(57)【要約】  本発明は、機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための培地および方法を提供し、培地は、ニューロン培地および栄養サプリメントを含み、そして、栄養サプリメントは、ＳＵ５４０２、ＢＩＢＦ１１２０、ＩＢＭＸ、およびグルコースのうちの一またはそれ以上である。ＦＧＦおよびＶＥＧＦシグナル伝達経路の阻害剤またはｃＡＭＰの活性化剤などの特定の因子が、神経細胞の分化および成熟を加速させるために、神経幹細胞または神経前駆細胞の様々な神経細胞への分化誘導のあいだの特定の時間に添加される本方法は、ヒト神経前駆細胞の誘導分化の開始後約７〜１４日で主要な機能性をもつ安定かつ健全な神経細胞を得ることが可能であり、製造コストを減少させ、そして、製造期間を短縮する。
2021519103.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための培地であって、ニューロン培地および栄養サプリメントを含み、前記栄養サプリメントが、ＳＵ５４０２、ＢＩＢＦ１１２０、ＩＢＭＸ、およびグルコースのうちの一またはそれ以上を含む培地。
【請求項２】
前記栄養サプリメントが、１００ｎＭ〜１００μＭのＳＵ５４０２、１〜５００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１〜１００μＭのＩＢＭＸ、および１〜１０ｍＭのグルコースのうちの一またはそれ以上を含む請求項１記載の培地。
【請求項３】
前記栄養サプリメントが、１００ｎＭ〜１００μＭのＳＵ５４０２、１〜５００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１〜１００μＭのＩＢＭＸ、および１〜１０ｍＭのグルコースを含む請求項２記載の培地。
【請求項４】
機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための方法であって、
神経幹細胞または神経前駆細胞が、分離後に細胞培養プレート上に蒔かれ、第１日目から神経細胞分化培地Ａ中で培養され、そしてその後、第７日目から神経細胞分化培地Ｂ中で培養される
ことを含み；
前記神経細胞分化培地Ｂが、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、栄養サプリメント、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントのうちの一またはそれ以上を含み；
前記栄養サプリメントが、ＳＵ５４０２、ＢＩＢＦ１１２０、ＩＢＭＸ、およびグルコースのうちの一またはそれ以上を含む方法。
【請求項５】
前記栄養サプリメントが、１００ｎＭ〜１００μＭのＳＵ５４０２、１〜５００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１〜１００μＭのＩＢＭＸ、および１〜１０ｍＭのグルコースのうちの一またはそれ以上を含む請求項４記載の分化を誘導するための方法。
【請求項６】
前記栄養サプリメントが、８０ｎＭ〜１２０ｎＭのＳＵ５４０２、１５０〜２５０ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、５〜１５μＭのＩＢＭＸ、および３〜８ｍＭのグルコースのうちの一またはそれ以上を含む請求項５記載の分化を誘導するための方法。
【請求項７】
前記栄養サプリメントが、１００ｎＭのＳＵ５４０２、２００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１０μＭのＩＢＭＸ、および５ｍＭのグルコースを含む請求項６記載の分化を誘導するための方法。
【請求項８】
前記神経細胞分化培地Ａが、２μＭのレチノイン酸、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、および０．２ｍＭのアスコルビン酸、１００ｎＭのＳＵ５４０２、２００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１０μＭのＩＢＭＸ、および５ｍＭのグルコース、補充されたｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントを含み、前記ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍの前記ビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントに対する比が５０：１であり；
前記神経細胞分化培地Ｂが、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、および０．２ｍＭのアスコルビン酸、１００ｎＭのＳＵ５４０２、２００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１０μＭのＩＢＭＸ、５ｍＭのグルコース、補充されたｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントを含み、前記ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍの前記ビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントに対する比が、５０：１である請求項４〜７のいずれか１項に記載の分化を誘導するための方法。
【請求項９】
培養が、第１日目から前記神経細胞分化培地Ａ中で、前記培地の半量が３〜５日毎に交換されながら行われ、；
培養が、第７日目から、前記神経細胞分化培地Ｂを用いて、前記培地の半量が３〜５日毎に交換されながら継続される請求項８記載の分化を誘導するための方法。
【請求項１０】
前記神経幹細胞または前記神経前駆細胞がアキュターゼによって分離され、および、５×１０5／ｃｍ2の密度で、ポリ−Ｄ−リシン／ラミニンコートプレート上に蒔かれる請求項９記載の分化を誘導するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するという技術分野に関し、および、特には、ヒト神経幹細胞の機能性大脳皮質細胞への迅速な分化を誘導するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００８年（Ｄｉｍｏｓら、２００８）以来、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト神経細胞への分化が誘導されてきた；分化された細胞は、神経性疾患の研究、薬剤スクリーニング、医薬の神経毒性試験に応用され得たであろう。移植の試みは、研究および薬剤開発における注目の話題であり、そして、関連する文献の数は増え続けている。その中で、分化を誘導する方法は、次々と登場しているものの、脳に近い組成および割合をもち、かつ成熟した機能性を有している神経細胞集団を得ることは、依然として大きな課題である。
【０００３】
ヒト神経前駆細胞が大脳皮質細胞へ分化誘導されるためには、通常３０〜６０日を要し、そして、それらが、例えば、シナプスにおける神経伝達物質レセプターの分布、自発的で強力な、高頻度の興奮性および抑制性電気生理学的シグナルなどといった真に成熟した神経構造および機能性を保有することは困難である。さらに、神経細胞は、ハイスループット薬剤スクリーニングマルチウェルプレート上で長期間、安定的および健全に培養することができず、そして、培地交換にも適さない。したがって、より長いインキュベーション時間および不十分な成熟性が、細胞障害研究、薬剤スクリーニング、および毒性試験への大規模な応用を制限し、そして、得られるデータの代表性および信頼性にも影響を与えている。
【発明の概要】
【０００４】
上記に鑑み、本発明は、機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための方法を提供する。主に機能的であり、および安定かつ健全な神経細胞が本発明の方法によって短時間で得られ得る。
【０００５】
本発明は、機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための方法であって、以下を含む方法を提供する：
神経幹細胞または神経前駆細胞が、分離後に細胞培養プレート上に蒔かれ、第１日目から神経細胞分化培地Ａ（neural differentiation medium A）中で培養され、そしてその後、第７日目から神経細胞分化培地Ｂ（neural differentiation medium B）中で培養される；
神経細胞分化培地Ａは、レチノイン酸、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、栄養サプリメント、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントのうちの一またはそれ以上を含む；
神経細胞分化培地Ｂは、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、栄養サプリメント、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントのうちの一またはそれ以上を含む；
栄養サプリメントは、ＳＵ５４０２、ＢＩＢＦ１１２０、ＩＢＭＸ、およびグルコースのうちの一またはそれ以上を含む。
【０００６】
本発明において、神経幹細胞または神経前駆細胞が様々な神経細胞へと分化するように誘導される時、神経細胞の分化および成熟を加速させることのできる、例えば、ＦＧＦおよびＶＥＧＦシグナル伝達経路の阻害剤、ｃＡＭＰの活性化剤などの、特定の因子が、特定の時間に添加される。興奮性および抑制性ニューロンなどの、主要な機能を有する安定かつ健全な神経細胞が、ヒト神経前駆細胞が約７〜１４日誘導された後に得られ得、したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト神経細胞培養が真に薬剤スクリーニングなどに応用され得る。本方法は、製造コストを低減させ、および、生産期間を短縮し得る。本発明において、神経幹細胞または神経前駆細胞は、まず、分離後に細胞培養プレート上に蒔かれる。具体的には、神経幹細胞または神経前駆細胞は、アキュターゼによって分離され、５×１０5／ｃｍ2の密度で、ポリ−Ｄ−リシン／ラミニンコートプレート上に蒔かれ、次いで、第１日目から神経細胞分化培地Ａ中で培養され、そしてその後、第７日目から神経細胞分化培地Ｂ中で継続的に培養される。
【０００７】
本発明において、神経細胞分化培地Ａは、レチノイン酸、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＧＤＮＦ（グリア細胞株由来神経栄養因子）、アスコルビン酸、栄養サプリメント、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）のうちの一またはそれ以上を含む。
【０００８】
神経細胞分化培地Ｂは、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、栄養サプリメント、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）のうちの一またはそれ以上を含む。
【０００９】
本発明において、ニューロン培地に添加される栄養サプリメントは、神経細胞の分化および成熟を加速させることができ、そして、栄養サプリメントは、ＳＵ５４０２、ＢＩＢＦ１１２０、ＩＢＭＸ、およびグルコースのうちの一または複数を含む。
【００１０】
ＳＵ５４０２およびＢＩＢＦ１１２０は、ＦＧＦおよびＶＥＧＦレセプターシグナル伝達経路ならびに細胞凝集を阻害するために、成熟ニューロンの遊走を増進させるために、ならびに、神経突起の成長および真に機能的なニューロンへの成熟を促進するための充分な空間をニューロンがもつことを可能とするために、使用される。細胞の凝集は、高密度のニューロンを導き、これは、細胞が神経突起を伸長させることを困難にし、そして、細胞が成熟することを妨げる。分化および神経培養の現在存在する方法は、一般的に、神経細胞の凝集に起因する、細胞の健全性、成熟、均一性、および成熟前の細胞集団死にも影響を及ぼす問題を含んでいる。ＳＵ５４０２およびＢＩＢＦ１１２０の添加は、細胞凝集を減少させることによって、健全性および均一な密度を維持しながら、これらの状況を効率的に防止することができ、神経細胞がより早期に成熟されることを可能とし、および、大規模および機能的リサーチおよび産業のニーズを満たすように死亡率を低下させる。培養された細胞は、ハイスループットスクリーニングのために使用され得る。さらに、ＳＵ５４０２およびＢＩＢＦ１１２０のサプリメントを含む培地中で培養された神経細胞は、３年以上のあいだ維持され得るが、他の方法によるヒト神経幹細胞の分化によって得られる神経細胞は、たった１〜２か月のあいだｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された後、大量に死んでしまうであろう。
【００１１】
ＩＢＭＸは、細胞内でｃＡＭＰを分解する酵素−ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）の非特異的阻害剤であり、ｃＡＭＰの分解を阻害することによって細胞内ｃＡＭＰのレベルを増加させることができる。ＩＢＭＸの役割は、その効果を発揮するためにグルコースの関与を必要とする。ニューロンの分化および成熟は、エネルギーの供給のために大量のｃＡＭＰを必要とし、そして、ｃＡＭＰの消費およびそのコストは非常に高い。しかしながら、ＩＢＭＸは、ｃＡＭＰ分解酵素−ホスホジエステラーゼの活性を阻害することによって細胞内ｃＡＭＰの濃度を間接的に増大させ得る。大量のｃＡＭＰと置き換えるためのＩＢＭＸおよびグルコースの使用は、神経細胞の早期の成熟を可能にするだけでなく、細胞培養のコストを低減させ、これは、科学的リサーチおよび産業の大規模性および機能的なニーズに合致し、そして、ハイスループットスクリーニングに適切である。
【００１２】
本発明はまた、ニューロン培地（neuronal medium）および栄養サプリメントを含む、機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための培地を提供する。
【００１３】
一実施形態において、栄養サプリメントは、ＳＵ５４０２、ＢＩＢＦ１１２０、ＩＢＭＸ、およびグルコースのうちの一またはそれ以上を含む。
【００１４】
一実施形態において、栄養サプリメントはＳＵ５４０２を含む。
【００１５】
一実施形態において、栄養サプリメントは、１００ｎＭ〜１００μＭのＳＵ５４０２、１〜５００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１〜１００μＭのＩＢＭＸ、および１〜１０ｍＭのグルコースのうちの一またはそれ以上を含む。
【００１６】
一実施形態において、栄養サプリメントは、１００ｎＭ〜１００μＭのＳＵ５４０２、１〜５００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１〜１００μＭのＩＢＭＸ、および１〜１０ｍＭのグルコースを含む。
【００１７】
一実施形態において、栄養サプリメントは、８０ｎＭ〜１２０ｎＭのＳＵ５４０２、１５０〜２５０ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、５〜１５μＭのＩＢＭＸ、および３〜８ｍＭのグルコースを含む。
【００１８】
一実施形態において、栄養サプリメントは、１００ｎＭのＳＵ５４０２、２００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１０μＭのＩＢＭＸ、および５ｍＭのグルコースを含む。
【００１９】
本発明において、ニューロン培地は、例えば脳ニューロン細胞培地などの基礎培地から選択され、そして、種々の因子の組み合わせが任意に添加され得る。一実施形態において、ニューロン培地は、レチノイン酸、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み、一実施形態において、ニューロン培地は、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含む。
【００２０】
神経幹細胞または神経前駆細胞の誘導分化が行われる場合、細胞は、第１日目からニューロン分化培地Ａ中で培養され、そしてその後、第７日目からニューロン分化培地Ｂ中で継続的に培養される。
【００２１】
具体的には、神経細胞分化培地Ａは、ニューロン培地Ａおよび栄養サプリメントを含む。ニューロン培地Ａは、レチノイン酸、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含む。一実施形態において、神経細胞分化培地Ａは、２μＭのレチノイン酸、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、１００ｎＭのＳＵ５４０２、２００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１０μＭのＩＢＭＸ、および５ｍＭのグルコース、補充されたｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）含み、ここで、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍのＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）に対する比は、５０：１である（他に特定されていない限り、「比（ratio）」は、「質量比（mass ratio）」を意味する）。
【００２２】
具体的には、神経細胞分化培地Ｂは、ニューロン培地Ｂおよび栄養サプリメントを含む。ニューロン培地Ｂは、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含む。一実施形態において、神経細胞分化培地Ｂは、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、１００ｎＭのＳＵ５４０２、２００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１０μＭのＩＢＭＸ、および５ｍＭのグルコース、補充されたｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）含み、ここで、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍのＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）に対する比は、５０：１である。
【００２３】
本発明において、神経細胞分化培地Ａは、第１日目から３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター中での培養のために使用され、ここで培地の半量が３〜５日毎に交換され、そして、神経細胞分化培地Ｂは、第７日目から、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター中での培養を継続するために使用され、ここで培地の半量が３〜５日毎に交換される。第７日目から、神経細胞の成熟度が、電気生理学的および免疫蛍光染色によって検出され得る。目的とする機能性指標が実現された時、神経細胞は、次の工程のために使用され得る。
【００２４】
本発明において、神経細胞の分化および成熟を加速させることのできる、例えば、ＦＧＦおよびＶＥＧＦシグナル伝達経路の阻害剤、ｃＡＭＰの活性化剤などの特定の因子が、神経幹細胞または神経前駆細胞が様々な神経細胞へと分化するように誘導される特定の時間に添加される。興奮性および抑制性神経細胞などの、主要な機能を有する安定かつ健全な神経細胞が、ヒト神経前駆細胞が約７〜１４日のあいだ誘導された後に得られ得る。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト神経細胞培養が薬剤スクリーニングなどに真に適用され得、これは、製造コストを減少させ、そして、製造期間を短縮する。加えて、本発明において提供される培地は、血清を含まない、および、動物起源のものを含まない培地であり、したがって、臨床的移植試験のためにもまた適切である。
【００２５】
本発明の実施形態、または従来存在する技術への技術的解法をより明確に示すために、実施形態の記載または従来技術において使用される図面が簡単に説明される。明らかに、以下の記載における図面は、本発明の実施形態にのみ関する。他の添付の図面はまた、当該技術分野における通常の技術者によっていかなる創造的な努力もすることなしに、本発明で提供されている図面から、得られ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明において提供される機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための方法の図示的なフローダイアグラムを示す図である。
【図２】図２は、本発明の実施例１で提供される、第１、７、１４および８４日目における誘導分化されたヒト神経細胞の明視野像を示す図である。
【図３】図３は、実施例１で提供される、１４日間の誘導分化後のシングルセルパッチクランプによって記録された、ヒト神経細胞のｍｉｎｉＩＰＳＣ（抑制性シナプス後電流）およびｍｉｎｉＥＰＳＣ（興奮性シナプス後電流）の活動電位を示す図である。
【図４】図４は、実施例１で提供される、１４日間の誘導分化後に記録された、細胞の興奮性および抑制性シナプス後電流の振幅および周波数の統計値を示す図である。
【図５】図５は、１４日間の誘導分化後のヒト神経細胞のシングルセルパッチクランプで記録されたｓＥＰＳＣ（自発性の興奮性シナプス後電流）の例を示す図である。
【図６】図６は、実施例１で提供される、１４日間の誘導分化後のヒト神経細胞の自発性のシナプス後電流の例を示す図である。
【図７】図７は、第１４日目における分化のＭＡＰ２蛍光免疫染色像を示す図である。
【図８】図８は、第１４日目における分化のＭＡＰ２蛍光免疫染色ヒストグラムを示す図である。
【図９】図９は、第１４日目における分化のシナプシン蛍光免疫染色像を示す図である。
【図１０】図１０は、第１４日目における分化のシナプシン蛍光免疫染色ヒストグラムを示す図である。
【図１１】図１１は、第２１日目における分化のｖＧｌｕｔ蛍光免疫染色像を示す図である。
【図１２】図１２は、第２１日目における分化のｖＧｌｕｔ蛍光免疫染色ヒストグラムを示す図である。
【図１３】図１３は、実施例２および比較例１の、第２１日目における分化のヒト神経細胞の明視野像を示す図である。
【図１４】図１４は、実施例２および比較例１の、第２１日目における分化のヒト神経細胞の分散度の統計的ヒストグラムを示す図である。
【図１５】図１５は、実施例２および比較例１の、第２１日目における分化のシナプシン蛍光免疫染色ヒストグラムを示す図である。
【図１６】図１６は、実施例２および比較例１の、第２１日目における分化のＦＯＸＧ１蛍光免疫染色ヒストグラムを示す図である。
【図１７】図１７は、実施例２および比較例１の、第７日目における分化のヒト神経細胞の平均の自発的発火頻度のヒストグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の実施形態における技術的解法は、以下に明確かつ完全に記載されるであろう。明らかに、本発明の実施形態の一部分のみが本明細書中には記載されている。当該技術分野における通常の技術者によっていかなる創造的な努力もすることなしに本発明の実施形態に基づいて取得される全ての他の実施形態は、本発明の保護の範囲内である。
【００２８】
実施例１
工程１：ヒト人工多能性幹細胞株ＤＹＲ０１００の分化により得られるヒト神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）が、アキュターゼによって分離され、そしてその後、５×１０5／ｃｍ2の密度で、ポリ−Ｄ−リシン／ラミニンコートプレート上に蒔かれた。
【００２９】
工程２：第１日目以降、ｈＮＰＣは、細胞培養インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ2で、神経細胞分化培地Ａで、３日毎に半量の培地が交換されながら、第７日目まで培養された。神経細胞分化培地Ａは、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍおよびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み、そして、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍは、２μＭのレチノイン酸、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、１００ｎＭのＳＵ５４０２、２００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１０μＭのＩＢＭＸ、５ｍＭのグルコースを含み（全ての濃度は、終濃度である）、ここで、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍのＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）に対する比は、５０：１であった。
【００３０】
工程３：ｈＮＰＣは、第７日目以降、細胞培養インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ2で、神経細胞分化培地Ｂで、３日毎に半量の培地が交換されながら、培養された。神経細胞分化培地Ｂは、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍおよびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み、そして、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍは、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、１００ｎＭのＳＵ５４０２、２００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１０μＭのＩＢＭＸ、５ｍＭのグルコースを含み（全ての濃度は、終濃度である）、ここで、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍのＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）に対する比は、５０：１であった。第７日目以降、神経細胞の成熟度が、電気生理学的および免疫蛍光染色によって検出され得た。目的とする機能性指標が実現された場合、神経細胞は、次の工程のために使用され得た。
【００３１】
図１を参照して、図１は、本発明で提供される機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための方法の図示的なフローダイアグラムである。ｈＮＳＣおよびｈＮＰＣは、分離された後、分化誘導され、第１日目から神経細胞分化培地Ａ中で培養され、そして、第７日目から培地Ｂ中で培養される。基本的なニューロン機能および成熟マーカーが、第１４日目以降、検出され得、そして、ヒト脳神経細胞がさらなる成熟後に得られ得る。ここで、神経細胞分化培地Ａは、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍおよびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み、そして、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍは、２μＭのレチノイン酸、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、１００ｎＭのＳＵ５４０２、２００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１０μＭのＩＢＭＸ、５ｍＭのグルコースを含む（全ての濃度は、終濃度である）。神経細胞分化培地Ｂは、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍおよびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み、そして、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍは、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、１００ｎＭのＳＵ５４０２、２００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１０μＭのＩＢＭＸ、５ｍＭのグルコースを含む（全ての濃度は、終濃度である）。
【００３２】
図２〜４を参照して、図２は、実施例１の第１、７、１４および８４日目における誘導分化されたヒト神経細胞の明視野像を示す図であり、図３は、実施例１の第１４日目の誘導分化後の、シングルセルパッチクランプによって記録された、ヒト神経細胞のｍｉｎｉＩＰＳＣ（抑制性シナプス後電流）およびｍｉｎｉＥＰＳＣ（興奮性シナプス後電流）の活動電位を示す図であり、図４は、実施例１の第１４日目に記録される、分化された細胞の興奮性および抑制性シナプス後電流の振幅および周波数の統計値を示す図である。図２〜４に示されるように、興奮性および抑制性ニューロンを有する神経細胞が、本発明の方法によって、第１４日目において得られ得、それらは、電気生理学的機能を有し、そして、長い期間にわたって培養され得る。
【００３３】
比較例１
実施例１との違いは、神経細胞分化培地Ａおよび神経細胞分化培地Ｂが神経細胞培養用基礎培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍおよびＢ２７）と置き換わったことであった。
【００３４】
比較例２
実施例１との違いは、神経細胞分化培地Ａおよび神経細胞分化培地Ｂが、神経細胞の神経生理学的成熟を促進させる培養培地（ＢｒａｉｎＰｈｙｓ）と置き換わったことであり、培養培地（ＢｒａｉｎＰｈｙｓ）は、著名な幹細胞試薬会社である、カナダ国のＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＣｏｍｐＡ）によって製造されている。
【００３５】
比較例３
実施例１との違いは、神経細胞分化培地Ａおよび神経細胞分化培地Ｂが、神経細胞の成熟を促進する培地サプリメントによって置き換わったことであり、ここで、培地サプリメントは、幹細胞神経分化の技術分野において広く知られているアメリカ国の教授によって運営されている会社、ＢｒａｉｎＸｅｌｌ社（ＣｏｍｐＢ）によって製造されている。
【００３６】
図５〜６を参照して、図５は、１４日間の誘導分化後のシングルセルパッチクランプで記録されたヒト神経細胞のｓＥＰＳＣ（自発性の興奮性シナプス後電流）の例を示しており、そして、比較例１〜３および実施例１が上から下にそれぞれ示されている。図６は、実施例１で提供される、１４日間の誘導分化後のヒト神経細胞の自発性のシナプス後電流の例を示しており（Ａｘｉｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のＭＥＡ（マルチ電極アレイ）によって記録された）、複数電極間でのクラスター様協調活動電位の連関がソフトウェア分析を通じて見出され得る。これは、第１４日目において、ある種のネットワーク結合（より成熟した機能的性能）が実施例１で提供される分化方法によって得られる神経細胞によって形成されていたことを示している。しかしながら、この現象は、他の分化方法によって得られた神経細胞（第１４日目）においては観察されない。そして、報告されている文献によれば、他の分化方法によると、２か月の間をも培養されたヒト神経細胞においてもこのような現象を観察することは困難である。
【００３７】
図７〜図８を参照して、図７は、第１４日目における分化のＭＡＰ２蛍光免疫染色像であり、比較例１、比較例２、比較例３、および実施例１の像が左から右にそれぞれ示されている。そして、明視野像、ＤＡＰＩ染色像、およびＭＡＰ２染色像が、上から下へとそれぞれ示されている。図８は、比較例１〜３および実施例１（左から右に示されている）の第１４日目における分化のＭＡＰ２蛍光免疫染色ヒストグラムである。
【００３８】
図９および図１０を参照して、図９は、第１４日目における分化のシナプシン蛍光免疫染色像であり、比較例１、比較例２、比較例３、および実施例１の像が左から右にそれぞれ示されている。そして、結合された像、ＭＡＰ２染色像およびシナプシン染色像が、それぞれ上から下へと示されている。図１０は、第１４日目における分化のシナプシン蛍光免疫染色ヒストグラムであり、比較例１、比較例２、比較例３、および実施例１の像が左から右にそれぞれ示されている。
【００３９】
図１１および１２を参照して、図１１は、第２１日目における分化のｖＧｌｕｔ蛍光免疫染色像であり、比較例１、比較例２、比較例３、および実施例１の像が左から右にそれぞれ示されている。そして、結合された像、ＤＡＰＩ染色像およびｖＧｌｕｔ染色像が、それぞれ上から下へと示されている。図１２は、第２１日目における分化のｖＧｌｕｔ蛍光免疫染色ヒストグラムであり、比較例１、比較例２、比較例３、および実施例１の像が左から右にそれぞれ示されている。
【００４０】
図７〜１２に示されているように、興奮性および抑制性ニューロンを有する神経細胞が本発明において提供される方法によって迅速に得られ得る。
【００４１】
実施例２
工程１：ヒト人工多能性幹細胞株ＤＹＲ０１００の分化により得られるヒト神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）が、アキュターゼによって分離され、そしてその後、５×１０5／ｃｍ2の密度で、ポリ−Ｄ−リシン／ラミニンコートプレート上に蒔かれた。
【００４２】
工程２：第１日目以降、ｈＮＰＣは、細胞培養インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ2で、神経細胞分化培地Ａで、３日毎に半量の培地が交換されながら、第７日目まで培養された。神経細胞分化培地Ａは、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍおよびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み、そして、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍは、２μＭのレチノイン酸、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、１００μＭのＳＵ５４０２を含み（全ての濃度は、終濃度である）、ここで、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍのＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）に対する比は、５０：１であった。
【００４３】
工程３：ｈＮＰＣは、第７日目以降、細胞培養インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ2で、神経細胞分化培地Ｂで、３日毎に半量の培地が交換されながら、培養された。神経細胞分化培地Ｂは、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍおよびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み、そして、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍは、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、１０μＭのＳＵ５４０２を含み（全ての濃度は、終濃度である）、ここで、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍのＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）に対する比は、５０：１であった。第７日目以降、神経細胞の成熟度が、電気生理学的および免疫蛍光染色によって検出され得た。目的とする機能性指標が実現された場合、神経細胞は、次の工程のために使用され得た。
【００４４】
図１３および１４を参照して、図１３は、実施例２および比較例１の、第２１日目における分化のヒト神経細胞の明視野像であり、図１４は、実施例２および比較例１の、第２１日目における分化のヒト神経細胞の分散度の統計的ヒストグラムである。
【００４５】
図１５および１６を参照して、図１５は、実施例２および比較例１の、第２１日目における分化のシナプシン蛍光免疫染色ヒストグラムであり、図１６は、実施例２および比較例１の、第２１日目における分化のＦＯＸＧ１蛍光免疫染色ヒストグラムである。
【００４６】
図１７を参照して、図１７は、実施例２および比較例１の、第７日目における分化のヒト神経細胞の平均の自発的発火頻度のヒストグラム（Ａｘｉｏｎ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＭＥＡ社によって記録された）であり、そして、神経細胞用培地中で培養された細胞の電気生理学的シグナルは、第７日目において検出されなかった。
【００４７】
図１３〜１７から、細胞凝集の阻害、およびニューロン成熟の促進が、ニューロンに充分な距離および空間を与えており、これは、本発明において提供される方法によって、神経突起を成長させ、そして、機能的ニューロンへとさらに成熟させるために好適である。
【００４８】
実施例３
工程１：ヒト人工多能性幹細胞株ＤＹＲ０１００の分化により得られるヒト神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）が、アキュターゼによって分離され、そしてその後、５×１０5／ｃｍ2の密度で、ポリ−Ｄ−リシン／ラミニンコートプレート上に蒔かれた。
【００４９】
工程２：第１日目以降、ｈＮＰＣは、細胞培養インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ2で、神経細胞分化培地Ａで、３日毎に半量の培地が交換されながら、第７日目まで培養された。神経細胞分化培地Ａは、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍおよびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み、そして、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍは、２μＭのレチノイン酸、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、５μＭのＳＵ５４０２、５０μＭのＩＢＭＸを含み（全ての濃度は、終濃度である）、ここで、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍのＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）に対する比は、５０：１であった。
【００５０】
工程３：ｈＮＰＣは、第７日目以降、細胞培養インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ2で、神経細胞分化培地Ｂで、３日毎に半量の培地が交換されながら、培養された。神経細胞分化培地Ｂは、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍおよびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み、そして、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍは、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、５μＭのＳＵ５４０２、５０μＭのＩＢＭＸを含み（全ての濃度は、終濃度である）、ここで、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍのＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）に対する比は、５０：１であった。結果は、実施例３によって提供される方法が、比較例１、比較例２、および比較例３と比較して、効果的に細胞凝集を抑制し得たことを示していた。
【００５１】
実施例４
工程１：ヒト人工多能性幹細胞株ＤＹＲ０１００の分化により得られるヒト神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）が、アキュターゼによって分離され、そしてその後、５×１０5／ｃｍ2の密度で、ポリ−Ｄ−リシン／ラミニンコートプレート上に蒔かれた。
【００５２】
工程２：第１日目以降、ｈＮＰＣは、細胞培養インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ2で、神経細胞分化培地Ａで、３日毎に半量の培地が交換されながら、第７日目まで培養された。神経細胞分化培地Ａは、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍおよびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み、そして、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍは、２μＭのレチノイン酸、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、５ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、５０μＭのＩＢＭＸを含み（全ての濃度は、終濃度である）、ここで、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍのＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）に対する比は、５０：１であった。
【００５３】
工程３：ｈＮＰＣは、第７日目以降、細胞培養インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ2で、神経細胞分化培地Ｂで、３日毎に半量の培地が交換されながら、培養された。神経細胞分化培地Ｂは、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍおよびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み、そして、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍは、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、５ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、５０μＭのＩＢＭＸを含み（全ての濃度は、終濃度である）、ここで、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍのＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）に対する比は、５０：１であった。結果は、実施例３によって提供される方法が、比較例１、比較例２、および比較例３と比較して、効果的に細胞凝集を抑制し得たことを示していた。
【００５４】
上述の実施例は、本発明の好ましい実施形態にすぎない。当該技術分野における通常の技術者であれば、本発明の原理の範囲から逸脱することなしに改変および修飾がなされ得ることが指摘されるべきであり、これら改変および修飾はまた、本発明の保護の範囲であると考えられるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年1月19日(2021.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための培地であって、ニューロン培地および栄養サプリメントを含み、前記栄養サプリメントが、ＦＧＦ／ＶＥＧＦシグナル伝達経路の阻害剤およびｃＡＭＰの活性化剤を含み、
前記ＦＧＦ／ＶＥＧＦシグナル伝達経路の阻害剤が、ＳＵ５４０２および／またはＢＩＢＦ１１２０であり、ならびに、
前記ｃＡＭＰの活性化剤が、ＩＢＭＸ単独、または、ＩＢＭＸおよびグルコースの組み合わせである培地。
【請求項２】
前記栄養サプリメントが、ＳＵ５４０２、ＢＩＢＦ１１２０、ＩＢＭＸ、およびグルコースを含む請求項１記載の培地。
【請求項３】
前記栄養サプリメントが、８０ｎＭ〜１００μＭのＳＵ５４０２、１〜５００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１〜１００μＭのＩＢＭＸ、および１〜１０ｍＭのグルコースのうちの一またはそれ以上を含む請求項１記載の培地。
【請求項４】
機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための方法であって、
神経幹細胞または神経前駆細胞が、分離後に細胞培養プレート上に蒔かれ、第１日目から神経細胞分化培地Ａ中で培養され、そしてその後、第７日目から神経細胞分化培地Ｂ中で培養される
ことを含み；
前記神経細胞分化培地Ａが、レチノイン酸、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、栄養サプリメント、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントのうちの一またはそれ以上を含み；
前記神経細胞分化培地Ｂが、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、栄養サプリメント、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントのうちの一またはそれ以上を含み；
前記栄養サプリメントが、ＦＧＦ／ＶＥＧＦシグナル伝達経路の阻害剤およびｃＡＭＰの活性化剤を含み、
前記ＦＧＦ／ＶＥＧＦシグナル伝達経路の阻害剤が、ＳＵ５４０２および／またはＢＩＢＦ１１２０であり、
前記ｃＡＭＰの活性化剤が、ＩＢＭＸ単独、または、ＩＢＭＸおよびグルコースの組み合わせである方法。
【請求項５】
前記栄養サプリメントが、ＳＵ５４０２、ＢＩＢＦ１１２０、ＩＢＭＸ、およびグルコースを含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記栄養サプリメントが、８０ｎＭ〜１００μＭのＳＵ５４０２、１〜５００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１〜１００μＭのＩＢＭＸ、および１〜１０ｍＭのグルコースのうちの一またはそれ以上を含む請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記栄養サプリメントが、８０ｎＭ〜１０μＭのＳＵ５４０２、１５０〜２５０ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、５〜１５μＭのＩＢＭＸ、および３〜８ｍＭのグルコースのうちの一またはそれ以上を含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記栄養サプリメントが、１００ｎＭのＳＵ５４０２、２００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１０μＭのＩＢＭＸ、および５ｍＭのグルコースを含む請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記栄養サプリメントが、１０μＭのＳＵ５４０２を含む請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記栄養サプリメントが、５μＭのＳＵ５４０２および５０μＭのＩＢＭＸを含む請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記栄養サプリメントが、５ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０および５０μＭのＩＢＭＸを含む請求項６記載の方法。
【請求項１２】
前記神経細胞分化培地Ａが、２μＭのレチノイン酸、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、および０．２ｍＭのアスコルビン酸、１００ｎＭのＳＵ５４０２、２００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１０μＭのＩＢＭＸ、５ｍＭのグルコース、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントを含み、前記ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍの前記ビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントに対する比が５０：１であり；
前記神経細胞分化培地Ｂが、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、および０．２ｍＭのアスコルビン酸、１００ｎＭのＳＵ５４０２、２００ｎｇ／ｍＬのＢＩＢＦ１１２０、１０μＭのＩＢＭＸ、５ｍＭのグルコース、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、およびビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントを含み、前記ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍの前記ビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントに対する比が、５０：１である請求項４記載の方法。
【請求項１３】
培養が、第１日目から前記神経細胞分化培地Ａ中で、前記培地の半量が３〜５日毎に交換されながら行われ、；
培養が、第７日目から、前記神経細胞分化培地Ｂを用いて、前記培地の半量が３〜５日毎に交換されながら継続される請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記神経幹細胞または前記神経前駆細胞がアキュターゼによって分離され、および、５×１０5／ｃｍ2の密度で、ポリ−Ｄ−リシン／ラミニンコートプレート上に蒔かれる請求項１３記載の方法。
【国際調査報告】
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