(57)【要約】  本発明は、蛍光顕微鏡法であって、Ａ．  第１の初期構成Ｃ1をもつ波面を有するコヒーレント励起光線（５）を備え、１つ以上の蛍光発光体を含む散乱サンプルを照らすことで、当該散乱サンプルに含まれる１つ以上の蛍光発光体を励起するステップと、Ｂ．  画素撮像ユニット（４５）を介して、散乱サンプルの背景画像Ｆ1＝ＦBに対応する第１の初期画像Ｆ1を取得し、スペックル粒子画像を得るステップと、Ｃ．  少なくとも１つの蛍光発光体の蛍光シグナルをもつ第１の初期画像Ｆ1の領域に属するＮ＝１…Ｍ個の座標［ｘN，ｙN］を有し、それぞれが第１の初期強度ＩPN1をもつＭ個の目標ピクセルＰNを選択するステップと、Ｄ．  Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて波面の第１の初期構成を最適化することで、第１の初期画像Ｆ1のスペックル粒子サイズを減少させ、目標ピクセルＰNの最大強度に対応する蛍光シグナルの局所最大ＩPNmaxを有する散乱サンプルの最終画像Ｆfin（ＩPNmax）を取得するステップと、Ｅ．  ステップＢで取得されたバックグラウンドの第１の初期画像ＦBを、ステップＤで取得された最終画像Ｆfin（ＩPNmax）から減算することで、Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて、強度ＩPNSPECKLEで画素［ｘN，ｙN］に位置する１つのスペックル粒子から来る蛍光シグナルのみを有する画像Ｆspeckle(PN)をそれぞれ取得するステップと、Ｆ．  自由中心座標をもつガウス関数で、ステップＥで得られた画像Ｆspeckle(PN)をフィッティングすることで、Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて、ｘｙ平面での座標（ＸN，ＹN）と強度ＩNを得るステップと、Ｇ．  Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて、ステップＦで得られた強度ＩNと、散乱サンプルのスペックル粒子の平均サイズＳに等しいクビレをもち、座標（ＸN，ＹN）を中心とするガウス分布を含む画像ＦNを生成するステップと、Ｈ．  Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて、ステップＧで得られたＭ個の画像ＦNを足し合わせてサンプルの最終画像を生成するステップと、を含む。【選択図】図３
2021519448.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光顕微鏡法であって、
Ａ．  第１の初期構成Ｃ1をもつ波面を有するコヒーレント励起光線（５）を備え、１つ以上の蛍光発光体を含む散乱サンプルを照らすことで、当該散乱サンプルに含まれる１つ以上の蛍光発光体を励起するステップと、
Ｂ．  画素撮像ユニット（４５）を介して、散乱サンプルの背景画像Ｆ1＝ＦBに対応する第１の初期画像Ｆ1を取得し、スペックル粒子画像を得るステップと、
Ｃ．  少なくとも１つの蛍光発光体の蛍光シグナルをもつ第１の初期画像Ｆ1の領域に属するＮ＝１…Ｍ個の座標［ｘN，ｙN］を有し、それぞれが第１の初期強度ＩPN1をもつＭ個の目標ピクセルＰNを選択するステップと、
Ｄ．  Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて波面の第１の初期構成を最適化することで、第１の初期画像Ｆ1のスペックル粒子サイズを減少させ、目標ピクセルＰNの最大強度に対応する蛍光シグナルの局所最大ＩPNmaxを有する散乱サンプルの最終画像Ｆfin（ＩPNmax）を取得するステップと、
Ｅ．  ステップＢで取得されたバックグラウンドの第１の初期画像ＦBを、ステップＤで取得された最終画像Ｆfin（ＩPNmax）から減算することで、Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて、強度ＩPNSPECKLEで画素［ｘN，ｙN］に位置する１つのスペックル粒子から来る蛍光シグナルのみを有する画像Ｆspeckle(PN)をそれぞれ取得するステップと、
Ｆ．  自由中心座標をもつガウス関数で、ステップＥで得られた画像Ｆspeckle(PN)をフィッティングすることで、Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて、ｘｙ平面での座標（ＸN，ＹN）と強度ＩNを得るステップと、
Ｇ．  Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて、ステップＦで得られた強度ＩNと、散乱サンプルのスペックル粒子の平均サイズＳに等しいクビレをもち、座標（ＸN，ＹN）を中心とするガウス分布を含む画像ＦNを生成するステップと、
Ｈ．  Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて、ステップＧで得られたＭ個の画像ＦNを足し合わせてサンプルの最終画像を生成するステップと、を含む、
ことを特徴とする蛍光顕微鏡法。
【請求項２】
請求項１に記載の蛍光顕微鏡法であって、
前記ステップＤは、Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて、以下のサブステップを含み、
Ｄ．１−  波面の第１の初期構成Ｃ1を波面の参考構成Ｃ1＝Ｃrefとして設定し、第１の初期画像Ｆ1を参考画像Ｆ1＝Ｆrefとして設定し、第１の初期画像Ｆ1の目標ピクセルＰNにおける第１強度ＩPN1を目標ピクセルＰNにおける参考強度ＩPN1＝ＩPNrefとして設定するステップと、
Ｄ．２−  次のサブステップのサイクルをＴ＞１となるようＴ回繰り返すステップと、
Ｄ．２．１−  振幅／位相変調ユニット（１０）を介して波面の参考構成Ｃrefを変化させることで、波面のｉ番目の構成Ｃを取得し、
Ｄ．２．２−  目標ピクセルＰNにおいてｉ番目の強度ＩPNiをもつｉ番目の画像Ｆiを取得し、
Ｄ．２．３−  目標ピクセルＰNにおけるｉ番目の強度ＩPNiの値が、参考強度ＩPNrefより大きいかどうかをチェックし、それによって、
ＩPNi＞ＩPNrefである場合には、前記ステップＤ．２．１で得られた波面のｉ番目の構成Ｃは、波面の参考構成Ｃrefとして受け入れら、すなわち、Ｃref＝Ｃi、Ｆref＝Ｆi、およびＩPNref＝ＩPNiが設定され、
ＩPNi＜ＩPNrefである場合には、前記ステップＤ．２．１で得られた波面のｉ番目の構成Ｃは受け入れられず、前記ステップＤ．２．１の実行で変化する前の波面の参考構成Ｃrefが復元され、
Ｄ．３−  参考画像Ｆrefを最終画像Ｆref＝Ｆfin（ＩPNmax）として設定し、参考強度ＩPNrefを目標ピクセルＰＮでの蛍光シグナルの局所最大ＩPNmaxとして設定するステップと、を含む、
ことを特徴とする蛍光顕微鏡法。
【請求項３】
請求項２に記載の蛍光顕微鏡法であって、
前記振幅／位相変調ユニット（１０）は、マイクロミラーのｐ×ｑ行列を備えるデジタルマイクロミラーデバイス（１０）であり、
前記ステップＤ．２．１は前記デジタルマイクロミラーデバイス（１０）のＱ≧１個のマイクロミラーの向きを変化させることによって実行され、当該実行によってＱ≦ｐ×ｑとなって、各マイクロミラーはＶ＞２の向きをとることができ、Ｔ＝Ｖ×Ｑとなることを特徴とする蛍光顕微鏡法。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡法であって、
散乱サンプルのスペックル粒子の平均サイズＳは、λ／２ｎと等しくなるように設定され、λは励起光の波長であり、ｎはサンプルの屈折率であることを特徴とする蛍光顕微鏡法。
【請求項５】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡法であって、
散乱サンプルのスペックル粒子の平均サイズＳは、距離の関数として、サンプル画像の強度の自己相関を測定することによって計算されることを特徴とする蛍光顕微鏡法。
【請求項６】
請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡法であって、
前記ステップＡの前に、前記コヒーレント励起光線（５）を縮小するステップを含むことを特徴とする蛍光顕微鏡法。
【請求項７】
蛍光顕微鏡装置（１００）であって、
励起光線を受け取り、振幅／位相変調するように構成された波面変調ユニット（１０）を備え、
前記波面変調ユニット（１０）によって変調された励起光線（５）によってサンプル（２０）を照らすように構成され、
前記サンプル（２０）から発せられた蛍光ビームを受け取って取得する撮像ユニット（４５）と、
前記波面変調ユニット（１０）及び前記撮像ユニット（４５）に接続される制御部（６０）とを、さらに備え、
請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡法を実施するように構成され、
前記制御部（６０）は、前記撮像ユニット（４５）によって取得された蛍光ビームに基づいて、ステップＤのように前記波面変調ユニット（１０）を制御するように構成される、
ことを特徴とする蛍光顕微鏡装置。
【請求項８】
請求項７に記載の蛍光顕微鏡装置（１００）であって、
前記波面変調ユニット（１０）は、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）であることを特徴とする蛍光顕微鏡装置。
【請求項９】
請求項７または請求項８に記載の蛍光顕微鏡装置（１００）であって、
コヒーレント励起光線（５）縮小ユニットを備え、請求項６に記載の蛍光顕微鏡法を実施するように構成されることを特徴とする蛍光顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、装置の複雑さを増すことなく、簡単で、信頼性があり、適応可能で、かつ、経済的な方法で、不透明または散乱サンプル上の蛍光顕微鏡装置の光学分解能を増加させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
このような方法は、サンプル自体によって散乱された光を利用することで、顕微鏡装置の有効開口数を増加させて、集光光学系、すなわち対物レンズの分解能を克服する。このような方法は、サンプルによって散乱された光線（光ビーム）から構造的な干渉を構築するために、散乱サンプル上の励起したコヒーレント光線の波面位相および/または振幅変調に基づき、小さな焦点を生じさせ、サンプルによって散乱された光の制御に基づく。特に、本発明による方法は、生物学的組織の蛍光タンパク質から放出される蛍光シグナルの強度を最大化し、最適化を繰り返した後、異なる位置でサンプルを横切り生成される複数の焦点によって生成される蛍光から得られる情報を、照明および集光光学系によって分解能（解像度）が制限されない画像に組み立てる。
【０００３】
さらに、本発明は、高い光学分解能を有する蛍光顕微鏡装置に関する。
【０００４】
本発明は主に、集光光学系の蛍光シグナルがサンプルから離れて配置されることを実験条件として必要とする生体サンプルの調査に向けられているが、添付の特許請求の範囲によって定義される保護の範囲内であれば、散乱サンプルによって生成される蛍光シグナルは、他の分野、例えば天文学および気象学といった分野や、セキュリティまたは民間用途のための遠隔調査といった分野に適用されてもよい。
【０００５】
回折限界はAbbeとRayleighによって定式化されており、レンズによる達成可能な最大分解能は開口数ＮＡによって規定される。照明および集光光学系の立体角が大きいほど、撮像システムによって達成可能な空間分解能は高くなる。Tangらの論文「補償技術を適応した反復多光子による超貫通光学顕微鏡法」、Proceedings of National Academy of Sciences 109, 8434-8439 (2012)、および、Ni N.らの会報「生体組織における高解像度画像化のための瞳分割による適応光学系」、Nature methods 7, 141-147 (2010)は、実レンズの理論的な分解能を得るための適応光学系を用いた光学収差の補正方法を開示している。このような理論的な分解能は、超解像技術によってバイパスされてもよく、例えば以下の文献に開示されている。
Betzig, E.らの論文「ナノメートル分解能での細胞内の蛍光蛋白質の画像化」、Science 313, 1642-1645 (2006)、
di Hell, S.とWichmann, N.らの「誘導放出による回析分解能の限界の突破：誘導放出-空乏化蛍光顕微鏡法」、Optics letters 19, 780-782 (1994)
Schermelleh, L.らの「超解像蛍光顕微鏡の手引き」、The Noural of cell biology 190, 165-175 (2010)
di Leung, B. O.やChou, K. C.の「生物学における超解像蛍光顕微鏡のレビュー」、Applied spectroscopy 65, 967-980 (2011)、
Pawley, N. B.の「共焦点顕微鏡の基本的な限界」、20-42 (Springer US, Boston, MA, 2006)、
Betzig, E.やTrautman, N. K.の「近接場光学：回析限界を超える顕微鏡、分光および表面改質」、Science 257, 189-196 (1992)、
Gustafsson, M. G.の「構造化照明顕微鏡法を用いて、横方向の解像限界を倍化させる"、Journal of microscopy 198, 82-87 (2000)。
【０００６】
蛍光顕微鏡法やその関連装置の別の従来技術の例が、Izeddin, I.らの「３次元の単分子の超解像イメージングと追跡のための補償光学系を使用したPSF成形」、Optics Express Vol. 20, Issue 5, pp. 4957-4967 (2012)には、開示されている。
【０００７】
提案された解決策には、多くの欠点がある。第１に、従来の光学顕微鏡装置によって達成され得る最大分解能はサンプルの近くに配置されるレンズを必要とし、これは、非侵襲性の（測定対象に負担を与えない）測定や生体内測定を行うのに厳しい制限となり得る。さらに、高い開口数ＮＡは、共焦点、近接場、構造化照明、刺激放出の枯渇、または光活性化局在顕微鏡法など、回折限界を回避することを目的とする現在のほとんどの顕微鏡法において不可欠な要素である。最後に、例えば不透明な組織からの散乱は、顕微鏡による完全な集束の障害物として一般的に見られており、光学収差によって波面形状を劣化させ、達成可能な分解能を制限する。例えば、ほとんどの脊椎動物組織(ヒトを含む)は光学的に不透明に見えるので、皮膚の一部に入るコヒーレント光線は、多数の無相関な光路内に拡散され、ある距離(輸送平均自由行程、b)の後、進行方向が完全にランダム化される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は上述の欠点を克服し、顕微鏡光学系の開口数ＮＡとは独立して、非侵襲的で、信頼でき、簡単に、かつ経済的な方法で蛍光顕微鏡装置の光学分解能を増加させることである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の特定の主題は、以下のステップを含む蛍光顕微鏡法である。
【００１０】
Ａ．  第１の初期構成Ｃ1をもつ波面を有するコヒーレント励起光線を備え、１つ以上の蛍光発光体を含む散乱サンプルを照らすことで、当該散乱サンプルに含まれる１つ以上の蛍光発光体を励起するステップと、
【００１１】
Ｂ．  画素撮像ユニットを介して、散乱サンプルの背景画像Ｆ1＝ＦBに対応する第１の初期画像Ｆ1を取得し、スペックル粒子画像を得るステップと、
【００１２】
Ｃ．  少なくとも１つの蛍光発光体の蛍光シグナルをもつ第１の初期画像Ｆ1の領域に属するＮ＝１…Ｍ個の座標［ｘN，ｙN］を有し、それぞれが第１の初期強度ＩPN1をもつＭ個の目標ピクセルＰNを選択するステップと、
【００１３】
Ｄ．  Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて波面の第１の初期構成を最適化することで、第１の初期画像Ｆ1のスペックル粒子サイズを減少させ、目標ピクセルＰNの最大強度に対応する蛍光シグナルの局所最大ＩPNmaxを有する散乱サンプルの最終画像Ｆfin（ＩPNmax）を取得するステップと、
【００１４】
Ｅ．  ステップＢで取得されたバックグラウンドの第１の初期画像ＦBを、ステップＤで取得された最終画像Ｆfin（ＩPNmax）から減算することで、Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて、強度ＩPNSPECKLEで画素［ｘN，ｙN］に位置する１つのスペックル粒子から来る蛍光シグナルのみを有する画像Ｆspeckle(PN)をそれぞれ取得するステップと、
【００１５】
Ｆ．  自由中心座標をもつガウス関数で、ステップＥで得られた画像Ｆspeckle(PN)をフィッティングすることで、Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて、ｘｙ平面での座標（ＸN，ＹN）と強度ＩNを得るステップと、
【００１６】
Ｇ．  Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて、ステップＦで得られた強度ＩNと、散乱サンプルのスペックル粒子の平均サイズＳに等しいクビレをもち、座標（ＸN，ＹN）を中心とするガウス分布を含む画像ＦNを生成するステップと、
【００１７】
Ｈ．  Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて、ステップＧで得られたＭ個の画像ＦNを足し合わせてサンプルの最終画像を生成するステップと、を含む。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、ステップＤは、Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれについて、以下のサブステップを含むことができる。
【００１９】
Ｄ．１−  波面の第１の初期構成Ｃ1を波面の参考構成Ｃ1＝Ｃrefとして設定し、第１の初期画像Ｆ1を参考画像Ｆ1＝Ｆrefとして設定し、第１の初期画像Ｆ1の目標ピクセルＰNにおける第１強度ＩPN1を目標ピクセルＰNにおける参考強度ＩPN1＝ＩPNrefとして設定するステップと、
【００２０】
Ｄ．２−  次のサブステップのサイクルをＴ＞１となるようＴ回繰り返すステップと、
Ｄ．２．１−  振幅／位相変調ユニット（１０）を介して波面の参考構成Ｃrefを変化させることで、波面のｉ番目の構成Ｃを取得し、
Ｄ．２．２−  目標ピクセルＰNにおいてｉ番目の強度ＩPNiをもつｉ番目の画像Ｆiを取得し、
Ｄ．２．３−  目標ピクセルＰNにおけるｉ番目の強度ＩPNiの値が、参考強度ＩPNrefより大きいかどうかをチェックし、それによって、
ＩPNi＞ＩPNrefである場合には、ステップＤ．２．１で得られた波面のｉ番目の構成Ｃは、波面の参考構成Ｃrefとして受け入れられる。すなわち、Ｃref＝Ｃi、Ｆref＝Ｆi、およびＩPNref＝ＩPNiが設定される。
ＩPNi＜ＩPNrefである場合には、ステップＤ．２．１で得られた波面のｉ番目の構成Ｃは受け入れられず、ステップＤ．２．１の実行で変化する前の波面の参考構成Ｃrefが復元される。
【００２１】
Ｄ．３−  参考画像Ｆrefを最終画像Ｆref＝Ｆfin（ＩPNmax）として設定し、参考強度ＩPNrefを目標ピクセルＰＮでの蛍光シグナルの局所最大ＩPNmaxとして設定するステップと、を含む。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、前記振幅／位相変調ユニットは、マイクロミラーのｐ×ｑ行列を備えるデジタルマイクロミラーデバイスであってもよく、ステップＤ．２．１はデジタルマイクロミラーデバイスのＱ≧１個のマイクロミラーの向きを変化させることによって実行される。これによって、Ｑ≦ｐ×ｑとなって、各マイクロミラーはＶ＞２の向きをとることができ、そのため、Ｔ＝Ｖ×Ｑとなる。
【００２３】
本発明の追加の態様によれば、散乱サンプルのスペックル粒子の前記平均サイズＳはλ／２ｎと等しくなるように設定されてもよい。ここで、λは励起光の波長であり、ｎはサンプルの屈折率である。
【００２４】
本発明の別の態様によれば、散乱サンプルのスペックル粒子の前記平均サイズＳは、距離の関数として、サンプル画像の強度の自己相関を測定することによって計算することができる。
【００２５】
本発明のさらなる態様によれば、本方法は、ステップＡの前に、コヒーレント励起光線を縮小するステップを含むことができる。
【００２６】
本発明の別の特定の主題は、励起光線を受け取り、振幅／位相変調するように構成された波面変調ユニットを備える蛍光顕微鏡装置であって、蛍光顕微鏡装置は、当該波面変調ユニットによって変調された励起光線によってサンプルを照らすように構成される。蛍光顕微鏡装置は、サンプルから発せられた蛍光ビームを受け取って取得する撮像ユニットと、波面変調ユニット及び撮像ユニットに接続される制御部とを、さらに備え、上記の蛍光顕微鏡法を実施するように構成され、これにより、制御部は、撮像ユニットによって取得された蛍光ビームに基づいて、ステップＤのように波面変調ユニットを制御するように構成される、ことを特徴とする。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、波面変調ユニットは、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）であってもよい。
【００２８】
本発明のさらなる態様によれば、蛍光顕微鏡装置は、コヒーレント励起光線縮小ユニットを備えて、上記の方法を実施するように構成されてもよい。
【００２９】
本発明による方法は、励起コヒーレント光線波面の振幅と位相の構成を成形する最適化アルゴリズムを使用することで、サンプルの表面上に位置する発光体、またはサンプル中に埋め込まれた発光体によって放射される蛍光シグナルを最大化する。以下の説明では、発光体によって放出される蛍光シグナルを最大化することを目的として、光線波面の振幅や位相の構成を最適化して成形する、すなわち、波面の振幅や位相の１つまたは複数が変化することについて区別しない。
【００３０】
シグナルの増強は、ターゲット発光体（増強されたスペックル粒子）に位置するスペックル粒子の光強度の増強によるものである。
【００３１】
明細書および添付の請求の範囲において、スペックルとは、コヒーレント光波として得られたドット図形が散乱体によって反射されることを意味し、スペックル粒子とは、スペックル場に位置し、最大強度であるものを意味する。最適化が完了すると、（最適化されていない蛍光を差し引いて得られる最適化された画像である）スペックル粒子のシグナルは、データのガウシアンフィッティングによって超局在化される。視野全体で複数の焦点、すなわち増強されたスペックル粒子を生成し、すべての寄与からの情報を集約することによって、サンプルの完全な画像が再構築される。
【００３２】
従来技術の解決策を超える本発明による方法の利点は、数多くあり、重要である。
【００３３】
本発明による方法は、励起光線の焦点、すなわち光焦点のサイズが、照明および集光光学系の開口数ＮＡによって限定されずに、サンプルの増強されたスペックル粒子のサイズによって定義されるという事実に基づいている。励起光線の焦点、すなわち光焦点は、散乱サンプルの近くまたは内側の波面の振幅や位相の構成を成形することによって得られる。言い換えれば、波面の振幅や位相の構成を成形した後、スペックル粒子のサイズと等しいサイズの光焦点が得られる。よって、顕微鏡装置の照明／集光光学系から空間分解能を独立させる。スペックル粒子の平均サイズＳは、λ／２ｎに等しい。これは、Goodman, N. W.らの「光学におけるスペックル現象：理論および応用」(Roberts and Company Publishers, 2007)に開示されている。ここで、λは入射光の波長であり、ｎは媒体の屈折率である。最近、高散乱体の表面におけるスペックル粒子のサイズＳは、１００ナノメートル未満であることが測定された。これは、Park, N. -H.らの「ランダムなナノ粒子を用いたサブ波長光集束」Nature photonics 7, 454-458(2013)、およびVan Putten, E.らの「散乱レンズは可視光で１００ｎｍ以下の構造を分解する」Physical review letters 106, 193905(2011)に開示されている。
【００３４】
言い換えれば、本発明に係る方法において、限定的な開口数は、照明や収集光学系によって規定されるものではなく、散乱を通してサンプルにより生成されるｋベクトルによって規定されるものである。
これにより、散乱サンプルのより深い回析分解能を有利に実現でき、理論的な回折限界の最大６倍までの分解能にすることができる。
【００３５】
本発明による方法の第２の有利な態様は、分解能が顕微鏡装置の光学系に依存しないので、本発明による方法は、長い作業距離を有し、調査されるサンプルに直接接続されない光学系を用いて作業することができる。言い換えれば、サンプルによって散乱される光の制御は、特に、長い作動距離とともに高い分解能が必要とされる場合に、分解能を増加させるための強力なツールとなることができる。さらに、この方法を実施するためには、フォトカメラや干渉フィルタなど、ほとんどの光学顕微鏡に共通する機能を、空間光変調器と組み合わせることによって、極めて単純な実験装置として利用することが可能になる。このことは、任意の蛍光画像化システムに適用することができ、本方法を極めて用途の広いものにできる点で有利である。
【００３６】
最後に、本発明による方法は、高出力光源を必要とせずに高分解能を得ることを可能にするので、さらなる利点はそれを使用して、損傷閾値が低いサンプルを調査することができ、人間の網膜などといった感覚組織における生体調査を容易に実施することができることである。
【００３７】
本発明について、以下の添付の図面を特に参照し、その好ましい実施形態に従って、限定としてではなく例示として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、本発明による方法を実施するよう構成された装置の好ましい実施形態の概略図（ａ）、標準的な顕微鏡装置における光学駆動分解能の限界を表す概略図（ｂ）、および、本発明による方法によって得られるスペックル粒子のサイズＳに依存する分解能の限界を表す概略図（ｃ）を示す。
【図２】図２は、本発明による方法の好ましい実施形態において、励起光線波面の振幅や位相の構成を成形することで実験的に得られ、研磨されたガラス表面（図２ａ）と既知の散乱体（図２ｂ）とに衝突する励起コヒーレント光線の焦点のサイズをそれぞれ示す。開口数ＮＡの関数としての関連する強度プロファイル（図２ｃ）と関連するビームウエスト値（図２ｄ）を示す。
【図３】図３は、第１の既知の散乱サンプルの高解像度の画像を得るために図１の装置によって実施される方法の好ましい実施形態のいくつかのステップを概略的に示す。
【図４】図４は、集光光学系の開口数ＮＡを変化させる標準的な蛍光顕微鏡法によって得られる第２の既知の散乱サンプルの画像（ａ）、（ｄ）、（ｇ）と、図２および図３の方法によって得られる対応する画像（ｂ）、（ｅ）、（ｈ）と、同じ破線に沿う異なる強度プロファイル（ｃ）、（ｆ）、（ｉ）の比較と、を示す。
【図５】図５は、標準的な蛍光顕微鏡法によって得られる生体サンプルの画像と（図５１と図５ｍ）、図１の装置および図３の図示により実施される好ましい実施形態の方法によって得られる生体サンプルの画像（図５ｎ）を示す。
【図６】図６は、図４の画像で示された散乱サンプルの距離の関数としての自己相関グラフと、図５の画像で示された生体サンプルと、をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
図１ａを参照すると、本発明による方法を実施するように構成された装置１００は、サンプル２０内の蛍光発光体を励起するように、波長λの励起コヒーレント光線５を放出する（図１には示されていない）光源を備える。例えば、５３２ナノメートル（ｎｍ）の波長が選択的に用いられる単色レーザビームが用いられる。装置１００は、ビーム５を縮小するための図示されていない縮小ユニットをさらに備える。縮小ユニットは、例えば、縮小率と等しい焦点比ｆ1／ｆ2を有する２つのレンズを備えるガリレイ望遠鏡である。装置１００は、光線波面の振幅や位相の構成を変調するユニット１０を備える。ユニット１０は、励起コヒーレント光線５を受信し、振幅や位相を変調するように構成される。
【００４０】
装置１００の好ましい実施形態では、このような光線波面の振幅や位相の構成を変調するユニット１０が、デジタルマイクロミラーデバイスＤＭＤである。本発明の他の実施形態は、例えば、光空間変調器および変形可能なミラーのような、光線波面の振幅や位相の構成を変調する別のユニット１０を含むことができる。変調用のユニット１０の下流では、光源からサンプル２０への光線５の経路に続いて、装置１００は、変調用のユニット１０から出てくる変調された励起コヒーレント光線５をサンプル２０上に集束させるために、レンズ２５および光学対物レンズ３０を備える。レンズ２５および光学対物レンズ３０は、単純なレンズであってもよい。さらに、光学対物レンズ３０は、蛍光放出成分（すなわち、サンプル２０によって放出される蛍光ビーム)および励起光線５の反射成分を含むサンプル２０から来る光を集める。光学対物レンズ３０の開口数ＮＡは、絞り３５を介して制御される。装置１００は、サンプルから出る光を、例えばＣＭＯＳ又はＣＣＤカメラのような撮像ユニット４５に向かうように動かすビームスプリッタをさらに備える。スペクトルフィルタ５０は、サンプルから出る光の励起光線５の反射成分を除去することで、蛍光放出成分のみが、例えば接眼レンズといった光学グループ５５を通過した後に撮像ユニット４５に到達する。本発明の好ましい実施形態では、スペクトルフィルタ５０は干渉フィルタである。制御部６０は、光線波面の振幅や位相の構成を変調するユニット１０と、イメージングユニット４５と、に接続されている。このような制御部６０は、撮像ユニット４５から取得された画像に応じて波面の振幅や位相の構成を変調するユニット１０を、特に以下の図２および図３で説明するように、フィードバックループを介して、制御する。
【００４１】
図１ｂおよび１ｃは、本発明による方法の基礎となる原理の概略図を示す。顕微鏡の分解能は、集束／集光光学系（図１ｂ）によって通常は決められるが、散乱サンプルへの蛍光発光体のシグナルが集光光学系の限界を克服するために利用されてもよい。このような場合には、サンプルの表面上のスペックル粒子のサイズＳによって、分解能が制限されることになる（図１ｃ）。
【００４２】
簡単にするために、以下の説明および特許請求の範囲では、波面の「構成」を、波面の振幅や位相の構成を意味する用語として使用する。なお、振幅や位相は、変調されていても、変調されていなくてもよい。
【００４３】
本発明に係る方法では、変調されていない第１の初期構成Ｃ1を有する励起光線５の波面がサンプル２０に入射し、サンプル２０の第１の初期画像Ｆ1またはバックグラウンドフレームｄｉ Ｆ1＝ＦBが、撮像ユニット４５によって取得される。蛍光シグナルが存在し、その内部にＮ＝１、…、ＭのＭ個の画素ＰNが選択される領域に、画像の関心領域がユニット４５により形成され、画像面上の座標ｘｙは［ｘi，ｙi］になる。
【００４４】
次に、励起光線５の波面の構成の最適化ステップが実施され、増強されたスペックル粒子を生成するサンプル２０の表面から来る蛍光シグナルを最大化する。最近では、乱れたスペックルスキームの単一の粒子に光を集中させるために、波面の最適化アルゴリズムが実施されることが開示されている。当該開示は、例えばVellekoop, I. M.らの論文「Exploiting disorder for perfect focusing.」Nature photonics 4, 320-322 (2010)、Vellekoop, I. M.らの論文「Focusing coherent light through opaque strongly scattering media.」Optics letters 32, 2309-2311 (2007)、およびDi Battista, D.らの論文「Enhanced adaptive focusing through semitransparent media.」Scientific reports 5, 17406 (2015)によって示される。このようなアルゴリズムによって得られる光焦点は、多くの異なる光路による強め合う干渉を通じて作られる。また、フィードバックループによるマイクロミラーデジタルデバイスなどの空間光変調器によって、励起光線の波面の構成が成形される、すなわち励起光線の波面の位相や振幅が処理される。この処理は、例えばVellekoop, I. & Mosk, A.の論文「Phase control algorithms for focusing light through turbid media.」Optics communications 281, 3071-3080 (2008)、およびAkbulut, D.らの「Focusing light through random photonic media by binary amplitude modulation.」Optics express 19, 4017-4029 (2011)によって示される。本発明による方法の好ましい実施形態では、励起光線の波面の最適化は、表面の変調用のＤＭＤユニット１０の活性領域を均一に照らすような方法で、ビーム５を縮小する予備的なフェーズを備える。言い換えれば、サンプルは、ビーム５に照明された変調用のＤＭＤユニット１０の縮小イメージによって照らされる。次に、Ｍ個の画素のうちの１つと、ＰNと、Ｎ＝１…Ｍとが、目標ピクセルとして選択され、サンプル２０に衝突する波面の構成は、以下で説明するように画素に関連する蛍光シグナルの強度を最大にするまで、変調用のユニット１０によって変化させられる。
【００４５】
第１の初期画像Ｆ1が目標ピクセルＰNの参考画像Ｆrefとして設定され、第１の初期画像Ｆ1の目標ピクセルＰNの第１強度ＩPN1が目標ピクセルＰNの参考強度ＩPNrefとして設定され、波面の第１の初期構成Ｃ1が参考構成Ｃ1＝Ｃrefとして設定される。変調用のＤＭＤユニット１０は、各ミラーが複数のＶ＝２配向間の配向（向き）をとれるｐ×ｑセグメント又はマイクロミラーで組み立てられる。本発明のさらなる実施形態では、各マイクロミラーは、２つ以上の向きに、すなわちＶ≧２にできる。ＤＭＤのランダムに選択されたマイクロミラーｍの向きが変更されることで、サンプルに衝突する波面が第２の構成Ｃ2をとり、第２画像Ｆ2が取得される。第２の構成Ｃ2は、第１のものとは異なるものである（Ｃ2≠Ｃ1）。第２画像Ｆ2の目標ピクセルＰNの第２強度ＩPN2は、目標ピクセルＰNの参考強度ＩPNrefと比較される。第２強度ＩPN2が参考強度ＩPNrefより大きい場合、マイクロミラーｍの向きの変更や波面の第２の構成は受け入れられる。したがって、それらの間でより大きな強度のものを参考強度としてとり（ＩPNref＝ＩPN2）、より大きな強度のものを波面の参考構成としてとり（Ｃref＝Ｃ2）、目標ピクセルＰNの強度がより大きい画像を参考画像としてとる（Ｆref＝Ｆ2）。第２強度ＩPN2が参考強度ＩPNref未満である場合、変更は許可されず、マイクロミラーｍの以前の向きや波面の以前の構成が復元される。後者の場合、参考強度および参考構成は、参考画像とともに変更されない。
【００４６】
続いて、ランダムに選択されたマイクロミラーｎの向きが変えられて（ｎ≠ｍ）、サンプルに衝突する波面が第３の構成Ｃ3をとり、第３画像Ｆ3が取得される。第３画像Ｆ3の目標ピクセルＰNの第３強度ＩPN3は、参考強度ＩPNrefと比較される。第３強度ＩPN3が参考強度ＩPNrefより大きい場合、マイクロミラーｎの向き変更や波面の第３の構成Ｃ3は受け入れられる。したがって、それらの間でより大きな強度のものを参考強度としてとり（ＩPNref＝ＩPN3）、より大きな強度のものを波面の参考構成としてとり（Ｃref＝Ｃ3）、目標ピクセルＰNの強度がより大きい画像を参考画像としてとる（Ｆref＝Ｆ3）。第３強度ＩPN3が参考強度ＩPNref未満である場合、変更は許可されず、マイクロミラーｎの以前の向きや波面の以前の構成が復元される。後者の場合、参考強度および参考構成は変更されない。
【００４７】
上述の手順は、関心領域の各目標ピクセル（すなわち、Ｍ個の目標ピクセルＰNのそれぞれ）について、変調用のＤＭＤユニット１０のＱ番面のマイクロミラーに対しても繰り返される。本方法の好ましい実施形態では、Ｑは６０以上である。全体として、各目標ピクセルに対して、励起光線の波面のＶ×Ｑ構成がサンプルに当たる。
【００４８】
波面の配置を最適化するステップにより、散乱サンプル画像のスペックル粒子のサイズＳが減少する。縮小されたサイズのスペックル粒子を取得し、集束光学系の光学開口部から独立させる。
【００４９】
発明者らは、非散乱サンプルによって散乱されたコヒーレント光と、散乱サンプルによって散乱されたコヒーレント光とを、観測する実験を行った。実験は図１の装置を使用し、集光光学系の分解能に影響を与えないように、スペクトルフィルタ５０なしで、ビームスプリッタ４０の前に絞り３５を配置した状態で実施されている。
【００５０】
図２は、上述した非散乱サンプルおよび散乱サンプル上の波面構成の最適化ステップの終わりに得られた励起コヒーレント光線５の焦点画像を示す。特に、集束光学系の開口数ＮＡの０．０３と等しい値について、絞り３５により決定される。図２ａは、研磨されたガラスのサンプル（非散布サンプル）により得られる光の焦点の画像を示す。図２ｂは、エタノール懸濁液中で調製され、スライド（散布サンプル）上に堆積させた６０μｍ層厚の市販の二酸化チタンＴｉＯ2（SIGMA ALDRICH社の製品224227）により得られる光の焦点の画像を示している。層厚は、隙間ゲージを利用して調整された。
【００５１】
散乱サンプルのスペックル粒子の平均サイズＳは約λ／２ｎ＝１５０ｎｍであることが観察できる。波面の構成の最適化は、それぞれが７０マイクロメートル（μｍ）の辺サイズで１１×１１の正方形セグメントに分割されたDMD Vialux discovery 4100を使用して実行された。実験では、目標ピクセル上の波面の各構成に対する露光時間は２〜４０マイクロ秒（μs）の範囲であり、波面の構成の最適化のステップは、各目標ピクセルについて６０個のマイクロミラーに対して実施された。図２ａおよび図２ｂは、波面の構成を最適化するステップによって得られた、滑らかな表面上の光の焦点の大きさが、散乱面上で得られた大きさよりもはるかに大きいことを示している。図２ｃは、図２ａの光の焦点（実線）と、図２ｂの光の焦点（破線）の強度プロファイルを任意の単位で示したものである。この図から、励起光線５の測定されたウエスト（ＭＷ）値が、ガウスフィッティング（連続線）によって得られ、理論的なウエスト（ＴＷ）値の５．７に関して、研磨されたガラス試料上では５．９５に等しくなり、散乱サンプル上では１．４５に等しくなる。
【００５２】
また、発明者らは、装置の開口数ＮＡを変化させて、絞りの直径Ｄを調整して同様の実験を行った。図２ｄは、研磨されたガラスサンプル上と、散乱サンプル上の、ビーム５のウエスト値のマイクロメートル（μｍ）単位のサイズを、絞りの直径Ｄの関数として示し、期待される理論値（連続線）と比較したものである。散乱サンプル上の光の焦点の大きさは開口数ＮＡに依存しないことが明らかである。
【００５３】
波面の構成の最適化ステップの最後に、関心領域内の目標ピクセルＰNについての局所的な最大蛍光発光を有する最終的な画像Ｆfin（ＩPNmax）が得られる。ここで、ＩPNmaxは、最適化の最後に決定される波面の構成のために、最適化ステップの最後に得られる目標ピクセルＰNにおける最大強度である。
【００５４】
続いて、本方法は、非変調励起光線を用いて以前に得られた背景画像ＦBを減算するステップを続ける。背景画像ＦBは、波面の構成の最適化ステップから得られた最終画像Ｆfin（ＩPNmax）から、任意に縮小される。そして、強度ＩPNspeckleを有し、画素［ｘN，ｙN］に含まれ、スペックル粒子から生成された(すなわちもっぱら蛍光シグナルを含む)光のみを含む画像Ｆspeckle(PN)を得る。言い換えれば、最適化されたスペックルに対応し、単一の照明スポットがあるサンプルの画像が得られる。最適化されたスペックルは、周囲のスペックル強度よりも大きな強度を有するスペックルである。下層のスペックル粒子は、もつれが生じる集光光学系の限定された光学分解能によって、実際の拡張よりも大きいサイズで撮像ユニット４５上に現れる（図３ａの画像を参照）。
【００５５】
次に、スペックル粒子は超局在化される、すなわち、ｘｙ平面における座標（ＸN，ＹN）や最終的に対応する光の焦点の強度ＩNは、自由中心座標を有するガウス関数にフィットさせることで局在化ステップにて最適化される。局在化ステップの最後において、サンプルの最適化された解像度で中心座標（ＸfN，ＹfN）と、強度ＩfNと、ウエストとがスペックル粒子の平均サイズＳに等しいガウス強度分布を備えるように、ＦN画像が再構成される。したがって、本発明による方法の最終的な高解像度画像を得るためには、散乱サンプルのスペックル粒子のサイズＳの知見が必要になる。このサイズは、式Ｓ＝λ／ｎから導出することができ、または、例えば、距離の関数としてのスペックル粒子のＧ取得画像の強度の自己相関から、実験的に計算することができる(図６にて後述する)。
【００５６】
次いで、波面の構成を最適化するステップ、減算するステップ、局在化するステップ、および再構成するステップが、選択領域に属するＭ個の目標ピクセルのそれぞれについて、繰り返される。
【００５７】
図３は、本方法の上述のステップから得られる画像を示す。図の（ｃｉ）（（ａ）の詳細部分）、（ｃ２）、および（ｃ３）は、本方法の好ましい実施形態における波面の構成の最適化ステップで得られた散乱サンプルの画像を示す。散乱サンプルの画像は、３つの異なる目標ピクセルについて、３つの異なる局所最大値を有する。図の（ｄｉ）（（ｂ）の詳細部分）、（ｄ２）、および（ｄ３）は、対応する画像（ｃｉ）、（ｃ２）、および（ｃ３）から背景画像を減算するステップと、ガウスフィットによって局在化されるステップとから、再構成された画像を示す。本方法の上述のステップは、図３の中央図において比喩的に描かれ、平面ｘｙに直交する軸は目標ピクセルＰNのインデックスＮを表す。本方法の最後のステップにおいて、Ｎ個の再構成された画像から得られた全ての情報が単一画像として報告されることで、散乱サンプルの最終的な高解像度画像（ｆ）が得られる。また、画像（ｅ）は、比較のために、変調用のユニット１０の異なる構成で最適化された光の焦点の画像を加算して得られる画像であるが、超局在化されたものではない。また、同様に、線に沿って画像（ｅ）、（ｆ）の強度プロファイル（ｇ）、（ｈ）も示される。
【００５８】
本方法の好ましい実施形態では、最適化するステップ、減算するステップ、および局在化するステップは、各画素Ｎに対して順番に実施される。他の実施形態では、各画素Ｎに対して最適化するステップを実施することができ、次いで、最適化するステップを終えた各画像に対して減算および局在化するステップを実施することができる。また、最適化するステップを終えた各画像に対して減算するステップを実施してから、次いで、減算するステップから生じる各画像に対して局在化するステップを実施してもよい。
【００５９】
本発明の発明者らは、図１の装置を使用して、図３に関連して記載された方法の好ましい実施形態について信頼性を確かめる実験を行った。図４は、（上述した図２の実験で使用された）二酸化チタン層のサンプル上に置かれた２つの市販の蛍光ビーズ（直径０．５μｍ、Spherotech FP-00556-2）についての第１の実験の結果を示す。図４ａは、本発明による方法を適用することなく、少ない開口数ＮＡを用いて、約１．３μｍの低い光学分解能ｒで得られた第１画像を示す。図４ｂは、本発明に係る方法を適用し、対物レンズの開口数ＮＡを同じにして得られた対応する再構成画像を示す。図４ａの画像では、２つの蛍光ビーズは単一の細長い構造として表示される一方で、対照的に、図４ｂの再構成画像では、２つの蛍光ビーズは分離して表示され明確に区別される。図４ｃは、図４ａと図４ｂの２つの蛍光ビーズに沿って示される同じ破線ｌに沿う強度プロファイルを示す。図４ｂ、図４ｃから、本発明による方法によって得られた画像の解像度は、散乱する二酸化チタンのサンプル中のスペックル粒子の予想サイズと一致し、約１５０ｎｍに等しいと計算される。
【００６０】
対物レンズの開口数ＮＡと光学分解能ｒを減少させても（絞りを閉じると、光学分解能ｒは最初約１．７μｍになり、次いで約２．２μｍになる）、本発明による方法を実施することによって、図４ｅおよび図４ｈの画像や、図４ｆおよび図４ｉの破線ｌ上の相対強度プロファイルに示されるように、２つの蛍光ビーズは明確に区別できる状態を維持する。
比較のために、本方法を実施せずに同じ開口数で得られた画像を図４ｄおよび図４ｇに示し、同じ破線ｌ上の相対プロファイルを図４ｆおよび図４ｉに示す。
【００６１】
標準的な半透明の生体系に対する本発明による方法の実現可能性を確かめるために、本発明者らは、アルツハイマー病（３ｘＴｇ−ＡＤ)に罹患したマウスに由来する脳切片で第２の実験を実施し、アミロイドベータのプラークの存在を検出した。アミロイドベータのプラークのシグナルは、ナイルレッドと結合した二次抗体を使用して検出された。
動物起源のサンプルは、欧州指令2010/63/EUおよび関連するイタリアの法的施行規則n.26 of 04.03.2014に従って入手した。高解像度（０．７５ ＮＡ対物レンズで取得)および低解像度(ＮＡを０．２１に低減し取得)の画像と、低解像度(すなわち、ＮＡは０．２１)に本方法を実施して再構成された画像を、図５ｌ、図５ｍ、および図５ｎにそれぞれ示す。
【００６２】
発明者らは、２００ｎｍの解像度（サンプル中のスペックル粒子の測定サイズＳと一致する）を算出した。これは、集光光学系によって得られる理論分解能と比較して６倍の増加に相当する。図４および図５にて結果が示されるように実験では、散乱サンプルのスペックル粒子のサイズＳの計算値が使用された。発明者らは、ＴｉＯ2層（図４の画像と同じ）に対してスペックル粒子のＧ＝１００画像を収集し、（図５の画像と同じ）アルツハイマー病の影響を受けたマウスの脳の２５０μｍのスライスを収集した。図６ａおよび図６ｂにそれぞれグラフで示すように、彼らは、強度の自己相関を距離の関数として計算した。自己相関関数の中心最大値のガウスフィットにより、ＳTiO2＝１４６±３ｎｍ、Ｓbrain＝１９５±７ｎｍにそれぞれ等しくなるように、スペックル粒子のサイズＳの値が得られた。
【００６３】
ＳTIO2＝１４６±３ｎｍ、Ｓcervello＝１９５±７ｎｍに等しいスペックル粒子のサイズＳの値は、自己相関関数の中心最大値のガウスフィットによって取得された。
【００６４】
上記において、好ましい実施形態が説明され、本発明の変形例が提案されたが、添付の特許請求の範囲によって定められるように、その保護の範囲から逸脱しない範囲で当業者は変形や変更を行うことができることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年11月26日(2020.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
回折限界はAbbeとRayleighによって定式化されており、レンズによる達成可能な最大分解能は開口数ＮＡによって規定される。照明および集光光学系の立体角が大きいほど、撮像システムによって達成可能な空間分解能は高くなる。Tangらの論文「補償技術を適応した反復多光子による超貫通光学顕微鏡法」、Proceedings of National Academy of Sciences 109, 8434-8439 (2012)、および、Ji N.らの会報「生体組織における高解像度画像化のための瞳分割による適応光学系」、Nature methods 7, 141-147 (2010)は、実レンズの理論的な分解能を得るための適応光学系を用いた光学収差の補正方法を開示している。このような理論的な分解能は、超解像技術によってバイパスされてもよく、例えば以下の文献に開示されている。
Betzig, E.らの論文「ナノメートル分解能での細胞内の蛍光蛋白質の画像化」、Science 313, 1642-1645 (2006)、
Hell, S.とWichmann, N.らの「誘導放出による回析分解能の限界の突破：誘導放出-空乏化蛍光顕微鏡法」、Optics letters 19, 780-782 (1994)
Schermelleh, L.らの「超解像蛍光顕微鏡の手引き」、The Journal of cell biology 190, 165-175 (2010)
Leung, B. O.やChou, K. C.の「生物学における超解像蛍光顕微鏡のレビュー」、Applied spectroscopy 65, 967-980 (2011)、
Pawley, N. B.の「共焦点顕微鏡の基本的な限界」、20-42 (Handbook of Biological Confocal Microscopy, Third Edition, edited by James B. Pawley, Springer Science+Business Media, LLC, New York, 2006)、
Betzig, E.やTrautman, N. K.の「近接場光学：回析限界を超える顕微鏡、分光および表面改質」、Science 257, 189-196 (1992)、
Gustafsson, M. G.の「構造化照明顕微鏡法を用いて、横方向の解像限界を倍化させる"、Journal of microscopy 198, 82-87 (2000)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【国際調査報告】
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