(57)【要約】本発明は、特に、インビボでペイロードを効率よく送達するための核酸含有ナノ粒子を製剤化する方法および組成物であって、ｍＲＮＡワクチンを生成するために使用され得るような方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボで免疫応答を誘導するための方法であって、
脂質ナノ粒子に封入された、抗原をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む組成物を、抗原特異的Ｔ細胞応答および／または抗原特異的抗体応答を誘導するのに十分な投薬レジメンで、それを必要とする対象に投与すること、を含む方法。
【請求項２】
前記組成物が皮下投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が皮内投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が筋肉内投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が静脈内投与されない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物がワクチン組成物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
インビボでワクチンを送達する方法であって、
脂質ナノ粒子に封入された、抗原をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むワクチン組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ワクチン組成物が筋肉内または皮下投与される、方法。
【請求項８】
前記ワクチン組成物が、抗原特異的Ｔ細胞応答、および／または抗原特異的抗体応答を誘導するのに十分な投薬レジメンで投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原がタンパク質である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗原がペプチドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が一つ以上のポリペプチドをコードする一つ以上のｍＲＮＡを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記投薬レジメンが単一用量を注射することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記投薬レジメンが複数用量を定期的に注射することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記単一用量または前記複数用量が、０．１μｇ〜１００ｍｇの範囲のｍＲＮＡである、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記単一用量または前記複数用量が、０．１μｇ〜５０ｍｇ、０．１μｇ〜２５ｍｇ、０．１μｇ〜１０ｍｇ、１μｇ〜１ｍｇ、または１μｇ〜１００μｇの範囲のｍＲＮＡである、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記単一用量または前記複数用量が、０．１μｇ、０．３μｇ、０．５μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、または１００μｇから選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記単一用量または前記複数用量が、０．０１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（ｍＲＮＡ／体重）の範囲である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記単一用量または前記複数用量が、０．０１μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、０．０１μｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、０．０１μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、または０．１μｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ（ｍＲＮＡ／体重）の範囲である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数用量の各々が同じ投薬量のｍＲＮＡを含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記複数用量の各々が異なる投薬量のｍＲＮＡを含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記複数用量の各々が１〜３週間の間隔を空けて注射される、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数用量の各々が毎週注射される、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数用量の少なくとも二つが、３週間以内に注射される、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数用量が、０週目に用量１、３週目に用量２、および５週目に用量３のスケジュールで注射される、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｍＲＮＡが一つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｍＲＮＡが、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および／または３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記脂質ナノ粒子が、一種以上のカチオン性脂質、一種以上のヘルパー脂質、および一種以上のＰＥＧ脂質を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記脂質ナノ粒子が、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＯＦ−０２、Ｃ１２−２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ＩＣＥ（イミダゾールベース）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、３−（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）−６−（４−（（２−ヒドロキシドデシル）（２−ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（ターゲット２３）、３−（５−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン−２−イル）−６−（５−（（２−ヒドロキシドデシル）（２−ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン−２−イル）−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（ターゲット２４）、およびその組み合わせからなる群から選択される、少なくとも一種のカチオン性脂質を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも一種のカチオン性脂質が、ＣＣＢｅｎｅ、ＩＣＥ、ＭＬ−２、Ｃ１２−２００、またはＤＬｉｎ−ＳＳ−ＤＭＡから選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも一種のカチオン性脂質がＩＣＥである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも一種のカチオン性脂質がＭＬ−２である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも一種のカチオン性脂質がＣＣＢｅｎｅである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記一種以上のヘルパー脂質が、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン）ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））から選択される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記脂質ナノ粒子が、Ｎ−オクタノイル−スフィンゴシン−ｌ−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８  ＰＥＧ−２０００セラミド）、長さがＣ６〜Ｃ２０のアルキル鎖を有する脂質に共有結合された長さ最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖を有するＰＥＧ修飾脂質、ＰＥＧ化コレステロール、およびＰＥＧ−２Ｋなどの誘導体化されたセラミドから選択される一種以上のＰＥＧ脂質を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＰＥＧ修飾脂質が、リポソーム内の総脂質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物の前記投与が、前記対象のリンパ球において、ｍＲＮＡによってコードされる前記抗原の発現をもたらす、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物の前記投与が抗原特異的抗体応答をもたらす、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗原特異的抗体応答が、血清内の抗原特異的抗体の存在によって測定される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物の前記投与が抗原特異的Ｔ細胞応答をもたらす、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗原特異的Ｔ細胞応答が、脾細胞内のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによって測定される、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月３０日出願の米国仮特許出願第６２／６７８，２２５号の恩典を主張し、当該出願の全体は参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、様々な疾患を治療する、または予防するための最も重要な医薬の一つである。ワクチンは、特定の疾患に対する能動的獲得免疫を誘導する生物学的組成物である。従来、ワクチンは典型的には、疾患を引き起こす微生物と似ており、またしばしば、ウイルスまたは他の病原菌の無力化されたもしくは死滅された形態から、あるいはその表面タンパク質から作成される作用物質を含有する。作用物質は身体の免疫系を刺激して、抗体またはサイトカインを産生させ、将来遭遇するかもしれないその作用物質に関連する任意の微生物を認識し、破壊させる。ワクチンは予防的、または治療的であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、様々な疾患を治療する、および予防するための、より安全で、より有効で、かつ費用対効果が高いワクチンを約束する、メッセンジャーＲＮＡの送達に基づく、改善された、型にはまらないワクチンの形態を提供する。
【０００４】
一態様では、本発明は、抗原をコードするｍＲＮＡを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）組成物を、抗原特異的Ｔ細胞応答、および／または抗原特異的抗体応答を誘導するのに十分な投薬レジメンで、対象に投与することによって、インビボで免疫応答を誘導するための方法を提供する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入される。一部の実施形態では、組成物は、ワクチン組成物である。
【０００５】
一部の実施形態では、組成物は、皮下投与される。一部の実施形態では、組成物は、皮内投与される。一部の実施形態では、組成物は、筋肉内投与される。一部の実施形態では、組成物は、静脈内投与される。一部の実施形態では、組成物は、静脈内投与されない。
【０００６】
別の態様では、本発明は、ＬＮＰに封入された、抗原をコードするｍＲＮＡを含むワクチン組成物を、対象に投与することを含む、インビボでワクチンを送達する方法であって、該ワクチン組成物が筋肉内または皮下に投与される、方法を提供する。様々な実施形態では、ワクチン組成物は、抗原特異的Ｔ細胞応答、および／または抗原特異的抗体応答を誘導するのに十分な投薬レジメンで投与される。
【０００７】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされる抗原は、タンパク質またはペプチドである。
【０００８】
一部の実施形態では、一つ以上のポリペプチドをコードする一種または一種を超えるｍＲＮＡを含む組成物が送達される。
【０００９】
一部の実施形態では、好適な投薬レジメンは単一用量を注射することを含む。一部の実施形態では、好適な投薬レジメンは、複数用量を定期的に投与することを含む。
【００１０】
一部の実施形態では、単一用量または複数用量（個別にまたは集合的に）は、約０．１μｇ〜１００ｍｇ  ｍＲＮＡの範囲である。一部の実施形態では、単一用量または複数用量（個別にまたは集合的に）は、約０．１μｇ〜５０ｍｇ  ｍＲＮＡ、約０．１μｇ〜２５ｍｇ  ｍＲＮＡ、約０．１μｇ〜１０ｍｇ  ｍＲＮＡ、約０．１μｇ〜５ｍｇ  ｍＲＮＡ、約０．１μｇ〜１ｍｇ  ｍＲＮＡ、または約０．１μｇ〜１００μｇ  ｍＲＮＡの範囲である。一部の実施形態では、単一用量は、または複数用量（個別にまたは集合的に）は、０．１μｇ。０．３μｇ、０．５μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、または１００μｇから選択される。
【００１１】
一部の実施形態では、単一用量または複数用量（個別にまたは集合的に）は、約０．０１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（ｍＲＮＡ／体重）の範囲である。一部の実施形態では、単一用量または複数用量（個別にまたは集合的に）は、約０．０１μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、約０．０１μｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、約０．０１μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１μｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ（ｍＲＮＡ／体重）の範囲である。
【００１２】
一部の実施形態では、複数用量は、ｍＲＮＡの同じ個別の投薬量を含む。一部の実施形態では、複数用量は、ｍＲＮＡの異なる個別の投薬量を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、複数用量の各々は、１〜３週間の間隔をあけて注射される。一部の実施形態では、複数用量の各々は、毎週注射される。一部の実施形態では、複数用量のうちの少なくとも二つは、３週間以内に注射される。一部の実施形態では、複数用量は次のようなスケジュールで注射される：０週目に用量１、３週目に用量２、および５週目に用量３。
【００１４】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、または１５ｋｂ以上の長さを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、非修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、一つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、該一つ以上の修飾ヌクレオチドは、シュードウリジン、Ｎ−１−メチル−シュードウリジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、４’チオウリジン、４’−チオシチジン、および／または２−チオシチジンを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および／または３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、ナノ粒子は脂質ベースまたはポリマーベースのナノ粒子である。一部の実施形態では、脂質ベースのナノ粒子はリポソームである。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、一種以上のカチオン性脂質、一種以上のヘルパー脂質、および／または一種以上のＰＥＧ化脂質を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、一種以上のカチオン性脂質、一種以上のヘルパー脂質、および一種以上のＰＥＧ化脂質を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、一種以上のカチオン性脂質、一種以上のヘルパー脂質、一種以上のコレステロール系脂質、および一種以上のＰＥＧ化脂質を含む。本明細書で使用される場合、「ＰＥＧ化脂質」および「ＰＥＧ修飾脂質」という用語は、互換的に使用される。
【００１７】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、一種以上のＰＥＧ化脂質を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、脂質ナノ粒子内の総脂質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、脂質ナノ粒子内の総脂質の少なくとも５％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、脂質ナノ粒子内の総脂質の約５％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、脂質ナノ粒子内の総脂質の１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、または３％以下を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、脂質ナノ粒子内の総脂質の５％以下を構成する。
【００１８】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、一種以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、一種以上のカチオン性脂質は、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＯＦ−０２、Ｃ１２−２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ＩＣＥ（イミダゾールベース）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、３−（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）−６−（４−（（２−ヒドロキシドデシル）（２−ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（ターゲット２３）、３−（５−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン−２−イル）−６−（５−（（２−ヒドロキシドデシル）（２−ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン−２−イル）−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（ターゲット２４）、ならびにその組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも一種のカチオン性脂質は、ＣＣＢｅｎｅ、ＩＣＥ、ＭＬ−２、Ｃ１２−２００、またはＤＬｉｎ−ＳＳ−ＤＭＡから選択される。一部の実施形態では、一種以上のカチオン性脂質は、ＩＣＥを含む。一部の実施形態では、一種以上のカチオン性脂質は、ＭＬ−２を含む。一部の実施形態では、一種以上のカチオン性脂質は、ＣＣＢｅｎｅを含む。
【００１９】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、一種以上のヘルパー脂質を含む。一部の実施形態では、ヘルパー脂質は、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））から選択される。
【００２０】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、一種以上のコレステロール系脂質を含む。一部の実施形態では、コレステロール系脂質は、ＤＣ−Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥから選択される。
【００２１】
一部の実施形態では、組成物の投与は、対象のリンパ節において、ｍＲＮＡによってコードされる抗原の発現をもたらす。一部の実施形態では、組成物の投与は、対象のリンパ球において、ｍＲＮＡによってコードされる抗原の発現をもたらす。
【００２２】
一部の実施形態では、組成物の投与は、抗原特異的抗体応答をもたらす。一部の実施形態では、抗原特異的抗体応答は、血清内の抗原特異的抗体の存在によって測定される。
【００２３】
一部の実施形態では、組成物の投与は、抗原特異的Ｔ細胞応答をもたらす。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞応答は、サイトカイン応答によって測定される。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞応答は、脾細胞内のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによって測定される。
【００２４】
一部の実施形態では、抗原特異的抗体応答、および／または抗原特異的Ｔ細胞応答は、投与後少なくとも２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、または１か月で検出可能である。
【００２５】
本発明の態様は、上述の方法に従って、治療を必要とする対象にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達することを含む、疾患、障害、または状態を治療する方法を提供する。
【００２６】
本出願において、「または」の使用は、他に記載がない限り、「および／または」を意味する。本開示において使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの用語の変化形は、他の添加物、成分、整数、または工程を除外することを意図するものではない。本出願において使用される場合、「約」および「およそ」という用語は同意語として用いられている。両方の用語は、当業者によって理解される任意の通常のゆらぎを網羅することを意味する。
【００２７】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲において明らかになる。しかしながら、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示すが、単に例示のために与えられるものであり、制限するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、当業者には明らかになるであろう。
【００２８】
図面は、例示を目的とするものであり、限定するためのものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１ＡおよびＢは、血清中のヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質を測定することにより示される、インビボでのヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）ｍＲＮＡ送達における、３種の異なる脂質組成物の有効性の比較データを示す。
【００３０】
【図２】図２は、血清中のｈＥＰＯタンパク質を測定することにより示される、インビボでのヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）ｍＲＮＡ送達の、３種の異なる経路の有効性の比較データを示す。
【００３１】
【図３】図３は、ＦＦＬ発現の組織特異的な富化に対する送達経路の比較を示す、異なるマウス組織におけるＦＦＬ発現の画像である。
【００３２】
【図４】図４は、ＦＦＬ発現の組織特異的な富化の異なるカチオン性脂質の比較を示す、異なるマウス組織におけるＦＦＬ発現の画像を示す。
【００３３】
【図５】図５は、リポソーム形成の再混合および従来的方法の比較を示す。再混合組成物は、複数のカチオン性脂質が使用される中で、例示的なｈＥＰＯ発現のより高い発現をもたらす。
【００３４】
【図６】図６は、リンパ節における再混合製剤の富化された発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、明細書全体を通して定められている。
【００３６】
アジュバント：本明細書で使用される場合、用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を非特異的に高める物質またはビヒクルを表す。
【００３７】
動物：本明細書で使用される場合、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階でのヒトを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階での非ヒト動物を意味する。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、ゲッ齒類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、および／または蠕虫類が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組換え動物、および／またはクローンであり得る。
【００３８】
抗原：本明細書で使用される場合、抗原は、免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチドであり、また抗原は、投与されたｍＲＮＡによってコードされる。一般的に、抗原は免疫応答を誘発する異物である。このような状況において、抗原は本質的にタンパク性であってもよいが、また、毒素、低分子、または核酸などの非タンパク質実体の可能性もある。本明細書における論考の目的で、抗原は、投与されたｍＲＮＡによってコードされるタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指し、それは免疫応答が抗原であることを明らかにするか、または明らかにすることが期待される。
【００３９】
およそまたは約：本明細書で使用される場合、対象となる一つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、記述された参照値に類似する値を指す。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に明記しない限り、または文脈からそうでないことが明らかでない限り（そのような数が可能値の１００％を超える場合を除く）、記述された参照値のいずれかの方向（より大きいかまたは小さい）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の値の範囲を指す。
【００４０】
送達：本明細書で使用される際に、用語「送達」は、局所送達および全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、そのコードされたタンパク質が発現され、そしてその標的組織内で保持される状況（「局所分布」または「局所送達」とも称される）、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、そのコードされたタンパク質が発現され、そして患者の循環系（例えば、血清）内に分泌され、そして全身に分布され、他の組織によって取り込まれる状況（「全身分布」または「全身送達」とも称される）を包含する。
【００４１】
封入：本明細書で使用される場合、用語「封入」または文法的等価物は、ナノ粒子内に個々のｍＲＮＡ分子を閉じ込めるプロセスを指す。
【００４２】
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、ｍＲＮＡをポリペプチドへと翻訳すること、複数のポリペプチドをインタクトなタンパク質（例えば、酵素）へと構築すること、および／またはポリペプチドもしくは完全に構築されたタンパク質（例えば、酵素）の翻訳後修飾をすることを指す。この用途において、用語「発現」および「産生」ならびに文法的等価物は互換的に使用される。
【００４３】
半減期：本明細書で使用される場合、用語「半減期」は、核酸またはタンパク質の濃度または活性などの量が、ある期間の開始時に測定された値の半分まで下がるのに要する時間である。
【００４４】
改善する、増加させる、または低減する：本明細書で使用される場合、「改善」、「増加」、もしくは「低減」という用語、または文法的等価物は、本明細書に記載される治療の開始前の同一個体での測定値、または本明細書に記載される治療を受けていない対照対象（または複数の対照対象）での測定値などのベースライン測定値に対する相対的な値を示唆するものである。「対照対象」とは、治療を受けている対象と同じ疾患形態を患っており、治療を受けている対象とほぼ同じ年齢の対象のことである。
【００４５】
インビトロ：本明細書で使用される場合、用語「インビトロ」は、多細胞生物体内ではなく、例えば、試験管または反応容器中、細胞培養液中などの人工的な環境で生じる事象を意味する。
【００４６】
インビボ：本明細書で使用される場合、用語「インビボ」は、ヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物体内で生じる事象を意味する。細胞型系の文脈において、該用語は、生細胞内で生じる事象を意味するのに（例えばインビトロ系の対語として）使用され得る。
【００４７】
局所分布または局所送達：本明細書において使用される場合、「局所分布」、「局所送達」という用語、または文法的等価物は、組織特異的な送達または分布を指す。典型的には、局所分布または局所送達は、細胞内で翻訳および発現される、または分泌が限定的で、患者の循環系へ入ることを回避する、ｍＲＮＡにコードされるタンパク質（たとえば酵素）を必要とする。
【００４８】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも一つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾および未修飾の両方のＲＮＡを包含する。ｍＲＮＡは一つ以上のコード領域および非コード領域を含み得る。ｍＲＮＡは、自然源から精製されてもよく、組換え発現系を用いて産生されてもよく、また任意選択的に精製、化学合成などをされてもよい。必要に応じて、例えば、化学合成された分子の場合、ｍＲＮＡは、化学修飾された塩基または糖類、骨格修飾などを有する類似体といった、ヌクレオシド類似体を含み得る。ｍＲＮＡ配列は、別段に示されない限り、５’から３’の方向に提示される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；介在塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ  ｂａｓｅ）；修飾された糖類（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；ならびに／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）を含む。
【００４９】
患者：本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、提供される組成物が、例えば、実験、診断、予防、美容、および／または治療目的のために投与され得る任意の生物体を意味する。典型的な患者としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、および／またはヒトなどの哺乳類）が挙げられる。一部の実施形態では、患者はヒトである。ヒトには、出生前および出生後の形態が含まれる。
【００５０】
医薬的に許容される：本明細書で使用される際に、用語「医薬的に許容される」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、炎症刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、合理的なベネフィット／リスクの比率に相応で、ヒトおよび動物の組織に接触させて使用することに適した物質を指す。
【００５１】
皮下投与：本明細書で使用される場合、「皮下投与」または「皮下注射」という用語は、皮膚と筋肉の間の組織層である皮下組織へのボーラス注射を意味する。
【００５２】
対象：本明細書で使用される際に、用語「対象」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。ヒトには、出生前および出生後の形態が含まれる。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は患者である場合があり、これは、疾患の診断または治療のために医療機関に来院するヒトを意味する。用語「対象」は、本明細書において「個体」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患または障害に罹患している可能性があるか、またはそれに感受性を有するが、疾患または障害の症状を表していてもいなくてもよい。
【００５３】
実質的に：本明細書で使用される際に、用語「実質的に」は、対象の特徴または特性の全てもしくはほぼ全ての範囲または程度を示す、定性的な状態を意味する。生物学分野の当業者であれば、生物学的および化学的な現象が、完了することおよび／もしくは完了の域に到達すること、または絶対的な結果を達成もしくは回避することが、仮にあったとしても稀であることを理解するであろう。したがって、用語「実質的に」は、本明細書において、多くの生物学的および化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を捉えるのに用いられる。
【００５４】
全身分布または全身送達：本明細書で使用される際に、用語「全身分布」、「全身送達」、または文法的等価物は、全身もしくは生物体全体に影響を及ぼす送達または分布のメカニズムまたはアプローチを意味する。典型的には、全身分布または全身送達は、身体の循環系、例えば、血流を介して成し遂げられる。「局所分布または局所送達」の定義と比較される。
【００５５】
標的組織：本明細書で使用される場合、用語「標的組織」は、治療されるべき疾患の影響を受ける任意の組織を意味する。一部の実施形態では、標的組織には、疾患に関連する病態、症状、または特徴を呈する組織が含まれる。
【００５６】
治療有効量：本明細書で使用される際に、「治療有効量」の治療剤という用語は、疾患、障害、および／もしくは状態に罹患しているか、または感受性を有する対象に投与される場合に、その疾患、障害、および／または状態を治療する、診断する、予防する、ならびに／あるいはその疾患、障害、および／または状態の症状の開始を遅延させるのに十分な量を意味する。当業者は、治療有効量が典型的には少なくとも一つの単位用量を含む投薬レジメンによって投与されることを理解するものとなる。
【００５７】
治療：本明細書で使用される際に、用語「治療する」、「治療」または「治療している」とは、特定の疾患、障害、および／または状態のうち一つ以上の症状または特徴を、部分的にまたは完全に軽減する、寛解させる、緩和する、抑制する、予防する、その開始を遅延させる、その重篤度を低減する、および／またはその発症率を低減するために使用される任意の方法を指す。疾患の徴候を示していない対象、および／または疾患の初期の徴候のみを示している対象に対して、その疾患に関連する病態を発症させるリスクを減少させることを目的として、治療が行われる場合がある。
【００５８】
ワクチン接種：本明細書で使用される場合、「ワクチン接種」という用語は、例えば抗原をコードするｍＲＮＡなどの、免疫応答を生じさせるように意図された組成物の投与を表す（例えば、疾患を引き起こす作用物質の組成物）。本発明の目的のために、ワクチン接種は、疾患を引き起こす作用物質に曝される前、曝されている間、および／または曝された後に受けることができ、一部の実施形態では、作用物質に曝される前、曝されている間、および／または曝された直後に受けることができる。一部の実施形態では、ワクチン接種には、適切に時間間隔をあけた、ワクチン接種組成物の複数回の投与が含まれる。
【００５９】
本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡワクチン送達のための改善された方法および組成物を提供する。
【００６０】
本発明の様々な態様は、以下のセクションで詳細に説明される。セクションの使用は、本発明を限定することを意味しない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願において、「または」の使用は、他に記載がない限り、「および／または」を意味する。
【００６１】
本発明の一態様では、対象内で免疫応答を誘導するための方法が提供される。方法は、抗原をコードするｍＲＮＡを含む組成物を、抗原特異的Ｔ細胞応答または抗原特異的抗体応答を誘導するのに十分な投薬レジメンで、投与することを含む。一部の実施形態では、組成物は、皮下投与される。一部の実施形態では、組成物は、皮内投与される。一部の実施形態では、組成物は、筋肉内投与される。
【００６２】
本発明の一態様では、インビボでワクチンを送達するための方法が提供される。方法は、脂質ナノ粒子内に封入された抗原をコードするｍＲＮＡを含むワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含む。一部の実施形態では、組成物は、皮下投与される。一部の実施形態では、組成物は、皮内投与される。一部の実施形態では、組成物は、筋肉内投与される。
【００６３】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ワクチン
ｍＲＮＡワクチンは、新規であり、かつ生ワクチン、弱毒化されたまたは死滅された病原体のワクチン、あるいはトキソイドワクチンを使用する現在の細胞をベースとするワクチンよりも、多くの有利を提供する。安全性に加え、ｍＲＮＡワクチンは費用対効果が高く、柔軟な設計プラットフォームを提供する。抗原をコードするｍＲＮＡは、特異的免疫応答を誘導するように指向されることができ、したがって、感染症や癌を含む幅広い種類の疾患のための、広範な治療的および予防的ｍＲＮＡワクチンを開発することに適用され得る。
【００６４】
感染症に対するワクチン
ワクチン候補は、多数の感染病原体に対して十分確立されている。典型的には、ワクチンとは、疾患を引き起こす作用物質を少なくとも部分的に模すことにより、哺乳動物宿主による免疫応答を誘発する薬剤である。一般的にワクチンは、加熱により死滅された、放射線照射された、もしくは弱毒化された病原体、生きた弱毒化された微生物、タンパク質もしくはペプチド抗原、結合体化した抗原、トキシン、または微生物表面タンパク質、あるいはそれらの断片などの生物学的薬剤である。しかしながら、タンパク質またはペプチド抗原をコードするｍＲＮＡは、疾患に対する免疫応答を誘導する安全で効果的な方法である。上述のように、ｍＲＮＡは、後のセクションで論じられる好適な脂質を含むリポソームに封入されることにより、インビボで発現するように効果的に送達され得る。したがって、この抗原ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡは、インビボでワクチンを生成するために使用され得る。哺乳動物宿主によって生成された、ワクチン成分に対する免疫応答は、宿主の免疫系が病原体の攻撃に対してプライミングされるため、今度は病原体による後の攻撃から宿主を守ることを意図される。言い換えれば、宿主系は病原体の免疫学的メモリー（適応免疫応答の成分）を有するということである。このプロセスは、予防的ワクチン接種として公知である。さらにワクチンは、例えば新たなおよびあまり認識されていない微生物抗原（サブドミナント抗原）に対して免疫応答を再方向付けし、ひいては強い免疫応答を誘導して病原体を排除することにより、既存の感染症において宿主の免疫系を促進することができる。このワクチン応答のタイプは治療的ワクチン接種に分類され得る。
【００６５】
病原体に対する免疫応答は、数段階に分解することができる。最初に、ヒトの身体（または哺乳類系）が、とりわけ肌などの露出表面、または呼吸器、胃腸、および泌尿生殖器官系の内部粘膜表面を介する接触によって、新たな病原体と遭遇し、それがパターン認識分子の活性化を介して非特異的先天的免疫応答をもたらす。パターン認識分子は、微生物表面と宿主細胞表面とを、または感染した細胞と正常な細胞とを識別することに特化した様々な生殖系列コード化受容体を含む。貪食細胞（単球、マクロファージ、および樹状細胞）は、自らの表面にパターン認識分子を発現し、主に、先天的免疫応答における病原体の認識、死滅、および排除を担う。そうすることで、貪食細胞はまた、適応免疫応答としても公知である、より特異的な抗原を標的とする免疫応答を生成するために、循環リンパ球に抗原を重合（ｐｒｏｃｅｓｓ）して提示する。この段階で、エフェクター細胞傷害性Ｔ細胞が、主要組織適合複合体分子（またはＭＨＣ）である細胞表面分子の第二のセットに関連して存在する場合、抗原を発現する細胞を認識して死滅させるように、活性化リンパ球はリンパ節で、抗原の認識のための抗原特異的Ｔ細胞発現受容体へと成熟する。またヘルパーＴ細胞は系を活性化して、Ｔ細胞メモリーおよび体液性免疫応答を生成する。体液性免疫応答は、先天性免疫が機能し続けている数日間にわたる間にクローン性発現およびクローン性分化により生成された抗体分泌Ｂ細胞を含む。細胞傷害性Ｔ細胞のクローン性増殖もまた、リンパ節などのリンパ器官で急速に生じ、抗原に曝露することによって増大される。活性化Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化の顕著な特徴と考えられるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）などの多くのサイトカインを生成する。最終的に、抗原特異的Ｔ細胞とその時の抗体とは血液中に放出され、感染部位に補充される。成功したワクチンは急速で堅牢な細胞傷害性Ｔ細胞応答、強力な抗体応答、および持続性のある免疫学的メモリーを生成する。
【００６６】
癌ワクチン
癌は免疫学的疾患と考えられ、癌の免疫療法は今日の研究および開発のセンターステージとなっている。癌の免疫療法では、ワクチンは、癌抗原と戦う免疫系を高め、抗原に向けられた活性化細胞傷害性Ｔ細胞によって腫瘍を排除するために開発される。癌抗原のある部類は、癌を引き起こすウイルスに関係するウイルス抗原であり、例えば、数例を挙げれば、リンパ腫や上咽頭癌に関連するＥＢＶ１やＥＢＶ２などのエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）抗原、子宮頸癌（ＣＣ）に関連するＨＰＶ１６などのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、肝細胞癌（ＨＣＣ）に関連するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫に関連するヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）、ならびにカポジ肉腫を伴うヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８）である。
【００６７】
一方、癌細胞は、非癌性細胞または組織によっては一般的に発現しない抗原を発現する。そのような抗原としては、限定するものではないが、乳癌に見られる上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＲＡＳファミリーメンバーｐ−５３および他の活性化ＲＡＳ抗原、卵巣癌抗原ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２、悪性黒色腫細胞に見られる黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病に見られるＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子産物、皮膚黒色腫および大腸癌に見られるＢＲＡＦ抗原、非小細胞肺癌の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、大腸および非小細胞肺癌に見られるＫＲＡＳ、神経芽細胞腫および非小細胞肺癌に見られる神経特異的エノラーゼ、神経芽細胞腫に見られるＮＹ−ＥＳＯ  １、メラノーマに見られるＴ細胞（ＭＡＲＴ−１）によって認識されるメラノーマ関連抗原、非小細胞肺癌に見られるプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、前立腺癌に見られる前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ＵＰＡ）、乳癌に見られるプラスミノーゲン活性化因子阻害物質（ＰＡＩ−１）、ならびに他の多くであり、そのほとんどが変異型内因性タンパク質である。これらの癌抗原は、内因性であることから、ウイルス抗原と同様の様式で、すなわち抗原を異質として分類するＭＨＣ−１分子と関連して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示されないが、細胞傷害性Ｔ細胞は、変異型自己抗原を分化し特定することが可能で、変異型抗原を有する細胞を捜して破壊する固有の特性を有する。したがって、癌の免疫療法の現在の目的は、変異型抗原に対して向けられる細胞傷害性Ｔ細胞の最適な活性化を達成することである。患者自らの癌に関連する特異的な変異は、マッピングすることができ、患者自身の細胞傷害性Ｔ細胞を誘導して腫瘍細胞を破壊するために必要な免疫応答を生成して、ワクチンを生成するのに使用されることができる。ｍＲＮＡワクチンは、このような個別化医療を可能にする、ぺプチドワクチンに対する安全で費用対効果が高い代替物である。癌患者が有する変異の全ゲノムの（ｐａｎ−ｇｅｎｏｍｉｃ）スキャニングおよび分析は、変異を含む抗原またはエピトープをコードするｍＲＮＡを、特異的に設計するのに使用することができ、それはインビボで投与する場合、細胞表面に翻訳産物を産生するであろう。これは免疫応答を変異型抗原に対して向けるであろう。プロセスにおいて、細胞傷害性Ｔ細胞は、本質的に変異型抗原を発現する腫瘍細胞を攻撃する。全ゲノム配列分析、変異分析、エピトープのマッピングおよび分析の実行、ならびにワクチン接種に好適なペプチドの設計に関わる方法およびプロトコルは当業者に公知である。
【００６８】
このアプローチはまた、患者のドミナント抗原およびサブドミナント抗原を見つけることにも利用できるであろう。慢性感染症および癌の両方において、特定の抗原が最初の免疫応答を産生するのに主要な役割を果たすことが観察された。しかしその後まもなく、そのようなドミナント抗原に対する寛容が起こり、それによって免疫応答が弱められる。最初のドミナント抗原応答を示さなかった抗原（しばしばサブドミナント抗原と呼ばれる）のゲノム分析および特定は現在、新たなおよび回復した免疫応答を生成するのに使用され得る。
【００６９】
ペプチドワクチンと比べたｍＲＮＡワクチンの利点の一つは、ｍＲＮＡワクチンは、受け取る宿主に対するＨＬＡのマッチングを回避することである。
【００７０】
ｍＲＮＡワクチン設計への合成アプローチにおいて、病原体プロテオームがワクチンの潜在能力を有する抗原性署名に関してスキャンされ得る。（プロテオームデータベースには、ＵｎｉＰｒｏｔコンソーシアム（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）を使用してアクセスし得る、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）。これは、ジカウイルスなどの新しい病原体に有効であり得る。逆ワクチン学（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ）のこのタイプは、多くの新規のペプチドワクチン候補を特定するのに用いられてきた。新たなペプチドワクチンはまた、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）および結核菌からも、ゲノミクスとプロテオミクスとを組み合わせることによって特定された（例えば、Ｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．２００２，９９（１０）６５７３−６５７８を参照されたい）。潜在的な抗原候補が成功裏に免疫応答を生成できるか否かを、細胞表面ディスプレイの様々な形態で潜在的な抗原のライブラリーを好適に発現させることによって、およびオプソニン作用と抗体結合とを試験に供することによって、実証し得る。ワクチン抗原開発のための例示的な有用なデータベースとしては：免疫遺伝学および免疫情報学のための、免疫遺伝学情報システム（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）；エピトープデータベース（Ｅｐｉｔｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）、（ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｒｏｓｔｌａｂ．ｏｒｇ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｅｐｉｔｏｍｅ）、免疫エピトープデータベースおよび分析供給源（Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）、ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ；Ｉｍｍｕｎｅｔデータベース、ｉｍｍｕｎｅｔ．ｃｎ／ｃｅｄ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ；ＨＩＶデータベース：ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙが挙げられる。
【００７１】
したがって、上述から、リンパ節へのｍＲＮＡワクチン送達の富化は、リンパ球増殖および抗原特異的Ｔ細胞とＢ細胞との生成のための、活性化リンパ球およびナイーブなリンパ球の両方へのワクチンのアクセスをもたらし得ることが明らかである。この抗原活性化の局在化はまた、広く行きわたった免疫活性化とは対照的に毒性が少ない。
【００７２】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
本発明は、本明細書に記載されるワクチンとして使用するのに好適な抗原をコードする任意のｍＲＮＡを送達することに使用され得る。本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡは、コードされたタンパク質を翻訳するためにＤＮＡからリボソームに情報を伝えるタイプのＲＮＡである。ｍＲＮＡは様々な公知の方法のいずれかにより合成され得る。たとえば本発明に従うｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成することができる。簡潔に述べると、ＩＶＴは多くの場合、プロモーターを含む直線状または環状のＤＮＡ鋳型、一群のリボヌクレオチド三リン酸塩、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含み得る緩衝系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（たとえば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅＩ、ピロホスファターゼ、ならびに／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて行われる。厳密な条件は具体的なアプリケーションに従い変化するであろう。
【００７３】
一部の実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、製剤および封入前に精製されて、ｍＲＮＡ合成中に使用された様々な酵素および他の試薬を含む望ましくない不純物が除去されてもよい。
【００７４】
本発明を使用して、様々な長さのｍＲＮＡを送達することができる。一部の実施形態では、本発明を使用して、長さ約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、または２０ｋｂ以上のインビトロで合成されたｍＲＮＡを送達することができる。一部の実施形態では、本発明を使用して、長さ約１〜２０ｋｂ、約１〜１５ｋｂ、約１〜１０ｋｂ、約５〜２０ｋｂ、約５〜１５ｋｂ、約５〜１２ｋｂ、約５〜１０ｋｂ、約８〜２０ｋｂ、または約８〜１５ｋｂの範囲のインビトロで合成されたｍＲＮＡを送達することができる。
【００７５】
本発明を使用して、未修飾のｍＲＮＡ、または安定性を一般的に強化する一つ以上の修飾を含むｍＲＮＡを送達することができる。一部の実施形態では、修飾は、修飾ヌクレオチド、修飾糖リン酸骨格、ならびに５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）から選択される。
【００７６】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡの修飾は、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含み得る。本発明による修飾ｍＲＮＡは、たとえば骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含み得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、以下に限定されないが、プリン類（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））またはピリミジン類（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））をはじめとする天然ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）から合成されてもよく、ならびに例えば１−メチル−アデニン、２−メチル−アデニン、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニル−アデニン、Ｎ６−メチル−アデニン、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン、２−チオ−シトシン、３−メチル−シトシン、４−アセチル−シトシン、５−メチル−シトシン、２，６−ジアミノプリン、１−メチル−グアニン、２−メチル−グアニン、２，２−ジメチル−グアニン、７−メチル−グアニン、イノシン、１−メチル−イノシン、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）（５−ウラシル）、ジヒドロウラシル、２−チオ−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、５−メチル−２−チオ−ウラシル、５−メチル−ウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、５−メチルアミノメチル−ウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５’−メトキシカルボニルメチル−ウラシル、５−メトキシ−ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、１−メチル−シュードウラシル、キューオシン、ベータ−Ｄ−マンノシル−キューオシン、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、ならびにホスホロアミデート類、ホスホロチオエート類、ペプチドヌクレオチド類、メチルホスホネート類、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシンおよびイノシンなどのプリン類ならびにピリミジン類の修飾ヌクレオチド類似体または誘導体として合成されてもよい。こうした類似体の調製は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、第５，２６２，５３０号および第５，７００，６４２号（その開示は参照によりその全範囲において本明細書に含まれる）から当業者に公知である。
【００７７】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡはＲＮＡ骨格修飾を含んでもよい。典型的には、骨格修飾は、ＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸塩が化学的に修飾される修飾である。例示的な骨格修飾として、典型的には、以下に限定されないが、メチルホスホネート、メチルホスホルアミデート、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート（例えば、シチジン５’−Ｏ−（１−チオフォスフェート））、ボラノリン酸塩、正荷電グアニジニウム基などからなる群由来の修飾が挙げられ、これは、ホスホジエステル結合を他のアニオン基、カチオン基、または中性基で置き換えることに基づくことを意味する。
【００７８】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは糖修飾を含み得る。典型的な糖修飾は、ヌクレオチドの糖の化学修飾であり、糖修飾として、以下に限定されないが、２’−デオキシ−２’−フルオロ−オリゴリボヌクレオチド（２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）、２’−デオキシ−２’−デアミン−オリゴリボヌクレオチド（２’−アミノ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルシチジン５’−三リン酸、２’−メチルウリジン５’−三リン酸）、２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびこれらの異性体（２’−アラシチジン５’−三リン酸、２’−アラウリジン５’−三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’−アジド−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）からなる群から選択される糖修飾が挙げられる。
【００７９】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡはヌクレオチドの塩基の修飾（塩基修飾）を含み得る。塩基修飾を含む修飾ヌクレオチドは、塩基修飾ヌクレオチドとも称される。こうした塩基修飾ヌクレオチドの例として、以下に限定されないが、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド５’−三リン酸、２−アミノアデノシン５’−三リン酸、２−チオシチジン５’−三リン酸、２−チオウリジン５’−三リン酸、４−チオウリジン５’−三リン酸、５−アミノアリルシチジン５’−三リン酸、５−アミノアリルウリジン５’−三リン酸、５−ブロモシチジン５’−三リン酸、５−ブロモウリジン５’−三リン酸、５−ヨードシチジン５’−三リン酸、５−ヨードウリジン５’−三リン酸、５−メチルシチジン５’−三リン酸、５−メチルウリジン５’−三リン酸、６−アザシチジン５’−三リン酸、６−アザウリジン５’−三リン酸、６−クロロプリンリボシド５’−三リン酸、７−デアザアデノシン５’−三リン酸、７−デアザグアノシン５’−三リン酸、８−アザアデノシン５’−三リン酸、８−アジドアデノシン５’−三リン酸、ベンゾイミダゾールリボシド５’−三リン酸、Ｎ１−メチルアデノシン５’−三リン酸、Ｎ１−メチルグアノシン５’−三リン酸、Ｎ６−メチルアデノシン５’−三リン酸、Ｏ６−メチルグアノシン５’−三リン酸、シュードウリジン５’−三リン酸、ピューロマイシン５’−三リン酸、またはキサントシン５’−三リン酸が挙げられる。
【００８０】
ｍＲＮＡ合成には、５’末端への「キャップ」および３’末端への「テール」の付加が含まれるのが典型的である。キャップの存在は、大半の真核生物細胞に見られるヌクレアーゼへの耐性を付与するのに重要である。「テール」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護するのに役立つものである。
【００８１】
したがって、一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には次のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの一つを除去して二つの末端リン酸を残し、次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加されて５’−５’逆三リン酸結合を生成し、次いで、グアニンの７−窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。２’−Ｏ−メチル化はまた、７−メチルグアノシン三リン酸塩残基の後の第一の塩基および／または第二の塩基で生じ得る。キャップ構造の例には、ｍ７ＧｐｐｐＮｐ−ＲＮＡ、ｍ７ＧｐｐｐＮｍｐ−ＲＮＡおよびｍ７ＧｐｐｐＮｍｐＮｍｐ−ＲＮＡ（式中、ｍは２’−Ｏ−メチル残基を示す）が含まれるが、これに限定されない。
【００８２】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端のポリＡテールは多くの場合、約１０〜３００個のアデノシンヌクレオチド（例えば、約１０〜２００個のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１５０個のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１００個のアデノシンヌクレオチド、約２０〜７０個のアデノシンヌクレオチド、または約２０〜６０個のアデノシンヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは３’ポリ（Ｃ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端の好適なポリＣテールは多くの場合、約１０〜２００個のシトシンヌクレオチド（例えば、約１０〜１５０個のシトシンヌクレオチド、約１０〜１００個のシトシンヌクレオチド、約２０〜７０個のシトシンヌクレオチド、約２０〜６０個のシトシンヌクレオチド、または約１０〜４０個のシトシンヌクレオチド）を含む。ポリＣテールは、ポリＡテールに付加され得るか、またはポリＡテールを置換し得る。
【００８３】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’および／または３’非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域には、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす一つ以上の要素、例えば、鉄応答要素が含まれる。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、長さ約５０〜５００のヌクレオチドであり得る。
【００８４】
一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞中のｍＲＮＡの位置の安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの一つ以上の結合部位のうちの一つ以上を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、長さ５０〜５００ヌクレオチドであるか、またはそれ以上の長さであり得る。
【００８５】
キャップ構造
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には次のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの一つを除去して二つの末端リン酸を残し、次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加されて５’−５’逆三リン酸結合を生成し、次いで、グアニンの７−窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。キャップ構造の例としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、およびＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
天然に存在するキャップ構造は７−メチルグアノシンを含み、これは、三リン酸架橋を介して第一の転写ヌクレオチドの５’末端に連結され、その結果、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（Ｎは任意のヌクレオシドである）のジヌクレオチドキャップをもたらす。インビボにおいて、キャップは酵素を用いて付加される。キャップは、核に付加され、酵素グアニリルトランスフェラーゼによる触媒作用を受ける。ＲＮＡの５’末端へのキャップの付加は、転写の開始直後に生じる。末端ヌクレオシドは、グアノシンであるのが典型的であり、全ての他のヌクレオチドとは逆の方向になっており、すなわち、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧｐＮｐＮｐである。
【００８７】
インビトロ転写により生成されたｍＲＮＡに対する普遍的なキャップは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇであり、これをインビトロでのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写においてジヌクレオチドキャップとして使用し、その５’末端にキャップ構造を有するＲＮＡが取得される。キャップされたｍＲＮＡの一般的なインビトロ合成方法では、転写の開始因子として、形態がｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（「ｍ７ＧｐｐｐＧ」）である予め形成されたジヌクレオチドが用いられている。
【００８８】
従来より、インビトロ翻訳実験に使用される合成ジヌクレオチドキャップの通常の形態は、アンチリバースキャップ類似体（「ＡＲＣＡ」）または修飾されたＡＲＣＡであり、これは、２’ＯＨ基または３’ＯＨ基が−ＯＣＨ３で置換される、修飾されたキャップ類似体であるのが一般的である。
【００８９】
さらなるキャップ類似体として、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ；非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）；ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、またはアンチリバースキャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ；ｍ７、２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧ、およびそれらの四リン酸誘導体）からなる群から選択される化学構造が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ‘ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ’ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３）を参照のこと）。
【００９０】
一部の実施形態では、好適なキャップは７−メチルグアニル酸（「ｍ７Ｇ」）であり、これは、三リン酸架橋を介して第一の転写ヌクレオチドの５’末端に連結され、その結果、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（Ｎは任意のヌクレオシドである）をもたらすものである。本発明の実施形態に利用されるｍ７Ｇキャップの好ましい実施形態は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである。
【００９１】
一部の実施形態では、キャップはキャップ０構造である。キャップ０構造は、塩基１および塩基２に結合したリボースの２’−Ｏ−メチル残基を欠く。一部の実施形態では、キャップはキャップ１構造である。キャップ１構造は、塩基２に２’−Ｏ−メチル残基を有する。一部の実施形態では、キャップはキャップ２構造である。キャップ２構造は、塩基２および塩基３の両方に結合した２’−Ｏ−メチル残基を有する。
【００９２】
様々なｍ７Ｇキャップ類似体が当該技術分野において公知であり、その多くは市販されている。これらには、上述のｍ７ＧｐｐｐＧ、ならびにＡＲＣＡ  ３’−ＯＣＨ３および２’−ＯＣＨ３キャップ類似体が含まれる（Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３））。本発明の実施形態において使用するためのさらなるキャップ類似体として、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１０：１４７９−１４８７（２００４）に記載）、ホスホロチオエートキャップ類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１３：１７４５−１７５５（２００７）に記載）、ならびに米国特許第８，０９３，３６７号および同第８，３０４，５２９号（参照により本明細書に援用される）に記載されるキャップ類似体（ビオチン化キャップ類似体を含む）が挙げられる。
【００９３】
テール構造
多くの場合、「テール」の存在はエキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護するという役割を果たす。ポリＡテールは、天然のメッセンジャーセンスＲＮＡおよび合成センスＲＮＡを安定させると考えられている。したがって、ある実施形態では、長いポリＡテールをｍＲＮＡ分子に付加することにより、そのＲＮＡをさらに安定化することができる。ポリＡテールは、当該技術分野において認識されている様々な技術を使用して付加することができる。例えば、長いポリＡテールは、ポリＡポリメラーゼを使用して合成ＲＮＡまたはインビトロ転写ＲＮＡに付加することができる（Ｙｏｋｏｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２−１２５６）。転写ベクターが、長いポリＡテールをコードすることもできる。加えて、ポリＡテールは、ＰＣＲ産物から直接転写することによって付加することができる。ポリＡは、ＲＮＡリガーゼを用いてセンスＲＮＡの３’末端にライゲーションすることもできる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９９１  ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと）。
【００９４】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは３’テール構造を含む。テール構造は典型的に、ポリ（Ａ）テールおよび／またはポリ（Ｃ）テールを含む。ｍＲＮＡの３’末端上のポリＡテールまたはポリＣテールは、典型的には、少なくとも５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも１５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、または少なくとも１ｋｂのアデノシヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチドをそれぞれ含む。一部の実施形態では、ポリＡテールまたはポリＣテールはそれぞれ、約１０〜８００個のアデノシンヌクレオチドまたはシトシンヌクレオチド（例えば、約１０〜２００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜３００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜４００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜５００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜５５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約５０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１００〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１５０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２００〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２５０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約３００〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約３５０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約４００〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約４５０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約５００〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜１５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜１００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２０〜７０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、または約２０〜６０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド）であり得る。一部の実施形態では、テール構造は、本明細書に記載の様々な長さを有するポリ（Ａ）テールおよびポリ（Ｃ）テールの組み合わせを含む。一部の実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアデノシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のシトシンヌクレオチドを含む。
【００９５】
一部の実施形態では、ポリＡテールまたはポリＣテールの長さを調節して、本発明の修飾センスｍＲＮＡ分子の安定性を制御し、それにともなってタンパク質の転写を制御する。例えば、ポリＡテールの長さはセンスｍＲＮＡ分子の半減期に影響を及ぼし得るため、ポリＡテールの長さを調節して、ヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの耐性のレベルを改変し、それによって、標的細胞におけるポリヌクレオチドの発現および／またはポリペプチドの産生の時間経過を制御してもよい。
【００９６】
５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’および／または３’非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域には、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす一つ以上の要素、例えば、鉄応答要素が含まれる。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、長さ約５０〜５００のヌクレオチドであり得る。
【００９７】
一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞中のｍＲＮＡの位置の安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの一つ以上の結合部位のうちの一つ以上を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、長さ５０〜５００ヌクレオチドであるか、またはそれ以上の長さであり得る。
【００９８】
例示的な３’および／または５’のＵＴＲ配列は、センスｍＲＮＡ分子の安定性を強化するために、安定なｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路酵素）から誘導されてもよい。例えば、５’ＵＴＲ配列は、ヌクレアーゼ耐性を改善するため、および／またはポリヌクレオチドの半減期を改善するために、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子またはその断片の部分配列を含み得る。ポリヌクレオチドをさらに安定化させるために、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端または非翻訳領域にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）またはその断片をコードする配列を含めることも想定される。一般に、これらの修飾は、ポリヌクレオチドの安定性および／または薬物動態特性（例えば、半減期）を、それらの未修飾の対応物に比べて改善するものであり、例えば、インビボヌクレアーゼ消化に対するポリヌクレオチド耐性を改善するように行われる修飾を含む。
【００９９】
インビトロ転写反応からもたらされたｍＲＮＡが、一部の実施形態で望ましい一方、細菌、真菌、植物、および／または動物から産生されたｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡの他の供給源が、本発明の範囲内であると意図される。
【０１００】
本発明を使用して、様々なタンパク質をコードするｍＲＮＡを送達することができる。本発明に好適なｍＲＮＡｓの非限定的な例は、ペプチドまたはタンパク質ワクチンをコードするｍＲＮＡを含む。
【０１０１】
例示的なｍＲＮＡ配列
一部の実施形態では、本発明は、標的タンパク質欠損の治療を目的に、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡを対象に送達するための方法および組成物を提供する。例示的なｍＲＮＡ配列を以下に示す。
コンストラクト設計：
Ｘ−ｍＲＮＡコード配列−Ｙ
５’および３’のＵＴＲ配列
Ｘ（５’ＵＴＲ配列）＝
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ（配列番号１）
Ｙ（３’ＵＴＲ配列）＝
ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＧＣＵ（配列番号２）
または
ＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＡＧＣＵ（配列番号３）
【０１０２】
一部の実施形態では、好適なｍＲＮＡは、別のタンパク質に融合した標的タンパク質（例えばＮ末端またはＣ末端融合物）の全長、断片、または一部を含む融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、標的タンパク質の全長、断片、または一部をコードするｍＲＮＡに融合したタンパク質は、シグナル配列または細胞標的化配列をコードする。
【０１０３】
脂質ナノ粒子
本発明によると、ｍＲＮＡはナノ粒子に封入されるかまたは複合体化され得る。一部の実施形態では、ナノ粒子は、「送達ビヒクル」、「移送ビヒクル」、またはそれらの文法的等価物とも称される。
【０１０４】
様々な実施形態によると、好適なナノ粒子として、以下に限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリマー系担体、脂質ナノ粒子およびリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然および合成由来のエキソソーム、天然層状体、合成層状体および半合成層状体、ナノ粒子、カルシウムリン−ケイ酸塩ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、微結晶微粒子、半導体ナノ粒子、ポリ（Ｄ−アルギニン）、ゾルゲル、ナノデンドリマー、デンプンベース送達系、ミセル、エマルジョン、ニオソーム、多ドメインブロックポリマー（ビニルポリマー、ポリプロピルアクリル酸ポリマー、動的多抱合体）、乾燥粉末製剤、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、ならびに他の指向性タグが挙げられる。
【０１０５】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは１個以上のリポソーム内に封入される。本明細書において使用される場合、「リポソーム」という用語は、任意の層状、多重層状、または固形のナノ粒子小胞を指す。典型的には、本明細書において使用されるリポソームは、一種以上の脂質を混合することにより、または一種以上の脂質とポリマーを混合することにより形成され得る。ゆえに本明細書において使用される「リポソーム」という用語は、脂質系ナノ粒子およびポリマー系ナノ粒子の両方を包含する。一部の実施形態では、本発明に好適なリポソームは、カチオン性または非カチオン性脂質、コレステロール系脂質、および／またはＰＥＧ修飾脂質を含む。
【０１０６】
ＰＥＧ化脂質
一部の実施形態では、好適な脂質溶液は、一種以上のＰＥＧ化脂質を含む。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質およびＮ−オクタノイル−スフィンゴシン−ｌ−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８  ＰＥＧ−２０００セラミド）を含めた誘導体化されたセラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）などの誘導体化脂質の使用も、本発明により企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質は、長さがＣ６〜Ｃ２０のアルキル鎖を有する脂質に共有結合された長さ最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖を含むが、これに限定されない。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ−２Ｋである。一部の実施形態では、特定の有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧセラミドである。
【０１０７】
ＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化脂質は、リポソーム内の総脂質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％を構成し得る。
【０１０８】
カチオン性脂質
本明細書において使用される場合、用語「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有する多数の脂質種およびリピドイド種のいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質は文献に記載されており、その多くは市販されている。
【０１０９】
本発明の組成物および方法で使用するための好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１０／１４４７４０号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、カチオン性脂質、以下の化合物構造を有する、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル  ４−（ジメチルアミノ）ブタン酸塩：
【化１】
2021525725.tif 000002
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１１０】
本発明の組成物および方法で使用するためのその他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される、国際特許公開第２０１３／１４９１４０号に記載されるイオン化可能なカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のうちの一種のカチオン性脂質：
【化２】
2021525725.tif 000003
またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素、任意で置換される、可変飽和または不飽和Ｃ１−Ｃ２０アルキル、および任意で置換される、可変飽和または不飽和Ｃ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、式中、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して水素、任意で置換されるＣ１−Ｃ３０アルキル、任意で置換される可変不飽和Ｃ１−Ｃ３０アルケニル、および任意で置換されるＣ１−Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され、式中、ｍおよびｏはそれぞれ独立して、ゼロおよび任意の正の整数（例えば、ｍは３）からなる群から選択され、および式中、ｎはゼロまたは任意の正の整数（例えば、ｎは１）である。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ、１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−ｌ−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン（「ＨＧＴ５０００」）：
【化３】
2021525725.tif 000004
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ、１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−ｌ−アミン（「ＨＧＴ５００１」）：
【化４】
2021525725.tif 000005
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質および（１５Ｚ、１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−１−アミン（「ＨＧＴ５００２」）：
【化５】
2021525725.tif 000006
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１１１】
本発明の組成物および方法で使用するためのその他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される、国際特許公開第２０１０／０５３５７２号に、アミノアルコールリピドイドとして記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化６】
2021525725.tif 000007
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１１２】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１６／１１８７２５号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化７】
2021525725.tif 000008
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１１３】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１６／１１８７２４号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化８】
2021525725.tif 000009
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１１４】
本発明の組成物および方法において使用するための他の好適なカチオン性脂質は、１４，２５−ジトリデシル１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタンの式を有するカチオン性脂質、およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１１５】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１３／０６３４６８号および国際特許公開第２０１６／２０５６９１号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
【化９】
2021525725.tif 000010
またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、ＲＬの各々の事例は、独立して、任意で置換されるＣ６−Ｃ４０アルケニルである。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化１０】
2021525725.tif 000011
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化１１】
2021525725.tif 000012
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化１２】
2021525725.tif 000013
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化１３】
2021525725.tif 000014
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１１６】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１５／１８４２５６号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
【化１４】
2021525725.tif 000015
またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、各Ｘは独立してＯまたはＳであり；各Ｙは独立してＯまたはＳであり；各ｍは独立して０〜２０であり；各ｎは独立して１〜６であり；各ＲＡは独立して水素、任意で置換されるＣ１−５０アルキル、任意で置換されるＣ２−５０アルケニル、任意で置換されるＣ２−５０アルキニル、任意で置換されるＣ３−１０カルボシクリル、任意で置換される３〜１４員のヘテロシクリル、任意で置換されるＣ６−１４アリール、任意で置換される５〜１４員のヘテロアリールまたはハロゲンであり、各ＲＢは独立して水素、任意で置換されるＣ１−５０アルキル、任意で置換されるＣ２−５０アルケニル、任意で置換されるＣ２−５０アルキニル、任意で置換されるＣ３−１０カルボシクリル、任意で置換される３〜１４員のヘテロシクリル、任意で置換されるＣ６−１４アリール、任意で置換される５〜１４員のヘテロアリールまたはハロゲンである。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ターゲット２３」：
【化１５】
2021525725.tif 000016
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１１７】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１６／００４２０２号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化１６】
2021525725.tif 000017
またはその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化１７】
2021525725.tif 000018
またはその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化１８】
2021525725.tif 000019
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【０１１８】
本発明の組成物および方法で使用するためのその他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照により援用される、Ｊ．ＭｃＣｌｅｌｌａｎ，Ｍ．Ｃ．Ｋｉｎｇ，Ｃｅｌｌ  ２０１０，１４１，２１０−２１７およびＷｈｉｔｅｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１４）５：４２７７に記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化１９】
2021525725.tif 000020
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１１９】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１５／１９９９５２号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２０】
2021525725.tif 000021
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２１】
2021525725.tif 000022
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２２】
2021525725.tif 000023
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２３】
2021525725.tif 000024
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２４】
2021525725.tif 000025
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２５】
2021525725.tif 000026
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２６】
2021525725.tif 000027
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２７】
2021525725.tif 000028
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２８】
2021525725.tif 000029
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２９】
2021525725.tif 000030
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３０】
2021525725.tif 000031
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３１】
2021525725.tif 000032
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３２】
2021525725.tif 000033
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１２０】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１７／００４１４３号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３３】
2021525725.tif 000034
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３４】
2021525725.tif 000035
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３５】
2021525725.tif 000036
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３６】
2021525725.tif 000037
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３７】
2021525725.tif 000038
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３８】
2021525725.tif 000039
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３９】
2021525725.tif 000040
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４０】
2021525725.tif 000041
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４１】
2021525725.tif 000042
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４２】
2021525725.tif 000043
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４３】
2021525725.tif 000044
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４４】
2021525725.tif 000045
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４５】
2021525725.tif 000046
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４６】
2021525725.tif 000047
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４７】
2021525725.tif 000048
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４８】
2021525725.tif 000049
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４９】
2021525725.tif 000050
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１２１】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１７／０７５５３１号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
【化５０】
2021525725.tif 000051
またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｌ１またはＬ２のうちの一つは、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、または−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−であり；もう一つのＬ１またはＬ２は、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−または−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−または直接結合であり；Ｇ１およびＧ２は、それぞれ独立して非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキレンまたはＣ１−Ｃ１２アルケニレンであり；Ｇ３はＣ１−Ｃ２４アルキレン、Ｃ１−Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３−Ｃ８シクロアルケニレンであり；ＲａはＨまたはＣ１−Ｃ１２アルキルであり；Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＣ６−Ｃ２４アルキルまたはＣ６−Ｃ２４アルケニルであり；Ｒ３はＨ、ＯＲ５、ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または−ＮＲ５  Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４はＣ１−Ｃ１２アルキルであり；Ｒ５はＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルであり；ｘは０、１または２である。
【０１２２】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１７／１１７５２８号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化５１】
2021525725.tif 000052
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化５２】
2021525725.tif 000053
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化５３】
2021525725.tif 000054
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１２３】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１７／０４９２４５号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の式のうちの一つの化合物：
【化５４】
2021525725.tif 000055
およびその薬学的に許容される塩を含む。これら四つの式のうちのいずれか一つについて、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱおよび−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから独立して選択され、Ｑは、−ＯＲ、−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、および複素環からなる群から選択され、ｎは１、２または３である。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化５５】
2021525725.tif 000056
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化５６】
2021525725.tif 000057
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化５７】
2021525725.tif 000058
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化５８】
2021525725.tif 000059
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１２４】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、それぞれ本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１７／１７３０５４号および国際特許公開第２０１５／０９５３４０号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化５９】
2021525725.tif 000060
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化６０】
2021525725.tif 000061
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化６１】
2021525725.tif 000062
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化６２】
2021525725.tif 000063
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１２５】
本発明の組成物および方法で使用するための他の適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１２／１７０８８９号に記載される切断可能カチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
【化６３】
2021525725.tif 000064
，
を含み、式中、Ｒ１は、イミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、任意で置換されるアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノなどのアルキルアミノ）およびピリジルからなる群から選択され、式中、Ｒ２は、以下の二つの式のうちの一つからなる群から選択され：
【化６４】
2021525725.tif 000065
式中、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、任意で置換される可変飽和または不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルキルおよび任意で置換される可変飽和または不飽和Ｃ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、式中、ｎは、０または任意の正の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）である。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００１」：
【化６５】
2021525725.tif 000066
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００２」：
【化６６】
2021525725.tif 000067
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００３」：
【化６７】
2021525725.tif 000068
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００４」：
【化６８】
2021525725.tif 000069
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００５」：
【化６９】
2021525725.tif 000070
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１２６】
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、カチオン性脂質、Ｎ−［ｌ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）を含む。（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；本明細書に参照によって援用される、米国特許第４，８９７，３５５号）。本発明の組成物および方法のために好適な他のカチオン性脂質は、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）（「ＤＯＧＳ」）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｌ−プロパンアミニウム（「ＤＯＳＰＡ」）（Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）；米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、ｌ，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、ｌ，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）を含む。
【０１２７】
本発明の組成物および方法に好適な追加の例示的なカチオン性脂質はまた、ｌ，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（「ＤＳＤＭＡ」）；１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（「ＤＯＤＭＡ」）、１，２−ジリノレイロキシオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（「ＤＬｉｎＤＭＡ」）、ｌ，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（「ＤＬｅｎＤＭＡ」）、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）、Ｎ−（ｌ，２−ジミリチルチルオキシプロップ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−ｌ−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（「ＣＬｉｎＤＭＡ」）；２−［５’−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチｌ−ｌ−（シス，シス−９’，ｌ−２’−オクタデカジエンオキシ）プロパン（「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（「ＤＭＯＢＡ」）；１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」）；２，３−ジリノレオイロイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミン（「ＤＬｉｎＤＡＰ」）、ｌ，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」）；ｌ，２−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」）；２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［ｌ，３］−ジオキソラン（「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ」）；２−（（８−［（３Ｐ）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル）オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（「オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ」）；（２Ｒ）−２−（（８−［（３ベータ）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル）オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（「オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）」）；（２Ｓ）−２−（（８−［（３Ｐ）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル）オキシ）−Ｎ、ｆｓｌ−ジメチ３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（「オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）」）；２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［ｌ，３］−ジオキソラン（「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」）、および２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，ｌ  ２−ジエン−  １−イル）−ｌ，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（「ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ」）を含む（本明細書に参照によって援用される国際公開第２０１０／０４２８７７号参照；Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃ��．２８：１７２−１７６（２０１０））。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７：２７６−２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３−１００７（２００５）；国際特許公開第２００５／１２１３４８）。一部の実施形態では、カチオン性脂質のうちの一種以上は、イミダゾール部分、ジアルキルアミノ部分、またはグアニジニウム部分のうちの少なくとも一つを含む。
【０１２８】
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に好適な一種以上のカチオン性脂質は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（「ＸＴＣ」）；（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（「ＡＬＮＹ−１００」）および／または４，７，１３−トリス（３−オキソ−３−（ウンデシルアミノ）プロピル）−Ｎ１，Ｎ１６−ジウンデシル−４，７，１０，１３−テトラアザヘキサデカン−１，１６−ジアミド（「ＮＣ９８−５」）を含む。
【０１２９】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子の重量で測定して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する一種以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子のモル％で測定して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する一種以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子の重量で測定して、約３０〜７０％（例えば、約３０〜６５％、約３０〜６０％、約３０〜５５％、約３０〜５０％、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する一種以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子のモル％で測定して、約３０〜７０％（例えば、約３０〜６５％、約３０〜６０％、約３０〜５５％、約３０〜５０％、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する一種以上のカチオン性脂質を含む
【０１３０】
一部の実施形態では、ステロール系カチオン性脂質が、本明細書に記載のカチオン性脂質の代わりに、または本明細書に記載のカチオン性脂質に加えて使用されてもよい。好適なステロール系カチオン性脂質は、ジアルキルアミノ含有ステロール系カチオン性脂質、イミダゾール含有ステロール系カチオン性脂質、およびグアニジニウム含有ステロール系カチオン性脂質である。例えば、特定の実施形態は、下記の構造（Ｉ）によって示されるように、イミダゾール、例えば、イミダゾールコレステロールエステル、または「ＩＣＥ」脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）−１０，１３−ジメチル−１７−（（Ｒ）−６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル  ３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパノエートを含む一種以上のステロール系カチオン性脂質をふくむ組成物を対象とする。特定の実施形態では、機能的なタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の送達のための脂質ナノ粒子は、以下の構造によって示されるように、イミダゾール系カチオン性脂質、例えば、イミダゾールコレステロールエステル、または「ＩＣＥ」脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）−１０，１３−ジメチル−１７−（（Ｒ）−６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル  ３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパノエートの一つ以上を含んでもよい。
【化７０】
2021525725.tif 000071
【０１３１】
一部の実施形態では、リポソーム中のカチオン性脂質の割合は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、または７０％超であり得る。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、リポソームの約３０〜５０重量％（例えば、約３０〜４５重量％、約３０〜４０重量％、約３５〜５０重量％、約３５〜４５重量％、または約３５〜４０重量％）を構成する。一部の実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ＩＣＥ脂質）は、モル比でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％を構成する。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、語句「非カチオン性脂質」は、任意の中性脂質、双性イオン性脂質、またはアニオン性脂質を意味する。本明細書で使用される場合、語句「アニオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたＨで正味の負電荷を保有する多数の脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質として、以下に限定されないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシド、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、ｌ−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が挙げられる。
【０１３３】
非カチオン性脂質
一部の実施形態では、こうした非カチオン性脂質は、単独で使用され得るが、好ましくは他の脂質、例えば、カチオン性脂質と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、リポソームに存在する総脂質の約５％〜約９０％、または約１０％〜約７０％のモル比を含み得る。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、中性脂質、すなわち、組成物が製剤化および／または投与される条件下で正味の電荷を保有しない脂質である。一部の実施形態では、リポソーム中の非カチオン性脂質の割合は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であり得る。
【０１３４】
コレステロール系脂質
一部の実施形態では、好適な脂質溶液は、一種以上のコレステロール系脂質を含む。例として、好適なコレステロール系カチオン性脂質として、例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥが挙げられる。一部の実施形態では、コレステロール系脂質は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％を構成する。一部の実施形態では、コレステロール系脂質は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の約３０〜５０％（例えば、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。
【０１３５】
一部の実施形態では、コレステロール系脂質は、リポソームに存在する総脂質の約２％〜約３０％、または約５％〜約２０％のモル割合を含み得る。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質の割合は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であり得る。
【０１３６】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質、およびＮ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８  ＰＥＧ−２０００セラミド）を含めた誘導体化されたセラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）などの誘導体化脂質の使用もまた、単独で、または好ましくは移入ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）を含む他の脂質製剤と組み合わされて、本発明によって企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質は、長さがＣ６〜Ｃ２０のアルキル鎖を有する脂質に共有結合された長さ最大Ｓ  ｋＤａのポリエチレングリコール鎖を含むが、これに限定されない。こうした成分の付加は、複合体の凝集を阻止することができ、また循環寿命を増加させ、脂質−核酸組成物の標的組織への送達を増加させるための手段を提供することができる（Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５−２３７）。あるいは、これらの成分はインビボで製剤の外へと速やかに交換されるように選択され得る（米国特許第５，８８５，６１３号を参照のこと）。特定の有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧセラミドである。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化された脂質は、リポソーム移入ビヒクルに存在する総脂質の約０％〜約２０％、約０．５％〜約２０％、約１％〜約１５％、約４％〜約１０％、または約２％のモル比を含み得る。
【０１３７】
様々な実施形態によると、脂質ナノ粒子を含む、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および／またはＰＥＧ修飾脂質の選択、ならびにこれらの脂質の相互の相対モル比の選択は、選択される脂質の特徴、目的の標的細胞の性質、送達されるｍＲＮＡの特徴に基づいて行われる。さらなる考慮すべき事項には、例えば、選択される脂質のアルキル鎖の飽和度、ならびに大きさ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合性、および毒性が含まれる。したがって、モル比はそれらに応じて調節され得る。
【０１３８】
一部の実施形態では、好適な送達ビヒクルは、担体としてポリマーを使用して、単独でまたは本明細書に記載される様々な脂質を含む他の担体と組み合わせて製剤化される。したがって、一部の実施形態では、本明細書で使用されるリポソーム送達ビヒクルは、ポリマーを含むナノ粒子も包含する。好適なポリマーとして、例えば、ポリアクリレート類、ポリアルキシアノアクリレート類、ポリラクチド、ポリラクチド−ポリグリコリドコポリマー類、ポリカプロラクトン類、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン類、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬ、およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が挙げられ得る。ＰＥＩを含む場合、ＰＥＩは１０〜４０ｋＤａの範囲の分子量を持つ分枝状ＰＥＩ、例えば、２５ｋＤａの分枝状ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ  ＃４０８７２７）であり得る。
【０１３９】
本発明に好適なリポソームは、本明細書に記載のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール脂質、ＰＥＧ修飾脂質、および／またはポリマーのいずれかのうちの一種以上を様々な割合で含み得る。非限定的な例として、好適なリポソーム製剤は、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；またはＩＣＥ、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋから選択される組み合わせを含み得る。
【０１４０】
様々な実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００、ＩＣＥ、および／またはＨＧＴ４００３）は、モル比でリポソームの約３０〜６０％（例えば、約３０〜５５％、約３０〜５０％、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。一部の実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００、ＩＣＥ、および／またはＨＧＴ４００３）の割合は、モル比でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、または約６０％以上である。
【０１４１】
一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比は、それぞれ約３０〜６０：２５〜３５：２０〜３０：１〜１５であり得る。一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比は、それぞれおよそ４０：３０：２０：１０である。一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比は、それぞれおよそ４０：３０：２５：５である。一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比は、それぞれおよそ４０：３２：２５：３である。一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比は、およそ５０：２５：２０：５である。一部の実施形態では、ステロール脂質：非カチオン性脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比は、５０：４５：５である。一部の実施形態では、ステロール脂質：非カチオン性脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比は、５０：４０：１０である。一部の実施形態では、ステロール脂質：非カチオン性脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比は、５５：４０：５である。一部の実施形態では、ステロール脂質：非カチオン性脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比は、５５：３５：１０である。一部の実施形態では、ステロール脂質：非カチオン性脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比は、６０：３５：５である。一部の実施形態では、ステロール脂質：非カチオン性脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比は、６０：３０：１０である。
【０１４２】
一部の実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＩＣＥとＤＯＰＥとを、ＩＣＥ：ＤＯＰＥのモル比を＞１：１で含む。一部の実施形態では、ＩＣＥ：ＤＯＰＥのモル比は＜２．５：１である。一部の実施形態では、ＩＣＥ：ＤＯＰＥのモル比は、１：１〜２．５：１の間である。一部の実施形態では、ＩＣＥ：ＤＯＰＥのモル比はおよそ１．５：１である。一部の実施形態では、ＩＣＥ：ＤＯＰＥのモル比はおよそ１．７：１である。一部の実施形態では、ＩＣＥ：ＤＯＰＥのモル比はおよそ２：１である。一部の実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＩＣＥとＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋとを、ＩＣＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋのモル比を＞１０：１で含む。一部の実施形態では、ＩＣＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋのモル比は＜１６：１である。一部の実施形態では、ＩＣＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋのモル比はおよそ１２：１である。一部の実施形態では、ＩＣＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋのモル比はおよそ１４：１である。一部の実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＤＯＰＥとＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋとを、ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋのモル比を＞５：１で含む。一部の実施形態では、ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋのモル比は＜１１：１である。一部の実施形態では、ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋのモル比はおよそ７：１である。一部の実施形態では、ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋのモル比はおよそ１０：１である。一部の実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＩＣＥとＤＯＰＥとＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋとを、ＩＣＥ：ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋのモル比を５０：４５：５で含む。一部の実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＩＣＥとＤＯＰＥとＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋとを、ＩＣＥ：ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋのモル比を５０：４０：１０で含む。一部の実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＩＣＥとＤＯＰＥとＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋとを、ＩＣＥ：ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋのモル比を５５：４０：５で含む。一部の実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＩＣＥとＤＯＰＥとＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋとを、ＩＣＥ：ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋのモル比を５５：３５：１０で含む。一部の実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＩＣＥとＤＯＰＥとＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋとを、ＩＣＥ：ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋのモル比を６０：３５：５で含む。一部の実施形態では、本発明に好適なリポソームは、ＩＣＥとＤＯＰＥとＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋとを、ＩＣＥ：ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ−２Ｋのモル比を６０：３０：１０で含む。
【０１４３】
本発明の組成物で使用するためのリポソーム移入ビヒクルは、当該技術分野において現在既知である様々な技術により調製することができる。様々な方法が、公開された米国出願第２０１１／０２４４０２６、公開された米国出願第２０１６／００３８４３２、および２０１７年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６２／５８０，１５５（これら全てが参照により本明細書に援用される）に記載されており、本発明の実施に使用され得る。
【０１４４】
出願人によって出願された脂質組成物を含む以下の出願は、参照によりその全体を本明細書に援用される：２０１８年５月１６日に出願された６２／６７２，１９４；２０１８年５月２４日に出願された６２／６７６，１４７；および代理人整理番号ＭＲＴ−２０１６ＵＳＰ１を有し、Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａ  Ｓｔｅｒｏｉｄａｌ  Ｍｏｉｅｔｙと題する本出願と同日付けで出願される出願；代理人整理番号ＭＲＴ−２０１７ＵＳＰ１、Ｐｈｏｓｐｈｏｅｓｔｅｒ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓと題する本出願と同日付けで出願される出願；代理人整理番号ＭＲＴ−２０１８ＵＳＰ１、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓと題する本出願と同日付けで出願される出願；代理人整理番号ＭＲＴ−２０１９ＵＳＰ１、Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓと題する本出願と同日付けで出願される出願；代理人整理番号ＭＲＴ−２０２２ＵＳＰ１、Ｖｉｔａｌｉｐｉｄｓ  ＩＩと題する本出願と同日付けで出願される出願；代理人整理番号ＭＲＴ−２０２３ＵＳＰ１、Ｖｉｔａｌｉｐｉｄｓ  ＩＩＩと題する本出願と同日付けで出願される出願；代理人整理番号ＭＲＴ−２０２４ＵＳＰ１、Ｖｉｔａｌｉｐｉｄｓ  ＩＶと題する本出願と同日付けで出願される出願。
【０１４５】
ｍＲＮＡ担持ナノ粒子
任意の望ましい脂質は、ｍＲＮＡの封入に好適な任意の比で混合され得る。一部の実施形態では、好適な脂質溶液は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール、および／またはＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。
【０１４６】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子にｍＲＮＡを封入するプロセスは、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合することを含み、該ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液は、混合前に周囲温度よりも高い所定温度に加熱されて、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子を形成する（２０１５年７月２日に出願された「Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ」と題する米国特許出願公開第１４／７９０，５６２号、および２０１４年７月２日に出願された米国仮特許出願第６２／０２０，１６３号を参照されたく、これらの開示はその全体が本明細書に援用される）。
【０１４７】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子にｍＲＮＡを封入するプロセスは、予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することを含む（２０１６年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４２０，４１３号、および２０１７年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６２／５８０，１５５号を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することで、ｍＲＮＡを細胞内に送達する効率を改善する脂質ナノ粒子が生じる。一部の実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することで、極めて高い封入効率（すなわち、９０〜９５％の範囲）でｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入することになる。一部の実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子とｍＲＮＡとを、プロセス全体にわたって脂質／ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を一定に維持し、かつ量産化を容易にするポンプシステムを用いて混合している。
【０１４８】
本発明による好適なリポソームは、様々な大きさに作製することができる。一部の実施形態では、提供されるリポソームは、従来から知られているｍＲＮＡ封入リポソームよりも小さく作製され得る。一部の実施形態では、リポソームの大きさが減少すると、ｍＲＮＡの送達効率が高くなる。適切なリポソームの大きさは、標的細胞または標的組織の部位を考慮し、また作製されるリポソームの用途をある程度考慮して選択することができる。
【０１４９】
一部の実施形態では、適切な大きさのリポソームを選択して、ｍＲＮＡによりコードされる抗体の全身分布を促進する。一部の実施形態では、特定の細胞または組織へのｍＲＮＡのトランスフェクションを限定することが望ましい場合がある。例えば、肝細胞を標的とするには、リポソームは、その寸法が肝臓の肝類洞を覆う内皮層の開窓よりも小さくなるように寸法決定されてもよく、こうした場合、リポソームは、その内皮開窓を容易に貫通して、標的肝細胞に達することができようになる。
【０１５０】
代替的または追加的に、リポソームは、リポソームの寸法が特定の細胞もしくは組織内への分布を制限するか、または意図的に分布しないようにするのに十分な直径であるように寸法決定されてもよい。例えば、リポソームは、その寸法が肝類洞を覆う内皮層の開窓より大きくなるように寸法決定されてもよく、それによって、リポソームの肝細胞への分布を制限する。
【０１５１】
一部の実施形態では、リポソームの大きさは、リポソーム粒子の最大直径の長さによって決定される。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約２５０ｎｍ以下（例えば、約２２５ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、または５０ｎｍ以下）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１０〜２５０ｎｍの範囲（例えば、約１０〜２２５ｎｍ、１０〜２００ｎｍ、１０〜１７５ｎｍ、１０〜１５０ｎｍ、１０〜１２５ｎｍ、１０〜１００ｎｍ、１０〜７５ｎｍ、または１０〜５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１００〜２５０ｎｍの範囲（例えば、約１００〜２２５ｎｍ、１００〜２００ｎｍ、１００〜１７５ｎｍ、１００〜１５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１０〜１００ｎｍの範囲（例えば、約１０〜９０ｎｍ、１０〜８０ｎｍ、１０〜７０ｎｍ、１０〜６０ｎｍ、または１０〜５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。特定の実施形態では、好適なリポソームは、約１００ｎｍ未満の大きさを有する。
【０１５２】
リポソーム集団の寸法決定に対して、当該技術分野において既知の様々な別の方法を利用することができる。こうした寸法決定方法の一つは、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、この文献は参照によって本明細書に援用される。バス超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかによるリポソーム懸濁液の超音波処理によって、直径が約０．０５マイクロメートル未満の小さいＵＬＶまでサイズ漸減する。ホモジナイゼーションは別の方法であり、大きいリポソームをより小さいものに断片化するのに剪断エネルギーを利用する。典型的なホモジナイゼーション手順において、ＭＬＶは、選択されたリポソームの大きさ、典型的には約０．１〜０．５マイクロメートルの大きさが観察されるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーを用いて再循環される。リポソームの大きさは、Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１−１５０（１９８１）（参照によって本明細書に援用される）に記載された準電気光散乱（ＱＥＬＳ）によって算出され得る。平均リポソーム直径を、形成されたリポソームを超音波処理することによって低減させることができる。断続的な超音波処理サイクルをＱＥＬＳ評価と交互に行って、効率的なリポソーム合成を導くことができる。
【０１５３】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子を調製する方法が特定され、これはこうした成分の追加順に起因し、得られた形成された粒子が改善された効力および有効性を示す条件下で、予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと組み合わせることを含む。成分の混合は、プロセス全体にわたって脂質／ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を一定に維持し、かつ量産化を容易にするポンプシステムを用いて達成される。このプロセスは、２０１６年１１月１０日に出願された出願第６２／４２０，４１３に対する優先権を主張する、２０１７年１１月１０日に出願された出願人の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１７／６１１１３、および同日に出願された米国特許出願第１５／８０９，６８０（これら全てが参照により本明細書にその全体を援用される）に、詳細に記載されている。上述の製剤のプロセスはしばしば本明細書で「再混合」製剤と称される。
【０１５４】
ワクチン組成物
本発明の免疫原性組成物は、アジュバントなどの追加の物質を含有してワクチンの有効性を高めることができ、また、限定されないが、湿潤剤または乳化剤または緩衝剤を含む、薬学的に許容される担体を含有することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，（ｅｄ．）１９８０）。
【０１５５】
アジュバント
好適なアジュバントとしては、限定されないが、鉱物塩（例えば、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ（ＳＯ４）２、シリカ、アルミニウム、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、または炭素）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）を伴う、もしくは免疫刺激複合体を伴わないポリヌクレオチド（例えば、Ｃｈｕａｎｇ，Ｔ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ，（２００２）Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．７１（３）：５３８−４４；Ａｈｍａｄ−Ｎｅｊａｄ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（７）：１９５８−６８に記載されたもののような、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリＩＣ酸またはポリＡＵ酸、ＣｐＧ  を伴う、もしくはＣｐＧ  を伴わないポリアルギニン（当分野においてＩＣ３１としても知られる；Ｓｃｈｅｌｌａｃｋ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３４ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｌｉｎｇｎａｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０（２９−３０）：３４９８−５０８を参照）、ＪｕｖａＶａｘ（商標）（米国特許第６，６９３，０８６）、ある自然物質（例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のワックスＤ、コリネバクテリウム‐パルヴムに見られる物質、百日咳菌、またはブルセラ菌属の仲間）、フラジェリン（トル様受容体５リガンド；ＭｃＳｏｒｌｅｙ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９（７）：３９１４−９を参照）、ＱＳ２１、ＱＳ１７、およびＱＳ７などのサポニン（米国特許第５，０５７，５４０、第５，６５０，３９８、第６，５２４，５８４、第６，６４５，４９５）、モノホスホリルリピドＡ、とりわけ、３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）、イミキモド（当分野においてＩＱＭとしても知られ、Ａｌｄａｒａ（登録商標）として市販；米国特許第４，６８９，３３８、第５，２３８，９４４；Ｚｕｂｅｒ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ（２００４）２２（１３−１４）：１７９１−８）、ＣＣＲ５阻害剤ＣＭＰＤ１６７（Ｖｅａｚｅｙ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８：１５５１−１５６２を参照）、およびスクアレン乳剤、すなわちＭＦ５９、が挙げられ得る。
【０１５６】
一部の実施形態では、アジュバントは別のＲＮＡである。
【０１５７】
ヒトに広く使用されてきたアジュバントは、アルミニウムである。一部の実施形態では、好適なアジュバントは、リン酸アルミニウムである。一部の実施形態では、好適なアジュバントは、水酸化アルミニウムである。一部の実施形態では、好適なアジュバントは、リン酸アルミニウムと水酸化アルミニウムの組み合わせである。サポニンとその精製成分Ｑｕｉｌ  Ａ、フロイント完全アジュバント、および他のアジュバントは、典型的には、研究および獣医学的用途に使用される、しかしながら、ムラミルジペプチド、モノホスホリルリピドＡ、Ｇｏｏｄｍａｎ−Ｓｎｉｔｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４１０−４１５（１９９１）に記載され、および参照により本明細書に援用されたものなどのリン脂質複合体などの新規の化学的に定義された調整物。
【０１５８】
担体、賦形剤
インビボでのｍＲＮＡの発現を促進するために、リポソームを含めた脂質ナノ粒子などの送達ビヒクルは、一つ以上の追加の核酸、担体、標的化リガンドまたは安定化試薬と組み合わせて製剤化されても、好適な賦形剤と混合されている薬理学的組成物に製剤化されてもよい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子は、ヒアルロニダーゼと同時に投与される。薬物の製剤化および投与の技術は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎで知ることができる。
【０１５９】
典型的には、本発明による免疫原性ワクチン組成物は、薬学的に許容される担体を含む。一般的に、薬学的に許容される担体には、以下に限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせが含まれる。担体および組成物は無菌であることができ、その製剤は投与方法に適するものである。組成物はまた、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。無菌生理食塩水またはゴマ油などの一般的な医薬担体のいずれも使用することができる。培地は、例えば、浸透圧を調整するための薬学的に許容される塩などの既存の医薬補助物質、緩衝液、防腐剤などを含むこともできる。
【０１６０】
薬学的に許容される担体が、一つには投与される特定の組成物によって、さらには組成物を投与するのに用いられる特定の方法によって決定される。したがって、本発明の免疫原性組成物の広く様々な好適な製剤がある。一部の実施形態では、免疫原性ワクチン組成物は、非経口（すなわち、筋肉内、皮内、または皮下）投与用、または鼻咽頭（すなわち、鼻腔内）投与用に製剤化される。典型的には、非経口的投与のための製剤としては、無菌水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油）、および注射可能な有機エステル（例えばオレイン酸エチル）である。水性担体としては、水、アルコール溶液／水性溶液、エマルジョン、または懸濁液が挙げられ、生理食塩水および緩衝培養液が含まれる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル油、または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルには、体液および栄養補充液、ならびに電解質補給剤（リンゲルデキストロースベースの補給剤）などが含まれる。防腐剤および他の添加物、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどもまた、存在してもよい。
【０１６１】
免疫原性組成物のいくつかは、潜在的に、薬学的に許容される酸付加塩または塩基付加塩として投与されてもよく、これらの塩は、無機酸（塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸）、および有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸）との反応によって、または無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム）および有機塩基（モノアルキル、ジアルキル、トリアルキル、およびアリールアミン、ならびに置換エタノールアミン）との反応により形成される。
【０１６２】
提供されるリポソームに封入されたｍＲＮＡ、またはリポソーム結合ｍＲＮＡ、およびそれを含む組成物は、対象の臨床状態、投与の部位および投与方法、投与スケジュール、対象の年齢、性別、体重、ならびに当該技術分野の臨床医に関連する他の要因を考慮して、現在の医療行為に従い投与および投薬され得る。本明細書における目的に適う「有効量」は、実験臨床研究、薬理学、臨床、および医療分野の当業者に既知のこうした適切な考慮すべき事項により決定され得る。一部の実施形態では、投与される量は、症状や、当業者によって疾患の進行、退行、または改善の適切な基準として選択される他の指標を、少なくともいくらか安定化、改善、または排除するのに有効である。例えば、好適な量および投薬レジメンは、少なくとも一過性タンパク質（例えば、酵素）の産生をもたらすものである。
【０１６３】
代替的または追加的に、本発明のリポソームに封入されたｍＲＮＡおよび組成物は、全身的な方法ではなく局所的な方法で投与され得る。
【０１６４】
投与は、単一、または複数用量で投与され得る。
【０１６５】
本発明の提供される方法は、本明細書に記載されるワクチン接種剤（例えば、抗原をコードするｍＲＮＡ）の治療有効量の単回投与ならびに複数回投与を企図する。ワクチン接種剤は、対象の状態の性質、重篤度、および範囲（例えば、感染の段階、有病率人口統計、または癌のステージなど）に応じて、定期的間隔で投与され得る。一部の実施形態では、本発明のワクチン接種剤（例えば、抗原をコードするｍＲＮＡ）の治療有効量を、規則的な間隔で（例えば、年に１回、６カ月に１回、５カ月に１回、３カ月に１回、隔月（２カ月に１回）、毎月（毎月１回）、隔週（２週間に１回）、月２回、３０日に１回、２８日に１回、１４日に１回、１０日に１回、７日に１回、毎週、週２回、毎日、または連続して）、定期的に投与してもよい。
【０１６６】
一部の実施形態では、提供されるリポソームおよび／または組成物は、その中に含まれるｍＲＮＡの徐放に適するように製剤化される。こうした徐放性組成物は、投薬間隔を延長させて対象に適宜投与することができる。例えば、一部の実施形態では、本発明の組成物は、１日２回、毎日、または１日おきに対象に投与される。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、週２回、週１回、７日に１回、１０日に１回、１４日に１回、２８日に１回、３０日に１回、２週間に１回、３週間に１回もしくはより好ましくは４週間に１回、１カ月に１回、１カ月に２回、６週間に１回、８週間に１回、隔月に１回、３カ月に１回、４カ月に１回、６カ月に１回、８カ月に１回、９カ月に１回、または毎年、対象に投与される。長期間にわたるｍＲＮＡの送達または放出のいずれかを行うために、デポ投与（例えば、筋肉内、皮下、硝子体内）用に製剤化される組成物およびリポソームも企図される。好ましくは、採用される徐放手段は、安定性を強化するためにｍＲＮＡに施される修飾と組み合わされる。
【０１６７】
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、主として、本発明のワクチン組成物に含まれるワクチン接種剤の総量に基づいている。一般に、治療有効量は、対象に対して意義のある利益を達成する（例えば、感染症または癌を治療、調節、治癒、防止、および／または寛解する）のに十分な量である。例えば、治療有効量は、所望の治療的および／または予防的効果を得るのに十分な量であり得る。一般的に、それを必要とする対象に投与される治療剤（例えば、抗原をコードするｍＲＮＡ）の量は、当該対象の特徴に依存するであろう。このような特徴には、対象の状態、疾患重篤度、全般的健康、年齢、性別および体重が含まれる。当業者は、これらおよび他の関連因子に応じて適切な投薬量を容易に決定することができるであろう。さらに、最適な投薬量範囲を同定するために、客観的および主観的アッセイの両方を任意に用いることができる。
【０１６８】
一部の実施形態では、ワクチンのプライミング用量が０週目に投与され、次に一つ以上の追加のワクチン用量が投与される。一部の実施形態では、ブースター用量としても知られる、追加の一つ、二つ、または三つワクチン用量が、プライミング用量の後に投与される。一部の実施形態では、プライミング用量、およびブースター用量は特定の時間間隔を有する。一部の実施形態では、プライミング用量、およびブースター用量は、１週間の間隔を空けて、または２週間の間隔を空けて、またはワクチンおよび所望の免疫学的応答に好適な任意の他の間隔で投与される。一部の実施形態では、二つの連続するブースター用量の間の時間間隔は、プライミングとブースター用量との間の間隔と同じである。一部の実施形態では、二つの連続するブースター用量の間の時間間隔は、プライミングとブースター用量との間の間隔とは異なる。
【０１６９】
治療有効量は、複数の単位用量を含み得る投薬レジメンで一般的に投与される。任意の特定のワクチンについて、治療有効量（および／または有効な投与レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路に応じて、他の医薬品との組み合わせに応じて変化し得る。また、任意の特定の患者に固有の治療有効量（および／または単位用量）は、治療される障害および障害の重篤度；採用される特定のワクチン剤の活性；採用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、および食事；投与時間、投与経路、および／または採用される特定のタンパク質の排出または代謝速度；治療期間；ならびに医療分野において周知の類似要因を含む様々な要因に依存し得る。
【０１７０】
一部の実施形態では、治療有効投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）、例えば、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜４００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜３００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜９０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜８０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜７０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜６０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜４０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜３０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲である。
【０１７１】
一部の実施形態では、ワクチンの治療有効投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約６０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約７０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約８０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約９０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５００ｍｇ／ｋｇ（体重）超である。特定の実施形態では、治療有効投与量は１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）である。一部の実施形態では、１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）の治療有効投与量が、皮下、筋肉内または静脈内に投与される。
【０１７２】
一部の実施形態では、１用量当たり約０．３μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約０．４μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約０．５μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約０．６μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約０．７μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約０．８μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約０．９μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約１μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約２μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約３μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約４μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約５μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約６μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約７μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約８μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約９μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約１０μｇのワクチンが投与される。一部の実施形態では、約１２、１５、２０、３０、５０、または１００μｇのワクチンが、あるいは間の任意の量で、投与される。一部の実施形態では、１用量当たり、最大約１ｍｇまでのワクチンが投与される。一部の実施形態では、１用量当たり最大約１０ｍｇまでのワクチンが投与される。一部の実施形態では、１用量当たり最大約１００ｍｇまでのワクチンが投与される。
【０１７３】
一部の実施形態では、プライミング用量と後続のワクチン用量とは、同じ量である。一部の実施形態では、プライミング用量と後続のワクチン用量とは、異なる量である。
【０１７４】
一部の実施形態では、組成物の投与は、対象のリンパ節において、ｍＲＮＡによってコードされる抗原の発現をもたらす。一部の実施形態では、組成物の投与は、対象のリンパ球において、ｍＲＮＡによってコードされる抗原の発現をもたらす。
【０１７５】
一部の実施形態では、組成物の投与は、抗原特異的抗体応答をもたらす。一部の実施形態では、抗原特異的抗体応答は、血清内の抗原特異的抗体の存在によって測定される。
【０１７６】
一部の実施形態では、組成物の投与は、抗原特異的Ｔ細胞応答をもたらす。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞応答は、サイトカイン応答によって測定される。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞応答は、脾細胞内のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによって測定される。
【０１７７】
一部の実施形態では、抗原特異的抗体応答、および／または抗原特異的Ｔ細胞応答は、投与後少なくとも２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、または１か月で検出可能である。
【０１７８】
また、本明細書に開示されるリポソームのうちの一つ以上を含む凍結乾燥された医薬組成物と、例えば、２０１２年６月８日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／４１６６３に開示されるような、かかる組成物を使用するための関連方法も、本明細書において企図される。当該出願の教示内容はその全体で参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本発明による凍結乾燥された医薬組成物は、投与前に戻されるか、またはインビボで戻され得る。例えば、凍結乾燥された医薬組成物は、適切な剤形（例えば、ディスク、ロッド、または膜などの皮内剤形）に製剤化され、剤形が個体の体液によってインビボで経時的に再水和されるように投与され得る。
【０１７９】
提供されるリポソームおよび組成物は、任意の所望の組織に投与され得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを含む提供されるリポソームおよび組成物は、皮下に送達され、ｍＲＮＡは皮下組織以外の細胞または組織型で発現する。特定の組成物は、投与部位以外の特定の組織に、送達および発現バイアスをもたらす。本発明は、リンパ節において堅牢な発現をもたらす皮下投与のための組成物を提供する。送達されるｍＲＮＡが発現され得る場所となる組織の他の例としては、限定されないが、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、血清、脳、骨格筋、リンパ節、皮膚、および／または脳脊髄液が挙げられる。
【０１８０】
一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、投与されるｍＲＮＡの発現が増加するか、および／または対象由来の生体試料における他の酵素またはタンパク質の発現および活性レベルが、治療または投与前のベースライン発現もしくは活性レベルと比較して増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、サイトカイン発現またはケモカイン発現が、治療前のベースライン発現もしくは活性レベルと比較して増加する。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞を刺激する、および活性化するＴ細胞ワクチンは、ベースラインを超えてＩＦＮ−ガンマ産生を増加させるであろう。ＩＦＮ−γ、ならびに他のサイトカインおよびケモカインは、免疫応答または活性化マーカーとして当分野で公知である。典型的には、ベースラインレベルは、治療直前に測定される。生体試料としては、例えば、全血、血清、血漿、尿、および組織試料（例えば、筋肉、肝臓、皮膚線維芽細胞）が含まれる。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、免疫応答の発現または活性マーカーレベルが、治療直前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象由来の生体試料におけるｍＲＮＡ発現レベルまたは活性レベルが、治療されていない対象と比較して増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象由来の生体試料における治療用タンパク質の発現レベルまたは活性レベルが、治療されていない対象と比較して増加する。
【０１８１】
様々な実施形態によると、送達されるｍＲＮＡの発現の時期を、特定の医学的要求に合うように調整することができる。一部の実施形態では、送達されるｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、提供されるリポソームおよび／または組成物の投与の１時間、２時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、または１カ月後に検出可能である。
【０１８２】
一部の実施形態では、投与された場合、提供される組成物の治療有効量。
【実施例】
【０１８３】
本発明の特定の化合物、組成物、および方法について、特定の実施形態に従って具体的に説明してきたが、以下の実施例は、本発明の化合物を単に説明するという役割を果たすものであり、それを制限することを意図するものではない。
【０１８４】
脂質材料
以下の実施例に記載される製剤は、特に記載しない限り、種々の核酸材料を封入するように設計された、一種以上のカチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば非カチオン性脂質および／またはコレステロール脂質）、およびＰＥＧ化脂質を用いた様々な比の多成分脂質混合物を含む。プロセス用のカチオン性脂質としては、以下に限定されないが、ｃＫＫ−Ｅ１２（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）、ＯＦ−０２、ターゲット２３、ターゲット２４、イミダゾールコレステロールエステル（ＩＣＥ）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ”Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６−２８７）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２−１７６）、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．“Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”ＰＮＡＳ  ２０１０，１０７，１８６４−１８６９）、ジアルキルアミノ系、イミダゾール系、グアニジニウム系などが挙げられ得る。ヘルパー脂質としては、以下に限定されないが、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン）、コレステロールなどが挙げられ得る。ＰＥＧ化脂質は、限定するものではないが、Ｃ６−Ｃ２０の長さのアルキル鎖を有する脂質に共有結合された、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含み得る。
【０１８５】
ｍＲＮＡ材料
一部の実施形態では、標的タンパク質をコードするコドン最適化されたメッセンジャーＲＮＡを、遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写により合成し、次いで、５’キャップ構造（Ｃａｐ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｃａｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００５，８６，１２３９−１２４９）および３’ポリ（Ａ）を付加した。各ｍＲＮＡ産物中に存在する５’および３’非翻訳領域は、それぞれＸおよびＹと表されており、前述したとおりに定義される。
【０１８６】
実施例１．血清中でのｍＲＮＡ発現についての異なる脂質製剤の単一用量での有効性比較
ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）を、ｍＲＮＡトランスフェクション有効性の高感度な定量的尺度として使用して、三つの異なる脂質製剤ＭＬ−２、ＭＬ−７、およびＭＣ３を血清中でのｈＥＰＯタンパク質の発現レベルについて比較した。ＭＣ３は特定のＲＮＡ送達プラットフォームに対する最新技術の製剤であると理解される。マウスが、ＭＬ−２、ＭＬ−７、またはＭＣ３のいずれかを含む脂質製剤中の０．３ｍｇ／Ｋｇまたは１ｍｇ／ＫｇのいずれかのｍＲＮＡを、静脈内投与された。血清中のｈＥＰＯタンパク質レベルが、それぞれ投与の６時間後および２４時間後に測定された。
【０１８７】
図１Ａおよび１Ｂで示すように、ＭＬ−２およびＭＬ−７の両方は、用量に関わらず、それぞれ６時間および２４時間で測定された血清ｈＥＰＯレベルでより高いレベルをもたらした。これらの結果は、脂質製剤ＭＬ−２およびＭＬ−７は、ｍＲＮＡ送達および発現において、従来のＭＣ３製剤よりも有効であることを示す。
【０１８８】
実施例２．血清中で発現したタンパク質の検出についての、ｍＲＮＡ送達経路の単一用量での有効性比較
この例示的実験では、血清中でのｈＥＰＯタンパク質発現について、皮内、皮下、および筋肉内経路でのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ投与が比較された。マウスは、１、１０、または５μｇのいずれかの量のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを、皮下または皮内または筋肉内のいずれかの方法で投与された。血清ｈＥＰＯタンパク質レベルが、投与の６時間後および２４時間後に血清中で測定された。図２に示すように、６時間および２４時間で研究された三つの投与経路の中で、筋肉内投与が、送達されたｍＲＮＡの血清発現について最も高い結果をもたらした。
【０１８９】
実施例３．ｍＲＮＡの皮下および皮内送達がもたらす、リンパ節における堅牢なｍＲＮＡ発現
この例示的な研究では、実験的なｍＲＮＡとしてホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）を使用して、皮下、皮内、および筋肉内送達経路を、マウスで単一用量で比較した。６〜８週齢の雄ＣＤ１マウス（Ｎ＝１３）に、１ｍｇ／ＫｇのＦＦＬ  ｍＲＮＡを、濃度０．２ｍｇ／ｍＬかつ５ｍＬ／Ｋｇの投与量で、皮内（ＳＣ）または皮下（ＩＤ）または筋肉内（ＩＭ）のいずれかで投与するか、または適切なｍＲＮＡを含まない対照を投与した。投与の２４時間後に、すべての動物に、１５０ｍｇ／Ｋｇ（６０ｍｇ／ｍＬ）のルシフェリンを腹腔内注射を介して、２．５ｍＬ／Ｋｇで投与した。すべてのマウスは、ルシフェリン投与の１５分後に安楽死させ、生理食塩水で全身心臓内灌流（ｗｈｏｌｅ  ｂｏｄｙ  ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を実施した。肝臓、脾臓、心臓、肺、腎臓、ならびに上腕、腋窩および鼠径部のリンパ節を採取して、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  装置およびプロトコルを使用した画像表示によるインビボでのルシフェラーゼアッセイのために調整した。以下に示すように、結果は、投与経路がインビボでのｍＲＮＡの送達および発現に影響を及ぼすことを示す。
【０１９０】
表１は、各治療群における、示された様々な組織での平均総蛍光として表された結果を示す。リンパ節における富化ＦＦＬ  ｍＲＮＡが、すべての送達経路で認められた。しかしながら、驚くことに、皮下および皮内経路による送達は、肝臓および脾臓に比べて、腋窩および上腕リンパ節において堅牢なＦＦＬタンパク質発現をもたらし、一方で筋肉内送達は、腋窩および上腕リンパ節で穏やかな発現をもたらしつつ、肝臓、脾臓、筋肉および鼠径部リンパ節では優先的な発現をもたらした。図３は、各群のそれぞれのマウス由来の組織の蛍光画像を示す。（群：ｍＲＮＡを含まない対照、皮下投与、皮内投与、および筋肉内投与）。ペトリ皿上の様々な組織の配置を示す図形は、形状および位置によって異なる組織を識別するための図中のインデックスとして提供される。
表１．
【表１−１】
2021525725.tif 000072
【表１−２】
2021525725.tif 000073
【０１９１】
実施例４．異なるカチオン性脂質を使用した、ＦＦＬ  ＬＮＰの生体分布の評価
この実施例では、マウスが、実施例３での研究で記載されたプロトコルを使用し、ＬＮＰ組成物の異なるカチオン性脂質成分を使用した、ＦＦＬ−ＬＮＰ（１ｍｇ／Ｋｇ）の単回皮下注射を受けた。結果は、複数の製剤が、リンパ節でのｍＲＮＡの富化と堅牢な発現をもたらすことを示唆する。しかしながら、特定のカチオン性脂質の使用はリンパ節でのｍＲＮＡの偏った発現をもたらす。例えば、ＩＣＥを含む組成物（表２のＬＮＰ組成物２）、ターゲット２３を含む組成物（表２のＬＮＰ組成物４および５）、ＭＬ２を含む組成物（表２のＬＮＰ組成物１）、およびＣＣＢｅｎｅを含む組成物（表２のＬＮＰ組成物８）は、リンパ節でのＦＦＬ  ｍＲＮＡの堅牢な発現をもたらす。代表的な組織画像を図４に示す。高い蛍光を有する組織を矢印で示す。ペトリ皿上の様々な組織の配置を示す図形は、形状および位置によって異なる組織を識別するための図中のインデックスとして提供される。表２は、ＦＦＬ発現がもたらした様々な組織における平均蛍光を示す。
表２．
【表２−１】
2021525725.tif 000074
【表２−２】
2021525725.tif 000075
【０１９２】
加えて、改善されたＬＮＰ製剤プロセスが適合され、インビボでのｍＲＮＡ−ＬＮＰ発現の効力を増加した。このプロセスは、一つ以上の溶液を、周囲温度を超える温度になるまで（または、温度を維持するまで）熱する（すなわち、溶液に熱源からの熱を加える）工程を含む。溶液は、出願人の先行出願である米国特許出願第１５／８０９，６８０号、または対応する国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１７／６１１１３（両方とも２０１７年１１月１０日に出願され、参照により本明細書に全体が援用される）に概説したように、予め形成された脂質ナノ粒子と、ｍＲＮＡと、脂質ナノ粒子により封入されたｍＲＮＡを含む混合溶液とを含む（以下では、再混合製剤）。例示的なｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを、再混合プロトコルを使用した概念実証として使用して図５に示すように、従来型（加熱なし、混合されていないＬＮＰ製剤）に比較して、ｈＥＰＯのより高い発現が、複数のカチオン性脂質組成物中に見られた。図６は、ｍＲＮＡ−ＬＮＰ組成物投与の２４時間後に再混合製剤として送達された場合の、腋窩および上腕リンパ節におけるＦＦＬ発現の富化を示す。
【０１９３】
均等物
当業者は、日常的な実験作業を越えない手法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認できるものとなる。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることは意図されず、むしろ以下の特許請求の範囲に記述されるとおりである。
【図１】
2021525725.tif 000076
【図２】
2021525725.tif 000077
【図３】
2021525725.tif 000078
【図４】
2021525725.tif 000079
【図５】
2021525725.tif 000080
【図６】
2021525725.tif 000081
【配列表】
2021525725000001.app
【国際調査報告】
2021525725.tif 000082
2021525725.tif 000083
2021525725.tif 000084
2021525725.tif 000085