(57)【要約】  インビトロで褐色脂肪細胞の集団を産生するための、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）シグナル伝達阻害剤の使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで褐色脂肪細胞の集団を産生するための、ＴＧＦ−β阻害剤の使用。
【請求項２】
前記ＴＧＦ−β阻害剤が、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３阻害剤、並びに／又はアクチビンシグナル伝達阻害剤である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＴＧＦ−β阻害剤が、
【化１】
2021525089.tif 000008
又はその塩若しくは誘導体である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記褐色脂肪細胞の集団が、幹細胞の集団及び／若しくは中胚葉細胞の集団からインビトロで産生され、好ましくは前記幹細胞が、人工多能性幹細胞であり、並びに／又は、好ましくは前記中胚葉細胞が、沿軸中胚葉細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記褐色脂肪細胞の集団が、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＣ２、ＭＲＦ４、ＭＳＧＮ１、ＭＹＦ５、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＰＲＲＸ１、ＳＩＸ１、及び／又はＴＢＸ６を発現する細胞の集団からインビトロで産生される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記褐色脂肪細胞が、ＰＧＣ１−α、ＰＰＡＲγ、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＤＭ１６、ＥＮＤＲＢ、ＣＩＤＥＡ、ＤＩＯ２、及び／又はＥＢＦ２を発現する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記褐色脂肪細胞が、ＵＣＰ１を発現する、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
細胞の集団をＴＧＦ−β阻害剤と接触させる工程を含む、褐色脂肪細胞の集団を産生する方法。
【請求項９】
前記ＴＧＦ−β阻害剤が、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３阻害剤、並びに／又はアクチビン阻害剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＧＦ−β阻害剤が、
【化２】
2021525089.tif 000009
又はその塩若しくは誘導体である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＧＦ−β阻害剤と接触させる前記細胞の集団が、中胚葉細胞の集団であり、好ましくは前記中胚葉細胞が、沿軸中胚葉細胞である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＧＦ−β阻害剤と接触させる前記細胞の集団が、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＣ２、ＭＲＦ４、ＭＳＧＮ１、ＭＹＦ５、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＰＲＲＸ１、ＳＩＸ１、及び／又はＴＢＸ６を発現する細胞の集団である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＧＦ−β阻害剤と接触させる前記細胞の集団が、幹細胞の集団から、好ましくは３Ｄ細胞培養を用いて産生され、並びに／又は、好ましくは前記幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
中胚葉細胞の集団を、前記ＴＧＦ−β阻害剤の存在下で約１〜１５日、好ましくは約６〜１０日、培養する工程と、
工程（ａ）によって提供された前記細胞の集団を、前記ＴＧＦ−β阻害剤の非存在下で約２０〜５０日、好ましくは約１５〜３０日、培養する工程と、
を含む、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ａ）及び（ｂ）の前記培養が、接着培養である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）によって提供された前記細胞の集団を、凝集褐色脂肪細胞の形成に好適な条件下で培養する工程であって、好ましくは、前記培養が回転浮遊培養である、工程を更に含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
褐色脂肪細胞を分析する方法であって、
請求項８〜１６のいずれか一項に記載の方法を用いて、褐色脂肪細胞の集団を準備する工程と、
前記褐色脂肪細胞の集団を、インビトロで分析する工程、又は前記褐色脂肪細胞の集団を動物モデルに移植する工程と、
を含む、方法。
【請求項１８】
ＴＧＦ−β阻害剤を使用してインビトロで得ることができる、褐色脂肪細胞の集団。
【請求項１９】
請求項８〜１７のいずれか一項に記載の方法によって産生された、褐色脂肪細胞の集団。
【請求項２０】
手術及び／又は治療における使用のための、請求項８〜１７のいずれか一項に記載の方法によって産生された、褐色脂肪細胞の集団。
【請求項２１】
糖尿病の治療又は予防における使用のための、請求項２０に記載の褐色脂肪細胞の集団。
【請求項２２】
褐色脂肪細胞を対象に移植する方法であって、
請求項８〜１７のいずれか一項に記載の方法を用いて、褐色脂肪細胞の集団を準備する工程と、
前記褐色脂肪細胞の集団を前記対象に移植する工程と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、褐色脂肪細胞の産生に関する。より具体的には、本発明は、ヒト多能性幹細胞などの細胞を褐色脂肪細胞に分化させる、改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真性糖尿病（一般に糖尿病と呼ばれる）は、長期間にわたり患者の血糖濃度が高いことを特徴とする代謝性疾患群である。糖尿病の世界的な有病数は３億８千７百万人に達し、２０３０年までに４億３千５百万人まで増加する見通しである。実際に、世界の人口の６５％は、栄養不足よりも肥満が死因となることが多い国で生活している（ＷＨＯ−２０１０）。
【０００３】
糖尿病には主として２つのタイプ（１型及び２型）があり、これらは原因及び治療方法が異なる。１型糖尿病は、膵臓においてインスリンを産生するベータ細胞が、多くの場合自己免疫機序により破壊されることを原因とする。２型糖尿病は、末梢組織におけるインスリン抵抗性を原因とするものであり、この抵抗性は膵臓ベータ細胞の機能不全、体重過多、身体活動の不足、及び遺伝的素因に結び付けられ得る。糖尿病症例の約１０％は、１型に相当する。しかし、患者の大部分（８５〜９０％）は、２型糖尿病を示す。米国内で２０１２年に診断された糖尿病による経済的コストの推定総額は、２００７年以前の推定額と比較して４１％増加し、２４５０億ドルに達した。これには糖尿病が社会に大きな負担を課していることが顕著に表れている。
【０００４】
１型糖尿病を管理するには、患者の生涯にわたり定期的にインスリンを注射する必要がある。対照的に、２型糖尿病は、食事、体重、及び身体運動の管理により制御することができるが、長期治療では、場合によりインスリン注射と投薬（例えばメトホルミン又はスルホニル尿素）の併用が必要なことがある。
【０００５】
患者は、１型糖尿病及び２型糖尿病の両方を既存の治療法で管理できる場合があるが、現時点では治癒は存在せず、糖尿病は死亡リスクを有意に増加させる。
【０００６】
肥満の発症を予防するためのエネルギー収支は、エネルギー消費次第である。身体活動は、過剰なエネルギーを消散させる上で主要な機序であるが、エネルギーはまた、身体が低体温にならないように発達した熱産生のシステムを通じて放散される場合もある。熱産生は、褐色脂肪細胞における、ミトコンドリアの脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）による酸化的リン酸化反応の脱共役に基づく。褐色脂肪組織（ＢＡＴ）は、エネルギー放散及びグルコース消失を介在する代謝活性の高い臓器であり、したがって、適切なエネルギーバランス及び炭水化物恒常性を維持するのに寄与する。
【０００７】
遺伝子操作又は薬剤によるＵＣＰ１の上方調節により、肥満を低減し、インスリン感受性を改善できることが示されている。その逆に、げっ歯類においては、ＢＡＴの機能不全により肥満が促進され、炭水化物の代謝が障害され、最終的にはベータ細胞に対する機能上の要求が増加するという証拠が存在する。成人における機能性ＢＡＴの発見以来、老化、２型糖尿病、並びにＢＡＴ貯蔵の量及び活性の間の逆相関が報告されている。活性化の際、ＢＡＴにより、遊離脂肪酸及びグルコース酸化のエネルギーは、ＵＣＰ１を介して熱に変換される。近年、ＢＡＴによりトリグリセリドの取り込み及びインスリン感受性が増加することが実証されている。
【０００８】
ヒト褐色脂肪組織の特徴及び機能に関する研究は、褐色脂肪細胞そのものの入手性によって妨げられてきた。
【０００９】
過去に、ヒト胚性幹細胞又は間葉系幹細胞、並びにヒト人工誘導多能性幹細胞のいずれかに由来する褐色脂肪細胞のモデルを開発するために、数多くの技術が用いられてきた。かかるプロトコルのあるものは、ＰＰＡＲｇ及びＰＧＣ１ａなどの、特定の褐色転写因子を発現させる遺伝子工学を応用していた（Ａｈｆｅｌｄｔ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４：２０９−２１９）。しかしながら、このような技術は、遺伝子の変化を生じることがあり、この変化が、生成された褐色脂肪細胞の機能に影響する恐れがあるという欠点を有する。別のアプローチでは、サイトカインカクテルを使用して、ｈｉＰＳＣを褐色脂肪様細胞に分化させた（Ｎｉｓｈｉｏ，Ｍ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．１６：３９４−４０６）。しかしながら、このアプローチは、十分に特異的なものでも堅牢なものでもなく、したがって、ヒト褐色脂肪組織の供給源を生成するのに用いることができない。
【００１０】
以上から、研究室においてこれらの細胞を確実に研究できるように、またそれだけでなくこれらの細胞の、医療及び美容目的のための移植（例えば、再建形成手術又は美容形成手術）などといった更なる応用も可能にするために、褐色脂肪細胞の入手方法を提供することが、当該技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、制御された方法で特定の増殖因子を使用して、褐色脂肪細胞の分化誘導及び分化の指定のための発生経路を再現する、プロトコルを開発した。
【００１２】
このプロトコルを適用することにより、本発明者らは、高効率（例えば８０％）で高度に濃縮されたヒト褐色脂肪細胞の集団を得ることが可能となった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
このことから、一態様として本発明は、インビトロで褐色脂肪細胞の集団を産生するための、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）阻害剤の使用を提供する。
【００１４】
一実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤は、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３阻害剤である。一実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤は、アクチビンＡ阻害剤である。
【００１５】
一実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤は、
【化１】
2021525089.tif 000002
又はその塩若しくは誘導体である。
【００１６】
一実施形態では、褐色脂肪細胞の集団は、幹細胞の集団及び／又は中胚葉細胞の集団からインビトロで産生される。好ましい実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。好ましい実施形態では、中胚葉細胞は、沿軸中胚葉細胞である。
【００１７】
一実施形態では、褐色脂肪細胞の集団は、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＣ２、ＭＲＦ４、ＭＳＧＮ１、ＭＹＦ５、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＰＲＲＸ１、ＳＩＸ１、及び／又はＴＢＸ６のうちのいずれか１つを発現する細胞の集団からインビトロで産生される。
【００１８】
好ましい実施形態では、褐色脂肪細胞の集団は、少なくとも分化の６日目までに、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＣ２、ＭＲＦ４、ＭＳＧＮ１、ＭＹＦ５、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＰＲＲＸ１、ＳＩＸ１、及び／又はＴＢＸ６のうちのいずれか１つを発現する。
【００１９】
一実施形態では、褐色脂肪細胞は、ＵＣＰ１、並びに望ましくはＰＧＣ１−α、ＰＰＡＲγ、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＤＭ１６、ＥＮＤＲＢ、ＣＩＤＥＡ、ＤＩＯ２、及び／又はＥＢＦ２を発現する。
【００２０】
好ましい実施形態では、褐色脂肪細胞は、ＵＣＰ１を発現する。別の好ましい実施形態では、フォルスコリンを褐色脂肪細胞に添加して、ＵＣＰ１の発現を増加させることができる。
【００２１】
更に別の好ましい実施形態では、褐色脂肪細胞の集団は、これらのマーカー、すなわちＵＣＰ１、ＰＧＣ１−α、ＰＰＡＲγ、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＤＭ１６、ＥＮＤＲＢ、ＣＩＤＥＡ、ＤＩＯ２、及び／又はＥＢＦ２のうちのいずれか１つを発現する。
【００２２】
一実施形態では、褐色脂肪細胞の集団は、分化の少なくとも３６日目までに、ＵＣＰ１、ＰＧＣ１−α、ＰＰＡＲγ、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＤＭ１６、ＥＮＤＲＢ、ＣＩＤＥＡ、ＤＩＯ２、及び／又はＥＢＦ２のうちのいずれか１つを発現する。
【００２３】
一実施形態では、細胞の集団のうち少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％が、ＵＣＰ１を発現する。
【００２４】
別の実施形態では、褐色脂肪細胞は、白色脂肪細胞及び／又は沿軸中胚葉細胞と比較して、脱共役した呼吸及び／又は最大呼吸をより多く示す。
【００２５】
別の実施形態では、褐色脂肪細胞は、フォルスコリンで刺激されたときに、脱共役した呼吸及び／又は最大呼吸をより多く示す。
【００２６】
一実施形態では、褐色脂肪細胞は、２つ以上の脂肪滴、例えば少なくとも３、４、５、１０、１５、２０、又は２５個の脂肪滴を含有する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、細胞の集団をトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）阻害剤と接触させる工程を含む、褐色脂肪細胞の集団を産生する方法を提供する。
【００２８】
一実施形態では、本方法は、インビトロでの方法である。
【００２９】
一実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤は、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３阻害剤である。一実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤は、アクチビンＡシグナル伝達阻害剤である。
【００３０】
一実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤は、
【化２】
2021525089.tif 000003
又はその塩若しくは誘導体である。
【００３１】
一実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤と接触させる細胞の集団は、中胚葉細胞の集団である。好ましい実施形態では、中胚葉細胞は、沿軸中胚葉細胞である。
【００３２】
一実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤と接触させる細胞の集団は、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＣ２、ＭＲＦ４、ＭＳＧＮ１、ＭＹＦ５、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＰＲＲＸ１、ＳＩＸ１、及び／又はＴＢＸ６のうちのいずれか１つを発現する細胞の集団である。好ましい実施形態では、褐色脂肪細胞の集団は、少なくとも分化の６日目までに、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＣ２、ＭＲＦ４、ＭＳＧＮ１、ＭＹＦ５、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＰＲＲＸ１、ＳＩＸ１、及び／又はＴＢＸ６のうちのいずれか１つを発現する。
【００３３】
一実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤と接触させる細胞の集団は、幹細胞の集団から、好ましくはインビトロで、産生される。好ましい実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤と接触させる細胞の集団は、３Ｄ細胞培養を用いて産生される。好ましい実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。
【００３４】
一実施形態では、ＵＣＰ−１活性化因子を添加して、褐色脂肪細胞のマーカーであるＵＣＰ−１の発現を増加させる。
【００３５】
一実施形態では、ＵＣＰ−１活性化因子は、フォルスコリン（ＦＳＫ）：
【化３】
2021525089.tif 000004
又はその塩若しくは誘導体である。
【００３６】
一実施形態では、フォルスコリン（ＦＳＫ）を添加して細胞を刺激し、ＵＣＰ１の発現を増加させ、細胞の機能を評価する。好ましい実施形態では、１〜５０μＭのフォルスコリン（ＦＳＫ）を、１〜２４時間添加する。
【００３７】
好ましい実施形態では、方法は、
（ａ）細胞の集団、好ましくは中胚葉細胞の集団を、ＴＧＢ−βシグナル伝達阻害剤の存在下で第１の期間にわたって培養する工程と、
（ｂ）工程（ａ）によって提供された細胞の集団を、ＴＧＢ−βシグナル伝達阻害剤の非存在下で第２の期間にわたって培養する工程と、を含む。
【００３８】
一実施形態では、第１の期間は、約１〜１５日、２〜１５日、３〜１５日、４〜１５日、５〜１５日、６〜１５日、７〜１５日、８〜１５日、１〜１４日、２〜１４日、３〜１４日、４〜１４日、５〜１４日、６〜１４日、７〜１４日、８〜１４日、１〜１３日、２〜１３日、３〜１３日、４〜１３日、５〜１３日、６〜１３日、７〜１３日、８〜１３日、１〜１２日、２〜１２日、３〜１２日、４〜１２日、５〜１２日、６〜１２日、７〜１２日、８〜１２日、１〜１１日、２〜１１日、３〜１１日、４〜１１日、５〜１１日、６〜１１日、７〜１１日、８〜１１日、１〜１０日、２〜１０日、３〜１０日、４〜１０日、５〜１０日、６〜１０日、７〜１０日、又は８〜１０日、好ましくは約６〜１０日である。
【００３９】
一実施形態では、第２の期間は、約１５〜３０日、１６〜３０日、１７〜３０日、１８〜３０日、１９〜３０日、２０〜３０日、１５〜２９日、１６〜２９日、１７〜２９日、１８〜２９日、１９〜２９日、２０〜２９日、１５〜２８日、１６〜２８日、１７〜２８日、１８〜２８日、１９〜２８日、２０〜２８日、１５〜２７日、１６〜２７日、１７〜２７日、１８〜２７日、１９〜２７日、２０〜２７日、１５〜２６日、１６〜２６日、１７〜２６日、１８〜２６日、１９〜２６日、２０〜２６日、１５〜２５日、１６〜２５日、１７〜２５日、１８〜２５日、１９〜２５日、２０〜２５日、１５〜２４日、１６〜２４日、１７〜２４日、１８〜２４日、１９〜２４日、又は２０〜２４日、好ましくは約１５〜３０日である。
【００４０】
特に好ましい実施形態では、方法は、
（ａ）細胞の集団、好ましくは中胚葉細胞の集団を、ＴＧＢ−βシグナル伝達阻害剤の存在下で約１〜１５日、好ましくは約６〜１０日、培養する工程と、
（ｂ）工程（ａ）によって提供された細胞の集団を、ＴＧＢ−βシグナル伝達阻害剤の非存在下で約２０〜５０日、好ましくは約１５〜３０日、培養する工程と、を含む。
特に好ましい実施形態では、方法は、
（ａ）細胞の集団、好ましくは中胚葉細胞の集団を、ＴＧＢ−βシグナル伝達阻害剤の存在下で約１〜１５日、好ましくは約６〜１０日、培養する工程と、
（ｂ）工程（ａ）によって提供された細胞の集団を、ＴＧＢ−βシグナル伝達阻害剤の非存在下で約２０〜５０日、好ましくは約１５〜３０日、培養する工程と、を含む。
【００４１】
一実施形態では、工程（ａ）及び（ｂ）の培養は、接着培養である。
【００４２】
一実施形態では、方法は、更なる工程として、
（ｃ）工程（ｂ）によって提供された細胞の集団を、凝集褐色脂肪細胞の形成に好適な条件下で培養する工程であって、好ましくは、培養が、回転浮遊培養である、培養する工程、を含む。
【００４３】
好ましくは、本発明の細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である。
【００４４】
別の態様では、本発明は、褐色脂肪細胞を分析する方法であって、
（ａ）褐色脂肪細胞の集団を、本発明の方法を用いて準備する工程と、
（ｂ）褐色脂肪細胞の集団をインビトロで分析する工程、又は褐色脂肪細胞の集団を動物モデルに移植する工程と、を含む、方法を提供する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）シグナル伝達阻害剤を使用してインビトロで得ることができる、褐色脂肪細胞の集団を提供する。
【００４６】
別の態様では、本発明は、本発明の方法によって産生された、褐色脂肪細胞の集団を提供する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、手術及び／又は治療における使用のための、本発明の方法によって産生された褐色脂肪細胞の集団を提供する。
【００４８】
一実施形態では、使用は、糖尿病の治療又は予防である。
【００４９】
別の態様では、本発明は、糖尿病の治療又は予防のための薬剤の製造のための、本発明の褐色脂肪細胞の集団の使用を提供する。
【００５０】
別の態様では、本発明は、褐色脂肪細胞を対象に移植する方法であって、
（ａ）褐色脂肪細胞の集団を、本発明の方法を用いて準備する工程と、
（ｂ）褐色脂肪細胞の集団を対象に移植する工程と、を含む、方法を提供する。
【００５１】
一実施形態では、本方法は、美容手術の方法である。
【００５２】
別の実施形態では、本方法は、再建形成手術の方法である。
【００５３】
別の態様では、本発明は、アディポカイン又は分泌因子の産生のための、本発明の褐色脂肪細胞の集団の使用を提供する。好ましくは、産生は、インビトロのものである。
【００５４】
別の態様では、本発明は、糖尿病を治療又は予防する方法であって、本発明の褐色脂肪細胞の集団を、当該治療又は予防を必要とする対象に移植する工程を含む、方法を提供する。
【００５５】
別の態様では、本発明は、治療薬のスクリーニング方法であって、本発明の褐色脂肪細胞の集団を、候補剤と接触させる工程を含む、方法を提供する。好ましくは、候補剤は、候補剤のライブラリー内に含まれている。スクリーニング方法は、例えば、インビトロで行われてもインビボで行われても（例えば、本発明の褐色脂肪細胞の集団を移植したモデル動物を用いて）よい。好ましくは、スクリーニング方法は、インビトロで行われる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】方法の概略図。  単層の多能性幹細胞（ＰＳＣ）から始め、スフィア培養（Ｓｐｈ）に、原条（ＰＳ）に、沿軸中胚葉（ＰＭ）に進める。次いで、細胞を分散し、アクチビン阻害剤であるＴＧＦβシグナル伝達阻害剤、ＳＢ４３１５４２を含有する特定のＢＡＤ１培地にて、２Ｄで培養する。この段階でＳＢ４３１５４２を含めることにより、側板中胚葉の汚染によって血管内皮及び心筋細胞の発達の出現が低減される。第２の工程では、細胞をＢＡＤ２培地内で培養し、ＳＢ４３１５４２の除去によりＴＧＦβシグナル伝達を活性化させる。ＳＢ４３１５４２の継続的使用により、適切な反応速度が遅延し、適切なＵＣＰ１誘導及び発現が混乱する。
【図２】ｈｉＰＳＣから沿軸中胚葉（ＰＭ）分化細胞までの遺伝子発現分析。  ＰＭ分化のｑＰＣＲ時間経過：−２日目＝ｉＰＳＣ培地＋ＲＯＣＫ阻害剤、０日目＝分化開始。Ｘ軸は、日数であり、０日目が分化の開始である
【図３】ｈｉＰＳＣから沿軸中胚葉（ＰＭ）分化細胞までの遺伝子発現分析。  ＰＭ分化のｑＰＣＲ時間経過：−２日目＝ｉＰＳＣ培地＋ＲＯＣＫ阻害剤、０日目＝分化開始。Ｘ軸は、日数であり、０日目が分化の開始である。
【図４】褐色脂肪細胞に関し選択された遺伝子の、時間経過に伴う発現についての分析。  沿軸中胚葉（ＰＭ）から、褐色脂肪細胞（ＢＡ）への分化の３６日目までの、選択された遺伝子のｑＰＣＲデータ。「＋」は、１０μＭのフォルスコリンへの４時間の曝露を示す。全てのサンプルを、ＰＭ  １８Ｓ  ｒＲＮＡ発現に対して表示する。
【図５】褐色脂肪細胞に関し選択された遺伝子の、時間経過に伴う発現についての分析。  沿軸中胚葉（ＰＭ）から、褐色脂肪細胞（ＢＡ）への分化の３６日目までの、選択された遺伝子のｑＰＣＲデータ。「＋」は、１０μＭのフォルスコリンへの４時間の曝露を示す。全てのサンプルを、ＰＭ  １８Ｓ  ｒＲＮＡ発現に対して表示する。
【図６】ＴＧＦβ阻害及びＴＧＦベータシグナル伝達の回復がＢＡ分化に対し示す影響。  長期（＋ＳＢ）又は短期（−ＳＢ）のＳＢ４３１５４２曝露の間のＵＣＰ１発現分析。長期ＳＢ曝露では、分散させた沿軸中胚葉細胞を蒔いた直後に始まる全ＢＡ分化の間、培地中にＳＢ４３１５４２を含む。短期ＳＢ曝露では、分散させた沿軸中胚葉細胞を蒔いた直後から最初の８日のみの間、培地にＳＢ４３１５４２を含む。「＋ＦＳＫ」と表記されたサンプルは、１０μＭのフォルスコリンを４時間含んだ。日数は、沿軸中胚葉分化後の日数である。内在性コントロールとして１８Ｓ  ｒＲＮＡを使用して、全てのサンプルをｉＰＳＣに対して表示する
【図７】脂肪分解機能。  このアッセイでは、細胞により脂肪分解によって培地に放出された遊離グリセロールを測定する。脂肪分解が活性化された細胞によって、より多量の遊離グリセロールが培地に放出される。この遊離グリセロールの量は、既知の標準である遊離グリセロール試薬番号６４２８（Ｓｉｇｍａ）、グリセロール標準番号Ｇ７７９３（Ｓｉｇｍａ）に対する比色分析的な比較（５４０ｎｍでの吸収）によって定量される。
【図８】褐色及び白色脂肪細胞の酸素消費プロファイル。  分化した褐色及び白色脂肪細胞を、コンフルエントまでＸＦ２４プレートにて３週間増殖させ、フォルスコリン（ＦＳＫ）の存在下（＋）又は非存在下（−）で終夜培養した。図８（Ａ）では、ＢＡ刺激（黒色線、円形状）、ＢＡ未刺激（黒色線、円形状）、ＷＡ刺激（灰色線、三角形形状）、及びＷＡ未刺激（灰色線、正方形状）プロファイルが示されている。ヒストグラムでは、図８（Ｂ）が各サンプルの平均基礎呼吸、図８（Ｃ）が各サンプルの脱共役能を表している。
【図９】ＢＡ細胞の電子顕微鏡イメージング。  分化の６０日目でのヒトｉＰＳＣ由来ＢＡ細胞の走査型電子顕微鏡画像化により、嚢に充填された多小胞性脂肪滴が示されている。Ｚｅｉｓｓ  １４５０ＥＰ  ＳＥＭでイメージングした。（Ａ）縮尺バー：２０μｍ。（Ｂ）縮尺バー：１０μｍ。
【図１０】ＮＥ刺激後にヒトＢＡ細胞を移植した後の、ｉｎ  ｖｉｖｏ熱量測定／呼吸測定。  ノルエピネフリン（ＮＥ）で１時間処理したヒトＢＡ細胞（ｉＢＡＴ）又は空のデバイス（ＥＭＰＴＹ）を移植したマウスの呼吸商（デルタＶＯ２）の測定。マウスは、内在性マウスＢＡ組織について外科的に枯渇されている（ＢＡＴｒ）か、又は熱的に中立な状態にて処置され内在性マウスＢＡ組織が不活性化されている（Ｔｈｅｒｍ）かのいずれかである。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包括的、すなわちオープンエンドであり、かつ追加の、列挙されていない構成、要素、又は工程を除外しない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」はまた、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を含む。
【００５８】
褐色脂肪細胞の集団の「産生」は、幹細胞から褐色脂肪細胞（例えば、中胚葉細胞、好ましくは沿軸中胚葉細胞）までの分化経路における、あまり成熟していない前駆細胞、例えば幹細胞又は細胞型の制御された分化による、産生を指す。本発明の褐色脂肪細胞の集団を提供する分化は、前駆細胞の集団を、それらの細胞の分化を指向する好適な条件下で、所望の方法にて、すなわち褐色脂肪細胞になるように、培養することによって行うことができる。
【００５９】
褐色脂肪細胞
褐色脂肪としても知られる褐色脂肪組織（ＢＡＴ）は、白色脂肪組織（白色脂肪）とともに臓器としての脂肪を形成する。ＢＡＴは、特に、新生児及び冬眠する哺乳動物において広く見られる。ＢＡＴは成人のヒトにも存在し、代謝的に活性であるが、その保有率はヒトが老化するにつれて減少する。
【００６０】
ＢＡＴの主要機能は体温調節である。筋肉を震わせることによって生成された熱とは対照的に、ＢＡＴでは、非ふるえ熱産生によって熱が生成する。
【００６１】
褐色脂肪細胞は、ＵＣＰ１、ＰＧＣ１−α、ＰＰＡＲγ、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＤＭ１６、ＥＮＤＲＢ、ＣＩＤＥＡ、ＤＩＯ２、及び／又はＥＢＦ２の発現により評価できる。
【００６２】
好ましい実施形態では、褐色脂肪細胞は、ＵＣＰ１を発現する。
【００６３】
別の好ましい実施形態では、褐色脂肪細胞は、分化の少なくとも３６日目までに、ＵＣＰ１、ＰＧＣ１−α、ＰＰＡＲγ、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＤＭ１６、ＥＮＤＲＢ、ＣＩＤＥＡ、ＤＩＯ２、及び／又はＥＢＦ２を発現する。
【００６４】
別の実施形態では、褐色脂肪細胞は、白色脂肪細胞及び／又は沿軸中胚葉細胞と比較して、脱共役した呼吸及び／又は最大呼吸をより多く示す。
【００６５】
別の実施形態では、褐色脂肪細胞は、ＦＳＫで刺激されたときに、脱共役した呼吸及び／又は最大呼吸をより多く示す。
【００６６】
褐色脂肪細胞はまた、当該細胞が数多くの（例えば、２つ以上の）脂肪滴を含有することも特徴とし得る。これにより、褐色脂肪細胞は、単一の脂肪滴を含有する白色脂肪細胞から区別され得る。
【００６７】
ミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）
サーモゲニンとしても知られるミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）は、ＢＡＴのミトコンドリアにて見られる脱共役タンパク質である。
【００６８】
ＵＣＰ１は、褐色脂肪細胞において酸化的リン酸化を脱共役させるように機能し、非ふるえ熱産生による熱の生成を可能にする。
【００６９】
ＵＣＰ１は、褐色脂肪細胞のマーカーである。
【００７０】
ヒトＵＣＰ１のアミノ酸配列の例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ０６８６０５．１で寄託された配列である。
【００７１】
ヒトＵＣＰ１のアミノ酸配列の例は、以下である。
ＭＧＧＬＴＡＳＤＶＨＰＴＬＧＶＱＬＦＳＡＧＩＡＡＣＬＡＤＶＩＴＦＰＬＤＴＡＫＶＲＬＱＶＱＧＥＣＰＴＳＳＶＩＲＹＫＧＶＬＧＴＩＴＡＶＶＫＴＥＧＲＭＫＬＹＳＧＬＰＡＧＬＱＲＱＩＳＳＡＳＬＲＩＧＬＹＤＴＶＱＥＦＬＴＡＧＫＥＴＡＰＳＬＧＳＫＩＬＡＧＬＴＴＧＧＶＡＶＦＩＧＱＰＴＥＶＶＫＶＲＬＱＡＱＳＨＬＨＧＩＫＰＲＹＴＧＴＹＮＡＹＲＩＩＡＴＴＥＧＬＴＧＬＷＫＧＴＴＰＮＬＭＲＳＶＩＩＮＣＴＥＬＶＴＹＤＬＭＫＥＡＦＶＫＮＮＩＬＡＤＤＶＰＣＨＬＶＳＡＬＩＡＧＦＣＡＴＡＭＳＳＰＶＤＶＶＫＴＲＦＩＮＳＰＰＧＱＹＫＳＶＰＮＣＡＭＫＶＦＴＮＥＧＰＴＡＦＦＫＧＬＶＰＳＦＬＲＬＧＳＷＮＶＩＭＦＶＣＦＥＱＬＫＲＥＬＳＫＳＲＱＴＭＤＣＡＴ
（配列番号１）。
【００７２】
中胚葉細胞
中胚葉は、全ての左右相称動物における初期胚に見られる３つの一次胚葉のうちの１つ（外胚葉及び内胚葉に加えて）である。中胚葉は、外胚葉と内胚葉との間に形成される中間層である。
【００７３】
中胚葉は、間葉、中皮、非上皮血液細胞、及び体腔細胞を形成する。中胚葉はまた、筋肉、及び生殖腺の一部も形成する。
【００７４】
未分節又は体節中胚葉としても知られる沿軸中胚葉は、神経管と同時に形成される神経管形成胚内の中胚葉の一部である。この領域の細胞は、神経管の両側のあたりに見られる組織領域である体節を生じさせ、筋肉、及び背の組織を形成する。
【００７５】
沿軸中胚葉細胞は、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＣ２、ＭＲＦ４、ＭＳＧＮ１、ＭＹＦ５、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＰＲＲＸ１、ＳＩＸ１、及び／又はＴＢＸ６のうちのいずれか１つの発現を特徴とし得る。
【００７６】
トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）
トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−β１）は、サイトカインのトランスフォーミング増殖因子ベータスーパーファミリーの一員であり、細胞成長、細胞増殖、細胞分化、及びアポトーシスの制御を含む、多数の機能を果たす分泌タンパク質である。
【００７７】
一実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤は、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３阻害剤である。
【００７８】
一実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤は、アクチビンＡ阻害剤である。
【００７９】
好ましい実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤は、ＳＢ−４３１５４２である。
【００８０】
好ましい実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤は、
【化４】
2021525089.tif 000005
又はその塩若しくは誘導体である。
【００８１】
本発明の使用及び方法ではまた、前駆細胞からの褐色脂肪細胞の産生中に実質的に同等の機能をもたらす、化合物（Ｉ）の誘導体を使用することもできる。
【００８２】
本発明の使用及び方法ではまた、前駆細胞からの褐色脂肪細胞の産生中に実質的に同等の機能をもたらす、他のＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤を使用することもできる。例えば、実質的に同等の機能をもたらす、他のＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤としては、ＳＢ５２５３３４、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９）、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ２１０９７６１、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ３６４９４７、及びＳＤ２０８が挙げられる。
【００８３】
一実施形態では、阻害剤は、約１〜５０μＭ、１〜４０μＭ、１〜３０μＭ、又は１〜２０μＭの濃度で、本発明に使用される。別の実施形態では、阻害剤は、約１〜２０μＭの濃度で、本発明に使用される。
【００８４】
別の実施形態では、阻害剤は、約５〜１５μＭ、６〜１４μＭ、７〜１３μＭ、８〜１２μＭ、又は９〜１１μＭの濃度で、本発明に使用される。別の実施形態では、阻害剤は、約５〜１０μＭの濃度で、本発明に使用される。
【００８５】
別の実施形態では、阻害剤は、約１〜５μＭ、６〜１０μＭ、１１〜１５μＭ、１６〜２０μＭ、２１〜２５μＭ、２６〜３０μＭ、３１〜３５μＭ、３６〜４０μＭ、４１〜４５μＭ、又は４６〜５０μＭの濃度で、本発明に使用される。好ましくは、阻害剤は、約１〜５０μＭ、最も好ましくは約１０μＭの濃度で、本発明に使用される。
【００８６】
ＵＣＰ−１活性化因子
ＵＣＰ−１活性化因子を使用して、褐色脂肪細胞の機能を試験することができる。
【００８７】
一実施形態では、ＵＣＰ−１活性化因子を添加して、褐色脂肪細胞のマーカーであるＵＣＰ−１の発現を増加させる。
【００８８】
一実施形態では、ＵＣＰ−１活性化因子は、フォルスコリン（ＦＳＫ）：
【化５】
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又はその塩若しくは誘導体である。
【００８９】
一実施形態では、フォルスコリン（ＦＳＫ）を添加して、細胞を刺激し、ＵＣＰ１発現を増加させる。好ましい実施形態では、１〜５０μＭのフォルスコリン（ＦＳＫ）を、６〜２４時間かけて添加する。
【００９０】
塩
本発明の剤は、塩、特に薬学的に許容される塩又はエステルとして存在することができる。
【００９１】
本発明の剤の薬学的に許容される塩としては、その好適な酸付加塩又は塩基塩が挙げられる。好適な薬学的塩の総説は、Ｂｅｒｇｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９に見出すことができる。塩は、例えば、強い無機酸、例えば鉱酸、例えば硫酸、リン酸、若しくはハロゲン化水素酸によって形成され；強い有機カルボン酸、例えば炭素数１〜４の、非置換でも置換されていてもよいアルカンカルボン酸、例えば酢酸によって形成され；飽和若しくは不飽和ジカルボン酸、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、若しくはテトラフタル酸によって形成され；ヒドロキシカルボン酸、例えば、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、若しくはクエン酸によって形成され；アミノ酸、例えば、アスパラギン酸、若しくはグルタミン酸によって形成され；安息香酸によって形成され；又は、有機スルホン酸、例えば非置換でも置換（例えばハロゲンによって置換）されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキル−若しくはアリールスルホン酸、例えばメタン−スルホン酸若しくはｐ−トルエンスルホン酸によって形成される。
【００９２】
エナンチオマー／互変異性体
本発明はまた、適宜、剤の全てのエナンチオマー及び互変異性体を含む。対応するエナンチオマー及び／又は互変異性体は、当該技術分野において既知の方法によって単離／調製することができる。
【００９３】
立体異性体及び幾何異性体
本発明の剤のうちのいくつかは、立体異性体及び／又は幾何異性体として存在することができる。例えば、それらは、１つ以上の不斉中心及び／又は幾何学的中心を有することができるので、２つ以上の立体異性体及び／又は幾何学的形態で存在し得る。本発明は、これらの剤の全ての個々の立体異性体及び幾何異性体、並びにこれらの混合物の使用を企図する。特許請求の範囲において使用される用語は、適切な機能的活性を保持する（ただし、必ずしも同じ程度ではない）のであれば、これらの形態を包含する。
【００９４】
本発明はまた、剤又はその薬学的に許容される塩の、全ての好適な同位体バリエーションを含む。本発明の剤又はその薬学的に許容される塩の同位体のバリエーションは、少なくとも１個の原子が、同じ原子番号を有するが天然において通常見られる原子質量とは異なる原子質量である原子で置換されているものとして定義される。剤及びその薬学的に許容される塩に組み込むことができる同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、及び塩素の同位体、例えば、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、及び３６Ｃｌが挙げられる。剤及びその薬学的に許容される塩の特定の同位体バリエーション、例えば、３Ｈ又は１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれているものは、薬物及び／又は基質の組織分布試験において有用である。トリチウム化、すなわち３Ｈ、及び炭素１４、すなわち１４Ｃ同位体は、調製しやすく、かつ検出しやすいことから特に好ましい。更に、同位体、例えば重水素、すなわち２Ｈによる置換は、代謝安定性の向上、例えば、インビボ半減期の延長又は投与量の低減により得られるある種の治療上の利点をもたらすことができるため、いくつかの状況で好ましい場合がある。本発明の剤及び本発明のその薬学的に許容される塩の同位体バリエーションは、概して、好適な試薬の適切な同位体バリエーションを使用して、従来の手順によって調製することができる。
【００９５】
溶媒和物
本発明はまた、本発明の剤の溶媒和物形態を含む。特許請求の範囲において使用される用語は、これらの形態を包含する。
【００９６】
多形
本発明はまた、様々な結晶形態、多形形態、及び（無水）水和形態の本発明の剤にも関する。このような化合物の合成による調製において用いられる溶媒の精製及び／又は単離方法をわずかに変更することによって、化学的化合物をこのような形態のいずれかで単離することができ、これは医薬業界において十分に確立されている。
【００９７】
産生方法
本発明の褐色脂肪細胞は、前駆細胞、例えば幹細胞及び／又は中胚葉細胞から産生することができる。
【００９８】
一態様では、本発明は、インビトロで褐色脂肪細胞の集団を産生するための、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）シグナル伝達阻害剤の使用を提供する。
【００９９】
別の態様では、本発明は、細胞の集団をトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）シグナル伝達阻害剤と接触させる工程を含む、褐色脂肪細胞の集団を産生する方法を提供する。
【０１００】
トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）シグナル伝達阻害剤と接触させる細胞の集団は、好適な条件下で培養されたときに褐色脂肪細胞に分化する能力を有する、前駆細胞の集団である。
【０１０１】
一実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤と接触させる細胞の集団は、幹細胞の集団から、好ましくはインビトロで、産生される。好ましい実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤と接触させる細胞の集団は、３Ｄ細胞培養を用いて産生される。好ましい実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。
【０１０２】
３Ｄ細胞培養は、細胞が三次元的に成長し、又は周囲と相互作用することができる、人工的に作製された環境である。かかる培養では、細胞は典型的には、「スフェロイド」と呼称され得る３Ｄコロニーを形成する。３Ｄ培養アプローチは、細胞のインビボ成長及び挙動をより正確にモデルリングすることができる。
【０１０３】
当業者は、例えば様々な市販の培養ツールのいずれかを活用することにより、３Ｄ細胞培養を容易に実施することができる。例えば、３Ｄ培養は、スキャフォールドによる手法又はスキャフォールドフリーの手法を用いて実施することができる。
【０１０４】
スキャフォールドベースの手法は、細胞による３Ｄ培養物の形成を可能にするため、固体スキャフォールド及びハイドロゲルなどの支持体を用いる。かかるスキャフォールドは、インビボで存在する天然の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を模倣することを目的とするものであってもよい。
【０１０５】
スキャフォールドフリー技術では、細胞を成長させるスキャフォールドを用いた分配が行われる。代わりに、３Ｄスフェロイドは、例えば、低接着プレート、懸滴プレート、マイクロパターン化表面、回転バイオリアクター、磁気浮上、及び磁気３Ｄバイオプリンティングの使用により作製することができる。
【０１０６】
例えば、幹細胞共凝集体３Ｄスフェロイドの構築は、例えば、超低接着プレートでの培養によって、及び／又は約８０〜１２０ＲＰＭ若しくは９０〜１１０ＲＰＭ、好ましくは約１００ＲＰＭでシェーカープラットフォームを用いる培養によって、達成することができる。最初の共凝集体の作製は、例えば約６〜１８時間又は９〜１５時間、好ましくは約１２時間のインキュベート後に行うことができる。
【０１０７】
好ましい実施形態では、当該方法は、
（ａ）細胞の集団、好ましくは中胚葉細胞の集団を、ＴＧＢ−βシグナル伝達阻害剤の存在下で第１の期間にわたって培養する工程と、
（ｂ）工程（ａ）によって提供された細胞の集団を、ＴＧＢ−βシグナル伝達阻害剤の非存在下で第２の期間にわたって培養する工程と、を含む。
【０１０８】
一実施形態では、第１の期間は、約１〜１５日、２〜１５日、３〜１５日、４〜１５日、５〜１５日、６〜１５日、７〜１５日、８〜１５日、１〜１４日、２〜１４日、３〜１４日、４〜１４日、５〜１４日、６〜１４日、７〜１４日、８〜１４日、１〜１３日、２〜１３日、３〜１３日、４〜１３日、５〜１３日、６〜１３日、７〜１３日、８〜１３日、１〜１２日、２〜１２日、３〜１２日、４〜１２日、５〜１２日、６〜１２日、７〜１２日、８〜１２日、１〜１１日、２〜１１日、３〜１１日、４〜１１日、５〜１１日、６〜１１日、７〜１１日、８〜１１日、１〜１０日、２〜１０日、３〜１０日、４〜１０日、５〜１０日、６〜１０日、７〜１０日、又は８〜１０日、好ましくは約６〜１０日である。
【０１０９】
一実施形態では、第２の期間は、約１５〜３０日、１６〜３０日、１７〜３０日、１８〜３０日、１９〜３０日、２０〜３０日、１５〜２９日、１６〜２９日、１７〜２９日、１８〜２９日、１９〜２９日、２０〜２９日、１５〜２８日、１６〜２８日、１７〜２８日、１８〜２８日、１９〜２８日、２０〜２８日、１５〜２７日、１６〜２７日、１７〜２７日、１８〜２７日、１９〜２７日、２０〜２７日、１５〜２６日、１６〜２６日、１７〜２６日、１８〜２６日、１９〜２６日、２０〜２６日、１５〜２５日、１６〜２５日、１７〜２５日、１８〜２５日、１９〜２５日、２０〜２５日、１５〜２４日、１６〜２４日、１７〜２４日、１８〜２４日、１９〜２４日、又は２０〜２４日、好ましくは約１５〜３０日である。
【０１１０】
特に好ましい実施形態では、方法は、
（ａ）細胞の集団、好ましくは中胚葉細胞の集団を、ＴＧＢ−βシグナル伝達阻害剤の存在下で約１〜１５日、好ましくは約６〜１０日、培養する工程と、
（ｂ）工程（ａ）によって提供された細胞の集団を、ＴＧＢ−βシグナル伝達阻害剤の非存在下で約２０〜５０日、好ましくは約１５〜３０日、培養する工程と、を含む。
【０１１１】
一実施形態では、工程（ａ）及び（ｂ）の培養は、接着培養である。
【０１１２】
一実施形態では、方法は、更なる工程として、
（ｃ）工程（ｂ）によって提供された細胞の集団を、凝集褐色脂肪細胞の形成に好適な条件下で培養する工程であって、好ましくは、培養が、回転浮遊培養である、培養する工程、を含む。
【０１１３】
本発明の方法において、細胞培養は、任意の好適な細胞培養培地を使用して行うことができる。
【０１１４】
例えば、培養は、グルタミン不含有であり、２％のプロブミンＰｒｏｂｕｍｉｎ（例えば、ＥＭＤ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）製）、１×抗生物質−抗真菌物質（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）製）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）製）、１×Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ａ（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）製）、１×Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｂ（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）製）、１×Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｃ（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）製）、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製）、１０μｇ／ｍＬのトランスフェリン（例えば、Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）製）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）製）、及び１×Ｇｌｕｔａｇｒｏ（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）製）を添加されたＤＭＥＭ／Ｆ−１２から構成される化学的に規定された基本培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂａｓｅ  ｍｅｄｉｕｍ，ＤＢＭ）内で行うことができる。この培地に、以下の最終濃度で、要素、すなわち、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）製）、１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ７（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）製）、２００ｎｇ／ｍＬのＬＯＮＧ（登録商標）Ｒ３  ＩＧＦ−Ｉ（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製）、１０μＭのＹ−２７６３２二塩酸塩（例えば、Ｔｏｃｒｉｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）製）、２μＭのロシグリタゾン（例えば、Ｔｏｃｒｉｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）製）、１μＭのデキサメタゾン（例えば、Ｔｏｃｒｉｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）製）、１ｎＭのＬＴ−３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−サイロニンナトリウム塩）（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製）、及び５００μＭのＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製）を更に添加することができる。
【０１１５】
培養培地に、好適な濃度のＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤を添加することができる。ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤の非存在下で培養するために、培地に、例えば、１：５００の化学的に規定された脂質濃縮物（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）製）を添加することができる。
【０１１６】
本発明の方法において用いる好適な培養条件は、例えば、
（ａ）約３６〜３８℃又は３６．５〜３７．５℃、好ましくは約３７℃で培養する工程、
（ｂ）約４〜６％又は４．５〜５．５％のＣＯ２、好ましくは約５％のＣＯ２で培養する工程、及び／又は
（ｃ）少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の湿度、好ましくは約１００％の湿度で培養する工程を含む。
【０１１７】
幹細胞
本発明の褐色脂肪細胞を、幹細胞から（例えば、インビトロで）産生することができる。
【０１１８】
幹細胞は、より専門化された細胞に分化する能力を有する細胞であり、分裂してより多くの幹細胞を産生することもできる。
【０１１９】
本発明の方法は、前駆細胞の集団（例えば、中胚葉細胞の集団、好ましくは沿軸中胚葉細胞の集団）を、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）シグナル伝達阻害剤と接触させる工程を含んでよく、当該前駆細胞の集団は、幹細胞の集団の分化によって産生された（例えば、インビトロで）当該前駆細胞を有する。
【０１２０】
したがって、本発明の方法は、幹細胞の集団から細胞の集団を（例えば、インビトロで）産生する工程を含んでもよい。
【０１２１】
好ましくは、本発明の幹細胞は多能性幹細胞である。
【０１２２】
多能性幹細胞は、際限なく増殖し、人体の全ての細胞型に分化できる幹細胞である。これらの幹細胞は、損傷又は疾患によって影響を受けた細胞と置き換えることができる単一の細胞源を提供することが期待できる。
【０１２３】
多能性幹細胞は、多数の手法によって生成することができる。好ましくは、本発明の幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【０１２４】
ｉＰＳＣは、成体細胞から直接作製することができる多能性幹細胞の一種である。当業者は、例えば、特定の転写因子を成体細胞に導入することによって、又は成体細胞を特定のタンパク質の組み合わせと接触させることによって、ｉＰＳＣを容易に調製することができる。
【０１２５】
ｉＰＳＣは、胚由来の材料を使用する必要がないという点において、またｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣから産生された細胞）は、後に再導入を受ける対象から調製可能であるという点において、胚性幹細胞よりも有益である。かかる自家細胞移植は、移植される材料が免疫拒絶を受けるリスクを克服することができる。
【０１２６】
本発明の幹細胞は、特に、胚を破壊することなく産生することができる。
【０１２７】
多能性幹細胞を、胚を破壊することなく産生する方法は、当該技術分野において既知である。特に、マウス及びヒトの胚性幹細胞は、胚をそのまま残存させたまま、単一の割球から産生され得ることが示されている。例えば、Ｃｈｕｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４３９：２１６−２１９は、単一の割球からマウス胚性幹細胞を作製するための方法を記載している。この手順のその後の進歩により、割球細胞株を他のＥＳＣと共培養する必要がない方法が提供された（Ｃｈｕｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：１１３−１１７）。
【０１２８】
好ましくは、本発明の幹細胞は、哺乳動物幹細胞、好ましくはヒト幹細胞である。
【０１２９】
疾患
本発明の褐色脂肪細胞は、長期間にわたり血糖濃度が高いことを特徴とする疾患の治療又は予防に使用することができる。このような病態としては、インスリン抵抗性、境界型糖尿病、１型又は２型糖尿病、代謝症候群、及び肥満関連の病態が挙げられる。
【０１３０】
インスリン抵抗性とは、身体がインスリンを産生するものの、インスリンを有効に利用しない病態である。対象がインスリン抵抗性を有するとき、グルコースは細胞によって吸収されずに血液中に蓄積し、２型糖尿病又は境界型糖尿病に至る。インスリン抵抗性とは、曝露されるインスリン濃度に対する標的細胞又は全器官の応答性の低下と定義することができる。この定義は、一般に、インスリンが介在するグルコース処理に対する感受性の障害を指すために使用される。
【０１３１】
境界型糖尿病は、糖尿病患者を診断するために必要な症状の全てが存在するわけではないが、血糖値が異常に高い医学的段階である。境界型糖尿病は、通常は、インスリン抵抗性を既に有する対象において起こる。インスリン抵抗性のみによって２型糖尿病が発症するわけではないが、多くの場合インスリン産生ベータ細胞に対する要求の高さによって、疾患のステージを設定する。境界型糖尿病では、ベータ細胞が、インスリン抵抗性を克服するのに十分なインスリンを産生することができないことから、血糖濃度が正常範囲を超えて上昇する。
【０１３２】
真性糖尿病（一般に糖尿病と称する）は、長期間にわたり患者血糖濃度が高いことを特徴とする代謝性疾患の群である。糖尿病の主要な２タイプ（１型及び２型）は原因が異なり、治療方法も異なる。
【０１３３】
１型糖尿病は、通常は自己免疫機序による膵臓におけるインスリン産生ベータ細胞の破壊が原因である。
【０１３４】
２型糖尿病は、末梢組織におけるインスリン抵抗性が原因であり、膵臓ベータ細胞の機能不全を合併している場合がある。
【０１３５】
２型糖尿病は、世界的に有病率が上昇している慢性代謝性障害である。世界のいくつかの国では、老齢人口の増加により、次の１０年で影響を受ける対象数が倍増すると予測されている。
【０１３６】
２型糖尿病は、インスリン抵抗性、インスリン産生の低下、及び最終的な膵臓ベータ細胞不全によってもたらされる、インスリン非感受性を特徴とする。この非感受性により、肝臓、筋細胞、及び脂肪細胞へのグルコース輸送が減少する。高血糖に関連した脂肪の分解が増加する。
【０１３７】
この機能不全の結果、空腹時に上昇するグルカゴンの量及び肝臓のグルコースの量が、食事によって抑制されない。インスリンの不適当な量及びインスリン抵抗性の上昇により、高血糖が生じる。
【０１３８】
２型糖尿病の対象は、糖尿病性ケトアシドーシス（ＤＫＡ）、高浸透圧性高血糖状態（ＨＨＳ）、網膜症、心疾患、腎症、及び神経障害を含む、様々な短期及び長期両方の合併症にかかりやすい。このような合併症により、早期に死亡する場合がある。
【０１３９】
メタボリックシンドロームは、次の医学的状態、すなわち、腹部（中心性）肥満、高血圧、空腹時血漿グルコースが高レベルであること、血清トリグリセリドが高レベルであること、及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルが低いこと、の５つのうちの少なくとも３つがまとめて発症することである。メタボリックシンドロームは、心血管疾患及び糖尿病の発症リスクと関連がある。
【０１４０】
肥満は、ヒトの体重を人の身長の二乗で割ることによって計算されるＢＭＩが３０ｋｇ／ｍ２超であることによって概ね評価される医学的病態である。肥満により、様々な疾患又は病態、特に心血管疾患、２型糖尿病、特定の型の癌、変形性関節症、及び抑うつの可能性が高まる。
【０１４１】
分析方法
一態様では、本発明は、褐色脂肪細胞を分析する方法を提供する。
【０１４２】
本発明は、従来では可能ではなかった、褐色脂肪細胞の集団の入手方法を提供することにより、当該細胞集団に対し研究を行い当該細胞の機能及び挙動を更に評価することを可能にする。
【０１４３】
好ましくは、当該分析方法は、インビトロで行われる。しかし、本発明の褐色脂肪細胞はまた、褐色脂肪細胞の集団を、動物モデル、例えばマウスモデルに移植することによって分析することもできる。
【０１４４】
好適な分析方法としては、当該技術分野において周知の技術である、フローサイトメトリー、イムノアッセイ、及び細胞画像ベースの研究（例えば、蛍光顕微鏡法）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
治療方法
一態様では、本発明は、手術及び／又は治療における使用のための、例えば糖尿病の治療又は予防における使用のための、本発明の褐色脂肪細胞の集団を提供する。
【０１４６】
治療又は予防は、本発明の褐色脂肪細胞の集団を、当該細胞集団を必要とする対象に移植すること、を含んでもよい。したがって、本発明は、糖尿病を治療又は予防する方法であって、本発明の褐色脂肪細胞の集団を、当該細胞集団を必要とする対象に移植する工程を含む、方法を提供する。
【０１４７】
治療又は予防されるべき糖尿病は、例えば、１型又は２型糖尿病であり得る。
【０１４８】
本明細書において「治療／処置」についてなされる全ての言及は、治癒的、緩和的、及び予防的な治療／処置を含むが、本発明の文脈においては、予防についての言及は、より一般的には予防的治療／処置と関係していることについて理解されたい。哺乳動物、特にヒトの治療が、好ましい。ヒト及び動物の両方の治療が、本発明の範囲内にある。
【０１４９】
移植
用語「移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）」及び「移植（ｉｍｐｌａｎｔ）」は、本明細書において互換的に用いられる。
【０１５０】
本発明の褐色脂肪細胞の集団は、例えば、自家細胞移植手順の一部として、又は同種異系細胞移植手順の一部として、対象に投与ことができる。
【０１５１】
用語「自家細胞移植手順」は、前駆細胞（この細胞から本発明の褐色脂肪細胞の集団を産生する）を、本発明の褐色脂肪細胞の集団を投与するのと同じ対象から得る、手順を指す。
【０１５２】
自家移植手順は、免疫学的不適合と関連する問題を回避し、遺伝的に適合するドナーの利用可能性とは無関係に、対象にとって利用可能であることから、有益である。
【０１５３】
用語「同種異系細胞移植手順」は、前駆細胞（この細胞から本発明の褐色脂肪細胞の集団が産生される）を、本発明の褐色脂肪細胞の集団を投与する対象とは異なる対象から得る、手順を指す。好ましくは、ドナーは、褐色脂肪細胞の集団を投与する対象と遺伝的に合致するものとし、免疫学的不適合のリスクを最小にする。
【０１５４】
本発明の褐色脂肪細胞の集団の好適な用量は、治療的及び／又は予防的に有効であるようなものである。投与すべき用量は、治療される対象及び病態によって異なり、当業者は容易に決定することができる。
【０１５５】
褐色脂肪細胞の集団を、美容手術手順の一部として、対象に移植することができる。
【０１５６】
褐色脂肪細胞の集団を、形成手術手順、例えば、再建形成手術、例えば事故又は熱傷後に行うことがある手術の一部として、対象に移植することができる。
【０１５７】
医薬組成物
本発明の細胞は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤とともに対象に投与するために配合することができる。好適な担体及び希釈剤は、等張生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水を含み、場合によりヒト血清アルブミンを含有する。
【０１５８】
当業者は、開示される本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される本発明の全ての特徴を組み合わせることができることを理解されたい。
【０１５９】
本発明の好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な例によってこれより記述する。
【０１６０】
本発明の実施では、特に指示がない限り、当業者の能力の範囲内のものである、化学、生化学、分子生物学、微生物学、及び免疫学の従来技術を用いる。かかる技術は文献で説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．９，１３  ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｒｏｅ，Ｂ．，Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｊ．ａｎｄ  Ｋａｈｎ，Ａ．（１９９６）ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｐｏｌａｋ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  ＭｃＧｅｅ，Ｊ．Ｏ’Ｄ．（１９９０）Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、並びに、Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｄａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。これらの一般的なテキストの各々は、本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【０１６１】
実施例１．
材料及び方法
細胞培養及び分化
グルタミン不含有のＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））に１：２００希釈したＧｅｌｔｒｅｘ  ＬＤＥＶ−Ｆｒｅｅ  ｈＥＳＣ  ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｍａｔｒｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））でコーティングしたポリスチレン培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））上に、ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）を５０，０００個／ｃｍ２播種した。ＰＳＣの維持、スフィア形成、沿軸中胚葉、及び褐色脂肪細胞分化のための培地は、化学的に規定した基本培地（ＤＢＭ）に特定の要素を添加して作製した。ＤＢＭは、グルタミン不含有のＤＭＥＭ／Ｆ−１２に、２％のプロブミンＰｒｏｂｕｍｉｎ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））、１×抗生物質−抗真菌物質（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））、１×  Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ａ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））、１×  Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｂ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））、１×  Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｃ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、１０μｇ／ｍＬのトランスフェリン（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ））、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））、及び１×Ｇｌｕｔａｇｒｏ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））を添加したものからなった。ＰＳＣ維持培地（ＭＭ）は、完全に規定された培地（ＣＤＭ）を構成するよう、８ｎｇ／ｍＬのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））、２００ｎｇ／ｍＬのＬＯＮＧ（登録商標）Ｒ３ヒトＩＧＦ−Ｉ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））、及び１０ｎｇ／ｍＬのヒトヘレグリンβ−１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ））を添加したＤＢＭからなった。２４時間毎に培地を交換し、最大９０％コンフルエントとして、４日間、３７℃のインキュベータ内で５％のＣＯ２にて、ヒトＰＳＣをＣＤＭで培養した。継代のため、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を使用して室温（ＲＴ）で５〜１０分間、ヒトＰＳＣを培養プレートか剥がした。１０００ｒｐｍで室温にて４分間遠心分離した後、Ａｃｃｕｔａｓｅを吸引し、細胞ペレットをＣＤＭに再懸濁し、次いで血球計数器を用いて細胞数を定量した。上記のようにｇｅｌｔｒｅｘをコーティングしたプレート上に細胞を再播種した。定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によりＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧの発現が陽性であったこと並びに免疫蛍光法から、細胞同一性を確認した。
【０１６２】
沿軸中胚葉（ＰＭ）分化
回転浮遊培養を用い、３ステッププロセスにおいて、沿軸中胚葉（ＰＭ）細胞を生成した。最初に、１×１０６個／ｍＬのｈＰＳＣを含む単細胞懸濁液を、５．５ｍＬのスフィア形成培地（ＳＦＭ）体積にて、６ウェル懸濁プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ（Ｍｏｎｒｏｅ，ＮＣ））に播種した。次いでこのプレートを、５％のＣＯ２、３７℃のインキュベータ内の、９７ＲＰＭに設定したＩｎｎｏｖａ２０００プラットフォームシェーカー（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ））上に置いた。スフィア形成培地を、１０μＭのＹ−２７６３２二塩酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ（ＭＮ））を２４時間かけて添加したｈＰＳＣ  ＭＭで構成した。スフィア及び培地をピペットによりコニカルチューブに移し、スフィアを最大１０分間重力沈降させることにより使用済み培地を除去した。使用済み培地は、慎重に、沈降したスフィアを乱さないように吸引した。ＳＦＭにて２４時間後、更に２４時間培地をｈＰＳＣ  ＭＭのみのものに交換して、スフィアを懸濁プレートに戻し、オービタルシェーカーに戻した。ＭＭにて２４時間後、培地を、上記の培地交換法により沿軸中胚葉培地１（ＰＭＭ１）と交換した。ＰＭＭ１は、以下の最終濃度で、要素、すなわち、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））、２００ｎｇ／ｍＬのＬＯＮＧ（登録商標）Ｒ３  ＩＧＦ−Ｉ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、及び２５０ｎＭのラパマイシン（Ｔｏｃｒｉｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を添加したＤＢＭから構成された。２４時間後、新たなＰＭＭ１を、使用済みＰＭＭ１と更に２４時間交換した。ＰＭＭ１にて合計４８時間後、培地をＤＢＭと交換して、細胞を洗浄した。細胞を再沈降させ、ＤＢＭを吸引し、スフィアをＰＭＭ２に更に９６時間再懸濁し、上記のように２４時間毎に培地交換した。前述のように、スフィアを、プラットフォームシェーカー上の懸濁プレートに保持した。ＰＭＭ２は、以下の最終濃度で、要素、すなわち、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））、２００ｎｇ／ｍＬのＬＯＮＧ（登録商標）Ｒ３  ＩＧＦ−Ｉ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、２５０ｎＭのラパマイシン（Ｔｏｃｒｉｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））、２５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ、５０ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））、２μＭのＢＩＯ（Ｔｏｃｒｉｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））、及び５μＭのフォルスコリン（Ｔｏｃｒｉｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を添加したＤＢＭで構成された。
【０１６３】
褐色脂肪細胞（ＢＡ）の分化
ＢＡＤ１及びＢＡＤ２と表記される一連の２つの培地配合物を使用して、褐色脂肪細胞（ＢＡ）の分化を実施した。最初にＰＭスフィアを単細胞懸濁液に分散させることによって、ＢＡを誘導した。簡潔に述べると、ＰＭスフィアを懸濁プレートから取り出し、コニカルチューブ内で重力沈降させた。培地を慎重に吸引し、カルシウムもマグネシウムも不含有の過剰量のＤＰＢＳで、スフィアを穏やかに１回洗浄した。スフィアを沈降させ、ＤＰＢＳを吸引した。スフィアを、５ｍＬのＲＴ  Ａｃｃｕｍａｘ（登録商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））に再懸濁し、単細胞懸濁液が得られるまで、シングルの高速回転ミキサー上に２０〜３０分間置いた。続いて、細胞を、１００μｍのフィルタ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））を通して５０ｍＬのコニカルチューブに濾過し、ＤＰＢＳで洗浄し、２００×ｇにて４分間、室温で遠心分離し、得られた上清を吸引し、血球計数器による計数のため細胞をＢＡＤ１培地に再懸濁した。ＢＡＤ１を、以下の最終濃度で、要素、すなわち、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））、１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））、２００ｎｇ／ｍＬのＬＯＮＧ（登録商標）Ｒ３  ＩＧＦ−Ｉ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、１０μＭのＹ−２７６３２二塩酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））、２μＭのロシグリタゾン（Ｔｏｃｒｉｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））、１μＭのデキサメタゾン（Ｔｏｃｒｉｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））、１ｎＭのＬＴ−３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−サイロニンナトリウム塩）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、５００μＭのＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、及び１０μＭのＳＢ４３１５４２を添加した、ＤＢＭで構成した。次いで、グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））不含有のＤＭＥＭ／Ｆ−１２に１：２００希釈したＧｅｌｔｒｅｘ  ＬＤＥＶ−Ｆｒｅｅ  ｈＥＳＣ  ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｍａｔｒｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））でコーティングしたポリスチレン培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））上に、細胞を９０，０００個／ｃｍ２の密度で播種した。細胞を、ＢＡＤ１で１００％コンフルエントまで（８〜１０日間）培養し、培地を２４時間毎に交換した。８〜１０日後、ＢＡＤ１をＢＡＤ２に切り替えた。ＢＡＤ２を、ＳＢ４３１５４２を除いてＢＡＤ１と同じように配合し、１：５００のＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））を添加した。更なる使用（例えば、移植又は更にインビトロ分析）のためにアッセイ又は再凝集するまで、細胞をＢＡＤ２で維持した。ＢＡＤ２培地は毎日交換した。最初に使��済みＢＡＤ２培地を吸引し、ＢＡプレートをＤＢＰＳで洗浄することによって、再凝集をもたらし、この細胞を、コラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））を各々４００ユニット含有するコラゲナーゼ混合物を使用して分離させ、カルシウム及びマグネシウム不含有のＨＢＳＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＮＹ））に希釈した。コラゲナーゼ混合物に、０．５ｍＭのＣａＣｌ２＋（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を添加し、酵素活性を高めた。ほぼシート状のＢＡ細胞の、プレートへの接着がゆるくなるまで（約２０〜３０分間）、当該細胞を３７℃にてコラゲナーゼ混合物中でインキュベートした。細胞及びコラゲナーゼを含有するプレートを、同等の体積のＥＤＴＡ分散溶液（Ｂｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）ですすぎ、コニカルチューブに移し、２００×ｇにてＲＴで４分間、遠心分離した。上清を除去し、次いで、細胞を５ｍＬのＡｃｃｕｍａｘ（登録商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））に再懸濁し、単細胞懸濁液が得られるまで、シングルの高速章動ミキサー上に２０〜３０分間置いた。続いて、細胞を、１００μｍのフィルタ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））を通して５０ｍＬのコニカルチューブに濾過し、ＤＰＢＳで洗浄し、２００×ｇにて４分間、室温で遠心分離し、得られた上清を吸引し、細胞をＢＡＤ２培地に再懸濁し、６ウェル懸濁プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ（Ｍｏｎｒｏｅ，ＮＣ））に５．５ｍＬ／ウェルの体積で入れた。概して、分散、濾過、洗浄、及び細胞死の間で数が減るので、１０ｃｍのＢＡプレート１枚からは、再凝集に際し、６ウェルプレートのうちの２つのウェルに対して十分な細胞が得られることになる。懸濁プレートを、５％のＣＯ２、３７℃のインキュベータ内の、９７ＲＰＭに設定したＩｎｎｏｖａ２０００プラットフォームシェーカー（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ））上に置き、ＢＡＤ２を、上記の重力沈降培地交換法によって１日おきに交換した。
【０１６４】
脂肪細胞由来幹細胞（ＡＤＳＣ）は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入したものであり、ＭｅｓｅｎＰＲＯ（商標）ＲＳ培地（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））にて７０％コンフルエントに達するまで、５，０００個／ｃｍ２の密度で培養した。細胞を、１×Ｔｒｙｐｌｅ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））で分散させ、１０，０００個／ｃｍ２の密度でＭｅｓｅｎＰＲＯ（商標）ＲＳ培地に４日間播種した。４日後、細胞はコンフルエントになっていた。培地をＳｔｅｍＰＲＯ（登録商標）脂肪生成分化培地（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））に切り替えて、細胞が白色脂肪細胞に分化するよう操作した。細胞を２１日間培養した後、アッセイした。
【０１６５】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
ＤＢＰＳ洗浄後に、２−メルカプトエタノールを添加したＴＲＫ溶解緩衝液（Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ））を使用して、細胞をディッシュ内で直接溶解し、氷上で採取した。Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ  ＲＮＡ単離キット（Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ））を用いて、製造元のプロトコルにしたがってＲＮＡを単離し、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダーでＲＮＡを定量した。１μｇのＲＮＡを使用し、製造元のプロトコルにしたがって、Ｉｓｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））によりｃＤＮＡを合成した。次いで、ｃＲＮＡを、分子グレードの水で最終体積５００μＬまで希釈した。ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））を用い、３８４ウェルプレートにて、５μＬのＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ（ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．５μＬのＴａｑＭａｎプライマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．５μＬの分子グレードの水、及び用いたＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブのための４μＬのｃＤＮＡ、を反応させて、ΔΔＣｔ  ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。各転写産物の発現を、１８Ｓリボソームに対し正規化し、３回行って平均±標準誤差としてプロットした。
【０１６６】
免疫蛍光顕微鏡法
ヒト多能性幹細胞を、５０，０００個／ｃｍ２の密度でＬａｂｔｅｋ４ウェルチャンバスライド（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））にて培養した。脂肪細胞由来幹細胞を、１０，０００個／ｃｍ２で播種した。８つのＬａｂｔｅｋスライドに、褐色脂肪細胞の再凝集体として、再凝集体１５個／ｃｍ２、又は６ウェル懸濁プレートのうちのおよそ１ウェルを播種した。重力沈降（１０分）を用いて、沿軸中胚葉スフィアを１５ｍＬのファルコンチューブに回収し、使用済みの培地を吸引し、スフィアを、Ｃａ２＋もＭｇ２＋も不含有の過剰量の１×ＤＰＢＳで１回洗浄し、再度沈降させ、上清を吸引し、次いで固定した。Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）染料を含めるには、生細胞が適切なミトコンドリア膜電位を有していることが必要とされる。したがって、含める場合、Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ染料を、増殖培地に２００ｎＭで３０〜４５分間添加した後、固定した。全ての細胞を、室温にて４％のパラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ））で３０分間固定した。固定したスフィアを、Ｃａ２＋もＭｇ２＋も不含有の過剰量の１×ＤＰＢＳで１回洗浄し、沈降させた。洗浄液を除去し、スフィアを覆うのに十分な体積まで１５％スクロースの溶液を添加した。次いで、凍結防止剤として、このスクロース及びスフィアの全量を、２ｍＬの体積の３０％スクロース溶液の表面に、４℃で終夜載せた。スクロースで終夜脱水した後、スフィアを、２００μＬのピペットチップの広い穴を介して取り出し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ（ＵＳＡ））で充填したクリオモルドに移した。次いで、クリオモルドを、５分間の瞬間凍結のために、液体窒素ガス相に移した。凍結したクリオモルドを−８０℃で保管した後、Ｌｅｃｉａ  ＣＭ３０５０Ｓクリオコート（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ））を用いて、顕微鏡スライド上に７μｍの厚さの切片を作製し、−８０℃で保管した。
【０１６７】
ヒトＰＳＣを、８０％コンフルエントまで培養した後、固定した。ヒトＡＤＳＣを、ＳｔｅｍＰＲＯ（登録商標）脂肪生成分化培地で２１日間培養した。褐色脂肪細胞を、再凝集体の播種後１４〜３０日間培養した。全てのサンプル、固定した細胞、及び切片を、Ｃａ２＋もＭｇ２＋も不含有の１×ＤＰＢＳで５分間洗浄した。ｈＰＳＣ及びＰＭの場合には、洗浄液を除去し、ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ及び０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））、１０％のロバ血清（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ）、０．３Ｍのグリシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を含有する透過処理及びブロッキング用のバッファーで室温で１時間交換した。ＢＡ細胞の場合には、洗浄液を除去し、ＰＢＳＳ（１×ＰＢＳ及び０．１％のＳｐａｐｏｎｉｎ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））、１０％のロバ血清、０．３Ｍのグリシンを含有する透過処理及びブロッキング用のバッファーにより、室温で１時間交換した。全ての場合で、透過処理及びブロッキング用バッファーを除去し、スライドを、ＰＢＳＴ又はＰＢＳＳと１０％のロバ血清とを含有する一次抗体インキュベーション緩衝液で１回すすぎ洗いした。洗浄液を除去した後で、一次抗体インキュベーション緩衝液で一次抗体（表１参照）を調製し、サンプルに添加し、４℃で終夜インキュベートした。一次抗体と終夜インキュベートした後、サンプルを、インキュベーション緩衝液のみで３回洗浄した。二次抗体を、２．５％のロバ血清、０．２ＭのＰＢＳＴ／Ｓ溶液に希釈し、暗所にて１時間、室温でインキュベートした。二次抗体の除去後、細胞をＤＰＢＳで２回、各５分間洗浄した。含める場合、ＬｉｐｉｄＴｏｘ  Ｇｒｅｅｎ／Ｒｅｄ染料を、ＤＰＢＳに１：２００希釈して３０分間添加した。ＬｉｐｉｄＴｏｘ染料の後で、ＤＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を、細胞に５分間添加した。ＤＰＢＳで３回洗浄した後、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））とともにカバーグラスをスライドに載せた。Ｌｅｉｃａ  ＤＭ６０００Ｂ顕微鏡及びＺｅｓｉｓ  ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を用いて、画像を得た。画像を、Ｓｌｉｄｅｂｏｏｋ６（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ））により加工した。
【０１６８】
フローサイトメトリー
それぞれの種類の細胞の正常な分散のために、上記の方法を用いて細胞を分散させ、滅菌ＤＰＢＳで洗浄し、２００×ｇで４分間かけてペレット化した。細胞を、０．５ｍＬのフローサイトメトリー固定緩衝液（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））に再懸濁し、室温で１５分間、インキュベートした。固定後、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、ペレット化し、２００μＬのフローサイトメトリー透過処理／洗浄緩衝液（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））に再懸濁した。固定した細胞と一次抗体（表２）を、４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、必要に応じて、二次抗体とともに４℃で３０分間インキュベートした。含める場合、二次抗体添加後に、ＤＰＢＳに１：２００希釈したＬｉｐｉｄＴｏｘ  Ｇｒｅｅｎ／Ｒｅｄ染料を３０分間添加した。分析はＢｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＣｙＡｎで行い、結果を分析してＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０を用いてプロットした。
【０１６９】
Ｓｅａｈｏｒｓｅ細胞外フラックス分析
沿軸中胚葉、ＢＡ、及び白色脂肪細胞（ＷＡ）を、通常の培養条件にてＳｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦｅ２４細胞培養マイクロプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ））に蒔いた。簡潔に述べると、Ｙ−２７６３２二塩酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を添加したＰＭＭ２培地に、ＰＭ細胞を１２０，０００個／ｃｍ２の密度で２４時間蒔き、次いで、更に４８時間ＰＭＭ２単独に切り替えた後、フラックス分析を行った。褐色脂肪細胞を、凝集体１５個／ｃｍ２の密度で再凝集体として蒔き、ＢＡＤ２で２１日間培養した。白色脂肪細胞フラックス分析の場合、ｈＡＤＳＣを１０，０００個／ｃｍ２の密度でＭｅｓｅｎＰＲＯ（商標）ＲＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））培地に４日間蒔き、次いで、ＳｔｅｍＰＲＯ（登録商標）脂肪生成分化培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））に２１日間切り替えた。ＢＡ細胞の場合、培地を１日おきに交換した。ｈＡＤＳＣの場合、蒔いた初日に新鮮なＭｅｓｅｎＰＲＯを添加し、交換しなかった。ＷＡ分化中、ＳｔｅｍＰＲＯ（登録商標）脂肪生成分化培地を、３日毎に交換した。
【０１７０】
Ｍｉｔｏストレス試験キット（Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ））を利用し、ミトコンドリア機能を分析した。褐色脂肪細胞に対する効果を最大にするため、薬物、オリゴマイシン、ＦＣＣＰ、及びロテノン／アンチマイシンＡの用量を設定した後、ＰＭ細胞及びＷＡ細胞のフラックス分析プロトコルを確立した。薬物濃度は、全ての細胞外フラックスアッセイを通して変化なしとした。オリゴマイシンを２μＭで使用し、ＦＣＣＰを２μＭで使用し、ロテノン／アンチマイシンＡを５μＭで使用した。
【０１７１】
ノルエピネフリン刺激分析の場合、細胞を、アッセイ直前までそれぞれの分化培地に保持した。イソプロテレノール刺激アッセイの場合、ＰＭ細胞には、アッセイの１８時間前に、フォルスコリン不含有でかつ１００μＭのイソプロテレノールを含有するＰＭＭ２培地を与えた。ＢＡ細胞には、ＩＢＭＸ不含有でかつ１００μＭのイソプロテレノールを含有するＢＡＤ２培地をアッセイ前に１８時間与えた。白色脂肪細胞は血清培地で分化させたことから、フォルスコリン刺激アッセイに際し、両方の細胞を同じ培地に４８時間曝露することにより、血清がＢＡ細胞に対し示し得る影響の正規化を試みた。ＢＡ細胞及びＷＡ細胞の両方に、グルタミン不含有のＤＭＥＭＦ−１２（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＮＹ））、２％のＥＳＣ適格ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｆｌｏｗｅｒｙ  Ｂｒａｎｃｈ，ＧＡ））、２ｍＭのｇｌｕｔａｇｒｏ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＮＹ））、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＮＹ））、２００ｎｇ／ｍＬのＬＯＮＧ（登録商標）Ｒ３  ＩＧＦ−Ｉ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、及び１μＭのデキサメタゾン（Ｔｏｃｒｉｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））で構成される最少培地を与えた。アッセイの２４時間前に、この最少培地に、１０μＭのフォルスコリンを添加した。脂肪酸酸化アッセイの場合、フラックスアッセイの２４時間前に、ＢＡ細胞及びＷＡ細胞の両方に基質制限培地を与えた。この基質制限培地は、０．５ｍＭのグルコース（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＮＹ））、１ｍＭのｇｌｕｔａｇｒｏ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＮＹ））、０．５ｍＭのカルニチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、及び２％のＥＳＣ適格ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｆｌｏｗｅｒｙ  Ｂｒａｎｃｈ，ＧＡ））を添加した、グルコースもグルタミンもピルビン酸ナトリウムも不含有のＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＮＹ））で構成された。
【０１７２】
アッセイの前に、新たに調製したＸＦアッセイ培地を細胞に与えた。この培地は、ＸＦ基本培地（Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ））と、基質として所望の濃度の、グルコース、グルタミン、及びピルビン酸ナトリウムとから構成された。刺激アッセイの場合、ＸＦアッセイ培地は、２５ｍＭのグルコース（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＮＹ））、２ｍＭのｇｌｕｔａｇｒｏ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＮＹ））、及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加した基本培地を含有した。培地を３７℃まで加温し、水酸化ナトリウムを使用してｐＨを７．４に調整し、０．２μｍのＳｔｅｒｉｃｕｐ（登録商標）フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））を通して濾過した。フラックスアッセイの開始の少なくとも１時間前に、ＸＦ２４プレートから増殖培地を除去し、製造業者のプロトコルにしたがって、ＸＦアッセイ培地を使用して細胞を３回洗浄し、並びに細胞を３７℃のｎｏｎ−ＣＯ２インキュベータに入れた。フラックス分析中に利用した全ての薬物は、同様にストック品をＸＦアッセイ培地に希釈した後、アッセイカートリッジのポートに充填した。脂肪酸酸化アッセイの場合、ＸＦアッセイ培地は、５．５ｍＭのグルコース及び０．５ｍＭのカルニチンを添加した、ＸＦ基本培地を含有した。
【０１７３】
１．５ｍＭのコンジュゲートしたパルミテート−ＢＳＡ溶液を、２ステッププロセスで逐次調製した。最初に、１ｍＭのパルミチン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を添加した１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液を作製し、続いて０．３４ｍＭの脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ））を添加した１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液を作製した。パルミチン酸ナトリウム溶液を、加熱した撹拌プレート上の水浴内にて、溶液が透明になるまで３７℃から７０℃まで加熱した。他方、ＢＳＡ溶液を、加熱した撹拌プレート上の水浴内にて、完全に溶解するまで３７℃で加熱し、次いで、０．２μｍのＳｔｅｒｉｃｕｐ（登録商標）フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））で濾過滅菌した。濾過したＢＳＡ溶液をコニカルチューブに移し、混合の準備が整うまで３７℃の水浴内に保持した。ＢＳＡのみの対照の場合、最終濃度が０．１７ｍＭのＢＳＡになるよう、０．３４ｍＭのＢＳＡ−ＮａＣｌ溶液の半分を、同体積の１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液で更に希釈した。この溶液を小分けし、−２０℃で保存した。パルミテートのコンジュゲーションを完了させるために、熱した同体積のパルミテートを、残りの温めた０．３４ｍＭのＢＳＡ溶液に５ｍＬ刻みで添加した（パルミテートとＢＳＡとのモル比＝６：１）。この溶液を、３７℃で１時間撹拌した。ｐＨを７．４に調整し、最終的な溶液を４ｍＬのガラスバイアル瓶に小分けし、−２０℃で保存した。
【０１７４】
フラックス分析の後で、細胞を溶解させて、タンパク質含有量をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより測定した。簡潔に述べると、フラックスアッセイの完了時に、プレートを取り出し、培地を吸引し、ウェルを、氷冷ＤＰＢＳで穏やかにすすいだ。洗浄液を吸引し、次いでプレートを液体窒素ガス相に入れ、その間新たな溶解緩衝液を調製した。溶解緩衝液は、１０ｍＭのＴｒｉｓで構成し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によりｐＨ７．４とした。凍結したプレートを取り出し、室温の溶解緩衝液を直ちに添加した。凍結、及び比較的温かい溶解緩衝液の添加により、脂肪細胞の溶解を助けた。溶解した細胞に対し、４５０μＬのＢｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を各ウェルに添加した。１００μＬの溶解細胞−Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬混合物を使用して、タンパク質濃度を、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ２にて５９５ｎｍで測定した。フラックスデータを、Ｗａｖｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ））により加工し、タンパク質含有量に対し正規化した。
【０１７５】
脂肪分解
ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）、褐色脂肪（ＢＡ）細胞、及び多能性ヒト脂肪由来間質／幹細胞（ｈＤＳＣ）を、１２ウェルファルコンプレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ））に蒔いた。ヒトＰＳＣを５０，０００個／ｃｍ２で播種し、ＭＭにて４日間、コンフルエントになるまで培養した。ヒトＡＤＳＣを１０，０００個／ｃｍ２で播種し、最初にＭｅｓｅｎＰＲＯ（商標）ＲＳ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））にて４日間、コンフルエントになるまで培養した。次いで、培地を、ＳｔｅｍＰＲＯ（登録商標）脂肪生成分化培地（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））に、２１日間切り替えた。褐色脂肪細胞凝集体を、凝集体１５個／ｃｍ２で１２ウェルファルコンプレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ））に蒔き、ＢＡＤ２培地にて２１日間培養した。製造元の使用説明書にしたがって遊離グリセロール試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を使用し、細胞培養培地へのグリセロール放出によって脂肪分解を測定した。アッセイの前に、それぞれの種類の細胞から増殖培地を除去し、細胞を、２％のＦＡフリーＢＳＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ））を添加した脂肪分解性基本培地［ＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））により３回洗浄して、残留脂肪酸をウェルから除去した。「ゼロ」時の時点で、１０μＭのフォルスコリン（Ｔｏｃｒｉｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ（ＭＮ））を脂肪分解基本培地に添加にして脂肪分解を刺激し、４時間及び８時間の時点でサンプリングした。トリアクシンＣ（５μＭ）を基本培地に添加して、アシル−ＣｏＡシンセターゼを阻害し、続いて、グリセロール及び遊離脂肪酸の再エステル化を阻害した。脂肪分解のデータを、タンパク質含有量に対して正規化した。
【０１７６】
【表１】
2021525089.tif 000007
【０１７７】
実施例２．マウスにおけるヒトｉＰＳＣ−ＢＡ移植
２群のマウスの皮下に、本発明の方法により産生し、デバイスに封入したヒト褐色脂肪細胞（ｈｉＰＳＣ由来ＢＡ細胞）を移植した。一方の群では、マウスにフォルスコリン（ＦＳＫ）を注入して、褐色脂肪細胞を刺激した。他方の群では、褐色脂肪細胞を移植したマウスにＦＳＫによる刺激を行わなかった。マウスの対照群には、空のデバイスを移植した。全ての群について、移植の３週間後に、インビボでのＰＥＴ−ＳＣＡＮイメージング及び移植したデバイスのエクスビボでのＰＥＴ−ＳＣＡＮイメージングについて評価した。エクスビボでのＰＥＴ−ＳＣＡＮイメージングによって分析したとき、ＦＳＫによって刺激した褐色脂肪細胞を移植した群では、褐色脂肪細胞は移植したがＦＳＫによる刺激は行わなかった群よりも標識されたグルコースのシグナルが増加した。空のデバイスを移植したマウスでは、シグナルは示されなかった。
【０１７８】
封入されたヒト褐色脂肪細胞又は空のデバイスを移植したマウスの群に対して熱量分析を行った。マウスの一方の群では、外科的に内在性マウスＢＡ組織を枯渇させ、別の群では、内在性マウスＢＡ組織を不活性化させるために、熱的に中立な状態に維持した。２つの群に、ヒトＢＡ細胞（（ｈｉＰＳＣ由来褐色脂肪細胞）又は空のデバイスのいずれかを移植した。移植の１週間後に、マウスの各群を、ノルエピネフリン（ＮＥ）で刺激（ＢＡ刺激）して、脱共役した呼吸の増加を評価した。熱量測定のため、４つに分けた群を分析し、ヒト褐色脂肪細胞によって誘導した呼吸指数の読み出しとした。内在性マウスＢＡ細胞を外科的に枯渇させたマウスでは、空のデバイスを移植したマウスと比較して、ＮＥにより呼吸指数の有意な増加が誘導された。熱的に中立に処置されたマウスの群では、ヒトＢＡ細胞を移植したマウスの群において、空のデバイスを移植した群と比較して呼吸指数のＮＥ依存的な誘導がわずかに改善されたものの、有意な改善ではなかった。
【０１７９】
上記明細書で言及した全ての刊行物は、本明細書に参照により組み込まれる。本発明の開示された細胞集団、使用、及び方法の様々な修正及び変更は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明白であろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して開示されているが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、当業者には自明であり、本発明を実施するために開示された様式の種々の改変は以下の特許請求の範囲の範囲内であることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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