(57)【要約】  本発明は、ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体の、血管内皮細胞障害性疾患を治療又は予防するための医薬の製造における使用、特に、脳梗塞又は心筋梗塞を治療又は予防するための医薬の製造における使用に関する。本発明は、さらに、具体的なｃ−ＭＥＴアゴニストに関する。
2021507936.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体の、血管内皮細胞障害性疾患を治療又は予防するための医薬の製造における使用。
【請求項２】
前記血管内皮細胞障害性疾患は、虚血性心疾患又は血液脳関門障害性疾患である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記虚血性心疾患は、脳梗塞又は心筋梗塞である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記の脳梗塞を治療又は予防することは、血液脳関門の透過性を低減することにより、及び／又は脳血管を保護・修復することにより、及び／又は脳梗塞体積を減少させることにより達成される、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体は、ｃ−ＭＥＴ抗原で動物を免疫することにより調製されたモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記ｃ−ＭＥＴ抗原は、免疫原性を有するｃ−ＭＥＴ完全長分子、融合タンパク質、分子断片及び／又はポリペプチドである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体は、Ｂリンパ球の抗体ライブラリー又は人工抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより得られる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体は、遺伝子工学的に改良されたが、依然としてアゴニスト活性を保持する抗体化合物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体は、ＦＷ及び／又はＦｃ断片がヒト化された抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体は、完全ヒト抗体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体は、ポリクローナル抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体は、重鎖及び軽鎖を含む抗体分子であり、且つ
前記重鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１から選ばれる少なくとも１つの重鎖可変領域の配列又はその突然変異配列を含み、且つ
前記軽鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４から選ばれる少なくとも１つの軽鎖可変領域の配列又はその突然変異配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記ｃ−ＭＥＴアゴニストは、抗体−薬物コンジュゲートである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
ｃ−ＭＥＴに結合できる抗体又はその機能的断片において、前記抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、且つ
前記重鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１から選ばれる少なくとも１つの重鎖可変領域の配列又はその突然変異配列を含み、且つ
前記軽鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４から選ばれる少なくとも１つの軽鎖可変領域の配列又はその突然変異配列を含む、抗体又はその機能的断片。
【請求項１５】
請求項１４に記載の抗体又はその機能的断片、及び任意に選択される薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内や皮下経路により投与され、又は経口経路により投与される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記医薬組成物は、静脈内注射剤である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
さらに、血管内皮細胞障害性疾患を治療又は予防する、別の１つ又は複数の薬学的に活性な化合物を含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記医薬組成物は、逐次使用のための組合せ製品であり、さらに、ＩＲＦ５阻害剤、パクリタキセル、脂質低下薬又は血管新生阻害剤、及びそれらの組み合わせを含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
血管内皮細胞障害性疾患の治療又は予防するために用いられる薬学的に活性な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）被験化合物をｃ−ＭＥＴと接触させること、及び
（ｉｉ）被験化合物がｃ−ＭＥＴに特異的に結合するかどうかを判断すること、を含み、
ここで、ｃ−ＭＥＴへの前記被験化合物の特異的結合は、前記被験化合物が血管内皮細胞障害性疾患を治療又は予防するための医薬として使用できることを示す、方法。
【請求項２１】
前記虚血性心疾患は、脳梗塞又は心筋梗塞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１４に記載の抗体又はその機能的断片の、医薬品又は診断キットを製造するための使用において、前記医薬又は診断キットは、対象からインビトロで血管内皮細胞障害性疾患を診断するために用いられる、使用。
【発明の詳細な説明】
【相互参照】
【０００１】
本願は、２０１７年１１月１３日に中国特許庁へ提出された、出願番号が２０１７１１１１６９２７．１、発明の名称が「ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体及びその用途」である中国特許出願に基づき優先権を主張し、その全内容は、援用により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体の、血管内皮細胞障害性疾患（例えば、虚血性心疾患又は血液脳関門障害性疾患を含む）を治療又は予防するための医薬の製造における使用、特に、脳梗塞又は心筋梗塞を治療又は予防するための医薬の製造における使用に関する。本発明は、さらに、具体的なｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
虚血組織は、血液灌流を回復させた後に、組織細胞の機能的・代謝障害及び構造的破壊の更なる悪化という病理学的過程を起こし、虚血再灌流障害（ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ、  ＩＲ）と呼ばれる。臨床的には、様々な理由による臓器及び組織のすべての虚血及び低酸素症は、臓器移植、脳卒中、外傷性ショック、心筋梗塞、下肢虚血などの治療回復の過程でＩＲの問題を伴う。血管内皮細胞は、微小血管の内壁に付着した単層細胞であり、血管と組織の間のバリアを構成するだけでなく、さまざまな生理活性物質を分泌して血管緊張、血液凝固線溶バランス、炎症性免疫反応を調節することにより組織細胞の代謝を調節するハブである。脳血管内皮細胞は、さらに、血液脳関門の重要な構成要素であり、その損傷は多くの二次的な病理学的プロセスを引き起こす。最近の研究では、血管内皮細胞がＩＲが発生する重要な部位であることを発見している。微小血管内皮細胞を保護することは、ＩＲを防ぐための鍵である。
【０００４】
肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）及びその受容体ｃ−ＭＥＴは、保護するための効果的なターゲットであることが証明されている。ＨＧＦと受容体ｃ−ＭＥＴの結合は、関連するシグナル伝達経路を活性化し、特異的に内皮細胞の増殖及び機能を促進・維持し、血管新生を促進し、さらに血管新生から側副循環を形成する。従って、ＨＧＦ／ｃ−ＭＥＴは、ターゲットとして血管の保護及び修復への研究に広く使用されている。中国特許出願の公開明細書ＣＮ１０１９２５３６２Ａは、被験者の虚血性心臓組織への灌流及び心筋層中血管密度を増加し、内皮修復を強化し、並びに血管損傷又は病変血管部位への治療を提供する方法を含む、血管内皮細胞の増殖を促進するための医薬へ２種又はそれ以上のＨＧＦアイソフォームを含む組成物の使用を提供する。
【０００５】
現在、ＨＧＦは、依然としてｉｎ  ｖｉｖｏ及び臨床応用の方法論に大きな障害がある。ＨＧＦの血清半減期は非常に短く、５分間未満であるため、組換えＨＧＦの応用が大幅に制限されている。このため、ウイルスベクターを介してＨＧＦ遺伝子を体内に直接導入する戦略を採用し、潜在的な臨床応用価値を研究するために虚血部位で内因的に持続的に発現させる。例えば、中国特許出願の公開明細書ＣＮ１５０２３６８Ａは、脳虚血におけるＨＧＦ遺伝子を運ぶ組換えアデノウイルスの応用を開示しており、細胞内プラスミドの相同組換えによりヒト肝細胞増殖因子遺伝子をアデノウイルスベクターに組み込まれ、組換えアデノウイルスを得、一定量のウイルス粒子を作成し、脳虚血の動物モデル及び適当な遺伝子導入法を確立し、脳におけるアデノウイルスの発現を観察し、ヒト肝細胞増殖因子が脳虚血によって引き起こす神経細胞死を減らすことができることを示す。しかしながら、この方法は、依然として安全性及び治療効果の点を含め、満足のいくものではない。ベクターから細胞内に入り込むまではある程度の時間をかけるが、ベクター注入法を使用しても、ＨＧＦの即時発現は保証できないが、作用の迅速な開始を保証することは、血管内皮細胞の虚血性疾患または虚血性損傷（特に、脳梗塞又は心筋梗塞病）にとって特に重要である。よって、従来技術では、依然として血管内皮細胞損傷の修復を効果的に促進する方法が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、予想外に、ｃ−ＭＥＴアゴニストが血管内皮細胞損傷の修復を効果的に促進でき、虚血性心疾患及び血液脳関門障害性疾患の治療に使用できることを発見している。ｃ−ＭＥＴは、チロシンキナーゼ型受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ、  ＲＴＫｓ）に属し、２つのモノマーで構成され、各モノマーは、ジスルフィド結合で連結された二本鎖タンパク質である。ｃ−ＭＥＴの活性化は、２つのモノマーの二量体化から開始し、それに伴い、チロシンキナーゼ領域は自己リン酸化し、シグナル伝達を引き起こす。抗体の二価構造により、２つのｃ−ＭＥＴモノマーを同時に結合でき、空間的に互いに接近させ、二量体化し、さらに、チロシンキナーゼの自己リン酸化が起こり、ｃ−ＭＥＴを活性化する目的が達成される。
本発明者らは、ｃ−ＭＥＴが血管内皮細胞を保護するための有効な標的であることを発見し、ｃ−ＭＥＴ抗体がＨＧＦ／ｃ−ＭＥＴ経路を活性化する役割を有することを確認した。本発明は、ｃ−ＭＥＴ抗体の有益な特性を利用し、血管内皮細胞を保護する方法、及び虚血性心疾患及び血液脳関門障害性疾患におけるその応用、並びに抗体医薬品を提供することを目的とする。
従って、本発明の第１側面では、ｃ−ＭＥＴアゴニストの、血液脳関門障害性疾患、特に、虚血性心疾患又は血管内皮細胞虚血性損傷を治療又は予防するための医薬の製造における使用を提供する。好ましくは、本発明に記載のｃ−ＭＥＴアゴニストは、ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体である。当業者は、ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体については、それは抗原に結合することができ、この結合はリガンドの受容体への結合も反映し、且つ結合後にエフェクターリガンドの活性又は能力の増加につながることを理解すべきである。
【０００７】
好ましくは、前記虚血性心疾患は、脳梗塞又は心筋梗塞である。幾つかの好ましい実施態様において、前記脳梗塞の治療又は予防は、血液脳関門の透過性を低減することにより、及び／又は脳血管を保護・修復することにより、及び／又は脳梗塞体積を減少させることにより達成される。
本発明の上記使用では、前記ｃ−ＭＥＴアゴニストは、ｃ−ＭＥＴ抗原で動物を免疫することにより調製されたモノクローナル抗体であってもよく、免疫原性を有するｃ−ＭＥＴ完全長分子、融合タンパク質、分子断片又はポリペプチドであってもよい。好ましい実施態様において、前記ｃ−ＭＥＴアゴニストは、Ｂリンパ球の抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができ、人工抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより得ることもできる。他の好ましい実施態様において、前記ｃ−ＭＥＴアゴニストは、遺伝子工学的に改良されたが、依然としてアゴニスト活性を保持する抗体化合物である。
本発明の使用では、前記ｃ−ＭＥＴアゴニストは、完全ヒト抗体であってもよい。或いは、前記ｃ−ＭＥＴアゴニストは、ＦＲ及び／又はＦｃ断片がヒト化された抗体であってもよい。
【０００８】
特に好ましい実施態様において、前記ｃ−ＭＥＴアゴニストは、重鎖及び軽鎖を含む抗体分子であり、且つ
前記重鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１から選ばれる少なくとも１つの重鎖可変領域の配列又はその突然変異配列を含み、且つ
前記軽鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４から選ばれる少なくとも１つの軽鎖可変領域の配列又はその突然変異配列を含む。
本発明の使用では、前記ｃ−ＭＥＴアゴニストは、抗体−薬物コンジュゲートであってもよい。前記薬物は、本発明に記載の抗体以外の別の知られている医薬活性成分であってもよく、例えば、ＩＲＦ５阻害剤、パクリタキセル、脂質低下薬又は血管新生阻害剤であるが、これらに限定されない。
本発明の他の側面では、ｃ−ＭＥＴに結合できる抗体又はその機能的断片を提供し、前記抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、且つ
前記重鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１から選ばれる少なくとも１つの重鎖可変領域の配列又はその突然変異配列を含み、且つ
前記軽鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４から選ばれる少なくとも１つの軽鎖可変領域の配列又はその突然変異配列を含む。
【０００９】
本発明の更に他の側面では、上記抗体又はその機能的断片、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内や皮下、又は経口経路を介して投与される。特に好ましくは、本発明の医薬組成物は、静脈内経路によって投与され、静脈内注射剤である。
本発明の医薬組成物において、さらに、虚血性心疾患又は血管内皮細胞虚血性損傷を治療又は予防する他の１つ又は複数の薬学的に活性な化合物を含む。前記薬学的に活性な化合物は、先行技術で知られている任意の虚血性心疾患又は血管内皮細胞虚血性損傷を治療又は予防するための化合物であることができる。
【００１０】
本発明の他の側面では、ｃ−ＭＥＴアゴニストを対象に投与することを含む、虚血性損傷の血管内皮細胞を保護する方法を提供する。好ましい側面では、前記ｃ−ＭＥＴアゴニストは、ｃ−ＭＥＴ抗体である。
好ましい実施態様において、前記ｃ−ＭＥＴ抗体は、ｃ−ＭＥＴの二量体化、チロシンリン酸化、及びｃ−ＭＥＴシグナル伝達経路の活性化を促進する活性を持つ。
他の好ましい実施態様において、前記ｃ−ＭＥＴ抗体は、ｃ−ＭＥＴ抗原で動物を免疫することにより調製されたモノクローナル抗体である。
【００１１】
他の好ましい実施態様において、前記ｃ−ＭＥＴ抗原は、免疫原性を有するｃ−ＭＥＴ完全長分子、融合タンパク質、分子断片又はポリペプチドである。
他の好ましい実施態様において、前記ｃ−ＭＥＴ抗体は、Ｂリンパ球の抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。
他の好ましい実施態様において、前記ｃ−ＭＥＴ抗体は、遺伝子工学的に改良されたが、依然としてアゴニスト活性を保持する抗体である。
他の好ましい実施態様において、前記ｃ−ＭＥＴ抗体は、ＦＲ、Ｆｃ断片がヒト化された抗体である。
【００１２】
他の好ましい実施態様において、前記ｃ−ＭＥＴ抗体は、完全ヒト抗体である。
他の好ましい実施態様において、前記ｃ−ＭＥＴ抗体は、アゴニスト活性を持つポリクローナル抗体である。
他の好ましい実施態様において、前記虚血性心疾患は、脳梗塞である。
他の好ましい実施態様において、前記組成物の投与方法は、静脈内注射である。
他の好ましい実施態様において、前記組成物は、脳血管を保護及び修復するために使用される。
他の好ましい実施態様において、前記組成物は、用于降低血液脳関門の透過性を低減させるために使用される。
他の好ましい実施態様において、前記組成物は、ニューロンを保護するために使用される。
他の好ましい実施態様において、前記組成物は、脳梗塞の体積を減少させるために使用される。
他の好ましい実施態様において、前記組成物は、梗塞領域の血流を維持するために使用される。
【００１３】
本発明の第３側面では、本発明の第１側面に記載の方法に従って開発された虚血性心疾患を治療するための抗体医薬を提供する。
他の好ましい実施例において、前記抗体医薬は、ハイブリドーマ細胞株により調製される。
他の好ましい実施例において、前記抗体医薬又はその抗原結合断片は、以下から選ばれる少なくとも１つのＣＤＲ領域配列又はその突然変異配列を含み、
抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ領域配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１、及び
抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ領域配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４。
本発明は、虚血性心疾患の治療するための、薬学的に実行可能な解決策を提供しながら、良好な薬効を有する代替医薬品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１ａは、本発明の実施例１におけるレンチウイルスシャトルベクターｐＲＲＬ−ＣＭＶ−ＥＤの制限酵素切断による同定を示す電気泳動図であり、図１ｂは、本発明の実施例１におけるｃ−ＭＥＴのキーのドメインＥＤ融合タンパク質の発現の検出結果を示す電気泳動図である。
【図２】図２は、本発明の実施例２における、ＥＤタンパク質に対するｃ−ＭＥＴ抗体ハイブリドーマ細胞の上清の結合能の検出結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例３におけるｃ−ＭＥＴ細胞外領域ＥＤタンパク質に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の結合能を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例４におけるｃ−ＭＥＴ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ＶＨ及びＶＬ遺伝子の取得結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例５におけるレンチウイルスシャトルベクターｐＲＲＬ−ＣＭＶ−ＶＨ及びｐＲＲＬ−ＣＭＶ−ＶＬの制限酵素切断による同定結果を示す電気泳動図である。
【図６】図６は、本発明の実施例６におけるｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の標的結合に対する検出結果を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例７におけるｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体が異なる処置時間で誘導されたＢｅｎｄ．３細胞におけるｃ−ＭＥＴ  Ｔｙｒ１２３４のリン酸化の検出結果を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例８におけるｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  結合活性の検出結果を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例９におけるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の作用を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例１０におけるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の移動に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の作用を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の実施例１１におけるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の微小管形成に対するｃ−ＭＥＴ  モノクローナル抗体の作用を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の実施例１３における酸素−グルコース欠乏の血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）の活性に対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の保護作用を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明の実施例１４における酸素−グルコース欠乏後の血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）のアポトーシスに対するヒト化キメラ抗体の保護作用を示すグラフである。
【図１４】図１４は、本発明の実施例１５における酸素−グルコース欠乏の血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）の死後の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出濃度に対するヒト化キメラ抗体の影響を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本発明の実施例１７における光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルの脳血管内皮細胞に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の保護作用を示すグラフである。
【図１６】図１６は、本発明の実施例１７におけるｉｎ  ｖｉｖｏモデル（マウス  ＭＣＡＯモデル）において血液脳関門関連タイトジャンクションタンパク質に対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の影響結果を示すグラフである。
【図１７】図１７は、本発明の実施例１７におけるｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体によるマウス心不全モデル（ＭＩ心筋梗塞モデル）の心筋梗塞領域の組織切片のＶＷＦ染色図である。
【図１８】図１８は、本発明の実施例１８における酸素−グルコース欠乏の血液脳関門インビトロモデルに対する抗ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の作用を示すグラフである。
【図１９】図１９は、本発明の実施例１８における光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルの血液脳関門透過性に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の保護作用を示すグラフである。
【図２０】図２０は、本発明の実施例１８のインビトロモデル（Ｂｅｎｄ．３細胞モデル）におけるｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の血液脳関門関連タイトジャンクションタンパク質への影響を示すグラフである。
【図２１】図２１は、本発明の実施例１９における塞栓糸によるマウス脳虚血モデル（ＭＣＡＯ）の脳梗塞体積に対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の作用を示すグラフである。
【図２２】図２２は、本発明の実施例１９における光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルの脳梗塞体積に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の作用を示すグラフである。
【図２３】図２３は、本発明の実施例１９におけるｃ−ＭＥＴ  ヒト化キメラ抗体によるマウス心不全モデル（ＭＩ心筋梗塞モデル）の心筋梗塞領域の組織切片のマッソン染色を示すグラフである。
【図２４】図２４は、本発明の実施例２０における光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルのニューロンに対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の保護作用を示すグラフである。
【図２５】図２５は、本発明の実施例２０における光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルの神経機能に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の保護作用を示すグラフである。
【図２６】図２６は、本発明の実施例２０における抗ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体によるマウス心不全モデル（ＭＩ心筋梗塞モデル）の心機能の評価を示すグラフである。
【００１５】
本発明の上記図面に関する実験及びその結果の詳細な説明は以下の通りである。
図１−ａは、レンチウイルスシャトルベクターｐＲＲＬ−ＣＭＶ−ＥＤの制限酵素切断による電気泳動図であり、レーン１は、ＤＮＡマーカーであり、レーン２は、レンチウイルスシャトルベクターｐＲＲＬ−ＣＭＶ−ＥＤがＡｇｅＩ及びＳａｌＩで二重消化された
サンプルであり、制限酵素切断の結果は、７５００ｂｐのベクターのバンド及び２７００ｂｐの目的遺伝子のバンドを得ることを示し、ヒトＭＥＴ細胞外領域ＥＤ断片のレンチウイルス発現プラスミドｐＲＲＬ−ＣＭＶ−ＥＤの構築に成功することを証明した。
図１−ｂは、ＭＥＴのキーのドメインのＥＤ融合タンパク質の発現の検出結果を示すグラフであり、ここで、レーン１は、発現上清ストック溶液（１：５希釈）であり、レーン２は、カラム通過溶液（１：５希釈）であり、レーン３は、２０ｍＭ  イミダゾール溶出画分であり、レーン４〜５は、５０ｍＭ  イミダゾール溶出画分であり、レーン６〜９は、２００ｍＭ  イミダゾール溶出画分であり、Ｍは、タンパク質分子量マーカーである。ここで、レーン５〜９では、１０５ＫＤａのバンドのサイズは、目的バンドの予想サイズに一致することは、ＭＥＴ細胞外領域のＥＤ融合タンパク質が発現及び精製に成功して得られることを証明した。
図２は、本発明の実施例２におけるＥＤタンパク質に対するｃ−ＭＥＴ抗体ハイブリドーマ細胞の上清の結合能の検出結果であり、ここで、横軸は、ｃ−ＭＥＴ抗体ハイブリドーマ上清のローディング体積（単位：μｌ）であり、縦軸は、波長４５０ｎｍでの吸光度である。結果は、１Ｈ９Ｄ６ハイブリドーマの上清は、ＭＥＴ細胞外領域のＥＤ融合タンパク質に特異的に結合でき、加えた体積が増加するほど、信号が増加することを示す。
図３は、本発明の実施例３におけるｃ−ＭＥＴ細胞外領域ＥＤタンパク質に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の結合能を示し、ここで、横軸は、ｃ−ＭＥＴ抗体の濃度（単位：ｎｇ／ｍｌ）であり、縦軸は、波長４５０ｎｍでの吸光度である。結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は、ｃ−ＭＥＴ細胞外領域のＥＤ融合タンパク質に特異的に結合でき、加えた体積が増加するほど、信号が増加し、該系の条件下で、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の最小検出濃度は０．０６ｎｇ／ｍｌであることを示し、ＭＥＴ細胞外領域ＥＤ融合タンパク質に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体１Ｈ９Ｄ６の結合能が強いことを示す。
【００１６】
図４は、本発明の実施例４におけるｃ−ＭＥＴ抗体の重鎖、軽鎖可変領域ＶＨ及びＶＬ遺伝子の取得を示し、ここで、レーン１は、ＤＮＡマーカーであり、レーン２は、ＶＨ遺伝子のＰＣＲ産物であり、レーン３は、ＶＬ遺伝子のＰＣＲ産物であり、電気泳動の結果は、マウス由来のＶＨ及びＶＬ遺伝子のＰＣＲ産物は、それぞれ約３５１及び３３６ｂｐの特異的なバンドを示し、マウス由来のＶＨ及びＶＬ遺伝子の取得に成功することを示す。
図５は、本発明の実施例５におけるレンチウイルスシャトルベクターｐＲＲＬ−ＣＭＶ−ＶＨ及びｐＲＲＬ−ＣＭＶ−ＶＬの制限酵素切断による同定を示し、ここで、レーン１は、ＤＮＡマーカーであり、レーン２は、レンチウイルスシャトルベクターｐＲＲＬ−ＣＭＶ−重鎖がＡｇｅＩ及びＳａｌＩで二重消化されたサンプルであり、レーン３は、レン
チウイルスシャトルベクターｐＲＲＬ−ＣＭＶ−軽鎖がＡｇｅＩ及びＳａｌＩで二重消化
されたサンプルであり、制限酵素切断結果は、７５００ｂｐのベクターのバンド及び１４００ｂｐ（重鎖）及び７００ｂｐ（軽鎖）の目的遺伝子のバンドを得ることを示し、キメラ抗体の軽鎖、重鎖レンチウイルス発現プラスミドの構築に成功することを示す。
図６は、本発明の実施例６におけるｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の標的結合に対する検出結果を示し、ここで、横軸は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の濃度（単位：ｎｇ／ｍｌ）であり、縦軸は、波長４５０ｎｍでの吸光度である。結果は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は、ＨＧＦ／ＭＥＴの特異的結合を遮断することができ、濃度が高くなるほど、遮断効果が高くなり、該系の条件下で、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体がＨＧＦ／ｃ−ＭＥＴの特異的結合に対する最大阻害率は７９．７％であることを示す。
【００１７】
図７は、本発明の実施例７におけるｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体が異なる処置時間で誘導されたＢｅｎｄ．３細胞におけるｃ−ＭＥＴ  Ｔｙｒ１２３４のリン酸化の検出結果を示す。
図８は、本発明の実施例８におけるｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  結合活性の検出結果を示し、ここで、横軸は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体のローディング濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）であり、縦軸は、波長４５０ｎｍでの吸光度である。結果は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体はＨＵＶＥＣ細胞表面のｃ−ＭＥＴタンパク質に特異的に結合でき、加えた濃度が高くなるほど、信号が増加することを示す。
図９は、本発明の実施例９におけるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の作用を示し、ここで、横軸は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）であり、縦軸は、波長４５０ｎｍでの吸光度である。結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体はＨＵＶＥＣ細胞の増殖効果を促進でき、加えた濃度が高くなるほど、効果はより顕著になることを示す。
図１０は、本発明の実施例１０におけるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の移動に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の作用を示し、ここで、横軸は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）であり、縦軸は、トランスウェルチャンバーの下面にある細胞数である。結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は、ＨＵＶＥＣ細胞の遊走効果を促進でき、加えた濃度が高くなるほど、効果はより顕著になることを示す。
【００１８】
図１１は、本発明の実施例１１におけるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の微小管形成に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の作用を示し、ここで、図１１−Ａは、ゲル塗布０時間後の対照群細胞の写真であり、１１−Ｂは、ゲル塗布０時間後の１Ｈ９Ｄ６投与群細胞の写真であり、ここで、１Ｈ９Ｄ６の濃度は１μｇ／ｍｌであり、図１１−Ｃは、ゲル塗布７２時間後の対照群細胞の写真であり、図１１−Ｄは、ゲル塗布７２時間後の１Ｈ９Ｄ６投与群細胞の写真であり、ここで、１Ｈ９Ｄ６の濃度は１μｇ／ｍｌである。ＡとＢを比較すると、初期細胞状態は一貫することを示し、ＣとＤを比較すると、１Ｈ９Ｄ６（１μｇ／ｍｌ）で７２時間作用した後、ＨＵＶＥＣ細胞の微小管形成数が大幅に増加することを示し、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体はＨＵＶＥＣ細胞の微小管の生成を促進できることを示す。
図１２は、本発明の実施例１３における酸素ーグルコース欠乏の血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）の活性に対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の保護作用を示し、ここで、横軸は、サンプル情報であり、ここで、対照群は、酸素ーグルコース欠乏処理なしのサンプルであり、損傷群は、酸素ーグルコース欠乏処理を受けたサンプルであり、保護群の値はｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）であり、縦軸は、波長４５０ｎｍでの吸光度である。結果は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は酸素ーグルコース欠乏の血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）に対して保護効果を有し、加えた濃度が高くなるほど、効果はより顕著になることを示す。
【００１９】
図１３は、本発明の実施例１４におけるｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の酸素ーグルコース欠乏後の血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）のアポトーシスへの影響を示し、図１３−ａでは、対照群は酸素−グルコース欠乏処理なしのサンプルであり、損傷群は、酸素ーグルコース欠乏処理を受けたサンプルであり、治療群は、酸素ーグルコース欠乏処理を受けるとともに、抗ｃ−ＭＥＴヒト化抗体を添加したサンプルであり、数値は抗ｃ−ＭＥＴヒト化抗体の濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）である。図１３−ｂは、抗ｃ−ＭＥＴヒト化抗体が投与された酸素−グルコース欠乏後の血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）のアポトーシス細胞数の統計結果を示す。結果は、血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）は、酸素−グルコース欠乏処理を経た後に、アポトーシス細胞数は大幅に増加し、抗ｃ−ＭＥＴヒト化抗体の添加に伴い、アポトーシス細胞数は減少することを示し、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は酸素ーグルコース欠乏後の血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）のアポトーシスに対して保護効果を有し、抗ｃ−ＭＥＴヒト化抗体の添加濃度が高くなるほど、保護効果はさらに顕著になる。
図１４は、本発明の実施例１５におけるｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体が酸素−グルコース欠乏による血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）死の指標である乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に与える影響を示し、ここで、横軸は、サンプルの情報であり、ここで、対照群は酸素−グルコース欠乏処理なしのサンプルであり、損傷群は酸素−グルコース欠乏処理を受けたサンプルであり、治療群の数値は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）であり、縦軸は、ＬＤＨ濃度（単位μｇ／ｍｌ）である。結果は、血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）が酸素−グルコース欠乏処理を経た後、ＬＤＨ濃度は大幅に増加し、抗ｃ−ＭＥＴヒト化抗体の添加に伴い、ＬＤＨ濃度は低減することを示し、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は酸素−グルコース欠乏血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）のＬＤＨ濃度を低減させる効果を有し、抗ｃ−ＭＥＴヒト化抗体の加入濃度が高くなるほど、低減効果はさらに顕著になること証明する。
【００２０】
図１５は、本発明の実施例１７におけるｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体が光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルの脳血管内皮細胞に対して保護作用を奏する脳血管内皮細胞の免疫組織化学的染色結果を示し、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、ＶＷＦは、血管内皮細胞マーカーであり、ＤＡＰＩは、核染色マーカーであり、合併とは、ＶＷＦ及びＤＡＰＩで染色された同一視野の写真が画像結合によって合成された画像を指す。結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は、光化学的損傷後の脳血管内皮細胞損傷を顕著に低減でき、血管完全性が良好であり、光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルによる脳梗塞に対して保護作用を有することを示す。
図１６は、本発明の実施例１７におけるｉｎ  ｖｉｖｏモデル（マウス  ＭＣＡＯモデル）において血液脳関門関連タイトジャンクションタンパク質に対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の影響結果を示すグラフである。図１６−ａは、ｃ−ＭＥＴ抗体の、糸塞栓法塞栓糸によるマウス脳虚血モデル（ＭＣＡＯ）の脳血管内皮細胞に対する影響及び密着結合タンパク質ＺＯ−１の発現量に対する影響の結果を示し、ここで、偽手術群は、動物を抱水クロラールで麻酔し、仰臥位固定する。損傷のモデリングを行わずに、正中頸部切開を行って右総頸動脈、外頸動脈、内頸動脈を剥離する。損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群は１Ｈ９Ｄ６精製抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、ＶＷＦは血管内皮細胞マーカーであり、ＺＯ−１は、密着結合タンパク質であり、合併とは、ＶＷＦ及びＺ０−１で染色された同一視野の写真が画像結合によって合成された画像を指す。結果は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体群の脳梗塞虚血半影帯に微小血管の完全性は損傷群よりも優れ、ＺＯ−１の発現量も比損傷よりも高くなることを示し、血液脳関門の破壊が少ない。図１６−ｂは、塞栓糸によるマウス脳虚血モデル（ＭＣＡＯ）の脳梗塞領域組織における密着結合タンパク質ＺＯ−１の発現量に対するｃ−ＭＥＴ抗体のウエスタンブロッティング結果であり、ここで、偽手術群は、動物を抱水クロラールで麻酔し、仰臥位固定する。正中頸部切開を行って、損傷のモデリングを行わずに右総頸動脈、外頸動脈、内頸動脈を剥離する。損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群は、１Ｈ９Ｄ６精製抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、β−アクチンは、ハウスキーピングタンパク質であり、ＷＢ内部標準として、ＺＯ−１は、密着結合タンパク質である。結果は、損傷群は、ＺＯ−１タンパク質の発現レベルが有意に低減するが、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体群は、ＺＯ−１タンパク質の発現レベルが偽手術群と基本的に一致することを示し、マウスＭＣＡＯモデルにおけるＺＯ−１タンパク質は有意に低減し、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体はＺＯ−１タンパク質の発現レベルを顕著に向上でき、偽手術群の発現レベルに近くすることを示す。
図１７は、本発明の実施例１７におけるｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体がマウス心不全モデル（ＭＩ心筋梗塞モデル）の心筋梗塞領域の組織切片のＶＷＦを染色するグラフを示す。ここで、対照群は、偽手術群であり、損傷群は、マウスＭＩ心筋梗塞後、尾静脈に同量の生理食塩水を注射し、治療群は、マウスＭＩ心筋梗塞後、尾静脈に１Ｈ９Ｄ６ヒト化抗体を３ｍｇ／ｋｇで注射し、結果は、対照群は、ＶＷＦ染色像が明瞭であり、血管構造が明瞭で完全であり、損傷群は、ＶＷＦ染色像が明瞭であり、血管部位構造がひどく損傷し、ＭＩ心筋梗塞によって引き起こされる血管損傷が重篤であることを示し、治療群は、ＶＷＦ染色像が明瞭であり、血管構造は依然とし比較的に完全に維持し、抗ｃ−ＭＥＴ  ヒト化抗体がマウス心不全モデル（ＭＩ心筋梗塞モデル）による心臓の微小血管損傷に対して保護作用を有することを示す。
【００２１】
図１８は、本発明の実施例１８における酸素−グルコース欠乏血液脳関門インビトロモデルに対する抗ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の作用結果を示し、ここで、横軸は、サンプルの情報であり、ここで、対照群は、酸素−グルコース欠乏処理なしのサンプルであり、損傷群は、酸素−グルコース欠乏処理を受けたサンプルであり、損傷群の数値は、抗ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）であり、縦軸は、波長４５０ｎｍでの吸光度である。結果は、血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）は酸素−グルコース欠乏処理を経た後、細胞層の完全性が損なわれ、細胞層を透過するマウスの末梢血中のリンパ球の数は有意に増加し、抗ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は酸素−グルコース欠乏後の血液脳関門インビトロモデルに対して保護効果を有し、透過したマウスの末梢血中のリンパ球の数は減少し、加えた濃度が高くなるほど、効果はより顕著になることを示す。
図１９は、本発明の実施例１８における光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルの血液脳関門透過性に対するｃ−ＭＥＴ抗体の保護作用を示し、ここで、図１９−ａは、動物の脳組織の写真を示し、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、図１９−ｂは、統計後のエバンスブルー含有量の結果を示す。横軸は、群分けの状況を示し、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、縦軸はエバンスブルー含有量（単位：脳組織でμｇ／ｇ）であり、結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は、光化学的損傷後動物脳組織におけるエバンスブルー含有量を有意に低減でき、光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルによる血液脳関門の透過性に対して修復作用を有することを示す。
【００２２】
図２０は、本発明の実施例１８におけるインビトロモデル（Ｂｅｎｄ．３細胞モデル）においてｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体が血液脳関門関連タイトジャンクションタンパク質に与える影響の結果を示す。図２０−ａ及び２０−ｂは、それぞれＢｅｎｄ．３酸素−グルコース欠乏モデルにおける密着結合タンパク質であるクローディン−５及びＺＯ−１の蛍光定量ＰＣＲの結果を示し、ここで、図２０−ａは、密着結合タンパク質クローディン−５の結果であり、図２０−ｂは、密着結合タンパク質ＺＯ−１の結果である。ここで、対照群は、酸素−グルコース欠乏処理なしの細胞サンプルであり、損傷群は、酸素−グルコース欠乏処理を受けた、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を添加しない細胞サンプルであり、治療群は、酸素−グルコース欠乏処理を受けた、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体（濃度は１００００ｎｇ／ｍｌ）を添加した細胞サンプルである。ここで、横軸は、サンプルの情報であり、縦軸は、各遺伝子のｍＲＮＡの相対的な転写レベルの結果であり、対照群の目的遺伝子のｍＲＮＡ転写レベルを１．０とする。結果は、酸素−グルコース欠乏後の血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）のクローディン−５及びＺＯ−１タンパク質のｍＲＮＡ転写レベルは有意に低減し、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の添加に伴い、クローディン−５及びＺＯ−１タンパク質のｍＲＮＡ転写レベルは有意に高くなり、対照群の発現レベルを超えることを示す。このように、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は酸素−グルコース欠乏血管内皮細胞における密着結合タンパク質のｍＲＮＡ転写レベルは有意に改善することが分かる。
図２１は、本発明の実施例１９における塞栓糸によるマウス脳虚血モデル（ＭＣＡＯ）の脳梗塞体積に対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の作用を示し、図２１−ａは、動物の脳組織剖面の写真を示し、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、図２１−ｂは、統計後の脳梗塞体積の結果である。横軸は、群分けの状況であり、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、縦軸は、脳梗塞の体積（単位ｍｍ3）である。結果は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は塞栓糸によるマウス脳虚血モデル（ＭＣＡＯ）の動物脳梗塞の体積を顕著に低減でき、ＳＤラット塞栓糸によるマウス脳虚血モデル（ＭＣＡＯ）による脳梗塞に対して保護作用を有することを示す。
図２２は、本発明の実施例１９における光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルの脳梗塞体積に対するｃ−ＭＥＴ抗体の作用を示し、ここで、図２２−ａは、動物脳組織剖面の写真であり、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、図２２−ｂは、統計後の脳梗塞体積の結果である。横軸は、群分けの状況であり、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、縦軸は、脳梗塞体積（単位ｍｍ3）であり、結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は、光化学的損傷後の動物脳梗塞体積を顕著に低減でき、光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルによる脳梗塞に対して保護作用を有することを示す。
【００２３】
図２３は、本発明の実施例１９におけるｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体によるマウス心不全モデル（ＭＩ心筋梗塞モデル）の心筋梗塞領域の組織切片のマッソン染色結果を示す。ここで、図２３−ａは、マッソン染色の結果であり、ここで、コラーゲン線維は緑色として現れ、筋線維は赤色として現れ、赤血球はオレンジ色として現れ、ここで、対照群は偽手術群であり、損傷群の０ｍｇ／ｋｇ群は、マウスＭＩ心筋梗塞後に、尾静脈に同量の生理食塩水を注射した単独損傷群であり、損傷群の１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ群は、２つの治療群であり、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を注射し、図２３−ｂは、梗塞領域の分布比（コラーゲン線維／筋線維）の結果であり、ここで、横軸は、各群の記号であり、ここで、対照群は偽手術群であり、損傷群の０ｍｇ／ｋｇ群は、マウスＭＩ心筋梗塞後に尾静脈に同量の生理食塩水を注射した単独損傷群であり、損傷群の１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ群は、２つの治療群であり、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を注射し、縦軸は、マウス心臓コラーゲン線維／筋線維の割合（単位％）である。結果は、対照群では、コラーゲン線維の陽性染色はほとんどなく、損傷群のコラーゲン線維染色は明瞭であり、ＭＩ心筋梗塞によって引き起こされる心筋線維化が重篤であることを示し、治療群心肌組織の線維化程度が顕著に軽減し、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体濃度が高くなるほど、線維化程度はさらに顕著に軽減し、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体がマウス心不全モデル（ＭＩ心筋梗塞モデル）による心臓線維化に対して抑制作用を有することを示す。
図２４は、本発明の実施例２０における光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルのニューロンに対するｃ−ＭＥＴ抗体の保護作用を示し、図２４−ａは、脳梗塞領域のニューロンの免疫組織化学的染色の結果であり、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、活性化カスパーゼ−３は、細胞アポトーシスマーカーであり、ＮｅｕＮは、ニューロン細胞マーカーであり、合併とは、活性化カスパーゼ−３及びＮｅｕＮで染色された同一視野の写真が画像結合によって合成された画像を指し、図２４−ｂは、統計後の単一視野内のアポトーシスのニューロン細胞数の結果である。横軸は群分けの状況であり、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、縦軸はアポトーシスのニューロン細胞数である。結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は光化学的損傷後の脳梗塞領域のニューロン細胞の損傷を顕著に低減でき、神経細胞の死細胞数は顕著に低減し、光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルによる脳梗塞に対して保護作用を有することを示す。
【００２４】
図２５は、本発明の実施例２０における光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルの神経機能に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の保護作用を示し、横軸は群分けの状況であり、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、縦軸は、神経機能スコアであり、スコア基準は以下の通りである。
０点、神経学的欠損の症状なし；
１点、軽度の神経学的欠損であり、左前足を完全に伸ばすことができない；
２点、中等度の局所神経学的欠損であり、歩行中に左に曲がる；
３点、重篤な局所神経学的欠損であり、左側に倒れる；
４点、自発的な歩行出来ない、意識レベルが低下する；
結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は、光化学的損傷後の動物神経機能を顕著に改善でき、光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルによる脳梗塞に対して保護作用を有することを示す。
図２６は、本発明の実施例２０におけるｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体によるマウス心不全モデル（ＭＩ心筋梗塞モデル）の心機能の評価結果を示し、心エコー検査を使用して評価する。ここで、図２６−ａは、心室駆出率（ＥＦ）の結果であり、ここで、横軸は、各群の記号であり、ここで、対照群は偽手術群であり、損傷群の０ｍｇ／ｋｇ群はマウスＭＩ心筋梗塞後に尾静脈に同量の生理食塩水を注射した単独損傷群であり、損傷群の１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ群は、２つの治療群であり、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を注射し、縦軸は、マウスの心室駆出率（ＥＦ）（単位％）である。図２６−ｂは、左室内径短縮率（ＦＳ）の結果であり、横軸の記号は図２６−ａと同じ、縦軸は、左室内径短縮率（ＦＳ）（単位％）である。図２６−ｃは、左室拡張末期容量（ＥＤＶ）の結果であり、横軸の記号は図２６−ａと同じ、縦軸は、左室内径短縮率（ＦＳ）（単位μｌ）である。図２６−ｄは、左室収縮末期容量（ＥＳＶ）の結果であり、横軸の記号は図２６−ａと同じ、縦軸は、左室収縮末期容量（ＥＳＶ）（単位μｌ）である。結果は、損傷群のＥＦ値はいずれも４０％未満であり、心筋梗塞モデルの構築に成功し、１ｍｇ／ｋｇ／３ｄのｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を尾静脈に注射した後に、ＥＦ値は回復の傾向があり、３ｍｇ／ｋｇ／３ｄのｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を尾静脈に注射した後、ＥＦ値の回復はさらに明らかになり、ＦＳ値、ＥＤＶ値及びＥＳＶ値は、いずれも同様の傾向があり、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体がマウスＭＩ心筋梗塞モデルの心機能に対して保護効果を有することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。当分野の定義及び用語は、当業者は具体的にはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照できる。アミノ酸残基の略語は、当分野で使用される２０個の通常のＬ−アミノ酸の１つの標準の３文字及び／又は１文字略号を指す。特に、本明細書に記載の用語の意味は、中国特許出願２０１１１０１３１０２９．Ｘにも記載されている。
本発明の広い範囲に示される数値範囲及びパラメータ近似値であるが、具体的な実施例に示される数値は、可能な限り正確に記載される。しかしながら、いずれの数値には必ずしもそれぞれの測定値の標準偏差による一定の誤差が含まれる。また、本明細書に開示されるすべての範囲は、それに含まれる任意及びすべてのサブ範囲をカバーすると理解されるべきである。例えば、「１〜１０」という範囲には最小値１から最大値１０（端点を含む）までの任意及びすべてのサブ範囲を含むことを理解すべきであり、つまり、最小値１又はそれ以上からのサブ範囲、例えば、１〜６．１が挙げられ、及び最大値１０又はそれ以下までのサブ範囲、例えば、５．５〜１０が挙げられる。また、「本明細書に組み込まれる」と呼ばれるあらゆる参照文献は、その全体として組み込まれることを理解すべきである。
また、本明細書で使用されるように、明確かつ明示的に１つの対象に限定されない限り、単数形はそれが指す対象の複数形を含む。「又は」という用語は、文脈から別に明示されない限り、「及び／又は」という用語と互換的に使用される。
【００２６】
本明細書で使用される「可溶性」タンパク質という用語は、生物学的に関連する温度、ｐＨレベル及び浸透圧で水溶液に溶解できるタンパク質を意味する。ある実施態様において、本発明の融合タンパク質は、可溶性タンパク質である。本明細書で使用される「可溶性融合タンパク質」とは、該融合タンパク質に膜貫通領域及び細胞内領域を含まないことを意味する。
本明細書で使用されるように、「単離された」という用語とは、（１）最初に生成される場合（自然環境にある及び／又は試験装置にある）にそれに関連する少なくとも幾つかの成分から単離され、及び／又は（２）人工生産、調製及び／又は製造により得られた物質及び／又は実体を指す。単離された物質及び／又は実体は、その最初に関連する他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、ほとんど１００％又は１００％から単離されることができる。ある実施態様において、本発明の融合タンパク質は、単離された融合タンパク質である。
「部分」及び「断片」という用語は、互換可能にポリペプチド、核酸又は他の分子構築物の一部を指す。
本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒトのような哺乳類動物を指すが、他の動物、例えば、ペット（例えば、犬、猫など）、家畜（例えば、牛、羊、豚、馬など）又は実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギなど）も含まれる。
【００２７】
本明細書で使用される「一致性」、「パーセント一致性」、「相同性」又は「同一性」という用語は、２つのアミノ酸配列間又は核酸配列間の配列同一性を指す。２つの配列を比較することによりパーセント一致性を確定することができ、パーセント一致性とは、比較される配列が同一な位置を共有する残基（即ち、アミノ酸又はヌクレオチド）の数を意味する。当技術分野の標準アルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ、  １９８１、  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ  ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２；  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、  １９７０、  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３；  Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ、  １９８８、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ、  ８５：２４４４）又はこれらのアルゴリズムのコンピューター化されたバージョン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、  Ｍａｄｉｓｏｎ、  ＷＩ）により配列のアライメント及び比較を行い、前記コンピューター化されたバージョンは、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡとして本開示に用いられる。また、アメリカ国立衛生研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ）から入手できるＥＮＴＲＥＺにより配列の比較に使用できる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合には、各々のプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＮ、米国立バイオテクノロジー情報センターのインターネットサイトで入手可能な）のデフォルトパラメータパラメータを使用できる。１つの実施態様において、ギャップ重みが１のＧＣＧを使用して２つの配列の百分率同一性を決定でき、各アミノ酸のギャップには、２つの配列間の単一のアミノ酸ミスマッチであるかのように重みが付けられる。或いは、ＧＣＧ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の配列解析ソフトウェアパッケージの一部とするＡＬＩＧＮ  プログラム（バージョン２．０）を利用できる。
組成物
本発明は、さらに、有効量の本発明の抗体又はその機能的断片、及び薬学的に許容される担体を含む医薬品組成物を提供する。好ましくは、前記抗体又はその機能的断片は、ｃ−ＭＥＴに結合することができ、前記抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、且つ
前記重鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１から選ばれる少なくとも１つの重鎖可変領域の配列又はその突然変異配列を含み、且つ
前記軽鎖ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４から選ばれる少なくとも１つの軽鎖可変領域の配列又はその突然変異配列を含む。
【００２８】
好ましくは、上記突然変異領域の配列とは、元の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、又は少なくとも８５％の配列同一性、又は少なくとも９０％の配列同一性、又は少なくとも９５％の配列同一性、又は少なくとも９７％、９８％や９９％の配列同一性を有する配列を指す。
当技術分野でよく知られているように、「同一性パーセント」という用語は、配列を比較することにより測定された２つ又はそれ以上のポリペプチド配列又は２つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を意味する。当技術分野では、「同一性」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も指し、具体的な状況に応じて決定され、例えば、これらの配列ストリング間の一致によって決定される。「同一性」及び「相似性」は、以下に説明する方法で容易に計算できる。前記方法は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．ディター）  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ  （Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．ディター）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ  （Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．＆Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．ディター）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ｖｏｎＨｅｉｎｊｅ、Ｇ．ディター）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８７）；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．＆Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．ディター）  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）を含むが、これらに限定されない。同一性を決定する好ましい方法は、決定された配列間で最良の一致が得られるように設計される。同一性及び相似性を決定する方法は、一般に入手可能なコンピュータープログラムに書き込まれる。シーケンスアラインメント及び同一性パーセントはシーケンス分析ソフトウェア（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  バイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲＩｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラム）により計算することができる。
本発明の医薬品組成物において、前記抗体は、治療有効量の範囲で含まれ、例えば、前記抗体又はその機能的断片は、重量比で、前記医薬品組成物に対して０．０００００１ｗｔ％〜５０ｗｔ％、好ましくは０．００００１ｗｔ％〜２０ｗｔ％、より好ましくは０．  ０００１ｗｔ％〜１０ｗｔ％である。特に好ましくは、前記抗体又はその機能的断片は、重量比で、前記医薬品組成物に対して０．００１ｗｔ％〜５ｗｔ％である。
【００２９】
本発明の組成物は、血管内皮細胞の修復・増殖を促進するために直接使用することができる、特に血管損傷性疾病に用いられる。さらに、同時に他の治療剤又は補助治療剤と併用することができる。好ましくは、前記医薬品組成物は、さらに、１つ又は複数の虚血性心疾患又は血管内皮細胞虚血性損傷を治療又は予防するための薬学的に活性な化合物を含む。
通常、本発明のｃ−ＭＥＴアゴニストは、非毒性で不活性の薬学的に許容される水性媒体に配合されることができ、ここで、ｐＨは、通常、約５〜９であり、好ましくはｐＨが約６〜８である。
本明細書で使用されるように、「含む」という用語は、本発明の混合物又は組成物に各成分を一緒に適用できることを意味する。従って、「主に……からなる」及び「……からなる」という用語は、「含む」という用語に含まれる。本明細書で使用されるように、「有効量」又は「有効用量」という用語は、ヒト及び／又は動物に機能又は活性を生み出すことができ、ヒト及び／又は動物が許容できる量を指す。
【００３０】
本明細書で使用されるように、「医薬的に許容される」又は「薬学的に許容される」成分は、ヒト及び／又は哺乳類動物に適用し、過度の有害な副作用（毒性、刺激、及びアレルギーなど）のないもの、即ち、合理的な利益／リスク比を持つ物質を指す。「薬学的に許容される担体」という用語は、様々な賦形剤及び希釈剤を含む、治療剤の投与のための担体を指す。
本発明の組成物は、安全かつ有効な量のｃ−ＭＥＴ抗体及び薬学的に許容される担体を含む。そのような担体は、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセリン、エタノール、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。通常、医薬品製剤は投与方法に対応し、本発明の医薬品組成物は、注射剤の形態で調製されることができ、例えば、生理食塩水、又はグルコース及び他の補助治療剤を含む水溶液を使用し、常法により調製することができる。前記医薬品組成物が無菌条件下で製造されるのは適当である。活性成分の投与量は、治療有効量である。本発明の医薬品製剤は、徐放性製剤とすることもできる。
本発明に係るｃ−ＭＥＴ抗体の有効量は、投与方法及び治療される疾患の重症度に応じて異なり得る。好ましい有効量の選択は、様々な要因に基づいて（例えば、臨床試験を通じて）当業者により決定され得る。前記要因は、前記ｃ−ＭＥＴ抗体の薬物動態パラメータ、例えば、バイオアベイラビリティ、代謝、半減期など；患者の治療される疾患の重症度、患者の体重、患者の免疫状態、投与経路などを含むが、これらに限定されない。通常、本発明のｃ−ＭＥＴ抗体は、約０．００００１ｍｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ動物体重（好ましくは０．０００１ｍｇ〜ｌ０ｍｇ／ｋｇ動物体重）の用量で毎日投与される場合には、満足させる効果を得ることができる。例えば、治療状况の切迫した要求に応じて、いくつかの分割された用量を毎日与えることができるか、または用量を比例的に減らすことができる。
【００３１】
本発明の好ましい態様としては、本発明の抗体は、ヒト化ｃ−ＭＥＴ抗体であり、０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ動物体重で毎日投与する場合には、良い效果を有し、好ましくは、０．５〜２００ｍｇ／ｋｇ動物体重で毎日投与し、より好ましくは、１〜１００ｍｇ／ｋｇ動物体重で毎日投与する。
本発明のｃ−ＭＥＴ抗体の投与方法は、特に限定されなく、全身的であっても局所的であってもよい。例えば、本発明のｃ−ＭＥＴ抗体は、脳内定位注射、腹腔内注射、静脈内注射、経口投与、皮下注射、皮内注射などにより動物に投与することができ、より好ましくは、静脈内注射である。
前記ｃ−ＭＥＴ抗体の用途を知見した後に、当技術分野でよく知られている様々な方法を使用して前記ｃ−ＭＥＴ抗体又はそのコードする遺伝子、又はその医薬品組成物を動物又はヒトに投与することができる。好ましくは、ｃ−ＭＥＴ抗体の組換えタンパク質は、注射などの方法により対象に投与することができる。一方、このｃ−ＭＥＴ抗体遺伝子を含む発現ベクター（例えば、ウイルス又はプラスミドなど）を標的臓器に送達し、ｉｎ  ｖｉｖｏでｃ−ＭＥＴ抗体タンパク質を発現させ、遺伝子治療の目的に達する。
【００３２】
本明細書で使用される「医薬品組成物」、「併用医薬品」及び「医薬品の組み合わせ」という用語は、互換的に使用され、特定の目的を達成するために一緒に組み合わされた少なくとも１つの薬物及び任意薬学的に許容される担体又はアジュバントの組み合わせを意味する。ある実施態様において、前記医薬品組成物は、本発明の目的を達成するために一緒に作用することができる限り、時間及び／又は空間において分離されている組み合わせを含む。例えば、前記医薬品組成物に含まれる成分（例えば、本発明による抗体、核酸分子、核酸分子の組み合わせ及び／又はコンジュゲート）は、全体として別々に対象に投与することができ、または別々に対象に投与することができる。医薬組成物に含まれる成分が対象に別々に投与される場合には、成分は、対象に同時にまたは逐次的に投与することができる。好ましくは、前記薬学的に許容される担体は、水、緩衝水溶液、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）などの等張な塩溶液、グルコース、マンニトール、デキストロース、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセリン、ヒアルロン酸、エタノール、又はポリプロピレングリコール、トリグリセリドなどのポリアルキレングリコールである。使用される薬学的に許容される担体のタイプは、特に、本発明の組成物が経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内または静脈内投与用に調製されるかどうかに依存する。本発明の組成物は、添加剤として湿潤剤、乳化剤または緩衝物質を含むことができる。
本発明の医薬組成物は、当技術分野で知られている任意の方法を使用して所望の部位に送達することができる。使用される送達装置の実例は、カテーテル（例えば、バルーンカテーテル、注入カテーテル、スティレットカテーテル（Ｓｔｉｌｅｔｔｏｃａｔｈｅｔｅｒ）、針、無針注射器、ステント、注入スリーブ、ネット、心臓ハーネス（ｃａｒｄｉａｃｈａｒｎｅｓｓ）、シャント、ペースメーカー、植込み型除細動器、縫合糸、釘、血管周囲ラップ（ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒｗｒａｐ）、創傷部位の輪郭に実質的に適合できる柔軟なシート又はフィルム、チューブ、グラフト、及びポンプを含むが、これらに限定されない。ＨＧＦアイソフォームを送達する方法の具体的な実例は、冠状静脈洞に流入する静脈（例えば、大心臓静脈、中部心臓静脈、左心室後部静脈、前心室間静脈、または他の任意の分岐）に設けられるバルーンカテーテルによる送達；１つまたは複数の冠状動脈（例えば、右冠状動脈または左冠状動脈など）の内腔に通じているカテーテルによる送達、ここで、ＨＧＦアイソフォームがその部位で膨らんだバルーンにコーティングされているか、又はカテーテルの先端から注入され；開心術または心臓移植中の針による送達（例えば、左心房、右心房、左心室や右心室への送達）；開心手術またはマイクロインターベンショナル手術により内部入口により左心房、右心室や左心室を通って心膜腔への送達又は外部入口により心膜領域への送達、或いは注射、カテーテル挿入、レーザー誘発灌流チャネル、スリーブによる チューブ挿入、パーティクルガンまたはポンプを使用して形成された経皮注入口を介する心膜領域への送達；順行性灌流を介して組織に血液を送達するチューブに配置されたカテーテルからの送達、または逆行性灌流を介して組織から血液を受け取るチューブに配置されたカテーテルからの送達；或いは、血管の開存性を維持するための管腔内デバイスまたは血管内プロテーゼ（例えば、ステント、グラフト、ステントグラフト、大静脈フィルター）による送達を含むが、これらに限定されない。１つの実施態様において、前記装置は、生分解性であるため、不要になった後に装置を取り外す必要はない。ある実施態様において、前記２つのＨＧＦアイソフォームは、ステントを使用して送達される。他の実施態様において、前記ステントは、ポリマーベースではないステンレス鋼ステント、ポリマーベースのステンレス鋼ステント、ポリマーベースではないコバルトクロムステント、及びポリマーベースのコバルトクロムステントから選択される。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、任意の適切な経路によって投与することができ、例えば、経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内または静脈内に投与することができる。
本明細書で使用される「治療剤」という用語は、治療作用（例えば、疾患及び／又は病状の治療、予防、緩和又は抑制）を果たす可能な任意の物質又は実体（ｅｎｔｉｔｙ）を意味し、それは、化学治療剤、放射線療法剤、免疫治療剤、温熱治療剤（ｔｈｅｒｍａｌｌｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）などを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」とは、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の超可変領域を意味し、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．によって定義される（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ、  ５ｔｈ  Ｅｄ．、  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、  ＮＩＨ、  １９９１、  及び後のバージョン）。３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲがある。場合に応じて、本明細書で使用されるＣＤＲ又はＣＤＲｓという用語は、これらの領域の1つ、またはこれらの領域のいくつかや全部でさえも示すために使用され、この領域は、抗原またはその認識エピトープに対する抗体の親和性を介した結合に関与するアミノ酸残基のほとんどを含む。
【００３４】
本発明は、２つの核酸又はアミノ酸配列間の「一致性」、「同一性」又は「相似性」とは、最適なアラインメント（最もよいアラインメント）後に得られたものであり、比較される２つの配列間で同じヌクレオチド又は同じアミノ酸残基の百分率を指し、該百分率は、純粋に統計的であり、且つ２つの配列間の差異はランダムに分布し、それらの全長をカバーする。２つの核酸又はアミノ酸配列間的配列比較は、通常、最適な方法でそれらを照合した後に行われ、前記比較セクションまたは「比較ウィンドウ」で実行できる。シーケンスを比較するための最適なアラインメントは、手動で実装できることに加えて、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）  ［Ａｄ．  Ａｐｐ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２］の局地的相同性アルゴリズム、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）  ［Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３］の局地的相同性アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）  ［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムを使用するコンピューターソフトウェア（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ＆ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、  Ｍａｄｉｓｏｎ、  ＷＩ、  又はＢＬＡＳＴ  Ｎ  ｏｒ  ＢＬＡＳＴ  Ｐ比較ソフトウェア）により実施される。
本明細書で使用される「治療有効量」又は「有効量」とは、投与される対象に利益を示すのに十分な用量を指す。投与される実際量、速度及び時間経過は、個体の状態及び重症度に依存する。治療の処方（例えば、用量の決定など）は、最終的に一般開業医及び他の医師の責任であり、通常は治療される疾患、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、その他の要因が考慮される。
本明細書で使用される「対象」という用語とは、ヒトなどの哺乳類動物であるが、他の動物、例えば、野生動物（サギ、コウノトリ、クレーンなど）、家畜（アヒル、ガチョウなど）又は実験動物（オランウータン、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、マーモット、ジリスなど）も指す。
【００３５】
「抗体」という用語は、完全抗体及びその任意の抗原結合フラグメント（「抗原結合部分」）または一本鎖を指す。「完全抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質を指す。各重鎖は、一つの重鎖可変領域（略語はＶＨ）及び一つの重鎖定常領域を含む。該重鎖定常領域には、３つのドメイン（ｄｏｍａｉｎ）であるＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、一つの軽鎖可変領域（略語はＶＬ）及び一つの軽鎖定常領域を含む。該軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高い変動性を持つ複数の領域にさらに分割でき、さらにその間にフレーム領域（ＦＲ）と呼ばれる保存された領域が散在する。各ＶＨ及びＶＬは、いずれも３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置されている。重鎖及び軽鎖のこれらの可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系第１成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主の組織又は因子への免疫グロブリンの結合を仲介する。キメラ抗体又はヒト化抗体も本発明の抗体に含まれる。
「ヒト化抗体」という用語は、抗体において非ヒト抗体に由来するＣＤＲ領域を含み、且つその抗体分子の他の部分は１つ（又は複数）のヒト抗体に由来する抗体を指す。しかも、結合親和性を保持するために、フレーム（ＦＲと呼ばれる）セグメントの一部の残基を修飾することができる（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎａｔｕｒｅ、  ３２１：５２２−５２５、  １９８６；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｓｃｉｅｎｃｅ、  ２３９：１５３４−１５３６、  １９８８；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ、  ３３２：３２３−３２７、  １９８８）。本発明のヒト化抗体又はその断片は、当業者に知られている技術によって調製することができる（例えば、Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．  １５０：２８４４−２８５７、  １９９２；  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｅｎｇ．  Ｒｅｖ．、  １０：１−１４２、  １９９２；  又は  Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、  １０：１６９−１７５、  １９９２を参照）。
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体を指し、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体である。本発明のキメラ抗体又はその断片は、遺伝子組換え技術により調製される。例えば、前記キメラ抗体は、プロモーター、本発明の非ヒト、特に、マウスモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列、及びヒト抗体定常領域をコードする配列を含む組換えＤＮＡをクローニングすることにより作製することができる。このような組換え遺伝子でコードされる本発明のキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラ抗体であり、該抗体の特異性は、マウスＤＮＡに由来する可変領域によって決定され、そのアイソタイプはヒトＤＮＡに由来する定常領域によって決定される。キメラ抗体の作製方法については、例えば、Ｖｅｒｈｏｅｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ、  ８：７４、  １９８８）を参照する。
【００３６】
「モノクローナル抗体」という用語は、単一の分子組成の抗体分子調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、体分子の準備を指す。モノクローナル抗体組成は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。
「誘導体」という用語は、指在Ｎ末端、Ｃ末端、主鎖、ペプチド結合及び／又は側鎖残基でアミノ酸／アミノ酸鎖を（化学的）修飾されたものを指す。この用語は、アミノ酸鎖におけるアミノ酸の追加、置換又は欠失を指すことを意図していない。そのようなＬ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸エナンチオマーの（化学）誘導体には、これらのアミノ酸の天然または非天然の誘導体が一般に含まれるが、即ち、上記に定義されるアミノ酸は、翻訳後修飾又は合成修飾を含み、ここで、アセチル化（（ポリ）ペプチド配列のＮ末端、リジン残基など）、脱アセチル化、メチル化、エチル化などのアルキル化など（好ましくは（ポリ）ペプチド配列のリジン又はアルギニン残基）、脱メチル化、脱エチル化などの脱アルキル化、アミド化（好ましくは（ポリ）ペプチド配列のＣ末端）、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グルタミル化（ｇｌｕｔａｍｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化（好ましくは（ポリ）ペプチド配列中のアスパラギン、リジン、ヒドロキシリジン、セリンまたはスレオニン残基など）、ヘムまたはヘモグロビン部分の増加、ヒドロキシル化、ヨウ素化、イソプレニル化によるファルネシルまたはゲラニルゲラニオール（ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｉｏｌ）などのイソプレノイド部分の増加、イソプレニル化、ミリストイル化、ファルネシル化、ゲラニルゲル化（ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒｎａｙｌａｔｉｏｎ）などのＧＰＩアンカーの形成などのリポイル化（ｌｉｐｏｙｌａｔｉｏｎ）（リポ酸官能基の連結）、酸化、リン酸化（例えば、（ポリ）ペプチド配列中のセリン、チロシン、スレオニン、またはヒスチジン部分など）、硫酸化（例えば、チロシンの硫酸化）、セレン化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化などを含むが、これらに限定されない。
投与
本発明の融合タンパク質は、単独で投与することができるが、好ましくは、計画された投与方法に従って選択された適切な医薬賦形剤、希釈剤または担体を一般に含む医薬組成物として投与される。融合タンパク質は、任意の適切な方法で治療を必要とする患者に適用することができる。正確な計量は、融合タンパク質の正確な性質を含む複数の要因に依存する。
【００３７】
いくつかの適切な使用方法は、経口、直腸、経鼻、局所（経口及び舌下を含む）、皮下、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内及び硬膜外）投与を含むが、これらに限定されない。
静脈内注射及び疼痛部位への注射は、有効成分は非経口的に許容される水溶液の態様とし、熱源が含まれなく、適切なｐＨ、等張性及び安定性を持つ。
当業者は、適切な溶媒または製剤を使用して、融合タンパク質を製剤化することができる。例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張性賦形剤が挙げられる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤及び／又は他の添加剤を加えることができる。経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、経口液剤などの形態であってもよい。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含み得。液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物または植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、グルコースまたは他の糖溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールも含むことができる。
上記の技術及び方案の例、及び他の本発明で使用される技術及び方案は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、  Ｏｓｌｏ、  Ａ．（ｅｄ）、  １９８０．に見出すことができる。
【００３８】
本発明のｃ−ＭＥＴ抗体は、天然に存在するものであってもよく、例えば、ヒトまたは哺乳動物のＢリンパ球または形質細胞から単離または精製されたものである。前記ｃ−ＭＥＴ抗体は、人工作製で取得されることもでき、例えば、動物をｃ−ＭＥＴ抗原で免疫し、ハイブリドーマ技術によりモノクローナル抗体を取得することができる。
前記ｃ−ＭＥＴ抗原は、完全長ｃ−ＭＥＴタンパク質、組換え断片又はポリペプチド、又はそれらの組み合わせであってもよい。前記動物は、一般的に使用される実験動物であってもよく、例えば、マウスを免疫してマウス抗ｃ−ＭＥＴ抗体を取得し、さらに、抗体工学技術により抗体のヒト化修飾を行い、医薬品に適するモノクローナル抗体を作製する。ｃ−ＭＥＴ抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニック動物を免疫することによっても取得でき、完全ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術によって直接取得できる。一方、ｃ−ＭＥＴ抗体は、Ｂリンパ球抗体ライブラリーをスクリーニングすることでも取得でき、最も一般的に使用される手法は、ファージ抗体ディスプレイ技術を使用して完全なヒト抗体を取得することができ、他のディスプレイ技術、例えば、リボソームディスプレイ技術、ＤＮＡディスプレイ技術、酵母ディスプレイ技術などにより完全なヒト抗体を取得することもできる。本発明は、組換えｃ−ＭＥＴ  タンパク質を利用して動物を免疫してモノクローナル抗体を取得する。前記ｃ−ＭＥＴタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  番号ＡＡＩ３０４２１．１に示される配列に従って取得できる。
本発明は、タンパク質及び細胞レベルのスクリーニングプラットフォームと組み合わされたハイブリドーマ技術を通じてアゴニストｃ−ＭＥＴ抗体を取得し、遺伝子クローニングによって抗体のアミノ酸配列を取得し、具体的な方法は実施例２を参照する。前記アゴニストｃ−ＭＥＴ抗体を作製するための前記ハイブリドーマ細胞株は、中国典型培養物保蔵センター（武漢大学、湖北省武漢市武昌区八一路Ｎｏ.２９９）に寄託され、寄託日は２０１７年１０月１７日であり、登録番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｃ２０１７１２４である。前記ｃ−ＭＥＴ抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示される。
【００３９】
その配列には１つ又は複数のアミノ酸残基的置換、欠失又は追加があれば、抗体の功能が依然として維持される可能性があることを指摘すべきである。該ｃ−ＭＥＴ抗体又はその生物学的に活性な断片は、保存的アミノ酸置換配列の一部を含み、前記アミノ酸で置換された配列はその活性に影響を与えないか、又はその活性の一部を保持する。アミノ酸又は断片の適切な置換は、当技術分野で周知の技術であり、容易に実施でき、得られる分子が抗原の結合、活性化または阻害活性を変化させないことを確保する。これらの技術に基づいて、当業者は、一般に、抗体の非必須領域の単一のアミノ酸を変化させても生物活性は実質的に変化しないので、これらの抗体の変異体は本発明に含まれないことを理解する。
本発明では、いずれか１つのｃ−ＭＥＴ抗体の機能的断片（生物学的活性断片）を使用することができる。ここで、ｃ−ＭＥＴ抗体の機能的断片とは、遺伝子工学的に改変された抗体断片を意味し、完全長ｃ−ＭＥＴ抗体の機能の全部又は一部を維持することができ。通常、前記機能的断片は、完全長ｃ−ＭＥＴ抗体の活性の少なくとも５０％を維持する。より好ましい条件下で、前記機能的断片は、完全長ｃ−ＭＥＴ抗体の活性の６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％を維持することができる。
本発明は、修飾又は改良されたｃ−ＭＥＴ抗体、例えば、それらの半減期、有効性、代謝、及び/又はタンパク質効力を促進するために修飾または改良されたｃ−ＭＥＴ抗体を使用することもできる。
【００４０】
本発明は、他の同種断片を含むｃ−ＭＥＴキメラ抗体又は修飾抗体を使用することができ、例えば、ヒト異種性を低減させるために改良されたｃ−ＭＥＴヒト化抗体を使用することもできる。
修飾又は改良されたｃ−ＭＥＴ抗体は、天然に存在するｃ−ＭＥＴ抗体との共通点が少ないものであってもよいが、損傷した血管内皮細胞の修復、増殖を促進することもでき、且つ他の悪影響又は毒性を引き起こすことはない。つまり、本発明では、ｃ−ＭＥＴ抗体の生物活性に影響を及ぼさない任意のバリエーションを使用することができる。
本発明の好ましい態様としては、前記ｃ−ＭＥＴ抗体には、ヒト化抗体、ＣＤＲ修飾キメラ抗体、ＦＲ修飾キメラ抗体、Ｆｃ修飾キメラ抗体を含むが、これらに限定されない。
ｃ−ＭＥＴ抗体のアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチドコード配列を簡単に取得できる。
【００４１】
本発明の好ましい態様としては、前記ｃ−ＭＥＴ抗体は、細胞に移された後にｃ−ＭＥＴ抗体を発現する（好ましくは過剰発現する）ことができる発現ベクター又は発現構築物を含むが、これらに限定されない。通常、前記発現ベクターは、ｃ−ＭＥＴ抗体をコードする遺伝子及びそれに作動可能に連結される発現制御配列を含む遺伝子カセットを含む。前記「作動的に連結される」又は「作動可能に連結される」とは、線状ＤＮＡ配列の特定の部分が同じ線状ＤＮＡ配列の他の部分の清浄度を調節または制御できる状況を指す。例えば、プロモーターが配列の転写を制御する場合には、コード配列に作動可能に連結されるものである。
本発明では、ｃ−ＭＥＴ抗体配列が組換え発現ベクターに含まれることができる。宿主体内で複製及び安定化できる限り、任意のプラスミド及びベクターを本発明で使用することができる。発現ベクターの重要な特徴は、通常、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子及び翻訳制御エレメントを含む。
当業者に周知の方法を使用して、ｃ−ＭＥＴ抗体のＤＮＡ配列及び適切な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、ｉｎ  ｖｉｖｏ組換え技術などを含む。前記ＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成をガイドするために、発現ベクターの適切なプロモーターに効果的に連結されることができる。形質転換ベクターには、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターも含まれる。
【００４２】
本発明の実施形態としては、前記ｃ−ＭＥＴ抗体を組換え発現させ、大規模生産を達成することができる。生産の目的に達するために、ｃ−ＭＥＴ抗体をコードする遺伝子は、分子生物学的方法で適切なベクター（従来の原核又は真核の発現プラスミド又はウイルス等）にクローニングし、前記ベクターを前記ｃ−ＭＥＴ抗体を発現できる細胞に導入し、前記の細胞にｃ−ＭＥＴ抗体を発現させ、ｃ−ＭＥＴ抗体の発現を達成することができる。発現用細胞は、多くの種類があり、真核細胞であってもよく、原核細胞であってもよい。該抗体に最高の生物学的活性を持たせるためには、哺乳類動物細胞を使用して発現させることが好ましく、ＣＨＯ細胞が最も好ましい。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を具体的な実施例によりさらに説明する。
第一部分：アゴニストｃ−ＭＥＴ抗体のスクリーニング及び作製
本発明は、まず、ハイブリドーマ技術によりｃ−ＭＥＴ抗体モノクローナル抗体を取得し、さらに、ヒト化してキメラ抗体とした。標的に対するｃ−ＭＥＴ抗体の結合能及びｃ−ＭＥＴのリン酸化促進活性によりアゴニストｃ−ＭＥＴ抗体をスクリーニングした。
【００４４】
実施例１．ｃ−ＭＥＴ抗原のクローニング及び発現
ｃ−ＭＥＴの細胞外領域は、ガンド認識部位として肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、  ＨＧＦ）を認識してそれに結合し、その後の一連の生物学的応答調節効果において重要な役割を果たすため、ｃ−ＭＥＴ細胞外領域が抗原として使用される。ＧｅｎＢａｎｋのヒトｃ−ＭＥＴの遺伝子配列（配列番号：ＮＭ＿００１１２７５００．１）に基づいてＰＣＲプライマーを設計し、上游プライマーＰ１（５’−３’）：ＴＡＴＡＣＣＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＧＣ  ＣＣＣＣＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＣＣＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）、下游プライマーＰ２（５’−３’）：ＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＴＡ  ＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡ  ＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧ  ＴＧＡＡＡＴＴＣＴＧ  ＡＴＣＴＧＧＴＴＧ  ＡＣＡＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）とし、増幅させて約２８００ｂｐのｃ−ＭＥＴ細胞外領域断片を得た。得られたＤＮＡ断片は、ＡｇｅＩ及びＳａｌＩの２つの制限酵素切断部位でレンチウイルス発現ベクターｐＲＲＬ−ＣＭＶに挿入され、アガロースゲル電気泳動で検証した結果を図１ａに示した。図１ａでは、レーン１はＤＮＡマーカーであり、レーン２はレンチウイルスシャトルベクターｐＲＲＬ−ＣＭＶ−ＥＤがＡｇｅＩ及びＳａｌＩで二重消化されたサンプルであり、制限酵素消化の結果は、７５００ｂｐのベクターのバンド及び２７００ｂｐの目的遺伝子のバンドが得られることを示し、ヒトＭＥＴ細胞外領域のＥＤ断片のレンチウイルス発現プラスミドｐＲＲＬ−ＣＭＶ−ＥＤの構築に成功することを証明した。図１ｂに示すようにポリアクリルアミドゲル電気泳動検出結果に供した。発現プラスミド及びパッケージングプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションし、細胞発現上清をニッケルカラムで精製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った検出結果は図１ｂに示した。図１ｂでは、レーン１：発現上清ストック溶液（１：５希釈）；レーン２：カラム通過溶液（１：５希釈）；レーン３：２０ｍＭ  イミダゾール溶出画分；レーン４〜５：５０ｍＭ  イミダゾール溶出画分；レーン６〜９：２００ｍＭ  イミダゾール溶出画分；Ｍ：タンパク質分子量マーカー。ここで、レーン５〜９での１０５ＫＤａのバンドのサイズは、目的とするバンドの予想サイズと一致し、ＭＥＴ細胞外領域のＥＤ融合タンパク質は発現に成功するとともに精製取得されることを証明した。
精製後に、ｃ−ＭＥＴ細胞外領域タンパク質は、免疫又はスクリーニングに用いられた。
クローンによって発現されたＤＮＡ  配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表される、ヒトｃ−ＭＥＴ細胞外領域ＤＮＡをコードする配列であり、そのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表される。
【００４５】
実施例２．ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の作製
組換え発現されたｃ−ＭＥＴ細胞外領域は、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｃａｔ  Ｎｏ．：ＳＨ３０２５６．０１Ｂ）で１ｍｇ／ｍｌに希釈され、フロイントアジュバント（初回免疫は完全フロイントアジュバントを、追加免疫は不完全フロイントアジュバントを用いる）と乳化された後、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（各群５匹）を皮下注射して接種し、各マウスに１００μｇの抗原を接種し、２週間間隔で免疫を追加した。初回の追加免疫から、毎回追加免疫後７〜１０日以内にマウスの血清を収集し、ＥＬＩＳＡにより力価を測定した。
免疫後に血清力価が１：１００００超えるマウスを選択すて細胞融合を行った。マウスＢ細胞及び骨髄腫細胞（ＳＰ２／０−Ａｇ１４、中国科学院の細胞バンク）を別々に無菌的に作製してカウントし、２つの細胞をＳＰ２／０：Ｂ細胞＝１：５の割合で混合した後に遠心し（１０００ｒ／ｍｉｎ、１０ｍｉｎ）、上清を廃棄し、５０％ポリエチレングリコール（Ｒｏｃｈｅ、ＲＥＦ：１０７８３６４１００１）１ｍｌを加え、その後、無血清ＲＰＭＩ１６４０（ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｃａｔ  Ｎｏ．：ＳＨ３０８０９．０１）２０ｍｌで終了し、１０ｍｉｎ遠心し、上清を廃棄し、血清（ＢＩ、ＲＥＦ：０４−００１−１ＡＣＳ）及びＨＡＴ（Ｇｉｂｃｏ、ＲＥＦ：２１０６０−０１７）を含有するＲＰＭＩ１６４０で沈澱を再懸濁し、各ウェルあたり１０5個のＢ細胞でプレートに加え、各ウェルあたり２００μｌ、次に各ウェルに１０5個のマウス腹腔マクロファージを加え、３７℃の細胞培養装置で培養し、７日後にＨＴ（Ｇｉｂｃｏ、ＲＥＦ：１１０６７−０３０）及び血清（ＢＩ、ＲＥＦ：０４−００１−１ＡＣＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０に取り替え、各ウェルあたり２００μｌ、７〜１０日後にＥＬＩＳＡにより陽性クローニングを検出し、結果は図２に示し、ここで、横軸は、ｃ−ＭＥＴ抗体ハイブリドーマ上清のローディング体積（単位μｌ）であり、縦軸は、波長４５０ｎｍでの吸光度である。結果は、大量のハイブリドーマクローニング上清は、ｃ−ＭＥＴタンパク質に特異的に結合でき、加えた上清体積の増加に伴い、ＥＬＩＳＡ結合シグナルも増加し、より優れた用量反応関係を示した。
【００４６】
実施例３．ターゲットに対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の結合実験（ＥＬＩＳＡ）
本発明のｃ−ＭＥＴ抗体の標的ｃ−ＭＥＴに対する認識及び結合能を検出するために、酵素結合免疫吸着測定法により抗体（ハイブリドーマ上清又は組換え発現されたモノクローナル抗体などを含む）がインビトロで抗原への親和性を検出した。
実験手順：抗原（ｃ−ＭＥＴ細胞外領域、実施例１）をコーティング溶液（ＣＢＳ）（０．０５Ｍ  Ｃａｒｂｏｎａｔｅ−Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ、  ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ９０１８、ＣａｔＮｏ．：０３１１３０２４）に加え、４℃で一晩インキュベートした。抗原でコーティングされた９６  ウェルマイクロプレートを翌日室温に戻し、洗浄液ＰＢＳ＋０．０５  ％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  （Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ  Ｎｏ．：  Ｐ１３７９）で２回洗浄した。次いで、２００μｌ／ウェルブでロッキング液（ＰＢＳ＋１％  ＢＳＡ  （ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ  Ｎｏ．：  Ｖ９００９３３）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄した。テストされる抗体ｃ−ＭＥＴ抗体を９６ウェルマイクロプレートに加え、室温で２時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄した。ブロッキング液で５０００倍に希釈された二次抗体（Ｇｏａｔａｎｔｉ−ＭｏｕｓｅＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）（ＨＲＰ）（杭州華安、カタログ番号：ＨＡ１００６）を１００μｌ／ウェルで９６ウェルマイクロプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄した。１００μｌ／ウェルで発色液ＴＭＢ（碧云天、カタログ番号：Ｐ０２０９）を９６ウェルマイクロプレートに加えた。５０μｌ／ウェルで停止液（２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4）を９６ウェルマイクロプレートに加えた。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ｉＭａｒｋ）を使用して４５０ｎｍでプレートを読み取った。
結果は図３に示すように、ここで、横軸はｃ−ＭＥＴ抗体の濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）であり、縦軸は波長４５０ｎｍでの吸光度である。結果は、ｃ−ＭＥＴ抗体はＭＥＴ細胞外領域ＥＤ融合タンパク質に特異的に結合でき、加えた体積が増加するほど、信号が増加し、該系の条件下で、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の最小検出濃度は０．０６ｎｇ／ｍｌであり、ｃ−ＭＥＴ抗体１Ｈ９Ｄ６はＭＥＴ細胞外領域ＥＤ融合タンパク質との結合能が強いことを示した。
【００４７】
実施例４．ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体配列のクローニング
実施例３で得られた良好な活性を有する単細胞株ｃ−ＭＥＴ抗体１Ｈ９Ｄ６については、ｃＤＮＡ配列をクローニングし、その後、モノクローナル抗体を組換え発現させ、活性測定を行った。本発明は、逆転写ＰＣＲを使用して抗体遺伝子の重鎖及び軽鎖可変領域を増幅し、ベクターに連結して配列決定し、モノクローナル抗体の軽鎖・重鎖配列を得た。まず、ＴＲＩｚｏｌ法によりｃ−ＭＥＴを分泌するハイブリドーマ細胞株のｃ−ＭＥＴ抗体から全細胞ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。次いで、合成されたｃＤＮＡをテンプレートとして使用し、マウス抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子の完全なセットを取得し、縮退プライマーによりマウスのｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の重鎖、軽鎖可変領域ＶＨ及びＶＬ遺伝子を増幅した。重鎖上流プライマーＶＨ−Ｆ：ＳＡＲ  ＧＴＲ  ＭＡＧ  ＣＴＧ  ＭＡＧ  ＳＡＧ  ＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、下流プライマー：Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１  Ｒ：  ＡＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、軽鎖上流プライマーＭｏｕｓｅ  Ｖκ−Ｆ：  ＧＡＹ  ＡＴＴ  ＧＴＤ  ＭＴＳ  ＡＣＭ  ＣＡＲ  ＷＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、下流プライマーＭｏｕｓｅ  Ｃκ−Ｒ：ＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）の電気泳動の結果は、図４に示し、ここで、レーン１はＤＮＡマーカーであり、レーン２はＶＨ遺伝子のＰＣＲ産物であり、レーン３はＶＬ遺伝子のＰＣＲ産物は、電気泳動の結果は、マウス由来のＶＨ及びＶＬ遺伝子のＰＣＲ産物はそれぞれ約３５１及び３３６ｂｐの特異的なバンドが現れることを示し、マウス由来のＶＨ及びＶＬ遺伝子の取得に成功することを示した。
【００４８】
最後に、増幅されたＰＣＲ産物は、ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクターにクローニングされ、配列決定された。ＩＭＧＴデータベースのアラインメントにより、本発明のマウス由来のＣＤＲ配列は、表１に示した。
【００４９】
【表１】
2021507936.tif 000003
【００５０】
実施例５．ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の構築
ｃ−ＭＥＴ抗体重鎖及び軽鎖可変領域は、オーバーラップエクステンションＰＣＲ法によりヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子Ｃγ１及びヒト軽鎖定常領域遺伝子Ｃκにそれぞれ連結され、ｃ−ＭＥＴ抗体キメラ抗体を構築した。１．５％アガロースゲルの結果は、マウス由来のＶＨ及びＶＬ遺伝子のＰＣＲ産物はそれぞれ約３５１及び３３６ｂｐの特異的なバンドが現れ、ヒトＣγ１及びＣκ遺伝子のＰＣＲ産物は約１０００及び３５０ｂｐの特異的なバンドが現れ、サイズはいずれも理論値と一致する。ＳＯＥ−ＰＣＲ産物は、ＡｇｅＩ及びＳａｌＩで二重消化されてレンチウイルス発現ベクターｐＲＲＬ−ＣＭＶに連
結し、電気泳動の結果は図５に示した。ここで、レーン１はＤＮＡマーカーであり、レーン２はレンチウイルスシャトルベクターｐＲＲＬ−ＣＭＶ−重鎖がＡｇｅＩ及びＳａｌＩ
で二重消化されたサンプルであり、レーン３は、レンチウイルスシャトルベクターｐＲＲＬ−ＣＭＶ−軽鎖がＡｇｅＩ及びＳａｌＩで二重消化されたサンプルであり、制限酵素切
断の結果は、７５００ｂｐのベクターのバンド、１４００ｂｐ（重鎖）及び７００ｂｐ（軽鎖）の目的遺伝子のバンドを取得し、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の軽鎖・重鎖レンチウイルス発現プラスミドの構築に成功することを示した。
【００５１】
実施例６．ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の標的検出
本発明のヒト化キメラ抗体が標的ｃ−ＭＥＴに対するターゲティング及び特異性を有し、ｃ−ＭＥＴ天然リガンドＨＧＦを使用して競合的結合実験を行った。
実験手順：抗原（ｃ−ＭＥＴ細胞外領域、実施例１）をコーティング溶液（ＣＢＳ）（  ０．０５  Ｍ  Ｃａｒｂｏｎａｔｅ−Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ、  ｐＨ  ９．６）で２μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ９０１８、ＣａｔＮｏ．：  ０３１１３０２４）に加え、４℃で一晩インキュベートした。抗原でコーティングされた９６ウェルマイクロプレートを翌日室温に戻し、洗浄液（ＰＢＳ＋０．０５  ％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  （Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ  Ｎｏ．：  Ｐ１３７９）で２回洗浄した。次いで、２００μｌ／ウェルでブロッキング液（ＰＢＳ＋１  ％  ＢＳＡ  （ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ  Ｎｏ．：  Ｖ９００９３３）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄した。テストされるｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を９６ウェルマイクロプレートに加え、室温で１．５時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄した。ブロッキング液で希釈された最終濃度が１５ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（ＲＤ、２９４−ＨＧ）１００μｌ／ウェルでを加え、３７℃で２時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄した。ブロッキング液で２０００倍に希釈されたＨＧＦ抗体（ＲＤ、ＡＦ２７６）を１００μｌ／ウェルで９６ウェルマイクロプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄した。ブロッキング液で２０００倍に希釈されたストレプトアビジン−ＨＲＰ酵素標識二次抗体（ＣＳＴ、＃３９９９）を１００μｌ／ウェルで９６ウェルマイクロプレートに加え、室温で０．５時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄した。１００μｌ／ウェルで発色液ＴＭＢ（碧云天、カタログ番号：Ｐ０２０９）を９６ウェルマイクロプレートに加えた。５０μｌ／ウェルで停止液（２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）を９６ウェルマイクロプレートに加えた。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ｉＭａｒｋ）を使用して４５０ｎｍでプレートを読み取った。
ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体に対するＨＧＦの競合的結合は図６に示し、ここで、横軸はｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）であり、縦軸は波長４５０ｎｍでの吸光度である。結果は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は、ＨＧＦ／ＭＥＴの特異的結合を遮断することができ、加えた濃度が高くなるほど、遮断効果が増強し、該系の条件下で、ＨＧＦ／ｃ−ＭＥＴ特異的結合に対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の最大遮断率は７９．７％である。ＨＧＦは抗原へのｃ−ＭＥＴキメラ抗体の結合を効果的に阻害できることがわかり、キメラｃ−ＭＥＴ抗体が標的ｃ−ＭＥＴをターゲットとすることを示した。
【００５２】
実施例７．ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の標的への二量化及びリン酸化活性の検証
本発明のｃ−ＭＥＴ抗体、特に、ヒト化キメラ抗体標的の、ｃ−ＭＥＴに対する活性化能を検出するために、ウェスタンブロット法により抗体が標的チロシンキナーゼ領域を二量体化した後に自己リン酸化する効果を検出した。
実験手順：Ｂｅｎｄ．３細胞をＦＢＳを含まない培地で２４ｈインキュベートし、その後、２０μｇ／ｍｌでｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を加え、３７℃でそれぞれ１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ及び１２０ｍｉｎインキュベートし、ＳＤＳライセートで細胞を溶解させ、ウェスタンブロット法によりライセートでのＴｙｒ１２３４リン酸化ＭＥＴを検出した。
結果は図７に示すように、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は、ｃ−ＭＥＴのリン酸化を活性化し、リン酸化活性化効果は５ｍｉｎで現れ始め、３０ｍｉｎで最大に達し、減衰せずに１２０ｍｉｎまで持続することをわかり、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は活性化抗体であることを示した。
【００５３】
第二部分：血管内皮システムの再構築及び修復活性を持つｃ−ＭＥＴ抗体のスクリーニング
血管内皮細胞の損傷は、多くの疾患の病理過程における重要なリンクであり、生物活性を高めることができる物質をスクリーニングすることで、血管損傷条件下で新しい血管の形成を促進し、損傷した血管を保護する可能で潜在的な医薬品先の前駆体を得る。研究により、ｃ−ＭＥＴは血管内皮細胞で高い発現レベルを示し、血管内皮細胞の損傷による疾患で有効な標的であることを証明した。従って、本発明は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をモデルとしてｃ−ＭＥＴ抗体をスクリーニングし、その潜在的な治療能力を評価した。
【００５４】
実施例８．標的細胞へのｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の結合活性の検出
本発明の抗体が標的細胞への結合活性を有するか否かを検出するために、ＥＬＩＳＡによりｃ−ＭＥＴ高発現細胞ＨＵＶＥＣへの表面結合能を検出した。
実験手順：対数増殖期のＨＵＶＥＣ細胞を採取し、消化してカウントし、細胞を２００００細胞／ウェルの密度であらかじめポリオルニチン（ＰＲＯＮ）でプレコートされた９６ウェル細胞培養プレートに播種され、翌日ＰＢＳで１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定され、室温で３０ｍｉｎ、ＰＢＳで洗浄された後、室温で６０ｍｉｎブロッキングし（ブロッキング液：１％  ＦＢＳ／ＰＢＳ（ｖ／ｖ））、次いで、８つの濃度（２０μｇ／ｍｌから５倍濃度勾配希釈）のｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を対応するウェルに入れ、最後に、最終容量は１００μｌであり、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄し、３回繰り返した。５０００倍に希釈された二次抗体（山羊抗マウスＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）（ＨＲＰ）（杭州華安、カタログ番号：ＨＡ１００６）１００μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。１００μｌ／ウェルで発色液ＴＭＢ（ＫＰＬ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．５３−００−０１）を９６ウェルマイクロプレートに加えた。５０μｌ／ウェルで停止液（２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）を９６ウェルマイクロプレートに加えた。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ｉＭａｒｋ）を使用して４５０ｎｍでプレートを読み取った。
ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体とＨＵＶＥＣ表面でのｃ−ＭＥＴ抗原の結合は図８に示し、ここで、横軸はｃ−ＭＥＴ抗体的ローディング濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）であり、縦軸は波長４５０ｎｍでの吸光度である。結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体はＨＵＶＥＣ細胞表面にあるｃ−ＭＥＴタンパク質と特異的に結合でき、加えた濃度が高くなるほど、信号が増加することが分かった。ヒト化抗体はＨＵＶＥＣに有意に結合できることを示した。上記結果は、ｃ−ＭＥＴ抗体は生きている細胞表面の抗原標的に対する結合能を有することを示した。
【００５５】
実施例９．ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の効果
本発明のｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の機能を検出するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をモデルとし、内皮細胞増殖の促進に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の効果を評価した。
実験原理：ｃ−ＭＥＴ抗体とｃ−ＭＥＴとの結合は、ｃ−ＭＥＴ分子の二量体化及びチロシンリン酸化を促進でき、さらにｃ−ＭＥＴ下流シグナル伝達経路を活性化するため、血管内皮細胞を増殖した。
実験手順：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）１×１０5個の細胞／ｍＬを５０μｌ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレート（ｃｏｓｔａｒ、＃３７９９）に加え、培地はＨＵＶＥＣ基本培地（Ａｌｌｃｅｌｌｓ、Ｃａｔ  Ｎｏ．：Ｈ００４Ｂ）＋１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＢＩ、ＲＥＦ：０４−００１−１ＡＣＳ）である。２４ｈ細胞培養後に５０μｌ／ウェルでｃ−ＭＥＴ  被験抗体を加え、３７℃のインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ、３１１１）で３日間培養した。細胞増殖検出用キット（ＣＣＫ８）（ＤＯＪＩＮＤＯ、ＣＫ０４）を使用し、キットの説明書に従って細胞増殖を検出した。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ｉＭａｒｋ）を使用して４５０ｎｍでプレートを読み取り、細胞カウントを行った。
細胞カウントの結果は、図９に示し、ここで、横軸はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）であり、縦軸は波長４５０ｎｍでの吸光度である。結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体はＨＵＶＥＣ細胞の増殖効果を促進でき、加えた濃度が高くなるほど、効果はより顕著になることが分かった。ＨＵＶＥＣはｃ−ＭＥＴ抗体の作用下でさらに顕著に増殖することが分かった。上記結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は血管内皮細胞の増殖を引き起こすことができ、血管を保護する潜在的な能力を有することを示した。
【００５６】
実施例１０．ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）移動に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の作用
本発明のｃ−ＭＥＴ抗体の血管形成を促進する機能を検出するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をモデルとし、ｃ−ＭＥＴ抗体の内皮細胞移動を促進する作用を評価した。
実験原理：ｃ−ＭＥＴ抗体とｃ−ＭＥＴとの結合は、ｃ−ＭＥＴ分子の二量体化及びチロシンリン酸化を促進でき、さらにｃ−ＭＥＴ下流シグナル伝達経路を活性化するため、血管内皮細胞の移動を促進した。
実験手順：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）２×１０5個の細胞／ｍＬを５００μｌ／ウェルでトランスウェルチャンバー（ＢＤ、３５３０９７）の上部チャンバーに加え、下部チャンバーに異なる濃度の被験抗体を含む培地７５０μｌを加え、培地はＨＵＶＥＣ基本培養液（Ａｌｌｃｅｌｌｓ、Ｃａｔ  Ｎｏ．：Ｈ００４Ｂ）＋１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＢＩ、ＲＥＦ：０４−００１−１ＡＣＳ）である。細胞を１６ｈ培養後にクリスタルバイオレットで染色し、下部チャンバーの細胞を顕微鏡下でカウントした。
細胞カウントの結果は図１０に示し、ここで、横軸はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）であり、縦軸はトランスウェルチャンバーの下面にある細胞数である。結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体はＨＵＶＥＣ細胞の遊走効果を促進でき、加えた濃度が高くなるほど、効果はより顕著になることを示した。ＨＵＶＥＣはｃ−ＭＥＴ  抗体の作用下でさらに顕著に移動することが分かった。上記結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は血管内皮細胞の移動を引き起こして血管内皮組織を形成させることができ、血管を保護する潜在的な能力を有することを示した。
【００５７】
実施例１１．ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の微小管形成に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の作用
本発明ｃ−ＭＥＴ抗体の血管形成を促進する機能を検出するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をモデルとして使用し、ｃ−ＭＥＴ抗体の内皮細胞微小管形成を促進する作用を評価した。
実験原理：ｃ−ＭＥＴ抗体とｃ−ＭＥＴとの結合は、ｃ−ＭＥＴ分子の二量体化及びチロシンリン酸化を促進でき、さらにｃ−ＭＥＴ下流シグナル伝達経路を活性化するため、血管内皮細胞分化及び微小管形成を促進する。該過程は損傷した血管の再構築及び修復の重要なリンクである。
実験手順：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）２×１０5個の細胞／ｍＬを１００μｌ／ウェルでｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ（ｓｉｇｍａ、Ｐ７２８０）でプレコートされた９６ウェル細胞培養プレート（ｃｏｓｔａｒ、＃３７９９）に加え、培地はＨＵＶＥＣ完全培地（Ａｌｌｃｅｌｌｓ、Ｃａｔ  Ｎｏ．：Ｈ００４）である。２４ｈ細胞培養後に５０μｌ／ウェルでマトリゲル（ＢＤ、３５４２３４）を加え、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした後、２００μｌ／ウェルでｃ−ＭＥＴ被験抗体を加え、培地はＨＵＶＥＣ基本培地（Ａｌｌｃｅｌｌｓ、Ｃａｔ  Ｎｏ．：Ｈ００４Ｂ）である。３７℃のインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ、３１１１）で３日間培養し、それぞれ２４ｈ、４８ｈ及び７２ｈで微小管形成を観察し、微小管の数に従って被験抗体がＨＵＶＥＣ細胞の微管形成に対する活性を評価した。
微管形成の結果は、図１１に示し、ここで、図１１−Ａは、ゲル塗布０時間後の対照群細胞写真であり、１１−Ｂはゲル塗布０時間後のｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体投与群の細胞写真であり、ここで、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の濃度は１μｇ／ｍｌであり；図１１−Ｃは、ゲル塗布７２時間後の対照群細胞写真であり、図１１−Ｄはゲル塗布７２時間後のｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体投与群の細胞写真であり、ここで、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の濃度は１μｇ／ｍｌである。ＡとＢを比較すると、初期細胞状態が一致することが分かり、ＣとＤを比較すると、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）投与後７２時間、ＨＵＶＥＣ細胞の微小管形成の数は有意に増加することを示し、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体はＨＵＶＥＣ細胞の微小管形成を促進できることを証明した。
ｃ−ＭＥＴ抗体の作用下でＨＵＶＥＣが形成した微小管の数はさらに顕著であることが分かった。上記結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体が起血管内皮細胞に微小管を分化、形成させることができ、血管損傷下で新生血管を保護又は形成する潜在的な能力を有することを示した。
【００５８】
第三部分：内皮細胞損傷及びアポトーシスに対するｃ−ＭＥＴ抗体の保護作用
血液脳血管内皮細胞の酸化は、損傷の主要な病理学的要因であり、ここで、脳微小血管内皮細胞の虚血再灌流は表面の密着結合タンパク質の発現に変化を引き起こし、血液脳関門の透過性の増加に直接つながり、脳虚血の損傷を悪化した。本発明は、血管内皮細胞の損傷に対するｃ−ＭＥＴアゴニストの保護作用を研究し、虚血再灌流（Ｉ−Ｒ）による脳血管内皮細胞アポトーシス及び損傷をモデルとして損傷内皮細胞に対するｃ−ＭＥＴ抗体の保護作用を評価した。
【００５９】
実施例１２．血管内皮細胞の酸素ーグルコース欠乏モデル（Ｉ−Ｒ）の確立
血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）培地は、ＤＭＥＭ基本培養液（ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３０２４３．０１）＋１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＢＩ、ＲＥＦ：０４−００１−１ＡＣＳ）である。２４ｈ細胞培養後に、ＤＭＥＭ基本培養液を交換し、異なる濃度のｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を加え、３７℃のインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ、３１１１）で１６ｈ培養した。その後、嫌気槽（三菱化学、Ｃ３１）内で嫌気性バッグ（三菱化学、Ｃ１）を使用して低酸素環境を作り、酸素ーグルコース欠乏損傷を６ｈ行い、培地はＤＭＥＭグルコース欠乏培養液（Ｇｉｂｃｏ、１１９６６−０２５）であり、異なる濃度のｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を加えた。その後、ＤＭＥＭ基本培養液を交換し、異なる濃度のｃ−ＭＥＴ  ヒト化抗体を加え、３７℃のインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ、３１１１）で１．５ｈ培養した。
【００６０】
実施例１３．内皮細胞損傷後細胞活性に対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の保護作用の検出
実施例１２のようにＢｅｎｄ．３酸素ーグルコース欠乏モデルが確立された。８×１０4個の細胞／ｍＬを１００μｌ／ウェルで細胞培養プレート（ｃｏｓｔａｒ、＃３７９９）に加え、９６ウェルプレートを使用し、群分け処理を行った後、細胞増殖検出用キット（ＣＣＫ８）（ＤＯＪＩＮＤＯ、ＣＫ０４）を使用し、キットの説明書に従って細胞生存率を検出した。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ｉＭａｒｋ）を使用して４５０ｎｍでプレートを読み取った。
酸素ーグルコース欠乏血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）に対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の保護作用による細胞カウント結果を図１２に示し、ここで、横軸は、サンプルの情報であり、その内、対照群は酸素ーグルコース欠乏処理なしのサンプルであり、損傷群は酸素ーグルコース欠乏処理を受けたサンプルであり、保護群の数値はｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）であり、縦軸は波長４５０ｎｍでの吸光度である。結果は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体が酸素ーグルコース欠乏後の血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）に対して保護効果を有し、加えた濃度が高くなるほど、効果はより顕著になることを示した。ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は、酸素ーグルコース欠乏血管内皮細胞に対して保護作用を有することが分かった。
【００６１】
実施例１４．内皮細胞アポトーシスに対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の保護作用の検出
実施例１２のようにＢｅｎｄ．３酸素ーグルコース欠乏モデルが確立された。血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）１×１０5個の細胞／ｍＬを２ｍｌでカバーガラス付き３５ｍｍ細胞培養皿に加え、細胞スライドを行い、群分け処理を行った後、スライドガラス上での血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）をＴＵＮＥＬ細胞アポトーシス検出用キット（南京諾唯賛生物科技有限公司、Ａ１１２−０１）で検出し、アポトーシス細胞数に従って酸素ーグルコース欠乏後の血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）のアポトーシスに対する被験抗体の作用を評価した。
対照群：酸素ーグルコース欠乏処理なしの細胞サンプル；
損傷群：酸素ーグルコース欠乏処理を受けた細胞サンプル；
保護群：数値は抗ｃ−ＭＥＴヒト化抗体の濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）である。
細胞アポトーシスの写真は図１３−ａに示し、アポトーシス細胞数の統計結果を図１３−ｂに示し、結果は、血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）が酸素ーグルコース欠乏処理を経た後、アポトーシス細胞数は有意に増加し、抗ｃ−ＭＥＴヒト化抗体の添加に伴い、アポトーシス細胞数は減少することを示し、抗ｃ−ＭＥＴヒト化抗体は酸素ーグルコース欠乏後の血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）のアポトーシスに対して保護効果を有し、抗ｃ−ＭＥＴヒト化抗体添加濃度が高くなるほど、保護効果はさらに顕著になることを証明した。
【００６２】
実施例１５．内皮細胞の死細胞指標ＬＤＨに対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の影響
血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）８×１０4個の細胞／ｍＬを０．１ｍｌ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに加え、実施例１２のようにＢｅｎｄ．３酸素ーグルコース欠乏モデルが確立された。血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）の上清を、ＬＤＨ検出キット（南京建成、Ａ０２０−２）で検出した。
対照群：酸素ーグルコース欠乏処理なしの細胞サンプル；
損傷群：酸素ーグルコース欠乏処理を受けた細胞サンプル；
保護群：数値は抗ｃ−ＭＥＴヒト化抗体の濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）である。
細胞の上清のＬＤＨ濃度は図１４に示し、結果は、血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）が酸素ーグルコース欠乏処理を経た後、ＬＤＨ濃度は有意に増加し、ｃ−ＭＥＴヒト源キメラ化抗体の添加に伴い、ＬＤＨ濃度は低減することを示し、抗ｃ−ＭＥＴヒト化抗体は酸素ーグルコース欠乏血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）のＬＤＨ濃度を効果的に低減させる効果を有し、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体添加濃度が高くなるほど、低減効果はさらに顕著になることを証明した。表面ｃ−ＭＥＴ抗体は、Ｉ／Ｒ環境下での内皮細胞の死亡率を大幅に低減させることができる。
【００６３】
第四部分：各種虚血性疾患に対するｃ−ＭＥＴ抗体の効果
病理学的条件下での内皮細胞に対するｃ−ＭＥＴ抗体の保護効果及び関連する病理学的プロセスの役割をさらに検証するために、本発明は、細胞及び全体として２つのレベルの病理学的モデルを使用し、脳虚血（脳梗塞）、心筋虚血（心筋梗塞）でのｃ−ＭＥＴ抗体の薬理学的効果を研究し、内皮細胞損傷による血液脳関門透過性の変化及びその続発性ニューロンアポトーシスなどの病理学的プロセスに対するｃ−ＭＥＴ抗体の影響を説明した。
【００６４】
実施例１６．虚血性損傷のインビトロモデルの構築
１）  冷光源光化学的に誘発された局所脳梗塞ラットモデル：
このモデルの基本原理は、光に敏感な物質であるローズベンガルが静脈内に注入され、循環系により微小血管に到達した後、特定の強度の光源の照射下で光化学反応が起こり、局所的な脳浮腫及び血小板微小血栓が脳の照射された局所に発生し、局所脳梗塞を形成した。このモデルの早い段階で、血液脳関門の開放、重度の血管性脳浮腫、微小血管血栓症が発生する可能性があるため、脳梗塞後の微小血管損傷及び血液脳関門の変化の病態生理学的研究に使用でき、虚血半影帯の病理学的特徴をよりよくシミュレートできた。
実験手順：実験動物に１０％抱水クロラールで腹腔内に３ｍＬ／ｋｇの体重で麻酔をかけ、麻酔に成功した後、尾静脈に５％ローズベンガルＢ  １．５ｍＬ／ｋｇをゆっくりと注入した。ラット定位固定器具で実験動物を固定し、頭髪を切り取り、通常のヨウ素アルコールで消毒し、両眼の線の中点後の５ｍｍから両耳の線の中点前の５ｍｍまで正中切開し、皮膚及び皮下を切開し、右側の骨膜を慎重に剥がし、電気凝固で血を止めた。右頭蓋骨の一部を露出させ、矢状縫合と冠状縫合の交差部分であるブレグマを露出させた。完全な硬膜を保持しながら、ブレグマの後ろ２．０ｍｍ、右側の２．０ｍｍでの直径約５ｍｍの範囲に頭蓋骨を削除した。レーザーは、脳組織から約１ｃｍ離れ、穴径約４ｍｍの遮光紙で覆われ、光強度は１０〜１２ＫＬＵＸであり、照射時間は５ｍｉｎである。手術後、頭皮を縫合した。照射中に体温を維持するために温度計を使用し、ラットのバイタルサインは安定化した。
偽手術群：手術中の放射線照射なし。
治療群：２０ｍｉｎ照射後、ｃ−ＭＥＴ抗体１ｍｇ／ｋｇを尾静脈内に注入する。
損傷群：同量の生理食塩水を尾静脈内に注入する。
【００６５】
２）  マウス脳虚血ＭＣＡＯモデル
右中大脳動脈閉塞（ｍｉｄｄｌｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ、ＭＣＡＯ）モデルである。マウスの体重を秤量し、体積分率１０％の抱水クロラール溶液（質量分率は３００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に注入して麻酔し、仰臥位に固定した。正中頸部切開を行って右総頸動脈、外頸動脈、内頸動脈を剥離した。３−０ナイロン糸を外頸動脈の切開部に挿入し、ゆっくりと内頸動脈の頭蓋内方向に進め、中大脳動脈をブロックして、局所的な脳虚血をもたらした。１．５ｈ後、ナイロン糸を引き出し、２４ｈ再灌流した。
偽手術群：手術中にナイロン糸が挿入されない。
治療群：ナイロン糸挿入後、ｃ−ＭＥＴ抗体１ｍｇ／ｋｇを尾静脈内に注入する。
損傷群：同量の生理食塩水を尾静脈内に注入する。
【００６６】
３）  マウス心筋梗塞モデル
マウスの体重を量り、１％ペントバルビタールナトリウムを５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内に注入して麻酔し、仰臥位に固定した。グースネックランプ下で気管チューブを挿入し、第２肋骨と第３肋骨の間の皮膚を横方向に切開し、斜め大胸筋を持ち上げ、内側縦小胸筋を引き抜き、胸腔を露出させた。第２肋骨と第３肋骨の間の筋肉を切開し、持ち上げ、肋骨スプレッダーに入れ、肺に触れないように心臓を露出させた。鋭いピンセットで心膜を取り外し、左手で心臓を固定し、心耳を露出させ、針ホルダーを右に持ち、心耳の下端の３〜５ｍｍＬＡＤで８〜０のナイロン糸で結紮し、左心室結紮下の色の変化及び鼓動を観察した。肋骨、筋肉、皮膚を５〜０の縫合糸で縫合し、自発呼吸が回復するまでマウスの状態を観察し、呼吸カテーテルを引き出した。
偽手術群：手術は結紮せずに行われた。
治療群：ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇを尾静脈内に注入し、合計２群、３日１回注射し、３０日間持続し、合計１０回投与した。
損傷群：対照として同量の生理食塩水を尾静脈内に注入した。
【００６７】
実施例１７．虚血環境での内皮細胞に対するｃ−ＭＥＴ抗体の保護作用
１）光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルの脳血管内皮細胞に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ保護効果
本発明のｃ−ＭＥＴ抗体がｉｎ  ｖｉｖｏでｃ−ＭＥＴに結合した後に血管内皮細胞に対して実質的な保護効果を有するか否かを検出するために、以下の各群マウスの局所的虚血部位に免疫組織化学的検出を行い、血管の損傷及び修復を評価した。
実施例１６のように局所脳虚血光化学モデルで構築され、群分け、モデリング、投与、動物麻酔を行った後、まず、３７℃のＰＢＳで心臓を灌流し、その後、４℃の４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で灌流固定し、最後に、脳組織を取り出し、組織をすぐにＯＣＴ（凍結切片包埋剤）で包埋した後、凍結切片し、切片厚さは、通常１２〜１６μｍであり、凍結切片を５％正常ヒツジ血清で室温、１時間ブロッキングし、次いで、５％正常ヒツジ血清で希釈された一次抗体を加え、４℃で一晩静置し、翌日ＰＢＳで３回洗浄した後、対応する蛍光二次抗体のように暗所で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した後、封入剤で固定した後に蛍光顕微鏡で観察した。
脳微小血管内皮細胞染色の結果は図１５に示し、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、ＶＷＦは血管内皮細胞マーカーであり、ＤＡＰＩは核染色マーカーであり、合併とはＶＷＦ及びＤＡＰＩで染色された同一視野の写真が画像結合によって合成された画像である。
結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は光化学的損傷後の脳血管内皮細胞損傷を有意に低減させることができ、血管完全性がよく、光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルによる脳梗塞に対して保護作用を有することを示した。
ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体群は、微小血管損傷の程度が対照群より低いことが分かった。上記結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は脳血管内皮系を効果的に保護できることを示した。
【００６８】
２）塞栓糸によるマウス脳虚血モデル（ＭＣＡＯ）の脳血管内皮細胞に対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ保護効果
実施例１６のように塞栓糸によるマウス脳虚血モデル（ＭＣＡＯ）構築され、群分け、モデリング、投与、動物麻酔を行った後、まず、３７℃のＰＢＳで心臓を灌流し、その後、４℃の４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で灌流固定し、最後に、脳組織を取り出し、組織をすぐにＯＣＴ（凍結切片包埋剤）に包埋した後、凍結切片し、切片厚は、通常１２〜１６μｍであり凍結切片を５％正常ヒツジ血清で室温、１時間ブロッキングし、次いで、５％正常ヒツジ血清で希釈された一次抗体を加え、４℃で一晩静置し、翌日ＰＢＳで３回洗浄した後、対応する蛍光二次抗体のように暗所で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した後、封入剤で固定した後に蛍光顕微鏡で観察した。
脳微小血管内皮細胞染色の結果は図１６−ａに示し、ここで、損傷群は生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、ＶＷＦ（血管内皮細胞マーカー）抗体及び抗ＺＯ−１（密着結合タンパク質）抗体については、合併とはＶＷＦ及びＺＯ−１で染色された同一視野の写真が画像結合によって合成された画像である。損傷部位でのＺＯ−１発現のウエスタンブロット結果を図１６−ｂに示した。
結果は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体はＭＣＡＯの脳血管内皮細胞損傷を大幅に低減させることができ、血管完全性がよく、ＭＣＡＯモデルによる内皮系の損傷に対して保護作用を有することを示した。
ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体群は、微小血管損傷の程度が対照群より低いことが分かった。上記結果は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は脳血管内皮系を効果的に保護できることを示した。
【００６９】
３）マウス心不全モデル（ＭＩ心筋梗塞モデル）の血管内皮細胞に対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の保護作用
実施例１６に記載のように立マウス心不全モデル（ＭＩ心筋梗塞モデル）を構築し、群分けを行った。心臓をすばやく取り出し、４％パラホルムアルデヒドに入れて固定した後、パラフィン包埋し、ＬＡＤ結紮糸の下部から３ｍｍの位置で切片を作り、切片厚さは３ｍｍであり、ＶＷＦ染色を行い、まず、ＶＷＦ抗体を使用して切片をインキュベートし、抗体希釈率は１：５０であり、室温で１２０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ標識抗ウサギ二次抗体を加え、抗体希釈率は１：５００であり、室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、各切片に新鮮に調製されたＤＡＢ溶液１滴を加え、顕微鏡下で５分間観察し、０．１％ＨＣｌで分別し、水道水で濯ぎ、青色に染色し、切片をアルコールで勾配脱水して乾燥させ、キシレンで透徹させ、中性樹脂で封入され、風乾後、顕微鏡で観察した。
評価指標：ＶＷＦは、血管内皮細胞マーカーであり、ＶＷＦへの免疫組織化学染色により血管内皮細胞の分布及び状態を観察し、血管の完全性を反映し、マウスＭＩ心筋梗塞モデルの心臓微小血管に対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の影響を評価した。
結果は、心臓組織切片のＶＷＦ染色結果は図１７に示し、ここで、損傷群は、同量の生理食塩水を注射し、治療群は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体３ｍｇ／ｋｇを注射した。対照群は偽手術群である。結果は、対照群は、ＶＷＦ染色像は明瞭であり、血管構造が明瞭で完全であり、損傷群は、ＶＷＦ染色像は明瞭であり、血管部位構造の損傷はひどく、ＭＩ心筋梗塞によって引き起こされる血管損傷がひどいことを示し、治療群はＶＷＦ染色像は明瞭であり、血管構造は比較的完全に維持し、抗ｃ−ＭＥＴ  ヒト化抗体はマウス心不全モデル（ＭＩ心筋梗塞モデル）による心臓微小血管損傷に対して保護作用を有することを証明した。
【００７０】
実施例１８．虚血による血液脳関門の透過に対するｃ−ＭＥＴ抗体の保護作用の研究
血液脳関門の透過性の増加は、脳血管内皮細胞損傷後の重要な病理学的関連であり、脳組織の続発性損傷につながる可能性がある。従って、本発明は、各種のモデルを使用して血液脳関門を保護するためのｃ−ＭＥＴ抗体の機能を検証した。
１）酸素ーグルコース欠乏後の単層Ｂｅｎｄ．３血液脳関門モデルへの影響
血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）４×１０4個の細胞／ｍＬを５００μｌ／ウェルでトランスウェルチャンバー（ＢＤ、３５３０９７）の上部チャンバーに加え、下部チャンバーに培地７５０μｌを加え、培地はＤＭＥＭ基本培養液（ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３０２４３．０１）＋１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＢＩ、ＲＥＦ：０４−００１−１ＡＣＳ）である。７２ｈ細胞培養後にＤＭＥＭ基本培養液を交換し、異なる濃度のｃ−Ｍｅｔヒト化抗体を加え、３７℃のインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ、３１１１）で１６ｈ培養した。その後、嫌気槽（三菱化学、Ｃ３１）内で嫌気性バッグ（三菱化学、Ｃ１）を使用して低酸素環境を作り、酸素ーグルコース欠乏損傷６ｈを行い、培地はＤＭＥＭ无糖培養液（Ｇｉｂｃｏ、１１９６６−０２５）であり、治療群は、異なる濃度のｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を加えた。次いで、ＤＭＥＭ完全培養液を交換し、ＤＭＥＭ基本培養液（ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３０２４３．０１）＋１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＢＩ、ＲＥＦ：０４−００１−１ＡＣＳ）であった。異なる濃度のｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を加え、上部チャンバーに１×１０6個のマウス末梢血リンパ球／ウェルを加え、３７℃のインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ、３１１１）で２４ｈ培養した。下部チャンバーの底部でのマウス末梢血リンパ球をクリスタルバイオレットで染色し、血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）の血液脳関門インビトロモデルに対する被験抗体の作用を細胞数で評価した。
対照群：酸素ーグルコース欠乏処理なしの細胞サンプル；
損傷群：酸素ーグルコース欠乏処理を受けた細胞サンプル；
治療群：酸素ーグルコース欠乏条件下で異なる濃度のｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体によって処置された細胞サンプル。
カウント結果は図１８に示し、結果は、血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）が酸素ーグルコース欠乏処理を経た後、細胞層の完全性が損なわれ、細胞層に透過したマウス末梢血中のリンパ球の数が有意に増加し、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は酸素ーグルコース欠乏後の血液脳関門インビトロモデルに対して保護効果を有し、透過したマウスの末梢血中のリンパ球の数が減少し、加えた濃度が高くなるほど、効果はより顕著になる。
【００７１】
２）光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルの血液脳関門透過性に対するｃ−ＭＥＴ  モノクローナル抗体の保護作用
本発明のｃ−ＭＥＴ抗体がｉｎ  ｖｉｖｏでｃ−ＭＥＴに結合した後、血液脳関門に対して実質的な保護作用を有するか否かを検出するために、実施例１６に記載のように冷光源光光化学的に誘発された局所脳梗塞ラットモデルを構築し、群分けし、各群マウス血液脳関門透過性を検出し、血液脳関門の維持に対するその効果を評価した。
実施例１６に記載のように冷光源光化学的に誘発された局所脳梗塞ラットモデルを構築し、群分けし、投与を行い、エバンスブルー浸出液で血液脳関門の破壊を観察し、対応する時点で試験動物を屠殺する１時間前に尾静脈に２％エバンスブルー生理食塩水溶液（４ｍＬ／ｋｇ体重）を注入した。開胸して灌流し、右心耳からの液体が基本的に透明な場合には、脳を断頭し、梗塞した大脳半球を取り出し、秤量した後、３ｍＬホルムアミド溶液に入れ、５０℃の恒温水槽で７２ｈインキュベートし、２０ｍｉｎ（４０００ｒ／ｍｉｎ）遠心し、上清を採取し、マイクロプレートリーダー（波長６３２ｎｍ）で吸光度を測定し、ＥＢによって描かれた標準曲線に従ってＥＢ含有量を計算し、結果はμｇ／ｇ脳組織で表された。
脳組織へのＥＢ浸潤の状況を図１９に示し、ここで、図１９−ａは、動物脳組織写真であり、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、図１９−ｂは、統計後のエバンスブルー含有量を示した。横軸は群分けの状況であり、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、縦軸は、エバンスブルー含有量（単位はμｇ／ｇ脳組織）である。
結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は光化学的損傷後の動物脳組織におけるエバンスブルーの含有量を顕著に低減させ、光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルによる血液脳関門の透過性増加に対して修復作用を有することを示した。
ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体群は、ＥＢ浸潤が対照群よりも有意に低いことが分かった。上記結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は血液脳関門を保護できることを示した。
【００７２】
３）内皮細胞損傷後の密着結合タンパク質発現に対するｃ−ＭＥＴ抗体の影響
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出
実施例１２に記載のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ酸素ーグルコース欠乏モデルを構築した後、細胞上清を廃棄し、細胞から全ＲＮＡを抽出し、異なる密着結合タンパク質のプライマーを使用して目的遺伝子の蛍光定量ＰＣＲ解析を行い、各群サンプルでの目的遺伝子のｍＲＮＡ転写レベルを取得した。
対照群：酸素ーグルコース欠乏処理なしの細胞サンプル。
損傷群：酸素ーグルコース欠乏処理を受け、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を添加しない細胞サンプル。
治療群：酸素ーグルコース欠乏処理を受け、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体（濃度１００００ｎｇ／ｍｌ）を添加する細胞サンプル。
蛍光定量ＰＣＲ結果は図２０−ａ及び２０−ｂに示し、ここで、横軸は、サンプルの情報であり、縦軸は各遺伝子のｍＲＮＡ相対的な転写レベルであり、対照群の目的遺伝子のｍＲＮＡ転写レベルを１．０とした。ここで、図２０−ａは密着結合タンパク質ＺＯ−１の結果を示し、図２０−ｂは密着結合タンパク質クローディン−５の結果を示した。結果は、酸素ーグルコース欠乏後の血管内皮細胞（Ｂｅｎｄ．３）のクローディン−５及びＺＯ−１タンパク質のｍＲＮＡ転写レベルは有意に低減し、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の添加に伴い、クローディン−５及びＺＯ−１タンパク質のｍＲＮＡ転写レベルは有意に向上し、対照群の発現レベルを超えた。ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は酸素ーグルコース欠乏血管内皮細胞での密着結合タンパク質のｍＲＮＡ転写レベルを顕著に向上させることを示した。
【００７３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ検出：
実施例１６に記載のように、マウス脳虚血ＭＣＡＯモデルを構築し、群分け処理した後、マウスの脳を取り出し、１ｍｍ間隔で切片にした後、脳切片に間接免疫蛍光二重染色を施し、抗ＶＷＦ（内皮細胞マーカー）抗体及び抗ＺＯ−１（密着結合タンパク質）抗体をそれぞれ加え、脳梗塞の虚血半影帯の微小血管を染色し、血液脳関門の完全性に与える影響、及び密着結合タンパク質ＺＯ−１の発現レベルに対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の影響を評価した。染色結果は図１６−ａに示し、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体群は、脳梗塞虚血の半影帯の微小血管の完全性が損傷群よりもよく、ＺＯ−１の発現量も損傷群よりも高く、血液脳関門の破壊が少ないことを証明した。
マウスの脳を取り出し、脳梗塞領域からサンプルを採取し、液体窒素で研磨し、サンプルを調製し、ＺＯ−１タンパク質へのウエスタンブロッティング解析を行った。ウエスタンブロッティング結果は図１６−ｂに示し、損傷群は、ＺＯ−１タンパク質の発現レベルは有意に低減し、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体群は、ＺＯ−１タンパク質の発現レベルが偽手術群と基本的に一致しており、ＺＯ−１タンパク質がマウスＭＣＡＯモデルにおいて顕著に低減し、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は、ＺＯ−１タンパク質の発現レベルを有意に向上でき、発現レベルを偽手術群に近づけることを証明した。
【００７４】
実施例１９．虚血モデル組織梗塞に対するｃ−ＭＥＴ抗体の影響
本発明のｃ−ＭＥＴ抗体がｉｎ  ｖｉｖｏでｃ−ＭＥＴに結合した後に梗塞巣に実質的な保護効果をもたらすか否かを検出するために、実施例１２に記載の各群マウスの局所的虚血部位の脳梗塞体積を評価した。
１）塞栓糸によるマウス脳虚血モデル（ＭＣＡＯ）の脳梗塞に対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の保護作用
実施例１６に記載のように、塞栓糸によるマウス脳虚血モデル（ＭＣＡＯ）を構築し、群分けを行った。処理済みに、マウスの脳を取り出し、２ｍｍ間隔で切片にした後、脳切片を２％  ２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ、０．９％生理食塩水中）で染色し、梗塞領域のサイズを決定した。
脳梗塞体積は図２１に示し、ここで、図２１−ａは、動物脳組織剖面の写真であり、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、図２１−ｂは、統計後の脳梗塞体積結果である。横軸は群分けの状況であり、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、縦軸は、脳梗塞体積（単位ｍｍ3）であり、結果は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は塞栓糸によるマウス脳虚血モデル（ＭＣＡＯ）の動物脳梗塞体積を顕著に低減でき、ＳＤラット塞栓糸によるマウス脳虚血モデル（ＭＣＡＯ）によって引き起こされる脳梗塞に対して保護作用を有することを示した。
ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体群は、脳梗塞体積が対照群よりも明らかに小さくなることを示した。上記結果は、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体は脳梗塞組織の損傷を軽減できることを示した。
【００７５】
２）光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルの脳組織に対するｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の保護作用
実施例１６に記載のように、光化学脳梗塞モデルを構築し、群分け処理を行い、手術後、マウスの脳を取り出し、２ｍｍ間隔で切片にした後、脳切片を２％  ２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ、０．９％生理食塩水中）で染色し、梗塞領域のサイズを決定した。
脳梗塞体積は図２２に示し、ここで、図２２−ａは、動物脳組織剖面の写真であり、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、図２２−ｂは統計後の脳梗塞体積の結果を示した。横軸は群分けの状況であり、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、縦軸は脳梗塞体積（単位ｍｍ3）であり、結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は光化学的損傷後の動物脳梗塞体積を顕著に低減でき、光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルによる脳梗塞に対して保護作用を有することを示した。
上記結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は脳梗塞組織の損傷を軽減できることを示した。
【００７６】
３）マウス心不全モデル（ＭＩ心筋梗塞モデル）の心筋線維化に対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の保護作用
実施例１６に記載のようにマウス心不全モデル（ＭＩ心筋梗塞モデル）を構築し、群分け処理を行った後、心臓をすばやく取り出し、４％パラホルムアルデヒドに入れて固定した後、パラフィン包埋し、ＬＡＤ結紮糸の下部から３ｍｍの位置で切片を作り、切片厚さは３ｍｍであり、マッソン染色を行い、まず、マッソン複合染色液を使用して５分間染色し、０．２％酢酸水溶液で１回洗浄した後、５％リンタングステン酸で５〜１０分間処理し、０．２％酢酸水溶液で２回洗浄した後、鮮やかな緑色の染色液で５分間染色し、０．２％酢酸水溶液で２回洗浄し、無水エタノールで脱水し、キシレンで透徹させ、中性樹脂に封入し、顕微鏡で観察して写真を撮った。
評価指標：マッソン染色法により心筋梗塞領域の線維化レベルを評価し、マウスＭＩ心筋梗塞モデルの心筋線維化に対するｃ−ＭＥＴ抗体の影響を観察した。
結果：心臓切片のマッソン染色結果は図２３に示し、ここで、図２３−ａはマッソン染色結果を示し、図２３−ｂは、梗塞領域の分布比（コラーゲン線維／筋線維）結果を湿ｓ、ここで、損傷群は同量の生理食塩水を注射し、治療群は、合計２群であり、それぞれｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇを注射した。対照群は、偽手術群である。結果は、対照群では、コラーゲン線維の陽性染色はほとんどなく、損傷群のコラーゲン線維の染色は明らかであり、ＭＩ心筋梗塞後によって引き起こされる心筋線維化は重篤であることを示し、治療群は、心肌組織線維化の程度は顕著に減少し、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体濃度が高くなるほど、線維化の程度はより著しく弱まり、ｃ−ＭＥＴ  ヒト化キメラ抗体はマウス心不全モデル（ＭＩ心筋梗塞モデル）による心肌組織の線維化に対して阻害作用を有することを証明した。
【００７７】
実施例２０．虚血モデルの生理機能に対するｃ−ＭＥＴ抗体の影響
１）光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルに対するｃ−ＭＥＴ  モノクローナル抗体のニューロン保護作用
本発明のｃ−ＭＥＴ抗体がｉｎ  ｖｉｖｏでｃ−ＭＥＴに結合した後、ニューロンに対して実質的な保護効果を有するか否かを検出するために、実施例８に記載の各群マウスの梗塞領域の末梢神経細胞に免疫組織化学的検出を行い、ニューロンに対するその保護作用を評価した。
実施例１６に記載のようにラット局所脳虚血光化学モデルを構築し、群分け、投与、動物麻酔を行った後、まず、３７℃のＰＢＳで心臓を灌流し、その後、４℃の４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で灌流固定し、最後に、脳組織を取り出し、組織をすぐにＯＣＴ（凍結切片包埋剤）で包埋した後、凍結切片し、切片厚さは、通常１２〜１６μｍであり、凍結切片を５％正常ヒツジ血清で室温、１時間ブロッキングし、次いで、５％正常ヒツジ血清で希釈された一次抗体を加え、４℃で一晩静置し、翌日ＰＢＳで３回洗浄した後、対応する蛍光二次抗体のように暗所で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した後、封入剤で固定した後に蛍光顕微鏡で観察した。
ニューロン染色結果は図２４に示し、ここで、図２４−ａは、脳梗塞領域のニューロンの免疫組織化学的染色の結果であり、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、活性化カスパーゼ−３は細胞アポトーシスマーカーであり、ＮｅｕＮは、ニューロン細胞マーカーであり、合併とは、活性化カスパーゼ−３及びＮｅｕＮで染色された同一視野の写真が画像結合によって合成された画像である。図２４−ｂは、統計後の単一視野内でのアポトーシスのニューロン細胞数の結果を示した。横軸は、群分けの状況であり、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、縦軸は、アポトーシスのニューロン細胞数である。
結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は光化学的損傷後の脳梗塞領域ニューロン細胞損傷を顕著に軽減でき、神経細胞の死細胞数は有意に低減し、光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルによる脳梗塞に対して保護作用を有することを示した。ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体群は、ニューロン損傷の程度が対照群よりも低いことが分かった。上記結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体はニューロンを保護できることを示した。
【００７８】
２）光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルの神経行動学的症状に対するｃ−ＭＥＴ  モノクローナル抗体の作用
ラット脳梗塞後に対するｃ−ＭＥＴ抗体の神経保護作用を検出するために、実施例１６に記載の各群マウスの神経機能及び神経行動を評価した。Ｌｏｎｇａらの５レベル４点法の基準を参照し、マウスが覚醒した後に神経機能スコアを行った。
スコア基準は、以下の通りである。
０点、神経学的欠損症状なし；
１点、軽度の神経学的欠損であり、左前足を完全に伸ばすことができない；
２点、中等度の局所神経学的欠損であり、歩行中に左に曲がる；
３点、重篤な局所神経学的欠損であり、左側に倒れる；
４点、自発的な歩行出来ない、意識レベルが低下する；
神経行動学的評価の結果は、図２５に示し、ここで、横軸は群分けの状況であり、ここで、損傷群は、生理食塩水を注射し、治療群はｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体を用量１ｍｇ／ｋｇで注射し、縦軸は、神経機能スコアであり、結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は光化学的損傷後の動物神経機能を顕著に改善させ、光化学的に誘発されたＳＤラット局所脳虚血モデルによる脳梗塞症状に対して保護作用を有することを示した。
ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体群は、行動能力は対照群よりも有意に優れたことが分かった。上記結果は、ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体は脳梗塞の臨床症状を改善できることを示した。
【００７９】
３）マウス心不全モデル（ＭＩ心筋梗塞モデル）に対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の心機能保護作用
実施例１６に記載のようにマウス心不全モデル（ＭＩ心筋梗塞モデル）を構築し、群分けを行った。評価指標：心機能指数を心エコー検査により評価し、マウスＭＩ心筋梗塞モデルの心機能に対するｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体の保護効果を観察した。
結果は、心エコー検査評価結果は図２６に示し、ここで、図２６−ａは心室駆出率（ＥＦ）の結果を示し、図２６−ｂは、左室内径短縮率（ＦＳ）の結果を示し、図２６−ｃは、左室拡張末期容量（ＥＤＶ）の結果を示し、図２６−ｄは，左室収縮末期容量（ＥＳＶ）の結果を示し、ここで、損傷群は同量の生理食塩水を注射し、治療群は合計２群、それぞれｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇを注射した。結果は、損傷群は、ＥＦ値はいずれも４０％未満であり、心筋梗塞モデルの構築に成功し、１ｍｇ／ｋｇ／３ｄのｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を尾静脈内に注射した後、ＥＦ値は回復の傾向があり、３ｍｇ／ｋｇ／３ｄのｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体を尾静脈に注射した後、ＥＦ値の回復はさらに明らかになり、ＦＳ値、ＥＤＶ値及びＥＳＶ値は、いずれも同様の傾向があり、ｃ−ＭＥＴヒト化キメラ抗体がマウスＭＩ心筋梗塞モデルの心機能に対して保護効果を有することを示した。
【図１】
2021507936.tif 000004
【図２】
2021507936.tif 000005
【図３】
2021507936.tif 000006
【図４】
2021507936.tif 000007
【図５】
2021507936.tif 000008
【図６】
2021507936.tif 000009
【図７】
2021507936.tif 000010
【図８】
2021507936.tif 000011
【図９】
2021507936.tif 000012
【図１０】
2021507936.tif 000013
【図１１】
2021507936.tif 000014
【図１２】
2021507936.tif 000015
【図１３】
2021507936.tif 000016
【図１４】
2021507936.tif 000017
【図１５】
2021507936.tif 000018
【図１６】
2021507936.tif 000019
【図１７】
2021507936.tif 000020
【図１８】
2021507936.tif 000021
【図１９】
2021507936.tif 000022
【図２０】
2021507936.tif 000023
【図２１】
2021507936.tif 000024
【図２２】
2021507936.tif 000025
【図２３】
2021507936.tif 000026
【図２４】
2021507936.tif 000027
【図２５】
2021507936.tif 000028
【図２６】
2021507936.tif 000029
【配列表】
2021507936000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月13日(2020.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体を含有する、血管内皮細胞障害性疾患の治療又は予防用組成物。
【請求項２】
前記血管内皮細胞障害性疾患は、虚血性心疾患又は血液脳関門障害性疾患である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記虚血性心疾患は、脳梗塞又は心筋梗塞である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記の脳梗塞を治療又は予防することは、血液脳関門の透過性を低減することにより、及び／又は脳血管を保護・修復することにより、及び／又は脳梗塞体積を減少させることにより達成される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体は、ｃ−ＭＥＴ抗原で動物を免疫することにより調製されたモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ｃ−ＭＥＴ抗原は、免疫原性を有するｃ−ＭＥＴ完全長分子、融合タンパク質、分子断片及び／又はポリペプチドである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体は、Ｂリンパ球の抗体ライブラリー又は人工抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより得られる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体は、遺伝子工学的に改良されたが、依然としてアゴニスト活性を保持する抗体化合物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体は、ＦＷ及び／又はＦｃ断片がヒト化された抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体は、完全ヒト抗体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体は、ポリクローナル抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ｃ−ＭＥＴアゴニスト抗体は、重鎖及び軽鎖を含む抗体分子であり、且つ
前記重鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１から選ばれる少なくとも１つの重鎖可変領域の配列又はその突然変異配列を含み、且つ  前記軽鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４から選ばれる少なくとも１つの軽鎖可変領域の配列又はその突然変異配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ｃ−ＭＥＴアゴニストは、抗体−薬物コンジュゲートである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
ｃ−ＭＥＴに結合できる抗体又はその機能的断片において、前記抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、且つ  前記重鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１から選ばれる少なくとも１つの重鎖可変領域の配列又はその突然変異配列を含み、且つ  前記軽鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４から選ばれる少なくとも１つの軽鎖可変領域の配列又はその突然変異配列を含む、抗体又はその機能的断片。
【請求項１５】
請求項１４に記載の抗体又はその機能的断片、及び任意に選択される薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内若しくは皮下経路により投与され、又は経口経路により投与される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記医薬組成物は、静脈内注射剤である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
さらに、血管内皮細胞障害性疾患を治療又は予防する、別の１つ又は複数の薬学的に活性な化合物を含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記医薬組成物は、逐次使用のための組合せ製品であり、さらに、ＩＲＦ５阻害剤、パクリタキセル、脂質低下薬又は血管新生阻害剤、及びそれらの組み合わせを含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
血管内皮細胞障害性疾患の治療又は予防するために用いられる薬学的に活性な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）被験化合物をｃ−ＭＥＴと接触させること、及び
（ｉｉ）被験化合物がｃ−ＭＥＴに特異的に結合するかどうかを判断すること、を含み、
ここで、ｃ−ＭＥＴへの前記被験化合物の特異的結合は、前記被験化合物が血管内皮細胞障害性疾患を治療又は予防するための医薬として使用できることを示す、方法。
【請求項２１】
前記虚血性心疾患は、脳梗塞又は心筋梗塞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１４に記載の抗体又はその機能的断片を含有する、対象からインビトロで血管内皮細胞障害性疾患を診断するための医薬品又は診断キット。
【国際調査報告】
2021507936.tif 000030
2021507936.tif 000031
2021507936.tif 000032
2021507936.tif 000033
2021507936.tif 000034
2021507936.tif 000035
2021507936.tif 000036
2021507936.tif 000037
2021507936.tif 000038
2021507936.tif 000039
2021507936.tif 000040
2021507936.tif 000041