(57)【要約】  微生物による感染を防止し、微生物による感染の再発を低減するために、対象の微生物生態系（マイクロバイオーム）に永続的に影響を与えるための方法および組成物が提供される。いくつかの実施形態では、様々な微生物感染を防止する可能性のある分子改変された細菌株の作製および使用のための組成物および方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成微生物であって、
誘導可能な第１のプロモーターを含む第１の調節領域に作動可能に結合されている第１の細胞死遺伝子を含む、少なくとも１つのキルスイッチ分子改変を含む、組換えヌクレオチドを含み、
前記第１の誘導性プロモーターが、血液、血清、または血漿への曝露に応答して、基礎生産性の少なくとも３倍の前記組換えヌクレオチドの条件的に高いレベルの遺伝子発現を示す、合成微生物。
【請求項２】
前記合成微生物が、
前記第１の細胞死遺伝子に特異的な抗毒素遺伝子を含む、少なくとも第２の分子改変（発現クランプ）をさらに含み、前記抗毒素遺伝子が、
真皮または粘膜のコロニー形成時または完全培地で活性（構成的）であるが、血液、血清、または血漿への少なくとも３０分の曝露後に誘導されないか、１．５倍未満誘導されるか、または抑制される、第２のプロモーターを含む第２の調節領域に作動可能に結合されている、請求項１に記載の合成微生物。
【請求項３】
前記合成微生物が、望ましくない微生物と同一の属および種を有する標的微生物に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のプロモーターが、血液、血清、または血漿への曝露後、少なくとも３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分、または少なくとも３６０分以内に、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍、上方制御される、請求項１または２に記載の合成微生物。
【請求項５】
前記第１のプロモーターが、血液、血清、または血漿の非存在下で誘導されないか、１．５倍未満誘導されるか、または抑制される、請求項１または２に記載の合成微生物。
【請求項６】
前記第２のプロモーターを含む第２の調節領域が、真皮もしくは粘膜のコロニー形成時またはＴＳＢ培地中で活性であるが、少なくとも３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分、および少なくとも３６０分からなる群から選択される期間の、血液、血清、または血漿への曝露時に少なくとも２倍抑制される、請求項２に記載の合成微生物。
【請求項７】
前記合成微生物の測定可能な平均細胞死が、前記第１のプロモーターの誘導後の少なくとも予め設定された期間内に起こる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の合成微生物。
【請求項８】
前記測定可能な平均細胞死が、血液、血清、または血漿への曝露後、少なくとも１、５、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００、または３６０分からなる群から選択される少なくとも予め設定された期間内に起こる、請求項７に記載の合成微生物。
【請求項９】
前記測定可能な平均細胞死が、前記予め設定された期間後の、少なくとも５０％ｃｆｕ、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％ｃｆｕ数の低減である、請求項８に記載の合成微生物。
【請求項１０】
前記キルスイッチ分子改変が、対象の全身状態下で前記合成微生物の感染性増殖を低減または防止する、請求項１〜９のいずれかに記載の合成微生物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの分子改変が、前記合成微生物の染色体に組み込まれている、請求項１または２に記載の合成微生物。
【請求項１２】
前記標的微生物が、少なくとも１つの抗菌剤に対して感受性である、請求項３に記載の合成微生物。
【請求項１３】
前記標的微生物が、細菌、真菌、または原生動物の標的微生物から選択される、請求項１２に記載の合成微生物。
【請求項１４】
前記標的微生物が、真皮および／または粘膜ニッチにコロニーを形成することができる細菌種であり、アシネトバクター属、コリネバクテリウム属、キューティバクテリウム属、ブドウ球菌属、ストレプトコッカス属、プロピオン酸菌属、およびシュードモナス属からなる群から選択される属のメンバーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記合成微生物が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株に由来する、請求項１４に記載の合成微生物。
【請求項１６】
前記細胞死遺伝子が、ｓｐｒＡ１、ｓｐｒＡ２、ｋｐｎ１、ｓｍａ１、ｓｐｒＧ、ｒｅｌＦ、ｒｓａＥ、ｙｏｅＢ、ｍａｚＦ、ｙｅｆＭ、またはリゾスタフィン毒素遺伝子からなる群から選択される、請求項１５に記載の合成微生物。
【請求項１７】
前記細胞死遺伝子が、配列番号１２２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、２７４、２７５、２８４、２８６、２８８、２９０、３１５、および３１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の合成微生物。
【請求項１８】
前記誘導可能な第１のプロモーターが、ｉｓｄＡ（鉄調節表面決定因子タンパク質Ａ）、ｉｓｄＢ（鉄調節表面決定因子タンパク質Ｂ）、ｉｓｄＧ（ヘム分解モノオキシゲナーゼ）、ｈｌｇＡ（ガンマ溶血素コンポーネントＡ）、ｈｌｇＡ１（ガンマ溶血素）、ｈｌｇＡ２（ガンマ溶血素）、ｈｌｇＢ（ガンマ溶血素コンポーネントＢ）、ｈｒｔＡＢ（ヘム調節トランスポーター）、ｓｂｎＣ（ｌｕｃ  Ｃファミリーシデロフォア生合成タンパク質）、ｓｂｎＤ、ｓｂｎＩ、ｓｂｎＥ（ｌｕｃＡ／ｌｕｃＣファミリーシデロフォア生合成タンパク質）、ｉｓｄＩ、ｌｒｇＡ（ムレインヒドロラーゼレギュレーターＡ）、ｌｒｇＢ（ムレインヒドロラーゼレギュレーターＢ）、ｅａｒ（Ｅａｒタンパク質）、ｆｈｕＡ（フェリクロム輸送ＡＴＰ結合タンパク質ｆｈｕＡ）、ｆｈｕＢ（フェリクロム輸送パーミアーゼ）、ｈｌｂ（ホスホリパーゼＣ）、ヘムＡＢＣトランスポーター２遺伝子、ヘムＡＢＣトランスポーター遺伝子、ｉｓｄ  ＯＲＦ３、ｓｂｎＦ、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、鉄ＡＢＣトランスポーター遺伝子、トレオニンデヒドラターゼ遺伝子、シデロフォアＡＢＣトランスポーター遺伝子、ＳＡＭ  ｄｅｐ  Ｍｅｔｒａｎｓ遺伝子、ＨａｒＡ、ｓｐｌＦ（セリンプロテアーゼＳｐｌＦ）、ｓｐｌＤ（セリンプロテアーゼＳｐｌＤ）、ｄｐｓ（一般ストレスタンパク質２０Ｕ）、ＳＡＵＳＡ３００＿２６１７（推定コバルトＡＢＣトランスポーター、ＡＴＰ結合タンパク質）、ＳＡＵＳＡ３００＿２２６８（ナトリウム／胆汁酸共トランスポーターファミリータンパク質）、ＳＡＵＳＡ３００＿２６１６（コバルトファミリー輸送タンパク質）、ｓｒｔＢ（ソルターゼＢ）、ｓｂｎＡ（推定シデロフォア生合成タンパク質ｓｂｎＡ）、ｓｂｎＢ、ｓｂｎＧ、ｌｅｕＡ（２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼアミノ酸生合成酵素）、ｓｓｔＡ（鉄輸送膜タンパク質）、ｓｉｒＡ（鉄ＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質）、ｉｓｄＡ（ヘムトランスポーター）、およびｓｐａ（ブドウ球菌属タンパク質Ａ）からなる群から選択される遺伝子を含むか、またはそれに由来する、請求項１６または１７に記載の合成微生物。
【請求項１９】
前記第１のプロモーターが、配列番号１１４、１１５、１１９、１２０、１２１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、および１６３からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の合成微生物。
【請求項２０】
前記抗毒素遺伝子が、前記第１の細胞死遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズすることができるアンチセンスＲＮＡ配列をコードする、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の合成微生物。
【請求項２１】
前記抗毒素遺伝子が、ｓｐｒＡ１抗毒素遺伝子、ｓｐｒＡ２抗毒素遺伝子、ｓｐｒＧ抗毒素遺伝子もしくはｓｐｒＦ、ホリン抗毒素遺伝子、１８７−ｌｙｓＫ抗毒素遺伝子、ｙｅｆＭ抗毒素遺伝子、リゾスタフィン抗毒素遺伝子、もしくはｍａｚＥ抗毒素遺伝子、ｋｐｎ１抗毒素遺伝子、ｓｍａ１抗毒素遺伝子、ｒｅｌＦ抗毒素遺伝子、ｒｓａＥ抗毒素遺伝子、またはｙｏｅＢ抗毒素遺伝子からなる群より選択される、請求項２０に記載の合成微生物。
【請求項２２】
前記抗毒素遺伝子が、配列番号２７３、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１４、３１９、もしくは３２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の合成微生物。
【請求項２３】
前記第２のプロモーターが、ｃｌｆＢ（クランピングファクターＢ）、ｓｃｅＤ（オートライシン、エキソプロテインＤ）、ｗａｌＫＲ（病原性レギュレーター）、ａｔｌＡ（主要な自己溶菌酵素）、ｏａｔＡ（Ｏ−アセチルトランスフェラーゼＡ）；ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンテターゼ遺伝子、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミド遺伝子、トレハロースパーミアーゼＩＩＣ遺伝子、ＤｅｏＲファミリー転写調節遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、ＰＴＳフルクトーストランスポーターサブユニットＩＩＣ遺伝子、ガラクトース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子、ＮａｒＺ、ＮａｒＨ、ＮａｒＴ、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、仮想タンパク質遺伝子、ＤｅｏＲトランスファクター遺伝子、リゾホスホリパーゼ遺伝子、タンパク質脱凝集シャペロン遺伝子、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、ｇｙｒＢ、ｓｉｇＢ、およびｒｈｏからなる群から選択される遺伝子を含むか、またはそれらに由来する、請求項２１または２２に記載の合成微生物。
【請求項２４】
前記第２のプロモーターがＰclfB（クランピングファクターＢ）であり、配列番号１１７、１１８、１２９、もしくは１３０のヌクレオチド配列、またはその実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載の合成微生物。
【請求項２５】
病原性ブロック分子改変およびナノファクトリー分子改変からなる群から選択される分子改変をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の合成微生物。
【請求項２６】
前記病原性ブロック分子改変が、前記望ましくない微生物からの遺伝物質の遺伝子水平伝播を防止する、請求項２５に記載の合成微生物。
【請求項２７】
前記ナノファクトリー分子改変が、酵素、アミノ酸、代謝中間体、および小分子からなる群から選択される産物をコードする遺伝子の挿入、それをコードする遺伝子のノックアウト、またはそれをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む、請求項２５に記載の合成微生物。
【請求項２８】
有効量の請求項１〜２７のいずれか１項に記載の合成微生物と、薬学的に許容される担体、希釈剤、皮膚軟化剤、結合剤、賦形剤、潤滑剤、甘味料、香味料、湿潤剤、保存料、緩衝剤、もしくは吸収剤、またはそれらの組み合わせと、を含む、組成物。
【請求項２９】
栄養素、プレバイオティクス、共生および／またはプロバイオティクス細菌種をさらに含む、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
請求項２８または２９に記載の組成物を含む単回用量単位。
【請求項３１】
少なくとも１０5、少なくとも１０6、少なくとも１０7、少なくとも１０8、少なくとも１０9、少なくとも１０10ＣＦＵ、または少なくとも１０11の合成株と、薬学的に許容される担体と、を含む、請求項３０に記載の単回用量単位。
【請求項３２】
局所投与用に製剤化された、請求項３１に記載の用量単位。
【請求項３３】
対象における望ましくない微生物の再発を排除および防止するための医薬の製造において使用するための、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の合成微生物または請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３４】
マイクロバイオームの宿主となる対象における望ましくない微生物の再発を排除および防止するための方法であって、
ａ．前記宿主マイクロバイオームを脱コロニー化することと、
ｂ．非ネイティブ属性を付与する少なくとも１つの要素を含む合成微生物を前記対象に投与することにより、前記望ましくない微生物を永続的に置き換えることであって、前記合成微生物が、前記宿主マイクロバイオームに永続的に組み込まれること、および前記宿主マイクロバイオームにおいて前記望ましくない微生物と同じニッチを占有することが可能である、置き換えることと、を含む、方法。
【請求項３５】
前記脱コロニー化することが、前記対象の少なくとも１つの部位で行われ、前記少なくとも１つの部位からの前記望ましくない微生物の検出可能な存在を実質的に低減または排除する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記望ましくない微生物の前記検出可能な存在が、表現型法および／または遺伝子型法を含む方法により判定され、任意選択的に、前記表現型法が、生化学反応、血清学的反応、抗菌剤に対する感受性、ファージに対する感受性、バクテリオシンに対する感受性、および／または細胞タンパク質のプロファイルからなる群から選択され、
任意選択的に、前記遺伝子型法が、ハイブリダイゼーション、プラスミドプロファイル、プラスミド多型の分析、制限酵素消化、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）による反応と分離、リボタイピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびそのバリアント、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ならびに転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ）からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ニッチが、前記少なくとも１つの部位での前記望ましくない微生物の安定したコロニー形成を可能にする真皮または粘膜環境である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記宿主マイクロバイオームに永続的に組み込まれる能力が、前記投与するステップ後の少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２６週間、少なくとも３０週間、少なくとも３６週間、少なくとも４２週間、または少なくとも５２週間の期間の、前記少なくとも１つの部位における前記合成微生物の検出可能な存在によって判定される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記望ましくない微生物を永続的に置き換える能力が、前記投与するステップ後の少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２６週間、少なくとも３０週間、少なくとも３６週間、少なくとも４２週間、または少なくとも５２週間の期間の、前記少なくとも１つの部位における前記合成微生物の検出可能な存在の不在によって判定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記同じニッチを占有する能力が、前記投与するステップ後の前記少なくとも１つの部位における前記望ましくない微生物と前記合成微生物との共コロニー化の不在によって判定され、
任意選択的に、前記共コロニー形成の不在が、前記投与するステップ後の少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２６週間、少なくとも３０週間、少なくとも３６週間、少なくとも４２週間、または少なくとも５２週間で判定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記非ネイティブ属性を付与する前記少なくとも１つの要素が、前記合成微生物に永続的に組み込まれる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記非ネイティブ属性を付与する前記少なくとも１つの要素が、前記合成微生物を介して前記宿主マイクロバイオームに永続的に組み込まれる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記非ネイティブ属性を付与する前記少なくとも１つの要素が、キルスイッチ分子改変、病原性ブロック分子改変、代謝改変、およびナノファクトリー分子改変からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記分子改変が、前記合成微生物の染色体に組み込まれている、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記合成微生物が、前記望ましくない微生物からの遺伝物質の遺伝子水平伝播を防止する病原性ブロック分子改変を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記合成微生物が、前記対象の全身状態下で前記合成微生物の感染性増殖を低減または防止するキルスイッチ分子改変を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記合成微生物が、前記望ましくない微生物と同一の属および種を有する標的微生物に由来する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記合成微生物が、前記脱コロニー化された宿主マイクロバイオームに生物的に組み込まれる能力を有する標的微生物に由来する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記合成微生物が、前記宿主マイクロバイオームから単離された標的微生物に由来する、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的微生物が、少なくとも１つの抗菌剤に感受性である、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記標的微生物が、細菌、真菌、または原生動物の標的微生物から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記標的微生物が、真皮および／または粘膜ニッチにコロニーを形成することができる細菌種であり、アシネトバクター属、コリネバクテリウム属、キューティバクテリウム属、ブドウ球菌属、ストレプトコッカス属、プロピオン酸菌属、およびシュードモナス属からなる群から選択される属のメンバーである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記標的微生物が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｉｓ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからなる群から選択され、任意選択的に、前記標的株が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ株またはＲＮ４２２０株である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記合成微生物のキルスイッチ分子改変が、第１の誘導性プロモーターを含む第１の調節領域に作動可能に連結された第１の細胞死遺伝子を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１のプロモーターが、前記対象の前記少なくとも１つの部位での正常な生理学的（ニッチ）状態とは対照的な微生物環境の状態変化によって活性化（誘導）される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記合成微生物の測定可能な平均細胞死が、前記第１のプロモーターの誘導後の少なくとも予め設定された期間内に起こる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記測定可能な平均細胞死が、前記状態の変化後、少なくとも１、５、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００、または３６０分からなる群から選択される少なくとも予め設定された期間内に起こる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記測定可能な平均細胞死が、前記予め設定された期間後の、少なくとも５０％ｃｆｕ、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％ｃｆｕ数の低減である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記状態の変化が、ｐＨ、温度、浸透圧、モル浸透圧濃度、酸素レベル、栄養素濃度、血中濃度、血漿中濃度、血清中濃度、金属濃度、キレート化金属濃度、１つ以上の免疫因子の組成物または濃度の変化、ミネラル濃度、および電解質濃度のうちの１つ以上から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記状態の変化が、前記対象の前記少なくとも１つの部位における正常な生理学的（ニッチ）状態と比較して、血液、血清、または血漿のより高い濃度および／または組成物の変化である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１のプロモーターが、血液、血清、血漿、および／またはヘム応答性プロモーターである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１のプロモーターが、前記状態の変化後、少なくとも３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分、および少なくとも３６０分からなる群から選択される期間内に、少なくとも１．５倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍、上方制御される、請求項５５〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記第１のプロモーターが、前記状態の変化の非存在下で誘導されないか、１．５倍未満誘導されるか、または抑制される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１のプロモーターが、血清または血液の存在下で一定期間内に少なくとも１．５、２、３、４、５、または少なくとも６倍誘導される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１のプロモーターが、前記少なくとも１つの部位での正常な生理学的（ニッチ）状態下で誘導されないか、１．５倍未満誘導されるか、または抑制される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記第１のプロモーターが、血液、血清、または血漿の非存在下で誘導されないか、１．５倍未満誘導されるか、または抑制される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記合成微生物がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株である標的微生物に由来し、前記第１のプロモーターが、ｉｓｄＡ（鉄調節表面決定因子タンパク質Ａ）、ｉｓｄＢ（鉄調節表面決定因子タンパク質Ｂ）、ｉｓｄＧ（ヘム分解モノオキシゲナーゼ）、ｈｌｇＡ（ガンマ溶血素コンポーネントＡ）、ｈｌｇＡ１（ガンマ溶血素）、ｈｌｇＡ２（ガンマ溶血素）、ｈｌｇＢ（ガンマ溶血素コンポーネントＢ）、ｈｒｔＡＢ（ヘム調節トランスポーター）、ｓｂｎＣ（ｌｕｃ  Ｃファミリーシデロフォア生合成タンパク質）、ｓｂｎＤ、ｓｂｎＩ、ｓｂｎＥ（ｌｕｃＡ／ｌｕｃＣファミリーシデロフォア生合成タンパク質）、ｉｓｄＩ、ｌｒｇＡ（ムレインヒドロラーゼレギュレーターＡ）、ｌｒｇＢ（ムレインヒドロラーゼレギュレーターＢ）、ｅａｒ（Ｅａｒタンパク質）、ｆｈｕＡ（フェリクロム輸送ＡＴＰ結合タンパク質ｆｈｕＡ）、ｆｈｕＢ（フェリクロム輸送パーミアーゼ）、ｈｌｂ（ホスホリパーゼＣ）、ヘムＡＢＣトランスポーター２遺伝子、ヘムＡＢＣトランスポーター遺伝子、ｉｓｄ  ＯＲＦ３、ｓｂｎＦ、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、鉄ＡＢＣトランスポーター遺伝子、トレオニンデヒドラターゼ遺伝子、シデロフォアＡＢＣトランスポーター遺伝子、ＳＡＭ  ｄｅｐ  Ｍｅｔｒａｎｓ遺伝子、ＨａｒＡ、ｓｐｌＦ（セリンプロテアーゼＳｐｌＦ）、ｓｐｌＤ（セリンプロテアーゼＳｐｌＤ）、ｄｐｓ（一般ストレスタンパク質２０Ｕ）、ＳＡＵＳＡ３００＿２６１７（推定コバルトＡＢＣトランスポーター、ＡＴＰ結合タンパク質）、ＳＡＵＳＡ３００＿２２６８（ナトリウム／胆汁酸共トランスポーターファミリータンパク質）、ＳＡＵＳＡ３００＿２６１６（コバルトファミリー輸送タンパク質）、ｓｒｔＢ（ソルターゼＢ）、ｓｂｎＡ（推定シデロフォア生合成タンパク質ｓｂｎＡ）、ｓｂｎＢ、ｓｂｎＧ、ｌｅｕＡ（２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼアミノ酸生合成酵素）、ｓｓｔＡ（鉄輸送膜タンパク質）、ｓｉｒＡ（鉄ＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質）、ｉｓｄＡ（ヘムトランスポーター）、およびｓｐａ（ブドウ球菌属タンパク質Ａ）からなる群から選択される遺伝子に由来する、請求項５４〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記第１のプロモーターが、配列番号１１４、１１５、１１９、１２０、１２１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、および１６３からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその実質的に同一のヌクレオチド配列に由来するか、またはそれを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記望ましくない微生物がＳｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株であり、前記検出可能な存在が、前記対象の前記少なくとも１つの部位から試料を得ることと、発色寒天を前記試料と接触させることと、前記接触させた寒天をインキュベートすることと、所定の時間後に前記細菌種の陽性ｃｆｕｓを計数することと、を含む方法によって測定される、請求項５４〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞死遺伝子が、ｓｐｒＡ１、ｓｐｒＡ２、ｋｐｎ１、ｓｍａ１、ｓｐｒＧ、ｒｅｌＦ、ｒｓａＥ、ｙｏｅＢ、ｍａｚＦ、ｙｅｆＭ、およびリゾスタフィン毒素遺伝子からなる群から選択される毒素遺伝子から選択される、請求項５４〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞死遺伝子が、配列番号１２２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、２７４、２７５、２８４、２８６、２８８、２９０、３１５、および３１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記合成微生物が、前記第１の細胞死遺伝子に特異的な抗毒素遺伝子を含む発現クランプ分子改変をさらに含み、前記抗毒素遺伝子が、真皮または粘膜のコロニー形成時またはＴＳＢ培地中で活性であるが、少なくとも３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分、および少なくとも３６０分からなる群から選択される期間の、血液、血清、または血漿への曝露時に少なくとも２倍抑制される、第２のプロモーターを含む第２の調節領域に作動可能に連結されている、請求項５４〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記抗毒素遺伝子が、前記第１の細胞死遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズすることができるアンチセンスＲＮＡ配列をコードする、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記抗毒素遺伝子が、ｓｐｒＡ１抗毒素遺伝子、ｓｐｒＡ２抗毒素遺伝子、ｓｐｒＧ抗毒素遺伝子もしくはｓｐｒＦ、ホリン抗毒素遺伝子、１８７−ｌｙｓＫ抗毒素遺伝子、ｙｅｆＭ抗毒素遺伝子、リゾスタフィン抗毒素遺伝子、もしくはｍａｚＥ抗毒素遺伝子、ｋｐｎ１抗毒素遺伝子、ｓｍａ１抗毒素遺伝子、ｒｅｌＦ抗毒素遺伝子、ｒｓａＥ抗毒素遺伝子、またはｙｏｅＢ抗毒素遺伝子からなる群より選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記抗毒素遺伝子が、配列番号２７３、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１４、３１９、もしくは３２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記第２のプロモーターが、ｃｌｆＢ（クランピングファクターＢ）、ｓｃｅＤ（オートライシン、エキソプロテインＤ）、ｗａｌＫＲ（病原性レギュレーター）、ａｔｌＡ（主要な自己溶菌酵素）、ｏａｔＡ（Ｏ−アセチルトランスフェラーゼＡ）；ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンテターゼ遺伝子、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミド遺伝子、トレハロースパーミアーゼＩＩＣ遺伝子、ＤｅｏＲファミリー転写調節遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、ＰＴＳフルクトーストランスポーターサブユニットＩＩＣ遺伝子、ガラクトース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子、ＮａｒＺ、ＮａｒＨ、ＮａｒＴ、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、仮想タンパク質遺伝子、ＤｅｏＲトランスファクター遺伝子、リゾホスホリパーゼ遺伝子、タンパク質脱凝集シャペロン遺伝子、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、ｇｙｒＢ、ｓｉｇＢ、およびｒｈｏからなる群から選択される遺伝子に由来する、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記第２のプロモーターがＰclfB（クランピングファクターＢ）であり、配列番号１１７、１１８、１２９、もしくは１３０のヌクレオチド配列、またはその実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記脱コロニー化するステップが、前記少なくとも１つの部位から前記望ましくない微生物の存在を低減または排除するために、前記対象の前記少なくとも１つの部位に脱コロニー化剤を局所投与することを含む、請求項４３〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記脱コロニー化するステップが、前記脱コロニー化剤の局所投与を含み、全身性抗菌剤が同時に投与されない、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記脱コロニー化剤の第１の局所投与から１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、または１年以内に全身性抗菌剤を投与しない、請求項７８または７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記脱コロニー化剤が、消毒剤、殺菌剤、防腐剤、収斂剤、および抗菌剤からなる群から選択される、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記脱コロニー化剤が、アルコール（エチルアルコール、イソプロピルアルコール）、アルデヒド（グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド放出剤（ノキシチオリン＝オキシメチレンチオ尿素、タウロリン、ヘキサミン、ダントイン）、ｏ−フタルアルデヒド）、アニリド（トリクロカルバン＝ＴＣＣ＝３，４，４’−トリクロルカルバニリド）、ビグアニド（クロルヘキシジン、アレキシジン、高分子ビグアニド（ＭＷ＞３，０００ｇ／ｍｏｌのポリヘキサメチレンビグアニド、バントシル）、ジアミジン（プロパミジン、イセチオン酸プロパミジン、プロパミジン二塩酸塩、ジブロモプロパミジン、イセチオン酸ジブロモプロパミジン）、フェノール（フェンチクロル、ｐ−クロロ−ｍ−キシレノール、クロロキシレノール、ヘキサクロロフェン）、ビスフェノール（トリクロサン、ヘキサクロロフェン）、クロロキシレノール（ＰＣＭＸ）、第４級アンモニウム化合物（セトリミド、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム）、銀化合物（スルファジアジン銀、硝酸銀）、ペルオキシ化合物（過酸化水素、過酢酸、過酸化ベンゾイル）、ヨウ素化合物（ポビドンヨード、ポロキサマーヨード、ヨウ素）、塩素放出剤（次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸、二酸化塩素、ジクロロイソシアヌル酸ナトリウム、クロラミン−Ｔ）、銅化合物（酸化銅）、イソトレチノイン、硫黄化合物、植物抽出物（メラロイカ属（ティーツリーオイル）、（スノキ属（例えば、Ａタイププロアントシアニジン）、Ｃａｓｓｉａ  ｆｉｓｔｕｌａ  Ｌｉｎｎ、Ｂａｅｋｅａ  ｆｒｕｔｅｓｄｅｎｓ  Ｌ．、Ｍｅｌｉａ  ａｚｅｄａｒａｃｈ  Ｌ．、Ｍｕｎｔｉｎｇｉａ  ｃａｌａｂｕｒａ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  Ｌ、Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ  ａｖｉｃｅｎｎｉｏｉｄｅｓ  Ｇｕｉｌｌ＆Ｐｅｒｒ．、Ｐｈｙｌａｎｔｕｓ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｓ  ｍｕｅｌ．Ｍｕｅｌ−Ａｒｇ．、Ｏｃｉｍｕｍ  ｇｒａｔｉｓｓｉｍｕｍ  Ｌｉｎｎ．、Ａｃａｌｙｐｈａ  ｗｉｌｋｅｓｉａｎａ  Ｍｕｅｌｌ−Ａｒｇ．、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｐｒｕｉｎａｔｕｍ  Ｂｏｉｓｓ．＆Ｂａｌ．、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｏｌｉｍｐｉｃｕｍ  Ｌ．およびＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｓａｂｒｕｍ  Ｌ．、Ｈａｍａｍｅｌｉｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ（アメリカマンサク）、チョウジ油、ユーカリ属、ローズマリー属（ローズマリー）、イブキジャコウソウ属（タイム）、イワダレソウ属（オレガノ）、レモングラス属、シナモン属、ゼラニウム属、ラベンデュラ属）、アミノレブロン酸、および局所抗生物質化合物（バクテリオシン、ムピロシン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、ゲンタマイシン）からなる群から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記抗菌剤が、バンコマイシン、セファゾリン、セパハロチン、セファレキシン、リネゾリド、ダプトマイシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ムピロシン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、ゲンタマイシン、ウリフロキサシン、フィダキソマイシン、ミノサイクリン、メトロニダゾール、メトロニダゾール、スルファメトキサゾール、アンピシリン、トリメトプリム、オフロキサシン、ノルフロキサシン、チニダゾール、ノルフロキサシン、オルニダゾール、レボフロキサシン、ナリジクス酸、セフトリアキソン、アジスロマイシン、セフィキシム、セフトリアキソン、セファレキシン、セフトリアキソン、リファキシミン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、プルフロキサシン、ウリフロキサシン、モキシフロキサシン、ナイスタチン、アンホテリシンＢ、フルシトシン、ケトコナゾール、ポサコナゾール、クロトリマゾール、ボリコナゾール、グリセオフルビン、硝酸ミコナゾール、およびフルコナゾールからなる群から選択される、請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記脱コロニー化することが、前記置き換えるステップの前に少なくとも１、２、３、４、５または６回またはそれ以上の回数、前記脱コロニー化剤を局所投与することを含む、請求項７８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記脱コロニー化するステップが、０．５〜４８時間の間隔をあけて１〜６回もしくはそれ以上または２〜４回、前記対象の前記少なくとも１つの宿主部位に前記脱コロニー化剤を投与することを含み、前記置き換えるステップが、前記最後の脱コロニー化するステップの後に実行される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記置き換えるステップが、前記対象の前記少なくとも１つの部位に対する、少なくとも１０5、少なくとも１０6、少なくとも１０7、少なくとも１０8、少なくとも１０9、少なくとも１０10ＣＦＵ、または少なくとも１０11の前記合成株と、薬学的に許容される担体と、を含む組成物の最初の局所投与を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記最初の置き換えるステップが、前記脱コロニー化するステップの１２時間、２４時間、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、または７日以内に行われる、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記置き換えるステップが、前記最後の脱コロニー化するステップの後、２週間ごとから６ヶ月ごとに１回以下の間隔で繰り返される、請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記脱コロニー化するステップおよび前記置き換えるステップが、２週間ごとから６ヶ月ごとに１回以下の間隔で繰り返される、請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記置き換えることが、前記合成微生物を前記少なくとも１つの部位に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回投与することを含む、請求項８６〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記置き換えることが、前記合成微生物を前記少なくとも１つの部位に、月に１回以下、２回以下、３回以下、または４回以下投与することを含む、請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
前記対象における前記合成微生物のコロニー形成を促進することをさらに含む、請求項４３〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記対象における前記合成微生物のコロニー形成を促進することが、前記対象に促進剤を投与することを含み、任意選択的に、前記促進剤が栄養素、プレバイオティクス、共生、安定剤、保湿剤、および／またはプロバイオティクス細菌種である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記促進することが、前記最初の脱コロニー化ステップの後に、１０6〜１０10ｃｆｕ、または１０7〜１０9ｃｆｕのプロバイオティクス細菌種を前記対象に投与することを含む、請求項９３記載の方法。
【請求項９５】
前記栄養素が、塩化ナトリウム、塩化リチウム、グリセロリン酸ナトリウム、フェニルエタノール、マンニトール、トリプトン、ペプチド、および酵母エキスから選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記プレバイオティクスが、短鎖脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸）、グリセロール、農業副産物由来のペクチン由来オリゴ糖、フルクトオリゴ糖（例えば、イヌリン様プレバイオティクス）、ガラクトオリゴ糖（例えば、ラフィノース）、コハク酸、乳酸、およびマンナンオリゴ糖からなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記プロバイオティクスが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｃａｌｉｓからなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
前記共生が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｉｓ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
前記望ましくない微生物が抗菌剤耐性微生物である、請求項４３〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記抗菌剤耐性微生物が抗生物質耐性細菌である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記抗生物質耐性細菌が、ストレプトコッカス属、クチバクテリウム属、およびブドウ球菌属からなる群から選択されるグラム陽性細菌種である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ストレプトコッカス属が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅからなる群から選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記クチバクテリウム属が、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ亜種ａｃｎｅｓ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ亜種ｄｅｆｅｎｄｅｎｓ、およびＣｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ亜種ｅｌｏｎｇａｔｕｍからなる群から選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ブドウ球菌属が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓからなる群から選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記望ましくない微生物が、１つ（ＳＣＣｍｅｃタイプＩ）または複数の抗生物質耐性遺伝子（ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩおよびＩＩＩ）をコードする、および／または毒素を生成する、ブドウ球菌染色体カセット（ＳＣＣｍｅｃタイプＩ〜ＩＩＩ）を含むメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）株である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記毒素が、パントン−バレンタインロイコシジン（ＰＶＬ）毒素、トキシックショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）、ブドウ球菌性アルファ溶血素毒素、ブドウ球菌性ベータ溶血素毒素、ブドウ球菌性ガンマ溶血毒素、ブドウ球菌性デルタ溶血毒素、エンテロトキシンＡ、エンテロトキシンＢ、エンテロトキシンＣ、エンテロトキシンＤ、エンテロトキシンＥ、およびコアグラーゼ毒素からなる群から選択される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記対象が、前記投与するステップの後、少なくとも２週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２４週間、少なくとも３０週間、少なくとも３６週間、少なくとも４２週間、または少なくとも５２週間、前記少なくとも１つの部位で前記対象をスワブすることによって証明されるとき、前記望ましくない微生物の再発を示さない、請求項４３〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
少なくとも１つの容器内に、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の合成微生物、請求項２８または２９に記載の組成物、または請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の単回投与、および任意選択的に、脱コロニー化剤を含む少なくとも第２の容器、説明書のシート、促進剤を含む少なくとも第３の容器、および／またはアプリケーターを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月４日にＰＣＴ国際特許出願として出願されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１２月５日に出願された米国仮出願第６２／５９４，９４３号の優先権の権益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、２０１８年１２月３日に作成され、１２８，０６５キロバイト（ＫＢ）のサイズを有する「配列表」という名称のｔｘｔファイルとしての電子フォーマットの配列表を含む。ｔｘｔファイル「配列表」の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
望ましくない微生物による感染に抵抗し、その感染の再発を低減するために、脱コロニー化して永続的に合成微生物と置き換えることにより、対象の微生物生態系（マイクロバイオーム）に永続的に影響を与えるための方法および組成物が提供される。真皮または粘膜状態下で望ましくない微生物を永続的に置き換えることのできる合成微生物が提供されており、それは、例えば、全身状態に曝された場合に自己破壊することにより、病原性または抗生物質耐性遺伝子の獲得の可能性を低減することにより、および／または対象の生態系の部位で望ましい産物を生産することにより、安全性を高めるように設計された分子改変を含む。
【背景技術】
【０００４】
ヘルスケアまたは地域社会に関連する感染は、多くの場合、患者の防御を克服する微生物のコロニー形成に起因する。抗生物質の不適切な使用は、マイクロバイオームの至らない管理をもたらす可能性がある。マイクロバイオームの至らない管理の重大な意図しない結果の１つは、抗生物質耐性微生物の出現である。
【０００５】
各個体は、おそらく１０，０００の異なる種、タイプ、および株からなる、何兆もの微生物の膨大な集団の宿主である。これらの「共生」生物は、外部部位（例えば、真皮）と内部部位（例えば、胃腸）の両方にあり、人類の生存に必要である。「コロニー形成」は、環境との継続的な相互作用を通じて自動的に起こる。
【０００６】
微生物の繁殖地は、多くの場合、そして多くの点で、我々の健康とウェルネスにとって不可欠である動的で構造化された生命システムである「バイオーム」を構成する。バイオームの構造は、宿主、環境、およびバイオームのコンポーネント間の関係の膨大な組み合わせのウェブによって作成される。ヒトのマイクロバイオームは生態系である。それは動的であるが永続的な構造を有し、−「回復力」があり、「健康な」正常の基礎状態を有する。
【０００７】
それにもかかわらず、いくつかの状況下では、マイクロバイオームは病原性微生物に侵入され、それによって占められる可能性がある。このタイプの「コロニー形成」は、「感染」の前兆となる可能性がある。マイクロバイオームのこの種の混乱は、深刻でさらに生命を脅かす疾患を引き起こす可能性がある。
【０００８】
我々のバイオームの至らない管理の意図しない結果の１つは、「抗生物質耐性」の出現である。これは、抗生物質と防腐剤が標的微生物を完全に排除（ｅｌｉｍｉｎａｔｅ）しない場合に起こる。これらの物質に対する耐性を示す少数の生存生物は、優先的に生育して、すでに競争生物を排除（ｃｌｅａｒ）した開放環境（または空の「ニッチ」）に戻る（「再コロニー化する」）。対背、生存生物は空間を支配し、通常はそれらの子孫においてその耐性を維持する。新しい殺傷剤に曝された場合、それらは同様にそれに対する耐性を発達させる傾向がある。ほんの数世代で、これらの微生物は我々の既知の抗生物質の多くまたはすべてに対して耐性を発達させ、今や有名な「スーパーバグ」になり、途方もなく巨大な新しい世界的な健康問題を引き起こす。
【０００９】
「再発」と呼ばれる現象は、抗生物質耐性を生み出すプロセスの中心にある。病原性感染を治療する方法は存在するが、再発を防止する方法は事実上存在しない。
【００１０】
細菌感染症は、出現しつつある「スーパーバグ」現象の本拠地である。抗生物質の乱用と誤用により、病原菌の多くの菌株が増加する数の抗生物質療法に対する耐性を進化させ、世界的な公衆衛生上の大きな問題を引き起こしている。これらのスーパーバグを治療するために抗生物質の新しいバリエーションが適用されるたびに、耐性株を選択する避けられないプロセスが新たに始まり、病原体の耐性バリアントが急速に発達する。残念ながら、今日の細菌は新しい抗生物質の開発よりも早く耐性を獲得している。
【００１１】
抗生物質耐性を培養し、レシピエントにしばしば健康への悪影響を引き起こすだけでなく、抗生物質治療は、善玉菌と悪玉菌の両方を含むマイクロバイオーム全体を破壊するという望ましくない影響もある。これはしばしば、治療後に外来性病原菌によるコロニー形成にマイクロバイオームを開くなどの新しい問題を引き起こす。
【００１２】
しかしながら、これらの要件は分子レベルでより基本的であり、ゲノムで本質的に定義されているため、細菌はさまざまなリソースに適応する余地が少ない。これにより、マイクロバイオームの生態が「理想的な」システムのように振る舞い、ニッチから同一株の競争生物の１つが完全に除外される。
【００１３】
人体にコロニーを形成する生物のコミュニティは、マイクロバイオームと呼ばれる。マイクロバイオームはしばしば、分析のために地理学のセクション（すなわち、真皮のマイクロバイオーム対胃腸のマイクロバイオーム）または系統発生のセクション（すなわち、細菌のマイクロバイオーム対真菌または原生生物のマイクロバイオーム）に細分される。
【００１４】
抗生物質は救命薬であるが、マイクロバイオームを変化させたり、バランスを崩したり、混乱させたりする可能性もある。マイクロバイオームは、皮膚、腸、口または気道、および尿路など、身体の中およびその上に、天然に存在する細菌のコミュニティである。健康なマイクロバイオームは感染からの保護に役立つ。抗生物質はマイクロバイオームを破壊し、「善玉」および「悪玉」の細菌の両方を排除する。ＭＲＳＡ、ＣＲＥ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのような薬剤耐性菌は、この混乱を利用して増殖することができる。この耐性菌の異常増殖により、身体は感染の準備が整う。対象が耐性菌によりコロニー化されると、耐性菌は他の人に容易に蔓延し得る。「抗生物質耐性（ＡＲ）ソリューションイニシアチブ：マイクロバイオーム、ＣＤＣマイクロバイオームファクトシート２０１６」、ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ／ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ−ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ／ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ−ｔｏ−ｓｌｏｗ−ＡＲ．ｈｔｍｌを参照されたい。
【００１５】
Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）によると、米国に対する薬物耐性の主な脅威には、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、多剤耐性アシネトバクター、薬物耐性カンピロバクター、フルコナゾール耐性カンジダ、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、薬剤耐性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、薬剤耐性非腸チフス性サルモネラ、薬剤耐性サルモネラ血清型チフス、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、薬剤耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、薬剤耐性結核、バンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ブドウ球菌耐性グループＡ連鎖球菌、およびクリンダマイシン耐性グループＢ連鎖球菌が含まれる。「抗生物質／抗菌剤耐性（ＡＲ／ＡＭＲ）」、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ／ｂｉｇｇｅｓｔ＿ｔｈｒｅａｔｓ．ｈｔｍｌを参照されたい。
【００１６】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは、尿道、子宮頸部、咽頭、または直腸で分泌物と炎症を引き起こす可能性がある性感染症である淋病を引き起こす。年間約８２０，０００の淋病感染がある。これらのうち、約２４６，０００の薬剤耐性淋病感染があり、１８８，６００のテトラサイクリン耐性、１１，４８９のセフィキシム感受性の低下、３，２８０のセフトリアキソン感受性の低下、約２，４６０のアジスロマイシン感受性の低下が見られる。
【００１７】
アシネトバクターは、重症患者の肺炎または血流感染の原因となるグラム陰性菌の一種である。これらの細菌の多くは抗生物質に対して非常に耐性を有している。年間約１２，０００のアクチノバクター感染症があり、これには約７，３００の多剤耐性アクチノバクター感染症と５００人の死亡が含まれる。
【００１８】
カンジダ症は、カンジダ属の酵母によって引き起こされる真菌感染症である。ヒトに感染を引き起こす可能性のあるカンジダ酵母には２０を超える種があるが、最も一般的なのはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓである。カンジダ酵母は通常、感染を引き起こさずに皮膚や粘膜に生息する。しかしながら、これらの微生物の異常増殖または侵入により、症状が発生する可能性がある。カンジダ症の症状は、感染している体の部位によって異なります。カンジダは、米国における医療関連の血流感染症の４番目に多い原因である。一部の病院では、それが最も一般的な原因である。これらの感染症は最も病気の患者で発生する傾向がある。年間約４６，０００のカンジダ感染症があり、これには約３，４００のフルコナゾール耐性カンジダ感染症と２２０人の死亡者が含まれます。
【００１９】
黄色ブドウ球菌は、皮膚に見られる一般的な種類の細菌である。患者がカテーテルまたは人工呼吸器を必要とする、または外科的処置を受ける医療処置中、黄色ブドウ球菌は体内に入り感染を引き起こす可能性がある。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、皮膚や創傷の感染症から、敗血症や死を引き起こす可能性のある肺炎や血流感染症まで、さまざまな病気を引き起こす。ＭＲＳＡを含むブドウ球菌は、医療関連感染の最も一般的な原因の１つである。年間約８０，４６１件の重度のＭＲＳＡ感染症があり、年間約１１，２８５名のＭＲＳＡによる死亡者がいます。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓがバンコマイシンに耐性を示すようになった場合、これまでに確認されたバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌もメチシリンや他のクラスの抗生物質に耐性があったため、利用できる治療オプションはほとんどない。２００２年以降、４つの州で少なくとも１３例のバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌が発生している。
【００２０】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、またはｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）は、米国における細菌性肺炎および髄膜炎の主な原因である。また、血流感染症や耳や副鼻腔の感染症の主な原因である。年間約１，２００，０００の薬剤耐性感染症があり、約１９，０００人が過剰入院し、７，０００人が死亡している。
【００２１】
グループＡ連鎖球菌（ＧＡＳ）は、咽頭炎（連鎖球菌性咽頭炎）、連鎖球菌毒素性ショック症候群、壊死性筋膜炎（「肉食性」疾患）、緋色熱、リウマチ熱、および膿疹などの皮膚感染症など、多くの病気を引き起こす。グループＡ連鎖球菌は、壊死性筋膜炎（「肉食性」疾患）の主な原因である。年間約１，３００万人の薬剤耐性グループＡ連鎖球菌感染を含む、約１００万〜２６０万人の連鎖球菌咽頭感染症があり、約１６０人が死亡している。
【００２２】
グループＢ連鎖球菌（ＧＢＳ）は、血流感染症（敗血症）および肺炎から髄膜炎および皮膚感染症に至るまで、すべての年齢の人々に深刻な病気を引き起こす可能性のある細菌の一種である。グループＢ連鎖球菌は、新生児の深刻な微生物感染の主な原因である。２０１１年には、約２７，０００のＧＢＳの重症の症例があり、これには約７，６００の薬剤耐性のグループＢ連鎖球菌感染症と約４４０人の死亡が含まれている。
【００２３】
コロニー化した個体における薬物耐性微生物の感染および伝染を防止する先行技術の方法は、スクリーニングおよび単離、薬物耐性微生物の脱コロニー化、および／または薬物感受性微生物による再コロニー化を含む。
【００２４】
抑制（脱コロニー化）のみを使用する従来技術の方法（抗生物質や抗菌剤の使用など）は、再発率が高いため、失敗することがよくある。薬剤耐性微生物の再発および／または伝染を効果的に防ぐために単独で使用する場合、脱コロニー化はしばしば不十分である。
【００２５】
ヘルスケア関連の感染症を引き起こす病原微生物の中で、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）は、その病原性と疾患スペクトル、多剤耐性プロファイル、およびヘルスケア環境での有病率の増加により、優先されています。ＭＲＳＡは、人工呼吸器関連肺炎と手術部位感染の最も一般的な原因であり、中心カテーテル関連血流感染の２番目に多い原因である。
【００２６】
ＭＲＳＡについての新しい入院患者のスクリーニング、および脱コロニー化の有無にかかわらずそれを保菌する人々を隔離することを含む戦略は、伝染を減らすのにいくらか効果的であることが示されている。しかしながら、このタイプの治療はかなり高価であり、特別な封じ込めおよび衛生手順を伴う追加の調整が必要である。
【００２７】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ保菌者の感染を減らし、疾患を予防するために、脱コロニー化のみが入院患者に使用されてきた。脱コロニー化は、抗生物質および／または消毒薬の複数日にわたるレジメン、例えば、鼻腔内ムピロシンおよびクロルヘキシジン入浴を含み得る。ユニバーサル脱コロニー化は一部の病院で採用されている方法であり、全ての集中治療室（ＩＣＵ）入院患者はクロルヘキシジンと鼻腔内ムピロシンで毎日洗浄されるが、広範囲に使用されているため、米国でのＭＲＳＡ感染率に大きな変化はない。さらに、微生物は、繰り返し曝露するとクロルヘキシジンとムピロシンに耐性を示す可能性がある。
【００２８】
単独で使用した場合の脱コロニー化は、空いたニッチが病原性または薬剤耐性微生物によって再コロニー化される可能性があるため、耐久性がない場合がある。
【００２９】
たとえば、Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９６３，Ａｍｅｒ  Ｊ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ  １０５，Ｊｕｎｅ  １９６３，１４６−１５４は、保菌者との接触による５２／５２ａ／８０／８１ファージ複合体のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株による新生児のコロニー形成は、しばしば赤ちゃんとその家族との接触における疾患が後に続いたことを観察した。Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄはまた、乳児に適用された防腐剤または抗菌剤を使用した制御手段が、主に高耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌ならびにシュードモナスおよびプロテウスなどのグラム陰性菌からなる異常な菌叢によるコロニー形成につながることも観察した。Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄは、鼻腔および／または臍帯接種によってブドウ球菌株５０２ａにより新生児に人工的にコロニーを形成することによって問題を解決しようとした。５０２ａは、病原性の低いＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのコアグラーゼ陽性株であり、ペニシリンに感受性であり、ベータラクタマーゼの産生を誘導できない。他のブドウ球菌の存在が５０２ａの獲得を妨げることが示された。コロニー化の持続は６ヶ月から１年後にせいぜい３５％であった。
【００３０】
Ｂｏｒｉｓ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，．"Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｔｒａｆａｍｉｌｉａｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ．"  Ａｍｅｒ  Ｊ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ  １１５（１９６８）：５２１−２９は、人生の最初の数時間で、意図的に約４０００人の乳児にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ５０２ａ（鼻孔および臍帯断端）をコロニー化した。８０／８１感染からの乳児の実質的に完全な防御が観察されました（乳児は接種後１年間モニターされた）。乳児の５−１５％は、治療後の最初の３日間で自己分解する小さな治療緊急小胞を発達させた。事前の脱コロニー化により、５０２ａの持続性はプラセボ（生理食塩水）と比較して最大５倍向上する（ｎ＝６３）。再発性フルンケル症の対照研究では、全身抗生物質＋経鼻抗菌薬による除菌とそれに続く５０２ａの適用により、患者の８０％で疾患が抑制されたことが示された。
【００３１】
薬物感受性株は全身感染を引き起こす可能性があるため、薬物感受性株による再コロニー化は安全ではない可能性がある。
【００３２】
Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，ｖｏｌ．１，５４１−５４７は、再発性フルンケル症の患者の治療における脱コロニー化を含む細菌置き換えの使用を報告した。慢性ブドウ球菌保菌者は、全身抗生物質を含む抗生物質療法と鼻粘膜への抗菌クリームの塗布で治療された。最初の研究では、３１人の患者が抗生物質療法のみを受け、元の株の７４％の再発率を示した。１８人の患者は抗生物質治療を受け、続いて５０２ａ接種を受け、元の株の２７％の再発を示した。５８７人の患者を対象とした大規模な研究では、１２か月後に元の菌株が２１％再発した。しかしながら、糖尿病、湿疹、にきびのある患者では高い再発率が認められた。５０２ａに関連する疾患は１１人の患者で認められた。
【００３３】
Ａｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １２９（６）ｐｐ．７２０−７２４は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの保菌者における細菌の干渉を研究した。保菌者は抗生物質と抗菌石鹸で処理され、５０２ａ株を接種された。具体的には、脱コロニー化方法には、ジクロキサシリンの８日間経口投与、ネオスポリンの８日間鼻腔内投与、トリクロロカバニリドが含まれる。良好な効果を得るには完全な脱コロニー化が必要であることがわかった。７日目は１００％の効果を示したが、２３日目にはこの効果は６０〜８０％まで低下した。持続性データは、十分に脱コロニー化された対象の２３週間で７３％、部分的に脱コロニー化された対象のわずか１７％の永続性であった。共コロニー形成は、３日目の５／１２の対象、１０日目の２／１２の対象、３５日目と７０日目の１／１２の対象に見られた。
【００３４】
脱コロニー化、それに続く同じ属であるが異なる種の微生物による再コロニー化は、空いたニッチが異なる種によって十分に満たされていないため、耐久性がない可能性がある。
【００３５】
Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒに帰属するＷＯ２００９１１７３１０  Ａ２、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｌｉｕは、脱コロニー化／再コロニー化法を使用した、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびメチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）の治療および予防のための方法を開示する。一例では、ＭＲＳＡを含む既存のフローラを根絶するために、マウスを抗生物質で処理し、新しく除去された表面領域に、同じ属であるが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓなどの異なる種の細菌をコロニー形成させる。再発に関する具体的なデータは提供されていない。
【００３６】
病原微生物による感染症を治療する試みにおけるプロバイオティクスの投与は、プロバイオティクスが対象に永久にコロニー形成しない可能性があるため、効果的でなく、耐久性がない可能性がある。
【００３７】
Ｂｏｖｉｎｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｃ．に帰属する米国特許第６，６６０，２６２号、Ｒａｎｄｙ  ＭｃＫｉｎｎｅｙは、動物の微生物感染症の治療に使用するための、特定のミネラル、ビタミン、コバルトアミノ酸、昆布、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種を含む幅広いスペクトラムの抗菌組成物を開示している。ウシおよびウマにおける野外試験が行われたが、感染性細菌株または他の感染性病原体は確認されなかった。
【００３８】
Ｇａｎｅｄｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．に帰属する米国特許第６，９０５，６９２号、Ｓｅａｎ  Ｆａｒｍｅｒは、特定の細菌、酵母、菌類、ウイルスの増殖を阻害するために哺乳動物の皮膚または粘膜に適用するためのプロバイオティクスバチルス菌、胞子および細胞外製品の特定の組み合わせを含む局所用組成物を開示する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌｅｎｓの胞子、またはエミュー油などの媒体中のバチルス種培養上清およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｉｎｄｂｅｒｇｉｉ培養上清を含む組成物が提供される。プロバイオティクスは恒久的に宿主にコロニー形成するわけではないため、健康を促進する特性が持続するためには、それらは定期的に摂取または適用する必要があると、開示には述べられている。
【００３９】
Ｇａｎｅｄｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．に帰属する米国特許第６，４６１，６０７号、Ｓｅａｎ  Ｆａｒｍｅｒは、哺乳動物の胃腸管病原体を制御するための乳酸産生菌、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓの株を開示している。抗生物質に対する耐性を有するプロバイオティクス乳酸生産菌株の選択的育種および単離方法が開示されている。抗生物質耐性乳酸産生細菌および抗生物質を含む組成物で感染症を治療する方法が開示される。
【００４０】
Ｓｅｒｅｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに帰属する米国特許第８，９０６，６６８号は、病原菌を永続的に排除（ｅｘｃｌｕｄｅ）するために、異なる操作分類単位（ＯＴＵ）の２つ以上の細菌の細胞毒性バイナリーの組み合わせを提供する。ＯＴＵは、生物間で配列を比較することによって、たとえば、少なくとも超可変領域で１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の少なくとも９５％の配列同一性を共有することによって決定される。
【００４１】
元の病原性微生物の置き換え（再コロニー化）のみを採用する従来技術の方法は、新しい微生物でのコロニー形成率が低い。再コロニー化が正しく行われない場合、プロセスは失敗する可能性がある。効果的な再コロニー化は重要ですが、再発を防ぐために単独で使用する場合は十分ではない。
【００４２】
元の病原性微生物の抑制（脱コロニー化）と新しい微生物での置き換え（再コロニー化）の両方を伴う従来技術の方法は、特定の方法に応じて病原性微生物の再発を変動させる可能性がある。
【００４３】
共生の病原性微生物または薬剤耐性微生物に対する勝てない戦争を繰り広げるよりも、より良いアプローチは、特定の病原性微生物の再発を選択的に抑制しながら、「良いバグ」とその支援システムのダイナミクスを積極的に促進するという、マイクロバイオームを管理することであり得る。毒性のある病原性および／または薬剤耐性微生物などの望ましくない微生物による感染の再発を安全かつ永続的に防止および低減するための改善された方法が望ましい。
【発明の概要】
【００４４】
対象における微生物生態系（マイクロバイオーム）に安全かつ永続的に影響を与えて様々な機能を実行するための方法および組成物であって、たとえば、病原性、病原性、および／または薬剤耐性微生物などの望ましくない微生物による感染のリスクの低減を含む、方法および組成物が提供される。
【００４５】
対象における望ましくない微生物によるコロニー形成、感染、コロニー形成の再発、または病原性感染の再発のリスクを予防または低減するための方法であって、対象の少なくとも１つの部位で望ましくない微生物を脱コロニー化して当該部位から望ましくない微生物の存在を低減または排除することと、対象の少なくとも１つの部位に合成微生物を投与することにより、望ましくない微生物を永続的に置き換えることであって、合成微生物は、以前に望ましくない微生物が占有していたニッチを占有することにより、宿主マイクロバイオームに永続的に組み込まれることができる置き換えることと、任意選択的に、対象内の合成微生物のコロニー化を促進することと、を含む方法が提供される。
【００４６】
本開示は、マイクロバイオームの宿主となる対象における望ましくない微生物の再発を排除および防止するための方法であって、（ａ）宿主マイクロバイオームを脱コロニー化することと、（ｂ）非ネイティブ属性を付与する少なくとも１つの要素を含む合成微生物を対象に投与することにより、望ましくない微生物を永続的に置き換えることであって、合成微生物が、宿主マイクロバイオームに永続的に組み込まれること、および宿主マイクロバイオームにおいて望ましくない微生物と同じニッチを占有することが可能である、置き換えることと、を含む、方法を提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、脱コロニー化することは、対象の少なくとも１つの部位で行われ、少なくとも１つの部位からの望ましくない微生物の検出可能な存在を実質的に低減または排除する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、望ましくない微生物または合成微生物の検出可能な存在は、表現型法および／または遺伝子型法を含む方法により判定され、任意選択的に、表現型法が、生化学反応、血清学的反応、抗菌剤に対する感受性、ファージに対する感受性、バクテリオシンに対する感受性、および／または細胞タンパク質のプロファイルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子型法は、選択された、ハイブリダイゼーション、プラスミドプロファイル、プラスミド多型の分析、制限酵素消化、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）による反応と分離、リボタイピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびそのバリアント、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ならびに転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ）である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ニッチは、対象の少なくとも１つの部位での望ましくない微生物の安定したコロニー形成を可能にする真皮または粘膜環境である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、宿主マイクロバイオームに永続的に組み込まれる能力は、投与するステップ後の少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２６週間、少なくとも３０週間、少なくとも３６週間、少なくとも４２週間、または少なくとも５２週間の期間の、少なくとも１つの部位における合成微生物の検出可能な存在によって判定される。
【００５１】
いくつかの実施形態では、望ましくない微生物を永続的に置き換える能力が、投与するステップ後の少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２６週間、少なくとも３０週間、少なくとも３６週間、少なくとも４２週間、または少なくとも５２週間の期間の、少なくとも１つの部位における合成微生物の検出可能な存在の不在によって判定される。
【００５２】
いくつかの実施形態では、同じニッチを占有する能力は、投与するステップ後の少なくとも１つの部位における望ましくない微生物と合成微生物との共コロニー化の不在によって判定される。いくつかの実施形態では、共コロニー形成の不在が、投与するステップ後の少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２６週間、少なくとも３０週間、少なくとも３６週間、少なくとも４２週間、または少なくとも５２週間で判定される。
【００５３】
いくつかの実施形態では、合成微生物は、合成微生物に永続的に組み込まれる非ネイティブ属性を付与する少なくとも１つの要素を含む。いくつかの実施形態では、非ネイティブ属性を付与する少なくとも１つの要素は、合成微生物を介して宿主マイクロバイオームに永続的に組み込まれる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、非ネイティブ属性を付与する少なくとも１つの要素は、キルスイッチ分子改変、病原性ブロック分子改変、またはナノファクトリー分子改変である。いくつかの実施形態では、合成微生物は、合成微生物の染色体に組み込まれる分子改変を含む。いくつかの実施形態では、合成微生物は、望ましくない微生物からの遺伝物質の遺伝子水平伝播を防止する病原性ブロック分子改変を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、合成微生物の測定可能な平均細胞死は、状態の変化後の第１のプロモーターの誘導後の少なくとも予め設定された期間内に起こる。いくつかの実施形態では、測定可能な平均細胞死は、状態の変化後、少なくとも１、５、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００、または３６０分からなる群から選択される少なくとも予め設定された期間内に起こる。一部の実施形態では、測定可能な平均細胞死は、予め設定された期間後の、少なくとも５０％ｃｆｕ、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％ｃｆｕ数の低減である。いくつかの実施形態では、状態の変化は、ｐＨ、温度、浸透圧、モル浸透圧濃度、酸素レベル、栄養素濃度、血中濃度、血漿中濃度、血清中濃度、金属濃度、キレート化金属濃度、１つ以上の免疫因子の組成物または濃度の変化、ミネラル濃度、および電解質濃度のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、状態の変化は、対象の少なくとも１つの部位における正常な生理学的（ニッチ）状態と比較して、血液、血清、または血漿のより高い濃度および／または組成物の変化である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、望ましくない微生物はＳｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株であり、検出可能な存在が、対象の少なくとも１つの部位から試料を得ることと、発色寒天を試料と接触させることと、接触させた寒天をインキュベートすることと、所定の時間後に細菌種の陽性ｃｆｕｓを計数することと、を含む方法によって測定される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの部位から望ましくない微生物の存在を低減または排除するために、対象の少なくとも１つの部位に脱コロニー化剤を局所投与することを含む脱コロニー化するステップを含む方法が提供される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、脱コロニー化するステップは、脱コロニー化剤の局所投与を含み、全身性抗菌剤は同時に投与されない。いくつかの実施形態では、全身抗菌剤は、脱コロニー化剤の最初の局所投与または合成微生物の投与の、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、または１年の前、それと同時、および／またはその後に投与されない。いくつかの実施形態では、脱コロニー化剤は、消毒剤、殺菌剤、防腐剤、収斂剤、および抗菌剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、脱コロニー化剤は、アルコール（エチルアルコール、イソプロピルアルコール）、アルデヒド（グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド放出剤（ノキシチオリン＝オキシメチレンチオ尿素、タウロリン、ヘキサミン、ダントイン）、ｏ−フタルアルデヒド）、アニリド（トリクロカルバン＝ＴＣＣ＝３，４，４’−トリクロルカルバニリド）、ビグアニド（クロルヘキシジン、アレキシジン、高分子ビグアニド（ＭＷ＞３，０００ｇ／ｍｏｌのポリヘキサメチレンビグアニド、バントシル）、ジアミジン（プロパミジン、イセチオン酸プロパミジン、プロパミジン二塩酸塩、ジブロモプロパミジン、イセチオン酸ジブロモプロパミジン）、フェノール（フェンチクロル、ｐ−クロロ−ｍ−キシレノール、クロロキシレノール、ヘキサクロロフェン）、ビスフェノール（トリクロサン、ヘキサクロロフェン）、クロロキシレノール（ＰＣＭＸ）、第４級アンモニウム化合物（セトリミド、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム）、銀化合物（スルファジアジン銀、硝酸銀）、ペルオキシ化合物（過酸化水素、過酢酸、過酸化ベンゾイル）、ヨウ素化合物（ポビドンヨード、ポロキサマーヨード、ヨウ素）、塩素放出剤（次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸、二酸化塩素、ジクロロイソシアヌル酸ナトリウム、クロラミン−Ｔ）、銅化合物（酸化銅）、イソトレチノイン、硫黄化合物、植物抽出物（メラロイカ属（ティーツリーオイル）、（スノキ属（例えば、Ａタイププロアントシアニジン）、Ｃａｓｓｉａ  ｆｉｓｔｕｌａ  Ｌｉｎｎ、Ｂａｅｋｅａ  ｆｒｕｔｅｓｄｅｎｓ  Ｌ．、Ｍｅｌｉａ  ａｚｅｄａｒａｃｈ  Ｌ．、Ｍｕｎｔｉｎｇｉａ  ｃａｌａｂｕｒａ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  Ｌ、Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ  ａｖｉｃｅｎｎｉｏｉｄｅｓ  Ｇｕｉｌｌ＆Ｐｅｒｒ．、Ｐｈｙｌａｎｔｕｓ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｓ  ｍｕｅｌ．Ｍｕｅｌ−Ａｒｇ．、Ｏｃｉｍｕｍ  ｇｒａｔｉｓｓｉｍｕｍ  Ｌｉｎｎ．、Ａｃａｌｙｐｈａ  ｗｉｌｋｅｓｉａｎａ  Ｍｕｅｌｌ−Ａｒｇ．、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｐｒｕｉｎａｔｕｍ  Ｂｏｉｓｓ．＆Ｂａｌ．、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｏｌｉｍｐｉｃｕｍ  Ｌ．およびＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｓａｂｒｕｍ  Ｌ．、Ｈａｍａｍｅｌｉｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ（アメリカマンサク）、チョウジ油、ユーカリ属、ローズマリー属（ローズマリー）、イブキジャコウソウ属（タイム）、イワダレソウ属（オレガノ）、レモングラス属、シナモン属、ゼラニウム属、ラベンデュラ属）、アミノレブロン酸、および局所抗生物質化合物（バクテリオシン、ムピロシン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、ゲンタマイシン）からなる群から選択される。
【００５９】
いくつかの実施形態では、抗菌剤は、バンコマイシン、セファゾリン、セパハロチン、セファレキシン、リネゾリド、ダプトマイシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ムピロシン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、ゲンタマイシン、ウリフロキサシン、フィダキソマイシン、ミノサイクリン、メトロニダゾール、メトロニダゾール、スルファメトキサゾール、アンピシリン、トリメトプリム、オフロキサシン、ノルフロキサシン、チニダゾール、ノルフロキサシン、オルニダゾール、レボフロキサシン、ナリジクス酸、セフトリアキソン、アジスロマイシン、セフィキシム、セフトリアキソン、セファレキシン、セフトリアキソン、リファキシミン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、プルフロキサシン、ウリフロキサシン、モキシフロキサシン、ナイスタチン、アンホテリシンＢ、フルシトシン、ケトコナゾール、ポサコナゾール、クロトリマゾール、ボリコナゾール、グリセオフルビン、硝酸ミコナゾール、およびフルコナゾールからなる群から選択される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、脱コロニー化することは、置き換えるステップの前に少なくとも１、２、３、４、５または６回またはそれ以上の回数、脱コロニー化剤を局所投与することを含む。いくつかの実施形態では、脱コロニー化するステップは、０．５〜４８時間の間隔をあけて１〜６回もしくはそれ以上または２〜４回、対象の少なくとも１つの宿主部位に脱コロニー化剤を投与することを含み、置き換えるステップが、最後の脱コロニー化ステップの後に実行される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、望ましくない微生物を脱コロニー化することと、対象の少なくとも１つの部位に対する、少なくとも１０5、少なくとも１０6、少なくとも１０7、少なくとも１０8、少なくとも１０9、少なくとも１０10、または少なくとも１０11ＣＦＵの合成株と、薬学的に許容される担体と、を含む組成物の局所投与を含む合成微生物によって置き換えることと、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、最初の置き換えるステップは、脱コロニー化するステップの、１２時間、２４時間、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、もしくは１０日以内、または０．５〜１０日、１〜７日、もしくは２〜５日で実施される。いくつかの実施形態では、置き換えるステップは、最後の脱コロニー化するステップの後、２週間ごとから６ヶ月ごとに１回以下の間隔で繰り返される。いくつかの実施形態では、脱コロニー化するステップおよび置き換えるステップは、２週間ごとから６ヶ月ごと、または３週間ごとから３ヶ月ごとに１回以下の間隔で繰り返される。いくつかの実施形態では、置き換えることは、合成微生物を少なくとも１つの部位に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回投与することを含む。いくつかの実施形態では、置き換えるは、合成微生物を少なくとも１つの部位に、月に１回以下、２回以下、３回以下、または４回以下投与することを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、望ましくない微生物を脱コロニー化し、合成微生物で置き換える方法は、対象における合成微生物のコロニー形成を促進することをさらに含む。いくつかの実施形態では、対象における合成微生物のコロニー形成を促進することは、対象に促進剤を投与することを含み、任意選択的に、促進剤が栄養素、プレバイオティクス、共生、安定剤、保湿剤、および／またはプロバイオティクス細菌種である。いくつかの実施形態では、促進することは、最初の脱コロニー化するステップの後、対象に、１０5〜１０10ｃｆｕ、１０6〜１０9ｃｆｕ、または１０7〜１０8ｃｆｕでプロバイオティクス種を投与することを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、栄養素は、塩化ナトリウム、塩化リチウム、グリセロリン酸ナトリウム、フェニルエタノール、マンニトール、トリプトン、ペプチド、および酵母エキスから選択される。いくつかの実施形態では、プレバイオティクスは、短鎖脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸）、グリセロール、農業副産物由来のペクチン由来オリゴ糖、フルクトオリゴ糖（例えば、イヌリン様プレバイオティクス）、ガラクトオリゴ糖（例えば、ラフィノース）、コハク酸、乳酸、およびマンナンオリゴ糖からなる群から選択される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、プロバイオティクスは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｃａｌｉｓからなる群から選択される。
【００６５】
いくつかの実施形態では、共生は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｉｓ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからなる群から選択される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、望ましくない微生物は、抗菌剤耐性微生物である。いくつかの実施形態では、抗菌剤耐性微生物は、抗生物質耐性細菌である。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性細菌は、ストレプトコッカス属、クチバクテリウム属、およびブドウ球菌属からなる群から選択されるグラム陽性細菌種である。いくつかの実施形態では、ストレプトコッカス属は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、クチバクテリウム属は、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ亜種ａｃｎｅｓ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ亜種ｄｅｆｅｎｄｅｎｓ、およびＣｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ亜種ｅｌｏｎｇａｔｕｍからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ブドウ球菌属は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、望ましくない微生物は、１つ（ＳＣＣｍｅｃタイプＩ）または複数の抗生物質耐性遺伝子（ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩおよびＩＩＩ）をコードする、および／または毒素を生成する、ブドウ球菌染色体カセット（ＳＣＣｍｅｃタイプＩ〜ＩＩＩ）を含むメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）株である。いくつかの実施形態では、毒素は、パントン−バレンタインロイコシジン（ＰＶＬ）毒素、トキシックショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）、ブドウ球菌性アルファ溶血素毒素、ブドウ球菌性ベータ溶血素毒素、ブドウ球菌性ガンマ溶血毒素、ブドウ球菌性デルタ溶血毒素、エンテロトキシンＡ、エンテロトキシンＢ、エンテロトキシンＣ、エンテロトキシンＤ、エンテロトキシンＥ、およびコアグラーゼ毒素からなる群から選択される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本開示による方法で治療された対象は、投与するステップの後、少なくとも２週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２４週間、少なくとも２６週間、少なくとも３０週間、少なくとも３６週間、少なくとも４２週間、または少なくとも５２週間、少なくとも１つの部位で対象をスワブすることによって証明されるとき、望ましくない微生物の再発またはコロニー化を示さない。
【００６８】
本開示は、対象において望ましくない微生物を永続的に置き換えるための合成微生物を提供する。合成微生物は、全身感染のリスクを低減することによって安全性を高めるように設計された分子改変を含む。一実施形態では、分子改変は、血液、血清、または血漿に応答して、合成微生物の増殖または細胞死を著しく減少させる。合成微生物は、対象における望ましくない微生物の真皮または粘膜のコロニー形成の再発または再コロニー形成を防止または低減するための方法および組成物で使用することができる。
【００６９】
本開示は、対象において望ましくない微生物によって引き起こされるコロニー形成、または再コロニー形成、全身感染、菌血症、または心内膜炎の治療もしくは予防、そのリスクの低減、またはその可能性の低減のための組成物および方法で使用する合成微生物を提供する。
【００７０】
本開示は、誘導可能な第１のプロモーターを含む第１の調節領域に作動可能に結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）されている第１の細胞死遺伝子を含む、少なくとも１つのキルスイッチ分子改変を含む、組換えヌクレオチドを含む合成微生物を提供し、ここで第１の誘導性プロモーターは、血液、血清、または血漿への曝露に応答して、基礎生産性の少なくとも３倍の組換えヌクレオチドの条件的に高いレベルの遺伝子発現を示す。いくつかの実施形態では、誘導可能な第１のプロモーターは、血液、血清、または血漿への曝露後、少なくとも３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分、または少なくとも３６０分以内に、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍の上方制御を示す、遺伝子を示すか、含むか、それに由来するか、またはそれから選択される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、合成微生物は、誘導可能な第１のプロモーターを含む第１の調節領域に作動可能に連結されている第１の細胞死遺伝子を含むキルスイッチ分子改変を含み、第１のプロモーターは、対象の少なくとも１つの部位での正常な生理学的（ニッチ）状態とは対照的な微生物環境の状態の変化によって活性化（誘導）される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、合成微生物は、第１の細胞死遺伝子またはその産物に特異的な抗毒素遺伝子を含む発現クランプ分子改変をさらに含み、抗毒素遺伝子は、構成的であるか、または真皮または粘膜のコロニー形成時または完全培地で活性であるが、血液、血清、または血漿への少なくとも３０分の曝露後に誘導されないか、１．５倍未満に誘導されるか、または抑制される、第２のプロモーターを含む第２の調節領域に作動可能に結合されている。いくつかの実施形態では、第２のプロモーターは、真皮または粘膜のコロニー形成時またはＴＳＢ培地中で活性であるが、少なくとも３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分、および少なくとも３６０分の、血液、血清、または血漿への曝露時に少なくとも２倍抑制される。
【００７３】
いくつかの実施形態では、合成微生物は、血液、血清、または血漿への曝露後少なくとも１、５、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００、または３６０分以内に少なくとも５０％のｃｆｕ減少の測定可能な平均細胞死を示す。いくつかの実施形態では、合成微生物は、血液、血清、または血漿への曝露後少なくとも１、５、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００、または３６０分以内に、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％ｃｆｕ数の低減の測定可能な平均細胞死を示す。
【００７４】
いくつかの実施形態では、合成微生物は、対象の全身状態下で合成微生物の感染性増殖を低減または防止するキルスイッチ分子改変を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、合成微生物は、合成微生物の染色体に組み込まれる少なくとも１つの分子改変を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、合成微生物は、望ましくない微生物と同一の属および種を有する標的微生物に由来する。いくつかの実施形態では、標的微生物は、少なくとも１つの抗菌剤に対して感受性である。いくつかの実施形態では、標的微生物は、細菌、真菌、または原生動物の標的微生物から選択される。特定の実施形態では、標的微生物は、真皮および／または粘膜ニッチにコロニーを形成することができる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、標的微生物は、脱コロニー化された宿主マイクロバイオームに生物的に組み込まれる能力を有する。いくつかの実施形態では、合成微生物は、宿主マイクロバイオームから単離された標的微生物に由来する。いくつかの実施形態では、標的微生物は、細菌、真菌、または原生動物の標的微生物から選択される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、標的微生物は、アシネトバクター属、コリネバクテリウム属、キューティバクテリウム属、ブドウ球菌属、ストレプトコッカス属、プロピオン酸菌属、およびシュードモナス属からなる群から選択される属のメンバーである。
【００７９】
いくつかの実施形態では、標的微生物が、真皮および／または粘膜ニッチにコロニーを形成することができる細菌種であり、アシネトバクター属、コリネバクテリウム属、キューティバクテリウム属、ブドウ球菌属、ストレプトコッカス属、プロピオン酸菌属、およびシュードモナス属からなる群から選択される属のメンバーである。いくつかの実施形態では、標的微生物は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｉｓ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからなる群から選択される。特定の実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株に由来する合成微生物が提供される。いくつかの実施形態では、標的株は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ５０２ａ株またはＲＮ４２２０株である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、合成微生物は、ｓｐｒＡ１、ｓｐｒＡ２、ｋｐｎ１、ｓｍａ１、ｓｐｒＧ、ｒｅｌＦ、ｒｓａＥ、ｙｏｅＢ、ｍａｚＦ、ｙｅｆＭ、またはリゾスタフィン毒素遺伝子からなる群から選択される細胞死遺伝子を含むキルスイッチ分子改変を含む。いくつかの実施形態では、細胞死遺伝子は、配列番号１２２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、２７４、２７５、２８４、２８６、２８８、２９０、３１５、および３１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、誘導可能な第１のプロモーターは、血液、血清、および／または血漿応答性プロモーターである。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、状態の変化後、少なくとも３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分、および少なくとも３６０分からなる群から選択される期間内に、少なくとも１．５倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、および少なくとも１００倍、上方制御される。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、状態の変化の非存在下で誘導されないか、１．５倍未満誘導されるか、または抑制される。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、血清、血液、または血漿の存在下で一定期間内に少なくとも１．５、２、３、４、５、または少なくとも６倍誘導される。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、少なくとも１つの部位での正常な生理学的（ニッチ）状態下で誘導されないか、１．５倍未満誘導されるか、または抑制される。
【００８２】
いくつかの実施形態では、誘導性の第１のプロモーターは、ｉｓｄＡ（鉄調節表面決定因子タンパク質Ａ）、ｉｓｄＢ（鉄調節表面決定因子タンパク質Ｂ）、ｉｓｄＧ（ヘム分解モノオキシゲナーゼ）、ｈｌｇＡ（ガンマ溶血素コンポーネントＡ）、ｈｌｇＡ１（ガンマ溶血素）、ｈｌｇＡ２（ガンマ溶血素）、ｈｌｇＢ（ガンマ溶血素コンポーネントＢ）、ｈｒｔＡＢ（ヘム調節トランスポーター）、ｓｂｎＣ（ｌｕｃ  Ｃファミリーシデロフォア生合成タンパク質）、ｓｂｎＤ、ｓｂｎＩ、ｓｂｎＥ（ｌｕｃＡ／ｌｕｃＣファミリーシデロフォア生合成タンパク質）、ｉｓｄＩ、ｌｒｇＡ（ムレインヒドロラーゼレギュレーターＡ）、ｌｒｇＢ（ムレインヒドロラーゼレギュレーターＢ）、ｅａｒ（Ｅａｒタンパク質）、ｆｈｕＡ（フェリクロム輸送ＡＴＰ結合タンパク質ｆｈｕＡ）、ｆｈｕＢ（フェリクロム輸送パーミアーゼ）、ｈｌｂ（ホスホリパーゼＣ）、ヘムＡＢＣトランスポーター２遺伝子、ヘムＡＢＣトランスポーター遺伝子、ｉｓｄ  ＯＲＦ３、ｓｂｎＦ、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、鉄ＡＢＣトランスポーター遺伝子、トレオニンデヒドラターゼ遺伝子、シデロフォアＡＢＣトランスポーター遺伝子、ＳＡＭ  ｄｅｐ  Ｍｅｔｒａｎｓ遺伝子、ＨａｒＡ、ｓｐｌＦ（セリンプロテアーゼＳｐｌＦ）、ｓｐｌＤ（セリンプロテアーゼＳｐｌＤ）、ｄｐｓ（一般ストレスタンパク質２０Ｕ）、ＳＡＵＳＡ３００＿２６１７（推定コバルトＡＢＣトランスポーター、ＡＴＰ結合タンパク質）、ＳＡＵＳＡ３００＿２２６８（ナトリウム／胆汁酸共トランスポーターファミリータンパク質）、ＳＡＵＳＡ３００＿２６１６（コバルトファミリー輸送タンパク質）、ｓｒｔＢ（ソルターゼＢ）、ｓｂｎＡ（推定シデロフォア生合成タンパク質ｓｂｎＡ）、ｓｂｎＢ、ｓｂｎＧ、ｌｅｕＡ（２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼアミノ酸生合成酵素）、ｓｓｔＡ（鉄輸送膜タンパク質）、ｓｉｒＡ（鉄ＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質）、ｉｓｄＡ（ヘムトランスポーター）、およびｓｐａ（ブドウ球菌属タンパク質Ａ）からなる群から選択される遺伝子を含むか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、誘導性の第１のプロモーターは、配列番号１１４、１１５、１１９、１２０、１２１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、および１６３からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【００８３】
配列をコードする抗毒素遺伝子に作動可能に結合している第２のプロモーターを含む発現クランプ分子改変を含む。いくつかの実施形態では、抗毒素遺伝子は、第１の細胞死遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズできるアンチセンスＲＮＡ配列をコードする。いくつかの実施形態では、抗毒素遺伝子は、ｓｐｒＡ１抗毒素遺伝子、ｓｐｒＡ２抗毒素遺伝子、ｓｐｒＧ抗毒素遺伝子もしくはｓｐｒＦ、ホリン抗毒素遺伝子、１８７−ｌｙｓＫ抗毒素遺伝子、ｙｅｆＭ抗毒素遺伝子、リゾスタフィン抗毒素遺伝子、もしくはｍａｚＥ抗毒素遺伝子、ｋｐｎ１抗毒素遺伝子、ｓｍａ１抗毒素遺伝子、ｒｅｌＦ抗毒素遺伝子、ｒｓａＥ抗毒素遺伝子、またはｙｏｅＢ抗毒素遺伝子からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、抗毒素遺伝子は、配列番号２７３、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１４、３１９、もしくは３２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、第２のプロモーターは、ｃｌｆＢ（クランピングファクターＢ）、ｓｃｅＤ（オートライシン、エキソプロテインＤ）、ｗａｌＫＲ（病原性レギュレーター）、ａｔｌＡ（主要な自己溶菌酵素）、ｏａｔＡ（Ｏ−アセチルトランスフェラーゼＡ）；ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンテターゼ遺伝子、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミド遺伝子、トレハロースパーミアーゼＩＩＣ遺伝子、ＤｅｏＲファミリー転写調節遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、ＰＴＳフルクトーストランスポーターサブユニットＩＩＣ遺伝子、ガラクトース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子、ＮａｒＺ、ＮａｒＨ、ＮａｒＴ、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、仮想タンパク質遺伝子、ＤｅｏＲトランスファクター遺伝子、リゾホスホリパーゼ遺伝子、タンパク質脱凝集シャペロン遺伝子、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、ｇｙｒＢ、ｓｉｇＢ、およびｒｈｏからなる群から選択される遺伝子を含むか、またはそれらに由来する。いくつかの実施形態では、第２のプロモーターは、配列番号１１７、１１８、１２９、もしくは１３０のヌクレオチド配列、またはその実質的に同一のヌクレオチド配列を含むＰclfB（クランピングファクターＢ）である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、合成微生物は、病原性ブロック分子改変、および／またはナノファクトリー分子改変を含む。いくつかの実施形態では、病原性ブロック分子改変は、望ましくない微生物からの遺伝物質の遺伝子水平伝播を防止する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ナノファクトリー分子改変は、酵素、アミノ酸、代謝中間体、および小分子からなる群から選択される産物をコードする遺伝子の挿入、それをコードする遺伝子のノックアウト、またはそれをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む。
【００８７】
本開示は、有効量の本開示による合成微生物と、薬学的に許容される担体、希釈剤、皮膚軟化剤、結合剤、賦形剤、潤滑剤、甘味料、香味料、湿潤剤、保存料、緩衝剤、もしくは吸収剤、またはそれらの組み合わせと、を含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は促進剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、促進剤は、栄養素、プレバイオティクス、共生、および／またはプロバイオティクス細菌種から選択される。
【００８８】
本開示は、本開示の組成物または合成微生物を含む単回用量単位を提供する。いくつかの実施形態では、単回用量単位は、少なくとも約１０5、少なくとも１０6、少なくとも１０7、少なくとも１０8、少なくとも１０9、少なくとも１０10ＣＦＵ、または少なくとも１０11の合成株と、薬学的に許容される担体と、を含む。いくつかの実施形態では、単回用量単位は局所投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、単回用量単位は、真皮または粘膜投与用に製剤化される。
【００８９】
本開示は、対象における望ましくない微生物の再発のリスクを排除、防止、または低減する方法で使用するための医薬の製造で使用するための、本発明による合成微生物、組成物を提供する。
【００９０】
本開示は、対象における真皮または粘膜のコロニー形成または望ましくない微生物の再コロニー形成の再発を防止または低減するためのキットであって、少なくとも１つの容器内に、本開示の合成微生物、組成物、または単回用量を含み、任意選択的に、脱コロニー剤を含む第２の容器、説明書のシート、促進剤を含む少なくとも第３の容器、および／またはアプリケーターから選択される１つまたは複数の追加のコンポーネントを含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、例えば、ＢｉｏＰｌｘ−０１に挿入して、合成微生物ＢｉｏＰｌｘ株を作成する代表的な分子改変の図を示す。分子改変を含むカセットは、キルスイッチと、ＳｐｒＡ１アンチセンス（アンチトキシン）ＲＮＡの発現を駆動するためにクローン化された発現クランプ（例えば、ＣｌｆＢ）プロモーターを含む発現クランプとを含み、ここでカセットは、ＳｐｒＡ１毒素遺伝子と作動可能に結合する血清応答性プロモーター（例えば、ＰhlgA）を含むキルスイッチと同じ発現モジュールに組み込まれる。この株では、血清／血液への曝露は毒素を活性化するが（例えば、３５０倍以上）、抗毒素は活性化せず、ＴＳＢまたは皮膚での増殖は抗毒素を活性化するが、毒素は活性化しない。
【図２】評価のためにベクターをＢｉｏＰｌｘ−０１にトランスフェクションするために、Ｅ  ｃｏｌｉ−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ通過株（ＩＭＯ８Ｂ）に遺伝子をクローニングするために使用されるシャトルベクターＰＣＮ５１を示す。
【図３Ａ】ＢｉｏＰｌｘ−０１株からの合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの組換え構築のためのプライマー配列を含む表４Ａを示す。
【図３Ｂ】ＢｉｏＰｌｘ−０１株からの合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの組換え構築のためのプライマー配列を含む表４Ａを示す。
【図３Ｃ】ＢｉｏＰｌｘ−０１株からの合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの組換え構築のためのプライマー配列を含む表４Ａを示す。
【図４Ａ】ＢｉｏＰｌｘ−０１株からの合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＣＲＩＳＰＲ構築のためのプライマー配列を含む表４Ｂを示す。
【図４Ｂ】ＢｉｏＰｌｘ−０１株からの合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＣＲＩＳＰＲ構築のためのプライマー配列を含む表４Ｂを示す。
【図４Ｃ】ＢｉｏＰｌｘ−０１株からの合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＣＲＩＳＰＲ構築のためのプライマー配列を含む表４Ｂを示す。
【図４Ｄ】ＢｉｏＰｌｘ−０１株からの合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＣＲＩＳＰＲ構築のためのプライマー配列を含む表４Ｂを示す。
【図５Ａ】ｒｅｐＦ（ｐＥ１９４ｔｓの複製遺伝子）、ｓｅｃＹ５７０（リボソーム結合部位を含むｓｅｃＹのＮ末端５７０ヌクレオチド）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、ａｔｔＰ（ページラムダ付着部位）、ｏｒｉ（−）（ＣｏｌＥ１プラスミド複製起点）、およびｂｌａ（ｂ−ラクタマーゼ）を示すｐＫＯＲ１組み込みプラスミドの遺伝子地図を示す。（＋）または（−）はグラム陽性菌（＋）またはグラム陰性菌（−）バクテリアの機能を示す。Ｐｘｙｌ／ｔｅｔＯプロモーターとプロモーターの転写方向は矢印で示されている。
【図５Ｂ】ｐＩＭＡＹ組み込みプラスミドの遺伝子地図を示す。（受託番号ＪＱ６２１９８）。
【図６】ヒト血清とのインキュベーションによるメチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株ＢｉｏＰｌｘ−０１中のＨｌｇＡ（ガンマ溶血素）プロモーター候補の誘導倍数を示す。発現はハウスキーピング遺伝子（ｇｙｒＢ）に正規化され、液体ＴＳＢ培地で対数増殖している細胞のものと比較された。
【図７】ヒト血清とのインキュベーションによるメチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株ＢｉｏＰｌｘ−０１中のＳｓｔＡ（鉄輸送）プロモーター候補の誘導倍数を示す。発現はハウスキーピング遺伝子（ＧｙｒＢ）に正規化され、液体ＴＳＢ培地で対数増殖している細胞のものと比較された。
【図８】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００７４５４．１で１，１０２，１００〜１，１０２，７００ｂｐの間で同定されたＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ標的部位遺伝子間領域を示す。
【図９】ＣＲＩＳＰＲ法で使用する推定ｇＲＮＡを見つけるために使用したＣＲＩＳＰＲＳｃａｎの代表的なスクリーンショットを示す。
【図１０】ＣＲＩＳＰＲを介する組み込み用カセットとｐＣａｓＳＡベクターのレイアウトを示す。Ｃａｐ１Ａは、ｇＲＮＡ転写を制御する構成的プロモーターである。Ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑは、たとえば１０の可能な切断標的（１．１、１．２など）を持つ標的配列である。ｓｇＲＮＡは一本鎖ガイドＲＮＡである（構造コンポーネントを提供する）。Ｘｂａ１とＸｈｏ１は、ＨＡをｐＣａｓＳＡベクターに付加するために使用される２つの制限部位である。ＨＡは相同性指向の修復のテンプレートとして使用する相同アームである（典型的には２００〜１０００ｂｐ）。ＰrpsL−ｍＣｈｅｒｒｙは、「最適化された」ｍＣｈｅｒｒｙを制御する構成的プロモーターである。ＰrpsL−Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９タンパク質の発現を制御する構成的プロモーターである。
【図１１】本開示で使用するためのベクターを示す。Ａは、ｐＣＮ５１を使用した蛍光によるプロモータースクリーニングに使用されるベクターである。Ｂは、細胞死遺伝子を含むプロモータースクリーニング用のベクターである。Ｃは、ＣＲＩＳＰＲを使用した染色体組み込み用のベクターである。Ｄは、相同組換えを用いた染色体組み込み用ベクターである。左および右（または上流および下流）のＨＡ：ゲノム標的遺伝子座に対する相同性アーム、ＣＲＩＳＰＲ標的化：ゲノム遺伝子座に対するＲＮＡガイド、ｍＣｈｅｒｒｙ：蛍光レポータータンパク質、Ｃａｓ９タンパク質：ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ｋａｎＲ：カナマイシン耐性、ｏｒｉＴ：転移の起点（組み込み用）、およびｓｍａ１：代表的なキル遺伝子（制限エンドヌクレアーゼ）。
【図１２Ａ】ｐＩＭＡＹ組み込みプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１３１）を示す。（受託番号ＪＱ６２１９８）。
【図１２Ｂ】ｐＩＭＡＹ組み込みプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１３１）を示す。（受託番号ＪＱ６２１９８）。
【図１２Ｃ】ｐＩＭＡＹ組み込みプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１３１）を示す。（受託番号ＪＱ６２１９８）。
【図１３Ａ】プロモーター候補ｉｓｄＡ、ｉｓｄＢ、ｈｌｇＡ２、ｈｒｔＡＢ、ｉｓｄＧ、ｓｂｎＥ、ｌｒｇＡ、ｌｒｇＢ、ｆｈｕＡ、ｆｈｕＢ、ｅａｒ、ｈｌｂ、ｓｐｌＦ、ｓｐｌＤ、ｄｐｓ、およびＳＡＵＳＡ３００＿２６１７の血清中１分、１５分、および４５分での活性、ならびにｑＰＣＲによる培地に対する遺伝子発現の倍数変化を示す。
【図１３Ｂ】プロモーター候補ｉｓｄＡ、ｉｓｄＢ、ｈｌｇＡ２、ｈｒｔＡＢ、ｉｓｄＧ、ｓｂｎＥ、ｌｒｇＡ、ｌｒｇＢ、ｆｈｕＡ、ｆｈｕＢ、ｅａｒ、ｈｌｂ、ｓｐｌＦ、ｓｐｌＤ、ｄｐｓ、およびＳＡＵＳＡ３００＿２６１７の血液中１分、１５分、および４５分での活性、ならびにｑＰＣＲによる培地に対する遺伝子発現の倍数変化を示す。
【図１３Ｃ】Ｔ＝９０分での血清中の遺伝子発現。
【図１４】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０細胞に形質転換されたｐＣＮ５１プラスミド（ｐＴＫ１）上のカドミウムプロモーターの後ろに細胞死毒素遺伝子（ｓｐｒＡ１）を含む合成微生物ｐＴＫ１細胞の細胞増殖の誘導性阻害を示す。誘導後２時間でＯＤ（６３０ｎｍ）を読み取った。野生型４２２０細胞は、カドミウムが存在しない場合と、５００ｎＭおよび１μＭのカドミウムが存在する場合の両方で、良好な細胞増殖を示した。ｐＴＫ１−１およびｐＴＫ１−２細胞はカドミウムの非存在下で良好な増殖を示したが、細胞増殖は５００ｎＭおよび１μＭカドミウムの存在下で誘導後２時間で有意に抑制された。
【図１５Ａ】Ｐｔｅｔ−ｓｐｒＡカセットを含むプラスミドの領域の図を拡大したｐ１７４（ｐＲＡＢ１１＿Ｐｔｅｔ−ｓｐｒＡ１）のプラスミド地図を示す。
【図１５Ｂ】ｐ１７４（ｐＲＡＢ１１＿Ｐｔｅｔ−ｓｐｒＡ１）プラスミド全体を環状の形で示す。
【図１５Ｃ】黄色ブドウ球菌５０２ａ細胞に形質転換されたｐＲＡＢ１１−２プラスミド（ｐ１７４）上のアンヒドロテトラサイクリンプロモーターの後ろに細胞死毒素遺伝子（ｓｐｒＡ１）を含む６時間の合成微生物Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ  ｐ１７４細胞でのプレート希釈の写真を示す。削除されたｓｐｒａ１アンチセンス（Ｄａｓ）を含むｐ１７４プラスミド。ＢＨＩ  ｃｈｌｏｒ１０上の非誘導（左）および誘導（右）５０２ａ  ｐ１７４（ｔｅｔ−ｓｐｒａ１Ｄａｓ）細胞の６時間の誘導後の１０ｅ−５でのプレート希釈を示す。左側のプレート（未誘導）は１０ｅ−５では数えられなかったが、１０ｅ−６では約７２０のコロニーが数えられた。右側の誘導されたプレートは、１０ｅ−５で１６個のコロニーを生成した。誘導後６時間での誘導細胞の生存パーセンテージは０．２２％であった。
【図１６】４つの異なる細胞死遺伝子候補ｓｐｒＡ１、１８７−ｌｙｓＫ、ホリン、およびｓｐｒＧを含むプラスミドベースの誘導発現システムを有する、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａに由来する４つの合成株の誘導前および誘導後の細胞増殖を示す。候補細胞死遺伝子は、ｐＲＡＢ１１プラスミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの後ろにクローニングされ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ細胞に形質転換された。計算されたＯＤ６００の読み取り値は、ＢＰ＿０６８（５０２ａ  ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−ｓｐｒＡ１）、ＢＰ＿０６９（５０２ａ  ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−１８７ｌｙｓＫ）、ＢＰ＿０７０（５０２ａ  ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−ホリン）、およびＢＰ＿０７１（５０２ａ  ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−ｓｐｒＧ１）について、破線（−−−−−−）で示されたＡｔＣで誘導された（＋）株の誘導後と、実線（______）で示された誘導されていない（−）株で、Ｔ＝０、３０、６０、１２０、および２４０分で取得され、ＢＨＩ培地中のＢＰ＿００１（５０２ａ  ｗｔ）と比較された。誘導された（＋）株ＢＰ＿０６８（ｓｐｒＡ１）、ＢＰ＿０６９（１８７ｌｙｓＫ）、およびＢＰ＿０７０（ホリン）のそれぞれは、（ｉ）良好な誘導前の細胞増殖と（ｉｉ）誘導後の細胞増殖の大幅な阻害の両方を示した。ＢＰ＿０６８（＋）は、誘導後の各時点Ｔ＝３０、Ｔ＝６０、Ｔ＝６０、Ｔ＝１２０、およびＴ＝２４０分で細胞増殖の最良の阻害を示したため、ｓｐｒＡ１遺伝子は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ５０２ａのキルスイッチの最初のさらなる開発のために選択された。
【図１７】ＢＨＩ培地中のＢＰ＿００１（５０２ａ  ｗｔ）と比較した、誘導されていない（−）およびアンヒドロテトラサイクリン誘導（＋）株ＢＰ＿０６８（５０２ａ  ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−ｓｐｒＡ１）、ＢＰ＿０６９（５０２ａ  ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−１８７ｌｙｓＫ）、ＢＰ＿０７０（５０２ａ  ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−ホリン）、およびＢＰ＿０７１（５０２ａ  ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−ｓｐｒＧ１）のＴ＝０（灰色）と２４０分（黒色）の間のコロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬの違いを示す棒グラフを示す。誘導された（＋）株ＢＰ＿０６８（ｓｐｒＡ１）、ＢＰ＿０６９（１８７ｌｙｓＫ）、およびＢＰ＿０７０（ホリン）のそれぞれは、（ｉ）良好な誘導前の細胞増殖と（ｉｉ）誘導後の細胞増殖の大幅な阻害の両方を示した。ＢＰ＿０６８は、誘導後２４０分で細胞増殖の最良の阻害を示したため、ｓｐｒＡ１遺伝子は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ５０２ａのキルスイッチの最初のさらなる開発のために選択された。
【図１８】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株ＢＰ＿００１、ＢＰ＿０５５およびＢＰ＿０７６の誘導（＋）および誘導されていない（−）サブカルチャーのＧＦＰ発現の倍率変化を示す。
【図１９】ＢＰ＿０７６株（ＳＡ  ５０２ａ、ΔｓｐｒＡ１：：Ｐｔｅｔ−ＧＦＰ）のゲノム地図を示す。
【図２０】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにゲノムを組み込むために構築されたプラスミド地図を示す。
【図２１】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａゲノムにおけるＰｓｂｎＡ−ｓｐｒＡ１キルスイッチの地図を示す。血清および血液応答性プロモーターＰｉｓｄＢは、ｓｐｒＡ１毒素細胞死遺伝子に作動可能に連結されている。
【図２２】ｓｐｒＡ１毒素細胞死遺伝子に作動可能に連結された血清および血液応答性プロモーターＰｉｓｄＢと、ｓｐｒＡ  ＡＳに作動可能に連結された第２プロモーターｃｌｆＢを含む発現クランプを使用して、血液または血清の非存在での毒素の漏出性発現を防ぐキルスイッチ構築のマップを示す。キルスイッチはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ５０２ａゲノムに組み込まれている。
【図２３】ＴＳＢ：５０２ａ−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ野生型、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＢＰ＿０１１−５０２ａΔｓｐｒＡ１−ｓｐｒＡ１（ＡＳ）、およびキルスイッチがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ５０２ａのゲノムに組み込まれているＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＢＰ＿０８４−５０２ａΔＰｓｐｒＡ：：ＰｓｂｎＡと比較した、ヒト血清に曝露したときの３つの株の増殖曲線を示す。破線は血清中で増殖した株を表し、実線はＴＳＢ中で増殖した株を表す。１８０分後、キルスイッチが組み込まれたＢＰ＿０８４株は、血清中の野生型および複合培地中のキルスイッチと比較して大幅に低下した増殖曲線を示す。ヒト血清への３時間の曝露後、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＢＰ＿０８４（５０２ａΔＰｓｐｒＡ：ＰｓｂｎＡ）細胞は、ＴＳＢ中の同じＢＰ＿０８４細胞と比較して９８．８４％の測定可能な平均細胞死を示した。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
本開示は、「細菌置き換え」または「ニッチ排除」として知られる原理に依拠しており、ある微生物が別の微生物を置き換えおよび排除する。生態学の分野では、競争的排除、またはガウスの法則は、まったく同じ資源をめぐって競争する２種は安定して共存できないと述べている。これは、競争者の１つが他の競争者よりもわずかに有利な点があり、長期的には下位の競争者の消滅につながるためである。より高次の生物では、これはしばしば、より下位の競争者のわずかに異なる生態学的ニッチへの適応をもたらす。
【００９３】
対象のマイクロバイオームを永続的に管理するための方法および組成物が提供される。実施形態では、マイクロバイオームは、真皮および／または粘膜のマイクロバイオーム（エキソビオーム）である。病原性微生物による感染を治療する方法は存在するが、再発を防止する方法は事実上存在しない。
【００９４】
感染性因子−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ）
２０世紀初頭以来、すべての病原菌の最も致命的なものとして分類されており、毎年米国の病院の約５０万人の患者が、主にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによるブドウ球菌感染症に罹っている。米国では毎年最大５０，０００人の死者がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症と関連している。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、健康な人の４０〜４４％の皮膚または鼻孔内に存在する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、口、胃腸、泌尿生殖器、および上気道にも見られることがある。いくつかの研究は、より高い定着率を示している。たとえば、Ｅｒｉｋｓｅｎらは、有病率を増加させる一時的または断続的な保菌者の割合が高く、７５％を超えることもあると主張している。
【００９５】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ  ＷＴＢｉｏＰｌｘ−０１ＷＴ（登録商標）およびその他の置き換え株とブロッキング株
ＢｉｏＰｌｘ−０１ＷＴ（登録商標）と呼ばれるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ  ＷＴ株が実施例１で使用されており、比較的非感染性であることが知られている天然の「野生型」生物であり、既知の副作用はない。ＢｉｏＰｌｘ臨床試験では、この意図されたアプリケーションで非常に効果的であることが示されている（ＭＲＳＡの再発を防ぐために必要な微生物学的ニッチを占有してブロックする）。
【００９６】
本発明の方法は、（典型的には病原性があり抗生物質耐性のある）コロニー化した望ましくないＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株を「ブロッキング」生物、本研究では、ＢｉｏＰｌｘ０１−ＷＴ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ  ＷＴ株、で永続的に置き換えることにより感染を防止する。この現象は、ＢｉｏＰｌｘによって開発された他の病原体置き換えにも同様に適用されると予想される。
【００９７】
適切に準備された皮膚および粘膜表面に完全にコロニーを形成し、この細菌種によって使用される生態学的ニッチを占有し、それによって他のバリアントがそのニッチを再コロニー化するのをブロックする、合成株などの他の置き換え株が本明細書に提供される。
【００９８】
非常に多数のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓバリアント（２０１７年９月の時点で１０，０００以上のゲノム）だけでなく、この種に関連する広範な遺伝子カセットおよび病原性因子がある。
【００９９】
メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）は、この一般的なヒトの共生細菌と、時には病原性細菌の抗生物質耐性バリアントのクラスを指す。これは、ＭＲＳＡ株が代替のペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ２Ａ）を生成して、ほとんどのベータラクタムおよび他の多くの第一選択の抗生物質による治療に耐性をもたらすｍｅｃＡカセットを担持している点で、野生型株（ＭＳＳＡ−メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）とは異なる。
【０１００】
メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）および病原性メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ｖＭＳＳＡ）は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの病原性があり、侵襲性のある変異体であり、多くのヒトにコロニーを形成し、表面の軟部組織と重度の全身感染の両方を引き起こす可能性がある。ＭＲＳＡまたはｖＭＳＳＡによるコロニー化は通常、活動性であるＳｔａｐｈ感染の必要な前駆体である。感染は、皮膚または粘膜の細菌コロニーによって引き起こされ、外側の免疫学的障壁を貫通し、創傷、切開、針の穿刺、または皮膚の他の切れ目から組織または血流に侵入する。これは、高い死亡率を有する菌血症および他の全身性感染を引き起こし得る。
【０１０１】
本開示は、ＭＲＳＡまたはｖＭＳＳＡを真皮／粘膜マイクロバイオームにおけるその通常の場所から置き換えおよび排除するために、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの一般的に受動的な株を使用する。ＢｉｏＰｌｘにより使用される野生型干渉Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは全身性疾患を引き起こすのに乏しいことが知られているが、変動や侵襲性のレベルに関係なく、事実上すべての微生物が自然または偶然の接種によって「偶然的病原体」になる可能性がある。これは、黄色ブドウ球菌の場合に特に当てはまる。
【０１０２】
ＢｉｏＰｌｘによって開発された脱コロニー化およびＢｉｏＰｌｘ０１株の適用方法は、本明細書に提供される株が、数値的および位置的な大きな競争上の優位性を可能にする。この方法の結果は、病原性のあるＭＲＳＡ株の単純な消毒による破壊よりもはるかに長いＭＲＳＡ脱コロニー化効果を提供する。従前の文献で、標準的な脱コロニー化法のみによる、４週間での４５％、および１２週間での６０％のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの鼻でのコロニー形成の再発が示されているのと対照的に、初期の研究では、ＢｉｏＰｌｘ製品でのＢｉｏＰｌｘ０１  ＭＲＳＡ脱コロニー化／再コロニー化プロセスの６か月を超える全体の排除効果が示されている。
【０１０３】
適応症の概要
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症は、病院と地域の健康環境の両方で深刻な問題である。メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）は、他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株とは遺伝的に異なり、抗生物質メチシリン、および通常Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症の治療に使用される他の（通常はベータ−ラクタム）抗生物質に対する耐性を与える遺伝的要素を有する。ＭＲＳＡ株は、ＭＲＳＡ株が代替ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ２Ａ）を生成できるようにするｍｅｃＡ発現カセットを担持しており、耐性を付与するのはこの変異である。この耐性のために、ＭＲＳＡは治療が困難であり、多くの場合生命を脅かす問題となっている。ＭＲＳＡは、病院またはその他の種類の医療施設で頻繁に感染している（Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ［ＨＡ］）。これらの感染症は、通常、手術、静脈内カテーテル法、挿管、または人工関節留置などの侵襲的処置時に発生する。地域社会関連（ＣＡ）ＭＲＳＡは通常、皮膚と皮膚の接触により感染し、最初の症状は皮膚の大きな炎症性の腫物となる傾向がある。
【０１０４】
ＢｉｏＰｌｘ株を使用するＢｉｏＰｌｘ法は、侵襲性ＭＲＳＡ疾患の治療法ではないため、侵襲性疾患状態の患者に意図的に適用されることはない。ＢｉｏＰｌｘ法の利点は、１）侵襲性疾患のリスクが高い、２）この高いリスクから高い罹患率と死亡率があり、侵重要な臨床的利益を示し、襲性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ疾患の予防に対する他の効果的な選択肢がない患者群で実証できる。これらの特性は、２００５年以降、ＡＢＣの２０１４年のサーベイランスデータによると７２，４４４人のすでに侵襲性ＭＲＳＡ疾患を経験したＭＲＳＡサブセットに関してＣｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌが追跡している患者の群を定義する。
【０１０５】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓがコロニー形成状態で存在するヒトの皮膚と粘膜層の表面には、人体の内部とは必要な栄養素のレベルが非常に異なり、環境の質も異なる。細菌が侵入に成功するためには、コロニー形成と侵入状態の間でニーズと応答を調整できなければならないことが広く認識されている。これは、細菌がこれらの環境間の変化を感知し、特定の遺伝子カセットをオンまたはオフに切り替えて、新しい侵襲的状態により適応したタンパク質の産生を可能にすることによって達成される。
【０１０６】
ＢｉｏＰｌｘ法、特にＢｉｏＰｌｘ０１菌株は、これらの特定のカセットの１つ以上のオペロンで生物の死をもたらす分子命令を再構成することにより、この要件を利用する。これは、それが導入された患者に疾患を引き起こすことができな、コロニーを形成するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの「保持株」を作成するが、通常、ヒト集団にコロニーを形成し得る他の循環Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株がこの患者にコロニーを形成することもできない。これは、競争的排除という生態学的前提を通じて発生する。
【０１０７】
ＭＲＳＡによりコロニー化されている患者の現在の「標準治療」は均一ではない。再発性疾患のリスクが高い患者におけるｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎのコロニー形成の管理に関するガイドラインはない。２０１１年の成人および小児におけるＭＲＳＡ感染症の治療のためのＩＤＳＡ臨床診療ガイドラインは、再発性の市中感染皮膚および軟部組織感染症の患者の脱コロニー化手順に対して、Ｃ−ＩＩＩレベル（最低−データなし、専門家の意見）のサポートのみを提供し、侵襲性ＭＲＳＡ疾患の予防における脱コロニー化の役割については述べられていない。一部の病院は、施設に入院したすべての患者に対して広範なスクリーニングおよび隔離プログラムを追求しているが、効果の持続性が低く、平均入院患者のベースラインリスクが低いため（すなわち、ＵＣアーバインＭＲＳＡアウトブレーク）、これは効果的であることが示されていない。したがって、他の病院では、ＩＣＵに入院した患者と心臓胸部外科の症例のみへと注意を縮小している。この戦略は、ＭＲＳＡの臨床分離株およびあらゆる病原体からの血流感染を減らすことが示されている。しかしながら、これらは、近い時間枠でＭＲＳＡ感染のリスクを低減するように設計された短期的な状況戦略である。
【０１０８】
ＭＲＳＡ疾患とコロニー形成は、米国とその他の国々の両方にとって複雑な疫学的問題である。ＭＲＳＡの症状は、無症候性のコロニー形成から侵襲性の病状まで幅広く、システムに高い死亡率とコストをもたらす。侵襲性疾患を経験したＭＲＳＡ患者が医学的に異なることは明らかである。彼らは他のどのＭＲＳＡ亜集団よりも高い死亡率を有している。彼らはより高い治療失敗率を有している。彼らは他のどの患者群よりも別の侵襲性ＭＲＳＡインシデントのリスクがはるかに高い。これにより、この群は、ＢｉｏＰｌｘ法が向けられるべきであり、その使用から利益が得られる適切な孤立した群となる。
【０１０９】
脱コロニー化は、ＭＲＳＡのコロニー化を永続的に解消する上ではほとんど効果がなく、高い再発率をもたらすと結論付けることができる。活動性の再コロニー化と組み合わせた脱コロニー化だけが、ある生物（バリアント）から別の生物への長期的な変換を提供することが判明した。
【０１１０】
臨床的に異なる疾患としての再発性侵襲性ＭＲＳＡ
別の適応症は「再発性侵襲性ＭＲＳＡの予防」である。侵襲性ＭＲＳＡ感染のエピソードを既に経験している患者は、その後の侵襲性ＭＲＳＡ感染に対する感受性が非常に高くなる。本明細書で提供されるＢｉｏＰｌｘ技術は、通常は病原性形態のＭＲＳＡによって占有される可能性があるマイクロバイオームのニッチを占有することによって機能する。
【０１１１】
侵襲性ＭＲＳＡの引き起こす全身感染：
バリアントＭＲＳＡを含むＳＡは、すべての人類の少なくとも４０％の皮膚と粘膜の表面に無害な共存状態で存在する可能性があるため、細菌自体は疾患を説明するものではなく、むしろ、その臨床症状は明確である。
【０１１２】
この状態を定義およびモニターする国内および国際的な当局全体は、侵襲性のＭＲＳＡ感染が、この細菌によって引き起こされる他の状態とは別の異なった疾患であることを認めている。
【０１１３】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの単純なコロニー形成は、疾患状態とはみなされない。実際、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに親しみやすい皮膚および粘膜バイオームの栄養的および環境的特徴を持つこれらのヒトは、安定したバランスのとれた「休止状態」のそれらのバイオームを達成するために、微生物フローラの一部としてそのようなニッチの占有者を必要とする。どの方法の目標も、リスクのある患者のＭＲＳＡ株を製品株（この場合、侵襲状態では人体内で生存できないように改変された抗生物質感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）で永続的に置き換えることである。
【０１１４】
侵襲性感染症を作成するには、ＭＲＳＡはその受動的な共生状態を放棄し、真皮／粘膜バリアを破って、皮下間質（間質液）または循環（血液、血清、血漿）領域に侵入する。この「状態変化」は、新しい生物の行動と宿主との関係によって、新しい疾患状態を引き起こす。
【０１１５】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ菌血症（ＳＡＢ）は、このタイプの感染症の重要な例であり、発生率は年間２０〜５０ケース／人口１０万人の範囲（年間６４，６００〜１６１，５００ケースの範囲）である。これらの患者の１０％〜３０％がＳＡＢで死亡する。侵襲性全身性ＭＲＳＡ菌血症の死亡率は約２０％である。比較すると、これはエイズ、結核、ウイルス性肝炎を合わせた場合よりも多くの数の死の原因となる。
【０１１６】
侵襲性ＭＲＳＡ疾患のＣＤＣ−ＵＳ全国症例推定値がある最新のレポート（２０１４）は、７２，４４４症例である。この疾患の患者数は年間２００，０００人未満であり、オーファンドラッグの指定が許可される場合がある。ＭＲＳＡは、３つの異なるレベルで患者に影響を与える可能性がある。１）コロニー化、２）表在性感染症−皮膚と軟部組織、３）全身性侵襲性感染。
【０１１７】
１）コロニー化Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、ヒト人口の約３分の１に永続的にコロニーを形成する通常の共生生物で、一時的なコロニー化は人口の更なる約３分の１で発生する。この生物のＭＲＳＡバリアントは、微生物のマイクロバイオームニッチを占有し、米国の人口の約２％にコロニー化している（場所と占有に応じて高度な変動性がある）。ＭＲＳＡのコロニー化は、免疫／防御システムの外層に直接位置する潜在的な感染性微生物の持続的な貯蔵庫を作成し、これは患者に継続的なリスクをもたらす。
【０１１８】
２）表在性感染−皮膚および軟部組織の感染。皮膚関連ＭＲＳＡまたは皮膚および軟部組織の感染は、２つの主要な疾患状態のカテゴリーの中で最も一般的である。これは通常、腫れた、膿または体液が充満した、炎症性の腫物として始まり、痛みを伴い、触ると温かくなり、時には発熱を伴う。治療せずに放置すると、これらの炎症性の腫物が膿瘍になり、排液のために外科的介入が必要になる。皮膚に限局しているＭＲＳＡの場合、膿瘍の外科的排液が唯一の必要な治療であり、抗生物質の適応はない。皮膚および軟部組織の感染症は、炎症性の腫物を外科的に排液し、絶対に必要と思われる場合にのみ抗生物質を投与することによって治療される。
【０１１９】
３）全身侵襲性感染症。ＭＲＳＡ菌血症（侵襲性ＭＲＳＡ）は、全身のＭＲＳＡ感染症であり、血流、脳脊髄液、関節液、骨、下気道、その他の体液を含む、通常は無菌の部位にＭＲＳＡが存在することと定義されている。ＭＲＳＡ菌血症は、皮膚に限定されたＭＲＳＡ感染症と比較して予後がはるかに悪く、症例の２０％が死に至る。予後、感染の場所、および状態の臨床症状の違いにより、皮膚および軟部組織の感染症ＭＲＳＡ感染症と臨床的に区別される。ＭＲＳＡ菌血症は、感染性心内膜炎、敗血症性関節炎、および骨髄炎を含む、皮膚および軟部組織の感染には見られない複数の合併症を引き起こす。侵襲性ＭＲＳＡの場合、米国ではダプトマイシンとバンコマイシンが推奨される治療法である。バンコマイシンは発症が比較的遅く、一部の組織への浸透が不十分である。ダプトマイシンは効果的であることが示されているが、ＭＲＳＡにおけるダプトマイシン耐性を促進するバンコマイシンの問題に加えて、治療に伴う非感受性が問題である。侵襲性ＭＲＳＡの臨床症状と治療方法の違いは、侵襲性ＭＲＳＡがＭＲＳＡの皮膚および軟部組織の感染と臨床的に異なる状態であることを明確に示している。
【０１２０】
ＢｉｏＰｌｘ技術は、コロニー化されたヒト（すでに侵襲性ＭＲＳＡ感染症を経験したヒトを含む）と脱コロニー化処置を受けたヒトの侵襲性ＭＲＳＡ感染の再発を防ぐことによって機能する。脱コロニー化／再コロニー化微生物法として、ＢｉｏＰｌｘ技術は、全身性ＭＲＳＡ感染症の患者を「治療」するために投与されない。それは、全身性ＭＲＳＡ感染症の除去（および全身脱コロニー化）に続いて適用される。
【０１２１】
疾患または状態が単に原因物質と同義ではないことは、医学的命名法の確立された原則である。現在のケースでは、ＭＲＳＡを介した全身性菌血症（または他の侵襲性全身性疾患の呼称）は、ＭＲＳＡによって、またはそれと関連して、または他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株によって引き起こされ得る、他の表在性および粘膜の状態と明確に区別される。侵襲性全身性ＭＲＳＡ媒介疾患は、診断、病理学、治療、および予後プロファイルが明確に異なる。
【０１２２】
ＢｉｏＰｌｘ０１株の作用機序に基づいて、侵襲性ＭＲＳＡ感染自体の治療とは対照的に、患者はその後の全身性ＭＲＳＡ感染を防止されることに注意することが重要である。したがって、「再発性全身性ＭＲＳＡ感染の予防」は、ＢｉｏＰｌｘ０１株の適応症の最も正確な説明になる。
【０１２３】
侵襲性のＭＲＳＡ感染症があり、通常は抗生物質による介入（例えば、バンコマイシン）によって微生物が首尾よく排除された患者の標的集団は、それにもかかわらずＭＲＳＡの再コロニー化、ＭＲＳＡ全身再感染の再発、および関連するリスクが高い。
【０１２４】
病気の指定の国際的および米国の認識：
この疾患の明確な定義は、２００５年から米国でこの状態を積極的にモニターしているため、疾病管理予防センター（ＣＤＣ）によって発表されている。機関は、新興感染症プログラム（ＥＩＰ）を介して積極的細菌コアサーベイランスシステムを利用してこのモニタリングを実行する。この文脈での症例は、通常は無菌の身体部位からのＭＲＳＡの分離によって定義される。通常は無菌の部位には、血液、脳脊髄液、胸膜液、心膜液、腹膜液、関節／滑液、骨、体内部位（リンパ節、脳、心臓、肝臓、脾臓、硝子体液、腎臓、膵臓、もしくは卵巣）、または他の通常は無菌の部位が含まれる。
【０１２５】
ＣＤＣはまた、予防の取り組みを導くためのデータを提供する１６，０００を超える米国の医療施設の追跡システムとして、全米医療安全ネットワーク（ＮＨＳＮ）も作成した。メディケアサービスセンター（ＣＭＳ）と他の支払者は、このデータを使用して、医療施設の業績に対する経済的インセンティブを決定する。このシステムは、疫学的目的で侵襲性疾患のマーカーとしてＭＲＳＡ血流感染を追跡する。
【０１２６】
ＭＲＳＡを介した侵襲性疾患の状態は、ＩＣＤ９およびＩＣＤ１０システムでも、原因物質ＭＲＳＡに固有の独自の数値コードを持つ状態の分類によって体系化されている。たとえば、ＭＲＳＡによる敗血症はＡ４１．０２とコードされ、ＭＲＳＡによる肺炎はＪ１５．２１２とコードされる。これは、侵襲性ＭＲＳＡ疾患が同じ因子による表在性皮膚および軟部組織の疾患−コードＬ０３．１１４（左上肢の例）の並置で与えられるという異なる特徴付けをさらに例証し、疾患状態の原因としてＭＲＳＡを示すために、他のさまざまな感染コードに添付されている、他の場所で分類された疾患の原因としてＢ９５．６  ＭＲＳＡの次のコードが付いている。
【０１２７】
ＥＵの支部である欧州疾病対策センター（ＥＣＤＣ）も、ＮＨＳＮと同様の定義で侵襲性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ分離株を監視し、メチシリン耐性のパーセンテージを追跡するが、報告要件では、年間の総症例数のＥＵ推定値は生成されない。
【０１２８】
特異的には、全身状態とは異なり、単純なＭＲＳＡコロニー化はそれ自体が通常は疾患と見なされない。しかしながら、コロニー化は、ほとんどの侵襲性疾患の前提条件とみなされ、これはたとえば、鼻のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ分離株は通常、後で臨床感染を引き起こす株と同じであることを示す研究で証明されている。この持続的なコロニー化の状態は、皮膚や粘膜表面におけるこの細菌の生態学的安定性を反映している。
【０１２９】
このコロニー化の状態は、ＩＣＤ１０システムのＺ２２．３２２のＺ小見出しの下に記録される。これは、健康状態に影響を与える要因と医療サービスとの接触に予約されているが、疾病やけが自体には影響しない。
【０１３０】
対象となる希少疾患集団：
ＢｉｏＰｌｘ非再発法の対象となる希少疾患集団は、以前にＭＲＳＡ（感受性が高いことが知られている集団）に侵襲的に感染（全身感染）し、ＭＲＳＡによる再コロニー化が進行し続けている人々の群である。ＣＤＣは、侵襲性ＭＲＳＡ感染のすべての米国のケースをモニターする。複数の研究者がこの医学的に異なる集団である侵襲性ＭＲＳＡ感染の１つの定義されたエピソードに既に苦しんでいる患者について述べている。この群は、それらの実証された感受性とそれらの継続的なコロニー化の結果として、生命を脅かす侵襲性疾患のリスクが高まっている。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、再コロニー形成を防止する、またはＭＲＳＡに起因する全身性侵襲性菌血症の再発を防止するための方法が提供され、以下により必須のＭＲＳＡコロニー化を予防（または再発の予防）することを含む。
１）粘膜および真皮のマイクロバイオームからのＭＲＳＡの脱コロニー化、および
２）合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（例えば、ＢｉｏＰｌｘ０１株）によるこれらのマイクロバイオームの再コロニー化。合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（例えば、ＢｉｏＰｌｘ０１株）が特定のニッチを占有し、ＭＲＳＡ再コロニー化をブロック／防止（再発をブロック）するため、この方法は、細菌の干渉の影響を通じて、標的真皮／粘膜のマイクロバイオーム生態系内のニッチダイナミクスを通じて機能する。この方法の有効性は、本明細書に提供されている原理の証明研究で明確に示されている。
【０１３２】
ＳＡはヒトの総人口の４０％以上の通常のマイクロバイオームの一部として存在する。ＭＳＳＡのコロニー化の状態は一般的である。ＭＲＳＡバリアントは米国の人口の約１〜２％に見られるが、特定の地域や人口統計では、このレベルはかなり高くなる可能性がある。ＭＲＳＡはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感受性集団内の誰にでもコロニーを形成する能力があると考えられている。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、最も一般的には皮膚の表面と前鼻前庭に生息するが、中咽頭深部と消化管、および一部の個体では正常な膣フローラにも少量が見られる。
【０１３３】
コロニー化された個体では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは通常、生態系ニッチを占有するだけで疾患を引き起こさない非侵襲性の共生細菌のままである。しかしながら、これらのコロニー化の一部では、この細菌は、日和見的に、またはいくつかの特定のバリアント特性による侵入の可能性の増加の結果として、疾患を引き起こす可能性がある。
【０１３４】
持続性ＭＲＳＡ保菌者の約２３％は、保菌者であると同定されてから１年以内に個別のＭＲＳＡ感染症を発症した。
【０１３５】
多くのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓバリアントは、そのような株が表皮または粘膜組織層を介してより効果的に侵入してその後深部または全身感染を開始できる病原性タンパク質産物をコードする遺伝子カセットを獲得している。コロニー化または感染症では、ｍｅｃＡカセットの存在がこれらの患者の治療選択肢を制限し、菌血症、血管内感染症、および肺炎におけるＭＳＳＡと比較した場合、多くの研究がＭＲＳＡに関連する死亡率の増加を記録している。
【０１３６】
ＭＲＳＡがコロニー化している個体が最終的に侵襲性疾患に進行するかどうかを事前に判断することはできないため、侵襲性ＭＲＳＡ疾患の増加したリスクが十分に実証されている患者の全集団を同定して治療することが特に重要である。
【０１３７】
ＭＲＳＡを介した侵襲性疾患の統計：
ＭＲＳＡは１９６１年に英国の科学者によって同定され、最初の米国の臨床症例は１９６８年に記録された。次の２５年間、ＭＲＳＡは主に発生率が増加している風土病の病院ベースの問題と見なされていたが、１９９０年代半ばから後期にかけて、地域社会に関連したＭＲＳＡの発生率の増加は主に表在性皮膚と軟部組織の感染においてもっとも発現しているのが見られた。学界にとって最大の関心事は、ＭＲＳＡによって引き起こされる侵襲性感染の増加である。侵襲性ＭＲＳＡ疾患の発生率の増加傾向は１９９０年代を通じて見られ、２００５年にピークに達した。
【０１３８】
ＣＤＣは、ＮＨＳＮと新興感染症プログラム−積極的細菌コアサーベイランスシステム（２００５年から開始）を通じて、侵襲性ＭＲＳＡ疾患の発生率を追跡する。２００５年と比較して、２０１５年のデータは、侵襲性ＭＲＳＡ疾患の全体的な発生率が３７．５６の発生率から１８．８にほぼ５０％減少したことを示している。この公衆衛生危機に対応して病院で制定された高価で面倒な感染対策介入は、成果の大部分が地域社会に関連するケースではなく、医療関連のケースで見られたため、発生率の減少の大部分の称賛を与えられた。過去１０年間に得られた成果にもかかわらず、侵襲性ＭＲＳＡ感染症は引き続き優先順位の高い公衆衛生問題である。これらの感染症は治療が非常に困難な場合があり、治療の失敗は適切な治療を受けている患者のほぼ２５％で示されている。どの医療経験のある患者が侵襲性ＭＲＳＡのリスクがあるかを予測することは困難な問題である。ＭＲＳＡコロニー化、慢性の開いた傷の存在、侵襲的なデバイスの存在などの危険因子が解明されている。
【０１３９】
これらの特性の存在だけでは、どの患者が最終的に侵襲性疾患を示すかを予測することはできない。しかしながら、侵襲性ＭＲＳＡ感染症にかかった患者の最も予測可能な危険因子の１つは、以前に侵襲性ＭＲＳＡ感染症があったことである。積極的細菌コアサーベイランスシステム（ＡＢＣ）の２００４〜２００５年のデータでは、侵襲性症例のほぼ１３％が１８か月の遡及的データ評価中に２回目の侵襲性ＭＲＳＡ感染を発症したことが指摘されている。２０１１年の暦年のＥＩＰ−ＡＢＣデータをもう一度見ると、これらの患者の８％に、少なくとも３０日離れた１回を超える侵襲性ＭＲＳＡ感染があったことが判明した。再発侵襲性ＭＲＳＡ感染の長期的なリスクは、これらの推定が、これらの患者の研究期間の前の初期の感染と、終了日後に発生する後の感染を見逃すため、さらに確実に大きくなります。Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｐｌａｔｔ（２００３）は、ＭＲＳＡのコロニー化または感染が判明している入院患者の２９％が、１８か月のフォローアップで２番目のＭＲＳＡ感染（多くの場合は重度）を発症し、侵襲性疾患の再発を防ぐためにこの群を標的化することは、約１７，５００の後続の侵襲性ＭＲＳＡ感染を防ぐことができることを示した（最新のＣＤＣデータを使用）。
【０１４０】
侵襲性ＭＲＳＡおよびＭＲＳＡによる皮膚および軟部組織の感染は、両方とも同じ病原体によって引き起こされる。しかしながら、希少の指定は、薬物と疾患の組み合わせに基づいて授与される。ＭＲＳＡは病原体であり、疾患状態状ではない。しかしながら、それは感染症を引き起こす可能性があり、治療されているのはこれらの異なるタイプの感染症である。侵襲性ＭＲＳＡには、はるかに重篤な予後と、皮膚に限局しているＭＲＳＡ、または単にＭＲＳＡがコロニー化していることとは異なる臨床症状が伴う。米国の人口の約４０％に、通常は鼻や皮膚に見られるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓがコロニー化している。一般に、「疾患状態」とみなされる感染の兆候はない。しかしながら、全身ＭＲＳＡ感染は、高熱、悪寒、めまい、胸痛、患部の腫脹、頭痛、発疹、咳、その他の全身症状として現れる。これらの２つの状態は異なる方法で治療される。皮膚と軟部組織の感染症は、通常、皮膚と軟部組織の感染症に関連する一般的な炎症性の腫物を切開して排液することによって治療される。抗生物質と脱コロニー化は、複数の部位に広がった全身性または重篤な疾患の兆候がある場合にのみ使用される。
【０１４１】
侵襲性ＭＲＳＡの発生率は年間２０〜５０ケース／１００，０００人である。6a現在の米国の人口は３２６，１９９，００２（２０１７年１１月２日にｗｗｗ．ｃｅｎｓｕｓ．ｇｏｖ／ｐｏｐｃｌｏｃｋからアクセス）であるため、これは、米国で１６３，１００例の侵襲性ＭＲＳＡ感染が控えめに存在し、ＦＤＡの希少指定の患者基準２０万件を下回っていることを意味する。報告された有病率の他の情報源を検索して、この患者集団の最も控えめな推定値を計算したことを確認した。Ｈａｓｓｏｕｎ  ｅｔ．ａｌは、２００５年7aに１１１，２６１から減少した２０１４年の米国での侵襲的ＭＲＳＡの７２，４４４例の発生率を報告した。これに基づき、人口が減少し続けると仮定して、我々は、米国で２０１７年において侵襲性ＭＲＳＡを有する１６３，０２９人の患者の有病率が非常に控えめな見積もりであると仮定することができる。ＣＤＣによれば、２０１１年には８万人以上の侵襲性ＭＲＳＡ感染症と１１，２８５人の関連死者があった。
【０１４２】
この問題に対処するために、本発明者らは、疾患を引き起こすことはできないが、ＭＲＳＡが踏襲する可能性のあるマイクロバイオームニッチに存在し得るＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの分子改変株であるＢｉｏＰｌｘ０１株を開発した。ＢｉｏＰｌｘ０１株の侵襲性の欠如は血液または血漿との接触時に作動し、生物の死を引き起こすオペロンによって可能にした。ＭＲＳＡ検査で陽性で全身症状を経験している患者は、ＢｉｏＰｌｘ０１株を投与する前に全身脱コロニー化を受け、ＭＲＳＡが以前にその患者のマイクロバイオームで占有していたニッチを占有することができる。ＭＲＳＡの病原性株がニッチを占有するのを防ぐことにより、これらの病原性株はコロニーを形成できず、その後、無菌組織部位に侵入することができない。ＢｉｏＰｌｘ０１株は全身性ＭＲＳＡ感染の再発を防ぐことができる。
【０１４３】
一実施形態では、嚢胞性線維症の患者におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ肺感染症の治療方法が提供される。
【０１４４】
一実施形態では、侵襲性菌血症の治療方法が提供される。ＣＤＣ（疾病管理予防センター）で採用されている基準を使用すると、侵襲性菌血症は、通常は無菌の身体部位からの細菌の分離によって示される。これらには、血液、ＣＳＦ、関節液、骨試料、下気道試料、およびその他の無菌の体液が含まれる。この状態は、単純な細菌のコロニー化ならびに細菌が介在する皮膚および軟部組織の感染に関連するが、明確に区別されている。コロニー化の状態は、大多数の症例で侵襲性疾患の前提条件であると認められている。
【０１４５】
ＭＲＳＡおよびｖ−ＭＳＳＡを介した侵襲性（全身性）細菌感染
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによって媒介されるＭＲＳＡ侵襲性細菌感染症は、一般的または文献では、ＭＲＳＡ菌血症または敗血症、全身性ＭＲＳＡ感染症、ＭＲＳＡ血流感染症、侵襲性ＭＲＳＡ感染症とも呼ばれる。特定のＭＲＳＡ誘発全身状態は、骨髄炎、敗血症性関節炎、肺炎、心内膜炎、菌血症、トキシックショック症候群から敗血症性ショックまでの範囲である。ハイリスク集団における侵襲性ＭＲＳＡ疾患の再発を予防または低減する方法の開発は、望ましくない株のコロニー化を永続的に妨害するメカニズムを通じて、侵襲性ＭＲＳＡ感染に通常必要とされる状態の予防において大きな進歩となり、これらの患者がその後の侵襲性ＭＲＳＡ感染に苦しむ可能性を低減するであろう。
【０１４６】
本開示の１つの目的は、活動的な健康な成人医療従事者におけるＭＲＳＡの再発を防止するＢｉｏＰｌｘ−０１  ＷＴ材料の能力を評価することである。この集団は特にＭＲＳＡ感染のリスクがあり、人口統計の中でＭＲＳＡコロニー化率が最も高い。この群の保護効果の実証に成功すれば、リスクのあるすべての人々の間でＭＲＳＡ再発を効果的に防止できるというＢｉｏＰｌｘ−０１  ＷＴの有効性が検証される。
【０１４７】
「再発」は単に「バグが再発する」ことを意味する。再発は、疾患の進展と制御の両方にとって最も重要である。再発すると、病原体は何度も戻って来て、それが生存サイクルを通過するたびに、それが遭遇した抗生物質に対してますます耐性になることを「学習」する。この再発がなければ、一度病原体が消えてしまえば、それは消えたままになるであろう。再発がなければ、抗生物質耐性に向かって進化する圧力はない。
【０１４８】
様々な実施形態では、対象は、１つ以上の病原性微生物でコロニー化される場合もある。特定の実施形態では、望ましくない微生物は、薬物耐性病原性微生物である。薬剤耐性病原微生物は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、フルコナゾール耐性カンジダ、ＭＲＳＡ、薬剤耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、薬剤耐性結核、バンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、エリスロマイシン耐性グループＡ連鎖球菌、およびクリンダマイシン耐性グループＢ連鎖球菌から選択できる。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ／ｂｉｇｇｅｓｔ＿ｔｈｒｅａｔｓ．ｈｔｍｌ
【０１４９】
一実施形態では、望ましくない微生物は、薬剤耐性の病原性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓであり得る。
【０１５０】
ブドウ球菌は最も豊富な皮膚コロニー化細菌属であり、院内感染および地域社会に関連した皮膚感染の最も重要な原因である。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ種は劇症感染を引き起こす可能性があるが、他のブドウ球菌種による感染はほとんど亜急性である。コロニー化は通常、感染の前提条件である。Ｏｔｔｏ  ２０１０，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２０１０  Ａｐｒ；  ５（２）：１８３−１９５．しかしながら、すべての侵襲性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症の前に、同一菌株でのコロニー化が検出されるわけではない。非相関部分は、２番目の保菌者からの術中イベントなどの「直接接種」もしくは「直接創傷播種」理論、または最初のコロニー調査以来の時間におけるこれらの患者のすべてのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株のコロニー化もしくは侵襲株によるコロニー化における不完全な検出のいずれかによって説明し得る。
【０１５１】
ＳＡは一般的なヒトの共生生物であり、（米国）人口の３０〜５０％に通常は無症状で存在する（コロニー形成）。ヒトによるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの無症候性の保菌は、主要な天然のリザーバーであるが、飼育動物、家畜、および感染媒介物は補助的なリザーバーとして機能し得る。
【０１５２】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにはさまざまな株があり、その多くは深刻な病原体としても作用し得る。黄色ブドウ球菌感染症の症状は、無から軽度の皮膚および軟部組織感染症、血管内感染症、肺炎、敗血症性関節炎、心内膜炎、骨髄炎、異物感染症、敗血症、毒性ショック、および心内膜炎などの生命にかかわる侵襲性の全身性疾患まで、多種多様である。前鼻粘膜は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによる健康な保菌者のコロニー化を検出するための最も頻繁な部位であると伝統的に考えられてきた。鼻孔、喉、腋窩、会陰、鼠径部、および直腸を含む、いくつかの部位に無症状でコロニーが形成されることがある。
【０１５３】
ＭＲＳＡ分離株は、かつては病院、その他の医療環境、およびこれらの施設に通院している患者に主に限定されていた。しかしながら、１９９０年代半ば以降、医療システムへの曝露の危険因子が欠如している集団で報告されたＭＲＳＡ感染の数は爆発的に増加している。ＭＲＳＡ感染の発生率のこの増加は、コミュニティ関連ＭＲＳＡ（ＣＡ−ＭＲＳＡ）として知られる新しいＭＲＳＡクローンの認識に関連している。ＣＡ−ＭＲＳＡ株は、以前の医療関連ＭＲＳＡ株とは異なる。それらは異なる群の患者に感染し、異なる臨床症候群を引き起こし、抗菌剤感受性パターンが異なり、地域社会の健康な人々の間で急速に広がり、医療環境でも同様に頻繁に感染を引き起こす。Ｄａｖｉｄ，Ｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２３（３）：６１６−６８７．
【０１５４】
再発性ＣＡ−ＭＲＳＡ皮膚および軟部組織感染が一般的である理由は不明である。再発のメカニズムは不明である。可能性としては、無症候性のＣＡ−ＭＲＳＡの持続的な保菌による再感染、または環境ＭＲＳＡからの取得後、またはヒトもしくは動物との密接な接触からの新しいＭＲＳＡの取得後の感染が含まれる。ＭＳＳＡによって引き起こされる皮膚や軟部組織の感染症も再発するが、ＭＲＳＡによって引き起こされる感染症よりも頻度は低くなる。
【０１５５】
一定の抗生物質圧力の下で、多くのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓバリアントは抗生物質耐性を発達させた。今日、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのペニシリン耐性は事実上普遍的であり、現在では一般的なβ−ラクタムおよび関連する多抗生物質（メチシリン）耐性が広まり、抗生物質耐性の「スーパーバグ」の重要な新しいクラスを生み出している。
【０１５６】
病原性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、ＭＲＳＡなどの薬剤耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、またはＶＩＳＡもしくはＶＲＳＡなどのバンコマイシン耐性株であり得る。あるいは、病原性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、病原性のメチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ｖ−ＭＳＳＡ）でもあり得る。ｖ−ＭＳＳＡは生命を脅かす侵襲性感染症の高い病原性の原因である。ＭＲＳＡとｖ−ＭＳＳＡは流行しており、人的コストが高くなる。
【０１５７】
ＭＲＳＡは病院、診療所、刑務所、兵舎、さらには世界中のジムやヘルスクラブでも深刻な公衆衛生問題になってきている。ＭＲＳＡは、院内感染（５０万人の米国患者／年）の一般的な原因であり、深刻である可能性のある地域社会感染のますますの原因である。全身浸潤性疾患の場合−症例の２０％が死亡する。ＭＲＳＡは、新しい抗生物質耐性の「スーパーバグ」の中で最も重要なものの１つである。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症を治療する方法は存在するが、再発を防止する方法は事実上存在しない。ＭＲＳＡ皮膚感染症の再発は、対象の３１％〜４５％で見られる。
【０１５８】
再発を防ぐ１つの取り組みには、脱コロニー化が含まれる。再発を防止するために最初に（現在では唯一の）広く実施されている手順は、脱コロニー化である。残念ながら、単純な脱コロニー化は再発を防ぐには不十分である。医師は最初に、微生物のコロニー化または感染−たとえばＭＲＳＡまたはｖ−ＭＳＳＡのコロニー化／感染−を局所化学物質（例えば、クロルヘキシジン）または抗生物質で治療できる。多くの場合、抗生物質による治療は「臨床的に」病気を根絶するかもしれない。ティーツリーオイルおよびクロルヘキシジンなどの防腐剤および収斂剤は、脱コロニー化（すなわち、抑制）に使用できる。抑制に使用される抗生物質には、ムピロシンなどの鼻の脱コロニー化のための局所抗生物質が含まれる。ＭＲＳＡで最も頻繁に使用される全身性抗生物質には、バンコマイシン、セファゾリン、セパハロチン、またはセファレキシンなどの第１世代抗生物質、リネゾリドまたはダプトマイシンなどの新世代抗生物質が含まれる。重症度の低いＭＲＳＡ症例では、クリンダマイシンまたはリンコマイシンが使用され得る。それにもかかわらず、この脱コロニー化だけで、ＭＲＳＡとｖ−ＭＳＳＡの病原体は通常、再発するか、ほぼ半分の時間で再び増殖する。このレベルのパフォーマンスは、再発防止における単純な脱コロニー化の効力に関して懐疑的な見方を自然に導いた。
【０１５９】
臨床医は、ブドウ球菌の保菌状態を根絶するために、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）によって引き起こされる再発性皮膚感染症の患者に、局所、鼻腔内、または全身性の抗菌剤を処方することがよくある。一部の薬剤はブドウ球菌の保菌を一時的に妨害することができるが、ＭＲＳＡによって引き起こされる皮膚感染の予防に有効であると証明されたものはない。Ｃｒｅｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．２０１５  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ；  ２９（３）：４２９−４６４．
【０１６０】
文献と本発明者らの実施の両方において、脱コロニー化の質は観察された再発率と相関していることが見出されたが、単純な脱コロニー化が永続的で成功した結果をもたらすことはめったになかった。
【０１６１】
本開示は、マイクロバイオーム集団の効果的かつ永続的な改変による再発防止に焦点を当てた方法および組成物を提供する。
【０１６２】
微生物感染またはコロニー化を抑制することを含む、病原性微生物感染の再発を防止または低減する方法が開発されている。
【０１６３】
対象における望ましくない微生物の病原性感染の再発を低減するか、またはそのコロニー化を低減する方法であって、対象の少なくとも１つの部位で望ましくない微生物を脱コロニー化して、部位からの望ましくない微生物の存在を大幅に低減または排除することと、望ましくない微生物と同じ属および種を有する合成の第２の微生物を対象に投与することによって、望ましくない微生物を置き換えることと、を含む方法が提供される。
【０１６４】
再発を防止するための方法および組成物は、病原体が占有するバイオームニッチを特別に設計された合成微生物または「良いバグ」で満たすことによる病原微生物の置き換えを含む。同じバイオームニッチを占有することにより、「良いバグ」は病原体押し出し、それが再コロニー化すること、またはその好ましい生態学的区域に移動する（または戻る）のを防止する。同じバイオームニッチが確実に満たされるようにする１つの方法は、病原微生物と同じ属および種から出発する合成微生物を設計することである。
【０１６５】
再発を防止するための方法と組成には、好ましい微生物をさらに促進し、病原体による再コロニー形成を阻害する主要な栄養、化学、または共生環境を再確立することにより、合成微生物−「良いバグ」−を促進またはサポートすることが含まれる。たとえば、共生クラスターは、病原体が古い生態学的ニッチに戻るのを防ぐ上でさらなる多層防御を提供する可能性があり−それは再発防止に役立つ可能性がある。
【０１６６】
ＢｉｏＰｌｘ法は、微生物学、システムおよび計算生物学、環境の相互作用（クラスターおよびシグナリング）；所有生物（選択および改変）；ならびにバリアントおよび株置換戦略を含む最先端の方法／技術によって可能となる。
【０１６７】
（１）「ＢｉｏＰｌｘ０１−ＷＴ（登録商標）バリアント」−分離され、検証され、実施例１に記載されるようなこの株クラスターを使用したフィールド試験用に準備された非病原性および受動的コロニー化の確立された歴史を持つＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ野生型微生物、（２）「ＢｉｏＰｌｘ０１−ＫＯ（登録商標）操作バリアント」、特定の病原性遺伝子をノックアウトすることにより安全性を高める合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株、（３）「ＢｉｏＰｌｘ０１−ＫＳ（登録商標）操作バリアント」は、分子プログラムされた細胞死トリガーを組み込んで侵襲性の病原性を防止する合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株を含む置き換え微生物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、合成微生物は、「新しい」感染またはコロニー化を伴わずに、純粋に病原性株の代替物として作用する。
【０１６８】
完全に特徴付けられたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ培養（株および変異株）の広範な独自のライブラリーが開発され、置き換え生物の源に使用、永続性と競争の分析に使用され、遺伝子型／表現型の比較分析に使用され、病原性ゲノム／トランスクリプトームクラスタリングモデリングに使用され、かつシグナル伝達ゲノム／トランスクリプトームクラスタモデリングに使用される。
【０１６９】
制御された共生生物のライブラリーは、ＢｉｏＰｌｘ０１−ＫＳ（登録商標）バリアントとの潜在的なバリアントクラスター同時投与のために開発されている。
【０１７０】
機械学習、複雑な動的微生物学システムのモデリング、ゲノム／トランスクリプトーム／プロテオーム（表現型）の関係、病原性因子の遺伝学とプロモーター、回復力のモデル化と時間／条件の変化、ｎ次元のニッチ形成関係、および高次元のクラスター関係を含む計算微生物学の方法も開発されている。
【０１７１】
現在のモデルの再発防止法の中心となるのは、「非共コロニー化」の原則である、すなわち、１つの種とその種の１つのバリアントのみが、関連する皮膚または粘膜のバイオーム生態学的ニッチを一度に占有できることを意味する。この単純で試験可能な現象の根底にあるのは、微生物学の新興科学を形成するために組み合わされる、より深い生成原理の宿主である。広く一般化可能であるが、このセクションでの非共コロニー化についての議論は、特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのコロニー化を指す。
【０１７２】
非共コロニー化
非共コロニー化（「細菌置き換え」とも呼ばれる）の原則では、１つの種の１つのバリアント／株のみが、いつでもバイオーム内の任意の特定のニッチを占有することができるとされている。
【０１７３】
非共コロニー化の中心的な経験的現象は、総体的な効果を表している。複雑なシステムで動作していることが判明している、今日だけよく特徴付けられ、数学化されている多数の力の相互作用の結果である。
【０１７４】
ヒトのバイオーム内の種レベルに固有の細菌ニッチは、本発明の技術の根底にある。生物学的ニッチの占有に固有性がない場合、実験的に示された細菌置き換え現象と同様に、意図的な株交換は達成できない。
【０１７５】
非共コロニー化への期待は、病原性コロニー化または感染の再発を防止するための本方法の永続性にとって重要である。バリアントからバリアントへの非共コロニー化は、株／バリアントの置換（例えば、Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９６３による、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ８０／８１から５０２ａへの変換）は文献により実験的に実証されており、実施例１に示すように、本願の臨床試験で確認されている。
【０１７６】
文献を注意深く読むと、耐久性が低く、ｉｎ  ｖｉｖｏでの証拠がまれであることを示しているため、持続的な種間ニッチの占有について疑いを持つ。一時的な占有が発生する可能性があるが、我々は永続的な結果にのみ関心があるため、重要な結果とはみなされない。
【０１７７】
種から種への置換における永続性の失敗は、特定のニッチ充足が「類似のバリアント」への置換を必要とする証拠となる。永続性のバイオームだけが効果的な非再発技術／製品に必要な機能特性（回復力など）を示すことができるため、これは重要である。
【０１７８】
ＭＲＳＡの再発防止材料に関して本開示で見られるような、バリアントからバリアントへの置換の場合、置き換えに「バイオーム破壊イベント」（抗菌剤、抗生物質などによる偶発的または意図的な脱コロニー化など）を必要とするかどうか、または「遅い競争による置き換え」（ある生物が別の生物と資源、増殖などで競争する）によって発生するかどうかに関して文献からの直接的な証拠は同定されていない。しかしながら、ヒト真皮バイオームでは圧倒的に１つの株のみがヒトに「完全に」コロニーを形成し、遅い競争的置換が発生することを示している。さらに、抗ＭＲＳＡ脱コロニー化法の５５％の成功率は、「バイオーム破壊イベント」も永続的なバイオーム変化を引き起こす可能性があることを示している。これらの現象はどちらも非コロニー化の表現である。
【０１７９】
非共コロニー化は自然に発生し、たとえば、大多数のケースでは、単一のバイオーム内でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの１つのバリアントのみが検出される（９５％以上のケースで、「一時的な状態」が原因である可能性が高いバランス）。
【０１８０】
非共コロニー化の永続性（有効性）を指定および評価する際には、次の３つの異なる結果のスケールを認識する必要がある：（１）短期−再植民地化の直後、（２）初期の安定期−過剰な生物を排出した後、（３）長期−安定した「新しい」バイオームが確立された後。
【０１８１】
短期的において−再コロニー化の直後に、脱コロニー化されたバイオームは、再コロニー化の間に「過剰」に適用された生物によって支配され、一種の偶発的で一時的な結合（ピーナッツバターの拡散のように）を生成する。この期間内の試験では、バイオームアプリケーションが発生したことのみを確認できる。期間＝数日、その後、過剰な生物が排出される。
【０１８２】
初期の安定した段階において−過剰な生物を排出した後、バイオーム自体は平衡状態を再確立しているが、表在的には既存の病原体ではなく置き換え生物を有する。この結果への信頼は、主に、生き残った脱コロニー化後の病原菌に対する新しい生物の圧倒的に大きな比率（おそらく数百万対１）によるものである。これは、高い永続性レベルを備えた安定したコロニーになることが期待される。この時期の試験では、ＭＲＳＡまたはｖＭＳＳＡが排除され、置き換え株が再コロニー化していることが確認される。期間＝数週間から数か月。
【０１８３】
長期的において−確立された安定した「新しい」バイオームは、生物がニッチを占有または「取得」する能力だけでなく、そのニッチを「保持」する能力を実証する。いくつかの実施形態では、この段階は、置き換え株または合成微生物が現在の世代の新しいバイオーム侵入者（ＵＳＡ３００など）に対してどれほど競争力があるかを評価するために使用される。この質問は、「新しい」置き換え生物が遅い競争的置き換えに対して時間をかけて競争する能力、および抗生物質もしくは防腐剤への曝露、または病原体への頻繁な再曝露、特に株が、このかく乱物質に対して感受性がある場合など、時間の経過とともに生物群を破壊する可能性のある外力によって参照される。
【０１８４】
微生物バリアントの非共コロニー化、バリアント対バリアントのニッチの占有の現象を特徴づけることは重要であり、この現象が存在し、真皮バイオーム生態系における強い力であるという経験的証拠がすでに構築されている。
【０１８５】
「競合的排除」の法則は、１つの生物のみが１つのニッチを支配する状況を指す。
【０１８６】
この現象を理解する際の１つの歴史的な誤りは、これがバイナリシステムであり、概念的には１つまたは２つのバリアントによって駆動されていると想定していることである。実際、多数の異なる微生物、例えば、様々なＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株が、いつでも、そして任意の時間で、環境的に存在する可能性がある。
【０１８７】
非共コロニー化の現象がなければ、事実上すべての「ｓｔａｐｈ可住性」バイオームは、本質的に複数のバリアントの非常に可変的な混合異種「スープ」であると結論付けることができる。さまざまな可能性を表１に示す。
【表１】
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【０１８８】
表１では、共コロニー化は５％未満で発生しているため（文献では）、ケース２と４を排除できる。これらの場合でも、共コロニー化の事例の大部分は他の１つの生物のみを含む。ケース３は、ニッチ対置き換え生物の不完全または重複しないフットプリントに潜在的に関連する少数のケース（５％未満）で可能な限り考慮することができる。
【０１８９】
観察された１つのバリアントの別のバリアントへの置き換え（たとえば、ＭＲＳＡの取得）がバイオーム破壊的なイベントによって引き起こされたのか、または遅い競争的置き換えによって引き起こされたのかは、文献から直接の証拠はない。しかしながら、一度に１つの株のみが個々のバイオーム（全部に）にコロニーを形成する傾向があることは経験的に明らかである。特定のバイオーム内の生物地理学的に異なる遠方の部位は、同じバリアントを持つ傾向が強く、これは、観察可能な全身脱コロニー化および置き換えプロセスなしで発生し、ルール主導の競合的置き換えプロセスが発生することを示す。競争的置き換えの観察は、非共コロニー化の原則の別の表現である。
【０１９０】
置き換えバリアントがニッチを完全に満たさない架空のケースでは、共コロニー化する傾向が弱い場合がある。これらの場合、共コロニー化が元の病原体ではなく合成置き換え微生物を支持するように、バリアントクラスターを使用して置き換え物で「スロットを埋める」ことができる。これは別の置き換え微生物の使用を伴う可能性があるが、これは再発ではなく−これは再発のさらなる阻止である。
【０１９１】
非共コロニー化の現在の証拠
ある大規模な研究では、２年間までの長期間追跡した英国のオックスフォードシャー州の健康な患者から採取されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの陽性試料３，１９７例における共コロニー化の有病率を調べた。鼻孔の試料に黄色ブドウ球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの複数の株が存在する点有病率は３．４〜５．８％であった。Ｖｏｔｉｎｔｓｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５２（４）：１１９２−１２００．２年間ほぼ２か月ごとにスワブを提出したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ保菌者のうち、１１％が一過性の共保菌を有していた。研究では、低コロニー形成株を見つけるための高感度の手順を可能にする効果的なスパタイピングプロトコルを使用した。このデータセットの解釈は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのコロニー形成が、時間の経過とともに同じニッチの存在を争う有病率が低い複数のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株との動的プロセスであることを示している。簡単な計算により、観察された結果が単に非特定のニッチの独立した占有ではないことが確認できる。この例では、１０００人の患者がスクリーニングされ、３６０人がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ陽性であることが判明した。非特定のニッチシナリオでは、．３６×．３６、または１３％（１３０人）は、共コロニー化を示すと予想される。しかしながら、その主要な時点で３６０保菌者（１４人）のわずか３．９％が実際に共コロニー化し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのマイクロバイオームニッチの株特異性を示した。
【０１９２】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ保菌者のごく一部には、任意の発生時点で、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの２つの異なる株によって一時的にコロニー形成されることがある。上述したように、Ｖｏｔｉｎｔｓｅｖａ  ｅｔ  ａｌは、ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ内のすべてのバリアントを調べ、この現象の点発生率が３．４〜５．８％の範囲であると報告した。ＭＲＳＡとＭＳＳＡの混合物のみを取り上げた論文（ｍｅｃＡ部位において異なる種のみが見出せるであろう）は２．３％と予測可能に低くなっている。共コロニー化が安定した状態であれば、実質的にすべての試料でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの混合物が予想される。これは観察されない。
【０１９３】
別の研究は、あらゆるタイプの入院を提示している６８０人の患者を調べた。入院しているすべての患者をＭＲＳＡについてスクリーニングするのは、当時の国民保健サービスの計画であった。Ｄａｌｌ’Ａｎｔｏｎｉａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  ６１，６２−６７．この評価中に、プロトコルは、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ、および共コロニー化されたＭＲＳＡとＭＳＳＡの患者を発見するように改良された。ＭＳＳＡのみが１１５人の患者（１６．９％）で見つかり、ＭＲＳＡのみが５６人の患者（８．２％）で見つかり、４人の患者（０．５８％）で共コロニー化が発見された。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのマイクロバイオームにおける株排他的ニッチの見解を再び支持する。それは、あるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株が別の黄色ブドウ球菌株の確立を防ぐことができるという概念を支持する。結果は、以前に常在するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株による１つのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株のコロニー化に対して有意な防御効果があることを示す帰無仮説によって予測されるように、共コロニー化保菌者の割合が低いことを示唆した。統計的有意性はｐ＜０．０１であった。ＭＲＳＡコロニー化に対するＭＳＳＡコロニー化の防御効果は７８％（ＣＩ：２９〜９９％）と計算された。
【０１９４】
さらなる研究では、メタドンクリニックでＨＩＶに感染したＩＶドラッグユーザーからなる集団で、一致しないＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ分離株を調べた。１２１のベースラインＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ試料があり、そのうちの４つはＰＦＧＥによって評価された３つのコロニー間で明確な不一致を示した。しかしながら、これらの４つの試料を再評価すると、４つのうちの２つが２回目の評価で一致していることが判明した。最初に一致すると判明した１８個の試料を再評価した後、不一致は見つからなかった。したがって、この集団の１．７〜３．３％が単一の時点で共コロニー化していることが判明した。Ｃｅｓｐｅｄｅｓ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００５；  １９１：４４４−５２。
【０１９５】
コロニー化／再コロニー化の研究の歴史的証拠はまた、非共コロニー化の証拠を示している。この原理は、１９６０年代から１９７０年代にかけて、よく知られている８０／８１から５０２ａまでの「細菌による干渉」の研究と臨床応用で部分的に実証された。共コロニー化の欠如は、１９６０年代と１９７０年代の初期の細菌干渉に関する論文に示されている。これらの論文は、共コロニー化の制御における「競争的排除」も明確に示している。常在株としての８０／８１とドナー株としての５０２Ａの両方の混合培養は観察されず、非共コロニー化がマイクロバイオームの安定した状況として実験的に示された。（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９６３、Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄ  ａｔ  ａｌ．，１９６６、Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３、Ａｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４、Ｂｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９６４、Ｌｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９６７、Ｆｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９６７）。
【０１９６】
「非同等性」と「競争的排除」がなければ、マイクロバイオームのニッチは一貫して同じ種の細菌の複数の株で満たされる。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの純粋な菌株培養物を鼻孔から自然に分離することは、これまでに見られたとしてもまれなイベントである。そのような状態での集団動態は、環境からの偶発的または無作為な曝露によって指示されるように、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの多くの品種の不均一な「スープ」を作成する。宿主がこれまでに接触した株はどれも、他の株のバリアントとの競争や干渉なしにその空間にコロニーを形成する機会がある（ポリクローナルコロニー化）。この実証的な結果がないことは、「競争的排除」を示している。
【０１９７】
しかし、排除の原則はそれほど厳格ではないため、ニッチが占有されると、他のバリアントがその位置を奪うことはできない。これらの観察結果は、堅固な排除原則を示しているが、その空間での支配に対する究極の競争が行われている間に、そのニッチを簡単に共有することにより、外部の種が占有種に挑戦できるようにする。場合によっては、「新しい」株が以前の常在株に打ち勝ち、新しい優勢な常在株を確立することがある。他の場合には、侵入者は反発され、常在株は置き換えの試みを拒絶し、特異な優位性を再確立する。これらのシナリオの両方で、共コロニー化された状態は一時的で不安定であり、低頻度で存在する。
【０１９８】
微生物学システム
対象における病原性微生物感染の再発を永続的かつ安全に防止するための方法および組成物が提供され、病原性微生物の抑制、病原体微生物を永続的に排除するために同じニッチを占有することができる合成微生物による置き換え、およびニッチ内の永続的な常在のための合成微生物の促進を含む。この方法は、上述のように、ＢｉｏＰｌｘ（登録商標）法と呼ばれる。いくつかの実施形態では、対象は、抑制ステップの前に病原性微生物がコロニー化していることが判明している。
【０１９９】
マイクロバイオーム内で首尾よく機能し、永続的な防御結果を生み出すような方法で目的の生物のコロニー化を促進するために、マイクロバイオームの「ルール」を知っている必要があり、これは次のセクションで詳述する。
【０２００】
非共コロニー化モデルは、コンテキストを提供し、標的製品の特性を確立するために開発された。本発明の技術の理論的根拠は、微生物学のパラダイム（バイオーム／生態系／ニッチ）、および特定の永続的で検証可能な特性を持つマイクロバイオームにある。重要な発見可能な指標は、脱コロニー化、試験、およびその他の関連する条件の詳細によって変更された文献の共コロニー化統計に基づいており、その後に実施例１の臨床試験からの直接観察が続く。
【０２０１】
対象の皮膚のマイクロバイオームは実体であり、永続的に識別可能なものである。１０，０００種を超える微生物が皮膚のマイクロバイオームを構成している。皮膚バイオームは、生物のコミュニティとそれらの環境との相互作用によって形成されるシステムまたは相互接続された要素の群として定義される可能性のある生態系である。皮膚のマイクロバイオームの生態系には、「健康」または「正常」な基礎状態がある。バイオームは「健康」または「病気」（腸内毒素症）である可能性があり、病原性微生物が侵入する可能性がある−換言すると、マイクロバイオームはＭＲＳＡなどの「悪いバグ」が侵入する可能性がある−望ましくない生物またはバリアントによって感染または汚染される可能性もある（腸内毒素症）。腸内毒素症は、マイクロバイオームの障害など、身体の表面または内部の微生物の不均衡または不適応を表す用語である。
【０２０２】
皮膚のマイクロバイオームは、宿主とバイオームのコンポーネント全ての間の関係の膨大な組み合わせのウェブによって作成される構造を有する。マイクロバイオーム、またはバイオームは、動的に構造化された複雑なシステムであり、「弾力的な回復力の」生態系である。
皮膚のマイクロバイオームは、動的であるが永続的な構造を有する−たとえば、大量の細胞死（例えば、洗浄、エタノールの使用、手指消毒剤など）の条件下でも、バイオームは同様の形で再生する。
【０２０３】
回復力
ヒトのマイクロバイオームは、回復力の質を有し、これは、穏やかな混乱が、種の混合と濃度の以前に確立されたベースラインに向かって再補正する傾向があることを意味する。しかしながら、各ニッチのメンバーは、急性の外部破壊イベント（すなわち、抗菌薬や消毒剤の使用）の結果として、または遅い競争者の置き換えとして、その安定した混合物の中で自分の場所に挑戦することができる。
【０２０４】
生態学では、回復力とは、損傷に抵抗し、迅速に回復することにより、混乱または撹乱に応答する生態系の能力である。回復力とは、生態系の安定性と、障害を許容し、それ自体を回復する能力を指す。
【０２０５】
文献では、回復力の主な数学的定義は、動的システム理論に基づいており、より具体的にはアトラクタとアトラクションの流域に基づく。ヒトのマイクロバイオームは、複数の流域の複雑なシステムのように多くの方法で動作する。それは状態または流域を変更するが、回復力はその状態を安定させる。Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ｉｎ：  Ｄｅｆｆｕａｎｔ  Ｇ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｎ．（ｅｄｓ）Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ｐｐ．１５−３６．
【０２０６】
マイクロバイオームは、複数のアトラクタの複雑なシステムのようにさまざまな方法で動作する−その状態または流域を変更できるが、そのアトラクタに関連付けられた回復力によってその状態が安定する。
【０２０７】
生態学的回復力とは、システムが障害を吸収し、本質的に同じ機能、構造、同一性、およびフィードバックを維持するために変更を受けながら再編成する能力と定義される。Ｍｉｔｒａ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｓｃｉｅｎｔ．Ｒｅｐ．，５，１−１２．
【０２０８】
「競争的排除原則」は、完全な競争者が存在することはできないと規定している。「不平等の公理」は、現実の世界では２つのものやプロセスが正確に等しいことはないと述べている。Ｈａｒｄｉｎ，１９６０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．１３１，１２９２−  １２９７，ｐ．１２９２．ハーディンの「不平等の公理」と競争的排除原則に基づいて、長期的な耐久性は類似バリアントの置換によってのみ達成されるべきであるが、種の置換に関しては利用可能ではないであろう。たとえば、ＭＲＳＡとＭＳＳＡは短期的に共コロニー化することができる−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの他のバリアントが一過性に共コロニー化するのと同様である。６８０人の患者があらゆる種類の入院を示し、入院しているすべての患者をＭＲＳＡについてスクリーニングした研究が開示されている、Ｄａｌｌ’Ａｎｔｏｎｉａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  ６１，６２−６７を参照されたい。この評価中に、プロトコルは、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ、および共コロニー化されたＭＲＳＡとＭＳＳＡの患者を発見するように改良された。ＭＳＳＡのみが１１５人の患者（１６．９％）で見つかり、ＭＲＳＡのみが５６人の患者（８．２％）で見つかり、４人の患者（０．５８％）で共コロニー化が発見された。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのマイクロバイオームにおける株排他的ニッチの見解を再び支持する。それは、あるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株が別の黄色ブドウ球菌株の確立を防ぐことができるという概念を支持する。
【０２０９】
回復力は、既存の（ＭＲＳＡで汚染された）バイオームがそれ自体を保護しようとするため、再発（観察された自然現象）を引き起こす可能性がある。
【０２１０】
しかしながら、回復力はまた、本明細書に提供される方法および組成物によって示されるように、ＭＲＳＡ再発を防止することができる。対象においてコロニー化したＭＲＳＡ（「悪いバグ」）などの病原微生物を抑制し、同種の安全な合成微生物（「良いバグ」）に置き換えることにより、「良いバグ」が「悪いバグ」の再発を永続的に防止する（ＭＲＳＡの再侵入を防止する）ことが確立されている。
【０２１１】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの保菌者と５０２ａ株との置き換えで、耐久性のある永続的な置換を作成する回復力の歴史的な例が見られる。Ａｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １２９（６）ｐｐ．７２０−７２４は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの保菌者における細菌の干渉を研究した。保菌者は抗生物質と抗菌石鹸で処理され、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ株を接種された。良好な５０２ａのコロニー化を得るには完全な脱コロニー化が必要であることがわかった。７日目は１００％の効果を示したが、２３日目にはこの効果は６０〜８０％まで低下した。十分に脱コロニー化された対象の持続性データは２３週間で７３％であった。したがって、長期的な永続性は、類似したバリアントの置換によってのみ達成される。共生マイクロフローラ（通常のマイクロバイオーム、固有の微生物叢）は再コロニー化の動態を助けることができるが、それらは類似したバリアントの永続性要件を満たしていない。本発明者らは、「置き換え」または「排除」されるべき生物または病原体（同じ種）の「受動的」バージョンを取得する方法を設計した。
【０２１２】
全体的な混乱がない場合の成人の微生物生態系の相対的安定性が示唆されており、人間のコミュニティの長期安定性は慣性ではなく、動的システム内の復元力の作用によって維持される。Ｒｅｌｍａｎ，Ｄ．Ａ．，２０１２，Ｎｕｔｒ  Ｒｅｖ．，７０（Ｓｕｐｐｌ  １）：  Ｓ２−Ｓ９．
【０２１３】
機能的回復力は微生物群集の固有の特性であり、環境変動に応じた状態変化が微生物群集の機能的回復力を促進する重要なメカニズムである可能性があることが示唆されている。Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６，１２９８．Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、すべての微生物群集に適用できる統合された概念を求めて、工学と生態学的回復力を比較し、回復力は、内生的な状態ではなく、混乱後にシステムレベルの機能と環境との相互作用を回復する複雑な適応システムの固有の特性であると主張して、それらを調和させた。
【０２１４】
したがって、バイオーム生態系には、動的であるが「安定した弾塑性平衡」がある。バイオームを混乱させたら、平衡に戻るように「試行」する。バイオーム生態系は常に平衡な「基礎状態」にある。ストレスまたは大量の細胞死の条件下（例えば、洗浄、エタノールの使用、手指消毒剤など）でさえ、バイオームは通常同様の形で再生されることが観察されている。
【０２１５】
マイクロバイオームの生態系には、構造と内部および外部の相互作用によって定義される「ニッチ」がある。バイオーム構造の１つの「事実」または「原理」は、関係の構造によって定義／許可されるように、異なる生物がバイオーム内の異なる「ニッチ」を占有することである。生態学的な「ニッチ」とは、その環境内での種の役割と位置であり、それがどのようにして食糧と避難所の必要性を満たすか、どのように生き残るか、そしてどのようにそれを再生産するかというものである。種のニッチには、その環境の生物的および非生物的要因との相互作用のすべてが含まれる。バイオーム「ニッチ」には、例えば、ｐＨ、温度、浸透圧、モル浸透圧濃度、酸素レベル、栄養素濃度、血中濃度、血漿中濃度、血清中濃度、電解質濃度など、特定の環境要因や条件がある。
【０２１６】
関係構造で定義／許可されているとおり、異なる生物はバイオーム内の異なる「ニッチ」を占有する。バイオーム生態系の永続性のある特徴としてのニッチ。各ニッチには、「ハッチンソンニッチ」のコンテキストで説明される、仮想形状または形状を反映する「フットプリント」である境界条件がある。
【０２１７】
ハッチンソンのニッチはｎ次元のハイパーボリュームであり、ここで次元は環境条件とリソースであり、個体または種が「その」生き方を実践するための要件、より詳細には、その集団が存続するための要件を定義する。「ハイパーボリューム」は、生物が利用できる（特に生物が使用する）資源（たとえば、光、栄養素、構造など）の多次元空間を定義し、「検討中のもの以外のすべての種は座標系の一部とみなされる」。
【０２１８】
ニッチは、単一の種が占有する生態系の非常に特有のセグメントである。すべての点で同一の２つの種はない（すなわち、ハーディンの「不平等の公理」）という仮定と競争的排除の原則では、いくつかの資源または適応次元が、各種に固有のニッチを提供する。
【０２１９】
ニッチは排他的である。各生物はそのニッチについて類似の生物と競争し、成功した生物がそのニッチを満たす。一方が長い時間をかけて他方を打ち負かすので、２つの生物は同じニッチを満たすことがない／できない。したがって、長期間にわたって同じバイオームに２つの生物が共存するということは、それらが同じニッチを満たすことができないことを意味する。
【０２２０】
ニッチが空になると、他の生物がその位置を満たすことができる。これは、ある種が別の種と同じフットプリントを持たないため、ある種が別の種と同じニッチを満たすことができないためである。置き換えを成功させるには、同じ生物（たとえば、同じ種または類似のバリアント）を使用して、ニッチ内を満たすか永続的に置き換える必要がある。部分的な競争は一時的なコロニー化／感染の形で存在し、観察可能な現象であることが認識されている。
【０２２１】
単一のニッチの部分的な競争が発生する可能性がある。ある生物は、部分的な競争によって別の生物の「ニッチ幅」を「狭める」ことができる。これは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ対Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの場合に当てはまる可能性がある。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、十分に高い濃度で使用すると、前もって形成されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのバイオフィルムを分解できるセリンプロテアーゼを分泌する共生細菌である。Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９５（８）１６４５−１６５５．しかしながら、有毒な表現型の発現の担持者としての生物（ある部位での適用によって一時的に大量に過負荷になる）と、病原体を狭めるか、または競争するニッチの持続性のとしての生物との間には、重要な違いがある。
【０２２２】
種間共コロニー化は、生態学的ニッチを永続的に満たしてブロックする能力とは異なる現象である。たとえば、Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３は、最も一般的な市中感染メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＣＡ−ＭＲＳＡ）であるＵＳＡ３００の増殖を阻害できる皮膚共生細菌であるＣｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ（Ｃ．ａｃｎｅｓ）によるグリセロールの発酵による短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の形成を示している。Ｓｈｕは、嫌気性条件下でＣ．ａｃｎｅｓによって産生されたＳＣＦＡが高濃度でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの増殖を阻害することを示している。Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（２）：  ｅ５５３８０．しかしながら、これらの細菌およびＣ．アクネスのこの発酵能力は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの病原性を効果的に根絶または減少させることなく、正常なヒト皮膚バイオームにすでに存在している。これらの基質の過剰生理的適用がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのコロニー化または疾患の発生率の減少という目標を達成すると信じる理由はない。
【０２２３】
脱コロニー化／再コロニー化
対象における望ましくない微生物の病原性感染の再発を防止または低減するための方法であって、（ｉ）対象の少なくとも１つの部位で望ましくない微生物を抑制（脱コロニー化）し、その部位から望ましくない微生物の存在を低減または排除するステップと、（ｉｉ）望ましくない微生物と同じ属および種を有する合成の第２の微生物を少なくとも１つの部位で対象に投与することによって、望ましくない微生物を置き換えるステップと、を含む方法が提供される。任意選択的に、方法は、（ｉｉｉ）例えば、投与部位での合成微生物のコロニー化を促進することをさらに含む。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、望ましくない微生物は病原性微生物であり、抑制する（Ｓ）という用語は、対象の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上の部位で病原微生物を抑制、低減または排除するプロセスを指す。例えば、望ましくない微生物は、鼻、粘膜、および／または皮膚の脱コロニー化プロトコルに供され得る。
【０２２５】
置き換える（Ｒ）という用語は、病原性微生物を、良性であり、薬物感受性であり、および／または対象において全身性または病原性感染を引き起こすことができない合成微生物で置き換えることを指す。置き換え微生物は、病原微生物と同じ種の分子改変された合成微生物であってもよい。合成微生物は、病原微生物と同じ種、異なる株の分子改変微生物であってよく、その結果、合成微生物は、対象の部位にコロニー化することができるが、対象に全身感染を引き起こすことができない。病原微生物の空いたニッチを満たすことにより、合成微生物は、対象における病原微生物による再コロニー形成を排除し、それにより病原感染の再発を低減または排除することができる。
【０２２６】
促進（Ｐ）という用語は、合成微生物を含む新しいバイオームを促進および支持するために、例えば、プレバイオティクスおよびバイオーム管理を採用することにより、例えば、バイオームモジュレーターを採用することにより、対象における合成微生物の置換を促進するための方法および組成物を指す。
【０２２７】
これらの方法は、特定の病状（例えば、ＭＲＳＡ）に対処するために開発された特別に設計されたプロトコルによる、プラットフォーム技術（ＳＲＰ）を広く定義する。Ｓ、Ｒ、およびＰのプロセスが適切に選択されている場合−特定のバイオームニッチを開いてから満たして維持する場合−病原性コロニー形成を撃退できる「永続的な」持続性のバイオームが作成される。
【０２２８】
対象における病原性微生物の全身感染の再発または可能性を減少させるための方法であって、対象上の病原性微生物を抑制して、病原性微生物の検出可能な存在を大幅に低減または排除することと、合成微生物を対象に投与することにより病原性微生物を置き換えることであって、合成微生物が、（１）病原性微生物と同じ遺伝的背景または属および種を有すること、および／または（２）置き換え後少なくとも６０日間、対象に永続的な検出可能な存在を示すことによって証明されるように、病原性微生物と同じニッチを占有することができる、置き換えることと、を含む、方法が提供される。方法は、対象の少なくとも１つの部位での合成微生物のコロニー化を促進することを含んでもよい。場合によっては、対象は病原性微生物がコロニー化していることが判明していてもよい。
【０２２９】
しばしば、対象への病原性微生物による全身感染の前に、対象における病原性微生物のコロニー形成が起こる。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ菌血症の症例のかなりの割合は、それらが鼻粘膜のコロニーに由来する可能性があるため、内因性起源であると思われる。たとえば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ菌血症の１つの多施設研究では、血液分離株は２１９人の患者のうち１８０人（８２．２％）の前鼻孔からの分離株と同じであった。２番目の研究では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの鼻でのコロニー化があった１２７８人の患者のうち１４人が、その後Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ菌血症を発症した。これら１４人の患者のうち１２人（８６％）で、鼻孔から得られた分離株は、１日から１４か月後に血液から得られた分離株とクローン的に同一であった。ｖｏｎ  Ｅｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＮＥＪＭ，ｖｏｌ．３４４，Ｎｏ．１，１１−１６を参照されたい。別の研究では、非保菌者と比較して、鼻腔保菌者でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ菌血症の相対リスクが複数倍に増加し、侵襲性分離株と以前に発見されたコロニー化株との８０％の一致が報告された。Ｗｅｒｔｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ２００４；  ３６４：７０３−７０５．
【０２３０】
いくつかの実施形態では、対象は、全身感染の前に微生物の病原性株がコロニー化していることが判明している。他の実施形態では、対象は、院内（病院感染）株または市中感染の病原微生物の株によってコロニー形成または感染している可能性がある。
【０２３１】
病原性微生物は、野生型微生物、および／またはコロニー化し得るか、または対象の少なくとも１つの部位に検出可能に存在し得る病原性微生物であり得る。部位は、対象の真皮または粘膜部位であり得る。コロニー形成の１つまたは複数の部位には、皮膚および軟部組織が含まれ、鼻孔、喉、会陰、鼠径部、膣、鼻、鼠径部、直腸周囲、指の帯、額、咽頭、腋窩、手、胸、腹部、頭、および／または足趾の間が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３２】
病原性微生物は、薬剤耐性微生物であり得る。疾病管理センター（ＣＤＣ）は最近、米国に対する薬物耐性の脅威の上位１８件をまとめたレポートを公開した。ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／  ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ／  ｂｉｇｇｅｓｔ＿ｔｈｒｅａｔｓを参照されたい。いくつかの実施形態では、望ましくない微生物は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、フルコナゾール耐性カンジダ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、薬剤耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、薬剤耐性結核、エリスロマイシン耐性グループＡ連鎖球菌、およびクリンダマイシン耐性グループＢ連鎖球菌から選択される。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、病原性微生物はＭＲＳＡである。
【０２３４】
合成微生物は、（ａ）抑制後の望ましくない微生物を永続的に排除するために、対象の少なくとも１つの部位の生態学的ニッチを満たすことができなければならず、かつ（ｂ）対象の少なくとも１つの部位の正常な生理学的条件と比較して環境の状態の変化によって活性化（誘導）される第１のプロモーターを含む第１の調節領域に作動可能に連結された第１の細胞死遺伝子を含む少なくとも１つの分子改変を有するべきである。
【０２３５】
合成微生物は、ニッチを満たす能力を高め、対象の少なくとも１つの部位の望ましくない微生物を永続的に排除するために、望ましくない微生物と同じ属および種であってよい。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、本開示は、病原体ではなく、状態の変化、例えば、血液または血清への曝露時に対象に感染する能力がないため、偶発的病原体にはなり得ない合成微生物を提供する。合成微生物は、対象の少なくとも１つの部位での正常な生理学的条件と比較して環境の状態の変化によって活性化（誘導）される第１のプロモーターを含む第１の調節領域に作動可能に連結された第１の細胞死遺伝子を含む少なくとも１つの分子改変を含む。例えば、対象の部位が真皮または粘膜の部位である場合、血液または血清への曝露は状態の変化であり、合成微生物の細胞死をもたらす。例えば、合成微生物の平均細胞死は、状態の変化後、６時間、５時間、４時間、２時間、９０分、６０分、４５分、３０分、２０分、１５分、１０分、５分、２分、または１分以内に発生し得る。状態の変化は、次の状態のうちの１つ以上の、対象の少なくとも１つの部位における状態からの変化であり得る：ｐＨ、温度、浸透圧、モル浸透圧濃度、酸素レベル、栄養素濃度、血中濃度、血漿中濃度、血清中濃度、および／または電解質濃度。いくつかの実施形態では、状態の変化は、対象の少なくとも１つの部位における正常な生理学的状態と比較して、血液、血清、または血漿のより高い濃度である。
【０２３７】
一実施形態では、病原性微生物はＭＲＳＡである。ＭＲＳＡは黄色ブドウ球菌のバリアント亜種である。ＭＲＳＡ株には通常、ほとんどのベータラクタムおよび他の第一選択の抗生物質による治療に耐性をもたらす代替のペニシリン結合タンパク質の産生を可能にするｍｅｃＡカセットが含まれている。全体（ＭＲＳＡを含む）としてのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、ヒトの総人口の約３０％の通常のマイクロバイオームの一部として存在する。マイクロバイオームの一部として、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、最も一般的には皮膚の表面と前鼻前庭に生息するが、中咽頭深部と消化管、および一部の個体では正常な膣フローラの一部として少量が見られる。
【０２３８】
大多数の個体では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、生態系ニッチを占有するだけで病気を引き起こさない非侵入性の共生細菌のままである。コロニー化の状態は侵襲性疾患のそれよりもはるかに一般的である−一部の研究者はこの比率が１０００対１のオーダーであると推定している。Ｌａｕｐｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ（２００８）１９８：３３６．しかしながら、これらのコロニー化されたそれらの一部では、この細菌は日和見的に、またはそのような株がより効果的に表皮または粘膜組織に介して深い感染を開始する層に侵入することを可能にする病原性タンパク質産物をコードする遺伝子カセットの獲得により、侵入傾向の増加の結果として疾患を引き起こす可能性がある。上記の両方の状況で、ｍｅｃＡカセットの存在がこれらの患者の治療選択肢を制限し、菌血症、血管内感染症、および肺炎におけるＭＳＳＡと比較した場合、多くの研究がＭＲＳＡに関連する死亡率の増加を記録している。
【０２３９】
定義
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形も含むことを意図している。
【０２４０】
「および／または」という用語は、関連する列挙された項目の１つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせを指し、包含する。
【０２４１】
本明細書で使用される場合、「含む」および／または「含むこと」という用語は、述べられた特徴、整数、ステップ、操作、要素、および／またはコンポーネントの存在を指定するが、１つ以上のその他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、および／またはコンポーネントの存在または追加を排除しない。特に定義されない限り、説明で使用される技術用語および科学用語を含むすべての用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。用語が矛盾する場合、本明細書が優先する。
【０２４２】
「病原体」または「病原性微生物」という用語は、疾患を引き起こすことができる微生物を指す。病原微生物は、対象の部位にコロニーを形成し、続いて対象に全身感染を引き起こす可能性がある。病原微生物は、通常は他の微生物を制限する細胞および解剖学的障壁を破る遺伝的能力を進化させてきた可能性がある。病原体は本質的に細胞に損傷を与えて、他の微生物との競争を減らし、栄養素の新しい供給源を提供する新しい独自のニッチへのアクセスを強制的に取得する。Ｆａｌｋｏｗ，Ｓｔａｎｌｅｙ，１９９８  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．３，４９５−４９７．病原性微生物は、薬剤耐性微生物であり得る。
【０２４３】
「病原性の」または「病原性」という用語は、微生物が疾患を引き起こす力を表すために使用される。
【０２４４】
「共生」という用語は、ある生物が別の生物に影響を与えることなく別の生物から食物または他の利益を得る共生の形態を指す。共生細菌は通常、通常のフローラの一部である。
【０２４５】
「抑制する」または「脱コロニー化」という用語は、元の望ましくない病原性微生物を様々な手段によって実質的に低減または排除すること（しばしば「脱コロニー化」と呼ばれる）を意味する。実質的に低減するとは、当該技術分野で公知の任意の手段による、元のコロニー形成の９０％、９５％、９８％、９９％を超える、または９９．９％を超える、望ましくない微生物の低減を指す。
【０２４６】
「置き換える」という用語は、元の微生物が通常占有するニッチ（複数可）を「押し出し」て占有する新しい微生物を導入し（しばしば「再コロニー化」と呼ばれる）、これにより元の望ましくない微生物がマイクロバイオーム生態系に戻るのを防止する（しばしば「干渉」および「非共コロニー化」と呼ばれる）ことによって元の病原性微生物を置き換えることを指す。
【０２４７】
「永続的に置き換える」、「永続的に排除する」、「永続的な排除」、または「永続的な置き換え」という用語は、例えば、対象をスワブすることによって検出された、対象への新規微生物の導入から少なくとも３０日間、６０日間、８４日間、１２０日間、１６８日間、または１８０日間の新しい合成微生物の検出可能な存在を指す。いくつかの実施形態では、「永続的に置き換える」、「永続的に排除する」、「永続的な排除」、または「永続的な置き換え」は、例えば、対象をスワブすることによって少なくとも２つの連続する複数の試料期間にわたって検出された、対象への新規の合成微生物の導入から少なくとも３０日間、６０日間、８４日間、１２０日間、１６８日間、または１８０日間の元の微生物の不在を指す。
【０２４８】
「促進する」または「促進すること」という用語は、例えば対象における、新しい生物のコロニー化および生存を増強するための活性または方法を指す。例えば、対象における合成細菌のコロニー化を促進することは、栄養、プレバイオティクス、および／またはプロバイオティクス細菌種を投与することを含み得る。
【０２４９】
「予防」、「予防する」、「予防すること」、「予防的」という用語は、本明細書で使用されるとき、疾患状態または状態の臨床症状の発症前に開始して、疾患状態または状態のそのような臨床症状を予防または軽減するための一連の行動（本開示の化合物または医薬組成物の投与など）を指す。そのような防止および抑制は、有用であるために絶対的である必要はない。
【０２５０】
「治療」、「治療する」および「治療すること」という用語は、本明細書で使用されるとき、疾患状態または状態の臨床症状の発症後に開始して、疾患状態または状態のそのような臨床症状を排除または軽減するための一連の行動（化合物または医薬組成物の投与など）を指す。そのような治療は、有用であるために絶対的である必要はない。
【０２５１】
本明細書で使用される「治療を必要とする」という用語は、患者が治療を必要とするか、または治療から恩恵を受けるであろうと介護者によってなされる判断を指す。この判断は、介護者の専門知識の範囲内にあるさまざまな要因に基づいて行われるが、これには、本開示の方法、化合物、または医薬組成物により治療可能な状態の結果として、患者は病気であるか、または病気になるであろうという知識が含まれる。
【０２５２】
本明細書で使用される「予防を必要とする」という用語は、患者が予防を必要とするか、または予防から恩恵を受けるであろうと介護者によってなされる判断を指す。この判断は、介護者の専門知識の範囲内にあるさまざまな要因に基づいて行われるが、これには、本開示の方法、化合物、または医薬組成物により予防可能な状態の結果として、患者は病気となろうとするか、または病気になるかもしれないという知識が含まれる。
【０２５３】
本明細書で使用される「個体」、「対象」、または「患者」という用語は、鳥類、またはマウス、ノルウェーラット、コットンラット、スナネズミ、テンジクネズミ、ハムスター、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、または霊長類、およびヒトなどの哺乳動物を含む任意の動物を指す。この用語は、オスかメス、またはその両方を指定する場合と、オスまたはメスを除外する場合がある。一態様では、患者は成人である。別の態様では、患者は非新生児の乳児である。別の態様では、患者は、ヒトの幼児、小児、または青年である。いくつかの実施形態では、対象は、全身感染の前に微生物の病原性株がコロニー化していることが見出され、または対象は、院内（病院感染）株または市中感染病原性微生物株でコロニー化または感染している可能性がある。
【０２５４】
「新生児」または新生児という用語は、出生後の最初の２８日間の乳児を指す。「非新生児」という用語は、２８日以上経過した動物を指す。
【０２５５】
本明細書で使用されるとき、「有効量」という用語は、単独または医薬組成物の一部として、疾患状態または状態の任意の症状、態様、または特徴に対して任意の検出可能な正の効果を有することができる薬剤の量を指す。そのような効果が有益であるために絶対的である必要はない。
【０２５６】
「測定可能な平均細胞死」という用語は、定義された条件下で状態の変化がない場合の同じ微生物と比較した、状態の変化を導入した後の所定の期間に決定された微生物の生存率の逆数を指す。生存率は、生きている微生物細胞を定量化するための任意の公知の方法によって決定することができる。たとえば、生存率は、所定の期間で、培養された合成微生物細胞のｃｆｕｓ／ｍＬを計数し、誘導していない合成微生物細胞のｃｆｕｓ／ｍＬを計数し、誘導されたｃｆｕｓ／ｍＬを誘導されていないｃｆｕｓ／ｍＬで割ったもの×１００＝ｘ％生存率として計算できる。測定可能な平均細胞死は、１００％−ｘ％生存率＝ｙ％測定可能な平均細胞死によって決定できる。例えば、生存パーセンテージが５％である場合、測定可能な平均細胞死は１００％−５％＝９５％である。ｃｆｕ、ＯＤ６００、フローサイトメトリー、または他の公知の技術を含む、生きた培養微生物細胞を計数するための任意の方法を用いて生存率を計算することができる。同様に、誘導された合成株は、１００％−生存率＝ｚ％「生存細胞の低減」である「生存率」を決定するために同様の計算を使用して、同じ期間に同じ条件にさらされた野生型標的微生物と比較できる。
【０２５７】
本明細書で使用されるとき、「含むこと」という用語は範囲を限定するものではないため、列挙されているものに加えて追加の要素が可能であると考えられる。この用語は、いかなる場合でも「含むがこれに限定されない」と読むことができる。
【０２５８】
「動物」という用語は、動物界の定義を指す。
【０２５９】
「実質的同一性」または「実質的に同一」という用語は、ヌクレオチドまたはそのフラグメントを指す場合、別のヌクレオチド（またはその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って最適に整列するとき、以下で論じるような、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧａｐなどの配列同一性のよく知られたアルゴリズムで測定するとき、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。参照ヌクレオチド分子と実質的な同一性を有するヌクレオチド分子は、特定の例において、参照ヌクレオチド分子によってコードされるポリペプチドと同一または実質的に同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
【０２６０】
「由来する」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に言及する場合、それぞれ隣接する参照ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の少なくとも５０％を有する改変された配列を指し、改変された配列は、状態の変化に応答した上方制御もしくは下方制御、またはナノファクトリー製品、または実質的に同様の配列、アンチセンスＲＮＡ抗毒素を転写する能力、または望ましくない微生物からの遺伝物質の遺伝子水平伝播を防止または低減する能力を含む、合成微生物にプロモーター、細胞死遺伝子、抗毒素遺伝子、病原性ブロック、またはナノファクトリーなどの遺伝要素の参照配列として類似の望ましい属性を示すことを引き起こす。ヌクレオチド配列に関して「由来する」という用語は、参照ヌクレオチド配列によってコードされるものと実質的に同様のアミノ酸配列を発現するように特定の微生物のためにコドン最適化された改変配列も含む。微生物に言及する場合、「由来する」という用語は、合成微生物を得るために分子改変を受ける標的微生物を指す。
【０２６１】
ポリペプチドに適用される「実質的な類似性」または「実質的に類似した」という用語は、デフォルトのギャップ重みを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインされた２つのペプチドまたはタンパク質配列が、少なくとも９５％の配列同一性、よりさらに好ましくは、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【０２６２】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、１つのアミノ酸残基が、電荷または疎水性などの類似の化学的性質を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されることを指す。一般に、保存的アミノ酸置換は、例えば毒素または抗毒素タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないであろう。同様の化学的性質を持つ側鎖を有するアミノ酸の群の例には以下が含まれる：（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）硫黄含有側鎖はシステインとメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換の群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【０２６３】
ポリペプチド配列は、デフォルトまたは推奨パラメーターを使用する、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦＡＳＴＡを使用して比較できる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリおよび検索配列の間の最良の重複の領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １３２：１８５−２１９（２０００）を参照されたい）。本開示の配列を異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較するときの別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用するコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−４１０（１９９０）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３３８９−４０２（１９９７）を参照されたい。
【０２６４】
別途示されない限り、本明細書で提供されるヌクレオチド配列は、５’−３’方向で示されている。
【０２６５】
すべての代名詞は、最も広い意味を与えられることを意図している。特に明記しない限り、女性代名詞は男性を含み、男性代名詞は女性を含み、単数代名詞は複数を含み、複数代名詞は単数を含む。
【０２６６】
「全身投与」という用語は、全身が影響を受けるような循環系への投与経路を指す。全身投与は、経腸投与（胃腸管を介した吸収、経口投与）または非経口投与（例えば、注射、注入、または埋め込み）によって行うことができる。
【０２６７】
「局所投与」という用語は、効果の場所に関係なく、身体の局所領域または身体部分の表面への適用を指す。局所投与の典型的な部位には、皮膚または粘膜上の部位が含まれる。いくつかの実施形態では、局所投与経路には、薬物または組成物の経腸投与が含まれる。
【０２６８】
「望ましくない微生物」という用語は、病原性微生物、薬剤耐性微生物、抗生物質耐性微生物、刺激を引き起こす微生物、悪臭を引き起こす微生物であってよく、かつ／または望ましくない病原性因子を含む微生物であってよい微生物を指す。
【０２６９】
「合成微生物」という用語は、非ネイティブ属性を付与する少なくとも１つの要素を含むように任意の手段によって改変された単離された微生物を指す。例えば、合成微生物は、非ネイティブ属性を組み込むために、遺伝物質の付加、欠失、および／または改変を含む分子改変を含むように操作されてもよい。いくつかの実施形態では、合成微生物は栄養要求性ではない。
【０２７０】
微生物の「検出可能な存在」という用語は、当該技術分野で公知の任意の方法による、微生物の属、種、および／または株の試料における確認された陽性検出を指す。確認は、熟練した開業医によるおよび／または方法を繰り返すことによる陽性の試験解釈であり得る。
【０２７１】
本明細書で使用されるとき、「マイクロバイオーム」または「マイクロバイオームの」または「微生物叢」という用語は、微生物生態系を指す。これらの生態系は、すべての動物および植物に見られる共生、共生および病原性微生物のコミュニティである。
【０２７２】
本明細書で使用される「微生物」という用語は、顕微鏡を用いてのみ見ることができ、典型的には単一の細胞のみからなる生物を指す。微生物には、細菌、原生動物、真菌が含まれる。
【０２７３】
本明細書で使用されるとき、「ニッチ」および「ニッチ状態」という用語は、特定の種の微生物に必要とされる環境的および栄養的要件の生態学的アレイを指す。種のニッチの値の定義は、その種が物理的に占有できる特定のバイオーム内の場所を定義し、想定し得る微生物の競争者を定義する。
【０２７４】
本明細書で使用されるとき、「コロニー化」という用語は、個体に疾患を引き起こすことなく、体表面、例えば、真皮または粘膜表面上の微生物の持続的な検出可能な存在を指す。
【０２７５】
本明細書で使用されるとき、「共コロニー化」という用語は、２つ以上の株、または同じ種の微生物内のバリアントによる対象の部位におけるニッチの同時のコロニー化を指す。例えば、「共コロニー化」という用語は、同時にかつ非一時的に同じニッチを占有する２つ以上の株またはバリアントを指す場合がある。非一過性という用語は、少なくとも２週間離れた対象から得られた多数の試料における２つ以上のその後の時点での経時的な対象の部位における株またはバリアントの陽性同定を指す。
【０２７６】
本明細書で使用されるとき、「細菌置き換え」または「非共コロニー化」という用語は、１つの種の１つのバリアント／株のみが、いつでもバイオーム内の任意の特定のニッチを占有することができるという原理を指す。
【０２７７】
本明細書で使用されるとき、「キルスイッチ」または「ＫＳ」という用語は、合成微生物の意図的な分子改変を指し、分子改変は、誘導性プロモーター、遺伝子エレメントまたはカセットを含む調節領域に作動可能に連結された細胞死遺伝子を含み、微生物の環境状態の変化などの特定の状態変化に応答したキルスイッチにおける細胞死遺伝子の誘導された発現は、微生物の細胞死、増殖の停止、または複製不能を引き起こす。
例えば、キルスイッチを含む合成微生物において、誘導可能な第１のプロモーターは、血液、血清、血漿、および／またはヘムの存在によって活性化され得、作動可能に結合する細胞死遺伝子の上方制御および転写／発現は、微生物の細胞死または微生物の増殖の停止により、合成微生物の安全性を向上させる。
【０２７８】
「細胞死遺伝子」という用語は、誘導されると、細胞が複製を停止するか、細胞の調節機構を十分に変化させて細胞生存率を永久に破壊するか、老化を誘導するか、または細胞の遺伝的またはプロテオミクスシステムに致命的な変化を誘導する状態を細胞に引き起こす遺伝子を指す。例えば、細胞死遺伝子は、毒素タンパク質または毒素ペプチドをコードする毒素遺伝子であってよい。
【０２７９】
「抗毒素遺伝子」という用語は、抗毒素ＲＮＡアンチセンス分子または抗毒素タンパク質をコードする遺伝子、または細胞死遺伝子またはそれによってコードされる産物に特異的な別の抗毒素分子を指す。
【０２８０】
「病原性ブロック」または「Ｖブロック」という用語は、微生物が他の株または種から外来ＤＮＡを受け入れる能力が低下し、外因性の病原性または抗生物質耐性遺伝子を獲得する能力が低下した微生物を効果的にもたらす微生物の分子改変を指す。
【０２８１】
本明細書で使用されるとき、「ナノファクトリー」という用語は、生成物−一次タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸もしくは核酸または有益な効果へのこれらの改変の二次生成物のいずれか−の生成をもたらす微生物の分子改変を指す。
【０２８２】
本明細書で使用されるとき、「毒素タンパク質」または「毒素ペプチド」という用語は、微生物がコロニーを形成する対象に有害な影響を引き起こさずに微生物に有害な影響を引き起こすのに有効な量で合成微生物内で内部的に生成される物質を指す。
【０２８３】
本明細書で使用されるとき、「分子改変」または「分子的に操作された」という用語は、当該技術分野で公知の任意の遺伝子編集方法を使用する微生物の遺伝子の意図的な改変を指し、本明細書で以下に記載されるような組換えＤＮＡ技術、ＮｇＡｇｏ、ｍｉｎｉ−Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃ２ｃ２、Ｔａｒｇｅｔ−ＡＩＤ、ラムダレッド、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、または当該技術分野で公知のファージ技術の使用を含むがこれらに限定されない。ＤＮＡは、例えば、調節領域、プロモーター、毒素遺伝子、抗毒素遺伝子、または他のドメインなどの１つ以上の要素を適切な構成に配置するため、またはコドンを導入するために、コドンを削除するために、コドンを最適化するために、システイン残基を作成するために、アミノ酸の改変、付加、欠失などのために、化学的または分子生物学技術を使用して、シークエンシングおよび操作することができる。分子改変には、たとえば、プラスミドの使用、遺伝子挿入、遺伝子ノックアウトによる望ましくない遺伝子の切り出しまたは削除、コーディングフレームを破壊するために塩基対を追加または削除することによるフレームシフト、外因性サイレンシング、例えば、ＤＮＡエンコーディングに埋め込まれている可能性がある誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターを使用することによる、例えば、ＲＮＡアンチセンス抗毒素、たとえばガイドＲＮＡを使用入ってくる病原性遺伝子を消化するＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９または他の消化のための編集タンパク質の生産、たとえば誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターに連結している、たとえば制限修飾／メチル化システム、入ってくる病原性遺伝子を認識して破壊し、遺伝子水平伝播に対する耐性を高めることなどが含まれ得る。分子改変（例えば、キルスイッチ、発現クランプ、および／またはｖ−ブロック）は、改変を合成微生物のゲノムに挿入することにより、合成微生物に永続的に組み込むことができる。
【０２８４】
合成微生物は、例えばナノファクトリー生成の効果の持続時間を調整するために、細菌ゲノムまたはプラスミドに直接組み込むことができる追加の分子改変（例えば、ナノファクトリー）をさらに含むことができ、短期（細菌種の非複製プラスミドを使用）から中期（嗜癖依存（ａｄｄｉｃｔｉｏｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ）なしの複製プラスミドを使用）まで、長期（直接細菌ゲノム操作を使用）までの範囲であり得る。
【０２８５】
分子改変は、宿主マイクロバイオームに永続的に組み込まれることが望まれる非ネイティブ属性を付与し得、マイクロバイオーム内の生物または宿主マイクロバイオーム全体に安全性または機能性を提供し得、キルスイッチ（複数可）または他の制御機能を含む強化された安全性特性を提供し得る。いくつかの実施形態では、そのように埋め込まれた安全性属性は、微生物または宿主マイクロバイオーム全体の状態または状態の変化に応答することができる。
【０２８６】
分子改変は、１つ以上、２つ以上、５つ以上、１０以上、３０以上、または１００以上のコピー、または１つ以下、３つ以下、５つ以下、１０以下、３０以下、または１００以下のコピーで合成微生物に組み込むことができる。
【０２８７】
本明細書で使用されるとき、「再発」という用語は、脱コロニーされた微生物による同じニッチの再コロニー化を指す。
【０２８８】
「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症もなくヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した化合物、担体、賦形剤、組成物、および／または剤形を指す。
【０２８９】
「薬学的に許容される担体」という用語は、それとともに投与される合成微生物の完全性および所望の特性を保持しながら、治療される対象にとって生理学的に許容される担体を指す。例示的な薬学的に許容される担体には、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水が含まれる。他の生理学的に許容される担体およびそれらの製剤は、本明細書で提供されるか、または当業者に公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａに記載されている。
【０２９０】
本明細書で使用される数値範囲は、具体的に開示されているか否かにかかわらず、その範囲内に含まれるすべての数および数のサブセットを含むことが意図されている。さらに、これらの数値範囲は、その範囲内の任意の数または数のサブセットに向けられた請求項のサポートを提供するものとして解釈されるべきである。たとえば、１〜１０までの開示は、２〜８、３〜７、５〜６、１〜９、３．６〜４．６、３．５〜９．９などの範囲をサポートすると解釈される。
【０２９１】
本明細書で引用されたすべての特許、特許公開、および査読済み刊行物（すなわち、「参考文献」）は、各個別の参照が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本開示と組み込まれた参考文献との間に矛盾がある場合、本開示が優先する。
【０２９２】
別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用されるとき、「約１００」という表現は、９９および１０１ならびにその間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【０２９３】
本明細書において記載されているものと類似または同等の任意の方法および物質は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および物質はここに記載される。
【０２９４】
ベクターと標的微生物
また、ポリヌクレオチド分子を含むベクター、およびそのようなベクターで形質転換された標的細胞も本明細書に記載されている。本明細書に記載されるポリヌクレオチド分子は、目的の増殖宿主に対する、選択マーカーおよび複製起点を含むベクターに結合され得る。標的細胞は、これらのベクターを含むように遺伝子操作され、それによりＲＮＡを転写し、ポリペプチドを発現する。本明細書のベクターは、微生物標的細胞のものなどの適切な転写または翻訳の調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチド分子を含む。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳を制御する適切な配列が含まれる。本明細書に記載のヌクレオチド配列は、本明細書の調節配列が、例えば、ポリヌクレオチドをコードする細胞死遺伝子に作動可能に結合する場合、作動可能に連結される。
【０２９５】
典型的な媒体には、プラスミド、シャトルベクター、バキュロウイルス、不活化アデノウイルスなどが含まれる。本明細書に記載される特定の例では、媒体は、本明細書で議論されるように、改変されたｐＩＭＡＹ、ｐＩＭＡＹｚ、またはｐＫＯＲ組み込みプラスミドであり得る。
【０２９６】
標的微生物は、脱コロニー化後に特定の望ましくない微生物を永続的に置き換える能力を有する任意の微生物から選択され得る。標的微生物は、本明細書に記載の方法により安全性を高めるために後で操作される野生型微生物であってよい。標的微生物は、細菌、真菌、または原生動物の標的微生物から選択され得る。標的微生物は、対象の真皮および／または粘膜ニッチにコロニーを形成することができる株であり得る。標的微生物は、野生型微生物、またはさらなる分子改変に供され得る合成微生物であり得る。標的微生物は、アシネトバクター属、コリネバクテリウム属、キューティバクテリウム属、ブドウ球菌属、ストレプトコッカス属、プロピオン酸菌属、およびシュードモナス属からなる群から選択される属から選択され得る。標的微生物は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｉｓ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからなる群から選択され得る。
【０２９７】
標的微生物は、望ましくない微生物と同じ属および種であり得るが、異なる株であり得る。例えば、望ましくない微生物は、ＭＲＳＡ株などの抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株であり得る。抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株は、真菌感染、粘膜感染、菌血症、および／または心内膜炎に関与していることが知られている病原菌株である可能性がある。望ましくない微生物がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株、例えば、ＭＲＳＡである場合、標的微生物は、例えば、ＲＮ４２２０または５０２ａ株などのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ標的細胞などの単離された株であり得る病原性の低い株であり得る。代替的に、標的細胞は、望ましくない微生物と同じ株であってもよい。別の例において、望ましくない微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ  ｃｏｌｉ株、例えば、尿路病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ  ｃｏｌｉ１型株またはｐ線毛株、例えば、尿路感染症、菌血症、および／または心内膜炎に関与する株である。別の例では、望ましくない株は、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ株、例えば尋常性ニキビ、菌血症、および／または心内膜炎に関与する株である。別の例では、望ましくない微生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ株、例えば、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの心内膜炎、虫歯に関与する株である。
【０２９８】
モデル的な抗生物質感受性標的微生物
標的微生物は、望ましくない微生物と同じ種の抗生物質感受性微生物であり得る。一実施形態では、望ましくない微生物はＭＲＳＡ株であり、置き換え標的微生物は抗生物質感受性のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株である。抗生物質感受性微生物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株５０２ａ（「５０２ａ」）であり得る。５０２ａは、コアグラーゼ陽性、ペニシリン感受性、非ペニシリナーゼ産生ブドウ球菌で、通常はファージ７、４７、５３、５４、および７７によって溶解される。血清型（ｂ）ｃｉ。この株５０２ａはテトラサイクリン（５μｇに耐性があるが、１０μｇのテトラサイクリンに感受性がある）を除くほとんどの抗生物質の低濃度に感受性があるため、異常なディスク抗生物質感受性パターンが５０２ａによって示される。いくつかの実施形態では、５０２ａ株は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ亜種Ａｕｒｅｕｓ  Ｒｏｓｅｎｂａｃｈ  ＡＴＣＣ（登録商標）２７２１７（商標）として商業的に購入され得る。
【０２９９】
残念ながら、抗菌剤感受性の標的微生物でさえ全身感染を引き起こす可能性がある。したがって、本明細書で提供されるように、標的微生物は、安全性を高め、本明細書に記載されるような病原性感染の可能性を低減するために、例えば細胞死遺伝子、ｖ−ブロック、またはナノファクトリーの発現のための誘導性の第１のプロモーターを含む調節配列を組み込むために分子改変を受ける。
【０３００】
標的微生物および／または合成微生物は、（ｉ）望ましくない微生物を脱コロニー化し、対象に標的または合成微生物を投与した後に対象のニッチに永続的にコロニーを形成する能力、および（ｉｉ）投与するステップの後、少なくとも２週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２４週間、少なくとも２６週間、少なくとも３０週間、少なくとも３６週間、少なくとも４２週間、または少なくとも５２週間の期間、対象に望ましくない微生物の再発を防止する能力を含む。
【０３０１】
ＭＲＳＡのための標的微生物の選択
標的微生物の選択は、本明細書に記載されるように、標的微生物を脱コロニー化し、推定標的微生物で置き換えることにより行われ得る。たとえば、望ましくない微生物であるメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）は、世界中で不均衡な量の侵襲性細菌感染の原因である。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのコロニー形成状態は、ほとんどの侵襲性感染に必要な前提条件とみなされる。しかしながら、ＭＲＳＡのコロニー化と感染を軽減する方法として、標準的な消毒レジメンによる脱コロニー化が検討されており、結果はまちまちである。本明細書で提供される一例では、候補の標的微生物として異なるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株による意図的な再コロニー化を使用することによる望ましくない微生物ＭＲＳＡに対する新規の脱コロニー化アプローチの実現可能性と永続性が、効果の持続時間と標準的な脱コロニー化の改善を期待して行われた。実施例１は、合計７６５人の健康な志願者がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓコロニー化についてスクリーニングされた研究を開示している。スクリーニングを受けた集団の全体的なＭＲＳＡ率は８．５％であった。５３人のＭＲＳＡコロニー形成個体のコホートが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ  ＷＴ株ＢｉｏＰｌｘ−０１と標準の脱コロニー化のみの対照群を使用した脱コロニー化／再コロニー化療法の対照研究に参加した。コロニー化状態からのＭＲＳＡ不在の期間、および意図的なＭＳＳＡ再コロニー化の持続を６か月間モニターした。ＭＲＳＡ脱コロニー化プロトコルの有効性部分の対照群（ｎ＝１５）は、４週間の時点で６０％のＭＲＳＡ再発を示した。ＢｉｏＰｌｘ−０１ＷＴププロトコルを使用した試験群（ｎ＝３４）は、８週間の主要評価項目で０％のＭＲＳＡ再発を示し、２６週間までＭＲＳＡ再発の証拠を示さなかった。代わりに、これらの参加者は、ＭＳＳＡによるコロニー化の驚くべき持続性を示し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ  ＢｉｏＰｌｘ−０１ＷＴ菌株製品による２６週間までのコロニー化の継続を示している可能性がある。さらに、脱コロニー化／再コロニー化療法で使用されるリン酸緩衝生理食塩水組成物中のＢｉｏＰｌｘ−０１ＷＴのコンポーネントは、５５人の参加者の別のコホートで皮膚刺激の証拠を示さなかった。したがって、標的株Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ  ＢｉｏＰｌｘ−０１ＷＴの脱コロニー化／再コロニー化プロトコルは、標準的な脱コロニー化よりもＭＲＳＡ株からの脱コロニー化の耐久性が長く、皮膚への悪影響は観察されなかった。
【０３０２】
検出可能な微生物の存在を判定する方法
微生物の属、種、および株の検出可能な存在を決定するために、当該技術分野で知られている任意の方法を使用することができる。方法の概要は、Ａｇｕｉｌｅｒａ−Ａｒｒｅｏｌａ  ＭＧ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：  ａ  Ｂｒｉｅｆ  Ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｓ  Ｃａｓｅ  ｏｆ  Ｓｔｕｄｙ．Ａｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５，７：１に見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０３０３】
細菌の属、種、および／または株の検出可能な存在は、表現型法および／または遺伝子型法によって判定できる。表現型法には、生化学的反応、血清学的反応、抗菌剤に対する感受性、ファージに対する感受性、バクテリオシンに対する感受性、および／または細胞タンパク質のプロファイルが含まれる。生化学反応の一例は、細胞外酵素の検出である。たとえば、ブドウ球菌は、ＤＮＡａｓｅ、プロテイナーゼ、およびリパーゼを含む、多くの異なる細胞外酵素を産生する。Ｇｏｕｌｄ，Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｒｏ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ａｎｄ  ＭＲＳＡ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｓｔｕｄｙ  ｇｒｏｕｐｓ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔ  ２９７；  １０−１６．細胞外酵素の検出のために走化性基質を使用することができる。たとえば、低レベルのＭＲＳＡを含むメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の単離と区別には、ＣＨＲＯＭａｇｅｒ（商標）ＭＲＳＡ発色培地（ＣＨＲＯＭａｇａｒ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用できる。試料は、例えば、鼻、会陰、喉、直腸標本から得られ、濃縮工程を経て得られる可能性がある。寒天プレートが冷蔵されている場合は、接種前に室温まで温めまる。試料をプレートに画線し、続いて好気性条件下で３７℃で１８〜２４時間インキュベートする。コロニーの外観が読み取られ、ＭＲＳＡコロニーはバラ色から藤色に見え、メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）コロニーは抑制され、他の細菌は青色、無色または抑制されたコロニーとして現れる。ＭＲＳＡとしての明確な識別には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとしての最終的な識別がさらに必要である。例えば、ＣＨＲＯＭａｇａｒ（商標）Ｓｔａｐｈ  ａｕｒｅｕｓ発色培地は、Ｓ．ａｕｒｕｅｓが藤色に見え、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓがターコイズブルーに見え、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、およびＥ．ｆａｅｃａｌｉｓが抑制される。グループＢ連鎖球菌（ＧＢＳ）（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の検出には、ＣＨＲＯＭａｇａｒ（商標）ＳｔｒｅｐＢプレートを使用でき、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（グループＢ）は藤色に見え、エンテロコッカス種、およびＥ．ｆａｅｃａｌｉｓはスティールブルー、乳酸桿菌、ロイコノストック属、およびラクトコッカスは淡いピンクに見え、他の微生物は青色、無色、または抑制される。さまざまなカンジダ種の検出には、ＣＨＲＯＭａｇｅｒ（商標）カンジダ発色培地を使用できる。カンジダ種は、表在性の口腔咽頭および泌尿生殖器の感染に関与している。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは依然として主要な種に含まれているが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対して新しい抗真菌剤が効果的に作用したため、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｋｒｕｓａｉ、またはＣ．ｇｌａｂｒａｔａなどの他のタイプが増加している。皮膚、痰、尿、膣標本の試料のサンプリン���と直接ストリーキング、およびプレートへの直接ストリーキングまたは延展、その後の好気的条件での３０〜３７℃での４８時間のインキュベーション、およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓが存在するコロニーの外観に関するプレートの読み取りは緑であり、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓではメタリックブルーであり、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉはピンクとファジーであり、Ｃ．ｋｅｆｙｒとＣ．ｇｌａｂｒａｔａは藤色〜茶色であり、その他の種は白色〜藤色である。
【０３０４】
属と種の同定についての遺伝子型の方法には、ハイブリダイゼーション、プラスミドプロファイル、プラスミド多型の分析、制限酵素消化、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）による反応と分離、リボタイピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびそのバリアント、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ならびに転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ）、または本明細書で説明する方法のいずれかが含まれ得る。
【０３０５】
微生物の同定は、例えば、グラム陰性菌のＤＮＡ配列に注釈を付けるＧａｌｉｌｅｏ（商標）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＡＭＲ）検出ソフトウェア（Ａｒｃ  Ｂｉｏ  ＬＬＣ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ  ａｎｄ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用することで実行できる。
【０３０６】
微生物タイピング法は、対立遺伝子プロファイルを作成するためにいくつかのハウスキーピング遺伝子のＰＣＲ増幅に依存するＭｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｙｐｉｎｇ（ＭＬＳＴ）、ゲノム内の反復配列のＰＣＲ増幅とバンディングパターンの比較を含むＰＣＲ−Ｅｘｔｒａｇｅｎｉｃ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（ｒｅｐ−ＰＣＲ）、任意のプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応であるＡＰ−ＰＣＲ、ゲノムＤＮＡの酵素制限消化、制限断片の結合、選択的増幅が含まれる増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、ゲノムＤＮＡ消化を含むＤＮＡ制限断片（ＲＦＬＰ）の多型、または短い制限断片を生成する制限酵素を含むアンプリコンの多型、任意のヌクレオチド配列の単一のプライマーを用いたゲノムＤＮＡのランダムなセグメントのＰＣＲ増幅からのマーカーＤＮＡフラグメントを使用するランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、多型を可視化して対立遺伝子プロファイルを作成する遺伝子座ＶＴＲのＰＣＲ増幅を含む多遺伝子座タンデムリピート配列分析（ＭＬＶＡ）、またはマクロ制限フラグメントの比較を含むパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を含む遺伝子型法から選択できる。電気泳動のＰＦＧＥ法は、５０ｋｂより大きく、１０Ｍｂまでの長さのフラグメントを分離でき、これは、１００ｂｐ〜５０ｋｂのフラグメントしか分離できない従来の電気泳動では不可能である。ＰＦＧＥのこの能力は、電界の方向を連続的に変更して、ＤＮＡ分子の方向を再配向する多方向性機能によるものであり、したがって、このイベントに加えて、ＤＮＡ分子がアガロースゲルを移動できるように、印加される電気パルスは、持続時間が異なり、分子の再配向と異なるサイズのフラグメントの分離を促進する。１つのＰＦＧＥ装置は、等高線クランプ均一電場（ＣＨＥＦ，ＢｉｏＲａｄ）であり得る。パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）は、その高い識別力のため、ＭＲＳＡタイピングのゴールドスタンダード技術とみなされているが、その手順は複雑で時間がかかる。ｓｐａ遺伝子はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  プロテインＡの細胞壁成分をコードし、多型を示す。配列ベースのｓｐａタイピングは、迅速な試験スクリーニングとして使用できる。Ｎａｒｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ  ２００９  Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００９，２１８，２０７−２１３．
【０３０７】
本明細書では、微生物生態系からの望ましくない微生物を新しい微生物で永続的に置換および置換して、元の望ましくない生物の再発を防ぐために、望ましくない微生物を抑制（脱コロニー化）し、新しい合成微生物で置き換えるための方法および組成物が本明細書で提供される（本明細書ではニッチまたは生態学的干渉と呼ばれる）。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、コロニー形成を防止し、感染を防止し、コロニー形成の再発を低減し、または対象における望ましくない微生物の病原性感染の再発を低減するための方法であって、脱コロニー化することと、野生型標的株と比較して対象に疾患を引き起こす合成微生物の能力を低減する分子改変を含む合成株を投与することを含むが提供され、ここで微生物は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｉｓ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからなる群から選択される。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、対象による伝染、または対象における病原性微生物のコロニー化または感染の再発を防止する方法であって、対象において病原微生物を抑制することと、対象への同じ種、異なる株の良性微生物を含む組成物の局所投与による病原性微生物を置き換えることと、を含む方法が提供される。この方法は、良性微生物のコロニー化を促進することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、良性微生物は、第１のプロモーターを含む第１の調節領域に作動可能に連結された第１の細胞死遺伝子を含む少なくとも１つの分子改変を有する合成微生物であり、第１のプロモーターはヒト血清または血液の存在下で活性化される。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、ヒト対象における真皮または粘膜のコロニー形成の間に活性化されない。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、対象による伝染、または対象におけるメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）のコロニー化または感染の再発を防止する方法であって、対象においてＭＲＳＡを抑制することと、対象への同じ種、異なる株のメチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）を含む組成物の局所投与によるＭＲＳＡを置き換えることと、を含む方法が提供される。この方法は、対象におけるＭＳＳＡのコロニー化を促進することをさらに含み得る。
【０３１１】
対象による伝染、または対象における望ましくない微生物のコロニー化または感染の再発を防止する方法であって、対象において望ましくない微生物を抑制することと、対象への同じ種、異なる株の第２の微生物の投与による望ましくない微生物を置き換えることと、を含む方法が提供される。この方法は、第２の微生物のコロニー化を促進することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、望ましくない微生物は、薬物耐性病原性微生物である。いくつかの実施形態では、第２の微生物は薬物感受性微生物である。いくつかの実施形態では、第２の微生物は合成微生物である。
【０３１２】
抑制／脱コロニー化
望ましくない微生物は、消毒剤、防腐剤、または殺生物性組成物を対象の皮膚または粘膜に直接局所的に適用することにより、例えば、消毒剤、防腐剤、または殺生物剤組成物で対象の患部、任意選択的に患部と隣接領域、または外部もしくは粘膜表面領域の２５％、５０％、７５％、もしくは９０％を超える領域を、スプレー、浸漬、またはコーティングすることにより、抑制または脱コロニー化することができる。いくつかの実施形態では、患部、または追加の表面領域は、空気乾燥させるか、穏やかな熱の下でエアドライヤーで乾燥させるか、または対象に衣服を着せるか包帯をする前に紫外線または日光にさらすようにさせる。一実施形態では、抑制は、対象の患部、および任意選択的に１つ以上の隣接または遠位領域を紫外線で露光することを含む。様々な実施形態では、一般的に使用される任意の消毒剤、防腐剤、または殺生物性組成物を使用することができる。一実施形態では、クロルヘキシジンまたはその薬学的に許容される塩を含む消毒剤が使用される。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、殺菌剤、防腐剤、収斂剤、および／または抗菌剤は、アルコール（エチルアルコール、イソプロピルアルコール）、アルデヒド（グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド放出剤（ノキシチオリン＝オキシメチレンチオ尿素、タウロリン、ヘキサミン、ダントイン）、ｏ−フタルアルデヒド）、アニリド（トリクロカルバン＝ＴＣＣ＝３，４，４’−トリクロルカルバニリド）、ビグアニド（クロルヘキシジン、アレキシジン、高分子ビグアニド（ＭＷ＞３，０００ｇ／ｍｏｌのポリヘキサメチレンビグアニド、バントシル）、ジアミジン（プロパミジン、イセチオン酸プロパミジン、プロパミジン二塩酸塩、ジブロモプロパミジン、イセチオン酸ジブロモプロパミジン）、フェノール（フェンチクロル、ｐ−クロロ−ｍ−キシレノール、クロロキシレノール、ヘキサクロロフェン）、ビスフェノール（トリクロサン、ヘキサクロロフェン）、第４級アンモニウム化合物（セトリミド、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム）、銀化合物（スルファジアジン銀、硝酸銀）、ペルオキシ化合物（過酸化水素、過酢酸）、ヨウ素化合物（ポビドンヨード、ポロキサマーヨード、ヨウ素）、塩素放出剤（次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸、二酸化塩素、ジクロロイソシアヌル酸ナトリウム、クロラミン−Ｔ）、銅化合物（酸化銅）、植物抽出物（メラロイカ属（ティーツリーオイル）、Ｃａｓｓｉａ  ｆｉｓｔｕｌａ  Ｌｉｎｎ、Ｂａｅｋｅａ  ｆｒｕｔｅｓｄｅｎｓ  Ｌ．、Ｍｅｌｉａ  ａｚｅｄａｒａｃｈ  Ｌ．、Ｍｕｎｔｉｎｇｉａ  ｃａｌａｂｕｒａ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  Ｌ、Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ  ａｖｉｃｅｎｎｉｏｉｄｅｓ  Ｇｕｉｌｌ＆Ｐｅｒｒ．、Ｐｈｙｌａｎｔｕｓ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｓ  ｍｕｅｌ．Ｍｕｅｌ−Ａｒｇ．、Ｏｃｉｍｕｍ  ｇｒａｔｉｓｓｉｍｕｍ  Ｌｉｎｎ．、Ａｃａｌｙｐｈａ  ｗｉｌｋｅｓｉａｎａ  Ｍｕｅｌｌ−Ａｒｇ．、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｐｒｕｉｎａｔｕｍ  Ｂｏｉｓｓ．＆Ｂａｌ．、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｏｌｉｍｐｉｃｕｍ  Ｌ．およびＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｓａｂｒｕｍ  Ｌ．、Ｈａｍａｍｅｌｉｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ（アメリカマンサク）、ユーカリ属、ローズマリー属（ローズマリー）、イブキジャコウソウ属（タイム）、イワダレソウ属（オレガノ）、オガルカヤ属（レモングラス）、シナモン属、ゼラニウム属、ラベンデュラ属）、および局所抗生物質化合物（バクテリオシン、ムピロシン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、ゲンタマイシン）からなる群から選択される。
【０３１４】
望ましくない微生物の抑制は、例えば、局所抗生物質の代わりに、またはそれに加えて、光増感剤を使用することによって行うこともできる。たとえば、Ｐｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｓｉｎｇ  Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  Ｉｎｓｔｅａｄ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｔｏ  Ｋｉｌｌ  ＭＲＳＡ，ＧＥＮ  Ｎｅｗｓ  Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ，Ａｕｇｕｓｔ  ２０，２０１８；  ４８３７３は、微生物の増殖を抑制する酸素を活性化するために光を使用する技術を開発した。色素分子などの光増感剤は、光を当てると励起される。光増感剤は、酸素をＭＲＳＡなどの微生物を殺傷する活性酸素種に変換する。光増感剤を濃縮して効力を改善するために、分子光増感剤を封入する両親媒性ポリマーで装飾された貴金属ナノ粒子を含む、水分散性のハイブリッド光増感剤がＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．によって開発された。ハイブリッド光増感剤は、スプレー、ローション、またはクリームの形態で、例えば真皮表面または創傷上で対象に適用され、次いで微生物増殖を低減するために赤色または青色光で照射され得る。
【０３１５】
脱コロニー化組成物は、消毒剤、殺生物剤光増感剤、または消毒化合物と、１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む局所溶液、ローション、または軟膏の形態であってもよい。１つの特定の例では、任意選択的にスプレーの適用範囲をマークするための染料を含む薬学的に許容される担体中にグルコン酸クロルヘキシジン（０．４％）、グリセリン（１０％）を含むエアゾール消毒スプレーが使用される。一実施形態では、抑制するステップは、米国特許第４，５４８，８０７号および／または第４，７１６，０３２号に開示されているスプレー消毒剤を用いて、１つ以上の患部、および任意選択的にトランスポーター１つ以上の周囲の領域への投与を含み、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。消毒スプレーは市販され、例えば、Ｆｉｇｈｔ  Ｂａｃ（登録商標）、Ｄｅｅｐ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｆａｒｍ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，ＣＴである。他の消毒材料には、クロルヘキシジンまたはその塩、例えばグルコン酸クロルヘキシジン、酢酸クロルヘキシジン、および他のジグアニド、エタノール、ＳＤアルコール、イソプロピルアルコール、ｐ−クロロ−ｏ−ベンジルフェノール、ｏ−フェニルフェノール、四級アンモニウム化合物、例えばｎ−アルキル／ジメチルエチルベンジルアンモニウムクロリド／ｎ−アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、セトリミド、メチルベンゼトニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、セタルコニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド、ドファニウムクロリド、ドミフェンブロミド、過酸化物および過マンガン酸塩、例えば過酸化水素溶液、過マンガン酸カリウム溶液、過酸化ベンゾイル、抗菌染料、例えばヘミ硫酸プロフラビン、トリフェニルメタン、ブリリアントグリーン、クリスタルバイオレット、ゲンチアナバイオレット、キノロン誘導体、例えばヒドロキシキノリン硫酸、ヒドロキシキノリン硫酸カリウム、クロルキナルドール、塩化デカリニウム、ジヨードヒドロキシキノリン、ブローの溶液（酢酸アルミニウムの水溶液）、漂白剤溶液、ヨウ素溶液、臭化物溶液が含まれ得る。一般に安全と認められているさまざまな（ＧＲＡＳ）材料を、例えば、食用脂肪形成脂肪酸のモノグリセリドとジグリセリド、モノグリセリドとジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、トリアセチン、アセトオレイン、アセトステアリン、ラクトパルミチン酸グリセリル、ラクトオレイン酸グリセリル、およびオキシステアリンなどであるがこれらに限定されない、グリセリンおよびグリセリドを含む殺菌剤または殺生物剤に使用することができる。
【０３１６】
抑制ステップまたは脱コロニー化は、１〜１０日、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日の期間にわたって、１日１〜３回投与することを含んで実行できる。他の実施形態では、抑制ステップは、２、３、４、５、または６回投与されてもよく、各投与は、６〜４８時間、８〜４０時間、１８〜３６時間、または約２０〜２８時間間隔で行われる。特定の実施形態では、抑制ステップは、１日〜５日、または３日〜４日の連続した日に、１日１回投与される。いくつかの実施形態では、抑制ステップは、抗菌剤の全身投与を含まない。いくつかの実施形態では、抑制ステップは、抗生物質、抗ウイルス剤、または抗真菌剤の全身投与を含まない。他の実施形態では、抑制ステップは、抗菌剤の全身投与を含む。いくつかの実施形態では、抑制ステップは、１つ以上の抗生物質、抗ウイルス剤、または抗真菌剤の全身投与を含み得る。
【０３１７】
置き換える
望ましくない微生物が永続的に合成微生物で置き換えられる方法が提供される。合成微生物は、病原微生物と同じ生態学的ニッチを満たす能力を有し、および／または病原微生物と同じ種、異なる株であり得る。同じ種、異なる株（または同じ株）を使用することにより、病原性微生物の環境ニッチは、良性の合成微生物で満たされるか、永続的に置き換えられる。
【０３１８】
合成微生物
いくつかの実施形態では、望ましくない病原性微生物は合成微生物で置き換えられる。例えば、置き換え株は、望ましくないまたは病原性微生物と同じ種、または望ましくないまたは病原性微生物と同じ株の、分子改変された株である合成微生物であり得る。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、「キルスイッチ」を含む合成微生物が提供され、血液または血清への曝露時に迅速かつ完全な細胞死を示すが、他の環境では正常な代謝およびコロニー形成機能を示す。いくつかの実施形態では、合成微生物は、安定かつ不動のキルスイッチ遺伝子を含む。最小キルスイッチ（ＫＳ）コンポーネントには、血液または血清への曝露に応答して強く活性化されるオペレーター、プロモーター、翻訳シグナルを含む調節領域（ＲＲ）、毒性タンパク質またはＲＮＡを発現するキルスイッチ遺伝子、および転写終結の手段が含まれる。ＫＳの染色体組み込みが好ましい。染色体遺伝子座は、転写的に不活性な領域、例えば、セリル−ｔＲＮＡシンテターゼとアミノ酸トランスポーターとの間の遺伝子間領域（ＩＲ）にあり得る。ここでの挿入は隣接遺伝子の転写には影響しない（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。好ましくは、公知のｓＲＮＡはＩＲに存在しない。他の不活性遺伝子座を選択してもよい。
【０３２０】
キルスイッチを含む合成微生物
特定の実施形態では、病原性微生物は抗菌剤耐性微生物であり、置き換え微生物は病原性微生物と同じ種の合成微生物である。合成微生物は、分子改変された抗生物質感受性微生物であってもよい。
【０３２１】
合成微生物は、誘導可能な第１のプロモーターを含む第１の調節領域に作動可能に連結された第１の細胞死遺伝子を含む１つ以上、２つ以上、または３つ以上の分子改変を含み得る。任意選択的に、合成微生物は、第１のプロモーターを含む第１の調節領域または誘導性の第２のプロモーターを含む第２の調節領域に作動可能に連結された第２の細胞死遺伝子をさらに含む。第１のプロモーター、および必要に応じた第２のプロモーターは、対象の少なくとも１つの部位での通常の生理学的状態と比較して、微生物環境の状態の変化によって活性化（誘導）される。例えば、状態の変化は、ｐＨ、温度、浸透圧、モル浸透圧濃度、酸素レベル、栄養素濃度、血中濃度、血漿中濃度、血清中濃度、および電解質濃度の１つ以上の変化から選択することができる。いくつかの実施形態では、状態の変化は、対象の少なくとも１つの部位における正常な生理学的状態と比較して、血液、血清、または血漿のより高い濃度である。
【０３２２】
特定の一実施形態では、病原微生物はＭＲＳＡであり、置き換え微生物は、分子改変されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓコアグラーゼ陽性株である合成微生物である。本明細書に記載されるように、合成微生物は、分子改変されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ５０２ａであり得る。
【０３２３】
生きているＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを治療プラットフォームとして使用すると、この病原体が循環系にアクセスする場合に深刻な疾患を引き起こす可能性があるため、安全上の懸念が生じる。一実施形態では、合成微生物は、「キルスイッチ」（ＫＳ）および全血または血清への曝露の際に迅速な細菌死を誘導する誘導性プロモーターを含むように分子操作される。キルスイッチは、３つの主要なコンポーネントをコードするＤＮＡからなる可能性がある：ｉ）血液または血漿により強く活性化されるプロモーターおよび他の調節配列を含む「制御領域」、ｉｉ）発現が制御領域によって駆動される毒性のＲＮＡまたはポリペプチド、ｉｉｉ）転写終結因子。これらの要素からなるカセットは、細菌の機能に悪影響を与えることなく、変更が可能な部位（複数可）でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ染色体に組み込まれ得る。
【０３２４】
制御領域の基礎的または「漏出性」の発現が最小化または回避されることが望ましい。たとえば、血液または血清に曝露される前に顕著なｍＲＮＡ産生が発生した場合、その株は製造中または皮膚でのコロニー化中に弱化し、ＫＳを回避またはエスケープする変異を蓄積する可能性がある。これに対処するために、候補者をスクリーニングして、血清中で強く誘導されるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標準的な増殖培地においてｍＲＮＡ発現が非常に低いかまたは検出できないものを見つける。この努力にもかかわらず、不規則な毒素産生を防ぐためにｉｖ）「発現クランプ」をさらに含むことによって制御され得るいくつかの漏出性発現が観察される可能性がある。
【０３２５】
合成微生物への組換えアプローチ
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に結合する細胞死遺伝子と、（ｉｉ）合成微生物の環境における状態の変化によって誘導される第１の誘導性プロモーターを含む第１の調節領域とを含む、少なくとも１つの分子改変（例えば、キルスイッチ）を含む組換えヌクレオチドを含む合成微生物が提供される。合成微生物は、（ｉｉｉ）第１の細胞死遺伝子に特異的な抗毒素遺伝子であって、ここで抗毒素遺伝子は（ｉｖ）に作動可能に結合する、抗毒素遺伝子と、（ｉｖ）真皮もしくは粘膜のコロニー形成時または培地中で活性（例えば、構成的）であり、好ましくは、合成微生物の環境の状態の変化によって下方制御される、第２のプロモーターを含む第２の調節領域とを含む、少なくとも第２の分子改変（発現クランプ）をさらに含み得る。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、第１のプロモーターを含む第１の調節領域に作動可能に連結された第１の細胞死遺伝子を含む少なくとも１つの分子改変（例えば、キルスイッチ）を含む合成微生物が提供され、第１のプロモーターは、対象の少なくとも１つの部位での正常な生理学的状態と比較した微生物環境の状態の変化によって活性化（誘導）され任意選択的に、合成微生物の細胞死は状態の変化後３０、６０、９０、１２０、１８０、３６０、または２４０分以内に起こる。状態の変化は、ｐＨ、温度、浸透圧、モル浸透圧濃度、酸素レベル、栄養素濃度、血中濃度、血漿中濃度、血清中濃度、ヘム濃度、汗濃度、皮脂濃度、金属濃度、キレート化金属濃度、１つ以上の免疫因子の組成または濃度の変化、ミネラル濃度、および電解質濃度のうちの１つ以上の状態から選択できる。いくつかの実施形態では、状態の変化は、対象の少なくとも１つの部位における正常な生理学的状態と比較して、血液、血清、または血漿のより高い濃度である。
【０３２７】
誘導性プロモーター
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に結合する細胞死遺伝子と、（ｉｉ）血液、血清、または血漿に応答して条件付きで組換えヌクレオチドの、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００の基礎生産性の増加の高レベル遺伝子発現を示す第１の誘導性プロモーターを含む第１の調節領域と、を含む少なくとも１つの分子改変（例えば、キルスイッチ）を含む組換えヌクレオチドを含み得る合成微生物が提供される。
【０３２８】
誘導性の第１のプロモーターは、一定期間後、例えば、１５分、３０分、４５分、９０分、１２０分、１８０分、２４０分、３６０分、またはその間の任意の時点の後で、増加した濃度の血液、血清、血漿、またはヘムへの曝露時に活性化（誘導）されて、転写および／または発現を、血液、血清、血漿、またはヘムの非存在下（非誘導）での転写および／または発現と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも３００倍、または少なくとも６００倍増加させることができる。
【０３２９】
血液または血清誘導性の第１のプロモーターは、標的微生物を選択することと、標的微生物における１つ以上の第１のプロモーター候補遺伝子を選択することと、培地中で微生物を増殖させることと、ｔ＝０分における微生物の試料を取得することと、血清または血液を培地に添加することと、ｔ＝ｎ分で試料を取得することと（ｎ＝１〜２４０分以上、１５〜１８０分、または３０〜１２０分）。試料のＲＮＡシーケンシングを実行することと、ｔ＝０分において取得された試料中の候補の第１のプロモーター遺伝子についてのＲＮＡシーケンシング読取を、血液または血清への曝露後ｔ＝ｎ分の候補の第１のプロモーターに対して比較することと、を含むプロセスによって選択され得る。代替的に、血液または血清への曝露後ｔ＝ｎ分後に取得された試料を、候補の第１のプロモーターについて、血液または血清を含まない培地におけるｔ＝ｎ分と比較することができる。候補の第１のプロモーターは、血液または血清中のｔ＝ｎでの標的細胞の増殖後、ｔ＝０の標的細胞の候補プロモーターと比較した場合、または血清または血液を含まない培地でのｔ＝ｎの標的細胞の候補プロモーターと比較した場合、ＲＮＡシーケンシングにおける約１０倍超、約２０倍超、約５０倍超、約１００倍超、または約５００倍超、上方制御を示すものから選択できる。
【０３３０】
ｉｓｄＢ遺伝子ＣＨ５２＿００２４５（４７９倍）、ｓｂｎＢ遺伝子ＣＨ５２＿０５１３５（１５８倍）、ｉｓｄＣ遺伝子ＣＨ５２＿００２３５（９３倍）、ｓｂｎＡ遺伝子ＣＨ５２＿０５１４０（８８倍）、ｓｒｔＢ遺伝子ＣＨ５２＿００２１５（７３倍）、ｓｂｎＥ遺伝子ＣＨ５２＿０５１２０（７０倍）、ｓｂｎＤ遺伝子ＣＨ５２＿０５１２５（６６倍）、ｉｓｄＩ遺伝子ＣＨ５２＿００２１０（６５倍）、ヘムＡＢＣトランスポーター２遺伝子ＣＨ５２＿００２２５（６５倍）、ｓｂｎＣ遺伝子ＣＨ５２＿０５１３０（６３倍）、ヘムＡＢＣトランスポーター遺伝子ＣＨ５２＿００２３０（６０倍）、ｉｓｄ  ＯＲＦ３遺伝子ＣＨ５２＿００２２０（５１倍）、ｓｂｎＦ遺伝子ＣＨ５２＿０５１１５（４３倍）、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子ＣＨ５２＿１１８７５（４３倍）、ＨａｒＡ遺伝子ＣＨ５２＿１０４５５（４３倍）、ｓｂｎＧ遺伝子ＣＨ５２＿０５１１０（４２倍）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子ＣＨ５２＿０５１０５（３２倍）、鉄ＡＢＣトランスポーター遺伝子ＣＨ５２＿０５１４５（３１倍）、スレオニンデヒドラターゼ遺伝子ＣＨ５２＿１１８８０（２４倍）、およびｉｓｄＡ遺伝子ＣＨ５２＿００２４０（２１倍）を含む、Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａのいくつかの血清応答性プロモーター候補遺伝子は、ｔ＝０と比較して、ＲＮＡシーケンシングによって決定されるとき、３０分間の血清への曝露後、２０倍以上上方制御された。
【０３３１】
ｉｓｄＢ遺伝子ＣＨ５２＿００２４５（４７１倍）、ｉｓｄＣ遺伝子ＣＨ５２＿００２３５（５６倍）、ｉｓｄＩ遺伝子ＣＨ５２＿００２１０（５３倍）、ｓｂｎＤ遺伝子ＣＨ５２＿０５１２５（５２倍）、ｓｂｎＣ遺伝子ＣＨ５２＿０５１３０（５１倍）、ｓｂｎＥ遺伝子ＣＨ５２＿０５１２０（５０倍）、ｓｒｔＢ遺伝子ＣＨ５２＿００２１５（４７倍）、ｓｂｎＢ遺伝子ＣＨ５２＿０５１３５（４４倍）、ｓｂｎＦ遺伝子ＣＨ５２＿０５１１５（４４倍）、ヘムＡＢＣトランスポーター２遺伝子ＣＨ５２＿００２２５（４３倍）、ｉｓｄＡ遺伝子ＣＨ５２＿００２４０（４０倍）、ヘムＡＢＣトランスポーター遺伝子ＣＨ５２＿００２３０（４０倍）、ｓｂｎＡ遺伝子ＣＨ５２＿０５１４０（３７倍）、ｉｓｄ  ＯＲＦ３遺伝子ＣＨ５２＿００２２０（３５倍）、ｓｂｎＧ遺伝子ＣＨ５２＿０５１１０（３４倍）、ＨａｒＡ遺伝子ＣＨ５２＿１０４５５（２８倍）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子ＣＨ５２＿０５１０５（２５倍）、ｓｂｎＩ遺伝子ＣＨ５２＿０５１００（２２倍）、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子ＣＨ５２＿１１８７５（２０倍）を含む、標的微生物であるＳｔａｐｙｌｏｃｏｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａのいくつかの血清応答性プロモーター候補遺伝子は、３０分でＴＳＢと比較して、ＲＮＡｓｅｑによって決定されるとき、３０分間の血清への曝露後、２０倍以上上方制御されることが判明した。鉄ＡＢＣトランスポーター遺伝子ＣＨ５２＿０５１４５は、ＴＳＢでの３０分と比較して、血清への曝露の３０分後に上方制御された（１９倍）。トレオニンデヒドラターゼ遺伝子ＣＨ５２＿１１８８０は、ＴＳＢでの３０分と比較して、血清への曝露の３０分後に上方制御された（１４倍）。
【０３３２】
ｉｓｄＢ遺伝子ＣＨ５２＿００２４５（２０５２倍）、ｓｂｎＢ遺伝子ＣＨ５２＿０５１３５（３１０倍）、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子ＣＨ５２＿１１８７５（３０４倍）、ｓｂｎＥ遺伝子ＣＨ５２＿０５１２０（１９０倍）、ｓｂｎＤ遺伝子ＣＨ５２＿０５１２５（１８７倍）、ｉｓｄＣ遺伝子ＣＨ５２＿００２３５（１７３倍）、ｓｂｎＣ遺伝子ＣＨ５２＿０５１３０（１６２倍）、ｓｂｎＡ遺伝子ＣＨ５２＿０５１４０（１４３倍）、ｓｒｔＢ遺伝子ＣＨ５２＿００２１５（１４３倍）、ｓｂｎＧ遺伝子ＣＨ５２＿０５１１０（１３３倍）、ｓｂｎＦ遺伝子ＣＨ５２＿０５１１５（１２９倍）、ヘムＡＢＣトランスポーター遺伝子ＣＨ５２＿００２３０（１２５倍）、ヘムＡＢＣトランスポーター２遺伝子ＣＨ５２＿００２２５（１１７倍）、ｉｓｄＩ遺伝子ＣＨ５２＿００２１０（１１５倍）、ＨａｒＡ遺伝子ＣＨ５２＿１０４５５（１１４倍）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子ＣＨ５２＿０５１０５（１０２倍）、ｓｂｎＩ遺伝子ＣＨ５２＿０５１００（１０１倍）、ｉｓｄ  ＯＲＦ３遺伝子ＣＨ５２＿００２２０（９７倍）、ＳＡＭ  ｄｅｐ  Ｍｅｔｒａｎｓ遺伝子ＣＨ５２＿０４３８５（７５倍）を含む、標的微生物であるＳｔａｐｙｌｏｃｏｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａのいくつかの血清応答性プロモーター候補遺伝子は、ｔ＝０と比較して、ＲＮＡｓｅｑによって決定されるとき、９０分間の血清への曝露後、５０倍以上上方制御された。鉄ＡＢＣトランスポーター遺伝子ＣＨ５２＿０５１４５（４４倍）、ｉｓｄＡ遺伝子ＣＨ５２＿００２４０（４４倍）、およびシデロフォアＡＢＣトランスポーター遺伝子ＣＨ５２＿０５１５０（３３倍）も、ｔ＝０と比較して血清への９０分の曝露後に上方制御された。
【０３３３】
ｉｓｄＢ遺伝子ＣＨ５２＿００２４５（１２４０倍）、ｓｂｎＤ遺伝子ＣＨ５２＿０５１２５（２２４倍）、ヘムＡＢＣトランスポーター遺伝子ＣＨ５２＿００２３０（１９６倍）、ｓｂｎＥ遺伝子ＣＨ５２＿０５１２０（１７１倍）、ｓｒｔＢ遺伝子ＣＨ５２＿００２１５（１７０倍）、ｉｓｄＣ遺伝子ＣＨ５２＿００２３５（１４９倍）、ｓｂｎＣ遺伝子ＣＨ５２＿０５１３０（１４７倍）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子ＣＨ５２＿０５１０５（１４１倍）、ヘムＡＢＣトランスポーター２遺伝子ＣＨ５２＿００２２５（１３５倍）、ｓｂｎＢ遺伝子ＣＨ５２＿０５１３５（１３０倍）、ｓｂｎＦ遺伝子ＣＨ５２＿０５１１５（１２７倍）、ｂｎＧ遺伝子ＣＨ５２＿０５１１０（１２０倍）、ｉｓｄ  ＯＲＦ３遺伝子ＣＨ５２＿００２２０（１１９倍）、ｉｓｄＩ遺伝子ＣＨ５２＿００２１０（１１８倍）、ＨａｒＡ遺伝子ＣＨ５２＿１０４５５（１１７倍）、ｉｓｄＡ遺伝子ＣＨ５２＿００２４０（１１５倍）、ｓｂｎＡ遺伝子ＣＨ５２＿０５１４０（９３倍）、およびｓｂｎＩ遺伝子ＣＨ５２＿０５１００（８９倍）を含む、標的微生物であるＳｔａｐｙｌｏｃｏｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａのいくつかの血清応答性プロモーター候補遺伝子は、９０分でＴＳＢ中の増殖と比較して、ＲＮＡシーケンシングによって決定されるとき、９０分後の血清への曝露後、５０倍以上上方制御されることが判明した。鉄ＡＢＣトランスポーター遺伝子ＣＨ５２＿０５１４５（４７倍）、シデロフォアＡＢＣトランスポーター遺伝子ＣＨ５２＿０５１５０（３７倍）、およびＳＡＭ  ｄｅｐ  Ｍｅｔｒａｎｓ遺伝子ＣＨ５２＿０４３８５（２５倍）も、ｔ＝９０分のＴＳＢと比較して、血清への９０分の曝露後に上方制御された。
【０３３４】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ合成微生物で使用するための血液または血清誘導性の第１のプロモーター遺伝子は、ｉｓｄＡ（鉄調節表面決定因子タンパク質Ａ）、ｉｓｄＢ（鉄調節表面決定因子タンパク質Ｂ）、ｉｓｄＧ（ヘム分解モノオキシゲナーゼ）、ｈｌｇＡ（ガンマ溶血素コンポーネントＡ）、ｈｌｇＡ１（ガンマ溶血素）、ｈｌｇＡ２（ガンマ溶血素）、ｈｌｇＢ（ガンマ溶血素コンポーネントＢ）、ｈｒｔＡＢ（ヘム調節トランスポーター）、ｓｂｎＣ（ｌｕｃ  Ｃファミリーシデロフォア生合成タンパク質）、ｓｂｎＥ（ｌｕｃＡ／ｌｕｃＣファミリーシデロフォア生合成タンパク質）、ｌｒｇＡ（ムレインヒドロラーゼレギュレーターＡ）、ｌｒｇＢ（ムレインヒドロラーゼレギュレーターＢ）、ｅａｒ（Ｅａｒタンパク質）、ｆｈｕＡ（フェリクロム輸送ＡＴＰ結合タンパク質ｆｈｕＡ）、ｆｈｕＢ（フェリクロム輸送パーミアーゼ）、ｈｌｂ（ホスホリパーゼＣ）、ｓｐｌＦ（セリンプロテアーゼＳｐｌＦ）、ｓｐｌＤ（セリンプロテアーゼＳｐｌＤ）、ｄｐｓ（一般的なストレスタンパク質２０Ｕ）、ＳＡＵＳＡ３００＿２６１７（推定コバルトＡＢＣトランスポーター、ＡＴＰ結合タンパク質）、ＳＡＵＳＡ３００＿２２６８（ナトリウム／胆汁酸シンポーターファミリータンパク質）、ＳＡＵＳＡ３００＿２６１６（コバルトファミリー輸送タンパク質）、ｓｒｔＢ（ソルターゼＢ）、ｓｂｎＡ（推定シデロフォア生合成タンパク質ｓｂｎＡ）、ｌｅｕＡ（２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼアミノ酸生合成酵素）、ｓｓｔＡ（鉄輸送膜タンパク質）、ｓｉｒＡ（鉄ＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質）、ＩｓｄＡ（ヘムトランスポーター）、およびＳｐａ（ブドウ球菌プロテインＡ）、ＨｌｇＡ（ガンマ溶血素）、ｌｅｕＡ（アミノ酸生合成酵素）、ｓｓｔＡ（鉄トランスポーター）、ｓｉｒＡ（鉄輸送）、ｓｐａ（タンパク質Ａ）、もしくはＩｓｄＡ（ヘムトランスポーター）、または実質的に同一の遺伝子から選択される遺伝子から選択できるか、またはそれに由来し得る。第１のプロモーター遺伝子は、ＳＡＵＳＡ３００＿０１１９（オルニチンシクロデアミナーゼファミリータンパク質）、ｌｒｇＡ（ムレインヒドロラーゼトランスポーター）、およびｂｉｏＡ（アデノシルメチオニン−８−アミノ−７−オキソノナノエートアミノトランスフェラーゼ）、または実質的に同一の遺伝子からなる群から選択することもできる。
【０３３５】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ合成微生物で使用するための血液または血清血液または血清誘導性の第１のプロモーター遺伝子は、ｉｓｄＢ遺伝子ＣＨ５２＿００２４５、ｓｂｎＤ遺伝子ＣＨ５２＿０５１２５、ヘムＡＢＣトランスポーター遺伝子ＣＨ５２＿００２３０、ｓｂｎＥ遺伝子ＣＨ５２＿０５１２０、ｓｒｔＢ遺伝子、ＣＨ５２＿００２１５、ｉｓｄＣ遺伝子ＣＨ５２＿００２３５、ｓｂｎＣ遺伝子ＣＨ５２＿０５１３０、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子ＣＨ５２＿０５１０５、ヘムＡＢＣトランスポーター２遺伝子ＣＨ５２＿００２２５、ｓｂｎＢ遺伝子ＣＨ５２＿０５１３５、ｓｂｎＦ遺伝子ＣＨ５２＿０５１１５、ｂｎＧ遺伝子ＣＨ５２＿０５１１０、ｉｓｄ  ＯＲＦ３遺伝子ＣＨ５２＿００２２０、ｉｓｄＩ遺伝子ＣＨ５２＿００２１０、ＨａｒＡ遺伝子ＣＨ５２＿１０４５５、ｉｓｄＡ遺伝子ＣＨ５２＿００２４０、ｓｂｎＡ遺伝子ＣＨ５２＿０５１４０、およびｓｂｎＩ遺伝子ＣＨ５２＿０５１００、鉄ＡＢＣトランスポーター遺伝子ＣＨ５２＿０５１４５、シデロフォアＡＢＣトランスポーター遺伝子ＣＨ５２＿０５１５０、およびＳＡＭ  ｄｅｐ  Ｍｅｔｒａｎｓ遺伝子ＣＨ５２＿０４３８５から選択される遺伝子から選択できるか、またはそれに由来し得る。
【０３３６】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ合成微生物で使用するための血液または血清誘導性の第１のプロモーター遺伝子は、１１４、１１５、１１９、１２０、１２１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、および１６３、または実質的に同一の配列から選択されるヌクレオチド配列に由来するか、またはそれを含み得る。
【０３３７】
一実施形態では、合成微生物は、分子改変されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａである。リアルタイムＰＣＲプローブの設計に使用される、開始コドンから停止コドンまでの各調節領域に続くオペロンの最初のＯＲＦの生の配列を表２に示す。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【０３３８】
本明細書で以下に述べるように、合成微生物は、細胞死遺伝子の発現を防止する発現クランプ分子改変を含むことができ、発現クランプは、真皮または粘膜のコロニー形成時、またはＴＳＢ培地中で活性であり、好ましくは、血液、血清または血漿中で下方制御される第２のプロモーターに作動可能に結合する細胞死遺伝子に特異的な抗毒素遺伝子を含み、例えば、第２のプロモーターは、例えば表３に示すように、ｃｌｆＢ遺伝子（クランピングファクターＢ）を含み得る。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【０３３９】
合成微生物分子改変Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ５０２ａを調製するための組換え手法で使用される追加のオリゴヌクレオチドを、図３Ａ〜Ｃに示す表４Ａに示し、プロモーター配列を以下に示す。
【０３４０】
細胞死遺伝子
本明細書に記載されるように、合成微生物は、誘導性の第１のプロモーターに作動可能に結合する細胞死遺伝子を含むキルスイッチ分子改変を含み得る。細胞死遺伝子は、過剰発現すると、誘導の所定の期間内、好ましくは１５分、３０分、６０分、９０分、１２０分、２４０分、または３６０分以内に、合成微生物の細胞死または増殖の大幅な減少をもたらす任意の遺伝子から選択され得る。
【０３４１】
細胞死遺伝子、毒素遺伝子、またはキルスイッチ遺伝子は、他の状況で開発されてきた。
【０３４２】
Ｓｙｎｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．に帰属するＷＯ２０１６／２１０３７３，Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｋｏｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．は、バイオセーフティのために操作された栄養要求性である、例えば毒素、抗毒素と、アラビノース誘導性プロモーターとを含み、細胞を生存させ続けるために誘導因子（例えば、アラビノース）の存在に依存する抑制ベースのキルスイッチ遺伝子を含む組換え細菌細胞を開示している。
【０３４３】
ＵＳ８，９７５，０６１，Ｂｉｅｌｉｎｓｋｉは、環境内での微生物の意図しないおよび／または制御不能の拡散を防ぐための生物学的封じ込めのための毒素および抗毒素遺伝子の調節を開示している。
【０３４４】
ＷＯ１９９９／０５８６５２，Ｇｅｒｄｅｓは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｅｌＢＥ遺伝子座ならびにグラム陰性およびグラム陽性細菌および古細菌に見られる同様のシステムを含む、細胞毒素ベースの生物学的封じ込めおよびキルシステムを開示している。
【０３４５】
ＵＳ２０１５／００５０２５３，Ｇａｂａｎｔは、微生物の制御された増殖と、他の外因性組換えまたは他の微生物の増殖／拡散の制御を開示している。
【０３４６】
ＷＯ２０１７／０２３８１８およびＷＯ２０１６／２１０３８４，Ｆａｌｂは、プロピオン酸代謝が関与する障害を治療するために操作された細菌を開示している。
【０３４７】
ＵＳ２０１６／０３３３３２６，Ｆａｌｂは、高アンモニア血症に関連する疾患を治療するために操作された細菌を開示している。
【０３４８】
ＵＳ９１０１５９７，Ｇａｒｒｙは、免疫保護性の初代間葉系幹細胞および方法を開示し、間葉系幹細胞での使用のためのアポトーシス促進性キルスイッチが記載されている。
【０３４９】
米国特許第２０１６／０２０６６６６号，Ｆａｌｂは、腸の炎症の減少および／または腸の粘膜障壁の引き締めから恩恵を受ける疾患を治療するように操作された細菌を開示している。
【０３５０】
いくつかの実施形態では、ＳｐｒＡ１（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、Ｓｍａ１（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、ＲｅｌＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＫｐｎＩ（肺炎球菌Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および／またはＲｓａＥ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）毒素遺伝子のうちの１つ以上を含む合成微生物が提供される。
【０３５１】
本開示では、様々な細胞死毒素遺伝子が、以前に特定された最適制御領域と組み合わせて試験された。ｉ）細胞膜に孔を形成し、その機能を損なう３０アミノ酸ペプチド（ＰｅｐＡ１）、ｉｉ）細菌染色体を迅速に消化する制限酵素（Ｋｐｎ１またはその他）、ｉｉｉ）２つの必須遺伝子の翻訳を阻害することにより中心的な生化学的代謝を損なう低分子ＲＮＡ（ＲｓａＥ）、ｉｖ）Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓに由来する制限エンドヌクレアーゼ（Ｓｍａ１）、およびｖ）Ｅ．ｃｏｌｉ由来の毒素遺伝子（ＲｅｌＦ）。一部の毒素は他のものよりも強力であり、制御領域の誘導強度と毒素の効力の理想的な組み合わせは、ベースラインで健康であり、循環系で迅速に死ぬ株をもたらすことができる。
【０３５２】
ｓｐｒＡ１（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）毒素遺伝子（ＰｅｐＡ１ペプチドをコードする）は、ＷＯ２０１３／０５０５９０，Ｆｅｌｄｅｎ，Ｂ，ａｎｄ  Ｓａｙｅｄ，Ｎに記載され、抗菌剤としてのＰｅｐＡ１の使用を開示するが、焦点は体内に送達される精製された外因性治療薬としてペプチドを使用することである。
【０３５３】
ｒｅｌＦ（大腸菌）毒素遺伝子はＥＰ２００９／０１６８９９８，Ｇｅｒｄｅｓに記載されており、生物的封じ込めを目的としたキルスイッチが開示されており、グラム陰性菌の査証に焦点を当てている。
【０３５４】
ｒｅｌＦ毒素遺伝子は、微生物の細胞死（プログラム細胞死）を誘発するメカニズムを開示しているＵＳ８８５２９１６，Ｈｙｄｅ  ａｎｄ  Ｒｏｄｅｒｉｃｋに記載されている。主な用途は、環境生物封じ込めでＲｅｌＦを使用することである。
【０３５５】
ｒｅｌＦはＵＳ８６８２６１９，Ａｍｏｄｅｉに記載されており、細菌集団の増殖を制御するＲｅｌＦを予言的に開示している。
【０３５６】
合成微生物は、毒素遺伝子であり得る細胞死遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む調節領域を含むキルスイッチ分子改変の挿入により、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ標的微生物に由来し得る。
【０３５７】
細胞死遺伝子は、ｓｐｒＡ１遺伝子（細胞膜に孔を形成するペプチド毒素をコードする）、ｓｐｒＡ２遺伝子、ｓｐｒＧ遺伝子、ｓｍａ１遺伝子（制限エンドヌクレアーゼ）、ｋｐｎ１遺伝子（細菌染色体を急速に消化する制限酵素）、ｒｓａＥ遺伝子（２つの必須遺伝子の翻訳を阻害することにより中心代謝を損なう小型ＲＮＡ）、ｒｅｌＦ遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｙｏｅＢ遺伝子、ｍａｚＦ遺伝子、ｙｅｆＭ遺伝子、またはリゾスタフィン毒素遺伝子から選択できるか、またはそれらに由来し得る。合成黄色ブドウ球菌は、配列番号１２２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、２７４、２７５、２８４、２８６、２８８、２９０、３１５、もしくは３１７、または実質的に同一のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を有する細胞死遺伝子を含むキルスイッチ分子改変を含み得る。
【０３５８】
特定の実施形態では、ＳｐｒＡ１遺伝子を含むまたはそれに由来する細胞死遺伝子に作動可能に結合する血液または血清誘導性の第１のプロモーターを含む分子改変を有する合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが提供される。
【０３５９】
複数のキルスイッチ
１つのＫＳで合成微生物に望ましい特性を持たせるには十分であり得るが、１つを超えるＫＳによって次のようにして株をさらに強化することができる：ｉ）ＫＳを不活性化する変異の割合を劇的に減少させる、ｉｉ）細胞を１つを超える経路で殺傷し、より速い細胞死を引き起こし得る（生成物強化特性）。細胞死遺伝子は、以下に示されるプロモーターの下流の１つ以上のＤＮＡ配列（７）を含み得る。塩基対番号は、ｐＣＮ５１ベクターの位置に対応している。
【０３６０】
１．制限部位ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩの間のｓｐｒＡ１遺伝子配列を以下に示す。配列はＤＮＡ  ２．０（Ａｔｕｍ）によって合成され、複製のためにＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換できるベクターに連結された。ｓｐｒＡ１遺伝子は、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位で制限切断され、ゲル電気泳動によって単離された。開始部位と停止部位の可能性がある制限部位間の完全な配列をイタリック体とする。
【表４】
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【０３６１】
２．ＣｌｆＢプロモーター下の調節ＲＮＡ  ｓｐｒＡ１ｓｐｒＡ１AS（ｓｐｒＡ１ｓｐｒＡ１アンチセンス）のＤＮＡ配列（アンチセンス調節ＲＮＡを含む、ｓｐｒＡ１遺伝子の後ろに逆向きでクローニングされている）。このＤＮＡ配列は、非コーディングアンチセンス調節ＲＮＡを生成する。これは、血清および／または血液の環境因子の外でｓｐｒＡ１の翻訳を調節することにより、抗毒素として機能する。以下は、ｓｐｒＡ１ｓｐｒＡ１ASＤＮＡ配列である。
【表５】
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【０３６２】
３．制限部位ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩの間のＳｍａＩ  ＤＮＡ配列。配列はＤＮＡ  ２．０（Ａｔｕｍ）によって合成され、複製のためにＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換できるベクターに連結された。ＳｍａＩ遺伝子は、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位で制限切断され、ゲル電気泳動によって単離された。開始部位と停止部位がある制限部位間の完全な配列をイタリック体とする。
【表６】
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【０３６３】
４．制限部位ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩの間のｒｓａＥ  ＤＮＡ配列。配列はＤＮＡ  ２．０（Ａｔｕｍ）によって合成され、複製のためにＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換できるベクターに連結された。ＲｓａＥ小型調節ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）は、ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩ部位で制限切断され、ゲル電気泳動で単離された。これには５’ラン−インが含まれ、成熟したＲＮＡは太字のＧＡＡＡＴＴＡＡから始まり、ＡＣＧの後のＴのストレッチで終わるように処理される。
【表７】
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【０３６４】
５．ＲｓａＥ  ｓＲＮＡの代わりにバリアントを使用すると、ｓＲＮＡをより高度に発現させることができ、より効果的に機能させることができる。このバリアントは、５’末端のＧＡＡＡＴＴＡＡで始まる。
【表８】
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【０３６５】
６．ｒｅｌＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡ配列。この潜在的なキル遺伝子が試験され、クローニングされる。
【表９】
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【０３６６】
７．ＫｐｎＩ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の制限酵素）ＤＮＡ配列が試験され、クローニングされる。
【表１０】
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【０３６７】
第一のプロモーターを含む第一の調節領域に作動可能に連結された第一の細胞死遺伝子を含む少なくとも１つの分子改変（キルスイッチ）を含む合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａが本明細書で提供され、任意選択的に、第１の細胞死遺伝子は配列番号１２２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、２７４、２７５、２８４、２８６、２８８、２９０、３１５、および３１７から選択されるヌクレオチド配列、または実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【０３６８】
キルスイッチ（ＫＳ）は他の目的で記載されているが、本発明のＫＳには独特の特徴がある：ｉ）それは血液または血清に曝露されると応答する、ｉｉ）内因的に調節されている、すなわちＫＳ（栄養要求性ではない）を活性化または調整するために小分子を追加または削除する必要がない、およびｉｉｉ）制御領域／毒素、および複数のそのようなカセットの有用な組み合わせを使用して、優れた性能を達成することができる。
【０３６９】
発現クランプ
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に結合する細胞死遺伝子と、（ｉｉ）血液または血清への曝露によって誘導される第１の誘導性プロモーターを含む第１の調節領域とを含む、キルスイッチ分子改変を含む合成微生物が提供される。合成微生物が対象の真皮または粘膜ニッチを永続的に占有するために、血液または血清がない場合、キルスイッチはサイレント（発現されない）であるべきことが好ましい。
【０３７０】
細胞死遺伝子の「漏出性発現」を回避するために、合成微生物は、（ｉｉｉ）細胞死遺伝子に特異的な抗毒素遺伝子であって、ここで抗毒素遺伝子は（ｉｖ）に作動可能に結合する、抗毒素遺伝子と、（ｉｖ）真皮もしくは粘膜のコロニー形成時または培地（例えば、ＴＳＢ）中で活性（例えば、構成的）であり、好ましくは、血液、血清、または血漿への曝露により下方制御される、第２のプロモーターを含む第２の調節領域とを含む、少なくとも第２の分子改変（発現クランプ）をさらに含み得る。
【０３７１】
血清との接触前に毒素を産生すると株を時期尚早に殺傷または弱めるので、ＫＳ株の基礎レベルの遺伝子発現（例えばＴＳＢ（トリプシン消化大豆ブロス）中で細胞が血液または血清に曝露されていないときに観察される発現）は理想的には非常に低いはずである。中程度の細胞の健康障害でさえ許容できないのは、次の理由がある。１）ＫＳ中のエスケープ変異が蓄積する（ＫＳ不安定性）−回避する必要がある既知の現象。および／または２）予備試験で我々の株で観察された自然の有効性が、低下または失われる可能性がある。漏出性の発現が問題であるかどうかを理解するために、基礎発現の絶対レベルと血清中の変化倍率の両方が測定され、ＫＳを駆動するための最適な制御領域の選択において綿密に考慮された。
【０３７２】
漏出性の発現を認識しても問題は解決せず、実際には、広く使用されている「厳密に制御された」、ＰCUP1およびＰGal7などのレオスタティックプロモーター、およびＰTet-ｏｎ／ｏｆｆバリアントでも、特定の誘導がない場合に測定可能なｍＲＮＡ転写が行われる。いくつかの実施形態では、ＫＳカセットが毒素発現を駆動する血清応答性制御領域を含むだけでなく、通常、皮膚のコロニー形成の間にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓで強く活性化し、血液中で下方制御されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロモーター（ＰclfBなど）の制御下で「翻訳遮断」ＲＮＡもコードする「発現クランプ」が使用される。
【０３７３】
ｃｌｆＢ遺伝子プロモーター（ＰclfB）は、ｓｐｒＡ１ｓｐｒＡ１ASＲＮＡの発現を駆動するためにクローニングされ、カセットは、血清応答性プロモーター（たとえば、ＰisdB、ＰhlgAなど）からのｓｐｒＡ１毒素の発現に使用されるのと同じ発現モジュールに組み込まれる。この株では、血清／血液への曝露は毒素を活性化するが（例えば、３５０倍以上）、抗毒素は活性化せず、ＴＳＢまたは皮膚での増殖は抗毒素を活性化するが、毒素は活性化しない。合成株の例示的な分子改変の代表的な図を図１に示す。
【０３７４】
合成微生物への代替アプローチ：ＫＯ法
合成微生物でキルスイッチのような表現型を作成する別の方法は、血液での生存および／または臓器の感染に必要であるが培地または皮膚上の増殖に必要（または重要）ではない１つ以上の遺伝子を破壊する（「ノックアウト」）ことである。いくつかの実施形態では、表５に示される６つの遺伝子のうちの１つ以上、または２つ以上が、ＫＯ法において使用され得る。
【表１１】
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【０３７５】
一実施形態では、対立遺伝子交換を使用して、表５の１つ以上の遺伝子を未修飾または発現クランプしたＫＳで置き換えることを含む合成微生物が提供される。これは、血液中の合成微生物の死亡率をさらに高める可能性がある。代替的に、２つのＫＳを組み込む必要性は、１つのＫＯと１つのＫＳを使用することで減少する。さらなる実施形態では、合成微生物は、相乗効果を有し得る１つを超えるＫＯの組み合わせを含み得る。
【０３７６】
キルスイッチ調節領域
キルスイッチを含む合成微生物が提供される。本明細書に記載されるように、キルスイッチは、誘導性プロモーターを含む調節領域（ＲＲ）に作動可能に連結された細胞死遺伝子を含む。
【０３７７】
合成微生物の開発には、キルスイッチ遺伝子を駆動するための最適な調節領域（ＲＲ）の同定と特徴付けが含まれ、血清応答遺伝子座のリストが選択され、ＲＲが同定され、そして、血清活性化応答が検証され、基礎発現が調査される。
【０３７８】
キルスイッチ候補を駆動するための最適な調節領域の同定と特徴付け。
【０３７９】
ＫＳ株構築のこの重要な段階では、ヒト血清および／またはヘパリン添加全血に応答して強く上方制御される遺伝子を同定する。遺伝子が同定されると、プロモーターと他の上流要素を含むそれらのＲＲが特定され、注釈が付けられる。１つのアプローチにおいて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける既知の血清および血液応答性遺伝子を、文献で知られているように使用することができる。
【０３８０】
ＲＲには、刺激に応じたｍＲＮＡ転写の活性化（または抑制）に必要な上流の調節配列が含まれている。モチーフには、「上流」エレメント、−３５、および−１０コンセンサスエレメント、リボソーム結合部位（「ｓｈｉｎｅ−ｄａｌｇａｒｎｏ配列」）、および転写に強く影響するタンパク質因子に結合する「オペレーター」配列が含まれる。真正細菌の場合、実際には、開始コドンの上流にあるＤＮＡ配列の２００ｂｐ領域を利用することで、通常はこれらすべてのエレメントを十分に捕捉できる。しかしながら、それらの包含を確実にするためにこれらの配列を意図的に同定することが好ましい。
【０３８１】
ヒトの血液または血清への暴露により強く上方制御される６つのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを表６に示す。
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【０３８２】
ＢｉｏＰｌｘ−０１株の各オペロンの完全な遺伝子と隣接配列はＧｅｎｂａｎｋから取得され、文献と既知のモチーフ同定アルゴリズムに基づいて注釈が付けられる。転写終結因子は、公開されている実験と予測ツールの組み合わせにより特定されている。
【０３８３】
ＴＳＢ（または同様の培地）における血清応答性プロモーターの発現に関する追加の文献証拠が調査された。例えば、ｓｐａ遺伝子とｉｓｄＡ遺伝子は、Ｙｔｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１１：１１２３−１１３９，２０１２に開示されている。ｓｉｒＡ遺伝子は、Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ，２００４  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８６（２４）８３５６−８３６２に開示されている。ｓｓｔ遺伝子はＭｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０００に開示されている。ｈｌｇＡ遺伝子は、Ｆｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４，ＰＮＡＳ  Ｅ２０３７−Ｅ２０４５．ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／  ｐｎａｓ．１３２２１２５１１１に開示されている。ｌｅｕＡ遺伝子は、Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５，Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ６：１，７５−８４に開示されている。
【０３８４】
これらのデータは多くの異なる株や実験システムから得られるため、リアルタイムＰＣＲを使用して定量的な遺伝子発現測定を行う単一の標準化されたアッセイシステムで、コレクション全体の発現を評価できる。重要なことに、血清との接触前に毒素を産生するとＢｉｏＰｌｘ−ＸＸ株（キルスイッチを含む合成微生物）を殺傷／弱めるため、基本的な「漏出性」レベルの遺伝子発現（細胞が血液または血清に曝露されていないとき、例えばＴＳＢ中で観察される発現）は非常に低くすべきである。中程度の細胞の健康障害でさえ許容できないのは、次の理由がある。１）ＫＳ中のエスケープ変異が蓄積する（ＫＳ不安定性）−回避する必要がある既知の現象。および／または２）ＢｉｏＰｌｘ−０１で観察された自然の有効性が、低下または失われる可能性がある。したがって、基礎発現の絶対レベルと血清中の変化倍率の両方を測定でき、ＫＳを駆動するための最適なＲＲの選択において綿密に考慮された。ｌｅｕＡはＴＳＢ中で下方制御され（６倍）、血清中で上方制御され（１５倍）、そのＲＲがＫＳ発現を制御するための特に興味深い候補となっていることに注目されたい。
【０３８５】
いくつかの実施形態では、キルスイッチを有する合成微生物は、ＫＳカセットが毒素発現を駆動する血清応答性ＲＲを含むだけでなく、コロニー化中に皮膚または鼻粘膜で通常活性であるプロモーターの制御下の「翻訳遮断」ＲＮＡ抗毒素もコードする「発現クランプ」をさらに含み得る。キルスイッチは、細胞死毒素遺伝子の悪影響を抑制することができる抗毒素をコードすることができる。
【０３８６】
いくつかの実施形態では、合成微生物は、キルスイッチを含む分子改変を有するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓであり、ＫＳカセットが毒素発現を駆動する血清応答性ＲＲを含むだけでなく、表７に示すような、コロニー化中に皮膚で通常活性であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロモーター（ＰclfBなど）の制御下の「翻訳遮断」ＲＮＡ抗毒素もコードする「発現クランプ」をさらに含む。
【０３８７】
表６に列挙されているプロモーターとリアルタイムＰＣＲデータから、基礎発現が低く血清／血液に対する応答が高い２つ以上のＲＲを選択して、ＫＳ発現を促進することができる。これらのＲＲは、本明細書に記載されるような３つの異なるＫＳ遺伝子と対にされ得、試験のためのＫＳ候補株のパネルを生成する。パネルには、次に説明する「発現クランプ」の候補が含まれる。
【０３８８】
ＫＳ株が皮膚または鼻上皮にあるときに毒素の発現をブロックする発現クランプ
合成微生物は発現クランプを含み得る。ヒト鼻孔のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのコロニー形成に関与する遺伝子を表７に示す。これらは、合成株が皮膚または粘膜環境にコロニー形成されたときに漏洩毒素の発現をブロックする抗毒素遺伝子をさらに含む発現クランプで使用する２番目のプロモーターとして使用できる。第２のプロモーターは、ハウスキーピング遺伝子などの構成的プロモーターであり得る。第二のプロモーターは、好ましくは、血液または血清の存在下で下方制御され得る。
【表１３】
2021505197.tif 000021
【０３８９】
いくつかの実施形態では、キルスイッチを含み、コロニー形成中に皮膚または鼻粘膜上で通常活性である第２のプロモーターによって駆動される抗毒素遺伝子を含む発現クランプをさらに含む、合成微生物が提供され、任意選択的に第２のプロモーターは表７に示すように、クランピングファクターＢ（ｃｌｆＢ）、オートリシン（ｓｃｅＤ、エキソプロテインＤ）、ｗａｌＫＲ（病原性調節因子）、ａｔｌＡ（主要なオートリシン）、およびｏａｔＡ（Ｏ−アセチルトランスフェラーゼＡ）から選択されるか、またはそれらに由来する遺伝子から選択される。あるいは、構成的な第２のプロモーターは、ハウスキーピング遺伝子、例えば、ｇｙｒＢ、ｓｉｇＢ、またはｒｈｏから選択されか、またはそれらに由来し得、任意選択的に、第２のプロモーターは、それぞれ配列番号３２４、３２５、または３２６のヌクレオチド配列、または実質的に同一の配列を含む。
【０３９０】
発現クランプで使用するための第２のプロモーターは、血液または血清への曝露時に下方制御されると認識されている、標的微生物で同定された遺伝子から選択することができる。
【０３９１】
発現クランプ分子改変で使用するための第２のプロモーターは、一定期間後、例えば１５分、３０分、４５分、９０分、１２０分、１８０分、２４０分、３６０分、またはその間の任意の時点の後の血液または血清への曝露時に好ましくは下方制御され、細胞死遺伝子の転写および／または発現を、血液または血清の非存在下での転写および／または発現と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、または少なくとも１０倍減少させる、構成的プロモーターであるべきである。
【０３９２】
第２のプロモーターは、標的微生物を選択することと、標的微生物における１つ以上の第２のプロモーター候補遺伝子を選択することと、培地中で微生物を増殖させることと、ｔ＝０分における微生物の試料を取得することと、血清または血液を培地に添加することと、ｔ＝ｎ分で試料を取得することと（ｎ＝１〜２４０分以上、１５〜１８０分、または３０〜１２０分）。試料のＲＮＡシーケンシングを実行することと、ｔ＝０分において取得された試料中の候補の第１のプロモーター遺伝子についてのＲＮＡシーケンシング読取を、血液または血清への曝露後ｔ＝ｎ分の候補の第１のプロモーターに対して比較することと、を含むプロセスによって選択され得る。代替的に、血液または血清への曝露後ｔ＝ｎ分後に取得された試料を、候補の第２のプロモーターについて、血液または血清を含まない培地におけるｔ＝ｎ分と比較することができる。候補の第２のプロモーターは、血液または血清中のｔ＝ｎでの標的細胞の増殖後、ｔ＝０の標的細胞の候補プロモーターと比較した場合、または血清または血液を含まない培地でのｔ＝ｎの標的細胞の候補プロモーターと比較した場合、ＲＮＡシーケンシングにおける下方制御を示すものから選択できる。
【０３９３】
第２のプロモーターは、ｔ＝０と比較してＲＮＡシーケンシングによって決定されるとき、３０分間の血清への曝露後に少なくとも２倍下方制御されることが判明した、Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａの発現クランプでの使用の可能性がある、本明細書で同定されたプロモーター候補遺伝子から選択されるか、またはそれ由来し得、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ遺伝子ＣＨ５２＿００５２５（−４．３０倍）、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンテターゼ遺伝子ＣＨ５２＿００５３０（−４．２７倍）、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子ＣＨ５２＿００５３５（−４．１３倍）、ホスホリボシル−ホルミルグリシナミジンシンターゼ遺伝子ＣＨ５２＿００５４０（−４．０４倍）、ホスホリボシルホルミルグリシナミジンシンターゼ遺伝子ＣＨ５２＿００５４５（−３．４９倍）、ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミド遺伝子ＣＨ５２＿００５５５（−３．３４倍）、トレハロースパーミアーゼＩＩＣ遺伝子ＣＨ５２＿０３４８０（−３．３３倍）、ＤｅｏＲファミリー転写制御遺伝子ＣＨ５２＿０２２７５（−２．５５倍）、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ＣＨ５２＿０２２７０（−２．４６倍）、およびＰＴＳフルクトーストランスポーターサブユニットＩＩＣ遺伝子ＣＨ５２＿０２２６５（−２．０４倍）を含む。
【０３９４】
第２のプロモーターは、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ遺伝子ＣＨ５２＿００５２５、トレハロースパーミアーゼＩＩＣ遺伝子ＣＨ５２＿０３４８０、ＤｅｏＲファミリー転写調節遺伝子ＣＨ５２＿０２２７５、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ＣＨ５２＿０２２７０、またはＰＴＳフルクトーストランスポーターサブユニットＩＩＣ遺伝子ＣＨ５２＿０２２６５から選択されるか、それらに由来し得る。
【０３９５】
第２のプロモーターは、ＰclfB（クランピング因子Ｂ）遺伝子であり得る。任意選択的に、第２のプロモーターは、配列番号７、１１７、１１８、１２９、または１３０のヌクレオチド配列、または実質的に同一の配列を含む。
【０３９６】
１つの特定の例では、ＫＳコンストラクトのうちの１つ（ｓｐｒＡ１）は、クランピングファクターＢ（ｃｌｆＢ）プロモーターから駆動される抗毒素（ｓｐｒＡ１AS）を含む発現クランプを備えている。このプロモーターは、クランプを駆動するための１つの選択肢であり、それがＴＳＢ中および鼻／皮膚のコロニー化時に強く発現する（豊富なハウスキーピング遺伝子ｇｙｒＡよりも１０倍高い）ためである（Ｂｕｒｉａｎ  ２０１０）。これは、それぞれ製品の製造と使用に直接関連している。クランピングファクターＢ（ｃｌｆＢ）プロモーターも、血液中で３倍下方制御され（Ｍａｌａｃｈｏｗａ  ２０１１）、クランプの非アクティブ化が促進される。血清応答性プロモーターの駆動は血液中で非常に強力に活性化されるため、血液中での完全な不活性化は必要ないかもしれない。
【０３９７】
クランピングファクターＢ（ｃｌｆＢ）プロモーターは、ヒトの鼻腔コロニー化時に少なくとも１２か月にわたって安定して発現し、また、コロニー化のげっ歯類およびｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでも同定された（Ｂｕｒｉａｎ  ２０１０）。
【０３９８】
発現クランプの１つの例では、ｃｌｆＢは、ＴＳＢ中での強い発現と血液または血清中での低い発現レベルを確認（リアルタイムＰＣＲ）した後、発現クランプで使用する構成的プロモーターとして選択され、標的Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ株における特性を決定する。ｃｌｆＢ調節領域は、ｓｐｒＡ１アンチセンス（抗毒素）ＲＮＡの発現を駆動するようにクローニングされ（表３、第１のエントリーを参照）、カセットは、血清応答性プロモーターからのｓｐｒＡ１毒素遺伝子の発現に使用されるものと同じ発現シャトルベクターに組み込まれる。血清／血液への曝露は毒素を強く活性化できるが、抗毒素は活性化できないことが望ましく、ＴＳＢまたは皮膚／鼻上皮への曝露は抗毒素を活性化するが毒素は活性化しない。この概念は、以下の表３の他のＫＳ遺伝子に適用できる。クランプを使用する別の可能性は、制限酵素ＫｐｎＩ（毒素）アプローチの場合である。このアプローチでは、抗毒素は、アプタマーに代謝安定性を与える手段として、この酵素の強力な阻害剤として最近開発されたＲＮＡアプタマーであり得る（Ｍｏｎｄｒａｇｏｎ，２０１５）。
【０３９９】
漏出性の発現を認識しても問題は解決せず、実際には、広く使用されている「厳密に制御された」、ＰCUP1およびＰGal7などのレオスタティックプロモーター、およびＰTet-ｏｎ／ｏｆｆバリアントでも、特定の誘導がない場合に測定可能なｍＲＮＡ転写が行われる。
【０４００】
発現クランプは、抗毒素遺伝子に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む。例えば、抗毒素遺伝子は、効果的であるために、キルスイッチの細胞死毒素遺伝子に特異的である。通常の生理学的条件下では、発現クランプは細胞死遺伝子の漏出性発現を防止する働きをする。血液または血清に曝されると、抗毒素に作動可能に連結された第２のプロモーターが下方制御され、細胞死遺伝子の発現が可能になる。
【０４０１】
合成微生物は、細胞死遺伝子をサイレンシングするのに特異的である抗毒素遺伝子を含む発現クランプを含み得る。抗毒素は、当該技術分野で知られているキルスイッチ分子改変における細胞死遺伝子に特異的な任意の抗毒素から選択できるかそれに由来し得る。抗毒素遺伝子は、細胞死遺伝子に特異的なアンチセンスＲＮＡまたは細胞死遺伝子に特異的な抗毒素タンパク質をコードすることができる。
【０４０２】
抗毒素遺伝子は、ｓｐｒＡ１抗毒素遺伝子、またはｓｐｒＡ１（ＡＳ）であり得る。ｓｐｒＡ１抗毒素遺伝子は、ＴＡＴＡＡＴＴＧＡＧＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＴＡＡＧＴＡＴＴＴＡＣＴＴＡＴＡＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＣＴＡＴＴＴＧＣＧＧＴＡＧＴＧＡＧＧＧＧＡＴＴＴ（配列番号３１１）のヌクレオチド配列、もしくは実質的に同一の配列、またはＣＣＣＣＴＣＡＣＴＡＣＣＧＣＡＡＡＴＡＧＴＧＡＧＧＧＧＡＴＴＧＧＴＧＴＡＴＡＡＧＴＡＡＡＴＡＣＴＴＡＴＴＴＴＣＧＴＴＧＴ（配列番号２７３）のヌクレオチド配列、もしくは実質的に同一の配列を含み得る。
【０４０３】
抗毒素遺伝子は、ｓｐｒＡ２抗毒素またはｓｐｒＡ２（ＡＳ）であり得、ＴＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴＡＡＡＴＴＧＡＡＣＡＴＣＴＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＴＡＧＴＧＡＧＧＧＧＡＴＴＴＡＴＴ（配列番号３０６）のヌクレオチド配列、もしくは実質的に同一の配列、またはＴＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴＡＡＡＴＴＧＡＡＣＡＴＣＴＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＴＡＧＴＧＡＧＧＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＧＧＴＧＴＴＧＧＴＴＡ（配列番号３１２）のヌクレオチド配列、もしくは実質的に同一の配列を含み得る。
【０４０４】
抗毒素遺伝子は、ｓｐｒＦとしても知られるｓｐｒＧ抗毒素遺伝子であってもよく、（５’−３’）ＡＴＡＴＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＧＣＡＡＡＣＡＴＧＴＴＡＣＣＣＴＡＡＴＧＡＧＣＣＣＧＴＴＡＡＡＡＡＧＡＣＧＧＴＧＧＣＴＡＴＴＴＴＡＧＡＴＴＡＡＡＧＡＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＣＣＡＴＴＴＡＡＣＣＡＴＣＧＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＡＡＧＴＴＡＧＣＧＡＴＧＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴ（配列番号３０７）のヌクレオチド配列、または実質的に同一の配列を含み得る。Ｐｉｎｅｌ−Ｍａｒｉｅ，Ｍａｒｉｅ−Ｌａｕｒｅ，Ｒｅｇｉｎｅ  Ｂｒｉｅｌｌｅ，ａｎｄ  Ｂｒｉｃｅ  Ｆｅｌｄｅｎ．"Ｄｕａｌ  ｔｏｘｉｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ−ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮＡ  ｕｎｄｅｒ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｒｉｖａｌｓ  ｕｎｅｑｕａｌｌｙ．"  Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ７．２（２０１４）：４２４−４３５．
【０４０５】
抗毒素遺伝子は、ｙｏｅＢ毒素遺伝子のサイレンシングに特異的なｙｅｆＭ抗毒素遺伝子であり得る。ｙｅｆＭ抗毒素遺伝子は、ＭＩＩＴＳＰＴＥＡＲＫＤＦＹＱＬＬＫＮＶＮＮＮＨＥＰＩＹＩＳＧＮＮＡＥＮＮＡＶＩＩＧＬＥＤＷＫＳＩＱＥＴＩＹＬＥＳＴＧＴＭＤＫＶＲＥＲＥＫＤＮＳＧＴＴＮＩＤＤＩＤＷＤＮＬ（配列番号３１４）のヌクレオチド配列、または実質的に同一のヌクレオチドを含み得る。
【０４０６】
抗毒素遺伝子は、リゾスタフィン毒素遺伝子に特異的なリゾスタフィン抗毒素遺伝子であり得る。リゾスタフィン抗毒素は、ＴＡＴＡＡＴＴＧＡＧＡＴＡＴＧＴＴＣＡＴＧＴＧＴＴＡＴＴＴＡＣＴＴＡＴＡＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＣＴＡＴＴＴＧＣＧＧＴＡＧＴＧＡＧＧＧＧＡＴＴＴＴＴ（配列番号３１９）のヌクレオチド配列、または実質的に同一のヌクレオチド配列を含み得る。
【０４０７】
抗毒素遺伝子は、ｍａｚＦを標的とするｍａｚＥ抗毒素遺伝子であり得る。ｍａｚＥ毒素遺伝子は、ＡＴＧＴＴＡＴＣＴＴＴＴＡＧＴＣＡＡＡＡＴＡＧＡＡＧＴＣＡＴＡＧＣＴＴＡＧＡＡＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣＡＣＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＴＣＴＣＣＣＴＡＧＣＧＡＡＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＧＡＴＡＧＡＧＴＧＴＧＡＡＧＣＡＴＧＣＧＡＴＴＧＣＡＡＣＧＡＡＡＣＡＴＡＴＴＴＡＴＣＴＴＣＴＡＡＴＴＣ（配列番号３２２）のヌクレオチド配列、または実質的に同一配列を含み得る。
【０４０８】
代替的に、抗毒素遺伝子は、以下のように設計され得る。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓでは、遺伝子サイレンシングに使用される主な方法が２つある。ｓｐｒＡ１によって例示される遺伝子サイレンシングの１つのスタイルでは、アンチセンスＲＮＡが標的遺伝子の５’ＵＴＲに結合して、遺伝子の翻訳をブロックし、ｍＲＮＡの早期分解を引き起こす。別のスタイルの遺伝子サイレンシングは、終止コドンの近くに転写終結因子が配置されていない遺伝子に使用される。これらの遺伝子の翻訳は、標的遺伝子の３’末端に相補的なアンチセンスＲＮＡ（約３〜１０塩基）によって制御できる。アンチセンスＲＮＡは、最後の対のコドンをコードする配列をカバーするｍＲＮＡ転写産物に結合（ｂｉｎｄ）し、ＲＮａｓｅＩＩＩによる分解の標的となる二本鎖ＲＮＡを作成する。
【０４０９】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓには、標的遺伝子を制御する能力が実証されているＲＮＡサイレンシングの多くの例があるため、これらの領域と配列は、毒素／抗毒素カセットを設計するための基本として使用できる。このアプローチでは、ＤＮＡ配列の小さな変更のみが必要である。
【０４１０】
本開示において、細胞死遺伝子に対する抗毒素は、標的遺伝子の５’ＵＴＲへのアンチセンス結合を含むように設計され得る。毒素遺伝子はＰｅｐＡ１リーディングフレームに挿入することができ、内因性ｓｐｒＡ１アンチセンス内の１２ｂｐは、異種毒素遺伝子の開始に向かう１２ｂｐに相同な配列に交換される。
【０４１１】
一例では、ｓｐｒＡ１位置に挿入されたホリンは、によってコード化されるアンチセンスＲＮＡフラグメントによって制御することができる（太字で１２ｂｐのホリン標的配列）＝
【表１４】
2021505197.tif 000022
【０４１２】
別の例では、ｓｐｒＡ１位置に挿入された１８７−ｌｙｓＫは、によってコード化されるアンチセンスＲＮＡフラグメントによって制御することができる（太字で１２ｂｐの１８７−ｌｙｓＫ標的配列）＝
【表１５】
2021505197.tif 000023
【０４１３】
細胞死遺伝子に特異的な抗毒素は、毒素遺伝子の３’ＵＴＲへのアンチセンス結合を含む可能性がある。この方法では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのゲノムのｓｐｒＧの代わりに異種毒素を挿入し、最後の停止コドンの前にリジンコドン（ＡＡＡ）を追加する。コード領域の最後の６塩基（ＡＡＡＡＡＡ）と停止コドン（ＴＡＡ）は、内因性ｓｐｒＦ抗毒素の３’領域と重複している。ｓｐｒＦ  ＲＮＡが異種毒素遺伝子の２．５倍の速度で転写されると、それは毒素転写産物の３’ＵＴＲ領域と二重鎖を形成し、ＲＮａｓｅＩＩＩによる分解を開始し、機能性ペプチドの形成をブロックする。両方の異種毒素の３’末端は、内因性ｓｐｒＧの３’末端と同じであるｓｐｒＦ配列（ＴＡＡ停止コドンの前にコドンＡＡＡを付加）と重複するように同じ方法で操作されたため、抗毒素の配列は、これら３つの毒素遺伝子すべてについて同じままである。例えば、ｓｐｒＧ抗毒素遺伝子（ｓｐｒＦ）は、ヌクレオチド配列ＡＴＡＴＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＧＣＡＡＡＣＡＴＧＴＴＡＣＣＣＴＡＡＴＧＡＧＣＣＣＧＴＴＡＡＡＡＡＧＡＣＧＧＴＧＧＣＴＡＴＴＴＴＡＧＡＴＴＡＡＡＧＡＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＣＣＡＴＴＴＡＡＣＣＡＴＣＧＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＡＡＧＴＴＡＧＣＧＡＴＧＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴ（配列番号３１０）を含み得る。
【０４１４】
抗毒素遺伝子は、配列番号２７３、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１４、３１９、または３２２のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列、またはそれらの実質的に同一の配列を含み得る。
【０４１５】
抗毒素遺伝子は抗毒素ペプチドをコードしてもしなくてもよい。合成微生物がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株に由来する場合、抗毒素ペプチドは、細胞死遺伝子によってコードされる毒素ペプチドに特異的であり得る。例えば、毒素遺伝子がｙｏｅＢ毒素遺伝子である、例えば、配列番号３１６のアミノ酸配列を含む毒素ペプチドをコードする場合、抗毒素遺伝子は、ＭＩＩＴＳＰＴＥＡＲＫＤＦＹＱＬＬＫＮＶＮＮＮＨＥＰＩＹＩＳＧＮＮＡＥＮＮＡＶＩＩＧＬＥＤＷＫＳＩＱＥＴＩＹＬＥＳＴＧＴＭＤＫＶＲＥＲＥＫＤＮＳＧＴＴＮＩＤＤＩＤＷＤＮＬ（配列番号３１４）のアミノ酸配列または実質的に同様の配列を含むｙｅｆＭ抗毒素タンパク質をコードし得る。別の例として、毒素遺伝子がｍａｚＦ毒素遺伝子である、例えば、配列番号３２１のアミノ酸配列を含む毒素ペプチドをコードする場合、抗毒素遺伝子は、例えばＭＬＳＦＳＱＮＲＳＨＳＬＥＱＳＬＫＥＧＹＳＱＭＡＤＬＮＬＳＬＡＮＥＡＦＰＩＥＣＥＡＣＤＣＮＥＴＹＬＳＳＮＳＴＮＥ（配列番号３２３）のアミノ酸配列または実質的に同様の配列を含む抗毒素タンパク質をコードするｍａｚＥ抗毒素遺伝子であり得る。
【０４１６】
３つのＫＳ候補遺伝子は、３つの異なる方法で細胞死を誘発するため、特に興味深いものとして選択された。いくつかの実施形態では、合成微生物は、初期のデータが示すように最大の死亡率を達成するために、ｓｐｒＡ１、ｋｐｎＩまたはｒｓａＥのうちの１つ以上、２つ以上、またはそれぞれを含む。ｓｐｒＡ１の作用機序は、細孔形成ペプチドの発現による原形質膜の完全性／機能の喪失である。ｋｐｎＩの作用機序には、制限酵素によるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓゲノムの破壊が含まれる。ｒｓａＥの作用機序には、ＴＣＡサイクルおよびテトラヒドロ葉酸生合成を含む中枢代謝の障害が含まれる。
【０４１７】
いくつかの実施形態では、合成微生物は、細胞死遺伝子に作動可能に連結された第１のプロモーターを含む調節領域を含み、細胞死遺伝子は毒素ペプチドまたはタンパク質をコードし、第１のプロモーターは血液または血清への曝露時に上方制御される。細胞死遺伝子は、ｓｐｒＡ１遺伝子であり得る。ＳｐｒＡ１は、Ｓａｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  ＪＢＣ  ＶＯＬ．２８７，ＮＯ．５２，ｐｐ．４３４５４−４３４６３，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２１，２０１２に記載されるように、毒素ペプチドＰｅｐＡ１をエンコードする。ＰｅｐＡ１は、膜透過化により細胞死を誘導する。ＰｅｐＡ１は、ＭＬＩＦＶＨＩＩＡＰＶＩＳＧＣＡＩＡＦＦＳＹＷＬＳＲＲＮＴＫ配列番号１０４のアミノ酸配列を有する。関連する抗菌ペプチドには、ＭＭＬＩＦＶＨＩＩＡＰＶＩＳＧＣＡＩＡＦＦＳＹＷＬＳＲＲＮＴＫ（配列番号１０５）、ＡＩＡＦＦＳＹＷＬＳＲＲＮＴＫ（配列番号１０６）、ＩＡＦＦＳＹＷＬＳＲＲＮＴＫ（配列番号１０７）、ＡＦＦＳＹＷＬＳＲＲＮＴＫ（配列番号１０８）、ＦＦＳＹＷＬＳＲＲＮＴＫ（配列番号１０９）、ＦＳＹＷＬＳＲＲＮＴＫ（配列番号１１０）、ＳＹＷＬＳＲＲＮＴＫ（配列番号１１１）、またはＹＷＬＳＲＲＮＴＫ（配列番号１１２）が含まれ、これは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０５０５９０に記載されている。細胞死遺伝子は、ｓｐｒＡ２遺伝子であり得る。ｓｐｒＡ２遺伝子は毒素ＭＦＮＬＬＩＮＩＭＴＳＡＬＳＧＣＬＶＡＦＦＡＨＷＬＲＴＲＮＮＫＫＧＤＫ（配列番号３０５）をコードし得る。細胞死遺伝子は、ＭＳＮＹＴＶＫＩＫＮＳＡＫＳＤＬＲＫＩＫＨＳＹＬＫＫＳＦＬＥＩＶＥＴＬＫＮＤＰＹＫＩＴＱＳＦＥＫＬＥＰＫＹＬＥＲＹＳＲＲＩＮＨＱＨＲＶＶＹＴＶＤＤＲＮＫＥＶＬＩＬＳＡＷＳＨＹＤ（配列番号３１６）のアミノ酸配列または実質的に類似した配列を有するｙｏｅＢ毒素をコードし得るＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのｙｏｅＢ遺伝子であり得る。ＭＴＨＥＨＳＡＱＷＬＮＮＹＫＫＧＹＧＹＧＰＹＰＬＧＩＮＧＧＭＨＹＧＶＤＦＦＭＮＩＧＴＰＶＫＡＩＳＳＧＫＩＶＥＡＧＷＳＮＹＧＧＧＮＱＩＧＬＩＥＮＤＧＶＨＲＱＷＹＭＨＬＳＫＹＮＶＫＶＧＤＹＶＫＡＧＱＩＩＧＷＳＧＳＴＧＹＳＴＡＰＨＬＨＦＱＲＭＶＮＳＦＳＮＳＴＡＱＤＰＭＰＦＬＫＳＡＧＹＧＫＡＧＧＴＶＴＰＴＰＮＴＧＷＫＴＮＫＹＧＴＬＹＫＳＥＳＡＳＦＴＰＮＴＤＩＩＴＲＴＴＧＰＦＲＳＭＰＱＳＧＶＬＫＡＧＱＴＩＨＹＤＥＶＭＫＱＤＧＨＶＷＶＧＹＴＧＮＳＧＱＲＩＹＬＰＶＲＴＷＮＫＳＴＮＴＬＧＶＬＷＧＴＩＫ（配列番号３１８）のアミノ酸配列または実質的に類似の配列を有するメタロペプチダーゼ毒素遺伝子をコードし得るＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ遺伝子であり得る。細胞死遺伝子は、ＭＩＲＲＧＤＶＹＬＡＤＬＳＰＶＱＧＳＥＱＧＧＶＲＰＶＶＩＩＱＮＤＴＧＮＫＹＳＰＴＶＩＶＡＡＩＴＧＲＩＮＫＡＫＩＰＴＨＶＥＩＥＫＫＫＹＫＬＤＫＤＳＶＩＬＬＥＱＩＲＴＬＤＫＫＲＬＫＥＫＬＴＹＬＳＤＤＫＭＫＥＶＤＮＡＬＭＩＳＬＧＬＮＡＶＡＨＱＫＮ（配列番号３２１）のアミノ酸配列または実質的に類似の配列を含むｍａｚＦ毒素をコードするｍａｚＦ毒素遺伝子であり得る。
【０４１８】
細胞死遺伝子は、配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、２８５、２８７、２８９、２９１、３０５、３１６、３１８、もしくは３２１のアミノ酸配列、または実質的に類似のアミノ酸配列を含む毒素ペプチドまたはタンパク質をコードし得る。好ましくは、第１のプロモーターは、血液または血清が存在しない場合、サイレントであるか、非活性であるか、または最小活性である。
【０４１９】
ＰｅｐＡ１は、必須の細胞膜機能を変化させることによりＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの死を引き起こす毒性の孔形成ペプチドである。その天然の役割は不明であるが、環境状態によって悪影響を受ける細胞を殺傷することにより、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの集団／培養に対する利他的な支援であると推測されている。この遺伝子を過剰発現させることにより、血清の存在下で迅速かつ完全な細胞死が起こる。注目すべきことに、ｓｐｒＡ１  ｍＲＮＡの翻訳は、ｓｐｒＡ１１（ＳｐｒＡ１アンチセンス）と呼ばれるアンチセンスＲＮＡによって抑制される。シスにコードされたＳｐｒＡ１AS  ＲＮＡは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０５０５９０に記載されているように、ｉｎ  ｖｉｖｏでｓｐｒＡ１にコードされたペプチド発現を下方制御するようにトランスで作動する。アンチセンスＲＮＡは、実際には「漏出性」毒性を最小限に抑えるための便利な保護手段である可能性がある。それはコロニー化の間にヒトの皮膚と鼻上皮上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓで発現するプロモーターから駆動される。ｓｐｒＡ１の利点には、既知の構造と活性を持つ低分子ペプチドの発現が含まれる。
【０４２０】
特定の実施形態では、配列番号１、２、３、４、５、６、１１４、１１５、１１９、１２０、１２１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、  １４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、または１６３のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む血液および／または血清誘導性の第１のプロモーターを含む第１の調節領域に作動可能に連結された第１の細胞死遺伝子ｓｐｒＡ１を含む合成微生物が提供される。第１のプロモーターは、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０、または２４０分の血液または血清中でのインキュベーションの後に、５倍超、１０倍超、５０倍超、１００倍超、３００倍超、または６００倍超に上方制御され得る。第１のプロモーターは、血清中の９０分間のインキュベーション後に５倍以上上方制御され得、ｆｈｕＡ、ｆｈｕＢ、ｉｓｄＩ、ｉｓｄＡ、ｓｒｔＢ、ｉｓｄＧ、ｓｂｎＥ、ｓｂｎＡ、ｓｂｎＣ、およびｉｓｄＢから選択できる。第１のプロモーターは、血清中の９０分間のインキュベーション後に１００倍以上上方制御され得、ｉｓｄＡ、ｓｒｔＢ、ｉｓｄＧ、ｓｂｎＥ、ｓｂｎＡ、ｓｂｎＣ、およびｉｓｄＢから選択できる。
【０４２１】
細胞死遺伝子は、配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、２８５、２８７、２８９、２９１、３０５、３１６、３１８、もしくは３２１のアミノ酸配列、またはそれらの実質的に類似のアミノ酸配列を含む抗菌ペプチドをコードし得る。
【０４２２】
細胞死遺伝子は、任意の既知のブドウ球菌属の毒素遺伝子から選択され得る。細胞死遺伝子は、ｓｐｒＡ１毒素遺伝子、ｓｐｒＡ２毒素遺伝子、１８７−ｌｙｓＫ毒素遺伝子、ホリン毒素遺伝子、ｓｐｒＧ毒素遺伝子、ｙｏｅＢ毒素遺伝子、リゾスタフィン毒素遺伝子、メタロペプチダーゼ毒素遺伝子、もしくはｍａｚＦ毒素遺伝子、または実質的に同一の毒素遺伝子から選択され得る。毒素遺伝子は、配列番号２７４、２７５、２８４、２８６、２８８、２９０、３０４、３１５、３１７、もしくは３２０のヌクレオチド配列、またはそれらの実質的に同一のヌクレオチド配列を含み得る。
【０４２３】
細胞死遺伝子は、抗菌ペプチドＰｅｐＡ１をコードするｓｐｒＡ１であり得る。いくつかの実施形態では、合成微生物は、配列番号７、１１７、１１８、１２９、もしくは１３０のヌクレオチド配列、または実質的に同一の配列を含むｃｌｆＢのヌクレオチド配列を含む第２のプロモーターを含む第２の調節領域に作動可能に連結された抗毒素遺伝子ＳｐｒＡ１−ＡＳをさらに含む。
【０４２４】
いくつかの一部の実施形態では、合成微生物は、制限酵素ＫｐｎＩ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｍｏｎｉａｅ）遺伝子を含む。ＫｐｎＩは、外来ＤＮＡによる侵入から細菌ゲノムを保護する。（例えば）６ｂｐ認識制限酵素ＫｐｎＩの高レベル発現は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓゲノムを効率的に切断する。いくつかの実施形態では、発現ベクター（下記）は、（例えば）コドン使用頻度の調整によって切断認識部位を欠くように操作される。６塩基の認識配列は４０９６ｂｐごとに１回発生し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの２．８  ＭＢのゲノムを約６８４個の断片に切断する。ＫｐｎＩには、迅速な活性という利点がある。いくつかの実施形態では、「漏出性」発現の問題は、ｓｐｒＡ１について上述したように、クランプとしてＲＮＡアプタマーを発現させることによって管理することができる。
【０４２５】
いくつかの実施形態では、合成微生物は、ｒｓａＥ遺伝子を含む。ｒｓａＥ遺伝子は、ＴＨＦ生合成経路とクエン酸回路の酵素をコードする特定のハウスキーピングｍＲＮＡの翻訳開始を標的とすることにより、２つの異なる代謝経路を協調的に阻害する小型ＲＮＡ（９３ｎｔ）であり、高レベルの発現は毒性である。ＲｓｅＥを過剰発現させることにより、必須のハウスキーピング酵素の阻害により増殖障害が発生する。これは、リボソーム結合部位と開始コドン領域のＯｐｐ３ＡおよびＯｐｐＢ  ｍＲＮＡに結合することで発生し、翻訳が妨げられる。両方の遺伝子は、ＡＢＣペプチドトランスポーターシステムのコンポーネントをコードし、細胞内の必須の窒素／アミノ酸の供給に影響を及ぼし、直接的および間接的に中心的な生化学的代謝を損なう。単一のｓＲＮＡが複数の重要な生化学的経路の発現を損なうため、利点には、深刻な成長阻害（空のベクター対照に対して１０，０００倍）、および効率的な多機能性が含まれる。Ｇｅｉｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９およびＢｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０は、ＲｓａＥの天然の機能について報告している。
【０４２６】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓでの発現のための血清活性化キルスイッチ（ＫＳ）プラスミド候補のパネルの作成が行われ、血清応答性ＲＲがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓシャトルベクターにサブクローニングされる。細胞死遺伝子はＲＲの下流に挿入され、シーケンシングされる。漏出性発現抑制因子「発現クランプ」の実現可能性が試験される。候補株を完成させて評価し、迅速かつ完全な死と良好な基礎生存率を示すリード候補（複数可）を選択する。
【０４２７】
最適なキルスイッチ候補の染色体組み込みは、長期の安定した発現にとって重要である。さらに、死亡率の程度とｉｎ  ｖｉｔｒｏでの株の安定性の比較が行われる。３つまでの最適なキルスイッチカセットのみの挿入、および２つの３種類の組み合わせで、合計６つの株までの挿入が実行される。この達成には、コンストラクトを構築するためにＥ．ｃｏｌｉでの多段階クローニングが必要になる場合がある。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＣ１０Ｂを使用することができる。ＤＣ１０Ｂは、ＤＣＭマイナス（ＢＥＩ製品番号ＮＲ−４９８０４）のみのＥ．ｃｏｌｉ株である。これは、ほとんどのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株に容易にトランスフェクトできるＤＮＡを生成する１つの方法である。この目的のために、安定した組み込み体が得られ、カウンター選択中にプラスミドベクターが切除される。血清誘発性細胞死の割合と程度が確認され、特徴付けられており、遺伝的安定性は全６株について決定される。好ましいＫＳ株候補の非ヒト機能試験は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの株死の機能試験、およびコロニー化皮膚ディスクの機能試験含めて行われる。
【０４２８】
いくつかの実施形態では、ＢｉｏＰｌｘ−０１から合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株を調製する方法であって、（１）Ｅ．ｃｏｌｉ中で中規模でシャトルベクターｐＣＮ５１を生成することと、（２）Ｅ．ｃｏｌｉ中でｐＣＮ５１に細胞死遺伝子をＣｄ誘導性プロモーターＰcadの下にクローニングすることと、（３）Ｐcadを血清応答性プロモーターで置き換えて、任意選択的に発現クランプを挿入することと、（４）ＫＳカセットをシーケンシングして構造を確認することと、（５）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０にエレクトロポレーションし、エリスロマイシンプレート上の形質転換体を選択することと（この株は制限マイナスであり、ＢｉｏＰｌｘ−０１で生き残るための正しいメチル化パターンを生成する）、（６）ＲＮ４２２０からプラスミドを調製し、識別を確認する制限消化することと、（７）ＢｉｏＰｌｘ−０１にプラスミドをエレクトロポレーションし、エリスロマイシンプレートで選択することと、（８）菌株を分離することと、を含む、方法が提供される。この方法で製造された株は、性能試験および血清実験の準備ができている。この方法は、本明細書でさらに詳細に説明される。
【０４２９】
いくつかの実施形態では、ＢｉｏＰｌｘ−０１からの合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株の性能試験方法であって、（１）プラスミドの選択圧としてＴＳＢ＋抗生物質中で増殖することと、（２）増殖をＷＴ  ＢｉｏＰｌｘ−０１と比較して、任意選択的に増殖曲線を生成することと、（３ａ）Ｃｄプロモーターバリアントの場合は、洗浄して細胞をＣｄ培地に移行すること（対照は細胞死遺伝子のない空のベクターを含むＢｉｏＰｌｘ−０１）−または−（３ｂ）ＫＳバリアントの場合は、洗浄して細胞を血清に移行することと（対照は細胞死遺伝子のない空のベクターを含むＷＴ  ＢｉｏＰｌｘ−０１）と、（４）プレートリーダーでＯＤ630nmを使用して増殖をモニタリングし、任意選択的にエスケープ変異体をモニタリングして長期間観察することと、を含む、方法が提供される。全血検査の場合、この方法は、好ましい候補に対してのみ行われ、ＴＳＡ上のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を死の読み出しとして使用する。それらが血液に曝露された後にコロニーがキルスイッチ担持株上に形成される場合、変異をチェックするためにプラスミドをシーケンシングする必要がある。エスケープ変異体がある場合は、プラスミドをＥ．ｃｏｌｉにシャトルし、プラスミド全体をシーケンシングする。
【０４３０】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）での発現のための血清活性化キルスイッチ（ＫＳ）プラスミド候補の作成方法
細胞死誘導の評価のための方法が提供され、遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ−ＳＡシャトルベクターにクローニングすることと、評価のためにこのベクターをＢｉｏＰｌｘ−０１にトランスフェクトすることとを含む合成微生物の組換え構築が含まれる。
【０４３１】
ステップ１：Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＰＣＮ５１を要求する
ＰＣＮ５１（ＢＥＩ経由で入手可能）などの市販のシャトルベクターが得られる。これには次のものが含まれているため、優れた選択肢の１つである：ｉ）毒素が発現して機能していることを証明するために陽性対照株で使用できるカドミウム誘導プロモーター、ｉｉ）我々のすべてのコンストラクトに適用される汎用の転写終結因子（ＴＴ）、ｉｉｉ）Ｅ．ｃｏｌｉとＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの確立されたレプリコン。市販のシャトルベクターｐＣＮ５１（ＢＥＩカタログ番号ＮＲ−４６１４９）の概略図を図２に示す。ｐＣＮ５１シャトルプラスミドの遺伝的要素を表８に示す。
【表１６】
2021505197.tif 000024
【０４３２】
開発に使用したプロモーター配列（７）を以下に示す。ｌｅｕＡ、ｈｌｇＡ、およびカドミウムプロモーターの塩基対番号は、ｐＣＮ５１ベクターの位置に対応している。
【０４３３】
１．ゲノムＢｉｏＰｌｘ−０１（５０２ａ）ＤＮＡから増幅された制限部位ＳｐｈＩとＰｓｔＩ（下線）間のｌｅｕＡプロモーター（ＰleuA）配列。
【表１７】
2021505197.tif 000025
【０４３４】
２．ゲノムＢｉｏＰｌｘ−０１（５０２ａ）ＤＮＡから増幅された制限部位ＳｐｈＩとＰｓｔＩの間のｈｌｇＡプロモーター（ＰhlgA）配列。
【表１８】
2021505197.tif 000026
【０４３５】
３．制限部位ＳｐｈＩとＰｓｔＩの間のカドミウムプロモーター（Ｐcad）配列。このプロモーターは対照に使用され、ＢＥＩ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｅｉｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．ｏｒｇ／）のオリジナルのｐＣＮ５１ベクターの一部である。
【表１９】
2021505197.tif 000027
【０４３６】
４．アンチセンス調節ＲＮＡ  ｓｐｒＡ１ASを駆動するｃｌｆＢプロモーター（ＰclfB）。これは、ＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位の順方向配列である。この配列は逆向きに配置され、ｓｐｒＡ１ASを駆動してクランプとして機能し、血液のない状態でｓｐｒＡＩ遺伝子を調節し続ける。下線は、それぞれＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を表す。
【表２０】
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【０４３７】
ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを逆にしたｐＣＮ５１ベクターにクローニングされたＰclfB。
【表２１】
2021505197.tif 000029
【０４３８】
５．ＮＣＢＩ  ５０２ａ完全ゲノムに見られるｓｉｒＡプロモーター（ＰsirA）。この配列は、下線が引かれたように、ｓｉｒＡ開始コドンの３００塩基対上流で取得された。
【表２２】
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【０４３９】
６．．ＮＣＢＩ  ５０２ａ完全ゲノムに見られるｓｓｔＡプロモーター（ＰsstA）。この配列は、下線が引かれたように、ｓｓｔＡ開始コドンの３００塩基対上流で取得された。
【表２３】
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【０４４０】
７．ｉｓｄＡプロモーター（ＰisdA）。この配列は、ＮＣＢＩ  ５０２ａ完全ゲノムから下線が引かれたようにＳｓｔＡ開始部位の３００塩基対上流で取得された。
【表２４】
2021505197.tif 000032
【０４４１】
いくつかの実施形態では、配列番号１１４、１１５、１１９、１２０、１２１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、および１６３からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または実質的に同一のヌクレオチド配列を含む誘導性血液または血清応答性の第１のプロモーターに作動可能に連結された細胞死遺伝子を含む分子改変を含むプラスミド、ベクター、または合成微生物が提供される。いくつかの実施形態では、分子改変は、配列番号７、１１７、１１８、１２９、または１３０から選択されるヌクレオチド配列を含む第２のプロモーターに作動可能に連結された抗毒素遺伝子を含む発現クランプをさらに含む。
【０４４２】
ステップ２：最良の２つの血清応答性ＲＲをシャトルベクター（Ｅ．ｃｏｌｉ宿主）にクローニングする
候補の血清応答性ＲＲのシャトルベクター（Ｅ．ｃｏｌｉ宿主）へのクローニングには、次のものが含まれる：（ａ）ＢｉｏＰｌｘ−０１ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）からの２つの好ましい血清応答性ＲＲのＰＣＲ増幅、（ｂ）カドミウム誘導性プロモーターをｐＣＮ５１のこれらのＲＲフラグメントで置き換えて、２つの新しいプラスミド（ＲＲ１およびＲＲ２）を作成する、（３）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ（またはＤＨ５α）でクローンを選択し、挿入のシーケンシングを行う。
【０４４３】
以下のＫＳ遺伝子は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのｇＤＮＡから、またはデノボ合成によって得られる：（ｉ）ｓｐｒＡ１／ｓｐｒＡ１AS：合成、（ｉｉ）ＲｓａＥ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡ、（ｉｉｉ）ＫｐｎＩ：合成。ｇＤＮＡから増幅された遺伝子の場合、ＰＣＲプライマーがクローニングに関連する制限酵素とともに使用される。合成遺伝子の場合、クローニング部位は合成時に含まれ、任意の望ましくない部位は構築中に削除される。たとえば、自己消化を防ぐために、ＫｐｎＩ部位はｋｐｎ１カセットから削除される。ＫＳ遺伝子は、プラスミドＲＲ１およびＲＲ２の血清応答性ＲＲの下流に挿入され、以下に示すすべてのコンストラクトを生成する。陽性対照コンストラクトを作成するには、ｐＣＮ５１中でＣｄ誘導性プロモーターの下流にＫＳ遺伝子を挿入する。これらのステップに有用な、本明細書で提供される追加の関連配列およびプライマー配列、例えば、表２、３、および４を参照されたい。すべてのコンストラクトのプロモーターとインサートのシーケンシングを行い、構築プロセスで変異が蓄積されていないことを確認する。
【０４４４】
作成されるプラスミドコンストラクトのリストを以下に示す。２、４、８、１１以外はすべてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにトランスフェクトされる。
１．ＣＤ誘導性プロモーター−ｓｐｒＡ１
２．Ｃｄ誘導性プロモーター逆方向ｓｐｒＡ１
３．血清応答性ＲＲ１−ｓｐｒＡ１
４．血清応答性ＲＲ１逆方向ｓｐｒＡ１
５．血清応答性ＲＲ１−ｓｐｒＡ１＋ＰclfB−ｓｐｒＡ１AS
６．血清応答性ＲＲ２−ｓｐｒＡ１
７．血清応答性ＲＲ１−ｒｓａＥ
８．血清応答性ＲＲ１−ｒｓａＥ−逆方向
９．血清応答性ＲＲ２−ｒｓａＥ
１０．血清応答性ＲＲ１−ｋｐｎＩ
１１．血清応答性ＲＲ１−ｋｐｎＩ逆方向
１２．血清応答性ＲＲ２−ｋｐｎＩ
細胞死遺伝子が増殖培地中でさえいくつかの基礎毒性を有する場合、順方向コンストラクトを得ることができない可能性があるため、逆方向コンストラクトがこのプロセスで作成される。このような否定的な結果は、逆方向のコンストラクトが並列して簡単に得られない限り、決定的なものではない。
【０４４５】
ステップ３：プラスミドを中間のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０にトランスフェクトする（正しいＤＮＡメチル化パターンを取得するため）。逆方向コンストラクトをトランスフェクトする必要はない。しかし、ｐＣＮ５１空ベクターのトランスフェクションは次のように行われる：
Ａ．ＲＮ４２２０にエレクトロポレーションする、
Ｂ．エリスロマイシンを含むプレートで形質転換体を選択する、
Ｃ．プラスミドＩＤを単離し、制限消化で確認する。
【０４４６】
ステップ４：ＢｉｏＰｌｘ−０１にトランスフェクションする
Ａ．ステップ３ＣからのプラスミドをコンピテントなＢｉｏＰｌｘ−０１にエレクトロポレートする、
Ｂ．エリスロマイシン耐性によって形質転換体を選択する、
Ｃ．プラスミドＩＤを単離し、制限酵素消化で確認する、９株のストックを保存する。
【０４４７】
ステップ５：ＫＳの発現と、血清および血液への曝露に対する応答の程度と死亡率を試験する
Ａ．血中／血清中の曝露前後のリアルタイムＰＣＲによるキル遺伝子の発現の定性的試験。これにより、ｉ）株構築を確認する、ｉｉ）毒素産生の開始と死亡の開始を相関させる、ｉｉｉ）ＫＳの文脈でプロモーターの「漏出性」を判定する。
Ｂ．ＴＳＢと比較した血清／血液中の細胞死誘導曲線（殺傷の程度とＣＦＵによる動態）；そして
Ｃ．空のベクターを含むＢｉｏＰｌｘ−０１とＫＳプラスミドを使用したＢｉｏＰｌｘ−０１の単純な増殖率の比較。
【０４４８】
ステップ６：ＫＳ変異の割合を測定する
連続継代により、血清または血液寒天プレート上および／または血清含有液体培地で数百世代にわたって増殖するコロニーを計数する。変異率が許容できるかどうかを判断する。ＫＳ機能の喪失率は、ＫＳ遺伝子の１コピーでは１０-6であるが、２つの異なるプロモーターからの同じまたは異なるＫＳ遺伝子の２コピーでは１０-10と低いことが報告されている（Ｋｎｕｄｓｅｎ  １９９５；実際の変異率のアッセイ測定）。
【０４４９】
ステップ７：分析と解釈
最良のＫＳ株（複数可）は、増殖率（およびコロニー形成の能力）に影響を与えない株である。そして、それは血液および／または血清に応答して急速かつ完全な死を示す。そしてそれは安定した分子改変を有する。
【０４５０】
ステップ８：複数のＫＳカセットを挿入する必要性を判断する
１つのＫＳの分子安定性が不十分とみなされた場合、９つの候補のリストから２番目の異なる機能的なＫＳ（別の機能的なものが存在する場合）がプラスミドに追加され、殺傷と安定性の再試験が行われる。ＫＳ安定性の劇的な改善は、Ｋｎｕｄｓｅｎ  １９９５および理論計算に基づいて予想される。
【０４５１】
長期安定発現のための最適なキルスイッチの染色体組み込み方法
最適な血清／血液応答性ＫＳコンストラクト（複数可）は、特に細胞の生物学を変化させることなく挿入を許容することが知られている事前に選択された場所で正確に染色体に組み込まれる。
【０４５２】
ステップ１：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓで使用する組み込みベクターを取得する。
最適な組み込みベクターを注意深く検討した後、プラスミドｐＫＯＲ１またはｐＩＭＡＹを使用できる。これらは、組み込み部位を選択する機能を提供するため、他の方法で発生する可能性があるゲノムの生物学的に重要な領域の混乱を回避できるためである。両方のベクターは、逆選択のための便利な手段（ｓｅｃＹ）を備えているため、ＫＳが組み込まれた後、プラスミドバックボーンとそのマーカーをゲノムから削除できる。ｐＫＯＲ１の遺伝地図を図５Ａに示し、特徴はＢａｅ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｐｌａｓｍｉｄ  ５５，ｐｐ．５８−６３に記載されており、表９に簡単に記載されている。ｐＫＯＲの利点は、特定の制限酵素の制限なしにインサートをクローニングできる能力である。
【表２５】
2021505197.tif 000033
【０４５３】
ｐＩＭＡＹの遺伝地図は、Ｍｏｎｋ，ＩＲ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＢｉｏ  ２０１２；  ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．００２７７−１１からであり、図５Ｂに示される。図１２Ａ〜１２Ｃは、ｐＩＭＡＹ組み込みプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１３１）を示す。（受託番号ＪＱ６２１９８）。Ｅ．ｃｏｌｉ／ブドウ球菌の温度感受性プラスミドｐＩＭＡＹｚは、低コピー数のＥ．ｃｏｌｉ複製起点（ｐ１５Ａ）、接合伝達の起点（ｏｒｉＴ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔマルチクローニング部位（ＭＣＳ）、およびｐＩＭＣに由来する高発現したｃａｔ遺伝子（Ｐｈｅｌｐ−ｃａｔ）を含む。グラム陽性菌の温度感受性レプリコン（ｒｅｐＢＣＡＤ）およびアンヒドロテトラサイクリン誘導性アンチセンスｓｅｃＹ領域（ａｎｔｉ−ｓｅｃＹ）は、それぞれｐＶＥ６００７およびｐＫＯＲ１から増幅できる。列挙されている制限部位は固有である。プライマー（ＩＭ１５１／１５２）は、ｐＩＭＡＹのＭＣＳの外部に結合し、Ｅ．ｃｏｌｉでのクローンのスクリーニング（クローニングされたインサートなしで２８３ｂｐを増幅する）および、ブドウ球菌での複製プラスミドの存在の判定に使用される。ｐＩＭＡＹｚの利点は、サイズが小さく、青白のスクリーニングが可能で、非許容温度が低いことである。これにより、組み込みプロセスで発生する可能性のある変異を回避することが報告されている。したがって、このプラスミドは、契約業者会社での新規遺伝子合成によって作成することができる。
【０４５４】
ステップ２ＢｉｏＰｌｘ−０１で選択可能なマーカーを確認する。
ＢｉｏＰｌｘ−０１は、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）、およびエリスロマイシンに感受性である（Ｄｒｕｒｙ  １９６５）。一実施形態では、クロラムフェニコール（ｃａｔ＋）遺伝子を使用して、組み込みプロセス中にクロラムフェニコールプレート上の形質転換体を選択する。
【０４５５】
ステップ３組み込まれるＤＮＡフラグメントを生成する。
次のエレメントをタンデムに含むシャトルベクターｐＴＫ１でプラスミドを調製する：［ａＴＴＢ２］−［置き換える標的領域の上流の１Ｋｂの配列］−［ＫＳカセット−ＡｍｐＲ］−［標的領域の下流の１Ｋｂの配列］Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６の改変によるＡＴＴＢ１。制限酵素でこのプラスミドからフラグメントを削除し、それを単離する。「ＫＳカセット」は、実際にはＫＳの１つまたは２つのコピーであってよいが、遺伝的安定性試験の結果は保留されている。
【０４５６】
ステップ４ＫＳカセット（複数可）をｐＫＯＲプラスミドに挿入する。
プラスミドＰＫＯＲ１を使用してステップ３のフラグメントのｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えを行い、組換え混合物をＤＨ５αにトランスフェクトし、制限マッピングを使用してＥ．ｃｏｌｉで標準的なスクリーニング方法により目的のプラスミドコンストラクトを取得し、構築を確認する。
【０４５７】
ステップ５ＢｉｏＰｌｘ−０１中に組み込みプラスミドを含むＫＳ株を取得する
ＲＮ４２２０にプラスミドをエレクトロポレーションする。このようにトランスフェクトされたＲＮ４２２０からプラスミドＤＮＡを単離し、このＤＮＡをＢｉｏＰｌｘ−０１にエレクトロポレーションし、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含むＴＳＡプレートで形質転換体を選択する。
【０４５８】
ステップ６染色体へのプラスミド組み込み
菌を非許容温度（４３℃）に移行して、標的部位へのプラスミド組み込みを促進し、クロラムフェニコールプレート（１０μｇ／ｍＬ）でコロニーを選択する。
【０４５９】
ステップ７プラスミドバックボーンを排除するためのカウンター選択
許容温度（３０℃）でステップ６からのコロニー分離株を増殖させ、プラスミドの切除を促進し、２μｇ／ｍＬおよび３μｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）寒天上に播種して、標的遺伝子が組み込まれ、プラスミドが削除および失われたコロニーを取得する（逆選択ステップ）。２μｇ／ｍＬ以上のａＴｃを含むプレートで増殖する任意のコロニーにはプラスミドが含まれていない。これは、プラスミドバックボーンが致命的なａＴｃ抑制解除可能なＳｅｃＹアンチセンス遺伝子が含まれているためである。
【０４６０】
ステップ８組み込まれた対立遺伝子配列を確認する
ＫＳ株からゲノムＤＮＡを単離し、ノックインカセットと隣接構造をＰＣＲ（およびＰＣＲアンプリコンのシーケンシング）で確認する。
【０４６１】
ステップ９血清誘導性細胞死を確認する
確認したら、まずＴＳＢ中で細胞を増殖させ、次にヒトの血液または血清に移行して、ＴＳＡ中でのＣＦＵプレーティングアッセイにより死亡率を決定することにより、細胞死率アッセイを実施する（１０日間）。
【０４６２】
ステップ１０ＫＳ  ｍＲＮＡの発現を確認する
血液、血清、ＴＳＢ中における標的遺伝子の発現変化を確認する。
【０４６３】
ステップ１１冷凍保存を調製する
これらの方法で作成された合成微生物ＢｉｏＰｌｘ−ＸＸによって動物実験を行うことができる。キルスイッチ株機能を試験するためのＩｎ  ｖｉｖｏ機能研究が行うことができる。可能な研究には、ｗｔ  ＢｉｏＰｌｘ−０１対ＫＳ株の静脈内または腹腔内注射の病原性の違いを示すためのマウス研究が含まれる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ皮膚コロニー化試験も行わうことができる。マウスでの追加の試験には、ＬＤ50試験が含まれ、ＢｉｏＰｌｘ−０１対ＢｉｏＰｌｘ−ＸＸが行われる。別の例として、ラットまたはその他の：コロニー形成試験では、ＢｉｏＰｌｘ−０１対ＢｉｏＰｌｘ−ＸＸが行われる。
【０４６４】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは、長期安定発現のための最適なキルスイッチ候補の挿入を指示する相同組換え修復を誘導した
いくつかの実施形態では、ＢｉｏＰｌｘ−０１から合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株を調製する方法が提供され、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ誘導相同組換え修復を使用して、長期安定発現のための最適なＫＳ候補の直接挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＢｉｏＰｌｘ−０１から合成黄色ブドウ球菌株を調製する方法であって、（１）コンピテントセルを取得することと、（２）ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列の設計および試験を行うこと、および同時にｐＣａｓＳＡを試験することと、（３）構成的レポーターによって制御される蛍光レポーターを使用して相同性依存修復テンプレートを設計および試験することと、（４）蛍光レポーターでＫＳプロモーターを確認することと、（５）ＫＳをＢｉｏＰｌｘ−０１に挿入して組み込みを検証することと、（６）有効性と寿命を試験することと、を含む、方法が提供される。任意選択的に、追加のＫＳカセットをＢｉｏＰｌｘ−０１ゲノム内の別の場所に挿入することも行われる。
【０４６５】
図１０は、ＣＲＩＳＰＲを介する組み込み用カセットとｐＣａｓＳＡベクターのレイアウトを示す。Ｐｃａｐ１Ａは、ｇＲＮＡ転写を制御する構成的プロモーターである。Ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑは、たとえば１０の可能な切断標的（１．１、１．２など）を持つ標的配列である。ｇＲＮＡは一本鎖ガイドＲＮＡである（構造コンポーネントを提供する）。Ｘｂａ１とＸｈｏ１は、ホモロジーアーム（ＨＡ）をｐＣａｓＳＡベクターに付加するために使用される２つの制限部位である。ＨＡは相同組換え修復のテンプレートとして使用するホモロジーアームである（２００〜１０００ｂｐ）。ＰrpsL−ｍＣｈｅｒｒｙは、「最適化された」ｍＣｈｅｒｒｙを制御する構成的プロモーターである。ＰrpsL−Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９タンパク質の発現を制御する構成的プロモーターである。
【０４６６】
図１１は、本開示で様々に使用するためのベクターを示す。Ａは、ｐＣＮ５１を使用した蛍光によるプロモータースクリーニングに使用されるベクターである。Ｂは、細胞死遺伝子を含むプロモータースクリーニング用のベクターである。Ｃは、ＣＲＩＳＰＲを使用した染色体組み込み用のベクターである。Ｄは、相同組換えを用いた染色体組み込み用ベクターである。ＬおよびＲのＨＡ：ゲノム標的遺伝子座に対する相同性アーム、ＣＲＩＳＰＲ標的化：ゲノム遺伝子座に対するＲＮＡガイド、ｍＣｈｅｒｒｙ：蛍光レポータータンパク質、Ｃａｓ９タンパク質：ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ｋａｎＲ：カナマイシン耐性、ｏｒｉＴ：転移の起点（組み込み用）、およびＳｍａ１：代表的なキル遺伝子（制限エンドヌクレアーゼ）。
【０４６７】
投与および組成物
いくつかの実施形態では、合成微生物と、賦形剤または担体と、を含む組成物が提供される。組成物は、適切な担体マトリックス内で、経口、静脈内、口腔内、経鼻、粘膜、真皮または他の方法を含む、それらの特定の免疫原性または生物学的または免疫学的反応特性に適した任意の方法で投与できる。一実施形態では、組成物は、対象の真皮部位および／または粘膜部位への局所投与のために提供される。別の特定の実施形態は、本開示の組成物の経口投与を含む。
【０４６８】
いくつかの実施形態では、置き換えステップは、少なくとも１回の宿主対象部位、および任意選択的に対象の隣接領域の真皮または粘膜に、１回以下、２回以下、または３回以下、合成株を局所投与することを含む。投与は、対象の少なくとも１つの部位に対する、少なくとも１０6、少なくとも１０7、少なくとも１０8、少なくとも１０9、または少なくとも１０10ＣＦＵの合成株と、薬学的に許容される担体と、を含む組成物の最初の局所投与を含み得る。最初の置き換えステップは、最終抑制ステップの１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、４日、５日、６日、７日、８日、または９日以内に実行できる。
【０４６９】
合成微生物を含む組成物は、対象の少なくとも１つの部位、および任意選択的に隣接する部位で、皮膚および／または粘膜に、少なくとも１回、たとえば１〜３０回、１〜２０回、１〜１０回、１〜６回、１〜５回、１〜４回、１〜３回、または１〜２回、または月に１回以下、２回、３回、４回、５回、６回、８回、または月に１０回、または１２回以下で投与することができる。組成物のその後の投与は、例えば、最初の投与後、１〜３０日、２〜２０日、３〜１５日、または４〜１０日の期間後に起こり得る。
【０４７０】
栄養、プレバイオティクス、安定剤、保湿剤、および／またはプロバイオティクス細菌種から選択される促進剤を含む組成物を投与することにより、合成微生物のコロニー化を対象において促進することができる。促進剤は、別個の促進剤組成物で対象に投与されてもよく、または微生物組成物に添加されてもよい。
【０４７１】
いくつかの実施形態では、促進剤は、例えば、塩化ナトリウム、塩化リチウム、グリセロリン酸ナトリウム、フェニルエタノール、マンニトール、トリプトン、および酵母エキスから選択される栄養素であり得る。いくつかの実施形態では、プレバイオティクスは、短鎖脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸）、グリセロール、農業副産物由来のペクチン由来オリゴ糖、フルクトオリゴ糖（例えば、イヌリン様プレバイオティクス）、ガラクトオリゴ糖（例えば、ラフィノース）、コハク酸、乳酸、およびマンナンオリゴ糖からなる群から選択される。
【０４７２】
いくつかの実施形態では、促進剤はプロバイオティクスであり得る。プロバイオティクスは、当該技術分野で知られている任意の公知のプロバイオティクスであってよい。プロバイオティクスは、宿主に健康上の利益をもたらす生きた微生物である。本明細書で提供される方法では、プロバイオティクスを真皮および粘膜のマイクロバイオームに局所的に適用することができ、および／またはプロバイオティクスを経口投与して、対象に皮膚および粘膜の健康上の利益をもたらすことができる。ラクトバチルス属のいくつかの株は、全身性の抗炎症作用を有することが示されている。研究は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉの特定の株が、インターロイキン（ＩＬ）−１０などの全身性抗炎症性サイトカインを誘発することを示している。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉの可溶性因子は、炎症誘発性サイトカインの産生を阻害する。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ株は、皮膚モデルで、好中球誘発性炎症を抑制することが示されている。Ｋｏｂｅｒ  ａｔ  ａｌ．，２０１５，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １（２０１５）８５−８９ヒト皮膚線維芽細胞と無毛マウスモデルでは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍは、ＵＶＢ誘発マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ−１）発現を阻害して、ヒト線維芽細胞でのプロコラーゲン発現を維持することが示されている。無毛マウスの組織学的試料におけるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの経口投与は、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍが皮膚組織におけるＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−９の発現を阻害したことを示した。
【０４７３】
臨床的には、プロバイオティクスの局所適用は、皮膚の抗菌特性の二次的な増加によって皮膚のバリア機能を変化させることも示されている。局所的に適用した場合のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓは、皮膚のバリア機能を変化させ、皮膚の抗菌特性を二次的に増加させることが示されている。局所的に適用した場合のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方でセラミド産生を増加させることが示されている。セラミドは皮膚の水分を閉じ込め、フィトスフィンゴシン（ＰＳ）などの特定のセラミドスフィンゴ脂質は、Ｐ．ａｃｎｅｓに対して直接的な抗菌活性を示す。Ｋｏｂｅｒ  ａｔ  ａｌ．，２０１５，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １（２０１５）８５−８９．
【０４７４】
プロバイオティクスの局所製剤の２つの臨床試験で、ニキビに対する効果が評価されている。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｃａｌｉｓローションを顔に８週間塗布すると、プラセボと比較して炎症性病変が５０％減少した。にきびの数、サイズ、および関連する紅斑の減少が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ局所抽出物の臨床試験中に認められた。Ｋｏｂｅｒ  ａｔ  ａｌ．，２０１５，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １（２０１５）８５−８９．
【０４７５】
局所プロバイオティクスの臨床試験では、粘膜システムへの影響が評価されている。ある研究では、急性中耳炎（ＡＯＭ）を予防するために、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓが鼻スプレーで投与された。鼻咽頭でのコロニー化に成功した場合、ＡＯＭの低下に大きな影響があった。Ｍａｒｃｈｉｓｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３４，２３７７−２３８３．別の試験では、Ｓ。ｓａｎｇｕｉｎｉｓおよびＬ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓのスプレー適用により、分泌性中耳炎の小児の中耳液が減少した。Ｓｋｏｖｂｊｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ．９４，９２−９８．
【０４７６】
プロバイオティクスは、局所プロバイオティクスまたは経口プロバイオティクスであってよい。プロバイオティクスは、例えば、望ましくない微生物とは異なる属および種であっても、望ましくない微生物とは同じ属であるが種が異なっていてもよい。プロバイオティクス種は、標的微生物とは異なる属および種であってよい。プロバイオティクスは、キルスイッチ分子改変を含むように改変されてもされなくてもよい。プロバイオティクスは、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、ストレプトコッカス属、またはエンテロコッカス属から選択されてもよい。プロバイオティクスは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｃａｌｉｓから選択され得る。
【０４７７】
促進剤は、米国特許第５，５２５，３３６号から参照により組み込まれるものに開示されているものなどのタンパク質安定剤を含むことができ、組成物に含まれる。非限定的な例には、グリセロール、トレヘロース、エチレンジアミン四酢酸、システイン、アルファ−、ベータ−、またはガンマ−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン、または２−ヒドロキシプロピルベータ−シクロデキストリンなどのその誘導体、ならびにロイペプチン、ペプスタチン、鎮痛剤、およびシスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤が含まれる。
【０４７８】
促進剤は保湿剤を含んでもよい。保湿剤の非限定的な例には、グリセリン、ソルビトール、２−ピロリドン−５−カルボン酸ナトリウム、可溶性コラーゲン、およびフタル酸ジブチルが含まれる。
【０４７９】
組成物
合成微生物と、薬学的に許容される担体、希釈剤、皮膚軟化剤、結合剤、賦形剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、緩衝剤、増粘剤、湿潤剤、または吸収剤と、を含む組成物が提供される。
【０４８０】
組成物を製剤化するための薬学的に許容される希釈剤または担体は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、または溶媒からなる群から選択される。溶媒は、例えば、エチルアルコール、トルエン、イソプロパノール、ｎ−ブチルアルコール、ヒマシ油、エチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、およびテトラヒドロフランから選択することができる。担体または希釈剤は、ｉ）アニオン性界面活性剤、例えば脂肪酸の金属塩またはアルカノールアミン塩、例えばラウリン酸ナトリウムおよびオレイン酸トリエタノールアミン；アルキルベンゼンスルホン、例えばトリエタノールアミンドデシルベンゼンスルホン酸塩；  アルキル硫酸塩、例えばラウリル硫酸ナトリウム；アルキルエーテル硫酸塩、例えばラウリルエーテル硫酸ナトリウム（２〜８ＥＯ）；スルホコハク酸塩、例えばジオクチルスルホンコハク酸ナトリウム；モノグリセリド硫酸塩、例えばモノステアリン酸グリセリルモノ硫酸塩；イソチオネート、例えばイソチオン酸ナトリウム；メチルタウリド、例えばイゲポンＴ；アシルサルコシン、例えばミリスチルサルコシンナトリウム；アシルペプチド、例えばメイポンおよびラメポン；アシルラクチレート、ポリアルコキシル化エーテルグリコレート、例えばトリデセス−７カルボン酸；リン酸塩、例えばジラウリルリン酸ナトリウム；カチオン性界面活性剤、例えばアミン塩、例えばサパミン塩酸塩；四級アンモニウム塩、例えばクオタニウム５、クオタニウム３１、およびクオタニウム１８；両性界面活性剤、例えばイミダゾール化合物、例えばミラノール；Ｎ−アルキルアミノ酸、例えばコカミノプロピオン酸ナトリウムおよびアスパラギン誘導体；ベタイン、例えばコカミドプロピルベタイン；非イオン性界面活性剤、例えば脂肪酸アルカノールアミド、例えばオレイン酸エタノールアミド；エステルまたは多価アルコール、例えばスパン；ポリグリセロールエステル、例えば脂肪酸および１つまたはいくつかのＯＨ基でエステル化されたもの；ポリアルコキシル化誘導体、例えばポリオキシ：ポリオキシエチレンステアレート；エーテル、例えばポリオキシエーテルラウリルエーテル；エステルエーテル、例えばＴｗｅｅｎ；アミンオキシド、例えばココナッツおよびドデシルジメチルアミンオキシドなどの１つ以上の界面活性剤をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、１つを超える界面活性剤または溶媒が含まれる。
【０４８１】
組成物は、ｐＨの安定化を助けるために緩衝成分を含み得る。いくつかの実施形態では、ｐＨは４．５〜８．５の間である。たとえば、ｐＨは約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０であり得、その間の値を含む。いくつかの実施形態では、ｐＨは５．０〜８．０、６．０〜７．５、６．８〜７．４、または約７．０である。緩衝液の非限定的な例には、ＡＣＥＳ、アセテート、ＡＤＡ、水酸化アンモニウム、ＡＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）、ＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ビス−トリス、ビス−トリスプロパン、ホウ酸塩、ＣＡＢＳ、カコジル酸塩、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、炭酸塩（ｐＫ１）、炭酸塩（ｐＫ２）、ＣＨＥＳ、クエン酸塩（ｐＫ１）、クエン酸塩（ｐＫ２）、クエン酸塩（ｐＫ３）、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳ、エタノールアミン、ギ酸塩、グリシン（ｐＫ１）、グリシン（ｐＫ２）、グリシルグリシン（ｐＫ１）、グリシルグリシン（ｐＫ２）、ＨＥＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ヒスチジン、ヒドラジン、イミダゾール、リンゴ酸塩（ｐＫ１）、リンゴ酸塩（ｐＫ２）、マレイン酸塩（ｐＫ１）、マレイン酸塩（ｐＫ２）、ＭＥＳ、メチルアミン、ＭＯＢＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、リン酸塩（ｐＫ１）、リン酸塩（ｐＫ２）、リン酸塩（ｐＫ３）、ピペラジン（ｐＫ１）、ピペラジン（ｐＫ２）、ピペリジン、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、プロピオン酸塩、ピリジン、ピロリン酸塩、コハク酸塩（ｐＫ１）、コハク酸塩（ｐＫ２）、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、タウリン（ＡＥＳ）、ＴＥＳ、トリシン、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、およびＴｒｉｚｍａ（トリス）が含まれ得る。賦形剤は、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、微結晶性セルロース、スクロース、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム、リン酸緩衝液、または単独もしくはそれらの適切な組み合わせで同様の性質の他の任意の成分を含み得る。
【０４８２】
微生物組成物は、例えば、トラガカントガム、アカシアガム、メチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、デンプンまたは単独もしくはそれらの適切な組み合わせで同様の性質の他の任意の成分であり得る結合剤；寒天−寒天、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ケイ酸塩、アルギン酸、トウモロコシデンプン、ジャガイモタピオカデンプン、プリモゲル、または単独もしくはそれらの適切な組み合わせで同様の性質の他の任意の成分からなる群から選択される賦形剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、または単独で同様の性質の他の任意の成分からなる群から選択される潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素、または単独もしくはそれらの適切な組み合わせで同様の性質の他の任意の成分からなる群から選択される流動促進剤；マンニトール、スクロース、トレハロース、グリシン、アルギニン、デキストラン、またはそれらの組み合わせなどからなる群から選択される安定剤；ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジフレーバー、バニラフレーバー、または他の任意の薬学的に許容される付臭剤もしくはフレーバーの、単独またはそれらの適切な組み合わせからなる群から選択される付臭剤またはフレーバー；アセチルアルコール、モノステアリン酸グリセリルまたは他の任意の薬学的に許容される湿潤剤の、単独またはそれらの適切な組み合わせからなる群から選択される湿潤剤；カオリン、ベントナイトクレー、または他の任意の薬学的に許容される吸収剤の、単独またはそれらの適切な組み合わせからなる群から選択される吸収剤；ワックス、パラフィン、または他の任意の薬学的に許容される遅延剤の、単独またはそれらの適切な組み合わせからなる群から選択される遅延剤を含み得る。
【０４８３】
微生物組成物は、１つ以上の皮膚軟化剤を含み得る。皮膚軟化剤の非限定的な例には、ステアリルアルコール、モノリシノール酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、プロパン−１，２−ジオール、ブタン−１，３−ジオール、ミンク油、セチルアルコール、イソステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸、パルミチン酸イソブチル、ステアリン酸イソセチル、オレイルアルコール、ラウリン酸イソプロピル、ラウリン酸ヘキシル、オレイン酸デシル、オクタデカン−２−オール、イソセチルアルコール、パルミチン酸セチル、ジメチルポリシロキサン、セバシン酸ジ−ｎ−ブチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ポリエチレングリコール、トリエチレングリコール、ラノリン、ゴマ油、ココナッツ油、落花生油、ヒマシ油、アセチル化ラノリンアルコール、石油、鉱油、ミリスチン酸ブチル、イソステアリン酸、パルミチン酸、リノール酸イソプロピル、乳酸ラウリル、乳酸ミリスチル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸ミリスチルが含まれる。
【０４８４】
微生物組成物は、例えば、ヒドロキシエチルセルロース（例えば、ナトロソル）、デンプン、アラビアゴムなどのゴム、カオリンまたは他の粘土、水和ケイ酸アルミニウム、ヒュームドシリカ、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたは他のセルロース誘導体、エチレングリコールモノステアレートおよびアルギン酸ナトリウムから選択され得る、増粘剤を含み得る。微生物組成物は、保存剤、防腐剤、顔料または着色剤、香料、マスキング剤、ならびに水および低級アルキル、アルコールなどの担体、参照により組み入れられる米国特許第５，５２５，３３６号に開示される組成物に含まれるものなどを含み得る。
【０４８５】
局所投与用の微生物組成物は、液体、溶液、懸濁液、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、または投与直前の懸濁液用の粉末、錠剤、またはトローチなどの固体形態で提供され得る。局所使用のための組成物は、ハードカプセルまたはソフトゼラチンカプセルとして提供することもでき、良性および／または合成微生物は、水または油媒体、例えばピーナッツ油、流動パラフィン、またはオリーブ油と混合される。粉末および顆粒は、例えばミキサー、流動床装置、凍結乾燥、または噴霧乾燥装置を使用する従来の方法で、溶解のための錠剤およびカプセルの下で上述の成分を使用して調製することができる。乾燥した微生物組成物は、直接投与されてもよいし、または担体中の懸濁用であってもよい。組成物が粉末形態である場合、粉末は、担体中にチョーク、タルク、フラー土、コロイド状二酸化ケイ素、ポリアクリル酸ナトリウム、テトラアルキルおよび／またはトリアルキルアリールアンモニウムスメクタイト、ならびに化学修飾ケイ酸アルミニウムマグネシウムを含み得る。組成物が粉末形態である場合、粉末は、チョーク、タルク、フラー土、コロイド状二酸化ケイ素、ポリアクリル酸ナトリウム、テトラアルキルおよび／またはトリアルキルアリールアンモニウムスメクタイト、ならびに化学修飾ケイ酸アルミニウムマグネシウムを含み得る。
【０４８６】
微生物組成物は、冷凍、冷蔵、または好ましくは室温で保存した場合、少なくとも１、２、３か月、６か月、１２か月、１８か月、または２４か月にわたって、３０％、２０％、１０％、または５％ｃｆｕ未満を損失する安定したＣＦＵを示す。
【０４８７】
キット
上述の組成物または合成微生物のいずれも、キットの形態で提供され得る。いくつかの実施形態では、キットは、生菌を収容する容器または凍結乾燥生菌を収容する容器を含む。キットには、培地を含む第２の容器を含めることができる。キットはまた、１つ以上の脱コロニー化剤を含み得る。キットはまた、組成物を投与するための説明書を含み得る。特定の実施形態では、細菌株を組成物の他の成分と混合するための説明書が提供される。いくつかの実施形態では、キットは、微生物組成物を対象に適用するためのアプリケーターをさらに含む。
【０４８８】
用量
特定の実施形態では、組成物は、溶液組成物である局所投与のために、または溶液組成物への再構成のために提供される。一実施形態では、組成物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの水溶液中の、約１×１０5〜１×１０12ｃｆｕ／ｍｌ、１×１０6〜１×１０10ｃｆｕ／ｍｌ、または１．２×１０7〜１．２×１０9ＣＦＵ／ｍＬの合成微生物を含み得る。対象の予備的な刺激試験には、より低い用量を使用することができる。
【０４８９】
好ましくは、対象は、最初の投与ステップの実施後、少なくとも２、３、４、６、１０、１５、２２、２６、３０、または５２週間後に対象の少なくとも１つの部位をスワブすることにより証明されるときに、望ましくない微生物の再発を示さない。
【０４９０】
ナノファクトリー
いくつかの実施形態では、マイクロバイオーム（ナノファクトリー）の部位で所望の物質の生成を生み出す方法が提供される。ナノファクトリー分子改変を含み得る合成微生物が提供される。「ナノファクトリー」という用語は、生成物−タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸もしくは核酸などの一次生成物、または有益な効果をもたらす小分子などの二次生成物のいずれか−の生成をもたらす標的微生物の分子改変を指す。生成物は合成微生物から分泌されてもよいし、封入体の形態であってもよい。そのようなナノファクトリー細菌株は、以下を含む幅広い永続的な利点を宿主対象に提供する可能性がある：（ｉ）宿主が以前に欠損していた細胞産物および酵素の取得、（ｉｉ）多様な治療的および予防的利益のための微生物学的に製造された小分子、ポリペプチド、またはタンパク質医薬品の送達システムの取得。本明細書に記載されるように、バイオームに永続的に組み込まれる場合、そのようなナノファクトリー細菌株は、直接の生成物適用よりも、生成物の有用な永続的な代替定常状態生産を提供するであろう。
【０４９１】
望ましくない微生物による既存のコロニー形成を、一次生成物または二次生成物の生産または消費のためのナノファクトリー分子改変を含む合成細菌株で置き換える方法および合成微生物が本明細書で提供され、標的微生物は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｉｓ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｅｒｓの株であり得る。
【０４９２】
合成微生物におけるナノファクトリー分子改変は、その宿主対象、すなわち、一次（同化または異化）もしくは二次代謝経路の欠損、またはいくつかの小分子もしくは酵素などの高分子の過剰もしくは不足に起因する他の病気を有する患者を助けるために使用できる。ナノファクトリー分子改変は、酵素、アミノ酸、代謝中間体、または小分子をコードしてもよい。ナノファクトリー分子改変は、特定の化合物を内因的に合成もしくは代謝する能力、または外因性マイクロバイオーム内で作動する酵素または他の活性分子を合成する能力など、宿主マイクロバイオームに新しい生産（合成）または代謝機能を付与してもよい。
【０４９３】
微生物は、選択的に調整された、誘導的または構成的に調整されたプロモーターの制御下の、生合成遺伝子、生合成遺伝子クラスター、または１つ以上の酵素をコードする遺伝子（複数可）から選択されたナノファクトリーを担持する。ナノファクトリーを含む合成微生物は、皮膚、粘膜、または他の部位のいずれかで、単一の薬剤として、または第１の合成微生物が宿主対象上またはその中の機能の喪失を回復させるのを助ける第２、第３、または第４の合成微生物と組み合わせて、身体の少なくとも１つの部位に投与される。
【０４９４】
一例において、ナノファクトリーを含む合成微生物は、細胞内活性因子の産生による機能の回復、例えば、小腸における分泌された組換え酵素による外分泌膵機能不全患者における消化酵素の微生物補給のために使用され得る。膵臓は重要な器官であり、消化に重要な役割を果たしている。外分泌膵機能不全（ＥＰＩ）は、膵臓への長期的な損傷によって引き起こされ、主に脂肪と炭水化物を分解する小腸の典型的な消化酵素の減少または欠如をもたらす。これらの酵素の喪失は、広範囲または症状を引き起こす可能性があり、ＥＰＩの重症度に依存する。近位の小腸（十二指腸）の小腸のｐＨレベルは、遠位の領域のｐＨレベルよりも低い。この環境の変化は、ｐＨに依存する微生物のニッチな占有をもたらす。このｐＨ依存性は、合成微生物になるように分子的に改変できる、本質的に消化管のその領域に自分自身を局在化させる十二指腸の共生細菌を自然に選択した。胃と小腸の上部３分の２には、耐酸性の乳酸桿菌と連鎖球菌が含まれており（Ｈａｏ，Ｗｌ，Ｌｅｅ  ＹＫ．Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００４，２６８，４９１−５０２）、健康なドナーから分離することができる。組み換えリパーゼ、アミラーゼ、および／またはプロテアーゼを分泌シグナル伝達配列でノックインすることにより、合成微生物による十二指腸のコロニー化は、ＥＰＩを患っている患者の消化機能を回復させることができる。
【０４９５】
ナノファクトリーの別の例では、ナノファクトリーを含む合成微生物は、細胞内活性因子の産生による機能の回復のために使用されてもよい。たとえば、胃腸管内のフェニルアラニンを除去することにより、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に罹患している対象を保護する。フェニルアラニンは必須アミノ酸であり、すなわち、人体はそれを生産できず、栄養を通じてそれを獲得しなければならない。体内に入ると、フェニルアラニンの分解は１つのタンパク質、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）によって行われる。フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）として知られている遺伝性の遺伝性疾患は、ＰＡＨをコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされ、その結果、体内にフェニルアラニンが蓄積する。この蓄積を回避する最も一般的なアプローチの１つは、フェニルアラニンが豊富な食品を避けることである。代替的に、細胞内でフェニアラニンを分解するように分子的に改変されている合成微生物を、胃腸管に導入することができる。この合成微生物はＰＡＨナノファクトリーを構成し、ＰＫＵで宿主の体に入る前にフェニアラニンを分解する。
【０４９６】
ナノファクトリーの別の例では、合成細菌は、ナノファクトリー分子改変を含み得る皮膚微生物叢からの標的共生細菌に由来し得る。標的共生皮膚または粘膜細菌は、例えば、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、またはクチバクテリウム属であってもよい。たとえば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、複数の真皮または粘膜環境タイプに見られるため、標的微生物であり得る。異なる環境で存続する能力を考慮して、合成Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを操作すると、複数の種類のデリバリー技術と場所の開発と最適化が可能になる。
【０４９７】
一例では、合成Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株は、男性性腺機能低下症に罹患している男性のための試験ステロンを生成するためのナノファクトリー分子改変を含み得る。試験ステロンの生成は、（ｉ）試験ステロンを生成するために必要な追加の酵素によるステロール生合成経路全体の導入、または（ｉｉ）部分的なステロール生合成経路の導入、および必要な前駆体分子、すなわち、ファルニセル、スクアレン、コレステロールなどの運搬媒体への導入であって、これにより試験ステロンが合成細菌で組み立てられるようにする導入によって達成することができる。別の例では、合成Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株は、ニコチンの生産のためのナノファクトリー分子改変を含み得る。この合成株は、禁煙を助ける経皮療法として適用できる。この合成株は、ナス科の植物に見られる１つ以上の生合成経路を含むように分子改変を含むことができ、さらに任意選択的に、前駆体分子、すなわちアスパラギン酸、オルニチンなどの内因性経路の強化のための分子改変をさらに含み得る。
【０４９８】
ナノファクトリーのさらなる例において、合成Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株は、スコポラミンの生産のためのナノファクトリー分子改変を含み得る。スコポラミンは現在、乗り物酔いと治療予防の治療のために、徐放性経皮パッチを介して提供されている。この株は、ナス科の植物に見られる生合成経路を担持し、おそらく前駆体分子の内因性経路を強化する必要がある。
【０４９９】
別の例として、合成Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株は、ヘルペス後神経痛、乾癬、または他の皮膚関連障害に起因する痛みを軽減するためのカプサイシンの生産のためのナノファクトリー分子改変を含み得る。
【０５００】
別の例において、標的微生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ株であり、これは、キルスイッチ、Ｖ−ブロック、またはナノファクトリー分子改変のうちの１つ以上を有し得る。虫歯と歯垢は、世界で最も一般的な疾患の１つであり、微生物と食物片の混合によって引き起こされる。特定の種類の酸生成菌、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓは、歯の表面にコロニーを形成し、ショ糖や果糖などの発酵性炭水化物の存在下で硬い歯の構造に損傷を与えることができる。虫歯と歯垢は、世界で最も一般的な疾患の１つであり、微生物と食物片の混合によって引き起こされる。特定の種類の酸生成菌、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓは、歯の表面にコロニーを形成し、ショ糖や果糖などの発酵性炭水化物の存在下で硬い歯の構造に損傷を与えることができる。Ｆｏｒｒｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ，２０１０  Ｍａｒ；  ２（３）：２９０−２９８．いくつかの実施形態では、標的微生物は、スクロース、フルクトース、または他の発酵性炭水化物の存在下で酸産生を低減するためのＫＳおよび／またはナノファクトリーノックアウトを有するＳ．ｍｕｔａｎｓである。
【０５０１】
皮膚科学的および美容的使用に対処するための合成微生物におけるナノファクトリー分子改変のさらなる例には以下が含まれる：（ｉ）アトピー性皮膚炎または乾燥皮膚に対するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓでのヒアルロン酸産生、（ｉｉ）細線およびしわを減らすため、ならびに不規則な色素沈着を軽減するためのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓでのアルファヒドロキシ酸産生、（ｉｉｉ）ニキビを減らすためのＣｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓにおけるサリチル酸産生、（ｉｖ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにおけるアルブチン産生（アルブチンおよびその代謝物ハイドロキノンは、メラニン抑制による皮膚美白剤として機能する、（ｖ）皮膚の色素沈着の軽減のためのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにおけるコウジ酸（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅを含むいくつかの真菌によって生成される）、（ｖｉ）小線およびしわの低減のためのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓによるレチノイド産生、（ｖｉｉ）コラーゲンの刺激および皮膚への抗酸化作用のためのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにおけるＬ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）の産生、（ｖｉｉｉ）コラーゲンおよびエラスチン産生の刺激および瘢痕形成の低減のためのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにおける銅ペプチド（ＧＨＫ−Ｃｕ）の産生、（ｉｘ）皮膚に対する有益な抗酸化作用のためのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにおけるアルファリポ酸産生、および（ｘ）細線およびしわの低下のためのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓおけるジメチルアミノエタノール産生。
【０５０２】
Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓは皮膚に生息する主要な細菌であり、健康な皮膚とさまざまな疾患の両方に関連している。これは、現代の分子生物学技術を増強および強化するために利用可能な別の生物およびニッチである。研究によると、Ｃ．ａｃｎｅｓのレベルは、健康な皮膚とにきびを帯びた皮膚の間で類似していることが示されている。Ｄｒｅｎｏ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．"Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）ａｎｄ  ａｃｎｅ  ｖｕｌｇａｒｉｓ：  ａ  ｂｒｉｅｆ  ｌｏｏｋ  ａｔ  ｔｈｅ  ｌａｔｅｓｔ  ｕｐｄａｔｅｓ．"  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌｏｇｙ  ３２（２０１８）：５−１４．これは、人の皮膚に存在するＣ．ａｃｎｅｓの数を減らすだけでは、疾患や症状の緩和に役立たないことを示している。代わりに、Ｃ．ａｃｎｅｓの他の株または真皮および皮下マイクロバイオームの他のメンバーを変更して、特定のＣ．ａｃｎｅｓ株が疾患を引き起こすために使用するメカニズムを緩和することができる。にきびの重症度の増加と最大の関連があることが示された分離株は、プロピオン酸と酪酸をより多く産生することも示されている。Ｂｅｙｌｏｔ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．"Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ：  ａｎ  ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｃｎｅ．"  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌｏｇｙ  ２８．３（２０１４）：２７１−２７８．
【０５０３】
ナノファクトリー分子改変の別の例には、プロピオン酸や酪酸などの短鎖脂肪酸への欲求が高まるように改変されたＣ．ａｃｎｅｓの別の株が含まれ、これにより病原性の強い株から炎症性化学分泌物を取り除き、毒性を低減する。炭素に富む脂肪酸は、異種経路を誘導するために使用でき、ビタミン合成の前駆体またはその場所に生息する皮膚またはマイクロバイオームに有益な他の有機化合物として使用できる。
【０５０４】
別の例では、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにおいて、リポテイコ酸は、ｍｉＲ−１４３を誘導することにより、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ（すなわち、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）の炎症反応を緩和するのに役立つことが示されている。Ｘｉａ，Ｘｉａｏｌｉ，ｅｔ  ａｌ．"Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ＬＴＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｉＲ−１４３  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｓｋｉｎ．"  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １３６．３（２０１６）：６２１−６３０．ｍｉＲ−１４３の誘導を介してＣ．ａｃｎｅｓ誘発性炎症を抑制するリポテイコ酸を生成するナノファクトリー分子改変を含む合成微生物を使用することができる。ナノファクトリーは、Ｃ．ａｃｎｅｓ誘発性炎症の管理のために尋常性座瘡の部位でＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓによって炎症反応を調節するために使用することができる。この経路は、放っておくと炎症や皮膚刺激を引き起こす短鎖脂肪酸から作られる有用な産物のほんの一例である。
【０５０５】
別の例では、炎症および温度の上昇は、Ｃ．ａｃｎｅｓによって引き起こされる疾患に関与する要因であり、それらは、操作された株において以前にサイレントな異種経路を誘導するシグナルとして使用することができた。温度の上昇（封じられた細孔のシグナル伝達と進行中の局所的な病状）は、病原性株または別の共生微生物に、皮脂を分解して皮脂の詰まった毛穴を再開し、その場所で通常の成長状態を再開できるようにする、非免疫刺激リパーゼ（または他の酵素）の転写および翻訳を誘導することができる。
【０５０６】
さらなる例では、合成乳酸桿菌属、例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｅｒｓは、女性の膣内に存在する一般的な優占種であり、閉経後の女性の膣内にエストラジオールを生成するナノファクトリー分子改変を含むように操作できる。
【０５０７】
望ましくない微生物による既存のコロニー形成を、例えば酵素、ニコチン、アスパラギン酸、オルニチン、プロピオン酸、酪酸、ヒアルロン酸、アルファ−ヒドロキシ酸、Ｌ−アスコルビン酸、銅ペプチド、アルファ−リポ酸、サリチル酸、アルブチン、コウジ酸、スコポラミン、カプサイシン、レチノイド、ジメチルアミノエタノール、リポテイコ酸、試験ステロン、エストラジオール、およびプロゲステロンから選択される一次または二次産物の生成または消費のためのナノファクトリー分子改変を含む合成微生物によって置き換える方法および合成微生物が本明細書で提供される。
【０５０８】
ナノファクトリー分子改変またはそのゲノムへの合成的付加の手段によって、吸収後の宿主内のマイクロバイオーム組み込みの部位または遠隔部位で、宿主にとって有益な基質、物質、または１つもしくは複数の製品を生成することのできる合成細菌株の永続的な組み込みは、所望の適応症に合わせて調整することができる。合成ヌクレオチドの変化が細菌のゲノムに直接組み込まれているかどうか、またはそれがプラスミドに導入されたかどうかによって、ナノファクトリー生成の効果の持続時間は、短期（細菌種の非複製プラスミドを使用）から中期（嗜癖依存なしの複製プラスミドを使用）まで、長期（直接細菌ゲノム操作を使用）までの範囲であり得る。
【０５０９】
病原性ブロック
いくつかの実施形態では、既存のコロニー形成を、望ましくない病原性または抗生物質耐性遺伝子の遺伝的移入を受け入れることができない合成細菌株で置き換える方法が提供される。「病原性ブロック」または「Ｖブロック」を含み得る合成微生物が提供される。「病原性ブロック」または「Ｖブロック」という用語は、微生物が他の株または種から外来ＤＮＡを受け入れる能力が低下し、外因性の病原性または抗生物質耐性遺伝子を獲得する能力が低下した微生物を効果的にもたらす微生物の分子改変を指す。
【０５１０】
本明細書では、望ましくない微生物による既存のコロニー形成を、望ましくない病原性または抗生物質耐性遺伝子の遺伝的移入を受け入れることができないＶブロック分子改変を含む合成細菌株で置き換える方法が提供され、標的微生物は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｉｓ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの株であり得る。
【０５１１】
感染症に関する主要な懸念の１つは、一般に「遺伝子水平伝播」と呼ばれ、外因性病原性タンパク質遺伝子または抗菌剤耐性遺伝子のいずれかを獲得する可能性のある細菌性病原体を伴う。取得は、局所のマイクロバイオーム環境における他の細菌株または種からのこれらの遺伝子の移入に起因し得る。侵襲性の細菌性病原体は、疾患を引き起こす前に、最初は皮膚または粘膜表面のコロニー形成細菌のマイクロバイオームの一部であることが一般的であるため、細菌ゲノムへの外来細菌ＤＮＡを受け入れることができないことをこれらのコロニー形成株に注入できることは、非常に実用的な利点となる。永続的に組み込まれた合成細菌株でこれを達成するプロセスは、「病原性ブロック」と呼ばれている。
そのような「病原性ブロック」操作株は、脱コロニー化イベントの後にマイクロバイオームに組み込むことができ、競争排除のプロセスを通じて、望ましくない病原性または抗生物質耐性特性を再取得することなく、その特定のニッチ内の主要株としてしばらく留まることができる。マイクロバイオーム内の潜在的な病原体に対して実行されるそのような概念は、水平伝播方式で病原性も抗菌耐性遺伝子も獲得できない安定したマイクロバイオームをもたらし、マイクロバイオームの全体をより堅牢にして変換可能性を低下させる。
【０５１２】
Ｖブロックは、望ましくない微生物からの病原性または遺伝子水平伝播を抑制するために合成微生物で使用できる分子改変である。Ｖブロック分子改変は、以下の方法で標的微生物で作成できる：（ｉ）１つ以上の既知の病原性遺伝子の遺伝子ノックアウト（削除または除去）、（ｉｉ）病原性領域のフレームシフト（塩基対を付加または削除してコーディングフレームを「破壊」する）、（ｉｉｉ）誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターを使用した病原性領域の外因性サイレンシング（ＤＮＡゲノムに埋め込まれているが、ＲＮＡで機能する）−抗毒素戦略と同様の、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターに連結することができるガイドＲＮＡを使用する、入ってくる遺伝子を消化するための、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９もしくは他の編集タンパク質の産生、または（ｉｖ）メチル化システムなどの制限修飾（ＲＭ）によって、生物の「自然免疫システム」をオンにして、入ってくる病原性遺伝子を分子のクラスごとに認識および破壊する。遺伝子水平伝播に対する耐性を高めるために、これらの方法のいずれかを採用することができる。Ｖブロックを構築するための遺伝子編集法には、ＮｇＡｇｏ、ｍｉｎｉ−Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃ２ｃ２、Ｔａｒｇｅｔ−ＡＩＤ、ラムダレッド、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、またはファージの使用が含まれ得る。病原性ブロックは、合成微生物の構成的プロモーターに作動可能に連結され得る。病原性ブロック分子改変は、病原性微生物からの遺伝物質の遺伝子水平伝播を防止し得る。
【０５１３】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）の株に抗生物質耐性を付与する遺伝子カセットは、特定の部位でレシピエント細胞のゲノムに組み込み得る。この部位は、細胞ゲノム内で削除または変更することができ、着陸部位は、入ってくるＤＮＡ配列のために利用できなくなる。これは、ＳＡの増殖能力を妨げないことが示されているため、生物による耐性カセットの獲得が発生する可能性がはるかに低くなる。
【０５１４】
Ｖ−ブロック分子改変は、病原性因子、耐性遺伝子座またはカセット、毒素または毒素産生機能、または生物的に組み込まれた微生物の他の望ましくない属性の除去または中和を引き起こし得る。
【０５１５】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの既知の病原性因子または抗生物質耐性遺伝子と一致する配列に対するＣａｓ９認識システムの形式の病原性ブロックを使用して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓライブバイオセラピューティック製品の株を追加の病原性因子および抗生物質クラスへの耐性を獲得しないように保護し、それらを最初に承認および製造されたのと同じくらい安全にすることができる。
【０５１６】
ＣＲＩＳＰＲは原核細胞に固有の適応免疫システムであり、ファージの攻撃を防御するために時間をかけて進化してきた。このシステムは、ファージＤＮＡ（または任意の標的ＤＮＡ）配列に相補的な短いＤＮＡ配列を使用して、入ってくるＤＮＡを標的にし、生細胞のゲノムに組み込む前に鎖を消化する。
この同じ技術は、細菌細胞に脅威を与えないＤＮＡ配列を標的とするように操作できるが、いったん取得すると、生物は疾患を引き起こし、以前は居住性が低かった環境で存続することができる。Ｃａｓ−９酵素をゲノムに統合するか、可能であれば内因性のＣａｓ−９を利用して、抗生物質耐性遺伝子を標的とする構成的に発現したガイドＲＮＡをゲノムに導入することが可能である。標的遺伝子が遺伝子水平伝播などによって細胞に導入されると、入ってくるＤＮＡが切断され、ゲノムに組み込まれたい、機能的なペプチドを生成したりできなくなる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが標的とする前に遺伝子がゲノムに組み込まれた場合、操作されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムはそれをゲノムで見つけ、標的化された場所で配列を切断し、生存不能な細胞を作り、抗生物質耐性カセットの拡散を停止する。
【０５１７】
ＣＲＩＳＰＲシステムは、遺伝子発現をサイレンシングした結果、ＲＮＡ配列を標的にするためにも使用できる。抗生物質耐性または病原性遺伝子のＤＮＡ配列を標的とする認識配列の代わりに、ｍＲＮＡを標的とする認識配列を設計できる。Ｃａｓ９と標的化ガイドＲＮＡがａｂｘＲまたは病原性遺伝子を受け取る細胞で構成的に発現している場合、タンパク質の形成と標的化遺伝子を使用する細胞の能力を妨げる操作されたＣＲＩＳＰＲシステムによって翻訳が中断される。
【０５１８】
病原性または抗生物質耐性遺伝子の発現を標的とするために使用できる原核生物における遺伝子サイレンシングのさらに別の方法は、通常はＲＢＳでｍＲＮＡ転写物を標的とする調節ＲＮＡを設計および構成的に発現することである。これらは、ゲノムに組み込まれ、構成的に発現して、合成生物を作成する。調節ＲＮＡは短い配列（＞１００ｂｐ）で、ａｂｘＲまたは病原性遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に相補的である。短い配列の構成的発現は、生物に対して代謝的に負担をかけるべきではなく、標的化されたｍＲＮＡのタンパク質への翻訳をブロックする結果となる。操作されたＲＮＡは、標的化遺伝子抗生物質耐性遺伝子が遺伝子水平伝播を通じて受け取られた場合に、それを利用する細胞の能力を十分にブロックする。
【０５１９】
ＤＮＡメチル化は、原核生物と真核生物で多くの重要な役割を果たす。ＤＮＡメチル化の１つの特徴により、細胞は自身のＤＮＡを外来ＤＮＡから区別することができる。生物のメチラーゼシステムは、形質転換されたプラスミドＤＮＡを異物として認識し、転写または組み込まれる前にそれを噛むため、多くの野生型株の編集と研究は非常に困難になる。遺伝子水平伝播は、メチル化パターンが非常に似ている生物間で発生する可能性があり、これは、入ってくるＤＮＡがレシピエント自身のＤＮＡと非常に似ており、消化されないためである。特定の配列にメチル基を付加するメカニズムと遺伝子、および不適切にメチル化されたＤＮＡを探して切断する遺伝子は、さまざまな細菌株で知られているため、独自のメチル化パターンを持つことができる合成生物を作成することが可能である。これは、すべての入ってくるＤＮＡを合成生物にとって異質に見せ、生物が新しい特性を獲得する前に消化されるようにするのに役立つ。これは、病原性または抗生物質耐性遺伝子の我々の合成生物への遺伝子水平伝播を問題なくするのに役立つであろう。
【０５２０】
合成微生物の１つ以上の細菌ゲノムカセット挿入部位の分子破壊の形のＶブロックは、バイオームに共生している常在バクテリア種から抗生物質クラス耐性遺伝子を獲得できないようにすることができる。そのような操作はまた、腸壁を横切る侵襲的イベントの可能性を増加させる可能性のある病原性遺伝子の獲得を妨げる。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）の株に抗生物質耐性を付与する遺伝子カセットは、特定の部位でレシピエント細胞のゲノムに組み込み得る。この部位は、細胞ゲノム内で削除または変更することができ、着陸部位は、入ってくるＤＮＡ配列のために利用できなくなる。Ｖ−ブロックが合成微生物の増殖能力を妨げないことが示される限り、生物による耐性カセットの獲得が発生する可能性がはるかに低くなる。
【実施例】
【０５２１】
実施例１フィールド調査−良性微生物を使用する排除ニッチ：
臨床研究−抑制および置き換え
臨床研究は、ＭＲＳＡ陽性の対象を特定し、ＭＲＳＡ株を抑制し、Ｂｉｏｐｌｘ−０１（すなわち、ＭＳＳＡ  ５０２ａ）を投与してＭＲＳＡを置き換え、対象のＭＲＳＡ再発を定期的に再検査するように設計された。研究集団は、主にメーラト地域の医療関係者と医学生から集められた。症状のある対象はこの研究に登録されていない。
【０５２２】
これは「原理の証明」研究であり、ほとんど改善されていない材料と方法で行われる−５５％の非再発を超える任意の結果は、これらの方法の潜在的な有効性の指標とみなされる。８０％以上の非再発の任意の結果は、このアプローチの現在の技術的強さを強く示している。
【０５２３】
研究の目的と主要評価項目：
１）一般集団における無症候性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとＭＲＳＡの発生率を決定する−Ｍｅｅｒｕｔ、ＵＰ（北インド）−この研究のさらなる段階のために参加者を適格とする。
２）ＢｉｏＰｌｘ脱コロニー化された参加者におけるＭＲＳＡ再発率を決定する。
３）ＢｉｏＰｌｘ０１−ＷＴ再コロニー形成された参加者のＭＲＳＡ再発率を決定する。
４）ＭＲＳＡ再発の防止におけるＢｉｏＰｌｘ０１−ＷＴの永続性を決定する（８および１２週間まで）；
５）許容される研究の再発レベル＝４０％、目標の再発レベル＝２０％。
【０５２４】
研究結果は、ピアレビューされたソースからの公表された再発率に対して評価され、平均４５％の再発、５５％の非再発である。
【０５２５】
潜在的な参加者の特定と勧誘は、参加者全員が登録および試験された状態で行われた：ｎ＝７６５。患者は、Ｍｅｅｒｕｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ−ＬＬＲＭ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ（ＭＵＭＣ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、Ｈａｒｉｓｈ  Ｃｈａｎｄｒａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｍｕｒｔｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｃｒｏｓｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ＪＰ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、およびＬｏｋｐｒｉｙａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｄｈａｎｖａｎｔｒｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｊａｓｗａｎｔｒａｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの医療スタッフおよび医学生から採用された。参加者全員が署名した紙の開示、インフォームドコンセント、サインアップ文書。
【０５２６】
７６５人の潜在的な参加者全員が、研究室の担当者によってスワブされた（鼻）。実験室の担当者がすべてのスワブをＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとＭＲＳＡのクロマガープレートに播種した。すべてのプレートを３７℃で２４時間インキュベートし、試験監督者が個人的に読み取り、スコアを付けた。読み取り時にすべてのプレートの写真を撮り、結果をラベル付けした。
【０５２７】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの鼻腔スワブ陽性（ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ）の参加者の合計は１６２または２１．１８％で、鼻腔スワブのみの予想率の下限であった。ＭＳＳＡのみ（非ＭＲＳＡ）の参加者の数は９７または１２．６８％であった。
【０５２８】
ＭＲＳＡ陽性の参加者の数は、試験された総集団の６５または８．５０％であった。
【０５２９】
ＭＲＳＡ陽性の参加者（ｎ＝６５）は、研究監督者によって有効性研究に選ばれた。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ陽性の参加者は、研究監督者によって刺激研究のために選ばれた。
【０５３０】
有効性研究は、ＰＢＳ中のＢｉｏＰｌｘ０１−ＷＴ（１０＾８）を使用して行われた。
【０５３１】
確認されたＭＲＳＡ陽性の参加者（ｎ＝６５）は、１２週間の期間とプロセスへの取り組みについてアドバイスを受けた。研究期間は６ヶ月に延長された。有効性試験の対象は、表１０に示すように分割された。
【表２６】
2021505197.tif 000034
【０５３２】
脱コロニー化／再コロニー化プロセス
脱コロニー化
最初に、参加者に対して完全な脱コロニー化が行われる。以下は、主要な部位におけるＭＲＳＡ根絶の確認である。全身の脱コロニー化はクロルヘキシジンで行われ、鼻の脱コロニー化はムピロシンで行われ、「脱コロニー化プロトコル」のセクションにある通りにリステリンオリジナルの防腐剤でうがいされる。脱コロニー化手順の全過程（５日間）の後、確認ＭＲＳＡ試験が実施され、主要な領域にＭＲＳＡが存在しないことを確認し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ試験が実施され、コロニー化後のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓレベルに関する情報を収集する。参加者は５日間の脱コロニー化プロセスを経、それは研究担当者によって管理され、観察された。皮膚の脱コロニー化は研究担当者によって行われ、１日１回、５日間以上の（１）クロルヘキサジンの全身スプレー塗布（４％）、（２）ムプリオシンによる鼻（粘膜）脱コロニー化（２％）、および（３）リステリンの適用による喉（粘膜）脱コロニー化が含まれる。参加者は、５日間の脱コロニー化プロセスを経、ＢｉｏＰｌｘ  Ｐｖｔ  Ｌｔｄのスタッフによって管理および監視される。
皮膚−クロルヘキサジン
鼻（粘膜）−ムプリオシン
喉（粘膜）−リステリン
【０５３３】
参加者は、皮膚と髪の毛を完全に脱コロニー化する全身クロルヘキシジン浴を１回受ける。クロルヘキシジンが皮膚の外層が存在する限り持続する残留抗生物質活性を持っていることも真実である。５日間の待機期間により、皮膚の外層が脱落し、対象が再コロニー形成されたときに、ＢｉｏＰｌｘ−０１がその過程で殺傷されないことが保証される。
【０５３４】
鼻の脱コロニー化参加者は、鼻と喉を脱コロニー化するために、ムピリシン抗生物質の５日間の過程を使用する必要がある。これにより、鼻孔（鼻）が完全に脱コロニー化される。
【０５３５】
喉の脱コロニー化喉を脱コロニー化するために、参加者は毎日オリジナルのリステリンで３０秒間うがいする必要がある。これは喉を完全に脱コロニー化する。
【０５３６】
成功した脱コロニー化は、鼻、喉、および腋窩（脇の下）のＭＲＳＡ結果が陰性であることを特徴とする。脱コロニー化が成功すると、下流の時点で必要なのは鼻の追跡検査のみである。鼻または喉でＭＲＳＡ陽性の場合は、２回目の完全脱コロニー化手順が必要である。このカテゴリーの患者は、脱コロニー化されるまで、研究の次の段階に進まない。腋窩のＭＲＳＡ陽性は、２回目の完全な脱コロニー化を必要とせず、研究の次の段階に進むことができる。ここで、腋窩部位は、すべての下流のＭＲＳＡ試験に含める必要がある。
【０５３７】
脱コロニー化後の適格性試験Ｎ−Ｔ−Ｈ−Ａ−各研究群（１、２、３）のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとＭＲＳＡ。Ｇａｒｇの実験室の担当者が採取したスワブＧａｒｄの実験室の担当者がすべてのスワブをＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとＭＲＳＡのクロマガープレートに播種した。すべてのプレートをＧａｒｇ博士の研究室で２４時間インキュベートした。すべてのプレートはＧａｒｇ博士が個人的に読み取り、スコア付けした。読み取り時にすべてのプレートの写真を撮り、Ｇａｒｇ博士の結果をラベル付けした。すべてのデータは、ＢｉｏＰｌｘ  Ｐｖｔ  Ｌｔｄによって紙とデジタル形式で記録された。すべてのデジタルデータは、ＢｉｏＰｌｘ、Ｉｎｃ．に送信され、記録システムに提出され、入力される。この手順は、有効性研究のすべてのステップで使用された。
【０５３８】
再コロニー化は、以下に説明するように、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１．２×１０8ｃｆｕ／ｍＬのＢｉｏｐｌｘ−０１を適用して、約１５ｍＬを１日に１回、次のスケジュールに従って２日間続けて行った。
【０５３９】
１．２×１０＾８の再コロニー化とＱＣ試験は、２日間続けて行われた。
【０５４０】
１．２×１０＾８の再コロニー化試験の後−１日。
【０５４１】
１．２×１０＾８の再コロニー化の後−１週間。
【０５４２】
毎週の観察−２週目以降。
【０５４３】
脱コロニー化後の適格性試験Ｎ−Ｔ−Ｈ−Ａ−各研究群（１、２、３）のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとＭＲＳＡについて実施された。
【０５４４】
対象のスワブを含む毎週の観察は、研究室の担当者によって行われた。試料採取された解剖学的部位には、鼻孔、喉、腋窩、手が含まれた。
【０５４５】
実験室の担当者がすべてのスワブをＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとＭＲＳＡのクロマガープレートに播種した。すべてのプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。すべてのプレートは、研究ディレクターが個人的に読み取り、スコア付けした。読み取り時にすべてのプレートの写真を撮り、結果をラベル付けした。
【０５４６】
陰性対照脱コロニー化後の陰性対照ｎ＝１５；ＩＤ番号：００２１、００２２、００６０、０５１２、０７０４、０７２４、０７３１、０２１８、０２３４、０２３９、０２４９、０３０２、０３２７、００３７、０２２１。脱コロニー化後のＭＲＳＡ再発ｎ＝１５：最初の陰性対照の実行（シート４週−脱コロニー化後の平均６週目）には、ＭＲＳＡ陽性ｎ＝０８、ＭＲＳＡ陰性ｎ＝０７が含まれ、再発＝５３％という結果であった。最終的な陰性対照の実行（シート１２週−脱コロニー化後の平均１６週目）により、ＭＲＳＡ陽性ｎ＝０９、ＭＲＳＡ陰性ｎ＝０６となり、再発＝６０％であった。
【０５４７】
治療群１、２、３脱コロニー化／再コロニー化（８＾１０細胞濃度）：３４。脱コロニー化／再コロニー化は、研究のために３つの群に分けられた：群１  ＰＢＳ中のＢｉｏＰｌｘ０１−ＷＴ（１０＾８）、ｎ＝１０、ＩＤ番号：００１５、００８６、０１４６、０１４７、０１４９、０１５５、０１７８、０６２５、０６５７、０６６７。群２  ＰＢＳ中のＢｉｏＰｌｘ０１−ＷＴ（１０＾８）、ｎ＝１０、ＩＤ番号：００６３、００７５、０１２４、０１３８、０１７２、０３２５、０４４４、０４７８、０４８３、０５３８；および群３  ＰＢＳ中のＢｉｏＰｌｘ０１−ＷＴ（１０＾８）、ｎ＝１４、ＩＤ番号：００６４、０１１２、０１５８、０２３２、０３３６、０４８８、０４９７、０４９８、０４９９、０５５２、０５７４、０６９２、０７２５、０７３５。
脱コロニー化／再コロニー化後ＭＲＳＡ再発：０、群１＝０、群２＝０、群３＝０。脱コロニー化後のＭＲＳＡ陰性期間：１８週間＝１６例：０再発；  １７週間＝１８例：０再発。
【０５４８】
検出可能な再コロニー化性能
有効性試験の対象は、ペニシリナーゼディスクを使用する置き換え用ＢｉｏＰｌｘ  ０１  ＷＴの存在を検出するために、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ陽性結果について試験された。結果を表１１に示す。
【表２７】
2021505197.tif 000035
【０５４９】
研究期間は６ヶ月に延長された。従前の文献で標準的な脱コロニー化法のみによる、４週間での４５％、および１２週間での６０％のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの鼻でのコロニー形成の再発が示されているのと対照的に、研究の結論では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ陽性は１００％で、研究の結論では、ＢｉｏＰｌｘ製品でのＢｉｏＰｌｘ−０１  ＭＲＳＡ脱コロニー化／再コロニー化プロセスの２６週間を超える全体の排除効果を示している。
【０５５０】
刺激研究
上述のように、ＭＲＳＡ陽性の参加者は、試験監督者（Ｇａｒｇ博士）によって有効性試験の対象として選択された。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ陽性の参加者は、研究監督者によって刺激研究のために選ばれた。ＭＲＳＡ患者はスクリーニングに多くの労力を必要とするため、研究の主な有効性評価のためにそれらを保存する試みが行われた。ＭＲＳＡ以外の陽性コロニー形成率は、スクリーニングされた全参加者の約３３％〜６６％であるため、より豊富な供給があった。ＭＲＳＡはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの抗生物質耐性株であるため、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ陽性の参加者に対する刺激試験は、ＭＲＳＡ陽性の参加者に対する刺激試験と同等である。
【０５５１】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ陽性対象５５人を対象に、約５ｍＬのＰＢＳ中のＢｉｏＰｌｘ−０１（５０２ａ）を１．２×１０7ＣＦＵ／ｍＬで右前腕に局所投与することにより、刺激試験を実施した。左腕は陰性対照として機能した。塗布後１日目、４日目、および７日目に、研究担当者が前腕を観察して写真を撮り、発赤または膿疱の発生を観察した。刺激研究の間、抑制ステップは行われなかった。刺激や有害事象は観察されなかった。
【０５５２】
培養条件
有効性研究では、水に溶解して１００ｍＭリン酸緩衝液、２．７ｍＭ  ＫＣｌおよび１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を２５℃で提供するＰＢＳ（Ｆｉｓｈｅｒ）ＢＰ２９４４１００リン酸緩衝生理食塩水錠剤中のＢｉｏＰｌｘ−０１（１．２×１０8ＣＦＵ／ｍＬ）を使用した。
【０５５３】
マスターストックは以下のように調製した。ＢｉｏＰｌｘ−０１株をトリプシン消化大豆寒天（ＴＳＡ）プレートに四角形で画線した。３７℃で２０時間後、新鮮な細胞ボーラスを使用して、フラスコの無菌のトリプシン消化大豆ブロス（ＴＳＢ）に無菌的に接種した。この培養物を、２５０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で１８時間インキュベートした。無菌の５０％グリセロールを培養液に５％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加し、バッチを無菌の５０  ｍＬポリプロピレンスクリューキャップチューブに等分した。アリコートを−２０℃で凍結した。品質管理のために、１つのアリコートを解凍し、激しく振とう混合して完全に再懸濁し、３７℃で１８時間Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）寒天プレート上でインキュベートすることにより、ｍＬあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を決定するために希釈した。ＣＦＵ値は、希釈補正されたコロニー数から計算された。この方法で製造された濃縮ＢｉｏＰｌｘ−０１マスターストックのバッチには、８×１０9ＣＦＵ／ｍＬのＢｉｏＰｌｘ−０１が含まれていた。株の表現型の同一性は、ＨｉＣｈｒｏｍブドウ球菌発色インジケーター培地上で３７℃で１８時間インキュベートすることにより確認され、予想される緑色のコロニーのみが生成された。ＭＲＳＡ発色インジケータープレート上で培養した場合、材料はコロニーを生成しなかった。
【０５５４】
有効性研究のためのワーキングストックの調製  １．２×１０8ＣＦＵ／ｍＬ
８×１０9ＣＦＵ／ｍＬの濃縮ＢｉｏＰｌｘ−０１ストックの１０ｍＬアリコートを完全に解凍し、完全に１分間振とうして混合した。この溶液８．５ｍＬを無菌（室温）ＰＢＳ２７５ｍＬに加え、２．４×１０8ＣＦＵ／ｍＬのストックを生成した。これを転倒混和し、使用するまで４℃で保存した。有効性研究で使用されているように、ＰＢＳマトリックス１．２×１０8ワーキングソリューション−ＢｉｏＰｌｘ−０１を提供するために、「２．４×１０8ＣＦＵ／ｍＬ」溶液のバイアルを激しく転倒混和し、その２００ｍＬを２００ｍＬ  ＰＢＳに加えて「１．２×１０8ＣＦＵ／ｍＬ作業溶液−ＢｉｏＰｌｘ−０１」を作成する。この後者の溶液は、有効性研究の対象に適用された材料であった。ボトルにしっかりと蓋をし、振盪して混合し、使用するまで４℃で保管した。
【０５５５】
実施例２１つ以上の誘導性プロモーターの選択
この例では、プロモーター候補が評価された。ＭＳＳＡ株ＢｉｏＰｌｘ−０１における６つのプロモーター候補の誘導倍数および基礎発現を、ヒト全血および血清とのインキュベーションにより評価した。発現はハウスキーピング遺伝子（ｇｙｒＢ）に正規化され、液体トリプシン消化大豆ブロス（ＴＳＢ）培地で対数増殖している細胞のものと比較された。
【０５５６】
ＢｉｏＰｌｘ−０１を対数増殖期中期（２ＯＤ／ｍＬ）まで増殖させた後、大きい体積で洗浄し、ドナーＴＫから新規に採取した血清とヘパリン添加血液に移した。
【０５５７】
試料をゆっくりと攪拌している通気フラスコ内で１２５ｒｐｍでインキュベートし、３７℃で１５、４５、または７５分でＲＮＡ単離のために試料を取り出した。収集した細菌を洗浄し、Ｑｉａｇｅｎ  Ａｌｌｐｒｅｐキットを使用してＲＮＡを抽出し、溶出してＲＮＡを凍結した。コードＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ＲＮＡから調製され、標的遺伝子発現は、ＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ装置でリアルタイムＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）によって評価された。
【０５５８】
相対ＲＮＡレベルは、連続的に希釈され、５つの推定血清応答性プロモーター（ＰhlgA、ＰleuA、ＰsstA、ＰsirA、ＰisdA）のいずれかによって駆動されるＯＲＦに特異的なプライマー／プローブと、発現クランプ戦略（ＰclfB）で使用するための、コロニー形成中に皮膚のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓで上方制御されるが、血中で上方制御されると報告されていない候補遺伝子の１つのプローブについて試験された共通のｃＤＮＡ試料で実行された標準曲線に対して挿入することによって決定された。
【０５５９】
すべての遺伝子の発現は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓでこの目的に広く使用されているハウスキーピング遺伝子ｇｙｒＢ（ジャイレースサブユニット）に正規化された。ＣｔはｒｔＰＣＲによって決定された。Ｃｔ、ＰＣＲしきい値サイクルは、所定の蛍光におけるサイクル数であり、遺伝子（ｍＲＮＡ）量が多いほど、Ｃｔは低くなる。
【０５６０】
単一ドナーの血清を使用した予備的な結果を表１２に示す。
【表２８】
2021505197.tif 000036
【０５６１】
ヒト血清におけるプロモーター候補ＰhlgAの誘導の時間経過は図６に示され、０．１９のＴＳＢにおけるｈｌｇＡ／ｇｙｒＢ比を示し、キルスイッチコンストラクトにおける使用に好ましい。「ＲＴなし」：７５分の時点のＲＮＡから作成されたｃＤＮＡを、他のすべての試料と同じ希釈率で反応液に希釈した。ＲＮＡ調製物にｇＤＮＡがない場合、シグナルは見えない。ヒト血清におけるｓｓｔＡの時間経過を図７に示し、ＴＳＢにおけるｓｓｔ／ｇｙｒＢ比が０．３３であることを示している。ＰhlgAとＰsstAは、さらなる評価のための予備的な好ましい候補として選択された。ＴＳＢ中のｈｌｇＡレベルは、ＴＳＢ中のハウスキーピング遺伝子のｇｙｒＢの１／５、またはそれ以下のみであったので、このプロモーターはリード候補となった。
【０５６２】
実験は、２つのドナーからの血清と全血を使用して、混入しているゲノムＤＮＡを除くためにＤＮａｓｅＩでｃＤＮＡを処理したことを除いて、全ＲＮＡでの分析を繰り返した。具体的には、ＲＮＡ試料は、Ｄｎａｓｅによる処理およびＤｎａｓｅの不活化のためのキットプロトコールに従って、ターボＤＮＡｓｅキットで処理された。ＤＮＡｓｅを伴う「逆転写なし」対照（ＲＴなし対照）は、ｂｋｇ／ベースラインレベルであり、許容範囲内であった。
【０５６３】
処理されたＲＮＡは、ｃＤＮＡを生成するために使用された（ＲＴなし対照が再度実行された）。ｃＤＮＡは、技術的三重でＴａｑｍａｎによって分析された（ｈｌｇＡおよびｓｓｔＡから開始）。結果を表１３に示す。
【表２９】
2021505197.tif 000037
【０５６４】
ＰisdA、ＰsstA、ＰsirAは、表１３に示すデータに基づいて削除された。ＰsstAは大幅な基礎発現のために除去され、全血では誘発されなかった。ＰsirAもまた、大幅な基礎発現と血清における低度の誘導のために排除され、全血では誘導されず、持続されなかった誘導を示した。
【０５６５】
この実験に基づいて、ＰleuAは、血清で非常に高い上方制御、ＴＳＢで非常に低い基礎発現を示し、コロニー形成中に上方制御されなかったため、１つの好ましいプロモーターとして選択された。発現クランプを使用してもよいが、プロモーターとしてＰleuAを使用する場合は任意であり得る。ＰleuAは、Ｍａｌａｃｈａｗａ  ２０１１（マイクロアレイ）および現在の例でも、血液または血清への曝露により強い活性化を示した。ｌｅｕＡは９遺伝子オペロン：ｉｌｖＤＢＨＣ、ｌｅｕＡＢＣＤ、ｉｌｖＡ．の一部である。Ｃｏｄｙと呼ばれる因子は、分岐鎖アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン）に結合すると、ＲＲに結合して転写を抑制する。したがって、遊離アミノ酸レベルがしきい値を超えると、プロモーターはサイレントになる。ＭＲＳＡによるブタのｅｘ  ｖｉｖｏ鼻コロニー形成アッセイでは、ｌｅｕを含むアミノ酸生合成オペロンは上方制御されておらず、著者らはコロニー形成中にこれらの経路の上方制御を防止するのに十分な量のアミノ酸が存在することを提案する（Ｔｕｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０５６６】
ｌｅｕＡ遺伝子は、血液および血清中で非常に強く活性化され、基礎発現が低いため、さらなる理解が重要である。ｌｅｕＡは、９遺伝子オペロン内の２つのカセットのうち２番目のカセット内にある。それを駆動する調節領域は、ｉｌｖＤのすぐ上流でも、ｌｅｕＡの上流でもよい。理解する１つの方法は、両方のバリアントを試験して比較することである。
【０５６７】
ｉｌｖＤＢＨＣ−ｌｅｕＡＢＣＤ−ｉｌｖＡ
ＰhlgAは、血清および血液において高い上方制御を示し、鼻のコロニー形成中に下方制御を示したので、別の好ましいプロモーターとして選択された。Ｐhlgの欠点の１つは、ＴＳＢの基礎発現でる。これはｈｌｇＡの発現クランプを含めることで対処できる。ペプチドＨｌｇＡは、宿主の赤血球と白血球を溶解する、分泌された孔形成毒素のサブユニットである。ＨｌｇＡ（クラスＳ）はＨｌｇＢ（クラスＦ）と会合し、ガンマ溶血素とロイコシジンの両方を産生する株でＡＢ毒素を形成する（ＨｌｇＡとＬｕｋＦ−ＰＶも複合体を形成できる）。
【０５６８】
ＨｌｇＡオペロンの転写は、クォーラムセンシングａｇｒの活性化によってＴＳＢで上方制御されるが、ｈｌｇＡが上方制御されている間、ａｇｒは血清中で下方制御されるため、ｈｌｇＡ上方制御は血清中のａｇｒ経路とは無関係である。ある論文では、溶血素はコロニー化中にＴＳＢと比較して５．７倍下方制御された。具体的には、ＭＲＳＡ  ＳＴ３９８でコロニー化されたブタの鼻の外植片である。Ｔｕｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４を参照されたい。しかしながら、これらの実験では、コロニー形成中にｈｌｇＡの発現の証拠は見られなかった。調節因子ｓａｒＴは溶血素オペロンの転写を抑制し、ＰhlgAを使用してＫＳを駆動する場合、たとえばコロニー化プロモーターからのｓａｒＴの過剰発現により、有用な「発現クランプ」になり得る。
【０５６９】
別の実施形態において、合成微生物は、血清または血液によって活性化されるがヒトの皮膚、粘膜、またはＴＳＢ中でほとんどまたは全く発現を示さない多数のプロモーターを含む第１の調節領域に作動可能に連結された第１の細胞死遺伝子を含む少なくとも１つの分子改変を含む。コロニー形成で下方制御されるため、ｈｌｇＡの皮膚での発現低下の確実性が高くなる。ＴＳＢでｌｅｕＡの発現が確実に低くなっている。
【０５７０】
実施例３１つ以上の死遺伝子の選択
この実施例では、細胞死遺伝子候補は、第１の誘導性プロモーターを含む第１の調節領域に作動可能に連結された第１の細胞死遺伝子を含む少なくとも１つの分子改変を有する合成微生物を調製するために評価される。死遺伝子の相対的効力は不明である。最良の死遺伝子のように見えるものは、漏出性の発現のため、必ずしも最も強力なものではない。作用機序の多様性により、２つ以上の死遺伝子の組み合わせの相乗効果が失われる可能性がある。死遺伝子の候補には以下が含まれる：ＳｐｒＡ１：膜破壊；  ｓｍａ１：ゲノム破壊；およびｒｓａＥ：中枢代謝を遮断する。死遺伝子のさまざまな組み合わせを表１４に示す。これらのプラスミドは、ＰleuAおよびＰhlgAによって駆動されるＫＳバリアントを試験するために作成およびシーケンシングされたプラスミドである。
【表３０−１】
2021505197.tif 000038
【表３０−２】
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【０５７１】
死遺伝子は商業的に入手でき（Ａｔｕｍ）、ベクターも商業的に入手できる（ＢＥＩ）。単一の死遺伝子の結果が得られた後、２つの死遺伝子を含む組み合わせが構築される。合成プラスミド、ベクター、および合成微生物は、表１４に基づいて調製される。
【０５７２】
細胞死遺伝子を含む合成株を作成するステップは以下の通りである。
【０５７３】
１．Ｅ．ｃｏｌｉでシャトルベクターｐＣＮ５１を中規模で生成する。
【０５７４】
２．Ｅ．ｃｏｌｉ中で死遺伝子をｐＣＮ５１にクローニングする（Ｃｄ誘導性Ｐcadの下）。
【０５７５】
３．Ｐcadを血清応答性プロモーターに置き換る。必要に応じて発現クランプを挿入する。
【０５７６】
４．ＫＳカセットをシーケンシングして構造を確認する。
【０５７７】
５．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０にエレクトロポレートし、エリスロマイシンプレートで形質転換体を選択する（この株は制限マイナスであり、ＢｉｏＰｌｘ−０１で生き残るための正しいメチル化パターンを生成する）。ＲＮ４２２０は、中間体として使用されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株である。制限マイナス、メチル化＋、ＢＥＩ製品番号ＮＲ−４５９４６。
【０５７８】
６．ＲＮ４２２０からプラスミドを調製し、ＩＤを確認するために制限消化を行う。
【０５７９】
７．プラスミドをＢｉｏＰｌｘ−０１にエレクトロポレートし、エリスロマイシンプレートで選択する。
【０５８０】
８．合成微生物株は血清実験の準備ができている。
【０５８１】
第１のプロモーターを含む第１の調節領域に作動可能に連結された第１の細胞死遺伝子を含む少なくとも１つの分子改変を有する合成微生物株を試験するステップは以下の通りである。
【０５８２】
１．プラスミドの選択圧としてのＴＳＢと抗生物質中での増殖。
【０５８３】
２．ＷＴ  Ｂｉｏｐｌｘ−０１との増殖の比較はどのようにするか？増殖曲線を準備する。
【０５８４】
３．Ｃｄプロモーターバリアント：細胞を洗浄してＣｄ培地に移す（対照は、死遺伝子を含まない空のベクターを含むＷＴ  Ｂｉｏｐｌｘ−０１である）。
【０５８５】
４．ＫＳバリアント：細胞を洗浄して血清に移す（対照は、死遺伝子を含まない空のベクターを含むＷＴ  Ｂｉｏｐｌｘ−０１である）。
【０５８６】
５．プレートリーダーでＯＤ630nmを使用して増殖をモニターする（長期間、エスケープ変異体の出現をモニターする）。
【０５８７】
６．全血試験の場合は、勝者の候補に対してのみ実行し、死の読み出しとしてＴＳＢ寒天培地でＣＦＵを使用する。
【０５８８】
７．明らかなエスケープ変異体がある場合は、プラスミドをＥ．ｃｏｌｉにシャトルし、プラスミド全体をシーケンシングする。
【０５８９】
プラスミドは市販の製品から調製することができる。一実施形態では、ｐＣＮ５１（６４３０ｂｐ）は、改変のための市販のプラスミドである。ｐＣＮ５１は、Ｅ．ｃｏｌｉ−ＳＡシャトルベクターであり、Ｅ．ｃｏｌｉ選択にはａｍｐＲ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ選択にはｅｒｍＣを使用する。これは、カドミウム誘導性プロモーターとＢＬＡターミネーターを含む、ｐＴ１８１ベースの低コピーローリングサークルプラスミドである。ＢＥＩ製品番号ＮＲ−４６１４９。１つのプラスミドでＫＳバリアントの組み合わせが可能である。シャトルベクタープラスミドのＭＣＳに１つを超えるＫＳを挿入することが可能である。
【０５９０】
１．３つのキル遺伝子をコードする３つのコンストラクトはＡｔｕｍ／ＤＮＡ２．０から注文され、方向性クローニングのために制限部位が各遺伝子の末端に戦略的に配置されている。
【０５９１】
２．ｐＣＮ５１シャトルベクター（ＢＥＩ  ＮＲ−４６１４９）、ＲＮ４２２０  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＢＥＩ  ＮＲ−４５９４６）、およびＤＣ１０Ｂ  Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＥＩ  ＮＲ−４９８０４）は、ＢＥＩ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓに注文する。
【０５９２】
３．表１５に示されているＤＮＡオリゴヌクレオチドは、次から注文される、ｉ）ＢｉｏＰｌｘ−０１  ｇＤＮＡからのＲＲのＰＣＲ増幅、方向性クローニングのための末端の制限部位を含む、ｉｉ）ＫＳコンストラクトのＤＮＡシーケンシング。
【表３１−１】
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【表３１−２】
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【０５９３】
クローニング
すべてのゲル電気泳動アガロースゲルは、１×ＴＡＥ緩衝液中１．０〜２．０％アガロースで、製造元の説明書に従ってミドリグリーン（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）が追加されている。
【０５９４】
例３ＡｐＴＫ１およびｐＴＫ２の構築
１．次のように、ｐＣＮ５１ならびにｓｐｒＡ１、ｓｍａ１、およびｒｓａＥプラスミドのミニプレップ量を調製する。
Ａ．株をＬＢ＋カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）プレートにストリークし、３７℃で１５〜１８時間インキュベートする。
Ｂ．ＬＢ＋カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）の液体にそれぞれ単一のコロニーを接種し、３７℃で１５〜１８時間攪拌（２４０ｒｐｍ）しながらインキュベートする。
Ｃ．製造元の説明書に従って、Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップキットで各株の５×複製ミニプレップを調製し、各カラムからＤＮＡを３０μＬで溶出し、複製プラスミドプレップを一緒にプールする（−２０℃でＤＮＡを凍結）。
【０５９５】
２．消化、ライゲーション、播種
２．１．ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩでｐＣＮ５１を切断して直線状にする（３７℃、３０分）。予想されるサイズは約６４００ｂｐである（マルチクローニング部位（ＭＣＳ）からの３５ｂｐフラグメントが脱落／ゲル上で可視化されない）。
２．２．ＫＣＮ１とＢａｍＨＩでｐＣＮ５１プラスミドを切断して、直線状にする（３７℃、３０分）。予想されるサイズは６４００ｂｐである（ＭＣＳからの３５ｂｐフラグメントが脱落／ゲル上で可視化されない）。
２．３  ＤＮＡ２．０からのｓｐｒＡ１プラスミドをＰｓｔ１とＥｃｏＲＩで切断し、目的の２３３ｂｐ  ｓｐｒＡ１インサートを遊離させる。
２．４  ＤＮＡ２．０からのｓｐｒＡ１プラスミドをＫｐｎ１とＢａｍＨＩで切断し、目的の２３３ｂｐ  ｓｐｒＡ１インサートを遊離させる。
２．５．記載されているように、ＤＮＡ消化中に電気泳動用の１．５％アガロースゲルであるゲルを注ぐ。
２．６．４つの反応すべてと、１ｋｂプラスＤＮＡサイズラダーに、８μＬの６×ローディング色素を添加する（３０μＬに３μＬ）。
２．７．１００Ｖで１．５時間ゲルを泳動する。
２．８．清浄なかみそりの刃で上述の目的のバンドを切り抜く。
２．９．Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットの３倍量の緩衝液ＱＧでスライスを溶解し（５６℃）、時々ボルテックスする。
２．１０．対のベクターを単離し、１つのカラムに一緒に挿入し、Ｑｉａｇｅｎの溶出緩衝液３０μｌ中に材料を溶出する。
Ａ．Ｐｓｔ１＋ＥｃｏＲＩインサートとｐＣＮ５１  Ｐｓｔ１／ＥｃｏＲＩベクター。
Ｂ．Ｋｐｎ１＋ＢａｍＨＩインサートとｐＣＮ５１  Ｋｐｎ１／ＢａｍＨＩ。
２．１１  発泡スチロールの箱の中で５００ｍＬのＲＴ水に氷を加えることにより、ウォーターバスをセットアップする。１６℃に達するのに十分な氷を追加する。
２．１２．３．４μＬの１０  ＸＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液を加え、混合する。１μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢからの４×１０5Ｕ／ｍＬストック）を添加し、１６℃で２時間インキュベートする。
２．１３  エレクトロポレーションユニットを１５００Ｖ／２００オーム／２５μＦに設定する。
２．１４．２バイアルのＤＨ５α  Ｅ．ｃｏｌｉを解凍し、それぞれに４０μＬを２つのエッペンドルフチューブに追加する。２エレクトロポレーションキュベットを氷上で冷却する。
２．１５．１μＬの未希釈ライゲーションを４０μＬの解凍したＤＨ５α  Ｅ．ｃｏｌｉに添加し、氷冷した１ｍｍギャップのエレクトロポレーションキュベットに移す。
２．１６．準備する：１ｍＬピペットに１ｍＬのＳＯＣ培地、無菌１ｍＬチップ、および２つの無菌１４ｍＬ培養チューブ
２．１７．細胞をエレクトロポレーションし（最初にライゲーションＡ）、次にＡＳＡＰで１ｍＬのＳＯＣをキュベットに加え、ピペットで６回上下し、全量を新しい１４ｍＬ培養チューブに移して回収する。ライゲーションＢのエレクトロポレーションのためにこのプロセスを繰り返す。２つの回収試料を３７℃の振とうウォーターバスに１時間入れる。
２．１８．細胞が回復する間、２  ＬＢ＋カベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）寒天プレートを３７℃のインキュベーター（加湿されていない）で蓋を少し外して逆さにする
２．１９．１時間の回復期間後、それに応じてＬＢ＋カベニシリン（１０５０μｇ／ｍＬ）寒天プレートを取り外してラベルを付け、ウォーターバスから１４ｍＬチューブを回収する。
２．２０．滅菌ガラスビーズを使用して、１ｍＬの各回復混合物１５０μＬをプレートに延展する。
２．２１  プレートを３７℃のインキュベーターに１６〜１８時間置く。
２．２２．以下ののコロニー数を記録する
ライゲーションＡ（Ｐcad：：ｓｐｒＡ１フォワード）および
ライゲーションＢ（Ｐcad：：ｓｐｒＡ１リバース）。
【０５９６】
３．陽性のスクリーニング：
３．１  スクリーニングする６つのコロニーを選ぶ
３．２  ライゲーションＡのコロニー６個とライゲーションＢのコロニー６個を、それぞれ１４ｍＬ培養チューブ内の液体ＬＢ＋カベニシリン（１０５０μｇ／ｍＬ）３ｍＬに播種する。
３．３  ３７℃で１６時間振とうする。
３．４  製造元の説明書に従ってＱｉａｇｅｎスピンミニキットを使用してプラスミドＤＮＡを単離し、４０μＬの溶出緩衝液にＤＮＡを溶出する。
３．５  １２個のプラスミドＤＮＡをそれぞれ以下の５μＬで消化する。
Ａ．ＰＳＴ１＋ＥＣＯＲ１
Ｂ．Ｋｐｎ１＋ＢａｍＨＩ
Ｃ．Ｘｍｎ１のみ
Ｐｓｔ１＋ＥｃｏＲＩの場合、７つの反応物を混合する。５μＬのＤＮＡ溶液を１５μＬの消化液に添加し、３７℃で２時間インキュベートする。Ｋｐｎ１＋ＢａｍＨＩおよびＸｍｎ１の消化についても同じようにする。
【０５９７】
予想されるゲルパターンと比較する：ｐＴＫ１消化の正しいパターン：ｉ）ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ；  ｉｉ）Ｋｐｎ１およびＢａｍＨＩ；  ｉｉｉ）Ｘｍｎ１。ｐＴＫ２消化の正しいパターン：ｉ）ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ；ｉｉ）Ｋｐｎ１およびＢａｍＨＩ；ｉｉｉ）Ｘｍｎ１。
【０５９８】
実施例３ＢｐＴＫ３（ＰleuA：：ｓｐｒＡ１）とｐＴＫ６（ＰhlgA：：ｓｐｒＡ１）とｐＴＫ４（ＰleuA：：ｓｐｒＡ１を反転）を作成する
１．Ｑｉａｇｅｎの「Ａｌｌ  ｐｒｅｐ」キットを使用して、ＢｉｏＰｌｘ−０１の対数期培養からｇＤＮＡを抽出する。
２．ｐｐｈ１  ＳｐｒＡ１をＳｐｈ１とＰｓｔ１で消化して、カドミウム誘導性プロモーター（Ｐcad）を脱落させる。
３．上流にＳｐｈ１制限配列、下流にＰｓｔ−１制限配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、Ｂｉｏｐｌｘ−０１  ｇＤＮＡからのｌｅｕＡ調節領域（ＰleuA）をＰＣＲ増幅する。（以下のＴＫＯ１およびＴＫＯ３配列、またはバックアップＴＫＯ２＋ＴＫＯ４）。前述のようにゲル電気泳動で制限を検証する。
ＰＣＲ混合物：
ＢｉｏＰｌｘ−０１からの１．０μＬのｇＤＮＡ  ５０ｎｇ／μＬ
２５．０μＬのｄＩ水
１０．０μＬの５×ＨＦ緩衝液
５．０μＬの２ｍＭ  ｄＴＮＰミックス
４．０μＬのプライマーＴＫＯ１（５ｐｍｏｌ／μＬストック）
４．０μＬのＴＫＯ３（５ｐｍｏｌ／μＬストック）
１．０μＬのｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼＮＥＢ
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
合計５０．０μＬ
サイクル：
９８℃で２分間
２０サイクル：９８℃１５秒−−６４℃３０秒−−７２℃１分
１５サイクル：９８℃で１５秒−−５５℃で３０秒−−７２℃で１分
保持：４℃、無期限
４．上流にＳｐｈ１制限配列、下流にＰｓｔ−１制限配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、Ｂｉｏｐｌｘ−０１  ｇＤＮＡからのｈｌｇＡ調節領域（ＰhlgA）をＰＣＲ増幅する。（ＴＫＯ９およびＴＫＯ１１またはバックアップセットＴＫＯ１０またはＴＫＯ１２）。プライマーの同一性を除いて、ＰＣＲ条件は上記のＰleuAと同じである。
５．Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットを使用して、ＰＣＲ反応物を清浄化し、４３μＬの溶出緩衝液に溶出する
６．ステップ３からのＰleuAＰＣＲ産物とステップ４からのＰhlgAＰＣＲ産物をＳＰＨ１およびＰｓｔＩで切断する。５μＬの１０Ｘ  ＣｕｔＳｍａｒｔ（ＮＥＢ）とそれぞれ１μＬのＳｐｈ１とＰｓｔ１を添加し、３７℃で２時間インキュベートして、これを行う。
７．Ｓｐｈ１／Ｐｓｔ１でｐＴＫ１を消化する。
８．ｐＴＫ１  Ｓｐｈ／Ｐｓｔ消化物とＳｐｈ／Ｐｓｔ消化したＰleuAとＰhlgAを１．５％アガロースゲルで分画し、約６０００  ｐＴＫ１バックボーンとＰleuA（３９０  ｂｐ）とＰhlgA（２５３ｂｐ）フラグメントを清浄な剃刀の刃で切り出す。
９．ｐＴＫ１バックボーンスライスを２つに分割し、半分をＬｅｕＡスライスと混合し、残りの半分をＨｌｇＡスライスと混合する。一緒に溶かし、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを使用して一緒に単離する。それぞれ３０ｕＬ  ＥＢに溶出する。
１０．１０Ｘ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液３．４μＬとＴ４  ＤＮＡリガーゼ１μＬを添加し、１６℃で少なくとも１時間インキュベートする。
１１．エレクトロポレーション、回収、およびコロニー播種については、セクション２．１３〜２．２２の手順に従う。
１２．２つのライゲーションは、順方向（ｐＴＫ３）にＰleuA：：ｓｐｒＡ１  ｗｔおよび順方向（ｐＴＫ６）にＰhlgA：：ｓｐｒＡ１  ｗｔを生成することを目的とする。
【０５９９】
実施例３ＣｐＴＫ４を作成する（ｐＴＫ３と同時にステップを実行する）
１．ｇＤＮＡ単離キットを使用して、ＢｉｏＰｌｘ−０１の対数期培養からｇＤＮＡを抽出する。
２．Ｓｐｈ１とＰｓｔ１でｐＴＫ２（センスｓｐｒＡ１）を消化し、Ｐcadを脱落させる（消化条件については上記を参照されたい）。
３．Ｓｐｈ１／Ｐｓｔ１で消化された上からのＰleuAフラグメントをＳｐｈ１／Ｐｓｔ１で消化されたｐＴＫ２に挿入して、ＰleuA：：ｓｐｒＡ１  ｗｔを逆方向（ｐＴＫ４）で生成する。ゲル抽出、ライゲーション、およびエレクトロポレーションプロセスの詳細は、上記のクローニングのセクション２と同じである。
【０６００】
ｐＴＫ３、ｐＴＫ４、およびｐＴＫ６のスクリーニング：
３．１  スクリーニングのために各ライゲーションの６つのコロニーを選ぶ
３．２  ６つのｐＴＫ３コロニーと６つｐＴＫ４と６つのｐＴＫ６を、それぞれ１４ｍＬ培養チューブ内のＬＢ＋カベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）３ｍＬに接種する。
３．３  攪拌しながら１６時間（３７℃、２４０ｒｐｍ）インキュベートする。
３．４  ミニプレップキットを使用してプラスミドＤＮＡを単離し、４０μＬの溶出緩衝液でＤＮＡを溶出する。
３．５  次のように１８個のプラスミドＤＮＡのそれぞれを５μＬで消化する（ピペッティングエラーを考慮して２０回の反応に十分な消化反応混合物を調製する）。
Ａ．Ｓｐｈ１＋Ｐｓｔ１
Ｂ．Ｘｍｎ１。
５μＬのＤＮＡを１５μＬの消化反応液に添加し、３７℃で２時間インキュベートする
３．６  ゲル電気泳動で消化を検証し、
ｐＴＫ３、ｐＴＫ４、およびｐＴＫ６の予想されるゲルパターンと比較する。
【０６０１】
ｐＴＫ５およびｐＴＫ７を作成する
１．上記で調製したＢｉｏＰｌｘ−０１のｇＤＮＡを使用する。
２．上流にＥｃｏＲＩ制限配列、下流にＢａｍＨＩ制限配列を持つプライマーを使用して、ＢｉｏＰｌｘ−０１ゲノムＤＮＡからｃｌｆＢ  ＲＲ（ＰclfB）をＰＣＲ増幅する（プライマー：ＴＫＯ５およびＴＫＯ７）
ＰＣＲ混合液（総容量５０μＬ）
ＢｉｏＰｌｘ−０１からの１．０μＬのｇＤＮＡ  ５０ｎｇ／μＬ
２５．０μＬのｄＩ水
１０．０μＬの５×ＨＦ緩衝液（ＮＥＢ）
５．０μＬの２ｍＭ  ｄＴＮＰミックス
４．０μＬのプライマーＴＫＯ５（５ｐｍｏｌ／μＬストック）
４．０μＬのＴＫＯ７（５ｐｍｏｌ／μＬストック）
１．０μＬのｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ）
サイクル：
９８℃で２分間
２０サイクル：９８℃１５秒−−６４℃３０秒−−７２℃１分
１５サイクル：９８℃で１５秒−−５５℃で３０秒−−７２℃で１分
保持：４℃、無期限
３．前述のように、ゲル電気泳動には５μＬのＰＣＲ反応物を使用する。
４．ＰＣＲクリーンアップキットを使用して、ＰＣＲ反応物を清浄化し、３０μＬの溶出緩衝液で溶出する。
５．ＢａｍＨ１とＥｃｏＲ１でＰclfBＰＣＲ産物を消化し、それをＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１で消化されたｐＴＫ３バックボーンに挿入してｐＴＫ５を生成する。このプラスミドには、ＰleuAによって制御されるｓｐｒＡ１と、ＰclfBによって制御されるｓｐｒＡ１ASが含まれる。同じＰclfBフラグメントを使用して、ＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１で消化したｐＴＫ６に挿入して、ｐＴＫ７を生成する。このプラスミドには、ＰhlgAによって制御されるｓｐｒＡ１と、ＰclfBＳｐｒＡ１によって制御されるｓｐｒＡ１ASが含まれる。
ゲル抽出、ライゲーション、およびエレクトロポレーションプロセスの詳細は、上記のクローニングのセクション２と同じである。
【０６０２】
ｐＴＫ５およびｐＴＫ７のスクリーニング
３．１  ライゲーションｐＴＫ５の６コロニーとライゲーションｐＴＫ７の６コロニーを、１４ｍＬ培養チューブ内のＬＢ＋カベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）３ｍＬに播種する。
３．３  攪拌しながら１６時間（３７℃、２４０ｒｐｍ）インキュベートする。
３．３  ミニプレップキットを使用してプラスミドＤＮＡを単離し、４０μＬの溶出緩衝液中にＤＮＡを溶出する。
３．５  １２個のプラスミドＤＮＡをそれぞれ以下の５μＬで消化する。
Ａ．ＢａｍＨＩ  ＋  ＥｃｏＲＩ
Ｂ．Ｘｍｎ１のみ
メーカーの推奨に従って、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩとＸｍｎ１で消化反応混合物を調製する。
５μＬのプラスミド溶液を１５μＬの消化反応液に添加し、３７℃で２時間インキュベートする。前述のようにゲル電気泳動で消化を検証する。
【０６０３】
実施例３ＤｐＴＫ８、ｐＴＫ９、およびｐＴＫ１０を構築する（Ｐcad−ｓｍａ１、ＰhlgA−ｓｍａ１およびＰleuA−ｓｍａ１）。
ｓｍａ１遺伝子は、上流にＰｓｔ１制限部位、下流にＥｃｏＲ１制限部位を有するＤＮＡ２．０から注文し、以下への挿入を可能にした。
●Ｐcad：：ｓｍａＩを作成するためのｐＣＮ５１はｐＴＫ８をもたらす
●Ｐｓｔ１／ＥｃｏＲ１を使用してｓｐｒＡ１を削除したｐＴＫ６により、ＰhlgA−ｓｍａ１が作成され、ｐＴＫ９をもたらす
●Ｐｓｔ１／ＥｃｏＲ１でｓｐｒＡ１を削除したｐＴＫ３により、ＰleuA−ｓｍａ１が作成され、ｐＴＫ１０をもたらす
１．ｐＣＮ５１、ｐＴＫ６、およびｐＴＫ３をＰｓｔ１およびＥｃｏＲ１  ｂｙｓｐｒＡ１で消化する。３７℃で２時間それぞれインキュベートする。
２．Ｐｓｔ１とＥｃｏＲ１で遺伝子を含む注文されたプラスミドを消化して（３７℃で２時間）、ｓｍａ１フラグメントを生成する。ゲル電気泳動で消化を検証する（予想フラグメントサイズは７５７ｂｐ）。
３．ゲル抽出、ライゲーション、エレクトロポレーション、回復、および抗生物質の選択については、ステップ２．５〜２．２２に従う。
【０６０４】
ｐＴＫ８、ｐＴＫ９、およびｐＴＫ１０のスクリーニング
３．１  ライゲーションｐＴＫ８の６コロニーとライゲーションｐＴＫ９の６コロニーとライゲーションｐＴＫ１０の６コロニーを、１４ｍＬ培養チューブ内のＬＢ＋カベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）３ｍＬに播種する。
３．３  攪拌しながら１６時間（３７℃、２４０ｒｐｍ）インキュベートする。
３．３  ミニプレップキットを使用してプラスミドＤＮＡを単離し、４０μＬの溶出緩衝液中にＤＮＡを溶出する。
３．５  １２個のプラスミドＤＮＡをそれぞれ以下の５μＬで消化する。
Ａ．Ｐｓｔ１およびＥｃｏＲＩ
Ｂ．Ｓｐｈ１およびＸｃｍ１
Ｃ．Ｘｍｎ１のみ
前述の制限反応およびゲル電気泳動手順に従う。
【０６０５】
実施例３ＥｐＴＫ１１、ｐＴＫ１２、およびｐＴＫ１３を作成する（それぞれＰcad−ｒｓａＥ、ＰhlgA−ｒｓａＥ、およびＰleuA−ｒｓａＥ）。
ｒｓａＥ遺伝子は、上流のＰｓｔ１制限部位と下流のＥｃｏＲ１制限部位を有するＤＮＡ２．０から注文し、次のプラスミドへの挿入を可能にした。
●Ｐcad−ｒｓａＥを作成するためのｐＣＮ５１はｐＴＫ１１をもたらす
●Ｐｓｔ１／ＥｃｏＲ１制限によりｓｐｒＡ１が削除されたｐＴＫ６により、ＰhlgA−ｒｓａＥが作成され、ｐＴＫ１２をもたらす
●Ｐｓｔ１／ＥｃｏＲ１制限によりｓｐｒＡ１ＳｐｒＡ１が削除されたｐＴＫ３により、ＰleuA−ｒｓａＥが作成され、ｐＴＫ１３をもたらす
１．前のセクションで説明したように、ｐＣＮ１、ｐＴＫ６、およびｐＴＫ３をＰｓｔ１およびＥｃｏＲＩ  ｓｐｒＡ１で消化する。
２．メーカーの提案に従って、ｒｓａＥ  Ｐｓｔ１およびＥｃｏＲ１を含む注文したＤＮＡを消化する。
ゲル電気泳動で消化を確認する（ｒｓａＥフラグメントは１４２ｂｐであるはずである）。
３．ゲル単離、ライゲーション、エレクトロポレーション、回復、および抗生物質の選択については、ステップ２．５〜２．２２に従う。
【０６０６】
実施例４インサートを作成するためにＤＮＡ２．０を使用するｓｐｒＡ１クランプおよびクランプなしのコンストラクトの作成：
ここでは、カドミウム誘導プロモーター（Ｐcad）、Ｂｌａターミネーター、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのエリスロマイシン耐性があるため、ｐＣＮ５１がベクターバックボーンとして採用される。Ｄｒｕｔｚ  １９６５では、５０２ａは２μｇ／ｍＬのエリスロマイシンに感受性であることが示された。
【０６０７】
プラスミドｐＴＫ１：ｓｐｒＡ１が誘導されると死を引き起こすことを証明する陽性対照カセット。
【０６０８】
１．ＤＮＡ２．０から次のインサートを注文する。注文したベクターからＰｓｔ１とＥｃｏＲ１制限酵素で切り出し、Ｐｓｔ１／ＥｃｏＲ１で消化したｐＣＮ５１に挿入する。ａＴｃプロモーター（Ｐtet）の代わりにＰcad機能が使用されていることを除いて、Ｓａｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１２のように本質的にｓｐｒＡ１を捕捉するのはオープンリーディングフレームであり、下流に少し隣接している。この配列は、戦略が機能することを保証するために、ｐＤＲＡＷで検証された。
【表３２】
2021505197.tif 000042
【０６０９】
ｐＴＫ２の作成：ｐＴＫ１の挿入を逆向きにする
１．Ｋｐｎ１とＢａｍＨＩでｐＴＫ１のインサートを切り出し、Ｋｐｎ１とＢａｍＨＩで消化したｐＣＮ５１に挿入する。これにより、毒素遺伝子のアンチセンス方向が作成され、毒素がカドミウムで誘導されるかどうかにかかわらず、毒素はまったく発現されない。製品はｐＴＫ２である。
【０６１０】
ＰＴＫ３およびＰＴＫ４：ＰhlgAがｓｐｒＡ１毒素を調節することで、ｓｐｒＡ１が血清または血液によって誘導された場合に、細胞死を引き起こすことを証明するため（それぞれ、フォワードおよびリバースコンストラクト）。
【０６１１】
ｓｐｒＡ１ASは存在するが、その天然のプロモーターのみがあるため、発現クランプは不活性である必要がある。また、ＰhlgAが漏出する場合、発現クランプが存在しないため、細胞毒性が発生する可能性がある。
【０６１２】
ｐＴＫ３：
１．Ｓｐｈ１とＰｓｔ１でｐＴＫ１（センスｓｐｒＡ１）を消化して、Ｐcadを脱落させる。
２．ＰＣＲは、上流Ｓｐｈ１制限部位とＰｓｔ１下流制限部位を含むＰＣＲプライマーを使用して、５０２ａ株からｈｌｇＡ調節領域（ＰhlgA）を増幅する。（プライマー：ＴＫＯ１およびＴＫＯ２）
３．ＰhlgA  ＰＣＲ産物をＳｐｈ１とＰｓｔ１で切り出し、それをＳｐｈ１／Ｐｓｔ１で消化したｐＴＫ１に挿入して、順方向にＰhlgA：：ｓｐｒＡ１  ｗｔを生成し、ｐＴＫ３を生成する。
【表３３】
2021505197.tif 000043
【０６１３】
【表３４】
2021505197.tif 000044
【０６１４】
【表３５】
2021505197.tif 000045
【０６１５】
ｐＴＫ４：
１．ＳＴＫ１とＰｓｔ１でｐＴＫ２（逆向きｓｐｒＡ１）を消化して、カドミウムプロモーターを脱落させる。
２．同じＳｐｈ１／Ｐｓｔ１で消化したＰhlgA  ＰＣＲ産物を挿入する。これにより、逆方向のＳｐｒＡ１が提供される。
【０６１６】
ｐＴＫ５：ＰclfBを使用してＳｐｒＡ１ASを駆動するｐＴＫ３の発現クランプ
１．プライマーを使用して５０２ａ  ｇＤＮＡからＰclfBをＰＣＲで増幅し、上流のＥｃｏＲ１制限部位とＢａｍＨＩの下流制限部位を生成する。
２．ＥｃｏＲ１とＢａｍＨＩでｐＴＫ３を消化し、ＥｃｏＲ１／ＢａｍＨＩで消化したＰclfBを挿入する。
【０６１７】
得られたプラスミドはｐＴＫ５と呼ばれ、血清応答性ＰhlgA（上方制御）によって制御されるＳｐｒＡ１センスと、血清応答性ＰclfB（下方制御）によって制御されるｓｐｒＡ１ASＳｐｒＡ１を含む。
【０６１８】
以下の配列は、ＰclfB（ＴＴＧ開始コドンのすぐ上流にある２１９ヌクレオチド）である。
【表３６】
2021505197.tif 000046
【０６１９】
【表３７】
2021505197.tif 000047
【０６２０】
【表３８】
2021505197.tif 000048
【０６２１】
ＰｅｐＡ１（ＳＡニューマン）
ＭＱＧＦＫＥＫＨＱＥＬＫＫＡＬＣＱＩＧＬＭＲＳＩＳＥＶＫＱＬＮＩＡ  配列番号１１３
【０６２２】
ｐＴＫ６。血清応答性プロモーター２−−ＳｐｒＡ１
【０６２３】
このコンストラクトでは、応答性プロモーター２はＰleuAである。
１．Ｓｐｈ１とＰｓｔ１でｐＴＫ１（センスｓｐｒＡ１を含む）を消化して、Ｐcadを脱落させる。
２．上流Ｓｐｈ１制限部位と下流Ｐｓｔ１制限部位（プライマー：ＴＫＯ５およびＴＫＯ６）を含むＰＣＲプライマーを使用して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ  ｇＤＮＡからのＰleuAをＰＣＲ増幅する。
３．ＰleuA  ＰＣＲ産物をＳｐｈ１とＰｓｔ１で消化し、それをＳｐｈ１／Ｐｓｔ１で消化したｐＴＫ１に挿入して、順方向にＰleuA：：ＳｐｒＡ１  ｗｔを生成し、ｐＴＫ６を生成する。
【０６２４】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓでは、ｉｌｖｌｅｕオペロンはｉｌｖＤＢＨＣ−ｌｅｕＡＢＣＤ−ｉｌｖＡ（９遺伝子）からなる。これはＢＣＡＡ生合成オペロンである。
【０６２５】
実施例５エレクトロコンピテントＤＣ１０Ｂの調製
エレクトロコンピテント細菌は、対数期の細胞を採取し、滅菌脱イオン水で広範囲に洗浄して、導電率を下げ、細胞をエレクトロポレーションプロセスに適した浸透状態にすることで調製される。
【０６２６】
１．新規にストリークした抗生物質を含まないプレートから、２５０ｍＬのＬＢ培地に各株を接種し、攪拌しながらインキュベートする（３７℃、２４０ｒｐｍ）。
【０６２７】
２．細胞を採取する前に、遠心分離機の電源を入れ、ローターを４℃まで冷却する。細胞を採取する前に、１Ｌの滅菌濾過１０％グリセロールを氷上に置く。
【０６２８】
３．ＯＤ630により増殖をモニターし、細胞が１．０ＯＤ630単位／ｍＬになったら、フラスコをすぐにウェットアイス上に１０分間置く。この時点から、培養物は氷冷しておく必要がある。各２５０ｍＬの培養液を、冷やした５００ｍＬの滅菌済み遠心ボトルに注ぐ。
【０６２９】
４．遠心分離（１５分、３５００ｒｐｍ、４℃）。上清を捨て、残っているブロスを吸引する。
【０６３０】
５．２５０ｍＬの滅菌１０％グリセロールを各遠心ボトルに追加し、上下にピペッティングして細胞を完全に懸濁する。
【０６３１】
６．４と５をさらに２回繰り返する。
【０６３２】
７．上清を注ぎ捨て、上下のピペッティングで細胞を２ｍＬの１０％グリセロールに懸濁する。
【０６３３】
８．凍結するには、１００μＬの培養液をウェットアイスのマイクロ遠心チューブに分注する。すべての培養液を使い終わったら、チューブをドライアイス／エタノール浴に１０分間移す。培養物が凍結したら、細胞を−８０℃の冷凍庫に移して保存する。
【０６３４】
細胞の効率を確認するには、１μＬのｐＵＣ１９（１０ｐＭ）で細胞を形質転換する。
【０６３５】
Ｅ．ｃｏｌｉのエレクトロポレーション条件は、１５００Ｖ、２５μＦ、２００オームである。ＤＨ５αから１μＬのプラスミドミニプレップを使用し、エレクトロコンピテントＤＣ１０Ｂの５０μＬにエレクトロポレーションする。
【０６３６】
１．エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉを氷上で解凍し、１μｌのプラスミドを氷冷した０．１ｃｍギャップのエレクトロポレーションキュベット内の５０μｌの細胞に加える。
【０６３７】
２．上記のようにエレクトロポレーションし、回復培地をすぐに追加する（１ｍＬ、ＳＯＣ培地）。
【０６３８】
３．３７℃で１時間、２５０ｒｐｍで攪拌し、１００μＬをＬＢ＋１００μｇ／ｍＬカルベニシリンに播種する。３７℃で１６時間プレートをインキュベートする。
【０６３９】
実施例６ＳＡ形質転換
形質転換の手法は、Ｃｈｅｎ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．２０１７，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  Ｓｙｓｔｅｍから採用されている。。Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３９，３７９０−３７９５．手元にある材料：５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート。１２クローンのＰＣＲスクリーニング用のシーケンシングプライマー；カナマイシン、細菌増殖用滅菌チューブを有するＴＳＢブロス、コロニーＰＣＲを行うためのＰＣＲ試薬（５００μｌのマスターミックス）、およびＰＣＲグレードＨ2Ｏ。
【０６４０】
ゴールデンゲートアセンブリの１０μＬ製品は、１００μＬの大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテントセルに形質転換される。成功したコロニーは、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートで選択される。ｐＣａｓＳＡ−ＮＮ＿ｓｐａｃｅｒプラスミドの構築の成功は、ＰＣＲまたはシーケンシングによって検証された。
【０６４１】
実施例７配列を確認するための大腸菌ＤＨ１０Ｂからの精製プラスミド
１．インサートのＤＮＡシーケンシング
ＴＫＯ１３からＴＫＯ２０までのプライマーは、これらの１３個のプラスミドのインサートをシーケンシングするためにさまざまに使用される。各プラスミドに使用するプライマーを表１５に示す。キル遺伝子インサートはＤＮＡ２．０から取得される。ＰleuAおよびＰhlgAプロモーターをＰＣＲで増幅し、これらのフラグメントのポリメラーゼエラーの可能性を評価した。
【０６４２】
２．配列の組み立てと確認
２．１  生のクロマトグラムが検査され、高品質の領域（非常に高い信号／ノイズと良好なピーク分離）のみが、組み立てプロセスで使用するために選択される。
【０６４３】
２．２  連続するプライマーからの配列リードの重複領域が特定され、削除される。ユニークな読み取りは、テキストのカラーコーディングを使用して、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄの先頭から末尾までつながっている。
【０６４４】
２．３  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗは、理論上の配列と実際の配列のアライメントを生成するために使用される。矛盾がある場合は、クロマトグラムを手動で検査して確認する。
【０６４５】
実施例８エレクトロコンピテントＢｉｏＰｌｘ−０１およびＲＮ４２２０の調製
エレクトロコンピテント細菌は、対数期の細胞を採取し、滅菌脱イオン水で広範囲に洗浄して、導電率を下げ、細胞をエレクトロポレーションプロセスに適した浸透状態にすることで調製される。
【０６４６】
手元にある材料：
１．５００ｍＬオレンジキャップ付きＶ底コーニング遠心分離ボトル
【０６４７】
２．５０ｍＬファルコンチューブ
【０６４８】
３．１．５ｍＬ滅菌マイクロ遠心チューブ
【０６４９】
４．Ａ６３０測定用の９６ウェルプレート
【０６５０】
５．１０および２５ｍＬの滅菌ピペットとすべてのサイズの滅菌ピペットチップ
【０６５１】
６．ＴＳＢブロス（合計６００ｍＬが必要）
【０６５２】
７．細胞を採取する前に、ウェットアイス上で１Ｌの滅菌５００ｍＭショ糖
【０６５３】
プロトコール
１．新規にストリークした抗生物質を含まないプレートから、２５０ｍＬのＴＳＢ培地に各株を接種し、攪拌しながらインキュベートする（３７℃、２５０ｒｐｍ）。
【０６５４】
２．細胞を採取する前に、遠心分離機の電源を入れ、ローターを４℃まで冷却する。細胞を採取する前に、１Ｌの１０％グリセロールを氷上に置く。
【０６５５】
３．ＯＤ630により増殖をモニターし、細胞が１．０ＯＤ630単位／ｍＬになったら、フラスコをすぐにウェットアイス上に１５分間置く。この時点から、培養物は氷冷しておく必要がある。各２５０ｍＬの培養液を、冷やした５００ｍＬの滅菌済み遠心ボトルに注ぐ。
【０６５６】
４．２９００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。上清を捨て、残っているブロスを吸引する。
【０６５７】
５．２５０ｍＬの１０％グリセロールを各遠心ボトルに追加し、上下にピペッティングして細胞を完全に懸濁する。
【０６５８】
６．２９００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。上清を注ぎ捨て、吸引する必要はない。細胞を２５０ｍｌのグリセロールに完全に懸濁し、再度遠心分離する。
【０６５９】
７．上清を注ぎ捨て、上下のピペッティングで細胞を残余のグリセロールに懸濁する。
【０６６０】
８．凍結するには、１００μＬの培養液をウェットアイスのマイクロ遠心チューブに添加する。すべての培養液を使い終わったら、チューブをドライアイス／エタノール浴に１０分間移す。培養物が凍結したら、それらを−８０℃の冷凍庫に移す。
【０６６１】
実施例９ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ配列の設計と試験およびｐＣａｓＳＡの試験を同時に行う
この例では、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）からＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ｐＣａｓＳＡ）に有効なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが取得され、以前の実験から標的とする遺伝子間領域を特定し、最後に遺伝子間領域を目的とするｇＲＮＡを設計および試験する。
【０６６２】
１．表１６に示すように、Ａｄｄｇｅｎｅから検証済みのＣＲＩＳＰＲコンポーネントを注文する。
【表３９】
2021505197.tif 000049
【０６６３】
２．ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ標的部位を選択する。標的とする場所を見つける。これは、生存率を妨げないように遺伝子間領域にある必要がある。現在、このような領域の１つは、図８に示すように、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００７４５４．１の５０２ａゲノムで１，１０２，１００〜１，１０２，７００ｂｐの範囲で確認されている。この領域は、組換えアプローチで以前に特定された領域と一致する。
【０６６４】
３．領域を選択したら、ＣＲＩＳＰＲＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｉｓｐｒｓｃａｎ．ｏｒｇ／）Ｍｏｒｅｎｏ−Ｍａｔｅｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，９８２−９８８を使用して、図９に示すように推定ｇＲＮＡを見つける。使用可能な配列はすべて大文字であることに注意されたい。
【０６６５】
４．ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＰＲＯＧ＿ＤＥＦ＝ｂｌａｓｔｎ＆ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＧ＿ＤＥＦ＝ｍｅｇａＢｌａｓｔ＆ＢＬＡＳＴ＿ＳＰＥＣ＝ＭｉｃｒｏｂｉａｌＧｅｎｏｍｅｓ＿１２８０＆ＤＢ＿ＧＲＯＵＰ＝ＡｌｌＭＧ）を使用するか、配列を直接検索（ＡＰＥまたは類似）して、起こり得るオフターゲット結合を確認する。注：非標準としてマークされたｇＲＮＡは、多くの場合、単一のミスマッチの塩基対を有するが、これらはおそらく機能するが、追加のオフターゲット効果を引き起こす可能性がある。
【０６６６】
５．表４Ｂ、図４Ａ〜４Ｄに示すように、オリゴを変更して注文する。オリゴの名前は、オリゴ番号、ＢＰＣ（ＢｉｏＰｌｘ  ＣＲＩＳＰＲ）、標的番号、方向（ＦＯＲまたはＲＥＶ）の形式で示され、その後に標的配列が続く。
【０６６７】
６．Ｃｈｅｎ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．２０１７から改変された以下のプロトコールに従って、ＣＲＩＳＰＲ標的配列のそれぞれをｐＣａｓＳＡプラスミドに付加する。操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用することによるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの迅速で効率的なゲノム編集。Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３９，３７９０−３７９５．
【０６６８】
ａ．オリゴ設計
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの標的遺伝子のＮＧＧ（ＮＧＧはスペーサーに含まれない）の前に２０ｂｐのスペーサー配列を選択する（４０％〜６０％のＧＣ比が最適である）。２つのオリゴを以下の形式で（上述のように）合成する。
【０６６９】
注：ＦＯＲプライマーは、標的配列のＮＧＧのすぐ上流にある必要がある。
【表４０】
2021505197.tif 000050
【０６７０】
ｂ．リン酸化
表１７に示すようにリン酸化混合物を調製する。
【表４１】
2021505197.tif 000051
【０６７１】
３７℃で１時間インキュベートする。
ｃ．アニーリング
２．５μｌの１Ｍ  ＮａＣｌをリン酸化オリゴペアに追加する。
９５℃で３分間インキュベートし、ゆっくりと室温まで冷却する（サーモサイクラーを使用）。（代替的に、ヒートブロックを使用して、ブロックをヒーターから取り出し、２時間自然冷却させる。）ｄｄＨ２Ｏを使用して、アニールしたオリゴを２０倍に希釈する。
【０６７２】
ｄ．ベクター消化
表１８に示すように１〜２ｕｇのｐＣａｓ９をＢｓａＩ（ＮＥＢ）で消化する。
【表４２】
2021505197.tif 000052
【０６７３】
消化されたｐＣａｓ９をゲル精製する（クローニングを成功させるために重要）。
【０６７４】
ｅ．ライゲーション
表１９に示すようにライゲーション混合物を調製する。
【表４３】
2021505197.tif 000053
【０６７５】
ＲＴで２時間または１６℃でＯ／Ｎでインキュベートする。
【０６７６】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＤＨ５ａ、ＤＨ１０Ｂ、またはＤＣ１０Ｂ）に形質転換する。
【０６７７】
ｆ．プラスミド取り込みについて選択
カナマイシン（５０ｕｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天プレート上に細胞を播種することにより、プラスミドの取り込みを選択する。注：ｐＣａｓＳＡプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉを３０℃で非常にゆっくりと増殖させるため、コロニーを確認するためにプレートを２４〜３６時間インキュベートする必要がある場合がある。
【０６７８】
コロニーが見えたら、カナマイシン（５０ｕｇ／ｍＬ）を含むＬＢブロスで液体増殖するようにいくつか選択する。後日簡単に増殖できるように、液体培養のアリコートを保存する。
【０６７９】
クライオチューブで、５０％滅菌グリセロールを液体培養混合物を転倒混和し、−８０℃で長期保存する。
【０６８０】
Ｑｉａｇｅｎキットを使用してプラスミドを抽出し、仕様を保存して−２０℃で保存する。
【０６８１】
７．ＰＣＲおよび／またはシーケンシングによる包含の検証
【０６８２】
ａ．ＰＣＲ試験
上記の手順６で生成されたテンプレートで２１ＢＰＣ  ＦＯＲ（配列番号６３）および２２ＢＰＣ  ＲＥＶ（配列番号６４）を使用して試験する。
【０６８３】
コンストラクトのＰＣＲを実行する。ＰＣＲ産物は、無切断のｐＣａｓＳＡベクターで約２７５ｂｐになる（陽性対照＝無傷のｐＣａｓＳＡベクター）。消化されたｐＣａｓＳＡベクターを使用したＰＣＲは、いかなる産物も生成しないはずである（陰性対照＝Ｂｓａ１消化されたｐＣａｓＳＡベクター）。
【０６８４】
消化された産物のごく一部を試験して、１００％の効果を確認する必要がある。試験は、消化されたプラスミド上で直接ＰＣＲまたはゲル電気泳動によって行うことができる。ｇＲＮＡ配列を含むｐＣａｓＳＡベクターでのＰＣＲにより、約２７８ｂｐのアンプリコンが生成される。注：これらは、無傷のｐＣａｓＳＡベクターと比較した場合、目に見える違いはない。そのため、Ｂｓａ１消化は１００％である必要がある。
【０６８５】
ｂ．シーケンシング方法
上述で生成したＰＣＲ産物をシーケンシング用に調製する。メーカーのプロトコールに従ってスピンカラムクリーンアップキットを使用してＰＣＲ反応物をクリーンアップする。
【０６８６】
ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して、精製されたＰＣＲ産物の濃度を測定する。
【０６８７】
Ｑｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓでシーケンシングするために、試料をフォワードまたはリバースプライマー（それぞれ２１ＢＰＣ  ＦＯＲおよび２２ＢＰＣ  ＲＥＶ）のいずれかと混合する。
【０６８８】
５ｎｇ／ｕｌのＰＣＲ産物と５ｐｍｏｌ／ｕｌ（５ｕＭ）のプライマー。無傷のｐＣａｓＳＡベクターからのＰＣＲ産物は、ベースラインを提供するための他の産物と並列してシーケンシングする必要がある。
【０６８９】
８．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの有効性／標的化の試験
【０６９０】
挿入されたｇＲＮＡ配列を含む任意のプラスミドを導入すると、標的化ＣＲＩＳＰＲ部位で二重鎖切断が生じる。さらに、相同組換え修復（ＨＤＲ）のための相同配列の欠如は、二重鎖切断誘発致死を引き起こす。したがって、標的化プラスミドを標的化プラスミドで形質転換すると、ＣＲＩＳＰＲ標的化の有効性に対応する死亡率が生じるはずである。
【０６９１】
１０のそれぞれ（すべての標的化の組み合わせが機能すると仮定）を、エレクトロコンピテントＲＮ４２２０Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ細胞の個別のアリコートに形質変換する。
【０６９２】
この場合、標的１、４、および６〜１０はＲＮ４２２０細胞で活性を示すはずである（配列はＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ結合を可能にするのに十分類似している）。
【０６９３】
実施例１０構成的プロモーターによって制御される蛍光レポーターを使用して、相同性に依存性修復テンプレートと有効性を設計および試験する
ａ．相同アームは、上記で同定された約６００ｂｐの遺伝子間領域に対応するさまざまな長さ（２００、３００、および４００ｂｐ）で設計されている。生存能力の証明のために、蛍光レポーター遺伝子（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）が構成的プロモーター（ｒｓｐＬ）の制御下に挿入される。プロモーターとレポーターは、導入遺伝子スワッピングを可能にするために制限部位（Ｎｏｔ１およびＸｍａ１）に隣接する。現在の設計には単一の停止コドンが含まれている。必要に応じて、追加の停止コドンを追加できる。コンストラクトは、ＡＴＵＭ（以前のＤＮＡ２．０）を介して設計および注文される。この配列全体（相同アーム＋プロモーター＋ｍＣｈｅｒｒｙ）は、Ｘｈｏ１およびＸｂａ１制限部位を使用してｐＣａｓＳＡベクターに配置される。
【０６９４】
ｂ．ｍＣｈｅｒｒｙの組み込み／発現の確認
完全なｐＣａｓＳＡ−ＸＸ−ＸＸＸベクターが組み立てられ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株に形質転換されたら、次のことを確認する。１）ｍＣｈｅｒｒｙの発現、および２）ｍＣｈｅｒｒｙ配列のゲノムの取り込み。現在、これらを確認する実行可能な方法がいくつかある。注：ｍＣｈｅｒｒｙの発現は、プラスミドを維持する細菌だけでなく、組み込みが成功したバクテリアでも発生するはずである。これらを区別するために、２つを区別できるＰＣＲの場合を除いて、プラスミドを修復（削除）する必要がある。
【０６９５】
プラスミドの修復（ｒｅｐＦカセットを使用）：
【０６９６】
以前と同様に抗生物質を用いて３０℃で液体培養を行う。
【０６９７】
この培養液３〜５ｕｌを新規のＴＳＢ（抗生物質なし）で１０００倍に希釈する。
【０６９８】
増殖が明らかになるまで（例えば、一晩）４２〜４３℃で静置する。
【０６９９】
クロラムフェニコールを含んだまたは含まずにＴＳＡプレート上で液体培養をストリークし、３７℃で増殖させる。
【０７００】
培養物は−ｃｈｌｏｒプレートで増殖し、３７℃の＋ｃｈｌｏｒプレートでは増殖しないはずである。
【０７０１】
蛍光顕微鏡の場合：
ｍＣｈｅｒｒｙフルオロフォアは、約５８７ｎｍの光で励起され、約６１０ｎｍを放射する。
【０７０２】
ＰＣＲの場合：
組み込みを確認するために挿入された領域全体でＰＣＲ。増幅用に設計されたプライマー：挿入領域全体（４１／４２および４３／４４）。ｍＣｈｅｒｒｙ（５１／４５）の存在を試験する。ゲノムＤＮＡの存在を確認する（ＴＫＯ  １／３）。挿入とｍＣｈｅｒｒｙプライマーの混合とマッチングは、ｍＣｈｅｒｒｙの組み込みの試験にも役立つ。
【０７０３】
組み込みは、ウエスタンブロット分析でも確認できる。
【０７０４】
ウエスタンブロット装置を使用する：ゲルボックスとｉＢｌｏｔトランスファーシステム。当該技術分野で知られている、一次抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体、二次比色抗体、プレキャストゲル（またはゲルキャスティング機器と試薬）、ｉＢｌｏｔトランスファーキット、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質抽出溶液（例えば、ＲＩＰＡ）、タンパク質マーカー（ラダー）、および緩衝液（ＴＢＳ、ｔｗｅｅｎ）など）を使用する。
【０７０５】
実施例１１蛍光レポーターによるＫＳプロモーターの分析
蛍光レポーターは、組換えアプローチで同定されたプロモーター（ＰｌｅｕＡ、Ｐｈｌｇａなど）の制御下にある。この組み合わせにより、選択したプロモーターの有効性を測定可能な（陽性）結果で試験できる。好ましくは、ｍＣｈｅｒｒｙは、ｐＣＮ５１バックボーンに基づくコンストラクト中に配置されるであろう。この組み合わせを使用して、考えられる複数の問題を試験する。
【０７０６】
プラスミドを含む細胞が血液／血清に曝露されている場合、ｍＣｈｅｒｒｙは発現するはずである。これは、蛍光顕微鏡（Ｅｘ  ５８７ｎｍ、Ｅｍ  ６１０ｎｍ）で、またはｍＣｈｅｒｒｙタンパク質のウエスタンブロッティングで確認できる。
【０７０７】
ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質が「通常の」条件（血液／血清の活性化なし）で作成される場合、プロモーターは「漏出性」である。低レベルのＫＳ発現でさえ生存率の損失を引き起こす可能性があるため、漏出性の活性化は、特定のプロモーター（すなわちＰleuA）を含むＫＳプラスミドを取得する問題のいくつかを説明できる。
【０７０８】
特定のプライマーによって引き起こされる上方制御の速度と適合性はどのくらいか？
【０７０９】
細胞をリアルタイム（蛍光顕微鏡）または経時変化サンプリング（ウエスタンブロット）で観察して、血液および／または血清への曝露時の蛍光発生率を観察する。
【０７１０】
実施例１２ＫＳのＢｉｏＰｌｘ−０１への挿入、組み込みの検証、有効性と寿命の試験
選択したＫＳは、各配列に隣接するＮｏｔ１およびＸｍａ１制限部位を使用してｐＣａｓＳＡベクターに挿入される。ｐＴＫは、Ｘｍａ１制限部位を付加するプライマーＢＰ−４０を使用して増幅される。ＫＳはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ細胞に挿入され、ゲノムの組み込みが検証される。組み込まれた細胞は、プラスミドが回復し、血液／血清に曝されたときにＫＳ活性について試験される。次いで、「ＢｉｏＰｌｘ−ＸＸ」と名付けられたＫＳ細胞を、本明細書に記載されるように継代して、寿命および生存能力を分析する。
【０７１１】
実施例１３血清誘発性細胞死の割合と程度を確認／特徴付ける。
ＫＳを有するＫＳ細胞ＢｉｏＰｌｘ−ＸＸは、ＴＳＢ中でＢｉｏＰｌｘ−０１（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ  ＷＴ）と並列して増殖させ、次いで洗浄し、新鮮なヒト血清に移す。ＫＳ株は移動直後に「フラットライン」になるが、ＷＴ株は血清中で増殖し始める。
【０７１２】
実施例１４ＫＳ株ＢｉｏＰｌｘ−ＸＸの安定性を評価する
この実験は、ＢｉｏＰｌｘ−ＸＸのＫＳが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖中に表現型および遺伝子型的に安定していることを示すために実行される。
【０７１３】
表現型の安定性（この場合、ＫＳ性能）は、Ｘ、Ｙ、およびＺ世代の株を継代した後の血清中の細胞死の割合を決定することによって評価され、ここでＸは、２００人の患者を治療するのに十分な単一の臨床ロットの材料を生産するための株製造で経験した倍加の数であり、ＹおよびＺは、最大４１の培養倍加後に経験した世代の数である。患者１人あたり４×１０9個の細胞×２００人の患者＝８×１０11個の合計細胞を目指している。
【０７１４】
患者１人あたり４×１０9個の細胞の用量×２００人の患者＝８×１０11個の合計細胞。
【０７１５】
１．５ｍＬのＴＳＢに、ＢｉｏＰｌｘ−０１の単一の大きなコロニーと２番目の５ｍＬのＢｉｏＰｌｘ−０２を接種する−両方とも凍結したマスターセルバンクから画線される。（おおよその密度は０．０５  Ａ６３０／ｍＬである）。
【０７１６】
２．２つの株が１ｍＬあたり１．６  Ａ６３０単位まで増殖するのを待つ（Ｂｉｏｔｅｋプレートリーダーでモニターし、５の倍加）。これは中間指数相までである。（機器の線形範囲が０．１から０．９の間であることに留意されたい。この線形範囲にとどまるには、試料をＴＳＢ中に希釈する必要がある）。増殖率に関する詳細な記録を保管する。この計算では、約４  Ａ６３０単位／ｍＬ＝８×１０9ＣＦＵ／ｍＬと想定している。合計８×１０11ＣＦＵを取得するために必要な飽和培養の容量＝（８×１０11ＣＦＵ／８×１０9ＣＦＵ／ｍＬ）＝１００ｍＬ
【０７１７】
３．（２）のスターターカルチャーを使用して、１００ｍＬの各々の「最終」培養に１ｍＬあたり０．０５  Ａ６３０単位の密度まで接種する。１．６ｍＬスターターを９８．４ｍＬのＴＳＢに追加する。
【０７１８】
４．２つの株を３７Ｃ／２５０ｒｐｍで増殖させる。３．２のＡ６３０に達するまで密度をモニターする。（６の倍加）。０．０５  Ａ６３０単位／ｍＬで開始した各菌株１００ｍＬの新しい培養を作成する（これは「ラウンド２」である）。フラスコをシェーカー２５０ｒｐｍ／３７Ｃに戻す。
【０７１９】
５．ステップ４の１ｍＬ量の細胞を各株について５０ｍＬのＰＢＳに回収する。
【０７２０】
５Ａ．２回目の培養１ｍＬを瞬間凍結し、後の遺伝子試験のために−８０℃に置く（以下の遺伝子型の安定性を参照）。
【０７２１】
６．２９００ｒｐｍで１５分間遠心する。
【０７２２】
７．上清を吸引除去し、細胞ペレットをボルテックスして再懸濁する。
【０７２３】
８．ＰＢＳで再び容量を５０ｍＬにし、ステップ６のように採取する。
【０７２４】
９．各株（ＢｉｏＰｌｘ−０１、ＢｉｏＰｌｘ−０２）のペレットを、あらかじめ温めておいた新鮮なヒト血清２０ｍｌに再懸濁する。
【０７２５】
１０．２５０ｒｐｍ／３７Ｃで振とうし、増殖をモニターする。期待される結果は、ＢｉｏＰｌｘ−０１が増殖し、ＢｉｏＰｌｘ−０２（ＫＳ）が増殖しないことである。それぞれの勾配が片対数プロットから計算され、比率化されるのに十分なデータ点を収集する。この比率は、ＫＳ性能の指標となる。殺傷率（ＫＲ）＝血清中のＢｉｏＰｌｘ−０１増殖の勾配／血清中のＢｉｏＰｌｘ−０２増殖の勾配。このＫＲは、ＴＳＢで合計１１の倍加に達したＫＳ性能の指標である。
【０７２６】
１１．ステップ４Ａの「ラウンド２」培養は、Ａ６３０が３．２に達する（６の倍加）までモニターされる。これを使用して、「ラウンド３」培養を０．０５  Ａ６３０／ｍＬに播種し、次にラウンド２飽和培養を使用して手順５〜１０に従う。ＫＲは、合計１７の倍加でのＫＳ性能の指標である。
【０７２７】
１２．ステップ１１の「ラウンド３」培養は、Ａ６３０が３．２（６の倍加）に達するまでモニターされ、その後再び０．０５  Ａ６３０  ／  ｍＬに分割される。この３．２への増殖プロセスとそれに続く０．０５への分割は、次のように４回実行された。ラウンド３は２３の倍加。ラウンド４は２９の倍加。ラウンド５は３５の倍加。ラウンド６は４１の倍加。手順５〜１０に従う。ＫＲは、４１の倍加のＫＳ性能の指標である。
【０７２８】
ＫＲを培養倍加数の関数としてプロットする。
【０７２９】
遺伝子型の安定性：
１．１１、１７、４１の倍加の各時点からのＢｉｏＰｌｘ−０２細胞の試料を見出す。ステップ５Ａを参照されたい。
【０７３０】
２．ＮｅｘｔＧｅｎシーケンシングを実行して、この試料の配列の均一性を判定する。単一分子シーケンシングを使用して、所与の時点で細胞の集団で発生する変異の％を決定することができる。
【０７３１】
実施例１５上方制御を検出するために蛍光によってスクリーニングされた候補血清および血液応答性プロモーター
概要。この実施例では、潜在的なＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロモーターを血液および／または血清中の活性について試験した。候補プロモーターは、血液または血清への曝露後の遺伝子発現の上方制御に基づいて、文献から選択された。次いで、これらのプロモーターを、プロモーターが活性化されると蛍光を発するレポーター分子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の上流にクローニングした。いくつかの増殖ステップの後、このプロモーター−ＧＦＰカセットを含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ細胞を血液または血清に曝露し、ＧＦＰの活性を蛍光顕微鏡で観察した。このスクリーニングの結果は、キルスイッチ、病原性ブロック、ナノファクトリーなどの分子改変を調節するために使用できる、血液および／または血清におけるさまざまな程度の活性を持ついくつかのプロモーターを示している。
【０７３２】
実施例１では、５０２ａと示されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの非病原性株を使用して、ヒト皮膚マイクロバイオームからメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を排除した。この試験では５０２ａの使用による副作用はなかったが、さらなる安全性の手段としてキルスイッチが設計された。本明細書に開示されたキルスイッチ分子改変は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａまたはＲＮ４２２０細胞などの標的微生物に組み込むことができ、血液または血清への曝露時に細胞増殖を遅らせるか、または細胞死を促進することにより、細胞増殖を阻害するように機能する。そのため、患者における全身感染の可能性が低減または排除される。キルスイッチは、細胞増殖を遅延または停止させるキル遺伝子と、キル遺伝子発現を制御する血液または血清応答性プロモーターの２つの重要な要素を含む。この実施例では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロモーターの候補が血液または血清中の活性の増加について試験された。約３００ｂｐ上流および開始コドンを含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株５０２ａゲノム（ＮＣＢＩ  ＣＰ００７４５４．１）に由来する候補プロモーター配列を表２０に示す。
【表４４−１】
2021505197.tif 000054
【表４４−２】
2021505197.tif 000055
【表４４−３】
2021505197.tif 000056
【表４４−４】
2021505197.tif 000057
【０７３３】
当初、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕ細胞が血液または血清と培養された場合、２１のプロモーター候補が遺伝子発現の変化を報告する文献から選択された。以下の遺伝子は、Ｍａｌａｃｈｏｗａ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｇｌｏｂａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ．ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ６：ｅ１８６１７．１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１８６１７によって記載される：ｉｓｄＡ、ｉｓｄＢ、ｉｓｄＧ、ｉｓｄＩ、ｓｂｎＣ、ｓｂｎＥ、ｆｈｕＡ、ｆｈｕＢ、ＳＡＵＳＡ３００＿２２６８、ＳＡＵＳＡ３００＿２６１６、ＳＡＵＳＡ３００＿２６１７、ｈｌｇＢ、ｌｒｇＡ、ｌｒｇＢ、ｅａｒ、ｓｐｌＤ、およびｓｐｌＦ。以下の遺伝子は、Ｐａｌａｚｚｏｌｏ−Ｂａｌｌａｎｃｅ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｃｉｄｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８０（１）：５００−５０９によって記載される：ｆｎｂ、ｈｌｂ、ｈｌｇＢ、ｉｓｄＡ、ｉｓｄＢ、ｉｓｄＧ、ｆｈｕＡ、ｆｈｕＢ、ｄｐｓ。最後に、Ｓｔａｕｆｆ  Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＨｓｓＲ−ＨｓｓＳ  ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｈｅｍｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｓｅｐ  ７；２８２（３６）：２６１１１−２１は、ｈｒｔＡＢを記載する。これらの遺伝子の関連する調節エレメントをすべて捕捉するために、プロモーター領域として各遺伝子の開始コドンの上流にある３００塩基対を選択した。次いで、各プロモーター領域を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の上流にクローニングし、培地、血液、および血清中のプロモーター活性を可視化した。プロモーターは、ＧＦＰｍｕｔ２（ＧＦＰバリアント）の前にクローニングされ、プロモーターが活性化されると、ＧＦＰが転写され、蛍光タンパク質に翻訳される。高い蛍光は、高いプロモーター活性と相関する。
【０７３４】
材料および方法
クローニング文献から選択された各血液または血清応答性遺伝子について、開始コドンのすぐ上流にある３００塩基対の配列をプロモーター領域として選択した。プロモーターは５０２ａＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓゲノムから増幅され、ギブソンアセンブリ（ＧＡ）または制限酵素（ＲＥ）消化のいずれかを使用してＧＦＰの前にクローニングされた。ギブソンアセンブリでは、ベクターバックボーンに相同性のあるプライマーを使用してプロモーターを増幅した。以下の表では、プロモーターと一致するプライマー配列は大文字であるが、ベクターのバックボーンと相同なプライマー配列は小文字である。制限酵素消化のために、プロモーターは、ＳｐｈＩまたはＰｓｔＩ制限部位を持つプライマーを使用して増幅された。以下の表では、制限部位を含むプライマー配列が太字で示されている。ベクターのバックボーンであるプラスミドｐＣＮ５６（ＢＥＩ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）は、ギブソンアセンブリー用のＰＣＲを使用して増幅するか、または制限酵素クローニングのために制限酵素で単純に消化した。ｄｐｓプロモーターがＧＦＰで正常にクローニングされたことはない。複数回試行した後、ｄｐｓ−ＧＦＰカセット脱落した。スクリーニング用の最終プラスミドカセットは、ｐＣＮ５６−プロモーター−ＧＦＰである。プロモーターの増幅に使用したプライマーを表２１に示す。ベクターバックボーンの増幅に使用したプライマーを表２２に示す。
【表４５−１】
2021505197.tif 000058
【表４５−２】
2021505197.tif 000059
【表４５−３】
2021505197.tif 000060
【表４６】
2021505197.tif 000061
【０７３５】
血液と血清の試料血液試料の場合、４〜８ｍｌのヒト血液をヘパリン処理したチューブに入れ、凍結した。血清試料の場合、４〜８ｍｌのヒト血液をヘパリン化されていないチューブに吸引し、完全に凝固するまで室温で１５〜３０分間静置し、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。血清上清を注意深く回収し、新しいチューブに移して凍結した。
【０７３６】
細胞株の構築ＲＮ４２２０Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ細胞を、エレクトロポレーションを使用してｐＣＮ５６−プロモーター−ＧＦＰプラスミドで形質転換した。各細胞株のグリセロールストックを、以下の血液／血清誘導アッセイの出発材料として保存した。スクリーニングのための最終的な細胞株は、ＲＮ４２２０＋ｐＣＮ５６−プロモーター−ＧＦＰである。
【０７３７】
血液と血清の誘導各細胞株について、１０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含む１〜３ｍｌのトリプシン消化大豆ブロス（ＴＳＢ）培地に、少量のグリセロールストックを接種した。培養物を、２４０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。朝に、培養物の光学密度（ＯＤ）を測定し、培養物を使用して１ｍｌの新規のＴＳＢ＋エリスロマイシンを０．１のＯＤまで接種した。この０．１  ＯＤ培養物を、ＯＤが１〜２に達するまで、２４０ｒｐｍで２〜３時間振とうしながら３７℃で増殖させた。次いで、培養物を使用して、すべてエリスロマイシンを含む、５００μｌの新たに解凍した血液、血清、またはＴＳＢの３つの別々の培養物に、０．１のＯＤになるように接種した。これらの３つの培養物を、２４０ｒｐｍで１．５〜２時間振盪しながら３７℃で増殖させた。各培養液１０μｌを顕微鏡のスライドに滴下し、カバーガラスで覆い、蛍光顕微鏡で観察した。
顕微鏡画像は蛍光顕微鏡の接眼レンズを通してｉＰｈｏｎｅ（登録商標）で撮影された。
【０７３８】
結果と結論培地（陰性対照）、血液、または血清のいずれかで培養された各Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０＋ｐＣＮ５６プロモーターＧＦＰ細胞株の蛍光画像を読み取り、表２３にまとめたように蛍光レベルをスコア化した。
【表４７】
2021505197.tif 000062
【０７３９】
キルスイッチのプロモーターには、２つの重要な特性が必要である。第１に、細胞が血液または血清に曝露されると、プロモーターがオンになるか、上方制御される必要がある。このスクリーニングは、血液または血清の存在下でのプロモーター活性のスペクトルを明確に示している。一部のプロモーターは血液または血清中で非常に活性であり、他のプロモーターはそれほど活性ではない。活性のメカニズムに応じて、異なるキル遺伝子はおそらく異なるレベルの活性を持つプロモーターを必要とするであろう。たとえば、毒性ではなく致命的であるキル遺伝子には、非常に低い強度のプロモーターが必要になる場合がある。さまざまなキル遺伝子が試験されているので、このプロモーターのリストに戻って、キルスイッチを合理的に構築することが可能である。
【０７４０】
第２の要件は、細胞が血液または血清に曝露されていない場合、候補プロモーターがほとんどまたはまったく活性を持たないことである。５０２ａの主な目的はＭＲＳＡへの曝露前に皮膚にコロニーを形成することであるため、細胞がそれらの意図したニッチで正常に増殖し、キルスイッチ活性がこの機能に干渉しないことが重要である。ｉｓｄＧ、ｓｂｎＣ、ｓｂｎＥ、ｈｌｇＢ、ｈｌｂ、ＳＡＵＳＡ３００＿２２６８、ｈｌｇＡ２、ｈｒｔＡＢを含むこのスクリーニングで最も望ましいキルスイッチ候補プロモーターは、ＴＳＢ中で非常に低い活性を示し、血液または血清で中／高活性を示した。しかしながら、ｉｓｄＩ、ｌｒｇＡ、ｌｒｇＢ、ｆｈｕＢ、ｓｐｌＦ、ｄｐｓ、ＳＡＵＳＡ３００＿２６１６、ＳＡＵＳＡ３００＿２６１７も、さらに評価するための有用なプロモーター候補である可能性がある。このスクリーニングでは、いくつかの候補プロモーター（ｉｓｄＡ、ｉｓｄＢ、ｆｈｕＡ、ｅａｒ、およびｆｎｂ）が血液および血清に曝露される前に活性であったため、これらは潜在的なキルスイッチプロモーターのリストから優先順位が下げられた。
【０７４１】
Ｍａｌａｃｈｏｗａ  Ｎ，２０１１およびＰａｌａｚｚｏｌｏ−Ｂａｌｌａｎｃｅ  ＡＭ，２００８に記載されているように、ｌｕｋＧ、ｌｕｋＨ、ｃｈｓ、ｅｆｂ、ｉｃａＢ、ＳＡＵＳＡ３００＿１０５９、ＳＡＵＳＡ３００＿０３７０、ａｕｒ、およびＳＡＵＳＡ３００＿０１６９を含む追加の候補プロモーターが、将来のスクリーニングのために文献から選択された。
【０７４２】
実施例１６．血液および血清応答性プロモーターのゲノム発現のためのｑＲＴ  ＰＣＲ
この実施例では、ｑＲＴ  ＰＣＲは、文献で血液および／または血清応答性であることが判明している２０種類の内因性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ遺伝子に対して行われた。スクリーニングは、細胞死遺伝子を含むキルスイッチ分子改変の構築に使用するための候補血液および／または血清応答性プロモーターの同定を助けるために使用された。簡潔に述べると、５０２ａ細胞をＴＳＢ培地、血液、または血清中で増殖させ、ＲＮＡをさまざまな時点で抽出した。さらに、血液または血清では反応しないと予測されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの遺伝子がいくつか試験された。これらは、細胞死遺伝子に特異的な抗毒素に作動可能に連結される第２のプロモーターの候補であると考えられる。結果は、血液または血清で上方制御されているいくつかの遺伝子と、血液または血清で安定しているいくつかの遺伝子を示している。
【０７４３】
増殖の手順増殖実験は以下のように実行された。５０２ａ細胞の４ｍｌ一晩培養物に、コンピテントセルの小さなスクープを接種した。朝に、１２５ｍｌの使い捨て滅菌振とうフラスコに５０ｍｌの一晩培養物を０．１の光学密度（ＯＤ）まで接種した。細胞を２のＯＤ（数時間）まで増殖させた。ＯＤ２で、Ｔ＝０ＲＮＡ試料について５００ｕｌを除去した。残りの細胞の３欠け鵜ｒ７ｍｌを三重で５０ｍｌコニカルチューブに移した。チューブを回転させ、上清をデカントし、ＰＢＳで洗浄し、再度回転させ、上清を除去し、細胞を７ｍｌのＴＳＢ、血清、または血液に再懸濁した。２４０ｒｐｍで振とうしながら、チューブを３７℃に置いた。追加のＲＮＡ試料は、血清または血液への曝露後Ｔ＝１（チューブはすぐにサンプリングされ、３７℃で振とうされなかった）、Ｔ＝１５およびＴ＝４５で収集された。ＴＳＢおよび血清培養液のＲＮＡサンプリング法は、５００ｕｌを１．５ｍｌチューブに移し、１３，２００ｒｐｍで１分間遠心し、上清をデカントし、１００ｕｌのＲＮＡＬａｔｅｒを添加した。血液培養液のサンプリングは、上澄みを吸引し、２００ｕｌのＲＮＡＬａｔｅｒを加えたことを除いて同じである。すべての試料は、さらに処理するまで−２０℃で保管した（１０か月保管）。
【０７４４】
ｑＰＣＲ試料処理およびデータ分析ＲＮＡ抽出とｃＤＮＡ合成を行った。ＲＮＡＬａｔｅｒに保存された凍結ＲＮＡペレットをＰＢＳで１回洗浄し、Ａｍｂｉｏｎ  ＲｉｂｏＰｕｒｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａキットを使用して抽出し、２×２５ｕｌで溶出した。Ａｍｂｉｏｎ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅキットを使用して、ＲＮＡ試料をＤＮａｓ処理した。最終濃度が５０ｎｇ／ｕｌ未満の試料をエタノール沈殿して、ＤＮＡを濃縮した。１０ｕｌのＤＮａｓｅｄ  ＲＮＡをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの大容量ｃＤＮＡ逆転写キットで使用した。ｑＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰｏｗｅｒＵｐ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（１ｕｌのｃＤＮＡで１０ｕｌの反応）を用いて行った。試料をプローブして、経時的および異なる培地での遺伝子発現の変化を調べ、ΔΔＣｔ法を使用してハウスキーピング遺伝子ｇｙｒＢに正規化した。各ＲＮＡ試料の遺伝子転写産物のＣｔ値から、ｇｙｒＢ転写産物のＣｔ（閾値までのサイクル数）値を差し引いた。次いで、これらのΔＣｔ値を初期時点に正規化した。候補血清および／または血液応答遺伝子のｑＲＴ  ＰＣＲスクリーニングのためのプライマーを表２４に示す。
【表４８−１】
2021505197.tif 000063
【表４８−２】
2021505197.tif 000064
【表４８−３】
2021505197.tif 000065
【０７４５】
ｑＰＣＲの結果は図１３Ａおよび１３Ｂに示され、血液および／または血清中で上方制御されるいくつかの遺伝子を示している。図１３Ａは、血清中１分、１５分、および４５分でのプロモーター候補ｉｓｄＡ、ｉｓｄＢ、ｈｌｇＡ２、ｈｒｔＡＢ、ｉｓｄＧ、ｓｂｎＥ、ｌｒｇＡ、ｌｒｇＢ、ｆｈｕＡ、ｆｈｕＢ、ｅａｒ、ｈｌｂ、ｓｐｌＦ、ｓｐｌＤ、ｄｐｓ、およびＳＡＵＳＡ３００＿２６１７、および培地に対する遺伝子発現の倍数変化を示す。このスクリーニングで好ましい血清応答性プロモーター候補には、表２５に示すように、ｈｌｇＡ２、ｈｒｔＡＢ、ｉｓｄＡ、ｉｓｄＢ、ｉｓｄＧ、ｓｂｎＥ、ｅａｒ、およびｓｐｌＤが含まれる。これらが、血清に曝露後、４５分後に少なくとも９倍の遺伝子発現の増加を示し、血清に対する応答がわずかに遅れ、Ｔ＝１分では有意に上方制御されないためである。
【表４９】
2021505197.tif 000066
【０７４６】
図１３Ｂは、血清中１分、１５分、および４５分でのプロモーター候補ｉｓｄＡ、ｉｓｄＢ、ｈｌｇＡ２、ｈｒｔＡＢ、ｉｓｄＧ、ｓｂｎＥ、ｌｒｇＡ、ｌｒｇＢ、ｆｈｕＡ、ｆｈｕＢ、ｅａｒ、ｈｌｂ、ｓｐｌＦ、ｓｐｌＤ、ｄｐｓ、およびＳＡＵＳＡ３００＿２６１７を血液に曝露したときの候補プロモーター活性、ならびにｑＰＣＲによる培地に対する遺伝子発現の倍数変化を示す。好ましいプロモーター候補は、１分でわずかに遅延した遺伝子発現応答を示したが、１５および４５分の時点で少なくとも３０倍と大幅に上方制御された。表２６に示すように、ｑＰＣＲによる血液応答性遺伝子の好ましいプロモーター候補には、ｉｓｄＡ、ｉｓｄＢ、ｉｓｄＧ、ｓｂｎＥ、およびＳＡＵＳＡ３００＿２６１７が含まれる。
【表５０】
2021505197.tif 000067
【０７４７】
血清応答性プロモーターのゲノム発現のための別のｑＲＴ  ＰＣＲ
この実施例ではまた、ｑＲＴ  ＰＣＲは、文献で血液および／または血清応答性であることが判明しているＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ遺伝子をさらにスクリーニングするためにも実行される。簡潔に述べると、５０２ａ細胞をＴＳＢ培地、または血清中で増殖させ、ＲＮＡをさまざまな時点で抽出した。結果は、血清中で高度に上方制御されているいくつかの遺伝子を示している。本質的に、実験プロトコールは、ｃＤＮＡに変換する前にＲＮＡ試料を正規化し、試料をＴ＝  ９０分で収集したことを除いて、上記の実施例と同様であった。
【０７４８】
増殖の手順増殖実験は以下のように実行された。５０２ａグリセロールストックを新しいバクテリアプレートに打ち、一晩培養した。プレートからの３〜５個の単一コロニーを４ｍｌのＢＨＩ培地に接種し、２４０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。朝に、培養物を５ｍｌの新規のＢＨＩ培地で０．０５の光学密度（ＯＤ）に希釈した。細胞を３７℃で１５０ｒｐｍで振盪しながら数時間増殖させ、ＯＤを約１にした。この時点で、ＲＮＡの試料をＴ＝０の時点で収集した（１ｍｌを１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに移し、１６，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を１ｍｌ滅菌ＰＢＳに再懸濁し、１６，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を吸引除去し、細胞を２００ｕｌのＲＮＡＬａｔｅｒに再懸濁し、−２０℃で保存した）。残りの培養物を、１０ｍｌの新規のＢＨＩ培地または解凍したヒト血清の３つの複製ヘパリン処理チューブでＯＤが０．０５になるように再希釈し、１５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。ＲＮＡの追加の試料は、Ｔ＝９０分とＴ＝１８０分に収集された。これらの後者の試料では、１つの１０ｍｌチューブを３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに移し、１６，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を吸引除去し、細胞を２００ｕｌのＲＮＡＬａｔｅｒに再懸濁し、−２０℃で保存する。
【０７４９】
ｑＰＣＲ試料処理およびデータ分析ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成は以下のように行った。ＲＮＡＬａｔｅｒに保存された凍結ＲＮＡペレットをＰＢＳで１回洗浄し、Ａｍｂｉｏｎ  ＲｉｂｏＰｕｒｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａキットを使用して抽出し、２×５０ｕｌで溶出した。Ａｍｂｉｏｎ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅキットを使用して、ＲＮＡ試料をＤＮａｓ処理した。最終濃度が５０ｎｇ／ｕｌ未満の試料をエタノール沈殿して、ＤＮＡを濃縮した。５００ｎｇのＤＮａｓｅｄ  ＲＮＡをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの大容量ｃＤＮＡ逆転写キットで使用した。ｑＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰｏｗｅｒＵｐ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（１ｕｌのｃＤＮＡを含む１０ｕｌの反応）を用いて行った。
試料をプローブして、経時的および異なる培地での遺伝子発現の変化を調べ、ハウスキーピング遺伝子であるｇｙｒＢ、ｓｉｇＢ、ｒｈｏ、または３つの平均で、ΔΔＣｔ法を使用して正規化した。各ＲＮＡ試料の遺伝子転写産物のＣｔ値から、ハウスキーピング遺伝子転写産物のＣｔ（閾値までのサイクル数）値を差し引いた。次いで、これらのΔＣｔ値を初期時点に正規化した。ＴＳＢと血清の両方で９０分の遺伝子発現は、Ｔ＝０の値に正規化された。
【０７５０】
結果は、ＴＳＢと比較したｑＰＣＲによって、プロモーター候補ｈｌｇＢ、ｅａｒ、ｆｎｂ、ｓｐｌＦ、ｓｐｌＤ、ｃｌｆＡ、ＣＨ５２＿３６０、ＣＨ５２＿３０５、ＣＨ５２＿１６７０、ｈｌｂ、ｌｒｇＢ、ｌｒｇＡ、ｅｍｐ、ｆｈｕＡ、ｆｈｕＢ、ｉｓｄＩ、ｉｓｄＡ、ｓｒｔＢ、ｉｓｄＧ、ｓｂｎＥ、ｓｂｎＡ、ｓｂｎＣ、およびｉｓｄＢについて、Ｔ＝９０分の血清における遺伝子発現を示す図１３Ｃに示されている。図１３Ｃは、血清中で５倍を超えて上方制御された遺伝子がｆｈｕＡ、ｆｈｕＢ、ｉｓｄＩ、ｉｓｄＡ、ｓｒｔＢ、ｉｓｄＧ、ｓｂｎＥ、ｓｂｎＡ、ｓｂｎＣ、およびｉｓｄＢを含むことを示している。血清中での９０分間のインキュベーション後に、図１３Ｃは、ｉｓｄＡ、ｓｒｔＢ、ｉｓｄＧ、ｓｂｎＥ、ｓｂｎＡ、ｓｂｎＣ、およびｉｓｄＢを含むいくつかの遺伝子が１００倍を超えて上方制御されることを示している。具体的には、ｉｓｄ、ｓｂｎ、およびｆｈｕファミリーの遺伝子は、さまざまな程度で上方制御されている。ここで調査されたすべての遺伝子は、ＴＳＢでＴ＝０からＴ＝  ９０分まで安定した発現を有する。この実験のいくつかの遺伝子は、血清中で高い上昇制御を示すが、他の遺伝子は血清中で安定した発現を示す。これらの特性は両方とも、キルスイッチの構築に役立ち得る。例えば、細胞死遺伝子は、血清および／または血液中で上方制御されるプロモーターで制御され得、細胞死遺伝子に特異的な抗毒素遺伝子は、血清中で下方制御されるかまたは安定のままであるプロモーターで制御され得る。
【０７５１】
実施例１７プラスミドベースの誘導系を使用した候補細胞死遺伝子毒素としてのＳｐｒａ１
この実施例では、候補細胞死遺伝子ｓｐｒＡ１が、２つのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株で２つの異なるプラスミドベースの誘導系を使用して評価された。
実施例１７ＡＳｔａｐｈ  ａｕｒｅｕｓ細胞（ＲＮ４２２０）の細胞増殖の阻害剤としてのｓｐｒＡ１の初期試験は、カドミウム誘導性プロモーターを使用して行われた。ｓｐｒａ１毒素遺伝子は、ｐＣＮ５１（ｐＴＫ１）のカドミウムプロモーターの後ろにクローニングされた。ｐＣＮ５１ベクターは、カドミウム誘導性プロモーターを含む低コピープラスミドである。
【０７５２】
このバージョンのｓｐｒａ１には、ｓｐｒａ１を調節するアンチセンスが含まれている。カドミウムプロモーターの下流にあるｓｐｒＡ１−ｓｐｒＡ１ＡＳの完全な配列を以下に示す。この構造はｐＴＫ１と呼ばれる。
【０７５３】
ｐＴＫ１：ｓｐｒＡ１−ｓｐｒＡ１ＡＳ：ｓｐｒＡ１毒素遺伝子およびリボソーム結合部位、および抗毒素遺伝子（ｐＴＫ１またはｐ００１）。ｐＴＫ１は、カドミウムプロモーターを使用した実験で使用された。
ＣＣＣＣＴＣＡＣＴＡＣＣＧＣＡＡＡＴＡＧＴＧＡＧＧＧＧＡＴＴＧＧＴＧＴＡＴＡＡＧＴＡＡＡＴＡＣＴＴＡＴＴＴＴＣＧＴＴＧＴ（配列番号２７３）ｓｐｒＡ１抗毒素遺伝子
【０７５４】
カドミウムは毒性のある化合物なので、最初のステップは、カドミウムが増殖に最小限の影響を与えて、ｓｐｒＡ１がＲＮ４２２０の増殖
【表５１】
2021505197.tif 000068
に負である場合にマークされたデルタを確認できるサブ抑制濃度を見つけることであった。ＲＮ４２２０をＴＳＢ培地で一晩増殖させ、０．５ＯＤに希釈し、それぞれが３ｍｌの希釈ＲＮ４２２０細胞を含む８本の１４ｍｌ培養チューブに分離した。４つの濃度のカドミウムを４本のチューブに接種し、それぞれにカドミウムなしの対照はなかった。１０ｎＭ、１００ｎＭ、１ｕＭ、および１０ｕＭが最終的なカドミウム濃度であった。結果は、２４０ＲＰＭの振とうで３０℃で２時間と２２時間の増殖で評価されました（データ示さず）。２２時間後、１０ｕＭのカドミウムが最大の負の影響を示した。
カドミウムの最小サブ阻害濃度を決定する実験は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０細胞を使用して、１０ｎＭ、１００ｎＭ、および１ｕＭカドミウムを使用して２回繰り返した。２時間後、カドミウム試験の細胞増殖結果は１ｕＭまで良好な耐性を示す（データ示さず）。
【０７５５】
次に、５００ｎＭと１ｕＭのカドミウムを、さらなる対象として使用されたカドミウム誘導性プロモーターを持つｐＣＮ５４で形質転換したＲＮ４２２０細胞を使用して試験した。ＲＮ４２２０細胞を０．５ＯＤ（６３０ｎｍ）に希釈し、それぞれ３ｍｌを含む４つの培養チューブに等分した。２本のチューブに５００ｎＭと１ｕＭのカドミウムを接種した。ｐＣＮ５４を含むＲＮ４２２０細胞を０．５ＯＤ（６３０ｎｍ）に希釈し、それぞれ３ｍｌを含む４つの培養チューブに等分した。２本のチューブに５００ｎＭと１ｕＭのカドミウムを接種した。すべてのｐＣＮ５４増殖には、抗生物質選択としてエリスロマイシン１０が含まれていた。３０℃で２時間増殖させた後、ＯＤ（６３０ｎｍ）を測定した。結果は、５００ｎＭおよび１ｕＭのカドミウムで良好な耐性を示した。（データ示さず）濃度が高すぎてカドミウム効果のみと誘導毒素との違いが見られない可能性がある１０ｕＭを除いて、４２２０細胞は試験したレベルで良好なカドミウム耐性を示したと結論付けられた。
次の実験には、ＲＮ４２２０細胞に形質転換されたｐＣＮ５１プラスミド（ｐＴＫ１）のカドミウムプロモーターの後ろに毒素（ｓｐｒＡ１）が含まれていた。５００ｎＭと１ｕＭの両方の濃度を、２つのｐＴＫ１クローンピックとＲＮ４２２０細胞（ｗｔ）で試験した。ｗｔ  ＲＮ４２２０細胞の一晩培養物およびＲＮ４２２０細胞におけるｐＴＫ１の２つのクローンを０．５ＯＤに希釈した。野生型（ＷＴ）ＲＮ４２２０細胞を３ｍｌ／チューブで３本の培養チューブに分けた。２本のチューブに５００ｎＭと１ｕＭのカドミウムを接種し、誘導後２時間でＯＤを読み取った。各ｐＴＫ１クローンを、３ｍｌ／チューブで３本の培養チューブに分割した（合計６本のチューブ）。各ｐＴＫ１クローンは５００ｎｍと１ｕＭで誘導され、１つは対照である。誘導後２時間でＯＤを読み取った。結果を表２７および図１４に示す。
【０７５６】
図１４は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０細胞に形質転換されたｐＣＮ５１プラスミド（ｐＴＫ１）上のカドミウムプロモーターの後ろに細胞死毒素遺伝子（ｓｐｒＡ１）を含む合成微生物ｐＴＫ１細胞の細胞増殖の誘導性阻害を示す。表２７に示すように、誘導後２時間でＯＤ（６３０ｎｍ）を読み取った。野生型４２２０細胞は、カドミウムが存在しない場合と、５００ｎＭおよび１μＭのカドミウムが存在する場合の両方で、良好な細胞増殖を示した。ｐＴＫ１−１およびｐＴＫ１−２細胞はカドミウムの非存在下で良好な増殖を示したが、細胞増殖は５００ｎＭおよび１μＭカドミウムの存在下で誘導後２時間で有意に抑制された。
【表５２】
2021505197.tif 000069
【０７５７】
実験が再現され、各試料は誘導後２時間で同様のＯＤ（６３０ｎｍ）の結果を示した（データ示さず）。要約すると、カドミウム耐性試験はｗｔ  ＲＮ４２２０細胞で行われ、５００ｎＭ〜１ｕＭカドミウムはＲＮ４２２０細胞で最小の負の影響を示した。この実施例は、カドミウムで誘導した場合、ｐＴＫ１の誘導が細胞増殖の抑制を示したことを示している。
【０７５８】
実施例１７Ｂ候補細胞死遺伝子ＳｐｒＡ１は、アンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）誘導性プロモーター：テトラサイクリン誘導性プロモーターを含む高コピープラスミドであるｐＲＡＢ１１を使用して、Ｓｔａｐｈ  ａｕｒｅｕｓ細胞（５０２ａ）の細胞増殖の阻害剤として評価された。ｓｐｒＡ１毒素の２つのバージョンが、ｐＲＡＢ１１−２のｔｅｔプロモーターの後ろにクローニングされた。試験したクローンは、削除されたｓｐｒａ１アンチセンス（Ｄａｓ）を含むｐ１７４プラスミドと、削除されたｓｐｒａ１アンチセンスと欠落したＲＢＳ部位を含むｐ１７５プラスミドであった。ｐ１７４のプラスミドマップ（ｐＲＡＢ１１＿Ｐｔｅｔ−ｓｐｒＡ１）を図１５Ａおよび１５Ｂに示す。図１５Ａは、Ｐｔｅｔ−ｓｐｒＡカセットを含むプラスミドの領域の拡大図を示す。図１５Ｂは、ｐ１７４プラスミド全体をその天然の環状の形で示している。
【０７５９】
ｐ１７４およびｐ１７５で使用されている配列を以下に示す。テトラサイクリンプロモーターを使用した実験では、ｐ１７４とｐ１７５の両方を使用した
【０７６０】
ｐ１７４  ｓｐｒＡ１：ｓｐｒＡ１毒素遺伝子およびリボソーム結合部位（ｐ１７４）：ＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＴＡＴＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＴＡＴＴＴＴＣＧＴＴＣＡＣＡＴＣＡＴＡＧＣＡＣＣＡＧＴＣＡＴＣＡＧＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＡＴＴＧＧＣＴＡＡＧＴＡＧＡＣＧＣＡＡＴＡＣＡＡＡＡＴＡＧＧＴＧＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＧＣＡＣＣＡＡＴＡＡＡＡＡＴ（配列番号２７４）
【０７６１】
ｐ１７５  ｓｐｒＡ１（ＡＴＧ）：開始コドンで始まるｓｐｒＡ１毒素遺伝子（リボソーム結合部位が削除された）（ｐ１７５）：ＡＴＧＣＴＴＡＴＴＴＴＣＧＴＴＣＡＣＡＴＣＡＴＡＧＣＡＣＣＡＧＴＣＡＴＣＡＧＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＡＴＴＧＧＣＴＡＡＧＴＡＧＡＣＧＣＡＡＴＡＣＡＡＡＡＴＡＧＧＴＧＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＧＣＡＣＣＡＡＴＡＡＡＡＡＴ（配列番号２７５）
【０７６２】
細胞増殖具体的には、５０２ａ細胞のｐＲＡＢ１１ベクター上のｔｅｔ誘導性遺伝子をＢＨＩで一晩増殖させた。ｐ１７４  ｐＲＡＢ１１−ｐｒｏ−ｔｅｔ−ｓｐｒａ１Ｄａｓは５．４ＯＤを示した。ｐ１７５  ｐＲＡＢ１１−ｐｒｏ−ｔｅｔ−ｓｐｒａ１Ｄａｓ（ＡＴＧ）は６．２ＯＤを示した。ＢＨＩ−ｃｈｌｏｒ１０（５０２ａ  ｗｔ  ｊｕｓｔ  ＢＨＩ）の最終１ｍｌ（１４ｍｌチューブ）で、５つの終夜培養物すべてを０．５ＯＤに希釈した。各細胞株は、非誘導および誘導アンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）−１０の合計２本のチューブに分けられた。
誘導文献では、１００ｎｇ／ｍｌのＡＴｃでの誘導が有効であることを示しているため、これらの実験では、この濃度を誘導用に選択した。各セットからの１つのチューブは、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で誘導された。エタノール中の１ｍｇ／ｍｌ  ＡＴｃストックをＥｔＯＨで１００ｕｇ／ｍｌに希釈した。最終的に１００ｎｇ／ｍｌになるように１マイクロリットルを適切なチューブに加えた。
【０７６３】
６３０ｎｍでのＯＤは、２、４、および６時間で取得された。ＯＤは２時間と４時間の時点で１／１０希釈で測定され、６時間のＯＤは１／１００希釈で測定され、測定値が線形範囲内にあることを確認した。
【０７６４】
５０２ａ（非誘導および誘導）およびｐ１７４（ｐＲＡＢ１１−ｐｒｏ−ｔｅｔ−ｓｐｒａ１Ｄａｓ）チューブを、それぞれＢＨＩおよびＢＨＩ−ｃｈｌｏｒ１０への希釈プレーティング用に１０ｅ−５および１０ｅ−６に連続希釈した。
【０７６５】
結果をＯＤについて表２８および２９に示し、プレート比較写真を図１５Ｃに示す。
【表５３】
2021505197.tif 000070
【表５４】
2021505197.tif 000071
【０７６６】
図１５Ｃは、非誘導（左）および誘導（右）５０２ａ  ｐ１７４（ｔｅｔ−ｓｐｒａ１Ｄａｓ）について６時間の誘導後の１０ｅ−５でのプレート希釈を示す。左側のプレート＝ＢＨＩ  ｃｈｌｏｒ１０で１０ｅ−５希釈した非誘導ｐ１７４（ｔｅｔ−ｓｐｒａ１Ｄａｓ）。右側のプレートは、ＢＨＩ  ｃｈｌｏｒ１０の１０ｅ−５で誘導されたｐ１７４（ｔｅｔ−ｓｐｒａ１Ｄａｓ）である。両方のプレートは、６時間の誘導後の時点からの試料である。左側のプレート（未誘導）は１０ｅ−５では数えられなかったが、１０ｅ−６では約７２０のコロニーが数えられた。表３０に示すように、右側の誘導されたプレートは、１０ｅ−５で１６個のコロニーを生成した。
【表５５】
2021505197.tif 000072
表３０に示すように、誘導後６時間での誘導細胞の生存率は１．６＊１０ｅ７／７．２＊１０ｅ９＝．００２２２×１００＝０．２２２％と計算された。誘導後６時間で誘導されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ５０２ａ  ｐ１７４（ｔｅｔ−ｓｐｒａ１Ｄａｓ）細胞の生存率は、誘導されていない細胞と比較して０．２２２％にすぎなかった。したがって、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ  ｐ１７４細胞は、非誘導細胞と比較して、誘導後６時間で１００％−０．２２２％＝９９．７８％の測定可能な平均細胞死を示した。
【０７６７】
要約すると、１００ｎｇ／ｍｌ  ＡＴｃによる誘導は、誘導後６時間までの５０２ａ細胞におけるｐ１７４の増殖の１％未満、０．５％未満、または０．２５％未満の良好な抑制を示した。具体的には、６時間の終わりのＣＦＵ数は、非誘導試料および５０２ａ野生型と比較したとき、生存率はわずか０．２２％であった。ｓｐｒａ１のＲＢＳ部位が削除されたｐ１７５対照の誘導は、６時間までの増殖に悪影響を与えなかった。要約すると、ＡＴｃで誘導した場合、ｐ１７４の誘導が細胞増殖の抑制を示したことを示している。しかしまがら、ＲＢＳを欠くｐ１７５コントロールの誘導は、ＡＴｃで誘導された場合、５０２ａ野生型細胞に匹敵する細胞増殖の抑制を示さなかった。
【０７６８】
実施例１８５０２ａのさまざまな毒素遺伝子の誘導性プラスミドベースの発現
この実施例は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ５０２ａのキルスイッチに使用できるさまざまな候補細胞死毒素遺伝子の有効性を示す。この実験には、プラスミドベースの誘導性毒素発現を使用した。ｐＲＡＢ１１は、Ｓｔａｐｈ  ａｕｒｅｕｓ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの高コピープラスミドであり、Ｐｔｅｔプロモーターは、１００ｎｇ／ｍＬのＡｔＣ（アンヒドロテトラサイクリン）を添加することで抑制を解除し、高い転写率を可能にする。ｐＲＡＢ１１は、Ｈｅｌｌｅ，Ｌｅｏｎｉｅ，ｅｔ  ａｌ．"Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｅｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｒａｄｕａｌ  ｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．"  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５７．１２（２０１１）：３３１４−３３２３に記載されている。４つの候補細胞死毒素遺伝子が評価のために選択された：ｓｐｒＡ１、１８７−ｌｙｓＫ、Ｈｏｌｉｎ、およびｓｐｒＧ。
【０７６９】
ｓｐｒＡ１（ＰｅｐＡ１）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株に見られるｓｒｐＡ１遺伝子は、小さな膜毒素ＰｅｐＡ１をコードすることが示されている。Ｓａｙｅｄ，Ｎｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｏｆ  Ａ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ  Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ−ｌｉｋｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｔｏｘｉｎ−Ａｎｔｉｔｏｘｉｎ  Ｍｏｄｕｌｅ．”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２８７，ｎｏ．５２，２０１２，ｐｐ．４３４５４−４３４６３，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．ｍ１１２．４０２６９３．Ｓａｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．は、細菌膜に局在し、細胞死を引き起こすＰｅｐＡ１と呼ばれる毒素タンパク質をｓｐｒＡ１遺伝子がどのようにコードするかを記載した。これは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのタイプＩ毒素抗毒素システムの一部であり、そのゲノムに進化的に保存されている。
【０７７０】
１８７−ｌｙｓＫこれは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来の操作されたファージリジンである。Ｋ．Ｈｏｒｇａｎ，Ｍａｒｉａｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．"Ｐｈａｇｅ  ｌｙｓｉｎ  ＬｙｓＫ  ｃａｎ  ｂｅ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｔｏ  ｉｔｓ  ＣＨＡＰ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｒｅｔａｉｎ  ｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｉｖｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ．"  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７５．３（２００９）：８７２−８７４Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．はこのペプチドを設計および短縮化し、それがまだ保持することが多くのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株の溶解活性であることを確認した。Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．"Ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｈａｇｅ  ｌｙｓｉｎ  ＬｙｓＫ  ｈａｓ  ａ  ｂｒｏａｄ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．"  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８７．２０（２００５）：７１６１−７１６４．
【０７７１】
ホリンこの実験で試験したホリン毒素は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを標的とする多くの溶菌性ファージのゲノムの一部である。細胞膜に病変を形成することにより、プラスミド発現ベクターから誘導された場合、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞増殖を妨害することが示されている。Ｓｏｎｇ，Ｊｕｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９７．５（２０１６）：１２７２−１２８１．
【０７７２】
ｓｐｒＧｓｐｒＧと呼ばれるコード領域は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの別のタイプＩ毒素抗毒素系の一部である。２つのペプチドがｓｐｒＧの同じリーディングフレームでコードされており、両方が誘導されると細胞死を引き起こすことが示されている。Ｐｉｎｅｌ−Ｍａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ７．２（２０１４）：４２４−４３５．
【０７７３】
材料以下に示すように様々な合成菌株調製し、５０２ａ  ｗｔも使用した。株には以下が含まれる：
−ＢＰ＿０６８（５０２ａ  ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−ｓｐｒＡ１）
−ＢＰ＿０６９（５０２ａ  ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−１８７ｌｙｓＫ）
−ＢＰ＿０７０（５０２ａ  ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−ｈｏｌｉｎ）
−ＢＰ＿０７１（５０２ａ  ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−ｓｐｒＧ１）
−ＢＰ＿００１（５０２ａ  ｗｔ）。
【０７７４】
この実施例で使用した増殖培地には、ＢＨＩブロス培地（３７ｇ／Ｌ）（Ａｌｐｈａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢＨＩ寒天プレート、ＢＨＩクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ（Ｔｅｋｎｏｖａ））寒天プレート、およびＢＨＩ  Ｃｈｌｏｒ（１０μｇ／ｍＬ（Ｔｅｋｎｏｖａ））＋ＡｔＣ（１００ｎｇ／ｍＬ（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ））寒天プレートが含まれていた。以下の表３１は、プラスミドを構築するために使用されるオリゴヌクレオチド配列のリストを示す。
【表５６】
2021505197.tif 000073
【０７７５】
表３２は、毒素遺伝子のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。この実験では、ｓｐｒＡ１、１８７−ｌｙｓＫ、ホリン、およびｓｐｒＧを試験した。毒素遺伝子ｓｐｒＧには２つのリーディングフレームがあり、どちらもＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに毒素活性があることが示されている。短い配列は太字で示されている。
【表５７−１】
2021505197.tif 000074
【表５７−２】
2021505197.tif 000075
【０７７６】
方法
プラスミド構築は以下のように行った。
１）空のベクターをテンプレートとして使用し、プライマーＢＰＣ＿６７０およびＢＰＣ＿６７１を使用してｐＲＡＢ１１バックボーンをＰＣＲ増幅する。
２）ＰＣＲは合成されたプラスミドＤＮＡ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）から毒素遺伝子を増幅する。これにより、標的遺伝子の下流のプラスミドバックボーンに結合するプライマーを設計できるため、各遺伝子の両端に固有のプライマーを設計して注文する必要がなくなる。
３）プライマーペア
ａ）ｓｐｒＡ−ＢＰＣ＿６７２／ＢＰＣ＿６７７
ｂ）１８７−ｌｙｓＫ−ＢＰＣ＿６７５／ＢＰＣ＿６７８
ｃ）Ｈｏｌｉｎ−ＢＰＣ＿６７６／ＢＰＣ＿６７８
ｄ）ｓｐｒＧ−ＢＰＣ＿６７４／ＢＰＣ＿６７８
４）ＰＣＲ産物を実行して正しいサイズを確認し、テンプレートＤＮＡをＤｐｎＩ（ＮＥＢ）で消化し、Ｚｙｍｏスピンカラムで反応物をクリーンアップする。
５）ギブソンアセンブリーによってクリーンアップされたＰＣＲ産物を組み立て、メーカーのプロトコール（ＮＥＢ）を使用してエレクトロコンピテントＩＭ０８ＢＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換する。
６）プラスミド上のプロモーターと毒素の正しい配列を確認する。
７）配列検証済みのプラスミドをエレクトロコンピテントＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに形質転換する。
【０７７７】
増殖実験は以下のように実行された。
１）５ｍＬのＢＨＩブロス培地での各株の一晩培養を開始する。ＢＰ＿０６８−ＢＰ＿０７１株の培地に１０ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを加える。
２）一晩培養物を新鮮なＢＨＩに１：１００希釈する。ＢＰ＿０６８−ＢＰ＿０７１株の培地に１０ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを加える。３７℃、２５０ｒｐｍで２時間振とう培養する。各株のプレートをストリークし、３７℃で一晩インキュベートして、培養が良好であることを確認する。
３）２時間培養のＯＤ６００読み取り値を取得し、培養物を０．０５のＯＤに希釈する。
ａ）各株は、（４）ＢＨＩブロスを含む５ｍＬチューブを受け取る
ｂ）次の表は、記録されたＯＤの読み取り値、および０．０５のＯＤまで新鮮な培養物に接種するために使用された各培養物の計算された量を示す。
【表５８】
2021505197.tif 000076
４）希釈播種のために各培養物の１００ｕＬの試料を保存する。（プレート３枚／培養物）
５）培養液をＯＤが０．５に達するまで３７℃でインキュベートする。各株の２つのチューブに１５０ｎｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリン（ＡｔＣ）を添加し、それらに＋の標識を付けて、誘導物質（抑制解除因子）を受け取ったことを示す。下記のように試料を採取して、さらに４時間細胞を増殖させ続ける。
６）Ｔ＝３０分、６０分、１２０分、および２４０分でＯＤ６００の測定値を取得する。以下の表に値を記録する。
ａ）Ｔ＝０、６０分、および２４０分で希釈播種を実行し、次のプレート（ＢＨＩ、ＢＨＩ  Ｃｈｌｏｒ１０、ＢＨＩ  Ｃｈｌｏｒ１０  ＋  ＡｔＣ  ０．１）に正しい希釈を播種する。
【０７７８】
Ｃｆｕ調査は以下のように行った。
１）毒素遺伝子が存在するプラスミドを含む株から増殖しているコロニーをＢＨＩ（Ｃｈｌｏｒ  １０、ＡｔＣ  ０．１）寒天プレートで同定する。Ｔ２４０からのプレートが最適である。
２）可能であれば、株ごとに８つのコロニーを選ぶ。コロニーを新しいＢＨＩ（Ｃｈｌｏｒ  １０、ＡｔＣ  １）寒天プレートにパッチし、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ溶解手順を実行する。Ｑ５／ＰｈｕｓｉｏｎなどのＨＦポリメラーゼを使用してプライマーＤＲ＿２１５／ＤＲ＿２１６を使用するコロニーＰＣＲのテンプレートとして、溶解反応の５ｕＬを使用する。
ａ）良好なバンドを生成する反応は、ＤｐｎＩ消化を１時間行い、ＰＣＲ反応をカラム精製する。プライマーＤＲ＿２１５／ＤＲ＿２１６を使用したシーケンシング用の精製済み製品を送付する。
【０７７９】
計算されたＯＤ６００の読み取り値は、誘導後Ｔ＝０、３０、６０、１２０、および２４０分で取得された。Ｔ０以降のすべての値は、２つのチューブの平均である。結果を表３４および図１６に示す。＋はＡｔＣを受けた培養物を示し、−は追加の因子を受け取らなかった培養物を示す。図１６は、計算されたＯＤ６００値対時間を示す。破線は、Ｔ＝０で１５０ｎｇ／ｍＬ  ＡｔＣを受けた培養物を表す。図１６は、ＰｅｐＡ１毒素タンパク質をコードするｓｐｒＡ遺伝子が、誘導後４時間の増殖後に生存可能な５０２ａＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ細胞の最大の減少を示したことを示している。
【０７８０】
具体的には、図１６は、４つの異なる細胞死遺伝子候補ｓｐｒＡ１、１８７−ｌｙｓＫ、Ｈｏｌｉｎ、およびｓｐｒＧを含むプラスミドベースの誘導発現システムを有する、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａに由来する４つの合成株の誘導前および誘導後の細胞増殖を示す。候補細胞死遺伝子は、ｐＲＡＢ１１プラスミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの後ろにクローニングされ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ細胞に形質転換された。計算されたＯＤ６００の読み取り値は、ＢＰ＿０６８（５０２ａ  ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−ｓｐｒＡ１）、ＢＰ＿０６９（５０２ａ  ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−１８７ｌｙｓＫ）、ＢＰ＿０７０（５０２ａ  ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−ｈｏｌｉｎ）、およびＢＰ＿０７１（５０２ａ  ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−ｓｐｒＧ１）について、破線（−−−−−−）で示されたＡｔＣで誘導された（＋）株の誘導後と、実線（______）で示された誘導されていない（−）株で、Ｔ＝０、３０、６０、１２０、および２４０分で取得され、ＢＨＩ培地中のＢＰ＿００１（５０２ａ  ｗｔ）と比較された。誘導された（＋）株ＢＰ＿０６８（ｓｐｒＡ１）、ＢＰ＿０６９（１８７ｌｙｓＫ）、およびＢＰ＿０７０（ｈｏｌｉｎ）のそれぞれは、（ｉ）良好な誘導前の細胞増殖と（ｉｉ）誘導後の細胞増殖の大幅な阻害の両方を示した。ＢＰ＿０６８（＋）は、誘導後の各時点Ｔ＝３０、Ｔ＝６０、Ｔ＝６０、Ｔ＝１２０、およびＴ＝２４０分で細胞増殖の最良の阻害を示したため、ｓｐｒＡ１遺伝子は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ５０２ａのキルスイッチの最初のさらなる開発のために選択された。
【表５９】
2021505197.tif 000077
【０７８１】
以下の表３５および図１７は、希釈された液体培養試料のプレート数から計算されたコロニー形成単位を示している。図１７は、Ｔ＝０（灰色）と２４０分（黒色）との間のコロニー形成単位／ｍＬの違いを示す棒グラフを示す。
【表６０】
2021505197.tif 000078
【０７８２】
この実施例では、複合リッチメディアで増殖させたときに、細胞の生存率を破壊する誘導性プロモーターに作動可能に連結された場合の複数の毒素遺伝子の有効性を調査した。２つのネイティブＳｔａｐｈ毒素ｓｐｒＡおよびｓｐｒＧ、１８７ｌｙｓＫと呼ばれる１つのキメラファージ毒素、および１つ以上のファージホリン毒素を、プラスミドベースの誘導性発現システムを使用して試験した。ＰｅｐＡ１毒素タンパク質をコードするｓｐｒＡ遺伝子が、誘導後４時間の増殖後に生存可能な５０２ａＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ細胞の最大の減少を示した。ｓｐｒＡ１遺伝子は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａのキルスイッチの初期のさらなる開発のために選択された。
【０７８３】
実施例１９ＢＰ＿０７６株（５０２ａΔｓｐｒＡ１：：Ｐtet−ｇｆｐ）のゲノムからのＧＦＰの誘導発現
概要。この実施例では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａバリアント株（ＢＰ＿０７６）のゲノムからの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）で確認された。ｇｆｐ遺伝子は、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｐtet）およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質遺伝子（ｔｅｔＲ）とともにゲノムに組み込まれた。組換え遺伝子の制御可能な発現を可能にするために、Ｐtet−ｇｆｐ発現システムが自殺プラスミドｐＩＭＡＹｚを介してゲノムに導入された。野生型株（ＢＰ＿００１）は陰性対照として機能し、同じＰtet−ｇｆｐ発現系を持つ高コピープラスミドを担持する株は陽性対照として機能した。テトラサイクリンよりも毒性が低いため、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を使用して１００ｎｇ／ｍＬで発現を誘導した。
【０７８４】
要約された結果。ＢＰ＿０５５およびＢＰ＿０７６のｔ＝０分の試料をＢＰ＿００１と比較すると、ｑＰＣＲデータは誘導前にマイナーなＧＦＰ発現を示す（Ｐtetが漏出性であることを示す）。しかしながら、誘導後の発現の変化倍率はまだはっきりと明らかである。プラスミドベースと組み込まれたＧＦＰの間で異なる発現パターンが見られる。組み込まれたｇｆｐはアッセイ全体で持続的な発現の増加を示すが、プラスミドベースのｇｆｐは３０分で高い上方制御を示し、９０分ではほとんど発現を示さない。ＢＰ＿０７６とＢＰ＿０５５の発現の違いは、各株の細胞あたりのｔｅｔＲのコピー数によるものである。ＢＰ＿０７６は細胞ごとに１つのコピーを持っているが、ＢＰ＿０５５は各細胞のプラスミドの数に応じて３００〜５００コピーを持っている。ＢＰ＿０５５培養液中に存在する大量の総ＴｅｔＲタンパク質は、アッセイの最後までに誘導に使用されるａＴｃの量を明らかに上回り、ｇｆｐ発現の抑制をもたらした。
【０７８５】
細菌株および材料。
株
ＢＰ＿００１（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ）
ＢＰ＿０５５（ＳＡ  ５０２ａ、ｐ２２９＿ｐＲＡＢ１１−Ｐｔｅｔ−ＧＦＰ）
ＢＰ＿０７６（ＳＡ  ５０２ａ、ΔｓｐｒＡ１：：Ｐｔｅｔ−ＧＦＰ）
【０７８６】
脳心臓浸出物（ＢＨＩ）培地、ＢＨＩ＋クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）寒天プレート、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を使用した。
【０７８７】
試料はＲＮＡ（１ｍＬ培養物）であった：ｔ＝０、３０、および９０分。
【０７８８】
方法−株の構築
１．Ｓｔａｐｈ  ａｕｒｅｕｓ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのゲノムに改変を加えるには、まず必要な遺伝的エレメントをそれらの改変を行うことができるプラスミドに追加する必要がある。
２．プラスミドバックボーンは、Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのシャトルベクターであるｐＩＭＡＹｚであり、クロラムフェニコール耐性、低複製Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、低複製温度感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ複製起点（３０℃での許容複製、しかし３７℃ではない）、Ｐｔｅｔプロモーターの制御下にあるｓｅｃＹ毒素、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓへの組み込み中の青／白スクリーニング用のｌａｃＺ遺伝子を含む。
３．プラスミドは、ギブソンアセンブリを使用して環状コンストラクトに組み立てられた直線状のＰＣＲ産物を使用して構築された
ａ．プライマーＤＲ＿０２２／ＤＲ＿０２３を使用してｐＩＭＡＹｚベクターのバックボーンをＰＣＲ増幅し、下流のアセンブリーで使用するために直線状化する。バックグラウンドテンプレートＤＮＡは、さらに使用する前に、製造元の説明書に従ってＤｐｎＩ（ＮＥＢ）で酵素消化する必要がある。
ｂ．プライマーＤＲ＿２５５／ＤＲ＿２４１を使用して、ｐＲＡＢ１１プラスミドをテンプレートとして使用し、ｔｅｔＲ−Ｐｔｅｔ−ＧＦＰ領域をＰＣＲ増幅する。
ｃ．プライマーＤＲ＿２５６／ＤＲ＿２５７、およびＤＲ＿２４０／ＤＲ＿２３６を使用して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａゲノムからの１ｋｂ領域をＰＣＲ増幅する。これらは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓゲノムに組み込む領域を標的にするホモロジーアームとして使用される。
ｄ．これらの直線状フラグメントは、製造元の説明書に従ってギブソンアセンブリマスターミックス（ＮＥＢ）で環状プラスミドに組み立てられ、ＩＭ０８Ｂ細胞に形質転換される。
４．新しいプラスミドＤＮＡの配列を確認できたら、エレクトロポレーションによるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａへの形質転換に十分な量を得るために、５０ｍＬの培養を開始する。
５．相同組換えによる黄色ブドウ球菌への組み込み
ａ．１〜５マイクログラムのプラスミドＤＮＡを使用して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにエレクトロポレーションする。３７℃で１時間回復し、ＢＨＩ＋１０ｕｇ／ｍＬクロラムフェニコールと１００ｕｇ／ｍＬ  ｘ−Ｇａｌに播種し、３７℃で一晩インキュベートする。
ｂ．翌日、複数の青いコロニーを選び、室温で５ｍＬのＢＨＩブロス培養を開始し、回転振とうユニットで１２〜２０時間増殖させる。
ｃ．ＢＨＩ＋１ｕｇ／ｍＬアンヒドロテトラサイクリン（ＡｔＣ）と１００ｕｇ／ｍＬ  Ｘ−ｇａｌで段階希釈（通常は１０-4〜１０-6）を実行して播種する。３７℃で一晩インキュベートする。
ｄ．翌日、ＢＨＩ、ＢＨＩ＋１ｕｇ／ｍＬアンヒドロテトラサイクリン（ＡｔＣ）、および１００ｕｇ／ｍＬ  Ｘ−ｇａｌ、およびＢＨＩ＋１０ｕｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１００ｕｇ／ｍＬ  ｘ−Ｇａｌ寒天プレートにパッチを当てて、白いコロニーを選択してスクリーニングし、クロラムフェニコール感受性とＡｔＣ耐性を確認する。
ｅ．望ましい表現型を示すコロニーは、プライマーＤＲ＿２３７／ＤＲ＿２３８を使用したＰＣＲでスクリーニングする必要がある。新しい遺伝子を取り込んだコロニーは４．４ｋｂのバンドを生成し、野生型に戻ったコロニーは２．８６ｋｂのバンドを含むはずである。正しい配列を確認するために、いくつかの陽性クローンのシーケンシングを行う必要があり、配列検証済みのクローンの１つを下流の実験で使用するためにピックアップする。
【０７８９】
細胞増殖手順
１．ＢＨＩブロス培地（５ｍＬ）で各株の一晩培養を開始し、攪拌しながらインキュベートする（３７℃、２４０ｒｐｍ）。クロラムフェニコール（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）をＢＰ＿０５５の培地に追加する。
２．一晩培養の光学密度（ＯＤ）を測定し、記録する。
培養物の光学密度（ＯＤ）を６３０ｎｍで測定し、新規の培地をブランクとして使用した。一晩培養物のＯＤを初期ＯＤとして示す。表３６に示すように、新しい培地５ｍＬに移した接種物はＯＤを０．０５に低下させたため、新しい培養物は接種後２時間で指数増殖期になった。
【表６１】
2021505197.tif 000079
３．培養あたり２×１４ｍＬ培養チューブで、新規のＢＨＩ（５ｍＬ）で一晩培養物を０．０５ＯＤに希釈する。再びクロラムフェニコールをＢＰ＿０５５培養液に加える。
４．攪拌しながら（３７℃、２４０ｒｐｍ）、ＯＤが０．５〜１に達するまでインキュベートする（「２時間培養」）。
５．ｔ＝０分のＲＮＡ試料の培養液１ｍＬを取り出し、１．５ｍＬマイクロチューブに移す。試料をスピンダウンし（１６，０００×ｇ、１分、ＲＴ）、上清を吸引除去し、ペレットを２００μＬＲＮＡｌａｔｅｒに再懸濁する。室温（ＲＴ）で数分間インキュベートした後、−２０℃で保存する。
６．各株の最初の１４ｍＬ培養チューブにａＴｃ（４μＬ、１００μｇ／ｍＬ）を追加する。誘導対象として各株の２番目のチューブに４μＬの１００％エタノールを追加する（ａＴｃは１００％エタノールに溶解した）。
７．他のサンプリング時点まで、培養物を攪拌しながら（３７℃、２４０ｒｐｍ）インキュベートする。
８．ｔ＝３０分と９０分でＲＮＡサンプリングを繰り返し、ｔ＝９０分でＯＤを測定する。
ｑＰＣＲ試料処理およびデータ分析
上述の実施例のプロトコールに従って、Ａｍｂｉｏｎ  ＲｉｂｏＰｕｒｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｋｉｔを使用して、ＲＮＡＬａｔｅｒに保存された凍結細胞ペレットからＲＮＡを抽出した。ｇｆｐ発現レベルはハウスキーピング遺伝子ｇｙｒＢに対して正規化され、ΔΔＣｔ法を使用して定量された。表３７のプライマー配列を参照されたい。
【表６２】
2021505197.tif 000080
【０７９０】
プラスミドおよび株の構築に使用されるプライマー配列を表３８に示す。
【表６３】
2021505197.tif 000081
図１９は、ＢＰ＿０７６株（ＳＡ  ５０２ａ、ΔｓｐｒＡ１：：Ｐｔｅｔ−ＧＦＰ）のゲノム地図を示す。
図２０は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにゲノムを組み込むために構築されたプラスミド地図を示す。
【０７９１】
結果。Ｐtet−ｇｆｐシステムを担持する両方の株のｔ＝０試料は、誘導前にいくらかのＧＦＰ発現を示した。表２は、ｔ＝０での３つの調査株のＣｔ値を示している。野生型株ＢＰ＿００１の増幅曲線は、３０サイクル後に閾値（０．４）を超えた。これは、何らかの形の非特異的な増幅またはプライマーダイマーの形成が原因である可能性がある。
表３９は、野生型株ＢＰ＿００１の発現誘導前の閾値（ＣＴ）値までのサイクル数を示し、プラスミドベースのＰtet−ｇｆｐ  ＢＰ＿０５５担持株、およびＰtet−ｇｆｐ遺伝子改変株ＢＰ＿０７６が示されている。閾値は０．４に設定された。
【表６４】
2021505197.tif 000082
【０７９２】
ＧＦＰの基礎発現レベルは、個別の各株の実験の時点（ｔ＝３０分、９０分）を対照の時点（ｔ＝０）に正規化することにより、ΔΔＣｔ計算で考慮された。ｑＰＣＲによって決定されたＧＦＰの発現レベルは、図１８の下に示されている。図１８は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株ＢＰ＿００１、ＢＰ＿０５５およびＢＰ＿０７６の誘導（＋）および誘導されていない（−）サブカルチャーのＧＦＰ発現の倍率変化を示す。プラスミドベースと組み込まれたＧＦＰの間で異なる発現パターンが見られる。組み込まれたｇｆｐは、アッセイ全体で持続的な発現増加を示すが、プラスミドベースのｇｆｐは、３０分で高い上方制御を示し、９０分ではほとんど発現を示さない。３つの株すべての誘導サブカルチャー（＋）および非誘導サブカルチャー（−）は、ａＴｃおよびＰtet−ｇｆｐ発現系の存在に対する発現誘導依存性を示す。予想通り、ＢＰ＿００１は実験全体を通して発現を示さなかった。ＢＰ＿０７６でのＧＦＰの発現は実験全体を通じて増加し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａのゲノムからの発現を示している。ＢＰ＿０５５で決定された発現パターンは、理想的な実験設計ではないことが原因と考えられる。しかしながら、それは誘導の陽性対照としての目的を果たした。ＢＰ＿０５５は、高コピー数プラスミドｐＲＡＢ１１にＰtet−ｇｆｐ発現系を担持する。各プラスミドには２つのＴｅｔＲタンパク質結合部位があり、ａＴｃがない場合はＧＦＰの発現を抑制する。誘導から３０分以内に、多数のプラスミドに細胞数を掛けると、ＧＦＰ発現が約１３００倍に上方制御され、アッセイ中にａＴｃが活性型であることが確認された。ＧＦＰの発現レベルは９０分でさらに高くなると予想されるかもしれないが、データはほとんど発現を示さない（ｔ＝０と比較して約７倍の上方制御）。ｔ＝９０分で培養物に存在するＴｅｔＲタンパク質の総数を考えると、これは驚くべきことではない。ａＴｃの量は、９０分の時点でＴｅｔＲによる抑制を阻害するのに十分ではなかったため、ほとんど発現しなかった。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａの分子改変株からの遺伝子発現は、テトラサイクリン誘導性ＧＦＰ発現のｑＰＣＲ分析によって確認された。
【０７９３】
実施例２０ＲＮＡ  ｓｅｑでスクリーニングされた血清応答性プロモーターの候補は上方制御を検出する
この実験では、ＴＳＢと比較してヒト血清で増殖させた場合の５０２ａＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓバリアント株ＢＰ＿００１  ＷＴのＲＮＡシーケンシングを実行して、循環系に入ったときに微生物内で発生する転写変化の全体的な理解を得た。ＲＮＡシーケンシングは、実験室の増殖培地とヒト血清から収集された試料に対して実行された。
【０７９４】
ヒト血清を含むまたは含まないＴＳＢでの培養（増殖アッセイ）は、以下のように行った。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａ細胞を、５％羊の血液を含むトリプシン消化大豆ブロス（ＴＳＢ）寒天プレート上にクライオストックから打ち出し、一晩増殖させた（３７℃）翌日、５つの単一コロニーを使用して、１４ｍＬの培養チューブに５ｍＬのＴＳＢを接種し、攪拌しながら一晩増殖させた（３７℃、２４０ｒｐｍ）。翌朝、５０ｍＬのＴＳＢを２５０ｍＬフラスコに移し、３７℃に加温した。一晩培養物のＯＤ600を測定し（ＯＤ600＝６．０）、温めたＴＳＢに接種して（４１６μＬ）０．０５のＯＤ600にした。この培養は約２時間（３７℃、１００ｒｐｍ）増殖し、１．２４のＯＤ600に達した。この間、５０ｍＬアリコートのヒト血清を３７℃のインキュベーターに入れ、解凍して温め、新規のＴＳＢも温めた。血清学的ピペットを使用して、１５ｍＬの培養液を１５ｍＬのファルコンチューブに移し、遠心分離した（ＲＴ、２０００×ｇ、１０分）。上清をデカントし、ペレットを滅菌ＰＢＳ（１５ｍＬ）に再懸濁し、遠心分離した（ＲＴ、２０００×ｇ、１０分）。洗浄ステップからの上清をデカントし、ペレットを滅菌ＰＢＳ（７．５ｍＬ）に再懸濁し、接種材料のＯＤ600を倍加して２．４８にした。ＰＢＳ懸濁液を使用して、ＯＤ600が０．０５でＴＳＢおよび血清培養試料に接種した（培地１０ｍＬあたり２０２μＬ）。
【０７９５】
ＲＮＡシーケンシングの試料の前処理は次のように行った。
【０７９６】
ｔ＝０分の試料（３倍）は、洗浄前の元の５０ｍＬスターターカルチャーのそれぞれ１ｍＬであった。割り当てられた時点で、培養チューブをインキュベーターから取り出し、氷水浴に５分間入れ、次に遠心分離した（４℃、２０００×ｇ、１０分）。上清をデカントし、ペレットを１ｍＬの氷冷滅菌ＰＢＳに再懸濁し、マイクロチューブに移した。懸濁液を遠心分離し（４℃、６０００×ｇ、３分）、上清を吸引除去し、ペレットをＲＮＡｌａｔｅｒに再懸濁した。ＲＮＡｌａｔｅｒ懸濁液は−２０℃で保存した。
【０７９７】
ＲＮＡ抽出のために試料を−２０℃の冷凍庫から取り出し、ＲＴで解凍した。細胞をペレット化し（ＲＴ、１６０００×ｇ、１分）、上清を吸引除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した−洗浄により血清からのキャリーオーバーを除去した。細胞を洗浄するために、ペレットをＰＢＳに再懸濁し、遠心分離し（ＲＴ、１６０００×ｇ、１分）、上清を廃棄した。製造元の説明書に従って、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＲｉｂｏＰｕｒｅバクテリアキットを使用してＲＮＡを抽出した。次いで、抽出したＲＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉで処理し、エタノール沈殿した。シーケンシング会社の要求に応じて、試料はドライアイス上のエタノール中のペレットとして送られた。
【０７９８】
トータルＲＮＡ試料から、リボゾームＲＮＡ分子をバクテリア用Ｒｉｂｏ−ＺｅｒｏｒＲＮＡ除去キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して除去した。ＲＮＡ試料の品質をＳｈｉｍａｄｚｕ  ＭｕｌｔｉＮＡマイクロチップ電気泳動システムで分析し、超音波（４パルス、３０秒、４℃）を使用して断片化した。アダプターを分子の３’末端に連結して、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素による第１の鎖のｃＤＮＡ合成を可能にした。ｃＤＮＡを精製し、５’Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑアダプターをアンチセンスｃＤＮＡの３’末端に連結した。次いで、ｃＤＮＡを高忠実度ポリメラーゼを使用するＰＣＲで増幅した。増幅後の濃度は１０〜２０ｎｇ／μＬであった。次に、ｃＤＮＡ試料を、それらが表す増殖条件に従ってバーコード化し、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して精製し、キャピラリー電気泳動で分析した。次いでｃＤＮＡをプールし、プールは２００〜５００ｂｐ分子をカバーした。
【０７９９】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑの場合、ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａの説明書に従ってＴｒｕＳｅｑシーケンシング用に設計された。ｃＤＮＡは、７５ｂｐのリード長を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００システムでシーケンシングされた。遺伝子の差次的発現は、ＳＡＲＴｏｏｌｓを使用するＤＥＳｅｑ２を介して分析された。
【０８００】
ＲＮＡシーケンシングにより上方制御された遺伝子の結果を表４０に示す。ｔ＝ヒト血清への曝露後の分単位の時間。
【表６５】
2021505197.tif 000083
【０８０１】
ＲＮＡシーケンシングにより、ｉｓｄＢ、ｓｂｎＢ、ｉｓｄＣ、ｓｂｎＡ、ｓｒｔＢ、ｓｂｎＥ、ｓｂｎＤ、ｉｓｄＩ、ヘムＡＢＣトランスポーター２、ヘムＡＢＣトランスポーター２、ヘムＡＢＣトランスポーター、ｉｓｄ  ＯＲＦ３、ｓｂｎＦ、アラニンデヒドロゲナーゼ、ＨａｒＡ、ｓｂｎＧ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、鉄ＡＢＣトランスポーター、スレオニンデヒドラターゼ、ｉｓｄＡ、およびｓｂｎＩを含む、いくつかの遺伝子が、ｔ＝０と比較して、またはＴＳＢ中でのｔ＝３０と比較して、ｔ＝３０分のヒト血清への曝露後で、２０倍を超えて上方制御されることが判明した。
【０８０２】
ＲＮＡシーケンシングにより、ｉｓｄＢ、ｓｂｎＢ、ｉｓｄＣ、ｓｂｎＡ、ｓｒｔＢ、ｓｂｎＥ、ｓｂｎＤ、ｉｓｄＩ、ヘムＡＢＣトランスポーター２、ヘムＡＢＣトランスポーター２、ヘムＡＢＣトランスポーター、ｉｓｄ  ＯＲＦ３を含む、いくつかの遺伝子が、ｔ＝０と比較して、またはＴＳＢ中でのｔ＝３０と比較して、ｔ＝３０分のヒト血清への曝露後で、５０倍を超えて上方制御された。ＲＮＡシーケンシングにより、ｔ＝０と比較して、またはＴＳＢ中でのｔ＝３０と比較して、ｔ＝３０分のヒト血清への曝露後で１００倍を超えて上方制御された遺伝子には、ｉｓｄＢとｓｂｎＢが含まれる。
【０８０３】
ＲＮＡシーケンシングにより、ｉｓｄＢ、ｓｂｎＢ、ｉｓｄＣ、ｓｂｎＡ、ｓｒｔＢ、ｓｂｎＥ、ｓｂｎＤ、ｉｓｄＩ、ヘムＡＢＣトランスポーター２、ヘムＡＢＣトランスポーター２、ヘムＡＢＣトランスポーター、ｉｓｄ  ＯＲＦ３、ｓｂｎＦ、アラニンデヒドロゲナーゼ、ＨａｒＡ、ｓｂｎＧ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ｉｓｄＡを含む、いくつかの遺伝子が、ｔ＝０と比較して、またはＴＳＢ中でのｔ＝９０と比較して、ｔ＝９０分のヒト血清への曝露後で、１００倍を超えて上方制御された。
【０８０４】
血清に曝された場合のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａの好ましい上方制御された遺伝子には、ｉｓｄＢ遺伝子ＣＨ５２＿００２４５、ｓｒｔＢ遺伝子ＣＨ５２＿００２１５、ヘムＡＢＣトランスポーター２遺伝子ＣＨ５２＿００２１５、およびＨａｒＡ遺伝子ＣＨ５２＿００２１５が含まれる。
【０８０５】
表４１と表４２に示すように、ＲＮＡシーケンシングによりヒト血清に曝露すると、いくつかのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｓｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａＷＴ遺伝子が下方制御されることが判明した。
【表６６】
2021505197.tif 000084
【表６７】
2021505197.tif 000085
【０８０６】
ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ遺伝子ＣＨ５２＿００５２５、トレハロースパーミアーゼＩＩＣ遺伝子ＣＨ５２＿０３４８０、ＤｅｏＲファミリー転写調節遺伝子ＣＨ５２＿０２２７５、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ＣＨ５２＿０２２７０、およびＰＴＳフルクトーストランスポーターサブユニットＩＩＣ遺伝子ＣＨ５２＿０２２６５を含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａのいくつかの遺伝子は、ｔ＝０またはＴＳＢ中と比較して、血清中でｔ＝３０またはｔ＝９０分後に少なくとも２倍下方制御された。
【０８０７】
実施例２１キルスイッチ構築
この実験では、血清または血液中で増殖できないＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）５０２ａの株を作製する目的で、血清応答性キルスイッチカセットを設計および構築した。このカセットは、ＳＡの内因性ｓｐｒＡ１毒素抗毒素システムをベースにしている。これは、毒素がアンチセンスＲＮＡによって翻訳抑制される小さな膜ポリンペプチド（ＰｅｐＡ１）であるタイプのＩＴ／ＡＴシステムである。アンチセンスＲＮＡはｓｐｒＡ１の５’ＵＴＲに結合してＲＢＳを覆い、一本鎖ｍＲＮＡに結合してタンパク質を合成するその能力をブロックする。
【０８０８】
このキルスイッチの設計は、その内因性システムからＰｅｐＡ１毒素の発現を駆動するプロモーター領域を、生物がヒト血清中で培養されるときに高度に上方制御されるものに変更する。このコンストラクトは、ＳＡ  ５０２ａ由来のｓｂｎＡプロモーターを使用して作成された。このキルスイッチの場合、アンチセンスＲＮＡのプロモーター領域は変更されてないが、この領域が通常の複合培地での増殖中に高度に上方制御されるが、生物が血液または血清中で増殖するとき、高度に抑制または下方制御されることが確認されているプロモーターに変更されるキルスイッチの追加バージョンが進行中である。これにより、血液または血清状態におけるｓｐｒＡ１の抗毒素抑制を克服することがさらに容易になるはずである。
【０８０９】
キルスイッチの機能を試験するために、ＰｅｐＡ１毒素の発現は、複合培地、トリプシン消化大豆ブロス（ＴＳＢ）で指数関数期の初期に増殖した培養液を採取し、増殖培地をヒト血清に変更することによって誘導された。ＯＤをモニターし、プレートへの連続希釈を行い、ＣＦＵを計数して、培養物中の生存細胞の数をモニターし、同じ条件下で増殖させた野生型ＳＡ  ５０２ａと比較した。図２１は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａゲノムにおけるＰｓｂｎＡ−ｓｐｒＡ１キルスイッチの地図を示す。
【０８１０】
プラスミドの構築に使用される方法、オリゴ、相同組換えを使用してＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ５０２ａゲノムに変更を加えるためのプロトコール、および殺傷アッセイを以下に示す。
【０８１１】
株
５０２ａ−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ野生型
ＢＰ＿０１１−５０２ａΔｓｐｒＡ１−ｓｐｒＡ１（ＡＳ）
ＢＰ＿０８４−５０２ａΔＰｓｐｒＡ：：ＰｓｂｎＡ
【０８１２】
この実験では、ＢＰ＿０１１にはｓｐｒＡ１毒素遺伝子とｓｐｒＡ１抗毒素領域の両方がノックアウトされています。これは、キルスイッチをその部位に直接組み込むことによってＫＯを「治癒」する方が、野生型５０２ａに直接組み込むよりも簡単であると考えられたためである。これは、組み込みに使用されるシステム、すなわち相同組換えが、挿入された遺伝子と染色体標的の間の相同性のセグメントに依存して組み込みの場所を決定し、内因性のｓｐｒＡ１毒素／抗毒素が、もしゲノムに存在する場合、組み込みに干渉する可能性があると感じられたためである。ＢＰ＿０１１株は、キルスイッチ株ＢＰ＿０８４の親である。ＢＰ−０１１株は、対照としてこの実験に含まれた。
【０８１３】
プラスミドの構築
１）ＳＡ  ５０２ａゲノムから相同領域をＰＣＲ増幅する
ａ．上流ホモロジーアーム−ＤＲ＿２３３／ＤＲ＿２９６
ｂ．下流ホモロジーアーム−ＤＲ＿２８０／ＤＲ＿２３６
２）ＩＤＴから合成された直線状ＤＮＡフラグメントからＰｓｂｎＡ−ｓｐｒＡ１をＰＣＲ増幅
ａ．ＰｓｂｎＡ−ｓｐｒＡ１−ＤＲ＿２９７／ＤＲ＿２２８
３）ｐＩＭＡＹｚバックボーンベクターをＰＣＲ増幅する
ａ．ＤＲ＿０２２／ＤＲ＿０２３
４）製造元の説明書に従って、Ｑｉａｇｅｎキットですべての試薬をゲル精製する
５）直線状ＤＮＡフラグメントを環状プラスミドに組み立て、製造元の説明書に従ってエレクトロコンピテントＩＭ０８Ｂ大腸菌細胞に形質転換する
６）コロニーＰＣＲを実行して、完全に組み立てられたプラスミドのコロニーをスクリーニングする
ａ．ＤＲ＿１１７／ＤＲ＿２２８（１５７１ｂｐフラグメント）
７）複数の陽性コロニーを選び、培養物を一晩培養し、プラスミドをシーケンシングして、新しく組み立てられたプラスミドに変異がないことを確認する
８）配列確認済みのプラスミドをエレクトロコンピテントＳＡ  ５０２ａに形質転換し、相同組換えを使用してＳＡゲノムを編集するためのプロトコールに従う
９）プライマー対ＤＲ＿３０３／ＤＲ＿３０４を使用して、組み込み体をＰＣＲにより最終コロニーをスクリーニングする
ａ．正しいバンドサイズが観察された場合、ＰＣＲ産物を配列確認のために送る。
【表６８】
2021505197.tif 000086
【０８１４】
相同組換えを使用してＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ５０２ａゲノムに変更を加えるために使用されるプロトコールを以下に示す。
材料
●ＢＨＩ寒天（クロラムフェニコール１０ｕｇ／ｍＬ）（Ｘ−Ｇａｌ  １００ｕｇ／ｍＬ）
●ＢＨＩ寒天（ＡｎｈｙｄｒｏＴｅｔ  １ｕｇ／ｍＬ）（Ｘ−Ｇａｌ  １００ｕｇ／ｍＬ）
●ＢＨＩ寒天
●ＢＨＩブロス
●一次および二次組換えイベント後にコロニーをスクリーニングするプライマー
プロトコール
１．高濃度のｐＩＭＡＹｚ組み込みプラスミドを調製する約２５ｍＬの一晩培養液を、（４）２倍容量のミニプレッププロトコールにスピンダウンする。これは、必要に応じて２つのカラムを通して精製し、ＤＮＡの収量を最大化するために実行できる。溶出液をプールし、Ｚｙｍｏコンセントレーターキットを使用して濃縮して、濃度を最大化する必要がある。
２．実験室で最適化されたエレクトロポレーションプロトコールを使用して、上述から最大５ｕＬの濃縮プラスミドを使用して５０２ａを形質転換する。
３．シェーカーで３０℃で１時間細胞を回復する
４．３〜４のＢＨＩ（Ｃｈｌｏｒ  １０、Ｘ−Ｇａｌ  １００）寒天プレートで回復混合物全体を播種する。３０℃で１プレートをインキュベートし、残りを３７℃で一晩インキュベートする（インキュベーターが３７℃以上であることを確認する）
５．プライマーＤＲ＿１１６／ＤＲ＿１１７を使用して、環状プラスミドの存在についてプレート上の青いコロニーをスクリーニングする。プライマーはｐＩＭＡＹｚのマルチクローニング部位に隣接しており、３０Ｃプレートの場合、ホモロジーアームプラス組み込まれた任意の領域と同じサイズのバンドが生成される。３７℃プレートはバンドを全く生成しない。
６．３７℃プレート上の青いコロニーは、ホモロジーアームの外側に結合するプライマーを使用して、ゲノムに組み込まれたプラスミドをスクリーニングする必要がある。各プライマーは、ＤＲ＿１１６またはＤＲ＿１１７と対にする必要がある。これにより、プラスミドがゲノムの適切な場所に組み込まれていることが確認される。
７．３７℃プレート上のコロニーが、プラスミドが組み込まれたことを示すバンドを生成しない場合、３０℃プレート上のプラスミドバンドを示すコロニーを希釈して、ＢＨＩ寒天（Ｃｈｌｏｒ  １０、Ｘ−Ｇａｌ  １００）に播種し、３７℃でインキュベートした。ステップ５〜６を繰り返して、組み込みのための新しいコロニーを再スクリーニングする。
８．ＰＣＲが組み込まれたプラスミドを示す場合は、いくつかのコロニーを選択し、可能であれば、それぞれの方法で組み込まれたクローンを選択する。室温のシェーカーで５ｍＬのＢＨＩブロスで一晩（約１６時間）増殖させる
９．１０＾−５と１０＾−６に希釈し、ＢＨＩ寒天（ＡｎｈｙｄｒｏＴｅｔ  １ｕｇ／ｍＬ、Ｘ−Ｇａｌ  １００ｕｇ／ｍＬ）に５０ｕＬを播種する。３７℃で一晩プレートをインキュベートする。
１０．白色コロニーをＢＨＩ寒天（Ｃｈｌｏｒ  １０ｕＧ／ｍＬ、Ｘ−Ｇａｌ  １００）、ＢＨＩ寒天（ＡｎｈｙｄｒｏＴｅｔ  １ｕｇ／ｍＬ、Ｘ−Ｇａｌ  １００ｕｇ／ｍＬ）、ＢＨＩ寒天にパッチして、アンヒドロテットに対する耐性とクロラムフェニコールに対する感受性をスクリーニングする。両方の表現型を持つコロニーをＢＨＩ寒天プレートから選び、ノックアウトまたはノックインについてスクリーニングする必要がある。最終的な遺伝子型のスクリーニングに使用するプライマーの少なくとも１つは、ホモロジーアームとして使用される領域の外側に結合する必要がある。
１１．いくつかの陽性クローンのパッチプレートからプレートをストリークし、ホモロジーアームの外側に結合するプライマーを使用してＨＦ  ＰＣＲを実行し、シーケンシングに送る。３７℃で一晩プレートをインキュベートする。
１２．ストリークされたプレートから少なくとも３つのコロニーを選び、コロニーＰＣＲを実行して遺伝子型を確認する。ＰＣＲがすべて陽性の場合、プレートを使用して株ストックを作製し、新しい株番号を割り当てる。
【０８１５】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａゲノムの合成ＰｓｂｎＡ−ｓｐｒＡ１キルスイッチの予備評価に使用した殺傷アッセイを以下に示す。
【０８１６】
キルアッセイ
１）試験する株と野生型対照株の５ｍＬ  ＴＳＢ培養を開始し、２５０ＲＰＭで軌道振とうしながらインキュベーター内で３７℃で一晩増殖させる
２）翌日、新規のＴＳＢ培地で１：１００に希釈し、培養液を２時間増殖させる。
３）ＯＤ６００の読み取り値を取得し、値を記録する。５ｍＬの培養液にＯＤが０．０５になるまで接種するのに必要な細胞培養液の量を計算する。計算された量の新しい培養物を予熱された培地（ＴＳＢ／血清）に接種する
４）３７℃で増殖培養を続ける。連続希釈を行い、いくつかの細胞希釈液をＢＨＩまたはＴＳＢ寒天プレートに播種する。３７℃で一晩プレートをインキュベートし、それらが出現した後（＞１６時間）、各プレート上のコロニーを計数する。
【０８１７】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａゲノムでＰｓｂｎＡ−ｓｐｒＡ１キルスイッチを使用した予備的な結果では、望み通り、ＴＳＢ中の通常の増殖条件下で、ＫＳと野生型の増殖曲線に差は見られなかった。記録されたコロニー数を表４４および図２３に示す。
【表６９】
2021505197.tif 000087
【０８１８】
表４４および図２３に示すように、ヒト血清への３時間の曝露後、ゲノムにキルスイッチが組み込まれたｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＫＳ株ＢＰ＿０８４は、野生型株よりも約１０００倍コロニーが少なかった。
【０８１９】
表４５に示すように、計算されたｃｆｕ／ｍｌは、計数されたコロニー数＊希釈係数＊２０（各希釈液から５０ｕＬが播種されることを考慮して）をとることによって求められた。
【表７０】
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【０８２０】
表４５のデータを使用して、キルスイッチ株のｃｆｕ／ｍＬを野生型５０２ａと比較した。血清誘導の３時間後、組み込まれたキルスイッチＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＫＳ株ＢＰ＿０８４（５０２ａΔＰｓｐｒＡ：：ＰｓｂｎＡ）を保有する株は、２．６１％の生存率を示した。これは、血清中の野生型と比較した生存細胞における９７．３９％の低減に対応する。
【０８２１】
同様に表４５に示すように、ヒト血清への３時間曝露後、ゲノムにキルスイッチが組み込まれたｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＫＳ株ＢＰ＿０８４は、ＢＰ＿０８４（血清）／ＢＰ＿０８４（ＴＳＢ）＊１００＝１．１６％生存率の生存率を示した。したがって、ヒト血清に曝露した場合、誘導後３時間のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＫＳ株ＢＰ＿０８４（５０２ａΔＰｓｐｒＡ：：ＰｓｂｎＡ）細胞は、ＴＳＢの同じＢＰ＿０８４細胞と比較して、１００％−１．１６％＝９８．８４％の測定可能な平均細胞死を示した。
【０８２２】
ゲノムに組み込まれたキルスイッチ分子改変を含む合成微生物ＢＰ＿０８４は、通常の状態下で望ましい増殖特性を示したが、ヒト血清に曝露された場合、細胞増殖を大幅に低減した。
【０８２３】
実施例２２発現クランプによるキルスイッチの構築
発現クランプによるキルスイッチ構築は以下のように行う。以前の実施例では、ヒト血清および血液に曝露されたときにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓで上方制御または下方制御される特定の遺伝子が同定された。例えば、ｉｓｄＢは、血液および血清応答性プロモーターを著しく上方制御するプロモーターとして選択される。また、ｃｌｆＢは、血清または血液の非存在下では活性であるが、血清または血液の存在下では下方制御される発現クランプで使用するための第２のプロモーターとして選択される。
【０８２４】
以前の例では、Ｓｔａｐｈ  ａｕｒｅｕｓの内因性毒素は、大幅に上方制御されると細胞を殺傷することが確認されている。例えば、ｓｐｒＡ１毒素は細胞死遺伝子として選択される。
【０８２５】
ステッチＰＣＲおよびギブソンアセンブリを使用することにより、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの血清／血液遺伝子の上方制御に関与するプロモーター領域を使用してｓｐｒＡ１毒素の発現を駆動し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの血清／血液遺伝子の下方制御に関与するプロモーター領域を使用してｓｐｒＡ１ASの発現を駆動するオペロンが構築される。図２２は、ｓｐｒＡ１細胞死遺伝子に作動可能に連結された血清および血液応答性プロモーターｉｓｄＢと、ｓｐｒＡ  ＡＳに作動可能に連結された第２プロモーターｃｌｆＢを使用して、血液または血清の非存在での毒素の漏出性発現を防ぐキルスイッチ構築の漫画を示す。このカセットは、前の実施例で説明したのと同じ手法を使用して、相同組換えによってＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａのゲノムのネイティブのｓｐｒＡ１位置に組み込まれる。
【０８２６】
有用性を確認するために、合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａを使用してキルアッセイ実験を行い、さまざまな培養条件下ならびに血液または血清の非存在下および存在下での皮膚アッセイでのキルスイッチの機能を判定する。合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａは、真皮または粘膜状態下で良好な増殖を示すが、血液または血清に曝露された場合、増殖または細胞死が大幅に低減する。コロニー形成された合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａは、全身条件下で生存または再生産することができないので、対象に投与しても安全であると考えられる。また、合成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５０２ａは、ＭＲＳＡなどのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株の脱コロニー化によって作製された宿主ミクロバイオーム内の空のニッチを永続的に占有することができると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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