(57)【要約】  本発明は、マイオカイン活性を有するＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド及びその変異体、並びに筋肉が関連する障害を処置、回復又は予防するための組成物及び方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイオカイン活性を有する、配列番号３若しくは配列番号４の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号３若しくは配列番号４のいずれか１つの前記配列内で、１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸が、修飾、欠失、付加及び／又は置換されている、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号３若しくは配列番号４のいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
治療において使用するための、単離されたＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体。
【請求項５】
医薬として使用するための、単離されたＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体。
【請求項６】
医薬として使用するための、
ａ．アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｂ．配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
ｄ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチド。
【請求項７】
医薬の製造において使用するための、
ａ．アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｂ．配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
ｄ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチド。
【請求項８】
マイオカイン活性を有する、請求項４〜７のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項９】
対象における筋肉が関連する障害の処置において使用するための、請求項４〜６及び８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
対象における筋肉が関連する障害の処置において使用するためのポリペプチドであって、前記処置は、前記対象に有効量の
ａ．アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｂ．配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｄ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチドを投与することを含み；
前記ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する、ポリペプチド。
【請求項１１】
ａ．医薬有効量の
ｉ）アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｉｉ）配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉｉｉ）配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
ｉｖ）配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される少なくとも１種のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する、ポリペプチド；並びに
ｂ．少なくとも１種の薬学的に許容される担体、賦形剤又は添加剤
を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
筋肉が関連する障害の処置において使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
対象における筋肉が関連する障害を処置する方法であって、前記方法は、前記対象に有効量の
ａ．アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｂ．配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｄ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチドを投与することを含み、
前記ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する、方法。
【請求項１４】
前記筋肉が関連する障害が、筋萎縮、整形外科的傷害、筋肉傷害、筋肉衰弱、心不全、化学療法、脳卒中後、二次性筋肉喪失、サルコペニア、肥満又は代謝症候群から選択されるか、又はこれらによってもたらされる障害である、請求項９若しくは１０に記載の使用のためのポリペプチド、又は請求項１２に記載の医薬組成物、又は請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マイオカイン活性が、筋機能増加活性を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド、又は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド、又は請求項１１若しくは１２に記載の医薬組成物、又は請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記マイオカイン活性が、筋肉強度増加活性を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド、又は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド、又は請求項１１若しくは１２に記載の医薬組成物、又は請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記マイオカイン活性が、筋肉再生改善活性を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド、又は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド、又は請求項１１若しくは１２に記載の医薬組成物、又は請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第１染色体オープンリーディングフレーム５４（Ｃ１ｏｒｆ５４）ポリペプチド及びその変異体に関する。本発明は、マイオカイン活性を有するヒト第１染色体オープンリーディングフレーム５４（Ｃ１ｏｒｆ５４）ポリペプチド及びその変異体を提供する。本発明は、治療において使用するための、ヒト第１染色体オープンリーディングフレーム５４（Ｃ１ｏｒｆ５４）ポリペプチド及びその変異体を提供する。特に、本発明は、筋肉が関連する障害を処置、回復又は予防するための、マイオカイン活性を有するＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド及びその変異体を提供する。
【背景技術】
【０００２】
多くの一般の急性及び慢性状態は、筋骨格の機能低下と関連している。例えば、手術、下肢の傷害、集中治療室（ＩＣＵ）ミオパチー、又は加齢に関連した健康上の制約に続いて廃用性萎縮を有する患者は、典型的には、筋肉量及び機能の進行性の喪失を経験する。正常に機能しない再生としばしば連動した筋肉量又は強度の低減は、不都合な帰結、例えば、重度の機能的な制限、転倒の危険性の増加、身体障害、及び生活の質の低減を伴う。筋骨格の機能低下は、現代社会の全ての社会人口統計学的層に亘る全ての年齢の男性及び女性において共通であり、世界的に数億人の人々に影響を与えている。筋骨格の機能低下の蔓延は年齢と共に著しく増加し、多くは最も一般な生活習慣要因、例えば、低い身体的活動によってさらに影響を受ける。したがって、これらの状態は、大きな未だ対処されていない医学的及び社会経済的な必要性を表す。現在の処置は、予防又は治癒を標的とするよりむしろ、症状の管理に限定されることが多い。
【０００３】
骨格筋は、高い可塑性及び運動に対して高い応答性を有する組織である。衛星細胞（筋肉前駆細胞）は典型的には、運動及び傷害によって活性化され、筋組織のリモデリングにおいて重要な役割を果たしている。運動は、とりわけ、精神疾患、神経系疾患、代謝性疾患、心血管疾患、肺疾患、筋骨格障害、及びがんについて高度に効果的な治療である（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｌｔｉｎ（２０１５）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  ２５  Ｓｕｐｐｌ  ３，１−７２）。筋肉由来分泌因子は、運動の有益な効果の媒介に関与していると考えられる（Ｇｉｕｄｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ（２０１７）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３４，４９−５５）。このような因子は、オートクリン、パラクリン又はエンドクリン効果を発揮し得る種々のサイトカイン及びペプチドを含み、「マイオカイン」と集合的に称される（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｆｅｂｂｒａｉｏ（２０１２）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ８，４５７−４６５）。骨格筋セクレトームの分析は、運動又は収縮に応えて分泌される数百のマイオカインを明らかにしてきた。しかし、全てのマイオカインが筋肉の成長に対してプラスの効果を有するとは限らない。マイオカインであるミオスタチンは、例えば、筋発生を疎外し、陰性の筋肉制御因子である（Ｅｌｋｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ  Ｃａｃｈｅｘｉａ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  Ｍｕｓｃｌｅ  ２，１４３−１５１）。さらに、冒されている患者について、激しい身体的活動を発揮することは一般に困難である。公知の筋肉同化剤は筋肉量を増加させ、これは筋肉強度の増加をそれに続いてもたらし得るが、同化剤は種々の望ましくない副作用をもたらし得る。ステロイドの使用は、高血圧（Ｕｒｈａｕｓｅｎ  Ａ，Ａｌｂｅｒｓ  Ｔ，Ｋｉｎｄｅｒｍａｎｎ  Ｗ．Ｈｅａｒｔ  Ｂｒ  Ｃａｒｄ  Ｓｏｃ．２００４；９０（５）：４９６−５０１）、心臓の心室の機能の低下（Ｐｏｐｅ  ＨＧ，Ｋａｎａｙａｍａ  Ｇ，Ａｔｈｅｙ  Ａ，Ｒｙａｎ  Ｅ，Ｈｕｄｓｏｎ  ＪＩ，Ｂａｇｇｉｓｈ  Ａ．Ａｍ  Ｊ  Ａｄｄｉｃｔ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ａｄｄｉｃｔ．２０１４；２３（４）：３７１−３７７）、心血管疾患、例えば、心臓発作（Ｖａｎｂｅｒｇ  Ｐ，Ａｔａｒ  Ｄ．Ｈａｎｄｂ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１０；（１９５）：４１１−４５７）、動脈損傷（Ｂａｇｇｉｓｈ  ＡＬ，Ｗｅｉｎｅｒ  ＲＢ，Ｋａｎａｙａｍａ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．２０１７；１３５（２１）：１９９１−２００２）及び脳卒中（Ｅｌ  Ｓｃｈｅｉｃｈ  Ｔ，Ｗｅｂｅｒ  Ａ−Ａ，Ｋｌｅｅ  Ｄ，Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ  Ｄ，Ｍａｙａｔｅｐｅｋ  Ｅ，Ｋａｒｅｎｆｏｒｔ  Ｍ．Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ＪＰＥＭ．２０１３；２６（１−２）：１６１−１６５）と関連付けられてきた。さらに、筋肉容量の増加は、必ずしも筋肉強度の増加につながらない（Ｈａｙａｓｈｉｄａ  Ｉ，Ｔａｎｉｍｏｔｏ  Ｙ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｙ，Ｋｕｓａｂｉｒａｋｉ  Ｔ，Ｔａｍａｋｉ  Ｊ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１４  Ｎｏｖ  ３；９（１１）：ｅ１１１８１０）。したがって、筋肉強度に対する直接の質的効果を伴う運動の効果を模倣す��マイオカインをベースとする処置を提供することについて強い医学上の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
本開示のある特定の実施形態を、下記の態様において説明する。
１．マイオカイン活性を有する、配列番号３若しくは配列番号４の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる単離ポリペプチド。
２．１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸が、配列番号３若しくは配列番号４のいずれか１つの配列内で修飾、欠失、付加及び／又は置換されている、態様１に記載の単離ポリペプチド。
３．配列番号３若しくは配列番号４のいずれか１つのアミノ酸配列からなる、態様１に記載の単離ポリペプチド。
４．治療において使用するための、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体。
５．医薬として使用するための、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体。
６．医薬として使用するための、
ａ．アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｂ．配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｄ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
ｅ．アミノ酸配列（ここで、１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸は、配列番号２、３、若しくは４のいずれか１つの配列内で修飾、欠失、付加及び／又は置換されている）を含むか、又はこれからなるポリペプチド
から選択されるポリペプチド。
７．医薬の製造において使用するための、
ａ．アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｂ．配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｄ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
ｅ．アミノ酸配列（ここで、１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸は、配列番号２、３、若しくは４のいずれか１つの配列内で修飾、欠失、付加及び／又は置換されている）を含むか、又はこれからなるポリペプチド
から選択されるポリペプチド。
８．マイオカイン活性を有する、態様４〜７のいずれかに記載の使用のためのポリペプチド。
９．対象における筋肉が関連する障害の処置のための医薬として使用するための、態様４〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
９．ａ．対象における筋肉が関連する障害の処置のための医薬の製造において使用するための、態様４〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
１０．対象における筋肉が関連する障害の処置において使用するためのポリペプチドであって、処置は、対象に有効量の
ａ．アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｂ．配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｄ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
ｅ．アミノ酸配列（ここで、１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸は、配列番号２、３、若しくは４のいずれか１つの配列内で修飾、欠失、付加及び／又は置換されている）を含むか、又はこれからなるポリペプチド
から選択されるポリペプチドを投与することを含み；
前記ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する、ポリペプチド。
１１．ａ．医薬有効量の
ｉ）アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｉｉ）配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉｉｉ）配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｉｖ）配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
ｖ）アミノ酸配列（ここで、１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸は、配列番号２、３、若しくは４のいずれか１つの配列内で修飾、欠失、付加及び／又は置換されている）を含むか、又はこれからなるポリペプチド
から選択される少なくとも１種のポリペプチド（前記ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する）；並びに
ｂ．少なくとも１種の薬学的に許容される担体、賦形剤又は添加剤
を含む、医薬組成物。
１２．筋肉が関連する障害の処置において使用するための、態様１１に記載の医薬組成物。
１３．対象における筋肉が関連する障害を処置する方法であって、前記方法は、対象に有効量の
ａ．アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｂ．配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｄ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
ｅ．アミノ酸配列（ここで、１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸は、配列番号２、３、若しくは４のいずれか１つの配列内で修飾、欠失、付加及び／又は置換されている）を含むか、又はこれからなるポリペプチド
から選択されるポリペプチドを投与することを含み、
前記ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する、方法。
１４．前記筋肉が関連する障害が、筋萎縮、整形外科的傷害、筋肉傷害、筋肉衰弱、心不全、化学療法、脳卒中後、二次性筋肉喪失、サルコペニア、肥満又は代謝症候群から選択されるか、又はこれらによってもたらされる障害である、態様９及び１０のいずれかに記載の使用のためのポリペプチド。
１４．ａ．前記筋肉が関連する障害が、筋萎縮、整形外科的傷害、筋肉傷害、筋肉衰弱、心不全、化学療法、脳卒中後、二次性筋肉喪失、サルコペニア、肥満又は代謝症候群から選択されるか、又はこれらによってもたらされる障害である、態様１２に記載の医薬組成物。
１４．ｂ．前記筋肉が関連する障害が、筋萎縮、整形外科的傷害、筋肉傷害、筋肉衰弱、心不全、化学療法、脳卒中後、二次性筋肉喪失、サルコペニア、肥満又は代謝症候群から選択されるか、又はこれらによってもたらされる障害である、態様１３に記載の方法。
１５．前記マイオカイン活性が、筋機能増加活性を含む、態様１〜３のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
１５．ａ．前記マイオカイン活性が、筋機能増加活性を含む、態様８〜１０のいずれかに記載の使用のための単離ポリペプチド。
１５．ｂ．前記マイオカイン活性が、筋機能増加活性を含む、態様１１〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
１５．ｃ．前記マイオカイン活性が、筋機能増加活性を含む、態様１３に記載の方法。
１６．前記マイオカイン活性が、筋肉強度増加活性を含む、態様１〜３のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
１６．ａ．前記マイオカイン活性が、筋肉強度増加活性を含む、態様８、９及び１０のいずれかに記載の使用のためのポリペプチド。
１６．ｂ．前記マイオカイン活性が、筋肉強度増加活性を含む、態様１１〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
１６．ｃ．前記マイオカイン活性が、筋肉強度増加活性を含む、態様１３に記載の方法。
１７．前記マイオカイン活性が、筋肉再生改善活性を含む、態様１〜３のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
１７ａ．前記マイオカイン活性が、筋肉再生改善活性を含む、態様８〜１０のいずれかに記載の使用のためのポリペプチド。
１７ｂ．前記マイオカイン活性が、筋肉再生改善活性を含む、態様１１〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
１７ｃ．前記マイオカイン活性が、筋肉再生改善活性を含む、態様１３に記載の方法。
１８．ポリペプチドが、少なくとも２つのサイクルを含む断続的な投薬スケジュールに従って投与され、各サイクルが、（ａ）前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体が対象に投与される投薬期間、及び（ｂ）休止期間を含む、対象における筋肉が関連する障害の処置において使用するための、態様４〜６、１０、１２、１４、１４ａ、１４ｂ、１５ａ、１５ｂ、１６ａ、１６ｂ、１７ａ及び１７ｂのいずれかに記載のポリペプチド又は医薬組成物。
１９．対象に有効量のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を投与することを含み、ここで、ポリペプチドが、少なくとも２つのサイクルを含む断続的な投薬スケジュールに従って投与され、ここで、各サイクルが、（ａ）前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体が対象に投与される投薬期間、及び（ｂ）休止期間を含む、態様１３、１４ｃ、１５ｃ、１６ｃ及び１７ｃのいずれかに記載の、対象における筋肉が関連する障害を処置する方法。
２０．対象における筋肉が関連する障害を処置する方法であって、前記方法は、対象に有効量の
ａ．アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｂ．配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｄ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
ｅ．アミノ酸配列（ここで、１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸は、配列番号２、３、若しくは４のいずれか１つの配列内で修飾、欠失、付加及び／又は置換されている）を含むか、又はこれからなるポリペプチド
から選択されるポリペプチドを投与することを含み；
ここで、前記ポリペプチドは、マイオカイン活性を有し、ここで、有効量の前記ポリペプチドは、少なくとも２つのサイクルを含む断続的な投薬スケジュールに従って投与され、ここで、各サイクルは、（ａ）治療的有効量の前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体が患者に投与される投薬期間、及びその後の（ｂ）休止期間を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１−１】図１：相同タンパク質（出現順に、それぞれ、配列番号４６〜６８）を伴うヒトＣ１ｏｒｆ５４（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ８ＷＷＦ１）（配列番号１）のアラインメント。配列は、それぞれ、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ（Ｔｈｅ  ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（２０１７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４５（Ｄ１）：Ｄ１５８−Ｄ１６９）又はｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ（Ｚｅｒｂｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６（Ｄ１）：Ｄ７５４−Ｄ７６１）から、２０１５年８月１８日に取得し、Ｊａｌｖｉｅｗ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２５（９）：１１８９−１１９１）においてＭＵＳＣＬＥアルゴリズム（Ｅｄｇａｒ（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２（５）：１７９２−１７９７）を使用して整列させた。
【図１−２】（上記の通り。）
【図２】ほとんど体を動かさないマウスと比較した、運動したマウスの四頭筋におけるＣ１ｏｒｆ５４ｍＲＮＡレベルの増加。Ｃ１ｏｒｆ５４ｍＲＮＡレベルは、運動の直後に上昇し、運動の停止の３０分後、６０分後及び１８０分後において上昇したままだった。ｎ＝７〜８匹のマウス／群。全ての値は平均±ＳＥＭとして表す。ｌｉｍｍａ−ｖｏｏｍ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを使用してカウント／１００万リードに対して微分解析を行った。全てのｐ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇ複数試験補正を使用して調節した。ほとんど体を動かさない群からの統計的有意差を下記のように示す：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ＦＰＫＭ＝フラグメント／トランスクリプトのキロベース／マッピングされた１００万リード。
【図３】単独で又は組み合わせた異なる運動パラダイムに応答した、若年の対象からのヒト骨格筋におけるＣ１ＯＲＦ５４ｍＲＮＡレベルの増加。トレーニング前及びトレーニング後の個々の値を、若年の参加者の群からの各対象について示す。ｎ＝７〜１１人の参加者／群。トレーニング後の値が入手可能でなかったため、ＣＴ群における１人の対象を統計解析から除外した。全てのｐ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇ複数試験補正を使用して調節した。トレーニング前からの統計的有意差を下記のように示す：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。ＦＰＫＭ＝フラグメント／トランスクリプトのキロベース／マッピングされた１００万リード、ＨＩＩＴ＝激しいエアロビクスインターバルトレーニング、ＲＴ＝レジスタンストレーニング、ＣＴ＝複合運動トレーニング。
【図４】ビヒクル（ＰＢＳ）、又は示した用量にてビヒクル中で配合したアミノ酸配列である配列番号２５を含む単離されたタンパク質で処理したマウスの腓腹筋におけるＭｙｏｄ１ｍＲＮＡにおける変化。ｎ＝５匹のマウス／群。全ての値は平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意差は、１元配置ＡＮＯＶＡ、それに続いてフィッシャーＬＳＤによってアセスメントし、下記のように示す：＊ｐ＜０．０５。Ｍｐｋ＝ミリグラム／体重キログラム。
【図５】示した用量を伴う組換え完全長ヒトＣ１ｏｒｆ５４（配列番号２、ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅｓ、参照ＭＢＳ１２８４９０１）、又はビヒクルによる６時間の処理によるヒト筋芽細胞におけるＭＹＯＤ１ｍＲＮＡの用量依存的減少。値は、平均±ＳＥＭとして表す（群毎にｎ＝４）。統計的有意差を１元配置ＡＮＯＶＡ及びチューキー事後検定によってアセスメントし、下記のように示す：緩衝液対照と比較して、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；グラフにおいて示したように比較して、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１。
【図６】図６Ａ：ビヒクル又はアミノ酸配列である配列番号２５を含む１ｍｇ／ｋｇの単離されたＣ１ｏｒｆ５４タンパク質による処置に応答した絶対筋力の増加。図６Ｂ：ビヒクル又はアミノ酸配列である配列番号２５を含む１ｍｇ／ｋｇの単離されたＣ１ｏｒｆ５４タンパク質による処置に応答した収縮力の増加。筋収縮力は、腓腹筋重量に対して絶対筋力を正規化することによって計算する。パネルＡ及びＢについて、ｎ＝９匹のマウス／群。全ての値は、平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意差は複数の対応のないｔ検定比較によってアセスメントし、下記のように示す：＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１。
【図７】ビヒクル、又はアミノ酸配列である配列番号２５を含む単離されたＣ１ｏｒｆ５４タンパク質による処置に続く、マウス腓腹筋におけるＰａｘ７陽性衛星細胞の数。値は、平均±ＳＥＭとして表す。ｎ＝９〜１０匹のマウス／群。統計的有意差は対応のないｔ検定によってアセスメントし、下記のように示す：＊＊ｐ＜０．０１。
【図８】１％ＦＢＳを含有する成長培地中の１μｇ／ｍＬの組換え完全長ヒトＣ１ｏｒｆ５４タンパク質（配列番号２、ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅｓ、参照ＭＢＳ１２８４９０１）（四角）及び溶媒対照（丸）で処理された一次ヒト筋芽細胞の成長曲線（コンフルエンスパーセントでの）。値は、平均±ＳＥＭとして表す（群毎にｎ＝６）。統計的有意差は複数の対応のないｔ検定比較によってアセスメントし、下記のように示す：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
一般的定義
本発明をより容易に理解し得るために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明を通して説明する。
【０００７】
用語「含むこと」は、「含めること」及び「からなること」を意味し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなり得るか、又は何かさらなるもの、例えば、Ｘ＋Ｙを含み得る。
【０００８】
本発明は、生物活性を有するＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド及びその変異体を含む。本明細書において使用する場合、用語「第１染色体オープンリーディングフレーム５４（Ｃ１ｏｒｆ５４）ポリペプチド」は、第１染色体オープンリーディングフレーム５４（Ｃ１ｏｒｆ５４）遺伝子によってコードされるポリペプチドを指し、特に好ましいのは、好ましくは、本明細書においてシグナルペプチドを伴わないＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドを指す、配列番号２において示すようなアミノ酸配列を有する、ヒト第１染色体オープンリーディングフレーム５４（Ｃ１ｏｒｆ５４）である（ＵｎｉＧｅｎｅ  ＩＤ：１４１４２６、ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．９１２８３、ＮＭ＿０２４５７９．３、ＮＰ＿０７８８５５．２、配列番号１を有するＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ８ＷＷＦ１、これは、本明細書において、シグナルペプチドを含むＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドを指す）。
【０００９】
明瞭性及び一貫性のために、本出願を通して及び特許請求の範囲においてＣ１ｏｒｆ５４タンパク質におけるアミノ酸残基の番号付けは、シグナルペプチドを伴わない（すなわち、配列番号２）Ｃ１ｏｒｆ５４の野生型Ｃ１ｏｒｆ５４タンパク質配列の番号付け（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ８ＷＷＦ１）をベースとする。本明細書において、この配列番号２は、「完全長配列」と称される。
【００１０】
用語「Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド」はまた、本明細書において開示されているＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドの変異体（例えば、アミノ酸配列番号３若しくは配列番号４を含むＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド、又は他の短縮型、融合若しくは変異Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド）を含む。この用語はまた、個々に及び一緒にポリペプチドのそれぞれを指す。例えば、○○の調製、○○の精製、○○の誘導、○○の投与、○○を含有する組成物、○○による疾患の処置などについての記載は、個々又は一緒の各ポリペプチドに関する。Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド変異体は、マイオカイン活性を有するＣ１ｏｒｆ５４野生型配列から少なくとも１個のアミノ酸（例えば、欠失、置換又は付加）が異なるタンパク質であり、ここで、用語「野生型配列」は、少なくとも１つの天然に存在する生物において利用可能であるポリペプチド若しくは遺伝子配列、又は人によって変化していないか、変異していないか、若しくは他の方法で操作されていないポリペプチド若しくは遺伝子配列を指す。このような野生型配列は、自然から単離することができるか、又は組換え若しくは合成手段によって生じさせることができる。
【００１１】
本明細書に記載されているＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドは、種々の源、例えば、ヒト組織のタイプから単離し得るか、又は組換え若しくは合成法によって調製し得る。
【００１２】
本明細書において使用する場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを説明する。用語「ポリペプチド」は、これらに全く限定されないが、組換え完全長、プロペプチド及び／又は成熟ポリペプチド形態、並びに生物活性を有するフラグメント若しくはスプライス変異体、又は完全長ポリペプチドに由来する生物活性を有する組換えによって作製された短縮型を意味することができる。ポリペプチドの組換え形態は、例えば、原核細胞及び／若しくは真核細胞における組換えタンパク質の発現、それに続く１つ若しくは複数の単離及び精製ステップ、並びに／又はペプチド合成機を使用してポリペプチド若しくはその部分を化学的に合成することを含めた、当業者には周知である標準的な方法及びプロトコルによって生じさせることができる。さらに、用語「ポリペプチド」は、１個若しくは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
【００１３】
本明細書において使用する場合、用語「単離ポリペプチド」は、その本来若しくは天然の環境（例えば、これが天然に存在する場合、自然環境）から取り出されたポリペプチドを指すことを意図する。例えば、生きている動物中に存在する天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、自然系において共存する材料のいくらか又は全てからヒトの介入によって分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの部分でよく、且つ／又はこのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは、組成物の部分でよく、このようなベクター又は組成物はそれが自然において見出される環境の部分ではないという点で、まだ単離することができる。
【００１４】
本明細書において使用する場合、「保存的に修飾された変異体」は、コードされた配列中の単一のアミノ酸又はアミノ酸の僅かな割合を変化させ、付加し、置換し、且つ／又は欠失させる、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列への個々の置換、欠失又は付加を指し、ここで、変化は、化学的に同様のアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす。機能的に同様のアミノ酸を実現する保存的置換表は、当技術分野において公知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多形変異体、種間ホモログ、及び対立遺伝子を除外しない。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されてきた。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。このように、ポリペプチド若しくはその変異体におけるアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えることができる。
【００１５】
用語「配列類似性」は、最良配列アラインメントの同じ位置におけるアミノ酸が同一又は同様、好ましくは、同一であることを意味する。「同様のアミノ酸」は、同様の特徴、例えば、極性、溶解性、親水性、疎水性、電荷、又はサイズを有する。
【００１６】
用語「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、本明細書に記載のようなＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド及びバリアント配列に関して、必要に応じて、配列を整列させ、ギャップを導入して、配列同一性の最大パーセントを達成した後に、且つ配列同一性の部分として保存的置換を考慮しない、特定のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当技術分野の範囲内の様々な方法で、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＥＭＢＯＳＳニードル、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長に亘る最大アラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含めた、アラインメントを測定するために適正なパラメーターを決定することができる。「アミノ酸配列類似性パーセント（％）」は、アミノ酸配列同一性％を決定するのに使用する同じ計算によって決定されるが、計算における同一のアミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含む。
【００１７】
用語「同一の」は、２つ若しくはそれより多い核酸又はポリペプチド配列との関連で、同じ配列を有する２つ若しくはそれより多い配列又は部分配列を指す。
【００１８】
２つ若しくはそれより多いポリペプチドにおける類似の位置は、アミノ酸配列又は構造的類似性に基づいて、ポリペプチド配列を整列させることによって決定することができる。このようなアラインメントツールは、好ましくは、Ａｌｉｇｎ  ＥＭＢＯＳＳニードルについて標準的な設定（マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５）を使用して、例えば、ワールドワイドウェブ、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）又はＡｌｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）上で得ることができる。満足できるアラインメントを生じさせるためにいずれかの配列においてギャップを導入することが必要であり得ることを当業者は理解する。２つ若しくはそれより多いＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体における残基は、残基が最良配列アラインメントで整列している場合、「対応している」と言われる。２個のポリペプチドの間の「最良配列アラインメント」は、最も大きな数の整列された同一の残基を生じさせるアラインメントと定義される。
【００１９】
本明細書に開示されているように、本発明は、最良配列アラインメントを使用したタンパク質の全長に亘り、及び／又は最良配列アラインメントの領域に亘り、単離されたＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド、好ましくは、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチドアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約８１％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約８２％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約８３％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約８４％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約８５％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約８６％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約８７％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約８８％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約８９％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約９０％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約９１％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約９２％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約９３％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約９４％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約９５％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約９６％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約９７％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約９８％のアミノ酸配列類似性、代わりに、少なくとも約９９％のアミノ酸配列類似性、好ましくは、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるヒトＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドに関し、ここで、最良配列アラインメントは、本明細書において配列番号２として示したアミノ酸配列では、標準的な設定、好ましくは、ＥＭＢＯＳＳ：：ニードル（マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５）を使用して、当技術分野において公知のツール、例えば、Ａｌｉｇｎで得ることができる。
【００２０】
「Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド変異体」又は「Ｃ１ｏｒｆ５４変異体」は、最良配列アラインメントを使用したタンパク質の全長に亘り、及び／又は最良配列アラインメントの領域に亘り、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列類似性、好ましくは、１００％の配列同一性を有する、本明細書に定義されているような生物活性のあるＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドを意味し、ここで、最良配列アラインメントは、完全長Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド配列、例えば、配列番号２、又は完全長Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド配列、例えば、本明細書に記載のような配列番号３若しくは配列番号４の任意の他のフラグメントでは、標準的な設定、好ましくは、ＥＭＢＯＳＳ：：ニードル（マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５）を使用して、公知のツール、例えば、Ａｌｉｇｎで得ることができる。Ｃ１ｏｒｆ５４変異体はまた、シグナルペプチド配列を含むＣ１ｏｒｆ５４前駆体タンパク質、例えば、アミノ酸配列番号１を含むポリペプチドである。Ｃ１ｏｒｆ５４変異体はまた、Ｃ１ｏｒｆ５４タンパク質を含む融合タンパク質、例えば、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列、例えば、免疫グロブリンＦｃ領域、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチドに融合しているか、又は例えば、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるために別の部分、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートしているＣ１ｏｒｆ５４タンパク質を含むタンパク質である。一実施形態では、このようなＣ１ｏｒｆ５４変異体は、タグポリペプチドを有するＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体の融合物を含む。タグは一般に、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に置かれる。Ｃ１ｏｒｆ５４変異体はまた、完全長Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド又はＣ１ｏｒｆ５４変異体の短縮型であり、ここで、短縮型は、ポリペプチドのＮ末端において、又はポリペプチドのＣ末端において、又はポリペプチドのＮ末端及びポリペプチドのＣ末端の両方においてでよい。本発明によれば、配列番号３及び配列番号４を有するポリペプチドは、配列番号２に示す完全長Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチドのこのような短縮型変異体である。変異体はまた、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくはそれより多いアミノ酸の位置においてアミノ酸の置換、修飾、付加及び／又は欠失を含有する生物活性を有するポリペプチドを含み、最良配列アラインメントを使用したフラグメントの全長に亘り、及び／又は最良配列アラインメントの領域に亘り、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは、１００％の配列同一性を有し、ここで、最良配列アラインメントは、配列番号２、３、若しくは４において示すアミノ酸配列では、標準的な設定、好ましくは、ＥＭＢＯＳＳ：：ニードル（マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５）を使用して、当技術分野において公知のツール、例えば、Ａｌｉｇｎで得ることができる。本明細書に記載のような適切な生物系、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでアセスメントするように、本明細書に記載のようなＣ１ｏｒｆ５４変異体は、このようなタンパク質が配列番号２において示すような完全長Ｃ１ｏｒｆ５４タンパク質の機能的等価物と考えることができるという意味でその生物活性を保持し、すなわち、変異体は、例えば、本明細書に記載のような増加する筋機能の生物活性を保持するか、又は変異体は、配列番号２において示すような完全長Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチドについて観察される、生物活性の少なくとも１つを超える。Ｃ１ｏｒｆ５４変異体はまた、アミノ酸配列である配列番号５〜９又は配列番号１０〜１４のいずれかを含む単離ポリペプチドである。
【００２１】
さらに、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチドに関する機能的等価物は、少なくとも１つの自然変異又は人工的変異を含むＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体として理解される。変異は、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチドの生物活性を減少させない１個若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失又は置換であり得る。
【００２２】
上記のような融合タンパク質の場合、配列同一性又は配列類似性は、このような融合タンパク質のＣ１ｏｒｆ５４部分のみに基づいて定義されるべきであり、すなわち、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体に由来しないさらなるアミノ酸は、このようなアラインメントにおいて考慮されず、すなわち、アラインメントスコアの計算から除外される。上記のような短縮型タンパク質の場合、配列同一性又は配列類似性は、短縮型Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体のみに基づいて定義されるべきである。変異体は、融合又は短縮型Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド変異体に対して、例えば、配列番号３若しくは配列番号４を有するＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド変異体に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を示し得る。
【００２３】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において公知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似法への探求によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された遂行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって、又は手操作によるアラインメント及び目視検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）によって行うことができる。
【００２４】
配列比較のための好ましいアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳニードルであり、これは、２つの入力配列を読み、それらの最適なグローバル配列アラインメントをファイルに書く。このプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列のそれらの全長に沿った最適なアラインメント（ギャップを含めた）を見つける。ＥＭＢＯＳＳニードルについての標準的な設定は、ギャップオープン１０．０について１０．０のペナルティー及びギャップ伸長について０．５を伴う、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスである。
【００２５】
Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチドは、それらの生理学的環境と情報交換するために筋細胞が使用する複雑系の部分であり、したがって、これはマイオカインとして分類される。
【００２６】
本明細書において使用する場合、用語「マイオカイン」は、筋細胞によって産生され、発現され、放出されるサイトカイン、ペプチド又はポリペプチド、プロテオグリカンペプチド、生理活性脂質、セカンドメッセンジャーなどを指す。
【００２７】
本明細書において使用する場合、用語「マイオカイン活性」は、対象、細胞、又は組織、例えば、脂肪組織、脳、膵臓、腸、肝臓、免疫細胞、骨、肝臓及び腫瘍細胞に対する、マイオカイン、又はマイオカインシグナルによって生じるオートクリン、パラクリン及び／又はエンドクリン効果を指す。マイオカイン活性は、阻害性又は刺激性であり得る。このような「マイオカイン活性」は、筋肉肥大、筋肉再生の増加、筋肉強度の増加（力発揮能力）、一次ヒト骨格筋細胞の増殖、筋神経支配の増加、細胞外マトリックスリモデリングに対する効果、骨代謝のモデュレーション（例えば、骨量、骨密度、骨形成、骨石灰化、骨治癒）、脂肪代謝のモデュレーション（例えば、脂肪分解の増加、リポタンパク質リパーゼ活性の減少、脂肪組織の褐変の増加、熱産生の増加、脂肪組織量の減少、脂肪酸酸化の増加、循環及び／又は肝臓トリグリセリドのレベルの減少、総体脂肪の減少、内臓脂肪の減少）、免疫細胞応答のモデュレーション、免疫調節性プロセスのレギュレーション、炎症過程のモデュレーション、免疫細胞の応答のモデュレーション、炎症の低減、エネルギー消費の刺激、全身代謝のモデュレーション、全身インスリン感受性のモデュレーション、グルコース代謝のレギュレーション（例えば、グルコース取込みの増加、グリコーゲン合成の増加、グルコース酸化の増加、グルコース耐性の改善、インスリン感受性の改善）、膵ベータ細胞生存率の促進、アルファ細胞過形成、全身性の心血管適応（心拍出量の増加、血液容量の増進を含めた）、血管形成の増加（例えば、血管新生、骨格筋細胞又はその近くの毛細血管化、改善された酸素供給及び利用、血管修復プロセスの増加、アテローム発生の減少、血圧の制御）、心臓保護、認知機能及び記憶の改善、ストレス及びうつの減少、脳神経発生、がん保護（例えば、アポトーシスの増加、及び免疫エフェクター細胞の動員を介した）、並びに抗加齢効果をもたらし得る。本明細書において使用する場合、前記マイオカイン活性は好ましくは、筋機能における増加をもたらす。
【００２８】
本明細書において使用する場合、用語「筋機能の増加」又は「増加した筋機能」又は「筋機能増加活性」（など）は、ｉ）筋肉強度の増加、ｉｉ）筋肉前駆細胞増殖の増加、ｉｉｉ）筋肉再生活性の改善、又はｉｖ）筋肉疲労性抵抗性の増加の少なくとも１つ若しくは複数をもたらす活性を指すことを意図する。用語「増加（した）」又は「改善された」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定されるパラメーター（例えば、筋肉強度、筋肉前駆細胞増殖、筋肉再生活性、衛星細胞増殖アッセイ又は筋肉疲労性抵抗性）が、第１の時点と比較して第２の時点において高い状態を指す。前記パラメーターは、例えば、本明細書に記載のような適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏでのアッセイ、例えば、ヒト筋芽細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイ又はｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス衛星細胞増殖又は筋肉強度を評価する方法を使用してアセスメントすることができる。
【００２９】
本明細書において使用する場合、用語「筋肉強度」（など）は、筋肉、又は筋肉群が合計で生じさせることができる力の最大量を指す。筋肉強度は、種々の方法、例えば、握力、１回反復最大強度試験、筋肉耐久性の時間依存試験、筋肉疲労の時間依存試験、又は筋肉耐久性及び疲労の時間依存試験などによって評価し得る。筋肉強度は、単一又は複数の関節及び呼吸筋及び他の筋肉（例えば、肺機能試験）に亘り、動的（例えば、３０秒の椅子立ち上がり試験、階段昇降試験、膝の屈曲／伸展）又は静的（例えば、握力測定、アイソメトリック膝伸展／屈曲）動作によってアセスメントし得る。
【００３０】
本明細書において使用する場合、対象における用語「筋肉強度の増加」（など）はまた、処置の前と比較し、少なくとも２週間後、少なくとも４週間後、少なくとも８週間後、少なくとも１２週間後、少なくとも１６週間後、少なくとも２０週間後、少なくとも２４週間後、少なくとも２８週間後、少なくとも３２週間後、少なくとも３６週間後、少なくとも４０週間後、少なくとも４４週間後、少なくとも４８週間後、少なくとも５２週間又はそれより長い処置の後で測定した、筋肉強度及び／又は身体的能力の増加を指すことを意図する。
【００３１】
身体的能力は、簡易身体能力バッテリー（ＳＰＰＢ）、歩調スピード測定、タイムドアップアンドゴー試験（ＴＧＵＧ）、階段昇降力試験（ＳＣＰＴ）、４００ｍ歩行試験及び／又は６分歩行距離試験（６ＭＷＤ）によってアセスメントし得る。
【００３２】
本明細書において使用する場合、用語「レギュレートする」は、機能のレベル又は活性が、本発明によって提供される薬剤の非存在下で観察されるものより大きいか、等しいか、若しくは満たないことを説明するために使用される。
【００３３】
用語「対象」又は「患者」は、本明細書において使用する場合、筋肉が関連する障害若しくは疾患を患い得るか、又は苦しんでいるか、或いは筋機能の増加から他に利益を得る、ヒト及び動物を含むことを意図する。対象の例は、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、及びトランスジェニックのヒトではない動物を含む。一実施形態では、対象は、ヒト、例えば、筋肉が関連する障害を患っているか、患う危険性があるか、又は患う潜在力があるヒトである。好ましい実施形態では、対象は、ヒト対象、例えば、筋肉が関連する障害を有するヒト患者である。別の実施形態では、対象は、動物、例えば、前記動物の除脂肪体重又は筋機能を増加させるために本明細書において開示された方法（例えば、Ｃ１ｏｒｆ５４の投与）によって処置されるウシ又はブタである。
【００３４】
本明細書において使用する場合、対象は、このような対象（患者）が生物学的に、医学的に又は生活の質においてこのような処置から利益を得る場合、処置を「必要としている」。
【００３５】
本明細書において使用する場合、用語「筋肉量」は、筋肉の重量、質量、面積、又は容量によって表されるような筋肉又は筋肉群の量又はサイズを指す。筋肉量はまた、総除脂肪体重、体の区画、例えば、脚の除脂肪体重、又は脚若しくは腕の区画の断面積として表し得る。筋肉の容量又は質量は、筋肉の面積、容量、又は質量を提供する任意の公知であるか若しくは他の有効な技術、例えば、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）、バイオインピーダンス分析（ＢＩＡ）、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、超音波、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、又は脂肪非含有軟部組織当たりの総若しくは部分的体内カリウム（ＴＢＫ若しくはＰＢＫ）を使用して決定することができる。
【００３６】
本明細書において使用する場合、用語「衛星細胞」は、筋線維の基底膜の下に天然に位置しており、且つ自己再生することができ、新たな骨格筋細胞を形成する（すなわち、筋原性）ことができる、小さな単核幹細胞を指すことを意図する。衛星細胞の最も決定的なマーカーは、出生後筋肉の全ての衛星細胞において存在し、且つそれらが分化し始めるまで増殖性筋芽細胞において発現しているＰａｘ７である。
【００３７】
本明細書において使用する場合、用語「筋肉の再生能」、「筋肉再生活性」又は「筋肉再生改善活性」（など）は、生存若しくは機能的筋細胞の総数を増加させるか、回復するか、又は維持し、且つ損傷、例えば、疾患又は傷害に続く組織喪失に応答した欠陥のある筋肉線維の置換を実現するための、筋細胞の再成長又は修復のプロセスを指すことを意図する。この損傷に応答して、衛星細胞は活性化され、コミットされた筋芽細胞となり、これは次いで、増殖し始め、修復のための前駆細胞の集団を拡張させる（例えば、Ｋｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｕｄｎｉｃｋｉ（２００８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １４，８２−９１を参照されたい）。最終的に、増殖性筋芽細胞は細胞周期から離脱し、最終分化を起こす。これらは互いに融合し、再生しつつある筋線維を形成し、損傷され死んだものを置き換える。用語「筋肉の再生能」又は「筋肉再生活性」（など）はまた、衛星細胞が媒介する成長（細胞周期に再び入り、増殖するか、現存する筋肉線維中に融合するか、又は新たな筋肉線維を形成する）、シンシチウム筋線維成長又は筋芽細胞依存性の新規の筋線維分化のプロセスを含み、それによって、筋線維成長はまた、筋芽細胞依存性であり得、新規の筋線維分化は、衛星細胞依存性であり得、ここで、筋線維は、現存する筋肉線維中に融合し、且つ／また再生する筋線維のサイズを増加させ、且つ／又は新たな筋肉線維を形成し、それによって、骨格筋再生を促進する。
【００３８】
本明細書において使用する場合、用語「筋肉が関連する障害」は、人間が正常な日々の独立性を維持するのに必要とされるレベルで筋肉がその機能を遂行することができないような、筋肉機能障害（例えば、筋肉強度若しくは筋力の低減、再生能の低減及び／又は耐久性の低減）をもたらす疾患若しくは障害を指すことを意図する。対象は、それらの生理学的タスクを適当に行う正常な機能を損ない得る。このような筋肉機能障害は、身体障害、損なわれた可動性、機能的独立性の喪失、頻繁な転倒、転倒する恐れ、傷害を与える転倒、筋肉の消耗、正常な機能が損なわれた不安定な歩調、不都合な歩調力学、側彎症、走りジャンプすることが困難なこと、物を持ち上げることが困難であること、筋強直、眼瞼下垂、筋肉肥大、筋肉の発育不全若しくは萎縮、呼吸困難、歩行不能、学習不能、バランスの不均衡、臥位若しくは座位から起き上がることが困難であること、立ち上がるのにガウアーの手段を使用すること、及び／又は耐久性の低減をもたらし得る。
【００３９】
本明細書において使用する場合、用語「筋肉喪失」は、筋肉量及び質の悪化の状態を指すことを意図する。筋肉喪失の非限定的な症状は、筋肉量の喪失若しくは低減、除脂肪筋肉の喪失若しくは低減、筋肉重量の喪失若しくは低減、筋肉周囲長の喪失若しくは低減、筋機能の喪失若しくは低減、筋肉強度の喪失若しくは低減、可動性の喪失若しくは低減、又は任意のこれらの組合せであり得る。例えば、筋肉喪失は、加齢、疾患（例えば、がん及び肝疾患）、無活動、傷害（例えば、肝臓移植）、又は任意のこれらの組合せによってもたらし得る。本明細書において使用する場合、用語「筋肉喪失」は、筋肉老化の自然のプロセス、並びに先天性の病状及び後天性の病状を包含する。筋肉老化は、進行性の骨格筋喪失をもたらし、これらに限定されないが、サルコペニアを含む。用語「筋肉喪失」はまた、任意の先天性又は後天性の筋肉の退化、骨格筋に影響を与える衰弱、機能障害及び／又は喪失を包含する。先天性の病状は、これらに限定されないが、ミオパチー（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィー、及びエメリ−ドレフュス型筋ジストロフィー）を含む。対照的に、骨格筋に影響を与える後天性の病状は遺伝せず、炎症（例えば、炎症性ミオパチー）、薬物（例えば、薬物誘発性ミオパチー）、外傷若しくは傷害（例えば、外傷によって誘発されるミオパチー若しくは手術によって誘発されるミオパチー）、結合組織及び筋肉の虚血（例えば、バージャー病）、がん（例えば、がんによって誘発されるサルコペニア）又はそれどころか食餌（例えば、食餌によって誘発されるミオパチー）によって誘発し得る。一部の実施形態では、開示されている組成物、使用、キット、方法及び化合物は、患者における筋肉喪失を低減、抑止又は反転させる。
【００４０】
本明細書において使用する場合、用語「二次性筋肉喪失」は、傷害、疾病又は外傷からもたらされる、筋肉量及び質の悪化の状態を指すことを意図する。これらには、これらに限定されないが、脳卒中、自動車事故、重度の火傷、戦闘傷害、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、糖尿病、がん、手術と関連する活動、筋肉及び関節を長時間動かすことができないこと（例えば、ベッドでの安静、ギプス固定）、並びに体内で負の窒素バランスを生じさせる他の状態が含まれる。１０日超のベッドでの安静による不使用は、骨格筋、強度及び患者の機能の喪失をもたらすことが長く認識されてきたが、短期間の不使用（１０日未満）の後でかなりの筋肉喪失及び萎縮が既に起こることが今やまた理解されている（Ｄｉｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６５，２８６２−２８７５、Ｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ  １２，８９８−９０６）。したがって、用語「二次性筋肉喪失」は、短期間の不使用及び長期間の不使用の後に起こる筋肉喪失を包含する。一部の実施形態では、開示されている組成物、使用、キット、方法及び化合物は、患者における二次性筋肉喪失を低減、抑止又は反転させる。
【００４１】
本明細書において使用する場合、用語「サルコペニア」は、Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｏｎ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ（Ｃｒｕｚ−Ｊｅｎｔｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｇｅ  Ａｇｅｉｎｇ  ３９，４１２−４２３）及びＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｎ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ（Ｆｉｅｌｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ  Ａｍ  Ｍｅｄ  Ｄｉｒ  Ａｓｓｏｃ  １２，２４９−２５６）によって定義されているような、高齢者において見られる、骨格筋量、強度の進行性及び全身性の喪失、並びに損なわれた機能的能力によって特性決定される症候群を指す。さらに、サルコペニアは、疾患、手術及び他の状態と関連する骨格筋量及び機能の喪失を説明するために使用される（がん（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）ＢＭＪ  Ｏｐｅｎ；４：ｅ００３６９７．ｄｏｉ：１０．１１３６／ｂｍｊｏｐｅｎ−２０１３−００３６９７）、肝硬変（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ＥＳＰＥＮ．２４：１８５−１８６）、慢性閉塞性肺疾患（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｔｈｏｒａｘ．７０：２１３−８）、末梢動脈疾患（Ａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ａｒｃｈ  Ｐｈｙｓ  Ｍｅｄ  Ｒｅｈａｂｉｌ．９９（４）：６２３−６２８）、脳卒中後（Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１７）Ａｒｃｈ  Ｐｈｙｓ  Ｍｅｄ  Ｒｅｈａｂｉｌ．９８（３）：４９５−４９９）、及び心不全（Ｓａｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｔｈｅｒ．１６（２）：１３３−１４２）、並びに臓器移植を経験したもの（Ｍｅｅｋ  ａｎｄ  Ｍａｄｉｌｌ（２０１７）Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ＥＳＰＥＮ．２２：７６−８０）及び股関節骨折から回復しているもの（Ｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１７）Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ  Ｉｎｔ．２８：１５６９−１５７６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００１９８−０１７−３９２９−ｚ）。一般に、サルコペニアの診断は、低い筋肉量、並びに低い筋肉強度及び低い身体的能力の少なくとも１つの存在を必要とする。用語「サルコペニア」は、一次性サルコペニア（加齢に関連したサルコペニア）及び二次性サルコペニアを含み、ここで、筋肉及び機能の喪失は、別の状態（例えば、ベッドでの安静、無活動、座ることの多い生活形態、及び体調不良からもたらされる、活動が関連するサルコペニア；心臓、肺、肝臓、腎臓及び／若しくは脳の進行性臓器不全、炎症性疾患、悪性腫瘍又は内分泌疾患と関連する、疾患が関連するサルコペニア、並びに例えば、吸収不良、胃腸障害、又は食欲不振症をもたらす医薬品の使用による、エネルギー及び／又はタンパク質の不適切な食物摂取からもたらされる栄養が関連するサルコペニアを含めた）の帰結である。一部の実施形態では、開示されている組成物、使用、キット、方法及び化合物は、患者におけるサルコペニアを低減、抑止又は反転させる。
【００４２】
本明細書において使用する場合、用語「悪液質」は、Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐｓ（ＳＩＧ）「ｃａｃｈｅｘｉａ−ａｎｏｒｅｘｉａ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」及び「ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ」（Ｍｕｓｃａｒｉｔｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ２９，１５４−１５９）によって定義されているような、脂肪組織の喪失を伴う若しくは伴わない骨格筋の喪失による、進行性の体重喪失、筋肉の消耗／喪失及び疲労によって特性決定される消耗を指す。悪液質は、炎症、インスリン抵抗性、食欲不振症、並びに重度の慢性疾病、例えば、がん、慢性心不全、慢性心筋症、慢性腎不全、末期腎疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝不全、肝硬変、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、重度の火傷傷害及び関節リウマチによる筋肉のタンパク質の分解の増加と関連付けられることが多い。一部の実施形態では、開示されている組成物、使用、キット、方法及び化合物は、患者における悪液質を低減、抑止又は反転させる。
【００４３】
本明細書において使用する場合、用語「筋肉衰弱」は、外傷、例えば、手術及び急性又は長期に亘る傷害、不使用に続いて、例えば、脳卒中、若しくは高レベルの炎症、又は収縮強度にかかわらず個々の筋肉若しくは筋肉群の下部の力発揮能力によってもたらされる関節の周りの力の減少をもたらす他の状態に続いて見られる、筋肉強度の喪失を含む。手術後の筋肉衰弱は、外科手術に続く１つ若しくは複数の筋肉の強度における低減を指す。衰弱は、全身化（すなわち、全身衰弱）し得るか、又は特定の領域、体の側面、肢、若しくは筋肉に局在化し得る。外傷後の筋肉衰弱は、外傷性エピソード（例えば、体の傷害、手術又は脳卒中）に続いて、１つ若しくは複数の筋肉の強度における低減によって特性決定される。一部の実施形態では、開示されている組成物、使用、キット、方法及び化合物は、患者における筋肉衰弱を低減、抑止又は反転させる。
【００４４】
本明細書において使用する場合、用語「投与すること」は、医薬活性成分、例えば、本明細書に記載のようなＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体の投与量を、それを必要とする対象に与える方法を指すことを意図する。
【００４５】
用語「薬学的に許容される」は、本明細書において使用する場合、正しい医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー応答及び他の問題又は合併症を伴わない、対象、例えば、哺乳動物又はヒトの組織との接触に適したそれらの化合物、材料、組成物及び／又は剤形を指す。
【００４６】
本明細書において使用する場合、用語「薬学的に許容される担体、賦形剤又は添加剤」又は「担体、賦形剤又は添加剤」は、組成物を増強若しくは安定化させるか、又は組成物の調製を促進するために使用することができる、医薬組成物の調製又は使用において有用な物質を指す。薬学的に許容される担体は、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤並びに吸収遅延剤などを含み、例えば、生理学的に適合性であり、且つ必要に応じて動物、又はヒトに投与したとき、拒絶反応、アレルギー反応又は他の有害反応を生じさせない、適切な賦形剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤、緩衝剤、かさ増し剤、凍結防止剤、リオプロテクタント、塩、薬物安定剤、結合剤、添加剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、染料、及びこれらの組合せ、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤並びに吸収遅延剤などを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  Ｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２０１３，ｐｐ．１０４９−１０７０を参照されたい）。任意の通常の媒体又は薬剤が活性化合物と不適合でない限りは、本明細書に記載されている組成物におけるその使用が意図される。
【００４７】
用語「医薬組成物」は、本明細書において使用する場合、それらの所望の活性のために最も適した身体的な部位への投与、例えば、全身投与に適した形態での、少なくとも１種の薬学的に許容される担体、賦形剤又は添加剤と一緒の、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を指す。用語「医薬組成物」は、対象に影響を与えている特定の疾患若しくは状態を処置するために対象、例えば、哺乳動物又はヒトに投与される、少なくとも１種の治療剤、好ましくは、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を含有する混合物又は溶液を指すことを意図する。他に示さない場合、これらは、例えば、様々な通常の混合、粉砕、直接圧縮、造粒、糖コーティング、溶解、凍結乾燥プロセス、又は当業者には容易に明らかである製作技術を用いて、それ自体公知の様式で調製される。必要な有効量は、複数の投与量単位の投与によって達し得るため、各剤形の個々の用量の単位含量は、それ自体で有効量を構成する必要はないことを認識されたい。単一の剤形を生じさせるために担体材料と合わせることができる活性剤の量は、処理される対象、及び投与の特定のモードによって変化する。単一の剤形を生じさせるために担体材料と合わせることができる活性剤の量は一般に、治療効果を生じさせる組成物のその量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせた、約０．０１パーセント〜約９９パーセントの範囲の活性剤、約０．１パーセント〜約７０パーセント、又は約１パーセント〜約３０パーセントの範囲の活性剤であり得る。
【００４８】
本発明の医薬組成物は、「治療的有効量」又は「有効量」の明細書に記載されているＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を含み得る。本明細書において使用する場合、用語「有効量」、「有効用量」、「医薬有効量」、「薬学的に有効な用量」、「治療的有効量」又は「治療有効用量」（など）は互換的に使用され、筋肉が関連する疾患若しくは障害の臨床的に観察可能な徴候及び症状のベースラインを超えた観察可能な若しくは臨床的に意味がある改善を実現し、且つ／又は筋肉が関連する疾患若しくは障害と関連する１つ若しくは複数の症状を予防するか、発生を阻害するか、回復させるか、遅延させるか、軽減するか、抑止するか、逆転させるか、又は処置するのに必要である投与量にて、及びこれらについて必要である期間について十分である、本明細書に記載されているＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体の量／用量を指すことを意図する。有効量は、疾患のタイプ、使用される組成物、投与経路、処置される哺乳動物のタイプ、考慮している特定の哺乳動物の身体的特徴、併用する医薬品、並びに医術における当業者が認識する他の要因、例えば、個体の病態、年齢、性別、及び体重によって決まる。治療的有効量はまた、治療剤の治療的に有益な効果は、任意の毒性効果又は有害な効果を補ってなお余り有る。このような化合物の毒性及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養物又は実験動物において標準的な医薬手順によって決定することができる。毒性効果及び治療効果の間の用量比は治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用し得る一方、非感染細胞への潜在的な損傷を最小化し、それによって、副作用を低減させるために、冒された組織の部位に対してこのような化合物を標的とする送達系を設計するように注意を要するべきである。細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトにおいて使用するための投与量範囲を配合することにおいて使用することができる。このような化合物の投与量は、好ましくは、僅かな毒性を伴う若しくは毒性を伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いる剤形及び投与経路によってこの範囲内で変化し得る。本発明の方法において使用する任意の化合物について、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養において決定するようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて配合し得る。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。別の実施形態では、用語「治療的有効量」は、細胞、又は組織、又は細胞ではない生物学的材料、又は媒体に投与したとき、細胞、組織又は細胞ではない生物学的材料上のマイオカインとして少なくとも部分的に作用するのに有効である本発明のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体の量を指す。
【００４９】
本明細書において使用する場合、疾患若しくは障害に関連して、用語「予防する」、「予防すること」又は「予防」は、対象が状態を発生させる可能性を減少させることをもたらす、状態（例えば、特定の疾患若しくは障害又はその臨床症状）を発生させる危険性がある対象の予防的処置を指す。一部の実施形態では、開示されている組成物、使用、キット、方法及び化合物は、患者における予防的処置において使用される。
【００５０】
本明細書において使用する場合、筋肉が関連する障害と関連して、用語「処置する」、「処置すること」又は「処置」は、一実施形態では、疾患若しくは障害を回復させること（すなわち、疾患、又はその臨床症状の少なくとも１つの発生を遅延又は抑止又は低減させること）を指す。別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」又は「処置」は、患者によって識別可能でないことがあるものを含めて、少なくとも１つの身体的パラメーターを軽減又は回復させることを指す。さらに別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」又は「処置」は、身体的に（例えば、識別できる症状の安定化）、生理学的に（例えば、身体的パラメーターの安定化）、又は両方において疾患若しくは障害をモジュレートすることを指す。さらに別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」又は「処置」は、筋肉が関連する障害の発症又は発生又は進行を遅延させることを指す。
【００５１】
本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書において他に示さない限り、又は他に文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書において提供するありとあらゆる例、又は例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより明確にすることを意図し、他に特許請求する本発明の範囲に対する限定を提起しない。
【００５２】
本発明の詳細な説明
本発明は、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体がマイオカイン活性を有するという知見に部分的に基づいている。Ｃ１ＯＲＦ５４ｍＲＮＡの発現のレベルは、対象における運動に応答して骨格筋において増加することが発見されてきた。
【００５３】
したがって、本発明は、マイオカイン活性を有するそのＣ１ｏｒｆ５４変異体を提供する。本発明はまた、医薬として使用するためのＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を提供する。本発明はまた、治療における使用のための、又は医薬の調製における使用のための、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を提供する。本発明はまた、筋肉が関連する障害の処置、予防又は回復において使用するための、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を含む医薬組成物を提供する。結果的に、マイオカイン活性を有する非常に望ましいＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド及びその変異体、並びに新規な治療的なアプローチを、本発明によって提供する。
【００５４】
さらに提供するのは、本明細書に記載のようなＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体（例えば、液体若しくは凍結乾燥した形態）、又は本明細書に記載のようなＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を含む医薬組成物を含むキットである。
【００５５】
本発明は、それを必要とする対象に有効量のマイオカイン活性を有する単離されたＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を投与することを含む、筋肉が関連する障害を処置、予防、又は回復させる方法をさらに提供する。
【００５６】
一実施形態では、本発明は、配列番号３若しくは配列番号４から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド分子を提供し、ここで、前記アミノ酸配列は、マイオカイン活性を有するＣ１ｏｒｆ５４変異体をコードする。
【００５７】
また提供するのは、ａ）異種制御配列に作動可能に連結している核酸配列を提供することと；ｂ）ポリペプチドの発現を可能とする条件下で（ａ）の核酸を発現させ、それによって、組換えポリペプチドを産生することとを含む、そのアミノ酸配列が、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％同一である組換えポリペプチドを産生する方法である；又は配列番号１６、１７、若しくは１８のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列。また提供するのは、異種プロモーターに作動可能に連結している、上記の方法において記載するような、産生されるＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド及びその変異体、例えば、アミノ酸配列番号２、３、若しくは４を含むＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド及びその変異体をコードする配列番号１６、１７、若しくは１８から選択されるポリヌクレオチドを含むベクターである。また提供するのは、前記ベクターの１つ若しくは複数を含む単離された宿主細胞である。また提供するのは、（ａ）前記ベクターの１つ若しくは複数を含む宿主細胞を培養することと；（ｂ）前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を回収することとを含む、上記の方法に従ってＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を産生するプロセスである。
【００５８】
代わりに、提供するのは、ａ）異種制御配列に作動可能に連結している核酸配列を提供することと；ｂ）ポリペプチドの発現を可能とする条件下で（ａ）の核酸を発現させ、それによって、組換えポリペプチドを産生することとを含む、そのアミノ酸配列が、配列番号１０〜１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％同一である組換えポリペプチドを産生する方法である；又は配列番号１９〜２３のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列。また提供するのは、異種プロモーターに作動可能に連結している、記載するような、産生されるＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド及びその変異体、例えば、アミノ酸配列番号１０〜１４を含むＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド及びその変異体をコードする配列番号１９〜２３から選択されるポリヌクレオチドを含むベクターである。また提供するのは、前記ベクターの１つ若しくは複数を含む単離された宿主細胞である。また提供するのは、（ａ）前記ベクターの１つ若しくは複数を含む宿主細胞を培養することと；（ｂ）前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を回収することとを含む、上記の方法に従ってＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を産生するプロセスである。
【００５９】
他の研究者は、Ｃ１ｏｒｆ５４をコードするポリヌクレオチドのクローニング及び単離（Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１，３１５−３２１、Ｈａｒｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １０，１７８８−１７９５、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９，１６８９９−１６９０３）並びにコードされたポリペプチドが分泌されるという事実について従前記載してきた（国際公開第１９９８／４２７３８号パンフレット、国際公開第１９９９／１８１２７号パンフレット、欧州特許第１１０４８０８号明細書）。
【００６０】
種々のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド及びその変異体は、本発明によって使用することができる。本発明は、マイオカイン活性を有する様々なＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド及びその変異体の使用を意図する。一部の実施形態では、本発明は、完全長Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチドアミノ酸配列又はその変異体の使用を提供する。一部の実施形態では、本発明は、マイオカイン活性を保持するＣ１ｏｒｆ５４配列、又はその変異体の（完全長配列ではなく）一部を含むＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドを提供する。このように、一部の実施形態では、本発明のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する、ヒト（例えば、配列番号２）Ｃ１ｏｒｆ５４タンパク質配列の少なくともフラグメント（例えば、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、少なくとも１００個、少なくとも１０５個、少なくとも１１０個の連続したアミノ酸）を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、本発明のＣ１ｏｒｆ５４タンパク質は、天然マウス（例えば、配列番号２４）、イヌ（例えば、配列番号３２）、ウシ（例えば、配列番号３３）又はウマ（例えば、配列番号３１）のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド配列の少なくともフラグメント（例えば、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、少なくとも１００個、少なくとも１０５個、少なくとも１１０個の連続したアミノ酸）を含む。
【００６２】
一部の実施形態では、本発明は、Ｃ末端配列の少なくとも一部を欠いている、例えば、Ｃ末端から少なくとも１０個、２０個、３０個、４０個、５０個のアミノ酸、例えば、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個のアミノ酸を欠いている、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド変異体（これらに限定されないが、配列番号１〜１４のいずれかを含めた）を提供する。
【００６３】
一部の実施形態では、本発明は、Ｎ末端配列の少なくとも一部を欠いている、例えば、Ｎ末端から少なくとも１０個、２０個、３０個、４０個、５０個のアミノ酸、例えば、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個のアミノ酸欠いている、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド変異体（これらに限定されないが、配列番号１〜１４のいずれかを含めた）を提供する。
【００６４】
本発明のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドは、天然に存在するＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドの変異体及び短縮型、並びにマイオカイン活性を有する本明細書に記載されているＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド変異体の変異体及び短縮型を包含する。本発明は、本発明の方法におけるマイオカイン活性を有する天然に存在するＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドのＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド変異体及び短縮型の使用を包含する。マイオカイン活性を有する活性変異体は、例えば、本明細書に記載のような当業者には公知のいくつもの方法で同定することができる。一部の実施形態では、活性タンパク質のアミノ酸アラインメントを確立して、インバリアントであるか、又は保存されたアミノ酸変化を含むそれらの位置を同定することができる。
【００６５】
したがって、本発明の一態様は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる単離ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する。
【００６６】
本発明の別の態様は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる単離ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する。
【００６７】
一実施形態では、提供するのは、配列番号３及び配列番号４の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる単離ポリペプチドであり、ここで、１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸は、配列番号３若しくは配列番号４の任意の１つの配列内で修飾、欠失又は置換されており、ここで、ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する。
【００６８】
別の実施形態では、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列からなる単離ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する。
【００６９】
別の実施形態では、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列からなる単離ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する。
【００７０】
本発明のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドはまた、非天然Ｃ１ｏｒｆ５４タンパク質フランキング配列を含むことができる。例えば、マイオカイン活性を有するＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドの一部は１つ若しくは複数の異種アミノ酸と融合して、融合タンパク質を形成することができる。融合パートナー配列は、これらに限定されないが、アミノ酸タグ、非Ｌ（例えば、Ｄ）アミノ酸、又はｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期及び／若しくはプロテアーゼ抵抗性を延長させる他のアミノ酸模倣物、ターゲティング配列又は他の配列、例えば、ヒト免疫グロブリンＦｃフラグメントを含むことができる。一実施形態では、本発明は、１つ若しくは複数の異種アミノ酸、ペプチド又はタンパク質に融合したＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドを提供し、ここで、異種アミノ酸、ペプチド又は融合タンパク質パートナーは、アミノ酸タグ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期延長剤、ターゲティング配列、ヒト免疫グロブリンＦｃフラグメントを含むことができる。
【００７１】
さらなる実施形態では、本発明による単離されたＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド、例えば、配列番号３及び配列番号４の群から選択されるアミノ酸配列からなる単離されたＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドは、マイオカイン活性を有し、ここで、前記マイオカイン活性は、筋機能増加活性を含む。
【００７２】
別の実施形態では、本発明による単離されたＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド、例えば、配列番号３及び配列番号４の群から選択されるアミノ酸配列からなる単離されたＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドは、マイオカイン活性を有し、ここで、前記マイオカイン活性は、筋肉強度増加活性を含む。
【００７３】
さらに別の実施形態では、本発明による単離ポリペプチド、例えば、配列番号３及び配列番号４の群から選択されるアミノ酸配列からなる単離されたＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドは、マイオカイン活性を有し、ここで、前記マイオカイン活性は、筋肉再生改善活性を含む。
【００７４】
医薬組成物
本明細書において提供するのは、薬学的に許容される担体、添加剤又は賦形剤と一緒に配合される、マイオカイン活性を有する単離されたＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を含む医薬組成物である。組成物は、医学的状態を処置するのに適した１種若しくは複数の他の治療剤をさらに含有することができる。
【００７５】
本明細書に記載されている医薬組成物は、種々の当技術分野において公知の方法によって投与することができる。投与の経路及び／又はモードは、所望の結果によって変化し得る。投与経路によって、マイオカイン活性を有するＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体は、化合物を不活性化し得る酸及び他の自然条件の作用から化合物を保護する材料でコーティングし得る。このように、別の態様において、本発明は、本明細書において開示されているＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、及び少なくとも１種の薬学的に許容される担体、賦形剤又は添加剤を含有する組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
【００７６】
したがって、提供するのは、医薬有効量の
ｉ．アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｉｉ．配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉｉｉ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｉｖ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
ｖ．アミノ酸配列（ここで、１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸は、配列番号２、３、若しくは４のいずれか１つの配列内で修飾、欠失、付加及び／又は置換されている）を含むか、又はこれからなるポリペプチド
から選択される少なくとも１種のポリペプチド（ここで、前記ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する）；
並びに少なくとも１種の薬学的に許容される担体、賦形剤又は添加剤
を含む医薬組成物である。
【００７７】
また提供するのは、
ｉ．アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｉｉ．配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉｉｉ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｉｖ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｖ．アミノ酸配列（ここで、１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸は、配列番号２、３、若しくは４のいずれか１つの配列内で修飾、欠失、付加及び／又は置換されている）を含むか、又はこれからなるポリペプチド
から選択される少なくとも１種のポリペプチド（ここで、前記ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する）；
並びに少なくとも１種の薬学的に許容される担体、賦形剤又は添加剤を含む医薬組成物である。別の実施形態では、前記医薬組成物は、筋肉が関連する障害の処置において使用するためである。一実施形態では、前記マイオカイン活性は、筋機能増加活性を含む。一実施形態では、前記筋機能増加活性は、本明細書に記載されているアッセイによって決定される。別の実施形態では、前記マイオカイン活性は、筋肉強度増加活性を含み得る。別の実施形態では、前記筋肉強度増加活性は、本明細書に記載されているアッセイによって決定される。また別の実施形態では、前記マイオカイン活性は、筋肉再生改善活性を含み得る。また別の実施形態では、前記筋肉再生改善活性は、本明細書に記載されているアッセイによって決定される。別の実施形態では、前記マイオカイン活性は、筋肉強度増加活性及び筋肉再生改善活性を含み得る。一実施形態では、本明細書において提供する医薬組成物は、筋肉が関連する障害の処置において使用するためである。一実施形態では、本明細書において提供する医薬組成物は、筋萎縮、整形外科的傷害、筋肉傷害、筋肉衰弱、心不全、化学療法、及び脳卒中後、二次性筋肉喪失、サルコペニア、悪液質、肥満又は代謝症候群から選択されるか、又はこれらによってもたらされる筋肉が関連する障害の処置において使用するためである。
【００７８】
一実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、添加剤又は賦形剤と一緒に配合される。
【００７９】
投与量レジメンを調節して、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を実現する。例えば、単一のボーラスを投与してもよいか、いくつかの分割用量をある期間に亘って投与してもよいか、又は用量は治療状況の事情によって示されるように比例的に低減若しくは増加させてもよい。投与量単位形態は、本明細書において使用する場合、処置される対象のための単位投与量として適した物理的個別単位を指し；各単位は、必要とされる医薬担体と関連した所望の治療効果を生じさせるように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の投与量単位形態についての明細は、活性化合物の独自の特性及び達成される特定の治療効果、並びに個体における感受性の処置のためのこのような活性化合物を配合する技術分野における固有の制限によって影響され、直接これらによって決まる。Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、又は前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を含む医薬組成物の治療的有効量は、約０．００１〜１５０ｍｇ／宿主の体重ｋｇ、又は０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ、より通常に、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。当業者は、投与経路（例えば、静脈内又は皮下）によって変化する適切な有効用量を同定することを理解している。全身投与のいくつかの方法において、投与量を調節して、１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法では、２５〜５００μｇ／ｍｌのＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体の血漿濃度を達成する。代わりに、組成物は、持続放出配合物でよく、この場合、より頻繁でない投与が必要とされる。投与量及び頻度は、患者におけるＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体の半減期によって変化する。投与量及び投与の頻度は、処置が予防的又は治療的であるかによって変化することができる。予防的用途において、例えば、相対的に低い投与量を、長期間に亘り相対的に頻繁でない間隔で投与する。治療的用途において、疾患の進行が低減若しくは終了するまで、又は患者が疾患の症状の部分的若しくは完全な回復を示すまで、例えば、相対的に短い間隔での相対的に高い投与量が時折必要とされる。その後、患者に予防的レジメンを投与することができる。本明細書において提供する医薬組成物中の活性剤の実際の投与量レベルは、患者に対して有毒であることを伴わずに、特定の患者、組成物、及び投与のモードについて所望の治療応答を達成するのに有効である活性剤の量を得るように変動し得る。選択された投与量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、又は投与経路、投与の時間、用いられる特定の化合物の排せつ率、処置の期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、身体全体の健康及びこれまでの病歴、並びに医術において公知の同様の要因を含めた種々の薬物動態学的要因によって決まる。例示的な処置方式は、少なくとも１日１回、少なくとも週１回、２週間に少なくとも１回、３週間に少なくとも１回、４週間に少なくとも１回、１カ月に少なくとも１回、３カ月に少なくとも１回、又は３〜６カ月に少なくとも１回の投与を必要とする。本発明の組成物に含まれる治療有効用量のＣ１ｏｒｆ５４ポリペ��チド若しくはその変異体の投与は、病徴の重症度の減少、病徴がない期間の頻度及び期間の増加、又は疾患の苦痛による機能低下若しくは身体障害の予防、すなわち、筋肉強度及び／又は筋肉の再生能の増加をもたらすことができる。
【００８０】
患者は、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体の有効量、すなわち、当該の筋肉が関連する障害を処置するか、回復させるか、又は予防するのに十分な量を受ける。治療効果はまた、身体症状の低減を含み得る。治療効果は、運動の効果を模倣し得る。投与量は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールによるものでよい。投与量は、断続的でよい。断続的な投薬の間に、例えば、本明細書に記載のような医薬組成物に含まれる、治療有効用量のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを、患者に投与し、それによって、本明細書に記載のようなＣ１ｏｒｆ５４の生物活性を誘発し、それに続いて、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドが、Ｃ１ｏｒｆ５４生物活性が誘発状態と比較して減少するように、前記患者に投与されない期間が続く。一実施形態では、断続的な投薬スケジュールは、少なくとも２つのサイクルを含み、各サイクルは、（ａ）例えば、本明細書に記載のような医薬組成物に含まれる、治療的有効量のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを患者に投与する投薬期間、及びその後の（ｂ）休止期間を含む。
【００８１】
本発明の組成物は、当技術分野において公知の種々の方法の１つ若しくは複数を使用して、１つ若しくは複数の投与経路によって投与することができる。当業者が認識するように、投与の経路及び／又はモードは、所望の結果によって変化する。本発明の治療用タンパク質のための投与経路は、例えば、注射又は注入による、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、皮下、局所送達、脊髄又は他の非経口投与経路を含む。一実施形態では、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、又は前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を含む組成物は、静脈内に投与される。別の実施形態では、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、又は前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を含む組成物は、皮下に投与される。別の実施形態では、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、又は前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を含む組成物は、筋肉内に投与される。
【００８２】
本発明の使用及び方法
例えば、本明細書に開示されているようなＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、又は前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を含む組成物は、治療的有用性を有する。例えば、これらの分子は、対象に投与することができ、疾患の処置、予防法において、及び／又は病徴の発症を遅延させるために使用し得る。本発明は、治療において又は医薬として使用するための、例えば、本明細書に開示されているようなＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、又は前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を含む組成物を提供する。本発明はさらに、病理学的障害、例えば、筋肉が関連する障害の処置において使用するための、例えば、本明細書に開示されているようなＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、又は前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を含む組成物を提供する。本発明はさらに、病理学的障害、例えば、筋肉が関連する障害の処置のための医薬の製造における、例えば、本明細書に開示されているようなＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、又は前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を含む組成物の使用を提供する。一実施形態では、本発明は、筋機能の増加において使用するための、例えば、本明細書に開示されているようなＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、又は前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を含む組成物に関する。特定の一実施形態では、前記筋機能は、増加した筋肉強度を含む。特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者において筋肉強度を増加させることにおいて使用するための、例えば、本明細書に開示されているようなＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、又は前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を含む組成物に関する。筋肉強度を増加させる必要性は、特に、筋肉が関連する障害の帰結として本明細書において記述する状態の１つに起因し得るか、又はこれは、やはり筋機能の増加から利益を得る、本明細書において記述しない状態、例えば、病的状態に起因し得る。別の実施形態では、前記筋機能は、改善された筋肉再生を含む。別の実施形態では、前記筋機能は、増加した筋肉強度及び改善された筋肉再生を含む。
【００８３】
一態様において、本発明は、治療において使用するための本明細書に記載のようなＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を提供する。したがって、本発明は、医薬として使用するための、
ａ．アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｂ．配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｄ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
ｅ．アミノ酸配列（ここで、１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸は、配列番号２、３、若しくは４のいずれか１つの配列内で修飾、欠失、付加及び／又は置換されている）を含むか、又はこれからなるポリペプチド
から選択されるポリペプチドを提供する。
【００８４】
一実施形態では、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、マイオカイン活性を有する。さらなる実施形態では、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、対象における筋肉が関連する障害の処置における使用のためである。
【００８５】
別の態様において、本発明は、医薬の製造において使用するための、本明細書に記載のようなＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を提供する。本発明は、医薬の製造において使用するための、
ａ．アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｂ．配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｄ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
ｅ．アミノ酸配列（ここで、１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸は、配列番号２、３、若しくは４のいずれか１つの配列内で修飾、欠失、付加及び／又は置換されている）を含むか、又はこれからなるポリペプチド
から選択されるポリペプチドを提供する。
【００８６】
一実施形態では、医薬の製造において使用するための、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、マイオカイン活性を有する。さらなる実施形態では、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、対象における筋肉が関連する障害の処置のための医薬の製造における使用のためである。
【００８７】
さらなる態様において、本発明は、対象における筋肉が関連する障害を処置することにおいて使用するためのポリペプチド若しくはその変異体を提供し、ここで、処置は、対象に、
ａ．アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｂ．配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｄ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
ｅ．アミノ酸配列（ここで、１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸は、配列番号２、３、若しくは４のいずれか１つの配列内で修飾、欠失、付加及び／又は置換されている）を含むか、又はこれからなるポリペプチド
から選択されるポリペプチドを投与することを含み、
ここで、前記ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する。
【００８８】
別の態様において、本発明は、対象における筋肉が関連する障害を処置することにおいて使用するためのポリペプチド若しくはその変異体を提供し、ここで、処置は、対象に有効量の
ｆ．アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｇ．配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｈ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は
ｉ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチドを投与することを含み；
ここで、前記ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する。
【００８９】
本発明はさらに、治療的有効量のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む医薬組成物を、前記患者に投与することを含む、病理学的障害、例えば、筋肉が関連する障害を患っている患者を処置する方法を提供する。したがって、本発明は、本明細書に記載のようなマイオカイン活性を有する、例えば、医薬組成物に含まれる、治療的有効量のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３若しくは４を有するポリペプチドを投与することを含む、筋肉が関連する障害を処置する方法を提供し、ここで、前記マイオカイン活性は、筋機能増加活性を含む。前記筋機能は、筋肉強度及び／又は筋肉再生を含む。特定の実施形態では、本発明は、筋肉強度を増加させるための方法に関する。別の実施形態では、前記筋機能は、改善された筋肉再生を含む。別の実施形態では、前記筋機能は、増加した筋肉強度及び改善された筋肉再生を含む。筋肉強度を増加させる必要性は、特に、筋肉が関連する障害の帰結として本明細書において記述する状態の１つに起因し得るか、又はこれは、やはり筋機能の増加から利益を得る、本明細書において記述しない状態、例えば、病的状態に起因し得る。
【００９０】
したがって、本発明は、本明細書に記載のようなＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体を投与することを含む、筋肉が関連する障害を処置する方法を提供する。本発明は、対象における筋肉が関連する障害を処置する方法を提供し、ここで、前記方法は、対象に治療的有効量の
ａ．アミノ酸配列である配列番号２、３、若しくは４からなるポリペプチド；
ｂ．配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｄ．配列番号２、３、若しくは４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
ｅ．アミノ酸配列（ここで、１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸は、配列番号２、３、若しくは４のいずれか１つの配列内で修飾、欠失、付加及び／又は置換されている）を含むか、又はこれからなるポリペプチド
から選択されるポリペプチドを投与することを含み；
ここで、前記ポリペプチドは、マイオカイン活性を有する。
【００９１】
下記のセクションにおいて、上記の使用及び方法の様々な態様及び実施形態を記載し、全てのこれらの態様及び実施形態は一緒に合わせることができる。下記のページにおいて開示されている教示は、全てが互いに合わせることができ、これらのページの様々な部分からのフィーチャを合わせる特定の態様及び実施形態は、当業者には適当に開示されていると考えられることを当業者は理解する。
【００９２】
例えば、本発明の医薬組成物に含まれる、単離されたＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、例えば、本明細書において提供するような、例えば、本発明を行うためのモードによって説明されているようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの試験において示されるようなマイオカイン活性を示し、したがって、治療、又はｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用に適用される。特に意図されるのは、筋機能の増加、例えば、筋肉強度及び／又は改善された筋肉再生から利益を得る疾患及び障害である。
【００９３】
したがって、本発明は、筋肉強度を増加させることにおいて使用するための、例えば、本明細書に記載のような医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド及びその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００９４】
本発明はまた、筋肉強度を増加させるための医薬として使用するための、例えば、本明細書に記載のような医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド及びその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００９５】
さらに、本発明は、例えば、本明細書に記載のような医薬組成物に含まれる、有効量のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含む、それを必要とする対象において筋肉強度を増加させる方法を提供する。
【００９６】
骨格筋は、高い可塑性及び運動に対する高い応答性を有する組織である。衛星細胞（筋肉前駆細胞）は典型的には、運動及び傷害によって活性化され、筋組織のリモデリングにおいて重要な役割を果たしている。ＭｙｏＤは、主に衛星細胞を分化へと推進することによって衛星細胞の運命を決定する重要な転写因子である。ＭｙｏＤを欠いている筋肉前駆細胞は、より幹細胞様表現型を取り戻し、傷害された筋肉中への注射の後、野生型細胞と比較してかなりより高い効率性を伴って生着する。さらに、ＭｙｏＤを欠いている衛星細胞は、筋肉線維の基底膜の下で検出することができ、生着の後、増殖及び生存の増加を示す（Ａｓａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４，１６５５２−１６５５７）。したがって、ＭｙｏＤを一過性に減少させることが望ましい。本発明のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（実施例５、図５）又はｉｎ  ｖｉｖｏ（実施例４、図４）でＭｙｏＤのレベルを減少させる。
【００９７】
したがって、本明細書において提供するのは、対象にこのようなポリペプチド又は医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする対象における筋機能を増加させることにおいて使用するためのマイオカイン活性を有する、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ここで、前記ポリペプチド又は医薬組成物の投与は、ＭｙｏＤのレベルを減少させ、それによって、対象において、筋機能の増加、適切には筋肉強度の増加及び／又は改善された筋肉再生を促進する。
【００９８】
別の実施形態では、提供するのは、治療的有効量のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含む、筋肉が関連する障害を処置する方法であり、ここで、前記ポリペプチドの投与は、ＭｙｏＤのレベルを減少させ、それによって、対象において、筋機能の増加、適切には筋肉強度の増加及び／又は改善された筋肉再生を促進する。
【００９９】
一実施形態では、例えば、本明細書に記載のような医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、筋芽細胞の増殖の刺激において使用するため、及び／又は衛星細胞の頻度若しくは数を増加させるためである。前記使用は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用であり得る。
【０１００】
したがって、一実施形態では、本明細書において提供するのは、対象に前記ポリペプチド又は医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする対象における筋機能を増加させることにおいて使用するためのマイオカイン活性を有する、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ここで、前記ポリペプチド又は医薬組成物の投与は、筋芽細胞の増殖を刺激し、それによって、対象において、筋機能の増加、適切には筋肉強度の増加及び／又は改善された筋肉再生を促進する。
【０１０１】
さらなる実施形態では、本発明はまた、対象に前記ポリペプチド又は医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする対象における筋機能を増加させることにおいて使用するためのマイオカイン活性を有する、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチド又は医薬組成物の投与は、対象の骨格筋の幹細胞又は衛星細胞の頻度又は数を増加させ、それによって、対象において、筋機能の増加、適切には筋肉強度の増加及び／又は改善された筋肉再生を促進する。
【０１０２】
別の実施形態では、本発明は、治療的有効量のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含む、筋肉が関連する障害を処置する方法を提供し、ここで、前記ポリペプチドの投与は、筋芽細胞の増殖を刺激し、それによって、対象において、筋機能の増加、適切には筋肉強度の増加及び／又は改善された筋肉再生を促進する。
【０１０３】
さらに別の実施形態では、本発明は、治療的有効量のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含む、筋肉が関連する障害を処置する方法を提供し、ここで、前記ポリペプチドの投与は、対象の骨格筋の幹細胞又は衛星細胞の頻度又は数を増加させ、それによって、対象において、筋機能の増加、適切には筋肉強度の増加及び／又は改善された筋肉再生を促進する。
【０１０４】
一実施形態では、本発明はまた、例えば、医薬組成物に含まれる、有効量の単離されたＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを、衛星細胞を含む単離された生体試料に投与するステップを含む、衛星細胞の自己再生及び／又は分化を促進するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法を提供する。さらなる実施形態では、提供するのは、前記衛星細胞が筋芽細胞へと増殖及び／又は分化するのに十分である時間及び条件下で、前記細胞と、例えば、医薬組成物に含まれる、ある量のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを接触させることを含む、筋芽細胞への衛星細胞の増殖及び／又は分化を刺激するための方法である。一実施形態では、本発明はまた、筋芽細胞成長を促進するための、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用を提供する。一実施形態では、提供するのは、例えば、本明細書に記載のような医薬組成物に含まれる、有効量のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを、筋芽細胞を含む単離された生体試料に投与することを含む、筋芽細胞成長を促進するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法である。前記生体試料は、ヒト骨格筋に由来する細胞（ｈＳｋＭＤＣ）でよい。
【０１０５】
別の実施形態では、本発明は、
ａ）単離された衛星細胞と候補薬剤又は候補薬剤の組合せとを接触させるステップ；
ｂ）前記細胞の細胞表現型をアセスメントするステップ；
ｃ）ステップｂ）における細胞表現型を、前記薬剤又は薬剤の組合せの非存在下での衛星細胞の表現型と、及び／又は例えば、医薬組成物に含まれる、単離されたＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触した衛星細胞の表現型と比較するステップ
を含む、衛星細胞の自己再生及び／又は分化を促進する薬剤又は薬剤の組合せを同定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのスクリーニング方法を提供する。
【０１０６】
好ましい一実施形態によれば、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、筋肉が関連する障害に影響を受けている対象において使用するためである。別の好ましい実施形態では、本発明は、筋肉が関連する障害で冒されている対象における使用のための、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。別の好ましい実施形態では、提供するのは、治療有効用量の本明細書に記載のようなＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含む、筋肉が関連する障害を有する対象を処置する方法である。
【０１０７】
多数の筋肉が関連する障害は、筋肉機能障害をもたらすことが示されてきた。これらの筋肉が関連する障害には、これらに限定されないが、１つ若しくは複数の筋骨格の疾患若しくは障害、例えば、全ての原因からの筋萎縮、遺伝性若しくは劣性遺伝性ミオパチー（例えば、筋ジストロフィー）及び薬物誘発性ミオパチー（例えば、グルココルチコイドによる処置からもたらされる）を含めたミオパチー、筋肉消耗疾患（例えば、根底にある疾病、例えば、後天性免疫不全疾患［ＡＩＤＳ］、うっ血性心不全、関節リウマチ、がん、慢性閉塞性肺疾患［ＣＯＰＤ］、肝不全若しくは肝硬変、火傷、敗血症からの結果であり得る悪液質）、長期化した不使用（例えば、麻痺、神経傷害、昏睡、安静、及びＩＣＵ滞在からもたらされる）、整形外科的傷害、筋肉傷害、手術（例えば、関節置換手術）によって誘発される衰弱、化学療法、脳卒中後、横紋筋融解症、筋萎縮若しくは衰弱の加齢に関連した状態（例えば、加齢の結果であり得るサルコペニア）、肥満、代謝症候群、糖尿病、心血管傷害若しくは疾患、内分泌障害、又は免疫障害が含まれる。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、本発明は、これらに限定されないが、任意の原因からの筋萎縮、ミオパチー、筋肉消耗疾患、長期化した不使用、整形外科的傷害、筋肉傷害、筋肉衰弱、化学療法、脳卒中後、慢性心不全、横紋筋融解症、加齢に関連した状態、例えば、サルコペニア、二次性筋肉喪失、肥満及び／又は代謝症候群を含めた筋肉が関連する障害の処置における方法における、又はこれらの処置における使用のための、化合物及び医薬組成物を提供する。このような使用又は方法は、それを必要とする対象に、例えば、マイオカイン活性を有する医薬組成物に含まれる、有効量のＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含む。
【０１０９】
一実施形態では、筋肉が関連する障害は、筋肉の消耗である。筋肉の消耗は、種々の疾患、障害、他の状態、又は事象からもたらされる骨格筋組織の不随意な喪失によって特徴付けられる状態を説明するために使用される一般用語である。ミオパチー、薬物誘発性ミオパチー、神経外傷による除神経、又は変性、代謝性、若しくは炎症性ニューロパチーの結果、及び筋萎縮若しくは衰弱の加齢に関連した状態を含めた筋肉の消耗の多くの原因が存在する。
【０１１０】
一実施形態では、筋萎縮は、ミオパチー、例えば、筋強直；ネマリンミオパチー、マルチコア／ミニコアミオパチー及び筋細管（中心核）ミオパチーを含めた先天性ミオパチー、良性先天性の低血圧症、中心コア病（セントラルコアミオパチーとしてまた知られている）；ミトコンドリアミオパチー（例えば、キーンズ−セイアー症候群）；家族性周期性麻痺；炎症性ミオパチー；例えば、グリコーゲン又は脂質蓄積症によってもたらされる代謝性ミオパチー；皮膚筋炎；多発性筋炎；封入体筋炎（例えば、孤発性封入体筋炎及び遺伝性封入体ミオパチー）；骨化性筋炎；横紋筋融解症及びミオグロビン尿症に起因する。ミオパチーは、筋ジストロフィー症候群、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー筋ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー、顔面−肩甲−上腕筋ジストロフィー、エメリ−ドレフュス型筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー（例えば、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、ベスレムミオパチー、Ｕｌｌｒｉｃｈ先天性筋ジストロフィー、福山先天性筋ジストロフィー）、脊髄性筋ジストロフィー、脊椎硬直筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィー、サルコグリカノパチー又は遺伝性遠位型ミオパチーによってもたらされ得る。
【０１１１】
一実施形態では、筋萎縮は、例えば、グルココルチコイド、例えば、コルチゾール、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、又はプレドニゾロンによる処置の結果としての薬物誘発性ミオパチーである。
【０１１２】
一実施形態では、筋萎縮は、神経外傷による除神経の結果、又は神経筋の疾患、障害若しくは傷害（例えば、運動ニューロン疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症、小児脊髄性筋萎縮、若年性脊髄性筋萎縮、多病巣性伝達ブロックを伴う自己免疫性運動ニューロパチー）、パーキンソン病、ハンチントン病、重症筋無力症、中心核ミオパチー（例えば、Ｘ連鎖筋細管ミオパチー）、自己免疫性神経変性疾患（例えば、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ筋無力症症候群）、クロイツフェルトヤコブ病、及び脳卒中若しくは脊髄傷害による麻痺を含めた、変性、代謝性、若しくは炎症性ニューロパチーの結果である。
【０１１３】
一実施形態では、筋萎縮は、筋機能の増加から利益を得る、加齢に関連した筋萎縮若しくは衰弱の状態である。処置し得る筋肉が関連する障害の例は、これらに限定されないが、サルコペニア、皮膚萎縮、筋肉の消耗、廃用性筋萎縮、アテローム性動脈硬化、動脈硬化、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節炎、免疫機能不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性症、がん、脳卒中、虚弱、正常な機能が損なわれた腎臓機能、及び加齢に関連した聴力喪失を含めた加齢／老化と関連するものを含む。
【０１１４】
本発明の一実施形態では、筋肉が関連する障害は、骨格固定化（例えば、外傷、安静、自発的な無活動、非自発的な無活動、傷害による）、栄養不全（例えば、絶食若しくは飢餓）、心筋症、心筋梗塞、狭心症、がん、ＨＩＶ消耗症候群、又は内分泌障害、例えば、甲状腺若しくは副腎又は下垂体障害からもたらされる。
【０１１５】
一実施形態では、筋肉が関連する障害は、ＩＩ型糖尿病を含めた代謝性障害、糖尿病が関連する筋萎縮、代謝症候群／症候群Ｘ／インスリン抵抗性症候群、高血糖症、肥満及び肥満が関連するサルコペニアである。
【０１１６】
一実施形態では、筋肉が関連する障害は、例えば、除脂肪体重の喪失及び／若しくは筋肉の消耗を患っている成人及び小児の火傷傷害、又は敗血症及び集中治療室（ＩＣＵ）中に発症する衰弱を患っている患者を含めた、重度及び中等度の火傷傷害において見られる急性筋肉の消耗性疾患である。
【０１１７】
一実施形態では、筋肉が関連する障害は、根底にある疾病、例えば、後天性免疫不全疾患［ＡＩＤＳ］、うっ血性心不全、関節リウマチ、がん、慢性閉塞性肺疾患［ＣＯＰＤ］）肝硬変、火傷、敗血症、多発性硬化症、結核、ヒト免疫不全ウイルス、栄養不良、パーキンソン病、気腫、心不全、運動ニューロン疾患、嚢胞性線維症、認知症、サルコペニア、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、腎臓疾患、及び腎臓の不全によってもたらし得る悪液質である。
【０１１８】
一実施形態では、筋肉が関連する障害は、肢（すなわち、脚又は腕）、頭蓋骨、脊椎、骨盤又は関節（すなわち、膝又は股関節）の骨折である。このように、一実施形態では、筋肉が関連する障害は、上腕骨、橈骨、尺骨、手根骨、中手骨、鎖骨、肩甲骨、大腿骨、寛骨、膝蓋骨、脛骨、腓骨、距骨、踵骨、足根骨、中足骨、坐骨又は腸骨の１つ若しくは複数の傷害又は骨折である。別の実施形態では、筋肉が関連する障害は、下記の関節：膝、股関節、足首、肩、肘、手首の１つ若しくは複数に対する手術である。このような手術は、股関節、膝、肩又は他の関節の１つ若しくは複数の置換を含む。一実施形態では、本発明はまた、対象に本発明のポリペプチド又は医薬組成物と投与することを含む、例えば、手術、例えば、股関節又は膝関節置換手術からもたらされる強制的な無活動による筋肉の消耗効果を回復させることにおける、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、前記ポリペプチド又は医薬組成物は、マイオカイン活性を有する。一実施形態では、患者は、強制的な安静／無活動の予想される期間の前に、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドで事前処置し得る。患者が例えば、手術のために病院に入院したとき、このような期間は起こり得る。無活動は、例えば、骨折した肢若しくは関節のギプス固定によって、又は麻痺剤の投与によって、又は股関節若しくは脚への手術の後、又は関節置換の後、局在化し得る。
【０１１９】
本明細書に記載されている方法及び使用による処置は、筋肉が関連する障害を有するか、又は筋肉が関連する障害の危険性がある対象において筋肉の消耗の低減をもたらし得る。これはまた、筋肉が関連する障害を有するか、又は筋肉が関連する障害の危険性がある対象において筋肉の消耗の遅延をもたらし得る。これはまた、筋肉が関連する障害を有するか、又は筋肉が関連する障害の危険性がある対象において筋肉の消耗の抑制をもたらし得る。これはまた、筋肉が関連する障害を有するか、又は筋肉が関連する障害の危険性がある対象において筋機能の維持をもたらし得る。これはまた、筋肉が関連する障害を有するか、又は筋肉が関連する障害の危険性がある対象において機能回復を増進し得る。一実施形態では、提供するのは、脳卒中後の機能回復の増進のための、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。一実施形態では、提供するのは、脳卒中後の患者において機能回復が達成されるまでの時間を減少させるための、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。別の実施形態では、本明細書において提供するのは、股関節骨折による急性筋肉傷害及び関連する筋萎縮を有する対象における機能回復の増進のための、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。別の実施形態では、本明細書において提供するのは、７０歳超の対象における機能回復の増進のための、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。別の実施形態では、本明細書において提供するのは、ＩＣＵミオパチーを有する対象における機能回復の増進のための、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。別の実施形態では、本明細書において提供するのは、末梢神経傷害を有する対象における機能回復の増進のための、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。別の実施形態では、本明細書において提供するのは、固定化を伴う整形外科的傷害を有する対象における機能回復の増進のための、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。別の実施形態では、本明細書において提供するのは、ＣＯＰＤと関連する筋肉衰弱及び／又は機能障害を有する対象における機能回復の増進のための、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。別の実施形態では、本明細書において提供するのは、心不全と関連する筋肉衰弱及び／又は機能障害を有する対象における機能回復の増進のための、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。別の実施形態では、本明細書において提供するのは、化学療法と関連する筋肉衰弱及び／又は機能障害を有する対象における機能回復の増進のための、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。別の実施形態では、本明細書において提供するのは、急性腎臓傷害（ＡＫＩ）と関連する筋肉衰弱及び／又は機能障害を有する対象における機能回復の増進のための、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。別の実施形態では、本明細書において提供するのは、慢性腎臓傷害（ＣＫＩ）と関連する筋肉衰弱及び／又は機能障害を有する対象における機能回復の増進のための、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【０１２０】
別の実施形態では、本発明はまた、健康な対象において筋機能、例えば、増加した筋肉強度及び／又は改善された筋肉再生及び／又は筋肉疲労性抵抗性における増加を増進するための、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【０１２１】
提案される処置から利益を得ることができる他の患者は、集中治療又は長期入院を必要とする急性又は重篤な疾病から回復している患者；重度の外傷、例えば、自動車事故、中等度若しくは重度の火傷、戦闘傷害から回復している若年成人を含む。筋肉の喪失は、重度又は長期である大部分の疾病の一般の合併症であるため、筋肉強度の増加及び／又は筋肉再生の改善は、この喪失の根本的原因に関わらず筋肉喪失を経験している患者の回復及び機能への回復を加速することが予測される。
【０１２２】
一実施形態では、本明細書において提供するのは、対象において傷害の直後に一時的又は持続性の身体障害を予防し、二次性筋肉喪失を予防する、例えば、医薬組成物に含まれる、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３、若しくは４のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【０１２３】
一実施形態では、本発明による方法及び使用による処置は、対象の身体的能力を改善させる。身体的能力は、これらに限定されないが、簡易身体能力バッテリー（ＳＰＰＢ）、歩調スピード測定、タイムドアップアンドゴー試験（ＴＧＵＧ）、階段昇降力試験（ＳＣＰＴ）、４００ｍ歩行試験及び／又は６分歩行距離試験（６ＭＷＤ）を含めた種々の試験によってアセスメントし得る。
【０１２４】
本明細書において記述するような６分歩行距離試験（６ＭＷＤ）は、例えば、ＡＴＳ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ：Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｉｘ−Ｍｉｎｕｔｅ  Ｗａｌｋ  Ｔｅｓｔ，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  Ｖｏｌ  １６６．ｐｐ  １１１−１１７，２００２に記載されているような、医師会、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙによって提供される現在の実用的ガイドラインにおいて定義されているような、現在の臨床実践に従って行われる標準的な身体運動試験を指す。
【０１２５】
本明細書において記述するような簡易身体能力バッテリー（ＳＰＰＢ）は、３つの別々の試験（起立バランス、８フィート（２．４４メートル）を歩行する時間、及び５回、椅子から立ち上がり、座位に戻る時間）（ＰＭＩＤ：８１２６３５６）の基準によって、下肢の身体的パフォーマンスステータスをアセスメントするために行われる標準的な身体運動試験を指す。次いで、これらの３つの別々の試験を、０〜１２ＳＰＰＢポイントのスケール上の成績スコアの要約へと合わせる。
【０１２６】
本明細書において記述するような歩調スピード測定は、８フィート（２．４４メートル）〜６メートルの歩行距離である確定した距離を歩行する対象の能力をアセスメントするために行われる標準的な身体運動試験を指す。好ましい実施形態では、歩調スピードは、４メートルの歩行距離に亘りアセスメントされる。歩行は、強度、協調及びバランスを必要とし、それによって、心血管系、呼吸器系、神経系、及び筋骨格系を含めた異なる器官系に対して要求する。
【０１２７】
本明細書において記述するようなタイムドアップアンドゴー試験（ＴＵＧ）は、対象の可動性をアセスメントするために行われる標準的な身体運動試験を指す。これは、椅子から立ち上がり、３メートル歩行し、向きを変え、椅子に歩行して戻り、再び座るのに人間が要する時間を測定し、静的及び動的強度の両方を必要とする。この試験は、医師会による推奨、例えば、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ／Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（２０１１）（Ｊ  Ａｍ  Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｓｏｃ  ５９，１４８−１５７）に従って行われる。
【０１２８】
本明細書において記述するような階段昇降力試験（ＳＣＰＴ）は、対象の下肢の強度、力、及びバランスをアセスメントするための機能試験を指す。いくつかの試験バリエーション、例えば、膝又は股関節置換（関節形成術）が、異なる患者集団のために開発されてきた。試験バリエーションは、ステップの数、個々のステップの高さ（例えば、１８ｃｍ若しくは２０ｃｍ）、タスク要求（昇りのみ若しくは昇り／降りを合わせる）、又は所定の数のステップに亘り試験の時間を計るかどうか、又は所与の期間についてステップカウントを記録するかどうか、例えば、９ステップの昇り／降り、５ステップの昇り／降り、４ステップの昇り／降り、３０秒試験、６ステップの高速及び自己ペースを含む。
【０１２９】
一実施形態では、本発明による方法及び使用による処置は、対象の筋肉強度を改善させる。筋肉強度は、単一又は複数の関節及び呼吸筋及び他の筋肉（例えば、肺機能試験）に亘り、動的（例えば、３０秒の椅子立ち上がり試験、階段昇降試験、膝屈曲／伸展）又は静的（例えば、握力測定、アイソメトリック膝伸展／屈曲）動作によってアセスメントし得る。筋肉強度をアセスメントするための他の一般に使用される試験は、自転車運動力測定、レジスタンストレーニング機器上の急速な動的収縮、及び最大垂直跳びを含む。
【０１３０】
本明細書において記述するような３０秒の椅子立ち上がり試験（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｒｅｓ  Ｑ  Ｅｘｅｒｃ  Ｓｐｏｒｔ  ７０，１１３−１１９）は、対象の下肢の強度及び耐久性をアセスメントするために行われる標準的な身体運動試験を指す。これは、３０秒で対象が座位から起き上がり、完全な立位となり、再び座る回数を測定する。これは、下肢強度及び耐久性の両方を必要とする。
【０１３１】
本明細書において記述するようなハンドグリップ試験は、対象の握力をアセスメントするために行われる標準的な身体運動試験を指す。握力は、握力計、例えば、Ｊａｍａｒ握力計（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）でアセスメントすることができる。
【０１３２】
本明細書において記述するような膝屈曲／伸展試験は、対象の四頭筋（膝伸展）及び／又はハムストリング（膝屈曲）の強度をアセスメントするために行われる標準的な身体運動試験を指す。アイソメトリック、アイソトニック又はアイソキネティック強度をアセスメントすることができる。
【０１３３】
キット
本開示はまた、筋肉が関連する障害を処置するためのキットを包含する。このようなキットは、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３若しくは４を含むポリペプチド、（例えば、液体若しくは凍結乾燥した形態での）、又は本明細書に記載のような、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３若しくは４を含むポリペプチドを含む医薬組成物を含む。さらに、このようなキットは、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３若しくは４を含むポリペプチドを投与するための手段（例えば、オートインジェクター、シリンジ及びバイアル、事前充填したシリンジ、事前充填したペン）、並びに使用説明書を含み得る。これらのキットは、例えば、封入されているＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３若しくは４を含むポリペプチドと組み合わせた送達のための、筋肉に関連する障害を処置するためのさらなる治療剤を含有し得る。このようなキットはまた、筋肉が関連する障害を有する患者を処置するためのＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３若しくは４を含むポリペプチドの投与のための説明書を含み得る。このような説明書は、封入されているＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３若しくは４を含むポリペプチドと共に使用するための、用量、投与経路、及び投薬レジメンを提供し得る。
【０１３４】
語句「投与のための手段」は、これらに限定されないが、事前充填したシリンジ、バイアル及びシリンジ、注射ペン、自動注射装置、点滴及び静注バッグ、ポンプなどを含めた、患者に薬物を全身的に投与するための任意の利用可能な道具を指すために使用される。このようなアイテムによって、患者は薬物を自己投与し得る（すなわち、医師の援助なしで薬物を投与する）か、又は医師が薬物を投与し得る。本明細書において開示されているのは、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３若しくは４を含むポリペプチドを含む、筋肉が関連する障害を有する患者の処置において使用するためのキット、及びＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３若しくは４を含むポリペプチドを患者に投与するための手段である。
【０１３５】
本明細書において開示されているのは、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３若しくは４を含むポリペプチドを含むキット、又はＣ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３若しくは４を含むポリペプチド、及び本明細書に記載のような薬学的に許容される担体、添加剤若しくは賦形剤を含む医薬組成物であり、ここで、キットは、前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３若しくは４を含むポリペプチド、又は前記Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチド若しくはその変異体、例えば、配列番号２、３若しくは４を含むポリペプチドを含む前記医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するための、使用のための説明書及び手段をさらに含む。
【０１３６】
配列
【０１３７】
【表１】
2021533113.tif 000002
【０１３８】
【表２】
2021533113.tif 000003
【０１３９】
【表３】
2021533113.tif 000004
【０１４０】
【表４】
2021533113.tif 000005
【０１４１】
【表５】
2021533113.tif 000006
【０１４２】
【表６】
2021533113.tif 000007
【０１４３】
本発明を行うためのモード
本発明は、ほんの一例として説明してきており、本発明の範囲及び精神内にとどまる一方で、修正を行い得ることが理解される。
【実施例】
【０１４４】
実施例１
Ｃ１ｏｒｆ５４発現構築物
（１）発現構築物の設計
組換え発現のためのヒト及びマウスＣ１ｏｒｆ５４構築物は、パブリックドメインにおいて利用可能な情報に基づいて設計した（Ｚｅｒｂｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６（Ｄ１）：Ｄ７５４−Ｄ７６１；Ｔｈｅ  ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（２０１７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４５（Ｄ１）：Ｄ１５８−Ｄ１６９）。
【０１４５】
推定上のＮ末端シグナルペプチド（残基Ｍ１〜Ｇ１６）が省略された完全長成熟マウスＣ１ｏｒｆ５４残基Ｑ１７〜Ｍ１４８（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ８Ｒ２Ｋ８）を、ＴＥＶ切断部位を含有するＮ末端ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＥＮＬＹＦＱＳＧタグ（配列番号３４）に（構築物１、構築物情報について表１を参照されたい）、又はＮ末端ＭＧ及びＣ末端ＧＳＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＨＨＨＨＨＨタグ（配列番号３５）の間に（構築物２）融合した。
【０１４６】
推定上のＮ末端シグナルペプチド（残基Ｍ１〜Ｇ１６）が省略された完全長成熟ヒトＣ１ｏｒｆ５４残基Ｑ１７〜Ｍ１３１（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ８ＷＷＦ１、配列番号２）を、ＴＥＶ切断部位を含有するＮ末端ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＥＮＬＹＦＱＳＧタグ（配列番号３４）に（構築物３）、又はＮ末端ＭＧ及びＣ末端ＧＳＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＨＨＨＨＨＨタグ（配列番号３５）の間に（構築物６）、又はＮ末端ＭＳペプチドのみに融合した。
【０１４７】
構築物４及び５の設計のために、ヒトＣ１ｏｒｆ５４を、他の種からの相同配列と整列させた（図１）。配列は、それぞれ、２０１５年８月１８日に、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ（Ｔｈｅ  ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（２０１７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４５（Ｄ１）：Ｄ１５８−Ｄ１６９）又はｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ（Ｚｅｒｂｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６（Ｄ１）：Ｄ７５４−Ｄ７６１）から取得し、Ｊａｌｖｉｅｗ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２５（９）：１１８９−１１９１）においてＭＵＳＣＬＥアルゴリズム（Ｅｄｇａｒ（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２（５）：１７９２−１７９７）を使用して整列させた。構築物４は、高度に保存され負に帯電しているＮ末端領域を欠いている残基Ｄ６７〜Ｍ１３１（配列番号４）を含む一方、構築物５は、Ｃ末端疎水性領域を欠いている残基Ｑ１７〜Ｐ１１６（配列番号３）を含む。構築物４及び５の両方を、ＴＥＶ切断部位を含有するＮ末端ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＥＮＬＹＦＱＳＧタグ（配列番号３４）に融合した。
【０１４８】
（２）構築物のクローニング
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のための最適化を含めたマウスＣ１Ｏｒｆ５４のＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）から購入した。ＭＲＧＳ−Ｈｉｓ６−ＴＥＶ−Ｇ−ｍＣ１Ｏｒｆ５４（ａａ１７−１４８）（構築物１）を生じさせるために、挿入断片は、フォワードプライマー：
【化１】
2021533113.tif 000008
及びリバースプライマー：
【化２】
2021533113.tif 000009
を使用して、Ｎ末端においてＭＲＧＳ−Ｈｉｓ６−ＴＥＶ−Ｇを加え、ＰＣＲによってＧｅｎｅＡｒｔ構築物から増幅した。
【０１４９】
ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ／ＮｏｔＩによって消化し、同じ制限酵素で処理したｐＥＴ２６ｂ（＋）発現ベクター中に連結した。構築物２について、ＭＧ−ｍＣ１Ｏｒｆ５４（ａａ１７−１４８）挿入断片を、フォワードプライマー：
【化３】
2021533113.tif 000010
及びリバースプライマー：
【化４】
2021533113.tif 000011
を使用してＰＣＲによって同じ鋳型から増幅した。
【０１５０】
ＤＮＡフラグメントを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ技術によって、既にＧＳＳ−Ａｖｉ−Ｈｉｓ６を含有し（且つ適正な制限酵素ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで処置した）ｐＥＴ２６ｂ（＋）骨格中にクローニングした。
【０１５１】
ヒトＣ１Ｏｒｆ５４の場合、成熟部分のＤＮＡ配列は、インハウスアルゴリズムを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化し、その後、ＧｅｎｅＡｒｔにおいて５’末端におけるＮｄｅＩ制限部位、及び２個の終止コドン、及び３’末端におけるＮｏｔＩ制限部位を含む構築物６の遺伝子合成物（ＭＧ−ｈｓＣ１Ｏｒｆ（ａａ１７−１３１）−ＧＳＳ−Ａｖｉ−Ｈｉｓ６）を購入した。ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩで処理したｐＥＴ２６ｂ（＋）発現ベクター中へのそれに続く連結のために、ＤＮＡフラグメントをＮｄｅ／ＮｏｔＩによって消化させた。構築物３〜５及び７は、表２において列挙したプライマーを使用して従前の構築物６からＰＣＲによって増幅した。４つの挿入断片全てをＮｄｅＩ／ＮｏｔＩで消化し、構築物＃６を生じさせるために使用された同じ骨格中にクローニングした。
【０１５２】
【表７】
2021533113.tif 000012
【０１５３】
いずれの場合にも、ライゲーション産物を、コンピテントなＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中にトランスフェクトさせた。ＬＢ／カナマイシンプレート上で成長させたいくつかのコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡの調製を行った。陽性クローンを配列によって後で同定した。
【０１５４】
（３）構築物の発現
発現プラスミドを、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）菌株ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）（Ａｇｉｌｅｎｔ）中に形質転換した。全ての構築物について、１リットルのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地を一晩前培養物で播種した。ＤＡＳＧＩＰバイオリアクターシステム（エッペンドルフ）において発酵を行った。ｐＨ７．０１のトリガーポイントに達するまで、培養物を３７℃にて成長させた。このポイントにおいて、１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって発現を誘発した。構築物１、２、４、及び７によって、培養を３７℃にて５時間続けた。構築物３、５、及び６について、温度を２０℃に低下させ、培養を１４時間続けた。培養相の終わりに、培養物を遠心分離によって収集した。細胞ペレットを−２０℃にて貯蔵し、さらなる下流の処理のために精製に供した。
【０１５５】
（４）組換えタンパク質の単離
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における構築物１、２、３、４、６、及び７の組換え発現は、封入体の形成をもたらす。これらの構築物のいずれかを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を、１ｇの湿った細胞ペレットについて１０ｍｌの緩衝液を使用して０．１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、０．１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、３ｍＭのＬ−メチオニン、ｐＨ７．０に懸濁させ、１００ｍｌ毎に１ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を補充した。０．１ｍｇ／ｍｌのニワトリ卵白リゾチームを加え、懸濁液を４℃にて穏やかに撹拌した。３０分後、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び１０Ｕ／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を加え、懸濁液を４℃にてさらに３０分間撹拌した。ＡＰＶ２０００実験室ホモジナイザー（ＳＰＸ  Ｆｌｏｗ）を使用して、細胞を高圧（８００バール及び周囲温度にて２代継代）によって溶解した。２分の１容の６０ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ＭのＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．０をライセートに加え、４℃にて６０分間穏やかに撹拌した。封入体を遠心分離によって３０分間１００００×ｇ及び４℃にて沈降させた。ペレットを１容の５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．６ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＬ−メチオニン、ｐＨ７．０で１回、及び１容の５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、０．３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で３回、４℃にて洗浄し、各洗浄ステップの後で１００００×ｇ及び４℃にて３０分間遠心した。封入体ペレットを、−２０℃にて貯蔵し、その後、さらに処理した。精製のために、１ｇのＩＢを、５ｍＭのＤＴＴを有する、ＮａＯＨでｐＨ８．０に調節した２０ｍｌの６ＭのＧｄｍＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのリン酸二水素塩（緩衝液Ａ１）に一晩周囲温度にて可溶化した。このように得られた変性タンパク溶液を遠心分離によって≧１００００×ｇ及び周囲温度にて３０分間浄化し、その後、無菌濾過した。溶液を、７℃にて５ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液Ａ１で平衡化した５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌ（商標）ＩＭＡＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に充填した。カラムを、１００ｍｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、３０％イソプロパノール、ｐＨ８．０、それに続いて１００ｍｌの緩衝液Ａ１で洗浄した。結合したタンパク質を、ＨＣｌでｐＨ４．５に調節した６ＭのＧｄｍＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのリン酸二水素塩（緩衝液Ａ２）と共に単一のステップで溶出させた。１．８ｍｌの画分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。目的のタンパク質を含有する画分をプールした。変性タンパク質のリフォールディングのために、次いで、プールを１：１比で５ｍＭのＤＴＴを補充した２ＭのＬ−Ａｒｇ−ＨＣｌと混合し、１ｍＭのＤＴＴを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．３に対して一晩透析した。透析した試料を、ＰＥＧ３５，０００を使用して所望の濃度に濃縮し（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９６２）Ｔｒａｎｓ，２（４）：２１６−２６４）、無菌濾過した。Ｃ末端タグを含有する構築物２及び６を、ゲル濾過によって、又は変性ＩＭＡＣの直後に、下記の酵素的に切断された構築物について記載したような���Ｐ−ＨＰＬＣによってポリッシュした。
【０１５６】
構築物５を、この構築物を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のサイトゾルに可溶性発現させ、これを、５０ｍｌ毎に１ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を補充し、ＮａＯＨでｐＨ８に調節した、５０ｍＭのリン酸二水素塩、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール（緩衝液Ａ２）、３０Ｕ／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）、及び１０ｍＭのＭｇＣｌ２に懸濁させた（１ｇの湿った細胞ペレットについて１０ｍｌの緩衝液を使用）。ＡＰＶ２０００実験室ホモジナイザー（ＳＰＸ  Ｆｌｏｗ）を使用して、細胞を高圧（８００バール及び周囲温度にて２代継代）によって溶解した。ライセートを１００００×ｇ及び４℃にて３０分間遠心した。上清を濾過し（０．２２ｕｍ）、緩衝液Ａ２で平衡化した５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌ（商標）ＩＭＡＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に一晩充填した。Ａ２８０ベースラインシグナルへと洗浄した後、１０カラム容量に亘り緩衝液Ａ２中の２０〜５００ｍＭのイミダゾールの直線勾配によってタンパク質を溶出させた。１．８ｍｌの画分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。目的のタンパク質を含有する画分をプールし、タグの酵素的切断のためにＰＢＳ、ｐＨ７．３、１ｍＭのＤＴＴに対して一晩透析した。
【０１５７】
構築物１、３、４、及び５について、ＡｃＴＥＶ（商標）プロテアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をそれぞれの試料（２００Ｕ／ｍｇ）に加え、それに続く３０℃での３時間のインキュベーションによってＮ末端タグを酵素的に切断した。酵素的切断はＭＳによって確認した。残存する切断されていないタンパク質及びプロテアーゼからの切断されたものの分離を促進するために、試料を５ｍＭのＤＴＴを有する緩衝液Ａ１に対して透析した。透析したタンパク質を濾過し、５ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液Ａ１で平衡化した５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌ（商標）ＩＭＡＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に充填し、フロースルーを集めた。切断されたタンパク質を含有する画分をプールし、ＰＢＳ、ｐＨ７．３、１ｍＭのＤＴＴに対して一晩透析し、それに続くＰＥＧ３５，０００を使用した濃縮を行うか、又は８ｍｌ／分及び５０℃にて２５ｍＭの炭酸水素アンモニウムで平衡化されたＰＯＲＯＳ（商標）２０Ｒ１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、９５×１５ｍｍ（１７ｍｌ）若しくは２５０×２０ｍｍ（７８ｍｌ）のＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に充填し、平衡化緩衝液によってＡ２８０ベースラインシグナルへと洗浄した後、２０カラム容量中の０〜７５％エタノールの直線勾配又は７５％エタノールへのステップ勾配を伴って、８ｍｌ／分及び５０℃にて溶出させた。目的のタンパク質を含有する画分をプールし、ＰＢＳ、ｐＨ７．３に対して４度にて≧２４時間透析し、最終的に無菌濾過した。
【０１５８】
構築物７の封入体を、０．２Ｍの亜硫酸ナトリウムを有する６Ｍの尿素、２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８（緩衝液Ａ３）に可溶化した。溶液を１０，０００×ｇにて３０分間遠心し、無菌濾過し、上記のようなＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、ＰＢＳに対して透析し、無菌濾過した。
【０１５９】
実施例２
筋肉Ｃ１ｏｒｆ５４ｍＲＮＡは、げっ歯類において運動によって増加する
方法：７〜８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。マウスを研究施設に７日間順応させた。それらを２５℃にて１２：１２時間の明暗サイクルと共に収容し、１５．８ＭＪ／ｋｇのエネルギー含量を伴う１８．２％のタンパク質及び３．０％の脂肪を含有する標準的な実験室用食餌を与えた（Ｎａｆａｇ、製品＃３８９０、Ｋｌｉｂａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。食物及び水は自由に与えた。
【０１６０】
ほとんど体を動かさない対照動物は２匹の群で収容した。運動に供した動物を単独で収容し、回し車（マウスのための薄型のワイヤレス回し車、Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ、製品＃：ＥＮＶ−０４７）に７日間連続的にアクセスさせた。８日目に、回し車へのアクセスを有する群からのマウスを、さらにトレッドミル（Ｐａｎｌａｂ、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）上の１回の運動に２５分間供し、次いで、特定の時点、すなわち、トレッドミル運動の直後、３０分後、６０分後若しくは１８０分後においてＣＯ２で安楽死させた。ほとんど体を動かさない対照群からの動物を同じ日に安楽死させた。四頭筋筋肉を迅速に解剖し、液体窒素中で急速凍結した。標準的な手順（ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＱＩＡｃｕｂｅ技術（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して、総ＲＮＡを四頭筋筋肉から抽出した。全ての試料をＤＮａｓｅで処理し、ＲＮＡの質及び量をバイオアナライザー（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００Ａｇｉｌｅｎｔ）で測定した。リボソームＲＮＡ枯渇プロトコルを使用してライブラリーを生じさせた。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００鎖対末端配列決定を使用して配列決定を行った。マウス参照ゲノムバージョンｍｍ１０上にｓｔａｒを使用してリードをマッピングし、遺伝子レベルパラメーターを使用したフィーチャカウントを使用してカウントを生じさせた。報告したカウントはＦＰＫＭ（フラグメント／Ｋｂ／１００万）である。
【０１６１】
結果：本発明者らは、自発的なホイールランニング及び強制的トレッドミルランニングからなる同時の運動パラダイムを適用して、分泌されることが予想される新規な運動が誘発する因子を発見し、今までのところ特性決定されていない因子としてＣ１ｏｒｆ５４を同定した：Ｃ１ｏｒｆ５４ｍＲＮＡレベルは、ほとんど体を動かさないマウスと比較した、運動したマウスの四頭筋筋肉において増加する。実際に、上昇したレベルのＣ１ｏｒｆ５４ｍＲＮＡが、運動の直後に四頭筋筋肉において検出され、少なくとも３時間持続し（図２）、これは、運動が筋肉におけるＣ１ｏｒｆ５４ｍＲＮＡの産生を刺激することを示す。
【０１６２】
実施例３
筋肉Ｃ１ＯＲＦ５４ｍＲＮＡは、運動に続いてヒトにおいて増加する
方法：様々なタイプの運動を経験しているヒトからの外側広筋バイオプシーからのトランスクリプトミクスデータを伴う公的に利用可能なデータセット（ＧＳＥ９７０８４）（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ２５，５８１−５９２）を、Ｃ１ＯＲＦ５４の発現レベルについて再分析した。報告したカウントは、ＦＰＫＭ（フラグメント／Ｋｂ／１００万）である。
【０１６３】
結果：マウスにおけるＣ１ｏｒｆ５４ｍＲＮＡ発現に対する運動の効果を考えると、公的に利用可能なデータセットを分析して、運動がヒトにおいて同様の様式でＣ１ＯＲＦ５４をレギュレートするかどうかを評価した。参加者が異なる運動パラダイムを経験するヒトの運動研究において（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ２５，５８１−５９２）、外側広筋におけるＣ１ＯＲＦ５４ｍＲＮＡレベルを、各研究の若年の参加者について運動前及び後に分析した。データは、運動がヒト骨格筋におけるＣ１ＯＲＦ５４のレベルを増加させたことを示す（図３）。Ｃ１ＯＲＦ５４ｍＲＮＡの増加は、（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ２５，５８１−５９２）によって記載されているように、運動レジメンのタイプ（激しいエアロビクスインターバルトレーニング（ＨＩＩＴ）、レジスタンストレーニング（ＲＴ）、及び複合（ＣＴ）運動トレーニング）と無関係であり、したがって、運動に対する一般応答を反映する。
【０１６４】
実施例４
Ｃ１ｏｒｆ５４は、Ｍｙｏｄ１の転写をｉｎ  ｖｉｖｏでレギュレートする
方法：７〜８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。マウスを研究施設に７日間順応させた。それらを２５℃にて１２：１２時間の明暗サイクルを伴って収容し、１５．８ＭＪ／ｋｇのエネルギー含量を伴う１８．２％のタンパク質及び３．０％の脂肪を含有する標準的な実験室用食餌を与えた（Ｎａｆａｇ、製品＃３８９０、Ｋｌｉｂａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。食物及び水は自由に与えた。
【０１６５】
マウスは、ビヒクル（ＰＢＳ）、又はビヒクル中で配合した配列番号２５のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドの単一の腹腔内注射を受けた。注射の６０分後、マウスをＣＯ２で安楽死させ、腓腹筋を切除し、液体窒素中で急速凍結した。メーカーの説明書に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して総ＲＮＡを腓腹筋から抽出した。大容量逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、１μｇの総ＲＮＡ上のランダム６量体によって逆転写を行った。リアルタイムＰＣＲは、筋分化１（Ｍｙｏｄ１、Ｍｍ００４４０３８７＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）並びに２つのハウスキーピング遺伝子（Ｔｂｐ、Ｍｍ００４４６９７１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ及びＨｐｒｔ、Ｍｍ０３０２４０７５＿ｍ２、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のための特異的ＴａｑＭａｎプローブを使用して、Ｃ１０００サーマルサイクラー（ＣＦＸ３８４Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で３８４ウェルプレートにおいて２連で行った。自動設定を適用して、ＣＴを決定した。２−ΔΔＣＴを使用した比較方法を使用して、相対的発現を決定した。２つのハウスキーピング遺伝子を正規化のために使用した（Ｔｂｐ、Ｍｍ００４４６９７１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ及びＨｐｒｔ、Ｍｍ０３０２４０７５＿ｍ２、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。全ての結果は、ビヒクルを超える倍率変化として表す。
【０１６６】
１元配置ＡＮＯＶＡ、それに続いてフィッシャー最小有意差（ＬＳＤ）を使用して統計解析を行った。確率値が＜０．０５であったとき、差異は有意であると考えた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）によって統計的分析を行った。
【０１６７】
結果：Ｃ１ｏｒｆ５４は、ビヒクルと比較して、０．５ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇの配列番号２５のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドの単一の腹腔内注射の６０分後に、腓腹筋におけるＭｙｏｄ１のｍＲＮＡレベルを低減させる（図４）。ＭｙｏＤ１は、主に衛星細胞を分化へと推進することによって、衛星細胞の運命を決定する重要な転写因子である。衛星細胞は、筋肉の成長、維持、修復及び再生に関与している（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｕｄｎｉｃｋｉ（２０１１）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３，１２７−１３３）。ＭｙｏＤ１を欠いている筋肉前駆細胞は、より幹細胞様表現型を取り戻し、傷害された筋肉中への注射の後、かなりより高い効率性を伴って生着し、野生型細胞と比較して生存の増加を示す。さらに、ＭｙｏＤ１陰性筋芽細胞由来の衛星細胞は、生着の後で筋肉線維の基底膜の下で検出することができ、ＭｙｏＤ１陰性筋芽細胞の自己再生特性を示す（Ａｓａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４，１６５５２−１６５５７）。したがって、Ｃ１ｏｒｆ５４の活性は、ＭｙｏＤ１を下方制御し、それによって、幹細胞様表現型を促進することによって、筋分化に影響を与える。したがって、Ｃ１ｏｒｆ５４は、筋機能改善活性を含む。
【０１６８】
実施例５
Ｃ１ｏｒｆ５４は、ヒト筋細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＹＯＤ１の転写を阻害する
方法：一次ヒト筋細胞（ｈＳｋＭＤＣ、ロットＰ４０１０６１−５１Ｍ、Ｃｏｏｋ  ＭｙｏＳｉｔｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）を解凍し、ＭｙｏＴｏｎｉｃ無血清成長培地（ＣＯＯＫ  ＭＫ−２２２２）、成長サプリメント（ＣＯＯＫ  ＭＫ−２２８８）、２０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、１６０００−０４４、ロット１２３３７０５）、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ、１５７１０−０４９）及び１０μｇ／ｍＬのインスリン（Ａｍｉｍｅｄ、５−７９Ｆ００−Ｇ、ロットＫ１１９８８Ｐ）を含有する成長培地（ＧＭ）中で２個のＴ１７５組織培養フラスコにおいて播種した。３７℃／５％ＣＯ２にて５日の成長の後、細胞をＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ１４１９０−１４４）ですすぎ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ  Ａ１１１０５−０１）で剥離し、ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用して計数した。０．２ｍＬのＧＭ中の４００００個の細胞を、ウェル毎に０．５ｍＬのゼラチン（ＥｍｂｒｙｏＭａｘ０．１％ゼラチン溶液、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＥＳ−００６−Ｂ）をコーティングした２４ウェルプレート中にウェル毎に室温（ＲＴ）にて３０分間播種した。翌日、細胞を、３７℃にて６時間、１２５ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬの組換えタグ非含有ヒトＣ１ｏｒｆ５４タンパク質ａａ１７−１３１（配列番号２；Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＭＢＳ１２８４９０１ロット０３０９５）、溶媒対照（３３μＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３．３μＭのＥＤＴＡ及び０．０７％グリセロール）で処理するか、又は処理しなかった。それに続いて、細胞を溶解し、メーカーの説明書（Ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従ってＤｉｒｅｃｔ−ｚｏｌキットを使用して総ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを大容量ｃＤＮＡアーカイブキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３６８８１３）を使用して合成し、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃４３６９０１６）、ＴａｑＭａｎアッセイ（Ｈｓ００１５９５２８＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した定量的ＰＣＲによってＭＹＯＤ１遺伝子発現を決定した。２−ΔΔＣＴを使用した比較方法を使用して、相対的発現を決定した。遺伝子発現を３つのハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（４３１０８８４Ｅ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＢＰ（Ｈｓ００４２７６２０＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＨＰＲＴ（Ｈｓ０１００３２６８＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に正規化した。
【０１６９】
結果：組換えヒトＣ１ｏｒｆ５４タンパク質（ａａ１７−１３１、配列番号２）は、６時間の処置の後、一次ヒト筋肉前駆細胞において用量依存的様式でＭＹＯＤ１遺伝子発現を阻害した（図５）。使用された最も高い用量（１０００ｎｇ／ｍＬ）は、ＭＹＯＤ１遺伝子発現において６５．６％の低減を生じさせた（図５）。後期筋原性転写因子であるマイオジェニンは、Ｃ１ｏｒｆ５４タンパク質によって有意にレギュレートされなかった（データは示さず）。ＭｙｏＤ１を欠いている筋細胞は、増殖の増加を示す（Ｓａｂｏｕｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４４，６３１−６４３）。したがって、これらのデータは、筋肉前駆細胞の増殖を促進する一方で、Ｃ１ｏｒｆ５４が筋分化を防止することを示す。
【０１７０】
実施例６
Ｃ１ｏｒｆ５４は、ｉｎ  ｖｉｖｏで筋力を増加させる
方法：１２週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。マウスを研究施設に７日間順応させ、２５℃にて１２：１２時間の明暗サイクルを伴って収容し、１５．８ＭＪ／ｋｇのエネルギー含量を伴い１８．２％のタンパク質及び３．０％の脂肪を含有する標準的な実験室用食餌を与えた（Ｎａｆａｇ、製品＃３８９０、Ｋｌｉｂａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。食物及び水は自由に与えた。
【０１７１】
順応に続いて、マウスを体重によって無作為化し、ビヒクル（ＰＢＳ）、又はビヒクル中で配合した１ｍｇ／ｋｇの配列番号２５のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドの腹腔内注射によって３日毎に処置した。各マウスは、全部で３回の注射を受けた（１日目、４日目及び７日目、ここで、１日目は、動物が注射を受ける最初の日と定義する）。９日目に、誘発された筋力を非侵襲的にアセスメントした。この目的のために、動物を麻酔し、脚を剪毛し、経皮電極を介した後脚の電気刺激によって筋収縮を誘発した。電極を四頭筋及び足に固定した。力変換器（ＫＤ４５．５Ｎ）と接続した自家製ペダル上で力を記録し、刺激による足の圧力を記録した。１０〜１２０Ｈｚの範囲の頻度を、刺激装置（刺激装置ＭＬ１８０、ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を介して逐次的に適用し、強縮力を各頻度において記録した（ＰｏｗｅｒＬａｂ、ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。
【０１７２】
複数の対応のないｔ検定比較を使用して、統計解析を行った。確率値が＜０．０５であったとき、差異は有意であると見なした。全ての統計的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）によって行った。
【０１７３】
結果：
１０〜７０Ｈｚの範囲の低い刺激頻度で（最大下の力発生）、後肢の誘発された力は、ビヒクル及び１ｍｇ／ｋｇのＣ１ｏｒｆ５４（配列番号２５のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド）で処置された動物の間で同様である（図６Ａ）。対照的に、８０〜１２０Ｈｚの範囲のより高い刺激頻度で、最大の力発生を反映して、Ｃ１ｏｒｆ５４で処置したマウスは、ビヒクル処置した動物と比較して概ね１５％高い絶対筋力を示す。
【０１７４】
収縮力は、主にモニターされる収縮をもたらす腓腹筋の重量に対して絶対筋力を正規化することによってアセスメントされる。より高い刺激頻度における誘発された収縮力は、ビヒクル処置した動物と比較して、Ｃ１ｏｒｆ５４において概ね１３％高い（図６Ｂ）。これは、Ｃ１ｏｒｆ５４ポリペプチドの断続的な投与が筋肉強度を増加させることを示す。
【０１７５】
実施例７
Ｃ１ｏｒｆ５４は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰａｘ７陽性衛星細胞の数を増加させる
方法：１２週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。マウスを研究施設に７日間順応させ、２５℃にて１２：１２時間の明暗サイクルを伴って収容し、１５．８ＭＪ／ｋｇのエネルギー含量を伴う１８．２％タンパク質及び３．０％脂肪を含有する標準的な実験室用食餌を与えた（Ｎａｆａｇ、製品＃３８９０、Ｋｌｉｂａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。食物及び水は自由に与えた。
【０１７６】
順応に続いて、マウスを体重によって無作為化し、ビヒクル（ＰＢＳ）、又はビヒクル中で配合した１ｍｇ／ｋｇの配列番号２５のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドの腹腔内注射で３日毎に処置した。各マウスは、全部で４回の注射を受けた（１日目、４日目、７日目及び１０日目、ここで、１日目は、動物が注射を受ける１日目と定義する）。１１日目に、動物をＣＯ２で安楽死させ、腓腹筋を迅速に解剖し、ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）中に包埋し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結した。
【０１７７】
凍結した筋肉を８μｍの断面に切断し、これを室温にて約２時間乾燥させ、袋中に密封したプラスチックボックス中で−２０℃にて貯蔵した。染色の日に、スライドをフリーザーから取り出し、室温にて３０分間乾燥させ、３％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。次いで、ＰＢＴＸ（０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含有するＰＢＳ）中のＶｅｃｔｏｒ  Ｍ．Ｏ．Ｍブロッキング試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＭＫＢ−２２１３、希釈１／１００）及び１０％ヤギ血清で３０分間切片をブロックした。衛星細胞を検出するために、切片を、ブロッキング緩衝液中で４℃にてＰａｘ７（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ（ＤＳＨＢ））に対する一次抗体と共に一晩インキュベートした。東京工業大学のＡ．Ｋａｗａｋａｍｉによって開発されたＰａｘ７ハイブリドーマは、ＮＩＨのＮＩＣＨＤによって生じ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ、ＩＡ５２２４２で維持されたＤＳＨＢから得た。マウス抗体はＮｏｖａｒｔｉｓにおいてハイブリドーマから精製したが、ニワトリＰａｘ７の抗原アミノ酸３５２−５２３を検出する。ＰＢＴＸによる数回の洗浄の後、ＰＢＴＸ中の１０％ヤギ血清中の架橋抗体（ラット抗マウスＩｇＧ、Ｓｅｒｏｔｅｃ、カタログ番号ＭＣＡ３３６、希釈１／５００）と共に切片を室温にて３時間インキュベートした。試料をそれに続いてＰＢＴＸで洗浄し、蛍光標識した二次抗体（Ａｌｅｘａ５９４ヤギ抗ラット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１１００７、希釈１／２００）で室温にて１時間染色した。ＰＢＴＸで洗浄した後、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  ａｎｔｉｆａｄｅ試薬と共に試料を乗せた。Ｐａｘ７及びＤＡＰＩの両方について陽性である細胞を計数した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を行った。確率値が＜０．０５であったとき、差異は有意であると考えた。統計的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）によって行った。
【０１７８】
結果：衛星細胞の数を決定するために、筋肉切片を、衛星細胞のための確立したマーカーを表すＰａｘ７で染色した（Ｋｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｕｄｎｉｃｋｉ（２００８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １４，８２−９１）。衛星細胞は、筋肉の成長、維持、修復及び再生に関与している（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｕｄｎｉｃｋｉ（２０１１）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３，１２７−１３３）。１日目、４日目、７日目及び１０日目の１ｍｇ／ｋｇのＣ１ｏｒｆ５４による断続的な処置は、ビヒクル処置と比較して概ね６６％だけ、腓腹筋におけるＰａｘ７陽性衛星細胞の数をかなり増加させた（図７）。Ｃ１ｏｒｆ５４による処置に続いて増加した数の衛星細胞は、Ｃ１ｏｒｆ５４が筋肉の成長及び骨格筋の再生能を促進することを示す。
【０１７９】
実施例８
Ｃ１ｏｒｆ５４は、ヒト筋芽細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進する
方法：Ｃｏｏｋ  ＭｙｏＳｉｔｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡからの一次ヒト筋細胞（ｈＳｋＭＤＣ、ロットＰ２０１０７６−１９Ｍ）を解凍し、３個のＴ１７５組織培養フラスコにおいてＭｙｏＴｏｎｉｃ無血清成長培地（ＣＯＯＫ  ＭＫ−２２２２）、成長サプリメント（ＣＯＯＫ  ＭＫ−８８８８）、１０％ウシ胎仔血清ｓｕｐｅｒｉｏｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓ０６１３、ロット１５Ｈ０９５）及び５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ、１５７１０−０４９）を含有する成長培地（ＧＭ）中で播種した。３７℃／５％ＣＯ２にて２日の成長の後、細胞をＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ１４１９０−１４４）ですすぎ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ａ１１１０５−０１）で剥離し、ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ）を使用して計数した。０．１ｍＬのＧＭ中の１０００個の細胞を、ウェル毎に０．１ｍＬのゼラチン（ＥｍｂｒｙｏＭａｘ０．１％ゼラチン溶液、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＥＳ−００６−Ｂ）でコーティングされた９６ウェルプレート中にウェル毎にＲＴにて３０分間播種した。一晩のインキュベーションの後、細胞を、ＦＢＳを有さないＧＭと共に２．５時間インキュベートし、それに続いて、１％ＦＢＳを含有するＧＭへと２．５時間培地交換した。それに続いて、細胞を、１０００ｎｇ／ｍＬの組換えタグ非含有ヒトＣ１ｏｒｆ５４タンパク質ａａ１７−１３１（配列番号２；Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＭＢＳ１２８４９０１ロット０３０９５）、Ｃ１ｏｒｆ５４ＭＢＳ溶媒対照（５３μＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５．３μＭのＥＤＴＡ及び０．２６％グリセロール）又は１％ＰＢＳ対照で処理した。コンフルエンスパーセント（％）として細胞成長を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＦＬ  Ｌｉｖｅ−Ｃｅｌｌ分析システム（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｌｔｄ．）を使用して生細胞イメージング（ウェル毎４時間毎に２つの像）によって測定した。
【０１８０】
複数の対応のないｔ検定比較を使用して統計解析を行った。全ての統計的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）によって行った。
【０１８１】
結果：組換えヒトＣ１ｏｒｆ５４タンパク質（配列番号２；ａａ１７−１３１）は、Ｃ１ｏｒｆ５４タンパク質溶媒で処理された対照細胞と比較して、処置の２日後から開始して６日目の実験の終わりまで明らかに持続的に成長を増進した（図８）。全ての条件下で細胞は連続的に成長したが、異なるスピードを伴った。これらのデータは、Ｃ１ｏｒｆ５４が筋肉前駆細胞の成長を刺激することを示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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