(57)【要約】  本発明は、アルファウイルス−レプリコンＲＮＡ粒子および油性アジュバントを使用した動物病原体に対するワクチン接種に関する。ワクチンならびにレプリコン粒子および油性アジュバントを含むキットオブパーツに関する。また、ワクチンとそのキットの構成要素を作製および使用する方法および使用に関する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含むワクチンであって、ここで、前記ワクチンは、油性アジュバントをも含む、ワクチン。
【請求項２】
前記油性アジュバントが鉱油を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記油性アジュバントが非鉱油を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記油性アジュバントが、鉱油および１種以上の非鉱油を含む、請求項１、２または３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記油性アジュバントが、流動パラフィン油およびビタミンＥ−アセテートを含む、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記油性アジュバントが、２種以上の非鉱油を含む、請求項１または３に記載のワクチン。
【請求項７】
前記油性アジュバントが、スクアランおよびビタミンＥ−アセテートを含む、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記油性アジュバント中の鉱油の量が、油性アジュバントの１〜７０％ｖ／ｖである、請求項１、２、４または５に記載のワクチン。
【請求項９】
前記油性アジュバント中の非鉱油の総量が、油性アジュバントの０．１〜３０％ｗ／ｖである、請求項１、３、４、５、６または７に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記油性アジュバントが、水中油型エマルジョンとして処方される、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
動物病原体を由来とするコードされた抗原が、ウイルスまたは細菌を由来とする抗原である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
動物病原体を由来とするコードされた抗原が、魚、鳥および哺乳動物から成る群から選択される動物病原体を由来とする抗原である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記哺乳動物がブタである、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記鳥が、ニワトリまたはシチメンチョウである、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記魚が、シクリッド科の一員である、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記シクリッド科の一員が、ティラピアである、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
少なくとも２つの容器を含むキットオブパーツであって、それにより少なくとも一方の容器が動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含み、そして、少なくとも一方の容器が油性アジュバントを含む、キットオブパーツ。
【請求項１９】
動物を免疫化する方法であって、免疫学的有効量の、動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および油性アジュバントを、前記動物へ投与することを含む、方法。
【請求項２０】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８のワクチンを、前記動物に投与することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記動物が魚であり、そして、動物病原体を由来とするコードされた抗原が魚病原体を由来とする抗原である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記魚がシクリッド科の一員であり、そして、魚病原体を由来とするコードされた抗原が、シクリッド科の一員である魚の病原体を由来とする抗原である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記シクリッド科の一員がティラピアであり、そして、シクリッド科の魚の病原体を由来とするコードされた抗原が、ティラピアの病原体を由来とする抗原である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記動物が哺乳動物であり、そして、動物病原体を由来とするコードされた抗原が、哺乳動物の病原体を由来とする抗原である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳動物がブタであり、そして、哺乳動物の病原体を由来とする抗原が、ブタの病原体を由来とする抗原である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記動物が鳥であり、そして、動物病原体を由来とするコードされた抗原が、鳥の病原体を由来とする抗原である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記鳥がニワトリであり、そして、鳥の病原体を由来とするコードされた抗原が、ニワトリの病原体を由来とする抗原である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および前記油性アジュバントが、同時使用または並行使用により、標的動物の身体内または身体上に投与される、請求項１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７のワクチンを製造するための方法であって、該方法は、動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と油性アジュバントとを混合する工程を含む、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７のワクチンを製造するための方法。
【請求項３０】
動物病原体により引き起こされる感染症または疾患に対する動物の防御に使用するための、動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子であって、ここで、前記アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、油性アジュバントとの同時使用または並行使用により標的動物の身体内または身体上に投与される、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子。
【請求項３１】
動物病原体により引き起こされる感染症または疾患に対する動物の防御用のワクチンを製造するための、動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の使用であって、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の油性アジュバントとの同時使用または並行使用を含む、使用。
【請求項３２】
請求項１８に定義されるキットオブパーツの構成要素を製造するための、動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の使用であって、それにより、前記キットは、キットの構成要素の同時使用または並行使用による、動物病原体により引き起こされる感染症または疾患に対する動物の防御用である、使用。
【請求項３３】
動物病原体により引き起こされる感染症または疾患に対する動物の防御用の、動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の使用であって、ここで、前記使用は、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の油性アジュバントとの同時使用または並行使用を含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルファウイルス−レプリコンＲＮＡ粒子および油性アジュバントを使用した動物病原体に対するワクチン接種に関する。ワクチン、ならびに、レプリコン粒子および油性アジュバントを含むキットオブパーツに関する。また、ワクチンとそのキットの構成要素を作製および使用する方法および使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
動物病原体から防御する目的で、ベクターに基づく多くの戦略がワクチンのために長年にわたり採用されてきた。こうしたベクター戦略の１つには、アルファウイルス由来のレプリコンＲＮＡ粒子（ＲＰ）の使用［Ｖａｎｄｅｒ  Ｖｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｉｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．１３（１）：１−９（２０１２）ｄｏｉ：１０．１０１７／Ｓ１４６６２５２３１２００００１１、Ｋａｍｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ  ７）：１７２３−１７２７（２０１０）］を含む。これは、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥ）［Ｐｕｓｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９：３８９−４０１（１９９７）］、シンドビスウイルス［Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：６４３９−６４４６（１９９３）］およびセムリキフォレストウイルス［Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ  ａｎｄ  Ｇａｒｏｆｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３５６−３６１（１９９１）］を含む、いくつかの異なるアルファウイルスから開発されたものである。標的のヒトまたは動物細胞が感染した後、レプリコン粒子によりコードされた病原性抗原が発現される。結果は、発現した抗原に対する防御抗体が誘導される。ＲＰは、いくつかの伝統的なワクチン製剤と比較すると、魅力的な安全性および有効な特性を有する［Ｖａｎｄｅｒ  Ｖｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｉｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．１３（１）：１−９（２０１２）］。ＲＰプラットフォームは、いくつかのＵＳＤＡにより認可されたワクチンを基にしており、これにはブタ流行性下痢ワクチン、ＲＮＡ粒子（製品コード１９Ｕ５Ｐ１）、ブタインフルエンザワクチン、ＲＮＡ（製品コード１９Ａ５Ｄ０）、鳥インフルエンザワクチン、ＲＮＡ（製品コード１９Ｏ５Ｄ０）および医療用薬品、ＲＮＡ粒子（製品コード９ＰＰ０００）を含む。
【０００３】
アルファウイルス由来のレプリコンＲＮＡ粒子は、アルファウイルス構造タンパク質遺伝子を欠損しているが、細胞質ＲＮＡの自己増幅に必要な複製要素および高度活性２６Ｓアルファウイルスのサブゲノムプロモータにより駆動される、挿入された異種核酸の発現を維持する。したがって、ＲＰは単一サイクルの感染性粒子であり、構造タンパク質遺伝子が欠如しているため複製に欠陥がある［Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ６：２３９２−２４１５（２０１４）］。このため、レプリコン粒子のパッケージングおよび産生に必要な構造タンパク質は、ＲＰを産生するために適切な宿主細胞中にて異なる分子間に提供されなければならない［Ｖａｊｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８２：６１７−６２７（２００４）を参照されたい］。構造タンパク質は、一般的に、レプリコンＲＮＡおよび構造タンパク質をコードした１種以上の「ヘルパー」ＲＮＡを、一過性で同時トランスフェクションすることにより提供される。代替的には、ＲＰは、１種以上のＤＮＡ発現カセットより構成的または一過性にウイルス性構造タンパク質を発現する、パッケージング細胞株から産生され得る。このようにして、レプリコン粒子の産生物は、得られるＲＰゲノム内に構造タンパク質を含まないため、ベクターの複製欠陥性質を維持する［Ｐｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１０４：１８１−１８５（２０００）］。こうした複製欠陥があるアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、標的となるヒトまたは動物の免疫化に使用する際に、インビボで防御免疫応答を誘導する。例えば、ＶＥＥを基とするアルファウイルスベクターは、マウスおよびそれよりも大きな動物の全身免疫化の後、強力な粘膜および全身免疫応答を誘発する［Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ  ５３：２０９−２１１（２００２）］。
【０００４】
アジュバントは、標的のヒトまたは動物の免疫系に対し、非特異的な刺激を提供することが可能な既知の化合物である。標準的なアジュバントの使用は、不活化またはサブユニット抗原を基とするワクチン中においてである。様々なアジュバントの種類および組成物が存在し：例えば、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩、リポソーム、グルカン、アルギネート、細胞壁成分のような細菌性成分、鉱油または非鉱油、非イオン性ブロックポリマーのような合成アジュバント、硫酸デキストランのようなポリアミン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（商標）、ピランおよびＱｕｉｌ  Ａ（商標）、Ｑ−ｖａｃ（商標）のようなサポニンである。ＩＳＣＯＭ（商標）においては、サポニンおよびワクチン成分が組み合わされていてよい。
【０００５】
更には、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシンのようなペプチドが、多くの場合アジュバントとして使用されている。同様に、ＩＳＡ（商標）組成物（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）のような組合せ製品が使用されている。
【０００６】
アジュバントおよびその使用と効果に関するハンドブックは、“Ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ”（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．４２，Ｄ．Ｏ’Ｈａｇａｎ  ｅｄ．，２０００，Ｈｕｍａｎａ  ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，ＩＳＢＮ：０８９６０３７３５５）である。
【０００７】
本明細書における任意の参照の引用は、そのような参照が本出願の「先行技術」として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｖａｎｄｅｒ  Ｖｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｉｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．１３（１）：１−９（２０１２）ｄｏｉ：１０．１０１７／Ｓ１４６６２５２３１２００００１１
【非特許文献２】Ｋａｍｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ  ７）：１７２３−１７２７（２０１０）
【非特許文献３】Ｐｕｓｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９：３８９−４０１（１９９７）
【非特許文献４】Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：６４３９−６４４６（１９９３）
【非特許文献５】Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ  ａｎｄ  Ｇａｒｏｆｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３５６−３６１（１９９１）
【非特許文献６】Ｖａｎｄｅｒ  Ｖｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｉｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．１３（１）：１−９（２０１２）
【非特許文献７】Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ６：２３９２−２４１５（２０１４）
【非特許文献８】Ｖａｊｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８２：６１７−６２７（２００４）
【非特許文献９】Ｐｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１０４：１８１−１８５（２０００）
【非特許文献１０】Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ  ５３：２０９−２１１（２００２）
【非特許文献１１】“Ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ”（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．４２，Ｄ．Ｏ’Ｈａｇａｎ  ｅｄ．，２０００，Ｈｕｍａｎａ  ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，ＩＳＢＮ：０８９６０３７３５５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、動物病原体を由来とする抗原をコードしている、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含むワクチンを提供し、ここで、該ワクチンは、油性アジュバントをも含む。
【００１０】
本発明のワクチンの一実施形態では、油性アジュバントは、鉱油および非鉱油から選択される少なくとも１種の油を含む。
【００１１】
本発明のワクチンの一実施形態では、油性アジュバントは鉱油を含み、好ましくは、鉱油は流動パラフィン油である。
【００１２】
本発明のワクチンの一実施形態では、油性アジュバントは非鉱油を含み、好ましくは、非鉱油は、合成油、半合成油、動物油および植物油から選択される。より好ましくは、非鉱油は、スクアラン、スクアレン、トコフェロールおよび植物油から選択される。一実施形態では、トコフェロールは、アルファ−トコフェロールであり、より好ましくは、アルファ−トコフェロールは、ビタミンＥおよびビタミンＥ−アセテートから選択される。一実施形態では、植物油はオレアートであり、より好ましくはエチル−オレアートである。
【００１３】
より好ましくは、非鉱油はスクアランである。
【００１４】
本発明のワクチンの好ましい実施形態では、油性アジュバントは、２種以上の油を含む。
【００１５】
２種以上の油を含む油性アジュバントの一実施形態では、アジュバントは鉱油および１種以上の非鉱油を含む。より好ましくは、油性アジュバントは、鉱油として流動パラフィン油と、スクアラン、スクアレン、ビタミンＥ、ビタミンＥ−アセテート、オレアートおよびエチル−オレアートから選択される１種以上の非鉱油と、を含む。一層より好ましくは、油性アジュバントは、流動パラフィン油およびビタミンＥ−アセテートを含む。最も好ましくは、油性アジュバントは、ＸＳｏｌｖｅ（商標）である。
【００１６】
２種以上の油を含む油性アジュバントの代替的実施形態では、アジュバントは、２種以上の非鉱油を含む。好ましくは、油性アジュバントは、スクアラン、スクアレン、ビタミンＥ、ビタミンＥ−アセテート、オレアートおよびエチル−オレアートから選択される２種以上の非鉱油を含む。一層より好ましくは、油性アジュバントは、スクアランおよびビタミンＥ−アセテートを含む。最も好ましくは、油性アジュバントはＳＶＥＡ（商標）である。
【００１７】
本発明のワクチンの一実施形態では、油性アジュバント中の鉱油量は、油性アジュバントの１〜７０％ｖ／ｖである。好ましくは、油性アジュバントは、油性アジュバントの５〜６０％ｖ／ｖの量の鉱油を含む。
【００１８】
本発明のワクチンの一実施形態では、非鉱油の総量は、油性アジュバントの０．１〜３０％ｗ／ｖである。好ましくは、油性アジュバントは、油性アジュバントの０．５〜２５％ｖ／ｖの非鉱油の総量を含む。
【００１９】
一実施形態では、非鉱油がスクアランを含むとき、油性アジュバントは、油性アジュバントの０．５〜３０％ｗ／ｖでスクアランを含み；より好ましくは、油性アジュバントは、１〜２５％ｗ／ｖ、２〜１５％ｗ／ｖでスクアランを含むか、または油性アジュバントの３〜１０％ｗ／ｖでもスクアランを含む。
【００２０】
代替的にはまたは追加的には、非鉱油がビタミンＥ−アセテートを含む場合の一実施形態では、油性アジュバントは、油性アジュバントの０．１〜３０％ｗ／ｖでビタミンＥ−アセテートを含み、より好ましくは、油性アジュバントは０．５〜２０％ｗ／ｖ、１〜１６％ｗ／ｖでビタミンＥ−アセテートを含み、または油性アジュバントの２〜１０％ｗ／ｖでもビタミンＥ−アセテートを含む。
【００２１】
本発明のワクチンの一実施形態では、油性アジュバントは、油相と水相のエマルジョンとして処方されている。好ましくは、油性アジュバントは、水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンとして処方されている。
【００２２】
一実施形態では、水相は、薬学的に許容される品質の水を含む。
【００２３】
一実施形態では、油性アジュバントのエマルジョンは、マイクロエマルジョンとして処方されており、ここで、内部相の液滴は１マイクロメートル未満である。好ましくは、マイクロエマルジョンは、Ｏ／Ｗエマルジョンであり、より好ましくは、Ｏ／Ｗマイクロエマルジョンは、高エネルギー均質化を使用して調製され、更により好ましくは、マイクロフルイダイゼーションの方法によって調製される。
【００２４】
本発明のワクチンの一実施形態では、油性アジュバントのエマルジョンは乳化剤を含み、好ましくは、乳化剤はポリソルベートを含み、より好ましくは、乳化剤はポリソルベート８０を含む。
【００２５】
一実施形態では、本発明のワクチンは油性アジュバントのエマルジョンを含み、好ましくは、ワクチンは、Ｏ／Ｗエマルジョンとして処方された油性アジュバントを含む。
【００２６】
本発明のワクチンの一実施形態では、ワクチンは水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンとして処方されている。
【００２７】
本発明のワクチンの一実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。更に特定の実施形態では、ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＴＣ−８３ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。更に他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、セムリキフォレスト（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルスアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。
【００２８】
本発明のワクチンの一実施形態では、動物病原体を由来とするコードされた抗原向けには、動物病原体は、ウイルス、細菌、寄生虫、原虫、真菌、リケッチアおよびプリオンから選択される。より好ましくは、コードされた動物病原体を由来とする抗原は、ウイルスまたは細菌由来である抗原である。最も好ましくは、抗原はウイルスに由来する。
【００２９】
本発明のワクチンの一実施形態では、ＲＰは、動物病原体を由来とする抗原をコードし、これにより、動物は、獣医科学に関連する動物である。好ましくは、動物は、魚、鳥および哺乳動物から選択される。より好ましくは、動物は、野生動物、家畜動物またはペット用動物である。家畜動物は、魚、鳥、ブタまたは反芻動物であり；好ましくは、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）はブタ（ｐｉｇ）であり；好ましくは、鳥は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラまたはダチョウであり；好ましくは、反芻動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、ラクダまたはシカであり；好ましくは、魚は、硬骨魚類でヒレを有するものであり、より好ましくは、サケ科の魚またはシクリッドの魚（すなわち、シクリッド科の一員）である。サケ科の魚は、タイセイヨウサケ、スチールヘッドサケ、マスノスケ、ギンザケ、カラフトマス、シロサケおよびベニザケ、ニジマス、カワマス、レイクトラウトおよびブラウントラウトならびにイワナから好ましくは選択される。シクリッドの魚は、好ましくはティラピアである。ペット用動物は好ましくは、ネコ、イヌおよびウマから選択される。より好ましくは、動物はティラピア、ニワトリまたはブタである。
【００３０】
本発明のワクチンの一実施形態では、本発明の動物病原体を由来とする抗原をコードしている遺伝子のヌクレオチド配列は、ワクチン用に標的動物種の細胞内で発現する目的で最適化されている。一実施形態では、ヌクレオチド配列最適化はコドン最適化である。一実施形態では、ヌクレオチド配列最適化は、ＲＮＡ転写の二次構造を最適化するものである。
【００３１】
好ましい実施形態では、本発明の動物病原体を由来とする抗原をコードしている遺伝子のヌクレオチド配列最適化は、コドン使用法およびＲＮＡ転写の二次構造の両方に関連する。好ましくは、ヌクレオチド配列最適化は、米国特許第７，５６１，９７２号、米国特許第７，５６１，９７３号、米国特許第７，８０５，２５２号および米国特許第８，１２６，６５３号のうち１つ以上に記載された手順に従って行われる。
【００３２】
本発明のワクチンの詳細な好ましい実施形態では、油性アジュバントは鉱油および非鉱油を含み、ワクチンはＯ／Ｗエマルジョンとして処方され、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子はＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子であり、動物病原体の抗原はウイルス抗原であり、そして、ウイルスはブタ病原体である。
【００３３】
本発明のワクチンの好ましい実施形態では、動物病原体を由来とするコードされた抗原は、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、またはそのようなＨＡタンパク質もしくはＮＡタンパク質の抗原断片である。ＨＡおよび／またはＮＡタンパク質は、好ましくはインフルエンザウイルスＡ型を由来とし、より好ましくはブタインフルエンザＡ型ウイルスまたはＰＥＤＶを由来とする。
【００３４】
本発明は、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む多価ワクチンを更に提供し、ここで、ワクチンは、抗原をコードしている２つ以上のＲＰを含むか、または１つまたは２つ以上の本発明での抗原をそれぞれコードしている１つ以上のＲＰを含む。
【００３５】
本発明のワクチンは、免疫学的有効量の本発明用のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。一実施形態では、ワクチンは、約１×１０＾３〜約１×１０＾１１のＲＰを含む。より具体的な実施形態では、ワクチンは、約１×１０＾４〜約１×１０＾１０のＲＰを含む。更により具体的な実施形態では、ワクチンは、約１×１０＾５〜約１×１０＾９のＲＰを含む。
【００３６】
本発明のワクチンは、免疫学的有効量の本発明用の油性アジュバントを含む。一実施形態では、ワクチンは、ワクチンの約１０％〜９０％ｖ／ｖの量の油性アジュバントを含む。より好ましくは、ワクチンは、ワクチンの約２０％〜８０％ｖ／ｖ、３０〜７０％ｖ／ｖまたは４０〜６０％ｖ／ｖでさえある量の、油性アジュバントを含む。最も好ましくは、ワクチンは、ワクチンの約５０％ｖ／ｖの量の油性アジュバントを含む。
【００３７】
具体的な実施形態では、本発明のワクチンは、動物用量あたり０．０５ｍＬ〜５ｍＬの体積で投与される。より具体的な実施形態では、動物あたり投与される用量は、０．１ｍＬ〜２ｍＬである。一層より具体的な実施形態では、投与される用量は、０．２ｍＬ〜１．５ｍＬである。更により具体的な実施形態では、投与される用量は、０．３〜１．０ｍＬである。一層より具体的な実施形態では、動物あたり投与される用量は、０．４ｍＬ〜０．８ｍＬである。
【００３８】
本発明のワクチンの一実施形態では、ワクチンは更なるアジュバントを含む。好ましくは、更なるアジュバントは、細菌細胞壁成分、サイトカインおよび非メチル化ＣｐＧを含む免疫刺激性核酸の群から選択される。一実施形態では、免疫刺激性核酸は、国際公開第２０１２／０８９８００号（Ｘ４ファミリー）、国際公開第２０１２／１６０１８３号（Ｘ４３ファミリー）および国際公開第２０１２／１６０１８４号（Ｘ２３ファミリー）から１種以上選択される。
【００３９】
本発明のワクチンの一実施形態では、ワクチンは、動物病原体の更なる抗原を含む。好ましい実施形態では、更なる抗原は、弱毒化生微生物、不活化微生物および微生物のサブユニットの群から選択される。
【００４０】
更なる態様では、本発明はキットオブパーツを提供し、該キットは少なくとも２つの容器を備え、これにより、少なくとも一方の容器は、動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含み、少なくとも一方の容器は、油性アジュバントを含む。少なくとも２つの容器は、免疫学的有効量で、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子または油性アジュバントをそれぞれ含む。
【００４１】
本発明のキットオブパーツの好ましい実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、コードされた抗原、動物病原体および油性アジュバントの１つ以上またはその全ては、本明細書に記載されたいずれか１つまたは複数の実施形態にて定義された通りである。
【００４２】
好ましい実施形態では、ＲＰを含む少なくとも一方の容器は、凍結乾燥物としてＲＰを含む。
【００４３】
代替的な実施形態では、ＲＰを含む少なくとも一方の容器は、水溶液中にＲＰを含み、該水溶液は好ましくは緩衝液を含み、該水溶液は好ましくは冷却状態または凍結状態を保っている。一実施形態では、水溶液は再構成したＲＰ溶液であり、これは、ＲＰ凍結乾燥物と適切な水性希釈液とを混合することにより生成される。
【００４４】
少なくとも一方の容器が凍結乾燥物としてＲＰを含む一実施形態では、本発明でのキットオブパーツは、凍結乾燥されたＲＰを再構成するための適切な希釈液を含有する更なる容器を含むことができる。好ましい実施形態では、希釈液は水溶液であり、好ましくは緩衝液および／または安定剤および薬学的に許容される品質の水を含む。
【００４５】
好ましい実施形態では、油性アジュバントを含む容器は、油相および水相のエマルジョンとして処方された油性アジュバントを含む。好ましくは、エマルジョンは水中油型エマルジョンである。
【００４６】
キットオブパーツの一実施形態では、キットは、キットおよび／またはその構成部分の使用に関する指示書を含む。好ましい実施形態では、使用に関する指示書は、１つ以上のキット構成部分上にもしくはそれに付属して提供され；または、例えば閲覧可能である情報またはキットの製造元もしくはキット販売元によるインターネットウェブサイトからダウンロード可能な情報のような電子形態での指示を参照することにより提供される。
【００４７】
一実施形態では、キットオブパーツは少なくとも２つの容器を含む箱と、箱とともにまたは箱内に含まれている情報媒体（例えば、カードまたはリーフレット）に表示された使用に関する指示書である。
【００４８】
キットオブパーツの一実施形態では、キットはまた、本発明の免疫化の方法に使用するため、例えばインターネットのウェブサイト上の、構成部分（商用に関連する）の提供であってよい。
【００４９】
キットオブパーツの一実施形態では、１つ以上の容器は、本明細書に記載されるような更なるアジュバントを含んでよく、更にはまたは代替的には、１つ以上の容器は、本明細書に記載されるような動物病原体の更なる抗原を含んでよい。
【００５０】
動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコンおよび油性アジュバントは、両方とも本明細書に定義されているように、標的動物に投与することができる。こうした投与により、動物病原体により引き起こされる感染症または疾患に対し、当該動物中での効果的な免疫防御が誘導されることになる。免疫学的な動物用医薬品を関連使用するため、例えば欧州医薬品庁動物用医薬品委員会（ＥＭＡ−ＣＶＭＰ）のガイドラインに沿って投与を実施することができる。
【００５１】
したがって、更なる態様では、本発明は、免疫学的有効量の、動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および油性アジュバントを、動物へと投与することを含む、動物を免疫化する方法を提供する。
【００５２】
本発明の動物を免疫化する方法の好ましい実施形態では、該方法は動物に本発明のワクチンを投与することを含む。
【００５３】
本発明の動物を免疫化する方法の好ましい実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、コードされた抗原、動物病原体および油性アジュバントのうちの１つ以上または全ては、本明細書に記載されたいずれか１つ以上の実施形態にて定義された通りである。
【００５４】
本発明の動物を免疫化する方法の好ましい実施形態では、動物病原体を由来とするコードされた抗原は、魚、シクリッド科の一員、ティラピア、哺乳動物、鳥およびニワトリからの病原体を由来とする抗原である。
【００５５】
本発明の動物を免疫化する方法の一実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および油性アジュバントは、同時使用または並行使用により、標的動物の身体内または身体上に投与される。
【００５６】
本発明の動物を免疫化する方法の好ましい実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および油性アジュバントは、同時使用（すなわち、単一組成物として）により、標的動物の身体内または身体上に投与される。
【００５７】
好ましい実施形態では、単一組成物は本発明のワクチンである。
【００５８】
好ましい実施形態では、単一組成物は、両方とも本発明用に記載されているように、ＲＰを含む組成物と油性アジュバントを含む組成物とを混合することにより、より好ましくは、本発明のキットオブパーツの容器の内容物を混合することにより、更により好ましくは、ＲＰを含む水溶液と、油性アジュバントのＯ／Ｗエマルジョンを含む組成物とを混合することにより、標的動物へと投与する直前に調製される。代替的な更により好ましい実施形態では、両方とも本発明向けに本明細書に記載されているように、油性アジュバントのＯ／Ｗエマルジョンを用いてＲＰ凍結乾燥物を再構成することにより、単一組成物が調製される。効果的には、単一組成物の調製により本発明のワクチンが生成される。
【００５９】
好ましくは、「標的動物へと投与する直前」とは、望ましい順に、標的動物へと投与する２４時間以内前、より好ましくは１６時間以内前、１２時間以内前、８時間以内前、４時間以内前であり、または標的動物へと投与する２時間以内前でさえある。
【００６０】
本発明の動物を免疫化する方法の代替的に好ましい実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および油性アジュバントは、並行使用（すなわち、位置および／または時間を分けて投与されるような、別個の組成物内に含まれるものとして）により、標的動物の身体内または身体上に投与される。
【００６１】
好ましい実施形態では、並行使用は、本発明のキットオブパーツ内に含まれるようなアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および油性アジュバントを、位置および／時間を分けて、標的動物の身体内または身体上へと投与することを含む。
【００６２】
本発明の並行使用の好ましい実施形態では、別個の組成物は、同一のまたは異なる投与経路により、標的動物の身体内または身体上の別個の部位へと、互いに限られた時間内で投与され；好ましくは、「限られた時間」は、望ましい順に、互いに２週間以内、より好ましくは互いに１週間以内、更により好ましくは１日以内、１６時間以内、１２時間以内、８時間以内、４時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分以内であり、または互いに１０分以内でさえある。最も好ましくは、並行使用による投与は、実質的には同時での使用である。
【００６３】
本発明の並行使用の好ましい実施形態では、別個の組成物は、別個の部位にて、同一のまたは異なる投与経路により標的動物の身体内または身体上へと、互いに限られた時間内で投与される。本発明では、別個の投与部位は、望ましい順に、互いに少なくとも１ｃｍ分、好ましくは少なくとも２ｃｍ分、少なくとも５ｃｍ分、少なくとも１０ｃｍ分または互いに少なくとも２５ｃｍ分でさえも、動物の身体上または身体内で分けられている。
【００６４】
本発明の並行使用の好ましい実施形態では、別個の組成物は、互いに限られた時間内に、同一のまたは異なる投与経路により、標的動物の身体内または身体上の実質的に同一の部位で標的動物の身体内または身体上で、ただし、投与部位で組成物同士が混合するのを防止するため、時間は互いに十分に離れて投与される。本発明では、混合を防止するために時間を十分離すということは、望ましい順に、互いに２時間以内であってはならず、好ましくは６時間以内であってはならず、１２時間以内であってはならず、１日以内であってはならず、２日以内であってはならず、または互いに１週間以内でさえあってはならない。
【００６５】
本発明の動物を免疫化する方法の一実施形態では、標的動物の身体内または身体上への投与は、非経口投与によって実施される。代替的な実施形態では、投与は、粘膜投与の方法による。一層代替的な実施形態では、ワクチンは局所投与の方法により投与される。
【００６６】
投与の好ましい方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、浸漬およびスプレーから選択される。皮内投与方法は、好ましくは針を用いない投与によるものであり、より好ましくはＩＤＡＬ（登録商標）デバイス（液体の皮内適用（Ｉｎｔｒａ−Ｄｅｒｍａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｑｕｉｄｓ））を使用する。
【００６７】
本発明のワクチン投与の一実施形態では、ワクチンはプライマーワクチンおよび／またはブースターワクチンとして投与される。特定の実施形態では、本発明のワクチンは、その後のブースター投与を必要としない１回（ワンショット）のワクチン接種として投与される。特定の実施形態では、プライマーワクチンおよびブースターワクチンの両方を投与する場合、プライマーワクチンおよびブースターワクチンは同一経路により投与される。代替的な実施形態では、プライマーワクチンおよびブースターワクチンの両方を投与する場合、プライマーワクチンの投与がある１つの経路によって実施され、ブースターワクチンはそれとは別の経路により実施される。
【００６８】
本発明のワクチン投与の一実施形態では、ワクチンはブタへと投与され、プライマーワクチンおよびブースターワクチンは、両方とも皮内注射により投与される。代替的な実施形態では、プライマーワクチンは皮内注射により投与され、ブースターワクチンは別の経路により投与される。
【００６９】
更なる態様では、本発明は、本発明のワクチンを製造するための方法を提供し、該方法は、動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、油性アジュバントとを混合する工程を含む。アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および油性アジュバントの両方は、免疫学的有効量で混合されている。
【００７０】
本発明のワクチンを製造するための方法の好ましい実施形態では、ワクチン、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、コードされた抗原、動物病原体および油性アジュバントのうち１つ以上または全ては、本明細書に記載されたいずれか１以上の実施形態にて定義された通りである。
【００７１】
本発明のワクチンを製造するための方法の一実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、水溶液中に含まれる。
【００７２】
本発明のワクチンを製造するための方法の好ましい実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、それぞれアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む水溶液、および油性アジュバントは、望ましい順に、１：１０〜１０：１の体積比、より好ましくは１：５〜５：１の体積比、１：４〜４：１、１：３〜３：１または１：２〜２：１でさえあってもその体積比で混合されるように混合が実施される。最も好ましくは、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、それぞれアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む水溶液、および油性アジュバントは、約１：１の体積比で混合される。
【００７３】
一実施形態では、本発明のワクチンを製造するための方法は、本発明のキットオブパーツの容器の内容物を混合することを含む。
【００７４】
本発明のワクチンを製造するための方法の一実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、それぞれアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む水溶液は、本発明のために定義された病原体の抗原を含む別のＯ／Ｗエマルジョン内に含まれた油性アジュバントと混合される。好ましくは、他のＯ／Ｗエマルジョンは、不活化されたウイルスおよび／または細菌病原体を含むワクチンである。より好ましい実施形態では、ＳＩＶまたはＰＥＤＶ由来の抗原をコードしているＲＰは、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）および／またはＣｉｒｃｕｍｖｅｎｔ（登録商標）ＰＣＶＭのようなマイコプラズマ・ハイオニューモニエを含むＯ／Ｗエマルジョンワクチンを用いて混合される。
【００７５】
更なる態様では、本発明は、動物病原体により引き起こされる感染症または疾患に対する動物の防御に使用するための、動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を提供し、ここで、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、油性アジュバントとともに、同時使用または並行使用において標的動物の身体内または身体上に投与される。アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および油性アジュバントの両方は、動物の防御に使用する際、免疫学的有効量で含まれる。
【００７６】
本発明の防御に使用するためのアルファウイルスＲＮＡレプリコンの好ましい実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、コードされた抗原、動物病原体および油性アジュバントのうちの１つ以上または全ては、本明細書に記載されたいずれか１以上の実施形態にて定義された通りである。
【００７７】
本発明の防御に使用するためのアルファウイルスＲＮＡレプリコンの好ましい実施形態では、使用は、本発明のワクチンの使用を含む。
【００７８】
本発明の防御に使用するためのアルファウイルスＲＮＡレプリコンの一実施形態では、防御は、異なる年齢および種類の標的動物に有効である。
【００７９】
一実施形態では、使用は若年動物の防御に対してのものである。好ましくは、若年動物は、週齢３週間までのブタ、または週齢１週間までのニワトリ、または月齢１４ヶ月までのサケ科の魚である。
【００８０】
更なる実施形態では、使用は青年期の動物の防御のためのものである。好ましくは、青年期の動物は、週齢３週間〜月齢８ヶ月のブタ、または週齢１〜２２週間のニワトリ、または月齢１４〜２４ヶ月のサケ科の魚である。
【００８１】
更なる実施形態では、使用は成体動物の防御のためのものである。好ましくは、成体動物は月齢８ヶ月以上のブタ、または週齢２２週間以上のニワトリ、または月齢２４ヶ月以上のサケ科の魚である。
【００８２】
ティラピアについて本発明の防御のために使用する好ましい期間は、通常は年齢ではなく、体重全体の範囲を表示することによって表され；薬浴処理によるワクチン接種は、好ましくはティラピアの重量が０．５ｇ〜５ｇの場合に行われる。非経口注射によるワクチン接種は、好ましくはティラピアの重量が１０ｇ〜１００ｇの場合に行われ、より好ましくはティラピアの重量が２０ｇ〜２５ｇの場合に行われる。
【００８３】
本発明の防御において使用するためのアルファウイルスＲＮＡレプリコンの一実施形態では、標的動物は、動物病原体にとっての抗体に対してまたは動物病原体に対して、動物病原体を由来とする抗原それぞれのいずれかに対して、血清反応が陽性または陰性であり得る。
【００８４】
本発明の防御において使用するためのアルファウイルスＲＮＡレプリコンの一実施形態では、標的動物は、ＭＤＡ（ｍａｔｅｒｎａｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：母体由来抗体）に対して陽性の動物であり、これにより、ＭＤＡは、防御が意図されている対象の動物病原体と反応する。より好ましくは、ＭＤＡに対して陽性の動物は、鳥、反芻動物またはブタである。一層より好ましくは、ＭＤＡに対して陽性の動物はブタである。
【００８５】
本発明の防御において使用するためのアルファウイルスＲＮＡレプリコンの一実施形態では、標的動物は妊娠中の動物である。より好ましくは妊娠中の動物は、反芻動物またはブタである。一層より好ましくは妊娠中の動物は、ブタである。
【００８６】
本発明の防御において使用するためのアルファウイルスＲＮＡレプリコンの一実施形態では、防御は畜産用動物のためである。好ましくは、畜産用動物は、肥育用に飼育されたブタであるか、またはブロイラーもしくは卵用ニワトリ、または乳もしくは肉の生産用に飼育された反芻動物、またはサケ、またはティラピアである。
【００８７】
更なる実施形態では、防御は個体群を繁殖させるための動物のためである。好ましくは、個体群を繁殖させるための動物は、畜産用動物の父母系統または祖父母系統である。
【００８８】
更なる態様では、本発明は、動物病原体により引き起こされる感染症または疾患に対する動物の防御用のワクチンの製造のための、動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の使用を提供し、前記アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の油性アジュバントとの同時使用または並行使用を含む。アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および油性アジュバントの両方は、免疫学的有効量で使用されている。
【００８９】
本発明のワクチンを製造するための使用の好ましい実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、コードされた抗原、動物病原体および油性アジュバントのうちの１以上または全てが、本明細書に記載されたいずれか１以上の実施形態にて定義された通りである。
【００９０】
更なる態様では、本発明は、本発明のための本明細書で定義されるキットオブパーツの構成要素の製造のための動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の使用を提供し、それによりキットは、前記キットの構成要素を同時使用または並行使用することによって、動物病原体により引き起こされる感染症または疾患に対して動物を防御するためのものである。アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および油性アジュバントの両方は、免疫学的有効量で使用されている。
【００９１】
本発明のキットオブパーツの構成要素の製造のための使用の好ましい実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、コードされた抗原、動物病原体、油性アジュバントおよびキットオブパーツのうちの１つ以上またはその全ては、本明細書に記載されたいずれか１つまたは複数の実施形態にて定義された通りである。
【００９２】
更なる態様では、本発明は、動物病原体により引き起こされる感染症または疾患に対する動物の防御のための動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の使用を提供し、ここで、該使用は、当該アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の油性アジュバントとの同時使用または並行使用を含む。アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および油性アジュバントの両方は、免疫学的有効量で使用されている。
【００９３】
本発明の動物の防御のための使用の好ましい実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、コードされた抗原、動物病原体および油性アジュバントのうちの１つ以上またはその全てが、本明細書に記載されたいずれか１以上の実施形態にて定義された通りである。
【００９４】
本発明のこうした態様および他の態様は、以下の図および詳細な説明を参照することにより、更に良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１Ａ】実施例２の結果であり、肺病変を示す。
【図１Ｂ】実施例２の結果であり、肺病変を示す。
【図１Ｃ】実施例２の結果であり、鼻排出を示す。
【図１Ｄ】実施例２の結果であり、鼻排出を示す。
【図１Ｅ】実施例２の結果であり、ＮＩ力価を示す。
【図１Ｆ】実施例２の結果であり、ＮＩ力価を示す。
【図２Ａ】実施例２の結果であり、ＨＩ力価の結果を示す（図は左から右の順に番号を割り振っており、上の列の後、下の列となる）。
【図２Ｂ】実施例２の結果であり、ＨＩ力価の結果を示す（図は左から右の順に番号を割り振っており、上の列の後、下の列となる）。
【図２Ｃ】実施例２の結果であり、ＨＩ力価の結果を示す（図は左から右の順に番号を割り振っており、上の列の後、下の列となる）。
【図２Ｄ】実施例２の結果であり、ＨＩ力価の結果を示す（図は左から右の順に番号を割り振っており、上の列の後、下の列となる）。
【図２Ｅ】実施例２の結果であり、ＨＩ力価の結果を示す（図は左から右の順に番号を割り振っており、上の列の後、下の列となる）。
【図２Ｆ】実施例２の結果であり、ＨＩ力価の結果を示す（図は左から右の順に番号を割り振っており、上の列の後、下の列となる）。
【図３】実施例３の多価ＮＡ−ＲＰでワクチン接種されたブタにおけるＮ１−古典的抗原に対する血清抗体応答である。実施例３に記載されたようなワクチン組成物のＮ１−古典的株に対して特異的である血清ノイラミニダーゼ抑制（ＮＩ）抗体応答が表されている。初回ワクチン接種（週齢３週）前、２回目のワクチン接種（週齢７週）前およびチャレンジ（週齢１０週）前に血清サンプルを収集した。
【図４】Ｈ１Ｎ１ウイルスによる感染後５日目の肉眼で確認できる肺病変スコアに関し、実施例３で試験したようなチャレンジ感染に対する４種混合ＮＡ−ＲＰワクチンの効果である。これは、実施例３にて記載されるワクチン接種組成物の投与およびＨ１−ガンマ−Ｎ１−古典的ウイルスによるチャレンジ感染後のブタの肺病変スコアを示す。
【図５】実施例８のＮＩ力価の結果である。図５は、標準偏差を含む経時的に測定された３つの時点におけるＮ１古典的ＮＡ抗原に対するＮＩ力価を表す。これは、他の３つのＮＡ種に対して測定されたＮＩ力価プロファイルを表している。
【図６】実施例８のＮＩ力価の結果である。図６は、２回目のワクチン接種後７日目時点における混合された４つのＮＡ種のグループ平均ＮＩ力価を表す。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
本発明は、動物病原体の１種以上の抗原をコードし、免疫学的有効量の、１種以上のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および油性アジュバントを含む、ワクチンを提供する。アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、標的であるヒトまたは動物の宿主細胞を感染させることができ、それらを含む遺伝子を発現させることができるという点で、生ウイルスと実質的に同様である。これはまた、ＲＰが細胞上で感染−滴定することにより一般的に定量化されるという事実によって証明される。したがって、こうしたＲＰは、薬学的に許容される担体中で一般的には有効なワクチンの単独の成分であり、生（弱毒化）ウイルスワクチンと同様のものである。非アジュバントＲＰを基とするいくつかのワクチンが開発されており、商品化されている。
【００９７】
アジュバントは、主に死菌またはサブユニットワクチン抗原とのみ組み合わせて使用される。更には、油性アジュバントは他のワクチン成分に対して極めて活動的であり得るため、これにより油性アジュバントは一般的には生ワクチンと結合されることはない。更に、アルファウイルスＲＮＡ  ＲＰのワクチンであって、特にＶＥＥアルファウイルスを基としたものは、後天的免疫応答と比較して、標的の先天的な免疫系からの、それら単独で既存の強力な抗ウイルス応答を誘導することが知られている。したがって、追加の免疫刺激といった任意の必要性を効果的に防ぐ。
【００９８】
それにも関わらず、驚くべきことに、油性アジュバントは、動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の免疫原性効果を著しく増強し得ることを見いだした。これは、水酸化アルミニウムのようなアルミニウムを基とするアジュバントとは対照的である。ＲＰおよび油性アジュバントを適用した場合、単一組成物中に組み合わされた際（すなわち同時使用）に、または、別個の組成物として投与した際（すなわち並行使用）の両方で、増強効果を得ることが可能であった。（油性）アジュバントなしの場合と比較した際、ＲＰおよび油性アジュバントを用いたワクチン接種では、ＲＰの最小有効用量を桁違いに減少させることが可能であるため、油性アジュバントによる効果増強の程度もまた予測できなかった。更に油性アジュバントを使用することにより、ＲＰワクチンを接種することによる免疫応答の期間を増加させることが可能であった。更には、油性アジュバントとＲＰを組み合わせることで、ＲＰ構成要素単独では全く免疫を誘導しない場合でも、優れた免疫応答を提供することが可能であった。
【００９９】
本発明をより完全に理解するために、以下の定義を提供する。
【０１００】
「ワクチン」とは、医学的効果を有する周知の組成物であり、免疫学的に活性な構成要素と、薬学的に許容される担体と、を含む。水溶液および／または油性アジュバントは、該ワクチンに対して「担体」として機能させることができる。本発明のワクチンにとって、「免疫学的に活性な構成要素」とは、動物病原体を由来とするコードされた抗原のことであり、これはＲＰを用いて送達かつ発現される。ワクチンは、ワクチン接種された標的動物の免疫系を刺激し、防御的な免疫学的応答を誘導する。応答は、動物の先天的免疫系および／または後天的免疫系に由来していてよく、細胞性型および／または体液性型であってよい。
【０１０１】
ワクチンは、例えば病原体の数を減少させ、または動物中もしくは動物上で病原体が複製する期間を短縮させ、感染もしくは侵入により引き起こされる病変の数、強度もしくは重症度を減少させることにより、ワクチン接種された動物内にて、その後に起こる感染または侵入による重症度を減少させることによる「感染症または疾患に対する」「防御」を提供する。更にはまたは結果的には、このような感染、侵入もしくは複製によって、またはその感染、侵入または複製に対する標的応答によって引き起こされ得る疾患による（臨床的な）症候を減少または改善させるという点でワクチンは効果的である。このような疾患および臨床的徴候に対する参照は、「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍａｎｕａｌ」（１０ｔｈ  ｅｄ．，２０１０，Ｃ．Ｍ．Ｋａｈｎ  ｅｄｔ．，ＩＳＢＮ：０９１１９１０９３Ｘ）である。こうしたワクチンは、口語的には、特定の病原体に「対する」ワクチンと呼ばれる。
【０１０２】
本明細書にて使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」のような変形）は、こうした要素または組み合わせが明示的に列挙されていない場合であっても、この用語が使用されるテキストの一部、段落、請求項などの範囲内であるかまたはその中に含まれる、全ての要素、および、本発明のために想定される任意の可能性のある組合せに言及し、そしてこうした任意の要素（類）または組合せの除外については言及しない。それゆえ、こうした任意のテキストの一部、段落、請求項などは、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」（またはその変形）が、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」のような用語に置換されるような１つ以上の実施形態にもまた関連している。
【０１０３】
本明細書にて使用される場合、用語「レプリコン」は、細胞培養物または動物宿主の中で親ウイルスを正常に増殖することが可能であるような１つ以上の要素（例えば、構造タンパク質に対するコード配列）が存在する場合、それらを欠損している修飾されたＲＮＡウイルスゲノムを指す。適切な細胞状況では、レプリコンは自身を増幅させ、１つ以上のサブゲノムのＲＮＡ種を産生することができる。
【０１０４】
本明細書にて使用される場合、「ＲＰ」と略された、用語「アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子」は、ウイルス性構造タンパク質中にパッケージングされた、例えばカプシドおよび糖タンパク質のアルファウイルス由来のＲＮＡレプリコンであり、例えばＰｕｓｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９（２）：３８９−４０１（１９９７）］により記載されているようなアルファウイルスから誘導されたものでもある。ＲＰは、適切な標的細胞を感染させ、その後挿入された異種遺伝子（類）を発現させるが、細胞培養物または動物宿主内では、（ヘルパープラスミドまたは類似成分なしでは）増殖させることができず、その理由は、レプリコンはアルファウイルスの構造成分（例えば、カプシドおよびウイルス糖タンパク質）をコードしないからである。
【０１０５】
説明に好都合であるために単数形の用語を使用することは、そのように制限することを意図するものでは決してない。そのため、例えば「アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子」への参照は、特に指示しない限り、こうした複数のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子への参照を含む。
【０１０６】
抗原を「コードしている」ＲＰは、ＲＰ中に含まれているそのタンパク質抗原に対する核酸の転写および／または核酸の翻訳を指し、発現しているタンパク質抗原を生じさせる。通常、タンパク質をコードしているこうした核酸は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であり、あまりにも早くタンパク質の翻訳を終結させ得るような、所望されない停止コドンが全く存在しないことを意味している。核酸は、完全なタンパク質をコードしている完全な遺伝子であってよく、または遺伝子断片であってよく、これらは、例えばタンパク質の成熟形態または分泌された形態のみをコードする、すなわち、「リーダー」、「アンカー」または「シグナル配列」を有さないタンパク質の一部をコードする。ヌクレオチド配列は、天然源のものまたは合成源のものであってよい。
【０１０７】
本発明のための抗原を発現する異種核酸配列の構築および操作は、クローニング、トランスフェクション、組換え、選択および増幅を含む周知の分子生物学的技術によって行うことができる。このような技術および他の技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」（２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．によるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＮＹ，２００３，ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ）、Ｃ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ＆Ｇ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒによる「ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」（ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０８７９６９６５４０）およびＪ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ａｎｄ  Ｄ．Ｓｔｉｒｌｉｎｇ（Ｈｕｍａｎａ  ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ：０８９６０３６４２１）による「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」のような標準的なテキストにてより詳細に説明されている。
【０１０８】
本発明では、「タンパク質」はアミノ酸の分子鎖である。タンパク質は、天然または成熟タンパク質、プレまたはプロタンパク質、またはタンパク質の一部であり得る。とりわけ、ペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドが、タンパク質の定義内に含まれている。
【０１０９】
本発明での「抗原」は、標的動物内での防御的な免疫学的応答を適正な環境内で誘導することができるタンパク質を指す。
【０１１０】
用語「を由来とする（ｏｒｉｇｉｎａｔｅ  ｆｒｏｍ）」、「を由来とする（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ  ｆｒｏｍ）」および「を由来としている（ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ）」は、所与のタンパク質抗原および天然にそれをコードする病原体または病原体の株に対し互換的に使用される。本明細書にて使用される場合、これらの用語は、修飾されていないおよび／または修飾された所与のタンパク質抗原のアミノ酸配列が、その病原体またはその病原体の株によってコードされていることを表す。病原体を由来とするタンパク質抗原に対する本発明の核酸構築物内のコード配列は、由来とする病原体または病原体の株（自然弱毒株も含む）内のそのタンパク質抗原の対応するコード配列に関連する発現されたタンパク質抗原のアミノ酸配列を修飾、短縮化および／または伸長させるように、遺伝子的に処理されていてよい。
【０１１１】
「動物病原体」は、例えば、野生動物、家畜動物またはペット用動物のような獣医学に関連する動物で、感染症および／または疾患を引き起こすことが可能である任意の生物学的実体を指す。
【０１１２】
本発明では、動物病原体は、本発明のワクチンを受けている標的動物の天然病原体であってもなくてもよい。
【０１１３】
「油」は、ここでは一般的な意味で使用され、典型的には比較的粘性のある液体であり、水よりも軽い密度を有し、疎水性かつ親油性の比較的高い炭化水素含有量を有する非極性の化学物質を指す。油は、合成、半合成、動物または植物由来のような、鉱物由来または「非鉱物」由来のものであり得る。油の一部は代謝可能である。
【０１１４】
用語「鉱物」は、それぞれの油が鉱物源を由来とし、典型的には石油由来であることを示す。
【０１１５】
「半合成油」は、動物油または植物油のような、由来が非鉱物である油であるが、これらは化学プロセスまたは物理プロセスにより構造および／または組成にて変性される。
【０１１６】
用語「アジュバント」は、ここでは、非特異的な方法にて標的動物内で免疫応答を刺激可能な一般的な意味の組成物で使用されている。
【０１１７】
「流動パラフィン油」は、白色（鉱物）油とも命名されている鉱油の一種であるか、または軽流動パラフィン油であり、これはＣＡＳ番号８０４２−４７−５を有する。それは一般的に入手可能であり、薬学的な等級品質でもある。例としては、Ｄｒａｋｅｏｌ（登録商標）６ＶＲ（Ｐｅｎｒｅｃｏ）、Ｍａｒｃｏｌ（登録商標）５２（Ｅｘｘｏｎ  Ｍｏｂｉｌｅ）およびＫｌｅａｒｏｌ（登録商標）（Ｓｏｎｎｅｂｏｒｎ）である。
【０１１８】
「ビタミンＥ−アセテート」は、ＣＡＳ番号５８−９５−７を有する化学化合物を指す。いくつかの別名は、トコフェリルアセテートまたはアルファ−トコフェロール−アセテートである。ビタミンＥ−アセテートは、ビタミンＥ（トコフェロール）の酢酸エステルであり、種子、ナッツ、果物もしくは葉のような植物性材料、または脂身から誘導されることができるが、合成的に製造されてもよい。そのため、ビタミンＥ−アセテートの定義には、天然、合成もしくは半合成形態、またはそれらの混合物が含まれる。ビタミンＥ−アセテートは、異なる程度の純度で市販されている。
【０１１９】
「スクアラン」は、ＣＡＳ番号１１１−０１−３を有する化学化合物を指す。いくつかの別名は、水素添加サメ肝油、ヘキサメチルテトラコサンまたはペルヒドロスクアレンである。これは、ポリ不飽和Ｃ３０油であり、コレステロール経路の化合物として代謝可能なスクアレン（ＣＡＳ番号１１１−０２−４）と混同されてはならない。
【０１２０】
元来、スクアランの前駆体はサメ肝から得られていたが、環境への懸念から、これはオリーブ油のような他の天然源または化学合成へと移行してきている。したがって、スクアランの定義には、天然、合成もしくは半合成形態、またはそれらの混合物が含まれる。スクアランは、例えば植物源由来、Ｗｏｒｌｅｅ（Ｓｑｕａｌａｎｅ、植物）またはＣｒｏｄａ（Ｐｒｉｐｕｒｅ  Ｓｑｕａｌａｎｅ）由来、または例えばＫｕｒａｒａｙ（Ｓｑｕａｌａｎｅ−ＰＥ）による合成物由来の様々な純度で市販されている。本発明では、高純度のスクアランが好ましく、望ましい順では、好ましくは７５％超の純度、より好ましくは８０、９０または一層より好ましくは９５％超の純度である。
【０１２１】
「エマルジョン」は、少なくとも２つの不混和性液体の混合物であり、それにより、一方が別のものの中に分散される。典型的には、分散相の液滴は、マイクロメートル未満の範囲であり、非常に小さい。本発明では、エマルジョンは油相および水相を含む。
【０１２２】
任意の規模にてエマルジョンを調製するための手順および機器は、当該技術分野にて周知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ」（２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）および「Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ」（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，１９９７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ  ０４４４８１９６８１）のようなハンドブック内に記載されている。
【０１２３】
本発明での油性アジュバントがエマルジョンである場合、該エマルジョンは油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルジョンであり得、ここで、油は連続した外側の相である。代替的には、エマルジョンは、「水中油型」（Ｏ／Ｗ）エマルジョンであり得、ここで、該油は分散された内部相である。
【０１２４】
適切な種類および濃度の乳化剤（類）を選択することにより、こうしたエマルジョンを形成することができ、安定的に維持することができる。
【０１２５】
乳化剤は、水と油間の界面相である位置に存在し、内部の分散相の液滴を安定化させる。多くの異なる乳化剤が知られており、これはワクチンのような薬学的な使用に適している。本発明の油性アジュバントにとって好ましい乳化剤は、ポリソルベート８０であり、これはポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートとしても知られており、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０として市販されている。Ｔｗｅｅｎ８０は、油性アジュバントの０．１〜１０％ｗ／ｖの量で、本発明向けの油性アジュバント中で使用されている。
【０１２６】
本発明では、Ｏ／Ｗエマルジョンの形態である場合、油性アジュバントはそれゆえに外側の水相と分散された内部の油相から成る。これにより、本発明での動物病原体を由来とする抗原をコードしているＲＰと、Ｏ／Ｗエマルジョンとしての油性アジュバントとの混合が促進される。例えば、ＲＰを含む水性組成物を、油性アジュバントＯ／Ｗエマルジョンと混合することによる。次いで、約１分間にわたる簡単な手での撹拌で、適切に２つの水性組成物を十分混合させる。
【０１２７】
代替的におよび高度に有利なことには、Ｏ／Ｗエマルジョンとしての油性アジュバントは、凍結乾燥形態からＲＰを再構成するのに直接使用されることができる。このことは、ＲＰが凍結乾燥物として高度に安定した形態で提供されることができ、本発明のワクチンが、標的動物に投与する前に、都合のよい時間に現場にて混合することにより調製することができることを意味する。
【０１２８】
本明細書にて使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」と互換的に使用され、値は、表示した値の５０パーセント以内であることを示し、すなわち、１ミリリットルあたり「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」１×１０＾８アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含有する組成物は、１ミリリットルあたり５×１０＾７〜１．５×１０＾８のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含有する。
【０１２９】
本発明のワクチン用であるＯ／Ｗエマルジョン油性アジュバントの一例は、ＸＳｏｌｖｅ（商標）である。ＸＳｏｌｖｅは、ビタミンＥアセテートを基とする（欧州特許第３８２，２７１号を参照されたい）Ｄｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ（商標）、および、流動パラフィン油を基とする（国際公開第２００９／１４４，０８８号を参照されたい）Ｍｉｃｒｏｓｏｌ（商標）の、２つのＯ／Ｗエマルジョンアジュバント成分の組合せである。
【０１３０】
こうしたエマルジョンにおいて、鉱油および非鉱油の油滴の体積平均サイズは異なっていてよい。好ましくは、鉱油の液滴はサブミクロンサイズである。
【０１３１】
好都合なことには、油性アジュバントエマルジョンは、本発明のＲＰとは分けて調製される。それゆえ、ＲＰが油性アジュバント内に存在する場合に、その性質維持に適合することがない油性アジュバントを乳化するための方法および機器が使用され得る。一例には、マイクロフルイダイザープロセッサ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）のような高圧均質化によってサブミクロンのエマルジョンを得るために使用される高せん断性の乳化法がある。
【０１３２】
本発明のワクチン用であるＯ／Ｗエマルジョン油性アジュバントの更なる例は、ＳＶＥＡ（商標）であり、これは、スクアランおよびビタミンＥ−アセテートを含んでおり、国際公開第２０１８／１１５，４３５号にて記載されている。
【０１３３】
本発明では、例えばベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥ）および鳥インフルエンザウイルスなどのような微生物または病原体の名称は、現在適用可能である前述微生物の各分類区分を指す。ただしそのような名称は、新しい見識により新規または異なる分類群へと再度区分化され得ることから、時間とともに変化する可能性がある。しかしながら、このことによって微生物そのものおよび抗原レパートリーが変化するわけではなく、単に科学的名称または区分が変化するのみであり、再度区分化された微生物は、本発明の範囲内であり続ける。
【０１３４】
分類学的ファミリーに対する参照は、そのファミリー内の種、サブタイプ、変異型、生物型、血清型または遺伝子型である任意の微生物を含む。
【０１３５】
本発明では、「ブタ」はイノシシ科のファミリーである動物を指し、好ましくは、例えば、野生または家畜用ブタ、イノシシ、バビルサまたはイボイノシシのイノシシ属の動物を指す。これはまた、それらの性別、年齢またはサイズを参照した任意の名称（例えば雌のブタ、雄のブタ、家畜用ブタ、若い雌のブタ、離乳したブタまたは子ブタ）によって示されるブタを含む。
【０１３６】
本明細書にて使用される場合、用語「鳥」は、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ヤマウズラ、クジャク、ウズラ、ハト、キジ、ホロホロチョウまたはダチョウのような農業的に関連のある鳥を指す。好ましくは、鳥はニワトリ、シチメンチョウ、アヒルまたはガチョウである。より好ましくは、鳥はニワトリまたはシチメンチョウである。最も好ましくは、鳥はニワトリである。
【０１３７】
鳥は例えば、卵用ニワトリ、種ニワトリ、ブロイラー、雑種または任意のこうした品種の父母系統のような任意の種類のものであり得る。好ましい鳥の種類はブロイラーである。
【０１３８】
本明細書にて使用される場合、用語「ティラピア」には、シクリッド科であり、ほぼ百種類の硬骨魚類でヒレを有するものを含み得る。ティラピアは、主に浅い小川、池、川および湖に生息しているおよび淡海水中に生息していることが稀に見られる淡水魚である。
【０１３９】
本発明用の「キットオブパーツ」は、典型的には所定量の特異的組成物を有する容器を梱包して組み合わせたものであり、このキットは、本発明の調製およびワクチン接種を実施するための指示書を含むか、これを指すものであってよい。
【０１４０】
ワクチン、免疫化方法ならびに動物を防御するための本発明の化合物および使用の標的は、コードされた抗原が由来とする特定の病原体により引き起こされる感染症または疾患に対しワクチン接種の必要がある動物である。健康であり、非感染状態である標的にワクチン接種し、かつできる限り早くワクチン接種することは明確に好ましいものの、年齢、重量、性別、免疫学的状態およびワクチン接種される／防御される／免疫化される標的の他のパラメータは重要ではない。
【０１４１】
本明細書にて使用される場合、「系統発生クラスター」は、系統樹または同じ（同種）祖先へと遡る進化樹にて（同じ枝上に）共に分類されてきている、一連のインフルエンザウイルス・ノイラミニダーゼである。米国にて発見されたＩＡＶ−Ｓノイラミニダーゼ（ＮＡ）に関しては、Ｎ１の２つの優性系統発生クラスターであるＮ１−古典的およびＮ１−パンデミック、ならびにＮ２の２つの優性である系統発生クラスターであるＮ２−１９９８およびＮ２−２００２が存在している。Ｎ１古典的系統発生クラスターは、Ｈ１Ｎ１古典的ブタインフルエンザウイルス由来であるＮＡとともに分類されたＮＡを含有する。Ｎ１パンデミック系統発生クラスターは、Ｈ１Ｎ１パンデミックインフルエンザウイルスが起源であるＮＡとともに分類されたＮＡを含有する。Ｎ２−１９９８系統発生クラスターは、１９９８年にブタへと感染したヒトＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス由来であるＮＡとともに分類されたＮＡを含有し、一方、Ｎ２−２００２系統発生クラスターは、２００２年にブタへと感染したヒトＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス由来であるＮＡとともに分類されたＮＡを含有する。［Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ７（Ｓｕｐｐｌ．４）：４２−５１（２０１３）を参照されたい。］。
【０１４２】
用語「非ＩＡＶ−Ｓ」は、各病原体および／または抗原（もしくは免疫源）は、ＩＡＶ−Ｓ病原体でもＩＡＶ−Ｓ抗原（免疫源）でもなく、非ＩＡＶ−Ｓタンパク質抗原（または免疫源）が、ＩＡＶ−Ｓを由来としていないことを表す病原体および／または抗原（もしくは免疫源）といった用語を修飾するために使用されている。
【０１４３】
本明細書にて使用される場合、多価ワクチンは、２つ以上の異なる抗原を含むワクチンであり、それにより、その違いは、属、種、血清型などのような多くの生物学的レベルのもののうちのどれかにおいて存在し得る。この種類の具体的な実施形態では、多価ワクチンは、２種以上の異なる動物病原体または同じ病原体のうち、免疫反応的に異質である変異型に対し標的動物の免疫系を刺激する。
【０１４４】
本明細書にて使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、修飾された名詞が薬学製品にて使用するのに適切であることを意味するよう、形容詞的に使用されている。例えば、薬学的なワクチン中の賦形剤を記載するためにその用語が使用されている場合、賦形剤は、組成物の他の成分と適合性があり、意図したレシピエント動物（例えばブタ）に対して不利益であるような有害性を持つものではないと特徴づけられる。
【０１４５】
動物標的に対して本発明のキットの各自構成要素であるワクチンの「投与」は、任意の実行可能な方法および経路を使用して実施されることができる。典型的には、投与の最適な方法は、適用されるワクチン／化合物の種類、および標的の特性、および防御を意図する対象である疾患によって決定されることになる。どのようにワクチン／化合物を処方するかによっては、異なる投与技術が適用され得る。例えば、本発明のＯ／Ｗエマルジョンワクチン／化合物の場合には、経腸経路または粘膜経路、すなわち点眼剤、点鼻剤、経口剤、腸溶剤、口腔鼻液滴剤、スプレー剤によって投与され得る。他の選択肢としては、水を飲むこと、広範囲スプレー、霧化、食事をとることなどを介するような大量投与方法を介することである。
【０１４６】
「非経口投与」には、皮下注射、粘膜下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射および点滴を含む。
【０１４７】
「粘膜投与」には、眼、鼻、経口、眼−鼻、気管内、腸管内、肛門および膣内投与経路を含む。
【０１４８】
「局所投与」には、皮膚および経皮投与経を含む。
【０１４９】
ワクチン、本発明のキットの各自構成要素を投与する方法、タイミングおよび体積は、好ましくは、標的のストレスを低減させ、かつ人件費を削減する目的のために、標的とする動物が必要とする可能性がある現存する他のワクチン接種のワクチン接種予定と一本化される。こうした他の免疫化自体は、登録済の用途と適合性のある方法で、関連する使用方法によって投与されることができる。
【０１５０】
本明細書にて使用される場合、特定のタンパク質（例えばタンパク質抗原）に関する用語「抗原断片」は、抗原性、すなわち、例えば免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体のような免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用可能なタンパク質の断片である。例えば、ＩＡＶ−Ｓノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原断片は、抗原性のＮＡタンパク質の断片である。好ましくは、本発明の抗原断片は、抗体および／またはＴ細胞受容体の認識に対して免疫優勢である。具体的な実施形態では、所与のタンパク質抗原に関する抗原断片は、完全長タンパク質の少なくとも２５％の抗原性を保持する。好ましい実施形態では、抗原断片は完全長タンパク質の少なくとも５０％の抗原性を保持する。より好ましい実施形態では、抗原断片は完全長タンパク質の少なくとも７５％の抗原性を保持する。抗原断片は１２個のアミノ酸と同じ程度で小さいものであり得るか、またはその一方で、完全長タンパク質から単一のアミノ酸と同じ程度欠損している大きな断片であり得る。具体的な実施形態では、抗原断片は２５〜１５０個のアミノ酸残基を含む。他の実施形態では、抗原断片は５０〜２５０個のアミノ酸残基を含む。
【０１５１】
本明細書にて使用される場合、あるアミノ酸配列は、両方の配列のアミノ酸残基が同一である場合、第２のアミノ酸配列に対して１００％「同一」であるか、または１００％の「同一性」を有する。したがって、２つのアミノ酸配列の５０％のアミノ酸残基が同一である場合、あるアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列に対して５０％「同一」である。配列比較は、例えばタンパク質といった所与のタンパク質または比較されているポリペプチドの一部により含まれているアミノ酸残基の隣接ブロックにわたって実施される。具体的な実施形態では、他の場合では２つのアミノ酸配列間の対応関係を変化させ得る、選択された欠失または挿入が考慮されている。
【０１５２】
本明細書にて使用される場合、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列のパーセント同一性は、Ｃ，ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ，ＮＣ  ２７５１９）、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．ＭＤ）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ  ＰＬＣ（１９９６）、ならびにアラインメントデフォルトパラメータおよび同一性用のデフォルトパラメータを用いたＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを用いて決定されることができる。こうした市販のプログラムもまた、同じまたは類似のデフォルトパラメータを使用して配列類似性を決定するために使用され得る。代替的には、例えば、デフォルトパラメータを使用したＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｖ．７（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）Ｐｉｌｅｕｐプログラムを使用して、デフォルトフィルタ条件下にてＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｌａｓｔ  ｓｅａｒｃｈを使用することができる。
【０１５３】
アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が個別に保存されているが、投与前に他のワクチン成分との混合が意図されている場合、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、他の成分の溶液、例えば緩衝液または高スクロース溶液と同じ水性安定化溶液中に保存され得る。
【０１５４】
本発明のワクチンは、任意の標準的な「動物を免疫化する方法」によって容易に投与されることができる。当業者は、投与される標的動物およびワクチンの特性を考慮した上で投与経路が選択されることを理解するであろう。好ましくは、ワクチン組成物は、各種の標的動物および投与経路に適切に処方される。
【０１５５】
本発明では、「微生物のサブユニット」は、タンパク質、炭水化物、リポ多糖、脂質または核酸分子のような生物学的または合成分子であり得る。
【０１５６】
ワクチン、キット、方法または本発明の使用を更に最適化することは、当業者にとって十分達成可能な範囲にある。一般的にこれは、提供された免疫防御を更に向上する目的でワクチン接種／免疫化の効果を微調整することを含む。これは、用量、体積、アジュバントまたは投与される物質の抗原含量を適用させることによって、または、異なる経路、方法またはレジメによる投与によって実施され得る。これらは全て本発明の範囲内である。
【０１５７】
こうした構成、工程段階および物質はある程度変化させることができるため、本発明は、特定の構成、工程段階、本明細書に開示されている物質に対して制限するものではないこともまた理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその同等物によってのみ制限されるものであるため、特定の実施形態のみを記載するという目的のために本明細書で用いられる専門用語が使用され、また制限することを目的としたものではないこともまた理解されるべきである。
【表１】
2021505558.tif 000003
【０１５８】
以下の非限定的な実施例は、本発明の更なる理解を提供するのに役立つものであるが、本発明の効果的な範囲を制限するいかなる方法も意味するものではない。
【０１５９】
［実施例］
［実施例１］
油性アジュバントは、ブタインフルエンザウイルス赤血球凝集素をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子に対し、ブタ中の抗体応答の規模および期間を向上する
物質および方法
配列最適化へとＨＡ遺伝子挿入を施す（ＡＴＵＭ，ＣＡ，ＵＳＡ）変更により、赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を発現するよう設計されたＶＥＥレプリコンベクターを、前に記載されたように構成した［参照として本明細書にここで組み込まれた内容としては、米国特許第９，４４１，２４７Ｂ２号を参照されたい］。Ｔｃ−８３−誘導レプリコンベクター「ｐＶＥＫ」［米国特許第９，４４１，２４７Ｂ２号内で開示され記載されている］は、制限酵素であるＡｓｃＩおよびＰａｃＩによって消化された。５’フランキング配列（５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣ−３’）［配列番号：１］および３’フランキング配列（５’−ＴＴＡＡＴＴＡＡ−３’）［配列番号：２］を有する、Ｎ１またはＮ２遺伝子をコドン最適化したオープンリーディングフレーム配列を含有するＤＮＡプラスミドは、制限酵素であるＡｓｃＩおよびＰａｃＩによって同様に消化された。次いで、合成遺伝子カセットを消化されたｐＶＥＫベクターへと結合し、得られたクローンを「ｐＶＨＶ−Ｎ１−パンデミック」、「ｐＶＨＶ−Ｎ１−古典的」、「ｐＶＨＶ−Ｎ２−２００２」および「ｐＶＨＶ−Ｎ２−１９９８」と再度命名した。「ｐＶＨＶ」ベクター命名は、ｐＶＥＫの複数のクローニング部位におけるＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位を介して、クローン化された導入遺伝子カセットを含有するｐＶＥＫ−誘導レプリコンベクターを指すように選択された。
【０１６０】
前に記載された方法［参照として本明細書にここで組み込まれた内容としては、米国特許第９，４４１，２４７Ｂ２号および米国特許第８，４６０，９１３Ｂ２号］に従って、ＴＣ−８３  ＲＮＡレプリコン粒子の産生が実行された。簡潔には、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびキャップアナログ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用した生体外の転写の前に、ｐＶＨＶレプリコンベクターＤＮＡおよびヘルパーＤＮＡプラスミドは、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化された。重要な点としては、産生に使用されるヘルパーＲＮＡは、前に記載されているようにＶＥＥサブゲノムプロモータ配列を欠損している［Ｋａｍｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ  ７）：１７２３−１７２７（２０１０）］。レプリコンおよびヘルパー成分用の精製ＲＮＡを、ベロ細胞の懸濁液と結合および混合し、４ｍｍキュベット内で電気穿孔し、ＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭ細胞培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）へと戻した。一晩インキュベーションした後、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を精製し、５％ｗ／ｖスクロースおよび１％ｖ／ｖブタ血清を有するリン酸緩衝生理食塩水中で処方し、０．２２ミクロンのメンブレンフィルタを通すことにより滅菌し、保存のためにアリコート中へと分散させた。ベロ細胞単層上での感染免疫蛍光法アッセイによって、機能的ＲＰの力価を決定した。パッケージングされたレプリコンによってコードされた抗原により、ＲＰのバッチを識別した。
【０１６１】
ブタインフルエンザウイルスに対する抗体に陰性である１０頭の子ブタを、５頭のブタのグループへと無作為化した。Ｈ３Ｎ２ブタインフルエンザ株の赤血球凝集素抗原を発現しているＲＰワクチンを、５×１０＾５ＲＰ／用量の力価で調製した。ワクチン接種の直前に、ＲＰのみのグループのワクチンは、滅菌ＰＢＳ希釈液で１：１（ｖ／ｖ）に希釈され、一方で、ＲＰ＋アジュバントグループのワクチンは、ＸＳｏｌｖｅアジュバントで１：１（ｖ／ｖ）に希釈された。その後、ブタは、２．０ｍＬの適切な物質を筋肉内へとワクチン接種された。ワクチン接種プロセスは０〜２１日間の試験日程で実施され、その時ごとにワクチンを新鮮に調製した。試験中収集された血清を、Ｈ３Ｎ２ブタインフルエンザウイルス抗原を使用した赤血球凝集抑制（ＨＩ）活性用にアッセイした。阻害活性を有した最大希釈として結果を報告し、１：１０未満の力価は１：９として報告し、６４０超の力価は１：６４１として報告した。幾何平均力価を表１に示す。
【表２】
2021505558.tif 000004
【０１６２】
比較的低用量の５×１０＾５ＲＰでは、非アジュバントワクチンは、低規模、短期間で一過性のＨＩ力価を誘導した。比較すると、アジュバントワクチンは、ブースターワクチンの接種後に高いＨＩ力価を誘導し、それらのＨＩ力価は、８４日間の試験終了まで上昇した状態を保っていた。
【０１６３】
この発見により、ＸＳｏｌｖｅは、非常に低い用量（５×１０＾５ＲＰ）でのブタＲＰ免疫化において非常に大幅な効果を有し得ることがまずはっきりと示された。アジュバントを含まないＲＰワクチンを使用する先行研究では、用量あたり非常に高い量のＲＰ成分を使用しなければならず、これは例えば、ＦＭＤ  ＲＰでは１×１０＾９であり、ＳＩＶ  ＲＰでは５×１０＾７であった。
【０１６４】
［実施例２］
油性アジュバントは、ブタインフルエンザウイルス抗原をコードしている多価アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子に対し、ブタ中の抗体応答の規模および期間を向上する
ブタインフルエンザに陰性である群れから、乳離れした子ブタのグループを表２に表示されるような処置グループへと無作為化した。ブタインフルエンザ向けの多価アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子ワクチンは、ブタインフルエンザの様々な株由来であるＨＡまたはＮＡのいずれかを発現している、８個の個別のＲＮＡ粒子抗原を使用して、それぞれ約１×１０＾７ＲＰ／用量に配合された。２つのＨ３、４つのＨ１、１つのＮ１および１つのＮ２抗原が含まれており、一対の血清学的アッセイ（ＨＩまたはＮＩ）が、各抗原に対する抗体応答を評価するために使用された。試験は重複させた設計として実行され、動物の半数はＨ１Ｎ１ウイルスでチャレンジされており、残りの半数はＨ１Ｎ２ウイルスでチャレンジした。
【表３】
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【０１６５】
ＸＳｏｌｖｅ油性アジュバントの使用により、８個全てのワクチン分画に対する血清応答の規模を著しく増加させることが見いだされた。両方のワクチン製剤により、肺病変を防御したが（図１Ａ〜図１Ｂ）、ＸＳｏｌｖｅを添加したものは、Ｈ１Ｎ１およびＨ１Ｎ２インフルエンザウイルスの鼻排出による測定の場合（図１Ｃ〜図１Ｄ）、ワクチン効果を向上させた。図１〜図１Ｆは、対応するＮＩ力価スコアを表す。ＨＩ力価上でのアジュバントの効果は、図２Ａ〜図２Ｆに表示されている。
【０１６６】
この試験により、非アジュバント多価ＳＩＶ  ＲＰは、全分画に対して抗体を誘導したが、油性アジュバントを添加することにより、全分画の免疫応答を著しく増強させたことが証明された。鼻排出および肺スコアのより密なクラスター化の減少は、例えば、群れまたは個体群内における感染症の水平拡散を制限することに関する、重要な臨床的利点を表す。
【０１６７】
［実施例３］
初回ワクチン接種時にＮ１抗体を有する乳離れしたブタにおけるＨ１Ｎ１感染に対する、アジュバント４種混合ＮＡ−ＲＰワクチンの効果
アジュバント４種混合ＮＡ−ＲＰワクチンの２つの用量レベルでの効果および免疫原性を決定するため、ワクチン接種チャレンジ試験を行った。アジュバントワクチンは、４つのＲＰコンストラクトを含み、これはそれぞれ、現代Ｕ．Ｓ．ＩＡＶ−Ｓ分離株の単独で異なるＮＡ遺伝子を、個別にコードしたものである。こうしたＮＡ遺伝子と一緒に、２つのＮ１系統発生クラスター（Ｎ１−古典的およびＮ１−パンデミック）ならびに２つのＮ２クラスター（Ｎ２−１９９８およびＮ２−２００２）を表す（表３を参照されたい）。初回ワクチン接種時にＮ１−古典的抗原に対して抗体陽性である乳離れしたブタに、１ｍＬ／用量にて２つの筋肉内（ＩＭ）ワクチン接種することによりアジュバントワクチンを投与した。アジュバント４種混合ＮＡ−ＲＰワクチン効果を、異種Ｎ１（Ｈ１Ｎ１ウイルス）チャレンジ感染に対して試験した。
【０１６８】
物質および方法
ＮＡ−ＲＰ抗原の構築：
複製に欠陥があるアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）はノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子をコードしており、本質的に本明細書の実施例１に記載された通りにこれを調製した。
【表４】
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【０１６９】
ウイルス
チャレンジウイルスは、ＵＳＤＡの国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から得た。Ａ／ブタ／イリノイ／Ａ０１５５４３５１／２０１５（Ｈ１Ｎ１）は、Ｈ１−ガンマクラスターのＨＡ遺伝子と、Ｎ１−古典的クラスターのＮＡ遺伝子を保持する。ウイルスをＭＤＣＫ細胞培養にて増殖した。集密的な細胞を約４８時間の間、細胞単層の７０％超で細胞変性効果が明らかになるまで感染させた。収集時、その上澄みを容器から取り除き、ウイルスを凍結保存する前に遠心分離することで清澄化した。
【０１７０】
動物
乳離れした子ブタを高度に健康な群れから血清スクリーニングを基に選択して、ワクチンおよびチャレンジ株に対する既存のＨＩまたはＮＩ（ノイラミニダーゼ抑制）抗体の欠損を確認した。動物は雄と雌を混合させており、初回ワクチン接種時には週齢約３週間であった。
【０１７１】
ワクチン接種およびチャレンジ
処置グループを表４にて概説した。４種混合ＮＡ−ＲＰワクチンは、各ＲＰ／用量につき１０＾６個のコピーにて処方されており、これは機能的ＲＰを定量化する免疫蛍光法に基づく効力アッセイに基づくものであった。ＮＡ−ＲＰ抗原は、１％のブタ血清と５％のスクロースから成る安定剤中で処方された。プラセボワクチンは、同様の安定剤から成っていたが、抗原を含まなかった。ワクチンは、週齢３週および週齢７週のブタへとＩＭ経路によって投与される直前に、ＸＳｏｌｖｅ油性アジュバント（１：１ｖ／ｖ、１ｍＬ用量）と混合された。用量レベルは、ワクチン接種後に保存されていたワクチン物質上でＩＦＡ試験を行うことにより逆滴定された。血清サンプルを初回ワクチン接種の日、２回目のワクチン接種の日、および、チャレンジ感染の日に収集した。
【０１７２】
初回ワクチン接種の１日前に全てのブタを計量し、Ｎ１−古典的抗体陽性グループのブタには、２ｍＬ／ｋｇ用量のＮ１−古典的過免疫血清（Ｎ１−古典的抗原に対し、１：２５６０の抗ＮＩ抗体力価）を皮下注射した。
【表５】
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【０１７３】
チャレンジ感染は、２回目のワクチン接種の３週間後にブタへと投与された。Ｈ１Ｎ１のチャレンジ物質（Ｈ１−ガンマ−Ｎ１−古典的）を、１０＾６．５ＴＣＩＤ５０／ブタ（６ｍＬの体積）である目標用量に処方した。チャレンジ物質を気管内経路により投与した。保存されていたチャレンジ物質を逆滴定することにより、チャレンジウイルス用量を確認した。全てのブタから、チャレンジ前日、チャレンジ後１日目、３日目および５日目時点で鼻スワブを収集した。
【０１７４】
剖検をチャレンジ後５日目時点で実施した。資格のある獣医師の監修の下で、５ＤＰＣでバルビツールを過量投与することにより、ブタを安楽死させた。肉眼で確認できる病変に侵された各葉の表面積を記録するため、肺を収集して観察し、総合的なパーセントの肺病変スコアを得た。全てのブタから気管支肺胞洗浄液および鼻スワブを収集し、ウイルス力価を測定した。肺切片は、顕微鏡レベルの病変を病理組織学的分析のために収集された。
【０１７５】
免疫応答分析：
ブタ血清サンプル中のＩＡＶ−Ｓ特異的抗体は、ＮＩ試験により決定された。血清は、５６℃で３０〜６０分間熱不活化された。ＮＩ試験は、Ｓａｎｄｂｕｌｔｅ＆Ｅｉｃｈｅｌｂｅｒｇｅｒ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１６１：３３７−４５，２０１４）の方法を少し変更して実施された。簡潔には、血清の２倍段階希釈物を、発現されたタンパク質抗原と等量にてフェチュインコーティングされた９６ウェルプレート上で混合し、３７℃で一晩インキュベートした。ピーナッツアグルチニン・ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体を、室温にて２時間添加し、シアル酸を取り除いたフェチュイン分子と結合させた。ＴＭＢ着色基質によりシグナルを得て、結果は６５０ｎｍで読み取られた。ＮＡ抗原を欠損したネガティブコントロールの平均光学密度（ＯＤ）を、全てのウェルから差し引いた。その後、試験サンプルのＯＤ値は、０〜１００％のスケール上で標準化され、ここで、ポジティブコントロールウェルの平均ＯＤ（ＮＡ抗原を含有していたが、血清は含有していない）を１００％と定義した。ＮＩ抗体力価は、ノイラミニダーゼ活性の５０％以上を阻害したサンプルの最大希釈として定義された。
【０１７６】
肺の病理検査
全ての肺葉の外側にて観察された肉眼で確認できる病変（紫〜桃色で明確に区分された浸潤影）を、肺前部および後部のグリッド図上に記録した。各ブタに対する総合スコア（パーセント肺病変）は、病変を侵しているグリッドの数に従って計算した。
【０１７７】
ウイルス排出
鼻スワブおよびＢＡＬ流体を、感染した媒体［０．３％のウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、２μｇ／ｍＬトリプシンＩＸを追加したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）］で１０倍段階希釈し、１００μＬの各希釈液を、９６ウェルプレート中の集密的なＭＤＣＫ細胞の４つ組のウェルへと添加した。プレートを５％のＣＯ２、３７℃でインキュベートし、各ウェルからの上澄みを赤血球凝集反応試験することにより、感染性ウイルスの存在を７２時間後に観察した。ＩＡＶ−Ｓ力価は、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を用いて計算され、ｍＬあたりＬｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０として表した。
【０１７８】
結果
多価ＮＡ−ＲＰによりワクチン接種されたブタの免疫応答を図３に表す。以下の点は注目すべき点である。
【０１７９】
−初回ワクチン接種を受ける前日にＮ１−古典的過免疫血清を用いて受動的に導入されたブタは、ワクチン接種時に４０〜８０のＮ１−古典的抗体力価を有した。
【０１８０】
−ＸＳｏｌｖｅアジュバントで４種混合ＮＡ−ＲＰワクチンを２回ワクチン接種した後、血清陰性およびＮ１−抗体血清陽性であるブタの両方は、そのＮ１−古典的抗体力価の著しい増加を示した。これは、ＲＰコードされた抗原に対する抗体に対して陽性である標的動物であっても、油性アジュバントを含むＲＰワクチン接種は効果的であることを示した。
【０１８１】
−Ｎ１−古典的陰性／プラセボワクチン接種されたグループにおけるブタのＮＩ力価は、血清陰性のままであった。
【０１８２】
肺病変に関して、チャレンジ感染に対する４種混合ＮＡ−ＲＰワクチン効果を図４に表す。注目すべきは、４種混合ＮＡ−ＲＰワクチン接種は、それらの初回ワクチン接種時にＮ１−古典的抗体を有するブタまたは有さないブタにワクチン接種した場合、両方の場合で肺病変を減少させる点で高い効果があったことである。両方のグループにおいて、肺病変のパーセントは、プラセボワクチン接種されたグループと比べて著しく減少した。
【０１８３】
［実施例４］
油性アジュバントは、アルミニウムアジュバントまたは水に対して、ブタ流行性下痢ウイルス抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子に対するブタ中の抗体応答の規模および期間を向上する
９頭の子ブタであって週齢が約３週である子ブタを、それぞれ３頭ずつの動物のグループへと無作為化した。ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）のスパイク糖タンパク質を発現しているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子ワクチンを調製し、２０用量のバイアル内に凍結乾燥させた。試験０日目に、ブタは、水、水酸化アルミニウムアジュバントまたはＸＳｏｌｖｅアジュバントのいずれかで再水和された１．０ｍｌのアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子ワクチンを用いて、筋肉内にワクチン接種された。試験２１日目、ワクチンの新しいバイアルにより該プロセスを繰り返した。再水和後の用量あたりのアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の最終力価は、免疫蛍光アッセイによって決定され、全グループに対して約７×１０＾６ＲＰ／用量であった。試験中収集された血清を、ＰＥＤＶ中和抗体用にアッセイした。表５を参照されたい。
【表６】
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【０１８４】
非アジュバントワクチンで処理されたブタは、２つの用量のワクチン後、中和抗体が低量かまたは検出不可能であった。水酸化アルミニウムによるアジュバントワクチンで処理されたブタは全て中和抗体を発現させ、検出限界のすぐ上であった。対照的に、ＸＳｏｌｖｅによるアジュバントワクチンは、２つの用量のワクチン後、より高い中和抗体を誘導しており、３頭のブタ全てが他の試験グループで観察されたピーク力価よりも高い最小抗体力価に達していた。したがって、アジュバントとしての水酸化アルミニウムの使用は有効ではなく、実質的には油性アジュバントの方がより効果的であった。
【０１８５】
［実施例５］
油性アジュバントは、ニワトリにおいてインフルエンザ抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子のワクチン接種効果を向上させる
初生雛を、１０羽の鳥のグループへと無作為化した。Ｈ３Ｎ２ブタインフルエンザ株の赤血球凝集素抗原を発現しているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子ワクチンを、１×１０＾８ＲＰ／用量の力価で調製した。ワクチン接種の直前に、ＲＰのみを受けるグループ向けのワクチンを、滅菌ＰＢＳ希釈液を用いて１：１（ｖ／ｖ）で希釈し、一方、アジュバントを加えたアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子のグループのワクチンを、ＸＳｏｌｖｅアジュバントを用いて１：１（ｖ／ｖ）で希釈した。雛からの血清を、ワクチン接種後試験０日目、７日目および１４日目における赤血球凝集抑制（ＨＩ）力価用にアッセイした。
【表７】
2021505558.tif 000009
【０１８６】
非アジュバントワクチンおよびプラセボワクチンと対照的に、ＸＳｏｌｖｅアジュバントをアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子ワクチンに添加することで、単回のワクチン接種後、鳥のＨＩ力価に対する明確な増加を誘導した。
【０１８７】
［実施例６］
油性アジュバントは、ニワトリにおいてＩＢＤＶ抗原を発現しているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子ワクチンの効果を向上させる
このワクチン接種チャレンジ検査は、ファラガー株５２／７０である、伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤＶ）由来のＶＰ２−４−３ポリタンパク質抗原を発現しているＲＰのワクチン接種効果において、油性アジュバントの効果を試験した。試験動物は、ＩＢＤＶに対して抗体に陰性であるＳＰＦ（特異的な病原体を含まない）ニワトリであった。グループのサイズは５羽または１０羽の鳥であった。皮下経路により、日齢（孵化日）にてワクチン接種を実施し、一方のグループ（ｎ＝５）は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で偽ワクチン接種された。ワクチン接種された一方のグループは、水性緩衝液中のＲＰワクチンを受け、他のワクチングループは、ＸＳｏｌｖｅアジュバントを１：１で混合したＲＰワクチンを受けた。ワクチン接種後２８日目には、全てのグループは、点眼経路により毒性の強いＩＢＤＶ株ＣＳ８９によってチャレンジ感染を施された。チャレンジ後１０日目に実施した剖検にて全体の病変に対する嚢状組織をスコアリングし、ＩＢＤＶ感染向けの周知の基準に従い、組織病理学により、ワクチン接種効果を監視した。
【表８】
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【０１８８】
油性アジュバントをＲＰワクチンに添加することにより、明らかに、ゼロから完全防御へとニワトリの免疫応答を向上させる、重篤なチャレンジ感染に対するワクチン接種効果において著しい効能が生じた。
【０１８９】
［実施例７］
油性アジュバントはまた、魚におけるアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子ワクチンの効果を向上させる
マダイイリドウイルス（ＲＳＩＶ）の主要なカプシドタンパク質を発現しているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子ワクチンを、本明細書に記載されるような標準方法によって調製した。ティラピアに、０．０５ｍｌのワクチンを用いて筋肉内へとワクチン接種し、次いで、ワクチン接種後異なる時点にてチャレンジさせた。本試験では、処置ごとおよびチャレンジ時間ごとに３０匹の魚を使用した。ワクチン接種直前に、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子ワクチンを、ＰＢＳまたは２つの物質を含む非鉱油アジュバントであるＳＶＥＡと、１：１（ｖ／ｖ）で混合させた。処置ごとのＲＰの力価は、１×１０＾７ＲＰ／用量であった。コントロールである魚を、プラセボワクチンでワクチン接種した。
【表９】
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【表１０】
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【０１９０】
「３週間の低用量」および「６週間の高用量」チャレンジの両方にて、アジュバントによりＲＰワクチン接種された魚の相対的な生存が強力に向上した。２つの他のチャレンジ処置により同等の結果を得た。したがって、アジュバントを含まないＲＰワクチンと比べて、アジュバントを含むアルファウイルスＲＮＡ  ＲＰワクチンはかなりより効果的であり、単回用量によるワクチン接種のみを用いるだけで有効なワクチン接種を提供した。
【０１９１】
［実施例８］
ＲＰおよび油性アジュバントの同時使用および並行使用の有効性
試験は、実施例３に記載されたように、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の４種混合ブタインフルエンザウイルスＮＡワクチンを用いてブタで実施された。これは、ワクチン成分であるＲＰと油性アジュバントを、異なる種類で使用することによる効果を示すのに役立った。
【０１９２】
物質および方法
ブタは、週齢約４週および約７週でワクチン接種された。４種混合ＮＡワクチンは、実施例３に記載されたように、二重遺伝子であるＮ１と、二重遺伝子であるＮ２  ＲＰコンストラクトとの混合物であり、それぞれ約２×１０＾６ＲＰ／用量で投与された。全グループは、４頭のブタを含有していた。試験プロトコルの構成を表９に表す。グループ２は、ＸＳｏｌｖｅアジュバントと混合されたＮＡ  ＲＰを同時使用にて受けていた。
【０１９３】
グループ３および４は、ＲＰおよび油性アジュバントの並行使用の効果を試験し；投与は、首の同じ側（５ｃｍ超離した）か、または首の反対側のいずれかにて、互いに約１０分間以内に施された。
【０１９４】
ブタインフルエンザＨＡ  Ｈ１抗原をコードしているＲＰを使用している、１つのコントロールグループであるグループ５が含まれていた。これは、約１×１０＾７ＲＰ／用量で投与された。
【０１９５】
血清は、初回ワクチン接種の日、２回目のワクチン接種の日および２回目のワクチン接種後７日目に収集された。これらの血清は、それぞれ４種類のＮＡ種用に個別の同種ＮＩアッセイ上で試験された。
【０１９６】
測定された得られたＮＩ力価は、図５および図６中に表されており、これにより、図５は経時的に測定された標準偏差を含む３つの時点でのＮ１古典的ＮＡ抗原に対するＮＩ力価を表す。図６は、２回目のワクチン接種後７日目時点における、結合された４種類のＮＡ種のグループ平均ＮＩ力価を表す。
【表１１】
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【０１９７】
結果および結論
実施例８にて測定された結果から、以下のいくつかの効果を観察できた：
−測定された３つの時点での４種類のＮＡ種に対するＮＩ力価のパターンはほぼ同一であり、したがって、図５で表されたＮＡ  Ｎ１古典的の結果は、他の３種類のＮＡ種に対する力価パターンを表す。
【０１９８】
−更には、７  ｄｐｖ２での４種類のＮＡ種向けのＮＩ力価応答パターンは、図６に表されているように大部分が同じものである。
【０１９９】
−予想されたように、ＨＡ  Ｈ１  ＲＰコントロール（グループ５）のＮＩ力価結果はＮＩ力価を誘導しなかった；これにより、特異的な応答に対する力価閾値を設定している。
【０２００】
−いくつかの試験用変化を除いて、グループ２〜４における大半のＮＩ力価は、ＲＰおよび油性アジュバントを受けた際には、ＲＰのみを受けたグループ（グループ１）の力価よりも著しく高かった。これは油性アジュバントが、ＲＰによる免疫化を強力に高めることを示す。
【０２０１】
−同時使用におけるＲＰおよび油性アジュバントを受けるグループ（グループ２）は、前述の実施例中で既に観察された油性アジュバントの強力な効果を確認した。
【０２０２】
−ＲＰおよび油性アジュバント（グループ３〜４）を並行使用することの免疫化効果は、同時使用のそれと非常に近い状態となっており、ＲＰ免疫応答による強力な刺激であった。投与の部位の違いによる明確な影響は存在しなかった。
【０２０３】
本発明は、本明細書に記載されるような特異的な実施形態によって範囲内に限定されるべきではない。実際には、本明細書に記載されるような変更に加え、前述の説明から様々な本発明の変更が当業者には明らかとなるだろう。こうした変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図されている。
【０２０４】
核酸またはポリペプチドに対して与えられた全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、全ての分子量または分子質量値は近似のものであり、説明のために提供されていることが更に理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月4日(2020.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物病原体を由来とする抗原をコードしているアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含むワクチンであって、ここで、前記ワクチンは、油性アジュバントをも含む、ワクチン。
【請求項２】
前記油性アジュバントが、鉱油、及び、スクワラン、スクワレン、トコフェロール及び植物油よりなる群から選択される１種以上の非鉱油、を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
トコフェロールが、ビタミンＥ、ビタミンＥ−アセテート及びその組み合わせよりなる群から選択され、そしてここで、植物油が、オレアート、エチルオレアート及びその組み合わせよりなる群から選択される、請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記鉱油が、流動パラフィン油である、請求項２または３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記油性アジュバントが、スクアランおよびビタミンＥ−アセテートを含む、請求項３または４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記油性アジュバント中の鉱油の量が、油性アジュバントの１〜７０％ｖ／ｖである、請求項１〜５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項７】
前記油性アジュバント中の非鉱油の総量が、油性アジュバントの０．１〜３０％ｗ／ｖである、請求項１〜６のいずれかに記載のワクチン。
【請求項８】
前記油性アジュバントが、水中油型エマルジョンとして処方される、請求項１〜７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項９】
前記アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である、請求項１〜８のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１０】
動物病原体が、魚、鳥および哺乳動物から成る群から選択される動物病原体である、請求項１から９のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１１】
前記哺乳動物がブタである、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記鳥が、ニワトリまたはシチメンチョウである、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記魚が、シクリッド科の一員である、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１４】
少なくとも２つの容器を含むキットであって、ここで少なくとも一方の容器が、動物病原体を由来とする抗原をコードしているベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含み、そして、少なくとも一方の容器が、鉱油、及び、スクワラン、スクワレン、トコフェロール及び植物油よりなる群から選択される１種以上の非鉱油、を含む油性アジュバントを含む、キット。
【請求項１５】
動物を免疫化する方法であって、免疫学的有効量の請求項１〜１４のいずれかのワクチンを前記動物へ投与することを含む方法。
【請求項１６】
動物病原体により引き起こされる感染症または疾患に対する動物の防御に使用するための、動物病原体を由来とする抗原をコードしているベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子であって、
ここで、前記アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、
鉱油、及び、スクワラン、スクワレン、トコフェロール及び植物油よりなる群から選択される１種以上の非鉱油、を含む油性アジュバント、との同時使用または並行使用により標的動物の身体内または身体上に投与される、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子。
【国際調査報告】
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