(57)【要約】  本発明は、細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその用途に関し、具体的にはヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷もしくは死滅中の細胞または遺伝子異常のある細胞との細胞融合により正常細胞に回復することが確認されたので、前記ＨＮ／Ｆタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターまたはそれで形質転換された細胞を、細胞損傷に関連する疾患、例えば神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用組成物の有効成分として有効に用いることができる。【選択図】図２１
2021529218.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを有効成分として含有する、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ及びＦタンパク質は、センダイウイルス（ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  １）、ヒトパラインフルエンザウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ；ＨＲＳＶ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）または水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）由来のものであることを特徴とする、請求項１に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項３】
前記ベクターは、直鎖状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、組換え非ウイルス性ベクター、組換えウイルス性ベクター及び遺伝子発現誘導ベクターシステム（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記組換えウイルス性ベクターは、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルパー依存性アデノウイルス（ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）及びワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）ベクターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項５】
前記神経変性疾患または神経疾患は、運動ニューロン損傷もしくは死滅、脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄神経損傷または末梢神経損傷を誘発するものであることを特徴とする、請求項１に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項６】
前記運動ニューロン損傷または死滅を誘発する神経変性疾患または神経疾患は、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、ケネディ病（ｓｐｉｎａｌ  ｂｕｌｂａｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発性側索硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）及び進行性球麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｂｕｌｂａｒ  ｐａｌｓｙ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項７】
前記脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄神経損傷または末梢神経損傷を誘発する神経変性疾患または神経疾患は、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）、認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、多発梗塞性認知症（ｍｕｌｔｉ−ｉｎｆａｃｔ  ｄｅｍｅｎｔｉａ；ｍｉｄ）、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、レビー小体型認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ）、軽度認知障害（ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、大脳皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）、うつ病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、代謝性脳疾患（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ；ＭＳＡ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｌｓｙ；ＰＳＰ）、てんかん（ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒｏｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ  ａｔｒｏｐｈｙ；ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ）、緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、脳虚血（ｂｒａｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、脳炎後パーキンソニズム（ｐｏｓｔ−ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｃ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）、トゥレット障害（Ｔｏｕｒｅｔｔｅ'ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、むずむず脚症候群（ｒｅｓｔｌｅｓｓ  ｌｅｇｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）及び注意欠陥多動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｔ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項８】
前記筋肉変性疾患または筋肉疾患は、ミオパチー（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、先天性ミオパチー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｍｙｏｐａｔｈｙ）、先天性筋ジストロフィー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂｅｃｋｅｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、肢帯型筋ジストロフィー（Ｌｉｍｂ  Ｇｉｒｄｌｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（Ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、遠位型筋ジストロフィー（ｄｉｓｔａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（Ｅｍｅｒｙ−Ｄｒｅｉｆｕｓｓ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋強直性ジストロフィー（Ｍｙｏｔｏｎｉｃ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、バース症候群（Ｂａｒｔｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心不全（ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、サルコペニア（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）及びＸ連鎖性拡張型心筋症（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項９】
ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を有効成分として含有する、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１０】
前記細胞は、幹細胞、前駆細胞及び動物細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１１】
前記細胞は、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）細胞、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）細胞及び異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１２】
前記幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１３】
前記成体幹細胞は、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）及び間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１４】
前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、血液、脳、皮膚、脂肪、骨格、筋肉、神経、骨膜、羊膜及び胎盤からなる群から選択される少なくとも１種の組織由来の間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項１３に記載の筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１５】
ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを治療学的に有効な量で個体に投与するステップを含む、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療方法。
【請求項１６】
ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を治療学的に有効な量で個体に投与するステップを含む、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療方法。
【請求項１７】
神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物として用いるための、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの用途。
【請求項１８】
神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物として用いるための、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその用途に関し、具体的にはヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）遺伝子を細胞に形質導入して過剰発現させることにより他の細胞との細胞融合能力を高め、損傷もしくは死滅中の細胞または遺伝子異常のある細胞との細胞融合により細胞損傷を回復させて正常遺伝子を伝達することができる、細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びに細胞損傷に関連する疾患における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、疾患及び老化は、細胞損傷及び細胞死により進行する。細胞損傷及び死滅が誘発される代表的な疾患としては、神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）などが挙げられる。
【０００３】
急速な老齢人口の増加に伴い、脳、脊椎、末梢神経の損傷をはじめとする神経変性疾患が増加する傾向にある。神経変性疾患の原因は、いまだ明らかにされていない。また、各神経変性疾患の病理機序として、少しずつ異なる機序が作用することが知られている。
【０００４】
例えば、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、ケネディ病（ｓｐｉｎａｌ  ｂｕｌｂａｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）などは、運動ニューロンのみ選択的に死滅して運動機能のみ退行するものである。その結果、四肢麻痺の症状が現れるので、運動ニューロン疾患ともいう。
【０００５】
一方、前記運動ニューロン疾患とは異なり、アルツハイマー病、パーキンソン病などは、脳のニューロンが消失する代表的な神経変性疾患として知られている。アルツハイマー病においては、ニューロンの消失により全般的な脳萎縮所見が現れる。このような脳病理所見は、疾患初期には主に記憶力を担う主な脳部位である海馬及び嗅内皮質部位に限定されて現れるが、次第に頭頂葉、前頭葉などを経て脳全体に広がる。このような脳病理所見の進行により、初期には記憶力の低下が主に現れるが、進行に伴う漸進的な経過を経て、様々な臨床症状が現れるようになり、徐々に悪化する。パーキンソン病は、中脳に位置する黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ  ｎｉｇｒａ；ＳＮ）におけるドーパミン作動性ニューロン（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎ）の消失により誘発される。ドーパミン作動性ニューロンの消失は、線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）内の深刻なドーパミン減少を誘発し、大脳基底核（ｂａｓａｌ  ｇａｎｇｌｉａ）、視床（ｔｈａｌａｍｕｓ）及び運動皮質（ｍｏｔｏｒ  ｃｏｒｔｅｘ）を含む錐体外路系（ｅｘｔｒａｐｙｒａｍｉｄａｌ  ｓｙｓｔｅｍ）による運動調節機能に障害を生じさせる。
【０００６】
このように様々な病理機序が作用するので、いずれか１つの機序に作用する治療剤では疾患の治療が困難であり、それ故に現在までほとんど全ての臨床試験が失敗しており、根本的な治療剤が全くない状態である。具体的には、ＡＬＳの治療剤で米国ＦＤＡに承認されたものとしては、運動ニューロンを破壊する過度なグルタミン酸を抑制するリルゾール（ｒｉｒｕｚｏｌｅ）、フリーラジカルによる酸化ストレス損傷を抑制するエダラボン（ｅｄａｒａｖｏｎｅ）以外にはほとんどない実情であり、これらも約３カ月間の生存延長効果や、身体機能の悪化を僅かに鈍化させる効果しかない。アルツハイマー病においては、米国ＦＤＡに承認された治療剤として、脳のニューロンの活動を助ける神経伝達物質であるアセチルコリンを活性化するアリセプト（Ａｒｉｃｅｐｔ）、エクセロン（Ｅｘｅｌｏｎ）、ナメンダ（Ｎａｍｅｎｄａ）、ラザダイン（Ｒａｚａｄｙｎｅ）などがあるが、これらも脳細胞の損傷を最小限に抑えて症状を緩和したり、進行速度を遅らせるだけであり、治療剤としては力不足である。パーキンソン病においても、ドーパミン作用剤であるレボドパ（ｌｅｖｏｄｏｐａ）が治療の根幹として用いられているが、長期的な効果は限定的である。他の神経変性疾患においても、完治をもたらす治療剤がない現状である。よって、より広範囲の機序に作用し、強力な効果を有する治療剤が至急必要とされ、幹細胞治療を含む新たな治療方法が切実に求められている疾患であるといえる。
【０００７】
現在、神経変性疾患を治療するために、細胞移植、症状を改善する薬物の投与など、様々な治療法が提示されており、特に最近は細胞治療に関心が置かれている。しかしながら、従来の細胞治療技術は、健康な細胞（または幹細胞）を疾患部位に挿入することにより死滅した細胞を代替したり、死滅中の細胞の周辺環境を改善して再生させることを目標とするが、そのような試みは、多くの前臨床または臨床試験において効果がないか、効果が僅かであった。また、ニューロンの場合は、他の器官とは異なり、神経回路を形成することが機能において非常に重要であるので、外部から供給された細胞がニューロンに分化し、既存の神経回路をそのまま復元することは期待しがたい。よって、従来の方法以外に、新たなニューロン損傷緩和または保護のための治療方法の開発が切実に求められる。
【０００８】
一方、筋肉は、人体を支えて生命現象を維持する必須組織である。筋肉においては、筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）が分化して多核筋管（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ  ｍｙｏｔｕｂｅ）細胞を形成して筋細胞（ｍｙｏｃｙｔｅ）を作るが、筋芽細胞と筋細胞の死滅は、様々な疾患の原因となっている。また、遺伝子突然変異や様々な原因で筋細胞が消失する疾患が報告されているが、根本的な治療剤がいまだない状況である。このような筋肉疾患は、種類によって症状や疾患の程度が様々であり、ニューロンや脊髄などの神経系統の問題により発生する複合的な形態をとることもある。
【０００９】
例えば、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）は、筋細胞が破壊される疾患であり、遺伝子異常により発生し、症状は力が弱くなり、立つことが困難になることから始まって次第に酷くなり、呼吸筋肉が麻痺して死亡することもある。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ；ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂｅｃｋｅｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ；ＢＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（Ｌｉｍｂ  Ｇｉｒｄｌｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）などの多くの種類があり、種類によって異なる症状が現れる。前記ＤＭＤ及びＢＭＤは、Ｘ染色体に存在するジストロフィン（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）遺伝子の異常により発生し、約１／３は自然突然変異、残りは伴性遺伝に起因する。ＤＭＤとＢＭＤは、どちらも同じ遺伝子の異常が原因であるが、フレームシフト突然変異（ｆｒａｍｅ−ｓｈｉｆｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）などにより強力な表現型を示すものをＤＭＤという。ＤＭＤにおいては、疾患の予後が不良であり、９〜１３才でほとんどの患者が歩行不能になり、筋力弱化だけでなく、認知低下を同伴することもあり、心筋症、呼吸筋障害を伴って死亡に至ることもある。ＤＭＤにおいては、近年、エキソンスキッピング（ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ）による治療を試みる方法が多く用いられている。エキソンスキッピングは、ジストロフィン遺伝子のｅｘｏｎ５１のスプライシング促進配列（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）を標的とするものであるが、ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅのみ回復させ、軽症型の遺伝子変異に置換する原理であるので、根本的な治療法ではなく、全てのＤＭＤを対象とする治療法でもない。
【００１０】
このように、筋肉疾患患者は疾患が進行すると一人では日常生活が行えず、根本的な治療剤も全くない状況であるので、筋細胞損傷または死滅による筋肉疾患を効果的に治療できる新たな治療法が強く求められている。
【００１１】
よって、本発明者らは、神経変性疾患、筋肉変性疾患などの細胞損傷に対する疾患治療剤を開発すべく努力した結果、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷もしくは死滅中の細胞または遺伝子異常のある細胞の細胞損傷を回復させて正常遺伝子を伝達する能力が高まることを確認した。よって、ＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合技術は、細胞損傷を誘発する神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の治療に有用であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２００８−００２６７８６号公報
【特許文献２】韓国公開特許第１０−２００６−０１１９０６４号公報
【特許文献３】米国特許第５４８６３５９号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Annemieke Aartsma-Rus et al" Development of Exon Skipping Therapies for Duchenne Muscular Dystrophy: A Critical Review and a Perspective on the Outstanding Issues, Nucleic Acid Ther. 2017 Oct 1;27(5): 251-259
【非特許文献２】Eckert DM, Kim PS. Annu Rev Biochem. 2001;70:777-810.
【非特許文献３】Sapir A, Avinoam O, Podbilewicz B, Chernomordik LV. Dev Cell. 2008 Jan;14(1):11-21.
【非特許文献４】Kouris NA, Schaefer JA, Hatta M, Freeman BT, Kamp TJ, Kawaoka Y, Ogle BM. Stem Cells Int. 2012;2012:414038
【非特許文献５】Eagle, H. Science 130:432(1959)
【非特許文献６】Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)
【非特許文献７】Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)
【非特許文献８】Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)
【非特許文献９】Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)
【非特許文献１０】Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)
【非特許文献１１】Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)
【非特許文献１２】Dulbecco, R. et al., VirProcy 8:396(1959)
【非特許文献１３】Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)
【非特許文献１４】Waymo, h, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)
【非特許文献１５】McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)
【非特許文献１６】Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)
【非特許文献１７】R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York (1984)
【非特許文献１８】Yu J et al. (2007) Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920
【非特許文献１９】Takahashi K et al. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872
【非特許文献２０】L.G. VILLA-DIAZ et al. (2012) Derivation of Mesenchymal Stem Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells Cultured on Synthetic Substrates. STEM CELLS. 30, 1174-1181
【非特許文献２１】Hyun Soo Choi et al. (2014) Neural Stem Cells Differentiated From iPS Cells Spontaneously Regain Pluripotency. STEMCELLS. 32, 2596-2604
【非特許文献２２】Remington's Pharmaceutical Sciences, 最新版
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその細胞損傷に関連する疾患、より具体的には神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患における用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを有効成分として含有する、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１６】
また、本発明は、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を有効成分として含有する、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを治療学的に有効な量で個体に投与するステップを含む、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療方法を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を治療学的に有効な量で個体に投与するステップを含む、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療方法を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物として用いるための、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの用途を提供する。
【００２０】
さらに、本発明は、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物として用いるための、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞の用途を提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷した細胞との融合によりＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞内の正常遺伝子及び転写調節因子を損傷した細胞の核内に伝達し、損傷した細胞内の細胞修復に関与する遺伝子の発現を調節したり、正常遺伝子を伝達して正常タンパク質を回復させることにより、損傷した細胞が回復することが確認された。また、細胞損傷に関連する様々な疾患モデルにおいて、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞または遺伝子異常が誘発された細胞と細胞融合すると正常細胞に回復することが確認された。
【００２２】
よって、ＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合技術により、細胞損傷を回復させて正常遺伝子を導入することができるので、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターまたはそれで形質転換された細胞は、細胞損傷に関連する疾患、具体的には神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患を治療するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施例によるｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合により死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株の細胞死抑制効果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例によるｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こったＮＳＣ３４  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｕｐにおけるＢａｘ及びＢｃｌ−ｘＬの発現分析を示す図である。
【図３】本発明の一実施例によりＨＮ及びＦをそれぞれ挿入したＰｃＤＮＡ３．１発現ベクターを作製するための模式図である。
【図４】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓにおいてＨＮ及びＦ  ｍＲＮＡ発現を分析した図である。
【図５】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓにおいてＨＮ及びＦタンパク質発現を画像解析した図である。
【図６】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓの免疫表現型（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）を分析した図である。
【図７】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓにおいてＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株との細胞融合能力を分析した図である。
【図８】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合した細胞においてＣｈＡＴ及びＣＤ１０５発現を分析した図である。
【図９】本発明の一実施例によるＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株、死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株、及びＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓのプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）分析結果を示す図である。
【図１０】本発明の一実施例によるＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株、死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株、及びＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓのヒートマップ（ｈｅａｔｍａｐ）分析結果を示す図である。
【図１１】本発明の一実施例によるＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株、死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株、及びＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓにおいて細胞修復に関連する遺伝子ＤＤＢ１、ＨＭＧＢ１及びＭＳＨ２  ｍＲＮＡ発現を分析した図である。
【図１２】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ−ＮＳＣｓとの細胞融合により死滅中のＣ２Ｃ１２筋芽細胞株の細胞死抑制効果を示す図である。
【図１３】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ−ＨｅＬａにおいてＨＮ及びＦ  ｍＲＮＡ発現を分析した図である。
【図１４】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ−ＨｅＬａにおいてＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株との細胞融合能力を分析した図である。
【図１５】本発明の一実施例によりＨＮ及びＦを挿入したｐｃＤＮＡ３．１−Ｐ２Ａ発現ベクターを作製するための模式図である。
【図１６】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ−ＨｅＬａまたはＦ−Ｐ２Ａ−ＨＮ−ＨｅＬａにおいてＣ２Ｃ１２筋芽細胞株との細胞融合能力を分析した図である。
【図１７】本発明の一実施例により選択した細胞修復に関連する遺伝子ＤＤＢ１のプロモーター部位（ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ）において転写調節因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ；ＴＦ）であるＴＤＰ−４３結合モチーフ（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ）を確認した図である。
【図１８】本発明の一実施例によりマウスＤＢＢｌ（ｍＤＤＢｌ）に特異的に結合するプロモーターを作製するための模式図である。
【図１９】本発明の一実施例によるＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を形質導入したＨｅＬａ細胞株が融合した細胞においてＴＤＰ−４３によるｍＤＤＢｌ発現を分析した図である。
【図２０】本発明の一実施例によるＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を形質導入したＨｅＬａ細胞株が融合した細胞においてＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株の核内へのＴＤＰ−４３の転座（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を画像解析した図である。
【図２１】損傷した細胞におけるＨＮ／Ｆタンパク質過剰発現細胞による細胞損傷回復機序を模式化した図である。
【図２２】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合により死滅中のアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）細胞モデルの細胞死抑制効果を示す図である。
【図２３】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合により死滅中のハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＨＤ）疾患細胞モデルの細胞死抑制効果を示す図である。
【図２４】本発明の一実施例によるＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合により死滅中の心不全疾患細胞モデルの細胞死抑制効果を示す図である。
【図２５】本発明の一実施例により筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）またはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ；ＤＭＤ）疾患マウスモデルにＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓを注入するための脊髄内注入（ｉｎｔｒａ−ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）方法を示す図である。
【図２６】本発明の一実施例によりＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓを注入したＧ９３Ａ  ＳＯＤ  Ｔｇマウスにおいて運動性能を分析した図である。
【図２７】本発明の実施例により作製したＤＭＤ疾患細胞モデルのジストロフィン及びＣＴＧＦ発現を分析した図である。
【図２８】本発明の実施例によりＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓ処理したＤＭＤ疾患細胞モデルのジストロフィン及びＣＴＧＦ発現を分析した図である。
【図２９】ＤＭＤ疾患動物モデルであるｍｄｘマウスの骨格筋においてジストロフィン発現を分析した図である。
【図３０】本発明の一実施例によりＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓを注入したｍｄｘマウスの骨格筋組織においてＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓの生着能を分析した図である。
【図３１】本発明の一実施例によりＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓを注入したｍｄｘマウスの骨格筋組織において注入３週間後及び注入１５週間後にジストロフィン発現を分析した図である。
【図３２】本発明の一実施例によりＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓを注入したｍｄｘマウスの骨格筋組織においてＣＴＧＦ発現を分析した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００２５】
本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供する。
【００２６】
本発明における前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ及びＦタンパク質は、センダイウイルス（ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  １）、ヒトパラインフルエンザウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ；ＨＲＳＶ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）または水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）由来のものであるが、これらに限定されるものではなく、これらのタンパク質と同一または類似の機序により細胞の融合を促進し、死滅を抑制し、損傷した細胞の損傷を回復させるものであれば、様々な由来のもの並びに／または全長及び／もしくは断片のいかなる形態のヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ及びＦタンパク質が用いられてもよい（非特許文献２，３，４）。
【００２７】
本発明によるヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）は、ウイルスで発現する糖タンパク質であり、ヘマグルチニンとノイラミニダーゼの両方の活性を有する単一のウイルスタンパク質であるか、またはそれぞれが別個のタンパク質として存在するものであるが、これらに限定されるものではなく、本発明による効果を発揮するものであれば、いかなるものでも本発明に含まれる。前者の例としては、ムンプスウイルス（ｍｕｍｐ  ｖｉｒｕｓ）、センダイウイルス（ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ−１）、２型（ＨＰＩＶ−２）または３型（ＨＰＩＶ−３）、鳥類ニューカッスル病ウイルス（ａｖｉａｎ  ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）などのパラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）由来のものが挙げられ、後者の例としては、インフルエンザウイルス由来のものが挙げられる。これらのタンパク質及び核酸配列は公知であり、例えばヘマグルチニン・ノイラミニダーゼは、Ｅｎｚｙｍｅ  ｅｎｔｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｅｎｚｙｍｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）ＥＣ：３．２．１．１８に開示されており、タンパク質配列は、例えばセンダイウイルス由来のものがＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＡＢ０６２８８．１に公開されている。本発明の一実施例においては、本発明の実施例２と同様に製造されるセンダイウイルス由来のＨＮ単一タンパク質が用いられる。
【００２８】
また、融合タンパク質（Ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とは、細胞間の融合またはウイルスの細胞への融合／エントリー、エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、膜トラフィッキング（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）に用いられる糖タンパク質を意味する。本発明の一実施例においては、ウイルス由来のＦタンパク質が用いられるが、それは構造的特徴によりクラスＩ、ＩＩ及びＩＩＩに分けられる。クラスＩの例としては、エボラウイルスのＧＰ２、ＭｏＭｕＬｖ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）のＭｏ−５５、免疫不全ウイルスＨＩＶのｇｐ４１、Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ（ＳＩＶ）ｇｐ４１などが挙げられる。クラスＩＩの例としては、ＳＦＶ  Ｅ１、ＴＢＥＶ  Ｅなどが挙げられる。クラスＩＩＩの例としては、ＨＳＶ（Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）のｇＢ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ）、ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）のｇＢ、ＶＳＶ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）のＧタンパク質、バキュロウイルスの糖タンパク質であるｇｐ６４などが挙げられる。これらの融合糖タンパク質及び核酸配列は公開されており、例えばＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＡＣ８２３００．１に公開されている。
【００２９】
本発明における前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子は、全長及び／または断片の形態で用いられる。具体的には、本発明に開示されているタンパク質をコードする野生型遺伝子配列及びその断片はもとより、細胞内での発現、タンパク質の安定性などの特徴が有利に働くように塩基配列の一部が人為的に改変された遺伝子、及び自然界に見られる塩基配列の一部が改変された遺伝子、またはそれらの全ての断片が含まれるものである。
【００３０】
本発明における前記ベクターとは、宿主細胞において標的遺伝子を発現させるための手段を意味する。前記ベクターは、標的遺伝子の発現のための要素（ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含むものであり、複製開始点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）、プロモーター、オペレーター（ｏｐｅｒａｔｏｒ）、転写終結配列（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）などを含んでもよく、宿主細胞のゲノムへの導入のための好ましい酵素部位（例えば、制限酵素部位）、宿主細胞への導入を確認するための選択マーカー、タンパク質への翻訳のためのリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ；ＲＢＳ）、ＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ）などをさらに含んでもよい。前記ベクターは、前記プロモーター以外の転写調節配列（例えば、インハンサーなど）をさらに含んでもよい。
【００３１】
さらに、前記ベクターは、当該技術分野で公知のプラスミドＤＮＡ、組換えベクターまたはその他の媒体であり、具体的には直鎖状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、組換え非ウイルス性ベクター、組換えウイルス性ベクターまたは遺伝子発現誘導ベクターシステム（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）であり、前記組換えウイルス性ベクターは、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルパー依存性アデノウイルス（ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）またはワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）ベクターであるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
さらに、前記ベクターとは、遺伝子治療用発現ベクターを意味する。前記「遺伝子治療（ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）」とは、遺伝子異常により誘発される各種遺伝病を治療するために、遺伝子異常のある細胞に正常遺伝子を挿入したり、新たな機能を提供することにより、その機能を正常化させる方法を意味する。よって、本発明における遺伝子治療用発現ベクターとは、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質遺伝子を体内の正常細胞に伝達して発現させることにより、遺伝子異常のある細胞と正常細胞との細胞融合を用いて新たな機能を提供し、その機能を正常化することのできる発現ベクターを意味する。
【００３３】
本発明の一実施例におけるヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質遺伝子は、前述したように公知の配列からそれを特異的に認識することのできるプライマーを作製し、それを用いてポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により前記遺伝子を増幅し、それを前述した発現ベクターに導入すると、それを後述する本発明による細胞に導入することができる。導入方法は公知であり、例えばリポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、ファージによる形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、ウイルスによる感染法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
また、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を提供する。
【００３５】
本発明における「形質転換」とは、外部から与えられたＤＮＡにより生物の遺伝的な性質が変わることであり、すなわち生物のある系統の細胞から抽出された核酸の一種であるＤＮＡを他の系統の生きている細胞に導入したときにＤＮＡがその細胞に取り込まれて遺伝子形質が変化する現象を意味する。
【００３６】
本発明における前記形質転換された細胞は、幹細胞、前駆細胞または動物細胞であるが、これらに限定されるものではない。また、前記幹細胞は、具体的には胚性幹細胞、成体幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ｉＰＳ）であるが、これらに限定されるものではなく、前記幹細胞から分化した幹細胞、例えば胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞などが全て含まれる。さらに、前記細胞は、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、非自己、同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）または異種（Ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞である。自己由来のものが最も好ましく、レシピエントに由来するものであるので、薬学的組成物の投与の際に免疫反応の問題がなく、安全であるという利点がある。
【００３７】
前記胚性幹細胞は、胚発生初期である胞胚期（ｂｌａｓｔｏｃｙｔｅ）の内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）から形成され、あらゆる細胞に分化可能な潜在力（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）を有するものであり、いかなる組織細胞にも分化可能であるという利点があり、細胞治療研究に用いられている。
【００３８】
前記成体幹細胞とは、胚芽発達段階以降も成体全般に見られる未分化の幹細胞を意味する。このような成体幹細胞は、周辺組織の特性に細胞自身を合わせて分化する組織特異的分化能力（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を有する。成体幹細胞は、骨髄、血液、脳、皮膚、脂肪、骨格筋、臍帯、臍帯血などの様々な成体細胞に由来するものである。具体例として、間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）、骨格筋幹細胞（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ＮＳＣ）、脂肪由来の幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、脂肪由来の前駆細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）、血管内皮前駆細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
また、前記間葉系幹細胞は、既に成人になったヒトの各部位から得られる成体組織由来の幹細胞であり、臍帯、臍帯血、骨髄、血液、脳、皮膚、脂肪、骨格、筋肉、神経、骨膜、羊膜または胎盤から分離することができ、様々な細胞、例えば脂肪細胞、運動ニューロンなどに分化することができる多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞を意味する。さらに、間葉系幹細胞は、免疫抑制剤を用いなくても、同種または異種の受益者において効果的に生着するという特徴がある。前記間葉系幹細胞は、動物、具体的には哺乳動物、より具体的にはヒトの間葉系幹細胞である。
【００４０】
本発明の一実施例における間葉系幹細胞は、脂肪組織由来の間葉系幹細胞である。脂肪組織由来の間葉系幹細胞は、骨髄、羊水、臍帯血幹細胞とは異なり、多量の提供が受けられるという実用的な利点を有し、脂肪細胞の約１％が幹細胞であるものと推定されており、近年、先進国において広範囲に行われている成形手術が脂肪吸引術（ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ）であることを考慮すると、脂肪由来の幹細胞は無限の供給性を有し、有用性が特に高いといえる。
【００４１】
前記間葉系幹細胞を得る過程は次の通りである。ヒトまたはマウスを含む哺乳動物、好ましくはヒトの間葉系幹細胞源、例えば脂肪組織、血液または骨髄から間葉系幹細胞を分離する。次に、前記細胞を好適な培地で培養する。培養過程で浮遊細胞を除去し、培養プレートに付着した細胞を継代培養し、最終的に確立された（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）間葉系幹細胞を得る。
【００４２】
また、骨髄などに非常に少量で存在する間葉系幹細胞を分離及び培養する過程は、当該技術分野において周知であり、例えば特許文献３に開示されている。
【００４３】
前記過程で用いられる培地としては、幹細胞の培養に用いられる一般的ないかなる培地を用いてもよい。より具体的には、血清（例えば、ウシ胎児血清、ウマ血清及びヒト血清）または血清代替物（ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を含む培地を用いる。本発明に用いられる培地としては、例えばＲＰＭＩシリーズ、Ｅａｇｌｅｓ'ｓ  ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ'ｓ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、非特許文献５）、α−ＭＥＭ（非特許文献６）、Ｉｓｃｏｖｅ'ｓ  ＭＥＭ（非特許文献７）、１９９培地（非特許文献８）、ＣＭＲＬ  １０６６、ＲＰＭＩ  １６４０（非特許文献９）、Ｆ１２（非特許文献１０）、Ｆ１０（非特許文献１１）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  ｍｅｄｉｕｍ、非特許文献１２）、ＤＭＥＭとＦ１２の混合物（非特許文献１３）、Ｗａｙ−ｍｏ、ｈ'ｓ  ＭＢ７５２／１（非特許文献１４）、ＭｃＣｏｙ'ｓ  ５Ａ（非特許文献１５）及びＭＣＤＢシリーズ（非特許文献１６）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記培地は、他の成分、例えば抗生剤または抗真菌剤（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）、グルタミンなどを含んでもよい。培地及び培養についての一般的な説明は非特許文献１７に記載されており、この文献は参照として本明細書に組み込まれる。
【００４４】
間葉系幹細胞の確認は、例えばフローサイトメトリーにより行うことができる。このフローサイトメトリーは、間葉系幹細胞の特異な表面マーカーを用いて行われる。本発明の一実施例による間葉系幹細胞は、マーカーとしてＣＤ２９、ＣＤ４４及びＣＤ９０と、陰性マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲの表現型を有する。
【００４５】
また、前記人工多能性幹細胞に関しては、多能性のない成人の皮膚細胞などの体細胞に逆分化を起こす４種類の特定遺伝子を導入して発現させるか、逆分化を起こす４種類の遺伝子を導入した細胞で形成された逆分化誘導タンパク質を抽出し、それを再び体細胞に注入することにより、胚性幹細胞などの多能性を有する幹細胞を作製することができるが、これを人工多能性幹細胞または逆分化幹細胞という。人工多能性幹細胞による幹細胞治療や、患者から体細胞を得て人工多能性幹細胞を作製し、生体外で分化させることにより様々な疾患の経過を研究し、疾患モデルや新薬開発における細胞基盤研究などに用いられる。前記人工多能性幹細胞は、公知の方法、例えば非特許文献１８、１９などに開示されている方法により得られる。また、人工多能性幹細胞由来の幹細胞、例えば人工多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｍｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳＣｓ−ＭＳＣｓ）、人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳＣｓ−ＮＳＣｓ）などが全て含まれる。本発明の一実施例における前記人工多能性幹細胞由来の幹細胞は、人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞である。
【００４６】
前記人工多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞または人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞は、公知の方法、例えば非特許文献２０、２１などに開示されている方法により得られる。
【００４７】
また、前記前駆細胞とは、特定細胞の形態及び機能を備える前段階の細胞であり、特定細胞系統の細胞に分化するか、特定タイプの組織を形成することができ、自己再生産（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）能は有するが、分化能は極めて制限される細胞を意味する。内胚葉前駆細胞、中胚葉前駆細胞及び外胚葉前駆細胞が全てこれに含まれる。
【００４８】
また、前記動物細胞は、ヒトを含む動物起源の機能的及び構造的基本単位であり、ヒトを含む動物（例えば、サル、イヌ、ヤギ、ブタ、ラットなどの哺乳動物）起源の細胞であればいかなるものでもよい。よって、本発明の動物細胞は、これらに限定されるものではないが、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、生殖細胞、皮膚細胞（例えば、線維芽細胞、角質細胞）、免疫細胞、癌細胞などが含まれる。具体例として、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、ＮＳ０（ｍｏｕｓｅ  ｍｙｅｌｏｍａ）細胞、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、Ｓｐ２／０（ｍｏｕｓｅ  ｍｙｅｌｏｍａ）細胞、ヒト網膜細胞（ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｃｅｌｌ）、ＨＵＶＥＣ細胞、ＨＭＶＥＣ細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅｐＧ−２細胞、ＨＬ−６０細胞、ＩＭ−９細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＭＣＦ−７細胞、Ｔ９８Ｇ細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
また、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを有効成分として含有する、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００５０】
本発明における前記ベクターについては、前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターについての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略し、以下では筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物の特有な構成についてのみ説明する。
【００５１】
なお、本発明によれば、ＨＮ及びＦタンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷した細胞との融合により正常遺伝子が伝達されて発現し、細胞損傷を回復させる遺伝子の発現が調節されることが確認された。また、細胞損傷に関連する様々な疾患モデルにおいて、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞または遺伝子異常が誘発された細胞と細胞融合し、正常細胞に回復することが確認された。よって、前記ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターは、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用組成物の有効成分として有用である。
【００５２】
本発明における前記筋肉変性疾患または筋肉疾患は、細胞損傷に関連する疾患である。
【００５３】
前記神経変性疾患または神経疾患は、ニューロン損傷、脊髄神経損傷、末梢神経損傷またはニューロン死滅を誘発する。
【００５４】
また、前記神経変性疾患または神経疾患は、運動ニューロン損傷または死滅を誘発する神経変性疾患または神経疾患と、脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄神経損傷または末梢神経損傷を誘発する神経変性疾患または神経疾患に分けられる。
【００５５】
前記運動ニューロン損傷または死滅を誘発する神経変性疾患または神経疾患の改善または治療のためには、運動ニューロンの保存及び回復が必須である。このような神経変性疾患または神経疾患の例としては、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、ケネディ病（ｓｐｉｎａｌ  ｂｕｌｂａｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発性側索硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）または進行性球麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｂｕｌｂａｒ  ｐａｌｓｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
前記脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄神経損傷または末梢神経損傷を誘発する神経変性疾患または神経疾患は、損傷した脳または脊髄のニューロン、末梢神経の回復により疾患を予防または治療することができる。このような神経変性疾患または神経疾患の例としては、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）、認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、多発梗塞性認知症（ｍｕｌｔｉ−ｉｎｆａｃｔ  ｄｅｍｅｎｔｉａ；ｍｉｄ）、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、レビー小体型認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ）、軽度認知障害（ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、大脳皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）、うつ病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、代謝性脳疾患（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ；ＭＳＡ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｌｓｙ；ＰＳＰ）、てんかん（ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒｏｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ  ａｔｒｏｐｈｙ；ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ）、緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、脳虚血（ｂｒａｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、脳炎後パーキンソニズム（ｐｏｓｔ−ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｃ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）、トゥレット障害（Ｔｏｕｒｅｔｔｅ'ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、むずむず脚症候群（ｒｅｓｔｌｅｓｓ  ｌｅｇｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）または注意欠陥多動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｔ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
前記筋肉変性疾患または筋肉疾患は、筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する。このような筋肉変性疾患または筋肉疾患の例としては、ミオパチー（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、先天性ミオパチー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｍｙｏｐａｔｈｙ）、先天性筋ジストロフィー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂｅｃｋｅｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、肢帯型筋ジストロフィー（Ｌｉｍｂ  Ｇｉｒｄｌｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（Ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、遠位型筋ジストロフィー（ｄｉｓｔａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（Ｅｍｅｒｙ−Ｄｒｅｉｆｕｓｓ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋強直性ジストロフィー（Ｍｙｏｔｏｎｉｃ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、バース症候群（Ｂａｒｔｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心不全（ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、サルコペニア（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）またはＸ連鎖性拡張型心筋症（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
本発明による薬学的組成物は、一般に用いられる薬学的に許容される担体と共に好適な形態に剤形化することができる。薬学的に許容される担体としては、例えば水、好適なオイル、食塩水、水性グルコース、グリコールなどの非経口投与用担体などが挙げられ、安定化剤や保存剤をさらに含んでもよい。好適な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸などの抗酸化剤が挙げられる。好適な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチルまたはプロピルパラベン及びクロロブタノールが挙げられる。また、本発明による細胞治療用組成物は、その投与方法や剤形に応じて、必要であれば懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、鎮痛剤、緩衝剤、酸化防止剤などを適宜含んでもよい。前述したものをはじめとして、本発明に適する薬学的に許容される担体及び製剤は、非特許文献２２に詳細に記載されている。
【００５９】
本発明の薬学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施することのできる方法で薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することにより、単位用量の形態または多用量容器に入れた形態に製造することができる。
【００６０】
また、前記薬学的組成物は、有効成分を標的細胞に送達することのできる任意の装置により投与される。本発明の薬学的組成物は、疾患の治療のために、治療学的に有効な量で含まれる。本発明における「治療」とは、特に断らない限り、その「治療」が行われる疾患または疾病の少なくとも１つの症状を逆転または緩和するか、その進行を抑制または予防することを意味する。また、前記「治療学的に有効な量」とは、研究者、獣医師、医師またはその他の臨床医により求められる、組織、系、動物またはヒトにおいて生物学的または医学的反応を誘導する有効成分または薬学的組成物の量を意味し、それには治療される疾患または障害の症状の緩和を誘導する量が含まれる。本発明の薬学的組成物に含まれる有効成分が効果に応じて変化することは、当業者にとって明らかである。
【００６１】
よって、最適な薬学的組成物含有量は、当業者が容易に決定することができ、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含まれる他の成分の含有量、剤形の種類、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、同時に用いられる薬物をはじめとする様々な因子に応じて調節される。
【００６２】
本発明の一実施例における薬学的組成物は、静脈投与または脊髄内投与される。
【００６３】
前記要素を全て考慮して副作用なく最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要である。例えば、本発明の組成物の投与量は、有効成分であるヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞０．１×１０５〜１．０×１０８細胞数／ｋｇ（体重）、より好ましくは０．５×１０６〜１．０×１０７細胞数／ｋｇ（体重）である。ただし、投与量は、製剤化方法、投与方法、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食餌、投与時間、投与経路、排泄速度、感受性などの要因に応じて様々に処方することができ、当業者であればこのような要因を考慮して投与量を好適に調節することができる。投与回数は１回、または臨床的に許容される副作用の範囲内で２回以上であってもよく、投与部位も１つの部位または２つ以上の部位であってもよい。ヒト以外の動物に対しても、ｋｇ当たりのヒトと同じ投与量で投与してもよく、例えば目的の動物とヒトの虚血器官（心臓など）の容積比（例えば、平均値）などで前記投与量を換算した量を投与してもよい。本発明による治療の対象動物の例としては、ヒト及びその他の目的とする哺乳動物を挙げることができ、具体的にはヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ヤギ、ウマ、ブタなどが含まれる。
【００６４】
また、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を有効成分として含有する、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００６５】
本発明における前記細胞については、前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞についての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略する。また、前記疾患、細胞の投与方法、投与量などについては、前記ベクターを含む薬学的組成物の投与方法、投与量などについての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略する。
【００６６】
なお、本発明によれば、ＨＮ及びＦタンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷した細胞との融合により正常遺伝子が伝達されて発現し、細胞損傷を回復させる遺伝子の発現が調節されることが確認された。また、細胞損傷に関連する様々な疾患モデルにおいて、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞または遺伝子異常が誘発された細胞と細胞融合し、正常細胞に回復することが確認された。よって、前記ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞は、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用組成物の有効成分として有用である。
【００６７】
また、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを治療学的に有効な量で個体に投与するステップを含む、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療方法を提供する。
【００６８】
さらに、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を治療学的に有効な量で個体に投与するステップを含む、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療方法を提供する。
【００６９】
本発明における前記ベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、その投与方法、投与量などについては、前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、それを含む薬学的組成物の投与方法、投与量などについての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略する。
【００７０】
本発明における前記個体は、筋肉変性疾患または筋肉疾患により苦痛を感じる個体であり、より具体的には前述したヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターまたは前記ベクターで形質転換された細胞を投与することにより前記疾患による細胞損傷、例えば筋細胞損傷が緩和及び／または回復する哺乳動物、例えばヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ヤギ、ウマ、ブタなどである。
【００７１】
前記神経変性疾患または神経疾患は、ニューロン損傷、脊髄損傷、末梢神経損傷またはニューロン死滅を誘発する。
【００７２】
また、前記神経変性疾患または神経疾患は、運動ニューロン損傷または死滅を誘発する神経変性疾患または神経疾患と、脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄損傷または末梢神経損傷を誘発する神経変性疾患または神経疾患に分けられる。
【００７３】
前記運動ニューロン損傷または死滅を誘発する神経変性疾患または神経疾患の改善または治療のためには、運動ニューロンの保存及び回復が必須である。このような神経変性疾患または神経疾患の例としては、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、ケネディ病（ｓｐｉｎａｌ  ｂｕｌｂａｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発性側索硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）または進行性球麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｂｕｌｂａｒ  ｐａｌｓｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
前記脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄損傷または末梢神経損傷を誘発する神経変性疾患または神経疾患は、損傷した脳または脊髄のニューロン、末梢神経の回復により疾患を予防または治療することができる。このような神経変性疾患または神経疾患の例としては、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）、認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、多発梗塞性認知症（ｍｕｌｔｉ−ｉｎｆａｃｔ  ｄｅｍｅｎｔｉａ；ｍｉｄ）、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、レビー小体型認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ）、軽度認知障害（ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、大脳皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）、うつ病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、代謝性脳疾患（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ；ＭＳＡ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｌｓｙ；ＰＳＰ）、てんかん（ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒｏｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ  ａｔｒｏｐｈｙ；ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ）、緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、脳虚血（ｂｒａｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、脳炎後パーキンソニズム（ｐｏｓｔ−ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｃ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）、トゥレット障害（Ｔｏｕｒｅｔｔｅ'ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、むずむず脚症候群（ｒｅｓｔｌｅｓｓ  ｌｅｇｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）または注意欠陥多動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｔ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
前記筋肉変性疾患または筋肉疾患は、筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する。このような筋肉変性疾患または筋肉疾患の例としては、ミオパチー（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、先天性ミオパチー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｍｙｏｐａｔｈｙ）、先天性筋ジストロフィー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂｅｃｋｅｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、肢帯型筋ジストロフィー（Ｌｉｍｂ  Ｇｉｒｄｌｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（Ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、遠位型筋ジストロフィー（ｄｉｓｔａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（Ｅｍｅｒｙ−Ｄｒｅｉｆｕｓｓ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋強直性ジストロフィー（Ｍｙｏｔｏｎｉｃ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、バース症候群（Ｂａｒｔｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心不全（ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、サルコペニア（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）またはＸ連鎖性拡張型心筋症（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
本発明によれば、ＨＮ及びＦタンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷した細胞との融合により正常遺伝子が伝達されて発現し、細胞損傷を回復させる遺伝子の発現が調節されることが確認された。また、細胞損傷に関連する様々な疾患モデルにおいて、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞または遺伝子異常が誘発された細胞と細胞融合し、正常細胞に回復することが確認された。よって、前記ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターまたはそれで形質転換された細胞は、筋肉変性疾患または筋肉疾患を予防または治療するのに有用である。
【００７７】
また、本発明は、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用組成物として用いるための、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの用途を提供する。
【００７８】
さらに、本発明は、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用組成物として用いるための、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞の用途を提供する。
【００７９】
本発明における前記ベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、その投与方法、投与量などについては、前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、それを含む薬学的組成物の投与方法、投与量などについての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略する。また、前記疾患については、前記筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物についての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略する。
【００８０】
本発明によれば、ＨＮ及びＦタンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷した細胞との融合により正常遺伝子が伝達されて発現し、細胞損傷を回復させる遺伝子の発現が調節されることが確認された。また、細胞損傷に関連する様々な疾患モデルにおいて、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞または遺伝子異常が誘発された細胞と細胞融合し、正常細胞に回復することが確認された。よって、前記ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターまたはそれで形質転換された細胞は、筋肉変性疾患または筋肉疾患を予防または治療するのに有用である。
【００８１】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８２】
細胞培養
Ｋ−ＳＴＭＥＣＥＬＬ  ＩＲＢ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｂｏａｒｄ）の同意及び了解の下に得たヒト脂肪由来の間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ｈＡＴＭＳＣｓ）は、抗生剤を添加したＲＫＣＭ培養培地（１０％ＦＢＳ添加、Ｋ−ＳＴＥＭＣＥＬＬにより提供）で培養した。マウス運動ニューロン細胞株（ＮＳＣ３４  Ｍｏｔｏｒ  Ｎｅｕｒｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ、ＵＳＡ）は、抗生剤を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。マウス神経芽細胞腫細胞株（Ｎ２Ａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）は、抗生剤を添加したＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。ヒト子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）は、抗生剤を添加したＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。マウス筋芽細胞株（Ｃ２Ｃ１２  ｍｕｓｃｌｅ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）は、抗生剤を添加したＤＭＥＭ培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。ラット心筋芽細胞株（Ｈ９ｃ２  ｈｅａｒｔ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）は、抗生剤を添加したＤＭＥＭ培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。
【００８３】
また、正常なヒトから同意の下に血液の提供を受けて作製したヒト人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳＣｓ）は、ｂＦＧＦを含まないｈＥＳ  ｃｅｌｌ培養培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の入った培養プレートに浮遊状態で４日間培養した。次に、Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＲＡ、５×１０−７Ｍ）の入ったｈＥＳ  ｃｅｌｌ培養培地で４日間培養し、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ［ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ２７（２％）、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ（２μｇ／ｍｌ）を含む無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培養培地］で７日間培養した。凝集状態のｃｏｌｏｎｉｅｓから離れた浮遊状態の細胞をｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍの入ったポリ−l−オルニチン（ｐｏｌｙ−l−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（１０ｍｇ／ｍｌ）／ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）（５μｇ／ｍｌ）コーティング培養プレートで７日間培養し、５〜７日ごとにアキュターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）で処理して細胞を継代培養することにより、人人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳＣｓ−ＮＳＣｓ）を得た。
【００８４】
前記細胞は、全て５％ＣＯ２を供給して３７℃の条件下で培養した。
【実施例１】
【００８５】
死滅中の運動ニューロン細胞株と脂肪由来の間葉系幹細胞の細胞融合による運動ニューロン細胞株の細胞死抑制効果の分析
細胞トラッカー（ｔｒａｃｋｅｒ）ＣＭ−ＤｉＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で標識した運動ニューロン細胞株ＮＳＣ３４細胞を細胞死誘導因子であるタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）２．５μＭで処理して２４時間培養した。アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ染色後に、アネキシンＶ抗体を用いたフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）によりアネキシンＶ陽性ＮＳＣ３４細胞を分離した。緑色染料（ｃｅｌｌ−ｓｔａｌｋｅｒＴＭ、Ｂｉｔｅｒｉａｌｓ）で標識したｈＡＴＭＳＣｓとアネキシンＶ陽性ＮＳＣ３４細胞をセンダイウイルス（ＨＶＪ）Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧｅｎｏｍＯＮＥＴＭ−ＣＦ  ＥＸ  Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ（ＨＶＪ）Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＣＯＳＭＯ  ＢＩＯ、Ｊａｐａｎ）でメーカーの示す方法に従って細胞融合し、その後フローサイトメトリーによりＶ陽性細胞を分析した。図１に示すように、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こっていないＮＳＣ３４細胞群において、９９．５％のアネキシンＶ陽性細胞が確認され、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こったＮＳＣ３４細胞群において、３２．９％のアネキシンＶ陽性細胞が確認された。これらの結果は、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合によりＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株の死滅を抑制できることを示すものである。
【００８６】
また、死滅抑制効果を分子レベルで確認した。要約すると、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こったＮＳＣ３４細胞群をフローサイトメトリーにより分離し、その後逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＲＴ−ＰＣＲ）及び定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）によりｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ遺伝子であるＢａｘとａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ遺伝子であるＢｃｌ−ｘＬの発現を分析した。図２に示すように、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こっていないＮＳＣ３４細胞群に比べて、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こったＮＳＣ３４細胞群において、Ｂａｘ  ｍＲＮＡの発現は大幅に減少し、Ｂｃｌ−ｘＬ  ｍＲＮＡの発現は大幅に増加した。
【００８７】
これらの結果は、死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株がｈＡＴＭＳＣｓと細胞融合を起こすと、ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ遺伝子であるＢａｘの発現減少及びａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ遺伝子であるＢｃｌ−ｘＬの発現増加により、細胞死が抑制されることを意味するものである。
【実施例２】
【００８８】
ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）／Ｆ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質を過剰発現するヒト脂肪由来の間葉系幹細胞（ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓ）の作製
センダイウイルスゲノムを鋳型とし、表１のプライマーを用いてヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）及びＦタンパク質（Ｆ）遺伝子をＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターにそれぞれ挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  ＤＨ５αにクローニングして配列を確認した（結果は提示せず）。クローニングしたＨＮ及びＦタンパク質は、それぞれ公開されている配列ＧｅｎＢｎａｋ  Ａｃｃｅｓｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ０６２８８．１及びＡＡＣ８２３００．１と同一である。
【００８９】
2021529218.tif 000003
【００９０】
クローニング後に得られたクローン（ｃｌｏｎｅ）は、ＬＢ液体培地で２４時間増殖培養し、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）抽出キット（Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いてプラスミドを抽出し、その後リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でメーカーの示す方法に従ってｈＡＴＭＳＣｓに形質導入し、ＨＮ／Ｆ遺伝子を導入したｈＡＴＭＳＣｓ（ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓ）を得た。形質導入した細胞株から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによりＨＮ及びＦ遺伝子の発現を分析した。対照群としてｈＡＴＭＳＣｓを用いた。部分（ｐａｒｔｉａｌ）ＨＮ及びＦプライマーは、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイム定量ＰＣＲを用いたＨＮまたはＦ  ｍＲＮＡにおける発現確認用に用いた。
【００９１】
発現分析の結果、図４に示すように、ＨＮ及びＦ遺伝子の過剰発現が確認された。これらの結果は、リポソームトランスフェクション（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によりＨＮ及びＦ遺伝子を同時に過剰発現させることに成功したこと意味するものである。
【００９２】
また、表１に示すように、ＨＮ遺伝子の増幅のための正方向プライマーにｍｙｃタンパク質をコードする塩基配列を連結し、Ｆ遺伝子の増幅のための正方向プライマーにヒスチジンをコードする塩基配列を連結したので、ｍｙｃタンパク質とヒスチジンに対する抗体（Ｓａｎｔｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いて、ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓにおいて共焦点レーザ顕微鏡（Ｎｉｃｏｎ、Ｊａｐａｎ）によりＨＮとＦタンパク質の発現を分析した。
【００９３】
画像解析の結果、図５に示すように、ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓの細胞表面にＨＮとＦタンパク質が発現することが確認された。これらの結果は、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現するヒト脂肪由来の間葉系幹細胞を作製することに成功したことを意味するものである。
【実施例３】
【００９４】
ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓにおける幹細胞のマーカーに対する発現の評価
脂肪由来の間葉系幹細胞の陽性マーカーであるＣＤ２９、ＣＤ４４及びＣＤ９０と、陰性マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲに対する抗体（Ｓａｎｔｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いて、フローサイトメトリーによりＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓにおける脂肪由来の間葉系幹細胞のマーカーに対する発現を分析した。対照群としてｈＡＴＭＳＣｓを用いた。発現分析の結果、図６に示すように、対照群と比較して、陽性マーカーであるＣＤ２９、ＣＤ４４及びＣＤ９０と、陰性マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲにおける発現差がないことが確認された。このような免疫表現型解析（Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）を行った結果は、ＨＮ及びＦ遺伝を導入したｈＡＴＭＳＣｓが幹細胞としての特性を維持することを意味するものである。
【実施例４】
【００９５】
ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株の細胞融合能力に関する評価
実施例２で作製したＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合能力を評価するために、緑色染料で標識したＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓと細胞トラッカーＣＭ−ＤｉＩで標識したＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株に対して融合分析（ｆｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を行った。２種類の細胞を細胞数１：１の比で１．５ｍｌ試験管に混合し、４℃の条件下で５分間反応させ、その後３７℃の細胞培養器で１５分間反応させた。抗生剤を添加したＤＭＥＭ培養培地（１０％ＦＢＳ添加）を入れた６ウェルプレートに移し、その後５％ＣＯ２を供給して３７℃の条件下で１６時間培養した。細胞を回収し、フローサイトメトリーによりＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株の細胞融合率を分析した。対照群としてｈＡＴＭＳＣｓを用いた。分析の結果、図７に示すように、対照群に比べて、ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株の細胞融合率が３．５倍以上に増加することが確認された。これらの結果は、ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓにおいてＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株に対する細胞融合率が向上したことを意味するものである。
【００９６】
また、図７に示すように、共焦点レーザ顕微鏡を用いた画像解析により、緑色蛍光を示すＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓと赤色蛍光を示すＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合した細胞の画像が確認された。
【実施例５】
【００９７】
ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合した細胞におけるｈＡＴＭＳＣｓのマーカー及び運動ニューロンのマーカーの発現分析
実施例４の融合細胞において、運動ニューロンのマーカーであるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｏｌｉｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＣｈＡＴ）と脂肪由来の間葉系幹細胞のマーカーであるＣＤ１０５に対する抗体（Ｓａｎｔｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いて、共焦点レーザ顕微鏡により脂肪由来の間葉系幹細胞のマーカーであるＣｈＡＴとＣＤ１０５の発現を分析した。分析の結果、図８に示すように、ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合した細胞において、運動ニューロンのマーカーであるＣｈＡＴと脂肪由来の間葉系幹細胞のマーカーであるＣＤ１０５の発現が確認された。
【００９８】
これらの結果は、ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合したことを示し、融合した細胞において、脂肪由来の間葉系幹細胞と運動ニューロン細胞株で発現するマーカータンパク質が全て発現することを意味するものである。
【実施例６】
【００９９】
死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株とＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合した細胞のプロテオミクス分析
死滅中の運動ニューロンとＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合による細胞損傷回復機序を調べるために、実施例２のアネキシンＶ陽性ＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株及び実施例４の融合細胞に対するプロテオミクス分析（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ）をＥＳＩ−ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｔｅｒｍｏ  Ｆｉｈｅｒ）及びｎａｎｏＨＰＬＣ（ＲＳＬＣ、Ｄｉｏｎｅｘ）により行い、ヒートマップ分析（ｈｅａｔｍａｐ  ａｎａｌｙｓｉｓ）をＭｅＶ  ｓｏｆｔｗａｒｅにより行った。対照群としてＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株を用いた。分析の結果、図９及び図１０に示すように、細胞修復（ｃｅｌｌ  ｒｅｐａｉｒ）に関連する５つの遺伝子（ＤＤＢ１、ＨＭＧＢ１、ＭＳＨ２、ＮＯＮＯ及びＰＣＮＡ）が死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロンにおいては減少するのに対して、ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合した細胞においては増加することが確認されたので、前記５つの遺伝子を細胞損傷回復標的遺伝子として選択した。
【０１００】
また、実施例２のアネキシンＶ陽性ＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株及び実施例４の融合細胞において、前記細胞修復に関連する５つの遺伝子（ＤＤＢ１、ＨＭＧＢ１、ＭＳＨ２、ＮＯＮＯ及びＰＣＮＡ）のうちＤＤＢ１、ＨＭＧＢ１及びＭＳＨ２の発現変化が確認された。要約すると、実施例２のアネキシンＶ陽性ＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株及び実施例４の融合細胞において、ＲＴ−ＰＣＲ及び定量ＲＴ−ＰＣＲによりＤＤＢ１、ＨＭＧＢ１及びＭＳＨ２の発現を分析した。対照群としてＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株を用いた。図１１に示すように、死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロンにおいてはＤＤＢ１、ＨＭＧＢ１及びＭＳＨ２  ｍＲＮＡの発現が減少するのに対して、ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合した細胞においては大幅に増加した。
【０１０１】
これらの結果は、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現するｈＡＴＭＳＣｓが死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株と融合して細胞損傷が回復する過程において、ＤＤＢ１、ＨＭＧＢ１及びＭＳＨ２が関与することを意味するものである。
【実施例７】
【０１０２】
死滅中のＣ２Ｃ１２筋芽細胞株とヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）／Ｆ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質を過剰発現する人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞（ＨＮ／Ｆ−ＮＳＣｓ）の細胞融合によるＣ２Ｃ１２筋芽細胞株細胞死抑制効果の分析
ＨＮとＦタンパク質を過剰発現する細胞において細胞融合能力が発揮されるか否かを調べるために、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現する人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞（ＨＮ／Ｆ−ＮＳＣｓ）を作製した。要約すると、実施例２でクローニングしたＨＮ及びＦタンパク質をそれぞれ挿入したｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターをリポソーム（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でメーカーの示す方法に従って人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞（ｉＰＳＣｓ−ＮＳＣｓ）に形質導入し、ＨＮ／Ｆ遺伝子を導入したｉＰＳＣｓ−ＮＳＣｓ（ＨＮ／Ｆ−ＮＳＣｓ）を得た。形質導入した細胞株から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによりＨＮ及びＦ遺伝子の発現を分析した（結果は提示せず）。
【０１０３】
次に、細胞トラッカーＣＭ−ＤｉＩで標識したＣ２Ｃ１２筋芽細胞株を細胞死誘導因子であるタプシガルギン２．５μｇ／ｍｌで処理して２４時間培養した。アネキシンＶ染色後に、アネキシンＶ抗体を用いたフローサイトメトリーによりアネキシンＶ−Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞株を分離した。前記ＨＮ／Ｆ−ＮＳＣｓを緑色染料で標識し、実施例１と同様にアネキシンＶ−Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞株と細胞融合し、その後細胞を回収してフローサイトメトリーによりＶ陽性細胞を分析した。分析の結果、図１２に示すように、ＨＮ／Ｆ−ＮＳＣｓとの細胞融合が起こっていないＣ２Ｃ１２細胞群において、７２．３％のアネキシンＶ陽性細胞が確認され、ＨＮ／Ｆ−ＮＳＣｓとの細胞融合が起こったＣ２Ｃ１２細胞群において、２１．６％のアネキシンＶ陽性細胞が確認された。
【０１０４】
これらの結果は、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現するｉＰＳＣｓ−ＮＳＣｓが死滅中のＣ２Ｃ１２筋芽細胞株と融合すると細胞損傷が回復することを意味するものである。
【実施例８】
【０１０５】
Ｎ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）／Ｆ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質を過剰発現するＨｅＬａ細胞株（ＨＮ／Ｆ−ＨｅＬａ）の細胞融合能力の評価
ＨＮとＦタンパク質を過剰発現する一般の細胞株においても細胞融合能力を発揮するか否かを調べるために、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現するＨｅＬａ細胞株（ＨＮ／Ｆ−ＨｅＬａ）を作製した。要約すると、ＧＦＰ−ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター及び実施例２で得たＨＮタンパク質遺伝子クローンを用いて、ＧＦＰ−ＨＮを挿入したｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターをクローニングした。また、ＲＦＰ−ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター及び実施例２で得たＦタンパク質遺伝子クローンを用いて、ＲＦＰ−Ｆタンパク質を挿入したｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターをクローニングした。次に、リポソーム（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でメーカーの示す方法に従ってＨｅＬａ細胞に形質導入し、ＨＮ／Ｆ遺伝子を導入したｈｅＬａ（ＨＮ／Ｆ−ＨｅＬａ）を得た。形質導入した細胞株から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによりＨＮ及びＦ遺伝子の発現を分析した。対照群としてｈｅＬａ細胞株を用いた。発現分析の結果、図１３に示すように、ＨＮ及びＦ遺伝子の過剰発現が確認された。
【０１０６】
前述したように作製したＨＮ／Ｆ−ＨｅＬａの細胞融合能力を評価するために、ＨＮ／Ｆ−ＨｅＬａとＤＡＰＩで標識したＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株を実施例４と同様に細胞融合し、その後細胞を回収してフローサイトメトリー及び共焦点レーザ顕微鏡によりＨＮ／Ｆ−ＨｅＬａとＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株の細胞融合率を分析した。対照群として、ＧＦＰを形質導入したＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とｍＣｈｅｒｒｙを形質導入したＨｅＬａ細胞株を実施例４と同様に細胞融合し、その後細胞を回収して共焦点レーザ顕微鏡により細胞融合率を比較分析した。分析の結果、図１４に示すように、ＨＮ／Ｆ−ＨｅＬａとＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株において細胞融合が起こり、対照群に比べて、ＨＮ／Ｆ−ＨｅＬａとＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株の細胞融合率が７倍以上に増加することが確認された。
【０１０７】
これらの結果は、細胞に関係なく、ＨＮとＦタンパク質により細胞融合が起こることを意味するものである。
【実施例９】
【０１０８】
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞株とヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）／Ｆ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質を過剰発現するＨｅＬａ細胞株の細胞融合能力の評価
様々なベクターによりＨＮとＦタンパク質を過剰発現するＨｅＬａ細胞株の細胞融合能力を評価するために、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターまたはｐｃＤＮＡ３．１−Ｐ２Ａ発現ベクターを用いて、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）とＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質遺伝子をＨｅＬａ細胞株に導入した。要約すると、図１５に示すように、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｐ２Ａ発現ベクターと実施例２で得たＨＮタンパク質遺伝子及びＦタンパク質遺伝子クローンを用いて、ＨＮ及びＦタンパク質を挿入したｐｃＤＮＡ３．１−Ｐ２Ａ発現ベクターをクローニングした。次に、リポソーム（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でメーカーの示す方法に従ってＨｅＬａ細胞株に形質導入し、ＨＮ／Ｆ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞株（Ｆ−Ｐ２Ａ−ＨＮ−ＨｅＬａ）を得た。また、実施例２でクローニングしたＨＮ及びＦタンパク質をそれぞれ挿入したｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターを前述したようにＨｅＬａ細胞株に形質導入し、ＨＮ／Ｆ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞株（ＨＮ／Ｆ−ＨｅＬａ）を得た。形質導入した細胞株から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによりＨＮ及びＦ遺伝子の発現を分析した（結果は提示せず）。
【０１０９】
次に、細胞融合能力を評価するために、前述したように得たＨｅＬａ細胞株のそれぞれをＧＦＰで標識し、実施例４と同様にＲＦＰで標識したＣ２Ｃ１２筋芽細胞株と細胞融合し、その後細胞を回収してフローサイトメトリーによりＨｅＬａ細胞株とＣ２Ｃ１２筋芽細胞株の細胞融合率を分析した。対照群として、ＧＦＰで標識したＨｅＬａ細胞株とＲＦＰで標識したＣ２Ｃ１２筋芽細胞株を実施例４と同様に細胞融合し、その後細胞を回収してフローサイトメトリーにより細胞融合率を比較分析した。分析の結果、図１６に示すように、Ｆ−Ｐ２Ａ−ＨＮ−ＨｅＬａの細胞融合率は２６．９％、ＨＮ／Ｆ−ＨｅＬａの細胞融合率は５０．１％であったので、対照群に比べて、細胞融合がそれぞれ約４倍、７倍に増加することが確認された。
【０１１０】
これらの結果は、様々なベクターにより細胞にＨＮとＦタンパク質が過剰発現し、ＨＮ及びＦタンパク質を過剰発現する細胞において、他の細胞との細胞融合能力が高まることを意味するものである。
【実施例１０】
【０１１１】
Ｎ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とＨｅＬａ細胞株が融合した細胞における細胞修復に関連する遺伝子発現の分析
ＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合の際の細胞損傷回復機序を確認するために、実施例６で選択した細胞修復に関連する遺伝子ＤＤＢ１のプロモーター部位（ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ）をスクリーニングしたところ、図１７のように転写調節因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ；ＴＦ）であるＴＤＰ−４３（ＴＡＲ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４３）の結合モチーフ（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ）がＤＤＢ１のプロモーター部位に存在することが確認された。
【０１１２】
よって、ＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合の際のＴＤＰ−４３の増加に伴ってＤＤＢ１の発現が増加するか否かを確認するために、図１８のようにマウスＤＤＢ１（ｍＤＤＢ１）に特異的に結合するプライマーを作製し、それを用いてＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とＨｅＬａ細胞株から全ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによりマウス特異的ＤＤＢ１遺伝子を確認した。ＤＤＢ１の発現がＴＤＰ−４３により調節されることを確認するために、Ｎ２Ａ神経芽細胞腫細胞株にＴＤＰ−４３を過剰発現させ、その後ＲＮＡを抽出して定量ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。次に、Ｎ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とＧＦＰを形質導入したＨｅＬａ細胞株、及びＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を形質導入したＨｅＬａ細胞株のそれぞれをセンダイウイルス（ＨＶＪ）Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧｅｎｏｍＯＮＥＴＭ−ＣＦ  ＥＸ  Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ（ＨＶＪ）Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＣＯＳＭＯ  ＢＩＯ、Ｊａｐａｎ）でメーカーの示す方法に従って細胞融合し、その後ｆｕｓｉｏｎ  ＧＦＰ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を用いてＣｈＩＰ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）ａｓｓａｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を行った。その結果、図１９に示すように、Ｎ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を形質導入したＨｅＬａ細胞株が融合した細胞株において融合時間に応じてｍＤＤＢ１が増加し、ｍＤＤＢ１プロモーター部位においてＴＤＰ−４３のｏｃｃｕｐａｎｃｙが４倍以上に増加することが確認され、ＴＤＰ−４３の増加に応じてＤＤＢ１の発現が調節されることが確認された。
【０１１３】
また、ＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合の際にＴＤＰ−４３が受容細胞（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｃｅｌｌ）の核内に転座（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）されたか否かを確認するために、ＣＭ−ＤｉＩで標識したＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を形質導入したＨｅＬａ細胞株を前述した方法と同様に細胞融合し、ＤＡＰＩ染色後に共焦点レーザ顕微鏡によりＴＤＰ−４３の転座を分析し、Ｎ２Ａ神経芽細胞腫細胞株にＮｕｃＢｌｕｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて染色し、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を形質導入したＨｅＬａ細胞株と前述した方法と同様に細胞融合し、その後ｈｕｍａｎ  ｎｕｃｌｅｉ抗体（ａｂｃａｍ）により免疫染色を行って共焦点レーザ顕微鏡により分析した。分析の結果、図２０に示すように、ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３を形質導入したＨｅＬａ細胞株のＴＤＰ−４３がＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株の核に転座されたことが確認された。
【０１１４】
これらの結果は、ＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合の際の細胞修復に関連する遺伝子ＤＤＢ１の発現増加は、ドナー細胞（ｄｏｎｏｒ  ｃｅｌｌ）のＴＤＰ−４３が受容細胞（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｃｅｌｌ）の核内に転座され、その後ｍＤＤＢ１のプロモーター部位に結合することにより発現が調節されて行われることを意味するものである。また、図２１に示すように、細胞損傷に関連する疾患において、ＨＮ／Ｆタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞との融合によりＨＮ／Ｆタンパク質過剰発現細胞内の転写調節因子を損傷した細胞の核内に伝達し、伝達した転写調節因子により損傷した細胞内の細胞修復に関与する遺伝子の発現が調節され、損傷した細胞が回復するので、細胞損傷に関連する疾患を治療することができることを意味する。
【実施例１１】
【０１１５】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）細胞モデルにおけるＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合を用いた治療効果の分析
細胞損傷に関連する疾患であるアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、ＡＤ細胞モデルを作製した。要約すると、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからＡＤ動物モデルであるＴＧ２５７６マウス（生後８０日）の提供を受けた。次に、ＴＧ２５７６マウスの脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）を分離し、分離した組織からトリプシンにより幹細胞を分離及び濾過した。次に、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＤＭＥＭ培養培地にＥＧＦ及びＦＧＦをそれぞれ２０ｎｇ／ｍｌ添加して球状に４日間培養した。４日後にウェルプレートに移し、５％ＦＢＳ及びＢ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＤＭＥＭ培養培地で７日間培養してＡＤマウス由来の神経幹細胞の分化を誘導した。
【０１１６】
次に、実施例２で得たＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓと前述したように得たＡＤマウス由来の神経幹細胞を実施例４と同様に細胞融合した。細胞融合の２４時間後にアネキシンＶ抗体を５μｌ添加して常温で１５分間反応させ、その後フローサイトメトリーによりＶ陽性細胞を分析した。分析の結果、図２２に示すように、ＡＤマウス由来の神経幹細胞において、５０．７％のアネキシンＶ陽性細胞が確認され、ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こったＡＤマウス由来の神経幹細胞において、１５．９％のアネキシンＶ陽性細胞が確認された。
【０１１７】
これらの結果は、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現するｈＡＴＭＳＣｓにおけるＨＮ及びＦタンパク質によるＡＤニューロンとの融合により、ハンチントン病ニューロンにおいて現れる細胞損傷が回復することを意味するものである。
【実施例１２】
【０１１８】
ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）疾患細胞モデルにおけるＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合を用いた治療効果の分析
細胞損傷に関連する疾患であるハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、ハンチントン病細胞モデルを作製した。要約すると、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからハンチントン病動物モデルであるＲ６／２  Ｔｇマウス（生後８０日）の提供を受けた。次に、Ｒ６／２マウスの脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）を分離し、分離した組織からトリプシンにより幹細胞を分離及び濾過した。次に、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＤＭＥＭ培養培地にＥＧＦ及びＦＧＦをそれぞれ２０ｎｇ／ｍｌ添加して球状に４日間培養し、その後ウェルプレートに移し、５％ＦＢＳ及びＢ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＤＭＥＭ培養培地で７日間培養してハンチントン病マウス由来の神経幹細胞の分化を誘導した。
【０１１９】
次に、実施例２で得たＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓと前述したように得たハンチントン病マウス由来の神経幹細胞を実施例４と同様に細胞融合した。細胞融合の２４時間後にアネキシンＶ抗体を５μｌ添加して常温で１５分間反応させ、その後フローサイトメトリーによりＶ陽性細胞を分析した。分析の結果、図２３に示すように、ハンチントン病マウス由来の神経幹細胞において、３７．５％のアネキシンＶ陽性細胞が確認され、ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こったハンチントン病マウス由来の神経幹細胞において、１１．１％のアネキシンＶ陽性細胞が確認された。
【０１２０】
これらの結果は、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現するｈＡＴＭＳＣｓにおけるＨＮ及びＦタンパク質によるハンチントン病ニューロンとの融合により、ハンチントン病ニューロンにおいて現れる細胞損傷が回復することを意味するものである。
【実施例１３】
【０１２１】
心不全（ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）疾患細胞モデルにおけるＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合を用いた治療効果の分析
細胞損傷に関連する疾患である心不全（ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）疾患において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、心不全疾患細胞モデルを作製した。要約すると、細胞トラッカーＣＭＤＦＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識したＨ９ｃ２心筋芽細胞株を過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）２００μＭで処理し、その後３時間培養して酸化ストレスを誘導することにより、心不全疾患細胞モデルを得た。
【０１２２】
次に、実施例２で得たＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓをＣＭ−ＤｉＩで標識し、前述したように得た心不全疾患細胞モデルを実施例４と同様に細胞融合し、その後細胞を回収した。回収した細胞をアネキシンＶで染色してフローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性細胞を分離し、その後分離した細胞のうちの緑色蛍光陽性細胞を分析した。分析の結果、図２４に示すように、心不全疾患細胞モデルにおいて、２９％のアネキシンＶ陽性細胞が確認され、ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こった心不全疾患細胞モデルにおいて、１３．４％のアネキシンＶ陽性細胞が確認された。
【０１２３】
これらの結果は、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現するｈＡＴＭＳＣｓにおけるＨＮ及びＦタンパク質による心不全が誘導された細胞との融合により、細胞損傷が回復することを意味するものである。
【実施例１４】
【０１２４】
筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）疾患動物モデルにおけるＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合を用いた治療効果の分析
細胞損傷に関連する疾患である筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）疾患において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからＡＬＳ疾患動物モデルであるＧ９３Ａ  ＳＯＤ１  Ｔｇマウス（生後８０日）の提供を受けた。次に、Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１  Ｔｇマウスを対照群（Ｔｇ−ｓａｌｉｎｅ）、Ｔｇ−ＭＳＣ及びＴｇ−ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ＭＳＣ群に分け、図２５に示すように、脊髄内注入（ｉｎｔｒａ−ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）方法により、対照群には塩類溶液（ｓａｌｉｎｅ）を、Ｔｇ−ＭＳＣ群にはｈＡＴＭＳＣｓを、Ｔｇ−ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ＭＳＣ群には実施例２で作製したＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓを０．５〜２×１０６の細胞数で注入してロータロッド試験（ｒｏｔａ  ｒｏｄ  ｔｅｓｔ）を行った。その結果、図２６に示すように、ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓを注入したＴｇ−ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ＭＳＣ群において、ＨＮ／Ｆタンパク質によるＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとニューロンの融合が確認され、ニューロン損傷の回復により運動性が向上することが確認された。
【実施例１５】
【０１２５】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ；ＤＭＤ）疾患細胞モデルにおけるＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合を用いた治療効果の分析
細胞損傷に関連する疾患であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）疾患において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、ＤＭＤ疾患細胞モデルを作製した。要約すると、ＤＭＤ疾患は筋肉線維のジストロフィン欠乏により発症する筋肉疾患であるので、ジストロフィンに特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉジストロフィン、ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ）を入手し、それをメーカーの示す方法に従ってＣ２Ｃ１２筋芽細胞に導入し、ジストロフィン発現が抑制されたＣ２Ｃ１２筋芽細胞株を作製した。ＤＭＤ疾患の病理症状によりジストロフィン及びＣＴＧＦ発現を確認するために、ジストロフィン及びＣＴＧＦに特異的に結合するプライマーを作製し、前記ｓｉジストロフィンを導入したＣ２Ｃ１２筋芽細胞株から全ＲＮＡを抽出し、定量ＲＴ−ＰＣＲによりジストロフィン及びＣＴＧＦ遺伝子発現を分析した。また、ＣＴＧＦ抗体（Ａｂｃａｍ）を用いたウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）によりＣＴＧＦタンパク質発現を分析した。対照群としてＣ２Ｃ１２細胞株を用いた。発現分析の結果、図２７に示すように、ｓｉジストロフィンを導入したＣ２Ｃ１２筋芽細胞株において、ＤＭＤ疾患細胞モデルのジストロフィンの遺伝子発現が減少し、ＣＴＧＦの遺伝子及びタンパク質発現が増加することが確認された。
【０１２６】
前述したように作製したＤＭＤ疾患細胞モデルにおいて、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、実施例２のように作製したＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓと前述したように作製したＤＭＤ疾患細胞モデルを実施例４と同様に細胞融合し、その後細胞を回収して定量ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロットによりジストロフィン及びＣＴＧＦの発現を分析した。分析の結果、図２８に示すように、ＤＭＤ疾患細胞モデルにおいて、ジストロフィン発現が減少し、ＣＴＧＦ発現が増加するのに対して、ＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓとＤＭＤ疾患細胞モデルが融合した細胞において、ジストロフィン発現が大幅に増加し、ＣＴＧＦ発現が大幅に減少することが確認された。
【０１２７】
これらの結果は、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現する細胞がＤＭＤ疾患細胞モデルと細胞融合し、細胞融合したＤＭＤ疾患細胞モデルが正常細胞に回復することを意味するものである。また、細胞融合したＤＭＤ疾患細胞モデルに正常なジストロフィン遺伝子が伝達され、ジストロフィンの発現が回復することを意味するものである。
【実施例１６】
【０１２８】
ＤＭＤ疾患動物モデルにおけるＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合を用いた治療効果の分析
ＤＭＤ疾患において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからＤＭＤ疾患動物モデルであるｍｄｘマウス（生後２〜４週間）の提供を受けた。ｍｄｘマウスから骨格筋を分離し、ジストロフィン抗体（ａｂｃａｍ）を用いて免疫組織化学を行ったところ、図２９に示すように、ジストロフィンが減少することが確認された。次に、ｍｄｘマウスを対照群（ｓａｌｉｎｅ）、ＭＳＣ及びｆＭＳＣ群に分け、図２５に示すように、脊髄内注入方法により、対照群には塩類溶液（ｓａｌｉｎｅ）を、ＭＳＣ群には緑色染料で標識したｈＡＴＭＳＣｓを、ｆＭＳＣ群には緑色染料で標識した実施例２のＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓを０．５〜２×１０６の細胞数で注入し、１週間後に骨格筋（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）を分離した。次に、ｈＮｕｃｌｅｉ抗体（ａｂｃａｍ）で染色し、摘出した骨格筋において共焦点レーザ顕微鏡により生着能を分析した。また、注入して３週間後または１５週間後に骨格筋を分離し、ジストロフィン抗体（ａｂｃａｍ）を用いて免疫組織化学を行った。さらに、注入して１週間後に骨格筋を分離し、分離した骨格筋から全ＲＮＡを抽出して定量ＲＴ−ＰＣＲによりＣＴＧＦ遺伝子発現を分析した。
【０１２９】
その結果、図３０に示すように、ＭＳＣ群及びｆＭＳＣ群のそれぞれにおいて、ｈＡＴＭＳＣｓ及びＨＮ／Ｆ−ｈＡＴＭＳＣｓの生着能が緑色染料で確認された。また、図３１に示すように、ｆＭＳＣ群において、注入３週間後及び注入１５週間後にヒト正常ジストロフィンタンパク質発現が大幅に増加し、ジストロフィンタンパク質発現が持続することが確認された。さらに、図３２に示すように、ｆＭＳＣ群において、注入１週間後にＣＴＧＦ遺伝子発現が大幅に減少することが確認された。
【０１３０】
これらの結果は、ｍｄｘマウスの筋肉でジストロフィンを正常に発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質によりジストロフィンが欠乏した筋細胞との細胞融合が高まり、細胞融合した筋細胞において、正常な筋細胞に回復することを意味するものである。
【０１３１】
これらの結果は、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞がＨＮ及びＦタンパク質により損傷した細胞と融合し、損傷した細胞との融合によりＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞内の転写調節因子を損傷した細胞の核内に伝達し、損傷した細胞において細胞修復に関与する遺伝子の発現が調節されることにより損傷した細胞が回復するので、ＨＮ及びＦタンパク質を用いた細胞融合技術により細胞損傷に関連する神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患を治療することができることを意味するものである。また、ＨＮ／Ｆタンパク質過剰発現細胞がＨＮ／Ｆタンパク質により遺伝子異常のある細胞と融合し、細胞融合により正常遺伝子が伝達されて発現するので、ＨＮ及びＦタンパク質を用いた細胞融合技術が遺伝子治療（ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）の送達ツール（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏｏｌ）として用いられることを意味するものである。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明は、細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその用途に関し、具体的にはＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合技術により細胞損傷を回復させて正常遺伝子を導入することができるので、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターまたはそれで形質転換された細胞を、細胞損傷に関連する疾患、より具体的には神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の治療に有効に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年2月5日(2021.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを有効成分として含有する、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ及びＦタンパク質は、センダイウイルス（ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  １）、ヒトパラインフルエンザウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ；ＨＲＳＶ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）または水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）由来のものであることを特徴とする、請求項１に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項３】
前記ベクターは、直鎖状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、組換え非ウイルス性ベクター、組換えウイルス性ベクター及び遺伝子発現誘導ベクターシステム（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記組換えウイルス性ベクターは、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルパー依存性アデノウイルス（ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）及びワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）ベクターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項５】
前記神経変性疾患または神経疾患は、運動ニューロン損傷もしくは死滅、脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄神経損傷または末梢神経損傷を誘発するものであることを特徴とする、請求項１に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項６】
前記運動ニューロン損傷または死滅を誘発する神経変性疾患または神経疾患は、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、ケネディ病（ｓｐｉｎａｌ  ｂｕｌｂａｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発性側索硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）及び進行性球麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｂｕｌｂａｒ  ｐａｌｓｙ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項７】
前記脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄神経損傷または末梢神経損傷を誘発する神経変性疾患または神経疾患は、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）、認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、多発梗塞性認知症（ｍｕｌｔｉ−ｉｎｆａｃｔ  ｄｅｍｅｎｔｉａ；ｍｉｄ）、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、レビー小体型認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ）、軽度認知障害（ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、大脳皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）、うつ病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、代謝性脳疾患（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ；ＭＳＡ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｌｓｙ；ＰＳＰ）、てんかん（ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒｏｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ  ａｔｒｏｐｈｙ；ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ）、緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、脳虚血（ｂｒａｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、脳炎後パーキンソニズム（ｐｏｓｔ−ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｃ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）、トゥレット障害（Ｔｏｕｒｅｔｔｅ'ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、むずむず脚症候群（ｒｅｓｔｌｅｓｓ  ｌｅｇｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）及び注意欠陥多動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｔ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項８】
前記筋肉変性疾患または筋肉疾患は、ミオパチー（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、先天性ミオパチー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｍｙｏｐａｔｈｙ）、先天性筋ジストロフィー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂｅｃｋｅｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、肢帯型筋ジストロフィー（Ｌｉｍｂ  Ｇｉｒｄｌｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（Ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、遠位型筋ジストロフィー（ｄｉｓｔａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（Ｅｍｅｒｙ−Ｄｒｅｉｆｕｓｓ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋強直性ジストロフィー（Ｍｙｏｔｏｎｉｃ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、バース症候群（Ｂａｒｔｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心不全（ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、サルコペニア（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）及びＸ連鎖性拡張型心筋症（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項９】
ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を有効成分として含有する、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１０】
前記細胞は、幹細胞、前駆細胞及び動物細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１１】
前記細胞は、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）細胞、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）細胞及び異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１２】
前記幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１３】
前記成体幹細胞は、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）及び間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１４】
前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、血液、脳、皮膚、脂肪、骨格、筋肉、神経、骨膜、羊膜及び胎盤からなる群から選択される少なくとも１種の組織由来の間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項１３に記載の筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【国際調査報告】
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