(57)【要約】  グラシリンA同族体及び免疫抑制及び神経保護剤としてそれらを使用するための方法。
2021530427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において免疫応答を抑制するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、下式:
【化１】
2021530427.tif 000074
を有する化合物又はその立体異性体若しくはラセミ体を投与することを含む方法
[式中:
R1、R2、及びR3は独立に、H又はC1〜C3アルキルであり、破線は、結合又は結合の非存在を示すが、ただし、1本の破線だけが結合であることを条件とする]。
【請求項２】
前記化合物が、
【化２】
2021530427.tif 000075
又はその立体異性体若しくはラセミ体である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、
【化３】
2021530427.tif 000076
である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、自己免疫疾患又は炎症性疾患に罹患していると診断されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物がインターロイキン-2産生を阻害する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記インターロイキン-2産生が約20%超阻害される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物が、約6μM未満のKDでCypAに結合する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が、インビトロでT細胞生存率を約10%未満低下させる、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
対象において神経変性疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、下式:
【化４】
2021530427.tif 000077
を有する化合物又はその立体異性体若しくはラセミ体を投与することを含む方法
[式中:
R1、R2、及びR3は独立に、H又はC1〜C3アルキルであり;
R4は、H、OH、OAcであるか、又は存在せず;
R5及びR8は独立に、H又はOAcであり;
R6及びR7は、Hであるか、又はR6及びR7は一緒になって、Oであり;
破線は、R4が存在しない場合、結合を示すか、又はR4がH、OH、又はOAcである場合、結合の非存在を示す]。
【請求項１０】
前記化合物が、
【化５】
2021530427.tif 000078
又はその立体異性体若しくはラセミ体である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、
【化６】
2021530427.tif 000079
である、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項9から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物がCypDを約0.5μM未満のIC50で阻害する、請求項9から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物がCypAを約0.3μM未満のIC50で阻害する、請求項9から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物がCypDを阻害し、CypAを阻害しない、請求項9から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
下式:
【化７】
2021530427.tif 000080
を有する化合物又はその立体異性体若しくはラセミ体
[式中:
R1、R2、及びR3は独立に、H又はC1〜C3アルキルであり;
R4は、H、OH、OAcであるか、又は存在せず;
R5及びR8は独立に、H又はOAcであり;
R6及びR7は、Hであるか、又はR6及びR7は一緒になって、Oであり;
破線は、結合又は結合の非存在を示すが、ただし、1本の破線だけが結合であることを条件とし、更に、R4がH、OH、又はOAcである場合、両方の破線が結合の非存在を示すことを条件とする]。
【請求項１７】
【化８】
2021530427.tif 000081
又はその立体異性体若しくはラセミ体である、請求項16に記載の化合物。
【請求項１８】
【化９】
2021530427.tif 000082
又はその立体異性体若しくはラセミ体である、請求項16に記載の化合物。
【請求項１９】
【化１０】
2021530427.tif 000083
からなる群から選択される、請求項16に記載の化合物。
【請求項２０】
請求項16から19のいずれか一項に記載の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項２１】
免疫抑制剤として使用するための、請求項16から19のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２】
神経保護剤として使用するための、請求項16から19のいずれか一項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に明確に援用される2018年3月5日出願の米国特許出願第62/638,856号の利益を請求する。
【０００２】
政府ライセンス権の申告
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes for Health)により授与された契約番号GM R37 052964及びアメリカ国立科学財団(National Science Foundation)により授与された契約番号CHE-1546973の下で政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
海綿動物(Porifera)門(海綿)は、最古の後生動物生物形態を示す。それらは単純なボディープラン及び限られた数の細胞型を有し、かつ多くの場合に、多量の高負荷の細菌共生生物又は片利共生生物を伴っている。海綿及び随伴微生物が産生する天然生成物の多様性は非常に高く、既知の生合成群のすべてのメンバーを含んでいる。このため、海綿は最も重点的に調査されている海洋無脊椎動物門であり、数種の海綿化合物又はそれらの誘導体が臨床で用いられているか、又は治験の進行段階にある。
【０００４】
スポンジオネラ(Spongionella)種の先行調査は、それらが天然生成物の種々の生合成群:ジテルペン類、ノル-及びビスノルジテルペン類、ポリヒドロキシル化ステロール類、及びフラノースエステルテルペン類を含有することを示した。希少なノル-ジテルペンであるグラシリンAを含むグラシリンは初めに、地中海産海綿のスポンジオネラ・グラシリス(Spongionella gracilis)から単離され、特徴づけられた。グラシリン類は、稀なジアセトキシヘキサヒドロジフロ[2,3-b;3',2'-d]フラン-2-オン核のために構造的に独特であると考えられる。12種のヒトがん細胞系からなる多様なパネルに対する、スポンジオネラ・プルチェラ(Spongionella pulchella)から単離されたグラシリンB、G〜Iの細胞傷害性活性が報告されているが、これらの化合物は、前臨床評価に更に進むことはなかった。これらのジテルペン類は、多くのメンバーにおいて見い出される稀なジアセトキシフラノースのために構造的に独特である。12種のヒトがん細胞系からなる多様なパネルに対する、スポンジオネラ・プルチェラから単離されたグラシリンB、G〜Iの細胞傷害性活性が報告されているが、これらの化合物は、前臨床評価に更に進むことはなかった。グラシリンAの絶対配置は確立されていないが、その相対配置は、9,11-ジヒドログラシリンA(3)のケト誘導体のX線分析により決定された。グラシリンAは、69%の不活性化効率で、ホスホリパーゼA2(PLA2)の強力な阻害薬であると報告された。グラシリンAは、K562及びPBMC細胞に対してそれぞれ0.6及び0.8μMのIC50値で中等度に細胞傷害性であり、100μM濃度でEGF-Rを70%阻害したことが報告されている。加えて、グラシリンAは、シクロフィリンA(CypA)の阻害を介してシクロスポリンA(CsA)の作用を模倣し、アルツハイマー病(AD)の特徴をインビトロ及びインビボで改善することが示された。
【０００５】
神経変性に関与する複雑で、高度に相互連絡している細胞プロセスにより、神経変性疾患の処置は、医薬品開発の難題である。例えば、酸化ストレス(OS)、活性酸素種(ROS)の放出と細胞抗酸化防御との間のアンバランスがアルツハイマー病(AD)の初期段階で検出されている。ニューロンは、それらの高い酸素消費率、低い抗酸化能、及び高レベルのポリ不飽和脂肪酸により、OSにより傷つきやすい。ADにおけるニューロンOSの初期の役割は、アミロイドベータタンパク質(Aβ)形成、ミトコンドリア機能障害、小グリア細胞活性化及びτ-過剰リン酸化に関連しており、現在第I又はII相治験中のN-アセチル-L-システイン等の抗酸化薬の研究につながっている。シクロフィリン(Cyp)は、タンパク質フォールディング及び輸送に関係する高度保存ペプチジル-プロリル、cis-transイソメラーゼ(PPIase)であり、複数の細胞コンパートメントにおいて見い出される。シクロフィリンA(CypA)、細胞質アイソフォームは、炎症及びがんにおいて発現が増強するサイトカインをコードする炎症誘発性遺伝子のカルシニューリン媒介性活性化を含めて、細胞代謝及びエネルギーホメオスターシスにおいて複数の役割を有する。CypAの炎症関連作用を選択的に遮断するが、他の機能には影響を及ぼさない小分子の使用は、有効な免疫抑制剤につながる重要な薬理学的戦略である。シクロフィリンDは、移動してミトコンドリア透過性遷移孔(mPTP)を形成するミトコンドリアアイソフォームであり、この活性は、ADにおいて観察されるミトコンドリア機能障害と相関し、ニューロン死につながる。更に、ミトコンドリアアミロイドベータタンパク質(Aβ)はPTPのCypD媒介性形成に関与しており、これは、ROS生成、細胞内カルシウム濃度の撹乱、アポトーシス促進因子の放出及び最終的に細胞死をもたらす。CypD欠損は、ADマウスモデルにおいて、AβとCa2+-誘発性ミトコンドリア膨張及び透過性との両方に対する抵抗性と相関し、認知及び記憶を増強させた。したがって、CypDの活性を選択的に阻害する小分子をADのために使用することができる。CsAは、CypDに対して所望の選択性を示さず、この大きな大環状ペプチドは、血液脳関門透過性ではない。したがって、CypAへの結合を通じた免疫抑制活性は欠い
ているが、所望のミトコンドリア作用及びBBB透過性は有するCypD阻害薬は、ADに対するアプローチであり得るであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2014/48065 A1
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Alfonso, A.、Pazos, M. J.、Fernandez-Araujo, A.、Tobio, A.、Alfonso, C.、Vieytes, M. R. and Botana, L. M.、Toxins 2014、6、96〜107
【非特許文献２】Sanchez, J. A.、Alfonso, A.、Leiros, M.、Alonso, E.、Rateb, M. E.、Jaspars, M.、Houssen, W. E.、Ebel, R.及びBotana, L. M.、Cell Physiol. Biochem.、2015、37、779〜792
【非特許文献３】Zydowsky,L. D.、Etzkorn,F. A.、Chang,H. Y.、Ferguson,S. B.、Stolz,L. A.、Ho,S. I. and Walsh,C. T.、Protein Sci.、1992、1、1092〜1099
【非特許文献４】Damsker,J. M.、Bukrinsky,M. I. and Constant,S. L. J. Leukoc. Biol.、2007、82、613〜618
【非特許文献５】Connern,C. P.及びHalestrap,A. P. Biochem. J.、1994、302、321〜324
【非特許文献６】Lee,S.、Kaib,P. S. J.及びList,B. J. Am. Chem. Soc.、2017、139、2156〜2159
【非特許文献７】Abbasov,M. E.、Hudson,B. M.、Tantillo,D. J.及びRomo,D. J. Am. Chem. Soc.、2014、136、4492〜4495
【非特許文献８】Fieser,L. F.;Fieser、M. Reagents for Organic Synthesis、1967、581〜595
【非特許文献９】Ren,H.、Dunet,G.、Mayer,P.及びKnochel,P. J. Am. Chem. Soc.、2007、127、5376〜5377
【非特許文献１０】Harvey,N. L.、Krysiak,J.、Chamni,S.、Cho,S. W.、Sieber,S. A. and Romo,D. Chem. Eur. J.、2015、21、1425〜1428
【非特許文献１１】Tao,D. J.;Slutskyy,Y.;Overman,L. E. J. Am. Chem. Soc. 2016、138、2186
【非特許文献１２】Moradei,O. M. and Paquette,L. A. Org. Synth. 2003、80、66
【非特許文献１３】Trost,B. M. and Toste,F. D. J. Am. Chem. Soc. 2003、125、3090
【非特許文献１４】Trost, B. M.;Crawley, M. L. Chem. Eur. J. 2004、10、2237
【非特許文献１５】Alfonso, A., Botana, M. A., Vieytes, M. R. and Botana, L. M. Cell Signal, 2001、13、819〜826
【非特許文献１６】Leiros, M., Alonso, E., Sanchez, J. A., Rateb, M. E., Ebel, R., Houssen, W. E., Jaspars, M., Alfonso, A.and Botana, L. M. ACS Chem. Neurosci.、2014、5、71〜80
【非特許文献１７】Burton, J. D. Methods Mol. Med.、2005、110、69〜78
【非特許文献１８】Halliwell, B. and Whiteman, M. Br. J. Pharmacol.、2004、142、231〜255
【非特許文献１９】Yan, W., Qing, J., Mei, H., Nong, J., Huang, J., Zhu, J., Jiang, H., Liu, L., Zhang, L. and Li, J. Bioorg. Med. Chem. Lett.、2015、25、5682〜5686
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の免疫抑制及び神経保護剤の開発の進展にも関わらず、CypAに対する高い親和性を免疫抑制薬としての有用性と共に有する簡略化グラシリンA誘導体、及びCypAとCypDとの間での有意な選択性を示し、免疫抑制作用を欠いた神経保護剤としてのそれらの可能性を示す他の誘導体が必要とされている。本発明は、この必要性を実現することを求め、さらなる関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、グラシリンA同族体並びにそのグラシリンA同族体を免疫抑制及び神経保護剤として使用するための方法を提供する。
【００１０】
一態様では、本発明は、グラシリンA同族体を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、下式:
【００１１】
【化１】
2021530427.tif 000003
【００１２】
を有する化合物又はその立体異性体若しくはラセミ体を提供する
[式中:
R1、R2、及びR3は独立に、H又はC1〜C3アルキルであり;
R4は、H、OH、OAcであるか、又は存在せず;
R5及びR8は独立に、H又はOAcであり;
R6及びR7は、Hであるか、又はR6及びR7は一緒になって、Oであり;
破線は、結合又は結合の非存在を示すが、ただし、1本の破線だけが結合であることを条件とし、更に、R4がH、OH、又はOAcである場合、両方の破線が結合の非存在を示すことを条件とする]。
【００１３】
本発明の別の態様では、対象において免疫応答を抑制するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、対象において免疫応答を抑制するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、下式:
【００１４】
【化２】
2021530427.tif 000004
【００１５】
を有する化合物又はその立体異性体若しくはラセミ体を投与することを含む方法を提供する
[式中:
R1、R2、及びR3は独立に、H又はC1〜C3アルキルであり、破線は、結合又は結合の非存在を示すが、ただし、1本の破線だけが結合であることを条件とする]。
【００１６】
さらなる一態様では、対象において神経変性疾患を処置するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、対象において神経変性疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、下式:
【００１７】
【化３】
2021530427.tif 000005
【００１８】
を有する化合物又はその立体異性体若しくはラセミ体を投与することを含む方法を提供する
[式中:
R1、R2、及びR3は独立に、H又はC1〜C3アルキルであり;
R4は、H、OH、OAcであるか、又は存在せず;
R5及びR8は独立に、H又はOAcであり;
R6及びR7は、Hであるか、又はR6及びR7は一緒になって、Oであり;
破線は、R4が存在しない場合、結合を示すか、又はR4がH、OH、又はOAcである場合、結合の非存在を示す]。
【００１９】
他の態様では、本発明は、本発明の化合物と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物、免疫抑制剤としての本発明の化合物の使用、並びに神経保護剤としての本発明の化合物の使用を提供する。
【００２０】
本発明の上述の態様及び付随する利点の多くは、添付の図面と併せた次の詳細な説明の参照により理解がより良好になるつれて、より容易に認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図1A〜1Dには、グラシリンA誘導体の合成:段階I〜III及び段階IV(SARプロファイルギャップファイリング)が示されている。図1Aには、段階I:提示のファルマコホアを持つ高度簡略化類似体の合成が示されている。
【図１Ｂ】図1A〜1Dには、グラシリンA誘導体の合成:段階I〜III及び段階IV(SARプロファイルギャップファイリング)が示されている。図1Bには、段階II:エナンチオ選択的有機触媒によるディールス・アルダー/ラクトン化カスケード及び簡略化二環式類似体への操作を介してのグラシリンAのcis-縮合6,5-二環式核15aの構築が示されている。
【図１Ｃ】図1A〜1Dには、グラシリンA誘導体の合成:段階I〜III及び段階IV(SARプロファイルギャップファイリング)が示されている。図1Cには、段階III:天然及び簡略化シクロヘキシル部分の環化反応が示されている。
【図１Ｄ】図1A〜1Dには、グラシリンA誘導体の合成:段階I〜III及び段階IV(SARプロファイルギャップファイリング)が示されている。図1Dには、SARプロファイルギャップファイリング:元のビス-アセトキシフラノースの代替酸化状態及びさらなる簡略化シクロヘキシル置換基が示されている。
【図２】グラシリンA誘導体の免疫抑制活性が比較されている。SPRにより測定した場合のCypAへのグラシリンA誘導体の結合についての反応速度平衡解離定数(KD、μM)、インターロイキン-2放出阻害率(%)、及びヒトTリンパ球での細胞生存率(生存%、MTTアッセイ)。アッセイで用いられた各誘導体の濃度は括弧内に示されている(μM)。NA=10μMまで活性は観察されなかった。
【図３】神経保護剤としてのグラシリンA誘導体の活性が比較されている。H2O2毒性に対する細胞生存率、ミトコンドリア膜電位復元(TMRM)、活性酸素種(ROS)放出の阻害%、細胞グルタチオン(GSH)レベル上昇の上昇%、mPTP遮断、並びにCypD及びCypAへの結合についてのIC50値。誘導体濃度は括弧内に示されている(μM)。値は、未処理対照細胞に対するパーセンテージとして、H2O2毒性55.6±4.4、TMRM75.9±3、ROS140.3±4.4、GSH82.9±1.6、mPTP遮断:76.7±2.8の値を有するH2O2処理細胞と比較して計算されている。CypD及びA活性はIC50値(μM)として表されている。CI(95%信頼区間);R2値(0.91〜0.99)は許容範囲内であった(詳細についてはESIを参照されたい);神経保護作用を示す一方で、CypAとCypDとで異なる活性も示した誘導体が強調されている(NA= 10μMまで活性ではない;ND=未決定)。
【図４Ａ】図4A〜4Dには、免疫抑制アッセイにおける選択されたグラシリンA誘導体の活性が示されている。図4Aでは、表面プラスモン共鳴(SPR)により測定した場合のシクロフィリンA(CypA)へのグラシリンA及び選択された誘導体の結合が比較されている。固定化CypA上に化合物を付加し、それらの個々の溶媒対照を差し引くことにより得られた会合曲線。グラフは、4つの実験を代表する1つの実験からのグラフである。リガンド結合の分析。
【図４Ｂ】図4A〜4Dには、免疫抑制アッセイにおける選択されたグラシリンA誘導体の活性が示されている。図4Bでは、図4Aから得られた見掛け会合速度定数Kobs(s-1)の反応速度プロットが比較されている。グラフは、4つの実験を代表する1つの実験からのグラフである。
【図４Ｃ】図4A〜4Dには、免疫抑制アッセイにおける選択されたグラシリンA誘導体の活性が示されている。図4Cでは、ヒトTリンパ球の生存率に対するグラシリンA及び選択された誘導体の作用が比較されている。細胞を様々な濃度の化合物と共に48時間インキュベートした。データは、対照細胞に対するパーセンテージ(一元ANOVA、続いて、事後ダネット検定)である。*p<0.05。データは3つの独立した実験の平均±SEMである。
【図４Ｄ】図4A〜4Dには、免疫抑制アッセイにおける選択されたグラシリンA誘導体の活性が示されている。図4Dでは、コンカナバリンA(ConA)で刺激されたヒトTリンパ球におけるインターロイキン-2(IL-2)産生に対するグラシリンA及び選択された誘導体の作用が比較されている。ヒトTリンパ球を化合物で2時間、かつConA(50μg/mL)で48時間事前処理した。値は、対照細胞に対するパーセンテージ(一元ANOVA、続いて、事後ダネット検定)である。**p<0.01及び***p<0.001。データは4つの独立した実験の平均±SEMである。
【図５Ａ】図5A〜5Dには、神経保護アッセイにおける選択されたグラシリンA誘導体の活性が示されている。点線は150μM H2O2でのみ処理された細胞のレベルを示している。データは、未処理対照細胞に対するパーセンテージとして表されており、一元ANOVA及びダネット事後検定により150μM H2O2でのみ処理された細胞と比較されている。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001。値は4つの独立した実験の平均±SEMである。図5Aでは、H2O2傷害に対抗しての細胞生存率に対する、選択されたグラシリンA誘導体の作用が比較されている。細胞生存率はMTTアッセイにより測定した。SH-SY5Y細胞を150μM H2O2及び誘導体で6時間処理した。
【図５Ｂ】図5A〜5Dには、神経保護アッセイにおける選択されたグラシリンA誘導体の活性が示されている。点線は150μM H2O2でのみ処理された細胞のレベルを示している。データは、未処理対照細胞に対するパーセンテージとして表されており、一元ANOVA及びダネット事後検定により150μM H2O2でのみ処理された細胞と比較されている。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001。値は4つの独立した実験の平均±SEMである。図5Bには、ミトコンドリア膜電位(DYm)回復に対する、選択されたグラシリンA誘導体の作用が示されている。DYmをTMRMアッセイにより測定した。細胞を150μM H2O2及び誘導体で6時間同時処理した。
【図５Ｃ】図5A〜5Dには、神経保護アッセイにおける選択されたグラシリンA誘導体の活性が示されている。点線は150μM H2O2でのみ処理された細胞のレベルを示している。データは、未処理対照細胞に対するパーセンテージとして表されており、一元ANOVA及びダネット事後検定により150μM H2O2でのみ処理された細胞と比較されている。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001。値は4つの独立した実験の平均±SEMである。図5Cには、選択されたグラシリンA誘導体による活性酸素種(ROS)放出の阻害が示されている。5-(及び-6)-カルボキシ-2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタートを用いて、ROSレベルを評価した。SH-SY5Y細胞を誘導体及び150μM H2O2と共に6時間同時インキュベートした。
【図５Ｄ】図5A〜5Dには、神経保護アッセイにおける選択されたグラシリンA誘導体の活性が示されている。点線は150μM H2O2でのみ処理された細胞のレベルを示している。データは、未処理対照細胞に対するパーセンテージとして表されており、一元ANOVA及びダネット事後検定により150μM H2O2でのみ処理された細胞と比較されている。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001。値は4つの独立した実験の平均±SEMである。図5Dには、選択されたグラシリンA誘導体で処理された細胞におけるグルタチオン(GSH)レベルの評価が示されている。Thiol Tracker Violetにより、150μM H2O2及び誘導体で6時間同時処理された神経芽細胞腫細胞において、GSHレベルを測定した。
【図６Ａ】図6A〜6Fには、ミトコンドリア膜透過性遷移孔(mPTP)に対する、選択されたグラシリンA誘導体の活性が示されている。SH-SY5Y細胞を1mM TBHP及びグラシリン誘導体の両方で処理し、mPTP開放の程度をフローサイトメトリーにより評価し、図6Aにおいて評価している。値は未処理対照細胞に対するパーセンテージとして表されており、一元ANOVA検定、続いてダネット事後検定により、1mM TBHPでのみ処理された細胞と比較されている。**p<0.01、***p<0.001。点線は1mM TBHPのみで処理された細胞のレベルを示している。値は4つの独立した実験の平均±SEMである。
【図６Ｂ】図6A〜6Fには、ミトコンドリア膜透過性遷移孔(mPTP)に対する、選択されたグラシリンA誘導体の活性が示されている。図6B〜6Eでは、グラシリンA誘導体によるCypD及びCypA PPIアーゼ活性の阻害が比較されている。実線は、CypD PPIアーゼ活性の阻害を表している一方で、点線は、CypA PPIアーゼ活性の阻害を示している。CsAを陽性対照として使用した(図6Fを参照されたい)。データは最大PPIアーゼ活性に対するパーセンテージとして表されている。値は4つの独立した実験の平均±SEMである。
【図６Ｃ】図6A〜6Fには、ミトコンドリア膜透過性遷移孔(mPTP)に対する、選択されたグラシリンA誘導体の活性が示されている。図6B〜6Eでは、グラシリンA誘導体によるCypD及びCypA PPIアーゼ活性の阻害が比較されている。実線は、CypD PPIアーゼ活性の阻害を表している一方で、点線は、CypA PPIアーゼ活性の阻害を示している。CsAを陽性対照として使用した(図6Fを参照されたい)。データは最大PPIアーゼ活性に対するパーセンテージとして表されている。値は4つの独立した実験の平均±SEMである。
【図６Ｄ】図6A〜6Fには、ミトコンドリア膜透過性遷移孔(mPTP)に対する、選択されたグラシリンA誘導体の活性が示されている。図6B〜6Eでは、グラシリンA誘導体によるCypD及びCypA PPIアーゼ活性の阻害が比較されている。実線は、CypD PPIアーゼ活性の阻害を表している一方で、点線は、CypA PPIアーゼ活性の阻害を示している。CsAを陽性対照として使用した(図6Fを参照されたい)。データは最大PPIアーゼ活性に対するパーセンテージとして表されている。値は4つの独立した実験の平均±SEMである。
【図６Ｅ】図6A〜6Fには、ミトコンドリア膜透過性遷移孔(mPTP)に対する、選択されたグラシリンA誘導体の活性が示されている。図6B〜6Eでは、グラシリンA誘導体によるCypD及びCypA PPIアーゼ活性の阻害が比較されている。実線は、CypD PPIアーゼ活性の阻害を表している一方で、点線は、CypA PPIアーゼ活性の阻害を示している。CsAを陽性対照として使用した(図6Fを参照されたい)。データは最大PPIアーゼ活性に対するパーセンテージとして表されている。値は4つの独立した実験の平均±SEMである。
【図６Ｆ】図6A〜6Fには、ミトコンドリア膜透過性遷移孔(mPTP)に対する、選択されたグラシリンA誘導体の活性が示されている。
【図７Ａ】図7A〜7Dでは、本発明の代表的なグラシリンA誘導体の抗炎症及び免疫抑制作用が比較されている。図7Aでは、BV2細胞におけるIL-6(右側の図)及びTNF-α(左側の図)放出に対する23a及び23dの作用が比較されている。
【図７Ｂ】図7A〜7Dでは、本発明の代表的なグラシリンA誘導体の抗炎症及び免疫抑制作用が比較されている。図7Bでは、BV2細胞におけるNF-κB p65(右側の図)及びNrf2(左側の図)の発現に対する23a及び23dの作用が比較されている。
【図７Ｃ】図7A〜7Dでは、本発明の代表的なグラシリンA誘導体の抗炎症及び免疫抑制作用が比較されている。図7Cでは、BV2細胞におけるCypAの発現に対する23a及び23dの作用が比較されている。
【図７Ｄ】図7A〜7Dでは、本発明の代表的なグラシリンA誘導体の抗炎症及び免疫抑制作用が比較されている。図7Dでは、活性化ヒトTリンパ球におけるCypA(右側の図)、CypB(中央の図)及びCypC放出(左側の図)に対する23a及び23dの作用が比較されている。
【図８Ａ】図8A〜8Dでは、本発明の代表的なグラシリンA誘導体の神経保護作用が比較されている。図8Aでは、グラシリンA誘導体及びH2O2で処理されたSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞における抗酸化酵素グルタチオンペルオキシダーゼ(左側のパネル)及びスーパーオキシドジスムターゼ1(右側のパネル)の相対的発現が比較されている。
【図８Ｂ】図8A〜8Dでは、本発明の代表的なグラシリンA誘導体の神経保護作用が比較されている。図8Bでは、β-セクレターゼ(BACE1)活性に対するグラシリンA誘導体の作用が比較されている。
【図８Ｃ】図8A〜8Dでは、本発明の代表的なグラシリンA誘導体の神経保護作用が比較されている。図8Cでは、BV2小神経膠細胞における転写因子Nrf2及びNFκB-p65の核発現が比較されている。
【図８Ｄ】図8A〜8Dでは、本発明の代表的なグラシリンA誘導体の神経保護作用が比較されている。図8Dでは、神経芽細胞腫の細胞生存率が決定されている。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、グラシリンA及びその同族体並びに免疫抑制及び神経保護剤としてグラシリンA及びその同族体を使用するための方法に関する。
【００２３】
一態様では、本発明は、グラシリンA同族体を提供する。本明細書で使用する場合、用語「グラシリンA同族体」は、由来、構造、又は機能においてグラシリンAに関連する化学物質を指す。用語「グラシリンA同族体」及び「グラシリンA誘導体」は互換的に使用される。
【００２４】
次は、本発明の態様及び実施形態の説明である。
【００２５】
一態様では、本発明は、グラシリンA同族体を提供する。
【００２６】
ある特定の実施形態では、本発明は、下式:
【００２７】
【化４】
2021530427.tif 000006
【００２８】
を有する化合物又はその立体異性体若しくはラセミ体を提供する
[式中:
R1、R2、及びR3は独立に、H又はC1〜C3アルキルであり;
R4は、H、OH、OAcであるか、又は存在せず;
R5及びR8は独立に、H又はOAcであり;
R6及びR7は、Hであるか、又はR6及びR7は一緒になって、Oであり;
破線は、結合又は結合の非存在を示すが、ただし、1本の破線だけが結合であることを条件とし、更に、R4がH、OH、又はOAcである場合、両方の破線が結合の非存在を示すことを条件とする]。
【００２９】
これらの実施形態のうちのいくつかでは、前記化合物は、
【００３０】
【化５】
2021530427.tif 000007
【００３１】
又はその立体異性体若しくはラセミ体である。
【００３２】
これらの実施形態のうちのいくつかでは、前記化合物は、
【００３３】
【化６】
2021530427.tif 000008
【００３４】
又はその立体異性体若しくはラセミ体である。
【００３５】
本発明の代表的なグラシリンA同族体には、式22、23a、23b、23c、23d、27a、27b、A1、29a、A1、A2,及びA3の化合物:
【００３６】
【化７】
2021530427.tif 000009
【００３７】
が含まれる。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「立体異性体」は、同じ分子式及び結合原子の配列を有するが、それらの原子の三次元配置が異なる分子を指す。立体異性体には、エナンチオマー、ジアステレオマー、及びラセミ混合物を含むそれらの混合物が含まれる。用語「エナンチオマー」は、相互の鏡像であり、重ね合わせることができない2種の立体異性体を指す。ジアステレオマーは、鏡映操作とは関連のない立体異性体であり、メソ化合物、cis-trans異性体、E-Z異性体、及び非エナンチオマー光学異性体が含まれる。
【００３９】
本明細書において使用される技術及び科学用語はすべて、別段に記載しない限り、通常の当業者が共通して理解するのと同じ意味を有する。
【００４０】
本発明の別の態様では、グラシリンA同族体の医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、前記組成物は、薬学的に許容される担体と、本発明のグラシリンA同族体とを含む。
【００４１】
さらなる態様では、本発明は、免疫抑制及び神経保護剤としてグラシリンA及びその同族体を使用するための方法を提供する。
【００４２】
さらなる一態様では、本発明は、対象において免疫応答を抑制するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、下式:
【００４３】
【化８】
2021530427.tif 000010
【００４４】
を有する化合物又はその立体異性体若しくはラセミ体を投与することを含む方法を提供する
[式中:
R1、R2、及びR3は独立に、H又はC1〜C3アルキルであり、破線は、結合又は結合の非存在を示すが、ただし、1本の破線だけが結合であることを条件とする]。
【００４５】
前記方法のある特定の実施形態では、前記化合物は:
【００４６】
【化９】
2021530427.tif 000011
【００４７】
又はその立体異性体若しくはラセミ体である。
【００４８】
前記方法において有用な代表的な化合物には:
【００４９】
【化１０】
2021530427.tif 000012
【００５０】
が含まれる。
【００５１】
前記方法のある特定の実施形態では、前記対象は、自己免疫疾患に罹患していると診断されている。
【００５２】
前記方法のある特定の実施形態では、前記対象は、炎症性疾患に罹患していると診断されている。
【００５３】
ある特定の実施形態では、前記化合物は、インターロイキン-2産生を阻害する。これらの実施形態のうちのいくつかでは、インターロイキン-2産生は、約20%超阻害される。
【００５４】
ある特定の実施形態では、前記化合物は、約6μM未満のKDでCypAに結合する。
【００５５】
ある特定の実施形態では、前記化合物は、インビトロでT細胞生存率を約10%未満低下させる。
【００５６】
本発明の代表的なグラシリンA同族体の抗炎症及び免疫抑制特性を下に更に記載する。
【００５７】
別のさらなる態様では、本発明は、神経保護作用を示すグラシリンA同族体を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、対象において神経変性疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、下式:
【００５８】
【化１１】
2021530427.tif 000013
【００５９】
を有する化合物又はその立体異性体若しくはラセミ体を投与することを含む方法を提供する
[式中:
R1、R2、及びR3は独立に、H又はC1〜C3アルキルであり;
R4は、H、OH、OAcであるか、又は存在せず;
R5及びR8は独立に、H又はOAcであり;
R6及びR7は、Hであるか、又はR6及びR7は一緒になって、Oであり;
破線は、R4が存在しない場合、結合を示すか、又はR4がH、OH、又はOAcである場合、結合の非存在を示す]。
【００６０】
前記方法のある特定の実施形態では、前記化合物は:
【００６１】
【化１２】
2021530427.tif 000014
【００６２】
又はその立体異性体若しくはラセミ体である。
【００６３】
前記方法において有用な代表的な化合物には、
【００６４】
【化１３】
2021530427.tif 000015
【００６５】
が含まれる。
【００６６】
ある特定の実施形態では、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病である。
【００６７】
ある特定の実施形態では、前記化合物は、CypDを約0.5μM未満のIC50で阻害する。
【００６８】
ある特定の実施形態では、前記化合物は、CypAを約0.3μM未満のIC50で阻害する。
【００６９】
ある特定の実施形態では、前記化合物は、CypDを阻害し、CypAを阻害しない。
【００７０】
本発明の代表的なグラシリンA同族体の神経保護特性を下に更に記載する。
【００７１】
本開示は、CypAに対する高い親和性により、免疫抑制剤としての効力を保持している簡略化グラシリンA同族体を、グラシリンAよりも有意に高い親和性を示す数種の誘導体と共に同定している。加えて、CypAとCypDとの間で選択性を示し、したがって、免疫抑制作用を欠いたこれらの同族体での強力な神経保護作用をもたらすグラシリンA同族体を本明細書において開示する。
【００７２】
次は、本発明のグラシリンA同族体を調製するための合成方法の説明である(図1A〜1Dを参照されたい)。
【００７３】
親ビス-アセトキシフラノース9は、syn-置換アセトキシフラノース(±)-9aをanti-ジアステレオマー(±)-9bと共にラセミ体として得るための2工程酸化/水素化シークエンスを介して容易に得られた。
【００７４】
シクロヘキシル置換基及び環外アルケンを欠いた誘導体、すなわち、二環式ビス-アセトキシフラノース18を目標とした。この誘導体を、他のグラシリンA誘導体すべてのために用いられるであろう共通の核15aから調製した。ジエン12及びアクリロイルクロリド11をルイス塩基触媒としてのテトラミゾールと共に使用するディールス-アルダー-ラクトン化(DAL)有機カスケードは、約3:1比のジアステレオマーシクロ付加物endo-15a/exo-15bをグラム規模で、かつ94%eeでもたらした。必要なendo-ジアステレオマー15aは収率58%で単離することができ、LiAlH4で還元し、続いて脱シリル化すると、ケトジオール16が得られた。スワーン酸化はジアルデヒドをもたらし、これをそのまま酸促進アセチル化に供し、エピマー化して、ケトビス-アセトキシフラノース17をsyn/antiジアステレオマーの混合物として得た。その後のNaBH4での還元及びSOCl2での脱水により、分離不可能なシクロヘキセニル縮合ビス-アセトキシフラノース18をsyn/antiジアステレオマー及び位置異性体の混合物として得た。
【００７５】
環外アルケンを欠くが、シクロヘキシル置換基を持つ誘導体(図1C)も目標であった。endo-ディールス-アルダー付加物15aの脱シリル化により、二環式ラクトン19を得、これを、スポンジオラクトンの合成で以前に使用した条件を用いて、シクロヘキセニルクロリド20aから誘導されるアリル亜鉛試薬に供した。これにより、三環式付加物21aが、生じた第四級炭素のところでジアステレオマーの1:1混合物として、ただし、第三級アルコール中心のところで単一エピマーをもたらす高い面選択性で得られた。その後の、アルケンを還元するための水素化及びすでに用いた同様の3工程プロセスにより、ヒドロキシビス-アセトキシフラノース22をジアステレオマーの1:1混合物として得た。マーティンスルフランでの脱水により、アルケン23を、アルケン位置異性体が生じたことによる4種のジアステレオマーの混合物として得た。HPLCによる精製は、C10エピマーではなく、23c及び23dからのオレフィン位置異性体23a及び23bの分離を可能にした。
【００７６】
当初のグラシリンA誘導体の生体活性についての先行スクリーニングとして、初めに合成した高度簡略化ビス-アセトキシフラノース(±)-9並びにシクロヘキシル置換基及び環外アルケンの両方を欠いた誘導体17及び18(分離不可能なオレフィン位置異性体の混合物として)のCypAとの相互作用を、対照としてシクロスポリンA(CsA)及びグラシリンAを用いる表面プラスモン共鳴(SPR)により分析した。会合曲線(KD)をグラシリンAと比較して様々な濃度で測定すると、高度簡略化誘導体(±)-9、17、及び18は、CypAに対して親和性を示さなかった(図2)。CypAに結合すると、CsA及びグラシリンAは、カルシニューリン経路を介してインターロイキン2放出(IL-2)を調節するので、IL-2産生及びT細胞に対する毒性に対するこれらの簡略化誘導体の作用を細胞生存%の決定により測定した。予測されたとおり、簡略化誘導体(±)-9、17、及び18は、IL-2産生を阻害しなかったが、0.1μMで細胞毒性の徴候も示さなかった。
【００７７】
二環式ビス-アセトキシフラノース核へのトリメチルシクロヘキシル部分の付加は、より大きな生体活性を有するグラシリンA誘導体22〜23をもたらした。シクロヘキセニル亜鉛付加に由来する第三級アルコール22の当初のジアステレオマー混合物は不活性であった。しかしながら、誘導体23a〜23dにおいてトリ-置換オレフィンを導入するために脱水すると、免疫抑制活性は当初、中等度のIL-2阻害(約19%)を伴う10S配置を持つアルケン23c (5.83±3.33μM)で、グラシリンA(2.53±0.40μM)と比べてKDの2倍の低下を伴って観察された。アルケン位置(Δ8,9対Δ9,11)とC10配置との間の相互作用が、グラシリンAと比較して、CypAに対してKDのほぼ1000倍の上昇を示した誘導体23a及び23d(それぞれ5.34±1.68nM及び7.57±1.61nM)により裏付けられた。アルケン23a、23dによるIL-2産生の阻害(約41〜46%)は、グラシリンA(約71%)のレベルではなかったが、しかしながら、細胞生存率に対する影響は、より強力なアルケン23dでは観察されず、かつ細胞生存率の約10%の低下がアルケン23aで観察された。付随してCypAに対する高い親和性を伴う誘導体23a、23dにおけるC8での環外メチリデンの非存在は、この部分が結合には重要ではないが、しかしながら、IL-2阻害には影響を及ぼし得ることを示唆している。図2を参照されたい。
【００７８】
これらのデータはまとめると、C8〜C10結合の周囲の配座優先性が生体活性において重要な役割を果たし得ることを示唆している。
【００７９】
免疫抑制活性についての構造活性相関プロファイルのギャップを埋めるために、すでに評価した中間体を使用して、テトラヒドロフランの酸化状態の変化(すなわち、24、26)及びシクロヘキシル部分の複雑性(すなわち、27a、b)を目標とした(図1D)。加えて、ジアステレオマーラクトンexo-15bから入手可能な二環式核(すなわち、29a/29b)のエナンチオマー系列も研究した(図1D)。テトラヒドロフランの酸化状態の変化を伴う誘導体はすべて不活性であり(24、26、27a)、ビス-アセトキシフラノースが必須の構造的特徴であるという元の仮説を裏付けた。ジアステレオマーディールス-アルダー付加物exo-15bのα-エピマー化は、第四級C10中心のところでエピマーなジアステレオマーモノ-アセトキシフラノース29a/29bにつながるエナンチオマー系列の研究を可能にした。両方のジアステレオマーでのCypAに対する親和性(KD約3μM)はグラシリンAに匹敵したが、しかしながら、IL-2産生の阻害に差(約26対0%)が観察された一方で、両方のジアステレオマーがT細胞に対して比較的に非毒性のままであった。C9〜C10結合の周囲の配置に直接的に影響を及ぼす第四級炭素立体化学の重要性が、最大の生体活性を付与する天然(S)配置を有するこの系列で強調される。
【００８０】
すでに記載のとおり、神経保護剤は、CypAのアイソフォームであるCypDの阻害を介してそれらの作用を媒介し得る。グラシリンAで以前に観察された神経保護作用を考慮して、BGRの適用を介して合成された誘導体を、それらの神経保護作用についても研究し、CypD対CypA PPiアーゼ活性に対するそれらの選択性を決定した(図3)。すべてのアッセイを、SHSY5Y細胞で決定された当初細胞傷害性に基づき、指示濃度(0.001、0.01,又は0.1μM)で行った(Table 1(表1))。簡略化グラシリンA誘導体の神経保護作用を評価するために、4つのパラメーターを測定した:H2O2での細胞攻撃後の細胞生存率、ミトコンドリア膜電位(ΔΨm)、ROS放出、及びグルタチオン(GSH)レベル。いくつかの高度簡略化グラシリンA誘導体、すなわち、モノアセトキシフラノース27a、高度簡略化ジアセタート27b(24に至る経路で中間体ジオールから誘導)、分離不可能なジアステレオマーアルコール22、及びモノアセトキシフラノース29a(ただし、そのジアステレオマー29bではない)は、5つのアッセイのすべてに基づき、有意な神経保護作用を示した。PPIアーゼ活性アッセイに基づき、CypAとの比較でのCypDに対する高い選択性がフラノース27a(約3倍)及び29a(約18倍)で観察されたが、アルコール22では観察されず、それらの抗酸化作用が、CypDに媒介されるミトコンドリアに関連するものであり、したがって、免疫抑制作用を欠いた神経保護剤としての可能性を持つことを示唆している。意外にも、非常に単純なジアセタート27bが、CypA(不活性)に対してCypD(IC50=0.48μM)親和性の最大の差を示した一方で、5つのアッセイすべてで、有意な抗酸化活性も示した。
【００８１】
代表的なグラシリンA誘導体の生物学的特性
CypA結合を表面プラスモン共鳴(SPR)により分析した((a) Alfonso, A.、Pazos, M. J.、Fernandez-Araujo, A.、Tobio, A.、Alfonso, C.、Vieytes, M. R. and Botana, L. M.、Toxins 2014、6、96〜107;(b)Sanchez, J. A.、Alfonso, A.、Leiros, M.、Alonso, E.、Rateb, M. E.、Jaspars, M.、Houssen, W. E.、Ebel, R.及びBotana, L. M.、Cell Physiol. Biochem.、2015、37、779〜792)。図4Aは、種々の濃度のグラシリンA並びに5種の合成誘導体:29a、29b、23d、23c及び23bでの会合曲線を示している。KD会合値は、CsA、グラシリンA並びに誘導体29a、29b、及び23cの間で同様であることが見い出された(約2.8〜6.8μM、図4B)。化合物23b及び23dは、ナノモルのKD値(それぞれ7.57±1.61 nM及び5.34±1.68 nM)、したがって、高いCypA親和性を有する。
【００８２】
CypAは、カルシニューリン経路を介してインターロイキン-2放出(IL-2)を調節する(Zydowsky,L. D.、Etzkorn,F. A.、Chang,H. Y.、Ferguson,S. B.、Stolz,L. A.、Ho,S. I. and Walsh,C. T.、Protein Sci.、1992、1、1092〜1099)。これら5種の化合物の細胞傷害性(図4C)及びIL-2レベルに対する作用。48時間後に、化合物29b及び23b〜23dが1μMで細胞生存率の15〜25%低下を示した一方で、29aは0.1μMでこの同じ低下を示し、より低い濃度では変化がなかった。コンカナバリンA(Con A)をヒトTリンパ球においてIL-2放出を誘導するために使用し(Damsker,J. M.、Bukrinsky,M. I. and Constant,S. L. J. Leukoc. Biol.、2007、82、613〜618)、その後、非毒性濃度の化合物と共に2時間インキュベートした。CsAがIL-2阻害の陽性対照であった。図4Dは、IL-2放出阻害に対するグラシリンA並びに化合物29a、23c、23d、及び23bの作用を示している。最大の阻害は、グラシリンA(71%)により得られ、23b(44%)及び23d(46%)、及び29a (26%)が続いた。
【００８３】
神経保護アッセイでは、化合物の細胞傷害性を初めに、SH-SY5Y細胞に対して評価した(Table 1(表1))。化合物(-)-27a、(-)-27b、29a、29b、22、23a、23b、23c、及び23dは、試験された比較的高い濃度で24時間後に細胞死をもたらした。化合物23a及び23d(IC50:1.4μM)により示された毒性により、これらのグラシリン誘導体をより低い濃度(0.001、0.01及び0.1μM)で、神経保護試験においてアッセイしたが、他の化合物は0.01、0.1及び1μMで試験した。
【００８４】
抗酸化可能性を決定するために、酸化促進物質H2O2の存在下で4つのパラメーター:細胞生存率、ミトコンドリア膜電位(ΔΨm)、ROS放出及びグルタチオン(GSH)レベルをモニターした。25μMの公知の抗酸化物質ビタミンE(VitE)を陽性対照として使用した。
【００８５】
H2O2毒性に対する神経保護を、細胞を150μM H2O2及び化合物で6時間にわたって同時処理することにより評価した。H2O2は、生存率を44.4±4.4%(p=0.00005)低下させた。8種のグラシリンA誘導体が1つ又は複数の濃度で保護的であった。(-)-27a、(-)-27b、29a、22及び23aは、ほぼすべての濃度(0.01、0.1及び1μM;図5A)で細胞をH2O2傷害に対して保護した。
【００８６】
テトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM)を、ΔΨmを評価するために使用した。H2O2処理後に、細胞は24.1±3%(p=0.0032)のTMRMシグナル低下を示す。29a、23a、(-)-27a、(-)-27b及び22は、H2O2対照と比較してΔΨmを回復させた(図5B)。
【００８７】
化合物がROS捕集物質として作用していたかどうかを評価するために、カルボキシ-H2DCFDAを使用して、ROSレベルを決定した。H2O2処理細胞は、ROSレベルを未処理細胞に対して141.4±4.6%(p=0.00002)上昇させた。8種の化合物との同時処理後に低下が観察され、未処理細胞レベルに達した。そのうち、5種の誘導体:(-)-27a、(-)-27b、22、23a及び23bが、2又は3つの濃度でROSを低下させるより良好な結果を示した(図5C)。
【００８８】
細胞における主な非酵素的抗酸化物質であるGSHについて、H2O2並びに(-)-27a、22、(-)-27b及び29aで同時処理された神経芽細胞腫は、H2O2対照(82.9±1.6%、p=0.027)に対して2つ以上の濃度でGSHレベルを回復した(図5D)。グラシリンAの抗OS作用はmPTP開放と関連するので、mPTPに対するそれらの作用を決定するために、各化合物の有効な濃度を選択した。
【００８９】
誘導体29a、(-)-27a、(-)-27b及び22は、TBHP誘導性開放を妨げた(77.13}2.3%、p=0.00002)(図6A)。CsA(0.2μM)を陽性対照として使用した。
【００９０】
mPTP機能におけるCypDの関与はそのPPIアーゼ活性と関連しているので(Connern,C. P.及びHalestrap,A. P. Biochem. J.、1994、302、321〜324)、この活性の調節を研究した。化合物29a、(-)-27a、(-)-27b及び22は、低いマイクロモル濃度(IC50<0.5μM)でCypD活性を阻害した(図6B〜6F)。CypDに対するこれらの化合物の特異性を分析するために、CypAに対するこれらの誘導体のPPIアーゼ阻害活性を研究した。化合物(-)-27bは、CypAに対して(10μMまで)不活性であり、IC50=0.48(CI:0.09〜2.3)μMでCypDに対して完全な選択性を示した。誘導体(-)-27a及び29aは、CypDに対してよりもCypAに対して高いIC50を示し、CypDに対してそれぞれ約3倍及び18倍の多少の選択性を示した。他方で、化合物22は、CypAに対して、CypDに対するよりも高い活性を示した(IC50=0.064(CI:0.022〜0.19)対0.48(CI:0.09〜2.3)μM;CypAに対して約4倍の選択性)。
【００９１】
【表１】
2021530427.tif 000016
【００９２】
24時間のインキュベーション後に得られ、GraphPad Prism 5.0ソフトウェアのlog(阻害薬)vs.応答フィッティングモデルで計算されたIC50。3つの独立した実験のデータ。
【００９３】
代表的なグラシリン誘導体の抗炎症及び免疫抑制作用
選択されたグラシリンA誘導体((+)-23a及び(-)-23d)の抗炎症及び免疫抑制作用が図7A〜7Dに示されている。BV2細胞におけるIL-6(右側の図)及びTNF-α(左側の図)放出に対する23a及び23dの作用が図7Aで比較されている。細胞を化合物(1μM)で1時間事前処理し、次いで、リポ多糖(LPS)500ng/mLで刺激した。IL-6及びTNF-αレベルをELISAにより測定した。データはパーセンテージとして表されており、2連で行われた最低N=3の独立した実験の平均±SEMの結果である。値は、ANOVA統計的解析、続く、事後ダネットt-検定による、LPSのみで処理された細胞と、LPSの存在下で化合物で処理された細胞との間(*p<0.05及び**p<0.01)、又はLPSで処理された細胞と対照細胞との間(###p<0.001)の差として示されている。BV2細胞におけるNF-κB p65(右側の図)及びNrf2(左側の図)の発現に対する23a及び23dの作用が図7Bで比較されている。細胞を化合物(1μM)で1時間事前処理し、次いで、リポ多糖(LPS)500ng/mLで刺激した。NF-κB p65サブユニット及びNrf2発現をサイトゾル及び核溶解産物において、更にウェスタンブロットにより測定し、核/サイトゾル比として表した。サイトゾルタンパク質レベルをβ-アクチンで正規化し、核タンパク質レベルをラミンB1で正規化した。データはパーセンテージとして表されており、3連で行われた最低N=3の独立した実験の平均吸光度±SEMの結果である。値は、ANOVA統計的解析、続く、事後ダネットt-検定による、LPSのみで処理された細胞と、LPSの存在下で化合物で処理された細胞との間(**p<0.01)、又はLPSで処理された細胞と対照細胞との間(###p<0.001)の差として示されている。BV2細胞におけるCypAの発現に対する23a及び23dの作用は図7Cで比較されている。細胞を化合物(1μM)で1時間事前処理し、次いで、リポ多糖(LPS)500ng/mLで刺激した。CypA発現をサイトゾル溶解産物において、更にウェスタンブロットにより測定した。タンパク質レベルをβ-アクチンで正規化した。データはパーセンテージとして表されており、3連で行われた最低N=3の独立した実験の平均吸光度±SEMの結果である。値は、ANOVA統計的解析、続く、事後ダネットt-検定による、LPSのみで処理された細胞と、LPSの存在下で化合物で処理された細胞との間(***p<0.001)、又はLPSで処理された細胞と対照細胞との間(###p<0.001)の差として示されている。活性化ヒトTリンパ球におけるCypA(右側の図)、CypB(中央の図)及びCypC放出(左側の図)に対する23a及び23dの作用が図7Dで比較されている。細胞を化合物(0.1μM)で2時間事前処理し、次いで、コンカナバリンA(CoA)50ng/mLで刺激した。シクロフィリンレベルをELISAにより測定した。データはパーセンテージとして表されており、2連で行われた最低N=3の独立した実験の平均±SEMの結果である。値は、ANOVA統計的解析、続く、事後ダネットt-検定による、CoAのみで処理された細胞と、LPSの存在下で化合物で処理された細胞との間(***p<0.001)、又はコンカナバリンAで処理された細胞と対照細胞との間(###p<0.001)の差として示されている。
【００９４】
代表的なグラシリン誘導体の神経保護作用
選択されたグラシリンA誘導体(21a、27a、27b、29a、21b、22及び23c)の神経保護作用が図8A〜8Dで比較されている。グラシリンA誘導体及びH2O2で処理されたSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞における抗酸化酵素のグルタチオンペルオキシダーゼ(左側のパネル)及びスーパーオキシドジスムターゼ1(右側のパネル)の相対発現が図8Aにおいて比較されている。H2O2のみで処理された細胞を較正物質として使用し、x軸に表されている。データは、3連で行われた3つの独立した反復試験の平均±SEMとして表され、かつ一元ANOVA及びダネット検定によりH2O2対照細胞と比較されている。*p<0.05、**p<0.01、*** p<0.001。β-セクレターゼ(BACE1)活性に対するグラシリンA誘導体の作用が図8Bで比較されている。前記酵素を阻害する化合物の能力を蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)アッセイキットで決定した。スタチン由来阻害薬(Inh)を使用して、アッセイの有効性をチェックした。結果は、3連で行われた3つの反復試験の平均±SEMとして表されている。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。BV2マイクロ神経膠細胞における転写因子Nrf2及びNFκB-p65の核発現が図8Cで比較されている。タンパク質発現レベルをラミンB1で正規化した。化合物で処理された細胞はLPS対照細胞と比較されている(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。LPS対照細胞は不活性化細胞と比較されている(#p<0.05、##p<0.01)。グラシリンA誘導体は、トランスウェル同時培養において活性化小グリア細胞からSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞を保護した。BV2細胞を、SH-SY5Y細胞上に設置されたインサートに播種し、神経芽細胞腫の細胞生存率を図8Dに示されているとおりに決定した。結果は、不活性化小グリア細胞(対照)と同時培養されたSH-SY5Y細胞のパーセンテージとして表されている。一元ANOVA及びダネット事後検定を使用して、処理群と、LPSのみで処理されたBV2細胞と共に同時培養された神経芽細胞腫細胞(LPS)との間の統計的差を分析した(*p<0.05)。LPS対照細胞は対照細胞と比較されている(##p<0.01)。
【実施例】
【００９５】
次の実施例は、説明を目的として提供するものであって、本発明を制限するものではない。
【００９６】
(実施例A)
代表的なグラシリン誘導体の合成
この実施例では、本発明の代表的なグラシリン誘導体の合成及び特徴づけを記載する。
【００９７】
一般手順
すべての非水性反応を窒素雰囲気下で、オーブン乾燥したガラス器具内で行った。ジクロロメタン(CH2Cl2)、テトラヒドロフラン(THF)、ジエチルエーテル(Et2O)、アセトニトリル(CH3CN)及びトルエン(PhMe)を活性化アルミナで濾過して乾燥した(溶媒精製システム)。ジイソプロピルエチルアミン(EtN(iPr)2)及びトリエチルアミン(Et3N)を使用前に、水素化カルシウムから蒸留した。他の溶媒及び試薬を市販の供給源から受け取ったまま使用した。重水素化溶媒をCambridge Isotopes社から購入し、受け取ったまま使用した。1H NMRスペクトルは500MHzで測定され、残留クロロホルム(7.26 ppm)又はベンゼン(7.16 ppm)を基準とし、百万分率で報告された。結合定数(J)はヘルツ(Hz)で報告され、多重性は通常の規則に従って報告された:s、一重線;d、二重線;t、三重線;q、四重線;dd、二重二重線;dt、三重線の二重線;dq、四重線の二重線;dq、四重線の二重線;td、二重線の三重線;tt、三重線の三重線;ddd、二重線の二重二重線;ddt、三重線の二重二重線;ddq、四重線の二重二重線;dddd、二重二重線の二重二重線;ddddt、三重線の二重二重線の二重二重線;ddquint、五重線の二重二重線;m、多重線、br s、ブロードの一重線。13C NMRスペクトルは125MHzで測定され、クロロホルム-dシグナル(77.23ppm)又はベンゼン(128.06ppm)を基準とし、百万分率(ppm)で報告された。フラッシュカラムクロマトグラフィーを60Åシリカゲル(230〜400メッシュ)を固定相として用いて、自動フラッシュクロマトグラフィーシステム(別段に示されていない限り溶離液としてEtOAc/ヘキサン)で行った。高分解能質量スペクトル(ESI)はLaboratory for Biological Mass Spectrometry (Texas A&M University)を通じて得た。薄層クロマトグラフィー(TLC)は、ガラス裏打ち(glass-backed)シリカゲルF254(Silicycle、250μm厚)を使用して行った。現像プレートの可視化は蛍光消光により、又はゼーバッハ染色液での処理により行った。フーリエ変換赤外(FTIR)スペクトルはNaClプレート上の薄膜として記録した。旋光性は旋光計で589nmで、25mmセルを使用して記録した。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)はクロマトグラフィーシステムで、記載のとおりの様々なキラルカラム(25cm)を使用して行った。X線回折は、Texas A&M UniversityのX-ray Diffraction Laboratoryにより得た。(S)-(-)-TM・HClはTCI chemicals社から購入し、受け取ったまま使用した。他の薬品はすべて、Sigma-Aldrich社又はAlfa Aesar社から購入し、更に精製せずに受け取ったまま使用した。
【００９８】
【表２】
2021530427.tif 000017
【００９９】
化合物(±)-9a、(±)-9b、(-)-15a、(+)-15b、16、17、18、(-)-19、(±)-20a、(-)-21a、(-)-27、(-)-28、(-)-21b、(-)-22、(-)-23a、(-)-23b、(-)-23c、(-)-23d、(-)-24、(-)-26、(-)-27、(-)-28、(+)-15a、(+)-19、S3、(+)-21b、(+)-30、(+)-31a、(+)-31b、(±)-S7の調製
【０１００】
【化１４】
2021530427.tif 000018
【０１０１】
cis-及びtrans-2,5-テトラヒドロフラン-2,5-ジイルジアセタート((±)-9a及び(±)-9b):  氷AcOH(10 mL)中のPb(OAc)4(2.0g、4.54mmol、1.1当量)の懸濁液に、フラン10(0.30mL、4.13mmol、1.0当量)を添加し、混合物を23℃で20時間撹拌した。AcOHを蒸発させ、Et2Oを残渣に添加した。沈澱物を濾過し、濾液を収集し、蒸発させ、残渣を無水EtOAc(50mL)に再溶解した。アルミナ上5%ロジウム(180mg)を添加し、水素化を水素雰囲気(1atm、バルーン)下で24時間実施した。溶液をセライトに通して濾過し、濾液を回転蒸発により濃縮し、自動フラッシュクロマトグラフィーシステム(5→50%EtOAc/ヘキサン)により精製して、(±)-9a及び(±)-9b 721mg(収率94%、2工程)を無色透明の油状物として、かつ2種の異性体の混合物(500MHz 1H-NMRによると1.7:1のcis:trans比)として得た。IR(薄膜): 2921、2851、1745cm-1;C8H12LiO5[M+Li]+のHRMS(ESI+) m/z  計算値:195.0847、実測値:195.0845。スペクトルデータは以前に報告されたものとマッチした(Lee,S.、Kaib,P. S. J.及びList,B. J. Am. Chem. Soc.、2017、139、2156〜2159)。
【０１０２】
【化１５】
2021530427.tif 000019
【０１０３】
(3aS,7aR)-5-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-3a,6,7,7a-テトラヒドロイソベンゾフラン-1(3H)-オン((-)-15a)及び(3aR,7aR)-5-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-3a,6,7,7a-テトラヒドロイソベンゾフラン-1(3H)-オン((+)-15b):磁気撹拌棒を備えたオーブン乾燥した250mL丸底フラスコに、シリルオキシジエンアルコール12(Abbasov,M. E.、Hudson,B. M.、Tantillo,D. J. and Romo,D. J. Am. Chem. Soc.、2014、136、4492〜4495)(2.14g、10.0mmol、1.0当量)、(S)-(-)-TM・HCl(2.40g、10.0mmol、1.0当量)、2,6-ルチジン(3.5mL、30.0mmol、3.0当量)及び無水CH2Cl2(100mL、シリルオキシジエンアルコールの最終濃度を0.1Mにする)を周囲温度(23℃)で添加した。激しく撹拌しながら、CH2Cl2(9.0mL)中の11(1.05mL、13.0mmol、1.3当量)を、シリンジポンプ添加により5時間かけて添加した。更に13時間撹拌した後に、反応混合物を、SiO2の短いパッドに通して濾過し、濾液を回転蒸発により濃縮した。自動フラッシュクロマトグラフィー(5→50% EtOAc/ヘキサン)により精製して、二環式γ-ラクトン(-)-15a(1.55g、収率58%、94%ee)及び(+)-15b(0.51g、収率19%、94%ee)を得た。
【０１０４】
(-)-15a:白色の結晶質固体;TLC(EtOAc/ヘキサン、1:4 v/v)、Rf=0.45;
【０１０５】
【数１】
2021530427.tif 000020
【０１０６】
エナンチオマー過剰率をキラルHPLC分析により、基準ラセミ物質と比較して、Chiralcel OD-Hカラムを使用して決定した:ヘキサン:iPrOH=95:05、流速0.5mL/分、λ=210 nm:tmajor=13.5分、tminor=15.2分、94%ee(図S1);1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.76 - 4.73 (m, 1H), 4.32 (dd, J = 8.8, 5.9 Hz, 1H), 3.98 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 3.17 - 3.11 (m, 1H), 2.74 (dt, J = 7.8, 4.3 Hz, 1H), 2.19 - 2.12 (m, 1H), 2.12 - 2.06 (m, 1H), 1.96 - 1.89 (m, 1H), 1.86 - 1.78 (m, 1H), 0.89 (s, 9H), 0.11 (s, 3H), 0.10 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 178.48, 153.66, 103.01, 73.13, 37.65, 35.50, 26.12, 25.69 (3), 20.58, 18.10, -4.26, -4.44; IR (薄膜): 2929, 2857, 1754, 1660 cm-1; HRMS (ESI+) m/z C14H24NaO3Si [M+Na]+の計算値: 291.1392, 実測値: 291.1387.
【０１０７】
(+)-15b:無色透明の油状物;TLC(EtOAc/ヘキサン、1:4v/v)、Rf=0.65;
【０１０８】
【数２】
2021530427.tif 000021
【０１０９】
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.91 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 4.38 (dd, J = 8.0, 6.6 Hz, 1H), 3.81 (dd, J = 11.4, 8.0 Hz, 1H), 2.91 - 2.82 (m, 1H), 2.28 - 2.17 (m, 3H), 1.70 - 1.58 (m, 2H), 0.91 (s, 9H), 0.14 (s, 3H), 0.08 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 176.35, 154.19, 100.93, 71.74, 43.76, 41.00, 30.47, 25.68 (3), 20.87, 18.11, -3.46, -4.39. IR (薄膜): 2930, 2857, 1777, 1640 cm-1; HRMS (ESI+) m/z C14H24NaO3Si [M+Na]+の計算値: 291.1392, 実測値: 291.1394.
【０１１０】
【化１６】
2021530427.tif 000022
【０１１１】
(3S,4R)-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)シクロヘキサン-1-オン(16):オーブン乾燥した50mL一口梨フラスコに、(-)-15a(493mg、1.85mmol、1.0当量)及びTHF 13.0mLを添加した。得られた溶液を氷浴で0℃に冷却し、10分間撹拌し、その後、THF中の溶液としてのLiAlH4(2.4M、1.68mL、4.04mmol、2.2当量)を、プラスチック製シリンジを介して滴下添加した。添加が完了した後に、混合物を15分間、0℃で撹拌し、その後、Fieserの方法(Fieser,L. F.;Fieser、M. Reagents for Organic Synthesis、1967、581〜595)によりクエンチした。0℃でクエンチした後に、反応混合物を、激しく撹拌しながら3時間かけて周囲温度(23℃)に加温する。次いで、MgSO4を混合物に添加し、得られたスラリーをセライトに通して濾過し、溶媒を回転蒸発により除去して、オフホワイト色の油状物を得、これを精製せずに次の工程で使用する。
【０１１２】
粗製のジオールを装入した50mL一口梨フラスコに、THF5.0mLを添加した。得られた溶液を氷浴で0℃に冷却し、AcOH(0.53mL、9.20mmol、5.0当量)を、続いて、THF中の溶液としてのTBAF(1.0M、9.20mL、9.20mmol、5.0当量)を添加した。次いで、反応混合物を1時間、0℃で撹拌し、その後、氷浴を取り外し、混合物を1時間かけて周囲温度(23℃)に加温した。次いで、反応混合物を回転蒸発により濃縮し、得られた粗製の油状物を自動フラッシュカラムクロマトグラフィー(0→20%MeOH/EtOAc)により精製して、ケトンジオール16(220mg、収率76%、2工程)を透明な油状物として得た:TLC、Rf=0.51(MeOH/EtOAc、1:4 v/v)。
【０１１３】
【化１７】
2021530427.tif 000023
【０１１４】
(1S,3R,3aS,7aR)-5-オキソオクタヒドロイソベンゾフラン-1,3-ジイルジアセタート(17):オーブン乾燥した50mL一口梨フラスコに、-78℃に冷却したCH2Cl210mLを添加し、10分間撹拌し、その後、(COCl)2(596μL、6.95mmol、5.0当量)を添加した。次いで、溶液を更に10分間撹拌し、その後、無水CH2Cl2中の溶液としてのDMSO(2.8M、5.0mL、13.9mmol、10.0当量)を、プラスチック製シリンジを介してゆっくり滴下添加した。得られた溶液を40分間、-78℃で撹拌した。次いで、ジオール16をCH2Cl2中の溶液(0.15M、220mg、1.39mmol、1.0当量)として、プラスチック製シリンジを介してゆっくり滴下添加し、1時間撹拌した。次いで、Et3N(3.87mL、27.8mmol、20.0当量)を反応混合物に、プラスチック製シリンジを介してゆっくり滴下添加した。次いで、反応混合物を30分間、-78℃で撹拌し、その後、冷却浴を0℃氷浴に置き換え、1時間撹拌した。反応混合物を飽和NaHCO3水溶液でクエンチし、CH2Cl2(3×15mL)で抽出し、MgSO4上で乾燥し、セライトに通して濾過し、回転蒸発により濃縮して、粗製の油状物を得、これを精製せずに次の工程で使用した。
【０１１５】
粗製の物質を装入した50mL一口梨フラスコに、AcOH7.0mL及びAc2O7.0mLを、続いて、NaOAc(1.14g、13.9mmol、10.0当量)及び濃H2SO4(74μL、1.39mmol、1.0当量)を添加した。反応混合物を周囲温度(23℃)で48時間撹拌し、飽和NaHCO3水溶液(50mL)に注ぎ入れ、水層をEtOAc(3×50mL)で抽出した。合わせた有機層をブライン(20mL)で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、セライトに通して濾過し、減圧下で濃縮して、粗製の油状物を得、これを自動フラッシュカラムクロマトグラフィー(0→100%EtOAc/ヘキサン)により精製して、ビス-アセトキシフラノース17(105mg、2工程で30%)を2種のジアステレオマーの混合物として、コハク色の油状物の外観で得た:TLC、Rf=0.39(EtOAc/ヘキサン、1:1v/v)。
【０１１６】
【化１８】
2021530427.tif 000024
【０１１７】
(3aR,7aS)-1,3,3a,4,5,7a-ヘキサヒドロイソベンゾフラン-1,3-ジイルジアセタート(18):17(105mg、0.41mmol、1.0当量)を装入したオーブン乾燥した50mL一口梨フラスコに、THF12.0mLを添加した。得られた溶液を0℃に冷却し、10分間撹拌し、その後、NaBH4(18mg、0.49mmol、1.2当量)を一度に添加した。得られた混合物を1時間、0℃で撹拌し、その後、AcOH(50μL、0.87mmol、2.1当量)でクエンチし、周囲温度(23℃)に加温した。混合物を回転蒸発により濃縮して、粗製の淡黄色の油状物を得、これを精製せずに次の工程で使用した。
【０１１８】
粗製の物質を装入したオーブン乾燥した10mL一口梨フラスコに、ピリジン3.0mLを添加した。得られた溶液を0℃に冷却し、10分間撹拌し、その後、SOCl2(87μL、1.20mmol、10.0当量)を添加した。冷却浴を取り外し、混合物を周囲温度(23℃)に加温し、3時間撹拌した。次いで、反応混合物を高真空回転蒸発により濃縮し、粗製の残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(0→100% EtOAc/ヘキサン)により精製して、アルケン二環18(16mg、2工程で収率17%)を透明な油状物並びに上のスキームに示されているとおりの位置異性体及びジアステレオマーの混合物として得た。
Rf=0.39(EtOAc/ヘキサン、1:1v/v)。
【０１１９】
【化１９】
2021530427.tif 000025
【０１２０】
(3aS,7aR)-テトラヒドロイソベンゾフラン-1,5(3H,4H)-ジオン((-)-19):  無水THF(18.0mL)中のシリルエノール  エーテル(-)-15a(495mg、1.84mmol、1.0当量)及び氷AcOH(0.22mL、3.69mmol、2.0当量)の事前冷却溶液(0℃)に、TBAF(THF中1.0M、3.7mL、3.69mmol、2.0当量)を滴下添加した。反応混合物を4時間かけて周囲温度(23℃)にゆっくり加温し、次いで、回転蒸発により濃縮した。自動フラッシュクロマトグラフィー(5→80%EtOAc/ヘキサン)により精製して、ケトラクトン(-)-19(278mg、収率98%)を得た。
【０１２１】
(-)-19:無色透明の油状物;TLC(EtOAc/ヘキサン、1:1v/v)、Rf=0.23;
【０１２２】
【数３】
2021530427.tif 000026
【０１２３】
1H NMR (500 MHz, CDCl3)δ 4.39 (dd, J = 9.4, 6.1 Hz, 1H), 3.98 (dd, J = 9.4, 2.3 Hz, 1H), 3.08 - 2.98 (m, 1H), 2.94 - 2.86 (m, 1H), 2.53 (dd, J = 15.2, 6.4 Hz, 1H), 2.38 - 2.26 (m, 4H), 2.21 - 2.10 (m, 1H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 209.03, 177.64, 71.67, 41.21, 38.14, 37.34, 35.72, 22.72; IR (薄膜): 2934, 2864, 1771, 1712 cm-1; HRMS (ESI+) m/z C8H11O3 [M+H]+の計算値: 155.0708, 実測値: 155.0711.
【０１２４】
【化２０】
2021530427.tif 000027
【０１２５】
3-クロロ-1-メチルシクロヘキサ-1-エン((±)-20a):N-クロロスクシンイミド(2.48g、18.6mmol、1.1当量)をオーブン乾燥した丸底フラスコに秤量添加し、CH2Cl2(33.0mL)に懸濁した。スラリーを0℃に冷却し、Me2S(1.61mL、21.9mmol、1.3当量)を約5分かけて滴下添加し、白色の溶液を生成した。3-メチルシクロヘキサ-2-エン-1-オール((±)-S1)(2.0mL、16.8mmol、1.0当量)を激しく撹拌しながら滴下添加して、透明な溶液を得た。約10分以内に、沈澱物が形成した。反応を0℃で2時間継続し、減圧下で濃縮した。ペンタン(50mL)を添加すると、白色の沈澱物がただちに形成した。次いで、フラスコをフリーザーに4時間入れ、上澄みをデカンテーションした。残りの固体を冷ペンタン(2×50mL)で洗浄し、合わせた有機物をブライン(2×50mL)で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、真空中で濃縮した。アリル塩化物(±)-20aを無色透明の油状物(1.76g、80%)として単離し、この物質は、精製せずにそのまま次の工程に入れるために十分な純度(1H-NMRにより判断して>95%)を有した。TLC(EtOAc/ヘキサン、3:7v/v)、Rf=0.79。スペクトルデータは、すでに報告されていたものとマッチした(Ren,H.、Dunet,G.、Mayer,P.及びKnochel,P. J. Am. Chem. Soc.、2007、127、5376〜5377).
【０１２６】
【化２１】
2021530427.tif 000028
【０１２７】
(3aS,5R,7aR)-5-ヒドロキシ-5-(1-メチルシクロヘキシル)ヘキサヒドロイソベンゾフラン-1(3H)-オン((-)-21a):シリンジを介して液体を添加するためのテフロン（登録商標）ライニングされたシーリングを備えた大口真空アダプターを用いて、オーブン乾燥した丸底フラスコに、亜鉛粉末(2.3g、35.0mmol、25当量)及びLiCl(300mg、7.0mmol、5.0当量)を添加した。次いで、固体の凝集を回避するために固体を撹拌しながら、繰り返しの加熱及び冷却サイクルにより、フラスコ及び固体を高真空下で慎重に火炎乾燥した(真空/N2二重マニホルドを使用)。加熱の最終サイクルの後に、固体をN2下で3分間冷却し、次いで、激しく撹拌しながら無水THF(20.0mL)をゆっくり慎重に添加した。THFの添加後に、1,2-ジブロモエタン(0.12mL、1.4mmol、1.0当量)を添加したが、これは時に、制御を必要とする急速な気体発生と同時に発熱をもたらした。1,2-ジブロメタンを添加すると生成する圧力変動を、マニホルドをN2から真空へと瞬間的にスイッチングすることにより制御した。[注:1,2-ジブロモエタンを添加しても気体発生が観察されなかった場合、ヒートガンを使用して気体発生を開始させた]。溶液を約5分かけて周囲温度に冷却し、その後、0℃に更に冷却した。THF(1.0mL)中の(-)-19(215mg、1.4mmol、1.0当量)の溶液をシリンジにより滴下添加し、続いて、THF(4.0mL)中の(±)-20a(1.65g、12.6mmol、9.0当量)をシリンジポンプを介して1.0mL/hの速度でゆっくり添加した。この時間の間に、反応混合物を周囲温度(23℃)にゆっくり加温した。次いで、反応混合物を飽和NH4Cl溶液(100mL)でクエンチした。有機相を分離し、水相をEtOAc(3×100mL)で更に抽出した。有機層を合わせ、ブライン(200mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、真空中で濃縮して、シクロヘキセノールラクトンS2を粗製の淡黄色の油状物として、かつ2種のジアステレオマーの分離不可能な混合物(粗製の混合物の1H-NMR分析に基づくと1:1dr)として得、これを精製せずに次の工程で使用した。
【０１２８】
無水EtOH(25.0mL)中及びN2の雰囲気下の上の粗製のシクロヘキセノールラクトンS2(267mg、1.07mmol、1.0当量)の溶液に、炭素上のPd(OH)2(300mg、20重量%、2.14mmol、2.0当量)を添加した。H2バルーンをフラスコに取り付け、排気(高真空下で)及びH2パージの3回の連続サイクルの後に、混合物を15時間撹拌した。アリコットを1H-NMR分析のために取り出し、シクロヘキセン部分の完全な水素化を保証した。反応混合物をセライトのパッドに通して濾過し、EtOAcで洗浄し、真空中で濃縮した。自動フラッシュクロマトグラフィー(5→60%EtOAc/ヘキサン)により精製して、シクロヘキサノールラクトン(-)-21a(307mg、2工程で収率88%)を単一のジアステレオマー(粗製の混合物の1H-NMR分析に基づくと>19:1dr)として得た。
【０１２９】
(-)-21a:無色の結晶質固体;TLC(EtOAc/ヘキサン、1:1 v/v)、Rf=0.43;
【０１３０】
【数４】
2021530427.tif 000029
【０１３１】
絶対立体化学をシクロヘキセノールラクトン(-)-21bとの類似により指定した;1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.23 (ddd, J = 8.8, 4.7, 0.7 Hz, 1H), 3.91 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 2.75 (dq, J = 11.9, 6.2 Hz, 1H), 2.63 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 2.10 - 1.92 (m, 2H), 1.84 (ddd, J = 13.8, 6.0, 2.9 Hz, 1H), 1.66 - 1.50 (m, 4H), 1.45- 1.19 (m, 9H), 1.07 - 0.95 (m, 1H), 0.88 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 178.65, 75.45, 72.07, 40.06, 38.94, 33.21, 31.34, 30.43, 30.35, 26.36, 26.27, 22.03 (2), 18.65, 17.22; IR (薄膜): 3509, 2966, 2929, 2862, 1747 cm-1; HRMS (ESI+) m/z C15H25O3 [M+H]+の計算値: 253.1804, 実測値: 253.1793.
【０１３２】
【化２２】
2021530427.tif 000030
【０１３３】
(3aS,7aR)-5-(1-メチルシクロヘキシル)-3a,6,7,7a-テトラヒドロイソベンゾフラン-1(3H)-one((-)-26):ガラス管に、無水CHCl3(35.0mL)中の(-)-21a(268mg、1.07mmol、1.0当量)の溶液、マーティンスルフラン脱水剤(1.44g、2.14mmol、2.0当量)を装入した。管を密閉し、60℃油浴内に1時間入れた。反応混合物を周囲温度(23℃)に冷却し、減圧下で濃縮し、自動フラッシュクロマトグラフィー(5→30%EtOAc/ヘキサン)により精製して、アルケンラクトン(-)-26(182mg、収率73%)を単一位置異性体(粗製の混合物の1H-NMR分析に基づくと>19:1rr)として得た。
【０１３４】
(-)-26:無色透明の油状物;TLC(EtOAc/ヘキサン、1:4 v/v)、Rf=0.40;
【０１３５】
【数５】
2021530427.tif 000031
【０１３６】
絶対立体化学をシクロヘキセノールラクトン(-)-21bとの類似により指定した;1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.38 (s, 1H), 4.38 (dd, J = 8.8, 6.7 Hz, 1H), 4.02 (dd, J = 8.8, 3.0 Hz, 1H), 3.10 (dtq, J = 8.4, 5.3, 3.1 Hz, 1H), 2.76 (dt, J = 8.0, 4.9 Hz, 1H), 2.08 (dt, J = 13.3, 4.8 Hz, 1H), 2.02 - 1.88 (m, 2H), 1.73 (dddd, J = 13.1, 10.0, 5.4, 4.7 Hz, 1H), 1.69 - 1.58 (m, 2H), 1.48 - 1.17 (m, 8H), 0.92 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 179.14, 147.95, 117.80, 72.89, 38.86, 37.91, 37.85, 36.08, 35.97, 27.03, 26.43, 22.73, 22.52, 21.35, 20.81; IR (薄膜): 2927, 2854, 1771 cm-1; HRMS (ESI+) m/z C15H22LiO2 [M+Li]+の計算値: 241.1780, 実測値: 241.1793.
【０１３７】
【化２３】
2021530427.tif 000032
【０１３８】
(1S,3aS,7aR)-5-(1-メチルシクロヘキシル)-1,3,3a,6,7,7a-ヘキサヒドロイソベンゾフラン-1-イルアセタート((-)-27): CH2Cl2(2.0mL)中の(-)-26(30mg、0.128mmol、1.0当量)の溶液に、DIBAl-H(CH2Cl2中1.0M溶液、154μL、0.154mmol、1.2当量)を-78℃で滴下添加した。反応混合物を-78℃で4時間撹拌し、H2O6μL、15%NaOH水溶液11μL、及びH2O16μLで順番に慎重にクエンチした。ドライアイス浴を取り外し、混合物を周囲温度(23℃)にゆっくり加温した。続いて、無水MgSO4を添加し、反応混合物を30分間激しく撹拌し、セライトのパッドに通して濾過し、回転蒸発により濃縮した。粗製のラクトールは、次の工程にそのまま入れるために十分な純度(1H-NMRにより判断して>95%)を有した。
【０１３９】
無水ピリジン(1.0mL)中の上の粗製のラクトールの溶液に、DMAP(2.0mg、0.012mmol、0.1当量)及びAc2O(120μL、1.28mmol、10.0当量)を添加した。反応混合物を周囲温度(23℃)で14時間撹拌し、飽和NaHCO3水溶液(10mL)に注ぎ入れ、水層をCH2Cl2(3×10mL)で抽出した。合わせた有機層をブライン(10mL)で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。自動フラッシュクロマトグラフィー(0→30%EtOAc/ヘキサン)により精製して、アセチルラクトール(-)-27(21mg、2工程で収率60%)を単一のジアステレオマー(粗製の混合物の1H-NMR分析に基づくと>19:1 dr)として得た。
【０１４０】
(-)-27:無色透明の油状物;TLC(EtOAc/ヘキサン、1:4 v/v)、Rf=0.49;
【０１４１】
【数６】
2021530427.tif 000033
【０１４２】
絶対立体化学をシクロヘキセノールラクトン(-)-21bとの類似により指定した;1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.04 (s, 1H), 5.44 (dd, J = 4.3, 1.6 Hz, 1H), 4.28 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 3.65 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 3.00 (q, J = 7.5 Hz, 1H), 2.30 (ddd, J = 11.6, 7.3, 4.4 Hz, 1H), 2.13 - 2.08 (m, 1H), 2.07 (s, 3H), 1.96 - 1.87 (m, 1H), 1.84 (dq, J = 13.5, 4.5 Hz, 1H), 1.71 - 1.62 (m, 3H), 1.52 - 1.22 (m, 8H), 0.95 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 170.77, 145.87, 117.56, 103.91, 74.92, 43.14, 38.68, 36.56, 36.26, 36.03, 27.10, 26.54, 22.86, 22.79, 22.69, 22.54, 21.53; IR (薄膜): 2931, 2857, 1746 cm-1; HRMS (ESI+) m/z C17H26LiO3 [M+Li]+の計算値: 285.2042, 実測値: 285.2052.
【０１４３】
【化２４】
2021530427.tif 000034
【０１４４】
(3aS,5R,7aR)-5-ヒドロキシ-5-(1,5,5-トリメチルシクロヘキサ-2-エン-1-イル)ヘキサヒドロイソベンゾ-フラン-1(3H)-オン((-)-21b):シリンジを介して液体を添加するためのテフロン（登録商標）ライニングされたシーリングを備えた大口真空アダプターを用いて、オーブン乾燥した丸底フラスコに、亜鉛粉末(2.3g、35.0mmol、25当量)及びLiCl(300mg、7.0mmol、5.0当量)を添加した。次いで、固体の凝集を回避するために固体を撹拌しながら、繰り返しの加熱及び冷却サイクルにより、フラスコ及び固体を高真空下で慎重に火炎乾燥した(真空/N2二重マニホルドを使用)。加熱の最終サイクルの後に、固体をN2下で3分間冷却し、次いで、激しく撹拌しながら無水THF(20.0mL)をゆっくり慎重に添加した。THFの添加後に、1,2-ジブロモエタン(0.12mL、1.4mmol、1.0当量)を添加したが、これは時に、制御を必要とする急速な気体発生と同時に発熱をもたらした。1,2-ジブロエタンを添加すると生成する圧力変動を、マニホルドをN2から真空へと瞬間的にスイッチングすることにより制御した。[注:1,2-ジブロモエタンを添加しても気体発生が観察されなかった場合、ヒートガンを使用して気体発生を開始させた]。溶液を約5分かけて周囲温度に冷却し、その後、0℃に更に冷却した。THF(1.0mL)中のケトラクトン(-)-19(215mg、1.4mmol、1.0当量)の溶液をシリンジにより滴下添加し、続いて、シリンジポンプを介して1.0mL/時の速度でTHF(4.0mL)中のアリル塩化物(±)-20b(Harvey,N. L.、Krysiak,J.、Chamni,S.、Cho,S. W.、Sieber,S. A. and Romo,D. Chem. Eur. J.、2015、21、1425〜1428)(2.22g、14.0mmol、10当量)をゆっくり添加した。この時間の間に、反応混合物を周囲温度(23℃)にゆっくり加温した。次いで、反応混合物を飽和NH4Cl溶液(100mL)でクエンチした。有機相を分離し、水相をEtOAc(3×100mL)で更に抽出した。有機層を合わせ、ブライン(200mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。自動フラッシュクロマトグラフィー(5→60%EtOAc/ヘキサン)により精製して、ジメチルシクロヘキセノールラクトン(-)-21b(318mg、収率82%)を2種のジアステレオマーの分離不可能な混合物(粗製の混合物の1H-NMR分析に基づくと1:1dr)として得た。
【０１４５】
(-)-21b:白色の結晶質固体、融点161.2〜163.7℃(ペンタンから再結晶化);TLC(EtOAc/ヘキサン、1:1 v/v)、Rf=0.44;
【０１４６】
【数７】
2021530427.tif 000035
【０１４７】
絶対立体化学を、異常分散を用いるX線解析に基づき指定した。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.89 (ddd, J = 9.9, 6.3, 2.1 Hz, 1H), 5.52 (dd, J = 10.2, 1.8 Hz, 1H), 4.24 (dt, J = 9.0, 4.5 Hz, 1H), 3.93 (dd, J = 8.9, 4.3 Hz, 1H), 2.75 (tt, J = 12.0, 6.1 Hz, 1H), 2.64 (q, J = 5.5 Hz, 1H), 2.14 - 2.02 (m, 1H), 2.05 - 1.92 (m, 1H), 1.86 - 1.64 (m, 4H), 1.63 - 1.50 (m, 1H), 1.45 - 1.21 (m, 3H), 1.10 (dtd, J = 13.6, 2.7, 1.3 Hz, 1H), 1.02 (s, 3H), 0.97 (s, 3H), 0.94 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 178.63, 130.27 (2), 75.44, 71.97, 43.43, 42.90, 39.05, 38.26, 33.22, 32.34, 30.92, 30.59, 27.20, 25.98, 22.16, 18.69; IR (薄膜): 3518, 2951, 2867, 1766 cm-1; HRMS (ESI+) m/z C17H27O3 [M+H]+の計算値: 279.1960, 実測値: 279.1963.
【０１４８】
【化２５】
2021530427.tif 000036
【０１４９】
(1S,3R,3aS,5R,7aR)-5-ヒドロキシ-5-(1,3,3-トリメチルシクロヘキシル)オクタヒドロイソベンゾ-フラン-1,3-ジイルジアセタート((-)-22):無水EtOH(20.0mL)中、及びN2の雰囲気下のシクロヘキセノールラクトン(-)-21b(281mg、1.01mmol、1.0当量)の溶液に、炭素上のPd(OH)2 (284mg、20重量%、2.02mmol、2.0当量)を添加した。H2バルーンをフラスコに取り付け、排気(高真空下で)及びH2パージの3回の連続サイクルの後に、混合物を18時間撹拌した。アリコットを1H-NMR分析のために取り出し、シクロヘキセン部分の完全な水素化を保証した。反応混合物をセライトのパッドに通して濾過し、EtOAcで洗浄し、真空中で濃縮し、精製せずに次の工程にそのまま入れた。
【０１５０】
無水THF(9.0mL)中の上の粗製のラクトンの溶液に、LiAlH4(THF中2.0M溶液、0.60mL、1.2mmol、2.7当量)を0℃で滴下添加した。20分間撹拌した後に、氷浴を取り外し、混合物を40分かけて周囲温度(23℃)にゆっくり加温した。出発物質が消費されたら(TLCにより判断して)、反応混合物を0℃に冷却し、H2O50μL、15%NaOH水溶液85μL、及びH2O120μLの順番で慎重にクエンチした。氷浴を取り外し、混合物を周囲温度(23℃)にゆっくり加温した。続いて、無水MgSO4を添加し、反応混合物を30分間激しく撹拌し、セライトのパッドに通して濾過し、回転蒸発により濃縮した。粗製のジオールは、次の工程にそのまま入れるために十分な純度(1H-NMRにより判断して>95%)を有した。
【０１５１】
CH2Cl2(15.0mL)中の(COCl)2(0.19mL、2.2mmol、10.0当量)の溶液に、DMSO(0.31mL、4.4mmol、20.0当量)を、続いて、CH2Cl2(5.0mL)中の上の粗製のジオールの溶液を、シリンジポンプを介して1時間かけて-78℃で添加した。反応混合物にEt3N(0.92mL、6.6mmol、30.0当量)を添加し、反応混合物を-78℃で1時間、次いで、周囲温度(23℃)で1時間撹拌した。混合物2N HCl(10mL)でクエンチし、水層をCH2Cl2(3×50mL)で抽出した。合わせた有機層をブライン(10mL)で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗製のジアルデヒドを精製せずに次の工程にそのまま入れた。
【０１５２】
AcOH/Ac2O(1.5:1、4.5/3.0mL)中の上の粗製のジアルデヒドの溶液に、NaOAc(180mg、2.2mmol、10.0当量)及び濃H2SO4(11μL、0.22mmol、1.0当量)を連続的に0℃で添加した。反応混合物を周囲温度(23℃)で48時間撹拌し、飽和NaHCO3水溶液(10mL)に注ぎ入れ、水層をEtOAc(3×50mL)で抽出した。合わせた有機層をブライン(20mL)で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。自動フラッシュクロマトグラフィー(0→20% EtOAc/ヘキサン)により精製して、シクロヘキサノール(cyclohaxanol)ジアセタート(-)-22(142mg、4工程で収率37%)を2種のジアステレオマーの分離不可能な混合物(粗製の混合物の1H-NMR分析に基づくと1:1dr)として得た。
【０１５３】
(-)-22:白色の固体;TLC(EtOAc/ヘキサン、1:4 v/v)、Rf=0.10;
【０１５４】
【数８】
2021530427.tif 000037
【０１５５】
絶対立体化学をシクロヘキセノールラクトン(-)-21bとの類似により指定した;1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.17 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 5.94 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 2.65 - 2.57 (m, 1H), 2.59 - 2.49 (m, 1H), 2.12 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.02 - 1.77 (m, 2H), 1.70 - 1.47 (m, 5H), 1.42 - 1.21 (m, 7H), 1.15 - 1.09 (m, 1H), 1.01 (s, 3H), 1.00 (s, 3H), 0.91 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 170.93, 170.12, 103.22, 100.78, 75.72, 43.29, 41.48, 40.91, 39.15, 38.92, 36.16, 30.79 (2), 30.10, 28.82, 27.80, 25.45, 21.42, 20.51, 18.98, 18.54; IR (薄膜): 3527, 2948, 2865, 1748 cm-1; HRMS (ESI-) m/z C21H34ClO6 [M+Cl]-の計算値: 417.2044, 実測値: 417.2062.
【０１５６】
【化２６】
2021530427.tif 000038
【０１５７】
(1S,3R,3aS,7aR)-5-((S)-1,3,3-トリメチルシクロヘキシル)-1,3,3a,4,7,7a-ヘキサヒドロイソベンゾフラン-1,3-ジイルジアセタート((-)-23a)、(1S,3R,3aS,7aR)-5-((R)-1,3,3-トリメチルシクロ-ヘキシル)-1,3,3a,4,7,7a-ヘキサヒドロイソベンゾフラン-1,3-ジイルジアセタート((-)-23b)、(1R,3S、3aR,7aS)-6-((S)-1,3,3-トリメチルシクロヘキシル)-1,3,3a,4,5,7a-ヘキサヒドロイソベンゾフラン-1,3-ジイルジアセタート((-)-23c)、及び(1R,3S,3aR,7aS)-6-((R)-1,3,3-トリメチル-シクロヘキシル)-1,3,3a,4,5,7a-ヘキサヒドロイソベンゾフラン-1,3-ジイルジアセタート((-)-23d)):ガラス管に、PhH(2.0mL)中のシクロヘキサノールジアセタート(-)-22(20mg、0.052mmol、1.0当量)及びメチルN-(トリエチルアンモニオスルホニル(triethylammoniosulfonyl))カルバマート(バージェス試薬、25mg、0.10mmol、2.0当量)を装入した。管を密閉し、80℃油浴に1時間入れた。反応混合物を周囲温度(23℃)に冷却し、減圧下で濃縮した。自動フラッシュクロマトグラフィー(0→20% EtOAc/ヘキサン)により精製して、シクロヘキセニルジアセタート(-)-23(18mg、収率97%)を無色透明の油状物として、かつ4種のジアステレオマーの分離不可能な混合物(粗製の混合物の1H-NMR分析に基づくと1:1 dr、1.3:1rr)として得た。TLC(EtOAc/ヘキサン、1:4 v/v)、Rf=0.32;
【０１５８】
【数９】
2021530427.tif 000039
【０１５９】
絶対立体化学をシクロヘキセノールラクトン(-)-21bとの類似により指定した;IR(薄膜): 2924、2864、1750cm-1;C21H32NaO5[M+Na]+のHRMS(ESI+)m/z計算値:387.2147、実測値:387.2151。次いで、このジアステレオマー混合物を、Chiralcel OJ-Hカラムを使用するキラルHPLC精製に供した:ヘキサン:iPrOH=96:04、流速0.4mL/分、λ=210nm: t(-)-23a=11.4〜13.5分、t(-)-23b=13.6〜15.4分、t(-)-23c=15.5〜17.5分、t(-)-23d=17.6〜20.8分。
【０１６０】
【化２７】
2021530427.tif 000040
【０１６１】
(-)-23a:1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.11 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.03 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 5.50 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 2.96 - 2.92 (m, 1H), 2.52 (dddd, J = 9.4, 7.3, 4.5, 2.2 Hz, 1H), 2.11 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 1.98 - 1.88 (m, 2H), 1.81 - 1.70 (m, 1H), 1.67 - 1.56 (m, 3H), 1.49 - 1.38 (m, 1H), 1.33 - 1.23 (m, 2H), 1.18 - 1.08 (m, 2H), 1.06 - 0.99 (m, 1H), 0.91 (s, 3H), 0.86 (s, 3H), 0.81 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 170.47, 170.33, 147.93, 114.39, 103.69, 103.10, 48.24, 44.10, 41.73, 40.41, 39.02, 36.32, 33.30, 31.55, 31.46, 26.71, 22.64, 21.79, 21.52, 21.49, 19.59.
【０１６２】
【化２８】
2021530427.tif 000041
【０１６３】
(-)-23b:1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.09 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 6.00 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 5.50 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 3.01 - 2.94 (m, 1H), 2.47 (dddd, J = 9.7, 7.5, 4.6, 1.6 Hz, 1H), 2.11 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.00 - 1.90 (m, 2H), 1.86 - 1.80 (m, 1H), 1.66 - 1.52 (m, 2H), 1.48 - 1.36 (m, 2H), 1.33 - 1.23 (m, 2H), 1.19 - 1.08 (m, 2H), 1.04 - 0.98 (m, 1H), 0.91 (s, 3H), 0.86 (s, 3H), 0.81 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 170.37, 170.21, 147.82, 114.13, 104.02, 103.07, 47.67, 43.43, 41.99, 40.34, 38.88, 36.06, 35.10, 33.15, 31.40, 26.78, 24.62, 23.01, 22.53, 21.36, 19.38
【０１６４】
【化２９】
2021530427.tif 000042
【０１６５】
(-)-23c:1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.01 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 5.97 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 5.57 (t, J = 4.4 Hz, 1H), 2.65 - 2.53 (m, 2H), 2.36 - 2.22 (m, 2H), 2.10 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.07 - 1.95 (m, 2H), 1.93 - 1.87 (m, 1H), 1.63 - 1.53 (m, 2H), 1.48 - 1.38 (m, 1H), 1.31 - 1.23 (m, 1H), 1.18 - 1.10 (m, 2H), 1.03 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 0.92 (s, 3H), 0.86 (s, 3H), 0.79 (s, 3H).; 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 170.41, 170.34, 143.99, 116.76, 104.27, 104.05, 48.17, 42.11, 40.65, 40.35, 38.53, 36.19, 33.20, 31.40, 31.28, 27.10, 24.35, 23.66, 21.49 (2), 19.54.
【０１６６】
【化３０】
2021530427.tif 000043
【０１６７】
(-)-23d:1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.06 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.01 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 5.57 (dt, J = 5.5, 2.8 Hz, 1H), 2.50 (ddt, J = 10.2, 7.3, 3.1 Hz, 1H), 2.46 - 2.35 (m, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.00 - 1.76 (m, 3H), 1.57 (d, J = 13.7 Hz, 1H), 1.49 - 1.38 (m, 1H), 1.31 - 1.22 (m, 2H), 1.14 (ddd, J = 13.8, 11.5, 3.6 Hz, 2H), 1.03 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 0.91 (s, 3H), 0.86 (s, 3H), 0.78 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 170.38, 170.30, 144.90, 116.91, 104.09, 103.66, 48.27, 43.18, 41.11, 40.27, 38.67, 36.07, 33.01, 31.40, 30.94, 27.17, 24.58, 24.52, 21.49, 21.47, 19.53.
【０１６８】
【化３１】
2021530427.tif 000044
【０１６９】
(1S,3aS,7aR)-5-オキソオクタヒドロイソベンゾフラン-1-イルアセタート((-)-24): CH2Cl2(2.7mL)中のラクトン(-)-15a(72mg、0.268mmol、1.0当量)の溶液に、DIBAl-H(CH2Cl2中1.0M溶液、321μL、0.321mmol、1.2当量)を-78℃で滴下添加した。反応混合物を-78℃で4時間撹拌し、H2O12μL、20%NaOH水溶液12μL、及びH2O32μLで順番に慎重にクエンチした。ドライアイス浴を外し、混合物を周囲温度(23℃)にゆっくり加温した。続いて、無水MgSO4を添加し、反応混合物を30分間激しく撹拌し、セライトのパッドに通して濾過し、減圧下で濃縮した。粗製のシリルエノールエーテルラクトールは、次の工程にそのまま入れるために十分な純度(1H-NMR分析により判断して>95%)を有した。
【０１７０】
無水THF(2.7mL)中の上の粗製のシリルエノールエーテルラクトールの事前冷却溶液(0℃)及び氷AcOH(31μL、0.536mmol、2.0当量)に、TBAF(THF中の1.0M、0.54mL、0.536mmol、2.0当量)を滴下添加した。反応混合物を4時間かけて周囲温度(23℃)にゆっくり加温し、次いで、減圧下で濃縮した。自動フラッシュクロマトグラフィー(5→80%EtOAc/ヘキサン)により精製して、ケトラクトールS3(42mg、2工程で収率81%)を2種のジアステレオマーの混合物(粗製の混合物の1H-NMR分析に基づくと4:1dr)として得た。
【０１７１】
S3:無色透明の油状物;TLC(EtOAc/ヘキサン、4:1v/v)、Rf=0.23;(NMRデータを主なジアステレオマーについて得る)1H NMR (500 MHz, C6D6) δ 5.08 (s, 1H), 3.94 (dd, J = 8.6, 7.4 Hz, 1H), 3.27 (dd, J = 8.6, 5.6 Hz, 1H), 2.40 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 2.15 - 1.85 (m, 5H), 1.76 (ddd, J = 16.4, 11.2, 5.2 Hz, 1H), 1.50 - 1.38 (m, 1H), 1.36 - 1.23 (m, 1H); 13C NMR (126 MHz, C6D6) δ 209.93, 103.43, 71.70, 44.13, 40.38, 37.76, 36.50, 23.83; IR (薄膜): 3383, 2924, 1710 cm-1; HRMS (ESI+) m/z C8H12LiO3 [M+Li]+の計算値: 163.0941, 実測値: 163.0949.
【０１７２】
無水ピリジン(1.0mL)中のケトラクトールS3(20mg、0.128mmol、1.0当量)の溶液に、DMAP(2.0mg、0.012mmol、0.1当量)及びAc2O(120μL、1.28mmol、10.0当量)を添加した。反応混合物を周囲温度(23℃)で18時間撹拌し、飽和NaHCO3水溶液(10mL)に注ぎ入れ、水層をCH2Cl2(3×10mL)で抽出した。合わせた有機層をブライン(10mL)で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。自動フラッシュクロマトグラフィー(0→40%EtOAc/ヘキサン)により精製して、アセチルケトラクトール(-)-24(24mg、収率98%)を単一のジアステレオマー(粗製の混合物の1H-NMR分析に基づくと>19:1dr)として得た。
【０１７３】
(-)-24:無色透明の油状物;TLC(EtOAc/ヘキサン、4:1 v/v)、Rf=0.49;
【０１７４】
【数１０】
2021530427.tif 000045
【０１７５】
1H NMR (500 MHz, C6D6) δ 6.05 (s, 1H), 3.76 (dd, J = 8.9, 7.7 Hz, 1H), 3.23 (dd, J = 8.8, 5.8 Hz, 1H), 2.19 - 2.09 (m, 1H), 1.96 - 1.83 (m, 3H), 1.70 - 1.60 (m, 4H), 1.46 - 1.33 (m, 2H), 1.26 - 1.10 (m, 1H); 13C NMR (126 MHz, C6D6) δ 208.12, 169.37, 103.35, 73.17, 43.34, 39.90, 37.57, 35.88, 23.42, 20.89; IR (薄膜): 2957, 2923, 2853, 1712 cm-1; HRMS (ESI+) m/z C10H14LiO4 [M+Li]+の計算値: 205.1047, 実測値: 205.1052.
【０１７６】
【化３２】
2021530427.tif 000046
【０１７７】
(1S,3aR,7aS)-3,6-ジオキソオクタヒドロイソベンゾフラン-1-イルアセタート((-)-25): H2O(1.0mL、0.13M)中のケトラクトン(-)-19(21mg、0.134mmol、1.0当量)の撹拌溶液に、KOH(11mg、0.201mmol、1.5当量)を周囲温度(23℃)で添加し、20分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、PhMe(3×10mL)と共沸して、対応するケト酸を非晶質固体として得た。
【０１７８】
DMF(5.0mL)中の上の粗製のケト酸の事前冷却溶液(0℃)に、デス-マーチンペルヨージナン(292mg、0.688mmol、5.0当量)及びNaHCO3(224mg、2.67mmol、20当量)を添加した。反応混合物を周囲温度(23℃)にゆっくり加温し、20時間撹拌した。次いで、反応混合物をH2O(20mL)でクエンチし、EtOAc(2×20mL)で抽出した。合わせた有機層をブライン(10mL)で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。自動フラッシュクロマトグラフィー(5→80%EtOAc/ヘキサン)により精製して、ヒドロキシケトラクトンS4(5.5mg、2工程で収率24%)を非晶質の白色の固体として、かつ2種のジアステレオマーの混合物(粗製の混合物の1H-NMR分析に基づくと1:1dr)として得た。TLC(EtOAc/ヘキサン、4:1v/v)、Rf=0.24。
【０１７９】
ピリジン(1.0mL、0.03M)中のヒドロキシルケトラクトンS4(5.0mg、0.0294mmol、1.0当量)の撹拌溶液に、Ac2O(28μL、0.294mmol、10当量)及びDMAP(3.6mg、0.0294mmol、1.0当量)を周囲温度(23℃)で添加した。反応混合物を4時間、23℃で撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。粗製の反応混合物を自動フラッシュカラムクロマトグラフィー(0→100%EtOAc/ヘキサン)による精製に供して、アセトキシケトラクトン(-)-25(2.1mg、収率34%)を単一のジアステレオマー(粗製の混合物の1H-NMR分析に基づくと>19:1dr)として得た。
【０１８０】
(-)-25:白色の固体;TLC(EtOAc/ヘキサン、4:1 v/v)、Rf=0.45;
【０１８１】
【数１１】
2021530427.tif 000047
【０１８２】
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.69 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 3.33 (dtd, J = 10.4, 6.6, 4.2 Hz, 1H), 3.02 (dt, J = 10.0, 6.7 Hz, 1H), 2.54 - 2.39 (m, 4H), 2.39 - 2.20 (m, 2H), 2.07 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3)δ 207.85, 176.43, 168.69, 94.73, 37.51, 36.47, 31.97, 23.53, 20.71, 17.32.
【０１８３】
【化３３】
2021530427.tif 000048
【０１８４】
(3aR,7aS)-5-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-3a,6,7,7a-テトラヒドロイソベンゾフラン-1(3H)-オン((+)-15a):CH2Cl2(7.5mL、0.1M)中のtrans-縮合二環式γ-ラクトン(+)-15b(202mg、0.752mmol、1.0当量)の溶液を含有するガラス管に、DBU(0.34mL、2.25mmol、3.0当量)を添加した。ガラス管を密閉し、40℃油浴内に24時間入れた。反応混合物を周囲温度(23℃)に冷却し、SiO2の短いパッドに通して濾過し、濾液を回転蒸発により濃縮した。自動フラッシュクロマトグラフィー(5→50%EtOAc/ヘキサン)により精製して、cis-縮合二環式γ-ラクトン(+)-15a(182mg、収率90%、94%ee)を得た。
【０１８５】
(+)-15a:白色の結晶質固体;TLC(EtOAc/ヘキサン、1:4 v/v)、Rf=0.45;
【０１８６】
【数１２】
2021530427.tif 000049
【０１８７】
エナンチオマー過剰率をキラルHPLC分析により、基準ラセミ物質と比較して、Chiralcel OD-Hカラムを使用して決定した:ヘキサン:iPrOH=95:05、流速0.5mL/分、λ=210nm:tminor=13.5分、tmajor=15.0分、94%ee;絶対立体化学を二環式γ-ラクトン(+)-3c'との類似により指定した;すべてのスペクトルデータが、cis-縮合二環式γ-ラクトン(-)-15aについて報告されたものとマッチした。
【０１８８】
【化３４】
2021530427.tif 000050
【０１８９】
(3aR,7aS)-テトラヒドロイソベンゾフラン-1,5(3H,4H)-ジオン((+)-19):  無水THF(2.7mL、0.1M)中の二環式γ-ラクトン(+)-15a(72mg、0.268mmol、1.0当量)及び氷AcOH(31μL、0.536mmol、2.0当量)の事前冷却溶液(0℃)に、TBAF(THF中1.0M、0.54mL、0.536mmol、2.0当量)を滴下添加した。反応混合物を4時間かけて周囲温度(23℃)にゆっくり加温し、次いで、減圧下で濃縮した。自動フラッシュクロマトグラフィー(5→80%EtOAc/ヘキサン)により精製して、ケトラクトン(+)-19(38mg、収率93%)を得た。
【０１９０】
(+)-19:無色透明の油状物;TLC(EtOAc/ヘキサン、1:1v/v)、Rf=0.23;
【０１９１】
【数１３】
2021530427.tif 000051
【０１９２】
絶対立体化学を二環式γ-ラクトン(+)-3c'との類似により指定した;すべてのスペクトルデータが、ケトラクトン(+)-19aについて報告されたものとマッチした。
【０１９３】
【化３５】
2021530427.tif 000052
【０１９４】
(3aR,5S,7aS)-5-ヒドロキシ-5-(1,5,5-トリメチルシクロヘキサ-2-エン-1-イル)ヘキサヒドロイソベンゾ-フラン-1(3H)-オン((+)-21b):シリンジを介して液体を添加するためのテフロン（登録商標）ライニングされたシーリングを備えた大口真空アダプターを用いて、オーブン乾燥した丸底フラスコに、亜鉛粉末(766mg、11.6mmol、25当量)及びLiCl(100mg、2.33mmol、5.0当量)を添加した。次いで、固体の凝集を回避するために固体を撹拌しながら、繰り返しの加熱及び冷却サイクルにより、フラスコ及び固体を高真空下で慎重に火炎乾燥した(真空/N2二重マニホルドを使用)。加熱の最終サイクルの後に、固体をN2下で3分間冷却し、次いで、激しく撹拌しながら無水THF(6.7mL)をゆっくり慎重に添加した。THFの添加後に、1,2-ジブロモエタン(40μL、0.46mmol、1.0当量)を添加したが、これは時に、制御を必要とする急速な気体発生と同時に発熱をもたらした。1,2-ジブロエタンを添加すると生成する圧力変動を、マニホルドをN2から真空へと瞬間的にスイッチングすることにより制御した。[注:1,2-ジブロモエタンを添加しても気体発生が観察されなかった場合、ヒートガンを使用して気体発生を開始させた]。溶液を約5分かけて周囲温度に冷却し、その後、0℃に更に冷却した。THF(0.33mL)中のケトラクトン(+)-19(71mg、0.46mmol、1.0当量)の溶液をシリンジにより滴下添加し、続いて、THF(1.3mL)中のアリル塩化物(±)-20b(740mg、4.6mmol、10当量)をシリンジポンプを介して1.0mL/hの速度でゆっくり添加した。この時間の間に、反応混合物を周囲温度(23℃)にゆっくり加温した。次いで、反応混合物を飽和NH4Cl溶液(30mL)でクエンチした。有機相を分離し、水相をEtOAc(3×30mL)で更に抽出した。有機層を合わせ、ブライン(10mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。自動フラッシュクロマトグラフィー(5→60%EtOAc/ヘキサン)により精製して、ジメチルシクロヘキセノールラクトン(+)-21b(98mg、収率78%)を2種のジアステレオマーの分離不可能な混合物(粗製の混合物の1H-NMR分析に基づくと1:1dr)として得た。
【０１９５】
(+)-21b:白色の結晶質固体;TLC(EtOAc/ヘキサン、1:1v/v)、Rf=0.44;
【０１９６】
【数１４】
2021530427.tif 000053
【０１９７】
絶対立体化学をジメチルシクロヘキセノールラクトン(-)-21bとの類似により指定した;すべてのスペクトルデータが、ジメチルシクロヘキセノールラクトン(-)-21bについて報告されたものとマッチした。
【０１９８】
【化３６】
2021530427.tif 000054
【０１９９】
(3aR,7aS)-5-(1,3,3-トリメチルシクロヘキシル)-3a,6,7,7a-テトラヒドロイソベンゾフラン-1(3H)-オン((+)-28):無水EtOH(6.6mL)中、N2の雰囲気下のジメチルシクロヘキセノールラクトン(+)-21b(93mg、0.33mmol、1.0当量)の溶液に、炭素上のPd(OH)2(94mg、20重量%、0.67mmol、2.0当量)を添加した。H2バルーンをフラスコに取り付け、排気(高真空下で)及びH2パージの3回の連続サイクルの後に、混合物を15時間撹拌した。アリコットを1H-NMR分析のために取り出し、シクロヘキセン部分の完全な水素化を保証した。反応混合物をセライトのパッドに通して濾過し、EtOAcで洗浄し、減圧下で濃縮し、精製せずにそのまま、次の工程に入れた。
【０２００】
ガラス管に、無水CHCl3(11.6mL、0.02M)中の上の粗製のアルコール(89mg、0.33mmol、1.0当量)及びマーティンスルフラン脱水剤(478mg、0.67mmol、2.0当量)を装入した。管を密閉し、60℃油浴内に1時間入れた。反応混合物を周囲温度(23℃)に冷却し、減圧下で濃縮し、自動フラッシュクロマトグラフィー(5→30%EtOAc/ヘキサン)により精製して、シクロヘキセンラクトン(+)-28(69mg、2工程で収率79%)を単一の位置異性体(粗製の混合物の1H-NMR分析に基づくと>19:1rr)として得た。
【０２０１】
(+)-28:無色透明の油状物;TLC(EtOAc/ヘキサン、1:4 v/v)、Rf=0.41;
【０２０２】
【数１５】
2021530427.tif 000055
【０２０３】
絶対立体化学をシクロヘキセノールラクトン(-)-21bの類似により指定した;(NMRデータを2種のジアステレオマーについて得る)1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.40 (s, 2H), 4.43 - 4.33 (m, 2H), 4.08 - 3.96 (m, 2H), 3.15 - 3.02 (m, 2H), 2.82 - 2.69 (m, 2H), 2.16 - 1.85 (m, 9H), 1.80 - 1.49 (m, 7H), 1.47 - 1.38 (m, 2H), 1.31 - 1.23 (m, 2H), 1.20 - 1.05 (m, 4H), 0.91 (s, 3H), 0.88 (s, 3H), 0.86 (s, 3H), 0.82 (s, 3H), 0.79 (s, 3H), 0.77 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 179.24, 179.19, 148.16, 148.03, 116.76, 116.67, 72.81, 72.79, 48.02, 47.72, 40.46, 40.37, 39.00, 38.95, 37.83, 37.82, 36.26, 36.23, 35.97, 35.93, 33.38, 33.18, 31.66, 31.64, 31.46, 31.39, 21.58, 21.57, 21.18, 20.98, 19.61, 19.46; IR (薄膜): 2932, 2860, 1769 cm-1; HRMS (ESI+) m/z C17H26LiO2 [M+Li]+の計算値: 269.2093, 実測値: 269.2107.
【０２０４】
【化３７】
2021530427.tif 000056
【０２０５】
(1R,3aR,7aS)-5-(1,3,3-トリメチルシクロヘキシル)-1,3,3a,6,7,7a-ヘキサヒドロイソベンゾフラン-1-イルアセタート((+)-29):CH2Cl2(1.3mL、0.06M)中のシクロヘキセンラクトン(+)-28(20mg、0.076mmol、1.0当量)の溶液に、DIBAl-H(CH2Cl2中1.0M溶液、92μL、0.092mmol、1.2当量)を-78℃で滴下添加した。反応混合物を-78℃で4時間撹拌し、MeOH92μL及び飽和ロッシェル塩水溶液(2.6mL)で順番に慎重にクエンチした。ドライアイス浴を取り外し、混合物を周囲温度(23℃)にゆっくり加温した。続いて、反応混合物をセライトのパッドに通して濾過し、CH2Cl2(3×10mL)で抽出し、ブライン(10mL)で洗浄し、減圧下で濃縮した。粗製のラクトールは、そのまま次の工程に入れるために十分な純度(1H-NMRにより判断して>95%)を有した。
【０２０６】
無水ピリジン(0.8mL)中の上の粗製のラクトールの溶液に、DMAP(2.0mg、0.015mmol、0.2当量)及びAc2O(36μL、0.38mmol、5.0当量)を添加した。反応混合物を周囲温度(23℃)で14時間撹拌し、飽和NaHCO3水溶液(10mL)に注ぎ入れ、水層をCH2Cl2(3×10mL)で抽出した。合わせた有機層をブライン(10mL)で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。自動フラッシュクロマトグラフィー(0→30%EtOAc/ヘキサン)により精製して、アセチルラクトール(+)-29(14mg、2工程で収率62%)を無色透明の油状物として、かつ単一のジアステレオマー(粗製の混合物の1H-NMR分析に基づくと>19:1dr)として得た。TLC(EtOAc/ヘキサン、1:4v/v)、Rf=0.51;
【０２０７】
【数１６】
2021530427.tif 000057
【０２０８】
IR(薄膜): 2939、2861、1744cm-1;C19H30LiO3[M+Li]+のHRMS(ESI+)m/z計算値:313.2355、実測値:313.2367。絶対立体化学をシクロヘキセノールラクトン(-)-21bとの類似により指定した;ジアステレオマー混合物を半分取逆相HPLC(100×21.20mm、5μm;直線勾配、20分かけて5→95%CH3CN/H2O(0.1%のNH4HCO3含有)、10mL/分)により更に分離して、(+)-29a(TR=5.7分)及び(+)-29b(TR=6.8分)を得た。
【０２０９】
【化３８】
2021530427.tif 000058
【０２１０】
(+)-29a:1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.03 (s, 1H), 5.46 (dd, J = 4.6, 1.9 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 3.70 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 2.96 (p, J = 7.3 Hz, 1H), 2.35 - 2.27 (m, 1H), 2.19 - 2.12 (m, 1H), 2.06 (s, 3H), 1.99 - 1.90 (m, 1H), 1.80 (dt, J = 12.9, 4.7 Hz, 1H), 1.73 - 1.67 (m, 1H), 1.66 - 1.24 (m, 5H), 1.21 - 1.07 (m, 1H), 1.03 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 0.92 (s, 3H), 0.87 (s, 3H), 0.82 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 170.48, 145.36, 117.37, 103.60, 74.63, 47.76, 40.20, 38.75, 37.58, 36.00, 35.72, 33.13, 31.38, 31.20, 26.77, 25.97, 21.33, 20.93, 19.36.
【０２１１】
【化３９】
2021530427.tif 000059
【０２１２】
(+)-29b:1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.01 (s, 1H), 5.43 (dd, J = 4.5, 2.0 Hz, 1H), 4.26 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 3.61 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 2.98 (dt, J = 13.4, 7.3 Hz, 1H), 2.26 (td, J = 7.4, 3.7 Hz, 1H), 2.09 (dt, J = 16.9, 4.5 Hz, 1H), 2.05 (s, 3H), 2.01 - 1.79 (m, 2H), 1.67 - 1.52 (m, 2H), 1.46 - 1.23 (m, 4H), 1.18 - 1.06 (m, 2H), 0.99 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 0.91 (s, 3H), 0.86 (s, 3H), 0.84 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 170.51, 145.39, 117.40, 103.75, 74.65, 47.47, 40.12, 38.69, 37.57, 35.97, 35.68, 32.93, 31.38, 31.14, 26.76, 25.97, 21.32, 20.73, 19.21.
【０２１３】
【化４０】
2021530427.tif 000060
【０２１４】
((3S,4R)-1'-メチル-[1,1'-ビ(シクロヘキサン)]-1-エン-3,4-ジイル)ビス(メチレン)ジアセタート(+)-S6):無水THF(1.5mL、0.08M)中のシクロヘキセンラクトン(-)-26(27mg、0.12mmol、1.0当量)の溶液に、LiAlH4(THF中2.0M溶液、0.15mL、0.30mmol、2.5当量)を0℃で滴下添加した。1時間撹拌した後に、氷浴を取り外し、混合物を30分かけて周囲温度(23℃)にゆっくり加温した。出発物質が(TLCにより判断して)消費されたら、反応混合物を0℃に冷却し、H2O12μL、25%NaOH水溶液12μL、及びH2O30μLで連続して慎重にクエンチした。氷浴を取り外し、混合物を周囲温度(23℃)にゆっくり加温した。続いて、無水MgSO4を添加し、反応混合物を30分間激しく撹拌し、セライトのパッドに通して濾過し、回転蒸発により濃縮した。粗製のジオールは、そのまま次の工程に入れるために十分な純度(1H-NMRにより判断して>95%)を有した。
【０２１５】
無水ピリジン中の上の粗製のジオールの溶液(1.0mL、0.1M)に、DMAP(2.0mg、0.012mmol、0.1当量)及びAc2O(120μL、1.28mmol、10.0当量)を添加した。反応混合物を周囲温度(23℃)で24時間撹拌し、飽和NaHCO3水溶液(10mL)に注ぎ入れ、水層をCH2Cl2(3×10mL)で抽出した。合わせた有機層をブライン(10mL)で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。自動フラッシュクロマトグラフィー(0→30%EtOAc/ヘキサン)により精製して、シクロヘキセンジアセタート(+)-27b(37mg、2工程で収率99%)を単一のジアステレオマー(粗製の混合物の1H-NMR分析に基づくと>19:1dr)として得た。(+)-27b:無色透明の油状物;TLC(EtOAc/ヘキサン、1:4v/v)、Rf=0.53;
【０２１６】
【数１７】
2021530427.tif 000061
【０２１７】
絶対立体化学をシクロヘキセノールラクトン(-)-21bとの類似により指定した;1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.34 (dt, J = 4.0, 1.6 Hz, 1H), 4.13 - 3.96 (m, 4H), 2.70 - 2.61 (m, 1H), 2.17 - 2.08 (m, 1H), 2.05 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.00 - 1.92 (m, 1H), 1.70 - 1.62 (m, 4H), 1.63 - 1.52 (m, 1H), 1.49 - 1.38 (m, 3H), 1.38 - 1.29 (m, 3H), 1.28 - 1.18 (m, 2H), 0.92 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 171.25, 171.15, 146.01, 118.56, 65.48, 65.11, 38.70, 36.59, 36.41, 36.30, 34.56, 26.47, 23.29, 23.02, 22.72, 21.13, 21.11; IR (薄膜): 2930, 2856, 1742, 1235 cm-1; HRMS (ESI+) m/z C19H31O4 [M+H]+の計算値: 323.2222, 実測値: 323.2232.
【０２１８】
【化４１】
2021530427.tif 000062
【０２１９】
1',3',3'-トリメチル-[1,1'-ビ(シクロヘキサン)]-1-エン((±)-S7):  シリンジを介して液体を添加するためのテフロン（登録商標）ライニングされたシーリングを備えた大口真空アダプターを用いて、オーブン乾燥した丸底フラスコに、亜鉛粉末(3.5g、53.5mmol、25当量)及びLiCl(900mg、21.4mmol、10.0当量)を添加した。次いで、固体の凝集を回避するために固体を撹拌しながら、繰り返しの加熱及び冷却サイクルにより、フラスコ及び固体を高真空下で慎重に火炎乾燥した(真空/N2二重マニホルドを使用)。加熱の最終サイクルの後に、固体をN2下で3分間冷却し、次いで、激しく撹拌しながら無水THF(40.0mL、0.05M)をゆっくり慎重に添加した。THFの添加後に、1,2-ジブロモエタン(0.4mL、4.28mmol、2.0当量)を添加したが、これは時に、制御を必要とする急速な気体発生と同時に発熱をもたらした。1,2-ジブロエタンを添加すると生成する圧力変動を、マニホルドをN2から真空へと瞬間的にスイッチングすることにより制御した。[注:1,2-ジブロモエタンを添加しても気体発生が観察されなかった場合、ヒートガンを使用して気体発生を開始させた]。溶液を約5分かけて周囲温度に冷却し、その後、0℃に更に冷却した。THF(1.0mL)中のシクロヘキサノンS5(0.22mL、2.14mmol、1.0当量)の溶液をシリンジにより滴下添加し、続いて、THF(2.4mL)中のアリル塩化物(±)-20b(1.7g、10.7mmol、5.0当量)をシリンジポンプを介して1.0mL/hの速度でゆっくり添加した。この時間の間に、反応混合物を周囲温度(23℃)にゆっくり加温した。次いで、反応混合物を飽和NH4Cl溶液(60mL)でクエンチした。有機相を分離し、水相をEtOAc(3×60mL)で更に抽出した。有機層を合わせ、ブライン(20mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、ジメチルシクロヘキセノール(±)-S6を単一のジアステレオマー(粗製の混合物の1H-NMR分析に基づくと>19:1dr)として得た。この物質は、精製せずにそのまま次の工程に入れるために十分な純度(1H-NMRにより判断して>95%)を有した。
【０２２０】
無水EtOH(55.0mL、0.05M)中、及びN2の雰囲気下の(±)-S6(600mg、2.7mmol、1.0当量)の溶液に、炭素上のPd(OH)2(758mg、20重量%、5.4mmol、2.0当量)を添加した。H2バルーンをフラスコに取り付け、排気(高真空下で)及びH2パージの3回の連続サイクルの後に、混合物を15時間撹拌した。アリコットを1H-NMR分析のために取り出し、シクロヘキセン部分の完全な水素化を保証した。反応混合物をセライトのパッドに通して濾過し、EtOAcで洗浄し、減圧下で濃縮し、精製せずにそのまま、次の工程に入れた。
【０２２１】
ガラス管に、無水CHCl3(5.0mL、0.04M)中の上の粗製のアルコール(45mg、0.20mmol、1.0当量)及びマーティンスルフラン脱水剤(202mg、0.30mmol、1.5当量)を装入した。管を密閉し、60℃油浴内に1時間入れた。反応混合物を周囲温度(23℃)に冷却し、減圧下で濃縮し、自動フラッシュクロマトグラフィーにより、HPLCグレードのn-ヘキサンでの定組成溶離を使用して精製して、シクロヘキセン(±)-S7(41mg、3工程で収率87%)を得た。
【０２２２】
(±)-S7:無色透明の油状物;TLC(ヘキサン)、Rf=0.94;1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.47 (dt, J = 3.7, 2.3 Hz, 1H), 2.10 - 1.86 (m, 5H), 1.69 - 1.49 (m, 6H), 1.44 - 1.37 (m, 1H), 1.33 - 1.22 (m, 1H), 1.18 - 1.04 (m, 2H), 0.98 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 0.92 (s, 3H), 0.87 (s, 3H), 0.86 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 143.86, 118.08, 48.11, 40.82, 38.71, 36.60, 33.32, 31.82, 31.60, 27.07, 25.92, 24.92, 23.74, 22.79, 19.76; IR (薄膜): 2978, 2951, 2866 cm-1;この化合物では、親イオンの十分な高分解能質量スペクトルは得られなかった。
【０２２３】
【化４２】
2021530427.tif 000063
【０２２４】
5-(1,3,3-トリメチルシクロヘキシル)ヘキサヒドロイソベンゾフラン-1-イルアセタート(33):マーティンスルフラン(1.20g、1.78mmol、5.00当量)を、N2充填グローブボックス内の火炎乾燥したRBフラスコに秤量添加した。フラスコを隔膜で密閉し、グローブボックスから取り出した。無水CHCl3(7.00mL)中の粗製のアルコール21b(100mg、1.78mmol、1.00当量)の溶液を反応フラスコに添加し、得られた混合物を2時間、70℃に加熱した。反応の完了後に、混合物を濃縮し、短いシリカパッドに通して濾過し(30%EtOAc:ヘキサン)、濃縮し、粗製物を次の工程で使用した。
【０２２５】
ラクトン(粗製物20mg)をCH2Cl2(1.3mL)に入れ、-78℃に冷却した。この温度でDIBAL(16.0mL、91.0mmol、1.20当量)を滴下添加し、反応物を4時間撹拌した。完了したら、混合物をH2O(4mL)、NaOH(15%水溶液、4mL)及びH2O(10mL)で連続的にクエンチした。混合物を30分間撹拌し、次いで、スパチュラの先端分のMgSO4を添加し、更に30分間撹拌した。得られた不均一な混合物をセライトに通して濾過し、濃縮した。物質を更に精製せずに使用した。
【０２２６】
粗製のラクトールをピリジン(1.00mL)に溶解し、DMAP(1.00mg、8.00mmol、0.10当量)を添加した。Ac2O(71.8mL、0.76mmol、10.0当量)を滴下添加し、反応物を終夜、室温で撹拌した。混合物をNaHCO3(飽和水溶液)でクエンチし、CH2Cl2で抽出した。合わせた有機物をブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥し、濾過し、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー(10〜40%Et2O:ヘキサン)により得られた残渣を精製して、23.4mg(収率28%、5工程)の標題化合物33をジアステレオマーの混合物として、無色透明の油状物として得た。スペクトル複雑性により、積分は補正せず、すべてのジアステレオマーについて列挙する。Rf=0.51(20%EtOAc:ヘキサン)。IR(膜) 2945(s) 2864(m)、2361(w)、1745(s)、1462(w)、1364(m)、1236(s)、1103(m)、1007(m)、964(m)、930(m)、905(m) cm-1。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 6.01 (s, 2H), 5.46 - 5.41 (m, 2H), 4.26 (td, J = 8.3, 2.1 Hz, 2H), 3.68 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 3.61 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 3.01 - 2.91 (m, 2H), 2.34 - 2.22 (m, 3H), 2.17 - 2.02 (m, 10H), 2.00 - 1.87 (m, 6H), 1.87 - 1.74 (m, 3H), 1.72 - 1.53 (m, 10H), 1.53 - 1.24 (m, 5H), 1.18 - 1.07 (m, 8H), 1.05 - 0.97 (m, 7H), 0.91 (d, J = 1.7 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 1.6 Hz, 3H), 0.84 (s, 2H), 0.81 (s, 2H). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 170.79, 170.77, 146.0, 116.5, 116.4, 104.0, 103.9, 75.0, 74.4, 48.5, 47.7, 43.23, 43.17, 40.6, 40.5, 38.83, 38.82, 36.8, 36.5, 36.3, 33.4, 31.6, 31.5, 23.8, 23.1, 22.64, 22.62, 21.6, 19.7, 19.5. HRMS (ESI): C19H30O3Na1 [M+Na]+の計算値: 329.2087, 実測値: 329.2093.
【０２２７】
【化４３】
2021530427.tif 000064
【０２２８】
化合物34:第三級アルコール21b(76.0mg、0.27mmol、1.00当量)を火炎乾燥した反応フラスコに添加し、CH2Cl2(1.00mL)に溶解した。得られた溶液を0℃に冷却し、Et3N(190mL、1.36mmol、5.00当量)を添加した。SOCl2(78.9mL、1.08mmol、4.00当量)を滴下添加し、反応物を1時間、0℃で撹拌した。TLCにより判断して反応が完了したら、混合物を濃縮した。残渣を30%Et2O:ヘキサンに入れ、短いシリカパッド(30%Et2O:ヘキサン)に通し、濃縮した。得られた黄色の油状物を更に精製せずに次の工程で使用した。
【０２２９】
残渣(20.4mg、78.0mmol、1.00当量)をTHF(1.00mL)に入れ、0℃に冷却した。LAH(THF中2M、78.0mL、156mmol)を添加し、反応物を30分間、0℃で撹拌した。混合物をH2O6mL、NaOH(15%水溶液)6mL、及びH2O18mLで順にクエンチし、次いで、30分間撹拌したが、その間に室温に加温した。スパチュラの先端分のMgSO4を添加し、混合物を更に30分間撹拌した。不均一な混合物をセライトに通して濾過し、濃縮し、精製せずに次の工程で使用した。
【０２３０】
粗製のジオールをピリジン(1.00mL)に溶解し、DMAP(1.00mg、7.80mmol、0.10当量)を添加した。Ac2O(74.0mL、0.78mmol、10.0当量)を添加し、反応物を終夜、室温で撹拌した。次いで、混合物をNaHCO3(飽和水溶液)でクエンチし、CH2Cl2(3×1mL)で抽出した。合わせた有機物をブラインで洗浄し、乾燥させ、濾過し、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、16.3mg(収率27%、3工程)のビスアセタート34を4種の異性体の混合物として得た。Rf=0.49(30%Et2O:ヘキサン、PAA)。IR(膜)2947(m)、2919(m)、2865(m)、1740(s)、1462(w)、1451(w)、1366(m)、1230(s)、1034(m)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.53 - 5.33 (m, 1H), 4.15 - 3.91 (m, 4H), 2.74 - 2.48 (m, 1H), 2.30 - 2.09 (m, 2H), 2.05 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.99 - 1.76 (m, 1H), 1.74 - 1.60 (m, 1H), 1.60 - 1.48 (m, 2H), 1.48 - 1.35 (m, 1H), 1.28 (m, 1H), 1.18 - 1.05 (m, 2H), 1.05 - 0.95 (m, 1H), 0.95 - 0.71 (m, 9H). HRMS (ESI): C21H34O4Na1 [M+Na]+の計算値: 373.2349, 実測値: 373.2344.
【０２３１】
(実施例B)
グラシリン核を合成するための方法
この実施例では、グラシリン核及び本発明の代表的なグラシリン誘導体を合成するための方法を記載する。
出発物質の合成
【０２３２】
【化４４】
2021530427.tif 000065
【０２３３】
(R)-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルアセタート(35):既知の文献手順(Tao,D. J.;Slutskyy,Y.;Overman,L. E. J. Am. Chem. Soc. 2016、138、2186)に従って合成した。5-ヒドロキシフラン-2(5H)-オン(Moradei,O. M. and Paquette,L. A. Org. Synth. 2003、80、66)(7.97g、89.9mmol)を、火炎乾燥した反応フラスコにN2下で添加し、酢酸ビニル(82.0mL)に懸濁した。リパーゼAK(5.50g)を添加し、反応混合物を8日間、室温で撹拌した。反応が完了したら、混合物をセライトに通して濾過し、濾液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物10.9グラム(収率96%、93:7er)を淡黄色の液体として得た。分光学的データは、以前に報告されたデータと一致した。エナンチオマー純度を、キラルカラムを使用するHPLC分析(Chiralpak AD-Hカラム、22℃、1.0mL/分、90:10のヘキサン:イソプロパノール、254nm、tminor=12.273分、tmajor=13.853分)により決定した。
【０２３４】
【化４５】
2021530427.tif 000066
【０２３５】
(R)-5-(ナフタレン-2-イルオキシ)フラン-2(5H)-オン(36):手順を既知の文献手順(Tao,D. J.;Slutskyy,Y.;Overman,L. E. J. Am. Chem. Soc. 2016、138、2186)から適合させた。Pd(PPh3)4(3.23g、2.79mmol、0.05当量)を火炎乾燥した丸底フラスコに、N2充填グローブボックス内で秤量添加した。フラスコのキャップを隔膜で締め、グローブボックスから取り出した。黄色の固体をCH2Cl2(475mL)に室温で溶かした。2-ナフトール(12.1g、83.8mmol、1.50当量)を反応フラスコに添加し、続いて、(R)-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルアセタート35(7.94g、55.9mmol、1.00当量)を添加した。得られた溶液を10時間、室温で撹拌し、その時間で、反応物は黄色からオレンジ色、最終的には暗い深紅色へと数回の色変化を受けた。反応混合物を濃縮し、そのままシリカゲルクロマトグラフィー(10〜100%EtOAc:ヘキサン)により精製して、標題化合物7.58グラム(収率60%、94:6er)を白色の固体として得た。この物質は所望の場合、CH2Cl2:ヘキサンから再結晶化させて単一のエナンチオマーにすることができた。分光学的データは、以前に報告されたデータと一致した。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.83 (見かけ上t, J = 9.0 Hz, 3H), 7.59 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.52 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.49 - 7.41 (m, 2H), 7.28 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 6.56 (s, 1H), 6.39 (d, J = 5.7 Hz, 1H).  13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 170.1, 154.3, 149.9, 134.2, 130.5, 130.1, 127.9, 127.5, 126.9, 125.5, 125.1, 118.7, 111.8, 100.9.エナンチオマー純度を、キラルカラムを使用するHPLC分析(Chiralpak AD-H、22℃、1.0mL/分、90:10のヘキサン:イソプロパノール、254nm、tmajor=11.292分、tminor=15.236分)により立証した。
【０２３６】
【化４６】
2021530427.tif 000067
【０２３７】
(S)-5-(ナフタレン-2-イルオキシ)フラン-2(5H)-オン(37):既知の文献手順(Trost,B. M. and Toste,F. D. J. Am. Chem. Soc. 2003、125、3090)に従って合成した。分光学的データは、上で調製したR-エナンチオマーと一致した。エナンチオ純度を、キラルカラムを使用するHPLC分析(Chiralpak AD-H、22℃、1.0mL/分、90:10のヘキサン:イソプロパノール、254nm、tminor=11.648分、tmajor=15.663分)により立証した。
【０２３８】
ディールス-アルダー付加環化最適化
ディールス-アルダー付加環化最適化のための一般手順:所望のラクトン(0.25mmol、1.00当量)を火炎乾燥した1ドラムシンチレーションバイアルに、乾燥N2の雰囲気下で添加した。トルエン(1.00mL)を反応容器に、続いて、2-トリメチルシロキシ-1,3-ブタジエン(下の表に示されているとおりの当量)を添加した。シンチレーションバイアルをスクリューキャップで密閉し、16時間、100℃に加熱した。
【０２３９】
23℃に冷却したら、溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣をTHF(575ml)に入れた。HCl(575ml、1M、水溶液)を添加し、二相の混合物を30分間激しく撹拌した。反応の完了時に、相を分離し、水層をEtOAc(3×1mL)で抽出した。合わせた抽出物をブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥し、濾過し、濃縮した。1,3,5-トリメトキシベンゼンを内標準として添加し、各反応の収率を決定した。
【０２４０】
【化４７】
2021530427.tif 000068
【０２４１】
【表３】
2021530427.tif 000069
【０２４２】
a較正内標準を用いて粗製の反応混合物の1H NMR分析により決定された位置異性比(rr)。bキラルカラムを用いるHPLC分析により決定されたエナンチオ特異性。*報告結果は再結晶化後のものである。
【０２４３】
代替の合成経路
【０２４４】
【化４８】
2021530427.tif 000070
【０２４５】
(3R,3aR,7aS)-3-(ナフタレン-2-イルオキシ)テトラヒドロイソベンゾフラン-1,5(3H,4H)-ジオン(40):(R)-5-(ナフタレン-2-イルオキシ)フラン-2(5H)-オン36(2.47g、10.9mmol、1.00当量)を火炎乾燥した容器に添加し、雰囲気をN2でパージした。PhMe(8.67mL)を、続いて、2-トリメチルシロキシ-1,3-ブタジエン38(4.73mL、27.2mmol、2.50当量)を添加した。圧力容器をスクリューキャップで密閉し、混合物を終夜120℃に加熱した。冷却したら、溶媒を減圧下で除去し、残渣をTHF(25mL)に入れた。HCl(25mL、1M水溶液)を添加し、得られた混合物を30分間激しく撹拌した。次いで、混合物を分液漏斗に移し、相を分離した。水相をEt2O(3×25mL)で抽出し、合わせた抽出物を初めにNaHCO3(15mL、飽和水溶液)で、次いで、ブライン(20mL)で洗浄した。有機相をMgSO4上で乾燥し、濾過し、位置異性体の9:1混合物としての粗製の化合物に濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー(10〜60%EtOAc:ヘキサン)、続いて、再結晶化により精製して、標題化合物1.35グラム(収率42%、94:6er)を白色の固体として得た。Rf=0.23(60%Et2O:ヘキサン)。融点=143〜145℃。IR(膜)3430(w)、3060(m)、2960(m)、2253(w)、1788(s)、1716(s)、1632(m)、1600(m)、1511(m)、1468(m)、1391(m)、1366(m)、1347(m)、1252(s)、1157(s)、1122(s)、1074(m) cm-1。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.80 (見かけ上d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.48 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.45 - 7.39 (m, 2H), 7.18 (dd, J = 8.9, 2.5 Hz, 1H), 5.85 (s, 1H), 3.42 - 3.36 (m, 1H), 3.28 - 3.21 (m, 1H), 2.73 (dd, J = 15.3, 6.7 Hz, 1H), 2.48 - 2.36 (m, 4H), 2.33 - 2.24 (m, 1H). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 207.9, 176.5, 153.7, 134.2, 130.3, 130.1, 127.8, 127.5, 127.0, 125.1, 118.6, 111.2, 103.7, 42.2, 39.6, 37.4, 36.8, 22.4. HRMS (ESI): C18H16O4Na1 [M+Na]+の計算値: 319.0941, 実測値: 319.0942.94:6erのエナンチオマー富化されたサンプルでの旋光性:[α]D25-201.6(c=1.00、CHCl3)。エナンチオマー純度を、キラルカラムを使用するHPLC分析(Chiralpak AD-Hカラム、22℃、1.0mL/分、90:10のヘキサン:イソプロパノール、254nm、tminor=39.708分、tmajor=59.605分)により立証した。絶対立体化学はX線回折を介して明確に決定した。
【０２４６】
【化４９】
2021530427.tif 000071
【０２４７】
(3R,3aR,5S,7aS)-5-ヒドロキシ-5-(1-メチルシクロヘキシル)-3-(ナフタレン-2-イルオキシ)ヘキサヒドロイソベンゾフラン-1(3H)-オン(41):Zno粉末(1.38g、21.1mmol、25.0当量)及びLiCl(179mg、4.22mmol、5.00当量)を火炎乾燥したRBフラスコに添加し、3サイクルで高真空下で火炎乾燥し、室温に冷却した。最後に冷却したら、THF(11.7mL)を添加し、得られた不均一な溶液を激しく撹拌した。1,2-ジブロモエタン(73.0mL、0.84mmol、1.00当量)を添加し、穏やかな還流を開始させるために溶液をヒートガンで加熱した。次いで、溶液を0℃に冷却し、ケトラクトン40(250mg、0.84mmol、1.00当量)をTHF(1.50mL)中の溶液として添加した。3-クロロ-1-メチルシクロヘキサ-1-エン(Machacek, M. R.;Romeo, E. T.;Kattar, S. D.;Christopher, M.;Altman, M. D.;Northrup, A. B.;Ellis, J. M.;O'Boyle, B.;Donofrio, A.;Grimm, J.;Reutershan, M. H.;Childers, K. K.;Otte, R. D.;Cash, B.;Ducharme, Y.;Haidle, A. M.;Spencer, K.;Vitharana, D.;Wu, L.;Zhang, L.;Zhang, P.;Beaulieu, C.;Guay, D. WO2014/48065 A1、2014年4月3日)(990mL、7.59mmol、9.00当量)をシリンジポンプを介して、THF(2.40mL)中の溶液として5時間かけて添加した。反応物を添加の間に室温に加温し、終夜撹拌した。反応が完了したら、混合物をNH4Cl(飽和水溶液)でクエンチし、EtOAc(3×10mL)で抽出した。合わせた抽出物をブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥し、濾過し、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー(10〜90%EtOAc:ヘキサン)により精製して、ホモアリルアルコール152mg(収率46%)をエピマーの分離不可能な混合物として得た。加えて、出発物質52.5mg(回収率21%)を単離し、反応条件に再び供することができた。Rf=0.38(30%EtOAc:Hex)。IR(膜)3499(br、w)、2933(s)、2863(m)、1784(s)、1658(w)、1631(m)、1600(m)、1512(m)、1467(m)、1443(m)、1252(m)、1213(m)、1177(m)、1139(m)、1121(m)、962(w)、927(w) cm-1。スペクトル複雑性により、積分は補正せず、両方のジアステレオマーについて列挙する。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.81 - 7.72 (m, 12H), 7.50 - 7.36 (m, 12H), 7.20 - 7.15 (m, 4H), 5.92 - 5.86 (m, 3H), 5.85 (s, 1H), 5.77 (d, J = 5.1 Hz, 3H), 5.61 - 5.54 (m, 3H), 3.26 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 3.21 - 3.10 (m, 4H), 3.05 (見かけ上dtd, J = 12.6, 6.5, 2.6 Hz, 3H), 2.54 - 2.47 (m, 1H), 2.40 - 2.34 (m, 1H), 2.28 (s, 1H), 2.21 - 1.62 (m, 36H), 1.40 (見かけ上dd, J = 17.3, 12.9 Hz, 8H), 1.34 - 1.19 (m, 15H), 1.00 (d, J = 4.0 Hz, 8H). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 177.88, 177.81, 176.7, 154.21, 154.19, 154.0, 134.3, 130.9, 130.8, 130.2, 130.1, 130.0, 129.85, 129.8, 127.81, 127.79, 127.42, 127.39, 126.9, 126.76, 126.74, 124.9, 124.73, 124.72, 118.83, 118.79, 118.6, 111.0, 110.91, 110.88, 104.0, 103.9, 103.1, 81.0, 74.4, 74.3, 42.6, 42.5, 39.7, 39.5, 39.4, 36.72, 36.69, 36.2, 31.1, 30.5, 30.2, 30.04, 30.02, 29.9, 27.9, 27.6, 26.8, 25.2, 22.2, 22.0, 19.68, 19.66, 18.7, 18.24, 18.20. HRMS (ESI): C25H28O4Na1 [M+Na]+の計算値: 415.1880, 実測値: 415.1881.
【０２４８】
上で調製したケトンをEtOAc(12.3mL)に入れ、Pd(OH)2/C(20重量%、108mg、0.40当量)を添加した。雰囲気をH2バルーンでパージし、混合物を終夜、室温で撹拌した。還元が完了したら、混合物をセライトに通して濾過し、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(30%EtOAc:Hex)により精製して、標題化合物84.5mg(収率55%)を白色の固体として得た。Rf=0.46(30%EtOAc:ヘキサン)。融点=156〜160℃。IR(膜) 3516(br、w) 2931(s)、2860(m)、1777(s)、1631(w)、1600(w)、1512(w)、1468(w)、1445(m) 1251(m)、1214(m)、1177(m)、1140(m)、1046(m)、922(s) cm-1.1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.80 - 7.73 (m, 3H), 7.46 (ddd, J = 8.1, 6.9, 1.0 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.39 (ddd, J = 8.0, 6.9, 1.0 Hz, 1H), 7.18 (dd, J = 8.9, 2.5 Hz, 1H), 5.77 (s, 1H), 3.71 (見かけ上t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.18 (見かけ上t, J = 6.4 Hz, 1H), 3.04 (見かけ上dt, J = 12.8, 6.4 Hz, 1H), 2.19 - 2.14 (m, 1H), 2.12 - 2.03 (m, 2H), 1.72 - 1.64 (m, 4H), 1.62 - 1.56 (m, 2H), 1.48 - 1.23 (m, 6H), 0.94 (s, 3H). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 177.8, 154.2, 134.3, 130.1, 129.9, 127.8, 127.4, 126.8, 124.7, 118.8, 110.9, 104.0, 75.1, 63.0, 40.2, 39.4, 36.7, 30.54, 30.45, 30.0, 29.9, 26.7, 26.3, 22.1, 18.3, 17.3. HRMS (ESI): C25H30O4Na1 [M+Na]+の計算値: 417.2036, 実測値: 417.2036.絶対立体化学を、X線回折を介して明確に決定した。
【０２４９】
【化５０】
2021530427.tif 000072
【０２５０】
(3R,3aR,7aS)-5-(1-メチルシクロヘキシル)-3-(ナフタレン-2-イルオキシ)-3a,6,7,7a-テトラヒドロイソベンゾフラン-1(3H)-オン及び(3R,3aR,7aS)-5-(1-メチルシクロヘキシル)-3-(ナフタレン-2-イルオキシ)-3a,4,7,7a-テトラヒドロイソベンゾフラン-1(3H)-オン(42)の混合物:第三級アルコール41(84.5mg、0.24mmol、1.00当量)を、火炎乾燥した反応フラスコに添加し、CH2Cl2(1.00mL)に溶解した。得られた溶液を0℃に冷却し、Et3N(150mL、1.07mmol、5.00当量)を添加した。SOCl2(62.5mL、0.86mmol、4.00当量)を滴下添加し、反応物を1時間、0℃で撹拌した。TLCにより判断して反応が完了したら、混合物を濃縮し、そのままシリカゲルクロマトグラフィー(0〜20%EtOAc:Hex)により精製して、除去された生成物38.0mg(収率47%)を淡黄色の油状物として得た。生成物の異性体を分離する試みは成功しなかった。Rf=0.65(30%EtOAc:ヘキサン)。IR(膜)2928(s)、2854(m)、1787(s)、1631(w)、1600(w)、1511(w)、1467(w)、1363(w)、1251(m)、1213(m)、1178(m)、1148(m)、1120(m)、972(m)、947(s)、845(m) cm-1。スペクトル複雑性により、積分は補正せず、すべてのジアステレオマーについて列挙する。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.82 - 7.74 (m, 10H), 7.49 - 7.43 (m, 7H), 7.39 (見かけ上ddt, J = 8.2, 6.8, 1.4 Hz, 3H), 7.21 (見かけ上ddd, J = 8.7, 6.1, 2.5 Hz, 3H), 7.10 (見かけ上ddd, J = 23.7, 8.9, 5.5 Hz, 4H), 5.84 (s, 2H), 5.82 (s, 1H), 5.65 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 5.56 - 5.53 (m, 2H), 5.45 (dq, J = 7.6, 3.1 Hz, 1H), 5.35 (s, 1H), 5.34 - 5.31 (m, 1H), 4.19 - 4.11 (m, 1H), 3.39 - 3.32 (m, 2H), 3.28 - 3.18 (m, 3H), 3.18 - 3.06 (m, 1H), 3.07 - 2.67 (m, 7H), 2.60 dddd, J = 17.1, 4.8, 3.0, 1.7 Hz, 1H), 2.43 (dddt, J = 17.1, 8.6, 4.1, 1.4 Hz, 1H), 2.34 (dd, J = 15.9, 6.8 Hz, 1H), 2.30 - 2.22 (m, 2H), 2.19 - 1.82 (m, 13H), 1.82 - 1.51 (m, 19H), 1.51 - 1.17 (m, 39H), 0.97 (s, 9H). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 178.7, 177.9, 154.1, 154.1, 134.2, 130.0, 129.73, 129.71, 127.66, 127.31, 127.28, 126.64, 126.62, 124.64, 124.61, 118.73, 118.69, 111.0, 110.9, 105.1, 104.4, 74.5, 74.3, 42.9, 40.8, 39.0, 38.4, 36.7, 36.6, 36.3, 35.96, 35.95, 35.9, 35.82, 35.80, 35.7, 26.4, 26.31, 26.29, 24.1, 23.1, 22.68, 22.67, 22.43, 22.36, 21.1, 20.4. HRMS (ESI): C25H28O3Na1 [M+Na]+の計算値: 399.1931, 実測値: 399.1934.
【０２５１】
【化５１】
2021530427.tif 000073
【０２５２】
(3aR,5S,7aS)-5-ヒドロキシ-5-(1-メチルシクロヘキサ-2-エン-1-イル)ヘキサヒドロイソベンゾフラン-1(3H)-オン(43):文献リポート(Trost, B. M.;Crawley, M. L. Chem. Eur. J. 2004、10、2237)から手順を適合させた。NaBH4(9.80mg、0.26mmol、2.50当量)をH2O(500mL)中のNaOH(20.4mg、0.51mmol、5.00当量)の撹拌溶液に、空気雰囲気下で添加した。5分間、室温で撹拌した後に、ナフチルオキシラクトン40a(40.3mg、0.1mmol、1.00当量)をMeOH(1.00mL)中の溶液として添加した。混合物を終夜、室温で撹拌し、次いで、HCl(濃100mL)でクエンチし、1時間撹拌した。反応物をCH2Cl2(2mL)及びH2O(2mL)で希釈し、層を分離した。有機相をブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥し、濾過し、濃縮した。粗製の残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(10〜50%EtOAc:ヘキサン)により精製して、標題化合物4.6mg(収率18%)をエピマーの分離不可能な混合物として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.87 (ddd, J = 10.1, 5.3, 2.0 Hz, 1H), 5.59 - 5.53 (m, 1H), 4.28 - 4.23 (m, 1H), 3.94 (dd, J = 8.9, 2.8 Hz, 1H), 2.78 (dq, J = 11.1, 5.7, 5.2 Hz, 1H), 2.68 - 2.63 (m, 1H), 2.13 - 2.06 (m, 1H), 2.06 - 1.80 (m, 6H), 1.70 (ddd, J = 14.7, 10.3, 3.6 Hz, 3H), 1.64 - 1.49 (m, 5H), 1.41 - 1.20 (m, 6H), 0.97 (d, J = 4.8 Hz, 2H). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 178.7, 178.61, 131.07, 131.02, 130.6, 74.88, 74.85, 72.1, 72.0, 42.6, 42.5, 39.1, 39.0, 33.33, 33.28, 32.5, 31.5, 
30.12, 30.05, 27.5, 26.6, 25.2, 22.1, 22.0, 19.68, 19.67, 18.7, 18.6.
【０２５３】
(実施例C)
代表的なグラシリンA誘導体の生物学的特性
この実施例では、本発明の代表的なグラシリンA誘導体の生物学的特性を記載する。
【０２５４】
材料
カルボキシメチルデキストラン(CM5)センサーチップ、ハンクス平衡塩溶液界面活性剤P20(HBS-EP)バッファー(pH7.4、0.01M 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンdsdエタンスルホン酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinedsdethanesulfonic acid、HEPES)、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%ポリソルベート)、アミンカップリングキット(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド(EDC)及びN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)はBiacoreAB社(Uppsala、Sweden)により供給された。パーコールはPharmacia社(Uppsala、Sweden)から得た。プラスチック製組織培養皿はFalcon社(Madrid、Spain)から購入した。Pan T細胞単離キット(ヒト)はMiltenyiBiotec社(Germany)から購入した。活性ヒトCypA全長タンパク質はAbcam社製であった。テトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM)、Thiol Tracker Violet、5-(及び6)-カルボキシ-2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート(カルボキシ-H2DCFDA)及びヒトIL-2 ELISAキットはThermo Fisher Scientific社(Madrid、Spain)から購入した。ウシ血清アルブミン(BSA)及び他の薬品は試薬グレードであり、Sigma-Aldrich社(Madrid、Spain)から購入した。ヒトTリンパ球精製で使用した生理食塩水(PBS)の組成(mM)は:137 NaCl、8.2 Na2HPO4、1.5 KH2PO4、3.2 KCl及び2 EDTAであった。Umbreit生理食塩水の組成(mM)は:NaCl 119、MgSO4 1.2、NaH2PO4 1.2、NaHCO3 22.85、KCl 5.94、CaCl2 1であった。グルコース(1g/L)を培地に添加した。pHを7.2〜7.3の間で平衡化した。薬物のストック溶解をジメチルスルホキシド(DMSO)で行った。
【０２５５】
細胞培養
ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞系、番号CRL 2266をAmerican Type Culture Collection(ATCC)から購入した。細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)、グルタマックス、100U/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地:Nutrient Mix F-12(DMEM/F-12)中で、37℃で、5%CO2及び95%空気の加湿雰囲気中で維持した。細胞を0.05%トリプシン/EDTAを使用して毎週分離した。すべての試薬がThermo Fisher Scientific社により供給された。
【０２５６】
ヒトTリンパ球の単離
以前に記載されたとおりに(Alfonso, A., Botana, M. A., Vieytes, M. R. and Botana, L. M. Cell Signal, 2001、13、819〜826)、末梢リンパ球を健康なボランティア由来の新鮮なヒトヘパリン化血液から単離した。血液を室温で予め平衡化させておいたEDTA(2mM)を含むPBSで同じ割合で希釈した。希釈血液4mLを等張性パーコール3mL(57.5%)に慎重に入れて、これら2つの層の混合を回避した。管を調製したら、3000rpmで25分、室温で遠心した。遠心後に、別々の相を得、リンパ球集団を含有する画分のみを収集し、PBS-EDTAで3回洗浄して、パーコールを1500rpmで、10分、室温で除去した。リンパ球純度は常に80%超であった。Pan T cell Isolation Kitを用いて、Tリンパ球をこの集団から精製した。これは、無傷のT細胞を単離するための間接的磁気標識システムである。T細胞純度は常に95%超であった。細胞純度の評価をフローサイトメトリーにより、FITCで標識されたヒトCD3に対するモノクローナル抗体を使用して行った。生存率(>95%)をトリパンブルー排除により決定した。純性なT細胞を、10%FBSを含むRPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640中で維持し、加湿5%CO2及び95%空気雰囲気中、37℃で、24プラスチック製組織培養皿にプレーティングした。
【０２５７】
細胞生存率アッセイ
MTT(3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイを使用して、Tリンパ球(Burton, J. D. Methods Mol. Med.、2005、110、69〜78)及びSH-SY5Y細胞におけるグラシリン誘導体の細胞傷害性、並びに以前に記載されたとおりに(Leiros, M., Alonso, E., Sanchez, J. A., Rateb, M. E., Ebel, R., Houssen, W. E., Jaspars, M., Alfonso, A.and Botana, L. M. ACS Chem. Neurosci.、2014、5、71〜80)、神経芽細胞腫細胞におけるH2O2に対するこれらの化合物の防御作用を決定した。ヒトTリンパ球を24ウェルプレートで、2.5×106細胞/mLの濃度で培養し、培養培地に添加された種々の化合物濃度(0.01、0.1、1及び10μM)に暴露した。ヒトT細胞を純粋な化合物の存在下で、37℃で、加湿5%CO2/95%空気雰囲気中で、48時間維持した。
【０２５８】
サポニンを細胞死対照として使用し、その吸光度を他のデータから差し引いた。化合物とのインキュベーション期間の後に、アッセイを行った。初めに、細胞を遠心した(1500rpm、5分、4℃)。ペレットをMTT(250μg/mL)を含む生理食塩水に再懸濁し、次いで、37℃で30分の間インキュベートした。過剰のMTTを生理食塩水で2回洗い流した後に、細胞をH2Oで分離し、1分間音波処理し、着色ホルマザン塩の吸光度を595nmで、分光光度計プレートリーダーで測定した。すべての実験を3回行った。
【０２５９】
SH-SY5Y細胞を96ウェルプレートに2.5×105細胞/mLの密度で播種し、24時間付着させた。初めに、細胞を10〜0.01μMの範囲の濃度の化合物のみで24時間処理して、それらの可能な細胞毒性作用を決定した。実験を3回実施した。神経保護実験のために、細胞を非毒性濃度(1μM→1nM)の化合物及び150μM H2O2で6時間処理した。簡単に述べると、細胞を生理食塩水で3回洗浄し、及び生理食塩バッファーに溶解したMTT200μL(500μg/mL)を各ウェルに添加した。37℃で1時間インキュベートした後に、細胞を5%のドデシル硫酸ナトリウムで分離した。
【０２６０】
ホルマザン結晶の吸光度を595nmで、分光光度計プレートリーダーで測定した。サポニンを死対照として使用し、その吸光度を他のデータから差し引いた。すべての実験を4回行った。
【０２６１】
結合実験:表面活性化、リガンド固定化及び結合
Biacore社(GE Healthcare、Uppsala、Sweden)製の、Control Software及びBIAevaluation Software version 3.0を備えたBiacore X SPRバイオセンサーを使用して、分子間の結合をチェックした。センサー表面活性化及びリガンド固定化を、5μL/分の流速及び25℃でHBS-EPを泳動バッファーとして使用することにより行った。CM5センサーチップを、Cyp A又はDをリガンドとして固定化する表面として使用した。CM5チップは、カルボキシメチル化デキストランのマトリックスと共有結合した金の薄層でコーティングされたガラススライドである。CM5チップを、アミンカップリングキットを用いて活性化させた。製造者指示に従って、EDC及びNHSの混合物(1:1、v/v)をセンサーチップ上に2分間施与した。活性化の後に、リガンドである、酢酸ナトリウム10mM中に溶解したpH4.5の100μg/mLの活性なヒトCypAタンパク質を添加して、CM5センサーチップ上に固定化した。最後に、エタノールアミン-HClを注入して、残りの活性エステルを不活性化し、非特異的結合を回避した。次に、分析物(陽性対照としてのCsA又は合成化合物)を添加して、それらと、CypAとの間の結合をチェックした。分析物を試験し、かつ相互作用を観察したら、個々の結合曲線を、分析物-CypA結合の反応速度定数、すなわち、観察された速度定数(Kobs)、会合速度定数(Kass)、解離速度定数(Kdiss)、及び反応速度平衡解離定数(KD)を決定することにより分析した。定義によると平衡では、Kdiss/Kass=KDである。擬一次会合速度定数Kobs(s-1)を各化合物濃度について、BiaEvaluationソフトウェア(BiaCore社、Uppsala、Sweden)の1:1 Langmuir会合モデルを使用することにより決定した。次いで、対応する濃度の各化合物に対するKobsの表示を行った。これらのプロットは、線形相関係数に従う。これらの表示の式から、Kass、M-1s-1、プロットの勾配、及びKdiss、s-1、プロットのインターセプトを得た。これら2つの値の範囲内で、各分析物-CypA結合についての反応速度平衡解離定数KDを得た。
【０２６２】
サンプル注入の持続期間は、流速10μL/分で2分であった。次に、HBS-EPバッファーフローにおける結合分子の解離を研究した。1Mグリシン-HClをpH2.5で添加して1分間おくことによって、次の注入の前に結合薬物をチップ表面から除去した。会合相を使用して、化合物-CypA又はD相互作用を定量化した。すべての実験を4回行った。
【０２６３】
インターロイキン2の放出
1×106細胞/mLの濃度のヒトTリンパ球を24ウェルプレートにプレーティングし、MTT試験により決定して細胞生存率の低下をもたらさない濃度のグラシリン誘導体で2時間事前処理した。次いで、細胞を50μg/mLのコンカナバリンA(Con A)で48時間刺激して、IL-2放出を誘導した。培養培地に放出されたIL-2の量を、ヒトIL-2 ELISAキットを使用して評価した。実験を4回実施した。
【０２６４】
ミトコンドリア膜電位の測定
ミトコンドリア膜電位(ΔΨm)をテトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM)プローブを使用して評価した。SH-SY5Y細胞を96ウェルプレートに2.5×105細胞/mLで播種した。24時間後に、細胞を種々の濃度(1μM→1nM)の化合物及び150μM H2O2で6時間処理した。次いで、細胞を生理食塩水で2回洗浄し、1μM TMRMを各ウェルに30分間、37℃で添加した。この時間の後に、細胞をDMSO及び50%のH2Oで可溶化した。蛍光を分光光度計プレートリーダー(励起535nm及び発光590nm)でモニターした。すべての実験を4回行った。
【０２６５】
細胞内ROSレベルの決定
活性酸素種(ROS)の細胞内レベルをカルボキシ-H2DCFDA(5-(及び-6)-カルボキシ-2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート)で決定した。この色素は細胞膜全体に散在し、細胞エステラーゼにより、カルボキシ-H2DCFH(非蛍光)に変換される。カルボキシ-H2DCFHがROSにより酸化されると、これは蛍光になる(Halliwell, B. and Whiteman, M. Br. J. Pharmacol.、2004、142、231〜255)。細胞を2.5×105細胞/mLの密度で96ウェルプレートに播種し、24時間付着させた。様々な濃度(1μM→1nM)の化合物及び150μM H2O2で6時間処理した後に、SH-SY5Y細胞を血清非含有培養培地で2回洗浄した。次いで、血清非含有培養培地に溶解したカルボキシ-H2DCFDA 20μMを各ウェルに添加し、細胞を1時間、37℃でインキュベートした。このインキュベーションの後に、蛍光色素を含む培地をPBSに置き換え、プレートを30分間、37℃でインキュベートした。蛍光を495nmの励起波長を用いて、527nmで読み取った。すべての実験を4回行った。
【０２６６】
グルタチオンアッセイ
グルタチオン(GSH)レベルを、細胞中の還元チオールと反応するThiol Tracker Violet色素を使用して決定した。還元グルタチオンは、細胞内遊離チオールの大部分に相当するので、このプローブを使用して、細胞におけるそのレベルを推定することができる。測定を、製造者プロトコルに従って行った。細胞を2.5×105細胞/mLで96ウェルプレートに24時間播種し、様々な濃度(1μM→1nM)の化合物及び150μM H2O2で処理した。6時間後に、SH-SY5Y細胞をPBSで2回洗浄し、事前加温したThiol Tracker Violet色素100μL (10μM)を30分間、37℃で負荷した。蛍光を励起404nm及び526nmでの発光で測定した。すべての実験を4回行った。
【０２６７】
ミトコンドリア膜透過性遷移孔(mPTP)測定
化合物によるmPTPの遮断を、MitoProbe Transition Assay Kitを製造者指示に従って用いて決定した。簡単に述べると、SH-SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞を事前加温したPBS/Ca+2バッファーに、1×106細胞/mLの最終濃度で再懸濁した。細胞に0.01μM Calcein-AMを負荷し、37℃で15分間インキュベートした。次いで、0.4mM CoCl2及び選択された濃度の化合物を添加し、15分間、37℃でインキュベートした。0.2μMのシクロスポリンA(CsA)を陽性対照として使用した。このインキュベーション後に、細胞を遠心し、PBS 100μLに再懸濁した。分析直前に、1mM tert-ブチルヒドロペルオキシド(TBHP)をサンプルに添加して、孔の開放を誘導した。蛍光強度を励起488nm及び発光波長517nmでフローサイトメトリーにより、ImageStreamMKII(Amnis Corporation社、Merck-Millipore社)及びINSPIRERソフトウェアを使用して測定した。10,000イベントの蛍光をIDEASR Application vs 6.0(Amnis Corporation社、Merck-Millipore社)で分析した。実験を4回実施した。
【０２６８】
CypD酵素阻害アッセイ
化合物のペプチジル-プロリルcis-transイソメラーゼ(PPIアーゼ)活性の阻害を、キモトリプシンによりN-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-pニトロアニリドの加水分解の割合を追跡することにより決定した。CsAを陽性対照として使用した。アッセイを、すでに記載されたとおりに(Yan, W., Qing, J., Mei, H., Nong, J., Huang, J., Zhu, J., Jiang, H., Liu, L., Zhang, L. and Li, J. Bioorg. Med. Chem. Lett.、2015、25、5682〜5686)、ただしわずかに変更して行った。アッセイバッファー(20mMトリス-HCl、50mM NaCl、pH7.8)、CypD(1nM)及び0.001〜10μMの範囲の濃度の化合物を4℃で1時間事前冷却した。その時間の後に、1mM HCl中0.4mg/mLのキモトリプシンを各ウェルに添加した。反応を、ペプチド(THF中500mM LiCl中の0.1mg/mL)を添加することにより開始した。380nmでの吸光度を5分間、30秒ごとに分光光度計プレートリーダーでモニターした。加水分解のブランクの割合(CypDの非存在下)を酵素の存在下での速度から差し引いた。50%阻害濃度(IC50)を、データをGraphPad Prism 5.0ソフトウェアのlog(阻害薬)vs.応答モデルとフィッティングすることにより計算した。すべての実験を4回行った。
【０２６９】
統計的分析
データを平均±SEMとして表す。差を、ダネット事後分析と共に一元ANOVAにより評価した。統計学的有意性をp<0.05で判断した。
【０２７０】
例示的実施形態を例示及び説明してきたが、本発明の意図及び範囲から逸脱することなく、それらを様々に変化させることができることは分かるであろう。
【０２７１】
独占的所有又は特権が請求される本発明の実施形態は、特許請求の範囲に記載のとおりに定義される。
【図１Ａ】
2021530427.tif 000084
【図１Ｂ】
2021530427.tif 000085
【図１Ｃ】
2021530427.tif 000086
【図１Ｄ】
2021530427.tif 000087
【図２】
2021530427.tif 000088
【図３】
2021530427.tif 000089
【図４Ａ】
2021530427.tif 000090
【図４Ｂ】
2021530427.tif 000091
【図４Ｃ】
2021530427.tif 000092
【図４Ｄ】
2021530427.tif 000093
【図５Ａ】
2021530427.tif 000094
【図５Ｂ】
2021530427.tif 000095
【図５Ｃ】
2021530427.tif 000096
【図５Ｄ】
2021530427.tif 000097
【図６Ａ】
2021530427.tif 000098
【図６Ｂ】
2021530427.tif 000099
【図６Ｃ】
2021530427.tif 000100
【図６Ｄ】
2021530427.tif 000101
【図６Ｅ】
2021530427.tif 000102
【図６Ｆ】
2021530427.tif 000103
【図７Ａ】
2021530427.tif 000104
【図７Ｂ】
2021530427.tif 000105
【図７Ｃ】
2021530427.tif 000106
【図７Ｄ】
2021530427.tif 000107
【図８Ａ】
2021530427.tif 000108
【図８Ｂ】
2021530427.tif 000109
【図８Ｃ】
2021530427.tif 000110
【図８Ｄ】
2021530427.tif 000111
【国際調査報告】
2021530427.tif 000112