(57)【要約】  本発明は、メタクリル酸エステル耐性微生物を使用したメタクリル酸エステルの産生の方法に関する。
2021525085.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタクリル酸エステルの産生の方法であって、
ａ）発酵培地中において、野生型微生物と比較してＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対して増加した耐性を有する遺伝子改変微生物を提供することと、
ｂ）Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルが産生される条件下で前記微生物を成長させることと
を含む方法。
【請求項２】
前記微生物は、液体培地中で約３７℃において成長されたとき、少なくとも２０％ｖ／ｖのＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対して耐性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物は、細菌である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のファミリーから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌は、エシェリシア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハイドロゲノバクター属（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾリゾビウム属（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アナプラズマ属（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カリマトバクテリウム属（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コクシエラ属（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、カプリアビダス属（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ガードネレラ属（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ロシャリメア属（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、ロチア属（Ｒｏｔｈｉａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ウォルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子改変微生物は、酸化ストレス応答系及び細菌多剤抵抗性系をレギュレートするか、又はそれらの部分を形成するタンパク質をコードする１つ又は複数の核酸において変異を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子改変微生物は、下記の核酸配列：ｓｏｘＲ核酸配列、ａｃｒＲ核酸配列、ｒｏｂ核酸配列及び／又はｍａｒＲ核酸配列の１つ又は複数における変異を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｓｏｘＲ核酸配列は、配列番号１又はそのホモログを含み、前記ａｃｒＲ核酸配列は、配列番号２又はそのホモログを含み、前記ｒｏｂ核酸配列は、配列番号５又はそのホモログを含み、及び前記ｍａｒＲ核酸配列は、配列番号７又はそのホモログを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記変異ｓｏｘＲ核酸配列は、ＤＮＡ結合ドメイン又はＦＥ−Ｓクラスタードメインにおいて変異を有する変異ＳｏｘＲタンパク質をコードする、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記変異は、下記：配列番号２に示されるＳｏｘＲにおける、別のアミノ酸によるＲ２０の置換、別のアミノ酸によるＲ２０の置換、残基１４６の欠失又は残基１３９におけるトランケーションの１つから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記変異ａｃｒＲ核酸配列は、ＤＮＡ結合ドメイン又はリガンド結合ドメインにおいて変異を有する変異ＡｃｒＲタンパク質をコードする、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記変異は、下記：配列番号３に示されるＡｃｒＲにおける、別のアミノ酸によるＶ２９の置換、Ｔ３２、Ａ１９１又は４９位におけるフレームシフト変異の１つから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記変異ｒｏｂ核酸配列は、Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメイン又はＣ末端ドメインにおいて変異を有する変異Ｒｏｂタンパク質をコードする、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記変異は、下記：配列番号５に示されるＲｏｂにおける、別のアミノ酸によるＡ７０の置換又はＲ１５６の置換の１つから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記変異ｍａｒＲ核酸配列は、ＤＮＡ結合ドメインにおいて変異を有するＭａｒＲタンパク質をコードする、請求項８〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記変異は、配列番号７に示されるＭａｒＲにおける、別のアミノ酸によるＶ８４の置換である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子改変微生物は、ａｃｒＲ核酸配列並びに下記の核酸配列：ｓｏｘＲ核酸配列、ｒｏｂ核酸配列及び／又はｍａｒＲ核酸配列の１つ又は複数において変異を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子改変生物は、例えば、表１ａ又は１ｂから選択される１つ又は複数のさらなる変異を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ又は複数のさらなる変異は、前記酸化ストレス応答系及び前記細菌多剤抵抗性系をレギュレートするか、又はそれらの部分を形成するタンパク質をコードする核酸中にある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記微生物は、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル生合成経路の酵素をコードするベクター又は構築体をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記微生物は、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの産生を増進するベクター又は構築体をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを前記発酵培地から取り出すステップと、前記取り出されたＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルをメタノールでエステル交換するステップとを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルは、ＢＭＡである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対する微生物の耐性を増加させる方法であって、酸化ストレス応答系及び細菌多剤抵抗性系をレギュレートするか、又はそれらの部分を形成するタンパク質をコードする核酸中に変異を導入することを含む方法。
【請求項２６】
Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの存在下で微生物を成長させるか又は維持する方法であって、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルが産生される条件下で発酵培地中において、野生型微生物と比較してＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対して増加した耐性を有する遺伝子改変微生物を提供することを含む方法。
【請求項２７】
Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルと、野生型微生物と比較してＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対して増加した耐性を有する遺伝子改変微生物とを含む発酵培地。
【請求項２８】
Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを産生させるための、野生型微生物と比較してＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対して増加した耐性を有する遺伝子改変微生物の使用。
【請求項２９】
前記微生物は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のファミリーから選択される、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
細菌は、エシェリシア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハイドロゲノバクター属（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾリゾビウム属（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アナプラズマ属（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カリマトバクテリウム属（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コクシエラ属（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、カプリアビダス属（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ガードネレラ属（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ロシャリメア属（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、ロチア属（Ｒｏｔｈｉａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ウォルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）から選択される、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
遺伝子改変微生物は、酸化ストレス応答系及び細菌多剤抵抗性系をレギュレートするか、又はそれらの部分を形成するタンパク質をコードする１つ又は複数の核酸において変異を含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
前記遺伝子改変微生物は、ｓｏｘＲ核酸配列、ａｃｒＲ核酸配列、ｒｏｂ核酸配列及び／又はｍａｒＲ核酸配列において変異を含む、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３４】
前記ｓｏｘＲ核酸配列は、配列番号１又はそのホモログを含み、前記ａｃｒＲ核酸配列は、配列番号２又はそのホモログを含み、前記ｒｏｂ核酸配列は、配列番号５又はそのホモログを含み、及び前記ｍａｒＲ核酸配列は、配列番号７又はそのホモログを含む、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記変異ｓｏｘＲ核酸配列は、ＤＮＡ結合ドメイン又はＦＥ−Ｓクラスタードメインにおいて変異を有する変異ＳｏｘＲタンパク質をコードする、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記変異は、下記：配列番号２に示されるＳｏｘＲにおける、別のアミノ酸によるＲ２０の置換、別のアミノ酸によるＲ２０の置換、残基１４６の欠失又は残基１３９におけるトランケーションの１つから選択される、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記変異ａｃｒＲ核酸配列は、ＤＮＡ結合ドメイン又はリガンド結合ドメインにおいて変異を有する変異ＡｃｒＲタンパク質をコードする、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３８】
前記変異は、下記：配列番号３に示されるＡｃｒＲにおける、別のアミノ酸によるＶ２９の置換、Ｔ３２、Ａ１９１又は４９位におけるフレームシフト変異の１つから選択される、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
前記変異ｒｏｂ核酸配列は、Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメイン又はＣ末端ドメインにおいて変異を有する変異Ｒｏｂタンパク質をコードする、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４０】
前記変異は、配列番号５に示されるＲｏｂにおける、別のアミノ酸によるＡ７０の置換又はＲ１５６の置換である、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記変異ｍａｒＲ核酸配列は、ＤＮＡ結合ドメインにおいて変異を有するＭａｒＲタンパク質をコードする、請求項３３〜４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４２】
前記変異は、配列番号７に示されるＭａｒＲにおける、別のアミノ酸によるＶ８４の置換である、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記遺伝子改変生物は、１つ又は複数のさらなる変異を含む、請求項２８〜４２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４４】
前記１つ又は複数のさらなる変異は、前記酸化ストレス応答系及び前記細菌多剤抵抗性系をレギュレートするか、又はそれらの部分を形成するタンパク質をコードする核酸中にある、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
下記の変異：ａ）変異タンパク質であって、Ｖ８４は、別のアミノ酸で置換されている、変異タンパク質をコードするｍａｒＲ核酸配列における変異；ｂ）変異タンパク質であって、Ａ７０若しくはＲ１５６は、別のアミノ酸で置換されている、変異タンパク質をコードするＲｏｂ核酸配列における変異；ｃ）変異タンパク質であって、Ｒ２０は、別のアミノ酸で置換されているか、残基１４６は、欠失されているか、若しくは前記タンパク質は、残基１３９において短縮されている、変異タンパク質をコードするｓｏｘＲ核酸配列における変異、又はｄ）ＡｃｒＲ中のＴ３２、Ａ１９１若しくは４９位におけるフレームシフト変異を有する変異タンパク質をコードするａｃｒＲ核酸配列における変異、或いはｅ）下記：ｓｏｘＲ、ａｃｒＲ、ｍａｒＲ及び／若しくはｒｏｂ核酸又はそのホモログから選択される２つ以上の核酸における変異であって、前記核酸は、変異タンパク質をコードする、変異の１つを含む、遺伝子改変微生物。
【請求項４６】
腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のファミリーから選択される、請求項４５に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４７】
細菌は、エシェリシア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハイドロゲノバクター属（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾリゾビウム属（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アナプラズマ属（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カリマトバクテリウム属（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コクシエラ属（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、カプリアビダス属（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ガードネレラ属（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ロシャリメア属（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、ロチア属（Ｒｏｔｈｉａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ウォルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）から選択される、請求項４５又は４６に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４８】
前記細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項４７に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４９】
酸化ストレス応答系及び細菌多剤抵抗性系をレギュレートするか、又はそれらの部分を形成するタンパク質をコードする１つ又は複数の核酸において変異を含む、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５０】
ｓｏｘＲ核酸配列、ａｃｒＲ核酸配列、ｒｏｂ核酸配列及び／又はｍａｒＲ核酸配列において変異を含む、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５１】
前記ｓｏｘＲ核酸配列は、配列番号１又はそのホモログを含み、前記ａｃｒＲ核酸配列は、配列番号２又はそのホモログを含み、前記ｒｏｂ核酸配列は、配列番号５又はそのホモログを含み、及び前記ｍａｒＲ核酸配列は、配列番号７又はそのホモログを含む、請求項５０に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５２】
前記変異ｓｏｘＲ核酸配列は、ＤＮＡ結合ドメイン又はＦＥ−Ｓクラスタードメインにおいて変異を有する変異ＳｏｘＲタンパク質をコードする、請求項５０又は５１に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５３】
前記変異は、下記：配列番号２に示されるＳｏｘＲにおける、別のアミノ酸によるＲ２０の置換、別のアミノ酸によるＲ２０の置換、残基１４６の欠失又は残基１３９におけるトランケーションの１つから選択される、請求項５２に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５４】
前記変異ａｃｒＲ核酸配列は、ＤＮＡ結合ドメイン又はリガンド結合ドメインにおいて変異を有する変異ＡｃｒＲタンパク質をコードする、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５５】
前記変異は、下記：配列番号３に示されるＡｃｒＲにおける、別のアミノ酸によるＶ２９の置換、Ｔ３２、Ａ１９１又は４９位におけるフレームシフト変異の１つから選択される、請求項５４に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５６】
前記変異ｒｏｂ核酸配列は、Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメイン又はＣ末端ドメインにおいて変異を有する変異Ｒｏｂタンパク質をコードする、請求項５０〜５５のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５７】
前記変異は、配列番号５に示されるＲｏｂにおける、別のアミノ酸によるＡ７０の置換又はＲ１５６の置換である、請求項５６に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５８】
前記変異ｍａｒＲ核酸配列は、ＤＮＡ結合ドメインにおいて変異を有するＭａｒＲタンパク質をコードする、請求項５０〜５７のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５９】
前記変異は、配列番号７に示されるＭａｒＲにおける、別のアミノ酸によるＶ８４の置換である、請求項５８に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項６０】
表１ａ又は１ｂから選択される１つ又は複数の変異を含む、請求項４５〜５９のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項６１】
前記１つ又は複数のさらなる変異は、前記酸化ストレス応答系及び前記細菌多剤抵抗性系をレギュレートするか、又はそれらの部分を形成するタンパク質をコードする核酸中にある、請求項６０に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項６２】
Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの産生を増進する遺伝子構築体又はベクターをさらに含む、請求項４５〜６１のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項６３】
Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを産生させるための、請求項４５〜６２のいずれか一項に記載の単離された遺伝子改変微生物の使用。
【請求項６４】
メタクリル酸エステル耐性微生物の単離の方法であって、
ａ）発酵培地中において微生物を提供することと、
ｂ）前記微生物をメタクリル酸エステルと接触させることと、
ｃ）ステップ（ｂ）の前記生存可能な微生物を単離することと
を含み、前記生存可能な微生物は、液体培地中で約３７℃において成長されたとき、少なくとも２０％ｖ／ｖのメタクリル酸エステルに対して耐性である、方法。
【請求項６５】
請求項６４に記載の方法によって得られるか又は得ることが可能であるメタクリル酸エステル耐性微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はメタクリル酸エステルの産生の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）は、化学工業において重要な単量体である。ＭＭＡの主要な使用は、様々な利用のためのプラスチックの生産におけるものであるが、ＭＭＡは、整形外科で使用するための骨セメントにおいても使用され得る。最も顕著な重合適用は、光学的透明度が高いプラスチックを製造するためのポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）の鋳造、成形又は押出である。ＰＭＭＡの世界的な消費量は、年間でおよそ２１０万トンと推定される。
【０００３】
最も広範に使用されるメタクリル酸エステルは、ＭＭＡであるが、メタクリル酸又はＭＭＡも使用して、それぞれ直接のエステル化又はエステル交換によって他のメタクリル酸エステルを生成することができる。例は、ブチル２−メチルプロパ−２−エノエート（ＢＭＡ、化学式Ｃ８Ｈ１４Ｏ２を有するメタクリル酸エステル）、メタクリル酸イソブチル（ｉＢＭＡ）、メタクリル酸エチル（ＥＭＡ）及び２−エチルヘキシルメタクリレート（２ＥＨＭＡ）である。ＢＭＡは、ブタノールとのＭＭＡのエステル交換から生成される。これらのエステル及びＰＭＭＡの全ては、すなわち、織物、コーティング及び接着剤、包装、潤滑剤、車両運搬具、ＬＣＤスクリーン、医療機器及び家庭用品の製造において多種な用途を有する。
【０００４】
ＭＭＡは、現在、専ら化学的手段により産生されており、ＭＭＡの産生のための現在の方法には、アセトンシアノヒドリン（ＡＣＨ）経路及び様々なＣ２〜Ｃ４前駆体から出発する他の経路が含まれる。ＭＭＡ産生のための最も良好な方法の１つは、「アルファ方法」であり、これにより、ホルムアルデヒドとの無水反応によってエステル、プロピオン酸メチルからＭＭＡを得る。アルファ方法において、エチレンのカルボニル化によりプロピオン酸メチルが産生される。このエチレン原料は、化石燃料由来である。アルファ方法には、ＭＭＡの産生で一般的に使用される他の方法と比較して多くの長所がある。これらの長所としては、危険な化学物質の使用の減少、生成物の選択制が格段に高いこと、原油由来の原料への依存の減少が挙げられる。しかし、原料の価格設定は、ガソリンのコストと関連する。したがって、これらの欠点を克服するＭＭＡの産生のための代替的な方法を開発することが望ましい。
【０００５】
化学合成によらず、発酵を介して高価な化学物質を産生するために微生物を使用し得る。このような微生物の組み換えＤＮＡ技術及び合成代謝工学により、特定の化学物質の産生に対する代謝経路の再構築が可能になった。近年、アクリレート類の生物学的産生に対するいくつかの持続可能な経路が開発されている。これらの方法は、一般的に、微生物発酵を介した再生可能原料からのアクリレート類の産生に焦点を当てている。例えば、特許文献１は、組換え微生物を使用してメタクリル酸及び／又はその誘導体を産生させる方法について記載している。
【０００６】
しかし、特定の濃度で発酵中のアクリル酸エステル、例えばＭＭＡ及びＢＭＡが蓄積することは、一般に生体触媒に対して有毒であり、細胞成長を阻害し、且つ／又は細胞死をもたらす。特に、高級メタクリル酸アルキル（例えば、メタクリル酸ブチル（ＢＭＡ））は、低級メタクリル酸アルキル、例えばＭＭＡより有毒である。したがって、これは、特に大きい工業規模での微生物を使用したメタクリル酸アルキルの生物学的産生について制限要因であり得る。
【０００７】
細菌は、特に遺伝子発現を制御する調節ネットワークを適合させることによって環境刺激に適合することができることが公知である。酸化ストレス応答系及び多剤抵抗性系を含めて、いくつかのこのようなネットワークが存在する。
【０００８】
微生物に対するメタクリル酸アルキルの毒性効果及びＭＭＡを産生させるための現在の化学工程と関連する所与の不都合を考慮して、メタクリル酸アルキルの産生の方法において使用するためのメタクリル酸エステルに対する改善された耐性を有する微生物を提供することが有利であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１８５２１１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、これらの問題の１つ又は複数を除去又は軽減し、メタクリル酸エステル、特にＢＭＡ及び／又はＭＭＡの産生のための改善された方法を提供し、メタクリル酸エステルに対する改善された耐性を有する微生物を提供することが本発明の１つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
実施例においてさらに説明するように、本発明者らは、培養物中のメタクリル酸エステルへの曝露により、メタクリル酸エステルに対する抵抗性を獲得した微生物を選択するために様々な戦略を用いてきた。驚くべきことに、本発明者らは、野生型細菌に対して通常毒性である濃度において、相分離したメタクリル酸エステルの存在下で生存した細菌菌株を単離することができた。抵抗性菌株を単離し、配列決定し、野生型と比較して抵抗性を与える遺伝子変異を同定した。抵抗性菌株もさらに特性決定した。ノックイン及びノックアウト菌株も開発して、観察される抵抗性に関与する変異をさらに評価した。本発明者らは、耐性を与えた変異が、とりわけ、酸化ストレス応答系及び細菌多剤抵抗性系の成分及びレギュレーターをコードする特定の遺伝子中に存在することを見出した。本発明者らは、特定の変異の組合せが耐性効果を増進できたことも見出した。このように、野生型細菌を遺伝学的に操作して、前記変異を導入することにより、同定された変異を使用して、細菌に耐性を与えることができる。
【００１２】
このように、本発明者らは、驚くべきことに、メタクリル酸エステルに対して野生型細菌より抵抗性であり、したがってこのような化合物の産生の方法において使用することができる細菌菌株を同定、単離及び特性決定してきた。このように、本発明者らは、酸化ストレス応答系及び細菌多剤抵抗性系並びにそのレギュレーターにおける変異が、メタクリル酸エステルに対する抵抗性の媒介において重要な役割を果たしていることを示した。特に、本発明者らは、アクリフラビン抵抗性レギュレーター（ａｃｒＲ）の変異体が、特にｍａｒＲ、ｓｏｘＲ又はｒｏｂから選択されるグローバルレギュレーターの１つと合わせたとき、メタクリル酸エステルへの耐性を与えることを示した。本発明者らは、観察される抵抗性の一因となり、このように微生物を遺伝学的に改変する方法を可能とし、メタクリル酸エステルに対して増加した耐性を与える、酸化ストレス応答系及び細菌多剤抵抗性系の成分及びレギュレーターも同定した。したがって、メタクリル酸エステルに対して増加した耐性を有する遺伝子改変微生物は、本発明の範囲内である。本発明者らは、メタクリル酸エステルに対して増加した耐性を有する遺伝子改変微生物を使用する、メタクリル酸エステルの産生の方法も開発した。
【００１３】
本発明を下記の非限定的な図においてさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の成長に対する２０％（ｖ／ｖ）のＢＭＡの非存在［■］又は存在［●］の効果。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５（Ａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）（Ｂ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）ａｃｒＲ（Ｖ２９Ｇ）（Ｃ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）（Ｄ）を２５０ｍＬの振盪フラスコにおいて３７℃及び２５０ｒｐｍの振盪でＭＳＸ培地中において成長させた。２回の反復実験の平均を示し、エラーバーは、標準偏差である。
【図２】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株の成長に対する中間指数増殖期中の２０％（ｖ／ｖ）のＢＭＡの添加の効果。（Ａ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５、（Ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）、（Ｃ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）ａｃｒＲ（Ｖ２９Ｇ）、及び（Ｄ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）の成長を示す。全ての菌株を２５０ｍＬの振盪フラスコにおいてＭＳＸ培地中で３７℃及び２５０ｒｐｍにおいて成長させた。概ね０．３のＯＤ６００ｎｍに達した後、ＢＭＡ又はＨ２Ｏを加えた。試料を異なる時間間隔で採取し、ＯＤ６００ｎｍを決定した。３回の反復実験の平均を示し、エラーバーは、標準偏差である。
【図３】単一の欠失体の成長に対する、播種の直後に加えた２０％（ｖ／ｖ）のＢＭＡの非存在［●］又は存在［▲］の効果。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１１５△ｓｏｘＲ（Ａ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１１５△ａｃｒＲ（Ｂ）を３０ｍＬのバイアルにおいて３７℃及び２５０ｒｐｍの振盪でＭＳＸ培地中において成長させた。試料を０時間、８時間及び２４時間で採取し、ＯＤ６００ｎｍを決定した。２回の反復実験の平均を示し、エラーバーは、標準偏差である。
【図４】単一変異菌株の成長に対する、播種の直後に加えた２０％（ｖ／ｖ）のＢＭＡの非存在［●］又は存在［▲］の効果。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ａｃｒＲ（Ｖ２９Ｇ）（Ａ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）（Ｂ）を３０ｍＬのバイアルにおいて３７℃及び２５０ｒｐｍの振盪でＭＳＸ培地中において成長させた。試料を０時間、８時間及び２４時間で採取し、ＯＤ６００ｎｍを決定した。２回の反復実験の平均を示し、エラーバーは、標準偏差である。
【図５ａ】低濃度でのＢＭＡの効果。３７℃及び２００ＲＰＭにおいて５０ｍＬの培地を有する２５０ｍＬの三角フラスコを使用した、Ｍ９最少培地中の０％ｖ／ｖ（□）、０．０１％ｖ／ｖ（◇）、０．０５％ｖ／ｖ（△）及び０．１％ｖ／ｖ（×）でのＢＭＡを伴う大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１１３の成長。
【図５ｂ】高濃度でのＢＭＡの効果。３７℃及び２００ＲＰＭにおいて５０ｍＬの培地を有する２５０ｍＬの三角フラスコを使用した、Ｍ９最少培地中の０％ｖ／ｖ（□）、０．５％ｖ／ｖ（◇）、１．０％ｖ／ｖ（△）、５．０％ｖ／ｖ（〇）、１０．０％ｖ／ｖ（×）及び２０．０％ｖ／ｖ（＋）でのＢＭＡを伴う大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１１３の成長。
【図５ｃ】ＢＭＡに対する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の固有の耐性についての試験。３７℃及び２００ＲＰＭにおいて５０ｍＬの培地を有する２５０ｍＬの三角フラスコを使用した、Ｍ９最少培地中の０％ｖ／ｖ（□）、０．１％ｖ／ｖ（×）、０．５％ｖ／ｖ（＊）、０．１％ｖ／ｖ継代培養後（◇）、０．５％ｖ／ｖ継代培養後（△）でのＢＭＡを伴う大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１１３の成長（３連）。
【図５ｄ】ＡＤＥ−１。ＢＭＡ濃度の逐次の増加を伴う連続的バッチ培養における適応進化。１０ｇ  Ｌ−１のグルコース及びＢＭＡを有するＭ９最少培地中で３７℃及び２００ＲＰＭにおいて１０ｍＬの培地を有する５０ｍＬのＦＡＬＣＯＮ（登録商標）チューブにおいて、３つの平行チューブであるチューブ１（実線）、チューブ２（点線）及びチューブ３（破線）において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を成長させた。３つのチューブのそれぞれについて開始培養物として最も良好に成長している培養物を使用して、０．１％ＢＭＡ（×）、０．５％ＢＭＡ（□）、１％ＢＭＡ（◇）、５％（△）、１０％（〇）及び２０％（＋）において、それぞれの逐次移動においてＢＭＡ濃度を増加させた。
【図５ｅ】ＡＤＥ−３。連続的バッチ培養における適応進化、それぞれのＢＭＡ濃度での５つの連続的培養物を伴う。１０ｇ  Ｌ−１のグルコース及びＢＭＡを有するＭ９最少培地中で３７℃及び２００ＲＰＭにおいて１０ｍＬの培地を有する５０ｍＬのＦＡＬＣＯＮ（登録商標）チューブにおいて、３つの平行チューブであるチューブ１（実線）、チューブ２（点線）及びチューブ３（破線）において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を成長させた。ＢＭＡ濃度は、それに続く移動のために開始培養物としてそれぞれの別々のチューブを使用して、０．１％ｖ／ｖ（×）から０．５％ｖ／ｖ（□）、１％ｖ／ｖ（◇）、５％ｖ／ｖ（△）、１０％ｖ／ｖ（＊）及び２０％ｖ／ｖ（〇）に増加させた。
【図５ｆ】ＡＤＥ−３。連続的バッチ培養における適応進化、０．１％ｖ／ｖのＢＭＡでの１つの連続的培養、１０％ｖ／ｖのＢＭＡでの２回の連続的移動及び２０％ｖ／ｖのＢＭＡでの４５回の連続的移動を伴う。１０ｇ  Ｌ−１のグルコース及びＢＭＡを有するＭ９最少培地中で３７℃及び２００ＲＰＭにおいて１０ｍＬの培地を有する５０ｍＬのＦＡＬＣＯＮ（登録商標）チューブにおいて、３つの平行チューブであるチューブ１（実線）、チューブ２（点線）及びチューブ３（破線）において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を成長させた。ＢＭＡ濃度は、３つのチューブのそれぞれについて開始培養物として最も良好に成長している培養物を使用して、０．１％ｖ／ｖ（×）から１０％ｖ／ｖ（□）及び２０％ｖ／ｖ（◇）に増加させた。
【図５ｇ】ケモスタットにおけるＢＭＡ耐性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＡＤＥ−４適応進化及び選択。ミニバイオリアクター（５５ｍＬの有効容量）中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のケモスタット培養物を、３７℃及び約０．３Ｌ  ｈ−１の通気速度で１ｇ  Ｌ−１のグルコースを有するＭ９最少培地中で成長させたが、ＢＭＡ濃度（◆）は、０％ｖ／ｖから２０％ｖ／ｖに徐々に増加させ、希釈率（□）は、０ｈ−１から０．５５ｈ−１まで変動した。細胞濃度（●）は、細胞乾重量ｇ  Ｌ−１で報告した。
【図５ｈ】２０％ｖ／ｖのＢＭＡを有するＭ９最少培地中の３７℃及び２００ＲＰＭにおいて５０ｍＬの培地を有する２５０ｍＬの三角フラスコを使用したＡＤＥ−１及びＡＤＥ−２からの単離物の成長（３連）。単離物２（△）、３（◇）、５（＊）、６（−）、７（〇）及びＢＭＡを伴わない野生型（点線を伴う−）。
【図５ｉ】２０％ｖ／ｖのＢＭＡを有するＭ９最少培地中の３７℃及び２００ＲＰＭにおいて５０ｍＬの培地を有する２５０ｍＬの三角フラスコを使用したＡＤＥ−３からの単離物の成長（３連）。単離物１４（□）、１５（◇）、１６（△）、１７（×）、１８（〇）及びＢＭＡを伴わない野生型（点線を伴う−）。
【図５ｊ】０．３３ｈ−１の希釈率で２０％ｖ／ｖのＢＭＡを有するＭ９最少培地中の３７℃及び２００ＲＰＭにおいて５０ｍＬの培地を有する２５０ｍＬの三角フラスコを使用したＡＤＥ−４からの単離物の成長（３連）。単離物８（□）、９（◇）、１０（△）及びＢＭＡを伴わない野生型（点線を伴う−）。
【図５ｋ】０．４６ｈ−１の希釈率で２０％ｖ／ｖのＢＭＡを有するＭ９最少培地中の３７℃及び２００ＲＰＭにおいて５０ｍＬの培地を有する２５０ｍＬの三角フラスコを使用したＡＤＥ−４からの単離物の成長（３連）。単離物１９（□）、２０（◇）、２１（△）及びＢＭＡを伴わない野生型（点線を伴う−）。
【図６】０．５５ｈ−１の希釈率で２０％ｖ／ｖのＢＭＡを有するＭ９最少培地中の３７℃及び２００ＲＰＭにおいて５０ｍＬの培地を有する２５０ｍＬの三角フラスコを使用した適応進化研究からの単離物の成長（３連）。単離物２２（◇）、２３（〇）及びＢＭＡを伴わない野生型（点線を伴う−）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ここで、本発明をさらに説明する。下記の文章において、本発明の異なる態様をより詳細に定義する。このように定義する各態様は、逆のことが明らかに示されない限り、任意の他の態様と合わされ得る。特に、好ましいか又は有利であると示した任意の特徴は、好ましいか又は有利であると示した任意の他の特徴と合わされ得る。
【００１６】
本発明の実施は、他に示さない限り、当技術分野の技術の範囲内である微生物学、組織培養、分子生物学、化学、生化学及び組換えＤＮＡ技術の従来の技術を用いる。このような技術は、文献、例えばＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１４において十分に説明されている。
メタクリル酸エステルを産生させ、微生物に対してメタクリル酸エステルへの耐性を与え、メタクリル酸エステル耐性微生物を成長させる方法
第１の態様において、本発明は、メタクリル酸エステルの産生の方法であって、
ａ）発酵培地中において、野生型微生物と比較してＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対して増加した耐性を有する遺伝子改変微生物を提供することと、
ｂ）Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルが産生される条件下で微生物を成長させることと
を含む方法に関する。
【００１７】
第２の態様において、本発明は、メタクリル酸エステルの存在下で微生物を成長させるか又は維持する方法であって、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルが産生される条件下で発酵培地中において、野生型微生物と比較してＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対して増加した耐性を有する遺伝子改変微生物を提供することを含む方法に関する。
【００１８】
本発明は、メタクリル酸エステルに対する微生物の耐性を与えるか又は増加させる方法であって、酸化ストレス応答系及び細菌多剤抵抗性系のタンパク質成分及び／又はレギュレーターをコードする核酸に変異を導入することを含む方法にも関する。
【００１９】
本明細書において使用する場合、用語「耐性」又は「抵抗性」は、メタクリル酸エステルの存在下、特にＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの存在下で生存する微生物の能力を指す。一実施形態では、耐性微生物は、したがって、野生型微生物に対して有毒であるメタクリル酸エステルの濃度で維持され得る。例えば、微生物は、野生型微生物と比較して、メタクリル酸ブチルの存在下で少なくとも約２．５時間より長く、好ましくは少なくとも約５時間より長く、より好ましくは少なくとも約１０時間より長く、最も好ましくは少なくとも約２０時間より長く生存及び成長し得る。微生物の生存及び成長は、当技術分野において任意の適切な公知の方法によって決定され得る。好ましくは、微生物の生存及び成長は、微生物の光学密度、より好ましくは約６００ｎｍの波長（ＯＤ６００）で測定した微生物の光学密度を測定することによって決定され得る。例えば、本発明の微生物は、メタクリル酸ブチルの存在下において、野生型微生物と比較して２．５時間より長く、好ましくは少なくとも約５時間より長く、より好ましくは少なくとも約１０時間より長く、最も好ましくは少なくとも約２０時間より長く、少なくとも０．５のＯＤ６００を有し得る。別の例において、０．０１〜０．１から０．１５〜３．０へのＯＤの増加は、生物が成長していることを示す。適切には、ＯＤ６００は、適切な発酵培地において測定される。微生物の光学密度は、使用する発酵培地によって異なる波長で測定され得ることを当業者は認識する。
【００２０】
別の実施形態では、耐性微生物は、野生型微生物の死亡又は成長停止をもたらすメタクリル酸エステルの濃度で成長することができる。
用語「耐性」又は「抵抗性」及び「耐性の」又は「抵抗性の」は、本明細書において互換的に使用される。本明細書に記載のような遺伝子改変生物は、遺伝子改変を含まない野生型微生物と比較してメタクリル酸エステル、特にＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対して増加した「耐性」又は「抵抗性」によって特性決定される。
【００２１】
本発明の態様の一実施形態では、微生物は、液体培地中で約３７℃において成長されたとき、少なくとも１０％ｖ／ｖ〜３０％ｖ／ｖ、例えば１０％ｖ／ｖ、１１％ｖ／ｖ、１２％ｖ／ｖ、１３％ｖ／ｖ、１４％ｖ／ｖ、１５％ｖ／ｖ、１６％ｖ／ｖ、１７％ｖ／ｖ、１８％ｖ／ｖ、１９％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖのＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対して耐性である。このように、様々な実施形態によれば、微生物は、少なくとも１０％ｖ／ｖ〜３０％ｖ／ｖ、例えば１０％ｖ／ｖ、１１％ｖ／ｖ、１２％ｖ／ｖ、１３％ｖ／ｖ、１４％ｖ／ｖ、１５％ｖ／ｖ、１６％ｖ／ｖ、１７％ｖ／ｖ、１８％ｖ／ｖ、１９％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖのＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの濃度のメタクリル酸エステルの存在下で維持することができる。
【００２２】
用語「増加する」、「改善する」若しくは「増進する」又は「増加した」、「改善した」、「増進した」若しくは「増加した」は、本明細書において互換的に使用される。
微生物という用語は、本明細書において使用する場合、原核細胞又は真核細胞を指す。一実施形態では、微生物は、原核細胞である。一実施形態では、微生物は、細菌である。
【００２３】
一実施形態では、改変された微生物は、例えば、排出ポンプ、例えばＡｃｒＡＢ  ＴｏｌＣ排出ポンプ複合体のメンバー又はレギュレーター及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において同定されるＡｒａＣファミリーメンバーを含めた、酸化ストレス応答系及び細菌多剤抵抗性系をレギュレートするか、又はそれらの部分を形成する１つ又はは複数のタンパク質（及びこのようなタンパク質をコードする核酸）において変異を有する。酸化ストレス応答系及び細菌多剤抵抗性系の成分及びレギュレーターは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において特性決定されており、相同複合体は、多くのグラム陰性種を含めた他の生物において見出される。
【００２４】
一実施形態では、微生物は、グラム陰性菌である。一実施形態では、グラム陰性菌は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）ファミリーのものである。
一実施形態では、本発明の範囲内の適切な細菌の例は、エシェリシア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）などのプロテオバクテリアに属する腸内細菌、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属するいわゆるコリネ型細菌及びアリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハイドロゲノバクター属（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾリゾビウム属（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アナプラズマ属（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カリマトバクテリウム属（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コクシエラ属（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、カプリアビダス属（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ガードネレラ属（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ロシャリメア属（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、ロチア属（Ｒｏｔｈｉａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ウォルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）などに属する細菌を含む。
【００２５】
代表的な細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、アナエロビオスピリルム・スクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、アクチノバチルス・スクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、マンヘイミア・スクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、ジモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ストレプトミセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ヒドロゲノバクター・サーモフィルス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、メタノコッカス・ジャンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）及びシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）から選択される種が挙げられる。
【００２６】
好ましくは、細菌は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属である。好ましくは、細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）又はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）である。
【００２７】
代表的な酵母又は真菌としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｔｐｏｃｏｃｃｕｓ）属に属するものなどが挙げられる。代表的な酵母又は真菌種としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から選択されるものなどが挙げられる。
【００２８】
一実施形態では、適切な微生物は、エシェリシア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）及びセラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）から選択される。エシェリシア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）内で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の種を使用することができる。例示的な菌株は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗなどを含む。一実施形態では、微生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば市販及び／又は十分に特性決定された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株、例えばＫ−１２ＭＧ１６５５、ＢＷ２５１１３又はＷ３１１０である。
【００２９】
本明細書において細菌細胞に関する態様及び実施形態は、典型的には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるそれらの命名による遺伝子又はタンパク質を指す一方、別のファミリー又は種の細菌細胞について、好ましくはゲノムにおける遺伝子及び／又は遺伝子座によって発現されるタンパク質の機能を考慮に入れて、典型的には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）配列に対する中程度（典型的には≧３０％）又は高い（典型的には≧５０％）同一性を有する配列を同定することにより、他のファミリー又は種における対応する遺伝子又はタンパク質、例えばホモログ、オルソログ及び／又はパラログを同定することは、当技術分野のレベル内である。下記の表１ａ及びｂは、それぞれの特定の遺伝子がコードするタンパク質の機能、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１１３ゲノムにおけるその遺伝子座及びコード配列の配列番号を示す。野生型核酸及びコードされたタンパク質の配列を本明細書において提供する。
【００３０】
このように、本発明の様々な態様は、他の微生物、好ましくは細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株における変異タンパク質及び核酸配列に及ぶことを当業者は理解する。このように、酸化ストレス応答系及び細菌多剤抵抗性系のレギュレーター及び成分並びに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質及び核酸のホモログであるそのレギュレーターについても参照する。本明細書において使用する場合、核酸配列又はアミノ酸配列のホモログは、野生型核酸配列又はアミノ酸配列に対して少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の全体的配列同一性を有する。
【００３１】
「同一性」は、それらの類似性又は関係を測定する配列の特性である。用語「配列同一性」又は「同一性」は、本開示において使用されるように、それらの２つの配列の長い方における残基の数に関して、（対象の配列を有する本開示のポリペプチドの配列の（相同）アラインメントを受けて）対での同一の残基の百分率を意味する。配列同一性は、同一のアミノ酸残基の数を残基の総数で割り、積を１００で乗じることによって測定される。
【００３２】
用語「相同性」は、本明細書においてその通常の意味で使用され、同一のアミノ酸及び本開示のポリペプチドの直鎖状アミノ酸配列における同等の位置での保存的置換（例えば、アスパルテート残基によるグルタメート残基の交換）であると見なされるアミノ酸を含む。
【００３３】
適切なホモログ又はオルソログは、データベース、例えば当業者に公知のＮＣＢＩ及びＰａｉｎｔアンサンブル及びアラインメントプログラムを使用して、配列比較及び保存ドメインの同定によって同定することができる。配列相同性又は配列同一性の百分率は、例えば、本明細書においてプログラムＢＬＡＳＴＰを使用して決定することができる。
【００３４】
アラインメントは、適切なコンピュータプログラム、例えばＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌを意味するＢＬＡＳＴ２．０又はＣｌｕｓｔａｌＷ又は配列アラインメントを生じさせるのに適した任意の他の適切なプログラムを使用して行うことができる。したがって、野生型核酸配列又はアミノ酸配列は、「対象配列」又は「参照配列」としての役割を果たすことができる一方、変異核酸のアミノ酸配列又は本明細書に記載されている野生型と異なるアミノ酸配列は、「問い合わせ配列」としての役割を果たす。用語「参照配列」及び「野生型配列」は、本明細書において互換的に使用される。
【００３５】
用語「遺伝子改変」又は「遺伝子工学操作」は、微生物のゲノム又は核酸の操作を広範に指す。同様に、用語「遺伝子工学操作された」又は「遺伝子改変された」は、野生型微生物のゲノム又は核酸と異なるゲノム又は核酸を含む微生物を指す。例えば、ゲノム又は核酸は、遺伝子改変の方法、例えば異種遺伝子発現、遺伝子又はプロモーターの挿入又は欠失、核酸変異、変化した遺伝子発現又は不活性化、酵素工学操作、ランダム突然変異誘発方法、遺伝子シャッフリング又はコドン最適化を使用して操作され得る。一実施形態では、「遺伝子工学操作された」又は「遺伝子改変された」微生物は、例えば、野生型微生物と異なるゲノム又は核酸を含む、細菌の単離された菌株を指す。
【００３６】
本発明の目的のために、「変異」又は「遺伝子改変された」微生物は、天然に生じる野生型（ＷＴ）微生物と比較して変化している微生物である。
本明細書において使用する場合、「変異した」は、野生型微生物と比較して、本発明の様々な態様の微生物において改変された核酸又はタンパク質を指す。核酸配列又はアミノ酸配列における変異は、１つ又は複数の残基の欠失、挿入又は置換であり得る。核酸配列における変異は、ミスセンス変異をもたらし、タンパク質における単一のアミノ酸の置換を引き起こし得る。代わりに、核酸配列における変異によって未熟な終止コドンが導入され、短縮されたタンパク質又はそれに続くアミノ酸配列における変化をもたらし得る。ノックアウト変異は、タンパク質の機能を無効にする変異である。
【００３７】
「変異」又は「遺伝子改変」微生物は、それらの自然環境から単離される。一実施形態では、「変異」又は「遺伝子改変」微生物は、自然において見出されない。
本明細書において使用する場合、単語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド」、「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、天然に存在する、変異した、合成のＤＮＡ又はＲＮＡ分子及びヌクレオチド類似体を使用して生じさせたＤＮＡ又はＲＮＡの類似体を含むことを意図する。これは、一本鎖又は二本鎖であり得る。このような核酸又はポリヌクレオチドには、これらに限定されないが、構造遺伝子のコード配列、アンチセンス配列及びｍＲＮＡ又はタンパク質産物をコードしない非コード制御配列が含まれる。これらの用語は、遺伝子も包含する。用語「遺伝子」又は「遺伝子配列」は、広範に使用されて、生物学的機能と関連するＤＮＡ核酸を指す。このように、遺伝子は、ゲノム配列におけるようにイントロン及びエクソンを含み得るか、又はｃＤＮＡにおけるようにコード配列のみを含み得るか、且つ／又は制御配列と組み合わせたｃＤＮＡを含み得る。
【００３８】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、ペプチド結合によって一緒に連結している任意の長さのポリマー形態のアミノ酸を指す。
【００３９】
本発明の目的のために、「トランスジェニック」、「導入遺伝子」又は「組換え」は、例えば、核酸配列、核酸配列を含む発現カセット、遺伝子構築体若しくはベクター又は本明細書に記載されている核酸配列、発現カセット若しくはベクターで形質転換された微生物に関して、本発明の方法において有用なタンパク質をコードする核酸配列がそれらの天然の遺伝子環境に位置していないか、又は組換え方法によって改変されていることを意味する。天然の遺伝子環境は、最初の微生物における天然のゲノム又は染色体の遺伝子座を意味すると理解される。
【００４０】
用語「異種」核酸配列又は遺伝子構築体は、生物において通常見出すことができない遺伝子構築体の核酸配列を示す。
本発明の様々な態様による変異した又は改変された遺伝子における変異は、酸化ストレス応答系及び細菌多剤抵抗性系のタンパク質成分又はレギュレーター及びそのレギュレーター、例えばＡｃｒＡＢ  ＴｏｌＣ排出ポンプ又はタンパク質のＡｒａＣファミリーのメンバーの成分又はレギュレーターをコードする遺伝子において存在し得る。例えば、本発明の様々な態様による変異した又は改変された遺伝子における変異は、転写レギュレーターのＡｒａＣファミリーのタンパク質をコードする遺伝子において存在し得る。特に、変異は、変異ＳｏｘＲタンパク質をもたらすｓｏｘＲ核酸配列、変異ＡｃｒＲタンパク質をもたらすａｃｒＲ核酸配列、変異Ｒｏｂタンパク質をもたらすｒｏｂ核酸配列及び／若しくは変異ＭａｒＲタンパク質をもたらすｍａｒＲ核酸配列又はこれらの組合せにおいて存在し得る。特に、アクリフラビン抵抗性レギュレーター（ａｃｒＲ）の変異体は、特にｍａｒＲ、ｓｏｘＲ又はｒｏｂから選択されるグローバルレギュレーターの１つと合わせたとき、メタクリル酸エステルへの耐性を与えることを本発明者らは示してきた。
酸化還元感受性転写活性化因子（ｓｏｘＲ）
一実施形態では、遺伝子改変微生物は、ｓｏｘＲ核酸配列において変異を含む。このように、遺伝子改変微生物は、野生型ｓｏｘＲ核酸配列と比較して変異ｓｏｘＲ核酸配列を含む。変異ｓｏｘＲ核酸配列は、変異ＳｏｘＲタンパク質をコードする。
【００４１】
ｓｏｘＲは、ＭｅｒＲファミリーのレギュレーターをコードする。酸化ストレスシグナルの非存在下において、ＳｏｘＲホモ二量体は、ｓｏｘＳのプロモーター領域に結合し、転写の増進を防止する。ＳｏｘＲクラスターが酸化されるとき、ＳｏｘＲは、ｓｏｘＳ転写の活性化因子となる。
【００４２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｓｏｘＲ核酸配列を配列番号１において示す。配列番号２において示すように、これは、タンパク質をコードする。１７ｋＤａのＳｏｘＲタンパク質は、１５４個のアミノ酸残基からなり、［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを含有するホモ二量体を形成する。これは、ＤＮＡ結合ドメイン（残基１〜８０）、二量体化ヘリックス（残基８１〜１１８）及びＦｅ−Ｓクラスター結合ドメイン（残基１１９〜１５４）を有する。ＳｏｘＲ活性化は、そのＦｅ−Ｓクラスターの酸化によって媒介され、これは、ｓｏｘＳの転写の増進をもたらす。
【００４３】
一実施形態では、野生型ｓｏｘＲ核酸配列は、配列番号１又はそのホモログを含む。
ｓｏｘＲ核酸配列又はＳｏｘＲアミノ酸配列のホモログは、それぞれ配列番号１及び配列番号２によって表される野生型核酸配列又はアミノ酸配列に対して少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の全体的配列同一性を有する。好ましくは、全体的配列同一性は、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。全体的配列同一性は、当技術分野において公知のグローバルアラインメントアルゴリズム、例えばプログラムＧＡＰ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ）におけるＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して決定される。
【００４４】
一実施形態では、ＳｏｘＲにおける変異は、酸化及び／又はＤＮＡ結合を促進し、これは、ＳｏｘＳを含めたＳｏｘＲレギュロンの転写を結果的に増加させる。
一実施形態では、微生物は、ＤＮＡ結合ドメイン（残基１〜８０）又はＦＥ−Ｓクラスタードメイン（残基１１９〜１５４）において変異を有する変異ＳｏｘＲタンパク質をコードする変異ｓｏｘＲ核酸配列を含む。
【００４５】
一実施形態では、ＳｏｘＲタンパク質における変異は、下記：配列番号２に関連して、別のアミノ酸によるＲ２０の置換、別のアミノ酸によるＲ２０の置換、残基１４６の欠失（核酸残基４３５、４３６、４３７の欠失）又は残基１３９におけるトランケーションの１つから選択される。一実施形態では、Ｒ２０の置換は、Ｈによるものである。一実施形態では、Ｒ２０の置換は、Ｌによるものである。また、本発明の範囲内であるのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）以外の微生物におけるＳｏｘＲのホモログにおける同等の位置での改変である。
【００４６】
一実施形態では、変異は、ノックアウト変異ではない。一実施形態では、変異は、機能獲得型変異である。変化したタンパク質は、メタクリル酸エステルへの耐性を与えることができる。
アクリフラビン抵抗性レギュレーター（ａｃｒＲ）
一実施形態では、遺伝子改変微生物は、ａｃｒＲ核酸配列において変異を含む。このように、遺伝子改変微生物は、野生型ａｃｒＲ配列と比較して変異ａｃｒＲ核酸配列を含む。変異ａｃｒＲ核酸配列は、変異ＡｃｒＲタンパク質をコードする。
【００４７】
ＡｃｒＲは、ＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣ多剤排出ポンプと関連するａｃｒＲＡＢ遺伝子の発現をレギュレートする。ＡｃｒＲホモ二量体は、そのオペレーター領域への結合によってａｃｒＡＢオペロンに対するリプレッサーとして作用し、活性化因子分子がそのＣ末端リガンド結合ドメインに結合するときに放出され、これによりａｃｒＡＢの転写が可能となる。ａｃｒＡＢオペロンは、ＡｃｒＡ及びＡｃｒＢをコードし、これは、ＴｏｌＣと連携し、主要な多剤排出ポンプ複合体であるＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣを形成させる。
【００４８】
ＡｃｒＲは、転写レギュレーターのＴｅｔＲファミリーのメンバーと同様の完全にらせん構造を有する二量体の２ドメイン分子である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、ａｃｒＲ遺伝子は、Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメイン（残基７〜５１）及びＣ末端リガンド結合ドメイン（残基５５〜２０４）を含有する、２１５個のアミノ酸のＡｃｒＲタンパク質をコードする。
【００４９】
一実施形態では、野生型ａｃｒＲ核酸配列は、配列番号３又は配列番号４をコードするそのホモログを含む。
ａｃｒＲ核酸配列又はＡｃｒＲアミノ酸配列のホモログは、それぞれ配列番号３及び配列番号４によって表される野生型核酸配列又はアミノ酸配列に対して少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の全体的配列同一性を有する。好ましくは、全体的配列同一性は、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。全体的配列同一性は、当技術分野において公知のグローバルアラインメントアルゴリズム、例えばプログラムＧＡＰ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ）におけるＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して決定される。
【００５０】
一実施形態では、微生物は、ＤＮＡ結合ドメイン（残基７〜５１）又はリガンド結合ドメイン（残基５５〜２０４）において変異を有する変異ＡｃｒＲタンパク質をコードする変異ａｃｒＲ核酸配列を含む。
【００５１】
一実施形態では、ＡｃｒＲにおける変異は、下記：配列番号４に関連して、別のアミノ酸によるＶ２９の置換、Ｙ４９におけるフレームシフト変異、Ａ１９１におけるフレームシフト変異又はＴ３２におけるフレームシフト変異の１つから選択される。一実施形態では、Ｖ２９の置換は、Ｇによるものである。また、本発明の範囲内であるのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）以外の微生物におけるＡｃｒＲのホモログにおける同等の位置での改変である。
【００５２】
一実施形態では、変異は、ノックアウト変異ではない。一実施形態では、変異は機能獲得型変異であり、すなわち野生型と比較して変化した機能を有する機能タンパク質が産生される。変化したタンパク質は、メタクリル酸エステルへの耐性を与えることができる。
右起点結合（ｒｏｂ）
一実施形態では、遺伝子改変微生物は、ｒｏｂ核酸配列において変異を含む。このように、遺伝子改変微生物は、野生型ｒｏｂ配列と比較して変異ｒｏｂ核酸配列を含む。変異ｒｏｂ核酸配列は、変異Ｒｏｂタンパク質をコードする。
【００５３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＲｏｂタンパク質は、Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメイン（残基１〜１２０）及びＣ末端ドメイン（残基１２１〜１８９）を有する２８９個のアミノ酸からなる。Ｃ末端ドメインは、Ｌｏｎプロテアーゼによるその分解及びその活性化−非活性化機序を防止するために必須であると考えられる。
【００５４】
一実施形態では、野生型ｒｏｂ核酸配列は、配列番号５又は配列番号６を有するタンパク質をコードするそのホモログを含む。
ｒｏｂ核酸配列又はＲｏｂアミノ酸配列のホモログは、それぞれ配列番号５及び配列番号６によって表される野生型核酸配列又はアミノ酸配列に対して少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の全体的配列同一性を有する。好ましくは、全体的配列同一性は、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。全体的配列同一性は、当技術分野において公知のグローバルアラインメントアルゴリズム、例えばプログラムＧＡＰ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ）におけるＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して決定される。
【００５５】
ＢＭＡ耐性菌株において見出される変異は、ＲｏｂのＤＮＡ結合部位から遠位のアミノ酸残基７０及び１５６におけるアミノ酸置換をもたらしたが、自己収納又は活性化因子についての特異性に関与しているタンパク質間相互作用に影響を与え得る。このような変異は、遊離／活性Ｒｏｂの量を増加させるか、又はＢＭＡに対するＲｏｂの親和性を増加させ、活性化を許容するか、又はＢＭＡによる活性化を増加させる。次いで、Ｒｏｂの活性の増加は、ＢＭＡに対する耐性を得ることにおいて補助することができるその調節制御下で多剤抵抗性遺伝子の発現の増加をもたらす。
【００５６】
一実施形態では、微生物は、Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメイン（残基１〜１２０）及びＣ末端ドメイン（残基１２１〜１８９）において変異を有する変異Ｒｏｂタンパク質をコードする変異ｒｏｂ核酸配列を含む。
【００５７】
一実施形態では、Ｒｏｂにおける変異は、下記：配列番号６に関連して、Ｒｏｂにおける、別のアミノ酸によるＡ７０の置換又はＲ１５６の置換の１つから選択される。一実施形態では、Ａ７０の置換は、Ｖ又はＴによるものである。一実施形態では、Ｒ１５６の置換は、Ｈによるものである。また、本発明の範囲内であるのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）以外の微生物におけるＲｏｂのホモログにおける同等の位置での改変である。
多剤抗生物質抵抗性タンパク質（ｍａｒＲ）
一実施形態では、遺伝子改変微生物は、ｍａｒＲ核酸配列における変異を含む。このように、遺伝子改変微生物は、野生型ｍａｒＲ配列と比較して変異ｍａｒＲ核酸配列を含む。変異ｍａｒＲ核酸配列は、変異ＭａｒＲタンパク質をコードする。
【００５８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、ｍａｒＲ遺伝子のタンパク質産物であるＭａｒＲは、１４４個のアミノ酸残基からなり、Ｎ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、ＤＮＡ結合部位（残基５５〜１００）及びサリチレート結合部位（残基７０〜８６）を含有する。ＭａｒＲは、ホモ二量体として、そのプロモーター領域への結合により、ｍａｒＡＢオペロンに対するリプレッサーとして作用する。そのＤＮＡ結合／リプレッサー活性は、ｍａｒＡ、ｍａｒＢ及びｍａｒＲの転写を可能とする小分子、例えばサリチレート、プルンバギン、２，４−ジニトロフェノール及びメナジオンの存在及び結合によって抑制される。
【００５９】
一実施形態では、野生型ｍａｒＲ核酸配列は、配列番号７又は配列番号８を有するタンパク質をコードするそのホモログを含む。
ｍａｒＲ核酸配列又はＭａｒＲアミノ酸配列のホモログは、それぞれ配列番号７及び配列番号８によって表される野生型核酸配列又はアミノ酸配列に対して少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の全体的配列同一性を有する。好ましくは、全体的配列同一性は、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。全体的配列同一性は、当技術分野において公知のグローバルアラインメントアルゴリズム、例えばプログラムＧＡＰ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ）におけるＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して決定される。
【００６０】
一実施形態では、微生物は、ＤＮＡ結合及びサリチレート結合ドメイン（残基５５〜１００）において変異を有する変異ＭａｒＲタンパク質をコードする変異ｍａｒＲ核酸配列を含む。例えば、変異は、ＤＮＡ結合親和性の低減及び／又は活性化因子としてのＢＭＡに対する親和性の増進をもたらし得る。
【００６１】
一実施形態では、ＭａｒＲにおける変異は、配列番号８に関連して、別のアミノ酸によるＶ８４の置換である。一実施形態では、Ｖ８４の置換は、Ｇによるものである。また、本発明の範囲内であるのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）以外の微生物におけるＭａｒＲのホモログにおける同等の位置での改変である。
【００６２】
一実施形態では、微生物は、変異ＡｃｒＲタンパク質、例えばｓｏｘＲ、ｒｏｂ又はｍａｒＲのいずれか１つの核酸配列における変異と組み合わせたＤＮＡ結合ドメイン（残基７〜５１）又はリガンド結合ドメイン（残基５５〜２０４）における変異を有するタンパク質をコードするａｃｒＲ核酸配列において変異を有する。例えば、微生物は、ａｃｒＲ及びｓｏｘＲ；ａｃｒＲ及びｒｏｂ又はａｃｒＲ及びｍａｒＲ核酸配列において変異を含み得る。すなわち、他の遺伝子におけるさらなる変異は、存在しても又は存在しなくてもよい。
【００６３】
一実施形態では、微生物は、下記のいずれかから選択されるｓｏｘＲにおける変異：配列番号２に関連して、別のアミノ酸によるＲ２０の置換、別のアミノ酸によるＲ２０の置換、残基１４６の欠失（核酸残基４３５、４３６、４３７の欠失）又は残基１３９におけるトランケーションと組み合わせた、配列番号４に関連して、別のアミノ酸によるＶ２９の置換、Ｙ４９におけるフレームシフト変異、Ａ１９１におけるフレームシフト変異又はＴ３２におけるフレームシフト変異の１つを含むＤＮＡ結合ドメイン（残基７〜５１）又はリガンド結合ドメイン（残基５５〜２０４）において変異を有する変異ＡｃｒＲタンパク質をコードするａｃｒＲ核酸配列において変異を含み得る。一実施形態では、Ｒ２０の置換は、Ｈによるものである。一実施形態では、Ｒ２０の置換は、Ｌによるものである。例えば、微生物は、変異の下記の組合せの１つを含む核酸配列を含み得る。
・ａｃｒＲ（Ｖ２９）及びＳｏｘＲ（Ｒ２０Ｌ）
・ａｃｒＲ（Ｙ４９ｆｓ）及びＳｏｘＲ（Ｒ２０Ｌ）
・ａｃｒＲ（Ａ１９１ｆｓ）及びＳｏｘＲ（Ｒ２０Ｌ）
・ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）及びＳｏｘＲ（Ｒ２０Ｌ）
・ａｃｒＲ（Ｖ２９）及びＳｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）
・ａｃｒＲ（Ｙ４９ｆｓ）及びＳｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）
・ａｃｒＲ（Ａ１９１ｆｓ）及びＳｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）
・ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）及びＳｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）
・ａｃｒＲ（Ｖ２９）及びＳｏｘＲ（１４６ｄｅｌ）
・ａｃｒＲ（Ｙ４９ｆｓ）及びＳｏｘＲ（１４６ｄｅｌ）
・ａｃｒＲ（Ａ１９１ｆｓ）及びＳｏｘＲ（１４６ｄｅｌ）
・ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）及びＳｏｘＲ（１４６ｄｅｌ）
・ａｃｒＲ（Ｖ２９）及びＳｏｘＲ（Ｌｅｕ１３９Ｘ）
・ａｃｒＲ（Ｙ４９ｆｓ）及びＳｏｘＲ（Ｌｅｕ１３９Ｘ）
・ａｃｒＲ（Ａ１９１ｆｓ）及びＳｏｘＲ（Ｌｅｕ１３９Ｘ）
・ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）及びＳｏｘＲ（Ｌｅｕ１３９Ｘ）
一実施形態では、微生物は、配列番号８に関連して、別のアミノ酸によるＶ８４の置換から選択されるｍａｒＲにおける変異と組み合わせた、配列番号４に関連して、別のアミノ酸によるＶ２９の置換、Ｙ４９におけるフレームシフト変異、Ａ１９１におけるフレームシフト変異又はＴ３２におけるフレームシフト変異の１つを含むＤＮＡ結合ドメイン（残基７〜５１）又はリガンド結合ドメイン（残基５５〜２０４）において変異を有する変異ＡｃｒＲタンパク質をコードするａｃｒＲ核酸配列において変異を含み得る。一実施形態では、Ｖ８４の置換は、Ｇによるものである。例えば、微生物は、変異の下記の組合せの１つを含む核酸配列を含み得る。
・ａｃｒＲ（Ｖ２９）及びｍａｒＲ（Ｖ８４Ｇ）・ａｃｒＲ（Ｙ４９ｆｓ）及びｍａｒＲ（Ｖ８４Ｇ）
・ａｃｒＲ（Ａ１９１ｆｓ）及びｍａｒＲ（Ｖ８４Ｇ）
・ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）及びｍａｒＲ（Ｖ８４Ｇ）
一実施形態では、微生物は、下記のいずれかの１つから選択されるｒｏｂにおける変異：配列番号６に関連して、Ｒｏｂにおける、別のアミノ酸によるＡ７０の置換又はＲ１５６の置換と組み合わせた、配列番号４に関連して、別のアミノ酸によるＶ２９の置換、Ｙ４９におけるフレームシフト変異、Ａ１９１におけるフレームシフト変異又はＴ３２におけるフレームシフト変異の１つを含むＤＮＡ結合ドメイン（残基７〜５１）又はリガンド結合ドメイン（残基５５〜２０４）において変異を有する変異ＡｃｒＲタンパク質をコードするａｃｒＲ核酸配列において変異を含み得る。一実施形態では、Ａ７０の置換は、Ｖ又はＴによるものである。一実施形態では、Ｒ１５６の置換は、Ｈによるものである。例えば、微生物は、変異の下記の組合せの１つを含む核酸配列を含み得る。
・ａｃｒＲ（Ｖ２９）及びｒｏｂ（１５６Ｈ）
・ａｃｒＲ（Ｙ４９ｆｓ）及びｒｏｂ（１５６Ｈ）
・ａｃｒＲ（Ａ１９１ｆｓ）及びｒｏｂ（１５６Ｈ）
・ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）及びｒｏｂ（１５６Ｈ）
・ａｃｒＲ（Ｖ２９）及びｒｏｂ（Ａ７０Ｔ）
・ａｃｒＲ（Ｙ４９ｆｓ）及びｒｏｂ（Ａ７０Ｔ）
・ａｃｒＲ（Ａ１９１ｆｓ）及びｒｏｂ（Ａ７０Ｔ）
・ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）及びｒｏｂ（Ａ７０Ｔ）
・ａｃｒＲ（Ｖ２９）及びｒｏｂ（Ａ７０Ｖ）
・ａｃｒＲ（Ｙ４９ｆｓ）及びｒｏｂ（Ａ７０Ｖ）
・ａｃｒＲ（Ａ１９１ｆｓ）及びｒｏｂ（Ａ７０Ｖ）
・ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）及びｒｏｂ（Ａ７０Ｖ）
上記の実施形態について、特定の変異が参照される。本明細書において説明するように、これらは、記述した遺伝子／タンパク質の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質配列における位置を指す（タンパク質配列についてそれぞれ配列番号２、４、６及び８を参照されたい）。
【００６４】
一実施形態では、微生物は、上記の変異核酸配列の２つ以上の組合せを含み得る。例えば、微生物は、ｓｏｘＲ、ｒｏｂ、ａｃｒＲ及びｍａｒＲ核酸配列又はそのホモログから選択される少なくとも２つの核酸配列において変異を有し得る。このように、微生物は、ｓｏｘＲ及びｒｏｂ核酸配列、ｓｏｘＲ及びａｃｒＲ核酸配列、ｓｏｘＲ及びｍａｒＲ核酸配列、ｒｏｂ及びａｃｒＲ核酸配列、ｒｏｂ及びｍａｒＲ核酸配列又はａｃｒＲ及びｍａｒＲ核酸配列又はそのホモログにおいて変異を含み得る。
【００６５】
別の実施形態では、微生物は、ｓｏｘＲ、ｒｏｂ、ａｃｒＲ及びｍａｒＲ核酸配列又はそのホモログから選択される少なくとも３つの核酸配列において変異を含み得る。このように、微生物は、ｓｏｘＲ、ａｃｒＲ及びｒｏｂ核酸配列又はそのホモログにおいて変異を含み得る。このように、微生物は、ｓｏｘＲ、ａｃｒＲ及びｍａｒＲ核酸配列又はそのホモログにおいて変異を含み得る。このように、微生物は、ｒｏｂ、ａｃｒＲ及びｍａｒＲ核酸配列又はそのホモログにおいて変異を含み得る。
【００６６】
別の実施形態では、微生物は、ｓｏｘＲ、ｒｏｂ、ａｃｒＲ及びｍａｒＲ核酸配列又はそのホモログから選択される４つの核酸配列において変異を含み得る。
一実施形態では、微生物は、表１ａにおいて示したものから選択される１つ又は複数の遺伝子変異を含み得る。
【００６７】
【表１】
2021525085.tif 000003
【００６８】
【表２】
2021525085.tif 000004
一実施形態では、微生物は、例えば、酸化ストレス応答系又は多剤抵抗性系のタンパク質成分をコードする遺伝子において１つ又は複数のさらなる変異も含む。一実施形態では、変異は、ｒｐｏ核酸配列、例えばｒｐｏＢ（配列番号２５）又はｒｐｏＣ（配列番号２７）、ｏｍｐＲ（配列番号２９）、ａｃｒＢ（配列番号９）、ｙｏｈＪ（配列番号１１）、ｔｏｒＹ（配列番号１３）、ｉｐｘＭ（配列番号１５）、ｄｎａＫ（配列番号１７）、ｇｒｏｌ（配列番号１９）、ｉｌｖＮ（配列番号２１）、ｐｈｏｐ（配列番号３１）、ｙｇｂＫ（配列番号２３）又はそのホモログ中にある。別の実施形態では、酸化ストレス応答系又は多剤抵抗性系のタンパク質成分又はレギュレーターのさらなる改変は存在しない。
【００６９】
一実施形態では、１つ又は複数のさらなる変異は、表１ｂにおいて列挙する遺伝子変異から選択される。
【００７０】
【表３】
2021525085.tif 000005
【００７１】
【表４】
2021525085.tif 000006
【００７２】
【表５】
2021525085.tif 000007
【００７３】
【表６】
2021525085.tif 000008
一実施形態では、微生物は、下記で列挙するような１つ又は複数の遺伝子変異を有する微生物から選択される：
−  ｒｏｂ（Ｒ１５６Ｈ）ｒｐｏＣ（Ｌ３６１Ｒ）ｉｌｖＮ（Ｃ４１Ｙ）ｙｇｂＫ（Ａ２９４Ｅ）ｌｐｘＭ（１６８＿１８５ｄｅｌ）；
−  ｒｏｂ（Ｒ１５６Ｈ）ｉｌｖＮ（Ｃ４１Ｙ）ｐｈｏＰ（Ｌ１１Ｆ）ａｃｒＢ（Ｖ４４８Ｌ）；
−  ｓｏｘＲ（Ｌｅｕ１３９Ｘ）５８０１１６（Ｇ＞Ｔ）；
−  ｓｓｏｘＲ（Ａ１４６ｄｅｌ））；
−  ｒｏｂ（Ａ７０Ｖ）；
−  ｒｏｂ（Ｒ１５６Ｈ）ｒｐｏＢ（Ｔ１０３７Ｐ）ｔｏｒＹ（Ａ８７Ｔ）ａｃｒＲ（４９Ｙｆｓ）；
−  ｒｏｂ（Ａ７０Ｔ）ｙｏｈＪ（Ｌ１０９Ｒ）ｄｎａＫ（Ｖ３７７Ｇ）９２７７７７（Ｃ＞Ｔ）ａｃｒＲ（Ａ１９１ｆｓ）；
−  ｍａｒＲ（Ｖ８４Ｇ）ｒｐｏＣ（Ｒ１０７５Ｃ）ｏｍｐＲ（Ｒ１５Ｓ）ａｃｒＢ（Ｔ３７９Ｉ）；
−  ｍａｒＲ（Ｖ８４Ｇ）ｒｐｏＣ（Ｒ１０７５Ｃ）ｏｍｐＲ（Ｒ１５Ｓ）；
−  ｍａｒＲ（Ｖ８４Ｇ）ｒｐｏＣ（Ｒ１０７５Ｃ）ｒｐｏＣ（Ａ７８７Ｖ）ｏｍｐＲ（Ｒ１５Ｓ）ａｃｒＢ（Ｖ９０１ｌ）；
−  ｒｏｂ（Ｒ１５６Ｈ）ｒｐｏＢ（Ｔ１０３７Ｐ）ｇｒｏＬ（Ｐ２７９Ｌ）ａｃｒＲ（４９Ｙｆｓ）１１９７６５９（Ｃ＞Ａ）、又は
−  ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｌ）ｒｐｏＣ（ｒ１０７５Ｃ）２１３３２３６（Ｔ＞Ａ）３９１５９１５（Ｔ＞Ｇ）。
【００７４】
本明細書において説明するように、上記で示した変異を野生型生物中に導入し、メタクリル酸エステルへの抵抗性を与えることができる。本明細書に記載されている核酸は、１つ又は複数のヌクレオチドの挿入、置換又は欠失によって変異し得る。
【００７５】
標的遺伝子の不活性化又はノックアウトを含めた操作のための技術は、当技術分野において周知である。これらの技術は、目的の遺伝子を標的とし、且つ特定の部位における導入遺伝子の組込みを可能とするベクターを使用した遺伝子標的を含む。標的化構築体は、工学操作されて、標的遺伝子と組み換えられるが、これは、遺伝子自体からの配列を構築体に組み込むことによって達成される。次いで、組換えが遺伝子内のその配列の領域において起こり、遺伝子を攪乱させる外来性配列の挿入をもたらす。その配列が中断されて、翻訳されるようなことがあれば、変化した遺伝子は、非機能タンパク質に翻訳される。他の技術は、下記のようなゲノム編集（標的化ゲノム工学操作）を含む。変異は、微生物を突然変異原に曝露させることによって導入することもできる。突然変異原は、高速中性子照射又は例えば下記の非限定的なリスト：メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、メチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、トリエチルメラミン（１’ＥＭ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）、プロカルバジン、クロランブシル、シクロホスファミド、硫酸ジエチル、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、ニトロソグアニジン、２−アミノプリン、７，１２ジメチル−ベンゾ（ａ）アントラセン（ＤＭＢＡ）、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホルアミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン（ＤＥＯ）、ジエポキシブタン（ＢＥＢ）など）、２−メトキシ−６−クロロ−９［３−（エチル−２−クロロエチル）アミノプロピルアミノ］アクリジン二塩酸塩（ＩＣＲ−１７０）若しくはホルムアルデヒドから選択される化学的突然変異原であり得る。
【００７６】
近年、ゲノム編集技術は、通常の突然変異誘発方法（例えば、物理的及び化学的突然変異誘発）又は農業において重要である改善された表現型を有する変異植物を生じさせるための植物における導入遺伝子の発現を使用した方法に対する代替方法として登場してきた。これらの技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＲＮＡガイドヌクレアーゼＣａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）を含めた配列特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）を用い、これらは標的化ＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせ、これは、次いで、エラーを起こしやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は高忠実度の相同組換え（ＨＲ）によって主に修復される。標的化ゲノム改変又は標的化ゲノム編集は、標的化ＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を使用して、相同組換え（ＨＲ）が媒介する組換え事象を通してゲノム編集を刺激するゲノム工学操作技術である。部位特異的ＤＮＡ  ＤＳＢの導入によって効率的なゲノム編集を達成するために、４つの主要なクラスのカスタマイズ可能なＤＮＡ結合タンパク質を使用することができる：微生物の可動遺伝因子に由来するメガヌクレアーゼ、真核生物の転写因子をベースとするＺＦヌクレアーゼ、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）細菌からの転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）及びＩＩ型細菌適応免疫系ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復）からのＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼＣａｓ９。メガヌクレアーゼ、ＺＦ及びＴＡＬＥタンパク質は、全てタンパク質−ＤＮＡ相互作用を通して特定のＤＮＡ配列を認識する。メガヌクレアーゼは、そのヌクレアーゼ及びＤＮＡ結合ドメインを組み込むが、ＺＦ及びＴＡＬＥタンパク質は、それぞれＤＮＡの３又は１ヌクレオチド（ｎｔ）を標的化する個々のモジュールからなる。ＺＦ及びＴＡＬＥは、所望の組合せでアセンブルされ、Ｆｏｋｌのヌクレアーゼドメインに付着して、核酸分解活性を特定のゲノム遺伝子座に向けて方向付け得る。細菌のＩＩＩ型分泌系を介した宿主細胞への送達により、ＴＡＬエフェクターは細胞核に入り、宿主遺伝子プロモーターにおけるエフェクター特異的配列に結合し、転写を活性化する。それらの標的化特異性は、タンデムの３３〜３５個のアミノ酸反復の中央ドメインによって決定される。これに、２０個のアミノ酸の単一の短縮された反復が続く。検査した天然に生じるＴＡＬエフェクターの大部分は、１２〜２７の完全反復を有する。
【００７７】
これらの反復は、２個の隣接するアミノ酸であるそれらの反復可変２残基（ＲＶＤ）によってのみ互いに異なる。ＲＶＤは、いずれの単一のヌクレオチドをＴＡＬエフェクターが認識するかを決定する：１つのＲＶＤは、１つのヌクレオチドに対応し、４つの最も一般のＲＶＤは、それぞれ４つの塩基の１つと優先的に関連する。天然に生じる認識部位は、ＴＡＬエフェクター活性のために必要とされるＴによって一律に先行される。ＴＡＬエフェクターは、Ｆｏｋｌヌクレアーゼの触媒ドメインに融合して、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を生じさせ、これは、ゲノム編集のためのｉｎ  ｖｉｖｏでの標的化ＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることができる。ゲノム編集におけるこの技術の使用は、例えば、米国特許第８，４４０，４３１号明細書、米国特許第８，４４０，４３２号明細書及び米国特許第８，４５０，４７１号明細書において当技術分野で十分に説明されている。カスタマイズされたプラスミドは、ゴールデンゲートクローニング方法と共に使用して、複数のＤＮＡフラグメントをアセンブルすることができる。ゴールデンゲート方法は、それらの認識部位外で切断され、独特の４ｂｐのオーバーハングを生じさせるＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼを使用する。正しいアセンブリーは、酵素認識部位を除去するため、クローニングは、同じ反応混合物中の消化及び連結によって促進される。カスタムＴＡＬＥＮ又はＴＡＬエフェクター構築体のアセンブリーは、２つのステップが関与する：（ｉ）１〜１０反復の中間アレイへの反復モジュールのアセンブリー、及び（ｉｉ）骨格中へ中間アレイが結合して、最終的な構築体が生じる。
【００７８】
本発明の様々な態様によって使用することができる別のゲノム編集方法は、ＣＲＩＳＰＲである。ゲノム編集におけるこの技術の使用は、例えば、米国特許第８，６９７，３５９号明細書及び本明細書において引用した参照文献において当技術分野で十分に説明されている。手短に言えば、ＣＲＩＳＰＲは、侵入するファージ及びプラスミドに対する防御に関与する微生物ヌクレアーゼ系である。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子及びＣＲＩＳＰＲが媒介する核酸切断の特異性をプログラム化することができる非コードＲＮＡ要素（ｓｇＲＮＡ）の組合せを含有する。３タイプ（Ｉ〜ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲ系が広範囲の細菌宿主に亘り同定されてきた。それぞれのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の１つの重要な特徴は、非反復配列（スペーサー）の短いストレッチによって間を置かれた反復配列（直接反復）のアレイの存在である。非コードＣＲＩＳＰＲアレイは、直接反復内で個々のスペーサー配列を含有する短いｃｒＲＮＡに転写及び切断され、これは、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位（プロトスペーサー）に方向付ける。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最も十分に特性決定されている系の１つであり、４つの逐次ステップにおいて標的化ＤＮＡ二重鎖切断を実行する。最初に、２つの非コードＲＮＡであるプレｃｒＲＮＡアレイ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡの反復領域とハイブリッド形成し、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプレｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的認識のためのさらに必要とされるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を介してＣａｓ９を標的ＤＮＡに方向付ける。最終的に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの切断を媒介し、プロトスペーサー内に二本鎖切断を生じさせる。
【００７９】
このように、Ｃａｓ９は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のホールマークタンパク質であり、且つ２つの非コードＲＮＡ：ＣＲＩＰＳＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の複合体により、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列モチーフに隣接するＤＮＡ標的配列にガイドされる大きいモノマーＤＮＡヌクレアーゼである。Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ及びＨＮＨヌクレアーゼと相同な２つのヌクレアーゼドメインを含有する。ＨＮＨヌクレアーゼドメインは、相補的ＤＮＡ鎖を切断する一方、ＲｕｖＣ様ドメインは、非相補的鎖を切断し、その結果、平滑切断が標的ＤＮＡ中に導入される。ｓｇＲＮＡと一緒のＣａｓ９の異種発現は、部位特異的二重鎖切断（ＤＳＢ）を様々な生物からの生細胞のゲノムＤＮＡに導入することができる。真核生物における適用のために、元来、細菌ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９のコドンを最適化したバージョンが使用されてきた。
【００８０】
単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の第２の成分である。ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡと融合させることによって生じさせた合成ＲＮＡキメラである。その５’末端に位置しているｓｇＲＮＡガイド配列は、ＤＮＡ標的特異性を与える。したがって、ガイド配列を改変することにより、異なる標的特異性を有するｓｇＲＮＡを生じさせることが可能である。ガイド配列の標準長さは、典型的には２０ｂｐである。
【００８１】
代わりに、グローバル転写機械工学操作（ｇＴＭＥ）は、菌株改善のための代替で有用なアプローチを提供することができる。
一実施形態では、変異体は、ＢＭＡによる選択圧を加えることにより、微生物の集団からの抵抗性変異体の選択によって単離される。微生物の集団は、自発的に生じる変異体を低頻度（１０６で＜１）で含有することが公知であり、選択圧を加えることは、最も適した変異体の過成長をもたらす。例えば、選択圧は、ＢＭＡの濃度を徐々に増加させることにより、又は最初から高濃度（１０〜３０％）のＢＭＡを加えることにより加えられる。選択圧は、（ａ）成長が観察されるまでのバッチ培養；（ｂ）２回以上の移動のための逐次バッチ培養；（ｃ）増加する濃度のＢＭＡ及び増加する希釈率を伴うケモスタット培養物中での成長；（ｄ）増加する濃度のＢＭＡを伴うｐＨ−オーキソスタット又はタービドスタット培養物中での成長を含むことができる。
Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル
用語Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルは、その構造異性体を含めたＣ３〜Ｃ１２アルキル、ヒドロキシアルキル、アルケニル、アルキルアリール又はアルケニルアリール基を含むメタクリル酸エステルを一般に意味する。Ｃ３〜Ｃ１２基は、環状、非環状又は部分環状、直鎖状又は分岐状の脂肪族、芳香族又は部分芳香族／脂肪族であり得る。好ましくは、本発明のＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルは、例えば、メタクリル酸ｎ−プロピル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸ｔ−ブチル、メタクリル酸イソペンチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸デシル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ヒドロキシプロピル、メタクリル酸イソボルニル、メタクリル酸アリル又はメタクリル酸シンナミルを含み得る。
【００８２】
好ましくは、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルは、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸アルキル、より好ましくはＣ３〜Ｃ８メタクリル酸アルキル、例えばメタクリル酸ｎ−プロピル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸イソペンチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸ヘプチル、メタクリル酸オクチル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸デシル又はメタクリル酸ドデシルである。
【００８３】
好ましくは、メタクリル酸ヒドロキシアルキルは、メタクリル酸ヒドロキシエチル又はメタクリル酸ヒドロキシプロピルである。
実施形態では、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルは、Ｃ３〜Ｃ１２アルケニルアリールメタクリレート、例えばメタクリル酸シンナミルである。
【００８４】
Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸アルキルは、より好ましくは、Ｃ３〜Ｃ６メタクリル酸アルキル、例えばその構造異性体を含めたメタクリル酸プロピル、メタクリル酸ブチル又はメタクリル酸ヘキシルである。より好ましくは、Ｃ３〜Ｃ６メタクリル酸アルキルは、メタクリル酸プロピル又はメタクリル酸ブチル、特にメタクリル酸イソプロピル又はメタクリル酸ｎ−ブチルである。
【００８５】
一実施形態では、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルは、メタクリル酸ブチル（ＢＭＡ）である。
ＭＭＡの産生のために、本明細書に記載の方法は、ｃ）発酵培地からＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを取り出し、且つ取り出されたＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルをメタノールでエステル交換してメタクリル酸メチルを産生させるさらなるステップを含み得る。
【００８６】
本発明の態様及び実施形態では、微生物を遺伝子改変して、野生型より多くのＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを産生させ得る。このように、微生物は、本明細書に記載のような野生型と比較してメタクリル酸エステルに対して微生物をより耐性なものとし、且つ野生型と比較してＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの産生を増加するように改変されている変異を有し、例えば、微生物は、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル生合成経路の酵素を発現するトランスジェニック構築体を担持する。
【００８７】
このように、本明細書に記載のようなメタクリル酸エステルの産生の方法は、ａ）発酵培地中において、野生型と比較してＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対して増加した耐性を有し、且つ野生型と比較してＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの産生を増加させるようにさらに改変されている遺伝子改変微生物を提供することと、ｂ）Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルが産生される条件下で微生物を成長させることとを含み得る。
【００８８】
野生型微生物と比較してＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの産生を増進することは、当技術分野で公知の様々な遺伝子工学的技術の使用により、既存の細胞代謝プロセス、核酸及び／又はタンパク質に対して改変を行うことを含み得る。Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの産生を増進することは、微生物中で１つ以上の異種遺伝子を発現するように微生物を改変することも含み得る。これらは、炭素ベースの原料からのＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対する所望の経路の酵素をコードする遺伝子を含み得るか、又はこのような経路において直接的若しくは間接的のいずれかで酵素の機能及び発現を促すために作用する他の補助的遺伝子を含み得る。したがって、一実施形態では、微生物を改変して、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの産生を増進し得る。Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル、好ましくはＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸アルキルを産生するように改変された微生物内で発現し得る１つ又は複数の遺伝子は、下記の酵素のいずれかをコードするものを含む。異種遺伝子は、微生物を、異種遺伝子を含むベクターで形質転換することによって発現し得る。
【００８９】
実施形態において、微生物は、イソブチリル−ＣｏＡをメタクリリル−ＣｏＡに変換し得る１つ以上の酵素、例えばオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ又はオキシドレダクターゼを発現し得る。
【００９０】
オキシダーゼは、ＥＣ番号ＥＣ１．３．ｘ．ｘ下の、ＣＨ−ＣＨ結合上で作用するオキシダーゼ、より好ましくはＥＣ番号ＥＣ１．３．３．ｘ下の、電子受容体として酸素を使用してＣＨ−ＣＨ結合上で作用するオキシダーゼであり得る。さらにより好ましくは、オキシダーゼは、適切にはＥＣ番号ＥＣ１．３．３．６下のアシル−ＣｏＡオキシダーゼである。より好ましくは、アシル−ＣｏＡオキシダーゼは、次の酵素のいずれか：アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡＣＸ４、アルスロバクター・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）由来の短鎖アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、ビグナ・ラジアタ（Ｖｉｇｎａ  ｒａｄｉａｔａ）由来のペルオキシソームアシル−ＣｏＡオキシダーゼ、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種由来のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ及びカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）由来のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ４から選択される。最も好ましくは、アシル−ＣｏＡオキシダーゼは、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡＣＸ４である。
【００９１】
オキシドレダクターゼは、ＥＣ群番号１．Ｘ．Ｘ．Ｘの下のオキシドレダクターゼであり得る。好ましくは、オキシドレダクターゼは、適切にはＥＣ群１．３．Ｘ．Ｘ下の、電子供与体のＣＨ−ＣＨ基上で作用するオキシドレダクターゼである。より好ましくは、供与体のＣＨ−ＣＨ基上で作用するオキシドレダクターゼは、ＦＡＤ依存性オキシドレダクターゼであり、さらにより好ましくは、オキシドレダクターゼは、ＥＣ群１．３．８．Ｘ下のＣｏＡデヒドロゲナーゼである。より好ましくは、さらに、オキシドレダクターゼは、適切にはＥＣ群１．３．８．１下の短鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、適切にはＥＣ群１．３．８．４下のイソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、適切にはＥＣ群１．３．８．５下の２−メチル−分岐鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ又は適切にはＥＣ群１．３．８．−下のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、例えばイソブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼなどである。最も好ましくは、オキシドレダクターゼは、次の酵素：シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）由来の短／分岐鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のイソブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ及びアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のイソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのいずれかから選択される。
【００９２】
ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素は、一般的にユビキノンの還元と基質の酸化をカップリングさせるための付随する電子伝達系を必要とし、これは、その後、再生される。このような電子伝達系は、電子移動フラボタンパク質（ＥＴＦ）及び電子移動フラボタンパク質ユビキノンオキシドレダクターゼ（ＥＴＦＱＯ）からなる。ＥＴＦは、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素及びＥＴＦＱＯの両方と適合性でなければならない。したがって、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼが使用される実施形態において、次の再生系の１つが好ましくは使用される：
・イソブチリル−ＣｏＡに対して活性がある内因性ＣｏＡデヒドロゲナーゼ及びその付随する電子伝達系を発現する宿主微生物、例えばシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）の場合など；
・異種ＣｏＡデヒドロゲナーゼと同じ生物からの電子伝達系のタンパク質を付随して異種ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素を発現する宿主微生物。例えば、全て大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（又は別の宿主生物）で発現される、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来又はアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＣｏＡデヒドロゲナーゼ及び電子伝達系構成成分；又は
・同様に異なる微生物由来の電子伝達系構成成分を付随する、異種ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素を発現する宿主微生物、それによりこれらの構成成分は、互いに且つＣｏＡデヒドロゲナーゼと適合性である。例えば、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＣｏＡデヒドロゲナーゼは、サス・スクロファ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）の電子移動フラボタンパク質と適合性であり、これは、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の電子移動フラボタンパク質ユビキノンオキシドレダクターゼとも適合性である。代わりに、Ａ．タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）のＥＴＦ−ユビキノンオキシドレダクターゼがＲ．スファエロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のＥＴＦ−ユビキノンオキシドレダクターゼと良好な配列相同性を有するため、Ａ．タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）のイソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ及びＥＴＦは、イソブチリル−ＣｏＡの酸化のために、Ｒ．スファエロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来のＥＴＦ−ユビキノンオキシドレダクターゼと共に機能的な系を形成し得る。最後に、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来のＥＴＦ及びＥＴＦ−ユビキノンオキシドレダクターゼは、Ｐ．デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＥＴＦがヒト及びブタＥＴＦと類似性があるため、Ｈ．サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）のもの又は異なる生物由来の相同体など、別の起源由来のイソブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼと適合性であると予測される。
【００９３】
実施形態において、微生物は、例えば、アルコールアシルトランスフェラーゼなど、メタクリリル−ＣｏＡをＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに変換し得る１つ以上の酵素を発現し得る。
【００９４】
好ましくは、アルコールアシルトランスフェラーゼは、アルコール、より好ましくはＣ３〜Ｃ１２アルコール、最も好ましくはＣ３〜Ｃ８アルコールの存在下、またより好ましくはプロパノール又はブタノール、例えばｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール又はオクタノールなどの存在下で作用する。最も好ましくは、アルコールアシルトランスフェラーゼは、イソプロパノール又はｎ−ブタノールの存在下で作用する。
【００９５】
本明細書中におけるアルコールという用語は、ヒドロキシル基（−ＯＨ基）を有し、メタクリレート類と共にエステル基を形成可能である種を意味する。
好ましくは、アルコールアシルトランスフェラーゼは、植物起源由来であり、より好ましくは、この植物は、ジンギベラレス（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）、ロサレス（Ｒｏｓａｌｅｓ）、エリカレス（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）、ククルビタレス（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｌｅｓ）、ブラシカレス（Ｂｒａｓｓｉｃａｌｅｓ）及びラウラレス（Ｌａｕｒａｌｅｓ）からなる群から選択されるいずれかの目に属し；さらにより好ましくは、この植物は、ムサセアエ（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、ロサセアエ（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、エリカセアエ（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）、アクチニジアセアエ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）、ククルビタセアエ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、カリカセアエ（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）及びラウラセアエ（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）からなる群から選択されるいずれかの科に属し；さらにより好ましくは、この植物は、ムサ（Ｍｕｓａ）、フラガリア（Ｆｒａｇａｒｉａ）、マルス（Ｍａｌｕｓ）、プルヌス（Ｐｒｕｎｕｓ）、ピルス（Ｐｙｒｕｓ）、ワクシニウム（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）、アクチニジア（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）、ククミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、カリカ（Ｃａｒｉｃａ）及びペルセア（Ｐｅｒｓｅａ）からなる群から選択されるいずれかの属に属し；さらにより好ましくは、この植物は、バナナ、イチゴ、リンゴ、プルヌス・ムメ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｍｕｍｅ）、ピルス・コミュニス（Ｐｙｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ブルーベリー、キウイ、メロン、パパイヤ及びアボカドからなる群から選択されるいずれか１つである。最も好ましくは、アルコールアシルトランスフェラーゼは、リンゴ、メロン又はトマト起源などの果実起源由来であり、適切にはリンゴ起源である。
【００９６】
本発明の実施形態において、微生物は、イソブチリルＣｏＡをＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに変換するためのオキシダーゼ及びアルコールアシルトランスフェラーゼを発現し得る。適切なオキシダーゼ及びアルコールアシルトランスフェラーゼは、上記で概説している。オキシダーゼがアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡＣＸ４であれば特に好ましい。
【００９７】
実施形態において、微生物は、２−ケトイソ吉草酸をイソブチリル−ＣｏＡに変換し得る１つ以上の酵素を発現し得る。実施形態において、１つ以上の酵素は、アルファサブユニット構成成分、リポアミドアシルトランスフェラーゼ構成成分及びリポアミドデヒドロゲナーゼ構成成分からなる、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ酵素複合体などの酵素複合体であり得る。最も好ましくは、デヒドロゲナーゼは、次の酵素：Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）由来の分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＢＣＫＤ、Ｐ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｕｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のＢＣＫＤ、Ａ．タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＢＣＫＤ、ストレプトミセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のＢＣＫＤ及びサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＢＣＫＤのいずれかから選択される。
【００９８】
代わりに、２−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡへの変換は、適切にはＥＣ群１．Ｘ．Ｘ．Ｘ下のオキシドレダクターゼ酵素、好ましくは適切にはＥＣ群１．２．Ｘ．Ｘ下の供与体のアルデヒド又はオキソ基上で作用するオキシドレダクターゼ、より好ましくは適切にはＥＣ群１．２．７．Ｘ下の、電子受容体としての鉄−イオウタンパク質を使用して供与体のアルデヒド又はオキソ基上で作用するオキシドレダクターゼ酵素、最も好ましくはアルファ、ベータ、ガンマ及びデルタサブユニットからなるテトラマーである、適切にはＥＣ群番号１．２．７．７下の２−ケトイソ吉草酸フェレドキシンレダクターゼ（ケトバリンフェレドキシンオキシドレダクターゼとしても知られる）により触媒され得る。このような酵素の例は、ピロコッカス・フリオシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓ）由来の２−ケトイソ吉草酸フェレドキシンレダクターゼ；ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）種由来の２−ケトイソ吉草酸フェレドキシンレダクターゼ；サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種由来の２−ケトイソ吉草酸フェレドキシンレダクターゼ；サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の２−ケトイソ吉草酸フェレドキシンレダクターゼ；サーモコッカス・プロフンドゥス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）由来の２−ケトイソ吉草酸フェレドキシンレダクターゼ及びメタノバクテリウム・サーモオートトロフィクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）由来の２−ケトイソ吉草酸フェレドキシンレダクターゼである。
【００９９】
代わりに、微生物は、イソ酪酸をイソブチリル−ＣｏＡに変換し得る１つ以上の酵素、例えばリガーゼを発現し得る。リガーゼは、適切にはＥＣ群番号６．Ｘ．Ｘ．Ｘ下であり、好ましくはＥＣ群６．２．Ｘ．Ｘ下の炭素−イオウ結合形成リガーゼ、より好ましくはＥＣ群６．２．１．Ｘ下の酸−チオール形成リガーゼ、より好ましくは適切にはＥＣ群６．２．１．１下の、ＧＤＰ形成、ＡＤＰ形成又はＡＭＰ形成リガーゼ、例えばＡＭＰ形成酢酸−ＣｏＡリガーゼなど、適切にはＥＣ群６．２．１．２下の酪酸−ＣｏＡリガーゼ、適切にはＥＣ群６．２．１．１０下のカルボン酸−ＣｏＡリガーゼ、適切にはＥＣ群６．２．１．１３下のＡＤＰ形成酢酸−ＣｏＡリガーゼ、適切にはＥＣ群６．２．１．１７下のプロピオン酸−ＣｏＡリガーゼ又はＥＣ群６．２．１．−の酸−チオールリガーゼである。最も好ましくは、リガーゼは、次の酵素：シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）由来のＡｃｓＡ、パエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｖａｒｉｏｔｉ）由来のブチリル−ＣｏＡシンテターゼ、ウシ心臓ミトコンドリア由来のブチリル−ＣｏＡシンテターゼのいずれかから選択される。
【０１００】
代わりに、微生物は、イソ酪酸エステルをイソブチリル−ＣｏＡに変換し得る１つ以上の酵素を発現し得る。例えば、イソ酪酸エステルは、キナーゼ酵素によりイソブチリル−ホスフェートに変換され得、イソブチリル−ホスフェートは、トランスフェラーゼ酵素によりイソブチリル−ＣｏＡに変換され得る。
【０１０１】
好ましくは、イソ酪酸エステルは、適切にはＥＣ群番号ＥＣ２．Ｘ．Ｘ．Ｘ下、好ましくはＥＣ２．７．Ｘ．Ｘ下、より好ましくはＥＣ群番号ＥＣ２．７．２．Ｘ下のキナーゼ酵素により、最も好ましくは適切にはＥＣ群２．７．２．１下の酢酸キナーゼ、ＥＣ２．７．２．６下のギ酸キナーゼ、ＥＣ２．７．２．７下の酪酸キナーゼ、ＥＣ２．７．２．１４下の分岐鎖脂肪酸キナーゼ又はＥＣ２．７．２．１５下のプロピオン酸キナーゼにより、イソブチリル−ホスフェートに変換される。最も好ましくは、キナーゼは、次の酵素：スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅ）ＭＡ−２由来の分岐鎖脂肪酸キナーゼ、Ｃ．ブチリクム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）由来の酪酸キナーゼのいずれかから選択される。
【０１０２】
好ましくは、イソブチリル−ホスフェートは、ＥＣ群番号２．Ｘ．Ｘ．Ｘ下のトランスフェラーゼ酵素の作用により、より好ましくはＥＣ群番号２．３．Ｘ．Ｘ下のアシルトランスフェラーゼの作用により、さらにより好ましくはＥＣ群番号２．３．１．Ｘ下のアミノ−アシル基以外の基を移動させるアシルトランスフェラーゼの作用により、イソブチリル−ＣｏＡに変換される。さらにより好ましくは、それぞれＥＣ群番号２．３．１．８及び２．３．１．１９下の、リン酸アセチルトランスフェラーゼ又はリン酸ブチリルトランスフェラーゼである。より好ましくは、トランスフェラーゼは、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ８２４由来のリン酸ブチリルトランスフェラーゼ又はバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）及びクロストリジウム・クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来のリン酸アセチルトランスフェラーゼである。これらの酵素の他の供給源としては、他の嫌気的細菌、特にクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、例えばクロストリジウム・パステウリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）又はクロストリジウム・ベイジェリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）などが挙げられる。
【０１０３】
微生物は、イソ酪酸をイソブチリル−ＣｏＡに変換し得る１つ以上の酵素、例えばシンテターゼ酵素、好ましくはイソブチリル−ＣｏＡシンテターゼ、最も好ましくはＰ．クロラフィス（Ｐ．ｃｈｌｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３由来のイソブチリル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡｃｓＡ）を発現し得る。
【０１０４】
使用される適切な改変及び構築体は、参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１６／１８５２１１号パンフレットにも開示されている。
発酵培地及び発酵
別の態様において、本発明は、野生型微生物と比較してメタクリル酸エステルに対して増加した耐性を有する単離された遺伝子改変微生物を含む発酵培地に関する。増加した耐性を伴う遺伝子改変微生物は、上記のような酸化ストレス応答系又は多剤抵抗性系のタンパク質成分又はレギュレーターの改変を含む。
【０１０５】
一実施形態では、微生物を、前記微生物がＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを産生する条件下で発酵培地中において提供する。
本発明の様々な態様及び実施形態は、前記発酵培地中で野生型又は遺伝子改変微生物を培養することを含む。培養すること又は培養は、適切には、微生物がエネルギーを引き出し、増殖し得る炭素に基づく原料を必要とする。したがって、好ましくは、微生物は、炭素に基づく原料において培養される。
【０１０６】
発酵培地は、微生物を取り囲む周囲の培地であり得る。好ましくは、炭素に基づく原料は、培地中に存在し、任意選択により培地中で溶解されるか、又は懸濁されるか、培地に通気され、且つ／又は培地と混合される。したがって、好ましくは、本培地は、何らかの緩衝物及び塩と共に、微生物及び炭素に基づく原料を含む。
【０１０７】
発酵培地は、微生物のニーズに適切な何らかの市販の培地であり得る。発酵培地は、適切には、炭素に基づく原料及び窒素供給源並びに微生物の増殖及び／又はＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの形成に必要なさらなる化合物を含有する。
【０１０８】
当技術分野で公知の適切な炭素に基づく原料の例としては、グルコース、マルトース、マルトデキストリン、スクロース、加水分解デンプン、デンプン、リグニン、芳香族化合物、合成ガス又はその構成成分、メタン、エタン、プロパン、ブタン、モラセス及び油、二酸化炭素が挙げられる。好ましくは、炭素に基づく原料は、バイオマス由来である。混合物も使用され得、且つ廃棄物、例えば都市廃棄物、食品加工、林業又は農業からの食品廃棄物及びリグノセルロース系廃棄物なども使用され得る。
【０１０９】
当技術分野で公知の適切な窒素供給源の例としては、ダイズミール、コーンスティープリカー、酵母エキス、アンモニア、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、窒素ガス又は他の窒素供給源が挙げられる。
【０１１０】
微生物増殖のために必要とされ得る（且つしたがって発酵培地中に存在し得る）さらなる化合物の例としては、抗生物質、抗真菌剤、抗酸化剤、緩衝剤、リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム塩、微量元素及び／又はビタミンが挙げられる。
【０１１１】
微生物の様々なクラス間、すなわち真菌、酵母及び細菌間で変動し得る量において、リン酸塩、硫酸塩又は微量元素のような、微生物の増殖のために、且つ／又はＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの産生のために必要とされるさらなる化合物が添加され得る。さらに、添加しようとするさらなる化合物の量は、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを形成させるために使用される経路がどのようなものであるかによって決定され得る。
【０１１２】
培地に添加しようとする炭素に基づく原料及び窒素供給源の量は、微生物のニーズ及び／又は微生物の培養の長さに依存して変動し得る。培養培地中の炭素に基づく原料と窒素供給源との比は、かなり変動し得る。
【０１１３】
一般的には、形成されるバイオマスの量は、使用される炭素に基づく原料の量及び何らかのフィーディングレジメ中に課される栄養制限により主に決定されるため、微生物の増殖に必要な各発酵培地構成成分の量は、栄養分に対して増殖収率を測定することによって決定され、培養プロセス中で使用される炭素に基づく原料の量に関してさらに評価される。
【０１１４】
炭素に基づく原料がバイオマス由来である実施形態において、バイオマスは、好ましくは、大量の炭水化物を含む。特に好ましいのは、Ｃ５又はＣ６糖の供給源である炭水化物、炭素に基づくガス又は芳香族化合物、好ましくはＣ５若しくはＣ６糖、より好ましくはグルコース、例えばデンプン、リグニン、セルロース、グリコーゲン、アラビノキシラン、キチン又はペクチンなどであるが、限定されない。
【０１１５】
代わりに、バイオマスは、大量の脂肪を含み得、特に好ましいのは、グリセロール及び脂肪酸、具体的にはトリグリセリドの供給源である脂肪又は油である。適切なトリグリセリドとしては、植物又は動物性供給源から容易に入手可能な何らかの油又は脂肪が挙げられる。このような油及び脂肪の例としては、パーム油、亜麻仁油、ナタネ油、ラード、バター、ニシン油、ヤシ油、植物油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ダイズ油、オリーブ油、カカオバター、ギー、脂身などが挙げられる。
【０１１６】
バイオマスは、１つ以上の異なるバイオマス供給源から構成され得る。適切なバイオマス供給源の例としては、原木、エネルギー作物、農業残渣、食品廃棄物、都市廃棄物及び工業廃棄物又は副産物が挙げられる。
【０１１７】
原木バイオマス供給源としては、木片、樹皮、枝くず、丸太、おがくず、木材ペレット又はブリケットが挙げられ得るが、限定されない。
エネルギー作物バイオマス供給源としては、短期輪作雑木林又は森林、ススキなどの非木材草本、ヘンプスイッチグラス、アシ又はライムギ、砂糖などの農作物、デンプン若しくは油作物又は微細藻類若しくは大型藻類及び海藻などの水生植物が挙げられ得るが、限定されない。
【０１１８】
農業残渣としては、外皮、麦藁、トウモロコシ茎葉、小麦粉、子実、家禽敷料、肥料、スラリー、合成ガス又は貯蔵牧草が挙げられ得るが、限定されない。
食品廃棄物としては、果皮／皮、殻、殻皮、芯、種／核果、動物又は魚の食用に適さない部分、絞り汁からのパルプ及び石油抽出物、醸造由来の大麦絞り粕又はホップ、一般家庭の台所の廃棄物、ラード、又は油、又は脂肪が挙げられ得るが、限定されない。
【０１１９】
工業廃棄物としては、ペレットを含む未処理材木、処理済み材木、シェールガス、ＭＤＦ／ＯＳＤを含む木質複合材、合板、紙パルプ／破砕物／廃棄物、繊維／糸／廃液を含む織物又は下水スラッジが挙げられ得るが、限定されない。
【０１２０】
微生物は、バッチ、反復バッチ、流加、反復流加又は連続培養（ケモスタット、タービドスタット若しくはオーキソスタット）プロセスとして培養され得る。
培養プロセスは、好ましくは、工業的規模で行われる。工業的規模のプロセスは、≧０．０１ｍ３、好ましくは≧０．１ｍ３、好ましくは≧０．５ｍ３、好ましくは≧５ｍ３、好ましくは≧１０ｍ３、より好ましくは≧２５ｍ３、より好ましくは≧５０ｍ３、より好ましくは≧１００ｍ３、最も好ましくは≧２００ｍ３である体積規模の１つ以上の発酵槽中での培養プロセスを包含すると理解される。
【０１２１】
実施形態において、培養は、バイオリアクター中で行われる。バイオリアクターは、一般に、微生物が工業的に培養される容器を意味すると理解される。バイオリアクターは、あらゆるサイズ、数及び形態であり得、栄養素、増殖のためのさらなる化合物、新鮮培地、炭素に基づく原料、空気、窒素、酸素又は二酸化炭素などであるが、限定されないガスの添加物を提供するための注入口を含み得る。バイオリアクターは、発酵培地からＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを回収するために培養培地の体積を取り出すための出口も含み得る。バイオリアクターは、培養物の試料採取のための出口も有し得る。バイオリアクターは、ｐＨを測定及び制御するための系を有し得る。このｐＨ制御系を使用して、ｐＨ−オーキソスタット培養物における培地添加を制御する。一部の実施形態では、フラスコ培養物を使用し得る。
【０１２２】
バイオリアクターは、一般に、例えば培養物を通じた撹拌、振動、振盪、転倒撹拌、ガス通気などにより発酵培地を混合させるように設定され得る。代わりに、一部の連続培養は、混合を必要とせず、例えば、マイクロリアクター系は、栓流系を使用する。バイオリアクターは、一般的であり、当技術分野で周知であり、例は、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ａｕｔｈｏｒｓ：Ｗｕｌｆ  Ｃｒｕｅｇａｒ及びＡｎｎｅｌｉｓｅ  Ｃｒｕｅｇｅｒ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ訳、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ」などの標準的な教科書で見出され得る。
【０１２３】
本発明は、本明細書に記載のような遺伝子改変生物を含む培養培地にも関する。さらに、本発明は、本明細書に記載のような遺伝子改変生物を含む発酵培地又は培養培地を含む容器に関する。さらに、本発明は、本明細書に記載のような遺伝子改変生物を含む発酵培地又は培養培地を含むキットに関する。
変異生物及びその使用
別の態様において、本発明は、メタクリル酸エステル、例えばＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの産生において使用するための、単離されたメタクリル酸エステル耐性、特にＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル耐性の遺伝子改変微生物にも関する。さらに、本発明は、メタクリル酸エステル、例えばＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの産生における、単離されたメタクリル酸エステル耐性、特にＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル耐性の遺伝子改変微生物の使用に関する。遺伝子改変微生物は、上記で詳細に説明した通りであり得る。
【０１２４】
さらなる態様において、本発明は、ｍａｒＲ（配列番号７）において変異を含む、単離されたメタクリル酸エステル耐性、特にＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル耐性の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記変異ｍａｒＲ核酸は、配列番号８に関連して、別のアミノ酸、例えばＧによるＶ８４の置換を有するタンパク質をコードする。さらなる態様において、本発明は、ｒｏｂ（配列番号５）において変異を含む、単離されたメタクリル酸エステル耐性、特にＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル耐性の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記変異Ｒｏｂ核酸は、配列番号６に関連して、Ｒｏｂにおける、別のアミノ酸によるＡ７０の置換又はＲ１５６の置換を有するタンパク質をコードする。さらなる態様において、本発明は、ａｃｒＲ（配列番号３）において変異を含む、単離されたメタクリル酸エステル耐性、特にＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル耐性の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記変異ａｃｒＲ核酸は、配列番号４に関連して、Ｔ３２におけるフレームシフト変異を有するタンパク質をコードする。さらなる態様において、本発明は、ｓｏｘＲ（配列番号１）において変異を含む、単離されたメタクリル酸エステル耐性、特にＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル耐性の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記変異ｓｏｘＲ核酸は、配列番号２に関連して、別のアミノ酸によるＲ２０の置換、残基１４６の欠失又は残基１３９におけるトランケーションを有するタンパク質をコードする。
【０１２５】
さらなる態様において、本発明は、下記：ｓｏｘＲ、ａｃｒＲ、ｍａｒＲ及び／若しくはｒｏｂ核酸又はそのホモログから選択される２つ以上の核酸において変異を含む、単離されたメタクリル酸エステル耐性、特にＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル耐性の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記核酸は、変異タンパク質をコードする。
【０１２６】
さらなる態様において、本発明は、ａｃｒＲにおける変異及び下記から選択される核酸：ｓｏｘＲ、ｍａｒＲ若しくはｒｏｂ核酸又はそのホモログにおける変異を含む、単離されたメタクリル酸エステル耐性、特にＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル耐性の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記核酸は、変異タンパク質をコードする。
【０１２７】
本発明の様々な態様によると、微生物は、上記の通りであり、一実施形態では、微生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
一実施形態では、変異ｓｏｘＲ核酸配列は、ＤＮＡ結合ドメイン（残基１〜８０）又はＦＥ−Ｓクラスタードメイン（残基１１９〜１５４）において変異を有する変異ＳｏｘＲタンパク質をコードする。一実施形態では、ＳｏｘＲにおける変異は、下記：配列番号２に関連して、別のアミノ酸によるＲ２０の置換、別のアミノ酸によるＲ２０の置換、残基１４６の欠失又は残基１３９におけるトランケーションの１つから選択される。一実施形態では、Ｒ２０の置換は、Ｈによるものである。一実施形態では、Ｒ２０の置換は、Ｌによるものである。また、本発明の範囲内であるのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）以外の微生物におけるＳｏｘＲのホモログにおける同等の位置での改変である。
【０１２８】
一実施形態では、ａｃｒＲ核酸配列は、ＤＮＡ結合ドメイン（残基７〜５１）又はリガンド結合ドメイン（残基５５〜２０４）において変異を有する変異ＡｃｒＲタンパク質をコードする。一実施形態では、ＡｃｒＲにおける変異は、下記：配列番号３に関連して、別のアミノ酸によるＶ２９の置換、Ｔ３２におけるフレームシフト変異、Ｙ４９におけるフレームシフト変異、Ａ１９１において起こるフレームシフト変異、残基１４６の欠失又は残基１３９におけるトランケーションの１つから選択される。一実施形態では、Ｖ２９の置換は、Ｇによるものである。また、本発明の範囲内であるのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）以外の微生物におけるＡｃｒＲのホモログにおける同等の位置での改変である。
【０１２９】
一実施形態では、変異ｒｏｂ核酸配列は、Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメイン（残基１〜１２０）及びＣ末端ドメイン（残基１２１〜１８９）において変異を有する変異Ｒｏｂタンパク質をコードする。一実施形態では、Ｒｏｂにおける変異は、下記：配列番号６に関連して、Ｒｏｂにおける、別のアミノ酸によるＡ７０の置換又はＲ１５６の置換の１つから選択される。一実施形態では、Ａ７０の置換は、Ｖ又はＴによるものである。一実施形態では、Ｒ１５６の置換は、Ｈによるものである。また、本発明の範囲内であるのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）以外の微生物におけるＲｏｂのホモログにおける同等の位置での改変である。
【０１３０】
一実施形態では、変異ｍａｒＲ核酸配列は、ＤＮＡ結合ドメイン（残基５５〜１００）において変異を有する変異ＭａｒＲタンパク質をコードする。一実施形態では、ＭａｒＲにおける変異は、配列番号８に関連して、別のアミノ酸によるＶ８４の置換である。一実施形態では、Ｖ８４の置換は、Ｇによるものである。また、本発明の範囲内であるのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）以外の微生物におけるＭａｒＲのホモログにおける同等の位置での改変である。
【０１３１】
一実施形態では、表１ａにおいて示すような２つ以上の変異が存在する。一実施形態では、微生物は、下記で列挙するような遺伝子変異を有する微生物から選択される：
−  ｒｏｂ（Ｒ１５６Ｈ）ｒｐｏＣ（Ｌ３６１Ｒ）ｉｌｖＮ（Ｃ４１Ｙ）ｙｇｂＫ（Ａ２９４Ｅ）ｌｐｘＭ（１６８＿１８５ｄｅｌ）；
−  ｒｏｂ（Ｒ１５６Ｈ）ｉｌｖＮ（Ｃ４１Ｙ）ｐｈｏＰ（Ｌ１１Ｆ）ａｃｒＢ（Ｖ４４８Ｌ）；
−  ｓｏｘＲ（Ｌｅｕ１３９Ｘ）５８０１１６（Ｇ＞Ｔ）；
−  ｓｏｘＲ（Ａ１４６ｄｅｌ）；
−  ｒｏｂ（Ａ７０Ｖ）；
−  ｒｏｂ（Ｒ１５６Ｈ）ｒｐｏＢ（Ｔ１０３７Ｐ）ｔｏｒＹ（Ａ８７Ｔ）ａｃｒＲ（４９Ｙｆｓ）；
−  ｒｏｂ（Ａ７０Ｔ）ｙｏｈＪ（Ｌ１０９Ｒ）ｄｎａＫ（Ｖ３７７Ｇ）９２７７７７（Ｃ＞Ｔ）ａｃｒＲ（Ａ１９１ｆｓ）；
−  ｍａｒＲ（Ｖ８４Ｇ）ｒｐｏＣ（Ｒ１０７５Ｃ）ｏｍｐＲ（Ｒ１５Ｓ）ａｃｒＢ（Ｔ３７９Ｉ）；
−  ｍａｒＲ（Ｖ８４Ｇ）ｒｐｏＣ（Ｒ１０７５Ｃ）ｏｍｐＲ（Ｒ１５Ｓ）；
−  ｍａｒＲ（Ｖ８４Ｇ）ｒｐｏＣ（Ｒ１０７５Ｃ）ｒｐｏＣ（Ａ７８７Ｖ）ｏｍｐＲ（Ｒ１５Ｓ）ａｃｒＢ（Ｖ９０１ｌ）；
−  ｒｏｂ（Ｒ１５６Ｈ）ｒｐｏＢ（Ｔ１０３７Ｐ）ｇｒｏＬ（Ｐ２７９Ｌ）ａｃｒＲ（４９Ｙｆｓ）１１９７６５９（Ｃ＞Ａ）又は
−  ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｌ）ｒｐｏＣ（ｒ１０７５Ｃ）２１３３２３６（Ｔ＞Ａ）３９１５９１５（Ｔ＞Ｇ）。
【０１３２】
一実施形態では、ｓｏｘＲにおける変異をａｃｒＲにおける変異と合わせる。実施例において示されるように、２つの遺伝子における変異を合わせることは、相加的耐性効果をもたらすことを本発明者らは驚くべきことに見出した。一実施形態では、ｓｏｘＲにおける変異をｍａｒＲにおける変異と合わせる。一実施形態では、ｓｏｘＲにおける変異をｒｏｂにおける変異と合わせる。
【０１３３】
一実施形態では、微生物は、例えば、酸化ストレス応答のタンパク質成分又はレギュレーターをコードする遺伝子において１つ又は複数のさらなる変異も含む。一実施形態では、変異は、ｒｐｏ核酸配列、例えばｒｐｏＢ（配列番号２５）又はｒｐｏＣ（配列番号２７）、ｏｍｐＲ（配列番号２９）、ａｃｒＢ（配列番号９）、ｙｏｈＪ（配列番号１１）、ｔｏｒＹ（配列番号１３）、ｉｐｘＭ（配列番号１５）、ｄｎａＫ（配列番号１７）、ｇｒｏｌ（配列番号１９）、ｉｌｖＮ（配列番号２１）、ｐｈｏｐ（配列番号３１）、ｙｇｂＫ（配列番号２３）中にある。別の実施形態では、酸化ストレス応答系又は多剤抵抗性系のタンパク質成分又はレギュレーターのさらなる改変は存在しない。
【０１３４】
一実施形態では、ａｃｒＲにおける変異をｍａｒＲ、ｒｏｂ又はｓｏｘＲの１つにおける１つ又は複数の変異と合わせる。これは、ｍａｒＲ、ｒｏｂ又はｓｏｘＲと組み合わせてａｃｒＲにおける変異が見出されたという驚くべき知見に基づく（実施例２を参照されたい）。
【０１３５】
一実施形態では、ａｃｒＲにおける変異をｍａｒＲにおける１つ又は複数の変異と合わせる。一実施形態では、ａｃｒＲにおける変異をｒｏｂにおける１つ又は複数の変異と合わせる。一実施形態では、１つ又は複数のさらなる変異は、表１ｂにおいて列挙する変異から選択される。
変異生物を作成する方法
本発明は、メタクリル酸エステル耐性微生物の単離の方法であって、
ａ）発酵培地中において微生物を提供することと、
ｂ）微生物をメタクリル酸エステルと接触させることと、
ｃ）ステップ（ｂ）の生存可能な微生物を単離することと
を含み、生存可能な微生物は、液体培地中で約３７℃において成長されたとき、少なくとも２０％ｖ／ｖのメタクリル酸エステルに対して耐性である、方法にも関する。
【０１３６】
微生物は、上記のような微生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から選択される。一実施形態では、方法は、逐次的に増加する濃度のメタクリル酸エステル、例えばＢＭＡを含む培地中で生物を培養することを含む適応進化アプローチを用いる。例えば、第１のステップにおいて、微生物は、０．１％の濃度でメタクリル酸エステルと接触させる。それに続くステップにおいて、濃度を０．１％から例えば０．５％、１％、５％、１０％及び２０％に段階的に増加させ、微生物は、ある期間にわたってこの濃度に曝露される。別の実施形態では、濃度を１０％及び２０％に段階的に増加させる。それぞれの濃度で微生物をメタクリル酸エステルと接触させることは、約（０．１時間〜１４４時間）で１〜４５回であり得る。別の実施形態では、培養温度は、方法中に変化し得る。培養温度は、４℃〜５０℃で維持され得る。別の実施形態では、方法は、成長が起こるまで１つの培養物をＢＭＡと共にインキュベートすることと、次いで変異体を単離することとを含む。
【０１３７】
例えば、適応進化は、下記の方法で行うことができる：ケモスタットにおける大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の適応進化は、約０．３３ｈ−１の開始希釈率で確立することができる。次いで、ＢＭＡ濃度を一定の希釈率で０から２０％ｖ／ｖに段階的様式で徐々に増加させる。約２０％ｖ／ｖのＢＭＡで安定な細胞濃度を達成した後、培養物の希釈率は、約０．３３ｈ−１〜約０．５５ｈ−１で調節することができ、ＢＭＡ濃度は、約２０％ｖ／ｖで一定に保つ。ＢＭＡ濃度を約２０％ｖ／ｖ及び最初の希釈率を約０．４１ｈ−１で維持する一方、３７℃から４４℃への温度の段階的な上昇を伴ってさらなる適応進化実験を達成した。ｐＨフィードバック制御系を使用してｐＨ−オーキソスタットの使用を伴う適応進化を達成することができ、ここで、栄養素、塩基及び他の添加物の流入は、ｐＨが設定値未満となるときのみ開始する。バイオリアクターにおける培地の酸性化は、栄養素の添加及び結果的に希釈率を制御するその速度を伴う培養物中の細胞の成長を示す。希釈率は、課せられた条件下で培養物の成長率に対応するように調節され、自動選択を可能とし、ここで、急速に成長する菌株は、バイオリアクター中で存続し、よりゆっくりと成長する菌株は、洗い落とされる。ｐＨ−オーキソスタットにおける大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の進化実験は、ＢＭＡを最初にバイオリアクターに加えることなく開始することができる。ＢＭＡ濃度は、０％ｖ／ｖから０．１％ｖ／ｖ、０．５％ｖ／ｖ、１．０％ｖ／ｖ、５．０％ｖ／ｖ、１０％ｖ／ｖ及び２０％ｖ／ｖに徐々に増加させることができる。
【０１３８】
微生物を、上記のような適切な発酵培地中で約３７℃において、例えば約２００ＲＰＭにおいて成長させる。
メタクリル酸エステルは、本明細書において他の場所で記載した通りである。
【０１３９】
本発明は、上記の方法によって単離された微生物にも関する。
遺伝子及びタンパク質データベースにおける配列番号への全ての参照文献を含めた本明細書において記述した全ての文献は、全内容が参照により本明細書中に組み込まれる。配列バージョンは、他に特定しない限りバージョン１である。
【０１４０】
「及び／又は」は、本明細書において使用される場合、他方を伴う又は伴わない２つの特定の特徴又は構成要素のそれぞれの特定の開示として解釈される。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、それぞれがあたかも本明細書において個々に示されるように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの特定の開示として解釈される。文脈によって他のことが指示されない限り、上記で示した特徴の説明及び定義は、本発明の任意の特定の態様又は実施形態に限定されず、記載する全ての態様及び実施形態に等しく当てはまる。
【０１４１】
本発明を下記の非限定的実施例においてさらに説明する。
【実施例】
【０１４２】
実施例１：ＢＭＡ耐性変異菌株の単離及び特性決定
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＭＧ１６５５をこれらの実験において使用した。これは、一般の実験室菌株であり、この菌株の完全なゲノム配列が利用可能である（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００９１３．３）。この菌株は、例えば、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ）（菌株７６３６）又はＡＴＣＣから得ることができる。
【０１４３】
本発明者らは、ＢＭＡに対して耐性である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５変異体を単離した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５を３０ｍＬのバイアルにおいて３７℃、２５０ｒｐｍにおいて２０％（ｖ／ｖ）のＢＭＡを含有するＭＳＸ培地中で７２時間成長させた。７２時間後に成長が観察された。この培養物からの試料をＬＢ寒天プレート上に塗り付け、３７℃において一晩インキュベートした。次いで、コロニーを単離し、メーカーの指示によるＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮＧＳ技術を使用した全ゲノムディープ配列決定分析を行い、変異体を特性決定した。Ｆａｓｔｑ出力ファイルをＭＧ１６５５参照ゲノム（受託番号ＮＣ＿００９１３．１）と比較して変異体について分析した。配列決定分析は、下記の変異を同定した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）ａｃｒＲ（Ｖ２９Ｇ）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）
それに続くスクリーニング実験において、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５及び上記のように単離した変異体（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）ａｃｒＲ（Ｖ２９Ｇ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ））を、播種の直後に加えた２０％（ｖ／ｖ）のＢＭＡの非存在下又は存在下において合成培地（ＭＳＸ）中で成長させた（図１）。培養物を２５０ｍＬの振盪フラスコにおいて３７℃及び２５０ｒｐｍにおいて成長させた。ＷＴ菌株は、２０％（ｖ／ｖ）のＢＭＡの存在下で成長することができなかったが、全ての変異体は、２０％（ｖ／ｖ）のＢＭＡの存在下で成長することができ、これは、変異がＢＭＡへの抵抗性を与えることを示す。二重変異体である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）ａｃｒＲ（Ｖ２９Ｇ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）は、ｓｏｘＲ変異を有する単一の変異体より良好に成長することができたが、これは、ｓｏｘＲ及びａｃｒＲにおける変異の組合せが相加効果を実現し、耐性表現型を増進することを示すことも本発明者らは観察した。
【０１４４】
次いで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）ａｃｒＲ（Ｖ２９Ｇ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）を、中間指数増殖期中に加えた２０％（ｖ／ｖ）のＢＭＡと共にＭＳＸ培地中で成長させた（図２）。培養物を２５０ｍＬの振盪フラスコにおいて３７℃及び２５０ｒｐｍにおいて成長させた。これらの結果は、ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）と組み合わせた変異遺伝子ａｃｒＲ（Ｖ２９Ｇ）及びａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）が、ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）変異単独と比較して、細胞の適応を改善させ、ＢＭＡへの増進した耐性を与えることを再度示す。
【０１４５】
次いで、本発明者らは、標準的なプロトコルを使用して、それぞれｓｏｘＲ及びａｃｒＲをノックアウトした菌株を生じさせた。ノックアウト菌株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１１３  △ｓｏｘＲ及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１１３  △ａｃｒＲを、播種の直後に加えた２０％（ｖ／ｖ）のＢＭＡの非存在下又は存在下で成長させた（図３）。培養物を３０ｍＬのバイアルにおいて３７℃及び２５０ｒｐｍの振盪でＭＳＸ培地中において成長させた。ノックアウト菌株は、ＢＭＡを有さない培地中で成長することができたが、これらの全てはＢＭＡの存在下で成長することができなかった。これは、ａｃｒＲ及びｓｏｘＲの機能喪失がＢＭＡ耐性を与えないことを示す。したがって、ｓｏｘＲ（Ｒ２０Ｈ）は、他の遺伝子の転写をレギュレートすることができる機能的ＳｏｘＲをコードする。同様に、変異遺伝子ａｃｒＲ（Ｖ２９Ｇ）及びａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）は、ＢＭＡ耐性を与えることができる機能タンパク質をコードし得る。
【０１４６】
単一の変異を有する菌株を調製し、ａｃｒＲ（Ｖ２９Ｇ）及びａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）がそれら自体でＢＭＡ耐性を与え、したがって機能タンパク質をコードすることができるかについて理解した。次いで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５  ａｃｒＲ（Ｖ２９Ｇ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５  ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）を、播種の直後に加えた２０％（ｖ／ｖ）のＢＭＡと共に又は伴わずに成長させた（図４）。培養物を３０ｍＬのバイアルにおいて３７℃及び２５０ｒｐｍの振盪でＭＳＸ培地中において成長させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５  ａｃｒＲ（Ｖ２９Ｇ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５  ａｃｒＲ（Ｔ３２ｆｓ）は、全てＢＭＡの存在下で成長することができた。これらの変異が機能的ＡｃｒＲをコードし、転写因子として作用することができ、ＢＭＡへの抵抗性を与えることをこれは示唆する。
【０１４７】
要約すれば、結果は、ｓｏｘＲ又はａｃｒＲにおける変異が野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と比較してＢＭＡへの抵抗性を与え、ｓｏｘＲ又はａｃｒＲの両方において変異を含む二重変異体が増進した抵抗性を示すことを示す。
実施例２：適応進化によるＢＭＡ耐性変異菌株の単離及び特性決定
本発明者らは、適応進化アプローチを使用してＢＭＡ耐性菌株を同定した。要約すれば、適応進化は、所望の選択圧の影響の下での微生物菌株の拡張された増殖が関与する。増加した耐性によって増進した成長率を有する変異体は、時間経過と共に集団内で時折生じ、拡張する。したがって、増進された菌株は、これらの変異単離物の反復単離、特性決定及び配列決定によって得られる。
【０１４８】
実験は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＢＷ２５１１３を使用した。これは、一般の実験室菌株であり、この菌株の完全なゲノム配列が利用可能である（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＺ＿ＣＰ００９２７３．１、Ｇｒｅｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＷ２５１１３，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｕｎｃ．２０１４  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；２（５）：ｅ０１０３８−１４を参照されたい）。この菌株は、例えば、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ）（菌株７６３６）又はＡＴＣＣから得ることができる。
【０１４９】
その成長に対するＢＭＡの効果を、０．０１％ｖ／ｖ〜２０．０％ｖ／ｖの濃度範囲のＢＭＡの存在下で微生物を成長させることによって第１に調査した（図５ａ及び５ｂ）。０．０１％ｖ／ｖのＢＭＡ濃度での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の成長（図５．１）は、ＢＭＡの非存在下でのその成長と非常に同様であった。しかし、ＢＭＡ濃度を０．０５ｖ／ｖ及び０．１％ｖ／ｖにさらに増加させるにつれ、より長い遅滞期及びより低い成長率が観察された（図５ａ及び表２．１）。したがって、ＢＭＡは、０．０５％ｖ／ｖ超の濃度で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の成長を阻害する。
【０１５０】
ＢＭＡ濃度が２０％ｖ／ｖ（図５ｂ）にさらに増加すると、細胞成長は、２４〜３６時間のインキュベーション後にのみ観察され、成長は、不定であった。
【０１５１】
【表７】
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０．１及び０．５％ｖ／ｖのＢＭＡと共に成長させた培養物を継代培養して（図５．３）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＢＭＡ耐性限界を理解した。０．１％ｖ／ｖのＢＭＡと共に成長させた培養物から一定分量を採取し、新鮮な培地に移動させ、同じ条件下で成長させた。継代培養集団の成長パターンは、従前の培養物に対するものと全く同じであったが（図５ｃ）、これは、０．１％ｖ／ｖのＢＭＡで観察された耐性が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の固有の耐性による可能性が高いことを示唆する。他方、０．５％ｖ／ｖのＢＭＡで成長させた培養物から採取した継代培養物は、１２時間のみの播種後に有意な成長を示したが、これは、同じ条件下で成長させた前駆細胞培養と比較して非常により早い（図５ｃ）。最初の培養物及び継代培養物の成長パターンにおける差異は、継代培養物における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の成長が固有の耐性によるものではなく、０．５％ｖ／ｖのＢＭＡへの曝露後にむしろ得られたことを示唆する。
【０１５２】
継代培養実験からの結果は、ＢＭＡに対する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の固有の耐性が、少なくとも０．１％ｖ／ｖであるが、０．５％ｖ／ｖ以下であることを示唆した。
様々な適応進化実験を使用して、ＢＭＡ耐性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を生じさせた。第１の実験（ＡＤＥ−１；図５ｄ）において、３つの平行培養物を、それぞれの逐次移動について０．１％ｖ／ｖからそれぞれ０．５％ｖ／ｖ、１．０％ｖ／ｖ、５．０％ｖ／ｖ、１０．０％ｖ／ｖ及び２０％ｖ／ｖに増加するＢＭＡ濃度を伴う、１０ｍＬのＭ９最少培地を含有する５０ｍＬのＦＡＬＣＯＮ（登録商標）チューブにおいて成長させた。０．１５ｍＬの一定分量を従前の培養物から使用し、より高いＢＭＡ濃度を有する新鮮な培地に移動させた。最も良好に成長している培養物を次の逐次移動のための開始培養物として使用した。
【０１５３】
第２の適応進化実験（ＡＤＥ−２；図５ｅ）において、細胞は、ＢＭＡ濃度を増加させる前に同じＢＭＡ濃度で５回の連続的移動を受けさせた。この実験において、３つの培養物のそれぞれを別々のチューブにおける逐次移動のために開始培養物として使用した。
【０１５４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を０．１％ｖ／ｖのＢＭＡと共に１回、次いで１０％ｖ／ｖのＢＭＡと共に２回及び最終的に２０％ｖ／ｖのＢＭＡと共に４５回成長させることにより、第３の適応進化実験（ＡＤＥ−３；図５ｆ）を行った。
【０１５５】
第４の適応進化実験を、ケモスタット培養物を使用して実現した（ＡＤＥ−４；図５ｇ）。ＢＭＡ濃度を一定の希釈率で０から２０％ｖ／ｖに段階的様式で徐々に増加させた。２０％ｖ／ｖのＢＭＡで安定な細胞濃度を達成した後、ＢＭＡ濃度を２０％ｖ／ｖで一定に保ちながら、培養物の希釈率を０．３３ｈ−１〜０．５５ｈ−１に調節した。
【０１５６】
適応進化実験後、残存している培養物の一定分量をＬＢ寒天中に蒔き、ある数（少なくとも６つ）の個々のコロニーを採取し、液体培地中で再成長させ、それぞれの単離した菌株のストック培養物を保存した。どのようにＢＭＡが単離した菌株のそれぞれの成長に影響を与えたかを評価及び比較するために、２０％ｖ／ｖのＢＭＡの存在下でのそれらの成長機構を決定した。菌株成長機構の決定において使用する標準的な成長条件は、ｓｕｂａシールを備えた２５０ｍＬの三角フラスコにおける３７℃及び２００ｒｐｍにおいて振盪インキュベーターを使用した、１０ｇ  Ｌ−１のグルコース及び２０％ｖ／ｖのＢＭＡを含有する５０ｍＬのＭ９培地中で約０．０２５の開始光学密度（Ｏ．Ｄ．）であった。そのＯ．Ｄ．を３６時間測定することによって成長をモニターし、試料を、播種後、最初の１３〜１８時間、２４時間及び３６時間に毎時に採取した。単離した菌株の細胞成長機構パラメーターの要約を表２．２において列挙する。単離した菌株の成長曲線も図５に示す。
【０１５７】
【表８】
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ＡＤＥ−１、ＡＤＥ−２、ＡＤＥ−３及びＡＤＥ−４から生じさせた様々なＢＭＡ耐性菌株のゲノムＤＮＡ配列を分析し、親菌株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１１３を参照して比較した（表２．３、２．４及び２．５５）。ＤＮＡ配列決定のためのゲノムＤＮＡ試料を、溶離液としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ；ｐＨ＝７．５）を伴うＧｅｎｅＥｌｕｔｅ（商標）細菌ゲノムＤＮＡキットを使用して、ＬＢブロス中の選択した単離物の一晩培養から調製した。ＤＮＡ配列を、ＭｉＳｅｑ  ｖ２  １５０ＰＥ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））を使用して分析し、１ラン当たり少なくとも１１Ｍ＋１１Ｍのリードを生じさせた。リードは、Ｃｕｔａｄａｐｔバージョン１．１２を使用して３０の閾値及びＮｅｘｔｅｒａ  ＸＴキットのアダプター配列（配列番号３３：ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡ）を伴って、３’末端における質のために３６の最小長さまでトリミングした。ゲノムアラインメント及びバリアントコールをＳｎｉｐｐｙパイプラインで行い、単離された菌株及び親菌株／参照ゲノム（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）菌株ＢＷ２５１１３、アセンブリーＡＳＭ７５０５５ｖ１、Ｅｎｓｅｍｂｌからのアノテーションバージョン３４）間のゲノムＤＮＡ配列における差異を同定した。各位置をカバーする最小で１０リード及び参照と異なる必要があるリードの最小画分として０．９を伴ってＳｎｉｐｐｙバージョン３を使用した。
【０１５８】
【表９】
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【０１５９】
【表１０】
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【０１６０】
【表１１】
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【０１６１】
【表１２】
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表２．３及び表２．４から推察することができるように、各菌株は、ａｃｒＲにおける変異を有した。さらに、各菌株は、ｓｏｘＲ、ｍａｒＲ又はｒｏｂの１つにおいて変異をさらに有した。
実施例３  −  トランスクリプトミクスデータ
トランスクリプトーム分析を行って、標準的な方法を使用して変異微生物における転写活性を特性決定した。
ＲＮＡ抽出プロトコル
材料：
・ＲＮｅａｓｙ保護細菌ミニキット（５０）−Ｑｉａｇｅｎ  ７４５２４
・ＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅセット（５０）−Ｑｉａｇｅｎ  ７９２５４
・ＲＮａｓｅＺＡＰ−Ｒｎａｓｅを除去するための洗浄剤−Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｒ２０２０−２５０ＭＬ
・ＲＮａｓｅ非含有ｅｐｐｅｎｆｏｒｄ及び１５ｍｌのｆａｌｃｏｎチューブ
・ＲＮａｓｅ非含有チップ
全ての抽出をＲＮａｓｅ非含有「環境」において行い、全てをＲＮａｓｅＺＡＰで浄化し、必ず手袋を使用し、手袋を頻繁に交換する。
１．ＭＳＸ培地
１Ｌを調製するために：
Ｖｉｓｈｎｉａｃ微量元素
ＥＤＴＡジナトリウム塩（５０ｇ）を水（８００ｍｌ）と合わせ、（一度に２〜３個の）ＫＯＨペレットを加えることによって溶解する。下記の順序で化学物質を加える：ＺｎＳＯ４（２．２ｇ）、ＣａＣｌ２（５．５４ｇ）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（５．０６ｇ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（５ｇ）、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ（１．１ｇ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（１．５７ｇ）及びＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（１．６１ｇ）。１ＭのＫＯＨを使用してｐＨ６に調節し、水を使用して１Ｌとし、４℃において使用まで貯蔵する。
ＭＳＡ
・水（７００ｍｌ）中のＫＨ２ＰＯ４（６ｇ）及びＶｉｓｈｎｉａｃ微量元素（２ｍｌ）
１ＭのＫＯＨを使用してｐＨ７に調節する。水で７６０ｍｌとする。
ＭＳＢ
・水（２００ｍｌ）中のＮＨ４Ｃｌ（３ｇ）及びＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．４ｇ）。
ＭＳＡ及びＭＳＢを無菌化し、次いで混合し、４０ｍＬの１２．５％グルコースのストック溶液を加える。全部で１ＬのＭＳＸを作製する。
２．試料の調製
１）凍結ストックから直接新鮮なＭＳＸ寒天（１５ｇ／Ｌ）プレート上に菌株を塗り付け、３７℃において一晩インキュベートする。
２）単一のコロニーを単離し、５０ｍｌの振盪フラスコを使用して前培養物をＭＳＸ中で播種する。３７℃及び２５０ｒｐｍにおいて一晩インキュベートする。
３）２４／２９ネックジョインを有する２５０ｍＬのｐｙｒｅｘ振盪フラスコを使用して、０．０５の最初のＯＤ６００までＭＳＸ中で培養物を播種する。３７℃及び２５０ｒｐｍにおいてインキュベートする。４回の生物学的反復実験（配列決定のために３回の反復実験及び１回のバックアップ）を行う−菌株毎に４つのフラスコ。
４）振盪フラスコを無菌のＳｕｂａシールで密封する。ＯＤをモニターするために、７０％エタノールでＳｕｂａシールを最初にふき取った後、無菌のシリンジ及び針を使用して試料を採取する。ＯＤをモニターする。
５）ＯＤが０．３に達したとき、ＲＮＡ抽出のための最初の試料（「前」試料）を事前冷却したｆａｌｃｏｎ中に収集する。試料を氷上に保持する。
６）直後に２０％（ｖ／ｖ）のＢＭＡを加える。培養物を再インキュベートする。
７）プロトコル１のステップ６までＲＮｅａｓｙキットのプロトコルによって試料を迅速に処理する。必ず試料を氷上に保持し、これをさらなる使用まで−８０℃において貯蔵し、可能な場合、これを液体窒素中で急速凍結し、その後、貯蔵する。
８）最初の試料捕集／ＢＭＡ添加の１時間後、ＲＮＡ抽出のための第２の試料（「後」試料）を収集する。上記で説明した通りに進行させる。
９）培養物が２４時間に達するまでＯＤをモニターし続ける。
【０１６２】
要約すると、試験した各菌株は、配列決定のために送る６つの試料を有し、３つは、添加の直前に収集し、３つは、１時間後に収集し、それにプラスして抽出中に何らかの問題が生じた場合、前及び後について１つの「バックアップ」とする（全部で８つの試料）。ＢＭＡの添加を伴うＷＴ菌株に加えて、０．３のＯＤに達した１時間後、対照として、試料は、ＢＭＡを有さないＷＴ培養物からも収集した。
３．ＲＮＡ抽出
ＲＮｅａｓｙキットの説明書によって進行させる。最少培地上で成長させたグラム陰性菌についてプロトコル１及び７並びに付録Ｂ「ＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅセットを使用したカラム上のＤＮａｓｅ消化」。
【０１６３】
最終試料を３つの一定分量に分離する。１つのみの一定分量を使用して、濃度及びｇＤＮＡ汚染が存在するかをチェックする。試料を解凍及び凍結することは、ＲＮＡを分解し得るため、配列決定のためにこの一定分量を使用しない。
【０１６４】
ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを使用してＲＮＡ濃度及びＲＩＮ数をチェックする。
ＢＭＡの非存在下での野生型におけるレベルに対する、ＢＭＡの存在下及び非存在下での二重変異体及び野生型について転写を比較した。疑義を避けるために、表におけるレベルは、加えたＢＭＡの非存在下での野生型におけるレベルに対する、ＢＭＡ曝露下の菌株におけるレベルの比である。ａｃｒＡ及びａｃｒＢの転写のレベルはＢＭＡの非存在下で増進されたが、これは、非常に変化するものであった。野生型菌株について、ＢＭＡへの曝露は、グローバルレギュレーターの発現レベルを実際低減させる。主要な多剤抵抗性ポンプがこれらの菌株において強く過剰発現していることをこれは示す。結果を下記の表２．６において示す。
【０１６５】
【表１３】
2021525085.tif 000015
いくつかの重要な遺伝子の転写レベルは、ＢＭＡによって強力に増進又は低減された。ＢＭＡ曝露を伴わないＢＷ２５１１３に対する、ＢＭＡによる「トップ２７」の増進を表２．７において示す。比較のために、ＢＭＡへの曝露を伴わない同じ遺伝子を表２．８において示す。ＢＭＡの非存在下での野生型におけるレベルに対する、ＢＭＡの存在下及び非存在下での二重変異体及び野生型について転写を比較した。疑義を避けるために、表におけるレベルは、加えられたＢＭＡの非存在下での野生型におけるレベルに対するＢＭＡ曝露下での菌株におけるレベルの比である。
【０１６６】
【表１４】
2021525085.tif 000016
【０１６７】
【表１５】
2021525085.tif 000017
ＢＭＡが供給されない場合、転写レベルについて、一貫した傾向は、存在しなかった。ＢＭＡの存在下において、ｉｂｐＡ、ｉｂｐＢ、ｙｎｆＭ、ｙｉｂＴ、ｐｓｐＡ、ｂｓｓＲ、ｙｂｆＡ、ｒａｉＡ、ｌｄｈＡ、ｐｓｐＢ、ｐｓｐＣ及びｐｓｐＤは、菌株において全てが１０倍超増進されるが、全てが野生型菌株において低減する。ＢＭＡの非存在下において、ｉｂｐＡ、ｉｂｐＢ、ｙｎｆＭ、ｙｉｂＴ、ｐｓｐＡ、ｂｓｓＲ、ｙｂｆＡ、ｒａｉＡ、ｌｄｈＡ、ｐｓｐＢ及びｐｓｐＣのいずれも菌株において増進されなかった。これらの遺伝子の機能を表２．９において列挙する。
【０１６８】
【表１６】
2021525085.tif 000018
【図１】
2021525085.tif 000019
【図２】
2021525085.tif 000020
【図３】
2021525085.tif 000021
【図４】
2021525085.tif 000022
【図５ａ】
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【図５ｂ】
2021525085.tif 000024
【図５ｃ】
2021525085.tif 000025
【図５ｄ】
2021525085.tif 000026
【図５ｅ】
2021525085.tif 000027
【図５ｆ】
2021525085.tif 000028
【図５ｇ】
2021525085.tif 000029
【図５ｈ】
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【図５ｉ】
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【図５ｊ】
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【図５ｋ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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