(57)【要約】  本明細書に提供されたいくつかの実施形態は、組換えヒトサーファクタントタンパク質D又はその活性断片を含む方法及び薬学的組成物に関する。いくつかのそのような実施形態は、組換えヒトサーファクタントタンパク質D又はその活性断片の溶液又は懸濁液、及び凍結乾燥した固形を含む。
2021519757.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えヒトサーファクタントタンパク質D(rhSP-D)又はその活性断片、バッファー、糖、及びカルシウム塩を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
バッファーが、酢酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩、及びリン酸塩からなる群から選択される、請求項1に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
バッファーがヒスチジンである、請求項1又は2に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
ヒスチジンの濃度が約0.1mMから約100mMである、請求項3に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
ヒスチジンの濃度が約1mMから約10mMである、請求項4に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
ヒスチジンの濃度が約3mMから約7mMである、請求項5に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
ヒスチジンの濃度が約5mMである、請求項6に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
糖が、スクロース、マルトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ラフィノース、チオグルコース、チオマンノース、チオフルクトース、オクタ-O-アセチル-チオトレハロース、チオスクロース、及びチオマルトースからなる群から選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
糖がラクトースである、請求項8に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
ラクトースの濃度が1mMから500mMである、請求項9に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
ラクトースの濃度が200mMから300mMである、請求項10に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
ラクトースの濃度が約265mMである、請求項11に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
カルシウム塩が、塩化カルシウム、臭化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウム、及びクエン酸カルシウムからなる群から選択される、請求項1から12のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
カルシウム塩が塩化カルシウムである、請求項13に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
塩化カルシウムの濃度が約0.1mMから約10mMである、請求項14に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
塩化カルシウムの濃度が約1mMから約10mMである、請求項15に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
塩化カルシウムの濃度が約3mMから約7mMである、請求項16に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
塩化カルシウムの濃度が約5mMである、請求項17に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
約4.0から約9.0のpHを有する、請求項1から18のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
約5.0から約7.0のpHを有する、請求項19に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
約5.5から約6.5のpHを有する、請求項20に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
約6.0のpHを有する、請求項21に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
rhSP-Dの濃度が約0.1mg/mlから約10mg/mlである、請求項1から22のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
rhSP-Dの濃度が約1mg/mlから約6mg/mlである、請求項23に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
rhSP-Dの濃度が約3mg/mlから約5mg/mlである、請求項24に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
rhSP-Dの濃度が約4mg/mlである、請求項25に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
rhSP-Dの濃度が約1mg/mlから約3mg/mlである、請求項24に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
rhSP-Dの濃度が約2mg/mlである、請求項27に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
オリゴマー型を有するrhSP-Dポリペプチド集団を含み、前記オリゴマー型の30%より多くがrhSP-Dの十二量体を含む、請求項1から28のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
オリゴマー型の35%より多くがrhSP-Dの十二量体を含む、請求項29に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
オリゴマー型の40%より多くがrhSP-Dの十二量体を含む、請求項30に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
オリゴマー型を有するrhSP-Dポリペプチド集団を含み、前記オリゴマー型の15%未満がrhSP-Dの凝集体を含み、前記凝集体が70nmより大きい半径を有する、請求項1から31のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
オリゴマー型の10%未満がrhSP-Dの凝集体を含み、前記凝集体が70nmより大きい半径を有する、請求項32に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
オリゴマー型の5%未満がrhSP-Dの凝集体を含み、前記凝集体が70nmより大きい半径を有する、請求項33に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
増量剤を更に含む、請求項1から34のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
増量剤が、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、グリセロール、エリスリトール、アラビトール、グリシン、アラニン、スレオニン、バリン、及びフェニルアラニンからなる群から選択される、請求項35に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
キレート剤を欠く、請求項1から36のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
キレート剤がEDTA及びEGTAから選択される、請求項37に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
1mg/ml rhSP-D、5mMヒスチジン、265mMラクトース、5mM塩化カルシウムを含み、pH 6.0を有する、請求項1に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
2mg/ml rhSP-D、5mMヒスチジン、265mMラクトース、5mM塩化カルシウムを含み、6.0のpHを有する、請求項1に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
2mg/ml rhSP-D、5mMヒスチジン、265mMラクトース、1mM塩化カルシウムを含み、pH 6.0を有する、請求項1に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
4mg/ml rhSP-D、5mMヒスチジン、265mMラクトース、5mM塩化カルシウムを含み、pH 6.0を有する、請求項1に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
rhSP-Dポリペプチドが、配列番号02のアミノ酸配列又はその活性断片を含む、請求項1から42のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
rhSP-D又はその活性断片が、Met 11、Thr 160、Ser 270、及びAla 286からなる群から選択される残基に対応する、多型位置における残基を含む、請求項43に記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
rhSP-Dポリペプチド又はその活性断片が、細菌凝集アッセイ又はTLR4阻害アッセイにおいて活性を有する、請求項1から44のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
請求項1から45のいずれか一項に記載の薬学的組成物の凍結乾燥物。
【請求項４７】
請求項1から45のいずれか一項に記載の薬学的組成物の凍結乾燥物を含む容器を含む物品。
【請求項４８】
請求項1から45のいずれか一項に記載の薬学的組成物を凍結乾燥する工程を含む、凍結乾燥物を調製する方法。
【請求項４９】
請求項1から45のいずれか一項に記載の薬学的組成物の凍結乾燥物を、薬学的に許容される希釈剤と接触させて、rhSP-D又はその活性断片の溶液又は懸濁液を形成する工程を含む、薬学的組成物を調製する方法。
【請求項５０】
希釈剤が肺への投与に適している、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
希釈剤が滅菌水である、請求項49又は50に記載の方法。
【請求項５２】
溶液又は懸濁液が、約0.1mg/mlから約10mg/mlのrhSP-D又はその活性断片の濃度を有する、請求項49から51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
溶液又は懸濁液が、約1mg/mlから約6mg/mlのrhSP-D又はその活性断片の濃度を有する、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
溶液又は懸濁液が、約3mg/mlから約5mg/mlのrhSP-D又はその活性断片の濃度を有する、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
溶液又は懸濁液が、約4mg/mlのrhSP-D又はその活性断片の濃度を有する、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
溶液又は懸濁液が、約1mg/mlから約3mg/mlのrhSP-D又はその活性断片の濃度を有する、請求項53に記載の方法。
【請求項５７】
溶液又は懸濁液が、約2mg/mlのrhSP-D又はその活性断片の濃度を有する、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
溶液又は懸濁液が、オリゴマー型を有するrhSP-Dポリペプチド集団を含む、請求項49から57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
オリゴマー型の30%より多くがrhSP-Dの十二量体を含む、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
オリゴマー型の35%より多くがrhSP-Dの十二量体を含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
オリゴマー型の40%より多くがrhSP-Dの十二量体を含む、請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
オリゴマー型の45%より多くがrhSP-Dの十二量体を含む、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
オリゴマー型の10%未満がrhSP-Dの凝集体を含み、前記凝集体が70nmより大きい半径を有する、請求項58から62のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
オリゴマー型の5%未満がrhSP-Dの凝集体を含み、前記凝集体が70nmより大きい半径を有する、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
オリゴマー型の3%未満がrhSP-Dの凝集体を含み、前記凝集体が70nmより大きい半径を有する、請求項64に記載の方法。
【請求項６６】
溶液又は懸濁液におけるrhSP-Dオリゴマー種の約3質量%未満が、70nmより大きい半径を有する高分子量のオリゴマー型である、請求項58から65のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられている、発明の名称「METHODS AND COMPOSITIONS COMPRISING SURFACTANT PROTEIN D (SP-D)」の2018年3月29日に出願された米国仮特許出願第62/650142号の優先権を主張する。
【０００２】
配列表への言及
本出願は、電子書式での配列表と共に出願される予定である。配列表は、サイズがおよそ7Kbである、2019年3月20日に作成されたAIRWY011WOSEQLISTという名前のファイルとして提供される。配列表の電子書式での情報は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【０００３】
本明細書に提供されたいくつかの実施形態は、組換えヒトサーファクタントタンパク質D(SP-D)又はその活性断片を含む方法及び薬学的組成物に関する。いくつかのそのような実施形態は、組換えヒトサーファクタントタンパク質D又はその活性断片の溶液及び凍結乾燥した固形を含む。
【背景技術】
【０００４】
哺乳類肺サーファクタントは、タンパク質(10%)と、主要な脂質成分ジパミルトイルホスファチジルコリンを含む脂質(90%)の混合物である(Zuo YYら、Biochim Biophys Acta (2008) 1778:1947〜77頁)。肺サーファクタントの主要な機能は、肺内の最小表面張力を保証して、呼吸中の崩壊を回避することである。更に、吸入病原体と相互作用することにより、肺サーファクタントはまた、宿主防御に関与する(Clements JA. Am Rev Respir Dis (1977) 115:67〜71頁)。肺サーファクタント欠乏は、喘息、細気管支炎、呼吸促迫症候群(RDS)、嚢胞性線維症、及び肺炎等の肺疾患に関連している(Griese M. Eur Respir J (1999) 13:1455〜76頁)。サーファクタント製剤は、RDSの処置に適応され、RDSは、毎年、世界で約150万人の未熟児を冒す。呼吸促迫症候群は、早産児において肺の構造的未熟さによって引き起こされる主要な肺サーファクタント欠乏疾患であり、それは、呼吸することを困難にし、ガス交換を阻害し、肺胞崩壊を促進する(Notter RH. 2000 Lung Surfactants. Basic Science and Clinical Applications. New York, NY: Marcel Dekker Inc.)。複雑な肺疾患の処置の成功は、典型的には、組成が天然の肺サーファクタントと可能な限り厳密に一致するサーファクタント製剤の作製を必要とする(Robertson Bら、Biochim Biophys Acta (1998) 1408:346〜61頁)。
【０００５】
肺サーファクタントは、4つの異なるサーファクタントタンパク質を含有する。その2つの疎水性タンパク質、サーファクタントタンパク質B及びCは、気液界面における表面張力の低下に関与し、一方、2つの親水性タンパク質、サーファクタントタンパク質A及びDは、コレクチンファミリーのメンバーであり、宿主免疫応答の調節及びサーファクタントプールリサイクリングに関与している(Awasthi S. (2010) Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery、5:115〜123頁)。サーファクタントタンパク質D(SP-D)は、4つのドメイン:分子間ジスルフィド結合の形成に必要とされるシステイン連結N末端領域、トリプルヘリックスコラーゲン領域、αヘリックスコイルドコイル三量体形成ネックペプチド、及びC末端カルシウム依存性糖鎖認識ドメイン(CRD)を含む、C型(Ca2+依存性)レクチンである(Crouch E.ら(1994) J Biol Chem 269:17311〜9頁)。単量体は、コラーゲン様領域のトリプルヘリックスへのフォールディング及びネック領域におけるαヘリックスのコイルドコイル束のアセンブリにより三量体を形成する。これらの三量体は、システインリッチN末端ドメインにおける2つのジスルフィド結合によって安定化される。SP-D三量体は、3つの同一の43kDaのポリペプチド鎖を含む129kDaの総分子量を有する。SP-D三量体は、サイズ及び立体構造が異なる、より高次のオリゴマー化状態を形成し得る。より高次のオリゴマー化状態は、SP-D機能にとって重要であり得る(Hakansson Kら、Protein Sci (2000) 9:1607〜17頁; Crouch E. Respir Res (2000) 1:93〜108頁; Crouch E.ら、(2006) J Biol Chem 281:18008〜14頁)。
【０００６】
他のサーファクタントタンパク質とは対照的に、SP-Dは、気液界面における表面張力の低下に関与せず、且つ肺サーファクタントの生物物理学的性質を変化させない(Awasthi S. (2010) Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery、5:115〜123頁)。SP-Dは、喘息、嚢胞性線維症、及び喫煙によって誘発される肺気腫等の慢性肺疾患に対処する抗炎症活性及び抗菌活性を提供することにより、肺の自然免疫系において役割をもつ(Clark Hら、Immunobiology (2002) 205:619〜31頁)。SP-Dはまた、サーファクタントプール恒常性を制御することにおいて重要な役割をもち、発生中のSP-Dの欠損は、結果として、肺気腫表現型を生じる(Wert, S.ら(2000) Chest 117:248S; Korfhagen, T. R.ら(1998) J Biol Chem 273: 28438〜28443頁)。早産新生仔の仔ヒツジに基づいたデータは、100mg/kg Survanta(登録商標)(USAで入手可能な天然サーファクタント)と併用した約2〜3mg/kgの組換えヒトSP-D(rhSP-D)の投与が、内毒素ショックの予防及び人工呼吸により引き起こされる肺炎症の低下について、Survanta(登録商標)単独より効果的であることを示唆する(Ikegami Mら、Am J Respir Crit Care Med (2006) 173:1342〜7頁; Sato Aら、Am J Respir Crit Care Med (2010) 181:1098〜105頁)。
【０００７】
伝統的に、SP-Dは、気管支肺胞洗浄液又は羊水の上清から単離されているが、SP-Dの、全部ではないが、大部分が、一部にはSP-Dの親水性の性質により、市販のサーファクタントの精製中に失われる(Dodagatta-Marri Eら、Methods Mol Biol (2014) 100:273〜90頁)。サプリメント肺サーファクタント製剤へのrhSP-Dの使用は、治療効果を確実にすることができ、現在の肺サーファクタント製剤が、親水性サーファクタントタンパク質の非存在下では、宿主免疫応答を効果的に調節する能力を欠くからである。いかなる薬学的組成物においても維持されなければならない天然SP-Dの重要な特性は、適切なオリゴマー化状態であり、内因性サーファクタントタンパク質におけるより高次の多量体化が、病原体の表面上の糖鎖リガンドに対するSP-D結合部位の数を増加させ、強力な細菌及びウイルス凝集効果を達成するからである(White Mら、J Immunol (2008) 181:7936〜43頁)。適切なオリゴマー化状態はまた、宿主免疫応答の調節のための受容体認識及び受容体媒介性シグナル伝達に(Yamazoe M.ら、J Biol Chem (2008) 283:35878〜35888頁)、加えて、サーファクタント恒常性の維持に(Zhang Lら、J Biol Chem (2001) 276:19214〜19219頁)、必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第8,865,643号
【特許文献２】米国特許出願公開第2019/0071693号
【特許文献３】米国特許出願公開第2019/0071694号
【特許文献４】米国仮特許出願第62/650138号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Zuo YYら、Biochim Biophys Acta (2008) 1778:1947〜77頁
【非特許文献２】Clements JA. Am Rev Respir Dis (1977) 115:67〜71頁
【非特許文献３】Griese M. Eur Respir J (1999) 13:1455〜76頁
【非特許文献４】Notter RH. 2000 Lung Surfactants. Basic Science and Clinical Applications. New York, NY: Marcel Dekker Inc.
【非特許文献５】Robertson Bら、Biochim Biophys Acta (1998) 1408:346〜61頁
【非特許文献６】Awasthi S. (2010) Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery、5:115〜123頁
【非特許文献７】Crouch E.ら(1994) J Biol Chem 269:17311〜9頁
【非特許文献８】Hakansson Kら、Protein Sci (2000) 9:1607〜17頁
【非特許文献９】Crouch E. Respir Res (2000) 1:93〜108頁
【非特許文献１０】Crouch E.ら、(2006) J Biol Chem 281:18008〜14頁
【非特許文献１１】Awasthi S. (2010) Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery、5:115〜123頁
【非特許文献１２】Clark Hら、Immunobiology (2002) 205:619〜31頁
【非特許文献１３】Wert, S.ら(2000) Chest 117:248S
【非特許文献１４】Korfhagen, T. R.ら(1998) J Biol Chem 273: 28438〜28443頁
【非特許文献１５】Ikegami Mら、Am J Respir Crit Care Med (2006) 173:1342〜7頁
【非特許文献１６】Sato Aら、Am J Respir Crit Care Med (2010) 181:1098〜105頁
【非特許文献１７】Dodagatta-Marri Eら、Methods Mol Biol (2014) 100:273〜90頁
【非特許文献１８】White Mら、J Immunol (2008) 181:7936〜43頁
【非特許文献１９】Yamazoe M.ら、J Biol Chem (2008) 283:35878〜35888頁
【非特許文献２０】Zhang Lら、J Biol Chem (2001) 276:19214〜19219頁
【非特許文献２１】Knudsen L.ら、(2009) The Anatomical Record 292:183〜189頁
【非特許文献２２】Knudsen L.ら、(2013) J. Anat 223:581〜592頁
【非特許文献２３】Winkler C.ら、(2014) Exp Lung Res 40:154〜163頁
【非特許文献２４】Ogasawara Y.ら、(1995) J Biol Chem 270:19052〜19058頁
【非特許文献２５】Kingma P.S.ら、(2006) J Biol Chem 281:24496〜24505頁
【非特許文献２６】「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、Lippincott Williams & Wilkins;第20版(2003年6月1日)
【非特許文献２７】「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Pub. Co.;第18版及び第19版(それぞれ、1985年12月、及び1990年6月)
【非特許文献２８】Arroyo Rら、(2017) Biophys J 112 (3): 503a
【非特許文献２９】Haagsman HPら、(2008) Neonatology 93:288〜294頁
【非特許文献３０】Vieira F.ら、(2017) Ann Anat 211:184〜201頁
【非特許文献３１】Malash AHら、(2016) Gene 592:23〜28頁
【非特許文献３２】Katz, M.H、「Multivariate Analysis: A Practice Guide for Clinicians.」Cambridge University Press、New York、158〜162頁(1999)
【非特許文献３３】Stahle, L.ら、(1988)「Multivariate data analysis and experimental design in biomedical research.」Prog. Med. Chem. 25: 291〜338頁
【非特許文献３４】Wold S. (2001)「PLS-regression: a basic tool of chemometrics.」Chemom. Intell. Lab. Syst. 58: 109〜130頁
【非特許文献３５】Martens, H.ら、(2001)「Multivariate Analysis of Quality: An Introduction」Wiley and Sons、Chichester、UK
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
いくつかの実施形態は、組換えヒトサーファクタントタンパク質D(rhSP-D)又はその活性断片を含む薬学的組成物を含む。いくつかの実施形態はまた、バッファー、糖、及びカルシウム塩を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、バッファーは、酢酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩、及びリン酸塩からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、バッファーはヒスチジンである。いくつかの実施形態において、ヒスチジンの濃度は、約0.1mMから約100mMである。いくつかの実施形態において、ヒスチジンの濃度は約5mMである。
【００１２】
いくつかの実施形態において、糖は、スクロース、マルトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ラフィノース、チオグルコース、チオマンノース、チオフルクトース、オクタ-O-アセチル-チオトレハロース、チオスクロース、及びチオマルトースからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、糖はラクトースである。いくつかの実施形態において、ラクトースの濃度は、1mMから500mMである。いくつかの実施形態において、ラクトースの濃度は、約265mMである。
【００１３】
いくつかの実施形態において、カルシウム塩は、塩化カルシウム、臭化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウム、及びクエン酸カルシウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、カルシウム塩は塩化カルシウムである。いくつかの実施形態において、塩化カルシウムの濃度は、約0.1mMから約10mMである。いくつかの実施形態において、塩化カルシウムの濃度は約5mMである。
【００１４】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約5.0から約9.0のpHを有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約5.5から約6.5のpHを有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は約6.0のpHを有する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、rhSP-Dの濃度は、約0.1mg/mlから約10mg/mlである。いくつかの実施形態において、rhSP-Dの濃度は、約1mg/mlから約4mg/mlである。いくつかの実施形態において、rhSP-Dの濃度は、約2mg/mlである。いくつかの実施形態において、rhSP-Dの濃度は、約4mg/mlである。
【００１６】
いくつかの実施形態は、オリゴマー型を有するrhSP-Dポリペプチド集団を含む薬学的組成物であって、前記オリゴマー型の30%より多くが、rhSP-Dの十二量体を含む、薬学的組成物を含む。いくつかの実施形態において、オリゴマー型の40%より多くが、rhSP-Dの十二量体を含む。いくつかの実施形態において、オリゴマー型の15%未満がrhSP-Dの凝集体を含み、前記凝集体が70nmより大きい半径を有する。いくつかの実施形態において、オリゴマー型の10%未満がrhSP-Dの凝集体を含み、前記凝集体が70nmより大きい半径を有する。いくつかの実施形態において、オリゴマー型の5%未満がrhSP-Dの凝集体を含み、前記凝集体が70nmより大きい半径を有する。
【００１７】
いくつかの実施形態はまた、増量剤を含む。いくつかの実施形態において、増量剤は、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、グリセロール、エリスリトール、アラビトール、グリシン、アラニン、スレオニン、バリン、及びフェニルアラニンからなる群から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、組成物は、EDTA及びEGTAから選択されるキレート剤を欠く。
【００１９】
いくつかの実施形態において、rhSP-Dポリペプチドは、配列番号02のアミノ酸配列又はその活性断片を含む。いくつかの実施形態において、rhSP-D又はその活性断片は、Met 11、Thr 160、Ser 270、及びAla 286からなる群から選択される残基に対応する多型位置における残基を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態は、2mg/ml rhSP-D、5mM  ヒスチジン、265mM  ラクトース、5mM  塩化カルシウムを含む薬学的組成物であって、前記溶液が6.0のpHを有する、薬学的組成物を含む。いくつかの実施形態は、2mg/ml rhSP-D、5mM  ヒスチジン、265mM  ラクトース、1mM  塩化カルシウムを含む薬学的組成物であって、前記溶液が6.0のpHを有する、薬学的組成物を含む。いくつかの実施形態は、1mg/ml rhSP-D、5mM  ヒスチジン、265mM  ラクトース、5mM  塩化カルシウムを含む薬学的組成物であって、前記溶液が6.0のpHを有する、薬学的組成物を含む。いくつかの実施形態は、4mg/ml rhSP-D、5mM  ヒスチジン、265mM  ラクトース、5mM  塩化カルシウムを含む薬学的組成物であって、前記溶液が6.0のpHを有する、薬学的組成物を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態は、前述の薬学的組成物のいずれか1つの薬学的組成物の凍結乾燥物を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態は、前述の薬学的組成物のいずれか1つの薬学的組成物の凍結乾燥物を含む容器を含む物品を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態は、前述の薬学的組成物のいずれか1つの薬学的組成物を凍結乾燥する工程を含む、凍結乾燥物を調製する方法を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態は、請求項1〜33のいずれか一項に記載の薬学的組成物の凍結乾燥物を、薬学的に許容される希釈剤と接触させて、rhSP-D又はその活性断片の溶液又は懸濁液を形成する工程を含む、薬学的組成物を調製する方法を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、希釈剤は、肺への投与に適している。いくつかの実施形態において、希釈剤は滅菌水である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、溶液又は懸濁液は、約0.1mg/mlから約10mg/mlのrhSP-D又はその活性断片の濃度を有する。いくつかの実施形態において、溶液又は懸濁液は、約1mg/mlから約4mg/mlのrhSP-D又はその活性断片の濃度を有する。いくつかの実施形態において、溶液又は懸濁液は、約2mg/mlのrhSP-D又はその活性断片の濃度を有する。いくつかの実施形態において、溶液又は懸濁液は、約4mg/mlのrhSP-D又はその活性断片の濃度を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、溶液又は懸濁液におけるrhSP-Dオリゴマー種の約3質量%未満が、70nmより大きい半径を有する高分子量のオリゴマー型である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、溶液又は懸濁液は、オリゴマー型を有するrhSP-Dポリペプチド集団を含み、前記オリゴマー型の30%より多くがrhSP-Dの十二量体を含む。いくつかの実施形態において、オリゴマー型の40%より多くがrhSP-Dの十二量体を含む。いくつかの実施形態において、オリゴマー型の45%より多くがrhSP-Dの十二量体を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、オリゴマー型の10%未満が、rhSP-Dの凝集体を含み、前記凝集体が、70nmより大きい半径を有する。いくつかの実施形態において、オリゴマー型の5%未満が、rhSP-Dの凝集体を含み、前記凝集体が、70nmより大きい半径を有する。いくつかの実施形態において、オリゴマー型の3%未満が、rhSP-Dの凝集体を含み、前記凝集体が、70nmより大きい半径を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】SP-D三量体の形成及びSP-D三量体の構造的特徴を描く概略図である。
【図２】6カ月間の凍結乾燥物安定性研究を描く棒グラフであり、1カ月間、3カ月間、又は6カ月間の期間、5℃又は25℃のいずれかで保存されていた、rhSP-Dの2mg/mlの再構成された凍結乾燥物についてのAF4-MALLS分析のピーク1、ピーク2、ピーク3、又はピーク4のいずれかにより表された異なるSP-Dオリゴマー種の分布を示す。
【図３】3カ月間の凍結乾燥物安定性研究を描く1セットの棒グラフパネルであり、2mg/ml(上方パネル)又は4mg/ml(下方パネル)のいずれかで再構成され、且つ1カ月間又は3カ月間の期間、5℃又は25℃のいずれかで保存されていた、rhSP-Dの凍結乾燥物についてのAF4-MALLS分析のピーク1、ピーク2、ピーク3、又はピーク4のいずれかにより表された異なるSP-Dオリゴマー種の分布を示す。
【図４】凍結/融解安定性研究を描く1セットの棒グラフパネルであり、2mg/ml(上方パネル)又は4mg/ml(下方パネル)のいずれかで再構成され、急速液体窒素凍結によるか又は-80℃冷凍庫においてかのいずれかにより凍結され、且つ1回、3回、又は5回の凍結/融解サイクルで融解されていた、rhSP-Dの凍結乾燥物についてのAF4-MALLS分析のピーク1、ピーク2、ピーク3、又はピーク4のいずれかにより表された異なるSP-Dオリゴマー種の分布を示す。
【図５】再構成された凍結乾燥物についての安定性研究を描く1セットの棒グラフパネルであり、2mg/ml(上方パネル)又は4mg/ml(下方パネル)のいずれかで再構成され、且つ1日間又は3日間の期間、5℃又は25℃のいずれかで保存されていた、rhSP-Dの凍結乾燥物についてのAF4-MALLS分析のピーク1、ピーク2、ピーク3、又はピーク4のいずれかにより表された異なるSP-Dオリゴマー種の分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
サーファクタントタンパク質D(SP-D)は、4つのドメイン:分子間ジスルフィド結合の形成に必要とされるシステイン連結N末端領域、トリプルヘリックスコラーゲン領域、αヘリックスコイルドコイル三量体形成ネックペプチド、及びC末端カルシウム依存性糖鎖認識ドメイン(CRD)を含む、C型(Ca2+依存性)レクチンである(Crouch E.ら(1994) J Biol Chem 269:17311〜9頁)。単量体は、コラーゲン様領域のトリプルヘリックスへのフォールディング及びネック領域におけるαヘリックスのコイルドコイル束のアセンブリにより三量体を形成する(図1)。これらの三量体は、システインリッチN末端ドメインにおける2つのジスルフィド結合によって安定化される。SP-D三量体は、3つの同一の43kDaのポリペプチド鎖を含む129kDaの総分子量を有する。SP-D三量体は、サイズ及び立体構造が異なる、より高次のオリゴマー化状態を形成し得る。より高次のオリゴマー化状態は、SP-D機能にとって重要であり得る(Hakansson Kら、Protein Sci (2000) 9:1607〜17頁; Crouch E. Respir Res (2000) 1:93〜108頁; Crouch E.ら、(2006) J Biol Chem 281:18008〜14頁)。SP-D三量体のより高次のオリゴマー化状態への会合は、精製及び保存中の環境因子及び条件に対して感受性がある。SP-Dの大きなオリゴマーの形成に関与する相互作用の経路及び型は、以前には解明されていなかった。
【００３２】
組換えヒトSP-D(rhSP-D)は、ある特定のヒト骨髄性白血病細胞株及びチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を含む様々な哺乳類系で産生されている。rhSP-Dの試料は、三量体、六量体、十二量体、星状の外観を有する六量体と十二量体の多量体、及び凝集体として同定される更に大きなオリゴマー種を含む、異なるrhSP-Dオリゴマー型の多様な集団を含み得る。様々な哺乳類系由来のrhSP-Dは、実質的に異なり得る。例えば、rhSP-Dの翻訳後修飾は、rhSP-Dの所定の試料内でのrhSP-Dオリゴマー型の分布に影響し得る。加えて、ある特定のヒト骨髄性白血病細胞株において産生されたrhSP-Dは、CHO細胞から産生されたrhSP-Dと比較して、より多い量のrhSP-D十二量体、及びより少ない量の、rhSP-D凝集体等のより大きいオリゴマー種を有し得る。
【００３３】
本出願人は、有効期間の向上、活性rhSP-Dタンパク質の安定性の向上、及びある特定のrhSP-Dオリゴマー型についての安定性の向上を提供する、rhSP-D及びその活性断片のある特定の製剤を発見した。そのような製剤のいくつかの実施形態は、投与用のrhSP-D、凍結乾燥のためのrhSP-D、凍結乾燥したrhSP-D、再構成された凍結乾燥rhSP-D、及び投与用の再構成された凍結乾燥rhSP-Dを含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、新生児肺等の肺への投与等、肺投与に適している。
【００３４】
薬学的組成物
本明細書に提供された組成物及び方法のいくつかの実施形態は、組換えヒトサーファクタントタンパク質D(rhSP-D)又はその活性断片の薬学的組成物を含む。いくつかの実施形態において、rhSP-D又はその活性断片は、細菌凝集アッセイ又はTLR4阻害アッセイにおいて活性を有する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、水溶液、懸濁液、又は固形であり得る。いくつかの実施形態において、rhSP-D又はその活性断片の薬学的組成物は、固形への凍結乾燥に適している。いくつかの実施形態において、凍結乾燥物又は粉末等の固形は、肺へ投与することができ、及び/又は肺への投与に適したある特定の溶液を形成するように再構成することができる。いくつかの実施形態において、rhSP-D又はその活性断片の水溶液又は懸濁液を含む薬学的組成物は、肺への投与に適している。
【００３５】
rhSP-D又はその断片のある特定の活性は、細菌凝集アッセイ、Toll様受容体4(TLR4)阻害アッセイ、及び/又は多角度レーザー光散乱と組み合わせた非対称フロー式フィールドフローフラクショネーション(AF4-MALLS)分析を用いて、容易に決定することができる。いくつかの実施形態において、rhSP-D又はその活性断片の活性には、細菌凝集アッセイ又はTLR4阻害アッセイにおいて測定される活性等の生物学的活性を挙げることができる。いくつかの実施形態において、rhSP-D又はその活性断片の活性には、rhSP-D又はその活性断片の集団の、rhSP-Dのある特定のオリゴマー型を形成する活性、及び/又はrhSP-Dのオリゴマー型のある特定の分布を形成する活性を挙げることができる。試料においてrhSP-Dのオリゴマー型の分布を同定するための方法例は、本明細書に提供されている。
【００３６】
SP-Dは、4つのドメイン:分子間ジスルフィド結合の形成に必要とされるシステイン連結N末端領域、トリプルヘリックスコラーゲン領域、αヘリックスコイルドコイル三量体形成ネックペプチド、及びC末端カルシウム依存性糖鎖認識ドメイン(CRD)を含む。rhSP-Dポリペプチド配列の例は、TABLE 1(表1)に提供されている。SP-Dのある特定の部分は、インビボでSP-Dの機能においてある特定の役割をもち得る。例えば、SP-Dノックアウトマウスにおいて、より短いコラーゲン領域(コラーゲン領域全体ではなく、又は野生型SP-Dのアミノ末端ではない)、ネックドメイン、及びCRDからなるヒトSP-Dの組換え断片は、肺気腫様病態の発生のある特定の局面を阻害する(全体として参照により本明細書に組み入れられている、Knudsen L.ら、(2009) The Anatomical Record 292:183〜189頁)。システイン連結N末端領域は、SP-Dのオリゴマー型の形成において活性を有し得る。例えば、そのタンパク質における位置11でのMetからThrへの置換(Met(11)Thr)を生じるAからCへのヌクレオチド変化は、SP-Dのオリゴマー型の形成に影響し得る。例えば、Knudsen L.ら、(2013) J. Anat 223:581〜592頁;及びWinkler C.ら、(2014) Exp Lung Res 40:154〜163頁(それぞれは、全体として参照により本明細書に組み入れられている)を参照。ラットトリプルヘリックスコラーゲン領域を欠損する変異体ラットSP-Dタンパク質に関する欠失研究は、変異体ラットSP-Dがまだなお、三量体を形成することができるが、十二量体等のより高次のオリゴマーを形成することができず、肺マクロファージ活性化、気腔リモデリング、及びサーファクタント脂質恒常性の制御における活性を欠損することを実証した。Ogasawara Y.ら、(1995) J Biol Chem 270:19052〜19058頁;及びKingma P.S.ら、(2006) J Biol Chem 281:24496〜24505頁(それらは、それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている)を参照。ラットSP-Dタンパク質に関する更なる欠失研究は、ラットシステイン連結N末端領域が、効率的なウイルス中和及びオプソニン化において役割をもつことを実証した。全体として参照により本明細書に組み入れられている、White M.ら、(2008) J. Immunol 181:7937〜7942頁を参照。ある特定のドメインを欠損するヒトSP-Dの例は、全体として参照により本明細書に組み入れられている、米国特許第8,865,643号に開示されている。
【００３７】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、バッファーを含み得る。バッファーの例には、酢酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩、及びリン酸塩が挙げられる。いくつかの実施形態において、バッファーはヒスチジンである。いくつかの実施形態において、ヒスチジン等のバッファーの濃度は、0.1mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、又は前述の濃度のいずれか2つの間の範囲における濃度である。いくつかの実施形態において、ヒスチジン等のバッファーの濃度は、約0.1mM、約1mM、約2mM、約3mM、約4mM、約5mM、約6mM、約7mM、約8mM、約9mM、約10mM、約20mM、約30mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM、約100mM、又は前述の濃度のいずれか2つの間の範囲における濃度である。
【００３８】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、糖を含み得る。糖の例には、トレハロース、スクロース、マルトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ラフィノース、チオグルコース、チオマンノース、チオフルクトース、オクタ-O-アセチル-チオトレハロース、チオスクロース、及びチオマルトースが挙げられる。いくつかの実施形態において、糖はラクトースである。いくつかの実施形態において、ラクトース等の糖の濃度は、0.1mM、1mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、265mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、1000mM、又は前述の濃度のいずれか2つの間の範囲における濃度である。いくつかの実施形態において、ラクトース等の糖の濃度は、約0.1mM、約1mM、約10mM、約20mM、約30mM、約40mM、約50mM、約100mM、約150mM、約200mM、約250mM、約265mM、約300mM、約350mM、約400mM、約450mM、約500mM、約600mM、約700mM、約800mM、約900mM、約1000mM、又は前述の濃度のいずれか2つの間の範囲における濃度である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、カルシウム塩を含み得る。カルシウム塩の例には、塩化カルシウム、臭化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウム、及びクエン酸カルシウムが挙げられる。いくつかの実施形態において、カルシウム塩は、塩化カルシウムである。いくつかの実施形態において、塩化カルシウム等のカルシウム塩の濃度は、0.1mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、又は前述の濃度のいずれか2つの間の範囲における濃度である。いくつかの実施形態において、塩化カルシウム等のカルシウム塩の濃度は、約0.1mM、約1mM、約2mM、約3mM、約4mM、約5mM、約6mM、約7mM、約8mM、約9mM、約10mM、約20mM、約30mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM、約100mM、又は前述の濃度のいずれか2つの間の範囲における濃度である。
【００４０】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、無機塩又は有機塩を含み得る。無機塩の例には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、及び炭酸水素ナトリウムが挙げられる。有機塩の例には、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、及び酢酸ナトリウムが挙げられる。いくつかの実施形態において、無機塩は塩化ナトリウムである。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム等の無機塩又は有機塩の濃度は、0.1mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、又は前述の濃度のいずれか2つの間の範囲における濃度である。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム等の無機塩又は有機塩の濃度は、約0.1mM、約1mM、約2mM、約3mM、約4mM、約5mM、約6mM、約7mM、約8mM、約9mM、約10mM、約20mM、約30mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM、約100mM、又は前述の濃度のいずれか2つの間の範囲における濃度である。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、塩化ナトリウム等の無機塩又は有機塩を欠き得る。
【００４１】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、表面活性剤を含み得る。表面活性剤の例には、ヘキサデカノール、チロキサポール、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、PG、パルミトイル-オレオイルホスファチジルグリセロール、パルミチン酸、トリパルミチン、ポリソルベート-20、ポリソルベート-80、ポリソルベート-21、ポリソルベート-40、ポリソルベート-60、ポリソルベート-65、ポリソルベート-81、及びポリソルベート-85等のポリソルベート類が挙げられる。表面活性剤の更なる例には、ポロキサマー188等のポロキサマー類、Triton X-100等のTriton、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ラウリル硫酸ナトリウム、オクチルグリコシドナトリウム、ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、ステアリルスルホベタイン、ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、ステアリルサルコシン、リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、セチルベタイン、ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン、イソステアラミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、イソステアラミドプロピルジメチルアミン、ココイルメチルタウリンナトリウム、オレオイルメチルタウリンジナトリウム、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、及びエチレンとプロピレングリコールのコポリマーが挙げられる。いくつかの実施形態において、表面活性剤は、チロキサポールである。いくつかの実施形態において、チロキサポール等の表面活性剤の濃度は、0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%(v/v)、又は前述の濃度のいずれか2つの間の範囲における濃度である。いくつかの実施形態において、チロキサポール等の表面活性剤の濃度は、約0.0001%、約0.0005%、約0.001%、約0.005%、約0.01%、約0.05%、約0.1%、約0.5%、約1%(v/v)、又は前述の濃度のいずれか2つの間の範囲における濃度である。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、チロキサポール等の表面活性剤を欠き得る。
【００４２】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0のpH、又は前述の値のいずれか2つの間の範囲におけるpHを有し得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約4.0、約4.5、約5.0、約5.5、約6.0、約6.5、約7.0、約7.5、約8.0、約8.5、約9.0、約9.5、約10.0のpH、又は前述の値のいずれか2つの間の範囲におけるpHを有し得る。
【００４３】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物におけるrhSP-D又はその活性断片等のタンパク質の濃度は、0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、又は前述の濃度のいずれか2つの間の範囲における濃度であり得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物におけるrhSP-D又はその活性断片等のタンパク質の濃度は、約0.01mg/ml、約0.05mg/ml、約0.1mg/ml、約0.5mg/ml、約1mg/ml、約2mg/ml、約3mg/ml、約4mg/ml、約5mg/ml、約6mg/ml、約7mg/ml、約8mg/ml、約9mg/ml、約10mg/ml、約20mg/ml、約30mg/ml、約40mg/ml、約50mg/ml、約60mg/ml、約70mg/ml、約80mg/ml、約90mg/ml、約100mg/ml、又は前述の濃度のいずれか2つの間の範囲における濃度であり得る。
【００４４】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、増量剤を含み得る。増量剤の例には、本明細書に開示された糖が挙げられる。増量剤の更なる例には、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、グリセロール、エリスリトール、アラビトール、グリセリン、グリシン、アラニン、スレオニン、バリン、及びフェニルアラニンが挙げられる。いくつかの実施形態において、増量剤の濃度は、0.1mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、又は前述の濃度のいずれか2つの間の範囲における濃度である。いくつかの実施形態において、増量剤の濃度は、約0.1mM、約1mM、約2mM、約3mM、約4mM、約5mM、約6mM、約7mM、約8mM、約9mM、約10mM、約20mM、約30mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM、約100mM、又は前述の濃度のいずれか2つの間の範囲における濃度である。
【００４５】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、キレート剤を含み得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、キレート剤を欠き得る。キレート剤の例には、EDTA及びEGTAが挙げられる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、rhSP-Dは、野生型ヒトSP-Dポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、rhSP-Dは、ヒトSP-Dポリペプチドの多型を含む。SP-Dポリペプチド配列の例は、TABLE 1(表1)に提供されている。ヒトSP-Dポリペプチドにおける多型には、残基11、ATG (Met)→ACG (Thr);  残基25、AGT (Ser)→AGC (Ser);  残基160、ACA (Thr)→GCA (Ala);  残基270、TCT (Ser)→ACT (Thr);及び残基286、GCT (Ala)→GCC (Ala)を挙げることができ、それらにおける位置は、成熟SP-Dポリペプチド、例えば、配列番号02のポリペプチド例における位置に関係する。いくつかの実施形態において、rhSP-Dは、Met 11/31、Thr 160/180、Ser 270/290、及びAla 286/306から選択される、多型位置におけるある特定の残基を含み、それらにおける残基位置は、成熟SP-Dポリペプチド、例えば、配列番号02の例における位置、及びそれのリーダーポリペプチドを有するSP-Dポリペプチド、例えば、配列番号01の例における位置に関係する。いくつかの実施形態において、rhSP-Dは、Met 11/31を含む。いくつかの実施形態において、rhSP-Dは、Met 11/31、Thr 160/180、Ser 270/290、及びAla 286/306を含む。いくつかの実施形態において、rhSP-Dポリペプチドは、配列番号02のポリペプチドと、そのポリペプチドの全長に対して、少なくとも80%、90%、95%、99%、及び100%、又は前述のパーセンテージのいずれかの間の範囲における任意のパーセンテージの同一性を有する。
【００４７】
【表１】
2021519757.tif 000003
【００４８】
いくつかの実施形態において、rhSP-Dは、組み込まれた導入遺伝子からrhSP-Dを発現するヒト骨髄性白血病細胞株に由来する。発現ベクター、rhSP-Dポリペプチド、細胞株、及びそのような細胞からrhSP-Dを精製する方法の例は、米国特許出願公開第2019/0071693号及び米国特許出願公開第2019/0071694号に提供され、それらの特許出願のそれぞれは、全体として参照により本明細書に明確に組み入れられている。
【００４９】
いくつかの実施形態において、rhSP-Dポリペプチド集団を含む溶液又は懸濁液等の薬学的組成物は、rhSP-Dのオリゴマー型のある特定の分布を有し得る。rhSP-Dの組成は、以下を含む異なるrhSP-Dオリゴマー型を含み得る:3個の単量体を含み、且つまとまって、原子間力顕微鏡法(AFM)により可視化された場合、棒状の外観を有し得る、SDS-PAGE上で約130〜150kDaの質量を有する三量体;6個の単量体を含む、SDS-PAGE上で約250kDaの質量を有する六量体;12個の単量体を含み、且つAFMにより可視化された場合、X状の外観を有し得る、AF4-MALLSにより測定された場合、約520kDaの推定質量をもつ十二量体;4より大きい数の倍数の三量体を含み、且つAFMにより可視化及び同定された場合、約70nmの半径をもつ星状又は星の形をした外観を有し得る、より大きな不均一オリゴマー種(そのようなオリゴマーは、星状オリゴマーとして知られている);及びAFMにより可視化され、且つAF4-MALLSにより測定された場合、70nmより大きい半径を有し、凝集体として知られた、更に大きいオリゴマー種。
【００５０】
いくつかの実施形態において、AF4-MALLS分析において相対ピーク領域(RPA)として測定された場合、rhSP-Dのオリゴマー型の約10%より多く、20%より多く、30%より多く、50%より多く、60%より多く、70%より多く、80%より多く、90%より多く、又は前述のパーセンテージのいずれか2つの間の範囲内のパーセンテージより多くが、rhSP-Dの十二量体オリゴマー型であり得る。いくつかの実施形態において、rhSP-Dの、溶液又は懸濁液中等の、オリゴマー型の質量の約10%より多く、20%より多く、30%より多く、50%より多く、60%より多く、70%より多く、80%より多く、90%より多く、又は前述のパーセンテージのいずれか2つの間の範囲内のパーセンテージより多くが、rhSP-Dの十二量体オリゴマー型であり得る。いくつかの実施形態において、rhSP-Dの、溶液又は懸濁液中等の、オリゴマー型の分子数の約10%より多く、20%より多く、30%より多く、50%より多く、60%より多く、70%より多く、80%より多く、90%より多く、又は前述のパーセンテージのいずれか2つの間の範囲内のパーセンテージより多くが、rhSP-Dの十二量体オリゴマー型であり得る。
【００５１】
いくつかの実施形態において、AF4-MALLS分析においてRPA又は調整されたRPAとして測定された場合、rhSP-Dのオリゴマー型の約0.5%未満、1%未満、2%未満、3%未満、4%未満、5%未満、10%未満、20%未満、30%未満、50%未満、又は前述のパーセンテージのいずれか2つの間の範囲内のパーセンテージ未満が、rhSP-Dの凝集体オリゴマー型であり得る。いくつかの実施形態において、rhSP-Dの、溶液又は懸濁液中等の、オリゴマー型の質量の約0.5%未満、1%未満、2%未満、3%未満、4%未満、5%未満、10%未満、20%未満、30%未満、50%未満、又は前述のパーセンテージのいずれか2つの間の範囲内のパーセンテージ未満が、rhSP-Dの凝集体オリゴマー型であり得る。いくつかの実施形態において、rhSP-Dの、溶液又は懸濁液中等の、オリゴマー型の分子数の約0.5%未満、1%未満、2%未満、3%未満、4%未満、5%未満、10%未満、20%未満、30%未満、50%未満、又は前述のパーセンテージのいずれか2つの間の範囲内のパーセンテージ未満が、rhSP-Dの凝集体オリゴマー型であり得る。
【００５２】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、6.0のpHを有する、1mg/ml rhSP-D、5mM  ヒスチジン、265mM  ラクトース、5mM  塩化カルシウムからなり、それらから本質的になり、又はそれらを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、6.0のpHを有する、1mg/ml rhSP-D、5mM  ヒスチジン、265mM  ラクトース、1mM  塩化カルシウムからなり、それらから本質的になり、又はそれらを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、pH 6.0、2mg/ml rhSP-D、5mM  ヒスチジン、265mM  ラクトース、1mM CaCl2からなり、それらから本質的になり、又はそれらを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、6.0のpHを有する、2mg/ml rhSP-D、5mM  ヒスチジン、265mM  ラクトース、5mM  塩化カルシウムからなり、それらから本質的になり、又はそれらを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、6.0のpHを有する、4mg/ml rhSP-D、5mM  ヒスチジン、265mM  ラクトース、5mM  塩化カルシウムからなり、それらから本質的になり、又はそれらを含む。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された薬学的組成物は、望まれる投与経路及び調製物に依存して、滅菌水、生理食塩水、グルコース等の適切な担体、希釈剤、又は賦形剤との混合物を含み得、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤、ゲル化又は粘度増強添加物、保存剤、香味剤、着色剤等の補助的物質を含有し得る。例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、Lippincott Williams & Wilkins;第20版(2003年6月1日)、並びに「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Pub. Co.;第18版及び第19版(それぞれ、1985年12月、及び1990年6月)を参照。いくつかの実施形態において、そのような調製物は、錯化剤、金属イオン、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ハイドロゲル、デキストラン等のポリマー化合物、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層又は多重膜ベシクル、赤血球ゴースト又はスフェロプラストを含み得る。リポソーム製剤のための適切な脂質には、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等が挙げられる。そのような追加の成分の存在は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボでの遊離の速度、及びインビボでのクリアランスの速度に影響し得、したがって、担体の特性が、選択された投与経路、例えば、新生児肺への送達等の肺への送達等の肺送達に合わされているように、意図される適用に応じて選択され得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、肺への気管内、気管支内、又は気管支肺胞の投与に適している。いくつかの実施形態において、気管内、気管支内、又は気管支肺胞の投与には、薬学的組成物が溶解している生理学的に許容される組成物を流体として用いる、噴霧、洗浄、吸入、フラッシング、又は設置を挙げることができる。投与方法には、持続陽圧呼吸療法(CPAP)の使用を挙げることができる。投与方法には、直接挿管を挙げることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される薬学的組成物は、吸入しながら肺へ送達することができる。送達され得る形の例には、乾燥粉末及びエアロゾルが挙げられる。治療用産物の肺送達のために設計された幅広い種類の機械的装置を用いることができ、それらには、噴霧器、定量噴霧吸入器、及び粉末吸入器が挙げられるが、それらに限定されず、それらの全ては、当業者によく知られている。これらの装置は、薬学的組成物の分注に適した製剤を用いる。典型的には、各製剤は、用いられる装置の型に特異的であり、治療において有用な希釈剤、補助剤、及び/又は担体に加えて、適切な噴霧材の使用を含み得る。
【００５５】
rhSP-Dのオリゴマー種の同定
溶液又は懸濁液中のrhSP-Dのオリゴマー型の分布等のrhSP-Dのオリゴマー型の分布は、様々な技術により決定することができる。いくつかの実施形態において、rhSP-Dのオリゴマー種を同定するための方法は、rhSP-Dの試料へ原子間力顕微鏡法(AFM)を実施する工程、AFM画像においてrhSP-Dのオリゴマー種を同定及び定量化する工程を含み得る。例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、Arroyo Rら、(2017) Biophys J 112 (3): 503aを参照。実施形態例において、rhSP-Dの試料を、希釈バッファー(200mM NaCl、20mM Tris (pH 7.4)、1mM EDTA)等のバッファー中に希釈し、新鮮に切断された雲母基板上に置くことができる。試料を、Nanotec社(Nanotec Electronica、Madrid、Spain)製の顕微鏡等の原子間力顕微鏡及びPointProbePlusチップ、PPP-NCH型(Nanosensors、Neuchatel、Switzerland)で画像化することができる。生画像を、一般的な平面減算(plane subtraction)、バックグラウンド減算での平坦化(flattening with background subtraction)、及びアーチファクト線除去(artifact line removal)に供することができる。得られた画像において同定することができるオリゴマー種は、三量体、六量体、十二量体、及び星状オリゴマーを含み得る。三量体は、棒状の外観を有し得、いくつかの三量体は、平均約65nm(±8.6nm)の長さを有し得る。十二量体は、Xの形をした外観を有し得、いくつかの十二量体は、約136nm(±8.1nm)の先端から反対側の先端までの長さを有し得る。星状オリゴマー種は、6〜20個の三量体で構成され、各三量体が、中心を通ってこの種の特定のメンバーに連結されている、星状又は星の形をした外観を有するメンバーを含み得る。いくつかの星状オリゴマーは、測定された十二量体の直径と類似した、約140nmの直径を有し得る。
【００５６】
いくつかの実施形態において、rhSP-Dのオリゴマー種を同定するための方法は、rhSP-Dの試料へ多角度レーザー光散乱と組み合わせた非対称フロー式フィールドフローフラクショネーション(AF4-MALLS)分析を実施する工程を含み得る。AF4-MALLSは、rhSP-D三量体及び六量体を表し得る第1のピーク(ピーク1);rhSP-D十二量体を表し得る第2のピーク(ピーク2);rhSP-D十二量体からrhSP-D星状オリゴマー種の間の中間種を表し得る第3のピーク(ピーク3);並びに約70nmの半径を有するrhSP-Dオリゴマーの不均一な質量を表し得る第4のピーク(ピーク4)を含むフラクトグラムを提供し得る。凝集体種を含み得る70nmより大きい半径を有する、rhSP-Dの他の種は、AF4-MALLSにより同定することができる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、rhSP-Dのオリゴマー種を同定するための方法は、サイズ排除クロマトグラフHPLC(SEC HPLC)を実施する工程を含み得る。いくつかの実施形態において、rhSP-Dのオリゴマー種を同定するための方法は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を実施する工程を含み得る。いくつかのそのような方法において、rhSP-Dの試料を、SDS等の陰イオン性界面活性剤と接触させ、そして、その試料を、1%グルタルアルデヒド等の架橋試薬と接触させ、PAGEによる等、rhSP-Dの種をサイズによって分離することができる。いくつかの方法はまた、ウェスタンブロットを実施する等のrhSP-Dの種を同定する工程を含み得る。
【００５８】
キット
本明細書に提供されたいくつかの実施形態は、キットを含む。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に提供された薬学的組成物を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に提供された薬学的組成物を含む無菌容器を含む。いくつかの実施形態は、凍結乾燥した形をとる本明細書に提供された薬学的組成物、及び無菌の再構成用溶液を含む。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に提供された薬学的組成物を投与するための装置、例えば、吸入器及び噴霧器を含み得る。
【実施例】
【００５９】
(実施例1)
ある特定の製剤の凍結乾燥
rhSP-Dを含まないある特定の製剤の凍結乾燥を調べた。rhSP-Dを含まない様々なバッファー製剤についての凍結乾燥のための一次乾燥温度を、準大気下の示差走査熱量測定(DSC)を用いて決定した。製剤はTABLE 2(表2)に列挙されている。rhSP-Dを含まない様々な製剤についての最初のガラス転移温度(Tg')、中間Tg'、及び融解温度が、決定され、TABLE 3(表3)に要約されている。
【００６０】
【表２】
2021519757.tif 000004
【００６１】
【表３】
2021519757.tif 000005
【００６２】
rhSP-Dを含まず、且つNaClを含有する製剤は、検出可能な最初のガラス転移温度(Tg')を有した。製剤F01-01、F02-01、F06-01、及びF07-01についての融解温度は、NaClの共融温度の範囲内であった。ラクトース及びラクトース/NaClは、Tg'>-37℃を有する。したがって、-35℃の一次乾燥温度が実行可能であった。rhSP-Dを含まない製剤を、TABLE 4(表4)に示されているような条件下で凍結乾燥させた。
【００６３】
【表４】
2021519757.tif 000006
【００６４】
静電容量型圧力計とピラニ圧力計の比較を用いて、一次乾燥の完了を決定した。rhSP-Dを含まない凍結乾燥した製剤の含水量を、熱重量分析(TGA)により決定した。結果は、TABLE 5(表5)に要約されている。
【００６５】
【表５】
2021519757.tif 000007
【００６６】
(実施例2)
rhSP-Dを含有する製剤の調製及び分析
rhSP-Dを含有する製剤を、1mg/ml SP-Dの溶液の、TABLE 2(表2)に列挙された特定のバッファーでの透析により調製した。rhSP-Dは、組み込まれた導入遺伝子からrhSP-Dを発現するヒト骨髄性白血病細胞株であるH9D8WT Clone P1315-2A5(Glycotope社)から得られた。発現ベクター、rhSP-Dポリペプチド、細胞株、及びそのような細胞からrhSP-Dを精製する方法の例は、米国特許出願公開第2019/0071693号及び米国特許出願公開第2019/0071694号に提供され、それらの特許出願のそれぞれは、全体として参照により本明細書に明確に組み入れられている。rhSP-Dを含有する製剤のpH及び重量モル浸透圧濃度は、最初のバッファーと実質的に同じであると決定され、透析が実質的に完全であることが確認された。rhSP-Dを含有する製剤を凍結乾燥し、5℃、25℃、及び40℃を含む様々な温度で様々な期間、保存した。再構成された製剤のタンパク質濃度を決定した。その結果は、TABLE 6(表6)に要約されている。
【００６７】
【表６】
2021519757.tif 000008
【００６８】
rhSP-Dを含有する再構成された製剤の濁度を、320nmにおける吸光度を測定することにより決定した。その結果はTABLE 7(表7)に要約されている。
【００６９】
【表７】
2021519757.tif 000009
【００７０】
タンパク質溶液の濁度は、タンパク質沈殿の指標であった。F04-01の低い濁度は、特に低いタンパク質濃度による可能性が高かった。それぞれ、ラクトース及びカルシウムを含有する製剤F03-01及びF05-01は、それぞれ、相対的に低い濁度を有した。対照的に、それぞれ、NaClを含有し、且つラクトースを欠いた製剤F01-01、F02-01、F06-01、及びF07-01は、F03-01及びF05-01より、25℃で2週間、その凍結乾燥物を保存した後、5倍を超える濁りであった。したがって、ラクトース及びカルシウムの存在、並びにNaClの非存在は、凍結乾燥物の再構成後に溶液を形成するrhSP-Dの能力を促進し得る。
【００７１】
rhSP-Dを含有する様々な再構成された製剤におけるrhSP-Dの異なるオリゴマー種の分布を、多角度レーザー光散乱と組み合わせた非対称フロー式フィールドフローフラクショネーション(AF4)分析(AF4-MALLS)により決定した。方法例はまた、発明の名称が「METHODS FOR CHARACTERIZING SURFACTANT PROTEIN D (SP-D) OLIGOMERS」である、2018年3月29日に出願された米国仮特許出願第62/650138号に提供されており、その米国仮特許出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。AF4-MALLS分析について、rhSP-D試料を、AF4システム(Eclipse Dual Tec、Wyatt Technology Corp.社、Santa Barbara、CA)、続いてUV(Ultimate 3000可変波長検出器、Dionex Corporation社、Sunnyvale、CA)及びMALS分析(Dawn Heleos II検出器、Wyatt Technology Corp.社、Santa Barbara、CA)により分離した。Dionex Ultimate 3000 HPLCシステム(Dionex Corporation社、Sunnyvale、CA)を用いて、AF4システムへ試料を注入し、移動相を送達した。AF4構成は、350μm厚さのスペーサーを有する短いチャネル(Wyatt Technology Corp.社、Santa Barbara、CA)を用いた。データの分析及び計算を、Chromeleon(Dionex Corporation社、Sunnyvale、CA)及びAstra(Wyatt Technology Corp.、Santa Barbara、CA)ソフトウェアを用いて実施した。AF4-MALLS分析からの結果は、数個のピークを有するフラクトグラムを含んだ。TABLE 8(表8)は、AF4について用いられたパラメータを列挙している。
【００７２】
【表８】
2021519757.tif 000010
【００７３】
AF4-MALLSを用いたデータを分析して、溶出中のある特定の時間におけるrhSP-Dの絶対モル質量及びサイズを決定した。サイズ:質量の比は、rhSP-Dの形を示している。サイズの質量に対する比から、溶出の初期段階(0〜34分間)において、rhSP-D分子は直鎖状又は棒状を有することが決定された。棒モデルの計算について、ソフトウェアは、棒状粒子の厚さが、それの長さと比較して、有意ではない(0.0nm)と想定した。その厚さが有意である場合には、nmでのそれの厚さ又は近似の厚さが用いられた。棒の厚さは、AFMデータから推定され、棒の長さは、136±8.1nmのAFM測定値と一致すると決定された。全体として参照により本明細書に組み入れられている、Arroyo Rら(2017) Biophysical Journal 112 (3): 503a。rhSP-Dについての溶出の後期段階(34〜45分間)は、よりコンパクトな構造が観察されつつあることを示した。溶出のこれらの段階の分析について、二次Debyeモデルを用いた。二次Debyeモデルは、非常に大きいもの(約106ダルトンより大きく、又は約50nmより大きいRMS半径)を含む、より幅広い範囲のモル質量に渡る、より良い結果を提供した。rhSP-Dの十二量体について、分子量は、520.09±4.61kDa(N=72決定値)であると決定された。
【００７４】
フラクトグラムにおける第1のピーク(ピーク1)は、棒モデルによる質量計算に基づいて、rhSP-D三量体及び六量体を含有した。フラクトグラムにおける第2のピーク(ピーク2)は、rhSP-D十二量体を含有した。フラクトグラムにおける第3のピーク(ピーク3)は、棒モデルにより決定された場合の中間分子量に基づいて、rhSP-D十二量体からrhSP-D星状オリゴマーの間の中間体種を含有した。フラクトグラムにおける第4のピーク(ピーク4)は、星状オリゴマー種についてのAFM測定により観察されているものと一致した約70nmの一定のRMS半径を有するrhSP-Dオリゴマー及び70nmより大きい半径を有するより大きい種の不均一な質量を含有した。フラクトグラムにおいて36分を越えると、RMS半径は更に増加し、更なる凝集体種を示した。各ピークについての相対ピーク領域(RPA)は、4つのピークの総ピーク領域に占めるパーセンテージとして決定された。
【００７５】
より高い分解能でAF4-MALLS分析を用いて溶液中のオリゴマー種の分布を決定するために、ピーク4の種を、更に分析した。調整済みRPAを、ピーク3及びピーク4のそれぞれについて決定した。具体的には、約70nmの一定RMS半径を有する星状オリゴマー種に対応するピーク4のRPAの局面を決定し、これらの局面を、ピーク4のRPAから除去し、ピーク3のRPAに加えて、ピーク4及びピーク3についての調整済みRPAを提供した。したがって、ピーク1のRPA、ピーク2のRPA、ピーク3の調整済みRPA、及びピーク4の調整済みRPAは、それぞれ、(1)三量体及び六量体、(2)十二量体、(3)約70nmの半径を有する星状オリゴマー種、並びに(4)70nmより大きい半径を有する凝集体についてのAF4-MALLS分析におけるrhSP-Dオリゴマー種の相対分布に対応した。
【００７６】
rhSP-Dを含有する製剤の凍結乾燥物を、様々な条件下で保存し、再構成し、AF4-MALLSにより分析した。調整済みAF4-MALLS分析の結果はTABLE 9(表9)に要約されている。rhSP-Dのオリゴマー種の分子量もまた、5℃で5週間、保存された製剤について決定し、TABLE 10(表10)に要約されている。
【００７７】
【表９Ａ】
2021519757.tif 000011
【００７８】
【表９Ｂ】
2021519757.tif 000012
【００７９】
【表９Ｃ】
2021519757.tif 000013
【００８０】
【表９Ｄ】
2021519757.tif 000014
【００８１】
【表１０】
2021519757.tif 000015
【００８２】
0週間目、及び25℃で2週間、凍結乾燥物を保存した後において、各製剤は、rhSP-Dオリゴマー種の実質的に類似した分布を示している、RPAの実質的に類似した分布を有した。
【００８３】
70nmより大きい半径を有するrhSP-Dの凝集体オリゴマー種を示している調整済みピーク4に関して、製剤F06-01が、最も大きい増加を生じることが観察され、0週間目における5.96%から、40℃で2週間、その凍結乾燥物を保存した後における10.23%への調整済みRPAを有した。rhSP-D十二量体を示しているピーク2に関して、製剤F01-01、F03-01、及び  F05-01、それぞれは、0週間目と40℃で2週間凍結乾燥物を保存した後との間で、ピーク2についてRPAの増加又は実質的な変化なしを示した。対照的に、製剤F02-01、F04-01、F06-01、及びF07-01、それぞれは、0週間目と40℃で2週間凍結乾燥物を保存した後との間で、ピーク2についてRPAの減少を示した。凍結乾燥したケーキにおけるrhSP-D十二量体の安定性は、ラクトース及びカルシウムを含有する、F03-01及びF05-01を含む製剤において、調べられた全ての条件下で、長い期間に渡って、より安定であった。これらはまた、本明細書に示されているように、再構成の際、相対的に低い濁度を示す製剤であった。
【００８４】
製剤F04-01は、最低のタンパク質濃度、及び凝集体rhSP-D種の最低の相対的割合を示している、ピーク4についての最低の調整済みRPAを有し、そのことは、タンパク質濃度が、凝集体の形成に役割をもち得ることを示唆した。
【００８５】
(実施例3)
細菌凝集アッセイにおけるrhSP-Dを含有する製剤の活性
rhSP-Dを含有する再構成された製剤の活性を、細菌凝集アッセイにおいて試験した。細菌凝集アッセイにおいて、活性rhSP-Dは、細菌細胞を凝集させ、細菌懸濁液を通した、吸光度を低下させ/透過を増加させる。細菌凝集アッセイを、以下の方法と実質的に類似した方法により実施した。大腸菌(E. coli)(ATCC: Y1088)を、細菌寒天プレート上へ画線し、37℃で一晩、インキュベートした。単一コロニーを選択し、それを用いて、一晩培養液に接種し、37℃で一晩、振盪した。1mL細菌培養物を、4つの1.5mL遠心管へピペッティングし、4,000rpmで5分間、遠心分離した。上清を捨て、ペレットを、1mLバッファー(150mM HEPES、20mM NaCl pH 7.4)中に再懸濁した。その遠心管を4,000rpmで5分間、遠心分離し、ペレットを7mLバッファー中に再懸濁した。細菌懸濁液の吸光度を、分光計において700nmで測定した。細菌懸濁液を、1.0000〜1.1000の範囲の吸光度が得られるように調整した。5mM CaCl2の最終濃度が得られるように、1M CaCl2を懸濁液に加えた。プラセボバッファー中のrhSP-D希釈液(各希釈液について15μlの総体積)を、濃度:5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.1μg/ml、0μg/mlで作製し、それぞれ20μLのHEPES-NaClバッファーを含有するキュベットへ加えた。その後、600μL細菌懸濁液をキュベットへ加え、吸光度を、各キュベットについて700nmで、2.5分ごとに、合計120分間、測定した。
【００８６】
再構成されたrhSP-Dの試験濃度は、0μg/ml、0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、及び5.0μg/mlを含んだ。60分間におけるパーセンテージ平均凝集を、以下の式に従って、各試験濃度において60分間目での吸光度値から計算した:
(1-abs)*100=%凝集
式中、1=rhSP-Dを含まない大腸菌懸濁液の測定された吸光度。
abs=60分間目における大腸菌懸濁液+rhSP-Dの吸光度値。
【００８７】
パーセンテージ(%)凝集値については、3つのレプリケートから平均をとり、標準偏差と共に、GraphPad Prism v7.0c(GraphPad社、La Jolla、CA 92037)へインポートした。平均された値を、4パラメータロジスティク曲線を用いてフィッティングした。EC50についての生じた値及びスパンを、それぞれ再構成されたrhSP-D試料について決定した。pEC50は、EC50の-Log10である。
【００８８】
結果の例は、TABLE 11(表11)に提示されている。rhSP-Dを含有する製剤は、細菌凝集アッセイにおいて、凍結乾燥の前と後で、実質的に類似した効力及び有効性(曲線スパン)を有し、凍結乾燥が、このアッセイにおいて試験された製剤の活性に実質的には影響しなかったことを示した。加えて、製剤は、試験された全ての条件下で、実質的に類似した効力及び有効性を有し、十二量体の安定性が、いくつかの製剤においては異なる条件下で影響されたが、これは、細菌凝集アッセイにおいて、活性を損なうようには見えないことを示した。TABLE 11(表11)参照。
【００８９】
(実施例4)
TLR4アッセイにおけるrhSP-Dを含有する製剤の活性
Toll様受容体(TLR)は、自然免疫系と適応免疫系の両方において役割をもち、SP-Dは、Toll様受容体2(TLR2)及びToll様受容体4(TLR4)等のTLRを通してのシグナル伝達を調節する活性を有する。例えば、Haagsman HPら、(2008) Neonatology 93:288〜294頁; Yamazoe M.ら、(2008) J. Biol Chem 283:35878〜35888頁;及びVieira F.ら、(2017) Ann Anat 211:184〜201頁(それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている)を参照。TLR4活性はまた、気管支肺異形成症(BPD)等の状態の重症度を調節し得る(全体として参照により本明細書に組み入れられている、Malash AHら、(2016) Gene 592:23〜28頁)。したがって、TLR4活性を調節するrhSP-Dの活性を、rhSP-Dの宿主免疫応答への効果の指標として測定した。rhSP-Dを含有する再構成された製剤の活性を、LPS-TLR4アッセイにおいて試験した。LPS-TLR4アッセイにおいて、再構成されたrhSP-Dは、LPSがToll様受容体4(TLR4)を結合/活性化するのを阻止することにより、リポ多糖(LPS)誘導性炎症細胞応答を阻害することができる。例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられている、Yamazoe M.ら、(2008) J. Biol Chem 283:35878〜35888頁参照。
【００９０】
TLR4アッセイにおける再構成されたrhSP-Dの活性を、以下の方法と実質的に類似した方法において試験した。HEK-Blue(商標)hTLR4細胞(InvivoGen社、San Diego、CA、U.S.A.)を、384ウェルプレートにおいて約20000個の細胞/ウェルの密度でプレーティングし、様々な濃度のrhSP-Dと、37℃、5% CO2で2時間、インキュベートした。EC80濃度におけるLPS(大腸菌(Escherichia coli) O26:B6、L5543 Sigma Aldrich社)を、各ウェルに加え、細胞を、37℃、5% CO2で更に22時間、インキュベートした。細胞をウェルから脱離させ、懸濁した細胞を洗浄し、細胞をPBS中に再懸濁し、穏やかなピペッティングによりいかなる凝集塊も除去することにより、TLR4活性を測定した。5mM CaCl2及び1%(v/v) BSAを含有するエンドトキシンフリーの水において作り上げられているHEK青色検出培地(InvivoGen社、San Diego、CA、U.S.A.)を含有する384ウェルプレートへ、洗浄された細胞を20e103個の細胞/ウェルの密度で移した。細胞を、5% CO2中、37℃で24時間、インキュベートし、分泌性胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)受容体遺伝子の活性を655nmにおける分光光度計を用いて測定することにより、TLR4の活性を決定した。rhSP-DについてのIC50値を、非線形回帰分析を用いて、データを4パラメータロジスティクス方程式にフィッティングすることにより決定した。IC50値の対数のみが正規分布されるため、一連の実験からの数を平均することを目的として、-Log10 (IC50)と定義されたpIC50値を用いた。曲線スパンは、フィッティングされた最大反応(Emax)とフィッティングされた最小反応(Emin)の差から決定され、用量反応曲線の振幅又は反応の有効性に対応している。
【００９１】
実施例3に記載された細菌凝集アッセイの結果と共に、再構成されたrhSP-Dに関するTLR4アッセイの結果は、TABLE 11(表11)に要約されている。細菌凝集アッセイについてのTABLE 11(表11)に提示されたデータは、3つの独立した実験における60分間目時点から得られた3連の決定値で構成される、単一用量反応曲線からのフィッティングされた曲線パラメータを含む。TLR4アッセイについて提示されたデータは、示された数の独立した実験から得られたフィッティング化曲線パラメータの平均±SDを含み、各用量反応曲線は、3連で実施された複数の濃度で構成された。
【００９２】
【表１１Ａ】
2021519757.tif 000016
【００９３】
【表１１Ｂ】
2021519757.tif 000017
【００９４】
【表１１Ｃ】
2021519757.tif 000018
【００９５】
全ての試験された製剤は、細菌凝集アッセイにおいて活性を有した。対照的に、様々な条件下で処理された製剤のサブセットのみが、TLR4アッセイにおいて活性を有した。F01-01、F02-01、F06-01に関して、40℃での2週間の保存後の再構成された凍結乾燥物について、TLR4アッセイにおける結果を決定することができなかった。F01-01、F02-1に関して、25℃か又は40℃のいずれかにおける保存での2週間後、TLR4アッセイにおいて、反応が得られなかった。F06-01に関して、いずれの条件でも、TLR4アッセイにおいて反応が得られなかった。対照的に、製剤F03-01、F05-01、及びF07-01は、40℃で2週間の保存後、再構成された凍結乾燥物についてTLR4アッセイにおいて活性を有した。更に、製剤F07-01とは違って、それぞれラクトース及びカルシウムを含有した製剤F03-01、F05-01は、5℃で5週間の保存後、再構成された凍結乾燥物についてTLR4アッセイにおいて活性を有した。特に、実施例2に示されているように、F03-01及びF05-01はまた、試験された全ての条件下で十二量体及び凝集体の安定性を維持し、且つ再構成の際、相対的に低い濁度を示した、唯一の製剤であった。まとめて考えると、データは、ラクトース及びCaCl2を含有する製剤が、NaClを含有する製剤より、SP-Dオリゴマー状態を安定化し、且つ活性を維持するより良い能力を示すことを示した。したがって、ラクトース及びCaCl2を含有する製剤を、更なる研究のために選択した。
【００９６】
(実施例5)
rhSP-Dオリゴマー型の多変量解析
rhSP-Dの様々な製剤についてのAF4-MALLS分析におけるフラクトグラムに観察されたピークと、細菌凝集アッセイか又はTLR4アッセイのいずれかにおけるrhSP-D試料の活性との間のいくらかの相関を決定するために、多変量統計解析を実施した。40個より多い異なる試料から得られたデジタル化されたフラクトグラムを、データマトリックスとして用い、TLR4アッセイからの測定されたpIC50値又は細菌凝集活性アッセイからのpEC50結果との相関を、PLSを用いて決定した。
【００９７】
標準技術を用いて、全てのキャリブレーションモデルへフルクロスバリデーションを実施した。例えば、Katz, M.H、「Multivariate Analysis: A Practice Guide for Clinicians.」  Cambridge University Press、New York、158〜162頁(1999); Stahle, L.ら、(1988)「Multivariate data analysis and experimental design in biomedical research.」Prog. Med. Chem. 25: 291〜338頁; Wold S. (2001)「PLS-regression: a basic tool of chemometrics.」Chemom. Intell. Lab. Syst. 58: 109〜130頁(それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている)を参照。簡単に述べれば、1回に1試料を除去し、データセットを再キャリブレーションし、新しいモデルを構築した。キャリブレーション試料の全てが一度は、除去され、バリデーションモデルとして定量化されるまで、このプロセスを繰り返した。したがって、全試料を含有する最初のセットは、キャリブレーションセットと呼ばれ、クロスバリデーション後のものは、バリデーションセットと呼ばれた。ジャックナイフアルゴリズムを用いて、部分最小二乗法(PLS)モデルを構築することに用いられる任意のファクターについての統計的有意性を決定した(Martens, H.ら、(2001)「Multivariate Analysis of Quality: An Introduction」Wiley and Sons、Chichester、UK)。
【００９８】
rhSP-Dの様々な製剤について、AF4-MALLS分析において観察された特定のピークと、細菌凝集アッセイにおける活性との間の相関に関して、活性の大部分はピーク1及びピーク2に存在し、一部はピーク3を通して持続することが見出された。ピーク4と細菌凝集アッセイにおける活性との間に負相関が見出された。rhSP-Dの様々な製剤について、AF4-MALLS分析に観察された特定のピークとTLR4アッセイにおける活性との間の相関に関して、活性は、ピーク2にほぼ独占的に限局化することが見出された。したがって、TLR4アッセイにおけるrhSP-Dの活性は、rhSP-Dの十二量体種と直接、関係していた。とりわけ、調整済みピーク4における>70nmの半径を有する凝集体種は、細菌凝集アッセイもTLR4アッセイのいずれにおいても、活性を伴わず、この種がrhSP-Dの不活性型を表していることが確認された。
【００９９】
(実施例6)
rhSP-D、ラクトース、及びCaCl2を含有する製剤
TABLE 12(表12)に列挙された製剤の第2世代を、rhSP-Dの単一バッチから、そのタンパク質溶液の製剤バッファーでの透析により調製した。製剤を、上記の実施例1に記載された方法と実質的に類似した方法により凍結乾燥した。
【０１００】
【表１２】
2021519757.tif 000019
【０１０１】
凍結乾燥物を、様々な条件に供し、再構成し、再構成された凍結乾燥物の活性を、細菌凝集アッセイにおいて調べた。rhSP-Dの様々な製剤は、様々な条件について、試験された条件下での細菌凝集アッセイにおいて活性があった。細菌凝集アッセイにおけるF02-02及びF07-02の活性についての結果の例は、TABLE 13(表13)に要約されている。
【０１０２】
【表１３】
2021519757.tif 000020
【０１０３】
TLR4アッセイにおける様々な条件下での製剤の活性を、本明細書に記載されているのと実質的に類似した方法により決定した。結果は、TABLE 14(表14)に要約されている。
【０１０４】
再構成された凍結乾燥物におけるrhSP-Dオリゴマー種の分布もまた、AF4-MALLS分析により、本明細書に記載された方法と実質的に類似した方法を用いて、調べた。TLR4アッセイにおける製剤の活性の結果を要約することに加えて、TABLE 14(表14)はまた、rhSP-D十二量体の相対分布に対応するピーク2についての相対ピーク領域(RPA)、及び70nmより大きい半径を有するrhSP-Dの相対分布に対応するピーク4についての調整済みRPAを要約している。
【０１０５】
【表１４Ａ】
2021519757.tif 000021
【０１０６】
【表１４Ｂ】
2021519757.tif 000022
【０１０７】
【表１４Ｃ】
2021519757.tif 000023
【０１０８】
TLR4アッセイにおける活性は、それぞれチロキサポールを含有する製剤F03-02及びF06-02について決定することができず、その製剤バッファー自体が、TLR4アッセイについての読み取りであるTLR4アッセイにおけるアンタゴニスト効果を示したからである。製剤F09-02、F10-02、及びF11-02はそれぞれ、その凍結乾燥物が25℃で10週間保存された後、TLR4アッセイにおいて活性を喪失した。製剤F10-02、F11-02、及びF12-02は、ピーク2について最も低く観察されたRPAを含んだ。製剤F07-02は、一貫して、研究された全ての様々な条件について、ピーク4における凝集体についての最低のRPAと共に、ピーク2についての最高のRPAを有した。
【０１０９】
水において再構成された製剤F01-02、F02-02、F07-02の凍結乾燥物は、様々な保存条件下でTLR4アッセイにおいて一貫して活性があった。これらの製剤はまた、再構成の際、2〜8℃で72時間の間、十二量体の安定性を維持した(TABLE 15(表15))。しかしながら、凍結乾燥物における十二量体(ピーク2)のレベルは、製剤F02-02及びF07-02について、長期間に渡って、より高く、再構成された溶液における不活性凝集体のレベルは、2〜8℃での72時間の保存後のF01-02についてより、F02-02及びF07-02について、より低かった(TABLE 15(表15))。
【０１１０】
評価された製剤の全部の中で、F02-02及びF07-02だけが、凍結乾燥物の保存温度に関わらず、10週間の期間を通して、再構成後のTLR4アッセイにおける一貫した活性、一貫して、rhSP-D十二量体に関連したピーク2 RPAについてのより高い値、及び70nmより大きい半径を有するrhSP-D凝集体に関連した調整済みピーク4 RPAについてのより低い値という特性を示した。まとめると、データは、加えられるNaClの非存在下で少なくとも1mM CaCl2を含有する、より高いレベルのラクトースを含む、pH 6でのヒスチジンバッファー中の製剤で、且つその凍結乾燥物が水において再構成される、製剤において、rhSP-Dの安定性及び活性が維持されることを意味した。
【０１１１】
再構成された製剤の安定性を調べるために、第2のAF4-MALLS分析を実施した。凍結乾燥物を、様々な条件に供し、再構成し、2〜8℃で72時間、保存し、その後、再構成された凍結乾燥物におけるrhSP-Dオリゴマー種の分布を、AF4-MALLS分析により、上記の方法と実質的に類似した方法を用いて調べた。TABLE 15(表15)は、凍結乾燥物が供された様々な条件を列挙し、且つ、rhSP-D十二量体及び70nmより大きい半径を有するrhSP-D凝集体の相対分布、それぞれに対応する、ピーク2についてのRPA及びピーク4についての調整済みRPAを列挙している。
【０１１２】
2〜8℃で72時間の保存後の再構成された試料におけるピーク2についてのRPA(TABLE 15(表15))の、再構成直後のピーク2についてのRPA(TABLE 14(表14))との比較により、凍結乾燥物製剤及び再構成溶液が十二量体安定性に影響することが明らかにされた。25℃で5週間、保存されており、食塩水において再構成され、2〜8℃で72時間、保存された製剤F04-02、F05-02、F08-02、及びF10-02の凍結乾燥物は全て、25℃で5週間、保存されており、食塩水において再構成され、その後すぐに分析されたピーク2についてのRPAと比較して、ピーク2についてのRPAの>5%増加を示した。5℃で7.5週間保存されていた凍結乾燥物について、これらの同じ製剤は、再構成直後に得られたピーク2についてのRPAと比較して、ピーク2についてのRPAの減少を生じた。しかしながら、25℃で5週間か又は5℃で7.5週間のいずれかで保存されており、水において再構成され、2〜8℃で72時間、保存された製剤F02-02及びF07-02の凍結乾燥物は、ピーク2について、RPAの変化<4%であり、実質的に安定したRPAを有した。したがって、AF4-MALLS分析において実証されているように、食塩水における再構成は、rhSP-Dの安定性を低下させた。
【０１１３】
【表１５Ａ】
2021519757.tif 000024
【０１１４】
【表１５Ｂ】
2021519757.tif 000025
【０１１５】
【表１５Ｃ】
2021519757.tif 000026
【０１１６】
(実施例7)
rhSP-D、ラクトース、及びCaCl2を含有する凍結乾燥した製剤の安定性
5mM  ヒスチジン、265mM  ラクトース、及び5mM CaCl2、pH 6.0中、2mg/mlか又は4mg/mlのいずれかのrhSP-Dを含有するrhSP-Dの製剤を、rhSP-Dの単一バッチから、そのタンパク質溶液のバッファーでの透析により調製した。製剤を、上記の実施例1に記載された方法と実質的に類似した方法により凍結乾燥した。凍結乾燥物を、様々な条件に供し、水において再構成し、分析した。再構成された凍結乾燥物の活性を、細菌凝集アッセイ及びTLR4アッセイを用いて測定した。再構成された凍結乾燥物におけるrhSP-Dオリゴマー種の分布もまた、AF4-MALLS分析により、本明細書に記載された方法と実質的に類似した方法を用いて調べた。
【０１１７】
6カ月間研究(2mg/ml rhSP-D)
5mM  ヒスチジン、265mM  ラクトース、及び5mM CaCl2、pH 6.0中の2mg/ml rhSP-Dに関して、6カ月間研究を実施した。細菌凝集アッセイにおける再構成された製剤の活性についての結果の例は、TABLE 14(表16)に要約されている。TLR4アッセイにおける再構成された製剤の活性についての結果の例は、TABLE 15(表17)に要約されている。TABLE 14(表16)及びTABLE 15(表17)の細菌凝集アッセイ及びTLR4アッセイに用いられたバッチとは異なるrhSP-Dのバッチから調製された、再構成された凍結乾燥物におけるオリゴマー種の分布についての結果の例は、図2に描かれている。25℃における3カ月間の試料を、1週間、45℃に保った。この研究において、オリゴマー種は、最初の3カ月間の間、ピーク2とピーク3の間、及びピーク1とピーク2の間で相互変換する傾向を示した。3カ月後、凝集ピーク4は、有意に増加した。25℃又は5℃に保たれた試料は、オリゴマー種の実質的に類似した活性及び分布を有した。TABLE 15(表17)に示されているように、rhSP-Dのこのバッチについての3カ月目及び6カ月目におけるTLR4アッセイにおけるアンタゴニスト効力は、t0におけるそれと類似し、そのアッセイの誤差範囲内であった(データ未呈示)。まとめると、両方のSP-Dバッチからのデータは、25℃で6カ月間保たれた試料は、5℃で6カ月間保たれたものより、活性アッセイにおいて実質的に悪く機能することはなく、活性アッセイにおける効力は維持されたことを示している。
【０１１８】
【表１６】
2021519757.tif 000027
2021519757.tif 000028
【０１１９】
【表１７】
2021519757.tif 000029
【０１２０】
3カ月間研究(2mg/ml及び4mg/ml rhSP-D)
5mM  ヒスチジン、265mM  ラクトース、及び5mM CaCl2、pH 6.0中の2mg/ml rhSP-D又は4mg/ml rhSP-Dに関して、3カ月間研究を実施した。細菌凝集アッセイにおける再構成された製剤の活性についての結果の例は、TABLE 16(表18)に要約されている。TLR4アッセイにおける再構成された製剤の活性についての結果の例は、TABLE 17(表19)に要約されている。再構成された凍結乾燥物におけるオリゴマー種の分布についての結果の例は、図3に描かれている(上方パネル:2mg/ml;下方パネル:4mg/ml)。この研究において、25℃又は5℃で保たれた試料は、オリゴマー種の実質的に類似した活性及び分布を有した。より低次(ピーク1)種への相互変換は実質的に観察されなかった。3カ月目において、ピーク2種は、ピーク3種へ相互変換する傾向にあった。活性は、細菌凝集アッセイとTLR4アッセイの両方において、保存温度に関わらず、3カ月間の期間全体に渡って類似した効力値(アッセイの誤差範囲内)により証明されているように、維持された。
【０１２１】
【表１８】
2021519757.tif 000030
【０１２２】
【表１９】
2021519757.tif 000031
【０１２３】
(実施例8)
凍結/融解サイクル中の製剤の安定性
5mM  ヒスチジン、265mM  ラクトース、及び5mM CaCl2、pH 6.0中に2mg/mlか又は4mg/mlのいずれかのrhSP-Dを含有するrhSP-Dの製剤を調製した。試料を分注し、試料が液体窒素中へ浸される急速凍結によるか、又は試料を-80℃での冷凍庫へ置くことによるかのいずれかで、凍結させた。凍結/融解サイクルは、アリコートを凍結させる工程及び室温で融解させる工程を含んだ。試料を、t0、1×、3×、及び5×を含む数回のサイクルに渡って分析した。
【０１２４】
再構成された凍結乾燥物におけるオリゴマー種の分布についての結果の例は、図4(上方パネル:2mg/ml;下方パネル:4mg/ml)に描かれている。細菌凝集アッセイ又はTLR4アッセイにおける試料の活性についての結果の例は、それぞれ、TABLE 18(表20)及びTABLE 19(表21)に要約されている。この研究において、2mg/ml  試料と4mg/ml  試料の間で有意差はなかった。試料を-80℃で5サイクル、凍結させることは、5サイクルでの急速凍結と比較して、2mg/ml  試料と4mg/ml  試料の両方についてピーク4凝集体を増加させた。したがって、最良の凍結条件は、急速凍結であった。
【０１２５】
【表２０】
2021519757.tif 000032
【０１２６】
【表２１】
2021519757.tif 000033
【０１２７】
(実施例9)
再構成された製剤の安定性
rhSP-D、5mM  ヒスチジン、265mM  ラクトース、及び5mM CaCl2、pH 6.0を含有するrhSP-Dの製剤を調製した。溶液を凍結乾燥し、2mg/ml rhSP-Dか又は4mg/ml rhSP-Dのいずれかで再構成し、その後、t0、2〜8℃で1日間若しくは3日間、又は25℃で1日間若しくは3日間、保った。
【０１２８】
再構成された凍結乾燥物におけるオリゴマー種の分布についての結果の例は、図5(上方パネル:2mg/ml;下方パネル:4mg/ml)に描かれている。TLR4アッセイにおける試料の活性についての結果の例は、TABLE 20(表22)に要約されている。この研究において、オリゴマー種の分布は、2mg/ml製剤及び4mg/ml製剤について様々な条件で実質的に安定であった。3日間、5℃で保たれた製剤と25℃で保たれた製剤についてのオリゴマー種の分布の間に実質的な差はなかった。したがって、再構成されたrhSP-Dは、3日間、5℃でも25℃でも安定であった。TABLE 20(表22)は、再構成された試料におけるrhSP-Dの抗力が、その再構成された試料が最長3日間、4℃か又は25℃のいずれかで保たれた場合、変化しなかったことを示しており、再構成された製剤の物理的安定性が、生物学的活性の保持に変換するという追加の証拠を提供している。
【０１２９】
【表２２】
2021519757.tif 000034
【０１３０】
(実施例10)
凍結乾燥した製剤の化学的安定性
RP HPLCアッセイを用いて、凍結乾燥したSP-D試料の安定性を評価した。12個の異なる製剤を調製した。RP HPLCアッセイは、Agilent社PLRPカラム、300Å、3μm、2.1×150mm(PL1912-3301)の使用を含んだ。最初のグラジエント(グラジエント1)は、かなり浅いグラジエントであった(1分あたり1.7% Bから、6分後の1分あたり6% Bへ)。結果は、還元型試料について、主要ピーク、加えて、主要ピークの前と後の両方を溶出する微量ピークの検出であった。
【０１３１】
試料の全ては、還元型試料を分析した場合、t0において95%に近い純度を示した(TABLE 21(表23))。25℃での5週間の保存後、試料の大部分においてRP HPLCプロファイルの実質的な変化はなかった;どちらもNaClを含有したF11-02及びF12-02は、最大の変化を示した(TABLE 22(表24))。TABLE 21(表23)は、製剤として還元型SP-D試料のRP HPLCクロマトグラムにおける、t0でのピークの相対領域を列挙している。TABLE 22(表24)は、製剤として還元型SP-D試料のRP HPLCクロマトグラムにおける、t5(25℃で5週間)でのピークの相対領域を列挙している。
【０１３２】
【表２３】
2021519757.tif 000035
【０１３３】
【表２４】
2021519757.tif 000036
【０１３４】
本明細書で用いられる場合、用語「含むこと(comprising)」は、「含むこと(including)」、「含有すること」、又は「によって特徴づけられる」と同義であり、包含的又はオープンエンドであり、追加の、列挙されていない要素又は方法工程を排除しない。
【０１３５】
上記の記載は、本発明のいくつかの方法及び材料を開示する。この発明は、その方法及び材料の改変、加えて、製作技術及び装置の変化が可能である。そのような改変は、この開示又は本明細書に開示された本発明の実践を考慮すれば、当業者にとって明らかになるだろう。それゆえに、この発明が、本明細書に開示された特定の実施形態に限定されることは意図されず、この発明が、本発明の真の範囲及び精神の範囲内に入る全ての改変及び代替を網羅することが意図される。
【０１３６】
非限定的に、公開された及び公開されていない出願、特許、及び文献参照を含む、本明細書に引用された全ての参考文献は、全体として参照により本明細書に組み入れられており、それにより、この明細書の一部となっている。参照により組み入れられた刊行物及び特許又は特許出願が、本明細書に含有される本開示と矛盾する限りにおいては、本明細書が、任意のそのような矛盾する材料に優先し、及び/又はそれの上位にあることを意図される。
【図１】
2021519757.tif 000037
【図２】
2021519757.tif 000038
【図３】
2021519757.tif 000039
【図４】
2021519757.tif 000040
【図５】
2021519757.tif 000041
【配列表】
2021519757000001.app
【国際調査報告】
2021519757.tif 000042
2021519757.tif 000043
2021519757.tif 000044