(57)【要約】【課題】本発明は、脱細胞化されたウォートンジェリーマトリックス（ＤＷＪＭ）から得られたバイオエンジニアリングされた細胞外マトリックスモデル、及びそれを作成及び使用する方法を提供する。【解決手段】脱細胞化後、ＤＷＪＭを型で均質化、凍結、及び凍結乾燥して、実質的に均一な細孔径、細孔分布、及びマトリックス成分分布を有する成形足場を形成し、任意のサイズにトリミング及び成形できる。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、培養細胞の幹細胞の性質を維持することができる。これは、がん、特にがん幹細胞集団を標的とする化学療法薬のスクリーニングに有用である。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、骨造血ニッチと同様のマトリックス成分を備えており、造血幹細胞の増殖と維持、及び骨再生と修復の促進に有用である。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
約２００μｍ〜約３５０μｍの範囲のメジアン細孔径を有する成形脱細胞化ウォートンジェリーマトリックス（ＤＷＪＭ）を含む多孔質マトリックス。
【請求項２】
前記メジアン細孔径が、約２３０μｍ〜約３３０μｍの範囲である、請求項１に記載の多孔質マトリックス。
【請求項３】
前記メジアン細孔径が、約２３５μｍ、約２７５μｍ、約２９０μｍ、約３００μｍ、約３１０μｍ、約３２０μｍ、または約３３０μｍである、請求項１に記載の多孔質マトリックス。
【請求項４】
前記細孔径分布が、前記メジアン細孔径の５０％または１７％以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多孔質マトリックス。
【請求項５】
約８０％〜９５％の体積多孔度を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多孔質マトリックス。
【請求項６】
コラーゲン、フィブロネクチン、テネイシンＣ（ＴＮ−Ｃ）、フィブリリン、ルミカン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、バーシカン、フィブリノーゲンガンマ鎖、ミオシン−９、ミオシン−１０、パラディン、フィラミン、ビンキュリン、モエシン、ペリオスチン、ラミニン、タリン−１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるマトリックス成分の均一な分布をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔質マトリックス。
【請求項７】
約３０〜３５のフィブリノーゲンガンマ鎖の存在比を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の多孔質マトリックス。
【請求項８】
約１０〜１５のミオシン−９の存在比を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多孔質マトリックス。
【請求項９】
約１０〜１５のミオシン−１０存在比を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の多孔質マトリックス。
【請求項１０】
前記マトリックスが、細胞培養ウェルに適合するサイズのディスク形状に成形またはトリミングされている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の多孔質マトリックス。
【請求項１１】
播種された細胞の少なくとも１つの集団をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の多孔質マトリックス。
【請求項１２】
少なくとも１つの治療剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の多孔質マトリックス。
【請求項１３】
バイオエンジニアリングされたマトリックスを作製する方法であって、
脱細胞化ウォートンジェリーマトリックス（ＤＷＪＭ）を液体媒体に浸漬するステップと；
前記浸漬されたＤＷＪＭにおいて１回または複数回の均質化サイクルを実行して、均質化されたＤＷＪＭを形成するステップであって、各均質化サイクルが、均質化期間と休止期間を含む、形成するステップと；
前記均質化されたＤＷＪＭを成形するステップと；
前記均質化したＤＷＪＭを凍結するステップと；
前記凍結されたＤＷＪＭを真空下で凍結乾燥して、バイオエンジニアリングされたマトリックスを形成するステップと、
を含む前記方法。
【請求項１４】
前記液体媒体が蒸留水である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記１回または複数回の均質化サイクルが、氷上に保持された浸漬されたＤＷＪＭで実行される、請求項１３〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
各均質化サイクルが、約３０秒の均質化期間と約１２０秒の休止期間とを含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
各均質化期間が、前記浸漬されたＤＷＪＭ内の分散ミキサーの作動を含む、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも３０回の均質化サイクルが実行される、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記均質化されたＤＷＪＭが３Ｄ印刷を使用して成形される、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記均質化されたＤＷＪＭが、型を使用して成形される、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記凍結ステップが約−８０℃〜−１８０℃で実行される、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記凍結乾燥ステップが、約０．０５ｍＢａｒで約−２０℃〜−６０℃で実行される、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
対象における骨再生を促進する方法であって、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多孔質マトリックスを提供するステップと；
前記マトリックスに１つまたは複数の骨形成増殖因子及び血管形成増殖因子をロードするステップと；
前記多孔質マトリックスを前記対象の骨欠損に埋め込むステップと、
を含む前記方法。
【請求項２４】
造血幹細胞を培養する方法であって、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多孔質マトリックス上にＣＤ３４＋細胞を播種するステップを含み、
前記細胞が、前記多孔質マトリックス上で培養されている間、静止状態を維持する、
前記方法。
【請求項２５】
前記播種されたＣＤ３４＋細胞が巨核球系統バイアスを有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多孔質マトリックスと；前記多孔質に埋め込まれたがん細胞の集団と、を含むがんモデル。
【請求項２７】
前記がん細胞の集団ががん幹細胞の特性を示す、請求項２６に記載のがんモデル。
【請求項２８】
前記がん細胞の集団が、白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳癌、前立腺癌、子宮内膜癌、膀胱癌、脳癌、子宮頸癌、肺癌、黒色腫、子宮頸癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵臓癌、食道癌、腎臓癌、甲状腺癌、肝臓癌、子宮癌、軟部肉腫、骨癌、及び胃癌からなる群から選択される、請求項２６〜２７のいずれか１項に記載のがんモデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／６５０，５５１号の優先権を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ウォートンジェリーは、臍帯血管の周囲のムコイド状の多孔質結合組織である。ウォートンジェリーには、多くのタンパク質、グリコサミノグリカン、及び増殖因子が含まれているため、天然の足場材料として適している。脱細胞化されたウォートンジェリーは、細胞を含まない多孔性、生分解性、及び生体適合性の足場を作り、その細胞外マトリックスタンパク質を保持する。しかしながら、脱細胞化ウォートンジェリーマトリックス（ＤＷＪＭ）の供給源は臍帯であるため、ＤＷＪＭのサイズ、厚さ、組成、及びタンパク質の分布は、各臍帯間で、さらには各臍帯の異なる領域間でも大きく異なり、一貫した方法で使用することを困難にする。
【０００３】
当該技術分野においては、脱細胞化ウォートンジェリーマトリックス構築物を改善する必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たす。
【発明の概要】
【０００４】
一態様では、本発明は、約２００μｍ〜約３５０μｍの範囲のメジアン細孔径を有する成形脱細胞化ウォートンジェリーマトリックス（ＤＷＪＭ）を含む多孔質マトリックスを提供する。
【０００５】
一実施形態では、メジアン細孔径は、約２３０μｍ〜約３３０μｍの範囲である。一実施形態では、メジアン細孔径は、約２３５μｍ、約２７５μｍ、約２９０μｍ、約３００μｍ、約３１０μｍ、約３２０μｍ、または約３３０μｍである。一実施形態では、細孔径分布は、メジアン細孔径の５０％または１７％以下である。一実施形態では、マトリックスは、約８０％〜９５％の体積多孔度を有する。
【０００６】
一実施形態では、マトリックスは、コラーゲン、フィブロネクチン、テネイシンＣ（ＴＮ−Ｃ）、フィブリリン、ルミカン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、バーシカン、フィブリノーゲンガンマ鎖、ミオシン−９、ミオシン−１０、パラディン、フィラミン、ビンキュリン、モエシン、ペリオスチン、ラミニン、タリン−１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるマトリックス成分の均一な分布をさらに含む。
【０００７】
一実施形態では、マトリックスは、約３０〜３５のフィブリノーゲンガンマ鎖の存在比を有する。一実施形態では、マトリックスは、約１０〜１５のミオシン−９の存在比を有する。一実施形態では、マトリックスは、約１０〜１５のミオシン−１０の存在比を有する。
【０００８】
一実施形態では、マトリックスは、細胞培養ウェルに適合するサイズのディスク形状に成形またはトリミングされる。一実施形態では、マトリックスは、播種された細胞の少なくとも１つの集団をさらに含む。一実施形態では、マトリックスは、少なくとも１つの治療薬をさらに含む。
【０００９】
別の態様では、本発明は、バイオエンジニアリングされたマトリックスを作製する方法であって、脱細胞化ウォートンジェリーマトリックス（ＤＷＪＭ）を液体媒体に浸漬するステップと；浸漬されたＤＷＪＭにおいて１回または複数回の均質化サイクルを実行して、均質化されたＤＷＪＭを形成するステップであって、各均質化サイクルが、均質化期間と休止期間を含む、形成するステップと；均質化されたＤＷＪＭを成形するステップと；均質化したＤＷＪＭを凍結するステップと；凍結されたＤＷＪＭを真空下で凍結乾燥して、バイオエンジニアリングされたマトリックスを形成するステップと、を含む方法を提供する。
【００１０】
一実施形態では、液体媒体は蒸留水である。一実施形態では、１回または複数回の均質化サイクルは、氷上に保持された浸漬されたＤＷＪＭで実行される。一実施形態では、各均質化サイクルは、約３０秒の均質化期間と約１２０秒の休止期間を含む。一実施形態では、各均質化期間は、浸漬されたＤＷＪＭ内の分散ミキサーの作動を含む。一実施形態では、少なくとも３０回の均質化サイクルが実行される。一実施形態では、均質化されたＤＷＪＭは、３Ｄ印刷を使用して成形される。一実施形態では、均質化されたＤＷＪＭは、型を使用して成形される。一実施形態では、凍結するステップは、約−８０℃〜−１８０℃で実行される。一実施形態では、凍結乾燥するステップは、約０．０５ｍＢａｒで約−２０℃〜−６０℃で実行される。
【００１１】
別の態様では、本発明は、対象における骨再生を促進する方法であって、本発明の多孔質マトリックスを提供するステップと；マトリックスに１つまたは複数の骨形成増殖因子及び血管形成増殖因子をロードするステップと；多孔質マトリックスを対象の骨欠損に埋め込むステップとを含む、方法が提供される。
【００１２】
別の態様では、本発明は、造血幹細胞を培養する方法であって、本発明の多孔質マトリックス上にＣＤ３４＋細胞を播種するステップを含み、細胞は、多孔質マトリックス上で培養されている間、静止状態を維持する、方法を提供する。一実施形態では、播種されたＣＤ３４＋細胞は、巨核球系統バイアスを有する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、本発明の多孔質マトリックスと、多孔質マトリックスに埋め込まれたがん細胞の集団とを含む癌モデルを提供する。一実施形態では、がん細胞の集団は、がん幹細胞の特徴を示す。一実施形態では、がん細胞の集団は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳癌、前立腺癌、子宮内膜癌、膀胱癌、脳癌、子宮頸癌、肺癌、黒色腫、子宮頸癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵臓癌、食道癌、腎臓癌、甲状腺癌、肝臓癌、子宮癌、軟部肉腫、骨癌、及び胃癌からなる群から選択される。
【００１４】
以下の本発明の実施形態の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことにより、よりよく理解されるであろう。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の正確な配置及び手段に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】以前に公開された、脱細胞化されたウォートンジェリーマトリックス（ＤＷＪＭ）の特徴を描写する。図１Ａは、ＤＷＪＭの代表的な断片である。図１Ｂは、ＤＷＪＭの切片のＨ＆Ｅ染色である。図１Ｃは、ＤＷＪＭのＳＥＭ画像である。図１Ｄは、ＤＷＪＭのＴＥＭ画像である。
【図２】バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭを示す。図２Ａは、凍結乾燥後のバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭシートである。図２Ｂは、凍結乾燥後のバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭディスクのＳＥＭ画像（左）である。中央のパネルの細孔径（３１〜７９μｍ）と、白血病患者の初代細胞のＤＷＪＭファイバーへの接着（右）に注目されたい。
【図３】バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの特性評価の結果を示す。図３Ａは、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの切片のＳＥＭ画像である。図３Ｂは、特性評価のために３つの領域に分割された、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの切片である。図３Ｃは、各領域の多孔度及び細孔径の特性評価の結果であり、その実質的な均一性を実証する。
【図４】図３Ｂに示されるバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの切片の各領域における細孔径分布を特性評価した結果を示すグラフである。
【図５】図３Ｂに示されるバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの切片の３つ全ての領域にわたる平均細孔径分布を示すグラフである。
【図６Ａ】質量分析によって決定された、ＤＷＪＭの切片と例示的なバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの同等のサイズの切片との間のより豊富なマトリックス成分の存在比を示すチャートである。
【図６Ｂ】質量分析によって決定された、ＤＷＪＭの切片と例示的なバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの同等のサイズの切片との間のより豊富なマトリックス成分の存在比を示すチャートである。
【図６Ｃ】質量分析によって決定された、ＤＷＪＭの切片と例示的なバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの同等のサイズの切片との間のより豊富なマトリックス成分の存在比を示すチャートである。
【図６Ｄ】質量分析によって決定された、ＤＷＪＭの切片と例示的なバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの同等のサイズの切片との間のより豊富なマトリックス成分の存在比を示すチャートである。
【図７Ａ】質量分析によって決定された、ＤＷＪＭの切片と例示的なバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの同等のサイズの切片との間のより少ないマトリックス成分の存在比を示すチャートである。
【図７Ｂ】質量分析によって決定された、ＤＷＪＭの切片と例示的なバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの同等のサイズの切片との間のより少ないマトリックス成分の存在比を示すチャートである。
【図８】バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭを製造するための例示的な方法のステップを列挙するフローチャートである。
【図９】懸濁状態の初代白血病細胞（左）とＤＷＪＭ内の接着状態の白血病細胞（右）を示す図である。解糖を誘発する予測される細胞シグナルは接着状態で示される。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、脱細胞化されたウォートンジェリーマトリックス（ＤＷＪＭ）から得られたバイオエンジニアリングされた細胞外マトリックスモデル、及びそれを作成及び使用する方法を提供する。脱細胞化後、ＤＷＪＭを型で均質化、凍結、及び凍結乾燥して、実質的に均一な細孔径、細孔分布、及びマトリックス成分分布を有する成形足場を形成し、任意のサイズにトリミング及び成形できる。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、培養細胞の幹細胞の性質を維持する。これは、がん、特にがん幹細胞集団を標的とする化学療法薬のスクリーニングに有用である。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、骨造血ニッチと同様のマトリックス成分を備えており、造血幹細胞の増殖と維持、及び骨再生と修復の促進に有用である。
【００１７】
定義
本発明の図及び説明は、本発明の明確な理解に関連する要素を示すために簡略化されているが、明確にするために、当該技術分野で通常見られる他の多くの要素を除外していることを理解されたい。当業者は、他の要素及び／またはステップが、本発明の実施の際に、望ましい及び／または必要であることを理解できる。しかしながら、そのような要素及びステップは当該技術分野で周知であり、またそれらは本発明のより良い理解を促さないため、そのような要素及びステップの説明は本明細書では提供されない。本明細書の開示は、当業者に知られているそのような要素及び方法に対するそのような全ての変形及び修正を対象とする。
【００１８】
いずこかで定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されているものと類似または同等の任意の方法及び物質は、本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法及び物質が記載される。
【００１９】
本明細書で使用されるとき、以下の各用語は、このセクションでそれに関連する意味を有する。
【００２０】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法的な対象の、１または１を超えるもの（すなわち、少なくとも１）を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
【００２１】
「約」は、量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合に本明細書で使用されるとき、指定された値からの±２０％、±１０％、±５％、±１％、及び±０．１％の変動を、そのような変動が適切であるときに包含することを意味する。
【００２２】
「細胞」及び「細胞の集団」という用語は互換可能に使用され、複数の細胞、すなわち１つより多い細胞を指す。集団は、１つの細胞型を含む純粋な集団であり得る。代替的に、集団は１つより多い細胞型を含み得る。本発明において、細胞集団が含み得る細胞型の数に制限はない。
【００２３】
「分化した」は、細胞が完全に発達し、生物学的特殊化及び／または特定の環境への適応及び／または機能を示すように、最終成熟状態を達成した細胞を指すために本明細書で使用される。典型的には、分化した細胞は、その細胞における分化関連タンパク質をコードする遺伝子の発現を特徴とする。細胞が「分化している」と言われる場合、その用語が本明細書で使用されているように、細胞は分化している過程にある。
【００２４】
「分化培地」は、培地中でインキュベートされたときに完全に分化しないような幹細胞、組織由来成体間質細胞、または他のそのような前駆細胞が、分化した細胞の特性の一部または全てを備えた細胞に発達するようにする、添加剤を含むかまたは添加剤の欠如を伴う細胞増殖培地を指すために本明細書で使用される。
【００２５】
「由来する」という用語は、本明細書では、特定の供給源に由来することを意味するために使用される。
【００２６】
「増殖性」は、本明細書では、細胞が増殖する能力、例えば、数において増加する能力、または細胞集団の場合は集団で細胞倍加するする能力を指すために使用される。
【００２７】
化合物の「有効量」または「治療有効量」は、化合物が投与される対象に有益な効果を提供するのに十分な化合物の量である。送達ビヒクルの「有効量」は、化合物を効果的に結合または送達するのに十分な量である。
【００２８】
「細胞外マトリックス」または「マトリックス」は、フィーダー細胞によって合成された細胞外マトリックスによって提供されるものと実質的に同じ細胞増殖を支持するための条件を提供する１つまたは複数の物質を指す。マトリックスは、基板上に提供されてもよい。代替的に、マトリックスを含む成分（複数可）は、溶液で提供されてもよい。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、「増殖因子」は、ピコグラム／ｍｌ〜ミリグラム／ｍｌレベルの濃度での、成長ホルモン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン７、マクロファージコロニー刺激因子、ｃ−ｋｉｔリガンド／幹細胞因子、オステオプロテゲリンリガンド、インスリン、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経増殖因子、毛様体神経栄養因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ−ベータ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及び骨形成タンパク質を含むがこれらに限定されない非限定的因子を意図する。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、「増殖培地」という用語は、細胞の増殖を促進する培養培地を指すことを意味する。増殖培地は一般的に動物血清を含む。場合によっては、増殖培地は動物血清を含まなくてもよい。
【００３１】
「単離された細胞」は、他の成分から分離された細胞、及び／または組織または哺乳類の単離された細胞に自然に付随する細胞を指す。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「多能性の」または「多能性」という用語は、幹細胞が複数の細胞型に分化する能力を指すことを意味する。
【００３３】
本明細書中で使用されるとき、「多能性細胞」は、少なくとも２つの異なる（遺伝子型的に及び／または表現型的に）さらに分化した子孫細胞を生じ得る、より分化されていない細胞を定義する。
【００３４】
「前駆細胞」、「前駆細胞」、及び「幹細胞」という用語は、当該技術分野及び本明細書で互換可能に使用され、無制限の数の有糸分裂能力を潜在的に可能にしてそれ自体を再生するか、または所望の細胞型に分化する前駆細胞を生成する、多能性または系統非拘束の前駆細胞のいずれかを指す。多能性幹細胞とは異なり、系統に拘束された前駆細胞は、一般に、表現型が互いに異なる多数の細胞型を生じさせることができないと考えられている。代わりに、前駆細胞は、１つまたは場合によっては２つの系統拘束の細胞型を生じさせる。
【００３５】
「増殖」は、本明細書では、特に細胞の、同様の形態の複製または増殖を指すために使用される。すなわち、増殖は、より多くの数の細胞の産生を包含し、とりわけ、細胞の数を単に数えること、細胞への３Ｈ−チミジンの取り込みを測定することなどによって、測定することができる。
【００３６】
「細胞周期の進行または細胞周期を介する」は、有糸分裂及び／または減数分裂を準備する、及び／またはそれに入るプロセスを指すために本明細書で使用される。細胞周期を介する進行には、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、及びＭ期を介する進行が含まれる。
【００３７】
「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書では互換可能に使用され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕのいずれであっても、本明細書に記載の方法を受け入れる任意の動物またはその細胞を指す。ある特定の非限定的な実施形態では、患者、対象、または個体は、ヒトである。
【００３８】
本開示全体を通して、本発明の様々な態様を範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は、単に便宜及び簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の全ての可能性のある部分範囲及び個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などに加えて、その範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、６、ならびにそれらの間の全体及び部分的な増分などの具体的に開示された部分範囲があるとみなされる。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【００３９】
バイオエンジニアリングされた脱細胞化ウォートンジェリーマトリックス
本発明は、バイオエンジニアリングされた脱細胞化ウォートンジェリーマトリックス（ＤＷＪＭ）に関する。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、ＤＷＪＭの３Ｄ構造と細胞外マトリックス組成を保持し、細孔径、細孔分布、及びマトリックス成分分布の実質的な均一性が強化されている。
【００４０】
ウォートンジェリーは、臍帯の血管を主に支える臍帯のゼラチン状の結合組織である（図１Ａ〜図１Ｄ）。コラーゲン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、及び硫酸化プロテオグリカンなどの細胞外マトリックス成分が豊富に含まれており、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−β１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）などのいくつかの増殖因子も含まれている。
【００４１】
本発明のバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、臍帯から分離され、脱細胞化され、均質化され、型内で凍結乾燥されて実質的に均一な３Ｄマトリックス構造を形成したウォートンジェリーを含む。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、使用する型のサイズと形状によって、または既存のバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭをトリミングすることによって決定できる適切なサイズまたは形状を有し得る。例えば、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、最初にシートとして形成され、生検パンチなどを用いて、より小さな断片（図２Ａ）にトリミングまたは切断されるか、またはディスク（図２Ｂ）に成形され得る。ディスク形状を有するバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、９６ウェルプレートなどのマルチウェルプレートのウェル内に適合するサイズであり、ハイスループットスクリーン及びその他の研究をサポートすることができる。
【００４２】
バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、任意の適切な細孔径を有し得る。例えば、細孔径の直径は、約１０μｍ〜１０００μｍの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、約２００μｍ〜３５０μｍのメジアン細孔径を有する。いくつかの実施形態では、メジアン細孔径は、約２３０μｍ〜３３０μｍの間である。いくつかの実施形態では、メジアン細孔径は、約２３５μｍ、約２７５μｍ、約２９０μｍ、約３００μｍ、約３１０μｍ、約３２０μｍ、または約３３０μｍである。細孔径分布の均一性は、メジアン細孔径のパーセント内の偏差として説明できる。様々な実施形態では、細孔径分布は、メジアン細孔径の５０％以下の偏差である。いくつかの実施形態では、細孔径分布は、メジアン細孔径の１７％以下の偏差である。
【００４３】
バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、任意の適切な体積多孔度を有し得る。体積多孔度は、材料内の空隙の尺度として定義される。例えば、２つの異なるバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは同じ体積サイズと同じ細孔径の範囲を有することができるが、異なる体積多孔度を有し、ここで、より大きい体積細孔度を有するバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭはより多数の細孔を持ち、各細孔間のマトリックス材料がより少なく、バイオエンジニアリングされた体積多孔度が低いＤＷＪＭは、より少ない数の細孔を含み、各細孔の間にマトリックス材料がより多い。様々な実施形態では、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、約８０％〜９５％の体積多孔度を有することができる。
【００４４】
上述のように、ウォートンジェリーは臍帯から採取されるため、各臍帯間で、さらには各臍帯の異なる領域間でさえその組成が変動する。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、コラーゲン、フィブロネクチン、テネイシンＣ（ＴＮ−Ｃ）、フィブリリン、ルミカン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、バーシカン、フィブリノーゲンガンマ鎖、ミオシン−９、ミオシン−１０、パラディン、フィラミン、ビンキュリン、モエシン、ペリオスチン、ラミニン、及びタリン−１を含むがこれらに限定されないマトリックス成分の均一な分布をさらに含む。
【００４５】
バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの作製方法
本発明はまた、本明細書のいずこかに記載されているバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭを作製する方法に関する。図８を参照すると、バイオエンジニアリングされたマトリックスを作製する例示的な方法１００が示されている。方法１００は、脱細胞化されたウォートンジェリーマトリックス（ＤＷＪＭ）が液体媒体に浸漬されるステップ１０２で始まる。ステップ１０４では、浸漬されたＤＷＪＭに対して１つまたは複数の均質化サイクルが実行されて均質化ＤＷＪＭが形成され、各均質化サイクルは均質化期間と休止期間を含む。ステップ１０６では、均質化されたＤＷＪＭが成形される。ステップ１０８では、均質化されたＤＷＪＭが凍結される。ステップ１１０では、凍結されたＤＷＪＭは、真空下で凍結乾燥されて、バイオエンジニアリングされたマトリックスを形成する。
【００４６】
ウォートンジェリーマトリックスは、適切な方法で調製及び脱細胞化してＤＷＪＭを形成することができる（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０１６５６７６号及び米国特許第９，８１４，８０２号を参照されたい）。例えば、様々な実施形態では、ウォートンジェリーマトリックスは、臍帯からの完全な単離によって、血管構造を無傷で単離することによって、または臍帯全体を使用することによって調製することができる。臍帯は、ヒトならびに霊長類及び有蹄動物などの他の胎盤哺乳動物を含むがこれらに限定されない任意の適切な供給源に由来し得る。ウォートンジェリーマトリックスは、１回または複数回の浸透圧ショックサイクルを通じて脱細胞化できる。浸透圧ショックサイクルは一般に、ウォートンジェリーマトリックスを高張液と低張液に交互に曝すことを含む。例示的な浸透圧ショックサイクルは、塩化ナトリウム、マンニトール、塩化マグネシウム、及び塩化カリウムを含む高張塩溶液と、再蒸留水中の０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む低張溶液とを交互にそれぞれ１時間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、低張溶液のインキュベーションは、遠心分離下で行うことができる。さらなる処理ステップには、洗剤洗浄、酵素消化、及び有機溶媒抽出が含まれ、その後、イオン交換ビーズを使用して全ての残留物質が除去される。
【００４７】
ＤＷＪＭは、蒸留水などの適切な媒体に浸漬することができる。液体媒体の量は、得られるバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの細孔径を制御でき、脱細胞化組織の比率が高いと、細孔径が小さいバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭを生成でき、脱細胞化組織の比率が低いと、細孔径が大きいバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭを生成できる。例えば、液体媒体１ｍＬあたり０．５ｇの脱細胞化組織の比率は、約３０μｍ〜８０μｍの細孔径を有するバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭを生成できる。
【００４８】
液体媒体への浸漬により、ＤＷＪＭを均一に均質化できる。各均質化サイクルは、ＤＷＪＭ液体を冷却するための休止期間を伴う均質化期間を含む。均質化ステップは、冷却速度を改善するために氷上で実行できる。均質化期間は、約１０秒〜１分であり得、そして休止期間は、約３０秒〜５分であり得る。いくつかの実施形態では、均質化期間は約３０秒であり、休止期間は約１２０秒である。様々な実施形態では、約１０〜１００回の均質化サイクルを実行することができる。
【００４９】
均質化されたＤＷＪＭは、任意の適切な方法で成形できる。例えば、いくつかの実施形態では、均質化されたＤＷＪＭは、任意の所望のサイズ及び形状に３Ｄ印刷され得る。均質化されたＤＷＪＭは、一般的に知られている後処理ステップを使用して取り外し可能なケーシングやフレームワークなどの適切な支持構造で３Ｄプリントできる。他の実施形態では、均質化されたＤＷＪＭは、任意のサイズの型にロードすることによって成形することができる。いくつかの実施形態では、型は、最終的な成形されたＤＷＪＭをトリミングし、任意の所望の形状にサイズ変更できるように、より大きく非特定の形状を有するように選択される。成形された均質化されたＤＷＪＭは、−８０℃以下の温度で少なくとも８時間凍結される。次いで、凍結されたＤＷＪＭは、約−２０℃及び−６０℃の温度で、約０．０１ｍＢａｒ〜０．１ｍＢａｒの真空で少なくとも８時間凍結乾燥される。
【００５０】
様々な実施形態では、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、滅菌ステップで処理することができる。滅菌ステップは、任意の適切な滅菌方法を適用することができる。例えば、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの製造プロセスの任意の段階で、ＤＷＪＭ成分を放射線（例えば、ガンマ線、Ｘ線放射線、紫外線滅菌、及び電子ビーム処理）、ガス状ホルムアルデヒド、二酸化炭素、オゾン、エチレンオキシド、過酢酸、エタノール、過酸化水素などによって処理することができる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、１つまたは複数の添加剤で強化することができる。添加剤は均質化されたＤＷＪＭの試料に混合することができ、細胞株の接着及び増殖を促進できる。例えば、１つまたは複数の添加剤は、コラーゲン、フィブリン、フィブリノーゲン、トロンビン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ビキサパチン（ＶＰ１２）、ヘパリン、及びケラタン硫酸、プロテオグリカン、及びこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の追加の細胞外マトリックス材料、及び／または天然に存在する細胞外マトリックスのブレンドを含み得る。有益であり得るいくつかのコラーゲンには、コラーゲンのＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、ＸＶＩＩＩ、及びＸＩＸの型が含まれるが、これらに限定されない。これらのタンパク質は、天然型及び変性型を含むがこれらに限定されない任意の形態であり得る。様々な実施形態では、１つまたは複数の表面処理は、キチン、キトサン、アルギン酸などの１つまたは複数の炭水化物、ならびにアルギン酸カルシウム及びアルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸塩を含むことができる。これらの材料は、植物産物、ヒトまたは他の生物または細胞から単離され得るか、または合成的に製造され得る。
【００５２】
様々な実施形態では、添加剤は、グリシル−アルギニル−グリシル−アスパルチル−セリン（ＧＲＧＤＳ）（配列番号１）、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）（配列番号２）、及びアメロゲニンなどの天然ペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、表面処理は、スクロース、フルクトース、セルロース、またはマンニトールを含むことができる。いくつかの実施形態では、添加剤は、ウシ血清アルブミンなどの栄養素を含むことができる。いくつかの実施形態では、添加剤は、ビタミンＢ２、ビタミンＡｄ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、及びビタミンＫなどのビタミンを含むことができる。いくつかの実施形態では、添加剤は、ｍＲＮＡ及びＤＮＡなどの核酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、添加剤は、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、エストロゲン、及びその誘導体などの天然または合成のステロイド及びホルモンを含むことができる。いくつかの実施形態では、添加剤は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、及び上皮増殖因子（ＥＧＦ）などの増殖因子を含むことができる。いくつかの実施形態では、添加剤は、ナノ粒子、マイクロ粒子、リポソーム、ウイルス及び非ウイルストランスフェクションシステムなどの送達ビヒクルを含むことができる。
【００５３】
様々な実施形態では、添加剤は、１つまたは複数の治療薬を含むことができる。治療薬は、鎮痛薬、麻酔薬、抗真菌薬、抗生物質、抗炎症薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、駆虫薬、解毒薬、制吐薬、抗ヒスタミン薬、抗がん薬、降圧薬など、抗マラリア薬、抗菌薬、抗精神病薬、解熱剤、防腐剤、抗関節炎薬、抗結核薬、鎮咳薬、抗ウイルス薬、心臓作用薬、下剤、化学療法薬、着色または蛍光造影剤、コルチコイド（ステロイドなど）、抗うつ薬、うつ薬、診断補助剤、利尿薬、酵素、去痰薬、ホルモン、催眠薬、ミネラル、栄養サプリメント、副交感神経刺激薬、カリウムサプリメント、放射線増感剤、放射性同位元素、ナノダイヤモンドなどの蛍光ナノ粒子、鎮静剤、スルホンアミド、刺激剤、交感神経刺激薬、精神安定剤、尿中の抗感染症薬、血管収縮薬、血管収縮薬、キサンチン誘導体などを含むがこれらに限定されない、天然または合成の薬物であり得る。治療薬はまた、他の小さな有機分子、天然に単離された実体またはそれらの類似体、有機金属剤、キレート化金属または金属塩、ペプチドベースの薬物、またはペプチドもしくは非ペプチド受容体標的化剤もしくは結合剤であり得る。
【００５４】
バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの使用方法
本発明はまた、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭを使用する方法に関する。本明細書のいずこかで記載されているように、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、任意の所望の形状及び寸法に形成できる３Ｄ構造、細孔径と細孔分布の実質的な均一性、細胞外マトリックス成分の均一な組成などを含むがこれらに限定されない、いくつかの有利な性質を備えている。そのため、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、多くのアプリケーションに適している。
【００５５】
細胞培養
一態様では、本発明は、細胞を培養するための方法を包含する。様々な実施形態では、方法は、１つまたは複数の細胞集団を支持及び増殖するためのバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの使用に関する。細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下を含む、任意の適切な環境で培養することができる。本発明のバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭを使用して培養することができる細胞は、任意の適切な細胞であり得る。適切な細胞の非限定的な例には、多能性幹細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、線維芽細胞、骨細胞、上皮細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞などが含まれる。適切な細胞はまた、白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳癌、前立腺癌、子宮内膜癌、膀胱癌、脳癌、子宮頸癌、肺癌、黒色腫、子宮頸癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵臓癌、食道癌、腎臓癌、甲状腺癌、肝臓癌、子宮癌、軟部肉腫、骨癌、胃癌などを含むがこれらに限定されない、がん細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、そこに播種される細胞の可塑性を維持する。
【００５６】
細胞は、例えば、生きている対象からの生検及び死体から回収された臓器全体を含む、多くの供給源から単離することができる。単離された細胞は、レシピエントであることが意図されている対象から生検によって得られた自家細胞であり得る。生検は、処置を迅速かつ簡単にする迅速処置針である生検針を使用して得ることができる。
【００５７】
細胞は、当業者に知られている技法を使用して単離することができる。例えば、組織は機械的に分解でき、及び／または消化酵素及び／または隣接する細胞間の結合を弱めるキレート剤で処理でき、かなりの細胞破壊をもたらすことなく組織を個々の細胞の懸濁液に分散させることを可能にする。酵素的解離は、組織を細かく切り刻み、切り刻まれた組織を、単独または組み合わせて、いくつかの消化酵素のいずれかで処理することによって達成することができる。これらには、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、及び／またはヒアルロニダーゼ、ＤＮａｓｅ、プロナーゼ、及びディスパーゼを含まれるがこれらに限定されない。機械的破壊はまた、組織の表面を擦過すること、グラインダー、ブレンダー、シーブ、ホモジナイザー、圧力セル、または超音波処理器の使用を含むがこれらに限定されないいくつかの方法によって達成され得る。
【００５８】
組織が個々の細胞の懸濁液になると、細胞エレメントが得ることのできる亜集団に懸濁液を分画することができる。これは、特定の細胞型のクローニングと選択、不要な細胞の選択的破壊（ネガティブセレクション）、混合集団での異なる細胞凝集力に基づく分離、凍結融解手順、混合集団内の細胞の異なる接着特性、濾過、従来型及びゾーン遠心分離、遠心エルトリエーション（逆流遠心分離）、単位重力分離、向流分配、電気泳動及び蛍光標識細胞分取を含むがこれらに限定されない、細胞分離の標準的な技法を使用しても達成できる。
【００５９】
細胞分画はまた、例えば、ドナーががんまたは他の腫瘍の所望の組織への転移などの疾患を有する場合に望ましくなり得る。細胞集団は、悪性細胞または他の腫瘍細胞を正常な非がん性細胞から分離するために分類し得る。次いで、１つまたは複数の選別技法から単離された正常な非がん性細胞を、組織再構築に使用することができる。
【００６０】
単離された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養して、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの播種に利用可能な細胞の数を増加することができる。自家細胞を使用すると、同種異系細胞で一般的に見られる組織拒絶反応を軽減または防止できる。しかしながら、人工臓器の移植後に免疫応答が対象に発生する場合、拒絶の可能性を減らすために、対象はシクロスポリンまたはＦＫ５０６などの免疫抑制剤で治療されてもよい。特定の実施形態では、キメラ細胞、またはトランスジェニック動物からの細胞を、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭに播種することができる。
【００６１】
単離された細胞は、遺伝物質でコーティングする前にトランスフェクトすることができる。有用な遺伝物質は、例えば、宿主における免疫応答を低減または排除することができる遺伝配列であり得る。例えば、クラスＩ及びクラスＩＩ組織適合性抗原などの細胞表面抗原の発現は抑制され得る。これは、移植された細胞が宿主による拒絶の可能性を減少させることを可能にし得る。さらに、遺伝子送達にはトランスフェクションも使用できる。
【００６２】
播種された細胞は、正常または遺伝子操作されたものであり得、追加または正常な機能を提供する。レトロウイルスベクター、ポリエチレングリコール、または当業者に知られている他の方法による細胞を遺伝子操作する方法を使用することができる。これらには、細胞内で核酸分子を輸送及び発現する発現ベクターの使用が含まれる。（Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．  （１９９０）を参照されたい）。ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技法を介して、原核生物または細胞中に導入することができる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ  （２００１））、及びその他の実験室の教科書に見出すことができる。
【００６３】
バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭへの細胞の播種は、標準的な方法に従って実行できる。例えば、組織修復に使用するためのポリマー基質への細胞の播種が報告されている（例えば、Ａｔａｌａ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｕｒｏｌ．  １４８（２  Ｐｔ  ２）：  ６５８−６２  （１９９２）；Ａｔａｌａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｕｒｏｌ．  １５０  （２  Ｐｔ  ２）：  ６０８−１２  （１９９３）を参照されたい）。培養物中で増殖した細胞は、細胞を分離するためにトリプシン処理されてもよく、分離された細胞はバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭに播種されてもよい。代替的に、細胞培養物から得られた細胞は、細胞層として培養プレートから持ち上げられてもよく、細胞層は、事前に細胞を分離することなく、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭに直接播種されてもよい。
【００６４】
一実施形態では、１００万から５０００万の範囲の細胞が培地に懸濁され、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの表面の各平方センチメートルに適用される。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、例えば、３７℃、５％ＣＯ２などの標準的な培養条件下で、細胞が接着するまでの期間、インキュベートされる。しかしながら、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭ上に播種された細胞の密度は変化し得ることが理解されるであろう。例えば、細胞密度が大きいほど、播種された細胞による組織再生が促進され、密度が小さいほど、宿主から移植片に浸潤する細胞による組織の比較的大きい再生が可能になり得る。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭと細胞に応じて、他の播種技法も使用できる。例えば、細胞は、真空濾過によりバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭに適用されてもよい。細胞型の選択、及びバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭへの細胞の播種は、本明細書の教示に照らして、当業者には日常的であろう。
【００６５】
いくつかの実施形態では、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、造血幹細胞（ＨＳＣ）を培養及び増殖するのに適している。ＨＳＣは、ＨＳＣの自己複製と多分化能を調節する特別な微小環境である骨髄（ＢＭ）造血系「ニッチ」に存在する。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を増殖及び分化するためのＢＭ造血ニッチを再現する３次元培養システムとして使用できる。簡潔に述べると、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭをＰＢＳで洗浄し、培養培地で一晩インキュベートできる。濃縮されたＣＤ３４＋ＨＳＰＣは、３７℃、５％ＣＯ２の培地でバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭに播種できる。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、ＨＳＰＣの静止状態を、それらの生存率とクローン原性を維持しながら促進することができる。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭへの細胞接着は、自己再生能力が強化された集団であるｃ−ｋｉｔ＋ＨＳＰＣの頻度も増加させる。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、その周囲の細胞でのＣＸＣＲ４の発現を誘導することができるため、間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）へのＨＳＰＣ遊走を促進する。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、ＣＤ３４＋細胞における巨核球分化、細胞の移動性とホーミング、及びＨＳＣマーカー遺伝子を上方制御することもできる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）などとのＨＳＣの共培養及び分化にも適している。簡潔に述べると、上述のように、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭをＰＢＳで洗浄し、培養培地で一晩インキュベートできる。次いで、ＭＳＣの集団を２日間バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭに播種してから、濃縮ＣＤ３４＋ＨＳＣの集団を追加できる。上述と同じ培養条件下で、ＭＳＣの集団と組み合わせたバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、ＨＳＰＣの増殖を非常に刺激し、ＣＸＣＲ４の発現を抑制することによりその遊走を減少させることができる。
【００６７】
様々な実施形態では、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、異なる細胞型、組織、及びマトリックス材料と組み合わせて使用して、移植またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物試験のための複雑な組織及び器官を形成することができる。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、複雑な組織及び臓器を形成するための３次元印刷に適合させることができる。
【００６８】
ハイスループットスクリーニング
一態様では、本発明は、任意の数の薬物及び治療法のハイスループットスクリーニングのための方法を包含する。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは再現性が高く、任意の適切なハイスループットテストシステムに適合するサイズにでき、成形することができる。いくつかの実施形態では、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭを使用して、薬物または療法の有効性をスクリーニングするためのハイスループットの細胞ベースのアッセイを支持することができる。
【００６９】
本発明のスクリーニング方法は、特定のタイプの化合物に限定されない。可能性のある試験化合物には、化学薬品（毒素など）、医薬品、ペプチド、タンパク質（抗体、サイトカイン、酵素など）、ならびに遺伝子医薬品、及びタンパク質、アンチセンス剤（すなわち、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡなどの標的細胞型で発現する標的ＲＮＡに相補的な配列を含む核酸）、リボザイムなどの治療薬をコードし得る導入遺伝子などの核酸が含まれる。さらにまたは代替的に、本発明のアッセイは、放射線（例えば、電離放射線、紫外線または熱）などの物理的因子をスクリーニングでき、これは単独で、または化学薬品や他の薬剤と組み合わせて試験できる。一実施形態では、化合物ライブラリー全体がスクリーニングされる。化合物ライブラリーは、ハイスループットスクリーニングに利用される保存された化合物の大規模なコレクションである。化合物ライブラリー内の化合物は、相互に関係がない可能性があり、または代替的に共通の特性を持つ可能性がある。例えば、仮定の化合物ライブラリーには、特定の結合領域に結合することが知られているすべての既知の化合物を含み得る。
【００７０】
本発明のアッセイはまた、送達ビヒクルを試験するために使用され得る。これらは、従来の医薬製剤から遺伝子送達ビヒクルまでの任意の形態であってよい。例えば、アッセイは、２つ以上の異なる送達システム（例えば、デポー製剤及び制御放出製剤）によって投与された同じ化合物の効果を比較するために使用できる。また、特定のビヒクルがそれ自体で影響を与える可能性があるかどうかを調査するためにも使用できる。遺伝子ベースの治療法の使用が増加するにつれて、さまざまな可能性のある送達システムに関連する安全性の問題がますます重要になる。したがって、本発明のモデルを使用して、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスまたはアデノウイルスベクター）、リポソームなどの核酸治療薬の送達システムの特性を調査することができる。したがって、試験化合物は、関連する治療薬を伴うかまたは伴わない任意の適切なタイプの送達媒体であり得る。送達ビヒクルの非限定的な例には、ポリマーソーム、小胞、ミセル、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが含まれる。
【００７１】
例えば、白血病幹細胞は化学療法に抵抗性があり、患者が最初の寛解を達成した後に白血病の再発を引き起こすと考えられている。しかしながら、従来のシステム、すなわち培地中での懸濁で培養された白血病細胞は、幹細胞の性質を失う。本発明のバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭを使用して、白血病幹細胞などのがん幹細胞を維持し、化学療法剤及び他の抗がん剤で処理して、それらの幹細胞変異体に対する有効性をスクリーニングすることができる。簡潔に述べると、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、マルチウェルプレートのウェル内に適合するようにトリミングし、ＰＢＳで洗浄し、スクリーニングアッセイの準備として培養液中でインキュベートすることができる。準備されたバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、マルチウェルプレートの各ウェルに分配され、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞の集団が播種され、５％のＣＯ２を含んで３７℃で培養され、各ウェルのＡＭＬ細胞の集団を確立することができる。この方法で培養すると、ＡＭＬ細胞は、ＡＬＤＨ＋集団の増加とともに、顕著な分化をすることなく増殖の減少を示す。化学療法の治療は、各ウェルの培養液を高用量のドキソルビシンを含む新鮮な培地と交換することでシミュレートできる。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭで培養されたＡＭＬ細胞は、懸濁中のＡＭＬ細胞と比較して少ないアポトーシスとを示し、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭがＡＭＬ細胞の幹細胞の性質を維持してドキソルビシン治療に抵抗できることを示している。白血病細胞のマトリックスへの接着は、化学療法に対する白血病細胞の抵抗性に典型的に関連する白血病細胞の代謝変化をもたらすことが示されている。
【００７２】
それにより、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭを使用して、そこで培養されている化学療法抵抗性のがん幹細胞の１つまたは複数の集団を標的とする際の抗がん剤の有効性をスクリーニングすることができる。抗がん剤は、化学療法剤、抗細胞増殖剤、放射線増感剤、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。例えば、以下の非限定的で例示的なクラスの任意の従来の化学療法剤をスクリーニングすることができる：ニトロソウレア；代謝拮抗剤；抗腫瘍抗生物質；植物アルキロイド；タキサン；ホルモン剤；及び様々な薬剤。さらに、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭ環境を改変して、がんに対するＴ細胞の効果を試験するためのがん細胞とＴリンパ球の播種を含むがこれらに限定されない、免疫ベースの治療法を試験することができる。
【００７３】
アルキル化剤は、細胞内に存在する条件下で多くの電気陰性基にアルキル基を付加し、それによってＤＮＡ複製を妨害してがん細胞の複製を妨げる能力があるため、そのように呼ばれている。ほとんどのアルキル化剤は細胞周期非特異的である。特定の態様において、それらは、ＤＮＡ二重らせん鎖のグアニン塩基を架橋することにより腫瘍増殖を止める。非限定的な例には、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、イホスファミド、塩酸メクロレタミン、メルファラン、プロカルバジン、チオテパ、及びウラシルマスタードが含まれる。
【００７４】
代謝拮抗剤は、細胞周期の合成（Ｓ）期中にＤＮＡへの塩基の取り込みを防ぎ、正常な発達と分裂を妨げる。代謝拮抗剤の非限定的な例には、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、カペシタビン、シトシンアラビノシド、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキサート、及びチオグアニンなどの薬物が含まれる。
【００７５】
抗腫瘍抗生物質は一般に、細胞分裂に必要な酵素を妨害したり、細胞を囲む膜を改変したりすることにより、細胞分裂を防ぐ。これらの薬剤は細胞周期非特異的である。抗腫瘍抗生物質の非限定的な例には、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、及びミトキサントロンが含まれる。
【００７６】
植物アルカロイドは、有糸分裂を阻害もしくは停止するか、または細胞が細胞増殖に必要なタンパク質を作るのを妨げるように酵素を阻害する。頻繁に使用される植物アルカロイドには、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンが含まれる。
【００７７】
タキサンは、細胞機能に重要である微小管と呼ばれる細胞構造に影響を与える。通常の細胞増殖では、細胞が分裂を開始すると微小管が形成されるが、細胞が分裂を停止すると、微小管は分解または破壊される。タキサンは、微小管が破壊されるのを防いで癌細胞が微小管で詰まるようにし、それらが増殖及び分裂できないようにする。非限定的な例示的なタキサンには、パクリタキセル及びドセタキセルが含まれる。
【００７８】
ホルモン剤及びホルモン様薬物は、例えば、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫を含む特定の型のがんに利用される。それらはしばしば他のタイプの化学療法薬と併用され、それらの効果を高める。性ホルモンは、女性ホルモンまたは男性ホルモンの作用または産生を変化させるために使用され、乳癌、前立腺癌、及び子宮内膜癌の増殖を遅らせるために使用される。これらのホルモンの産生（アロマターゼ阻害剤）または作用（タモキシフェン）を阻害することは、治療の補助としてしばしば使用される。他のいくつかの腫瘍もホルモン依存性である。タモキシフェンは、乳癌細胞の増殖を促進するエストロゲンの活性を妨害するホルモン剤の非限定的な例である。
【００７９】
その他の薬剤には、ブレオマイシン、ヒドロキシ尿素、Ｌ−アスパラギナーゼ、及びプロカルバジンなどの化学療法剤が含まれ、これらはバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭを使用してスクリーニングすることもできる。
【００８０】
抗細胞増殖剤はさらに、アポトーシス誘導剤または細胞傷害性薬剤として定義され得る。アポトーシス誘導剤は、グランザイム、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー、チトクロームＣ、カスパーゼ、またはそれらの組み合わせであり得る。例示的なグランザイムには、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グランザイムＣ、グランザイムＤ、グランザイムＥ、グランザイムＦ、グランザイムＧ、グランザイムＨ、グランザイムＩ、グランザイムＪ、グランザイムＫ、グランザイムＬ、グランザイムＭ、グランザイムＮ、またはそれらの組み合わせが含まれる。他の態様において、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーには、例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｈｒｋ、Ｂｏｋ、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、カスパーゼは、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１２、カスパーゼ−１３、カスパーゼ−１４、またはそれらの組み合わせである。他の実施形態では、細胞毒性剤は、ＴＮＦ−α、ゲロニン、プロジジオシン、リボソーム阻害タンパク質（ＲＩＰ）、緑膿菌エクソトクシン、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ＶａｃＡ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ＹｏｐＴ、ビオラセイン、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、イロフルベン、ジフテリア毒素、ミトギリン、リシン、ボツリヌス毒素、コレラ毒素、サポリン６、またはそれらの組み合わせである。
【００８２】
スクリーニングに適したさらなる抗癌剤には、エベロリムス、トラベクチン、アブラキサン、ＴＬＫ  ２８６、ＡＶ−２９９、ＤＮ−１０１、パゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ  ７４４、ＯＮ  ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ  ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＡＭＮ−１０７、ＴＫＩ−２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ  １１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ−１９７、ＭＫ−０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ−７３９３５８、Ｒ−７６３、ＡＴ−９２６３、ＦＬＴ−３阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＥＧＦＲ  ＴＫ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤、ＰＩＫ−１調節剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、ＨＤＡＣ調節剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、Ｃｄｋ阻害剤、ＥＧＦＲ  ＴＫ阻害剤、ＩＧＦＲ−ＴＫ阻害剤、抗ＨＧＦ抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＧＤ２抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、免疫チェックポイント阻害、チェックポイント−１または２阻害剤、局所接着キナーゼ阻害剤、マップキナーゼキナーゼ（ｍｅｋ）阻害剤、ＶＥＧＦトラップ抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサタニブ、ニロチニブ、デカタニブ、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ−ｅｔｕ、ノラトレキセド、ａｚｄ２１７１、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェネ、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、Ｂｉｏ  １１１、１３１−Ｉ−ＴＭ−６０１、ＡＬＴ−１１０、ＢＩＯ  １４０、ＣＣ  ８４９０、シレンギチド、ギマテカン、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ  １００１、ＩＰｄＲ１  ＫＲＸ−０４０２、ルカントン、ＬＹ  ３１７６１５、ノイラジアブ（ｎｅｕｒａｄｉａｂ）、ビテスパン（ｖｉｔｅｓｐａｎ）、Ｒｔａ  ７４４、Ｓｄｘ  １０２、タランパネル、アトラセンタン、Ｘｒ  ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ−  １００３８０、スニチニブ、５−フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、ＺＫ−３０４７０９、セリシクリブ；ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ−６２４４、カペシタビン、Ｌ−グルタミン酸七水和物、カンプトテシン、ＰＥＧ−標識イリノテカン、タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、共役エストロゲン、ベバシズマブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＣＨＩＲ−２５８）；３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル−キノロン、バタラニブ、ＡＧ−０１３７３６、ＡＶＥ−０００５、ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｚｇｌｙ−ＮＨ２ｘ（アセテート）（式中、ｘ＝１〜２．４）、酢酸ゴセレリン、酢酸ロイプロリド、パモ酸トリプトレリン、酢酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ＣＰ−７２��７１４；ＴＡＫ−１６５、ＨＫＩ−２７２、エルロチニブ、ラパタニブ、カネルチニブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ抗体、アービタックス、ＥＫＢ−５６９、ＰＫＩ−１６６、ＧＷ−５７２０１６、ロナファルニブ、ＢＭＳ−２１４６６２、チピファルニブ；アミホスチン、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、スベロイルアナリドヒドロキサム酸、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ−２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アルナクリン、アナグレリド、Ｌ−アスパラギナーゼ、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３−シス−レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５−デオオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メカプトプリン、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステリド、シミチジン、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトックス、ゲフィチニブ、ボルテジミブ、パクリタキセル、クレモフォアフリーパクリタキセル、ドセタキセル、エピチロンＢ、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−３１０７０５、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ−９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ−４２４、ＨＭＲ−３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＶＸ−７４５、ＰＤ１８４３５２、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３、ＲＡＤ００１、ＡＢＴ−５７８、ＢＣ−２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ワートマニン、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９，４５０、ＰＥＧ−フィルグラスチム、ダルベポ��チン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレンドロネート、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ペグ化インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ａ、ペグ化インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン−１１、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、オール−トランスレチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン−２、メゲストロール、免疫グロブリン、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニゾロン、イブトリグモマブチウセタン、アンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エジトロネート（ｅｄｉｔｒｏｎａｔｅ）、ミトタン、シクロスポリン、リポソームダウノルビシン、Ｅｄｗｉｎａアスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント（ｎｅｔｕｐｉｔａｎｔ）、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセトロン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンアルファ、ダルベポエチンアルファ、及びそれらの組み合わせなどの、小分子、ペプチド、タンパク質、及び合成化合物が含まれる。
【００８３】
バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭを免疫細胞と組み合わせて、任意の数の免疫療法の有効性をスクリーニングすることもできる。免疫療法にはＴ細胞ワクチン接種が含まれるが、これには典型的には、がん細胞集団を排除する不活性化された自己反応性Ｔ細胞による免疫が含まれる。別の免疫療法は、内因性Ｔ細胞と本明細書に記載のがん細胞の特定の抗原に同時に結合して２つの細胞型を連結するように設計された抗体である、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）の使用を含む。特定の実施形態では、免疫療法は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を使用する。ＭＡｂは、がん細胞を破壊する免疫応答を刺激する。Ｂ細胞によって自然に産生される抗体と同様に、これらのＭＡｂは癌細胞表面を「コーティング」し、免疫系によるその破壊を引き起こす。例えば、ベバシズマブは、腫瘍の微小環境で腫瘍細胞及び他の細胞から分泌され、腫瘍血管の発達を促進するタンパク質である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的とする。ベバシズマブに結合すると、ＶＥＧＦはその細胞受容体と相互作用できなくなり、新しい血管の成長につながるシグナル伝達を妨げる。同様に、セツキシマブとパニツムマブは上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とし、トラスツズマブはヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ−２）を標的とする。細胞表面増殖因子受容体に結合するＭＡｂは、標的化された受容体が正常な増殖促進シグナルを送信するのを防ぐ。それらはまた、アポトーシスを誘発し、免疫系を活性化して腫瘍細胞を破壊できる。
【００８４】
バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭ内で培養されたがん幹細胞に対する有効性をスクリーニングできるさらなる治療法には、現在使用されているさまざまな放射線療法のいずれかが含まれる。放射線療法は、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭによって提供されるＥＣＭ化合物と構造への影響についてもスクリーニングできる。例示的な放射線療法には、３Ｄ原体放射線治療、強度変調放射線療法、近接照射療法、定位放射線療法、強度変調陽子療法などが含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
組織工学
いくつかの実施形態では、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭをｉｎ  ｖｉｖｏで使用して、細胞の動員、浸潤、及び分化を促進することができる。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭへの細胞の流入と成熟を使用して、組織を再生し、欠損及び創傷を治療できる。本発明の方法が閉鎖を促進するのに有用である創傷には、擦過傷、裂傷、切開創、火傷、挫傷、銃創、切開創、開放創、貫通創、穿孔創、穿刺創、串線創、刺創、外科的創傷、皮下創傷、または接線創傷が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、外胚葉分化を促進して、汗腺、皮脂腺、毛包などを含む、皮膚の様々な下部構造を再生する。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、縫合糸、接着剤、または包帯を使用して、創傷領域に固定できる。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、創傷のサイズに一致するように切断できるか、または創傷の端に重なるようにできる。場合によっては、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、深い創傷によって形成された空洞に浸透するように成形できる。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、手術関連の外傷や事故などの粘膜損傷の治癒にも使用できる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、移植時にバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭが天然組織からの細胞遊走及び増殖を支持するように、無細胞で適用される。無細胞のバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、治癒を促進するためにＥＣＭ及びその他の細胞性分泌物を補充することができる。他の実施形態では、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭに、１つまたは複数の細胞集団を播種して、人工組織構築物を形成する。人工組織構築物は、細胞集団が患者自身の組織に由来する自己由来であってもよいか、または細胞集団が患者と同じ種内の別の対象に由来する同種異系であってもよい。人工臓器構築物は、異なる細胞集団が対象とは異なる哺乳動物種に由来する異種であってもよい。例えば、細胞は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、及びヒツジなどの哺乳動物の器官に由来し得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、骨組織の再生及び骨欠損の修復に適している。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、内因性細胞のホーミングを促進する増殖因子送達の足場として使用できる。簡潔に述べると、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、骨折や骨欠損に適合するサイズにでき、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２）及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含むがこれらに限定されない、骨形成及び血管新生の増殖因子をロードできる。骨欠損の部位は、適切なサイズのバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの移植前に生理食塩水で洗浄できる。バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、炎症または免疫反応を誘発することなく、骨欠損を軽減または閉鎖することができる。いくつかの実施形態では、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、天然の骨と同様の顕著な骨髄腔を伴う典型的な骨形態を有する新しい骨を形成することができる。
【実験例】
【００８８】
本発明は、これから次の実施例を参照してさらに詳述される。これらの実施例は、説明のみを目的として提供されており、別段の定めがない限り、限定することを意図したものではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
【００８９】
さらに説明することなく、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明の化合物を作製及び利用し、特許請求される方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の例示的な実施形態を具体的に指摘しており、決して開示の残りの部分を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００９０】
実施例１：がんにおける化学療法薬のハイスループットスクリーニングのためのバイオエンジニアリングされた脱細胞化ウォートンジェリー由来細胞外マトリックス
以前の研究は、白血病細胞が合成足場に播種された初代骨髄間葉系間質細胞（ＭＳＣ）と共培養される、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の化学療法抵抗性を試験するための３Ｄストローマベースのモデルを確立した。このモデルでは、白血病細胞は化学療法抵抗性の増加を示した（Ａｌｊｉｔａｗｉ  ＯＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ，  ２０１４，  ５５（２）：３７８−９１）。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は幹細胞の特性を有する白血病の亜集団を濃縮することにより化学療法抵抗性に重要な役割を果たすので、次に細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に焦点が当てられた。ＥＣＭ成分については、以前に例示され、特性評価された、脱細胞化ウォートンジェリーマトリックス（ＤＷＪＭ）が使用された（図１Ａ）（Ａｌｊｉｔａｗｉ  ＯＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ，  ２０１３，  ２２（１）：１８−２６）。ウォートンジェリーは、臍帯の血管を主に支える臍帯のゼラチン状の結合組織である。コラーゲン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、及び硫酸化プロテオグリカンなどのその成分（Ｆｒａｎｃ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｃｅｎｔａ，  １９９８，  １９（１）：９５−１０４；Ｓｏｂｏｌｅｗｓｋｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌ  Ｎｅｏｎａｔｅ，  １９９７，  ７１（１）：１１−２１）は、骨造血ニッチにも存在する（Ｌｏ  Ｃｅｌｓｏ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００９，  ４５７（７２２５）：９２−６）。
【００９１】
臍帯は、正常な経膣分娩後、満期妊娠の同意した母親から直ちに収集された。臍帯を、ペニシリン８００Ｕ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）、ストレプトマイシン９．１ｍｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びアムホテリシン０．２５ｍｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した乳酸リンガー液で作製された輸送液に入れ、４℃ですぐに冷蔵保存した。脱細胞化プロセスは、臍帯収集から７２時間以内に開始された。簡潔に述べると、新鮮なヒトの臍帯を、４℃の輸送溶液中で分娩室から輸送した。臍帯は、マトリックスを周囲の膜及び血管構造から大きな楕円形の断片に分離することにより、層流安全キャビネット内で解剖された。次いで、マトリックスを、浸透圧が約１，２５７ｍＯｓｍ／Ｌの塩化ナトリウム、マンニトール、塩化マグネシウム、及び塩化カリウムを含む高張塩溶液と４℃の遠心分離機で５，０００ｒｐｍのｄｄＨ２Ｏ中の０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とで交互にすることによって、２サイクルの浸透圧ショックにかけた。浸透圧ショックを２サイクル行った後、組織をアニオン性界面活性剤（ラウリルナトリウム）とコハク酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｌ５７７７）に入れ、１６時間の間、緩衝水（Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ）中の組換え核酸酵素（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）と交互にした。これに続いて、４０％エチルアルコールによる有機溶媒抽出を、４℃の遠心分離機で５，０００ｒｐｍで１０分間実行した。次いで、室温においてｄｄＨ２Ｏ中で３０時間、往復フロースルーガラスシステムで、イオン交換ビーズ（ＩＷＴ−ＴＭＤ，  Ｓｉｇｍａ；ＸＡＤ−１６  Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ｂｅａｄｓ，  Ｓｉｇｍａ；及びＤｏｗｅｌ  Ｍｏｎｏｓｐｈｅｒｅ  ５５０Ａ  ＵＰＷ  ｂｅａｄｓ，  Ｓｕｐｅｌｃｏ）を使用して、洗剤とその他の処理残留物を全て除去した。脱細胞化マトリックスは、−１℃／分で−１８０℃まで凍結するように開発された、コンピューター制御の材料固有の凍結プロファイルを採用して、標準ＲＰＭＩ培地中の１０％ヒト組換えアルブミン（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）及び１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）溶液を使用して凍結保存した。
【００９２】
非常に再現性の高いＤＷＪＭディスクは、凍結均質化とそれに続く凍結乾燥によって作成された。製造プロセスをＤＷＪＭに適用して、均一な厚さと多孔性を持つマトリックスのシートを作製した。これらのシートは、さまざまなサイズと形状で製造でき、任意の形状または形態にトリミングできる。例えば、パンチ生検キットを使用することによって、均一なディスクを９６ウェルプレートに適合させて、薬物や小分子のハイスループットスクリーニングに適したプラットフォームを作成できる。現在適用されているプロトコルでは、０．５ｇ組織／ｍＬの蒸留水を使用して、足場の組織濃度を調整した。組織濃度は、ＤＷＪＭディスクの多孔性に影響する。
【００９３】
実施例２：均質化されていないＤＷＪＭとバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの質量分析の比較
図６Ａから図６Ｄ、及び図７Ａから図７Ｂは、例示的な７５ｍｇ／ｍＬの均質化されていないＤＷＪＭの切片と、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの同じサイズの切片の間の質量分析の結果を示す。均質化されていないＤＷＪＭの切片には、均一に分散されたバイオエンジニアリングされたＤＷＪＭの場合よりも数倍少ない量のマトリックス成分を含めることができる。例えば、同じサイズの均質化されていないＤＷＪＭのサイズの切片と比較して、バイオエンジニアリングされたＤＷＪＭは、約３０〜３５のフィブリノーゲンガンマチェーンの存在比、１０〜１５のミオシン−９の存在比、及び約１０〜１５のミオシン−１０の存在比を有することができる。この違いは、均質化されていないＤＷＪＭのムラによるものであり、その構成は、供給源由来の各臍帯間で、及び供給源由来の各臍帯の領域間で異なるためである。
【００９４】
実施例３：ＤＷＪＭ接着は白血病細胞代謝を変化させることにより初代急性骨髄性白血病の化学療法抵抗性を誘導する
以前の研究は、臍帯組織のゼラチン状物質である脱細胞化ウォートンジェリー（ＷＪ）マトリックス（ＤＷＪＭ）で白血病細胞株を培養すると、化学療法抵抗性が生じることを実証した。ＷＪマトリックスのさまざまな部分の間の生化学的組成の変動を減らし、３次元（３Ｄ）ＤＷＪＭベースの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）モデルを初代急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のために最適化するために、ＤＷＪＭ由来の多孔質ディスクは、均質化とそれに続くヒトＤＷＪＭの凍結乾燥によって均一の構造と細孔径を伴って作製された。次の研究では、ＤＷＪＭディスクが初代白血病細胞を支持し、化学療法抵抗性をもたらすかどうかを調べる。
【００９５】
白血球除去によって収集されたＡＭＬ患者の試料は、ＤＷＪＭディスクで１週間培養された。最初に非接着細胞を吸引し、接着細胞を個別に分離して、生存率、アポトーシス、及びコロニー形成単位（ＣＦＵ）を評価した。培養の最後にＲＮＡシークエンシングを行った。ドキソルビシンによる処理後の化学療法に対する応答も評価した。全ての研究で、ＤＷＪＭ接着細胞と非接着細胞を懸濁培養対照と比較した。代謝経路分析は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して実行された。群間の比較に片側ｔ検定を使用した。
【００９６】
以前の研究と一致して、接着ＤＷＪＭ細胞はより少ないアポトーシス（Ｐ＝０．０２７）、及び大きい高密度のコロニーを伴う高いＣＦＵ活性（１対４／５０，０００細胞、Ｐ＝０．０００８）を実証した。初代ＡＭＬ試料とＤＷＪＭの共培養により、懸濁培養細胞の処理と比較して、ドキソルビシン誘発細胞死が減少し（Ｐ＝．０４７）、ＣＦＵ活性を保持した（３．３対０．３／３００，０００細胞、Ｐ＝．０４７）。ＤＷＪＭとの共培養が白血病前駆細胞機能と治療抵抗性を増強するメカニズムを理解するために、ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析を実行した。７日目からのＲＮＡ−Ｓｅｑデータ分析は、懸濁集団と比較した接着集団において、ＦＡＭ８３Ａ及びＭＩＲ３４Ａの有意な上方制御と、ＢＰＩ、ＺＮＦ５２１、ＮＨＬＨ２、ＣＤ６９、ＦＫＢＰ１４、ＰＢＸ１、ＴＡＮＣ１、ＧＲＩＮ２ｂ、ＭＹＯ６、ＩＮＨＢＡ、ＳＡ１００８、ＣＸＣＬ１、Ａ１００９、ＢＬＮＫ、ＭＭＰ９、ＢＨＬＨＥ４１、及びＣＤ９の下方制御を示した（調整されたＰ値＜０．０５）。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）は、グルタミン酸受容体シグナル伝達を、２つの培養条件間の主な代謝プロセスの違いを示唆する、最も影響を受ける標準経路として同定した。さらに、ＩＰＡは、ＦＡＭ８３Ａが最も上方制御された分子であるのに対し、ＭＴ−ＴＨとＭＴ−ＴＷは接着細胞で最も下方制御された分子の２つであることを示した。ＤＷＪＭ培養条件は、懸濁対照と比較して培養上清中で、乳酸の有意な増加（Ｐ＝０．０２０）、及びブドウ糖の有意な減少（Ｐ＝０．００５）と関連していた。
【００９７】
これにより、本研究は、ＤＷＪＭディスクが初代白血病細胞の生存を支持することを実証した。ＤＷＪＭ接着細胞は解糖系の誘導に関連して化学療法抵抗性を示した。ＲＮＡ  Ｓｅｑデータに基づいて、白血病細胞のＤＷＪＭへの接着が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達経路で機能するＦＡＭ８３Ａを上方制御することが示されている。ＦＡＭ８３Ａは、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＴＯＲシグナル伝達カスケードを制御することが知られている。次に、Ｍ−ＴＯＲは、解糖を調節するＨＩＦ−１α経路を活性化することが知られている（図９）。さらに、ミトコンドリア関連分子（ＭＴ−ＴＨ及びＭＴ−ＴＷ）の下方制御は、接着細胞における酸化的リン酸化から解糖への切り替えと一致している。
【００９８】
本明細書で引用されるありとあらゆる特許、特許出願、及び刊行物の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本発明は、具体的な実施形態を参照して開示されてきたが、他の当業者によって、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態及び変形が考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのそのような実施形態及び均等の変形を含むと解釈されることを意図している。
【図１】
2021519613.tif 000003
【図２】
2021519613.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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