(57)【要約】  本発明は、モノテルペノイド化合物を生成するための酵素及び方法に関する。１つの側面によれば、本発明は、（１）モノテルペノイド前駆体を供給し；（２）ＮＥＰＳ酵素を供給し；そして（３）前記モノテルペノイド前駆体と、前記酵素とを、モノテルペノイド化合物を生成するために、触媒条件下で接触させることを含む、モノテルペノイド化合物の製造方法に関する。【選択図】図１−２
2021525098.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノテルペノイド化合物の製造方法であって、
（１）モノテルペノイド前駆体を供給し；
（２）酵素を供給し；そして
（３）前記モノテルペノイド前駆体と、前記酵素とを、モノテルペノイド化合物を生成するために、触媒条件下で接触させることを含み、ここで前記酵素は、配列番号１〔ＮＥＰＳ1〕、及び／又は配列番号２〔ＮＥＰＳ2〕、及び／又は配列番号３〔ＮＥＰＳ3〕を含むアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を含む、方法。
【請求項２】
前記酵素が、配列番号１を含むアミノ酸配列を含み、そして配列番号４を含むヌクレオチド配列によりコードされ、そして／又は前記酵素が、配列番号２を含むアミノ酸配列を含み、そして配列番号５を含むヌクレオチド配列によりコードされ、そして／又は前記酵素が、配列番号３を含むアミノ酸配列を含み、そして配列番号６を含むヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記モノテルペノイド化合物が、モノテルペンインドールアルカロイド（ＭＩＡ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記モノテルペノイド前駆体が、８−オキソシトロネリルエノール及び／又は８−オキソシトロネラール、及び／又はそれらの誘導体を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素はさらに、イリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）、例えば配列番号７ ［ＡｍＩＳＹ］、配列番号８ ［ＮｍＩＳＹ２］又は配列番号９ ［ＣｒＩＳＹ］のアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を含むＩＳＹを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
配列番号７のアミノ酸配列を含む前記ＩＳＹが配列番号１０を含むヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号８のアミノ酸配列を含む前記ＩＳＹが配列番号１１を含むヌクレオチド配列によりコードされ、又は配列番号９のアミノ酸配列を含む前記ＩＳＹが配列番号１２を含むヌクレオチド配列によりコードされる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記モノテルペノイド前駆体が、８−オキソゲラニアルを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記モノテルペノイド前駆体又は化合物が、ネペタラクトールを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ネペタラクトールがシス−トランスネペタラクトールを含み、そして前記酵素が配列番号１及び／又は配列番号２を含むアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ネペタラクトールがシス−シスネペタラクトールを含み、そして前記酵素が配列番号１及び／又は配列番号３を含むアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記モノテルペノイド化合物が、ネペタラクトンを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ネペタラクトンがシス−トランスネペタラクトンを含み、そして前記酵素が配列番号１及び／又は配列番号２を含むアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ネペタラクトンがシス−シスネペタラクトンを含み、そして前記酵素が配列番号１及び／又は配列番号３を含むアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ネペタラクトンが、シス−トランスネペタラクトン及びシス−シスネペタラクトンの両方を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記モノテルペノイド化合物が、シクロペンタピランを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記モノテルペノイド化合物が、オキサデカリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
インビボで、例えば植物において実施される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
１つ又は複数の前記酵素が、インビボでの発現、例えば異種発現により提供される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
インビトロで、例えば単離された植物細胞、例えばNicotiana benthalmiana、Catharanthus roseus又はNepeta ssp．、例えばNepeta cataria、Nepeta racemosa、 Nepeta faassenii 又は Nepeta mussiniiからの植物細胞において、又は酵母、例えばPichia pastoris 又は Saccharomyces cerevisiaeにおいて、又は細菌、例えばＥ．コリ（E. coli）において実施される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
生物学的活性化合物の製造方法であって、下記工程：
（１）請求項１〜１９のいずれか１項に定義される工程を実施する工程；及び
（２）前記モノテルペノイド化合物を、生物学的活性化合物に変換する工程、
を含む方法。
【請求項２１】
前記生物学的化合物が、防虫剤; 昆虫誘引剤; 猫の誘引剤; 及びモノテルペンインドールアルカロイド、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、カンプトテシン、キニーネ及び／又はヨヒンビンから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号１を含むアミノ酸配列又はその機能的変異体又は相同体を有する酵素；配列番号２を含むアミノ酸配列又はその機能的変異体又は相同体を有する酵素；及び配列番号３を含むアミノ酸配列又はその機能的変異体又は相同体を有する酵素から選択される単離された酵素。
【請求項２３】
配列番号４を含むヌクレオチド配列又はその機能的変異体又は相同体を有する核酸；配列番号５を含むヌクレオチド配列又はその機能的変異体又は相同体を有する核酸；及び配列番号６を含むヌクレオチド配列又はその機能的変異体又は相同体を有する核酸から選択される単離された核酸。
【請求項２４】
キットであって、
配列番号１、配列番号２及び／又は配列番号３を含む群から選択された第１アミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を有する第１酵素を含み；そして任意にはまた、
配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９を含む群から選択されたアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を有する第２酵素を含む、キット。
【請求項２５】
請求項２２に記載の酵素を発現するように遺伝子編集された、及び任意にはまた、配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９を含む群から選択されたアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を有する第２酵素を発現するように遺伝子編集された植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノテルペノイド化合物の製造のための酵素、及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ネペタラクトン１は、ネペタ属の植物、特にキャットミント（Nepeta mussinii syn racemosa）及びキャットニップ（N. cataria）により生成される揮発性の天然物である（図１Ａ）。それらの化合物は、それらの植物がネコに与える刺激効果の原因である。さらに、特定の昆虫は、ネペタラクトンを性フェロモンとして使用するので、植物によるそれらの化合物の生成もまた、昆虫との相互作用に影響を与える。特に、ブリッジヘッド立体中心（炭素４ａ及び７ａ）は、ネペタ種間及び種内で異なる。例えば、N. mussinii個体は、異なる比率でシス−トランス１ａ、シス−シス１ｂ及びトランス−シス−ネペタラクトン１ｃを生成する。立体異性体比の変動は、昆虫の草食動物の忌避に影響を与える可能性がある。立体異性体の比率は重要な生物学的効果の原因である可能性があるが、ネペタラクトン生合成における立体制御のメカニズムは不明である。
【０００３】
ネペタラクトンは、イリドイドであり、シクロペンタノピラン環を含む非標準的なモノテルペノイドである。標準的な環状テルペノイド（例えば、（−）−リモネン）は、テルペンシンターゼにより線状前駆体から生合成される（図１Ｂ）。それらの酵素は、ピロリン酸の損失又はプロトン化のいずれかにより線状前駆体を活性化する。得られるカルボカチオンは急速に環化を生成し、一連の環状生成物を形成する。従って、標準的なテルペノイド生合成においては、前駆体の活性化及び環化がカップリングされ、そして同じ酵素活性部位で発生する。
【０００４】
植物のインドイド生合成においては、ゲラニルピロリン酸が加水分解され、そして８−オキソゲラニアル２に酸化される。次に、この前駆体は、標準的なテルペン合成に類似する２段階活性化−環化工程を受ける（図１Ｃ）。しかしながら、標準的なテルペン合成とは異なって、活性化は還元により達成され、そして中間体はカルボカチオンではなく、エノール又はエノラート種３である。この中間体の環化は、イリドジアール副産物と共にシス−トランス−ネペタラクトール４ａを生成する（図１Ｃ）。
【０００５】
２から４ａ及び５への変換は、イリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）により触媒される。ＩＳＹは、Catharanthus roseus (ＣｒＩＳＹ)で最初発見され、それは抗癌性モノテルペンインドールアルカロイドのビンクリスチン及びビンブラスチンへの生合成経路の一部を形成する。その後の研究は、オリーブ（Olea europaea, ＯｅＩＳＹ）及びキンギョソウ（Antirrhinum majus, ＡｍＩＳＹ）からのＩＳＹ、及び無差別的なＩＳＹ活性を有するC. roseusにおけるパラロガスタンパク質を明らかにした。
【０００６】
最初の還元的活性化工程の酵素的制御は、ＣｒＩＳＹにおいて構造的に特徴付けられており：補因子及び阻害剤又は基質を有する結晶構造は、エノール酸中間体の還元及び形成を促進する結合モードを示す。さらに、この還元は、７Ｓ−４ａを生成するＣｒＩＳＹと、その光学異性体を生成するＡｍＩＳＹとの比較により例示されるように、立体選択的である。
【０００７】
対照的に、イリドイド足場のブリッジヘッド４ａ−７ａ−炭素の立体化学を決定する環化が、ネペタにおいて観察される立体化学的変化をどのように生成するかは不明である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
第１の側面によれば、本発明は、
（１）モノテルペノイド前駆体を供給し；
（２）酵素を供給し；そして
（３）前記モノテルペノイド前駆体と、前記酵素とを、モノテルペノイド化合物を生成するために、触媒条件下で接触させることを含み、ここで前記酵素は、配列番号１〔ＮＥＰＳ1〕、及び／又は配列番号２〔ＮＥＰＳ2〕、及び／又は配列番号３〔ＮＥＰＳ3〕を含むアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を含む、モノテルペノイド化合物の製造方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のさらなる側面及び特徴は、添付の特許請求の範囲に記載され、そして以下でさらに説明されている。
【００１０】
本発明は、N. mussiniiにおける２つのネペタラクトン立体異性体であるシス−トランス１ａ及びシス−シス１ｂへの生合成経路の発見に基かれている。それらの遺伝子の発見は、ネペタにおけるイリドイド生合成の還元及び環化工程が、カップリングされておらず、そして別個の酵素により触媒されていることを明らかにしている（図１Ｄ）。この工程は、活性化中間体の生成及び環化が同じ酵素部位で起こる標準的なテルペン生合成とは対照的に、酵素活性部位間の活性化中間体８−オキソシトロネリルエノール３の拡散を含む。本発明者は、活性化中間体３の立体選択的環化及び別個のネペタラクトンジアステレオマーへの続く酸化を担当する、N. mussiniiからの３つのシクラーゼ（本明細書においては、ＮＥＰＳ１−３とも呼ばれる）を発見し、そして特徴づけた。本発明者はまた、結晶構造ＮＥＰＳ３を決定し、そのメカニズム及びレダクターゼからレドックス中性シクラーゼへの進化についての洞察を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−１】図１は、ネペタラクトン及びテルペノイド生合成を示す。Ａ、ネペタ種で観察されたネペタラクトン１立体異性体（１ａ＝シス−トランス−ネペタラクトン、１ｂ＝シス−シス−ネペタラクトン、１ｃ＝トランス−シス−ネペタラクトン）、１ｄ＝トランス−トランス−ネペタラクトン。Ｂ、代表的な標準的（モノ）テルペン生合成メカニズム。典型的なテルペンシンターゼ（ＴＳ）は、ニリン酸の除去又はプロトン化により線状前駆体を活性化する（Ａ＝活性化）。活性化されたカルボカチオン中間体は、同じテルペン（Ｃ＝環化）シンターゼ活性部位内で選択的環化を受ける。リモネンシンターゼが例として示される。Ｃ、イリドイド生合成メカニズム。イリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）は、（Ａ）その線状前駆体（８−オキソゲラニアル２）を、還元により活性化し、８−オキソシトロネリルエノール／エノラート中間体３を形成する。次に、これは、環化（Ｃ）を受け、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ及びイリドジアール５の混合物を形成する。Ｄ、この作業：ネペタにおけるネペタラクトン生合成。この論文で報告されているネペタにおけるシス−トランス及びシス−シス−ネペタラクトン、立体異性体の生合成起源（Ｒ＝還元、Ｔ＝互変異性化、Ｃ＝環化、Ｏ＝酸化、ＧＡ＝一般酸、４ｂ＝シス−シス−ネペタラクトン、６＝８−オキソシトロネラール）。
【００１２】
【図１−２】図１は、ネペタラクトン及びテルペノイド生合成を示す。Ａ、ネペタ種で観察されたネペタラクトン１立体異性体（１ａ＝シス−トランス−ネペタラクトン、１ｂ＝シス−シス−ネペタラクトン、１ｃ＝トランス−シス−ネペタラクトン）、１ｄ＝トランス−トランス−ネペタラクトン。Ｂ、代表的な標準的（モノ）テルペン生合成メカニズム。典型的なテルペンシンターゼ（ＴＳ）は、ニリン酸の除去又はプロトン化により線状前駆体を活性化する（Ａ＝活性化）。活性化されたカルボカチオン中間体は、同じテルペン（Ｃ＝環化）シンターゼ活性部位内で選択的環化を受ける。リモネンシンターゼが例として示される。Ｃ、イリドイド生合成メカニズム。イリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）は、（Ａ）その線状前駆体（８−オキソゲラニアル２）を、還元により活性化し、８−オキソシトロネリルエノール／エノラート中間体３を形成する。次に、これは、環化（Ｃ）を受け、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ及びイリドジアール５の混合物を形成する。Ｄ、この作業：ネペタにおけるネペタラクトン生合成。この論文で報告されているネペタにおけるシス−トランス及びシス−シス−ネペタラクトン、立体異性体の生合成起源（Ｒ＝還元、Ｔ＝互変異性化、Ｃ＝環化、Ｏ＝酸化、ＧＡ＝一般酸、４ｂ＝シス−シス−ネペタラクトン、６＝８−オキソシトロネラール）。
【００１３】
【図２−１】図２は、イリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）反応メカニズムを示す。Ａ、８−オキソゲラニアル２のＩＳＹ触媒による還元的環化において観察される生成物混合物。生成物：シス−シス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトールに４ｂ、シス−トランス−イリドジアール５ａ、トランス−シス−イリドジアール５ｃ、トランス−トランス−イリドジアール５ｄ、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７及びＳ−８−オキソシトロネラール６。Ｂ、Antirrhinum majus (ＡｍＩＳＹ)、 Catharanthus roseus (ＣｒＩＳＹ) 及び N. mussinii (ＮｍＩＳＹ２)からのＩＳＹにより触媒される８−オキソゲラニアル２還元。酵素は、それらの進化の距離及び配列の同一性にもかかわらず、ほぼ同一の生成物混合物を形成する。★ＡｍＩＳＹは、パネルａに示されるものとは反対の鏡像異性体系列を生成する。反応物は３時間インキュベートされた。条件：０．５ μＭ のＩＳＹ、０．５ ｍＭの ２、１ ｍＭの ＮＡＤＰＨ、０．１ Ｍの ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。化合物同定のための電子イオン化（ＥＩ）スペクトルについては、図７を参照のこと。ＳＴＤＳ ＝標準、ＲＴ ＝保持時間。Ｃ、異なる緩衝液濃度での２のＩＳＹ触媒された還元。低い緩衝液濃度で、主要生成物は、シス−トランス−ネペタラクトール４ａである。緩衝液濃度が上昇するにつれて、より大量のシス−トランス−イリドジアール５ａが観察される。高いＭＯＰＳ（緩衝液）濃度（＞１００ｍＭ）で、８−オキソシトロネラール（６）が主要生成物になる。ＩＳＹが２を還元し、そして次に、溶媒中に活性化された３を放出し、そこで環化が起こることを、本発明者は提案している。緩衝液は一般的酸触媒（ＧＡ）として機能し、環化の代わりに互変異性化を促進するように見える。低い一般的酸濃度で、環化は促進されるが、しかし高い一般的酸濃度では、互変異性化が促進される。条件：０．５ ｍＭの ２、０．５ μＭ のＮｍＩＳＹ２、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５（さまざまな濃度）。反応物は、３時間インキュベートされた。ＲＴ＝保持時間。溶媒条件のさらなる説明については、図８，９及び１０を参照のこと。Ｄ、Ｓ−８−オキソシトロネラール６の一般的な酸触媒された環化。４ａ及び５の非酵素（ＮＥ）形成は、３への互変異性化及び一般的酸（緩衝液、ＧＡ）により触媒された自発的環化により達成した。０．５Ｍ緩衝液での生成物プロファイルは、同等のＩＳＹ触媒された還元を模倣し、非酵素触媒された環化を支持する。非酵素（ＮＥ）条件：ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５（さまざまな濃度）、０．５ ｍＭの ６、１６時間のインキュベーション。ＮｍＩＳＹ２条件：０．５ μＭ のＮｍＩＳＹ２、０．５ ｍＭ の２、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、０．１ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。酸性／アルカリ性の非緩衝水中での６との反応については図１１、及びＥＩスペクトルについては図１２を参照のこと。全ての反応は、ＧＣ−ＭＳトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）として表される。ＲＴ：保持時間。
【００１４】
【図２−２】図２は、イリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）反応メカニズムを示す。Ａ、８−オキソゲラニアル２のＩＳＹ触媒による還元的環化において観察される生成物混合物。生成物：シス−シス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトールに４ｂ、シス−トランス−イリドジアール５ａ、トランス−シス−イリドジアール５ｃ、トランス−トランス−イリドジアール５ｄ、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７及びＳ−８−オキソシトロネラール６。Ｂ、Antirrhinum majus (ＡｍＩＳＹ)、 Catharanthus roseus (ＣｒＩＳＹ) 及び N. mussinii (ＮｍＩＳＹ２)からのＩＳＹにより触媒される８−オキソゲラニアル２還元。酵素は、それらの進化の距離及び配列の同一性にもかかわらず、ほぼ同一の生成物混合物を形成する。★ＡｍＩＳＹは、パネルａに示されるものとは反対の鏡像異性体系列を生成する。反応物は３時間インキュベートされた。条件：０．５ μＭ のＩＳＹ、０．５ ｍＭの ２、１ ｍＭの ＮＡＤＰＨ、０．１ Ｍの ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。化合物同定のための電子イオン化（ＥＩ）スペクトルについては、図７を参照のこと。ＳＴＤＳ ＝標準、ＲＴ ＝保持時間。Ｃ、異なる緩衝液濃度での２のＩＳＹ触媒された還元。低い緩衝液濃度で、主要生成物は、シス−トランス−ネペタラクトール４ａである。緩衝液濃度が上昇するにつれて、より大量のシス−トランス−イリドジアール５ａが観察される。高いＭＯＰＳ（緩衝液）濃度（＞１００ｍＭ）で、８−オキソシトロネラール（６）が主要生成物になる。ＩＳＹが２を還元し、そして次に、溶媒中に活性化された３を放出し、そこで環化が起こることを、本発明者は提案している。緩衝液は一般的酸触媒（ＧＡ）として機能し、環化の代わりに互変異性化を促進するように見える。低い一般的酸濃度で、環化は促進されるが、しかし高い一般的酸濃度では、互変異性化が促進される。条件：０．５ ｍＭの ２、０．５ μＭ のＮｍＩＳＹ２、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５（さまざまな濃度）。反応物は、３時間インキュベートされた。ＲＴ＝保持時間。溶媒条件のさらなる説明については、図８，９及び１０を参照のこと。Ｄ、Ｓ−８−オキソシトロネラール６の一般的な酸触媒された環化。４ａ及び５の非酵素（ＮＥ）形成は、３への互変異性化及び一般的酸（緩衝液、ＧＡ）により触媒された自発的環化により達成した。０．５Ｍ緩衝液での生成物プロファイルは、同等のＩＳＹ触媒された還元を模倣し、非酵素触媒された環化を支持する。非酵素（ＮＥ）条件：ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５（さまざまな濃度）、０．５ ｍＭの ６、１６時間のインキュベーション。ＮｍＩＳＹ２条件：０．５ μＭ のＮｍＩＳＹ２、０．５ ｍＭ の２、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、０．１ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。酸性／アルカリ性の非緩衝水中での６との反応については図１１、及びＥＩスペクトルについては図１２を参照のこと。全ての反応は、ＧＣ−ＭＳトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）として表される。ＲＴ：保持時間。
【００１５】
【図２−３】図２は、イリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）反応メカニズムを示す。Ａ、８−オキソゲラニアル２のＩＳＹ触媒による還元的環化において観察される生成物混合物。生成物：シス−シス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトールに４ｂ、シス−トランス−イリドジアール５ａ、トランス−シス−イリドジアール５ｃ、トランス−トランス−イリドジアール５ｄ、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７及びＳ−８−オキソシトロネラール６。Ｂ、Antirrhinum majus (ＡｍＩＳＹ)、 Catharanthus roseus (ＣｒＩＳＹ) 及び N. mussinii (ＮｍＩＳＹ２)からのＩＳＹにより触媒される８−オキソゲラニアル２還元。酵素は、それらの進化の距離及び配列の同一性にもかかわらず、ほぼ同一の生成物混合物を形成する。★ＡｍＩＳＹは、パネルａに示されるものとは反対の鏡像異性体系列を生成する。反応物は３時間インキュベートされた。条件：０．５ μＭ のＩＳＹ、０．５ ｍＭの ２、１ ｍＭの ＮＡＤＰＨ、０．１ Ｍの ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。化合物同定のための電子イオン化（ＥＩ）スペクトルについては、図７を参照のこと。ＳＴＤＳ ＝標準、ＲＴ ＝保持時間。Ｃ、異なる緩衝液濃度での２のＩＳＹ触媒された還元。低い緩衝液濃度で、主要生成物は、シス−トランス−ネペタラクトール４ａである。緩衝液濃度が上昇するにつれて、より大量のシス−トランス−イリドジアール５ａが観察される。高いＭＯＰＳ（緩衝液）濃度（＞１００ｍＭ）で、８−オキソシトロネラール（６）が主要生成物になる。ＩＳＹが２を還元し、そして次に、溶媒中に活性化された３を放出し、そこで環化が起こることを、本発明者は提案している。緩衝液は一般的酸触媒（ＧＡ）として機能し、環化の代わりに互変異性化を促進するように見える。低い一般的酸濃度で、環化は促進されるが、しかし高い一般的酸濃度では、互変異性化が促進される。条件：０．５ ｍＭの ２、０．５ μＭ のＮｍＩＳＹ２、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５（さまざまな濃度）。反応物は、３時間インキュベートされた。ＲＴ＝保持時間。溶媒条件のさらなる説明については、図８，９及び１０を参照のこと。Ｄ、Ｓ−８−オキソシトロネラール６の一般的な酸触媒された環化。４ａ及び５の非酵素（ＮＥ）形成は、３への互変異性化及び一般的酸（緩衝液、ＧＡ）により触媒された自発的環化により達成した。０．５Ｍ緩衝液での生成物プロファイルは、同等のＩＳＹ触媒された還元を模倣し、非酵素触媒された環化を支持する。非酵素（ＮＥ）条件：ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５（さまざまな濃度）、０．５ ｍＭの ６、１６時間のインキュベーション。ＮｍＩＳＹ２条件：０．５ μＭ のＮｍＩＳＹ２、０．５ ｍＭ の２、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、０．１ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。酸性／アルカリ性の非緩衝水中での６との反応については図１１、及びＥＩスペクトルについては図１２を参照のこと。全ての反応は、ＧＣ−ＭＳトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）として表される。ＲＴ：保持時間。
【００１６】
【図３−１】図３は、ＮＥＰＳ酵素によるネペタラクトンの形成を示す。Ａ、この図に記載されるＮＥＰＳ酵素活性の要約。Ｒ＝還元、Ｃ＝環化、Ｏ＝酸化。Ｂ、ＮＥＰＳ１のシス−トランス−ネペタラクトールデビドロゲナーゼ活性。ＮＥＰＳ１は、シス−トランス−ネペタラクトール４ａからシス−トランス−ネペタラクトン１ａへのＮＡＤ＋依存性脱水素化を触媒する。条件：０．５ ｍＭ の４ａ 、０．５ μＭのＮＥＰＳ１、 １ ｍＭ のＮＡＤ ＋、５０ ｍＭ のＨＥＰＥＳ ｐＨ ８、０．１ＭのＮａＣｌ。 ＲＴ ＝保持時間、ＳＴＤＳ ＝標準、Ｂ ＝煮沸。Ｃ、ＮＥＰＳ１のシス−シス−ネペタラクトールデヒドロゲナーゼ活性。ＮＥＰＳ１は、シス−シス−ネペタラクトール４ｂからシス−トランス−ネペタラクトン１ｂへのＮＡＤ＋依存性脱水素化を触媒する。条件：０．５ ｍＭ の４ｂ 、０．５ μＭのＮＥＰＳ１、１ ｍＭの ＮＡＤ ＋、５０ ｍＭ のＨＥＰＥＳ ｐＨ ８、０．１ Ｍの ＮａＣｌ。Ｄ、ＩＳＹ及びＮＥＰＳ酵素の複合活性。８−オキソゲラニアル２、ＣｒＩＳＹ、ＮＥＰＳ及び補因子のインキュベーションは、以下の主要なニ環式生成物（ＭＢＰ）を含む生成物（Ｐ）の生成を可能にする：シス−トランス−ネペタラクトール４ａ（ＮＥＰＳ又はＮＥＰＳ２なし）、シス−トランス−ネペタラクトン１ａ（ＮＥＰＳ１）、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ（ＮＥＰＳ３）又はシス−シス−ネペタラクトン１ｂ（ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ３）。条件：０．５ ｍＭの ２、０．５ μＭ のＣｒＩＳＹ、２ μＭ のＮＥＰＳ、１ ｍＭの ＮＡＤＰＨ、５ ｍＭの ＮＡＤ ＋、０．１ Ｍの ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。ＮＥＰＳカスケードと、ＮｍＩＳＹ２及びＣｒＩＳＹとの比較については、図１７を参照のこと。ＮＥＰＳ３環化反応のさらなる分析については、図１８を参照のこと。ＲＴ＝保持時間。Ｅ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａのＮＥＰＳ触媒された形成。ＮＡＤ＋及び／又はＮＥＰＳ濃度の調整は、ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ２シス−トランス−ネペタラクトール４ａの形成を促進できたことを明らかにする。条件：０．５ ｍＭ の２、０．５ μＭ のＣｒＩＳＹ、ＮＥＰＳ１又は２（さまざまな濃度）、１ ｍＭの ＮＡＤＰＨ、０又は５ ｍＭ のＮＡＤ ＋、０．１ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。全ての反応物は、３時間インキュベートされ、そしてＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして表される。ＥＩスペクトルについては、図１４を参照のこと。
【００１７】
【図３−２】図３は、ＮＥＰＳ酵素によるネペタラクトンの形成を示す。Ａ、この図に記載されるＮＥＰＳ酵素活性の要約。Ｒ＝還元、Ｃ＝環化、Ｏ＝酸化。Ｂ、ＮＥＰＳ１のシス−トランス−ネペタラクトールデビドロゲナーゼ活性。ＮＥＰＳ１は、シス−トランス−ネペタラクトール４ａからシス−トランス−ネペタラクトン１ａへのＮＡＤ＋依存性脱水素化を触媒する。条件：０．５ ｍＭ の４ａ 、０．５ μＭのＮＥＰＳ１、 １ ｍＭ のＮＡＤ ＋、５０ ｍＭ のＨＥＰＥＳ ｐＨ ８、０．１ＭのＮａＣｌ。 ＲＴ ＝保持時間、ＳＴＤＳ ＝標準、Ｂ ＝煮沸。Ｃ、ＮＥＰＳ１のシス−シス−ネペタラクトールデヒドロゲナーゼ活性。ＮＥＰＳ１は、シス−シス−ネペタラクトール４ｂからシス−トランス−ネペタラクトン１ｂへのＮＡＤ＋依存性脱水素化を触媒する。条件：０．５ ｍＭ の４ｂ 、０．５ μＭのＮＥＰＳ１、１ ｍＭの ＮＡＤ ＋、５０ ｍＭ のＨＥＰＥＳ ｐＨ ８、０．１ Ｍの ＮａＣｌ。Ｄ、ＩＳＹ及びＮＥＰＳ酵素の複合活性。８−オキソゲラニアル２、ＣｒＩＳＹ、ＮＥＰＳ及び補因子のインキュベーションは、以下の主要なニ環式生成物（ＭＢＰ）を含む生成物（Ｐ）の生成を可能にする：シス−トランス−ネペタラクトール４ａ（ＮＥＰＳ又はＮＥＰＳ２なし）、シス−トランス−ネペタラクトン１ａ（ＮＥＰＳ１）、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ（ＮＥＰＳ３）又はシス−シス−ネペタラクトン１ｂ（ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ３）。条件：０．５ ｍＭの ２、０．５ μＭ のＣｒＩＳＹ、２ μＭ のＮＥＰＳ、１ ｍＭの ＮＡＤＰＨ、５ ｍＭの ＮＡＤ ＋、０．１ Ｍの ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。ＮＥＰＳカスケードと、ＮｍＩＳＹ２及びＣｒＩＳＹとの比較については、図１７を参照のこと。ＮＥＰＳ３環化反応のさらなる分析については、図１８を参照のこと。ＲＴ＝保持時間。Ｅ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａのＮＥＰＳ触媒された形成。ＮＡＤ＋及び／又はＮＥＰＳ濃度の調整は、ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ２シス−トランス−ネペタラクトール４ａの形成を促進できたことを明らかにする。条件：０．５ ｍＭ の２、０．５ μＭ のＣｒＩＳＹ、ＮＥＰＳ１又は２（さまざまな濃度）、１ ｍＭの ＮＡＤＰＨ、０又は５ ｍＭ のＮＡＤ ＋、０．１ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。全ての反応物は、３時間インキュベートされ、そしてＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして表される。ＥＩスペクトルについては、図１４を参照のこと。
【００１８】
【図３−３】図３は、ＮＥＰＳ酵素によるネペタラクトンの形成を示す。Ａ、この図に記載されるＮＥＰＳ酵素活性の要約。Ｒ＝還元、Ｃ＝環化、Ｏ＝酸化。Ｂ、ＮＥＰＳ１のシス−トランス−ネペタラクトールデビドロゲナーゼ活性。ＮＥＰＳ１は、シス−トランス−ネペタラクトール４ａからシス−トランス−ネペタラクトン１ａへのＮＡＤ＋依存性脱水素化を触媒する。条件：０．５ ｍＭ の４ａ 、０．５ μＭのＮＥＰＳ１、 １ ｍＭ のＮＡＤ ＋、５０ ｍＭ のＨＥＰＥＳ ｐＨ ８、０．１ＭのＮａＣｌ。 ＲＴ ＝保持時間、ＳＴＤＳ ＝標準、Ｂ ＝煮沸。Ｃ、ＮＥＰＳ１のシス−シス−ネペタラクトールデヒドロゲナーゼ活性。ＮＥＰＳ１は、シス−シス−ネペタラクトール４ｂからシス−トランス−ネペタラクトン１ｂへのＮＡＤ＋依存性脱水素化を触媒する。条件：０．５ ｍＭ の４ｂ 、０．５ μＭのＮＥＰＳ１、１ ｍＭの ＮＡＤ ＋、５０ ｍＭ のＨＥＰＥＳ ｐＨ ８、０．１ Ｍの ＮａＣｌ。Ｄ、ＩＳＹ及びＮＥＰＳ酵素の複合活性。８−オキソゲラニアル２、ＣｒＩＳＹ、ＮＥＰＳ及び補因子のインキュベーションは、以下の主要なニ環式生成物（ＭＢＰ）を含む生成物（Ｐ）の生成を可能にする：シス−トランス−ネペタラクトール４ａ（ＮＥＰＳ又はＮＥＰＳ２なし）、シス−トランス−ネペタラクトン１ａ（ＮＥＰＳ１）、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ（ＮＥＰＳ３）又はシス−シス−ネペタラクトン１ｂ（ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ３）。条件：０．５ ｍＭの ２、０．５ μＭ のＣｒＩＳＹ、２ μＭ のＮＥＰＳ、１ ｍＭの ＮＡＤＰＨ、５ ｍＭの ＮＡＤ ＋、０．１ Ｍの ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。ＮＥＰＳカスケードと、ＮｍＩＳＹ２及びＣｒＩＳＹとの比較については、図１７を参照のこと。ＮＥＰＳ３環化反応のさらなる分析については、図１８を参照のこと。ＲＴ＝保持時間。Ｅ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａのＮＥＰＳ触媒された形成。ＮＡＤ＋及び／又はＮＥＰＳ濃度の調整は、ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ２シス−トランス−ネペタラクトール４ａの形成を促進できたことを明らかにする。条件：０．５ ｍＭ の２、０．５ μＭ のＣｒＩＳＹ、ＮＥＰＳ１又は２（さまざまな濃度）、１ ｍＭの ＮＡＤＰＨ、０又は５ ｍＭ のＮＡＤ ＋、０．１ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。全ての反応物は、３時間インキュベートされ、そしてＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして表される。ＥＩスペクトルについては、図１４を参照のこと。
【００１９】
【図３−４】図３は、ＮＥＰＳ酵素によるネペタラクトンの形成を示す。Ａ、この図に記載されるＮＥＰＳ酵素活性の要約。Ｒ＝還元、Ｃ＝環化、Ｏ＝酸化。Ｂ、ＮＥＰＳ１のシス−トランス−ネペタラクトールデビドロゲナーゼ活性。ＮＥＰＳ１は、シス−トランス−ネペタラクトール４ａからシス−トランス−ネペタラクトン１ａへのＮＡＤ＋依存性脱水素化を触媒する。条件：０．５ ｍＭ の４ａ 、０．５ μＭのＮＥＰＳ１、 １ ｍＭ のＮＡＤ ＋、５０ ｍＭ のＨＥＰＥＳ ｐＨ ８、０．１ＭのＮａＣｌ。 ＲＴ ＝保持時間、ＳＴＤＳ ＝標準、Ｂ ＝煮沸。Ｃ、ＮＥＰＳ１のシス−シス−ネペタラクトールデヒドロゲナーゼ活性。ＮＥＰＳ１は、シス−シス−ネペタラクトール４ｂからシス−トランス−ネペタラクトン１ｂへのＮＡＤ＋依存性脱水素化を触媒する。条件：０．５ ｍＭ の４ｂ 、０．５ μＭのＮＥＰＳ１、１ ｍＭの ＮＡＤ ＋、５０ ｍＭ のＨＥＰＥＳ ｐＨ ８、０．１ Ｍの ＮａＣｌ。Ｄ、ＩＳＹ及びＮＥＰＳ酵素の複合活性。８−オキソゲラニアル２、ＣｒＩＳＹ、ＮＥＰＳ及び補因子のインキュベーションは、以下の主要なニ環式生成物（ＭＢＰ）を含む生成物（Ｐ）の生成を可能にする：シス−トランス−ネペタラクトール４ａ（ＮＥＰＳ又はＮＥＰＳ２なし）、シス−トランス−ネペタラクトン１ａ（ＮＥＰＳ１）、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ（ＮＥＰＳ３）又はシス−シス−ネペタラクトン１ｂ（ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ３）。条件：０．５ ｍＭの ２、０．５ μＭ のＣｒＩＳＹ、２ μＭ のＮＥＰＳ、１ ｍＭの ＮＡＤＰＨ、５ ｍＭの ＮＡＤ ＋、０．１ Ｍの ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。ＮＥＰＳカスケードと、ＮｍＩＳＹ２及びＣｒＩＳＹとの比較については、図１７を参照のこと。ＮＥＰＳ３環化反応のさらなる分析については、図１８を参照のこと。ＲＴ＝保持時間。Ｅ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａのＮＥＰＳ触媒された形成。ＮＡＤ＋及び／又はＮＥＰＳ濃度の調整は、ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ２シス−トランス−ネペタラクトール４ａの形成を促進できたことを明らかにする。条件：０．５ ｍＭ の２、０．５ μＭ のＣｒＩＳＹ、ＮＥＰＳ１又は２（さまざまな濃度）、１ ｍＭの ＮＡＤＰＨ、０又は５ ｍＭ のＮＡＤ ＋、０．１ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。全ての反応物は、３時間インキュベートされ、そしてＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして表される。ＥＩスペクトルについては、図１４を参照のこと。
【００２０】
【図４−１】図４は、Ｓ−８−オキソシトロネラール６により調査されたＮＥＰＳ活性を示す。Ａ、この図に記載されるＮＥＰＳ酵素活性の要約。Ｔ＝互変異性化、Ｃ＝環化、Ｏ＝酸化、ＧＡ＝一般的酸（緩衝液）。Ｂ、ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして提示された、Ｓ−８−オキソシトロネラール６、緩衝液及びＮＡＤ＋によるＮＥＰＳ活性。パネルは図３Ｂの観察を主に要約しているが、しかしＩＳＹの不在下である。未知の副産物は、ＮＥＰＳ１により形成される。条件：０．５ ｍＭ の６、２ μＭ のＮＥＰＳ、５ ｍＭ のＮＡＤ ＋、０．５ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。ＮＥＰＳなしでの実験は、ＮＡＤ＋を含まなかった。６、ＮＥＰＳ及びＣｒＩＳＹとの反応については、図１９を参照のこと。Ｐ＝生成物、ＭＢＰ＝主要ニ環式生成物。Ｃ、Ｓ−８−オキソシトロネラール６によるＮＥＰＳ活性の緩衝液依存性。緩衝液の不在下で、ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ３は検出できる活性を有さず；緩衝液の追加が酵素活性を明らかにする。６の緩衝液触媒された互変異性化は、酵素活性のために必要であるように見え、Ｓ−８−オキソ−シトロネラール６ではなく、活性化された８−オキソシトロネリルエノール３が重要なＮＥＰＳ基質であるという仮説を支持している。条件：０．５ ｍＭ の６、２ μＭ のＮＥＰＳ、５ ｍＭ のＮＡＤ ＋、ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５（０．５Ｍ、又は緩衝液なし）。Ｐ-＝生成物。Ｄ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂを形成するためのＮＥＰＳ３触媒された環化。ＮＥＰＳ３環化活性には、ＮＡＤ＋の添加は必要でないが、その添加は反応を促進する。本発明者は、環化が酸化還元的ではないが、ＮＡＤ＋は非化学的態様（すなわち、タンパク質安定化）で作用すると仮定する。条件：０．５ ｍＭ の６、２又は２０ μＭの ＮＥＰＳ、０又は５ ｍＭの ＮＡＤ ＋、０．５ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。全ての反応分析は、ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして表示される。
【００２１】
【図４−２】図４は、Ｓ−８−オキソシトロネラール６により調査されたＮＥＰＳ活性を示す。Ａ、この図に記載されるＮＥＰＳ酵素活性の要約。Ｔ＝互変異性化、Ｃ＝環化、Ｏ＝酸化、ＧＡ＝一般的酸（緩衝液）。Ｂ、ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして提示された、Ｓ−８−オキソシトロネラール６、緩衝液及びＮＡＤ＋によるＮＥＰＳ活性。パネルは図３Ｂの観察を主に要約しているが、しかしＩＳＹの不在下である。未知の副産物は、ＮＥＰＳ１により形成される。条件：０．５ ｍＭ の６、２ μＭ のＮＥＰＳ、５ ｍＭ のＮＡＤ ＋、０．５ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。ＮＥＰＳなしでの実験は、ＮＡＤ＋を含まなかった。６、ＮＥＰＳ及びＣｒＩＳＹとの反応については、図１９を参照のこと。Ｐ＝生成物、ＭＢＰ＝主要ニ環式生成物。Ｃ、Ｓ−８−オキソシトロネラール６によるＮＥＰＳ活性の緩衝液依存性。緩衝液の不在下で、ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ３は検出できる活性を有さず；緩衝液の追加が酵素活性を明らかにする。６の緩衝液触媒された互変異性化は、酵素活性のために必要であるように見え、Ｓ−８−オキソ−シトロネラール６ではなく、活性化された８−オキソシトロネリルエノール３が重要なＮＥＰＳ基質であるという仮説を支持している。条件：０．５ ｍＭ の６、２ μＭ のＮＥＰＳ、５ ｍＭ のＮＡＤ ＋、ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５（０．５Ｍ、又は緩衝液なし）。Ｐ-＝生成物。Ｄ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂを形成するためのＮＥＰＳ３触媒された環化。ＮＥＰＳ３環化活性には、ＮＡＤ＋の添加は必要でないが、その添加は反応を促進する。本発明者は、環化が酸化還元的ではないが、ＮＡＤ＋は非化学的態様（すなわち、タンパク質安定化）で作用すると仮定する。条件：０．５ ｍＭ の６、２又は２０ μＭの ＮＥＰＳ、０又は５ ｍＭの ＮＡＤ ＋、０．５ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。全ての反応分析は、ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして表示される。
【００２２】
【図４−３】図４は、Ｓ−８−オキソシトロネラール６により調査されたＮＥＰＳ活性を示す。Ａ、この図に記載されるＮＥＰＳ酵素活性の要約。Ｔ＝互変異性化、Ｃ＝環化、Ｏ＝酸化、ＧＡ＝一般的酸（緩衝液）。Ｂ、ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして提示された、Ｓ−８−オキソシトロネラール６、緩衝液及びＮＡＤ＋によるＮＥＰＳ活性。パネルは図３Ｂの観察を主に要約しているが、しかしＩＳＹの不在下である。未知の副産物は、ＮＥＰＳ１により形成される。条件：０．５ ｍＭ の６、２ μＭ のＮＥＰＳ、５ ｍＭ のＮＡＤ ＋、０．５ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。ＮＥＰＳなしでの実験は、ＮＡＤ＋を含まなかった。６、ＮＥＰＳ及びＣｒＩＳＹとの反応については、図１９を参照のこと。Ｐ＝生成物、ＭＢＰ＝主要ニ環式生成物。Ｃ、Ｓ−８−オキソシトロネラール６によるＮＥＰＳ活性の緩衝液依存性。緩衝液の不在下で、ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ３は検出できる活性を有さず；緩衝液の追加が酵素活性を明らかにする。６の緩衝液触媒された互変異性化は、酵素活性のために必要であるように見え、Ｓ−８−オキソ−シトロネラール６ではなく、活性化された８−オキソシトロネリルエノール３が重要なＮＥＰＳ基質であるという仮説を支持している。条件：０．５ ｍＭ の６、２ μＭ のＮＥＰＳ、５ ｍＭ のＮＡＤ ＋、ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５（０．５Ｍ、又は緩衝液なし）。Ｐ-＝生成物。Ｄ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂを形成するためのＮＥＰＳ３触媒された環化。ＮＥＰＳ３環化活性には、ＮＡＤ＋の添加は必要でないが、その添加は反応を促進する。本発明者は、環化が酸化還元的ではないが、ＮＡＤ＋は非化学的態様（すなわち、タンパク質安定化）で作用すると仮定する。条件：０．５ ｍＭ の６、２又は２０ μＭの ＮＥＰＳ、０又は５ ｍＭの ＮＡＤ ＋、０．５ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。全ての反応分析は、ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして表示される。
【００２３】
【図５】図５は、ＮＥＰＳ酵素の構造を示す。ＮＥＰＳ３（６Ｆ９Ｑ）のＸ線結晶構造、及びＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ２の相同性モデル（ＨＭ、テンプレート６Ｆ９Ｑ）構造。活性部位ＮＡＤ＋及び残基は、ステックとして表されている。破線は、提案されたＨ結合を表す。ＮＥＰＳ３活性部位は、ＳＤＲ触媒テトラッド（Ｇ１５２）の特徴的なＳｅｒ／Ｔｈｒを欠いている。それは、Ｓ１５４に結合された塩化物及びＳ１５３とＰ１９０との間の水素結合を特徴とし、ＮＥＰＳ１（Ｌ１５６）及びＮＥＰＳ２（Ｌ１５２）には不在である。太字及び下線付きの残基の役割は、突然変異により分析されている。ＮＥＰＳ３結晶構造のさらなる分析については、図２０を参照のこと。
【００２４】
【図６−１】図６は、ＮＥＰＳ変異体を示す。Ａ、ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして提示された、８−オキソゲラニアル２、ＩＳＹ及びＮＥＰＳ変異体によるカップリングアッセイ。生成物プロファイルは、３時間後に測定された。ＮＥＰＳ３における置換Ｓ１５４Ｌは、シス−シスシクラーゼ活性（４ｂの不在）を除去するように見えるが、１０μＭの酵素では、シス−トランス−ネペタラクトール４ａの形成は、イリドジアール５に比べて促進されたように見える。ＮＥＰＳ１におけるＬ１５６Ｓ置換は、ＮＥＰＳ１のデヒドロゲナーゼ活性を大幅に除去するが（少ないシス−トランス−ネペタラクトン１ａ）、しかしシス−シス−ネペタラクトール４ｂにおける上昇は観察されていない。条件：０．５ ｍＭ の２、０．５ μＭ のＣｒＩＳＹ、２又は１０ μＭ のＮＥＰＳ、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、５ ｍＭの ＮＡＤ ＋、０．１ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。ＳＰ＝副産物、ＲＴ＝保持時間。Ｂ、８−オキソゲラニアル２、ＩＳＹ及びＮＥＰＳ１  ＷＴ又はＴ１５４Ｇを用いてのカップリングされたアッセイの時間経過。シス−トランス−ネペタラクトール４ａ（白四角）及びシス−トランス−ネペタラクトン１ａ（黒丸）の量が、反応の過程で測定される。ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣ、ピーク面積として記載される生成物比率は、総生成物ピーク面積（ＰＡ）の％比率として示される。ＮＥＰＳ１−ＷＴは４ａを急速に酸化するが、ＮＥＰＳ１−Ｔ１５４Ｇは４ａをより低い効率で酸化する。時間経過の全てのＴＩＣについては図２２を、及び速度論的分析については表２を参照のこと。Ｔ＝時間。条件：０．５ ｍＭ の２、０．５ μＭ のＣｒＩＳＹ、２ μＭ のＮＥＰＳ、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、１ ｍＭ のＮＡＤ ＋、０．１ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。Ｃ、ＮＥＰＳ１活性部位におけるシス−トランス−ネペタラクトール４ａの推定結合モード。ＮＥＰＳ１相同モデルを用いての計算ドッキング計算により生成された結合モード。ラクトールとＴ１５４との間の推定水素結合相互作用は、点線により強調されている。描かれた結合モードは、１０の予測された結合モードの３番目にランク付けされた（ランク１スコア＝−６．４ｋａｌ・ｍｏｌ−１、描かれたランク３のエネルギー＝６．３ｋａｌ・ｍｏｌ−１）。Ｄ、ＮＥＰＳ１活性及び相互作用のスキーム。ＮＥＰＳ１は、２つの異なる活性−環化及び脱水素化を有するように見える。変異体Ｔ１５４Ｇの挙動は、Ｔ１５４が脱水素化に関与していることを示唆する。それらの２つの活性は別個に見え、そして異なる活性部位の相互作用を含む場合さえある。Ｔ１５４Ｇのわずかに改善されたシクラーゼ活性は、３を４ａに結合し、そして環化するためにより多くの酵素を開放する、４ａの不十分な結合のためである。ＳＰ＝副産物。Ｓ＝溶媒。
【００２５】
【図６−２】図６は、ＮＥＰＳ変異体を示す。Ａ、ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして提示された、８−オキソゲラニアル２、ＩＳＹ及びＮＥＰＳ変異体によるカップリングアッセイ。生成物プロファイルは、３時間後に測定された。ＮＥＰＳ３における置換Ｓ１５４Ｌは、シス−シスシクラーゼ活性（４ｂの不在）を除去するように見えるが、１０μＭの酵素では、シス−トランス−ネペタラクトール４ａの形成は、イリドジアール５に比べて促進されたように見える。ＮＥＰＳ１におけるＬ１５６Ｓ置換は、ＮＥＰＳ１のデヒドロゲナーゼ活性を大幅に除去するが（少ないシス−トランス−ネペタラクトン１ａ）、しかしシス−シス−ネペタラクトール４ｂにおける上昇は観察されていない。条件：０．５ ｍＭ の２、０．５ μＭ のＣｒＩＳＹ、２又は１０ μＭ のＮＥＰＳ、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、５ ｍＭの ＮＡＤ ＋、０．１ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。ＳＰ＝副産物、ＲＴ＝保持時間。Ｂ、８−オキソゲラニアル２、ＩＳＹ及びＮＥＰＳ１  ＷＴ又はＴ１５４Ｇを用いてのカップリングされたアッセイの時間経過。シス−トランス−ネペタラクトール４ａ（白四角）及びシス−トランス−ネペタラクトン１ａ（黒丸）の量が、反応の過程で測定される。ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣ、ピーク面積として記載される生成物比率は、総生成物ピーク面積（ＰＡ）の％比率として示される。ＮＥＰＳ１−ＷＴは４ａを急速に酸化するが、ＮＥＰＳ１−Ｔ１５４Ｇは４ａをより低い効率で酸化する。時間経過の全てのＴＩＣについては図２２を、及び速度論的分析については表２を参照のこと。Ｔ＝時間。条件：０．５ ｍＭ の２、０．５ μＭ のＣｒＩＳＹ、２ μＭ のＮＥＰＳ、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、１ ｍＭ のＮＡＤ ＋、０．１ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。Ｃ、ＮＥＰＳ１活性部位におけるシス−トランス−ネペタラクトール４ａの推定結合モード。ＮＥＰＳ１相同モデルを用いての計算ドッキング計算により生成された結合モード。ラクトールとＴ１５４との間の推定水素結合相互作用は、点線により強調されている。描かれた結合モードは、１０の予測された結合モードの３番目にランク付けされた（ランク１スコア＝−６．４ｋａｌ・ｍｏｌ−１、描かれたランク３のエネルギー＝６．３ｋａｌ・ｍｏｌ−１）。Ｄ、ＮＥＰＳ１活性及び相互作用のスキーム。ＮＥＰＳ１は、２つの異なる活性−環化及び脱水素化を有するように見える。変異体Ｔ１５４Ｇの挙動は、Ｔ１５４が脱水素化に関与していることを示唆する。それらの２つの活性は別個に見え、そして異なる活性部位の相互作用を含む場合さえある。Ｔ１５４Ｇのわずかに改善されたシクラーゼ活性は、３を４ａに結合し、そして環化するためにより多くの酵素を開放する、４ａの不十分な結合のためである。ＳＰ＝副産物。Ｓ＝溶媒。
【００２６】
【図６−３】図６は、ＮＥＰＳ変異体を示す。Ａ、ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして提示された、８−オキソゲラニアル２、ＩＳＹ及びＮＥＰＳ変異体によるカップリングアッセイ。生成物プロファイルは、３時間後に測定された。ＮＥＰＳ３における置換Ｓ１５４Ｌは、シス−シスシクラーゼ活性（４ｂの不在）を除去するように見えるが、１０μＭの酵素では、シス−トランス−ネペタラクトール４ａの形成は、イリドジアール５に比べて促進されたように見える。ＮＥＰＳ１におけるＬ１５６Ｓ置換は、ＮＥＰＳ１のデヒドロゲナーゼ活性を大幅に除去するが（少ないシス−トランス−ネペタラクトン１ａ）、しかしシス−シス−ネペタラクトール４ｂにおける上昇は観察されていない。条件：０．５ ｍＭ の２、０．５ μＭ のＣｒＩＳＹ、２又は１０ μＭ のＮＥＰＳ、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、５ ｍＭの ＮＡＤ ＋、０．１ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。ＳＰ＝副産物、ＲＴ＝保持時間。Ｂ、８−オキソゲラニアル２、ＩＳＹ及びＮＥＰＳ１  ＷＴ又はＴ１５４Ｇを用いてのカップリングされたアッセイの時間経過。シス−トランス−ネペタラクトール４ａ（白四角）及びシス−トランス−ネペタラクトン１ａ（黒丸）の量が、反応の過程で測定される。ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣ、ピーク面積として記載される生成物比率は、総生成物ピーク面積（ＰＡ）の％比率として示される。ＮＥＰＳ１−ＷＴは４ａを急速に酸化するが、ＮＥＰＳ１−Ｔ１５４Ｇは４ａをより低い効率で酸化する。時間経過の全てのＴＩＣについては図２２を、及び速度論的分析については表２を参照のこと。Ｔ＝時間。条件：０．５ ｍＭ の２、０．５ μＭ のＣｒＩＳＹ、２ μＭ のＮＥＰＳ、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、１ ｍＭ のＮＡＤ ＋、０．１ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。Ｃ、ＮＥＰＳ１活性部位におけるシス−トランス−ネペタラクトール４ａの推定結合モード。ＮＥＰＳ１相同モデルを用いての計算ドッキング計算により生成された結合モード。ラクトールとＴ１５４との間の推定水素結合相互作用は、点線により強調されている。描かれた結合モードは、１０の予測された結合モードの３番目にランク付けされた（ランク１スコア＝−６．４ｋａｌ・ｍｏｌ−１、描かれたランク３のエネルギー＝６．３ｋａｌ・ｍｏｌ−１）。Ｄ、ＮＥＰＳ１活性及び相互作用のスキーム。ＮＥＰＳ１は、２つの異なる活性−環化及び脱水素化を有するように見える。変異体Ｔ１５４Ｇの挙動は、Ｔ１５４が脱水素化に関与していることを示唆する。それらの２つの活性は別個に見え、そして異なる活性部位の相互作用を含む場合さえある。Ｔ１５４Ｇのわずかに改善されたシクラーゼ活性は、３を４ａに結合し、そして環化するためにより多くの酵素を開放する、４ａの不十分な結合のためである。ＳＰ＝副産物。Ｓ＝溶媒。
【００２７】
【図７−１】図７は、図２Ａからの化合物の電子イオン化（ＥＩ）スペクトルを示す。シス−シス−イリドジアール５a′との重複を回避するためにピークテールから取得されたＣｒＩＳＹトランス−トランス−イリドジアール５ｄ′スペクトルを除いて、全てのスペクトルは、ピークの中心から取得された。ここに提供されている標準の同一性は、以前に報告されたようなＮＭＲ特性評価により検証されている（方法を参照のこと）。ＳＴＤ＝標準、Ａ＝アバンダンス。Ａ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ。 Ｂ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ。 Ｃ、シス−トランス−イリドジアール５a．＋ ５a 。 Ｄ、トランス−シス−イリドジアール５c．＋ ５c 。 Ｅ、トランス−トランス−イリドジアール５d．＋５d ’。 Ｆ、Ｓ−８−オキソシトロネラール６。 Ｇ、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７。
【００２８】
【図７−２】図７は、図２Ａからの化合物の電子イオン化（ＥＩ）スペクトルを示す。シス−シス−イリドジアール５a′との重複を回避するためにピークテールから取得されたＣｒＩＳＹトランス−トランス−イリドジアール５ｄ′スペクトルを除いて、全てのスペクトルは、ピークの中心から取得された。ここに提供されている標準の同一性は、以前に報告されたようなＮＭＲ特性評価により検証されている（方法を参照のこと）。ＳＴＤ＝標準、Ａ＝アバンダンス。Ａ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ。 Ｂ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ。 Ｃ、シス−トランス−イリドジアール５a．＋ ５a 。 Ｄ、トランス−シス−イリドジアール５c．＋ ５c 。 Ｅ、トランス−トランス−イリドジアール５d．＋５d ’。 Ｆ、Ｓ−８−オキソシトロネラール６。 Ｇ、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７。
【００２９】
【図７−３】図７は、図２Ａからの化合物の電子イオン化（ＥＩ）スペクトルを示す。シス−シス−イリドジアール５a′との重複を回避するためにピークテールから取得されたＣｒＩＳＹトランス−トランス−イリドジアール５ｄ′スペクトルを除いて、全てのスペクトルは、ピークの中心から取得された。ここに提供されている標準の同一性は、以前に報告されたようなＮＭＲ特性評価により検証されている（方法を参照のこと）。ＳＴＤ＝標準、Ａ＝アバンダンス。Ａ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ。 Ｂ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ。 Ｃ、シス−トランス−イリドジアール５a．＋ ５a 。 Ｄ、トランス−シス−イリドジアール５c．＋ ５c 。 Ｅ、トランス−トランス−イリドジアール５d．＋５d ’。 Ｆ、Ｓ−８−オキソシトロネラール６。 Ｇ、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７。
【００３０】
【図７−４】図７は、図２Ａからの化合物の電子イオン化（ＥＩ）スペクトルを示す。シス−シス−イリドジアール５a′との重複を回避するためにピークテールから取得されたＣｒＩＳＹトランス−トランス−イリドジアール５ｄ′スペクトルを除いて、全てのスペクトルは、ピークの中心から取得された。ここに提供されている標準の同一性は、以前に報告されたようなＮＭＲ特性評価により検証されている（方法を参照のこと）。ＳＴＤ＝標準、Ａ＝アバンダンス。Ａ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ。 Ｂ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ。 Ｃ、シス−トランス−イリドジアール５a．＋ ５a 。 Ｄ、トランス−シス−イリドジアール５c．＋ ５c 。 Ｅ、トランス−トランス−イリドジアール５d．＋５d ’。 Ｆ、Ｓ−８−オキソシトロネラール６。 Ｇ、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７。
【００３１】
【図７−５】図７は、図２Ａからの化合物の電子イオン化（ＥＩ）スペクトルを示す。シス−シス−イリドジアール５a′との重複を回避するためにピークテールから取得されたＣｒＩＳＹトランス−トランス−イリドジアール５ｄ′スペクトルを除いて、全てのスペクトルは、ピークの中心から取得された。ここに提供されている標準の同一性は、以前に報告されたようなＮＭＲ特性評価により検証されている（方法を参照のこと）。ＳＴＤ＝標準、Ａ＝アバンダンス。Ａ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ。 Ｂ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ。 Ｃ、シス−トランス−イリドジアール５a．＋ ５a 。 Ｄ、トランス−シス−イリドジアール５c．＋ ５c 。 Ｅ、トランス−トランス−イリドジアール５d．＋５d ’。 Ｆ、Ｓ−８−オキソシトロネラール６。 Ｇ、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７。
【００３２】
【図８−１】図８は、８−オキソゲラニアル２のＩＳＹ触媒された還元に対する緩衝液の影響を示す。Ａ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ、シス−トランス−イリドジアール５a、シス−シス−イリドジアール５c、トランス−トランス−イリドジアール５d、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７及びＳ−８−オキソゲラニアル６を形成するＩＳＹによる８−オキソゲラニアル２の還元。条件：０．５ μＭ のＩＳＹ、１ ｍＭのＮＡＤＰＨ緩衝液。Ｂ、ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして表される異なるＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）濃度でのＣｒＩＳＹによる２の還元、ＮｍＩＳＹ２（図２Ｃ）及びＡｍＩＳＹ（図８Ｃ）と同様のプロットとの類似性に注意すること。Ｃ、異なるＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）濃度でのＡｍＩＳＹによる２の還元。ＮｍＩＳＹ２（図２Ｃ）及びＣｒＩＳＹ（図８Ｂ）と同様のプロットとの類似性に注意すること。＊ＡｍＩＳＹは、パネルａに示されているものと同じ鏡像異性体系列列を生成する。Ｄ、生成物プロファイルに対する緩衝液選択の影響。異なる緩衝液を用いてのＣｒＩＳＹによる２の還元。以下の異なる生成物プロファイルを注意すること：ＰＯＰＳＯからの６の不在、ＫＰiｈ７の存在、及び最も重要なことには、ＰＯＰＳＯにおけるジアステレオマー比５a及び５ａ′の異なる比率。これは、互変異性化メカニズムに緩衝液の直接的関与を示している。Ｅ、２のＣｒＩＳＹ触媒された還元の生成物プロファイルに対する緩衝液選択の効果。ｐＨの低下（より酸性にする）は、緩衝液（一般的酸）濃度の上昇と類似する結果を有する。使用される緩衝液は、Ｇｏｏｄ緩衝液の組合せ（各５０ ｍＭのＨＥＰＥＳ、ＣＨＥＳ 及び ＭＥＳ）であった。
【００３３】
【図８−２】図８は、８−オキソゲラニアル２のＩＳＹ触媒された還元に対する緩衝液の影響を示す。Ａ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ、シス−トランス−イリドジアール５a、シス−シス−イリドジアール５c、トランス−トランス−イリドジアール５d、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７及びＳ−８−オキソゲラニアル６を形成するＩＳＹによる８−オキソゲラニアル２の還元。条件：０．５ μＭ のＩＳＹ、１ ｍＭのＮＡＤＰＨ緩衝液。Ｂ、ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして表される異なるＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）濃度でのＣｒＩＳＹによる２の還元、ＮｍＩＳＹ２（図２Ｃ）及びＡｍＩＳＹ（図８Ｃ）と同様のプロットとの類似性に注意すること。Ｃ、異なるＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）濃度でのＡｍＩＳＹによる２の還元。ＮｍＩＳＹ２（図２Ｃ）及びＣｒＩＳＹ（図８Ｂ）と同様のプロットとの類似性に注意すること。＊ＡｍＩＳＹは、パネルａに示されているものと同じ鏡像異性体系列列を生成する。Ｄ、生成物プロファイルに対する緩衝液選択の影響。異なる緩衝液を用いてのＣｒＩＳＹによる２の還元。以下の異なる生成物プロファイルを注意すること：ＰＯＰＳＯからの６の不在、ＫＰiｈ７の存在、及び最も重要なことには、ＰＯＰＳＯにおけるジアステレオマー比５a及び５ａ′の異なる比率。これは、互変異性化メカニズムに緩衝液の直接的関与を示している。Ｅ、２のＣｒＩＳＹ触媒された還元の生成物プロファイルに対する緩衝液選択の効果。ｐＨの低下（より酸性にする）は、緩衝液（一般的酸）濃度の上昇と類似する結果を有する。使用される緩衝液は、Ｇｏｏｄ緩衝液の組合せ（各５０ ｍＭのＨＥＰＥＳ、ＣＨＥＳ 及び ＭＥＳ）であった。
【００３４】
【図９−１】図９は、８−オキソゲラニアル２にＩＳＹ触媒された還元に対する緩衝液の影響の分析を示す。ＣｒＩＳＹ（ＩＳＹ）及びＮＡＤＰＨによる２の還元は、ｐＨ７．５で異なる緩衝液濃度で異なる緩衝液により実施された、生成物は、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ、シス−トランス−イリドジアール５ａ、トランス−シス−イリドジアール５ｃ、トランス−トランス−イリドジアール５ｄ、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７及びＳ−８−オキソシトロネラール６であった。Ａ、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）; Ｂ、ＨＥＰＥＳ（4−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）; Ｃ、ＫＰｉ（リン酸カリウム）; Ｄ、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１,４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））。全ての場合、シス−トランス−ネペタラクトール４ａの濃度は、緩衝液濃度の上昇につれて、低下する。０〜１００ｍＭの緩衝液濃度で、シス−トランス−イリドジアール５ａは上昇する。１００ｍＭ以上の緩衝液で、その効果は、より緩衝液依存性である：ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ及びＫＰiについては、８−オキソシトロネラール６の濃度は上昇し；ＫＰiについては、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７の上昇がまた見られ；そしてＰＯＰＳＯについては、６は見られなかたが、特定のイリドジアール５ジアステレオマーの上昇が見られた。さらに、ＰＯＰＳＯは、他の緩衝液と比較して、５の異なるジアステレオマー比率を生成するように見える。このデータは、２のＩＳＹ触媒された還元における環化／互変異性化工程への直接的な緩衝液の関与の証拠である。生成物ピーク面積は、生成物ピーク面積を、総生成物ピーク面積（ＰＡ）により割ることにより得られる、％生成物比率として表される。生成物ピーク面積は、標準曲線により正規化されず、結果的に、絶対濃度を表すものではない。ＧＣ方法においては、５ａ′及び５ｄ′のピークが重なっていることを注意すること。それらの化合物のピーク面積は、ピークショルダーとしてではなく、スプリットピーク（すなわち、両方ともベースラインに対する）として測定された。ＨＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰＳＯ化学構造は双性イオン形で描かれ、ＫＰiはＰＨ７．５での主要リン酸形として描かれた。
【００３５】
【図９−２】図９は、８−オキソゲラニアル２にＩＳＹ触媒された還元に対する緩衝液の影響の分析を示す。ＣｒＩＳＹ（ＩＳＹ）及びＮＡＤＰＨによる２の還元は、ｐＨ７．５で異なる緩衝液濃度で異なる緩衝液により実施された、生成物は、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ、シス−トランス−イリドジアール５ａ、トランス−シス−イリドジアール５ｃ、トランス−トランス−イリドジアール５ｄ、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７及びＳ−８−オキソシトロネラール６であった。Ａ、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）; Ｂ、ＨＥＰＥＳ（4−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）; Ｃ、ＫＰｉ（リン酸カリウム）; Ｄ、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１,４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））。全ての場合、シス−トランス−ネペタラクトール４ａの濃度は、緩衝液濃度の上昇につれて、低下する。０〜１００ｍＭの緩衝液濃度で、シス−トランス−イリドジアール５ａは上昇する。１００ｍＭ以上の緩衝液で、その効果は、より緩衝液依存性である：ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ及びＫＰiについては、８−オキソシトロネラール６の濃度は上昇し；ＫＰiについては、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７の上昇がまた見られ；そしてＰＯＰＳＯについては、６は見られなかたが、特定のイリドジアール５ジアステレオマーの上昇が見られた。さらに、ＰＯＰＳＯは、他の緩衝液と比較して、５の異なるジアステレオマー比率を生成するように見える。このデータは、２のＩＳＹ触媒された還元における環化／互変異性化工程への直接的な緩衝液の関与の証拠である。生成物ピーク面積は、生成物ピーク面積を、総生成物ピーク面積（ＰＡ）により割ることにより得られる、％生成物比率として表される。生成物ピーク面積は、標準曲線により正規化されず、結果的に、絶対濃度を表すものではない。ＧＣ方法においては、５ａ′及び５ｄ′のピークが重なっていることを注意すること。それらの化合物のピーク面積は、ピークショルダーとしてではなく、スプリットピーク（すなわち、両方ともベースラインに対する）として測定された。ＨＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰＳＯ化学構造は双性イオン形で描かれ、ＫＰiはＰＨ７．５での主要リン酸形として描かれた。
【００３６】
【図９−３】図９は、８−オキソゲラニアル２にＩＳＹ触媒された還元に対する緩衝液の影響の分析を示す。ＣｒＩＳＹ（ＩＳＹ）及びＮＡＤＰＨによる２の還元は、ｐＨ７．５で異なる緩衝液濃度で異なる緩衝液により実施された、生成物は、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ、シス−トランス−イリドジアール５ａ、トランス−シス−イリドジアール５ｃ、トランス−トランス−イリドジアール５ｄ、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７及びＳ−８−オキソシトロネラール６であった。Ａ、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）; Ｂ、ＨＥＰＥＳ（4−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）; Ｃ、ＫＰｉ（リン酸カリウム）; Ｄ、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１,４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））。全ての場合、シス−トランス−ネペタラクトール４ａの濃度は、緩衝液濃度の上昇につれて、低下する。０〜１００ｍＭの緩衝液濃度で、シス−トランス−イリドジアール５ａは上昇する。１００ｍＭ以上の緩衝液で、その効果は、より緩衝液依存性である：ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ及びＫＰiについては、８−オキソシトロネラール６の濃度は上昇し；ＫＰiについては、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７の上昇がまた見られ；そしてＰＯＰＳＯについては、６は見られなかたが、特定のイリドジアール５ジアステレオマーの上昇が見られた。さらに、ＰＯＰＳＯは、他の緩衝液と比較して、５の異なるジアステレオマー比率を生成するように見える。このデータは、２のＩＳＹ触媒された還元における環化／互変異性化工程への直接的な緩衝液の関与の証拠である。生成物ピーク面積は、生成物ピーク面積を、総生成物ピーク面積（ＰＡ）により割ることにより得られる、％生成物比率として表される。生成物ピーク面積は、標準曲線により正規化されず、結果的に、絶対濃度を表すものではない。ＧＣ方法においては、５ａ′及び５ｄ′のピークが重なっていることを注意すること。それらの化合物のピーク面積は、ピークショルダーとしてではなく、スプリットピーク（すなわち、両方ともベースラインに対する）として測定された。ＨＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰＳＯ化学構造は双性イオン形で描かれ、ＫＰiはＰＨ７．５での主要リン酸形として描かれた。
【００３７】
【図９−４】図９は、８−オキソゲラニアル２にＩＳＹ触媒された還元に対する緩衝液の影響の分析を示す。ＣｒＩＳＹ（ＩＳＹ）及びＮＡＤＰＨによる２の還元は、ｐＨ７．５で異なる緩衝液濃度で異なる緩衝液により実施された、生成物は、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ、シス−トランス−イリドジアール５ａ、トランス−シス−イリドジアール５ｃ、トランス−トランス−イリドジアール５ｄ、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７及びＳ−８−オキソシトロネラール６であった。Ａ、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）; Ｂ、ＨＥＰＥＳ（4−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）; Ｃ、ＫＰｉ（リン酸カリウム）; Ｄ、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１,４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））。全ての場合、シス−トランス−ネペタラクトール４ａの濃度は、緩衝液濃度の上昇につれて、低下する。０〜１００ｍＭの緩衝液濃度で、シス−トランス−イリドジアール５ａは上昇する。１００ｍＭ以上の緩衝液で、その効果は、より緩衝液依存性である：ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ及びＫＰiについては、８−オキソシトロネラール６の濃度は上昇し；ＫＰiについては、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７の上昇がまた見られ；そしてＰＯＰＳＯについては、６は見られなかたが、特定のイリドジアール５ジアステレオマーの上昇が見られた。さらに、ＰＯＰＳＯは、他の緩衝液と比較して、５の異なるジアステレオマー比率を生成するように見える。このデータは、２のＩＳＹ触媒された還元における環化／互変異性化工程への直接的な緩衝液の関与の証拠である。生成物ピーク面積は、生成物ピーク面積を、総生成物ピーク面積（ＰＡ）により割ることにより得られる、％生成物比率として表される。生成物ピーク面積は、標準曲線により正規化されず、結果的に、絶対濃度を表すものではない。ＧＣ方法においては、５ａ′及び５ｄ′のピークが重なっていることを注意すること。それらの化合物のピーク面積は、ピークショルダーとしてではなく、スプリットピーク（すなわち、両方ともベースラインに対する）として測定された。ＨＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰＳＯ化学構造は双性イオン形で描かれ、ＫＰiはＰＨ７．５での主要リン酸形として描かれた。
【００３８】
【図１０】図１０は、緩衝液におけるネペタラクトール安定性を示す。１０ｍＭ及び０．５ＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）におけるシス−トランス−ネペタラクトール(4a, Fig. 10A) 及びシス−シス−ネペタラクトール (4b, Fig. 10B)の安定性。４ａは、それらの両方の条件下で安定しているように見える。４ｂは、１０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）においてほぼ安定しているように見えるが、高い緩衝液濃度（０．５ＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．５）では安定しておらず、そして分解し、イリドジアール５を形成する。クロマトグラムは全てＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣである。ＲＴ＝保持時間（分）、インキュベーションは３０℃で１６時間であった。
【００３９】
【図１１】図１１は、酸性及びアルカリ性条件下でのＳ−８−オキソシトロネラール６の環化を示す。Ａ、環化反応の概略。Ｓ−８−オキソシトロネラール６は、Ｈ＋又はＯＨ−、及びＨ２Ｏの存在下で、シス−トランス−ネペタラクトール４a、シス−トランス−イリドジアール５a、トランス−シス−イリドジアール５ｃ、及びトランス−シス−イリドジアール５ｄに環化する。Ｂ、酸性（ＨＣｌ）又はアルカリ性（ＮａＯＨ）ｐＨでの水中、Ｓ−８−オキソシトロネラール６（０．５ｍＭ）のインキュベーション。Ｂ、酸性（ＨＣｌ）又はアルカリ性（ＮａＯＨ）ｐＨでの水中、Ｓ−８−オキソシトロネラール６（０．５ｍＭ）のインキュベーション。ｐＨ、２、３、４、５、６、７、８及び９でのサンプルがまた試験されたが、しかし変換は観察されなかった。ＲＴ＝保持時間（分）。Ｃ、パネルｂにおけるように、但し３０℃での２４時間のインキュベーションの後、ｐＨ２〜１０の間では、変換はほとんど観察されなかった。ｐＨ１２でのサンプルは、６及び生成物の完全な分解を示すように見えた。シス−シス−ネペタラクトール４ｂは、いずれのｐＨでも検出されなかった。Ｄ、ｐＨ１０．５〜１１．０（ＮａＯＨ）間での水中、Ｓ−８−オキソシトロネラール６（０．５ｍＭ）のインキュベーション。サンプルは、３０℃で１６時間インキュベートされた。ｐＨ１０．０〜１０．５でのサンプルが試験されたが、変換はほとんど観察されなかった。二環式シス−トランス−ネペタラクトール４ａはアルカリ性条件下で主要生成物であるのに対して、シス−シス−ネペタラクトール４ｂは不在であることは注目に値する。シス−シス−ネペタラクトール４ｂの自発的形成は好ましくないように見える。
【００４０】
【図１２−１】図１２は、図２Ｄからの化合物の電子イオン化（ＥＩ）スペクトルを示す。８−オキソシトロネラール６及び０．５ＭのＭＯＰＳ（ｐｈ７．５）との非酵素反応、及び８−オキソゲラニアル２、ＮｍＩＳＹ２、ＮＡＤＰＨ及び０．５ＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）との酵素反応からのＥＩスペクトルの比較。スペクトルは、生成物がそれらの異なる起源にもかかわらず化学的に同一であることを確認する。非酵素反応で生成された２つの未知の化合物のスペクトルが含まれている。それらは、６の非環状異性体のようである。シス−シス−イリドジアール５ａ′との重複を避けるためにピークテールから取得されたトランス−トランス−イリドジアール５ｄ′スペクトルを除いて、全てのスペクトルは、ピークの中心から取得された。Ａ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ。 Ｂ、Ｓ−８−オキソシトロネラ−ル６。Ｃ、シス−トランス−イリドジアール５ａ．＋ ５ａ ’。 Ｄ、トランス−シス−イリドジアール５ｃ． ＋５c ’。 Ｅ、トランス−トランス−イリドジアール５ｄ．＋５ｄ ’。Ｆ、０．５ｍＭの６及び０．５ＭのＭＯＰＳを含む反応からの未知のピークａ及びｂ。ＲＴ＝保持時間（分）。
【００４１】
【図１２−２】図１２は、図２Ｄからの化合物の電子イオン化（ＥＩ）スペクトルを示す。８−オキソシトロネラール６及び０．５ＭのＭＯＰＳ（ｐｈ７．５）との非酵素反応、及び８−オキソゲラニアル２、ＮｍＩＳＹ２、ＮＡＤＰＨ及び０．５ＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）との酵素反応からのＥＩスペクトルの比較。スペクトルは、生成物がそれらの異なる起源にもかかわらず化学的に同一であることを確認する。非酵素反応で生成された２つの未知の化合物のスペクトルが含まれている。それらは、６の非環状異性体のようである。シス−シス−イリドジアール５ａ′との重複を避けるためにピークテールから取得されたトランス−トランス−イリドジアール５ｄ′スペクトルを除いて、全てのスペクトルは、ピークの中心から取得された。Ａ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ。 Ｂ、Ｓ−８−オキソシトロネラ−ル６。Ｃ、シス−トランス−イリドジアール５ａ．＋ ５ａ ’。 Ｄ、トランス−シス−イリドジアール５ｃ． ＋５c ’。 Ｅ、トランス−トランス−イリドジアール５ｄ．＋５ｄ ’。Ｆ、０．５ｍＭの６及び０．５ＭのＭＯＰＳを含む反応からの未知のピークａ及びｂ。ＲＴ＝保持時間（分）。
【００４２】
【図１２−３】図１２は、図２Ｄからの化合物の電子イオン化（ＥＩ）スペクトルを示す。８−オキソシトロネラール６及び０．５ＭのＭＯＰＳ（ｐｈ７．５）との非酵素反応、及び８−オキソゲラニアル２、ＮｍＩＳＹ２、ＮＡＤＰＨ及び０．５ＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）との酵素反応からのＥＩスペクトルの比較。スペクトルは、生成物がそれらの異なる起源にもかかわらず化学的に同一であることを確認する。非酵素反応で生成された２つの未知の化合物のスペクトルが含まれている。それらは、６の非環状異性体のようである。シス−シス−イリドジアール５ａ′との重複を避けるためにピークテールから取得されたトランス−トランス−イリドジアール５ｄ′スペクトルを除いて、全てのスペクトルは、ピークの中心から取得された。Ａ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ。 Ｂ、Ｓ−８−オキソシトロネラ−ル６。Ｃ、シス−トランス−イリドジアール５ａ．＋ ５ａ ’。 Ｄ、トランス−シス−イリドジアール５ｃ． ＋５c ’。 Ｅ、トランス−トランス−イリドジアール５ｄ．＋５ｄ ’。Ｆ、０．５ｍＭの６及び０．５ＭのＭＯＰＳを含む反応からの未知のピークａ及びｂ。ＲＴ＝保持時間（分）。
【００４３】
【図１２−４】図１２は、図２Ｄからの化合物の電子イオン化（ＥＩ）スペクトルを示す。８−オキソシトロネラール６及び０．５ＭのＭＯＰＳ（ｐｈ７．５）との非酵素反応、及び８−オキソゲラニアル２、ＮｍＩＳＹ２、ＮＡＤＰＨ及び０．５ＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）との酵素反応からのＥＩスペクトルの比較。スペクトルは、生成物がそれらの異なる起源にもかかわらず化学的に同一であることを確認する。非酵素反応で生成された２つの未知の化合物のスペクトルが含まれている。それらは、６の非環状異性体のようである。シス−シス−イリドジアール５ａ′との重複を避けるためにピークテールから取得されたトランス−トランス−イリドジアール５ｄ′スペクトルを除いて、全てのスペクトルは、ピークの中心から取得された。Ａ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ。 Ｂ、Ｓ−８−オキソシトロネラ−ル６。Ｃ、シス−トランス−イリドジアール５ａ．＋ ５ａ ’。 Ｄ、トランス−シス−イリドジアール５ｃ． ＋５c ’。 Ｅ、トランス−トランス−イリドジアール５ｄ．＋５ｄ ’。Ｆ、０．５ｍＭの６及び０．５ＭのＭＯＰＳを含む反応からの未知のピークａ及びｂ。ＲＴ＝保持時間（分）。
【００４４】
【図１２−５】図１２は、図２Ｄからの化合物の電子イオン化（ＥＩ）スペクトルを示す。８−オキソシトロネラール６及び０．５ＭのＭＯＰＳ（ｐｈ７．５）との非酵素反応、及び８−オキソゲラニアル２、ＮｍＩＳＹ２、ＮＡＤＰＨ及び０．５ＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）との酵素反応からのＥＩスペクトルの比較。スペクトルは、生成物がそれらの異なる起源にもかかわらず化学的に同一であることを確認する。非酵素反応で生成された２つの未知の化合物のスペクトルが含まれている。それらは、６の非環状異性体のようである。シス−シス−イリドジアール５ａ′との重複を避けるためにピークテールから取得されたトランス−トランス−イリドジアール５ｄ′スペクトルを除いて、全てのスペクトルは、ピークの中心から取得された。Ａ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ。 Ｂ、Ｓ−８−オキソシトロネラ−ル６。Ｃ、シス−トランス−イリドジアール５ａ．＋ ５ａ ’。 Ｄ、トランス−シス−イリドジアール５ｃ． ＋５c ’。 Ｅ、トランス−トランス−イリドジアール５ｄ．＋５ｄ ’。Ｆ、０．５ｍＭの６及び０．５ＭのＭＯＰＳを含む反応からの未知のピークａ及びｂ。ＲＴ＝保持時間（分）。
【００４５】
【図１３−１】図１３は、毛状突起に位置するネペタラクトールデヒドロゲナーゼの同定を示す。Ａ、ドライアイス磨耗を用いての毛状突起の分離。単離された毛状突起の代表的な顕微鏡写真。毛状突起の種類：非腺毛（ａ）、楯状毛状突起（ｂ）及び有頭突起（ｃ）。Ｂ、イソプレノイド２−Ｃ−メチルエリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）経路及びイリドイド生合成経路。Ｃ、毛状突起におけるＭＥＰ及びイリドイド生合成タンパク質の富化。タンパク質はＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアノテーシャン及びショットガンプロテオミクスにより推定的に識別された。ＭＣＳ及びＣＭＳを除いて、全てのタンパク質は、有意に毛状突起富化された（毛状突起が枯渇した葉と比較しての毛状突起、Ｆｉｓｈｅｒの直接確立検定、Ｐ＜０．０５）。ＴＤＬ＝毛状突起枯渇葉、Ｌ＝葉、ＰＡ＝タンパク質アバンダンス（総スペクトル）。Ｄ、毛状突起における選択されたオキシドレダクターゼの富化。全てのタンパク質は、有意に毛状突起富化された（毛状突起が枯渇した葉と比較しての毛状突起、Ｆｉｓｈｅｒの直接確立検定、Ｐ＜０．０５）。特徴づけられたN. mussiniiＩＳＹが比較のために含まれた。Ｅ、シス−トランス−ネペタラクトールデヒドロゲナーゼ活性の観察。毛状突起に富むオキシドレダクターゼがクローン化され、発現され、そして１ｍＭのＮＡＤ＋、０．５ｍＭのシス−トランス−ネペタラクトール４ａ及び５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．８）を含む清澄化されたライセートとしてアッセイされた。ＮＡＤＨの形成が、３４０ｎｍでの吸光度によってモニターされた。青のバーは、反応の最初の５分間のＡ３４０の平均であり、緑色のバーは反応の最後の５分間（反応時間３０分）のＡ３４０の平均である。エラーバーは、平均からの１つの標準偏差を示す。Ａ＝吸光度（３４０ｎｍ）ＡＵ、Ｂ＝ブランク、ＥＶ＝空のベクター。
【００４６】
【図１３−２】図１３は、毛状突起に位置するネペタラクトールデヒドロゲナーゼの同定を示す。Ａ、ドライアイス磨耗を用いての毛状突起の分離。単離された毛状突起の代表的な顕微鏡写真。毛状突起の種類：非腺毛（ａ）、楯状毛状突起（ｂ）及び有頭突起（ｃ）。Ｂ、イソプレノイド２−Ｃ−メチルエリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）経路及びイリドイド生合成経路。Ｃ、毛状突起におけるＭＥＰ及びイリドイド生合成タンパク質の富化。タンパク質はＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアノテーシャン及びショットガンプロテオミクスにより推定的に識別された。ＭＣＳ及びＣＭＳを除いて、全てのタンパク質は、有意に毛状突起富化された（毛状突起が枯渇した葉と比較しての毛状突起、Ｆｉｓｈｅｒの直接確立検定、Ｐ＜０．０５）。ＴＤＬ＝毛状突起枯渇葉、Ｌ＝葉、ＰＡ＝タンパク質アバンダンス（総スペクトル）。Ｄ、毛状突起における選択されたオキシドレダクターゼの富化。全てのタンパク質は、有意に毛状突起富化された（毛状突起が枯渇した葉と比較しての毛状突起、Ｆｉｓｈｅｒの直接確立検定、Ｐ＜０．０５）。特徴づけられたN. mussiniiＩＳＹが比較のために含まれた。Ｅ、シス−トランス−ネペタラクトールデヒドロゲナーゼ活性の観察。毛状突起に富むオキシドレダクターゼがクローン化され、発現され、そして１ｍＭのＮＡＤ＋、０．５ｍＭのシス−トランス−ネペタラクトール４ａ及び５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．８）を含む清澄化されたライセートとしてアッセイされた。ＮＡＤＨの形成が、３４０ｎｍでの吸光度によってモニターされた。青のバーは、反応の最初の５分間のＡ３４０の平均であり、緑色のバーは反応の最後の５分間（反応時間３０分）のＡ３４０の平均である。エラーバーは、平均からの１つの標準偏差を示す。Ａ＝吸光度（３４０ｎｍ）ＡＵ、Ｂ＝ブランク、ＥＶ＝空のベクター。
【００４７】
【図１４−１】図１４は、図３からの化合物の電子イオン化（ＥＩ）スペクトルを示す。Ａ、図３Ｂ及びＣ（脱水素反応）からの生成物（シス−トランス−ネペタラクトン１ａ及びシス−シス−ネペタラクトン１ｂ）のスペクトル．Ｂ、図３Ｄ：（ＮＥＰＳ及びＩＳＹとのカスケード）からのシス−トランス−ネペタラクトール４ａ生成物。Ｃ、図３Ｄからのシス−シス−ネペタラクトールｌ４ｂ。 Ｄ、図３Ｄからのシス−トランス−ネペタラクトン１ａ。Ｅ、図３Ｄからのシス−シス−ネペタラクトン１ｂ。 Ｆ、図３Ｄからのトランス−シス−ネペタラクトン１ｃ。ＳＴＤ ＝標準、Ａ ＝アバンダンス。
【００４８】
【図１４−２】図１４は、図３からの化合物の電子イオン化（ＥＩ）スペクトルを示す。Ａ、図３Ｂ及びＣ（脱水素反応）からの生成物（シス−トランス−ネペタラクトン１ａ及びシス−シス−ネペタラクトン１ｂ）のスペクトル．Ｂ、図３Ｄ：（ＮＥＰＳ及びＩＳＹとのカスケード）からのシス−トランス−ネペタラクトール４ａ生成物。Ｃ、図３Ｄからのシス−シス−ネペタラクトールｌ４ｂ。 Ｄ、図３Ｄからのシス−トランス−ネペタラクトン１ａ。Ｅ、図３Ｄからのシス−シス−ネペタラクトン１ｂ。 Ｆ、図３Ｄからのトランス−シス−ネペタラクトン１ｃ。ＳＴＤ ＝標準、Ａ ＝アバンダンス。
【００４９】
【図１４−３】図１４は、図３からの化合物の電子イオン化（ＥＩ）スペクトルを示す。Ａ、図３Ｂ及びＣ（脱水素反応）からの生成物（シス−トランス−ネペタラクトン１ａ及びシス−シス−ネペタラクトン１ｂ）のスペクトル．Ｂ、図３Ｄ：（ＮＥＰＳ及びＩＳＹとのカスケード）からのシス−トランス−ネペタラクトール４ａ生成物。Ｃ、図３Ｄからのシス−シス−ネペタラクトールｌ４ｂ。 Ｄ、図３Ｄからのシス−トランス−ネペタラクトン１ａ。Ｅ、図３Ｄからのシス−シス−ネペタラクトン１ｂ。 Ｆ、図３Ｄからのトランス−シス−ネペタラクトン１ｃ。ＳＴＤ ＝標準、Ａ ＝アバンダンス。
【００５０】
【図１４−４】図１４は、図３からの化合物の電子イオン化（ＥＩ）スペクトルを示す。Ａ、図３Ｂ及びＣ（脱水素反応）からの生成物（シス−トランス−ネペタラクトン１ａ及びシス−シス−ネペタラクトン１ｂ）のスペクトル．Ｂ、図３Ｄ：（ＮＥＰＳ及びＩＳＹとのカスケード）からのシス−トランス−ネペタラクトール４ａ生成物。Ｃ、図３Ｄからのシス−シス−ネペタラクトールｌ４ｂ。 Ｄ、図３Ｄからのシス−トランス−ネペタラクトン１ａ。Ｅ、図３Ｄからのシス−シス−ネペタラクトン１ｂ。 Ｆ、図３Ｄからのトランス−シス−ネペタラクトン１ｃ。ＳＴＤ ＝標準、Ａ ＝アバンダンス。
【００５１】
【図１４−５】図１４は、図３からの化合物の電子イオン化（ＥＩ）スペクトルを示す。Ａ、図３Ｂ及びＣ（脱水素反応）からの生成物（シス−トランス−ネペタラクトン１ａ及びシス−シス−ネペタラクトン１ｂ）のスペクトル．Ｂ、図３Ｄ：（ＮＥＰＳ及びＩＳＹとのカスケード）からのシス−トランス−ネペタラクトール４ａ生成物。Ｃ、図３Ｄからのシス−シス−ネペタラクトールｌ４ｂ。 Ｄ、図３Ｄからのシス−トランス−ネペタラクトン１ａ。Ｅ、図３Ｄからのシス−シス−ネペタラクトン１ｂ。 Ｆ、図３Ｄからのトランス−シス−ネペタラクトン１ｃ。ＳＴＤ ＝標準、Ａ ＝アバンダンス。
【００５２】
【図１４−６】図１４は、図３からの化合物の電子イオン化（ＥＩ）スペクトルを示す。Ａ、図３Ｂ及びＣ（脱水素反応）からの生成物（シス−トランス−ネペタラクトン１ａ及びシス−シス−ネペタラクトン１ｂ）のスペクトル．Ｂ、図３Ｄ：（ＮＥＰＳ及びＩＳＹとのカスケード）からのシス−トランス−ネペタラクトール４ａ生成物。Ｃ、図３Ｄからのシス−シス−ネペタラクトールｌ４ｂ。 Ｄ、図３Ｄからのシス−トランス−ネペタラクトン１ａ。Ｅ、図３Ｄからのシス−シス−ネペタラクトン１ｂ。 Ｆ、図３Ｄからのトランス−シス−ネペタラクトン１ｃ。ＳＴＤ ＝標準、Ａ ＝アバンダンス。
【００５３】
【図１５−１】図１５は、ＮＥＰＳ酵素の配列及び系統発生を示す。Ａ、Nepeta mussiniiからクローン化されたＮＥＰＳ酵素のアミノ酸配列。Nepeta mussiniiイソピペリテノール／カルベオールデヒドロゲナーゼ（ＭｐＩＰＤＨ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ５Ｃ９１９）が、比較のために含まれた。配列の下で強調表示されている重要な残基：＊は、ＳＤＲ触媒テトラッド（Ｎ−Ｙ−Ｋ−Ｔ／Ｓ）であり、そしてＯは、ＮＥＰＳ３におけるオキシアニオン結合に関与していると仮定されている。Ｂ、ＮＥＰＳ酵素とＭｐＩＰＤＨとの間の配列同一性（％）。パネルａにおける配置に基く。Ｃ、ＮＥＰＳ酵素の進化的背景。この研究で試験されたＮＥＰＳ酵素は、以前に特徴付けられたＭｐＩＰＤＨ酵素と同様に、太字で示されている。ＮＥＰＳ１配列を用いて、ミント植物ファミリー（Lamiaceae）全体から密接に関連する配列を取得した。Lamiaceae及び外群の配列は、Mint Genome Project (http://mints.plantbiology.msu.edu/, NCBI BioProject PRJNA359989)から入手された。相同配列はＢＬＡＳＴにより同定され、そしてキュレーションされ、完全長配列のみを保持し、そして近いパラログを削除した（＞９５％同一性）。コード配列を整列し、そして最尤系統樹を推定した。ＮＥＰＳ酵素は、ネペタに固有の単一のクレード（太字）に位置するように見え、これは、それらの酵素がネペタ系統内で進化したことを意味する。Nepeta mussiniiの２つの栽培品種からの配列が含まれる：この研究で使用された栽培品種（及びＭｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔで使用された栽培品種）。種の頭字語：AGFO, Agastache foeniculum; AUPE、Aureolaria pectinata (outgroup); BAPS、Ballota pseudodictamnus; COPY、Cornutia pyramidata; GLHE、Glechoma hederacea; GMPH、 Gmelina philippensis; HOSA、 Holmskioldia sanguinea; HYOF、 Hyssopus officinalis; HYSU、 Hyptis suaveolens; LAAL、 Lamium album; LATI、Lancea tibetica (outgroup); LECA、 Leonurus cardiaca; LYAM、Lycopus americanus; MAVU、Marrubium vulgare; MEOF、 Melissa officinalis; MEPI、 Mentha x piperita; MESP、Mentha spicata; MODI、 Monarda didyma; NECA、Nepeta cataria; NEMU、 Nepeta mussinii; ORMA、Origanum majorana; PEAT、Perovskia atriplicifolia; PEBA、 Petraeovitex bambusetorium; PHFR、Phlomis fruticosa; ROMY、Rotheca myricoides; ROOF、Rosmarinus officinalis; SAHI、Salvia hispanica; SCBA、Scutellaria baicalensis; STOF、Stachys officinalis/Betonica officinalis; THVU、Thymus vulgaris; VIAG、Vitex agnus-castus。選択された遺伝子ラベル：a = NECA_c35378_g1_i1、b = NEMU_c14104_g1_i1、 c = SAHI_c28856_g3_i1、d = SAHI_c28856_g1_i2、e = MESP_c41507_g1_i、f = MpIPDH。ＣＳ＝クレードのサポート、ＳＰＣ＝コドン当たりの置換。
【００５４】
【図１５−２】図１５は、ＮＥＰＳ酵素の配列及び系統発生を示す。Ａ、Nepeta mussiniiからクローン化されたＮＥＰＳ酵素のアミノ酸配列。Nepeta mussiniiイソピペリテノール／カルベオールデヒドロゲナーゼ（ＭｐＩＰＤＨ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ５Ｃ９１９）が、比較のために含まれた。配列の下で強調表示されている重要な残基：＊は、ＳＤＲ触媒テトラッド（Ｎ−Ｙ−Ｋ−Ｔ／Ｓ）であり、そしてＯは、ＮＥＰＳ３におけるオキシアニオン結合に関与していると仮定されている。Ｂ、ＮＥＰＳ酵素とＭｐＩＰＤＨとの間の配列同一性（％）。パネルａにおける配置に基く。Ｃ、ＮＥＰＳ酵素の進化的背景。この研究で試験されたＮＥＰＳ酵素は、以前に特徴付けられたＭｐＩＰＤＨ酵素と同様に、太字で示されている。ＮＥＰＳ１配列を用いて、ミント植物ファミリー（Lamiaceae）全体から密接に関連する配列を取得した。Lamiaceae及び外群の配列は、Mint Genome Project (http://mints.plantbiology.msu.edu/, NCBI BioProject PRJNA359989)から入手された。相同配列はＢＬＡＳＴにより同定され、そしてキュレーションされ、完全長配列のみを保持し、そして近いパラログを削除した（＞９５％同一性）。コード配列を整列し、そして最尤系統樹を推定した。ＮＥＰＳ酵素は、ネペタに固有の単一のクレード（太字）に位置するように見え、これは、それらの酵素がネペタ系統内で進化したことを意味する。Nepeta mussiniiの２つの栽培品種からの配列が含まれる：この研究で使用された栽培品種（及びＭｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔで使用された栽培品種）。種の頭字語：AGFO, Agastache foeniculum; AUPE、Aureolaria pectinata (outgroup); BAPS、Ballota pseudodictamnus; COPY、Cornutia pyramidata; GLHE、Glechoma hederacea; GMPH、 Gmelina philippensis; HOSA、 Holmskioldia sanguinea; HYOF、 Hyssopus officinalis; HYSU、 Hyptis suaveolens; LAAL、 Lamium album; LATI、Lancea tibetica (outgroup); LECA、 Leonurus cardiaca; LYAM、Lycopus americanus; MAVU、Marrubium vulgare; MEOF、 Melissa officinalis; MEPI、 Mentha x piperita; MESP、Mentha spicata; MODI、 Monarda didyma; NECA、Nepeta cataria; NEMU、 Nepeta mussinii; ORMA、Origanum majorana; PEAT、Perovskia atriplicifolia; PEBA、 Petraeovitex bambusetorium; PHFR、Phlomis fruticosa; ROMY、Rotheca myricoides; ROOF、Rosmarinus officinalis; SAHI、Salvia hispanica; SCBA、Scutellaria baicalensis; STOF、Stachys officinalis/Betonica officinalis; THVU、Thymus vulgaris; VIAG、Vitex agnus-castus。選択された遺伝子ラベル：a = NECA_c35378_g1_i1、b = NEMU_c14104_g1_i1、 c = SAHI_c28856_g3_i1、d = SAHI_c28856_g1_i2、e = MESP_c41507_g1_i、f = MpIPDH。ＣＳ＝クレードのサポート、ＳＰＣ＝コドン当たりの置換。
【００５５】
【図１６】図１６は、ＮＥＰＳ酵素及びネペタラクトン関連基質を用いての酵素アッセイを示す。Ａ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａからシス−トランス−ネペタラクトン１ａ。Ｂ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂからシス−シス−ネペタラクトン１ｂ。Ｃ、シス−トランス−イリドジアール５ａ からシス−トランス−ネペタラクトン１ａ。Ｄ、シス−シス−イリドジアール５ｂからシス−シス−ネペタラクトン１ｂ。Ｅ、 トランス−シス−イリドジアール５ｃからトランス−シス−ネペタラクトン１ｃ。Ｆ、シス-トランス-ネペタラクトン１ａ から未知の生成物。Ｇ、８−オキソゲラニアル２から未知の生成物への還元。４ａ及び４ｂによるＮＥＰＳ１デヒドロケナーゼ活性以外に、他の注目すべき活性は観察されない（すなわち、基質は生成物に変換されない）。ＮＥＰＳ１は、５ａにより微量の１ａを生成するに見えるが、しかしながら、これは単に基質サンプルに存在する残留物４ａの変換である可能性がある。また、それぞれ、５ｂ及び５ｃのサンプルにおいては、ＮＥＰＳ１によるネペタラクトン１ｂ及び１ｃの微量形成も存在する。１ａの未知の分解生成物（＊によりマークされている）は、基質として１ａを用いたサンプルに存在する。これはまた、煮沸酵素対照にも存在するので、ＮＥＰＳ活性であるとは見なされなかった。ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして提示された反応。全条件：ＮＡＤ＋の変わりにＮＡＤＨを使用したｇを除いて、０．５ｍＭの基質、１ｍＭのＮＡＤ＋、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、０．１ＭのＮａＣｌ。ＲＴ＝Ｏ保持時間（分）、Ｂ＝煮沸。
【００５６】
【図１７】図１７は、２つの異なるＩＳＹとのＮＥＰＳ酵素の挙動を示す。２、ＩＳＹ（ＣｒＩＳＹ又はＮｍＩＳＹ２）、ＮＥＳＰ（１及び／又は３）、補因子及び緩衝液とのカスケード反応。形成された生成物：シス−トランス−ネペタラクトン１ａ、シス−シス−ネペタラクトン１ｂ、トランス−シス−ネペタラクトン１ｃ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ、イリドジアール５、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７及びＳ−８−オキソシトロネラール６。条件：２ μＭ のＮＥＰＳ、０．５ μＭの ＩＳＹ、１ ｍＭの ＮＡＤＰＨ、５ ｍＭの ＮＡＤ ＋、０．１ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。ＮＥＰＳ酵素の挙動は、使用されるＩＳＹにより影響されるとは思えない。これは、ＣｒＩＳＹ及びＮｍＩＳＹの進化距離及び低い配列同一性のために特に注目に値する。この結果は、ＩＳＹとＮＥＰＳとの活性間の相互使用が本質的に化学的であり、そして特定のタンパク質−タンパク質相互作用に依存していないことを示唆している。クロマトグラム間で唯一の観察できる差異は、ＣｒＩＳＹとの反応における微量な二重還元生成物７の存在である。これは、無差別的なＣｒＩＳＹ活性の結果である。ＲＴ＝保持時間（分）。
【００５７】
【図１８−１】図１８は、ＩＳＹと組合してのＮＥＰＳ３活性に対する酵素及び補因子濃度の影響を示す。測定された生成物：シス−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ、シス−トランス−イリドジアール５ａ、トランス−トランス−イリドジアール５ｄ、トランス−シス−イリドジアール５ｃ、シス−シス−ネペタラクトン１ｂ、８−オキソゲラニアル２、８−オキソネラルＯＮ。ＰＡとして報告される変換＝ピーク面積（全体の７％）。Ａ、生成物に対するＮＥＰＳ３濃度の影響。ＮＥＰＳ３濃度が高められるにつれて、形成されるシス−シス−ネペタラクトール４ｂの割合は高まる。シスオ−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−トランス−イリドジアール５ａ及びトランス−シス−イリドジアール５ｃの割合は下降する。高ＮＥＰＳ３濃度で、微量のシス−シス−ネペタラクトンの形成が観察される。０．５ μＭの ＣｒＩＳＹ、０．５ ｍＭの ２、１ ｍＭ のＮＡＤ ＋、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、５０ ｍＭ のＨＥＰＥＳ ｐＨ ８、及び１００ ｍＭ のＮａＣｌとの反応が行われた。Ｂ、ＮＡＤ＋濃度の影響。反応は０．５ｍＭの８−オキソゲラニアル２を含み、そして同等量のＮＡＤ＋が垂直の点線で表される。ＮＡＤ＋が反応で消費される場合（化学量論が２に等しい場合）、５００μＭで最大の変換が期待され、そしてこれを越える濃度では、変化はない。しかしながら、５０〜１５０μＭ〔ＮＡＤ＋〕で、生成物の比率は最大に達し、そして＞２００μＭで、比較的安定しているように見え、特に、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ及びシス−シス−ネペタラクトール４ｂの比率が顕著である。ＮＡＤ＋の消費を必要とする酸化生成物であるシス−シス−ネペタラクトン１ｂのみが、異なる挙動を示す。さらに、残る基質２がいずれのサンプルにも観察されず、このことは、完全な変換を示唆する。０〜１５０μＭ〔ＮＡＤ＋〕の間で、４a 及び４ｂの比率は変化しているように見え、ＮＡＤ＋が補充されるにつれて、４ｂ濃度が上昇する。このデータは、ＮＡＤ＋がＮＥＰＳ３触媒された４ｂの形成では消費されず（すなわち、環化は酸化還元的ではない）、その存在は４ｂの形成を助けることを示唆している。それは、厳密に触媒的役割を演じているように見え、例えばＮＥＰＳ３構造に寄与するように見える。反応がパネルａと同様に行われたが、〔ＮＡＤ＋〕を変え、そして５μＭのＮＥＰＳ３を固定した。Ｃ、ＮＡＤＰＨ濃度の影響。反応は０．５ｍＭの８−オキソゲラニアル２を含み、そして同等の化学量論量のＮＡＤＰＨが垂直の点線で表されている。ＮＡＤＰＨが反応で消費される場合（化学量論が２に等しい場合）、５００μＭで最大の変換が期待され、そしてこの濃度を越えると変化はない。これは本質的に観察されるものである。シス−トランス−ネペタラクトール４ａ及びシス−シス−ネペタラクトール４ｂの相対的比率は、〔ＮＡＤＰＨ〕を変更することにより影響を受けず、しかし全体的な変換は、〔ＮＡＤＰＨ〕、＜５００μＭの場合、制限されるように見える。これはまた、〔ＮＡＤＰＨ〕＜５００μＭで、未反応の基質２において観察される。ＮＡＤＰＨは、ＩＳＹ触媒された還元により消費されるように見え、そしてＮＥＰＳ３の環化には影���しない。反応は、パネルａと同様に行われたが、しかし〔ＮＡＤＰＨ〕は、変化させ、そして５μＭのＮＥＰＳ３は固定された。生成物のピーク面積は、生成物のピーク面積を総生成物ピークの面積により割ることにより得られる、生成物の割合として表される。生成物のピーク面積は、標準曲線により正規化され、絶対濃度を表すものではない。５ａ′及び５ｄ′のピークはＧＣ方法において重なっていることに注意すること。すなわち、それらの化合物のピーク面積は、ピークショルダーとしてではなく、スプリットピーク（すなわち、ベースラインの両方）として測定された。
【００５８】
【図１８−２】図１８は、ＩＳＹと組合してのＮＥＰＳ３活性に対する酵素及び補因子濃度の影響を示す。測定された生成物：シス−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ、シス−トランス−イリドジアール５ａ、トランス−トランス−イリドジアール５ｄ、トランス−シス−イリドジアール５ｃ、シス−シス−ネペタラクトン１ｂ、８−オキソゲラニアル２、８−オキソネラルＯＮ。ＰＡとして報告される変換＝ピーク面積（全体の７％）。Ａ、生成物に対するＮＥＰＳ３濃度の影響。ＮＥＰＳ３濃度が高められるにつれて、形成されるシス−シス−ネペタラクトール４ｂの割合は高まる。シスオ−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−トランス−イリドジアール５ａ及びトランス−シス−イリドジアール５ｃの割合は下降する。高ＮＥＰＳ３濃度で、微量のシス−シス−ネペタラクトンの形成が観察される。０．５ μＭの ＣｒＩＳＹ、０．５ ｍＭの ２、１ ｍＭ のＮＡＤ ＋、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、５０ ｍＭ のＨＥＰＥＳ ｐＨ ８、及び１００ ｍＭ のＮａＣｌとの反応が行われた。Ｂ、ＮＡＤ＋濃度の影響。反応は０．５ｍＭの８−オキソゲラニアル２を含み、そして同等量のＮＡＤ＋が垂直の点線で表される。ＮＡＤ＋が反応で消費される場合（化学量論が２に等しい場合）、５００μＭで最大の変換が期待され、そしてこれを越える濃度では、変化はない。しかしながら、５０〜１５０μＭ〔ＮＡＤ＋〕で、生成物の比率は最大に達し、そして＞２００μＭで、比較的安定しているように見え、特に、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ及びシス−シス−ネペタラクトール４ｂの比率が顕著である。ＮＡＤ＋の消費を必要とする酸化生成物であるシス−シス−ネペタラクトン１ｂのみが、異なる挙動を示す。さらに、残る基質２がいずれのサンプルにも観察されず、このことは、完全な変換を示唆する。０〜１５０μＭ〔ＮＡＤ＋〕の間で、４a 及び４ｂの比率は変化しているように見え、ＮＡＤ＋が補充されるにつれて、４ｂ濃度が上昇する。このデータは、ＮＡＤ＋がＮＥＰＳ３触媒された４ｂの形成では消費されず（すなわち、環化は酸化還元的ではない）、その存在は４ｂの形成を助けることを示唆している。それは、厳密に触媒的役割を演じているように見え、例えばＮＥＰＳ３構造に寄与するように見える。反応がパネルａと同様に行われたが、〔ＮＡＤ＋〕を変え、そして５μＭのＮＥＰＳ３を固定した。Ｃ、ＮＡＤＰＨ濃度の影響。反応は０．５ｍＭの８−オキソゲラニアル２を含み、そして同等の化学量論量のＮＡＤＰＨが垂直の点線で表されている。ＮＡＤＰＨが反応で消費される場合（化学量論が２に等しい場合）、５００μＭで最大の変換が期待され、そしてこの濃度を越えると変化はない。これは本質的に観察されるものである。シス−トランス−ネペタラクトール４ａ及びシス−シス−ネペタラクトール４ｂの相対的比率は、〔ＮＡＤＰＨ〕を変更することにより影響を受けず、しかし全体的な変換は、〔ＮＡＤＰＨ〕、＜５００μＭの場合、制限されるように見える。これはまた、〔ＮＡＤＰＨ〕＜５００μＭで、未反応の基質２において観察される。ＮＡＤＰＨは、ＩＳＹ触媒された還元により消費されるように見え、そしてＮＥＰＳ３の環化には影���しない。反応は、パネルａと同様に行われたが、しかし〔ＮＡＤＰＨ〕は、変化させ、そして５μＭのＮＥＰＳ３は固定された。生成物のピーク面積は、生成物のピーク面積を総生成物ピークの面積により割ることにより得られる、生成物の割合として表される。生成物のピーク面積は、標準曲線により正規化され、絶対濃度を表すものではない。５ａ′及び５ｄ′のピークはＧＣ方法において重なっていることに注意すること。すなわち、それらの化合物のピーク面積は、ピークショルダーとしてではなく、スプリットピーク（すなわち、ベースラインの両方）として測定された。
【００５９】
【図１８−３】図１８は、ＩＳＹと組合してのＮＥＰＳ３活性に対する酵素及び補因子濃度の影響を示す。測定された生成物：シス−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ、シス−トランス−イリドジアール５ａ、トランス−トランス−イリドジアール５ｄ、トランス−シス−イリドジアール５ｃ、シス−シス−ネペタラクトン１ｂ、８−オキソゲラニアル２、８−オキソネラルＯＮ。ＰＡとして報告される変換＝ピーク面積（全体の７％）。Ａ、生成物に対するＮＥＰＳ３濃度の影響。ＮＥＰＳ３濃度が高められるにつれて、形成されるシス−シス−ネペタラクトール４ｂの割合は高まる。シスオ−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−トランス−イリドジアール５ａ及びトランス−シス−イリドジアール５ｃの割合は下降する。高ＮＥＰＳ３濃度で、微量のシス−シス−ネペタラクトンの形成が観察される。０．５ μＭの ＣｒＩＳＹ、０．５ ｍＭの ２、１ ｍＭ のＮＡＤ ＋、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、５０ ｍＭ のＨＥＰＥＳ ｐＨ ８、及び１００ ｍＭ のＮａＣｌとの反応が行われた。Ｂ、ＮＡＤ＋濃度の影響。反応は０．５ｍＭの８−オキソゲラニアル２を含み、そして同等量のＮＡＤ＋が垂直の点線で表される。ＮＡＤ＋が反応で消費される場合（化学量論が２に等しい場合）、５００μＭで最大の変換が期待され、そしてこれを越える濃度では、変化はない。しかしながら、５０〜１５０μＭ〔ＮＡＤ＋〕で、生成物の比率は最大に達し、そして＞２００μＭで、比較的安定しているように見え、特に、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ及びシス−シス−ネペタラクトール４ｂの比率が顕著である。ＮＡＤ＋の消費を必要とする酸化生成物であるシス−シス−ネペタラクトン１ｂのみが、異なる挙動を示す。さらに、残る基質２がいずれのサンプルにも観察されず、このことは、完全な変換を示唆する。０〜１５０μＭ〔ＮＡＤ＋〕の間で、４a 及び４ｂの比率は変化しているように見え、ＮＡＤ＋が補充されるにつれて、４ｂ濃度が上昇する。このデータは、ＮＡＤ＋がＮＥＰＳ３触媒された４ｂの形成では消費されず（すなわち、環化は酸化還元的ではない）、その存在は４ｂの形成を助けることを示唆している。それは、厳密に触媒的役割を演じているように見え、例えばＮＥＰＳ３構造に寄与するように見える。反応がパネルａと同様に行われたが、〔ＮＡＤ＋〕を変え、そして５μＭのＮＥＰＳ３を固定した。Ｃ、ＮＡＤＰＨ濃度の影響。反応は０．５ｍＭの８−オキソゲラニアル２を含み、そして同等の化学量論量のＮＡＤＰＨが垂直の点線で表されている。ＮＡＤＰＨが反応で消費される場合（化学量論が２に等しい場合）、５００μＭで最大の変換が期待され、そしてこの濃度を越えると変化はない。これは本質的に観察されるものである。シス−トランス−ネペタラクトール４ａ及びシス−シス−ネペタラクトール４ｂの相対的比率は、〔ＮＡＤＰＨ〕を変更することにより影響を受けず、しかし全体的な変換は、〔ＮＡＤＰＨ〕、＜５００μＭの場合、制限されるように見える。これはまた、〔ＮＡＤＰＨ〕＜５００μＭで、未反応の基質２において観察される。ＮＡＤＰＨは、ＩＳＹ触媒された還元により消費されるように見え、そしてＮＥＰＳ３の環化には影���しない。反応は、パネルａと同様に行われたが、しかし〔ＮＡＤＰＨ〕は、変化させ、そして５μＭのＮＥＰＳ３は固定された。生成物のピーク面積は、生成物のピーク面積を総生成物ピークの面積により割ることにより得られる、生成物の割合として表される。生成物のピーク面積は、標準曲線により正規化され、絶対濃度を表すものではない。５ａ′及び５ｄ′のピークはＧＣ方法において重なっていることに注意すること。すなわち、それらの化合物のピーク面積は、ピークショルダーとしてではなく、スプリットピーク（すなわち、ベースラインの両方）として測定された。
【００６０】
【図１９−１】図１９は、８−オキソシトロネラール６、ＣｒＩＳＹ及びＮＥＰＳ酵素との反応を示す。０．５ｍＭのＳ−８−オキソシトロネラール６、０．５μＭのＣｒＩＳＹ、２μＭのＮＥＰＳ、０又は５ｍＭのＮＡＤ＋、１ｍＭのＮＡＤＰＨ、及び０．５ＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．５との反応のＧＣ−ＭＣ  ＴＩＣ。形成される化合物：テトラ−ヒドロ−８−オキソゲラニアル７及び生成物。ＣｒＩＳＹ及びＮＥＰＳの両方が存在する場合、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７の生成が注目に値する。ＣｒＩＳＹ＋ＮＥＰＳ２及びＣｒＩＳＹ＋ＮＥＰＳ３についてのＴＩＣアバンダンスは、３分の１に低められた。ＳＴＤ＝標準、ＲＴ＝保持時間（分）、Ｅ＝酵素。Ｂ、パネルa とは異なる反応におけるテトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７のＥＩスペクトル。Ａ＝アバンダンス。Ｃ、８−オキソシトロネラール６、ＣｒＩＳＹ及びＮＥＰＳとのカスケードで発生する提案された工程のスキーム。Ｂ ＝結合、Ｔ ＝互変異性、Ｃ ＝環化、Ｒ ＝還元、ＥＢ ＝酵素結合、ＣＰ＝環状生成物、ＦＳ ＝溶液中で遊離（ＮＥＰＳの存在下で低濃度）。酵素が存在しない場合、６は緩衝液により触媒された互変性化（エノール３へ）及び環化を受け、４ａ及びイリドジアールを形成する（パネルａ、上から２番目のクロマトグラム）。ＣｒＩＳＹは、６をテトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７に還元する。この還元は、自発的互変異性化／環化と競合している。すなわち、ＣｒＩＳＹが還元できない６は、互変異性化／環化工程を受ける（パネルａ、上から３番目のクロマトグラム）。ＣｒＩＳＹ及びＮＥＰＳの両方が添加される場合、互変異性化／環化工程は、最小限にされているように見え、そして７は蓄積する（パネルａ、下の３つのクロマトグラム）。これを説明するために、ＮＥＰＳは６を可逆的に結合し、溶液中で遊離６の濃度を低めると仮定する。次に、ＣｒＩＳＹは、遊離６を全て７に還元することができ、互変異性化／環化を受ける前、６を枯渇させることができる。ＮＥＰＳ２又は３との反応においては、この工程は、最終的に全ての６を７に変換するように見える（パネルａ、下の２つのクロマトグラム）。この工程の重要な側面は、ＮＥＰＳ酵素が、それをひっくり返すことなく６を結合しているように見えることである。これは、６ではなくエノール３がＮＥＰＳ酵素の重要な基質であるという概念を支持している。
【００６１】
【図１９−２】図１９は、８−オキソシトロネラール６、ＣｒＩＳＹ及びＮＥＰＳ酵素との反応を示す。０．５ｍＭのＳ−８−オキソシトロネラール６、０．５μＭのＣｒＩＳＹ、２μＭのＮＥＰＳ、０又は５ｍＭのＮＡＤ＋、１ｍＭのＮＡＤＰＨ、及び０．５ＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．５との反応のＧＣ−ＭＣ  ＴＩＣ。形成される化合物：テトラ−ヒドロ−８−オキソゲラニアル７及び生成物。ＣｒＩＳＹ及びＮＥＰＳの両方が存在する場合、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７の生成が注目に値する。ＣｒＩＳＹ＋ＮＥＰＳ２及びＣｒＩＳＹ＋ＮＥＰＳ３についてのＴＩＣアバンダンスは、３分の１に低められた。ＳＴＤ＝標準、ＲＴ＝保持時間（分）、Ｅ＝酵素。Ｂ、パネルa とは異なる反応におけるテトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７のＥＩスペクトル。Ａ＝アバンダンス。Ｃ、８−オキソシトロネラール６、ＣｒＩＳＹ及びＮＥＰＳとのカスケードで発生する提案された工程のスキーム。Ｂ ＝結合、Ｔ ＝互変異性、Ｃ ＝環化、Ｒ ＝還元、ＥＢ ＝酵素結合、ＣＰ＝環状生成物、ＦＳ ＝溶液中で遊離（ＮＥＰＳの存在下で低濃度）。酵素が存在しない場合、６は緩衝液により触媒された互変性化（エノール３へ）及び環化を受け、４ａ及びイリドジアールを形成する（パネルａ、上から２番目のクロマトグラム）。ＣｒＩＳＹは、６をテトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７に還元する。この還元は、自発的互変異性化／環化と競合している。すなわち、ＣｒＩＳＹが還元できない６は、互変異性化／環化工程を受ける（パネルａ、上から３番目のクロマトグラム）。ＣｒＩＳＹ及びＮＥＰＳの両方が添加される場合、互変異性化／環化工程は、最小限にされているように見え、そして７は蓄積する（パネルａ、下の３つのクロマトグラム）。これを説明するために、ＮＥＰＳは６を可逆的に結合し、溶液中で遊離６の濃度を低めると仮定する。次に、ＣｒＩＳＹは、遊離６を全て７に還元することができ、互変異性化／環化を受ける前、６を枯渇させることができる。ＮＥＰＳ２又は３との反応においては、この工程は、最終的に全ての６を７に変換するように見える（パネルａ、下の２つのクロマトグラム）。この工程の重要な側面は、ＮＥＰＳ酵素が、それをひっくり返すことなく６を結合しているように見えることである。これは、６ではなくエノール３がＮＥＰＳ酵素の重要な基質であるという概念を支持している。
【００６２】
【図１９−３】図１９は、８−オキソシトロネラール６、ＣｒＩＳＹ及びＮＥＰＳ酵素との反応を示す。０．５ｍＭのＳ−８−オキソシトロネラール６、０．５μＭのＣｒＩＳＹ、２μＭのＮＥＰＳ、０又は５ｍＭのＮＡＤ＋、１ｍＭのＮＡＤＰＨ、及び０．５ＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．５との反応のＧＣ−ＭＣ  ＴＩＣ。形成される化合物：テトラ−ヒドロ−８−オキソゲラニアル７及び生成物。ＣｒＩＳＹ及びＮＥＰＳの両方が存在する場合、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７の生成が注目に値する。ＣｒＩＳＹ＋ＮＥＰＳ２及びＣｒＩＳＹ＋ＮＥＰＳ３についてのＴＩＣアバンダンスは、３分の１に低められた。ＳＴＤ＝標準、ＲＴ＝保持時間（分）、Ｅ＝酵素。Ｂ、パネルa とは異なる反応におけるテトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７のＥＩスペクトル。Ａ＝アバンダンス。Ｃ、８−オキソシトロネラール６、ＣｒＩＳＹ及びＮＥＰＳとのカスケードで発生する提案された工程のスキーム。Ｂ ＝結合、Ｔ ＝互変異性、Ｃ ＝環化、Ｒ ＝還元、ＥＢ ＝酵素結合、ＣＰ＝環状生成物、ＦＳ ＝溶液中で遊離（ＮＥＰＳの存在下で低濃度）。酵素が存在しない場合、６は緩衝液により触媒された互変性化（エノール３へ）及び環化を受け、４ａ及びイリドジアールを形成する（パネルａ、上から２番目のクロマトグラム）。ＣｒＩＳＹは、６をテトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７に還元する。この還元は、自発的互変異性化／環化と競合している。すなわち、ＣｒＩＳＹが還元できない６は、互変異性化／環化工程を受ける（パネルａ、上から３番目のクロマトグラム）。ＣｒＩＳＹ及びＮＥＰＳの両方が添加される場合、互変異性化／環化工程は、最小限にされているように見え、そして７は蓄積する（パネルａ、下の３つのクロマトグラム）。これを説明するために、ＮＥＰＳは６を可逆的に結合し、溶液中で遊離６の濃度を低めると仮定する。次に、ＣｒＩＳＹは、遊離６を全て７に還元することができ、互変異性化／環化を受ける前、６を枯渇させることができる。ＮＥＰＳ２又は３との反応においては、この工程は、最終的に全ての６を７に変換するように見える（パネルａ、下の２つのクロマトグラム）。この工程の重要な側面は、ＮＥＰＳ酵素が、それをひっくり返すことなく６を結合しているように見えることである。これは、６ではなくエノール３がＮＥＰＳ酵素の重要な基質であるという概念を支持している。
【００６３】
【図２０】図２０は、ＮＥＰＳ３（６Ｆ９Ｑ）の構造を示す。Ａ、ＮＥＰＳ３テトラマー構造。サブユニットの主鎖リボンは、Ｎ末端（青）からＣ末端（赤）まで着色されている。ＮＡＤ＋補因子は、黒色の球として描かれている。Ｂ、セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼ（２ＢＧＬ）に整列されたＮＥＰＳ３サブユニットＡ構造。ＮＥＰＳ３は薄茶色のリボンとして描かれ、セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼは、シアン色のリボンとして描かれている。活性部位残基及びＮＡＤ＋はスティックとして描かれる。２つの酵素は、４２％の配列同一性を有する。Ｃ、リボンとして描かれたＮＥＰＳ３サブユニットＡ主鎖、及びスティックとして描かれたＮＡＤ＋。補因子のみについての１．４Åの分解能電子密度（青のメッシュ、２ｍＦｏ−ＤＦｃ、１σで輪部が描かれている）もまた示されている。Ｄ、ＣｒＩＳＹ基質結合部位（５ＤＢＩ）とＮＥＰＢＳ３塩化物結合部位との比較。塩化物は、ＣｒＩＳＹ上の部位（Ｋ１４６）と同様に、オキシアニオン部位（Ｓ１５４）を占めると仮定する。ＮＥＰＳ３における塩化物は、無秩序であり、そしてそれぞれ５０％の有占率で２つの位置Ａ及びＢで精製された。塩化物の位置Ｂは、全ての４つのサブユニットにおける位置Ａよりも低いＢ−因子を有する。このために、位置Ｂは電子密度への主要貢献体であるように見える。
【００６４】
【図２１−１】図２１は、ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ３変異体のスクリーニングを示す。ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ３変異体は、１０ｍｌの培養液において増殖され、部分的に精製され、そしてアッセイされた。アッセイは、０．５ ｍＭ の８−オキソゲラニアル２、０．２５ μＭの ＣｒＩＳＹ、２．５ ｍＭ のＮＡＤ ＋、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、及び０．１ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５を用いて実施された。観察される生成物は、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ及びシス−トランス−ネペタラクトン１ａであった。反応物は、３０℃で８時間インキュベートされた。ＮＥＰＳ濃度は、２８０ｎｍでの吸光度に基いて、約２μＭ（不純物を含む総タンパク質）であった。Ａ、可溶性発現を伴うＮＥＰＳ３変異体。Ｎ１５０Ｔは、ＮＥＰＳ３活性を維持している。Ｓ１５４Ｌ、Ｋ１６９Ｍ及びＭ１９６Ｓは、シス−シス−ネペタラクトール４ｂの低いか又は検出できない形成を示す。変異体Ａ１５１Ｔ、Ｇ１５２Ｔ、ＳＩ５３Ｐ、Ｙ１６５Ｆは、検出できる可溶性発現を有さない。Ｂ、シス−トランス−ネペタラクトン１a の検出可能な形成を示さないＮＥＰＳ１変異体：Ｔ１５２Ｎ、Ｌ１５６Ｓ、Ｙ１７６Ｆ、Ｋ１７１Ｍ、Ｔ２０２Ａ。＊（ＴＴ１５２ＮＡ、Ｓ１９８Ｍ）とラベルされたへに体は、不良な可溶性発現を示し、そして従って、低い変換は、低いＮＥＰＳ濃度の結果であり、単なる活性ではない。Ｃ、シス−トランス−ネペタラクトン１ａの検出できる形成を示すＮＥＰＳ１変異体。Ｖ１１０Ａは、シス−トランス−ネペタラクトン１ａへの最大の変換を示し、ＷＴよりも優れている。変異体Ｔ１５３Ａ及びＶ１９９Ａは、妥当な変換を示した。変異体Ｎ１２５Ａ及びＰ１５５Ｓは、微量ではあるが、検出可能な１ａの形成を触媒した。Ｎ１２５Ａは、不良な可溶性発現／精製を示し、そして従って、低い変換は低いＮＥＰＳ濃度の結果である可能性があり、単なる活性ではない。Ｄ、Ｔ１５４Ｇ置換を含むＮＥＰＳ１変異体。Ｔ１５４Ｇを含む全ての変異体は、ＷＴに比較して、シス−トランスネペタラクトール１４の高められた形成を示した。Ｔ１５４Ｇ及びＴＴＴ１５２ＮＡＧは、最大のシクラーゼ活性（４ａの形成及びイリドジアル５の低下）を示したが、妥当なデヒドロゲナーゼ活性を維持した（１ａの存在により証明された）。ＴＴＴＰ１５２ＮＡＧＳ及びＴＴＴＰＬ１５２ＮＡＧＳＳは、ＷＴよりも高い４ａの形成を示したが、しかしデヒドロゲナーゼ活性はごくわずかであった（１ａ）。Ｔ１５４Ｇが、さらに、図６、図２２及び表２において試験される。
【００６５】
【図２１−２】図２１は、ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ３変異体のスクリーニングを示す。ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ３変異体は、１０ｍｌの培養液において増殖され、部分的に精製され、そしてアッセイされた。アッセイは、０．５ ｍＭ の８−オキソゲラニアル２、０．２５ μＭの ＣｒＩＳＹ、２．５ ｍＭ のＮＡＤ ＋、１ ｍＭ のＮＡＤＰＨ、及び０．１ Ｍ のＭＯＰＳ ｐＨ ７．５を用いて実施された。観察される生成物は、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ及びシス−トランス−ネペタラクトン１ａであった。反応物は、３０℃で８時間インキュベートされた。ＮＥＰＳ濃度は、２８０ｎｍでの吸光度に基いて、約２μＭ（不純物を含む総タンパク質）であった。Ａ、可溶性発現を伴うＮＥＰＳ３変異体。Ｎ１５０Ｔは、ＮＥＰＳ３活性を維持している。Ｓ１５４Ｌ、Ｋ１６９Ｍ及びＭ１９６Ｓは、シス−シス−ネペタラクトール４ｂの低いか又は検出できない形成を示す。変異体Ａ１５１Ｔ、Ｇ１５２Ｔ、ＳＩ５３Ｐ、Ｙ１６５Ｆは、検出できる可溶性発現を有さない。Ｂ、シス−トランス−ネペタラクトン１a の検出可能な形成を示さないＮＥＰＳ１変異体：Ｔ１５２Ｎ、Ｌ１５６Ｓ、Ｙ１７６Ｆ、Ｋ１７１Ｍ、Ｔ２０２Ａ。＊（ＴＴ１５２ＮＡ、Ｓ１９８Ｍ）とラベルされたへに体は、不良な可溶性発現を示し、そして従って、低い変換は、低いＮＥＰＳ濃度の結果であり、単なる活性ではない。Ｃ、シス−トランス−ネペタラクトン１ａの検出できる形成を示すＮＥＰＳ１変異体。Ｖ１１０Ａは、シス−トランス−ネペタラクトン１ａへの最大の変換を示し、ＷＴよりも優れている。変異体Ｔ１５３Ａ及びＶ１９９Ａは、妥当な変換を示した。変異体Ｎ１２５Ａ及びＰ１５５Ｓは、微量ではあるが、検出可能な１ａの形成を触媒した。Ｎ１２５Ａは、不良な可溶性発現／精製を示し、そして従って、低い変換は低いＮＥＰＳ濃度の結果である可能性があり、単なる活性ではない。Ｄ、Ｔ１５４Ｇ置換を含むＮＥＰＳ１変異体。Ｔ１５４Ｇを含む全ての変異体は、ＷＴに比較して、シス−トランスネペタラクトール１４の高められた形成を示した。Ｔ１５４Ｇ及びＴＴＴ１５２ＮＡＧは、最大のシクラーゼ活性（４ａの形成及びイリドジアル５の低下）を示したが、妥当なデヒドロゲナーゼ活性を維持した（１ａの存在により証明された）。ＴＴＴＰ１５２ＮＡＧＳ及びＴＴＴＰＬ１５２ＮＡＧＳＳは、ＷＴよりも高い４ａの形成を示したが、しかしデヒドロゲナーゼ活性はごくわずかであった（１ａ）。Ｔ１５４Ｇが、さらに、図６、図２２及び表２において試験される。
【００６６】
【図２２−１】図２２は、ＮＥＰＳ１−Ｔ１５４Ｇ変異体の挙動を示す。Ａ、ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして提示される、８−オキソゲラニアル２、ＩＳＹ及びＮＥＰＳ１  ＷＴ又はＴ１５４Ｇとのカップリングアッセイの時間経過。図６Ｂに記載されている４ａ及び１ａのピーク面積。条件：０．５ ｍＭの ８−オキソゲラニアル２、０．５ ｕＭ のＣｒＩＳＹ、２ μＭ のＮＥＰＳ１変異体、１ ｍＭの ＮＡＤＰＨ、１ ｍＭ のＮＡＤ ＋、０．１ Ｍの ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。形成される生物：シス−トランス−ネペタラクトン１ａ、シス−シス−ネペタラクトン１ｂ、トランス−シス−ネペタラクトン１ｃ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ、シス−トランス−イリドジアール５ａ、トランス−トランス−イリドジアール５ａ、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７及びＳ−８−オキソシトロネラール６。ＲＴ＝保持時間（分）；Ｔ＝時間（時）。Ｂ、８−オキソシトロネラール６により調べられたＮＥＰＳ１のシクラーゼ活性。追加の補因子の不在の場合、ＮＥＳ１は、バックグラウンドレベルを超えるレベルで、６及び緩衝液の存在下でシス−トランス−ネペタラクトール４ａを検出可能に形成するようには見えない。対照的に、ＮＥＰＳ１−Ｔ１５４Ｇは同じ条件下でバックグラウンドレベルよりも高いレベルで４ａを形成する。ＮＥＰＳ−Ｔ１５４Ｇの速度論的分析が、表２に見出され得る。条件：０．５ ｍＭの Ｓ−８−オキソシトロネラール６、２０ μＭ のＮＥＰＳ１、０．５ Ｍの ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５、ＮＡＤ ＋なし。シス−トランス−ネペタラクトール４ａの形成が検出される。
【００６７】
【図２２−２】図２２は、ＮＥＰＳ１−Ｔ１５４Ｇ変異体の挙動を示す。Ａ、ＧＣ−ＭＳ  ＴＩＣとして提示される、８−オキソゲラニアル２、ＩＳＹ及びＮＥＰＳ１  ＷＴ又はＴ１５４Ｇとのカップリングアッセイの時間経過。図６Ｂに記載されている４ａ及び１ａのピーク面積。条件：０．５ ｍＭの ８−オキソゲラニアル２、０．５ ｕＭ のＣｒＩＳＹ、２ μＭ のＮＥＰＳ１変異体、１ ｍＭの ＮＡＤＰＨ、１ ｍＭ のＮＡＤ ＋、０．１ Ｍの ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５。形成される生物：シス−トランス−ネペタラクトン１ａ、シス−シス−ネペタラクトン１ｂ、トランス−シス−ネペタラクトン１ｃ、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ、シス−トランス−イリドジアール５ａ、トランス−トランス−イリドジアール５ａ、テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７及びＳ−８−オキソシトロネラール６。ＲＴ＝保持時間（分）；Ｔ＝時間（時）。Ｂ、８−オキソシトロネラール６により調べられたＮＥＰＳ１のシクラーゼ活性。追加の補因子の不在の場合、ＮＥＳ１は、バックグラウンドレベルを超えるレベルで、６及び緩衝液の存在下でシス−トランス−ネペタラクトール４ａを検出可能に形成するようには見えない。対照的に、ＮＥＰＳ１−Ｔ１５４Ｇは同じ条件下でバックグラウンドレベルよりも高いレベルで４ａを形成する。ＮＥＰＳ−Ｔ１５４Ｇの速度論的分析が、表２に見出され得る。条件：０．５ ｍＭの Ｓ−８−オキソシトロネラール６、２０ μＭ のＮＥＰＳ１、０．５ Ｍの ＭＯＰＳ ｐＨ ７．５、ＮＡＤ ＋なし。シス−トランス−ネペタラクトール４ａの形成が検出される。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
色の特徴への言及は、「キャットミント還元性テルベノイド生合成における非カップリング活性化及び環化」と提されたジャーナル論文のカラー図に対応する（Lichman et al., 2019, Nat Chem Biol 15: 71-79を参照のこと）。ここに提出された図におけるグレースケール特徴は、論文の図中の色の特徴と対応しており、そして以下の例に記載される色の特徴と相互参照され得る。
【００６９】
第１の側面によれば、本発明は、
（１）モノテルペノイド前駆体を供給し；
（２）酵素を供給し；そして
（３）前記モノテルペノイド前駆体と、前記酵素とを、モノテルペノイド化合物を生成するために、触媒条件下で接触させることを含み、ここで前記酵素は、配列番号１〔ＮＥＰＳ1〕、及び／又は配列番号２〔ＮＥＰＳ2〕、及び／又は配列番号３〔ＮＥＰＳ3〕を含むアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を含む、モノテルペノイド化合物の製造方法に関する。
【００７０】
前記酵素は、配列番号１を含むアミノ酸配列を含み、そして配列番号４を含むヌクレオチド配列によりコードされ、そして／又は前記酵素は、配列番号２を含むアミノ酸配列を含み、そして配列番号５を含むヌクレオチド配列によりコードされ、そして／又は前記酵素は、配列番号３を含むアミノ酸配列を含み、そして配列番号６を含むヌクレオチド配列によりコードされる。
【００７１】
前記モノテルペノイド化合物は、モノテルペンインドールアルカロイド（ＭＩＡ）を含む。
【００７２】
前記モノテルペノイド前駆体は、８−オキソシトロネリルエノール及び／又は８−オキソシトロネラール、及び／又はそれらの誘導体を含む。
【００７３】
前記酵素はさらに、イリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）、例えば配列番号７ ［ＡｍＩＳＹ］、配列番号８ ［ＮｍＩＳＹ２］又は配列番号９ ［ＣｒＩＳＹ］のアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を含むＩＳＹを含む。
【００７４】
ＩＳＹはさらに、配列番号１０〔ＡｍＩＳＹ〕を含むヌクレオチド配列によりコードされる配列番号７のアミノ酸配列、又は配列番号１１〔ＮｍＩＳＹ２〕を含むヌクレオチド配列によりコードされる配列番号８のアミノ酸配列、又は配列番号１２〔ＣｒＩＳＹ〕を含むヌクレオチド配列によりコードされる配列番号９のアミノ酸配列を含むことができる。モノテルぺノイド前駆体は、８−オキソゲラニアルを含むことができる。
【００７５】
モノテルペノイド前駆体又は化合物は、ネペタラクトールを含む。ネペタラクトールはシス−トランスネペタラクトールを含み、例えば、酵素は配列番号１及び／又は配列番号２を含むアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を含む。ネペタラクトールはシス−シスネペタラクトールを含み、そして酵素が配列番号１を含むアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を含む。
【００７６】
モノテルペノイド化合物は、ネペタラクトンを含む。ネペタラクトンはシス−トランスネペタラクトンを含み、酵素は配列番号１及び／又は配列番号２を含むアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を含む。ネペタラクトンはシス−シスネペタラクトンを含み、そして酵素は配列番号１及び／又は配列番号３を含むアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を含む。
【００７７】
ネペタラクトンは、シス−トランス−ネペタラクトン及びシス−シス−ネペタラクトンの両方を含むことができ、ここで前記酵素は、配列番号１及び／又は配列番号３を含むアミノ酸配列、又はその機能的変異体又は相同体を含む。
【００７８】
触媒条件は、酸化剤、例えば酸化されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を含むことができる。
【００７９】
モノテルペノイド化合物は、シクロペンタピラン及び／又はオキサデカリンを含むことができる。
【００８０】
本発明の方法は、インビボで、例えば植物において実施され得る。
【００８１】
１つの又は複数の酵素は、インビボでの発現、例えば異種発現により提供され得る。
【００８２】
本発明の方法は、インビトロで、例えば単離された植物細胞において実施され、ここで前記植物はNicotiana benthalmiana、Catharanthus roseus又はNepeta ssp．、例えばNepeta cataria、Nepeta racemosa、 Nepeta faassenii 又は Nepeta mussiniiであり得る。
【００８３】
本発明の方法は、酵母、例えばPichia pastoris 又は Saccharomyces cerevisiaeにおいて、又は細菌、例えばＥ．コリ（E. coli）において実施される。１つの又は複数の酵素が、酵母、細菌又は植物細胞において、発現により、例えば異種発現により提供され得る。
【００８４】
別の側面によれば、本発明は、本発明の方法に従って生物学的活性化合物を生成し、そしてモノテルペノイド化合物を、生物学的活性化合物に変換するための方法に関する。生物学的活性化合物は、昆虫忌避剤、昆虫誘引剤及び／又はネコ誘引剤であり得る。
【００８５】
生物学的活性化合物は、モノテルペンインドールアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、カンプトテシン、キニーネ及び／又はヨヒンビンであり得る。
【００８６】
別の側面によれば、本発明は、配列番号１を含むアミノ酸配列、又はその機能的変異体又は相同体を有する単離された酵素に関する。
【００８７】
別の側面によれば、本発明は、配列番号２を含むアミノ酸配列、又はその機能的変異体又は相同体を有する単離された酵素に関する。
【００８８】
別の側面によれば、本発明は、配列番号３を含むアミノ酸配列、又はその機能的変異体又は相同体を有する単離された酵素に関する。
【００８９】
別の側面によれば、本発明は、配列番号４を含むアミノ酸配列、又はその機能的変異体又は相同体を有する単離された酵素に関する。
【００９０】
別の側面によれば、本発明は、配列番号５を含むアミノ酸配列、又はその機能的変異体又は相同体を有する単離された酵素に関する。
【００９１】
別の側面によれば、本発明は、配列番号６を含むアミノ酸配列、又はその機能的変異体又は相同体を有する単離された酵素に関する。
【００９２】
別の側面によれば、本発明は、
配列番号１、配列番号２及び／又は配列番号３を含む群から選択された第１アミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を有する第１酵素を含み；そして任意にはまた、
配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９を含む群から選択されたアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を有する第２酵素を含む、キットに関する。
【００９３】
別の側面によれば、本発明は、本発明の単離された酵素、及び任意にはまた、配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９を含む群から選択されたアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を有する第２酵素をコードする発現ベクターに関する。発現ベクターは任意には、人工的な調節配列を含む。
【００９４】
別の側面によれば、本発明は、本発明の核酸配列及び／又は本発明の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００９５】
別の側面によれば、本発明は、本発明の酵素を発現し、そして任意にはまた、配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９を含む群から選択されたアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を有する第２酵素を発現するために遺伝子的に修飾された宿主細胞に関する。
【００９６】
別の側面によれば、本発明は本発明の宿主細胞に関し、ここで前記細胞は、酵母細胞、例えばPichia pastoris細胞、又は植物細胞、例えばNicotiana benthalmiana, Catharanthus roseus又は Nepeta ssp細胞、例えばNepeta cataria、Nepeta racemosa、Nepeta faassenii 又はNepeta mussinii細胞である。
【００９７】
別の側面は、本発明は、本発明の核酸及び／又は発現ベクターを含む遺伝子的に修飾された植物に関する。
【００９８】
さらに別の側面によれば、本発明は、本発明の酵素を発現するように遺伝子編集された、及び任意にはまた、配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９を含む群から選択されたアミノ酸配列、又はそれらの機能的変異体又は相同体を有する第２酵素を発現するように遺伝子編集された植物に関する。
【００９９】
本発明の植物は、Nicotiana benthalmiana、Catharanthus roseus又は Nepeta ssp、 例えばNepeta cataria、Nepeta racemosa、Nepeta faassenii又は Nepeta mussiniiであり得る
【０１００】
「変異体」とは、ネイティブ、非変異性又は野生型配列における遺伝的変異を含む。そのような遺伝的変異は、置換、欠失、挿入などから選択された突然変異を含む。
【０１０１】
より一般的には、本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸のポリマーを指す。この用語はポリマーの特定の長さを指していないため、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。用語「ポリペプチド」は、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などの発現後修飾を有するポリペプチドを含むことができる。「ポリペプチド」の定義内に含まれるものは、例えばアミノ酸の１つ又は複数の類似体（例えば、非天然のアミノ酸を含む）を含むポリペプチド、置換された結合を有するポリペプチド、並びに天然に存在する及び天然に存在しない当業界において知られている他の修飾を有するポリペプチドである。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「機能的変異体又は相同体」とは、参照配列に対して、少なくとも５０％の配列同一性、例えば少なくとも５５％の配列同一性、少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも６５％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド又はヌクレオチドとして定義される。
【０１０３】
ヌクレオチド又はアミノ酸配列の配列同一性は、配列のアラインメントを比較することにより決定され得る。比較される配列における同等の位置が同じ塩基又はアミノ酸により示される場合、分子はその位置で同一である。同一性の％としてのアラインメイントのスコアリングは、比較される配列により共有される位置での同一のアミノ酸又は塩基の数の関数である。配列を比較する場合、最適なアラインメントは、配列における可能性ある挿入及び欠失を考慮して、１つ又は複数の配列に導入されるギャップを必要とする。配列比較法は、ギャップペナルティを採用し、結果的に、比較される配列における同一分子の数が同じ場合、２つの比較される配列間の関連性が高いことを反映して、できるだけ少ないギャップを有する配列アライメントが、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成するであろう。最大％同一性の計算は、ギャップペナルティを考慮して、最適なアラインメントの生成を包含する。
【０１０４】
配列比較を実施するための適切なコンピュータープログラムは、商業及び公共部門で広く利用可能である。例としては、以下を含む：ＭａｔＧａｔ (Campanella et al., 2003, BMC Bioinformatics 4: 29; program available from http://bitincka.com/ledion/matgat)、 Ｇａｐ (Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)、 ＦＡＳＴＡ (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410; http://www.ebi.ac.uk/fastaから入手できるプログラム)、 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ ２．０ 及びＸ ２．０ (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948; http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2から入手できるプログラム) 及び ＥＭＢＯＳＳ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ (Needleman & Wunsch, 1970, supra;  Kruskal, 1983, In: Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, Sankoff & Kruskal (eds), pp 1-44, Addison Wesley; http://www.ebi.ac.uk/tools/emboss/alignから入手できるプログラム)。全てのプログラムは、デフォールトパラメーターを用いて実行され得る。
【０１０５】
例えば、配列比較は、ＥＭＢＯＳＳ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓの「ニードル」法を用いて行われ得、これは、２つの配列の全長にわたって考慮した場合に、それらの２つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）を決定し、そして同一スコアの％を提供する。アミノ酸配列比較のためのデフォルトパラメーター（「タンパク質分子」オプション）は、ギャップ拡張ペナルティ：０．５、ギャップオープンペナルティ：１０．０、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２である。ヌクレオチド配列比較のためのデフォルトパラメーター（「ＤＮＡ分子」オプション）は、ギャップ拡張ペナルティ：０．５、ギャップオープンペナルティ：１０．０、マトリックス：ＤＮＡｆｕｌｌである。
【０１０６】
本発明の１つの側面によれば、配列比較は、参照配列の全長にわたって実施され得る。
【０１０７】
本発明の特定の非限定的な実施形態が詳細に説明される。
【実施例】
【０１０８】
実施例１
序論：
テルペンシンターゼは典型的には、単一の酵素活性部位で線状出発材料の強調された活性化及び環化により、複雑な分子足場を形成する。ここで、非定型の還元性テルペンシンターゼであるイリドイドシンターゼが、その基質の８−オキソゲラニアルの反応性エノール中間体への活性化を触媒するが、ネペタラクトールへの続く環化を触媒しないことを示す。この発見は、この反応性中間体を捕捉し、そして異なるネペタラクトール立体異性体への立体選択的環化を触媒する、キャットミント（Nepeta mussinii）からのネペタラクトール関連短鎖デヒドロゲナーゼ酵素（ＮＥＰＳ）のクラスとを特定することを導いた。ＮＥＰＳ１によるネペタラクトールの続く酸化は、ネペタラクトン、すなわちネコにおける防虫活性及び陶酔効果の両方で良く知られている代謝物である。ＮＥＰＳ３シクラーゼの構造的特徴は、ＮＡＤ＋に結合するが、非酸化還元性の正式な〔４＋２〕環化には化学的に利用しないことを示している。それらの発見は、イリドイド及びモノテルペンインドールアルカロイド生合成の代謝再構築を補完する。
【０１０９】
結果：
イリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）のメカニズム：
最近、ネペタにおける異なるネペタラクトン立体異性体の合成が２の還元及び続く立体発散環化の両方を触媒する種間ＩＳＹにより制御されることを仮定した。しかしながら、そうではなかった；ネペタＩＳＹは、ＣｒＩＳＹと同じ立体異性体生成物プロファイルを生成した。従って、イリドイド立体化学を抑制するための代替メカニズムが開発された。
【０１１０】
ネペタラクトン１の発散立体化学の起源を理解するための最初の工程は、ＩＳＹメカニズムをさらに調査することであった。以前の研究で観察されたように、８−オキシゲラニアル２のＩＳＹ触媒された還元は、多くの異性体生成物を生成する（図２Ａ及びＢ、図７）。観察された異性体のアキラル性生物プロファイルは、適度な配列同一性（４８〜６５％）及び還元工程の異なる立体選択性（ＡｍＩＳＹは７Ｒ−選択的であり、ＮｍＩＳＹ２及びＣｒＩＳＹは７Ｓ−選択的である）にもかかわらず、使用されるＩＳＹとはほとんど無関係であった（図２Ｂ）。
【０１１１】
生成物プロファイルは酵素触媒に関して不変であったが、それは反応条件、特に緩衝液の濃度により強く影響された（図２Ｃ）。低い緩衝液濃度では、シス−トランス−ネペタラクトール４a が主要生成物であり；緩衝液濃度が高められるにつれて、より多くのイリドジアール５及び非環化８−オキソシトロネラール６が観察された。試験された全てのＩＳＹ及び緩衝液で、類似するパターンが観察された（図８Ａ−Ｄ，９）。この傾向は、高緩衝液濃度でシス−トランス−ネペタラクトール４ａの環の開環の結果ではなかった（図１０Ａ）。さらに、緩衝液のｐＨの変更はまた、生成物プロファイルに影響を及ぼし、低いｐＨは、シス−トランス−ネペタラクトール４ａに比較して、より多くのシス−トランス−イリダジアール５ａの形成をもたらす（図８Ｅ）。
【０１１２】
溶媒条件の変化に対する生成物分布の感度は、ＩＳＹが２を還元し、活性化された中間体３が形成され、次に、それが酵素活性部位を離れ、そして溶媒中に拡散するという仮説を導いた。溶媒下で、３は環化又は互変異性化のいずれかによりクエンチし、生成物の混合物を形成する。緩衝液が一般的な酸触媒として作用し、互変異性化を促進することを提案する。ＭＯＰＳ緩衝液を用いると、これは以下の３つのレジームをもたらす（図２Ｃ）：低緩衝液濃度＜５０ｍＭ）で、２回の環化が主要生成物として二環式４ａを生成し；適度な緩衝液濃度（５０〜５００ｍＭ）で、１回の環化、続くケト−エノール互変異性により、単環式５ａが形成され、これが好ましく；高緩衝液濃度（２５００ｍＭ）で、３から６への直接的なケト−エノール互変異性化が主要な経路になる。緩衝液分子による互変異性化の促進は、互変異性化メカニズムにおける溶媒分子の積極的な関与を強調したシュミレーションを反映している。
【０１１３】
ＩＳＹ生成物プロファイルが３の非酵素的環化の結果であったことを検証するために、酵素の不在下で３を形成することを目指した。これは、酸性（＜２）又はアルカリ性（＞１０）のｐＨで非緩衝水において（図１１）、又はｐＨ７．５での緩衝水において（図２Ｄ、図１２）、Ｓ−８−オキソシトロネラール６をインキュベートすることにより達成された。緩衝液又は極端なｐＨは、６から３へのケト−エノール互変異性化を促進し、これは、次に、ＩＳＹ反応と同様の態様で環化／互変異性化を受ける可能性がある。字際、６から４ａの形成は、確立された合成経路である。高濃度の緩衝液（５００ｍＭのＭＯＰＳ）において、ＩＳＹ触媒された２の還元及び６の非化学的環化の生成物プロファイルは、非常に類似しており（図２Ｄ、図１２）、イリドイド環化が酵素的に触媒されない仮説を支持する。
【０１１４】
従って、協調的な活性化及び環化を触媒する標準的なテルペンシンターゼ（図１Ｂ）とは異なり、ＩＳＹはその線状基質（８−オキソゲラニアル２−から８−オキソシトロネリルエノール３）の活性化を触媒するが、しかし続く環化を触媒するようには見えない。代わりに、３がＩＳｌＹ活性部位から、溶媒に拡散し、そこでそれは環化すると仮定する。このメカニズムは、環化を助長する基質結合モードを示さなかったＩＳＹ結晶構造により支持される。遊離３の概念は、イリドイド立体化学が、３を基質として受け入れ、ジアステレオ選択的環化を触媒できるパートナーシクラーゼ酵素により定義される可能性を高めた。
【０１１５】
ネペタラクトール関連短鎖レダクターゼ（ＮＥＰＳ）の同定：
ＩＳＹと連携して作動するシクラーゼを同定することは課題がある：この提案された反応は前例がないので、どのタイプの酵素ファミリーがそのような環化を触媒するかを予測することは困難である。しかしながら、ネペタにおけるネペタラクトン生合成は、特定の植物器官の腺毛状突起に局在している。従って、毛状突起のプロテオームを、毛状突起が枯渇された葉に比較して、ネペタラクトン生合成の部位で選択的に発現される遺伝子を同定し、それにより潜在的な遺伝子候補体のプールを相当に狭めることができる。
【０１１６】
Nepta  mussiniiの毛状突起、葉及び毛状突起を枯渇された葉のプロテオームを取得した（図１３Ａ）。それらのプロテオームの比較は、毛状突起富化されたタンパク質の同定を可能にする。このアプローチは、上流のイソプレノイド生合成（２−Ｃ−メチルエリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）経路）及びイリドイド生合成からの毛状突起富化された酵素の同定により検証された（図Ｂ，Ｃ）。
【０１１７】
出発点として、最初に、それらのプロテオームを用いて、ネペタラクトール４を、ＮＡＤ＋依存性酵素であるネペタラクトン１に変換する酵素を同定した。そのような活性を有する酵素は、以前に、Nepeta  mussiniiの毛状突起から単離されているが、しかしその配列は同定されていない。６つの毛状突起富化されたデヒドロゲナーゼ遺伝子がクローン化され、そしてＥ．コリにおいて組換え発現された（図１３Ｄ、表１）。それらのうち、１つがシス−トランス−ネペタラクトール４ａデヒドロゲナーゼ活性を示した（図１３Ｅ）。
【０１１８】
活性酵素は、短鎖レダクターゼ（ＳＤＲ）であり、ＳＤＲ１１０Ｃファミリーの一部であり、植物の二次代謝にしばしば関連するＮＡＤ依存性デヒドロゲナーゼの大きく多様なファミリーである。その結果、それはネペタラクトール関連ＳＤＲ１（ＮＥＰＳ１）と名付けられた。ＮＥＰＳ１は、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ又はシス−シス−ネペタラクトール４ｂのいずれかから、対応するネペタラクトン１ａへのＮＡＤ＋−依存性脱水素化を触媒することができた（図３Ａ−Ｃ、図１４Ａ、表２）。全体的な触媒効率は４ａの脱水素化でわずかに大きかったが、４ｂは２倍の速度で反転した。この活性の比率は、天然酵素の特徴と一致していた。
【０１１９】
ＮＥＰＳ１及び残るデヒドロゲナーゼ候補体の配列分析は、ＮＥＰＳ１、ＮＥＰＳ２及びＮＥＰＳ３の２つの追加の毛状突起富化されたパラログを明らかにした（図１５Ａ、Ｂ）。系統発生分析は、それらの３つのタンパク質が、密接な進化的関係を有し、そしてネペタ系統内で独自に見出されたことを明らかにした（図１５Ｃ）。従って、ＮＥＰＳ２及びＮＥＰＳ３もまた、ネペタラクトン生合成の役割を果たすと仮定した。結果的に、ＮＥＰＳ１−３酵素は、種々のネペタラクトン関連化合物及び前駆体、例えばネペタラクトール４、イリドジアール５及び８−オキソゲラニアル２を用いてアッセイされた（図１６）。しかしながら、上記のＮＥＰＳ１活性以外に、他の注目すべき活性は、ＮＥＰＳ１−３で観察されなかった。
【０１２０】
ＩＳＹと連携してのＮＥＰＳ活性：
上記のように、ＩＳＹの機構的調査は、別のシクラーゼ酵素が、ＩＳＹにより生成される活性化中間体３に対して作用することができるという仮説を導いた。ＮＥＰＳがそのような酵素として作用するかどうかを試験するために、ＮＥＰＳ酵素と、ＩＳＹにより触媒された８−オキソゲラニアル２の還元とを組合すワンポットカスケード反応が実行された（図３Ａ、Ｄ、Ｅ）。予想通りに、ＮＥＰＳ１及び過剰なＮＡＤ＋の添加は、予想外にＩＳＹイリドジアール副産物５が低められたが、シス−トランス−ネペタラクトン１a（図３Ｄ、図１４Ｂ）の形成をい導いた。注目すべきことには、ＮＥＰＳ３のＩＳＹ及び８−オキソゲニアル２への添加は、シス−視す−ネペタラクトール４ｂの形成を導いた。ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ３の組合せは、シス−シス−ネペタラクトン１ｂの生成を導いた。酵素及び補因子の濃度の調整は、ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ２が、イリドジアール５の消費でシス−トランス−ネペタラクトール４ａの形成を促進したことを明らかにした（図３Ｅ）。観察される生成物は、ＮＥＰＳ酵素が、ＩＳＹの生成物である３を受容でき、そしてそれを４ａ（ＮＥＰＳ１及び２）又は４ｂ（ＮＥＰＳ３）に環化できるシクラーゼ（図３Ａ）であることを示した。次にＮＥＰＳ１は、４ａ及び４ｂを、それぞれ１ａ及び１ｂに酸化できる。ＮＥＰＳ酵素の活性は、ＣｒＩＳＹ又はＮｍＩＳＹにより試験される場合、違いは見られず、このことはＩＳＹとＮＥＰＳとの間のタンパク質−タンパク質相互作用がシステムにおいて役割を果たしていないことを示唆する（図１７）。
【０１２１】
３から４への環化は、非酸化還元のネット〔４＋２〕環状付加である。ＮＥＰＳのシクラーゼ活性はまた、酸化還元性であるように見えない。ＩＳＹ−ＮＥＰＳ３反応の補因子依存性の調査は、以下を示した：ＮＡＤ＋濃度は、全体的な反応変化に限定されておらず、ＮＡＤ＋が消費されなかったことを示唆している（図１８）。さらに、ＮＥＰＳ３は、添加は活性を改善したが、補充されたＮＡＰ＋の不在下で活性的であった。ＮＡＤ＋は、環化の間、ＮＥＰＳ３によりターンオーバーされないが、たぶん、タンパク質構造の安定化を通して、酵素の触媒能力を促進できるように見える。
【０１２２】
Ｓ−８−オキソシトロネラールによるＮＥＰＳ活性：
ＮＥＰＳ活性を検証するために、ＩＳＹを用いないで、Ｓ−８−オキソシトロネラール６を用いて、反応を行った（図４）。高濃度の緩衝液を用いて、６から３の提案されたＮＥＰＳ基質の形成を促進した。それらの条件下で、以前に観察されたＮＥＰＳの活性が要約された（図４Ｂを図３Ｄに比較する）。
【０１２３】
緩衝液の不在下で６と共にインキュベートされる場合、ＮＥＰＳ１もＮＥＰＳ３の何れも活性的でなかった（図４Ｃ）。活性のためには、緩衝液が必要であり、６は重要な基質ではないが、しかし互変異体３は重要な基質であるという考えを支持している。これについてのさらなる証拠は、ＮＥＰＳ及び６を含む反応にＣｒＩＳＰＥ添加することにより得られ−観察された生成物のパターンは、暗黙のＮＥＰＳがそのターンオーバーなしに、６に結合していることを示した（図１９）。
【０１２４】
ＮＥＰＳ３環化の非酸化還元性質についての支持は、補充されるＮＡＤ＋又はＮＡＤＰＨの不在下で、６及び緩衝液と共にＮＥＰＳ３をインキュベートすることから得られ：シス−シス−ネペタラクトール４ｂの形成は依然として観察されていた（図４Ｄ）。上記のように、ＮＡＤ＋の添加は、活性のためには必要ではないが、反応を促進する。興味あることには、高ＮＡＤ＋濃度で、微量の１ｂが観察される（図４Ｄ、また図３Ｄ）。全体として、６とのＮＥＰＳ反応は、基質として３の概念を支持し、そして非酸化還元的環化のさらなる証拠を追加する（図４Ａ）。
【０１２５】
ＮＥＰＳ酵素の構造及びメカニズム：
ＮＥＰＳ３シス−シス環化反応のメカニズムを理解するために、ＮＡＤ＋に結合されたＮＥＰＳ３のＸ線結晶構造を取得した（６Ｆ９Ｇ、表３）。構造的同族体と共通して、それは２２２対称性のホモテトラマーを形成し、４つの活性中心が個々のプロトマー内に完全に含まれている（図２０Ａ）。ＮＥＰＳ１を結晶化するための努力と同様に、アポ又はリガンド結合構造を生成するための努力は成功していない。ＮＥＰＳ３は主に非酸化還元性シクラーゼとして機能するように見える事実にもかかわらず、その構造は、典型的な方法で結合されるＮＡＤ＋と共に、古典的なＳＤＳの特徴を有する（図２０Ｂ、Ｃ）。証拠は、ＮＡＤ＋が環化の間、ＮＥＰＳ３によりターンオーバーされないことを示唆するが、補因子は、結晶化のために必要であり、そしてタンパク質による複数のＨ結合により結合されるので、酵素構造のために重要であるように見える。
【０１２６】
ＮＥＰＳ３構造に基く、ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ２の相同性モデルは、酵素活性部位の比較を可能にするために生成された（図５）。ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ２は典型的なＳＤＲ触媒テトラッド（Ｎ−Ｙ−Ｋ−Ｔ／Ｓ）を有するが、ＮＥＰＳ３はトレオニン／セリンを欠いており、そして変わりに、グリシン（Ｇ１５２）を有する。さらに、ＮＥＰＳ３は、セリンの代わりにプロリンの存在のために、ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ２の両方に存在しない、活性部位残基Ｓ１５３及びＰ１９０のＨ結合を特徴とする。
【０１２７】
興味あることには、ＮＥＰＳ３構造は、アミドＮＨ及びＳ１５４の側鎖に結合される塩化物アニオンを特徴としているように見えた。塩化物の存在、及びＣｒＬＳＹにおける基質オキシアニオン結合部位との類似性に基いて、この位置は、基質オキシアニオン結合部位である可能性がある（図２０Ｃ）。この部位は、同等の位置に存在するロイシン側鎖の立体的障害のためにＮＥＰＳ１及び２には存在しないようである。
【０１２８】
ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ３における活性部位の役割は、変異スクリーンを介して調査された（表４）。ＮＥＰＳ３は突然変異に対して特に敏感であり、いくつかの活性部位の置換により、検出可能な可溶性発現が無効になる（Ａ１５１Ｔ、Ｇ１５２Ｔ、Ｓ１５３Ｐ、Ｙ１６５Ｆ）。それらの突然変異は、活性部位におけるＨ結合ネットワークを破壊し、タンパク質の安定性を低める可能性がある。可溶性タンパク質を生成する突然変異のうち、Ｎ１５Ｔのみが天然レベルの活性を維持し、Ｓ１５４Ｌ、Ｋ１６９Ｍ及びＭ１９６Ｓは、活性の大幅な低下又は完全な損失を有した（図２１Ａ）。いくつかのＮＥＰＳ１変異体は、１ａの検出可能な形成がなく、これは、それらが機能的に重要な残基である可能性があることを示している（Ｔ１５２Ｎ、Ｌ１５６Ｓ、Ｙ１６７Ｆ、Ｋ１７１Ｍ、Ｓ１９８Ｍ、Ｔ２０２Ａ、図２１Ｂ）。１ａのほぼＷＴレベルは、変異体Ｖ１１０Ａ、Ｔ１５３Ａ、Ｖ１９９Ａのサンプルで同定されたが、微量の１ａはＮ１２５Ａ及びＰ１５５Ｓで同定された（図２１Ｃ）。最も興味あるのは、ＷＴよりも相当な大量の４ａを生成するＴ１５４Ｇ置換を含む変異体であった（図２１Ｄ）。
【０１２９】
ＮＥＰＳ３  Ｓ１５４の推定オキシアニオン結合部位の役割が、ＮＥＰＳ３−Ｓ１５４Ｌ及び相補的なＮＥＰＳ１−Ｌ１５６Ｓ変異体のさらなる特性評価により試験された。ＮＥＰＳ３−Ｓ１５４Ｌ（2μＭ）は、検出可能なシス−シスシクラーゼ活性を示さなかったが、高酵素濃度（１０μＭ）では、変異体はシス−トランス−ネペタラクトール4ａの形成を促進するように見えた（図６Ａ）。ＮＥＰＳ１、Ｌ１５６Ｓにおける相補的置換は、デヒドロゲナーゼ活性を低めたが、シス−シス−ネペタラクトール４ｂ又はラクトン１ｂの形成を高めることはできなかった（図６Ａ）。従って、ＮＥＰＳ３−Ｓ１５４オキシアニオン結合部位は、ＮＥＰＳ３におけるシス−シス環化に必要であるように見えるが、しかしＮＥＰＳ１へのその導入は、シス−シス環化活性を確立するのには不十分である。対照的に、ＮＥＰＳ３からＳ１５４の除去は、環化選択性をシス−シスからシス−トランスに切替えるように見える。
【０１３０】
ＮＥＰＳ１−Ｔ１５４Ｇ変異体がまたさらに、特徴づけられた。ＮＥＰＳ１−ＷＴと比較して、変異体４ａを蓄積し、そして１ａの形成障害を示した（図６Ｂ、図２２Ａ）。デヒドロゲナーゼ活性のこの損失は、Ｔ１５４Ｇ置換により引起される４ａのＫｍの１５０倍の上昇の結果であるように見える（表２）。この結果は、Ｔ１５４が脱水素化工程の間又は前、４ａと相互作用することを示しており；推定結合モードは、ドッキング計算により提供される（図６Ｃ）。興味あることには、変異体はわずかに増強された環化活性を有するように見え：Ｔ１５４Ｇとの反応は、シス−トランス−イリドジアール５ａ副産物の最小の形成を示し（図２２Ａ）、そして変異体はまた、補充される補因子を伴わないで、緩衝液において６から検出可能レベルの４ａを形成できる（図２２Ｂ）。この改善された環化は、不十分な４ａ結合の結果である可能性があり−４ａが急速に放出される場合、３を結合し、そしてその環化を触媒するために多くの利用できる酵素が存在する（図６Ｄ）。
【０１３１】
議論：
ここでは、ＩＳＹの機構的分析が、別のシクラーゼがイリドイドフレームワークの立体化学の設定に関与しているという仮説をどのようにして導くかを示している。比較プロテオーム分析は、それらの不可解な酵素の発見を可能にした。それらのＮＥＰＳ酵素は、植物の二次代謝酵素に特徴的な可塑性及び革新性を示している。例えば、ＮＥＰＳ３は、構造及び配列によるＳＤＲであるが、その主要な触媒活性は非酸化還元性であり；ＮＡＤ＋は、共基質としてではなく、タンパク質構造足場として利用される。興味あることには、非常に高いＮＡＤ＋濃度で、ＮＥＰＳ３は、低い触媒効率で脱水素を触媒することができ、これは、その環化の過去を垣間見ることができる現象である。
【０１３２】
その固有の反応性のために、基質３の現場生成が、ＮＥＰＳ酵素の活性を明らかにするために必要とされた。反応性の非分離性基質は、モノテルペンインドールアルカロイド及びリグナン生合成を含む、植物に特化した代謝の他の場所に出現する。ＮＥＰＳは、別の酵素により生成される反応性中間体の立体選択的環化を制御するリグナン生合成におけるタンパク質である形成性タンパク質を彷彿とさせる。他の代謝経路に類似する未発見の工程が存在する可能性があり；それらは、単純な１つの基質、１つの酵素アッセイでは明らかにされ得るが、しかし複数の酵素カスケード戦略が必要であり、そのような酵素の発見は困難である。
【０１３３】
構造及び変異データに基いて、ＮＥＰＳ１／２及びＮＥＰＳ３は異なる態様で環化を触媒することを提案する。ＮＥＰＳ１／２は、エノール３のデフォルト「無触媒」経路への進行を可能にし、水中で形成されたものと同じ生成物を形成するように見える（図２）。環化におけるそれらの重要な役割は、一般的な酸触媒された互変異性化から中間体を保護することであるように思われ；ＮＥＰＳ１／２メカニズムは、溶液に見られる段階的マイケル付加を反映していないことを示唆する証拠は存在しない。一方、ＮＥＰＳ３は、特定の７Ｓ−シス−シス−ネペタラクトールシクラーゼ活性を有し、多分Ｓ１５４を介して３に結合し、そしてシス−シス立体化学の形成を可能にするために、立体的及び／又は静電的影響を及ぼす。ＮＥＰＳ３が〔４＋２〕環化を、段階的又は協調的態様で触媒するかどうかを決定するのには、さらなる分析が必要とされる（すなわち、Michaelase 又は Diels-Alderase）。「受動的」ＮＥＰＳ１／２と「活性的」ＮＥＰＳ３との間の対比は、標準的なテルペンシンダーゼメカニズムにおける固有の基質反応性対酵素影響のニ分法を反映している。
【０１３４】
系統発生分析は、ＮＥＰＳ酵素がネペタに特有であることを示唆している。しかし、他の生物からのＩＳＹもまたイリドイド環化を触媒しない。従って、ＮＥＰＳとは関係のない異なるシクラーゼが、他のイリドイド生成種において作動している可能性がある。微生物で再構成されたイリドイド経路からのそのようなシクラーゼの欠如は、収量に負の影響を及ぼした可能性がある。ここで記載されるＮＥＰＳシクラーゼ、特に専用のシス−トランスシクラーゼであるＮＥＰＳ２は、収量を改善するために、そのようなシステムに組込まれ得る。
【０１３５】
ネコの誘引及び虫よけを担当するネペタにおける化合物であるシス−トランス−ネペタラクトンの生合成起源を明らかにした。そのようにすることで、以下の３種の新規酵素を発見した：２つの専用シクラーゼ及び１つの多様能シクラーゼ−デヒドロゲナーゼ。それらの酵素の１つの構造は、それが異なる触媒機能のためにデヒドロゲナーゼ構造を再利用したことを明らかにする。イリドイド生合成は、カップリングされない活性化及び環化を含む：反応性で分離不可能なエノールが還元により形成され、そして別の酵素により環化されることを示している。そのような発見は、合成生物学の代謝再構築に貢献し、そして（生）合成経路の新規企画に情報を提供し；それらはまた、植物の天然生成物のダイナミックで革新的な性質を強調する。
【０１３６】
材料及び方法
データ可用性：
N. mussinii ＮＥＰＳ酵素の配列は、GenBank / EMBL / DDBJに寄託コードＭＧ６７７１２４（ＮｍＮＥＰＳ１）、ＭＧ６７７１２５（ＮｍＮＥＰＳ２）、ＭＧ６７７１２６（ＮｍＮＥＰＳ３）で寄託されている。ＮＡＤ＋結合ＮｍＮＥＰＳ３（７Ｓ−シス−シス−ネペタラクトールシンターゼ）Ｘ線構造は、受託コード６Ｆ９ＱでＰＤＢに寄託された。質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子ＰＸＤ００８７０４でＰＲＩＤＥパートナーリポジトリを介してProteomeXchange Consortiumに寄託された。
【０１３７】
化学薬品：
全ての化学薬品は、特にことわらない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入された。化合物の同一性及び純度は、ＮＭＲ分光法、Bruker 400 MHz / 54 mm UltraShield Plus、400 MHz (1H-NMR) 及び100 MHz (13C-NMR)での長時間保持時間自動分光計を使用して決定された。
【０１３８】
８−オキソゲラニアル２を合成した。酢酸ゲラニル（５ｇ、２９．５ｍモル）を、二酸化セレン（４３３ ｍｇ）、ジクロロメタン（１２．５ ｍＬ）及びｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（１２ ｍＬ、７０％ｗ / ｖ水）の混合物に添加し、そして室温で３０時間、攪拌した。その混合物を、Ｅｔ２Ｏ（４０ｍｌまで）に希釈し、そして次に、セライトを通して濾過し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（６０ ｇ / Ｌ、３ ｘ ４０ ｍＬ）、飽和 ＮａＨＣＯ３（４０ ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（２ ｘ ４０ ｍＬ）及びブライン（４０ ｍＬ）により洗浄した。有機画分を、ＭｇＳＯ４／木炭上で乾燥し、そして真空下で濃縮した。粗生成物を、勾配溶出でヘキサン及び０〜３０％ｖ／ｖ  ＥｔＯＡｃを用いてシリカフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。画分を真空下で濃縮し、８−オキソゲラニルアセテート（１．１５ｇ、２７％）及び８−ヒドロオキシゲラニルアセテート（１．４２ｇ、２６％）を得た。次に、８−オキソゲラニルアセテート（１ｇ、４．７５ｍモル）を、Ｋ２ＣＯ３（３２９ ｍｇ、０．５ ｅｑ）、ＭｅＯＨ（９．５ ｍＬ）及びＨ２Ｏ（０．５ ｍＬ）の混合物に添加した。その反応物を、室温で２時間、攪拌し、次に、水（６０ｍｌ）及びブライン（２０ｍｌ）を添加した。これをＥｔＯＡｃ（９×２０ｍｌ）に抽出し、そして真空下で濃縮した。化合物を、勾配溶出により、ヘキサン及び０〜５０％ｖ／ｖ  ＥｔＯＡｃを用いてシリカフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。画分を真空下で濃縮し、８−オキソゲラニオール（０．５７ｇ、７１％）を得た。最後に、８−オキソゲラニオール（５００ｍｇ、２．９７ｍモル）に、ジクロロメタン（３５ ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（１．５ ｇ、６ ｅｑ）及びデスマーチンペルヨージナン（１．５１ ｇ、１．２ ｅｑ）を添加した。この混合物を、氷上で１時間、攪拌した。粗生成物を、溶離液としてＥｔ２Ｏ／ヘキサン、及び次にＥｔ２Ｏを用いて、シリカクロマトグラフィーにより一部精製した。画分を真空下で濃縮し、一部精製された８−オキソゲラニアル（４１６ｍｇ）を得た。この一部を、溶離液としてＥｔ２Ｏ／ヘキサン及び次に、Ｅｔ２Ｏを用いて、Ｆｌｏｒｉｓｉｌゲルクロマトグラフィーにより、さらに精製した。最終８−オキシゲラニアル化合物の同一性及び純度を、ＮＭＲ及びＧＣ−ＭＳにより確認した。
【０１３９】
Ｓ−８−オキシシトロネラール６を合成した。Ｓ−シトロネラール（１ｇ、６．４８ｍモル）を、二酸化セレン（１１５ ｍｇ）、ジクロロメタン（２．５ ｍＬ）及びｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（２．６ ｍＬ、７０％ｗ / ｖ水）の混合物に添加した。その混合物を室温で攪拌した。４８時間後、その混合物を、Ｅｔ２Ｏ（１０ｍｌに）により希釈し、そしてセライト上で濾過した。濾液を、水性Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（６０ ｇ / Ｌ、３ ｘ １０ ｍＬ）、飽和 ＮａＨＣＯ３（１０ ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（２ ｘ １０ ｍＬ）及びブライン（10 mL）により洗浄した。有機画分を、ＭｇＳＯ４／木炭上で乾燥し、そして真空下で濃縮した。粗生成物を、勾配溶出でヘキサン及び０〜３０％ｖ／ｖ  ＥｔＯＡｃを用いて、シリカフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物Ｓ−８−オキソシトロネラールを含む画分を組合し、そして濃縮し、Ｓ−８−オキシシトロネラール６（１５２ｍｇ、１４％）を得た。この化合物の同一性及び純度を、ＮＭＲ及びＧＣ−ＭＳにより確認した。この化合物は、Ｓ−８−オキソシトロネラール−１−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルアセタールとして暫定的に同定された分離不可能な不純物を約１０％含んだ。
【０１４０】
２，３，６，７−テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル７を、生体内変化により得た。８−オキソシトロネラール６（１０μモル）を、ＣｒＩＳＹ（０．５ μＭ）、ＮＥＰＳ３（２ μＭ）、ＮＡＤＰＨ（１ ｍＭ）、ＮＡＤ ＋（５ ｍＭ）及びＭＯＰＳ（０．５ Ｍ、ｐＨ ７．５）を含む混合物（２０ｍｌ）に添加した。その反応物を３０℃で１６時間インキュベートし、そしてＥｔＯＡｃ（３×２０ｍｌ）により抽出した。有機画分を、ブライン（２０ｍｌ）により洗浄し、ＭｇＳＯ４により乾燥し、真空下で濃縮し、２，３，６，７−テトラヒドロ−８−オキソゲラニアル（０．４ｍｇ、２３％）を得た。この化合物の同一性を、ＮＭＲ及びＧＣ−ＭＳにより確認した。この化合物は完全には純粋ではないが、しかしＧＣ−ＭＳ化合物標準としての使用のためには十分であった。
【０１４１】
シス−トランス−ネペタラクトン１ａを、Ｎｅｐｅｔａ  ｆａｓｓｉｎｉｉ  “Ｓｉｘ  Ｈｉｌｌｓ  Ｇｉａｎｔ”  （Ｂｕｒｎｃｏｏｓｅ  Ｎｕｒｓｅｒｉｅｓ，  Ｇｗｅｎｎａｐ，  Ｒｅｄｒｕｔｈ，  Ｃｏｒｎｗａｌｌ，  ＴＲ１６  ６ＢＪ，  ＵＫ）から単離した。シス−シス−ネペタラクトン１ｂを、Ｎｅｐｅｔａ  ｍｕｓｓｉｎｉｉ  “Ｓｎｏｗｆｌａｋｅ”  （Ｂｕｒｎｃｏｏｓｅ  Ｎｕｒｓｅｒｉｅｓ，  Ｇｗｅｎｎａｐ，  ＵＫ）から単離した。トランス−シス−ネペタラクトン１ｃを、キャットニップから単離した。シス−トランス−ネペタラクトール４ａを、１ａのＤＩＢＡＬ−Ｈ還元により得た。シス−シス−ネペタラクトール４ｂを、１ｂのＤＩＢＡＬ−Ｈ還元により得た。シス−シス−イリドジアール５ａを、シス−トランス−ネペタラクトール４ａの酸加水分解により得た。シス−シス−イリドジアール５ｂを、シス−トランス−ネペタラクトール１ａの酸加水分解により得た。トランス−シス−イリドジアール５ｃを、トランス−シス−ネペタラクトン１ｃのＤＩＢＡＬ−Ｈ還元により得た。それらの化合物の化学的同一性及び純度を、以前に報告されたように、ＮＭＲ及びＧＣ−ＭＳにより確証した。トランス−トランス−イリドジアール５を得た。最初に、シス−シス−ネペタラクトン１ｂを、トランス−トランス−ネペタラクトンにエピマー化し、そして次に、この化合物をＤＩＢＡＬ−Ｈ還元し、５ｄを得た。
【０１４２】
プロテオーム分析：
Ｎ．mussiniiの葉全体（1.5 g x 4, Herbal Haven, Coldhams Farm, Rickling, Saffron Walden, CB11 3YL, UKから得られた）を、５０ｍｌの遠心分離管に入れ、粉末ドライアイス（約２０ｍｌ）を加えた。これをボルテックスし（１分、２０，０００ｒｐｍ）、そして乾燥した材料を、メッシュ（２００μｍ及び１００μｍ）に注ぎ、そしてメッシュを通過する材料を収集した。収量を最大にするために、葉及び管を、冷分離緩衝液（２００ ｍＭのソルビトール、２５ ｍＭ のＨＥＰＥＳ、５ ｍＭの ＭｇＣｌ２、５ ｍＭのコハク酸、１ ｍＭの ＥＧＴＡ、０．５ ｍＭの ＮａＨ２ＰＯ４、５ ｍＭの ＤＴＴ、２ ｍＭのスクロース、ｐＨ ７）により洗浄し、そしてこれをメッシュ（１００μｍ）を通して濾過し、そして収集した。サンプルを光学顕微鏡により検査し、抽出工程の成功を判断した。サンプルを遠心分離し（７００ｘｇ、１０分）、上清液を除き、毛状突起を除き、毛状突起を含むペレットを得た。葉及び毛状突起を枯渇された葉を液体窒素下で凍結し、そして乳棒及び乳鉢で均質化した。毛状突起を、抽出緩衝液（１ ｍＬ、０．１ Ｍ のＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８、２％w / v ＳＤＳ、３０％w / vスクロース、５％v / v ２−メルカプトエタノール、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド）に再懸濁し、ボルテックスし、そして超音波処理（１０秒オン、１０秒オフ、２０サイクル）により均質化した。トリス緩衝フェノール（１ｍｌ）を、均質化されたサンプルに添加し、次にボルテックス（１０分）、そして遠心分離した（１０，０００ｘｇ、１０分）。上層を得、そしてそれに、抽出緩衝液（１ｍｌ）を添加し、そしてその混合物をボルテックスし（５分間）、そして遠心分離した（１０，０００ｘｇ、１０分）。上層を、新しい管に移し、そしてこれに、４体積のメタノール／０．１ＭのＮＨ４Ａｃ（１：１、−２０℃）を添加し、サンプルを混合し、そして次に、−２０℃で一晩インキュベートした。沈殿されたタンパク質を、遠心分離によりペレット化し、そしてペレットを、メタノール／０．１ＭのＮＨ４Ａｃ（１：１、−２０℃）及び次に、アセトン（−２０℃）により２度、洗浄した。アセトンを除去し、そしてペレットを空気乾燥した。
【０１４３】
葉及び枯渇された葉からのタンパク質ペレットを、５％デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）、５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ８に溶解し、毛状突起からのペレットを、１％ＳＤＣ、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解した。タンパク質濃度を、Direct Detect（登録商標）分光計(Merck Millipore, UK)を用いて決定した。総タンパク質量は、葉について４００μｇ、枯渇された葉について２２５μｇ、及び毛状突起について２０μｇであった。サンプルを、ＤＴＴ及びヨードアセトアミドにより処理し、システイン残基を還元し、そしてアルキル化した。総毛状突起のサンプル及び５０μｇの葉サンプルを、トリプシンにより消化した。ＳＤＣを酸性沈殿により除去し、そして約１μｇのアリコートを、Acclaim PepMap C18 カラム(２ μｍ、７５ μｍ ｘ 5００mm、 Thermo)を使用して、UltiMate（登録商標）3000 RSLCnano Systemを備えたOrbitrap-Fusion（登録商標） 質量分光計 (Thermo Fisher, Hemel Hempstead, UK)上で、データ依存性ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に使用した。プレカラムを用いて、サンプルを負荷し、そしてトラップし、次に、これを、分離するための分析カラムにインラインで切替えた。ペプチドを、水中、６〜３８％アセトニトリル／０．１％蟻酸の勾配で、０．４％／分の速度で溶出した。カラムを、質量分光計に注入するために、１０μｍのSilicaTip（登録商標）ナノスプレーエミッター(New Objective, Woburn, MA, USA)に連結した。データ依存性分析を、以下のパラメーターを用いたパラレルＨＣＤ／ＣＩＤフラグメント法により実施した：正イオンモード、オービトラップＭＳ分解能＝ ６０ｋ、質量範囲（四重極）＝ ３００−１５００ ｍ / ｚ、イオントラップ内のＭＳ２、閾値２ｅ４、分離ウィンドウ１．６ Ｄａ、電荷状態２−５、３秒のサイクルタイムで利用可能な全ての並列化可能な時間を注入する、ＡＧＣターゲット２ｅ３、最大注入時間１００ ｍｓ、動的除外１カウント１０秒及び６０秒以内の除外、除外質量ウィンドウ±７ｐｐｍ。ＭＳスキャンは、プロファイルモードで保存され、そしてＭＳＭＳスキャンは、セントロイドモードで保存された。
【０１４４】
Ｏｒｂｉｔｒａｐからの生ファイルを、MaxQuant (バーション 1.5.3.30)により処理し、Mascot 検索エンジン（バージョン2.4.1, Matrixscience, London)によるデータベース検索のために使用された再校正済みのピークリストファイルを生成した。予測されるペプチドライブラリーを、予測されたオープンリーディングフレームの翻訳によりN. mussiniiトランスクリプトームから生成した（最小サイズ１００ｂｐ、ＡＴＧ開始コドン、開始／停止コドンは配列外である可能性がある）。この予測されたペプチドライブラリーは、Swiss-Prot 参照タンパク質 (http://www.uniprot.org/)を用いてｐｈｍｍｅｒにより注釈が付けられ、そして２つの失われた切断を有するトリプシン／Ｐ、固定されたカルバミドメチル化（Ｃ）及び酸化（Ｍ）、アセチル化（タンパク質のＮ末端）、及び可変修飾としての脱アミド化（Ｎ，Ｑ）を用いてのＭａｓｃｏｔデータベース検索のために使用された。質量公差は、前駆体イオンについては６ｐｐｍ、及びフラグメントイオンについては０．６Ｄａであった。Ｍａｓｃｏｔ検索結果を、Ｓｃｏｆｆｏｌｄソフトウェアにインポートし、そしてＳｃａｆｆｏｌｄの定量値（正規化された全スペクトル）を、Benjamini-Hochberg多重検定補正によるフィッシャーの直接確率検定を用いて、毛状突起と毛状突起を枯渇された葉サンプルとの間のペアワイズ比較のために使用した。ＭＥＰ経路酵素は、機能的注記により推定的に同定された。ネペタラクトールデヒドロゲナーゼ候補体は、以下の基準により選択された：機能的に特徴づけられていない、統計学的に有意な毛状突起（ｐ＜０．０５）及び酵素クラスＥＣ １．１.１ .−（オキシドレダクターゼ、アルコールに作用、ＮＡＤ（Ｐ）＋依存性）。
【０１４５】
クローニング：
ｃＤＮＡを得た。デヒドロゲナーゼ候補体のためのプライマーを、トランスクリプトーム配列に基いて企画し、そして５′−オーバーハングを、ｐＯＰＩＮＦベクターへのクローニングのために付加した（順方向: 5’-AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG-3’ (配列番号１３)、逆方向: 5’-CTGGTCTAGAAAGCTTTA-3’ (配列番号１４)）。プライマーを使用して、ｃＤＮＡからの遺伝子をＰＣＲ増幅した。それを、アガロースゲルから精製し、そして次に、InFusion HD クローニングキット (Clontech)を用いて、線状化されたｐＯＰＩＮＦベクター中にクローン化した。プラスミド配列を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定に検証した。クローン化されたＮＥＰＳ２及びＮＥＰＳ３は、トランスクリプトームからの完全長配列と正確には一致しなかったが、しかし複数の転写体からの領域を含むように見えた。それらの遺伝子の不十分なアセンブリーは、密接なパラログ、又は選択的スプライシングを示している。SoluBL21Ｅ．コリ（Genlantis）を、発現のためのプラスミドにより形質転換した。
【０１４６】
ＰＣＲによりＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ３遺伝子中に突然変異を導入した。最初に、２つの遺伝子フラグメントを増幅した。最初のフラグメントを、元のクローニングからの遺伝子特異的順方向プライマー及び突然変異部位の５′で終わる逆方向プライプライマー（逆方向突然変異プライマー）を用いてクローン化した。クローン化された２番目のフラグメントは、突然変異部位を含む順方向突然変異プライマー（順方向突然変異プライマー）及び元のクローニングからの逆方向プライマーを使用した。フラグメントを、ゲル精製し、そして次に、元の遺伝子特異的順方向及び逆方向プライマーを用いての３回目のＰＣＲを使用して、フラグメントをアセンブリーした。この遺伝子長のアンプリコンをゲル精製し、そして次に、InFusion HD クローニングキット (Clontech)を用いて、ｐＯＰＩＮＦベクター中にクローン化した。プラスミド配列を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定により検証した。SoluBL21 細胞 (Genlantis)を、発現のためのプラスミドにより形質転換した。
【０１４７】
酵素発現及び精製：
目的のプラスミドを含む発現株細胞を一晩、増殖させた（ＬＢ培地、１０ ｍＬ、１００マイクロｇ/ ｍＬのカルベニシリン）。１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む２ｘＹＴ培地を、一晩の培養物（５％ｖ／ｖ）により接種し、そしてＯＤ６００＝０．５まで３７℃で増殖した。次に、培養物を、ＯＤ６００＝０．６〜０．８まで、１８℃で増殖し、そして次に、タンパク質生成を、ＩＰＴＧ（５００μＭ）の添加により誘発した。細胞を、遠心分離（４０００ｘｇ、１０分）による収穫の前、１８℃で１６時間インキュベートした。ペレットをすぐに使用しない場合、それを、−２０℃での貯蔵の前、ＰＢＳにより洗浄した。
【０１４８】
デヒドロゲナーゼ活性についてのスクリーニングのために使用される溶解物アッセイに関しては、各デヒドロゲナーゼ候補体の培養物（１ｍｌ）を、上記のようにして培養した。細胞ペレットを、BugBuster MasterMix (100 μL) (Merck)に再懸濁し、４℃で１０分間インキュベートし、そして次に、遠心分離した（２０，０００ｘｇ、１０分）、上清溶解物（１μｌ）を、シス−トランス−ネペタラクトール４ａ（０．５ｍＭ）、ＮＡＤ＋（１ｍＭ）及びリン酸ナトリウム緩衝液を含む混合物（合計１００μｌ）に添加した。反応を、３４０ｎｍでの吸光度を用いて、FLUOStar Omega マルチプレートリーダー(BMG Labtech)上で３０分間、追跡した（位置決め遅延０．２秒、ウェルあたり２２回の点滅、３２秒のサイクル時間、１秒２００ｒｐｍの各サイクルの振盪）。各候補体については、ＮＡＤ＋及び４ａの両方を欠いているか、又は４ａのみを欠いている２つの対照サンプルが含まれた。空のベクターを用いた対照反応をまた測定した。０〜５分と２５〜３０分との間の吸光度測定値の平均を得、そして吸光度の上昇（すなわち、ＮＡＤＨの形成）を同定するために、比較した。
【０１４９】
ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ３変異体の最初のスリーニングに関しては、各ＮＥＰＳ変異体の培養物（１０ｍｌ）を、上記のようにして増殖した。細胞ペレットを、BugBuster MasterMix (1 ｍＬ、cOmpleteEDTAフリープロテアーゼ阻害剤を含む(Roche))に再懸濁し、４℃で２０分間インキュベートし、そして次に、遠心分離した（２０，０００ｘｇ、２０分）。ニッケル−ＮＩＡアガロース（１００μｌ）（Qiagen）を、結合緩衝液（５０ ｍＭの Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８、５０ ｍＭのグリセリン、５％v / vグリセロール、０．５ Ｍの ＮａＣｌ、２０ ｍＭのイミダゾール、１ ｍＭ のＤＴＴ）で洗浄し、上清溶解物に添加し、そしてその混合物を４℃で１時間、穏やかに揺り動かしながらインキュベートした。その混合物を遠心分離し（１０００ｘｇ、１分）、そして上清液を捨てた。Ｎｉ−ＮＴＡペレットを、１ｍｌの結合緩衝液により２度、洗浄し、そして次に、溶出緩衝液（５０ ｍＭの Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８、５０ ｍＭのグリセリン、５％v / vグリセロール、０．５ Ｍの ＮａＣｌ、５００ ｍＭのイミダゾール、１ ｍＭ のＤＴＴ）を添加した（５００μｌ）。混合物を遠心分離し（１０００ｘｇ、１分）、上清液を集め、そして濾過した（Ultrafree-MC VV 遠心フィルター, Merck）。緩衝液を、遠心濾過（Amicon Ultra 10 kDa MWCO, (Merck)）を使用して、４回の濃縮−希釈工程により、サンプル緩衝液（２０ ｍＭの ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、１５０ ｍＭ のＮａＣｌ）に交換した。タンパク質を小分けし、そして液体窒素により瞬間冷凍し、そして−８０℃で貯蔵した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び分光光度分析（２８０ｎｍでの吸光度）を使用して、タンパク質の純度及びおおよその量を調べた。
【０１５０】
上記の活性スクリーンを除く全ての酵素アッセイ、及び結晶試験に関しては、培養物（１Ｌ）を上記のようにして増殖した。細胞ペレットを、溶解緩衝液（結合緩衝液とcOmpleteEDTA−遊離プロテアーゼ阻害剤（Roche）及び０．４ ｍｇ / ｍＬのリゾチーム）に再懸濁し、そして４℃で３０分間インキュベートした。次に、溶解物を遠心分離し（３５，０００ｘｇ、４５分、４℃）、そして上清液を濾過した（Minisart NML Plus 0.7 μm GF (Sartorius)）。炉液を、AKTA純粋システム(GE Lifesciences)に接続された５ｍｌのHisTrap HP カラム (GE Lifesciences)に適用した。タンパク質がカラムから外れるのが検出されなくなるまで、カラムを結合緩衝液により洗浄した（２８０ｎmでの吸光度を用いての検出）。次に、目的のタンパク質を、溶出緩衝液のカラムへの適用により溶出した。溶出されたタンパク質をプールし、濾過し（ＰＥＳ膜、０．４５μｍ（Ｓｔａｒｌａｂ））、そしてさらに、Superdex 200 16/60 GFカラム (GE Lifesciences)上でのサイズ排除のクロマトグラフィーにより精製した。この工程の間、タンパク質を、サンプル緩衝液に交換した。溶出液画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そして目的のタンパク質を含むそれらをプールし、遠心分離（Amicon 10 kDa MWCO）により遠心分離し、液体窒素により瞬間凍結し、そして−８０℃で貯蔵し、タンパク質純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確証した。タンパク質濃度を、ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)により計算された吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの分光光度分析により決定した。
【０１５１】
酵素アッセイ：
速度論及びデヒドロゲナーゼ活性の測定を、PerkinElmer Lambda 35装置上で、３４０ｎｍの波長で、及び１ｃｍの光路長のキュベットで、分光光度法で実施した。反応を２５℃で及び５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌで実施した。反応を酵素の添加により開始し、そして吸光度値を１Ｈｚの速度で記録した。酵素濃度は、直線速度を維持するために、０．０２５〜０．２５μＭの範囲で変化させた。Ｒソフトウェア環境を使用して、酵素反応の２０秒間の線状初期速度を適合させた。ミカエリス−メンテン実験に関しては、少なくとも８つのデータポイントを、各基質の組合せのために得た。ミカエリス−メンテン等式を、ｎｌｓ関数によりＲのデータポイントに適合させ、速度論的パラメーターの値を得た。速度論的パラメーターは、最適な適合推定値±ＳＥとして報告されている。ＮＡＤＰ＋及びＮＡＤＨを用いての活性測定に関して、単一の基質濃度を使用した。速度値（イタリック体）は、３回の測定の平均±平均からの標準偏差として提供される。
【０１５２】
精製された酵素を用いてのエンドポイントアッセイを、１００μｌの総量で実施した。基質として８−オキソゲラニアル２又は８−オキソシトロネラール６のいずれかを用いての反応は、１％ｖ／ｖ  ＭｅＣＮを含んだ。緩衝液濃度の効果を試験する実験においては、酵素を水により希釈した。酵素サンプル中にサンプル緩衝液の微量残留濃度は、生成物プロファイルに影響を与えるには低すぎた。全反応は、３０℃で行われた。基質として８−オキソゲラニアル２を含む反応を、３時間インキュベートし、そして８−オキソシトロネラール６を含む反応は、特にことわらない限り、１６時間インキュベートした。反応終了で、樟脳標準（１０μｌ、ＨｅＣＮ中、ストック１ｍＭ）及びＥｔＯＡｃ（１００μｌ）を添加した。反応物をボルテックスし、遠心分離し（１０，０００ｘｇ、１０分）、そして有機層を、ＧＣ−ＭＳ分析に使用した。反応中の成分の濃度は、大きく異なり、そして従って、各反応について、図又は図の凡例は、使用された正確な条件を記載している。
【０１５３】
ガスクロマトグラフィー−質量分析：
サンプルを、９７３質量選択検出器（ＭＳＤ）、及びAgilent7683Bシリーズインジェクター及びオートサンプラーを備えたHewlett Packard 6890 GC-MS上で、２２０℃の入口温度で、スプリットモード（２μｌ、スプリット比５：１）で注入した。分離を、ガードカラムを備えたZebron ZB5-HT-INFERNOカラム（５％フェニルメチルシロキサン；長さ：３５ｍ；直径：２５０μｍ）上で実施した。ヘリウムを、移動相として、１．２ｍｌ／分の一定流量及び３７ｃｍ／秒の平均速度で使用した。８０℃での５分後、カラム温度を、２．５Ｋ／分の速度で１１０℃に上げ、次に１２０Ｋ／分で２８０℃に上げ、そしてさらに４分間、２８０℃で維持した。７０ｅＶのフラグメンテーションエネルギーで、ＭＳスペクトルを収集する前、５分の溶媒遅延を許容した。（＋）−樟脳の内部標準を、保持時間較正のために使用した。化学的に特性評価された標準を使用して、保持時間及び電子衝撃スペクトルにより化合物を同定した。
【０１５４】
結晶化及びデータ収集：
ＮＥＰＳ３を、上記のようにして精製した。タンパク質（７ｍｇ／ｍｌ）を解凍し、そしてＣ３−プロテアーゼ（０．３６ｍｇ／ｍｌ）と共に室温で１時間インキュベーオトした。タンパク質を濾過し（Ultrafree-MCVV遠心フィルター）、そしてニッケル−ＮＴＡアガロースに通し、切断されたＨｉｓ−Ｔａｇ及びタグ付きＣ３−プロテアーゼを除去した。溶出液（タグなしのＮＥＰＳ３）を、サンプル緩衝液で７ｍｇ／ｍｌ（Amicon 10 kDa MWCO）に濃縮した。結晶を、２９％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４０００及び０．１ＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）から成る沈殿剤を用いて、ハンギングドロップ法（合計３μｌ、１：２のタンパク質：緩衝液、１ｍＭのＮＡＤ＋最終濃度）を使用して形成した。結晶を、２０％ｖ／ｖエチレングリコールを含む結晶化緩衝液により凍結保護し、次に、LithoLoops (Molecular Dimensions)を用いて液体窒素下で瞬間冷却し、そしてデータ収集の前、Unipuck カッセット (MiTeGen)に貯蔵した。結晶を、Diamond Light Source (Oxfordshire, UK)のビームライン１０３上のゴニオスタットに、ロボットにより移し、そしてCryojet クライオクーラー (Oxford Instruments)により−１７３℃で維持した。Ｘ線回折データを、Pilatus 6Mハイブリッドフォトンカウンティング検出器（Dectris）を用いて、１．４Åの解像度で記録し、次にＸＩＡ２エキスパートシステムを介して、ＸＤＳを用いて統合し、そしてスケーリングし、そして次に、ＡＩＭＬＥＳＳを用いて、プリミティブ単斜晶ユニットセルに合併し；結果のデータ収集統計学は表３に要約される。
【０１５５】
構造解法及び改良：
ダウンストリーム分析の大部分は、ＣＣＰ４i2にグラフィカルユーザーインターフェイス（http://www.ccp4.ac.uk/）を介して実行された。ＮＥＰＳ３サブユニットの分子置換鋳型を、ＳＣＵＬＰＴＯＲを用いて、４２％の配列同一性を共有するＰＤＢエントリー２ＢＧＫから調製した。Ｘ線データの高解像度は、低溶媒含有量を示しており、そして４０％の値は、非対称ユニット（ＡＳＵ）における約２８ｋＤａサブユニットの４つのコピーについて推定された。さらに、自己回転関数の検査は、結晶学的な二重軸に加えて、いくつかの非結晶学的な二重軸を明らかにした。鋳型構造の機能的単位であるセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼは、２２２対称性のホモテトラマーであり、これは、ＳＣＵＬＰＴＯＲ出力から同等のテトラマーの調製を促進した。後者は、空間グループＰ２１において非常に説得力のある解答（ＴＦＺスコア＝１５）を生成するＰＨＡＳＥＲのための入力として使用された。このモデルは、ＢＵＣＣＡＮＥＥＲで再構築され、そして次に、ＣＯＯＴでの手動編集及びＲＥＦＭＡＣ５での改良を繰り返すことで改善された。最初に、テトラマーの４つの独立した活性部位のそれぞれにおけるニコチンアミド環に隣接する電子密度の細長いピークを、離散的に無秩序な水分子としてモデル化した。しかしながら、精製の後、それらは、有意な量の正の差電子密度と関連し、そしてそれらは、周囲の電子の温度係数値よりも有意に低い精製温度係数値を有し、より電子密度の高い種を示している。いずれの場合も、原子が２つのバックボーンアミドから３．６Å以内にある場合、それは、離散的に無秩序な塩化物イオン（ＮａＣｌはサンプル緩衝液に１５０ｍＭで存在した）として再割り当てられた。精製後、塩化物イオンの温度係数は、周囲の原子の温度係数と同等か、又はわずかに高かった。MolProbityによる分析を含む、最終的に精製されたモデルの統計が、表３に表されている。このモデルは、寄託コード６Ｆ９ＱとしてProtein Data Bankに寄託された。図及び構造アラインメントは、UCSF-Chimera (http://www.rbvi.ucsf.edu/chimera/)を用いて作成された。ＮＥＰＳ１及びＮＥＰＳ２の相同性モデルを、ｉＴaｓｓｅｒサーバーを用いて構築した。ＮＡＤ＋がその構造に追加され（モデルとしてＮＥＰＳ３を使用する）、そして次に、複合体は、Yasaraエネルギー最小化サーバーを使用してエネルギー最小化された。ドッキング計算を、AutoDock Vina（網羅性= 8）により実行した。
【０１５６】
系統発生学及び配列分析：
タンパク質多重アライメントＮＥＰＳ及びＭｐＩＰＤＨを、ＣｌuｓｔａｌＷ２により実行し、そしてＥＳＰｒｉｐｔで示した。系統発生分析のために、Lamiaceae及び外群の配列を、Mint Genome Project (http://mints.plantbiology.msu.edu/, NCBI BioProject PRJNA359989)から入手した。ＮＥＰＳと相同性のある配列を、BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)により同定した。Mentha x piperitaイソピペリテノールデヒドロゲナーゼ（MpIPDH、AY641428）もまた、分析に含まれた。アライメントの前、不完全な配列及び重複した配列を削除した。コドンアライメントを、ＭＵＳＣＬＥを用いて実行し、そして次に、手動で確認し、そしてキュレーションし、不規則な末端を除去した。系統樹の推論を、IQ−Tree１．５．４を用いて実行した。最初に、置換モデル（ＴIＭ＋Ｉ＋Ｇ４）を、ModelFinderにより決定した。次に、最尤ツリーを、１４６回以上の反復でヒューリスティックに決定し、そしてブランチサポート値を、超高速ブートストラップ（１０００回の反復）を用いて計算した。ツリーは、FigTree v1.4.3 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)で可視化された。
【０１５７】
【表１】
2021525098.tif 000003
【０１５８】
プライマーを、方法に記載されているようにして、ベクター特異的オーバーハングにより合成した。クローン化された配列ＮＥＰＳ２及びＮＥＰＳ３は、トランスクリプトームからの完全長配列コンティグと正確には一致しなかったが、しかし複数のコンティグからの領域を含むように見えた。それらの遺伝子の不十分なアセンブリーは、密接なパラログ又は選択的スプライシングを示している。  
【０１５９】
【表２】
2021525098.tif 000004
【０１６０】
３４０ｎｍでの吸光度により分光光度的に測定された活性。活性は、基質濃度が変化した場合、Ｋｃａｔとして報告され、そして単一の基質濃度が使用される場合には、速度（Ｖ、イタリック）として報告される。動的ミカエリス−メンテンパラメーターは、最適な推定値±ＳＥとして報告される。速度（イタリック）は、３回の測定の平均±平均からの標準偏差として報告される。
【０１６１】
【表３】
2021525098.tif 000005
a  括弧内の数字は、外側の解像度シェルの値を示す。
b  Rmerge = Σhkl Σi |Ii(hkl)- (l(hkl) |/ Σhkl Σi/ i (hkl)
c  Rmeas = Σhkl [N/(N -1 )]1/2 x Σi|li(hkl) - (l(hkl)) |/ Σhkl Σi/ i (hkl), ここでli(hkl)は、反射hklのi番目の観測値であり、（l（hkl））は、反射hklの全ての観測値iの加重平均強度であり、そしてNは反射hklの観測数である。
d  CC1/2は、データセットのランダムな半分から取得された強度間の相関係数である。
e  データセットは、それぞれ、データの９５%と５%で構成される「ワーキング」セットと「フリー」セットに分割された。フリーセットは改善には使用されなかった。
f  Ｒ因子Ｒwork及びＲfreeは次のように計算される：Ｒ＝Σ(| Ｆobs− Ｆcalc |)/Σ| Ｆobs |、ここでＲwork及びＲfreeはそれぞれ、観測及び計算された構造因子の振幅である。
g  MolProbityを使用して計算される場合。
【０１６２】
【表４−１】
2021525098.tif 000006
【表４−２】
2021525098.tif 000007
（表中の説明）：SEQ ID NO：配列番号
【図１−１】
2021525098.tif 000008
【図１−２】
2021525098.tif 000009
【図２−１】
2021525098.tif 000010
【図２−２】
2021525098.tif 000011
【図２−３】
2021525098.tif 000012
【図３−１】
2021525098.tif 000013
【図３−２】
2021525098.tif 000014
【図３−３】
2021525098.tif 000015
【図３−４】
2021525098.tif 000016
【図４−１】
2021525098.tif 000017
【図４−２】
2021525098.tif 000018
【図４−３】
2021525098.tif 000019
【図５】
2021525098.tif 000020
【図６−１】
2021525098.tif 000021
【図６−２】
2021525098.tif 000022
【図６−３】
2021525098.tif 000023
【図７Ａ】
2021525098.tif 000024
【図７Ｂ】
2021525098.tif 000025
【図７Ｃ】
2021525098.tif 000026
【図７Ｄ】
2021525098.tif 000027
【図７Ｅ】
2021525098.tif 000028
【図７Ｆ】
2021525098.tif 000029
【図７Ｇ】
2021525098.tif 000030
【図８−１】
2021525098.tif 000031
【図８−２】
2021525098.tif 000032
【図９−１】
2021525098.tif 000033
【図９−２】
2021525098.tif 000034
【図９−３】
2021525098.tif 000035
【図９−４】
2021525098.tif 000036
【図１０Ａ】
2021525098.tif 000037
【図１０Ｂ】
2021525098.tif 000038
【図１１Ａ】
2021525098.tif 000039
【図１１Ｂ−１１Ｃ】
2021525098.tif 000040
【図１１Ｄ】
2021525098.tif 000041
【図１２Ａ】
2021525098.tif 000042
【図１２Ｂ】
2021525098.tif 000043
【図１２Ｃ】
2021525098.tif 000044
【図１２Ｄ】
2021525098.tif 000045
【図１２Ｅ】
2021525098.tif 000046
【図１２Ｆ】
2021525098.tif 000047
【図１３−１】
2021525098.tif 000048
【図１３−２】
2021525098.tif 000049
【図１４−１】
2021525098.tif 000050
【図１４−２】
2021525098.tif 000051
【図１４−３】
2021525098.tif 000052
【図１４−４】
2021525098.tif 000053
【図１４−５】
2021525098.tif 000054
【図１４−６】
2021525098.tif 000055
【図１５Ａ】
2021525098.tif 000056
【図１５Ｂ】
2021525098.tif 000057
【図１５Ｃ】
2021525098.tif 000058
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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