(57)【要約】本明細書は、B型肝炎ウイルス(HBV)ゲノムを標的化する二本鎖RNA剤、およびそのような薬剤を用いて1つまたはそれ以上のHBV遺伝子を阻害する方法、およびHBV感染又はHBV関連障害、例えば慢性B型肝炎を有する対象を処置する方法に関する。
2021533767.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖リボ核酸(dsRNA)物質であって、アンチセンス鎖は、
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号16)、
5'-usGfsuga(Agn)gcgaaguGfdCAfcacsusu-3'(配列番号18)、
5'-usGfsudGa(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号20)、
5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号23)、
5'-usGfsuga(Agn)dGCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号24)、
5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfdCacsusu-3'(配列番号25)、または
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfdCAfcacsusu-3'(配列番号28)：
［配列中、a、c、gおよびuはそれぞれ、2'-O-メチルアデノシン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルシチジン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-O-メチルウリジン-3'-ホスフェートであり；
Af、Cf、GfおよびUfはそれぞれ、2'-フルオロアデノシン-3'-ホスフェート、2'-フルオロシチジン-3'-ホスフェート、2'-フルオログアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-フルオロウリジン-3'-ホスフェートであり；
dA、dC、dGおよびdTはそれぞれ、2'-デオキシアデノシン-3'-ホスフェート、2'-デオキシシチジン-3'-ホスフェート、2'-デオキシグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-デオキシチミジン-3'-ホスフェートであり；
(Agn)は、アデノシン-グリコール核酸(GNA)であり；そして
ｓは、ホスホロチオエート連結である］
で示される修飾ヌクレオチド配列を含むdsRNA物質。
【請求項２】
センス鎖が、修飾ヌクレオチド配列：5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号29)
［配列中、a、c、gおよびuはそれぞれ、2'-O-メチルアデノシン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルシチジン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-O-メチルウリジン-3'-ホスフェートであり；
Af、Cf、GfおよびUfはそれぞれ、2'-フルオロアデノシン-3'-ホスフェート、2'-フルオロシチジン-3'-ホスフェート、2'-フルオログアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-フルオロウリジン-3'-ホスフェートであり；そして
ｓは、ホスホロチオエート連結である］
を含む、請求項1記載のdsRNA物質。
【請求項３】
アンチセンス鎖およびセンス鎖が、
(a)5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号16)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号29);
(b)5'-usGfsuga(Agn)gcgaaguGfdCAfcacsusu-3'(配列番号18)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号29);
(c)5'-usGfsudGa(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号20)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号:29);
(d)5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号23)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号29);
(e)5'-usGfsuga(Agn)dGCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号24)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号29);
(f)5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfdCacsusu-3'(配列番号25)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号29);または
(g)5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfdCAfcacsusu-3'(配列番号28)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号29)：
［配列中、a、c、gおよびuはそれぞれ、2'-O-メチルアデノシン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルシチジン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-O-メチルウリジン-3'-ホスフェートであり；
Af、Cf、GfおよびUfはそれぞれ、2'-フルオロアデノシン-3'-ホスフェート、2'-フルオロシチジン-3'-ホスフェート、2'-フルオログアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-フルオロウリジン-3'-ホスフェートであり;
dA、dC、dGおよびdTはそれぞれ、2'-デオキシアデノシン-3'-ホスフェート、2'-デオキシシチジン-3'-ホスフェート、2'-デオキシグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-デオキシチミジン-3'-ホスフェートであり;
(Agn)は、アデノシン-グリコール核酸(GNA)であり;そして
sは、ホスホロチオエート連結である］
で示される修飾ヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載のdsRNA物質。
【請求項４】
少なくとも1つの鎖が、少なくとも1つのヌクレオチドの3'オーバーハングを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のdsRNA物質。
【請求項５】
少なくとも1つの鎖が、2つのヌクレオチドの3'オーバーハングを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のdsRNA物質。
【請求項６】
二本鎖領域が、19〜21ヌクレオチド長の対である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のdsRNA物質。
【請求項７】
各鎖が独立して、19〜23のヌクレオチドを有する、請求項1〜6のいずれか一項に記載のdsRNA物質。
【請求項８】
各鎖が独立して、19〜21のヌクレオチドを有する、請求項7に記載のdsRNA物質。
【請求項９】
さらにリガンドを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のdsRNA物質。
【請求項１０】
リガンドが、dsRNA物質のセンス鎖の3'末端にコンジュゲートしている、請求項9に記載のdsRNA物質。
【請求項１１】
リガンドが、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)誘導体である、請求項9または10に記載のdsRNA物質。
【請求項１２】
リガンドが、式：
【化１】
2021533767.tif 000034
で示される、請求項11に記載のdsRNA物質。
【請求項１３】
式：
【化２】
2021533767.tif 000035
「式中、XはOまたはSである」
で示される、dsRNA物質がリガンドにコンジュゲートされている、請求項12に記載のdsRNA物質。
【請求項１４】
Xが、Oである、請求項13に記載のdsRNA物質。
【請求項１５】
アンチセンス鎖が、
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号16)、
5'-usGfsuga(Agn)gcgaaguGfdCAfcacsusu-3'(配列番号18)、
5'-usGfsudGa(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号20)、
5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号23)、
5'-usGfsuga(Agn)dGCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号24)、
5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfdCacsusu-3'(配列番号25)、または
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfdCAfcacsusu-3'(配列番号28)：
「配列中、a、c、gおよびuはそれぞれ、2'-O-メチルアデノシン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルシチジン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-O-メチルウリジン-3'-ホスフェートであり;
Af、Cf、GfおよびUfはそれぞれ、2'-フルオロアデノシン-3'-ホスフェート、2'-フルオロシチジン-3'-ホスフェート、2'-フルオログアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-フルオロウリジン-3'-ホスフェートであり;
dA、dC、dGおよびdTはそれぞれ、2'-デオキシアデノシン-3'-ホスフェート、2'-デオキシシチジン-3'-ホスフェート、2'-デオキシグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-デオキシチミジン-3'-ホスフェートであり;
(Agn)は、アデノシン-グリコール核酸(GNA)であり;そして
sは、ホスホロチオエート連結である」
で示される修飾ヌクレオチド配列からなる、請求項1に記載のdsRNA物質。
【請求項１６】
アンチセンス鎖およびセンス鎖が、
(a)5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号16)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(配列番号10);
(b)5'-usGfsuga(Agn)gcgaaguGfdCAfcacsusu-3'(配列番号18)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(配列番号10);
(c)5'-usGfsudGa(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号20)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(配列番号10);
(d)5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号23)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(配列番号10);
(e)5'-usGfsuga(Agn)dGCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号24)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(配列番号10);
(f)5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfdCacsusu-3'(配列番号25)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(配列番号10);または
(g)5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfdCAfcacsusu-3'(配列番号28)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(配列番号10)：
「配列中、a、c、gおよびuはそれぞれ、2'-O-メチルアデノシン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルシチジン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-O-メチルウリジン-3'-ホスフェートであり;
Af、Cf、GfおよびUfはそれぞれ、2'-フルオロアデノシン-3'-ホスフェート、2'-フルオロシチジン-3'-ホスフェート、2'-フルオログアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-フルオロウリジン-3'-ホスフェートであり;
dA、dC、dGおよびdTはそれぞれ、2'-デオキシアデノシン-3'-ホスフェート、2'-デオキシシチジン-3'-ホスフェート、2'-デオキシグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-デオキシチミジン-3'-ホスフェートであり;
(Agn)は、アデノシン-グリコール核酸(GNA)であり;
sは、ホスホロチオエート連結であり;そして
L96は、N-[トリス(GalNAc-アルキル)-アミドデカノイル)]-4-ヒドロキシプロリノールである」
で示される修飾ヌクレオチド配列からなる、請求項1に記載のdsRNA物質。
【請求項１７】
アンチセンス鎖およびセンス鎖が、5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号16)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(配列番号10);
「配列中、a、c、gおよびuはそれぞれ、2'-O-メチルアデノシン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルシチジン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-O-メチルウリジン-3'-ホスフェートであり;
Af、Cf、GfおよびUfはそれぞれ、2'-フルオロアデノシン-3'-ホスフェート、2'-フルオロシチジン-3'-ホスフェート、2'-フルオログアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-フルオロウリジン-3'-ホスフェートであり;
dA、dC、dGおよびdTはそれぞれ、2'-デオキシアデノシン-3'-ホスフェート、2'-デオキシシチジン-3'-ホスフェート、2'-デオキシグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-デオキシチミジン-3'-ホスフェートであり;
(Agn)は、アデノシン-グリコール核酸(GNA)であり;
sは、ホスホロチオエート連結であり;そして
L96は、N-[トリス(GalNAc-アルキル)-アミドデカノイル)]-4-ヒドロキシプロリノールである」
で示される修飾ヌクレオチド配列からなる、請求項1に記載のdsRNA物質。
【請求項１８】
dsRNA物質が、細胞内でのB型肝炎ウイルス(HBV)の発現を阻害する、請求項1〜17のいずれか一項に記載のdsRNA物質。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか一項に記載のdsRNA物質を含有する細胞。
【請求項２０】
請求項1〜19のいずれか一項に記載のdsRNA物質、および医薬用賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２１】
細胞内でのB型肝炎ウイルス(HBV)遺伝子発現を阻害する方法であって、請求項1〜18のいずれか一項に記載のdsRNA物質、または請求項20に記載の医薬組成物と該細胞を接触させることにより、細胞内でのHBV遺伝子発現を阻害する方法。
【請求項２２】
HBV遺伝子発現を、少なくとも80%、90%、95%もしくは98%、またはアッセイ方法の検出レベル未満にまで阻害する、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
細胞内でのB型肝炎ウイルス(HBV)の複製を阻害する方法であって、請求項1〜18のいずれか一項に記載のdsRNA物質、または請求項20に記載の医薬組成物と該細胞を接触させることにより、細胞内でのHBVの複製を阻害する方法。
【請求項２４】
細胞内でのHBVの複製を、少なくとも80%、90%、95%もしくは98%、またはアッセイ方法の検出レベル未満にまで阻害する、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
細胞が、対象の内にある、請求項21〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
対象が、ヒトである、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
対象が、HBV関連疾患に罹患している、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
細胞が、インビトロである、請求項21〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
HBVに感染した対象のB型肝炎ウイルス(HBV)抗原のレベルを低減する方法であって、請求項1〜18のいずれか一項に記載のdsRNA物質の治療有効量、または請求項20に記載の医薬組成物を該対象に投与することにより、対象におけるHBV抗原レベルを低減する方法。
【請求項３０】
HBV抗原が、HBsAgである、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
HBV抗原が、HBeAgである、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
抗原を、対象からの血清中で測定する、請求項29に記載の方法。
【請求項３３】
対象が、HBeAg陽性である、請求項29に記載の方法。
【請求項３４】
対象が、HBeAg陰性である、請求項29に記載の方法。
【請求項３５】
HBV抗原レベルを、血清中で少なくとも1log10、少なくとも2log10、少なくとも3log10もしくは少なくとも4log10、またはアッセイの検出レベル未満にまで低減する、請求項29〜34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
HBVに感染した対象におけるB型肝炎ウイルス(HBV)のウイルス負荷を低減する方法であって、請求項1〜18のいずれか一項に記載のdsRNA物質の治療有効量、または請求項20に記載の医薬組成物を該対象に投与することにより、対象におけるHBVのウイルス負荷を低減することを含む方法。
【請求項３７】
HBVウイルス負荷を、対象からの血清中で測定する、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
対象が、HBeAg陽性である、請求項36または37に記載の方法。
【請求項３９】
対象が、HBeAg陰性である、請求項36または37に記載の方法。
【請求項４０】
HBVウイルス負荷を、血清中で少なくとも1log10、少なくとも2log10、少なくとも3log10もしくは少なくとも4log10、またはアッセイの検出レベル未満にまで低減する、請求項36〜39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
B型肝炎ウイルス(HBV)感染を有する対象を処置する方法であって、請求項1〜18のいずれか一項に記載のdsRNA物質の治療有効量、または請求項20に記載の医薬組成物を該対象に投与することにより、対象を処置することを含む方法。
【請求項４２】
B型肝炎ウイルス(HBV)関連障害を有する対象を処置する方法であって、請求項1〜18のいずれか一項に記載のdsRNA物質の治療有効量、または請求項20に記載の医薬組成物を該対象に投与することにより、対象を処置することを含む方法。
【請求項４３】
HBV関連障害が慢性肝炎であり、対象がHBeAg陽性である、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
HBV関連障害が慢性肝炎であり、対象がHBeAg陰性である、請求項42に記載の方法。
【請求項４５】
dsRNA物質を、0.01mg/kg〜10mg/kg、0.5mg/kg〜50mg/kgまたは3mg/kg〜10mg/kgの用量で対象に投与する、請求項21〜44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
dsRNA物質を、3mg/kg〜10mg/kgの用量で対象に投与する、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
dsRNA物質を、50mg〜200mgまたは50mg〜900mgの一定用量で対象に投与する、請求項21〜44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
dsRNA物質を、対象に皮下投与する、請求項21〜47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
dsRNA物質を、対象に2用量またはそれ以上で投与する、請求項21〜48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
dsRNA物質を、対象に月に一回、2ヵ月に一回または3ヵ月に一回投与する、請求項21〜49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
dsRNA物質を、対象に月に一回を超えない回数で投与する、請求項21〜49のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項５２】
さらに、1つまたはそれ以上の追加の治療物質を対象に投与することを含む、請求項21〜51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
追加の治療物質が、抗ウイルス物質、逆転写酵素阻害物質、免疫賦活物質、治療ワクチン、ウイルス侵入阻害物質、HbsAgの分泌または放出を阻害するオリゴヌクレオチド、カプシド阻害物質もしくは共有結合閉環状(ccc)HBV DNA阻害物質、またはこれらのいずれかの組み合わせである、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
追加の治療物質が、逆転写酵素阻害物質である、請求項52に記載の方法。
【請求項５５】
追加の治療物質が、逆転写酵素阻害物質および免疫賦活物質である、請求項52に記載の方法。
【請求項５６】
逆転写酵素阻害物質が、テノフォビルジソプロキシルフマレート(TDF)、テノフォビルアラフェナミド、ラミブジン、アデフォビルジピボキシル、エンテカビル(ETV)、テルビブジンまたはAGX-1009である、請求項54または55に記載の方法。
【請求項５７】
免疫賦活物質が、ペグ化インターフェロンα2a(PEG-IFN-α2a)、インターフェロンα-2b、組換えヒトインターロイキン-7またはトール様受容体7(TLR7)アゴニストである、請求項55に記載の方法。
【請求項５８】
請求項1〜18のいずれか一項に記載のdsRNA物質および医薬用賦形剤を含む請求項21〜57のいずれか一項に記載のいずれかの方法を実施するための医薬組成物。
【請求項５９】
対象におけるB型肝炎ウイルス(HBV)感染の処置に使用するための、請求項1〜18のいずれか一項に記載のdsRNA物質、または請求項20に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
対象におけるB型肝炎ウイルス(HBV)関連障害の処置に使用するための、請求項1〜18のいずれか一項に記載のdsRNA物質、または請求項20に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
HBV関連障害が慢性肝炎であり、対象がHBeAg陽性である、請求項60に記載の使用のためのdsRNA物質または医薬組成物。
【請求項６２】
HBV関連障害が慢性肝炎であり、対象がHBeAg陰性である、請求項60に記載の使用のためのdsRNA物質または医薬組成物。
【請求項６３】
1つまたはそれ以上の追加の治療物質を対象に投与している、または既に投与していた、請求項59〜62のいずれかに一項に記載の使用のためのdsRNA物質または医薬組成物。
【請求項６４】
追加の治療物質が、抗ウイルス物質、逆転写酵素阻害物質、免疫賦活物質、治療ワクチン、ウイルス侵入阻害物質、HbsAgの分泌または放出を阻害するオリゴヌクレオチド、カプシド阻害物質もしくは共有結合閉環状(ccc)HBV DNA阻害物質、またはこれらのいずれかの組み合わせである、請求項63に記載の使用のためのdsRNA物質または医薬組成物。
【請求項６５】
追加の治療物質が、逆転写酵素阻害物質である、請求項63に記載の使用のためのdsRNA物質または医薬組成物。
【請求項６６】
追加の治療物質が、逆転写酵素阻害物質および免疫賦活物質である、請求項63に記載の使用のためのdsRNA物質または医薬組成物。
【請求項６７】
逆転写酵素阻害物質が、テノフォビルジソプロキシルフマレート(TDF)、テノフォビルアラフェナミド、ラミブジン、アデフォビルジピボキシル、エンテカビル(ETV)、テルビブジンまたはAGX-1009である、請求項65または66に記載の使用のためのdsRNA物質または医薬組成物。
【請求項６８】
免疫賦活物質が、ペグ化インターフェロンα2a(PEG-IFN-α2a)、インターフェロンα-2b、組換えヒトインターロイキン-7またはトール様受容体7(TLR7)アゴニストである、請求項66に記載の使用のためのdsRNA物質または医薬組成物。
【請求項６９】
請求項21〜57のいずれか一項に記載のいずれかの方法を実施するための、請求項1〜18のいずれか一項に記載のdsRNA物質または請求項20に記載の医薬組成物の使用。
【請求項７０】
請求項21〜57のいずれか一項に記載のいずれかの方法を実施するための医薬の調製のための、請求項1〜18のいずれか一項に記載のdsRNA物質または請求項20に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、引用により本明細書に包含される。配列表を含むテキストファイルの名称は930385_410WO_配列_LISTING.txtである。テキストファイルは83.1KBで、2019年8月4日に作成され、EFS-Web経由で電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００２】
世界中で4億人以上がHBVに慢性的に感染しており、従って、慢性肝炎、肝硬変、肝不全および肝細胞癌(HCC)などの重篤な肝疾患を発症するリスクが高く、毎年推定600,000人が死亡するという状況である。
【０００３】
慢性HBV感染の自然の展開には、4つの連続的な段階が含まれる：(1)初期「免疫寛容」段階、高レベルのウイルス複製および最小の肝炎；(2)免疫反応段階、重大な肝炎および血清アミノトランスフェラーゼ上昇；一部の患者は(3)に進行する；(3)「非複製」段階、抗HBeへの血清転換、検出不能または低レベルのウイルス血症(PCRベースのアッセイで2000IU/ml未満)、および肝炎症の消散；および(4)特定のウイルス突然変異の出現に起因するHBeAg陰性慢性B型肝炎、この変異は、HBeAgの産生を阻むが、ウイルス複製は妨げない。この形態の慢性B型肝炎(CHB)は、血清HBV DNAおよび血清アミノトランスフェラーゼ(ALTおよびAST)レベルの変動、ならびに進行性肝疾患を特徴とする。CHBは、HBeAg陽性CHBとしても、またHBeAg陰性CHBとしても存在し得る点に留意することが重要である。CHB患者の縦断的研究は、肝硬変発症の5年累積発生率が8〜20%の範囲であることを示している。肝代償不全の5年累積発生率は約20%である。世界的にHCCの発生率は増加しており、現在、5番目に多い癌となっている。HBV関連HCCの年間発生率は高く、肝硬変が確立している場合は、2〜5%の範囲である。
【０００４】
HBV処置の主目標は、HBV複製を永久に阻害し、肝疾患を改善することである。臨床的に重要な短期目標は、HBeAg-血清変換、血清ALTおよびASTの正常化、肝炎症の消散を達成し、肝代償不全を予防することである。処置の最終目標は、肝硬変および肝癌の発症を予防し、かつ生存を延長させる持続的お応答を達成することである。HBV感染は、感染肝細胞の核において特定の形態のウイルス共有結合閉環状DNA(cccHBV DNA)が残存し続けるため、完全には根絶することができない。しかしながら、処置によって誘導される血清HBsAgクリアランスは、慢性HBV感染が終結するマーカーであり、長期の最良の成果と関連付けられている。
【０００５】
現在の標準的なHBV処置の方法は、インターフェロンまたはチモシンα1を基本とする免疫療法、およびHBVポリメラーゼの阻害によるウイルス産生の阻害療法がある。HBVポリメラーゼ阻害物質は、ウイルス産生の低減に有効であるが、HBsAgを急速に低減させる効果はほとんど無いか、全く無く、または(テノフォビル ジソプロキシルフマレートによる場合のように)限られた数の患者における長期処置では、HBsAgを緩徐にしか低減することができない。インターフェロンを基本とする免疫療法は、ウイルス産生の低減と初期の血液からのHBsAg除去との両方を達成することができるが、処置された対象のごく一部において可能であるに過ぎない。一般に認められている血中でのHBsAgの役割は、抗HBsAg抗体を隔離し、そして感染性ウイルス粒子が免疫検出を回避できるようにすることであり、これが、HBV感染が慢性状態のままになってしまう理由の1つと推定される。加えて、HBsAg、HBeAgおよびHBcAgは全て、免疫阻害特性を有しており、これらのウイルスタンパク質が、現在利用可能なHBV処置のいずれかを投与した後に患者の血中に残存することが、患者のHBV感染を免疫学的に制御することを妨げている点で重大な影響があるものと思われる。
【０００６】
3つの主要なHBVタンパク質(HBsAg、HBeAgおよびHBcAg)は全て、免疫阻害特性を有するが、HBsAgが、HBV感染対象の循環系にあるHBVタンパク質の圧倒的大多数を占める。加えて、HBeAgの(血清転換を介した)除去または血清ウイルス血症の低減が処置中止時の持続的なHBV感染制御の発生に相関しない一方、HBV感染における血中からの血清HBsAgの除去(および血清転換)は、処置中止時のHBV感染制御につながり得る処置中の抗ウイルス応答の充分に認識された予後指標である(しかしこれは免疫療法を受けている患者のごく一部に起こるに過ぎない)。従って、3つ全ての主要なHBVタンパク質(HBsAg、HBeAgおよびHBcAg)の低減が阻害効果の最適な除去をもたらし得るが、ウイルスによるHBV感染対象の免疫機能阻害の大部分を除去するには、HBsAg単独の除去がそれ自体として十分であるものと思われる。
【０００７】
従って、大部分の患者でHBVの免疫学的制御を回復させることのできる処置レジメンが現在存在しない中、大多数の患者においてウイルス複製を阻害できるとともに免疫学的制御を回復させることのできる、HBV感染に対する有効な処置が必要とされている。従って、当該技術分野においては、HBVに感染した、またはHBV関連疾患を有する対象のための代替療法および併用療法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
いくつかの実施態様において、本明細書は、B型肝炎ウイルス(HBV)遺伝子のRNA転写物のRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)介在性切断に影響を与える二本鎖リボ核酸(dsRNA)剤組成物を提供する。HBV遺伝子は、細胞内、例えばヒトなどの対象の内にある細胞内にあってもよい。
【０００９】
本明細書はまた、HBV遺伝子の発現を阻害することにより利益が得られる、HBV感染症またはHBV関連疾患などの障害、例えば慢性B型肝炎感染症(CHB)を有する対象を、HBV遺伝子の発現を阻害するためのHBV遺伝子のRNA転写物のRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)介在性切断に影響を与えるdsRNA物質組成物を用いて処置する方法および療法も提供する。
【００１０】
一態様において、本明細書は、HBVの発現を阻害するためのdsRNA物質を提供する。例えば、本明細書は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むdsRNA物質であって、アンチセンス鎖は、
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号16)、
5'-usGfsuga(Agn)gcgaaguGfdCAfcacsusu-3'(配列番号18)、
5'-usGfsudGa(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号20)、
5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号23)、
5'-usGfsuga(Agn)dGCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号24)、
5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfdCacsusu-3'(配列番号25)、または
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfdCAfcacsusu-3'(配列番号28)：
［配列中、a、c、gおよびuはそれぞれ、2'-O-メチルアデノシン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルシチジン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-O-メチルウリジン-3'-ホスフェートであり；
Af、Cf、GfおよびUfはそれぞれ、2'-フルオロアデノシン-3'-ホスフェート、2'-フルオロシチジン-3'-ホスフェート、2'-フルオログアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-フルオロウリジン-3'-ホスフェートであり；
dA、dC、dGおよびdTはそれぞれ、2'-デオキシアデノシン-3'-ホスフェート、2'-デオキシシチジン-3'-ホスフェート、2'-デオキシグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-デオキシチミジン-3'-ホスフェートであり；
(Agn)は、アデノシン-グリコール核酸(GNA)であり；そして
sは、ホスホロチオエート連結である。］
で示される修飾ヌクレオチド配列を含むdsRNA物質を提供する。
【００１１】
いくつかの実施態様において、センス鎖は、修飾ヌクレオチド配列：5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号:29)
［配列中、a、c、gおよびuはそれぞれ、2'-O-メチルアデノシン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルシチジン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-O-メチルウリジン-3'-ホスフェートであり；
Af、Cf、GfおよびUfはそれぞれ、2'-フルオロアデノシン-3'-ホスフェート、2'-フルオロシチジン-3'-ホスフェート、2'-フルオログアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-フルオロウリジン-3'-ホスフェートであり；そして
sは、ホスホロチオエート連結である。］
を含む。
【００１２】
いくつかの実施態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、
(a)5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号16)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号29)；
(b)5'-usGfsuga(Agn)gcgaaguGfdCAfcacsusu-3'(配列番号:18)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号29)；
(c)5'-usGfsudGa(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号20)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号29)；
(d)5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号23)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号29)；
(e)5'-usGfsuga(Agn)dGCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号24)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号29)；
(f)5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfdCacsusu-3'(配列番号:25)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号29)；または
(g)5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfdCAfcacsusu-3'(配列番号:28)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号29)：
［配列中、a、c、gおよびuはそれぞれ、2'-O-メチルアデノシン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルシチジン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-O-メチルウリジン-3'-ホスフェートであり；
Af、Cf、GfおよびUfはそれぞれ、2'-フルオロアデノシン-3'-ホスフェート、2'-フルオロシチジン-3'-ホスフェート、2'-フルオログアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-フルオロウリジン-3'-ホスフェートであり；
dA、dC、dGおよびdTはそれぞれ、2'-デオキシアデノシン-3'-ホスフェート、2'-デオキシシチジン-3'-ホスフェート、2'-デオキシグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-デオキシチミジン-3'-ホスフェートであり；
(Agn)は、アデノシン-グリコール核酸(GNA)であり；そして
sは、ホスホロチオエート連結である。］
で示される修飾ヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
いくつかの実施態様において、dsRNA物質の少なくとも1つの鎖は、少なくとも1つのヌクレオチドの3'オーバーハング(突出部)を含む。いくつかの実施態様において、dsRNA物質の少なくとも1つの鎖は、2つのヌクレオチドの3'オーバーハングを含む。
【００１４】
いくつかの実施態様において、dsRNA物質の二本鎖領域は、19〜21ヌクレオチド長の対である。
【００１５】
いくつかの実施態様において、dsRNA物質の各鎖は独立して、19〜23のヌクレオチドを有する。いくつかの実施態様において、dsRNA物質の各鎖は独立して、19〜21のヌクレオチドを有する。
【００１６】
いくつかの実施態様において、dsRNA物質はさらにリガンドを含む。いくつかの実施態様において、リガンドは、dsRNA物質のセンス鎖の3'末端にコンジュゲート(結合)している。いくつかの実施態様において、リガンドは、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)誘導体である。特定の実施態様において、リガンドは、式：
【化１】
2021533767.tif 000003
で示される。
【００１７】
いくつかの実施態様において、dsRNA物質は、式：
【化２】
2021533767.tif 000004
［式中、XはOまたはSである］
で示されるようにリガンドにコンジュゲートされている。いくつかの実施態様において、Xは、Oである。
【００１８】
いくつかの実施態様において、アンチセンス鎖は、
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号:16)、
5'-usGfsuga(Agn)gcgaaguGfdCAfcacsusu-3'(配列番号:18)、
5'-usGfsudGa(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号20)、
5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号23)、
5'-usGfsuga(Agn)dGCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号24)、
5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfdCacsusu-3'(配列番号25)、または
5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfdCAfcacsusu-3'(配列番号28)：
［配列中、a、c、gおよびuはそれぞれ、2'-O-メチルアデノシン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルシチジン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-O-メチルウリジン-3'-ホスフェートであり；
Af、Cf、GfおよびUfはそれぞれ、2'-フルオロアデノシン-3'-ホスフェート、2'-フルオロシチジン-3'-ホスフェート、2'-フルオログアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-フルオロウリジン-3'-ホスフェートであり；
dA、dC、dGおよびdTはそれぞれ、2'-デオキシアデノシン-3'-ホスフェート、2'-デオキシシチジン-3'-ホスフェート、2'-デオキシグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-デオキシチミジン-3'-ホスフェートであり；
(Agn)は、アデノシン-グリコール核酸(GNA)であり；そして
ｓは、ホスホロチオエート連結である。］
で示される修飾ヌクレオチド配列からなる。
【００１９】
いくつかの実施態様において、本明細書は、以下の修飾ヌクレオチド配列からなるセンス鎖およびアンチセンス鎖のdsRNA物質を提供する：
(a)5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号16)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号:29);
(b)5'-usGfsuga(Agn)gcgaaguGfdCAfcacsusu-3' (配列番号18)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (配列番号:29);
(c)5'-usGfsudGa(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号20)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号:29);
(d)5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号23)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号:29);
(e)5'-usGfsuga(Agn)dGCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号24)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号:29);
(f)5'-usGfsudGadAgdCGfaaguGfcAfdCacsusu-3'(配列番号25)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (配列番号:29);または
(g)5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfdCAfcacsusu-3'(配列番号28)および5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3'(配列番号29)：
配列中、a、c、gおよびuはそれぞれ、2'-O-メチルアデノシン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルシチジン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-O-メチルウリジン-3'-ホスフェートであり；
Af、Cf、GfおよびUfはそれぞれ、2'-フルオロアデノシン-3'-ホスフェート、2'-フルオロシチジン-3'-ホスフェート、2'-フルオログアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-フルオロウリジン-3'-ホスフェートであり；
dA、dC、dGおよびdTはそれぞれ、2'-デオキシアデノシン-3'-ホスフェート、2'-デオキシシチジン-3'-ホスフェート、2'-デオキシグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-デオキシチミジン-3'-ホスフェートであり；
(Agn)は、アデノシン-グリコール核酸(GNA)であり；
ｓは、ホスホロチオエート連結であり；そして
センス鎖の3'末端は、N-[トリス(GalNAc-アルキル)-アミドデカノイル)]-4-ヒドロキシプロリノール(L96)リガンドにコンジュゲートされている。
【００２０】
他の態様において、本明細書は、本明細書に開示されるdsRNA物質を含有する細胞を提供する。
【００２１】
本明細書はまた、本明細書に記載されるdsRNA物質、および医薬用賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
本明細書はまた、細胞中でのB型肝炎ウイルス(HBV)遺伝子発現を阻害する方法であって、本発明に開示されるdsRNA物質または医薬組成物と細胞を接触させることにより、細胞中でのHBV遺伝子発現を阻害する方法を提供する。いくつかの実施態様において、細胞は、対象の内にある。いくつかの実施態様において、対象は、ヒトである。いくつかの実施態様において、対象は、HBV関連疾患に罹患している。いくつかの実施態様において、細胞は、インビトロである。いくつかの実施態様において、HBV遺伝子発現は、少なくとも80％、90％、95％もしくは98％、またはアッセイ法の検出レベル未満にまで阻害される。
【００２３】
本明細書は、細胞中でのB型肝炎ウイルス(HBV)の複製を阻害する方法であって、本明細書に開示されるdsRNA物質または医薬組成物と細胞を接触させることにより、細胞中でのHBVの複製を阻害することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様において、細胞は対象の内にある。いくつかの実施態様において、対象は、ヒトである。特定の実施態様において、対象は、HBV関連疾患に罹患している。いくつかの実施態様において、細胞は、インビトロである。特定の実施態様において、細胞中でのHBVの複製は、少なくとも80%、90%、95%もしくは98%、またはアッセイ法の検出レベル未満にまで阻害される。
【００２４】
また、本明細書では、HBVに感染した対象におけるB型肝炎ウイルス(HBV)抗原レベルを低減する方法であって、本明細書に開示されるdsRNA物質または医薬組成物の治療有効量を該対象に投与することにより、対象のHBV抗原レベルを低減することを含む方法が提供される。いくつかの実施態様において、HBV抗原は、HBsAgである。いくつかの実施態様において、HBV抗原は、HBeAgである。いくつかの実施態様において、HBV抗原は、対象からの血清中で測定される。いくつかの実施態様において、対象は、HBeAg陽性である。いくつかの実施態様において、対象は、HBeAg陰性である。いくつかの実施態様において、HBV抗原レベルは、血清中で少なくとも1log10、少なくとも2log10、少なくとも3log10もしくは少なくとも4log10、またはアッセイ法の検出レベル未満にまで低減する。
【００２５】
本明細書はまた、HBVに感染した対象におけるB型肝炎ウイルス(HBV)のウイルス負荷を低減する方法であって、本明細書に開示されるdsRNA物質または医薬組成物の治療有効量を該対象に投与することにより、対象のHBVのウイルス負荷を低減することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様において、HBVのウイルス負荷は、対象からの血清で測定される。いくつかの実施態様において、対象はHBeAg陽性である。いくつかの実施態様において、対象はHBeAg陰性である。いくつかの実施態様において、HBVのウイルス負荷は、血清中で少なくとも1log10、少なくとも2log10、少なくとも3log10もしくは少なくとも4log10、またはアッセイ法の検出レベル未満にまで低減する。
【００２６】
また、本明細書では、B型肝炎ウイルス(HBV)感染またはHBV関連障害を有する対象を処置する方法であって、本明細書に開示されるdsRNA物質または医薬組成物の治療有効量を該対象に投与することにより、対象を処置することを含む方法が提供される。いくつかの実施態様において、対象は、HBeAg陽性である。いくつかの実施態様において、対象は、HBeAg陰性である。いくつかの実施態様において、HBV関連障害は、慢性肝炎であり、対象は、HBeAg陽性である。いくつかの実施態様において、HBV関連障害は、慢性肝炎であり、対象は、HBeAg陰性である。
【００２７】
上記の方法のいくつかの実施態様において、dsRNA物質は、0.01mg/kg〜10mg/kg、0.5mg/kg〜50mg/kgまたは3mg/kg〜10mg/kgの用量で対象に投与される。該方法のいくつかの実施態様において、dsRNA物質は3mg/kg〜10mg/kgの用量で対象に投与される。該方法のいくつかの実施態様において、dsRNA物質は、50mg〜200mgの一定用量で対象に投与される。
【００２８】
上記の方法のいくつかの実施態様において、dsRNA物質は、対象に皮下投与される。
【００２９】
上記の方法のいくつかの実施態様において、dsRNA物質は、2用量またはそれ以上で対象に投与される。
【００３０】
上記の方法のいくつかの実施態様において、dsRNA物質は、月に一回、2ヵ月に一回または3ヵ月に一回対象に投与される。該方法のいくつかの実施態様において、dsRNA物質は、月に一回を超える回数対象に投与される。
【００３１】
上記の方法のいくつかの実施態様において、該方法はさらに、追加の治療物質、例えば、1つまたはそれ以上の追加の治療物質を対象に投与することを含む。追加の治療物質には、例えば、抗ウイルス剤、逆転写酵素阻害物質、免疫賦活物質、治療ワクチン、ウイルス侵入阻害物質、HbsAgの分泌または放出を阻害するオリゴヌクレオチド、カプシド阻害物質、共有結合閉環状(ccc)HBV DNA阻害物質、および前述のいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、追加の治療物質は逆転写酵素阻害物質である。
【００３２】
いくつかの実施態様において、1つを超える追加の治療物質が投与され、該追加の治療物質は逆転写酵素阻害物質および免疫賦活物質である。逆転写酵素阻害物質としては、テノフォビルジソプロキシルフマレート(TDF)、テノフォビルアラフェナミド、ラミブジン、アデフォビルジピボキシル、エンテカビル(ETV)、テルビブジンおよびAGX-1009が挙げられるが、これらに限定されない。免疫賦活物質には、ペグ化インターフェロンα2a(PEG-IFN-α2a)、インターフェロンα-2b、組換え  ヒトインターロイキン-7、およびトール様受容体7(TLR7)アゴニストがあるが、これらに限定されない。
【００３３】
また、本明細書では、本明細書に開示されるいずれかの方法を実施するための組成物が提供される。いくつかの実施態様において、本明細書は、対象のB型肝炎ウイルス(HBV)感染の処置に使用するための、本明細書に開示されるdsRNA物質または医薬組成物を提供する。いくつかの実施態様において、本明細書は、対象のB型肝炎ウイルス(HBV)関連障害を処置するための、本明細書に開示され鵜dsRNA物質または医薬組成物を提供する。いくつかの実施態様において、HBV関連障害は慢性肝炎であり、対象はHBeAg陽性である。いくつかの実施態様において、HBV関連障害は慢性肝炎であり、対象はHBeAg陰性である。いくつかの実施態様において、対象は、追加の治療物質、例えば、抗ウイルス剤、逆転写酵素阻害物質、免疫賦活物質、治療ワクチン、ウイルス侵入阻害物質、HbsAgの分泌または放出を阻害するオリゴヌクレオチド、カプシド阻害物質、共有結合閉環状(ccc)HBV DNA阻害物質、または上記のいずれかの組み合わせが投与されているか、または投与された。いくつかの実施態様において、追加の治療物質は、逆転写酵素 阻害物質、例えば、テノフォビルジソプロキシルフマレート(TDF)、テノフォビルアラフェナミド、ラミブジン、アデフォビルジピボキシル、エンテカビル(ETV)、テルビブジンまたはAGX-1009である。いくつかの実施態様において、投与される追加の治療物質は、逆転写酵素阻害物質(例えば、テノフォビルジソプロキシルフマレート(TDF)、テノフォビルアラフェナミド、ラミブジン、アデフォビルジピボキシル、エンテカビル(ETV)、テルビブジンまたはAGX-1009)、および免疫賦活物質(例えば、ペグ化インターフェロンα2a(PEG-IFN-α2a)、インターフェロンα-2b、組換えヒトインターロイキン-7またはトール様受容体7(TLR7)アゴニスト)である。
【００３４】
本明細書は、上記の方法のいずれかを実施するための、本明細書に開示されるdsRNA物質または医薬組成物の使用を提供する。
【００３５】
本明細書はまた、上記の方法のいずれかを実施するための治療用医薬の調製または製造のための、本明細書に開示されるdsRNA物質の使用を提供する。
【００３６】
本明細書は、本明細書に開示されるdsRNA物質または医薬組成物を含み、場合により、本明細書に記載される方法を実施するための使用説明書を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図1は、約3.2kb二本鎖HBVゲノムの構造を概略的に示す。HBVゲノムの複製はRNA中間体を介して起こり、3つのリーディングフレームにわたって翻訳される7つのウイルスタンパク質(pre-S1、pre-S2、S、P、X、pre-CおよびC)をコードする4つのオーバーラップウイルス転写物(約3.5kb転写物、約2.4kb転写物、約2.1kb転写物および約0.7kb転写物)を産生する。
【００３８】
【図２】図2A-2Bは、AAV-HBVマウスモデルにおける投与前と比較した(A)血清中HBsAg濃度(ng/mL)および(B)血清中HBsAgレベルを示す。図2Aは、HBV-AAVマウスの、AD-81890の投与前(-24日目、-2日目、0日目)、または0.3mg/kg、1mg/kgまたは3mg/kgでの単回投与後(14日目、21日目、33日目、47日目、59日目、74日目)のHBsAgの血清中レベルを示す。各点はn=6〜9匹の動物の平均を示し、バーはSDを示す。図2Bは、HBV-AAVマウスの、AD-81890の投与前(-24日目、-2日目、0日目)、または0.3mg/kg、1mg/kgまたは3mg/kgでの単回投与後(14日目、21日目、33日目、47日目、59日目、74日目)と比較した、HBsAgの血清中レベルを示す。各点はn=6〜9匹の動物の平均を示し、バーはSDを示す。
【００３９】
【図３】図3は、AAV-HBVマウスモデルに投与前-55日目、-27日目、-13日目、0日目、14日目、28日目、42日目、56日目、84日目、112日目および140日目と比較した血清中HBsAgレベルを示す。投与レジメンには、対照(PBS)Q2W x 6；AD-66810(1mg/kg;Q2W x 6)；AD-81890(1mg/kg;Q2W x 6)；AD-81890(1mg/kg;QM x 3)；AD-81890(3mg/kg;Q2W x 6);AD-81890(3mg/kg;QM x 3)；およびAD-81890(9mg/kg;QM x 1)が含まれた。初回投与は、0日目に投与された。各点はn=4〜6匹の動物の平均を示し、バーはSDを示す。
【００４０】
【図４】図4は、AD-66810またはAD-81890において有意にダウンレギュレートされた(調整されたp値<0.05、log2倍率変化<0)すべての遺伝子のlog2倍率変化(処置/対照)を示すボックスプロットを示す。太い横線はlog2倍率変化の中央値を示し、各ボックスの垂直方向の範囲は、クォータータイル間の範囲(IQR)を示し、ウィスカは、+/-1.58 IQR/sqrt(N)までに広がり、ここで、Nは、各群の遺伝子数を示す。統計的有意性は、ウェルチの両側2標本t検定を用いて評価された。
【００４１】
【図５】図5A-5Bは、PBSが投与されたマウスと比較した、AD-66810(図5A)またはAD-81890(図5B)の投与後のPXBマウスのALTレベルを経時的に示す。マウスは、0日目、21日目、28日目、35日目および42日目に、12mg/kg、36mg/kgまたは100mg/kgのAD-66810、AD-81890またはPBS(対照)を皮下注射で投与された(グループあたりn=4)。血液は週に2回後眼窩の出血によって採取され、血清は通常の方法を用いて調製された。
【００４２】
詳細な説明
本明細書は、B型肝炎ウイルス(HBV)遺伝子のRNA転写物のRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)介在性切断に影響を与えるdsRNA物質組成物を提供する。遺伝子は、細胞内、例えばヒトなどの対象の内にある細胞内にあってもよい。これらのdsRNA物質を使用することにより、哺乳動物における対応する遺伝子(HBV遺伝子)のmRNAを標的として分解することを可能にする。
【００４３】
本明細書に記載されるdsRNA物質は、HBVゲノム内でHBVの少なくとも8つの既知の遺伝子型にわたって保存されている領域を標的とするように設計されている。さらに、本明細書のdsRNA物質は、1つを超えるHBV遺伝子の発現を阻害することにより、HBVのライフサイクルの全ての段階、例えば複製、集合(アッセンブル)、ウイルスの分泌およびサブウイルス抗原の分泌を阻害するように設計されている。詳細には、HBVゲノムが転写されるとポリシストロン性の重複RNAが生じるため、いくつかの実施態様において、単一のHBV遺伝子を標的化するdsRNA物質は、ほとんどまたはすべてのHBV転写物の発現を有意に阻害することになる。例えば、HBVゲノムは単一のmRNAに転写されるため、S遺伝子を標的化する本明細書のdsRNA物質は、S遺伝子発現のみならず、その「下流」ポリメラーゼ遺伝子の発現もまた阻害することになる。さらに、本明細書のdsRNA物質は、HBV構造遺伝子およびHBV X遺伝子を標的化することによってHBVウイルス複製を阻害し、それによって対象の免疫系がHBsAgの存在を検出してそれに反応し、抗HBV抗体を産生してHBV感染を除去することが可能となるように設計されている。特定の理論に制限されることを意図するものではないが、上記の性質と本明細書のdsRNA物質の特定の標的部位または特定の修飾との組み合わせ（コンビネーション）または部分的な組み合わせ(サブコンビネーション)は、本明細書のdsRNA物質に、有効性、安定性、安全性、効力、および耐久性における改善を付与すると考えられる。
【００４４】
本発明者らは、インビトロおよびインビボアッセイを用いて、HBV遺伝子を標的化するdsRNA物質がRNAiを強力に媒介し、1つを超えるHBV遺伝子の発現を有意に阻害できることを実証した。従って、本明細書のdsRNA物質を含む方法および組成物は、HBV感染またはHBV関連疾患、例えば慢性B型肝炎(CHB)を有する対象の処置に有用である。
【００４５】
従って、本明細書はまた、HBV遺伝子の発現を阻害または低減することから利益を得られ得る障害、例えばB型慢性肝炎ウイルス感染(CHB)などのHBV関連疾患を有する対象を、HBV遺伝子のRNA転写物のRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)介在性切断に影響を与えるdsRNA物質組成物を用いて処置する方法も提供する。
【００４６】
本明細書のdsRNA物質は、約9〜21ヌクレオチド長、例えば約19ヌクレオチド長の相補的な領域であって、少なくとも1つのHBV遺伝子型のHBV遺伝子のmRNA転写物の少なくとも一部と実質的に相補的な領域を有するRNA鎖(アンチセンス鎖)を含む。本明細書のdsRNA物質が、異なるHBV遺伝子型に対する相補性の程度が異なることがあるように、複数のHBV遺伝子型が存在すると理解される。
【００４７】
いくつかの実施態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、19〜21個の連続するヌクレオチドの二本鎖を形成する。
【００４８】
以下の詳細な説明には、HBV遺伝子の発現を阻害するために、dsRNA物質を含有する組成物をどのように作製および使用すればよいか、ならびにHBV遺伝子の発現の阻害または低減から利益を得られ得る疾患および障害を有する対象を処置するための組成物、使用、および方法を開示される。
【００４９】
I.定義
本明細書がより容易に理解され得るように、特定の用語がまず定義される。さらに、パラメーターの値または値の範囲が記載されるときは常に、記載される値の中間の値および範囲も、本特徴の一部であることが意図されることに留意されたい。
【００５０】
文脈上で他に要求しない限り、本明細書および特許請求の範囲全体を通して、用語「含む(comprise)」およびその変形、例えば「含む(comprises)」および「含む(comprising)」は、開放的な包括的な意味、すなわち「含むが、これらに限定されない」と解釈されるべきである。「からなる(Consisting of)」とは、本明細書に開示される他の成分または実質的な方法の工程の微量元素を超えるものを除外することを意味するものとする。例えば、ポリヌクレオチドは、いずれかのさらなるヌクレオチドを含まない場合、ヌクレオチドの配列からなるが、リガンド、例えば標的化リガンド、または修飾の取り込みを除外しない。用語「本質的に〜からなる」は、請求の範囲を、特定の材料物質もしくは工程、または特許請求の範囲に係る発明の基本的統制に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。例えば、本質的に本明細書で定義される成分からなる医薬組成物は、単離および精製方法からの微量混入物質、ならびにリン酸緩衝生理食塩水、防腐剤などの製薬的に許容できる担体を除外しない。同様に、ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチド長の少なくとも20％に寄与し、かつポリヌクレオチドの活性に実質的に影響を与えない（例えば、ポリヌクレオチドの活性を50％未満で改変する)さらなるのヌクレオチドを含む場合、ポリヌクレオチドは本質的にヌクレオチド配列からなる。各移行性用語によって定義される実施態様は、本発明の範囲内である。
【００５１】
冠詞「1つの(a)」および「1つの(an)」は、その冠詞の文法的目的語の1つまたは1つを超える(即ち、少なくとも1つ)を指すために本明細書において使用される。例として、「成分(an element)」は、1つの要素または1つを超える成分、例えば、複数の成分を意味する。
【００５２】
用語「〜を含む(including)」は、「〜を含むが、これらに限定されない(including but not limited to)」という語句を意味するために本明細書において使用され、この語句と同義的に使用される。
【００５３】
用語「または」は、文脈上明らかに他の意味を示さない限り、用語「および/または」を意味するために本明細書において使用され、この用語と同義的に使用される。例えば、「センス鎖またはアンチセンス鎖」は、「センス鎖もしくはアンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖」と理解される。
【００５４】
用語「約」は、当技術分野における許容範囲の典型的な範囲内であることを意味するために本明細書において使用される。例えば、「約」は平均値から2標準偏差以内であると理解され得る。「約」は、それが一連の数または範囲の前に存在する場合、一連の数または範囲内の各数字を変更できると理解される。
【００５５】
数または一連の数の前の用語「少なくとも」は、文脈から明らかなように、一連の数の各数、および論理的に含まれ得る後続のすべての数または整数として理解される。例えば、核酸分子のヌクレオチド数は整数であるべきである。例えば、「21個の核酸分子の少なくとも18個のヌクレオチド」とは、18個、19個、20個または21個のヌクレオチドが指示された性質を有することを意味する。「少なくとも」は、それが一連の数または範囲の前に存在する場合、一連の数または範囲内の各数を変更できると理解される。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「〜を超えない」または「未満」は、文脈から論理的なものとして、フレーズと論理的な下位値または整数に隣接する値からゼロまでの数と理解される。例えば、「2個を超えないヌクレオチド」のオーバーハングを有する二本鎖は、2個、1個または0個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。「〜を超えない」は、それが一連の数字または範囲の前に存在する場合、一連または範囲内の各数を変更できると理解される
【００５７】
本明細書で使用されるように、範囲は、上限および下限の両方を含む。
【００５８】
配列と、転写物または他の配列上のその示された部位との間に矛盾が生じた場合には、本明細書に記載されるヌクレオチド配列が優先される。
【００５９】
本明細書のさまざまな実施態様は、当業者によって適切に決定されるように組み合わせることができる。
【００６０】
本明細書で使用される「B型肝炎ウイルス」は、用語「HBV」と同義的に使用され、ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)に属する周知の非細胞変性性の肝向性DNAウイルスを意味する。
【００６１】
HBVゲノムは、重複した解読枠(リーディングフレーム)を有する部分的に二本鎖である環状DNAである(例えば、図1を参照のこと)。
【００６２】
HBVゲノムによってコードされる、大きさに基づく4つの転写物(本明細書では「遺伝子」または「オープンリーディングフレーム」と称することがある)がある。これらは、C、X、P、およびSと称されるオープンリーディングフレームを含有する。コアタンパク質は、遺伝子Cによってコードされる(HBcAg)。B型肝炎e抗原(HBeAg)は、pre-コア(pre-C)タンパク質のタンパク質分解プロセシングによって産生される。DNAポリメラーゼは、遺伝子Pによってコードされる。遺伝子Sは、表面抗原(HBsAg)をコードする遺伝子である。HBsAg遺伝子は、ラージ、ミドルおよびスモールS抗原と称される3つの異なるサイズのポリペプチド(pre-S1＋pre-S2＋S、pre-S2＋S、またはS)を生じさせる3つのインフレームの「開始」(ATG)コドンを含有する1つの長いオープンリーディングフレームである。表面抗原は、HBVのエンベロープを飾ることに加えて、ビリオン粒子に比べて過剰に産生されるサブウイルス粒子の一部でもあり、そして、免疫耐性や抗HBsAg抗体を隔離する役割を果たし、それによって感染性粒子が免疫検出から逃れることを可能にする。遺伝子Xによってコードされる非構造タンパク質の機能は十分に解明されていないが、転写のトランス活性化と複製に役割を持ち、肝癌の発症に関連していると考えられる。
【００６３】
HBVは、侵入、脱コーティング、および核へのウイルスゲノムの輸送を含む複数の段階を伴う複製過程において、逆転写酵素を利用する数少ないDNAウイルスの1つである。初めに、HBVゲノムの複製はRNA中間体の生成を伴い、これが次に逆転写されてDNAウイルスゲノムが産生される。
【００６４】
細胞がHBVに感染すると、ウイルスゲノムの弛緩した環状DNA(rcDNA)が細胞核に輸送され、エピソーム性の共有結合閉環状DNA(cccDNA)に変換されて、これがウイルスmRNAの転写鋳型として働く。転写および核外輸送した後、細胞質のウイルスプレゲノムRNA(pgRNA)は、HBVポリメラーゼおよびカプシドタンパク質と集合してヌクレオカプシドを形成し、その内部では、ポリメラーゼ触媒性逆転写によってマイナス鎖DNAが生じ、続いてこれがプラス鎖DNAにコピーされて子孫rcDNAゲノムが形成される。次いで、成熟ヌクレオカプシドは、ウイルスエンベロープタンパク質にパッケージされてビリオン粒子として出現するか、または核にシャトル輸送され、細胞内cccDNA増幅経路を介してcccDNAリザーバを増幅する。cccDNAは、HBV複製サイクルの必須の構成要素であり、感染の確立とウイルス持続性の役割を担っている。
【００６５】
HBV感染は、2つの異なる粒子を産生させる：1)感染性のHBVウイルスそれ自体(またはデーン(Dane)粒子)、これは、HBcAgから構築されるウイルスカプシドを含み、HBV表面抗原を有する脂質膜からなるエンベロープによって被覆されており、および2)サブウイルス粒子(またはSVP)、これは、非感染性のB型肝炎表面抗原HBsAgの小形態および中間形態を含有する。産生される各ウイルス粒子につき、10,000個を超えるSVPが血中に放出される。従って、SVP(およびそれらが担持するHBsAgタンパク質)は、血中のウイルスタンパク質の圧倒的大多数に相当する。HBV感染細胞はまた、HBVe抗原(HBeAg)と称されるプレコアタンパク質の可溶性タンパク質分解性産物も分泌する。
【００６６】
HBVの8個の遺伝子型はA〜Hと命名され、配列決定されており、また、さらなる2つの遺伝子型IとJが提案され、各々は異なる地理的分布を有する。このウイルスは非細胞変性性であり、ウイルス特異的な細胞性免疫が、HBVへの曝露の結果、すなわち6ヵ月で肝疾患の消散を伴う急性感染であるか、または高頻度で進行性肝傷害を伴う慢性HBV感染であるか、を決定する主な要因である。
【００６７】
用語「HBV」は、HBVのいずれかの遺伝子型(A〜J)を含む。HBVゲノムの参照配列の完全なコード配列は、例えば、GenBank受託番号GI：21326584(配列番号1)およびGI：3582357(配列番号3)に見出すことができる。アンチセンス配列はそれぞれ、配列番号2および配列番号4に示している。C、X、PおよびSタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、NCBI受託番号YP_009173857.1(Cタンパク質)(配列番号37)；YP_009173867.1およびBAA32912.1(Xタンパク質)(配列番号36および40)；YP_009173866.1およびBAA32913.1(Pタンパク質)(配列番号32および38)；およびYP_009173869.1、YP_009173870.1、YP_009173871.1、およびBAA32914.1(Sタンパク質)(配列番号33、34、35、39)に見出すことができる。HBV遺伝子型D、株aywからのタンパク質およびDNA配列は、配列番号36〜37に示している。HBV遺伝子からのタンパク質およびDNA配列は、配列番号38-39に示している。HBVタンパク質およびDNA配列のさらなる例、またはそれらの逆相補配列は、配列番号41-49に示している。
【００６８】
HBV mRNA配列のさらなる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、GenBank、UniProtおよびOMIMを使用して容易に入手できる。B型肝炎ウイルス株データの国際的リポジトリは、http：//www.hpa- bioinformatics.org.uk/HepSEQ/main.phpからアクセスできる。
【００６９】
本明細書で使用される用語「HBV」は、HBVゲノムの天然に存在するDNA配列変異、例えば遺伝子型A〜Jおよびそれらの変異体も意味する。
【００７０】
本明細書で使用される「D型肝炎ウイルス」は、用語「HDV」と同義的に使用され、ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)に属する周知の非細胞変性性の肝向性DNAウイルスを意味する。例えば、Ciancio and Rizzetto,Nat.Rev.11:68-71,2014;Le Gal et al.,Emerg.Infect.Dis.12:1447-1450,2006;およびAbbas and afzal,World J.Hep.,5:666-675,2013(これらは全て、引用により本明細書に包含される)を参照のこと。特に断りが無い限り、HDVは、HDVの全てのクレードおよび変異体を意味する。
【００７１】
HDVは1つのタンパク質、即ちHDAgを産生する。これには2つの形態、即ち27kDaのラージHDAg(これは、lHD、L-HDAgおよびラージHDV抗原とも称される)、および24kDaのスモールHDAg(これは、sHD、S-HDAgおよびスモールHDV抗原とも称される)がある。これらの2つの形態のN末端は同じであり、両者はラージHDAgのC末端が19アミノ酸だけ異なる。両方のアイソフォームは同じリーディングフレームから産生され、これは、コドン196にUAG終止コドンを含有し、通常はスモールHDAgのみを産生する。しかし、細胞性酵素アデノシンデアミナーゼ−１による編集によって終止コドンがUCGに変わると、ラージHDAgが産生される。これらの2つのタンパク質は90％同一の配列を有するにも関わらず、感染過程で異なる役割を果たす。HDAg-Sは感染初期に産生され、核に侵入してウイルス複製を補助する。対照的にHDAg-Lは、感染後期に産生され、ウイルス複製の阻害物質として働き、ウイルス粒子の集合に必要とされる。
【００７２】
HDV mRNA配列のさらなる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、GenBank、uNIpROT、およびOMIMを使用して容易に入手可能である。
【００７３】
本明細書で使用される用語「HDV」はまた、HDVゲノムの天然に存在するDNA配列変異も意味する。
【００７４】
本明細書で使用される用語「ヌクレオチ(シ)ドアナログ」または「逆転写酵素阻害物質」は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドと構造的に類似しており、HBV cccDNAの複製を特異的に阻害し、かつ宿主(例えば、ヒト)DNAの複製を有意に阻害しない、DNA複製の阻害物質である。このような阻害物質には、テノフォビルジソプロキシルフマレート(TDF)、テノフォビルアラフェナミド(TAF)、ラミブジン、アデフォビルジピボキシル、エンテカビル(ETV)、テルビブジン、AGX-1009、エムトリシタビン、クレブジン、リトナビル、ジピボキシル、ロブカビル、ファムビル、FTC、N-アセチル-システイン(NAC)、PC1323、theradigm-HBV、チモシン-アルファ、ガンシクロビル、ベシホビル(besifovir)(ANA-380/LB-80380)、およびテノフォビル-エキサリアデ(tenofvir-exaliade)(TLX/CMX157)がある。特定の実施態様において、ヌクレオチ(シ)ドアナログは、エンテカビル(ETV)である。ヌクレオチ(シ)ドアナログは、多くの供給先から市販されており、それらのラベル表示(例えば、典型的には特定の用量で経口投与される)に従って、またはHBVの処置において熟練した開業医によって決定されるように、本明細書で提供される方法で使用される。
【００７５】
本明細書で使用される「標的配列」は、一次転写産物のRNAプロセシングの産物であるmRNAを含む、HBV遺伝子の転写の際に形成されるmRNA分子のヌクレオチド配列の連続する部分を意味する。いくつかの実施形態において、配列の標的部分は少なくとも、HBV遺伝子の転写の際に形成されるmRNA分子のヌクレオチド配列における該標的部分で、またはその近くで、dsRNA物質が目的とする切断のための基質として働くのに十分な長さであろう。
【００７６】
標的配列は、約19〜21ヌクレオチド長、例えば、19、20または21ヌクレオチド長であり得る。
【００７７】
本明細書で使用される用語「配列を含む鎖」は、標準的なヌクレオチドの命名法を用いて言及される配列によって示されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
【００７８】
「G」、「C」、「A」、「T」および「U」はそれぞれ、一般に、塩基としてのグアニン、シトシン、アデニン、チミジンおよびウラシルを含有するヌクレオチドを意味する。しかし、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、以下にさらに詳述しているように、修飾ヌクレオチド、またはサロゲート置換部分(surrogate replacement moiety)(例えば表1を参照)も意味し得ることは理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルが、他の部分によって置換されても、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対の対合性を実質的には変化させないことを十分に認識している。例えば、限定はされないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対合し得る。したがって、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含有するヌクレオチドは、本明細書において特徴づけられるdsRNAのヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって置換されてもよい。別の例において、オリゴヌクレオチド中のいずれかの箇所のアデニンおよびシトシンはそれぞれ、グアニンおよびウラシルによって置換されて、標的mRNAとのG-Uゆらぎ塩基対合が形成され得る。このような置換部分を含有する配列は、本明細書において特徴づけられる組成物および方法に適している。
【００７９】
用語「dsRNA物質」、「RNAi物質」、「iRNA物質」、「iRNA」および「RNA干渉物質」は本明細書において同義的に使用され、その用語が本明細書において定義されるRNAを含有し、且つRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)経路を介してRNA転写物の標的化された切断を仲介する物質を意味する。dsRNA物質は、RNA干渉(RNAi)として知られているプロセスによってmRNAの配列-特異的な分解を指令する。dsRNA物質は、細胞、例えば哺乳動物対象などの対象中の細胞内でのHBV遺伝子(例えば、1つまたはそれ以上のHBV遺伝子)の発現を調節、例えば阻害する。
【００８０】
本明細書に開示される組成物、使用および方法において使用するための「dsRNA物質」は、二本鎖RNAであり、本明細書では、「dsRNA物質」、「二本鎖RNA物質」、「二本鎖RNA(dsRNA)分子」、「dsRNA」、「iRNA」、「iRNA物質」、「dsRNAi物質」、「RNAi物質」または「siRNA」と称される。用語「dsRNA」とは、リボ核酸分子の複合体を意味し、これは、標的RNA、すなわちHBV遺伝子に対して「センス」と「アンチセンス」の配向性を有することを意味する、2つの逆平行でかつ実質的に相補的な核酸の鎖を含む二重構造を有している複合体である。本明細書のいくつかの実施態様において、dsRNAは、本明細書でRNA干渉またはRNAiと称される、転写後の遺伝子サイレンシング機構を介して、標的RNA、例えばmRNAの分解を誘発する。
【００８１】
一般に、dsRNA分子のそれぞれの鎖は、リボヌクレオチドを含有することができるが、本明細書において詳細に記載しているように、それぞれの鎖または両方の鎖はまた、1つまたはそれ以上の非リボヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドも含み得る。さらに、本明細書で使用している「dsRNA物質」は、化学的修飾を有するリボヌクレオチドを含むことができ；dsRNA物質は、複数のヌクレオチドにおいて実質的な修飾を含んでもよい。本明細書で使用している用語「修飾ヌクレオチド」とは、独立して、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオチド間連結または修飾された核酸塩基を有するヌクレオチドを意味する。したがって、用語「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド間連結、糖部分または核酸塩基に対する、例えば官能基または原子の置換、付加または除去を包含する。本明細書の物質に使用するのに適当な修飾は、本明細書に開示されるかまたは当該技術分野において知られている全てのタイプの修飾を含む。dsRNA物質タイプの分子に使用されるいずれかのこのような修飾は、本明細書および特許請求の範囲の目的に沿った「dsRNA物質」に包含されている。
【００８２】
本明細書で使用している用語「阻害する」は、「低減する」、「サイレンシングする」、「ダウンレギュレートする」、「抑制する」および他の類似の用語と同義的に使用され、阻害のあらゆるレベルを含む。好ましくは、「阻害する」は、統計的に有意な阻害または臨床的に有意な阻害を含む。
【００８３】
本明細書で使用している語句「HBVの発現を阻害する」または「HBV遺伝子の発現を阻害する」には、HBV遺伝子(例えば、HBVウイルス感染においてHBVから発現されるHBV遺伝子、細胞において発現構成物から発現されるHBV遺伝子)、および、HBVタンパク質をコードするHBV遺伝子のバリアントまたは突然変異体の発現の阻害が含まれる。この用語には、1つまたはそれ以上のHBVウイルスタンパク質(例えば、pre-S1/2-S、pre-S、S、P、X、pre-CおよびCなど)をコードするHBV転写物(例えば、3.5kb、2.4kb、2.1kbまたは0.7kb転写物)のいずれか、およびHBV遺伝子のバリアントまたは突然変異体のノックダウンが含まれる。
【００８４】
「HBV遺伝子の発現を阻害する」には、HBV遺伝子または転写物のいずれかのレベルの阻害、例えば、少なくともHBV遺伝子、例えば、HBV遺伝子S、P、XもしくはC、またはそれらのいずれかの組み合わせ、例えば、S、PおよびCの発現の部分的な阻害が含まれる。HBV遺伝子の発現は、例えば、HBVmRNAレベルまたはHBVタンパク質レベル、またはHBV cccDNAレベルなどのHBV遺伝子と関連して変動できるレベルまたはレベルの変動に基づいて評価され得る。このレベルは、例えば、対象に由来するサンプルを含む、個々の細胞または細胞群において評価され、例えば、レベルは、血清においてモニターされ得る。阻害は、対照レベルと比較した、これらの変数の1つまたはそれ以上の絶対レベルまたは相対レベルの減少によって評価され得る。対照レベルは、当技術分野で利用されているいずれかのタイプの対照レベル、例えば、投与前のベースラインレベルであってもよく、または未処理、または対照物(例えば、緩衝剤のみの対照物または不活性剤の対照物)で処理された適切な対照対象、細胞またはサンプルからの類似の対象または個体群平均から決定されるレベルであってもよい。
【００８５】
本明細書の方法のいくつかの実施態様において、HBV遺伝子の発現は、少なくとも80％、85％、90％、95％、例えば、対象において、少なくとも1log10、2log10、3log10、4log10、またはアッセイの検出レベル未満にまで阻害される。好ましい実施態様において、対象におけるHBV遺伝子の発現の阻害は、臨床的に関連するレベルの遺伝子発現の阻害をもたらし、例えば、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて投与され、免疫応答を促進または増強する場合、十分に阻害され、HBVタンパク質に対する有効な免疫応答を可能にする。
【００８６】
インビトロ細胞を基本とするアッセイまたはインビボモデルにおける異種遺伝子の発現、例えば、本明細書で提供されるマウスAAV-hHBVモデルにおいて、少なくとも90％の総HBV発現の阻害が好ましく、例えば、少なくとも1log10、2log10または3log10である。HBV感染対象の処置において、HBV遺伝子またはタンパク質レベルの少なくとも90％の低減、すなわち、処置前後のHBV遺伝子またはタンパク質レベルの差が好ましい。所望のレベルの阻害を達成するためには、一回を超える回数の投与が必要となることがある。
【００８７】
HBV遺伝子の発現の阻害は、第一細胞または細胞群(このような細胞は、例えば、対象由来のサンプル中に存在し得る)によって発現されるRNAの数の低減によって顕在化されることがあり、ここで、第一細胞または細胞群におけるHBV遺伝子が転写され、第一細胞または細胞群が(例えば、本明細書のdsRNA物質と細胞を接触させることによって、または細胞が存在するまたは存在していた対象に本明細書のdsRNA物質を投与することによって)処置されることにより、第一細胞または細胞群と実質的には同じであるが、そのような処置がされていない第二細胞または細胞群(対照細胞)と比べて、HBV遺伝子の発現が阻害される。好ましい実施態様において、阻害は、10nM濃度の二本鎖を有する適切に適合した細胞株で行われるインビトロアッセイを用いた(参照により本明細書に援用される)WO2016/077321の実施例2に提供されているrtPCR法によって評価され、以下の式を用いて、処理された細胞内のmRNAのレベルを対照細胞内のmRNAのレベルの百分率として表す。
【数１】
2021533767.tif 000005
【００８８】
これに代えて、HBV遺伝子の発現の阻害は、HBV遺伝子の発現に機能的に関連するパラメーターの低減という観点から評価され得る。HBV遺伝子サイレンシングは、HBV遺伝子を発現するいずれかの細胞において、構成的にまたはゲノム工学的に、および当該技術分野で知られているいずれかのアッセイによって決定され得る。
【００８９】
HBVタンパク質の発現の阻害は、細胞または細胞群によって発現されるHBVタンパク質のレベル(例えば、対象に由来するサンプル中に発現されるタンパク質のレベル)の低減によって顕在化され得る。上記で説明したように、mRNA阻害の評価のために、処置された細胞または細胞群におけるタンパク質発現レベルの阻害は、同様に、対照細胞または細胞群におけるタンパク質レベルの百分率、または血清中のタンパク質レベルの百分率で表されてもよい。
【００９０】
HBV遺伝子の発現の阻害の評価に使用され得る対照細胞または細胞群には、本明細書のdsRNA物質と接触されていない細胞または細胞群がある。例えば、対照細胞または細胞群は、対象をdsRNA物質で処置する前の、個々の対象(例えばヒトまたは動物対象)に由来し得る。代替的な実施態様において、レベルは、適切な対照サンプル、例えば、知られている個体群対照サンプルと比較されてもよい。
【００９１】
細胞または細胞群によって発現されるHBV RNAのレベル、または血中HBV RNAのレベルは、mRNA発現を評価するための当技術分野で知られているいずれかの方法を用いて、好ましくはWO2016/077321の実施例2に提供されているrtPCR法を用いて決定され得る。いくつかの実施態様において、サンプル中のHBV遺伝子(例えば、総HBV RNA、HBV転写物、例えば、HBV 3.5kb転写物)の発現レベルは、転写されるポリヌクレオチドまたはその一部、例えば、HBV遺伝子のRNAを検出することによって決定される。RNAは、例えば、酸性フェノール/グアニジンイソチオシアネート抽出(RNAzol B;生物発生説)、RNeasy RNA調製キット(Qiagen(登録商標))またはPAX遺伝子(Preanalytix、スイス)を使用することを含むRNA抽出技術を用いて細胞から抽出され得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式には、核ランオンアッセイ、RT-PCR、RNase保護アッセイ(Meltonら、Nuc. Acids Res. 12:7035)、ノーザンブロッティング、インサイチュのハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイ分析がある。血中HBV mRNAは、WO2012/177906に記載されている方法を用いて検出することができ、この方法は参照により本明細書に援用される。
【００９２】
いくつかの実施態様において、HBV遺伝子の発現レベルは、核酸プローブを用いて測定される。本明細書で使用される用語「プローブ」とは、特定のHBV遺伝子に選択的に結合できる分子を意味する。プローブは、当業者によって合成されてもよく、適切な生物学的調製に由来してもよい。プローブは、ラベル付けされるように特別に設計されてもよい。プローブとして利用され得る分子の例として、RNA、DNA、タンパク質、抗体および有機分子があるが、これらに限定されない。
【００９３】
単離されたRNAは、ノーザン分析、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)分析およびプローブアレイを含むがこれらに限定されないハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに使用され得る。mRNAレベルを測定する1つの方法は、単離されたRNAを、HBV mRNAにハイブリダイズし得る核酸分子(プローブ)と接触させることを伴う。いくつかの実施態様において、例えば、mRNAは、単離されたRNAをアガロースゲル上でランニングさせ、mRNAをゲルからニトロセルロースなどの膜に移送することによって、個体表面に個体化され、プローブに接触さる。いくつかの他の実施態様において、プローブは固体表面に個体化され、mRNAは、例えば、Affymetrix(登録商標)遺伝子チップアレイでプローブと接触される。当業者は、HBV mRNAのレベルの測定に使用するための、知られているmRNA検出方法を容易に適応させることができる。
【００９４】
サンプル中のHBV遺伝子の発現レベルを測定するための代替的な方法は、例えば、RT-PCR(Mullis, 1987,米国特許第4,683,202号に記載の実験的実施態様)、リガーゼ連鎖反応(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193)、自己継代配列複製(Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅系(Kwohら（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Q-βレプリカーゼ(Lizardiら(1988) Bio/Technology 6:1197)、ローリングサークルレプリケーション複製(Lizardiら、米国特許第5,854,033号)、または他の核酸増幅方法のいずれかによる、例えば、サンプル中のmRNAの核酸増幅または逆転写酵素(cDNAを調製する)の段階を含み、続いて、当業者によく知られている技術を用いて増幅分子を検出する。これらの検出スキームは、そのような分子が非常に少ない数で存在する場合に、核酸分子の検出に特に有用である。本明細書の特定の態様において、HBV遺伝子の発現のレベルは、例えば、本明細書で提供される方法を用いて、定量的な蛍光性RT-PCR(すなわち、TaqManTMシステム)によって測定される。
【００９５】
HBV RNAの発現レベルは、メンブレンブロット(ノーザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析に使用されるようなもの）、またはマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズ、ファイバー(または結合核酸を含むいずれかの固体支持体)を用いてモニターされ得る。このような方法に関連する教示については、参照により本明細書に援用される米国特許第5,770,722号、同第5,874,219号、同第5,744,305号、同第5,677,195号および同第5,445,934号を参照のこと。HBV発現レベルの測定には、溶液中の核酸プローブを使用することも含んでもよい。
【００９６】
好ましい実施態様において、RNA発現のレベルは、実時間PCR(qPCR)を用いて評価される。これらの方法の使用は、WO2016/077321の実施例2に記載され、例示されている。
【００９７】
HBVタンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための当該分野で知られているいずれかの方法を用いて測定され得る。このような方法には、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、超拡散(hyperdiffusion)クロマトグラフィー、流体またはゲル沈殿反応、吸収分光法、比色分析法、分光光度法アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散(シングルまたはダブル)、免疫電気泳動法、ウェスタンブロッティング、放射免疫測定法(RIA)、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどがある。
【００９８】
dsRNA物質
二本鎖領域は、RISC経路を介した所望の標的RNAの特異的な分解を可能にするいずれかの長さのものであってもよく、約19〜21塩基長の対の範囲、例えば、約19、20または21塩基長の対であり得る。本明細書で提供する例示的なdsRNA物質には、19〜21塩基対の長さの二本鎖が含まれる。
【００９９】
dsRNAの2本の実質的に相補的な鎖が、別個のRNA分子に含まれる場合、それらの分子は、共有結合されている必要はないが、共有結合されていてもよい。2本の鎖が、二本鎖構造を形成する一方の鎖の3’末端とその他方の鎖の5’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖以外の手段によって共有結合されている場合、その連結構造は、「リンカー」と称される。2本のRNA鎖は、同じかまたは異なる数のヌクレオチドを有することができる。塩基対の最大数は、dsRNAの最も短い鎖のヌクレオチドの数から、二本鎖に存在するオーバーハングを引いた数である。二本鎖構造に加えて、dsRNA物質は、1つまたはそれ以上のヌクレオチドオーバーハングを含むことができる。
【０１００】
本明細書で使用している用語「ヌクレオチドオーバーハング」とは、二本鎖のdsRNA物質の二本鎖構造から突出する、少なくとも1つの不対ヌクレオチドを意味する。例えば、dsRNAの一方の鎖の3’末端が、他方の鎖の5’末端を越えて延びるかまたはその逆である場合、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。dsRNAは、少なくとも1つのヌクレオチドのオーバーハングを含むことができるが、或いはオーバーハングは、2つのヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド/ヌクレオシドを含むヌクレオチド/ヌクレオシドアナログを含むか、またはそれからなることができる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖またはそれらのいずれかの組み合わせに存在し得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチドは、dsRNAのアンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかの5’末端、3’末端または両方の末端に存在し得る。好ましい実施態様において、ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の3'末端に存在する。
【０１０１】
「平滑な」または「平滑末端」とは、二本鎖dsRNA物質のその末端に不対ヌクレオチドが存在しない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端」dsRNA物質は、その全長にわたって二本鎖である、すなわち、該分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないdsRNAである。いくつかの実施態様において、本明細書のdsRNA物質は、一方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するdsRNA物質(すなわち、1つのオーバーハングおよび1つの平滑末端を有するdsRNA物質)または両方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するdsRNA物質を含む。
【０１０２】
用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」とは、標的配列、例えばHBV mRNAに実質的に相補的な領域を含むdsRNA物質の鎖を意味する。本明細書で使用している用語「相補的な領域」とは、本明細書で定義されている、配列、例えば標的配列、例えばHBVヌクレオチド配列に実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を意味する。相補的な領域が、標的配列と完全には相補的でない場合、その分子の内部領域または末端領域にミスマッチが存在し得る。一般に、ほとんどの許容されるミスマッチは、末端領域、例えばdsRNA物質の5’末端および/または3’末端の5、4、3、2または1個のヌクレオチド内にある。いくつかの実施態様において、本明細書のdsRNA物質は、アンチセンス鎖にヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施態様において、本明細書のdsRNA物質は、センス鎖にヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施態様において、ヌクレオチドミスマッチは、例えばdsRNA物質の3’末端からの5、4、3、2または1個のヌクレオチド内にある。いくつかの実施態様において、ヌクレオチドミスマッチは、例えばdsRNA物質の3’末端ヌクレオチドにある。
【０１０３】
本明細書で使用している用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」とは、その用語が本明細書で定義されているアンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含むdsRNA物質の鎖を意味する。
【０１０４】
本明細書で使用している用語「相補的」とは、特に明記しない限り、当業者により理解されるように、第1のヌクレオチド配列を第2のヌクレオチド配列と関連して説明するのに使用する場合、第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定の条件下で、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を意味する。このような条件は、例えばストリンジェントな条件であることができ、ここで、ストリンジェントな条件は、400mMのNaCl、40mMのPIPES(pH6.4)、1mMのEDTA、50℃または70℃で12〜16時間と、それに続く洗浄を含み得る(例えば“Molecular Cloning：A Laboratory Manual， Sambrook,et al.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと）。生物の内部で起こり得る生理学的に関連した条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な適用に従って、2つの配列の相補性試験に最も適切な条件のセットを決定することができるであろう。
【０１０５】
dsRNA物質内、例えば、本明細書に記載されるdsRNA内の相補的配列は、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対する第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対を含む。このような配列は、本明細書において互いに対して「完全に相補的」と称され得る。しかしながら、本明細書において第1の配列が第2の配列に対して「実質的に相補的」と称される場合、2つの配列は、完全に相補的であるか、または、それらの最終的な適用、例えば、RISC経路を介した遺伝子発現の阻害に最適な条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、最大で21塩基対の二本鎖に対するハイブリダイゼーションを行うと、それらは、1個またはそれ以上であるが、一般に、4個、3個または2個を超えないミスマッチ塩基対を形成することがある。しかしながら、2つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション後に1つまたはそれ以上の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、このようなオーバーハングは、相補性決定に関してはミスマッチと見做されないものとする。例えば、21ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドと、23ヌクレオチド長の他方のオリゴヌクレオチドとを含むdsRNAは、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な21ヌクレオチドの配列を含む場合、本明細書に記載の目的のために、「完全に相補的」と称することができる。
【０１０６】
本明細書で使用している「相補的な」配列はさらに、それらのハイブリダイズする能力に関連した上記の要求が満たされる限りにおいて、非ワトソン−クリック塩基対または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含んでもよく、そのような塩基対から完全に形成されてもよい。このような非ワトソン−クリック塩基対としては、G：Uゆらぎ(G:U Wobble)またはフーグスティーン(Hoogstein)型塩基対が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
本明細書における用語「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」は、それらの使用の状況から理解されるように、dsRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖との間で、またはdsRNA物質のアンチセンス鎖と標的配列との間で適合する塩基に関連して使用することができる。複数のHBV遺伝子型が知られていることが理解されている。したがって、1つのHBV遺伝子型に完全に相補的であるように設計されたdsRNA物質は、すべてのHBV遺伝子型に完全に相補的ではないことがある。特定の部位を標的としたdsRNA物質は、すべての遺伝子型にわたって完全に相補的でなくても、複数の遺伝子型にわたって標的ノックダウンにおいて有効である。
【０１０８】
本明細書で使用されるように、メッセンジャーRNA(mRNA)の「少なくとも一部に実質的に相補的」であるポリヌクレオチドとは、目的のmRNA(例えば、HBV遺伝子をコードするmRNA)の連続する部分に実質的に相補的であるポリヌクレオチドを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がHBV遺伝子をコードするmRNAの連続した部分に実質的に相補的である場合、少なくともHBV mRNAの一部に相補的である。
【０１０９】
したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的HBV配列に完全に相補的である。他のいくつかの実施態様において、本明細書に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは標的HBV配列に実質的に相補的であり、配列番号1のヌクレオチド配列、または配列番号1の断片の等価領域全長にわたって少なくとも80％相補的で、例えば、少なくとも80％、85％、90％または95％相補的である連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１１０】
いくつかの実施態様において、本明細書のdsRNA物質は、アンチセンスポリヌクレオチドと実質的に相補的なセンス鎖を含み、次にはそのアンチセンスポリヌクレオチドが標的HBV配列と相補的であり、ここで、センス鎖ポリヌクレオチドは、配列番号2のヌクレオチド配列の等価領域とその全長にわたって少なくとも約80％相補的で、例えば、少なくとも85%、90%または95%相補的である連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１１１】
いくつかの実施態様において、dsRNA物質は、標的HBV配列と実質的に相補的なアンチセンス鎖を含み、表2におけるいずれか1つのセンスヌクレオチド配列のヌクレオチド配列、または表2におけるいずれか1つのセンスヌクレオチド配列断片の等価領域とその全長にわたって少なくとも80%相補的で、例えば、少なくとも85%、90%または95%相補的である連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１１２】
本明細書に詳細に記載されるように、それぞれのまたは両方の鎖はまた、1つまたはそれ以上の非リボヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含み得る。さらに、dsRNA物質は、化学的修飾を有するリボヌクレオチドを含み得る。このような修飾は、本明細書に開示されているか、または当技術分野で知られているすべてのタイプの修飾を含み得る。dsRNA物質に使用されるこのような修飾のいずれかは、本明細書および特許請求の範囲の目的のために「dsRNA物質」によって包含され得る。
【０１１３】
いくつかの実施態様において、それぞれの鎖のヌクレオチドの大多数はリボヌクレオチドであるが、本明細書に詳細に記載されるように、それぞれのまたは両方の鎖はまた、1つまたはそれ以上の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドも含み得る。さらに、dsRNA物質は、化学的修飾を有するリボヌクレオチドを含み得る。このような修飾は、本明細書に開示されるか、または当該技術分野において知られているすべてのタイプの修飾を含み得る。dsRNA物質に使用されるこのような修飾のいずれかは、本明細書および特許請求の範囲の目的のために「dsRNA物質」によって包含される。
【０１１４】
対象におけるHBV遺伝子発現もしくはHBVタンパク質産生、または疾患マーカーまたは症状のレベルの状況で用語「より低い」とは、そのようなレベルの統計学的に有意な低減を意味する。低減は、例えば、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または検出方法の検出のレベル未満、または正常レベルに向かうレベルまたは正常レベルに到達するレベル(ゼロであってもよく、ゼロでなくてもよい)であり得る。HBV感染のモニタリングにおいて、log10スケールは一般に、抗原血症のレベル(例えば、血清中HBsAgレベル)またはウイルス血症のレベル(血清中HBV DNAレベル)を説明するのに使用される。1log10の低減は90％の低減(残り10％)、2log10の低減は99％の低減(残り1％)などであると理解される。特定の実施態様において、疾患マーカーは検出のレベル未満にまで低減する。特定の実施態様において、該方法は、例えば、HBVの発現を低減させる物質で対照を処置した後に臨床的に関連した転帰によって証明される、HBVの発現の臨床的に関連した阻害を含む。いくつかの実施態様において、HBV遺伝子の発現の少なくとも部分的な阻害は、第一細胞または細胞群(該細胞または細胞群中のHBV遺伝子が転写され、または該細胞が処理されることにより、第一細胞または細胞群と実質的には同じであるが、そのような処理がされていない第二細胞または細胞群(対照細胞)と比べて、HBV遺伝子の発現が阻害される)から単離され得るHBV mRNAの数の低減によって評価される。
【０１１５】
特定の実施態様において、「より低い」または「低減」は、レベルを正常レベルに向かって、または正常レベルまでに低下、または低減させる、すなわち、レベルを正規化すると理解される。特定の実施態様において、標的の発現は、そのような障害を有しない個体の正常範囲内として認められるレベルに正規化され、例えば、ALTまたはASTなどの疾患マーカーのレベルが、そのような障害を有しない個体の正常範囲内として認められるレベルまで低減する。疾患関連レベルが正常レベルから上昇している場合、変化は正常レベルの上限(ULN)から計算される。疾患関連レベルが正常レベルから低減している場合、変化は正常レベルの下限(LLN)から計算される。低減とは、対象値と正常値との間の変化のパーセント差のことである。例えば、ASTの正常レベルは、1リットル当たり10〜40単位で報告され得る。処置前のASTレベルが1リットル当たり200単位、すなわちULNの5倍、1リットル当たり正常レベルの上限を超える160単位である対象が、処置後のASTレベルが1リットル当たり120単位、すなわちULNの3倍、1リットル当たり正常レベルの上限を超える80単位であれば、上昇したASTが正常に向かって50％(80/160)低減することになる。
【０１１６】
別の例として、ALTの正常レベルは一般に、1リットル当たり7〜55単位(U/L)とされており、正常レベルの上限を55U/Lとしている。処置前のALTレベルが100U/L(正常レベルの上限を45U/L超)、処置後のALTレベルが75U/L(25U/L低減)である対象のALTは、正常値に向かって55％(25/45×100％)低減することになる。本明細書で使用されるように、疾患が症状値の上昇に関連している場合、「正常」は正常レベルの上限であると見なされる。疾患が症状値の低減に関連している場合、「正常」は正常レベルの下限であると見なされる。
【０１１７】
本明細書で使用される語句「細胞をdsRNA物質と接触させる」、例えばdsRNAと接触させるとは、いずれかの可能な手段で細胞を接触させることを含む。細胞をdsRNA物質と接触させることは、インビトロで細胞をdsRNA物質と接触させること、またはインビボで細胞をdsRNA物質と接触させることを含む。接触は、直接に行われてもよく、間接的に行われてもよい。したがって、例えば、dsRNA物質は、方法を行う個人によって細胞と物理的に接触させてもよく、あるいは、dsRNA物質は、それが細胞と接触することを可能にするか、またはその後引き起こすような状況に置かれてもよい。
【０１１８】
細胞をインビトロで接触させることは、例えば、細胞を、dsRNA物質を用いてインキュベートすることによって行われ得る。細胞をインビボで接触させることは、例えば、dsRNA物質を細胞が位置する組織内またはその近傍に注射することによって、またはdsRNA物質を別の領域、例えば血流または皮下腔に注射することによって、その後、接触される細胞が位置する組織に該物質が到達するように行われ得る。例えば、dsRNA物質は、dsRNA物質を目的の部位、例えば肝臓に誘導するリガンド、例えばGalNAc3を含有するか、またはそれにカップリングされ得る。インビトロとインビボでの接触方法の組み合わせも可能である。例えば、細胞はインビトロでdsRNA物質と接触され、続いて対象に移植されることもある。
【０１１９】
いくつかの実施態様において、細胞をdsRNA物質と接触させることは、細胞内への取り込みまたは吸収を促進するか、またはもたらすことによって、「dsRNA物質を細胞内に導入する」または「dsRNA物質を細胞内に送達する」ことを含む。dsRNA物質の吸収または取り込みは、自発的拡散性もしくは活性化細胞性段階を介して、または助剤または装置によって行われ得る。dsRNA物質の細胞内への導入は、インビトロで行われてもよく、インビボで行われてもよい。例えば、インビボでの導入について、dsRNA物質は、組織部位に注射されてもよく、全身的に投与されてもよい。細胞内へのインビトロでの導入には、エレクトロポレーションやリポフェクションなどの当該分野で知られている方法が含まれる。さらなるアプローチは、本明細書で以下に記載されるか、または当技術分野で知られている。
【０１２０】
本明細書で使用されるように、「対象」は、HBVに感染され得るいずれかの哺乳動物、例えば霊長類(例えばヒト、非ヒト霊長類、例えば、サルまたはチンパンジー)を含む哺乳動物などの動物、または、HBV感染の許容される臨床的モデルと見做される動物である動物であるHBV-AAVマウスモデル(例えば、Yang et al. (2014) Cell and Mol Immunol 11:71を参照のこと)またはHBV 1.3xfsトランスジェニックマウスモデル(Guidotti et al. (1995) J. Virol. 69:6158)である。いくつかの実施態様において、対象はB型肝炎ウイルス(HBV)感染を有する。いくつかの実施態様において、対象は、B型肝炎ウイルス(HBV)感染症およびD型肝炎ウイルス(HDV)感染症の両方を有する。いくつかの実施態様において、対象はヒト、例えば、HBV感染症、特にB型慢性肝炎ウイルス(HBV)感染症を有するヒトである。
【０１２１】
本明細書で使用されるように、用語「処置する」または「処置」とは、限定はされないが、望ましくないHBV遺伝子発現またはHBV複製に関連する1つまたはそれ以上の徴候または症状、例えば、血清または肝臓HBV ccc DNAの存在；血清中HBV DNAの存在；血清または肝臓HBV抗原、例えばHBsAgまたはHBeAgの存在；ALTの上昇；ASTの上昇(正常範囲は一般に、約10〜34U/Lと見做せる)；抗HBV抗体の不在または低レベル、肝傷害；肝硬変；デルタ肝炎、急性B型肝炎；急性B型劇症肝炎；慢性B型肝炎；肝線維症；末期肝疾患；肝細胞癌；血清病様症候群；摂食障害；悪心；嘔吐、軽度の発熱；筋肉痛；易疲労感；味覚および嗅覚障害(食物およびタバコ忌避)；右上腹部痛および心窩部痛(間欠性、軽度から中等度)；肝性脳症；傾眠；睡眠パターンの乱れ；精神錯乱；昏睡；腹水；胃腸出血；凝血異常；黄疸；肝腫大(軽度に肥大した軟らかい肝臓)；脾腫大；手掌紅斑；クモ状母斑；筋肉の消耗；クモ状血管腫；脈管炎；静脈瘤出血；末梢性浮腫；女性化乳房；精巣萎縮；腹部側副静脈(メズサの頭(caput medusa))； ASTレベルより高いALTレベル；γ−グルタミルトランスペプチダーゼ(GGT)(正常範囲は一般に、約8〜65U/Lであると見做せる)およびアルカリホスファターゼ(ALP)レベルの上昇(正常範囲は、一般に約44〜147IU/L(リットル当たり国際単位)であると見做せ、ULNの3倍を超えない)；やや低いアルブミンレベル；血清鉄レベルの上昇；白血球減少症(すなわち、顆粒球減少症)；リンパ球増加症；赤血球沈降速度(ESR)の増加；赤血球寿命の短縮；溶血；血小板減少症；国際標準化比(INR)の延長；血清または肝臓HBsAg、HBeAg、B型肝炎コア抗体(抗HBc)免疫グロブリンM(IgM)の存在；B型肝炎表面抗体(抗HBs)、B型肝炎e抗体(抗HBe)またはHBV DNAの存在；ビリルビンレベルの増加；高グロブリン血症；抗平滑筋抗体(ASMA)または抗核抗体(ANA)などの組織非特異的抗体の存在(10〜20％)；甲状腺に対する抗体などの組織特異的抗体の存在(10〜20％)；リウマチ因子(RF)レベルの上昇；血小板数および白血球数の低減；小葉の、変性および修復性肝細胞変化を伴う付随する炎症；および検出可能か検出不能かに関わらず主に小葉中心性の壊死の軽減または改善を含めた、有益なまたは所望の結果を意味する。肝線維症を発症する可能性は、例えば、肝線維症、例えば慢性B型肝炎感染症のリスク要因を1つまたはそれ以上有する個体が肝線維症を発症しないか、または同じリスク要因を有し且つ本明細書に記載されるとおりの処置を受けていない個体群と比較して低い重症度で肝線維症を発症するとき、低減する。疾患、障害または病態が発症しないこと、またはそのような疾患、障害または病態に関連する徴候または症状の発症が(例えば、臨床的に適切な量で)低減すること、または徴候または症状の(例えば、数日、数週間、数ヵ月または数年の)遅延を呈することは、有効な予防と見なされる。「処置」はまた、処置の不在の場合の予想される生存と比較して、生存を延長することを意味し得る。予防には一回を超える回数の投与が必要な場合がある。
【０１２２】
好ましい実施態様において、HBV感染症の処置により、B型肝炎の「機能的治癒」をもたらす。本明細書で使用されるように、機能的治癒は、血中HBsAgのクリアランスとして理解され、好ましくは、臨床的に関連するアッセイを用いてHBsAg抗体が検出可能となる状態への転換を伴う。例えば、検出可能な抗体は、化学発光の微粒子イムノアッセイ(CMIA)、または抗HBsセロコンバージョンと称される他のいかなる免疫測定法によって測定されるように、10mIU/mlよりも高いシグナルを含み得る。機能的治癒は、HBVのすべての複製型(例えば、肝臓からのcccDNA)のクリアランスを必要としない。抗HBsセロコンバージョンは、一年あたり約0.2〜1％の慢性感染者で自然に起こる。しかしながら、抗HBsセロコンバージョン後も、HBVの低レベルの持続性は数十年にわたって観察され、これは完全な治癒ではなく機能的な治癒が起こることを示している。メカニズムに縛られることなく、免疫系がHBVを阻害することができることが提案されている。機能的治癒は、HBV感染の処置を中止することを可能にする。しかしながら、HBV感染に対する「機能的治療」は、HBV感染に起因する疾患または病態、例えば肝線維症、HCC、肝硬変などを予防または処置するのに十分ではない可能性があることが理解されている。
【０１２３】
本明細書で使用されるように、用語「B型肝炎ウイルス関連疾患」または「HBV関連疾患」は、HBV感染または複製によって引き起こされるか、またはそれに関連する疾患または障害である。用語「HBV関連疾患」は、HBV遺伝子発現または複製の低減から利益が得られる疾患、障害または病態を含む。HBV関連疾患の非限定的な例としては、例えば、D型肝炎ウイルス感染症、デルタ肝炎、急性B型肝炎；急性B型劇症肝炎；慢性B型肝炎；肝線維症；末期肝疾患；および肝細胞癌が挙げられる。
【０１２４】
いくつかの実施態様において、HBV関連疾患はD型肝炎ウイルス感染症である。D型肝炎ウイルスまたはデルタ型肝炎ウイルス(HDV)はヒト病原体である。しかしながら、このウイルスは欠損ウイルスであり、B型肝炎ウイルス(HBV)によって提供される必須ヘルパー機能に依存して伝染し；実際、HDVが感染性になって増殖するには、関連または既存HBV感染、詳細にはB型肝炎の表面抗原を含有するウイルスエンベロープが必要である。HDVは、HBVに関連する重篤な急性型および慢性型の肝疾患につながり得る。D型肝炎感染またはデルタ肝炎は、いくつかのアフリカ諸国、アマゾン地方、および中東に極めて特有の風土病であり、一方、工業先進国では、地中海沿岸地域を除きその有病率が低い。
【０１２５】
HDVの伝染はHBVとの同時感染によって起こり得るか(共感染)、または、B型慢性肝炎またはB型肝炎保菌状態に重ねて起こり得る(重感染)。HDVとの重感染および共感染の両方は、HBV単独の感染と比較してより重篤な合併症に至る。これらの合併症には、急性感染症における肝不全、および慢性感染症における肝硬変への急速な進行と、肝癌の発症を経験するより高い可能性が含まれる。B型肝炎ウイルスとの組み合わせで、D型肝炎は全ての肝炎感染症のなかで20％の最も高い致死率を有する。
【０１２６】
いくつかの実施態様において、HBV関連疾患は急性B型肝炎である。急性B型肝炎には、6ヵ月未満続く肝臓の炎症が含まれる。B型急性肝炎の典型的な症状は、疲労、摂食障害、悪心および嘔吐である。極めて高いアミノトランスフェラーゼ値(＞1000U/L)および高ビリルビン血症は多くの場合に観察される。急性B型肝炎の重症例は、不十分な肝臓の合成機能を特徴とする急性肝不全へ急速に進行し得る。これは、多くの場合に、先行肝疾患がない場合に16秒のプロトロンビン時間(PT)または1.5の国際標準化比(INR)として定義される。急性B型肝炎は慢性B型肝炎に発展し得る。
【０１２７】
いくつかの実施態様において、HBV関連疾患は慢性肝炎である。慢性B型肝炎(CHB)には、6ヵ月超続く肝臓の炎症が含まれる。CHBを有する対象は、HBsAg陽性であり、高ウイルス血症(≧104HBV-DNAコピー/mlの血液)または低ウイルス血症(<103HBV-DNAコピー/mlの血液)のいずれかを有する。いくつかの実施態様において、対象は少なくとも5年間HBVに感染している。いくつかの実施態様において、対象は少なくとも10年間HBVに感染している。いくつかの実施態様において、対象は出生時にHBVに感染した。慢性B型肝炎疾患を有する対象は免疫寛容を有するか、または活動性疾患のエビデンスがない非活動性慢性感染を有することがあり、またこれらは無症候性でもある。慢性活動性肝炎患者は、特に複製状態中に、急性肝炎と同程度の症状を有し得る。慢性B型肝炎疾患を有する対象は、壊死性炎症性肝疾患を伴う活動性慢性感染を有するか、検出可能な壊死性炎症が不存在中での肝細胞ターンオーバーの増加を有するか、活動性疾患のいずれかのエビデンスがない非活動性慢性感染を有することがあり、またこれらは無症候性でもある。CHB対象におけるHBV感染の持続性は、ccc HBV DNAによるものである。いくつかの実施態様において、CHBを有する対象はHBeAg陽性である。別の実施態様において、CHBを有する対象はHBeAg陰性である。CHBを有する対象は、105未満の血清HBV DNAレベル、およびトランスアミナーゼ、例えばALT、ASTおよびγ−グルタミルトランスフェラーゼの持続的上昇を有する。CHBを有する対象は、4未満の肝生検スコア(例えば、壊死性炎症性スコア)を有し得る。
【０１２８】
いくつか実施態様において、HBV関連疾患は急性B型劇症肝炎である。急性B型劇症肝炎を有する対象は、急性肝炎の症状、ならびに、(肝臓が化学物質を解毒できないことに起因する)錯乱または昏睡および(血液凝固因子の不足に起因する)紫斑または出血のさらなる症状を有する。
【０１２９】
HBV感染、例えばCHBを有する対象は、肝線維症を発症し得る。従って、いくつかの実施態様において、HBV関連疾患は肝線維症(iver fibrosis)である。肝線維症または肝硬変は、組織学的には、線維症(過剰な線維性結合組織)、および正常肝臓構造から異常な結節への構造上変化を特徴とするびまん性肝病変と定義される。
【０１３０】
HBV感染、例えばCHBを有する対象は、末期肝疾患を発症し得る。従って、いくつかの実施態様において、HBV関連疾患は末期肝疾患である。例えば、肝線維症は、肝線維症(すなわち、非代償性肝)の結果として、体が例えば肝機能の低減をこれ以上代償することができず、例えば精神的および神経学的症状ならびに肝不全が引き起こされる点まで進行し得る。
【０１３１】
HBV感染、例えばCHBを有する対象は、悪性肝癌とも称される肝細胞癌(HCC)を発症し得る。従って、いくつかの実施態様において、HBV関連疾患はHCCである。HCCは、CHBを有する対象に発症することが多く、線維層板型、偽腺性(腺様)、多形性(巨細胞型)または明細胞であり得る。
【０１３２】
「HDV関連障害」または「D型肝炎ウイルス関連障害」は、HDVの発現に関連する疾患または障害である。例示的HDV関連障害としては、B型肝炎ウイルス感染、急性B型肝炎(acute hepatits B)、急性D型肝炎；急性D型劇症肝炎；慢性D型肝炎；肝線維症；末期肝疾患；および肝細胞癌が挙げられる。
【０１３３】
本明細書で使用される「治療有効量」は、HBV感染またはHBV関連疾患を有する対象を処置するために患者に投与したとき、(例えば既存の疾患または疾患の1つまたはそれ以上の症状を減弱させるか、または維持することにより)疾患の処置を引き起こすのに十分なdsRNA物質の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、dsRNA物質、この物質の投与方法、疾患およびその重症度、病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、HBV遺伝子発現によって媒介される病理学的過程の段階、先行または併用処置があればそれらの種類、ならびに処置される患者の他の個別的な特性に応じて異なり得る。治療有効量は、一回を超える回数の投与を必要とすることがある。
【０１３４】
「治療有効量」はまた、いずれかの処置に適用可能な妥当な利益/リスク比でいくつかの所望の効果を生じさせるdsRNA物質の量も含む。本明細書の方法で用いられるdsRNA物質は、そのような処置に適用可能な妥当な利益/リスク比を生じさせるのに十分な量で投与され得る。
【０１３５】
本明細書で使用される用語「試料」は、対象から単離される類似の体液、細胞、または組織、ならびに対象の内に存在する体液、細胞、または組織の採取物を含む。生体液の例としては、血液、血清、および漿膜液、血漿、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織試料には、組織、臓器または局所領域からの試料が含まれ得る。例えば、試料は、特定の臓器、臓器の一部、またはそれらの臓器内にある体液もしくは細胞に由来し得る。特定の実施態様において、試料は、肝臓(例えば、全肝臓または肝臓の特定の部分、または例えば肝細胞などの肝臓の特定のタイプの細胞)に由来し得る。好ましい実施態様において、「対象に由来する試料」とは、対象から採取される血液から得られる血漿または血清を意味する。さらなる実施態様において、「対象に由来する試料」とは、対象に由来する肝組織(またはそのサブコンポーネント)または血液組織(またはそのサブコンポーネント、例えば血清)を意味する。
【０１３６】
II.dsRNA物質
本明細書は、1つまたはそれ以上のHBV遺伝子の発現を阻害するdsRNA物質を提供する。いくつかの実施態様において、dsRNA物質は、HBV関連疾患、例えばB型慢性肝炎を有する対象、例えば、ヒトなどの哺乳動物の体内の細胞などの細胞内でのHBV遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を含む。dsRNA物質は、HBV遺伝子の発現中に形成されるmRNAの少なくとも一部に対して相補的である相補的な領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補的な領域は、約19〜21ヌクレオチド長である。HBV遺伝子を発現する細胞と接触すると、dsRNA物質は、例えば、PCRまたは分岐状DNA(bDNA)に基づいた方法、または例えば、ウェスタンブロット法またはフローサイトメトリー技術を用いた免疫蛍光分析などによるタンパク質に基づいた方法によってアッセイされる際にHBV遺伝子の発現を少なくとも80％阻害する。好ましい実施態様において、阻害の百分率は、実施例2で提供される実時間PCR方法を用いて、そこで提供される細胞株を、トランスフェクションにおいて10nMの濃度で使用されるdsRNA物質とともに用いて測定される。
【０１３７】
dsRNAは、2本のRNA鎖を含み、この2本のRNA鎖は、相補的であり、dsRNAが使用される条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。dsRNAの1本の鎖(アンチセンス鎖)は、標的配列に実質的に相補的で、一般に完全に相補的である相補的な領域を含む。ただし、HBV遺伝子型間の配列の違いにより、dsRNAはすべてではないが一部のHBV遺伝子型に完全に相補的であり得る。標的配列は、HBV遺伝子の発現中に形成されるmRNAの配列に由来し得る。他方の鎖(センス鎖)は、アンチセンス鎖に相補的である領域を含み、2本の鎖がハイブリダイズして、適当な条件下で組み合わされた際に二本鎖構造を形成するようになっている。本明細書のいずれかの箇所に記載されるように、および当該技術分野において知られているように、dsRNAの相補的配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるのと対照的に、1つの核酸分子の自己相補的領域として含有されることもある。
【０１３８】
一般に、二本鎖構造は、19〜21塩基対の長、例えば19、20または21塩基対の長である。
【０１３９】
同様に、標的配列の相補的な領域は、19〜23ヌクレオチド長、例えば、19〜23、19〜22、19〜21、19〜20、20〜23、20〜22、20〜21、21〜22、19、20、21、22または23ヌクレオチド長である。いくつかの実施態様において、相補的な領域は21ヌクレオチド長である。当業者がやはり認識するように、切断のために標的化されたRNAの領域は、ほとんどの場合、より大きいRNA分子(mRNA分子であることが多い)の一部である。関連する場合、mRNA標的の「一部」は、RNAi指向性の切断(すなわち、RISC経路を介した切断)のための基質であるのが可能であるほど十分な長さのmRNA標的の連続する配列である。
【０１４０】
二本鎖領域が、dsRNAの一次機能部分、例えば、約19〜21塩基対、例えば、19〜21、19〜20、20〜21、19、20または21塩基対の二本鎖領域であることも当業者は認識するであろう。いくつかの実施態様において、二本鎖領域は19塩基対である。
【０１４１】
本明細書に記載されるdsRNAはさらに、1つまたはそれ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング、例えば、1または2個のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド/ヌクレオシドを含むヌクレオチド/ヌクレオシドアナログを含むか、またはそれからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖またはそれらのいずれかの組み合わせ上にあり得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチドは、dsRNAのアンチセンス鎖またはセンス鎖の一本または両方の5’末端、3’末端または両方の末端上に存在し得る。いくつかの実施態様において、dsRNAは、アンチセンス鎖の3’末端上に2-ヌクレオチドオーバーハングを含む。
【０１４２】
dsRNAは、例えば、自動DNA合成装置(例えば、Biosearch, Applied BiosystemsTM, Inc.から市販されているものなど)の使用によって、さらに後述されるように、当該技術分野で知られている標準方法によって合成され得る。医薬組成物に使用するためのdsRNAの合成方法も当該分野で知られている。
【０１４３】
本明細書のdsRNA物質化合物は、2工程操作を用いて調製され得る。まず、二本鎖RNA分子の個々の鎖は個別に調製される。次に、構成要素の鎖はアニールされる。dsRNA物質化合物の個々の鎖は、溶液相または固相有機合成または両方を用いて調製され得る。有機合成は、非天然または修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が容易に調製され得るという利点を提供する。本明細書の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相または固相有機合成または両方を用いて調製され得る。
【０１４４】
いくつかの実施態様において、本明細書のdsRNA物質は、少なくとも2つのヌクレオチド配列であるセンス鎖配列およびアンチセンス鎖配列を含む。センス鎖は、表2のいずれか1つの二本鎖のいずれか1つのセンス鎖ヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。アンチセンス鎖は、表2のいずれか1つの二本鎖のいずれか1つのアンチセンス鎖ヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施態様において、dsRNA物質はAD-66810ではない。
【０１４５】
いくつかの実施態様において、本明細書のdsRNA物質は、表2に示されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。
【０１４６】
III.修飾dsRNA物質
特定の実施態様において、本明細書のdsRNA物質のRNAは、修飾されておらず、かつ、例えば、当該技術分野で知られているおよび本明細書に記載の化学的修飾またはコンジュゲーションを含まない。別の実施態様において、本明細書のdsRNA物質のRNAは、安定性または他の有益な特性を向上させるために化学的に修飾される。いくつかの実施態様において、本明細書のdsRNA物質のヌクレオチドは実質的に全てが修飾される。本明細書のいくつかの実施態様において、dsRNA物質のヌクレオチドの全て、またはdsRNA物質のヌクレオチドの実質的に全てが修飾され、すなわち、dsRNA物質の鎖には、5、4、3、2または1個を超えない非修飾ヌクレオチドが存在する。
【０１４７】
本発明において特許づけられる核酸は、参照により本明細書に援用される“Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されるものなどの当該技術分野において十分に確立されている方法によって合成または修飾され得る。修飾には、例えば、末端修飾、例えば、5'末端修飾(リン酸化、コンジュゲーション、逆連結)または3'末端修飾(コンジュゲーション、DNAヌクレオチド、逆連結など)；塩基修飾、例えば、安定塩基、不安定塩基、または広がるパートナーのレパートリーと塩基対合する塩基による置換、塩基の除去(脱塩基ヌクレオチド)、またはコンジュゲート塩基；糖修飾(例えば、2'位または4'位で)または糖の置換；またはホスホジエステル連結の修飾または置換を含む骨格修飾がある。本明細書に記載される実施態様に有用なdsRNA物質化合物の具体例としては、修飾された骨格を含有するか、または天然のヌクレオシド間連結を含有しないRNAが挙げられるが、これらに限定はされない。修飾された骨格を有するRNAとしては、特に、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のために、当該技術分野において時折言及されるように、ヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない修飾RNAは、オリゴヌクレオシドであると見做すこともできる。いくつかの実施態様において、修飾dsRNA物質は、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有する。
【０１４８】
修飾RNA骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートならびに3'-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の3'-5'連結を有するボラノホスフェート、これらの2'-5'連結アナログ、およびヌクレオシド単位の隣接する対が、3'-5'から5'-3'または2'-5'から5'-2'に連結する反転極性を有するものが挙げられる。さまざまな塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
【０１４９】
上記のリン含有連結の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第3,687,808号；同第4,469,863号；同第4,476,301号；同第5,023,243号；同第5,177,195号；同第5,188,897号；同第5,264,423号；同第5,276,019号；同第5,278,302号；同第5,286,717号；同第5,321,131号；同第5,399,676号；同第5,405,939号；同第5,453,496号；同第5,455,233号；同第5,466,677号；同第5,476,925号；同第5,519,126号；同第5,536,821号；同第5,541,316号；同第5,550,111号；同第5,563,253号；同第5,571,799号；同第5,587,361号；同第5,625,050号；同第6,028,188号；同第6,124,445号；同第6,160,109号；同第6,169,170号；同第6,172,209号；同第6,239,265号；同第6,277,603号；同第6,326,199号；同第6,346,614号；同第6,444,423号；同第6,531,590号；同第6,534,639号；同第6,608,035号；同第6,683,167号；同第6,858,715号；同第6,867,294号；同第6,878,805号；同第7,015,315号；同第7,041,816号；同第7,273,933号；同第7,321,029号；および米国特許第RE39464号があるが、これらに限定されなく、これらのそれぞれは、そのような調製方法に関連する教示のために、引用により本明細書に包含される。
【０１５０】
内部にリン原子を含まない修飾RNA骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または1つまたはそれ以上の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらには、(一部がヌクレオシドの糖部分から形成される)モルホリノ連結を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合N、O、SおよびCH2成分部分を有する他のものがある。
【０１５１】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第5,034,506号；同第5,166,315号；同第5,185,444号；同第5,214,134号；同第5,216,141号；同第5,235,033号；同第5,64,562号；同第5,264,564号；同第5,405,938号；同第5,434,257号；同第5,466,677号；同第5,470,967号；同第5,489,677号；同第5,541,307号；同第5,561,225号；同第5,596,086号；同第5,602,240号；同第5,608,046号；同第5,610,289号；同第5,618,704号；同第5,623,070号；同第5,663,312号；同第5,633,360号；同第5,677,437号；および同第5,677,439号があるが、これらに限定されなく、これらのそれぞれは、そのような方法に関連する教示のために、引用により本明細書に包含される。
【０１５２】
本明細書で提供されるdsRNA物質に使用するために、糖およびヌクレオシド間連結の両方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が新規な基によって置換されている適当なRNA模倣体が考慮される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション性質を有することが示されている、このようなオリゴマー化合物の1つであるRNA模倣体は、ペプチド核酸(PNA)と称される。PNA化合物において、RNAの糖骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格によって置換される。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第5,539,082号；同第5,714,331号；および同第5,719,262号があるが、これらに限定はされなく、これらのそれぞれは、そのような方法に関連する教示のために、参照により本明細書に援用される。本明細書のdsRNA物質に使用するのに適当なさらなるPNA化合物は、例えば、Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500に記載されている。
【０１５３】
本発明において特許づけられるいくつかの実施態様には、ホスホロチオエート骨格を有するRNAおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド、特に、上述した米国特許第5,489,677号の--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--［メチレン(メチルイミノ)またはMMI骨格として知られている］、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--および--N(CH3)--CH2--CH2--［式中、天然のホスホジエステル骨格は、--O--P--O--CH2--として表される］、および上述した米国特許第5,602,240号のアミド骨格が含まれる。いくつかの実施態様において、本明細書において特許づけられるRNAは、上述した米国特許第5,034,506号のモルホリノ骨格構造を有する。
【０１５４】
修飾RNAはまた、1つまたはそれ以上の置換されている糖部分を含有し得る。本明細書において特許づけられるdsRNA物質は、2'位に、OH；F；O-、S-またはN-アルキル；O-、S-またはN-アルケニル；O-、S-またはN-アルキニル；またはO-アルキル-O-アルキル［ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換C1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルであり得る］のうちの1つを含むことができる。例示的な適当な修飾は、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2を含み、式中、nおよびmが、1〜約10である。他の実施態様において、dsRNAは、2'位に、C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、挿入基(intercalator)、dsRNA物質の薬物動態学的性質を向上させる基、またはdsRNA物質の薬力学的性質を向上させる基、および同様の性質を有する他の置換基のうちの1つを含む。いくつかの実施態様において、修飾は、2’-メトキシエトキシ(2’-O-(2-メトキシエチル)または2’-MOEとしても知られている2’-O--CH2CH2OCH3)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78:486-504)、すなわち、アルコキシ-アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、本明細書において以下の実施例に記載されるように、2’-DMAOEとしても知られている2’-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、O(CH2)2ON(CH3)2基、および2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(当該技術分野で、2’-O-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2’-DMAEOEとしても知られている)、すなわち、2’-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2である。さらなる例示的修飾は、5’-Me-2’-Fヌクレオチド、5’-Me-2’-OMeヌクレオチド、5’-Me-2’-デオキシヌクレオチド、(これらの3つのファミリーのRとSの両方の異性体)；2’-アルコキシアルキル;および2’-NMA(N-メチルアセトアミド)を含む。
【０１５５】
他の修飾は、2’-メトキシ(2’-OCH3)、2’-アミノプロポキシ(2’-OCH2CH2CH2NH2)および2’-フルオロ(2’-F)を含む。同様の修飾を、dsRNA物質のRNA上の他の位置、特に、3’末端ヌクレオチド上または2’-5’連結dsRNA中の糖の3’位および5’末端ヌクレオチドの5’位で行うこともできる。dsRNA物質はまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第4,981,957号；同第5,118,800号；同第5,319,080号；同第5,359,044号；同第5,393,878号；同第5,446,137号；同第5,466,786号；同第5,514,785号；同第5,519,134号；同第5,567,811号；同第5,576,427号；同第5,591,722号；同第5,597,909号；同第5,610,300号；同第5,627,053号；同第5,639,873号；同第5,646,265号；同第5,658,873号；同第5,670,633号；および同第5,700,920号があるが、これらに限定されなく、これらのうちのいくつかは、本出願と所有者が同一である。上記の各特許公報の内容は、そのような方法に関連する教示のために、引用により本明細書に包含される。
【０１５６】
dsRNA物質はまた、核酸塩基(当該技術分野において多くの場合、単に「塩基」と称される)修飾または置換も含み得る。本明細書で使用されるように、「非修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン(A)およびグアニン(G)、ならびにピリミジン塩基チミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)を含む。修飾核酸塩基は、他の合成および天然核酸塩基、例えばデオキシ−チミン(dT)、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-ダアザアデニン(daazaadenine)、ならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンを含む。さらなる核酸塩基には、米国特許第3,687,808号に開示されるもの、Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008に開示されるもの；Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley&Sons,1990に開示されるもの、Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613によって開示されるもの、およびSanghvi,Y S.,Chapter 15,dsRNA Research and Applications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRC Press,1993によって開示されるものがある。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明で特許づけられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらには、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含む、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンならびにN-2、N-6および0-6置換プリンがある。5-メチルシトシン置換基は、核酸二本鎖安定性を0.6〜1.2℃増加させることが示されており(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)、例示的な塩基置換であり、特に2’-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わされる場合は尚更である。
【０１５７】
上記の修飾された核酸塩基およびに他の修飾された核酸塩基のいくつかの調製を教示する代表的な米国特許には、上記の米国特許第3,687,808号、同第4,845,205号；同第5,130,30号；同第5,134,066号；同第5,175,273号；同第5,367,066号；同第5,432,272号；同第5,457,187号；同第5,459,255号；同第5,484,908号；同第5,502,177号；同第5,525,711号；同第5,552,540号；同第5,587,469号；同第5,594,121号、同第5,596,091号；同第5,614,617号；同第5,681,941号；同第5,750,692号；同第6,015,886号；同第6,147,200号；同第6,166,197号；同第6,222,025号；同第6,235,887号；同第6,380,368号；同第6,528,640号；同第6,639,062号；同第6,617,438号；同第7,045,610号；同第7,427,672号；および同第7,495,088号があるが、これらに限定されなく、これらのそれぞれは、そのような方法に関連する教示のために、引用により本明細書に援用される。
【０１５８】
いくつかの実施態様において、dsRNA物質のRNAはまた、1つまたはそれ以上の二環式糖部分を含むように修飾され得る。「二環式糖」は、2個の原子の架橋によって修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」(「BNA」)は、糖環の2個の炭素原子を連結し、それによって、二環式環系を形成する架橋を含む糖部分を有するヌクレオシドである。特定の実施態様において、架橋は、糖環の4'-炭素と2'-炭素を連結する。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書の物質は、1つまたはそれ以上の固定核酸(LNA)を含み得る。固定核酸は、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分は、2'炭素と4'炭素を連結する追加の架橋を含む。言い換えると、LNAは、4'-CH2-O-2'架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、3'-エンド構造的立体配置におけるリボースを有効に「固定する」。dsRNA物質に固定核酸を加えると、血清中のdsRNA物質安定性が増加し、オフターゲット効果が低減することが示されている(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic Acids Research 33(1):439-447;Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843;Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。本明細書のポリヌクレオチドに使用するための二環式ヌクレオシドの例としては、4'および2'リボシル環原子の間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、本明細書のアンチセンスポリヌクレオチド物質としては、4'-2'架橋を含む1つまたはそれ以上の二環式ヌクレオシドが挙げられる。このような4'-2'架橋二環式ヌクレオシドの例としては、4'-(CH2)--O-2'(LNA)；4'-(CH2)--S-2'；4'-(CH2)2--O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)--O-2'(「拘束エチル」または「cEt」とも称される)および4’-CH(CH2OCH3)--O-2'(およびそのアナログ；例えば、米国特許第7,399,845号を参照)；4'-C(CH3)(CH3)--O-2'(およびそのアナログ；例えば、米国特許第8,278,283号を参照)；4'-CH2--N(OCH3)-2'(およびそのアナログ；例えば、米国特許第8,278,425号を参照)；4'-CH2--O-N(CH3)-2'(例えば、米国特許公開第2004/0171570号を参照)；4'-CH2--N(R)-O-2'(ここで、Rが、H、C1〜C12アルキルである)、または保護基(例えば、米国特許第7,427,672号を参照)；4'-CH2--C(H)(CH3)-2'(例えば、Chattopadhyaya et al.,J.Org.Chem.,2009,74,118-134を参照)；および4'-CH2--C(=CH2)-2'(およびそのアナログ；例えば、米国特許第8,278,426号を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。修飾された核酸に関連する上記の各内容は、参照により本明細書に援用される。
【０１５９】
固定核酸ヌクレオチドの調製を教示するさらなる代表的な米国特許および米国特許公開には、米国特許第6,268,490号；同第6,525,191号；同第6,670,461号；同第6,770,748号；同第6,794,499号；同第6,998,484号；同第7,053,207号；同第7,034,133号；同第7,084,125号；同第7,399,845号；同第7,427,672号；同第7,569,686号；同第7,741,457号；同第8,022,193号；同第8,030,467号；同第8,278,425号；同第8,278,426号；同第8,278,283号；米国特許公開第2008/0039618号；および米国特許公開第2009/0012281号があるが、これらに限定されなく、そのような方法に関連する教示のために、引用により本明細書に包含される。
【０１６０】
例えば、α-L-リボフラノースおよびβ-D-リボフラノースを含む1つまたはそれ以上の立体化学的糖配置を有する上記の二環式ヌクレオシドのいずれかが調製され得る(WO99/14226を参照のこと)。
【０１６１】
dsRNA物質のRNAはまた、1つまたはそれ以上の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾され得る。本明細書で使用されるように、「拘束エチルヌクレオチド」または「cEt」は、4’-CH(CH3)-0-2’架橋を含む二環式糖部分を含む固定核酸である。いくつかの実施態様において、拘束エチルヌクレオチドは、本明細書において「S-cEt」と称されるS立体配置にある。
【０１６２】
本明細書のdsRNA物質はまた、1つまたはそれ以上の「立体配置的に制限されたヌクレオチド」(「CRN」)も含み得る。CRNは、リボースのC2’とC4’炭素またはリボースのC3と-C5’炭素を連結するリンカーを有するヌクレオチドアナログである。CRNは、リボース環を安定した立体配置へ固定し、mRNAに対するハイブリダイゼーション親和性(hybridization affinity)を高める。リンカーは、酸素を安定性および親和性のために最適な位置に配置するのに十分な長さを有し、結果としてリボース環の歪み(puckering)を少なくする。
【０１６３】
上記のCRNのいくつかの調製を教示する代表的な公開には、米国特許公開第2013/0190383号；およびPCT公開WO2013/036868号があるが、これらに限定されなく、これらは、そのような方法に関連する教示のために、引用により本明細書に包含される。
【０１６４】
いくつかの実施態様において、本明細書のdsRNA物質は、UNA(非固定核酸)ヌクレオチドである1つまたはそれ以上の単量体を含む。UNAは、糖のいずれかの結合が除去され、非固定「糖」残留物を形成している非固定非環式核酸である。1つの例において、UNAはまた、C1'-C4'の間の結合(すなわち、C1'炭素とC4'炭素の間の共有炭素-酸素-炭素結合)が除去された単量体を包含する。別の例において、糖のC2'-C3'結合(すなわち、C2'炭素とC3'炭素の間の共有炭素-炭素結合)が除去されている(非固定核酸ヌクレオチドに関連する教示のために、参照により本明細書に援用されるNuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) and Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039を参照のこと)。
【０１６５】
UNAの調製を教示する代表的な米国特許公開には、米国特許第8,314,227号；および米国公開第2013/0096289号；同第2013/0011922号；および同第2011/0313020号があるが、これらに限定されなく、これらは、そのような方法に関連する教示のために、参照により本明細書に援用される。
【０１６６】
RNA分子の末端に対する潜在的に安定した修飾は、N-(アセチルアミノカプロイル)-4-ヒドロキシプロリノール(Hyp-C6-NHAc)、N-(カプロイル4-ヒドロキシプロリノール(Hyp-C6)、N-(アセチル-4-ヒドロキシプロリノール(Hyp-NHAc)、チミジン-2'-O-デオキシチミジン(エーテル)、N-(アミノカプロイル)-4-ヒドロキシプロリノール(Hyp-C6-アミノ)、2-ドコサノイル-ウリジン-3”-ホスフェート、逆方向塩基(inverted base)dT(idT)などを含み得る。この修飾の開示は、PCT公開第WO2011/005861号に見出される。
【０１６７】
特定の実施態様において、dsRNA物質は、1つまたはそれ以上のアデノシン-グリコール核酸(「GNA」)を含むように修飾される。用語「GNA]とは、DNAまたはRNAと類似しているポリマーでであるが、組成において、ホスホジエステル結合によって連結される繰り返しグリセロール単位からなるその「骨格」が異なるグリコール核酸である：
【化３】
2021533767.tif 000006
。アデノシン-GNAの説明は、例えば、Zhang, et al. (JACS 127(12):4174-75 (2005)に見出される。
【０１６８】
本明細書に開示されるdsRNA物質のヌクレオチドの他の修飾は、5'ホスフェートまたは5'ホスフェート模倣体、例えば、dsRNA物質のアンチセンス鎖に対する5'末端ホスフェートまたはホスフェート模倣体を含む。適当なホスフェート模倣体は、米国特許公開第2012/0157511号に開示され、これは、そのような修飾に関連する教示のために、参照により本明細書に援用される。
【０１６９】
さらなる修飾dsRNA物質標的HBVは、例えば、WO2016/077321で提供され、これは、そのような修飾に関連する教示のために、参照により本明細書に援用される。
【０１７０】
いくつかの実施態様において、dsRNA物質は、表2に示される修飾センス鎖および修飾アンチセンス鎖を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。
【０１７１】
IV.リガンドにコンジュゲートされたdsRNA物質
本明細書のdsRNA物質は、リガンドがコンジュゲートしていてもよい。リガンドは、それが組み込まれているdsRNA物質の分布、標的化または寿命を変化させることができる。好ましい実施態様において、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない物質種と比較して、選択された標的、例えば分子、細胞または細胞型、区画、例えば、細胞または器官の区画、身体の組織、器官または領域に対する親和性を向上させる。好ましいリガンドは、二本鎖核酸における二本鎖の対合形成の邪魔をしない。
【０１７２】
本明細書におけるリガンド−コンジュゲート化オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに連結分子を結合して誘導されるような、ペンダント反応性官能基を有するオリゴヌクレオチドを使用することによって合成することができる(後述している)。この反応性オリゴヌクレオチドを、市販のリガンド、様々な保護基のいずれかを有する合成リガンド、または連結部分が結合しているリガンドと直接反応させればよい。
【０１７３】
本明細書におけるリガンド−コンジュゲート化オリゴヌクレオチドおよび配列特異的な連結ヌクレオシドを有するリガンド分子において、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準的なヌクレオチドもしくはヌクレオシド前駆体、または連結部分を既に有するヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子を既に有するリガンド−ヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンド含有ビルディングブロックを用いて、適当なDNA合成装置によって組み立てることができる。
【０１７４】
連結部分を既に有するヌクレオチド−コンジュゲート前駆体を使用する場合、典型的には、配列特異的な連結ヌクレオシドを合成し、次いでリガンド分子を連結部分と反応させ、リガンド−コンジュゲート化オリゴヌクレオチドを形成する。いくつかの実施態様において、本明細書のオリゴヌクレオチドまたは連結ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド合成に通例使用される、市販されている標準的なホスホロアミダイトおよび非標準的なホスホロアミダイトとともに、リガンド−ヌクレオシドコンジュゲートから誘導されるホスホロアミダイトを用いて、自動合成装置によって合成される。
【０１７５】
RNAコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第4,828,979号；同第4,948,882号；同第5,218,105号；同第5,525,465号；同第5,541,313号；同第5,545,730号；同第5,552,538号；同第5,578,717号、同第5,580,731号；同第5,591,584号；同第5,109,124号；同第5,118,802号；同第5,138,045号；同第5,414,077号；同第5,486,603号；同第5,512,439号；同第5,578,718号；同第5,608,046号；同第4,587,044号；同第4,605,735号；同第4,667,025号；同第4,762,779号；同第4,789,737号；同第4,824,941号；同第4,835,263号；同第4,876,335号；同第4,904,582号；同第4,958,013号；同第5,082,830号；同第5,112,963号；同第5,214,136号；同第5,082,830号；同第5,112,963号；同第5,214,136号；同第5,245,022号；同第5,254,469号；同第5,258,506号；同第5,262,536号；同第5,272,250号；同第5,292,873号；同第5,317,098号；同第5,371,241号、同第5,391,723号；同第5,416,203号、同第5,451,463号；同第5,510,475号；同第5,512,667号；同第5,514,785号；同第5,565,552号；同第5,567,810号；同第5,574,142号；同第5,585,481号；同第5,587,371号；同第5,595,726号；同第5,597,696号；同第5,599,923号；同第5,599,928号および同第5,688,941号；同第6,294,664号；同第6,320,017号；同第6,576,752号；同第6,783,931号；同第6,900,297号；同第7,037,646号；同第8,106,022号があるが、これらに限定されなく、これらは、そのような方法に関連する教示のために、引用により本明細書に包含される。
【０１７６】
A.炭水化物コンジュゲート
本明細書の組成物および方法の好ましい実施態様において、dsRNA物質オリゴヌクレオチドはさらに、炭水化物を含む。炭水化物−コンジュゲート化dsRNA物質は、本明細書に記載しているように、インビボでの核酸の送達に、またインビボでの治療的使用に適当である組成物に好都合である。本明細書で使用される「炭水化物」とは、少なくとも6個の炭素原子(直鎖状、分枝鎖状または環状であり得る)を有し、各炭素原子に酸素、窒素または硫黄原子が結合している1つまたはそれ以上の単糖単位から構成されている炭水化物それ自体である化合物、または、少なくとも6個の炭素原子(直鎖状、分枝鎖状または環状であり得る)を有し、各炭素原子に酸素、窒素または硫黄原子が結合している1つまたはそれ以上の単糖単位から構成されている炭水化物部分を一部として有する化合物のいずれかを意味する。代表的な炭水化物には、糖(単糖、二糖、三糖、および約4、5、6、7、8または9個の単糖単位を含有するオリゴ糖)、ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ゴムなどの多糖がある。特定の単糖としては、C5およびそれ以上(例えば、C5、C6、C7またはC8)の糖が挙げられ、また二糖および三糖としては、2個または3個の単糖単位(例えば、C5、C6、C7またはC8)を有する糖が挙げられる。
【０１７７】
いくつかの実施態様において、本明細書の組成物および方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは単糖である。いくつかの実施態様において、本明細書の組成物および方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは、
【化４】
2021533767.tif 000007
【化５】
2021533767.tif 000008
【化６】
2021533767.tif 000009
【化７】
2021533767.tif 000010
【化８】
2021533767.tif 000011
【化９】
2021533767.tif 000012
からなる群から選択される。
【０１７８】
いくつかの実施態様において、単糖はN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)である。いくつかの実施態様において、炭水化物は、複数のN-アセチルガラクトサミン単位、例えば
【化１０】
2021533767.tif 000013
を含む。
【０１７９】
本明細書に記載される実施態様に使用され得る別の代表的な炭水化物コンジュゲートは、
【化１１】
2021533767.tif 000014
［式中、1つのXまたはYはオリゴヌクレオチドである場合、他方は水素である］を含むが、これに限定されない。
【０１８０】
本明細書のいくつかの実施態様において、本明細書のdsRNA物質には、GalNAcまたはGalNAc誘導体が一価リンカーを介して結合している。いくつかの実施態様において、本明細書のdsRNA物質には、GalNAcまたはGalNAc誘導体が二価リンカーを介して結合している。本明細書のいくつかの実施態様において、本明細書のdsRNA物質には、GalNAcまたはGalNAc誘導体が三価リンカーを介して結合している。いくつかの実施態様において、炭水化物リガンドは、三価リンカーを介して結合している3個のN-アセチルガラクトサミン単位(「GalNAc3」)を含む。
【０１８１】
いくつかの実施態様において、二本鎖dsRNA物質は、dsRNA物質に結合された1つのGalNAcまたはGalNAc誘導体を含む。いくつかの実施態様において、二本鎖dsRNA物質は、複数個(例えば、2、3、4、5または6個)のGalNAcまたはGalNAc誘導体を含み、これらはそれぞれ独立して、複数個の一価リンカーを介して二本鎖dsRNA物質の複数個のヌクレオチドに結合されている。
【０１８２】
本明細書に使用するのに適当なさらなる炭水化物コンジュゲートは、PCT公開WO2014/179620号およびWO2014/179627号に記載されるものを含み、これらは、そのようなコンジュゲートに関連する教示のために、参照により本明細書に援用される。
【０１８３】
本明細書に開示される組成物および方法に使用され得るリンカーを有するdsRNA物質炭水化物コンジュゲートの非限定的な例としては、
【化１２】
2021533767.tif 000015
【化１３】
2021533767.tif 000016
【化１４】
2021533767.tif 000017
［式中、1つのXまたはYがオリゴヌクレオチドである場合、他方は水素である］を含むが、これらに限定されない。
【０１８４】
本明細書に開示される組成物および方法のいくつかの実施態様において、リガンドは、二価または三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された1つまたはそれ以上の「GalNAc」(N-アセチルガラクトサミン)誘導体である。
【０１８５】
いくつかの実施態様において、本明細書に開示されるdsRNA物質は、式(XXXI)〜(XXXIV)：
【化１５】
2021533767.tif 000018
【化１６】
2021533767.tif 000019
［式中、
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5Bおよびq5Cは、出現するごとに独立して、0〜20を表し、繰返し単位は同一または異なっていてもよく；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5Cはそれぞれ、出現するごとに独立して不存在であるか、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NHまたはCH2Oであり；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5Cは、出現するごとに独立して不存在であるか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで、1つまたはそれ以上のメチレンは、1つまたはそれ以上のO、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R')=C(R'')、C≡CまたはC(O)によって中断または終端されてもよく；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5Cはそれぞれ、出現するごとに独立して不存在であるか、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、
【化１７】
2021533767.tif 000020
【化１８】
2021533767.tif 000021
またはヘテロシクリルであり;
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5BおよびL5Cはリガンドを表し；すなわち、それぞれ、出現するごとに独立して、単糖(GalNAcなど)、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖または多糖であり；そして
RaはHまたはアミノ酸側鎖である］
のいずれかに示される構造の群から選択されるコンジュゲートされた二価または三価の分枝鎖状リンカーである。三価コンジュゲートGalNAc誘導体は、dsRNA物質とともに使用されて、式(XXXIV):
【化１９】
2021533767.tif 000022
［式中、L5A、L5BおよびL5Cは、GalNAc誘導体などの単糖を表す］
ものなどの標的遺伝子の発現を阻害するのに特に有用である。
【０１８６】
適当な二価および三価の分枝鎖状リンカー基がコンジュゲートしているGalNAc誘導体の例としては、式I、VI、X、IXおよびXIIとして上記に列挙している構造が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１８７】
B.リンカー
いくつかの実施態様において、dsRNA物質オリゴヌクレオチドには、本明細書に記載しているコンジュゲートまたはリガンドが、切断可能または切断不可能であり得る様々なリンカーによって結合できる。
【０１８８】
用語「リンカー」または「連結基」とは、化合物の2つの部分を連結する、例えば、化合物の2つの部分を共有結合する有機部分を意味する。リンカーは典型的には、直接結合を含み、または原子、例えば酸素または硫黄、単位、例えばNR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH、または原子の鎖、例えば、限定はされないが、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールであって、これらは1つまたはそれ以上のメチレンがO、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換ヘテロ環式（ここで、R8は、水素、アシル、脂肪族または置換された脂肪族である)により中断または終結することがあるものを含む。いくつかの実施態様において、リンカーは、約1〜24個、2〜24個、3〜24個、4〜24個、5〜24個、6〜24個、6〜18個、7〜18個、8〜18個、7〜17個、8〜17個、6〜16個、7〜16個または8〜16個の原子である。
【０１８９】
切断可能な連結基は、細胞の外部では十分安定であるが、標的細胞内に入ると切断されて、リンカーが一緒に保持している2つの部分を放出する。いくつかの実施態様において、切断可能な連結基は、標的細胞内または第一の参照(例えば、細胞内条件を模倣または代表するように選択できる)条件下において、対象の血液中、または第二の参照(例えば、血液または血清に見出される条件を模倣または代表するよう選択できる)条件下よりも、少なくとも約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍またはそれ以上、または少なくとも約100倍速く、切断される。
【０１９０】
切断可能な連結基は、切断剤、例えば、pH、酸化還元電位または分解性分子の存在に敏感である。一般に、切断剤は、血清または血液中と比較して細胞内部により広く存在し、またはより高いレベルもしくは活性で見出される。このような分解剤の例としては、例えば、細胞内に存在する酸化もしくは還元酵素、または還元により酸化還元切断可能な連結基を分解できるメルカプタンなどの還元剤を含む、特定の基質用に選択されまたは基質特異性を有さない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソーム、または酸性環境を形成できる物質、例えば、5またはそれ以下のpHをもたらす物質；一般的な酸として作用することにより、酸切断可能な連結基を加水分解または分解できる酵素、ペプチダーゼ(基質特異的であり得る)およびホスファターゼが挙げられる。
【０１９１】
ジスルフィド結合などの切断可能な連結基は、pHに敏感であり得る。ヒト血清のpHは7.4である一方、細胞内平均pHは、僅かに低く、約7.1〜7.3の範囲である。エンドソームは、5.5〜6.0の範囲内のより酸性のpHを有し、リソソームは、5.0程度の、更により酸性のpHを有する。いくつかのリンカーは、好ましいpHで切断される切断可能な連結基を有することによって、細胞内部でリガンドからカチオン性脂質を放出し、または細胞の所望の区画内へ放出するであろう。
【０１９２】
リンカーは、特定の酵素により切断可能な、切断可能な連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能な連結基のタイプは、標的とされる細胞に依存し得る。例えば、肝臓標的リガンドは、エステル基を含むリンカーを介して、カチオン性脂質に連結され得る。肝細胞はエステラーゼに富んでいるため、このリンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞型内と比較して、肝細胞内でより効率的に切断されるであろう。エステラーゼに富んだ他の細胞型には、肺、腎皮質および精巣の細胞がある。
【０１９３】
ペプチド結合を含有するリンカーは、肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼに富んだ細胞型を標的とする際に使用することができる。
【０１９４】
一般に、切断可能な候補連結基の適切性は、分解剤(または分解条件)の候補連結基を切断する能力を試験することにより評価することができる。血液中、または他の非標的組織との接触の際に、切断可能な候補連結基の切断に抵抗する能力を試験することも望ましいであろう。したがって、第一の条件と第二の条件との間の、切断に対する相対的な感受性を決定することができ、ここで、第一の条件は標的細胞内での切断を示すよう選択され、第二の条件は他の組織内または生体液、例えば血液または血清中での切断を示すよう選択される。該評価は、無細胞系内、細胞内、細胞培養物中、臓器内若しくは組織培養物中、または全動物内で行うことができる。無細胞または培養物条件内で最初の評価を行い、全動物内でのさらなる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施態様において、有用な候補化合物は、血液または血清(または細胞外条件を模倣するよう選択された、インビトロでの条件下)と比較して、細胞内(または細胞内条件を模倣するよう選択された、インビトロでの条件下)で少なくとも約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍または約100倍速く切断される。
【０１９５】
i.酸化還元切断可能な連結基
いくつかの実施態様において、切断可能な連結基は、還元または酸化後に切断される酸化還元切断可能な連結基である。還元的に切断可能な連結基の例としては、ジスルフィド連結基(-S-S-)がある。切断可能な候補連結基が適当な「還元的に切断可能な連結基」であるか、または例えば特定のdsRNA物質部分および特定の標的化剤との使用に適当であるかを決定するために、本明細書に記載される方法に注目し得る。例えば、候補は、ジチオスレイトール(DTT)、または当該技術分野で知られている試薬を用いた他の還元剤とのインキュベーションによって評価することができ、これは、細胞、例えば標的細胞内で観察され得る切断の速度を模倣する。候補はまた、血液または血清条件を模倣するよう選択された条件下でも評価され得る。いくつかの実施態様において、候補化合物は、血液中で最大で約10％切断される。いくつかの実施態様において、有用な候補化合物は、血液中(または、細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下)と比較して、細胞内(または、細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下)で少なくとも約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍または約100倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下での標準的な酵素動力学アッセイを用いて決定され、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較され得る。
【０１９６】
ii.ホスフェートを基本とする切断可能な連結基
いくつかの実施態様において、切断可能なリンカーは、ホスフェートを基本とする切断可能な連結基を含む。ホスフェートを基本とする切断可能な連結基は、リン酸基を分解たは加水分解する薬剤によって切断される。細胞内でリン酸基を切断する薬剤の例としては、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。ホスフェートを基本とする連結基の例としては、-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-が挙げられる。いくつかの実施態様において、ホスフェートを基本とする連結基は、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-または-O-P(S)(H)-S-である。いくつかの実施態様において、ホスフェートを基本とする連結基は-O-P(O)(OH)-O-である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
【０１９７】
iii.酸切断可能な連結基
いくつかの実施態様において、切断可能なリンカーは酸切断可能な連結基である。酸切断可能な連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。いくつかの実施態様において、酸切断可能な連結基は、約6.5またはそれ以下(例えば、約6.0、5.75、5.5、5.25、5.0、またはそれ以下)のpHの酸性環境で、または一般的な酸として作用し得る酵素などの薬剤によって切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低pH小器官は、酸切断可能な連結基のために切断環境を提供し得る。酸切断可能な連結基の例としては、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。酸切断可能な基は、一般式-C=NN-、C(O)Oまたは-OC(O)を有し得る。いくつかの実施態様において、エステルの酸素に結合した炭素(アルコキシ基)は、アリール基、置換されているアルキル基、またはジメチルペンチルもしくはｔ-ブチルなどの第三級アルキル基である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価され得る。
【０１９８】
iv.エステルを基本とする連結基
いくつかの実施態様において、切断可能なリンカーは、エステルを基本とする切断可能な連結基を含む。エステルを基本とする切断可能な連結基は、細胞内のエステラーゼおよびアミラーゼなどの酵素によって切断される。エステルを基本とする切断可能な連結基の例としては、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。エステル切断可能な連結基は、一般式-C(O)O-、または-OC(O)-で示される。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価され得る。
【０１９９】
v.ペプチドを基本とする切断基
いくつかの実施態様において、切断可能なリンカーは、ペプチドを基本とする切断可能な連結基を含む。ペプチドを基本とする切断可能な連結基は、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドを基本とする切断可能な連結基は、アミノ酸間で形成されてオリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)およびポリペプチドを産生するペプチド結合である。ペプチドを基本とする切断可能な基は、アミド基(-C(O)NH-)を含まない。アミド基は、いずれかのアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチドおよびタンパク質を産生するアミド結合の特別なタイプである。ペプチドを基本とする切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されてペプチドおよびタンパク質を産生するペプチド結合(すなわた、アミド結合)に限定され、アミド官能基全部は含まない。ペプチドを基本とする切断可能な連結基は、一般式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)−で示され、式中、RAおよびRBは、隣接する2つのアミノ酸のR基である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価され得る。
【０２００】
V.dsRNA物質の送達
細胞、例えば、ヒト対象などの対象の内の細胞への本発明のdsRNA物質の送達は、いくつかの異なる方法で達成することができる。例えば、送達は、細胞を、本明細書のdsRNA物質とインビトロまたはインビボのいずれかで接触させることによって行われ得る。インビボでの送達はまた、dsRNA物質を含む組成物を対象に投与することによって直接行われ得る。或いは、インビボであの送達は、dsRNA物質の発現をコードし、それを誘導する1つまたはそれ以上のベクターを投与することによって、間接的に行われ得る。これらの代替例は、以下に更に論じられる。
【０２０１】
一般に、核酸分子を(インビトロまたはインビボで)送達するいずれかの方法は、本明細書のdsRNA物質とともに使用するのに適合され得る(例えば、そのような送達方法に関連する教示のために、参照により本明細書に援用される、Akhtar S.and Julian RL.,(1992)Trends Cell.Biol.2(5):139-144およびWO94/02595を参照)。インビボでの送達の場合、dsRNA物質分子を送達するために考慮される因子としては、例えば、送達される分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、および標的組織における送達される分子の蓄積が挙げられる
【０２０２】
疾患の処置のためにdsRNA物質を全身投与するために、RNAは、修飾されてもよく、代わりに薬物送達システムを用いて送達されてもよく；両方の方法は、インビボでのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによるdsRNAの急速な分解を防ぐように作用する。RNA、医薬担体または医薬用賦形剤の修飾は、標的組織へのdsRNA物質組成物の標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避することもできる。dsRNA物質分子は、化学的コンジュゲーション、例えば、上記に記載の炭水化物コンジュゲートによって修飾され得る。
【０２０３】
VI.医薬組成物
本明細書はまた、本明細書のdsRNA物質を含む医薬組成物および製剤を含む。いくつかの実施態様において、本明細書では、本明細書に記載されるdsRNA物質を含有する医薬組成物、製薬的に許容される担体が提供される。該dsRNA物質を含有する医薬組成物は、HBV 遺伝子の発現または活性に関連する疾患または障害を処置するのに有用である。このような医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例は、非経口送達、例えば、皮下(SC)筋肉内(IM)または静脈内(IV)送達を介した全身投与用に製剤化される組成物である。特定の実施態様において、本明細書は、臓器特異的(例えば、肝臓)動脈内、腫瘍内、皮内、硝子体内注射、眼局所、眼部(点眼薬)、噴霧、眼局所または他の局所経路、坐薬、または経口投与のために製剤化される組成物を提供する。好ましい実施態様において、組成物は皮下投与される。
【０２０４】
本明細書の医薬組成物は、HBV遺伝子の発現を阻害するのに十分である用量で投与され得る。いくつかの実施態様において、投与あたり0.5mg/kg〜50mg/kg、0.3mg/kg〜20mg/kg、または3mg/kg〜10mg/kg、または好ましくは投与あたり3mg/kg〜10mg/kgの用量で投与される。例えば、dsRNAは、単回投与あたり約0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、または50mg/kgで投与される。いくつかの実施態様において、dsRNA物質は、50mg〜900mgの用量で投与される。
【０２０５】
組成物はまた、対象への体重に依存しない固定用量に調製され、包装され得る。例示的な投与量レベルは、1キログラムあたりの体重に平均的な対象の体重を掛けることによって計算することができる。例えば、平均的な成人は通常、約70kgと見なされる。
【０２０６】
繰り返し投与レジメンは、月に1回、隔月に1回、または3ヶ月に1回など、治療量のdsRNA物質を定期的に投与することを含み得る。好ましい実施態様において、dsRNA物質は、月に1回を超えない頻度で投与される。最初の処置レジメンの後、処置はより低い頻度で投与され得る。
【０２０７】
医薬組成物は、例えば、HBV感染、例えば、検出可能なHBV抗原または、HBV cccDNAを含むHBV DNAの1つまたはそれ以上の徴候または症状を有する対象に不確定期限投与され得る。いくつかの実施態様において、dsRNA物質での処置は離散または一定期間行われ、機能的治癒を提供する。
【０２０８】
当業者は、疾患または疾患の重症度、以前の処置、対象の全体的な健康または年齢、および存在する他の疾患を含むが、それらに限定されない特定の因子が、対象を効果的に処置するのに必要な投与量および時間に影響し得ることを認識するであろう。さらに、治療的有効量の組成物での対象の処置は、単一の処置または一連の処置を含み得る。本明細書により包含される個々のdsRNA物質に関する有効な投与量およびインビボでの半減期は、従来の方法論を用いて、または本明細書の他の箇所に記載される、適切な動物モデルを用いたインビボでの試験に基づいて概算することができる。
【０２０９】
A.賦形剤
「医薬担体」または「医薬用賦形剤」は、動物に1つまたはそれ以上の核酸を送達するための製薬的に許容され得る溶媒、懸濁化剤、またはいずれかの他の薬理学的に不活性なビヒクルである。このような薬剤は当技術分野でよく知られている。
【０２１０】
B.他の構成成分
本明細書の組成物はさらに、医薬組成物中に従来見出されている他の補助構成成分も、当技術分野にて確立されたそれらの使用レベルで含有し得る。それ故、例えば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬もしくは抗炎症剤など、さらなる適合可能な薬学的に活性な材料物質を含有することができ、または防腐剤、抗酸化剤および安定化剤などの本明細書の組成物のさまざまな剤形を物理的に製剤化するのに有用なさらなる材料物質を含有することができる。しかしながら、そのような材料物質は、加えられた際、本明細書の組成物の構成成分の生物学的活性を過度に妨害しない必要がある。製剤は滅菌されてもよく、また必要に応じて、製剤の核酸と有害に相互作用しない助剤、例えば防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、または緩衝液などと混合されてもよい。
【０２１１】
いくつかの実施態様において、本発明で特許づけられる医薬組成物は、(a)1つまたはそれ以上のdsRNA物質化合物と、(b)非iRNAメカニズムによって機能する、且つHBV関連障害を処置するのに有用な1つまたはそれ以上の薬剤とを含む。このような薬剤の例としては抗炎症薬、抗脂肪症剤、抗ウイルス剤および抗線維症剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１２】
さらに、シリマリンなどの、一般に肝臓の保護に使用される他の物質はまた、本明細書に記載されるdsRNA物質との組み合わせにも使用され得る。肝疾患を処置するのに有用な他の薬剤には、テルビブジン、エンテカビル、およびプロテアーゼ阻害物質、例えばテラプレビル、ならびに他の、例えばUS2005/0148548、US2004/0167116、US2003/0144217およびUS2004/0127488に開示されているものがある。
【０２１３】
このような化合物の毒性および処置効果は、例えば、LD50(個体群の50％の致死量)およびED50(個体群の50％に治療的有効な用量)を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、LD50/ED50比として示され得る。いくつかの実施態様において、高い治療指数を示す化合物が好ましい。
【０２１４】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトに使用するためのある範囲の投与量を製剤化するのに使用され得る。本開示における本明細書で特許づけられる組成物の投与量は、一般に、わずかの毒性があるか、または毒性がないED50を含む血中濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本明細書で特許づけられる方法に使用されるいずれかの化合物では、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推測され得る。用量は、細胞培養物中で測定されるIC50(すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む、化合物の、または適切な場合、標的配列のポリペプチド産物の血中血漿濃度範囲を動物モデル内で達成する(例えば、ポリペプチドの濃度の低減を達成する)ように製剤化され得る。このような情報は、ヒトでの有用な用量をより正確に決定するのに使用され得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０２１５】
上記に述べたそれらの投与に加えて、本明細書で取り上げされるdsRNA物質は、HBV感染症の処置に有効である他の知られている薬剤と組み合わせて投与されてもよい。いずれの場合でも、投与する医師は、当技術分野で知られているまたは本明細書に記載される標準的な有効性の尺度を用いて、観察された結果に基づいて、dsRNA物質の投与量および投与時間を調整することができる。
【０２１６】
VII.方法
本明細書はまた、細胞におけるHBVの発現を阻害する方法を提供する。該方法は、細胞を、細胞におけるHBVの発現を阻害するのに有効な量のdsRNA物質、例えば、二本鎖dsRNA物質と接触させることで、細胞におけるHBVの発現を阻害することを含む。
【０２１７】
細胞とdsRNA物質、例えば二本鎖dsRNA物質との接触は、インビトロで行われてもよく、インビボで行われてもよい。細胞をインビボでdsRNA物質と接触させることは、対象、例えばヒト対象の内の細胞または細胞群をdsRNA物質と接触させることを含む。細胞を接触させるインビトロおよびインビボ方法の組み合わせも可能である。上で論じたように、細胞への接触は直接的または間接的であり得る。さらに、細胞への接触は、本明細書に記載されるまたは当該分野で知られるいずれかのリガンドを含む標的リガンドを介して行われてもよい。好ましい実施態様において、標的リガンドは炭水化物部分、例えばGalNAc3リガンド、またはdsRNA物質を意味深い部位に誘導するその他のリガンドのいずれかである。
【０２１８】
本明細書の方法のいくつかの実施態様において、dsRNA物質は対象に投与され、対象の内の特定の部位に送達される。HBV遺伝子の発現の阻害は、対象の内の特定の部位からの体液または組織から得られる試料中のHBV mRNAまたはHBVタンパク質のレベルの測定、または変動を用いて評価される。好ましい実施態様において、該部位は肝臓および血液から選択される。該部位はまた、上記の部位のいずれか1つから調製される細胞または体液のサブセクションであってもよく、サブグループであってもよい。
【０２１９】
いくつかの実施態様において、本明細書に開示される方法は、HBV感染を有する対象、例えば、HBV遺伝子の発現またはHBV複製の低減から利益が得られる対象の処置に有用である。一態様において、本明細書は、HBVに感染した対象のB型肝炎ウイルスccc DNAのレベルを低減する方法を提供する。別の態様において、本明細書は、HBVに感染した対象のHBV抗原、例えばHBsAgまたはHBeAgのレベルを低減する方法を提供する。別の態様において、本明細書は、HBVに感染した対象のHBVのウイルス負荷を低減する方法を提供する。本明細書はまた、HBVに感染した対象のアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)のレベルを低減する方法も提供する(ただし、ALTまたはASTの一過性の上昇は、ウイルスクリアランスに関連することがある)。一態様において、本明細書は、HBVに感染した対象の抗HBV抗体のレベルを増加させる方法を提供する。別の態様において、本明細書は、HBV感染を有する対象を処置する方法を提供する。一態様において、本明細書は、HBV関連疾患、例えば、D型肝炎ウイルス感染症、デルタ肝炎、B型急性肝炎；急性B型劇症肝炎；慢性B型肝炎；肝線維症；末期肝疾患；または肝細胞癌を有する対象を処置する方法を提供する。されに、HDV感染症は伝染に関してHBVによって提供される必須ヘルパー機能に依存し、HBV感染を有する対象はHDV感染症も有し得るため、いくつかの実施態様において、本明細書に記載される処置方法はまた、HDV感染またはHDV関連障害、例えば、B型肝炎ウイルス感染症、慢性B型肝炎感染症(CHB)、慢性B型肝炎感染(CHB)、肝硬変、肝不全および肝細胞癌(HCC)を有する対象の処置にも有用である。いくつかの実施態様において、本明細書の処置方法(および使用)は、HBV遺伝子を標的化する本明細書のdsRNA物質、またはHBV遺伝子を標的化する本明細書のdsRNA物質の治療有効量を含む医薬組成物のを対象、例えばヒトに投与することを含む。
【０２２０】
一態様において、本明細書は、HBV感染を有する対象における少なくとも1つの症状、例えば、血清または肝臓HBV ccc DNAの存在；血清HBV DNAの存在；血清または肝臓HBV抗原、例えばHBsAgまたはHBeAgの存在；ALTの上昇；ASTの上昇；抗HBV抗体の不存在または低レベル；肝傷害；肝硬変；デルタ肝炎、急性B型肝炎；急性B型劇症肝炎；慢性B型肝炎；肝線維症；末期肝疾患；肝細胞癌；血清病様症候群；摂食障害；悪心；嘔吐、軽度の発熱；筋肉痛；易疲労感；味覚および嗅覚障害(食物およびタバコ忌避)；右上腹部痛および心窩部痛(間欠性、軽度から中等度)；肝性脳症；傾眠；睡眠パターンの乱れ；精神錯乱；昏睡；腹水；胃腸出血；凝血異常；黄疸；肝腫大(軽度に肥大した軟らかい肝臓）；脾腫大；手掌紅斑；クモ状母斑；筋肉の消耗；クモ状血管腫；脈管炎；静脈瘤出血；末梢性浮腫；女性化乳房；精巣萎縮；腹部側副静脈(メズサの頭(caput medusa))；ASTレベルより高いALTレベル；γ−グルタミルトランスペプチダーゼ(GGT)およびアルカリホスファターゼ(ALP)レベルのULNの3倍を超えない上昇；やや低いアルブミンレベル；血清鉄レベルの上昇；白血球減少症(すなわち、顆粒球減少症)；リンパ球増加症；赤血球沈降速度(ESR)の増加；赤血球寿命の短縮；溶血；血小板減少症；国際標準化比(INR)の延長；血清または肝臓HBsAg、HBeAg、B型肝炎コア抗体(抗HBc)免疫グロブリンM(IgM)の存在；B型肝炎表面抗体(抗HBs)、B型肝炎e抗体(抗HBe)またはHBV DNA；ビリルビンレベルの増加；高グロブリン血症；抗平滑筋抗体(ASMA)または抗核抗体(ANA)などの組織非特異的抗体の存在(10〜20％)；甲状腺に対する抗体などの組織特異的抗体の存在(10〜20％)；リウマチ因子(RF)のレベル上昇；血小板数および白血球数の低減；小葉の、変性および修復性肝細胞変化を伴う、および付随する炎症；または検出可能か検出不可能かにかかわらず、主に小葉中心性の壊死、を予防する方法を提供する。本方法は、本発明のdsRNA物質、例えば、dsRNA、または該dsRNA物質治療有効量を含む医薬組成物を対象に投与し、それによって、HBV感染を有する対象、またはHBVおよびHDV感染の両方を有する対象など、HBV遺伝子発現の低減から利益が得られる障害を有する対象の少なくとも1つの症状を予防することを含む。
【０２２１】
別の態様において、本明細書は、対象、例えば、HBV感染を有する対象、またはHBVおよびHDV感染の両方を有する対象など、HBV遺伝子発現の低減または阻害から利益を得られ得る対象を処置するための、本明細書の治療有効量のdsRNA物質の使用を提供する。
【０２２２】
さらなる態様において、本明細書は、対象、例えば、HBV感染を有する対象、またはHBVおよびHDV感染の両方を有する対象など、HBV遺伝子発現またはHBV複製の低減から利益が得られる対象、およびHBV遺伝子発現の低減から利益が得られる障害、例えばHBV関連疾患を有する対象の処置のための治療用医薬の製造における、HBV遺伝子を標的化する本明細書のdsRNA物質、例えばdsRNA、またはHBV遺伝子を標的化するdsRNA物質を含む医薬組成物の使用を提供する。
【０２２３】
別の態様において、本明細書は、HBV遺伝子発現またはHBV複製の低減または阻害から利益が得られる障害に罹患している対象の少なくとも1つの症状を予防するための、本明細書に記載されるdsRNA物質の使用を提供する。
【０２２４】
さらなる態様において、本明細書は、HBV遺伝子発現またはHBV複製の低減または阻害から利益が得られる障害、例えばHBV関連疾患に罹患している対象の少なくとも1つの症状を予防するための治療用医薬の製造における本明細書に記載のdsRNA物質の使用を提供する。
【０２２５】
いくつかの実施態様において、dsRNA物質が対象に投与される場合、dsRNA物質標的化HBVは、HBV感染症を有するか、HBVおよびHDV感染の両方を有するか、またはHBV関連疾患を有する対象に対して、例えば対象の細胞、組織、血液、他の組織または体液中の1つまたはそれ以上のHBV遺伝子の発現、HBV ccc DNA レベル、HBV抗原レベル、HBVウイルス負荷レベル、ALTまたはASTが少なくとも80%、85%、90%、95%、98%にまたは標準により向かって低減または正規化されるように投与される。
【０２２６】
本明細書の方法および使用は、いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組成物を、標的HBV遺伝子発現が例えば、一ヶ月間低減するように投与することを含む。いくつかの実施態様において、標的HBV遺伝子の発現は、長時間、例えば、少なくとも二ヶ月、三ヶ月またはそれ以上の時間低減する。いくつかの実施態様において、本明細書の方法および使用は、機能的治癒をもたらす本明細書に記載される組成物を投与することを含む。
【０２２７】
本明細書に記載される方法および使用によるdsRNAの投与は、HBV感染症またはHBVおよびHDV感染症の両方、またはHBV関連疾患を有する患者におけるそのような疾患または障害の重症度、徴候、症状またはマーカーの低減をもたらす。この状況で「低減」とは、そのようなレベルの臨床的に有意な低減を意味する。低減は、例えば、少なくとも80%、85%、90%、95%もしくは98%、または検出レベル未満であり得る。
【０２２８】
いくつかの実施態様において、本明細書の方法の有効性は、HBV関連疾患の症状の低減を検出またはモニタリングによってモニターされ得る。これらの症状は、当該分野で知られているいずれかの方法を用いてインビトロまたはインビボで評価され得る。
【０２２９】
疾患の処置の有効性は、例えば、疾患進行、疾患寛解、症状重症度、疼痛の低減、クオリティ・オブ・ライフ、処置効果の持続に必要な薬物の用量、疾患マーカーのレベル、または処置される所定の疾患に適切な測定可能なその他のパラメーターを測定することによって評価され得る。このようなパラメーターのいずれか1つ、またはパラメーターのいずれかの組み合わせを測定することによって処置の有効性をモニターすることは、十分当業者の能力の範囲内である。例えば、CHBの処置の有効性は、例えば、ウイルス負荷およびトランスアミナーゼレベルの定期的なモニタリングによって評価され得る。初期の読み取り値と後の読み取り値との比較により、処置が有効かどうかの指標を医師に提供する。このようなパラメーター、またはパラメーターのいずれかの組み合わせのいずれか1つを測定することによって処置の有効性をモニターすることは、十分当業者の能力の範囲内である。HBVを標的化するdsRNA物質またはその医薬組成物の投与と関連して、HBV関連疾病「に対して有効である」は、臨床的に適切な方法での投与により、症状の改善、治癒、疾患の軽減、寿命の延長、クオリティ・オブ・ライフの改善、またはHBV感染またはHBVに関連疾患および関連する原因の処置に精通した医師によって好ましいと一般に認識される他の効果など、少なくとも統計的に有意な割合の患者に対する有益な効果をもたらすことを示す。
【０２３０】
処置効果は、疾患状態の1つまたはそれ以上のパラメーターの臨床的に有意な改善がある場合、または悪化もしくは本来予想されていた症状が発症しないことにより明らかである。一例として、疾患の測定可能なパラメーターの少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％またはそれ以上の有利な変化は、有効な処置を示し得る。所定のdsRNA物質薬物またはその薬物の製剤の有効性も、当該技術分野で知られているように、所定の疾患に関して実験動物モデルを用いて判断することができる。実験動物モデルを用いる場合、処置の有効性は、徴候または症状の統計的に有意な低減が観察された場合に証明される。
【０２３１】
dsRNA物質の投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿または他の区画中の血清または肝臓HBVcccDNAの存在、血清または肝臓HBV抗原、例えばHBsAgもしくはHBeAgの存在；または正規化ALTレベルもしくはASTレベルを、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%に、またはアッセイの検出のレベル未満までに、臨床検査値の正常値の上限に向かってまたは上限まで低減することができる。
【０２３２】
dsRNA物質の投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液または他の区画中の血清または肝臓抗HBV抗体、例えば抗HBsAg抗体の存在を、検出可能にするか、または少なくとも80%、85%、90%、95%またはそれ以上増加させるか、または処置前に何も検出されなかった場合に抗体を検出可能にすることができる。
【０２３３】
HBV発現の阻害性効果のため、いくつかの実施態様において、本明細書による組成物またはそれから調製される医薬組成物はクオリティ・オブ・ライフを向上させることができる。
【０２３４】
HBV遺伝子発現の低減または阻害から利益が得られる対象は、本明細書に記載されるHBV感染またはHBV関連疾患もしくは障害を有する者である。
【０２３５】
HBV遺伝子発現の低減または阻害から利益が得られる対象の処置は、治療的および予防処置を含む
【０２３６】
本明細書はさらに、他の医薬品または他の治療法、例えば、知られている医薬品または知られている治療法、例えば、現在これらの障害の処置に用いられるものとの組み合わせで、HBV遺伝子発現の低減または阻害から利益が得られる対象、例えばHBV関連疾患を有する対象を処置するためのdsRNA物質またはその医薬組成物の方法および使用を提供する。
【０２３７】
例えば、いくつかの実施態様において、1つまたはそれ以上のHBV遺伝子を標的化するdsRNA物質は、例えば、本明細書に記載されるHBV関連疾患の処置に有用な物質との組み合わせで投与される。例えば、HBV発現の低減から利益が得られ得る対象、例えばHBV関連疾患を有する対象を処置するのに適当なさらなる治療薬および治療法には、HBVゲノムの異なる部分を標的化するdsRNA物質、抗ウイルス剤、a ヌクレオチドアナログ、ヌクレオシドアナログ、逆転写酵素阻害物質(例えば、テノフォビルジソプロキシルフマレート(TDF)、テノフォビルアラフェナミド、ラミブジン、アデフォビルジピボキシル、エンテカビル(ETV)、テルビブジン、AGX-1009、エムトリシタビン、クレブジン、リトナビル、ジピボキシル、ロブカビル、ファムビル、FTC、N-アセチル-システイン(NAC)、PC1323、theradigm-HBV、チモシン-アルファ、およびガンシクロビル)、免疫賦活物質(例えば、ペグ化インターフェロンα2a(PEG-IFN-α2a)、インターフェロンα-2b、組換えヒトインターロイキン-7、およびトール様受容体7(TLR7)アゴニスト)、治療ワクチン(例えば、GS-4774、DV-601、およびTG1050)、ウイルス侵入阻害物質(例えば、Myrcludex)、HbsAgの分泌または放出を阻害するオリゴヌクレオチド(例えば、REP9AC)、カプシド阻害物質(例えば、Bay41-4109およびNVR-1221)、ccc DNA阻害物質(例えば、IHVR-25)、または他の治療物質またはHBV関連疾患を処置するための操作、例えば、肝臓移植または化学療法、または上記のいずれかの組み合わせがある。
【０２３８】
本明細書のdsRNA物質を投与される対象にはさらに、非RNAiメカニズムによって機能し、HBV感染の処置に有用な1つまたはそれ以上の他の治療薬が投与される。本明細書の療法との組み合わせに使用され得る例示的な治療法としては、例えば、T細胞ヘルパー活性の増強、Bリンパ球の成熟、T-細胞サプレッサーの阻害、およびHLA I型発現によって免疫系を刺激する免疫モジュレーターが挙げられる。適当な免疫モジュレーターには、抗ウイルス効果、免疫調節効果、および抗増殖効果を含む種々の性質を有するインターフェロンがある。
【０２３９】
例えば、現在の慢性B型肝炎処置はインターフェロン療法であり、これは、少なくとも6ヶ月間確認されたHBV感染、肝酵素(ASTおよびALT)の上昇、およびその血中で活発に分裂しているウイルス(HBeAgまたはHBV DNA陽性試験)を有する対象に投与されるものである。インターフェロン-α療法は、慢性B型肝炎者のうち約35％に、肝酵素の正常化および3つの活動性感染マーカー(HBeAg、HBV DNAおよびHBsAg)の消失を伴う、疾患の長期にわたる持続的な寛解を産生させる。急性HBV感染、末期肝硬変または他の重大な医学的問題を有する対象は、一般的にはインターフェロンを用いて処置されない。
【０２４０】
さらに、HBV関連肝硬変患者のためのインターフェロン療法は、特に多量の血清HBV DNAを有する患者において肝細胞癌(HCC)率を有意に低減させる。HBeAg陽性代償性肝硬変患者では、インターフェロン療法後のウイルス学的および生化学的寛解が生存の改善と関連付けられる。慢性HBV感染患者では、インターフェロン-αによる治療後のHBeAgのクリアランスが臨床転帰の改善と関連付けられる。標準的な治療期間は16週間と考えられる。標準的なレジメンの終了時に低レベルのウイルス複製を呈する患者は、長期処置が最も利益を得る。
【０２４１】
いくつかの実施態様において、本明細書の方法は、HBV感染またはHBV関連疾患を有する対象に逆転写酵素阻害物質を投与することを含む。いくつかの実施態様において、本明細書の方法は、HBV感染またはHBV関連疾患を有する対象に逆転写酵素阻害物質および免疫賦活物質を投与することを含む。
【０２４２】
dsRNA物質と追加の治療物質または処置とは同じ時点でまたは同じ組み合わせで、例えば非経腸的に投与されてもよく、または追加の治療物質は、別個の組成物の一部として投与されてもよく、別個の時点で投与されてもよく、当該分野で知られているまたは本明細書に記載される別の方法によって投与されてもよい。
【０２４３】
本明細書はまた、本明細書に記載されるdsRNA物質、または本明細書に記載されるdsRNA物質を含有する組成物を用いて細胞におけるHBV発現を低減または阻害する方法を提供する。さらに他の態様において、細胞におけるHBV遺伝子発現を低減または阻害するための治療用医薬の製造のための、本明細書に記載されるdsRNA物質、または本明細書に記載されるdsRNA物質を含む組成物の使用が提供される。さらに他の態様において、本明細書は、細胞におけるHBV複製の低減または阻害に使用するための、本明細書に記載されるdsRNA物質、または本明細書に記載されるdsRNA物質を含む組成物が提供される。さらに別の態様において、細胞におけるHBV複製を低減または阻害するための医薬の製造のための、本明細書に記載されるdsRNA物質、または本明細書に記載されるdsRNA物質を含む組成物を使用が提供される。本方法および使用は、本明細書に開示されるように、細胞をdsRNA物質と接触させることと、HBV遺伝子のmRNA転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって細胞を維持し、それによって細胞におけるHBV遺伝子の発現を阻害し、またはHBV複製を阻害することとを含む。
【０２４４】
上記の方法および使用において、細胞は、インビトロまたはインビボで接触されてもよく、すなわち、細胞は対象の内にあり得る。
【０２４５】
本明細書に開示される方法を用いた処置に適当な細胞は、HBV遺伝子を発現するいずれかの細胞、例えば、HBVに感染した細胞、HBVゲノムもしくはHBV遺伝子の一部分を含む発現ベクターを含む細胞、またはHBV遺伝子を発現するトランスジェニックマウスであり得る。本明細書に開示される方法および使用に用いるのに適当な細胞は、哺乳類の細胞、例えば、霊長類細胞(ヒト細胞または非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞またはチンパンジー細胞など)または非霊長類細胞(マウス細胞、ラット細胞、または他の哺乳類の細胞)であり得る。特定の実施態様において、細胞は、HBVに感染し得る細胞である。特定の実施態様において、細胞はヒト細胞、例えば、ヒト肝細胞である。
【０２４６】
HBV遺伝子発現は、細胞において少なくとも80%、85%、90%、95%またはそれ以上、例えば、アッセイの検出レベル未満にまでに阻害され得る。
【０２４７】
HBV複製は、細胞において少なくとも80%、85%、90%、95%またはそれ以上、例えば、アッセイの検出レベル未満にまで阻害され得る。
【０２４８】
本明細書に開示されるインビボ方法および使用は、処置される哺乳動物のHBV遺伝子のRNA転写物の少なくとも一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含むdsRNA物質を含有する組成物を対処に投与することを含み得る。処置される生物がヒトである場合、組成物は、皮下投与、静脈内投与または筋肉内投与を含むか、これらに限定されない当該分野で知られているいずれかの手段によって投与され得る。いくつかの実施態様において、組成物は皮下注射によって投与される。いくつかの実施態様において、dsRNA物質は、全用量を単回注射として投与するように製剤化される。いくつかの実施態様において、本明細書は、臓器特異的(例えば、肝臓)動脈内、腫瘍内、皮内、硝子体内注射、眼局所、眼(点眼薬)、噴霧、眼局所または他の局所経路、坐薬、または経口投与のために製剤化される組成物を提供する。
【０２４９】
一態様において、本明細書はまた、哺乳動物、例えばヒトにおけるHBV遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。本明細書はまた、哺乳動物におけるHBV遺伝子の発現の阻害に使用するための、哺乳動物の細胞内のHBV遺伝子を標的とするdsRNA物質を含む組成物を提供する。別の実施態様において、本明細書は、哺乳動物におけるHBV遺伝子の発現を阻害するための治療用医薬の製造における哺乳動物の細胞内のHBV遺伝子を標的とするdsRNA物質の使用を提供する。
【０２５０】
本方法および使用は、哺乳動物における細胞内のHBV遺伝子を標的とするdsRNA物質を含む組成物を、哺乳動物、例えば、ヒトに投与することと、HBV遺伝子のmRNA転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって哺乳動物を維持し、それによって、哺乳動物におけるHBV遺伝子の発現を阻害することとを含む。
【０２５１】
特定の実施態様において、遺伝子発現の低減は、当該分野で知られているいずれかの方法、例えば、本明細書に記載されるqRT-PCRによって、dsRNA物質を投与された対象の末梢血試料中で評価され得る。タンパク質産生の低減は、当該分野で知られているいずれかの方法によって、および本明細書に記載される方法、例えばELISAまたはウェスタンブロット法によって評価され得る。遺伝子およびタンパク質発現レベルを測定するための臨床的に許容される方法が適切に使用される。特定の実施態様において、肝穿刺生検試料が、HBV遺伝子またはタンパク質発現の低減をモニタリングするための組織材料物質として役立つ。いくつかの他の実施態様において、血液試料が、HBV遺伝子またはタンパク質発現の低減をモニタリングするための組織材料物質として役立つ。
【０２５２】
いくつかの実施態様において、dsRNA物質の投与後のインビボでの標的のRISC薬用切断の検証は、5'-RACEまたは当該分野で知られているプロトコールの変更によって行われる(Lasham A et al., (2010) Nucleic Acid Res., 38 (3) p-e19)(Zimmermann et al. (2006) Nature 441: 111-4)。
【０２５３】
本発明は以下の例によってさらに例示され、これらの例は限定するものと解釈されてはならない。
【実施例】
【０２５４】
実施例1
DSRNA物質の合成
試薬の供給元
試薬の供給元が本明細書に具体的に示されない場合、このような試薬は、任意の分子生物学試薬供給業者から分子生物学的適用の品質/純度基準で入手することができる。
【０２５５】
dsRNA物質の設計
WO/2016/077321に記載されているように、HBVを標的とするdsRNA設計の選択は、知られている全ての遺伝子型(A〜H)の多数の公開されているHBV配列をほぼ完全に一致する物質、およびその90%超の断片を網羅する物質のa)効力、およびb)それを用いたい要望という2つの基本的な要因に基づき行った。RNA物質を選択するための座標は、NCBI HBV参照ゲノム配列NC_003977.1(GenBank受託番号GI:21326584(配列番号1))に対して決定した。表面抗原(HbSAg)およびHBVポリメラーゼをコードするHBVゲノムの2つの隣接する領域を中心とした、種々の2'-O-メチルおよび2'-フルオロ置換パターンを含む、構造−活性修飾を含有する第一セットのRNA物質を設計し、合成し、インビトロでスクリーニングした。また、HBVゲノム中のさらなる領域、具体的にはHbSAg、ポリメラーゼおよびX遺伝子をコードする領域である、配列番号1の1581〜1599位を標的とする第二セットの物質を設計し、合成し、インビトロでスクリーニングした。選択した配列にさらに化学的修飾を施し、試験した。これらの二本鎖設計は、WO2016/077321に記載されており(その内容の全体は、引用により本明細書に包含される)、非修飾HBVセンス鎖およびアンチセンス鎖ヌクレオチド配列の詳しいリストは、WO2016/077321の表3、6、12、22および25に、修飾HBVセンス鎖およびアンチセンス鎖ヌクレオチド配列の詳しいリストは、WO2016/077321の表4、7、13、23および26に記載されている。それらの物質で行われたスクリーニンアッセイからの結果も、そこに記載されている。
【０２５６】
これらの研究により、二本鎖AD-66810が、修飾ヌクレオチド配列：5'-usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(配列番号13)を有するアンチセンス鎖、および、修飾ヌクレオチド配列：5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3’(配列番号29)を有するセンス鎖［配列中、a、c、gおよびuはそれぞれ、2'-O-メチルアデノシン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルシチジン-3'-ホスフェート、2'-O-メチルグアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-O-メチルウリジン-3'-ホスフェートであり；Af、Cf、GfおよびUfはそれぞれ、2'-フルオロアデノシン-3'-ホスフェート、2'-フルオロシチジン-3'-ホスフェート、2'-フルオログアノシン-3'-ホスフェートおよび2'-フルオロウリジン-3'-ホスフェートであり；そして、sはホスホロチオエート連結であり；そして、ここで、N-アセチルガラクトサミン部分であるN-[トリス(GalNAc-アルキル)-アミドデカノイル)]-4-ヒドロキシプロリノール((Hyp-(GalNAc-アルキル)3としても知られている)または本明細書ではL96と称している)は、該センス鎖の3'末端に共有結合している］を有することを同定した。
【０２５７】
本明細書に記載しているさらなる研究を行うことで、ヒトB型肝炎ウイルス(HBV;U95551)のX転写物を標的化する、以前に同定された配列AD-66810に基づいて、強力かつ特異的なdsRNA物質分子を同定した。この目的を達成するために、一連の化学的に修飾したdsRNA物質を設計し、合成し、Dual-Lucレポーター基本アッセイおよびHepG2.2.15細胞株を用いてインビトロでの活性を試験した。すべての化合物を、そのセンス鎖の3'末端に共有結合している三元系N-アセチルガラクトサミン(GalNac)リガンド(L96)にコンジュゲートした。
【０２５８】
dsRNA物質の合成
固体支持体媒介ホスホラミダイト化学を用いてMermade 192合成装置(BioAutomation)で1μmolスケールのHBVセンスおよびアンチセンス鎖配列を合成した。固体支持体は、カスタムのGalNAcリガンドをロードしたコントロールド・ポア・グラス(controlled pore glass)(500A)または普遍的な支持体(AM biochemical)であった。補助的合成試薬、2'-Fおよび2'-O-メチルRNA、およびデオキシホスホラミダイトは、Thermo-FisherTM(Milwaukee、WI)およびHongene(China)から入手した。対応するホスホラミダイトを用いて2'F2'-O-メチル、GNA(グリコール核酸)、5'-ホスフェートおよび脱塩基修飾を導入した。3' GalNAcコンジュゲート一本鎖の合成は、GalNAc修飾CPG支持体で行った。アンチセンス一本鎖の合成にはカスタムCPG普遍的な固体支持体を使用した。全てのホスホラミダイト(アセトニトリル中100mM)のカップリング時間を5分とし、5-エチルチオ-1H-テトラゾール(ETT)をアクティベーター(アセトニトリル中0.6M)として用いた。無水アセトニトリル/ピリジン(1:1 v/v)中の3-((ジメチルアミノ-メチリデン)アミノ)-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-チオン(DDTT、(Wilmington, MA, USA)から入手した)の50mM溶液を用いてホスホロチオエート連結を作成した。酸化時間は3分とした。配列は全て、最終的にDMT基を除去して合成した(「DMTオフ」)。
【０２５９】
固相合成の完了後、オリゴリボヌクレオチドを固体支持体から切断し、密封された96ディープウェルプレートで200μLメチルアミン水溶性試薬を用いて60℃で20分間脱保護した。切断および脱保護工程の終了時に合成プレートを室温に至らせ、1mLのアセトニトリル(acetontile)：エタノール混合物(9：1)を添加することによって沈殿させた。プレートを-80℃で2時間冷却し、多重チャンネルピペットを用いて上清を慎重にデカントした。オリゴヌクレオチドペレットを20mMのNaOAc緩衝液に再懸濁し、A905オートサンプラーおよびFrac 950フラクションコレクターを備えたAKTA精製装置システムで5mLのHiTrapTMサイズの排除カラム(GE HealthcareTM)を用いて脱塩した。脱塩した試料を96ウェルプレートに収集した。各配列からの試料をLC-MSによって分析してアイデンティティを確認し、UV(260nm)で定量化し、IEXクロマトグラフィーによって選択の試料セットの純度を測定した。
【０２６０】
Tecan液体ハンドリングロボットで一本鎖のアニーリングを行った。センスおよびアンチセンス一本鎖の等モル混合物を一緒にし、96ウェルプレートでアニールした。相補的である一本鎖を一緒にした後、96ウェルプレートをしっかりと密閉し、オーブンで、100℃下で10分間加熱し、2〜3時間の時間をかけてゆっくりと室温に至らせた。各二本鎖の濃度を1XPBSで1μMに正規化した。
【０２６１】
本明細書に開示される修飾ヌクレオチド単量体の略称は表1に示した。表2は、上記の方法を用いて合成したAD-66810およびHBV dsRNA物質を示している。
【０２６２】
表1.修飾核酸配列レプリゼンテーションに使用されるヌクレオチド単量体の略称
特に断らない限り、これらの単量体は、オリゴヌクレオチドで存在する場合、5'-3'-ホスホジエステル結合によって相互に連結されると理解されるだろう。
【表１−１】
2021533767.tif 000023
【表１−２】
2021533767.tif 000024
【０２６３】
【表２】
2021533767.tif 000025
【０２６４】
実施例2
DSRNA物質二本鎖のインビトロスクリーニング
Dual-Glo(登録商標)ルシフェラーゼアッセイ:
Cos7細胞(ATCC(登録商標)、Manassas、VA)を、10％のFBSを補足したDMEM(ATCC)中5％のCO2の雰囲気下37℃でほぼコンフルエンスになるまで成長させた後、トリプシン処理によってプレートから剥がした。ウェルあたり5μlのRNA二本鎖および5μlのpsiCHECK2-HBV(またはpsiCHECK2-HBV遺伝子型A、C、EまたはF)プラスミドを、5μlのOpti-MEM(登録商標)プラス0.1μlのLipofectimeTMRNAiMax(InvitrogenTM、Carlsbad CA.cat# 13778-150)とともに添加することによって、二本鎖物質およびpsiCHECK2-HBV(一致した野生型HBV配列の一部分をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター;配列番号5)、またはHBV遺伝子型A、C、E、またはF(それぞれ配列番号6、7、8または9)のヌクレオチド配列を発現する二本鎖物質およびpsiCHECK2ベクターを用いて、Cos7細胞のトランスフェクションを行い、室温で15分間インキュベートした。次に、35μlの新鮮完全培地に再懸濁した細胞にこの混合物を加えた。トランスフェクトした細胞を50％CO2の雰囲気下でインキュベートした。
【０２６５】
dsRNA物質およびpsiCHECK2プラスミドをトランスフェクトして28時間後に、Firefly(トランスフェクション対照)およびRinella(HBV標的配列に融合している)ルシフェラーゼを測定した。最初に、細胞から培地を除去した。次に、各ウェルに培地容積と等しい20μlのDual-Glo(登録商標)ルシフェラーゼ試薬を添加することによってFireflyルシフェラーゼ活性を測定し、混合した。この混合物を室温で30分間インキュベートした後、Spectramax(登録商標)(分子デバイス)でルミネセンス(500nm)を測定してFireflyルシフェラーゼシグナルを検出した。各ウェルに20μlの室温のDual-Glo(登録商標)Stop&Glo(登録商標)試薬を添加することによってRenillaルシフェラーゼ活性を測定し、プレートを10〜15分間インキュベートした後、ルミネセンスを再び測定してRenillaルシフェラーゼシグナルを決定した。Dual-Glo(登録商標)Stop&Glo(登録商標)試薬は、fireflyルシフェラーゼシグナルを停止させ、Renillaルシフェラーゼ反応のルミネセンスを維持する。各ウェル内でRenilla(HBV)シグナルをFirefly(対照)シグナルに正規化することによってdsRNA物質活性を決定した。次に、同じベクターでトランスフェクトしたが、dsRNA物質で処理しなかったか、または非標的化dsRNA物質で処理した細胞と比べて、dsRNA物質活性の大きさを評価した。全てのトランスフェクションはn=2またはそれ以上で行った。
【０２６６】
表2に記載されている薬剤を用いて、これらのアッセイの結果を表3に提供した。
【０２６７】
HepG2.2.15およびPLCインビトロスクリーニング:
HepG2.2.15およびPLC(ヒトヘパトーマ細胞;ATCC(登録商標)CRL-8024)細胞を、10％のFBS(ATCC)をそれぞれ補足したDMEMまたはEMEM培地(ATCC)中5％のCO2の雰囲気下37℃でほぼコンフルエンスになるまで成長させた後、トリプシン処理によってプレートから剥がした。96ウェルプレートにウェルあたり、5μlのdsRNA物質二本鎖を、ウェルあたり14.8μlのOpti-MEM(登録商標)プラス0.2μlのLipofectamineTMRNAiMax(InvitrogenTM、Carlsbad CA.cat # 13778-150)とともに添加することによって逆トランスフェクションを行い、室温で15分間インキュベートした。次に、2x104HepG2.2.15またはPLC細胞を含有する抗生物質を含まない80μlの完全増殖培地を加えた。細胞を24、48および72時間インキュベートした後、RNA精製を行った。
【０２６８】
表2に記載されている物質を用いたこれらのアッセイの結果は表4に提供する。
【０２６９】
MagMAX-96全RNA単離キット(Applied Biosystem, Forer City CA, part #: AM1830)を用いた全RNA単離:
細胞を採取して140μlの溶解/結合溶液に溶解した後、Eppendorf TMThermomixerを用いて850rpmで1分間混合した(混合速度は過程全体にわたって同じであった)。20μlの電磁ビーズおよび溶解/結合エンハンサー混合物を細胞溶解物に添加し、5分間混合した。磁気スタンドを用いて電磁ビーズを捕捉し、該ビーズを妨害せずに上清を除去した。上清を除去した後、(イソプロパノールが添加された)洗浄溶液1を用いて電磁ビーズを洗浄し、1分間混合した。ビーズを再び捕捉し、上清を除去した。次に、(エタノールが添加された)150μlの洗浄溶液2を用いてビーズを洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次に、50μlのDNase混合物(MagMax turbo DNase緩衝液およびTurbo DNase)をビーズに加え、これらを10〜15分間混合した。混合した後、100μlのRNA再結合溶液を添加し、3分間混合した。上清を除去し、150μlの洗浄溶液2を用いて電磁ビーズを再び洗浄し、1分間混合し、上清を完全に除去した。電磁ビーズを2分間混合して乾燥させた後、50μlの水でRNAを溶出させた。
【０２７０】
ABI高容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813)を用いたcDNA合成：
2μlの10X緩衝液、0.8μlの25XdNTPs、2μlのランダムプライマー、1μlの逆転写酵素、1μlのRNase阻害物質のマスターミックス、および反応あたり3.2μlのH2Oを、10μlの全RNAに加えた。以下の段階によってBio-Rad(登録商標)C-1000またはS-1000サーマルサイクラー(Hercules,CA)を用いてcDNAを生成させた：25℃  10分間、37℃  120分間、85℃  5秒間、4℃ホールド。
【０２７１】
リアルタイムPCR:
2μlのcDNAを、384ウェルプレート(Roche cat # 04887301001)ウェルあたり0.5μlのヒトGAPDH TaqManプローブ(Applied Biosystems Cat # 4319413E)、1μlのSORF2 specific TaqMan(登録商標)プローブおよび5μlのLightCycler480プローブマスターミックス(Roche Cat # 04887301001)を含有するマスターミックスに加えた。DDCt(RQ)アッセイを用いてLightCycler480リアルタイムPCRシステム(Roche)でリアルタイムPCRを行った。相対的な倍率変化を計算するために、DDCt法を用いて実時間データを分析し、AD-1955でトランスフェクトした細胞または模擬トランスフェクト細胞で行われたアッセイに正規化した。
【０２７２】
相対的な倍率変化を計算するために、DDCt法を用いて実時間データを分析し、非標的化対照dsRNA物質でトランスフェクトした細胞で行われたアッセイに正規化した。
【０２７３】
実施例3
DUAL-LUCシステムにおけるGALNACコンジュゲート化HBV-標的化DSRNA物質のトランスフェクション
各コンジュゲートdsRNA物質でトランスフェクションを行った後のHBV mRNAのサイレンシングを表3に示した。Cos7細胞における50nM、10nM、および0.1nMのdsRNA物質濃度でのトランスフェクションを行うことによって各dsRNA物質を試験した。スクリーニング結果に基づき、20個のdsRNA物質のうち7個がAD-66810親と同等の効力を示した。
【表３】
2021533767.tif 000026
【０２７４】
実施例4
HEPG2.2.15細胞におけるGALNACコンジュゲート化HBV-標的化DSRNA物質のトランスフェクション
各コンジュゲートdsRNA物質でのトランスフェクション後のHepG2.2.15細胞におけるHBV mRNA(順方向および逆方向プライマーならびにTaqManプローブを用いて決定されたPORF1およびSORF2 mRNA)のサイレンシングは表4に示している。全体的に、Dual-Luc過剰発現系で観察されたサイレンシングと比較して、PORF1およびSORF2ウイルス転写物のより強固なサイレンシングがHepG2.2.15細胞で観察され、10個のdsRNA物質は親分子AD-66810と同等の効力を有していた。PORF1およびSORF2mRNAに対して同様のdsRNA物質活性が観察され、これは、dsRNA物質の標的部位が両方の転写物に存在するために予想されたものである。
【表４】
2021533767.tif 000027
【０２７５】
上記の研究に基づき、二本鎖AD-81890を選別してさらなる分析を行った。
【０２７６】
実施例5
アデノ関連性HBVマウスモデルにおける単回皮下注射後のAD-81890の薬理学的評価
AD-81890の薬理はアデノ関連性HBV(HBV-AAV)マウスモデルでアッセイした。AAV8-HBV(SignaGen Laboratories)を1×PBSで希釈し、最終濃度が2×1012GC/mLになるようにした。6〜8週齢の雄性C57BL/6マウスに、2×1011GC/マウスを、100μＬの固定容積で側尾静脈を介して静脈内注射した。
【０２７７】
AD-81890を無菌1×PBSで希釈し、10μl/gの可変容積で投与した。表5に記載したように、AD-81890を、0.3mg/kg、1mg/kgまたは3mg/kgで動物に単回SC投与し、投与後の第-24日目、-2日目、0日目、14日目、21日目、33日目、47日目、59日目および74日目に後眼窩洞(後眼窩洞)を介して採血した。
【表５】
2021533767.tif 000028
【０２７８】
採血した後、血液を30分間凝固させ、次に、微量遠心機で13,000rpm、4℃で10分間回転させた。血清を吸引し、-20℃で貯蔵した。
【０２７９】
ELISA(BioTang, Waltham, MA)を介してB型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質レベルを評価した。US Biologics(Memphis, TN)HBsAgタンパク質を用いて標準的な曲線を作成した。血清試料を1×PBS(Gibco, Gaithersburg, MD)で1:2000または1:500に希釈し、わずかな変更を加えたELISAプロトコールを用いて評価した。簡単に説明すると、50μL/ウェルの希釈した血清または標準物質をプレートに充填し、37℃で1時間インキュベートした。このインキュベーション後、50μL/ウェルの酵素コンジュゲートを各ウェルに添加し、そのプレートを37℃で30分間インキュベートした。このプレートを300μL/ウェルの1×洗浄緩衝液で3回洗浄し、次に、全ての液体がウェルから除去されるまでブロットし、100μL/ウェルの基質を添加し、プレートを37℃で30分間インキュベートした。最後に、さらなる100μL/ウェルの停止液を添加し、450nmの波長で吸光度を測定した。計算されたHBsAgレベルがアッセイの定量下限(LLOQ)を下回った場合は、値をLLOQ(すなわち、313ng/mL)として記録した。
【０２８０】
HBV-AAVマウスにおけるAD-81890の単回皮下(SC)投与後の平均±SD血清HBsAg濃度は図2Aに示す。HBV-AAVマウスのベースラインに対する平均±SD血清HBsAgレベルは図2Bに示す。AD-81890の0.3mg/kg、1mg/kgまたは3mg/kgでの単回SC注射により、HBV-AAVマウスの血清HBsAg濃度を強力かつ持続的に低減させ、最高(3mg/kg)のAD-81890投与群では7日目に92％の最大低減が観察された。最大の低減レベルは最高用量群で33日目まで維持され、その後HBsAg濃度はベースラインに戻り始めた(図2B)。血清中HBsAg濃度の中間的な低減は0.3mg/kgおよび1mg/kgでのAD081890投与群で観察され、7日目にはそれぞれ最大で23％および72％低減した。0.3mg/kgおよび1mg/kgの両方でのAD-81890投与群のHBsAgレベルは、研究終了(74日目)までにベースラインレベルに戻った。
【０２８１】
実施例6
多回皮下注射後のアデノ関連性HBVマウスモデルにおけるAD-81890の薬理学的評価
AD-81890の薬理はアデノ関連性HBV(HBV-AAV)マウスモデルでアッセイした。AAV8-HBV(SignaGen Laboratories)を1×PBSで希釈し、最終濃度が2×1012GC/mLになるようにした。6〜8週齢の雄性C57BL/6マウスに、2×1011GC/マウスを、100μＬの固定容積で側尾静脈を介して静脈内注射した。
【０２８２】
AD-66810およびAD-81890それぞれを無菌1XDPBSで希釈し、10ul/gの可変容積で投与した。動物に、AD-66810を、1mg/kgで特定のQ2Wx6によって投与するか、または、AD-81890を、9mg/kgでの単回投与または1mg/kgもしくは3mg/kgでの多回投与で特定のQ2Wx6またはQMx3によって投与した。表6に記載されるように、複数の時点で動物から血清を採取した。表6に記載されるように、血液は後眼窩洞から採取した。
【表６】
2021533767.tif 000029
【０２８３】
前の実施例で記載されているように、血液試料を処理し、ELISAアッセイを行った。結果は下記の表7に示す。標準偏差を含めた結果は図3に示す。
【表７】
2021533767.tif 000030
【０２８４】
AD-81890投与後のAAV8-HBVマウスモデルで用量反応性血清HBsAgレベルが観察された。AD-81890の9mg/kgでの単回投与または3mg/kgでのq2w×6投与後、最大約2.7log10のHBsAg低減が観察された。3mg/kgでq2w×6投与した動物は、2log10超のHBsAg低減が合計で約8週間持続した。
【０２８５】
これらのインビボ試験により、AD-81890がHBV-AAVマウスモデルにおける血清中HBsAgの低減に有効であることを証明した。
【０２８６】
実施例7
AD-81890の特定のオフターゲット分析
AD-81890のアンチセンス鎖の潜在的なオフターゲット活性の評価に、インシリコバイオインフォマティクス法とインビトロ法の組み合わせを使用した。
【０２８７】
バイオインフォマティクス
カスタムRおよびPythonスクリプトを用いて、B型肝炎ウイルス(HBV)サブタイプayw(GenBank ヌクレオチド ID U95551；NCBI遺伝子ID:7276；配列番号:49)の「X」遺伝子を標的化する一連のdsRNA物質を設計した。環状のU95551HBVゲノムは3182塩基の長さを有し、「X」遺伝子のCDS領域はNCBI記録中の1376〜1840位にコードする。dsRNA物質の設計およびスクリーニング方法の詳細は、上記およびWO2016/077321に記載されている。
【０２８８】
HepG2.2.15 細胞におけるオフターゲット検出のためのGalNAc-コンジュゲートdsRNA物質のトランスフェクションスクリーン
オフターゲット阻害を測定するために、qPCRによる内因性発現転写物の応答を、肝細胞の細胞株HepG2.2.15で試験した。Lipofectamine RNAiMax(ThermoFisher)を用いて、細胞を、50nMから5fMまでの濃度範囲のAD-81890で96ウェルプレート(ウェルあたり2×104細胞)にトランスフェクトした。24時間後、MagMAXTM-96全RNA単離キット(ThermoFisher)を用いて細胞からRNAを抽出し、ABI高容量cDNA逆トランスフェクションキット(ThermoFisher)を用いてcDNAを合成した。試料を、HBV mRNAの阻害および潜在的なオフターゲットサイレンシングについてアッセイした。qPCRによる定量化のために、HBVウイルス転写物の異なる領域を認識する2つの異なるカスタムTaqManアッセイであるPORF-1およびSORF-2を用いてHBV発現を評価した。
【０２８９】
オフターゲットサイレンシングを評価するために、各潜在的なオフターゲットに特異的なTaqManプローブ(表8）を定量化に使用した。qPCRは、LightCycler 480実時間PCRマシン(Roche)を用いて行った。
【表８】
2021533767.tif 000031
【０２９０】
オンターゲット(HBV)および潜在的なオフターゲット遺伝子阻害の程度を決定するために、同じ試料からのヒトGAPDH RNA発現に対する正規化によって相対的なRNAレベルを決定した。結果を、トランスフェクトした非特異的dsRNA物質の対照群と比較し、誤差は標準偏差として表した。AD-81890のIC50は、PORF1転写産物標的に対して0.803nM、SORF2転写産物標的に対して0.766nMであった。AD-81890の最高濃度であっても、SIDT2およびZBTB2転写物に対して有意な標的ノックダウンは観察されなかった。
【０２９１】
AD-81890によるオフターゲット阻害の程度は、HepG2.2.15における内因性発現転写物からの2つの潜在的なオフターゲットの用量反応スクリーンで評価した。AD-81890は、試験したどの用量でもSIDT2またはZBTB2の発現を阻害しなかったが、HBV阻害は用量に反応した。4パラメーターフィットモデル(XLfit)を用いて用量反応データを適合させると、PORF-1またはSORF-2に対するIC50はそれぞれ803pMおよび766pMであった。
【０２９２】
実施例8
HEPG2.2.15細胞におけるRNA-SEQを用いたAD-81890特異性のインビトロ分析
RNA-Seqを用いた発現レベルにおけるトランスクリプトームワイド(transcriptome-wide)な変化を用いて、HBV発現HepG2.2.15細胞株におけるAD-66810とAD-81890の比較によるdsRNA物質の化学修飾の影響を測定した。AD-66810とAD-81890分子は、同じヌクレオチド配列を有するが、アンチセンス鎖(表2を参照)の分子の5'末端から6位に単一のグリコール核酸(GNA)の置換によって異なる。
【０２９３】
全ゲノムHBVで安定的にトランスフェクトしたHepG2由来細胞株であるHepG2.2.15細胞を培地で187,500細胞/mLの最終濃度に希釈し、80μLを96ウェルコラーゲンコーティングプレート(BD Biocoat, Cat#356407)にピペットして15,000細胞/ウェルの最終濃度を与えた。
【０２９４】
dsRNA物質の株を1XDPBSで1,000nMまたは100nMの濃度に希釈した。RNAiMAX(ThermoFisher, Cat#13778150)をOpti-MEM(ThermoFisher Cat#31985062)で0.3μLRNAiMAX/10μLOpti-MEMの濃度に希釈し、室温で5分間インキュベートした。インキュベーション後、10μL/ウェルを、10μL/ウェルの適切なdsRNA物質希釈液とともに、96ウェルコラーゲンコーティングプレート(BD Biocoat, Cat#356407)の各ウェルに加え、穏やかに混合し、室温で20分間インキュベートした。調製した細胞懸濁液を各ウェルに80μL添加し、最終的な細胞密度が15,000細胞/ウェルとなり、最終的なdsRNA物質濃度が100nMおよび10nMとなるようにした。細胞を、5％のCO2を含む37℃のインキュベーターで16〜22時間インキュベートした。各実験条件が16ウェルを有するように細胞をプレートし、実験を2回行った。
【０２９５】
プロトコールに従って、ThermoFisher RNAqueous-96全RNA単離キットを用いてRNAを単離した。簡単に説明すると、16〜22時間後に各ウェルから上清を吸引し、100μL/ウェルの1×DPBSを添加して残りの培地を洗い流し、次いで吸引した。各プレートの1列目および5列目の各ウェルに200μL溶解/結合溶液を添加し、上下に数回ピペットし、4ウェル/条件がプールされるように後続の列に移し、RNAが十分に回収されることを確保した。これにより、条件ごとに4つの複製を得た。溶解物を含有する培養プレート各ウェルに100μLの100％エタノールを添加し、数回混合し、フィルタープレートのウェルに移した。一連の遠心分離工程(1,900×g、1分)によって、試料を、提供される洗浄液で洗浄し、DNase試薬で処理し、100μLのヌクレアーゼ無しの水に溶出させた。RNA濃度は、NanoDrop 8000分光光度計(ThermoFisher)で測定した。
【０２９６】
RNAをさらにTURBO DNase(Ambion)で処理した。各RNA試料(≦10μgのRNA/試料)を2μLのDNase、10μLの10X緩衝液およびヌクレアーゼ無しの水と混合して全容積を100μLにし、37℃で30分間インキュベートした。プロトコール通りに、DNase処理後、RNAをさらに
RNeasy MinElute Cleanup Kit(Qiagen)を用いて精製した。RNAを30μLのヌクレアーゼ無しの水に溶出させ、NanoDrop 8000分光光度計でRNA濃度を測定した。RNAを-80℃で貯蔵した。続いて、このRNAを、TruSeq標準的な全RNAライブラリー調製キット(Illumina)を用いたcDNAライブラリー調製に使用し、NextSeq500デスクトップシーケンサー(Illumina)でシーケンス作成し、すべて製造者の使用説明書に従って行った。実験的繰り返しを2回行った。
【０２９７】
HepG2.2.15細胞を、10nMまたは100nMのAD-66810またはAD-81890を用いて4倍でトランスフェクトし、未処理の対照群と一緒に24時間培養した。Purelink RNAキット(ThermoFisher)で抽出したRNAを、rRNA除去のためのRibo-Zeroヒト/マウス/ラットを備えたTruSeq標準的な全RNAライブラリー調製キット(Illumina)を用いたcDNAライブラリー調製に使用し、NextSeq500デスクトップシーケンサー(Illumina)でシーケンス作成し、すべて製造者の使用説明書に従って行った。総40個の試料を、NextSeq 500/550高出力v2 (75サイクル)フローセル(Illumina)ごとにプールした。実験的繰り返しを2回行った。
【０２９８】
生のRNA-Seq読み取りデータを、fastq-mcfを用いて、最小平均品質スコア25、最小残存長36でフィルターした。選別した読み取りデータを、STAR(2.4.2a版)を用いてヒト(hg19/GRCh37)およびHBV(GenBankヌクレオチドID U95551；NCBI遺伝子ID:7276)ゲノムに同時に整列させた。HBVゲノムの環状構造により、HBV配列の直線化バージョンの末端に46塩基対が繰り返されて、読み取りをブレークポイントでマッピングさせる。featureCounts(バージョン1.5.0)によってエキソンにマッピングする特異的整列化読み取りをカウントした。全ての試料は>5Mのマッピングされた読み取りを有していた。差動的な遺伝子発現分析は、package DESeq2(バージョン1.16.1)を用いてR(バージョン3.4.1)で行った。調整されたp値を取得するための多重検定補正は、Benjamini & Hochberg, 1995の方法を用いてDESeq2によって行った。
【０２９９】
MAプロットは、オンターゲットHBVノックダウンとオフターゲット効果の両方の可視化に使用した。グローバルなオフターゲット効果を緩和するためのGNA化学の分析は、ダウンレギュレートされた遺伝子(log2倍率変化<0)に限定した。アップレギュレートされた遺伝子(log2倍率変化>0)は二次効果と見なされた。ほぼ最大のHBVノックダウンを達成したため、オフターゲット効果の評価を最低(10nM)用量に制限した。トランスクリプトームのノイズを比較するために、有意にダウンレギュレートされた(調整されたp値段<0.05)遺伝子をAD-66810および/またはAD-81890で同定した。ダウンレギュレーションの程度は、ウェルチの両側、2試料のt検定(表9)を用いて評価したAD-66810とAD-81890の間の統計的差異で、log2倍率変化(図4)のボックスプロットによって視覚化した。
【表９】
2021533767.tif 000032
【０３００】
実験的繰り返しの両方(図4、表9)でAD-66810と比較したAD-81890でのオフターゲット効果の一貫した低減が観察された。10nMでは、AD-81890はAD-66810(表9)と比較して、有意にダウンレギュレートされた遺伝子の平均log2倍率変化が52％の低減(一回繰り返し)または54%の低減(二回繰り返し)を示した。100nMでは、AD-81890はAD-66810(表9)と比較して、平均log2倍率変化が71％の低減(一回繰り返し)または43％の低減(二回繰り返し)を示した。すべての場合において、log2倍率変化で観察された低減は統計的に有意であった。したがって、AD-81890は実質的により低いレベルのトランスクリプトームのノイズを有した。
【０３０１】
実施例9
PXB-マウスにおけるヒト-特異的肝毒性の評価
PXB-マウスは、ヒト肝細胞によって高度に再配置させた、ヒト化肝臓を有するキメラマウス(PhoenixBio)である。該マウスは、ヒト肝細胞を移植したウロキナーゼ-タイププラスミノーゲンアクティベーター(uPA)/重症複合型免疫不全症(SCID)マウス(ヒト化肝臓uPA/SCIDマウス)(Mercer et al., Nat. Med. 7:927-933, 2001)である。報告されているヒト化肝臓uPA/SCIDマウスは、肝臓内のヒト肝細胞の割合である置換指数(RI)が70％超である。該マウスは、ヒト薬物代謝、薬物動態および肝毒性の予測ためのモデルとして使用し得る(Naritomi et al., Drug Metab Pharmacokinet. 33:31-39, 2018)。
【０３０２】
PBX-マウスで研究を行い、AD-66810とAD-81890の肝毒性を比較した。0日目、21日目、28日目、35日目および42日目に12mg/kg、36mg/kgまたは100mg/kgのAD-66810、AD-81890またはPBS(対照)を皮下注射(群あたりn=4)でマウスに投与した。一般状態観察と体重測定は、49日目まで週2回行った。血液は週に2回後眼窩の出血によって採取し、血清は通常の方法を用いて調製した。終末出血(terminal bleed)を行い、心穿刺と放血によって動物を犠牲にした。放血後に剖検を行った。肝臓を採取して秤量した。肝臓を分離して、パラフィン包埋の前にRNAlater溶液(Ambion)に貯蔵し、ホルマリンに貯蔵し、スナップ凍結させた。
【０３０３】
全ての動物は、研究期間中、初期レベルの80％超の体重を維持した。さらに、化合物-処置群における最低算術平均値は、対照PBS-処置群より高かった。
【０３０４】
血中ヒト血清アルブミンレベルは、研究期間中ずっとモニターした。生き残しているすべての動物は、研究の生存期間中、7.0mg/mlを超える血中h-Alb濃度を維持した。
【０３０５】
肝酵素は、試験過程中ずっとモニターした。具体的には、研究期間中、ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、TGをモニターした。AD-66810、AD-81890またはPBSを投与されたマウスについて、49日目に測定した酵素レベルを、以下の表10に示した。図5Aおよび5Bは、PBSの投与と比較した、AD-66810(図5A)またはAD-81890(図5B)の投与後の経時的なALTレベルを示している。
【表１０】
2021533767.tif 000033
【０３０６】
試験化合物処置群の両方において、ALT、AST、ALPおよびGGTは対照群と比較して増加を示した。さらに、AD-66810処置群のALT、ASTおよびGGTにおいて用量依存性変化が実証された。
【０３０７】
剖検では、いずれの群でも試験化合物に特異的な所見はなかった。対照群と比較した場合、化合物処置群の動物の相対的な(肝臓/体重)肝臓重量に明らかな変化はなかった。
【０３０８】
当量
当業者であれば、本明細書に記載されている特定の実施態様および方法と同等のものが多数存在することを認識するか、または日常的な実験のみでそれを確認することができるであろう。そのような同等のものは、以下の請求項の範囲によって包含されることが意図されている。
【０３０９】
特定の実施態様が例示および説明されてきたが、上記の様々な実施多様を組み合わせてさらなる実施態様を提供することができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができることは容易に理解されるだろう。
【０３１０】
2018年8月13日に出願された米国仮特許出願第62/718,314号を含む、本明細書で言及された、または出願データシートに記載された図、米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許公開公報のすべては、特に断らない限り、その全体が参照により本明細書に援用される。さまざまな特許、出願、および刊行物の概念を採用してさらなる実施態様を提供する必要がある場合、実施態様の側面を修正することができる。
【０３１１】
上述の詳細な説明に照らして、実施例に対して、これらおよび他の変更を行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施態様に限定するものと解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を有する等価物のすべての範囲とともに、すべての可能な実施態様を含むように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本明細書によって限定されない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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