(57)【要約】  本開示は、レア対立遺伝子バリアントなどの低頻度標的ポリヌクレオチドを検出する際の使用のための試薬、混合物、キット、および方法に関する。【選択図】図１
2021533769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物。
【請求項２】
ｃ）前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第３の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列と少なくとも部分的に重複し、前記第３の配列が、前記標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在する第１の配列（Ａ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド（「第１のバリアントヌクレオチド」）を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の配列（Ｂ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の配列が、第３の配列（Ｃ）に相補的であり、前記第３の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、前記第３の配列（Ｃ）が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列（Ａ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物。
【請求項４】
ｃ）第５の配列（Ｅ）に相補的な第４の配列（Ｄ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第５の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、前記第５の配列（Ｅ）が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖における前記第１の配列（Ａ）と少なくとも部分的に重複し、前記第１の標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２に記載の混合物。
【請求項５】
前記第３のオリゴヌクレオチドにおける前記標的バリアントヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項６】
前記第３のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、請求項２、４、および５のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項７】
前記検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項６に記載の混合物。
【請求項８】
前記検出可能な標識が、第１の末端ヌクレオチド上にある、請求項６または７に記載の混合物。
【請求項９】
前記第３のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１０】
前記消光部分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、請求項９に記載の混合物。
【請求項１１】
前記消光部分が、前記検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、請求項９または１０に記載の混合物。
【請求項１２】
前記第１の末端ヌクレオチドが、５’末端ヌクレオチドである、請求項１０に記載の混合物。
【請求項１３】
前記第２の末端ヌクレオチドが、３’末端ヌクレオチドである、請求項１０に記載の混合物。
【請求項１４】
前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子を含む、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項１５】
配列Ａ、Ｅ、およびＣが、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖上の一本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置している、請求項４に記載の混合物。
【請求項１６】
前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、前記第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項１７】
前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、前記第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的であり、配列ＤおよびＢが、前記標的相補体ポリヌクレオチド鎖上の前記二本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置し、配列Ａ、Ｅ、およびＣが、前記標的ポリヌクレオチド鎖上の前記二本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置している、請求項４に記載の混合物。
【請求項１８】
前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、前記第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的であり、二本鎖ポリヌクレオチド分子が、バリアントポリヌクレオチド鎖およびバリアント相補体ポリヌクレオチド鎖を含み、前記バリアントポリヌクレオチド鎖が、前記標的ポリヌクレオチド鎖と実質的に同一であり、前記標的ポリヌクレオチド鎖とは前記標的バリアントヌクレオチドで異なるヌクレオチドを含み、前記バリアント相補体ポリヌクレオチド鎖が、前記バリアントポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項１９】
前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第１の配列の３〜６つの連続するヌクレオチドを含む、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項２０】
前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第１の配列のヌクレオチドの配列と重複しない前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの配列をさらに含む、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項２１】
前記混合物が、第４のオリゴヌクレオチドを含まない、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項２２】
前記混合物が、検出可能な標識を含む第４のオリゴヌクレオチドを含まない、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項２３】
前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に結合する第４のオリゴヌクレオチドを含まない、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項２４】
前記混合物が、検出可能な標識および前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に結合する配列を有する第４のオリゴヌクレオチドを含まない、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項２５】
前記第３のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識および前記標的ポリヌクレオチド鎖の配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する混合物における唯一のオリゴヌクレオチドである、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項２６】
前記混合物が、３０ｍＭ〜８０ｍＭの塩化カリウムをさらに含む、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項２７】
塩化カリウムの濃度が、少なくとも４０ｍＭである、請求項２６に記載の混合物。
【請求項２８】
塩化カリウムの濃度が、７０ｍＭ未満である、請求項２６に記載の混合物。
【請求項２９】
塩化カリウムの濃度が、少なくとも４０ｍＭおよび７０ｍＭ未満である、請求項２６に記載の混合物。
【請求項３０】
前記混合物が、１０ｍＭ〜４０ｍＭの硫酸アンモニウムをさらに含む、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項３１】
硫酸アンモニウムの濃度が、少なくとも２０ｍＭである、請求項３０に記載の混合物。
【請求項３２】
硫酸アンモニウムの濃度が、３５ｍＭ未満である、請求項３０に記載の混合物。
【請求項３３】
硫酸アンモニウムの濃度が、少なくとも２０ｍＭおよび３５ｍＭ未満である、請求項３０に記載の混合物。
【請求項３４】
硫酸アンモニウムの濃度が、２０〜２５ｍＭである、請求項３０に記載の混合物。
【請求項３５】
前記混合物が、
ａ）３０ｍＭ〜８０ｍＭの塩化カリウムの濃度と、
ｂ）１０ｍＭ〜４０ｍＭの硫酸アンモニウムの濃度と、をさらに含む、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項３６】
塩化カリウムの濃度が、４０ｍＭ〜７０ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２０ｍＭ〜３５ｍＭである、請求項３５に記載の混合物。
【請求項３７】
塩化カリウムの濃度が、４０ｍＭ〜４８ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２０〜２４ｍＭである、請求項３５に記載の混合物。
【請求項３８】
塩化カリウムの濃度が、４５ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２２ｍＭである、請求項３５に記載の混合物。
【請求項３９】
前記検出可能な標識が、ＤＮＡ結合色素、レポーター色素、蛍光プローブ、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ（商標））、テトラクロロフルオレシン（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）（ＴＥＴ（商標））、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル（ＪＯＥ（商標））、ＶＩＣ（商標）、カルボキシレート基の代わりにＳＯ3を含むフルオレセイン色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホルアミダイト形態、ＣＹ５のホスホルアミダイト形態、非ＦＲＥＴ標識、フェロセン試薬、ＡＢＹ（商標）、ＮＥＤ（商標）ＪＵＮ（商標）、Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０、ＴＹＥ（商標）５６３、ＴＹＥ（商標）６６５、ＴＹＥ（商標）７０５、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の混合物。
【請求項４０】
前記消光部分が、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、非蛍光消光剤（ＮＦＱ）、ブラックホールクエンチャー、アイオワブラッククエンチャー、ＱＳＹ消光剤、ＱＳＹ７消光剤、ＱＳＹ２１消光剤、ダブシルおよび／またはダブシルスルホネート／カルボキシレート消光剤からなる群から選択される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項４１】
前記第３のオリゴヌクレオチドのＴmが、前記第１のオリゴヌクレオチドのＴmよりも少なくとも５℃および２５℃以下高い、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項４２】
前記第３のオリゴヌクレオチドのＴmが、前記第１のオリゴヌクレオチドのＴmよりも少なくとも８℃および１２℃以下高い、請求項４１に記載の混合物。
【請求項４３】
前記第１のオリゴヌクレオチドのＴmが、前記第２のオリゴヌクレオチドのＴmの５℃以内である、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項４４】
前記第１のオリゴヌクレオチドのＴmが、４５〜６０℃であり、前記第２のオリゴヌクレオチドのＴmが、４５〜６０℃である、請求項４２または４３のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項４５】
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項４６】
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項４７】
前記第３のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項４８】
前記第３のオリゴヌクレオチドが、プローブである、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項４９】
前記第１、第２、および／または第３のオリゴヌクレオチドが、１０〜４０個のヌクレオチドを含む、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項５０】
前記第３のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項５１】
前記遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、請求項５０に記載の混合物。
【請求項５２】
前記ＭＧＢ部分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの前記３’末端および／または３’部分に位置している、請求項５１に記載の混合物。
【請求項５３】
前記混合物が、
ａ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第４のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチドにおける前記第１の配列が、第２の標的バリアントヌクレオチドを含み、前記第４のオリゴヌクレオチドが、前記第２の標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに含む、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第５のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２の配列が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の前記第１の配列から５’上流に位置している、第５のオリゴヌクレオチドと、
ｃ）前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第６のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第３の配列が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の前記第１の配列と少なくとも部分的に重複し、前記第２の標的バリアントヌクレオチドを含む、第６のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、請求項２に記載の混合物。
【請求項５４】
前記混合物が、
ａ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ｆ）にハイブリダイズするように構成された第４のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチドにおける前記第１の配列が、第２の標的バリアントヌクレオチド（「第２のバリアントヌクレオチド」）を含み、前記第４のオリゴヌクレオチドが、前記第２の標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第２の配列（Ｇ）にハイブリダイズするように構成された第５のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２の配列が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列（Ｈ）に相補的であり、前記標的ポリヌクレオチド鎖の前記第３の配列が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、前記第３の配列（Ｈ）が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列（Ｆ）から５’上流に位置している、第５のオリゴヌクレオチドと、
ｃ）前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第４の配列（Ｉ）にハイブリダイズするように構成された第６のオリゴヌクレオチドであって、前記第４の配列（Ｉ）が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第５の配列（Ｊ）に相補的であり、第５の配列（Ｊ）が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、前記第５の配列（Ｊ）が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖における前記第１の配列（Ｆ）と少なくとも部分的に重複し、前記第２の標的バリアントヌクレオチドを含む、第６のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、請求項４に記載の混合物。
【請求項５５】
前記第６のオリゴヌクレオチドにおける前記標的バリアントヌクレオチドが、前記第６のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、請求項５３または５４に記載の混合物。
【請求項５６】
前記第６のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、請求項５３、５４、または５５に記載の混合物。
【請求項５７】
前記第６のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項５６に記載の混合物。
【請求項５８】
前記第６のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識が、第１の末端ヌクレオチド上にある、請求項５６または５７に記載の混合物。
【請求項５９】
前記第６のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、請求項５３、５４、または５６のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項６０】
前記第６のオリゴヌクレオチドの前記消光部分が、前記第６のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、請求項５９に記載の混合物。
【請求項６１】
前記第６のオリゴヌクレオチドの前記消光部分が、前記第６のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、請求項５９または６０に記載の混合物。
【請求項６２】
前記第４および第５のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、請求項５３または５４に記載の混合物。
【請求項６３】
前記第４および第５のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、請求項５３または５４に記載の混合物。
【請求項６４】
前記第６のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、請求項５３または５４に記載の混合物。
【請求項６５】
前記第６のオリゴヌクレオチドが、プローブである、請求項５３または５４に記載の混合物。
【請求項６６】
前記第４、第５、および／または第６のオリゴヌクレオチドが、１０〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項５３または５４に記載の混合物。
【請求項６７】
前記第６のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、請求項５３または５４に記載の混合物。
【請求項６８】
前記第６のオリゴヌクレオチドの前記遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、請求項６７に記載の混合物。
【請求項６９】
前記第６のオリゴヌクレオチドの前記ＭＧＢ部分が、前記第６のオリゴヌクレオチドの前記３’末端および／または３’部分に位置している、請求項６８に記載の混合物。
【請求項７０】
前記混合物が、
ａ）前記第１のオリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第４のオリゴヌクレオチドであって、前記第４のオリゴヌクレオチドが、前記第１の配列に実質的にハイブリダイズするように構成され、その３’末端に前記標的バリアントヌクレオチドの相補体とは異なるヌクレオチドを含む、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第３のオリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第５のオリゴヌクレオチドであって、前記第５のオリゴヌクレオチドが、前記標的バリアントヌクレオチドの部位に異なるヌクレオチドを含む、第５のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項７１】
前記異なるヌクレオチドが、その３’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、請求項７０に記載の混合物。
【請求項７２】
前記第５のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、請求項７０または７１に記載の混合物。
【請求項７３】
前記第５のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項７２に記載の混合物。
【請求項７４】
［７４］  前記第５のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識が、前記第５のオリゴヌクレオチドの第１の末端ヌクレオチド上にある、請求項７２または７３に記載の混合物。
［７４］  前記第５のオリゴヌクレオチド上の前記検出可能な標識が、前記第３のオリゴヌクレオチド上の前記検出可能な標識と区別可能である、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項７５】
前記第５のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項７６】
前記第５のオリゴヌクレオチドの前記消光部分が、前記第５のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、請求項７５に記載の混合物。
【請求項７７】
前記第５のオリゴヌクレオチドの前記消光部分が、前記第５のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、請求項７５または７６に記載の混合物。
【請求項７８】
前記第４のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、請求項７０に記載の混合物。
【請求項７９】
前記第４のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、請求項７０に記載の混合物。
【請求項８０】
前記第５のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、請求項７０に記載の混合物。
【請求項８１】
前記第５のオリゴヌクレオチドが、プローブである、請求項７０に記載の混合物。
【請求項８２】
前記第４および第５のオリゴヌクレオチドが、１０〜４０個のヌクレオチドを含む、請求項７０に記載の混合物。
【請求項８３】
前記第５のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、請求項７０に記載の混合物。
【請求項８４】
前記第５のオリゴヌクレオチドの前記遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、請求項８３に記載の混合物。
【請求項８５】
前記第５のオリゴヌクレオチドの前記ＭＧＢ部分が、前記第５のオリゴヌクレオチドの前記３’末端および／または３’部分に位置している、請求項８４に記載の混合物。
【請求項８６】
複数のオリゴヌクレオチドセットを含む混合物であって、各オリゴヌクレオチドセットが、
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含み、
各セットの前記第１のオリゴヌクレオチドが、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成される、混合物。
【請求項８７】
各オリゴヌクレオチドセットが、
ｃ）前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第３の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列と少なくとも部分的に重複し、前記第３の配列が、前記標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含み、
各セットの前記第３のオリゴヌクレオチドが、異なる第３の配列と配列類似性を共有し、
各セットの前記第３のオリゴヌクレオチドが、異なる区別可能な検出可能な標識を含む、請求項８６に記載の混合物。
【請求項８８】
複数のオリゴヌクレオチドセットを含む混合物であって、各オリゴヌクレオチドセットが、
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在する第１の配列（Ａ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド（「第１のバリアントヌクレオチド」）を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の配列（Ｂ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の配列が、第３の配列（Ｃ）に相補的であり、前記第３の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、前記第３の配列（Ｃ）が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列（Ａ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含み、
各セットの前記第１のオリゴヌクレオチドが、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成される、混合物。
【請求項８９】
各オリゴヌクレオチドセットが、
ｃ）第５の配列（Ｅ）に相補的な第４の配列（Ｄ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第５の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、前記第５の配列（Ｅ）が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖における前記第１の配列（Ａ）と少なくとも部分的に重複し、前記第１の標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含み、
各セットの前記第３のオリゴヌクレオチドが、異なる第３の配列と配列類似性を共有し、
各セットの前記第３のオリゴヌクレオチドが、異なる区別可能な検出可能な標識を含む、請求項８８に記載の混合物。
【請求項９０】
前記混合物が、ポリメラーゼをさらに含む、請求項１〜８９のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項９１】
前記ポリメラーゼが、熱安定性である、請求項９０に記載の混合物。
【請求項９２】
前記混合物が、ホットスタート成分をさらに含む、請求項９１に記載の混合物。
【請求項９３】
前記ホットスタート成分が、熱安定性ポリメラーゼに向けられた抗体、オリゴヌクレオチド、アプタマー、および／または前記ポリメラーゼの化学修飾を含む、請求項９２に記載の混合物。
【請求項９４】
前記混合物が、ヌクレオチド源をさらに含む、請求項１〜９３のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項９５】
前記第３のオリゴヌクレオチドが、加水分解プローブである、請求項１〜９４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項９６】
前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含むことが疑われる核酸試料をさらに含む、請求項１〜９５のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項９７】
前記標的バリアントヌクレオチドが、突然変異体対立遺伝子内にある、請求項１〜９６のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項９８】
前記突然変異体対立遺伝子が、前記標的バリアントヌクレオチドにおけるプリンからプリンへの単一点突然変異またはピリミジンからピリミジンへの単一点突然変異のいずれかである、請求項９７に記載の混合物。
【請求項９９】
前記突然変異体対立遺伝子が、ＫＲＡＳ癌遺伝子の対立遺伝子である、請求項９７または９８に記載の混合物。
【請求項１００】
前記突然変異体対立遺伝子が、確率的突然変異である、請求項９７に記載の混合物。
【請求項１０１】
前記標的バリアントヌクレオチドが、メジャー対立遺伝子バリアントまたはマイナー対立遺伝子バリアントに対応する同一性を有する、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１０２】
前記標的バリアントヌクレオチドが、１％未満のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有するマイナー対立遺伝子バリアントの同一性を有する、請求項１０１に記載の混合物。
【請求項１０３】
前記標的バリアントヌクレオチドが、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有するマイナー対立遺伝子バリアントの同一性を有する、請求項１０２に記載の混合物。
【請求項１０４】
前記標的バリアントヌクレオチドが、一塩基多型の位置で発生する、請求項１〜１０３のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１０５】
前記混合物が、マスターミックスである、請求項１〜９５のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１０６】
前記マスターミックスが、４〜８℃で最大１２ヶ月間安定である、請求項１０５に記載の混合物。
【請求項１０７】
前記混合物が、反応混合物である、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１０８】
前記反応混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列を含むアンプリコンをさらに含む、請求項１０７に記載の混合物。
【請求項１０９】
前記反応混合物が、任意の他の異なる（例えば、第２の）ポリヌクレオチド鎖の配列を含むアンプリコンを含まない、請求項１０８に記載の混合物。
【請求項１１０】
前記混合物が、以下：
ａ）少なくとも１つの洗浄剤、
ｂ）グリセロール、および
ｃ）少なくとも１つの参照色素のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１〜１０９のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１１１】
前記混合物が、ウシ血清アルブミンおよび／またはゼラチンをさらに含む、請求項１〜１１０のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１１２】
前記混合物が、凍結乾燥される、請求項１〜１０６のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１１３】
任意の前述の請求項に記載の混合物を含有する第１の容器と、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖と配列類似性を共有するポリヌクレオチド分子を含む対照ポリヌクレオチド試料を含有する第２の容器と、を含む、キット。
【請求項１１４】
前記対照ポリヌクレオチド試料が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖全体を含む、請求項１１３に記載のキット。
【請求項１１５】
前記対照ポリヌクレオチド試料が、前記標的バリアントヌクレオチドにおける前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖と配列類似性を共有しない、請求項１１３に記載のキット。
【請求項１１６】
試験ポリヌクレオチド試料において標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と請求項２または４に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）少なくとも前記第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、前記試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチド分子の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）ステップｂ）において生成された前記アンプリコンを、前記第３のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｃ）において前記アンプリコンを検出することが、前記標的ポリヌクレオチド分子が前記試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
【請求項１１７】
前記標的ポリヌクレオチド分子が、ポリヌクレオチド分子の混合物を含む試験ポリヌクレオチド試料において検出され、前記混合物が、前記標的バリアントヌクレオチドの第１のバリアント形態を含むポリヌクレオチド分子（「第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子」）、および前記標的バリアントヌクレオチドの第２のバリアント形態を含むポリヌクレオチド分子（「第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子」）を含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記試験ポリヌクレオチド試料が、標的ポリヌクレオチド配列を含まないポリヌクレオチド鎖（「非標的ポリヌクレオチド分子」）を含む、請求項１１６または１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記試験試料が、標的ポリヌクレオチド分子よりも多くの非標的ポリヌクレオチド分子を含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記標的ポリヌクレオチド分子が、突然変異体ポリヌクレオチド配列である、請求項１１６〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記非標的ポリヌクレオチド分子が、メジャー対立遺伝子または野生型ポリヌクレオチド配列である、請求項１１８〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記試験試料が、非標的ポリヌクレオチド分子と比較して、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満の標的ポリヌクレオチド分子を含む、請求項１１８〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記試験試料が、第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子と比較して、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満の第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子を含む、請求項１１７〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子および／または第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子が、突然変異体ポリヌクレオチド配列である、請求項１１７〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子および／または第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子が、野生型ポリヌクレオチド配列である、請求項１１７〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
ステップａ）〜ｃ）の前の前記第２のバリアントポリヌクレオチド分子と比較して、前記ポリヌクレオチド試験試料における第１のバリアントポリヌクレオチド分子の数を富化することをさらに含む、請求項１１７〜１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記富化することが、ステップａ）〜ｃ）のいずれかにおいて使用されるものと比較して異なる条件を含む増幅反応を含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ポリヌクレオチド試験試料における第１のバリアントポリヌクレオチド分子の数が、前記第２のバリアントポリヌクレオチド分子と比較して、少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、または１０倍富化される、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記富化することが、前記第１のオリゴヌクレオチドの計算された融解温度（ＴM）よりも１２〜１６度高い温度での１５〜２５サイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応を使用して実施される、請求項１２６〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
ステップｂ）が、前記第３のオリゴヌクレオチドのＴMに近く、前記富化することが実施される温度よりも４〜６度低い温度での３５〜４０サイクルを使用して実施される、請求項１２６〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記試験ポリヌクレオチド試料が、哺乳動物もしくは非哺乳動物の動物組織もしくは細胞、または植物組織もしくは細胞に由来する、請求項１１６〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記試料が、唾液、頬組織、皮膚、毛髪、血液、血漿、尿、糞便、精液、および腫瘍試料からなる群から選択される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記ポリヌクレオチド試験試料が、癌細胞に由来する、請求項１３１または１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
アンプリコンの検出が、前記試験ポリヌクレオチド試料が由来する組織内の癌細胞の存在を示す、請求項１３１〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記標的ポリヌクレオチドが、Ｒａｓ、ＥＦＧＲ、Ｋｉｔ、ｐＴＥＮ、および／もしくはｐ５３における少なくとも１つの突然変異、ならびに／または少なくとも１つのＫＲＡＳもしくはＮＲＡＳ突然変異を含む、請求項１１６〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項１１６〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドのＴｍよりも８〜１２℃高いＴｍを有し、前記ＰＣＲが、前記第１のオリゴヌクレオチドのＴｍの５℃以内であるアニーリング温度で実施される、請求項１３６または１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記方法が、少なくとも前記第１のオリゴヌクレオチド、前記第２のオリゴヌクレオチド、および前記第３のオリゴヌクレオチドを含有する第１の容器と、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む対照ポリヌクレオチド試料を含有する第２の容器と、を含む、キットを使用して実施される、請求項１１６〜１３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記方法が、突然変異を示す標的バリアントヌクレオチドを検出し、前記試験ポリヌクレオチド試料が、前記標的ポリヌクレオチドの１〜１０コピーを含む、請求項１１６〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記標的バリアントヌクレオチドが、プリン塩基を含み、前記標的バリアントヌクレオチド位置における対応する野生型ヌクレオチドが、異なるプリン塩基を含む、請求項１１６〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記標的バリアントヌクレオチドが、ピリミジン塩基を含み、前記標的バリアントヌクレオチド位置における対応する野生型ヌクレオチドが、異なるピリミジン塩基を含む、請求項１１６〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
試験ポリヌクレオチド試料において標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と請求項１〜９４、１０４、１０５、および１０９〜１１１のいずれか一項に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）少なくとも前記第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、前記試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチド分子の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）ステップｂ）において生成された前記アンプリコンを、前記第３のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｃ）において前記アンプリコンを検出することが、前記標的ポリヌクレオチド分子が前記試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
【請求項１４４】
試験ポリヌクレオチド試料において、各々が標的バリアントヌクレオチドを含む、少なくとも２つの異なる標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と請求項５３または５４に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）前記第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、前記試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、第１の標的ポリヌクレオチド分子の第１の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）前記第４および第５のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、前記試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、第２の標的ポリヌクレオチド分子の第２の標的ポリヌクレオチド配列の第２のアンプリコンを生成することと、
ｄ）ステップｂ）およびｃ）において生成された前記アンプリコンを、前記第３および第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｄ）において前記アンプリコンを検出することが、前記第１および／または第２の標的ポリヌクレオチド分子が前記試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
【請求項１４５】
前記第３および第６のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な特性が、蛍光標識である、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記第３および第６のオリゴヌクレオチドの各々の上の前記蛍光標識が異なる、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記混合物が、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異を検出するために使用される、請求項１〜１１２のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１４８】
前記キットが、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異の検出のために使用される、請求項１１３〜１１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４９】
前記方法が、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異を検出するために使用される、請求項１１６〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月１６日に出願された、米国仮特許出願第６２／７１９，０７４号の優先権を主張し、その開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、標的ポリヌクレオチド、特に突然変異体または低存在量の標的ポリヌクレオチドを検出する際の使用のための試薬、混合物、キット、および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、癌の検出および治療は進歩している。この進歩の大部分は、我々が、癌の分子基盤および免疫系を回避するために癌細胞によって使用される詳細な分子メカニズムの理解を深めていることによるものである。よって、特定の癌治療に応答するであろう患者を特定するのに役立つバイオマーカーが特定されている。例えば、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）などの腫瘍細胞に見られるバイオマーカーは、抗ＰＤ−１抗体などの免疫療法に応答するであろう患者を特定する。さらに、バイオマーカーには、特定の遺伝子における特異的な突然変異が含まれる。例えば、特定のキナーゼにおける突然変異の検出は、キナーゼ阻害剤の癌治療剤に応答する可能性がはるかに高い患者を特定するのに役立ち得る。次いで、癌がさらに突然変異して第１のキナーゼの遮断を克服すると、癌にこの第１のキナーゼを克服する能力を与える新しい突然変異の検出が、このタイプの癌に有効であり得る次の選択療法を特定するために、ここで使用され得る。
【０００４】
癌における突然変異を検出する能力は、低存在量の対立遺伝子を検出するための改善された方法を必要とする。腫瘍を構成する癌性細胞における不均一性のために、腫瘍の根底にある遺伝的欠陥を特定する場合、低存在量の対立遺伝子の検出が重要である。さらに、正常細胞からの循環ＤＮＡと比較して相対的に少量の循環腫瘍ＤＮＡの存在のために、癌患者の循環ＤＮＡの分析では低存在量の対立遺伝子の検出が重要である。両方の文脈において、そのような低存在量の対立遺伝子をより良好に検出する能力は、癌患者の改善された検出および改善された標的治療につながるはずである。現在利用可能なシステムは、非常に少ないコピー数（例えば、３０ｎｇの試験核酸試料において１０コピー未満および／または０．１％未満）で標的ポリヌクレオチド（例えば、突然変異体核酸配列を含む）を検出することができないか、または非常に費用がかかり、かつ／もしくは時間がかかり、複雑であるかのいずれかである。よって、当該技術分野では、低存在量の標的ポリヌクレオチドを検出する際の使用のための単純化された入手可能な試薬、混合物、キット、および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
低存在量の標的ポリヌクレオチドを検出する際の使用のための試薬、混合物、キット、および方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本開示は、ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖（二本鎖ポリヌクレオチドにおける第１の鎖など）における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを有し、第１のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、ｂ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列に相補的な配列に（例えば、第１の鎖に相補的である第２の鎖の一部分に）ハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、ｃ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖および標的バリアントヌクレオチドの第１の配列と少なくとも部分的に重複する、第３のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物に関する。いくつかの実施形態では、追加のオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドのセットも提供される。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、検出可能である。そのような混合物を提供するために組み合わされる試薬もまた、それを含む、および／またはそれを使用するキットおよび方法と同様に、本明細書で企図される。本開示の態様および実施形態に関するさらなる詳細は、この特許出願全体を通して提供される。セクションおよびセクションヘッダーは、方法、組成物、およびキットまたはその中の機能要素の組み合わせを限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】例示的な標的ポリヌクレオチドと整列させた例示的な第１のオリゴヌクレオチド（例えば、標的配列特異的プライマー（「ＴＳＰ」））、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、遺伝子座特異的プライマー（「ＬＳＰ」））、および第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）。
【図２Ａ−２Ｆ】富化サイクルあり（図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃ）およびなし（図２Ｄ、２Ｅ、および２Ｆ）での、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ（３４Ｇ＞Ｃ）標的ポリヌクレオチドの検出のための、例示的な標的配列特異的プライマー（ＴＳＰ）、および遺伝子座特異的プライマー（ＬＳＰ）を使用した標的ポリヌクレオチドの例示的な増幅。野生型ＤＮＡの試料（１０ｎｇ）またはスパイク試料（０．１％の対立遺伝子バリアントＤＮＡ（例えば、突然変異体ＤＮＡ）がスパイクされた１０ｎｇの野生型ＤＮＡ（ＣＥＰＨ個体１３４７−０２からの対照ＤＮＡ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ．Ｎｏ．４０３０６２、以下で「ＣＥＰＨ」と呼ばれる））は、３００ｎＭの各プライマー、２５０ｎＭのプローブ、１ｍＭのｄＮＴＰ、３９ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、３０ｍＭのＫＣｌ、１６ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、７％グリセロール、および０．０８５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑと組み合わせ、反応混合物を形成した。次に、混合物の１０μｌアリコートを９６ウェルプレートの４つの複製ウェルに播種した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ５  Ｆ９６（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）上の各ウェルにおいてｑＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、富化フェーズあり（図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃ）または富化フェーズなし（図２Ｄ、２Ｅ、および２Ｆ）で行った。
【図３Ａ−３Ｆ】富化サイクルあり（図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃ）およびなし（図３Ｄ、３Ｅ、および３Ｆ）での、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ（３５Ｇ＞Ｃ）標的ポリヌクレオチドについての、例示的な標的配列特異的プライマー（ＴＳＰ）、および遺伝子座特異的プライマー（ＬＳＰ）を使用した標的ポリヌクレオチドの例示的な増幅。野生型ＤＮＡの試料（１０ｎｇ）またはスパイク試料（０．１％の対立遺伝子バリアントＤＮＡ（例えば、突然変異体ＤＮＡ）がスパイクされた１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ）は、３００ｎＭの各プライマー、２５０ｎＭのプローブ、１ｍＭのｄＮＴＰ、３９ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、３０ｍＭのＫＣｌ、１６ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、７％グリセロール、および０．０８５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑと組み合わせ、反応混合物を形成した。次に、混合物の１０μｌアリコートを９６ウェルプレートの４つの複製ウェルに播種した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ５  Ｆ９６（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）上の各ウェルにおいてｑＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、富化フェーズあり（図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃ）または富化フェーズなし（図３Ｄ、３Ｅ、および３Ｆ）で行った。
【図４Ａ−４Ｆ】野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡおよび０．１％の以下の対立遺伝子バリアント（例えば、突然変異体）ＫＲＡＳ  ＤＮＡ：ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ（３４Ｇ＞Ｃ、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２８７）（図４Ａ）、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ（３５Ｇ＞Ｃ、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２６５）（図４Ｂ）、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ（３４Ｇ＞Ａ、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２８８）（図４Ｃ）、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ（３４Ｇ＞Ｔ、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２６９）（図４Ｄ）、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ（３５Ｇ＞Ａ、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２７２）（図４Ｅ）、またはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ（３５Ｇ＞Ｔ、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２８９）（図４Ｆ）で個別にスパイクされた野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡの区別。ＰＣＲ条件は、富化ありで、図２および３について上記の通りであった。
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａでは、突然変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ（「Ｇ１３Ｄ」）標的ポリヌクレオチドと野生型（ＣＥＰＨ）核酸との間の区別は、最大６０ｍＭのＫＣｌ（塩化カリウム）および最大３０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4（硫酸アンモニウム）を含むｑＰＣＲ反応において観察された。図５Ｂでは、突然変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ標的ポリヌクレオチドと野生型（ＣＥＰＨ）核酸との間の区別は、ＫＣｌおよび（ＮＨ4）2ＳＯ4（硫酸アンモニウム）を欠くｑＰＣＲ反応において観察されなかった。野生型ＤＮＡは、両方の反応において０．２％の突然変異体ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ標的ポリヌクレオチドでスパイクした。
【図６Ａ−６Ｄ】標的ポリヌクレオチドの増幅および検出に対する塩化カリウムおよび硫酸アンモニウムの効果。１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、３００ｎＭの各プライマー（ＴＳＰおよびＬＳＰ）、２５０ｎＭのプローブ、１ｍｍのｄＮＴＰ、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および７％グリセロールを含有する２０ｕＬの反応混合物を調製した。塩化カリウムおよび硫酸アンモニウムは、以下に記載されるように反応混合物に滴定した。図６Ａ：ＫＣｌまたは硫酸アンモニウムなし（区別なし）、図６Ｂ：３０ｍＭの硫酸アンモニウム、塩化カリウムなし（いくらか区別）、図６Ｃ：３０ｍＭのＫＣｌおよび３０ｍＭの硫酸アンモニウム（十分な区別）、ならびに図６Ｄ：６０ｍＭのＫＣｌおよび３０ｍＭの硫酸アンモニウム（抑制された反応）。Ｇ１３Ｄ突然変異体スパイクとの反応は、野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡに０．２％でスパイクされた２０ｐｇのＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ参照標準ＤＮＡ（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２９０）を含有した。以下の熱サイクリングプロトコル：９５℃（３分）、９５℃（３秒）／６４℃（２０秒）１９サイクル（富化フェーズ）、次いで９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）４０サイクル（増幅および検出フェーズ）を使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ７装置で反応を増幅した。
【図７Ａ−７Ｂ】図６において上記の通りのｑＰＣＲ条件（野生型ＤＮＡにスパイクされた０．１５％の突然変異体ＤＮＡを含む）を使用するが、示された濃度のＫＣｌおよび硫酸アンモニウムを含む中間濃度の試験。図７Ａは、４５ｍＭのＫＣｌおよび３０ｍＭの硫酸アンモニウムを含んだ。図７Ｂは、４５ｍＭのＫＣｌおよび２２ｍＭの硫酸アンモニウムを含んだ。
【図８】第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）の末端からの標的可変ヌクレオチドの距離の効果。実験は、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、および７％グリセロール、３００ｎＭの各プライマー（ＴＳＰおよびＬＳＰ）、２５０ｎＭのプローブ１、２、または３のうちの１つ、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、および１０ｐｇのＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ参照標準ＤＮＡ（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２５４）を含有する２０μＬの反応において実施した。示されるデータは、プローブの３’末端から３（プローブ１）、４（プローブ２）、または５（プローブ３）ヌクレオチドに位置している標的バリアントヌクレオチドで効果的な増幅およびリアルタイム検出が達成されたことを示す。
【図９Ａ−９Ｆ】野生型ＤＮＡにスパイクされた突然変異体標的ＤＮＡの滴定およびその区別。これらの実験は、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、および７％グリセロールを含有する２０μＬの反応において行った。示された点突然変異を含有する人工突然変異体テンプレートの５０ｆＭ溶液を、まず３０００コピー／ｕＬに、次いで２５０コピー／ｕＬに希釈し、次いで２倍希釈を２コピー／ｕＬまで行った。以下の熱サイクリングプロトコル：９５℃（３分）、９５℃（３秒）／６４℃（２０秒）１９サイクル（富化フェーズ）、次いで９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）４０サイクルを使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ７装置で反応を増幅した。実験は、以下の量およびコピーのプライマーおよび標的ポリヌクレオチドを使用して行った。図９Ａは、３００ｎＭの各プライマーおよび２５０コピーの標的ポリヌクレオチドを含み、図９Ｂは、３００ｎＭの各プライマーおよび１６コピーの標的ポリヌクレオチドを含み、図９Ｃは、３００ｎＭの各プライマーおよび２コピーの標的ポリヌクレオチドを含み、図９Ｄは、４５０ｎＭの各プライマーおよび２５０コピーの標的ポリヌクレオチドを含み、図９Ｅは、４５０ｎＭの各プライマーおよび１６コピーの標的ポリヌクレオチドを含み、図９Ｆは、４５０ｎＭの各プライマーおよび２コピーの標的ポリヌクレオチドを含んだ。
【図１０】突然変異体ＤＮＡの野生型ＤＮＡへの滴定。これらの実験は、図９Ａ〜９Ｆについて記載される通り、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、および７％グリセロールを含有する２０μＬの反応を使用して行った。人工突然変異体テンプレートの５０ｆＭ溶液は、まず３０００コピー／ｕＬに、次いで２５０コピー／ｕＬに希釈し、次いで２倍希釈を２コピー／ｕＬまで行った。以下の熱サイクリングプロトコル：９５℃（３分）、９５℃（３秒）／６４℃（２０秒）１９サイクル（富化フェーズ）、次いで９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）４０サイクルを使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ７装置で反応を増幅した。反応にスパイクされた各プライマーの量およびバリアント対立遺伝子（例えば、突然変異体）ポリヌクレオチドのコピーは、示される通りであった。左側ｙ軸は、ＦＡＭのＣｑを示す。右側軸は、ＦＡＭ−ＶＩＣのデルタＣｑを示す。
【図１１】３０００、３００、３０、および３コピーの標的ポリヌクレオチド（ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ）の示された数の希釈を野生型ＤＮＡにスパイクした。これらの実験では、３００ｎＭの各プライマー（ＴＳＰおよびＬＳＰ）、２５０ｎＭのプローブ、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、および示された量の突然変異体ＤＮＡ（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ５７４）、１コピー未満、３コピー、３０コピー、３００コピー、または３０００コピー、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および７％のグリセロールを含有する２０ｕＬの反応混合物を調製した。データはＥｘｃｅｌ形式でエクスポートし、複製反応についてのＣｑ値は平均化し、各条件における標的のデルタ平均Ｃｑは決定、プロットした（データは図示しない）。デルタＣｑは、定量化方法として使用した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ７の熱サイクリング条件は、９５℃（３分）、富化フェーズ−９５℃（３秒）／６４℃（２０秒）の１９サイクル、増幅−９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）の４０サイクルであった。「ｎｔｃ」＝テンプレートコントロールなし。
【図１２】標的ポリヌクレオチド（ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｋ）の示されたコピー数（２、４、８、１６、３１、６２、１２５、または２５０コピー）の希釈を野生型ＤＮＡにスパイクした。これらの実験では、３００ｎＭの各プライマー（ＴＳＰおよびＬＳＰ）、２５０ｎＭのプローブ、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、および示された量の突然変異体（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ３５１）、２、４、８、１６、３１、６２．５、１２５、または２５０コピー、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および７％のグリセロールを含有する２０ｕＬの反応混合物を調製した。データはＥｘｃｅｌ形式でエクスポートし、複製反応についてのＣｑ値は平均化し、各条件における標的のデルタ平均Ｃｑは決定、プロットした（データは図示しない）。デルタＣｑは、定量化方法として使用した。Ｑｕａｎｔ  Ｓｔｕｄｉｏ  ７の熱サイクリング条件は、９５℃（３分）、９５℃（３秒）／６４℃（２０秒）の１９サイクル、９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）の４０サイクルであった。
【図１３Ａ−１３Ｃ】標的ポリヌクレオチド（ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ）の３コピーの、２０ｎｇ（０．０５％スパイクイン、図１３Ａ）、１０ｎｇ（０．１％スパイクイン、図１３Ｂ）、および５ｎｇ（０．２％スパイクイン、図１３Ｃ）野生型ＤＮＡへの希釈。これらの実験は、３００ｎＭのＫＲＡＳ順方向および逆方向プライマー、１００ｎＭのＲＰＰＨ１順方向および逆方向プライマー、２５０ｎＭのＫＲＡＳ−ＦＡＭプローブ、１５０ｎＭのＲＰＰＨ１−ＶＩＣプローブ、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、７％グリセロールを含有する反応混合物において実施した。１０ｐｇのＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ参照標準ＤＮＡ（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２８７）、示された量の野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡを調製した。以下の熱サイクリングプロトコル：９５℃（２分）、９５℃（１秒）／６４℃（２０秒）１９サイクル（富化）、次いで９５℃（１秒）／６０℃（２０秒）４０サイクルを使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ５で反応を実行した。
【図１４】標的ポリヌクレオチドの増幅における逆方向ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ（３５Ｇ＞Ａ）プライマーの使用。これらの実験は、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、３００ｎＭの示されたＫＲＡＳ順方向および逆方向プライマー、２５０ｎＭのＫＲＡＳプローブを含有する２０ｕＬの反応混合物において実施し、突然変異体ＫＲＡＳ（示されるように、Ｇ１２ＤまたはＧ１２Ｓ）参照標準ＤＮＡの１０ｐｇのスパイク（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、それぞれ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２７２またはＨＤ２８８）を利用し、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および７％のグリセロールを調製した。熱サイクリング条件は、９５℃（３分）、９５℃（３秒）、６４℃（２０秒）（富化）の１９サイクル、続いて９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）の４０サイクルであった。
【図１５】図１４について記載されるように実施されるが、代わりにＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ（３４Ｇ＞Ａ）の逆方向プライマーを使用する、標的ポリヌクレオチドの増幅における逆方向ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ（３４Ｇ＞Ａ）プライマーの使用。
【図１６Ａ−１６Ｆ】野生型ＤＮＡの存在下での標的ポリヌクレオチド（０．１％突然変異体標的ポリヌクレオチド）の増幅。図１６Ａ．ＥＧＦＲ２０  Ｔ７９０Ｍ（２３６９Ｃ＞Ｔ、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２５８）標的ポリヌクレオチド。図１６Ｂ．ＥＧＦＲ１９（ｄｅｌ７４６−７５０、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２５１）標的ポリヌクレオチド。図１６Ｃ．ＮＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ（３５Ｇ＞Ａ、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ７４５）標的ポリヌクレオチド。図１６Ｄ．ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ（１７９９Ｔ＞Ａ、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２３８）標的ポリヌクレオチド。図１６Ｅ．ＮＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ（３８Ｇ＞Ａ、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ７４５）標的ポリヌクレオチド。図１６Ｆ．ＥＧＦＲ  Ｌ８６１Ｑ（２５８２Ｔ＞Ａ、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２５７）標的ポリヌクレオチド。実験の各々は、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、各々３００ｎＭの第１および第２のオリゴヌクレオチド（例えば、標的配列特異的プライマー（ＴＳＰ）および遺伝子座特異的プライマー（ＬＳＰ））、２５０ｎＭのプローブを含有する２０ｕＬの反応混合物において実施し、上記で列挙される対応する突然変異体ＤＮＡの１０ｐｇのスパイクを利用し（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および７％のグリセロールを調製した。データはＥｘｃｅｌ形式でエクスポートし、複製反応についてのＣｑ値は平均化し、各条件における標的のデルタ平均Ｃｑは決定、プロットした（データは図示しない）。デルタＣｑは、定量化方法として使用した。使用された熱サイクリング条件は、９５℃（３分）、９５℃（３秒）／６４℃（２０秒）の１９サイクル（富化）、続いて９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）の４０サイクルであった。
【図１７Ａ−１７Ｂ】異なる長さのプローブを使用した標的ポリヌクレオチドの増幅。図１７Ａ．ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｌ（１８２Ａ＞Ｔ）、１６および２１ヌクレオチドプローブ。図１７Ｂ．ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｈ（１８３Ａ＞Ｔ）、１５および２０ヌクレオチドプローブ。これらの実験は、３００ｎＭの各プライマー、２５０ｎＭの対応するプローブ、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡを含有する２０ｕＬの反応混合物において実施し、２０ｐｇ  ＮＲＡＳ  Ｑ６１ＬまたはＱ６１Ｈ参照標準ＤＮＡの突然変異体スパイク（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、それぞれ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ４１２またはＨＤ３０３）が含まれ、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および７％のグリセロールを調製した。以下の熱プロトコルを使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ５上で反応を実行した：９５℃（２分）、９５℃（１秒）／６４℃（２０秒）で１９サイクル（富化）、次いで９５℃（１秒）／６０℃（２０秒）で４０サイクル。
【図１８Ａ−１８Ｃ】野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡの存在下での標的ポリヌクレオチド（０．１％突然変異体標的ポリヌクレオチド）の増幅。図１８Ａ．ＥＳＲ１  Ｅ３８０Ｑ（１１３８Ｇ＞Ｃ）標的ポリヌクレオチド。図１８Ｂ．ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ（３１４０Ａ＞Ｇ）標的ポリヌクレオチド。図１８Ｃ．ＴＰ５３  Ｈ１７９Ｑ（５３７Ｔ＞Ａ）標的ポリヌクレオチド。実験の各々は、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、各々３００ｎＭの第１および第２のオリゴヌクレオチド（例えば、示された突然変異体標的およびＲＰＰＨ１対照標的の各々についての標的配列特異的プライマー（ＴＳＰ）および遺伝子座特異的プライマー（ＬＳＰ））、示された突然変異体標的およびＲＰＰＨ１対照標的の各々についての２５０ｎＭのプローブを含有する２０ｕＬの反応混合物において実施し、上記で列挙される対応する突然変異体ＤＮＡの１０ｐｇのスパイクを利用し、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および７％のグリセロールを調製した。データはＥｘｃｅｌ形式でエクスポートし、複製反応についてのＣｑ値は平均化し、各反応条件における標的のデルタ平均Ｃｑは決定、プロットした（データは図示しない）。ＲＰＰＨ１対照標的と各個々の突然変異体標的との間のデルタＣｑは、定量化方法として使用した。使用された熱サイクリング条件は、９５℃（３分）、９５℃（３秒）／６４℃（２０秒）の１９サイクル（富化）、続いて９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）の４０サイクルであった。
【図１９Ａ−１９Ｂ】野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡの存在下での標的ポリヌクレオチド（０．１％突然変異体標的ポリヌクレオチド）の増幅。図１９Ａ．ＴＰ５３  Ｙ２２０Ｃ（６５９Ａ＞Ｇ）標的ポリヌクレオチド。図１９Ｂ．ＴＰ５３  Ｒ２４９Ｍ（７４６Ｇ＞Ｔ）標的ポリヌクレオチド。実験の各々は、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、各々３００ｎＭの第１および第２のオリゴヌクレオチド（例えば、示された突然変異体標的およびＲＰＰＨ１対照標的の各々についての標的配列特異的プライマー（ＴＳＰ）および遺伝子座特異的プライマー（ＬＳＰ））、示された突然変異体標的およびＲＰＰＨ１対照標的の各々についての２５０ｎＭのプローブを含有する２０ｕＬの反応混合物において実施し、上記で列挙される対応する突然変異体ＤＮＡの１０ｐｇのスパイクを利用し、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および７％のグリセロールを調製した。データはＥｘｃｅｌ形式でエクスポートし、複製反応についてのＣｑ値は平均化し、各反応条件における標的のデルタ平均Ｃｑは決定、プロットした（データは図示しない）。ＲＰＰＨ１対照標的と各個々の突然変異体標的との間のデルタＣｑは、定量化方法として使用した。使用された熱サイクリング条件は、９５℃（３分）、９５℃（３秒）／６４℃（２０秒）の１９サイクル（富化）、続いて９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）の４０サイクルであった。
【図２０】例示的な野生型ＥＧＦＲおよびＢＲＡＦ配列。太字のヌクレオチドは、本明細書の他の場所に記載される突然変異体ポリヌクレオチドにおいて突然変異している塩基を表す。
【図２１】例示的な野生型ＫＲＡＳおよびＮＲＡＳ配列。太字のヌクレオチドは、本明細書の他の場所に記載される突然変異体ポリヌクレオチド（例えば、ＫＲＡＳ  ｃ．３４Ｇ、ｃ．３５Ｇ、ｃ．３８Ｇ）において突然変異している塩基を表す。
【０００７】
定義
本明細書で使用される場合、「マイナー対立遺伝子」または「マイナー対立遺伝子バリアント」という用語は、代替対立遺伝子バリアント（例えば、「メジャー対立遺伝子」および／または「野生型対立遺伝子」などの「豊富な対立遺伝子」）と比較して、試料中により低レベルで存在する標的ポリヌクレオチドを指す。例えば、マイナー対立遺伝子バリアントは、所与の一塩基多型（ＳＮＰ）または遺伝子についての別の対立遺伝子バリアントと比較して、１／１０、１／１００、１／１，０００、１／１０，０００、１／１００，０００、１／１，０００，０００、１／１０，０００，０００、１／１００，０００，０００、または１／１，０００，０００，０００未満の頻度で見られ得る（例えば、そのマイナー対立遺伝子頻度（「ＭＡＦ」）を有する）。あるいは、レア対立遺伝子バリアントは、例えば、試料または反応体積の１、１０、１００、１，０００マイクロリットルあたり２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１，０００、２，５００、５，０００、７，５００、１０，０００、２５，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、２５０，０００、５００，０００、７５０，０００、または１，０００，０００コピー未満であり得る。いくつかの実施形態では、所与のＳＮＰまたは遺伝子の別の対立遺伝子バリアントと比較して１，０００コピーにおいて１以下の頻度で存在する対立遺伝子は、本明細書において「レア対立遺伝子」、「レア対立遺伝子バリアント」、「低存在量の対立遺伝子」、または「低存在量の対立遺伝子バリアント」を指すことができる。当業者は、本明細書で明示的に定義されるもの以外のマイナー対立遺伝子またはマイナー対立遺伝子バリアントが本開示に適用可能であることを理解するであろう。
【０００８】
本明細書で使用される場合、「豊富な対立遺伝子」という用語は、代替対立遺伝子バリアントと比較して、試料中により高レベルで存在する標的ポリヌクレオチドを指す。豊富な対立遺伝子は、「メジャー対立遺伝子」および／または「野生型対立遺伝子」とも呼ばれ得る。例えば、豊富な対立遺伝子は、所与のＳＮＰもしくは遺伝子についての対立遺伝子バリアント、および／またはメジャー対立遺伝子（もしくは野生型対立遺伝子）と比較して、１０ｘ、１００ｘ、１，０００ｘ、１０，０００ｘ、１００，０００ｘ、１，０００，０００ｘ、１０，０００，０００ｘ、１００，０００，０００ｘ、または１，０００，０００，０００ｘを超える頻度で見られ得る。あるいは、豊富な対立遺伝子バリアントは、例えば、試料または反応体積の１、１０、１００、１，０００マイクロリットルあたり２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１，０００、２，５００、５，０００、７，５００、１０，０００、２５，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、２５０，０００、５００，０００、７５０，０００、１，０００，０００コピー超で存在し得る。当業者は、本明細書で明示的に定義されるもの以外の豊富な対立遺伝子が本開示に適用可能であることを理解するであろう。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示は、低存在量（または「レア」）標的ポリヌクレオチドなどの１つ以上の標的ポリヌクレオチド（あるいは、本明細書では標的ポリヌクレオチドおよび／または標的ポリヌクレオチド配列と呼ばれ得る）を検出する際の使用のための試薬、混合物、キット、および方法に関し、少なくとも１つの標的バリアントヌクレオチドについての特異性を有する標的配列特異的プライマー（「ＴＳＰ」と略されることもある）として機能する少なくとも第１のオリゴヌクレオチド、標的バリアントヌクレオチドではなく、標的ポリヌクレオチドについての特異性を有するプライマーとして機能する少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチド（遺伝子座特異的プライマー（「ＬＳＰ」）と呼ばれることもある）、および少なくとも１つの標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド配列についての結合特異性を有する標的部位特異的プローブとして機能し、検出可能な特性（例えば、検出可能な標識）を含むことができる、少なくとも第３のオリゴヌクレオチドを使用する、少なくとも１つの標的バリアントヌクレオチド（例えば、突然変異された遺伝子バリアントおよび／またはマイナー／特定の対立遺伝子バリアント）を含む。いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、豊富な代替核酸配列（例えば、非突然変異、「野生型」、またはメジャー対立遺伝子バリアント）を含む試料（例えば、混合物）内からの低存在量の標的ポリヌクレオチドを増幅する増幅反応において第１、第２、および第３のオリゴヌクレオチドを使用する試薬、キット、および方法に関する。いくつかの実施形態では、低存在量の標的ポリヌクレオチドは、検出可能なオリゴヌクレオチド（例えば、第３のオリゴヌクレオチドなどの標的部位特異的プローブ）の検出可能な特性における変化を検出することによって特定され得る。第１、第２、および第３のオリゴヌクレオチドを含む各混合物は、典型的には、特定の標的バリアントヌクレオチドを含む（またはそれに相補的である）特定の標的ポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれに相補的である、核酸配列についての結合特異性を有する１つのタイプの第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）のみを含むことができる。しかしながら、いくつかの実施形態では、混合物は、異なる標的配列特異的プライマー、遺伝子座特異的プライマー、および／または標的部位特異的プローブ（例えば、マルチプレックス反応など）を含むことができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（すなわち、プライマーおよびプローブ）、および／またはその混合物を使用して、より豊富な「野生型」核酸（例えば、非突然変異核酸、またはメジャー対立遺伝子を表す核酸（例えば、「メジャー対立遺伝子」または「メジャー対立遺伝子バリアント」）の存在下で、少量の、例えば、３コピー以下の１つ以上の低存在量の標的ポリヌクレオチド（複数可）（例えば、レア標的ポリヌクレオチド）を検出することができる。例示的な例では、混合物は、例えば、約１０ｐｇの低存在量（または「レア」）標的ポリヌクレオチドおよび約１０ｎｇのゲノムＤＮＡ、または約０．１％の低存在量（もしくは「レア」）標的ポリヌクレオチドを含み得る。他の実施形態、変形などは、本明細書で企図され、本開示から当業者によって理解されるであろう。
【００１０】
標的バリアントヌクレオチド
標的バリアントヌクレオチドは、核酸配列の異なるバージョン間で変化する標的ポリヌクレオチド配列内のヌクレオチド残基である（例えば、特定の突然変異体および／または対立遺伝子に対応する遺伝子および／またはコード配列）。いくつかの実施形態では、標的バリアントヌクレオチドは、対立遺伝子（すなわち、対立遺伝子バリアント）に「対応する」、関連する、および／またはその内に見られると言われ、それは、本開示の目的のために、遺伝子のコード配列、または遺伝子の非コード配列内に見られるか、またはそれらに関連し得る、特定の遺伝子の２つ以上のバリアント間のＤＮＡ配列の相違を表す。標的バリアントヌクレオチドは、メジャー対立遺伝子またはマイナー対立遺伝子に対応することができ、そのようなマイナー対立遺伝子は、それを低存在量の対立遺伝子またはレア対立遺伝子として認める頻度で見られ得る。いくつかの実施形態では、標的バリアントヌクレオチドは、より大きな対立遺伝子配列の相違の一部である。ヒトでは、個体のゲノム内の特定の対立遺伝子の存在は、例えば、目の色などの変化をもたらし得るが、特定の疾患状態にも関連または相関し得る。植物などの非哺乳動物では、ゲノムにおける特定の対立遺伝子の存在を使用して、例えば、特定の植物種、サブタイプ、および／または遺伝子型を特定することができる。標的バリアントヌクレオチドはまた、遺伝的、確率的（すなわち、ランダム）、または他の突然変異の結果として、標的ポリヌクレオチド内に存在し得る。標的バリアントヌクレオチドを含む例示的な突然変異は、例えば、異常な状態（例えば、疾患）をもたらす別のものについての「正常な」ヌクレオチドの置換、挿入、または欠失から生じる、点または他の突然変異を含む核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、標的バリアントヌクレオチドは、核酸配列の集団において、１／１０、１／１００、１／１，０００、１／１０，０００、１／１００，０００、１／１，０００，０００、１／１０，０００，０００、１／１００，０００，０００、または１／１，０００，０００，０００、およびその間の任意の分画範囲未満の頻度で存在する対立遺伝子バリアントに対応し得る。例えば、いくつかの実施形態では、標的バリアントヌクレオチドは、試料核酸集団の約１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、または０．０００１％のいずれか未満の集団頻度を有するマイナー対立遺伝子配列の同一性に対応する（すなわち、「集団頻度」は、試料がマイナー対立遺伝子を含む場合、ヘテロ接合型個体では５０％優勢であり得るため、ここでは「試料集団」を優先して参照される）。特定の実施形態では、標的対立遺伝子は、レア対立遺伝子または低存在量の対立遺伝子である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、標的バリアントヌクレオチドは、一塩基多型（「ＳＮＰ」）に対応し、かつ／またはその位置で発生し得る。ＳＮＰは、生物のゲノム全体で発生する遺伝性一塩基対変異である。ＳＮＰは、最も一般的な形態の遺伝的変異を含み、所与のヒトゲノムにおけるＳＮＰは１，０００万個を超えるという推定もある。ＳＮＰジェノタイピングは、個体および集団の特徴分析、ヒトおよび他の生物における疾患特性の研究、有利な作物特性の原因となる遺伝子の特定において中心的な役割を果たす。よって、ＳＮＰは、特定のヌクレオチドが別の個々の生物における対応する位置で見られるものとは異なる個々の生物のゲノムにおいて見られる、生物間の遺伝的変異の一般的な形態を表す。ＳＮＰは、結合ＳＮＰ（タンパク質産生または機能に対する影響なしに遺伝子の外側に位置している）、コードＳＮＰ（すなわち、遺伝子のコード領域内に位置している）、または非コードＳＮＰ（すなわち、遺伝子の調節配列内に位置している）であり得る。ヒトゲノムでは、ＳＮＰは、典型的には、３００個のヌクレオチド毎に約１個の頻度で発生し（すなわち、ヒトゲノム全体で約１，０００万個のＳＮＰが存在し得）、いくつかは、疾患と関連付けられている（例えば、疾患関連ＳＮＰ）。ＳＮＰはまた、発現量的形質遺伝子座（ｅＱＴＬ）と関連付けられており、これらのいくつかは、細胞型特異的であり得る。疾患に関連するＳＮＰは、本開示に特に関連している。ＳＮＰは、植物などの非ヒト生物にも見られる。いくつかの実施形態では、標的バリアントヌクレオチドは、任意のそのようなＳＮＰに対応し、かつ／またはそれらにおいて発生し得る。
【００１２】
いくつかの実施形態では、標的バリアントヌクレオチドは、点突然変異に対応することができ、これはまた、本明細書において対立遺伝子バリアントとみなされ得る。ヒトでは、標的バリアントヌクレオチドとして役立ち得る１つ以上の点突然変異から生じ得る例示的な疾患には、例えば、嚢胞性線維症（Ｆ５０８突然変異によって引き起こされる）、癌（例えば、腫瘍抑制遺伝子または特定の癌関連キナーゼ）、神経線維腫症（ニューロフィブロミン１または２突然変異）、鎌状赤血球貧血（β−グロビン突然変異）、テイ−サックス病（ＨＥＸＡ突然変異）、および色盲（例えば、Ｘ染色体突然変異）が含まれるが、これらに限定されない。癌に関連する例示的な突然変異には、Ｒａｓ（例えば、ＫＲＡＳ（例えば、コドン１２および／またはコドン１３における）またはおよび／またはＮＲＡＳ突然変異）、ＥＧＦＲ、Ｋｉｔ、ｐＴＥＮ、ＴＰ５３（ｐ５３としても知られる）、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＫＴ１、および／またはＥＳＲ１（表１および表２に列挙され、以下でより詳細に記載されるものなど）への突然変異が含まれるが、これらに限定されない。標的バリアントヌクレオチドは、任意のそのような突然変異に対応するか、一致するか、または関連し得る。したがって、いくつかの実施形態では、突然変異体対立遺伝子は、標的バリアントヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、突然変異体対立遺伝子は、標的バリアントヌクレオチドにおけるプリンからプリンへの単一点もしくは塩基突然変異、またはピリミジンからピリミジンへの単一点もしくは塩基突然変異のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、突然変異体対立遺伝子は、確率的突然変異であり得る。いくつかの実施形態では、標的バリアントヌクレオチドは、メジャー対立遺伝子配列またはマイナー対立遺伝子配列に対応する同一性を有することができる。本明細書で提供される方法を使用して、メジャー対立遺伝子およびマイナー対立遺伝子を検出、および任意に、定量化することができる。よって、標的バリアントヌクレオチドの同一性を、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド、混合物、および方法と共に使用して、メジャー対立遺伝子および／またはマイナー対立遺伝子を検出、分化、および任意に、定量化することができる。同様に、標的バリアントヌクレオチドの同一性を、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド、混合物、および方法と共に使用して、遺伝性または後天性疾患および／または障害に関連する標的ポリヌクレオチドを検出、分化、および任意に、定量化することができる。
【表１】
2021533769.tif 000003
【表２】
2021533769.tif 000004
【００１３】
第１のオリゴヌクレオチド（標的配列特異的プライマー、「ＴＳＰ」）
本明細書で提供される特定の態様では、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、標的配列特異的プライマー「ＴＳＰ」）は、典型的には、その末端ヌクレオチドで、または末端ヌクレオチドの３つのヌクレオチド内で、標的バリアントヌクレオチドの相補体（complement）に対応するか、これにハイブリダイズ可能である（例えば、ハイブリダイズするように構成される）か、またはこれを含む。標的バリアントヌクレオチドは、典型的には、単一のバリアントヌクレオチドを介して特定されるが、この標的バリアントヌクレオチドは、本明細書では第１の標的ポリヌクレオチドにおける第１の配列と呼ばれることがある、ヌクレオチドのより長い配列内に（例えば、対立遺伝子または突然変異遺伝子内などの標的ポリヌクレオチド内に）常在することが当業者によって理解されるであろう。したがって、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）は、標的ポリヌクレオチド鎖に相補的なヌクレオチド配列に対応するか、これにハイブリダイズ可能である（例えば、ハイブリダイズするように構成される）か、またはこれを含み、第１のオリゴヌクレオチドは、これに限定されないが、標的バリアントヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを含み、典型的にはこれによって終結される。標的ポリヌクレオチド鎖は、二本鎖核酸のいずれかの鎖であり得る。したがって、標的ポリヌクレオチド配列に対する第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）の相補性は、全体として第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）によって定義される結合特異性によって部分的に決定されるが、特に、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）の末端に存在する標的バリアントヌクレオチド（またはその相補体）によって決定される。第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）が順方向または逆方向プライマー（例えば、増幅反応における）であるかにかかわらず、標的バリアントヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）の３’末端に位置している。したがって、いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成され、第１の標的ポリヌクレオチドにおける第１の配列は、標的バリアントヌクレオチドを有し、第１のオリゴヌクレオチドは、標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端におけるヌクレオチドをさらに有する。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）は、１０〜３０個のヌクレオチド（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドのいずれか）、または例示的な実施形態では、１５〜２２個のヌクレオチドなどの１２〜３０個のヌクレオチドを含み得る。当業者によって理解されるように、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）の他の形態および／またはバージョンもまた、本明細書で企図される。
【００１４】
第２のオリゴヌクレオチド（遺伝子座特異的プライマー、「ＬＳＰ」）
第２のオリゴヌクレオチド（例えば、遺伝子座特異的プライマー「ＬＳＰ」）は、典型的には、標的ポリヌクレオチド（すなわち、標的ポリヌクレオチド）についての結合特異性を示すが、標的バリアントヌクレオチド（またはその相補体）位置では示さない。第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ）および第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）は、典型的には、必ずしもではないが、二本鎖標的ポリヌクレオチド配列の異なる鎖に結合する。よって、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ）は、典型的には、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）の上流または下流の、第１のポリヌクレオチド鎖の第２の配列と呼ばれることもある、ヌクレオチド配列についての結合特異性を有する。例えば、標的ポリヌクレオチドが二本鎖核酸である場合、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ）は、典型的には、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）が結合する鎖の、３’、または例示的な例では５’、およびその上に配置されたヌクレオチド配列に相補的であり、例示的な実施形態では、これと同一性を有するか、または有意に同一である配列にハイブリダイズするように構成される（すなわち、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ））は、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）がハイブリダイズするが、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）が結合するものとは異なる部位または位置にあるものに相補的な鎖に結合する。第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ）および第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）は、典型的には、必ずしもではないが、二本鎖標的ポリヌクレオチド配列の同じ鎖上の異なるヌクレオチド配列について結合特異性を有する。したがって、いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドは、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有し、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列は、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列から５’上流に位置している。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ）は、１０〜３０個のヌクレオチド（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドのいずれか）、または例示的な実施形態では、１６〜２４個のヌクレオチドなどの１２〜３０個、または１５〜２５個のヌクレオチドを含み得る。当業者によって理解されるように、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ）の他の形態および／またはバージョンもまた、本明細書で企図される。
【００１５】
第３のオリゴヌクレオチド（標的部位特異的プローブ）
第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）はまた、標的バリアントヌクレオチド位置で、または標的バリアントヌクレオチドを含む配列に対応するか、もしくはこれに相補的な位置で結合特異性を有し、典型的には、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成され、標的バリアントヌクレオチドは、第３のオリゴヌクレオチドの５’末端からの１〜８個のヌクレオチドである。しかしながら、典型的には、第３のオリゴヌクレオチドは、標的バリアントヌクレオチドと同一のヌクレオチドを有するが、典型的には、第３のオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドには有しない。よって、いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチド内の標的バリアントヌクレオチドと同一のヌクレオチドは、代わりに、末端ヌクレオチドの近くに配置されるが、末端ヌクレオチドには配置されない。例えば、標的バリアントヌクレオチドは、典型的には、第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）の末端ヌクレオチドの少なくとも２つ、および／または３〜６つのヌクレオチド内に配置されている。よって、いくつかの実施形態では、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）における標的バリアントヌクレオチドは、その３’末端からの少なくとも２つ、および／または２、３、４、５、もしくは６つ以内のヌクレオチドである。いくつかの例示的な実施形態では、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）における標的バリアントヌクレオチドは、その中央近くにあり、例えば、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）の３’または５’末端からの１〜７つのヌクレオチド残基（すなわち、１、２、３、４、５、６、または７つのヌクレオチド残基）内にある。いくつかの実施形態では、標的バリアントヌクレオチドは、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）の３’または５’末端からの３〜５つのヌクレオチド残基内に配置されている。いくつかの好ましい実施形態では、標的バリアントヌクレオチドは、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）の３’末端からの３〜５つのヌクレオチド残基内に配置されている。いくつかの好ましい実施形態では、標的バリアントヌクレオチドは、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）の５’末端からの３〜５つのヌクレオチド残基内に配置されている。いくつかの実施形態では、標的部位特異的プローブにおける標的バリアントヌクレオチドは、その中間位置（複数可）のヌクレオチド（複数可）からの約１〜３つのヌクレオチド残基に配置されている。いくつかの実施形態では、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）における標的バリアントヌクレオチドは、その３’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである。標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）はまた、典型的には、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）がハイブリダイズするように構成される（典型的にはそれに相補的である）第１の標的ポリヌクレオチドの第１の配列と重複するヌクレオチド配列を含み、第１の標的ポリヌクレオチドの第１の配列と重複しない配列（例えば、いくつかの実施形態では、２〜７つのヌクレオチド）も含む。いくつかの実施形態では、標的部位特異的プローブと、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）がハイブリダイズするように構成される第１の標的ポリヌクレオチドの第１の配列との間で重複するヌクレオチド残基の数は、２〜７（すなわち、２、３、４、５、６、または７つのヌクレオチド残基）である。いくつかの好ましい実施形態では、標的部位特異的プローブと、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）がハイブリダイズするように構成される第１の標的ポリヌクレオチドの第１の配列との間で重複するヌクレオチド残基の数は、３〜５（すなわち、３、４、または５つのヌクレオチド残基）である。いくつかの好ましい実施形態では、標的部位特異的プローブと、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）がハイブリダイズするように構成される第１の標的ポリヌクレオチドの第１の配列との間で重複するヌクレオチド残基の数は、３つのヌクレオチド（例えば、３つの塩基）である。いくつかの実施形態では、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）は、米国特許第６，７２７，３５６号（その開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される方法および原理に従って設計され得、かつ／または加水分解もしくはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））であり得る。標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）および第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）は、典型的には、必ずしもではないが、二本鎖標的ポリヌクレオチド配列の異なる鎖にハイブリダイズ可能である。いくつかの実施形態では、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）は、検出可能であり（例えば、検出可能な標識などの検出可能な特性を含み）、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有し、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列は、第１の標的ポリヌクレオチド鎖および標的バリアントヌクレオチドの第１の配列と少なくとも部分的に重複する。当業者によって理解されるように、第３のオリゴヌクレオチドの他の形態および／またはバージョンもまた、本明細書で企図される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）は、１２〜４０個のヌクレオチドの長さ（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のヌクレオチドのいずれか）、または１１〜２３個のヌクレオチドなど１０〜２５個のヌクレオチドの長さの例示的な実施形態であり得る。いくつかの実施形態では、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）の融解温度（Ｔm）は、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）のＴmよりも少なくとも５℃および２５℃以下高い。いくつかの実施形態では、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）のＴmは、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）のＴmよりも少なくとも８℃および１２℃以下高い。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドのＴmは、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ）のＴmの５℃以内である。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）のＴmは、４５℃〜約６０℃、約４８℃〜約５８℃、または４８℃〜５８℃であり、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ）のＴmは、４５℃〜約６０℃であるが、互いの約５℃以内である。本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマーまたはプローブ）のＴmは、一本鎖オリゴヌクレオチドの集団におけるオリゴヌクレオチドの５０％がそれらの相補的配列にハイブリダイズされ、集団におけるオリゴヌクレオチドの５０％が相補的配列にハイブリダイズされない温度（摂氏度）を指す。オリゴヌクレオチドのＴmは、（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．によってＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：１９８２）において、および当該技術分野の他の箇所において記載されるように）当該技術分野で周知の融解曲線によって、または他の方法もしくは式を使用することによって経験的に決定することができる。
【００１７】
標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）もまた、任意に、およびいくつかの実施形態では、好ましくは、標的ポリヌクレオチド配列の増幅時に検出可能なシグナルを提供する、例えば、少なくとも１つの検出可能な標識（例えば、蛍光標識）によって提供され得るような、少なくとも１つの検出可能な特性を含む。そのような検出可能な標識は、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）の第１の末端ヌクレオチド（例えば、５’末端または３’末端塩基またはヌクレオチド残基）上にあり得、好ましくは、その上にあるが、典型的には、小溝結合剤（ＭＧＢ）などの別の部分と同じヌクレオチド残基上にはない。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、標的部位特異的プローブの第１の末端ヌクレオチド上に位置している。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、標的部位特異的プローブの５’末端ヌクレオチド上に位置している。他の実施形態では、検出可能な標識は、内部であるが、プローブの５’末端の近く（例えば、プローブの５’部分内）に位置している。標的ポリヌクレオチド配列の増幅時の標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）の検出可能な特性における変化は、典型的には、低存在量の標的ポリヌクレオチド配列がアッセイされる試料（例えば、組織試料）内に存在することを示す。典型的には、必ずしもそうではないが、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）も第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ）も、例えば、検出可能な標識によって提供され得るような検出可能な特性を含まない。検出可能な特性は、１つ以上の検出可能な標識を介して、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）に提供され得る。好適、非限定的、および例示的な検出可能な標識には、例えば、とりわけ、ＤＮＡ結合色素、レポーター色素、蛍光プローブ、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ（商標））、テトラクロロフルオレシン（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）（ＴＥＴ（商標））、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル（ＪＯＥ（商標））、ＶＩＣ（商標）、カルボキシレート基の代わりにＳＯ3を含むフルオレセイン色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホルアミダイト形態、ＣＹ５のホスホルアミダイト形態、非ＦＲＥＴ標識、フェロセン試薬、ＡＢＹ（商標）、ＮＥＤ（商標）、およびＪＵＮ（商標）、Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０、ＴＹＥ（商標）５６３、ＴＹＥ（商標）６６５、およびＴＹＥ（商標）７０５が含まれる。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）上の検出可能な標識は、その第１の末端ヌクレオチド残基上にある。いくつかの実施形態では、標的部位特異的プローブは、加水分解プローブであり得る。よって、特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、核酸合成または重合中にポリメ��ーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって切断され（例えば、酵素がプライマーをプローブの領域に伸長する場合）、蛍光標識ヌクレオチドまたはヌクレオチド断片が放出され、検出される。そのような検出可能な標識の２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ以上）が単一の反応（例えば、混合物）に存在し得る多重アッセイもまた、本明細書で企図される。いくつかの実施形態では、混合物はまた、少なくとも１つの受動的参照色素（例えば、ＲＯＸ（商標）、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標））を含み得る。
【００１８】
標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）はまた、標的ポリヌクレオチドの増幅の前に、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）からのシグナルを消光することができる消光部分を含み得る。そのような消光部分は、典型的には、それが検出可能な標識からのシグナルを消光することができる位置でヌクレオチドに結合している。よって、消光剤および標識は、好ましくは、２つが互いに対するそれらの位置によって制約されない限り、離れたヌクレオチドの任意の長さ（およびプローブの末端からの任意の長さ）に配置され、プローブが相補鎖にハイブリダイズされない場合、検出可能な標識からのシグナルが消光される（例えば、抑制される）ように、互いに近接することができる。例えば、いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、その５’末端で標的部位特異的プローブに結合し、消光部分は、その３’末端で標的部位特異的プローブに結合する。いくつかの実施形態では、消光部分は、第３のオリゴヌクレオチドの３’末端上またはその近くにあり、消光部分は、５’末端上またはその近くにある。いくつかの実施形態では、消光部分は、検出可能な標識がその第１の末端ヌクレオチド上にある場合など、標的部位特異的プローブの第２の末端ヌクレオチド（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）上にある。したがって、いくつかの実施形態では、消光部分は、検出可能な標識からのシグナルを消光することができる。好適な非限定的で例示的な消光剤には、例えば、とりわけ、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、非蛍光消光剤（ＮＦＱ）、ブラックホールクエンチャー、アイオワブラック、ＱＳＹ、ＱＳＹ７、ＱＳＹ２１、ＮＦＱ、ダブシル、および／またはダブシルスルホネート／カルボキシレートクエンチャーが含まれる。第３のオリゴヌクレオチドが検出可能な標識および消光部分の両方を含むいくつかの例示的な実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、加水分解プローブである。
【００１９】
いくつかの実施形態では、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）は、伸長不可能であり得、この点まで、ジデオキシヌクレオチド（例えば、２’３’−ｄｄＸ）（ＸはＣ、Ａ、Ｇ、またはＴであり得る）などの伸長不可能な遮断剤部分、３炭素リンカー（Ｃ３）などのスペーサー、逆ｄＴ、修飾された伸長不可能なプライマー遮断剤（ＮＥＢＰ、ＡＳ−ＮＥＢＰ−ＰＣＲ（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．１５（１）：６２−９（２０１３））、または小溝結合剤（ＭＧＢ、「ＭＧＢ」、「ＭＧＢ基」、「ＭＧＢ化合物」、または「ＭＢＧ部分」と呼ぶことができる）を含むことができる。例示的な実施形態では、伸長不可能な遮断剤部分は、第３のオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド残基に配置されている。したがって、いくつかの実施形態では、伸長不可能な遮断剤部分は、ＭＧＢであり得る。ＭＧＢ部分に結合したオリゴヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ標的と非常に安定した二重鎖を形成し、よってより短いプローブがハイブリダイゼーションベースのアッセイに使用されることを可能にする。未修飾オリゴヌクレオチドまたはプローブと比較して、ＭＧＢプローブは、特にミスマッチがハイブリダイズされた二重鎖のＭＧＢ領域の近くにある場合、より高い融解温度（Ｔｍ）および増加した特異性を有する。（例えば、Ｋｕｔｙａｖｉｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．２：６５５−６６１を参照されたい。）これは、ＭＧＢプローブが従来のプローブよりも大幅に短く、より良好な配列区別およびより多くの標的を収容する柔軟性を提供し得ることを意味する。一般的に言えば、ＭＧＢは、三日月形の３次元構造、および二本鎖ＤＮＡのＢ形態のＡ−Ｔ（アデニンおよびチミン）に富む領域についての強い選好性を有する。それにもかかわらず、Ｃ−Ｇ（シトシンおよびグアニン）に富む領域に対する選好性を示すであろうＭＧＢ化合物もまた、本明細書に記載されるように有用であり得る。いくつかのＭＧＢは、１０3Ｍ-1以上の会合定数で二本鎖ＤＮＡの小溝内に結合することができる。そのような結合は、紫外線（ＵＶ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、および／またはゲル電気泳動などの十分に確立された分光光度法によって検出することができる。小溝結合剤分子の結合時のＵＶスペクトルにおけるシフト、および「核オーバーハウザー」（ＮＯＳＥＹ）効果を利用したＮＭＲ分光法は、特に周知であり、この目的に有用な技法である。ゲル電気泳動は、ＭＧＢの二本鎖ＤＮＡまたはその断片への結合を検出し、これは、そのような結合後、二本鎖ＤＮＡの移動度が変化するためである。様々な好適な小溝結合剤が文献に記載されている（例えば、Ｋｕｔｙａｖｉｎ，ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，８０１，１５５号、Ｗｅｍｍｅｒ，Ｄ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｄｅｒｖａｎ  Ｐ．Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：３５５−３６１（１９９７）、Ｗａｌｋｅｒ，Ｗ．Ｌ．，Ｋｏｐｋａ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ  Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，４４：３２３−３３４（１９９７）、Ｚｉｍｍｅｒ，Ｃ．＆Ｗａｈｎｅｒｔ，Ｕ．Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ．４７：３１−１１２（１９８６）、および／またはＲｅｄｄｙ，Ｂ．Ｓ．Ｐ．，Ｄｏｎｄｈｉ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｌｏｗｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．，８４：１−１１１（１９９９）を参照されたい）。本開示による好ましいＭＧＢは、ＤＰＩ3である。そのようなＭＧＢの合成方法および／または供給源も、当該技術分野で周知である。（例えば、その開示がその全体において参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８０１，１５５号、第６，４９２，３４６号、第６，０８４，１０２号、および第６，７２７，３５６号を参照されたい。）オリゴヌクレオチドの３’末端に結合した場合、ＭＧＢ基は、伸長不可能な遮断剤部分として機能することができる。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）は、その３’および／または５’末端にＭＧＢ部分を含み得る。いくつかの実施形態では、ＭＧＢは、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）の３’末端（例えば、３’末端ヌクレオチド残基）またはその３’末端ヌクレオチドからの第２もしくは第３のヌクレオチドに配置されている。いくつかの実施形態では、ＭＧＢ部分は、消光剤部分に共有結合することができる。よって、いくつかの実施形態では、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）は、典型的には検出可能であり（例えば、１つ以上の検出可能な標識を含み）、消光剤を含み、ＭＧＢなどの遮断剤部分も含み得る。上記で論じられるように、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）が１つ以上の検出可能な標識を含み、消光剤も含む場合、検出可能な標識および消光剤は、典型的には、プローブの反対端に配置されている。
【００２０】
二本鎖標的ポリヌクレオチド（「順方向」および「逆方向」鎖を含む）の文脈における、少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ、第１のプライマー）、および少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ、第２のプライマー）、および少なくとも１つの第３のオリゴヌクレオチド（例えば、検出可能な標的部位特異的プローブ、第１のプローブ）の混合物の実施形態が図１に示される。この図では、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）は、標的ポリヌクレオチドの順鎖に相補的な「順方向プライマー」であり、その３’末端に、その上鎖に存在する標的バリアントヌクレオチド（例えば、「Ｔ」）に対する相補体を含む。図１に示される第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）は、標的バリアントヌクレオチドを含む配列を含む、標的ポリヌクレオチドの対応する逆鎖に相補的である（すなわち、標的ポリヌクレオチド順鎖の一部分と同一性を有する）。いくつかの例示的な実施形態では、この標的部位特異的プローブはまた、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）が結合する配列に相補的であり、重複するヌクレオチド残基、および第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）が結合する配列と重複しないヌクレオチド残基を含む。例えば、図１に示される実施形態は、標的特異的プライマー（ＴＳＰ）が結合する標的ポリヌクレオチドの配列（すなわち、標的部位）と重複する３’配列（または部分）および標的部位と重複しない５’配列（または部分）を有する標的部位特異的プローブを含む。ＴＳＰが標的ポリヌクレオチドの「逆」鎖に相補的である場合などのいくつかの実施形態では、標的部位特異的プローブ（例えば、第１のオリゴヌクレオチド）は、その５’末端に重複配列を含み得る。いくつかの実施形態では、例えば、重複配列は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのヌクレオチド残基に及び得る。（図１の順鎖に関して）標的バリアントヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド５’の逆鎖に相補的な第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ）も示される。図１に示される標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）はまた、その５’末端における検出可能な標識（「Ｒ」）およびその３’末端における消光剤（「Ｑ」）を含む。したがって、標的ポリヌクレオチドを増幅するために、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ、順方向プライマー）および第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ、逆方向プライマー）のこの組み合わせが使用され得、標的ポリヌクレオチドの増幅は、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド、いくつかの実施形態では、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブなどの加水分解プローブであり得る、第１のプローブ）からの検出可能な標識の放出を検出することによって決定される。第１、第２、および第３のオリゴヌクレオチド、またはそれらの様々な組み合わせ（例えば、第１および第２のオリゴヌクレオチド、第１および第３のオリゴヌクレオチド、第２および第３のオリゴヌクレオチド）は、同じまたは異なる量（例えば、等モルまたは非等モル）で組み合わせて、本明細書に記載される方法を実施する際の使用のための混合物（複数可）を提供し得る。
【００２１】
よって、いくつかの実施形態では、本開示は、ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列に相補的な第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドに相補的なその３’末端におけるヌクレオチドを含む、第１のオリゴヌクレオチドと、ｂ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖上の第１の配列の上流または下流に位置している第２の配列に相補的な（例えば、これと同一性を有する）配列にハイブリダイズするように構成された配列を含有する第２のオリゴヌクレオチドと、ｃ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する（例えば、検出可能な標識、ならびに任意に消光剤および／または伸長不可能な遮断剤部分を含む）（任意に検出可能な）第３のオリゴヌクレオチドであって、第３の配列が、第１の配列と同一性を共有し、少なくとも部分的に重複し、標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドと、を含む、組成物および／または混合物、ならびにそれを含有するキットおよびそれを使用するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、伸長可能である。いくつかの実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、プライマーである。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、伸長不可能であり得、（例えば、上記のような）検出可能な標識および／もしくは（例えば、上記のような）消光部分を含み得るプローブ（例えば、標的部位特異的プローブ）であり得、（例えば、上記のような）小溝結合剤（ＭＧＢ）部分を含み得、かつ／または好ましくはプローブ（例えば、存在する場合、第２、第３、もしくは第４のオリゴヌクレオチドプローブ）として機能する混合物中の任意の他のオリゴヌクレオチドと区別可能である。いくつかの実施形態では、第１、第２、および／または第３のオリゴヌクレオチドは、１０〜４０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、それを使用するための方法、ならびにそのような試薬を使用および／もしくは保存するための、ならびに／またはそのような方法を実施するための説明書を含むことができるキットを提供する。
【００２２】
またいくつかの実施形態では、本開示は、ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを有し、第１のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドに相補的なその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、ｂ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列とハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖上の第１の配列から上流または下流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、ｃ）（例えば、任意に検出可能な標識、消光剤、および／または伸長不可能な遮断剤部分を含む）（任意に検出可能な）第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）であって、配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列とハイブリダイズするように構成された配列を有し、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列と少なくとも部分的に重複し、標的バリアントヌクレオチドを含む配列を含む、第３のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物、ならびにそれを使用する方法、ならびにそのような試薬を使用および／もしくは保存するための、ならびに／またはそのような方法を実施するための説明書を含み得るキットを提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在する第１の配列（Ａ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド残基（「第１のバリアントヌクレオチド」）を含み、第１のオリゴヌクレオチドが、第１のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端におけるヌクレオチドをさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、ｂ）第２の配列（Ｂ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の配列が、第３の配列（Ｃ）に相補的であり、第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、第３の配列（Ｃ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列（Ａ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、ｃ）第５の配列（Ｅ）に相補的な第４の配列（Ｄ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、第５の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、第５の配列（Ｅ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ａ）と少なくとも部分的に重複し、第１の標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドと、を含む、組成物および／または混合物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、それを使用するための方法、ならびにそのような試薬を使用および／もしくは保存するための、ならびに／またはそのような方法を実施するための説明書を含むことができるキットを提供する。いくつかの実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、伸長可能である。いくつかの実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、プライマーである。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、伸長不可能であり得、（例えば、上記のような）検出可能な標識および／もしくは（例えば、上記のような）消光部分を含み得るプローブ（例えば、標的部位特異的プローブ）であり得、（例えば、上記のような）小溝結合剤（ＭＧＢ）部分を含み得、かつ／または好ましくはプローブ（例えば、存在する場合、第２、第３、もしくは第４のオリゴヌクレオチドプローブ）として機能する混合物中の任意の他のオリゴヌクレオチドと区別可能である。いくつかの実施形態では、第１、第２、および／または第３のオリゴヌクレオチドは、１０〜４０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、それを使用するための方法、ならびにそのような試薬を使用および／もしくは保存するための、ならびに／またはそのような方法を実施するための説明書を含むことができるキットを提供する。
【００２４】
第４、第５、および／または第６のオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、ａ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第４のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチドにおける第１の配列が、第２の標的バリアントヌクレオチドを含み、第４のオリゴヌクレオチドが、第２の標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端におけるヌクレオチドをさらに含む、第４のオリゴヌクレオチドと、ｂ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を含む第５のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の第１の配列から３’上流に位置している、第５のオリゴヌクレオチドと、ｃ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された第６のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の第１の配列と少なくとも部分的に重複し、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列との同一性を有する配列を含む（例えば、例えば、検出可能な標識、ならびに任意に消光剤および／または伸長不可能な遮断剤部分を含むことによって、プローブとして機能する）第２の標的バリアントヌクレオチドを含み、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の第１の配列と少なくとも部分的に重複し、第２の標的バリアントヌクレオチドを含む、第６のオリゴヌクレオチドと、を含む、（いくつかの実施形態では、第１、第２、および第３のオリゴヌクレオチドを有する上記のものも含み、いくつかの実施形態では、そのような第１、第２、および第３のオリゴヌクレオチドを有する上記のものを含まない）組成物および／または混合物を提供する。いくつかの実施形態では、第４および第５のオリゴヌクレオチドは、伸長可能である。いくつかの実施形態では、第４および第５のオリゴヌクレオチドは、プライマーである。いくつかの実施形態では、第６のオリゴヌクレオチドは、伸長不可能であり得、（例えば、上記のような）検出可能な標識および／もしくは（例えば、上記のような）消光部分を含み得るプローブ（例えば、標的部位特異的プローブ）であり得、（例えば、上記のような）小溝結合剤（ＭＧＢ）部分を含み得、かつ／または好ましくはプローブ（例えば、存在する場合、第３のオリゴヌクレオチド）として機能する混合物中の任意の他のオリゴヌクレオチドと区別可能である。いくつかの実施形態では、第４、第５、および／または第６のオリゴヌクレオチドは、１０〜４０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、それを使用するための方法、ならびにそのような試薬を使用および／もしくは保存するための、ならびに／またはそのような方法を実施するための説明書を含むことができるキットを提供する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本開示は、（いくつかの実施形態では、第１、第２、および第３のオリゴヌクレオチドを有する上記のものも含み、いくつかの実施形態では、そのような第１、第２、および第３のオリゴヌクレオチドを有する上記のものを含まない）、ａ）第１のオリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズするように構成される配列を含む第４のオリゴヌクレオチドであって、第４のオリゴヌクレオチドが、第１の配列に実質的にハイブリダイズするように構成され、その３’末端に標的バリアントヌクレオチドの相補体とは異なるヌクレオチドを含む、第４のオリゴヌクレオチドと、ｂ）第３のオリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズするように構成された（任意に検出可能な）第５のオリゴヌクレオチドであって、第５のオリゴヌクレオチドが、それと同じまたは相補的ではない標的バリアントヌクレオチドに対応する位置にヌクレオチドを含む、第５のオリゴヌクレオチドと、を含む、組成物および／または混合物を提供する。いくつかの実施形態では、第５のオリゴヌクレオチドは、伸長不可能であり得、プローブ（例えば、標的部位特異的プローブ）であり得、検出可能な標識（例えば、上記のような）、消光部分（例えば、上記のような）、および／または小溝結合剤（ＭＧＢ）部分（例えば、上記のような）を含み得、プローブとして機能する混合物中の任意の他のオリゴヌクレオチド（例えば、存在する場合、第３のオリゴヌクレオチド）からの検出可能な特性（例えば、検出可能な標識、ならびに任意に消光剤および／または伸長不可能な遮断剤部分）と区別可能である。いくつかの実施形態では、第４、第５、および／または第６のオリゴヌクレオチドは、１０〜４０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、それを使用するための方法、ならびにそのような試薬を使用および／もしくは保存するための、ならびに／またはそのような方法を実施するための説明書を含むことができるキットを提供する。
【００２６】
オリゴヌクレオチドのタイプ
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド、特にプローブとして機能するもの（例えば、第３のオリゴヌクレオチド、標的部位特異的プローブ）は、自然発生塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルに加えて、１つ以上の修飾塩基を含むことができる。いくつかの実施形態では、修飾塩基（複数可）は、一致した標的配列とミスマッチ標的配列との間のＴmの差を増加させ、かつ／またはミスマッチプライミング効率を低下させ、それによってアッセイ特異性だけでなく、選択性も改善し得る。修飾塩基は、１つ以上の官能基の付加もしくは欠失、複素環式環構造における相違（すなわち、ヘテロ原子での炭素の置換、もしくはその逆）、および／または塩基への１つ以上のリンカーアーム構造の結合によって自然発生塩基とは異なるものであり得る。そのような修飾塩基（複数可）は、例えば、８−アザ−７−デアザ−ｄＡ（ｐｐＡ）、８−アザ−７−デアザ−ｄＧ（ｐｐＧ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、または２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン核酸（ＥＮＡ）塩基を含み得る。修飾塩基の他の例には、塩基類似体の一般的なクラスである７−デアザプリンおよびそれらの誘導体、ならびにピラゾロピリミジンおよびそれらの誘導体（例えば、ＰＣＴ  ＷＯ  ９０／１４３５３に記載される）が含まれるが、これらに限定されない。これらの塩基類似体は、オリゴヌクレオチドに存在する場合、ハイブリダイゼーションを強化し、ミスマッチの区別を改善することができる。自然発生塩基、修飾塩基、および塩基類似体の全ての互変異性形態を含めることができる。修飾ヌクレオチド間結合もまた、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドに存在し得る。そのような修飾結合には、ペプチド、リン酸、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、アルキルホスフェート、アルカンホスホネート、チオホスフェート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、置換ホスホルアミデートなどが含まれるが、これらに限定されない。プローブおよび／またはプライマーとして機能するオリゴヌクレオチドにおけるそれらの使用と適合性である、塩基、糖、および／またはヌクレオチド間結合のいくつかのさらなる修飾は、当業者には明らかであろう。加えて、いくつかの実施形態では、プローブとして作用するオリゴヌクレオチド（例えば、第３および／または第６のオリゴヌクレオチド、標的部位特異的プローブ）に組み込まれるヌクレオチドユニット、例えば、ＭＧＢ部分を含むものは、結合アームを通して、塩基のうちの１つ以上に共有結合した交差結合機能（アルキル化剤）を有することができる。同様に、修飾糖または糖類似体は、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットの１つ以上に存在することができる。糖修飾には、糖の２’、３’、および／または４’炭素原子への置換基の結合、糖の異なるエピマー形態、グリコシド結合のアルファまたはベータ配置における相違、および他のアノマー変化が含まれるが、これらに限定されない。糖部分には、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、リボース、デオキシリボース、グルコース、アラビノース、ペントフラノース���キシロース、リキソース、およびシクロペンチルが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、プローブとして作用するオリゴヌクレオチド（例えば、第３および／または第６のオリゴヌクレオチド、標的部位特異的プローブ）のいくつかの実施形態の糖またはグリコシド部分、例えば、ＭＧＢ部分を含むものは、デオキシリボース、リボース、２−フルオロリボース、２−０アルキル、またはアルケニルリボースを含むことができ、アルキル基は１〜６個の炭素、アルケニル基は２〜６個の炭素を有し得る。いくつかの実施形態では、自然発生ヌクレオチドならびに本明細書に記載される修飾および類似体において、デオキシリボースまたはリボース部分は、フラノース環を形成することができ、プリン塩基は９位を介して、ピリミジンはＩ位を介して、およびピラゾロピリミジンはＩ位を介して糖部分に結合することができる。またいくつかの実施形態では、特にプローブとして作用するオリゴヌクレオチド（例えば、第３および／または第６のオリゴヌクレオチド、標的部位特異的プローブ）において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニットは、当該技術分野で周知のように、「リン酸」骨格によって相互接続することができ、かつ／または「天然」ホスホジエステル結合に加えて、ホスホロチオートおよびメチルホスホネートを含むことができる。当業者によって理解されるように、他のタイプのオリゴヌクレオチドまたは修飾塩基もまた、本明細書で企図される。
【００２７】
オリゴヌクレオチドセット
いくつかの実施形態では、本開示は、複数のオリゴヌクレオチドセットを含む組成物および／または混合物を提供し、各オリゴヌクレオチドセットは、ａ）標的ポリヌクレオチド鎖に相補的なヌクレオチド配列に対応するか、ハイブリダイズ可能である（例えば、ハイブリダイズするように構成される）か、またはこれを含む、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）であって、第１のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを含むが、これに限定されず、典型的にはこれによって終結され、第１のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端におけるヌクレオチドをさらに含む、第１のオリゴヌクレオチドと、ｂ）標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列に対して第２の配列に相補的である配列にハイブリダイズするように構成された配列を含む第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ）であって、第２の配列が、第１の配列から上流または下流（例えば、５’上流）に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、ｃ）標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列に相補的である配列にハイブリダイズするように構成された配列を含む（任意に検出可能な）第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）であって、第３の配列が、第１の配列と部分的に重複し、標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドと、を含み、各セットの第１のオリゴヌクレオチドは、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成され、各セットの第３のオリゴヌクレオチドは、異なる第３の配列と同一性を有し、各セットの第３のオリゴヌクレオチドは、異なる区別可能な検出可能な特性（例えば、異なる検出可能な標識）を含む。オリゴヌクレオチドの各セットは、典型的には、標的バリアントヌクレオチドを含む（またはこれに相補的である）標的ポリヌクレオチド配列を含むか、またはこれに相補的である核酸配列についての結合特異性を有する１つの検出可能な第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）のみを含む。よって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物および／または混合物は、複数のオリゴヌクレオチドセットを含み得、各オリゴヌクレオチドセットは、ａ）標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）であって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端におけるヌクレオチドをさらに含む、第１のオリゴヌクレオチドと、ｂ）標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列に対して第２の配列に相補的である配列にハイブリダイズするように構成された配列を含む第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ）であって、第２の配列が、第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、ｃ）検出可能な標識および標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列に相補的である配列にハイブリダイズするように構成された配列の両方を含む第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）であって、第３の配列が、第１の配列と部分的に重複し、標的バリアントヌクレオチド（またはその相補体）を含む、第３のオリゴヌクレオチドと、を含み、各セットの第１のオリゴヌクレオチドは、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成され、各セットの第３のオリゴヌクレオチドは、異なる第３の配列と同一性を有し、各セットの第３のオリゴヌクレオチドは、異なる区別可能な検出可能な標識を含む。したがって、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの各セットは、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、上記のＴＳＰ）、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、上記のＬＳＰ）、および検出可能な第３のオリゴヌクレオチド（例えば、上記の標的部位特異的プローブ）を含み、各セットの各第３のオリゴヌクレオチドは、セットの第１の第３のオリゴヌクレオチドが結合する第１の標的ポリヌクレオチド配列の増幅が、別のセットの任意の他の第３のオリゴヌクレオチドが結合する任意の他の標的ポリヌクレオチド配列の増幅と区別可能であり得るように、異なる検出可能な特性を含む。当業者によって理解されるように、他の条件もまた、本開示によって企図される。
【００２８】
ＰＣＲ反応混合物
特定の態様では、本明細書で提供される組成物および／または混合物は、本明細書で提供される、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ）、および第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）、またはそのオリゴヌクレオチドセットに加えて、ＰＣＲ反応混合物の成分として当該技術分野で知られる１つ以上の成分を含む。特定の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ）、および第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）は、各々、０．０５ｕＭ〜１ｕＭ、および例示的な実施形態では、０．１５ｕＭ〜１ｕＭ（例えば、約２５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約４００ｎＭ、４５０ｎＭ、約５００ｎＭ、約５５０ｎＭ、約６００ｎＭ、約６５０ｎＭ、約７００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約８００ｎＭ、約８５０ｎＭ、または約９００ｎｍ、および好ましい実施形態では、約３００ｎＭまたは約４５０ｎＭであり得る同じまたは異なる濃度で存在する。例示的な実施形態では、第１（例えば、ＴＳＰ）および第２（例えば、ＬＳＰ）オリゴヌクレオチドは、各々、約０．１５ｕＭ〜約０．４５ｕＭ、好ましくは約０．１５ｕＭ、０．３０ｕＭ、または０．４５ｕＭの濃度で存在することができ、第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）は、約０．２５ｕＭの濃度で存在することができる。例示的な実施形態では、そのような混合物は、ＰＣＲ熱サイクリング条件に供される場合に標的の増幅をもたらす成分を含む。そのようなＰＣＲ反応混合物成分は、ｄＮＴＰ、１つ以上のＰＣＲバッファー、１つ以上の熱安定性ポリメラーゼ、およびＰＣＲを可能にするか、またはそのような反応混合物で使用される濃度のＭｇ2+などの遊離ヌクレオチドの供給源を含み得る。例えば、Ｍｇ2+は、０．５〜４ｍＭ（好ましくは、２．５５ｍＭ）で、例えば、ＭｇＳＯ4またはＭｇＣｌとして、ｄＮＴＰは、全ての４つのヌクレオチドについて各々０．１〜５ｍＭ、例えば、各々２ｍＭ、または好ましくは１ｍＭの等濃度で存在し得る。さらに、例示的な実施形態では、そのような反応混合物は、ＰＣＲ反応においてテンプレートポリヌクレオチドとして作用することができる、標的ポリヌクレオチドを含む。本明細書で提供されるいくつかの反応混合物において、標的ポリヌクレオチドは、０．１〜１ｕｇ／ｕｌまたは０．０１〜１ｎｇ／ｎｌで存在する。熱安定性ポリメラーゼ（複数可）は、例えば、反応混合物１ｕｌあたり０．０１ユニット〜０．１ユニットなどの、ＰＣＲ反応の既知の活性で存在することができる。ＰＣＲバッファーは、当該技術分野で知られており、０．５〜２倍、例えば、１倍濃度で使用することができる。さらに、本明細書でより詳細に論じられるように、リン酸カリウムおよび硫酸アンモニウムなどの追加の成分が存在し得る。他の成分の中でも、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、例えば、１０〜１００μｇ／ｍｌ）などのアルブミン、バッファー（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ約８〜９．５）、ゼラチン（魚および／またはヒトゼラチンなど、例えば、０．０１％）、ホルムアミド（例��ば、１．２５〜１０％）、グリセロール（例えば、５〜２０％）、ポリエチレングリコール（例えば、５〜１５％）、非イオン性洗浄剤（detergent）（複数可）（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、例えば、０．０５〜１％）、Ｎ−Ｎ−Ｎ−トリメチルグリシン（ベタイン、例えば、１〜３Ｍ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、例えば、１〜１０％）、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、および／もしくはベタイン、ならびに／またはそれらの組み合わせなどの追加の成分も、本明細書で提供される反応混合物に存在し得る。
【００２９】
リン酸カリウムおよび硫酸アンモニウム
本発明者／出願人は、驚くべきことに、本明細書に記載される反応および／または方法に有効量で含まれる場合、追加の成分が標的ポリヌクレオチド配列増幅の効率を高めることを見出した。したがって、いくつかの実施形態では、混合物は、標的ポリヌクレオチド配列増幅の効率を高めるために、そのような追加の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような追加の成分には、有効量の塩化カリウムおよび／または硫酸アンモニウムが含まれる。塩化カリウム（ＫＣｌ）および／または硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4）は、増幅反応において「有効量」、すなわち、当該量の塩化カリウムおよび／または硫酸アンモニウムを含まない増幅反応と比較される場合、（例えば、実施例に示される）増幅反応における標的ヌクレオチド位置でのより豊富なヌクレオチドに対して、標的バリアントヌクレオチドの増幅を改善する塩化カリウムおよび／または硫酸アンモニウムの量で含まれる。よって、混合物は、例えば、当該濃度の塩化カリウムおよび／または硫酸アンモニウムを欠く増幅反応後のＣｑと比較して、増幅反応後のＣｑによって決定される、より豊富な野生型核酸からの標的ポリヌクレオチドの区別を改善する濃度の塩化カリウムおよび／または硫酸アンモニウムを含み得る。いくつかの実施形態では、混合物は、有効濃度の塩化カリウムおよび硫酸アンモニウムの組み合わせを含み、これは、組み合わせを欠く増幅反応後のＣｑと比較して、反応増幅後のＣｑによって決定される野生型核酸からの突然変異体標的ポリヌクレオチドの区別を改善する各々の濃度の組み合わせである。例えば、塩化カリウムの有効濃度は、少なくとも２０ｍＭ〜８０ｍＭ、３０ｍＭ〜８０ｍＭ、４０ｍＭ〜７０ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ〜７０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ、４０ｍＭ〜４８ｍＭ、４５ｍＭ、１０ｍＭ〜４０ｍＭであり得る。また、例えば、硫酸アンモニウムの有効濃度は、少なくとも２０ｍＭ、２０ｍＭ〜３５ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ〜３５ｍＭ未満、３５ｍＭ未満、２０ｍＭ〜２５ｍＭ、２０ｍＭ〜２４ｍＭ、２２ｍＭ、１０〜２０ｍＭ、または１５ｍＭであり得る。本明細書において実施例に示されるように、組み合わせて、塩化カリウムおよび硫酸アンモニウムの特に有効な濃度は、それぞれ６０ｍＭおよび１５ｍＭ、またはそれぞれ３０ｍＭおよび１６ｍＭ、または、好ましくは、それぞれ４５ｍＭおよび２２ｍＭであり得る。塩化カリウムおよび硫酸アンモニウムの各々の他の濃度も企図され、また当業者によって（例えば、標的ポリヌクレオチド（例えば、突然変異体またはバリアント核酸）の本明細書に記載される方法におけるより豊富な標的ポリヌクレオチド（例えば、野生型核酸）からの区別が、他の濃度と比較して、特定の濃度の存在下で改善されているかを決定することによって）決定され得るように、使用され得る。
【００３０】
ポリメラーゼ
本明細書に開示される混合物はまた、少なくとも１つのポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）および少なくとも１つのヌクレオチド源（例えば、ｄＮＴＰ）を含み得る。ポリメラーゼは、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼであり得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、「熱安定性ポリメラーゼ」であり得、これは、増幅中に一本鎖核酸の不安定化または二本鎖核酸の変性をもたらすために必要な時間にわたって高温に供される場合に熱安定性であり、耐熱性であり、かつ／または不可逆的に不活性化されず（例えば、（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における）増幅に典型的に必要とされるような、約９０〜約１００℃で不可逆的に変性せず）、デオキシリボヌクレオチドの重合を触媒して、標的ポリヌクレオチド鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成する酵素を指す。熱安定性ポリメラーゼは、例えば、（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．から）市販されている様々な好熱性細菌から、当業者に周知の方法を使用して入手され得る（例えば、米国特許第６，２４５，５３３号を参照されたい）。細菌細胞は、当業者に周知の特定の種の活性培養物を成長させるのに適した培地およびインキュベーション条件を使用して、標準的な微生物学的技法に従って成長させ得る（例えば、Ｂｒｏｃｋ，Ｔ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｆｒｅｅｚｅ，Ｈ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９８（１）：２８９−２９７（１９６９）、Ｏｓｈｉｍａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｉｍａｈｏｒｉ，Ｋ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２４（１）：１０２−１１２（１９７４）を参照されたい）。熱安定性ポリメラーゼの供給源としての使用に好適なものは、例えば、好熱性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｏｓｉｉ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属の他の種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の他の種、ならびにＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、ならびにこれらの種の各々の突然変異体である。例示的な熱安定性ポリメラーゼには、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ、ＴａｑＭａｎ、ＭｉｃｒｏＡｍｐ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、および／または融合ポリメラーゼのいずれかが含まれ得るが、これらに限定されない。例示的なポリメラーゼには、Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｒｅａｍＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉに発現したＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝��の組換え、修飾形態（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ｉＴａｑ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）ＩＩ  Ｔａｑ（商標）Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳｕｐｅｒＦｉ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉｒｅ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｕ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｉＰｒｏｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ））、例えば、室温などの特定の温度でその活性を遮断する化学的に修飾されたポリメラーゼ）、ならびに／またはその突然変異体、誘導体、および／もしくは断片が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはアプタマーはまた、ホットスタート剤として使用され得、かつ／またはホットスタート機能は、特定の温度（例えば、室温）でその活性を遮断するポリメラーゼへの化学修飾から生じ得る（例えば、ＴａｑＧｏｌｄ、ＦｌａｓｈＴａｑ、Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ）。いくつかの実施形態では、ホットスタート成分は、（例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）ＩＩ  Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＤｒｅａｍＴａｑ（商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｕ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｕｌｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｐｈｉｒｅ  Ｇｒｅｅｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、またはＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）Ｇｏｌｄ  ３６０  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能な）混合物中の熱安定性ポリメラーゼに向けられた１つ以上の抗体であり得る（すなわち、これについての結合特異性を有する）。いくつかの実施形態では、デュアルホットスタートメカニズムが使用され得る。例えば、オリゴヌクレオチドなどの第１のホットスタート成分は、１つ以上の抗体などの第２のホットスタート成分と組み合わせてホットスタート剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、デュアルホットスタートメカニズムの第１および第２のホットスタート成分は、同じタイプでも異なっていてもよい（オリゴベース、抗体ベース、化学ベースなど）。いくつかの実施形態では、デュアルホットスタートメカニズムの第１および第２のホットスタート成分は、同じポリメラーゼに対して阻害性であり得る（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに向けられた阻害性抗体およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに特異的な阻害性オリゴヌクレオチドを使用するデュアルホットスタートメカニズム）。いくつかの実施形態で��、ポリメラーゼは、異なる供給源に由来する異なるドメインまたは配列で構成される酵素またはポリメラーゼを指す融合またはキメラポリメラーゼであり得る。例えば、融合ポリメラーゼは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質ドメインなどの、ＤＮＡ結合ドメインと融合した、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ポリメラーゼドメインなどの、ポリメラーゼドメインを含み得る。融合またはキメラポリメラーゼは、例えば、当業者に周知の方法（例えば、米国特許第８，８２８，７００号を参照されたい）を使用して得ることができ、その開示は、その全体が参照によって組み込まれる。いくつかの実施形態では、そのような融合またはキメラポリメラーゼは、熱安定性である。いくつかの実施形態では、混合物は、マスターミックスおよび／または反応混合物である混合物（例えば、ＴａｑＰａｔｈ（商標）ＰｒｏＡｍｐ（商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））、ＴａｑＰａｔｈ（商標）ＰｒｏＡｍｐ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））、ＴａｑＭａｎ（商標）ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ  ｗｉｔｈ  ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ（ｎｏ  ＵＮＧ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ  ｗｉｔｈ  ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））、ＥＸＰＲＥＳＳ  ｑＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ，ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））、ＴａｑＭａｎ（商標）ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ，ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ（商標）ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））、ＰｏｗｅｒＵｐ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））、またはＦｌａｓｈＴａｑ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ２Ｘ  ＭｅａｎＧｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を含むことができる。いくつかの実施形態では、混合物は、少なくとも１つの洗浄剤、グリセロール、および少なくとも１つの参照色素（例えば、ＲＯＸ（商標）、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標））のうちの１つ以上をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、反応混合物は、標的ポリヌクレオチド鎖の標的ポリヌクレオチド配列（例えば、第１の配列）を含むアンプリコン（複数可）をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、混合物は、第２のポリヌクレオチド鎖の（例えば、メジャー対立遺伝子バリアントの）配列を含むアンプリコンを含まない。
【００３１】
標的ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される混合物は、標的ポリヌクレオチド鎖（例えば、標的ポリヌクレオチド配列または標的ポリヌクレオチド）を含むことが疑われる核酸試料を含む。標的ポリヌクレオチド配列（例えば、標的ポリヌクレオチド）は、標的配列特異的プライマー（例えば、第１のオリゴヌクレオチド、ＴＳＰ）、遺伝子座特異的プライマー（例えば、第２のオリゴヌクレオチド、ＬＳＰ）、および標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）が結合し、それの増幅を支持することができる、任意の好適な一本鎖、二本鎖、またはその他に構成されたポリヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、核酸試料は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）または相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり得る。よって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される混合物は、標的ポリヌクレオチド鎖を含む一本鎖標的ポリヌクレオチド、および／または、標的ポリヌクレオチド鎖および標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖標的ポリヌクレオチドであって、標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である、二本鎖標的ポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、二本鎖標的ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド鎖および標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含み、標的相補体ポリヌクレオチド鎖は、標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的であり、二本鎖標的ポリヌクレオチドは、バリアントポリヌクレオチド鎖およびバリアント相補体ポリヌクレオチド鎖を含み、バリアントポリヌクレオチド鎖は、標的ポリヌクレオチド鎖と同一性を有するか、または実質的に同一であり、標的ポリヌクレオチド鎖とは標的バリアントヌクレオチドで異なるヌクレオチドを含み、バリアント相補体ポリヌクレオチド鎖は、バリアントポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である。
【００３２】
上記のように、標的ポリヌクレオチド配列は、対立遺伝子に「対応」し、ハイブリダイズ可能であり、関連し、および／またはその内に見られ得る、標的バリアントヌクレオチド（すなわち、ＳＮＰおよび／または突然変異によって表され得るような対立遺伝子バリアント）を含むことができる。そのようなＳＮＰまたは突然変異は、例えば、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）（例えば、図２０）、ＫＲＡＳ（例えば、コドン１２および／またはコドン１３にある）、またはＮＲＡＳ突然変異（例えば、図２１）、Ｋｉｔ、ｐＴＥＮ  ＴＰ５３、ＥＳＲ１、ＰＩＫ２ＣＡ、ＴＳＣ１、ＭＤＭ２、ＥＲＢＢ２、ＳＭＡＤ４、およびＦＧＦＲ２遺伝子（表１および表２に列挙される突然変異を含む）において見られるものを含み得るが、これらに限定されない。例えば、本明細書において例に示されるように、本開示の混合物および方法を使用して、以下の例示的、非限定的な突然変異：翻訳タンパク質のアミノ酸１２でのグリシンからアスパラギン酸への（Ｇ１２Ｄ）置換をコードする、グアノシンからアデノシンへの（Ｇ＞Ａ（ＧＧＴ＞ＧＡＴ））突然変異、翻訳タンパク質のアミノ酸１２でのグリシンからバリンへの（Ｇ１２Ｖ）置換をコードするグアノシンからチミジンへの（Ｇ＞Ｔ（ＧＧＴ＞ＧＴＴ））突然変異、翻訳タンパク質のアミノ酸１２でのグリシンからシステインへの（Ｇ１２Ｃ）置換をコードするグアノシンからチミジンへの（Ｇ＞Ｔ（ＧＧＴ＞ＴＧＴ））突然変異、翻訳タンパク質のアミノ酸１２でのグリシンからセリンへの（Ｇ１２Ｓ）置換をコードするグアノシンからアデノシンへの（Ｇ＞Ａ（ＧＧＴ＞ＡＧＴ））突然変異、翻訳タンパク質のアミノ酸１２でのグリシンからアラニンへの（Ｇ１２Ａ）置換をコードするグアノシンからシトシンへの（Ｇ＞Ｃ（ＧＧＴ＞ＧＣＴ））突然変異、翻訳タンパク質のアミノ酸１２でのグリシンからアルギニンへの（Ｇ１２Ｒ）置換をコードするグアノシンからシトシンへの（Ｇ＞Ｃ（ＧＧＴ＞ＣＧＴ））突然変異、および／または翻訳タンパク質のアミノ酸１３でのグリシンからアスパラギン酸への（Ｇ１３Ｄ）置換をコードするグアノシンからアデノシンへの（Ｇ＞Ａ（ＧＧＣ＞ＧＡＣ））突然変異のいずれかを有するＫＲＡＳを特定および／または定量化することができる。当業者によって理解されるように、上記のような他のＫＲＡＳ突然変異、および表２に列挙されるものを超える他のＫＲＡＳ突然変異もまた企図され、本明細書に記載される試薬および方法を使用する分析および／または検出にも好適であり得る。
【００３３】
同様に本明細書において例に示されるように、本開示の組成物および／または混合物ならびに方法を使用して、以下の例示的、非限定的な突然変異：翻訳タンパク質のアミノ酸１２（Ｇ１２Ｄ）でのグリシンからアスパラギン酸への突然変異をコードするグアニンからアデノシンへの（Ｇ＞Ａ）突然変異、翻訳タンパク質のアミノ酸１３（Ｇ１３Ｄ）でのグリシンからアスパラギン酸への突然変異をコードするグアノシンからアデノシンへの（Ｇ＞Ａ）突然変異、翻訳タンパク質のアミノ酸６１でのアデノシンからチミジンへの（Ａ＞Ｔ）突然変異、グルタミンからリジンへの突然変異、翻訳タンパク質のアミノ酸６１（Ｑ６１Ｒ）でのグルタミンからアルギニンへの突然変異をコードするアデノシンからグアノシンへの（Ａ＞Ｇ）突然変異、翻訳タンパク質のアミノ酸６１（Ｑ６１Ｈ）でのグルタミンからヒスチジンへの突然変異をコードする、アデノシンからチミジンへの（Ａ＞Ｔ）突然変異、および／または翻訳タンパク質のアミノ酸６１（Ｑ６１Ｌ）でのグルタミンからロイシンへの突然変異をコードするアデノシンからチミジンへの（Ａ＞Ｔ）突然変異のいずれかを有するＮＲＡＳを特定および／または定量化することができる。当業者によって理解されるように、上記のような他のＮＲＡＳ突然変異、および表２に列挙されるものを超える他のＮＲＡＳ突然変異もまた企図され、本明細書に記載される試薬および方法を使用する分析および／または検出にも好適であり得る。
【００３４】
同様に本明細書において例に示されるように、本開示の組成物および／または混合物ならびに方法を使用して、以下の例示的、非限定的な突然変異：翻訳タンパク質（ＥＧＦＲ２０）のアミノ酸７９０でのスレオニンからメチオニンへの突然変異をコードするシトシンからチミジンへの（Ｃ＞Ｔ）突然変異、野生型コード配列（ＥＧＦＲ１９）のヌクレオチド７４６−７５０の欠失、および／または翻訳タンパク質のアミノ酸８６１（Ｌ８６１Ｑ）でのロイシンからグルタミン酸への突然変異をコードするチミジンからアデノシンへの（Ｔ＞Ａ）への突然変異のいずれかを有するＥＧＦＲを特定および／または定量化することができる。当業者によって理解されるように、上記のような他のＥＧＦＲ突然変異、および表２に列挙されるものを超える他のＥＧＦＲ突然変異もまた企図され、本明細書に記載される試薬および方法を使用する分析および／または検出にも好適であり得る。
【００３５】
本明細書における例にも示されるように、本開示の組成物および／または混合物ならびに方法を使用して、非限定的な例として、翻訳タンパク質のアミノ酸６００（Ｖ６００Ｅ）でのバリンからグルタミン酸への突然変異をコードするチミジンからアデノシンへの突然変異を有するＢＲＡＦを特定および／または定量化することができる。当業者によって理解されるように、上記のような他のＢＲＡＦ突然変異、および表２に列挙されるものを超える他のＢＲＡＦ突然変異もまた企図され、本明細書に記載される試薬および方法を使用する分析および／または検出にも好適であり得る。
【００３６】
同様に本明細書において例に示されるように、本開示の組成物および／または混合物ならびに方法を使用して、以下の例示的、非限定的な突然変異：翻訳タンパク質のアミノ酸３８０（Ｅ３８０Ｑ）でのグルタミン酸からグルタミンへの突然変異をコードするグアニンからシトシンへの（Ｇ＞Ｃ）突然変異のいずれかを有するＥＳＲ１；以下の例示的、非限定的な突然変異：翻訳タンパク質のアミノ酸１０４７（Ｈ１０４７Ｒ）でのヒスチジンからアルギニンへの突然変異をコードするアデノシンからグアニンへの（Ａ＞Ｇ）突然変異のいずれかを有するＰＩＫ３ＣＡ；以下の例示的、非限定的な突然変異：翻訳タンパク質のアミノ酸２７３（Ｒ２７３Ｈ）でのアルギニンからヒスチジンへの突然変異をコードするグアニンからアデノシンへの（Ｇ＞Ａ）突然変異、翻訳タンパク質のアミノ酸１７９（Ｈ１７９Ｑ）でのヒスチジンからグルタミンへの突然変異をコードするチミジンからアデノシンへの（Ｔ＞Ａ）突然変異、翻訳タンパク質のアミノ酸２２０（Ｙ２２０Ｃ）でのチロシンからシステインへの突然変異をコードするアデノシンからグアニンへの（Ａ＞Ｇ）突然変異、翻訳タンパク質のアミノ酸１７９（Ｒ２４９Ｍ）でのアルギニンからメチオニンへの突然変異をコードするグアニンからチミジンへの（Ｇ＞Ｔ）突然変異のいずれかを有するＴＰ５３を特定および／または定量化することができる。当業者によって理解されるように、上記のような他のＥＳＲ１、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＴＰ５３突然変異、ならびに表１および／または表２に列挙されるものを超える他のＥＳＲ１、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＴＰ５３突然変異もまた企図され、本明細書に記載される試薬および方法を使用する分析および／または検出にも好適であり得る。
【００３７】
標的ポリヌクレオチドが存在し得る試料には、例えば、哺乳動物または非哺乳動物（例えば、植物、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、真菌、および／または他の生物）を含むが、これらに限定されない）の組織、細胞、および／または流体（例えば、循環、乾燥、再構成）が含まれる。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、哺乳動物唾液、頬上皮細胞、頬組織、リンパ、脳脊髄液、皮膚、毛髪、血液、血漿、尿、糞便、精液、腫瘍試料（例えば、癌細胞）、培養細胞、培養腫瘍細胞であり得るか、またはこれらに由来し得る。標的ポリヌクレオチドは、ゲノム形態のＤＮＡであり得るか、またはそれは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、および／もしくは他のベクターにおいてクローン化され得る。他のタイプの試料もまた、例えば、診断または法医学的アッセイに関連し得る、本明細書に記載される方法において有用であり得る。
【００３８】
凍結乾燥
いくつかの実施形態では、個々のタイプのオリゴヌクレオチドおよび／またはその混合物は、凍結乾燥に適切な追加の成分を含み、かつ／または凍結乾燥および／もしくは他の方法で安定化（例えば、凍結乾燥（例えば、凍結、一次乾燥、二次乾燥）もしくは蒸発組成物として調製）することができ、したがって、成分を含むか、またはそのような安定化を提供するように処理することができる。混合物は、−２０℃で約２年間（例えば、乾燥、または水もしくはＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５〜８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）の溶液中）、４℃で約１年間（例えば、乾燥、または水もしくはＴＥバッファーの溶液中）、室温で約３〜６ヶ月間（例えば、乾燥、または水もしくはＴＥバッファーの溶液中）、および／または室温よりも高い温度で約１〜２ヶ月間（例えば、乾燥、または水もしくはＴＥバッファーの溶液中）安定な組成物として調製することができる。以下に記載されるキットはまた、凍結乾燥または他の方法で安定化されたオリゴヌクレオチドおよび／もしくは混合物の再構成のためのバッファー（例えば、水（例えば、滅菌、ヌクレアーゼフリー水）、またはＴＥもしくはＴｒｉｓ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）などの弱いバッファー）を含み得る。
【００３９】
方法
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、一般に、例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）に記載されるように、典型的には、熱安定性酵素および／またはそのような反応を行うように設計された熱サイクラーデバイスを使用して実施される、標的ポリヌクレオチドの相補鎖にハイブリダイズするプライマーを使用する核酸のサイクリングポリメラーゼ媒介性指数関数的増幅を指す。好適なＰＣＲには、リアルタイムＰＣＲ（例えば、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ））、ネステッドＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、エンドポイントＰＣＲ、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、ドロップｄＰＣＲ、等温ＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、より低い変性温度での共増幅（ＣＯＬＤ）ＰＣＲ、および／または等温ＰＣＲが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲ（例えば、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ））であり得る。当業者は、オリゴヌクレオチドの融解温度（「Ｔm」）がＰＣＲ性能に著しく影響を及ぼし得ることを理解する。オリゴヌクレオチドのＴmは、一本鎖オリゴヌクレオチドの集団におけるポリヌクレオチドの５０％がそれらの相補配列にハイブリダイズされ、集団におけるポリヌクレオチドの５０％が当該相補配列にハイブリダイズされない温度（典型的には摂氏度）を指す。当業者によって理解されるように、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）のＴmは、融解曲線によって経験的に決定することができる。Ｔｍは、プライマーの長さ、ＧＣ含有量のパーセンテージ、分子量、およびその減衰係数に依存し得る。いくつかの場合、Ｔmは、当該技術分野で周知の式および／または計算機を使用して計算することができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ／Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：１９８２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍから入手可能なＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｔm  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ、ＴａｑＰｉｐｅ、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓを参照されたい）。当業者はまた、ＰＣＲで使用されるプライマー（例えば、プライマー対）のＴmを使用して適切なアニーリング温度を決定することができ、ＰＣＲの特異性および収率もプライマー濃度および使用されるポリメラーゼに依存し得ることを理解する。どのポリメラーゼが使用されるかに基づいて、特定の計算を行う必要があり得る。例えば、改変されたＡｌｌａｗｉおよびＳａｎｔａＬｕｃｉａの熱力学法は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳｕｐｅｒＦｉ、Ｐｈｕｓｉｏｎ、およびＰｈｉｒｅ  ＤＮＡポリメラーゼとの反応のＴmおよびアニーリング温度計算に使用することができる（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６（３４）：１０５８１−９４（１９９７））。いくつかの実施形態では、ＰＣＲのアニーリング温度は、特定のプライマー対のオリゴヌクレオチドの最低Ｔmよりもわずかに高く（例えば、５〜１０度以内）、両方のオリゴヌクレオチドのＴmよりも高い場合がある。いくつ��の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドのＴmは、第２のオリゴヌクレオチドのＴmの５℃以内である。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドのＴmは、４８〜５８℃であり得、第２のオリゴヌクレオチドのＴmは、４８〜５８℃であり得る。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドのＴmは、第１のオリゴヌクレオチドのＴmよりも少なくとも５℃および２５℃以下高い場合がある。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドのＴmは、第１のオリゴヌクレオチドのＴmよりも少なくとも８℃および１２℃以下高い場合がある。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプライマー（例えば、第１および第２のオリゴヌクレオチド）を使用するＰＣＲのアニーリング温度は、特定のプライマー対の高い方のＴmの５〜１０℃以内であり得る。例えば、第１のオリゴヌクレオチドのＴmが第２のオリゴヌクレオチドのＴmの５℃以内である場合、アニーリング温度は、当該オリゴヌクレオチドの高い方の計算Ｔmの５℃以内であり得る。いくつかの実施形態では、例えば、第１のオリゴヌクレオチドのＴmが４８〜５８℃であり得、第２のオリゴヌクレオチドのＴmが４８〜５８℃であり得る場合、例えば、アニーリング温度は、４８℃または５８℃超（例えば、高い方のＴmの約５℃以内）であり得る。当業者によって理解されるように、ＰＣＲの他の条件もまた、本開示によって企図される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ＰＣＲ反応は、低存在量核酸（すなわち、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチド分子）が、より豊富な核酸（例えば、メジャー対立遺伝子、野生型核酸）に優先して増幅される「富化フェーズ」または「富化サイクル（複数可）」を含むことができ、混合物を、２分間９５℃の１サイクル、１〜３秒間９５℃および２０秒間６４℃の１５〜２０サイクル（富化フェーズ）、ならびに１秒間９５℃および２０秒間６０℃の４０サイクル（増幅および検出フェーズ）に供した。理論によって限定されないが、富化フェーズにおける高温は、標的配列特異的プライマーに結合した場合に単一塩基ミスマッチ（例えば、単一塩基ミスマッチ）を含有する、豊富な核酸への標的配列特異的プライマーのアニーリングと比較して、標的配列特異的プライマーに結合した場合に完全一致を形成する、低存在量の標的ポリヌクレオチドへの配列特異的プライマーのアニーリングに有利に働く可能性がある。いくつかの実施形態では、ｑＰＣＲ反応を、富化フェーズなしで実施し、混合物を、１〜１０分、例えば２分間９５℃の１サイクル、ならびに１秒間９５℃および２０秒間６０℃の４０サイクル（増幅および検出フェーズ）に供した。いくつかの実施形態では、富化は、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）および／または第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ）の計算された融解温度（Ｔm）よりも１２〜１６℃高い温度での１５〜２５サイクルを含むＰＣＲを使用して実施することができる。アニール／伸長温度の許容されるガイドラインは、計算されたプライマーＴmよりも５℃低い。ここで記載されるアプローチは、豊富な標的ポリヌクレオチド配列（例えば、メジャー対立遺伝子、野生型核酸）を犠牲にして、標的ポリヌクレオチド（すなわち、低存在量またはレア核酸分子）のアニーリングおよび増幅に有利に働くように、富化フェーズにおいて高温を使用する。ＴＳＰは、（レア）標的ポリヌクレオチド配列の完璧な一致であるが、より豊富な標的ポリヌクレオチド（例えば、メジャー対立遺伝子、野生型核酸）との単一塩基ミスマッチを含む。より高いアニール／伸長温度と組み合わされたこのミスマッチは、低存在量のポリヌクレオチド種（すなわち、低存在量および／またはレア標的ポリヌクレオチド分子）の増幅を可能にする。アニール／伸長温度は、典型的には、富化温度よりも３℃〜８℃低い。富化およびアニール／伸長温度が同等である場合、レア標的と豊富な標的との区別は失われるであろう。いくつかの実施形態では、ｑＰＣＲは、特に（結果の統計分析で）試料中に低コピー数の標的ポリヌクレオチドを含むと予想される試料について、最低３つの複製を使用して段階希釈（例えば、５対数希釈）で実施され得る。当業者によって理解されるように、ＰＣＲの他の条件もまた、本開示によって企図される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本開示は、標的ポリヌクレオチド配列を潜在的に含む試験核酸試料の反応混合物、ならびに第１のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＰ）、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＳＰ）、および第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）の混合物を形成し、少なくとも第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してアンプリコンを生成する増幅反応を実施し、第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）の検出可能な特性における変化を検出することによってアンプリコンを検出することによって、標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチドを検出するための方法を提供し、アンプリコンの検出は、標的ポリヌクレオチドが試験核酸試料内に存在することを示す。いくつかの実施形態では、試験核酸試料は、標的バリアントヌクレオチドを含むか、またはこれに対応する標的ポリヌクレオチドを含む核酸と、標的バリアントヌクレオチドを含まないか、またはこれに対応しない野生型核酸との混合物を含む。いくつかの実施形態では、上記され、例で示されるように、方法は、例えば、検出のために標的ポリヌクレオチド配列を増幅するために使用されるものとは異なる条件下で増幅反応を実施することによって、より豊富な（例えば、野生型）核酸ポリヌクレオチドと比較して、試験核酸試料における標的ポリヌクレオチドの数を富化する（例えば、増加させる）こと（すなわち、例えば、第１のオリゴヌクレオチドの計算された融解温度（Ｔm）よりも１２〜１６℃高い温度での１５〜２５サイクルを含むＰＣＲを実施することと、次いで第３のオリゴヌクレオチドのＴmの約５℃〜２５℃および富化が行われた温度よりも３〜８℃低い温度で１５〜６０、２０〜５０、３０〜５０、３５〜４５、３８〜４２、または４０サイクルを実施することと、を含む富化フェーズ）を含み得る。
【００４２】
ＰＣＲから得られる増幅は、典型的には、閾値サイクル（Ｃt）、試料における増幅された核酸の濃度の相対的な測定値を測定することによって定量化され、これは増幅曲線と閾値線との間の交点である。Ｃtデータは、ＰＣＲサイクル数でのｌｏｇ（ΔＲｎ）の変動を示す増幅プロットに表される。Ｒｎは、レポーター色素の蛍光を受動的参照色素の蛍光で割ったもの、すなわち、Ｒｎは、レポーター色素の蛍光シグナルに対して正規化されたレポーターシグナルである。Ｒｎは、ＰＣＲサイクル数に対してプロットされる。ΔＲｎは、Ｒｎからベースライン蛍光値（例えば、バックグラウンドＦＡＭ蛍光）を差し引いたものであり、増幅条件（例えば、使用されるレポーター色素のタイプおよび／または使用されるマスターミックスのタイプ）に応じて異なり得る。例示的なレポーター色素（または受動的参照色素）としては、ＲＯＸ（商標）またはＭｕｓｔａｎｇ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃt値は、テンプレートの量が減少するにつれて増加する。本明細書において例に示されるものなどのいくつかの実施形態では、複数のｑＰＣＲ反応（例えば、２つ以上）は、同じ混合物（例えば、対照および試験反応）で実施され得、増幅プロット上で互いに区別される２つのＣt値をもたらし、デルタＣt（ΔＣt）として表され得る。いくつかの実施形態では、ΔＣtは、例えば、少なくとも約８であり得る（例えば、本明細書における実施例１は、９．０〜１６．３のΔＣt値を示す）。増幅反応から生成されたデータは、Ｅｘｃｅｌ形式でエクスポートすることができ、複製反応のＣｔ（あるいはＣｑとも呼ばれる）値が平均化され、各条件における標識された標的ポリヌクレオチド（例えば、ＦＡＭおよびＶＩＣ標的）のデルタ平均Ｃｑが決定され、プロットされる。よって、デルタＣｑを使用して、相対的または絶対的な方法で、標的ポリヌクレオチドまたは標的バリアントポリヌクレオチドの開始量を定量化することができる（例えば、本開示の例および図に示されるように）。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物および／または混合物は、例えば、本明細書に開示される組成物および／または混合物、ならびに方法を使用する逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）において出発材料として役立ち得るリボ核酸（ＲＮＡ）を含み得る。そのような実施形態では、組成物および／または混合物は、逆転写酵素（ＲＴ）および関連する成分を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＴ−ＰＣＲは、１つ以上の標的配列特異的プライマー（例えば、ＴＳＰまたは第１のオリゴヌクレオチド）、１つ以上の遺伝子座特異的プライマー（例えば、ＬＳＰまたは第２のオリゴヌクレオチド）、および１つ以上の標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）を使用する一段階手順であり得る。好適な例示的なＲＴには、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、またはＭａｘｉｍａ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれ得る。組成物および／または混合物はまた、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ  ＶＩＬＯマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、または任意の他の好適なマスターミックス（上記のものを含む）に見られ得るような、そのような反応を実施するために必要な任意の他の成分を含み得る。
【００４４】
特定の波長の光ビームを放出し、蛍光色素の強度を読み取り、各サイクル後に蛍光の強度を表示することができる蛍光指示剤を含有する組成物で熱サイクリング反応を行うことができるデバイスが開発されている。サーマルサイクラー、光ビームエミッター、および蛍光シグナル検出器を含むデバイスは、例えば、米国特許第５，９２８，９０７号、第６，０１５，６７４号、第６，１７４，６７０号、および第６，８１４，９３４号に記載されており、とりわけ、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡＢＩ  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡＢＩ  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７３００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡＢＩ  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７５００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡＢＩ  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２Ｋ  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ７  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ６  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ５  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ３  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＶｉｉＡ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｓ１０００（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｔ１００（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ＣＦＸ３８４  Ｔｏｕｃｈ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、およびＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ（Ｑｉａｇｅｎ）、ならびにそれらに対するシステム（例えば、ソフトウェア）を含むが、これらに限定されない。当業者に周知のように、これらのシステムは、複数の試料（例えば、９６ウェルまたは３８４ウェルシステム）および／または複数の検出可能な標識（例えば、マルチプレックスアッセイ）などを同時に分析するために使用することができ、本明細書に記載される混合物および方法での使用に適している。例えば、これらのデバイスは、異なる検出可能な標識を検出するための複数のチャネル（例えば、緑および黄色を検出するための２つのチャネル、緑、黄、オレンジ、および赤を検出するための４つのチャネル、緑、黄、オレンジ、赤、および深紅を検出するための５つのチャネル、青、緑、黄、オレンジ、赤、および深紅などを検出するための６つのチャネル）を含むことができる。これらのシステムの多くが自動化され、かつ／またはソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＣＦＸ  Ｍａｅｓｔｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ＣＦＸ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｑ−Ｒｅｘソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ））に依存および／もしくはこれらを使用し得ることも周知である。チューブ（例えば、０．１または０．２ｍｌ）、カード、プレート（例えば、マイクロプレート、４８、６０、９６、または３８４ウェルプレート）、アレイ、オープンアレイ、マイクロフルイディクス、および／またはＰＣＲで使用される特定のデバイスにおける使用のために設計された任意のプラスチックもしくは他の部品を含むが、これらに限定されない、利用可能なＰＣＲフォーマットのいずれも利用することができる。これらのデバイスおよびソフトウェアのいずれか、ならびに／または当業者に利用可能な任意の他のものも、好適であり得、本明細書で企図される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、突然変異を示す標的バリアントヌクレオチドを検出することができ、核酸試料は、わずか約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１〜約１０、約１０〜１５、約１５〜２０、約２０〜２５、約２６〜５０、約５０〜７５、または約７５〜１００コピーのいずれかの標的ポリヌクレオチド（例えば、はるかに多数のより豊富なポリヌクレオチドの存在下で）を含む。例えば、メジャー対立遺伝子（複数可）および／または野生型ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの９９％超を含み得、かつ／または標的ポリヌクレオチドは、試料ポリヌクレオチド集団（例えば、試験試料）の例えば、約２％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、または０．０００１％のいずれかを含む。標的ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される方法を使用して、そのような試料ポリヌクレオチド集団内から検出することができる。いくつかの実施形態では、他の対立遺伝子を含むプールまたは混合された試料中の標的バリアントヌクレオチドを含む低存在量の（例えば、レア）対立遺伝子バリアントを検出および／または定量化するための方法。いくつかの実施形態では、標的バリアントヌクレオチドは、プリン塩基を含み、標的バリアントヌクレオチド位置の野生型ヌクレオチドは、異なるプリン塩基を含み、標的バリアントヌクレオチドは、ピリミジン塩基を含み、標的バリアントヌクレオチド位置の野生型ヌクレオチドは、異なるピリミジン塩基を含む。いくつかの実施形態では、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）は、ＴＳＰ（例えば、第１のオリゴヌクレオチド）のＴmよりも６〜２０℃（最適には８〜１２℃）高いＴmを有し、増幅反応（例えば、ｑＰＣＲ）は、ＴＳＰのＴmの５℃以内のアニーリング温度で実施される。いくつかの実施形態では、試験核酸試料は、哺乳動物もしくは非哺乳動物の動物組織もしくは細胞、または植物組織もしくは細胞に由来する。いくつかの実施形態では、アンプリコンの検出は、試験核酸試料が由来する組織内の癌細胞の存在を示す。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、Ｒａｓ、ＥＦＧＲ、Ｋｉｔ、ｐＴＥＮ、および／もしくはｐ５３における少なくとも１つの突然変異、ならびに／または少なくとも１つのＫＲＡＳもしくはＮＲＡＳ突然変異を含む。いくつかの実施形態では、これらの方法において実施される増幅反応は、リアルタイムＰＣＲを含むがこれに限定されないポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であるか、またはこれに依存するか、またはこれを含む。例えば、以下の特定の例では、対立遺伝子バリアントＫＲＡＳ  ＤＮＡ内に存在する標的バリアントヌクレオチド（本明細書の他の場所で標的ポリヌクレオチドと呼ばれ得る）、順方向または逆方向プライマー（ＴＳＰ）は、アッセイ対象の対立遺伝子バリアントＫＲＡＳ  ＤＮＡの標的バリアントヌクレオチドに相補的な３’末端におけるヌクレオチドを含むことによって、標的バリアントヌクレオチドに結合するように設計され、標識されたＴａｑＭａｎプローブは、標的バリアントヌクレオチドを含むように設計され、標的ポリヌクレオチドは、増幅および検出された（例えば、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃおよび野生型（ＷＴ）ＤＮＡのＣt値を区別する図４Ｄ、または試料における標的ポリヌクレオチドの量に基づくＣt値における変動を示す図１０を参照されたい）。当業者によって理解されるように、他の実施形態も企図される。
【００４６】
特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、所与の核酸配列（例えば、ＳＮＰまたは遺伝子）について野生型核酸配列（例えば、第２の対立遺伝子バリアント）の１／１０、１／１００、１／１，０００、１／１０，０００、１／１００，０００、１／１，０００，０００、１／１０，０００，０００、１／１００，０００，０００、または１／１，０００，０００，０００、およびその間の任意の分画範囲未満の頻度で試料中に存在する標的ポリヌクレオチド配列（例えば、第１の対立遺伝子バリアント）を検出するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、試料（例えば、試験試料）または反応体積の１、１０、１００、１，０００マイクロリットル、およびその間の任意の分画範囲あたり２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１，０００、２，５００、５，０００、７，５００、１０，０００、２５，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、２５０，０００、５００，０００、７５０，０００、１，０００，０００コピー未満で存在する標的ポリヌクレオチド配列（例えば、第１の対立遺伝子バリアント）を検出するために使用され得る。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、第１の対立遺伝子バリアント）は、突然変異体核酸配列であり得る。いくつかの実施形態では、第２の対立遺伝子バリアントは、野生型核酸配列である。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１，０００〜１，０００，０００、例えば、約１０００〜１０，０００、約１０，０００〜１００，０００、もしくは約１００，０００〜１，０００，０００の野生型ポリヌクレオチド、またはその間の任意の分画範囲のバックグラウンドにおいて１つの標的ポリヌクレオチド配列（例えば、第１の対立遺伝子バリアント、突然変異体）を検出することを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、高感度および少なくともＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースのアッセイに相当する効率を提供することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法を含む第１のアンプリコン（例えば、標的ポリヌクレオチド配列を表す）および第２のアンプリコン（例えば、野生型核酸配列を表す）の比較は、１００倍〜１，０００，０００倍の倍率差、例えば、約１００〜１，０００倍、約１，０００〜１０，０００倍、約１０，０００〜１００，０００倍、もしくは約１００，０００〜１，０００，０００倍の倍率差、またはその間の任意の分画範囲の特異性における改善を提供し得る。いくつかの実施形態では、アンプリコンのサイズは、約６０〜１２０ヌクレオチド長の範囲である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、混合物、組成物、方法、および／またはそれを含むか、もしくはそれに関連するキット（例えば、本明細書に記載される）は、テトラ、トリ、およびジアレリックＳＮＰのジェノタイピングに使用することができる。いくつかの実施形態では、組成物、方法、および／またはキットは、品質管理（ＱＣ）およびヒト特定アッセイのための混合ＤＮＡ試料からのＤＮＡタイピング、細胞汚染についての細胞株ＱＣ、対立遺伝子発現分析、ウイルスタイピング／レア病原体検出、プールされた試料からの突然変異検出、血液中の循環腫瘍細胞の検出、ならびに／または出生前診断に使用され得る。いくつかの実施形態では、（例えば、本明細書に記載される）オリゴヌクレオチド、混合物、組成物、方法、および／またはそれを含むか、もしくはそれに関連するキットは、早期癌診断のために血液中の腫瘍細胞を検出するために使用することができる。いくつかの実施形態では、組成物、方法、および／またはキットは、癌もしくは疾患関連遺伝的変異または体細胞突然変異の検出および検証のために使用することができる。いくつかの実施形態では、（例えば、本明細書に記載される）オリゴヌクレオチド、混合物、組成物、方法、および／またはそれを含むか、もしくはそれに関連するキットは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）からのＳＤＳソフトウェアベースの機器などの様々な機器と適合性であり得る。本明細書に開示される（例えば、本明細書に記載される）オリゴヌクレオチド、混合物、組成物、方法、および／またそれを含むか、もしくはそれに関連するキットの他の使用および用途もまた、当業者によって理解されるように、本開示によって企図される。
【００４８】
キット
本開示はまた、本明細書に開示される、オリゴヌクレオチド、混合物、および組成物を使用、ならびに／または本明細書に記載される方法を実施するためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）標的ポリヌクレオチドにおける標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズすることができる標的配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、第１のオリゴヌクレオチドまたは第１の対立遺伝子特異的プライマー）と、（ｂ）遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド（例えば、第２のオリゴヌクレオチド、または第２の対立遺伝子特異的プライマー）と、（ｃ）典型的には検出可能であり（例えば、検出可能な標識を含み）、消光部分および／またはＭＧＢ部分を含む、標的ポリヌクレオチド配列の標的バリアントヌクレオチドに対応するヌクレオチドにハイブリダイズすることができるプローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）と、を含む、高存在量の核酸配列（例えば、第２の対立遺伝子バリアント、野生型核酸配列）を含む試料における標的ポリヌクレオチド配列（例えば、第１の対立遺伝子バリアント、突然変異体）を定量化するためのキットを提供する。任意に、ポリメラーゼおよび／もしくはｄＮＴＰなどの他の反応成分、ならびに／またはＭｇ2+などの補因子もまた、キットに含まれ得る。いくつかの実施形態では、キットは、（例えば、本明細書に記載されるように）ＲＴ−ＰＣＲを実施するために必要な試薬などを含み得、１つ以上のＲＴは、キットに含まれ得るＤＮＡポリメラーゼ（複数可）と同じまたは別個の容器に含有され得る。いくつかの実施形態では、キットは、そのような容器に独立して分配されるか、または１つまたは別の容器に任意の組み合わせで一緒に含まれる、そのような成分を含む２つ以上の容器を含むことができる。いくつかの実施形態では、そのようなキットは、本明細書で提供される混合物（またはその任意の成分）を含有する第１の容器、および第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む対照核酸試料を含有する第２の容器を含むことができる。よって、いくつかの実施形態では、キットは、（ａ）標的ポリヌクレオチドにおける標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズすることができる標的配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、第１のオリゴヌクレオチドまたは第１の対立遺伝子特異的プライマー）と、（ｂ）遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド（例えば、第２のオリゴヌクレオチド、または第２の対立遺伝子特異的プライマー）と、（ｃ）典型的には検出可能であり（例えば、検出可能な標識を含み）、消光部分および／またはＭＧＢ部分を含む標的ポリヌクレオチド配列の標的バリアントヌクレオチドに対応するヌクレオチドにハイブリダイズすることができるプローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）と、を含有する、第１の容器（例えば、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、および第３のオリゴヌクレオチド）、ならびに第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む対照核酸試料を含有する第２の容器および／またはキットを含む。いくつかの実施形態では、キットに含まれるオリゴヌクレオチドおよび／または他の成分は、凍結乾燥されるか、またはそうでなければ保存および／もしくは出荷のために安定化され、ユ���ザーの所望に応じて再構成され得る。使用説明書も含めることができる。
【００４９】
例示的な実施形態
よって、いくつかの実施形態では、本開示は、ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、ｂ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、ｃ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列と少なくとも部分的に重複し、第３の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第１の配列（Ａ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド（「第１のバリアントヌクレオチド」）を含み、第１のオリゴヌクレオチドが、第１のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端におけるヌクレオチドをさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、ｂ）第２の配列（Ｂ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の配列が、第３の配列（Ｃ）に相補的であり、第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、第３の配列（Ｃ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列（Ａ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、ｃ）第５の配列（Ｅ）に相補的な第４の配列（Ｄ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、第５の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、第５の配列（Ｅ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ａ）と少なくとも部分的に重複し、第１の標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物、およびそれを使用するための方法、ならびにそのような試薬を使用および／もしくは保存するため、ならびに／またはそのような方法を実施するための説明書を含み得るキットを提供する。例示的な実施形態が図１に示される。いくつかの実施形態では、第１の標的ポリヌクレオチド鎖は、第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される配列Ａ、Ｅ、およびＣは、第１の標的ポリヌクレオチド鎖上の一本鎖Ｂポリヌクレオチド分子内に位置している。
【００５０】
いくつかの実施形態では、第２の標的ポリヌクレオチドの増幅および検出に適したオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの追加のセットが含まれ得る。この少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチドのセットのオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列ではなく、機能において、上記のように第１の標的ポリヌクレオチドを増幅および検出するために使用されるものに対応する。例えば、少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチドのセットは、ａ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在する第１の配列（Ｆ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド（「第２のバリアントヌクレオチド」）を含み、第１のオリゴヌクレオチドが、第２のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端におけるヌクレオチドをさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、ｂ）第２の配列（Ｇ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の配列（Ｇ）が、第３の配列（Ｈ）に相補的であり、第３の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、第３の配列（Ｈ）が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列（Ｆ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、ｃ）第５の配列（Ｊ）に相補的な第４の配列（Ｉ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、第５の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、第５の配列（Ｊ）が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ｆ）と少なくとも部分的に重複し、第２の標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドと、を含み得る。本明細書に記載されるように配置されたオリゴヌクレオチドの追加のセットも含まれ得る。いくつかの実施形態では、第１、第２、および／または第３のオリゴヌクレオチドは、１０〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、伸長可能である。いくつかの実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、プライマーである。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドにおける標的バリアントヌクレオチドは、第３のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、第１の配列の３〜６つの連続するヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、第１の配列のヌクレオチドの配列と重複しない第１の標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、伸長不可能であり得、および／またはプローブであり得る。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、第３のオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドに位置することができる小溝結合剤（ＭＧＢ）部分を含む。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、加水分解プローブであり得る。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドのＴmは、第２のオリゴヌクレオチドのＴmの５℃以内である。いくつかの実施形態では、第１のオリゴ���クレオチドのＴmは、４５〜６０℃であり得、第２のオリゴヌクレオチドのＴmは、４５〜６０℃であり得る。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドのＴmは、第１のオリゴヌクレオチドのＴmよりも少なくとも５℃および２５℃以下高い場合がある。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドのＴmは、第１のオリゴヌクレオチドのＴmよりも少なくとも８℃および１２℃以下高い場合がある。
【００５１】
いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、第３のオリゴヌクレオチドの第１の末端ヌクレオチド上にあり得る蛍光標識などの検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＤＮＡ結合色素、レポーター色素、蛍光プローブ、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ（商標））、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ（商標））、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル（ＪＯＥ（商標））、ＶＩＣ（商標）、カルボキシレート基の代わりにＳＯ3を含むフルオレセイン色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホルアミダイト型、ＣＹ５のホスホルアミダイト型、非ＦＲＥＴ標識、フェロセン試薬、ＡＢＹ（商標）、ＮＥＤ（商標）、ＪＵＮ（商標）、Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０、ＴＹＥ（商標）５６３、ＴＹＥ（商標）６６５、ＴＹＥ（商標）７０５、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、第３のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にあり得る消光部分（例えば、検出可能な標識からのシグナルを消光することができる）をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、消光標識は、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、非蛍光消光剤（ＮＦＱ）、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ、ＱＳＹ、ＱＳＹ７、ＱＳＹ２１、ＮＦＱ、ダブシルおよび／またはダブシルスルホネート／カルボキシレートクエンチャーからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、第１の末端ヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２の末端ヌクレオチドは、３’末端ヌクレオチドである。
【００５２】
いくつかの実施形態では、組成物および／または混合物は、第４のオリゴヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、混合物は、検出可能な標識を含む第４のオリゴヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、混合物は、標的ポリヌクレオチド鎖に結合する第４のオリゴヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、混合物は、検出可能な標識を含む第４のオリゴヌクレオチドを含まず、標的ポリヌクレオチド鎖に結合する。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識、および標的ポリヌクレオチド鎖の配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する混合物における唯一のオリゴヌクレオチドである。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本開示は、標的ポリヌクレオチド鎖を含む少なくとも１つの一本鎖標的ポリヌクレオチドを含む組成物および／または混合物を提供する。いくつかの実施形態では、混合物は、標的ポリヌクレオチド鎖および標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む少なくとも１つの二本鎖標的ポリヌクレオチドを含み、標的相補体ポリヌクレオチド鎖は、標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である。いくつかの実施形態では、混合物は、標的ポリヌクレオチド鎖および標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む少なくとも１つの二本鎖標的ポリヌクレオチドを含み、標的相補体ポリヌクレオチド鎖は、標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的であり、二本鎖標的ポリヌクレオチドは、バリアントポリヌクレオチド鎖およびバリアント相補体ポリヌクレオチド鎖を含み、バリアントポリヌクレオチド鎖は、標的ポリヌクレオチド鎖との同一性を有するか、または実質的に同一であり、標的ポリヌクレオチド鎖とは異なるヌクレオチドを標的バリアントヌクレオチドに含み、バリアント相補体ポリヌクレオチド鎖は、バリアントポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である。いくつかの実施形態では、突然変異体対立遺伝子は、標的バリアントヌクレオチドを含み得、メジャー対立遺伝子配列もしくはマイナー対立遺伝子配列（例えば、集団頻度が１％未満の対立遺伝子）に対応する同一性を有し得、一塩基多型の位置で生じ得、例えば、限定されないがＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ  ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＫＴ１、ＥＳＲ１、ＴＰ５３の対立遺伝子であり得、かつ／または確率的突然変異であり得る。いくつかの実施形態では、突然変異体対立遺伝子は、標的バリアントヌクレオチドにおけるプリンからプリンへの単一点突然変異またはピリミジンからピリミジンへの単一点突然変異のいずれかである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、組成物および／または混合物は、ａ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第４のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチドにおける第１の配列が、第２の標的バリアントヌクレオチドを含み、第４のオリゴヌクレオチドが、第２の標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチドをさらに含む、第４のオリゴヌクレオチドと、ｂ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を含む第５のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の第１の配列から３’下流に位置している、第５のオリゴヌクレオチドと、ｃ）検出可能な標識、および第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列の両方を含む（任意に検出可能な）第６のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の第１の配列と少なくとも部分的に重複し、第２の標的バリアントヌクレオチドを含む、第６のオリゴヌクレオチドと、をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、第４、第５、および／または第６のオリゴヌクレオチドは、１０〜４０ヌクレオチドを含み得、第４および第５のオリゴヌクレオチドは、好ましくは１０〜３０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第４および第５のオリゴヌクレオチドは、伸長可能であり得、かつ／またはプライマーであり得る。いくつかの実施形態では、第６のオリゴヌクレオチドにおける標的バリアントヌクレオチドは、第６のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第６のオリゴヌクレオチドは、第６のオリゴヌクレオチドの第１の末端ヌクレオチド上にあり得る検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含むことができる。第６のオリゴヌクレオチドは、第６のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にあり得る、検出可能な標識からのシグナルを消光することができる消光部分をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、第６のオリゴヌクレオチドは、伸長不可能であり得、かつ／またはプローブであり得る。いくつかの実施形態では、第６のオリゴヌクレオチドは、第６のオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド上にあり得る小溝結合剤（ＭＧＢ）部分を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、組成物および／または混合物は、ａ）第１のオリゴヌクレオチドに相補的である配列にハイブリダイズするように構成された配列を含む第４のオリゴヌクレオチドであって、第４のオリゴヌクレオチドが、第１の配列に実質的にハイブリダイズするように構成され、その３’末端に、標的バリアントヌクレオチドの相補体とは異なるヌクレオチドを含む、第４のオリゴヌクレオチドと、ｂ）第３のオリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズするように構成された（任意に検出可能な）第５のオリゴヌクレオチドであって、第５のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドの部位に異なるヌクレオチドを含む、第５のオリゴヌクレオチドと、をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、第４および第５のオリゴヌクレオチドは、１０〜４０ヌクレオチドを含み、第４のオリゴヌクレオチドは、好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドは、伸長可能であり得、かつ／またはプライマーであり得る。いくつかの実施形態では、第５のオリゴヌクレオチドにおける標的バリアントヌクレオチドは、第５のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、第５のオリゴヌクレオチドは、第３のオリゴヌクレオチド上の検出可能な標識とは区別可能であり得る、第１の末端ヌクレオチド上にあり得る検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含むことができる。第５のオリゴヌクレオチドは、第３のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にあり得る、検出可能な標識からのシグナルを消光することができる消光部分をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、第５のオリゴヌクレオチドは、伸長不可能であり、かつ／またはプローブである。いくつかの実施形態では、第５のオリゴヌクレオチドは、その３’末端ヌクレオチド上にあり得る小溝結合剤（ＭＧＢ）部分を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本開示は、複数のオリゴヌクレオチドセットを含む組成物および／または混合物を提供し、各オリゴヌクレオチドセットは、ａ）標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに含む、第１のオリゴヌクレオチドと、ｂ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的である配列にハイブリダイズするように構成された配列を含む第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の配列が、第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、ｃ）標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列に相補的である配列にハイブリダイズするように構成された配列を含む検出可能な第３のオリゴヌクレオチドであって、第３の配列が、第１の配列と少なくとも部分的に重複し、標的バリアントヌクレオチドを含み、各セットの前記第１のオリゴヌクレオチドが、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成され、各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる第３の配列と配列類似性を共有し、各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる区別可能な検出可能な標識を含む、検出可能な第３のオリゴヌクレオチドと、を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本開示は、複数のオリゴヌクレオチドセットを含む組成物および／または混合物を提供し、各オリゴヌクレオチドセットは、ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、ｂ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ヌクレオチド鎖の第２の配列が、第１の標的ヌクレオチド鎖の第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、ｃ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ヌクレオチド鎖の第３の配列が、第１の標的ヌクレオチド鎖の第１の配列と少なくとも部分的に重複し、第３の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、各セットの前記第１のオリゴヌクレオチドが、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成され、各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる第３の配列と配列類似性を共有し、かつ／または各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる区別可能な検出可能な標識を含む、第３のオリゴヌクレオチドと、を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本開示は、複数のオリゴヌクレオチドセットを含む組成物および／または混合物を提供し、各オリゴヌクレオチドセットは、ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在する第１の配列（Ａ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド（「第１のバリアントヌクレオチド」）を含み、第１のオリゴヌクレオチドが、第１のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチドをさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、ｂ）第２の配列（Ｂ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の配列が、第３の配列（Ｃ）に相補的であり、第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、第３の配列（Ｃ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列（Ａ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、ｃ）第５の配列（Ｅ）に相補的な第４の配列（Ｄ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、第５の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、第５の配列（Ｅ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ａ）と少なくとも部分的に重複し、第１の標的バリアントヌクレオチドを含み、各セットの第１のオリゴヌクレオチドが、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成され、各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる第３の配列と配列類似性を共有し、かつ／または各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる区別可能な検出可能な標識を含む、第３のオリゴヌクレオチドと、を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物および／または混合物は、追加の成分を含むことができる。例えば、混合物は、約１０ｍＭ〜約８０ｍＭの塩化カリウム、および／または約１０ｍＭ〜約４０ｍＭの硫酸アンモニウムをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、混合物は、３０ｍＭ〜８０ｍＭの濃度の塩化カリウム、および１０ｍＭ〜４０ｍＭの濃度の硫酸アンモニウムを含むことができる。いくつかの実施形態では、混合物は、約４５ｍＭの塩化カリウム、約２２ｍＭの硫酸アンモニウムを含むことができる。いくつかの実施形態では、混合物は、熱安定性であり得るポリメラーゼをさらに含むことができ、かつ熱安定性ポリメラーゼに向けられた抗体、オリゴヌクレオチド、および／またはアプタマーなどのホットスタート成分をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、混合物は、ヌクレオチド源をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、混合物は、反応混合物である。いくつかの他の実施形態では、混合物は、貯蔵混合物である。いくつかの実施形態では、混合物は、標的ポリヌクレオチド鎖を含むことが疑われる核酸試料を含むことができる。いくつかの実施形態では、混合物は、マスターミックスを含むことができ、かつ／またはマスターミックスであり得る。いくつかの実施形態では、混合物は、標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列を含むアンプリコンをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、混合物は、第２のポリヌクレオチド鎖の配列を含むアンプリコンを含まない。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つの洗浄剤、グリセロール、少なくとも１つの参照色素、ウシ血清アルブミン、および／またはゼラチンのうちの１つ以上を含む混合物を提供する。いくつかの実施形態では、混合物は、凍結乾燥され得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される１つ以上の混合物を含有する第１の容器と、第１の標的ポリヌクレオチド鎖と配列類似性を共有することを含む対照核酸試料を含有する第２の容器とを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、対照核酸試料は、標的ポリヌクレオチドの一部分（例えば、異種配列）のみを含むことができ、いくつかの実施形態では、対照核酸試料は、第１の標的ポリヌクレオチド鎖全体を含む。
【００６１】
本開示はまた、本明細書に記載される試薬（例えば、オリゴヌクレオチド）を使用して、標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチドを検出するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ａ）試験核酸試料と本明細書に記載される混合物のうちの１つ以上との反応混合物を形成することと、ｂ）少なくとも第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、試料に存在する場合、標的ポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、ｃ）第３のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって、アンプリコンを検出することと、を含むことができ、ステップｃ）においてアンプリコンを検出することは、標的ポリヌクレオチドが試験核酸試料内に存在することを示す。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド（例えば、まれな／低存在量核酸）と、標的バリアントヌクレオチドを含まない非標的ポリヌクレオチド（例えば、高存在量核酸）とを含む核酸の混合物を含む試料において同定され得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本開示は、試験ポリヌクレオチド試料における標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法を提供し、方法は、ａ）試験ポリヌクレオチド試料と、本明細書に記載される第１、第２、および第３のオリゴヌクレオチドの混合物との反応混合物を形成することと（いくつかの実施形態では、本明細書に記載される第４、第５、および／もしくは第６のオリゴヌクレオチドもまた含む）、ｂ）少なくとも第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、標的ポリヌクレオチド分子の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、ｃ）第３のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって、ステップｂ）において生成されたアンプリコンを検出することと、を含み、ステップｃ）においてアンプリコンを検出することは、標的ポリヌクレオチド分子が試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す。これらの方法のいくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド分子は、ポリヌクレオチド分子の混合物を含む試験ポリヌクレオチド試料において検出され、混合物は、標的バリアントヌクレオチドの第１のバリアント形態を含むポリヌクレオチド分子（「第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子」）、および標的バリアントヌクレオチドの第２のバリアント形態を含むポリヌクレオチド分子（「第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子」）を含む。これらの方法のいくつかの実施形態では、試験ポリヌクレオチド試料は、標的ポリヌクレオチド配列を含まないポリヌクレオチド鎖（「非標的ポリヌクレオチド分子」）を含む。これらの方法のいくつかの実施形態では、試験試料は、標的ポリヌクレオチド分子よりも多くの非標的ポリヌクレオチド分子を含む。これらの方法のいくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド分子は、まれな対立遺伝子または突然変異体ポリヌクレオチド配列である。これらの方法のいくつかの実施形態では、非標的ポリヌクレオチド分子は、メジャー対立遺伝子または野生型ポリヌクレオチド配列である。これらの方法のいくつかの実施形態では、試験試料は、非標的ポリヌクレオチド分子と比較して、２％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満の標的ポリヌクレオチド分子を含む。これらの方法のいくつかの実施形態では、試験試料は、第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子と比較して、２％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満の第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子を含む。これらの方法のいくつかの実施形態では、第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子および／または第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子は、突然変異体ポリヌクレオチド配列である。これらの方法のいくつかの実施形態では、第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子および／または第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子は、野生型ポリヌクレオチド配列である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、方法は、ステップａ）〜ｃ）の前の第２のバリアントポリヌクレオチド分子と比較して、ポリヌクレオチド試験試料における第１のバリアントポリヌクレオチド分子の数を富化することをさらに含む（「富化」ステップ）。これらの方法のいくつかの実施形態では、富化ステップは、ステップａ）〜ｃ）で使用されるものとは異なる条件下での増幅反応を含む。いくつかの実施形態では、富化ステップは、ポリヌクレオチド試験試料における第１のバリアントポリヌクレオチド分子の数を、第２のバリアントポリヌクレオチド分子と比較して、少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、または１０倍増加させる（富化する）。例えば、いくつかの実施形態では、富化ステップは、第１のオリゴヌクレオチドの計算された融解温度（ＴM）よりも１２〜１６度高い温度での１５〜２５サイクルを含むＰＣＲを使用して実施される。いくつかの実施形態では、ステップａ）〜ｃ）は、富化が行われる温度より４〜６度低い温度で、標的部位特異的プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド）のＴm近くでの４０サイクルを含む。これらの方法のいくつかの実施形態では、試験ポリヌクレオチド試料は、哺乳動物もしくは非哺乳動物の動物組織もしくは細胞、または植物組織もしくは細胞に由来する。これらの方法のいくつかの実施形態では、試料は、唾液、頬組織、皮膚、毛髪、血液、血漿、尿、糞便、精液、および腫瘍試料からなる群から選択される。これらの方法のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド試験試料は、癌細胞に由来する。これらの方法のいくつかの実施形態では、アンプリコンの検出は、試験ポリヌクレオチド試料が由来する組織内の癌細胞の存在を示す。これらの方法のいくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＥＦＧＲ（例えば、図２０）、Ｒａｓ（例えば、少なくとも１つのＫＲＡＳもしくはＮＲＡＳ突然変異（例えば、図２１））、Ｋｉｔ、ｐＴＥＮ、および／もしくはｐ５３における少なくとも１つの突然変異、ならびに／または少なくとも１つのＫＲＡＳもしくはＮＲＡＳ突然変異、ならびに／または表１および／もしくは表２に列挙される少なくとも１つの突然変異を含む。これらの方法のいくつかの実施形態では、増幅反応は、リアルタイムＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。これらの方法のいくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドのＴｍよりも６〜２０℃（最適には８〜１２℃）高いＴｍを有し、ＰＣＲは、第１のオリゴヌクレオチドのＴｍの５℃以内のアニーリング温度で実施される。いくつかの実施形態では、これらの方法は、少なくとも第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、および第３のオリゴヌクレオチドを含有する第１の容器と、第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む対照ポリヌクレオチド試料を含有する第２の容器とを含むキットを使用して実施される。いくつかの実施形態では、方法は、突然変異を示す標的バリアントヌクレオチドを検出し、ポリヌクレオチド試料は、標的ポリヌクレオチドの１〜１０コピーを含む。これらの方法のいくつかの実施形態では、標的バリアントヌクレオチドがプリン塩基を含み、標的バリアントヌクレオチド位置における対���するメジャー対立遺伝子もしくは野生型ヌクレオチドが異なるプリン塩基を含むか、または標的バリアントヌクレオチドがピリミジン塩基を含み、標的バリアントヌクレオチド位置における対応するメジャー対立遺伝子もしくは野生型ヌクレオチドが異なるピリミジン塩基を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、方法は、ステップａ）〜ｃ）の前に、野生型核酸と比較して試料における標的ポリヌクレオチドの数を富化することをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、この富化プロセスは、ステップａ）〜ｃ）で使用されるような異なる条件を含む増幅反応を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、富化ステップは、第１のオリゴヌクレオチドの計算された融解温度（Ｔm）よりも１２〜１６℃高い温度での１５〜２５サイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応を使用して実施され得る。いくつかの実施形態では、ステップａ）〜ｃ）は、第３のオリゴヌクレオチドのＴmに近く、富化が実施される温度よりも４〜６度低い温度での４０サイクルを含むことができる（例えば、「近く」は、富化プロセスで使用される温度より４〜６℃低いことを意味し得る）。いくつかの実施形態では、試験核酸試料は、哺乳動物または非哺乳動物の動物組織もしくは細胞、または植物組織もしくは細胞（例えば、唾液、頬組織、皮膚、毛髪、血液、血漿、尿、糞便、精液、および腫瘍試料（例えば、癌細胞））に由来する。いくつかの実施形態では、アンプリコンの検出は、試験核酸試料が由来する組織内の癌細胞の存在を示す。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＥＦＧＲ（例えば、図２０）、Ｒａｓ（例えば、少なくとも１つのＫＲＡＳもしくはＮＲＡＳ突然変異（例えば、図２１））、ＢＲＡＦ、Ｋｉｔ、ｐＴＥＮ、ＥＳＲ１、および／もしくはｐ５３；ならびに／または表１および／もしくは表２に列挙される突然変異のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、増幅反応は、リアルタイムＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などであるが、これらに限定されないポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。いくつかの実施形態では、例えば、第３のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドのＴmよりも６〜２０℃（最適には８〜１２℃）高いＴmを有することができ、ＰＣＲは、第１のオリゴヌクレオチドのＴmの５℃以内のアニーリング温度で実施され得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、および第３のオリゴヌクレオチドを含有する第１の容器と、第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む対照核酸試料を含有する第２の容器とを含むキットを使用して実施され得る。いくつかの実施形態では、方法は、突然変異を示す標的バリアントヌクレオチドを検出することができ、核酸試料は、はるかに多数の野生型核酸配列のバックグラウンドからの標的ポリヌクレオチド配列の１〜１０コピーを含む。いくつかの実施形態では、標的バリアントヌクレオチドがプリン塩基を含み、標的バリアントヌクレオチド位置における対応する野生型ヌクレオチドが異なるプリン塩基を含み、かつ／またはピリミジン塩基を含み、標的バリアントヌクレオチド位置における対応する野生型ヌクレオチドが異なるピリミジン塩基を含む。当業者によって理解されるように、他の方法も本開示によって企図される。
【００６６】
一般情報
「約」、「およそ」などの用語は、数値または範囲のリストの前に付く場合、その用語がそのリストまたは範囲の各個々の値の直前に付くかのように、そのリストまたは範囲の各個々の値を独立して指す。これらの用語は、同じものが参照する値が正確にそれであるか、それに近いか、またはそれに類似していることを意味する。
【００６７】
本明細書で使用される場合、対象または宿主は、個体であることを意味する。対象には、ネコおよびイヌなどの飼育動物、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、およびヤギ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット）、ならびにトリが含まれ得る。一態様では、対象は、霊長類またはヒトなどの哺乳動物である。
【００６８】
「任意の」または「任意に」とは、後に記載される事象または状況が発生する可能性がある、または発生しない可能性があることを意味し、その記載には、その事象または状況が発生する実例および発生しない実例が含まれる。例えば、「任意に、組成物は、組み合わせを含むことができる」という語句は、その記載が組み合わせおよび組み合わせの非存在（すなわち、組み合わせの個々のメンバー）の両方を含むように、組成物が異なるポリヌクレオチドの組み合わせを含んでもよいか、または組み合わせを含まなくてもよいことを意味する。
【００６９】
範囲は、本明細書において、約１つの特定の値から、および／または約別の特定の値までとして表現され得る。そのような範囲が表現されるとき、別の態様は、一方の特定の値から、および／またはもう一方の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表現される場合、約またはおよそという先行詞を使用することによって、その特定の値が別の側面を形成することが理解されるであろう。さらに、各範囲の終点は、もう一方の終点と関連して、およびもう一方の終点とは独立して、の両方において重要であることが理解されるであろう。範囲（例えば９０〜１００％）は、各値が個別に列挙されているかのように、その範囲自体ならびにその範囲内の各独立した値を含むことを意味する。
【００７０】
「組み合わせた」または「組み合わせて」または「併せて」という用語は、特定の疾患を治療、予防、および／または改善するための、一緒に投与される薬剤の物理的組み合わせ、またはレジメンにおける２つ以上の薬剤の使用（例えば、別個に、物理的に、および／もしくは時間内に投与される）を指し得る。
【００７１】
治療、予防、および／もしくは改善という用語、またはそれらの派生語が、所与の状態に対する所与の治療（例えば、ＨＩＶによる癌感染の予防）に関連して本明細書で使用される場合、治療された患者が臨床的に観察可能なレベルの状態を全く発症しないか、または治療を行わなかった場合よりもゆっくり、および／もしくは低い程度まで発症することを伝えることを意味する。これらの用語は、患者が状態のいかなる側面も全く経験しない状況だけに限定されない。例えば、治療は、状態の所与の発現をもたらすと予想されたであろう刺激への患者の曝露中に与えられ、結果として、患者がそうでなければ予想された状態のより少ないおよび／またはより軽度の症状を経験する場合、状態を予防したと言われる。例えば、治療は、結果として患者が感染の軽度の明白な症状のみを示すことによって、感染を「予防」することができ、感染微生物による任意の細胞への侵入がなかったに違いないということを意味するものではない。
【００７２】
同様に、特定の治療による所与の状態の予防、治療、および／または改善に関連して本明細書で使用される「低減する」、「低減すること」、および「低減」は、典型的には、治療なしで感染を発症する対照または基礎レベルと比較して、よりゆっくりまたはより少ない程度まで感染を発症する対象を指す。感染のリスクの低減の結果として、患者は、感染の軽度の明白な症状のみまたは感染の遅発性症状を示し得、感染微生物による任意の細胞への侵入がなかったに違いないということを意味するものではない。
【００７３】
本開示内で引用された全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態は、以下の実施例でさらに説明される。これらの実施形態は、例としてのみ提供され、いかなる方法でも特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００７４】
本明細書に開示される試薬およびアッセイ設計は、非標的ヌクレオチド配列（例えば、「野生型」、共通、またはより高存在量のヌクレオチド配列）のバックグラウンドからの、標的ヌクレオチド配列（例えば、突然変異体、レアまたは低存在量標的ヌクレオチド配列）の１０コピー未満（例えば、１〜３コピーほど少ない）の検出を例示する。上述のように、これらの方法は、無細胞ＤＮＡ癌関連アッセイ（例えば、初期診断および／もしくは再発の検出のため）、一塩基多型（ＳＮＰ）決定アッセイ、法医学関連アッセイ、ならびに／または農学関連アッセイが挙げられるが、これらに限定されない様々なアッセイにおける、そのようなレア（例えば、低存在量）標的核酸の検出に有用であり得る。
【００７５】
これらの例に示されるように、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）反応を実施して、図１に示されるような例示的なプライマーおよびプローブアッセイ設計を使用して、より豊富な野生型核酸配列（例えば、非変異遺伝子またはメジャー対立遺伝子を表す）の存在下で、低存在量核酸配列（例えば、変異遺伝子または対立遺伝子バリアントを表す）を検出、同定、および／または定量化した。各ｑＰＣＲ反応は、第１および第２の標的ポリヌクレオチド鎖を含む標的ポリヌクレオチドを増幅させるために使用される、以下に記載される実施例に例示されるが、限定されるものではない、少なくとも１つの順方向プライマー（例えば、第１のオリゴヌクレオチド）と、少なくとも１つの逆方向プライマー（例えば、第２のオリゴヌクレオチド）と、少なくとも１つのプローブ（例えば、５’ヌクレアーゼであり得る第３のオリゴヌクレオチドまたはＴａｑＭａｎプローブ）との混合物を利用した。プライマーのうちの１つ（すなわち、順方向または逆方向プライマーのいずれか、第１のオリゴヌクレオチド）は、第１の標的ポリヌクレオチド鎖における少なくとも１つの標的バリアントヌクレオチド（例えば、突然変異体遺伝子または低存在量対立遺伝子バリアントを示し得る標的部位）を含む、第１のヌクレオチド配列（「第１の配列」と呼ばれることもある）に対して結合特異性を有した。標的バリアントヌクレオチドは、プライマーの結合特異性が主に標的バリアントヌクレオチドによって決定されるように、プライマーの末端ヌクレオチドに対応していた（すなわち、それに対してハイブリダイズ可能であり、それと同じまたはそれに相補的であったことを意味する）。したがって、順方向または逆方向プライマーのいずれかである第１のオリゴヌクレオチドを、第１のヌクレオチド配列に結合し、その３’末端に、標的バリアントヌクレオチドに相補的なヌクレオチド（例えば、突然変異体遺伝子または対立遺伝子バリアントに対応するヌクレオチド）を含むように設計した。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端における標的バリアントヌクレオチドに相補的なヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドの実際の３’末端ヌクレオチド（ｎ）の２ヌクレオチド（ｎ＋２、ｎ＋１、ｎ）内にあり得る。
【００７６】
各々が、第１のポリヌクレオチド鎖の第２の配列および第３の配列のそれぞれと配列同一性を共有する配列を有する、第２のオリゴヌクレオチド（すなわち、もう一方のプライマー；順方向または逆方向プライマー）および第３のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブまたは加水分解プローブなどの標的部位特異的プローブ）（すなわち、第２および第３の配列は、典型的には、二本鎖標的ポリヌクレオチドの第２のポリヌクレオチド鎖に相補的である）。混合物中の第２のオリゴヌクレオチド（例えば、第２のプライマー）を、第１の標的ポリヌクレオチド鎖と同一性を共有するように設計したたが、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、第１のプライマー）がハイブリダイズされた第１の配列の上流または下流の位置であり、重複していない。第３のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）がハイブリダイズされた第３の配列を、第１の配列と少なくとも部分的に重複し、標的バリアントヌクレオチドを含むように設計した。いくつかの例示的な実施形態では、第３のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）はまた、第１のオリゴヌクレオチドまたは第１のプライマーによって結合された第１の配列と重複しない第１の標的ポリヌクレオチド鎖と同一の追加のヌクレオチドを含んだ。いくつかの例示的な実施形態では、これらの実験で使用される第３のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブなどの標的部位特異的プローブ）は、その５’末端に共有結合したフルオロフォア（例えば、６−ＦＡＭ）を有するオリゴヌクレオチド、クエンチャー（非蛍光クエンチャー、「ＮＦＱ」と呼ばれることもある）、およびその３’末端に共有結合した小溝結合剤（「ＭＧＢ」）を含んだ。理論によって限定されないが、オリゴヌクレオチドの３’末端に結合した小溝結合剤は、それをＴａｑポリメラーゼによって伸長不可能にするものと考えられている。一般に、第３のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）を、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、第１のプライマー）の融解温度よりも６〜２０℃（最適には８〜１２℃）高い融解温度（ＴM）を示すように設計し、標準的な技術を使用してＰＣＲを実施した（例えば、第３のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴａｑＭａｎプローブなどの標的部位特異的プローブ）のＴMに近いアニーリング／伸長温度での４０サイクル）。例えば、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒに関する例示的なアッセイにおいて、第１のオリゴヌクレオチドのＴm（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓで計算されるような）は、５２．４℃であり、第２のオリゴヌクレオチドのＴmは、５０．８℃であり、第３のオリゴヌクレオチドのＴmは、６１℃であった。別の例では、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃに関するアッセイにおいて、第１のオリゴヌクレオチドのＴmは、５０．２℃であり、第２のオリゴヌクレオチドのＴmは、５１．６℃であり、第３のオリゴヌクレオチドのＴmは、６２℃であった。ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａに関するさらに別の例では、第１のオリゴヌクレオチドのＴｍは、５１．４℃であり、第２のオリゴヌクレオチドのＴｍは、５１．６℃であり、第３のオリゴヌクレオチドのＴｍは、６１℃であった。
【００７７】
ある特定の実施形態では、ｑＰＣＲ反応は、「富化サイクル」または「富化フェーズ」を含み、低存在量核酸を、高存在量（例えば、野生型）核酸よりも優先して増幅させ、混合物を、９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で１秒間および６４℃で２０秒間の１５〜２０サイクル（富化フェーズ）、ならびに９５℃で１秒間および６０℃で２０秒間の４０サイクル（増幅および検出フェーズ）に供した。いくつかの実施形態では、ｑＰＣＲ反応を富化フェーズなしで実施し、混合物を、９５℃で２分間の１サイクル、ならびに９５℃で１秒間および６０℃で２０秒間の４０サイクル（増幅および検出フェーズ）に供した。反応にＶＩＣ標識ＲＰＰＨ１アッセイが含まれていた場合、増幅反応から生成されたデータをＥｘｃｅｌ形式でエクスポートし、複製反応のＣｑ値を平均化し、各条件でのＦＡＭおよびＶＩＣ標的のデルタ平均Ｃｑを決定およびプロットし、デルタＣｑを定量化方法に使用した。
【００７８】
以下のある特定の例示的な実施例では、例えば、標的バリアントヌクレオチドは、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲなどの対立遺伝子変異ＤＮＡ（本明細書の他の箇所では標的核酸と呼ばれ得る）内に存在し、順方向または逆方向プライマー（第１のオリゴヌクレオチド）を、対立遺伝子バリアントＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲなど、分析されているＤＮＡの標的バリアントヌクレオチドに相補的な３’末端にヌクレオチドを含むことによって、標的バリアントヌクレオチドに結合するように設計し、標識された第３のオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブであり得る）を、標的バリアントヌクレオチドを含むように設計し、標的核酸を増幅させ検出した。これらの例示的な実施例で実施される様々なアッセイの追加の詳細は、以下に提供される。
【００７９】
実施例１
野生型と突然変異体配列の区別
Ａ．ｑＰＣＲアッセイ
ｑＰＣＲ分析の場合、野生型ＤＮＡの試料（ＣＥＰＨ個体１３４７−０２（「ＣＥＰＨ」）からの対照ＤＮＡ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号４０３０６２）を、０．１％の標的対立遺伝子バリアントＫＲＡＳ  ＤＮＡ（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄから購入したＫＲＡＳ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ＤＮＡ、カタログ番号：ＫＲＡＳ  Ｇ１２ＲについてはＨＤ２８７、ＫＲＡＳ  Ｇ１２ＡについてはＨＤ２６４）がある場合またはない場合でスパイクした。野生型ＤＮＡ試料（１０ｎｇ）またはスパイクされた試料（対立遺伝子バリアントスパイクを含む１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ（例えば、突然変異体試料）を、３００ｎＭの各プライマー（順方向および逆方向、第１および第２オリゴヌクレオチド）、２５０ｎＭのプローブ（第３のオリゴヌクレオチド）、１ｍＭのｄＮＴＰ、３９ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、３０ｍＭのＫＣｌ、１６ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、７％グリセロール、および０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑに添加して、応混合物を形成し、１０μＬの混合物のアリコートを９６ウェルプレートの４つの複製ウェルで平板培養した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ５  Ｆ９６（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）上で、ｑＰＣＲ反応を実施した。富化フェーズなしで実施したｑＰＣＲ反応について、混合物を、９５℃で２分間の１サイクル、ならびに９５℃で１秒間、次いで示されるように５８〜６２℃で２０秒間の４０サイクル（増幅および検出フェーズ）に供した。富化フェーズありで実施したｑＰＣＲ反応について、混合物を、９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で３秒間および６４℃で２０秒間の１９サイクル（富化）、ならびに９５℃で１秒間、次いで示されるように５８〜６２℃で２０秒間の４０サイクル（増幅および検出フェーズ）に供した。これらのアッセイで利用されるプライマー、プローブ、および標的核酸を、上記のように設計した。データをＥｘｃｅｌ形式でエクスポートし、複製反応のＣｑ値を平均化し、標的のデルタ平均Ｃｑを決定およびプロットした。デルタＣｑを定量化方法に使用した。
【００８０】
Ｂ．実験結果
上記のように、反応が標的部位特異的プローブおよび２つのプライマーを含み、そのうちの一方が第１のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プライマー）であり、もう一方が第２のオリゴヌクレオチド（例えば、遺伝子座特異的プライマー）であるアッセイ設計によるｑＰＣＲ反応は、非常に類似した豊富な核酸の存在下で、低存在量標的核酸を識別的に増幅させた（図２〜４）。特に、アッセイ設計は、増幅富化フェーズがある場合またはない場合でスパイクされた対立遺伝子バリアントＫＲＡＳ  ＤＮＡがある場合とない場合との試料を識別することが可能であった（図２Ａ〜Ｃおよび３Ａ〜Ｃに示される富化フェーズを含む実験の結果）。これらの反応条件およびアッセイ下では、増幅の成功を示す増幅曲線は、低存在量対立遺伝子バリアントＫＲＡＳ  ＤＮＡ（１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡと１０ｐｇの標的配列（０．１％または３コピー））が反応混合物中に存在する場合にのみ観察された（すなわち、野生型ＤＮＡ（１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ）のみが存在する場合ではない）（図２Ａ〜Ｆおよび３Ａ〜Ｆ）。
【００８１】
富化フェーズを含む反応は、より低いＣｔ値を有し、富化フェーズが、排他的ではないにしても優先的に低存在量対立遺伝子バリアントＤＮＡを増幅させ、したがってアッセイ設計を使用して性能をさらに改善することを示している（図２Ａ〜Ｆおよび３Ａ〜Ｆ）。一方、野生型ＫＲＡＳ  ＤＮＡのみを含有する一部の試料のバックグラウンド蛍光は、富化フェーズを含むことで増加した。これらのバックグラウンドｑＰＣＲ曲線は、低存在量対立遺伝子バリアントが存在する場合に見られるように、典型的なｑＰＣＲ曲線とは容易に区別可能であった（例えば、図２Ａ〜Ｃおよび３Ａ）。理論によって限定されないが、富化フェーズでの高温は、標的配列特異的プライマーに結合したときに単一の塩基ミスマッチを含有する、豊富な核酸への標的配列特異的プライマーのアニーリングと比較して、標的配列特異的プライマーに結合したときに完全一致を形成する、低存在量標的核酸への標的配列特異的プライマーのアニーリングに有利に働き、これはその後、豊富な核酸よりも低存在量標的核酸の優先的な増幅をもたらすと考えられている。
【００８２】
その後の実験では、同様のアッセイ設計を使用して、示されているように（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ）、０．１％の以下の対立遺伝子バリアントＫＲＡＳ  ＤＮＡで個別にスパイクされた野生型ＤＮＡと、野生型ＤＮＡを識別した：３４  Ｇ＞Ｃ（図４Ａ）、３５  Ｇ＞Ｃ（図４Ｂ）、３４  Ｇ＞Ａ（図４Ｃ）、３４  Ｇ＞Ｔ（図４Ｄ）、３５  Ｇ＞Ａ（図４Ｅ）、および３５  Ｇ＞Ｔ（図４Ｆ）。反応が第１のオリゴヌクレオチド（例えば、標的配列特異的プライマー）、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、遺伝子座特異的プライマー）、および第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）を含むアッセイ設計で構成されたｑＰＣＲ反応は、野生型ＫＲＡＳ  ＤＮＡのみを含有する試料よりも、０．１％の示された対立遺伝子バリアントＫＲＡＳ  ＤＮＡがスパイクされた野生型ＫＲＡＳ  ＤＮＡ試料を含有する試料において低いＣｔ値を有した。表３は、これらのｑＰＣＲ反応からのスパイクされた対立遺伝子バリアントＫＲＡＳ  ＤＮＡがある場合またはない場合の平均Ｃｔ値を示し、２つのＣｔ値間の差（ｄＣｔ）を示す。プライマー／プローブの組み合わせは全て、低存在量ＫＲＡＳ対立遺伝子ＤＮＡを含有する試料と野生型ＫＲＡＳ  ＤＮＡとの効果的な識別を示し、６つの対立遺伝子バリアントのうち５つが９以上のｄＣｔ値を有した。
【表３】
2021533769.tif 000005
【００８３】
この実施例に開示されたものと同様のアッセイ設計および循環条件を使用した追加の実験もまた、様々な他の試料に対して実施し、野生型標的核酸のバックグラウンドにおいて対立遺伝子バリアントＤＮＡの１〜３コピーを検出した（データは図示せず）。
【００８４】
実施例２
塩化カリウムおよび硫酸アンモニウム
低存在量標的核酸の検出に対する塩化カリウムおよび硫酸アンモニウム濃度の効果も試験した。この例示的な例に示されるように、単一の塩基変化によって豊富な核酸とは異なる標的核酸の１０コピー未満を、図１に示され、かつ／または以下により詳細に記載されるプライマーおよびプローブアッセイ設計、ならびにＫＣｌおよび（ＮＨ4）2ＳＯ4の両方の最適化された濃度を含有する増幅混合物によって検出した。単一の塩基変化が同じ構造ファミリーにある場合（プリンからプリンまたはピリミジンからピリミジン）、非常に類似した豊富な核酸の存在下での低存在量標的核酸の識別は、特に困難である。これらの例では、塩化カリウムが増幅を改善し、硫酸アンモニウムが、非常に類似した豊富な核酸の存在下で、低存在量標的核酸の識別を改善することが実証された。塩化カリウムおよび硫酸アンモニウムの両方の濃度を、低存在量標的核酸の増幅および豊富な標的の増幅の抑制のために最適化した。上記で一般的に説明したように、これらのアッセイの第３のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）を、標的核酸の標的バリアントヌクレオチド（例えば、対立遺伝子バリアント）に及ぶヌクレオチドに結合するように設計した。第３のオリゴヌクレオチド（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）に加えて、順方向または逆方向のいずれかのプライマーを、その３’末端に、標的核酸上の標的バリアントヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含むように設計した。上述のように、その３’末端に、標的バリアントに相補的なヌクレオチドを含むプライマーは、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、標的配列特異的プライマー（ＴＳＰ））である。標的核酸に対して結合特異性を有するもう一方のプライマー（すなわち、第２のオリゴヌクレオチド）は、その３’末端に、本明細書に記載される標的バリアントヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含まず、遺伝子座特異的プライマー（ＬＳＰ）と呼ばれ得る。
【００８５】
Ａ．増幅に対する塩化カリウムおよび硫酸アンモニウムの効果
これらの実験では、０．３μＭの順方向［または逆方向］プライマー（例えば、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、標的配列特異的プライマー（ＴＳＰ））、０．３μＭの逆方向［または順方向］プライマー（例えば、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、遺伝子座特異的プライマー（ＬＳＰ））、０．２５μＭの検出プローブ（例えば、第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ））、１ｍＭのｄＮＴＰ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、３９ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、および０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを有する増幅試薬；ゼロ、３０ｍＭ、または６０ｍＭのＫＣｌ（ゼロおよび６０ｍＭのデータのみ図示）；ならびにゼロ、１５ｍＭ、または３０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4（ゼロおよび３０ｍＭのデータのみ図示）、ならびに１０ｎｇの野生型ＤＮＡ（図５および６に示されるように、０．２％（４コピー）の対立遺伝子バリアントＤＮＡがスパイクインした場合またはしていない場合の）を含有する、２０ｕＬの反応混合物を作製した。ｑＰＣＲをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ７において次のサイクルで実施した：９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で３秒間／６４℃で２０秒間の１９サイクル（富化フェーズ）、ならびに９５℃で３秒間／６０℃で２０秒間の４０サイクル（増幅および検出フェーズ）。これらの実験および結果として得られるデータは、以下でさらに説明される。
【００８６】
最大６０ｍＭのＫＣｌおよび最大３０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4を含むｑＰＣＲ反応、ならびに図１および上記でさらに記載されるプライマーおよびプローブアッセイの設計が、より低いＣｔ値によって示されるように、野生型ＤＮＡのみを含有する試料と、０．２％の対立遺伝子バリアントＤＮＡがスパイクされた野生型ＤＮＡとを識別したことが観察された（図５Ａ。６０ｍＭのＫＣｌおよび３０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の存在下で実施した反応）。対照的に、どちらの塩も含まないｑＰＣＲ反応は、野生型ＤＮＡおよび０．２％の対立遺伝子バリアントＤＮＡがスパイクされた野生型ＤＮＡを含有する反応について同様のＣｔ値を示した（図５Ｂ。ＫＣｌおよび（ＮＨ４）２ＳＯ４の非存在下で実施した反応）。したがって、図１に提供されるプライマーおよびプローブアッセイ設計（例えば、本明細書において上記のように例示される）と共に、有効量のＫＣｌおよび（ＮＨ4）2ＳＯ4をｑＰＣＲマスターミックスに含むことは、単一ヌクレオチド（すなわち、標的バリアントヌクレオチド）のみによって標的核酸とは異なる、豊富な（例えば、野生型）核酸を含む試料中のわずか０．２％（例えば、４コピー）の標的核酸を検出するための有効な方法を提供した。
【００８７】
低コピー数の標的核酸と野生型核酸との区別を提供する濃度の範囲を決定するために、追加の実験を実施した。１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号４０３０６２）、３００ｎＭの各プライマー（順方向および逆方向、第１および第２オリゴヌクレオチド、ＴＳＰおよびＬＳＰ）、２５０ｎＭプローブ（第３のオリゴヌクレオチド）、１ｍｍのｄＮＴＰ、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、ならびに７％グリセロールを含有する２０ｕＬの反応混合物を調製した。以下に示されるように、塩化カリウムおよび硫酸アンモニウムを反応混合物に滴定した：図６Ａ：ＫＣｌまたは硫酸アンモニウムなし、図６Ｂ：３０ｍＭの硫酸アンモニウム、塩化カリウムなし、図６Ｃ：３０ｍＭのＫＣｌおよび３０ｍＭの硫酸アンモニウム、ならびに図６Ｄ：６０ｍＭのＫＣｌおよび３０ｍＭの硫酸アンモニウム。Ｇ１３Ｄ突然変異体スパイクとの反応は、２０ｐｇのＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＤＮＡ（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、カタログ番号ＨＤ２９０）を含んだ。以下の熱プロトコルを使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７機器上で反応を増幅させた：９５℃（３分間）、９５℃（３秒間）／６４℃（２０秒間）で１９サイクル（富化フェーズ）、次いで９５℃（３秒間）／６０℃（２０秒間）で４０サイクル（増幅および検出フェーズ）。図６Ｃに示されるように、例示的な反応で使用される条件（３０ｍＭのＫＣｌおよび３０ｍＭの硫酸アンモニウム）は、標的核酸と野生型核酸との間の明確な区別を示したが、ＫＣｌおよび硫酸アンモニウムの両方の除外（図６Ａ）は示さなかった。したがって、これらの実験では、ＫＣｌおよび硫酸アンモニウムの「有効量」（標的核酸と野生型核酸との間の区別を提供する量）は、それぞれ最大約６０ｍＭおよび最大約３０ｍＭであることが分かった。
【００８８】
ＫＣｌおよび硫酸アンモニウム濃度を使用した実験において、２つの塩の効果をさらに調査し、初期の高濃度（６０ｍＭのＫＣｌ、３０ｍＭの硫酸アンモニウム）と初期の低濃度（３０ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭの硫酸アンモニウム）との間の濃度も試験した。図６Ｃが実証するように、より高濃度で使用された場合の２つの塩の効果は、識別を提供するが、Ｃｑが遅延することも示している。したがって、中間濃度を試験して、いずれも低存在量標的に対して許容可能な識別およびより低いＣｑ値を提供し得るかどうかを判断した。図７Ａ中、２つの塩の濃度が４５ｍＭ（ＫＣｌ）および３０ｍＭ（硫酸アンモニウム）であった一方で、図７Ｂ中では、硫酸アンモニウムの濃度を２２ｍＭに減少させた（ＫＣｌを４５ｍＭに保持）。４５ｍＭのＫＣｌおよび２２ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ4の存在下で実施した反応（図７Ｂ）では、野生型ポリヌクレオチドからの突然変異体の明確な分離を維持しながら、突然変異体のＣｑが減少した。突然変異体スパイクを有するウェルの平均Ｃｑは、野生型のみを含有するウェルからの分離を維持しながら、３５．１（図７Ａ、３０ｍＭの硫酸アンモニウムを使用した反応の場合）から２８．０（図７Ｂ、２２ｍＭの硫酸アンモニウムを使用した反応の場合）に減少した。これらの実験に基づいて、４５ｍＭのＫＣｌおよび２２ｍＭの硫酸アンモニウムの使用を、同様の条件を使用したさらなる研究に最適なものとして選択した。
【００８９】
実施例３
プローブの３’末端からの標的バリアントヌクレオチド距離の効果
第１のオリゴヌクレオチド（例えば、標的配列特異的プライマー（ＴＳＰ））のいずれかの末端からの、および標的核酸に結合しない異なる数のオーバーハングの塩基を有する、標的可変ヌクレオチドの距離の効果を評価した。実験は、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、３９ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８および７％グリセロール、３００ｎｍの各プライマー（ＴＳＰおよびＬＳＰ）、２５０ｎＭのプローブ１、２、または３のうちの１つ、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号４０３９６２）、ならびに１０ｐｇのＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＤＮＡ（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、カタログＮｏ．ＨＤ２５４）を含有する２０μＬの反応において実施した。図８に示されるデータは、有効な増幅およびリアルタイム検出が、プローブの末端から２塩基を超えて位置する標的バリアントヌクレオチド（すなわち、３’末端から３、４、または５ヌクレオチドにおいて、プローブ１、２、および３のそれぞれ）で達成されたことを示す。３’末端からの３塩基（プローブ１）と比較して、３’末端から５塩基（プローブ３）までの標的バリアントヌクレオチドの距離を長くすると、結果として、反応中に存在するｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ色素で割った、プローブ上の６−ＦＡＭレポーター色素の蛍光における変化が０．１のカットオフを超える、サイクル数が減少した。
【００９０】
実施例４
突然変異体ＤＮＡの野生型ＤＮＡへの滴定
Ａ．異なるプライマー濃度を使用した標的核酸の検出
これらの実験を、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号４０３０６２）、および示された量の突然変異体（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  Ｌｔｄ．、カタログ番号ＨＤ５７４（ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ）（スパイクイン）、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、３９ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、ならびに７％グリセロールを含有する２０ｕＬの反応において実施した。「３００ｎＭのプライマー」で示された反応は、突然変異体および対照標的（ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ突然変異体標的およびＲＰＰＨ１対照標的）に対する３００ｎＭの順方向および逆方向プライマー（ＴＳＰおよびＬＳＰ）を含み、「４５０ｎＭのプライマー」で示された反応は、突然変異体および対照標的の両方に対する４５０ｎＭの順方向および逆方向プライマー（ＴＳＰおよびＬＳＰ）を含んだ。全ての場合において、ＦＡＭ標識（突然変異体）およびＶＩＣ標識（ＲＰＰＨ１）プローブ濃度は、２５０ｎＭであった。ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ突然変異体標的を、示された濃度（例えば、２５０コピー、１２５コピー、６２．５コピー、３１コピー、１６コピー、８コピー、４コピー、および２コピー）で反応に添加した。突然変異体テンプレートの５０ｆＭ溶液（３００００コピー／ｕＬ）を、３０００コピー／ｕＬ、次いで２５０コピー／ｕＬに希釈した。そこから、２コピー／ｕＬに至るまで２倍希釈を実施した。以下の熱プロトコルを使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７機器上で反応を増幅させた：９５℃（３分間）、９５℃（３秒間）／６４℃（２０秒間）で１９サイクル、次いで９５℃（３秒間）／６０℃（２０秒間）で４０サイクル。データをＥｘｃｅｌ形式でエクスポートし、複製反応のＣｑ値を平均化し、各条件における標的のデルタ平均Ｃｑを決定およびプロットした（図１０）。デルタＣｑを定量化方法に使用した。図９および１０に示されるように、より少ない数の標的核酸（すなわち、２または１６コピー）と組み合わせて３００ｎＭまたは４５０ｎＭプライマーのいずれかを含むことは、内因性対照標的、ＲＰＰＨ１と突然変異体標的の区別を示した（例えば、図９Ｃ、９Ｅ、および９Ｆ）。
【００９１】
Ｂ．異なるコピー数における標的核酸の検出
これらの実験では、３００ｎＭの各プライマー（ＴＳＰおよびＬＳＰ）、２５０ｎＭのプローブ、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号４０３０６２）、および示された量およびタイプの突然変異体（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  Ｌｔｄ．、カタログ番号ＨＤ５７４（ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ）またはＨＤ３５１（ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｋ）（スパイクイン）、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、３９ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、ならびに７％グリセロールを含有する２０ｕＬの反応混合物を調製した。データをＥｘｃｅｌ形式でエクスポートし、複製反応のＣｑ値を平均化し、各条件における標的のデルタ平均Ｃｑを決定およびプロットした（データは図示せず）。デルタＣｑを定量化方法に使用した。Ｑｕａｎｔ  Ｓｔｕｄｉｏ  ７上の熱循環条件は、９５℃（３分間）、９５℃（３秒間）／６４℃（２０秒間）の１９サイクル、９５℃（３秒間）／６０℃（２０秒間）の４０サイクルであった。図１１（ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ）および図１２（ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｋ）に示されるように、本明細書に記載されるシステムを使用して、わずか３および４コピーの標的核酸を検出することができた。
【００９２】
Ｃ．異なる量の野生型ＤＮＡとの反応
これらの実験を実施するために、３００ｎＭのＫＲＡＳ順方向および逆方向（ＴＳＰおよびＬＳＰ）プライマー、１５０ｎＭのＲＰＰＨ１順方向および逆方向プライマー、２５０ｎＭのＫＲＡＳ  ＦＡＭプローブ、１５０ｎＭのＲＰＰＨ１  ＶＩＣプローブ、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、３９ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、ならびに７％グリセロールを含有する反応混合物を調製した。１０ｐｇのＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＤＮＡ（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、カタログ番号ＨＤ２８７）、および示された量の野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡを各反応に添加した。以下の熱プロトコルを使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ５上で反応を実行した：９５℃（２分間）、９５℃（１秒間）／６４℃（２０秒間）で１９サイクル、次いで９５℃（１秒間）／６０℃（２０秒間）で４０サイクル。図１３Ａ〜Ｃに示されるように、突然変異体（例えば、より低存在量の）標的核酸は、５、１０、および２０ｎｇの野生型（例えば、より高存在量の）ＤＮＡのバックグラウンドで検出され得た。
【００９３】
実施例５
逆方向プライマーの３’末端の標的部位
これらの実験を実施するために、１０ｎｇのＣＥＰＨ  ＤＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号４０３０６２）、３００ｎＭの各プライマー（ＴＳＰおよびＬＳＰ）、２５０ｎＭのプローブ、１０ｐｇのＫＲＡＳ  Ｇ１２ＤまたはＧ１２Ｓ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＤＮＡの突然変異体スパイク（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、カタログ番号ＨＤ２７２またはＨＤ２８８のそれぞれ）を含有する２０ｕＬの反応混合物を示されるように利用し、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、３９ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、ならびに７％グリセロールを調製した。熱循環条件は、９５℃（３分間）、９５℃（３秒間）、６４℃（２０秒間）の１９サイクル、続いて９５℃（３秒間）／６０℃（２０秒間）の４０サイクルであった。図１４（ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ）および図１５（ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ）に示されるように、逆方向プライマーは、標的特異的プライマー（ＴＳＰ）であり得（例えば、二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかの鎖へのハイブリダイゼーションに使用され得る。標的部位は、順方向または逆方向ＴＳＰプライマーのいずれかの３’末端に位置し得る）、本明細書に記載されるシステムは適切に機能し、低存在量（例えば、突然変異体）標的と高存在量（例えば、野生型）標的との間の区別を実証する。
【００９４】
実施例６
追加の遺伝子およびレアバリアント
これらの実験を実施するために、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号４０３０６２）、各々が３００ｎＭの第１および第２のオリゴヌクレオチド（例えば、標的配列特異的プライマー（ＴＳＰ）および遺伝子座特異的プライマー（ＬＳＰ））、２５０ｎＭのプローブ（第３のオリゴヌクレオチド、標的部位特異的プローブ）、１０ｐｇの対応する突然変異体ＤＮＡのスパイク（例えば、図１６Ａ〜１６Ｆに示されるような突然変異体ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ。表２を参照）（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．、本明細書の他の箇所に提供されるようなＲｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓカタログ番号）を含有する２０ｕＬの反応混合物を、突然変異体試料に対して利用し、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、３９ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、ならびに７％グリセロールを調製した。データをＥｘｃｅｌ形式でエクスポートし、複製反応のＣｑ値を平均化し、各条件における標的のデルタ平均Ｃｑを決定およびプロットした（データは図示せず）。デルタＣｑを定量化方法に使用した。使用した熱循環条件は、９５℃（３分間）、９５℃（３秒間）／６４℃（２０秒間）の１９サイクル、続いて９５℃（３秒間）／６０℃（２０秒間）の４０サイクルであった。図１６Ａ〜１６Ｆに示されるように、表２に列挙されるものなどの試験した様々な標的突然変異体核酸の各々は、野生型核酸から明確に区別された。
【００９５】
実施例７
異なる長さのプローブとの反応
これらの実験を実施するために、３００ｎＭの各プライマー、２５０ｎＭの適切なプローブ、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号４０３０６２）、示されているような２０ｐｇのＮＲＡＳ  Ｑ６１ＬまたはＱ６１Ｈ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＤＮＡの突然変異体スパイク（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔ．、カタログ番号ＨＤ４１２またはＨＤ３０３のそれぞれ）、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｎＭのＲＯＸ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、３９ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、および７％グリセロールを含有する２０ｕＬの反応混合物を調製した。以下の熱プロトコルを使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ５上で反応を実行した：９５℃（２分間）、９５℃（１秒間）／６４℃（２０秒間）で１９サイクル、次いで９５℃（１秒間）／６０℃（２０秒間）で４０サイクル。図１７に示されるように、プローブ長を最大５ヌクレオチドの差で変化させることは、これらの実験で低存在量標的を検出する能力にはほとんど影響しなかったが、他のいくつかの場合においては、プローブ長がＣｑ値を低下させることが観察されている（データは図示せず）。図１７Ａは、１６または２１ヌクレオチドのいずれかの長さを有する２つの異なるプローブを使用した、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｌ（１８２Ａ＞Ｔ）の検出を実証する。図１７Ｂは、１５または２０ヌクレオチドのいずれかの長さを有する２つの異なるプローブを使用した、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｈ（１８３Ａ＞Ｔ）の検出を実証する。
【００９６】
実施例８
試験した様々な突然変異体標的
標的の参照材料が市販されていなかった場合、人工二本鎖ＤＮＡテンプレートを使用した。示された突然変異を有する３００ｂｐの人工ｄｓＤＮＡフラグメントを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから注文した（ＧｅｎｅＡｒｔ  Ｓｔｒｉｎｇｓ  ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、カタログ番号８１５０１０ＤＥ）。ｄｓＤＮＡフラグメントを、各ｄｓＤＮＡ製品に付属する試験成績書に基づいて５０ｆＭ（３００００コピー／ｕＬ）に希釈した。その後の希釈を、個々のｑＰＣＲ反応に追加するために必要に応じて行った。各２０ｕＬの反応は、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡも含んだ。示されるように、野生型ＤＮＡ（１０ｎｇのＣＥＰＨ）および人工テンプレートに加えて、各々が３００ｎＭの第１および第２オリゴヌクレオチド（例えば、示された突然変異体標的またはＲＰＰＨ１対照標的のいずれかに対する標的配列特異的プライマー（ＴＳＰ）および遺伝子座特異的プライマー（ＬＳＰ））、示差的に標識された、示された突然変異体標的またはＲＰＰＨ１対照標的のいずれかに対する２５０ｎＭのプローブ、１．３ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．１７５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、２．８５ｍＭのＭｇＣｌ２、４５ｎＭのＲＯＸ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、４０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、ならびに７％グリセロールを含有する各２０ｕＬの反応を調製した。突然変異体標的および対照標的の両方に対するプローブを含む二重反応について、データをＥｘｃｅｌ形式でエクスポートし、複製反応のＣｑ値を平均化し、各条件における標的のデルタ平均Ｃｑを決定およびプロットした（データは図示せず）。示された突然変異体標的とＲＰＰＨ１標的との間のデルタＣｑを、定量化方法として使用した。使用した熱循環条件は、９５℃（３分間）、９５℃（３秒間）／６４℃（２０秒間）の１９サイクル、続いて９５℃（３秒間）／６０℃（２０秒間）の４０サイクルであった。
【００９７】
図１８Ａ〜１８Ｃならびに図１９Ａおよび１９Ｂに示されるように、表２に列挙されるものなどの多数の人工突然変異体標的が、本明細書に記載される方法を使用して検出された。
【００９８】
前述の例は、本発明の様々な態様および本発明の方法の実施を示す。例は、本発明の多くの異なる実施形態の網羅的な説明を提供することを意図しない。よって、前述の発明は、理解を明確にするために例示および例としていくらか詳細に説明されてきたが、当業者は、以下の項および添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それに多くの変更および修正を行うことができることを容易に理解するであろう。
【００９９】
追加の実施形態は、以下の番号付きの項に従い得る。
１．
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物。
２．
ｃ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列と少なくとも部分的に重複し、第３の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、項１に記載の混合物。
３．
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在する第１の配列（Ａ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド（「第１のバリアントヌクレオチド」）を含み、第１のオリゴヌクレオチドが、第１のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の配列（Ｂ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の配列が、第３の配列（Ｃ）に相補的であり、第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、第３の配列（Ｃ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列（Ａ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物。
４．
ｃ）第５の配列（Ｅ）に相補的な第４の配列（Ｄ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、第５の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、第５の配列（Ｅ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ａ）と少なくとも部分的に重複し、第１の標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、項２に記載の混合物。
５．第３のオリゴヌクレオチドにおける標的バリアントヌクレオチドが、第３のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、項２または４に記載の混合物。
６．第３のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、項２、４、および５のいずれか一項に記載の混合物。
７．検出可能な標識が、蛍光標識である、項６に記載の混合物。
８．検出可能な標識が、第１の末端ヌクレオチド上にある、項６または７に記載の混合物。
９．第３のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、項６〜８のいずれか一項に記載の混合物。
１０．消光部分が、第３のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、項９に記載の混合物。
１１．消光部分が、検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、項９または１０に記載の混合物。
１２．第１の末端ヌクレオチドが、５’末端ヌクレオチドである、項１０に記載の混合物。
１３．第２の末端ヌクレオチドが、３’末端ヌクレオチドである、項１０に記載の混合物。
１４．混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子を含む、項２または４に記載の混合物。
１５．配列Ａ、Ｅ、およびＣが、第１の標的ポリヌクレオチド鎖上の一本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置している、項４に記載の混合物。
１６．混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である、項２または４に記載の混合物。
１７．混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的であり、配列ＤおよびＢが、標的相補体ポリヌクレオチド鎖上の二本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置し、配列Ａ、Ｅ、およびＣが、標的ポリヌクレオチド鎖上の二本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置している、項４に記載の混合物。
１８．混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的であり、二本鎖ポリヌクレオチド分子が、バリアントポリヌクレオチド鎖およびバリアント相補体ポリヌクレオチド鎖を含み、バリアントポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド鎖と実質的に同一であり、標的ポリヌクレオチド鎖とは標的バリアントヌクレオチドで異なるヌクレオチドを含み、バリアント相補体ポリヌクレオチド鎖が、バリアントポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である、項２または４に記載の混合物。
１９．第３のオリゴヌクレオチドが、第１の配列の３〜６つの連続するヌクレオチドを含む、項２または４に記載の混合物。
２０．第３のオリゴヌクレオチドが、第１の配列のヌクレオチドの配列と重複しない第１の標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの配列をさらに含む、項２または４に記載の混合物。
２１．混合物が、第４のオリゴヌクレオチドを含まない、項２または４に記載の混合物。
２２．混合物が、検出可能な標識を含む第４のオリゴヌクレオチドを含まない、項２または４に記載の混合物。
２３．混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に結合する第４のオリゴヌクレオチドを含まない、項２または４に記載の混合物。
２４．混合物が、検出可能な標識および第１の標的ポリヌクレオチド鎖に結合する配列を有する第４のオリゴヌクレオチドを含まない、項２または４に記載の混合物。
２５．第３のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識および標的ポリヌクレオチド鎖の配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する混合物における唯一のオリゴヌクレオチドである、項２または４に記載の混合物。
２６．混合物が、３０ｍＭ〜８０ｍＭの塩化カリウムをさらに含む、項２または４に記載の混合物。
２７．塩化カリウムの濃度が、少なくとも４０ｍＭである、項２６に記載の混合物。
２８．塩化カリウムの濃度が、７０ｍＭ未満である、項２６に記載の混合物。
２９．塩化カリウムの濃度が、少なくとも４０ｍＭおよび７０ｍＭ未満である、項２６に記載の混合物。
３０．混合物が、１０ｍＭ〜４０ｍＭの硫酸アンモニウムをさらに含む、項２または４に記載の混合物。
３１．硫酸アンモニウムの濃度が、少なくとも２０ｍＭである、項３０に記載の混合物。
３２．硫酸アンモニウムの濃度が、３５ｍＭ未満である、項３０に記載の混合物。
３３．硫酸アンモニウムの濃度が、少なくとも２０ｍＭおよび３５ｍＭ未満である、項３０に記載の混合物。
３４．硫酸アンモニウムの濃度が、２０〜２５ｍＭである、項３０に記載の混合物。
３５．混合物が、
ａ）３０ｍＭ〜８０ｍＭの塩化カリウムの濃度と、
ｂ）１０ｍＭ〜４０ｍＭの硫酸アンモニウムの濃度と、をさらに含む、項２または４に記載の混合物。
３６．塩化カリウムの濃度が、４０ｍＭ〜７０ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２０ｍＭ〜３５ｍＭである、項３５に記載の混合物。
３７．塩化カリウムの濃度が、４０ｍＭ〜４８ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２０〜２４ｍＭである、項３５に記載の混合物。
３８．塩化カリウムの濃度が、４５ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２２ｍＭである、項３５に記載の混合物。
３９．検出可能な標識が、ＤＮＡ結合色素、レポーター色素、蛍光プローブ、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ（商標））、テトラクロロフルオレシン（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）（ＴＥＴ（商標））、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル（ＪＯＥ（商標））、ＶＩＣ（商標）、カルボキシレート基の代わりにＳＯ3を含むフルオレセイン色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホルアミダイト形態、ＣＹ５のホスホルアミダイト形態、非ＦＲＥＴ標識、フェロセン試薬、ＡＢＹ（商標）、ＮＥＤ（商標）ＪＵＮ（商標）、Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０、ＴＹＥ（商標）５６３、ＴＹＥ（商標）６６５、ＴＹＥ（商標）７０５、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項６に記載の混合物。
４０．消光部分が、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、非蛍光消光剤（ＮＦＱ）、ブラックホールクエンチャー、アイオワブラッククエンチャー、ＱＳＹ消光剤、ＱＳＹ７消光剤、ＱＳＹ２１消光剤、ダブシルおよび／またはダブシルスルホネート／カルボキシレート消光剤からなる群から選択される、項９〜１１のいずれか一項に記載の混合物。
４１．第３のオリゴヌクレオチドのＴmが、第１のオリゴヌクレオチドのＴmよりも少なくとも５℃および２５℃以下高い、項２または４に記載の混合物。
４２．第３のオリゴヌクレオチドのＴmが、第１のオリゴヌクレオチドのＴmよりも少なくとも８℃および１２℃以下高い、項４１に記載の混合物。
４３．第１のオリゴヌクレオチドのＴmが、第２のオリゴヌクレオチドのＴmの５℃以内である、項２または４に記載の混合物。
４４．第１のオリゴヌクレオチドのＴmが、４５〜６０℃であり、第２のオリゴヌクレオチドのＴmが、４５〜６０℃である、項４２または４３のいずれか一項に記載の混合物。
４５．第１および第２のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、項１〜４のいずれか一項に記載の混合物。
４６．第１および第２のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、項１〜４のいずれか一項に記載の混合物。
４７．第３のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、項２または４に記載の混合物。
４８．第３のオリゴヌクレオチドが、プローブである、項２または４に記載の混合物。
４９．第１、第２、および／または第３のオリゴヌクレオチドが、１０〜４０個のヌクレオチドを含む、項２または４に記載の混合物。
５０．第３のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、項２または４に記載の混合物。
５１．遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、項５０に記載の混合物。
５２．ＭＧＢ部分が、第３のオリゴヌクレオチドの３’末端および／または３’部分に位置している、項５１に記載の混合物。
５３．混合物が、
ａ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第４のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチドにおける第１の配列が、第２の標的バリアントヌクレオチドを含み、第４のオリゴヌクレオチドが、第２の標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに含む、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第５のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の第１の配列から５’上流に位置している、第５のオリゴヌクレオチドと、
ｃ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第６のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の第１の配列と少なくとも部分的に重複し、第２の標的バリアントヌクレオチドを含む、第６のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、項２に記載の混合物。
５４．混合物が、
ａ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ｆ）にハイブリダイズするように構成された第４のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチドにおける第１の配列が、第２の標的バリアントヌクレオチド（「第２のバリアントヌクレオチド」）を含み、第４のオリゴヌクレオチドが、第２の標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第２の配列（Ｇ）にハイブリダイズするように構成された第５のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列（Ｈ）に相補的であり、標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、第３の配列（Ｈ）が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列（Ｆ）から５’上流に位置している、第５のオリゴヌクレオチドと、
ｃ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第４の配列（Ｉ）にハイブリダイズするように構成された第６のオリゴヌクレオチドであって、第４の配列（Ｉ）が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第５の配列（Ｊ）に相補的であり、第５の配列（Ｊ）が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、第５の配列（Ｊ）が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ｆ）と少なくとも部分的に重複し、第２の標的バリアントヌクレオチドを含む、第６のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、項４に記載の混合物。
５５．第６のオリゴヌクレオチドにおける標的バリアントヌクレオチドが、第６のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、項５３または５４に記載の混合物。
５６．第６のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、項５３、５４、または５５に記載の混合物。
５７．第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識が、蛍光標識である、項５６に記載の混合物。
５８．第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識が、第１の末端ヌクレオチド上にある、項５６または５７に記載の混合物。
５９．第６のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、項５３、５４、または５６のいずれか一項に記載の混合物。
６０．第６のオリゴヌクレオチドの消光部分が、第６のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、項５９に記載の混合物。
６１．第６のオリゴヌクレオチドの消光部分が、第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、項５９または６０に記載の混合物。
６２．第４および第５のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、項５３または５４に記載の混合物。
６３．第４および第５のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、項５３または５４に記載の混合物。
６４．第６のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、項５３または５４に記載の混合物。
６５．第６のオリゴヌクレオチドが、プローブである、項５３または５４に記載の混合物。
６６．第４、第５、および／または第６のオリゴヌクレオチドが、１０〜３０個のヌクレオチドを含む、項５３または５４に記載の混合物。
６７．第６のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、項５３または５４に記載の混合物。
６８．第６のオリゴヌクレオチドの遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、項６７に記載の混合物。
６９．第６のオリゴヌクレオチドのＭＧＢ部分が、第６のオリゴヌクレオチドの３’末端および／または３’部分に位置している、項６８に記載の混合物。
７０．混合物が、
ａ）第１のオリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第４のオリゴヌクレオチドであって、第４のオリゴヌクレオチドが、第１の配列に実質的にハイブリダイズするように構成され、その３’末端に標的バリアントヌクレオチドの相補体とは異なるヌクレオチドを含む、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第３のオリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第５のオリゴヌクレオチドであって、第５のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドの部位に異なるヌクレオチドを含む、第５のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、項２または４に記載の混合物。
７１．異なるヌクレオチドが、その３’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、項７０に記載の混合物。
７２．第５のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、項７０または７１に記載の混合物。
７３．第５のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識が、蛍光標識である、項７２に記載の混合物。
７４．第５のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識が、第５のオリゴヌクレオチドの第１の末端ヌクレオチド上にある、項７２または７３に記載の混合物。
７４．第５のオリゴヌクレオチド上の検出可能な標識が、第３のオリゴヌクレオチド上の検出可能な標識と区別可能である、項７２〜７４のいずれか一項に記載の混合物。
７５．第５のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、項７２〜７４のいずれか一項に記載の混合物。
７６．第５のオリゴヌクレオチドの消光部分が、第５のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、項７５に記載の混合物。
７７．第５のオリゴヌクレオチドの消光部分が、第５のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、項７５または７６に記載の混合物。
７８．第４のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、項７０に記載の混合物。
７９．第４のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、項７０に記載の混合物。
８０．第５のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、項７０に記載の混合物。
８１．第５のオリゴヌクレオチドが、プローブである、項７０に記載の混合物。
８２．第４および第５のオリゴヌクレオチドが、１０〜４０個のヌクレオチドを含む、項７０に記載の混合物。
８３．第５のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、項７０に記載の混合物。
８４．第５のオリゴヌクレオチドの遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、項８３に記載の混合物。
８５．第５のオリゴヌクレオチドのＭＧＢ部分が、第５のオリゴヌクレオチドの３’末端および／または３’部分に位置している、項８４に記載の混合物。
８６．混合物であって、
複数のオリゴヌクレオチドセットを含む混合物であって、各オリゴヌクレオチドセットが、
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含み、
各セットの第１のオリゴヌクレオチドが、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成される、混合物。
８７．各オリゴヌクレオチドセットが、
ｃ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列と少なくとも部分的に重複し、第３の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含み、
各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる第３の配列と配列類似性を共有し、
各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる区別可能な検出可能な標識を含む、項８６に記載の混合物。
８８．
複数のオリゴヌクレオチドセットを含む混合物であって、各オリゴヌクレオチドセットが、
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在する第１の配列（Ａ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド（「第１のバリアントヌクレオチド」）を含み、第１のオリゴヌクレオチドが、第１のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の配列（Ｂ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の配列が、第３の配列（Ｃ）に相補的であり、第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、第３の配列（Ｃ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列（Ａ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含み、
各セットの第１のオリゴヌクレオチドが、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成される、混合物。
８９．各オリゴヌクレオチドセットが、
ｃ）第５の配列（Ｅ）に相補的な第４の配列（Ｄ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、第５の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、第５の配列（Ｅ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ａ）と少なくとも部分的に重複し、第１の標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含み、
各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる第３の配列と配列類似性を共有し、
各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる区別可能な検出可能な標識を含む、項８８に記載の混合物。
９０．混合物が、ポリメラーゼをさらに含む、項１〜８９のいずれか一項に記載の混合物。
９１．ポリメラーゼが、熱安定性である、項９０に記載の混合物。
９２．混合物が、ホットスタート成分をさらに含む、項９１に記載の混合物。
９３．ホットスタート成分が、熱安定性ポリメラーゼに向けられた抗体、オリゴヌクレオチド、アプタマー、および／またはポリメラーゼの化学修飾を含む、項９２に記載の混合物。
９４．混合物が、ヌクレオチド源をさらに含む、項１〜９３のいずれか一項に記載の混合物。
９５．第３のオリゴヌクレオチドが、加水分解プローブである、項１〜９４のいずれか一項に記載の混合物。
９６．第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含むことが疑われる核酸試料をさらに含む、項１〜９５のいずれか一項に記載の混合物。
９７．標的バリアントヌクレオチドが、突然変異体対立遺伝子内にある、項１〜９６のいずれか一項に記載の混合物。
９８．突然変異体対立遺伝子が、標的バリアントヌクレオチドにおけるプリンからプリンへの単一点突然変異またはピリミジンからピリミジンへの単一点突然変異のいずれかである、項９７に記載の混合物。
９９．突然変異体対立遺伝子が、ＫＲＡＳ癌遺伝子の対立遺伝子である、項９７または９８に記載の混合物。
１００．突然変異体対立遺伝子が、確率的突然変異である、項９７に記載の混合物。
１０１．標的バリアントヌクレオチドが、メジャー対立遺伝子バリアントまたはマイナー対立遺伝子バリアントに対応する同一性を有する、項１〜１００のいずれか一項に記載の混合物。
１０２．標的バリアントヌクレオチドが、１％未満のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有するマイナー対立遺伝子バリアントの同一性を有する、項１０１に記載の混合物。
１０３．標的バリアントヌクレオチドが、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有するマイナー対立遺伝子バリアントの同一性を有する、項１０２に記載の混合物。
１０４．標的バリアントヌクレオチドが、一塩基多型の位置で発生する、項１〜１０３のいずれか一項に記載の混合物。
１０５．混合物が、マスターミックスである、項１〜９５のいずれか一項に記載の混合物。
１０６．マスターミックスが、４〜８℃で最大１２ヶ月間安定である、項１０５に記載の混合物。
１０７．混合物が、反応混合物である、項１〜１０４のいずれか一項に記載の混合物。
１０８．反応混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列を含むアンプリコンをさらに含む、項１０７に記載の混合物。
１０９．反応混合物が、任意の他の異なる（例えば、第２の）ポリヌクレオチド鎖の配列を含むアンプリコンを含まない、項１０８に記載の混合物。
１１０．混合物が、以下：
ａ）少なくとも１つの洗浄剤、
ｂ）グリセロール、および
ｃ）少なくとも１つの参照色素のうちの１つ以上をさらに含む、項１〜１０９のいずれか一項に記載の混合物。
１１１．混合物が、ウシ血清アルブミンおよび／またはゼラチンをさらに含む、項１〜１１０のいずれか一項に記載の混合物。
１１２．混合物が、凍結乾燥される、項１〜１０６のいずれか一項に記載の混合物。
１１３．任意の前述の項に記載の混合物を含有する第１の容器と、第１の標的ポリヌクレオチド鎖と配列類似性を共有するポリヌクレオチド分子を含む対照ポリヌクレオチド試料を含有する第２の容器と、を含む、キット。
１１４．対照ポリヌクレオチド試料が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖全体を含む、項１１３に記載のキット。
１１５．対照ポリヌクレオチド試料が、標的バリアントヌクレオチドにおける第１の標的ポリヌクレオチド鎖と配列類似性を共有しない、項１１３に記載のキット。
１１６．試験ポリヌクレオチド試料において標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と項２または４に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）少なくとも第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、標的ポリヌクレオチド分子の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）ステップｂ）において生成されたアンプリコンを、第３のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｃ）においてアンプリコンを検出することが、標的ポリヌクレオチド分子が試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
１１７．標的ポリヌクレオチド分子が、ポリヌクレオチド分子の混合物を含む試験ポリヌクレオチド試料において検出され、混合物が、標的バリアントヌクレオチドの第１のバリアント形態を含むポリヌクレオチド分子（「第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子」）、および標的バリアントヌクレオチドの第２のバリアント形態を含むポリヌクレオチド分子（「第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子」）を含む、項１１６に記載の方法。
１１８．試験ポリヌクレオチド試料が、標的ポリヌクレオチド配列を含まないポリヌクレオチド鎖（「非標的ポリヌクレオチド分子」）を含む、項１１６または１１７に記載の方法。
１１９．試験試料が、標的ポリヌクレオチド分子よりも多くの非標的ポリヌクレオチド分子を含む、項１１８に記載の方法。
１２０．標的ポリヌクレオチド分子が、突然変異体ポリヌクレオチド配列である、項１１６〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
１２１．非標的ポリヌクレオチド分子が、メジャー対立遺伝子または野生型ポリヌクレオチド配列である、項１１８〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
１２２．試験試料が、非標的ポリヌクレオチド分子と比較して、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満の標的ポリヌクレオチド分子を含む、項１１８〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
１２３．試験試料が、第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子と比較して、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満の第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子を含む、項１１７〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
１２４．第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子および／または第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子が、突然変異体ポリヌクレオチド配列である、項１１７〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
１２５．第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子および／または第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子が、野生型ポリヌクレオチド配列である、項１１７〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
１２６．ステップａ）〜ｃ）の前の第２のバリアントポリヌクレオチド分子と比較して、ポリヌクレオチド試験試料における第１のバリアントポリヌクレオチド分子の数を富化することをさらに含む、項１１７〜１２５に記載の方法。
１２７．富化することが、ステップａ）〜ｃ）のいずれかにおいて使用されるものと比較して異なる条件を含む増幅反応を含む、項１２６に記載の方法。
１２８．ポリヌクレオチド試験試料における第１のバリアントポリヌクレオチド分子の数が、第２のバリアントポリヌクレオチド分子と比較して、少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、または１０倍富化される、項１２６または１２７に記載の方法。
１２９．富化することが、第１のオリゴヌクレオチドの計算された融解温度（ＴM）よりも１２〜１６度高い温度での１５〜２５サイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応を使用して実施される、項１２６〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
１３０．ステップｂ）が、第３のオリゴヌクレオチドのＴMに近く、富化することが実施される温度よりも４〜６度低い温度での３５〜４０サイクルを使用して実施される、項１２６〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
１３１．試験ポリヌクレオチド試料が、哺乳動物もしくは非哺乳動物の動物組織もしくは細胞、または植物組織もしくは細胞に由来する、項１１６〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
１３２．試料が、唾液、頬組織、皮膚、毛髪、血液、血漿、尿、糞便、精液、および腫瘍試料からなる群から選択される、項１３１に記載の方法。
１３３．ポリヌクレオチド試験試料が、癌細胞に由来する、項１３１または１３２に記載の方法。
１３４．アンプリコンの検出が、試験ポリヌクレオチド試料が由来する組織内の癌細胞の存在を示す、項１３１〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
１３５．標的ポリヌクレオチドが、Ｒａｓ、ＥＦＧＲ、Ｋｉｔ、ｐＴＥＮ、および／もしくはｐ５３における少なくとも１つの突然変異、ならびに／または少なくとも１つのＫＲＡＳもしくはＮＲＡＳ突然変異を含む、項１１６〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
１３６．増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、項１１６〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
１３７．ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である、項１３６に記載の方法。
１３８．第３のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドのＴｍよりも８〜１２℃高いＴｍを有し、ＰＣＲが、第１のオリゴヌクレオチドのＴｍの５℃以内であるアニーリング温度で実施される、項１３６または１３７に記載の方法。
１３９．方法が、少なくとも第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、および第３のオリゴヌクレオチドを含有する第１の容器と、第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む対照ポリヌクレオチド試料を含有する第２の容器と、を含む、キットを使用して実施される、項１１６〜１３８のいずれか一項に記載の方法。
１４０．方法が、突然変異を示す標的バリアントヌクレオチドを検出し、試験ポリヌクレオチド試料が、標的ポリヌクレオチドの１〜１０コピーを含む、項１１６〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
１４１．標的バリアントヌクレオチドが、プリン塩基を含み、標的バリアントヌクレオチド位置における対応する野生型ヌクレオチドが、異なるプリン塩基を含む、項１１６〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
１４２．標的バリアントヌクレオチドが、ピリミジン塩基を含み、標的バリアントヌクレオチド位置における対応する野生型ヌクレオチドが、異なるピリミジン塩基を含む、項１１６〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
１４３．試験ポリヌクレオチド試料において標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と項１〜９４、１０４、１０５、および１０９〜１１１のいずれか一項に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）少なくとも第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、標的ポリヌクレオチド分子の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）ステップｂ）において生成されたアンプリコンを、第３のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｃ）においてアンプリコンを検出することが、標的ポリヌクレオチド分子が試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
１４４．試験ポリヌクレオチド試料において、各々が標的バリアントヌクレオチドを含む、少なくとも２つの異なる標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と項５３または５４に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、第１の標的ポリヌクレオチド分子の第１の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）第４および第５のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、第２の標的ポリヌクレオチド分子の第２の標的ポリヌクレオチド配列の第２のアンプリコンを生成することと、
ｄ）ステップｂ）およびｃ）において生成されたアンプリコンを、第３および第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｄ）においてアンプリコンを検出することが、第１および／または第２の標的ポリヌクレオチド分子が試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
１４５．第３および第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性が、蛍光標識である、項１４４に記載の方法。
１４６．第３および第６のオリゴヌクレオチドの各々の上の蛍光標識が異なる、項１４５に記載の方法。
１４７．混合物が、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異を検出するために使用される、項１〜１１２のいずれか一項に記載の混合物。
１４８．キットが、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異の検出のために使用される、項１１３〜１１５のいずれか一項に記載のキット。
１４９．方法が、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異を検出するために使用される、項１１６〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
2021533769.tif 000006
【図２Ａ】
2021533769.tif 000007
【図２Ｂ】
2021533769.tif 000008
【図２Ｃ】
2021533769.tif 000009
【図２Ｄ】
2021533769.tif 000010
【図２Ｅ】
2021533769.tif 000011
【図２Ｆ】
2021533769.tif 000012
【図３Ａ】
2021533769.tif 000013
【図３Ｂ】
2021533769.tif 000014
【図３Ｃ】
2021533769.tif 000015
【図３Ｄ】
2021533769.tif 000016
【図３Ｅ】
2021533769.tif 000017
【図３Ｆ】
2021533769.tif 000018
【図４Ａ】
2021533769.tif 000019
【図４Ｂ】
2021533769.tif 000020
【図４Ｃ】
2021533769.tif 000021
【図４Ｄ】
2021533769.tif 000022
【図４Ｅ】
2021533769.tif 000023
【図４Ｆ】
2021533769.tif 000024
【図５Ａ】
2021533769.tif 000025
【図５Ｂ】
2021533769.tif 000026
【図６Ａ】
2021533769.tif 000027
【図６Ｂ】
2021533769.tif 000028
【図６Ｃ】
2021533769.tif 000029
【図６Ｄ】
2021533769.tif 000030
【図７Ａ】
2021533769.tif 000031
【図７Ｂ】
2021533769.tif 000032
【図８】
2021533769.tif 000033
【図９Ａ】
2021533769.tif 000034
【図９Ｂ】
2021533769.tif 000035
【図９Ｃ】
2021533769.tif 000036
【図９Ｄ】
2021533769.tif 000037
【図９Ｅ】
2021533769.tif 000038
【図９Ｆ】
2021533769.tif 000039
【図１０】
2021533769.tif 000040
【図１１】
2021533769.tif 000041
【図１２】
2021533769.tif 000042
【図１３Ａ】
2021533769.tif 000043
【図１３Ｂ】
2021533769.tif 000044
【図１３Ｃ】
2021533769.tif 000045
【図１４】
2021533769.tif 000046
【図１５】
2021533769.tif 000047
【図１６Ａ】
2021533769.tif 000048
【図１６Ｂ】
2021533769.tif 000049
【図１６Ｃ】
2021533769.tif 000050
【図１６Ｄ】
2021533769.tif 000051
【図１６Ｅ】
2021533769.tif 000052
【図１６Ｆ】
2021533769.tif 000053
【図１７Ａ】
2021533769.tif 000054
【図１７Ｂ】
2021533769.tif 000055
【図１８Ａ】
2021533769.tif 000056
【図１８Ｂ】
2021533769.tif 000057
【図１８Ｃ】
2021533769.tif 000058
【図１９Ａ】
2021533769.tif 000059
【図１９Ｂ】
2021533769.tif 000060
【図２０】
2021533769.tif 000061
【図２１】
2021533769.tif 000062
【配列表】
2021533769000001.app
【国際調査報告】
2021533769.tif 000063
2021533769.tif 000064
2021533769.tif 000065