(57)【要約】  構造的に異なるヒトミルクオリゴ糖の混合物を含む噴霧乾燥粉末、前記噴霧乾燥粉末を生成するための方法、栄養組成物の製造のためのその使用、および前記噴霧乾燥粉末を含む栄養組成物が開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造的に異なるヒトミルクオリゴ糖の混合物を含有する噴霧乾燥粉末。
【請求項２】
前記混合物の構造的に異なるＨＭＯが、２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰＩ、３’−ＳＬ、６’−ＳＬ、ＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃおよびＤＳＬＮＴからなる群から選択される、請求項１に記載の噴霧乾燥粉末。
【請求項３】
前記噴霧乾燥粉末が、少なくとも１種の単糖をさらに含有し、前記少なくとも１種の単糖は、好ましくはＬ−フコースおよびＮ−アセチルノイラミン酸からなる群から選択される、請求項１または２に記載の噴霧乾燥粉末。
【請求項４】
少なくとも８０ｗｔ％、少なくとも８５ｗｔ％、少なくとも９０ｗｔ％、少なくとも９３ｗｔ％、少なくとも９５ｗｔ％、または少なくとも９８ｗｔ％のヒトミルクオリゴ糖を含有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の噴霧乾燥粉末。
【請求項５】
前記混合物の少なくとも１種のＨＭＯ、好ましくは前記混合物の全てのＨＭＯ、任意選択で少なくとも１種の単糖が、非晶質形態で存在する、請求項１から４のいずれか一項に記載の噴霧乾燥粉末。
【請求項６】
少なくとも１種の単糖、好ましくは全ての単糖が、非晶質形態で存在する、請求項３から５のいずれか一項に記載の噴霧乾燥粉末。
【請求項７】
１５ｗｔ％以下の水、好ましくは１０ｗｔ％以下の水、より好ましくは７ｗｔ％以下の水、最も好ましくは５ｗｔ％以下の水を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の噴霧乾燥粉末。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の噴霧乾燥粉末を製造するための方法であって、
ａ）発酵ブロスから構造的に異なるＨＭＯの少なくとも１種を精製する工程と；
ｂ）工程ａ）の少なくとも１種のＨＭＯを含有する水溶液を用意する工程と；
ｃ）工程ｂ）の溶液を噴霧乾燥に供する工程と
を含む方法。
【請求項９】
工程ｂ）の水溶液が、少なくとも５種、好ましくは７種の構造的に異なるＨＭＯを含有し、前記構造的に異なるＨＭＯは、好ましくは２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰＩ、３’−ＳＬ、６’−ＳＬ、ＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃおよびＤＳＬＮＴからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）の水溶液が、少なくとも１種の単糖をさらに含有し、前記少なくとも１種の単糖は、好ましくはＬ−フコースおよびＮ−アセチルノイラミン酸からなる群から選択される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
発酵ブロスから少なくとも１種のＨＭＯおよび／または少なくとも１種の単糖を精製する工程（工程ａ））が、
ｉ）発酵ブロスから微生物細胞を除去して、プロセス流を得る工程；
ｉｉ）プロセス流を少なくとも１回の限外濾過に供する工程；
ｉｉｉ）プロセス流をカチオン交換樹脂で少なくとも１回、および／もしくはアニオン交換樹脂で少なくとも１回処理する工程；
ｉｖ）プロセス流を少なくとも１回のナノ濾過および／もしくは透析濾過に供する工程；
ｖ）プロセス流を少なくとも１回の電気透析に供する工程；
ｖｉ）プロセス流を活性チャコールで少なくとも１回処理する工程；ならびに／または
ｖｉｉ）プロセス流を少なくとも１回結晶化および／もしくは沈殿工程に供する工程
の１つまたは複数を含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記水溶液が、少なくとも１種のＨＭＯ、構造的に異なるＨＭＯの混合物、および／または少なくとも１種の単糖を、合計糖類量として少なくとも２０％（ｗ／ｖ）、３０％（ｗ／ｖ）、３５％（ｗ／ｖ）、および最大４５％（ｗ／ｖ）、５０％（ｗ／ｖ）、６０％（ｗ／ｖ）の量で含有する、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１種のＨＭＯ、および任意選択で少なくとも１種の単糖を含有する水溶液が、少なくとも１１０℃、好ましくは少なくとも１２０℃、より好ましくは少なくとも１２５℃、および１５０℃未満、好ましくは１４０℃未満、より好ましくは１３５℃未満のノズル温度で噴霧乾燥される、請求項８から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１種のＨＭＯ、および任意選択で少なくとも１種の単糖を含有する水溶液が、少なくとも６０℃、好ましくは少なくとも６５℃、および８０℃未満、好ましくは７０℃未満の出口温度で噴霧乾燥される、請求項８から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
栄養組成物、好ましくは乳児用フォーミュラを製造するための、請求項１から７のいずれか一項に記載の噴霧乾燥粉末の使用。
【請求項１６】
請求項１から７のいずれか一項に記載の噴霧乾燥粉末を含有する栄養組成物。
【請求項１７】
少なくとも１種のプロバイオティクス微生物をさらに含有する、請求項１６に記載の栄養組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトミルクオリゴ糖の調製物に関する。より詳細には、本発明は、ヒトミルクオリゴ糖の固体調製物、および前記固体調製物を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト母乳は、相当量の炭水化物を含有する。ヒト母乳中に存在する炭水化物は、Ｌ−フコースおよびＮ−アセチルノイラミン酸等の単糖、二糖であるラクトース、ならびに最大２０ｇ／ｌのオリゴ糖、いわゆる「ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）」を含む。ＨＭＯは、ヒト母乳の３番目に豊富な構成成分である。ヒトミルク中には、１５０を超える構造的に異なるオリゴ糖が存在すると推定される。選択されたＨＭＯを表１に示す。約１０〜１３種のこれらのＨＭＯがそれぞれ、ヒトミルク中に１リットル当たり数百ミリグラムから数グラムの間の濃度で存在する（Ｔｈｕｒｌら（２０１７）、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ７５（１１）９２０〜９３３）。ＨＭＯのうち、中性ＨＭＯ、および少なくとも１つのＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）部分を含有する酸性ＨＭＯが知られている。これらのオリゴ糖の構造的複雑性および豊富さは、ヒトミルクに特有であり、例えば乳畜等の他の哺乳動物のミルクには見られない。
【０００３】
ＨＭＯはヒトによって消化されないため、これらの糖の生理学的役割は、ここ数十年にわたり調査されている。ＨＭＯのプレバイオティクス効果は、１００年以上前に発見された。消費されると、ＨＭＯは、有益な細菌の増殖を補助することにより腸内微生物叢の組成を調整することができる。
【０００４】
【表１−１】
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【０００５】
【表１−２】
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【０００６】
ＨＭＯのいくつかの他の機能的効果、特に新生児の発育に対するそれらの効果がここ数年間で明らかとなった。ＨＭＯは、ヒト細胞の表面糖タンパク質に結合することによってヒト細胞に接着する細菌およびウイルス病原体による感染のリスクを低減するためのデコイとして機能することが知られている。さらに、様々なＨＭＯが抗炎症効果を有し、免疫修飾物質として機能する。したがって、ＨＭＯが食品アレルギーの発生のリスクを低減することが提示された。新生児の中枢神経系の発達に対するシアリル化ＨＭＯの好ましい効果もまた激しく議論されている（「Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｌｋ，Ｏｒｉｇｉｎｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｉｌｋ−ｂｏｒｎｅ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０１７）、編集者：ＭｃＧｕｉｒｅ  Ｍ．、ＭｃＧｕｉｒｅ  Ｍ．およびＢｏｄｅ  Ｌ．において考察されている）。
【０００７】
ＨＭＯの有益な効果を利用するために、栄養組成物、特に乳児用フォーミュラに個々のＨＭＯを添加する取り組みがなされている。しかしながら、栄養組成物に異なるＨＭＯの組合せを補足するほうが良く、これは、そのような組成物が、単一種のＨＭＯのみを含有する組成物よりも、ＨＭＯの天然源、すなわちヒトミルクにより酷似し、ヒトの健康および発育に対するより良好な効果を有する可能性がより高いためである。
【０００８】
栄養組成物を補足するためのＨＭＯの供給が限られていることから、ＨＭＯの化学合成の手順が開発された。そのような化学合成における欠点により、グリコシルトランスフェラーゼ等の精製酵素を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＭＯが合成される生体触媒アプローチがもたらされる。今日では、遺伝子操作微生物細胞の発酵を使用して、個々のＨＭＯが工業規模で生成されている（ＷＯ２０１５／１５０３２８Ａ１、ＷＯ２０１７／０４３３８２Ａ１、ＷＯ２０１０／０７０１０４Ａ１、ＷＯ２０１２／０９７９５０Ａ１）。ＨＭＯは、遺伝子操作微生物細胞により合成され、発酵培地および／または細胞分解物から回収されて、実質的に純粋なＨＭＯの調製物を得ることができる。
【０００９】
発酵ブロスからのその回収の間、ＨＭＯは通常、目的のＨＭＯを含有し、また所望のＨＭＯの発酵生成中に生成された副生成物である望ましくないＨＭＯを含有する液体プロセス流、例えば水溶液の形態で存在する。所望のＨＭＯ、すなわち目的のＨＭＯの回収に従い、プロセス流中のその濃度およびその純度は増加する。しかしながら、ＨＭＯを含有する水溶液は、細菌または真菌汚染に対して脆弱である。したがって、少量の水を含有する乾燥または固体生成物として所望のＨＭＯを提供することが好ましい。そのような固体生成物上／中では、微生物の成長はほぼ不可能である。
【００１０】
典型的には、糖は、結晶化により固体形態で得られる。水溶液からの個々のＨＭＯの結晶化は、３−フコシルラクトースに関して（ＷＯ２０１４／０７５６８０Ａ）、２’−フコシルラクトースに関して（ＷＯ２０１１／１５０９３９Ａ）、ジ−フコシルラクトースに関して（ＷＯ２０１６／０８６９４７Ａ）、ラクト−Ｎ−テトラオースに関して（ＷＯ２０１７／１０１９５３Ａ）、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースに関して（ＷＯ２０１４／０９４７８３Ａ）説明されている。ＨＭＯの結晶化は、アルコール、主にエタノールもしくはメタノール等の有機溶媒、または氷酢酸等の有機酸の使用を伴う。しかしながら、回収プロセスの最後にＨＭＯを結晶化させるためのアルコール、特にメタノールの使用は、ＨＭＯがヒトによる消費に使用される場合には不適切である。さらに、有機溶媒は、購入および廃棄するのに費用を要する。また、有機溶媒は、環境およびそれを取り扱う人員に有害である。したがって、ＨＭＯの結晶化は、工業規模でのＨＭＯの生成における欠点であり、特に所望のＨＭＯの回収プロセスの最後には回避されるべきである。
【００１１】
したがって、好ましくは少なくとも１種の単糖と組み合わされたＨＭＯの混合物を固体形態で提供する方法が必要とされており、方法は、工業規模生成に適用可能であり、ＨＭＯの１種または複数種の精製の最後に、前記ＨＭＯの固体調製物を提供するための有機溶媒の使用を伴わない。
【００１２】
目的は、構造的に異なるＨＭＯの混合物を含む噴霧乾燥粉末を製造するための方法によって達成された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第１の態様において、構造的に異なるＨＭＯの混合物から本質的になる、またはそれを含有する噴霧乾燥粉末が提供される。
第２の態様において、構造的に異なるＨＭＯの混合物から本質的になる、またはそれを含有する噴霧乾燥粉末を製造するための方法が提供される。
【００１４】
第３の態様において、栄養組成物を製造するための構造的に異なるＨＭＯの混合物から本質的になる、またはそれを含有する噴霧乾燥粉末の使用が提供される。
第４の態様において、構造的に異なるＨＭＯの混合物から本質的になる、またはそれを含有する噴霧乾燥粉末を含む栄養組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】噴霧乾燥３−フコシルラクトースの粉末Ｘ線回折の結果を示すグラフである。
【図２】噴霧乾燥ラクト−Ｎ−テトラオースの粉末Ｘ線回折の結果を示すグラフである。
【図３】噴霧乾燥６’−シアリルラクトースの粉末Ｘ線回折の結果を示すグラフである。
【図４】噴霧乾燥３’−シアリルラクトースの粉末Ｘ線回折の結果を示すグラフである。
【図５】２’−フコシルラクトースおよびラクト−Ｎ−テトラオースの噴霧乾燥混合物の粉末Ｘ線回折の結果を示すグラフである。
【図６】２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、３’−シアリルラクトース、および６’−シアリルラクトースの噴霧乾燥混合物の粉末Ｘ線回折の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
第１の態様によれば、構造的に異なるＨＭＯの混合物から本質的になる、またはそれを含有する噴霧乾燥粉末が提供される。
実施形態において、噴霧乾燥粉末は、構造的に異なるＨＭＯの混合物から本質的になる。
【００１７】
「から本質的になる」という用語は、本明細書において使用される場合、前記用語の後に特定された化合物、および任意選択で不可避の副生成物からなる組成物を指す。前記不可避の副生成物は、例えば、ＨＭＯの１種または複数種の生成のための微生物発酵中に生成された化合物、およびＨＭＯが回収されるプロセス流に導入されたがそこから除去されていない可能性がある化合物を含む。噴霧乾燥粉末に関する「から本質的になる」という用語は、噴霧乾燥粉末の乾燥物質に関して少なくとも８０ｗｔ％、少なくとも８５ｗｔ％、少なくとも９０ｗｔ％、少なくとも９３ｗｔ％、少なくとも９５ｗｔ％、または少なくとも９８ｗｔ％のＨＭＯを含有する噴霧乾燥粉末を含む。「から本質的になる」という用語は、ＨＭＯを含有する噴霧乾燥粉末、プロセス流および溶液に関して同様に使用される。
【００１８】
追加および／または代替の実施形態において、構造的に異なるＨＭＯの混合物は、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種以上の構造的に異なるＨＭＯからなる。構造的に異なるＨＭＯは、中性ＨＭＯおよびシアリル化ＨＭＯを含有する。したがって、ＨＭＯの混合物は、少なくとも１種の中性ＨＭＯおよび／または少なくとも１種の酸性ＨＭＯを含んでもよい。
【００１９】
少なくとも１種の中性ＨＭＯは、２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）、３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）、ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）およびラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ（ＬＮＰＦＩ）からなる群から選択され得る。
【００２０】
少なくとも１種の酸性ＨＭＯは、シアリル化ＨＭＯからなる群から、好ましくは３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）、６’−シアリルラクトース（６’−ＳＬ）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ（ＬＳＴ−ａ）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ（ＬＳＴ−ｂ）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｃ（ＬＳＴ−ｃ）およびジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース（ＤＳＬＮＴ）からなる群から選択され得る。
【００２１】
したがって、構造的に異なるＨＭＯの混合物の構造的に異なるＨＭＯは、２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰＩ、３’−ＳＬ、６’−ＳＬ、ＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃおよびＤＳＬＮＴからなる群から選択され得る。
【００２２】
追加および／または代替の実施形態において、構造的に異なるＨＭＯの混合物は、５種の構造的に異なるＨＭＯを含有する、またはそれらから本質的になる。追加の実施形態において、それらの５種の構造的に異なるＨＭＯは、２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＮＴ、３’−ＳＬおよび６’−ＳＬである。混合物の例示的組成において、５種の構造的に異なるＨＭＯは、構造的に異なるＨＭＯの混合物中に表２に指定されるような量で存在する。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
追加および／または代替の実施形態において、構造的に異なるＨＭＯの混合物は、７種の構造的に異なるＨＭＯを含有する、またはそれらから本質的になる。追加の実施形態において、それらの７種の構造的に異なるＨＭＯは、２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰＩ、３’−ＳＬおよび６’−ＳＬである。混合物の例示的組成において、７種の構造的に異なるＨＭＯは、混合物中に表３に指定されるような量で存在する。
【００２５】
【表３】
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【００２６】
追加および／または代替の実施形態において、噴霧乾燥粉末は、構造的に異なるＨＭＯの混合物および少なくとも１種の単糖を含有する、またはそれらから本質的になる。好ましくは、前記少なくとも１種の単糖は、Ｌ−フコースおよびＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）からなる群から選択される。追加および／または代替の実施形態において、噴霧乾燥粉末は、単糖であるＬ−フコースおよびＮ−アセチルノイラミン酸を含有する。
【００２７】
特定の実施形態において、噴霧乾燥粉末は、ＨＭＯである２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰＩ、３’−ＳＬおよび６’−ＳＬ、ならびに単糖であるＬ−フコースおよびＮ−アセチルノイラミン酸から本質的になる。
【００２８】
例示的組成において、７種の構造的に異なるＨＭＯおよび２種の単糖は、表４に指定されるような量で存在する。
【００２９】
【表４】
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【００３０】
追加および／または代替の実施形態において、噴霧乾燥粉末は、表５に示される組成を含む、またはそれらから本質的になる。
【００３１】
【表５】
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【００３２】
追加および／または代替の実施形態において、構造的に異なるＨＭＯの混合物および／または噴霧乾燥粉末のＨＭＯの少なくとも１種は、微生物発酵により生成されたものである。具体的実施形態において、構造的に異なるＨＭＯの混合物および／または噴霧乾燥粉末の全てのＨＭＯが、微生物発酵により生成されたものである。
【００３３】
噴霧乾燥粉末が少なくとも１種の単糖を含有する追加および／または代替の実施形態において、前記少なくとも１種の単糖は、微生物発酵により生成されたものである。噴霧乾燥粉末がＬ−フコースおよびＮ−アセチルノイラミン酸を含有する別の実施形態において、両方の単糖が、微生物発酵により生成されたものである。
【００３４】
したがって、特定の実施形態において、噴霧乾燥粉末中に存在する全ての糖類(saccharides)、すなわちＨＭＯ、またはＨＭＯおよび単糖が、微生物発酵により生成されたものである。
追加および／または代替の実施形態において、噴霧乾燥粉末中のＨＭＯの少なくとも１種、好ましくは噴霧乾燥粉末中の全てのＨＭＯが、非晶質形態で存在する。噴霧乾燥粉末が単糖であるＬ−フコースおよび／またはＮ−アセチルノイラミン酸を含有するそれらの実施形態において、単糖の少なくとも１種、または両方の単糖が、非晶質形態で存在する。
【００３５】
追加および／または代替の実施形態において、噴霧乾燥粉末は、少量の水を含有する。「少量の水」という用語は、１５ｗｔ％以下の水、好ましくは１０ｗｔ％以下の水、より好ましくは７ｗｔ％以下の水、最も好ましくは５ｗｔ％以下の水の量を指す。
【００３６】
追加および／または代替の実施形態において、噴霧乾燥粉末は、遺伝子操作微生物を含まず、遺伝子操作微生物由来の核酸分子を含まない。
任意選択で少なくとも１種の単糖と組み合わされた構造的に異なるＨＭＯの混合物から本質的になる噴霧乾燥粉末は、前記噴霧乾燥粉末が微生物汚染に対してより脆弱でないという点で、液体組成物より有利である。前記噴霧乾燥粉末はまた、噴霧乾燥粉末がより低い吸湿性を有し、はるかに長く流動性を維持するという点で、フリーズドライまたは凍結乾燥により得られた同じ成分の組成を有する粉末より有利である。
【００３７】
第２の態様によれば、構造的に異なるＨＭＯの混合物から本質的になる、またはそれを含む噴霧乾燥粉末を製造するための方法が提供され、構造的に異なるＨＭＯの少なくとも１種、好ましくは構造的に異なるＨＭＯの全てが、微生物発酵により生成されたものである。方法は、
ａ）発酵ブロスから構造的に異なるＨＭＯの少なくとも１種を回収する工程と；
ｂ）工程ａ）の少なくとも１種のＨＭＯの水溶液を用意する工程と；
ｃ）工程ｂ）の溶液を噴霧乾燥に供する工程と
を含む。
【００３８】
追加および／または代替の実施形態において、発酵ブロスからの少なくとも１種のＨＭＯの精製（ステップａ）は、
ｉ）発酵ブロスから微生物細胞を除去して、プロセス流を得る工程；
ｉｉ）プロセス流を少なくとも１回の限外濾過に供する工程；
ｉｉｉ）プロセス流をカチオン交換樹脂で少なくとも１回、および／もしくはアニオン交換樹脂で少なくとも１回処理する工程；
ｉｖ）プロセス流を少なくとも１回のナノ濾過に供する工程；
ｖ）プロセス流を少なくとも１回の電気透析に供する工程；
ｖｉ）プロセス流を活性チャコールで少なくとも１回処理する工程；ならびに／または
ｖｉｉ）プロセス流を少なくとも１回結晶化および／もしくは沈殿工程に供する工程
の１つまたは複数を含む。
【００３９】
混合物の少なくとも１種のＨＭＯ、または構造的に異なるＨＭＯのいずれか１種は、微生物発酵により生成され得、ＨＭＯを合成することができる遺伝子操作微生物が、培養培地（発酵ブロス）中で、および前記遺伝子操作微生物による前記ＨＭＯの合成を許容する条件下で培養される。遺伝子操作微生物の細胞により合成されたＨＭＯの精製は、発酵ブロスから微生物細胞を分離して、プロセス流を得る工程を含む。プロセス流は、細胞を本質的に含まず、前記ＨＭＯを含有する。この工程は、所望のＨＭＯを精製する方法の第１の工程である。
【００４０】
発酵ブロスから微生物細胞を分離するための好適な方法は遠心分離を含み、微生物細胞はペレットとして得られ、発酵ブロスは上清として得られる。追加および／または代替の実施形態において、微生物細胞は、濾過を用いることにより発酵ブロスから分離される。発酵ブロスから細胞を分離するための好適な濾過方法は、精密濾過および限外濾過を含む。
【００４１】
そのような精密濾過は、粒子含有流体が特殊な細孔サイズの膜に通されて流体から粒子が分離される、物理的濾過プロセスである。「精密濾過」という用語は、本明細書において使用される場合、発酵ブロスから細胞が分離される物理的濾過プロセスを指す。
【００４２】
限外濾過は膜濾過の１種であり、根本的な違いはない。限外濾過では、圧力または濃度勾配等の力が、半透膜を介した分離をもたらす。細胞、懸濁固体および高分子量の溶質は、いわゆる保持物中に保持され、一方水および低分子量溶質、例えば所望のシアリル化オリゴ糖は、膜を通過して透過液（濾液）中に入る。
【００４３】
限外濾過膜は、使用される膜の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）により定義される。限外濾過は、クロスフローまたはデッドエンドモードで適用される。
典型的には、微生物細胞は、細胞内でＨＭＯを合成する。ＨＭＯの構造に依存して、ＨＭＯは、発酵ブロス中に送達されるか、または微生物細胞内に残留する。前者の場合、そのようにして生成されたＨＭＯは、発酵の最後に発酵ブロス中に存在し、発酵ブロスから取り出され得、したがってこれがプロセス流となる。後者の場合、ＨＭＯを保有する微生物細胞が発酵ブロスから分離され、溶解されて、ＨＭＯを放出する。したがって、細胞溶解物はＨＭＯを含有しており、本明細書で以降に記載されるようにＨＭＯの精製のためのプロセス流となる。
【００４４】
方法は、微生物発酵により生成されたＨＭＯの精製に使用されるが、前記方法はまた、ｉｎ−ｖｉｔｒｏでの酵素触媒により生成されたＨＭＯを精製するために使用されてもよい。次いで、ＨＭＯは、生体触媒反応の最後に反応混合物から精製され得る。前記反応混合物は、プロセス流として精製のプロセスに供される。
【００４５】
プロセス流は、所望のＨＭＯ、ならびに副生成物および望ましくない不純物、例えば単糖、二糖、望ましくないオリゴ糖副生成物、イオン、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質および／または核酸分子を含有する。
【００４６】
追加および／または代替の実施形態において、ＨＭＯを精製するための方法は、清澄化プロセス流から正電荷を有する化合物を除去するために、少なくとも１回のカチオン交換処理の工程を含む。
【００４７】
プロセス流から正電荷を有する化合物を除去するための好適なカチオン交換樹脂は、Ｈ＋形態のＬｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ６３６８Ａ（Ｌａｎｘｅｓｓ  ＡＧ、ケルン、ＤＥ）；Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ２５６８（Ｈ＋）（Ｌａｎｘｅｓｓ  ＡＧ、ケルン、ＤＥ）を含む。
【００４８】
追加および／または代替の実施形態において、ＨＭＯを精製するための方法は、清澄化プロセス流から望ましくない負電荷を有する化合物を除去するために、アニオン交換処理の工程を含む。
【００４９】
好適なアニオン交換樹脂は、Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ２５６８（Ｃｌ−）（Ｌａｎｘｅｓｓ  ＡＧ、ケルン、ＤＥ）、Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ６３６８Ａ（Ｌａｎｘｅｓｓ  ＡＧ、ケルン、ＤＥ）、Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ４２６８（Ｌａｎｘｅｓｓ  ＡＧ、ケルン、ＤＥ）、Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ５５２８（Ｌａｎｘｅｓｓ  ＡＧ、ケルン、ＤＥ）、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＡＧ１ｘ２（メッシュ２００〜４００）、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）１ｘ８（メッシュ１００〜２００）、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ（登録商標）ＣＧＡ１００ｘ４（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  ＧｍｂＨ、ラーティンゲン、ＤＥ）、Ｄｏｗ（登録商標）Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＦＰＡ５１（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＭＩ、ＵＳＡ）を含む。
【００５０】
追加および／または代替の実施形態において、ＨＭＯを精製するための方法は、より低分子量の不純物を除去し、所望のＨＭＯを濃縮するために、ナノ濾過および／または透析濾過工程を含む。
【００５１】
透析濾過は、膜透過性成分を除去（洗浄）するために溶液に新鮮な水を添加することを含む。透析濾過は、１つまたは複数の種が効率的に保持され、他の種は膜透過性である適切な膜を使用することによって、その分子サイズおよび電荷に基づいて成分を分離するために使用され得る。特に、ナノ濾過膜を使用した透析濾過は、小分子および塩等の低分子量化合物の分離に効果的である。ナノ濾過膜は通常、１５０〜１０００ダルトンの範囲内の分子量カットオフを有する。ナノ濾過は、酪農業において乳清の濃縮および脱ミネラル化のために広く使用される。
【００５２】
ナノ濾過および／または透析濾過のための好適な膜は、Ｄｏｗ（登録商標）Ｆｉｌｍｔｅｃ（商標）ＮＦ２７０−４０４０、Ｔｒｉｓｅｐ（登録商標）４０４０−ＸＮ４５−ＴＳＦ（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ  ＧｍｂＨ、ヴィースバーデン、ＤＥ）、ＧＥ４０４０Ｆ３０およびＧＨ４０４０Ｆ５０（ＧＥ  Ｗａｔｅｒ  ＆  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ラーティンゲン、ＤＥ）を含む。
【００５３】
ナノ濾過膜を使用した透析濾過は、オリゴ糖含有溶液の電気透析処理の前に著しい量の夾雑物を除去するための前処理として効率的であることが判明した。ＨＭＯの精製中の濃縮および透析濾過のためのナノ濾過膜の使用は、より低いエネルギーおよび処理コスト、ならびに低減された熱曝露に起因するより良好な製品品質をもたらし、メイラード反応およびアルドール反応の低減につながる。
【００５４】
追加および／または代替の実施形態において、ＨＭＯを精製するための方法は、少なくとも１回の電気透析工程を含む。
電気透析（ＥＤ）は、透析および電気分解を組み合わせたものであり、半透膜を通したその選択的エレクトロマイグレーションに基づく溶液中のイオンの分離または濃縮に使用され得る。
【００５５】
電気透析の基本原理は、直流発電機に接続された、イオン伝導のために電解質に浸漬された電極の対を備える電解槽からなる。直流発電機の陽極に接続された電極はアノードであり、陰極に接続された電極はカソードである。次いで電解液は電流の流れを担うが、これは、それぞれアノードおよびカソードに向かう陰イオンおよび陽イオンの移動から生じる。電気透析に使用される膜は、本質的に、負電荷基または正電荷基を有する多孔質イオン交換樹脂のシートであり、したがってそれぞれカチオン膜またはアニオン膜と記述される。イオン交換膜は、通常、ジビニルベンゼンと架橋された好適な官能基（例えばカチオン膜の場合スルホン酸基、またはアニオン膜の場合四級アンモニウム基）を保持するポリスチレンで作製される。電解質は、例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウムまたはスルファミン酸であってもよい。次いで、イオンが枯渇している流れが、イオンが高濃度化されている流れから十分に分離される（２つの溶液はまた、希釈物（イオンが枯渇している）および濃縮物（イオンが高濃度化されている）と呼ばれる）ように、アニオン膜およびカチオン膜が２つの電極ブロック間のフィルタプレスのように平行となる様式で電気透析積層体が組み立てられる。電気透析プロセスの中心は膜積層体であり、これは、２つの電極間に設置されるスペーサーで隔てられたいくつかのアニオン交換膜およびカチオン交換膜からなる。直流電流を印加することにより、アニオンおよびカチオンは、膜を介して電極に移動する。
【００５６】
追加および／または代替の実施形態において、ＨＭＯを精製するための方法は、疑似床移動（ＳＭＢ）クロマトグラフィー等の連続クロマトグラフィーの工程をさらに含む。
疑似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーは、石油化学工業および鉱業で始まった。今日では、ＳＭＢクロマトグラフィーは、製薬産業によりラセミ混合物から鏡像異性体を単離するために使用されている。大規模ＳＭＢクロマトグラフィーは、フルクトース−グルコース溶液からの単糖フルクトースの分離に、およびテンサイまたはサトウキビシロップからの二糖スクロースの分離にすでに使用されている。
【００５７】
糖類を分離するために使用されるＳＭＢクロマトグラフィープロセスは、例えば、カルシウム充填架橋ポリスチレン樹脂、重亜硫酸塩形態のアニオン樹脂（Ｂｅｃｈｔｈｏｌｄ  Ｍ．ら、Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｇｅｎｉｅｕｒ  Ｔｅｃｈｎｉｋ、２０１０、８２、６５〜７５）、または水素形態のポリスチレンゲル強酸カチオン樹脂（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）ＰＣＲ８３３Ｈ）（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ、Ｂａｌａ  Ｃｙｎｗｙｄ、ＵＳＡ）を使用する。
【００５８】
連続動作モード、移動相のリサイクル、および大型カラムサイズを使用する可能性を考慮して、ＳＭＢクロマトグラフィーシステムは、原則的に、数百トンの生産量を達成するように拡張され得る。
【００５９】
疑似移動床クロマトグラフィーのプロセス工程は、このプロセス工程により所望のオリゴ糖に構造的に密接に関連したオリゴ糖のさらなる除去が可能になるという点で有利である。
【００６０】
追加および／または代替の実施形態において、少なくとも１種のＨＭＯを精製するための方法は、プロセス流から着色剤等の汚染物質を除去するために、プロセス流の活性チャコールでの処理を含む。
【００６１】
追加および／または代替の実施形態において、少なくとも１種のＨＭＯを精製するための方法は、プロセス流からのＨＭＯの結晶化または沈殿の少なくとも１つの工程を含む。プロセス流からの少なくとも１種のＨＭＯの結晶化または沈殿は、少なくとも１種のＨＭＯを含有するプロセス流に、水と混和性の好適な量の有機溶媒を添加することにより行うことができる。有機溶媒は、Ｃ１−〜Ｃ６−アルコールおよびＣ１−〜Ｃ４−カルボン酸からなる群から選択され得る。少なくとも１種のＨＭＯの結晶化または沈殿の工程は、残留量の有機溶媒またはカルボン酸が後続のプロセス工程により除去され得るように、回収工程の最後には行われない。
【００６２】
追加および／または代替の実施形態において、少なくとも１種のＨＭＯを精製するための方法は、好ましくは３ｋＤａフィルタまたは６ｋＤａフィルタを通したプロセス流の濾過による、無菌濾過および／またはエンドトキシン除去の工程を含む。
【００６３】
追加および／または代替の実施形態において、少なくとも１種のＨＭＯを精製するための方法は、プロセス流中の少なくとも１種のＨＭＯの濃度を増加させる工程を含む。プロセス流中の少なくとも１種のＨＭＯの濃度は、プロセス流を真空蒸発、逆浸透またはナノ濾過（例えば２０Å以下のサイズ排除限界を有するナノ濾過膜によるナノ濾過）に供することにより増加され得る。代替として、結晶化または沈殿したＨＭＯを水に溶解し、少なくとも１種のＨＭＯの水溶液を得るが、水溶液は、所望の濃度の前記少なくとも１種のＨＭＯを有する。
【００６４】
追加および／または代替の実施形態において、得られるプロセス流は、２０ｇ／ｌ以上、２５ｇ／ｌ以上、３０ｇ／ｌ以上、４０ｇ／ｌ以上、６０ｇ／ｌ以上、１００ｇ／ｌ以上、２００ｇ／ｌ以上、またはさらに３００ｇ／ｌ以上の濃度の少なくとも１種のＨＭＯを含有する水溶液である。
【００６５】
追加および／または代替の実施形態において、水溶液は、溶液中の乾燥物質／溶質の重量に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の純度の少なくとも１種のＨＭＯを含有する。
【００６６】
「純度」という用語は、本明細書において使用される場合、化学的純度、すなわち物質が異物で希釈されていない、または異物と混合されていない程度を指す。したがって、化学的純度は、少なくとも１種のＨＭＯと副生成物／不純物との間の関係の指標である。化学的純度は、パーセンテージ（％）として表現され、以下の式を用いて計算される。
【００６７】
【数１】
2021505173.tif 000009
【００６８】
調製物中のＨＭＯの純度は、当業者に知られている任意の好適な方法によって、例えば、ＨＰＬＣを使用し、同じクロマトグラムにおけるＨＭＯおよびそのＨＭＯ以外の全ての化合物を表すピーク下面積の合計に対する、そのＨＭＯの量を表すピーク下面積の比を計算することによって決定され得る。
【００６９】
少なくとも１種のＨＭＯを含有する水溶液は、適切な条件下で保存されてもよく、例えば、前記水溶液は凍結されてもよい。
少なくとも１種のＨＭＯを精製するための方法は、コスト効率的であり、拡張が容易であり、数トン規模の製造方法の基礎として好適である。
【００７０】
少なくとも１種のＨＭＯを精製するための方法はまた、水溶液が遺伝子操作微生物、および遺伝子操作微生物由来の核酸分子を含まないという点で有利である。さらに、水溶液は、タンパク質を含まない。タンパク質を完全に除去すると、潜在的消費者にアレルギーをもたらすリスクが排除される。
【００７１】
噴霧乾燥粉末を製造するための方法は、少なくとも１種のＨＭＯまたは構造的に異なるＨＭＯの混合物、および任意選択で少なくとも１種の単糖を含有する水溶液を用意する工程を含む。
【００７２】
追加および／または代替の実施形態において、少なくとも１種のＨＭＯは、２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰＩ、３’−ＳＬ、６’−ＳＬ、ＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃおよびＤＳＬＮＴからなる群から選択される。
【００７３】
追加および／または代替の実施形態において、構造的に異なるＨＭＯの混合物は、５種の構造的に異なるＨＭＯ、好ましくは２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＮＴ、３’−ＳＬおよび６’−ＳＬからなる。別の実施形態において、構造的に異なるＨＭＯの混合物は、７種の構造的に異なるＨＭＯ、好ましくは２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰＩ、３’−ＳＬおよび６’−ＳＬからなる。
【００７４】
追加および／または代替の実施形態において、水溶液は、好ましくはＬ−フコースおよびＮ−アセチルノイラミン酸からなる群から選択される少なくとも１種の単糖をさらに含有する。別の実施形態において、水溶液は、Ｌ−フコースおよびＮ−アセチルノイラミン酸をさらに含有する。
【００７５】
追加および／または代替の実施形態において、水溶液は、少なくとも１種のＨＭＯもしくはＨＭＯの混合物、および／または少なくとも１種の単糖を、合計糖類量として少なくとも２０％（ｗ／ｖ）、３０％（ｗ／ｖ）、３５％（ｗ／ｖ）、および最大４５％（ｗ／ｖ）、５０％（ｗ／ｖ）、６０％（ｗ／ｖ）の量で含有する。
【００７６】
追加および／または代替の実施形態において、水溶液は、溶液中の乾燥物質／溶質の重量に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の純度の少なくとも１種のＨＭＯまたはＨＭＯの混合物を含有する。
【００７７】
追加および／または代替の実施形態において、水溶液は、遺伝子操作微生物、遺伝子操作微生物由来の核酸分子、およびタンパク質を含まない。
噴霧乾燥粉末を製造するための方法において、少なくとも１種のＨＭＯまたは構造的に異なるＨＭＯの混合物を含有する水溶液は、噴霧乾燥に供される。
【００７８】
噴霧乾燥は、乾燥粉末を得るための方法であり、目的の物質を含む溶液は、まず液滴として噴霧され、これが高温空気により急速に乾燥される。噴霧乾燥は非常に速く、乾燥させる物質の高温への曝露は極めて短期間である。
【００７９】
追加および／または代替の実施形態において、少なくとも１種のＨＭＯまたは構造的に異なるＨＭＯの混合物を含有する水溶液は、少なくとも１１０℃、好ましくは少なくとも１２０℃、より好ましくは少なくとも１２５℃、および１５０℃未満、好ましくは１４０℃未満、より好ましくは１３５℃未満のノズル温度で噴霧乾燥される。
【００８０】
追加および／または代替の実施形態において、少なくとも１種のＨＭＯまたは構造的に異なるＨＭＯの混合物を含有する水溶液は、少なくとも６０℃、好ましくは少なくとも６５℃、および８０℃未満、好ましくは７０℃未満の出口温度で噴霧乾燥される。特に好ましい実施形態において、ＨＭＯ含有水溶液は、約６８℃〜約７０℃のノズル温度で噴霧乾燥される。
【００８１】
任意選択で少なくとも１種の単糖と組み合わされた構造的に異なるＨＭＯのそれぞれの種は、個々に精製および噴霧乾燥されてもよいこと、また得られた噴霧乾燥粉末は任意の所望の比率で混合されてもよいことが理解される。代替の実施形態において、水溶液は、全ての構造的に異なるＨＭＯを含み、構造的に異なるＨＭＯの混合物を所望の比率で含有する得られる水溶液は、噴霧乾燥に供される。
【００８２】
追加および／または代替の実施形態において、少なくとも１種のＨＭＯまたは実質的に異なるＨＭＯの混合物を含有する水溶液は、少なくとも１種の単糖、例えばＬ−フコースおよび／またはＮ−アセチルノイラミン酸等をさらに含有する。少なくとも１種のＨＭＯまたは構造的に異なるＨＭＯの混合物、および少なくとも１種の単糖を含有する水溶液は、次いで噴霧乾燥に供され、少なくとも１種のＨＭＯおよび少なくとも１種の単糖、または構造的に異なるＨＭＯの混合物および少なくとも１種の単糖から本質的になる噴霧乾燥粉末が得られる。
【００８３】
得られた噴霧乾燥粉末中の糖類（ＨＭＯおよび単糖）の比率は、水溶液中のこれらの糖類の比率に対応する。
後者の手順は、個々に噴霧乾燥され得ない単糖が、１種または複数種のＨＭＯの存在下で噴霧乾燥可能となる点で有利である。
【００８４】
少なくとも１種のＨＭＯまたは構造的に異なるＨＭＯの混合物を含有する水溶液の噴霧乾燥は、低吸湿性の粉末を提供し、ＨＭＯは非晶質形態で存在し、粒子サイズは均一である。少なくとも１種のＨＭＯまたは構造的に異なるＨＭＯの混合物から本質的になる噴霧乾燥粉末は、フリーズドライにより得られた同一組成の粉末より吸湿性が低い。したがって、本明細書に記載の噴霧乾燥粉末は、そのさらなる使用および加工に関して有利である。
【００８５】
第３の態様によれば、栄養組成物を製造するための、構造的に異なるＨＭＯの混合物、ならびに少なくとも１種の単糖、好ましくはＬ−フコースおよび／もしくはＮ−アセチルノイラミン酸から本質的になる、または構造的に異なるＨＭＯの混合物、ならびに少なくとも１種の単糖、好ましくはＬ−フコースおよび／もしくはＮ−アセチルノイラミン酸を含有する噴霧乾燥粉末の使用が提供される。構造的に異なるＨＭＯの混合物、ならびに任意選択で好ましくはＬ−フコースおよびＮ−アセチルノイラミン酸からなる群から選択される少なくとも１種の単糖から本質的になる噴霧乾燥粉末は、ヒトによる消費に好適であり、したがって、医薬製剤、乳児用フォーミュラ、乳飲料または健康補助食品等のヒトによる消費用の調製物中に含めることができる。
【００８６】
第４の態様によれば、第１の態様に記載の、および／または第２の態様に従って製造された噴霧乾燥粉末を含有する栄養組成物が提供される。
追加および／または代替の実施形態において、栄養組成物は、Ｎｅｕ５Ａｃ、２’−ＦＬ、３−ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰＩ、３’−ＳＬ、６’−ＳＬおよびＬ−フコースから本質的になる混合物を含む。好ましい量の上記化合物のそれぞれを含む組成物を、表６に示す。
【００８７】
表６の２列目による組成は、
【００８８】
【表６】
2021505173.tif 000010
【００８９】
直接消費のための最終的乳児用フォーミュラが、表６の３列目に指定された濃度の混合物の化合物を含有し得るように、乳児用フォーミュラを補足するのに特に有利である。
追加および／または代替の実施形態において、栄養組成物は、１つまたは複数の追加の成分を含有する。前記１つまたは複数の追加の成分は、油、脂肪および脂肪酸（例えばオリーブ油、ヒマワリ油、ココナッツ油、ナッツ油、菜種油、パーム油、アマニ油、魚油、リノレン酸、大豆油等）、炭水化物（例えばグルコース、フルクトース、ラクトース、マルトデキストリン、デンプン、スクロース、イノシトール等）、タンパク質（無脂肪乳、乳清、カゼイン（任意の乳畜由来）、または大豆からのもの）、ビタミン（Ａ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ビオチン、葉酸、ナイアシン、コリン）、ミネラルおよび微量元素（ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、リン、マグネシウム、鉄、亜鉛、マンガン、フッ化物、セレン、ヨウ素、銅）からなる群から選択される。
【００９０】
好ましい実施形態において、少なくとも１種のヒトミルクオリゴ糖またはヒトミルクオリゴ糖の混合物または少なくとも１種のヒトミルクオリゴ糖と少なくとも１種の単糖との混合物または構造的に異なるヒトミルクオリゴ糖と他の繊維との混合物を含有する／それらから本質的になる噴霧乾燥粉末を含有する栄養組成物は、規則（ＥＵ）２０１６／１２７および／または連邦規制基準（ＵＳＡ）  Ｔｉｔｌｅ  ２１  １０７．１００（栄養物仕様）に記載の組成要件に適合する乳児用フォーミュラである。乳児用フォーミュラの代表的組成を、表７および８に示す。
【００９１】
【表７】
2021505173.tif 000011
【００９２】
【表８−１】
2021505173.tif 000012
【００９３】
【表８−２】
2021505173.tif 000013
【００９４】
追加および／または代替の実施形態において、栄養組成物はまた、微生物、好ましくはプロバイオティクス微生物を含む。乳児用食品用途では、好ましい微生物は、健康なヒトの微生物叢から得られる、またはそれに見出すことができる。好ましくは、これらに限定されないが、微生物は、ビフィドバクテリウム属、ラクトバチルス属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、ペプトストレプトコッカス属、ロイコノストック属、クロストリジウム属、ユーバクテリウム属、ベイロネラ属、フソバクテリウム属、バクテロイデス属、プレボテラ属、エシェリキア属、プロピオニバクテリウム属およびサッカロミセス属から選択される。追加および／または代替の実施形態において、微生物は、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、Ｂ．アニマリス、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．インファンティス、Ｂ．ラクティス、Ｂ．ロンガム；エンテロコッカス・フェシウム；大腸菌；クリベロマイセス・マルキシアヌス；ラクトバチルス・アシドフィルス、Ｌ．ブルガリカス、Ｌ．カゼイ、Ｌ．クリスパタス、Ｌ．ファーメンタム、Ｌ．ガセリ、Ｌ．ヘルヴェティクス、Ｌ．ジョンソニイ、Ｌ．パラカゼイ、Ｌ．プランタラム、Ｌ．ロイテリ、Ｌ．ラムノサス、Ｌ．サリバリウス、Ｌ．サケイ；ラクトコッカス・ラクティス（亜種であるラクティス、クレモリスおよびジアセチラクティスを含むがこれらに限定されない）；ロイコノストック・メセンテロイデス（亜種であるメセンテロイデスを含むがこれに限定されない）；ペディオコッカス・アシディラクティシ、Ｐ．ペントサス；プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ、Ｐ．フロイデンライヒｓｓｐ．シェルマニー；スタフィロコッカス・カルノーサス；ならびにストレプトコッカス・サーモフィルスからなる群から選択される。
【００９５】
生体の組合せに加えて、栄養組成物はまた、死細胞培養物を含んでもよい。プロバイオティクスの分野において、死滅細胞培養物が使用される場合がある（例えば間欠滅菌された（ｔｙｎｄａｌｉｚｅｄ）細菌）。これらの死滅培養物は、タンパク質、ペプチド、オリゴ糖、細胞外壁断片および天然生成物を提供し、免疫系の短期刺激をもたらし得る。
【００９６】
特にＨＭＯの存在下で栄養組成物中にプロバイオティクス微生物を含めることは、健康な腸内微生物叢の確立も促進するという点で特に有利である。
追加および／または代替の実施形態において、栄養組成物はまた、ガラクト−オリゴ糖（ＧＯＳ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、イヌリンまたはそれらの組合せ等のプレバイオティクスを含む。
【００９７】
栄養組成物は、液体形態で、または、これらに限定されないが、粉末、顆粒、フレークおよびペレットを含む固体形態で存在してもよい。
追加の実施形態において、栄養組成物は、医薬製剤、乳児用フォーミュラおよび健康補助食品からなる群から選択される。
【００９８】
特定の実施形態に関して、および図面を参照しながら本発明を説明するが、本発明はそれに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、明細書および特許請求の範囲における第１、第２等の用語は、類似の要素間を区別するために使用され、必ずしも、時間的、空間的、ランク付けまたは任意の他の様式での順序を説明するものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で互換的であること、および本明細書に記載の本発明の実施形態は、本明細書に記載または例示されるもの以外の順序で機能し得ることを理解されたい。
【００９９】
「含む」という用語は、特許請求の範囲において使用される場合、その後に列挙される手段に制限されるものとして解釈されるべきではなく、他の要素または工程を除外しないことに留意されたい。したがってこれは、参照されるような述べられた特徴、整数、工程または構成要素の存在を指定するものであるが、１つまたは複数の他の特徴、整数、工程もしくは構成要素、またはそれらの群の存在または追加を除外しないものとして解釈されるべきである。したがって、「手段ＡおよびＢを含むデバイス」という表現の範囲は、構成要素ＡおよびＢのみからなるデバイスに限定されるべきではない。これは、本発明に関して、デバイスの唯一の関連する構成要素がＡおよびＢであることを意味する。
【０１００】
本明細書全体にわたる「一実施形態」または「実施形態」という言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所での「一実施形態において」または「実施形態において」という語句の出現は、必ずしも常に同じ実施形態を指すわけではない。さらに、本開示から当業者に明らかであるように、特定の特徴、構造または特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わされてもよい。
【０１０１】
同様に、本発明の代表的な実施形態の説明において、本発明の様々な特徴が、単一の実施形態、図、またはその説明において、開示の簡素化、および様々な本発明の態様の１つまたは複数の理解の容易化のために、一緒にまとめられる場合があることを理解されたい。この開示の方法は、請求される発明が各請求項において明示的に列挙されるものより多くの特徴を必要とすることの意図を反映するものとして解釈されるべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映するように、本発明の態様は、任意の上記の開示された実施形態の全ての特徴より少ない特徴を必要とし得る。したがって、詳細な説明に続く特許請求の範囲はこの詳細な説明に明示的に組み込まれ、各請求項は、本発明の別個の実施形態として独立している。
【０１０２】
さらに、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴を含み、他の特徴は含まないが、異なる実施形態の特徴の組合せは、本発明の範囲内であることを意図し、当業者に理解されるように、異なる実施形態を形成する。例えば、以下の特許請求の範囲において、請求される実施形態のいずれも、任意の組合せとして使用され得る。
【０１０３】
さらに、実施形態のいくつかは、本明細書において、コンピュータシステムのプロセッサによって、または機能を実行する他の手段によって実装され得る方法または方法の要素の組合せとして説明される。したがって、そのような方法または方法の要素を実行するために必要な命令を有するプロセッサは、方法または方法の要素を実行するための手段を形成する。さらに、装置実施形態の本明細書に記載の要素は、本発明を実行するための要素によって行われる機能を実行するための手段の例である。
【０１０４】
本明細書に記載の説明および図面において、数多くの具体的な詳細が記載される。しかしながら、本発明の実施形態は、これらの具体的な詳細なしで実践されてもよい。他の場合において、周知の方法、構造および技術は、説明および図面の理解を容易にするために詳細には示されていない。
【０１０５】
ここで、本発明のいくつかの実施形態の詳細な説明により本発明を説明する。本発明の精神または技術的利点から逸脱せずに、本発明の他の実施形態が当業者の知識に従って構成され得るが、本発明は添付の特許請求の範囲の用語によってのみ制限されることは明白である。
【実施例】
【０１０６】
実施例１
発酵ブロスからの２’−フコシルラクトースの精製
欧州特許出願第１６１９６４８６．１号に記載のように、遺伝子修飾大腸菌株を使用した発酵による２’−フコシルラクトースの生成を行った。ＷＯ２０１５／１０６９４３Ａ１に記載のように、濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ナノ濾過、透析濾過または電気透析、およびチャコールでの処理によって２’−フコシルラクトースを発酵ブロスから精製した。得られた２’−フコシルラクトース含有溶液を噴霧乾燥に供すると、安定な固体生成物が得られた。
【０１０７】
実施例２
発酵ブロスからの３−フコシルラクトースの精製
欧州特許出願第１６１９６４８６．１号に記載のように、遺伝子修飾大腸菌株を使用した発酵により３−フコシルラクトースを生成した。
【０１０８】
限外濾過（０．０５μｍカットオフ）（ＣＵＴ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、エルクラート、ドイツ）に続いて１５０ｋＤａのＭＷＣＯを有するクロスフローフィルタ（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ、ヴィースバーデン、ドイツ）で濾過することにより、培養培地から細胞を分離した。約３０ｇ／Ｌの３−フコシルラクトースを含有する無細胞発酵培地を、Ｈ＋形態の強カチオン性イオン交換体（Ｌｅｗａｔｉｔ  Ｓ２５６８（Ｌａｎｘｅｓｓ、ケルン、ドイツ））に通過させ、正電荷を有する夾雑物を除去した。その後、水酸化ナトリウムを使用して溶液をｐＨ７．０に設定し、塩化物形態のアニオン性イオン交換体（Ｌｅｗａｔｉｔ  Ｓ６３６８Ａ、Ｌａｎｘｅｓｓ）に適用した。イオン交換体は共に、２００Ｌの体積で使用した。第２の濾過（１５０ｋＤａ；Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ、ヴィースバーデン、ドイツ）の後、粒子を含まない溶液を、Ｆｉｌｍｔｅｃｈ  ＮＦ２７０膜（Ｄｏｗ、ミッドランド、ＵＳＡ）を使用したナノ濾過により５倍、および真空蒸発により２．５倍濃縮した。約１５ｍＳｃｍ−１の導電率を有する濃縮溶液を濾過し（１０ｋＤａ；Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ、ヴィースバーデン、ドイツ）、活性炭チャコール（ＣＡＳ：７４４０−４４−０、Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、カールスルーエ、ドイツ）で浄化し、電気透析により脱イオン化した。そのために、以下の膜を含むＰＣ−Ｃｅｌｌ  Ｅ２００膜積層体を有するＰＣ−Ｃｅｌｌ  ＢＥＤ  １−３電気透析装置（ＰＣ−Ｃｅｌｌ、ホイスヴァイラー、ドイツ）を使用した：カチオン交換膜ＣＥＭ：ＰＣ  ＳＫおよびアニオン膜ＡＥＭ：ＰＣＡｃｉｄ６０。０．２５Ｍのスルファミン酸をプロセスの電解質として使用した。メイラード反応により生じた褐色変色、および発酵プロセス由来のアルドール生成物を低減するために、Ｎａ＋およびＣｌ−形態の上述と同じイオン交換材料を使用して、ただし５０Ｌの体積で２回目のイオン交換クロマトグラフィーを行った。蒸発により糖溶液を濃縮した後、前述のＰＣ−Ｃｅｌｌ  ＢＥＤ  １−３を使用した電気透析により導電率は再び４ｍＳｃｍ−１から０．４ｍＳｃｍ−１以下に低減した。さらなる脱色のために、溶液を活性チャコール（ＣＡＳ：７４４０−４４−０、Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、カールスルーエ、ドイツ）と混合し、濾過によりほぼ無色の溶液を得た。
【０１０９】
実施例３
発酵ブロスからのラクト−Ｎ−テトラオースの精製
ラクト−Ｎ−テトラオースのｉｎ  ｖｉｖｏ合成に必須であるゲノムに組み込まれた遺伝子、すなわちＮ−アセチルグルコサミングリコシルトランスフェラーゼ（髄膜炎菌ＭＣ５８からのｌｇｔＡ）、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（サルモネラ菌Salmonella enterica亜種サラメ血清型ＧｒｅｅｎｓｉｄｅからのｗｂｄＯ）、大腸菌Ｋ１２からのｌａｃＹ、共に大腸菌Ｋ１２からのＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼｇａｌＥおよびＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼｇａｌＵを有する遺伝子修飾大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｌａｃＺ株を使用して、ラクト−Ｎ−テトラオースの発酵生成を行った。ラクト−Ｎ−テトラオースの発酵生成のために、７ｇｌ−１のＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、７ｇｌ−１のＫ２ＨＰＯ４、２ｇｌ−１のＫＯＨ、０．３ｇｌ−１のクエン酸、５ｇ／ｌ−１のＮＨ４Ｃｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、８ｍＭのＭｇＳＯ４、微量元素（０．１０１ｇｌ−１のニトリロ三酢酸、ｐＨ６．５、０．０５６ｇｌ−１のクエン酸第二鉄アンモニウム、０．０１ｇｌ−１のＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、０．００２ｇｌ−１のＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、０．００１ｇｌ−１のＣｕＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．００２ｇｌ−１のホウ酸、０．００９ｇｌ−１のＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．００１ｇｌ−１のＮａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．００２ｇｌ−１のＮａ２ＳｅＯ３、０．００２ｇｌ−１のＮｉＳＯ４×６Ｈ２Ｏ）および炭素源として２％グルコースを含む規定無機塩培地中で、株を増殖させた。必要に応じて消泡剤（Ｓｔｒｕｋｔｏｌ  Ｊ６７３、Ｓｃｈｉｌｌ＋Ｓｅｉｌａｃｈｅｒ）を添加した。２５％アンモニア溶液を使用してｐＨを制御した。２１６ｇｌ−１のラクトース原液から１５ｍＭの最終濃度までラクトースを段階的に添加し、培養培地中のラクトース濃度を発酵プロセスの間一定に保持した。副生成物としてのプロセス中の残留ラクトースおよびラクト−Ｎ−トリオースＩＩの蓄積は、発酵槽に添加された第２の大腸菌株により加水分解された。この株は、機能性ベータ−ラクタマーゼ、ベータ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４からのｂｂｈＩ）、および単糖の分解のための機能性ｇａｌ−オペロンを発現した（ＥＰ２８４５９０５Ａ）。
【０１１０】
細胞を発酵ブロスから分離し、ラクト−Ｎ−テトラオース含有流体を、実施例２に記載の手順に従って、質量収支により決定される７５〜８０％の純度まで精製した。
非効率的な酵素分解および代謝により生じる汚染炭水化物副生成物を、ＷＯ２０１５／０４９３３１に従い、疑似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーを使用したクロマトグラフィーにより除去した。あるいは、イソプロパノールを用いた結晶化によりラクト−Ｎ−テトラオースを精製した。結晶化のために、ラクト−Ｎ−テトラオース含有溶液を蒸発により２０％の濃度まで濃縮し、噴霧乾燥した。ＮＵＢＩＬＯＳＡ  ＬＴＣ−ＧＭＰ噴霧乾燥機（ＮＵＢＩＬＯＳＡ、コンスタンツ、ドイツ）を使用して、溶液を窒素流下で１３０℃の入口温度の噴霧乾燥機ノズルに通過させながら、生成物流を６７℃〜６８℃の出口温度を維持するように制御した。
【０１１１】
固体材料を、イソプロパノールおよび水の混合物（３：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ））に、１２Ｌのイソプロパノール／水中に１ｋｇの粉末の比率で添加した。懸濁液を激しく撹拌し、次いで不溶性ラクト−Ｎ−テトラオースを濾過し、４０℃で乾燥させた。７３〜８９％の純度の材料で開始して、結晶化ラクト−Ｎ−テトラオースは、約９５％まで、８５％の回収率で精製された。糖を水中に２５％の濃度まで溶解し、６ｋＤａフィルタ（Ｐａｌｌ  Ｍｉｃｒｏｚａ限外濾過モジュールＳＩＰ−２０１３、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ドライアイヒ、ドイツ）および０．２μｍ無菌フィルタに順次通した。上述の条件下で無菌材料を噴霧乾燥することにより、固体材料が得られた。
【０１１２】
実施例４
発酵ブロスからの３’−および６’−シアリルラクトースの精製
３’−および６’−シアリルラクトースの生成のために、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｌａｃＺ株を使用した。株は、共通の遺伝子修飾を有していた：大腸菌からのグルコサミン−６−ホスフェートシンターゼＧｌｍＳ、シネコシスティスｓｐ．からのＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼＳｌｒ１９７５、サッカロミセス・セレビシエからのグルコサミン６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼＧｎａ１、大腸菌からのホスホエノールピルベートシンターゼＰｐｓＡ、共にカンピロバクター・ジェジュニからのＮ−アセチルノイラミネートシンターゼＮｅｕＢおよびＣＭＰ−シアル酸シンテターゼＮｅｕＡの染色体構成的発現。さらに、大腸菌からのラクトースパーミアーゼＬａｃＹ、大腸菌ＷからのｃｓｃＢ（スクロースパーミアーゼ）、ｃｓｃＫ（フルクトキナーゼ）、ｃｓｃＡ（スクロースヒドロラーゼ）、およびｃｓｃＲ（転写制御因子）をコードする遺伝子、ならびに大腸菌Ｋ１２からの遺伝子ｇａｌＥ（ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ）、ｇａｌＴ（ガラクトース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ）、ｇａｌＫ（ガラクトキナーゼ）、およびｇａｌＭ（ガラクトース−１−エピメラーゼ）からなる機能性ｇａｌ−オペロンを、ＢＬ２１株のゲノム内に組み込み、構成的に発現させた。
【０１１３】
３’−シアリルラクトースを合成する株は、ビブリオｓｐ．ＪＴ−ＦＡＪ−１６からの３’−シアリルトランスフェラーゼ遺伝子を保有し、一方６’−シアリルラクトース生成株は、フォトバクテリウム・レイオグナチＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９からのアルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼｐｌｓＴ６を含む。
【０１１４】
７ｇｌ−１のＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、７ｇｌ−１のＫ２ＨＰＯ４、２ｇｌ−１のＫＯＨ、０．３ｇｌ−１のクエン酸、５ｇｌ−１のＮＨ４Ｃｌ、１ｍｌｌ−１の消泡剤（Ｓｔｒｕｋｔｏｌ  Ｊ６７３、Ｓｃｈｉｌｌ＋Ｓｅｉｌａｃｈｅｒ）、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、８ｍＭのＭｇＳＯ４、微量元素および炭素源としての２％スクロースを含む規定無機塩培地中で、シアリルラクトース生成株を増殖させた。供給回分段階で供給されるスクロース供給物（５００ｇｌ−１）に、８ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、微量元素、および５ｇｌ−１のＮＨ４Ｃｌを補足した。
【０１１５】
微量元素は、０．１０１ｇｌ−１のニトリロ三酢酸、ｐＨ６．５、０．０５６ｇｌ−１のクエン酸第二鉄アンモニウム、０．０１ｇｌ−１のＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、０．００２ｇｌ−１のＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、０．００１ｇｌ−１のＣｕＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．００２ｇｌ−１のホウ酸、０．００９ｇｌ−１のＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．００１ｇｌ−１のＮａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．００２ｇｌ−１のＮａ２ＳｅＯ３、０．００２ｇｌ−１のＮｉＳＯ４×６Ｈ２Ｏからなっていた。
【０１１６】
シアリルラクトース形成のために、２１６ｇｌ−１のラクトース供給物を使用した。アンモニア溶液（２５％ｖ／ｖ）を使用することによりｐＨを制御した。供給回分発酵は、一定の通気および撹拌下で３０℃で行った。発酵の最後に残留ラクトースを除去するために、β−ガラクトシダーゼを発酵槽に添加した。得られた単糖を、生成株により代謝させた。
【０１１７】
次いで、細胞を含まない液体をイオン交換クロマトグラフィーにより脱イオン化した。まず、Ｈ＋形態の２００Ｌの体積の強カチオン交換体（Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ２５６８（Ｌａｎｘｅｓｓ、ケルン、ドイツ））でカチオン性夾雑物を除去した。ＮａＯＨを使用して、得られた溶液のｐＨを７．０に設定した。第２の工程において、塩化物形態の強アニオン交換体Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ６３６８Ｓ（Ｌａｎｘｅｓｓ、ケルン、ドイツ）を使用して、アニオン性イオンおよび望ましくない着色剤を溶液から除去した。イオン交換体は、２００Ｌの床容積を有していた。クロスフローフィルタ（１５０ｋＤａカットオフ）（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ、ヴィースバーデン、ドイツ）での第２の濾過工程を使用して、溶液の酸性化に由来する沈殿物を除去した。糖の濃縮のために、Ｄｏｗ  ＦＩＬＭＴＥＣＨ  ＮＦ２７０−４０４０（Ｉｎａｑｕａ、メンヒェングラートバッハ、ドイツ）で、または代替としてＴｒｉｓｅｐ  ４０４０−ＸＮ４５−ＴＳＦ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（０．５ｋＤａカットオフ）（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ、ヴィースバーデン、ドイツ）で溶液をナノ濾過した。後者を使用して、発酵プロセスに由来し、シアリルラクトース溶液を汚染する単糖Ｎ−アセチルグルコサミンを生成物から分離した。次いで、濃縮シアリルラクトース溶液を活性チャコール（ＣＡＳ：７４４０−４４−０、Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、カールスルーエ、ドイツ）で処理して、メイラード反応生成物およびアルドール反応生成物等の着色剤を除去した。シアル酸およびＮ−アセチルグルコサミン等の発酵プロセスに由来する副生成物からシアリルラクトースを分離するために、１ｋＤａカットオフ膜ＧＥ４０４０Ｆ３０（ＧＥ  ｗａｔｅｒ  ＆  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ラーティンゲン、ドイツ）により溶液を濾過し、０．６〜０．８ｍＳｃｍ−１の導電率まで透析濾過した。希釈溶液をロータリーエバポレーターで約３００ｇＬ−１の濃度まで濃縮した。最後のクロマトグラフィー分離において、他の汚染糖、例えばジ−シアリルラクトースを除去した。そのために、濃縮溶液をアセテート形態の弱アニオンイオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＦＰＡ５１、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミシガン、ＵＳＡ）に適用した。シアリルラクトースが樹脂に結合するのは稀であり、ジ−シアリルラクトースが吸着される。したがって、シアリルラクトースは１０ｍＭの酢酸アンモニウムで溶出され、ジ−シアリルラクトースは１Ｍの酢酸アンモニウムで溶出される。酢酸アンモニウムの除去のために、シアリルラクトースを１０倍過剰のエタノールで沈殿させた。固体分画を濾過し、乾燥させた。
【０１１８】
２０％のシアリルラクトース溶液を６ｋＤａフィルタ（Ｐａｌｌ  Ｍｉｃｒｏｚａ限外濾過モジュールＳＩＰ−２０１３、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ドライアイヒ、ドイツ）および０．２μｍ無菌フィルタに順次通すことにより、生成物を最終処理した。
【０１１９】
Ｂｕｃｈｉ噴霧乾燥機（Ｂｕｃｈｉ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｅｒ  Ｂ−２９０）（Ｂｕｃｈｉ、エッセン、ドイツ）を使用し、以下のパラメータを適用して溶液の一部を噴霧乾燥した：入口温度１３０℃、出口温度６７℃〜７１℃、ガス流量６７０Ｌ／時、アスピレータ１００％。
【０１２０】
噴霧乾燥した６’−シアリルラクトースは９１％の純度を有し、一方３’−シアリルラクトース材料は９３％の純度を有していた。
実施例５
ＨＭＯ混合物の調製
異なるＨＭＯの混合物を、固体生成物から調製した。したがって、個々のＨＭＯを噴霧乾燥し、得られた粉末を混合した。ＨＭＯ混合物Ｉは、２’−フコシルラクトースおよびラクト−Ｎ−テトラオースを７０ｗｔ％対３０ｗｔ％の比率で含み、ＨＭＯ混合物ＩＩは、２’−フコシルラクトース（５２ｗｔ％）、３−フコシルラクトース（１３ｗｔ％）、ラクト−Ｎ−テトラオース（２６ｗｔ％）、３’−シアリルラクトース（４ｗｔ％）および６’−シアリルラクトース（５ｗｔ％）を含んでいた。混合粉末を２０ｗｔ％のＨＭＯを含有する溶液まで水に溶解し、再び実施例４に記載のようにＢｕｃｈｉ噴霧乾燥機を使用して噴霧乾燥した。
【０１２１】
得られた噴霧乾燥粉末を分析すると、粉末は、異なるＨＭＯの比率に関して噴霧乾燥に供された溶液と同じ組成を有していることが明らかとなった。
実施例６
糖類混合物の調製
８ｇの２’−ＦＬおよび１ｇのＬ−フコースを、５０ｍｌの蒸留水に溶解した。実施例４に記載のように、得られた溶液をＢｕｃｈｉ噴霧乾燥機を使用して噴霧乾燥した。２’−ＦＬおよびＬ−フコースから本質的になる噴霧乾燥粉末が得られ、噴霧乾燥粉末中の２’−ＦＬおよびＬ−フコースの比率は、噴霧乾燥に供された溶液中の２’−ＦＬおよびＬ−フコースの比率と同一であった。したがって、Ｌ−フコースは、ＨＭＯの存在下で噴霧乾燥され得る。
【０１２２】
実施例７
噴霧乾燥ヒトミルクオリゴ糖の特性決定
１．  示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ８２１ｅ（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ、ギーセン、ドイツ）で示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、噴霧乾燥ヒトミルクオリゴ糖、すなわち３−フコシルラクトース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、およびヒトミルクオリゴ糖の噴霧乾燥混合物、２’−フコシルラクトース／ラクト−Ｎ−テトラオースの混合物（ＨＭＯ混合物Ｉ）、および２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリルラクトースの混合物（ＨＭＯ混合物ＩＩ）のそれぞれの熱イベントを決定した。
【０１２３】
Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ８２１ｅ（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ、ギーセン、ドイツ）を使用して、噴霧乾燥生成物の熱イベント（ガラス転移温度（Ｔｇ）、さらなる発熱および吸熱イベント）を決定した。
【０１２４】
約２５ｍｇの噴霧乾燥ヒトミルクオリゴ糖を、クリンプされたＡｌるつぼ（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ、ギーセン、ドイツ）内で分析した。試料を１０Ｋ／分で０℃に冷却し、１０Ｋ／分の走査速度で１００℃に再加熱した。第２の加熱サイクルで試料を０℃に冷却した後、試料を１５０℃に再加熱した。加熱走査中のベースラインの吸熱シフトの中点が、ガラス転移温度（Ｔｇ）とみなされた。発熱および吸熱ピークは、イベントのピーク温度および正規化エネルギーを用いて報告される。
【０１２５】
全試料の第１の加熱走査では、約４８〜５８℃の範囲内の主な段階的転移により明らかである、全熱流量における主要なガラス転移イベントが示され、試料のほとんどにおいて、第１の加熱走査において観察された主要なガラス転移イベントは、第２の加熱走査で再び発生した。ＤＳＣ分析の結果を表９に要約する。
【０１２６】
【表９】
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【０１２７】
３−フコシルラクトースの場合、第１の加熱走査におけるＴｇ後に吸熱緩和ピークが検出された。ラクト−Ｎ−テトラオースの場合、他の試料と比較して、第２の加熱走査においてはるかに高い約７９℃のＴｇが検出された。これは、約８９℃（−６．０４Ｊ／ｇ）での第１の加熱走査中の吸熱イベントにより引き起こされ得る。３−フコシルラクトースの場合と同様、６’−シアリルラクトースの場合も、Ｔｇの後に吸熱緩和ピークが検出されたが、この試料ではさらに７７℃（−０．２２Ｊ／ｇ）で吸熱イベントが生じた。３’−シアリルラクトースおよびＨＭＯ混合物Ｉでは吸熱イベントは検出されなかったが、ＨＭＯ混合物ＩＩの場合、第１の加熱走査中の吸熱イベントは７９℃（０．３４Ｊ／ｇ）であった。
【０１２８】
２．  粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）
広角粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）を使用して、凍結乾燥生成物の形態を精査した。銅アノード（４５ｋＶ、４０ｍＡ、０．１５４ｎｍの波長でＫα１発光）およびＰＩＸｃｅｌ３Ｄ検出器を備えたＸ線回折計Ｅｍｐｙｒｅａｎ（Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ、アルメロ、オランダ）を使用した。約１００ｍｇの噴霧乾燥試料を、反射モードで、５〜４５°の２θ角範囲内、０．０４°の２θステップサイズ、およびステップ当たり１００秒のカウント時間で分析した。
【０１２９】
全ての単一オリゴ糖ならびにＨＭＯ混合物ＩおよびＩＩは、完全に非晶質の状態を示した（図１〜６）。ラクト−Ｎ−テトラオースの場合、第２の（非晶質）信号が９〜１０°付近に検出された。
【０１３０】
３．  レーザ回折
レーザ回折により粉末粒子サイズを評価した。システムは、同心円状に配置されたセンサ素子のアレイによって散乱光および回折光を検出する。次いで、ソフトウェアアルゴリズムが、異なるセンサ素子に到達する光強度値のｚ値を計算することによって粒子カウントを近似する。分析は、ＳＡＬＤ−７５００  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｓｉｚｅｒ  （株式会社島津製作所、京都、日本）定量レーザ回折システム（ｑＬＤ）を使用して実行された。
【０１３１】
少量（スパチュラ先端）の各試料を２ｍｌのイソオクタンに分散させ、超音波処理により５分間均質化した。分散液をイソオクタンで満たされたバッチセル内に移し、手動モードで分析した。
【０１３２】
データ取得設定は以下の通りであった：測定毎の信号平均化カウント：１２８、信号蓄積カウント：３、および間隔：２秒。
測定前に、システムをイソオクタンでゼロ調整した。各試料分散液を３回測定したが、平均値および標準偏差が報告される。ソフトウェアＷＩＮＧ  ＳＡＬＤ  ＩＩバージョンＶ３．１を使用してデータを評価した。試料の屈折率は未知であったため、糖（二糖）粒子の屈折率（１．５３０）をサイズ分布プロファイルの決定に使用した。平均および中央直径のサイズ値が報告される。
【０１３３】
全ての試料の平均粒子サイズは非常に類似していたが、ＨＭＯ混合物ＩＩについては若干低い値が測定された。粒子サイズ特性を表１０に要約する。さらに、粒子サイズ分布は、試料の全てに対して単一主要サイズの集団の存在を示した。
【０１３４】
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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