(57)【要約】本発明は、ＣＤ４７に高い親和性および特異性で結合する抗体およびがんの処置におけるその使用を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変（Ｖｈ）領域；（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖領域；または（ｃ）配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する再フォーマットされた重鎖領域を含む、単離されたヒト抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ＣＤ４７とシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰ−α）との相互作用を遮断する、請求項１記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３】
以下からなる群から選択される少なくとも１つの効果を促進または増強する、請求項１記載の抗体または抗原結合フラグメント：マクロファージ介在性貪食を増強する、抗体依存性細胞傷害を誘導しない、アポトーシスを誘導しない、およびヒトＲＢＣの血球凝集を誘導しない。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖領域を含む、請求項１記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項６】
配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する再フォーマットされた重鎖領域を含む、請求項１記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項７】
配列番号１５、１９および２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する再フォーマットされた重鎖領域を含む、請求項６記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項８】
配列番号１および２のアミノ酸配列、配列番号３および４のアミノ酸配列、配列番号５および６のアミノ酸配列、配列番号７および８のアミノ酸配列、配列番号９および１０のアミノ酸配列、配列番号１１および１２のアミノ酸配列、ならびに配列番号１３および１４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および軽鎖領域を含む、請求項１記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項９】
配列番号１５および２のアミノ酸配列、配列番号１６および４のアミノ酸配列、配列番号１７および６のアミノ酸配列、配列番号１８および８のアミノ酸配列、配列番号１９および１０のアミノ酸配列、配列番号２０および１２のアミノ酸配列、ならびに配列番号２１および１４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する再フォーマットされた重鎖領域および軽鎖領域を含む、請求項１記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
先行請求項のいずれかに記載の抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖである、ＣＤ４７に結合するフラグメント。
【請求項１１】
ＣＤ４７発現細胞のマクロファージ介在性貪食を促進する、先行請求項のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
ＩｇＧ１アイソタイプおよびＩｇＧ２アイソタイプからなる群から選択されるＩｇＧアイソタイプを含む、先行請求項のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
ＩｇＧ４により再フォーマットされたＣＤ４７抗体である、先行請求項のいずれかに記載の抗体。
【請求項１４】
治療有効量の先行請求項のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメントを必要とする対象に投与することを含む、前記対象におけるＣＤ４７を発現するがんを処置する方法、ここでがんは、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、膀胱がん、乳がん、頭頸部扁平上皮がん、卵巣がん、および結腸がんからなる群から選択される。
【請求項１５】
先行請求項のいずれかに記載のヒトＣＤ４７に結合する抗体または抗原結合フラグメントならびに薬学的許容され得る担体および／または賦形剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗ＣＤ４７抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜タンパク質であるＣＤ４７は、５つの膜貫通ドメインおよび短いＣ末端の細胞内尾部を有する細胞外Ｎ末端Ｉｇ可変（ＩｇＶ）ドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。これまでに、細胞質内尾部の長さが異なるＣＤ４７の４つの代替的なスプライスされたアイソフォームが同定されている［Brown, E. (2001) J Clin Invest 107(12):1499-500; Reinhold, M.I., et al. (1995) J Cell Sci 108 (Part 11):3419-25］。最近の研究により、ＣＤ４７が免疫系の貪食細胞（マクロファージ、樹状細胞および好中球を含む）上に発現するＳＩＲＰ−のリガンドであることが実証されている［Tsai et al. (2008) J Cell Biol 180(5):989-1003］。ＣＤ４７−ＳＩＲＰ−相互作用軸は、いくつかの細胞プロセス（アポトーシス［Wang et al. (2016) J Dent Res 95(6):697-703］、増殖［Sick et al. (2011) Glia 59(2):308-19; Kaur et al. (2013) Sci Rep 3:1673］、接着および遊走［Rebres et al. (2005) J Cell Physiol 205(2):182-93; Sick et al. (2012) Br J Pharmacol 167(7):1415-30］を含む）に関与していることが示されている。さらに、研究により、ＣＤ４７−ＳＩＲＰ−相互作用は血管新生プロセスにおいても重要な役割を果たしていることが示唆されている［Zhang et al. (2015) Brain Res 1623:74-80; Chao et al. (2012) Curr Opin Immunol 24(2): 225-32］。
【０００３】
ＣＤ４７はすべてのヒト細胞で普遍的に発現しており、様々な腫瘍細胞において過剰発現していることが示されている。実際、これまでに研究されたヒトがんのほとんど（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病［Jaiswal et al. (2009) Cell 138(2):271-85］、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）［Chao et al. (2011) Cancer Res 71(4):1374-84］、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）［Chao et al. (2010) Cell 142(5):699-713］、多発性骨髄腫（ＭＭ）［Rendtlew et al.  (2007) Br J Haematol 138(6):756-60］、膀胱がん、および他の固形腫瘍（Chan et al. (2009) Proc Natl Acad Sci U S A 106(33):14016-21）を含む）は表面ＣＤ４７を過剰発現しており、ＣＤ４７はヒトのがんを処置するための普遍的な標的となっている。高レベルのＣＤ４７は、貪食細胞上のＳＩＲＰ−αとＣＤ４７との結合により、がん細胞が貪食を回避するのを可能にすることが示された。ＣＤ４７とＳＩＲＰ−αとの間の相互作用は貪食細胞に「ｄｏｎ’ｔ−ｅａｔ−ｍｅ」シグナルを与え、がん細胞の貪食による除去を妨げ、次いでＴ細胞免疫応答を阻害する［Oldenborg et al. (2000) Science 288(5473):2051-4, Blazar et al. (2001) J Exp Med 194(4): 541-9.］。腫瘍細胞はＣＤ４７を過剰発現して宿主免疫系の監視を回避するため、腫瘍細胞のクリアランスを回復することを目的としたＣＤ−４７標的治療が現在臨床において積極的に試験されている。
【０００４】
ＣＤ４７−ＳＩＰＲ−軸を標的とする多くの治療物質（抗ＣＤ４７抗体、設計されたデコイ受容体、抗ＳＩＲＰα抗体および二重特異性物質を含む）が現在開発中である。投与により、抗ＣＤ４７抗体または誘導体はＣＤ４７とＳＩＲＰ−との間の相互作用を選択的に阻害する。ＣＤ４７−ＳＩＲＰ−相互作用の遮断は貪食細胞へのＳＩＲＰ−介在性抑制シグナルを抑制し、例えばマクロファージの活性化および腫瘍細胞の貪食をもたらす［Chao et al. (2011) Cancer Res 71(4):1374-84; Chao et al. (2010) Cell 142(5):699-713; Majeti et al. (2009) Cell 138(2): 286-99, Chao et al. (2010) Sci Transl Med 2(63):63ra94］。さらに、ＣＤ４７により伝達されるシグナル伝達を抗体によって遮断することは、抗腫瘍Ｔリンパ球免疫応答およびＣＤ４７発現腫瘍細胞のＴ細胞介在性死滅の両方を活性化する［Matozaki et al (2009) Trends Cell Biol 19(2):72-80; Latour et al. (2001) J Immunol 167(5):2547-54］。
【０００５】
したがって、本発明は、がん患者抗体Ｆａｂライブラリーから同定された新規なヒトＣＤ４７遮断抗体（以下、抗ＣＤ４７抗体という）を提供する。
【０００６】
ある態様において、本発明は、（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変（Ｖｈ）領域；（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬ鎖領域；または（ｃ）配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する再フォーマットされたＨ鎖領域を含む、単離されたヒト抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【０００７】
本発明のある例において、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＤ４７とシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰ−α）との相互作用を遮断する。
【０００８】
別の態様において、本発明はＩｇＧ４により再フォーマットされたＣＤ４７抗体を提供し、これは抗ＣＤ４７抗体から調製および取得される。
【０００９】
本発明のある例において、ＩｇＧ４により再フォーマットされたＣＤ４７遮断抗体はインビトロにおいてがん細胞（Ｊｕｒｋａｔ−１細胞またはＨＬ６０細胞など）を処置し、極性化したＴＨＰ−１マクロファージおよび末梢血単核球（ＰＢＭＣ）によって説明される頑強な貪食活性を誘導したが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および試験されたがん細胞のアポトーシスを誘導しなかったことが本発明において見出されたため、ＩｇＧ４により再フォーマットされたＣＤ４７遮断抗体はがんの処置に有効であることが確認された。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、治療有効量の抗ＣＤ４７抗体を必要とする対象に投与することを含む、がんを処置する方法を提供する。
【００１１】
ある実施態様において、処置される広範囲の哺乳動物がんは、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、膀胱がん、乳がん、頭頸部扁平上皮がん、卵巣がん、および結腸がんからなる群から選択される。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、治療上許容され得る量の抗ＣＤ４７抗体および１以上の薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。特に、該医薬組成物はがんの処置に有効である。
【００１３】
本発明のある例において、抗ＣＤ４７抗体は、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変（Ｖｈ）領域を含む。
【００１４】
本発明のある例において、抗ＣＤ４７抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖領域を含む。
【００１５】
本発明のある例において、抗ＣＤ４７抗体は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖領域を含む。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、本発明における抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖを含むＣＤ４７に結合するフラグメントを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、精製したＩｇＧ４により再フォーマットされたＣＤ４７抗体のゲル分析を示す；ここで、ＨＥＫ２９３Ｆにより一過性に発現されたＣＤ４７抗体をプロテインＧクロマトグラフィーを用いて培養上清から精製し、精製した抗体（〜２μｇ／レーン）を還元条件下および非還元条件下でＰＡＧＥ−ゲル解析し、クーマシーブルー染色を用いて可視化した（Ｍ：タンパク質分子量マーカー、１：非還元条件下でのＣＤ４７抗体、２：還元条件下でのＣＤ４７抗体）。
【００１８】
【図２】図２は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた精製した抗体とＣＤ４７−Ｆｃタンパク質（R&D Systems, USA）との結合の結果を示す。図２Ａは、ＣＤ４７−Ｆｃタンパク質に対する精製した抗体の直接ＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を示す；ここで、精製した抗体およびＨｕ５Ｆ９−Ｇ４はＣＤ４７−Ｆｃタンパク質に特異的に結合するが、ＳＩＲＰ−には結合しないことが示された。図２Ｂは、ＣＤ４７−Ｆｃタンパク質に対する精製した抗体の滴定ＥＬＩＳＡ分析を示す；ここで、精製した抗体およびＨｕ５Ｆ９−Ｇ４は、精製したＣＤ４７抗体間で変動する結合活性を伴って組換えＣＤ４７に用量依存的な様式で結合することが示された。
【００１９】
【図３】図３は、抗ＣＤ４７抗体を用いた細胞表面ＣＤ４７結合のフローサイトメトリー分析を示す；ここで、フローサイトメトリーを用いて分析されたように、ライブラリーからの抗ＣＤ４７抗体は細胞表面ＣＤ４７に用量依存的な様式で結合した；Ｊｕｒｋａｔ−１細胞（図３Ａ）またはＨＬ−６０細胞（図３Ｂ）を抗ＣＤ４７抗体、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４抗体または精製したヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照で染色し、フローサイトメトリーによって表面結合について分析した。ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Jackson ImmunoResearch, USA）を検出のために用いた。
【００２０】
【図４】図４は、フローサイトメーターを用いた細胞表面ＣＤ４７と組換えＣＤ４７−Ｆｃタンパク質との間の抗体結合の競合分析を示す；ここで、Ｊｕｒｋａｔ−１細胞を２０μｇ／ｍｌのＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質の非存在下（青色）または存在下（赤色）において抗ＣＤ４７抗体（１μｇ／ｍｌ）で染色し、フローサイトメトリーを用いて表面結合について分析した；ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Jackson ImmunoResearch, USA）を検出のために用いた。Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４を比較のために含み、精製したヒトＩｇＧ４を陰性対照（黒）として用いた。選択されたＣＤ４７抗体、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４またはヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照を用いた代表的なフロー分析を示した。
【００２１】
【図５】図５は、抗ＣＤ４７抗体によるＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用の遮断を示す。ヒトＣＤ４７−ＦｃのＳＩＲＰで予めコーティングされたウェルへの結合を、増加した濃度の抗ＣＤ４７抗体または対照としてのＨｕ５Ｆ９−Ｇ４の非存在下または存在下においてＥＬＩＳＡによって検出した。抗ＣＤ４７抗体およびＨｕ５Ｆ９−Ｇ４は、異なる活性の程度でＣＤ４７とＳＩＲＰ−αとの相互作用を遮断できた。
【００２２】
【図６】図６は、抗ＣＤ４７抗体が極性化したＴＨＰ−１マクロファージまたはＰＢＭＣを用いたＨＬ−６０細胞またはＪｕｒｋａｔ−１細胞の抗体依存性貪食活性を増強したことを示す。抗ＣＤ４７抗体ＣｗＰ１Ａ１、ＣｗＰ２Ｅ８、ＢｒＰ１Ｆ３、ＢｒＰ１Ｆ１１およびＨｕ５Ｆ９−Ｇ４は、抗体で処理された細胞に対する極性化したＴＨＰ−１またはＰＢＭＣ介在性貪食を著しく増強できた。
【００２３】
【図７】図７は、抗ＣＤ４７抗体がＡＤＣＣを誘導しなかったことを示す。標的としてＲａｊｉ細胞を用いたＡＤＣＣレポーターバイオアッセイコンプリートキット（Promega, USA）を使用した。（ｘ軸に）指定された種々の濃度のＨｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＣｗＰ１Ａ１−ＩｇＧ４またはＢｒＰ１Ｆ１１−ＩｇＧ４とともに、エフェクター細胞対標的細胞を６対１の比率で６時間インキュベートした。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントを有するＣｗＰ１Ａ１−ＩｇＧ１およびＨｕＩｇＧ４が対照として含まれた。
【００２４】
【図８】図８は、抗ＣＤ４７抗体の存在下におけるＪｕｒｋａｔ−１細胞またはＨＬ−６０細胞のアポトーシスアッセイを示す。Ｊｕｒｋａｔ−１細胞を、１０ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ４７抗体、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４またはＩｇＧ４アイソタイプ対照とともにインキュベートした。アポトーシス細胞をアネキシンＶで染色することによって同定し、フローサイトメトリーを用いて分析した。抗ＣＤ４７抗体またはＨｕ５Ｆ９−Ｇ４処理は、Ｊｕｒｋａｔ−１細胞またはＨＬ−６０細胞のアポトーシスを誘導しなかった。
【００２５】
【図９】図９は、ＲＢＣ表面抗原結合アッセイ（Ａ）およびＲＢＣ凝集アッセイ（Ｂ）を示す。ヒト抗ＣＤ４７抗体（ＣｗＰ１Ａ１、ＣｗＰ２Ｆ１２、およびＢｒＰ１Ｆ１１）は、ＲＢＣの表面ＣＤ４７に用量依存的な様式で結合した。さらに、ＣｗＰ１Ａ１およびＢｒＰ１Ｆ１１は、ヒトＲＢＣの血球凝集を誘導しなかった。
【００２６】
【図１０】図１０は、ＨＬ−６０マウス異種移植モデルにおけるヒト抗ＣＤ４７抗体ＣｗＰ１Ａ１およびＢｒＰ１Ｆ１１による抗腫瘍活性を示す。雄性ＳＣＩＤマウスの右脇腹に１００μｌマトリゲルプラス１．０×１０７個のＨＬ−６０細胞を皮下注射した後、アイソタイプ対照抗体（４００μｇ／マウス）、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４またはヒト抗ＣＤ４７抗体ＢｒＰ１Ｆ１１−Ｇ４およびＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのＣｗＰ１Ａ１（４００μｇ／マウス）を週３回、３週間腹腔内注射した。ＣｗＰ１Ａ１−Ｇ１、ＣｗＰ１Ａ１−Ｇ４およびＢｒＰ１Ｆ１１−Ｇ４抗体は、ＨＬ６０異種移植片に対して著しい抗腫瘍活性を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【００２８】
本明細書において、用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む４つのポリペプチド鎖から構成される免疫グロブリン分子を指す。抗体は、無傷の免疫グロブリンならびに当分野で周知の抗体のバリアントおよび部分を含み得る。本発明においてＣＤ４７に結合するフラグメントが提供され、これは本発明における抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖを含む。
【００２９】
本明細書において、用語「Ｆｃ」は、細胞表面受容体と相互作用する抗体の尾部領域である。この性質は、抗体が免疫系を活性化することを可能にする。Ｆａｂとは対照的に、あるクラスのすべての抗体のＦｃ領域は各種において同じである；これらは可変ではなく一定である。
【００３０】
本明細書において、用語「フラグメント抗原結合」または「Ｆａｂ」は、抗原に結合する抗体の抗原結合フラグメントを指す。Ｆａｂフラグメントは抗原に未だ結合するが、Ｆｃ部分を持たない一価の抗体構造物である。Ｆａｂは重鎖および軽鎖のそれぞれ１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインから構成され、可変ドメインはモノマーのアミノ末端に一連の相補性決定領域を含む抗原結合部位を含む。酵素パパインによって消化された抗体は、それぞれ約５０ｋＤａの２つのＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントをもたらす。
【００３１】
本明細書における用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、ヒンジ領域の一部を無傷のまま残しながらＦｃ領域の大部分を除去するためにＩｇＧ抗体全体のペプシン消化によって生成されるフラグメント抗体を指す。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントはジスルフィド結合によってともに連結された２つの抗原結合Ｆ（ａｂ）部分を有し、したがって約１１０ｋＤａの分子量を有する二価である。
【００３２】
本明細書において、用語「単鎖可変フラグメント」または「ｓｃＦｖ」は、抗体または免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合タンパク質を指し、これらは短いリンカーペプチド（１０〜２５アミノ酸を有するリンカーなど）によって接続されている。この単鎖可変フラグメントは、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず元の抗体の特異性を保持している。
【００３３】
本明細書において、用語「抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）」は、Ｆｃ受容体を有するエフェクター細胞が、腫瘍または病原体由来の抗原を表面に発現する抗体でコーティングされた標的細胞を認識でき、死滅できる免疫機構を指す。
【００３４】
本発明は、ヒトＣＤ４７に特異的に結合し、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用を遮断する抗ＣＤ４７抗体を提供する。実施例８および実施例９に示されている分析に従って、本発明の抗ＣＤ４７抗体はマクロファージ介在性貪食を増強でき、アポトーシスを誘導しない。
【００３５】
本発明によれば、抗ＣＤ４７抗体はヒトおよびマウスＣＤ４７に特異的に結合する。
【００３６】
本発明によれば、抗ＣＤ４７抗体は、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変（Ｖｈ）領域を含む。
【００３７】
本発明によれば、抗ＣＤ４７抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬ鎖領域を含む。
【００３８】
本発明によれば、抗ＣＤ４７抗体は、以下からなる群から選択されるアミノ酸を含むものである：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶｈ領域、および配列番号２のアミノ酸配列を有するＬ鎖領域；
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶｈ領域、および配列番号４のアミノ酸配列を有するＬ鎖領域；
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶｈ領域、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＬ鎖領域；
配列番号７のアミノ酸配列を有するＶｈ領域、および配列番号８のアミノ酸配列を有するＬ鎖領域；
配列番号９のアミノ酸配列を有するＶｈ領域、および配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬ鎖領域；
配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶｈ領域、および配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬ鎖領域；ならびに
配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶｈ領域、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬ鎖領域。
【００３９】
さらに、本発明の抗ＣＤ４７抗体は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する再フォーマットされたＨ鎖を含む。
【００４０】
アミノ酸配列は以下の表に記載されている。
【００４１】
表１．ライブラリースクリーニングから同定された抗ＣＤ４７ Ｆａｂ結合剤のアミノ酸配列。
【表１−１】
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【表１−２】
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表２．ＩｇＧ４により再フォーマットされたＣＤ４７抗体の重鎖のアミノ酸配列。
【表２−１】
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【表２−２】
2021529219.tif 000006
【００４２】
本発明によれば、抗ＣＤ４７抗体は以下からなる群から選択されるアミノ酸を含むものである：
配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨ鎖領域、および配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬ鎖領域；
配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨ鎖領域、および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬ鎖領域；
配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨ鎖領域、および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬ鎖領域；
配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨ鎖領域、および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬ鎖領域；
配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨ鎖領域、および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬ鎖領域；
配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨ鎖領域、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬ鎖領域；ならびに
配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨ鎖領域、および配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬ鎖領域。
【００４３】
本書のあらゆる箇所において、以下の代表的な本発明の抗ＣＤ４７抗体についての言及がなされる。ＣｗＰ１Ａ１は、配列番号１５に対応するＨ鎖領域および配列番号２に対応するＬ鎖領域を有する抗体を表す。ＣｗＰ１Ｃ４は、配列番号１６に対応するＨ鎖領域および配列番号４に対応するＬ鎖領域を有する抗体を表す。ＣｗＰ２Ｅ８は、配列番号１７に対応するＨ鎖領域および配列番号６に対応するＬ鎖領域を有する抗体を表す。ＣｗＰ２Ｆ８は、配列番号１８に対応するＨ鎖領域および配列番号８に対応するＬ鎖領域を有する抗体を表す。ＣｗＰ２Ｆ１２は、配列番号１９に対応するＨ鎖領域および配列番号１０に対応するＬ鎖領域を有する抗体を表す。ＢｒＰ１Ｆ３は、配列番号２０に対応するＨ鎖領域および配列番号１２に対応するＬ鎖領域を有する抗体を表す。ＢｒＰ１Ｆ１１は、配列番号２１に対応するＨ鎖領域および配列番号１４に対応するＬ鎖領域を有する抗体を表す。
【００４４】
本発明において、抗ＣＤ４７抗体は、ＣＤ４７発現細胞のマクロファージ介在性貪食を促進する。
【００４５】
本発明において、抗ＣＤ４７抗体は、抗体依存性細胞傷害およびアポトーシス活性のいずれも誘導しない。
【００４６】
本発明において、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプおよびＩｇＧ２アイソタイプからなる群から選択されるＩｇＧアイソタイプを含み得る。
【００４７】
本発明において、抗体は、ＩｇＧ４により再フォーマットされたＣＤ４７抗体として調製され得る。
【００４８】
ある実施態様において、本発明は、治療有効量の抗ＣＤ４７抗体を必要とする対象に投与することを含む、がんを処置する方法を提供する。
【００４９】
ある実施態様において、処置される広範囲の哺乳動物がんは、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、膀胱がん、乳がん、頭頸部扁平上皮がん、卵巣がん、および結腸がんからなる群から選択される。
【００５０】
さらなる実施態様において、本発明は、治療上許容され得る量の抗ＣＤ４７抗体および１以上の薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。特に、該医薬組成物はがんの処置に有効である。
【００５１】
本発明のある実施態様において、研究用抗体ＦａｂライブラリーであるＴＲＢ８００−０１を市販の組換えＣＤ４７タンパク質（R&D Systems, USA）を用いてスクリーニングし、ＣＤ４７に対する完全ヒト抗体を単離した。ＴＲＢ８００−０１は、〜１ｘ１０１０の容量を伴って１６ｘの口腔がん、２２ｘの食道がんおよび１５ｘの前立腺がん（ＩＲＢ番号ＶＧＨＫＳ１７−ＣＴ１１−１３）を含む臨床的に診断された患者から収集された血液試料を用いて作製された。
【００５２】
本発明の別の実施態様において、溶出されたファージの力価はパニングにより著しく増加し、これはＣＤ４７特異的な結合剤の濃縮を示していた。３回目のパニングから無作為に選択された３８４クローンをＣＤ４７タンパク質に対する直接ＥＬＩＳＡ分析を用いてさらに確認し、ＯＤ４５０が０．５より大きい陽性結合剤を配列解析のために選択した。７つの特有のクラスターが同定され、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３−Ｆシステム（Invitrogen, USA）におけるＨＥＫ２９３細胞を用いた発現およびさらなる特性評価のために、完全長ヒトＩｇＧ４に再フォーマットされるように選択された。
【００５３】
本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは説明的なものとしてのみ解釈されるべきであり、本発明の残部をいかなる方法においても制限しない。さらなる説明がなくても、当業者は本明細書の記載に基づいて本発明を最大限に活用できると考えられる。
【実施例】
【００５４】
実施例１  組換えＣＤ４７タンパク質に対するヒト抗体Ｆａｂライブラリーのスクリーニング
【００５５】
ヒト抗体Ｆａｂライブラリーを、選択されたがん患者の血液から〜１０１０の多様性を伴って作製した。簡潔に述べると、抗体ライブラリーからのＣＤ４７抗体の同定を以下に記載されるように行った。ＥＬＩＳＡウェルを、５００ｎｇ／ウェル（ＰＢＳ中）のヒトＣＤ４７−Ｆｃタンパク質（R&D Systems, USA）で４℃において１６時間コーティングした。ブロッキング後、〜１０１０個のファージを添加し、室温においてシェーカー上で１時間インキュベートした。結合していないファージを除去し、ウェルを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で１０回洗浄した。洗浄後、結合したファージを１００μｌの０．１Ｍ ＴＥＡ溶液（Sigma, USA）を添加することによって溶出させ、５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４により中和させた。次いで、溶出したファージを用いて対数期ＴＧ−１細胞を感染させ、これは抗生物質およびグルコースを含む１．５％寒天プレート上にプレーティングされ、３０℃で一晩インキュベートされた。翌朝、スクラップされた細菌(scrapped bacteria)（３０ ＯＤ６００）を、Ｍ１３ハイパーファージ（PROGEN, Germany）を用いたファージのレスキューのために使用した。遠心分離後、レスキューしたファージをＰＥＧペレット化し、ＰＢＳ中で再構成し、滴定し、次回のパニングのために使用した。パニングプロセスをさらに２回繰り返した。最後の選択の後、個々のクローンを選択し、増殖させ、Ｆａｂ産生のために１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。それぞれの個々のクローンから発現されたＦａｂを含む上清を、結合剤同定のためにＣＤ４７−Ｆｃタンパク質に対するＥＬＩＳＡによって分析した。
【００５６】
実施例２ ＣＤ４７結合剤の配列解析および再フォーマット
【００５７】
ＯＤ４５０＞０．５のＥＬＩＳＡ陽性結合剤を配列解析のために選択した。Ｆｃ依存性エフェクター機能（ＡＤＣＣおよびＣＤＣなど）の漸増を最小限にするために、同定されたＣＤ４７結合剤の重鎖をヒトＩｇＧ４スキャフォールド上に設計した。同定されたＣＤ４７結合剤の軽鎖および重鎖可変領域（Ｖｈ）ならびに再フォーマットされた完全長重鎖配列（ＩｇＧ４アイソタイプ）のアミノ酸配列を表１および表２に示す。次に、個々の再フォーマットされたＣＤ４７抗体重鎖および対応する軽鎖を、対でのＨＥＫ２９３遺伝子導入、発現、精製および特性評価のために別個のｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Promega, USA）上にサブクローニングした。
【００５８】
実施例３ 抗体発現および精製
【００５９】
組換え抗体産生のために、ＨＥＫ２９３細胞およびＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Invitrogen, USA）を用いた。製造者の説明書（Invitrogen, USA）に従って一過性導入を行った。抗体を精製するために、培養上清をＰｉｅｒｃｅプロテインＧアガロース樹脂（ThermoFisher, USA）に適用し、ＰＢＳに対して透析した。精製した抗体を還元条件下または非還元条件下において４〜１２％Ｂｏｌｔビストリスプラスゲル（Invitrogen, USA）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、クーマシーブリリアントブルー染色（Invitrogen, USA）によって可視化した。
【００６０】
図１からの結果は、全てのＩｇＧ４により再フォーマットされた抗ＣＤ４７抗体が適切に発現および形成されたことを示していた。また、９０％を上回る純度の個々の抗体がプロテインＧクロマトグラフィーを用いて得られた。
【００６１】
実施例４ ＣＤ４７結合研究
【００６２】
結合特異性を調査および確認するために、精製した抗ＣＤ４７抗体をまず直接ＥＬＩＳＡアッセイを用いてアッセイした。簡潔に述べると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Nunc, Denmark）を１μｇ／ｍｌの組換えＣＤ４７−ＦｃまたはＳＩＲＰ−α（R＆D Systems, USA）で４℃において１６時間コーティングした。ＣＤ４７またはＳＩＲＰ−αで予めコーティングしたウェルをＰＢＳ中の５％無脂肪乳で室温において１時間ブロッキングした後、１００μｌの０．５μｇ／ｍｌヒト抗ＣＤ４７抗体を添加し、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。インキュベーションおよび洗浄後、１：２５００希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Jackson ImmunoResearch, USA）を各ウェルに１００μｌ添加し、室温で１時間インキュベートした。最後の洗浄後、結合した抗体をＴＭＢ溶液（Invitrogen, USA）を用いて検出した。５０μｌの１Ｍ ＨＣｌを添加して反応を停止させ、ＯＤ４５０ｎｍでの各ウェルの吸光度を読み取った。
【００６３】
図２Ａの結果は、結合活性はクローン間で変動していたが、すべての候補抗体およびＨｕ５Ｆ９−Ｇ４が組換えＣＤ４７に対して特異的であり、ＳＩＲＰ−タンパク質（R&D Systems, USA）に対して交差反応性を持たないことを示した。インビトロおよびインビボにおいて驚異的な生理活性を有するＣＤ４７を標的としたヒト化抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４を比較のための陽性対照として用いた。
【００６４】
滴定ＥＬＩＳＡアッセイを用いてこれらの候補抗体の結合活性を調べた。滴定ＥＬＩＳＡアッセイのために、ウェルを１μｇ／ｍｌの組換えＣＤ４７−Ｆｃで４℃において１６時間コーティングした。ＣＤ４７で予めコーティングしたウェルをＰＢＳ中の５％無脂肪乳で室温において１時間ブロッキングした後、３０ｎＭから１：３で段階希釈された抗ＣＤ４７抗体を１００μｌ添加し、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。インキュベーションおよび洗浄後、１：２５００希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Jackson ImmunoResearch, USA）を各ウェルに１００μｌ添加し、室温で１時間インキュベートした。最後の洗浄後、結合した抗体をＴＭＢ溶液（Invitrogen, USA）を用いて検出した。反応を１Ｍ ＨＣｌにより停止させ、ＯＤ４５０ｎｍでの各ウェルの吸光度を読み取った。次に、最大吸光度の半分に必要とされる抗体濃度であるＥＣ５０を、試験した各ＣＤ４７抗体についてＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアによって計算した。
【００６５】
図２Ｂに示されるように、試験したすべての抗ＣＤ４７抗体は組換えＣＤ４７に用量依存的な様式で結合した。Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＣｗＰ１Ａ１、ＣｗＰ１Ｃ４、ＣｗＰ２Ｅ８、ＣｗＰ２Ｆ８、ＣｗＰ２Ｆ１２、ＢｒＰ１Ｆ３、およびＢｒＰ１Ｆ１１の測定されたＥＣ５０は、それぞれ０．１４４２ｎＭ、０．１８３５ｎＭ、０．２２７１ｎＭ、０．４６９４ｎＭ、０．３２６４ｎＭ、０．４４１３ｎＭ、１０．１ｎＭ、および１．２１ｎＭであった。
【００６６】
実施例５ 細胞表面抗原結合アッセイ
【００６７】
本発明のある実施態様において、フローサイトメーターによる細胞表面ＣＤ４７結合を用いて、組換えＣＤ４７タンパク質と天然ＣＤ４７タンパク質との間に矛盾があるか否かを調べた。Ｊｕｒｋａｔ−１細胞またはＨＬ−６０細胞（BCRC, Taiwan）上の細胞表面ＣＤ４７に対する抗ＣＤ４７抗体の濃度増加に伴う結合活性。細胞表面抗原結合アッセイのために、１×１０５個のＪｕｒｋａｔ−１細胞（BCRC, Taiwan）を、０．００１、０．０１、０．１、１、１０または１００μｌ／ｍｌ抗ＣＤ４７抗体とともに１００μｌ中で４℃において１５分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を氷冷染色（１Ｘ ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋０．０５％ＮａＮ３）緩衝液で３回洗浄し、次いでＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Jackson ImmunoResearch, USA）とともにインキュベートした。最後に、細胞を洗浄し、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（BD Biosciences, USA）を用いて分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値をプロットした。
【００６８】
図３から収集された結果は、両方の試験された細胞株において抗ＣＤ４７抗体およびＨｕ５Ｆ９−Ｇ４の細胞表面結合の用量依存的な様式を示唆したが、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照（BioLegend, USA）については示唆しなかった。
【００６９】
実施例６ フローサイトメトリーを用いたＣＤ４７結合の競合アッセイ
【００７０】
本発明の別の実施態様において、天然ＣＤ４７に対する抗ＣＤ４７抗体の結合特異性を、過剰量の組換えＣＤ４７−Ｆｃタンパク質を伴う、または伴わないフローサイトメトリーを用いた抗体結合競合アッセイにより行った。１×１０５個のＪｕｒｋａｔ−１細胞を、１０μｇ／ｍｌの組換えＣＤ４７−Ｆｃタンパク質の非存在下または存在下において１μｇ／ｍｌのヒト抗ＣＤ４７抗体とともに４℃で１５分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Jackson ImmunoResearch, USA）で染色した後、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６ Ｐｌｕｓ（BD Biosciences, USA）フローサイトメーターを用いて分析した。
【００７１】
図４は、抗ＣＤ４７抗体およびＨｕ５Ｆ９−Ｇ４の表面ＣＤ４７結合活性が１０μｇ／ｍｌのＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質の存在によって遮断されたことを示し、これはＣＤ４７に対する試験したすべての抗体の特異的な結合を示していた。
【００７２】
実施例７ ＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用遮断アッセイ
【００７３】
組換え抗ＣＤ４７抗体のＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用遮断活性を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて試験した。ＥＬＩＳＡウェル（Nunc, Denmark）を、１μｇ／ｍｌの組換えヒトＨｉｓタグ付きＳＩＲＰ−αタンパク質（R&D Systems, USA）で４℃において１６時間コーティングした。ブロッキング後、１μｇ／ｍｌの組換えＣＤ４７−Ｆｃタンパク質および３０ｎＭから３倍ずつ段階希釈した抗ＣＤ４７抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（１：２５００希釈、Jackson ImmunoResearch, USA）とともに１時間インキュベートした。最後の洗浄後、結合したＣＤ４７−Ｆｃタンパク質をＴＭＢ基質により検出した。１Ｍ ＨＣｌを添加することにより反応を停止させ、ＯＤ４５０の読み取り値を得た。最大吸光度の半分を阻害するのに必要な抗体濃度であるＩＣ５０を、試験した各ＣＤ４７抗体についてＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアによって計算した。
【００７４】
図５に示される抗ＣＤ４７抗体は、組換えヒトＣＤ４７と組換えヒトＳＩＲＰ−αとの間の相互作用を遮断できた。Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＣｗＰ１Ａ１、ＣｗＰ１Ｃ４、ＣｗＰ２Ｅ８、ＣｗＰ２Ｆ８、およびＣｗＰ２Ｆ１２について計算されたＩＣ５０は、それぞれ０．０６３ｎＭ、０．０５３ｎＭ、０．１５５ｎＭ、０．５５６ｎＭ、０．０６８ｎＭ、および０．０６３ｎＭである。この研究結果は、ＣｗＰ１Ａ１、ＣｗＰ２Ｆ８およびＣｗＰ２Ｆ１２が、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４に類似した遮断活性またはＨｕ５Ｆ９−Ｇ４よりも良い遮断活性を有することを示した。
【００７５】
実施例８ インビトロでの抗体介在性貪食アッセイ
【００７６】
次に、ＣＤ４７およびＳＩＲＰ−α相互作用遮断抗体が、ＣＤ４７＋癌細胞のマクロファージ介在性貪食を誘導できるか否かを調べた。インビトロでの貪食アッセイを以下に簡潔に記載されているように行った。ＴＨＰ−１（BCRC, Taiwan）単球のマクロファージへの分化を、ＰＭＡ、ＬＰＳ（Sigma, USA）およびＩＦＮ−（R&D Systems, USA）によって誘導した。次に、極性化したＴＨＰ−１細胞を使用前にＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（CTR, Life Technology, USA）で染色した。ＣＦＳＥ標識ヒト細胞Ｊｕｒｋａｔ−１またはＨＬ−６０細胞（BCRC, Taiwan）を、５μｇ／ｍｌアイソタイプ対照抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４またはヒト抗ＣＤ４７抗体（ＩｇＧ４）の存在下において極性化したＴＨＰ−１マクロファージとともに３７℃で３時間インキュベートした。細胞を洗浄した後、フローサイトメトリーによって分析し、貪食指数（マクロファージ１００個あたりの摂取された細胞数）を決定した。ＰＢＭＣ由来のマクロファージを７日間の５０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＭ−ＣＳＦ（Peprotech, USA）処理によって誘導し、抗ＣＤ１４抗体（Abcam, USA）染色により確認した。１０μｇ／ｍｌアイソタイプ対照抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４またはヒト抗ＣＤ４７抗体の存在下において、ＣＦＳＥ標識ＨＬ−６０細胞をマクロファージとともに３７℃で２時間インキュベートした。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、貪食指数を決定した。
【００７７】
ＨＬ−６０ ＡＭＬ細胞およびＪｕｒｋａｔ−１ ＡＬＬ細胞を標的細胞として用いた。極性化したＴＨＰ−１細胞およびヒト末梢血由来マクロファージを用いて貪食活性を調べた。貪食活性をフローサイトメトリーにより測定した。図６Ａ〜Ｃに示されるように、ヒト抗ＣＤ４７抗体およびＨｕ５Ｆ９−Ｇ４は、極性化したＴＨＰ−１およびＰＢＭＣ由来マクロファージによる腫瘍細胞の貪食を著しく促進した。
【００７８】
実施例９ ＡＤＣＣアッセイ
【００７９】
ヒトＣＤ４７抗体が貪食に加えてＡＤＣＣも可能であるか否かを評価するために、ＩｇＧ４スキャフォールドを有するＣｗＰ１Ａ１−ＩｇＧ４、ＢｒＰ１Ｆ１１−ＩｇＧ４およびＨｕ５Ｆ９−Ｇ４をＡＤＣＣ活性についてＡＤＣＣレポーターバイオアッセイを用いて調べた。本研究では、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントを有するＣｗＰ１Ａ１−ＩｇＧ１およびＨｕＩｇＧ４がそれぞれ対照として含まれた。Ｒａｊｉ細胞を標的としたＡＤＣＣレポーターバイオアッセイコンプリートキット（Promega, USA）を製造者の説明書に従って用いた。（ｘ軸に）指定された種々の濃度のＨｕＩｇＧ４、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＣｗＰ１Ａ１−ＩｇＧ１、ＣｗＰ１Ａ１−ＩｇＧ４またはＢｒＰ１Ｆ１１−ＩｇＧ４とともに、エフェクター細胞対標的細胞を６対１の比率で６時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、発光を読み取った。試料を二通りで実行し、二通りの値の平均を平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示すエラーバーとともにグラフ化した。
【００８０】
図７に示される結果は、ＣｗＰ１Ａ１−ＩｇＧ１がＡＤＣＣ活性を用量依存的な様式で誘導できることを示した。対照的に、ＣｗＰ１Ａ１−ＩｇＧ４、ＢｒＰ１Ｆ１１−ＩｇＧ４、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４およびＨｕＩｇＧ４はＡＤＣＣを誘導しなかった。まとめると、ＴＲＢヒトＣＤ４７抗体ＣｗＰ１Ａ１−ＩｇＧ４およびＢｒＰ１Ｆ１１−ＩｇＧ４の作用機構はＡＤＣＣおよびアポトーシスのいずれも誘導せず、抗体依存性細胞貪食の活性化を誘導する。
【００８１】
実施例１０ アポトーシスアッセイ
【００８２】
抗ＣＤ４７抗体のＣＤ４７への結合ががん細胞のアポトーシスを直接誘導しているか否かを調べるために、アポトーシスアッセイを行った。ヒト細胞Ｊｕｒｋａｔ−１、ＨＬ−６０またはＲａｊｉ細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に１ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。１０μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照２Ｄ３、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４またはヒト抗ＣＤ４７抗体（ＩｇＧ４）を添加し、細胞を３７℃で３時間インキュベートした。ＨＬ−６０細胞株の場合には、スタウロスポリンを陽性対照として使用した。アポトーシス細胞を、製造者の説明書（BD Biosciences, USA）に従ってアネキシンＶおよびＰＩで染色することによって同定し、フローサイトメトリーを用いて分析した。
【００８３】
図８Ａに示されるように、アイソタイプ対照と同様に、試験した抗ＣＤ４７抗体およびＨｕ５Ｆ９−Ｇ４はＪｕｒｋａｔ−１細胞のアポトーシスを誘導しなかったことが見出された。図８Ｂは、スタウロスポリンによる処理とは異なり、ヒト抗ＣＤ４７抗体がＨＬ−６０細胞のアポトーシスを誘導しなかったことを示した。類似の結果がアッセイについてＲａｊｉ細胞を用いても得られた（データ示さず）。まとめると、我々の結果は、抗ヒトＣＤ４７抗体がアポトーシス活性ではなく、貪食を誘導することを示した。
【００８４】
治療可能性を有する本発明の抗ＣＤ４７抗体は現在、急性骨髄性白血病および固形腫瘍に対する効力について異種移植動物モデルにおいて試験されている。
【００８５】
実施例１１ ＲＢＣ表面抗原結合アッセイおよびＲＢＣ凝集アッセイ
【００８６】
ＲＢＣ表面抗原結合アッセイのために、細胞表面ＣＤ４７結合活性をフローサイトメーターを用いて測定した。ヒト赤血球を、密度勾配遠心分離を用いてＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Sigma, Sweden）により単離した。精製したヒトＲＢＣを、１、１０および１００μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４７抗体（ＩｇＧ４）とともに１００μｌ中で４℃において１５分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を氷冷染色緩衝液（１Ｘ ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋０．０５％ＮａＮ３）で３回洗浄し、次いでＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Jackson ImmunoResearch, USA）とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（BD Biosciences, USA）を用いて分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値をプロットした。ＲＢＣ凝集アッセイのために、ヒトＲＢＣを最初にＰＢＳで希釈し、次いで様々な濃度の抗体を含む９６ウェル丸底プレート（Thermo, Denmark）に添加した。プレートを３７℃で４時間インキュベートした。凝集していないＲＢＣを断続的な点(punctuate dot)として規定し、ＨＡ指数をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって計算した。
【００８７】
図９Ａに示されるように、ヒト抗ＣＤ４７抗体（ＣｗＰ１Ａ１、ＣｗＰ２Ｆ１２およびＢｒＰ１Ｆ１１）はＲＢＣの表面ＣＤ４７に用量依存的な様式で結合した。 図９Ｂは、ＣｗＰ１Ａ１およびＢｒＰ１Ｆ１１がヒトＲＢＣの血球凝集を誘導しなかったことを示した。対照的に、臨床研究中の抗ＣＤ４７抗体であるＨｕ５Ｆ９−Ｇ４は重篤なＲＢＣ血球凝集を誘導した。この結果は、抗ＣＤ４７抗体ＣｗＰ１Ａ１およびＢｒＰ１Ｆ１１が、ＲＢＣの血球凝集に関してＨｕ５Ｆ９−Ｇ４よりも良い安全性プロファイルを有し得ることを示した。
【００８８】
実施例１２ マウス異種移植モデルを用いたインビボでの抗ＣＤ４７抗体の効力評価
【００８９】
雄性ＳＣＩＤマウス（BioLASCO, Taiwan）の右脇腹に１００μｌマトリゲル（Corning, USA）プラス１．０×１０７個のＨＬ−６０細胞（０．１ｍＬ細胞懸濁液）を皮下注射した。マウスに、アイソタイプ対照抗体（４００μｇ／マウス）、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４またはヒト抗ＣＤ４７抗体ＢｒＰ１Ｆ１１−Ｇ４およびＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのＣｗＰ１Ａ１（４００μｇ／マウス）を週３回、３週間腹腔内注射した。腫瘍体積を週２回測定した。腫瘍体積を、式Ｖ＝ＬＷ２／２を用いて計算した。屠殺した後、腫瘍組織を切除し、ホルマリンで固定した。
【００９０】
抗腫瘍活性を評価するために、抗ＣＤ４７抗体ＢｒＰ１Ｆ１１−Ｇ４、ＣｗＰ１Ａ１−Ｇ１およびＣｗＰ１Ａ１−Ｇ４をＨＬ−６０異種移植モデルを用いて試験し、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４抗体と比較した。図１０Ａに示されるように、４００μｇ／マウスで腹腔内投与したＣｗＰ１Ａ１−Ｇ１抗体、ＣｗＰ１Ａ１−Ｇ４抗体およびＢｒＰ１Ｆ１１−Ｇ４抗体はヒト急性前骨髄球性白血病ＨＬ６０異種移植片に対して著しい抗腫瘍活性を示し、これはＨｕ５Ｆ９−Ｇ４と同等であった。各処理からの代表的な腫瘍を図１０Ｂに示した。
【００９１】
実施例１２ 薬物動態評価
【００９２】
抗ＣＤ４７抗体のＰＫをラット（ｎ＝５）において評価する。１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４７抗体をラットに尾静脈注射によって投与する。血液試料を各ラットから尾側の大静脈を介して注射の０分後、１時間後、４時間後、８時間後、１２時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、６日後、８日後、１０日後、１２日後および１４日後に採取する。血清中の抗体濃度を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定する。抗ＣＤ４７抗体の血清濃度を、同一プレートに対する検量線の４パラメータロジスティック回帰から補間した。
【００９３】
上述のように、抗ＣＤ４７抗体はＦｃ依存性エフェクター機能（ＡＤＣＣおよびＣＤＣ）の漸増を最小限にするためにヒトＩｇＧ４スキャフォールド上に設計され、アポトーシスに関与しなかった。したがって、本発明において、抗ＣＤ４７抗体（Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４も同様である）はＣＤ４７とＳＩＲＰ−との相互作用を遮断することにより、マクロファージ介在性貪食の活性化を開始できることが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021529219.tif 000018
2021529219.tif 000019