酸水素塩により変換した。
【００８８】
定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）
次いで亜硫酸水素塩により変換したＤＮＡをＤＮＡメチル化分析のための鋳型として使用した。多重ｑＭＳＰ反応を合計１４個の遺伝子について実施した（図１）。メチル化した亜硫酸水素塩により処理したＤＮＡを特異的に増幅させるようにプライマーを設計し、以前に記載されているように（Ｗｉｌｔｉｎｇ  ２０１６；Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｅｎ  ２０１３；Ｖｅｒｌａａｔ  ２０１７；Ｈｕｂｅｒｓ  ２０１５）、試料品質コントロールとしてＡＣＴＢを用いて２〜３個の遺伝子を標的とする多重アッセイにおいて組み合わせた。プライマーおよびプローブ配列を表２に示す。ＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）上で、５０ｎｇの亜硫酸水素塩により変換したＤＮＡおよび２００〜３００ｎｍｏｌ／Ｌの各プライマーおよび蛍光色素により標識したプローブを使用して多重ｑＭＳＰを実施した。ＢＣ細胞株ＲＴ−１１２、ＴＣＣ−ＳＵＰおよびＪ８２の修飾ＤＮＡを陽性対照として使用し、Ｈ２Ｏを陰性対照として使用した。ＡＣＴＢ  ＣＴ＞３２である試料は、ＤＮＡメチル化分析に適していないと考えられ、その結果、２人の患者および２人の対照が除外された。標的のメチル化の値は、比較ＣＴ法（２−ΔＣＴ×１００）（Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ  ２００８）を使用して、参照遺伝子ＡＣＴＢに対して正規化した。
【００８９】
統計分析
カテゴリーデータは、頻度およびパーセンテージを用いて要約し、連続データは、平均、中央値、第１四分位数および第３四分位数を用いて要約した。χ２検定を使用して群間のカテゴリーデータを比較し、独立標本ｔ検定を使用して群間の連続データの平均を比較した。ＢＣ患者のＣＴ比をマン・ホイットニーのＵ検定を使用して対照のＣＴ比と比較した。全てのＣＴ比を２ｌｏｇ変換した。
受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を各マーカーについての比率値でプロットし、曲線下面積（ＡＵＣ）を決定した。カットオフは、Ｙｏｕｄｅｎ’ｓ  Ｊ  ｉｎｄｅｘ（Ｓｃｈｉｓｔｅｒｍａｎ  ２００８；Ｙｏｕｄｅｎ  １９５０）によって得た。メチル化マーカーの最適な組合せを見出すために、多変量ロジスティック回帰を２つの選択手順：前進および後退選択で使用した。前進手順に関して、エントリーについてのｐ値は０．０５以下であった。さらに、最も大きいＡＵＣを有する７つのマーカーを、後退選択手順を用いて試験した（除去についてのｐ値＞０．０５）。このように同定したマーカーの組合せを、その後、単一の試験として考慮した。これらのマーカーの最終的な組合せは、個々のマーカーのうちの少なくとも１つが陽性であった場合、陽性とみなした（「陽性と信じられる」）（Ｍａｒｓｈａｌｌ  １９８９）。いくつかのＢＣ下位群間の感度の差を、χ２検定を用いて分析した。
個々にマーカーの診断価値の精度、同様に最終モデル（マーカーの組合せ）からの診断価値の精度を推定するために、一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ）を実施した。ＬＯＯＣＶはＲ統計ソフトウェア（バージョン３．４．２）を用いて実施した。残りの統計分析は、ＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳ２２．０、ＩＢＭ  Ｃｏｒｐ．、Ａｒｍｏｎｋ、ＮＹ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて実施した。検定は両側とし、有意水準は全ての検定について０．０５に設定した。
【００９０】
結果
ＤＮＡ過剰メチル化分析：個々の遺伝子の識別能力
マーカーＦＡＭ１９Ａ４、ＧＨＳＲ、ＭＡＬ、ＰＨＡＣＴＲ３、ＰＲＤＭ１４、ＳＳＴ、ＺＩＣ１、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１４８およびｍｉＲ−９３５のメチル化レベルは、対照と比較してＢＣ患者において有意に高かった。マーカーＣＡＤＭ１、ｍｉＲ−１３７およびｍｉＲ−１８１のメチル化レベルは、ＢＣ患者と対照との間で有意に異なっていなかった（図１）。
各マーカーについてのＡＵＣ、感度および特異度を表４に提示する。最も大きいＡＵＣを有する４つのマーカーのＲＯＣ曲線を図２に示す。ＧＨＳＲ（８３％）、ＳＳＴ（７６％）、ＰＲＤＭ１４（７５％）およびＭＡＬ（７３％）について、それぞれ８７％、８１％、９０％および９４％の対応する特異度で最も高い感度が得られた。残りのマーカーのＲＯＣ曲線を図３に示す。個体ごとの各マーカーの性能を表５〜６に提示する。
ＬＯＯＣＶにより、ｍｉＲ−１４８を除き、ほぼ全ての個々のマーカーについて同様の診断精度（正確な診断のパーセンテージ）が得られた（表７）。ｍｉＲ−１４８については、診断精度はＬＯＯＣＶにおいて低かった（５８％のＬＯＯＣＶ対６６％のオリジナルの分析）。
【００９１】
ＤＮＡ過剰メチル化分析：複数の遺伝子の識別能力
どのマーカーが互いに補完的であるかを決定し、それによって最適な遺伝子パネルを規定するために、前進および後退選択手順を使用した。ＢＣ患者において有意に高かったマーカーのみを試験した。前進および後退選択手順の両方から、ＧＨＳＲおよびＭＡＬの組合せを最適パネルとして同定した。これら２つのマーカーのうちの少なくとも１つ（「陽性と信じられる」）の陽性ＤＮＡメチル化は、９２％の感度（９５％信頼区間（ＣＩ）：８６〜９９）および８５％の特異度（９５％ＣＩ：７６〜９４）を生じた。ＧＨＳＲとＭＡＬの組合せのＬＯＯＣＶにより、オリジナルの分析と同様の診断精度が得られた（オリジナルの分析において８９％対ＬＯＯＣＶにおいて８９％の診断精度）。
【００９２】
ＧＨＳＲおよびＭＡＬの過剰メチル化が腫瘍に由来することを検証するために、組織標本も分析した。ＧＨＳＲおよびＭＡＬの両方は、良性膀胱組織と比較してＢＣ組織において、より高いメチル化レベルを示した（図４）。
２つのマーカーのうちの少なくとも１つの陽性ＤＮＡメチル化についてのマーカーの全ての組合せの感度および特異度を表９および１０に示す。
【００９３】
腫瘍のＴ−ステージ、再発（あり／なし）、腫瘍の悪性度および性別に関連するメチル化レベル
対照と比較してＢＣ患者において有意に高かった１０個のメチル化マーカーについて、腫瘍のステージに関連する感度を表８に提示する。ＭＡＬを除く全てのマーカーは、Ｔａ〜Ｔ１の腫瘍（ｎ＝４２）と比較してＴ２以上の腫瘍（ｎ＝２５）に対して、より高い感度を有した。ＧＨＳＲおよびＭＡＬの組合せはＴａ〜Ｔ１の腫瘍において良好に作用したが、その差は統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．６）。驚くべきことに、全ての腫瘍の悪性度ならびに原発腫瘍および再発がんに対する感度は、いずれの個々のマーカーで達成され得るよりも高い。単一のマーカーの感度は、悪性度１〜２の腫瘍（ｎ＝２９）と比較して、悪性度３の腫瘍（ｎ＝３７）に対してほとんどが高かった。また、ＧＨＳＲおよびＭＡＬの組合せは悪性度３の腫瘍において、より高い感度を示したが、その差は統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．８）。
原発腫瘍対再発腫瘍の検出に対する感度はマーカーごとに変化していたが、ＧＨＳＲおよびＭＡＬのマーカーの組合せについては異なっていなかった。しかしながら、ＧＨＳＲ／ＭＡＬの組合せは、女性（ｎ＝１８）患者と比較して男性患者（ｎ＝５２）において有意に高い感度を示したが（９８％対７３％、ｐ＝０．００１）、特異度では差はなかった（８２％対９３％、ｐ＝０．３）。腫瘍悪性度ごとの細分化でも同様の傾向が見られた。
【００９４】
【表３】
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【００９５】
【表４】
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【００９６】
【表５】
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【００９７】
【表６】
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【００９８】
【表７】
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【００９９】
【表８】
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【０１００】
【表９】
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【０１０１】
【表１０】
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【０１０２】
実施例２  採尿およびＤＮＡメチル化分析前の貯蔵についてのプロトコール
材料および方法
この予備研究および患者試料研究は、ＶＵ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｅの医療倫理審査委員会（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認され、書面によるインフォームドコンセントを全ての参加者から得た。
【０１０３】
試料採取および貯蔵
予備研究
患者材料についてのさらなる試験のための貯蔵条件を予め選択するために、メチル化分析についてのＤＮＡ収率を、種々の条件下で保存した３人の健常なボランティアから採取した尿中で決定した。３人全てのボランティアは研究参加のために書面によるインフォームドコンセントを提供した。各尿試料を４つの等体積のアリコートに分け、そのうちの１つのアリコートを即時ＤＮＡ単離のために使用した。ＤＮＡをそのままの尿から抽出した。保存剤、ＥＤＴＡ（最終濃度４０ｍＭ）および７０μｌ／ｍｌのＵｒｉｎｅ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（商標）（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）をそれぞれアリコート２および３に添加した。保存剤をアリコート４には添加しなかった。その後、試料を異なる温度（室温（ＲＴ）、４℃、−２０℃および−８０℃）で保存し、１、２、７および２８日目に処理した（図５）。
【０１０４】
患者試料研究
尿試料は、２０１６年１１月から２０１７年５月の間にＶＵ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ＡｍｓｔｅｒｄａｍおよびＡｍｓｔｅｌｌａｎｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ａｍｓｔｅｌｖｅｅｎにおいて膀胱がんおよび非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者によって提供された。膀胱がん患者（ｎ＝１０）の試料を経尿道的切除術の前に採取し、ＮＳＣＬＣ患者からの試料を肺葉切除の前に採取した（ｎ＝１０）。全ての標本を９つの等体積のアリコートに分けた。保存剤は４０ｍＭの最終濃度のＥＤＴＡおよび／または２０ｕｌ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ）を含んだ。貯蔵温度はＲＴまたは４℃であった。採取直後（０日）および７日目に処理を行った（図５）。
【０１０５】
ＤＮＡ単離
製造業者のプロトコールに従ってＱｕｉｃｋ−ＤＮＡ（商標）Ｕｒｉｎｅ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用してＤＮＡを単離した。予備研究では、１０ｍｌのアリコートを使用したが、患者の試料は元の体積に応じて４〜１０ｍｌの等しいアリコートを含有した。ＤＮＡを５０μｌの溶出緩衝液中で溶出し、−２０℃で保存した。
【０１０６】
メチル化特異的ＰＣＲ
定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）分析を可能にするために、４０μｌの単離したＤＮＡを、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して亜硫酸水素塩により処理した。Ｇ．Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓ教授（ＶＵ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダ）のご厚意によって提供された膀胱がん細胞株ＲＴ−１１２から単離されたＤＮＡを標準曲線の作成のために使用した。ハウスキーピング遺伝子β−アクチン（ＡＣＴＢ）およびＲＡＳＳＦ１Ａの定量的ＭＳＰを以前に記載されているように実施した［１１、１２］。
簡潔に述べると、増幅反応は、ＥｐｉＴｅｃｔ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）、２００ｎＭの各プライマーおよび蛍光色素により標識したプローブ、ならびに２．５μｌの亜硫酸水素塩により処理したＤＮＡを含む１２μｌの全容積を含有した。増幅反応は、ＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において９６ウェルプレート中で、９５℃にて５分間、続いて、９５℃にて１５秒間、および６０℃にて１分間、４５サイクルで実施した。０日目に３２超のＡＣＴＢサイクル閾値（ＣＴ）（信頼できないｈｍＤＮＡ分析を定義するために一般に使用される閾値）［１３］を有する試料は除外した。
【０１０７】
データ分析
予備研究のために、限定された試料サイズ（ｎ＝３）を使用し、統計比較は計画しなかった。
患者試料研究において、ｈｍＤＮＡ分析のためのＤＮＡ収率の減衰を、ＡＣＴＢ（ｌｏｇ２ＦＣＡＣＴＢ）のｌｏｇ倍率変化を分析することによって計算した。以下の式を使用した：
【０１０８】
【数１】
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（式１）
ＣＴＡＣＴＢ（ｔ）およびＣＴＡＣＴＢ（０）は、それぞれｔ＝７日および０日の時間におけるＡＣＴＢのＣＴ値。
【０１０９】
種々の条件においてＡＣＴＢ−ＣＴとＲＡＳＳＦ１Ａ−ＣＴとの相関を定義するために以下の式を使用した：
ΔＣＴ遺伝子、条件Ｘ＝ＣＴ遺伝子、条件Ｘ（ｔ）−ＣＴ遺伝子、条件Ｘ（０）（式２）
ＣＴ遺伝子、条件Ｘ（ｔ）は、条件Ｘでの時間ｔにおける目的の遺伝子のＣＴ。
ＮＳＣＬＣおよび膀胱がんの患者の試料を合わせる前に、両群間のΔＣＴＡＣＴＢとΔＣＴＲＡＳＳＦ１Ａの差を、マン・ホイットニーのＵ検定を使用して分析した。差が統計的に有意でなかった場合、両群の試料を合わせて統計的検出力を高めた。ウィルコクソンの符号順位検定を使用して種々の条件におけるΔＣＴＡＣＴＢとΔＣＴＲＡＳＳＦ１Ａとの差を評価した。貯蔵条件間の差は、多回抽出についてのフリードマン検定を使用して調べた。全体的な有意性が観察された場合、２×２比較（ｔｗｏ−ｂｙ−ｔｗｏ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）のための関連試料のウィルコクソンの符号順位検定を使用して事後ボンフェローニ補正分析（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。複数の貯蔵条件についてのオムニバス検定を、ＦＳＡパッケージを使用したＲ統計ソフトウェア（バージョン３．３．１）を用いて実施した［１４］。残りの分析は、ＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳ２２．０、ＩＢＭ、Ａｒｍｏｎｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて実施した。全ての検定は両側であり、０．０５の有意水準を適用した。
【０１１０】
結果
予備研究
ＲＴで保存した３つのアリコートした尿試料の分析は、Ｕｒｉｎｅ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（商標）（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）およびＥＤＴＡの両方の添加が、保存剤なしと比較して、より良好に保持されたＤＮＡ収率をもたらしたことを示した（図６）。ＥＤＴＡまたはＵｒｉｎｅ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（商標）を添加した試料のいずれも、３２超のＣＴＡＣＴＢを有さなかった。保存剤なしでは、３つの試料のうちの１つが、２日目にこの値を超え、７日目に別の１つがこの値を超えた。２８日目に、３つ全ての未処理の試料が３２超のＣＴＡＣＴＢを有した。
４℃で貯蔵すると、ＤＮＡ収率は、保存剤の使用に関係なく、最初の２日間維持された（図６）。７日後、ＥＤＴＡまたは市販の緩衝液を添加した場合、保存剤なしと比較してＤＮＡ収率は良好に保持された（図６）。−２０℃および−８０℃において、ＤＮＡ収率は、保存剤の使用にかかわらず安定であった（図６）。
【０１１１】
これらの結果は、試料が４℃で保存される場合、ＥＤＴＡの添加がＤＮＡ分解を低減させるという点で市販の緩衝液と同様の効果があることを示唆している。ＲＴにおいて、市販の緩衝液およびＥＤＴＡの効果は７日の期間の間、同等であった。しかしながら、２８日後、市販の緩衝液はＥＤＴＡよりも優れているようであった。それにもかかわらず、本発明者らは、経済的理由から、さらなる試験のためにＥＤＴＡを使用することを選択した。さらに、７日目には、さらなる処理を可能にするのに十分な同等の有効性が依然として存在した。室温および４℃での貯蔵は日常的な環境において最も実用的である。これらの理由のために、本発明者らは、本発明者らが患者試料を使用した本発明者らのさらなる研究においてＲＴおよび４℃でのＥＤＴＡの有効性を決定することを選択した。さらに、細菌汚染の可能性を念頭に置き、抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン；ＰｅｎＳｔｒｅｐ）の添加も試験した。
【０１１２】
患者試料研究
ＤＮＡ収率
１人の患者は、０日でのＡＣＴＢについての高いＣＴ値（＞３２）のために分析から除外した。ＮＳＣＬＣ試料と膀胱がん試料との間のΔＣＴＡＣＴＢとΔＣＴＲＡＳＳＦ１Ａとの差は、いずれの条件においても有意に異ならなかった（表１１）。このようなものとして、両方の患者群の試料をさらなる分析において合わせて統計的検出力を高めた。
種々の条件でのＡＣＴＢレベル（ｎ＝１９）の計算した平均ｌｏｇ倍率変化を図７に提示する。統計的に有意な差が、尿試料をＲＴで保存した場合（図７、ｐ＜０．００１）、種々の条件間でのＡＣＴＢレベルの平均ｌｏｇ倍率変化において存在したが、４℃で保存した場合（図７、ｐ＝０．１８）、存在しなかった。
【０１１３】
ＲＴで保存した尿についてのＤＮＡ収率の差に関する事後分析により、ＥＤＴＡを添加した場合、ＤＮＡ収率が、より有意に良好であることが実証された（図７）。ＰｅｎＳｔｒｅｐの添加はＤＮＡ収率を改善しなかった（ｐ＞０．９９）。
合計７つの試料が３２超のＣＴＡＣＴＢを有した。これらの試料の条件には、ＲＴでのＰｅｎＳｔｒｅｐ（ｎ＝３）、ＲＴでの保存剤なし（ｎ＝３）および４℃でのＰｅｎＳｔｒｅｐ（ｎ＝１）が含まれた。ＥＤＴＡを添加した試料のいずれも、３２超のＣＴＡＣＴＢと関連していなかった。
【０１１４】
ｈｍＤＮＡ収率
種々の条件においてΔＣＴＡＣＴＢとΔＣＴＲＡＳＳＦ１Ａとの差を散布図においてグラフで提示する（図８）。いずれの条件においてもΔＣＴＡＣＴＢとΔＣＴＲＡＳＳＦ１Ａに統計的に有意な差は存在しなかった（表１２）。
【０１１５】
図８においてＡ〜Ｅと標識付けた５つの外れ値は、ＰＣＲ定量が不正確になる高いＣＴ値の結果である。
【０１１６】
【表１１】
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【０１１７】
【表１２】
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【０１１８】
実施例３  異なる尿試料
データは、膀胱がんを有する患者および年齢を一致させた健常な対照のそのままの（完全な）尿試料中のＤＮＡメチル化の分析に基づいた。膀胱がん検出のためのメチル化マーカーは、現在、異なる尿画分に対して比較されている。本発明者らは、１４人の膀胱がん患者および良性血尿を有する１２人の一致させた対照の尿を使用して、尿沈渣を、尿上清および完全な（そのままの）尿と比較した。後者の集団は泌尿器科クリニックにおいて頻繁に受診される集団を表し、膀胱がん患者と識別する必要性が最も高い集団である。
本発明者らは、尿沈渣の使用により、個々および組合せの両方において表４のマーカーの多くの感度が有意に（ｐ＜０．０５）増加することを見出した。尿沈渣の使用は、完全な尿の使用と比較して膀胱がん検出のためのマーカーＧＨＳＲおよびＭＡＬならびにＧＨＳＲ／ＭＡＬの組合せの感度を有意に（ｐ＜０．０５）増加させた。相対感度はそれぞれ１．６０（ＧＨＳＲ）、１．５０（ＭＡＬ）および１．４３（ＧＨＳＲ／ＭＡＬ）であった。この発見は、尿沈渣におけるそれらの診断性能を完全な尿と比較した場合、ＦＡＭ１９Ａ４、ＳＳＴおよびＺＩＣ１などの他のマーカーのいくつかについて感度の増加が見出されなかったという事実を考慮すると、特に驚くべきことであった。膀胱がんのためのマーカーＧＨＳＲおよびＭＡＬならびにＧＨＳＲ／ＭＡＬの組合せの感度は、表４の他のマーカーおよびそれらの２つの組合せと比較した場合、最も増加した。
次に本発明者らは、尿沈渣中で検出されたメチル化レベルと、同じ患者の腫瘍組織中で検出されたメチル化レベルとの相関を決定した。この分析により、ＧＨＳＲおよびＭＡＬが尿沈渣と組織標本との間で最も高い相関を示したことが明らかになった（スピアマンの相関０．７６８（ＧＨＳＲ）および０．７４４（ＭＡＬ））。比較において、ＦＡＭ１９Ａ４は、０．５６７の相関、ＳＳＴは０．６７５およびＺＩＣ１は０．６９１を示した。
【０１１９】
これらの発見により、尿沈渣を試験すると、ＧＨＳＲ、ＭＡＬおよびパネルＧＨＳＲ／ＭＡＬの診断精度が増加することが実証される。とりわけ、これらのマーカーは、腫瘍自体におけるメチル化状態を最も密接に反映しているように見える。これらの発見により、他のメチル化マーカーよりもＧＨＳＲ、ＭＡＬおよびＧＨＳＲ／ＭＡＬの驚くほど優れた性能が実証される。
【０１２０】
参考文献
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【図１−１】
2021530214.tif 000019
【図１−２】
2021530214.tif 000020
【図１−３】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【国際調査報告】
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