(57)【要約】本開示は、少なくとも部分的に、インビボでのフソソーム送達のための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態において、フソソームは、標的細胞に対する特異性を促進するエレメントの組み合わせ、例えば、再標的化フソゲン、ポジティブ標的細胞特異的調節エレメント、および非標的細胞特異的調節エレメントのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、フソソームに対する免疫応答を減少させる１つ以上の改変を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フソソームであって、
ａ）フソゲンを含む脂質二重層と、
ｂ）核酸であって、
（ｉ）外因性薬剤をコードする核酸と操作可能に連結されたポジティブ標的細胞特異的調節エレメントであって、ポジティブ組織特異的調節エレメントが、標的細胞または組織における前記外因性薬剤の発現を、前記ポジティブ組織特異的調節エレメントを欠如する以外は同様なフソソームと比べて増加させる、ポジティブ標的細胞特異的調節エレメント、または
（ｉｉ）前記外因性薬剤をコードする前記核酸と操作可能に連結された非標的細胞特異的調節エレメントであって、非標的細胞または組織における前記外因性薬剤の発現を、前記非標的細胞特異的調節エレメントを欠如する以外は同様なフソソームと比べて減少させる、非標的細胞特異的調節エレメントを含むまたはコードする核酸と、を含む、フソソーム。
【請求項２】
フソソームであって、
ａ）フソゲンを含む脂質二重層と、
ｂ）核酸であって、
（ｉ）外因性薬剤をコードする核酸と操作可能に連結されたポジティブ標的細胞特異的調節エレメントであって、ポジティブ組織特異的調節エレメントが、標的細胞または組織における前記外因性薬剤の発現を、前記ポジティブ組織特異的調節エレメントを欠如する以外は同様なフソソームと比べて増加させる、ポジティブ標的細胞特異的調節エレメント、および
（ｉｉ）前記外因性薬剤をコードする前記核酸と操作可能に連結された非標的細胞特異的調節エレメントであって、非標的細胞または組織における前記外因性薬剤の発現を、前記非標的細胞特異的調節エレメントを欠如する以外は同様なフソソームと比べて減少させる、非標的細胞特異的調節エレメントを含むまたはコードする核酸と、を含む、フソソーム。
【請求項３】
前記フソソームが、前記外因性薬剤または前記外因性薬剤をコードする核酸を含む、請求項１または請求項２に記載のフソソーム。
【請求項４】
ｉ）前記フソソームが非標的細胞とよりも標的細胞と高い割合で融合し、任意に、前記高い割合は、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍である、
ｉｉ）前記フソソームが、別のフソソームとよりも標的細胞と高い割合で融合し、任意に、前記高い割合は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍である、
ｉｉｉ）前記フソソームは、前記フソソームにおける前記外因性薬剤が２４、４８、または７２時間後に標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に送達されるような割合で標的細胞と融合し、
ｉｖ）前記フソソームが、前記核酸を標的細胞に非標的細胞よりも高い割合で送達し、任意に、前記高い割合は少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍である、
ｖ）前記フソソームが、前記核酸を標的細胞に別のフソソームよりも高い割合で送達し、任意に、前記高い割合は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍である、あるいは
ｖｉ）前記フソソームが前記核酸を標的細胞に、前記フソソームにおける前記外因性薬剤が２４、４８、または７２時間に標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に送達されるような割合で送達する、のうちの１つ以上である、請求項１〜３のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項５】
前記フソソームが対象に投与される場合、
ｉ）前記対象において検出可能で存在する前記外因性薬剤の１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満が非標的細胞にある、
ｉｉ）前記外因性薬剤を検出可能で含む前記対象の前記細胞のうちの少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が標的細胞であり、任意に、前記標的細胞が単一細胞型のものであり、任意に前記標的細胞がＴ細胞である、
ｉｉｉ）前記外因性薬剤を検出可能で含む前記対象の前記細胞のうちの１，０００，０００、５００，０００、２００，０００、１００，０００、５０，０００、２０，０００、または１０，０００個未満の細胞が非標的細胞である、
ｉｖ）前記対象の全標的細胞における前記外因性薬剤の平均レベルが、前記対象の全非標的細胞における前記外因性薬剤の平均レベルよりも少なくとも１００倍、２００倍、５００倍、または１，０００倍高いものである、あるいは
ｖ）前記外因性薬剤が前記対象におけるいずれの非標的細胞でも検出可能ではない、のうちの１つ以上である、請求項１〜４のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項６】
前記フソゲンが再標的化フソゲンである、請求項１〜５のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項７】
前記再標的化フソゲンが、ニパウイルスＦおよびＧタンパク質、麻疹ウイルスＦおよびＨタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦおよびＨタンパク質、パラミクソウイルスＦおよびＧタンパク質もしくはＦおよびＨタンパク質もしくはＦおよびＨＮタンパク質、ヘンドラウイルスＦおよびＧタンパク質、ヘニパウイルスＦおよびＧタンパク質、モルビリウイルスＦおよびＨタンパク質、レスピロウイルスＦおよびＨＮタンパク質、センダイウイルスＦおよびＨＮタンパク質、ルブラウイルスＦおよびＨＮタンパク質、またはアブラウイルスＦおよびＨＮタンパク質、あるいはそれらの誘導体、あるいはそれらの任意の組み合わせから選択される配列を含む、請求項６に記載のフソソーム。
【請求項８】
前記フソゲンが、野生型パラミクソウイルスフソゲンと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する長さが少なくとも１００個のアミノ酸のドメインを含み、任意に、前記野生型パラミクソウイルスフソゲンが配列番号１〜１３２のうちのいずれか１つで示される、請求項１〜７のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項９】
前記野生型パラミクソウイルスがニパウイルスであり、任意に、前記ニパウイルスがヘニパウイルスである、請求項８に記載のフソソーム。
【請求項１０】
前記ポジティブ標的細胞特異的調節エレメントが、組織特異的プロモーター、組織特異的エンハンサー、組織特異的スプライス部位、ＲＮＡもしくはタンパク質の半減期を延長する組織特異的部位、組織特異的ｍＲＮＡ核外輸送促進部位、組織特異的翻訳増強部位、または組織特異的翻訳後改変部位を含む、請求項１〜９のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１１】
前記ポジティブ標的細胞特異的調節エレメントが組織特異的プロモーターを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１２】
前記非標的細胞特異的調節エレメントが、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、組織特異的プロテアーゼ認識部位、組織特異的ユビキチンリガーゼ部位、組織特異的転写抑制部位、または組織特異的エピジェネティック抑制部位を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１３】
前記非標的細胞特異的調節エレメントが組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１４】
前記非標的細胞特異的調節エレメントが、前記外因性薬剤をコードする転写化領域内に配置またはコードされ、任意に、前記転写化領域によって生成されたＲＮＡが、ＵＴＲまたはコード領域内の前記組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列を含む、請求項１３に記載のフソソーム。
【請求項１５】
前記標的細胞が癌細胞であり、前記非標的細胞が非癌性細胞である、請求項１〜１４のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１６】
前記外因性薬剤が外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡであり、任意に、前記外因性薬剤が治療剤である、請求項１〜１５のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１７】
前記フソソームがさらに、
ｉ）前記脂質二重層に第１の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、および前記脂質二重層に第２の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、
ｉｉ）前記脂質二重層に第１の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、および不在または低下したレベルで存在し、任意に前記低下したレベルが、非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％である第２の免疫刺激タンパク質、あるいは
ｉｉｉ）不在または低下したレベルで存在し、任意に、前記低下したレベルが非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％である第１の免疫刺激タンパク質、および不在または低下したレベルで存在し、任意に、前記低下したレベルが非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％である第２の免疫刺激タンパク質を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項１８】
対象に投与される場合、
ｉ）前記フソソームが検出可能な抗体応答を生じず、または前記フソソームに対する抗体がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在する、
ｉｉ）前記フソソームが検出可能な細胞性免疫応答を生じず、または前記フソソームに対する細胞性免疫応答がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在する、
ｉｉｉ）前記フソソームが検出可能な自然免疫応答を生じず、または前記フソソームに対する前記自然免疫応答がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在する、
ｉｖ）フソソームの１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満が血清によって不活性化される、
ｖ）前記フソソームから前記外因性薬剤を受容した標的細胞が検出可能な抗体応答を生じず、または前記標的細胞に対する抗体がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在する、あるいは
ｖｉ）前記フソソームから前記外因性薬剤を受容した標的細胞が検出可能な細胞性免疫応答を生じず、または前記標的細胞に対する細胞応答がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在する、のうちの１つ以上である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
フソソームであって、
ａ）フソゲンを含む脂質二重層と、
ｂ）外因性薬剤または外因性薬剤をコードする核酸と、
ｃ）
ｉ）前記脂質二重層に第１の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、および前記脂質二重層に第２の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、
ｉｉ）前記脂質二重層に第１の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、および不在または低下したレベルで存在し、任意に前記低下したレベルが、非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％である第２の免疫刺激タンパク質、あるいは
ｉｉｉ）不在、または低下したレベルで存在し、任意に、前記低下したレベルが非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％低下した第１の免疫刺激タンパク質、および不在または低下したレベルで存在し、任意に、前記低下したレベルが非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％低下した第２の免疫刺激タンパク質、のうちの１つ以上と、を含み、
対象に投与される場合、任意に、前記対象がヒト対象またはマウスであり、
ｉ）前記フソソームが検出可能な抗体応答を生じず、または前記フソソームに対する抗体がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在する、
ｉｉ）前記フソソームが検出可能な細胞性免疫応答を生じず、または前記フソソームに対する細胞性免疫応答がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在する、
ｉｉｉ）前記フソソームが検出可能な自然免疫応答を生じず、または前記フソソームに対する前記自然免疫応答がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在する、
ｉｖ）フソソームの１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満が血清によって不活性化される、
ｖ）前記フソソームから前記外因性薬剤を受容した標的細胞が検出可能な抗体応答を生じず、または前記標的細胞に対する抗体がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在する、あるいは
ｖｉ）前記フソソームから前記外因性薬剤を受容した標的細胞が検出可能な細胞性免疫応答を生じず、または前記標的細胞に対する細胞応答がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在する、のうちの１つ以上である、フソソーム。
【請求項２０】
前記バックグラウンドレベルが、前記フソソームの投与前の前記同一対象におけるその対応するレベルである、請求項１８または請求項１９に記載のフソソーム。
【請求項２１】
前記免疫抑制タンパク質が補体調節タンパク質またはＣＤ４７である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のフソソーム。
【請求項２２】
前記免疫刺激タンパク質がＭＨＣであり、任意に、前記ＭＨＣがタンパク質であるＨＬＡである、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のフソソーム。
【請求項２３】
フソソームであって、
ａ）フソゲンを含む脂質二重層と、
ｂ）外因性薬剤をコードする核酸と、
ｃ）前記脂質二重層に外因性または過剰発現されたＭＨＣであって、任意に、前記ＭＨＣはＨＬＡであり、任意に、前記ＨＬＡはＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−Ｅ、またはそれらの組み合わせである、ＨＭＣと、を含む、フソソーム。
【請求項２４】
前記フソゲンが、配列番号１〜１３２のいずれか１つに示される野生型パラミクソウイルスフソゲンと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する長さが少なくとも１００個のアミノ酸のドメインを含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のフソソーム。
【請求項２５】
フソソームであって、
ａ）フソゲンを含む脂質二重層であって、前記フソゲンが配列番号１〜１３２のいずれか１つに示される野生型パラミクソウイルスフソゲンと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する長さが少なくとも１００個のアミノ酸のドメインを含む、脂質二重層と、
ｂ）外因性薬剤をコードする核酸と、
ｃ）前記脂質二重層に外因性もしくは過剰発現したＣＤ４７または補体調節タンパク質、あるいはそれらの組み合わせと、を含む、フソソーム。
【請求項２６】
フソソームであって、
ａ）フソゲンを含む脂質二重層であって、前記フソゲンが、配列番号１〜１３２のいずれか１つに示される野生型パラミクソウイルスフソゲンと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する長さが少なくとも１００個のアミノ酸のドメインを含む、脂質二重層と、
ｂ）外因性薬剤をコードする核酸と、
ｃ）ＭＨＣＩであって、任意に前記ＭＨＣＩがＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、もしくはＨＬＡ−Ｃ、またはＭＨＣＩＩであり、任意に、ＭＨＣＩＩがＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはＨＬＡ−ＤＲであり、不在または低下したレベルで存在し、任意に、前記低下したレベルが非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０、もしくは９０％低下した、ＨＭＣＩと、を含む、フソソーム。
【請求項２７】
フソソームであって、
ａ）フソゲンを含む脂質二重層であって、前記フソゲンが、配列番号１〜１３２のいずれか１つで示される野生型パラミクソウイルスフソゲンと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する長さが少なくとも１００個のアミノ酸のドメインを含む、脂質二重層と、
ｂ）外因性薬剤をコードする核酸と、
ｃ）不在または低下したレベルで存在し、任意に、前記低下したレベルが非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％低下した、外因性もしくは過剰発現した免疫抑制タンパク質または免疫刺激タンパク質のうちの一方または両方と、を含む、フソソーム。
【請求項２８】
前記核酸が１つ以上のインスレーターエレメントを含む、請求項１〜２７のいずれかに記載のフソソーム。
【請求項２９】
フソソームであって、
ａ）フソゲンを含む脂質二重層であって、前記フソゲンが、配列番号１〜１３２のいずれか１つで示される野生型パラミクソウイルスフソゲンと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する長さが少なくとも１００個のアミノ酸のドメインを含む、脂質二重層と、
ｂ）外因性薬剤をコードする核酸であって、１つ以上のインスレーターエレメントを含む核酸と、を含む、フソソーム。
【請求項３０】
前記核酸が２つのインスレーターエレメントを含み、任意に、前記２つのインスレーターエレメントが、前記外因性薬剤をコードする領域の上流である第１のインスレーターエレメントおよび前記外因性薬剤をコードする領域の下流である第２のインスレーターエレメントを含み、任意に、前記第１のインスレーターエレメントおよび前記第２のインスレーターエレメントが同一または異なる配列を含む、請求項２８または請求項２９に記載のフソソーム。
【請求項３１】
前記対象に第１の時点で前記フソソームを投与した後に単離された細胞の試料における前記外因性薬剤の中央レベルの変動が、前記対象に後の第２の時点で前記フソソームを投与した後に単離された細胞の試料における前記外因性薬剤の中央レベルの少なくとも、約１０，０００％、５，０００％、２，０００％、１，０００％、５００％、２００％、１００％、５０％、２０％、１０％、または５％、あるいはそれら未満である、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のフソソーム。
【請求項３２】
前記対象における標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が前記外因性薬剤を検出可能で含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のフソソーム。
【請求項３３】
第１の時点で前記外因性薬剤を検出可能で含んだ前記対象における標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、後の第２の時点で前記外因性薬剤を依然として検出可能で含む、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載のフソソーム。
【請求項３４】
遺伝毒性でなく、または標的細胞における腫瘍形成の割合を増加しない、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載のフソソーム。
【請求項３５】
前記外因性薬剤が外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡであり、任意に、前記外因性薬剤が治療剤である、請求項１９〜３４に記載のいずれか一項に記載のフソソーム。
【請求項３６】
外因性薬剤を対象に送達する方法であって、前記対象に請求項１〜３５のいずれかに記載のフソソームを投与することを含み、それによって前記外因性薬剤を前記対象に送達し、任意に、前記対象がヒト対象である、方法。
【請求項３７】
対象、標的組織、または標的細胞において機能を調節する方法であって、前記標的組織または前記標的細胞を請求項１〜３６のいずれかに記載のフソソームと接触させることを含み、任意に、前記対象がヒト対象である、方法。
【請求項３８】
前記標的組織または前記標的細胞が対象に存在する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記接触することが、前記フソソームを前記対象に投与することによって実行される、請求項３７または請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
対象において、障害を治療または予防する方法であって、前記対象に請求項１〜３９のいずれか一項に記載のフソソームを投与することを含み、任意に、前記対象がヒト対象である、方法。
【請求項４１】
ａ）前記核酸および前記フソゲン（例えば、再標的化フソゲン）を含む細胞を用意することと、
ｂ）前記細胞を前記フソソームの生成を可能にする条件下で培養することと、
ｃ）前記細胞から前記フソソームを分離、豊富化、または精製することと、を含み、それによってフソソームを作製する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のフソソームを作製する方法。
【請求項４２】
フソソームを生成するための供給源細胞であって、
ａ）核酸と、
ｂ）前記核酸をパッケージングすることができる構造タンパク質であって、少なくとも１つの構造タンパク質が、フソゲン受容体と結合するフソゲンを含む構造タンパク質と、
ｃ）不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞と比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低下）で存在するフソゲン受容体と、を含む、供給源細胞。
【請求項４３】
前記フソゲンが、前記フソゲン受容体と結合するとときに、前記フソソームと前記標的細胞との融合を生じる、請求項４２に記載の供給源細胞。
【請求項４４】
第２の同様な供給源細胞と結合し、例えば、前記供給源細胞の前記フソゲンが前記第２の供給源細胞上の前記フソゲン受容体と結合する、請求項４２または４３に記載の供給源細胞。
【請求項４５】
請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の供給源細胞の、集団。
【請求項４６】
前記集団における細胞の１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満が多核化されている、請求項４５に記載の供給源細胞の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月１５日に出願された米国特許第６２／６７１，８３８号および２０１８年７月９日に出願された米国特許第６２／６９５，５２９号の優先権を主張し、これらの各々は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列リストの参照による組み込み
本出願は、電子形式の配列リストと共に出願されている。配列リストは、２０１９年５月１４日に作成されたＶ２０５０−７０２３ＷＯ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ．ＴＸＴというタイトルのファイルとして提供され、サイズは６５１キロバイトである。配列リストの電子形式の情報は、その全体が参照によって組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
複合的な生物製剤は、様々な疾患における有望な治療候補である。しかしながら、原形質膜は細胞と細胞外空間との間の障壁として作用するため、大きい生物学的薬剤を細胞に送達することは困難である。当技術分野において、対象における細胞に複合的な生物製剤を送達する新しい方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、少なくとも部分的に、インビボ送達のためのフソソーム法および組成物を提供する。いくつかの実施形態において、フソソームは、標的細胞に対する特異性を促進するエレメントの組み合わせ、例えば、再標的化フソゲン、ポジティブ標的細胞特異的調節エレメント、および非標的細胞特異的調節エレメントのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、フソソームは、フソソームに対する免疫応答を低下させる１つ以上の改変を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１Ａ】ポジティブＴＣＳＲＥまたはＮＴＣＳＲＥを含む核酸構築体をコードするレンチウイルス（ＬＶ）によって形質導入された、標的ヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）および非標的（非肝）細胞株を含む細胞株に関する結果を示す一連のグラフである。図１Ａは、ＰＧＫプロモーターの制御下で、ｍｉＲＴ配列を加えて（ｈＰＧＫ−ｅＧＦＰ＋ｍｉＲＴ）またはｍｉＲＴ配列を加えず（ｈＰＧＫ−ｅＧＦＰ）に生成されたＬＶによって形質導入された、ヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）、ヒト胎児腎臓細胞株（２９３ＬＸ）、造血由来のヒトＴ細胞株（Ｍｏｌｔ４．８）、およびマウス脳に由来する内皮細胞株（ｂＥＮＤ．３）におけるＧＦＰ発現を示す。図１Ｂは、ＰＧＫプロモーターの制御下で生成されたＬＶ（ｈＰＧＫ−ｅＧＦＰ）、または肝細胞特異的プロモーターＡｐｏＥの制御下でｍｉｒＴ配列およびＧＦＰを含むＬＶ（ｈＡｐｏＥ−ｅＧＦＰ＋ｍｉＲＴ）によって形質導入されたＨｅｐＧ２および２９３ＬＸ細胞におけるＧＦＰ発現を示す。図１Ｃは、導入遺伝子フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をＳＦＦＶプロモーターの制御下で含むＬＶ（ＳＦＦＶ−ＰＡＬ）、またはｍｉｒＴ配列をｈＡｐｏＥプロモーターの制御下で含むＬＶ（ｈＡｐｏＥ−ＰＡＬ＋ｍｉＲＴ）によって形質導入されたＨｅｐＧ２および２９３ＬＸ細胞の上清中のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）の定量化を示す。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
実施形態の列挙
本明細書で提供されるのは、レンチウイルスベクターまたは粒子などのレトロウイルスベクターまたは粒子を含むフソソームであり、一般的に、例えば対象において、細胞へのフソソームの導入後に、非標的細胞と比較して、標的細胞における所望の外因性薬剤（例えば、治療用導入遺伝子）の発現の増加をもたらす。例えば、いくつかの例では、発現における増加が、提供されたフソソーム（例えば、レトロウイルスベクターまたは粒子）の対象、例えばヒト対象へのインビボでの投与の後に続いている。特に、遺伝子治療を成功させるための主要な課題の１つは、インビボで遺伝子改変細胞からの治療用導入遺伝子（例えば、外因性薬剤）の安定した長期発現を維持する能力である。抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの非標的細胞における導入遺伝子の発現は、いくつかの態様において、適応免疫応答の活性化を生じ、Ｂ細胞による導入遺伝子産物に対する中和抗体の生成および／またはＴ細胞による導入遺伝子産生細胞の排除をもたらす。したがって、導入遺伝子の発現を標的細胞に限定することは、いくつかの実施形態では、免疫クリアランスを回避することによって、導入遺伝子発現の耐久性に実質的に影響を及ぼし得る。さらに、細胞型特異的導入遺伝子の発現は、例えば、アポトーシス促進遺伝子の発現を腫瘍細胞または他の標的細胞（例えば、肝細胞）に限定するなど、疾患生物学に非常に関連し得る。
【０００７】
特に、本明細書で提供されるのは、いくつかの例では、ポジティブ標的細胞特異的調節エレメント（ＴＣＳＲＥ、例えば、組織特異的プロモーター）および／またはネガティブ標的細胞特異的調節エレメント（ネガティブＴＣＳＲＥ）、例えば、非標的細胞特異的調節エレメント（ＮＴＣＳＲＥ）の制御下にある、またはそれらによって調節される核酸配列の発現を含むフソソーム（例えば、レトロウイルスベクターｐｒ粒子）である。いくつかの実施形態において、ＮＣＳＲＥなどのネガティブＴＣＳＣＲＥは、細胞におけるｍｉＲＮＡ配列に相補的である核酸配列によるなど、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシングによるものである。いくつかの実施形態において、提供されるフソソーム（例えば、レトロウイルスベクターまたは粒子）は、非標的細胞における発現を制限または限定しながら、標的細胞株（例えば、腫瘍もしくは肝細胞または他の標的細胞）における導入遺伝子（外因性薬剤）発現を特異的に促進することができる。
【０００８】
提供される実施形態は、なかでも以下である。
１．フソソームであって、
ａ）再標的化フソゲンを含む脂質二重層と、
ｂ）核酸であって、
（ｉ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）をコードする核酸と操作可能に連結されたポジティブ標的細胞特異的調節エレメント（例えば、組織特異的プロモーター）であって、ポジティブ組織特異的調節エレメントが標的細胞または組織における外因性薬剤の発現を、ポジティブ組織特異的調節エレメントを欠如する異なるフソソームと比べて増加させる、ポジティブ標的細胞特異的調節エレメント、または
（ｉｉ）外因性薬剤をコードする核酸と操作可能に連結された非標的細胞特異的調節エレメント（例えば、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列）であって、非標的細胞または組織における外因性薬剤の発現を、非標的細胞特異的調節エレメントを欠如する以外は同様なフソソームと比べて減少させる非標的細胞特異的調節エレメント、を含むまたはコードする核酸と、を含む、フソソーム。
【０００９】
２．フソソームであって、
ａ）再標的化されたフソゲンを含む脂質二重層と、
ｂ）核酸であって、
（ｉ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）をコードする核酸と操作可能に連結されたポジティブ標的細胞特異的調節エレメント（例えば、組織特異的プロモーター）であって、ポジティブ組織特異的調節エレメントが標的細胞または組織における外因性薬剤の発現を、ポジティブ組織特異的調節エレメントを欠如する異なるレトロウイルスベクターと比べて増加させる、ポジティブ標的細胞特異的調節エレメント、または
（ｉｉ）外因性薬剤をコードする核酸と操作可能に連結されたネガティブ標的細胞特異的調節エレメント（例えば、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列）であって、ネガティブ組織特異的調節エレメントが非標的細胞または組織における外因性薬剤の発現を、ネガティブ組織特異的調節エレメントを欠如する以外は同様なレトロウイルスと比べて減少させる、ネガティブ標的細胞特異的調節エレメント、を含むまたはコードする核酸と、を含む、フソソーム。
【００１０】
３．フソソームであって、
ａ）フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）を含む脂質二重層と、
ｂ）核酸であって、
（ｉ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）をコードする核酸と操作可能に連結されたポジティブ標的細胞特異的調節エレメント（例えば、組織特異的プロモーター）であって、ポジティブ組織特異的調節エレメントが標的細胞または組織における外因性薬剤の発現を、ポジティブ組織特異的調節エレメントを欠如する以外は同様なフソソームと比べて増加させる、ポジティブ標的細胞特異的調節エレメント、および
（ｉｉ）外因性薬剤をコードする核酸と操作可能に連結された非標的細胞特異的調節エレメント（例えば、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列）であって、非標的細胞または組織における外因性薬剤の発現を、非標的細胞特異的調節エレメントを欠如する以外は同様なフソソームと比べて減少させる非標的細胞特異的調節エレメント、を含むまたはコードする核酸と、を含む、フソソーム。
【００１１】
４．フソソームであって、
ａ）フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）を含む脂質二重層と、
ｂ）核酸であって、
（ｉ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）をコードする核酸と操作可能に連結されたポジティブ標的細胞特異的調節エレメント（例えば、組織特異的プロモーター）であって、ポジティブ組織特異的調節エレメントが標的細胞または組織における外因性薬剤の発現を、ポジティブ組織特異的調節エレメントを欠如する異なるレトロウイルスベクターと比べて増加させる、ポジティブ標的細胞特異的調節エレメント、および
（ｉｉ）外因性薬剤をコードする核酸と操作可能に連結されたネガティブ標的細胞特異的調節エレメント（例えば、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列）であって、ネガティブ組織特異的調節エレメントが非標的細胞または組織における外因性薬剤の発現を、ネガティブ組織特異的調節エレメントを欠如する以外は同様なレトロウイルスと比べて減少させるネガティブ標的細胞特異的調節エレメント、を含むまたはコードする核酸と、を含む、フソソーム。
【００１２】
５．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
ｉ）フソソームが、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い割合で融合し、
ｉｉ）フソソームが、別のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い割合で融合し、
ｉｉｉ）フソソームが標的細胞と、フソソームにおける薬剤が２４、４８、または７２時間後に標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に送達されるような割合で融合し、
ｉｖ）フソソームが核酸を、非標的細胞よりも標的細胞に、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い割合で送達し、
ｖ）フソソームが核酸を標的細胞に、別のフソソームよりも、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い割合で送達し、あるいは
ｖｉ）核酸を標的細胞に、フソソームにおける薬剤が２４、４８、または７２時間後に標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に送達されるような割合で送達する、のうちの１つであるフソソーム。
【００１３】
６．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームがレトロウイルスベクターであり、脂質二重層がエンベロープ、例えば、ウイルスエンベロープによって構成され、そして核酸がレトロウイルス核酸である、のうちの１つ以上（例えば、２つまたは３つすべて）が適用される、フソソーム。
【００１４】
７．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、核酸が、５’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能的Ｕ３ドメインを欠如する）、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）、ペイロード遺伝子、例えば外因性薬剤をコードする核酸と操作可能に連結された中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）プロモーター、ペイロード遺伝子、例えば外因性薬剤をコードする核酸（任意に、オープンリーディングフレームの前にイントロンを含む）、ポリＡテール配列、ＷＰＲＥ、および３’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能的Ｕ３を欠如している）、のうちの１つ以上（例えば、すべて）を含む、フソソーム。
【００１５】
８．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、ポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素、例えば、ｐｏｌまたはその一部分）、インテグラーゼ（例えば、ｐｏｌまたはその一部、例えば、機能的または非機能的変異体）、マトリックスタンパク質（例えば、ｇａｇまたはその一部分）、カプシドタンパク質（例えば、ｇａｇまたはその一部分）、ヌクレオカプシドタンパク質（例えば、ｇａｇまたはその一部分）、およびプロテアーゼ（例えば、ｐｒｏ）、のうちの１つ以上（例えば、すべて）を含む、フソソーム。
【００１６】
９．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームが対象に投与される場合、
ｉ）対象において検出可能で存在する外因性薬剤の１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満が非標的細胞にあり、
ｉｉ）外因性薬剤を検出可能で含む対象の細胞の少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が標的細胞（例えば、単一細胞型の細胞、例えば、Ｔ細胞）であり、
ｉｉｉ）外因性薬剤を検出可能で含む対象の細胞の１，０００，０００、５００，０００、２００，０００、１００，０００、５０，０００、２０，０００、または１０，０００個未満の細胞が非標的細胞であり、
ｉｖ）対象の全標的細胞における外因性薬剤の平均レベルが、対象の全非標的細胞における外因性薬剤の平均レベルよりも少なくとも１００倍、２００倍、５００倍、または１，０００倍高く、あるいは
ｖ）外因性薬剤が対象においていずれの非標的細胞でも検出可能ではない、のうちの１つ以上である、フソソーム。
【００１７】
１０．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、再標的化フソゲンが、ニパウイルスＦおよびＧタンパク質、麻疹ウイルスＦおよびＨタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦおよびＨタンパク質、パラミクソウイルスＦおよびＧタンパク質もしくはＦおよびＨタンパク質もしくはＦおよびＨＮタンパク質、ヘンドラウイルスＦおよびＧタンパク質、ヘニパウイルスＦおよびＧタンパク質、モルビリウイルスＦおよびＨタンパク質、レスピロウイルスＦおよびＨＮタンパク質、センダイウイルスＦおよびＨＮタンパク質、ルブラウイルスＦおよびＨＮタンパク質、またはアブラウイルスＦおよびＨＮタンパク質、またはそれらの誘導体、あるいはそれらの任意の組み合わせから選択される配列を含む、フソソーム。
【００１８】
１１．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソゲンが、野生型パラミクソウイルスフソゲン、例えば、表４または表５の配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する長さが少なくとも４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸のドメインを含み、任意に、野生型パラミクソウイルスフソゲンが配列番号１〜１３２のいずれかに示される配列を有する、フソソーム。
【００１９】
１２．実施形態１１のフソソームであって、パラミクソウイルスがニパウイルス、例えばヘニパウイルスである、フソソーム。
【００２０】
１３．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、ポジティブ標的細胞特異的調節エレメントが、組織特異的プロモーター、組織特異的エンハンサー、組織特異的スプライス部位、ＲＮＡもしくはタンパク質の半減期を延長する組織特異的部位、組織特異的ｍＲＮＡ核外輸送促進部位、組織特異的翻訳増強部位、または組織特異的翻訳後改変部位を含む、フソソーム。
【００２１】
１４．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、非標的細胞特異的調節エレメントまたはネガティブＴＣＳＲＥが、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、組織特異的プロテアーゼ認識部位、組織特異的ユビキチンリガーゼ部位、組織特異的転写抑制部位、または組織特異的エピジェネティック抑制部位を含む、フソソーム。
【００２２】
１５．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、非標的細胞特異的調節エレメントまたはネガティブＴＣＳＲＥが、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列を含む、フソソーム。
【００２３】
１６．実施形態１５のフソソームであって、非標的細胞特異的調節エレメントまたはネガティブＴＣＳＲＥが、転写化領域（例えば、外因性薬剤をコードする転写化領域）内に配置またはコードされ、例えば、転写化領域によって生成されるＲＮＡがＵＴＲまたはコード領域内にｍｉＲＮＡ認識配列を含む、フソソーム。
【００２４】
１７．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、標的細胞が癌細胞であり、非標的細胞が非癌性細胞である、フソソーム。
【００２５】
１８．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、核酸、例えばレトロウイルス核酸が、ポジティブＴＣＳＲＥおよび／またはＮＴＣＳＲＥもしくはネガティブＴＣＳＲＥをコードする、フソソーム。
【００２６】
１９．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、レトロウイルス核酸が、ポジティブＴＣＳＲＥおよび／またはＮＴＣＳＲＥもしくはネガティブＴＣＳＲＥの相補体を含む、フソソーム。
【００２７】
２０．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、非標的細胞、例えば、抗原提示細胞、ＭＨＣクラスＩＩ＋細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞、異型抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、骨髄性樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、脾細胞、Ｂ細胞、肝細胞、内皮細胞、または非癌性細胞に、核酸を送達しない、フソソーム、
【００２８】
２１．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、非標的細胞型（例えば、抗原提示細胞、ＭＨＣクラスＩＩ＋細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞、異型抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、骨髄性樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、脾細胞、Ｂ細胞、肝細胞、内皮細胞、または非癌性細胞）の１０％、５％、２．５％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％、０．００００１％、または０．０００００１％未満が、定量的ＰＣＲを使用して、例えば、実施例１のアッセイを使用して、核酸、例えば、レトロウイルス核酸を含む、フソソーム。
【００２９】
２２．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、標的細胞が、ホスト細胞ゲノムあたり核酸、例えば、レトロウイルス核酸またはその一部の０．００００１〜１０、０．０００１−１０、０．００１〜１０、０．０１〜１０、０．１〜１０、０．５〜５、１〜４、１〜３、または１〜２コピーを含み、例えば、核酸のコピー数がインビボでの投与後に評価される、フソソーム。
【００３０】
２３．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
非標的細胞（例えば、抗原提示細胞、ＭＨＣクラスＩＩ＋細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞、異型抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、骨髄性樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、脾細胞、Ｂ細胞、肝細胞、内皮細胞、または非癌性細胞）の１０％、５％、２．５％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％未満が外因性薬剤を含み、または
外因性薬剤（例えば、タンパク質）が、非標的細胞に、例えば、抗原提示細胞、ＭＨＣクラスＩＩ＋細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞、異型抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、骨髄性樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、脾細胞、Ｂ細胞、肝細胞、内皮細胞、もしくは非癌性細胞に、検出可能で存在しない、フソソーム。
【００３１】
２４．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、核酸、例えば、レトロウイルス核酸を、標的細胞、例えば、Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、肝細胞、造血幹細胞、ＣＤ３４＋造血幹細胞、ＣＤ１０５＋造血幹細胞、ＣＤ１１７＋造血幹細胞、ＣＤ１０５＋内皮細胞、Ｂ細胞、ＣＤ２０＋Ｂ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、癌細胞、ＣＤ１３３＋癌細胞、ＥｐＣＡＭ＋癌細胞、ＣＤ１９＋キャンセル細胞、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ＋癌細胞、ＧｌｕＡ２＋ニューロン、ＧｌｕＡ４＋ニューロン、ＮＫＧ２Ｄ＋ナチュラルキラー細胞、ＳＬＣ１Ａ３＋星状細胞、ＳＬＣ７Ａ１０＋脂肪細胞、またはＣＤ３０＋肺上皮細胞に送達する、フソソーム。
【００３２】
２５．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、標的細胞（例えば、Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、肝細胞、造血幹細胞、ＣＤ３４＋造血幹細胞、ＣＤ１０５＋造血幹細胞、ＣＤ１１７＋造血幹細胞、ＣＤ１０５＋内皮細胞、Ｂ細胞、ＣＤ２０＋Ｂ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、癌細胞、ＣＤ１３３＋癌細胞、ＥｐＣＡＭ＋癌細胞、ＣＤ１９＋キャンセル細胞、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ＋癌細胞、ＧｌｕＡ２＋ニューロン、ＧｌｕＡ４＋ニューロン、ＮＫＧ２Ｄ＋ナチュラルキラー細胞、ＳＬＣ１Ａ３＋星状細胞、ＳＬＣ７Ａ１０＋脂肪細胞、またはＣＤ３０＋肺上皮細胞のうちの１つ以上）の少なくとも０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、例えば、定量的ＰＣＲを使用して、例えば、実施例３のアッセイを使用して、核酸を含む、フソソーム。
【００３３】
２６．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、標的細胞（例えば、Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、肝細胞、造血幹細胞、ＣＤ３４＋造血幹細胞、ＣＤ１０５＋造血幹細胞、ＣＤ１１７＋造血幹細胞、ＣＤ１０５＋内皮細胞、Ｂ細胞、ＣＤ２０＋Ｂ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、癌細胞、ＣＤ１３３＋癌細胞、ＥｐＣＡＭ＋癌細胞、ＣＤ１９＋キャンセル細胞、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ＋癌細胞、ＧｌｕＡ２＋ニューロン、ＧｌｕＡ４＋ニューロン、ＮＫＧ２Ｄ＋ナチュラルキラー細胞、ＳＬＣ１Ａ３＋星状細胞、ＳＬＣ７Ａ１０＋脂肪細胞、またはＣＤ３０＋肺上皮細胞）の少なくとも０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が外因性薬剤を含む、フソソーム。
【００３４】
２７．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、投与時に、上記核酸を含む非標的細胞に対する上記核酸を含む標的細胞の比が、例えば、定量的ＰＣＲアッセイによって、例えば、実施例１および実施例３のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、フソソーム。
【００３５】
２８．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、非標的細胞における上記核酸またはその一部の平均コピー数に対する標的細胞における上記核酸またはその一部の平均コピー数の比が、例えば、定量的ＰＣＲアッセイによって、例えば、実施例１および実施例３のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、フソソーム。
【００３６】
２９．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、非標的細胞における上記核酸またはその一部のコピー数の中央値に対する標的細胞における上記核酸またはその一部分のコピー数の中央値の比が、例えば、定量的ＰＣＲアッセイによって、例えば、実施例１および実施例３のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、フソソーム。
【００３７】
３０．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、外因性ＲＮＡ剤を含む非標的細胞に対する外因性ＲＮＡ剤を含む標的細胞の比が、例えば、逆転写定量的ＰＣＲアッセイによって、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、フソソーム。
【００３８】
３１．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、非標的細胞の外因性ＲＮＡ剤の平均レベルに対する標的細胞の外因性ＲＮＡ剤の平均レベルの比が、例えば、逆転写定量的ＰＣＲアッセイによって、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、フソソーム。
【００３９】
３２．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、非標的細胞の外因性ＲＮＡ剤レベルの中央値に対する標的細胞の外因性ＲＮＡ剤レベルの中央値の比が、例えば、逆転写定量的ＰＣＲアッセイによって、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、フソソーム。
【００４０】
３３．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、外因性タンパク質剤を含む非標的細胞に対する外因性タンパク質剤を含む標的細胞の比が、例えば、ＦＡＣＳアッセイによって、例えば、実施例２および／または実施例４のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、フソソーム。
【００４１】
３４．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、非標的細胞の外因性タンパク質剤の平均レベルに対する標的細胞の外因性タンパク質剤の平均レベルの比が、例えば、ＦＡＣＳアッセイによって、例えば、実施例２および／または実施例４のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、フソソーム。
【００４２】
３５．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、非標的細胞の外因性タンパク質剤レベルの中央値に対する標的細胞の外因性タンパク質剤レベルの中央値の比が、例えば、ＦＡＣＳアッセイによって、例えば、実施例２および／または実施例４のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、フソソーム。
【００４３】
３６．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
ｉ）脂質二重層、例えば、エンベロープに、外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、および
ｉｉ）不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在する免疫刺激タンパク質、のうちの一方または両方を含むフソソーム。
【００４４】
３７．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
ｉ）脂質二重層、例えば、エンベロープに、第１の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、および脂質二重層、例えば、エンベロープに、第２の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、
ｉｉ）脂質二重層、例えばエンベロープに、第１の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、および不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在する第２の免疫刺激タンパク質、あるいは
ｉｉｉ）不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在する第１の免疫刺激タンパク質、および不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在する第２の免疫刺激タンパク質、のうちの１つ以上を含むフソソーム。
【００４５】
３８．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、核酸が１つ以上のインスレーターエレメントを含む、フソソーム。
【００４６】
３９．フソソームであって、
ａ）フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）を含む脂質二重層と、
ｂ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）または外因性薬剤をコードする核酸（例えば、レトロウイルス核酸）と、
ｃ）
ｉ）脂質二重層、例えば、エンベロープに、第１の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、および脂質二重層、例えば、エンベロープに、第２の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、
ｉｉ）脂質二重層、例えばエンベロープに、第１の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、および不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在する第２の免疫刺激タンパク質、あるいは
ｉｉｉ）不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在する第１の免疫刺激タンパク質、および不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在する第２の免疫刺激タンパク質、のうちの１つ以上と、を含み、
対象（例えば、ヒト対象またはマウス）に投与される場合、
ｉ）フソソームが、例えば、ＦＡＣＳ抗体検出アッセイ、例えば、実施例１３または実施例１４のアッセイによって、検出可能な抗体反応（例えば、単回投与または複数回投与後）を生じず、またはフソソームに対する抗体がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在し、
ｉｉ）フソソームが、例えば、ＰＢＭＣ溶解アッセイ（例えば、実施例５のアッセイ）によって、ＮＫ細胞溶解アッセイ（例えば、実施例６のアッセイ）によって、ＣＤ８キラーＴ細胞溶解アッセイ（例えば、実施例７のアッセイ）によって、マクロファージ食作用アッセイ（例えば、実施例８のアッセイ）によって、検出可能な細胞性免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答、ＮＫ細胞応答、またはマクロファージ応答）を生じず、またはフソソームに対する細胞性免疫応答がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在し、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、補体活性アッセイ（例えば、実施例９のアッセイ）によって、検出可能な自然免疫応答、例えば、補体活性化（例えば、単回投与または複数回投与後）を生じず、またはフソソームに対する自然免疫応答がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満高いレベルで存在し、
ｉｖ）フソソームの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２、０．１％、０．０５％、０．０２％、０．０１％、０．００５％、０．００２％、または０．００１％未満が、例えば、血清不活性化アッセイ、例えば、実施例１１または実施例１２のアッセイによって、血清によって不活性化され、
ｖ）フソソームから外因性薬剤を受容した標的細胞が、例えば、ＦＡＣＳ抗体検出アッセイ、例えば、実施例１５のアッセイによって、検出可能な抗体応答を生じず（例えば、単回投与または複数回投与後）、または標的細胞に対する抗体がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在し、あるいは
ｖｉ）フソソームから外因性薬剤を受容した標的細胞が、例えば、マクロファージ食作用アッセイ（例えば、実施例１６のアッセイ）によって、ＰＢＭＣ溶解アッセイ（例えば、実施例１７のアッセイ）によって、ＮＫ細胞溶解アッセイ（例えば、実施例１８のアッセイ）によって、またはＣＤ８キラーＴ細胞溶解アッセイ（例えば、実施例１９のアッセイ）によって、検出可能な細胞性免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答、ＮＫ細胞応答、またはマクロファージ応答）を生じず、または標的細胞に対する細胞応答がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％高いレベルで存在する、のうちの１つ以上である、フソソーム。
【００４７】
４０．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームがレトロウイルスベクターであり、脂質二重層がエンベロープ、例えば、ウイルスエンベロープによって構成され、そして核酸がレトロウイルス核酸である、のうちの１つ以上（例えば、２つまたは３つすべて）が適用される、フソソーム。
【００４８】
４１．実施形態３９または４０のフソソームであって、バックグラウンドレベルが、粒子またはベクターの投与前の同一対象におけるその対応するレベルである、フソソーム。
【００４９】
４２．実施形態３９〜４１のいずれかのフソソームであって、免疫抑制タンパク質が補体調節タンパク質またはＣＤ４７である、フソソーム。
【００５０】
４３．実施形態３９〜４２のいずれかのフソソームであって、免疫刺激タンパク質がＭＨＣ（例えば、ＨＬＡ）タンパク質である、フソソーム。
【００５１】
４４．実施形態３９〜４３のいずれかのフソソームであって、第１の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質のうちの一方または両方がＣＤ４７以外であり、第２の免疫刺激タンパク質がＭＨＣ以外である、フソソーム。
【００５２】
４５．フソソームであって、
ａ）フソゲンを含む脂質二重層と、
ｂ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）をコードする核酸と、
ｃ）脂質二重層に外因性または過剰発現したＭＨＣ、例えば、ＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅ）、またはそれらの組み合わせと、を含む、フソソーム。
【００５３】
４６．フソソームであって、
ａ）フソゲンを含む脂質二重層であって、フソゲンが、野生型パラミクソウイルスフソゲン、例えば、表４または表５の配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する長さが少なくとも４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸のドメインを含み、任意に、野生型パラミクソウイルスフソゲンが配列番号１〜１３２のうちのいずれか１つに示される、脂質二重層と、
ｂ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）をコードする核酸と、
ｃ）エンベロープに外因性または過剰発現したＣＤ４７または補体調節タンパク質、あるいはそれらの組み合わせと、を含む、フソソーム。
【００５４】
４７．フソソームであって、
ａ）フソゲンを含む脂質二重層であって、フソゲンが、野生型パラミクソウイルスフソゲン、例えば、表４または表５の配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する長さが少なくとも４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸のドメインを含み、任意に、野生型パラミクソウイルスフソゲンが配列番号１〜１３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸の配列を有する、脂質二重層と、
ｂ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）をコードする核酸と、
ｃ）不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在するＭＨＣＩ（例、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃ）またはＭＨＣＩＩ（例、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはＨＬＡ−ＤＲ）と、を含む、フソソーム。
【００５５】
４８．フソソームであって、
ａ）フソゲンを含む脂質二重層であって、フソゲンが、野生型パラミクソウイルスフソゲン、例えば、表４または表５の配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する長さが少なくとも４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸のドメインを含み、任意に、野生型パラミクソウイルスフソゲンが配列番号１〜１３２のうちのいずれか１つに示される配列を有する、脂質二重層と、
ｂ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）をコードする核酸と、
ｃ）不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたフソソームと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在する外因性もしくは過剰発現した免疫抑制タンパク質または免疫刺激タンパク質のうちの一方または両方と、を含む、フソソーム。
【００５６】
４９．実施形態４５〜４８のいずれかのフソソームであって、フソソームがレトロウイルスベクターであり、脂質二重層がエンベロープ、例えば、ウイルスエンベロープによって構成され、そして核酸がレトロウイルス核酸である、のうちの１つ以上（例えば、２つまたは３つすべて）が適用される、フソソーム。
【００５７】
５０．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームが対象への投与後、少なくとも０．５、１、２、３、４、６、１２、１８、２４、３６、または４８時間循環している、フソソーム。
【００５８】
５１．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に３０分循環している、フソソーム。
【００５９】
５２．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に１時間循環している、フソソーム。
【００６０】
５３．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に２時間循環している、フソソーム。
【００６１】
５４．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に４時間循環している、フソソーム。
【００６２】
５５．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に８時間循環している、フソソーム。
【００６３】
５６．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に１２時間循環している、フソソーム。
【００６４】
５７．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に１８時間循環している、フソソーム。
【００６５】
５８．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に２４時間循環している、フソソーム。
【００６６】
５９．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に３６時間循環している、フソソーム。
【００６７】
６０．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に４８時間循環している、フソソーム。
【００６８】
６１．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、適切な動物モデル、例えば、本明細書で記載される動物モデルへのフソソームの１回以上の投与後に、対照レトロウイルス、例えば、非改変である以外は当該フソソームと同様なフソソームと比べて、体液性応答における低下によって測定されたとき、免疫原性に低下を有する、フソソーム。
【００６９】
６２．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、体液性応答における低下が、抗細胞抗体力価、例えば、抗レトロウイルス抗体力価によって、例えば、ＥＬＩＳＡによって、血清試料において測定される、フソソーム。
【００７０】
６３．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、レトロウイルス組成物が投与された動物からの血清試料が、非改変細胞を投与された対象からの血清試料と比べて、抗フソソーム抗体力価の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の低下を有する、フソソーム。
【００７１】
６４．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームが投与された対象からの血清試料が、ベースライン、例えば、フソソーム投与前の同一対象からの血清試料を参考にするベースラインから、増加した抗細胞抗体力価、例えば、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、または４０％の増加を有する、フソソーム。
【００７２】
６５．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
フソソームを投与されるべき対象が、フソソームと反応性である既存の抗体（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）を有し、もしくは有することが知られ、または試験され、
フソソームを投与されるべき対象が、フソソームと反応性である既存の抗体の検出可能なレベルを有さず、
フソソームを受けた対象が、フソソームと反応性である抗体（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）を有し、もしくは有することが知られ、または試験され、
フソソームを受ける対象（例えば、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回以上）が、フソソームと反応性である抗体の検出可能なレベルの抗体を有さず、あるいは
抗体のレベルが、２つの時点である、フソソームの最初の投与前である第１の時点と、フソソームの１回以上の投与後である第２の時点との間で、１％、２％、５％、１０％、２０％、または５０％を超えて上昇しない、フソソーム。
【００７３】
６６．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームが、例えば、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＥｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から、実施例５、６、または７の方法によって生成されるレトロウイルスベクターである、フソソーム。
【００７４】
６７．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームがＮＭＣ−ＨＬＡ−Ｇ細胞から生成されたレトロウイルスベクターであり、溶解、例えば、ＰＢＭＣ媒介溶解、ＮＫ細胞媒介溶解、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞媒介溶解の割合が、ＮＭＣまたはＮＭＣ空ベクターから生成されたレトロウイルスベクターと比べて、特定の時点で減少している、フソソーム。
【００７５】
６８．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、改変されたフソソームがマクロファージによる食作用を回避する、フソソーム。
【００７６】
６９．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームが、実施例８の方法によって、例えば、ＣＤ４７ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から生成される、フソソーム。
【００７７】
７０．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームがレトロウイルスベクターであり、マクロファージがＮＭＣ−ＣＤ４７に由来するレトロウイルスベクターとインキュベートされるとき、食作用指数がＮＭＣまたはＮＭＣ空ベクターに由来するものと比べて低下される、フソソーム。
【００７８】
７１．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、対照フソソーム、例えば、非改変である以外は当該フソソームと同様であるフソソームと比べて、マクロファージ食作用における低下、例えば、マクロファージ食作用における１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の低下を有し、マクロファージ食作用における低下がインビトロでの食作用指数、例えば、実施例８で説明されるようにアッセイすることによって決定される、フソソーム。
【００７９】
７２．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、複数のフソソームを含む組成物が、マクロファージ食作用のインビトロアッセイでマクロファージとインキュベートされたとき、例えば、実施例８のアッセイによって測定されたとき、０、１、１０、１００以上の食作用指数を有する、フソソーム。
【００８０】
７３．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、改変されており、改変されていないレトロウイルスベクターと比較して低下した補体活性を有するフソソーム。
【００８１】
７４．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、実施例９の方法によって、例えば、補体調節タンパク質、例えば、ＤＡＦをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から生成される、フソソーム。
【００８２】
７５．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームがレトロウイルスベクターであり、レトロウイルスベクターの用量は、２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在して、対照レトロウイルスベクター（例えば、ＨＥＫ２９３レトロウイルスベクター）が対応するマウス血清（例えば、ＨＥＫ２９３マウス血清）とインキュベートされたよりも、改変レトロウイルスベクター（例えば、ＨＥＫ２９３−ＤＡＦ）が対応するマウス血清（例えば、ＨＥＫ−２９３ＤＡＦマウス血清）とインキュベートされたもので大きい、フソソーム。
【００８３】
７６．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームがレトロウイルスベクターであり、レトロウイルスベクターの用量は、２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在して、未処置マウス血清とインキュベートされた対照レトロウイルスベクター（例えば、ＨＥＫ２９３レトロウイルスベクター）よりも、ナイーブマウス血清とインキュベートれた改変されたレトロウイルスベクター（例えば、ＨＥＫ２９３−ＤＡＦ）で大きい、フソソーム。
【００８４】
７７．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、実施例９のアッセイによって、投与後３０分の患者血清における補体媒介不活性化に耐性であるフソソーム。
【００８５】
７８．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が補体媒介性不活性化に耐性である、フソソーム。
【００８６】
７９．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、補体調節タンパク質が、崩壊促進因子（ＤＡＦ、ＣＤ５５）と結合するタンパク質、例えばＨ因子（ＦＨ）様タンパク質−１（ＦＨＬ−１）、例えばＣ４ｂ−結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、例えば補体受容体１（ＣＤ３５）、例えば膜補因子タンパク質（ＭＣＰ、ＣＤ４６）、例えばプロテクチン（ＣＤ５９）、例えば古典的および代替補体経路ＣＤ／Ｃ５変換酵素を阻害するタンパク質、例えばＭＡＣアセンブリを調節するタンパク質、のうちの１つ以上を含む、フソソーム。
【００８７】
８０．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、実施例１０の方法によって、例えば、ＭＨＣクラスＩを標的にするｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から生成され、例えば、ＮＭＣ−ｓｈＭＨＣクラスＩに由来するレトロウイルスベクターがＮＭＣおよびＮＭＣベクターコントロールと比べてＭＨＣクラスＩの低い発現を有する、フソソーム。
【００８８】
８１．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソーム（例えば、レトロウイルスベクター）における免疫原性の尺度が、血清不活性化、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１１で説明されるように測定される血清不活性化である、フソソーム。
【００８９】
８２．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントが、フソソームナイーブマウスからの血清および熱不活性化血清とインキュベートされているフソソーム試料の間で異ならない、フソソーム。
【００９０】
８３．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントが、フソソームナイーブマウスからの血清と共にインキュベートされているフソソーム試料と無血清コントロールインキュベーションとの間で異ならない、フソソーム。
【００９１】
８４．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントが、フソソームナイーブマウスからの血清と共にインキュベートされているフソソーム試料よりも、陽性コントロール血清と共にインキュベートされているフソソーム試料において低い、フソソーム。
【００９２】
８５．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、例えば、本明細書で説明される方法によって改変された、改変レトロウイルスベクターが、本改変レトロウイルスベクターの複数回（例えば１回超、例えば２回以上）の投与後に、低下した（非改変レトロウイルスベクターの投与と比較して低下した）血清不活性化を有する、フソソーム。
【００９３】
８６．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、本明細書で説明されるフソソームが、複数回の投与後に血清によって不活性化されない、フソソーム。
【００９４】
８７．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームにおける免疫原性の尺度が、血清不活性化、例えば、複数回投与後に、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１２で説明されるように測定された、例えば複数回投与後の血清不活性化である、フソソーム。
【００９５】
８８．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントが、改変された（例えば、ＨＥＫ２９３−ＨＬＡ−Ｇ）フソソームで処理されたマウスからの血清および熱不活性化血清と共にインキュベートされているフソソーム試料の間で異ならない、フソソーム。
【００９６】
８９．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントが、改変された（例えば、ＨＥＫ２９３−ＨＬＡ−Ｇ）レトロウイルスベクターで１、２、３、５、または１０回処理されたマウスからの血清と共にインキュベートされているフソソーム試料間で異ならない、フソソーム。
【００９７】
９０．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントが、ビヒクルで処理されたマウスおよび改変された（例えば、ＨＥＫ２９３−ＨＬＡ−Ｇ）フソソームで処理されたマウスからの血清とインキュベートされているフソソーム試料間で異ならない、フソソーム。
【００９８】
９１．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントが、改変された（例えば、ＨＥＫ２９３−ＨＬＡ−Ｇ）フソソームよりも対照細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）に由来するフソソームにおいて少ない、フソソーム。
【００９９】
９２．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームにおける免疫原性の尺度が抗体応答である、フソソーム。
【０１００】
９３．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、本明細書で説明されるフソソームを受ける対象が、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１３で説明されるように測定されて、フソソームと結合して認識する既存の抗体を有する、フソソーム。
【０１０１】
９４．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームナイーブマウスからの血清が、陰性コントロール、例えば、免疫原性が生じていることを示すＩｇＭおよびＩｇＧが、例えば、枯渇したマウスからの血清である陰性コントロールよりも多いシグナル（例えば、蛍光）を示す、フソソーム。
【０１０２】
９５．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソームナイーブマウスからの血清が、例えば、免疫原性が検出可能で生じなかったことを示す陰性コントロールと比べて同様なシグナル（例えば、蛍光）を示す、フソソーム。
【０１０３】
９６．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、改変された、例えば、本明細書で説明される方法によって改変されたレトロウイルスベクターを含み、改変レトロウイルスの複数回（例えば、１回超、例えば２回以上）の投与後に、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１４で説明されるように測定されて、体液性応答の低下（例えば、非改変レトロウイルスの投与と比較して低下した）を有する、フソソーム。
【０１０４】
９７．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソソーム、例えばレトロウイルスベクターが、実施例５、６、７、または１４の方法によって、例えば、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＥｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から生成される、フソソーム。
【０１０５】
９８．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、体液性応答が、抗フソソーム抗体（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、および／またはＩｇＧ２抗体）のレベルの値を決定することによって評価される、フソソーム。
【０１０６】
９９．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、改変された（例えば、ＮＭＣ−ＨＬＡ−Ｇ）フソソーム、例えば、レトロウイルスベクターが、コントロール、例えば、ＮＭＣレトロウイルスベクターまたはＮＭＣ空レトロウイルスベクターと比べて、注入後に抗ウイルスＩｇＭまたはＩｇＧ１／２抗体力価（例えば、ＦＡＣＳの蛍光強度によって測定されたとき）を減少させた、フソソーム。
【０１０７】
１００．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、レシピエント細胞が抗体応答によって標的化されない、または抗体応答が、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１５で説明されるように測定されて、対照レベル未満である、フソソーム。
【０１０８】
１０１．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、シグナル（例えば、平均蛍光強度）が、レトロウイルスベクターで処理されたマウスおよびＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞について同様である、フソソーム。
【０１０９】
１０２．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、レシピエント細胞の免疫原性の尺度がマクロファージ応答である、フソソーム。
【０１１０】
１０３．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、レシピエント細胞がマクロファージによって標的化されない、または対照レベルより低く標的化される、フソソーム。
【０１１１】
１０４．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１６で説明されるように測定される食作用指数が、フソソームで処理されたマウスおよびＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞について同様である、フソソーム。
【０１１２】
１０５．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、レシピエント細胞の免疫原性の尺度がＰＢＭＣ応答である、フソソーム。
【０１１３】
１０６．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、レシピエント細胞がＰＢＭＣ応答を誘発しない、フソソーム。
【０１１４】
１０７．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞のパーセントが、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１７で説明されるように測定されたとき、フソソームで処理されたマウスおよびＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞において同様である、フソソーム。
【０１１５】
１０８．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、レシピエント細胞の免疫原性の尺度がナチュラルキラー細胞応答である、フソソーム。
【０１１６】
１０９．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、レシピエント細胞がナチュラルキラー細胞応答を誘発せず、または、より低いナチュラルキラー細胞応答を、例えば、対照値より低く誘発する、フソソーム。
【０１１７】
１１０．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞のパーセントが、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１８で説明されるように測定されたとき、フソソームで処理されたマウスおよびＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞において同様である、フソソーム。
【０１１８】
１１１．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、レシピエント細胞の免疫原性の尺度がＣＤ８＋Ｔ細胞応答である、フソソーム。
【０１１９】
１１２．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、レシピエント細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発せず、または、より低いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、例えば、対照値より低く誘発する、フソソーム。
【０１２０】
１１３．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞のパーセントが、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１９で説明されるように測定されたとき、フソソームで処理されたマウスおよびＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞において同様である、フソソーム。
【０１２１】
１１４．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、フソゲンが再標的化されたフソゲンである、フソソーム。
【０１２２】
１１５．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、（ｉ）外因性薬剤をコードする核酸と操作可能に連結されたポジティブ標的細胞特異的調節エレメント、または（ｉｉ）外因性薬剤をコードする核酸と操作可能に連結された非標的細胞特異的調節エレメントまたはネガティブＴＣＳＲＥ、のうちの一方または両方をコードするレトロウイルス核酸を含む、フソソーム。
【０１２３】
１１６．フソソームであって、
ａ）フソゲンを含む脂質二重層であって、フソゲンが、野生型パラミクソウイルスフソゲンと、例えば、表４または表５の配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する長さが少なくとも４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸のドメインを含み、任意に、野生型パラミクソウイルスが配列番号１〜１３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸の配列を有する、脂質二重層と、
ｂ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）をコードする核酸であって、レトロウイルス核酸が１つ以上のインスレーターエレメントを含む核酸と、を含むフソソーム。
【０１２４】
１１７．実施形態１１６のフソソームであって、フソソームがレトロウイルスベクターであり、脂質二重層がエンベロープ、例えば、ウイルスエンベロープ、例えば、偽型エンベロープによって構成され、そして核酸がレトロウイルス核酸である、のうちの１つ以上（例えば、２つまたは３つすべて）が適用される、フソソーム。
【０１２５】
１１８．実施形態１１６または１１７のフソソームであって、核酸が２つのインスレーターエレメント、例えば、外因性薬剤をコードする領域の上流である第１のインスレーターエレメント、および外因性薬剤をコードする領域の下流である第２のインスレーターエレメントを含み、例えば、第１のインスレーターエレメントおよび第２のインスレーターエレメントが、同一または異なる配列を含む、フソソーム。
【０１２６】
１１９．実施形態１１６〜１１８のいずれかのフソソームであって、対象に第１の時点でフソソームを投与した後に単離された細胞の試料における外因性薬剤レベルの中央値における変動が、対象に後の第２の時点でフソソームを投与した後に単離された細胞の試料における外因性薬剤レベルの中央値の少なくとも、約１０，０００％、５，０００％、２，０００％、１，０００％、５００％、２００％、１００％、５０％、２０％、１０％、または５％、あるいはそれら未満である、フソソーム。
【０１２７】
１２０．実施形態１１９のフソソームであって、細胞あたりの発現レベルの中央値が、少なくとも１．０のレトロウイルスゲノムコピー数を有する細胞においてのみ評価される、フソソーム。
【０１２８】
１２１．実施形態１１６〜１２０のいずれかのフソソームであって、対象における標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が外因性薬剤を検出可能で含む、フソソーム。
【０１２９】
１２２．実施形態１１９〜１２１のいずれかのフソソームであって、ペイロード遺伝子発現レベルの中央値が、対象へのフソソームの投与後、７日、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、１０９５日で対象から単離された細胞にわたって評価される、フソソーム。
【０１３０】
１２３．実施形態１１６〜１２２のいずれかのフソソームであって、第１の時点で外因性薬剤を検出可能で含んだ対象における標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、後の第２の時点で依然として外因性薬剤を検出可能で含み、第１の時点が、対象へのフソソームの投与後、７日、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、１０９５日である、フソソーム。
【０１３１】
１２４．実施形態１２３のフソソームであって、第２の時点が、第１の時点後の７日、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、１０９５日である、フソソーム。
【０１３２】
１２５．実施形態１１６〜１２４のいずれかのフソソームであって、遺伝毒性ではなく、またはフソソームで処理されていない標的細胞と比較して標的細胞における腫瘍形成の割合を増加させない、フソソーム。
【０１３３】
１２６．実施形態１１６〜１２５のいずれかのフソソームであって、外因性薬剤レベルの中央値が、フソソームを受けた対象からの細胞の集団において評価される、フソソーム。
【０１３４】
１２７．実施形態１１６〜１２６のいずれかのフソソームであって、投与後の異なる日に対象から収集された（例えば、単離された）細胞の集団において評価された外因性薬剤レベルの中央値が、７日、１４日、２８日、または５６日で評価された細胞の集団における外因性薬剤レベルの中央値と、約１０，０００％、１０００％、１００％、または１０％未満、例えば、１０，０００％〜１０００％、１０００％〜１００％、または１００％〜１０％異なり、集団内の細胞が少なくとも１．０のベクターコピー数を有する、フソソーム。
【０１３５】
１２８．実施形態１１６〜１２７のいずれかのフソソームであって、外因性薬剤レベルが、フソソームを受けた対象からの細胞にわたって評価される、フソソーム。
【０１３６】
１２９．実施形態１１６〜１２８のいずれかのフソソームであって、外因性薬剤を含む細胞のパーセントが、フソソームの投与後、７日、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、１０９５日で対象から収集された（例えば、単離された）複数の細胞において評価される、フソソーム。
【０１３７】
１３０．実施形態１１６〜１２９のいずれかのフソソームであって、投与後２つの異なる日で単離された細胞で評価された外因性薬剤を含む細胞のパーセントにおける差が、１％、５％、１０％、２０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、７５０％、１０００％、１５００％、または２０００％未満である、フソソーム。
【０１３８】
１３１．実施形態１１６〜１３０のいずれかのフソソームであって、外因性薬剤について陽性である標的細胞のパーセントが、７日、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で収集された細胞にわたって同様である、フソソーム。
【０１３９】
１３２．実施形態１１６〜１３１のいずれかのフソソームであって、
７日と少なくとも同じ数の標的細胞が、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で外因性薬剤について陽性であり、
１４日と少なくとも同じ数の標的細胞が、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で外因性薬剤について陽性であり、
２８日と少なくとも同じ数の標的細胞が、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で外因性薬剤について陽性であり、
５６日と少なくとも同じ数の標的細胞が、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で外因性薬剤について陽性であり、
１１２日と少なくとも同じ数の標的細胞が、３６５日、７３０日、または１０９５日で外因性薬剤について陽性であり、
３６５日と少なくとも同じ数の標的細胞が、７３０日または１０９５日で外因性薬剤について陽性であり、
７３０日と少なくとも同じ数の標的細胞が、１０９５日で外因性薬剤について陽性である、フソソーム。
【０１４０】
１３３．実施形態１１６〜１３２のいずれかのフソソームであって、
外因性薬剤を含む標的細胞における外因性薬剤レベルの中央値が、７日、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で収集された細胞において同様であり、
外因性薬剤を１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で含む標的細胞における外因性薬剤レベルの中央値が、７日と少なくとも同じ高さであり、
外因性薬剤を２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で含む標的細胞における外因性薬剤レベルの中央値が、１４日と少なくとも同じ高さであり、
外因性薬剤を５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で含む標的細胞の外因性薬剤レベルの中央値が、２８日と少なくとも同じ高さであり、
外因性薬剤を１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で含む標的細胞の外因性薬剤レベルの中央値が、５６日と少なくとも同じ高さであり、
外因性薬剤を３６５日、７３０日、または１０９５日で含む標的細胞の外因性薬剤レベルの中央値が、１１２日と少なくとも同じ高さであり、
外因性薬剤を７３０日または１０９５日で含む標的細胞の外因性薬剤レベルの中央値が、３６５日と少なくとも同じ高さであり、あるいは
外因性薬剤を１０９５日で含む標的細胞の外因性薬剤レベルの中央値が、７３０日と少なくとも同じ高さである、フソソーム。
【０１４１】
１３４．対象（例えば、ヒト対象）に外因性薬剤を送達する方法であって、対象に上記実施形態のいずれかのフソソームを投与すること、それによって外因性薬剤を対象に送達することを含む、方法。
【０１４２】
１３５．対象（例えば、ヒト対象）、標的組織、または標的細胞における機能を調節する方法であって、対象、標的組織、または標的細胞に上記実施形態のいずれかのフソソームに接触させる、例えば、投与することを含む、方法。
【０１４３】
１３６．実施形態１３５の方法であって、標的組織または標的細胞が対象に存在する、方法。
【０１４４】
１３７．対象（例えば、ヒト対象）における障害、例えば、癌を治療または予防する方法であって、対象に上記実施形態のいずれかのフソソームを投与することを含む、方法。
【０１４５】
１３８．上記実施形態のいずれかのフソソームを作製する方法であって、
ａ）核酸およびフソゲン（例えば、再標的化フソゲン）を含む供給源細胞を用意することと、
ｂ）フソソームの生成を可能にする条件下で供給源細胞を培養することと、
ｃ）供給源細胞からフソソームを分離すること、豊富化すること、または精製することと、を含み、それによってフソソームを作製する、方法。
【０１４６】
１３９．フソソームを生成するための供給源細胞であって、
ａ）核酸と、
ｂ）核酸をパッケージングすることができる構造タンパク質であって、少なくとも１つの構造タンパク質がフソゲン受容体と結合するフソゲンを含む、構造タンパク質と、
ｃ）不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞と比べて、低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在するフソゲンと、を含む、供給源細胞。
【０１４７】
１４０．実施形態１３８の方法または実施形態１３９の供給源細胞であって、フソソームがレトロウイルスベクターであり、核酸がレトロウイルス核酸であり、そして構造的タンパク質がウイルス構造タンパク質である、のうちの１つ以上（例えば、２つまたは３つすべて）が適用される、方法または供給源細胞。
【０１４８】
１４１．実施形態１３９または１４０の供給源細胞であって、フソゲンがフソゲン受容体と結合すると、フソソームと標的細胞との融合を生じる、供給源細胞。
【０１４９】
１４２．実施形態１３９〜１４１のいずれかの供給源細胞であって、第２の同様な供給源細胞と結合する、例えば、供給源細胞のフソゲンが第２の供給源細胞でフソゲン受容体と結合する、供給源細胞。
【０１５０】
１４３．実施形態１３９〜１４２のいずれかの供給源細胞の、集団。
【０１５１】
１４４．実施形態１４３の供給源細胞の集団であって、集団における細胞の１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満が多核化されている、供給源細胞の集団。
【０１５２】
１４５．実施形態１３９〜１４４のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、本明細書で説明されるフソソームの製造の際に、他の供給源細胞との融合が低減している（例えば、融合しない）ように改変されている、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０１５３】
１４６．実施形態１３９〜１４５のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、フソゲン（例えば、再標的化フソゲン）が、供給源細胞によって含まれるタンパク質に、例えば、供給源細胞の表面上のタンパク質に、結合しない、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０１５４】
１４７．実施形態１３９〜１４６のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、フソゲン（例えば、再標的化フソゲン）が、供給源細胞によって含まれるタンパク質と結合するが、細胞と融合しない、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０１５５】
１４８．実施形態１３９〜１４７のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、フソゲンが供給源細胞との融合を誘発しない、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０１５６】
１４９．実施形態１３９〜１４８のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、供給源細胞が、フソゲンと結合するタンパク質（例えば、抗原）を発現しない、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０１５７】
１５０．実施形態１３９〜１４９のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、複数の供給源細胞が、フソゲンを発現するときに合胞体を形成せず、または集団における細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満が多核化される（例えば、２つ以上の核を含む）、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０１５８】
１５１．実施形態１３９〜１５０のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、複数の供給源細胞が、フソソームを生成するときに合胞体を形成せず、または集団における細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満が多核化される、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０１５９】
１５２．実施形態１３９〜１５１のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、集団における核の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満が合胞体にある、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０１６０】
１５３．実施形態１３９〜１５２のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、集団における核の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％が単核細胞内にある、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０１６１】
１５４．実施形態１３９〜１５３のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、多核化されている細胞のパーセンテージが、非改変である以外は同様である供給源細胞の集団と比べて低い、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低い、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０１６２】
１５５．実施形態１３９〜１５４のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、合胞体に存在する核のパーセントが、非改変である以外は同様である供給源細胞と比べて低い、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低い、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０１６３】
１５６．実施形態１３９〜１５５のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、多核化細胞（例えば、２つ以上の核を有する細胞）が、顕微鏡アッセイ、例えば、ＤＮＡ染色を使用した、例えば、実施例２０のアッセイによって検出される、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０１６４】
１５７．実施形態１３９〜１５６のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、改変された供給源細胞から得られる機能的フソソーム（例えば、ウイルス粒子）が、例えば、実施例２０のアッセイを使用して、非改変である以外は同様である供給源細胞から得られるフソソームの数よりも、少なくとも１０％、２０％、４０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、５倍、または１０倍多い、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０１６５】
１５８．フソソームであって、フソゲン受容体を欠如する、または非改変である以外は同様な供給源細胞に由来する非改変フソソームと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在するフソゲン受容体を含む、フソソーム。
【０１６６】
１５９．フソソームを作製する方法であって、
ａ）フソゲン（例えば、再標的化フソゲン）を含む供給源細胞であって、供給源細胞がフソゲン受容体を欠如する、または非改変である以外は同様な供給源細胞と比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在するフソゲン受容体を含む、供給源細胞を用意することと、
ｂ）フソソームの生成を可能にする条件下で供給源細胞を培養することと、
ｃ）供給源細胞からフソソームを分離すること、豊富化すること、または精製することと、を含み、それによりフソソームを作製する、方法。
【０１６７】
１６０．実施形態１５９の方法であって、供給源細胞を用意することが、供給源細胞またはその前駆体におけるフソゲン受容体をノックダウンまたはノックアウトすることを含む、方法。
【０１６８】
１６１．実施形態１５８のフソソーム、または実施形態１５９もしくは１６０の方法であって、フソソームがレトロウイルスベクターまたはレトロウイルス様粒子である、フソソームまたは方法。
【０１６９】
１６２．レトロウイルスベクター（例えば、ヒト対象におけるインビボでの使用に好適な）であって、
ａ）再標的化フソゲンを含むエンベロープと、
ｂ）
（ｉ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）をコードする核酸と操作可能に連結されたポジティブ標的細胞特異的調節エレメント（例えば、組織特異的プロモーター）であって、ポジティブ組織特異的調節エレメントが標的細胞または組織における外因性薬剤の発現を、ポジティブ組織特異的調節エレメントを欠如する異なるレトロウイルスベクターと比べて増加させるポジティブ標的細胞特異的調節エレメント、あるいは
（ｉｉ）外因性薬剤をコードする核酸と操作可能に連結されたネガティブ標的細胞特異的調節エレメント（例えば、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列）であって、ネガティブ組織特異的調節エレメントが非標的細胞または組織における外因性薬剤の発現を、ネガティブ組織特異的調節エレメントを欠如する以外は同様なレトロウイルスと比べて減少させるネガティブ標的細胞特異的調節エレメント、を含むまたはコードするレトロウイルス核酸と、を含む、レトロウイルスベクター。
【０１７０】
１６３．レトロウイルスベクター（例えば、ヒト対象におけるインビボでの使用に好適な）であって、
ａ）フソゲン（例えば、再標的化フソゲン）を含むエンベロープと、
ｂ）
（ｉ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）をコードする核酸と操作可能に連結されたポジティブ標的細胞特異的調節エレメント（例えば、組織特異的プロモーター）であって、ポジティブ組織特異的調節エレメントが標的細胞または組織における外因性薬剤の発現を、ポジティブ組織特異的調節エレメントを欠如する異なるレトロウイルスベクターと比べて増加させる、ポジティブ標的細胞特異的調節エレメント、および
（ｉｉ）外因性薬剤をコードする核酸と操作可能に連結されたネガティブ標的細胞特異的調節エレメント（例えば、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列）であって、ネガティブ組織特異的調節エレメントが非標的細胞または組織における外因性薬剤の発現を、ネガティブ組織特異的調節エレメントを欠如する以外は同様なレトロウイルスと比べて減少させる、ネガティブ標的細胞特異的調節エレメント、を含むまたはコードするレトロウイルス核酸と、を含む、レトロウイルスベクター。
【０１７１】
１６４．上記実施形態のどちらかのレトロウイルスベクターであって、対象に投与される場合、
ｉ）対象において検出可能で存在する外因性薬剤の１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満が非標的細胞にあり、
ｉｉ）外因性薬剤を検出可能で含む対象の細胞の少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が標的細胞（例えば、単一細胞型の細胞、例えば、Ｔ細胞）であり、
ｉｉｉ）外因性薬剤を検出可能で含む対象の細胞の１，０００，０００，５００，０００，２００，０００、１００，０００、５０，０００、２０，０００、または１０，０００個未満の細胞が非標的細胞であり、
ｉｖ）対象の全標的細胞における外因性薬剤の平均レベルが、対象の全非標的細胞における外因性薬剤の平均レベルよりも少なくとも１００倍、２００倍、５００倍、または１，０００倍高く、あるいは
ｖ）外因性薬剤が対象におけるいずれの非標的細胞でも検出可能ではない、のうちの１つ以上である、レトロウイルスベクター。
【０１７２】
１６５．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、再標的化フソゲンが、ニパウイルスＦおよびＧタンパク質、麻疹ウイルスＦおよびＨタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦおよびＨタンパク質、パラミクソウイルスＦおよびＧタンパク質もしくはＦおよびＨタンパク質もしくはＦおよびＨＮタンパク質、ヘンドラウイルスＦおよびＧタンパク質、ヘニパウイルスＦおよびＧタンパク質、モルビリウイルスＦおよびＨタンパク質、レスピロウイルスＦおよびＨＮタンパク質、センダイウイルスＦおよびＨＮタンパク質、ルブラウイルスＦおよびＨＮタンパク質、またはアブラウイルスＦおよびＨＮタンパク質、またはそれらの誘導体、あるいはそれらの任意の組み合わせから選択される配列を含む、レトロウイルスベクター。
【０１７３】
１６６．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、フソゲンが、野生型パラミクソウイルスフソゲン、例えば、表４または表５の配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する長さが少なくとも４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸のドメインを含み、任意に、野生型パラミクソウイルスフソゲンが配列番号１〜１３２のうちのいずれかに示されるアミノ酸の配列を有する、レトロウイルスベクター。
【０１７４】
１６７．実施形態１６６のレトロウイルスベクターであって、パラミクソウイルスがニパウイルス、例えばヘニパウイルスである、レトロウイルスベクター。
【０１７５】
１６８．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、ポジティブ標的細胞特異的調節エレメントが、組織特異的プロモーター、組織特異的エンハンサー、組織特異的スプライス部位、ＲＮＡもしくはタンパク質の半減期を延長する組織特異的部位、組織特異的ｍＲＮＡ核外輸送促進部位、組織特異的翻訳増強部位、または組織特異的翻訳後改変部位を含む、レトロウイルスベクター。
【０１７６】
１６９．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、ネガティブ標的細胞特異的調節エレメントが、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、組織特異的プロテアーゼ認識部位、組織特異的ユビキチンリガーゼ部位、組織特異的転写抑制部位、または組織特異的エピジェネティック抑制部位を含む、レトロウイルスベクター。
【０１７７】
１７０．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、ネガティブ標的細胞特異的調節エレメントが組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列を含む、レトロウイルスベクター。
【０１７８】
１７１．実施形態１７０のレトロウイルスベクターであって、ネガティブ標的細胞特異的調節エレメントが、転写化領域（例えば、外因性薬剤をコードする転写化領域）内に配置またはコードされ、例えば、それにより、転写化領域によって生成されるＲＮＡが、ＵＴＲまたはコード領域内にｍｉＲＮＡ認識配列を含む、レトロウイルスベクター。
【０１７９】
１７２．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、標的細胞が癌細胞であり、非標的細胞が非癌性細胞である、レトロウイルスベクター。
【０１８０】
１７３．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、レトロウイルス核酸がポジティブＴＣＳＲＥおよび／またはネガティブＴＣＳＲＥをコードする、レトロウイルスベクター。
【０１８１】
１７４．実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、レトロウイルス核酸がポジティブＴＣＳＲＥおよび／またはネガティブＴＣＳＲＥの相補体を含む、レトロウイルスベクター。
【０１８２】
１７５．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、非標的細胞、例えば、抗原提示細胞、ＭＨＣクラスＩＩ＋細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞、異型抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、骨髄性樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤＩｌｅ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、脾細胞、Ｂ細胞、肝細胞、内皮細胞、または非癌性細胞に、核酸を送達しない、レトロウイルスベクター。
【０１８３】
１７６．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、非標的細胞型（例えば、抗原提示細胞、ＭＨＣクラスＩＩ＋細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞、異型抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、骨髄性樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤＩｌｅ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、脾細胞、Ｂ細胞、肝細胞、内皮細胞、または非癌性細胞）の１０％、５％、２．５％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％、０．００００１％、または０．０００００１％未満が、定量的ＰＣＲを使用して、例えば、実施例１のアッセイを使用して、レトロウイルス核酸を含む、レトロウイルスベクター。
【０１８４】
１７７．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、標的細胞が、ホスト細胞ゲノムあたりレトロウイルス核酸またはその一部の０．００００１〜１０、０．０００１−１０、０．００１〜１０、０．０１〜１０、０．１〜１０、０．５〜５、１〜４、１〜３、または１〜２コピーを含み、例えば、レトロウイルス核酸のコピー数がインビボで投与後に評価される、レトロウイルスベクター。
【０１８５】
１７８．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、非標的細胞（例えば、抗原提示細胞、ＭＨＣクラスＩＩ＋細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞、異型抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、骨髄樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、脾細胞、Ｂ細胞、肝細胞、内皮細胞、または非癌性細胞）の１０％、５％、２．５％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％未満が外因性薬剤を含み、あるいは外因性薬剤（例えば、タンパク質）が非標的細胞、例えば、抗原提示細胞、ＭＨＣクラスＩＩ＋細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞、異型抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、骨髄性樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、脾細胞、Ｂ細胞、肝細胞、内皮細胞、または非癌性細胞に検出可能で存在しない、レトロウイルスベクター。
【０１８６】
１７９．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスベクターがレトロウイルス核酸を標的細胞、例えば、Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤＳ＋Ｔ細胞、肝細胞、造血幹細胞、ＣＤ３４＋造血幹細胞、ＣＤＩ０５＋造血幹細胞、ＣＤ１１７＋造血幹細胞、ＣＤＩ０５＋内皮細胞、Ｂ細胞、ＣＤ２０＋Ｂ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、癌細胞、ＣＤ１３３＋癌細胞、ＥｐＣＡＭ＋癌細胞、ＣＤ１９＋キャンセル細胞、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ＋癌細胞、ＧｌｕＡ２＋ニューロン、ＧｌｕＡ４＋ニューロン、ＮＫＧ２Ｄ＋ナチュラルキラー細胞、ＳＬＣＩＡ３＋星状細胞、ＳＬＣ７ＡＩＯ＋脂肪細胞、またはＣＤ３０＋肺上皮細胞に送達する、レトロウイルスベクター。
【０１８７】
１８０．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスであって、標的細胞（例えば、Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤＳ＋Ｔ細胞、肝細胞、造血幹細胞、ＣＤ３４＋造血幹細胞、ＣＤＩ０５＋造血幹細胞、ＣＤ１１７＋造血幹細胞、ＣＤＩ０５＋内皮細胞、Ｂ細胞、ＣＤ２０＋Ｂ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、癌細胞、ＣＤ１３３＋癌細胞、ＥｐＣＡＭ＋癌細胞、ＣＤ１９＋キャンセル細胞、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ＋癌細胞、ＧｌｕＡ２＋ニューロン、ＧｌｕＡ４＋ニューロン、ＮＫＧ２Ｄ＋ナチュラルキラー細胞、ＳＬＣＩＡ３＋星状細胞、ＳＬＣ７ＡＩＯ＋脂肪細胞、またはＣＤ３０＋肺上皮細胞のうちの１つ以上）の少なくとも０．００００１％、２０  ０．０００１％、０．００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、例えば、定量的ＰＣＲを使用して、例えば、実施例３のアッセイを使用して、レトロウイルス核酸を含む、レトロウイルスベクター。
【０１８８】
１８１．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスであって、標的細胞（例えば、Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤＳ＋Ｔ細胞、肝細胞、造血幹細胞、ＣＤ３４＋造血幹細胞、ＣＤＩ０５＋造血幹細胞、ＣＤ１１７＋造血幹細胞、ＣＤＩ０５＋内皮細胞、Ｂ細胞、ＣＤ２０＋Ｂ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、癌細胞、ＣＤ１３３＋癌細胞、ＥｐＣＡＭ＋癌細胞、ＣＤ１９＋キャンセル細胞、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ＋癌細胞、ＧｌｕＡ２＋ニューロン、ＧｌｕＡ４＋ニューロン、ＮＫＧ２Ｄ＋ナチュラルキラー細胞、ＳＬＣＩＡ３＋星状細胞、ＳＬＣ７ＡｌＯ＋脂肪細胞、またはＣＤ３０＋肺上皮細胞）の少なくとも０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が外因性薬剤を含む、レトロウイルスベクター。
【０１８９】
１８２．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスであって、投与時に、レトロウイルス核酸を含む非標的細胞に対するレトロウイルス核酸を含む標的細胞の比が、例えば、定量的ＰＣＲアッセイによって、例えば、実施例１および実施例３のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、レトロウイルスベクター。
【０１９０】
１８３．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、非標的細胞におけるレトロウイルス核酸またはその一部の平均コピー数に対する標的細胞におけるレトロウイルス核酸またはその一部の平均コピー数の比が、例えば、定量的ＰＣＲアッセイによって、例えば、実施例１および実施例３のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、レトロウイルスベクター。
【０１９１】
１８４．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、非標的細胞におけるレトロウイルス核酸またはその一部のコピー数の中央値に対する標的細胞におけるレトロウイルス核酸またはその一部のコピー数の中央値の比が、例えば、定量的ＰＣＲアッセイによって、例えば、実施例１および実施例３のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、レトロウイルスベクター。
【０１９２】
１８５．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、外因性ＲＮＡ剤を含む非標的細胞に対する外因性ＲＮＡ剤を含む標的細胞の比が、例えば、逆転写定量的ＰＣＲアッセイによって、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、レトロウイルスベクター。
【０１９３】
１８６．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、非標的細胞の外因性ＲＮＡ剤の平均レベルに対する標的細胞の外因性ＲＮＡ剤の平均レベルの比が、例えば、逆転写定量的ＰＣＲアッセイによって、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、レトロウイルスベクター。
【０１９４】
１８７．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、非標的細胞の外因性ＲＮＡ剤レベルの中央値に対する標的細胞の外因性ＲＮＡ剤レベルの中央値の比が、逆転写定量的ＰＣＲアッセイによって、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、レトロウイルスベクター。
【０１９５】
１８８．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、外因性タンパク質剤を含む非標的細胞に対する外因性タンパク質剤を含む標的細胞の比が、例えば、ＦＡＣＳアッセイによって、例えば、実施例２および／または実施例４のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、レトロウイルスベクター。
【０１９６】
１８９．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、非標的細胞の外因性タンパク質剤の平均レベルに対する標的細胞の外因性タンパク質剤の平均レベルの比が、例えば、ＦＡＣＳアッセイによって、例えば、実施例２および／または実施例４のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、レトロウイルスベクター。
【０１９７】
１９０．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、非標的細胞の外因性タンパク質剤レベルの中央値に対する標的細胞の外因性タンパク質剤レベルの中央値の比が、例えば、ＦＡＣＳアッセイによって、例えば、実施例２および／または実施例４のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、レトロウイルスベクター。
【０１９８】
１９１．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、
ｉ）エンベロープに外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、および
ｉｉ）不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたレトロウイルスベクターと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在する免疫刺激タンパク質、のうちの一方または両方、を含むレトロウイルスベクター。
【０１９９】
１９２．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、
ｉ）エンベロープに第１の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、およびエンベロープに第２の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、
ｉｉ）エンベロープに第１の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、および不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたレトロウイルス様粒子もしくはレトロウイルスベクターと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在する第２の免疫刺激タンパク質、あるいは
ｉｉｉ）不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたレトロウイルス様粒子もしくはレトロウイルスベクターと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在する第１の免疫刺激タンパク質、および不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたレトロウイルス様粒子もしくはレトロウイルスベクターと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在する第２の免疫刺激タンパク質、のうちの１つ以上を含む、レトロウイルスベクター。
【０２００】
１９３．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターであって、レトロウイルス核酸が１つ以上のインスレーターエレメントを含む、レトロウイルスベクター。
【０２０１】
１９４．レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター（例えば、ヒト対象におけるインビボ使用に好適な粒子またはベクター）であって、
ａ）フソゲン（例えば、再標的化フソゲン）を含むエンベロープと、
ｂ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）または外因性薬剤をコードする核酸（例えば、レトロウイルス核酸）と、
ｃ）
ｉ）エンベロープに第１の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、およびエンベロープに第２の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、
ｉｉ）エンベロープに第１の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質、および不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたレトロウイルス様粒子もしくはレトロウイルスベクターと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在する第２の免疫刺激タンパク質、あるいは
ｉｉｉ）不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたレトロウイルス様粒子もしくはレトロウイルスベクターと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在する第１の免疫刺激タンパク質、および不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたレトロウイルス様粒子もしくはレトロウイルスベクターと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在する第２の免疫刺激タンパク質、のうちの１つ以上と、を含み、対象（例えば、ヒト対象またはマウス）に投与される場合、
ｉ）粒子もしくはベクターが、例えば、ＦＡＣＳ抗体検出アッセイ、例えば、実施例１３もしくは実施例１４のアッセイによって、検出可能な抗体反応を生じず（例えば、単回投与または複数回投与後）、または粒子もしくはベクターに対する抗体がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在し、
ｉｉ）粒子またはベクターが、例えば、ＰＢＭＣ溶解アッセイ（例えば、実施例５のアッセイ）によって、ＮＫ細胞溶解アッセイ（例えば、実施例６のアッセイ）によって、ＣＤＳキラーＴ細胞溶解アッセイ（例えば、実施例７のアッセイ）によって、マクロファージ食作用アッセイ（例えば、実施例８のアッセイ）によって、検出可能な細胞性免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答、ＮＫ細胞応答、またはマクロファージ応答）を生じず、または粒子もしくはベクターに対する細胞性免疫応答がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在し、
ｉｉｉ）粒子もしくはベクターが、例えば、補体活性アッセイ（例えば、実施例９のアッセイ）によって、検出可能な自然免疫応答、例えば、補体活性化（例えば、単回投与または複数回投与後）を生じない、または粒子もしくはベクターに対する自然免疫応答がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在し、
ｉｖ）ウイルスの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２、０．１％、０．０５％、０．０２％、０．０１％、０．００５％、０．００２％、もしくは０．００１％未満が、例えば、血清不活性化アッセイによって、例えば、実施例１１または実施例１２のアッセイによって、血清で不活性化され、
ｖ）粒子もしくはベクターから外因性薬剤を受容した標的細胞が、例えば、ＦＡＣＳ抗体検出アッセイ、例えば、実施例１５のアッセイによって、検出可能な抗体応答を生じない（例えば、単回投与または複数回投与後）、または標的細胞に対する抗体がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在し、あるいは
ｖｉ）粒子もしくはベクターから外因性薬剤を受容した標的細胞が、例えば、マクロファージ食作用アッセイ（例えば、実施例１６のアッセイ）によって、ＰＢＭＣ溶解アッセイ（例えば、実施例１７のアッセイ）によって、ＮＫ細胞溶解アッセイ（例えば、実施例１８のアッセイ）によって、またはＣＤＳキラーＴ細胞溶解アッセイ（例えば、実施例１９のアッセイ）によって、検出可能な細胞性免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答、ＮＫ細胞応答、もしくはマクロファージ応答）を生じない、または標的細胞に対する細胞応答がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満高いレベルで存在する、のうちの１つである、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２０２】
１９５．実施形態１９４のレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、バックグラウンドレベルが、粒子またはベクターの投与前の同一対象におけるその対応するレベルである、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２０３】
１９６．実施形態１９４または１９５のレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、免疫抑制タンパク質が補体調節タンパク質またはＣＤ４７である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２０４】
１９７．実施形態１９４〜１９６のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、免疫刺激タンパク質がＭＨＣ（例えば、ＨＬＡ）タンパク質である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２０５】
１９８．実施形態１９４〜１９７のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、第１の外因性または過剰発現した免疫抑制タンパク質のうちの一方または両方がＣＤ４７以外であり、第２の免疫刺激タンパク質がＭＨＣ以外である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２０６】
１９９．レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター（例えば、ヒト対象におけるインビボ使用に好適な粒子またはベクター）であって、
ａ）フソゲンを含むエンベロープと、
ｂ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）をコードするレトロウイルス核酸と、
ｃ）エンベロープに外因性または過剰発現したＭＨＣ、例えば、ＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅ）、またはそれらの組み合わせと、を含む、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２０７】
２００．偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター（例えば、ヒト対象におけるインビボ使用に好適な粒子またはベクター）であって、
ａ）フソゲンを含む偽型エンベロープであって、フソゲンが、野生型パラミクソウイルスフソゲン、例えば、表４または表５の配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する長さが少なくとも４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸のドメインを含み、任意に、野生型パラミクソウイルスフソゲンが配列番号１〜１３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸の配列を有する、偽型エンベロープと、
ｂ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）をコードするレトロウイルス核酸と、
ｃ）エンベロープに外因性もしくは過剰発現したＣＤ４７または補体調節タンパク質、あるいはそれらの組み合わせと、を含む、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２０８】
２０１．偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター（例えば、ヒト対象におけるインビボ使用に好適な粒子またはベクター）であって、
ａ）フソゲンを含む偽型エンベロープであって、フソゲンが、野生型パラミクソウイルスフソゲン、例えば、表４または表５の配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する長さが少なくとも４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸のドメインを含み、任意に、野生型パラミクソウイルスフソゲンが配列番号１〜１３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸の配列を有する、偽型エンベロープと、
ｂ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）をコードするレトロウイルス核酸と、
ｃ）不在、または非改変である以外は同一な供給源細胞から生成されたレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在するＭＨＣＩ（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＡＬ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃ）またはＭＨＣＩＩ（例えば、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはＨＬＡ−ＤＲ）と、を含む、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルス。
【０２０９】
２０２．偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター（例えば、ヒト対象におけるインビボ使用に好適な粒子またはベクター）であって、
ａ）フソゲンを含む偽型エンベロープであって、フソゲンが、野生型パラミクソウイルスフソゲン、例えば、表４または表５の配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する長さが少なくとも４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸のドメインを含み、任意に、野生型パラミクソウイルスフソゲンが配列番号１〜１３２のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列を有する、偽型エンベロープと、
ｂ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）をコードするレトロウイルス核酸と、
ｃ）不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞から生成されたレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターと比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）である外因性もしくは過剰発現した免疫抑制タンパク質または免疫刺激タンパク質のうちの一方または両方と、を含む、偽レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２１０】
２０３．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターが、患者への投与後、少なくとも０．５、１、２、３、４、６、１２、１８、２４、３６、または４８時間循環している、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２１１】
２０４．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に３０分循環している、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２１２】
２０５．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に１時間循環している、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２１３】
２０６．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に２時間循環している、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２１４】
２０７．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に４時間循環している、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２１５】
２０８．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に８時間循環している、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２１６】
２０９．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に１２時間循環している、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２１７】
２１０．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に１８時間循環している、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２１８】
２１１．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に２４時間循環している、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２１９】
２１２．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に３６時間循環している、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２２０】
２１３．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、投与後に４８時間循環している、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２２１】
２１４．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、対照レトロウイルス、例えば、非改変である以外は当該レトロウイルスと同様なレトロウイルスと比べて、適切な動物モデル、例えば、本明細書で記載される動物モデルへのレトロウイルスの１回以上の投与後の体液性応答における低下によって測定されたとき、免疫原性の低下を有する、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２２２】
２１５．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、体液性応答における低下が、血清試料において、抗細胞抗体力価、例えば、抗レトロウイルス抗体力価、例えば、ＥＬＩＳＡによって測定される、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２２３】
２１６．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルス組成物が投与された動物からの血清試料が、非改変細胞を投与された対象からの血清試料と比べて、抗レトロウイルス抗体力価の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の低下を有する、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２２４】
２１７．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルス組成物が投与された対象からの血清試料が、ベースライン、例えば、レトロウイルス組成物投与前の同一対象からの血清試料を参考にするベースラインから、増加した抗細胞抗体力価、例えば、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、または４０％の増加を有する、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２２５】
２１８．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスまたは医薬組成物を投与されるべき対象が、レトロウイルスと反応性である既存の抗体（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）を有し、もしくは有することが知られ、または試験され、レトロウイルス組成物を投与されるべき対象が、レトロウイルスと反応性である既存の抗体の検出可能なレベルを有さず、レトロウイルスまたは医薬組成物を受けた対象が、レトロウイルスと反応性である抗体（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）を有し、もしくは有することが知られ、または試験され、レトロウイルスまたは医薬組成物（例えば、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回以上）を受けている対象が、レトロウイルスと反応性である抗体の検出可能なレベルを有さない、あるいは抗体のレベルが２つの時点である、レトロウイルスの最初の投与前である第１の時点、およびレトロウイルスの１回以上の投与後である第２の時点の間で、１％、２％、５％、１０％、２０％、または５０％を超えて上昇しない、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２２６】
２１９．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスベクターが実施例５、６、または７の方法によって、例えば、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＥｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から生成される、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２２７】
２２０．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、ＮＭＣ−ＨＬＡ−Ｇ細胞から生成されたレトロウイルスベクターが、ＮＭＣまたはＮＭＣ空ベクターから生成されたレトロウイルスベクターと比較して、特定の時点で溶解、例えば、ＰＢＭＣ媒介溶解、ＮＫ細胞媒介溶解、および／またはＣＤＳ＋Ｔ細胞媒介溶解のパーセントが減少している、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２２８】
２２１．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、改変されたレトロウイルスベクターがマクロファージによる食作用を回避する、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２２９】
２２２．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスベクターが、例えば、ＣＤ４７ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から、実施例８の方法によって生成される、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２３０】
２２３．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、マクロファージがＮＭＣ−ＣＤ４７に由来するレトロウイルスベクターとインキュベートされるとき、ＮＭＣまたはＮＭＣ空ベクターに由来するものに比べて、食作用指数が低下される、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２３１】
２２４．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、対照レトロウイルス、例えば、非改変である以外は当該レトロウイルスと同様であるレトロウイルスと比べて、マクロファージ食作用における低下、例えば、マクロファージ食作用における１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の低下を有し、マクロファージ食作用における低下が、例えば、実施例８で説明されるように、食作用指数をインビトロでアッセイすることによって決定される、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２３２】
２２５．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルス組成物が、マクロファージ食作用のインビトロアッセイでマクロファージとインキュベートされたとき、例えば、実施例８のアッセイによって測定されたとき、０、１、１０、１００以上の食作用指数を有する、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２３３】
２２６．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、改変されており、非改変レトロウイルスベクターと比べて低下した補体活性を有する、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２３４】
２２７．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、実施例９の方法によって、例えば、補体調節タンパク質、例えば、ＤＡＦをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から生成される、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２３５】
２２８．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスベクターの用量が、２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在して、対照レトロウイルスベクター（例えば、ＨＥＫ２９３レトロウイルスベクター）が対応するマウス血清（例えば、ＨＥＫ２９３マウス血清）とインキュベートされたよりも、改変レトロウイルスベクター（例えば、ＨＥＫ２９３−ＤＡＦ）が対応するマウス血清（例えば、ＨＥＫ−２９３ＤＡＦマウス血清）とインキュベートされたもので大きい、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２３６】
２２９．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスベクターの用量が、２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在して、対照レトロウイルスベクター（例えば、ＨＥＫ２９３レトロウイルスベクター）がナイーブマウス血清とインキュベートされたよりも、改変レトロウイルスベクター（例えば、ＨＥＫ２９３−ＤＡＦ）がナイーブマウス血清とインキュベートされたもので大きい、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２３７】
２３０．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルス組成物が、実施例９のアッセイによって、投与後３０分の患者血清における補体媒介不活性化に耐性である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２３８】
２３１．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスの少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、補体媒介不活性化に耐性である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２３９】
２３２．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、補体調節タンパク質が、崩壊促進因子（ＤＡＦ、ＣＤ５５）と結合するタンパク質、例えばＨ因子（ＦＨ）様タンパク質−Ｉ（ＦＨＬ−１）、例えばＣ４ｂ−結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、例えば補体受容体Ｉ（ＣＤ３５）、例えば膜補因子タンパク質（ＭＣＰ、ＣＤ４６）、例えばプロテクチン（ＣＤ５９）、例えば古典的および代替補体経路ＣＤ／Ｃ５変換酵素を阻害するタンパク質、例えばＭＡＣアセンブリを調節するタンパク質、のうちの１つ以上を含む、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２４０】
２３３．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、実施例１０の方法によって、例えば、ＭＨＣクラスＩを標的にするｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から生成され、例えば、ＮＭＣ−ｓｈＭＨＣクラスＩに由来するレトロウイルスベクターがＮＭＣおよびＮＭＣベクターコントロールと比べてＭＨＣクラスＩの低い発現を有する、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２４１】
２３４．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスベクターにおける免疫原性の尺度が、血清不活性化、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１１で説明されるように測定される血清不活性化である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２４２】
２３５．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントが、レトロウイルスベクターナイーブマウスからの血清および熱不活性化血清とインキュベートされているレトロウイルス試料の間で異ならない、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２４３】
２３６．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントが、レトロウイルスベクターナイーブマウスからの血清と共にインキュベートされているレトロウイルスベクター試料と無血清コントロールインキュベーションとの間で異ならない、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２４４】
２３７．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントが、レトロウイルスベクターナイーブマウスからの血清と共にインキュベートされているレトロウイルスベクター試料よりも、陽性コントロール血清と共にインキュベートされているレトロウイルスベクター試料において少ない、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２４５】
２３８．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、例えば、本明細書で説明される方法によって改変された改変レトロウイルスベクターが、改変レトロウイルスベクターの複数回（例えば１回超、例えば２回以上）の投与後に、低下した（非改変レトロウイルスベクターの投与と比較して低下した）血清不活性化を有する、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２４６】
２３９．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、本明細書で説明されるレトロウイルスベクターが、複数回の投与後に血清によって不活性化されない、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２４７】
２４０．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスベクターにおける免疫原性の尺度が、血清の不活性化、例えば、複数回投与後の、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１２で説明されるように測定された、例えば複数回投与後の血清不活性化である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２４８】
２４１．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントが、改変された（例えば、ＨＥＫ２９３−ＨＬＡ−Ｇ）レトロウイルスベクターで処理されたマウスからの血清および熱不活性化血清とインキュベートされているレトロウイルスベクター試料の間で異ならない、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２４９】
２４２．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントが、改変された（例えば、ＨＥＫ２９３−ＨＬＡ−Ｇ）レトロウイルスベクターで１、２、３、５、または１０回処理されたマウスからインキュベートされているレトロウイルスベクター試料間で異ならない、フソソーム。
【０２５０】
２４３．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントが、ビヒクルで処理されたマウスおよび改変された（例えば、ＨＥＫ２９３−ＨＬＡ−Ｇ）レトロウイルスベクターで処理されたマウスからの血清とインキュベートされているレトロウイルスベクター試料間で異ならない、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２５１】
２４４．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントが、改変された（例えば、ＨＥＫ２９３−ＨＬＡ−Ｇ）レトロウイルスベクターにおけるよりも対照細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）に由来するレトロウイルスベクターにおいて少ない、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２５２】
２４５．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスベクターにおける免疫原性の尺度が抗体応答である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２５３】
２４６．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、本明細書で説明されるレトロウイルスベクターを受ける対象が、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１３で説明されるように測定されて、レトロウイルスベクターと結合して認識する既存の抗体を有する、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２５４】
２４７．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスベクター−ナイーブマウスからの血清が、陰性コントロール、例えば、免疫原性が生じていることを示すＩｇＭおよびＩｇＧが、例えば、枯渇したマウスからの血清である陰性コントロールよりも多いシグナル（例えば、蛍光）を示す、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２５５】
２４８．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスベクター−ナイーブマウスからの血清が、例えば、免疫原性が検出可能で生じなかったことを示す陰性コントロールと比べて、同様なシグナル（例えば、蛍光）を示す、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２５６】
２４９．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、改変された、例えば、本明細書で説明される方法によって改変されたレトロウイルスベクターであり、改変レトロウイルスベクターの複数回（例えば、１回超、例えば２回以上）の投与後に、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１４で説明されるように測定されて、体液性応答の低下（例えば、非改変レトロウイルスの投与と比較して低下した）を有する、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２５７】
２５０．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルスベクターが実施例５、６、７、または１４の方法によって、例えば、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＥｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から生成される、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２５８】
２５１．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、体液性応答が、抗レトロウイルスベクター抗体（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、および／またはＩｇＧ２抗体）のレベルについて値を決定することによって評価される、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２５９】
２５２．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、改変された（例えば、ＮＭＣ−ＨＬＡ−Ｇ）レトロウイルスベクターが、コントロール、例えば、ＮＭＣレトロウイルスベクターまたはＮＭＣ空レトロウイルスベクターと比べて、注入後に抗ウイルスＩｇＭまたはＩｇＧ１／２抗体力価（例えば、ＦＡＣＳの蛍光強度によって測定されたとき）を減少させた、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２６０】
２５３．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レシピエント細胞が抗体応答によって標的化されず、または抗体応答が、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１５で説明されるように測定されて、対照レベル未満である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２６１】
２５４．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、シグナル（例えば、平均蛍光強度）が、レトロウイルスベクターで処理されたマウスおよびＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞について同様である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２６２】
２５５．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レシピエント細胞の免疫原性の尺度がマクロファージ応答である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２６３】
２５６．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レシピエント細胞がマクロファージによって標的化されない、または対照レベルより低く標的化される、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２６４】
２５７．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、食作用指数が、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１６で説明されるように測定されるとき、レトロウイルスベクターで処理されたマウスおよびＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞について同様である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２６５】
２５８．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レシピエント細胞の免疫原性の尺度がＰＢＭＣ応答である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２６６】
２５９．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レシピエント細胞がＰＢＭＣ応答を誘発しない、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２６７】
２６０．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞のパーセントが、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１７で説明されるように測定されたとき、レトロウイルスベクターで処理されたマウスおよびＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞において同様である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２６８】
２６１．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レシピエント細胞の免疫原性の尺度がナチュラルキラー細胞応答である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２６９】
２６２．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レシピエント細胞がナチュラルキラー細胞応答を誘発せず、または低いナチュラルキラー細胞応答を、例えば、対照値より低く、誘発する、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２７０】
２６３．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞のパーセントが、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１８で説明されるように測定されたとき、レトロウイルスベクターで処理されたマウスおよびＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞において同様である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２７１】
２６４．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レシピエント細胞の免疫原性の尺度がＣＤＳ＋Ｔ細胞応答である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２７２】
２６５．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レシピエント細胞がＣＤＳ＋Ｔ細胞応答を誘発せず、または低いＣＤＳ＋Ｔ細胞応答を、例えば、対照値より低く誘発する、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２７３】
２６６．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞のパーセントが、例えば、本明細書で説明されるように、例えば、実施例１９で説明されるように測定されたとき、レトロウイルスベクターで処理されたマウスおよびＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞において同様である、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２７４】
２６７．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、フソゲンが再標的化されたフソゲンである、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２７５】
２６８．上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、（ｉ）外因性薬剤をコードする核酸と操作可能に連結されたポジティブ標的細胞特異的調節エレメント、または（ｉｉ）外因性薬剤をコードする核酸と操作可能に連結されたネガティブ標的細胞特異的調節エレメント、のうちの一方または両方をコードするレトロウイルス核酸を含む、レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２７６】
２６９．偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター（例えば、ヒト対象におけるインビボ使用に好適な粒子またはベクター）であって、
ａ）フソゲンを含む偽型エンベロープであって、フソゲンが、野生型パラミクソウイルスフソゲン、例えば、表４または表５の配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する長さが少なくとも４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸のドメインを含み、任意に、野生型パラミクソウイルスフソゲンが配列番号１〜１３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸の配列を有する、偽型エンベロープと、
ｂ）外因性薬剤（例えば、外因性ポリペプチドまたは外因性ＲＮＡ）をコードするレトロウイルス核酸であって、レトロウイルス核酸が１つ以上のインスレーターエレメントを含むレトロウイルス核酸と、を含む、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２７７】
２７０．実施形態２６９の偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、レトロウイルス核酸が２つのインスレーターエレメント、例えば、外因性薬剤をコードする領域の上流である第１のインスレーターエレメント、および外因性薬剤をコードする領域の下流である第２のインスレーターエレメントを含み、例えば、第１のインスレーターエレメントおよび第２のインスレーターエレメントが、同一または異なる配列を含む、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２７８】
２７１．実施形態２６９または２７０の偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、対象に第１の時点での粒子またはベクターの投与後に単離された細胞の試料における外因性薬剤レベルの中央値における変動が、対象に後の第２の時点での粒子またはベクターの投与後に単離された細胞の試料における外因性薬剤レベルの中央値の少なくとも、約１０，０００％、５，０００％、２，０００％、１，０００％、５００％、２００％、１００％、５０％、２０％、１０％、または５％、あるいはそれら未満である、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２７９】
２７２．実施形態２７１の偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、細胞あたりの発現レベルの中央値が、少なくとも１．０のレトロウイルスゲノムコピー数を有する細胞においてのみ評価される、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２８０】
２７３．実施形態２６９〜２７２のいずれかの偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、対象における標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が外因性薬剤を検出可能で含む、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２８１】
２７４．実施形態２７１〜２７３のいずれかの偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、ペイロード遺伝子発現レベルの中央値が、対象へのレトロウイルス組成物の投与後、７日、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、１０９５日で対象から単離された細胞にわたって評価される、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２８２】
２７５．実施形態２６９〜２７４のいずれかの偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、第１の時点で外因性薬剤を検出可能で含んだ対象における標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、後の第２の時点で依然として外因性薬剤を検出可能で含み、第１の時点が、対象へのレトロウイルス組成物の投与後、７日、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、１０９５日である、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２８３】
２７６．実施形態２７５の偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、第２の時点が、第１の時点後の７日、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、１０９５日である、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２８４】
２７７．実施形態２６９〜２７６のいずれかの偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、遺伝毒性ではなく、またはレトロウイルス様粒子もしくはレトロウイルスベクターで処理されていない標的細胞と比較して標的細胞における腫瘍形成の割合を増加させない、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２８５】
２７８．実施形態２６９〜２７７のいずれかの偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、外因性薬剤レベルの中央値が、レトロウイルスベクターまたは医薬組成物を受けた対象からの細胞の集団において評価される、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２８６】
２７９．実施形態２６９〜２７８のいずれかの偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、投与後の異なる日に対象から収集された（例えば、単離された）細胞の集団において評価された外因性薬剤レベルの中央値が、７日、１４日、２８日、または５６日で評価された細胞の集団における外因性薬剤レベルの中央値と、約１０，０００％、１０００％、１００％、または１０％未満、例えば、１０，０００％〜１０００％、１０００％〜１００％、または１００％〜１０％異なり、集団内の細胞は少なくとも１．０のベクターコピー数を有する、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２８７】
２８０．実施形態２６９〜２７９のいずれかの偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、外因性薬剤レベルが、レトロウイルスベクターまたは医薬組成物を受けた対象からの細胞にわたって評価される、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２８８】
２８１．実施形態２６９〜２８０のいずれかの偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、外因性薬剤を含む細胞のパーセントが、レトロウイルスベクターまたは医薬組成物の投与後、７日、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、１０９５日で対象から収集された（例えば、単離された）複数の細胞において評価される、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２８９】
２８２．実施形態２６９〜２８１のいずれかの偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、投与後２つの異なる日で単離された細胞で評価された外因性薬剤を含む細胞のパーセントにおける差が、１％、５％、１０％、２０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、７５０％、１０００％、１５００％、または２０００％未満である、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２９０】
２８３．実施形態２６９〜２８２のいずれかの偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、外因性薬剤について陽性である標的細胞のパーセントが、７日、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で収集された細胞にわたって同様である、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２９１】
２８４．実施形態２６９〜２８３のいずれかの偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、７日と少なくとも同じ数の標的細胞が、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５で外因性薬剤について陽性であり、１４日と少なくとも同じ数の標的細胞が２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で外因性物質について陽性であり、２８日と少なくとも同じ数の標的細胞が５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で外因性物質について陽性であり、５６日と少なくとも同じ数の標的細胞が１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で外因性薬剤について陽性であり、１１２日と少なくとも同じ数の標的細胞が３６５日、７３０日、または１０９５日で外因性薬剤について陽性であり、３６５日と少なくとも同じ数の標的細胞が７３０日または１０９５日で外因性薬剤について陽性であり、あるいは７３０日と少なくとも同じ数の標的細胞が１０９５日で外因性薬剤について陽性である、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２９２】
２８５．実施形態２６９〜２８４のいずれかの偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクターであって、外因性薬剤を含む標的細胞における外因性薬剤レベルの中央値が、７日、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で収集された細胞において同様であり、外因性薬剤を１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で含む標的細胞における外因性薬剤レベルの中央値が７日と少なくとも同じくらい高く、外因性薬剤を２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で含む標的細胞における外因性薬剤レベルの中央値が１４日と少なくとも同じくらい高く、外因性薬剤を５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で含む標的細胞における外因性薬剤レベルの中央値が２８日と少なくとも同じくらい高く、外因性薬剤を１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で含む標的細胞における外因性薬剤レベルの中央値が５６日と少なくとも同じくらい高く、外因性薬剤を３６５日、７３０日、または１０９５日で含む標的細胞における外因性薬剤レベルの中央値が１１２日と少なくとも同じくらい高く、外因性薬剤を７３０日または１０９５日で含む標的細胞における外因性薬剤レベルの中央値が３６５日と少なくとも同じくらい高く、あるいは、外因性薬剤を１０９５日で含む標的細胞における外因性薬剤レベルの中央値が７３０日と少なくとも同じくらい高い、偽型レトロウイルス様粒子またはレトロウイルスベクター。
【０２９３】
２８６．外因性薬剤を対象（例えば、ヒト対象）に送達する方法であって、対象に上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子（例えば、偽型レトロウイルス様粒子）またはレトロウイルスベクター（例えば、偽型レトロウイルスベクター）を投与することを含み、それによって外因性薬剤を対象に送達する、方法。
【０２９４】
２８７．対象（例えば、ヒト対象）、標的組織、または標的細胞において機能を調節する方法であって、対象、標的組織、または標的細胞に上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子（例えば、偽型レトロウイルス様粒子）またはレトロウイルスベクター（例えば、偽型レトロウイルスベクター）を接触させる、例えば、投与することを含む、方法。
【０２９５】
２８８．実施形態２８７の方法であって、標的組織または標的細胞が対象に存在する、方法。
【０２９６】
２８９．対象（例えば、ヒト対象）における障害、例えば、癌を治療または予防する方法であって、対象に上記実施形態のいずれかのレトロウイルス様粒子（例えば、偽型レトロウイルス様粒子）またはレトロウイルスベクター（例えば、偽型レトロウイルスベクター）を投与することを含む、方法。
【０２９７】
２９０．上記実施形態のいずれかのレトロウイルスベクターまたはレトロウイルス様粒子を作製する方法であって、
ａ）レトロウイルス核酸およびフソゲン（例えば、再標的化フソゲン）を含む供給源細胞を用意することと、
ｂ）レトロウイルスベクターの生成を可能にする条件下で供給源細胞を培養することと、
ｃ）レトロウイルスベクターを供給源細胞から分離すること、豊富化すること、または精製することと、を含み、それによってレトロウイルスベクターを作製する、方法。
【０２９８】
２９１．レトロウイルスベクターを生成するための供給源細胞であって、
ａ）レトロウイルス核酸と、
ｂ）レトロウイルス核酸をパッケージングすることができるウイルス構造タンパク質であって、少なくとも１つの構造タンパク質がフソゲン受容体と結合するフソゲンを含む、ウイルス構造タンパク質と、
ｃ）不在、または非改変である以外は同様な供給源細胞と比べて、低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在するフソゲン受容体と、を含む、供給源細胞。
【０２９９】
２９２．実施形態２９１の供給源細胞であって、フソゲンがフソゲン受容体と結合すると、レトロウイルスベクターと標的細胞との融合を生じる、供給源細胞。
【０３００】
２９３．実施形態２９１または２９２の供給源細胞であって、第２の類似した供給源細胞と結合する、例えば、供給源細胞のフソゲンが第２の供給源細胞上のフソゲンと結合する、供給源細胞。
【０３０１】
２９４．実施形態２９１〜２９３のいずれかの供給源細胞の、集団。
【０３０２】
２９５．実施形態２９４の供給源細胞の集団であって、集団における細胞の１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満が多核化されている、供給源細胞の集団。
【０３０３】
２９６．実施形態２９１〜２９５のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、供給源細胞が、本明細書で説明されるレトロウイルスの製造中に、他の供給源との融合が低減されている（例えば、融合しない）ように改変されている、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０３０４】
２９７．実施形態２９１〜２９６のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、フソゲン（例えば、再標的化フソゲン）が、供給源細胞によって含まれるタンパク質、例えば、供給源細胞の表面上のタンパク質と、結合しない、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０３０５】
２９８．実施形態２９１〜２９７のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、フソゲン（例えば、再標的化フソゲン）が、供給源細胞によって含まれるタンパク質と結合するが、細胞と融合しない、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０３０６】
２９９．実施形態２９１〜２９８のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、フソゲンが供給源細胞との融合を誘発しない、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０３０７】
３００．実施形態２９１〜２９９のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、供給源細胞が、フソゲンと結合するタンパク質、例えば、抗原を発現しない、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０３０８】
３０１．実施形態２９１〜３００のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、複数の供給源細胞が、フソゲンを発現するときに合胞体を形成せず、または集団における細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満が多核化される（例えば、２つ以上の核を含む）、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０３０９】
３０２．実施形態２９１〜３０１のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、複数の供給源細胞が、レンチウイルスを生成するときに融合細胞を形成せず、または集団における細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満が多核化される、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０３１０】
３０３．実施形態２９１〜３０２のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、集団における核の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満が合胞体にある、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０３１１】
３０４．実施形態２９１〜３０３のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、集団における核の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％が単核細胞にある、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０３１２】
３０５．実施形態２９１〜３０４のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、多核化されている細胞のパーセンテージが、非改変である以外は同様である供給源細胞の集団と比べて低い、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低い、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０３１３】
３０６．実施形態２９１〜３０５のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、合胞体に存在する核のパーセントが、非改変である以外は同様である供給源細胞の集団と比べて低い、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低い、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０３１４】
３０７．実施形態２９１〜３０６のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、多核化細胞（例えば、２つ以上の核を有する細胞）が、顕微鏡アッセイ、例えば、ＤＮＡ染色を使用して、例えば、実施例２０のアッセイによって検出される、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０３１５】
３０８．実施形態２９１〜３０７のいずれかの供給源細胞または供給源細胞の集団であって、改変された供給源細胞から得られる機能的ウイルス粒子が、例えば、実施例２０のアッセイを使用して、非改変である以外は同様である供給源細胞から得られる機能的ウイルス粒子の数よりも、少なくとも１０％、２０％、４０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、５倍、または１０倍多い、供給源細胞または供給源細胞の集団。
【０３１６】
３０９．レトロウイルスベクターまたはレトロウイルス様粒子であって、フソゲン受容体を欠如する、または非改変である以外は同様な供給源細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターまたはレトロウイルス様粒子と比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在するフソゲン受容体を含む、レトロウイルスベクターまたはレトロウイルス様粒子。
【０３１７】
３１０．レトロウイルスベクターまたはレトロウイルス様粒子を作製する方法であって、
ａ）フソゲン（例えば、再標的化フソゲン）を含む供給源細胞であって、供給源細胞がフソゲン受容体を欠如し、または非改変である以外は同様な供給源細胞と比べて低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下）で存在するフソゲン受容体を含む、供給源細胞を用意することと、
ｂ）レトロウイルスベクターの生成を可能にする条件下で供給源細胞を培養することと、
ｃ）レトロウイルスベクターを供給源細胞から分離すること、豊富化すること、または精製することと、を含み、それによってレトロウイルスベクターを作製する、方法。
【０３１８】
３１１．実施形態３１０の方法であって、供給源細胞を用意することが、供給源細胞またはその前駆体におけるフソゲン受容体をノックダウンまたはノックアウトすることを含む、方法。
【０３１９】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【０３２０】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。例えば、本明細書で言及される、例えば、本明細書の任意の表において、すべてのＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、およびＥｎｔｒｅｚ配列は参照によって組み込まれる。特に明記されていない限り、本明細書におけるいずれの表も含め、本明細書で指定された配列寄託番号は、２０１８年５月１５日現在のデータベースエントリを参照している。１つの遺伝子またはタンパク質が複数の配列寄託番号を参照する場合、すべての配列変異体が包含される。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定することは意図されていない。
［発明を実施するための形態］
【０３２１】
本開示は、少なくとも部分的に、インビボ送達のためのフソソーム法および組成物を提供する。いくつかの実施形態において、フソソームは、標的細胞に対する特異性を促進するエレメントの組み合わせ、例えば、再標的化フソゲン、ポジティブ標的細胞特異的調節エレメント、および非標的細胞特異的調節エレメントのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、フソソームは、フソソームに対する免疫応答を減少させる１つ以上の改変を含む。
【０３２２】
定義
特許請求の範囲および明細書で使用される用語は、特に明記しない限り、以下に記載されるように定義される。
【０３２３】
本明細書で使用される場合、「検出可能で存在する」は、外因性薬剤が検出可能で存在するという文脈で使用される場合、外因性薬剤それ自体が検出可能で存在することを意味する。例えば、外因性薬剤がタンパク質である場合、それをコードする核酸が検出可能で存在するかに関係なく、外因性タンパク質薬剤は検出可能で存在することができる。
【０３２４】
本明細書で使用される場合、「フソソーム」は、管腔または空洞を取り囲む両親媒性脂質の二重層、および両親媒性脂質二重層と相互作用するフソゲンを指す。実施形態では、フソソームは核酸を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、膜で囲まれた調製物である。いくつかの実施形態において、フソソームは、供給源細胞に由来する。
【０３２５】
本明細書で使用される場合、「フソソーム組成物」は、１つ以上のフソソームを含む組成物を指す。
【０３２６】
本明細書で使用される場合、「フソゲン」は、管腔を囲む２つの膜の間に相互作用を生じる薬剤または分子を指す。実施形態において、フソゲンは膜の融合を促進する。他の実施形態では、フソゲンは、２つの管腔（例えば、レトロウイルスベクターの管腔と標的細胞の細胞質）の間に接続、例えば、孔を生じる。いくつかの実施形態において、フソゲンは、２つ以上のタンパク質の複合体を含み、例えば、どちらのタンパク質も単独では融合活性を有さない。いくつかの実施形態において、フソゲンは標的化ドメインを含む。
【０３２７】
本明細書で使用される場合、「フソゲン受容体」は、標的細胞によって含まれる実体（例えば、タンパク質）を指し、フソソーム（例えば、レトロウイルス）上のフソゲンと、標的細胞上のフソゲン受容体との結合は、標的細胞への核酸（例えば、レトロウイルス核酸）（および任意にまた、そこにコードされるコードされる外因性薬剤）の送達を促進する。
【０３２８】
本明細書で使用される場合、「インスレーターエレメント」は、エンハンサーを遮断する、またはヘテロクロマチン拡散を防ぐヌクレオチド配列を指す。インスレーターエレメントは、野生型または変異体である得る。
【０３２９】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、治療される症状および／または状態を有意かつポジティブに変更するのに十分である（例えば、ポジティブ臨床反応を提供する）医薬組成物の量を意味する。医薬組成物に使用するための有効成分の有効量は、治療される特定の状態、状態の重症度、治療の期間、併用療法の性質、使用される特定の有効成分（複数可）、使用される特定の薬学的に許容される賦形剤（複数可）および／または担体（複数可）、ならびに主治医の知識および専門技術を伴うような要因によって変化する。
【０３３０】
ウイルス、ＶＬＰ、またはフソソームに関連して本明細書で使用される「外因性薬剤」は、対応する野生型ウイルスまたは対応する野生型供給源細胞から作製されたフソゲンによって含まれず、コードされない薬剤を指す。いくつかの実施形態において、外因性薬剤は、天然由来タンパク質と比較して（例えば、挿入、欠失、または置換によって）変異される配列を有するタンパク質または核酸など、天然に存在しない。いくつかの実施形態では、外因性薬剤は、供給源細胞に天然に存在しない。いくつかの実施形態において、外因性薬剤は、供給源細胞に天然に存在するが、ウイルスにとって外因性である。いくつかの実施形態では、外因性薬剤は、レシピエント細胞に天然に存在しない。いくつかの実施形態では、外因性薬剤は、レシピエント細胞に天然に存在するが、所望のレベルまたは所望の期間で存在しない。いくつかの実施形態において、外因性薬剤は、ＲＮＡまたはタンパク質を含む。
【０３３１】
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに好適であり、合理的な利益／リスク比に見合う、賦形剤、組成物、および／または剤形を指す。
【０３３２】
本明細書で使用される場合、「ポジティブ標的細胞特異的調節エレメント」（またはポジティブＴＣＳＲＥ）は、非標的細胞と比較して標的細胞における外因性薬剤のレベルを増加させる核酸配列を指し、外因性薬剤をコードする核酸は、ポジティブＴＣＳＲＥと操作可能に連結される。いくつかの実施形態において、ポジティブＴＣＳＲＥは機能的核酸配列であり、例えば、ポジティブＴＣＳＲＥはプロモーターまたはエンハンサーを含むことができる。いくつかの実施形態において、ポジティブＴＣＳＲＥは機能的ＲＮＡ配列をコードし、例えば、ポジティブＴＣＳＲＥは、標的細胞におけるＲＮＡの正しいスプライシングを促進するスプライス部位をコードすることができる。いくつかの実施形態において、ポジティブＴＣＳＲＥは、機能的なタンパク質配列をコードし、またはポジティブＴＣＳＲＥは、タンパク質の正しい翻訳後改変を促進するタンパク質配列をコードすることができる。いくつかの実施形態では、ポジティブＴＣＳＲＥは、外因性薬剤のダウンレギュレーターまたは阻害剤のレベルまたは活性を減少させる。
【０３３３】
本明細書で使用される場合、「ネガティブ標的細胞特異的調節エレメント」（またはネガティブＴＣＳＲＥ）は、標的細胞と比較して非標的細胞における外因性薬剤のレベルを減少させる核酸配列を指し、外因性薬剤をコードする核酸は、ネガティブＴＣＳＲＥに操作可能に連結される。いくつかの実施形態において、ネガティブＴＣＳＲＥは機能的核酸配列、例えば、非標的細胞においてレトロウイルス核酸の分解または阻害を生じるｍｉＲＮＡ認識部位である。いくつかの実施形態において、核酸配列は機能的ＲＮＡ配列をコードし、例えば、核酸は、外因性タンパク質剤をコードするｍＲＮＡに存在するｍｉＲＮＡ配列をコードし、それによってｍＲＮＡが非標的細胞において分解または阻害される。いくつかの実施形態において、ネガティブＴＣＳＲＥは、外因性薬剤のダウンレギュレーターまたは阻害剤のレベルまたは活性を増加させる。
【０３３４】
本明細書で使用される場合、「非標的細胞特異的調節エレメント」（またはＮＴＣＳＲＥ）は、標的細胞と比較して非標的細胞における外因性薬剤のレベルを低下させる核酸配列を指し、外因性薬剤をコードする核酸はＮＴＣＳＲＥに操作可能に連結される。いくつかの実施形態において、ＮＴＣＳＲＥは、機能的核酸配列、例えば、非標的細胞においてレトロウイルス核酸の分解または阻害を生じるｍｉＲＮＡ認識部位である。いくつかの実施形態において、核酸配列は機能的ＲＮＡ配列をコードし、例えば、核酸は、外因性タンパク質剤をコードするｍＲＮＡに存在するｍｉＲＮＡ配列をコードし、それによってｍＲＮＡが非標的細胞において分解または阻害される。いくつかの実施形態において、ＮＴＣＳＲＥは、外因性薬剤のダウンレギュレーターまたは阻害剤のレベルまたは活性を増加させる。「ネガティブＴＣＳＲＥ」および「ＮＴＣＳＲＥ」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
【０３３５】
本明細書で使用される場合、「再標的化フソゲン」は、フソゲンの天然起源型の一部ではない配列を有する標的化部分を含むフソゲンを指す。実施形態において、フソゲンは、フソゲンの天然起源型における標的化部分と比べて、異なる標的化部分を含む。実施形態において、フソゲンの天然起源型は標的化ドメインを欠如し、再標的化フソゲンは、フソゲンの天然起源型に存在しない標的化部分を含む。実施形態において、フソゲンは、標的化部分を含むように改変される。実施形態において、フソゲンは、例えば、膜貫通ドメイン、融合形成的に活性なドメイン、または細胞質ドメインにおいて、フソゲンの天然起源型と比較して、標的化部分の外側に１つ以上の配列変化を含む。
【０３３６】
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス核酸」は、単独で、またはヘルパー細胞、ヘルパーウイルス、もしくはヘルパープラスミドと組み合わせて、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターにパッケージングするための少なくとも最小配列要求を含む核酸を指す。いくつかの実施形態において、レトロウイルス核酸はさらに、外因性薬剤、ポジティブ標的細胞特異的調節エレメント、非標的細胞特異的調節エレメント、またはネガティブＴＣＳＲＥを含み、またはコードする。いくつかの実施形態において、レトロウイルス核酸は、５’ＬＴＲ（例えば、統合を促進するため）、Ｕ３（例えば、ウイルスゲノムＲＮＡ転写を活性化するため）、Ｒ（例えば、Ｔａｔ−結合領域）、Ｕ５、３’ＬＴＲ（例えば、統合を促進するため）、パッケージング部位（例えば、ｐｓｉ（Ψ））、ＲＲＥ（例えば、Ｒｅｖに結合して核外輸送を促進するため）、のうちの１つ以上（例えば、すべて）を含む。レトロウイルス核酸は、ＲＮＡ（例えば、ビリオンの一部である場合）またはＤＮＡ（例えば、供給源細胞に導入されるとき、またはレシピエント細胞における逆転写後）を含むことができる。いくつかの実施形態において、レトロウイルス核酸は、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖのうちの１つ以上（例えば、すべて）を含むヘルパー細胞、ヘルパーウイルス、またはヘルパープラスミドを使用してパッケージングされる。
【０３３７】
本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、フソソーム（例えば、レンチウイルスベクター）が外因性薬剤を送達することが望まれるタイプの細胞を指す。実施形態では、標的細胞は、特定の組織タイプまたはクラスの細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、罹患細胞、例えば、癌細胞である。いくつかの実施形態において、フソゲン、例えば、再標的化フソゲン（単独で、またはポジティブＴＣＳＲＥ、ＮＴＣＳＲＥ、ネガティブＴＣＳＲＥ、もしくはそれらの任意の組み合わせと組み合わせて）は、非標的細胞と比べて、標的細胞への外因性薬剤の優先的送達をもたらす。
【０３３８】
本明細書で使用される場合、「非標的細胞」は、フソソーム（例えば、レンチウイルスベクター）が外因性薬剤を送達することが望まれないタイプの細胞を指す。いくつかの実施形態では、非標的細胞は、特定の組織タイプまたはクラスの細胞である。いくつかの実施形態において、非標的細胞は、非罹患細胞、例えば、非癌性細胞である。いくつかの実施形態において、フソゲン、例えば、再標的化フソゲン（単独で、またはポジティブＴＣＳＲＥ、ＮＴＣＳＲＥ、ネガティブＴＣＳＲＥ、もしくはそれらの任意の組み合わせと組み合わせて）は、標的細胞に比べて、非標的細胞への外因性薬剤の低下した送達をもたらす。
【０３３９】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療している」、または「治療」という用語は、疾患または障害を改善すること、例えば、疾患または障害、例えば、障害の根本原因またはその臨床症状のうちの少なくとも１つの発症を、遅延すること、または阻止すること、または低減することを指す。
【０３４０】
フソソーム、例えば、細胞由来フソソーム
フソソームは様々な形態をとることができる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるフソソームは、供給源細胞に由来する。フソソームは、例えば、細胞外小胞、微小胞、ナノ小胞、エキソソーム、アポトーシス小体（アポトーシス細胞由来）、微粒子（例えば、血小板から派生され得る）、エクトソーム（例えば、血清中の好中球および単球から派生可能である）、プロスタトソーム（前立腺癌細胞から得られる）、カルディオソーム（心臓細胞から得られる）、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、フソソームは供給源細胞から自然に放出され、いくつかの実施形態では、供給源細胞は、フソソームの形成を増強するように処理される。いくつかの実施形態では、フソソームは、直径が約１０〜１０，０００ｎｍ、例えば、直径が約３０〜１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、フソソームは、１つ以上の合成脂質を含む。
【０３４１】
いくつかの実施形態において、フソソームは、ウイルス、例えば、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスであり、またはそれらを含む。いくつかの実施形態において、脂質二重層を含むフソソームは、エンベロープを含むレトロウイルスベクターを含む。例えば、いくつかの実施形態において、両親媒性脂質のフソソームの二重層は、ウイルスエンベロープであり、またはそれらを含む。ウイルスエンベロープは、フソゲン、例えば、ウイルスに内因性であるフソゲンまたは偽型フソゲンを含み得る。いくつかの実施形態において、フソソームの内腔または空洞は、ウイルス核酸、例えば、レトロウイルス核酸、例えば、レンチウイルス核酸を含む。ウイルス核酸はウイルスゲノムであり得る。いくつかの実施形態において、フソソームはさらに、例えば、その空洞または内腔内に、１つ以上のウイルス非構造タンパク質を含む。
【０３４２】
フソソームは、例えば、所望の導入遺伝子または外因性薬剤などのペイロードの標的細胞への送達を容易にする様々な特性を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、フソソームおよび供給源細胞は共に、標的細胞と融合することができる粒子を作製するのに十分な核酸（複数可）を含む。実施形態において、これらの核酸（複数可）は、ｇａｇポリタンパク質活性、ポリメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、プロテアーゼ活性、およびフソゲン活性である活性のうちの１つ以上（例えば、すべて）を有するタンパク質をコードする。
【０３４３】
フソソームはまた、標的細胞へのペイロードの送達を容易にする様々な構造を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、フソソーム（例えば、ウイルス、例えば、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス）は、ｇａｇポリタンパク質、ポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ）、インテグラーゼ（例えば、機能的または非機能的変異体）、プロテアーゼ、およびフソゲンであるタンパク質のうちの１つ以上（例えば、すべて）を含む。いくつかの実施形態では、フソソームはさらにｒｅｖを含む。いくつかの実施形態では、上記タンパク質のうちの１つ以上はレトロウイルスゲノムにコードされ、いくつかの実施形態では、上記タンパク質のうちの１つ以上は、例えば、ヘルパー細胞、ヘルパーウイルス、またはヘルパープラスミドによる導入で提供される。いくつかの実施形態において、フソソーム核酸（例えば、レトロウイルス核酸）は、５’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能的Ｕ３ドメインを欠如している）、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）、ペイロード遺伝子と操作可能に連結される中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）プロモーター、ペイロード遺伝子（任意にオープンリーディングフレームの前にイントロンを含む）、ポリＡテール配列、ＷＰＲＥ、および３’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能的Ｕ３を欠如している）である核酸配列のうちの１つ以上（例えば、すべて）を含む。いくつかの実施形態において、フソソーム核酸（例えば、レトロウイルス核酸）はさらも、１つ以上のインスレーターエレメントを含む。いくつかの実施形態において、フソソーム核酸（例えば、レトロウイルス核酸）はさらに、１つ以上のｍｉＲＮＡ認識部位を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ認識部位のうちの１つ以上は、ポリＡテール配列の下流、例えば、ポリＡテール配列とＷＰＲＥとの間に位置する。
【０３４４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるフソソームは、対象、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトに投与される。そのような実施形態では、対象は、特定の疾患または状態（例えば、本明細書に記載の疾患または状態）のリスクがあり得、症状を有し得、あるいは有すると診断または特定され得る。一実施形態では、対象は癌を有する。一実施形態では、対象は感染症を有する。いくつかの実施形態において、フソソームは、疾患または状態を治療するための外因性薬剤をコードする核酸配列を含む。
【０３４５】
レンチウイルス成分およびヘルパー細胞
いくつかの実施形態において、レトロウイルス核酸は、５’プロモーター（例えば、パッケージされたＲＮＡ全体の発現を制御するため）、５’ＬＴＲ（例えば、Ｒ（ポリアデニル化テールシグナル）および／またはプライマー活性化シグナルを含むＵ５）、プライマー結合部位、ｐｓｉパッケージングシグナル、核外輸送のためのＲＲＥエレメント、導入遺伝子の発現を制御するために導入遺伝子のすぐ上流であるプロモーター、導入遺伝子（または他の外因性薬剤エレメント）、ポリプリントラクト、および３’ＬＴＲ（例えば、変異したＵ３、Ｒ、およびＵ５を含む）のうちの１つ以上（例えば、すべて）を含む。いくつかの実施形態において、レトロウイルス核酸はさらに、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥ、および／またはインスレーターエレメントのうちの１つ以上を含む。
【０３４６】
レトロウイルスは通常、そのゲノムＲＮＡを逆転写によって線状の二本鎖ＤＮＡコピーに複製し、続いてそのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合によって統合する。特定の実施形態での使用に好適な例示的なレトロウイルスには、限定されないが、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーネズミ肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイネズミ肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、ネズミ乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプマウイルス、フレンドネズミ白血病ウイルス、ネズミ幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、ならびにレンチウイルスが含まれる。
【０３４７】
いくつかの実施形態では、レトロウイルスはガムレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスはイプシロンレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスはアルファレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスはベータレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスはデルタレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスはレンチウイルスである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、スプマレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスは内在性レトロウイルスである。
【０３４８】
例示的なレンチウイルスには、限定されないが、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）、ビスナ・マウディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＨＩＶをベースとした骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が使用される。
【０３４９】
いくつかの実施形態では、本明細書におけるベクターは、別の核酸分子を移行または輸送することができる核酸分子である。移行された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結、例えば、それらに挿入される。ベクターは、細胞内で自律複製を指示する配列を含み得、または宿主細胞ＤＮＡへの統合を可能にするのに十分な配列を含み得る。有用なベクターには、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターが含まれる。有用なウイルスベクターには、例えば、複製欠損性レトロウイルスおよびレンチウイルスが含まれる。
【０３５０】
ウイルスベクターは、例えば、核酸分子の転移または細胞のゲノムもしくは核酸転移を媒介するウイルス粒子への統合を一般的に促進するウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、転移プラスミド）を含み得る。ウイルス粒子は、通常、核酸（複数可）に加えて、様々なウイルス成分、およびまたしばしば宿主細胞成分を含む。ウイルスベクターは、例えば、核酸を細胞に、または転移された核酸（例えば、裸のＤＮＡとして）に移行することができるウイルスまたはウイルス粒子を含むことができる。ウイルスベクターおよびトランスファープラスミドは、主にウイルスに由来する構造的および／または機能的遺伝子エレメントを含むことができる。レトロウイルスベクターは、構造的および機能的遺伝子エレメント、またはそれらの部分を含むウイルスベクターまたはプラスミドを含むことができ、主にレトロウイルスに由来する。レンチウイルスベクターは、構造的および機能的遺伝的要素、またはそれらの部分を含むウイルスベクターまたはプラスミドを含むことができ、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含む。
【０３５１】
実施形態において、レンチウイルスベクター（例えば、レンチウイルス発現ベクター）は、レンチウイルス転移プラスミド（例えば、裸のＤＮＡとして）または感染性レンチウイルス粒子を含み得る。クローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸などのエレメントに関して、これらのエレメントの配列は、レンチウイルス粒子中にＲＮＡ形態で存在することができ、ＤＮＡプラスミド中にＤＮＡ形態で存在することができることが理解されるべきである。
【０３５２】
本明細書で説明されるいくつかのベクターでは、複製に寄与し、または複製に必須である１つ以上のタンパク質コード領域の少なくとも一部が、対応する野生型ウイルスと比較して不在であり得る。これがウイルスベクター複製欠損をもたらす。いくつかの実施形態において、ベクターは、標的の非分裂宿主細胞を形質導入すること、および／またはそのゲノムを宿主ゲノムに統合することが可能である。
【０３５３】
野生型レトロウイルスゲノムの構造は、しばしば、５’長末端反復（ＬＴＲ）および３’ＬＴＲを含み、その間または内部に、ゲノムのパッケージングを可能にするパッケージングシグナル、プライマー結合部位、宿主ゲノムへの統合を可能にする統合部位、ならびにウイルス粒子の集合を促進するパッケージング成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含む。より複雑なレトロウイルスは、ＨＩＶにおけるｒｅｖおよびＲＲＥ配列などの追加の特性を有し、統合されたプロウイルスのＲＮＡ転写物の、核から感染標的細胞の細胞質への効率的な輸送を可能にする。プロウイルスでは、ウイルス遺伝子は長末端反復（ＬＴＲ）と呼ばれる領域によって両端でフランキングされる。ＬＴＲは、プロウイルスの統合および転写に含まれる。ＬＴＲはまた、エンハンサー−プロモーター配列としても機能し、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。レトロウイルスＲＮＡのカプシド形成は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するｐｓｉ配列によって生じる。
【０３５４】
ＬＴＲ自体は通常、類似した（例えば、同一の）配列であり、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と呼ばれる３つのエレメントに分けることができる。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に固有である配列に由来する。ＲはＲＮＡの両端で反復される配列に由来し、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に固有である配列に由来する。３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルス間でかなり変化し得る。
【０３５５】
ウイルスゲノムの場合、転写開始部位は通常、１つのＬＴＲにおけるＵ３とＲの間の境界にあり、ポリ（Ａ）付加（末端）部位は他方のＬＴＲにおけるＲとＵ５の間の境界にある。Ｕ３は、プロウイルスの転写制御エレメントのほとんどを含み、細胞の、いくつかの例では、ウイルスの、転写アクチベータータンパク質に応答するプロモーターおよび多数のエンハンサー配列が含まれる。いくつかのレトロウイルスは、遺伝子発現の調節に含まれるタンパク質をコードする遺伝子である、ｔｏｔ、ｒｅｖ、ｔａｘ、およびｒｅｘのうちのいずれか１つ以上を含む。
【０３５６】
構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖそれら自体に関し、ｇａｇはウイルスの内部構造タンパク質をコードする。Ｇａｇタンパク質は、タンパク質分解によって、成熟タンパク質ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（カプシド）、およびＮＣ（ヌクレオカプシド）にまで処理される。ｐｏｌ遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼ、関連するＲＮａｓｅＨ、およびインテグラーゼ（ＩＮ）を含む逆転写酵素（ＲＴ）をコードし、ゲノムの複製を媒介する。ｅｎｖ遺伝子は、細胞受容体タンパク質と特異的に相互作用する複合体を形成する、ビリオンの表面（ＳＵ）糖タンパク質および膜貫通（ＴＭ）タンパク質をコードする。この相互作用は、例えばウイルス膜と細胞膜との融合によって、感染を促進する。
【０３５７】
複製欠損レトロウイルスベクターゲノムでは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖは不在であり得、または機能的でないことがあり得る。ＲＮＡの両端でのＲ領域は、通常、反復配列である。Ｕ５およびＵ３は、それぞれＲＮＡゲノムの５’末端および３’末端にある固有の配列を表す。
【０３５８】
レトロウイルスはまた、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ以外のタンパク質をコードする追加の遺伝子を含み得る。追加の遺伝子の例には、（ＨＩＶにおいて）、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、およびｎｅｆのうちの１つ以上が含まれる。ＥＩＡＶは（とりわけ）追加の遺伝子Ｓ２を有する。追加の遺伝子によってコードされるタンパク質は様々な機能を果たし、そのいくつかは細胞タンパク質によってもたらされる機能と重複し得る。ＥＩＡＶでは、例えば、ｔａｔはウイルスＬＴＲの転写アクチベーターとして機能する（ＤｅｒｓｅおよびＮｅｗｂｏｌｄ  １９９３  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９４：５３０−６、Ｍａｕｒｙら、１９９４  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００：６３２−４２）。それはＴＡＲと呼ばれる安定したステムループＲＮＡ二次構造と結合する。Ｒｅｖは、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を介してウイルス遺伝子の発現を調節および調整する（Ｍａｒｔａｒａｎｏら、１９９４Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３１０２−１１）。これら２つのタンパク質の作用機序は、霊長類ウイルスにおける類似の機序とおおむね同様であると考えられる。さらに、ＥＩＡＶタンパク質であるＴｔｍは、膜貫通タンパク質の開始時にｅｎｖコード配列にスプライシングされたｔａｔの最初のエクソンによってコードされることが特定されている。
【０３５９】
プロテアーゼ、逆転写酵素、およびインテグラーゼに加えて、非霊長類レンチウイルスは、ｄＵＴＰアーゼをコードする４番目のｐｏｌ遺伝子産物を含む。これは、特定の非分裂細胞またはゆっくり分裂する細胞型に感染するこれらのレンチウイルスの能力において役割を果たし得る。
【０３６０】
実施形態において、組換えレンチウイルスベクター（ＲＬＶ）は、パッケージング成分の存在下で、標的細胞に感染することができるウイルス粒子へのＲＮＡゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なレトロウイルス遺伝情報を有するベクターである。標的細胞の感染は、逆転写および標的細胞ゲノムへの統合を含むことができる。ＲＬＶは通常、ベクターによって標的細胞に送達される非ウイルスコード配列を有する。実施形態では、ＲＬＶは、標的細胞内で感染性レトロウイルス粒子を生成するための独立した複製能力がない。通常、ＲＬＶは機能的なｇａｇ−ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ遺伝子および／または複製に関与する他の遺伝子を欠如している。ベクターは、スプリットイントロンベクターとして、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願第ＷＯ９９／１５６８３号に記載されているように、構成され得る。
【０３６１】
いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、最小のウイルスゲノムを含み、例えば、ウイルスベクターは、感染、形質導入、および標的宿主細胞に目的のヌクレオチド配列を送達するために必要とされる機能性を得るために、非必須エレメントを取り除いて必須エレメントを保持するように操作されており、例えば、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ９８／１７８１５に記載されている。
【０３６２】
最小のレンチウイルスゲノムは、例えば、（５’）Ｒ−Ｕ５−１つ以上の第１のヌクレオチド配列−Ｕ３−Ｒ（３’）を含み得る。しかし、供給源細胞内でレンチウイルスゲノムを生成するために使用されるプラスミドベクターはまた、供給源細胞内のゲノムの転写を指示するためにレンチウイルスゲノムに操作可能に連結される転写調節制御配列を含むことができる。これらの調節配列は、転写化レトロウイルス配列、例えば５’Ｕ３領域に関連する天然配列を含み得、またはそれらは、別のウイルスプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターなどの異種プロモーターを含み得る。いくつかのレンチウイルスゲノムは、効率的なウイルス生成を促進する追加の配列を含む。例えば、ＨＩＶの場合、ｒｅｖおよびＲＲＥ配列が含まれ得る。これに代えて、または組み合わせて、コドン最適化が使用され得、例えば、外因性薬剤をコードする遺伝子は、例えば、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０１／７９５１８に記載されるように、コドン最適化され得る。ｒｅｖ／ＲＲＥ系と同様または同じ機能を実施する代替配列も使用され得る。例えば、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の機能的類似体は、マソン・ファイザーサルウイルスに認められる。これはＣＴＥとして知られており、感染した細胞における因子と相互作用すると考えられるゲノム内のＲＲＥタイプの配列を含む。細胞因子は、ｒｅｖ類似体として考えることができる。したがって、ＣＴＥはｒｅｖ／ＲＲＥ系の代替として使用され得る。さらに、ＨＴＬＶ−ＩのＲｅｘタンパク質は、ＨＩＶ−ＩのＲｅｖタンパク質を機能的に置き換えることができる。ＲｅｖおよびＲｅｘはＩＲＥ−ＢＰと同様な効果を有する。
【０３６３】
いくつかの実施形態において、レトロウイルス核酸（例えば、レンチウイルス核酸、例えば、霊長類または非霊長類レンチウイルス核酸）は、（１）ｇａｇにおける欠失が、ｇａｇコード配列の約３５０〜３５４ヌクレオチドの下流である１つ以上のヌクレオチドを取り除いた、欠失したｇａｇ遺伝子を含み、（２）レトロウイルス核酸に存在しない１つ以上のアクセサリー遺伝子を有し、（３）ｔａｔ遺伝子を欠如しているが、５’ＬＴＲの端とｇａｇのＡＴＧの間にリーダー配列を含み、ならびに（４）（１）、（２）、および（３）の組み合わせである。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、特性（１）と（２）と（３）のすべてを含む。この戦略は、ＷＯ９９／３２６４６でさらに詳細に記載され、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３６４】
いくつかの実施形態において、霊長類レンチウイルス最小系は、ベクター生成または分裂細胞および非分裂細胞のトランスダクションのいずれかのために、ＨＩＶ／ＳＩＶ追加遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、およびｎｅｆのいずれも必要としない。いくつかの実施形態において、ＥＩＡＶ最小ベクター系は、ベクター生成または分裂細胞および非分裂細胞の形質導入のいずれもＳ２を必要としない。
【０３６５】
追加の遺伝子の削除は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）感染症における疾患と関連する遺伝子を伴わずにベクターを生成することを可能にし得る。特に、ｔａｔは疾患と関連している。第二に、追加の遺伝子の削除は、ベクターがより異種のＤＮＡをパッケージ化することを可能にする。第三に、Ｓ２などの機能が不明な遺伝子を省略して、それによって望ましくない影響を生じるリスクを低減し得る。最小レンチウイルスベクターの例は、ＷＯ９９／３２６４６およびＷＯ９８／１７８１５に開示されている。
【０３６６】
いくつかの実施形態において、レトロウイルス核酸は、少なくともｔａｔおよびＳ２（ＥＩＡＶベクター系である場合）、そしておそらくｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ、およびｎｅｆも欠いている。いくつかの実施形態において、レトロウイルス核酸はまた、ｒｅｖ、ＲＲＥ、またはその両方を欠いている。
【０３６７】
いくつかの実施形態において、レトロウイルス核酸はｖｐｘを含む。Ｖｐｘポリペプチドは、細胞質内の遊離ｄＮＴＰを分解するＳＡＭＨＤ１制限因子と結合してその分解を誘導する。したがって、ＶｐｘがＳＡＭＨＤ１を分解して細胞質内の遊離ｄＮＴＰの濃度が増加し、逆転写活性が増加され、そのためレトロウイルスゲノムの逆転写および標的細胞ゲノムへの統合を促進する。
【０３６８】
異なる細胞では、特定のコドンのそれらの使用法が異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的な量におけるバイアスに対応する。配列におけるコドンを変更することによって、それらは対応するｔＲＮＡの相対的な量と一致するように調整され、それによって発現を増加させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型にまれであることが知られているコドンを意図的に選択することによって、発現を減少させることが可能である。したがって、追加レベルの翻訳制御が利用可能である。コドン最適化の追加の説明は、例えば、ＷＯ９９／４１３９７に認められ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３６９】
ＨＩＶおよび他のレンチウイルスを含む多くのウイルスは、多数のまれなコドンを使用し、これらを一般的に使用される哺乳動物のコドンに対応するように変更することによって、哺乳動物のプロデューサー細胞におけるパッケージング成分の増加した発現を達成することができる。
【０３７０】
コドン最適化は多くの他の利点を有する。それらの配列の変化によって、パッケージング成分をコードするヌクレオチド配列は、それらから減少または排除されるＲＮＡ不安定性配列（ＩＮＳ）を有し得る。同時に、パッケージング成分のアミノ酸配列コード配列が保持され、それによって、配列によってコードされるウイルス成分は、パッケージング成分の機能が損なわれないものと同一または少なくとも十分同様に保持される。いくつかの実施形態では、コドン最適化はまた、輸送のためのＲｅｖ／ＲＲＥ要件を克服し、最適化された配列をＲｅｖに依存しないようにする。いくつかの実施形態において、コドン最適化はまた、ベクター系内の異なる構築体間の相同組換えを低減する（例えば、ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖオープンリーディングフレームにおける重複領域間）。いくつかの実施形態において、コドン最適化は、ウイルス力価の増加および／または改善された安全性をもたらす。
【０３７１】
いくつかの実施形態では、ＩＮＳに関連するコドンのみがコドン最適化される。他の実施形態では、配列は、ｇａｇ−ｐｏｌのフレームシフト部位を包含する配列を除いて、それらの全体でコドン最適化される。
【０３７２】
ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子は、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質をコードする２つの重複するリーディングフレームを含む。両タンパク質の発現は、翻訳中にフレームシフトに依存する。このフレームシフトは、翻訳中にリボソームの「滑り」の結果として発生する。この滑りは、少なくとも部分的にはリボソームを失速させるＲＮＡの二次構造によって引き起こされると考えられる。このような二次構造は、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子におけるフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶの場合、重複領域は、ｇａｇの始まりの下流のヌクレオチド１２２２位（ヌクレオチド１はｇａｇＡＴＧのＡ）からｇａｇの終わり（ｎｔ１５０３）まで伸長する。結果として、フレームシフト部位および２つのリーディングフレームの重複領域にまたがる２８１ｂｐフラグメントは、好ましくは、コドン最適化されない。いくつかの実施形態において、このフラグメントを保持することは、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質のより効率的な発現を可能にする。ＥＩＡＶの場合、重複の始まりはｎｔ１２６２である（ヌクレオチド１位はｇａｇＡＴＧのＡである）。重複の終わりはｎｔ１４６１である。フレームシフト部位およびｇａｇ−ｐｏｌの重複が維持されることを確実にするために、野生型配列がｎｔ１１５６〜１４６５まで保持され得る。
【０３７３】
例えば、都合の良い制限部位に適応するために、最適なコドン使用から誘導させ得、保存的アミノ酸変化をｇａｇ−ｐｏｌタンパク質に導入し得る。
【０３７４】
いくつかの実施形態では、コドン最適化は、哺乳動物系における低いコドン使用を有するコドンに基づいている。３番目ならびに時々２番目および３番目の塩基が変化され得る。
【０３７５】
遺伝暗号の縮退性のため、多くのｇａｇ−ｐｏｌ配列が当業者によって達成することができることが理解されよう。また、コドン最適化されたｇａｇ−ｐｏｌ配列を生成するための開始点として使用することができる多くの報告されたレトロウイルス変異体がある。レンチウイルスのゲノムはかなり可変的であり得る。例えば、依然として機能的であるＨＩＶ−Ｉの多くの準種がある。これはまたＥＩＡＶにも当てはまる。これらの変異体は、形質導入プロセスの特定の部分を増強するために使用され得る。ＨＩＶ−Ｉ変異体の例は、ロスアラモス国立研究所によって維持されるＨＩＶデータベースに認められ得る。ＥＩＡＶクローンの詳細は、国立衛生研究所によって維持されるＮＣＢＩデータベースで認められ得る。
【０３７６】
コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ配列のための戦略は、いずれかのレトロウイルス、例えば、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ−Ｉ、およびＨＩＶ−２と関連して使用することができる。さらに、この方法は、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶ、およびヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ＭＬＶ、ならびに他のレトロウイルスからの遺伝子の発現を増加させるために使用することができる。
【０３７７】
上記のように、レトロウイルスベクターのためのパッケージング成分は、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の発現生成物を含むことができる。さらに、パッケージングは、４つのステムループの短配列、それに続くパッケージングシグナルとしてｇａｇおよびｅｎｖからの部分的配列を使用することができる。したがって、レトロウイルスベクターゲノムにおける削除されたｇａｇ配列の包含（パッケージング構築体における完全なｇａｇ配列に加えて）を使用することができる。実施形態において、レトロウイルスベクターは、依然としてｅｎｖ配列を保持するベクター中のｇａｇの２５５から３６０ヌクレオチド、またはスプライスドナー突然変異である、ｇａｇおよびｅｎｖ欠失の特定の組み合わせにおけるｇａｇの約４０ヌクレオチドを含むパッケージングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、１つ以上の欠失を含むｇａｇ配列を含み、例えば、ｇａｇ配列は、Ｎ末端に由来する約３６０ヌクレオチドを含む。
【０３７８】
レトロウイルスベクター、ヘルパー細胞、ヘルパーウイルス、またはヘルパープラスミドは、レトロウイルスの構造およびアクセサリータンパク質、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、もしくはｎｅｆタンパク質、または他のレトロウイルスタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、レトロウイルスタンパク質は、同じレトロウイルスに由来する。いくつかの実施形態において、レトロウイルスタンパク質は、２つ以上のレトロウイルス、例えば、２、３、４つ以上のレトロウイルスに由来する。
【０３７９】
ｇａｇおよびｐｏｌコード配列は、一般に、ネイティブレンチウイルスにおけるＧａｇ−Ｐｏｌ前駆体として編成される。ｇａｇ配列は、ｐ５５とも呼ばれる５５ｋＤのＧａｇ前駆体タンパク質をコードする。ｐ５５は、ＭＡ（マトリックス［ｐ１７］）、ＣＡ（カプシド［ｐ２４］）、ＮＣ（ヌクレオカプシド［ｐ９］）、およびｐ６と呼ばれる４つの小さいタンパク質に成熟するプロセス中に、ウイルスにコードされたプロテアーゼ４（ｐｏｌ遺伝子の生成物）によって切断される。ｐｏｌ前駆体タンパク質は、ウイルスにコードされたプロテアーゼによってＧａｇから切断して離され、さらに消化されて、プロテアーゼ（ｐ１０）、ＲＴ（ｐ５０）、ＲＮアーゼＨ（ｐ１５）、およびインテグラーゼ（ｐ３１）の活性を分離する。
【０３８０】
ネイティブＧａｇ−Ｐｏｌ配列は、ヘルパーベクター（例えば、ヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルス）で利用することができ、改変が加えられ得る。これらの改変には、ＧａｇおよびＰｏｌ配列が異なるウイルス（例えば、異なる種、亜種、株、クレードなど）から得られるキメラＧａｇ−Ｐｏｌ、および／または配列は転写および／または翻訳を改善するため、および／または組換えと低下するために改変されている配列を含む。
【０３８１】
様々な例において、レトロウイルス核酸は、（ｉ）野生型ＩＮＳ１と比較してＲＮＡの核外輸送の制限を低減する変異ＩＮＳ１阻害配列を含み、（ｉｉ）フレームシフトおよび早期終結をもたらす２つのヌクレオチド挿入を含み、および／または（ｉｉｉ）ｇａｇのＩＮＳ２、ＩＮＳ３、およびＩＮＳ４阻害配列を含まない、ｇａｇタンパク質の１５０〜２５０（例えば、１６８）ヌクレオチド部分をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３８２】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるベクターは、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）配列および非レンチウイルス配列の両方を含むハイブリッドベクターである。いくつかの実施形態において、ハイブリッドベクターは、逆転写、複製、統合、および／またはパッケージングのためのレトロウイルス、例えばレンチウイルスの配列を含む。
【０３８３】
特定の具体的な実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列のほとんどまたはすべては、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１に由来する。しかし、レトロウイルスおよび／またはレンチウイルス配列の多くの異なる供給源を使用、または組み合わせることができ、特定のレンチウイルス配列における多数の置換および変更が、本明細書で説明される機能を実施する移行ベクターの能力を損なうことなく適応され得ることが理解される。様々なレンチウイルスベクターがＮａｌｄｉｎｉら（１９９６ａ、１９９６ｂ、および１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７）、Ｄｕｌｌら、１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号、および同第５，９９４，１３６号に記載されており、それらの多くはレトロウイルス核酸を生成するために適応され得る。
【０３８４】
プロウイルスの両端には、通常、長末端反復（ＬＴＲ）が認められる。ＬＴＲは通常、レトロウイルス核酸の末端に位置するドメインを含み、これらの天然配列の関連で、直接反復であり、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域を含む。ＬＴＲは一般に、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、遺伝子転写物の促進、開始、およびポリアデニル化）およびウイルス複製を促進する。ＬＴＲは多数の調節シグナルを含むことができ、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナル、およびウイルスゲノムの複製と統合のための配列が含まれる。ウイルスのＬＴＲは通常、Ｕ３、Ｒ、Ｕ５と呼ばれる３つの領域に分けられる。Ｕ３領域に通常、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含む。Ｕ５領域は通常、プライマー結合部位とＲ領域の間の配列であり、ポリアデニル化配列を含むことができる。Ｒ（リピート）領域は、Ｕ３およびＵ５領域によってフランキングされ得る。ＬＴＲは通常、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域から構成され、ウイルスゲノムの５’および３’末端の両方に出現することができる。いくつかの実施形態では、５’ＬＴＲに隣接して、ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）および粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なパッケージング（Ｐｓｉ部位）のための配列がある。
【０３８５】
パッケージングシグナルは、ウイルスカプシドまたは粒子へのウイルスＲＮＡの挿入を媒介するレトロウイルスゲノム内に位置する配列を含むことができ、例えば、Ｃｌｅｖｅｒら、１９９５．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのカプシド形成のために最小限のパッケージングシグナル（ｐｓｉ［Ψ］配列）を使用する。
【０３８６】
様々な実施形態において、レトロウイルス核酸は、改変された５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲを含む。ＬＴＲのいずれかまたは両方は、１つ以上の改変を含み得、限定されないが、１つ以上の欠失、挿入、または置換が含まれる。３’ＬＴＲの改変は、ウイルスを複製欠損、例えば、感染性ビリオンが生成されないように完全で有効な複製ができないウイルス（例えば、複製欠損レンチウイルスの子孫）にすることによって、レンチウイルスまたはレトロウイルス系の安全性を改善するすることがしばしば行われる。
【０３８７】
いくつかの実施形態において、ベクターは、自己不活性化（ＳＩＮ）ベクター、例えば、複製欠損ベクター、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターであり、Ｕ３領域として知られる右（３’）ＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域が、ウイルス複製の初回を超えてウイルス転写を防ぐように改変（例えば、欠失または置換によって）されている。これは、ウイルス複製の際に右（３’）ＬＴＲ  Ｕ３領域が左（５’）ＬＴＲ  Ｕ３領域のテンプレートとして使用され得、したがってＵ３エンハンサープロモーターの不在によってウイルス複製が阻害されるためである。実施形態において、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が除去、変更、または、例えば、外因性ポリ（Ａ）配列によって置換されるように改変され、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’および５’の両ＬＴＲは、改変されたＬＴＲである得る。
【０３８８】
いくつかの実施形態において、５’ＬＴＲのＵ３領域は、ウイルス粒子の生成の際にウイルスゲノムの転写を推進するために異種プロモーターによって置換される。使用することができる異種プロモーターの例には、例えば、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、即時初期）、モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが含まれる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、Ｔａｔ非依存的様式で高レベルの転写を推進することができる。特定の実施形態において、異種プロモーターは、ウイルスゲノムが転写される様式を制御する追加の利点を有する。例えば、異種プロモーターは誘導性であり得、これによってウイルスゲノムの全部または一部の転写が、誘導要因が存在する場合にのみ生じる。誘導要因には、限定されないが、１つ以上の化合物、および宿主細胞が培養される温度またはｐＨなどの生理学的条件が含まれる。
【０３８９】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、例えば、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）ＬＴＲのＲ領域に位置する、ＴＡＲ（トランス活性化応答）エレメントを含む。このエレメントは、レンチウイルストランスアクチベーター（ｔａｔ）遺伝子エレメントと相互作用して、ウイルス複製を高める。しかし、このエレメントは、例えば、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターによって置換される実施形態では必要とされない。
【０３９０】
Ｒ領域、例えば、キャッピング基の開始（すなわち、転写の開始）で始まり、ポリＡトラクトの開始の直前に終了するレトロウイルスＬＴＲ内の領域は、Ｕ３およびＵ５領域によってフランキングされ得る。Ｒ領域は、ゲノムの一方の端から他方の端への新生ＤＮＡの移送における逆転写の際に役割を演じる。
【０３９１】
レトロウイルス核酸はまた、ＦＬＡＰエレメント、例えば、配列がレトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の中央ポリプリントラクトおよび中央終結配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸、を含むことができる。好適なＦＬＡＰエレメントは、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕら、２０００、Ｃｅｌｌ、１０１：１７３に記載されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＨＩＶ−１逆転写の際、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）でのプラス鎖ＤＮＡの中央開始と、中央終結配列（ＣＴＳ）での中央終結は、３本鎖ＤＮＡ構造：ＨＩＶ−１中央ＤＮＡフラップの形成をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクター骨格は、外因性薬剤をコードする遺伝子の上流または下流に１つ以上のＦＬＡＰエレメントを含む。例えば、いくつかの実施形態において、トランスファープラスミドは、ＦＬＡＰエレメント、例えば、ＨＩＶ−１から派生または単離されたＦＬＡＰエレメントを含む。
【０３９２】
実施形態において、レトロウイルスまたはレンチウイルス核酸は、１つ以上の輸送エレメント、例えば、核から細胞の細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを含む。ＲＮＡ輸送エレメントの例には、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎら、１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３、およびＣｕｌｌｅｎら、１９９１．Ｃｅｌｌ  ５８：４２３を参照）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が含まれ、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。一般に、ＲＮＡ輸送エレメントは遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１つまたは多数のコピーとして挿入され得る。
【０３９３】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節エレメント、ポリアデニル化部位、および転写終結シグナルのうちの１つ以上、例えば、それらのすべてをベクターに組み込むことによって増加する。様々な転写後調節エレメントは、タンパク質での異種核酸、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）、（Ｌｉｕら，１９９５、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１７６６）などの発現を増加させることができ、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるレトロウイルス核酸は、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントを含む。
【０３９４】
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるレトロウイルス核酸は、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントを欠如し、または含まない。
【０３９５】
異種核酸転写物の終結およびポリアデニル化を指示するエレメントは、例えば、外因性薬剤の発現を増加させるために含まれ得る。転写終結シグナルは、ポリアデニル化シグナルの下流に認められえる。いくつかの実施形態において、ベクターは外因性薬剤をコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。ポリＡ部位は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を含み得る。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加によってｍＲＮＡの安定性を促進して、翻訳効率の増加に寄与することができる。レトロウイルス核酸で使用することができるポリＡシグナルの実例には、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ、ウシ成長ホルモンｐｏｌｙＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または別の好適な異種または内因性ポリＡ配列が含まれる。
【０３９６】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターは、１つ以上のインスレーターエレメント、例えば、本明細書で説明されるインスレーターエレメントをさらに含む。
【０３９７】
様々な実施形態において、ベクターは、外因性薬剤をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターを含む。ベクターは、１つ以上のＬＴＲを有し得、いずれかのＬＴＲは、ヌクレオチド置換、付加、または欠失などの１つ以上の改変を含む。ベクターはさらに、形質導入効率を増加させる１つ以上のアクセサリーエレメント（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスパッケージング（例えば、Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）、および／または外因性遺伝子発現を増加させる他のエレメント（例えば、ポリ（Ａ）配列）を含み得、任意にＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含み得る。
【０３９８】
いくつかの実施形態において、レンチウイルス核酸は、１つ以上、例えば、５’から３’まで、プロモーター（例えば、ＣＭＶ）、Ｒ配列（例えば、ＴＡＲを含む）、Ｕ５配列（例えば、統合のため）、ＰＢＳ配列（例えば、逆転写のため）、ＤＩＳ配列（例えば、ゲノム二量体化のため）、ｐｓｉパッケージングシグナル、部分的ｇａｇ配列、ＲＲＥ配列（例えば、核外輸送のため）、ｃＰＰＴ配列（例えば、核外輸送のため）、外因性薬剤の発現を促進するプロモーター、外因性薬剤をコードする遺伝子、ＷＰＲＥ配列（例えば、効率的な導入遺伝子発現のため）、ＰＰＴ配列（例えば、逆転写のため）、Ｒ配列（例えば、ポリアデニル化および終結のため）、およびＵ５シグナル（例えば、統合のため）のうちの１つ以上、例えば、すべてを含む。
【０３９９】
スプライス部位を除去するように操作されたベクター
いくつかのレンチウイルスベクターは、内部活性遺伝子を統合し、異常な切断され得る転写物の形成をもたらし得る強いスプライシングおよびポリアデニル化シグナルを有する。
【０４００】
癌原遺伝子活性化のメカニズムは、挿入変異原のゲノムに含まれるプロモーターエレメントまたはスプライス部位と、統合によって標的にされる細胞転写ユニットとの相互作用から生じるキメラ転写物の生成を含み得る（Ｇａｂｒｉｅｌら、２００９．Ｎａｔ  Ｍｅｄ１５：１４３１−１４３６、Ｂｏｋｈｏｖｅｎら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：２８３−２９）。ベクター配列および細胞ｍＲＮＡを含むキメラ融合転写物は、ベクター配列から始まり、隣接する細胞遺伝子に進むリードスルー転写、またはその逆によるいずれかによって生成され得る。
【０４０１】
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるレンチウイルス核酸は、少なくとも２つのスプライス部位が、例えば、レンチウイルスベクターの安全性プロファイルを改善するために除去されているレンチウイルス骨格を含む。そのようなスプライス部位の種および特定の方法は、ＷＯ２０１２／１５６８３９Ａ２に記載されており、これらはすべて参照によって含まれる。
【０４０２】
レトロウイルス生成法
大規模なウイルス粒子生成は、所望のウイルス力価を達成するためにしばしば有用である。ウイルス粒子は、ウイルスの構造および／またはアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、もしくはｎｅｆ遺伝子または他のレトロウイルス遺伝子を含むパッケージング細胞株にトランスファーベクターをトランスフェクトすることによって生成することができる。
【０４０３】
実施形態において、パッケージングベクターは、パッケージングシグナルを欠き、１、２、３、４つ以上のウイルス構造および／またはアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクターまたはウイルスベクターである。通常、パッケージングベクターはパッケージング細胞に含まれ、トランスフェクション、形質導入、または感染を介して細胞に導入される。レトロウイルス、例えば、レンチウイルスのトランスファーベクターを、トランスフェクション、形質導入、または感染を介してパッケージング細胞株に導入して、供給源細胞または細胞株を生成することができる。パッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む標準的な方法によって、ヒト細胞または細胞株に導入することができる。いくつかの実施形態において、パッケージングベクターは、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストシジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎシンテターゼ、またはＡＤＡなどの主要な選択可能マーカーと共に細胞に導入され、その後、適切な薬剤の存在下での選択およびクローンの単離が続けられる。選択可能なマーカー遺伝子は、パッケージングベクター、例えば、ＩＲＥＳまたは自己切断ウイルスペプチドによってコードされる遺伝子に物理的に連結することができる。
【０４０４】
パッケージング細胞株には、パッケージングシグナルを含まないが、ウイルス粒子をパッケージングすることができるウイルス構造タンパク質および複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）を安定的または一時的に発現する細胞株が含まれる。任意の好適な細胞株、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を使用することができる。使用することができる好適な細胞株には、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ−２細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、および２１１Ａ細胞が挙げられる。実施形態では、パッケージング細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、またはＡ５４９細胞である。
【０４０５】
供給源細胞株は、組換えレトロウイルス粒子を生成することができる細胞株を含み、パッケージング細胞株およびパッケージングシグナルを含むトランスファーベクター構築体を含む。ウイルスストック溶液を調製する方法は、例えば、Ｙ．Ｓｏｎｅｏｋａら（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６２８−６３３、およびＮ．Ｒ．Ｌａｎｄａｕら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５１１０−５１１３によって説明され、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。感染性ウイルス粒子は、例えば、細胞溶解、または細胞培養物の上清の収集によって、パッケージング細胞から収集され得る。任意に、収集されたウイルス粒子は、豊富化または精製され得る。
【０４０６】
パッケージングプラスミドおよび細胞株
いくつかの実施形態において、供給源細胞は、ウイルス粒子をパッケージングすることができるウイルス構造タンパク質および複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）をコードする１つ以上のプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ前駆体のうちの少なくとも２つをコードする配列は、同一プラスミドにある。いくつかの実施形態において、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ前駆体をコードする配列は、異なるプラスミドにある。いくつかの実施形態において、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ前駆体をコードする配列は、同一発現シグナル、例えば、プロモーターを有する。いくつかの実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ前駆体をコードする配列は、異なる発現シグナル、例えば、異なるプロモーターを有する。いくつかの実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ前駆体の発現は誘導性である。いくつかの実施形態において、ウイルス構造タンパク質および複製酵素をコードするプラスミドは、同時にまたは異なる時にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態において、ウイルス構造タンパク質および複製酵素をコードするプラスミドは、パッケージングベクターと同時にまたは異なる時にトランスフェクトされる。
【０４０７】
いくつかの実施形態において、供給源細胞株は、１つ以上の安定して統合されたウイルス構造遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、安定して統合されたウイルス構造遺伝子の発現は誘導可能である。
【０４０８】
いくつかの実施形態において、ウイルス構造遺伝子の発現は、転写レベルで調節される。いくつかの実施形態において、ウイルス構造遺伝子の発現は、翻訳レベルで調節される。いくつかの実施形態において、ウイルス構造遺伝子の発現は、翻訳後レベルで調節される。
【０４０９】
いくつかの実施形態において、ウイルス構造遺伝子の発現は、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）依存性システムによって調節され、Ｔｅｔ調節転写リプレッサー（Ｔｅｔ−Ｒ）は、プロモーターに含まれるＤＮＡ配列と結合し、立体障害によって転写を抑制する（Ｙａｏら、１９９８；Ｊｏｎｅｓら、２００５）。ドキシサイクリン（ｄｏｘ）の添加で、Ｔｅｔ−Ｒが放出され、転写が可能になる。多数の他の好適な転写調節プロモーター、転写因子、および小分子インデューサーは、ウイルス構造遺伝子の転写を調節するのに好適である。
【０４１０】
いくつかの実施形態では、Ｔｅｔ調節プロモーターの制御下にあり、抗生物質耐性カセットと結合された、第３世代レンチウイルス成分、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ）Ｒｅｖ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ、およびエンベロープが、供給源細胞ゲノムに別々に統合される。いくつかの実施形態では、供給源細胞は、ゲノムに統合された、Ｒｅｖ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ、およびエンベロープタンパク質の各々の１つのコピーを有するのみである。
【０４１１】
いくつかの実施形態において、外因性薬剤をコードする核酸（例えば、外因性薬剤をコードするレトロウイルス核酸）もまた、供給源細胞ゲノムに統合される。いくつかの実施形態において、外因性薬剤をコードする核酸は、エピソームによって維持される。いくつかの実施形態において、外因性薬剤をコードする核酸は、ゲノム内に安定して統合されたＲｅｖ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ、およびエンベロープタンパク質を有する供給源細胞にトランスフェクトされる。例えば、Ｍｉｌａｎｉら．ＥＭＢＯ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１７を参照し、その全体が明細書に参照によって組み込まれる。
【０４１２】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるレトロウイルス核酸は、逆転写を受けることができない。そのような核酸は、実施形態では、外因性薬剤を一時的に発現することができる。レトロウイルスまたはＶＬＰは、無効化された逆転写酵素タンパク質を含み得、または逆転写酵素タンパク質を含み得ない。実施形態において、レトロウイルス核酸は、無効化されたプライマー結合部位（ＰＢＳ）および／またはａｔｔ部位を含む。実施形態において、ｒｅｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、およびＳ２またはそれらの機能的同等物を含む１つ以上のウイルスアクセサリー遺伝子は、無効化されるか、またはレトロウイルス核酸に存在しない。実施形態において、Ｓ２、ｒｅｖ、およびｔａｔから選択される１つ以上のアクセサリー遺伝子は、無効化されるか、またはレトロウイルス核酸に存在しない。
【０４１３】
レトロウイルス核酸をパッケージングするための戦略
通常、最新のレトロウイルスベクターシステムは、ウイルスＲＮＡのウイルス粒子への転写、逆転写、統合、翻訳、およびパッケージングのためのシス作用性ベクター配列を有するウイルスゲノム、および（２）ウイルス粒子の生成のために必要とされるトランス作用性レトロウイルス遺伝子配列（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）を発現するプロデューサー細胞株からなる。シスおよびトランス作用性ベクター配列を完全に分離することによって、ウイルスは感染の１サイクルを超えて複製を維持することができない。生きたウイルスの生成は、多くの戦略によって回避することができ、例えば、組換えを回避するためにシスおよびトランス作用性配列間の重複を最小することによる。
【０４１４】
ウイルスＲＮＡを欠くかまたは欠如する配列を含むウイルスベクター粒子は、配列からウイルスＲＮＡを除去または排除した結果であり得る。一実施形態では、これは、ｇａｇにおける内因性パッケージングシグナル結合部位を使用することによって達成され得る。あるいは、内因性パッケージングシグナル結合部位はｐｏｌ上にある。この実施形態では、送達されるべきＲＮＡは、同族のパッケージングシグナルを含む。別の実施形態では、送達されるべきＲＮＡに位置する異種結合ドメイン（ｇａｇに対して異種である）、およびｇａｇまたはｐｏｌに位置する同族結合部位を使用して、送達されるべきＲＮＡのパッケージングを確実にすることができる。異種配列は非ウイルス性であり得、またはそれはウイルス性であり得、その場合、それは異なるウイルスに由来し得る。ベクター粒子を使用して治療用ＲＮＡを送達することができ、その場合、機能的インテグラーゼおよび／または逆転写酵素は必要とされない。これらのベクター粒子はまた、目的の治療用遺伝子を送達するために使用することができ、その場合、通常、ｐｏｌが含まれる。
【０４１５】
一実施形態では、ｇａｇ−ｐｏｌが変異され、パッケージングシグナルが対応するパッケージングシグナルに置換される。この実施形態では、粒子は、新しいパッケージングシグナルによってＲＮＡをパッケージングすることができる。この手法の利点は、ウイルス配列を欠くＲＮＡ配列、例えばＲＮＡｉをパッケージ化することが可能であることである。
【０４１６】
別の手法は、パッケージ化されるべきＲＮＡの過剰発現に依存することである。一実施形態では、パッケージングされるべきＲＮＡは、パッケージングシグナルを含むいずれかのＲＮＡの不在下で過剰発現される。これは、かなりのレベルの治療用ＲＮＡがパッケージ化されることをもたらし得、この量は細胞に形質導入して生物学的効果を有するのに十分である。
【０４１７】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ウイルスｇａｇタンパク質またはレトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ｇａｇタンパク質またはｐｏｌタンパク質は、ＲＮＡ配列中の対応する配列を認識してウイルスベクター粒子へのＲＮＡ配列のパッケージングを容易にすることができる異種ＲＮＡ結合ドメインを含む。
【０４１８】
いくつかの実施形態において、異種ＲＮＡ結合ドメインは、バクテリオファージコートタンパク質、Ｒｅｖタンパク質、Ｕ１小核リボヌクレオタンパク質粒子のタンパク質、Ｎｏｖａタンパク質、ＴＦ１１１Ａタンパク質、ＴＩＳ１１タンパク質、ｔｒｐＲＮＡ−結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）またはシュードウリジンシンターゼに由来するＲＮＡ結合ドメインを含む。
【０４１９】
いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、複製能力のあるレトロウイルスの不在を検出または確認することを含む。この方法は、遺伝子産物がガンマレトロウイルスまたはレンチウイルスなどの複製能力のあるレトロウイルスに感染した特定の細胞において発現されるが、異種核酸で細胞に形質導入するために使用されるウイルスベクターに存在せず、複製能力のあるレトロウイルスを含まない細胞で存在および／または発現がされない、または予想されない、ウイルス遺伝子、例えば、構造遺伝子またはパッケージング遺伝子などの１つ以上の標的遺伝子のＲＮＡレベルを評価することを含み得る。複製能力のあるレトロウイルスは、１つ以上の標的遺伝子のＲＮＡレベルが対照値より高い場合に存在することが決定され得、例えば標的遺伝子を含む陽性コントロール試料から直接的または間接的に測定することができる。詳細な開示については、ＷＯ２０１８／０２３０９４Ａ１を参照。
【０４２０】
供給源細胞における外因性薬剤をコードする遺伝子の抑制
供給源細胞で（過剰）発現されたタンパク質は、ベクタービリオンアセンブリおよび／または感染性に間接的または直接的に影響を有し得る。ベクタービリオンへの外因性薬剤の取り込みも、ベクター粒子の下流プロセシングに影響し得る。
【０４２１】
いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターを使用して、供給源細胞における外因性薬剤の発現を制限する。いくつかの実施形態において、異種翻訳制御システムが、真核細胞培養で使用され、供給源細胞における外因性薬剤の翻訳を抑制する。より具体的には、レトロウイルス核酸は、外因性薬剤をコードする遺伝子と操作可能に連結された結合部位を含み得、結合部位は、外因性薬剤の翻訳が供給源細胞において抑制または防止されるように、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用することができる。
【０４２２】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ結合タンパク質は、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）、例えば、細菌性トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質である。ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、細菌性ｔｒｐオペロンレギュレータータンパク質、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質、ＴＲＡＰ）、およびそれが結合するＲＮＡ標的の使用は、供給源細胞内の導入遺伝子翻訳を抑制または防止する。このシステムは、ベクター生成細胞における導入遺伝子抑制システムまたはＴＲＩＰシステムと呼ばれる。
【０４２３】
実施形態では、ＮＯＩ翻訳開始コドンの上流にＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ結合配列、ｔｂｓ）の結合部位を配置することによって、内部発現カセットに由来するｍＲＮＡの翻訳の特異的抑制が可能になり、ベクターＲＮＡの生成または安定性に有害な効果を有さない。外因性薬剤をコードする遺伝子のｔｂｓと翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドの数は、０から１２ヌクレオチドまで変化し得る。ｔｂｓは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の下流に配置されて、マルチシストロンｍＲＮＡで外因性薬剤をコードする遺伝子の翻訳を抑制し得る。
【０４２４】
キルスイッチシステムおよび増幅
いくつかの実施形態において、外因性薬剤をコードする遺伝子を有するポリヌクレオチドまたは細胞は、自殺遺伝子、例えば、誘導性自殺遺伝子を利用して、直接的毒性および／または制御されない増殖のリスクを低減させる。特定の態様において、自殺遺伝子は、外因性薬剤を有する宿主細胞に免疫原性ではない。自殺遺伝子の例には、カスパーゼ−９、カスパーゼ−８、またはシトシンデアミナーゼが含まれる。カスパーゼ−９は、二量体化の特異的化学誘導物質（ＣＩＤ）を使用して活性化することができる。
【０４２５】
特定の実施形態において、ベクターは、標的細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、インビボで陰性選択に対して敏感である遺伝子セグメントを含む。例えば、形質導入された細胞は、個体のインビボ状態における変化の結果として排除され得る。陰性選択可能な表現型は、投与された薬剤、例えば、化合物に対して感受性を付与する遺伝子の挿入から生じ得る。陰性選択可能な遺伝子は当技術分野で知られており、とりわけ、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＩＴＫ）遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ１１：２２３，１９７７）、細胞のヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞のアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、および細菌のシトシンデアミナーゼ（Ｍｕｌｌｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：３３（１９９２））が含まれる。
【０４２６】
いくつかの実施形態において、形質導入された細胞、例えば、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、インビトロで陽性選択可能な表現型の細胞の選択を可能にする陽性マーカーをさらに含むポリヌクレオチドを含む。陽性選択マーカーは、標的細胞に導入されると、遺伝子を有する細胞の陽性選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であり得る。このタイプの遺伝子には、とりわけ、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５からのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子が含まれる。
【０４２７】
いくつかの実施形態では、陽性選択可能マーカーおよび陰性選択可能エレメントは、陰性選択可能エレメントの喪失が必然的に陽性選択可能マーカーの喪失も伴うように連結される。例えば、陽性および陰性の選択可能なマーカーを融合して、一方の損失は、必然的に他方の損失をもたらすことができる。上記の所望の陽性および陰性選択機能の両方を付与するポリペプチドを発現産物として生成する融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、インビトロでの陽性選択についてハイグロマイシンＢ耐性を、インビボでの陰性選択についてガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドを生成する。ＬｕｐｔｏｎＳ．Ｄ．ら、Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ１１：３３７４−３３７８，１９９１を参照。さらに、実施形態において、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドは、融合遺伝子、特にインビトロでの陽性選択についてハイグロマイシンＢ耐性、およびインビボでの陰性選択についてガンシクロビル感受性を付与するものを含むレトロウイルスベクター、例えば、Ｌｕｐｔｏｎ，Ｓ．Ｄ．ら（１９９１）、前出に記載されたＨｙＴＫレトロウイルスベクターである。有力な陽性選択可能マーカーと陰性選択可能マーカーとの融合に由来する二重機能性選択可能融合遺伝子の使用を説明している、ＰＣＴＵ５９１／０８４４２およびＰＣＴ／Ｕ５９４／０５６０１の公開も。
【０４２８】
好適な陽性選択マーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来し、好適な陰性選択マーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−ＩＴＫ、ＶＺＶＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＲＲＴ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来し得る。他の好適なマーカーは二重機能性選択可能融合遺伝子であり、陽性選択可能マーカーはｈｐｈまたはｎｅｏに由来し、陰性選択可能マーカーはシトシンデアミナーゼもしくはＴＫ遺伝子または選択可能マーカーに由来する。
【０４２９】
レンチウイルス統合を調節するための戦略
レトロウイルスまたはレンチウイルスゲノムの標的細胞ゲノムへの統合を防ぐために、重要なタンパク質／配列が欠如しているかまたは無効にされているレトロウイルスおよびレンチウイルス核酸が開示される。例えば、レトロウイルスインテグラーゼの高度に保存されたＤＤＥモチーフを構成する各アミノ酸の各々を欠くウイルス核酸（ＥｎｇｅｌｍａｎおよびＣｒａｉｇｉｅ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６３６１−６３６９、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７６４８−７６５２、Ｋｈａｎら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：８５１−８６０）は、統合欠損レトロウイルス核酸の生成を可能にする。
【０４３０】
例えば、いくつかの実施形態では、本明細書のレトロウイルス核酸は、インテグラーゼをウイルスゲノムの細胞ゲノムへの統合に触媒作用を及ぼすことを不可能にさせる変異を含むレンチウイルスインテグラーゼを含む。いくつかの実施形態において、変異は、統合に直接的に影響を与えるＩ型変異、またはビリオン形態形成および／または逆転写に影響を与える多面発現欠損を誘発するＩＩ型変異である。Ｉ型変異の例示的な非限定的な例は、インテグラーゼの触媒コアドメインに関与する３つの残基である、ＤＸ３９〜５８ＤＸ３５Ｅ（ＨＩＶ−１のインテグラーゼのＤ６４、Ｄ１１６、およびＥ１５２残基）のいずれかに影響を与えるこれらの変異である。特定の実施形態において、インテグラーゼをウイルスゲノムの細胞ゲノムへの統合に触媒作用を及ぼすことを不可能にさせる変異は、インテグラーゼの触媒コアドメインのＤＤＥモチーフの１つ以上のアミノ酸残基の置換、好ましくはＤＥＥモチーフの最初のアスパラギン酸残基のアスパラギン残基による置換である。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、インテグラーゼタンパク質を含まない。
【０４３１】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスは、活性な転写ユニットを統合する。いくつかの実施形態において、レトロウイルスは、転写開始部位である遺伝子の５’末端、またはＤＮＡｓｅ１切断部位の付近に統合しない。いくつかの実施形態では、レトロウイルス統合は、活性な癌原遺伝子または不活性な腫瘍抑制遺伝子を行わない。いくつかの実施形態において、レトロウイルスは遺伝毒性ではない。いくつかの実施形態では、レンチウイルスはイントロンを統合する。
【０４３２】
いくつかの実施形態において、レトロウイルス核酸は、特定のコピー数で標的細胞のゲノムを統合する。平均コピー数は、単一の細胞、細胞の集団、または個々の細胞コロニーから決定され得る。コピー数を決定するための例示的な方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびフローサイトメトリーが含まれる。
【０４３３】
いくつかの実施形態において、外因性薬剤をコードするＤＮＡは、ゲノムに統合される。いくつかの実施形態において、外因性薬剤をコードするＤＮＡは、エピソームによって維持される。いくつかの実施形態において、外因性薬剤をコードするエピソームＤＮＡに対する統合された比は、少なくとも０．０１、０．１、０．５、１．０、２、５、１０、１００である。
【０４３４】
いくつかの実施形態では、外因性薬剤をコードするＤＮＡは線状である。いくつかの実施形態では、外因性薬剤をコードするＤＮＡは環状である。いくつかの実施形態では、外因性薬剤をコードする環状ＤＮＡコピーに対する線状コピーの比は、少なくとも０．０１、０．１、０．５、１．０、２、５、１０、１００である。
【０４３５】
実施形態では、外因性薬剤をコードするＤＮＡは、１つのＬＴＲを有する環状である。いくつかの実施形態では、外因性薬剤をコードするＤＮＡは、２つのＬＴＲを有する環状である。いくつかの実施形態では、外因性薬剤をコードするＤＮＡを含む環状の２つのＬＴＲに対する外因性薬剤をコードするＤＮＡを含む環状の１つのＬＴＲの比は、少なくとも０．１、０．５、１．０、２、５、１０、２０、５０、１００である。
【０４３６】
エピソームウイルスの維持
統合が不足しているレトロウイルスでは、逆転写（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）の環状ｃＤＮＡ副産物（例えば、１−ＬＴＲおよび２−ＬＴＲ）は、宿主ゲノムに統合されることなく細胞核に蓄積し得る（Ｙａｎｅｚ−Ｍｕｎｏｚ  ＲＪら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００６，１２：３４８−３５３を参照）。他の外因性ＤＮＡのように、これらの中間体は、次いで、同じ頻度（例えば、１０３〜１０５／細胞）で細胞ＤＮＡに統合されることができる。
【０４３７】
いくつかの実施形態において、エピソームレトロウイルス核酸は複製しない。エピソームウイルスＤＮＡは、真核生物の複製起点および核マトリックスとの結合のためのスキャホルド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）の含有によって、複製細胞で維持されるように改変することができる。
【０４３８】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるレトロウイルス核酸は、真核生物の複製起点またはその変異体を含む。対象となる真核生物の複製起点の例は、Ａｌａｄｊｅｍら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５、２７０：８１５−８１９）によって報告されているβ−グロビン遺伝子の複製起点、Ｐｒｉｃｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，２７８（２２）：１９６４９−５９によって報告されているサルＣＶ−１細胞およびヒト皮膚線維芽細胞から既に単離されているアルファ−サテライト配列と結合された自律複製配列に由来するコンセンサス配列、ＭｃＷｉｎｎｅｙおよびＬｅｆｆａｋ（ＭｃＷｉｎｎｅｙ  Ｃ．およびＬｅｆｆａｋ  Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１９９０、１８（５）：１２３３−４２）によって報告されているヒトｃ−ｍｙｃプロモーター領域の複製起点である。実施形態において、変異体は、真核生物において複製を開始する能力を実質的に維持する。複製を開始する特定の配列の能力は、任意の好適な方法、例えば、ブロモデオキシウリジン取り込みおよび密度シフトに基づく自律複製アッセイによって決定することができる（Ａｒａｕｊｏ  Ｆ．Ｄ．ら、前出；Ｆｒａｐｐｉｅｒ  Ｌ．ら、前出）。
【０４３９】
いくつかの実施形態において、レトロウイルス核酸は、スキャホルド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）またはその変異体、例えば、長さが数百塩基対の非コンセンサス様ＡＴリッチＤＮＡエレメントを含み、タンパク質スキャホルドまたは細胞核のマトリックスへの断続的な結合によって、真核生物ゲノムの核ＤＮＡをクロマチンドメインに編成する。それらは通常、フランキング領域、クロマチン境界領域、およびイントロンなどの非コード化領域に認められる。Ｓ／ＭＡＲ領域の例は、Ｂｏｄｅら（Ｂｏｄｅ  Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５５：１９５−７）によって報告されているヒトＩＦＮ−γ遺伝子（ｈＩＦＮ−γｌａｒｇｅ）の１．８ｋｂｐのＳ／ＭＡＲ、Ｒａｍｅｚａｎｉ（Ｒａｍｅｚａｎｉ  Ａ．ら、Ｂｌｏｏｄ２００３，１０１：４７１７−２４）によって報告されているヒトＩＦＮ−γ遺伝子（ｈＩＦＮ−γｓｈｏｒｔ）のＳ／ＭＡＲの０．７ｋｂｐ最小領域、Ｍｅｓｎｅｒ  Ｌ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００３，１００：３２８１−８６）によって報告されているヒトデヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｈＤＨＦＲ）のＳ／ＭＡＲの０．２Ｋｂｐ最小領域である。実施形態では、Ｓ／ＭＡＲの機能的に同等な変異体は、Ｓ／ＭＡＲ機能に寄与することが共同または単独で示唆されている６つの規則のセットに基づいて選択される配列である（Ｋｒａｍｅｒら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３３，３０５、Ｓｉｎｇｈら（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ２５，１４１９）。これらの規則は、ｇｅｎｏｍｅｃｌｕｓｔｅｒ．ｓｅｃｓ．ｏａｋｌａｎｄ．ｅｄｕ／ＭＡＲ−Ｗｉｚで無料で入手可能なＭＡＲ−Ｗｉｚコンピュータープログラムに併合されている。実施形態において、変異体は、それが由来するＳ／ＭＡＲの同じ機能、特に、核、マトリックスと特異的に結合する能力を実質的に維持する。当業者は、特定の変異体が核マトリックスに特異的に結合することができるか、例えば、Ｍｅｓｎｅｒら（Ｍｅｓｎｅｒ  Ｌ．Ｄ．ら、前出）によって報告されたインビトロまたはインビボＭＡＲアッセイによって決定することができる。いくつかの実施形態では、特定の変異体がＤＮＡ鎖分離の傾向を示す場合、特定の配列はＳ／ＭＡＲの変異体である。この特性は、平衡統計力学の方法に基づく特定のプログラムを使用して決定することができる。ストレス誘発性二本鎖不安定化（ＳＩＤＤ）分析手法は、「［．．．］高次ラセンストレスの負荷されたレベルが各ＤＮＡ配列に沿った各位置で二重鎖を開くために必要とされる自由エネルギーを減少させる程度を計算する。結果はＳＩＤＤプロファイルとして表され、強い不安定化の部位が深い最小値として示される［．．．］」として、Ｂｏｄｅら（２００５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５８，５９７で定義されている。ＳＩＤＤアルゴリズムと数学的基礎（ＢｉおよびＢｅｎｈａｍ（２００４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２０，１４７７）、およびＳＩＤＤプロファイルの分析は、ＷｅｂＳＩＤＤ（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅｃｅｎｔｅｒ．ｕｃｄａｖｉｓ．ｅｄｕ／ｂｅｎｈａｍ）で無料で入手可能なインターネットリソースを使用して実施することができる。したがって、いくつかの実施形態に���いて、ポリヌクレオチドは、それがＳ／ＭＡＲと同様なＳＩＤＤプロファイルを示す場合、Ｓ／ＭＡＲ配列の変異体と考えられる。
【０４４０】
フソゲンおよび偽型化
フソゲンは、ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）を含み、一般に、フソソームによって感染されて形質転換され得る宿主細胞の範囲を決定する。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、およびＥＩＶなどのレンチウイルスの場合、ネイティブｅｎｖタンパク質はｇｐ４１およびｇｐ１２０を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で説明される供給源細胞によって発現されるウイルスｅｎｖタンパク質は、既に報告されているように、ウイルスのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子とは別のベクターでコードされる。
【０４４１】
使用することができるレトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の実例には、限定されないが、ＭＬＶエンベロープ、１０Ａ１エンベロープ、ＢＡＥＶ、ＦｅＬＶ−Ｂ、ＲＤ１１４、ＳＳＡＶ、エボラ、センダイ、ＦＰＶ（トリペストウイルス）、およびインフルエンザウイルスエンベロープが含まれる。同様に、ＲＮＡウイルス（例えば、ピコロナウイルス科、カルシビル科、アストロウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルソミクソウイルス科、ブニャウイルス科、アレナウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、レトロウイルス科のＲＮＡウイルス科）、ならびにＤＮＡウイルス（ヘパドナウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科、パポウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポキシーウイルス科、イリドウイルス科の科）からのエンベロープをコードする遺伝子が利用され得る。代表的な例には、ＦｅＬＶ、ＶＥＥ、ＨＦＶＷ、ＷＤＳＶ、ＳＦＶ、狂犬病、ＡＬＶ、ＢＩＶ、ＢＬＶ、ＥＢＶ、ＣＡＥＶ、ＳＮＶ、ＣｈＴＬＶ、ＳＴＬＶ、ＭＰＭＶ、ＳＭＲＶ、ＲＡＶ、ＦｕＳＶ、ＭＨ２、ＡＥＶ、ＡＭＶ、ＣＴ１０、およびＥＩＡＶが挙げられる。
【０４４２】
いくつかの実施形態において、フソソームでの提示のためのエンベロープタンパク質は、限定されないが、以下の供給源のいずれかを含み、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１（鳥インフルエンザ）などのインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群の任意のウイルス、腸内アデノウイルス、パルボウイルス、デングフィーバーウイルス、モンキーポックス、モノネガウイルス、狂犬病ウイルスなどのリサウイルス、ラゴスバットウイルス、モコラウイルス、デュベンヘイジウイルス、ヨーロッパのコウモリウイルス１および２、オーストラリアコウモリウイルス、エフェメロウイルス、ベシキュロウイルス、小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、単純ヘルペスウイルス１型および２型などのヘルペスウイルス、バリセラ帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型および８型、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、乳頭腫ウイルス、ネズミガンマヘルペスウイルス、アルゼンチン出血熱ウイルスなどのアリーナウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、クリミア・コンゴ出血熱ウイルスなどのブニヤウイルス科、ハンタウイルス、腎症候群を引き起こす出血熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、エボラ出血熱およびマールブルグ出血熱を含むフィロウイルス科（フィロウイルス）、カイサヌール森林病ウイルスを含むフラビウイルス科、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎を引き起こすウイルスおよびヘンドラウイルスとニパウイルスなどのパラミクソウイルス科、バリオラメジャーおよびバリオラマイナー（スモールポックス）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルスなどのアルファウイルス科、西部ウマ脳炎ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、西ナイルウイルス、脳炎を引き起こすいずれかのウイルスが挙げられる。
【０４４３】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明される供給源細胞は、フソソーム、例えば、組換えレトロウイルス、例えば、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質で偽型化されたレンチウイルスを生成する。
【０４４４】
フソソームまたは偽型ウイルスは、一般に、そのエンベロープタンパク質のうちの１つ以上に改変を有し、例えば、エンベロープタンパク質は、別のウイルスに由来するエンベロープタンパク質で置換される。例えば、ＨＩＶは水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質で偽型化され得、ＨＩＶをより広範囲の細胞に感染させることが可能になり、これはＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）は通常、本ウイルスをＣＤ４＋提示細胞に標的化させるためである。いくつかの実施形態において、レンチウイルスエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇで偽型化される。一実施形態では、供給源細胞は、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質で偽型化された組換えレトロウイルス、例えばレンチウイルスを生成する。
【０４４５】
さらに、フソゲンまたはウイルスエンベロープタンパク質は、形質導入ベクターがその通常範囲外の宿主細胞を標的にして感染することを可能にし、またはより具体的には細胞または組織タイプへの形質導入を制限することを可能にするポリペプチド配列を含むように改変または操作することができる。例えば、フソゲンまたはエンベロープタンパク質は、受容体リガンド、抗体（抗体の抗原結合部分または単鎖抗体などの組換え抗体型分子を使用する）などの標的配列とインフレームで結合することができ、ポリペプチド部分またはその修飾（例えば、グリコシル化部位が標的配列に存在する場合）は、形質導入ベクターコート上に提示されるとき、目的の標的細胞へのビリオン粒子の直接送達を容易にする。さらに、エンベロープタンパク質は、細胞機能を調節する配列をさらに含むことができる。細胞機能を形質導入ベクターで調節することによって、細胞の混合集団中における特定の細胞タイプについて形質導入効率を増加または減少させ得る。例えば、幹細胞は、血液または骨髄で認められる他の細胞型よりもむしろ、幹細胞に特異的に結合するリガンドまたは結合パートナーを含むエンベロープ配列によって、より特異的に形質導入することができる。非限定的な例は、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＦｌｔ−３リガンドである。他の例には、例えば、抗体（例えば、細胞型に特異的な単鎖抗体）、および肺、肝臓、膵臓、心臓、内皮、平滑、乳房、前立腺、上皮、血管の癌などの組織と結合する基本的に任意の抗原（受容体を含む）が含まれる。
【０４４６】
例示的なフソゲン
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、例えば、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと膜、例えば、細胞膜との融合を促進するために、１つ以上のフソゲンを含む。
【０４４７】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、特定の細胞または組織タイプを標的とするために、そのエンベロープに１つ以上のフソゲンを含む。フソゲンには、限定されないが、タンパク質ベース、脂質ベース、および化学物質ベースのフソゲンが含まれる。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、タンパク質フソゲンである第１のフソゲンおよび、脂質フソゲンまたは化学物質フソゲンである第２のフソゲンを含む。フソゲンは、標的細胞の表面上のフソゲン結合パートナーと結合し得る。いくつかの実施形態において、フソゲンを含むレトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、膜を標的細胞の脂質二重層に統合する。
【０４４８】
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるフソゲンのうちの１つ以上は、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰに含まれ得る。
【０４４９】
タンパク質フソゲン
いくつかの実施形態において、フソゲンは、タンパク質フソゲン、例えば、哺乳動物タンパク質または哺乳動物タンパク質のホモログ（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える同一性を有する）、ウイルスタンパク質またはウイルスタンパク質のホモログ（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える同一性を有する）などの非哺乳動物タンパク質、天然タンパク質または天然タンパク質の誘導体、合成タンパク質、それらのフラグメント、それらの変異体、フソゲンまたはフラグメントのうちの１つ以上を含むタンパク質、およびそれらの任意の組み合わせである。
【０４５０】
いくつかの実施形態において、フソゲンは、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ中の脂質と標的細胞中の脂質との間の混合をもたらす。いくつかの実施形態において、フソゲンは、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰの内部と標的細胞のサイトゾルとの間に１つ以上の孔の形成をもたらす。
【０４５１】
哺乳動物タンパク質
いくつかの実施形態において、フソゲンは、哺乳動物タンパク質を含み得、表１を参照する。哺乳動物のフソゲンの例には、限定されないが、ｖＳＮＡＲＥおよびｔＳＮＡＲＥなどのＳＮＡＲＥファミリータンパク質、シンシチン−１（ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７６．１３．６４４２−６４５２．２００２）およびシンシチン−２などのシンシチンタンパク質、ミオマーカー（ｍｙｏｍａｋｅｒ）（ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｅａｒｌｙ／２０１７／０４／０２／１２３１５８、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１２３１５８、ｄｏｉ：１０．１０９６／ｆｊ．２０１６００９４５Ｒ、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３４３）、ミオミキサー（ｍｙｏｍｉｘｅｒ）（ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎａｔｕｒｅ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ４９９／ｎ７４５８／ｆｕｌｌ／ｎａｔｕｒｅ１２３４３．ｈｔｍｌ、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３４３）、ミオマーガー（ｍｙｏｍｅｒｇｅｒ）（ｓｃｉｅｎｃｅ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｅａｒｌｙ／２０１７／０４／０５／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｍ９３６１、ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｍ９３６１）、ＦＧＦＲＬ１（線維芽細胞成長因子受容体様１）、ミニオン（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１２２６９７）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のアイソフォーム（例えば、米国特許第６，０９９，８５７Ａ号に開示されている）、コネキシン４３、コネキシン４０、コネキシン４５、コネキシン３２、またはコネキシン３７などのｇａｇ連結タンパク質（例えば、米国特許第２００７／０２２４１７６号に開示されている、Ｈａｐ２、異種細胞間でシンシチン形成を誘導することができる任意のタンパク質（表２を参照）、フソゲン特性を有する任意のタンパク質（表３を参照）、それらのホモログ、それらのフラグメント、それらの変異体、およびそれらの１つ以上のタンパク質またはフラグメントを含むタンパク質融合物が含まれ得る。いくつかの実施形態において、フソゲンは、ヒトゲノムで認められるヒト内在性レトロウイルスエレメント（ｈＥＲＶ）によってコードされる。追加の例示的なフソゲンは、米国特許第６，０９９，８５７Ａ号および米国特許第２００７／０２２４１７６号に開示されており、その全容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【表１】
2021523724.tif 000002
【表２−１】
2021523724.tif 000003
【表２−２】
2021523724.tif 000004
【表３−１】
2021523724.tif 000005
【表３−２】
2021523724.tif 000006
【０４５２】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、湾曲生成タンパク質、例えば、エプシン１、ダイナミン、またはＢＡＲドメインを含むタンパク質を含む。例えば、Ｋｏｚｌｏｖら、ＣｕｒｒＯｐ  ＳｔｒｕｃＢｉｏ  ２０１５，Ｚｉｍｍｅｒｂｅｒｇら．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  ２００６、Ｒｉｃｈａｒｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２０１１を参照。
【０４５３】
非哺乳動物タンパク質
ウイルスタンパク質
いくつかの実施形態において、フソゲンは、非哺乳動物タンパク質、例えば、ウイルスタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、ウイルスフソゲンは、クラスＩウイルス膜融合タンパク質、クラスＩＩウイルス膜タンパク質、クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質、ウイルス膜糖タンパク質、または他のウイルス融合タンパク質、あるいはそれらのホモログ、それらのフラグメント、それらの変異体、またはそれらの１つ以上のタンパク質またはフラグメントを含むタンパク質融合物である。
【０４５４】
いくつかの実施形態において、クラスＩウイルス膜融合タンパク質には、限定されないが、バキュロウイルスＦタンパク質、例えば、核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）属のＦタンパク質、例えば、シロイチモジヨトウＭＮＰＶ（ＳｅＭＮＰＶ）Ｆタンパク質およびマイマイガＭＮＰＶ（ＬｄＭＮＰＶ）、ならびにパラミクソウイルスＦタンパク質が含まれる。
【０４５５】
いくつかの実施形態では、クラスＩＩウイルス膜タンパク質には、限定されないが、ダニ骨脳炎Ｅ（ＴＢＥＶＥ）、セムリキ森林ウイルスＥ１／Ｅ２が含まれる。
【０４５６】
いくつかの実施形態において、クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質には、限定されないが、ラブドウイルスＧ（例えば、小胞性胃炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）の融合性タンパク質Ｇ）、ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂ（例えば、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ｇＢ））、エプスタインバーウイルス糖タンパク質Ｂ（ＥＢＶｇＢ）、トゴトウイルスＧ、バキュロウイルスｇｐ６４（例、オートグラファカリフォルニアマルチプルＮＰＶ（ＡｃＭＮＰＶ）ｇｐ６４）、およびボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）糖タンパク質（ＢＤＶＧ）が含まれる。
【０４５７】
他のウイルスフソゲン、例えば、膜糖タンパク質およびウイルス融合タンパク質の例には、限定されないが、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）または変異体などのウイルス合胞体タンパク質、またはそれらの融合タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス１型エンベロープタンパク質（ＨＩＶ−１ＥＮＶ）、リンパ球合胞体を形成するＨＩＶ結合ＬＦＡ−１由来のｇｐ１２０、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｇｐ１６０、またはＨＩＶ転写トランスアクチベーター（ＴＡＴ）、ウイルス糖タンパク質ＶＳＶ−Ｇ、ラブドウイルス科の水疱性口内炎ウイルス由来のウイルス糖タンパク質、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の糖タンパク質ｇＢおよびｇＨ−ｇＬ、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）−１０Ａ１、テナガザル白血病ウイルス糖タンパク質（ＧａＬＶ）、狂犬病、モコラ、水疱性口内炎ウイルスおよびトガウイルスのＧ型糖タンパク質。ネズミ肝炎ウイルスＪＨＭ表面突起タンパク質、ブタ呼吸器コロナウイルススパイクおよび膜糖タンパク質、鳥類伝染性気管支炎スパイク糖タンパク質とその前駆体、ウシ腸コロナウイルススパイクタンパク質、麻疹ウイルスのＦおよびＨ、ＨＮまたはＧ遺伝子、イヌジステンパーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス３、シミアンウイルス４１、センダイウイルスおよびヒト呼吸器合胞体ウイルス、シャペロンタンパク質ｇＬを有するヒトヘルペスウイルス１型および水痘帯状疱疹ウイルスのｇＨ、ヒト、ウシ、およびオナガザルヘルペスウイルスｇＢ、フレンドネズミ白血病ウイルスおよびメイソンファイザーモンキーウイルスのエンベロープ糖タンパク質、おたふく風邪ウイルス血球凝集素ノイラミニダーゼ、およびグリオプロテインＦ１およびＦ２、ベネズエラウマ脳脊髄炎の膜糖タンパク質、パラミクソウイルスＦタンパク質、ＳＩＶｇｐ１６０タンパク質、エボラウイルスＧタンパク質、またはセンダイウイルス融合タンパク質、あるいはそれらのホモログ、それらのフラグメント片、それらの変異体、ならびにそれらの１つ以上のタンパク質またはそのフラグメントを含むタンパク質融合が含まれる。
【０４５８】
非哺乳動物フソゲンには、ウイルスフソゲン、それらのホモログ、それらのフラグメント、およびそれらの１つ以上のタンパク質またはそのフラグメントを含む融合タンパク質が含まれる。ウイルス性フソゲンには、クラスＩフソゲン、クラスＩＩフソゲン、クラスＩＩＩフソゲン、およびクラスＩＶフソゲンが含まれる。実施形態において、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ４１などのクラスＩフソゲンは、中央のコイルドコイル構造を伴うαヘリックスヘアピンのシグネチャー三量体を有する特徴的な融合後構造を有する。クラスＩウイルス融合タンパク質には、中央の融合後６ヘリックスバンドルを有するタンパク質が含まれる。クラスＩウイルス融合タンパク質には、インフルエンザＨＡ、パラインフルエンザＦ、ＨＩＶ  Ｅｎｖ、Ｅｂｏｌａ  ＧＰ、オルトミクソウイルス由来の血球凝集素、パラミクソウイルス由来のＦタンパク質（例えば、麻疹、（Ｋａｔｏｈら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１０，１０：３７））、レトロウイルスに由来するＥＮＶタンパク質、およびフィロウイルスとコロナウイルスのフソゲンが含まれる。実施形態では、デング熱Ｅ糖タンパク質などのクラスＩＩウイルスフソゲンは、ヘアピンの三量体をもたらすようにリフォールディングする細長い外部ドメインを形成するβシートの構造的シグナチャーを有する。実施形態では、クラスＩＩウイルスフソゲンは、中央のコイルドコイルを欠いている。クラスＩＩウイルスフソゲンは、アルファウイルス（例えば、Ｅ１タンパク質）およびフラビウイルス（例えば、Ｅ糖タンパク質）に認められることができる。クラスＩＩウイルスフソゲンには、セムリキ森林ウイルス、シンビス、風疹ウイルス、およびデング熱ウイルスに由来するフソゲンが含まれる。実施形態において、水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質などのクラスＩＩＩウイルスフソゲンは、クラスＩおよびＩＩに認められる構造的シグナチャーを組み合わせる。実施形態において、クラスＩＩＩウイルスフソゲンは、αヘリックス（例えば、クラスＩウイルスフソゲンと同様にタンパク質を折り返すために６ヘリックスバンドルを形成する）、およびその末端に両親媒性融合ペプチドを有するβシートを含み、クラスＩＩウイルスを暗示させる。クラスＩＩＩウイルスフソゲンは、ラブドウイルスおよびヘルペスウイルスに認められ得る。実施形態では、クラスＩＶウイルスフソゲンは、融合関連小膜貫通（ＦＡＳＴ）タンパク質であり（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｅｍｂｏｊ．７６００７６７、Ｎｅｓｂｉｔｔ，ＲａｅＬ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＦＡＳＴ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（２０１２）Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ．Ｐａｐｅｒ  ３８８）、非エンベロープレオウイルスによってコードされる。実施形態では、クラスＩＶウイルスフソゲンは、ヘアピンを形成しないほど小さい（ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ−ｃｅｌｌｂｉｏ−１０１５１２−１２２４２２、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ��ｄｅｖｃｅｌ．２００７．１２．００８）。
【０４５９】
いくつかの実施形態において、フソゲンはパラミクソウイルスフソゲンである。いくつかの実施形態において、フソゲンは、ニパウイルスタンパク質Ｆ、麻疹ウイルスＦタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦタンパク質、パラミクソウイルスＦタンパク質、ヘンドラウイルスＦタンパク質、ヘニパウイルスＦタンパク質、モルビリウイルスＦタンパク質、レスピロウイルスＦタンパク質、センダイウイルスＦタンパク質、ルブラウイルスＦタンパク質、またはアブラウイルスＦタンパク質である。
【０４６０】
いくつかの実施形態において、フソゲンはポックスウイルス科のフソゲンである。
【０４６１】
追加の例示的なフソゲンは、ＵＳ９，６９５，４４６、ＵＳ２００４／００２８６８７、ＵＳ６，４１６，９９７、ＵＳ７，３２９，８０７、ＵＳ２０１７／０１１２７７３、ＵＳ２００９／０２０２６２２、ＷＯ２００６／０２７２０２、およびＵＳ２００４／０００９６０４に開示されており、これらすべての全容は本明細書に参照により組み込まれる。
【０４６２】
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるフソゲンは、表４のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは、配列の一部、例えば、長さが１００、２００、３００、４００、５００、もしくは６００個のアミノ酸の部分と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるフソゲンは、表４の任意のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明される核酸配列は、表４のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは配列の一部、例えば、長さが４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸の部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
【０４６３】
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるフソゲンは、配列番号１〜５６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは配列の一部、例えば、長さが１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸の部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるフソゲンは、配列番号１〜５６のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明される核酸配列は、配列番号１〜５６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは配列の一部、例えば、長さが４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸の部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【表４−１３】
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【表４−１４】
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【表４−１５】
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【表４−１６】
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【表４−１７】
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【表４−１８】
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【表４−１９】
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【表４−２０】
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【表４−２１】
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【表４−２２】
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【表４−２３】
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【表４−２４】
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【表４−２５】
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【表４−２６】
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【表４−２７】
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【表４−２８】
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【０４６４】
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるフソゲンは、表５のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは、配列の一部、例えば、長さが１００、２００、３００、４００、５００、もしくは６００個のアミノ酸と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるフソゲンは、表５の任意のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明される核酸配列は、表５のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは配列の一部、例えば、長さが４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、もしくは６００個のアミノ酸の部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
【０４６５】
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるフソゲンは、配列番号５７〜１３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは配列の一部、例えば、長さが１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸の部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるフソゲンは、配列番号５７〜１３２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明される核酸配列は、配列番号５７〜１３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは配列の一部、例えば、長さが４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、もしくは６００個のアミノ酸の部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【表５−９】
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【表５−１０】
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【表５−１１】
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【表５−１２】
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【表５−１３】
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【表５−１４】
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【表５−１５】
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【表５−１６】
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【表５−１７】
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【表５−１８】
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【表５−１９】
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【表５−２０】
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【表５−２１】
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【表５−２２】
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【表５−２３】
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【表５−２４】
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【表５−２５】
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【表５−２６】
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【表５−２７】
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【表５−２８】
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【表５−２９】
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【表５−３０】
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【表５−３１】
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【表５−３２】
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【表５−３３】
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【表５−３４】
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【表５−３５】
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【表５−３６】
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【表５−３７】
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【表５−３８】
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【０４６６】
他のタンパク質
いくつかの実施形態において、フソゲンは、ｐＨ依存性タンパク質、そのホモログ、そのフラグメント、およびその１つ以上のタンパク質またはそのフラグメントを含むタンパク質融合物を含み得る。フソゲンは、細胞表面またはエンドソームあるいは別の細胞膜結合空間において膜融合を媒介し得る。
【０４６７】
いくつかの実施形態において、フソゲンは、ＥＦＦ−１、ＡＦＦ−１、ｇａｐ結合タンパク質、例えば、コネキシン（Ｃｎ４３、ＧＡＰ４３、ＣＸ４３など）（ＤＯＩ：１０．１０２１／ｊａｃｓ．６ｂ０５１９１）、他の腫瘍結合タンパク質、それらのホモログ、それらのフラグメント、それらの変異体、およびそれらの１つ以上のタンパク質またはそのフラグメントを含むタンパク質融合物を含む。
【０４６８】
脂質フソゲン
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、飽和脂肪酸などの１つ以上の融合性脂質を含むことができる。いくつかの実施形態において、飽和脂肪酸は、１０〜１４個の炭素を有する。いくつかの実施形態において、飽和脂肪酸は、より長い鎖のカルボン酸を有する。いくつかの実施形態では、飽和脂肪酸はモノエステルである。
【０４６９】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、１つ以上の不飽和脂肪酸を含み得る。いくつかの実施形態において、不飽和脂肪酸は、Ｃ１６〜Ｃ１８不飽和脂肪酸を有する。いくつかの実施形態では、不飽和脂肪酸には、オレイン酸、モノオレイン酸グリセロール、グリセリド、ジアシルグリセロール、変性不飽和脂肪酸、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０４７０】
理論に拘束されることを望まないが、いくつかの実施形態では、負の湾曲脂質は膜融合を促進する。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、膜内に、１つ以上の負の湾曲脂質、例えば、外因性の負の湾曲脂質を含む。実施形態において、負の湾曲脂質またはその前駆体は、供給源細胞、レトロウイルスベクター、またはＶＬＰを含むメディアに添加される。実施形態において、供給源細胞は、１つ以上の脂質合成遺伝子を発現または過剰発現するように操作される。負の湾曲脂質は、例えば、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、コレステロール、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、または脂肪酸（ＦＡ）であり得る。
【０４７１】
理論に拘束されることを望まないが、いくつかの実施形態では、正の湾曲脂質は膜融合を阻害する。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、膜において、１つ以上の正の湾曲脂質、例えば、外因性の正の湾曲脂質の低下したレベルを含む。実施形態では、レベルは、供給源細胞において脂質の合成を阻害することによって、例えば、脂質合成遺伝子のノックアウトまたはノックダウンによって、減少される。正の湾曲脂質は、例えば、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、またはモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）であり得る。
【０４７２】
化学物質フソゲン
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、融合性化学物質によって処理され得る。いくつかの実施形態では、融合性化学物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体である。
【０４７３】
いくつかの実施形態において、化学物質フソゲンは、２つの膜の間に局所的な脱水を誘発し、二重層の好ましくない分子パッキングをもたらす。いくつかの実施形態において、化学物質フソゲンは、脂質二重層付近の領域の脱水を誘発し、２つの膜間の水性分子の排除を引き起こし、２つの互いの膜間の相互作用を可能にする。
【０４７４】
いくつかの実施形態では、化学物質フソゲンは正のカチオンである。正のカチオンのいくつかの非限定的な例には、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｌａ３＋、Ｓｒ３＋、およびＨ＋が挙げられる。
【０４７５】
いくつかの実施形態において、化学物質フソゲンは、表面極性を変更することによって標的膜に結合し、水和依存性の膜間反発を変化させる。
【０４７６】
いくつかの実施形態において、化学物質フソゲンは、溶解可能である可溶性脂質である。いくつかの非限定的な例には、オレオイルグリセロール、ジオレオイルグリセロール、トリオレオイルグリセロール、ならびにそれらの変種および誘導体が挙げられる。
【０４７７】
いくつかの実施形態では、化学物質フソゲンは水溶性化学物質である。いくつかの非限定的な例には、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ならびにそれらの変種および誘導体が挙げられる。
【０４７８】
いくつかの実施形態では、化学物質フソゲンは小さい有機分子である。非限定的な例には、ｎ−ヘキシルブロミドが挙げられる。
【０４７９】
いくつかの実施形態において、化学物質フソゲンは、フソゲンまたは標的膜の構成、細胞生存率、またはイオン輸送特性を変化させない。
【０４８０】
いくつかの実施形態において、化学物質フソゲンは、ホルモンまたはビタミンである。いくつかの非限定的な例には、アブシジン酸、レチノール（ビタミンＡ１）、トコフェロール（ビタミンＥ）、ならびにそれらの変種および誘導体が挙げられる。
【０４８１】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、アクチンおよび重合化アクチンを安定化する薬剤を含む。理論に拘束されることは望まないが、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰにおける安定化されたアクチンは、標的細胞との融合を促進することができる。実施形態において、重合化アクチンを安定化させる薬剤は、アクチン、ミオシン、ビオチン−ストレプトアビジン、ＡＴＰ、神経性ウィスコット−アルドリッチ症候群タンパク質（Ｎ−ＷＡＳＰ）、またはフォルミンから選択される。例えば、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２０１１  Ａｕｇ１６；２７（１６）：１００６１−７１、およびＷｅら、ＮａｔＣｏｍｍｕｎ．２０１６Ａｕｇ３１；７を参照。実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、外因性アクチン、例えば、野生型アクチンまたは重合を促進する変異を含むアクチンを含む。実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、ＡＴＰまたはホスホクレアチン、例えば、外因性ＡＴＰまたはホスホクレアチンを含む。
【０４８２】
小分子フソゲン
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、融合性小分子で処理され得る。いくつかの非限定的な例には、ハロタン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）であるメロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、およびクロルプロマジンなどが挙げられる。
【０４８３】
いくつかの実施形態において、小分子フソゲンは、ミセル様凝集体で、または凝集体なしで存在し得る。
【０４８４】
タンパク質フソゲンにおける変異
タンパク質フソゲンまたはウイルスエンベロープタンパク質は、融合タンパク質または標的タンパク質（例えば、血球凝集素タンパク質）のアミノ酸残基を変異させることによって再標的化され得る。いくつかの実施形態では、フソゲンはランダムに変異される。いくつかの実施形態では、フソゲンは合理的に変異される。いくつかの実施形態では、フソゲンは定向進化が加えられる。いくつかの実施形態では、フソゲンは切断され、ペプチドのサブセットのみがレトロウイルスベクターまたはＶＬＰで使用される。例えば、麻疹血球凝集素タンパク質のアミノ酸残基を変異させて、タンパク質の結合特性を変化させ、融合を向け直し得る（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ９４２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙｖｏｌ．１６  ｎｏ．８、１４２７−１４３６  Ａｕｇ．２００８、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１０６０、ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７６．７．３５５８−３５６３．２００２、ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７５．１７．８０１６−８０２０．２００１、ｄｏｉ：１０．１０７３ｐｎａｓ．０６０４９９３１０３）。
【０４８５】
タンパク質フソゲンは、標的化部分を融合タンパク質または標的化タンパク質（例えば、血球凝集素タンパク質）と共有結合させることによって再標的化され得る。いくつかの実施形態において、融合体および標的化部分は、標的化部分に連結されたフソゲンを含むキメラタンパク質の発現によって共有結合される。標的には、標的細胞に提示される任意のペプチド（例えば、受容体）が含まれる。いくつかの例では、標的は、非標的細胞よりも標的細胞において高いレベルで発現される。例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をフソゲンに結合させて、フソゲン活性をｓｃＦｖ結合標的を提示する細胞に向け直すことができる（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１０６０、ＤＯＩ１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１２−１１−４６８５７９、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１５１４、ｄｏｉ：１０．１００６／ｍｔｈｅ．２００２．０５５０、ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥＴＨＥＲＡＰＹ１１：８１７−８２６、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ９４２、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２６３８１、ＤＯＩ１０．１１８６／ｓ１２８９６−０１５−０１４２−ｚ）。例えば、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）をフソゲンに結合させて、ＤＡＲＰｉｎ結合標的（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１３．１６、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１０．２９８、ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１５００９５６）、ならびに異なるＤＡＲＰｉｎの組み合わせ（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｏ．２０１６．３）を提示する細胞に融合活性を向け直すことができる。例えば、受容体リガンドおよび抗原をフソゲンと結合させて、標的受容体を提示する細胞にフソゲン活性を向け直すことができる（ＤＯＩ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１２．０５４、ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７６．７．３５５８−３５６３．２００２）。標的タンパク質はまた、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、線形抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨ）などの単一ドメイン抗体、ナノボディ、またはラクダＶＨＨドメイン）、フィブロネクチンポリペプチドミニボディなどの抗原結合フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）スキャホルド、リガンド、サイトカイン、ケモカイン、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むことができる。タンパク質フソゲンは、標的化部分を融合タンパク質または標的化タンパク質（例えば、血球凝集素タンパク質）に非共有結合的に結合させることによって再標的化され得る。例えば、融合タンパク質は、標的細胞上の抗原を標的とする抗体のＦｃ領域と結合するように操作され、抗体の標的を提示する細胞に向けて融合活性を向け直すことができる（ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７５．１７．８０１６−８０２０．２００１、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ１１９２）。改変フソゲンおよび非改変フソゲンは、同じレトロウイルスベクターまたはＶＬＰで提示され得る（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ���２０１４．０１．０５１）。
【０４８６】
標的化部分は、例えば、ヒト化抗体分子、インタクト無傷のＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体、二重特異性または多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、および単離されたＣＤＲまたはそれらのセットなどの抗体フラグメント、単鎖Ｆｖｓ、ポリペプチド−Ｆｃ融合、単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはそのフラグメントなどのシャーク単一ドメイン抗体）、ラクダ様抗体、マスクされた抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（「ＳＭＩＰｓＴＭ」）、単鎖またはタンデム二重抗体（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリン反復タンパク質またはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｏｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）、およびＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）を含み得る。
【０４８７】
実施形態において、再標的化されたフソゲンは、標的細胞上の細胞表面マーカー、例えば、タンパク質、糖タンパク質、受容体、細胞表面リガンド、アゴニスト、脂質、糖、クラスＩ膜貫通タンパク質、クラスＩＩ膜貫通タンパク質、またはクラスＩＩＩ膜貫通タンパク質と結合する。
【０４８８】
レトロウイルスベクターまたはＶＬＰはタンパク質フソゲンに結合されていない標的部分を提示して、融合活性を標的部分によって結合される細胞に向け直し、またはホーミングに影響を及ぼし得る。
【０４８９】
レトロウイルスベクターまたはＶＬＰに付加された標的化部分は、異なる結合強度を有するように調節され得る。例えば、様々な結合強度を有するｓｃＦｖおよび抗体を使用して、大量または少量の標的抗原を提示する細胞に対するレトロウイルスベクターまたはＶＬＰの融合活性を変化させ得る（ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０１４１５−０７、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｇｔ．２０１４．２５、ＤＯＩ：１０．１００２／ｊｇｍ．１１５１）。例えば、異なる親和性を有するＤＡＲＰｉｎを使用して、大量または少量の標的抗原を提示する細胞に対するレトロウイルスベクターまたはＶＬＰの融合活性を変化させ得る（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１０．２９８）。標的化部分はまた、標的リガンド上の異なる領域を標的にするように調節され得、標的を提示する細胞との融合割合に影響を与える（ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｖ００５）。
【０４９０】
いくつかの実施形態において、タンパク質フソゲンは、例えば、本明細書で説明されるように、免疫反応性を低減するように変化させることができる。例えば、タンパク質フソゲンは、ＰＥＧなどの免疫相互作用を低減する分子で装飾され得る（ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７８．２．９１２−９２１．２００４）。したがって、いくつかの実施形態では、フソゲンは、ＰＥＧを含み、例えば、ＰＥＧ化ポリペプチドである。免疫系によって標的にされるフソゲン中のアミノ酸残基は、免疫系によって認識されないように変更され得る（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｏｌ．２０１４．０１．０２７、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４６６６７）。いくつかの実施形態において、フソゲンのタンパク質配列は、ヒト（ヒト化）で認められるアミノ酸配列に類似するように変更される。いくつかの実施形態において、フソゲンのタンパク質配列は、ＭＨＣ複合体とわずかな強さで結合するタンパク質配列に変更される。いくつかの実施形態において、タンパク質フソゲンは、ヒトに感染しない（そしてヒトがワクチン接種されていない）ウイルスまたは生物に由来し、患者の免疫系がタンパク質フソゲンに対してナイーブである可能性を高める（例えば、フソゲンに対する無視できるほどの体液性または細胞媒介性の適応免疫応答がある）（ｄｏｉ：１０．１００６／ｍｔｈｅ．２００２．０５５０、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００５６４１、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１１．２０９、ＤＯＩ１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１４−０２−５５８１６３）。いくつかの実施形態では、フソゲンのグリコシル化を変更して、免疫相互作用を変化、または免疫反応性を低下させ得る。理論に束縛されることを望まないが、いくつかの実施形態において、ヒトに感染しないウイルスまたは生物に由来するタンパク質フソゲンは、患者において天然の融合標的を有さず、したがって高い特異性を有する。
【０４９１】
ポジティブ標的細胞特異的調節エレメント
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるレトロウイルス核酸は、ポジティブ標的細胞特異的調節エレメントを含み、組織特異的プロモーター、組織特異的エンハンサー、組織特異的スプライス部位、ＲＮＡもしくはタンパク質の半減期を延長する組織特異的部位、組織特異的ｍＲＮＡ核外輸送促進部位、組織特異的翻訳増強部位、または組織特異的翻訳後改変部位などが挙げられる。
【０４９２】
本明細書で説明されるレトロウイルス核酸は、ホスト細胞と相互作用して転写および翻訳を実行する領域、例えば、複製の起点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャインダルガルノ配列またはコザック配列）、イントロン、５’および３’非翻訳領域などの非翻訳領域を含み、操作可能に連結されるポリヌクレオチドの転写または発現を指示、増加、調節、または制御することができる。このようなエレメントは、その強度および特異性が異なり得る。利用されるベクターシステムおよび宿主に応じて、遍在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、任意の数の好適な転写および翻訳エレメントを使用し得る。
【０４９３】
特定の実施形態では、制御エレメントは、細胞特異的な様式で、操作可能に連結されたポリヌクレオチドの転写または発現を指示、増加、調節、または制御することができる。特定の実施形態では、レトロウイルス核酸は、特定の細胞、細胞型、または細胞系統、例えば標的細胞に特異的である１つ以上の発現制御配列を含み、すなわち、特定の細胞、細胞型、または細胞系統に特異的である発現制御配列に操作可能に連結されたポリヌクレオチドの発現は、標的細胞で発現され、非標的細胞では発現されない（またはより低いレベル）。
【０４９４】
特定の実施形態において、レトロウイルス核酸は、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの外因性、内因性、または異種の制御配列を含むことができる。
【０４９５】
実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合する認識部位を含む。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに操作可能に連結されたポリヌクレオチドを開始および転写する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞で機能するプロモーターは、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域、および／または転写開始から７０〜８０塩基上流に認められる別の配列である、Ｎが任意のヌクレオチドであり得るＣＮＣＡＡＴ領域を含む。
【０４９６】
実施形態では、エンハンサーは、増強された転写を提供することができ、いくつかの例では、別の制御配列に対する適応とは無関係に機能することができる配列を含むＤＮＡのセグメントを含む。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサーエレメントと協調的または相加的に機能することができる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡのプロモーター／エンハンサーセグメントは、プロモーターおよびエンハンサー機能の両方をもたらすことができる配列を含む。
【０４９７】
例示的な遍在性発現制御配列には、限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーター、ウイルスシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５、およびＰ１１プロモーター、伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座Ｏｒｉｏｎｓら，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２５、１４７７−１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーターおよび骨髄増殖肉腫ウイルスエンハンサー、削除されたネガティブコントロール領域、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔら，ＪＶｉｒｏｌ．６９（２）：７４８−５５（１９９５））が挙げられる。
【０４９８】
いくつかの実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、肝臓細胞、例えば、肝細胞、肝臓類洞内皮細胞、胆管細胞、星状細胞、肝常在抗原提示細胞（例えば、クッパー細胞）、肝常在免疫リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞）、または門脈線維芽細胞における発現を促進するプロモーターである。様々な好適な肝臓特異的プロモーター（例えば、肝細胞特異的プロモーターおよび肝類洞内皮細胞プロモーター）を以下の表６に記載する。表６にはまた、肝細胞に特異的ではないいくつかの遍在性プロモーターも列挙される。いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるフソソーム（例えば、ウイルスベクター）は、その核酸において、表６の配列を有するプロモーター、またはそれらの転写活性フラグメント、あるいはそれらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する変異体を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるフソソーム（例えば、ウイルスベクター）は、その核酸において、表６に列挙される遺伝子のための転写開始部位の３ｋｂ内の領域からの転写因子結合部位を有するプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるフソソーム（例えば、ウイルスベクター）は、その核酸において、表６に列挙される遺伝子の転写開始部位のすぐ上流の２．５ｋｂ、２ｋｂ、１．５ｋｂ、１ｋｂ、もしくは０．５ｋｂ内の領域、あるいはそれらの転写活性フラグメント、またはそれらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する変異体を含む。
【０４９９】
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるフソソーム（例えば、ウイルスベクター）は、その核酸において、配列番号１３３〜１４２もしくは１６１〜１６８のうちのいずれか１つに示される配列を有するプロモーター、またはそれらの転写活性フラグメント、あるいはそれらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する変異体を含む。
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【表６−８】
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【表６−９】
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【表６−１０】
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【表６−１１】
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【０５００】
肝臓特異的シス調節モジュール（例えば、プロモーター）内の様々なコンセンサス配列が記載されている。いくつかの実施形態において、肝臓特異的シス調節モジュールは、ＨＮＦ１α、Ｃ／ＥＢＰ、ＬＥＦ１、ＦＯＸ、ＩＲＦ、ＬＥＦ１／ＴＣＦ、Ｔａｌ１β／Ｅ４７、およびＭｙｏＤのうちの１つ以上について結合部位を含む。いくつかの実施形態において、肝臓特異的シス調節モジュールは、Ｃｈｕａｈら、“Ｌｉｖｅｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｕｌｅｓ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｅｎａｂｌｅ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｉｍａｔｅｓ”  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１４  Ｓｅｐ；２２（９）：１６０５−１６１３の図１または表１に示された配列を含み、その全体が、その図１および表１の配列を含めて、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、肝臓特異的シス調節モジュールは、Ｄｈｕａｈらの前出に記載されている、ＨＳ−ＣＲＭ１、ＨＳ−ＣＲＭ２、ＨＳ−ＣＲＭ３、ＨＳ−ＣＲＭ４、ＨＳ−ＣＲＭ５、ＨＳ−ＣＲＭ６、ＨＳ−ＣＲＭ７、ＨＳ−ＣＲＭ８、ＨＳ−ＣＲＭ９、ＨＳ−ＣＲＭ１０、ＨＳ−ＣＲＭ１１、ＨＳ−ＣＲＭ１２、ＨＳ−ＣＲＭ１３、またはＨＳ−ＣＲＭ１４のヒト配列を含む。
【０５０１】
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）は通常、シストロン（タンパク質コード領域）のＡＴＧなどの開始コドンへの直接的な内部リボソーム侵入を促進し、それによって遺伝子のｃａｐ非依存性翻訳をもたらす。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎら（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ１５（１２）：４７７−８３、ならびにＪａｃｋｓｏｎおよびＫａｍｉｎｓｋｉ．（１９９５）ＲＮＡ１（１０）：９８５−１０００を参照。特定の実施形態では、ベクターは、１つ以上の外因性薬剤をコードする１つ以上の外因性遺伝子を含む。特定の実施形態において、複数の外因性タンパク質剤の各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、１つ以上のＩＲＥＳ配列または自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって分離することができる。
【０５０２】
本明細書におけるレトロウイルス核酸はまた、１つ以上のコザック配列、例えば、リボソームの小サブユニットとのｍＲＮＡの初期結合を促進し、翻訳を増加させる短いヌクレオチド配列を含み得る。コンセンサスコザック配列は（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧであり、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ，（１９８６）Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３−９２、およびＫｏｚａｋ，（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５（２０）：８１２５−４８）。
【０５０３】
異種転写因子およびインデューサーに応答するプロモーター
いくつかの実施形態において、レトロウイルス核酸は、外因性薬剤の条件付き発現、例えば、限定されないが、誘導性発現、抑制性発現、細胞型特異的発現、または組織特異的発現を含む任意のタイプの条件付き発現を可能にする。いくつかの実施形態では、外因性薬剤の条件付き発現を達成するために、発現は、細胞、組織、または生物に、外因性薬剤を発現させる、または外因性の発現の増加または減少を生じる処理または条件を加えることによって制御される。
【０５０４】
誘導性プロモーター／システムの例示的な例には、限定されないが、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のためのプロモーター（対応するホルモンによる処理によって誘導可能）などのステロイド誘導性プロモーター、メタロチオニンプロモーター（様々な重金属による処理によって誘導可能）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導可能）、「遺伝子スイッチ」ミフェプリストン調節可能システム（Ｓｉｒｉｎら、２００３、Ｇｅｎｅ、３２３：６７）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節システムなどが含まれる。
【０５０５】
導入遺伝子発現は、インデューサー分子の存在または不在によって活性化または抑制され得る。いくつかの例では、インデューサー分子は段階的様式で遺伝子発現を活性化または抑制し、いくつかの例では、インデューサー分子はオールオアナッシング様式で遺伝子発現を活性化または抑制する。
【０５０６】
一般的に使用される誘導性プロモーター／システムは、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）調節システムである。Ｔｅｔシステムは、それぞれの標的細胞における２つのエレメントの共発現に基づいており、（ｉ）最小プロモーターに融合され、目的の遺伝子（例：外因性薬剤をコードする遺伝子）に接続されたＴｅｔオペレーター配列（ＴｅｔＯ）の反復を含むテトラサイクリン応答エレメントおよび（ｉｉ）転写トランスアクチベーター（ｔＴＡ）、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）の融合タンパク質、および単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６タンパク質のトランス活性化ドメインである。最初に説明された方式では、導入遺伝子発現はテトラサイクリンまたはその強力な類似体であるドキシサイクリン（Ｄｏ）の不在下で活性であり、Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムと呼ばれるが、トランスアクチベータータンパク質内の４つのアミノ酸の改変は逆ｔＴＡ（ｒｔＴＡ）をもたらし、Ｄｏｘの存在下でのみＴｅｔＯと結合する（Ｔｅｔ−ＯＮシステム）。いくつかの実施形態では、トランスアクチベーターにおいて、ＶＰ１６ドメインが最小の活性化ドメインによって置き換えられており、潜在的なスプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位が除去されており、タンパク質はコドン最適化されており、Ｄｏｘに対するより高い感受性および低いベースライン活性を有する改善されたトランスアクチベーター変異体ｒｔＴＡ２Ｓ−Ｍ２をもたらす。さらに、様々なＴｅｔ応答性プロモーターエレメントが生成されており、調節を増強するために隣接するオペレーターから３６ヌクレオチド離れたＴｅｔＯにおける改変が含まれる。追加の改変は、基礎活性をさらに低下させ、発現ダイナミックレンジを増加させるのに有用であり得る。例として、ｐＴｅｔ−Ｔ１１（単にＴＩＩ）変異体は、高いダイナミックレンジと低いバックグラウンド活性を示す。
【０５０７】
条件付き発現はまた、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって達成することができる。特定の実施形態によれば、レトロウイルス核酸は、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための少なくとも１つ（典型的には２つ）の部位（複数可）を含み、例えば、切除性または統合性タンパク質、酵素、補因子、または１つ以上の組換え部位（例えば、２、３、４、５、７、１０、１２、１５、２０、３０、５０など）を含む組換え反応に含まれる関連タンパク質が挙げられ、野生型タンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６９９−７０７（１９９３））、または変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列もしくはそのフラグメントを含む融合タンパク質）、フラグメント、およびそれらの変異体であり得る。リコンビナーゼの例示的な例には、限定されないが、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３レゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが含まれる。
【０５０８】
外因性薬剤の発現を調節するリボスイッチ
本明細書で提供される組成物および方法のいくつかは、１つ以上のリボスイッチまたは１つ以上のリボスイッチを含むポリヌクレオチドを含む。リボスイッチは、遺伝子発現を調節する細菌における一般的な機能であり、生物学的機能のＲＮＡ制御を達成する手段である。リボスイッチは、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に存在することができ、リボスイッチ活性を誘発または抑制する小分子リガンドの結合を通じて遺伝子発現の調節制御を可能にすることができる。いくつかの実施形態では、リボスイッチは、小分子リガンドの生成に含まれる遺伝子産物を制御する。リボスイッチは通常、シス方式で作用するが、リボスイッチはトランス方式で作用することが特定されている。天然のリボスイッチは、２つのドメインからなり、三次元で折り畳まれたＲＮＡ構造を介してリガンドと結合するアプタマードメイン、およびリガンドの不在または存在に基づいてリボスイッチにおける活性を誘発または抑制する機能スイッチングドメインである。したがって、リボスイッチによって達成される２つのリガンド感受性構造があり、オン状態およびオフ状態を示す。（Ｇａｒｓｔら、２０１１）。機能スイッチングドメインは、内部リボソーム侵入部位、レトロウイルス遺伝子構築体におけるプレｍＲＮＡスプライスドナーの接近性、翻訳、転写の終了、転写物分解、ｍｉＲＮＡ発現、またはｓｈＲＮＡ発現を調節することによってポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼすことができる（ＤａｍｂａｃｈおよびＷｉｎｋｌｅｒ２００９）。アプタマーおよび機能スイッチングドメインはモジュラー成分として使用することができ、合成ＲＮＡデバイスが遺伝子発現を、ネイティブアプタマー、変異／進化したネイティブアプタマー、またはランダムＲＮＡライブラリーのスクリーニングから特定される全合成アプタマーのいずれかとして制御できるようにする（ＭｃＫｅａｇｕｅら２０１６）。
【０５０９】
プリンリボスイッチファミリーは、認められた５００配列を超える最大のファミリーの１つを表す（Ｍａｎｄａｌら２００３、ＵＳ２００８／０２６９２５８、およびＷＯ２００６／０５５３５１）。プリンリボスイッチは、介在するループ／接合エレメント（Ｊ１−２、Ｌ２、Ｊ２−３、Ｌ３、Ｊ３−１）を有する３つの保存されたラセン構造／ステム構造（ＰＩ、Ｐ２、Ｐ３）からなる同様の構造を共有する。リボスイッチのプリンファミリーのアプタマードメインは、配列の変化に起因する、アデニン、グアニン、アデノシン、グアノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシンなどの様々なプリン化合物によって、それらの親和性／調節において自然に変化する（Ｋｉｍら２００７）。
【０５１０】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるレトロウイルス核酸は、プロモーターおよびリボスイッチに操作可能に連結された外因性薬剤をコードするポリヌクレオチドを含む。リボスイッチは、ａ．）アプタマードメイン、例えば、ヌクレオシド類似体抗ウイルス剤に結合することができ、ヌクレオシド類似体抗ウイルス剤と比較してグアニンまたは２’−デオキシグアノシンへの結合が減少しているアプタマードメイン、ｂ．）機能スイッチングドメイン、例えば、外因性薬剤の発現を調節することができ、アプタマードメインによるヌクレオシド類似体の結合が、機能スイッチングドメインの発現調節活性を誘導または抑制し、それによって外因性薬剤の発現を調節する、機能スイッチングドメイン、のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、外因性薬剤は、ポリペプチド、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡであり得る。例えば、一実施形態では、リボスイッチは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸に操作可能に連結されている。本明細書で提供される非限定的な例示的な例では、外因性遺伝子は、１つ以上の操作されたシグナル伝達ポリペプチドをコードする。例えば、リボスイッチおよび１つ以上の操作されたシグナル伝達ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドは、供給源細胞のゲノムに、複製能力のない組換えレトロウイルス粒子に、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞に認めることができる。
【０５１１】
アプタマードメインは、例えば、モジュラー構成要素として使用することができ、ＲＮＡ転写物に影響を及ぼすために機能スイッチングドメインのいずれかと組み合わせることができる。本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、リボスイッチは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、プレｍＲＮＡスプライスドナーの接近性、翻訳、転写の終結、転写物分解、ｍｉＲＮＡ発現、またはｓｈＲＮＡ発現の活性のいずれかを調節することによってＲＮＡ転写物に影響を及ぼすことができる。いくつかの実施形態では、機能スイッチングドメインは、抗ＩＲＥＳのＩＲＥＳとの結合を制御することができる（例えば、Ｏｇａｗａ，ＲＮＡ（２０１１），１７：４７８〜４８８を参照、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書に開示される実施形態のいずれかにおいて、小分子リガンドの存在または不在は、リボスイッチにＲＮＡ転写物への影響を及ぼさせることができる。いくつかの実施形態において、リボスイッチは、リボザイムを含むことができる。リボザイムを有するリボスイッチは、小分子リガンドの存在下で標的ポリヌクレオチドの転写物分解を阻害または増強することができる。いくつかの実施形態において、リボザイムは、リボザイムのピストルクラス、リボザイムのハンマーヘッドクラス、リボザイムのツイストクラス、リボザイムのハチェットクラス、またはＨＤＶ（デルタ肝炎ウイルス）であり得る。
【０５１２】
非標的細胞特異的調節エレメント
いくつかの実施形態において、非標的細胞特異的調節エレメントまたはネガティブＴＣＳＲＥは、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、組織特異的プロテアーゼ認識部位、組織特異的ユビキチンリガーゼ部位、組織特異的転写抑制部位、または組織特異的エピジェネティック抑制部位を含む。
【０５１３】
いくつかの実施形態において、非標的細胞は、内因性ｍｉＲＮＡを含む。レトロウイルス核酸（例えば、外因性薬剤をコードする遺伝子）は、そのｍｉＲＮＡの認識配列を含み得る。したがって、レトロウイルスの核酸が非標的細胞に入ると、ｍｉＲＮＡは外因性物質の発現を下方調節することができる。これは、標的細胞と非標的細胞に対する特異性を達成するのに役立つ。
【０５１４】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、２０〜２２ヌクレオチドの小さい非コードＲＮＡであり、典型的には、プレｍｉＲＮＡとして知られる約７０ヌクレオチドのフォールドバックＲＮＡ前駆体構造から切り取られる。一般に、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡと標的の間の相補性の程度に応じて、２つの方式のうちの１つでそれらの標的をネガティブ調節する。最初に、タンパク質コード化ｍＲＮＡ配列と完全またはほぼ完全な相補性で結合するｍｉＲＮＡは、通常、ＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する。ｍｉＲＮＡは、それらのｍＲＮＡ標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の不完全な相補的部位と結合することによってそれらの調節効果を発揮し、通常、ＲＮＡｉ経路に使用されるものと類似、または同一の可能性があるＲＩＳＣ複合体を介して、標的遺伝子発現を転写後に、明らかに翻訳のレベルで抑制する。翻訳制御と一致して、このメカニズムを使用するｍｉＲＮＡは、それらの標的遺伝子のタンパク質レベルを低下させるが、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは最小限の影響のみ受ける。ｍｉＲＮＡ（例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡまたは人工的に設計されたｍｉＲＮＡ）は、任意のｍＲＮＡ配列を特異的に標的にすることができる。例えば、一実施形態では、当業者は、ヒトｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−３０またはｍｉＲ−２１）一次転写物として発現される短ヘアピンＲＮＡ構築体を設計することができる。この設計は、ヘアピン構築体にＤｒｏｓｈａプロセシング部位を追加して、ノックダウン効率を大幅に増加させることが示されている（Ｐｕｓｃｈら、２００４）。ヘアピンステムは、２２ｎｔのｄｓＲＮＡ（例えば、アンチセンスは所望の標的と完全な相補性を有する）およびヒトｍｉＲからの１５〜１９ｎｔのループからなる。ヘアピンの片側または両側にｍｉＲループおよびｍｉＲ３０フランキング配列を追加することによって、マイクロＲＮＡを有さない従来のｓｈＲＮＡ設計と比較して、発現したヘアピンのＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒプロセッシングは１０倍を超える増加をもたらす。ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒプロセシングの増加は、ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ生成および発現したヘアピンに対する効力を増加させる。
【０５１５】
何百もの異なるｍｉＲＮＡ遺伝子が、発生の際そして組織タイプにわたって差次的に発現される。いくつかの研究は、発生の時機、細胞分化、増殖、アポトーシス、発癌、インスリン分泌、およびコレステロール生合成を含む、幅広い生物学的プロセスにおけるｍｉＲＮＡに関する重量な調節的役割を示唆した。（Ｂａｒｔｅｌ  ２００４  Ｃｅｌｌ  １１６：２８１−９７、Ａｍｂｒｏｓ  ２００４  Ｎａｔｕｒｅ  ４３１：３５０−５５、Ｄｕｆら．２００５  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３２：４６４５−５２、Ｃｈｅｎ  ２００５  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５３：１７６８−７１、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔら．２００５  Ｎａｔｕｒｅ  ４３８：６８５−８９を参照。）分子分析は、ｍｉＲＮＡが異なる組織で異なる発現プロファイルを有することを示した。コンピュータ法を使用して、約７，０００の予測されるヒトｍｉＲＮＡ標的の発現を分析している。データは、ｍｉＲＮＡ発現が多くのヒト組織におけるｍＲＮＡ発現の組織特異性に広く寄与することを示唆する。（Ｓｏｏｄら．２００６ＰＮＡＳ  ＵＳＡ１０３（８）：２７４６−５１を参照。）
【０５１６】
したがって、ｍｉＲＮＡをベースとした方法は、内因性マイクロＲＮＡ種を使用して非標的細胞タイプでの外因性薬剤の発現をサイレンシングすることによって、外因性薬剤の発現を標的細胞集団に限定するために使用され得る。マイクロＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳を阻害することによって、またはｍＲＮＡの分解を引き起こすことによって、多くの生物で配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導する。例えば、Ｂｒｏｗｎら．２００６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１２（５）：５８５−９１およびＷＯ２００７／０００６６８を参照、これらの各々は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、レトロウイルス核酸は、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列のうちの１つ以上（例えば、複数の）を含む。いくつかの実施形態において、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列は、長さが約２０〜２５、２１〜２４、または２３ヌクレオチドである。実施形態において、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列は、非標的細胞に存在するｍｉＲＮＡと完全な相補性を有する。いくつかの実施形態において、外因性薬剤は、ＧＦＰを含まず、例えば、蛍光タンパク質を含まず、例えば、レポータータンパク質を含まない。いくつかの実施形態では、標的外細胞は造血細胞ではなく、および／またはｍｉＲＮＡは造血細胞に存在しない。
【０５１７】
いくつかの実施形態では、本明細書における方法は、標的細胞における外因性薬剤の組織特異的発現を含み、外因性薬剤をコードするヌクレオチドおよび少なくとも１つの組織特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含む複数のレトロウイルスベクターを、標的細胞および非標的細胞を含む複数の細胞と接触させることを含み、外因性薬剤が標的細胞で優先的に、例えば、限定されて、発現される。
【０５１８】
例えば、レトロウイルス核酸は、非標的細胞、例えば、造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）において対応するｍｉＲＮＡを有するヌクレオチド配列に操作可能に連結された少なくとも１つのｍｉＲＮＡ認識配列を含むことができ、非標的細胞におけるヌクレオチド配列の発現を防止または低減するが、標的細胞、例えば、分化細胞において防止または低減しない。いくつかの実施形態において、レトロウイルス核酸は、非標的細胞において有効量で存在する（例えば、内因性ｍｉＲＮＡの濃度が導入遺伝子の発現を低減または防止するのに十分である）ｍｉＲＮＡに対する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列標的を含み、かつ導入遺伝子を含む。実施形態では、このシステムで使用されるｍｉＲＮＡは、ＨＳＰＣおよびＨＳＣなどの非標的細胞で強く発現されるが、例えば骨髄およびリンパ球系の分化した子孫では発現されず、感受性幹細胞集団における導入遺伝子の発現を防止または低減し、一方、標的細胞における発現と治療効能を維持する。
【０５１９】
いくつかの実施形態において、ネガティブＴＳＣＲＥまたはＮＴＳＣＲＥは、ｍｉＲＮＡ認識部位、例えば、造血細胞に対して内因性であるｍｉＲＮＡによって結合されるｍｉＲＮＡ認識部位を含む。例えば、ネガティブＴＳＣＲＥまたはＮＴＳＣＲＥは、造血細胞に内因性であるｍｉＲＮＡに相補的な配列である。例示的なｍｉＲＮＡを以下の表７に示す。いくつかの実施形態において、核酸（例えば、フソソーム核酸またはレトロウイルス核酸）は、表７のｍｉＲＮＡに相補的であるか、またはそれらと少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、、もしくは９９％相補性を有する。いくつかの実施形態において、核酸（例えば、フソソーム核酸またはレトロウイルス核酸）は、内因性ｍｉＲＮＡ、例えば、表７のｍｉＲＮＡにおけるシード配列と完全に相補的である配列を含む。実施形態では、シード配列は、長さが少なくとも６、７、８、９、または１０ヌクレオチドである。
【０５２０】
いくつかの実施形態において、核酸（例えば、フソソーム核酸またはレトロウイルス核酸）は、配列番号１４３〜１６０のいずれか１つに示されるｍｉＲＮＡに相補的な配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸（例えば、フソソーム核酸またはレトロウイルス核酸）は、配列番号１４３〜１６０のいずれか１つに示される内因性ｍｉＲＮＡ内のシード配列と完全に相補的である配列を含むＴＳＣＲＥまたはＮＴＳＣＲＥを含む。実施形態では、シード配列は、長さが少なくとも６、７、８、９、または１０ヌクレオチドである。
【表７】
2021523724.tif 000084
【０５２１】
いくつかの実施形態では、ネガティブＴＳＣＲＥまたはＮＴＳＣＲＥは、本明細書で説明されるｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ認識部位を含む。例示的なｍｉＲＮＡは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００６  Ｊａｎ１、３４、ＣｈｅｎおよびＬｏｄｉｓｈ、Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５Ａｐｒ；１７（２）：１５５−６５、Ｃｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００４Ｊａｎ２；３０３（５６５４）：８３−６、Ｂａｒａｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００４Ｄｅｃ；１４（１２）：２４８６−２４９４、Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙら、ＲＮＡ．２００３Ｏｃｔ；９（１０）：１２７４−８１、Ｋａｓａｓｈｉｍａら．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００４Ｓｅｐ１７；３２２（２）：４０３−１０、Ｈｏｕｂａｖｉｙら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ．２００３Ａｕｇ；５（２）：３５１−８、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．２００２Ａｐｒ３０；１２（９）：７３５−９、Ｃａｌｉｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００４Ｍａｒ２；１０１（９）：２９９９−３００４、Ｓｅｍｐｅｒｅら．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００４；５（３）：Ｒ１３、Ｍｅｔｚｌｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ．２００４Ｆｅｂ；３９（２）：１６７−９、Ｃａｌｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００２Ｎｏｖ２６；９９（２４）：１５５２４−９、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら、ＮａｔＧｅｎｅｔ．２００４Ｏｃｔ；３６（１０）：１０７９−８３、Ｍｉｃｈａｅｌら．ＭｏｌＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００３Ｏｃｔ；１（１２）：８８２−９１、およびｗｗｗ．ｍｉＲＮＡ．ｏｒｇで認められるものに含まれる。
【０５２２】
いくつかの実施形態では、ネガティブＴＳＣＲＥまたはＮＴＳＣＲＥは、ｍｉＲ−１ｂ、ｍｉＲ−１８９ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ１２４ａ、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ９９ａ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１４２−ｓ、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１９、ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１７８、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−１４２−ａ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１８１、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−９＊、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２６６、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１３１、ｍｉＲ−１２４ｂ、ｍｉＲ−１５１、ｍｉＲ−７ｂ、ｍｉＲ−１０３、およびｍｉＲ−２０８から選択されるｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ認識部位を含む。
【０５２３】
いくつかの実施形態において、核酸（例えば、フソソーム核酸またはレトロウイルス核酸）は、２つ以上のｍｉＲＮＡ認識部位を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上のｍｉＲＮＡ認識部位の各々は、本明細書で説明されるような、例えば、表７に列挙されるいずれかのｍｉＲＮＡによって認識される。いくつかの実施形態では、２つ以上のｍｉＲＮＡ認識部位の各々は、配列番号１４３〜１６０のうちのいずれか１つに示されるｍｉＲＮＡによって認識される。いくつかの実施形態では、２つ以上のｍｉＲＮＡ認識部位は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のｍｉＲＮＡ認識部位を含むことができる。２つ以上のｍｉＲＮＡ認識部位を核酸内にタンデムに配置して、ｍｉＲＮＡに対する多数のタンデム結合部位をもたらすことができる。
【０５２４】
いくつかの実施形態では、２つ以上のｍｉＲＮＡ認識部位は、１、２、３、４、５、６つ以上の第１のｍｉＲＮＡ認識部位など、少なくとも１つの第１のｍｉＲＮＡ認識部位、および１、２、３、４、５、６つ以上の第２のｍｉＲＮＡ認識部位など、少なくとも１つの第２のｍｉＲＮＡ認識部位を含むことができる。いくつかの実施形態において、核酸は、２つ以上の第１のｍｉＲＮＡ認識部位を含み、当該第１のｍｉＲＮＡ認識部位の各々は、核酸中にタンデムに存在し、第１のｍｉＲＮＡに対する複数のタンデム結合部位を提供し、および／または核酸は、さらに２つの第２のｍｉＲＮＡ認識部位を含み、当該第２のｍｉＲＮＡ認識部位の各々は、核酸中にタンデムに存在し、第２のｍｉＲＮＡに対する複数のタンデム結合部位を提供する。いくつかの実施形態では、第１のｍｉＲＮＡ認識部位および第２のｍｉＲＮＡ認識部位は、同じｍｉＲＮＡによって認識され、いくつかの実施形態では、第１のｍｉＲＮＡ認識部位および第２のｍｉＲＮＡ認識部位は、異なるｍｉＲＮＡによって認識される。いくつかの実施形態では、第１のｍｉＲＮＡ認識部位および第２のｍｉＲＮＡ認識部位は、同一の非標的細胞に存在するｍｉＲＮＡによって認識され、いくつかの実施形態では、第１のｍｉＲＮＡ認識部位および第２のｍｉＲＮＡ認識部位は、異なる非標的細胞に存在するｍｉＲＮＡによって認識される。いくつかの実施形態では、第１のｍｉＲＮＡ認識部位および第２のｍｉＲＮＡ認識部位のうちの一方または両方は、本明細書で説明されるような、表７に示されるいずれかなどのｍｉＲＮＡによって認識される。いくつかの実施形態では、第１のｍｉＲＮＡ認識部位および第２のｍｉＲＮＡ認識部位のうちの一方または両方は、配列番号１４３〜１６０のうちのいずれか１つに示されるｍｉＲＮＡによって認識される。いくつかの実施形態において、フソソーム核酸（例えば、エグレトロウイルス核酸）上のｍｉＲＮＡ認識部位のうちの１つ以上は、外因性薬剤によってシスで転写される。いくつかの実施形態において、フソソーム核酸（例えば、レトロウイルス核酸）上のｍｉＲＮＡ認識部位のうちの１つ以上は、ポリＡテール配列の下流、例えば、ポリＡテール配列とＷＰＲＥとの間、に位置する。いくつかの実施形態において、フソソーム核酸（例えば、レトロウイルス核酸）上のｍｉＲＮＡ認識部位のうちの１つ以上は、ＷＰＲＥの下流に位置する。
【０５２５】
免疫調節
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるレトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、上昇したＣＤ４７を含む。例えば、ＵＳ９，０５０，２６９を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるレトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、上昇した補体調節タンパク質を含む。例えば、ＥＳ２６２７４４５Ｔ３およびＵＳ６７９０６４１を参照、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるレトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、ＭＨＣタンパク質、例えば、ＭＨＣ−１クラス１またはクラスＩＩの欠如または低下したレベルを含む。例えば、ＵＳ２０１７／０１６５３４８を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０５２６】
レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、ときには対象の免疫系によって認識される。エンベロープ化ウイルスベクター粒子（例えば、レトロウイルスベクター粒子）の場合、ウイルスエンベロープの表面に提示される膜結合タンパク質が認識され得、ウイルス粒子それ自体が中和され得る。さらに、標的細胞に感染すると、ウイルスエンベロープは細胞膜と統合され、結果として、ウイルスエンベロープタンパク質が細胞の表面に提示されるか、または細胞の表面と密接に結合したままであり得る。したがって、免疫系は、ウイルスベクター粒子が感染した細胞も標的にし得る。両方の効果は、ウイルスベクターによる外因性薬剤送達の有効性の低下をもたらし得る。
【０５２７】
ウイルス粒子エンベロープは通常、供給源細胞の膜に由来する。したがって、ウイルス粒子が突き出る細胞膜上に発現される膜タンパク質は、ウイルスエンベロープに組み込まれ得る。
【０５２８】
免疫調節タンパク質ＣＤ４７
細胞外物質の細胞への内在化は、一般にエンドサイトーシスと呼ばれるプロセスによって実施される（Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５（３）：８５−７、Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，１９９５、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５（３）：１４１−２、Ｓｗａｎｓｏｎら，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５（３）：８９−９３、Ａｌｌｅｎら，１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４（２）：６２７−３７）。エンドサイトーシスは２つの一般的なカテゴリに分類され、粒子の取り込みを含む食作用、ならびに、流体および溶質の取り込みを含む飲作用である。
【０５２９】
膜受容体ＣＤ４７を欠くノックアウトマウスを用いる研究に基づいて、プロフェッショナル食細胞が非自己と自己と区別することが示されている（Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇら，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８８（５４７３）：２０５１−４）。ＣＤ４７は、マクロファージに認められた免疫阻害受容体ＳＩＲＰα（シグナル調節タンパク質）と相互作用するＩｇスーパーファミリーの遍在性メンバーである（Ｆｕｊｉｏｋａら、１９９６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６（１２）：６８８７−９９、Ｖｅｉｌｌｅｔｔｅら、１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（３５）：２２７１９−２８、Ｊｉａｎｇら、１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２）：５５９−６２）。ＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用はマウスにおいて自己マクロファージを不活性化するように思われるが、ＣＤ４７の著しい減少（おそらく９０％）がいくつかのＲｈ遺伝子型に由来するヒト血液細胞で認められ、貧血の証拠をほとんどまたはまったく示さず（Ｍｏｕｒｏ−Ｃｈａｎｔｅｌｏｕｐら、２００３、Ｂｌｏｏｄ１０１（１）：３３８−３４４）、そして食細胞単球との高められた細胞相互作用の証拠もほとんどまたはまったく示さない（Ａｒｎｄｔら、２００４、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２５（３）：４１２−４）。
【０５３０】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ（例えば、約１μｍ未満、約４００ｎｍ未満、または約１５０ｎｍ未満の半径を有するウイルス粒子）は、ＣＤ４７の少なくとも生物学的に活性な部分を、例えば、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰの曝露される表面に含む。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルス）またはＶＬＰは、脂質コーティングを含む。実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰにおける生物学的に活性なＣＤ４７の量は、約２０〜２５０、２０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、または２００〜２５０分子／μｍ２である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７はヒトＣＤ４７である。
【０５３１】
本明細書で説明される方法は、食細胞による粒子の食作用を回避することを含むことができる。この方法は、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰにおいてＣＤ４７の少なくとも生物学的に活性な部分を含む少なくとも１つのペプチドを発現させることを含み得、それによって、ＣＤ４７を含むレトロウイルスベクターまたはＶＬＰが食作用細胞に曝露されるとき、ウイルス粒子は食作用細胞による食作用を回避し、または非改変である以外は同様なレトロウイルスベクターまたはＶＬＰと比べて食作用の減少を示す。いくつかの実施形態において、対象におけるレトロウイルスベクターまたはＶＬＰの半減期は、非改変である以外は同様であるレトロウイルスベクターまたはＶＬＰと比べて延長される。
【０５３２】
ＭＨＣの削除
主要組織適合複合体クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）は、ウイルスエンベロープに組み込むことができる宿主細胞膜タンパク質であり、本来的に多型性が高いため、体の免疫応答の主要な標的である（ＭｃＤｅｖｉｔｔ  Ｈ．Ｏ．（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１−１７）。供給源細胞の原形質膜に曝露されるＭＨＣ−Ｉ分子は、ベクターの出芽のプロセス中にウイルス粒子エンベロープに組み込まれ得る。供給源細胞に由来し、ウイルス粒子に組み込まれたこれらのＭＨＣ−Ｉ分子は、次に、標的細胞の原形質膜に移ることができる。あるいは、ＭＨＣ−Ｉ分子は、ウイルス粒子が標的細胞膜を吸収して結合したままになる傾向の結果として、標的細胞膜と密接に結合したままであり得る。
【０５３３】
形質導入された細胞の原形質膜上またはその付近における外因性ＭＨＣ−Ｉ分子の存在は、対象におけるアロ反応性免疫応答を誘発し得る。これは、体外遺伝子導入とそれに続く対象への形質導入細胞の投与で、またはウイルス粒子の直接的なインビボ投与のいずれかで、形質導入した細胞の免疫媒介性の死滅または食作用をもたらし得る。さらに、ウイルス粒子を有するＭＨＣ−Ｉの血流へのインビボ投与の場合には、ウイルス粒子は、それらの標的細胞に到達する前に、既存のＭＨＣ−Ｉ特異的抗体によって中和され得る。
【０５３４】
したがって、いくつかの実施形態では、供給源細胞は、細胞の表面でのＭＨＣ−Ｉの発現を減少させるように改変される（例えば、遺伝子操作される）。実施形態では、供給源は、β２−ミクログロブリン（β２Ｍ）をコードする遺伝子の遺伝子操作された破壊を含む。実施形態では、供給源細胞は、ＭＨＣ−Ｉα鎖をコードする１つ以上の遺伝子の遺伝子操作された破壊を含む。細胞は、β２−ミクログロブリンをコードする遺伝子のすべてのコピーにおいて遺伝子操作された破壊を含み得る細胞は、ＭＨＣ−Ｉα鎖をコードする遺伝子のすべてのコピーにおいて遺伝子操作された破壊を含み得る。細胞は、β２−ミクログロブリンをコードする遺伝子の遺伝子操作された破壊、およびＭＨＣ−Ｉα鎖をコードする遺伝子の遺伝子操作された破壊の両方を含み得る。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、表面に露出されたＭＨＣ−Ｉ分子数の減少を含む。表面に露出したＭＨＣ−Ｉ分子の数は、ＭＨＣ−Ｉに対する免疫応答が治療的に適切な程度まで減少するように、減少され得る。いくつかの実施形態において、エンベロープ化ウイルスベクター粒子は、表面に露出されたＭＨＣ−Ｉ分子を実質的に欠いている。
【０５３５】
ＨＬＡ−Ｇ／Ｅ過剰発現
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、そのエンベロープに、免疫寛容原性タンパク質、例えば、ＩＬＴ−２もしくはＩＬＴ−４アゴニスト、例えば、ＨＬＡ−ＥもしくはＨＬＡ−Ｇ、または任意の他のＩＬＴ−２もしくはＩＬＴ−４アゴニストを提示する。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、対照レトロウイルス、例えば、非改変である以外は同様であるレトロウイルスと比べて、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＬＴ−２またはＩＬＴ−４の増加した発現を有する。
【０５３６】
いくつかの実施形態において、レトロウイルス組成物は、非改変レトロウイルスと比べて低下したＭＨＣクラスＩ、および非改変レトロウイルスと比較して増加したＨＬＡ−Ｇを有する。
【０５３７】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、対照レトロウイルス、例えば、非改変である以外は同様なレトロウイルスと比べて、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅの発現における増加、例えば、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の発現における増加を有し、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅの発現は、フローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣＳを使用してインビトロでアッセイされる。
【０５３８】
いくつかの実施形態において、増加したＨＬＡ−Ｇ発現を有するレトロウイルスは、奇形腫形成アッセイにおいて、例えば、免疫細胞浸潤の減少によって測定されたとき、低下した免疫原性を示す。
【０５３９】
補体調節タンパク質
補体活性は通常、多くの補体調節タンパク質（ＣＲＰ）によって制御される。これらのタンパク質は、偽炎症および宿主組織の損傷を防止する。ＣＤ５５／崩壊促進因子（ＤＡＦ）およびＣＤ４６／膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）を含むタンパク質の一群は、古典的な代替経路のＣ３／Ｃ５転換酵素を阻害する。ＣＤ５９を含む別の一連のタンパク質はＭＡＣアセンブリを調節する。ＣＲＰは、異種移植した組織の拒絶反応を防ぐために使用されており、ウイルスやウイルスベクターを補体不活性化から保護することも示されている。
【０５４０】
膜侵襲補体制御因子には、例えば、崩壊促進因子（ＤＡＦ）またはＣＤ５５、Ｈ因子（ＦＨ）様タンパク質−１（ＦＨＬ−１）、Ｃ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、補体受容体１（ＣＤ３５）、膜穂因子タンパク質（ＭＣＰ）またはＣＤ４６、およびＣＤ５９（プロテクチン）（例えば、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成を防ぎ、細胞を溶解から保護するため）が含まれる。
【０５４１】
アルブミン結合タンパク質
いくつかの実施形態において、レンチウイルスは、アルブミンと結合する。いくつかの実施形態において、レンチウイルスは、その表面に、アルブミンと結合するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスは、その表面にアルブミン結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、アルブミン結合タンパク質は、連鎖球菌のアルブミン結合タンパク質である。いくつかの実施形態において、アルブミン結合タンパク質は、連鎖球菌のアルブミン結合ドメインである。
【０５４２】
レンチウイルスエンベロープにおける非フソゲンタンパク質の発現
いくつかの実施形態において、レンチウイルスは、その表面に１つ以上のタンパク質を含むように操作される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、対象との免疫相互作用に影響を及ぼす。いくつかの実施形態において、タンパク質は、対象においてレンチウイルスの薬理学に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、タンパク質は受容体である。いくつかの実施形態では、タンパク質はアゴニストである。いくつかの実施形態では、タンパク質はシグナル伝達分子である。いくつかの実施形態において、レンチウイルス表面上のタンパク質は、抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ３）またはＩＬ７を含む。
【０５４３】
いくつかの実施形態において、マイトジェン膜貫通タンパク質および／またはサイトカインベースの膜貫通タンパク質が、供給源細胞に存在し、それが供給源細胞膜から出芽するときにレトロウイルスに組み込まれ得る。マイトジェン膜貫通タンパク質および／またはサイトカインベースの膜貫通タンパク質は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質の一部であるというよりも、供給源細胞に別の細胞表面分子として発現され得る。
【０５４４】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、または医薬組成物は、実質的に非免疫原性である。免疫原性は、例えば、本明細書に記載されるように定量化することができる。
【０５４５】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、標的細胞と融合して、レシピエント細胞を生成する。いくつかの実施形態において、１つ以上のレトロウイルスベクターまたはＶＬＰと融合したレシピエント細胞は、免疫原性について評価される。実施形態において、レシピエント細胞は、細胞表面上の抗体の存在について、例えば、抗ＩｇＭ抗体で染色することによって、分析される。他の実施形態では、免疫原性は、ＰＢＭＣ細胞溶解アッセイによって評価される。実施形態において、レシピエント細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と共にインキュベートされ、次いで、ＰＢＭＣによる細胞の溶解について評価される。他の実施形態において、免疫原性は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解アッセイによって評価される。実施形態において、レシピエント細胞は、ＮＫ細胞と共にインキュベートされ、次いで、ＮＫ細胞による細胞の溶解について評価される。他の実施形態において、免疫原性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞溶解アッセイによって評価される。実施形態において、レシピエント細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞と共にインキュベートされ、次いで、ＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞の溶解について評価される。
【０５４６】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、対照レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ、例えば、非改変である以外は同様の供給源細胞またはＨＥＫ２９３細胞から生成されるものと比べて、上昇したレベルの免疫抑制物質（例えば、免疫抑制タンパク質）を含む。いくつかの実施形態において、上昇したレベルは、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍である。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、対照細胞から存在しない免疫抑制物質を含む。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、対照レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ、例えば、非改変である以外は同様の供給源細胞またはＨＥＫ２９３細胞から生成されるものと比べて、減少したレベルの免疫刺激物質（例えば、免疫刺激タンパク質）を含む。いくつかの実施形態では、減少したレベルは、対照レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと比べて、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％である。いくつかの実施形態において、免疫刺激剤は、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰに実質的に存在しない。
【０５４７】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰが由来するレトロウイルスベクターまたはＶＬＰあるいは供給源細胞は、以下の特性、
ａ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な供給源細胞、またはＨｅＬａ細胞、もしくはＨＥＫ２９３細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ未満の発現、
ｂ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な供給源細胞、またはＨＥＫ細胞、もしくは本明細書に記載の対照細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、と比べて、限定されないが、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＯＳ、Ｏｘ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、Ｂ７−Ｈ３、またはＢ７−Ｈ４を含む１つ以上の共刺激タンパク質の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ未満の発現、
ｃ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、またはジャーカット細胞もしくはＨＥＫ２９３細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、マクロファージ貪食を抑制する表面タンパク質、例えば、ＣＤ４７の発現が、例えば、本明細書に記載される方法によって検出可能な発現が、例えば、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上を超えるマクロファージ貪食を抑制する表面タンパク質、例えば、ＣＤ４７の発現、
ｄ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、またはＨＥＫ２９３細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、可溶性免疫抑制サイトカイン、例えば、ＩＬ−１０の発現が、例えば、本明細書に記載の方法による検出可能な発現が、例えば、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上を超える、可溶性免疫抑制サイトカイン、例えば、ＩＬ−１０の発現、
ｅ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、またはＨＥＫ２９３細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、可溶性免疫抑制タンパク質、例えば、ＰＤ−Ｌ１の発現が、例えば、本明細書に記載の方法による検出可能な発現が、例えば、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上を超える、可溶性免疫抑制タンパク質、例えば、ＰＤ−Ｌ１の発現、
ｆ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、またはＨＥＫ２９３細胞もしくはＵ−２６６細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、可溶性免疫刺激サイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−ａの５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ未満の発現、
ｇ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、またはＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞、もしくはＳＫ−ＢＲ−３細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、内因性免疫刺激抗原、例えば、Ｚｇ１６またはＨｏｒｍａｄ１の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ未満の発現、
ｈ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、またはＨＥＫ２９３細胞、またはジャーカット細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇの発現、例えば、本明細書に記載の方法によって検出可能な発現、
ｉ．例えば、ＮＫ細胞の活性化を抑制するように作用する、例えば、シアル酸を含む、表面グリコシル化プロファイル、
ｊ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、またはＨＥＫ２９３細胞、もしくはジャーカット細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、ＴＣＲα／βの発現の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ未満の発現、
ｋ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、またはＨＥＫ２９３細胞、もしくはＨｅＬａ細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、ＡＢＯ式血液型の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ未満の発現、
ｌ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、またはＨＥＫ２９３細胞、もしくはジャーカット細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、マイナー組織適合性抗原（ＭＨＡ）の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ未満の発現、もしくは
ｍ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、またはＨＥＫ２９３細胞、もしくはジャーカット細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、もしくはそれ未満のミトコンドリアＭＨＡを有し、または検出可能なミトコンドリアＭＨＡを有さない、のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上を有する。
【０５４８】
実施形態では、共刺激タンパク質は４−１ＢＢ、Ｂ７、ＳＬＡＭ、ＬＡＧ３、ＨＶＥＭ、またはＬＩＧＨＴであり、対照細胞はＨＤＬＭ−２である。いくつかの実施形態では、共刺激タンパク質はＢＹ−Ｈ３であり、対照細胞はＨｅＬａである。いくつかの実施形態において、共刺激タンパク質は、ＩＣＯＳＬまたはＢ７−Ｈ４であり、対照細胞は、ＳＫ−ＢＲ−３である。いくつかの実施形態では、共刺激タンパク質はＩＣＯＳまたはＯＸ４０であり、対照細胞はＭＯＬＴ−４である。いくつかの実施形態では、共刺激タンパク質はＣＤ２８であり、対照細胞はＵ−２６６である。いくつかの実施形態では、共刺激タンパク質はＣＤ３０ＬまたはＣＤ２７であり、対照細胞はダウディである。
【０５４９】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、または医薬組成物は、免疫系、例えば、自然免疫系による免疫原性応答を実質的に誘発しない。実施形態において、免疫原性応答は、例えば、本明細書に記載されるように、定量化することができる。いくつかの実施形態において、自然免疫系による免疫原性応答は、自然免疫細胞による応答を含み、限定されないが、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、マスト細胞、またはガンマ／デルタＴ細胞が含まれる。いくつかの実施形態において、自然免疫系による免疫原性応答は、可溶性血液成分および膜結合成分を含む補体系による応答を含む。
【０５５０】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、または医薬組成物は、免疫系、例えば、適応免疫系による免疫原性応答を実質的に誘発しない。いくつかの実施形態において、適応免疫系による免疫原性応答は、限定されないが、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、および／またはガンマ‐デルタＴ細胞）またはＢリンパ球の数もしくは活性における変化、例えば、増加を含む適応免疫細胞による免疫原性応答を含む。いくつかの実施形態において、適応免疫系による免疫原性応答は、限定されないが、サイトカインまたは抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ）の数もしくは活性における変化、例えば、増加を含む、可溶性血液成分のレベルの増加を含む。
【０５５１】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、または医薬組成物は、低下した免疫原性を有するように改変される。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、または医薬組成物は、対照レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ、例えば、非改変以外は当該供給源細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはジャーカット細胞と同一である細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターまたはＶＬＰよりも、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％未満の低い免疫原性を有する。
【０５５２】
本明細書で説明される態様のいずれかのいくつかの実施形態において、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、または医薬組成物は、例えば、免疫原性を低下、例えば、低減させるように、例えば、本明細書で説明される方法を使用して改変された、改変されたゲノムを有する、供給源細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来する。免疫原性は、例えば、本明細書に記載されるように定量化することができる。
【０５５３】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、または医薬組成物は、
ａ．ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、またはＭＨＡ、
ｂ．１つ以上の共刺激タンパク質、限定されないが、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＯＳ、Ｏｘ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、Ｂ７−Ｈ３、またはＢ７−Ｈ４、
ｃ．可溶性免疫刺激サイトカイン、例えば、ＩＦＮ−ガンマまたはＴＮＦ−ａ
ｄ．内因性免疫刺激抗原、例えば、Ｚｇ１６またはＨｏｒｍａｄ１、
ｅ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、
ｆ．ＡＢＯ式血液型をコードする遺伝子、例えばＡＢＯ遺伝子、
ｇ．免疫活性化を促進する転写因子、例えば、ＮＦｋＢ、
ｈ．ＭＨＣ発現を制御する転写因子、例えば、クラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）、Ｘｂｏｘ５の調節因子（ＲＦＸ５）、ＲＦＸ関連タンパク質（ＲＦＸＡＰ）、またはＲＦＸアンキリン反復（ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＢとしても知られている）、あるいは
ｉ．ＴＡＰタンパク質、例えば、ＭＨＣクラスＩの発現を低下させるＴＡＰ２、ＴＡＰ１、ＴＡＰＢＰ、のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ以上を枯渇した、例えば、ノックアウトを有する、哺乳動物細胞に由来する。
【０５５４】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、免疫抑制物質、例えば、以下のうちの１つ、２つ、３つ以上の発現の増加をもたらす遺伝子改変を伴う供給源細胞に由来する（例えば、遺伝子改変の前に、細胞は因子を発現しなかった）。
ａ．マクロファージ貪食を抑制する表面タンパク質、例えばＣＤ４７、例えば、対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な供給源細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはジャーカット細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、ＣＤ４７の増加した発現、
ｂ．可溶性免疫抑制性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１０、例えば、対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはジャーカット細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、ＩＬ−１０の増加した発現、
ｃ．可溶性免疫抑制タンパク質、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、またはＢＴＬＡ、例えば、対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはジャーカット細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、免疫抑制タンパク質の増加した発現、
ｄ．免疫寛容原性タンパク質、例えば、ＩＬＴ−２もしくはＩＬＴ−４アゴニスト、例えば、ＨＬＡ−ＥもしくはＨＬＡ−Ｇ、または任意の他の内因性ＩＬＴ−２もしくはＩＬＴ−４アゴニスト、例えば、対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはジャーカット細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＬＴ−２、またはＩＬＴ−４の増加した発現、あるいは
ｅ．補体活性を抑制する表面タンパク質、例えば、補体調節タンパク質、例えば、崩壊促進因子（ＤＡＦ、ＣＤ５５）に結合するタンパク質、例えば、Ｈ因子（ＦＨ）様タンパク質−１（ＦＨＬ−１）、例えば、Ｃ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、例えば、補体受容体１（ＣＤ３５）、例えば、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ、ＣＤ４６）、例えば、プロフェクチン（ＣＤ５９）、例えば、古典的な代替補体経路ＣＤ／Ｃ５コンバターゼ酵素を阻害するタンパク質、例えば、ＭＡＣアセンブリを調節するタンパク質、例えば、対照レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはジャーカット細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、補体調節タンパク質の増加した発現。
【０５５５】
いくつかの実施形態において、増加した発現レベルは、対照レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い。
【０５５６】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、免疫刺激物質、例えば、以下のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ以上の減少した発現を有するように改変された供給源細胞に由来する。
ａ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＨｅＬａ細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満またはそれ未満の発現、
ｂ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、ＨＥＫ２９３細胞、または本明細書に記載される参照細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、１つ以上の共刺激タンパク質、限定されないが、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＯＳ、Ｏｘ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、Ｂ７−Ｈ３、またはＢ７−Ｈ４の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満またはそれ未満の発現、
ｃ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＵ−２６６細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、可溶性免疫刺激サイトカイン、例えば、ＩＦＮ−ガンマまたはＴＮＦ−ａの５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満またはそれ未満の発現、
ｄ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞、またはＳＫ−ＢＲ−３細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、内因性免疫刺激抗原、例えば、Ｚｇ１６またはＨｏｒｍａｄ１の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満またはそれ未満の発現、
ｅ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはジャーカット細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満またはそれ未満の発現、
ｆ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＨｅＬａ細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、ＡＢＯ血液型群の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満またはそれ未満の発現、
ｇ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはジャーカット細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと比べて、免疫活性化を促進する転写因子、例えばＮＦｋＢの５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満またはそれ未満の発現、
ｈ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはジャーカット細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、ＭＨＣ発現を制御する転写因子、例えば、クラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）、Ｘｂｏｘ５（ＲＦＸ５）の調節因子、ＲＦＸ関連タンパク質（ＲＦＸＡＰ）、またはＲＦＸアンキリン反復（ＲＦＸＡＮＫ；ＲＦＸＢとしても知られる）の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満またはそれ未満の発現、あるいは
ｉ．対照レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰ、例えば、当該供給源細胞と非改変である以外は同様な細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＨｅＬａ細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰと比べて、ＭＨＣクラスＩ発現を低下させるＴＡＰタンパク質、例えば、ＴＡＰ２、ＴＡＰ１、もしくはＴＡＰＢＰの５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満またはそれ未満の発現。
【０５５７】
いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ発現を減少させるためにｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスを使用して改変された哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３に由来する、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、または医薬組成物は、非改変レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ、例えば、改変されていない細胞（例えば、間葉系幹細胞）に由来する非改変レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと比較して、ＭＨＣクラスＩの低下した発現を有する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ−Ｇの発現を増加させるためにＨＬＡ−Ｇを発現するレンチウイルスを使用して改変された哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３に由来するレトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、例えば、改変されていない細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）に由来する、非改変レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと比べて、ＨＬＡ−Ｇの増加した発現を有する。
【０５５８】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、または医薬組成物は、供給源細胞、例えば、実質的に免疫原性ではない哺乳動物細胞に由来し、供給源細胞は、Ｔ細胞ＩＦＮ−ガンマ分泌を、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、例えば、インビトロでアッセイされた場合、例えば、０ｐｇ／ｍＬから＞０ｐｇ／ｍＬのレベルで、刺激、例えば、誘発する。
【０５５９】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、または医薬組成物は、供給源細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来し、哺乳動物細胞は、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）、細胞増殖抑制剤（例えば、メトトレキサート）、抗体（例えば、ムロモナブ（ＯＫＴ３）−ＣＤ３）、またはイムノフィリンモジュレーター（例えば、シクロスポリンまたはラパマイシンによって処理された細胞培養からのものである。
【０５６０】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、または医薬組成物は、供給源細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来し、哺乳動物細胞は、外因性薬剤、例えば、治療剤を含む。
【０５６１】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、または医薬組成物は、供給源細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来し、哺乳動物細胞は組換え細胞である。
【０５６２】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、または薬剤は、ウイルス免疫エバシン、例えば、ｈＣＭＶ  ＵＳ２、またはＵＳ１１を発現するように遺伝子改変された哺乳動物細胞に由来する。
【０５６３】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰの表面、または供給源細胞の表面は、ポリマー、例えば、免疫原性および免疫媒介性クリアランスを低減させる生体適合性ポリマー、例えば、ＰＥＧと共有結合または非共有結合によって修飾される。
【０５６４】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰの表面、または供給源細胞の表面は、シアル酸、例えば、ＮＫ抑制グリカンエピトープを含む糖ポリマーを含むシアル酸と共有結合または非共有結合によって修飾される。
【０５６５】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰの表面、または供給源細胞の表面は、ＡＢＯ血液型を除去するために、例えば、グリコシダーゼ酵素、例えば、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼで酵素的に処理される。
【０５６６】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターもしくはＶＬＰの表面、または供給源細胞の表面は、酵素的に処理されて、レシピエントの血液型に一致するＡＢＯ血液型上昇させる、例えば、発現を誘発する。
【０５６７】
免疫原性を評価するためのパラメーター
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、実質的に免疫原性ではなく、または免疫原性の低下を有するように改変された、例えば、本明細書で説明される方法を使用して改変された、供給源細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来する。供給源細胞およびレトロウイルスベクターまたはＶＬＰの免疫原性は、本明細書に記載のアッセイのいずれかによって決定することができる。
【０５６８】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、対照レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ、例えば、非改変である以外は当該供給源細胞と同様である細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと比べて、インビボでの移植片生着の増加、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の増加を有する。
【０５６９】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルへの対照レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ、例えば、非改変である以外は当該供給源細胞と同様である細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターまたはＶＬＰの１つ以上の移植後の体液性応答と比べて、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルへの当該レトロウイルスベクターまたはＶＬＰの１つ以上の移植後の体液性応答における低下によって測定されたとき、免疫原性の低下を有する。いくつかの実施形態において、体液性応答における低下は、血清試料において、抗細胞抗体力価、例えば、抗レトロウイルスまたは抗ＶＬＰ抗体力価によって、例えば、ＥＬＩＳＡによって測定される。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰが投与された動物からの血清試料は、非改変レトロウイルスベクターまたはＶＬＰが投与された動物からの試料と比べて、抗レトロウイルスまたは抗ＶＬＰ抗体力価の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の低下を有する。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰが投与された動物からの血清試料は、増加した抗レトロウイルスまたは抗ＶＬＰ抗体力価、例えば、ベースラインから１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、または４０％の増加を有し、ベースラインは、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰの投与前の同一動物からの血清試料を参考にする。
【０５７０】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、対照レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ、例えば、非改変である以外は当該供給源細胞と同様である細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと比べて、マクロファージ食作用における低下、例えば、マクロファージ食作用における１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の低下を有し、マクロファージ食作用における低下は、インビトロでの食作用指数を、例えば、実施例８に記載されるようにアッセイすることによって決定される。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、例えば、マクロファージ食作用のインビトロアッセイにおいてマクロファージと共にインキュベートされた場合、例えば、実施例８のアッセイによって測定されたとき、０、１、１０、１００以上の食作用指数を有する。
【０５７１】
いくつかの実施形態では、供給源細胞もしくはレシピエント細胞は、対照細胞、例えば、非改変である以外は当該供給源細胞と同様な細胞、または非改変レトロウイルスもしくはＶＬＰを受容したレシピエント細胞、もしくは間葉幹細胞と比べて、例えば、実施例１７のアッセイを使用して、ＰＢＭＣによる細胞毒性媒介細胞溶解における低下、例えば、細胞溶解における１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の低下を有する。実施形態において、ソース細胞は外因性ＨＬＡ−Ｇを発現する。
【０５７２】
いくつかの実施形態において、供給源細胞またはレシピエント細胞は、対照細胞、例えば、非改変である以外は当該供給源細胞と同様な細胞、または非改変レトロウイルスもしくはＶＬＰを受容したレシピエント細胞と比べて、ＮＫ媒介性細胞溶解における低下、例えば、ＮＫ媒介細胞溶解における１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の低下を有し、ＮＫ媒介細胞溶解は、インビトロで、例えば、クロム放出アッセイまたはユーロピウム放出アッセイによって、例えば、実施例１８のアッセイを使用して、アッセイされる。
【０５７３】
いくつかの実施形態において、供給源細胞またはレシピエント細胞は、対照細胞、例えば、非改変である以外は当該供給源細胞と同様な細胞、または非改変レトロウイルスもしくはＶＬＰを受容したレシピエント細胞と比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性細胞溶解における低下、例えば、ＣＤ８  Ｔ細胞媒介細胞溶解における１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の低下を有し、ＣＤ８  Ｔ細胞媒介細胞溶解は、インビトロで、実施例１９のアッセイによって、アッセイされる。
【０５７４】
いくつかの実施形態において、供給源細胞またはレシピエント細胞は、対照細胞、例えば、非改変である以外は当該供給源細胞と同様な細胞、または非改変レトロウイルスもしくはＶＬＰを受容したレシピエント細胞と比べて、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性細胞溶解における低下、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の低下を有し、ＣＤ４  Ｔ細胞媒介細胞溶解は、インビトロでアッセイされる（例えば、改変または非改変哺乳動物供給源細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙａｎｂｅａｄｓを添加した共培養アッセイ）。
【０５７５】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、対照レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ、例えば、非改変である以外は当該供給源細胞と同様である細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと比べて、Ｔ細胞ＩＦＮ−ガンマ分泌における低下、例えば、Ｔ細胞ＩＦＮ−γ分泌における１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の低下を生じ、Ｔ細胞ＩＦＮ−ガンマ分泌は、インビトロで、例えばＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴによってアッセイされる。
【０５７６】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、対照レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ、例えば、非改変である以外は当該供給源細胞と同様である細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと比べて、免疫原性サイトカインの分泌における低下、例えば、免疫原性サイトカインの分泌における１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の低下を生じ、免疫原性サイトカイン分泌は、インビトロで、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴを使用してアッセイされる。
【０５７７】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、対照レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ、例えば、非改変である以外は当該供給源細胞と同様である細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと比べて、免疫抑制サイトカインの増加した分泌、例えば、免疫抑制サイトカインの分泌における１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の増加をもたらし、免疫抑制サイトカインの分泌は、インビトロで、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴを使用してアッセイされる。
【０５７８】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、対照レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ、例えば、非改変である以外は当該供給源細胞と同様である細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと比べて、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅの発現における増加、例えば、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の発現における増加を有し、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅの発現は、インビトロでフローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣＳを使用してアッセイされる。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、例えば、改変されていない細胞と比較して、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅの増加した発現、例えば、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の増加した発現を有するように改変される供給源細胞に由来し、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅの発現は、インビトロでフローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣＳを使用してインビトロでアッセイされる。いくつかの実施形態において、増加したＨＬＡ−Ｇ発現を有する改変細胞に由来するレトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、低下した免疫原性を示す。
【０５７９】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、対照レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ、例えば、非改変である以外は当該供給源細胞と同様である細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと比べて、Ｔ細胞インヒビターリガンド（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１）の発現における増加、例えば、Ｔ細胞インヒビターリガンドの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の発現における増加を有し、または生じ、Ｔ細胞インヒビターリガンドの発現は、インビトロでフローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣＳを使用してアッセイされる。
【０５８０】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、対照レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ、例えば、非改変である以外は当該供給源細胞と同様である細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと比べて、共刺激リガンドの発現における減少、例えば、共刺激リガンドの発現における１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の減少を有し、共刺激リガンドの発現は、インビトロでフローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣＳを使用してアッセイされる。
【０５８１】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、対照レトロウイルスベクターまたはＶＬＰ、例えば、非改変である以外は当該供給源細胞またはＨｅＬａ細胞と同様である細胞に由来する非改変レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと比べて、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの発現における減少、例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの発現における１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の減少を有し、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩの発現は、インビトロでフローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣＳを使用してアッセイされる。
【０５８２】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰは、実質的に非免疫原性である細胞源、例えば、哺乳動物細胞源に由来する。いくつかの実施形態において、免疫原性は、例えば、本明細書に記載されるように、定量化され得る。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞源は、以下の特徴のいずれか１つ、すべて、または組み合わせを含む。
ａ．供給源細胞が自家細胞源、例えば、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰを受ける、例えば、投与されるレシピエントから得られる細胞から得られ、
ｂ．供給源細胞が、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰを受ける、例えば、投与されるレシピエント、例えば、本明細書に記載のレシピエントと一致する、例えば、同一の性別のものである同種異系細胞源から得られ、
ｃ．供給源細胞が、レシピエントのＨＬＡと、例えば、１つ以上の対立遺伝子で、一致するＨＬＡである同種異系細胞源から得られ、
ｄ．供給源細胞が、ＨＬＡホモ接合体である同種異系細胞源から得られ、
ｅ．供給源細胞が、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩを欠如している（または対照細胞と比較して低下したレベルを有する）同種異系細胞源から得られ、あるいは
ｆ．供給源細胞が、限定されないが、幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、セルトリ細胞、または網膜色素上皮細胞を含む、実質的に非免疫原性であることが知られている細胞源から得られる。
【０５８３】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰを投与される対象は、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと反応する既存抗体（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）を有し、もしくは有することが知られ、またはそれらについて試験される。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰを投与される対象は、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと反応する既存抗体の検出可能なレベルの有さない。抗体に関する試験は、例えば、実施例１３に記載される。
【０５８４】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰを受けた対象は、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと反応する抗体（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）を有し、もしくは有することが知られ、またはそれらについて試験される。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰを受けた対象（例えば、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回以上）は、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰと反応する抗体の検出可能なレベルを有さない。実施形態において、抗体のレベルは、２つの時点である、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰの最初の投与の前である第１の時点と、レトロウイルスベクターまたはＶＬＰの１回以上の投与の後である第２の時点との間で、１％、２％、５％、１０％、２０％、または５０％を超えて上昇しない。抗体に関する試験は、例えば、実施例１４に記載される。
【０５８５】
外因性薬剤
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるレトロウイルスベクター、ＶＬＰ、または医薬組成物は、外因性薬剤をコードする。
【０５８６】
外因性タンパク質剤
いくつかの実施形態では、外因性薬剤は、細胞質ゾルタンパク質、例えば、レシピエント細胞で生成され、レシピエント細胞の細胞質に局在するタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、外因性薬剤は、分泌されたタンパク質、例えば、レシピエント細胞によって生成されて分泌されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、外因性薬剤は、核タンパク質、例えば、レシピエント細胞で生成され、レシピエント細胞の核に移入されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、外因性薬剤は、オルガネラタンパク質（例えば、ミトコンドリアタンパク質）、例えば、レシピエント細胞で生成され、レシピエント細胞のオルガネラ（例えば、ミトコンドリア）に移入されるタンパク質を含む。
【０５８７】
いくつかの実施形態において、外因性薬剤は、核酸、例えば、ＲＮＡ、イントロン（複数可）、エクソン（複数可）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、改変ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（小干渉ＲＮＡ）、ｔｍＲＮＡ（トランスファーメッセンジャーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍｔＲＮＡ（ミトコンドリアＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（小核ＲＮＡ）、小体核ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ＳｍＹ  ＲＮＡ（ｍＲＮＡトランススプライシングＲＮＡ）、ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）、ＴＥＲＣ（テロメラーゼＲＮＡ成分）、ａＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）、ｃｉｓ−ＮＡＴ（シス天然アンチセンス転写物）、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡ（長非コードＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（短ヘアピンＲＮＡ）、ｔａｓｉＲＮＡ（トランス作用性ｓｉＲＮＡ）、ｅＲＮＡ（エンハンサーＲＮＡ）、サテライトＲＮＡ、ｐｃＲＮＡ（タンパク質コードＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ＲＮＡｉ（干渉ＲＮＡ）、ｃｉｒｃＲＮＡ（環状ＲＮＡ）、リプログラミングＲＮＡ、アプタマー、およびそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、野生型核酸または変異体核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は、多数の核酸配列の融合またはキメラである。
【０５８８】
いくつかの実施形態において、外因性薬剤は、ポリペプチド、例えば、酵素、構造ポリペプチド、シグナル伝達ポリペプチド、調節ポリペプチド、輸送ポリペプチド、感覚ポリペプチド、モーターポリペプチド、防御ポリペプチド、貯蔵ポリペプチド、転写因子、抗体、サイトカイン、ホルモン、異化ポリペプチド、同化ポリペプチド、タンパク質分解ポリペプチド、代謝ポリペプチド、キナーゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、酵素モジュレーターポリペプチド、タンパク質結合ポリペプチド、脂質結合ポリペプチド、膜融合ポリペプチド、細胞分化ポリペプチド、エピジェネティックポリペプチド、細胞死ポリペプチド、核輸送ポリペプチド、核酸結合ポリペプチド、再プログラミングポリペプチド、ＤＮＡ編集ポリペプチド、ＤＮＡ修復ポリペプチド、ＤＮＡ組換えポリペプチド、トランスポターゼポリペプチド、ＤＮＡ統合ポリペプチド、標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｃａｓ９およびそのホモログ）、リコンビナーゼ、およびそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、分解のために細胞内のタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態において、タンパク質は、タンパク質をプロテアソームに局在化させることによる分解のために細胞内のタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態において、タンパク質は、野生型タンパク質または変異体タンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、融合またはキメラタンパク質である。
【０５８９】
膜タンパク質
いくつかの実施形態において、外因性薬剤は膜タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、膜タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体、インテグリン、イオンチャネル、孔形成タンパク質、トール様受容体、インターロイキン受容体、細胞接着タンパク質、または輸送タンパク質を含む。
【０５９０】
いくつかの実施形態では、膜タンパク質は、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４〜１６１３１の配列を含み、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、膜タンパク質は、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４〜１６１３１の配列のフラグメント、変異体、またはホモログを含む。いくつかの実施形態では、膜タンパク質は、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４〜１６１３１の配列を含むタンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、膜タンパク質は、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４〜１６１３１の配列のフラグメント、変異体、またはホモログを含むタンパク質をコードする核酸を含む。
【０５９１】
いくつかの実施形態において、膜タンパク質は、抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメイン（例えば、１つ、２つ、または３つのシグナル伝達ドメイン）を含む第一世代ＣＡＲであり、または含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む第三世代ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、第四世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、３つまたは４つのシグナル伝達ドメイン、およびＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖまたはＦａｂであり、またはそれを含む。
【０５９２】
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、新生細胞に特徴的な抗原を標的とする。いくつかの実施形態において、新生細胞に特徴的な抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Ｇタンパク質結合受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ関連受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ関連受容体、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４を含む）、線維芽細胞成長因子受容体など（ＦＧＦＲ）（ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１８、およびＦＧＦ２１を含む）血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、およびＰＩＧＦを含む）、ＲＥＴ受容体およびＥｐｈ受容体ファミリー（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ９、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、およびＥｐｈＢ６を含む）、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ−１、ＣＩＣ−２、ＣＩＣ−４、ＣＩＣ−５、ＣＩＣ−７、ＣＩＣ−Ｋａ、ＣＩＣ−Ｋｂ、ベストロフィン、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、ＡＢＣトランスポーター、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン−１−リン酸受容体（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、ＮＭＤＡチャネル、膜貫通タンパク質、マルチスパン膜貫通タンパク質、Ｔ細胞受容体モチーフ。Ｔ細胞アルファ鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１６３、Ｆ４／８０、ＩＬ−４Ｒａ、Ｓｃａ−１、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ−１、トランスフェリン受容体、ＮＫｐ４６、パーフォリン、ＣＤ４＋、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ４０、Ｔｈ２２、Ｔｈ９、Ｔｆｈ、古典的Ｔｒｅｇ、ＦｏｘＰ３＋、Ｔｒ１、Ｔｈ３、Ｔｒｅｇ１７、ＴＲＥＧ、ＣＤＣＰ１、ＮＴ５Ｅ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、炭酸アンヒドラーゼＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＧＭ２など）、ルイス−γ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１／２／３、αＶβ３、α５β１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ２、ＥｒＢ３、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＰＤＬ−１、ＢＡＦＦ、��ＤＡＣ、ＡＢＬ、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＩＬ−１β、ＡＬＫ、ＲＡＮＫＬ、ｍＴＯＲ、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＪＡＫ３、ＢＲＡＦ、ＰＴＣＨ、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＰＩＧＦ、ＡＮＰＥＰ、ＴＩＭＰ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＰＲＪ、ＬＴＢＲ、またはＡＮＴＸＲ１、葉酸受容体アルファ（ＦＲａ）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥｐｈＡ２、ＩＬ−１３Ｒａ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）、Ｌ１ＣＡＭ、ＬｅＹ、ＭＳＬＮ、ＩＬ１３Ｒ□１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＴｎＡｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、インターロイキン−１１受容体ａ（ＩＬ−１１Ｒａ）、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲベータ）、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−１受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ−ａｂｌ、テロメラーゼ、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣｌ、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、レグマイン、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロスタイン、サバイビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰＩＢＩ、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、新生抗原、ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ１８４、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０、ＣＤ２００、ｔｋｒＡ、ｔｒｋＢ、ｔｒｋＣ、あるいはそれらの抗原性フラグメントまたは抗原性部分から選択される。
【０５９３】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ膜貫通ドメインは、少なくともＴ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖の膜貫通領域、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはそれらの機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、少なくともＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、およびＦＧＦＲ２Ｂ、またはそれらの機能的変異体の膜貫通領域（複数可）を含む。
【０５９４】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ、ＰＤＣＤ６）、４−１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦＲ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ−α、ＴＮＦＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ−１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、イカロス、インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ−１、ＬＡＧ−３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＣＡＰ１２、デクチン−１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ−４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ３ゼータドメイン、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの機能的フラグメント、のうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。
【０５９５】
ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ
実施形態において、レトロウイルスゲノムは、１つ以上のＲＮＡ標的に対して向けられた１つ以上（例えば、２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子をコードする。阻害性ＲＮＡ分子は、例えば、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、阻害性分子は、例えば、Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡもしくはＰｒｅ−ｍｉＲＮＡなどのｍｉＲＮＡの前駆体、またはｓｈＲＮＡの前駆体であり得る。いくつかの実施形態において、阻害性分子は、人工的に派生されたｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり得る。他の実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ自体にプロセシングされるｄｓＲＮＡ（転写または人工的に導入される）であり得る。いくつかの実施形態において、阻害性ＲＮＡ分子は、自然界に見出されない配列を有し、または自然界に見出されない少なくとも１つの機能的セグメントを有し、または自然界に見出されない機能的セグメントの組み合わせを有するｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり得る。例示的な実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つまたはすべては、ｍｉＲ−１５５である。
【０５９６】
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるレトロウイルスベクターは、１つ以上のＲＮＡ標的に対して向けられた２つ以上の阻害性ＲＮＡ分子をコードする。いくつかの実施形態では、２つ以上の阻害性ＲＮＡ分子は、異なる標的に対して向けることができる。他の実施形態では、２つ以上の抑制性ＲＮＡ分子は、同じ標的に対して向けられる。
【０５９７】
いくつかの実施形態において、外因性薬剤はｓｈＲＮＡを含む。ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）は、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖によって形成される二本鎖構造を含むことができる。ｓｈＲＮＡ構築体は、標的遺伝子のコード配列または非コード配列のいずれかの部分と同一のヌクレオチド配列を含むことができる。標的配列に対して挿入、欠失、および単一点突然変異を伴うＲＮＡ配列も使用することができる。阻害性ＲＮＡと標的遺伝子の部分との間における９０％を超える配列同一性、または同じ１００％の配列同一性を使用することができる。特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡの二本鎖形成部分の長さは、例えば、ダイサー依存性切断によって生成されるＲＮＡ生成物にサイズが対応する、長さが少なくとも２０、２１、または２２ヌクレオチドである。特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡ構築体は、長さが少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、または４００塩基である。特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡ構築体は、長さが４００〜８００塩基である。ｓｈＲＮＡ構築体は、ループ配列およびループサイズにおける変動に対して高度に耐性である。
【０５９８】
実施形態において、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはリボザイムをコードするレトロウイルスベクターは、１つ以上の調節配列、例えば、強力な構成的ｐｏｌ  ＩＩＩ、例えば、ヒトＵ６ｓｎＲＮＡプロモーター、マウスＵ６ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトおよびマウスＨ１  ＲＮＡプロモーター、ならびにヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター、または強力な構成的ｐｏｌ  ＩＩプロモーターを含む。
【０５９９】
フソゲン受容体および供給源細胞融合を防止する方法
いくつかの実施形態において、供給源細胞は、供給源細胞によって発現されるフソゲンと結合するフソゲン受容体の低下した発現を有する（例えば、発現なし）ように改変される（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ゲノム編集、または他の方法を使用して）。いくつかの実施形態において、フソゲンは、再標的化されたフソゲンであり、例えば、フソゲンは標的結合ドメイン、例えば、抗体、例えば、ｓｃＦｖを含み得る。いくつかの実施形態において、フソゲン受容体は抗体によって結合される。
【０６００】
インスレーターエレメント
いくつかの実施形態において、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクターまたはＶＬＰはさらに、１つ以上のインスレーターエレメント、例えば、本明細書で説明されるインスレーターエレメントを含む。インスレーターエレメントは、レンチウイルス発現配列、例えば治療用ポリペプチドを、ゲノムＤＮＡに存在するシス作用エレメントによって媒介され、転移された配列の調節解除された発現（例えば、位置効果、例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９９：１６４３３、およびＺｈａｎら、２００１，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０９：４７１を参照）、または転移された配列と隣接する内因性配列の調節解除された発現をもたらし得る、統合部位効果から保護することに寄与し得る。いくつかの実施形態において、転移ベクターは、１つ以上のインスレーターエレメント３’ＬＴＲを含み、プロウイルスが宿主ゲノムに統合されると、プロウイルスは、３’ＬＴＲを複製することによって５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲにおいて、１つ以上のインスレーターを含む。好適なインスレーターには、限定されないが、ニワトリＨＳ４などのニワトリβ−グロビンインスレーター（本明細書に参照により組み込まれるＣｈｕｎｇら、１９９３．Ｃｅｌｌ７４：５０５、Ｃｈｕｎｇら、１９９７．Ｎ４Ｓ９４：５７５、およびＢｅｌｌら、１９９９．Ｃｅｌｌ９８：３８７を参照）、またはヒトβ−グロビン遺伝子座に由来するインスレーターが含まれる。いくつかの実施形態では、インスレーターは、ＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）と結合する。いくつかの実施形態では、インスレーターはバリアインスレーターである。いくつかの実施形態では、インスレーターは、エンハンサー遮断インスレーターである。例えば、その両方は参照によってそれらの全体が含まれる、Ｅｍｅｒｙら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，２０１１、ならびにＢｒｏｗｎｉｎｇおよびＴｒｏｂｒｉｄｇｅ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，２０１６を参照。
【０６０１】
いくつかの実施形態において、レトロウイルス核酸におけるインスレーターは、レシピエント細胞における遺伝毒性を低減する。遺伝毒性は、例えば、Ｃｅｓａｎａら「Ｕｎｃｏｖｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１４  Ａｐｒ；２２（４）：７７４−８５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１４．３．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｊａｎ  ２０で報告されるように測定することができる。
【０６０２】
医薬組成物およびそれらを作製する方法
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターの１つ以上の形質導入ユニットが対象に投与される。いくつかの実施形態では、１ｋｇあたり少なくとも１、１０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４の形質導入単位が対象に投与される。いくつかの実施形態では、血液１ｍｌあたり１標的細胞につき少なくとも１、１０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４の形質導入単位が対象に投与される。
【０６０３】
レンチウイルスの濃縮および精製
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるレトロウイルスベクター製剤は、例えば、時系列で
（ｉ）レトロウイルスベクターを生成する細胞を培養するステップと、
（ｉｉ）レトロウイルスベクター含有上清を収集するステップと、
（ｉｉｉ）任意に、上清を浄化するステップと、
（ｉｖ）レトロウイルスベクターを精製してレトロウイルスベクター調製物を得るステップと、
（ｖ）任意に、レトロウイルスベクター調製物をフィルター滅菌するステップと、
（ｖｉ）レトロウイルスベクター調製物を濃縮して最終的なバルク生成物を生成するステップと、のうちの１つ以上、例えば、すべてを含むプロセスによって生成することができる。
【０６０４】
いくつかの実施形態では、プロセスは、浄化ステップ（ｉｉｉ）を含まない。他の実施形態では、プロセスは、浄化ステップ（ｉｉｉ）を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｖｉ）は、限外ろ過、または接線流ろ過、より好ましくはホローファイバー限外ろ過を使用して実施される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｖ）における精製方法は、イオン交換クロマトグラフィー、より好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｖ）におけるフィルター滅菌は、０．２２μｍまたは０．２μｍの滅菌フィルターを使用して実施される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、フィルター浄化によって実施される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｖ）は、クロマトグラフィー、限外ろ過／透析ろ過、または遠心分離から選択される方法または方法の組み合わせを使用して実施される。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー法または方法の組み合わせは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーから選択される。いくつかの実施形態では、遠心分離法は、ゾーン遠心分離、等密度遠心分離、およびペレット化遠心分離から選択される。いくつかの実施形態では、限外ろ過／透析ろ過法は、接線流透析ろ過、撹拌セル透析ろ過、および透析から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステップが、核酸を分解して精製を改善するプロセスに含まれる。いくつかの実施形態において、当該ステップは、ヌクレアーゼ処理である。
【０６０５】
いくつかの実施形態において、ベクターの濃縮は、ろ過前に行われる。いくつかの実施形態において、ベクターの濃縮は、ろ過後に行われる。いくつかの実施形態では、濃縮およびろ過のステップが繰り返される。
【０６０６】
いくつかの実施形態では、最終濃縮ステップは、フィルター滅菌ステップ後に実施される。いくつかの実施形態では、本プロセスは、治療薬としてヒトに投与するのに好適な臨床グレード製剤を生成するための大規模プロセスである。いくつかの実施形態では、フィルター滅菌ステップは、濃縮ステップの前に行われる。いくつかの実施形態では、濃縮ステップは本プロセスの最後のステップであり、フィルター滅菌ステップは本プロセスの最後から２番目のステップである。いくつかの実施形態では、濃縮ステップは、限外ろ過、好ましくは接線流ろ過、より好ましくはホローファイバー限外ろ過を使用して実行される。いくつかの実施形態では、フィルター滅菌ステップは、約０．２２μｍの最大孔径を有する滅菌フィルターを使用して実施される。別の好ましい実施形態では、最大孔サイズは０．２μｍである。
【０６０７】
いくつかの実施形態において、ベクター濃度は、フィルター滅菌前の調製物１ｍｌあたり約４．６×１０１１ＲＮＡゲノムコピー以下である。適切な濃度レベルは、必要に応じて、例えば希釈ステップを使用して、ベクター濃度を制御することによって達成することができる。したがって、いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター調製物は、フィルター滅菌前に希釈される。
【０６０８】
浄化は、ろ過ステップによって行い、細胞デブリおよび他の不純物を除去し得る。好適なフィルターは、セルロースフィルター、再生セルロースファイバー、無機ろ過助剤（例えば、珪藻土、パーライト、ヒュームドシリカ）と組み合わせたセルロースファイバー、無機ろ過助剤および有機レジンと組み合わせたセルロースフィルター、またはそれらの任意の組み合わせ、ならびにポリマーフィルター（例として、限定されないが、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホンが含まれる）を利用して、有効な除去および許容可能な回収を達成し得る。多段階プロセスが使用され得る。例示的な２段階または３段階のプロセスは、大きな沈殿物および細胞デブリを除去する粗いフィルター（複数可）と、続いて０．２ミクロンより大きく１ミクロン未満の公称孔サイズを有する洗練化第２段階フィルター（複数可）からなる。最適な組み合わせは、沈殿物のサイズ分布ならびに他の変数の関数であり得る。さらに、比較的小さな孔サイズフィルターまたは遠心分離を使用する単一段階操作もまた、浄化のために使用され得る。より一般的には、限定されないが、全量ろ過、精密ろ過、遠心分離、または全量ろ過または深層ろ過と組み合わせたろ過助剤（例えば、珪藻土）のボディフィードを含む任意の浄化方法は、その後のステップでメンブランおよび／またはレジンを詰まらせない好適な浄化度のろ液をもたらし、本発明の浄化ステップで使用することが許容される。
【０６０９】
いくつかの実施形態では、深層ろ過およびメンブランろ過が使用される。これに関して有用である市販の製品は、例えば、ＷＯ０３／０９７７９７、ｐ．２０〜２１に記載されている。使用することができるメンブランは、異なる材料で構成され得、孔サイズが異なり得、組み合わせて使用され得る。それらは、いくつかの供給業者から商業的に入手できる。いくつかの実施形態では、浄化に使用されるフィルターは、１．２〜０．２２μｍの範囲にある。いくつかの実施形態では、浄化に使用されるフィルターは、１．２／０．４５μｍフィルターまたは０．２２μｍの最小公称孔サイズを有する非対称フィルターのいずれかである。
【０６１０】
いくつかの実施形態では、この方法は、ヌクレアーゼを使用して、混入しているＤＮＡ／ＲＮＡ、すなわち主に宿主細胞の核酸を分解する。本発明における使用に好適な例示的なヌクレアーゼには、あらゆる形態のＤＮＡおよびＲＮＡ（一本鎖、二本鎖の線状または環状）を攻撃して分解するＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（ＥＰ０２２９８６６）、または調製物から不要または混入したＤＮＡおよび／またはＲＮＡを排除する目的のために当技術分野で一般的に使用される任意の他のＤＮアーゼおよび／またはＲＮアーゼが含まれる。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼであり、特定のヌクレオチド間の内部ホスホジエステル結合を加水分解することによって核酸を迅速に加水分解し、それによってベクター含有上清におけるポリヌクレオチドのサイズを減少させる。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼは、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ（コードＷ２１４９５０）から市販されており、入手することができる。ヌクレアーゼが使用される濃度は、好ましくは１〜１００単位／ｍｌの範囲内である。
【０６１１】
いくつかの実施形態において、ベクター懸濁液は、本プロセス中に少なくとも１回の限外ろ過（緩衝液交換に使用される場合、透析ろ過と呼ばれることもある）が、例えば、ベクターを濃縮および／または緩衝液交換のために加えられる。ベクターを濃縮するために使用されるプロセスは、希釈液がベクター調製物から取り除かれ、一方、ベクターはフィルターを通過できずにベクター調製物に濃縮された形態で残るような様式で、希釈液を強制的にフィルターに通すことによってベクター濃度が増加される、任意のろ過プロセス（例えば、限外ろ過（ＵＦ））を含むことができる。ＵＦは、例えば、Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌ．Ｚｅｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｚｙｄｎｅｙ  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９６）、およびＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｍｕｎｉｒ  Ｃｈｅｒｙａｎ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８６；ＩＳＢＮ  Ｎｏ．８７７６２−４５６−９）に詳細が記載されている。好適なろ過プロセスは、例えば、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ」ｐｐ．１７７−２０２（Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．，１９９５／９６）と題されたＭＩＬＬＩＰＯＲＥカタログに記載されている接線流ろ過（「ＴＦＦ」）である。ＴＦＦは、ウイルスを含む生成物の細胞収集、浄化、精製、濃縮のためにバイオプロセシング業界で広く使用されている。このシステムは、３つの異なるプロセス流である供給溶液、透過液、および保持液から構成されている。用途に応じて、異なる孔サイズを有するフィルターを使用し得る。いくつかの実施形態において、保持液は、生成物（レンチウイルスベクター）を含む。選択された特定の限外ろ過メンブランは、ベクターを保持するためには十分小さいが、不純物を効果的に除去するためには十分大きい孔サイズを有し得る。製造業者およびメンブランタイプに応じて、レトロウイルスベクターでは、１００〜１０００ｋＤａの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣ）が適切であり得、例えば、３００ｋＤａまたは５００ｋＤａのＮＭＷＣを有するメンブランである。メンブラン組成物は、限定されないが、再生セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、またはそれらの誘導体であり得る。メンブランは、フラットシート（フラットスクリーンとも呼ばれる）またはホローファイバーであることができる。好適なＵＦは、ホローファイバーＵＦ、例えば、０．１μｍ未満の孔サイズを有するフィルターを使用するろ過である。生成物は一般に保持されるが、透過によって体積を低減することができる（または、透析ろ過の際に、緩衝液および不純物を含有する透過液が透過液側で除去される速度と同じ速度で緩衝液を添加することによって、一定に維持される）。
【０６１２】
バイオ製薬業界においてＴＦＦで最も広く使用されている２つの形状は、プレート＆フレーム（フラットスクリーン）およびホローファイバーモジュールである。限外ろ過および精密ろ過用のホローファイバーユニットは、１９７０年代の初めにＡｍｉｃｏｎとＲａｍｉｃｏｎによって開発されたが（Ｃｈｅｒｙａｎ、Ｍ．Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、現在はＳｐｅｃｔｒｕｍおよびＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅを含む多数の供給業者がある。ホローファイバーモジュールは、高密度のスキン層を備えた一連の自立型ファイバーで構成される。ファイバーの直径は０．５ｍｍ〜３ｍｍの範囲である。特定の実施形態では、ホローファイバーがＴＦＦに使用される。特定の実施形態では、５００ｋＤａ（０．０５μｍ）の孔サイズのホローファイバーが使用される。限外ろ過は、透析ろ過（ＤＦ）を含み得る。微量溶質は、限外ろ過される溶液に、ＵＦ速度に等しい速度で溶媒を加えることによって除去することができる。これにより、溶液から微小種が一定容量で洗い流され、保持されたベクターが精製される。
【０６１３】
ＵＦ／ＤＦは、精製プロセスの様々な段階で、ベクター懸濁液を濃縮および／または緩衝液交換するために使用することができる。この方法は、ＤＦステップを利用してクロマトグラフィーまたは他の精製ステップの後に上清の緩衝液を交換することができるが、クロマトグラフィーの前にも使用され得る。
【０６１４】
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーステップからの溶出液は、濃縮され、さらに限外ろ過−透析ろ過によって精製される。このプロセス中に、ベクターは製剤緩衝液に交換される。最終的な所望の濃度への濃縮は、フィルター滅菌ステップ後に行うことができる。滅菌ろ過後、フィルター滅菌された物質は無菌ＵＦによって濃縮されて、バルクベクター生成物を生成する。
【０６１５】
実施形態では、限外ろ過／透析ろ過は、接線流透析ろ過、撹拌セル透析ろ過、および透析であり得る。
【０６１６】
精製技術は、細胞環境からのベクター粒子の分離、および必要に応じて、ベクター粒子のさらなる精製を含める傾向がある。様々なクロマトグラフィー法のうちの１つ以上がこの精製のために使用され得る。イオン交換、より具体的には陰イオン交換、クロマトグラフィーが好適な方法であり、他の方法を使用され得る。いくつかのクロマトグラフィー技術の説明を以下に示す。
【０６１７】
イオン交換クロマトグラフィーは、生体分子およびウイルスベクターなどの荷電種が、反対の荷電を有する基を、その表面に固定されて有する固定相（メンブラン、またはカラム内に充填など）と可逆的に結合できるという事実を利用する。イオン交換体には２つのタイプがある。陰イオン交換体は、正電荷を有する基を有する固定相であり、したがって、負電荷を有する種と結合することができる。陽イオン交換体は負電荷を有する基を有し、したがって、正電荷を有する種と結合することができる。メディウムのｐＨは、種の電荷を変えることができ、これに対して影響を有する。したがって、タンパク質などの種では、ｐＨがｐＩを超える場合、正味電荷は負になり、ｐＩを下回ると正味電荷は正になる。
【０６１８】
結合種の置換（溶出）は、好適な緩衝液の使用によって達成され得る。したがって、一般に、緩衝液のイオン濃度は、種が固定相におけるイオン部位に対する緩衝液イオンの競合によって置換されるまで、増加させる。これに代わる溶出方法では、種の正味電荷が固定にとどまることを支持しなくなるまで、緩衝液のｐＨを変更する必要がある。例としては、種が正味の正電荷であると考えられ、陰イオン交換体とにもはや結合しなくなるまで、ｐＨを下げる。
【０６１９】
不純物が帯電していない場合、またはそれらが目的の化学種とは反対の符号の電荷を有しているが、イオン交換体の電荷と同じ符号を有している場合、ある程度の精製を達成することができる。これは、非荷電種およびイオン交換体と同じ符号の電荷を有するものは、通常結合しないためである。異なる結合種の場合、結合の強度は、電荷密度および様々な種における電荷の分布などの要因によって異なる。したがって、イオン勾配またはｐＨ勾配（連続勾配として、または一連のステップとして）を適用することによって、所望の種を不純物とは別々に溶出し得る。
【０６２０】
サイズ排除クロマトグラフィーは、種をそれらのサイズに応じて分離する手法である。通常、それは、十分定められたサイズの孔を有する粒子が充填されたカラムを使用によって実施される。クロマトグラフィー分離では、粒子は分離されるべき混合物中の種のサイズに関して適切である孔サイズを有するものが選択される。混合物が溶液（または懸濁液、ウイルスの場合）としてカラムにアプライされ、次いで緩衝液によって溶出され、最大の粒子は、それらが孔への制限された（またはアクセスしない）アクセスを有するため、最初に溶出される。小さい粒子は孔に入ることができるため、後で溶出し、したがって、カラムを通過する経路が長くなる。そのため、ウイルスベクターの精製においてサイズ排除クロマトグラフィーの使用を検討する場合、ベクターはタンパク質などのより小さな不純物の前に溶出されることが予想される。
【０６２１】
タンパク質などの種は、それらの表面に、固定相における弱い疎水性部位と可逆的に結合することができる疎水性領域を有する。比較的高い塩濃度を有するメディウムでは、この結合が促進される。通常、ＨＩＣでは、精製される試料は、高い塩濃度環境で固定相に結合される。次に、溶出が、減少させた塩濃度の勾配（連続的または一連のステップとして）の適用によって達成される。一般的に使用される塩は硫酸アンモニウムである。異なる疎水性レベルを有する種は、異なる塩濃度で溶出される傾向があり、そのため標的種を不純物から精製することができる。ｐＨ、温度、ならびに界面活性剤、カオトロピック塩、および有機物などの溶出媒体への添加剤などの他の要因も、ＨＩＣ固定相への種の結合の強度に影響を与えることができる。これらの要因のうちの１つ以上を調整または利用して、生成物の溶出および精製を最適化することができる。
【０６２２】
ウイルスベクターは、それらの表面にタンパク質などの疎水性部分を有し、そのため、ＨＩＣを精製の手段として潜在的に使用され得る。
【０６２３】
ＨＩＣと同様に、ＲＰＣは種をそれらの疎水性の差に従って分離する。ＨＩＣで使用されているものよりも疎水性の高い固定相が使用される。固定相は、しばしば、アルキル基またはフェニル基などの疎水性部分が結合した材料、典型的にはシリカからなる。あるいは、固定相は、結合した基のない有機ポリマーであり得る。分離されるべき種の混合物を含む試料は、結合を促進する比較的高い極性の水性メディウムにおける固定相に加えられる。次に、溶出は、イソプロパノールまたはアセトニトリルなどの有機溶媒の添加によって水性メディウムの極性を低下させることによって達成される。通常、有機溶媒濃度を増加させる勾配（連続的または一連のステップとして）が使用され、種はそれらそれぞれの疎水性の順に溶出される。
【０６２４】
溶出メディウムのｐＨなどの他の要因および添加剤の使用も、ＲＰＣ固定相への種の結合の強度に影響を及ぼすことができる。これらの要因のうちの１つ以上を調整または利用して、生成物の溶出および精製を最適化することができる。一般的な添加剤はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である。これは、試料中のカルボキシル部分などの酸性基のイオン化を抑制する。また、それは溶出メディウムにおけるｐＨを低下させ、このことがシリカマトリックスを有する固定相の表面に存在し得る遊離シラノール基のイオン化を抑制する。ＴＦＡは、イオン対形成剤として知られる添加剤のクラスの１つである。これらは、反対の電荷を有する試料中の種に存在して、イオン基と相互作用する。相互作用は電荷をマスキングする傾向があり、種の疎水性を増加させる。ＴＦＡおよびペンタフルオロプロピオン酸などの陰イオン対形成剤は、種における正電荷基と相互作用する。トリエチルアミンなどの陽イオン対形成剤は、負電荷基と相互作用する。
【０６２５】
ウイルスベクターはそれらの表面にタンパク質などの疎水性部分を有し、そのためＲＰＣが精製の手段として潜在的に使用され得る。
【０６２６】
アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質またはヌクレオチドなどの生体分子と特異的に結合する特定のリガンドを、固定相に固定化できるという事実を利用している。次に、修飾された固定相を使用して、混合物から関連する生体分子を分離することができる。高度に特異的なリガンドの例は、標的抗原を精製するための抗体および酵素を精製するための酵素阻害剤である。広範囲の抗体を単離するためのプロテインＡリガンドの使用など、より一般的な相互作用も利用できる。
【０６２７】
通常、アフィニティークロマトグラフィーは、目的の種を含む混合物を、結合された関連するリガンドを有する固定相に適用することによって実施される。適切な条件下では、これが種の固定相との結合をもたらす。次に、未結合の成分は、溶出メディウムが加えられる前に洗い流される。溶出メディウムは、リガンドの標的種との結合を破壊するように選択される。これは通常、適切なイオン強度、ｐＨの選択によって、またはリガンド部位で標的種と競合する物質の使用によって達成される。いくつかの結合種では、尿素などのカオトロピック剤を使用して、リガンドからの置換を達成する。しかし、これは、種の不可逆的な変性をもたらし得る。
【０６２８】
ウイルスベクターは、それらの表面に、適切なリガンドと特異的に結合することができ得るタンパク質などの部分を有する。これは、潜在的に、アフィニティークロマトグラフィーがそれらの分離に使用することができることを意味する。
【０６２９】
タンパク質などの生体分子は、金属イオンと配位結合を形成できる電子供与部分をそれらの表面に有することができる。これは、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、またはＦｅ３＋などの固定化金属イオンを有する固定相へのそれらの結合を促進することができる。ＩＭＡＣで使用される固定相には、それらの表面と共有結合されているキレート剤、通常はニトリロ酢酸またはイミノ二酢酸を有し、金属イオンを保持するのはキレート剤である。キレート化された金属イオンは、生体分子との配位結合を形成するために利用可能なままである、少なくとも１つの配位部位を有することが必要である。潜在的に、生体分子の表面には、固定化された金属イオンと結合することができ得るいくつかの部分がある。これらには、ヒスチジン、トリプトファン、およびシステイン残基、ならびにリン酸基が含まれる。しかし、タンパク質では、主なドナーはヒスチジン残基のイミダゾール基であるように思われる。ネイティブタンパク質は、それらが好適なドナー部分をそれらの表面に示す場合、ＩＭＡＣを使用して分離することができる。それ以外の場合、ＩＭＡＣは、いくつかの連結されたヒスチジン残基の鎖を有する組換えタンパク質の分離のために使用することができる。
【０６３０】
通常、ＩＭＡＣは、目的の種を含む混合物を固定相に適用することによって実施される。適切な条件下では、このことが種の固定相との配位結合をもたらす。次に、未結合の成分は、溶出メディウムが加えられる前に洗い流される。溶出には、塩濃度を上げるまたはｐＨを下げる勾配（連続的または一連のステップとして）が使用され得る。また、一般的に使用される手順は、イミダゾール濃度を増加させる勾配の適用である。異なる供与体特性を有する、例えば、異なる環境にヒスチジン残基を有する生体分子は、勾配溶出の使用によって分離することができる。
【０６３１】
ウイルスベクターは、それらの表面に、ＩＭＡＣ固定相と結合することができ得るタンパク質などの部分を有する。これは、潜在的に、ＩＭＡＣをそれらの分離に使用することができることを意味する。
【０６３２】
好適な遠心分離技術には、ゾーン遠心分離、等密度超遠心分離、およびペレット化遠心分離が含まれる。
【０６３３】
フィルター滅菌は、医薬品グレードの材料におけるプロセスに好適である。フィルター滅菌は、得られた製剤に混入物を実質的に含まなくする。フィルター滅菌後の混入物質のレベルは、製剤が臨床使用に好適であるようなものである。フィルター滅菌ステップに続くさらなる濃縮（例えば、限外ろ過による）は、無菌状態で実施され得る。いくつかの実施形態では、滅菌フィルターは、０．２２μｍの最大孔サイズを有する。
【０６３４】
本明細書におけるレトロウイルスベクターはまた、フロースルー超遠心分離および高速遠心分離、ならびに接線流ろ過を使用してレンチウイルスベクターを濃縮および精製する方法を行うことができる。フロースルー超遠心分離は、ＲＮＡ腫瘍ウイルスの精製に使用することができる（Ｔｏｐｌｉｎら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５：５８２−５８９，１９６７、Ｂｕｒｇｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ４５：４９９−５０３，１９７０）。フロースルー超遠心分離は、レンチウイルスベクターの精製のために使用することができる。この方法は、以下のステップのうちの１つ以上を含むことができる。例えば、レンチウイルスベクターは、セルファクトリーまたはバイオリアクターシステムを使用して細胞から生成することができる。一過性トランスフェクションシステムを使用することができ、あるいはパッケージングまたはプロデューサー細胞株を同様に使用することもできる。材料を超遠心分離機に加える前の前浄化ステップが、必要に応じて、使用され得る。フロースルー超遠心分離は、連続フローまたはバッチ沈降を使用して実施することができる。沈降に使用される材料は、例えば、塩化セシウム、酒石酸カリウム、および臭化カリウムであり、それらはすべて腐食性であるが、高密度を低粘度で生じる。ＣｓＣｌは、得られる広い密度勾配（１．０〜１．９ｇ／ｃｍ３）によって高度な純度が達成することができるため、プロセス開発のためにしばしば使用される。臭化カリウムは、例えば、２５℃などの高められた温度で、高密度で使用され得、いくつかのタンパク質の安定性と両立し得ない。ショ糖は安価で非毒性であるために広く使用されており、ほとんどのタンパク質、細胞内画分、および細胞全体の分離に好適な勾配を形成することができる。典型的には最大密度は約１．３グラム／ｃｍ３である。ショ糖の浸透ポテンシャルは細胞に有毒であり得、その場合、複合的な勾配材料、例えばナイコデンツを使用することができる。勾配は、勾配における１つ以上のステップによって使用することができる。一実施形態は、段階的なショ糖勾配を使用することである。材料の容量は、１回の実施あたり０．５リットルから２００リットル超であることができる。流速は１時間あたり５〜２５リット超であることができる。好適な動作速度は２５，０００〜４０，５００ｒｐｍであり、最大１２２，０００×ｇの力を生じる。ローターは、所望の容量画分で静的に取り外すことができる。一実施形態は、遠心分離された材料を１００ｍｌの画分で取り出すことである。次に、精製および濃縮されたレンチウイルスベクターを含む単離された画分を、ゲルろ過またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、所望の緩衝液中に交換することができる。陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィーは、緩衝液交換またはさらなる精製のための代替または追加の方法としても使用することができる。さらに、接線流ろ過は、必要に応じて、緩衝液交換および最終製剤にも使用することができる。接線流ろ過（ＴＦＦ）は、超高速または高速遠心分離の代替ステップとしても使用することでき、２ステップＴＦＦ手順が実行される。第１のステップはベクター上清の容量を減少させ、第２のステップは緩衝液交換、最終製剤、および材料のさらなる濃縮のために使用される。ＴＦＦメンブランは、１００〜５００キロダルトンのメンブランサイズを有することができ、第１のＴＦＦステップは５００キロダルトンのメンブランサイズを有することができ、第２のＴＦＦは３００〜５００キロダルトンのメンブランを有することができる。最終緩衝液は、ベクターを長期間保存することを可能にする材料を含むべきである。
【０６３５】
実施形態では、本方法は、接着細胞を含むセルファクトリー、またはベクターおよびヘルパー構築体でトランスフェクトまたは形質導入されてレンチウイルスベクターを生成する浮遊細胞を含むバイオリアクターのいずれかを使用する。非限定的な例またはバイオリアクターには、ＷａｖｅバイオリアクターシステムおよびＸｃｅｌｌｅｒｅｘバイオリアクターが含まれる。どちらも使い捨てシステムである。しかし、使い捨てではないシステムも使用することができる。構築体は、本明細書で説明されるもの、ならびに他のレンチウイルス形質導入ベクターであることができる。あるいは、細胞株は、形質導入またはトランスフェクションを必要とせずにレンチウイルスベクターを生成するように操作することができる。トランスフェクション後、レンチウイルスベクターを収集してろ過して粒子を除去し、次いで連続フローの高速または超遠心分離を使用して遠心分離する。好ましい実施形態は、高速遠心分離機を備えたＪＣＦ−Ａゾーンおよび連続フローローターのような高速連続フロー装置を使用することである。また、中規模のレンチウイルスベクター生成のためにＣｏｎｔｉｆｕｇｅ  Ｓｔｒａｔｕｓ遠心分離機の使用も好ましい。また、遠心分離の速度が５，０００×ｇＲＣＦ超および、２６，０００×ｇＲＣＦ未満である任意の連続フロー遠心分離機も好適である。好ましくは、連続フロー遠心力は、２０時間〜４時間の回転時間による約１０，５００×ｇ〜２３，５００×ｇＲＣＦであり、より緩い遠心力ではより長い遠心時間を使用する。レンチウイルスベクターは、より密度の高い物質のクッション上で遠心分離することができ（非限定的な例はショ糖であるが、他の試薬を使用してクッションを形成することができ、これらは当技術分野で周知である）、それによってレンチウイルスベクターは、ウイルスベクターペレットをもたらすベクターの直接遠心分離によって時々生じるような、ろ過できない凝集体を形成しない。クッション上での連続フロー遠心分離は、ベクターが大きな凝集体の形成を回避することを可能にし、また、レンチウイルスベクターを生成する大容量のトランスフェクトされた材料からベクターを高レベルに濃縮することを可能にする。さらに、ショ糖の第２の密度の低い層を使用して、レンチウイルスベクター調製物を帯状にすることができる。連続フロー遠心分離機の流量は、１分あたり１〜１００ｍｌであることができるが、さらに高いそして低い流量も使用することができる。流量は、高流量のために大量のベクターが失われることなく、ベクターが遠心分離機のコアに入るのに十分な時間を得るように調整される。より高い流量が望まれる場合は、連続フロー遠心分離機から流出する物質を再循環させて、遠心分離機を再度通過させることができる。ウイルスを連続フロー遠心分離を使用して濃縮した後、ベクターは接線流フローろ過（ＴＦＦ）を使用してさらに濃縮することができ、またはＴＦＦシステムを緩衝液交換のために使用することができる。ＴＦＦシステムの非限定的な例は、ＧＢ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって製造されるＸａｍｐｌｅｒカートリッジシステムである。好ましいカートリッジは、５００，０００ＭＷ以下のＭＷカットオフを有するものである��好ましくは、カートリッジは、３００，０００ＭＷのＭＷカットオフで使用される。１００，０００ＭＷカットオフのカートリッジも使用することができる。より大きな容量の場合、より大きなカートリッジを使用することができ、ベクター調製物の最終充填の前に、この最終緩衝液交換および／または濃縮ステップに適切なＴＦＦシステムを見い出すこと当業者にとって容易であろう。最終的な充填調製物は、ベクターを安定化する因子を含み得、糖が一般的に使用され、当技術分野で知られている。
【０６３６】
タンパク質含有物
いくつかの実施形態において、レトロウイルス粒子は、様々な供給源細胞ゲノム由来タンパク質、外因性タンパク質、およびウイルスゲノム由来タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、レトロウイルス粒子は、ウイルスゲノム由来タンパク質に対する供給源細胞ゲノム由来タンパク質、外因性タンパク質に対する供給源細胞ゲノム由来タンパク質、およびウイルスゲノム由来タンパク質に対する外因性タンパク質の様々な比を含む。
【０６３７】
いくつかの実施形態において、ウイルスゲノム由来タンパク質は、ＧＡＧポリタンパク質前駆体、ＨＩＶ−１インテグラーゼ、ＰＯＬポリタンパク質前駆体、カプシド、ヌクレオカプシド、ｐ１７マトリックス、ｐ６、ｐ２、ＶＰＲ、Ｖｉｆである。
【０６３８】
いくつかの実施形態において、供給源細胞由来タンパク質は、シクロフィリンＡ、ヒートショック７０ｋＤ、ヒト伸長因子−１アルファ（ＥＦ−１Ｒ）、ヒストーンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ３、Ｈ４、ベータグロビン、トリプシン前駆体、パルブリン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌｃｋ、ユビキチン、ＳＵＭＯ−１、ＣＤ４８、シンテニン−１、ヌクレオホスミン、異種核リボヌクレオプロテインＣ１／Ｃ２、ヌクレオリン、ＡＴＰ依存性ヘリカーゼＤＤＸ４８、マトリン−３、転移性ＥＲＡＴＰアーゼ、ＧＴＰ結合核タンパク質Ｒａｎ、異種核リボヌクレオプロテインＵ、インターロイキンエンハンサー結合因子２、オクタマー結合タンパク質を含む非ＰＯＵドメイン、ＲｕｖＢ様２、ＨＳＰ９０−ｂ、ＨＳＰ９０−ａ、伸長因子２、Ｃ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、ａ−エノラーゼ、Ｃ−１−テトラヒドロ葉酸シンターゼ、細胞質性、ピルビン酸キナーゼ、アイソザイムＭ１／Ｍ２、ユビキチン活性化酵素Ｅ１、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニットＳ１０Ｂ、６０Ｓ酸性リボソームタンパク質Ｐ２、６０Ｓ酸性リボソームタンパク質Ｐ０、４０Ｓリボソームタンパク質ＳＡ、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ３、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ４、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ３ａ、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ７、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ７ａ、６０Ｓ酸性リボソームタンパク質Ｌ３１、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１０ａ、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ６、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット１、チューブリンｂ−２鎖、アクチン、細胞質１、アクチン、大動脈平滑筋、チューブリンａ−遍在鎖、クラスリン重鎖１、ヒストンＨ２Ｂ．ｂ、ヒストンＨ４、ヒストンＨ３．１、ヒストンＨ３．３、ヒストンＨ２Ａタイプ８、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニット６Ａ、ユビキチン−４、ＲｕｖＢ様１、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニット７、ロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼ、細胞質性、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１９、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット１３、ヒストンＨ２Ｂ．Ｆ、Ｕ５小核リボヌクレオプロテイン２００ｋＤａヘリカーゼ、ポリ［ＡＤＰ−リボース］ポリメラーゼ−１、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＩＩ、ＤＮＡ複製ライセンス因子ＭＣＭ５、核酸感受性エレメント結合タンパク質１、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼＡ、インターロイキンエンハンサー結合因子３、転写伸長因子Ｂポリペプチド１、Ｐｒｅ−ｍＲＮＡプロセシングスプライシングファクター８、タンパク質を含むブドウ球菌ヌクレアーゼドメイン１、プログラム化細胞死６−相互作用タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写サブユニット８ホモログのメディエーター、核ＲＮＡヘリカーゼＩＩ、エンドプラスミン、ＤｎａＪホモログサブファミリーＡメンバー１、熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ｌ、Ｔ−複合タンパク質１ｅサブユニット、ＧＣＮ１様タンパク質１、セロトランスフェリン、フルクトース二リン酸アルドラーゼＡ、イノシン−５’一リン酸デヒドロゲナーゼ２、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニット６Ｂ、脂肪酸シンターゼ、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１７、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ７、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１２、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ９、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ８、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ４Ｘアイソフォーム、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１１、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット２、コアトマーサブユニット、ヒストンＨ２Ａ．ｚ、ヒストンＨ１．２、Ｄｙｎｅｉｎ重鎖サイトゾルである。Ｓａｐｈｉｒｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５、およびＷｈｅｅｌｅｒら．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２００７を参照する。
【０６３９】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターはペグ化されている。
【０６４０】
粒子サイズ
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターの直径の中央値は、１０〜１０００ｎＭ、２５〜５００ｎｍ、４０〜３００ｎｍ、５０〜２５０ｎｍ、６０〜２２５ｎｍ、７０〜２００ｎｍ、８０〜１７５ｎｍ、または９０〜１５０ｎｍである。
【０６４１】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターの９０％は、レトロウイルスの直径の中央値の５０％以内である。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターの９０％は、レトロウイルスの直径の中央値の２５％以内である。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターの９０％は、レトロウイルスの直径の中央値の２０％以内である。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターの９０％は、レトロウイルスの直径の中央値の１５％以内である。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターの９０％は、レトロウイルスの直径の中央値の１０％以内である。
【０６４２】
適応症および使用
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるフソソーム、例えば、レトロウイルスベクターもしくは粒子、またはそれらの医薬組成物は、対象、例えば哺乳動物、例えばヒトに投与することができる。いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、対象、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトに投与することができる、本明細書で説明されるいずれかなどの、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、または医薬組成物である。そのような実施形態では、対象は、特定の疾患または状態（例えば、本明細書に記載の疾患または状態）のリスクがあり得、症状を有し得、あるいは有すると診断または特定され得る。一実施形態では、対象は癌を有する。一実施形態では、対象は感染症を有する。いくつかの実施形態では、フソソーム、例えばレトロウイルスベクターまたは粒子は、対象における疾患または状態を治療するための外因性薬剤をコードする核酸配列を含む。例えば、外因性薬剤は、新生細胞のタンパク質を標的とし、または特異的であり、フソソームは対象に、対象における腫瘍または癌を治療するために投与される。別の例では、外因性薬剤は、サイトカインなどの炎症性メディエーターまたは免疫分子であり、フソソームは、癌または感染症などの免疫応答を調節（例えば増加）することが望まれる任意の状態を治療するために対象に投与される。
【０６４３】
したがって、いくつかの態様において、提供されるフソソーム、例えば、レンチウイルスベクターおよび粒子などのレトロウイルスベクターおよび粒子、および／またはそれらを含む組成物の投与方法および使用、例えば、治療的および予防的使用も提供される。そのような方法および使用は、例えば、疾患、状態、または障害を有する対象に、当該疾患、状態、または障害の治療のための外因性薬剤の送達のため、フソソーム、例えば、レンチウイルスベクターもしくは粒子などのレトロウイルスベクターもしくは粒子、またはそれらを含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、フソソーム（例えば、レンチウイルスベクターもしくは粒子などのレトロウイルスベクターもしくは粒子）は、疾患、状態、または障害の治療を達成するのに有効な量または用量で投与される。本明細書に提供されるのは、そのような方法および治療における、ならびにそのような治療方法を実行するための薬品の調製における、提供されるフソソーム（例えば、レンチウイルスベクターまたは粒子などのレトロウイルスベクターまたは粒子）のいずれかの使用である。いくつかの実施形態では、本方法は、フソソーム（例えば、レンチウイルスベクターまたは粒子などのレトロウイルスベクターまたは粒子）、またはそれらを含む組成物を、疾患または状態または障害を有するか、有しているか、または有することが疑われる対象に投与することによって実行される。いくつかの実施形態では、本法は、それによって、対象における疾患または状態または障害を治療する。また本明細書に提供されるのは、外因性薬剤によって標的化または提供される特定の遺伝子またはタンパク質に関連する疾患、状態、または障害の治療のための、本明細書に提供される医薬組成物などの組成物のいずれかの使用である。
【０６４４】
癌には、例えば、白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、骨髄腫および骨髄増殖性疾患肉腫、黒色腫、腺腫、固形組織の癌腫、口、喉、喉頭、および肺の扁平上皮癌、肝臓癌、前立腺、子宮頸部、膀胱、子宮などの泌尿生殖器癌、および内分泌癌と腎細胞癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、皮膚または眼内黒色腫、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、頭頸部癌、乳癌、胃腸癌、および神経系癌、良性病変乳頭腫などの良性病変、などが含まれる。
【０６４５】
哺乳動物（例えば、ヒト）組織に由来する標的細胞には、上皮、結合、筋肉、または神経組織もしくは細胞、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。標的となる哺乳類（例、ヒト）の細胞および臓器系には、心臓血管系（心臓、血管系）、消化器系（食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸、肛門）、内分泌系（視床下部、下垂体、松果体または松果腺、甲状腺、副甲状腺、副腎）、排泄系（腎臓、尿管、膀胱）、リンパ系（リンパ、リンパ節、リンパ管、扁桃腺、アデノイド、胸腺、脾臓）、外皮系（皮膚、髪、爪）、筋肉系（例えば、骨格筋）、神経系（脳、脊髄、神経）’、生殖器系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺）、呼吸器系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）、骨格系（骨、軟骨）、およびそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、非標的細胞または器官系は、心臓血管系（心臓、血管系）、消化器系（食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸、肛門）、内分泌系（視床下部、下垂体、松果体または松果腺、甲状腺、副甲状腺、副腎）、排泄系（腎臓、尿管、膀胱）、リンパ系（リンパ、リンパ節、リンパ管、扁桃腺、アデノイド、胸腺、脾臓）、外皮系（皮膚、髪、爪）、筋肉系（例えば、骨格筋）、神経系（脳、脊髄、神経）’、生殖器系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺）、呼吸器系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）、骨格系（骨、軟骨）、およびそれらの組み合わせから選択される。
【０６４６】
本明細書で説明される医薬組成物の投与は、例えば、経口、吸入、経皮、または非経口（静脈内、腫瘍内、腹腔内、筋肉内、腔内、および皮下を含む）投与の方法によるものであり得る。フソソームは、いくつかの実施形態において、単独で投与され得、または医薬組成物として製剤化され得る。
【０６４７】
実施形態では、フソソーム組成物は、標的細胞に対する効果を媒介し、効果は、少なくとも１、２、３、４、５、６、もしくは７日、２、３、もしくは４週間、または１、２、３、６、もしくは１２か月の間持続する。いくつかの実施形態（例えば、フソソーム組成物が外因性タンパク質を含む）では、効果は、１、２、３、４、５、６、もしくは７日、２、３、もしくは４週間、または１、２、３、６、もしくは１２か月未満の間持続する。
【０６４８】
実施形態では、本明細書で説明されるフソソーム組成物は、細胞または組織、例えば、ヒトの細胞または組織に体外で送達される。
【０６４９】
本明細書で説明されるフソソーム組成物は、いくつかの実施形態では、対象、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトに投与することができる。特定の実施形態において、対象は、特定の疾患または状態（例えば、本明細書に記載の疾患または状態）のリスクがあり得、症状を有し得、または有すると診断もしくは特定され得る。
【０６５０】
いくつかの実施形態において、フソソームの供給源は、フソソーム組成物が投与される同一対象に由来する。他の実施形態では、それらは異なる。例えば、フソソームおよびレシピエント組織の供給源は、自家（同一対象から）または異種（異なる対象から）であり得る。いずれの場合も、本明細書で説明されるフソソーム組成物のドナー組織は、レシピエント組織とは異なる組織タイプであり得る。例えば、ドナー組織は筋肉組織であり得、レシピエント組織は結合組織（例えば、脂肪組織）であり得る。他の実施形態では、ドナー組織およびレシピエント組織は、同一または異なるタイプであり得るが、異なる器官系からであり得る。
【０６５１】
いくつかの実施形態において、フソソームは、膜融合を阻害するタンパク質の阻害剤と同時投与される。例えば、サプレシンは細胞間融合を阻害するヒトタンパク質である（Ｓｕｇｉｍｏｔｏら“Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ３：１４６２  ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０１４６２）。したがって、いくつかの実施形態において、フソソームは、シプレシンの阻害剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたは阻害性抗体と同時投与される。
【０６５２】
本明細書で説明される組成物は、いくつかの実施形態において、様々な他の生物の細胞または組織の機能または生理学を同様に調節するために使用され得、限定されないが、家畜または使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）、愛玩用または動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ、クマなど）、水産養殖動物（魚類、カニ、エビ、カキなど）、植物種（木、作物、観賞用花など）、発酵種（サッカロミセスなど）が含まれる。本明細書で説明されるフソソーム組成物は、いくつかの実施形態では、そのような非ヒト供給源から作製され、非ヒト標的細胞もしくは組織または対象に投与することができる。
【０６５３】
フソソーム組成物は、標的に対して自家、同種異系、または異種であることができる。
【０６５４】
追加の治療剤
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、追加の薬剤、例えば、治療剤、と共に、対象、例えば、レシピエント、例えば、本明細書に記載のレシピエントに同時投与される。いくつかの実施形態において、同時投与される治療剤は、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）、細胞増殖抑制剤（例えば、メトトレキサート）、抗体（例えば、ムロモナブ−ＣＤ３）、またはイムノフィリンモジュレーター（例えば、シクロスポリンまたはラパマイシン）である。実施形態において、免疫抑制剤は、フソソームの免疫媒介性クリアランスを減少させる。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、免疫刺激剤、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインと同時投与される。
【０６５５】
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物および免疫抑制剤は、同時に投与され、例えば、同じ時間に投与される。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、免疫抑制剤の投与前に投与される。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、免疫抑制剤の投与後に投与される。
【０６５６】
いくつかの実施形態において、免疫抑制剤は、イブプロフェン、アセトアミノフェン、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸、シクロホスファミド、グルココルチコイド、シロリムス、アザスリオピン、またはメトトレキサートなどの小分子である。
【０６５７】
いくつかの実施形態において、免疫抑制剤は抗体分子であり、限定されないが、ムロノマブ（抗ＣＤ３）、ダクリズマブ（抗ＩＬ１２）、バシリキシマブ、インフリキシマブ（抗ＴＮＦα）、またはリツキシマブ（抗ＣＤ２０）が含まれる。
【０６５８】
いくつかの実施形態において、免疫抑制剤とのフソソーム組成物の同時投与は、フソソーム組成物単独の投与と比較して、対象におけるフソソーム組成物の増強された持続性をもたらす。いくつかの実施形態において、同時投与におけるフソソーム組成物の増強された持続性は、単独で投与された場合のフソソーム組成物の持続性と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上長い。いくつかの実施形態において、同時投与におけるフソソーム組成物の増強された持続性は、単独で投与されたときのフソソーム組成物の残存と比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、２５、もしくは３０日、またはそれ以上長い。
【実施例】
【０６５９】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために記載されているが、その範囲を制限することを意図されておらず、またそのように解釈されるべきではない。
【０６６０】
実施例１．標的外細胞をアッセイしてレトロウイルス核酸送達の特異性を検出する
この実施例は、単一細胞におけるベクターコピー数を測定することによる、標的外レシピエント細胞における核酸の定量化を説明する。
【０６６１】
一実施形態では、処理されたマウスは、標的外細胞において、未処理のマウス、例えば、ベクターなし、からのものと同様なベクターコピー数、または陰性コントロールレベルと同様なベクターコピー数を有する。一実施形態では、処理されたマウスは、未処理のマウス、例えば、細胞なし、からのものと同様な、ベクターを含む標的外細胞のパーセント、または陰性コントロールレベルと同様な細胞数を有する。
【０６６２】
この実施例では、標的外レシピエント細胞はＣＤ１１ｃ＋細胞である。しかし、このプロトコルは、好適な表面マーカーが存在し、対象から単離することができる任意の細胞タイプに適応され得る。特に、本明細書で説明される方法は、プロトコルへの最適化を伴うヒト、ラット、サルに等しく適用可能であり得る。
【０６６３】
マウスは、本明細書で説明されるように生成されたレトロウイルスベクターまたはＰＢＳ（陰性コントロール）によって処理される。処理の２８日後、レトロウイルスベクターを受けたマウスおよびＰＢＳ処理を受けたマウスから末梢血を収集する。血液は５μＭのＥＤＴＡを含有する１ｍｌのＰＢＳに収集され、直ちに混合して凝固を防止する。チューブを氷上に維持し、赤血球は緩衝化塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して取り除く。細胞は、細胞染色緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  カタログ番号：４２０２０１）中で１０分間Ｆｃブロッキング（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  カタログ番号：１０１３１９）した後、ネズミＣＤ１１ｃ：ＡＰＣ−Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  カタログ番号：１１７３２３）またはアイソタイプコントロールＡＰＣ−Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  カタログ番号：４００２３０）によって暗所で４℃、３０分間染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を実行して、６４０ｎｍレーザー励起および７８０−／＋６０ｎｍで収集された発光によって分析し、アイソタイプコントロールＡＰＣ−Ｃｙ７抗体標識細胞を使用して陰性ゲートを設定する。ＡＰＣ−Ｃｙ７陽性細胞は、ベクターコピー数分析のためにプレートの単一ウェルに分類される。
【０６６４】
ベクターコピー数を、シングルセルネステッドＰＣＲを使用して評価する。ＰＣＲは、ベクターおよび内因性コントロール遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブを使用したｑＰＣＲで実施する。ベクターコピー数は、ベクターのｑＰＣＲシグナルの量を内因性のコントロール遺伝子のｑＰＣＲシグナルの量で除することによって決定される。ベクターを受けた細胞は、少なくとも１．０のベクターコピー数を有する。ベクターコピー数は、複数の細胞のベクターコピー数を平均することによって、集団にわたって評価される。
【０６６５】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターで処置されたマウスは、ビヒクルで処置されたマウスからのものと同様な標的外細胞における平均ベクターコピー数を有する。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターで処理されたマウスは、ビヒクルで処理され処理されたマウスからのものと同様な、ベクターを受けた標的外細胞のパーセントを有する。
【０６６６】
実施例２．標的外細胞をアッセイして外因性タンパク質剤の送達の特異性を検出する
この実施例は、単一細胞における外因性薬剤の発現による、標的外レシピエント細胞における外因性薬剤の発現の定量化を説明する。
【０６６７】
一実施形態では、処理されたマウスは、未処理のマウスからのものと同様な、標的外細胞における外因性薬剤発現を有する。一実施形態では、処理されたマウスは、未処理のマウスからのものと同様な、外因性薬剤を発現する標的外細胞のパーセントを有する。
【０６６８】
この実施例では、標的外レシピエント細胞はＣＤ１１ｃ＋細胞である。しかし、このプロトコルは、好適な表面マーカーが存在し、対象から単離することができる任意の細胞タイプに適応され得る。特に、本明細書で説明される方法は、プロトコルへの最適化を伴うヒト、ラット、サルに等しく適用可能であり得る。この実施例では、外因性薬剤は蛍光タンパク質であり、発現はフローサイトメトリーによって測定される。他の実施形態では、外因性タンパク質剤の発現は、タンパク質について免疫染色を用いて測定され得る。他の実施形態では、外因性タンパク質剤の発現は、顕微鏡検査またはウエスタンブロットを介して測定され得る。
【０６６９】
マウスは、本出願で説明される方法のいずれかを介して生成されたｔｄｔｏｍａｔｏ蛍光タンパク質剤を有するレトロウイルスベクターによって、またはＰＢＳ（陰性コントロール）によって処理される。処理の２８日後、レトロウイルスベクターを受けたマウスおよびＰＢＳ処理を受けたマウスから末梢血を収集する。血液は５μＭのＥＤＴＡを含有する１ｍｌのＰＢＳに収集され、直ちに混合して凝固を防止する。チューブを氷上に維持し、赤血球は緩衝化塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して取り除く。細胞は、細胞染色緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  カタログ番号：４２０２０１）中で１０分間Ｆｃブロッキング（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  カタログ番号：１０１３１９）した後、ネズミＣＤ１１ｃ：ＡＰＣ−Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｇｅｎｄ  カタログ番号：１１７３２３）またはアイソタイプコントロールＡＰＣ−Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  カタログ番号：４００２３０）によって暗所で４℃、３０分間染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を実行して、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で細胞を分析する。ＣＤ１１ｃの陰性ゲートは、アイソタイプコントロールＡＰＣ−Ｃｙ７抗体標識細胞を使用し、６４０ｎｍのレーザー励起および７８０−／＋６０で収集された発光で設定する。ｔｄｔｏｍａｔｏ発現での陰性ゲートは、ビヒクルで処理されたマウスから分離された細胞によって、５５２ｎｍのレーザー励起および５８５−／＋４２ｎｍで収集された発光で設定する。
【０６７０】
ｔｄｔｏｍａｔｏ陽性であるＣＤ１１ｃ＋細胞のパーセントを測定する。いくつかの実施形態において、ｔｄｔｏｍａｔｏ陽性であるＣＤ１１ｃ＋細胞のパーセントは、処置マウスおよび未処理マウスからの細胞において同様である。ｔｄｔｏｍａｔｏ蛍光レベルの中央値はＣＤ１１ｃ＋細胞で測定される。いくつかの実施形態において、ＣＤ１１ｃ＋細胞におけるｔｄｔｏｍａｔｏ蛍光レベルの中央値は、処置マウスおよび未処置マウスからの細胞において同様である。
【０６７１】
実施例３．標的細胞をアッセイしてレトロウイルス核酸送達の特異性を検出する
この実施例は、単一細胞におけるベクターコピー数を測定することによる、標的レシピエント細胞における核酸の定量化を説明する。
【０６７２】
一実施形態では、処置されたマウスは、未処置マウスからのものよりも、標的細胞における高いベクターコピー数を有する。一実施形態では、処理されたマウスは、ベクターを含む標的細胞のパーセントが、未処理マウスよりも高い。
【０６７３】
この実施例では、標的レシピエント細胞はＣＤ３＋細胞である。しかし、このプロトコルは、好適な表面マーカーが存在し、対象から単離することができる任意の細胞タイプに適応され得る。特に、本明細書で説明される方法は、プロトコルへの最適化を伴うヒト、ラット、サルに等しく適用可能であり得る。
【０６７４】
マウスをレトロウイルスベクターで処理し、血液試料を実施例１で前述されたように収集する。細胞は、マウスＣＤ３：ＡＰＣ−Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  カタログ番号：１００３３０）または実施例１で前述されたプロトコルを使用したアイソタイプコントロールによって染色する。ベクターのコピー数は、実施例１で説明されたようにシングルセルネステッドＰＣＲを使用して評価する。
【０６７５】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターで処理されたマウスは、ビヒクルで処理されたマウスからのものよりも、標的細胞における高い平均ベクターコピー数を有する。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターで処理され処理されたマウスは、ビヒクルで処理されたマウスからのものよりも、ベクターを受容した標的細胞の高いパーセントを有する。
【０６７６】
実施例４．標的細胞をアッセイして外因性タンパク質剤の送達の特異性を検出する
この実施例は、単一細胞における外因性タンパク質剤の発現による、標的レシピエント細胞における外因性タンパク質剤の発現の定量化を説明する。
【０６７７】
一実施形態では、処置されたマウスは、処置されていないマウスからのものよりも、標的細胞においてより高い外因性タンパク質剤の発現を有する。一実施形態では、処理されたマウスは、未処理マウスからのものよりも、外因性タンパク質剤を発現する標的細胞の高いパーセントを有する。
【０６７８】
この実施例では、標的レシピエント細胞はＣＤ３＋細胞である。しかし、このプロトコルは、好適な表面マーカーが存在し、対象から単離することができる任意の細胞タイプに適応され得る。特に、本明細書で説明される方法は、プロトコルへの最適化を伴うヒト、ラット、サルに等しく適用可能であり得る。この例では、外因性タンパク質剤は蛍光タンパク質であり、発現はフローサイトメトリーによって測定される。他の実施形態では、外因性タンパク質剤の発現は、タンパク質について免疫染色を用いて測定され得る。他の実施形態では、外因性タンパク質剤の発現は、顕微鏡検査またはウエスタンブロットを介して測定され得る。
【０６７９】
マウスをレトロウイルスベクターで処理し、血液試料を実施例２で前述されたように収集する。細胞をマウスＣＤ３：ＡＰＣ−Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  カタログ番号：１００３３０）またはアイソタイプコントロールを用いて染色し、実施例２で説明されるプロトコルを使用してフローサイトメトリーによって分析する。
【０６８０】
ｔｄｔｏｍａｔｏ陽性であるＣＤ３＋細胞のパーセントが測定される。いくつかの実施形態において、ｔｄｔｏｍａｔｏ陽性であるＣＤ３＋細胞のパーセントは、未処理マウスよりも処理されたマウスからの細胞で高い。ｔｄｔｏｍａｔｏ蛍光レベルの中央値はＣＤ３＋細胞で測定される。いくつかの実施形態において、ＣＤ３＋細胞におけるｔｄｔｏｍａｔｏ蛍光レベルの中央値は、未処理マウスよりも処理されたマウスからの細胞で高い。
【０６８１】
実施例５．ＰＢＭＣ細胞溶解によって媒介される減少した細胞毒性のためのＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅによるレトロウイルスベクターの改変
この実施例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）による細胞溶解に起因する細胞毒性の低下を有するように改変された細胞に由来するレトロウイルスベクターを説明する。
【０６８２】
一実施形態では、ＰＢＭＣによるレトロウイルスベクターの細胞毒性媒介細胞溶解は、溶解がレトロウイルスベクターの活性を低減、例えば、阻害または停止するとき、レトロウイルスベクターの免疫原性の尺度である。
【０６８３】
レトロウイルスベクターは、未改変細胞（以後、ＮＭＣ、陽性コントロール）、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＥｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞（以後、ＮＭＣ−ＨＬＡ−Ｇ）、および空ベクターコントロールでトランスフェクトされた細胞（以後、ＮＭＣ−空ベクター、陰性コントロール）から作成される。
【０６８４】
レトロウイルスベクターのＰＢＭＣ媒介性溶解は、Ｂｏｕｍａら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５（２）：８５−９２；１９９２、およびｖａｎＢｅｓｏｕｗら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ７０（１）：１３６−１４３；２０００で報告されているユーロピウム放出アッセイによって決定する。ＰＢＭＣ（以後、エフェクター細胞）を適切なドナーから単離し、丸底９６ウェルプレート中で同種異系のガンマ線照射したＰＭＢＣおよび２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（プロロイキン、Ｃｈｉｒｏｎ  ＢＶ、アムステルダム、オランダ）によって３７℃で７日間刺激する。レトロウイルスベクターは、ユーロピウム−ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）（ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ、米国）で標識化する。
【０６８５】
７日目に、細胞毒性媒介溶解アッセイを、６３Ｅｕ標識レトロウイルスベクターをエフェクター細胞と９６ウェルプレートで、１０００：１〜１：１および１：１．２５〜１：１０００の範囲のエフェクター／標的比でプレートに加えてから、１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２４、または４８時間インキュベートすることによって実施する。インキュベーション後、プレートを遠心分離し、上清の試料を、バックグラウンド蛍光の低い９６ウェルプレート（フルオロイムノプレート、Ｎｕｎｃ、ロスキレ、デンマーク）に移す。
【０６８６】
続いて、増強溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、フローニンゲン、オランダ）を各ウェルに加える。放出されるユーロピウムを、時間分解蛍光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ１４２０マルチラベルカウンター、ＬＫＢ−Ｗａｌｌａｃ、フィンランド）で測定する。蛍光は１秒あたりのカウント数（ＣＰＳ）で表される。標的レトロウイルスベクターによるユーロピウムの最大放出パーセントは、レトロウイルスベクターの適切な数（１×１０２〜１×１０８）を１％トリトン（シグマアルドリッチ）と適切な時間インキュベートすることによって決定される。標的レトロウイルスベクターによるユーロピウムの自発的放出は、エフェクター細胞が添加されない標識化された標的レトロウイルスベクターのインキュベーションによって測定される。次に、漏出のパーセントは、（自発的放出／最大放出）×１００％として計算される。細胞毒性媒介溶解のパーセンテージは、溶解％＝［（測定された溶解−自発的溶解−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）］×１００％として計算される。データは、異なるエフェクター標的比の関数として溶解のパーセントを調べることによって分析される。
【０６８７】
一実施形態では、ＮＭＣ−ＨＬＡ−Ｇ細胞から生成されたレトロウイルスベクターは、ＮＭＣまたはＮＭＣ空ベクターから生成されたレトロウイルスベクターと比較して、特定の時点で標的細胞による溶解の減少したパーセントを有する。
【０６８８】
実施例６．減少したＮＫ溶解活性のためのＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅによるレトロウイルスベクターの改変
この実施例は、ＮＫ細胞による細胞毒性媒介細胞溶解を減少させるように改変されている細胞源に由来するレトロウイルスベクター組成物の生成を説明する。一実施形態では、ＮＫ細胞によるレトロウイルスベクターの細胞毒性媒介細胞溶解は、レトロウイルスベクターの免疫原性の尺度である。
【０６８９】
レトロウイルスベクターは、未改変細胞（以後、ＮＭＣ、陽性コントロール）、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＥｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞（以後、ＮＭＣ−ＨＬＡ−Ｇ）、および空ベクターコントロールでトランスフェクトされた細胞（以後、ＮＭＣ−空ベクター、陰性コントロール）から作成される。
【０６９０】
レトロウイルスベクターのＮＫ細胞媒介性溶解は、Ｂｏｕｍａら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５（２）：８５−９２；１９９２、およびｖａｎＢｅｓｏｕｗら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ７０（１）：１３６−１４３；２０００で報告されているユーロピウム放出アッセイによって決定する。ＮＫ細胞（以後、エフェクター細胞）を、Ｃｒｏｐら、Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２０）：１５４７−１５５９；２０１１における方法に従って適切なドナーから単離し、丸底９６ウェルプレート中で同種異系のガンマ線照射したＰＭＢＣおよび２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（プロロイキン、Ｃｈｉｒｏｎ  ＢＶ、アムステルダム、オランダ）によって３７℃で７日間刺激する。レトロウイルスベクターは、ユーロピウム−ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）（ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ、米国）で標識化する。細胞毒性媒介溶解アッセイおよびデータ分析は、実施例５で前述されたように実施する。
【０６９１】
一実施形態では、ＮＭＣ−ＨＬＡ−Ｇ細胞から生成されたレトロウイルスベクターは、ＮＭＣまたはＮＭＣ空ベクターから生成されたレトロウイルスベクターと比較して、特定の時点で標的細胞による溶解の減少したパーセントを有する。
【０６９２】
実施例７．減少したＣＤ８キラーＴ細胞溶解のためのＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−Ｅによるレトロウイルスベクターの改変
この実施例は、ＣＤ８＋細胞による細胞毒性媒介細胞溶解を減少させるように改変されている細胞源に由来するレトロウイルスベクター組成物の生成を説明する。一実施形態では、ＣＤ８＋細胞によるレトロウイルスベクターの細胞毒性媒介細胞溶解は、レトロウイルスベクターの免疫原性の尺度である。
【０６９３】
レトロウイルスベクターは、未改変細胞（以後、ＮＭＣ、陽性コントロール）、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＥｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞（以後、ＮＭＣ−ＨＬＡ−Ｇ）、および空ベクターコントロールでトランスフェクトされた細胞（以後、ＮＭＣ−空ベクター、陰性コントロール）から作成される。
【０６９４】
レトロウイルスベクターのＣＤ８＋細胞媒介性溶解は、Ｂｏｕｍａら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５（２）：８５−９２；１９９２、およびｖａｎＢｅｓｏｕｗら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ７０（１）：１３６−１４３；２０００で報告されているユーロピウム放出アッセイによって決定する。ＣＤ８＋細胞（以後、エフェクター細胞）を、Ｃｒｏｐら．Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２０）：１５４７−１５５９；２０１１における方法に従って適切なドナーから単離し、丸底９６ウェルプレート中で同種異系のガンマ線照射したＰＭＢＣおよび２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（プロロイキン、Ｃｈｉｒｏｎ  ＢＶ、アムステルダム、オランダ）によって３７℃で７日間刺激する。レトロウイルスベクターは、ユーロピウム−ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）（ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ、米国）で標識化する。細胞毒性媒介溶解アッセイおよびデータ分析は、実施例５で前述されたように実施する。
【０６９５】
一実施形態では、ＮＭＣ−ＨＬＡ−Ｇ細胞から生成されたレトロウイルスベクターは、ＮＭＣまたはＮＭＣ空ベクターから生成されたレトロウイルスベクターと比較して、特定の時点で標的細胞による溶解の減少したパーセントを有する。
【０６９６】
実施例８：マクロファージ食作用を回避するためのＣＤ４７によるレトロウイルスベクターの改変
この実施例は、改変レトロウイルスベクターによる食作用の回避の定量化を説明する。一実施形態では、改変されたレトロウイルスベクターは、マクロファージによる食作用を回避する。
【０６９７】
細胞は食作用に関与し、粒子を貪食し、細菌や死んだ細胞などの外来侵入物の隔離および破壊を可能にする。いくつかの実施形態において、マクロファージによるレンチウイルスベクターの食作用は、それらの活性を低下させるであろう。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターの食作用は、レトロウイルスベクターの免疫原性の尺度である。
【０６９８】
レトロウイルスベクターは、ＣＤ４７を欠く細胞（以後、ＮＭＣ、陽性コントロール）、ＣＤ４７ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞（以後、ＮＭＣ−ＣＤ４７）、および空ベクターコントロールでトランスフェクトされた細胞（以後、ＮＭＣ−空ベクター、陰性コントロール）から生成される。レトロウイルスベクター生成前に、細胞はＣＳＦＥで標識化される。
【０６９９】
マクロファージを媒介した免疫クリアランスの低下は、以下のプロトコルに従った食作用アッセイによって決定される。マクロファージを、収集後直ちに共焦点ガラス底皿に播種する。マクロファージをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓで１時間インキュベートして付着させる。ＮＭＣ、ＮＭＣ−ＣＤ４７、ＮＭＣ−空ベクターから生成された適切な数のレトロウイルスベクターを、プロトコルに示されるようにマクロファージに加え、２時間インキュベートする、ｔｏｏｌｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｍｐ０６６９４．ｐｄｆ。
【０７００】
２時間後、皿を穏やかに洗浄し、細胞内蛍光を検査する。貪食されたレトロウイルス粒子によって放出された細胞内蛍光は、４８８励起で共焦点顕微鏡によって画像化する。食作用陽性マクロファージの数は、画像化ソフトウェアを使用して定量化する。データは、食作用指数＝（貪食された細胞の総数／カウントされたマクロファージの総数）×（貪食された細胞を含むマクロファージの数／カウントされたマクロファージの総数）×１００として表される。
【０７０１】
一実施形態では、食作用指数は、マクロファージがＮＭＣ−ＣＤ４７に由来するレトロウイルスベクターとインキュベートされるとき、ＮＭＣまたはＮＭＣ空ベクターに由来するものと比べて低下する。
【０７０２】
実施例９：補体を回避するための補体調節タンパク質によるレトロウイルスベクターの改変
この実施例は、インビトロアッセイを使用したレトロウイルスベクターに対する補体活性の定量化を説明する。いくつかの実施形態において、本明細書で説明される改変レトロウイルスベクターは、非改変レトロウイルスベクターと比較して、低下した補体活性を有する。
【０７０３】
この実施例では、マウスからの血清を、レトロウイルスベクターに対する補体活性について評価する。この実施例では、すべての補体経路における中心節点である補体Ｃ３ａのレベルを測定する。本明細書で説明される方法は、プロトコルに最適化されたヒト、ラット、サルに等しく適用可能であり得る。
【０７０４】
この実施例では、レトロウイルスベクターは、補体調節タンパク質ＤＡＦをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＤＡＦレトロウイルスベクター）または相補的調節タンパク質を発現しないＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３レトロウイルスベクター）から生成される。他の実施形態では、他の補体調節タンパク質が使用され、崩壊促進因子（ＤＡＦ、ＣＤ５５）、例えばＨ因子（ＦＨ）様タンパク質−１（ＦＨＬ−１）、例えばＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、例えば補体受容体１（ＣＤ３５）、例えば膜補因子タンパク質（ＭＣＰ、ＣＤ４６）、例えばプロフェクチン（ＣＤ５９）、例えば古典的および代替補体経路ＣＤ／Ｃ５コンバターゼ酵素を阻害するタンパク質、例えばＭＡＣアセンブリを調節するタンパク質などが挙げられる。
【０７０５】
血清は、ナイーブマウス、ＨＥＫ２９３−ＤＡＦレトロウイルスベクターを投与されたマウス、またはＨＥＫ２９３レトロウイルスベクターを投与されたマウスから回収される。血清はマウスから、新鮮な全血を採取し、数時間完全に凝固させることによって収集する。遠心分離によって血餅をペレット化し、血清上清を取り出す。陰性コントロールは、熱不活性化マウス血清である。陰性コントロール試料は、摂氏５６度で１時間加熱する。血清は小分けして冷凍し得る。
【０７０６】
異なるレトロウイルスベクターを、標的細胞集団における細胞の５０％がレトロウイルスベクター中の外因性薬剤を受容する用量について試験する。レトロウイルスベクターは、本明細書で説明される外因性薬剤のいずれかを含み得る。外因性薬剤のレシピエント細胞へのレトロウイルス送達をアッセイするための多くの方法もまた、本明細書で説明される。この特定の例では、外因性薬剤はＣｒｅタンパク質（レトロウイルス核酸によってコードされる）であり、標的細胞は、ＣＭＶプロモーターの下で「ＬｏｘＰ−ＧＦＰ−ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−ＲＦＰ」カセットを安定して発現するＲＰＭＩ８２２６細胞であり、Ｃｒｅによる組換えで、送達のマーカーとして、ＧＦＰからＲＦＰ発現に切り替える。レシピエント細胞の５０％がＲＦＰ陽性であると特定された用量は、さらなる実験に使用される。いくつかの実施形態において、レシピエント細胞の５０％が外因性薬剤を受容することが特定された用量は、レトロウイルスベクターにわたって同様であるであろう。
【０７０７】
レトロウイルスベクターのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）による２倍希釈液を、標的細胞の５０％が外因性薬剤を受容するレトロウイルスベクターの用量から開始し、同一レトロウイルスベクターで処理されたマウスまたはナイーブマウスからの血清の１：１０希釈液と混合し（アッセイ容量、２０μｌ）、３７℃で１時間インキュベートする。試料はさらに１：５００に希釈し、Ｃ３ａに特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）に使用する。ＥＬＩＳＡは、ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃによって販売されてるマウス補体Ｃ３ａ  ＥＬＩＳＡキット製品ＬＳ−Ｆ４２１０であり、試料中のＣ３ａ濃度を測定する。２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在するレトロウイルスベクターの用量を、マウスから単離された血清にわたって比較する。
【０７０８】
いくつかの実施形態では、２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在するレトロウイルスベクターの用量は、ＨＥＫ２９３マウス血清とインキュベートされたＨＥＫ２９３レトロウイルスベクターよりも、ＨＥＫ−２９３ＤＡＦマウス血清とインキュベートされたＨＥＫ２９３−ＤＡＦレトロウイルスベクターの方が高く、レトロウイルスベクターを標的とする補体活性は、ＨＥＫ２９３−ＤＡＦレトロウイルスベクターよりもＨＥＫ２９３レトロウイルスベクターで処理されたマウスの方が高いことを示す。いくつかの実施形態では、２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在するレトロウイルスベクターの用量は、ナイーブマウス血清とインキュベートされたＨＥＫ２９３レトロウイルスベクターよりもナイーブマウス血清とインキュベートされたＨＥＫ２９３−ＤＡＦレトロウイルスベクターの方が高く、レトロウイルスを標的とする補体活性は、ＨＥＫ２９３−ＤＡＦレトロウイルスベクターよりもＨＥＫ２９３レトロウイルスベクターで処理されたマウスの方が高いことを示す。
【０７０９】
実施例１０：免疫原性タンパク質をノックダウンして免疫原性を低下させるためのレトロウイルスベクターの改変
この実施例は、免疫原性である分子の発現を減少させるように改変された細胞源に由来するレトロウイルスベクター組成物の生成、および減少した発現の定量化を説明する。一実施形態では、レトロウイルスベクターは、免疫原性である分子の発現を低下させるように改変されている細胞源に由来することができる。
【０７１０】
免疫応答を刺激する治療法は、治療効能を低下させ、または、レシピエントに毒性を生じる可能性がある。したがって、免疫原性は、安全で有効な治療用レトロウイルスベクターにとって重要な特性である。特定の免疫活性化剤の発現は、免疫応答を引き起こすことができる。ＭＨＣクラスＩは、免疫活性化剤の一例である。
【０７１１】
レトロウイルスベクターを、通常ＭＨＣ−１を発現する非改変細胞（以後、ＮＭＣ、陽性コントロール）、ＭＨＣクラスＩを標的とするｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞（以後、ＮＭＣ−ｓｈＭＨＣクラスＩ）、および非標的スクランブルｓｈＲＮＡベクターコントロールをコードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞（以後、ＮＭＣ−ベクターコントロール、陰性コントロール）から生成する。レトロウイルス生成前に、細胞はＣＳＦＥで標識化される。
【０７１２】
レトロウイルスベクターを、フローサイトメトリーを使用してＭＨＣクラスＩの発現についてアッセイする。適切な数のレトロウイルスベクターを洗浄し、ＰＢＳに再懸濁化させ、ＭＨＣクラスＩ（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｅｒａ−Ｌａｂ、ベルトン、英国）に対する蛍光結合モノクローナル抗体の１：１０〜１：４０００希釈液と共に氷上で３０分間維持する。レトロウイルスベクターをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁化させる。非特異的蛍光は、同等の希釈率で適切な蛍光結合アイソタイプコントロール抗体とインキュベートしたレトロウイルスベクター調製物の等量を使用して決定する。レトロウイルスベクターをフローサイトメーター（ＦＡＣＳｏｒｔ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でアッセイし、データをフロー分析ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析する。
【０７１３】
ＮＭＣ、ＮＭＣ−ｓｈＭＨＣクラスＩ、およびＮＭＣ−ベクターコントロールに由来するレトロウイルスベクターの平均蛍光データを比較する。一実施形態では、ＮＭＣ−ｓｈＭＨＣクラスＩに由来するレトロウイルスベクターは、ＮＭＣおよびＮＭＣ−ベクターコントロールと比較して、ＭＨＣクラスＩの低い発現を有する。
【０７１４】
実施例１１：レトロウイルスベクターの既存血清不活性化を測定する
この実施例は、インビトロ送達アッセイを使用してレトロウイルスベクターの既存血清不活性化の定量化を説明する。
【０７１５】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターの免疫原性の尺度は、血清不活性化である。レトロウイルスベクターの血清不活性化は、抗体を媒介した中和または補体を媒介した分解に起因し得る。一実施形態では、本明細書で説明されるレトロウイルスベクターのいくつかのレシピエントは、レトロウイルスベクターと結合して不活性化するそれらの血清中の因子を有する。
【０７１６】
この実施例では、レトロウイルスベクターナイーブマウスを、血清中のレトロウイルスベクターを不活性化する因子の存在について評価する。特に、本明細書で説明される方法は、プロトコルへの最適化を伴うヒト、ラット、サルに等しく適用可能であり得る。
【０７１７】
陰性コントロールは熱不活性化マウス血清であり、陽性コントロールは異種供給源細胞から生成されたレトロウイルスベクターの複数回の注射を受けたマウスに由来する血清である。血清はマウスから、新鮮な全血を採取し、数時間完全に凝固させることによって収集する。遠心分離によって血餅をペレット化し、血清上清を取り出す。陰性コントロール試料は、摂氏５６度で１時間加熱する。血清は小分けして冷凍し得る。
【０７１８】
レトロウイルスベクターは、実施例９で前述されたように、標的細胞集団中の細胞の５０％がレトロウイルスベクター中の外因性薬剤を受容する用量について試験する。
【０７１９】
レトロウイルスベクターの血清不活性化を評価するために、レトロウイルスベクターを正常または熱不活性化血清（または無血清コントロールとして１０％熱不活性化ＦＢＳを含むメディウム）に１：５に希釈し、混合物を３７℃で１分間インキュベートする。インキュベーション後、メディウムを反応液に加えてさらに１：５に希釈し、１：１０の比率で連続して２回希釈する。このステップに続いて、レトロウイルスベクターは、レシピエント細胞の５０％が外因性薬剤を受容する（例えばＲＦＰ陽性）既に特定された用量で存在するはずである。
【０７２０】
次に、血清に曝露されているレトロウイルスベクターを標的細胞と共にインキュベートする。外因性薬剤を受容する細胞、したがってＲＦＰ陽性である細胞のパーセントを計算する。いくつかの実施形態において、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントは、レトロウイルスベクターナイーブマウスからの血清および熱不活性化血清と共にインキュベートされているレトロウイルスベクター試料との間で異ならず、レトロウイルスベクターの血清不活性化がないことを示す。いくつかの実施形態において、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントは、レトロウイルスベクターナイーブマウスからの血清と共にインキュベートされたレトロウイルスベクター試料と無血清コントロールインキュベーションとの間で異ならず、レトロウイルスベクターの血清不活性化がないことを示す。いくつかの実施形態において、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントは、レトロウイルスベクターナイーブマウスからの血清と共にインキュベートされているレトロウイルスベクター試料よりも、陽性コントロール血清と共にインキュベートされているレトロウイルスベクター試料において低く、レトロウイルスベクターの血清不活性化がないことを示す。
【０７２１】
実施例１２：複数回投与後のレトロウイルスベクターの血清不活性化を測定する
この実施例は、レトロウイルスベクターの複数回投与後のインビトロ送達アッセイを使用して、レトロウイルスベクターの血清不活性化の定量化を説明する。一実施形態において、例えば、本明細書で説明される方法によって改変された、改変レトロウイルスベクターは、改変レトロウイルスベクターの複数回（例えば１回超、例えば２回以上）の投与後に、低下した（非改変レトロウイルスベクターの投与と比較して低下した）血清不活性化を有するであろう。一実施形態では、本明細書で説明されるレトロウイルスベクターは、複数回の投与後に血清によって不活性化されないであろう。
【０７２２】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターにおける免疫原性の尺度は、血清不活性化である。一実施形態では、レトロウイルスベクターの反復注入は、抗レトロウイルスベクター抗体、例えば、レトロウイルスベクターを認識する抗体の発生をもたらし得る。一実施形態では、レトロウイルスベクターを認識する抗体は、レトロウイルスベクターの活性または寿命を制限し、補体分解を媒介することができる様式で結合することができる。
【０７２３】
この実施例では、レトロウイルスベクターの１回以上の投与後に血清不活性化を検査する。レトロウイルスベクターは、先の実施例のいずれかによって生成される。この例では、レトロウイルスは、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＥｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞（以後、ＮＭＣ−ＨＬＡ−Ｇ）、および空ベクターコントロール（以後、ＮＭＣ−空ベクター、陰性コントロール）でトランスフェクトされた細胞から作成される。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、他の免疫調節タンパク質を発現している細胞に由来する。
【０７２４】
血清は、ビヒクル（レトロウイルスベクターナイーブ群）、ＨＥＫ２９３−ＨＬＡ−Ｇレトロウイルスベクター、またはＨＥＫ２９３レトロウイルスベクターの１、２、３、５、または１０回注入によって全身および／または局所注入されたマウスである、異なるコホートから採取される。血清はマウスから、新鮮な全血を採取し、数時間完全に凝固させることによって収集する。遠心分離によって血餅をペレット化し、血清上清を取り出す。陰性コントロールは、熱不活性化マウス血清である。陰性コントロール試料は、摂氏５６度で１時間加熱する。血清は小分けして冷凍し得る。
【０７２５】
レトロウイルスベクターは、実施例９で前述されたように、標的細胞集団中の細胞の５０％がレトロウイルスベクター中の外因性薬剤を受容する用量について試験する。
【０７２６】
レトロウイルスベクターの血清不活性化を評価するために、レトロウイルスベクターを血清に曝露し、上記の実施例１１で説明されるように標的細胞と共にインキュベートする。
【０７２７】
外因性薬剤を受容する細胞、したがってＲＦＰ陽性である細胞のパーセントを計算する。いくつかの実施形態において、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントは、ＨＥＫ２９３−ＨＬＡ−Ｇレトロウイルスベクターで処理されたマウスからの血清および熱不活性化血清と共にインキュベートされているレトロウイルスベクター試料の間で異ならず、レトロウイルスベクターの不活性化または適応免疫応答がないことを示す。いくつかの実施形態において、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントは、ＨＥＫ２９３−ＨＬＡ−Ｇレトロウイルスベクターで１、２、３、５、または１０回処理されたマウスからインキュベートされたレトロウイルスベクター試料間で異ならず、レトロウイルスベクターの血清不活性化または適応免疫応答がないことを示す。いくつかの実施形態において、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントは、ビヒクルで処理されたマウスおよびＨＥＫ２９３−ＨＬＡ−Ｇレトロウイルスベクターで処理されたマウスからの血清と共にインキュベートされたレトロウイルスベクター試料間で異ならず、レトロウイルスベクターの血清不活性化または適応免疫応答がないことを示す。いくつかの実施形態では、外因性薬剤を受容する細胞のパーセントは、ＨＥＫ２９３−ＨＬＡ−ＧレトロウイルスベクターよりもＨＥＫ２９３由来のレトロウイルスベクターの方が低く、ＨＥＫ２９３−ＨＬＡ−Ｇレトロウイルスベクターの血清不活性化または適応免疫応答がないことを示す。
【０７２８】
実施例１３：レトロウイルスベクターに対して反応性である既存のＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を測定する
この実施例は、フローサイトメトリーを使用して測定された既存の抗レトロウイルスベクター抗体価の定量化について説明する。
【０７２９】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターの免疫原性の尺度は、抗体応答である。レトロウイルスベクターを認識する抗体は、レトロウイルスベクターの活性または寿命を制限することができる様式で結合することができる。一実施形態では、本明細書で説明されるレトロウイルスベクターのいくつかのレシピエントは、レトロウイルスベクターと結合して認識する既存の抗体を有する。
【０７３０】
この実施例では、抗レトロウイルスベクター抗体力価は、異種供給源細胞を使用して生成されたレトロウイルスベクターを使用して試験される。この実施例では、レトロウイルスベクターナイーブマウスを抗レトロウイルスベクター抗体の存在について評価する。特に、本明細書で説明される方法は、プロトコルへの最適化を伴うヒト、ラット、サルに等しく適用可能であり得る。
【０７３１】
陰性コントロールは、ＩｇＭおよびＩｇＧが枯渇しているマウス血清であり、陽性コントロールは、異種供給源細胞から生成されたレトロウイルスベクターの複数回注入を受けたマウスに由来する血清である。
【０７３２】
レトロウイルスベクターと結合する既存の抗体の存在を評価するために、レトロウイルスベクターナイーブマウスからの血清を最初に５６℃で３０分間加熱してすることによって最初に補体除去し、続いて３％ＦＣＳおよび０．１％ＮａＮ３を含有するＰＢＳで３３％に希釈する。等量の血清およびレトロウイルスベクター（１×１０２〜１×１０８レトロウイルスベクター／ｍＬ）懸濁液を４℃で３０分間インキュベートし、仔ウシ血清クッションを介してＰＢＳで洗浄する。
【０７３３】
ＩｇＭ異種反応性抗体は、レトロウイルスベクターをマウスＩｇＭのＦｃ部分に特異的なＰＥ結合ヤギ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と４℃で４５分間インキュベートすることによって染色する。特に、抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２二次抗体も使用し得る。全群からのレトロウイルスベクターを２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析する。蛍光データは、対数増幅の使用によって収集し、平均蛍光強度として表す。
【０７３４】
一実施形態では、陰性コントロール血清は、無血清または二次単独コントロールに匹敵する無視できる蛍光を示す。一実施形態では、陽性対照は、陰性対照よりも強い蛍光、および無血清または二次単独コントロールよりも強く示す。一実施形態では、免疫原性が生じる場合、レトロウイルスベクターナイーブマウスからの血清は、陰性コントロールよりも強い蛍光を示す。一実施形態では、免疫原性が生じない場合、レトロウイルスベクターナイーブマウスからの血清は、陰性コントロールと比較して同様の蛍光を示す。
【０７３５】
実施例１４：レトロウイルスベクターの複数回投与後のＩｇＧおよびＩｇＭ抗体応答を測定する
この実施例は、改変レトロウイルスベクターの複数回投与後の改変レトロウイルスベクターの体液性応答の定量化を説明する。一実施形態において、改変レトロウイルスベクター、例えば、本明細書で説明される方法によって改変された改変レトロウイルスベクターの複数回（例えば１回超、例えば２回以上）の投与後に、低下した（非改変レトロウイルスベクターの投与と比較して低下した）体液性応答を有する。
【０７３６】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターの免疫原性の尺度は、抗体応答である。一実施形態では、レトロウイルスベクターの反復注入は、抗レトロウイルスベクター抗体、例えば、レトロウイルスベクターを認識する抗体の発生をもたらし得る。一実施形態では、レトロウイルスベクターを認識する抗体は、レトロウイルスベクターの活性または寿命を制限することができる様式で結合し得る。
【０７３７】
この実施例では、抗レトロウイルスベクター抗体力価は、レトロウイルスベクターの１回以上の投与後に検査される。レトロウイルスベクターは、先の実施例のいずれかによって生成される。この実施例では、レトロウイルスは、免疫調節タンパク質でトランスフェクトされていない細胞（ＮＭＣ）、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＥｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞（以後、ＮＭＣ−ＨＬＡ−Ｇ）、および空ベクターコントロール細胞でトランスフェクトされた細胞（以後、ＮＭＣ−空ベクター、陰性コントロール）から作成される。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、他の免疫調節タンパク質を発現している細胞に由来する。
【０７３８】
血清は、ビヒクル（レトロウイルスベクターナイーブ群）、ＮＭＣレトロウイルスベクター、ＮＭＣ−ＨＬＡ−Ｇレトロウイルスベクター、またはＮＭＣ空ベクターレトロウイルスベクターの１、２、３、５、または１０回注入によって全身および／または局所注入されたマウスである、異なるコホートから採取される。
【０７３９】
抗レトロウイルスベクター抗体の存在および量を評価するために、マウスからの血清を最初に５６℃で３０分間加熱して補体除去し、続いて３％ＦＣＳと０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳで３３％に希釈する。等量の血清およびレトロウイルスベクター（１×１０２〜１×１０８レトロウイルスベクター／ｍＬ）を４℃で３０分間インキュベートし、仔ウシ血清クッションを介してＰＢＳで洗浄する。
【０７４０】
レトロウイルスベクター反応性ＩｇＭ抗体は、レトロウイルスベクターをマウスＩｇＭのＦｃ部分に特異的なＰＥ結合ヤギ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と４℃で４５分間インキュベートすることによって染色する。特に、抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２二次抗体も使用し得る。全群からのレトロウイルスベクターを２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析する。蛍光データは、対数増幅の使用によって収集し、平均蛍光強度として表す。
【０７４１】
一実施形態では、ＮＭＣ−ＨＬＡ−Ｇレトロウイルスベクターは、ＮＭＣレトロウイルスベクターまたはＮＭＣが空のレトロウイルスベクターと比較して、注入後の抗ウイルスＩｇＭ（またはＩｇＧ１／２）抗体力価（ＦＡＣＳの蛍光強度によって測定されたとき）が減少する。
【０７４２】
実施例１５：レトロウイルスベクターレシピエント細胞に対するＩｇＧおよびＩｇＭ力価抗体応答を測定する
この実施例は、フローサイトメトリーを使用したレシピエント細胞（レトロウイルスベクターと融合した細胞）に対する抗体価の定量化を説明する。いくつかの実施形態において、レシピエント細胞の免疫原性の尺度は、抗体応答である。レシピエント細胞を認識する抗体は、細胞の活性または寿命を制限することができる様式で結合し得る。一実施形態では、レシピエント細胞は、抗体応答の標的とならず、または抗体応答が対照レベルを下回る。
【０７４３】
この実施例では、対象（例えば、ヒト、ラット、またはサル）における抗レシピエント細胞抗体力価が試験される。さらに、プロトコルは、好適な表面マーカーが存在する任意の細胞タイプに適応され得る。この実施例では、標的レシピエント細胞はＣＤ３＋細胞である。
【０７４４】
マウスは、本出願で説明される方法のいずれかを介して生成されたレトロウイルスベクターまたはＰＢＳ（陰性コントロール）で５日間毎日処理する。最終処置の２８日後、末梢血をレトロウイルスベクターを受けたマウスおよびＰＢＳ処理を受けたマウスから収集する。血液は５μＭのＥＤＴＡを含有する１ｍｌのＰＢＳに収集され、直ちに混合して凝固を防止する。チューブを氷上に維持し、赤血球は緩衝化塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して取り除く。細胞を、ウシ血清アルブミンで１０分間ブロッキングした後、ネズミＣＤ３−ＦＩＴＣ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  カタログ番号：１１−００３２−８２）によって、暗所で４℃、３０分間染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を実行して、４８８ｎｍのレーザー励起および５３０＋／−３０ｎｍで収集した発光によって分析する。ＣＤ３＋細胞を分類する。
【０７４５】
次に、反応混合物をマウスＩｇＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のＦｃ部分に特異的なＰＥ結合ヤギ抗体と４℃で４５分間インキュベートすることによって、分類したＣＤ３＋細胞をＩｇＭ抗体で染色する。特に、抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２二次抗体も使用し得る。すべての群からの細胞を２％ＦＣＳ含有ＰＢＳで２回洗浄し、次いでＦＡＣＳシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析する。蛍光データは、対数増幅の使用によって収集し、平均蛍光強度として表す。平均蛍光強度を、レトロウイルスベクターで処理されたマウスおよびＰＢＳで処理されたマウスからの分類されたＣＤ３細胞について計算する。
【０７４６】
低い平均蛍光強度は、レシピエント細胞に対する低い体液性応答を示す。ＰＢＳで処理されたマウスは、低い平均蛍光強度を有することが予測される。一実施形態では、平均蛍光強度は、レトロウイルスベクターで処理されたマウスおよびＰＢＳで処理されたマウスからのレシピエント細胞において同様である。
【０７４７】
実施例１６：レトロウイルスベクターレシピエント細胞に対する食作用応答を測定する
この実施例は、食作用アッセイを用いたレシピエント細胞に対するマクロファージ応答の定量化を説明する。
【０７４８】
いくつかの実施形態において、レシピエント細胞の免疫原性の尺度は、マクロファージ応答である。マクロファージは食作用に関与し、細胞を貪食し、細菌や死細胞などの外来侵入物の隔離および破壊を可能する。いくつかの実施形態において、マクロファージによるレシピエント細胞の食作用は、それらの活性を低下させる。
【０７４９】
一実施形態では、レシピエント細胞はマクロファージによって標的化されない。この実施例では、対象におけるレシピエント細胞に対するマクロファージ応答が試験される。さらに、プロトコルは、好適な表面マーカーが存在する任意の細胞タイプに適応され得る。この実施例では、標的レシピエント細胞はＣＤ３＋細胞である。
【０７５０】
マウスは、本出願で説明される方法のいずれかを介して生成されたレトロウイルスベクターまたはＰＢＳ（陰性コントロール）で５日間毎日処理する。最終処置の２８日後、末梢血をレトロウイルスベクターを受けたマウスおよびＰＢＳ処理を受けたマウスから収集する。血液は５μＭのＥＤＴＡを含有する１ｍｌのＰＢＳに収集され、直ちに混合して凝固を防止する。チューブを氷上に維持し、赤血球は緩衝化塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して取り除く。
【０７５１】
細胞をウシ血清アルブミンで１０分間ブロッキングした後、マウスＣＤ３−ＦＩＴＣ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号：１１−００３２−８２）によって、暗所で４℃、３０分間染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を実行して、４８８ｎｍのレーザー励起および５３０＋／−３０ｎｍで収集した発光によって分析する。次に、ＣＤ３＋細胞を分類する。
【０７５２】
食作用アッセイは、以下のプロトコルに従ってマクロファージ媒介性免疫クリアランスを評価するために実行する。マクロファージを、収集後直ちに共焦点ガラス底皿に播種する。マクロファージをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓで１時間インキュベートして付着させる。レトロウイルスベクターおよびＰＢＳを受けたマウスに由来する適切な数の分類されてＦＩＴＣ染色されたＣＤ３＋細胞を、プロトコルに示されるようにマクロファージに添加し、例えば、Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔの製品情報インサート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、２００１年３月１８日改訂、ｔｏｏｌｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｍｐ０６６９４．ｐｄｆでみられる）に記載されるように、２時間インキュベートする。
【０７５３】
２時間後、皿を穏やかに洗浄し、細胞内蛍光を検査する。マクロファージを同定するために、細胞を最初にＦｃ受容体ブロッキング抗体（ｅＢｉｏｓｃｅｎｃｅ  カタログ番号１４−０１６１−８６、クローン９３）と氷上で１５分間インキュベートし、マクロファージで多量に発現されるＦｃ受容体への標識化ｍＡｂの結合を遮断する。このステップに続いて、抗Ｆ４／８０−ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  カタログ番号１２−４８０１−８２、クローンＢＭ８）および抗ＣＤ１１ｂ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  カタログ番号５５０９９３、クローンＭ１／７０）結合抗体を添加してマクロファージ表面抗原を染色する。細胞を暗所で４℃で３０分間インキュベートした後、遠心分離してＰＢＳで洗浄する。次に、細胞をＰＢＳに再懸濁させる。次に、試料のフローサイトメトリーを実施し、マクロファージは、それぞれ５３３ｎｍおよび６４７ｎｍのレーザー励起を使用したＦ４／８０−ＰＥおよびＣＤ１１ｂ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５の陽性蛍光シグナルによって同定される。マクロファージをゲーティングした後、貪食されたレシピエント細胞によって放出される細胞内蛍光を、４８８ｎｍレーザー励起によって評価する。食作用陽性マクロファージの数は、画像化ソフトウェアを使用して定量化する。データは、食作用指数＝（貪食された細胞の総数／カウントされたマクロファージの総数）×（貪食された細胞を含むマクロファージの数／カウントされたマクロファージの総数）×１００として表される。
【０７５４】
低い食作用指数は、低い食作用およびマクロファージによる標的化を示す。ＰＢＳで処理されたマウスは、低い食作用指数を有することが予想される。一実施形態では、食作用指数は、レトロウイルスベクターで処理されたマウスおよびＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞において同様である。
【０７５５】
実施例１７：レトロウイルスベクターレシピエント細胞に対するＰＢＭＣ応答を測定する
この実施例は、細胞溶解アッセイを用いるレシピエント細胞に対するＰＢＭＣ応答の定量化を説明する。
【０７５６】
いくつかの実施形態において、レシピエント細胞の免疫原性の尺度は、ＰＢＭＣ応答である。一実施形態では、ＰＢＭＣによるレシピエント細胞の細胞毒性媒介細胞溶解は、溶解がレトロウイルスベクターの活性を低下、例えば、阻害または停止させるため、免疫原性の尺度である。
【０７５７】
一実施形態では、レシピエント細胞は、ＰＢＭＣ応答を誘発しない。この実施例では、対象におけるレシピエント細胞に対するＰＢＭＣ応答が試験される。
【０７５８】
さらに、プロトコルは、好適な表面マーカーが存在する任意の細胞タイプに適応され得る。この実施例では、標的レシピエント細胞はＣＤ３＋細胞である。
【０７５９】
マウスは、本出願で説明される方法のいずれかを介して生成されたレトロウイルスベクターまたはＰＢＳ（陰性コントロール）によって５日間毎日処理される。最終処理の２８日後、末梢血をレトロウイルスベクターを受けたマウスおよびＰＢＳ処理を受けたマウスから収集する。血液は５μＭのＥＤＴＡを含有する１ｍｌのＰＢＳに収集され、直ちに混合して凝固を防止する。チューブを氷上に維持し、赤血球は緩衝化塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して取り除く。細胞は、細胞染色緩衝液（Ｂｉｏｌｇｅｎｄ  カタログ番号：４２０２０１）で１０分間Ｆｃブロッキング（Ｂｉｏｌｇｅｎｄ  カタログ番号：１０１３１９）した後、ネズミＣＤ３：ＡＰＣ−Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｇｅｎｄ  カタログ番号：１００３３０）またはアイソタイプコントロールＡＰＣ−Ｃｙ７（ＩＣ：ＡＰＣ−Ｃｙ７）抗体（Ｂｉｏｌｇｅｎｄ  カタログ番号：４００２３０）によって暗所で４℃、３０分間染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を実行して、６４０ｎｍレーザー励起および７８０−／＋６０ｎｍで収集された発光によって分析し、アイソタイプコントロールＡＰＣ−Ｃｙ７抗体標識細胞を使用して陰性ゲートを設定し、次いでＡＰＣ−Ｃｙ７陽性細胞を分類して収集する。次いで、分類したＣＤ３＋細胞は、ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｐｌａｓｍａ膜染色（ＣＭＧ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号：Ｃ３７６０８）または陰性コントロールとしてＤＭＳＯのいずれかで標識化する。
【０７６０】
レトロウイルスベクターまたはＰＢＳで処理されたマウスからＣＤ３＋細胞を単離する７日前に、Ｃｒｏｐら、Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２０）：１５４７−１５５９；２０１１の方法に従ってレトロウイルスベクターまたはＰＢＳで処理したマウスからＰＢＭＣを単離し、丸底９６ウェルプレート中で、ＩＬ−２組換えマウスタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号：４０２−ＭＬ−０２０）およびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号：１１４５６Ｄ）の存在下、３７℃で７日間シミュレーションした。７日目に、刺激したＰＢＭＣをＣＤ３＋／ＣＭＧ＋またはＣＤ３＋／ＤＭＳＯコントロール細胞と共に、ＰＢＭＣ：ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋またはＰＢＭＣ：ＣＤ３＋／ＤＭＳＯコントロール細胞細胞のプレートに加えた比を１０００：１〜１：１および１：１．２５〜１：１０００の範囲で、１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２４、４８時間共培養する。陰性コントロールとして、一連のウェルはＣＤ３＋／ＣＭＧ＋およびＣＤ３＋／ＤＭＳＯコントロール細胞のみ加え、ＰＢＭＣは加えない。インキュベーション後、プレートを遠心分離して処理し、上記のネズミＣＤ３：ＡＰＣ−Ｃｙ７抗体またはＩＣ：ＡＰＣ−Ｃｙ７抗体のいずれかを用いて標識化する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＡＰＣ−Ｃｙ７：６４０ｎｍレーザー励起／７８０−／＋６０ｎｍで発光収集、およびＣＭＧ：５６１ｎｍレーザー励起／５８５−／＋１６ｎｍで発光収集）で、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、カリフォルニア州）を実行して分析する。次に、ＦＳＣ／ＳＳＣイベントデータを最初に使用して、「細胞」と標識化されたイベントのゲートを設定する。次に、この「細胞」ゲートを使用してイベントを表示し、ＩＣ：ＡＰＣ−Ｃｙ７／ＤＭＳＯのみで標識化された試料を分析する６４０ｎｍおよび５６１ｎｍのレーザー用にＰＭＴ電圧を設定する。この試料は、ＡＰＣ−Ｃｙ７およびＣＭＧの両方における陰性細胞についてゲートを設定するためにも使用される。次に、いずれのＰＢＭＣも受容しなかったＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞を使用して、ＣＤ３＋およびＣＭＧ＋細胞における陽性ゲートを設定する。
【０７６１】
データを、全細胞の集団におけるＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞のパーセントを調べることによって分析する。処理群を比較すると、ＰＢＭＣ：ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の任意の所定のアッセイ比でのＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞のパーセントが比較的低く、レシピエント細胞溶解を示す。一実施形態では、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋のパーセントは、レトロウイルスベクターで処理されたマウスおよびＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞について同様である。
【０７６２】
実施例１８：レトロウイルスベクターレシピエント細胞に対するＮＫ細胞応答を測定する
この実施例は、細胞溶解アッセイによるレシピエント細胞に対するナチュラルキラー細胞応答の定量化を説明する。
【０７６３】
いくつかの実施形態において、レシピエント細胞の免疫原性の尺度は、ナチュラルキラー細胞応答である。一実施形態では、ナチュラルキラー細胞によるレシピエント細胞の細胞毒性媒介細胞溶解は、溶解がレトロウイルスベクターの活性を低下、例えば阻害または停止させるため、免疫原性の尺度である。
【０７６４】
一実施形態では、レシピエント細胞はナチュラルキラー細胞応答を誘発しない。この実施例では、対象におけるレシピエント細胞に対するナチュラルキラー応答が試験される。さらに、プロトコルは、好適な表面マーカーが存在する任意の細胞タイプに適応され得る。この実施例では、標的レシピエント細胞はＣＤ３＋細胞である。
【０７６５】
マウスをレトロウイルスベクターで処理し、血液試料を採取し、ＣＤ３＋細胞を上記の実施例１７に記載したように選別する。ＮＫ細胞は、実施例１７で使用されるＰＢＭＣ細胞の代わりにＮＫ細胞が使用されることを除いて、実施例１７で前述されたプロトコルに従って単離され、ＣＤ３＋細胞と共に培養され、ＦＡＣＳによって分析される。
【０７６６】
データを、全細胞の集団におけるＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞のパーセントを調べることによって分析する。処理群を比較すると、ＮＫ細胞：ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の任意の所定のアッセイ比でのＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の割合が比較的低いことは、レシピエント細胞溶解を示す。一実施形態では、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋のパーセントは、レトロウイルスベクターで処理されたマウスおよびＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞について同様である。
【０７６７】
実施例１９：レトロウイルスベクターレシピエント細胞に対するＣＤ８Ｔ細胞応答を測定する
この実施例は、細胞溶解アッセイによって、レシピエント細胞（レトロウイルスベクターと融合している細胞）に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の定量化を説明する。
【０７６８】
いくつかの実施形態において、レシピエント細胞の免疫原性の尺度は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。一実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるレシピエント細胞の細胞傷害性媒介細胞溶解は、溶解がレトロウイルスベクターの活性を低下、例えば阻害または停止させるため、免疫原性の尺度である。
【０７６９】
一実施形態では、レシピエント細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発しない。この実施例では、対象におけるレシピエント細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の応答が試験される。さらに、プロトコルは、好適な表面マーカーが存在する任意の細胞タイプに適応され得る。この実施例では、標的レシピエント細胞はＣＤ３＋細胞である。
【０７７０】
マウスをレトロウイルスベクターで処理し、血液試料を採取し、ＣＤ３＋細胞を上記の実施例１７に記載したように選別する。ＣＤ８＋細胞は、実施例１７で使用されるＰＢＭＣ細胞の代わりにＣＤ８＋細胞が使用されることを除いて、実施例１７で前述されたプロトコルに従って単離され、ＣＤ３＋細胞と共に培養され、ＦＡＣＳによって分析される。
【０７７１】
データを、全細胞の集団におけるＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞のパーセントを調べることによって分析する。処理群を比較すると、ＣＤ８＋細胞：ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の任意の所定のアッセイ比でのＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の割合が比較的低いことは、レシピエント細胞溶解を示す。一実施形態では、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋のパーセントは、レトロウイルスベクターで処理されたマウスおよびＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞について同様ある。
【０７７２】
実施例２０．フソゲン耐性供給源細胞を作成する
この実施例は、レトロウイルスベクターが標的とする受容体が存在せず、または低下したレベルであるように供給源細胞が改変されているため、レトロウイルスベクターによって標的化することができない（または低レベルで標的化される）供給源細胞を説明する。
【０７７３】
この実施例では、フソゲンはシンシチン−１（ＨＥＲＶ−Ｗ）であり、受容体はＡＳＣＴ２であり、受容体発現は、Ｃａｓ９によるゲノム編集およびＡＳＣＴ２遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡを使用して、供給源細胞において低下される。他の様々な受容体は、様々な方法、例えば、ＲＮＡ干渉を使用することによって下方調節することができることが理解される。
【０７７４】
ＨＥＫ２９３Ｔ供給源株を、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡおよびＡＳＣＴ２を標的とするガイドＲＮＡ（ＨＥＫ２９３Ｔ−ＡＳＣＴ２）、またはＣａｓ９を発現しないコントロールｍＲＮＡ（ＨＥＫ２９３Ｔ−コントロール）でトランスフェクトする。細胞を３週間培養した後、免疫染色およびフローサイトメトリーを使用してＡＳＣＴ２発現について染色する。いくつかの実施形態において、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＡＳＣＴ２集団における細胞の少なくとも９０％は、ＡＳＣＴ２について陰性に染色され、ＨＥＫ２９３Ｔコントロール集団における細胞の少なくとも９０％は、ＡＳＣＴ２について陽性に染色される。これらの細胞は、その後の実験に使用される。
【０７７５】
次に、細胞を、レンチウイルスパッケージングベクター（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＲｅｖ）、シンシチン−１エンベロープベクター、およびＧＦＰをコードするペイロードベクターによってトランスフェクトする。２４時間後、顕微鏡を使用して細胞を画像化し、合胞体形成をアッセイし、次いでウイルス粒子を上清から収集する。
【０７７６】
供給源細胞集団における合胞体の量は、ＤＡＰＩによる染色後に合胞体あたりの核の数を顕微鏡で定量化することによってアッセイすることができる。いくつかの実施形態において、合胞体あたりの核のパーセントは、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＡＳＣＴ２供給源細胞において、ＨＥＫ２９３Ｔコントロール供給源細胞よりも低い。
【０７７７】
ＨＥＫ２９３Ｔ−ＡＳＣＴ２供給源細胞およびＨＥＫ２９３Ｔコントロール供給源細胞からの機能的なウイルス粒子の量は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を上清から収集されたウイルス粒子と共に培養することによって定量化される。細胞をウイルス粒子と共に培養した後に５日間培養し、ＧＦＰ陽性細胞のパーセントをフローサイトメトリーでアッセイする。いくつかの実施形態において、ＧＦＰ陽性細胞のパーセントは、ＨＥＫ２９３Ｔコントロール供給源細胞由来ウイルス粒子よりも、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＡＳＣＴ２供給源細胞由来ウイルス粒子で処理されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で高い。
【０７７８】
実施例２１：標的細胞における発現レベルの中央値を時間にわたって評価する
この実施例は、単一細胞における外因性薬剤レベルを測定することによる、標的細胞における外因性薬剤の発現の定量化を説明する。
【０７７９】
一実施形態では、外因性薬剤レベルは、ハウスキーピング遺伝子よりも高い。一実施形態では、ペイロード発現は、標的細胞にわって同様である。
【０７８０】
この実施例では、標的細胞はＣＤ３＋細胞である。しかし、このプロトコルは、好適な表面マーカーが存在し、対象から単離することができる任意の細胞タイプに適応され得る。特に、本明細書で説明される方法は、プロトコルへの最適化を伴うヒト、ラット、サルに等しく適用可能であり得る。この実施例では、ペイロードは蛍光タンパク質であり、発現はフローサイトメトリーを介して測定される。他の実施形態では、タンパク質ペイロードの発現は、タンパク質の免疫染色によって測定され得る。他の実施形態では、タンパク質ペイロードの発現は、顕微鏡検査またはウエスタンブロットを介して測定され得る。
【０７８１】
マウスは、本出願で説明される方法のいずれかを介して生成されたｔｄｔｏｍａｔｏ蛍光タンパク質剤を有するレトロウイルスベクターによって、またはＰＢＳ（陰性コントロール）によって処理される。処理後７日、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、および１０９５日に、レトロウイルスベクターを受けたマウスおよびＰＢＳ処理を受けたマウスから末梢血を収集する。血液を実施例２に前述されたように収集する。細胞をマウスＣＤ３：ＡＰＣ−Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  カタログ番号：１００３３０）またはアイソタイプコントロールを用いて染色し、実施例２で説明されるプロトコルを使用してフローサイトメトリーによって分析する。
【０７８２】
ｔｄｔｏｍａｔｏ陽性であるＣＤ３＋細胞のパーセントを測定する。いくつかの実施形態において、ｔｄｔｏｍａｔｏ陽性であるＣＤ３＋細胞のパーセントは、未処理マウスよりも処理されたマウスからの細胞で高い。いくつかの実施形態では、ｔｄｔｏｍａｔｏ陽性であるＣＤ３＋細胞のパーセントは、７日、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で収集された細胞にわたって同様である。ｔｄｔｏｍａｔｏ蛍光レベルの中央値はＣＤ３＋Ｔｄｔｏｍａｔｏ＋細胞で測定される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３＋Ｔｄｔｏｍａｔｏ＋細胞におけるｔｄｔｏｍａｔｏ蛍光レベルの中央値は、７日、１４日、２８日、５６日、１１２日、３６５日、７３０日、または１０９５日で収集された細胞において同様である。
【０７８３】
実施例２２：組織特異的プロモーターおよびｍｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングを使用した導入遺伝子発現の特異性の評価。
この実施例は、標的ヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）における外因性薬剤の定量化および、非標的（非肝）細胞株と比較して説明する。細胞株は、ポジティブＴＣＳＲＥ（例えば、組織特異的プロモーター）またはポジティブＴＣＳＲＥとＮＴＣＳＲＥの組み合わせ（例えば、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列によるｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシング）を含むレンチウイルス（ＬＶ）によって形質導入した。標的および非標的細胞株を、ポジティブおよびネガティブ調節エレメントを含む生成されたレンチウイルス粒子で形質導入し、細胞株における導入遺伝子発現の効果を評価した。
【０７８４】
Ａ．導入遺伝子発現の特異性におけるｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子調節の効果。
肝細胞に加えて、肝類洞を系統にする主要な細胞集団には、内皮細胞およびクッパー細胞（造血系統に由来する常在性マクロファージ）が含まれ、それぞれｍｉｒ−１２６−３ｐおよびｍｉｒ−１４２−３ｐを発現する。これらのｍｉＲＮＡは肝細胞では実質的に発現されない。レンチウイルスベクターは、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）発現カセットを、構成的に活性なプロモーターホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ、ポジティブＴＣＳＲＥ、例えば、配列番号１３９を参照、の制御下で、ＮＴＣＳＲＥとして、ｍｉｒ−１４２−３ｐ（例えば、表７、配列番号１４３）およびｍｉＲ−１２６−３ｐ（例えば、表７、配列番号１６０）に相補的である配列の各々の４つのタンデムコピーの添加または無添加で含むように構築した。ＮＴＣＳＲＥを有するレンチウイルスベクター（ＬＶ）構築体はｈＰＧＫ−ｅＧＦＰ＋ｍｉＲＴと呼ばれ、ＮＴＣＳＲＥを有さない構築体はｈＰＧＫ−ｅＧＦＰと呼ばれる。
【０７８５】
これらのｈＰＧＫ−ｅＧＦＰ＋ｍｉＲＴおよびｈＰＧＫ−ｅＧＦＰベクターから生成されたレンチウイルス（ＬＶ）をそれぞれ使用して、標的ヒト肝細胞株（ＨｅｐＧ２）、ヒト胎児腎臓細胞株（２９３ＬＸ）、ヒト造血系起源のヒトＴ細胞株（Ｍｏｌｔ４．８）、またはマウス脳に由来する内皮細胞株（ｂＥＮＤ．３）に形質導入した。形質導入の７日後、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーによって測定した。
【０７８６】
図１Ａに示されるように、ｈＰＧＫ−ｅＧＦＰＬＶで形質導入したすべての細胞タイプの１８〜３０％がＧＦＰを発現した。非標的細胞におけるｍｉｒＴ配列（ｈＰＧＫ−ｅＧＦＰ＋ｍｉＲＴ）を含むＬＶの形質導入後、０．６％のＧＦＰ発現のみがＭｏｌｔ４．８細胞（ｍｉｒ−１４２−３ｐを発現）で認められ、ｂＥＮＤ．３細胞では発現が認められなかった（ｍｉｒ−１２６−３ｐを発現）。ＧＦＰ発現の軽度の低下が２９３ＬＸ細胞で認められ、これらｍｉＲＮＡのうちの一方または両方の非常に低いレベルの発現を有し得る。ｍｉｒＴ配列（ｈＰＧＫ−ｅＧＦＰ＋ｍｉＲＴ）を含むＬＶで形質導入されていたＨｅｐＧ２標的細胞では、ＧＦＰ発現における効果は認められなかった。これらの結果は、レンチウイルスベクターにおけるｍｉＲＴ配列の組み込みが、造血系および内皮系の細胞において導入遺伝子発現の少なくとも５０倍の低下をもたらし、一方、肝細胞において頑強な発現を維持したことを示した。
【０７８７】
Ｂ．導入遺伝子発現におけるｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子調節および組織特異的プロモーターの組み合わせ効果。
追加のレンチウイルスベクター（ＬＶ）は、前述のように実質的に生成したが、ｅＧＦＰまたは以下に示されるＮ末端フラグタグヌクレオチド配列を有する酵素フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする導入遺伝子のいずれかを伴い、ポジティブＴＣＳＲＥとしての組織特異的調節プロモーターとして肝細胞特異的ヒト（ＡｐｏＥ．ＨＣＲ−ｈＡＡＴ（ｈＡｐｏＥ）プロモーター（例えば、表６、配列番号１３３に示される）または構成的に活性な脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター（例えば、表６、配列番号１４２に示される）の制御下にある。得られる核酸構築体を使用した肝細胞におけるＰＡＬの発現は、標的細胞における所望の外因性薬剤の発現を表す。例えば、ヒト肝細胞における内因性ＰＡＨ欠乏は、血中のＰｈｅの毒性蓄積を引き起こし、重度の神経障害および発育阻害を特徴とする臨床症状であるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）をもたらす可能性がある。いくつかの態様において、ＰＫＵ患者へのＰＡＬの早期投与は、血中Ｐｈｅレベルを首尾よく減少させ、症状を軽減することが示される。
【０７８８】
ＰＡＬ遺伝子のヌクレオチド配列を示す（配列番号１６９）：
【化１】
2021523724.tif 000085
【０７８９】
図１Ｂに示すように、肝細胞特異的プロモーター（ｈＡｐｏＥ−ｅＧＦＰ＋ｍｉＲＴ）の制御下でのｈＰＧＫ−ｅＧＦＰを含むＬＶまたはｍｉｒＴ配列およびＧＦＰを含むＬＶによる形質導入は、フローサイトメトリーで測定されたとき、２９３ＬＸでのＧＦＰ発現の２５０倍を超える抑制をもたらし、ＨｅｐＧ２細胞ではほとんど影響を伴わない。
【０７９０】
ＨｅｐＧ２および２９３ＬＸ細胞を、ＳＦＦＶプロモーターの制御下でＰＡＬ導入遺伝子を含むＬＶ（ＳＦＦＶ−ＰＡＬ）、またはｈＡｐｏＥプロモーターの制御下でｍｉｒＴ配列と共にＰＡＬ導入遺伝子を含むＬＶ（ｈＡｐｏＥ−ＰＡＬ＋ｍｉＲＴ）によって形質導入した。ＰＡＬは、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のアンモニアと桂皮酸への変換に触媒作用を及ぼし、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の先天性欠損症を有する患者における酵素補充療法で使用されている。ＰＡＬ導入遺伝子発現の特異性は、新鮮な培地と比較した培養上清（ＳＮ）におけるＰｈｅレベルの低下によって測定した。
【０７９１】
図１Ｃに示されるように、構成的プロモーター（ＳＦＦＶ）からの発現は、両方の細胞タイプから収集されたＳＮにおけるＰｈｅレベルに大きな低下をもたらした。しかし、ｈＡｐｏＥ−ＰＡＬ＋ｍｉＲＴ構築体は、ＨｅｐＧ２細胞でのみ大きなＰｈｅの低下をもたらし、ｈＡｐｏＥ−ＰＡＬ＋ｍｉＲＴ  ＬＶで形質導入された２９３ＬＸ細胞から収集されたＳＮにおけるＰｈｅレベルは、形質導入されていないコントロールと区別できなかった。この結果は、ポジティブＴＳＣＲＥおよびＮＴＳＣＲＥを含むＬＶ構築体で形質導入されたとき、非標的２９３ＬＸ細胞にはない、ＨｅｐＧ２標的細胞における例示的な導入遺伝子ＰＡＬの高い発現と一致する。
【０７９２】
Ｃ．結論
総合すると、これらのデータは、ｍｉＲＮＡ標的部位と連結された組織特異的プロモーターの使用が導入遺伝子発現に実質的な特異性を付与することができるという発見を支持する。
【図１Ａ】
2021523724.tif 000086
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2021523724.tif 000088
【配列表】
2021523724000001.app
【国際調査報告】
2021523724.tif 000089
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