(57)【要約】  本開示は、抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド、およびインフルエンザに対する抗体の誘発におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドであって、（ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインで置き換える変異を含むフェリチンタンパク質と、（ｉｉ）インフルエンザポリペプチドとを含む前記抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項２】
抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドであって、（ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインで置き換える変異およびシステインにコンジュゲートした免疫刺激性部分を含むフェリチンタンパク質と、（ｉｉ）インフルエンザポリペプチドとを含む前記抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項３】
システインを介してフェリチンタンパク質にコンジュゲートした免疫刺激性部分をさらに含む、請求項１に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項４】
インフルエンザポリペプチドは、血球凝集素（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）ポリペプチドを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項５】
ＨＡポリペプチドは保存領域を含む、請求項４に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項６】
保存領域はＨＡのステム領域の全てまたは一部を含む、請求項５に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項７】
インフルエンザ抗原はＹ９８Ｆ変異を含むＨＡ抗原を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項８】
内部システインを非システインアミノ酸で置き換える変異をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項９】
内部システインが、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位、またはペアワイズアライメントもしくは構造アライメントによって決定される、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に対応する位置にあり、場合により内部システインがセリンに変異している、請求項８に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項１０】
表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸で置き換える変異をさらに含み、場合により該非アスパラギンアミノ酸はグルタミンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項１１】
表面に露出したアミノ酸は、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２、Ｓ２６、Ｓ７２、Ａ７５、Ｋ７９、Ｓ１００、もしくはＳ１１１の変異、またはペアワイズアライメントもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける類似のアミノ酸である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項１２】
表面に露出したアミノ酸の変異は、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２Ｃ、Ｓ２６Ｃ、Ｓ７２Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｋ７９Ｃ、Ｓ１００Ｃ、もしくはＳ１１１Ｃ、またはペアワイズアライメントもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける類似のアミノ酸である、請求項１１に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項１３】
免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８のアゴニストである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項１４】
免疫刺激性部分はＴＬＲ９のアゴニストである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項１５】
免疫刺激性部分とフェリチンタンパク質との間にリンカーをさらに含む、請求項１または３〜１４のいずれか１項に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項１６】
リンカーは、マレイミド部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、およびジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）部分のうちの１つ、２つ、または３つを含む、請求項１５に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項１７】
フェリチンタンパク質とインフルエンザポリペプチドとの間にペプチドリンカーをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドを含むフェリチン粒子。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドまたはフェリチン粒子、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２０】
フェリチンタンパク質および異なるインフルエンザポリペプチドを含む第２の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドをさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
インフルエンザポリペプチドは、インフルエンザＡ型に由来し、第２の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドのインフルエンザポリペプチドが、インフルエンザＢ型に由来するか、またはインフルエンザポリペプチドおよび第２のインフルエンザ−フェリチンポリペプチドのインフルエンザポリペプチドが、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、もしくはＨ１８に由来するか、またはインフルエンザポリペプチドの１つもしくは両方がサブタイプＨ１、Ｈ３、Ｈ７、もしくはＨ１０に由来する操作された安定化ステム抗原を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
インフルエンザに対する免疫応答を誘発する方法において、またはインフルエンザによる感染に対する対象の保護に使用するための、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド、フェリチン粒子、または組成物。
【請求項２３】
インフルエンザに対する免疫応答を誘発するか、またはインフルエンザによる感染に対して対象を保護する方法であって、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のいずれか１つまたはそれ以上の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド、フェリチン粒子、または組成物を対象に投与することを含む前記方法。
【請求項２４】
対象はヒトである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド、フェリチン粒子、組成物、または方法。
【請求項２５】
場合により、核酸はＭＲＮＡである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全内容が参照によって本明細書に組み入れられる、２０１８年４月３日に提出された米国仮特許出願第６２／６５２，２０４号の利益を主張する。
【０００２】
本出願は、配列表を含有し、それらはＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年３月１８日に作成され、名称は２０１９−０３−１８＿０１１２１−００３４−００ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは２８５，７３１バイトである。
【背景技術】
【０００３】
ワクチン学の分野での多くの成功にも関わらず、生命を脅かす多くの感染疾患からヒトを保護するために、新規打開策が必要である。現在認可されている多くのワクチンは、何十年も前の技術に依存して生弱毒化または不活化死菌ワクチンを産生しているが、これらは固有の安全性の懸念を有し、多くの場合、ごく短命な弱い免疫応答を刺激するに過ぎず、複数回用量の投与を必要とする。遺伝子工学および生化学工学の進歩により、難題である疾患標的に対する治療薬を開発することが可能となっているが、ワクチン学の分野へのこれらの応用は、まだ十分に実現されていない。組換えタンパク質技術により、現在では最適な抗原の設計が可能となっている。加えて、ナノ粒子は、最適な抗原提示および標的化薬物送達の潜在性をますます証明している。複数の抗原を付着させたナノ粒子は、それらの分子カーゴの多価ディスプレイによってもたらされる結合アビディティの増加、およびその微視的サイズのために生物学的障壁をより効率的に通過する能力が示されている。インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タンパク質に融合したヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ））フェリチンナノ粒子は、マウスインフルエンザモデルにおいて抗原安定性を改善し、免疫原性を増加させた（非特許文献１を参照されたい）。この融合タンパク質は、８面体の対称性ナノ粒子へと自己集合して８個の３量体ＨＡスパイク構造を提示し、アジュバントと共に使用する場合、様々な前臨床モデルにおいて強力な免疫応答を与える。
【０００４】
インフルエンザは、依然として世界的に深刻な健康上の脅威であり、成人の年間５〜１０％が感染し、毎年２５〜５０万人が死亡している。製造時間が長期であるため、ワクチン株は流行シーズンの半年以上前に選択されなければならず、遺伝的シフトおよびドリフト、ならびに新株の出現により、しばしばミスマッチに悩まされることがある。適切にマッチさせた場合でさえ、現在のワクチンの有効性は５０〜６０％にすぎない。したがって、ワクチン接種の幅、効力および／または耐久性を増加させることによってワクチンの有効性を改善し、近代的な製造方法を導入することが実質的に必要である。
【０００５】
多くのシーズンで観察されたインフルエンザワクチンの低い有効性の根底にある重要な要因は、ウイルスが、エラーを起こしやすい複製を介して変異する傾向にあり、これにより、ウイルスはワクチン接種された個体における中和抗体の結合を回避することができる。インフルエンザウイルスにおいて保存されたエピトープが存在することは、ウイルスのドリフトに抵抗し得る、幅広く中和するインフルエンザワクチンへの道を示唆する。しかしながら、これらの保存されたエピトープに対する抗体を誘発するためには、これらのエピトープを免疫系に好ましい方法で提示するために組換えタンパク質工学が必要である。例えば、全長血球凝集素（ＨＡ）を免疫原として用いる場合、誘発される抗体は、主に、免疫優性であるといわれる非常に可変的な頭部ドメインに結合する抗体である。サブドミナントの高度に保存されたステム領域に対する抗体を誘導するために考案された戦略は、タンパク質工学（非特許文献２を参照されたい）を通じて、ＨＡの頭部を「削り」、残りのタンパク質鎖を結びつけることを伴った。
【０００６】
ここでは、インフルエンザに対するワクチン治療における一連の新たな前進を提示する。操作されたシステインがフェリチン中の表面に露出したアミノ酸を置き換える抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドが開発された。アジュバントなどの免疫刺激性部分は、システインを介して抗原性ポリペプチドにコンジュゲートされた。抗原性ポリペプチドから集合した自己アジュバント性フェリチン粒子は非常に抗原性であった。免疫刺激性部分のフェリチン粒子への直接的なコンジュゲーション、およびインフルエンザポリペプチドへの融合により、単一の巨大分子実体における免疫刺激性部分およびインフルエンザポリペプチドの標的化された同時送達が可能となり、これは、個別の分子として抗原およびアジュバントを含む従来のワクチンに関して懸念される全身毒性の可能性を大幅に減少させることができる。さらに、高分子実体中のインフルエンザポリペプチドと共に免疫刺激性部分を同時送達すること、およびそれらが多価で提示されることもまた、必要なワクチンの全体的な用量を低減させ、製造負荷およびコストを低減させることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ４９９：１０２〜１０６頁（２０１３）
【非特許文献２】Ｙａｓｓｉｎｅ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１（９）：１０６５〜１０７１頁（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本開示の目的は、上記の利点の１つまたはそれ以上を提供することができる、または有用な選択を公共に少なくとも提供する組成物、キット、方法、および使用を提供することである。したがって、以下の実施形態が本明細書で開示される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
実施形態１は、（Ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含むフェリチンタンパク質と、（ＩＩ）インフルエンザポリペプチドとを含む抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００１０】
実施形態２は、（Ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異およびシステインにコンジュゲートした免疫刺激性部分を含むフェリチンタンパク質と、（ＩＩ）インフルエンザポリペプチドとを含む抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００１１】
実施形態３は、システインを介してフェリチンタンパク質にコンジュゲートした免疫刺激性部分をさらに含む、実施形態１に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００１２】
実施形態４は、インフルエンザポリペプチドが、血球凝集素（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）ポリペプチドを含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の実施形態の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００１３】
実施形態５は、ＨＡポリペプチドが保存領域を含む、実施形態４に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００１４】
実施形態６は、保存領域が、ＨＡのステム領域の全てまたは一部を含む、実施形態５に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００１５】
実施形態７は、インフルエンザ抗原がＹ９８Ｆ変異を含むＨＡ抗原を含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００１６】
実施形態８は、内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異をさらに含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００１７】
実施形態９は、内部システインが、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位、またはペアワイズアライメントまたは構造アライメントによって決定される、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に対応する位置にあり、場合により、内部システインがセリンに変異している、実施形態８に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００１８】
実施形態１０は、表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異をさらに含み、場合により非アスパラギンアミノ酸がグルタミンである、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００１９】
実施形態１１は、表面に露出したアミノ酸が、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２、Ｓ２６、Ｓ７２、Ａ７５、Ｋ７９、Ｓ１００、もしくはＳ１１１の変異、または非Ｈ．ピロリフェリチンにおける類似のアミノ酸である、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００２０】
実施形態１２は、表面に露出したアミノ酸の変異が、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２Ｃ、Ｓ２６Ｃ、Ｓ７２Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｋ７９Ｃ、Ｓ１００Ｃ、もしくはＳ１１１Ｃ、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける類似のアミノ酸である、実施形態１１に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００２１】
実施形態１３は、免疫刺激性部分が、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８のアゴニストである、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００２２】
実施形態１４は、免疫刺激性部分がＴＬＲ９のアゴニストである、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００２３】
実施形態１５は、免疫刺激性部分とフェリチンタンパク質との間にリンカーをさらに含む、実施形態１または３〜１４のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００２４】
実施形態１６は、リンカーが、マレイミド部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、およびジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）部分の１つ、２つ、または３つを含む、実施形態１５に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００２５】
実施形態１７は、フェリチンタンパク質とインフルエンザポリペプチドとの間にペプチドリンカーをさらに含む、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
【００２６】
実施形態１８は、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドを含むフェリチン粒子である。
【００２７】
実施形態１９は、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドまたはフェリチン粒子、および薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【００２８】
実施形態２０は、フェリチンタンパク質および異なるインフルエンザポリペプチドを含む第２の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドをさらに含む、実施形態１９の組成物である。
【００２９】
実施形態２１は、インフルエンザポリペプチドが、インフルエンザＡ型に由来し、第２の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドのインフルエンザポリペプチドが、インフルエンザＢ型に由来するか、またはインフルエンザポリペプチドおよび第２のインフルエンザ−フェリチンポリペプチドのインフルエンザポリペプチドが、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、もしくはＨ１８に由来するか、またはインフルエンザポリペプチドの１つもしくは両方がサブタイプＨ１、Ｈ３、Ｈ７、もしくはＨ１０に由来する操作された安定化ステム抗原を含む、実施形態２０に記載の組成物である。
【００３０】
実施形態２２は、インフルエンザに対する免疫応答を誘発する方法において、またはインフルエンザに感染した対象の保護において使用するための、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド、フェリチン粒子、または組成物である。
【００３１】
実施形態２３は、インフルエンザに対する免疫応答を誘発する、またはインフルエンザ感染に対して対象を保護する方法であって、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の１つまたはそれ以上の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド、フェリチン粒子、または組成物を対象に投与する工程を含む方法である。
【００３２】
実施形態２４は、対象がヒトである、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド、フェリチン粒子、組成物、または方法である。
【００３３】
実施形態２５は、場合により核酸がｍＲＮＡである、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドをコードする核酸である。
【００３４】
追加の目的および利点は、以下の説明に記載され、ならびに／または説明から明白であり、または実践により学ぶことができるであろう。目的および利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘された要素および組合せによって実現および達成される。
【００３５】
前述の一般的説明および以下の詳細な説明は、単なる例示および説明であり、特許請求の範囲を制限するものではない。
【００３６】
本明細書に組み入れられ、本明細書の一部を構成する以下の図面は、特定の実施形態を例証し、説明と共に本明細書に記載する原理を説明するために役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１−１】図１Ａ−１Ｂは、代表的なＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株の配列比較および相同性を示す図である。（図１Ａ）ベクターＮＴＩ  ＡｌｉｇｎＸソフトウェアを用いた、候補抗原性ＨＡポリペプチドの配列アライメント。白地に黒：所定の位置で完全に保存された残基に由来するコンセンサス残基。黒地に白：所定の位置で１個の残基が５０％を超えて出現することに由来するコンセンサス残基。白地に黒の下線および太字：所定の位置でコンセンサス残基に弱く類似した残基。二重下線およびイタリックの白地に黒：所定の位置で類似した残基のブロックに由来するコンセンサス残基。白地に黒の太字：類似しない残基。示された配列は、以下の配列のＨＡ部分＋Ｃ末端でのリンカーのセリンである：ＣＡ０９  ＨＡ−Ｎｐ＝配列番号１５の残基１〜５１９。ＣＯＢＲＡ  Ｐ１  ＨＡ−Ｎｐ＝配列番号２７の残基１〜５１９。ＣＯＢＲＡ  Ｘ６  ＨＡ−Ｎｐ＝配列番号２９の残基１〜５１８。ＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐ＝配列番号１の残基１〜５１８。ＨＫ７７  ＨＡ−Ｎｐ＝配列番号１８の残基１〜５１９。ＦＭ４７  ＨＡ−Ｎｐ＝配列番号１７の残基１〜５１９。ＤＶ５７  ＨＡ−Ｎｐ＝配列番号２１の残基１〜５１８。ＭＡＬ５４  ＨＡ−Ｎｐ＝配列番号１６の残基１〜５１９。（図１Ｂ）列挙されたインフルエンザ株由来のＨＡタンパク質配列について、近隣結合法（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ）を用いて作製された樹状図。矢印は、これらの配列からＨＡ−フェリチンナノ粒子を生成し、マウスにおけるそれらの免疫原性を試験することによって評価のための候補として選択された株を示す。
【図１−２】図１−１の続き。
【図１−３】図１−２の続き。
【図２】フェリチン上の操作された表面露出システイン（Ｃｙｓ）を示す図である。表面露出アミノ酸を置き換える変異から生じるシステインの位置は、フェリチンナノ粒子との関連で示される。
【図３Ａ】Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストのフェリチンへのコンジュゲーションを示す図である。（図３Ａ）マレイミド反応性基を有するＰＥＧ４リンカーを介してフェリチンの表面露出アミノ酸を置き換える変異から生じるシステインへのＳＭ７／８ａ小分子のコンジュゲーションの結果は、フェリチンナノ粒子との関連において示される。
【図３Ｂ】Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストのフェリチンへのコンジュゲーションを示す図である。（図３Ｂ）フェリチンの表面露出アミノ酸を置き換える変異から生じるシステインへのＣｐＧ（配列番号２３０）のコンジュゲーションの結果は、２ステップクリックケミストリーを用いたフェリチンナノ粒子との関連において、マレイミド−ＤＢＣＯ二官能性リンカーおよびアジド官能化ＣｐＧ試薬で示される。
【図４Ａ】フェリチンに対するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストのコンジュゲーションを示す図である。（図４Ａ）マレイミド−ＤＢＣＯ二官能性リンカーおよびアジド官能化３Ｍ−０１２試薬を介した２ステップクリックケミストリー反応を用いて、フェリチンの表面露出システインにコンジュゲートしたＨＡポリペプチドおよび３Ｍ−０１２を含むフェリチンナノ粒子のモデル。
【図４Ｂ】フェリチンに対するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストのコンジュゲーションを示す図である。（図４Ｂ）マレイミド−ＤＢＣＯ二官能性リンカーおよびアジド官能化ＣｐＧ試薬を用いた２ステップクリックケミストリー反応を用いて、フェリチンの表面露出システインにコンジュゲートしたＨＡポリペプチドおよびＣｐＧ（配列番号２３１）を含むフェリチンナノ粒子のモデル。
【図５】特定のフェリチンナノ粒子構築物のフェリチン部分内のトリプシン切断部位を示す図である。いくつかのフェリチンナノ粒子は、アジュバントのコンジュゲーションのための不対表面露出システインに加えてトリプシン切断部位を含む。図５に示されるアミノ酸配列は、複数の構築物に共通の配列を示す「一般化された」配列である。例えば、配列番号１４の残基５１９〜６９４は、図５に示される「一般化された」配列を含む。「ＸＸＸ」配列は、インフルエンザポリペプチドを表す。この配列に存在するフェリチンＳ１１１Ｃ変異の位置もまた示される。
【図６】図６Ａ−６Ｂは、コンジュゲーション有りまたは無しでのゲルシフトおよび質量分析（ＭＳ）の結果を示す図である。（図６Ａ）マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションの存在（＋）または不存在（−）におけるＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（配列番号４３）のゲルシフトおよび質量分析の結果。（図６Ｂ）マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションの存在（＋）または不存在（−）におけるＨ５／ｈＣｏｂｒａ２−Ｎｐ（配列番号３２）のゲルシフトおよび質量分析の結果。
【図７Ａ】コンジュゲーション有りまたは無しでの、さらなるゲルシフトの結果を示す図である。（図７Ａ）マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションを伴うまたは伴わないペプチドＮ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ）処理後のＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐのゲルシフトの結果、またはマレイミド−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯおよびアジド−ＣｐＧを用いる２ステップクリックケミストリーによる結果。
【図７Ｂ】コンジュゲーション有りまたは無しでの、さらなるゲルシフトの結果を示す図である。（図７Ｂ）２ステップクリックケミストリーによる、マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａまたはマレイミド−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯおよびアジド−ＣｐＧのいずれかへのコンジュゲーション有りまたは無しでの、トリプシン処理後のＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐについてのゲルシフト結果。
【図８Ａ】マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａのＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐへのコンジュゲーション有りまたは無しでの質量スペクトルを示す図である。（図８Ａ）ＰＮＧａｓｅ処理後のＭＳデータは、マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションの前後におけるＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐの質量を示す。
【図８Ｂ】マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａのＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐへのコンジュゲーション有りまたは無しでの質量スペクトルを示す図である。（図８Ｂ）Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐをトリプシンで処理した後のＭＳデータは、マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションの前後における切断されたフェリチンの質量を示す。
【図９】マレイミド−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯリンカーのＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐへのコンジュゲーション有りまたは無しでの質量スペクトルを示す図である。Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐへのマレイミド−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯリンカー付加をリンカー添加後のＭＳにより測定した質量変化により確認した。
【図１０】２ステップクリックケミストリーによるＣｐＧのコンジュゲーションの前およびその種々の段階でのＨ１／Ｓｔｅｍ−ＮｐのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。「アジド−ＣｐＧコンジュゲーション後」とは、２ステップクリック反応の最終生成物を指す。
【図１１】３Ｍ−０１２を含むリンカーのＮＣ９９  ＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐ構築物へのコンジュゲーションの特徴付けを示す図である。ＷＴレーンおよび＋ＴＥＶレーンにおける構築物は、配列番号１３の配列を有し、Ｓ２６Ｃは、配列番号１０を指し、Ｓ７２Ｃは、配列番号１１を指し、Ａ７５Ｃは、配列番号１２を指し、Ｓ１１１Ｃは、配列番号９を指す。ＷＴを除く全ての試料をタバコエッチ秒ウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）で処理した。
【図１２−１】図１２Ａ−１２Ｅは、還元またはコンジュゲーション有りまたは無しでの、種々の構築物の質量スペクトルを示す図である。（図１２Ａ）還元前のＳ１１１Ｃを含むＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ。（図１２Ｂ）還元後のＳ１１１Ｃを含むＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ。還元後に観察された質量（１１５Ｄａ）の減少は、システインの反応性を阻害する翻訳後修飾の除去と一致する。（図１２Ｃ）３Ｍ０１２とのコンジュゲーション有りまたは無しでの、ＮＣ９９  ＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐ−Ｓ２６Ｃナノ粒子（配列番号１０）の質量スペクトル。（図１２Ｄ）３Ｍ０１２へのコンジュゲーション有りまたは無しでの、ＮＣ９９  ＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐ−Ａ７５Ｃナノ粒子（配列番号１２）の質量スペクトル。（図１２Ｅ）３Ｍ０１２へのコンジュゲーション有りまたは無しでの、ＮＣ９９  ＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐ−Ｓ１１１Ｃナノ粒子（配列番号９）の質量スペクトル。
【図１２−２】図１２−１の続き。
【図１２−３】図１２−２の続き。
【図１２−４】図１２−３の続き。
【図１３−１】図１３Ａ−１３Ｆは、ＳＭ７／８ａ、３Ｍ０１２、またはＣｐＧへのコンジュゲーション有りまたは無しでの、Ｈ１／Ｓｔｅｍ−ＮｐまたはＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐのナノ粒子のネガティブ染色電子顕微鏡（ＥＭ）画像を示す図である。（図１３Ａ）コンジュゲートしていないＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ。（図１３Ｂ）Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＳＭ７／８ａコンジュゲート。（図１３Ｃ）Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＣｐＧコンジュゲート。（図１３Ｄ）ＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐ（配列番号９）。（図１３Ｅ）ＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐ−３Ｍ０１２コンジュゲート。（図１３Ｆ）．ＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐ−ＣｐＧコンジュゲート。
【図１３−２】図１３−１の続き。
【図１４−１】図１４Ａ−１４Ｃは、Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＳＭ７／８ａコンジュゲート（図１４Ａ）、Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＣｐＧコンジュゲート（図１４Ｂ）、またはコンジュゲートしていないＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（図１４Ｃ）の動的光散乱（ＤＬＳ）分析を示す図である。
【図１４−２】図１４−１の続き。
【図１４−３】図１４−２の続き。
【図１５Ａ】示される混合アジュバントを用いて製剤化された、または図３Ａ−Ｂに示されるように、ＰＥＧ４リンカーを介してＳＭ７／８ａもしくはＣｐＧなどのＴＬＲアゴニストにコンジュゲートされたＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐに対する抗体応答を示す図である。血清を免疫後５週間（第０週および第３週）でマウス（ｎ＝５）から回収し、抗体力価を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。このデータは、Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＴＬＲ−アゴニストコンジュゲートの自己アジュバント特性を実証する。図１５Ａは、Ｈ１／ニューカレドニア／２０／１９９９  ＨＡ三量体に対するＥＬＩＳＡを示す。ＰＡＡ＝ポリアクリル酸、混合された等モル＝８３．３ｎｇのＳＭ７／８ａ（ＳＭ７／８をコンジュゲートしたフェリチンナノ粒子を用いて投与される用量に同等である）、高用量＝２１．８４μｇ（ＳＭ７／８をコンジュゲートしたフェリチンナノ粒子を用いて投与される用量よりも高い）。
【図１５Ｂ】示される混合アジュバントを用いて製剤化された、または図３Ａ−Ｂに示されるように、ＰＥＧ４リンカーを介してＳＭ７／８ａもしくはＣｐＧなどのＴＬＲアゴニストにコンジュゲートされたＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐに対する抗体応答を示す図である。血清を免疫後５週間（第０週および第３週）でマウス（ｎ＝５）から回収し、抗体力価を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。このデータは、Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＴＬＲ−アゴニストコンジュゲートの自己アジュバント特性を実証する。図１５Ｂは、Ｈ１／ステム三量体に対するＥＬＩＳＡを示す。混合等モル＝８５０ｎｇのＣｐＧ（ＣｐＧをコンジュゲートしたフェリチンナノ粒子を用いて投与される用量に同等である）、高用量＝２０μｇのＣｐＧ。
【図１６−１】図１６Ａ−１６Ｃは、コンジュゲートされたまたは分離した３Ｍ−０１２（配列番号９）有りまたは無しでの、ＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐを用いて得られた力価の比較を示す図である。ＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐ−３Ｍ０１２をコンジュゲートしたナノ粒子（０．２２μｇ／用量）に対する抗体応答をマウスにおいて試験した。混合対照には、ＨＡ−Ｎｐ（０．２２μｇ／用量）と１０μｇの３Ｍ０１２（典型的な文献用量）の混合物、およびＨＡ−Ｎｐ（０．２２μｇ／用量）と１．７ｎｇの３Ｍ０１２（コンジュゲートと等モルマッチ）の混合物が含まれた。追加の対照には、一致したＨＡ含量（０．１７μｇのＨＡ／用量）で投薬される、コンジュゲートされていないＨＡ−ＮｐおよびＩＩＶが含まれた。ＥＬＩＳＡエンドポイント力価（図１６Ａ）、偽ウイルス（ＰｓＶ）中和ＩＣ５０力価、および（図１６Ｂ）血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価（図１６Ｃ）に基づいて、ＨＡ−Ｎｐ−３Ｍ０１２コンジュゲートは、等モル混合対照よりも有意に強い抗体応答を誘導した。コンジュゲートされたナノ粒子はまた、コンジュゲートされていないナノ粒子およびＩＩＶ標準治療よりも強い応答（ＥＬＩＳＡ）および強い中和抗体応答（ＰｓＶ）を誘導したが、この結果は、ＨＡＩアッセイでは統計学的に有意ではなかった。アッセイは、ブーストの２週間後からの血清のものである。全試料を３重にして実験した。中央値±ＳＥＭをグラフにする。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図１６−２】図１６−１の続き。
【図１７−１】図１７Ａ−１７Ｃは、コンジュゲートされたまたは分離したＣｐＧ（配列番号９）有りまたは無しでの、ＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐを用いて得られた力価の比較を示す図である。ＨＡ−Ｎｐ−ＣｐＧをコンジュゲートしたナノ粒子（０．２２μｇ／用量）に対する抗体応答をマウスにおいて試験した。混合対照には、ＨＡ−Ｎｐ（０．２２μｇ／用量）と２０μｇのＣｐＧ（典型的な治療用量）の混合物、およびＨＡ−Ｎｐ（０．２２μｇ／用量）と２１ｎｇのＣｐＧ（コンジュゲートと等モルマッチ）の混合物が含まれた。追加の対照には、一致したＨＡ含量（０．１７μｇのＨＡ／用量）で投薬される、コンジュゲートされていないＨＡ−ＮｐおよびＩＩＶが含まれた。ＥＬＩＳＡエンドポイント力価（図１７Ａ）および偽ウイルス中和ＩＣ５０力価（図１７Ｂ）に基づいて、コンジュゲートは、マッチさせた混合物、コンジュゲートされていない粒子、またはＩＩＶよりも強い結合および中和抗体応答を誘導した。また、ＨＡ−Ｎｐ−ＣｐＧコンジュゲートは、等モル混合対照よりも有意に強いＨＡＩ力価（図１７Ｃ）を誘導した。さらに、ＨＡＩ力価は、コンジュゲートされていないＨＡ−ＦｅｒｒおよびＩＩＶよりも２．６倍および３．０倍高かったが、これらの結果は有意ではなかった。ＥＬＩＳＡおよびＰｓＶアッセイは、ブーストの２週間後の血清のものであり、ＨＡＩアッセイは、ブーストの５週間後の血清のものであった。全試料を３重にして実験し、中央値±ＳＥＭをグラフにした。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図１７−２】図１７−１の続き。
【図１８−１】図１８Ａ−１８Ｃは、６つの進化的に分岐したＨ１血球凝集素（ＨＡ）抗原および２つの計算的に生成した（ＣＯＢＲＡ）抗原に由来する自己集合ＨＡ−フェリチンナノ粒子の特徴付けを示す図である。（図１８Ａ）ナノ粒子サイズおよび多分散性（「分散性」）は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定された。（図１８Ｂ）ＨＡ−ナノ粒子の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色により評価された。（図１８Ｃ）ナノ粒子の完全性は、８０，０００倍のネガティブ染色電子顕微鏡により可視化された。ＦＭ４７＝Ａ／フォートモンマス／１−ＪＹ２／１９４７、ＭＡＬ５４＝Ａ／マレーシア／３０２／１９５４、ＤＶ５７＝Ａ／デンバー／１９５７（ＤＶ５７）、ＨＫ７７＝Ａ／香港／１１７／１９７７、ＮＣ９９＝Ａ／ニューカレドニア／２０／９９、ＣＡ０９＝Ａ／カリフォルニア／４／２００９。ＣＯＢＲＡ  Ｐ１およびＣＯＢＲＡ  Ｘ６は、Ｃａｒｔｅｒ  ＤＭら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ９０：４７２０〜４７３４頁（２０１６）によって最近記載された複数の配列から計算により生成されたコンセンサスである。配列番号については、図１Ａ〜図１Ｂの凡例を参照されたい。
【図１８−２】図１８−１の続き。
【図１９−１】図１９Ａ−１９Ｈは、種々のＨＡ−フェリチンナノ粒子によって誘発される免疫応答の効力および幅を示す図である（配列番号については図１Ａ〜図１Ｂの凡例を参照されたい）。示されたＨＡ−Ｎｐワクチンを用いた免疫から６週間後のマウス由来血清の血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価（ｌｏｇ２）を多様なＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスのパネルに対してアッセイした。マウス（ｎ＝５）を第０週および第３週に血球凝集素ナノ粒子（ＨＡ−Ｎｐｓ）を用いて免疫した。破線は、アッセイの検出限界を示す。（図１９Ａ〜１９Ｅ）Ｒｉｂｉアジュバントを用いたデータ。（図１９Ｆ〜１９Ｈ）ＡＦ０３アジュバントを用いたデータ。ｘ軸は、基準年（１９３４〜２０１３年）のＨ１Ｎ１インフルエンザ株のパネルを示す。表２は、各年に対応する株の完全な名称を示す。アスタリスクは、適合株を示す。
【図１９−２】図１９−１の続き。
【図１９−３】図１９−２の続き。
【図１９−４】図１９−３の続き。
【図２０−１】図２０Ａ−２０Ｆは、ＨＡ−フェリチンナノ粒子によって誘導されるＨＡ抗体応答を示す図である。（図２０Ａ）マウス［ｎ＝５］を、Ｓｉｇｍａアジュバントシステム（カタログ番号  Ｓ６３２２）を使用して、特定のナノ粒子またはナノ粒子の組合せを用いて免疫した。ＩＩＶとは、インフルエンザ不活化ワクチンを指す。（図２０Ｂ−Ｆ）抗体応答は、Ａ／フォートモンマス／１／１９４７（図２０Ｂ）、Ａ／マレーシア／３０２／１９５４（図２０Ｃ）、Ａ／香港／１１７／１９７７（図２０Ｄ）、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（図２０Ｅ）、またはＡ／カリフォルニア／４／２００９（図２０Ｆ）からＨＡ三量体に対するＥＬＩＳＡ力価を決定することによって測定された。ＥＬＩＳＡ力価は、最初の免疫の５週間後に測定された。試験した血清希釈の最低値は、点線で示されるように検出のアッセイ限界を設定する。白丸は、マウスに投与されたナノ粒子の起源の株とＥＬＩＳＡによりアッセイされた株との間の一致を示す。
【図２０−２】図２０−１の続き。
【図２０−３】図２０−２の続き。
【図２１−１】図２１Ａ−２１Ｈは、ＨＡＩ力価のアッセイで測定した、マウスに投与された複数のフェリチンナノ粒子のＨＡ混合物に対する抗体応答を示す図である。（図２１Ａ〜２１Ｂ）二価の組合せ。（図２１Ｃ〜２１Ｅ）三価の組合せ。（図２１Ｆ〜２１Ｈ）四価の組合せ。一連の分岐型Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスのＨＡＩ力価（ｌｏｇ２）をアッセイした。マウス（ｎ＝５）を第０週および第３週にアジュバントを用いて、示されたＨＡ−ナノ粒子の組合せで免疫した。二価組合せＣＯＢＲＡ  Ｘ６＋ＣＯＢＲＡ  Ｐ１  ＨＡ−Ｎｐｓは、一価ＣＯＢＲＡ  ＨＡ−Ｎｐの評価と一致させるために、ＡＦ０３アジュバントを用いて試験された。同様に、個々の株ＨＡ−フェリチンナノ粒子の組合せは、一価の個々の株ＨＡ−Ｎｐｓの評価と一致させるためにＲｉｂｉアジュバントを使用された。アスタリスクは、マウスに投与されたナノ粒子の起源の株とＥＬＩＳＡによりアッセイされた株との間の一致を示す。ｘ軸は、基準年（１９３４〜２０１３年）のＨ１Ｎ１インフルエンザ株のパネルを示す。表２は、各年の株の完全な名称を示す。破線は、アッセイの検出限界を示す。
【図２１−２】図２１−１の続き。
【図２１−３】図２１−２の続き。
【図２１−４】図２１−３の続き。
【図２２−１】図２２Ａ−２２Ｆは、ＨＡＩ力価のアッセイにより測定した、ＲｉｂｉまたはＡＦ０３アジュバントを含む組成物に対する抗体応答を示す図である。ＡＦ０３アジュバントを用いて得られた結果（図２２Ｂ、２２Ｄ、および２２Ｆ）と比較して、Ｒｉｂｉアジュバントを用いて得られた結果（図２２Ａ、２２Ｃ、および２２Ｅ）は、ＮＣ９９とＣＡ０９  ＨＡ−Ｎｐｓの二価組合せ（図２２Ａ〜２２Ｂ）、ＮＣ９９、ＣＡ０９とＨＫ７７  ＨＡ−Ｎｐｓの三価組合せ（図２２Ｃ〜２２Ｄ）、ならびにＮＣ９９、ＣＡ０９とＦＭ４７  ＨＡ−Ｎｐｓの三価組合せ（図２２Ｅ〜２２Ｆ）について類似する。ＨＡＩ力価は、プライム投薬から６週間後にマウス血清で測定し、３週間後にブーストした。マウス［ｎ＝５］は、示されるように、ＲｉｂｉまたはＡＦ０３アジュバントのいずれかを用いて、ＨＡ−Ｎｐｓの組合せを用いて免疫された。アスタリスクは、マウスに投与されたナノ粒子の起源の株とＥＬＩＳＡによりアッセイされた株との間の一致を示す。ｘ軸は、基準年（１９３４〜２０１３年）のＨ１Ｎ１インフルエンザ株のパネルを示す。表２は、各年の株の完全な名称を示す。破線は、アッセイの検出限界を示す。
【図２２−２】図２２−１の続き。
【図２２−３】図２２−２の続き。
【図２３−１】図２３Ａ−２３Ｃは、ＨＡＩ力価のアッセイによって測定された、卵で産生されたＮＣ９９およびＣＡ０９不活化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ）によって誘発された比較抗体応答を示す図である。（図２３Ａ）ＮＣ９９  ＩＩＩＶ。（図２３Ｂ）ＣＡ０９  ＩＩＶ。（図２３Ｃ）ＮＣ９９＋ＣＡ０９  ＩＩＶ。多様なＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスのパネルに対して、単一成分または同時投与として、示されたＩＩＶワクチンによる免疫から６週間後のマウス由来血清の血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価（ｌｏｇ２）。マウス（ｎ＝５）は、Ｒｉｂｉアジュバントを用いて、第０週および第３週に各ワクチンの１７０ｎｇ（ＨＡ含有量）で免疫した。ｘ軸は、１９３４年から２０１３年までの基準年で試験したＨ１Ｎ１インフルエンザ株のパネルを示す（表２も参照されたい）。ｘ軸は、基準年（１９３４〜２０１３年）に試験されたＨ１Ｎ１インフルエンザ株のパネルを示す。表２は、各年の株の完全な名称を示す。破線は、アッセイの検出限界を示す。
【図２３−２】図２３−１の続き。
【図２４−１】図２４Ａ−２４Ｄは、ＨＡＩ力価のアッセイにより測定した、ＨＡ−フェリチンナノ粒子組成物またはＩＩＶを用いたフェレットの免疫後の種々のインフルエンザウイルスに対する抗体応答を示す図である。ＡＦ０３アジュバントと以下のものと混合した２回の免疫後のフェレット（ｎ＝１２匹／群）由来の血清のＨＡＩ力価（ｌｏｇ２）：図２４Ａ：ＰＢＳ単独、図２４Ｂ：Ａ／カリフォルニア／２００９  ＩＩＶ、図２４Ｃ：ＮＣ９９＋ＣＡ０９＋ＨＫ７７  ＨＡ−Ｎｐｓ、および図２４Ｄ：ＣＯＢＲＡ−Ｘ６＋Ｐ１＋ＨＫ７７  ＨＡ−Ｎｐｓ。図２４Ｅは、ＨＡ−フェリチンナノ粒子組成物、ＩＩＶ、またはＰＢＳで免疫したフェレットの異種負荷。フェレットを図２４Ａ−Ｅに記載されるように免疫し、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の１０４．６５倍で１ｍＬのＡ／フォートモンマス／１／１９４７ウイルスを鼻腔内接種することにより、最終免疫から４週間後に１９４７年フォートモンマスウイルスで負荷した。ウイルス力価は、負荷後の７日間にわたって鼻腔洗浄液で定量化された。破線は、アッセイの検出限界を示す。ウイルス力価は、ＨＡ−Ｎｐｓ組合せで免疫したフェレットでは、ワンテール非対ｔ検定およびワンウェイＡＮＯＶＡ［Ｆ（３，４４）＝５．１８、ｐ＝０．００３７５］によって、ビヒクル（ＰＢＳ）対照と比較して、負荷から５日後に有意に低下したが、ＣＡ０９  ＩＶでは低下しなかった。＊＊＊＝Ｐ≦０．００１、スチューデントｔ検定による。
【図２４−２】図２４−１の続き。
【図２４−３】図２４−２の続き。
【図２５−１】図２５Ａ−Ｃは、混合したＡＦ０３アジュバントとともに製剤化された５０μｇのＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ、または２００μｇのＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（アジュバント対照なし）、または２００μｇのＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＳＭ７／８ａコンジュゲート（図３Ａに示される）、または２００μｇのＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＣｐＧコンジュゲート（図３Ｂに示される）で免疫した後のカニクイザル（Macaca fascicularis）の抗体応答を示す図である。図２５Ａは、０、４および１０週目に免疫された、指示された時点でのＨ１／ニューカレドニア／２０／１９９９  ＨＡ三量体で被覆されたプレート上の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定されたＨＡ抗体力価を示す。図２５Ｂは、Ｈ１／ニューカレドニア／２０／１９９９  ＨＡおよびＮＡを用いてシュードタイプ化されたレンチウイルスの中和ＩＣ５０を示す。図２５Ｃは、Ｈ５／ベトナム／１２０３／２００４  ＨＡおよびＮＡを用いてシュードタイプ化されたレンチウイルスの中和ＩＣ５０を示す。このデータは、霊長類モデルにおけるＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＴＬＲ−アゴニストコンジュゲートの自己アジュバント特性を実証する。
【図２５−２】図２５−１の続き。
【図２６−１】図２６Ａ−２６Ｂは、コンジュゲートまたは分離された３Ｍ−０１２（配列番号９）有りまたは無しでの、ＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐで得られた力価の比較を示す図である。ＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐ−３Ｍ０１２をコンジュゲートしたナノ粒子に対する抗体応答は、０．１μｇ、０．５μｇ、２．５μｇ、および１２．５μｇの４用量であった。比較のために、混合対照およびコンジュゲートされていないナノ粒子を含めた。「等モル」混合対照および「高用量」混合対照に使用したＴＬＲアゴニストの量は、最初のコンジュゲーション試験で使用したアジュバントに対する抗原の比を維持するために計算された（「等モル」については１．７ｎｇの３Ｍ０１２または「高用量」については１０μｇのいずれかを伴う０．２２μｇのＨＡ−ＮＰ）。血清中和は、ＮＣ９９レンチウイルスレポーターアッセイ（左、図２６Ａ）およびＮＣ９９  ＨＡＩアッセイ（右、図２６Ｂ）において測定された。矢印は、２．５μｇ用量を強調し、ＨＡ−ＮＰ−３Ｍ０１２コンジュゲートは、５０００倍より少ない３Ｍ０１２アジュバントを含むにも関わらず、ＨＡ−ＮＰ＋３Ｍ０１２に対して同様の抗体力価を誘導した。平均値±標準誤差をグラフにする。
【図２６−２】図２６−１の続き。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本明細書には、インフルエンザに対する免疫のための抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドが提供される。抗原性ポリペプチドは、インフルエンザポリペプチドおよびフェリチンを含み、インフルエンザに対して対象にワクチン接種するために使用することができる。フェリチンは、別々に投与されるアジュバントの必要性を排除し、インフルエンザポリペプチドに対する免疫応答を誘発するのに必要な全アジュバントの量を潜在的に減少させるために、免疫刺激性分子、例えば、アジュバントへのコンジュゲーション（例えば、表面に露出したアミノ酸をシステインで置き換える変異を介して）を可能にする。抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドを含む粒子、組成物、およびキット、ならびにそれらの使用もまた提供され、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸もまた提供される。
【００３９】
Ａ．定義
「血球凝集素」または「ＨＡ」は、本明細書で使用される場合、宿主細胞膜上のシアル酸への結合に関与する任意のインフルエンザウイルスの糖タンパク質を指す（例示的な血球凝集素は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ０３４５１である）。ＨＡは、以下に記載されるＣＯＢＲＡ  Ｐ１、ＣＯＢＲＡ  Ｘ６およびＣＯＢＲＡ  Ｘ３などの抗ＨＡ抗体によって認識されるまたはそれを誘発することができる合成ポリペプチドを包含する。
【００４０】
「ＨＡステム」は、本明細書で使用される場合、ＨＡエクトドメイン内のＨＡの保存領域から設計され、無傷のＨＡ頭部を欠損する、操作されたインフルエンザポリペプチドを指す。「保存」は、この領域が、異なるＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザ株由来のＨＡ間で、全体としてのＨＡの配列同一性よりも有意に高い配列同一性を維持することを意味する。ＨＡステム抗原は、例えば、Ｉｍｐａｇｌｉａｚｚｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１５年９月１８日、３４９（６２５４）：１３０１〜６頁；Ｖａｌｋｅｎｂｕｒｇら、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．、２０１６年３月７日、６：２２６６６頁；Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａら、Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１５、６：３２９頁において詳細に考察される。
【００４１】
「ノイラミニダーゼ」または「ＮＡ」は、本明細書で使用される場合、ウイルスおよび細胞グリココンジュゲート由来の末端シアル酸残基の除去を触媒することに関与する任意のインフルエンザウイルスの糖タンパク質を指す（例示的なノイラミニダーゼは、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ０３４７２である）。
【００４２】
「Ｙ９８Ｆ変異」は、本明細書で使用される場合、シアル酸と直接接触する野生型ＨＡ配列中のチロシンのフェニルアラニンによる置き換えを指す。この変異によって生じるフェニルアラニンの位置を図１に示す。正確な位置は一部のＨＡサブタイプにおいて異なり得るが、配列アライメントまたは構造解析によって同定することができる。ＨＡ配列にＹ９８Ｆ変異が存在することは、対応する野生型ＨＡが、シアル酸と直接接触するチロシンを含むサブタイプであることを暗示している。
【００４３】
「フェリチン」または「フェリチンタンパク質」は、本明細書で使用される場合、Ｈ．ピロリフェリチン（配列番号２０８または２０９）、またはＰ．フリオスス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）フェリチン、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）フェリチン、もしくはヒトフェリチンのような本明細書で考察される別のフェリチンと検出可能な配列同一性を有し、鉄を例えば細胞内もしくは組織内で貯蔵する、または鉄を血流に運ぶ役目を果たすタンパク質を指す。重鎖および軽鎖（例えば、イラクサギンウワバおよびヒトフェリチン）として知られる２つのポリペプチド鎖として存在するフェリチンを含むそのような例示的なフェリチンを、以下で詳細に考察する。一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に、例えば表１（配列表）に開示されるフェリチン配列と少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む。フェリチンは、完全長の天然に存在する配列の断片であり得る。
【００４４】
「野生型フェリチン」は、本明細書で使用される場合、その配列が天然に存在する配列からなるフェリチンを指す。フェリチンはまた、完全長のフェリチン、または野生型フェリチンとはそのアミノ酸配列において１つまたはそれ以上の差を有するフェリチンの断片も含む。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「フェリチン単量体」は、他のフェリチン分子と集合していない単一のフェリチン分子（例えば、該当する場合、単一のフェリチン重鎖または軽鎖）を指す。「フェリチン多量体」は、複数の会合したフェリチン単量体を含む。「フェリチンタンパク質」は、単量体フェリチンおよび多量体フェリチンを含む。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「フェリチン粒子」は、球状形態に自己集合したフェリチンを指す。フェリチン粒子は時に、「フェリチンナノ粒子」または単に「ナノ粒子」と呼ばれる。一部の実施形態では、フェリチン粒子は、２４個のフェリチン単量体（または該当する場合、全体で２４個の重鎖および軽鎖）を含む。
【００４７】
「ハイブリッドフェリチン」は、本明細書で使用される場合、ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部を有するＨ．ピロリフェリチンを含むフェリチンを指す。ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部として使用される例示的な配列を、配列番号２１７として示す。ハイブリッドフェリチンでは、免疫刺激性部分の結合部位がフェリチン粒子表面上に均一に分布するように、ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部をＨ．ピロリフェリチンに融合することができる。「ウシガエルリンカー」は、本明細書で使用される場合、配列番号２１７の配列を含むリンカーである。ハイブリッドフェリチンはまた、時に「ｂｆｐＦｅｒｒ」または「ｂｆｐフェリチン」と呼ばれる。ウシガエル配列を含むいずれの構築物も、ウシガエル配列がなくとも、例えばリンカーまたは代替リンカーがなくとも提供することができる。例示的なウシガエルリンカー配列を、表１に提供する。表１はウシガエルリンカーを示すが、リンカーまたは代替リンカーを有しない同じ構築物を作製してもよい。
【００４８】
「Ｎ−グリカン」は、本明細書で使用される場合、タンパク質のＮ（アスパラギン）残基のアミド窒素でタンパク質に結合した糖質鎖を指す。そのため、Ｎ−グリカンは、Ｎグリコシル化のプロセスによって形成される。このグリカンは多糖類であり得る。
【００４９】
「グリコシル化」は、本明細書で使用される場合、タンパク質への糖質単位の付加を指す。
【００５０】
「免疫応答」は、本明細書で使用される場合、抗原またはワクチンのような刺激に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、または多形核細胞のような免疫系の細胞の応答を指す。免疫応答は、例えばインターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞を含む、宿主防御応答に関係する体の任意の細胞を含み得る。免疫応答は、生得のおよび／または適応免疫応答を含むがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、「保護的免疫応答」は、対象を感染から保護する（例えば、感染を防止する、または感染に関連する疾患の発生を防止する）免疫応答を指す。免疫応答を測定する方法は、当技術分野で周知であり、例えばリンパ球（例えば、ＢまたはＴ細胞）の増殖および／または活性、サイトカインまたはケモカインの分泌、炎症、抗体産生等を測定することを含む。「抗体応答」は、抗体が産生される免疫応答である。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「抗原」は、生物に曝露または投与した場合に、免疫応答を誘発する作用物質、および／またはＴ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子によって提示される場合）が結合する、もしくは抗体（例えば、Ｂ細胞によって産生される場合）に結合する作用物質を指す。一部の実施形態では、抗原は、生物において液性応答（例えば、抗原特異的抗体の産生を含む）を誘発する。あるいはまたは加えて、一部の実施形態では、抗原は、生物において細胞性応答（例えば、その受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞を含む）を誘発する。特定の抗原は、標的生物（例えば、マウス、ウサギ、霊長類、ヒト）の１つまたはいくつかのメンバーにおいて免疫応答を誘発し得るが、標的生物種の全てのメンバーにおいて誘発するわけではない。一部の実施形態では、抗原は、標的生物種のメンバーの少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％において免疫応答を誘発する。一部の実施形態では、抗原は、抗体および／またはＴ細胞受容体に結合するが、生物において特定の生理的応答を誘導しても誘導しなくてもよい。一部の実施形態では、例えば、抗原は、ｉｎ  ｖｉｖｏでそのような相互作用が起こるか否かによらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗体および／またはＴ細胞受容体に結合し得る。一部の実施形態では、抗原は、異種免疫原によって誘導される産物を含む、特異的液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。抗原は、本明細書に記載される抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド質を含む。
【００５２】
「免疫刺激性部分」は、本明細書で使用される場合、フェリチンまたは抗原性フェリチンポリペプチドに共有結合し、免疫系の構成要素を活性化することができる（単独で、またはフェリチンまたは抗原性フェリチンポリペプチドに結合した場合）部分を指す。例示的な免疫刺激性部分は、ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）、例えば、ＴＬＲ４、７、８、または９のアゴニストを含む。一部の実施形態では、免疫刺激性部分はアジュバントである。
【００５３】
「アジュバント」は、本明細書で使用される場合、抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する物質またはビヒクルを指す。アジュバントには、抗原を吸着させた無機質（例えば、ミョウバン、水酸化アルミニウム、またはリン酸塩）の懸濁液、抗原溶液を鉱油または水中で乳化させた油中水型または水中油型乳剤（例えば、フロイント不完全アジュバント）を挙げることができるがこれらに限定されない。時に、抗原性をさらに増強するために死菌マイコバクテリア（例えば、フロイント完全アジュバント）を含める。免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフ）もまた、アジュバントとして使用することができる（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；第６，３３９，０６８号；第６，４０６，７０５号；および第６，４２９，１９９号を参照されたい）。アジュバントはまた、Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）アゴニストおよび共刺激分子のような生物学的分子も含み得る。アジュバントは、組成物中の個別の分子として、または抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドに共有結合（コンジュゲート）して投与してもよい。
【００５４】
「抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、分子がインフルエンザポリペプチドに関して抗原性であるフェリチンおよびインフルエンザポリペプチドを含む分子を指す。抗原性は、より大きい構築物の一部としてのインフルエンザポリペプチドの特色であり得る。すなわち、構築物は、フェリチンを有しないインフルエンザポリペプチドがそうすることができるか否かによらず、インフルエンザポリペプチドに対する抗体を生成する抗原としての役目を果たすことができれば十分である。一部の実施形態では、インフルエンザポリペプチドおよびフェリチンは、融合タンパク質として遺伝子融合されている。一部の実施形態では、インフルエンザポリペプチドおよびフェリチンは、例えば化学コンジュゲーションによって非遺伝的に連結されている。
【００５５】
「自己アジュバント性」は、本明細書で使用される場合、フェリチンおよび免疫刺激性部分が同じ分子実体中にあるように、フェリチンおよびフェリチンに直接コンジュゲートされた免疫刺激性部分を含む組成物またはポリペプチドを指す。抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドを、免疫刺激性部分にコンジュゲートして、自己アジュバント性ポリペプチドを生成してもよい。
【００５６】
「表面に露出した」アミノ酸は、本明細書で使用される場合、該当する場合に、多量体形成後、タンパク質がその本来の三次元コンフォメーションにある場合に溶媒分子が接触することができる側鎖を有するタンパク質（例えば、フェリチン）中のアミノ酸残基を指す。このように、例えば２４量体を形成するフェリチンの場合、表面に露出したアミノ酸残基は、フェリチンが２４量体として、例えばフェリチン多量体またはフェリチン粒子として集合する場合に、その側鎖に溶媒が接触することができる残基である。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「対象」は、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「対象」はヒトを指す。一部の実施形態では、「対象」は非ヒト動物を指す。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類、昆虫、および／または虫を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、非ヒト対象は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、対象は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、および／またはクローンであり得る。本発明のある特定の実施形態では、対象は成体、青年期、または幼体である。一部の実施形態では、用語「個体」または「患者」は、「対象」と互換的に使用され、互換的であると意図される。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「ワクチン接種」または「ワクチン接種する」は、例えば病原体に対して免疫応答を生成することが意図される組成物の投与を指す。ワクチン接種は、病原体に対する曝露および／または１つもしくはそれ以上の症状の発生の前、間、および／または後に投与することができ、一部の実施形態では、病原体に対する曝露の前、間、および／または直後に投与することができる。一部の実施形態では、ワクチン接種は、ワクチン接種組成物の適切な間隔を空けた複数回の投与を含む。
【００５９】
本開示は、所定の核酸配列またはアミノ酸配列（参照配列）に対してそれぞれ、ある特定の程度の同一性を有する核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。
【００６０】
２つの核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同定されたヌクレオチドのパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。
【００６１】
用語「同一％」、「同一性％」、または類似の用語は、特に比較される配列間の最適なアライメントにおいて同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指すと意図される。前記パーセンテージは、純粋に統計学的であり、２つの配列間の差は、比較される配列の全長にわたって分布していてもよいが、必ずしもランダムに分布している必要はない。２つの配列の比較は通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアライメント後に前記配列を、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して比較することによって実行される。比較のための最適なアライメントは、手動で、またはＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２頁によるローカルホモロジーアルゴリズムの助けを借りて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３頁のローカルホモロジーアルゴリズムの助けを借りて、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，２４４４頁の類似性検索アルゴリズムの助けを借りて、または前記アルゴリズムを使用するコンピュータプログラムの助けを借りて（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ、およびＴＦＡＳＴＡ、  ｉｎ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）実行してもよい。
【００６２】
パーセンテージ同一性は、比較される配列が対応する同一の位置の数を決定する工程、この数を比較される位置の数（例えば、参照配列における位置の数）で除算する工程、およびこの結果に１００を乗算する工程によって得られる。
【００６３】
一部の実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％である領域に関して与えられる。例えば、参照核酸配列が２００ヌクレオチドからなる場合、同一性の程度は、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００ヌクレオチド、一部の実施形態では、連続ヌクレオチドに関して与えられる。一部の実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長にわたって与えられる。
【００６４】
所定の核酸配列またはアミノ酸配列に対してそれぞれ、特定の同一性の程度を有する核酸配列またはアミノ酸配列は、前記所定の配列の少なくとも１つの機能的特性を有することができ、例えば、一部の例では前記所定の配列と機能的に等価である。１つの重要な特性は、特に、対象に投与した場合にサイトカインとして作用する能力を含む。一部の実施形態では、所定の核酸配列またはアミノ酸配列に対して特定の同一性の程度を有する核酸配列またはアミノ酸配列は、前記所定の配列と機能的に等価である。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「キット」は、１つまたはそれ以上の化合物または組成物のような関連する構成要素、および溶媒、溶液、緩衝液、説明書、または乾燥剤のような１つまたはそれ以上の関連する材料の包装された組を指す。
【００６６】
Ｂ．抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド
本明細書には、インフルエンザポリペプチド、および表面に露出したアミノ酸をシステインで置き換える変異を含むフェリチンを含む抗原性ポリペプチドが提供される。ポリペプチドは、別個の分子として、および／または自己アジュバント性であり得るナノ粒子（例えば、フェリチン粒子）の一部として、アジュバントとともに投与される場合、抗原性であり得る。
【００６７】
１．ＨＡおよびＮＡポリペプチド
一部の実施形態では、インフルエンザポリペプチドは、全長または部分長のＨＡまたはＮＡを含むＨＡまたはＮＡポリペプチドである。任意のＨＡまたはＮＡポリペプチドを使用することができる。ＨＡまたはＮＡポリペプチドは、天然に存在してもよく、または天然から変化してもよい。一部の実施形態では、ＨＡは、Ｈ１〜Ｈ１８のいずれ１つに由来する。一部の実施形態では、ＮＡは、Ｎ１〜Ｎ１１のいずれか１つに由来する。
【００６８】
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、ＨＡエクトドメインを含む。ＨＡエクトドメインは、Ｈ１〜Ｈ１８を含むインフルエンザの任意のサブタイプに由来し得る。
【００６９】
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、ＨＡのステム領域を含む。ＨＡのステム領域は、Ｈ１〜Ｈ１８を含む任意のサブタイプのインフルエンザに由来し得る。
【００７０】
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、インフルエンザＡ型ウイルスに由来する。インフルエンザＡ型ウイルスは、Ａ／プエルトリコ／１９３４、Ａ／ワイス／１／１９４３、Ａ／フォートモンマス／１／１９４７（ＦＭ４７）、Ａ／マレーシア／３０２／５４（ＭＡＬ５４）、Ａ／デンバー／１／１９５７（ＤＶ５７）、Ａ／ニュージャージー／８／１９７６、Ａ／ＵＳＳＲ／９０／１９７７、Ａ／香港／１１７／１９７７（ＨＫ７７）、Ａ／ブラジル／１１／１９７８、Ａ／チリ／１／１９８３、Ａ／台湾／１／１９８６、Ａ／テキサス／３６／１９９１、Ａ／北京／２６２／１９９５、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（ＮＣ９９）、Ａ／ソロモン諸島／６／２００６、Ａ／ブリスベン／５９／２００７、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９（ＣＡ０９）、Ａ／バングラデシュ／２０２１／２０１２、またはＡ／ベトナム／３０５０／２０１３であり得る。
【００７１】
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、Ｈ１インフルエンザウイルスに由来する。一部の実施形態では、Ｈ１ウイルスは、Ａ／サウスカロライナ／１／１８である。
【００７２】
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、Ｈ２インフルエンザウイルスに由来する。一部の実施形態では、Ｈ２ウイルスは、１９５７年に流行したＨ２Ｎ２インフルエンザＡウイルスである。
【００７３】
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、Ｈ３インフルエンザウイルスに由来する。一部の実施形態では、Ｈ３インフルエンザウイルスは、Ｈ３Ｎ８ウイルスである。一部の実施形態では、Ｈ３Ｎ８ウイルスはウマ−オハイオ２００３である。一部の実施形態では、Ｈ３Ｎ８ウイルスは、ウマバリ２００５である。一部の実施形態では、Ｈ３Ｎ８ウイルスは、ウマ−アボイン２００３である。一部の実施形態では、Ｈ３インフルエンザウイルスは、Ｈ３Ｎ２ウイルスである。一部の実施形態では、Ｈ３Ｎ２ウイルスは、パース２００９である。一部の実施形態では、Ｈ３Ｎ２ウイルスは、ビクトリア２０１１である。
【００７４】
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、Ｈ５インフルエンザウイルスに由来する。一部の実施形態では、Ｈ５インフルエンザウイルスは、Ｈ５／Ｎ１ウイルスである。一部の実施形態では、Ｈ５／Ｎ１ウイルスは、インドネシア２００５である。一部の実施形態では、Ｈ５／Ｎ１ウイルスは、インドガン２００５である。一部の実施形態では、Ｈ５／Ｎ１ウイルスは、オオハクチョウ２００５である。一部の実施形態では、Ｈ５／Ｎ１ウイルスは、マガモ／華東２００３である。
【００７５】
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、インフルエンザＢ型ウイルスに由来する。一部の実施形態では、Ｂ型ウイルスは、ウィスコンシン２０１０である。一部の実施形態では、Ｂ型ウイルスは、マサチューセッツ２０１２である。一部の実施形態では、Ｂ型ウイルスは、プーケット２０１３である。一部の実施形態では、Ｂ型ウイルスは、ブリスベン２００８である。一部の実施形態では、ブリスベン２００８配列は、Ｄ１９７Ｎ変異を含む。この変異は、このナノ粒子の発現を改善することが見出され、Ｂ／ブリスベン／２００９およびＢ／プーケット／２０１３などの他の株において天然に存在する変異である。このアミノ酸は、シアル酸受容体との接触に関与している可能性がある。
【００７６】
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、Ｇｉｌｅｓ  ＢＭ  ａｎｄＲｏｓｓ  ＴＭ、  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９（１６）：３０４３〜５４頁（２０１１）またはＣａｒｔｅｒ  ＤＭら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、９０：４７２０〜４７３４頁（２０１６）の例に続いて生成された計算上最適化された広範反応性抗原（ＣＯＢＲＡ）を含む。
【００７７】
一部の実施形態では、ＣＯＢＲＡ配列は、ヒトＨ１Ｎ１インフルエンザ配列から生成される。一部の実施形態では、ＣＯＢＲＡ配列は、１９９９〜２０１２年に及ぶヒトＨ１Ｎ１インフルエンザ配列から生成される。１９９９〜２０１２年に及ぶヒトＨ１Ｎ１インフルエンザ配列から生成された例示的なＣＯＢＲＡ配列は、配列番号２９に含まれるＣＯＢＲＡ  Ｘ６である。一部の実施形態では、ＣＯＢＲＡ配列は、１９３３〜１９５７年および２００９〜２０１１年に及ぶヒトＨ１Ｎ１株＋１９３１〜１９９８年のブタＨ１Ｎ１インフルエンザ株から生成される。１９３３〜１９５７年および２００９〜２０１１年に及ぶヒトＨ１Ｎ１株＋１９３１〜１９９８年のブタＨ１Ｎ１インフルエンザ株から生成された例示的なＣＯＢＲＡ配列は、配列番号２７に含まれるＣＯＢＲＡ  Ｐ１である。
【００７８】
一部の実施形態では、ＣＯＢＲＡ配列はＸ３である。一部の実施形態では、ＣＯＢＲＡ配列は、Ｈ５Ｎ１から生成されたｈＣＯＢＲＡ−２である。
【００７９】
ＨＡ受容体結合部位（Ｙ９８Ｆ）を除去する変異は、ＷＨＩＴＴＬＥら、Ｗｈｉｔｔｌｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１１（８）：４０４７〜４０５７頁（２０１４）に記載された。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、Ｙ９８Ｆ変異を含むように改変することができる。上記のＨＡのいずれのも、Ｙ９８Ｆ変異を含むように改変することができる。一部の実施形態では、ＨＡは、Ｈ１ニューカレドニア／１９９９（ＮＣ９９）ウイルスに由来し、Ｙ９８Ｆ変異を含む。
【００８０】
２．フェリチン
フェリチンタンパク質は、複数の個々の単量体を含む球状のタンパク質複合体へと自己集合する。自己集合したフェリチン複合体は、フェリチン粒子またはナノ粒子と呼ぶことができる。
【００８１】
フェリチン遺伝子は、多くの種において見出され、配列の変動はあるものの一般的に保存された高度のアルファヘリックス構造を示す。そのため、任意の特に記載されたフェリチンとのその配列同一性にも関わらず、細菌、昆虫、およびヒトフェリチンを含む任意のフェリチンを本発明において使用することができる。
【００８２】
一部の実施形態では、フェリチンは、細菌、昆虫、真菌、鳥類、または哺乳動物である。一部の実施形態では、フェリチンはヒトである。一部の実施形態では、フェリチンは細菌である。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｈ．ピロリフェリチンである。
【００８３】
一部の実施形態では、フェリチンは、軽鎖および／または重鎖フェリチンである。一部の実施形態では、フェリチンは、場合により本明細書に記載される１つまたはそれ以上の改変を有する、ヒト重鎖フェリチン（ＦＴＨ１、ＧＥＮＥ  ＩＤ番号：２４９５）、またはヒト軽鎖フェリチン（ＦＴＬ、ＧＥＮＥ  ＩＤ番号：２５１２）である。一部の実施形態では、フェリチンは、場合により本明細書に記載される１つまたはそれ以上の変異を有する、イラクサギンウワバ重鎖フェリチン（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ９７０２９１．１）またはイラクサギンウワバ軽鎖フェリチン（ＡＹ９７０２９２．１）である。一部の実施形態では、フェリチンナノ粒子は、重鎖フェリチンおよび軽鎖フェリチンの全体で２４個のサブユニット、例えば１２個の重鎖サブユニットおよび１２個の軽鎖サブユニットを含む。一部の実施形態では、フェリチンは、表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含む。
【００８４】
一部の実施形態では、分子がインフルエンザポリペプチドに対して抗原性であるのに十分な長さのインフルエンザポリペプチドを含む抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドが提供される。
【００８５】
一部の実施形態では、抗原性フェリチンポリペプチドは、軽鎖フェリチンおよびインフルエンザポリペプチドを含む。一部の実施形態では、抗原性フェリチンポリペプチドは、重鎖フェリチンおよびインフルエンザポリペプチドを含む。一部の実施形態では、軽鎖フェリチンおよびインフルエンザポリペプチドは、インフルエンザポリペプチドを含まない重鎖フェリチンと集合することができる。一部の実施形態では、重鎖フェリチンおよびインフルエンザポリペプチドは、インフルエンザポリペプチドを含まない軽鎖フェリチンと集合することができる。非フェリチンポリペプチド（例えば、インフルエンザポリペプチド）を含まないフェリチンは、「裸のフェリチン」と呼ばれる。
【００８６】
一部の実施形態では、抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドは、重鎖フェリチンおよびインフルエンザポリペプチド、または軽鎖フェリチンおよびインフルエンザポリペプチドを含む。このようなポリペプチドは、単一のフェリチン多量体または粒子上の同一もしくは異なるインフルエンザポリペプチドの２つの発現を可能にするために組み合わせることができる。一部の実施形態では、２つの異なるインフルエンザポリペプチドは、２つの異なる感染性因子、例えば、異なる株またはタイプのインフルエンザから得られ、ナノ粒子への集合のために重鎖および軽鎖フェリチンに結合される。
【００８７】
一部の実施形態では、抗原性フェリチンポリペプチドは、二価ワクチンを生成するために、軽鎖フェリチンおよび第２のインフルエンザポリペプチドと集合した重鎖フェリチンおよび第１のインフルエンザポリペプチドを含む。一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の変異を有するＨ．ピロリフェリチン（例示的なＨ．ピロリフェリチン配列に関しては、配列番号２０８または２０９を参照されたい）である。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチン（または他の細菌フェリチン）とヒトフェリチンとの間の配列相同性がより低いことにより、ワクチンプラットフォームとして使用した場合に自己免疫の可能性を減少させ得る（Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｃｅｌｌ  １６２，１０９０〜１１００頁（２０１５）を参照されたい）。
【００８８】
一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の変異を有するピュロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）フェリチン（ＮＣＢＩ  ｓｅｑ  ＷＰ＿０１１０１１８７１．１）である。
【００８９】
一部の実施形態では、フェリチンは、野生型フェリチンと７０％より高い、７５％より高い、８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、９７％より高い、９８％より高い、または９９％より高い同一性を有する配列を含む。
【００９０】
Ａ）フェリチン変異
一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書において開示される１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の変異は、例えば野生型フェリチンのアミノ酸配列の変化、および／またはＮもしくはＣ末端での挿入を含む。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、またはそれより多くの異なるアミノ酸が、野生型フェリチンと比較してフェリチンにおいて変異している（一部の実施形態では、任意のＮ末端挿入に加えて）。１つまたはそれ以上の変異は、例えば以下で詳細に考察するように、フェリチンの機能的特性を変化させることができる。一般的に、変異は単に、対応する野生型フェリチンと比較した配列の差（置換された、付加された、または欠失されたアミノ酸残基または複数の残基のような）を指す。
【００９１】
（１）コンジュゲーションのためのシステイン
一部の実施形態では、フェリチンを、免疫刺激性部分および／またはインフルエンザポリペプチドのコンジュゲーションのための化学ハンドルを提供するように変異させる。これは、表面に露出した非システインアミノ酸をシステインに置き換える変異によって達成することができる。誤解を避けるため、「表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える」のような表現は、野生型または変異前配列における表面に露出したアミノ酸がシステインではないことを必然的に暗示している。免疫刺激性部分またはインフルエンザポリペプチドのコンジュゲーションのための化学ハンドルを提供する別のアプローチは、リンカーのようなアミノ酸のセグメントをフェリチンのＮまたはＣ末端に含めることであり、アミノ酸のセグメントはシステインを含む。一部の実施形態では、このシステイン（表面に露出したアミノ酸を置き換えるか、またはＮもしくはＣ末端リンカーにある）は不対であり、このことは、これがジスルフィド結合を形成するために適切なパートナーシステインを有していないことを意味する。一部の実施形態では、このシステインは、フェリチンの二次構造を変化させない。一部の実施形態では、このシステインは、フェリチンの三次構造を変化させない。
【００９２】
一部の実施形態では、このシステインを使用して、免疫刺激性部分のような作用物質をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、このシステインは、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン上のこのシステインにコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン粒子の表面上で露出する。一部の実施形態では、このシステインは、投与後にフェリチン粒子が集合する間、対象の分子および細胞と相互作用することができる。
【００９３】
一部の実施形態では、このシステインの存在により、１つまたはそれ以上の免疫刺激性部分、例えばアジュバントのコンジュゲーションが可能となる。一部の実施形態では、免疫刺激性部分のコンジュゲーションは、このシステインの非存在下では起こらない。
【００９４】
一部の実施形態では、システインに置き換えられる非システインアミノ酸は、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２、Ｓ７２、Ａ７５、Ｋ７９、Ｓ１００、およびＳ１１１から選択される。このように、一部の実施形態では、システインのために置き換えられる表面に露出したアミノ酸は、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２、Ｓ２６、Ｓ７２、Ａ７５、Ｋ７９、Ｓ１００、またはＳ１１１に対応するアミノ酸残基である。類似のアミノ酸を、ペアワイズまたは構造アライメントによって、非Ｈ．ピロリフェリチンにおいて見出すことができる。一部の実施形態では、システインに置き換えられる非システインアミノ酸は、ヒト軽鎖フェリチンのＳ３、Ｓ１９、Ｓ３３、Ｉ８２、Ａ８６、Ａ１０２、およびＡ１２０に対応するアミノ酸から選択することができる。一部の実施形態では、システインに置き換えられる表面に露出したアミノ酸は、本来のアミノ酸がシステインに置き換えられた場合、これは集合したフェリチン多量体もしくは粒子において反応性である、および／またはこのシステインはフェリチン多量体もしくは粒子の安定性を妨害しない、および／またはこのシステインがフェリチンの発現レベルの低減をもたらさないという理解に基づいて選択される。
【００９５】
一部の実施形態では、フェリチンはＥ１２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｅ１２Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはインフルエンザポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｅ１２Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＥ１２Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＥ１２Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【００９６】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ２６Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ２６Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはインフルエンザポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ２６Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ２６Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ２６Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【００９７】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ７２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ７２Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはインフルエンザポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ７２Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ７２Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ７２Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【００９８】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ａ７５Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ａ７５Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはインフルエンザポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ａ７５Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＡ７５Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＡ７５Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【００９９】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｋ７９Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｋ７９Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはインフルエンザポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｋ７９Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＫ７９Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＫ７９Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１００】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ１００Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ１００Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはインフルエンザポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ１００Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ１００Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ１００Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１０１】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ１１１Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ１１１Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはインフルエンザポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ１１１Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ１１１Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ１１１Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１０２】
（２）内部システインの除去
一部の実施形態では、フェリチンは、内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異を含む。本来の内部システイン残基を除去することによって、フェリチン単量体あたり１つのみの不対システインが存在することを確実にし、ジスルフィド形成のような望ましくない反応を回避することができ、より安定かつ効率的な結果（例えば、アジュバントの提示）をもたらし得る。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１が非システインアミノ酸に置き換えられる。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１がセリンに置き換えられる（Ｃ３１Ｓ）が、任意の非システイン残基、例えばアラニン、グリシン、トレオニン、またはアスパラギンを使用してもよい。類似のアミノ酸を、ペアワイズまたは構造アライメントによって、非Ｈ．ピロリフェリチンにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、非システインのために置き換えられる内部システインは、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１と整列するアミノ酸残基である。Ｃ３１Ｓ変異を示す例示的なフェリチン配列を、配列番号２０１〜２０７に示す。一部の実施形態では、１つより多くの内部システインがフェリチンに存在する場合、２つまたはそれより多く（例えば、各々の）内部システインは、セリン、またはセリン、アラニン、グリシン、トレオニン、もしくはアスパラギンから選択されるアミノ酸のような非システインアミノ酸に置き換えられる。
【０１０３】
（３）グリコシル化
ヒト適合性のグリコシル化は、組換え薬物製品における安全性および効能に関与し得る。規制当局の承認は、極めて重要な品質属性として適切なグリコシル化を証明することを条件とし得る（Ｚｈａｎｇら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１（５）：７４０〜７６５頁（２０１６）を参照されたい）。Ｎ−グリカンは、アスパラギン側鎖のグリコシル化に起因することができ、ヒトと、細菌および酵母のような他の生物との間で構造が異なり得る。このように、本開示に従うフェリチンにおいて、非ヒトグリコシル化および／またはＮグリカン形成を低減または除去することが望ましいであろう。一部の実施形態では、フェリチンのグリコシル化を制御することにより、特にヒトワクチン接種に使用する場合、組成物の効能および／または安全性が改善される。
【０１０４】
一部の実施形態では、フェリチンを、Ｎ−グリカンの形成を阻害するように変異させる。一部の実施形態では、変異したフェリチンは、その対応する野生型フェリチンと比較して低減されたグリコシル化を有する。
【０１０５】
一部の実施形態では、フェリチンは、表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異を含む。一部の実施形態では、表面に露出したアスパラギンは、Ｈ．ピロリフェリチンのＮ１９、またはペアワイズまたは構造アライメントによって決定される、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に対応する位置である。一部の実施形態では、そのようなアスパラギン、例えばＨ．ピロリフェリチンのＮ１９を変異させることは、フェリチンのグリコシル化を減少させる。一部の実施形態では、変異は、アスパラギンをグルタミンに置き換える。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異を含むＨ．ピロリフェリチンである。配列番号２０１〜２０７は、Ｎ１９Ｑ変異を含む例示的なフェリチン配列である。
【０１０６】
細菌または酵母において産生されたグリコシル化タンパク質に曝露された哺乳動物は、細菌または酵母における所定のタンパク質のグリコシル化パターンが、哺乳動物における同じタンパク質のグリコシル化パターンとは異なり得ることから、グリコシル化タンパク質に対する免疫応答を生じ得る。このように、いくつかのグリコシル化治療タンパク質は、細菌または酵母における産生にとって適切ではないことがあり得る。
【０１０７】
一部の実施形態では、アミノ酸変異によるフェリチンのグリコシル化の減少は、細菌または酵母におけるタンパク質の産生を促進する。一部の実施形態では、フェリチンのグリコシル化の減少は、細菌または酵母において発現された変異フェリチンの投与時の哺乳動物における副作用の可能性を低減させる。一部の実施形態では、細菌または酵母において産生された変異フェリチンのヒト対象における反応原性は、グリコシル化が減少していることから低い。一部の実施形態では、ヒト対象における過敏応答の発生率は、野生型フェリチンと比較して低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンによる処置後では低い。
【０１０８】
一部の実施形態では、低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンを含む組成物の対象における分解は、野生型フェリチンを含む組成物、または野生型グリコシル化を有する対応するフェリチンを含む組成物と比較して遅い。一部の実施形態では、低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンを含む組成物は、野生型フェリチン、または野生型グリコシル化を有する対応するフェリチンを含む組成物と比較して、対象において低減されたクリアランスを有する。一部の実施形態では、低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンを含む組成物は、野生型フェリチン、または野生型グリコシル化を有する対応するフェリチンを含む組成物と比較してより長い血清中半減期を有する。
【０１０９】
（４）変異の組合せ
一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に記載される変異の１つより多くのタイプを含む。一部の実施形態では、フェリチンは、グリコシル化を減少させる変異、内部システインを除去する変異、および表面に露出したシステインを生成する変異から独立して選択される１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、グリコシル化を減少させる変異、内部システインを除去する変異、および表面に露出したシステインを生成する変異を含む。
【０１１０】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、および表面に露出したシステインを生成する変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＥ１２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＳ７２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＡ７５Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＫ７９Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＳ１００Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＳ１１１Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、前述の変異の組のいずれかに対応する変異を含み、対応する変異は、フェリチンアミノ酸配列とＨ．ピロリフェリチンアミノ酸配列（配列番号２０８または２０９）とのペアワイズアライメントによって決定した位置で、ＮをＱに、ＣをＳに、および非システインの表面に露出したアミノ酸をシステインに変化させる。
【０１１１】
１つより多くのタイプの変異を含む例示的なフェリチンを、配列番号２０１〜２０７に提供する。
【０１１２】
３．リンカー
インフルエンザポリペプチドおよびフェリチンをリンカーを介して連結して、抗原性インフルエンザフェリチンポリペプチドを提供することができる。一部の実施形態では、リンカーは、インフルエンザポリペプチドのアミノ酸配列をフェリチンのアミノ酸配列から分離する。任意のリンカーを使用することができる。一部の実施形態では、フェリチンは、ペプチドリンカーを介してＨＡポリペプチドに接続される。これは、融合タンパク質（例えば、単一のオープンリーディングフレームからの）としての抗原性フェリチンポリペプチドの発現を促進することができる。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンリンカーである。一部の実施形態では、グリシン−セリンリンカーは、ＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号２２６）、２ＸＧＧＧＳ（配列番号２２７）（すなわち、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２２７））、または５ＸＧＧＧＧＧＳ（配列番号２２８）である。リンカーは、フェリチンに対してＮ末端側またはＣ末端側であり得る。
【０１１３】
一部の実施形態では、リンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、約２〜４、２〜６、２〜８、２〜１０、２〜１２、または２〜１４アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、長さが少なくとも１５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも２５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも３０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、長さが少なくとも３５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも４０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、６０アミノ酸長未満またはそれに等しい。一部の実施形態では、リンカーは、５０アミノ酸長未満またはそれに等しい。一部の実施形態では、リンカーは、約１６、２８、４０、４６、または４７アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、可撓性である。一部の実施形態では、リンカーは、例えば、免疫刺激性部分（例えば、アジュバント）のコンジュゲーションのための部位として使用するためのシステインを含み；システインを含む例示的なリンカーは、配列番号２２５として提供される。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２２５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含み、さらに配列番号２２５におけるシステインに対応するシステインを含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも２５アミノ酸（例えば、２５〜６０アミノ酸）を含み、システインは、Ｎ末端から８番目のアミノ酸からＣ末端から８番目までのアミノ酸までの範囲の位置、またはリンカーの中央残基の１０アミノ酸以内の位置、またはリンカーの結合位置に位置する。
【０１１４】
一部の実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）および／またはセリン（Ｓ）アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、および／またはアラニン（Ａ）アミノ酸、ならびに場合により本明細書に記載されるシステインを含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２２２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２２０）、ＧＧＳＧＳＧＳＮＳＳＡＳＳＧＡＳＳＧＧＡＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２２１）、ＧＧＳＧＳＡＳＳＧＡＳＡＳＧＳＳＮＧＳＧＳＧＳＧＳＮＳＳＡＳＳＧＡＳＳＧＧＡＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２２２）、またはＧＳである。一部の実施形態では、リンカーは、ＦＲ１（配列番号２２３）またはＦＲ２（配列番号２２４）である。
【０１１５】
一部の実施形態では、フェリチンは、ウシガエルフェリチン（ハイブリッドフェリチンと称される）のアミノ末端伸長を伴うＨ．ピロリフェリチンを含む。一部の実施形態では、このハイブリッドフェリチンは、インフルエンザポリペプチド結合部位が表面に均等に分布する多量体を形成する（Ｋａｎｅｋｉｙｏ、２０１５を参照されたい）。一部の実施形態では、ハイブリッドフェリチンを有するＮ末端融合タンパク質は、フェリチンナノ粒子表面上にインフルエンザポリペプチドの提示を可能にする。一部の実施形態では、フェリチンは、配列番号２０８の１３位（このグルタミン酸を含むハイブリッドフェリチン）または配列番号２０９の６位（６位がイソロイシンである野生型Ｈ．ピロリフェリチン）に対応する位置にグルタミン酸を含む。ウシガエルリンカーと組み合わせて、このグルタミン酸は、ヒトおよびウシガエルフェリチン（ヒト軽鎖とウシガエル低サブユニットフェリチンの両方で６Ｒおよび１４Ｅ）に見られる保存された塩橋を保存すると考えられている。Ｋａｎｅｋｉｙｏら、ＣＥＬ、１６２、１０９０〜１１００頁（２０１５）を参照されたい。
【０１１６】
一部の実施形態では、インフルエンザポリペプチドは、システイン−トロンビン−ヒスチジンリンカーを介してフェリチンに連結される。一部の実施形態では、このリンカーは、クリックケミストリーを介して、部分（例えば、免疫刺激性部分またはインフルエンザポリペプチド）をフェリチンに直接コンジュゲートするために使用される。システイン−トロンビン−ヒスチジンリンカーを含む例示的な配列は、配列番号２１８である。システイン−トロンビン−ヒスチジンリンカーを伴うコンジュゲーション反応に適したクリックケミストリーは、本明細書において検討される。
【０１１７】
一部の実施形態では、アジュバントなどの免疫刺激性部分のコンジュゲーション部位としてシステインを含むリンカーは、不対の表面に露出したシステインを欠損するフェリチン分子を含む構築物において、または不対の表面に露出したシステインを含むフェリチン分子を含む構築物において使用される。
【０１１８】
一部の実施形態では、構築物は、リンカーを含まない。一部の実施形態では、構築物は、１つのリンカーを含む。一部の実施形態では、構築物は、２つまたは２つ以上のリンカーを含む。
【０１１９】
４．構造アライメント
本明細書で考察したように、所与のポリペプチド（例えば、Ｈ．ピロリフェリチン）に関して記載した変異に対応する変異の位置は、ペアワイズまたは構造アライメントによって同定することができる。構造アライメントは、タンパク質がかなりの配列変動にも関わらず類似の構造を共有し、ファミリーの多くのメンバーが構造的に特徴付けされている、フェリチンのような大きいタンパク質ファミリーにとって適切であり、これもまた、インフルエンザポリペプチド（例えば、血球凝集素）のような、本明細書に記載される他のポリペプチドの異なる形態における対応する位置を同定するために使用することができる。タンパク質データバンク（ＰＤＢ）は、その受託番号と共に以下に列挙するフェリチンを含む、多くのフェリチンに関する３Ｄ構造を含む。
【０１２０】
２ｊｄ６，２ｊｄ７−ＰｆＦＲ−ピュロコックス・フリオスス。２ｊｄ８−ＰｆＦＲ＋Ｚｎ。３ａ６８−遺伝子ＳｆｅｒＨ４由来のｓｏＦＲ−ダイズ。３ａ９ｑ−遺伝子ＳｆｅｒＨ４（変異体）由来のｓｏＦＲ。３ｅｇｍ，３ｂｖｆ，３ｂｖｉ，３ｂｖｋ，３ｂｖｌ−ＨｐＦＲ−ヘリコバクター・ピロリ。５ｃ６ｆ−ＨｐＦＲ（変異体）＋Ｆｅ。１ｚ４ａ，１ｖｌｇ−ＦＲ−テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ）。１ｓ３ｑ，１ｓｑ３，３ｋｘ９−ＦＲ−アルカエオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｕｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ），１ｋｒｑ−ＦＲ−カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）。１ｅｕｍ−ＥｃＦＲ−大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）。４ｒｅｕ−ＥｃＦＲ＋Ｆｅ。４ｘｇｓ−ＥｃＦＲ（変異体）＋Ｆｅ２Ｏ２。４ｚｔｔ−ＥｃＦＲ（変異体）＋Ｆｅ２Ｏ＋Ｆｅ２＋Ｆｅ＋Ｏ２。１ｑｇｈ−ＬｉＦＲ−リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）。３ｑｚ３−ＶｃＦＲ−ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）。３ｖｎｘ−ＦＲ−アナアオサ（Ｕｌｖａ  ｐｅｒｔｕｓａ）。４ｉｓｍ，４ｉｓｐ，４ｉｔｔ，４ｉｔｗ，４ｉｗｊ，４ｉｗｋ，４ｉｘｋ，３ｅ６ｓ−ＰｎｍＦＲ−プセウドニッチア（Ｐｓｅｕｄｏ−ｎｉｔｓｃｈｉａ  ｍｕｌｔｉｓｅｒｉｅｓ）。４ｚｋｈ，４ｚｋｗ，４ｚｋｘ，４ｚｌ５，４ｚｌ６，４ｚｌｗ，４ｚｍｃ−ＰｎｍＦＲ（変異体）＋Ｆｅ。１ｚ６ｏ−ＦＲ−イラクサギンウワバ。４ｃｍｙ−ＦＲ＋Ｆｅ−緑色硫黄細菌（Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ）。フェリチン軽鎖（ＦＴＬ）。１ｌｂ３，１ｈ９６−ｍＦＴＬ−マウス。１ｒｃｃ，１ｒｃｄ，１ｒｃｉ−ｂＦＴＬ＋タルトレート＋Ｍｇ。１ｒｃｅ，１ｒｃｇ−ｂＦＴＬ＋タルトレート＋Ｍｎ。３ｎｏｚ，３ｎｐ０，３ｎｐ２，３ｏ７ｒ−ｈｏＦＴＬ（変異体）−ウマ。３ｏ７ｓ，３ｕ９０−ｈｏＦＴＬ。４ｖ１ｗ−ｈｏＦＴＬ−ｃｒｙｏ  ＥＭ。３ｒａｖ，３ｒｄ０−ｈｏＦＴＬ＋バルビツレート。フェリチン軽鎖＋重鎖：５ｇｎ８−ｈＦＴＨ＋Ｃａ。
【０１２１】
構造アライメントは、（ｉ）第２の配列の公知の構造を使用して第１の配列の構造をモデリングする工程、または（ｉｉ）両方が公知である第１および第２の配列の構造を比較する工程、ならびに第２の配列における目的の残基に最も類似に位置する第１の配列中の残基を同定する工程によって、２つ（またはそれより多く）のポリペプチド配列を超えて対応する残基を同定する工程を伴う。対応する残基は、重ねた構造におけるアルファ炭素の距離の最小化（例えば、どの組のアルファ炭素対がアライメントに関する最小平均二乗偏差を提供するか）に基づいて一部のアルゴリズムにおいて同定される。Ｈ．ピロリフェリチンに関して記載された位置に対応する非Ｈ．ピロリフェリチンにおける位置を同定する場合、Ｈ．ピロリフェリチンは、「第２の」配列であり得る。目的の非Ｈ．ピロリフェリチンが利用可能な公知の構造を有しないが、公知の構造を有する別の非Ｈ．ピロリフェリチンに、Ｈ．ピロリフェリチンより密接に関連する場合、密接に関連する非Ｈ．ピロリフェリチンの公知の構造を使用して目的の非Ｈ．ピロリフェリチンをモデリングし、次にそのモデルをＨ．ピロリフェリチン構造と比較して、目的のフェリチンにおける所望の対応する残基を同定することが最も有効であり得る。構造モデリングおよびアライメントに関して広範囲の文献が存在し、代表的な開示には、米国特許第６８５９７３６号；米国特許第８７３８３４３号；およびＡｓｌａｍら、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０（２０１６）９〜１３頁において引用される開示が挙げられる。公知の関連する構造または複数の構造に基づく構造のモデリングの考察に関して、例えば、Ｂｏｒｄｏｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ４（２００９）１〜１３頁、およびその中で引用されている参考文献を参照されたい。
【０１２２】
５．免疫刺激性部分；アジュバント；コンジュゲートされたインフルエンザポリペプチド
一部の実施形態では、インフルエンザポリペプチド、および／またはアジュバントなどの免疫刺激性部分は、フェリチンまたはリンカーの表面に露出したアミノ酸に結合される。一部の実施形態では、表面に露出したアミノ酸は、例えば上記で考察した変異に起因するシステインである。一部の実施形態では、表面に露出したアミノ酸は、リシン、アスパルテート、またはグルタメートである。グルタルアルデヒド（リシンをアミノ担持リンカーまたは部分にコンジュゲートするため）またはカルボジイミド（例えば、アスパルテートもしくはグルタメートをアミノ担持リンカーもしくは部分にコンジュゲートするための、またはリシンをカルボキシル担持リンカーもしくは部分にコンジュゲートするための、１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリン−４−イル−エチル）カルボジイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ；ＥＤＡＣ））を使用するコンジュゲーション手順は、例えばｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ．でワールドワイドウェブから入手可能な、Ｃｈａｐｔｅｒ  ４  ｏｆ  Ｈｏｌｔｚｈａｕｅｒ，Ｍ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌａｂ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ２００６，ＩＳＢＮ  ９７８−３−５４０−３２７８５−１に記載されている。
【０１２３】
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分は、フェリチンの表面に露出したアミノ酸に結合する。一部の実施形態では、アジュバントのような１つより多くの免疫刺激性部分が、フェリチンの表面に露出したアミノ酸に結合する。一部の実施形態では、２４個の免疫刺激性部分が、フェリチン多量体または粒子（例えば、Ｈ．ピロリフェリチン粒子における各々の単量体の１つの部分）に結合する。複数の免疫刺激性部分がフェリチンナノ粒子に結合した一部の実施形態では、免疫刺激性部分は全て同一である。複数の免疫刺激性部分がフェリチンナノ粒子に結合した一部の実施形態では、免疫刺激性部分は全て同一ではない。
【０１２４】
Ａ）免疫刺激性部分の種類；アジュバント
表面に露出したアミノ酸（例えば、システイン）に結合することができる免疫刺激性部分を、本開示に従ってフェリチンにおいて使用することができる。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、Ｂ細胞アゴニストである。
【０１２５】
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、疎水性ではない。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は親水性である。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、極性である。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、水素結合またはイオン結合することが可能であり、例えば水素結合ドナー、水素結合アクセプター、カチオン性部分またはアニオン性部分を含む。部分が、ｐＨ  ６、７、７．４、または８のような生理的に関連するｐＨで、水溶液中でイオン化される場合、部分はカチオン性またはアニオン性であると考えられる。
【０１２６】
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、アジュバントである。一部の実施形態では、アジュバントは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を含む。一部の実施形態では、アジュバントは、ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）アゴニストまたはインターフェロン遺伝子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストの刺激剤である。一部の実施形態では、アジュバントはＢおよび／またはＴ細胞におけるＴＬＲシグナル伝達を活性化する。一部の実施形態では、アジュバントは、適応免疫応答を調節する。
【０１２７】
（１）ＴＬＲ２アゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２アゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
【０１２８】
一部の実施形態では、ＴＬＲ２アゴニストは、ＰＡＭ２ＣＳＫ４、ＦＳＬ−１、またはＰＡＭ３ＣＳＫ４である。
【０１２９】
（２）ＴＬＲ７／８アゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニスト（すなわち、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の少なくとも１つのアゴニスト）である。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
【０１３０】
一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、一本鎖（ｓｓＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、イミダゾキノリンである。一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、ヌクレオシドアナログである。
【０１３１】
一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、３Ｍ−０１２（３Ｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のようなイミダゾキノリンアミンＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。遊離の３Ｍ−０１２の構造は：
【化１】
2021519600.tif 000002
である。３Ｍ−０１２または本明細書で考察する任意の部分のような免疫刺激性部分は、この部分の適切な末端原子（例えば、水素）を、例えば表面に露出したシステインの硫黄での本明細書に記載されるフェリチンとの結合に置換することによって、またはそのような硫黄に結合するリンカーによってフェリチンにコンジュゲートすることができると理解される。このように、フェリチンにコンジュゲートする場合、免疫刺激性部分の構造は、遊離の分子の構造とはわずかに異なる。
【０１３２】
一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、ＳＭ７／８ａである。遊離のＳＭ７／８ａの構造は：
【化２】
2021519600.tif 000003
である。
【０１３３】
例えば、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５  Ｎｏｖ；３３（１１）：１２０１〜１０頁．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３３７１を参照されたい。
【０１３４】
（３）ＴＬＲ９アゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９アゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
【０１３５】
一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、非メチル化ＣｐＧ  ＯＤＮである。一部の実施形態では、ＣｐＧ  ＯＤＮは、通常のＤＮＡにおいて見出される天然のホスホジエステル（ＰＯ）骨格の代わりに、部分的または完全なホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を含む。
【０１３６】
一部の実施形態では、ＣｐＧ  ＯＤＮは、クラスＢ  ＯＤＮであり、これは５’プリン（Ｐｕ）−ピリミジン（Ｐｙ）−Ｃ−Ｇ−Ｐｙ−Ｐｕ３’を含む１つまたはそれ以上の６量体ＣｐＧモチーフを含み；十分にホスホロチオエート化された（すなわち、ＰＳ改変された）骨格を有し；１８〜２８ヌクレオチド長を有する。一部の実施形態では、ＣｐＧ  ＯＤＮは、配列番号２１０の配列を含み、場合により、骨格にホスホロチオエート結合を含む。
【０１３７】
一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、免疫刺激性配列（ＩＳＳ）を含む。一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、ＩＳＳ−１０１８（Ｄｙｎａｖａｘ）（配列番号２１０）である。
【０１３８】
（４）ＳＴＩＮＧアゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子タンパク質刺激因子、小胞体ＩＦＮ刺激因子とも呼ばれる）アゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧの合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
【０１３９】
一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）である。例えば、Ｄａｎｉｌｃｈａｎｋａら、Ｃｅｌｌ  １５４：９６２〜９７０頁（２０１３）を参照されたい。例示的なＣＤＮは、ｃｄＡ、ｃｄＧ、ｃＡＭＰ−ｃＧＭＰ、および２’−５’，３’−５’ｃＧＡＭＰを含む（構造に関しては、Ｄａｎｉｌｃｈａｎｋａらを参照されたい）。ＳＴＩＮＧアゴニストはまた、ＤＭＸＡＡのような合成アゴニストも含む。
【化３】
2021519600.tif 000004
【０１４０】
ｂ）コンジュゲートされたインフルエンザポリペプチド
一部の実施形態では、インフルエンザポリペプチドは、フェリチンの表面に露出したアミノ酸にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、インフルエンザポリペプチドは、単独で抗原性であるが、一部の実施形態では、インフルエンザポリペプチドは、フェリチンとのその会合のために抗原性である。インフルエンザポリペプチドは、本明細書に記載されるインフルエンザポリペプチドのいずれか１つであり得る。
【０１４１】
ｃ）コンジュゲーション
一部の実施形態では、表面に露出したシステイン（例えば、本明細書に記載される変異に起因する）、またはフェリチン（例えば、フェリチンのＮ末端）に結合したペプチドリンカー中のシステインを使用して、アジュバントのような免疫刺激性部分またはインフルエンザポリペプチドを、フェリチンにコンジュゲートする。一部の実施形態では、リンカーは、そのようなシステインにコンジュゲートされ、リンカーを次に、アジュバントのような免疫刺激性部分、またはインフルエンザポリペプチドにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、そのようなシステインは、アジュバント、リンカー、またはインフルエンザポリペプチドを結合させるコンジュゲーション反応のための化学ハンドルを作製する。一部の実施形態では、バイオコンジュゲートが産生され、アジュバントのような免疫刺激性部分またはインフルエンザポリペプチドは、そのようなシステインの還元後にフェリチンに連結される。一部の実施形態では、システインは、表面に露出した不対システイン、すなわちジスルフィド結合を形成するための適切な位置にパートナーシステインを欠如するシステインである。一部の実施形態では、システインは、遊離のチオール側鎖を含む不対システインである。
【０１４２】
（１）コンジュゲーションケミストリーのタイプ
任意のタイプのケミストリーを使用して、例えばシステインまたはＬｙｓ、Ｇｌｕ、もしくはＡｓｐのような別のアミノ酸のような表面に露出したアミノ酸の反応を介して、アジュバントのような免疫刺激性部分またはインフルエンザポリペプチドをフェリチンにコンジュゲートすることができる。
【０１４３】
一部の実施形態では、コンジュゲーションは、クリックケミストリーを使用して実施される。本明細書で使用される場合、「クリックケミストリー」は、互いに急速かつ選択的に反応する（すなわち、「クリックする」）１対の官能基間での反応を指す。一部の実施形態では、クリックケミストリーは、緩和な水性条件下で実施することができる。一部の実施形態では、クリックケミストリー反応は、表面に露出したアミノ酸の変異に起因するシステインのようなフェリチンの表面上のシステインを利用し、システインと反応することができる官能基を使用してクリックケミストリーを実施する。
【０１４４】
クリックケミストリーの基準を満たす多様な反応が、当技術分野で公知であり、当業者は、複数の公表された方法論のいずれかを使用することができる（例えば、Ｈｅｉｎら、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２５（１０）：２２１６〜２２３０頁（２００８）を参照されたい）。クリックケミストリーに関してＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、またはＬｕｍｉｐｒｏｂｅの試薬のような広範囲の市販の試薬を使用することができる。一部の実施形態では、コンジュゲーションは、以下の実施例に記載されるようにクリックケミストリーを使用して実施される。
【０１４５】
一部の実施形態では、クリックケミストリーは、フェリチンの還元後に起こる。
【０１４６】
一部の実施形態では、クリックケミストリーは、１ステップクリック反応であり得る。一部の実施形態では、クリックケミストリーは、２ステップクリック反応であり得る。
【０１４７】
一部の実施形態では、反応は、金属フリーのクリックケミストリーを含む。一部の実施形態では、反応は、チオール−マレイミドおよび／またはジスルフィド交換を含む。
【０１４８】
金属フリークリックケミストリー
金属フリークリックケミストリーは、タンパク質の起こり得る酸化を回避するためにコンジュゲーション反応に関して使用することができる。金属フリークリックケミストリーは、抗体コンジュゲートを形成するために使用されている（ｖａｎ  Ｇｅｅｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０１５，２６，２２３３〜２２４２頁を参照されたい）。
【０１４９】
一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、アジュバントをフェリチンに結合させる反応において使用される。一部の実施形態では、アジュバントをフェリチンに結合させる反応において銅フリーコンジュゲーションを使用する。一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）を使用する。一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、ジベンゾアザシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を使用する。一部の実施形態では、ＢＣＮまたはＤＢＣＯは、アジド基と反応する。
【０１５０】
ＤＢＣＯは、触媒の非存在下での歪み促進型クリック反応を介してアジド基に対して高い特異性を有し、高収率の安定なトリアゾールをもたらす。一部の実施形態では、ＤＢＣＯは、銅触媒の非存在下でアジドと反応する。
【０１５１】
一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、１ステップクリック反応において使用される。一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、２ステップクリック反応において使用される。
【０１５２】
チオール−マレイミドおよびジスルフィド交換
本明細書で使用されるフェリチンは、スルフヒドリルとしても知られるチオールを含むシステインを含むことができ、これはスルフヒドリル反応性化学基との反応に関して利用可能である（または還元を通して利用可能となり得る）。このように、システインは、アジュバントのような免疫刺激性部分をフェリチンに付加するための化学選択的改変を可能にする。塩基性条件下では、システインは、脱プロトン化されて、チオレート求核試薬を生成し、これはマレイミドおよびヨードアセトアミドのような弱い求電子試薬と反応することができる。システインとマレイミドまたはヨードアセトアミドとの反応は、炭素−硫黄結合をもたらす。
【０１５３】
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、表面に露出したシステインまたはフェリチンのリンカー中のシステインと反応する。一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、またはＴＮＢ−チオールである。
【０１５４】
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、アルキル化によってシステインのスルフヒドリルにコンジュゲートする（すなわち、チオエーテル結合の形成）。一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ジスルフィド交換によってシステインのスルフヒドリルにコンジュゲートする（すなわち、ジスルフィド結合の形成）。
【０１５５】
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分をフェリチンにコンジュゲートする反応は、チオール−マレイミド反応である。
【０１５６】
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、マレイミドである。一部の実施形態では、マレイミドとシステインとの反応は、例えば可逆的ではない安定なチオエステル結合の形成をもたらす。一部の実施形態では、マレイミドは、フェリチン中のチロシン、ヒスチジン、またはメチオニンとは反応しない。一部の実施形態では、非反応マレイミドは、遊離のチオールを例えば過剰に添加することによって、反応終了時にクエンチされる。
【０１５７】
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分をフェリチンにコンジュゲートする反応は、ジスルフィド相互交換としても知られるチオール−ジスルフィド交換である。一部の実施形態では、反応は、当初のジスルフィドの一部を含む混合ジスルフィドの形成を伴う。一部の実施形態では、当初のジスルフィドは、表面に露出したアミノ酸の変異またはＮ末端リンカーの付加によってフェリチンに導入されたシステインである。
【０１５８】
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ピリジルジチオールである。一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ＴＮＢ−チオール基である。
【０１５９】
（２）リンカー
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分、またはインフルエンザポリペプチドは、システインのような表面に露出したアミノ酸に共有結合したリンカーを介してフェリチンに結合する。一部の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧリンカーを含む。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ）リンカーは、アジュバントのような免疫刺激性部分に連結したフェリチンの水溶性およびライゲーション効率を増加させる。ＰＥＧリンカーは、２〜１８ＰＥＧ長の間、例えば、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ１４、ＰＥＧ１５、ＰＥＧ１６、ＰＥＧ１７、およびＰＥＧ１８である。
【０１６０】
一部の実施形態では、リンカーは、マレイミドを含む。一部の実施形態では、リンカーは、免疫刺激性部分（ＩＳＭ）−リンカー−マレイミドの構成要素を含む。一部の実施形態では、ＩＳＭ−リンカー−マレイミドは、マレイミドとフェリチンのシステインとの反応によって１ステップクリックケミストリーにおいてフェリチンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、アジュバント−リンカー−マレイミドのＩＳＭは、ＳＭ７／８ａである。一部の実施形態では、ＩＳＭ−リンカー−マレイミドのリンカーはＰＥＧ４である。一部の実施形態では、ＩＳＭ−リンカー−マレイミドは、ＳＭ７／８ａ−ＰＥＧ４−マレイミドである。
【０１６１】
一部の実施形態では、２ステップクリックケミストリープロトコルを、１つの末端でスルフヒドリル反応性化学基および他方の末端でアミン反応基を含むリンカーと共に使用する。そのような２ステップクリックケミストリープロトコルでは、スルフヒドリル反応性化学基は、フェリチンのシステインと反応するが、アミン反応基はＩＳＭに結合した試薬と反応する。このようにして、ＩＳＭは、１組の２クリックケミストリー試薬の組を介してフェリチンにコンジュゲートされる。
【０１６２】
２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基はマレイミドである。２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、マレイミドは、表面に露出したアミノ酸の変異またはＮ末端リンカーの付加によってフェリチンに導入されたシステインと反応する。
【０１６３】
２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、アミン反応基はＤＢＣＯである。２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、ＤＢＣＯは、ＩＳＭに結合したアジド基と反応する。
【０１６４】
一部の実施形態では、マレイミド−リンカー−ＤＢＣＯを使用する。一部の実施形態では、マレイミド−リンカー−ＤＢＣＯは、フェリチンの還元後、フェリチンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、マレイミド−リンカー−試薬は、第１のステップでマレイミドとフェリチンのシステインとの反応によってフェリチンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＤＢＣＯを使用してアジドに結合したＩＳＭに連結する。一部の実施形態では、アジドに連結したＩＳＭは、ＩＳＳ−１０１８である。一部の実施形態では、アジドにカップリングしたアジュバントは、３Ｍ−０１２またはＣｐＧである。
【０１６５】
一部の実施形態では、反応基を有するリンカーをＩＳＭに付加する。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧ４−アジドリンカー、またはＰＥＧ４−マレイミドリンカーである。
【０１６６】
一部の実施形態では、ＰＥＧ４−アジドリンカーは、３Ｍ−０１２にコンジュゲートされる。ＰＥＧ４−アジドリンカーにコンジュゲートされた３Ｍ−０１２の例示的な構造は：
【化４】
2021519600.tif 000005
である。
【０１６７】
一部の実施形態では、ＰＥＧ４−アジドリンカーは、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートされる。ＰＥＧ４−アジドリンカーにコンジュゲートされたＳＭ７／８ａの例示的な構造は：
【化５】
2021519600.tif 000006
である。
【０１６８】
一部の実施形態では、ＰＥＧ４−マレイミドリンカーは、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートされる。ＰＥＧ４−マレイミドリンカーにコンジュゲートされたＳＭ７／８ａの例示的な構造は：
【化６】
2021519600.tif 000007
である。
【０１６９】
一部の実施形態では、アジド基は、ＩＳＳ−１０１８にコンジュゲートされる。ＮＨＳエステル−アジドリンカーにコンジュゲートされたＩＳＳ−１０１８の例示的な構造は：
【化７】
2021519600.tif 000008
である。
【０１７０】
Ｃ．例示的な組成物、キット、核酸、使用、および方法
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドのいずれか１つまたはそれ以上を含む組成物、および薬学的に許容されるビヒクル、アジュバント、または賦形剤が提供される。
【０１７１】
一部の実施形態では、本発明は、インフルエンザによる感染に対して対象を免疫する方法を提供する。本発明は、対象におけるインフルエンザに対する免疫応答を誘発する方法をさらに提供する。一部の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載される医薬組成物の有効量を対象に投与する工程を含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載される抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドまたはナノ粒子の有効量を対象に投与する工程を含む。
【０１７２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドまたは組成物は、インフルエンザによる将来の感染に対する保護的免疫応答を生じさせるために、ヒトなどの対象に投与される。一部の実施形態では、配列番号１〜４３のいずれか１つを含む抗原性ポリペプチドが投与される。
【０１７３】
一部の実施形態では、保護的免疫応答は、入院の発生率を減少させる。一部の実施形態では、保護的免疫応答は、検査により確認されたインフルエンザ感染症の発生率を減少させる。
【０１７４】
一部の実施形態では、１を超える抗原性ポリペプチドを個体に投与して、インフルエンザの複数の株に対して免疫化することができ、抗原性ポリペプチドのＨＡまたはＮＡポリペプチド部分は異なる。投与は、同時に行われるか、または連続して行われる。一部の実施形態では、異なるインフルエンザ株の２つのＨＡまたはＮＡポリペプチドが投与される。一部の実施形態では、異なるインフルエンザ株の３つのＨＡまたはＮＡポリペプチドが投与される。一部の実施形態では、異なるインフルエンザ株の４つのＨＡまたはＮＡポリペプチドが投与される。一部の実施形態では、異なるインフルエンザ株の５つのＨＡまたはＮＡポリペプチドが投与される。一部の実施形態では、異なるインフルエンザ株の５つを超えるＨＡまたはＮＡポリペプチドが投与される。
【０１７５】
１．対象
一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。
【０１７６】
一部の実施形態では、対象は成人（年齢１８歳より上または１８歳に等しい）である。一部の実施形態では、対象は小児または青年（年齢１８歳未満）である。一部の実施形態では、対象は高齢者（年齢６０歳より上）である。一部の実施形態では、対象は、非高齢成人（年齢１８歳より上またはそれに等しく、年齢６０歳未満またはそれに等しい）である。
【０１７７】
一部の実施形態では、組成物の１回より多くの投与を対象に投与する。一部の実施形態では、ブースター投与は免疫応答を改善する。
【０１７８】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドまたは組成物の１つまたはそれ以上は、霊長類（例えば、サル（例えば、アカゲザルまたはカニクイザルのようなマカク）または類人猿のような非ヒト霊長類）、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、または家畜哺乳動物（例えば、イヌ、ウサギ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ラクダ、またはロバ）のような哺乳動物において使用するためである。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドまたは組成物の１つまたはそれ以上は、家禽（例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ホロホロ鳥、または白鳥）のような鳥類において使用するためである。
【０１７９】
２．アジュバント
本明細書で使用される場合、アジュバントは、表面に露出したアミノ酸，例えば、システインを介してフェリチンにコンジュゲートしてもよい。非コンジュゲートアジュバントもまた、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドと共に対象に投与してもよい。一部の実施形態では、抗原性フェリチンポリペプチドと共にアジュバントを投与すると、アジュバントを投与しないインフルエンザポリペプチド単独、または抗原性フェリチンポリペプチド単独の投与と比較して、対象においてインフルエンザポリペプチドに対するより高力価の抗体を生じる。アジュバントは、抗原性ポリペプチドに対するより早期の、より強力な、またはより持続性の免疫応答を促進し得る。
【０１８０】
一部の実施形態では、組成物は、１つのアジュバントを含む。一部の実施形態では、組成物は１つより多くのアジュバントを含む。一部の実施形態では、組成物は、アジュバントを含まない。
【０１８１】
一部の実施形態では、アジュバントはアルミニウムを含む。一部の実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。一部の実施形態では、アジュバントはミョウバン（Ａｌｙｈｙｄｒｏｇｅｌ’８５  ２％；Ｂｒｅｎｎｔａｇ−カタログ番号２１６４５−５１−２）である。
【０１８２】
一部の実施形態では、アジュバントは有機アジュバントである。一部の実施形態では、アジュバントは油基剤のアジュバントである。一部の実施形態では、アジュバントは水中油型ナノ乳剤を含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、アジュバントはスクアレンを含む。一部の実施形態では、スクアレンを含むアジュバントは、Ｒｉｂｉ（Ｓｉｇｍａ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍカタログ番号Ｓ６３２２−１ｖｌ）、Ａｄｄａｖａｘ（商標）ＭＦ５９、ＡＳ０３、またはＡＦ０３（米国特許第９７０３０９５号を参照されたい）である。一部の実施形態では、スクアレンを含むアジュバントは、ナノ乳剤である。
【０１８４】
一部の実施形態では、アジュバントは、ポリアクリル酸ポリマー（ＰＡＡ）を含む。一部の実施形態では、ＰＡＡを含むアジュバントはＳＰＡ０９である（ＷＯ２０１７２１８８１９を参照されたい）。
【０１８５】
一部の実施形態では、アジュバントは非代謝性油を含む。一部の実施形態では、アジュバントは、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を含む。
【０１８６】
一部の実施形態では、アジュバントは、非代謝性油および結核死菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む。一部の実施形態では、アジュバントはフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）である。
【０１８７】
一部の実施形態では、アジュバントは、リポ多糖類である。一部の実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルＡ（ＭＰＬまたはＭＰＬＡ）である。
【０１８８】
３．医薬組成物
様々な実施形態では、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドおよび／または関連する実体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、病原体に対して保護的免疫応答のような免疫応答を誘発することが可能な免疫原性組成物（例えば、ワクチン）である。
【０１８９】
例えば、一部の実施形態では、医薬組成物は、以下の１つまたはそれ以上を含み得る：（１）（ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異、および（ｉｉ）インフルエンザポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質；（２）（ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異、およびシステインに連結した免疫刺激性部分；ならびに（ｉｉ）インフルエンザポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質；（３）（ｉ）表面に露出したシステイン、（ｉｉ）フェリチンタンパク質に対してＮ末端側のペプチドリンカー；および（ｉｉｉ）ペプチドリンカーに対してＮ末端側のインフルエンザポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質；（４）（ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異、およびシステインに連結した免疫刺激性部分、（ｉｉ）Ｈ．ピロリフェリチンの３１位の内部システイン、またはペアワイズまたは構造アライメントによって同定される、非Ｈ．ピロリフェリチンの３１位と類似の位置の内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異；（ｉｉｉ）表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異、ならびに（ｉｖ）インフルエンザポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質；または（５）前述のフェリチンタンパク質を含むフェリチン粒子。
【０１９０】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドに関連する抗体または他の作用物質を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドに結合するおよび／またはそれと競合する抗体を含む。あるいは、抗体は、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドのインフルエンザポリペプチド構成要素を含むウイルス粒子または細菌を認識し得る。
【０１９１】
一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、単独で、または免疫応答を増強するための１つもしくはそれ以上の作用物質、例えば本明細書に記載されるアジュバントと組み合わせて投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、上記のアジュバントをさらに含む。
【０１９２】
一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「担体」は、それと共に医薬組成物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。例示的な実施形態では、担体は、滅菌液体、例えば水、および石油、動物、植物、または合成起源の油を含む油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等を含み得る。一部の実施形態では、担体は、１つまたはそれ以上の固体構成要素であるか、またはそれらを含む。薬学的に許容される担体はまた、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびその組合せを含み得るがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、賦形剤は、例えば所望のコンシステンシーまたは安定化効果を提供するまたはそれに関与するように医薬組成物に含めることができる任意の非治療剤である。適した薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を含むがこれらに限定されない。様々な実施形態では、医薬組成物は無菌的である。
【０１９３】
一部の実施形態では、医薬組成物は、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、安定化剤、緩衝剤、または保存剤のような任意の多様な添加剤を含み得る。加えて、補助剤、安定化剤、濃化剤、潤滑剤、および着色剤を含めることができる。
【０１９４】
様々な実施形態では、医薬組成物は、任意の所望の投与様式に適合するように製剤化することができる。例えば、医薬組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、滴剤、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル剤、液体を含有するカプセル、ゼラチンカプセル、散剤、徐放性製剤、坐剤、乳剤、エアロゾル、噴霧剤、懸濁剤、凍結乾燥粉末、凍結懸濁液、乾燥粉末の形態、または使用するために適した他の任意の形態をとることができる。薬剤の製剤化および製造における一般的検討は、例えば参照によって本明細書に組み入れられる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に見出すことができる。
【０１９５】
医薬組成物は、任意の投与経路を介して投与することができる。投与経路は、例えば経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、粘膜、硬膜外、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸内、気管内点滴、気管支点滴、吸入、または局所投与経路を含む。投与は局所または全身であり得る。一部の実施形態では、投与は経口で実施される。別の実施形態では、投与は非経口注射による。一部の例では、投与は、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドの血流への放出をもたらす。投与様式は、医師の裁量に委ねることができる。
【０１９６】
一部の実施形態では、医薬組成物は、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、および皮下）にとって適している。そのような組成物は、例えば、液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤等として製剤化することができる。それらは、使用直前に滅菌注射可能媒体に溶解または懸濁することができる滅菌固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造してもよい。例えば、非経口投与は注射によって達成することができる。そのような実施形態では、注射剤は、通常の形態、すなわち液体溶液または懸濁液、注射前に液体中の溶液または懸濁液にとって適した固体形態、または乳剤として調製される。一部の実施形態では、注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、凍結乾燥粉末、または顆粒から調製される。
【０１９７】
さらなる実施形態では、医薬組成物は、吸入（例えば、肺および呼吸器への直接送達）による送達のために製剤化される。例えば、組成物は、点鼻用噴霧剤または他の任意の公知のエアロゾル製剤の形態をとり得る。一部の実施形態では、吸入用またはエアロゾル送達のための調製物は、複数の粒子を含む。一部の実施形態では、そのような調製物は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、または約１３ミクロンの平均粒子サイズを有し得る。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、乾燥粉末として製剤化される。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、例えば湿潤剤を含めることを通して湿潤粉末として製剤化される。一部の実施形態では、湿潤剤は、水、食塩水、または生理的ｐＨの他の液体からなる群から選択される。
【０１９８】
一部の実施形態では、本発明に従う医薬組成物は、鼻または口腔への滴剤として投与される。一部の実施形態では、用量は、複数の液滴（例えば、１〜１００、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１〜５滴等）を含み得る。
【０１９９】
本発明の医薬組成物は、所望の転帰を達成するために適切な任意の用量で投与することができる。一部の実施形態では、所望の転帰は、組成物に存在する抗原性フェリチンポリペプチドに存在するインフルエンザポリペプチドの起源のような病原体に対する長期間持続する適応免疫応答の誘導である。一部の実施形態では、所望の転帰は、感染症の１つまたはそれ以上の症状の強度、重症度、頻度の低減、および／または発生の遅延である。一部の実施形態では、所望の転帰は、感染症の阻害または予防である。必要な用量は、対象の種、年齢、体重、および全身状態、予防または処置される感染の重症度、使用される特定の組成物、およびその投与様式に応じて対象毎に変化する。
【０２００】
一部の実施形態では、本発明に従う医薬組成物は、単回または複数回用量で投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、異なる日に投与される複数回用量で投与される（例えば、プライム−ブースト免疫戦略）一部の実施形態では、医薬組成物は、ブースターレジメンの一部として投与される。
【０２０１】
様々な実施形態では、医薬組成物は、１つまたはそれ以上の追加の治療剤と同時投与される。同時投与は、それらの投与時期が、追加の治療剤および医薬組成物中の活性成分の薬理活性が時間的に重複し、それによって組み合わせた治療効果を発揮する場合には、治療剤を同時に投与する必要はない。一般的に、各々の作用物質は、その作用物質に関して決定された用量および時間スケジュールで投与される。
【０２０２】
４．核酸／ｍＲＮＡ
同様に、本明細書に記載される抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドをコードする核酸も提供される。一部の実施形態では、核酸はｍＲＮＡである。ポリペプチドをもたらす翻訳を受けることが可能な任意の核酸は、本開示の目的に関してｍＲＮＡであると考えられる。
【０２０３】
５．キット
同様に本明細書において、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の抗原性ポリペプチド、核酸、抗原性フェリチン粒子、組成物、または医薬組成物を含むキットも提供される。一部の実施形態では、キットは、溶媒、溶液、緩衝剤、説明書、または乾燥剤の１つまたはそれ以上をさらに含む。
【０２０４】
本説明および例示的な実施形態は、制限すると解釈すべきではない。本明細書および添付の特許請求の目的に関して、特に示していない限り、量、パーセンテージ、または割合を表記する全ての数値、ならびに本明細書および特許請求の範囲で使用される他の数値は、全ての例において、既にそのように修飾されていない程度に、用語「約」によって修飾されると理解される。「約」は、記載される主題の特性に実質的に影響を及ぼさない変動の程度、例えば１０％、５％、２％、または１％以内の変動を示す。したがって、逆を示していない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲で記載される数値パラメータは、得ることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、および特許請求の範囲と均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各々の数値パラメータは、報告された有効数字を検討する、および通常の四捨五入技術を適用することによると少なくとも解釈すべきである。
【０２０５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その」、ならびに他の用語の任意の単数形での使用は、１つの指示対象に明白かつ明確に限定されていない限り、複数の指示対象を含むことに注意されたい。本明細書に使用される場合、用語「含む」およびその文法的変形形態は、非制限的であると意図され、リストにおける項目の引用は、列挙される項目に置換または追加することができる他の類似の項目の除外ではない。用語「または」は、包括的な意味で使用され、すなわち本文がそれ以外であることを示していない限り、「および／または」と等価である。
【０２０６】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【実施例】
【０２０７】
以下の実施例は開示した特定の実施形態を説明するために提供され、本開示の範囲を限定するものとは決して解釈すべきでない。
【０２０８】
１．ＨＡ−フェリチンナノ粒子の設計、精製、および特徴解析
ＨＡのエクトドメイン配列（４８個のＣ末端膜貫通残基を欠如する）をフェリチンのＮ末端に融合して哺乳動物細胞中で自己集合するナノ粒子を生成させることによって、ＨＡナノ粒子（ＨＡ−Ｎｐ）を産生した。フェリチンは表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異（配列番号２０８のフェリチン配列に対するＳ２６Ｃ、Ａ７５Ｃ、またはＳ１１１Ｃの変異に起因する）を含み、ＨＡ−Ｎｐへのアジュバントのコンジュゲーションが可能になる。そのようなシステインの表現を図２に提示する。
【０２０９】
上記の変異に起因するシステインは免疫刺激性部分をコンジュゲートするために用いることができる。図３Ａに、マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａクリック試薬を用いてＴＬＲアゴニストをフェリチンにコンジュゲートする例示的な１ステップクリックケミストリー反応の結果を図示する。この反応では、マレイミドは対になっていないシステインと反応し、表面に露出したシステインにおいて介在するリンカーを介してＴＬＲ７／８アゴニスト分子を共有結合でフェリチンにコンジュゲートさせ、共有結合によるＴＬＲ７／８アゴニスト−フェリチンコンジュゲートを生じる。本例では１つの単量体の表面上の１つのシステインを示している。フェリチンナノ粒子は多量体であり、例えば２４個の単量体からなっている。したがって、フェリチンナノ粒子は単量体の数と等しい数の表面露出システインを含むことができ、表面露出システインのそれぞれがコンジュゲートすることができる。
【０２１０】
図３Ｂおよび図４Ａ〜図４Ｂに、アジュバントをフェリチンナノ粒子にコンジュゲートするために用いることができる例示的な２ステップクリックケミストリー、ならびにＣｐＧおよび３Ｍ−０１２（３Ｍ０１２と称することもある）が中間二官能性リンカーを介する２ステップクリックケミストリー反応によってどのようにしてフェリチンにコンジュゲートさせることができるかを示す。例示的なリンカーは、マレイミドおよびＤＢＣＯ反応基を含むＳｉｇｍａ社のＰＥＧリンカー（カタログ＃７６０６７６）である。本例では、ＴＬＲアゴニストは反応性アジド基によって官能化される。
【０２１１】
以下に記載した実験においてマススペクトロメトリー（ＭＳ）を用いて、コンジュゲートした免疫刺激性部分を含みおよび含まないインフルエンザ−フェリチンを特徴解析する。ＭＳに供した分析物質は、いくつかの場合にはインフルエンザ−フェリチンのトリプシン消化物であった。トリプシンは一般に、プロリンが後に続く場合を除いて、リシンおよびアルギニン残基の後で切断する。しかし、構成したナノ粒子（指示したトリプシン部位のＣ末端）は、タンパク質分解に耐性がある。天然の条件下で配列番号１４等のウシガエル−Ｈ．ピロリフェリチン構築物においてトリプシンによって切断される最遠位（Ｃ末端）のトリプシン部位を図５に示す。このように、トリプシン消化はＭＳ解析に好適なタンパク質分解耐性のフェリチン粒子を放出する。
【０２１２】
したがって、リンカー配列がトリプシンにより接近可能であるという前提で、切断されていないポリペプチドの中のＮ末端抗原の存在とは関係なしに、トリプシン消化およびそれに続く単純化されたＭＳ解析を用いてナノ粒子へのコンジュゲーションを評価することができる。本方法は、糖タンパク質抗原がＭＳ解析に提起する複雑さを克服するために考案された。例えば、Ｈ１／Ｓｔｅｍ−ＮｐがＭＳによって解析できるのは、そうでなければＰＮＧａｓｅ処理の後のみである（図８Ａ）。
【０２１３】
以下のインフルエンザ株からのＨＡ配列をヘリコバクター・ピロリ−ウシガエルハイブリッドフェリチンのＮ末端に遺伝子的に融合してＨＡナノ粒子を構築した。Ａ／フォートマンモス／１−ＪＹ２／１９４７（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＹ１４７３４２、アミノ酸１〜５１８、Ｙ１０８Ｆ）；Ａ／マレーシア／３０２／１９５４（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＹ００９３４０．１、アミノ酸１〜５１８、Ｙ１０８Ｆ）；Ａ／デンバー／１９５７（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＹ００８９８８、アミノ酸１〜５１７、Ｙ１０８Ｆ）；Ａ／香港／１１７／１９７７（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＹ００９２９２、アミノ酸１〜５１８、Ｙ１０８Ｆ）；Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨＪ０９８８３．１、アミノ酸１〜５１８）；Ａ／カリフォルニア／４／２００９（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨＪ０９８８４．１、アミノ酸１〜５１８）；ＣＯＢＲＡ  Ｐ１（米国特許出願公開第２０１５００１７１９６Ａ１の配列番号２、アミノ酸１〜５１８、Ｙ１０８Ｆ）、およびＣＯＢＲＡ  Ｘ６（米国特許出願公開第２０１４０１２７２４８Ａ１、アミノ酸１〜５１７、Ｙ１０８Ｆ）。ＣＯＢＲＡ  Ｐ１およびＣＯＢＲＡ  Ｘ６は、階層的配列平均化（Ｃａｒｔｅｒ  ＤＭら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ９０：４７２０〜４７３４頁（２０１６））のコンピュータ法によって産生した。ＣＯＢＲＡ  Ｘ６は１９９９年〜２０１２年にわたるヒトＨ１Ｎ１インフルエンザ配列から、またＣＯＢＲＡ  Ｐ１は１９３３年〜１９５７年および２００９年〜２０１１年にわたるヒトＨ１Ｎ１株ならびに１９３１年〜１９９８年にわたるブタＨ１Ｎ１インフルエンザ株から産生した（Ｃａｒｔｅｒ、２０１６）。ＨＡ−フェリチン遺伝子は哺乳動物での発現のために、ＡＴＧ開始コドンの前のｇｃｃａｃｃ  ｋｏｚａｋ配列とともにＳＩＢ００２ベクターのＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。全ての配列はヒト細胞株での発現のためにコドン最適化した。
【０２１４】
ＨＡ−ＮｐプラスミドをＰｏｗｅｒｐｒｅｐキット（Ｏｒｉｇｅｎｅ社カタログ＃ＮＰ１００００９）で精製して、Ｅｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社カタログ＃Ａ１４６３５）にトランスフェクトするために用いた。ＦｅｃｔｏＰＲＯ  ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社＃１１６−１００）を標準的条件（ＤＮＡ０．５μｇ／ｍＬ、ＦｅｃｔｏＰＲＯ試薬０．７５μｌ／ｍＬ、エンハンサー０．４５μｌ／ｍＬ）で用いた。トランスフェクションの４〜６日後に４℃で１５分、３，４８８ｇで遠心分離することによって、Ｅｘｐｉ２９３の上清からナノ粒子を回収し、０．４５μｍの真空駆動フィルターユニット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社カタログ＃１６７−００４５）を通して濾過した。ＨＡ−Ｎｐを重力流でＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔフローカラム（ＧＥ社カタログ＃１７０５１００１）に通過させ、フロースルーを採取し、水で３倍に希釈し、Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を加えて最終濃度５０ｍＭになるようｐＨを調節した。あるいは、最初のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いる代わりに、上清を緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、５ｍＭ  ＮａＣｌ）で５倍に希釈した。次いでサンプルをＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ、ＧＥ社カタログ＃１７１１５４０１）に負荷し、カラム体積の３０倍の緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、５ｍＭ  ＮａＣｌ）と緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、１Ｍ  ＮａＣｌ）の０〜６０％の混合物のＮａＣｌ勾配でタンパク質を溶出させた。ＨＡ−ナノ粒子タンパク質分画を採取し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社カタログ＃ＵＦＣ９１００２４）で濃縮し、リン酸緩衝食塩液中のＳｕｐｅｒｏｓｅ６カラムＰＧ  ＸＫ  １６／７０、６０〜６５ｃｍ（カタログ＃＃９０１０００４２）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。最終分画を濃縮し、０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社ＳＬＧＶ００４ＳＬ）を通して濾過滅菌した。エンドトキシンフリーの溶液を用い、検出限界０．０５ＥＵ／ｍｌのＬＡＬカートリッジを備えたＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ  ＰＴＳ装置を用いて最終タンパク質を試験した。
【０２１５】
Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（配列番号４３、図６Ａ）およびＨ５／ＣＯＢＲＡ−Ｎｐ（配列番号３２、図６Ｂ）のトリプシン消化を示す。両方の例では、トリプシン消化による分子量のシフト（「＋」で示す）は、ＳＭ７／８ａの分子量（７１１ダルトン）に相当する。したがって、これらのデータは、表面に露出したシステインを含むフェリチンナノ粒子へのＳＭ７／８ａのコンジュゲーションが成功したことを示している。
【０２１６】
マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａのような低分子量の分子へのコンジュゲーションの後のフェリチンナノ粒子の質量変化の決定は、トリプシン処理なしにＰＮＧａｓｅを用いてＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐのグリコシル化を除去するゲルシフト実験（図７Ａ）では明確でない。図７Ｂに示すように、トリプシン処理によって、ＳＭ７／８ａのような小分子のＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐへのコンジュゲーションをゲルシフトアッセイで確認することが可能になる。ＣｐＧのような分子量がより高い分子のコンジュゲーションは、脱グリコシル化されたＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐのゲルシフトアッセイによって（図７Ａ）、および天然の条件下でのトリプシン消化によってＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐから放出されたフェリチンナノ粒子のゲルシフトアッセイによって、観察することができる。したがって、天然の条件下でのフェリチンナノ粒子のトリプシン消化を用いることによって、これらの分析アッセイに干渉する可能性がある特性を有する所与の抗原について、さもなければゲルシフトまたはマススペクトロメトリー（ＭＳ）実験で解析することが困難なプラットフォーム技術としての、ＴＬＲアゴニストがコンジュゲートするコア断片の特徴解析の方法が提供される。
【０２１７】
ＳＭ７／８ａ−ＰＥＧ４−マレイミドをＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐにコンジュゲートし、分析目的のためのみにＰＮＧａｓｅ処理を行った後、ＭＳ上のコンジュゲーション生成物は４２９３０Ｄａの質量を有することが分かった。これはコンジュゲートしていないＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐよりほぼ７１５ｋＤａ重かった（図８Ａ）。トリプシン消化の後、還元したフェリチンナノ粒子は１９５１０Ｄａの質量を有していた（ナノ粒子のＨ１／Ｓｔｅｍ部分の切断に基づく）（図８Ｂ）。コンジュゲーションの後、トリプシン消化したコンジュゲートしたナノ粒子の質量もほぼ７１５ｋＤａ重かった。したがって、図８Ａおよび図８Ｂはいずれも、アジュバントを含むリンカーのフェリチンナノ粒子へのコンジュゲーションにおけるコンジュゲーション効率は約１００％であることを支持している。
【０２１８】
マレイミド−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯリンカーを２ステップのクリックケミストリー反応でＨ１−ｓｔｅｍ−Ｎｐにコンジュゲートした。このとき、マレイミドはフェリチンナノ粒子の表面上に露出したシステインと反応し、トリプシン消化後のＭＳ解析によって、リンカー付加の分子量であるほぼ６７５Ｄａと符合する質量増加が見られた（図９）。
【０２１９】
次に、アジド−ＣｐＧをＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ中間体（図１０において「Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ後」とラベル）に添加した。これは、ゲルシフトアッセイによって確認した。アジド−ＣｐＧはＩＤＴ社に発注した（配列番号４５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に、コンジュゲートおよび対照をＰＮＧａｓｅで処理した。ＣｐＧのコンジュゲーションは、付加された質量（約７．５ｋＤａ）のために、リンカーのコンジュゲーションと比較して上方へのゲルシフトを生じた。「Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＣｐＧ」および「Ｓｔｅｍ−Ｎｐ」とラベルした２つのバンドのデンシトメトリーによって定量したコンジュゲーション効率５０％の例を図１０に示す。Ｓｔｅｍ−ＮｐはＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（配列番号４３）である。未処理は還元前のＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐを意味する。ＴＣＥＰ−還元は３ｍＭのＴＣＥＰと室温で１時間処理し、ＰＢＳに対して４℃で終夜透析したＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐを意味する。
【０２２０】
コンジュゲーションを評価するためにタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位（配列番号４４）も用いた。２ステップクリックケミストリープロセスを用いて３Ｍ−０１２を種々のＮＣ９９  ＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐ構築物（配列番号９〜１２）にコンジュゲートした。２ｍＭまたは１０ｍＭのＴＣＥＰを用いてＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐ構築物を還元した。ＴＣＥＰはＴＲＩＳ緩衝液（１００ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）への透析（ＭＷＣＯ  １０ｋＤａの３ｍＬの透析カセット、Ｔｈｅｒｍｏ社＃８７７３０）によって除去した。ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドリンカー（Ｓｉｇｍａ社＃７６０６７６）を加えた。緩衝液をＰＢＳ７．４に変更しつつ過剰なリンカーを超濾過（ＭＷＣＯ  １００ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社Ａｍｉｃｏｎ＃ＵＦＣ８１００２４または＃ＵＦＣ９１００９６）によって除去した。最後に、アジド官能化ＴＬＲアゴニスト（ＣｐＧまたは３Ｍ−０１２）を分子にクリックした。超濾過（ＭＷＣＯ  １００ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社Ａｍｉｃｏｎ＃ＵＦＣ８１００２４または＃ＵＦＣ９１００９６）またはゲル濾過によって過剰な薬物を除去した。ＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐの中のＴＥＶ切断部位により、コンジュゲーションの解析のためのＴＥＶによる選択的切断が可能になる。
【０２２１】
３Ｍ−０１２（リンカー約５００Ｄａ＋約６００Ｄａ）のＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐ構築物へのコンジュゲーションの後、構築物をＴＥＶで処理した。ＴＥＶ切断の後、ゲルシフトＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の得られたＨＡバンドは約５７ｋＤａとグリカンおよびＦｅｒｒの約２０ｋＤａである（図１１、「＋ＴＥＶ」とラベルしたレーン）。約２０ｋＤａおよび２１ｋＤａの二重のバンド（「Ｓ２６Ｃ」、「Ｓ７２Ｃ」、「Ａ７５Ｃ」、および「Ｓ１１１Ｃ」（それぞれ配列番号１０、１１、１２、および９）は、コンジュゲーションの成功を示している。コンジュゲーションの有効性はバンドの強度に対応し、ここで低いバンドはコンジュゲートされていないフェリチン、高いバンドはコンジュゲートされたフェリチンである。
【０２２２】
Ｓ１１１Ｃを含むＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐは２９３Ｅｘｐｉ細胞中に発現されると１０９ダルトン（システイン化に符合する）の翻訳後改変を有することが見出された（図１２Ａ）。これは、反応性チオールを遊離させるための３ｍＭ濃度のＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）との室温、１時間の還元によって除去した（図１２Ｂ）。したがって、改変部位を還元して表面に露出したシステインを遊離のチオールとして露出することができ、これは市販のリンカーまたはカスタム化された小分子の上のマレイミド基との反応性が極めて高い。
【０２２３】
ＭＳデータによっても、３Ｍ−０１２のＨＡ−Ｎｐへのコンジュゲーションが成功したことが確認された。ＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐ−Ｓ２６Ｃ（配列番号１０、図１２Ｃ）、Ａ７５Ｃ（配列番号１２、図１２Ｄ）、またはＳ１１１Ｃ（配列番号９、図１２Ｅ）。Ａ７５ＣおよびＳ１１１Ｃのフェリチン改変を含むナノ粒子（それぞれ配列番号１２および９）は、３Ｍ−０１２への９５％を超えるコンジュゲーションを示した。したがって、ＭＳデータは、アジュバントをフェリチンの変異に起因する種々の表面露出システインに連結して、アジュバントに連結された抗原性フェリチンポリペプチドを成功裏に産生できることを示している。
【０２２４】
陰性染色電子顕微鏡（ＥＭ）から、コンジュゲーションがナノ粒子の一体性に影響しないことが確認された。Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（配列番号４３）単独（図１３Ａ）、マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａにコンジュゲートされたＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（図１３Ｂ）、ＣｐＧにコンジュゲートされたＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（図１３Ｃ）、ＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐ（配列番号９）単独（図１３Ｄ）、ＤＢＣＯ−マレイミドリンカーを介して３Ｍ−０１２にコンジュゲートされたＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐ（図１３Ｅ）、およびＤＢＣＯ−マレイミドリンカーを介してＣｐＧにコンジュゲートされたＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐ（図１３Ｆ）を示す。さらに、マレイミド−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯリンカーを介するＴＬＲ７／８アゴニスト（マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａ、図１４Ａ）またはＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ、図１４Ｂ）のＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐへのコンジュゲーションは、動的光散乱（ＤＬＳ）による測定で、コンジュゲートしていないＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐと比較して、ナノ粒子の一体性に影響しない（図１４Ｃ）。
【０２２５】
これらのデータは、フェリチンおよびＨＡポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドの調製が成功したことを実証している。さらに、アジュバントを含むリンカーをこれらのフェリチンナノ粒子に成功裏にコンジュゲートすることができる。
【０２２６】
２．ＨＡ−フェリチンナノ粒子組成物の免疫原性の特徴解析
種々のアジュバントおよびＨ１／Ｓｔｅｍ−ＮｐへのＴＬＲアゴニストのコンジュゲーションのＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ組成物の免疫原性に対する影響を評価した。図１５Ａに、Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ  ＴＬＲ７／８アゴニストコンジュゲートによる免疫で誘起されたＨ１／ニューカレドニア／１９９９（ＮＣ９９）ＨＡ三量体に対するＩｇＧ抗体力価を示す。Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ  １０μｇを、アジュバントなしに、等モル量の遊離ＳＭ７／８ａアジュバント（８３．３ｎｇ）と混合して、高用量の遊離ＳＭ７／８ａアジュバント（２１．８４μｇ）と混合して、または体積比１：１のＰＡＡもしくはＡＦ０３アジュバントと、０週および３週で投与した。Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＳＭ７／８ａコンジュゲートは、他のアジュバントなしに投与した。２回目の投与の２週後に血清をアッセイした。図１５Ｂに、Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ  ＴＬＲ９アゴニストコンジュゲートによる免疫で誘起されたＨ１／Ｓｔｅｍ三量体に対するＩｇＧ抗体力価を示す。Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ  １０μｇを、アジュバントなしに、等モル量の遊離ＣｐＧアジュバント（８５０ｎｇ）と混合して、高用量の遊離ＣｐＧアジュバント（２０μｇ）と混合して、または体積比１：１のＡＦ０３アジュバントと、０週および３週で投与した。Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＣｐＧコンジュゲートは、他のアジュバントなしに投与した。２回目の投与の２週後に血清をアッセイした。
【０２２７】
図１５Ａのデータは、ＳＭ７／８ａとコンジュゲートしたＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐが、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）またはＡＦ０３アジュバントと混合したコンジュゲートしていないナノ粒子と同程度の免疫原性を示すことを示している。フェリチンナノ粒子に直接コンジュゲートしたＳＭ７／８ａは、フェリチンナノ粒子とは別の化合物として投与した等モル用量のＳＭ７／８ａ（「等モル混合」）よりも効果的であった。さらに、フェリチンナノ粒子に直接コンジュゲートしたＳＭ７／８は、フェリチンナノ粒子とは別の化合物として投与した高用量のＳＭ７／８ａ（「高用量混合」）よりも効果的であった。したがって、ＨＡポリペプチドおよびフェリチンを含む抗原ポリペプチドにＳＭ７／８ａをコンジュゲートすることによって、この化合物は免疫原性かつ自己アジュバント性になった。自己アジュバント性組成物を投与することによって、別個のアジュバントを低減しまたは排除することができた。同様に図１５Ｂは、ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧをＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐにコンジュゲートすることによって、コンジュゲートしていない等モル混合物の対照と比較して、混合したＣｐＧ分子を２３倍高い用量で投与した場合に匹敵するレベルまで、その免疫原性が改善されることを示している。
【０２２８】
血清は、Ｈ１／ニューカレドニア／１９９９（ＮＣ９９）ＨＡ／ＮＡシュードタイプ化レンチウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏで中和する能力についても評価した。シュードタイプ化中和アッセイは以前記載されたように実施した（Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ４９９：１０２〜１０６頁（２０１３））。簡単には、Ｐｒｏｆｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社カタログ＃Ｅ１２００）を用い、５種のプラスミド、すなわちＨＡ  ４００ｎｇ、ＮＡ  １００ｎｇ、ＴＭＰＲＳＳ２  ５０ｎｇ、ＣＭＶΔＲ８．２  ７μｇ、およびｐＨＲ’ＣＭＶ−Ｌｕｃ  ７μｇのトランスフェクションによってレンチウイルスをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にパッケージした。トランスフェクションの４８時間後および７２時間後にウイルス粒子を採取し、０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。
【０２２９】
マウス（ｎ＝５／群）を、３週の投与間隔で２回免疫した。３Ｍ−０１２にコンジュゲートしたＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐ（配列番号９）（ＨＡ−Ｆｅｒｒ−３Ｍ−０１２、０．２２μｇ／用量）を、混合した対照と並行して投与した。対照は、ＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐ（０．２２μｇ／用量）と３Ｍ−０１２  １０μｇの混合物（典型的な治療用量）、および別にＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐ（０．２２μｇ／用量）と３Ｍ−０１２  １．７ｎｇの混合物（コンジュゲートと等モルで一致）とした。ＨＡ含量（ＨＡ  ０．１７μｇ／用量）を一致させて投与したコンジュゲートしていないＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐおよび不活化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ）を追加の対照とした。５週目に、これらのマウスからの血清を段階希釈して、指示された株からのＨＡおよびニューラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子でシュードタイプ化したレンチウイルスに対する中和活性についてアッセイした。希釈の範囲の抗血清を固定された量のレンチウイルスと前インキュベートし、標的の２９３Ａ細胞に感染させるために用いた。感染はＰｒｏｍｅｇａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ＃Ｅ１５００）を用いて７２時間後に定量した。これらの中和曲線からＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてＩＣ５０値を計算し、ＰｓＶの５０％中和を達成する血清希釈係数を決定した。エンドポイント力価（ＥＬＩＳＡ）および血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価も、それぞれ５週目と８週目に決定した。例示的なＥＬＩＳＡおよびＨＡＩの手順については以下の実施例を参照されたい。全てのサンプルは３重測定した。
【０２３０】
ＥＬＩＳＡのエンドポイント力価（図１６Ａ）またはシュードウイルス中和ＩＣ５０力価（図１６Ｂ）に基づいて、３Ｍ−０１２にコンジュゲートしたＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐは、一致させた混合物、コンジュゲートしていない粒子、またはＩＩＶよりも強い結合および中和抗体応答を誘起した。ＨＡ−Ｎｐ−３Ｍ−０１２コンジュゲートは、等モル混合の対照より有意に強いＨＡＩ力価（図１６Ｃ）をも誘起した。さらに、ＨＡＩ力価は、コンジュゲートされていないＨＡ−ＦｅｒｒおよびＩＩＶよりも３．７倍および１．６倍高かったが、これらの結果は有意ではなかった。
【０２３１】
ＣｐＧにコンジュゲートしたＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐ（配列番号９）（ＨＡ−Ｆｅｒｒ−ＣｐＧ、０．２２μＧ／用量）の免疫原性はまた、混合対照（ＨＡ−Ｎｐ（０．２２μＧ／用量）と２０ΜＧのＣｐＧ（典型的な治療用量）との混合、およびＨＡ−Ｆｅｒｒ（０．２２μＧ／用量）と２１ＮＧのＣｐＧ（コンジュゲートと等モルマッチ）との混合物）と比較して評価された。追加の対照は、ＨＡ含有量（０．１７μＧのＨＡ／用量）に一致して投薬されたコンジュゲートされていないＨＡ−ＮｐおよびＩＩＶであった。上記されるように、投薬は第０週および第３週に行われた。ＥＬＩＳＡおよびＰＳＶアッセイはブーストから２週間後の血清のものであり、ＨＡＩはブーストから５週間の血清のものであった。全試料を３重にして実験した。
【０２３２】
ＥＬＩＳＡエンドポイント力価（図１７Ａ）または偽ウイルス中和ＩＣ５０力価（図１７Ｂ）に基づいて、コンジュゲートは、マッチさせた混合物、コンジュゲートされていない粒子、またはＩＶよりも強い結合および中和抗体応答を誘導する。ＨＡ−Ｎｐ−ＣｐＧコンジュゲートは、等モル混合対照よりも有意に強いＨＡＩ力価（図１７Ｃ）を誘導する。さらに、ＨＡＩ力価は、コンジュゲートされていないＨＡ−ＦｅｒｒおよびＩＩＶよりも２．６倍および３．０倍高かったが、これらの結果は有意ではなかった。
【０２３３】
Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＴＬＲアゴニストコンジュゲートの免疫原性も、非ヒト霊長類モデルで評価した。ＵＳＤＡの規制およびＡｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔを含む全ての連邦規制を順守して、Ｂｉｏｑｕａｌ  Ｉｎｃ．社によって１２匹のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を収容し、世話した。動物は事前スクリーニングし、ＥＬＩＳＡによって２０１６〜２０１７年のＦｌｕｚｏｎｅ  Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ抗原（Ａ／カリフォルニア／０７／２００９；Ａ／香港／４８０１／２０１４  Ｘ−２６３Ｂ；Ｂ／プーケット／３０７３／２０１３；Ｂ／ブリスベン／６０／２００８）への反応性がないことで選択した。ＮＨＰ対象（雌１０匹、雄２匹）（５〜１３年齢、体重３．５ｋｇ〜７．８ｋｇ）を各免疫群（ｎ＝３匹／群）にランダムに割り付けた。各群に、Ｈ１−ＳＳ−ｎｐとＡＦ０３  ５０μｇ、またはＨ１−ＳＳ−ｎｐ（アジュバント対照なし）  ２００μｇ、またはＨ１−ＳＳ−ｎｐ−ＳＭ７／８コンジュゲート  ２００μｇ、またはＨ１−ＳＳ−ｎｐ−ＣｐＧ  ２００μｇのいずれかを０週、４週、および１０週に３用量投与した。血清を単離するため、０週、２週、４週、６週、８週、１０週、および１２週に血液サンプル１０ｍＬを採取した。ＰＢＭＣを単離するため、０週、２週、５週、６週、および１２週に血液サンプル１０〜１６ｍＬを採取した。血清およびＰＢＭＣを単離し、標準的な操作手順に従って凍結保存した。カニクイザルを、ＡＦ０３アジュバントを混合して処方したＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ  ５０μｇ、またはＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（アジュバント対照なし）  ２００μｇ、またはＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＳＭ７／８ａコンジュゲート（図３Ａに示す）  ２００μｇ、またはＨ１/Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＣｐＧコンジュゲート（図３Ｂに示す）  ２００μｇのいずれかで０週、４週、および１０週に免疫するように割り付けた。種々の時点で単離した血清を、ＥＬＩＳＡによる抗ＨＡ抗体力価について（図２５Ａ）、ならびにＨ１サブタイプＨＡおよびＮＡ（図２５Ｂ）またはＨ５サブタイプＨＡおよびＮＡ（図２５Ｃ）でシュードタイプ化したレンチウイルスの中和について、アッセイした。これらを合わせて、図２５Ａ〜図２５Ｃに示す結果は、ＴＬＲ−アゴニストのコンジュゲーションが非ヒト霊長類モデルにおけるＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐの免疫原性を改善することを実証している。このモデルでは、ＴＬＲ７／８アゴニストコンジュゲートはＣｐＧコンジュゲートよりも高い力価を生じるようであり、ＡＦ０３混合アジュバントは試験した条件において最高の力価を誘発した。
【０２３４】
次に、より高い用量で与えた場合に３Ｍ０１２コンジュゲートの免疫原性が改善されるか否かを決定した。これを行うため、コンジュゲート、等モル混合物、高用量混合物、コンジュゲートしていないナノ粒子を、ＨＡ−ＮＰの用量を０．１μｇ、０．５μｇ、２．５μｇ、および１２．５μｇとして試験した（図２６Ａ〜図２６Ｂ）。ＨＡ−ＮＰの用量０．１μｇおよび０．５μｇでは、高い混合用量の場合を除いて中和およびＨＡＩアッセイにおいて最小の応答が見られた。２．５μｇの用量では、コンジュゲートしていないＨＡ−ＮＰおよびＨＡ−ＮＰと３Ｍ０１２の等モル混合物はいずれも最小限の抗体応答を誘起した。高用量の混合物群と比較すると、３Ｍ０１２をコンジュゲートしたＨＡ−ＮＰは３Ｍ０１２の含量が５０００分の１以上少ないにも関わらず、同様の抗体応答を誘起し、直接のコンジュゲーションおよびＴＬＲアゴニストの標的送達の有効性が立証された。
【０２３５】
３．候補ポリペプチドを含むナノ粒子のＥＭおよびＤＬＳによる特徴解析
上に概要を示したプロセスを用いて、図１Ａに提示するインフルエンザポリペプチドを含むＨＡ−Ｎｐを発現し、培地中に放出した（ＨＡ部分の配列アライメントを図１Ａに示し、デンドグラムを図１Ｂに示す）。図１Ｂ中の矢印は候補ポリペプチドを示す。図１８Ａに列挙するＨＡ−Ｎｐはアニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーによって２９３Ｅｘｐｉ細胞培養上清から精製した。ナノ粒子の生成に成功したことを確認するクーマシー染色の結果を図１８Ｂに示す。
【０２３６】
電子顕微鏡（ＥＭ）および動的光散乱（ＤＬＳ）解析は、下記のように実施した。
【０２３７】
動的光散乱はＷｙａｔｔ社のＤｙｎａＰｒｏ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＩＩを用いて２５℃で測定した。精製したＨＡ−Ｎｐは動的光散乱で予想された１６〜１８ｎｍの大きさを呈した（図１８Ａ、「サイズ」尺度で示す）。ナノ粒子の形成は陰性染色透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）でも確認された（図１８Ｃ）。ＥＭのために、グロー放電に３０秒曝露することによって親水化した炭素コートグリッドにＨＡ−フェリチンナノ粒子サンプルを１分間吸着させた。過剰な液体を濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社＃１）で除去し、サンプルを０．７５％のギ酸ウラニルで３０秒染色した。過剰なギ酸ウラニルを濾紙で除去した後、グリッドをＴｅｃｎａｉＧ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮで検査し、ＡＭＴ  ２ｋ  ＣＣＤカメラで画像を記録した。
【０２３８】
４．分岐したＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスの代表的なパネルに対する単一株ＨＡ−フェリチンナノ粒子の免疫原性
特定のウイルス株からのＨＡ−Ｎｐの免疫原性を検討するため、目的の株からのナノ粒子でマウスを２回免疫し、第２の免疫の３週後に血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）を用いて血清をアッセイした。全ての免疫は動物の取り扱いのための確立されたガイドラインに従った。Ｂａｌｂ／ｃマウス（５匹／群）を０週および３週にＨＡ−フェリチンナノ粒子２２０ｎｇ（ＨＡ含量１７０ｎｇ）で、および適用可能な場合には筋肉内注射（後ろ足あたり５０μＬ）の直前に１：１でアジュバントと混合して、免疫した。Ｒｉｂｉ（Ｓｉｇｍａ社アジュバントシステムカタログ＃Ｓ６３２２−１ｖｌ）またはＡＦ０３（Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ社）を図の凡例に指示するように用いた。二価、三価、および四価の組合せについては、注射の前に各ナノ粒子２２０ｎｇを事前混合した。ブースト注射の２週および３週後に血清を採取した。
【０２３９】
インフルエンザシードストックを用いるＨＡ阻害アッセイ（ＨＡＩ）は、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（Ａｔｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ，ＵＳＡ）から入手した。免疫血清は血清１部を酵素３部で希釈することによる受容体破壊酵素（ＲＤＥ）で前処理し、３７℃の水浴中で終夜インキュベートした。酵素は５６℃、３０分のインキュベーションおよびそれに続いてＰＢＳ６部を添加して最終希釈１０倍にすることによって不活化した。ＨＡＩアッセイは、Ｖ底９６ウェルのマイクロ力価プレート中、０．５％のシチメンチョウ赤血球中の４ＨＡ単位（ＨＡＵ）のウイルスを用いて実施した。ＨＡＩ力価は、血球凝集の完全な阻害をもたらす血清の最大希釈度として決定した。
【０２４０】
全てのデータについて、エラーバーは所与の処置群（マウスについてｎ＝５、フェレットについてｎ＝１２）における各動物からのサンプルをアッセイして得られた平均値の標準誤差を表す。ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社のＥｘｃｅｌを用いて計算した。ＡＮＯＶＡはＶａｓｓａｒＳｔａｔｓ（ウェブからvassarstats.net/anova1u.htmlで入手可能）を用いて計算した。
【０２４１】
ウイルスの進化の７８年にわたる代表的な１６種のインフルエンザ株のパネルを用いた。パネル中のウイルスを表２に列挙する。
【０２４２】
【表１６】
2021519600.tif 000024
【０２４３】
全ての例において、一致した株の強力な中和が観察された（ＣＡ０９、ＮＣ９９、ＦＭ４７、およびＨＫ７７、図１９Ａ〜図１９Ｄ）。
【０２４４】
血清学的応答も、一致した抗原に対するＥＬＩＳＡによって確認した（図２０Ａ〜図２０Ｆ）。各群に投与した免疫原を図２０Ａに列挙する。図２０Ｂ〜図２０Ｆに示すように、ＥＬＩＳＡには三量体を用いた。
【０２４５】
ＥＬＩＳＡアッセイのため、Ｎｕｎｃ社のＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェルプレート（カタログ＃４４−２４０４−２１）を１００ｎｇ／ウェルの三量体ＨＡまたは安定化されたステムタンパク質で、４℃で終夜コートし、ＰＢＳＴ中５％のスキムミルクでブロックした。指示した通りに抗血清を希釈し、室温で１時間インキュベートし、結合した抗体を、抗マウス−ＨＲＰ抗体（カタログ＃ＮＡ９３１、５，０００倍）または抗サル−ＨＲＰ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、カタログ＃４７００−０５、ロット＃Ａ３８１４−Ｐ９０７、５，０００倍）と５％ミルク−ＰＢＳＴ中でこれも室温で、１時間インキュベートすることによって検出した。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ基質（カタログ＃５２−００−０２）でＨＲＰを発色させ、０．５Ｎの硫酸で停止した。吸光度は４５０ｎｍ（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５）で読み取った。エンドポイント力価は、閾値を０．２、典型的バックグラウンドレベルを０．０５として、Ｇｒａｐｈｐａｄプリズムで計算した。
【０２４６】
ＨＡ／ＮＡシュードタイプ化レンチウイルスの中和も上記のようにして評価した。結果を表３に示す。試験した全ての例において、一致した株については強い中和活性が観察され、これらの値を閾値として用いた。ＨＡ−Ｎｐと相補的中和活性との組合せにより、交差反応性への加成的な拡張が導かれた。
【０２４７】
【表１７】
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【０２４８】
ＣＡ０９  ＨＡ−Ｎｐは強い免疫応答を誘発したが、これらは、これもブタ起源でＣＡ０９と近いホモロジーを有する現代（２００９年以降）の株および１９７６年の単離株に限られていた（図１９Ａ）（Ｇａｙｄｏｓら、２００６．Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １２：２３〜２８頁（１９７６）を参照）。ＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐは１９９０年代後半および２０００年代初期のインフルエンザウイルスに対して強力な中和を誘発した（図１９Ｂ）。ＦＭ４７  ＨＡ−Ｎｐに対する免疫応答は一次的には一致した株に拡張していたが、これも１９７７年の株への中等度の交差反応性を示した（図１９Ｃ）。この交差反応性のレベルは、主として２６歳以下の人が罹患した１９７７年の流行との臨床的関連性を有しており、１９４０年〜１９５０年の流行によるインフルエンザウイルスへの曝露によって１９７７年の株に対する保護が付与されたことを示唆している（Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ、２００６）。興味深いことに、ＨＡ配列の中でＨＫ７７  ＨＡ−Ｎｐは、その交差反応性が１９４７年、１９７８年、および１９８３年の株に拡張しており、目を引く（図１９Ｄ）。一方、ＭＡＬ５４  ＨＡ−ＮｐおよびＤＶ５７  ＨＡ−Ｎｐへの免疫応答は一致した株に制限されている（図１９Ｅ、図１９Ｆ、および表３）。
【０２４９】
ＣＯＢＲＡ  Ｐ１およびＣＯＢＲＡ  Ｘ６のナノ粒子で観察された交差反応性は、それらのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の同等物と符合した（Ｃａｒｔｅｒ  ＤＭら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ９０：４７２０〜４７３４頁（２０１６）参照）。ＣＯＢＲＡ  Ｐ１  ＨＡ−Ｎｐによって誘発された免疫応答はＣＡ０９  ＨＡ−Ｎｐと同様であり（図１９Ａおよび図１９Ｇ）、ＣＯＢＲＡ  Ｘ６  ＨＡ−ＮｐはＮＣ９９  ＨＡ−Ｎｐと同様の免疫プロファイルを示した（図１９Ｂおよび図１９Ｈ）。
【０２５０】
５．ＨＡ−フェリチンナノ粒子の一価、二価、三価、および四価の処方
選定したＨＡ−Ｎｐの組合せによって誘発されたＨＡＩ交差反応性を評価した。個別のナノ粒子を組み合わせることによって作成した二価、三価、または四価の処方で、上述のようにマウスを免疫し、試験した。ＮＣ９９およびＣＡ０９のＨＡ−Ｎｐの二価の組合せは、いずれかの一価の組成物と比較して拡張した交差反応性を示した（図２１Ａ）。しかし、この二価の組合せは１９３４年〜１９５７年および１９７７年〜１９９１年の古い分岐した株に対しては検出可能な抗体力価を誘発しなかった。ＣＯＢＲＡ  Ｘ６およびＣＯＢＲＡ  Ｐ１の二価の組合せの免疫原性は同じ傾向に従った（図２１Ｂ）。この組合せはＮＣ９９／ＣＡ０９の二価組成物と比較して増大した幅を示したが、いくつかの株に対するＨＡＩ力価は中程度であった。三価の組合せについては、ＮＣ９９およびＣＡ０９のＨＡ−Ｎｐへの第３成分の含有によって、第３成分がＦＭ４７  ＨＡ−Ｎｐ（図２１Ｃ）またはＨＫ７７  ＨＡ−Ｎｐ（図２１Ｅ）の場合には交差反応性が増大したが、ＭＡＬ５４  ＨＡ−Ｎｐ（図２１Ｄ）は幅を増強しなかった。四価処方における第４成分の添加は、ＮＣ９９、ＣＡ０９、およびＨＫ７７のＨＡ−Ｎｐの三価の組合せと比較して観察可能な交差反応性の付加を生じなかった（図２１Ｆ〜図２１Ｈ）。
【０２５１】
様々なアジュバントを用いた場合に、類似の結果が観察された（すなわち、Ｒｉｂｉ対ＡＦ０３、図２２Ａ〜図２２Ｆ）。重要なことに、様々なＨＡ−Ｎｐの共投与による抗原の競合の証拠はなかった。これらのデータは、個別のＨＡＩプロファイルに高度の相補性がある場合には、交差反応性プロファイルに加成性があることを示唆している。正規化したＨＡの用量を用いて卵から製造した不活化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ）として送達したＮＣ９９およびＣＡ０９の免疫原によって得られたＨＡＩプロファイルも測定した（図２３Ａ〜図２３Ｃ）。
【０２５２】
６．フェレットにおけるナノ粒子組成物によるチャレンジに対する保護
ある種のＨＡ−Ｎｐ組合せの有効性を、ヒト疾患に関連する動物モデルであるフェレットで試験した。フェレット（ｎ＝１２匹／群）を、リン酸緩衝食塩液（図２４Ａ）、ＣＡ０９不活化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ、図２４Ｂ）、野生型ＨＡ−Ｎｐの三価の組合せ（ＮＣ９９＋ＣＡ０９＋ＨＫ７７、図２４Ｃ）、またはＣＯＢＲＡ  Ｐ１＋ＣＯＢＲＡ  Ｘ６＋ＨＫ７７  ＨＡ−Ｎｐの組合せ（図２４Ｄ）のいずれかで免疫した。筋肉内注射の前に、これらの組成物をＡＦ０３アジュバントと１：１で混合して最終注射量を１ｍｌとした。
【０２５３】
２回の免疫の後、一致した株に対する顕著なＨＡＩ力価が観察された（図２４Ｂ〜図２４Ｄ）。ナノ粒子の組合せで免疫した両方の群のフェレットは、ＦＭ４７、ＨＫ７７、およびＮＣ９９に対して顕著なＨＡＩ力価を示した。ＣＡ０９  ＩＩＶはマウスで観察されたＦＭ４７およびＨＫ７７株に対する交差中和力価をフェレットでは誘発しなかった（図２４Ｂ）。
【０２５４】
免疫の後、一致しない分岐株であるＨ１／フォートマンモス／１９４７ウイルスをフェレットにチャレンジした。インフルエンザチャレンジは２回目の免疫の４週後に５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）の１０４．６５倍のＡ／フォートマンモス／１／１９４７ウイルス１ｍｌの鼻内接種で実施した。臨床兆候を２週間、毎日追跡し、チャレンジ後７日の間、鼻の洗浄液を毎日採取し、標準的なＴＣＩＤ５０アッセイによってウイルス負荷を試験した。チャレンジに続いて鼻の洗浄液からウイルス力価を定量した。三価のＮＣ９９＋ＣＡ０９＋ＨＫ７７またはＣＯＢＲＡ−Ｐ１＋Ｘ６＋ＨＫ７７のナノ粒子の組合せのいずれかを受けたフェレットのコホートでは対照群より早くウイルスが消滅し、感染後５日目のウイルス力価が顕著に低減したことを示した（図２４Ｅ、ｐ≦０．００１）。対照的に、ＣＡ０９  ＩＩＶで免疫した群はＰＢＳで免疫した対照群より顕著に早くウイルスが消滅しなかった。全ての群では、ＦＭ４７株の複製に成功し、感染後１週以内に消滅した。したがって、ヒト疾患に関連する感染の動物モデルにおいて、三価の組合せは効果的なＨＡＩ応答を刺激し、これは分岐したウイルスチャレンジに対しても保護する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2021519600.tif 000083
2021519600.tif 000084
2021519600.tif 000085
2021519600.tif 000086