(57)【要約】本発明は、被験体におけるがん性悪液質の予防又は治療に用いる化合物であって、前記化合物が一般式Ｉ（式中、−Ｒ１は、５個以下の−ＯＲ２置換基があるＣ１−Ｃ６アルキル基であり、ここで、Ｒ２は水素、若しくはＣ１−Ｃ６アルキル、又は、ＯＲ２は（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸部分を表し；又は−Ｒ１は、アルコールＨＯＲ１に由来する部分であり、ここで前記アルコールは糖である）である化合物、又はその医薬的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を提供する。典型的には、本発明はまた、筋消耗等の悪液質関連症状の治療を提供する。
2021525775.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体におけるがん性悪液質の予防又は治療に用いる化合物であって、前記化合物が以下の一般式Ｉ：
【化１】
2021525775.tif 000013
（式中、
−Ｒ１は、５個以下の−ＯＲ２置換基があるＣ１−Ｃ６アルキル基であり、ここで、Ｒ２は水素、若しくはＣ１−Ｃ６アルキル、又は、ＯＲ２は（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸部分を表し；又は
−Ｒ１は、アルコールＨＯＲ１に由来する部分であり、ここで前記アルコールは糖である）
である化合物、又はその医薬的に許容可能な塩若しくは溶媒和物である、化合物。
【請求項２】
Ｒ１は、１、２又は３−ＯＲ２置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２がＨである、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１は、式−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２（ＯＨ）又はＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ３を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１は、アルコールＨＯＲ１に由来する部分であり、ここで前記アルコールは、アルトロース、アラビノース、デキストロース、エリトロース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、グロース、アイドース、ラクトース、リキソース、マンノース、リボース、リブロース、スクロース、タロース、トレオース、及びキシロースから選択される糖である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
以下の式：
【化２】
2021525775.tif 000014
の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸（Ｒ）−１，３−ブタンジオールモノエステルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記被験体は、がんに罹患している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記がんは、結腸がんである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記化合物は、さらに、腫瘍増殖の抑制に用いられる、請求項７又は８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記化合物は、さらに、前記被験体の生存促進に用いられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記化合物は、さらに、前記被験体の筋肉量の維持又は増加に用いられる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記化合物は、さらに、前記被験体の活性レベルの維持又は増加に用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
炭水化物化合物、好ましくは、前記炭水化物化合物は、グルコース、フルクトース又はマルトースのような単純糖である、と共に用いる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の化合物、及び１又はそれ以上の医薬的に許容される賦形剤を含む、被験体におけるがん性悪液質の治療に用いる医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれかに記載の化合物を含み、かつ、場合によっては、さらに、水及び、香味剤、タンパク質、炭水化物、糖類、脂肪、繊維、ビタミン類及びミネラル類の１又はそれ以上、をさらに含む、被験体におけるがん性悪液質の治療に用いる、滋養組成物。
【請求項１６】
さらに、中鎖トリグリセリドを含み、好ましくは、前記中鎖トリグリセリドには、式ＣＨ２Ｒａ−ＣＨ２Ｒｂ−ＣＨ２Ｒｃがあり、ここでＲａ、Ｒｂ及びＲｃの炭素原子が５〜１２個である脂肪酸である、請求項１５に記載の滋養組成物。
【請求項１７】
被験体におけるがん性悪液質の予防又は治療のための医薬の製造における化合物又はその医薬的に許容可能な塩若しくは溶媒和物の使用であって、前記化合物が、以下の一般式Ｉ
【化３】
2021525775.tif 000015
（式中、
−Ｒ１は、５個以下の−ＯＲ２置換基があるＣ１−Ｃ６アルキル基であり、ここで、Ｒ２は水素、若しくはＣ１−Ｃ６アルキル、又は、ＯＲ２は（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸部分を表し；又は
−Ｒ１は、アルコールＨＯＲ１に由来する部分であり、ここで前記アルコールは糖である）
である、使用。
【請求項１８】
前記化合物は、請求項１〜１３のいずれかに記載の化合物である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
以下の一般式Ｉ：
【化４】
2021525775.tif 000016
（式中、
−Ｒ１は、５個以下の−ＯＲ２置換基があるＣ１−Ｃ６アルキル基であり、ここで、Ｒ２は水素、若しくはＣ１−Ｃ６アルキル、又は、ＯＲ２は（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸部分を表し；又は
−Ｒ１は、アルコールＨＯＲ１に由来する部分であり、ここで前記アルコールは糖である）
の化合物又はその医薬的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、前記被験体におけるがん性悪液質の治療方法。
【請求項２０】
前記化合物は、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験体における悪液質、具体的には、がん関連悪液質、の予防又は治療に用いる化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん性悪液質は、がん患者が罹患し、体重減少、食欲不振、無力症及び貧血を特徴とする消耗性症候群である。それにより患者の筋肉は不随意に消耗される。悪液質は、患者の感染防御能、化学療法や放射線療法への耐性能に悪影響を及ぼす。その結果、患者の身体が消耗され始める。
【０００３】
食物摂取量の減少（１５００ｋｃａｌ／日未満）と、１０％以上の体重減少及び全身性炎症反応は、がん性悪液質の予後因子と考えられる。当該体重減少は栄養補助食品では回復されない。最終的に、がん性悪液質は致死の場合があるが、患者の総体重が２５〜３０％まで減少すると死亡する。
【０００４】
がんの悪液質に関与する機序は複雑で多因子性のようである。現在の治療方法としては、食欲刺激剤、悪液質シグナル伝達分子及び消耗の予防及び治療に効果的なメディエーターに対する薬剤があげられる。
【０００５】
先行技術の特許文献１で考察されているように、ケトン食はよく知られており、がんの治療に汎用される。一般に、ケトン食は、高脂肪、中〜低タンパク質、及び超低炭水化物含量を特徴とする。がんにおけるケトン食の適用は、有望ではあるがその結果に一貫性がない（非特許文献１）。ケトン食適用は、がん細胞の異常なエネルギー代謝を標的とした代謝療法の基礎理論に基づく。ケトン体生成状態により、グルコースの利用が制限され、がん細胞の解糖が損なわれる一方で、健常細胞用の代替エネルギー源が提供される。これにより、がん細胞が選択的に阻害されるものの、正常細胞は無害である。
【０００６】
非特許文献２では、ケトン食が有望な抗がん療法である可能性を開示する。非特許文献２では、ケトン食が血管新生、炎症、腫瘍周囲の浮腫、腫瘍の遊走及び浸潤をどのように減少させるかについて考察する。さらに、当該食は、神経膠腫のマウスモデルにおいて、放射線及び化学療法の有効性を高め、それによって生存率が高まりうる。さらに、非特許文献２文ではケトン体自体の抗腫瘍効果、つまりケトン体補給を単独使用した場合にいくつかの疾患に効果があることを論じた。
【０００７】
悪液質を逆転させ、ケトン食を与えることにより、腫瘍からエネルギー産生のための代謝基質を選択的に奪う試みがなされている。例えば、非特許文献３では、腫瘍と宿主組織の代謝の相違に基づく食事を用いた悪液質の改善が試みられ、これは腫瘍を費やして宿主への選択的給餌を目的とする。
【０００８】
特許文献２は、筋破壊を治療するケトン体エステルの使用を開示する。悪液質は特許文献２で言及されているが、がんの悪液質は具体的には開示されていない。
【０００９】
悪液質に罹患したがん患者へのケトン食の適用について、相反する参考文献がある。腫瘍細胞はグルコース消費速度が速く、好気的解糖の速度が速く、炭水化物欠乏の影響を受けやすいことが知られている。さらに、多くの腫瘍は特定の重要なミトコンドリア酵素を欠くため、エネルギー産生における脂肪やケトン体を利用能がほとんど失われている。したがって、グルコースのケトン体への置換により、宿主へのエネルギー供給が維持されつつ、腫瘍へのエネルギー供給が減少すると考えられる。一方、がん患者では、ケトン食の摂取量過多が懸念される。
【００１０】
用語「ケトン体」は、一般に、３つの化合物、すなわち、ｄ−β−ヒドロキシ酪酸、アセト酢酸及びアセトンを包含することが理解される。ｄ−β−ヒドロキシ酪酸はβ−ＨＢ又は（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸として知られる。ケトン体は、食物摂取量が少ない時期に脂肪酸から肝臓で産生される。
【００１１】
特許文献３は、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸誘導体を含む栄養補給剤及び治療用組成物を開示する。特許文献３で開示された組成物は、腫瘍、特に星状膠細胞腫等の脳腫瘍の治療に用いられうる。がんの悪液質の治療方法は開示がない。
【００１２】
非特許文献４は、ケトン塩、ヒドロキシ酪酸ナトリウム及びアセト酢酸リチウムを用いた膵がんの悪液質の治療を開示する。腫瘍増殖の抑制、筋肉及び体重減少の抑制が示される。多量のケトン塩が用いられているが、インビボでの使用は危険である。
【００１３】
ケトン塩の投与は、βＨＢ又はＡｃＡｃの濃度をヒトで適当なレベル（例えば、血中で１０〜２０ｍＭの範囲）への上昇には用いえない。なぜなら、当該塩濃度は、アシドーシス、高血圧及び／又は腎不全を生じさせうるからである。１日の推奨塩量をはるかに超えずに、ヒト必要量の塩の摂取は不可能であろう。胃腸障害及び高血圧は、しばしば塩分の多量摂取の結果である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第９，８０１，９０３号明細書
【特許文献２】英国特許出願公開第２５１７０８８号明細書
【特許文献３】国際公開第２００４／１０８７４０号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Oliveira et al; J Acad Nutr Diet, 2017 “A nutritional perspective of ketogenic diet in cancer: A narrative review”
【非特許文献２】Woolf et al in Front Mol Neurosci, Nov 2016, Vol 9, Article 122 “Tumour metabolism, the ketogenic diet and β-hydroxybutyrate: Novel approaches to adjuvant brain tumour therapy”
【非特許文献３】Tisdale et al, the Br J Cancer (1987) Vol 56, pages 39-43
【非特許文献４】Shukla et al in Cancer Metab (2014) Vol 2 page 18 “Metabolic reprogramming induced by ketone bodies diminishes pancreatic cancer cachexia”
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従って、被験体におけるがん性悪液質を治療するための新しい有効な治療方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
従って、本発明は、第１態様では、被験体におけるがん性悪液質の予防又は治療に用いる化合物であって、前記化合物が以下の一般式Ｉ：
【００１８】
【化１】
2021525775.tif 000003
（式中、
−Ｒ１は、５個以下の−ＯＲ２置換基があるＣ１−Ｃ６アルキル基であり、ここで、Ｒ２は水素、若しくはＣ１−Ｃ６アルキル、又は、ＯＲ２は（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸部分を表し；又は
−Ｒ１は、アルコールＨＯＲ１に由来する部分であり、ここで前記アルコールは糖である）
である化合物、又はその医薬的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を提供する。
【００１９】
本発明は、第２態様では、被験体におけるがんの治療に用いる、以下の式：
【００２０】
【化２】
2021525775.tif 000004
の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸（Ｒ）−１，３−ブタンジオールモノエステルである化合物を提供する。
【００２１】
本発明は、第３態様では、被験体におけるがんの治療に用いる化合物を提供し、ここで、前記化合物は以下の一般式Ｉ：
【００２２】
【化１】
2021525775.tif 000005
（式中、
−Ｒ１は、５個以下の−ＯＲ２置換基があるＣ１−Ｃ６アルキル基であり、ここで、Ｒ２は水素、若しくはＣ１−Ｃ６アルキル、又は、ＯＲ２は（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸部分を表し；又は
−Ｒ１は、アルコールＨＯＲ１に由来する部分であり、ここで前記アルコールは糖である）
、又はその医薬的に許容可能な塩若しくは溶媒和物であり；
ここで、化合物の投与１時間後に、被験体における（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩の血中濃度は、１〜２０ｍＭの範囲内である。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態は、以下の：
上記で特定された一般式Ｉの化合物の治療有効量を、被験体に投与することを含む、前記被験体におけるがん性悪液質の治療方法；
以下の式：
【００２４】
【化２】
2021525775.tif 000006
の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸（Ｒ）−１，３−ブタンジオールモノエステルの治療有効量を、被験体に投与することを含む、前記被験体におけるがんの治療方法：
化合物の投与１時間後に、被験体における（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩の血中濃度は、１〜２０ｍＭの範囲内である、前記被験体に上記一般式Ｉの化合物の治療有効量を投与することを含む、前記被験体におけるがんの治療方法；
被験体におけるがん性悪液質の治療用医薬の製造における、上記で特定された一般式Ｉの化合物の使用；
被験体におけるがん性悪液質の治療用医薬の製造における、以下の式：
【００２５】
【化３】
2021525775.tif 000007
の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸（Ｒ）−１，３−ブタンジオールモノエステルの使用；
被験体におけるがん性悪液質の治療用医薬の製造における、化合物の投与１時間後に、被験体における（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩の血中濃度は、１〜２０ｍＭの範囲内である、上記で特定された一般式Ｉの化合物の使用；
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】マウスの生存期間を示すグラフであり、（Ａ）５つの実験群すべての生存曲線、（Ｂ）運動条件の主な効果、（Ｃ）栄養状態の主な効果を示す。
【図２】（Ａ）食物摂取量と（Ｂ）各実験群の体重を示すグラフである。
【図３】各実験群の（Ａ）血中βＨＢ及び（Ｂ）血糖値の血液パラメータを示すグラフである。
【図４】車輪走行動作を示すグラフである。
【図５】腫瘍質量を示すグラフである。
【図６】各実験群の筋肉量を示し、（Ａ）前脛骨筋（ＴＡ）、（Ｂ）大腿四頭筋（ＱＵＡＤ）及び（Ｃ）腓腹筋（ＧＡＳ）の質量示すグラフである。
【図７】異なる実験群の１６日目における握力（Ａ）前肢及び（Ｂ）後肢の筋力を示すグラフである。
【図８】異なる実験群をインビトロで測定したヒラメ筋（ｍ．ｓｏｌｅｕｓ）の筋収縮特性−ヒラメ筋のピーク攣縮（Ａ）及び強縮（Ｂ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の化合物は、被験体の体内における（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の供給源を提供する。このように、化合物は（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸のエステルであり、体内でエステラーゼによって分解されて（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を生成することができる。
【００２８】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸はケトン体であり、“Metabolic Regulation: A Human Perspective” by K N Fraynに定義がある。
【００２９】
特許文献３は、ケトン体を被験体に直接投与して、高レベルのケトン体を達成しうることを開示する。しかしながら、ケトン塩又はケトン酸の直接投与は、特定の状況下では困難かつ危険な場合があるため、エステルの使用が好ましい代替法として提案されている。ケトンエステルの製造は、例えば、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチル（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩を製造する方法を記載する国際公開第２０１４／１４０３０８公報に開示されている。
【００３０】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸のエステルは、エチル−（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸とアルコールとのエステル交換反応によって生成しうる。当該反応は酵素を触媒することができる。例えば、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸エステル及び（Ｒ）−１，３−ブタンジオールのエチルエステルを、穏和な減圧下で固定化リパーゼの存在下でともに反応させて、得られたエタノール副生成物を除去することができる。
【００３１】
本発明の第１実施形態では、（Ｒ）−３ヒドロキシ酪酸エステルは、以下の一般式Ｉ：
【００３２】
【化４】
2021525775.tif 000008
（式中、
−Ｒ１は、５個以下の−ＯＲ２置換基があるＣ１−Ｃ６アルキル基であり、ここで、Ｒ２は水素、若しくはＣ１−Ｃ６アルキル、又は、ＯＲ２は（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸部分を表し；又は
−Ｒ１は、アルコールＨＯＲ１に由来する部分であり、ここで前記アルコールは糖である）である。
【００３３】
通常、０、１又は２の−ＯＲ２は、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸部分を表す。好ましくは、０又は１の−ＯＲ２のみが（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸部分を表す。
【００３４】
Ｒ１部分は対応するアルコールＨＯ−Ｒ１に由来する。アルコールＨＯ−Ｒ１は、例えば、モノアルコール、ジオール、ポリオール、又は糖であり得る。
【００３５】
好ましくは、式Ｉにおいて、Ｒ１は、０，１，２，３，４又は５の−ＯＲ２置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル基である。最も好ましくは、Ｒ１は、１、２又は３の−ＯＲ２置換基、典型的には１又は２の−ＯＲ２置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル基である。
【００３６】
好ましくは、Ｒ２はＨである。
【００３７】
好ましくは、Ｒ１は、式−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２（ＯＨ）又はＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ３を有する。この場合、Ｒ１は、ブタンジオール及びグリセロール各々に対応するアルコールＨＯ−Ｒ１に由来する部分である。ブタンジオールはラセミ体の１，３ブタンジオールである。最も好ましくは、アルコールＨＯ−Ｒ１は、Ｒ−１，３ブタンジオールに対応する。この場合、基Ｒ１は以下の式：
【００３８】
【化５】
2021525775.tif 000009
である。
【００３９】
好ましくは、本発明の第１態様で用いられる化合物は、モノエステルである、すなわち、アルコールＨＯ−Ｒ１が１を超えるペンダントヒドロキシルを含む場合、これらのうちの１のみが反応してヒドロキシ酪酸部分を形成する。部分エステルは、アルコールＨＯ−Ｒ１が２又はそれ以上のペンダントヒドロキシルを含み、当該化合物はこれらの全てが反応してヒドロキシ酪酸部分を形成したわけではない。
【００４０】
本発明者らは、（Ｒ）‐３‐ヒドロキシ酪酸（Ｒ）‐１、３‐ブタンジオールモノエステル及び（Ｒ）‐３‐ヒドロキシ酪酸‐グリセロール部分エステルが血中において（Ｒ）‐３‐ヒドロキシ酪酸の高循環レベルを提供することを見出した。さらに、当該エステルの腸への摂取は、驚くほど高いレベルであり、それにより、飲料摂取時に（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の血中濃度が高くなりうる。
【００４１】
従って、好ましい実施形態では、本発明は、被験体におけるがん性悪液質の治療に用いるヒドロキシ酪酸エステル又は部分エステル、例えば（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸（Ｒ）−１，３−ブタンジオールモノエステル及び（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸グリセロール部分エステルを提供する。
【００４２】
特に有利には、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチル−（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩であり、ラセミ体ケトンよりも経口摂取用が少量であっても、血中（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩を大幅に上昇させうる。当該物質を摂取する被験体は、身体的不快感（例えば、大量の液体の摂取、又は苦味／嫌香味料による）の危険なく、適当なケトンをより容易に摂取して、生理学的に有用な反応を提供できる。（Ｒ）−３−ヒドロキシブチル−（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩は、ケトン塩よりも長期間にわたり（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩濃度を上昇させる。その後、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸濃度をより高く維持するためには、投与頻度がより低くなければならない。これにより、また、投与計画に対する被験体のコンプライアンスが容易となる。
【００４３】
従って、本発明の第１態様で用いる、特に好ましい化合物は、以下の式：
【００４４】
【化６】
2021525775.tif 000010
の（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート（Ｒ）−１，３−ブタンジオールモノエステルであり、これは別名（Ｒ）−３−ヒドロキシブチル−（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートとして知られる。
【００４５】
本発明のさらなる好ましい化合物は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート−グリセロール部分エステル、即ち（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート−グリセロールモノエステル又はジエステルである。
【００４６】
本発明の異なる実施形態では、Ｒ１は、アルコールＨＯＲ１に由来し、ここで、該アルコールは糖である。糖は、アルトロース、アラビノース、デキストロース、エリトロース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、グロース、アイドース、ラクトース、リキソース、マンノース、リボース、リブロース、スクロース、タロース、トレオース、及びキシロースから選択され得る。
【００４７】
Ｒ１が、ポリオールであるアルコールＨＯＲ１から誘導される場合、ポリオールは、グリセロール、ソルビトール及びキシリトールから選択され得る。
【００４８】
本発明の化合物が、上記で示した式に加えてキラル中心を含む場合、化合物は、ラセミ混合物又は純粋なエナンチオマー形態として存在し得る。
【００４９】
本発明の化合物は、生理学的に適合性の塩として存在し得る。例えば、そのナトリウム、カリウム、カルシウム又はマグネシウムの塩を用いうる。
【００５０】
被験体への上記化合物の投与は、被験体における悪液質、特にがん患者における悪液質を治療又は予防することができる。上記のように、悪液質は筋肉の不随意的な体重減少を特徴とする患者が被る消耗性症候群である。「がん性悪液質」は、がん患者が経験する消耗性症候群である。
【００５１】
がん性悪液質の治療では、被験体の筋肉量を維持又は増加させうる。例えば、本明細書で特定される化合物又は組成物は、筋肉量が少なくとも１％ポイント、好ましくは少なくとも３％ポイント、望ましくは少なくとも５％ポイント増加する期間、被験体に投与され得る。通常、化合物又は組成物は、少なくとも１日に１回、例えば１日に１、２回又は３回、被験体に投与される。組成物は、一般に、がん治療の期間及びその後に、被験体に投与される。
【００５２】
好ましくは、本発明の摂取の間、被験体の総体重は、維持又は増加する。一般に、本発明では、被験体の通常の食物摂取量を維持又は増加させる。
【００５３】
好適には、本明細書で特定された化合物又は組成物、好ましくは（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸（Ｒ）−１，３−ブタンジオールモノエステルは、少なくとも１００ｍｇ／ｋｇ体重／日のレベルのケトンで摂取される。望ましくは、化合物は、少なくとも０．１ｍＭ、好ましくは少なくとも０．２ｍＭ、より好ましくは少なくとも１ｍＭ、そして最適には少なくとも２ｍＭの血漿ケトン（（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸）濃度を提供するのに適したレベルで摂取される。一般に、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の血漿レベルは、化合物を投与してから１時間以内に１〜２０ｍＭの範囲内にある。好適には、化合物又は組成物は、血中ケトン濃度が２０ｍＭを超えず、好適には１０ｍＭ又は８ｍＭを超えず、５ｍＭを超えないレベルで摂取される。
【００５４】
ケトンの血中濃度は個体の体重に依存するであろう。発明者らは、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸（Ｒ）−１，３−ブタンジオールモノエステルを体重１ｋｇ当たり少なくとも３００ｍｇ経口投与すると、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の血漿中濃度は約１．５ｍＭとなり、５００ｍｇ／ｋｇで投与すると、少なくとも３ｍＭ（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸が得られることを見出した。被験体の体重１ｋｇあたり７００ｍｇの用量で、血液（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩濃度は、好適には少なくとも５ｍＭ、好ましくは６ｍＭである。被験体の体重１ｋｇ／ｋｇのモノエステルの経口投与において、血液（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩濃度は、好適には少なくとも７ｍＭ、好ましくは少なくとも８ｍＭ、特に少なくとも９ｍＭである。投与方式は、複数の飲料を別々に摂取することを含む。
【００５５】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の血中濃度は、市販の検査キットによって測定することができ、例えば、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸は、ハンドヘルドモニター及び試薬ストリップ（Precision Xtra, Abbott Diabetes Care, UK）を用いて全血で測定することができる。
【００５６】
本発明は、筋肉消耗、体重減少及び食欲不振等の悪液質関連の症状の治療又は予防を提供する。
【００５７】
本発明のさらなる態様では、本明細書で特定される又は組成物の投与は、被験体の筋肉の収縮特性を増加させる。これは、有利には、被験体の強度を向上させることができる。
【００５８】
本発明のさらなる実施形態では、悪液質の治療中に、被験体の活性レベルを高めうる。従って、被験者は、身体活動の実施を望み、治療の間により活発になりうる。
【００５９】
悪液質の治療では、被験体の生存が促進され得る。従って、被験体は、治療を行わない場合よりも長時間生存することができる。
【００６０】
悪液質の治療では、腫瘍の増殖が抑制されることがある。
【００６１】
筋肉量、筋肉の収縮特性、被験体の活動レベル、被験体の腫瘍増殖及び生存は、哺乳動物、例えばマウスにおいて、生体インピーダンス、身体キャリパ、活動モニタ（例えば、歩数計）、二重エネルギーＸ線スキャン、ＣＴスキャン、及びＭＲスキャンなどを用いて、実施例及びヒトに用いられる方法により測定することができる。
【００６２】
本明細書中で用いられる用語「がん」は、通常、未調節の細胞成長、すなわち、増殖性障害によって特徴付けられる生理学的状態を指す。当該増殖性疾患の例としては、がん、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病が挙げられる。
【００６３】
具体的には、投与は結腸がんに関連する悪液質を治療することができる。
【００６４】
本明細書で特定された化合物は、炭水化物と併用投与しうる。炭水化物は、例えば、グルコース、フルクトース又はマルトース等の単純糖であり得る。あるいは、化合物は、タンパク質又はアミノ酸と併用投与（又は同様に）され得る。
【００６５】
本発明のさらなる実施形態では、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート（Ｒ）−１，３−ブタンジオールモノエステル、別名（Ｒ）−３−ヒドロキシブチル（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートとして知られる化合物を、がんの治療方法において被験体に投与する。
【００６６】
被験体は動物、好ましくは哺乳動物、例えばヒトであり得る。
【００６７】
１の実施形態では、化合物、例えば（Ｒ）−３−ヒドロキシブチル（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートは、肝臓のがんの治療に用いられない。例えば、がんは肝細胞がんではない。より詳細には、本化合物は、肝細胞がんに罹患している被験体において肝臓脂肪の減少のために用いられうる。
【００６８】
本発明の化合物は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）及び非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、肝硬変及び肝細胞がんを含む脂肪性肝疾患に罹患している被験体の治療に用いられなくてよい。例えば、本化合物は、これらの被験者の肝臓脂肪の減少に用いられない場合がある。
【００６９】
好ましくは、がんは結腸がんである。
【００７０】
被験体は、上記のように、がん性悪液質に罹患し得る。
【００７１】
本発明で有用な化合物は、滋養組成物と共に含まれ得る。適当には、滋養組成物は、水及び（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の供給源を含む。好ましくは、組成物は、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸のエステル、香味剤、及び場合によっては、タンパク質、炭水化物、糖類、脂肪、繊維、ビタミン類及びミネラル類の１又はそれ以上を含む。適当には、香味剤は、果実系香味料を含むことができる。一実施形態では、当該香味料は、例えばコーヒー、チョコレート、及びクランベリー等、適度に苦い。当該苦味は、例えばグレープフルーツ、ラズベリー及びクランベリー等の果実系香味料等の他の香味料と組み合わせることができる。
【００７２】
本発明の組成物は、上記式Ｉの化合物の異性体の混合物を含んでもよい。
【００７３】
当該組成物は、適当に官能的に許容し得る。「官能的に許容可能」とは、組成物が、味、色、感触及び臭気の許容可能な感覚特性を有すべきことを意味する。
【００７４】
当該組成物は、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）を含み得る。中鎖トリグリセリドがある場合、好ましくは、式ＣＨ２Ｒａ−ＣＨ２Ｒｂ−ＣＨ２Ｒｃがあり、ここでＲａ、Ｒｂ及びＲｃの炭素原子が５〜１２個である脂肪酸を有する中鎖トリグリセリドを含む。適当には、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、ｔｒｉ−Ｃ６：０  ＭＣＴｓとして６炭素骨格（ｔｒｉ−Ｃ６：０）を含む脂肪酸であり、胃腸管によって速やかに吸収されるという報告がある。
【００７５】
本発明の組成物は、Ｌ−カルニチン又はＬ−カルニチンの誘導体を含み得る。Ｌ−カルニチンの誘導体の例としては、デカノイルカルニチン、ヘキサノイルカルニチン、カプロイルカルニチン、ラウロイルカルニチン、オクタノイルカルニチン、ステアロイルカルニチン、ミリストイルカルニチン、アセチル−Ｌ−カルニチン、Ｏ−アセチル−Ｌ−カルニチン、及びパルミトイル−Ｌ−カルニチンが挙げられる。カルニチンが用いられる場合、本発明の組成物は、ｉ）ケトン体、好ましくはケトンモノエステル、より好ましくは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートモノエステル、及びｉｉ）Ｌ−カルニチン又はＬ−カルニチンの誘導体、及び必要に応じてＭＣＴを含む。
【００７６】
ＭＣＴ及びＬ−カルニチン又はその誘導体を用いる場合、適当には、ＭＣＴをカルニチンで乳化する。好ましくは、１０〜５００ｇの乳化ＭＣＴを１０〜２０００ｍｇのカルニチン、例えば、５０ｇのモノグリセリド及びジグリセリドと５００ｍｇのＬ−カルニチンと組み合わせた５０ｇのＭＣＴ（９５％トリＣ８：０）と混合する。好ましくは、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の供給源のレベルは、ＭＣＴのレベルよりも大きい。
【００７７】
本発明による組成物は、固体、例えば粉末、錠剤、バー、菓子製品、又は顆粒、液体、例えば飲料、ゲル、カプセル、又はいかなる他の通常の製品形態を含む、いかなる適当な形態で提供することができる。組成物は、食品、食品サプリメント、食物サプリメント、機能性食品又は栄養補助食品又はそれらの成分であり得る。
【００７８】
組成物を添加剤として導入しうる食品の例としては、スナックバー、シリアル、菓子及びヨーグルトを含むプロバイオティック製剤が挙げられる。飲料の例としては、軟飲料、アルコール飲料、エネルギー飲料、ドライドリンクミックス、栄養飲料及び注入用のハーブティー、又は水中の煎剤用のハーブブレンドがあげられる。
【００７９】
栄養補助食品とは、食品成分、食品サプリメント又は食品であり、疾病の予防及び治療を含む、医療又は健康上の利益をもたらすと考えられる。一般に、栄養補助食品は、特に、消費者に健康上の利益を与えるように適合される。栄養補助食品は、登場は、対応する通常の食品に含まれるよりも高いレベルで、ビタミン類、ミネラル類、ハーブ又は植物化学物質等の微量栄養素を含む。当該レベルは、通常、単一食餌として、又は食餌計画の一部として、又は栄養療法のコースの一部として、栄養補助食品の意図された健康上の利益を最適化するように選択される。
【００８０】
本発明で用いられる化合物は、通常、栄養補助食品として処方される。
【００８１】
固体形態の場合、組成物は、本発明の化合物の少なくとも５質量％、より好ましくは少なくとも１０質量％、及び９５質量％までの組成物を好適に含む。例えば、組成物が液体と共に使用して液体組成物を製造することを意図した乾燥粉末である場合、乾燥組成物の１５〜３０質量％のレベルが好適であり得るが、固体バー又は生成物形態は、組成物の３０〜９５質量％、特に５０〜９５質量％を好適に含む。
【００８２】
組成物が固体形態である場合、組成物は、以下の成分の１又はそれ以上をさらに含むことができる：
−  希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、トウモロコシデンプン又はジャガイモデンプン；
−  シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カルシウム及び／又はポリエチレングリコール等の潤滑剤；
−  デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はポリビニルピロリドン等の結合剤；
−  デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩又はデンプングリコール酸ナトリウム等の崩壊剤；
−  発泡剤；
−  染料；
−  フレーバー；
−  湿潤剤、例えば、レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩；及び／又は
−  キャリア
組成物が液体形態である場合、組成物は、本明細書中で特定される化合物等を、液体組成物の少なくとも１質量％、例えば３〜４０質量％のレベルで含むのが適当であるが、組成物が、所望の血中ケトンレベルに達するように、単回投与として受け取ることが意図されるのか、又は複数回のより小さな用量として受け取ることが意図されるのかに応じて、組成物の例えば５０質量％まで高くすることができる。
【００８３】
液体形態の組成物は、併用すて適当にブレンドされるある液体成分を含むことができ、又は適宜液体成分と混合されるか又は液体成分に溶解される液体及び固体成分を含むことができる。１つの実施形態では、上記で特定された化合物を含む乾燥組成物は、好適な液体、例えば水、フルーツジュース、ヨーグルト又はミルクで、好ましくは乾燥組成物対液体の比１：１〜１：１０、より好ましくは１：３〜１：７で希釈される。
【００８４】
組成物は、必要に応じて、消費可能な形態の液体製品として、又は使用時に希釈するのに適した濃縮物又はペーストとして提供することができる。液体組成物と併用する希釈剤は、好ましくは、ミルク、フルーツジュース又は水である。
【００８５】
所望であれば、カプセル化材料及びその適用量がヒトの消化の安全に適する場合、当該組成物はカプセル化形態で提供することもできる。
【００８６】
本発明の一態様は、１又はそれ以上の医薬的に許容される賦形剤と共に、医薬組成物において上記特定された本発明の化合物を提供する。
【００８７】
本発明で用いられる化合物は、医薬的に許容される塩として存在し得る。本明細書で用いられる場合、医薬的に許容される塩は、医薬的に許容される酸又は塩基との塩である。医薬的に許容される酸には、塩酸、硫酸、リン酸、二リン酸、臭化水素酸又は硝酸等の無機酸と、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、酒石酸、安息香酸、酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸又はｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸がともに含まれる。医薬的に許容される塩基としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム又はカリウム）及びアルカリ土類金属（例えば、カルシウム又はマグネシウム）水酸化物及びアルキルアミン、アラルキルアミン及び複素環アミン等の有機塩基が挙げられる。
【００８８】
本発明で用いられる化合物は、溶媒和物として存在してよい。用語「溶媒和物」は、溶質の１又はそれ以上の分子、即ち、本発明の化合物又はその医薬的に許容される塩、及び溶媒の１又はそれ以上の分子によって形成される複合体又は凝集体を意味する。そのような溶媒和物は、通報、実質的に固定されたモル比の溶質及び溶媒を有する結晶性固体である。代表的な溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、酢酸などが挙げられる。溶媒が水の場合、生成した溶媒和物は水和物である。
【００８９】
本発明の化合物はキラル中心を含む。従って、それらは、ラセミ混合物、エナンチオマー、又は１又はそれ以上の立体異性体に富む混合物の形態で用いうる。本発明の範囲は、本発明の化合物のラセミ体、ならびに個々のエナンチオマー、及び立体異性体が富化の混合物を包含する。
【００９０】
用語「又はその医薬的に許容可能な塩又は溶媒和物」は、本発明の化合物の医薬的に許容可能な塩の溶媒和物のような塩及び溶媒和物の全ての順列を含むことが意図されていることが理解されるであろう。
【００９１】
医薬組成物は、１又はそれ以上の医薬上許容される希釈剤、賦形剤又は担体と混合された本発明の化合物を含む。本発明において有用な化合物（それらの医薬的に許容される塩、エステル及び医薬的に許容される溶媒和物を含む）は単独で投与され得るが、それらは、一般に、特にヒト治療では、医薬的担体、賦形剤又は希釈剤と混合して投与される。医薬組成物は、ヒト及び獣医学におけるヒト又は動物へ用いうる。
【００９２】
本明細書に記載された種々の異なる形態の医薬組成物用の当該適当な賦形剤の例は、「医薬品添加物ハンドブック第２版（１９９４）編集Ａ  Ｗａｄｅ及びＰＪ  Ｗｅｌｌｅｒ」に見出すことができる。
【００９３】
当該
組成物（医薬的及び栄養学的ともに）は、医薬的に許容される吸着剤を含み得る。好適には、吸着体は、吸着体内又は吸着体上に本発明の化合物を吸着する。有利には、化合物の香味（嫌味かもしれない）は、吸着剤なしで同じ組成物を消費した場合に経験されるよりも、使用者が経験するレベルが低い。好ましくは、前記吸着体は、本発明の化合物を保持することができる格子又はボイドを含む。食品に使用又は使用することが知られているいかなる吸着剤を使用することができる。好適な吸着剤の例としては、ポリマーヒドロゲル、例えば架橋ポリカルボキシレートホモポリマー又はコポリマーのポリマー、包接化合物、環状オリゴ糖、例えばシクロデキストリン、及び乳粉末が挙げられる。吸着体は、特定の処方に従っていかなる所望のレベルで存在することができ、組成物の５質量％〜８０質量％、例えば、１０質量％〜５０質量％であり得る。
【００９４】
通常、本発明の使用は、化合物を経口、非経口又は静脈内に投与することを含む。経口投与が好ましい。
【００９５】
本発明はまた、本明細書で特定されるように、実質的に純粋な形態で、又は被験体においてがん、特にがん性悪液質の治療に用いる１又はそれ以上の医薬的に許容される希釈剤又は担体と共に、化合物を提供する。
【００９６】
本明細書で使用する「実質的に純粋な形態」という用語は、通常、５０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の純度を有する化合物をいう。
【００９７】
以下の実施例は、本発明を例示する。
【実施例】
【００９８】
一般的な材料及び方法
動物飼育形態及び飼育  −  １１週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウスを入手し、室温（２１〜２３℃）及び湿度（４０〜６０％）の制御条件下で午前６時〜午後６時の光サイクルでポリカーボネートケージに収容した。マウスを個別に飼育して、個々のエネルギー摂取量及び身体活動パラメータを評価した。ケージにはトウヒの粒子（Ｌｉｇｎｏｃｅｌ（登録商標）ＢＫ８／１５）の敷物が含まれ、３週間ごとに交換した。濃縮は、ケージ交換時に交換した２つの綿ペレットで行った。流動食を与えている間、マウスに木製の棒を１本与えて、歯を正しく磨耗させた。固形食はケージの頂部の金属ワイヤ蓋の凹部に供給し、液体食は供給チューブ（Ｂｉｏ−ＳｅｒｖＴＭ、カタログ＃１４−７２６−５１８）により毎日供給した。ケージ内に延伸する金属ディスペンサを備えた集中システムによって水を供給した。全ての手順は、ベルギーのＫＵ  Ｌｅｕｖｅｎ動物倫理委員会によって承認された（Ｐ０９３／２０１７）。
【００９９】
実験用飼料  −  粉末Ｌｉｅｂｅｒ−ＤｅＣａｒｌｉ飼料はＢｉｏ−Ｓｅｒｖ  （製品Ｆ１２５８ＳＰ及びＦ１２５９ＳＰ；Bio-Serv,Frenchtown,NJ,USA）から購入した。対照飼料（ＣＯＮ）は、Ｌｉｅｂｅｒ‐ＤｅＣａｒｌｉ対照飼料粉末（Ｆ１２５９ＳＰ）に温水を添加して調製した。ケトン‐エステル食（ＫＥＴ）は、温水、（Ｒ）‐３‐ヒドロキシブチル‐（Ｒ）‐３‐ヒドロキシ酪酸（ケトンエステル）及びマルトデキストリン（Candelel,Ternat,Belgium）をＦ１２５８ＳＰ粉末に添加して調製した。市販のバニラ風味（０．４％ｖ／ｖ；Dr.Oetker,Diegem,Belgium）を両方の流動食に加え、嗜好性を高めた。飼料中の多量栄養素の組成を表１に示す。どちらの飼料にも、食物１ｇ当たり同量のエネルギー（ｋｃａｌ）、タンパク質、脂肪が含まれた。
表１：実験飼料の多量栄養素組成
【０１００】
【表１】
2021525775.tif 000011
一般試験プロトコル及び食事介入−マウスは、試験開始前に個別に飼育し、標準飼料（Ｓｓｎｉｆｆ（登録商標）R/M-H, Soest, Germany）を摂取させた。摂餌量を登録し、体重を５日間毎日測定し、正常摂餌量を評価した。この基準追跡期間後、マウスを体重と食物摂取について一致させて、以下の５つの実験群に無作為に割り付けた：ｉ）対照食で休息するＣ２６腫瘍担持マウス（ＣＯＮｒｅｓｔ）、ｉｉ）ケトン食で休息するＣ２６担持マウス（ＫＥＴｒｅｓｔ）、ｉｉｉ）対照食で自発的輪走行（ＷＲ）を行うＣ２６担持マウス（ＣＯＮＥＸ）、ｉｖ）ケトン食でＷＲを行うＣ２６担持マウス（ＫＥＴＥＸ）、及びｖ）対照食で休息する健常マウス（ＷＴ）。マウスは、段階的に食物供給を変化させて、実験食に慣れさせた。最初の３日間に、マウスに実験用の液体飼料（ケトン非添加）と標準飼料の両方を与えた。３〜６日目に、マウスに実験的な流動食（すなわち、０％ＫＥＴ又はＣＯＮ食）のみを与えた。その後、ケトンエステルをＫＥＴ群の飼料に添加して、６日目に３％、９日目に４．５％の濃度を得た。マッチドトリプレット（ＣＯＮｒｅｓｔ、ＫＥＴｒｅｓｔ及びＷＴ）及びマッチドペア（ＣＯＮＥＸ及びＫＥＴＥＸ）をペア給餌し、等カロリー食を得た。ＣＯＮ及びＷＴマウスには、そのペア給餌ＫＥＴマウスが前日に摂取したのと同じエネルギー量（ｋｃａｌ）を送達する食物を与えた。
【０１０１】
腫瘍誘発及び運動介入  −  １２日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μｌに溶解した５×１０５個のマウス結腸がんＣ２６細胞の肩甲間注射により腫瘍異種移植片を誘発した。Ｃ２６細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％グルタミン（Ｓｉｇｍａ  Ｇ７５１３）及び１％ペニシリン及びストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ（Thermo Fisher Scientific, 41965-062）中で培養した。ＷＴマウスに同量のＰＢＳを注射した。腫瘍接種の２４時間前に、ＷＲマウス（ＣＯＮＥＸ及びＫＥＴＥＸ）は、Coletti D et al.が既に報告するように、随意運動を誘発するランニングホイールを受けた。近交系マウスのサブストレインは、行動としての身体活動性が異なる。Sci World J 2013:1-7, 2013．各車輪には、身体活動パラメータ（すなわち、走行時間、距離、及び速度）を記録するための市販のサイクリングコンピュータ（２Ｃｙｃｌｅ、８１４８８）が供給された。
【０１０２】
具体的な実験方法・手順
生存実験  −  ４０匹のマウスを、初期体重に基づいて様々な実験群に無作為に割り付け、上記のように処置した。マウスの寿命を延ばし、瀕死状態と考えられた場合にのみ安楽死させた。体重、摂餌量及び車輪走行パラメータを毎日測定した。生存期間に対する交絡作用を避けるため、追加測定は行わなかった。
行動試験及び組織採取実験−  第２実験では、各実験群に９匹のマウスを含め、行動試験及び組織採取に用いた。マウスは、ＰＢＳ又は腫瘍細胞接種の１６日後に安楽死させた。測定した変数に対する運動の潜在的な急性効果を排除するために、走行輪を犠牲にする２４時間前に除去した。
体重、摂餌量及び車輪走行パラメータ−体重は、食品トレーニング期間中３日毎に測定した。腫瘍誘発後、体重を４日間隔で測定した。摂餌量及び車輪走行パラメータを毎日測定した。
【０１０３】
握力−等尺力変換器(BIO-GS3 Grip Strength Test, BIOSEB, Pinellas Park, Florida)に接続した棒及び格子を用いて、ベースライン（５日目）及び腫瘍誘発から４日毎に、前肢及び後肢の握力を評価した。マウスを尾部で持ち上げ、金属棒又はグリッドをつかむように位置決めし、グリップを保持できなくなるまで水平方向に引っ張った。最大力（ｇ）は、前肢と後肢の両方に対して５回の実施の間に登録された。パフォーマンスは、３つの最善の試みの平均として計算した。実施の間、マウスを自宅のケージに戻し、３分の休息時間を与えた。
【０１０４】
血中代謝物濃度−  血液パラメータを食後１時間、食餌馴化期間中は３日毎、腫瘍誘発日からは４日毎に測定した。血中βＨＢ及び血糖値は、それぞれＬｘβ‐ケトン又はＬｘグルコースストリップを用いたグルコメンＬｘプラスメーター（Menarini Diagnostics, Firenze, Italy）を用いて測定した。β−ヒドロキシ酪酸の検出限界は０．１〜８．０ｍＭであった。血中乳酸濃度は、Ｌａｃｔａｔｅ−Ｐｒｏ  ２モニタリングシステム（Ａｒｋｒａｙ、京都、日本）を用いて評価した。測定はメーカーの指示に従って実施した。
【０１０５】
筋収縮特性  −  Ｅｘ−ｖｉｖｏ筋収縮特性は、Derave W et al; Skeletal muscle properties in a transgenic mouse model for amyotrophic lateral sclerosis: Effects of creatine treatment. Neurobiol Dis 13: 264−272, 2003 and Eijnde BO et al; Effect of muscle creatine content manipulation on contractile properties in mouse muscles. Muscle and Nerve 29: 428−435, 2004の記載のように評価した。
【０１０６】
ケタミン‐キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によりマウスを麻酔した。両後肢のヒラメ筋及び長趾伸筋（ＥＤＬ）の解剖後、筋肉を力変換器（HSE, March-Hugstetten, Germany）上に垂直に取り付け、Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液（１１８ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び１ｍＭ  グルコース）を含む臓器浴中でインキュベートした。９５％  Ｏ２と５％  ＣＯ２の混合物で臓器浴を連続的にガス化し、２５℃に維持した。装着後、１５分間の安定化期間を設けて、解離処置から回復するようにした。回復後、静止長（Ｌ０）を、マイクロポジショナとオシロスコープを用いて、ヒラメ筋とＥＤＬをそれぞれ８０Ｈｚと１２０Ｈｚで３５０ｍｓ間、２分間の静止間隔で刺激することにより決定した。その後、筋肉を刺激し、痙攣及び強直特性を評価した。筋肉を、５Ｈｚで３回電気的に刺激し、１分間の休止間隔（痙攣刺激）、８０Ｈｚで５００ｍｓ、１００Ｈｚで２５０ｍｓ、２分間の休止間隔（強直刺激）で３回散布した。平均最大張力及び比張力（筋断面積に対して補正した力）を、痙攣及び強直刺激の両方について計算した。横断面積は、湿った筋肉量を安静時筋肉長（Ｌ０）と哺乳類骨格筋密度（１．０６ｇ／ｃｍ３）の積で割ることによって決定した。
【０１０７】
統計解析  −  データは平均±標準誤差で示す。実験群間の差は、二元配置分散分析（２元配置分散分析）を用いて評価し、その後、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を行い、どの群が有意に異なるかを判定した。ＷＴ群のマウスは、２ウェイＡＮＯＶＡモデルには含まれなかったが、参考として加えた。車輪走行活動の差は、対応のないｔ検定を用いて評価した。生存実験では、各実験群の曲線をＫａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒ法を用いて推定し、生存期間の差をＬｏｇ‐Ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ‐Ｃｏｘ）検定とＴｕｋｅｙ検定を用いて検定し、第一種の過誤率を０．０５に維持した。統計学的有意性はｐ＜０．０５と定義した。
【０１０８】
結果
図１は生存期間を示し、図１（Ａ）は５つの実験群すべての生存曲線を示す。図１（Ｂ）は運動状態の主な影響を示す（ＣＯＮｒｅｓｔ＆ＫＥＴｒｅｓｔ  ｖｓ．ＣＯＮＥＸ＆ＫＥＴＥＸ）。図１（Ｃ）は栄養状態の主な影響を示す（ＣＯＮｒｅｓｔ＋ＣＯＮＷＲ  ｖｓ．ＫＥＴｒｅｓｔ  ＋  ＫＥＴＥＸ）。ケトン群のマウスは、対照群と比較して、生存期間の平均及び中央値が大幅に増加した（それぞれ＋４０％及び＋１７％、ｐ＜０．０１）。生存率は、安静群と運動群で同程度であった。
【０１０９】
図２に、各実験群の摂餌量と体重（Ａ）摂餌量と（Ｂ）体重を示す。運動群（ＣＯＮｅｘ  ＆  ＫＥＴｅｘ）の食物摂取量は、他の群（ＣＯＮｒｅｓｔ  ＆  ＫＥＴｒｅｓｔ）よりも平均約１５％高かったが、ＫＥＴ群とＣＯＮ群との間に差は認められなかった。体重はすべての実験群で同様に経時的に減少した。
【０１１０】
図３は、各実験群の血液パラメータ−（Ａ）血中βＨＢ及び（Ｂ）血糖値を示す。基準時の血中βＨＢ濃度は全群で検出不能（＜０．１ｍＭ）であった。食事介入期間中、ＫＥＴ群ではβＨＢレベルは〜２ｍＭまで増加したが、ＣＯＮではを上回る増加は認められなかった。ＣＯＮ群と比較して、血糖値は常にＫＥＴで低かった。
【０１１１】
図４にホイールの走行状況を示す。以下の表２に示すように、ＫＥＴＥＸ群のマウスでは、ＣＯＮＥＸと比較して車輪走行活動が大幅に増加し、走行距離（ｋｍ／日）、走行速度及び持続時間が共に増加したことが証明された。
表２：対照飼料又はケトンエステル飼料のいずれかを摂取した場合のマウスホイールの走行活動
【０１１２】
【表２】
2021525775.tif 000012
図５に腫瘍質量を示す。ＣＯＮ群（４５５±２２ｍｇ）と比較して、ＫＥＴマウスの腫瘍質量はかなり低かった（２０４±３２ｍｇ，ｐ＜０．０５）。腫瘍質量は、残りの群と運動群の間で同様であった。
【０１１３】
図６は、各実験群の筋肉量を示す。（Ａ）前脛骨筋（ＴＡ）、（Ｂ）大腿四頭筋（ＱＵＡＤ）及び（Ｃ）腓腹筋（ＧＡＳ）の質量である。ＣＯＮ（３７．０±１．５ｍｇ）と比較して、ＴＡ質量はＫＥＴで平均〜１２％高かった（４１．６±２．１ｍｇ，ｐ＜０．０５）。ＱＵＡＤ質量は、非運動群より運動群で低かった（４４．４±１．１対５１．４±１．６ｍｇ，ｐ＜０．０５）。ＧＡＳ質量は群間で同程度であった。
【０１１４】
図７は、異なる実験群の１６日目における握力−（Ａ）前肢及び（Ｂ）後肢の筋力を示す。ケトン群（ＫＥＴｒｅｓｔ  ＆  ＫＥＴｅｘ）では、前肢及び後肢の握力が、対照群よりも高かった（ＣＯＮｒｅｓｔ  ＆  ＣＯＮＥＸ，ｐ＜０．０５）。運動自体では握力を変化しなかった。
【０１１５】
図８は、異なる実験群で測定したの筋収縮特性のインビトロ測定値をヒラメ筋（ｍ．ｓｏｌｅｕｓ）  −  Ｐｅａｋ  ｔｗｉｔｃｈ  （Ａ）及びヒラメ筋の強縮（Ｂ）に示したものである。ケトン群（ＫＥＴｒｅｓｔ  ＆  ＫＥＴｅｘ）では対照群（ＣＯＮｒｅｓｔ  ＆  ＣＯＮＥＸ、ｐ＜０．０５）よりも平均で〜４５％及び〜２９％高かった。運動自体では筋力は変化しなかった。
【図１】
2021525775.tif 000017
【図２】
2021525775.tif 000018
【図３】
2021525775.tif 000019
【図４】
2021525775.tif 000020
【図５】
2021525775.tif 000021
【図６Ａ】
2021525775.tif 000022
【図６Ｂ】
2021525775.tif 000023
【図６Ｃ】
2021525775.tif 000024
【図７】
2021525775.tif 000025
【図８Ａ】
2021525775.tif 000026
【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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2021525775.tif 000029
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