(57)【要約】  対象へのカチオン性脂質の投与を含む対象におけるＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路を修飾するための方法及び組成物を提供する。カチオン性脂質は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、鏡像異性体及びそれらの組み合わせを含む。組成物は、１つ以上の抗原成分をさらに含み得、ここで、そのような成分は、自家性又は非自家性である。
2021505606.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物へのカチオン性脂質の投与を含む対象におけるＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路を修飾するための方法。
【請求項２】
カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、及びそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カチオン性脂質が、カチオン性脂質の鏡像異性体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
鏡像異性体が、（Ｒ）−１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（Ｒ−ＤＯＴＡＰ）又は（Ｓ）−１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（Ｓ−ＤＯＴＡＰ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達経路が、アップレギュレート／活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達経路が、ダウンレギュレート／不活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、及びそれらの組み合わせを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
カチオン性脂質が、カチオン性脂質の鏡像異性体を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
鏡像異性体が、（Ｒ）−１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（Ｒ−ＤＯＴＡＰ）又は（Ｓ）−１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（Ｓ−ＤＯＴＡＰ）である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
抗原をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
抗原をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
Ｔ細胞応答が上昇している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が上昇している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
カチオン性脂質を含む組成物の投与を含む対象において免疫原性応答を誘導するための方法であって、カチオン性脂質の投与は、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達経路の刺激をもたらす方法。
【請求項１６】
カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、及びそれらの組み合わせを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
カチオン性脂質が、（Ｒ）−１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（Ｒ−ＤＯＴＡＰ）を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｔ細胞応答が上昇している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が上昇している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
カチオン性脂質を含む組成物の投与を含み、カチオン性脂質の投与がＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路の刺激をもたらす、対象における癌を治療するための方法。
【請求項２１】
カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、及びそれらの組み合わせを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
カチオン性脂質が、（Ｒ）−１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（Ｒ−ＤＯＴＡＰ）を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
抗原の投与をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
抗原が腫瘍抗原である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
腫瘍抗原がＨＰＶである、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／５９４，８１５号の優先権及びすべての利益を主張し、これは、その全体が参照により本明細書に明示的に援用される。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、概して、カチオン性脂質の投与を含むＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路を修飾するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
過去１０年間のＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）は、疾患に対する哺乳類の免疫応答において極めて重要であることが示されている。Ｉ型インターフェロンは、ウイルス感染によって直接誘導されるため、「ウイルス」インターフェロンと呼ばれている。対照的に、「免疫」ＩＦＮ、すなわちＩＦＮ−γは、免疫応答の際にＴ細胞とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が受容体と結合した後に合成される。また、ＩＦＮ−Ｉは、インターフェロンα受容体（ＩＦＮＡＲ）を介したシグナル伝達を介した腫瘍細胞アポトーシス及び抗血管新生のインデューサーとしても十分に立証されている。治療的免疫応答におけるＩＦＮ−Ｉの重要な役割のため、現在、ワクチン、免疫療法及び他の免疫ベースの医薬の予防的及び治療的利益の両方を改善するために、ＩＦＮ−Ｉを活性化する安全で有効な方法の同定に重点が置かれている。例えば、マウスを用いた前臨床研究では、ＩＦＮ−Ｉは、抗原提示樹状細胞（ＤＣ）やＣＤ４、ＣＤ８  Ｔ細胞など、免疫系の他の重要な細胞を直接活性化することが示されている。ＩＦＮ−Ｉはまた、Ｔリンパ球によって認識される腫瘍細胞の抗原提示を増加させ、したがって、癌免疫療法において重要な潜在的役割を示す。
【０００４】
ワクチン開発の分野では、病原体によって引き起こされる疾患を治療するために、又は癌を治療するために、ヒトにおいて多数の強力な抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を産生する方法及びアプローチは、依然として満たされていない医学的ニーズである。アジュバントなどの免疫刺激物質と組み合わせて使用されるタンパク質及びペプチドベースのワクチンは、細胞傷害性Ｔ細胞を発生させるために評価されている、より有望なアプローチの１つである。しかしながら、現在、ヒトへの使用が承認されているアジュバントのほとんどは、Ｉ型インターフェロン及び細胞傷害性Ｔ細胞の誘導物質としては不十分であり、長期間の予防効果又は治療効果の確立に失敗している。
【０００５】
インターフェロン（ＩＦＮ−α／β／γ）は、より強力な免疫刺激サイトカインの一部であり、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の発生において重要な役割を果たす。インターフェロンはまた、抗ウイルス免疫にも重要である。効果的なＴ細胞免疫には、適切な共刺激シグナル（シグナル２）及びサイトカイン（シグナル３）の存在下で抗原（シグナル１）を有するＴ細胞の活性化が必要であり、Ｔ細胞の増殖、生存、分化、及びエフェクター機能を促進することによって特異的なＴ細胞免疫応答を駆動する。ＩＦＮ−Ｉは、シグナル３としてＴ細胞に直接作用し、Ｔ細胞の活性化を誘導し、Ｔ細胞の最適な増殖、生存、及びエフェクター機能を駆動することができる。当初、抗ウイルスサイトカインとして同定されたＩＦＮ−Ｉは、ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖、生存及びエフェクター機能を増強することが示されている。インターフェロンはまた、補助刺激分子を調節し、Ｔ細胞活性化に必要な抗原交差提示を増強することによって、抗原提示細胞の成熟を促進する。さらに、インターフェロンは、ＩＬ−１５産生を介して、直接的な抗腫瘍特性ならびに間接的な抗腫瘍特性を有することが実証されている。これらの重要な免疫学的特性の結果として、種々のＩＦＮ−Ｉ誘導剤及び組換えＩＦＮ−Ｉ療法が、現在、ヒト試験において試験されている。
【０００６】
Ｉ型ＩＦＮは、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の発現を維持することにより、インビトロで細胞形質転換を阻害することが報告されている（Takaoka A, Hayakawa S, Yanai H, Stoiber D, Negishi H, Kikuchi H, et al. Integration of interferon-α/β signaling to p53 responses in tumor suppression and antiviral defense. Nature (2003)424:516-23）。ヒト癌細胞株における腫瘍細胞増殖の負の調節及び細胞死の誘発におけるＩＦＮ−Ｉシグナル伝達の特異的役割もまた実証されている（Zitvogel L, Galluzzi L, Kepp O, Smyth MJ, Kroemer G.Type I interferons in anticancer immunity. Nat Rev Immunol (2015) 15:405-14）。インビボで、腸上皮細胞からのＩＦＮＡＲ１の欠失は、マウスにおける腫瘍形成を増加させた（Tschurtschenthaler M, Wang J, Fricke C, Fritz TMJ, Niederreiter L, Adolph TE, et al. Type I interferon signaling in the intestinal epithelium affects Paneth cells, microbial ecology and epithelial regeneration. Gut (2014) 63:1921-31）。複数の研究から、ＩＦＮ−Ｉが主に免疫細胞の間接的刺激を介して抗腫瘍効果を誘導し、悪性細胞を迅速に排除するという強い証拠が得られている。いくつかの研究は、ＩＦＮ−Ｉが病原体に対する宿主の反応と類似した抗癌免疫応答を促進することを強く示唆している。
【０００７】
普遍的なＩＦＮＡＲ発現の結果として、ＩＦＮ−Ｉは、炎症性及びウイルス性疾患との関連において、免疫細胞に対して重要な調節作用を有することが示されている（Decker T, Muller M, Stockinger S. The yin and yang of type I interferon activity in bacterial infection. Nat Rev Immunol (2005) 5:675-87; Stetson DB, Medzhitov R. Type I interferons in host defense. Immunity (2006) 25:373-81）。したがって、先天性及び適応免疫応答の細胞メディエータは、悪性疾患に対する防御においてＩＦＮ−Ｉによって非常によく調節され得ることが明らかである。
【０００８】
ＩＦＮ−Ｉは、腫瘍免疫サーベイランスにおいて重要であることが示されている（Dunn GP, Bruce AT, Sheehan KCF, Shankaran V, Uppaluri R, Bui JD, et al. A critical function for type I interferons in cancer immunoediting. Nat Immunol (2005)6:722-9）。ＩＦＮ−γとは対照的に、ＩＦＮ−Ｉは、骨髄移植実験において、保護的抗腫瘍免疫応答の誘導中に腫瘍細胞自体ではなく宿主造血細胞に作用することが見出された。Ｉ型ＩＦＮが、腫瘍サーベイランスとの関連で、自然免疫系及び適応免疫系の細胞に影響を及ぼす機序について多くの報告がある［Zitvogel L, Galluzzi L, Kepp O, Smyth MJ, Kroemer G. Type I interferons in anticancer immunity. Nat Rev Immunol (2015) 15:405-14; Parker BS, Rautela J, Hertzog PJ. Antitumour actions of interferons: implications for cancer therapy. Nat Rev Cancer (2016) 16:131-44)］。宿主抗原提示細胞の活性化において、Ｉ型ＩＦＮの重要な役割がいくつかの研究によって同定されている（Fuertes MB, Kacha AK, Kline J, Woo S-R, Kranz DM, Murphy KM, et al. Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8α+ dendritic cells. J Exp Med (2011) 208:2005-16; Diamond MS, Kinder M, Matsushita H, Mashayekhi M, Dunn GP, Archambault JM, et al. Type I interferon is selectively required by dendritic cells for immune rejection of tumors. J Exp Med (2011) 208:1989-2003）。初期に産生されたＩ型ＩＦＮは、腫瘍抗原特異的細胞傷害性ＣＤ８+Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化に必要なＣＤ８α+樹状細胞（ＤＣ）の濃度に作用することが決定されている。Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達は、ＣＤ８α+ＤＣが抗原を交差させる能力を特異的に促進する（Diamond MS, Kinder M, Matsushita H, Mashayekhi M, Dunn GP, Archambault JM, et al. Type I interferon is selectively required by dendritic cells for immune rejection of tumors. J Exp Med (2011) 208:1989-2003）。この効果は、ＤＣの生存を増強し、従って交差提示中の細胞表面での抗原持続性を増強するためのＩＦＮ−Ｉの結果であると仮定されている（Lorenzi S, Mattei F, Sistigu A, Bracci L, Spadaro F, Sanchez M, et al. Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming. J Immunol (2011) 186:5142-50; Schiavoni G, Mattei F, Gabriele L. Type I interferons as stimulators of DC-mediated cross-priming: impact on anti-tumor response. Front Immunol (2013) 4:483）。Ｉ型ＩＦＮは、ＤＣの成熟、分化、移動を促進する（Fuertes MB, Woo S-R, Burnett B, Fu Y-X, Gajewski TF. Type I interferon response and innate immune sensing of cancer. Trends Immunol (2013) 34:67-73）。
【０００９】
Ｉ型ＩＦＮは、ＤＣによってインターロイキン１５（ＩＬ１５）の放出を誘導することができることに留意することが重要である（Mattei F, Schiavoni G, Belardelli F, Tough DF. IL-15 is expressed by dendritic cells in response to type I IFN, double-stranded RNA, or lipopolysaccharide and promotes dendritic cell activation. J Immunol (2001) 167:1179-87）。これは、ＣＤ８+記憶細胞及びＮＫ細胞の生存を促進する（Huntington ND. The unconventional expression of IL-15 and its role in NK cell homeostasis. Immunol Cell Biol (2014) 92:210-3）。この作用はＮＫ細胞に限定されない。ＣＴＬはまた、Ｉ型ＩＦＮに応答して、完全なエフェクター機能を獲得することも示されている（Curtsinger JM, Mescher MF. Inflammatory cytokines as a third signal for T cell activation. Curr Opin Immunol (2010) 22:333-40; Fuertes MB, Kacha AK, Kline J, Woo S-R, Kranz DM, Murphy KM, et al. Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8α+ dendritic cells. J Exp Med (2011) 208:2005-16）。また、好中球（Wu C-F, Andzinski L, Kasnitz N, Kroger A, Klawonn F, Lienenklaus S, et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. Int J Cancer(2015) 137:837-47; Jablonska J, Wu C-F, Andzinski L, Leschner S, Weiss S. CXCR2-mediated tumor-associated neutrophil recruitment is regulated by IFN-β. Int J Cancer (2014) 134:1346-58）、ＮＫＴ、およびγδ  Ｔ細胞（Woo S-R, Corrales L, Gajewski TF. Innate immune recognition of cancer. Annu Rev Immunol (2015) 33:445-74）などの他の自然免疫細胞サブセットに影響を与える能力を有することによって、Ｉ型ＩＦＮは、腫瘍増殖制限特性を示す。
【００１０】
Ｉ型ＩＦＮは、感染の非常に初期に放出される（Biron CA. Initial and innate responses to viral infections - pattern setting in immunity or disease. Curr Opin Microbiol (1999) 2:374-81）、抗癌宿主応答におけるＤＣ及びＮＫ細胞などの先天性免疫細胞サブセットの重要な調節因子である。ＮＫ細胞については、Ｉ型ＩＦＮは、ウイルス感染において、感染に対する初期応答を生成する能力において重要であることが示されており、ＮＫ細胞の細胞毒性及びサイトカイン産生を増強すると考えられている（Lee CK, Rao DT, Gertner R, Gimeno R, Frey AB, Levy DE. Distinct requirements for IFNs and STAT1 in NK cell function. J Immunol (2000) 165:3571-7; Nguyen KB, Salazar-Mather TP, Dalod MY, Van Deusen JB, Wei X, Liew FY, et al. Coordinated and distinct roles for IFN-alpha beta, IL-12, and IL-15 regulation of NK cell responses to viral infection. J Immunol (2002) 169:4279-87）。
【００１１】
ヒトでは、Ｉ型インターフェロンは、通常、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＯＤ様受容体、及びレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ様（ＲＩＧ−Ｉ）受容体などの病原体関連パターン認識受容体の結合を介して誘発されることが報告されている。さらに、種々の細胞質二次メッセンジャー（ｃ−ＧＭＰ）及び細胞質核酸センサーは、インターフェロン遺伝子刺激（ＳＴＩＮＧ）経路の活性化を介してＩ型インターフェロン産生を引き起こすことができる。
【００１２】
ＩＦＮ−Ｉは様々な方法で抗腫瘍活性を媒介すると考えられている。例えば、インターフェロンは、腫瘍細胞に対して直接作用し、生存及び増殖能力を変化させることができる［Parker, B.S., J. Rautela, and P.J. Hertzog, Antitumour actions of interferons: implications for cancer therapy. Nat Rev Cancer, 2016. 16(3): p. 131-443］。
【００１３】
Ｉ型を介した免疫学的特性を利用するために、多くの方法がヒトで研究されている。組換えＩＦＮ−Ｉ単独療法の投与は、組換えインターフェロンαの投与によって、慢性Ｃ型肝炎の治療において臨床的に証明されている（Adrian M. Di Bisceglie, M.D., Paul Martin, M.D., Chris Kassianides, M.D., Mauricio Lisker-Melman, M.D., Linda Murray, R.N., Jeanne Waggoner, B.A., Zachary Goodman, M.D., Steven M. Banks, Ph.D., and Jay H. Hoofnagle, M.D., Recombinant Interferon Alfa Therapy for Chronic Hepatitis C, November 30, 1989 N Engl J Med 1989; 321:1506-1510）。別のアプローチには、二本鎖ＲＮＡ（Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、単一標準ＲＮＡなどのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを投与して、Ｉ型インターフェロンの内因性産生を誘発することが含まれる（Munir Akkaya, Billur Akkaya, Patrick Sheehan, Pietro Miozzo, Mukul Rawat, Mirna Pena, Ann S Kim, Olena Kamenyeva, Juraj Kabat, Chen-Feng Qi, Silvia Bolland, Akanksha Chaturvedi and Susan K Pierce, The Toll-like receptor ligand CpG-A induces type 1 interferons in B cells contrasting the proinflammatory inducing activity of CpG-B, J Immunol May 1, 2017, 198 (1 Supplement) 152.4）。より最近では、ＳＴＩＮＧ経路アゴニストは、抗腫瘍免疫のための集束型Ｉ型インターフェロン活性化剤としてより重要性を増している［Corrales, L., et al., The host STING pathway at the interface of cancer and immunity. J Clin Invest, 2016. 126(7): p. 2404-11］。
【００１４】
しかしながら、Ｉ型インターフェロン経路の強力な活性化を促進するための効果的な方法については、依然として明確な必要性がある。Ｉ型インターフェロン経路の活性化の結果に伴う多くの治療上の利益を考えると、そのための改善された方法が明らかに望ましい。
【００１５】
したがって、必要とされるのは、ＩＦＮ１（ＩＦＮ−α／β／γ）の強力な活性化を可能にするワクチンのための改良された方法及び組成物である。さらに、必要なものは、ペプチド又はタンパク質抗原のような抗原の有無にかかわらず、頑強な細胞傷害性Ｔ細胞免疫応答を誘発するワクチンのような改良された方法及び組成物である。好ましくは、このような組成物及びワクチンは、安全であり、投与が容易であり、副作用又は毒性が最小限である免疫治療剤の使用を組み込む。
【発明の概要】
【００１６】
本明細書では、ＩＦＮ１（ＩＦＮ−α／β／γ）の強力な活性化剤としてカチオン性脂質を含むワクチンのための新規な方法及び組成物を提供する。本明細書に記載されるように、本組成物は、宿主に投与された場合、効果的で頑強な細胞傷害性Ｔ細胞免疫応答の誘導を可能にする。組成物は、所望によりペプチド又はタンパク質抗原と組み合わされたカチオン性脂質を含む；特定の実施形態では、カチオン性脂質はリポソームの形態である。以下に詳細に記載されるように、本発明の組成物は、マウスのような哺乳動物において確立された腫瘍を退行させる能力を有するＩＦＮ−Ｉ活性化細胞傷害性細胞をもたらす。本発明はさらに、感染性病原体に対するより効果的な予防並びに癌及び他の疾患に対する治療を開発するために、ＩＦＮ−Ｉを特異的に活性化するのに使用するためのカチオン性リポソームの使用を提供する。
【００１７】
本発明の他の特徴及び利点は、添付の図面を参照して後続の説明を読んだ後、本発明がよりよく理解されるようになるにつれて容易に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、Ｖｅｒｓａｍｕｎｅ（登録商標）（Ｒ−ＤＯＴＡＰ）が、流入リンパ節における免疫細胞の迅速かつ持続的な動員を誘導したことを示すグラフである。図１のデータは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝４）に、頸部の後方に１００μｌの１２ｍＭ  Ｒ−ＤＯＴＡＰリポソームナノ粒子を皮下注射した実験に対応する。ＰＢＳ及びＬＰＳ（５０μｇ／マウス）を注射したマウス（２４時間時点）を、それぞれ陰性及び陽性対照として用いた。注射の４時間後又は２４時間後に、各マウスからの腋窩リンパ節及び上腕リンパ節をプールし、コラゲナーゼ消化により処理した。これらのリンパ節細胞懸濁液中のＣＤ１１ｃ陽性細胞（〜２０，０００細胞）を選別精製し、ＲＬＴ緩衝液中で溶解し、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）マウス炎症キット及びナノストリング技術を用いて相対的遺伝子発現分析のために処理した。データは、Ｒ−ＤＯＴＡＰによるＩ型インターフェロン遺伝子のアップレギュレーションを示し、各群の平均４匹のマウスを示す。
【図２】図２は、流入リンパ節におけるＲ−ＤＯＴＡＰ誘導型ＩＦＮ遺伝子発現を示すグラフである。図２のデータは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝２）に、足パッド内に５０μｌの６ｍＭ  Ｒ−ＤＯＴＡＰ又はＳ−ＤＯＴＡＰナノ粒子を皮下注射した実験に対応する。ＰＢＳ及びＬＰＳ（５０μｇ／マウス）を注射したマウス（２４時間時点）を、それぞれ陰性及び陽性対照として用いた。注射後３時間又は２４時間、各マウスからの膝窩リンパ節をプールし、ＲＬＴ緩衝液中で溶解し、Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ及びＲＴ−ＰＣＲを用いて相対遺伝子発現分析のために処理した。データは、Ｓ−ＤＯＴＡＰとＲ−ＤＯＴＡＰの両方によるＩ型インターフェロン遺伝子のアップレギュレーションを示している。
【図３Ａ】図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃは、流入リンパ節におけるＲ−ＤＯＴＡＰ誘導細胞動員及びＣＤ６９発現を示すグラフを提供する。図３のデータは、Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）に５０μｌの６ｍＭ  Ｒ−ＤＯＴＡＰ又は２８０ｍＭスクロースを足パッドに皮下注射した実験に対応する。指示された時間に、各マウスから膝窩リンパ節ドレナージリンパ節を単離し、全細胞数を得るために血球計を用いてリンパ節の単一懸濁液を計数した。Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ｎ＝３）又はＩＦＮＡＲ−／−（ｎ＝３）マウスに、足パッドに５０μｌの６ｍＭ  Ｒ−ＤＯＴＡＰ又は２８０ｍＭスクロースを注射し、各マウスから排液性膝窩リンパ節を採取し、２４時間後（Ｂ）の全細胞数について酵素的に消化したリンパ節を血球計を用いて評価し、ＣＤ３＋Ｔ細胞（Ｂ）上のＣＤ６９の発現をフローサイトメトリーを用いて評価した。Ａ−Ｂ）データは各所属リンパ節の総細胞数を示す。Ｃ）ワクチン接種２の４時間後の各群のＣＤ６９＋細胞数の割合（％）を示す（ｎ＝３匹／群）。
【図３Ｂ】図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃは、流入リンパ節におけるＲ−ＤＯＴＡＰ誘導細胞動員及びＣＤ６９発現を示すグラフを提供する。図３のデータは、Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）に５０μｌの６ｍＭ  Ｒ−ＤＯＴＡＰ又は２８０ｍＭスクロースを足パッドに皮下注射した実験に対応する。指示された時間に、各マウスから膝窩リンパ節ドレナージリンパ節を単離し、全細胞数を得るために血球計を用いてリンパ節の単一懸濁液を計数した。Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ｎ＝３）又はＩＦＮＡＲ−／−（ｎ＝３）マウスに、足パッドに５０μｌの６ｍＭ  Ｒ−ＤＯＴＡＰ又は２８０ｍＭスクロースを注射し、各マウスから排液性膝窩リンパ節を採取し、２４時間後（Ｂ）の全細胞数について酵素的に消化したリンパ節を血球計を用いて評価し、ＣＤ３＋Ｔ細胞（Ｂ）上のＣＤ６９の発現をフローサイトメトリーを用いて評価した。Ａ−Ｂ）データは各所属リンパ節の総細胞数を示す。Ｃ）ワクチン接種２の４時間後の各群のＣＤ６９＋細胞数の割合（％）を示す（ｎ＝３匹／群）。
【図３Ｃ】図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃは、流入リンパ節におけるＲ−ＤＯＴＡＰ誘導細胞動員及びＣＤ６９発現を示すグラフを提供する。図３のデータは、Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）に５０μｌの６ｍＭ  Ｒ−ＤＯＴＡＰ又は２８０ｍＭスクロースを足パッドに皮下注射した実験に対応する。指示された時間に、各マウスから膝窩リンパ節ドレナージリンパ節を単離し、全細胞数を得るために血球計を用いてリンパ節の単一懸濁液を計数した。Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ｎ＝３）又はＩＦＮＡＲ−／−（ｎ＝３）マウスに、足パッドに５０μｌの６ｍＭ  Ｒ−ＤＯＴＡＰ又は２８０ｍＭスクロースを注射し、各マウスから排液性膝窩リンパ節を採取し、２４時間後（Ｂ）の全細胞数について酵素的に消化したリンパ節を血球計を用いて評価し、ＣＤ３＋Ｔ細胞（Ｂ）上のＣＤ６９の発現をフローサイトメトリーを用いて評価した。Ａ−Ｂ）データは各所属リンパ節の総細胞数を示す。Ｃ）ワクチン接種２の４時間後の各群のＣＤ６９＋細胞数の割合（％）を示す（ｎ＝３匹／群）。
【図４Ａ】図４は、カチオン性脂質による樹状細胞によるＩ型インターフェロン産生の誘導を示すグラフを示す。図４のデータは、Ａ）ＩＦＮＡＲ−Ｋｏマウス由来の骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、示された（６〜４００μＭ）濃度のカチオン性脂質又はＬＰＳ陽性対照（１〜５００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した実験に対応する。Ｂ）所定濃度（６〜４００μＭ）のカチオン性脂質又はＬＰＳ陽性対照（１〜５００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間、ＦＬＴ３誘導ＢＭＤＣ（ｐＤＣ）及びＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４誘導ＢＭＤＣ（ｃＢＭＤＣ）を刺激した。Ｉ型インターフェロン産生を測定するために、細胞上清（１００μｌ）をレポーター細胞（米国インビボジェン社のＢ１６．Ｂｌｕｅ−ＩＦＮα／β細胞）に添加し、１８時間インキュベートして、レポーター細胞によるＩ型インターフェロン誘導性の分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）産生を刺激した。レポーター細胞上清中のＳＥＡＰ活性を、製造プロトコールに従って比色ＳＥＡＰアッセイキットを用いて定量した。ＢＭＤＣ分泌Ｉ型インターフェロンを、レポーター細胞株において組換えマウスＩＦＮ−β刺激ＳＥＡＰ活性を用いて標準曲線を用いて定量した。
【図４Ｂ】図４は、カチオン性脂質による樹状細胞によるＩ型インターフェロン産生の誘導を示すグラフを示す。図４のデータは、Ａ）ＩＦＮＡＲ−Ｋｏマウス由来の骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、示された（６〜４００μＭ）濃度のカチオン性脂質又はＬＰＳ陽性対照（１〜５００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した実験に対応する。Ｂ）所定濃度（６〜４００μＭ）のカチオン性脂質又はＬＰＳ陽性対照（１〜５００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間、ＦＬＴ３誘導ＢＭＤＣ（ｐＤＣ）及びＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４誘導ＢＭＤＣ（ｃＢＭＤＣ）を刺激した。Ｉ型インターフェロン産生を測定するために、細胞上清（１００μｌ）をレポーター細胞（米国インビボジェン社のＢ１６．Ｂｌｕｅ−ＩＦＮα／β細胞）に添加し、１８時間インキュベートして、レポーター細胞によるＩ型インターフェロン誘導性の分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）産生を刺激した。レポーター細胞上清中のＳＥＡＰ活性を、製造プロトコールに従って比色ＳＥＡＰアッセイキットを用いて定量した。ＢＭＤＣ分泌Ｉ型インターフェロンを、レポーター細胞株において組換えマウスＩＦＮ−β刺激ＳＥＡＰ活性を用いて標準曲線を用いて定量した。
【図５Ａ】図５は、Ｉ型ＩＦＮシグナル欠損マウスにおけるＲ−ＤＯＴＡＰベースのワクチンの有効性を示すグラフを提供する。図５のデータは、Ｊａｃｋｓｏｎ由来のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝６）又はＩＦＮＡＲ−／−マウスに、０日目及び７日目にＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（Ａ）（配列番号１）又はＲＦ９ペプチド（Ｂ）（配列番号２）を含有するワクチン製剤（Ｖｅｒｓａｍｕｎｅ（登録商標）又は完全フロイントアジュバント）１００μｌを皮下注射した実験に対応する。２回目のワクチン接種から７日後に、ワクチン接種マウス及び対照マウス由来の脾臓を処理して、野生型及びＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるワクチン製剤によって誘導された抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を測定した。抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的（Ａ）（配列番号１）及びＲＦ９ペプチド特異的（Ｂ）（配列番号２）ＣＤ８  Ｔ細胞産生を測定することによって評価した。データは、同様の結果を有する複数の実験の代表である。データの統計的有意性を一方向ＡＮＯＶＡを用いて推定し、多重比較をＴｕｋｅｙ検定を用いて分析した。**ＷＴ  Ｖｅｒｓａｍｕｎｅ（登録商標）ワクチン接種群を統計学的に有意（ｐ＜０．０５）に比較した。
【図５Ｂ】図５は、Ｉ型ＩＦＮシグナル欠損マウスにおけるＲ−ＤＯＴＡＰベースのワクチンの有効性を示すグラフを提供する。図５のデータは、Ｊａｃｋｓｏｎ由来のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝６）又はＩＦＮＡＲ−／−マウスに、０日目及び７日目にＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（Ａ）（配列番号１）又はＲＦ９ペプチド（Ｂ）（配列番号２）を含有するワクチン製剤（Ｖｅｒｓａｍｕｎｅ（登録商標）又は完全フロイントアジュバント）１００μｌを皮下注射した実験に対応する。２回目のワクチン接種から７日後に、ワクチン接種マウス及び対照マウス由来の脾臓を処理して、野生型及びＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるワクチン製剤によって誘導された抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を測定した。抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的（Ａ）（配列番号１）及びＲＦ９ペプチド特異的（Ｂ）（配列番号２）ＣＤ８  Ｔ細胞産生を測定することによって評価した。データは、同様の結果を有する複数の実験の代表である。データの統計的有意性を一方向ＡＮＯＶＡを用いて推定し、多重比較をＴｕｋｅｙ検定を用いて分析した。**ＷＴ  Ｖｅｒｓａｍｕｎｅ（登録商標）ワクチン接種群を統計学的に有意（ｐ＜０．０５）に比較した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、本明細書に含まれる特定の実施形態の以下の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解することができる。本発明は、その特定の実施形態の特定の詳細を参照して説明されてきたが、そのような詳細は、本発明の範囲に対する制限とみなされるべきではない。
【００２０】
本明細書に記載される参照文献の全文は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、米国仮特許出願第６２／５９４，８１５号、米国特許第７，３０３，８８１号、第８，８７７，２０６号、第９，７８９，１２９号、及び米国特許出願第１４／３４４，３２７号、第１４／４０７，４１９号、第１４／４２９，１２３号、及び第１５／７７５，６８０号が含まれる。
【００２１】
本明細書では、Ｉ型インターフェロン遺伝子の修飾のためのカチオン性脂質の使用を含む新規な方法及び組成物を提供する。ある実施形態では、Ｉ型インターフェロン遺伝子は、アップレギュレートされ、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達を誘導又は活性化する。ある実施形態では、Ｉ型インターフェロン遺伝子は、下方制御され、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達を抑制又は不活性化する。また、Ｉ型インターフェロンの効果を介して疾患特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の効力を促進及び増大させるためのカチオン性脂質の使用を含む新規な方法及び組成物も提供される。ある実施形態では、本明細書に請求される方法及び組成物は、特異的な感染又は罹患細胞に対する細胞溶解活性を指示することを意図した疾患特異的抗原の使用を含み得る。
【００２２】
カチオン性リポソームは、低分子量薬物、プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質及びペプチドを送達するために、またワクチンアジュバントとして、インビボで広く使用されてきた。本発明では、カチオン性脂質が免疫系とどのように相互作用するかをよりよく理解するために実施された研究の結果、及びある種のカチオン性脂質が交差提示を容易にする能力のメカニズム的理由により、Ｉ型インターフェロンをアップレギュレートするカチオン性脂質の独特な能力が発見された。初期に産生されたＩ型ＩＦＮは、腫瘍抗原特異的細胞傷害性ＣＤ８+Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化に必要なＣＤ８α+樹状細胞（ＤＣ）の濃度に作用し、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達は、ＣＤ８α+ＤＣの抗原交差発現能を特異的に促進することが報告されている。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き起こす抗原交差提示を促進するカチオン性脂質のこの能力は、現在、前臨床研究及びヒト臨床研究の両方で実証されている。ヒトにおける抗原交差提示及びＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を促進するためにＩ型インターフェロンを安全に活性化するためにカチオン性脂質を使用する能力は、治療免疫学の分野における重大なアンメットメディカルニーズに成功裏に対処する可能性を提供する。
【００２３】
本明細書に意図される実施形態では、カチオン性脂質を投与して、対象においてＩ型インターフェロン経路を活性化する。
【００２４】
別の実施形態では、カチオン性脂質を疾患特異的抗原と組み合わせて、Ｉ型インターフェロンを活性化し、抗原の交差提示を促進して、疾患特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をプライミングして、対象における疾患を治療する。
【００２５】
別の実施形態では、癌を治療する方法が提供され、この方法は、タンパク質抗原と組み合わされたＩ型インターフェロン活性化カチオン性脂質で対象を治療する工程を含む。
【００２６】
別の実施形態では、癌を治療する方法が提供され、この方法は、Ｔ細胞活性化ワクチンと組み合わされたカチオン性脂質で対象を治療する工程を含む。
【００２７】
別の実施形態では、癌を治療する方法が提供され、この方法は、対象を、タンパク質又はペプチド腫瘍抗原と組み合わされたカチオン性脂質で、かつアジュバントと組み合わせて治療する工程を含む。
【００２８】
別の実施形態では、癌を治療する方法が提供され、この方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡベースの抗原を含む任意の腫瘍抗原と組み合わされたカチオン性脂質で対象を治療する工程を含む。
【００２９】
別の実施形態では、癌を治療する方法が提供され、この方法は、ＭＤＳＣ、Ｔｒｅｇの減少又は免疫チェックポイントの遮断を介して腫瘍免疫抑制と闘うアジュバント及び／又は任意の薬剤と組み合わせて、必要に応じて腫瘍抗原と組み合わされたＩ型インターフェロン経路を活性化するために、カチオン性脂質で対象を処置する工程を含む。
【００３０】
別の実施形態では、癌を治療する方法が提供され、この方法は、腫瘍免疫抑制と闘うアジュバント及び／又は任意の剤と組み合わせて、ＤＮＡ又はＲＮＡベースの腫瘍抗原と組み合わせたカチオン性脂質ベースのワクチンで対象を治療する工程を含む。
【００３１】
さらに別の実施形態では、哺乳動物における抗腫瘍免疫応答を増強する方法が提供される。本方法は、ＧＭ−ＣＳＦ及びサイトカインのようないくつかの場合において、哺乳動物をＩ型インターフェロン活性化カチオン性脂質、又は１以上のカチオン性脂質と共に成長因子で処理する工程を含む。
【００３２】
種々の実施形態では、組成物は、少なくとも１つのＩ型インターフェロン活性化カチオン性脂質及び少なくとも１つの抗原を有する１つ以上の脂質を含む。ある態様において、２つ以上の抗原が含まれる。
【００３３】
一実施形態では、哺乳動物などの対象におけるＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路を修飾するための方法及び組成物が提供され、この方法は対象へのカチオン性脂質を含む組成物の投与を含む。一実施形態では、カチオン性脂質は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、及びそれらの組み合わせを含む。組成物は、カチオン性脂質の特定の鏡像異性体を含むことができる。一実施形態では、カチオン性脂質は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、一実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ、（Ｒ）−１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（Ｒ−ＤＯＴＡＰ）のＲ鏡像異性体である。ある態様において、組成物は、タンパク質又はペプチド抗原などの抗原をさらに含む。
【００３４】
ある実施形態では、対象におけるＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路の修飾は、経路のダウンレギュレーション又は活性化を含む。ある実施形態では、対象におけるＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路の修飾は、経路のダウンレギュレーション又は不活性化を含む。ある実施形態では、Ｔ細胞応答は上昇し、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は上昇し、及び／又は組成物の免疫原性は増強される。一実施形態では、対象における癌を治療する方法が提供され、この方法は、カチオン性脂質を含む組成物の投与を含み、カチオン性脂質の投与は、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達経路の刺激をもたらす。
【００３５】
抗原
一実施形態では、本明細書に請求される新規な方法は、対象自身の腫瘍に由来する抗原などの１つ以上の自己抗原とカチオン性脂質の投与を含む。別の実施形態では、本方法は、合成ペプチド、組換えタンパク質、ＲＮＡもしくはＤＮＡ又はそれらの活性断片などの１つ以上の非自己抗原と組み合わせたカチオン性脂質を含む組成物の投与を含むが、これらに限定されない。それぞれの場合において、目的はＩ型インターフェロンを活性化して、強力な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導を促進することである。抗原は、当業者に公知の任意の疾患関連抗原であり得る。
【００３６】
本明細書で使用される「腫瘍関連抗原」は、腫瘍又は癌細胞に関連する分子又は化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡ、及び／もしくはＤＮＡ、又はそれらの活性断片）であり、ＭＨＣ分子との関連で抗原提示細胞の表面上に発現されると、免疫応答（体液性及び／又は細胞性）を引き起こすことができる。腫瘍関連抗原は、自己抗原、ならびに、癌と特異的に関連しないが、それにもかかわらず、動物に投与された場合、腫瘍又は癌細胞に対する免疫応答を増強し、及び／又は腫瘍又は癌細胞の増殖を減少させ得る他の抗原を含む。さらなる特定の実施形態が、本明細書に提供される。
【００３７】
本明細書で使用される「微生物抗原」は、微生物の抗原であり、限定されないが、感染性ウイルス、感染性細菌、感染性寄生虫及び感染性真菌を含む。微生物抗原は、無傷の微生物であってもよく、天然に存在する微生物抗原と同一又は類似の合成化合物、及び好ましくは、対応する微生物（天然に存在する微生物抗原が由来する）に特異的な免疫応答を誘導する天然の分離物、断片、又はその誘導体であってもよい。好ましい実施形態では、化合物は、天然に存在する微生物抗原と類似の免疫応答（体液性及び／又は細胞性）を誘導する場合、天然に存在する微生物抗原に類似する。天然微生物抗原に類似する化合物又は抗原は、例えば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡ、及び／又はＤＮＡなど、当業者に周知である。天然微生物抗原に類似する化合物の別の非限定的な例は、多糖類抗原のペプチド模倣物である。より具体的な実施形態が本明細書に提供される。
【００３８】
用語「抗原」は、さらに、本明細書に記載されるもののような、既知又は野生型抗原のペプチド又はタンパク質類似体を包含することを意図する。類似体は、野生型抗原よりも可溶性であっても、より安定であってもよく、また、抗原をより免疫学的に活性にする突然変異又は修飾を含んでいてもよい。抗原は、脂質又は糖部分の添加、ペプチド又はタンパク質アミノ酸配列の突然変異、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の突然変異、又は当業者に公知の任意の他の修飾など、任意の方法で修飾することができる。抗原は、当業者に公知の標準的方法を用いて修飾することができる。
【００３９】
また、本発明の組成物及び方法において有用なのは、所望の抗原のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質であり、相同抗原は、それぞれの腫瘍、微生物又は感染細胞に対する免疫応答を誘導する。
【００４０】
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、カチオン性脂質が抗原なしで投与され、Ｉ型インターフェロンを活性化し、例えば、疾患細胞又は感染細胞を攻撃及び死滅させるためにナチュラルキラー細胞を活性化することによって、対象における疾患を治療するための所望の免疫応答を促進する組成物を含む。別の実施形態では、本発明の方法は、カチオン性脂質が抗原と共に投与される組成物を含み、抗原は、腫瘍又は癌、すなわち、腫瘍を予防又は治療するための免疫療法を開発するための腫瘍関連抗原と関連し得る。したがって、１つの実施形態では、本発明の腫瘍又は免疫療法は、少なくとも１つの腫瘍関連抗原の少なくとも１つのエピトープをさらに含む。別の実施形態では、本発明の免疫療法方法は、１つ以上の腫瘍関連抗原由来の複数のエピトープをさらに含む。本発明のカチオン性脂質及び方法で使用される腫瘍関連抗原は、本質的に免疫原性であっても、非免疫原性であっても、又はわずかに免疫原性であってもよい。本明細書で示されるように、本組成物は、いくつかの腫瘍タイプに対する抗腫瘍効果を媒介することが知られているＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）を活性化することができるため、腫瘍関連自己抗原であっても、治療効果のための本免疫療法において有利に使用することができる。例示的な抗原としては、合成、組換え、外来、又は相同な抗原が挙げられ、抗原性物質としては、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡ及びＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。そのような治療の例には、乳癌、頭頸部癌、黒色腫、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌腸癌、又は免疫療法に感受性である当該技術分野で公知の任意の他の癌の治療又は予防が含まれるが、これらに限定されない。このような治療では、カプセル封入なしで抗原をカチオン性脂質と結合させることも可能である。
【００４１】
本発明での使用に適した腫瘍関連抗原は、単一の腫瘍タイプを示すことができ、いくつかのタイプの腫瘍間で共有され、及び／又は正常細胞と比較して腫瘍細胞においてのみ発現又は過剰発現され得る、天然に存在する分子及び修飾された分子の両方を含む。タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド、及びリポペプチドに加えて、炭水化物、ガングリオシド、糖脂質、及びムチンの腫瘍特異的発現パターンも報告されている。癌ワクチンに使用するための例示的な腫瘍関連抗原は、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、及び腫瘍細胞に特有の突然変異又は再配列を有する他の遺伝子のタンパク質産物、再活性化された胚性遺伝子産物、腫瘍胎児性抗原、組織特異的（腫瘍特異的ではない）分化抗原、成長因子受容体、細胞表面炭水化物残基、外来性ウイルスタンパク質、及び多数の他の自己タンパク質を含む。
【００４２】
腫瘍関連抗原の具体的な実施形態には、例えば、突然変異した又は修飾された抗原、例えば、Ｒａｓ  ｐ２１癌原遺伝子、腫瘍抑制因子ｐ５３及びＢＣＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子、及びＢＣＲ−ａｂｌ癌遺伝子、ならびにＣＤＫ４、ＭＵＭ１、カスパーゼ８、及びベータカテニンのタンパク質産物；過剰発現した抗原、例えば、ガレクチン４、ガレクチン９、カルボニックアンヒドラーゼＡ、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２及びＫＳＡ、腫瘍胎児抗原、例えば、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）；自己抗原、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびメラノサイト分化抗原、例えば、Ｍａｒｔ  １／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１およびＴＲＰ２；Ｍａｒｔ  １／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１及びＴＲＰ２のようなメラニン細胞分化抗原；前立腺関連抗原、例えば、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ−Ｐ１及びＰＳＭ−Ｐ２；再活性化された胚性遺伝子産物、例えば、ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、ＧＡＧＥ  １、ＧＡＧＥ  ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、他の癌精巣抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ２及びＳＣＰ１；ムチン、例えば、Ｍｕｃ−１及びＭｕｃ−２；ガングリオシド、例えば、ＧＭ２、ＧＤ２及びＧＤ３、中性糖脂質、及び糖タンパク質、例えば、Ｌｅｗｉｓ（ｙ）；ならびに糖タンパク質、例えば、Ｔｎ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｉｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ）及びｓＴｎが挙げられる。また、本明細書中の腫瘍関連抗原としては、Ｂ細胞リンパ腫に対する使用のためのＢリンパ球の単クローン性増殖に発現される免疫グロブリンイディオタイプと同様に、全細胞及び腫瘍細胞溶解物ならびにそれらの免疫原性部分が含まれる。
【００４３】
腫瘍関連抗原及びそれらのそれぞれの腫瘍細胞標的は、癌の抗原として、例えば、サイトケラチン、特にサイトケラチン８、１８及び１９を含む。上皮膜抗原（ＥＭＡ）、ヒト胚性抗原（ＨＥＡ−１２５）、ヒト乳脂肪球、ＭＢｒ１、ＭＢｒ８、Ｂｅｒ−ＥＰ４、１７−１Ａ、Ｃ２６及びＴ１６もまた、既知の癌抗原である。デスミン及び筋特異的アクチンは筋原性肉腫の抗原である。胎盤アルカリホスファターゼ、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、及びα−フェトプロテインは、栄養膜及び胚細胞腫瘍の抗原である。前立腺特異抗原は、前立腺癌、結腸腺癌の癌胎児性抗原の抗原である。ＨＭＢ−４５は黒色腫の抗原である。子宮頸癌では、有用な抗原がヒトパピローマウイルスによってコードされ得る。クロマグラニンＡ及びシナプトフィシンは、神経内分泌腫瘍及び神経外胚葉性腫瘍の抗原である。特に興味深いのは、壊死領域を有する固形腫瘍塊を形成する侵攻性腫瘍である。このような壊死細胞の溶解は、抗原提示細胞に対する抗原の豊富な供給源であり、したがって、本治療は、従来の化学療法及び／又は放射線療法と共に有利な使用を見出すことができる。
【００４４】
腫瘍関連抗原は、当該技術分野で周知の方法によって調製することができる。例えば、これらの抗原は、癌細胞の粗抽出物を調製することによって（例えば、Cohen et al., Cancer Res., 54:1055 (1994)に記載される）、抗原を部分的に精製することによって、組換え技術によって、又は既知の抗原のデノボ合成によって、癌細胞から調製することができる。抗原はまた、対象における発現及び免疫化対象の免疫系への提示に適した形態の抗原ペプチドをコードする核酸の形態であってもよい。さらに、抗原は完全な抗原であってもよく、又はそれは少なくとも１つのエピトープを含む完全な抗原の断片であってもよい。
【００４５】
ある種の癌の素因となることが知られている病原体由来の抗原もまた、有利には、本発明の癌ワクチンに含まれ得る。世界の癌発生率の１６％近くは感染性病原体に起因すると推定されており、多くの一般的な悪性腫瘍は特定のウイルス遺伝子産物の発現によって特徴付けられる。したがって、癌を引き起こすことに関与する病原体からの１つ以上の抗原の包含は、宿主免疫応答を拡大し、癌ワクチンの予防的又は治療的効果を増強する助けとなり得る。本明細書で提供される癌ワクチンにおいて使用するために特に関心のある病原体には、
Ｂ型肝炎ウイルス（肝細胞癌）、Ｃ型肝炎ウイルス（ヘプトーマ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）（バーキットリンパ腫、鼻咽頭癌、免疫抑制された個人におけるＰＴＬＤ）、ＨＴＬＶＬ（成人Ｔ細胞白血病）、発癌性ヒトパピローマウイルス１６、１８、３３、４５型（成人子宮頸癌）、及びヘリコバクターピロリ（Ｂ細胞胃リンパ腫）が含まれる。哺乳動物及びより詳細にはヒトにおける抗原として役立つ他の医学的に関連する微生物は、文献、例えばC. G. A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983に広く記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４６】
別の実施形態では、抗原は、病原体、すなわち微生物抗原に由来する、又はそれに関連する抗原を含む。従って、１つの実施形態では、本発明の病原体ワクチンは、少なくとも１つの微生物抗原の少なくとも１つのエピトープをさらに含む。本免疫療法によって標的化され得る病原体には、ウイルス、細菌、寄生虫及び真菌が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、本発明の病原体ワクチンは、１以上の微生物抗原由来の複数のエピトープをさらに含む。
【００４７】
陽イオン性脂質免疫療法及び方法に使用される微生物抗原は、本質的に免疫原性であっても、非免疫原性であっても、又はわずかに免疫原性であってもよい。例示的な抗原としては、合成、組換え、外来、又は相同な抗原が挙げられ、抗原性物質としては、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡ、及びＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
例示的なウイルス病原体には、限定されないが、哺乳動物、より具体的にはヒトに感染するウイルスが含まれる。ウイルスの例としては、限定されないが、Retroviridae（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）；および分離株、例えば、ＨＩＶ−ＬＰ；Picornaviridae（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；Calciviridae（例えば、胃腸炎を引き起こす菌株）；Togaviridae（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；Flaviridae（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；Coronoviridae（例えば、コロノウイルス）；Rhabdoviradae（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Coronaviridae（例えば、コロナウイルス）；Rhabdoviridae（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Filoviridae（例えば、エボラウイルス）；Paramyxoviridae（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；Orthomyxoviridae（例えば、インフルエンザウイルス）；Bungaviridae（例えば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス；Arenaviridae（出血熱ウイルス）；Reoviridae（例えば、レオウイルス、オルビウルスおよびロタウイルスなど）；Birnaviridae；Hepadnaviridae（Ｂ型肝炎ウイルス）；Parvovirida（パルボウイルス）；Papovaviridae（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；Adenoviridae（ほとんどのアデノウイルス）；Herpesviridae（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２）、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；Poxyiridae（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびIridoviridae（例えば、アフリカ豚コレラウイルス）；及び分類不能のウイルス（例えば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥のあるサテライトであると考えられている）、非Ａ、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部感染；クラス２＝非経口感染（すなわち、Ｃ型肝炎）；Ｎｏｒｗａｌｋおよび関連ウイルス、およびアストロウイルス）が含まれる。
【００４９】
また、グラム陰性菌及びグラム陽性菌は、脊椎動物における本組成物及び方法によって標的化され得る。このようなグラム陽性菌には、限定されないが、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ種、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種が含まれる。グラム陰性菌には、限定されないが、大腸菌、シュードモナス種、及びサルモネラ種が含まれる。感染性細菌の特定の例には、限定されないが、Helicobacter pyloris、Borella burgdorferi、Legionella pneumophiliaii、Mycobacteria属種（例えば、M. tuberculosis、M. avium、M. intracellulare、M. kansaii、M. gordonae）、Staphylococcus aureus、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Listeria monocytogenes、Streptococcus pyogenes（Ａ群連鎖球菌)、Streptococcus agalactiae（Ｂ群Streptococcus)、Streptococcus（ビリダンス群）、Streptococcus faecalis、Streptococcus bovis、Streptococcus（嫌気性菌）、Streptococcus pneumoniae、pathogenic Campylobacter sp.、Enterococcus sp.、Haemophilus infuenzae、Bacillus antracis、corynebacterium diphtheriae、corynebacterium sp.、Erysipelothrix rhusiopathiae、Clostridium perfringers、Clostridium tetani、Enterobacter aerogenes、Klebsiella pneumoniae、Pasturella multocida、Bacteroides sp.、Fusobacterium nucleatumii、Streptobacillus moniliformis、Treponema pallidium、Treponema pertenue、Leptospira、Rickettsia、およびActinomyces israelliが含まれる。
【００５０】
主題の組成物中の微生物抗原源として使用され得る細菌性病原体のポリペプチドは、限定されないが、鉄調節外膜タンパク質（「ＩＲＯＭＰ」）、外膜タンパク質（「ＯＭＰ」）、フルンクロシスを引き起こすAeromonis salmonicidaのＡタンパク質、細菌性腎疾患を引き起こすRenibacterium salmoninarumのｐ５７タンパク質（「ＢＫＤ」）、主要表面関連抗原（「ｍｓａ」）、表面発現細胞毒素（「ｍｐｒ」）、表面発現溶血素（「ｉｓｈ」）、およびエルシニア症のべん毛抗原； 細胞外タンパク質（「ECP」）、鉄調節外膜タンパク質（「IROMP」）、およびパスツレラ症の構造タンパク質; Vibrosis anguillarumおよびV. ordaliiのＯＭＰおよびべん毛タンパク質；Edwardsiellosis ictaluriおよびE. tardaのべん毛タンパク質、ＯＭＰタンパク質、ａｒｏＡ、ｐｕｒＡ；およびIchthyophthiriusの表面抗原；およびCytophaga columnariの構造および調節タンパク質; ならびにリケッチアの構造および調節タンパク質が含まれる。そのような抗原は、組換え的に、又は当技術分野で公知の任意の他の手段によって単離又は調製することができる。
【００５１】
病原体の例としては、さらに、限定されないが、哺乳動物、より具体的にはヒトに感染する真菌が挙げられる。真菌の例としては、限定されないが、Cryptococcus neoformansi、Histoplasma capsulatum、Coccidioides immitis、Blastomyces dermatitidis、Chlamydia trachomatis、Candida albicansが挙げられる。感染性寄生虫の例としては、Plasmodium、例えば、Plasmodium falciparum、Plasmodium malariae、Plasmodium ovale、およびPlasmodium vivaxが挙げられる。他の感染性微生物（すなわち、原生生物）には、Toxoplasma gondiiが含まれる。寄生性病原体のポリペプチドには、Ichthyophthiriusの表面抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
哺乳動物及びより詳細にはヒトにおける抗原として作用する他の医学的に関連する微生物は、文献に広く記載されており、例えば、C. G. A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983を参照されたい。感染性ヒト疾患及びヒト病原体の治療に加えて、本発明の組成物及び方法は、ヒト以外の哺乳動物の感染を治療するのに有用である。非ヒト哺乳動物の治療のための多くのワクチンは、Bennett, K. Compendium of Veterinary Products, 3rd ed, North American Compendiums, Inc., 1995に開示されている；ＷＯ０２／０６９３６９も参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００５３】
例示的な非ヒト病原体には、限定されないが、マウス乳腺腫瘍ウイルス（「ＭＭＴＶ」）、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）、トリ白血病ウイルス（「ＡＬＶ」）、トリ骨髄芽球症ウイルス（「ＡＭＶ」）、マウス白血病ウイルス（「ＭＬＶ」）、ネコ白血病ウイルス（「ＦｅＬＶ」）、マウス肉腫ウイルス（「ＭＳＶ」）、テナガザル白血病ウイルス（「ＧＡＬＶ」）、脾臓壊死ウイルス（「ＳＮＶ」）、細網内皮症ウイルス（「ＲＳＶ」）、サル肉腫ウイルス（「ＳＳＶ」）、メイソンファイザーサルウイルス（「ＭＰＭＶ」）、サルレトロウイルス１型（「ＳＲＶ−１」）、レンチウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、Ｖｉｓｎａウイルスなど）、ネコ免疫不全ウイルス（「ＦＩＶ」）、および馬伝染性貧血ウイルス（「ＥＩＡＶ」）、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、サルＴ細胞白血病ウイルス（「ＳＴＬＶ」）などのＴ細胞白血病ウイルス、およびウシ白血病ウイルス（「ＢＬＶ」）、およびヒト泡沫状ウイルス（「ＨＦＶ」）、サル泡沫状ウイルス（「ＳＦＶ」）、ウシ泡沫状ウイルス（「ＢＦＶ」）などの泡沫状ウイルスが含まれる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本明細書中で感染性病原体に関して使用される場合、「治療」、「治療する」、及び「治療すること」とは、病原体による感染に対する対象の抵抗性を増加させるか、又は対象が病原体に感染する可能性を減少させる予防的処置；及び／又は対象が感染と戦うために、例えば、感染を減少又は排除するか、又は感染の悪化を防止するために、対象が感染した後の処置を指す。
【００５５】
微生物抗原は、当該技術分野で周知の方法によって調製することができる。例えば、これらの抗原は、粗抽出物を調製することによって、抗原を部分的に精製することによって、又は組換え技術によって、又は既知の抗原のデノボ合成によって、ウイルス及び細菌細胞から直接調製することができる。抗原はまた、対象における発現及び免疫化対象の免疫系への提示に適した形態の抗原ペプチドをコードする核酸の形態であり得る。さらに、抗原は完全な抗原であってもよく、又はそれは少なくとも１つのエピトープを含む完全な抗原の断片であってもよい。
【００５６】
抗原のカチオン性脂質小胞への取り込みを改善し、また免疫系の細胞への送達を改善するために、抗原を修飾して、その疎水性又は抗原上の負電荷を増加させることができる。抗原の疎水性は、例えば、分子の抗原特性を維持しつつ、カチオン性脂質の疎水性アシル鎖における抗原の溶解性を改善するために、脂質鎖又は疎水性アミノ酸に結合させることによって増大させることができる。修飾された抗原は、リポタンパク質、リポペプチド、増大した疎水性を有するアミノ酸配列で修飾されたタンパク質又はペプチド、及びそれらの組み合わせであり得る。修飾された抗原は、脂質と抗原との間でコンジュゲートされたリンカーを有することができ、例えば、Ｎ末端α又はε−パルミトイルリジンは、ジペプチドセリン−セリンリンリンカーを介して抗原に連結され得る。さらに、抗原がカチオン性脂質複合体中にカプセル化される処方緩衝液を変化させることによって、又はアニオン性部分、例えばアニオン性アミノ酸を抗原に共有結合させることによって、その負電荷を増加させるように抗原を操作することができる。
【００５７】
本明細書に記載されるいくつかの態様において、カチオン性脂質は、ナノ粒子集合体の形態であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「ナノ粒子」とは、ナノメートルスケールで測定されたサイズを有する粒子を指す。本明細書中で使用される「ナノ粒子」とは、約１０，０００ナノメートル未満のサイズを有する構造を有する粒子を指す。いくつかの態様において、ナノ粒子は、リポソームである。
【００５８】
本発明のカチオン性脂質組成物は、必要に応じて抗原と混合されるリポソームを形成することができ、カイラルカチオン性脂質単独又はカイラルカチオン性脂質を中性脂質と組み合わせて含有することができる。適切なキラルカチオン性脂質種としては、Ｒ及びＳ鏡像異性体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「カチオン性脂質」は、生理的ｐＨで正味の正電荷を有するか、又はプロトン化可能な基を有し、ｐＫａより低いｐＨで正電荷を有する多数の脂質種のいずれかを指す。本開示による適切なカチオン性脂質は、以下を含み得るが、これらに限定されない：３-β［4Ｎ-（1Ｎ，8Ｎ-ジグアニジノスペルミジン）-カルバモイル］コレステロール（ＢＧＳＣ）；３−β［Ｎ，Ｎ−ジグアニジノエチル−アミノエタン）−カルバモイル］コレステロール；ＢＧＴＣ）；Ｎ，Ｎ1Ｎ2Ｎ3テトラメチルテトラパルミチルスペルミン（セルフェクチン）；Ｎ−ｔ−ブチル−Ｎ’−テトラデシル−３−テトラデシル−アミノプロピオン−アミジン（ＣＬＯＮｆｅｃｔｉｎ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−ｐ−ロパナミニウムトリフルオロアセテート）（ＤＯＳＰＡ）；１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；４−（２，３−ビス−パルミトイルオキシ−プロピル）−１−メチル−１Ｈ−イミダゾール（ＤＰＩＭ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−ブタン−ヨウ化ジアンモニウム）（Ｔｆｘ−５０）；Ｎ−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）または他のＮ−（Ｎ，Ｎ−１−ジアルコキシ）−アルキル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ置換アンモニウム界面活性剤；１，２ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノール−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＢＴ）またはコレステリル（４’トリメチルアンモニア）ブタノエート（ＣｈＯＴＢ）（ここで、トリメチルアンモニウム基は、ブタノールスペーサーアームを介して二重鎖（ＤＯＴＢの場合）またはコレステリル基（ＣｈＯＴＢの場合）に連結される）；ＤＯＲＩ（ＤＬ−１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム）またはＤＯＲＩＥ（ＤＬ−１，２−Ｏ−ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム−ｍ）（ＤＯＲＩＥ）またはＷＯ９３／０３７０９に開示されているその類似体；１，２−ジオレオイル−３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ）；コレステリルヘミコハク酸エステル（ＣｈＯＳＣ）；リポポリアミン、例えば、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、コレステリル−３β−カルボキシル−アミドエチレントリメチルアンモニウムヨウ化物、１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ−ＤＬ−２−プロピル−コレステリルカルボキシレートヨウ化物、コレステリル−３−Ｏ−カルボキシアミドエチレンアミン、コレステリル−３−β−オキシスクシンアミド−エチレントリメチルアンモニウムヨウ化物、１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ��ＤＬ−２−プロピル−コレステリル−３−β−オキシス−シン酸ヨウ化物、２−（２−トリメチルアンモニオ）−エチルメチルアミノエチル−コレステリル−３−β−オキシコハク酸ヨウ化物、３−β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイルコレステロール（ＤＣ−コール）、および３−β−Ｎ−（ポリエチレンイミン）−カルバモイルコレステロール；Ｏ，Ｏ’−ジミリスチル−Ｎ−リシルアスパラギン酸（ＤＭＫＥ）；Ｏ，Ｏ’−ジミリスチル−Ｎ−リシル−グルタミン酸（ＤＭＫＤ）；１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＬＥＰＣ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＰＥＰＣ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＳＥＰＣ）；１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；ジオレオイルジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２−パルミトイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）；１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）；およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）。さらに、記載されたいずれかのカチオン性脂質の構造変種及び誘導体も意図される。
【００６０】
いくつかの態様において、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＥＰＣ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。他の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰである。さらに他の態様において、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡである。他の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＥＰＣである。いくつかの態様において、カチオン性脂質は精製される。
【００６１】
いくつかの態様において、カチオン性脂質は、カチオン性脂質の鏡像異性体である。用語「鏡像異性体」とは、カチオン性脂質の立体異性体であって、その対応する立体異性体、例えばＲ及びＳ鏡像異性体の重ね合わせることができない鏡像であるものを指す。種々の例において、鏡像異性体はＲ−ＤＯＴＡＰ又はＳ−ＤＯＴＡＰである。一つの例では、鏡像異性体はＲ−ＤＯＴＡＰである。別の例では、鏡像異性体はＳ−ＤＯＴＡＰである。いくつかの態様において、鏡像異性体は精製される。種々の例において、鏡像異性体は、Ｒ−ＤＯＴＭＡ又はＳ−ＤＯＴＭＡである。一例では、鏡像異性体はＲ−ＤＯＴＭＡである。別の例では、鏡像異性体はＳ−ＤＯＴＭＡである。いくつかの態様において、鏡像異性体は精製される。種々の例において、鏡像異性体は、Ｒ−ＤＯＥＰＣ又はＳ−ＤＯＥＰＣである。一例では、鏡像異性体はＲ−ＤＯＥＰＣである。別の例では、鏡像異性体はＳ−ＤＯＥＰＣである。いくつかの態様において、鏡像異性体は精製される。
【００６２】
例示の目的のために、十分に研究され、ＣＤ８＋Ｔ細胞への抗原交差提示に対するＩ型インターフェロンアップレギュレーションの効果を例示するのに適した抗原として役立つモデルＨＰＶ抗原を利用して、いくつかの例が実施されることに留意されたい。
【００６３】
一般に、治療を参照する場合、本明細書に記載される組成物は、経口的、非経口的（例えば、静脈内又は皮下投与）、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮的、体外的、腔内投与、経皮的、又は局所的、もしくは吸入剤による投与を含む、局所的、非経口的（例えば、静脈内又は皮下投与）に投与することができる。局所投与は、眼科的、膣内、直腸内、又は鼻腔内に行うことができる。本明細書において、「局所的鼻腔内投与」とは、鼻孔の一方又は両方を通って鼻及び鼻腔への組成物の送達を意味し、噴霧機構又は液滴機構による送達、又は核酸又はベクターのエアロゾル化を通じた送達を含み得る。吸入剤による組成物の投与は、スプレー又は液滴機構による送達を介して鼻又は口から行うことができる。送達はまた、挿管を介して、呼吸器系の任意の領域（例えば、肺）に直接送達することもできる。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、組成物の「非経口投与」は、一般に、注射によって特徴付けられる。注射剤は、液体溶液又は懸濁液として、注射前の液体中の懸濁液の溶液に適した固体形態として、又はエマルジョンとして、慣用の形態で調製することができる。非経口投与には、一定の投与量が維持されるように、徐放性、時間放出又は徐放性システムの使用が含まれる。
【００６５】
用語「治療的に有効な」は、使用される組成物の量が、異常な細胞増殖、腫瘍発生、及び癌などの疾患又は障害の１以上の原因又は症状を改善するのに十分な量であることを意味する。このような改善は、必ずしも除去ではなく、減少又は改変のみを必要とする。このような改善は、免疫応答の誘発を含み得る。開示された組成物を投与するための有効な投与量及びスケジュールは経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の範囲内である。組成物の投与のための投与量範囲は、障害の症状が影響を受ける所望の効果を生じるのに十分な大きさである。望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応等の副作用を起こすほどの投与量であってはならない。一般に、投与量は、患者における疾患の年齢、状態、性別及び程度、投与経路、又は他の薬物がレジメンに含まれているかどうかに応じて変化し、当業者によって決定することができる。いずれかのカウンターインディケーションの場合、用量は、個々の医師によって調節することができる。投与量は様々であり、１日１回又は複数回の投与で、１日又は数日間投与することができる。ガイダンスは、あるクラスの医薬品の適切な投与量についての文献に記載されている。
【００６６】
任意の特定の対象又は患者に投与される組成物の具体的な有効量は、治療される疾患又は障害、及び障害の重症度；使用される特定の組成物の同一性及び活性；患者の年齢、体重、一般健康、性別及び食事；投与時間；投与経路；使用される特定の組成物の排泄速度；使用される治療の期間；使用される特定の組成物と組み合わせて使用されるか又は同時に使用される薬物、及び医学分野で周知の類似の因子を含む種々の要因に依存する。
【００６７】
例えば、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで組成物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、当業者の範囲内である。また、虚血−再潅流損傷、外傷、薬物／毒物誘発損傷、神経変性疾患、癌、又は他の疾患及び／又は状態の治療のために注意を必要とする対象の状態を評価するのに有用であることが知られている、病歴、徴候、症状、及び客観的臨床検査の特定の側面を評価することができる。これらの徴候、症状、及び客観的臨床検査は、治療又は予防される特定の疾患又は状態に応じて、このような患者を治療する臨床医又はこの分野で実験を実施する研究者に知られているように、変化する。例えば、適切な対照群との比較及び／又は一般集団もしくは特定の対象もしくは患者における疾患の正常な進行に関する知識に基づいて、（１）対象の身体的状態が改善されたことが示され（例えば、腫瘍が部分的又は完全に退縮した）、（２）疾患又は状態の進行が安定したこと、遅延したこと、又は逆転したことが示され、又は（３）疾患又は状態を治療するための他の薬剤の必要性が低下したか又は除去された場合、特定の治療レジメンは有効であるとみなされる。
【００６８】
処方された治療薬の有効量は、毎日、隔日、毎週、毎週、毎月、隔月、毎年、又は有効であると医師又は提供者が決定する他の間隔で投与され得る。例えば、有効な１日投与量は、投与目的のために複数回投与に分割することができる。結論として、単回投与治療薬は、そのような量又はそのサブマルチプルを含み、１日投与量を構成することができる。開示された治療薬は、抗腫瘍又は抗癌治療の組み合わせの一部として投与することもできる。一態様では、開示された組成物は、抗腫瘍又は抗癌治療による治療の前に、対象又は患者に投与することができる。ある態様において、開示された組成物は、抗腫瘍又は抗癌治療と同時に投与することができる。ある態様において、開示された組成物は、抗腫瘍又は抗癌治療の後に投与することができる。一態様では、患者又は対象は、交互又は回転スケジュールで両方の治療を受ける。一態様では、対象又は患者は、開示された組成物による特異な治療を受ける。一態様では、対象又は患者は、開示された組成物による少なくとも１つの治療を受ける。一態様では、対象又は患者は、開示された組成物及び少なくとも１つの他の抗腫瘍又は抗癌治療による少なくとも１つの治療を受ける。
【００６９】
用量は、いずれかのカウンターインディケーションの場合に、個々の医師又は対象によって調節することができる。投与量は様々であり、１日１回又は複数回の投与で、１日又は数日間投与することができる。ガイダンスは、あるクラスの医薬品の適切な投与量についての文献に記載されている。
【００７０】
本明細書で使用される用語は、特定の態様のみを記載する目的であり、限定することを意図しない。
【００７１】
明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、文脈が明確に別段の指示をしない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の基準を含むことができる。したがって、例えば、「化合物」への言及は化合物の混合物を含み、「薬学的担体」への言及は、２つ以上のそのような担体の混合物などを含む。
【００７２】
範囲は、本明細書では、１つの特定の値「約」から、及び／又は別の特定の値「約」まで表現することができる。用語「約」は、本明細書において、ほぼ、その領域内、ほぼ、又はその周囲を意味するために使用される。用語「約」が数値範囲と共に使用される場合、それは、記載される数値の上下に境界を拡張することによって、その範囲を修飾する。一般に、用語「約」は、本明細書では、２０％の分散で、上下の数値を修飾するために使用される。そのような範囲が表現される場合、態様は、１つの特定の値及び／又は他の特定の値を含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行する「約」を使用することによって、特定の値が態様を形成することが理解される。さらに、各範囲のエンドポイントは、他のエンドポイントとの関係において、及び他のエンドポイントとは独立して、有意であることが理解される。
【００７３】
本明細書で使用される「又は」という用語は、特定のリストのいずれか１つのメンバーを意味し、また、そのリストのメンバーのいずれかの組合せを含む。
【００７４】
「阻害する」、「阻害すること」、及び「阻害」とは、活性、反応、状態、疾患、又は他の生物学的パラメータを減少又は減少させることを意味する。これには、限定されるものではないが、活性、反応、状態、又は疾患の完全なアブレーションが含まれ得る。これはまた、例えば、天然又は対照レベルと比較して、活性、反応、状態、又は疾患における１０％の阻害又は減少を含み得る。したがって、一態様では、阻害又は還元は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％であってもよく、又は天然レベル又は対照レベルと比較して、任意の量の還元であってもよい。ある態様において、阻害又は還元は、天然又は対照レベルと比較して、１０−２０、２０−３０、３０−４０、４０−５０、５０−６０、６０−７０、７０−８０、８０−９０、又は９０−１００％である。一態様では、阻害又は還元は、天然又は対照レベルと比較して、０−２５、２５−５０、５０−７５、又は７５−１００％である。
【００７５】
「修飾する」、「修飾すること」及び「修飾」とは、本明細書中で使用される場合、活性又は機能又は数の変化を意味する。変化は、活性、機能又は数の増加又は減少、増強又は阻害であり得る。
【００７６】
「促進する」、「促進」、及び「促進すること」とは、活性、反応、状態、疾患、又は他の生物学的パラメータの増加を指す。これには、活動、反応、状態又は疾患の開始が含まれるが、これらに限定されない。これはまた、例えば、天然又は対照レベルと比較して、活性、反応、状態又は疾患の１０％の増加を含み得る。したがって、ある態様において、増加又は促進は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％以上、又は、天然レベル又は対照レベルと比較して、いずれかの量のプロモーションであり得る。ある態様において、増加又は促進は、天然又は対照レベルと比較して、１０−２０、２０−３０、３０−４０、４０−５０、５０−６０、６０−７０、７０−８０、８０−９０、又は９０−１００％である。ある態様では、増加又は促進は、０−２５、２５−５０、５０−７５、又は７５−１００％以上であり、例えば、ネイティブレベル又は対照レベルと比較して、２００、３００、５００、又は１０００％以上である。ある態様では、増加又は促進は、天然レベル又は対照レベルと比較して、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００％又はそれ以上のような天然レベル又は対照レベルと比較して１００％を超えることができる。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、用語「決定する」は、量、量、又は活性の変化を測定又は確認することを指すことができる。例えば、本明細書中で使用される試料中の開示されたポリペプチドの量を決定することは、当業者が試料中のポリペプチドのある定量可能な値を測定又は確認するために取る工程を指すことができる。当業者は、開示されたポリペプチド及び試料中に開示されたヌクレオチドの量を測定する方法に精通している。
【００７８】
用語「試料」は、対象由来の組織又は臓器；細胞（対象内で、対象から直接的に採取された、又は培養中又は培養細胞株から維持された細胞）；細胞溶解物（又は溶解物画分）又は細胞抽出物；又は細胞又は細胞材料（例えば、ポリペプチド又は核酸）由来の１つ以上の分子を含有する溶液を指すことができる。試料はまた、細胞又は細胞成分を含有する任意の体液又は排泄物（例えば、血液、尿、糞便、唾液、涙、胆汁）であり得る。
【００７９】
以下の実施例を参照して本発明をさらに説明するが、本発明はこのような実施例に限定されるものではないことを理解されたい。むしろ、本発明を実施するための現在の最良のモードを説明する本開示に照らして、多くの変更及び変形が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者に提示される。特許請求の範囲の同等性の意味及び範囲内に入る全ての変更、修正及びバリエーションは、それらの範囲内であるとみなされるべきである。
【００８０】
本発明は、例示的な方法で説明されてきた。使用されてきた用語は、限定ではなく、説明の単語の性質を有するものであることが意図されていることが理解されるべきである。
【００８１】
本発明の多くの変更及び変形は、上記教示に照らして可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本発明は、具体的に記載された以外の方法で実施することができる。
【実施例】
【００８２】
以下に説明する実施例について、以下の材料、方法及びプロトコールを使用した。
【００８３】
材料及び方法
動物：６〜１２週齢Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（Ｂ６マウス）、Ｂ６。ヒトＨＬＡ−Ａ２遺伝子（ＡＡＤマウス）を発現するＣｇ−Ｔｇ（ＨＬＡ−Ａ／Ｈ２−Ｄ）２Ｅｎｇｅ／Ｊトランスジェニックブリーダーマウス、及びＪａｃｋｓｏｎ研究所（Ｂａｒ港、ＭＥ）から得たＩＦＮＡＲ−／−（Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉｆｎａｒ１ｔｍ１Ａｇｔ／Ｍｍｊａｘ）遺伝子ノックアウトブリーダーマウスを、特異的病原体フリー条件下で飼育した。ＤＬＡＲにより承認されたＩＡＣＵＣプロトコールに従って、動物の飼育、繁殖及び実験手順を実施した。
【００８４】
ペプチド及び試薬：ペプチド及び試薬：ｃＧＭＰグレードのＲ−ＤＯＴＡＰ及びＳ−ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）は、スイス、ＳｈａｆｆｈａｕｓｅｎのＭｅｒｃｋ＆Ｃｉｅにより提供された。ｃＧＭＰグレードのＲ−ＤＯＴＡＰリポソームナノ粒子を、標準的なリポソーム製造プロセスによって製造した。ペプチド抗原（ＫＦ１８：ＫＳＳＧＰＤＡＥＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号３）、ＳＦ９：ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）、ＲＦ９：ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号２）を合成し、米国ニュージャージー州ピスカタウェイのＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより＞９５％純度まで精製した。他のすべてのカチオン性脂質はＡｖａｎｔｉ  ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬから購入した。
【００８５】
細胞株および骨髄由来樹状細胞培養：初代骨髄由来樹状細胞を、組換えマウスＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４（従来のＢＭＤＣ（ｃＤＣ））又は組換えｆｌｔ３リガンド（形質細胞様ＢＭＤＣ（ｐＤＣ））を補充した完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、５０μＭ  β−メルカプトエタノール、１００ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｕ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地）中で８日間造血骨髄細胞を培養することにより得た。カチオン性脂質誘導Ｉ型ＩＦＮの検出に使用するＢ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ−α／β細胞を、米国カリフォルニア州サンディエゴのＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入し、細胞培養物を製造業者のプロトコールに従って維持した。
【００８６】
ＩＦＮレポーター細胞アッセイ及び細胞表現型分析：ＩＦＮを検出するために、Ｉ型ＩＦＮ産生細胞からの上清を、９６ウェルプレート中のＢ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ−α／β細胞に添加した。２４時間のインキュベーション後、上清を、製造業者の指示に従って、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、米国）を用いてＳＥＡＰ活性についてアッセイした。簡単に説明すると、ＳＥＡＰを含有する細胞上清５０μｌを１５０μｌのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）試薬と混合し、３７℃で３〜４時間インキュベートし、分光計を用いて６５０ｎｍで吸光度を測定した。試験試料中のＩ型ＩＦＮ濃度は、同じアッセイにおいて、組換えＩ型ＩＦＮβ処理Ｂ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ−α／β細胞から生成した標準曲線を用いて定量した。ＣＤ６９の発現を測定するために、リンパ節の単一細胞懸濁液を蛍光色素結合ＣＤ３で染色し、各流入リンパ節のＣＤ６９及びパーセントＣＤ６９＋ＣＤ３＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーを用いて測定した。
【００８７】
ＲＮＡ単離、ナノストリング分析及び遺伝子発現分析：遺伝子発現分析のために、流出膝窩リンパ節（ｎ＝４）を３７℃で６０分間細胞解離カクテルを用いて酵素的に消化し、単一細胞懸濁液を用いてソニーＳＹ３２００細胞ソーターを用いてＣＤ１１ｃ＋細胞を選別した。選別精製ＣＤ１１ｃ＋細胞（２５Ｋ細胞）をＱｉａｇｅｎのＲＬＴ細胞溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）中で溶解し、全ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ全ＲＮＡ分離キット（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて単離した。得られた全ＲＮＡは、ケンタッキー大学ゲノミクスコア研究所（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）に送られ、そこで、免疫応答に関与する５４７以上の遺伝子を測定することができる、ｎｃｏｕｎｔｅｒＴＭマウス炎症パネル（Ｎａｎｏ  Ｓｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）と全ＲＮＡを混合した。ｍＲＮＡの結合をＮａｎｓｏ  Ｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システムで検出し、生計数データを正規化し、英国ゲノミクスコアラボラトリーによるＳＡＳプログラムを用いて統計的に分析した。ＲＴ−ＰＣＲを用いた確認試験のために、リンパ節をＲＬＴ細胞溶解緩衝液中で直接溶解し、全分離ＲＮＡをＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。次いで、ｃＤＮＡをＴａｑＭａｎ遺伝子発現システム（米国アプライドバイオシステムズ）を用いて増幅し、定量的ＰＣＲ反応を用いて、ＧＡＰＤＨ発現に対するマウスＩＦＮα及びＩＦＮβ転写物を検出し定量した。
【００８８】
ワクチン接種及び抗原特異的Ｔ細胞応答の評価：マウスをイソフルランを用いて麻酔し、ワクチン接種前に注射部位を剃毛し、７０％エタノールで洗浄した。ＥＬＩＳＰＯＴを用いて抗原特異的Ｔ細胞応答を評価するために、マウスに、カチオン性脂質及び抗原性ペプチドを含むワクチン製剤を７日間隔で２回（１００μｌ／用量）、又は０日目に送達された完全フロイントアジュバント及び抗原性ペプチドの等量を乳化することによって調製されたＣＦＡ製剤を１回、ワクチン接種した。最初のワクチン接種から１４日後に抗原特異的反応を評価した。抗原特異的応答を測定するために、安楽死させたマウス由来の脾臓細胞を用いて、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（マブテック社、米国オハイオ州シンシナティ）を用いて抗原特異的Ｔ細胞応答を検出した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために、２．５×１０5の処理された脾臓細胞を、マウスＩＦＮ−γ捕獲抗体で予めコーティングされた９６ウェルプレートにおいて、関心対象のＣＤ８  Ｔ細胞エピトープで３７℃にて１８〜２４時間刺激した。刺激後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、ビオチン結合ａｎｔｉ−ＩＦＮγ抗体、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ抗体とインキュベートした。抗原特異的ＩＦＮ−γ産生細胞を可視化するために、ウェルをＴＭＢ基質と共に６分間インキュベートし、水で洗浄し、風乾した。スポットをスキャンし、ＣＴＬ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ及びＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ｖｅｒ．４ソフトウェア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）を用いて計数した。  スポット数は、３回のサンプルからの中央値として要約した。各試料は、バックグラウンド及び陽性対照を検出するために、非刺激及びＰＭＡ／イオノマイシン対照ウェルを有した。スポット数が５スポットを超え、抗原特異的反応が陽性の場合、スポット数が対照の３倍を超える場合、ウェルは陽性とみなした。
【００８９】
実施例１
Ｒ−ＤＯＴＡＰは流入領域リンパ節におけるＩ型インターフェロン遺伝子発現を誘導する
カチオン性ナノ粒子誘導遺伝子発現を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに頸部後方の皮下に１００μｌの１２ｍＭ  Ｒ−ＤＯＴＡＰナノ粒子を注射し、流入リンパ節における炎症性遺伝子発現をワクチン接種後４又は２４時間で分析した。ＰＢＳ及びＬＰＳ（５０μｇ／マウス）を注射したマウス（２４時間時点）を、それぞれ陰性及び陽性対照として用いた。注射の４時間後又は２４時間後に、各マウスからの腋窩リンパ節及び上腕リンパ節をプールし、コラゲナーゼ消化により処理した。リンパ節細胞懸濁液中の活性化樹状細胞（ＣＤ１１ｃ+）細胞を選別精製し、ＲＬＴ緩衝液中で溶解し、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）マウス炎症キット及びナノストリング技術を用いて相対遺伝子発現解析のために処理した。Ｒ−ＤＯＴＡＰ注射は、両方の時点でいくつかの炎症性遺伝子の発現を有意に変化させることが分かった。ＩＦＮ−１α及びＩＦＮ−１βを含むいくつかの遺伝子は、陽性対照として使用したＬＰＳよりも５倍以上高い増加を示した。Ｃｘｃｌ１０を含む他の遺伝子の発現も有意に増加し、ＬＰＳによって誘導されるレベルと同程度であった（図１）。
【００９０】
実施例２
Ｒ−ＤＯＴＡＰとＳ−ＤＯＴＡＰはいずれも流入領域リンパ節におけるインターフェロンαとインターフェロンβ遺伝子発現を誘導する
【００９１】
Ｒ−及びＳ−ＤＯＴＡＰの両方によるＩ型インターフェロン遺伝子発現を比較するために、実施例１に概説した同様の研究を実施した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、足パッドに５０μｌの６ｍＭ  ＲＤＯＴＡＰナノ粒子を皮下注射した。ＰＢＳ及びＬＰＳ（５０μｇ／マウス）を注射したマウス（２４時間時点）を、それぞれ陰性及び陽性対照として用いた。注射後３時間又は２４時間、各マウスからの膝窩リンパ節をプールし、ＲＬＴ緩衝液中で溶解し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ及びＲＴ−ＰＣＲを用いて相対遺伝子発現分析のために処理した。これらの研究から、Ｒ−及びＳ−ＤＯＴＡＰはいずれもＩ型インターフェロンの強力な誘導因子であることが確認されている（図２）。
【００９２】
実施例３
Ｒ−ＤＯＴＡＰ及びＳ−ＤＯＴＡＰはＴ細胞におけるＩ型インターフェロン関連ＣＤ６９発現をアップレギュレートする
Ｉ型インターフェロンを活性化するカチオン性脂質の効果及び能力をさらに理解するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス又はＩＦＮＡＲ−／−マウスに、足パッドに５０μｌの６ｍＭ  Ｒ−ＤＯＴＡＰナノ粒子又は６ｍＭ  Ｓ−ＤＯＴＡＰ又は２８０ｍＭスクロースを皮下注射した。注射２４時間後、各マウスから膝窩リンパ節流出リンパ節を単離し、リンパ節の単細胞懸濁液を蛍光色素結合ＣＤ３及びＣＤ６９で染色した。Ｒ−ＤＯＴＡＰ単独（抗原なし）はＤＬＮサイズの目に見える増加をもたらし、これは７日間にわたる総細胞数の着実な増加によるものであった（図３Ａ）。百日咳毒素を用いたＤＬＮへのＴ細胞流入の研究は、Ｒ−ＤＯＴＡＰに構造的に関連する脂質がリンパ節ホーミングケモカインを誘導することを示唆しており、おそらくＩ型ＩＦＮシグナル伝達の直接的な結果であると思われる。この総細胞数の増加は、ＩＦＮαＲノックアウトマウスで大幅に減少したことから、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達に依存していることが確認された（図３Ｂ）。Ｉ型ＩＦＮは、ＣＤ６９のアップレギュレーションを介してリンパ器官からのリンパ球排出を阻害することが知られており、ＣＤ６９は、次に、リンパ球排出に必要なスフィンゴシン１リン酸受容体を阻害する。従って、Ｓ−ＤＯＴＡＰとＲ−ＤＯＴＡＰの両方の注射はＤＬＮにおけるＣＤ６９のアップレギュレーションをもたらすと仮定した。実際、野生型マウスに両カチオン性脂質を皮下注射すると、Ｔ細胞で最も強くＣＤ６９のアップレギュレーションが生じた。対照的に、ＩＦＮαＲノックアウトマウスのＲ−ＤＯＴＡＰ注射後にはＣＤ６９のアップレギュレーションは認められず、Ｒ−ＤＯＴＡＰが誘導するＣＤ６９のアップレギュレーションがＩ型ＩＦＮ依存性であることが示された（図３Ｃ）。データは、各所属リンパ節におけるＣＤ６９＋ＣＤ３＋Ｔ細胞％を表す。
【００９３】
実施例４
種々のカチオン性脂質はＩ型インターフェロンをアップレギュレートする
種々のカチオン性脂質がＩ型インターフェロンを誘導する可能性を評価するために、インビトロで研究を行った。本研究では、カチオン性脂質ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ及びＤＯＴＭＡを研究した。中性脂質ＤＯＰＣも評価し、カチオン性脂質に対するインターフェロンアップレギュレーションの特異性を確認した。ある研究では、ＩＦＮＡＲ−Ｋｏマウス由来の骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、示された（６〜４００μＭ）濃度のカチオン性脂質又はＬＰＳ陽性対照（１〜５００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した（図４Ａ）。第２の研究では、ＦＬＴ３誘導ＢＭＤＣ（ｐＤＣ）及びＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４誘導ＢＭＤＣ（ｃＢＭＤＣ）を、Ｒ−ＤＯＴＡＰ又はＬＰＳ陽性対照（１〜５００ｎｇ／ｍｌ）の所定濃度（６〜４００μＭ）で２４時間刺激した（図４Ｂ）。Ｉ型インターフェロン産生を測定するために、細胞上清（１００μｌ）をレポーター細胞（米国インビボゲンのＢ１６．Ｂｌｕｅ−ＩＦＮα／β細胞）に添加し、１８時間インキュベートして、レポーター細胞によるＩ型インターフェロン誘導性の分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）産生を刺激した。レポーター細胞上清中のＳＥＡＰ活性を、製造プロトコールに従って比色ＳＥＡＰアッセイキットを用いて定量した。ＢＭＤＣ分泌Ｉ型インターフェロンを、レポーター細胞株において組換えマウスＩＦＮ−β刺激ＳＥＡＰ活性を用いて標準曲線を用いて定量した。これらの研究は、Ｉ型インターフェロンをアップレギュレートする能力がＤＯＴＡＰに特異的ではなく、複数のカチオン性脂質によって活性化され得ることを確認している。また、中性脂質がＩ型インターフェロン経路を活性化できないことも確認されている。
【００９４】
実施例５
カチオン性脂質を介したＣＤ８＋Ｔ細胞応答の低下がＩ型ＩＦＮ欠損マウスにおいて観察される
カチオン性脂質によるＩ型ＩＦＮ遺伝子のアップレギュレーションが実証されたことは、カチオン性脂質がＩ型ＩＦＮ経路を標的とし、強固なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することを示唆している。この仮説をさらに確認するために、ニワトリ卵白アルブミン又はＨＰＶ１６−Ｅ７蛋白由来ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ（ＲＦ９：ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号２））の十分に特徴付けられたマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１））を含むＲ−ＤＯＴＡＰ製剤を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＩ型インターフェロンシグナル欠損ＩＦＮＡＲ-/-マウスに、０日目及び７日目に投与した。マウスにも完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）＋ＳＩＩＮＦＥＫＬを接種した。陽性対照としてペプチドのみのワクチンを用いた。１４日目に、Ｒ−ＤＯＴＡＰ又はＣＦＡによって誘導された抗原特異的（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて評価した。図５Ａに示されるように、ＤＯＴＡＰ製剤で野生型マウスにワクチン接種すると、ＣＦＡアジュバント製剤よりも大きさが高い強力な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が誘導された。対照的に、Ｒ−ＤＯＴＡＰによって誘導されるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答は、ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおいて劇的に減少するが、ＣＦＡ−アジュバント製剤ではそのような差は認められない。ＨＰＶ１６陽性腫瘍で発現した腫瘍関連抗原でも同様の結果が認められた（図５Ｂ）。ＣＦＡアジュバントは、複数のＴＬＲ経路を標的とし、したがって、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するためのＩ型ＩＦＮシグナル伝達の必要性を回避することができることは十分に立証されている。
【００９５】
Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を欠損したマウスにおけるカチオン性脂質誘導効果の喪失は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子を強力に活性化する能力と相まって、Ｒ−ＤＯＴＡＰが抗原交差提示を効果的に促進し、同時にＩ型ＩＦＮ経路を活性化して強固な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を駆動することを強く示している（図５）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2021505606.tif 000009
【図５Ａ】
2021505606.tif 000010
【図５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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