(57)【要約】本発明は、ヒト対象において腎結石または腎臓結石を処置または予防するための組成物および方法を含む。ある特定の態様では、該対象に、ある特定のENPP1ポリペプチドもしくはENPP3ポリペプチド、その変異体、またはその変異体断片が投与される。2021523139.tif 000076
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎石症と診断されたヒト対象において腎石症の進行を遅らせる方法であって、
治療的有効量の可溶性ENPP1ポリペプチドを該対象に投与する工程を含み、該対象において該腎石症の進行が遅くなる、該方法。
【請求項２】
前記可溶性ENPP1ポリペプチドが、該可溶性ENPP1ポリペプチドの半減期を延ばしかつ/または該可溶性ENPP1ポリペプチドの免疫原性を低減する部分と融合されている、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記部分が、免疫グロブリン(Ig)Fcドメイン、ポリエチレングリコール(PEG)、およびアルブミンからなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記可溶性ENPP1ポリペプチドが、骨を標的にするドメインと融合されている、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記可溶性ENPP1ポリペプチドが、該可溶性ENPP1ポリペプチドと融合したシグナル配列を含む前駆体ポリペプチドの分泌産物であり、該シグナル配列が、ENPP2シグナル配列、ENPP5シグナル配列、およびENPP7シグナル配列からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記腎石症が、シスチン尿症、尿酸結石疾患、ストルバイト結石疾患、高カルシウム尿症、カルシウム結石疾患、および高シュウ酸尿症からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記腎石症がカルシウム結石疾患である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記腎石症が、シュウ酸塩、尿酸塩、シスチン、ヒドロキシウレア、およびリン酸カルシウムからなる群より選択される無機質を含有する腎臓結石を少なくとも1種類含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
局所、局部、非経口、および全身からなる群より選択される経路を介して前記対象に前記可溶性ENPP1ポリペプチドが投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
腎石症と診断された対象において腎石症の進行を遅らせる方法であって、
治療的有効量の可溶性ENPP3ポリペプチドを該対象に投与する工程を含み、該対象において該腎石症の進行が遅くなる、該方法。
【請求項１１】
前記可溶性ENPP3ポリペプチドが、該可溶性ENPP3ポリペプチドの半減期を延ばしかつ/または該可溶性ENPP3ポリペプチドの免疫原性を低減する部分と融合されている、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記部分が、免疫グロブリン(Ig)Fcドメイン、ポリエチレングリコール(PEG)、およびアルブミンからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記可溶性ENPP3ポリペプチドが、骨を標的にするドメインと融合されている、請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
前記可溶性ENPP3ポリペプチドが、該可溶性ENPP3ポリペプチドと融合したシグナル配列を含む前駆体ポリペプチドの分泌産物であり、該シグナル配列が、ENPP2シグナル配列、ENPP5シグナル配列、およびENPP7シグナル配列からなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
【請求項１５】
前記腎石症が、シスチン尿症、尿酸結石疾患、ストルバイト結石疾患、高カルシウム尿症、カルシウム結石疾患、および高シュウ酸尿症からなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
【請求項１６】
前記腎石症がカルシウム結石疾患である、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記腎石症が、シュウ酸塩、尿酸塩、シスチン、ヒドロキシウレア、およびリン酸カルシウムからなる群より選択される無機質を含有する腎臓結石を少なくとも1種類含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１８】
局所、局部、非経口、および全身からなる群より選択される経路を介して前記対象に前記可溶性ENPP3ポリペプチドが投与される、請求項10に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、35U.S.C.119条(e)に基づいて、全体が参照により本明細書に組み入れられる2018年5月8日に出願された米国特許仮出願第62/668,293号に係る優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発の記載
本発明は米国立衛生研究所によって付与されたDK079310の下で政府助成金を受けてなされた。米国政府は本発明においてある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
腎(腎臓)石灰化には、2つの異なる病因である、腎臓軟部組織に影響を及ぼす広汎性の腎臓石灰化に対応する腎石灰沈着症と、腎尿細管内での石灰化に対応する腎石症(通称、腎結石または腎臓結石と呼ばれる)とが含まれる。
【０００４】
腎石灰沈着症は、重篤な疾患、例えば、末期腎疾患(ESRD)、乳児全身性動脈石灰化(GACI)、糖尿病II、常染色体劣性低リン血症性くる病、心血管障害、アテローム性動脈硬化症、慢性腎疾患(CKD)、および/または弾力線維性仮性黄色腫(PXE)に起因することが最も多い。腎石灰沈着症は、軟部組織石灰化の他に腎臓結石を伴うことまたは伴わないことがある。
【０００５】
腎石症または一般的な腎臓結石疾患(重篤な組織石灰化疾患に冒されていない対象が腎臓結石を発症する)は、無症候性である場合、または側腹痛、肉眼的血尿もしくは顕微鏡的血尿、一方もしくは両方の腎臓の閉塞、および尿路感染症のうちの1つもしくはいくつかと関連する場合がある。腎臓結石の徴候および症状には、重篤な疼痛、悪心、嘔吐、発熱、悪寒、および尿中への出血が含まれる場合がある。疼痛は典型的に重篤であり、波状に現れ、顕微鏡的血尿または肉眼的血尿を伴う。
【０００６】
経口リン酸サプリメントおよびチアジド利尿薬が腎石症を和らげるのに用いられる。タンパク質摂取量およびナトリウム摂取量の減少、クエン酸による尿の酸性化、ならびに水分摂取量の増加が、腎臓結石に対するさらなる非特異的な治療戦略である。しかしながら、これらの治療は、忍容性が乏しい(すなわち、リン酸サプリメント)こと、または再発性の結石形成を予防するのにもしくは既存の結石を分解するのに効果がないことが多い。
【０００７】
ヒトENPP(エクトヌクレオチドピロホスファターゼ)タンパク質ファミリーは、ホスホジエステル結合を加水分解する7種類の細胞外グリコシル化タンパク質(すなわち、ENPP1、ENPP2、ENPP3、ENPP4、ENPP5、ENPP6、およびENPP7)からなる。ENPPはENPP2以外が細胞表面酵素であり、ENPP2は原形質膜に輸送されるが、フューリンによって切断され、細胞外液に放出される。これらの酵素は、高度の配列相同性と構造相同性を有するが、ヌクレオチドから脂質までを含む多様な基質特異性を示す。
【０００８】
ENPP1変異がホモ接合性であるマウス(ENPPlasi/asi)において、構築物ENPP1-Fcは全身性動脈石灰化を低減する(Albright, et al., 2015, Nature Comm. 10006(非特許文献1))。乳児で発生し、広範な動脈石灰化を伴う重篤な疾患であるGACI(乳児全身性動脈石灰化)の動物モデルとして、ENPPlasi/asiマウスが役立つ。動脈石灰化がGACIの主症状であるが、Albrightらは、心臓、大動脈、冠状動脈、および腎臓の軟部組織を含む他のモデルマウス組織でも広範な石灰化を観察した。腎臓では重度の石灰化が腎臓の髄質外部に集中し、腎皮質まで及んでいた。少なくとも腎臓石灰化がヒトGACIの特徴ではないので、GACIマウスモデルはヒト疾患とは異なる(Albright, et al., 2015, Nature Comm. 10006(非特許文献1))。重篤な組織石灰化の疾患を処置するためにENPP1融合タンパク質も述べられており(PCT/US2014/015945(特許文献1)およびPCT/US2016/033236(特許文献2))、GACIを処置するために、骨を標的にするドメインを含むENPP1融合タンパク質が述べられている(PCT/US2011/051858(特許文献3))。
【０００９】
従って、対象において腎石症の形成および/または進行を阻止し、逆転させ、かつ/または遅らせるための新規の組成物および方法が当技術分野において必要とされている。本発明はこの必要性を満たす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】PCT/US2014/015945
【特許文献２】PCT/US2016/033236
【特許文献３】PCT/US2011/051858
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Albright, et al., 2015, Nature Comm. 10006
【発明の概要】
【００１２】
発明の簡単な概要
本発明は、ヒト対象において腎石症の形成および/または進行を阻止し、逆転させ、かつ/または遅らせる方法を提供する。ある特定の態様では、対象は腎石症と診断されている。他の態様では、対象は腎臓結石を発症しやすい。さらに他の態様では、対象には腎石症の家族歴がある。さらに他の態様では、対象は腎石症に罹患したことがある。
【００１３】
本発明は、ヒト対象において腎石灰沈着症の形成および/または進行を阻止し、逆転させ、かつ/または遅らせる方法を提供する。ある特定の態様では、対象は腎石灰沈着症と診断されている。他の態様では、対象は腎石灰沈着症を発症しやすい。さらに他の態様では、対象には腎石灰沈着症の家族歴がある。さらに他の態様では、対象は腎石灰沈着症に罹患したことがある。さらに他の態様では、対象は重篤な石灰化疾患に全く罹患していない。さらに他の態様では、対象は末期腎疾患(ESRD)に罹患していない。さらに他の態様では、対象は乳児全身性動脈石灰化(GACI)に罹患していない。さらに他の態様では、対象は糖尿病IIに罹患していない。さらに他の態様では、対象は常染色体劣性低リン血症性くる病に罹患していない。さらに他の態様では、対象は心血管障害に罹患していない。さらに他の態様では、対象はアテローム性動脈硬化症に罹患していない。さらに他の態様では、対象は慢性腎疾患(CKD)に罹患していない。さらに他の態様では、対象は弾力線維性仮性黄色腫(PXE)に罹患していない。
【００１４】
ある特定の態様では、前記方法は、治療的有効量の可溶性ENPP1ポリペプチドを対象に投与する工程を含み、対象において腎石症の形成および/または進行は阻止され、逆転され、かつ/または遅くなる。他の態様では、前記方法は、治療的有効量の可溶性ENPP3ポリペプチドを対象に投与する工程を含み、対象において腎石症の形成および/または進行は阻止され、逆転され、かつ/または遅くなる。
【００１５】
ある特定の態様では、可溶性ENPP1ポリペプチドは、可溶性ENPP1ポリペプチドの半減期を延ばしかつ/または可溶性ENPP1ポリペプチドの免疫原性を低減する部分と融合されている。他の態様では、可溶性ENPP3ポリペプチドは、可溶性ENPP3ポリペプチドの半減期を延ばしかつ/または可溶性ENPP3ポリペプチドの免疫原性を低減する部分と融合されている。
【００１６】
ある特定の態様では、前記部分は、免疫グロブリン(Ig)Fcドメイン、ポリエチレングリコール(PEG)、およびアルブミンからなる群より選択される。
【００１７】
ある特定の態様では、可溶性ENPP1ポリペプチドは骨を標的にするドメインと融合されている。他の態様では、可溶性ENPP1ポリペプチドは骨を標的にするドメインと融合されていない。さらに他の態様では、可溶性ENPP3ポリペプチドは骨を標的にするドメインと融合されている。さらに他の態様では、可溶性ENPP3ポリペプチドは骨を標的にするドメインと融合されていない。
【００１８】
ある特定の態様では、可溶性ENPP1ポリペプチドは、可溶性ENPP1ポリペプチドと融合したシグナル配列を含む前駆体ポリペプチドの分泌産物であり、シグナル配列は、ENPP2シグナル配列、ENPP5シグナル配列、およびENPP7シグナル配列からなる群より選択される。
【００１９】
ある特定の態様では、可溶性ENPP3ポリペプチドは、可溶性ENPP3ポリペプチドと融合したシグナル配列を含む前駆体ポリペプチドの分泌産物であり、シグナル配列は、ENPP2シグナル配列、ENPP5シグナル配列、およびENPP7シグナル配列からなる群より選択される。
【００２０】
ある特定の態様では、腎石症は、カルシウム結石疾患、シスチン尿症、尿酸結石疾患、ストルバイト結石疾患、高カルシウム尿症、および高シュウ酸尿症からなる群より選択される。他の態様では、腎石症はカルシウム結石疾患である。さらに他の態様では、腎石症は、シスチン尿症、尿酸結石疾患、ストルバイト結石疾患、高カルシウム尿症、および高シュウ酸尿症からなる群より選択される。
【００２１】
ある特定の態様では、対象に、局所、局部、非経口、および全身からなる群より選択される経路を介して可溶性ENPP1ポリペプチドが投与される。他の態様では、対象に、局所、局部、非経口、および全身からなる群より選択される経路を介して可溶性ENPP3ポリペプチドが投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本発明の例示的な態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と組み合わせて読めばさらに深く理解される。本発明を例示するために、例示的な態様を図面に示した。しかしながら、本発明は、図面に示した態様の正確な配置および手段に限定されないと理解されるはずである。
【図１】ENPP3ポリペプチドの非限定的な発現および精製を示したタンパク質ゲルを図示する。
【図２】本発明の中で企図される非限定的なENPP3構築物のプラスミド地図を図示する。
【図３】本発明の中で企図される非限定的なENPP3-Fc構築物のプラスミド地図を図示する。
【図４】本発明の中で企図される非限定的なENPP3-アルブミン構築物のプラスミド地図を図示する。
【図５】ENPP1ポリペプチドの非限定的な発現および精製を示したタンパク質ゲルを図示する。
【図６】本発明の中で企図される非限定的なENPP71-Fc構築物のプラスミド地図を図示する。
【図７】本発明の中で企図される非限定的なENPP71-アルブミン構築物のプラスミド地図を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、一局面では、ある特定のENPP1ポリペプチドもしくはENPP3ポリペプチド、その変異体、またはその変異体断片が、対象において腎石症の形成および/または進行を阻止し、逆転させ、かつ/または遅らせるのに使用できるという発見に関する。
【００２４】
ある特定のENPP1ポリペプチドもしくはENPP3ポリペプチド、その変異体、またはその変異体断片は、全てその全体が参照により本明細書に組み入れられるPCT出願公報番号WO2014/126965およびPCT出願公報番号WO/2016/187408において以前に公開されている。
【００２５】
定義
特に定義のない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および材料を説明する。本明細書で使用する、以下の用語はそれぞれ、このセクションにおいて、それぞれの用語に関連する意味を有する。
【００２６】
「1つの(a)」および「1つの(an)」という冠詞は、冠詞の文法上の目的語の1つまたは複数(すなわち、少なくとも1つ)を指すために本明細書において用いられる。例として、「要素」とは1つの要素または複数の要素を意味する。
【００２７】
理解しやすいように、以下の表記上のきまりが本開示に適用される。どのような場合でも、このきまりに従わない本明細書中のあらゆる開示が本開示の一部であり、本開示が開示される文脈を考慮すれば十分に理解することができる。タンパク質の略号は、イタリック体でない大文字で開示される。非限定的な例として「ENPP1」または「ENPP7」は、対応するタンパク質を指す。ある特定の態様では、タンパク質がヒトタンパク質であれば、タンパク質の略号の前に「h」が用いられる。他の態様では、タンパク質がマウスタンパク質であれば、略号の前に「m」が用いられる。従って、ヒトENPP1は「hENPP1」と呼ばれ、マウスENPP1は「mENPP1」と呼ばれる。ヒト遺伝子の略号はイタリック体の大文字で開示される。非限定的な例として、タンパク質hENPP1に対応するヒト遺伝子はENPP1である。マウス遺伝子の略号は最初の文字は大文字、残りの文字は小文字で開示される。さらに、マウス遺伝子の略号はイタリック体である。非限定的な例として、タンパク質mEnpp1を作るマウス遺伝子はEnpp1である。遺伝子変異についての表記は大文字で示される。例えば、関節のこわばりに関連する遺伝子Enpp1に変異があるトランスジェニックマウスは「asj」変異と呼ばれ、この変異に関連する遺伝子および表現型を表すためにEnpp1asj/asjとアノテートされる。
【００２８】
本明細書で使用する「約」とは、測定可能な値、例えば、量、期間などを指している場合には、指定値からの±20％または±10％、ある特定の態様では±5％、ある特定の態様では±1％、ある特定の態様では±0.1％のばらつきが、開示された方法を実施するのに適している場合に、このようなばらつきを包含することを意味する。
【００２９】
本明細書で使用する「ALB」という用語は血清アルブミンタンパク質を指す。ある特定の態様では、アルブミンはヒト血清アルブミンを指す。ウシ血清アルブミン、ウマ血清アルブム(album)、およびブタ血清アルブミンなどの他のアルブミンの使用も本発明の中で企図される。
【００３０】
疾患もしくは障害の症状の重篤度、患者がこのような症状を経験する頻度、またはその両方が低減すれば、疾患もしくは障害は「軽減」されている。
【００３１】
本明細書で使用する「変化」、「欠損」、「バリエーション」、または「変異」という用語は、ミスセンス変異およびナンセンス変異、挿入、欠失、フレームシフトおよび中途終止を含む、遺伝子がコードするポリペプチドの機能、活性、発現(転写もしくは翻訳)、またはコンホメーションに影響を及ぼす、細胞にある遺伝子の変異を指す。
【００３２】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、抗原上にある特定のエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。抗体は天然供給源または組換え供給源に由来するインタクトな免疫グロブリンでもよく、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分でもよい。
【００３３】
本明細書で使用する「Ap3P」という用語はアデノシン-5’-トリホスホ-5’-アデノシンまたはその塩を指す。
【００３４】
本明細書で使用する「カルシウム結石疾患」は腎石症の一種であり、腎尿細管で形成する結石の結石形成疾患の全症例の約70％を占めている。
【００３５】
本明細書で使用する「コード配列」という用語は、mRNAおよび/もしくはポリペプチドまたはその断片を産生するように転写および/または翻訳することができる、核酸もしくはその相補鎖またはその一部の配列を意味する。コード配列には、ゲノムDNAまたは未熟な一次RNA転写物にあるエキソンが含まれ、エキソンは、成熟mRNAを生じるように細胞の生化学的機構によってつなぎ合わされる。アンチセンス鎖は、このような核酸の相補鎖であり、アンチセンス鎖からコード配列を推定することができる。対照的に、本明細書で使用する「非コード配列」という用語は、インビボでアミノ酸に翻訳されないか、またはアミノ酸を配置するようにtRNAが相互作用しないか、もしくはアミノ酸を配置しようとしない核酸もしくはその相補鎖またはその一部の配列を意味する。非コード配列には、ゲノムDNAまたは未熟な一次RNA転写物にあるイントロン配列と、遺伝子に関連する配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの両方が含まれる。
【００３６】
本明細書で使用する「保存的バリエーション」または「保存的置換」という用語は、本明細書で使用する場合には、アミノ酸残基と別の生物学的に類似する残基との交換を指す。保存的バリエーションまたは保存的置換はペプチド鎖の形状を変える可能性が低い。保存的バリエーションまたは保存的置換の例には、ある疎水性残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニンと別の疎水性残基との交換、またはある極性残基と別の極性残基との置換、例えば、リジンからアルギニンへの置換、アスパラギン酸からグルタミン酸への置換、またはアスパラギンからグルタミンへの置換が含まれる。
【００３７】
本明細書で使用する「システイン結石」は、システイン輸送に欠陥があるために尿中のシステインが過剰になり、それによって結石が形成する、まれな遺伝障害である「シスチン尿症」に起因して形成した腎臓結石を指す。
【００３８】
「疾患」とは、動物がホメオスタシスを維持することができない、動物の健康状態であり、疾患が良くならなければ、動物の健康は悪化し続ける。
【００３９】
動物における「障害」とは、動物がホメオスタシスを維持することができる健康状態であるが、障害が存在しない時より動物の健康状態は好ましくない。無処置のままにしておいたら、障害は、必ず、動物の健康状態をさらに低下させるとは限らない。
【００４０】
本明細書で使用する「有効量」、「薬学的有効量」、および「治療的有効量」という用語は、望ましい生物学的結果をもたらすのに無毒であるが十分な薬剤の量を指す。この結果は、疾患の徴候、症状、もしくは原因の低減および/もしくは軽減でもよく、生物システムの他の任意の望ましい変化でもよい。任意の個々の症例における適切な治療上の量は日常的な実験方法を用いて当業者によって決定することができる。
【００４１】
「コードする」とは、生物学的プロセスにおいて、規定されたヌクレオチド配列(すなわち、rRNA、tRNA、およびmRNA)または規定されたアミノ酸配列を有し、結果として生じる生物学的特性を有する他のポリマーおよび高分子を合成するためのテンプレートとして働くようなポリヌクレオチド、例えば、遺伝子、cDNA、またはmRNAにおける特定のヌクレオチド配列の固有の性質を指す。従って、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳によって細胞または他の生物システムにおいてタンパク質が産生されるのであればタンパク質をコードする。mRNA配列と同一であり、通常、配列表に示されているヌクレオチド配列であるコード鎖と、遺伝子またはcDNAの転写用のテンプレートとして用いられる非コード鎖の両方とも、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードすると言うことができる。
【００４２】
本明細書で使用する「家族歴」は、対象の母親もしくは父親または祖父母、あるいは対象の同胞における腎石症または一般的な腎臓結石の発生を指す。「家族歴」はまた、腎石症に関連する遺伝子変異の系統学的家族歴、および対象におけるそれらの同じ遺伝子変異のうちの1つまたは複数の発生も指すことがある。
【００４３】
本明細書で使用する「Fc」という用語はヒトIgG(免疫グロブリン)Fcドメインを指す。Fcドメインとしての使用にはIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4などのIgGサブタイプが企図される。
【００４４】
本明細書で使用する「断片」という用語は核酸に適用される場合には、もっと大きな核酸の部分配列を指す。核酸の「断片」は少なくとも約15ヌクレオチド、少なくとも約50〜100ヌクレオチド、少なくとも約100〜500ヌクレオチド、少なくとも約500〜1000ヌクレオチド、少なくとも約1000〜1500ヌクレオチド、少なくとも約1500〜2500ヌクレオチド、または少なくとも約2500ヌクレオチド(およびその間の任意の整数値)でもよい。本明細書で使用する「断片」という用語はタンパク質またはペプチドに適用される場合には大きなタンパク質またはペプチドの部分配列を指し、長さが少なくとも約20アミノ酸、少なくとも約50アミノ酸、少なくとも約100アミノ酸、少なくとも約200アミノ酸、少なくとも約300アミノ酸、または少なくとも約400アミノ酸(およびその間の任意の整数値)でもよい。
【００４５】
本明細書で使用する「ヒドロキシアパタイト結石」は、ヒドロキシアパタイトを含有し、飼料によって誘発される腎臓石灰化に起因し得る腎臓結石を指す。
【００４６】
本明細書で使用する「高カルシウム尿症」は、尿中のカルシウムが多い状態を指す。慢性高カルシウム尿症は、腎石灰沈着症、腎機能の低下、および腎不全につながることがある。
【００４７】
本明細書で使用する「低リン酸血症」は、血中に異常に低いレベルのリン酸がある電解質不均衡を指す。血中リン酸の減少は、リン酸塩尿症につながる尿中リン酸の増加と関連する場合もある。
【００４８】
「説明材料」とは、この用語が本明細書において用いられる場合には、本明細書において列挙された様々な疾患または障害を同定または軽減または処置するためのキットの中にある、本発明の核酸、ペプチド、および/または化合物の有用性を伝えるのに使用することができる刊行物、記録、図、または他の任意の表現媒体を含む。
【００４９】
「単離された」とは、自然状態から変えられているかまたは取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に天然で存在する核酸またはポリペプチドは「単離されて」いないが、自然状態の同時に存在する材料から部分的または完全に分離されている同じ核酸またはポリペプチドは「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は実質的に精製された形で存在してもよく、例えば、宿主細胞などの自然ではない環境に存在してもよい。
【００５０】
「腎石灰沈着症」は、腎臓の軟部組織における(リン酸カルシウムおよび/またはシュウ酸カルシウムの形をとる)カルシウム塩の沈着を指す。腎臓の軟部組織は腎髄質および腎皮質(renal cortext)を含み、腎尿細管(ネフロン)を含まない。この障害は対称性の場合があるか、または海綿腎などの解剖学的障害では1個の腎臓しか関与しない場合がある。軟部組織石灰化は0.0005〜0.002μm2のサイズ範囲になる場合がある(石灰化サイズ=無機化面積/石灰化の数)。ある特定の軟部組織面積の中にある石灰化の程度は0.2％〜1.0％になる場合がある(％石灰化=100*無機化面積/組織面積)。腎石灰沈着症は、重篤な石灰化疾患、例えば、末期腎疾患(ESRD)、乳児全身性動脈石灰化(GACI)、糖尿病II、常染色体劣性低リン血症性くる病、心血管障害、アテローム性動脈硬化症、慢性腎疾患(CKD)、および/または弾力線維性仮性黄色腫(PXE)において発生する。
【００５１】
「腎石症」は、腎尿細管中に腎臓結石が形成することを指す。この疾患は、腎盂と尿細管内腔に石(結石)が形成することを伴う。結石は、尿から析出した(分離した)結晶から形成する。本明細書で使用する腎石症は、末期腎疾患(ESRD)、乳児全身性動脈石灰化(GACI)、糖尿病II、常染色体劣性低リン血症性くる病、心血管障害、アテローム性動脈硬化症、慢性腎疾患(CKD)、および/または弾力線維性仮性黄色腫(PXE)を含まない。
【００５２】
本明細書で使用する「NPP」または「ENPP」という用語はエクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼを指す。
【００５３】
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、長さが少なくとも2ヌクレオチド、ある特定の態様では少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドの核酸であるが、50ヌクレオチド長まで、100ヌクレオチド長まで、1000ヌクレオチド長まで、または5000ヌクレオチド長まででもよく、ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする化合物でもよい。
【００５４】
本明細書で使用する「患者」、「個体」、または「対象」という用語はヒトを指す。
【００５５】
本明細書で使用する「薬学的組成物」または「組成物」という用語は、薬学的に許容される担体との、本発明において有用な少なくとも1種類の化合物の混合物を指す。薬学的組成物は患者への化合物の投与を容易にする。静脈内投与、経口投与、エアロゾル投与、吸入投与、直腸投与、腟投与、経皮投与、鼻腔内投与、頬投与、舌下投与、非経口投与、くも膜下腔内投与、胃内投与、眼投与、肺投与、および局所的投与を含むが、これに限定されない、化合物を投与する複数の技法が当技術分野において存在する。
【００５６】
本明細書で使用する「薬学的に許容される」という用語は、化合物の生物学的活性または生物学的特性を無くさない比較的無毒の材料、例えば、担体または希釈剤を指す。すなわち、この材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはこの材料が含まれる組成物のどの成分とも有害に相互作用することなく個体に投与することができる。
【００５７】
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」という用語は、本発明において有用な化合物が、意図された機能を果たすことができるように、本発明において有用な化合物を患者の中にまたは患者に運搬もしくは輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物、または担体、例えば、液体または固体の増量剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒、またはカプセル化材料を意味する。典型的には、このような構築物は、ある臓器または身体の一部から別の臓器または身体の一部に運搬または輸送される。それぞれの担体は、本発明において有用な化合物を含む、製剤の他の成分と適合し、患者に害を及ぼさないという意味で「許容」されなければならない。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース;デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプン;セルロースおよびその誘導体が含まれる。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」はまた、本発明において有用な化合物の活性と適合し、患者に生理学的に許容される、任意のおよび全てのコーティング、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤なども含む。「薬学的に許容される担体」は、本発明において有用な化合物の薬学的に許容される塩をさらに含んでもよい。本発明の実施において用いられる薬学的組成物に含まれ得る他のさらなる成分は当技術分野において公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)に記載されている。
【００５８】
本明細書で使用する「薬学的に許容される塩」という言葉は、無機酸、無機塩基、有機酸、無機塩基、その溶媒和化合物、水和物、および包接化合物を含む、薬学的に許容される無毒の酸および塩基から調製された、投与される化合物の塩を指す。適切な薬学的に許容される酸添加塩は無機酸から調製されてもよく、有機酸から調製されてもよい。
【００５９】
本明細書で使用する「リン酸塩尿症」は、過剰なリン酸塩が尿中に存在する状態であり、尿は外見が乳白色、または濁っているように見える場合がある。
【００６０】
本明細書で使用する「血漿ピロリン酸(PPi)レベル」という用語は、動物の血漿中に存在するピロリン酸の量を指す。ある特定の態様では、動物は、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ヒト、ウシ、およびウマを含む。血小板から放出されるため、血清ではなく血漿中でPPiを測定する必要がある。いくつかのPPi測定法があり、このうちの1つは、改良が加えられた、ウリジン二リン酸グルコース(UDPG)ピロホスホリラーゼを用いた酵素アッセイ(Lust & Seegmiller, 1976, Clin. Chim. Acta 66:241-249; Cheung & Suhadolnik, 1977, Anal. Biochem. 83:61-63)によるものである。
【００６１】
本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して連結したアミノ酸残基、その関連する天然構造変種、および合成非天然類似体で構成されるポリマーを指す。
【００６２】
本明細書で使用する「PPi」という用語はピロリン酸を指す。
【００６３】
本明細書で使用する「予防する」または「予防」という用語は、何も起こっていなければ、障害の発症も疾患の発症も無いこと、または障害もしくは疾患が既に発症していれば、これ以上の障害の発症も疾患の発症も無いことを意味する。障害または疾患に関連する症状の一部または全てを予防できることも考慮される。
【００６４】
本明細書で使用する、腎臓結石「の形成を遅らせる」という用語は、対象に既にある腎臓結石の形成を最小にできるか、または逆転できることを指し、腎臓結石が既に存在する場所で行われてもよく、腎結石が形成されたことがない、または検出されたことがない場所で行われてもよいが、対象には、腎臓石灰化の家族歴または他の任意の腎臓石灰化素因がある。他の態様では、腎臓結石形成の低減が腎尿細内で検出される。他の態様では、処置前および処置後に、腎臓結石の検出、結石の低減、または結石の小型化が対象の尿中で生じる。
【００６５】
本明細書で使用する、腎臓結石または腎臓結石形成「の進行を遅らせる」という用語は、既にある腎臓結石のサイズを小さくできること(またはサイズの点で成長を止める、妨害する、もしくは逆転できること)、および/あるいは腎結石の数を低減できること(または数の点で成長を止める、妨害する、もしくは逆転できること)指す。
【００６６】
本明細書で使用する「腎結石」または「腎臓結石」は、目に見える場合があり、直径が2〜50mmの場合がある、腎臓で形成した大きな無機質沈着物を指す。サイズは腎臓結石を定義するための制限因子でなく、むしろ腎尿細管内での場所である。腎結石に存在する、よくある組成物には、カルシウム、シュウ酸塩、リン酸塩、尿酸、およびシステインが含まれる。ある特定の態様では、腎結石の形成は、初期石灰化芽(initial calcification bud)(結晶核)が形成することから始まり、この芽の周囲に腎結石が形成し、成長する。
【００６７】
本明細書で使用する「試料」または「生物学的試料」とは、対象から単離された生物学的材料を意味する。生物学的試料は、対象においてmRNA、ポリペプチド、または生理学的プロセスもしくは病的プロセスの他のマーカーを検出するのに適した任意の生物学的材料を含有してよく、個体から得られた流体、組織、細胞材料、および/または非細胞材料を含んでもよい。
【００６８】
本明細書で使用する「実質的に精製された」とは、他の成分を本質的に含まないことを指す。例えば、実質的に精製されたポリペプチドは、天然状態で通常関連する他の成分から分離されているポリペプチドである。非限定的な態様は、95％純度、99％純度、99.5％純度、99.9％純度、および100％純度を含む。
【００６９】
本明細書で使用する「ストルバイト結石」は、尿路感染(例えば、膀胱感染)が尿の化学平衡に影響を及ぼす時に、感染結石または三重リン酸塩結石が発症することを指す。尿路中の細菌が、尿中の酸を中和する化学物質を放出し、これにより細菌は急速に増殖することが可能になり、ストルバイト結石の発生が促進される。
【００７０】
本明細書で使用する「処置」または「処置する工程」という用語は、疾患もしくは障害(例えば、腎尿細管中の腎結石)、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害を発症する可能性を治すか、治癒するか、軽減するか、緩和するか、変えるか、いやすか、寛解させるか、改善するか、またはこれに影響を及ぼす目的で、疾患もしくは障害を有するか、疾患もしくは障害の症状を有するか、または疾患もしくは障害を発症する可能性を有する患者への、治療剤、すなわち、本発明において有用な化合物の(単独で、もしくは別の薬学的薬剤と組み合わせた)適用もしくは投与、または患者に由来する単離された組織もしくは細胞株への治療剤の適用もしくは投与(例えば、診断もしくはエクスビボ適用の場合)と定義される。このような処置は、ファーマコゲノミクスの分野から得られた知識に基づいて個別に合わせられてもよく、変更されてもよい。
【００７１】
本明細書で使用する「尿酸結石」は、低い尿pH条件下で2-または8-ジヒドロキシアデニン、アデニン、キサンチン、および尿酸などのプリン代謝産物が析出すると形成される腎臓結石を指す。
【００７２】
本明細書で使用する「野生型」という用語は、天然供給源から単離された遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は集団内で最も頻繁に観察され、従って、任意で、遺伝子の「正常」型または「野生」型だと指定される。対照的に、「改変された」または「変異体」という用語は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に配列および/または機能的特性の改変(すなわち、特徴の変化)を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然変異体は単離することができる。これらは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に特徴の変化(核酸配列の変化を含む)を有するという事実によって同定される。
【００７３】
範囲: 本願全体を通じて、本発明の様々な局面を範囲の形で提示することができる。範囲の形での説明は単なる便宜および簡略のためのものであり、本発明の範囲に対する融通の利かない限定として解釈してはならないことが理解されるはずである。従って、範囲の説明は、可能性のある全ての部分範囲(subrange)ならびにその範囲内にある個々の数値を具体的に開示したとみなされるはずである。例えば、1〜6などの範囲の説明は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの部分範囲、ならびにその範囲内にある個々の数値、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示したとみなされるはずである。これは範囲の幅に関係なく適用される。
【００７４】
説明
本発明は、一局面では、ある特定のENPP1ポリペプチドもしくはENPP3ポリペプチド、その変異体、またはその変異体断片が、ヒト対象において腎石症の形成および/または進行を阻止し、逆転させ、かつ/または遅らせるのに使用できるという発見に関する。
【００７５】
組成物
ある特定の態様では、本発明はENPP1(NPP1とも呼ばれる)ポリペプチドを提供する。他の態様では、本発明はENPP3(NPP3とも呼ばれる)ポリペプチドを提供する。
【００７６】
ある特定の態様では、本発明の組成物は、式(I):
プロテイン-Z-ドメイン-X-Y  (I)
の少なくとも1つの化合物、またはその溶媒和化合物もしくは塩(例えば、薬学的に許容される塩)を含み、
式中、プロテインは、ENPP1(SEQ ID NO:1)、ENPP121(SEQ ID NO:15)、ENPP71(SEQ ID NO:17)、ENPP1 N末端GLKを欠くENPP71(SEQ ID NO:19)、ENPP51(SEQ ID NO:24)、およびA-B-SEQ ID NO:32からなる群より選択される少なくとも1つであり、
Aはタンパク質輸送配列であり、
Bは存在しないか、またはSEQ ID NO:33において残基Xaap〜Xaa17に対応する配列であり、pは1〜17の整数であり、
ドメインは、存在しないか、またはヒトIgG Fcドメイン(Fc)(IgG1、IgG2、IgG3、および/またはIgG4などがあるが、これに限定されない)、ヒト血清アルブミンタンパク質(ALB)、ならびにその断片からなる群より選択される少なくとも1つであり、
XおよびZは独立して、存在しないか、または1〜20個のアミノ酸を含むポリペプチドであり、
Yは、存在しないか、または
2021523139.tif 000003
からなる「骨を標的にする」配列群より選択される配列であり、ここでmは、1〜15の整数であり、かつnは1〜10の整数である。
【００７７】
ある特定の態様では、AはSEQ ID NO:34〜39からなる群より選択される。
【００７８】
ある特定の態様では、Bは存在しないか、またはSEQ ID NO:40〜55からなる群より選択される。
【００７９】
ある特定の態様では、ドメインはヒトIgG Fcドメインまたはその断片を含む。他の態様では、ドメインはヒトIgG Fcドメインまたはその断片から本質的になる。さらに他の態様では、ドメインはヒトIgG Fcドメインまたはその断片からなる。
【００８０】
ある特定の態様では、ドメインはヒト血清アルブミンタンパク質またはその断片を含む。他の態様では、ドメインはヒト血清アルブミンタンパク質またはその断片から本質的になる。さらに他の態様では、ドメインはヒト血清アルブミンタンパク質またはその断片からなる。さらに他の態様では、ドメインは存在しない。
【００８１】
ある特定の態様では、Yは、負に荷電している、骨を標的にする配列である。ある特定の態様では、Yは存在しない。ある特定の態様では、Yは存在せず、式(I)の化合物は、負に荷電している、骨を標的にする配列を欠く。さらに他の態様では、ポリアスパラギン酸ドメインおよびSEQ ID NO:3〜14が、負に荷電している、骨を標的にする配列の非限定的な例である。さらに他の態様では、可溶性ENPP1ポリペプチドは、負に荷電している、骨を標的にするドメインを欠く。
【００８２】
ある特定の態様では、前記プロテインまたはその変異体は、ヌクレアーゼドメインを取り除くように切断されている。さらに他の態様では、前記プロテインまたはその変異体は、SEQ ID NO:1と比べて残基約524〜残基約885のヌクレアーゼドメインを取り除くように切断されており、SEQ ID NO:1と比べて、タンパク質の触媒活性を保存するのに役立つ、残基約186〜残基約586の触媒ドメインしか残っていない。
【００８３】
ある特定の態様では、プロテイン-Z-ドメインは(SEQ ID NO:15)-Z-(Fcまたはその断片)を含む。他の態様では、Zはトリペプチドである。さらに他の態様では、ZはLINである。さらに他の態様では、プロテイン-Z-ドメインはSEQ ID NO:16を含む。
【００８４】
ある特定の態様では、プロテイン-Z-ドメインは(SEQ ID NO:17)-Z-(Fcまたはその断片)を含む。他の態様では、Zはトリペプチドである。さらに他の態様では、ZはLINである。さらに他の態様では、プロテイン-Z-ドメインはSEQ ID NO:18を含む。
【００８５】
ある特定の態様では、プロテイン-Z-ドメインは(SEQ ID NO:19)-Z-(Fcまたはその断片)を含む。他の態様では、Zはトリペプチドである。さらに他の態様では、ZはLINである。さらに他の態様では、プロテイン-Z-ドメインはSEQ ID NO:20を含む。
【００８６】
ある特定の態様では、プロテイン-Z-ドメインは(SEQ ID NO:24)-Z-(Fcまたはその断片)を含む。他の態様では、Zはトリペプチドである。さらに他の態様では、ZはLINである。さらに他の態様では、プロテイン-Z-ドメインは(SEQ ID NO:24)-Z-(SEQ ID NO:26)を含む。
【００８７】
ある特定の態様では、プロテイン-Z-ドメインは(SEQ ID NO:15)-Z-(ALBまたはその断片)を含む。他の態様では、Zはトリペプチドである。さらに他の態様では、Zは、SEQ ID NO:28〜30からなる群より選択されるものである。さらに他の態様では、プロテイン-Z-ドメインはSEQ ID NO:21を含む。
【００８８】
ある特定の態様では、プロテイン-Z-ドメインは(SEQ ID NO:17)-Z-(ALBまたはその断片)を含む。他の態様では、Zはトリペプチドである。さらに他の態様では、Zは、SEQ ID NO:28〜30からなる群より選択されるものである。さらに他の態様では、プロテイン-Z-ドメインは(SEQ ID NO:17)-Z-(SEQ ID NO:27)を含み、Zは、SEQ ID NO:28〜30からなる群より選択されるものである。
【００８９】
ある特定の態様では、プロテイン-Z-ドメインは(SEQ ID NO:19)-Z-(ALBまたはその断片)を含む。他の態様では、Zはトリペプチドである。さらに他の態様では、Zは、SEQ ID NO:28〜30からなる群より選択されるものである。さらに他の態様では、プロテイン-Z-ドメインはSEQ ID NO:22を含む。
【００９０】
ある特定の態様では、プロテイン-Z-ドメインは(SEQ ID NO:24)-Z-(ALBまたはその断片)を含む。他の態様では、Zはトリペプチドである。さらに他の態様では、Zは、SEQ ID NO:28〜30からなる群より選択されるものである。さらに他の態様では、プロテイン-Z-ドメインはSEQ ID NO:25を含む。
【００９１】
ある特定の態様では、XおよびZは独立して存在しないか、または1〜18個のアミノ酸を含むポリペプチドである。他の態様では、XおよびZは独立して存在しないか、または1〜16個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは独立して存在しないか、または1〜14個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは独立して存在しないか、または1〜12個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは独立して存在しないか、または1〜10個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは独立して存在しないか、または1〜8個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは独立して存在しないか、または1〜6個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは独立して存在しないか、または1〜5個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは独立して存在しないか、または1〜4個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは独立して存在しないか、または1〜3個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは独立して存在しないか、または1〜2個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは独立して存在しないか、または1個のアミノ酸である。
【００９２】
ある特定の態様では、mは1である。他の態様では、mは2である。さらに他の態様では、mは3である。さらに他の態様では、mは4である。さらに他の態様では、mは5である。さらに他の態様では、mは6である。さらに他の態様では、mは7である。さらに他の態様では、mは8である。さらに他の態様では、mは9である。さらに他の態様では、mは10である。さらに他の態様では、mは11である。さらに他の態様では、mは12である。さらに他の態様では、mは13である。さらに他の態様では、mは14である。さらに他の態様では、mは15である。さらに他の態様では、mのそれぞれの出現は、独立して、1〜15、2〜15、3〜15、4〜15、5〜15、6〜15、7〜15、8〜15、9〜15、10〜15、11〜15、12〜15、13〜15、14〜15、1〜14、2〜14、3〜14、4〜14、5〜14、6〜14、7〜14、8〜14、9〜14、10〜14、11〜14、12〜14、13〜14、1〜13、2〜13、3〜13、4〜13、5〜13、6〜13、7〜13、8〜13、9〜13、10〜13、11〜13、12〜13、1〜12、2〜12、3〜12、4〜12、5〜12、6〜12、7〜12、8〜12、9〜12、10〜12、11〜12、1〜11、2〜11、3〜11、4〜11、5〜11、6〜11、7〜11、8〜11、9〜11、10〜11、1〜10、2〜10、3〜10、4〜10、5〜10、6〜10、7〜10、8〜10、9〜10、1〜9、2〜9、3〜9、4〜9、5〜9、6〜9、7〜9、8〜9、1〜8、2〜8、3〜8、4〜8、5〜8、6〜8、7〜8、1〜7、2〜7、3〜7、4〜7、5〜7、6〜7、1〜6、2〜6、3〜6、4〜6、5〜6、1〜5、2〜5、3〜5、4〜5、1〜4、2〜4、3〜4、1〜3、2〜3、および1〜2の整数からなる群より選択される。
【００９３】
ある特定の態様では、nは1であるか、nは2であるか、nは3であるか、nは4であるか、nは5であるか、nは6であるか、nは7であるか、nは8であるか、nは9であるか、またはnは10である。さらに他の態様では、nのそれぞれの出現は独立して、1〜10、2〜10、3〜10、4〜10、5〜10、6〜10、7〜10、8〜10、9〜10、1〜9、2〜9、3〜9、4〜9、5〜9、6〜9、7〜9、8〜9、1〜8、2〜8、3〜8、4〜8、5〜8、6〜8、7〜8、1〜7、2〜7、3〜7、4〜7、5〜7、6〜7、1〜6、2〜6、3〜6、4〜6、5〜6、1〜5、2〜5、3〜5、4〜5、1〜4、2〜4、3〜4、1〜3、2〜3、および1〜2の整数からなる群より選択される。
【００９４】
ある特定の態様では、前記プロテインまたはその変異体は、SEQ ID NO:1と比較して膜貫通ドメインと細胞外ドメインとの間にフューリン切断部位を含有する、ENPP1またはENPP3の細胞外領域セグメントを用いて改変されている。他の態様では、前記プロテインまたはその変異体は、SEQ ID NO:1と比較して膜貫通ドメインと細胞外ドメインとの間にフューリン切断部位を含有する、ENPP1またはENPP3の細胞外領域セグメントを用いて改変されていない。
【００９５】
ある特定の態様では、前記プロテインまたはその変異体は、SEQ ID NO:1と比較してシグナルペプチダーゼ切断部位を含有する、ENPP2の細胞外領域セグメントを用いて改変されている。他の態様では、前記プロテインまたはその変異体は、SEQ ID NO:1と比較してシグナルペプチダーゼ切断部位を含有する、ENPP2の細胞外領域セグメントを用いて改変されていない。
【００９６】
ある特定の態様では、本発明の化合物は可溶性である。他の態様では、本発明の化合物は組換えポリペプチドである。さらに他の態様では、本発明の化合物は、ENPP1またはENPP3膜貫通ドメインを欠く、ENPP1もしくはENPP3ポリペプチドまたはその変異体を含む。さらに他の態様では、前記化合物は、ENPP1もしくはENPP3膜貫通ドメインまたはその変異体が除去(および/または切断)されており、非限定的な例としてENPP2などの別のポリペプチドの膜貫通ドメインと交換されている、ENPP1もしくはENPP3ポリペプチドまたはその変異体を含む。
【００９７】
他の態様では、可溶性ENPP1ポリペプチドは、哺乳動物細胞で発現している前駆体ポリペプチドの分泌産物であり、前駆体ポリペプチドはENPP2シグナル配列を含み、ENPP2シグナル配列はENPP1ポリペプチドのN末端と融合されており、前駆体ポリペプチドは可溶性ENPP1ポリペプチドへのタンパク質分解処理を受ける。さらに他の態様では、可溶性ENPP1ポリペプチドは、哺乳動物細胞で発現している前駆体ポリペプチドであり、前駆体ポリペプチドはENPPl(SEQ ID NO:1)の残基1〜76、NPP2(NCBIアクセッション番号NP_001124335、SEQ ID NO:2)の残基12〜30、およびENPP1(SEQ ID NO:1)の残基96〜925を含み、前駆体ポリペプチドは可溶性ENPP1ポリペプチドへのタンパク質分解処理を受ける。さらに他の態様では、可溶性ENPP1ポリペプチドは、細胞で発現している前駆体ポリペプチドの分泌産物であり、前駆体ポリペプチドはENPP1膜貫通ドメインの残基77〜98を欠き、シグナル配列を含み、前駆体ポリペプチドは可溶性ENPP1ポリペプチドへのタンパク質分解処理を受ける。さらに他の態様では、可溶性ENPP1ポリペプチドはポリアスパラギン酸ドメインを欠く。
【００９８】
ある特定の態様では、可溶性ENPP1ポリペプチドは、哺乳動物細胞で発現している前駆体ポリペプチドの分泌産物であり、前駆体ポリペプチドは、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼ-5(ENPP5)シグナルペプチドおよびエクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼ-7(ENPP7)シグナルペプチド、ENPP1ポリペプチド、ならびに安定性ドメインからなる群より選択されるシグナルペプチドを含み、ENPP1前駆体ポリペプチド融合は細胞から分泌されるとタンパク分解処理されて、安定性ドメインを含む可溶性の酵素的に活性なENPP1ポリペプチド融合が生じる。他の態様では、安定性ドメインはアルブミンおよびIgG Fcからなる群より選択される。さらに他の態様では、ENPP7シグナルペプチドはENPP7(SEQ ID NO:17)の残基1〜22を含む。さらに他の態様では、ENPP5シグナルペプチドはENPP5(SEQ ID NO:24)の残基1〜24を含む。さらに他の態様では、可溶性の酵素的に活性なENPP1ポリペプチド融合はヒトENPP1(SEQ ID NO:1)の残基96〜925を含む。さらに他の態様では、ENPP1前駆体ポリペプチド融合はヒトENPP1(SEQ ID NO:1)の残基77〜98を欠く。さらに他の態様では、ENPP1前駆体ポリペプチド融合はヒトENPP1(SEQ ID NO:1)の残基1〜76およびヒトENPP1(SEQ ID NO:1)の残基96〜925を含む。
【００９９】
ある特定の態様では、本発明の化合物はENPP1もしくはENPP3ポリペプチドまたはその変異体を含み、複数の膜貫通ドメインをさらに含む。
【０１００】
ある特定の態様では、ENPP1またはENPP3はC末端で、ヒト免疫グロブリン1(IgG1)、ヒト免疫グロブリン2(IgG2)、ヒト免疫グロブリン3(IgG3)、および/またはヒト免疫グロブリン4(IgG4)のFcドメインと融合されている。
【０１０１】
ある特定の態様では、ENPP1またはENPP3はC末端でヒト血清アルブミンと融合されている。
【０１０２】
ある特定の態様では、ENPP1またはENPP3の断片および/または変種はヒト血清アルブミンもしくは変種および/またはその断片と融合されている。ヒト血清アルブミンは、天然ジスルフィド結合もしくは操作されたジスルフィド結合を含むが、これに限定されない化学リンカーを介して、あるいはENPP1もしくはENPP3またはその断片および/もしくは変種との遺伝子融合によってENPP1またはENPP3タンパク質に結合体化されてもよい。
【０１０３】
ある特定の態様では、本発明の化合物は、ENPP1またはENPP3の膜貫通ドメインを含むENPP1もしくはENPP3ポリペプチドまたはその変異体と、別のポリペプチド、例えば、非限定的な例としてENPP2とを含む。他の態様では、ENPP1またはENPP3ポリペプチドは、ENPP2膜貫通ドメインを含む前駆体ENPP1またはENPP3ポリペプチドの切断産物を含む。さらに他の態様では、ENPP2膜貫通ドメインは、
2021523139.tif 000004
に対応する、NCBIアクセッション番号NP_001124335(SEQ ID NO:2)の残基12〜30を含む。
【０１０４】
ある特定の態様では、本発明の化合物は、SEQ ID NO:21、22、および25からなる群より選択される配列を有する。
【０１０５】
ある特定の態様では、本発明の化合物は、SEQ ID NO:21、22、25、および(SEQ ID NO:17)-Z-(SEQ ID NO:27)からなる群より選択される配列を有する。
【０１０６】
ある特定の態様では、本発明の化合物は、SEQ ID NO:16、18、20、および(SEQ ID NO:24)-Z-(SEQ ID NO:26)からなる群より選択される配列を有する。
【０１０７】
ある特定の態様では、本発明の化合物は複数の膜貫通ドメインを有する。他の態様では、本発明の化合物はさらにペグ化されている(ポリ(エチレングリコール)鎖と融合されている)。さらに他の態様では、本発明の化合物は複数の膜貫通ドメインを有し、さらにペグ化されている。
【０１０８】
ある特定の態様では、本発明の化合物のkcat値は約3.4(±0.4)s-1酵素-1より大きいか、またはこれに等しく、kcatは化合物のATP加水分解速度を測定することによって求められる。
【０１０９】
ある特定の態様では、本発明の化合物のKM値は約2μMより小さいかまたはこれに等しく、KMは化合物のATP加水分解速度を測定することによって求められる。
【０１１０】
ある特定の態様では、本発明の化合物は液体製剤として処方される。他の態様では、本発明は、治療量の本発明の化合物を含む薬学的組成物の乾燥製品形態を提供し、乾燥製品は液体の形をした化合物の溶液に再構成可能である。
【０１１１】
本発明は、本発明の少なくとも1つの化合物、またはその塩もしくは溶媒和化合物と、本発明の方法の中で前記化合物を使用するための説明書とを備えるキットを提供する。
【０１１２】
ENPP1およびENPP3
ENPP1(PC-1とも知られる)は、骨芽細胞および軟骨細胞の無機質沈着マトリックス小胞(mineral-depositing matrix vesicle)の表面に位置し、細胞外ヌクレオチド(主にATP)をAMPおよびPPiに加水分解する2型細胞外膜結合型糖タンパク質である(Bollen, et al., 2000, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 35:393-432; Terkeltaub, 2006, Purinergic Signaling 2:371-377)。PPiは新生ヒドロキシアパタイト(HA)結晶に結合し、それによって、これらの結晶が将来成長するのを阻止することで異所性組織無機化の強力な阻害物質として機能する(Terkeltaub, 2006, Purinergic signaling 2:371-377; Addison, et al., 2007, J. Biol. Chem. 282:15872-15873)。ENPP1はヌクレオチド三リン酸(NTP)を加水分解することでPPiを生成し、ANKが細胞内PPiを細胞外空間に輸送し、TNAPがPPiをPiに直接加水分解することでPPiを除去する(内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる、US2015/0359858A1)。
【０１１３】
ある特定の態様では、ENPP1ポリペプチドは可溶性である。他の態様では、ENPP1ポリペプチドは組換えENPP1ポリペプチドである。さらに他の態様では、本発明のポリペプチドは、ENPP1膜貫通ドメインを欠くENPP1ポリペプチドを含む。さらに他の態様では、本発明のポリペプチドは、ENPP1 膜貫通ドメインが除去されており、非限定的な例として、ENPP2、ENPP5、またはENPP7などの別のポリペプチドの膜貫通ドメインと交換されているENPP1ポリペプチドを含む。
【０１１４】
ある特定の態様では、本発明のポリペプチドはIgG Fcドメインを含む。他の態様では、本発明のポリペプチドは、約2〜約20個もしくはそれ以上の連続したアスパラギン酸残基であるポリアスパラギン酸ドメインを含むか、またはそれを欠く。さらに他の態様では、本発明のポリペプチドは、IgG Fcドメインと、約2〜約20個もしくはそれ以上の連続したアスパラギン酸残基を含むポリアスパラギン酸ドメインとを含む。さらに他の態様では、ENPP1ポリペプチドは切断されており、ヌクレアーゼドメインを欠く。さらに他の態様では、ENPP1ポリペプチドは切断されており、SEQ ID NO:1と比べて残基約524〜残基約885のヌクレアーゼドメインを欠き、SEQ ID NO:1と比べて、タンパク質の触媒活性を保存している、残基約186〜残基約586の触媒ドメインしか残っていない。
【０１１５】
ある特定の態様では、本発明のポリペプチドはアルブミンまたはその一部(アルブミンドメイン)を含む。他の態様では、アルブミンドメインはENPP1ポリペプチドのC末端領域に位置する。他の態様では、IgG FcドメインはENPP1ポリペプチドのC末端領域に位置する。別の態様では、IgFcドメインまたはアルブミンドメインが存在すると、ENPP1ポリペプチドの半減期、溶解度が改善し、免疫原性が低減し、かつ活性が増加する。
【０１１６】
ある特定の態様では、本発明のポリペプチドはENPP1ポリペプチドの前駆体を分泌させるシグナルペプチドを含み、ENPP1ポリペプチドの前駆体はタンパク質分解処理を受けてENPP1ポリペプチドが生じる。他の態様では、シグナルペプチドはENPP2、ENPP5、およびENPP7のシグナルペプチドからなる群より選択される。さらに他の態様では、シグナルペプチドはSEQ ID NO:37〜39からなる群より選択される。
【０１１７】
ある特定の態様では、IgG Fcドメインまたはアルブミンドメインはリンカー領域によってENPP1ポリペプチドのC末端領域に接続されている。他の態様では、リンカーはSEQ ID NO:3〜14より選択され、nは1〜20の整数である。
【０１１８】
ENPP3は、ATPからPPiおよびAMPを生成することができる強力なATP加水分解酵素である。ENPP3には、ENPP1に匹敵するATP加水分解酵素活性がある。ENPP3は、ENPP酵素ファミリーの別のメンバーであるENPP1とほぼ同じミカエリスメンテン速度式でATPからPPiへの加水分解を触媒する。
【０１１９】
ある特定の態様では、ENPP3ポリペプチドは可溶性である。他の態様では、ENPP3ポリペプチドは組換えENPP3ポリペプチドである。さらに他の態様では、本発明のポリペプチドは、ENPP3膜貫通ドメインを欠くENPP3ポリペプチドを含む。さらに他の態様では、本発明のポリペプチドは、ENPP3膜貫通ドメインが除去されており、非限定的な例として、ENPP2、ENPP5、またはENPP7などの別のポリペプチドの膜貫通ドメインと交換されているENPP3ポリペプチドを含む。
【０１２０】
一部の態様では、本発明のポリペプチドはIgG Fcドメインを含む。他の態様では、本発明のポリペプチドはポリアスパラギン酸ドメイン、約2〜約20個もしくはそれ以上の連続したアスパラギン酸残基、または2〜約20個の連続したグルタミン酸残基を含むか、あるいはそれを欠く。さらに他の態様では、本発明のポリペプチドは、IgG Fcドメインと、約2〜約20個もしくはそれ以上の連続したアスパラギン酸残基を含むポリアスパラギン酸ドメインとを含む。
【０１２１】
ある特定の態様では、本発明のポリペプチドはアルブミンドメインを含む。他の態様では、アルブミンドメインはENPP3ポリペプチドのC末端領域に位置する。さらに他の態様では、IgG FcドメインはENPP3ポリペプチドのC末端領域に位置する。さらに他の態様では、IgG Fcドメインまたはアルブミンドメインが存在すると、ENPP3ポリペプチドの半減期、溶解度が改善し、免疫原性が低減し、かつ活性が増加する。
【０１２２】
ある特定の態様では、本発明のポリペプチドはENPP3ポリペプチドの前駆体を分泌させるシグナルペプチドを含み、ENPP3ポリペプチドの前駆体はタンパク質分解処理を受けてENPP3ポリペプチドが生じる。他の態様では、シグナルペプチドはENPP2、ENPP5、およびENPP7のシグナルペプチドからなる群より選択される。さらに他の態様では、シグナルペプチドはSEQ ID NO:37〜39からなる群より選択される。
【０１２３】
ある特定の態様では、IgG Fcドメインまたはアルブミンドメインはリンカー領域によってENPP3ポリペプチドのC末端領域に接続されている。他の態様では、リンカーはSEQ ID NO:3〜14より選択され、nは1〜20の整数である。
【０１２４】
ENPP1のクローニングおよび発現
ENPP1、すなわちENPP1ポリペプチドは、その全体が参照により本明細書に組み入れられるUS2015/0359858A1に記載のように調製される。ENPP1は、別個の膜内ドメインを有する、細胞表面に局在する膜貫通タンパク質である。可溶性細胞外タンパク質としてENPP1を発現させるために、ENPP1膜貫通ドメインは、バキュロウイルス培養物の細胞外流体中に可溶性組換えENPP1を蓄積させるENPP2膜貫通ドメインと交換される場合がある。
【０１２５】
分泌するようにENPP1細胞外ドメインを標的にするために、免疫グロブリンκおよびλ軽鎖タンパク質のシグナル配列などがあるが、これに限定されない他の任意の公知のタンパク質のシグナル配列も使用することができる。さらに、本発明は、本明細書に記載の構築物に限定されると解釈してはならず、ENPP1細胞外ドメインの任意の酵素的に活性な切断物を含む構築物も含む。
【０１２６】
ENPP1は膜貫通ドメインを省くことで可溶性になる。ヒトENPP1(NCBIアクセッションNP006199)は、その膜貫通領域(例えば、残基77〜98)を、対応するヒトENPP2サブドメイン(NCBIアクセッションNP_00112433 5、例えば、残基12〜30)と交換することで可溶性組換えタンパク質を発現するように改変された。改変ENPP1配列は、TEVプロテアーゼ切断部位に続いてC末端9-F1ISタグを有する改変pFastbac FITベクターにクローニングされ、昆虫細胞においてクローニングおよび発現され、以前に述べられたように(Albright, et al., 2012, Blood 120:4432-4440; Saunders, et al., 2011, J. Biol. Chem. 18:994-1004; Saunders, et al., 2008, Mol. Cancer Ther. 7:3352-3362)、両タンパク質ともバキュロウイルスシステムにおいて発現され、その結果、可溶性の組換えタンパク質が細胞外液に蓄積した(図2〜3)。
【０１２７】
ENPP1およびENPP1融合タンパク質の産生および精製
ある特定の態様では、可溶性ENPP1ポリペプチド、ならびにそのアルブミン融合構築物および/もしくはそのIgG Fcドメイン構築物を含み、かつ/または骨を標的にするドメイン、例えば、2〜20個の連続したポリアスパラギン酸残基もしくは2〜20個の連続したポリグルタミン酸残基を含む、可溶性ENPP1融合構築物は、腎結石の進行を処置し、遅らせ、かつ/または阻止するのに有効である。他の態様では、可溶性ENPP1ポリペプチドは、骨を標的にするドメイン、例えば、2〜20個の連続したポリアスパラギン酸残基もしくは2〜20個の連続したポリグルタミン酸残基を含まない。
【０１２８】
インビトロで使用するための可溶性組換えENPP1を産生するために、ENPP1をIgGのFcドメインと融合させ(「NPP1-Fc」と呼ぶ)、融合タンパク質を安定哺乳動物細胞株(HEK293)において発現させた。このタンパク質は、適切なベクターを用いてバキュロウイルス昆虫細胞システムまたは酵母ピキア属(Pichia)発現システムからも発現させることができる。このタンパク質は付着細胞または懸濁細胞において産生することができる。安定細胞株を樹立するために、ENPP1融合タンパク質をコードする核酸配列(図5〜7;および本明細書の他の場所で列挙した配列)を大規模タンパク質生産に適したベクターにクローニングされる。
【０１２９】
細菌(例えば、大腸菌(E. coli)および枯草菌(Bacillus subtilis))、酵母(例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、クリベロンマイセス・ラクティス(Kluyveronmyces lactis)、およびピキア・パストリス(Pichia pastoris))、糸状菌(例えば、アスペルギルス属(Aspergillus))、植物細胞、動物細胞、ならびに昆虫細胞を含む多くの発現システムが公知であり、ENPP1融合タンパク質の産生に使用することができる。望ましいタンパク質を、従来のやり方で、例えば、宿主染色体に挿入された、または遊離プラスミド上にあるコード配列から産生することができる。
【０１３０】
酵母は、任意の有用な手法、例えば、エレクトロポレーションで、望ましいタンパク質のコード配列を用いて形質転換することができる。エレクトロポレーションによる酵母の形質転換方法は、Becker & Guarente, 1990, Methods Enzymol. 194: 182に開示される。首尾良く形質転換された細胞、すなわち、本発明のDNA構築物を含有する細胞は周知の技法によって同定することができる。例えば、発現構築物を導入することで得られた細胞を増殖させて望ましいポリペプチドを産生することができる。細胞を収集および溶解し、Southern, 1975, J. Mol. Biol, 98:503および/またはBerent, et al., 1985, Biotech 3:208に記載のような方法を用いて、そのDNA内容物を、DNAが存在するかどうか調べることができる。または、上清中のタンパク質の存在は抗体を用いて検出することができる。
【０１３１】
有用な酵母プラスミドベクターはpRS403-406およびpRS413-416を含み、一般的に、Strat:1.gene Cloning Systems, La Jolla, CA, USAから入手可能である。プラスミドpRS403、pRS404、pRS405、およびpRS406は酵母組み込みプラスミド(Yeast Integrating plasmid)(Y1ps)であり、酵母選択マーカーI-llS3、TRP1、LEU2、およびlJRA3を組み込んでいる。プラスミドpRS413-416は酵母セントロメアプラスミド(YCps)である。
【０１３２】
相補的付着末端を介してDNAをベクターに機能的に連結するために様々な方法が開発されている。例えば、相補的ホモポリマートラクトを、ベクターDNAに挿入しようとするDNAセグメントに付加することができる。次いで、組換えDNA分子を形成するために、このベクターとDNAセグメントが相補的ホモポリマーテール間の水素結合によって結合される。
【０１３３】
1つまたは複数の制限部位を含有する合成リンカーは、DNAセグメントをベクターに結合させる代替方法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化によって生じたDNAセグメントは、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性で3'一本鎖突出末端を除去し、重合活性で陥凹3'末端をフィルイン(fill in)する酵素であるバクテリオファージT4 DNAポリメラーゼまたは大腸菌DNAポリメラーゼIで処理される。
【０１３４】
従って、これらの活性の組み合わせによって平滑末端DNAセグメントが生じる。次いで、平滑末端セグメントは、バクテリオファージT4 DNAリガーゼなどの平滑末端DNA分子の連結を触媒することができる酵素の存在下でモル大過剰のリンカー分子とインキュベートされる。従って、反応産物は、末端にポリマーリンカー配列を運ぶDNAセグメントである。次いで、これらのDNAセグメントは適切な制限酵素で切断され、DNAセグメントの末端と適合する末端を生じる酵素で切断されている発現ベクターと連結される。
【０１３５】
次いで、安定にトランスフェクトされた単一細胞のクローンが樹立され、望ましい融合タンパク質の高発現クローンがあるかどうかスクリーニングされる。以前に述べられたように(Albright, et al., 2015, Nat. Commun. 6:10006)、ENPP3タンパク質発現があるかどうか単一細胞クローンを、合成酵素基質pNP-TMPを用いて96ウェルプレート内でハイスループット形式でスクリーニングすることができる。スクリーニングによって高発現クローンが同定されたら、Albright, et al., 2015, Nat. Commun. 6:10006において以前に述べられたように振盪フラスコまたはバイオリアクタに入れてタンパク質を産生することができる。
【０１３６】
ENPP1の精製は、当技術分野において公知の標準精製法の組み合わせを用いて成し遂げられることができる。これらの技法の例はENPP3タンパク質の産生において前述されている。精製後に、ENPPl-Fcを、Zn2+およびMg2+を加えたPBS(PBSplus)に対して透析し、5〜7mg/mlまで濃縮し、200〜500μlに等分して-80℃で凍結した。アリコートを使用直前に解凍し、溶液の比活性を、PBSplusで希釈することで31.25au/ml(または調製に応じて約0.7mg/ml)に調整した。
【０１３７】
ENPP3のクローニングおよび発現
可溶性ENPP3ポリペプチド、ならびにそのアルブミン融合構築物および/もしくはそのIgG Fcドメイン構築物を含み、かつ/または骨を標的にするドメイン、例えば、2〜20個の連続したポリアスパラギン酸残基もしくは2〜20個の連続したポリグルタミン酸残基を含む、可溶性ENPP3融合構築物は、本発明の方法の中で有効である。ある特定の態様では、可溶性ENPP3は、骨を標的にするドメイン、例えば、2〜20個の連続したポリアスパラギン酸残基もしくは2〜20個の連続したポリグルタミン酸残基を含まない。
【０１３８】
NPP3は十分に細胞表面に輸送されない。可溶性ENPP3タンパク質はENPP3シグナル配列を他のENPPの天然シグナルと交換することで構築される。可溶性ENPP3構築物は、ENPP7および/またはENPP5などがあるが、これに限定されない他のENPP酵素のシグナル輸送シグナル配列を用いることで調製される。可溶性ENPP3構築物は、ENPP1およびENPP2のシグナル配列の組み合わせで構成されるシグナル配列(以下「NPP1-2-1」または「NPP121」)を用いることで調製される。分泌するようにENPP3細胞外ドメインを標的にするために、免疫グロブリンκおよびλ軽鎖タンパク質のシグナル配列などがあるが、これに限定されない他の任意の公知のタンパク質のシグナル配列も使用することができる。さらに、本発明は本明細書に記載の構築物に限定されると解釈してはならず、ENPP3細胞外ドメインの任意の酵素的に活性な切断物を含む構築物も含む。
【０１３９】
ENPP3およびENPP3融合タンパク質の作製および精製：
ENPP3は、CHOまたはHEK293哺乳動物細胞のいずれかにおいて安定したトランスフェクションを確立することによって産生される。このタンパク質は付着細胞または懸濁細胞のいずれかにおいて産生されてもよい。安定細胞株を樹立するために、ENPP3融合タンパク質をコードする核酸配列(本明細書のその他の箇所で開示されている配列など)を、大規模タンパク質産生に適切したベクターに導入した。商業的供給業者から入手可能な、これらの様々なベクターがあり、これらのベクターのうちどれでも使用してもよい。
【０１４０】
例えば、図3は、適切なエンドヌクレアーゼ制限部位を用いてpcDNA3プラスミドにクローニングしたENPP121-exNPP3-Fcのプラスミドマップを示す。融合タンパク質のシグナル配列、ENPP3の細胞外ドメイン、およびFcドメインを図示するためにタンパク質サブドメインを色分けした。クローニングしたタンパク質のアミノ酸配列もプラスミドマップの下に示し、これも融合タンパク質のドメインを図示するために色分けした。望ましいタンパク質構築物を含むpcDNA3プラスミドを、エレクトロポレーションまたはリポフェクタミンなどの確立した技法を用いて安定したトランスフェクションによって発現プラスミドに導入することができ、安定にトランスフェクトされた細胞を増やすために細胞を抗生物質選択下で増殖することができる。
【０１４１】
次いで、安定にトランスフェクトされた単一細胞のクローンを樹立し、望ましい融合タンパク質の高発現クローンがあるかどうかスクリーニングする。ENPP1について以前に述べられたように(Saunders, et al., 2008, Mol. Cancer Ther. 7(10):3352-62; Albright, et al., 2015, Nat Commun. 6:10006)、ENPP3タンパク質発現があるかどうか単一細胞クローンを、96ウェルプレートに入れてハイスループット方式で合成酵素基質pNP-TMPを用いてスクリーニングすることができる。
【０１４２】
スクリーニングによって高発現クローンが同定されたら、ENPP1について以前に述べられたように(Albright, et al., 2015, Nat Commun. 6:10006)、タンパク質を振盪フラスコまたはバイオリアクタの中で産生することができる。
【０１４３】
ENPP3は、当技術分野において公知の標準的な精製法の組み合わせを用いて精製することができる。これらの技法は当技術分野において周知であり、カラムクロマトグラフ、超遠心、濾過、および沈殿などの技法より選択される。カラムクロマトグラフィー精製は、アフィニティクロマトグラフィー、例えば、プロテインA樹脂およびプロテインG樹脂、金属アフィニティ樹脂、例えば、ニッケルまたは銅、疎水性交換クロマトグラフィー、ならびにC8-C14樹脂を用いた逆相高圧クロマトグラフィー(HPLC)を用いて成し遂げられる。市販の樹脂、例えば、Q-sepharose(陰イオン交換)およびSP-sepharose(陽イオン交換)、blue sepharose樹脂およびblue-sephadex樹脂、ならびにヒドロキシアパタイト樹脂を用いた、イオン交換、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーも用いられてもよい。当技術分野において公知のように、市販のS-75およびS200 Superdex樹脂を用いたサイズ排除クロマトグラフィーも用いられてもよい。タンパク質を可溶化し、上記のクロマトグラフィー工程のための選択培地を供給するのに用いられる緩衝液は、タンパク質化学の分野(art)および分野(science)の当業者に公知の標準的な生物学的緩衝液である。
【０１４４】
調製において用いられる緩衝液のいくつかの例には、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、tris(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液、食塩緩衝液(saline buffer)、グリシン-HCL緩衝液、カコジル酸緩衝液、およびバルビタールナトリウム緩衝液が含まれ、これらは当技術分野において周知である。図1に示されたように、1種類の技法または組み合わせられた一連の技法と、適切なpHに調整した適切な緩衝系とを用いて、粗材料から、説明された融合タンパク質を99％超の純度まで精製することができる。この図では、1回の精製工程後のクマシー染色ポリアクリルアミドゲル上で、部分的に精製されたENPP3と粗出発物質を横に並べて比較している。
【０１４５】
図1に示されたように、1回の精製工程後の右レーンに示した粗出発物質から、ENPP3の適切な分子量に対応する105kDをわずかに超える分子量のタンパク質が濃縮された。次いで、約99％純度などのかなり大きな純度に達するように、前記のように、さらなる技法および/またはクロマトグラフィー工程を用いて、この材料をさらに精製してもよい。
【０１４６】
ENPP1-アルブミンおよびENPP3-アルブミン融合タンパク質の発現および精製
ヒトENPP1またはENPP3タンパク質を、pFUSEプラスミド(lnvivoGen, San Diego CA)にサブクローニングすることでヒト血清アルブミン(HSA)と融合させる。ENPPl-ALBまたはENPP3-ALBの安定トランスフェクションをHEK293細胞においてゼオシン(zeocin)選択下で確立し、付着性のHEK293細胞を懸濁増殖に適応することができる。適応された細胞を使用して、液体培養増殖物を、振盪フラスコに入っているFreeStyle培地(Gibco#12338-018)に37℃および5％CO2で播種し、高湿度で120RPMにおいて攪拌する。培養物を徐々に望ましい目標体積に拡大し、次いで、細胞外タンパク質を蓄積するためにさらに何日か維持する。維持期の間に、タンパク質産生を強化するために培養物にCD EfficientFeed CAGI(Gibco #Al3275-05)を加える。細胞を、溶存酸素およびpHの制御を備えた10リットルバイオリアクター内で増殖させる。80RPMの攪拌速度で3リットル/分を超えずに空気と酸素の混合物を培養物に供給することで溶存酸素を40％空気飽和度に保つ。pHが7.4を超えた場合には、CO2を散布することでpHを7.4に制御する。培養増殖の後に、細胞数、細胞生存率、グルコースおよび乳酸塩の濃度を測定する。
【０１４７】
液体培養物を4300×gで15分間遠心分離し、上清を0.2μm膜で濾過し、Pellicon(登録商標)3 0.11m2 Ultracell 30kDカセット(Millipore, Billerica MA)を用いたタンジェンシャルフローを介して濃縮する。濃縮された上清をプロテイン-AGカラムにロードし、50mMクエン酸ナトリウム、150mM、NaCl、3mM ZnCl2、3mM CaCl2、pH=3 5を含む緩衝液で溶出することができる。酵素活性を含有する画分をプールし、IX PBS緩衝液pH7.4、11μM ZnCl2、20μM CaCl2に対して透析し、次いで、6mg/mlまで濃縮し、小さなアリコートに分配し、-80℃で保管する。結果として生じたタンパク質試料を、全てエンドトキシンを含まないことを確認するためにPierce LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit(cat 88282)を用いて試験する。
【０１４８】
上記で議論したおよび他(例えば、PCT/2014/015945およびPCT/2016/033236)に記載の実験プロトコールに従って、精製後のENPP-アルブミン融合タンパク質を特徴決定する。
【０１４９】
動物モデル
本発明は、患者における腎石症の処置および/または予防を企図する。腎石症は、一般的に、シュウ酸塩、尿酸塩、シスチン、ヒドロキシウレア、および/またはリン酸カルシウムを含む結晶を伴う。ある特定の非限定的な態様では、本発明は、シスチン尿症、尿酸結石疾患、ストルバイト結石疾患、高カルシウム尿症、カルシウム結石疾患、および高シュウ酸尿症などの腎石症の複数の形態の処置と、シュウ酸塩、尿酸塩、シスチン、ヒドロキシウレア、および/またはリン酸カルシウムを含む腎臓結石の組成物とを企図する。
【０１５０】
動物モデル、例えば、以下のマウスモデル:飼料によって誘発される腎結石形成を起こした、(a)Npt2a-/-、(b)二重変異体Npt2a-/-/Enpp1asj/asj、および(c)C57BL/6マウス(Jackson Labs)を使用して、本発明に従う腎石症の処置を試験することができる。飼料は、高カルシウム低マグネシウム飼料(例えば、Teklad Labs diet TD.00042, Harlan Labs, Madison, WI)である。
【０１５１】
Npt2a-/-マウスは、離乳年齢から開始して、少なくとも10週齢まで通常固形飼料を用いて餌が与えられると腎臓結石形成を示す。逆に、二重変異体Npt2a-/-/Enpp1asj/asjマウスは、通常固形飼料を用いて餌が与えられると、Npt2a-/-マウスと比較した場合に2倍のレベルの腎臓結石形成を示す。Npt2a-/-マウスおよびEnpp1asj/asjマウスはJackson laboratory, MEから商業的に得られる。二重変異体マウス(Npt2a-/-/Enppasj/asj)は、当技術分野において公知の標準プロトコール(Jackson Laboratory Recourse Manual, (2007, 1-29)に従ってNpt2a-/-マウスとEnpp1asj/asjマウスを掛け合わせることで作り出される。腎結石関連疾患用のNpt2a-/-またはNpt2a-/-/Enpp1asj/asj二重変異体マウスモデルを使用して、本発明に従う処置の効力を試験することができる(Khan & Canales, 2011, J. Urol. 186(3):1107-13; Wu, 2015, Urolithiasis 43(Suppl 1):65-76)。シュウ酸塩結石を形成するげっ歯類モデル、すなわち、エチレングリコール、ヒドロキシルプリンを与えたマウスもしくはラット、またはマウスおよびラットへのシュウ酸ナトリウム腹腔内注射(Khan & Glenton, J. Urology 184:1189-1196)、尿酸塩結石形成(Wu, et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 91(2):742-6)ならびにシスチン尿症マウスモデル(Zee, et al., 2017, Nat. Med. 23(3):288-290; Sahota, et al., 2014, Urology 84(5):1249 e9-15)も試験することができる。
【０１５２】
酵素活性、血漿PPiの定量、マイクロ-CTスキャン、血漿PPi取り込みの定量についての実験詳細は、それら全ての全体が本明細書に組み入れられるPCT/US2016/33236、WO2014/126965、およびUS2015/0359858の特許出願および特許公報において詳述されている。
【０１５３】
腎臓結石の同定または腎結石の形成
腎臓結石の検査には、血液検査(カルシウム、リン、尿酸、および電解質レベルのチェックを目的とする);腎機能検査;尿検査(結晶および/または赤血球の探索を目的とする);ならびに腎臓結石のタイプ、組成、および形態を判定するための結石の検査が含まれることがある。
【０１５４】
腎臓結石または腎尿細管遮断は、以下の方法:腹部CTスキャン;腹部/腎臓MRI;腹部X線;静脈性腎盂造影(IVP);腎臓超音波;および逆行性腎盂造影のうちの1つを用いて見ることができる。
【０１５５】
配列
ENPP1アミノ酸配列(NCBIアクセッションNP_006199)(SEQ ID NO:1)
2021523139.tif 000005
ENPP2アミノ酸配列(NCBIアクセッションNP_001124335)(SEQ ID NO:2)
2021523139.tif 000006
配列Dm、配列中、mは1〜15の整数である(SEQ ID NO:3)。
配列(DSS)n、配列中、nは1〜10の整数である(SEQ ID NO:4)。
配列(ESS)n、配列中、nは1〜10の整数である(SEQ ID NO:5)。
配列(RQQ)n、配列中、nは1〜10の整数である(SEQ ID NO:6)。
配列(KR)n、配列中、nは1〜10の整数である(SEQ ID NO:7)。
配列Rm、配列中、mは1〜15の整数である(SEQ ID NO:8)。
配列
2021523139.tif 000007
配列
2021523139.tif 000008
配列
2021523139.tif 000009
配列
2021523139.tif 000010
配列
2021523139.tif 000011
配列Em、配列中、mは1〜15の整数である(SEQ ID NO:14)。
ENPP121アミノ酸配列(SEQ ID NO:15)
2021523139.tif 000012
一重下線:移行位置(**)で切断するためにENPP2残基1〜27と交換した残基;二重下線:ENPP1タンパク質(始まりと終わり)。
ENPP121-Fcアミノ酸配列(SEQ ID NO:16)
2021523139.tif 000013
2021523139.tif 000014
一重下線:移行位置(**)で切断するためにENPP2残基1〜27と交換した残基;二重下線:ENPP1タンパク質(始まりと終わり);太字:hIgG1(Fc)。
ENPP71アミノ酸配列(SEQ ID NO:17)
2021523139.tif 000015
一重下線:ENPP7;二重下線:ENPP1タンパク質(始まりと終わり)。
ENPP71-Fcアミノ酸配列(SEQ ID NO:18)
2021523139.tif 000016
一重下線:ENPP7;二重下線:ENPP1タンパク質(始まりと終わり);太字:hIgG1(Fc)。
(ENPP1 N末端GLKを欠くENPP71)アミノ酸配列(SEQ ID NO:19)
2021523139.tif 000017
一重下線:ENPP7;二重下線:ENPP1タンパク質(始まりと終わり)(ENPP1のN末端にある最初の3アミノ酸、GLKは省かれている)。
(ENPP1 N末端GLKを欠くENPP71)-Fcアミノ酸配列(SEQ ID NO:20)
2021523139.tif 000018
一重下線:ENPP7;二重下線:ENPP1タンパク質(始まりと終わり)(ENPP1のN末端にある最初の3アミノ酸は省かれている);太字:hIgG1(Fc)。
ENPP121-ALBアミノ酸配列(SEQ ID NO:21)
2021523139.tif 000019
太字のイタリック体:ENPP1細胞質および膜貫通;一重下線:移行位置(**)で切断するためにENPP2残基1〜27と交換した残基;二重下線:ENPP1膜貫通;プレーン:ENPP1細胞外ドメイン;太字の下線:リンカー;太字:アルブミン。
(ENPP1 N末端GLKを欠くENPP71)-ALBアミノ酸配列(SEQ ID NO:22)
2021523139.tif 000020
二重下線:ENPP7;プレーンテキスト:ENPP1;太字:スペーサー配列;一重下線:アルブミン。
配列IISLFTFAVGVNICLGFTA(SEQ ID NO:23)
ENPP51アミノ酸配列(SEQ ID NO:24)
2021523139.tif 000021
下線:ENPP5;プレーン:ENPP1。
ENPP51-ALBアミノ酸配列(SEQ ID NO:25)
2021523139.tif 000022
二重下線:ENPP5;プレーン:ENPP1;太字:スペーサー;一重下線:アルブミン。
ヒトIgG Fcドメイン、Fc(SEQ ID NO:26)
2021523139.tif 000023
ALB(SEQ ID NO:27)
2021523139.tif 000024
配列LIN(SEQ ID NO:28)
配列GGSGGS(SEQ ID NO:29)
配列RSGSGGS(SEQ ID NO:30)
ENPP3アミノ酸配列(NCBIアクセッションNP_ O14638-1)(SEQ ID NO:31)
2021523139.tif 000025
ENPP3の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:32)
2021523139.tif 000026
exENPP3配列(SEQ ID NO:33)
2021523139.tif 000027
ENPP7タンパク質輸送シグナル配列(SEQ ID NO:34)
2021523139.tif 000028
ENPP121GLKタンパク質輸送シグナル配列(SEQ ID NO:35)
2021523139.tif 000029
太字イタリック体:ENPP1細胞質および膜貫通;一重下線:移行位置(**)で切断するためにENPP2残基1〜27と交換した残基;二重下線:ENPP1膜貫通。
ENPP121タンパク質輸送シグナル配列(SEQ ID NO:36)
2021523139.tif 000030
太字イタリック体:ENPP1細胞質および膜貫通;一重下線:移行位置(**)で切断するためにENPP2残基1〜27と交換した残基;二重下線:ENPP1膜貫通。
ENPP5タンパク質輸送シグナル配列(SEQ ID NO:37)
2021523139.tif 000031
配列中、Xaa23は存在しないか、Lであり、Xaa23が存在しなければXaa24は存在しない、またはXaa23がLであれば、Xaa24は存在しないか、Qである。
ENPP7シグナル配列(SEQ ID NO:38)
2021523139.tif 000032
ENPP7シグナル配列(SEQ ID NO:39)
2021523139.tif 000033
配列LVIMSLGLGLGLGLRK  (SEQ ID NO:40)
配列VIMSLGLGLGLGLRK  (SEQ ID NO:41)
配列IMSLGLGLGLGLRK  (SEQ ID NO:42)
配列MSLGLGLGLGLRK  (SEQ ID NO:43)
配列SLGLGLGLGLRK  (SEQ ID NO:44)
配列LGLGLGLGLRK  (SEQ ID NO:45)
配列GLGLGLGLRK  (SEQ ID NO:46)
配列LGLGLGLRK  (SEQ ID NO:47)
配列GLGLGLRK  (SEQ ID NO:48)
配列LGLGLRK  (SEQ ID NO:49)
配列GLGLRK  (SEQ ID NO:50)
配列LGLRK  (SEQ ID NO:51)
配列GLRK  (SEQ ID NO:52)
配列LRK  (SEQ ID NO:53)
配列RK  (SEQ ID NO:54)
配列K  (SEQ ID NO:55)
ENPP121-NPP3-Fc配列(SEQ ID NO:56)
2021523139.tif 000034
太字の残基:ENPP1に由来する配列。一重下線の付いた残基:ENPP2に由来するシグナルペプチド配列。二重下線の付いた残基: サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4のいずれにも由来してよいIgG Fcドメインの配列。またはFcドメインの代わりにアルブミンドメインを使用することができる。ある特定の態様では、ENPP3 C末端領域とFcドメインは可動性リンカーでつながっている。他の態様では、可動性リンカーは少なくとも2つのアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーはPEG鎖または多炭素(multicarbon)鎖などの合成リンカーを含む。
ENPP7-ENPP3-Fc配列(SEQ ID NO:57)
2021523139.tif 000035
一重下線:ENPP7に由来するシグナルペプチド配列。二重下線:サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4のいずれにも由来してよいIgG Fcドメインの配列。またはFcドメインの代わりにアルブミンドメインを使用することができる。ある特定の態様では、ENPP3 C末端領域とFcドメインは可動性リンカーでつながっている。他の態様では、可動性リンカーは少なくとも2つのアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーはPEG鎖または多炭素鎖などの合成リンカーを含む。
ENPP5-ENPP3-Fc配列(SEQ ID NO:58)
2021523139.tif 000036
一重下線:ENPP5に由来するシグナルペプチド配列。二重下線:サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4のいずれにも由来してよいIgG Fcドメインの配列。またはFcドメインの代わりにアルブミンドメインを使用することができる。ある特定の態様では、ENPP3 C末端領域とFcドメインは可動性リンカーでつながっている。他の態様では、可動性リンカーは少なくとも2つのアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーはPEG鎖または多炭素鎖などの合成リンカーを含む。
アルブミン配列(SEQ ID NO:59)
2021523139.tif 000037
ENPP121-ENPP3-アルブミン配列(SEQ ID NO:60)
2021523139.tif 000038
太字の残基:ENPP1に由来する配列。一重下線:ENPP2に由来するシグナルペプチド配列。二重下線:アルブミンドメインの配列。ある特定の態様では、ENPP3 C末端領域とFcドメインは可動性リンカーでつながっている。他の態様では、可動性リンカーは少なくとも2つのアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーはPEG鎖または多炭素鎖などの合成リンカーを含む。
ENPP7-ENPP3-アルブミン配列(SEQ ID NO:61)
2021523139.tif 000039
一重下線:ENPP7に由来するシグナルペプチド配列。二重下線:アルブミンドメインの配列。ある特定の態様では、ENPP3 C末端領域とFcドメインは可動性リンカーでつながっている。他の態様では、可動性リンカーは少なくとも2つのアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーはPEG鎖または多炭素鎖などの合成リンカーを含む。
ENPP5-ENPP3-アルブミン配列(SEQ ID NO:62)
2021523139.tif 000040
一重下線:ENPP5に由来するシグナルペプチド配列。二重下線:アルブミンドメインの配列。ある特定の態様では、ENPP3 C末端領域とFcドメインは可動性リンカーでつながっている。他の態様では、可動性リンカーは少なくとも2つのアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーはPEG鎖または多炭素鎖などの合成リンカーを含む。
ENPP121-ENPP3-Fcのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:63)
2021523139.tif 000041
2021523139.tif 000042
ENPP121-ENPP3-アルブミンのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:64)
2021523139.tif 000043
2021523139.tif 000044
2021523139.tif 000045
hNPP3-hFc-pcDNA3のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:65)
2021523139.tif 000046
2021523139.tif 000047
2021523139.tif 000048
2021523139.tif 000049
ENPP121-Fcアミノ酸配列(SEQ ID NO:66)
2021523139.tif 000050
一重下線:移行位置(**)で切断するためにENPP2残基と交換した残基。二重下線:ENPP1残基の始まりと終わりを意味する。太字の残基はIgG Fcドメインの残基を示す。
ENPP71-Fcアミノ酸配列(SEQ ID NO:67)
2021523139.tif 000051
一重下線:ENPP7残基。二重下線:ENPP1残基の始まりと終わり。太字:IgG Fcドメインの残基。
ENPP51-Fcアミノ酸配列(SEQ ID NO:68)
2021523139.tif 000052
一重下線:ENPP5残基。二重下線:ENPP1残基の始まりと終わり。太字:IgG Fcドメインの残基。
ENPP121-ALBアミノ酸配列(SEQ ID NO:69)
2021523139.tif 000053
一重下線:移行位置(**)で切断するためにENPP2残基と交換した残基。二重下線:ENPP1残基の始まりと終わりを意味する。太字:アルブミンの残基。太字の下線:リンカー領域。
NPP71-ALBアミノ酸配列(SEQ ID NO:70)
2021523139.tif 000054
一重下線:ENPP7残基。二重下線:ENPP1残基の始まりと終わり。太字:アルブミンの残基。太字の下線:リンカー領域。
ENPP121-Fcのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:71)
2021523139.tif 000055
2021523139.tif 000056
ENPP121-アルブミンのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:72)
2021523139.tif 000057
2021523139.tif 000058
2021523139.tif 000059
ENPP7-1-Fcのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:73)
2021523139.tif 000060
2021523139.tif 000061
ENPP7-NPP1-アルブミンのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:74)
2021523139.tif 000062
2021523139.tif 000063
ENPP3のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:75)
2021523139.tif 000064
ENPP1のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:76)
2021523139.tif 000065
【０１５６】
方法
本発明は、それを必要とする対象において腎石症の形成および/または進行を阻止し、逆転させ、かつ/または遅らせる方法を含む。ある特定の態様では、前記方法は、ENPP1ポリペプチドおよび/またはENPP3ポリペプチド、その変異体、またはその変異体断片を含む治療的有効量のポリペプチドを対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドは天然タンパク質と類似のATP加水分解活性を有する。他の態様では、対象は腎石症と診断されている。さらに他の態様では、対象は哺乳動物である。さらに他の態様では、哺乳動物はヒトである。
【０１５７】
本発明は、ヒト対象において腎石灰沈着症の形成および/または進行を阻止し、逆転させ、かつ/または遅らせる方法をさらに含む。ある特定の態様では、対象は腎石灰沈着症と診断されている。他の態様では、対象は腎石灰沈着症を発症しやすい。さらに他の態様では、対象には腎石灰沈着症の家族歴がある。さらに他の態様では、対象は腎石灰沈着症に罹患したことがある。さらに他の態様では、対象は重篤な石灰化疾患に全く罹患していない。さらに他の態様では、対象は末期腎疾患(ESRD)に罹患していない。さらに他の態様では、対象は乳児全身性動脈石灰化(GACI)に罹患していない。さらに他の態様では、対象は糖尿病IIに罹患していない。さらに他の態様では、対象は常染色体劣性低リン血症性くる病に罹患していない。さらに他の態様では、対象は心血管障害に罹患していない。さらに他の態様では、対象はアテローム性動脈硬化症に罹患していない。さらに他の態様では、対象は慢性腎疾患(CKD)に罹患していない。さらに他の態様では、対象は弾力線維性仮性黄色腫(PXE)に罹患していない。さらに他の態様では、対象は末期腎疾患(ESRD)に罹患している。さらに他の態様では、対象は乳児全身性動脈石灰化(GACI)に罹患している。さらに他の態様では、対象は糖尿病IIに罹患している。さらに他の態様では、対象は常染色体劣性低リン血症性くる病に罹患している。さらに他の態様では、対象は心血管障害に罹患している。さらに他の態様では、対象はアテローム性動脈硬化症に罹患している。さらに他の態様では、対象は慢性腎疾患(CKD)に罹患している。さらに他の態様では、対象は弾力線維性仮性黄色腫(PXE)に罹患している。
【０１５８】
腎石症は腎尿細管中での腎臓結石の形成または進行を伴う。ある特定の態様では、腎石症はシスチン結石である。他の態様では、腎石症はカルシウム結石疾患(ある特定の態様では特発性の高カルシウム尿症によって引き起こされる)である。さらに他の態様では、腎石症は尿酸結石疾患(ある特定の態様では痛風によって引き起こされる)である。さらに他の態様では、腎石症はストルバイト結石疾患(ある特定の態様では尿路感染によって引き起こされる)である。さらに他の態様では、腎石症はシュウ酸塩結石疾患(ある特定の態様では高シュウ酸尿症によって引き起こされる)である。さらに他の態様では、腎石症は高カルシウム尿症である。
【０１５９】
腎石症は腎臓実質および/もしくは腎臓軟部組織における石灰化を含まないか、または腎臓実質および/もしくは腎臓軟部組織における石灰化に対応しない。ある特定の態様では、対象はGACI(乳児全身性動脈石灰化)に罹患していない。
【０１６０】
ある特定の態様では、対象には、腎臓結石があったか、腎臓結石があったことがあるか、腎結石があるか、または腎結石の家族歴がある。他の態様では、対象は腎結石を発症する可能性が高い。さらに他の態様では、対象には腎結石を発症する素因がある。
【０１６１】
ある特定の態様では、対象はNpt2a-/-である。他の態様では、対象はNpt2a+/-である。さらに他の態様では、対象はNpt2c-/-である。さらに他の態様では、対象はNpt2c+/-である。
【０１６２】
ある特定の態様では、対象は、腎臓石灰化を引き起こす遺伝子がホモ接合性である。他の態様では、対象は、腎臓石灰化を引き起こす遺伝子がヘテロ接合性である。
【０１６３】
ある特定の態様では、ENPP1ポリペプチドもしくはENPP3ポリペプチド、その変異体、またはその変異体断片は、それぞれ、可溶性のENPP1タンパク質またはENPP3タンパク質を生じるように切断される前駆体分子として投与される。ある特定の態様では、ENPP1ポリペプチドもしくはENPP3ポリペプチド、その変異体、またはその変異体断片は可溶性のENPP1タンパク質またはENPP3タンパク質そのものとして投与される。さらに他の態様では、ENPP1ポリペプチドもしくはENPP3ポリペプチド、その変異体、またはその変異体断片は、ENPP1またはENPP3可溶性タンパク質の半減期を延ばしかつ/またはENPP1またはENPP3可溶性タンパク質の免疫原性を低減する部分と融合された可溶性のENPP1タンパク質またはENPP3タンパク質として、投与される。このような部分には、例えば、Ig Fcドメイン、PEG、および/またはアルブミンが含まれる。さらに他の態様では、可溶性のENPP1ポリペプチドもしくはENPP3ポリペプチドまたはその前駆体は、ENPP1またはENPP3ポリペプチドそれぞれと融合されたENPP2、ENPP5、および/またはENPP7シグナル配列を含む。
【０１６４】
ある特定の態様では、可溶性ENPP1ポリペプチドはヒトENPP1[NCBI#006199, SEQ ID NO:I]の残基96〜925を含む。他の態様では、可溶性ENPP1ポリペプチドは、哺乳動物細胞で発現している前駆体ポリペプチドの分泌産物であり、前駆体ポリペプチドはシグナル配列およびENPP1を含み、前駆体ポリペプチドは可溶性ENPP1ポリペプチドへのタンパク質分解処理を受ける。
【０１６５】
本発明に従うENPP1ポリペプチドまたはENPP3ポリペプチドの使用は天然ヒトタンパク質だけでなく、天然タンパク質のATP加水分解活性を有する、その任意の断片、誘導体、融合、結合体、または変異体も含むと理解される。本開示において本明細書で使用する「ENPP1ポリペプチドおよび/もしくはENPP3ポリペプチド、その変異体、またはその変異体断片」という句は、ENPP1ポリペプチドおよび/もしくはENPP3ポリペプチド、その変異体、またはその変異体断片を含む任意の化合物またはポリペプチド(融合タンパク質などがあるが、これに限定されない)も含む。本発明に従う融合タンパク質はENPP1およびENPP3の生物学的等価物とみなされるが、もっと長い半減期をもたらすと意図される。
【０１６６】
ある特定の態様では、本発明のポリペプチドまたはその前駆体は、皮下、経口、エアロゾル、吸入、直腸、腟、経皮、皮下、鼻腔内、頬、舌下、非経口、くも膜下腔内、胃内、眼、肺、および局所からなる群より選択される少なくとも1つの経路によって投与される。他の態様では、本発明のポリペプチドまたはその前駆体は、少なくとも1種類の薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物として対象に投与される。
【０１６７】
ある特定の態様では、本発明のポリペプチドは急性的または慢性的に対象に投与される。他の態様では、本発明のポリペプチドは対象に局所投与、局部投与、または全身投与される。さらに別の態様では、本発明のポリペプチドまたはその前駆体は、コードされているベクターに載せられて送達され、ベクターはタンパク質をコードし、ベクターが対象に投与されるとタンパク質はベクターから転写および翻訳される。
【０１６８】
本明細書において詳述された方法を含む本開示を携えて、当業者には、本発明は確立されたら疾患または障害の処置に限定されないと理解される。特に、疾患または障害の症状は対象に害を与えると言ってもよい程度まで現れている必要はない。実際に、処置が投与される前に疾患または障害は対象において検出される必要はない。すなわち、本発明が利益を与える可能性がある前に、疾患または障害に由来する重大な病状が発生している必要はない。
【０１６９】
従って、本発明の化合物は、本明細書の他の場所で議論されるように、疾患または障害が発症する前に対象に投与することができ、それによって、疾患または障害が発症しないようにすることができるので、本発明は、本明細書においてさらに詳細に説明されるように、対象において疾患および障害を予防するための方法を含む。特に、腎臓石灰化の症状は対象に害を与えると言ってもよい程度まで現れている必要はない。実際に、処置が投与される前に、腎臓石灰化は対象において検出される必要はない。すなわち、本発明が利益を与える可能性がある前に、腎臓石灰化に由来する重大な病状が発生している必要はない。従って、本発明の化合物は、腎臓石灰化が検出される前に対象に投与することができるので、本発明は、対象において腎臓石灰化の発症を予防するかもしくは遅延させるかまたは腎臓石灰化の進行もしくは成長を遅らせるための方法を含む。ある特定の態様では、本発明の化合物は、腎臓石灰化の強い家族歴をもつ対象に投与され、それによって、腎臓石灰化の発症または進行または形成が予防または遅延される。
【０１７０】
従って、当業者であれば、本明細書中の開示を携えて、対象における疾患または障害の予防は、本発明の化合物を腎結石の形成および/または成長に対する予防的措置として対象に投与する工程を包含することを理解するであろう。
【０１７１】
薬学的組成物および製剤
本発明は、本明細書に記載される方法の中の本発明の化合物を含む薬学的組成物を提供する。
【０１７２】
このような薬学的組成物は対象への投与に適した形をとる。または、薬学的組成物は、1種類もしくは複数種類の薬学的に許容される担体、1種類もしくは複数種類のさらなる成分、またはこれらの何らかの組み合わせをさらに含んでもよい。薬学的組成物の様々な成分は、当技術分野において周知のように、生理学的に許容される塩の形で、例えば、生理学的に許容されるカチオンまたはアニオンと組み合わせて存在してもよい。
【０１７３】
一態様において、本発明の方法を実施するのに有用な薬学的組成物は、1ng/kg/day〜100mg/kg/dayの用量を送達するために投与されてもよい。他の態様では、本発明を実施するのに有用な薬学的組成物は1ng/kg/day〜500mg/kg/dayの用量を送達するために投与されてもよい。
【０１７４】
本発明の薬学的組成物中にある活性成分、薬学的に許容される担体、および任意のさらなる成分の相対量は、処置される対象の身元(identity)、大きさ、および状態に応じて、さらには、組成物が投与される経路に応じて変化する。例として、前記組成物は約0.1％〜約100％(w/w)の活性成分を含んでもよい。
【０１７５】
本発明の方法において有用な薬学的組成物は、投与の吸入経路用、経口経路用、直腸経路用、腟経路用、非経口経路用、局所的経路用、経皮経路用、肺経路用、鼻腔内経路用、頬経路用、眼経路用、くも膜下腔内経路用、静脈内経路用、または別の経路用に適宜、開発されてもよい。他の企図される製剤は、射出されるナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含有する再封入された赤血球、および免疫に基づく製剤を含む。投与経路は当業者に容易に明らかであり、治療される疾患のタイプおよび重篤度、治療される獣医学患畜またはヒト患者のタイプおよび年齢などを含む任意の数の要因に左右される。
【０１７６】
本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野において公知の任意の方法によって調製されてもよく、薬理学の分野において将来開発される任意の方法によって調製されてもよい。一般的に、このような準備方法は、活性成分を担体または1種類もしくは複数種類の他のアクセサリー成分と結合させる工程、次いで、必要であれば、または所望であれば、生成物を望ましい単回投与単位または複数回投与単位に成型または包装する工程を含む。
【０１７７】
本明細書で使用する「単位用量」とは、活性成分の予め決定された量を含む、薬学的組成物の別々の量である。活性成分の量は、一般的に、対象に投与される活性成分の投与量に等しいか、またはこのような投与量の便利な一部分、例えば、このような投与量の1/2もしくは1/3である。単位剤形は単回一日量用の単位剤形でもよく、複数回一日量(例えば、1日につき約1〜4回またはそれより多い回数)のうちの1つの単位剤形でもよい。複数回一日量が用いられる場合、単位剤形は各用量について同じでもよく異なってもよい。
【０１７８】
投与/投薬
投与計画は、有効量を構成するものに影響を及ぼす可能性がある。例えば、いくつかの分割投与量ならびに時間をずらした(staggered)投与量が毎日または連続して投与されてもよい。または、用量は連続注入されてもよく、ボーラス注射でもよい。さらに、治療状況または予防状況の切迫した要件により示されるように、治療用製剤の投与量は比例して増やしてもよく減らしてもよい。ある特定の態様において、対象への本発明の化合物の投与によって対象の血漿PPiが約2.5μMのレベルまで上昇する。
【０１７９】
本発明の組成物は、公知の手順を用いて、患者にある疾患または障害を治療するのに有効な投与量および期間で、患者に、例えば哺乳動物に、例えばヒトに投与することができる。治療効果を実現するのに必要な治療用化合物の有効量は、使用される特定の化合物の活性、投与時間、化合物の排出速度、処置期間、化合物と併用される他の薬物、化合物、または材料、疾患または障害の状態、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、身体全体の健康、および前病歴などの要因、ならびに医学分野において周知の同様の要因に従って変化することがある。最適な治療応答を提供するように投与計画が調整されてもよい。例えば、いくつかの分割量が毎日投与されてもよい。または、治療状況の切迫した要件により示されるように用量が比例して減らされてもよい。本発明の治療用化合物の有効な用量範囲の非限定的な例は約0.01〜50mg/体重kg/日である。当業者であれば、関連する要因を研究し、過度の実験なく治療用化合物の有効量に関する決定を下すことができるであろう。
【０１８０】
前記化合物は、1日に数回もの頻度で患者に投与されてもよく、1日に1回、1週間に1回、2週間に1回、1ヶ月に1回などのもっと少ない頻度で、あるいは数ヶ月に1回もしくは1年に1回、またはそれ未満などのさらにもっと少ない頻度で投与されてもよい。1日あたりに投薬される量の化合物は、非限定的な例では、毎日、1日おきに、2日ごとに、3日ごとに、4日ごとに、または5日ごとに投与されてもよいことが理解される。例えば、1日おきに投与する場合、月曜日に1日あたり5mgの用量が開始し、水曜日に、その後の1日あたり5mgの第1の用量が投与され、金曜日に、その後の1日あたり5mgの第2の用量が投与されてもよい。投薬の頻度は当業者に容易に明らかであり、治療される疾患のタイプおよび重篤度ならびに患者のタイプおよび年齢などがあるが、これに限定されない任意の数の要因に左右される。
【０１８１】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者への毒性が無く、特定の患者、組成物、および投与方法について望ましい治療応答を実現するのに有効な活性成分の量を得るように変えられてもよい。
【０１８２】
当技術分野において通常の知識を有する医師、例えば内科医は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定し、薬学的組成物の有効量を処方することができる。例えば、医師または獣医師は、望ましい治療効果を実現するために必要なレベルより少ないレベルで、薬学的組成物において用いられる本発明の化合物の投薬を開始し、望ましい効果が実現するまで投与量を除去に増やすことができる。
【０１８３】
特定の態様では、投与を容易にするために、および投与量を均一にするために化合物を単位剤形で処方することが特に有利である。本明細書で使用する単位剤形とは、処置しようとする患者への単位投与として適した物理的に別個の単位を指す。それぞれの単位は、必要とされる薬学的ビヒクルに結合して望ましい治療効果を生じるように計算された所定量の治療用化合物を含有する。本発明の単位剤形は、(a)治療用化合物の独特の特徴、および実現しようとする特定の治療効果と、(b)患者にある疾患または障害を治療するために、このような治療用化合物を配合/処方する分野に固有にある制約とによって決められ、かつこれらに直接左右される。
【０１８４】
ある特定の態様では、本発明の組成物は、1日に1〜5回またはそれより多い投薬で患者に投与される。他の態様では、本発明の組成物は、1日1回、2日に1回、3日に1回から1週間に1回、および2週間に1回を含むが、これに限定されない投薬の範囲で患者に投与される。年齢、治療される疾患または障害、性別、健康全般、および他の要因を含むが、これに限定されない多くの要因に応じて、本発明の様々な組み合わせ組成物の投与の頻度は対象ごとに異なる。従って、本発明は、任意の特定の投与計画に限定されると解釈してはならず、任意の患者に投与される正確な投与量および組成物は、患者についての他の全ての要因を考慮に入れて、主治医によって決定される。
【０１８５】
投与用の本発明の化合物は、約1μg〜約7,500mg、約20μg〜約7,000mg、約40μg〜約6,500mg、約80μg〜約6,000mg、約100μg〜約5,500mg、約200μg〜約5,000mg、約400μg〜約4,000mg、約800μg〜約3,000mg、約1mg〜約2,500mg、約2mg〜約2,000mg、約5mg〜約1,000mg、約10mg〜約750mg、約20mg〜約600mg、約30mg〜約500mg、約40mg〜約400mg、約50mg〜約300mg、約60mg〜約250mg、約70mg〜約200mg、約80mg〜約150mg、ならびにその間の任意の、および全ての全増加分または部分的な増加分の範囲でもよい。
【０１８６】
一部の態様では、本発明の化合物の用量は約0.5μg〜約5,000mgである。一部の態様では、本明細書に記載の組成物において用いられる本発明の化合物の用量は、約5,000mg未満、または約4,000mg未満、または約3,000mg未満、または約2,000mg未満、または約1,000mg未満、または約800mg未満、または約600mg未満、または約500mg未満、または約200mg未満、または約50mg未満である。同様に、一部の態様では、本明細書に記載の第2の化合物の用量は、約1,000mg未満、または約800mg未満、または約600mg未満、または約500mg未満、または約400mg未満、または約300mg未満、または約200mg未満、または約100mg未満、または約50mg未満、または約40mg未満、または約30mg未満、または約25mg未満、または約20mg未満、または約15mg未満、または約10mg未満、または約5mg未満、または約2mg未満、または約1mg未満、または約0.5mg未満、ならびにその任意の、および全ての全増加分または部分的な増加分である。
【０１８７】
ある特定の態様では、本発明は、単独でまたは第2の薬学的薬剤と組み合わせて、本発明の化合物の治療的有効量を収容するための容器と；患者において疾患または障害の1つまたは複数の症状を治療、予防、または低減するために前記化合物を使用するための説明書とを備える、包装された薬学的組成物に関する。
【０１８８】
投与経路
本発明の任意の組成物の投与経路には、吸入投与、経口投与、鼻投与、直腸投与、非経口投与、舌下投与、経皮投与、経粘膜投与(例えば、舌下投与、舌投与、(経)頬投与、(経)尿道投与、腟投与(例えば、経腟投与および膣周囲投与)、鼻(鼻腔内)投与、ならびに(経)直腸投与)、膀胱内投与、肺内投与、十二指腸内投与、胃内投与、くも膜下腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、動脈内投与、静脈内投与、気管支内投与、吸入投与、ならびに局所的投与が含まれる。
【０１８９】
適切な組成物および剤形には、例えば、錠剤、カプセル、カプレット、丸剤、ゲルキャップ(gel cap)、トローチ、分散液、懸濁液、溶液、シロップ、顆粒、ビーズ、経皮パッチ、ゲル、散剤、ペレット、マグマ剤、ロゼンジ、クリーム、パスタ剤、硬膏剤、ローション剤、ディスク、坐剤、鼻投与用または経口投与用の液体スプレー、吸入用の乾燥粉末またはエアロゾル化製剤、膀胱内投与用の組成物および製剤などが含まれる。本発明において有用な製剤および組成物は、本明細書に記載の特定の製剤および組成物に限定されない。
【０１９０】
非経口投与
本明細書で使用する、薬学的組成物の「非経口投与」は、対象の組織に物理的に穴を作り、組織にある穴を通して薬学的組成物を投与することを特徴とする任意の投与経路を含む。従って、非経口投与には、薬学的組成物の注射、外科的切開部を通した薬学的組成物の適用、組織を貫通する非外科的創傷を通した薬学的組成物の適用などによる薬学的組成物の投与が含まれるが、これに限定されない。特に、非経口投与は、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、胸骨内注射、および腎臓透析注入法を含むが、これに限定されないことが企図される。
【０１９１】
さらなる投与形態
本発明のさらなる剤形には、米国特許第6,340,475号、同第6,488,962号、同第6,451,808号、同第5,972,389号、同第5,582,837号、および同第5,007,790号に記載の剤形が含まれる。本発明のさらなる剤形はまた、米国特許出願第20030147952号、同第20030104062号、同第20030104053号、同第20030044466号、同第20030039688号、および同第20020051820号に記載の剤形も含む。本発明のさらなる剤形はまた、PCT出願番号WO03/35041、同WO03/35040、同WO03/35029、同WO03/35177、同WO03/35039、同WO02/96404、同WO02/32416、同WO01/97783、同WO01/56544、同WO01/32217、同WO98/55107、同WO98/11879、同WO97/47285、同WO93/18755、および同WO90/11757に記載の剤形も含む。
【０１９２】
徐放製剤および薬物送達システム
本発明の薬学的組成物の徐放製剤または持続放出製剤は従来の技術を用いて作製することができる。場合によっては、使用される剤形は、例えば、望ましい放出プロファイルを提供するために、比率の異なる、ヒドロプロピルメチル(hydropropylmethyl)セルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透析膜、浸透圧系、多層コーティング、微粒子、リポソーム、もしくはマイクロスフェア、またはその組み合わせを用いて、その中にある1種類または複数種類の活性成分をゆっくりと放出するか、または徐放するものとして提供することができる。徐放用に合わせられた、経口投与に適した単一単位剤形、例えば、錠剤、カプセル、ゲルキャップ、およびカプレットが本発明に含まれる。
【０１９３】
ある特定の態様では、本発明の製剤は、短期製剤、急速作用消失(rapid-offset)製剤、ならびに徐放製剤、例えば、持続放出製剤、遅延放出製剤、および拍動放出(pulsatile release)製剤でもよいが、これに限定されない。
【０１９４】
持続放出という用語は、長期間にわたって薬物を徐々に放出し、必ずしもそうであるとは限らないが、長期間にわたって実質的に一定の薬物血中濃度をもたらし得る薬物製剤を指すために従来の意味で用いられる。期間は1ヶ月またはそれ以上という長さであってもよく、ボーラスの形で投与される等量の薬剤より長い放出になるはずである。持続放出の場合、化合物は、化合物に持続放出特性を付与する適切なポリマー材料または疎水性材料を用いて処方されてもよい。従って、本発明の方法を使用するための化合物は、微粒子の形で、例えば、注射によって投与されてもよく、カシェ剤またはディスクの形で移植によって投与されてもよい。本発明のある特定の態様では、本発明の化合物は、持続放出製剤を用いて、単独で、または別の薬学的薬剤と組み合わせて患者に投与される。
【０１９５】
遅延放出という用語は、本明細書では、薬物が投与された後に、いくらかの遅延の後に薬物を初めて放出し、必ずしもそうであるとは限らないが、約10分から約12時間までの遅延を含んでもよい薬物製剤を指すために従来の意味で用いられる。拍動放出という用語は、本明細書では、薬物が投与された後に、薬物パルス血漿プロファイルを生じるように薬物を放出する薬物製剤を指すために従来の意味で用いられる。即時放出という用語は、薬物が投与された直後に薬物を放出する薬物製剤を指すために従来の意味で用いられる。
【０１９６】
本明細書で使用する短期とは、薬物が投与された後の、約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分、ならびにその任意の、および全ての全増加分または部分的な増加分までの、またはこれらを含む任意の期間を指す。
【０１９７】
本明細書で使用する急速作用消失とは、薬物が投与された後の、約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分、ならびにその任意の、および全ての全増加分および部分的な増加分までの、またはこれらを含む任意の期間を指す。
【０１９８】
当業者は、本明細書に記載の特定の手順、態様、クレーム、および実施例に対する非常に多くの等価物を認識しているか、または日常的な実験法のみを用いて認めることができる。このような等価物は本発明の範囲内だとみなされ、添付の特許請求の範囲によってカバーされた。例えば、当技術分野において認められている代案による、および日常的な実験法のみを用いた、反応条件および調製条件の変更は本願の範囲内であると理解されるはずである。
【０１９９】
値および範囲が本明細書において提供される場合は必ず、これらの値および範囲に含まれる全ての値および範囲は本発明の範囲内に含まれることが企図されると理解されなければならない。さらに、これらの範囲内にある値は全て、ならびに値の範囲の上限または下限も本願に含まれる。
【０２００】
以下の実施例は本発明の局面をさらに例示する。しかしながら、以下の実施例は、本明細書において示された本発明の教示も開示も限定するものではない。
【実施例】
【０２０１】
これより、以下の実施例に関連して本発明を説明する。これらの実施例は例示目的のためのみに提供される。本発明は、これらの実施例に限定されず、本明細書において提供される教示の結果として明らかな全てのバリエーションを包含する。
【０２０２】
方法および材料
動物
C57BL/6マウス(Jackson Labs)は、飼料によって誘発される腎結石形成を起こし、腎石症モデルとして用いられる。腎臓結石形成は、高カルシウム低マグネシウム飼料(例えば、Teklad Labs diet TD.00042, Harlan Labs, Madison, WI)をモデルマウスに与えることによって誘発される。
【０２０３】
雄および雌のC57BL/6マウスをCharles River Laboratory, MAから入手する。雄および雌のNpt2a-/-マウス(B6.129S2-Slc34a1tm1Hten/J, Stock No: 004802)およびEnpp1asj/asjマウス(C57BL/6J-Enpp1asj/GrsrJ Stock No: 012810)をJackson Laboratory, MEから購入する。Enpp1asjアレルはリーキー(leaky)であり、野生型対照と比較してEnpp1活性の約15％レベルを示す(Li, et al., 2013, Dis. Model Mech. 6:1227-1235)。尾の切断(tail clipping)から抽出し、記載(Albright, et al., 2015, Nat. Commun. 6:10006)のようにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅したゲノムDNAをPCR増幅することによってマウスの遺伝子型を同定する。マウスを3週齢で離乳させ、水と通常固形飼料(1.0％カルシウム、0.7％リン。このうち0.3％リンは容易に吸収される。Harlan Teklad TD.2018S)を自由に摂取できるようにする。O'Neill, et al., 2011, Kidney Int. 79:512-517に従って、ハンクス緩衝食塩水(Gibco, Life Sciences)またはHBSSに溶解したピロリン酸ナトリウム(160micromol/Kg/day)を2週間にわたって毎日腹腔内(i.p.)注射した後4週間でマウスを屠殺する。離乳齢を過ぎて腎臓結石が持続するかどうか判定するために、記載のように(Caballero, et al., 2016, Am. J. Physiol. Renal Physiol. ajprenal 00367 02016)、10週齢で、一晩絶食させ、最後のi.p.注射の約18〜24時間後にマウスを屠殺する。全マウス系統のバックグラウンドはC57BL/6であり、対照のために同腹子を使用すると遺伝的バックグラウンドに基づく偏りがさらに少なくなった。以前に報告されたように(Caballero, et al., 2016, Am. J. Physiol. Renal Physiol. ajprenal 00367 02016)、雄雌間で腎結石の差異は観察されなかった。従って、ここでは雄雌を組み合わせた。
【０２０４】
血液および尿のパラメータ
生化学的分析を、一晩絶食後、10AM〜2PMの同じ時刻に、眼窩全採血によって収集した血液試料とスポット尿に対して行う。濾過(NanoSep 300 K, Pall Corp., Ann Arbor, MI)によってヘパリン添加血漿を除タンパクした後に、蛍光定量プローブ(fluorometric probe)(AB112155, ABCAM, Cambridge, MA)を用いて血漿中および尿中の全ピロリン酸(PPi)濃度を求める。アッセイ間のばらつきに合わせて調整するために、尿中PPiを、LC-MS/MSまたは適切な対照を用いてELISAによって測定した尿クレアチニンに対して補正する。
【０２０５】
腎臓組織学
左腎臓を4％ホルマリン/PBS中4℃で12時間固定し、次いで、漸増濃度のエタノールとキシレンで脱水した後に、パラフィン包埋する。無機質沈着物を、1％メチルグリーンで対比染色した10μmフォン・コッサ染色切片上で確認する。形態学的評価のためにヘマトキシリン/エオシンを対比染色として使用する。1匹の動物につき皮質、髄質、および腎盂を含む1枚の腎臓矢状切片の組織形態計測的評価を、2人の無関係の観察者がOsteomeasure System(Osteometrics, Atlanta, GA)を用いて盲検で行う。式:石灰化サイズ=1切片あたりの石灰化面積/観察された石灰化領域の数を用いて、無機化サイズを求めた。
【０２０６】
透過型電子顕微鏡の場合、左腎臓の1mm3ブロックを、リン酸緩衝食塩水に溶解した2.5％グルタルアルデヒドおよび2％パラホルムアルデヒドで2時間固定した後に、1％オスミウム液で2時間、後固定した。脱水を一連のエタノール濃度(50％〜100％)を用いて行う。腎臓組織をエポキシ樹脂に包埋し、重合を60℃で一晩行う。薄片(50nm)を作製した後に、組織をウランと鉛で二重染色し、Yale Center for Cellular and Molecular Imaging(YCCMI)にあるTecnai Biotwin (LaB6, 80 kV)(FEI, Thermo Fisher, Hillsboro, OR)を用いて観察する。
【０２０７】
腎臓遺伝子発現分析
Trizol(Thermo Fisher Sci, Inc., Waltham, MA)を用いて全RNAを調製するために右腎臓を使用する。qRT-PCR(Omniscript, QuantiTect, Qiagen, Valencia, CA)を、ABI-Step One Plus Cycler(Fisher, life technologies, Waltham, MA)において、マウスβアクチンフォワードプライマー:
2021523139.tif 000066
、およびリバースプライマー:
2021523139.tif 000067
、マウスEnpp1フォワードプライマー:
2021523139.tif 000068
およびリバースプライマー:
2021523139.tif 000069
、マウスEntpd5フォワードプライマー:
2021523139.tif 000070
およびリバースプライマー:
2021523139.tif 000071
、マウスAnkフォワードプライマー:
2021523139.tif 000072
およびリバースプライマー:
2021523139.tif 000073
、およびマウスTnsalpフォワードプライマー:
2021523139.tif 000074
およびリバースプライマー:
2021523139.tif 000075
を用いて行う。
【０２０８】
統計解析
データを平均±SEMで表し、Microsoft Excel 2010 または Graphpad Prism 6.0で分析した。独立両側スチューデントt検定、または多重比較のためにチューキー補正を用いる一方向ANOVAを用いたp値が0.05未満であれば、差は有意だとみなされた。
【０２０９】
実施例1:ENPP1ポリペプチドを用いた腎石症の処置
本発明は、腎尿細管結石の形成を遅らせることを目的とした、マウス腎石症モデルへの可溶性ENPP1ポリペプチドの投与を企図する。ある特定の態様では、可溶性ENPP1ポリペプチドはマウスモデルにおいて腎結石のサイズおよび/もしくは数を低減し、かつ/または腎結石形成を阻止しかつ/もしくは逆転させる。
【０２１０】
投与量5〜40mg/kgのENPP1をモデルマウスに2週齢から4週間にわたって毎日、腹腔内注射する。4週間が終了した後に、マウスを屠殺し、ENPP1投与の効果を判定する目的で腎結石の存在を同定するために腎臓を分析する。ある特定の態様では、未処置の変異体マウスと比較した場合に、ENPP1ポリペプチドを投与すると、腎臓結石のサイズおよび/または量が少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、またはそれより多く低減する。
【０２１１】
未処置のモデルマウスは、透過型電子顕微鏡(TEM; Khan, et al., 2011, J. Urol.186:1107-1113)を用いて光学顕微鏡上で管内結石を示す。ある特定の態様では、ENPP1ポリペプチドを投与すると腎臓結石および/または結石形成が有意に低減する。他の態様では、任意のENPP1ポリペプチドまたはその融合変種、例えば、ENPP1-FcまたはENPP1-アルブミン融合タンパク質を投与することによって同様の結果が得られる。
【０２１２】
実施例2:ENPP3を用いた腎結石の処置
本発明は、腎尿細管結石の形成を遅らせることを目的とした、マウス腎石症モデルへの可溶性ENPP3ポリペプチドの投与を企図する。ある特定の態様では、可溶性ENPP3ポリペプチドはマウスモデルにおいて腎臓結石のサイズおよび/もしくは数を低減し、かつ/または腎臓結石形成を阻止しかつ/もしくは逆転させる。
【０２１３】
投与量5〜40mg/kgのENPP3をモデルマウスに2週齢から4週間にわたって毎日、腹腔内注射する。4週間が終了した後に、マウスを屠殺し、ENPP3投与の効果を判定する目的で腎臓結石の存在を同定するために腎臓を分析する。ある特定の態様では、未処置の変異体マウスと比較した場合に、ENPP3ポリペプチドを投与すると、腎結石のサイズおよび/または量が少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、またはそれより多く低減する。
【０２１４】
未処置のモデルマウスは、透過型電子顕微鏡(TEM; Khan, et al., 2011, J. Urol. 186:1107-1113)を用いて光学顕微鏡上で管内結石を示す。ある特定の態様では、ENPP3ポリペプチドを投与すると腎臓結石および/または結石形成が有意に低減する。他の態様では、任意のENPP3ポリペプチドまたはその融合変種、例えば、ENPP1-FcまたはENPP1-アルブミン融合タンパク質を投与することによって同様の結果が得られる。
【０２１５】
列挙した態様
以下の例示的な態様が提供され、その番号付けは重要性のレベルを指定するものとして解釈されるべきではない。
態様1は、腎石症と診断されたヒト対象において腎石症の進行を遅らせる方法であって、治療的有効量の可溶性ENPP1ポリペプチドを該対象に投与する工程を含み、該対象において該腎石症の進行が遅くなる、該方法を提供する。
態様2は、前記可溶性ENPP1ポリペプチドが、該可溶性ENPP1ポリペプチドの半減期を延ばしかつ/または該可溶性ENPP1ポリペプチドの免疫原性を低減する部分と融合されている、態様1の方法を提供する。
態様3は、前記部分が、免疫グロブリン(Ig)Fcドメイン、ポリエチレングリコール(PEG)、およびアルブミンからなる群より選択される、態様2の方法を提供する。
態様4は、前記可溶性ENPP1ポリペプチドが、骨を標的にするドメインと融合されている、態様1〜3のいずれかの方法を提供する。
態様5は、前記可溶性ENPP1ポリペプチドが、該可溶性ENPP1ポリペプチドと融合したシグナル配列を含む前駆体ポリペプチドの分泌産物であり、該シグナル配列が、ENPP2シグナル配列、ENPP5シグナル配列、およびENPP7シグナル配列からなる群より選択される、態様1〜4のいずれかの方法を提供する。
態様6は、前記腎石症が、シスチン尿症、尿酸結石疾患、ストルバイト結石疾患、高カルシウム尿症、カルシウム結石疾患、および高シュウ酸尿症からなる群より選択される、態様1〜5のいずれかの方法を提供する。
態様7は、前記腎石症がカルシウム結石疾患である、態様1〜6のいずれかの方法を提供する。
態様8は、前記腎石症が、シュウ酸塩、尿酸塩、シスチン、ヒドロキシウレア、およびリン酸カルシウムからなる群より選択される無機質を含有する腎臓結石を少なくとも1種類含む、態様1〜7のいずれかの方法を提供する。
態様9は、局所、局部、非経口、および全身からなる群より選択される経路を介して前記対象に前記可溶性ENPP1ポリペプチドが投与される、態様1〜8のいずれかの方法を提供する。
態様10は、腎石症と診断された対象において腎石症の進行を遅らせる方法であって、治療的有効量の可溶性ENPP3ポリペプチドを該対象に投与する工程を含み、該対象において該腎石症の進行が遅くなる、該方法を提供する。
態様11は、前記可溶性ENPP3ポリペプチドが、該可溶性ENPP3ポリペプチドの半減期を延ばしかつ/または該可溶性ENPP3ポリペプチドの免疫原性を低減する部分と融合されている、態様10の方法を提供する。
態様12は、前記部分が、免疫グロブリン(Ig)Fcドメイン、ポリエチレングリコール(PEG)、およびアルブミンからなる群より選択される、態様11の方法を提供する。
態様13は、前記可溶性ENPP3ポリペプチドが、骨を標的にするドメインと融合されている、態様10〜12のいずれかの方法を提供する。
態様14は、前記可溶性ENPP3ポリペプチドが、該可溶性ENPP3ポリペプチドと融合したシグナル配列を含む前駆体ポリペプチドの分泌産物であり、該シグナル配列が、ENPP2シグナル配列、ENPP5シグナル配列、およびENPP7シグナル配列からなる群より選択される、態様10〜13のいずれかの方法を提供する。
態様15は、前記腎石症が、シスチン尿症、尿酸結石疾患、ストルバイト結石疾患、高カルシウム尿症、カルシウム結石疾患、および高シュウ酸尿症からなる群より選択される、態様10〜14のいずれかの方法を提供する。
態様16は、前記腎石症がカルシウム結石疾患である、態様10〜15のいずれかの方法を提供する。
態様17は、前記腎石症が、シュウ酸塩、尿酸塩、シスチン、ヒドロキシウレア、およびリン酸カルシウムからなる群より選択される無機質を含有する腎臓結石を少なくとも1種類含む、態様10〜16のいずれかの方法を提供する。
態様18は、局所、局部、非経口、および全身からなる群より選択される経路を介して前記対象に前記可溶性ENPP3ポリペプチドが投与される、態様10〜17のいずれかの方法を提供する。
【０２１６】
本明細書において引用された全ての特許、特許出願、および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明は特定の態様に関連して開示されたが、本発明の他の態様およびバリエーションが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのこのような態様および等価なバリエーションを含むと解釈されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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