(57)【要約】  本発明は、ＭＤＳＣで発現するＣＤ６６ｃに結合する抗−ＣＤ６６ｃ抗体およびその用途に関するものであって、ＭＤＳＣに結合する抗−ＣＤ６６ｃ抗体、これを含む薬学組成物、診断用組成物に関するものである。本発明の抗−ＣＤ６６ｃ抗体は、免疫抑制を誘導するＭＤＳＣをターゲットすることによってこれによる多様な疾病の治療に有用に用いることができる。
2021523193.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄由来免疫抑制細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌ、ＭＤＳＣ）で発現するＣＤ６６ｃに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、免疫活性増強剤。
【請求項２】
前記免疫活性増強剤が、ＭＤＳＣの活性、生成または死滅を調節することによってＭＤＳＣの免疫抑制能を除去または減少させるものである、請求項１に記載の免疫活性増強剤。
【請求項３】
前記免疫活性増強剤が、ＭＤＳＣの細胞死滅を誘導することによって免疫抑制能を除去または減少させるものである、請求項１に記載の免疫活性増強剤。
【請求項４】
前記免疫活性増強剤が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ）の活性に対するＭＤＳＣの抑制能を調節するものである、請求項１に記載の免疫活性増強剤。
【請求項５】
前記抗体が、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１に記載の免疫活性増強剤。
【請求項６】
前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含むものである、請求項１に記載の免疫活性増強剤。
【請求項７】
前記抗体が脱フコース化抗体である、請求項１に記載の免疫活性増強剤。
【請求項８】
前記抗体が、以下の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲｓ）を含む、抗−ＣＤ６６ｃ抗体またはその抗原結合断片である、請求項１に記載の免疫活性増強剤：
配列番号１または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号２または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、
配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、
配列番号４、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
配列番号６または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３。
【請求項９】
前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号２２、２３、２４、２５、２６または２７のアミノ酸配列を含むフレームワーク（Ｖ−ＦＲ１）、配列番号３２、３３、３４、３５、３６または３７のアミノ酸配列を含むフレームワーク（Ｖ−ＦＲ２）、配列番号４２、４３、４４、４５、４６または４７のアミノ酸配列を含むフレームワーク（Ｖ−ＦＲ３）、および配列番号５２、５３、５４、５５、５６または５７のアミノ酸配列を含むフレームワーク（Ｖ−ＦＲ４）からなる群より選択された少なくとも一つのフレームワークを含むものである、請求項１に記載の免疫活性増強剤。
【請求項１０】
前記抗体の軽鎖可変領域が、配列番号２８、２９、３０または３１のアミノ酸配列を含むフレームワーク（Ｌ−ＦＲ１）、配列番号３８、３９、４０または４１のアミノ酸配列を含むフレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、配列番号４８、４９、５０、または５１のアミノ酸配列を含むフレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および配列番号５８、５９、６０または６１のアミノ酸配列を含むフレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）からなる群より選択された少なくとも一つのフレームワークを含むものである、請求項１に記載の免疫活性増強剤。
【請求項１１】
前記抗体が、配列番号７、１４、１５、１６、１７または１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号８、１９、２０、または２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の免疫活性増強剤。
【請求項１２】
前記抗体が、温度６２℃でＡＮＳ結合による蛍光値変異率が２００％未満である、請求項１に記載の免疫活性増強剤。
【請求項１３】
前記抗原結合断片が、前記抗−ＣＤ６６ｃ抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２である、請求項１に記載の免疫活性増強剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の免疫活性増強剤を含む、ＭＤＳＣ関連疾患または症状の予防、治療または改善用の薬学組成物。
【請求項１５】
前記ＭＤＳＣ関連疾患が、リンパ球を除いたＨＬＡ−ＤＲ  Ｌｏｗ／（−）、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ３３＋表現型を示し、ＣＤ６６ｃが陽性であるＭＤＳＣの細胞数が正常細胞に比べて増加された疾患である、請求項１４に記載の薬学組成物。
【請求項１６】
前記Ｔ細胞、ＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）、または制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ）の活性に対するＭＤＳＣの抑制能を調節するものである、請求項１４に記載の薬学組成物。
【請求項１７】
前記ＭＤＳＣ関連疾患が、癌または炎症性疾患である、請求項１４に記載の薬学組成物。
【請求項１８】
前記ＭＤＳＣ関連疾患が、クルーズ・トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リーシュマニア・メジャ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）、ヘルミンス（ｈｅｌｍｉｎｔｈｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、またはポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の感染、トキソプラズマ症、または多菌性敗血症である、請求項１４に記載の薬学組成物。
【請求項１９】
前記ＭＤＳＣ関連疾患が、胃癌、乳癌、肺癌、大腸癌、肝癌、胆嚢癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、膀胱癌、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性単球性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、またはホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、または非ホジキンリンパ腫である、請求項１４に記載の薬学組成物
【請求項２０】
前記癌細胞の成長または癌転移誘導を抑制するものである、請求項１９に記載の薬学組成物。
【請求項２１】
前記抗体が、ＭＤＳＣで発現するＣＤ６６ｃおよびＣＤ６６ｂを認知するＩｇＧ１タイプ抗体である、請求項１４に記載の薬学組成物。
【請求項２２】
前記薬学組成物が、ＭＤＳＣで発現するＣＤ６６ｃに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片に加えて、ＮＫ細胞またはＮＫ細胞由来細胞治療剤を追加的に含むものである、請求項１４に記載の薬学組成物。
【請求項２３】
骨髄由来免疫抑制細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌ、ＭＤＳＣ）で発現するＣＤ６６ｃに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、ＣＤ６６ｃが陽性であるＭＤＳＣを探知する、ＭＤＳＣ関連疾患の診断用組成物。
【請求項２４】
前記診断の試料が、対象の生体試料である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＭＤＳＣ関連疾患が、リンパ球を除いたＨＬＡ−ＤＲ  Ｌｏｗ／（−）、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ３３＋表現型を示し、ＣＤ６６ｃが陽性であるＭＤＳＣが増加された疾患である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＭＤＳＣ関連疾患が、クルーズ・トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リーシュマニア・メジャ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）、ヘルミンス（ｈｅｌｍｉｎｔｈｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、またはポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の感染、トキソプラズマ症、多菌性敗血症、胃癌、乳癌、肺癌、大腸癌、肝癌および胆嚢癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、膀胱癌、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性単球性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、または非ホジキンリンパ腫である、請求項２３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄由来抑制細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌ、ＭＤＳＣ）で発現するＣＤ６６ｃに対する抗体またはその抗原結合断片を含む免疫活性増強剤、および前記免疫活性増強剤を用いたＭＤＳＣ関連疾患の予防、治療または改善に関する用途に関するものである。具体的に、本発明は、ＣＤ６６ｃに特異的に結合する単一クローン抗体を用いてＭＤＳＣの生成、死滅または活性を調節してＭＤＳＣの免疫抑制能を減少させる効果を誘導することによって、ＭＤＳＣ関連疾患の予防、治療あるいは改善用途または診断用途を提供する。
【背景技術】
【０００２】
最近、癌の治療において抗体や免疫細胞ワクチンを用いた免疫療法治療に対する研究が活発に行われているが、癌細胞の免疫回避および抑制作用はこのような治療効果を阻害させる。癌細胞は自己に対する免疫反応を防ぐために各種免疫細胞の活動を低下させ、不活性樹状細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍関連マクロファージ（Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、ＴＡＭ）のような免疫抑制機能を有する細胞を誘導するが、このような免疫抑制細胞の一つとして最近は骨髄由来免疫抑制細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌ、ＭＤＳＣ）の役割が知られながら大きく注目されている。
【０００３】
ＭＤＳＣは、免疫抑制機能を有する骨髄由来未成熟骨髄細胞の集合と定義され、健康な個体では数が制約的であるが、慢性／急性感染、癌などの病的な状態で末梢血液、リンパ器官、脾臓、癌組織などに蓄積されると報告されている。
【０００４】
ＭＤＳＣは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の免疫反応を抑制し、免疫抑制細胞（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｃｅｌｌ）であるＴｒｅｇ細胞の生成を誘導することによって、癌細胞の成長を促進させ、また癌細胞の遠隔転移を誘導することもできると確認された。
【０００５】
今まで知られたＭＤＳＣの免疫抑制機序は大きく４つの形態に分けられるが、第１は、リンパ球が必要とする栄養素を欠乏させる方法である。第２の形態は、酸化ストレスを形成するものであって、活性酸素や活性窒素を作ってＴ細胞の増殖から機能まで多様な過程を阻害する。第３は、リンパ球の移動（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）と生存に影響を与える方式である。Ｔ細胞がリンパ節に再循環（ｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）する過程を阻害したり、腫瘍の中心にＴ細胞が移動することを妨害したりして、Ｔ細胞死滅を誘導するなどの機序が知られている。第４は、抗原特異ナチュラルＴｒｅｇ（ｎａｔｕｒａｌ  Ｔｒｅｇ）細胞を増殖させ、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞をＴｒｅｇに転換する過程を促進すると知られている。
【０００６】
ＭＤＳＣの最も大きい特徴の一つは、形態、表現型、および機能において多様性を有するということである。ＭＤＳＣの標識マーカとしては、Ｌｉｎｅａｇｅ（−）、ＨＬＡ−ＤＲ  ＬＯＷ／（−）、ＣＤ１１ｂ（＋）、ＣＤ３３（＋）が知られている。このような標識マーカは、樹状細胞、大食細胞、顆粒性白血球の前駆体細胞のような多様な異なる種類の骨髄性細胞で共通的に発現しており、ＭＤＳＣは免疫抑制機能を有する骨髄性由来細胞の集合群と定義されてきた。このようなＭＤＳＣの多様性は、ＭＤＳＣの起源および特性を研究するに当たり、互いに異なる分析につながって大きい混乱を与えてきた。そこで、ＭＤＳＣの細部群を明らかにしようとする研究が進行されて現在ＭＤＳＣは８０％の多核球性（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ）ＭＤＳＣと２０％の単核球性（ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ）ＭＤＳＣからなることが明らかになった。この二つの細胞は模様と表現型でのみ差を示すのではなく、免疫を抑制する機序も異なると明らかになったが、多核球性ＭＤＳＣは活性酸素を媒介としてＴ細胞間の接触を通じて抗原特異的な免疫抑制を誘導する反面、単核球性ＭＤＳＣは主にアルギナーゼ（ａｒｇｉｎａｓｅ）の高発現および多様な免疫抑制サイトカインを媒介として免疫抑制機能を示す。
【０００７】
最近、研究を通じて癌患者で作られる免疫抑制環境にＭＤＳＣの蓄積が関与することが報告されており、これはほぼ全ての癌腫で共通的に示された。ＭＤＳＣが増加する程度は、癌の病期が進行されるほど大きくなるということが多くの研究を通じて裏付けられている。そこで、ＭＤＳＣの増加程度を、癌患者の低い生存率と治療反応率に対する予後指標として活用しようとする研究が活発に進行中である。癌の病態生理でＭＤＳＣが重要な役割を果たしていることは明確であるように見える。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の一例は、ＭＤＳＣで発現するＣＤ６６ｃに結合する抗体およびその抗原結合断片を含む免疫増強剤、免疫活性化剤、またはＭＤＳＣによる免疫抑制能を減少または除去するための組成物に関するものである。
【０００９】
本発明の一例は、ＭＤＳＣで発現するＣＤ６６ｃに結合する抗体およびその抗原結合断片を含むＭＤＳＣ関連疾患の予防、治療、または改善用薬学的組成物またはその用途に関するものである。
【００１０】
本発明の一例は、ＭＤＳＣで発現するＣＤ６６ｃに結合する抗体およびその抗原結合断片をこれを必要とする対象に投与する段階を含む対象の免疫反応を増加させたり活性化させる方法を提供する。
【００１１】
本発明の追加の一例は、ＭＤＳＣで発現するＣＤ６６ｃに結合する抗体およびその抗原結合断片をＭＤＳＣと接触する段階を含む、ＭＤＳＣの活性を抑制する方法に関するものである。
【００１２】
また、本発明の一例は、前記免疫増強剤または免疫活性化剤を、ＭＤＳＣ関連疾患を有する対象に投与する段階を含む、ＭＤＳＣ関連疾患の予防、治療、または改善方法に関するものである。
【００１３】
本発明の一例は、、ＭＤＳＣで発現するＣＤ６６ｃに結合する抗体およびその抗原結合断片を含む免疫増強剤または免疫活性化剤を、ＭＤＳＣ関連疾患を有する対象に投与する段階を含む、ＭＤＳＣ関連疾患の予防、治療、または改善方法に関するものである。
【００１４】
本発明によるＭＤＳＣで発現するＣＤ６６ｃに結合する抗体およびその抗原結合断片は、ＭＤＳＣの免疫抑制能を除去または減少させたり、ＭＳＤＣの細胞数を減少させ、具体的にＭＤＳＣの活性、生成または死滅を調節したり、死滅を誘導して達成することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ＭＤＳＣで発現するＣＤ６６ｃに結合する抗体およびその抗原結合断片を含む免疫増強用、免疫活性化用、またはＭＤＳＣによる免疫抑制能を減少または除去するための用途に関するものである。
【００１６】
また、本発明の追加の一例は、ＭＤＳＣで発現するＣＤ６６ｃに結合する抗体およびその抗原結合断片を含むＭＤＳＣ関連疾患、例えば、癌、感染性疾患の予防、治療または軽減用途に関するものである。
【００１７】
具体的に、ＭＤＳＣで発現するＣＤ６６ｃに特異的に結合する抗体を用いてＭＤＳＣによる免疫抑制反応を減少させる効果を誘導することによって、ＭＤＳＣ関連疾患の予防または治療および診断用途に関するものである。前記抗体は、多クローン抗体または単クローン抗体であってもよく、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。
【００１８】
他の例は、前記抗−ＣＤ６６ｃ抗体またはその抗原結合断片を暗号化する核酸分子を提供する。
【００１９】
他の例は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する。前記組換えベクターは、前記核酸分子を宿主細胞で発現させるための発現ベクターとして用いることができる。
【００２０】
他の例は、前記核酸分子または前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。前記組換え細胞は、前記核酸分子または前記組換えベクターを宿主細胞に形質転換させて得られたものであってもよい。
【００２１】
他の例は、前記抗−ＣＤ６６ｃ抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。前記製造方法は、前記核酸分子を宿主細胞で発現させる段階を含むことができる。前記発現させる段階は、前記組換え細胞を培養する段階を含むことができ、任意に、前記得られた細胞培養物から抗体を分離および／または精製する段階を追加的に含むことができる。
（ａ）前記核酸分子または前記組換えベクターに形質転換された組換え細胞を準備する段階；
（ｂ）前記核酸分子の十分な発現のための条件および／または期間で前記組換え細胞を培養する段階；および
（ｃ）前記（b）段階で得られた培養物から抗−ＣＤ６６ｃ抗体またはその抗原結合断片を分離および／または精製する段階。
【発明の具体的説明】
【００２２】
以下、本発明をより詳しく説明する。
具体的な一例で、前記製造方法は、ＭＤＳＣで発現するＣＤ６６ｃに結合する抗体およびその抗原結合断片を含む免疫増強剤、免疫活性化剤、またはＭＤＳＣによる免疫抑制能を減少または除去するための組成物に関するものである。
【００２３】
ＭＤＳＣは、免疫抑制機能を有する骨髄由来未成熟骨髄細胞の集合と定義され、健康な個体では数が制約的であるが、慢性／急性感染、癌などの病的な状態で末梢血液、リンパ器官、脾臓、癌組織などに蓄積されると報告されている。
【００２４】
ＭＤＳＣは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の免疫反応を抑制し、免疫抑制細胞（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｃｅｌｌ）であるＴｒｅｇ細胞の生成を誘導することによって、癌細胞の成長を促進させ、また癌細胞の遠隔転移を誘導することもできると確認された。今まで知られたＭＤＳＣの免疫抑制機序は、リンパ球が必要とする栄養素を欠乏させる方法、リンパ球の移動（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）と生存に影響を与える方法、活性酸素や活性窒素を作ってＴ細胞の増殖から機能まで多様な過程を阻害する酸化ストレスを形成する方法、Ｔ細胞がリンパ節に再循環（ｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）する過程を阻害したり、腫瘍の中心にＴ細胞が移動することを妨害したりして、Ｔ細胞死滅を誘導するなどの機序が知られている。また、抗原特異的ナチュラルＴｒｅｇ（ｎａｔｕｒａｌ  Ｔｒｅｇ）細胞を増殖させ、ｎａ＿ｖｅ  ＣＤ４＋  Ｔ細胞をＴｒｅｇに転換する過程を促進すると知られている。
【００２５】
ＭＤＳＣは、免疫抑制機能を有する骨髄由来未成熟骨髄細胞の集合と定義され、健康な個体では数が制約的であるが、慢性／急性感染、癌などの病的な状態で末梢血液、リンパ器官、脾臓、癌組織などに蓄積されると報告されている。癌腫においてＭＤＳＣ蓄積と免疫抑制機能は大腸癌、繊維肉腫、胸腺種、肺癌、中皮腫、リンパ腫、前立腺癌、頭頸部癌、黒色腫などで報告された（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ＤＩ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒｓ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２（４）：２５３−６８  （２０１２））。ＭＤＳＣは癌だけでなく、クルーズ・トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リーシュマニア・メジャ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）、ヘルミンス（ｈｅｌｍｉｎｔｈｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）などの感染またはトキソプラズマ症、多菌性敗血症の疾患でも蓄積されて免疫抑制を誘発すると知られている（Ｇａｒｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ＤＩ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９（３）：１６２−７４  （２００９））。
【００２６】
本明細書でＭＤＳＣは、非リンパ球性ＨＬＡ−ＤＲＬｏｗ／（−）、ＣＤ１１ｂ＋、およびＣＤ３３＋表現型を示すものであり、前記表現型を示しながらＣＤ６６ｃ発現するＭＤＳＣが本願発明による抗−ＣＤ６６ｃ抗体またはその抗原結合断片の標的になることができる。具体的に、本発明による組成物は、非リンパ球性ＨＬＡ−ＤＲＬｏｗ／（−）、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ３３＋表現型を示すＭＤＳＣの中でＣＤ６６ｃ陽性ＭＤＳＣが蓄積された前記疾患をターゲットしてＭＤＳＣによる免疫欠乏、免疫低下または免疫損傷を改善または治療するための方案を提示する。例えば、本発明は、点図表（ｄｏｔ  ｐｌｏｔ）で細胞の大きさによりリンパ球を除いて単核球と顆粒球領域だけを指定した後、ＨＬＡ−ＤＲの発現がないかまたは低い群を選択し、その群でＣＤ１１ｂとＣＤ３３に陽性であるグループをＭＤＳＣと指定することができる。
【００２７】
本発明によるＭＤＳＣで発現するＣＤ６６ｃに結合する抗体およびその抗原結合断片または前記抗体または抗原結合断片を含む免疫増強剤を用いてＭＤＳＣ関連疾患の予防、治療または改善用薬学的組成物または用途を提供することができる。
【００２８】
本発明による抗−ＣＤ６６ｃ抗体によるＭＤＳＣの溶解効果を全血（ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ）とＰＭＢＣで全てＣＥＡＣＡＭ６陽性である細胞をＭＤＳＣ細胞数減少または細胞死滅を誘導することができ、好ましくはＡＤＣＣ方式でＭＤＳＣの細胞水減少または細胞死滅を誘導することができる。全血にはＣＥＡＣＡＭ６ターゲット抗原が陽性である好中球とＭＤＳＣが混合されており、ＭＤＳＣのみを選択的に溶解したとみることは難しいが、好中球を除去して得られた末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）に対して抗−ＣＤ６６ｃ抗体によるＭＤＳＣの選択的な溶解が可能である。
【００２９】
前記ＭＤＳＣ関連疾患は、ＭＤＳＣによる免疫抑制活性を示す疾患として、ＣＤ６６ｃ陽性であるＭＤＳＣが増加された疾患の基準である正常細胞と比較して増加した疾患であり、例えば、特定の疾患を有する対象でＣＤ６６ｃ陽性であるＭＤＳＣの数または活性が、対応する正常対象の試料の単位体積当たりＭＤＳＣの数または活性を１００％基準にする時、約２００％以上、約３００％以上、約５００％以上、約７００％以上、約１、０００％以上、約１，５００％以上であってもよく、例えば約２００〜５，０００％、または２００％〜３，０００％、２００〜１，５００％などであってもよい。例えば、ＭＤＳＣ関連疾患を有すると疑われる対象および正常人の試料、血液を取って、フローサイトメーターでＭＳＤＣの試料内細胞数を分析して、ＭＤＳＣ関連疾患を有すると疑われる対象のＭＤＳＣの細胞数が正常人の細胞数と比較して増加の有無を決定する。具体的に、試料（例、血液）の単位体積当たりＭＳＤＣ細胞の数が正常人に比べて増加した場合であってもよく、正常対象の試料の単位体積当たりＭＤＳＣの数または活性を１００％基準にする時、約２００％以上、約３００％以上、約５００％以上、約７００％以上、約１，０００％以上、約１，５００％以上であってもよく、例えば約２００〜５，０００％、または２００％〜３，０００％、２００〜１，５００％などであってもよい。
【００３０】
具体的なＭＤＳＣは、例えば非リンパ球性ＨＬＡ−ＤＲ  Ｌｏｗ／（−）、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ３３＋表現型を示すＭＤＳＣの中でＣＤ６６ｃ陽性ＭＤＳＣが増加されたまたは蓄積された疾患または前記ＭＤＳＣ細胞数が正常細胞数に比べて増加した疾患であってもよい。前記ＭＤＳＣ関連疾患の例は、慢性／急性感染および癌などを含み、具体的にＭＤＳＣによる免疫抑制能を示す慢性／急性感染および癌であってもよく、例えば非リンパ球性ＨＬＡ−ＤＲＬｏｗ／（−）、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ３３＋表現型を示すＭＤＳＣの中でＣＤ６６ｃ陽性ＭＤＳＣが蓄積された疾患、またはＭＤＳＣの中でＣＤ６６ｃ陽性ＭＤＳＣが蓄積された感染疾患および癌などを含む。
【００３１】
前記ＭＤＳＣ関連感染疾患は、クルーズ・トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リーシュマニア・メジャ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）、ヘルミンス（ｈｅｌｍｉｎｔｈｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）などの感染またはトキソプラズマ症、多菌性敗血症の疾患であってもよい。
【００３２】
例えば、前記ＭＤＳＣ関連癌は、ＣＤ６６ｃ陽性であるＭＤＳＣが増加された癌であってもよく、固形癌および血液癌を含み、前記固形癌の例は、大腸癌、繊維肉腫、胸腺種、肺癌、中皮腫、リンパ腫、前立腺癌、頭頸部癌、黒色腫、胃癌、肝癌、または乳癌であってもよく、好ましくは大腸癌、胃癌または肝癌であってもよい。前記癌および癌転移の予防、抑制、または治療用途は例えば、癌細胞成長を抑制することができる。前記血液癌（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）の例は急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性単球性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、またはホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）であってもよい。
【００３３】
本発明は、ＭＤＳＣで発現するＣＤ６６ｃに結合する抗体およびその抗原結合断片に関するものであって、ＣＤ６６ｃ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ６６ｃ）は、ＣＥＡＣＡＭ  ６（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ６）またはＮＣＡ（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）−９０としても知られた蛋白質であり、細胞接着（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）と関連した重要な蛋白質と知られており、これに限定されないが、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎｏ．ＡＡＨ０５００８）で表示され得る。
【００３４】
本明細書で“抗体”とは、免疫系内で抗原の刺激により作られる物質を意味するものであって、その種類は特に制限されない。前記抗体は、非自然的に生成されたもの、例えば、組換え的または合成的に生成されたものであり得る。前記抗体は、動物抗体（例えば、マウス抗体など）、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。前記抗体は、単クローン抗体または多クローン抗体であり得る。
【００３５】
前記抗−ＣＤ６６ｃ抗体または抗原結合断片は、先に説明したＣＤ６６ｃの特定の抗原決定部位に特異的に結合するものであって、動物抗体（例えば、マウス抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびこれらの抗原結合断片からなる群より選択されたものであり得る。前記動物抗体は、ヒト以外の動物種に由来したものであってもよく、例えば、ラット、マウス、ヤギ、モルモット、ロバ、ウサギ、馬、ラマ、ラクダ、鳥類（例えば、鶏、鴨など）などに由来したものであり得るが、これに限定されるのではない。このような動物抗体からキメラ抗体および／またはヒト化抗体を製作する技術は関連技術分野によく知られている。前記ヒト化抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたは任意のサブクラス（ｓｕｂｃｌａｓｓ）のような任意の適したアイソタイプであってもよく、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプであってもよく、より好ましくは脱フコース化されたＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプであってもよい。
【００３６】
また本明細書で抗体は、特別な言及がない限り、抗原結合能を保有する抗体の抗原結合断片も含むものと理解され得る。本明細書で“相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ、ＣＤＲ）”とは、抗体の可変部位の中で抗原との結合特異性を付与する部位を意味する。先に説明した抗体の抗原結合断片は、前記相補性決定領域を一つ以上含む抗体断片であり得る。用語、“ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）”は免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖はそれぞれ３つのＣＤＲを含むことができる（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。前記ＣＤＲは抗体が抗原またはエピトープに結合することにおいて主要な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語“特異的に結合”または“特異的に認識”は、当業者に通常公知されている意味と同一なものであって、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応をすることを意味する。
【００３７】
用語、“抗原結合断片”は、免疫グロブリン全体構造に対するその断片であって、抗原が結合できる部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２であってもよいが、これに限定されない。
【００３８】
本発明による抗−ＣＤ６６ｃは、ＣＤ６６ｃを特異的に認識および／または結合し、抗体はマウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体を含む。本発明でキメラ抗体は、可変領域配列が一つの種に由来し、不変領域配列が他の種に由来した抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、不変領域配列がヒト抗体に由来した抗体を意味する。本発明でヒト化抗体とは、ヒトで免疫性が少ないながら非ヒト抗体の活性を保有する抗体を意味する。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を維持させ、抗体の残りの部分をヒト対応部（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）で置換することによって製造できる。例えば、下記文献が参照される：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ＳｃＬ  ＵＳＡ，  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ４４：６５−９２  （１９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：１５３４−１５３６  （１９８８）；  Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．，  ２８：４８９−４９８  （１９９１）；  Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．，  ３１（３）：１６９−２１７  （１９９４）。
【００３９】
本発明で抗体切片は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでＣＤ６６ｃエピトープを選択的に認識することができるものであればこれに制限がないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲからなる群より選択されたものであり得る。特に、前記ｓｃＦｖは、前記重鎖可変部位（ＶＨ）および軽鎖可変部位（ＶＬ）をリンカーポリペプチドで連結して単鎖（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ）に作った抗体切片である。
【００４０】
用語“ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）”は、抗体の重鎖に含まれている領域として、ＣＨ１およびＣＨ２領域の間に存在し、抗体内抗原結合部位の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供する機能をする領域を意味する。例えば、前記ヒンジは、ヒト抗体に由来したものであってもよく、具体的に、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来したものであってもよい。
【００４１】
抗−ＣＤ６６ｃ抗体は、多クローン抗体または単クローン抗体であってもよく、例えば、単クローン抗体であってもよい。単クローン抗体は、当業界に広く知られた方法の通り製造され得る。例えば、ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）技法を用いて製造され得る。
【００４２】
前記ヒト化抗体は、マウス抗体やキメラ抗体とは異なり、人体投与時、免疫原性の原因を大幅減らす差別性以外にも、安定性の面でキメラ８Ｆ５抗体より１０倍以上の高い安定性を示した。具体的には、高い温度、例えば温度６２℃でＡＮＳ結合による蛍光値変異率が２００％未満で、安定性が高い。
【００４３】
具体的な苛酷条件で抗体物性の変異によりキメラ８Ｆ５抗体は１，４０６％のＡＮＳ反応性変化を示した反面、ヒト化抗体は１１４％、１３３％程度の相対的に微小な変化を示して非常に蛋白質の面で安定化されたことが分かる。
【００４４】
前記キメラ８Ｆ５およびヒト化抗体はＴ細胞の活性化を増加させ、これはＴ細胞活性因子による活性化増大および互いに異なるヒトの同種樹状細胞とＴ細胞の混合によるＴ細胞活性条件でも活性増大を示す場合が挙げられる。このようなＴ細胞活性化誘導は癌細胞との共同培養時に癌細胞の死滅を誘導し、多様な癌細胞と共同培養条件でＴ細胞活性化を誘導する場合が挙げられる。
【００４５】
本発明による抗体またはその断片は、腫瘍退縮（ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）活性および腫瘍細胞株に対して直接的な抑制効果を有する。本明細書で腫瘍の退縮は腫瘍大きさの減少および／または腫瘍細胞の成長阻害、中断または減少などを誘導または促進することを含む。腫瘍の大きさ減少は例えば、本発明の抗体またはその断片を含む組成物を処理する前を１００％を基準にして、前記抗体またはその断片を含む組成物を投与した場合に得られた腫瘍の大きさが９７％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下の大きさを有する場合などが挙げられる。
【００４６】
本発明による抗体は、抗体−依存性細胞介在性細胞毒性（ＡＤＣＣ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）と補体系依存細胞毒性（ＣＤＣ、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有し、好ましくはＡＤＣＣ特性を有する。
【００４７】
本発明による抗体またはその抗原結合断片は、ナチュラルキラー（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ）細胞またはＮＫ細胞由来細胞治療剤を併用してＭＤＳＣ関連疾患を改善または治療することができる。
【００４８】
具体的に、本発明による抗−ＣＤ６６ｃ抗体は、癌細胞殺害能がナチュラルキラー細胞との併用により増加し、これによって、ＣＥＡＣＡＭ６陽性である癌細胞だけでなく、またＣＥＡＣＡＭ６陽性であるＭＤＳＣの効果的な除去のためにＮＫ細胞またはＮＫ細胞治療剤との併用処理の効果に優れている。
【００４９】
具体的な実験として、ＥＺ−ｃｙｔｏｘ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｋｉｔ（Ｄａｅｉｌ  Ｌａｂ）を用いて細胞生存率を測定した結果、２種の癌細胞株の全てでナチュラルキラー細胞の併用による細胞死滅効果が単独処理時に比べて増加すると確認された（図１２ａおよび図１２ｂ）。本発明による抗−ＣＤ６６ｃ抗体によるＭＤＳＣの選択的溶解結果とＮＫ細胞またはＮＫ細胞治療剤の併用効果を通じて、ＣＥＡＣＡＭ６陽性である癌細胞およびＣＥＡＣＡＭ６陽性であるＭＤＳＣを全て標的にして除去することができる。本発明による抗−ＣＤ６６ｃ抗体は、それぞれＭＤＳＣと癌細胞で、他の標的細胞に対してＡＤＣＣを示すが、実際２種類の細胞が共に増加されている癌患者の場合、本発明による抗−ＣＤ６６ｃ抗体で２種類の標的を同時に除去することができ、またＮＫ細胞治療剤との併用で癌細胞およびＭＤＳＣ標的を同時除去する効能がより向上する。
【００５０】
本発明による抗体は、抗体に結合された糖残基であるＦＵＣＯＳＥを一部または全部除去したものであってもよい。本発明によるフコース除去抗体は、ＭＤＳＣの細胞死滅効果を有し、一例で本発明による抗体は、低フコース形態または脱フコース（ｄｅｆｕｃｏｓｅ）形態の抗体がｆｕｃｏｓｅ形態の抗体に比べてＭＤＳＣ殺傷に対する効能に優れて免疫活性増強効能が大きい。本明細書に使用されるように、“正常フコース”または“正常フコース含有量”はフコース含有量が典型的に９０％以上である抗体を指称するす。本発明による低フコースまたは脱フコース形態の抗体は、フコース含有量が約１０％以下である抗体、約７％以下、または約５％以下であってもよく、例えば０〜約１０％、０〜約７％、または０〜約５％範囲であってもよい。
【００５１】
具体的に、本発明に適用される抗体は、以下の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲｓ）を含む、抗−ＣＤ６６ｃ抗体またはその抗原結合断片であり得る：
配列番号１または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号２または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、
配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、
配列番号４、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
配列番号６または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３である。
【００５２】
前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号２２、２３、２４、２５、２６または２７のアミノ酸配列を含むフレームワーク（Ｖ−ＦＲ１）、配列番号３２、３３、３４、３５、３６または３７のアミノ酸配列を含むフレームワーク（Ｖ−ＦＲ２）、配列番号４２、４３、４４、４５、４６または４７のアミノ酸配列を含むフレームワーク（Ｖ−ＦＲ３）、および配列番号５２、５３、５４、５５、５６または５７のアミノ酸配列を含むフレームワーク（Ｖ−ＦＲ４）からなる群より選択された少なくとも一つのフレームワークを含むものである抗−ＣＤ６６ｃ抗体またはその抗原結合断片であり得る。
【００５３】
前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２８、２９、３０または３１のアミノ酸配列を含むフレームワーク（Ｌ−ＦＲ１）、配列番号３８、３９、４０または４１のアミノ酸配列を含むフレームワーク（Ｌ−ＦＲ２）、配列番号４８、４９、５０、または５１のアミノ酸配列を含むフレームワーク（Ｌ−ＦＲ３）、および配列番号５８、５９、６０または６１のアミノ酸配列を含むフレームワーク（Ｌ−ＦＲ４）からなる群より選択された少なくとも一つのフレームワークを含むものである抗−ＣＤ６６ｃ抗体またはその抗原結合断片であり得る。
【００５４】
前記抗体は、配列番号７、１４、１５、１６、１７または１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号８、１９、２０、または２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗−ＣＤ６６ｃ抗体またはその抗原結合断片であり得る。
【００５５】
本発明によるマウス抗体またはキメラ抗体の一例は、配列番号１〜３のアミノ酸配列を含むＶＨ領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列および配列番号４〜６のアミノ酸配列を含むＶＬ領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片であり得る。前記マウス抗体またはキメラ抗体の一例によるＣＤＲ配列と可変領域配列を下記表１に整理する。
【００５６】
具体的に、本発明の抗体の一例は、ＶＨ領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列として配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）および配列番号３（ＣＤＲ３）および／またはＶＬ領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列である配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む。
【００５７】
前記マウス抗体またはキメラ抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含むものであり得る。
【００５８】
本発明によるマウス抗体またはキメラ抗体を有効性分として含むＭＤＳＣ関連疾病またはその症状の改善、予防または治療用薬学組成物、キットまたは治療方法に関するものである。
【００５９】
本発明によるマウス抗体またはキメラ抗体、例えば寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２３０のハイブリードマから生産された抗−ＣＤ６６ｃ抗体のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む抗−ＣＤ６６ｃ抗体またはその抗原結合断片を含むＭＤＳＣ関連疾病またはその症状の予防または治療用薬学組成物に関するものである。前記ハイブリードマ細胞は、韓国細胞株銀行（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ＫＣＬＲＦ）に‘８Ｆ５’として２０１０年２月２２日付で寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２３０で寄託されたものであり、ＫＲ１０−１２１４１７７登録公報に詳しく記載されている。
【００６０】
本発明は、前記マウス抗体またはキメラ抗体を用いて抗−ＣＤ６６ｃ抗体８Ｆ５のアミノ酸配列とヒト抗体配列をフレームワーク配列に基づいて製造する。ヒト化組換え抗体候補の中から発現程度と凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）有無、細胞結合程度を基準にして、ヒト化候補抗体の中から、発現が正常に行われ、蛋白質自体の不安定性により形成される凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が少なく、またターゲット抗原陽性の細胞に結合する能力がキメラ抗体と類似したヒト化抗体候補を選別する。具体的に細胞結合様相はキメラ抗体と類似した水準であって、抗体陽性率（％ｇａｔｅｄ）と蛍光平均値（ｍｅａｎ）をかけ、これをキメラ抗体と相対比較して±２０％範囲内に含まれる候補抗体を選別する。したがって、本発明で選定された抗体群は通常ヒト化抗体生成時、ヒト化抗体のフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）にマウス抗体ＣＤＲ部位配列を挿入した時に元の蛋白質構造の変更で抗体結合力が急激に低下するという結果を考慮した時、非常に優れたヒト化抗体を選別したと言える。
【００６１】
好ましくは、キメラ抗体と比較して細胞結合力を基準にして高い結合力を示す５種類のヒト化組換え抗体を選択し、これらをＥＬＩＳＡ方法でＣＤ６６ｃ抗原および類似ＣＤ６６抗原に対する結合力分析を実施する。
【００６２】
また、本願発明によるヒト化抗体は、キメラ抗体に比べて優れた安定性を示し、例えばＡＮＳ反応性変異％が２００％未満で安定した抗体であり、２００％未満は変化が非常に微小であると見なされ、それ以上は有意義な蛋白質構造変更が行われてＡＮＳ反応性が観察されたと解釈され得る。したがって、本発明によるヒト化抗体は、キメラ抗体と比較して類似した抗原結合力および細胞結合力を有し、抗体蛋白質自体の物理的安定性が増加し、このような事実は治療用抗体のドラッガビリティ（ｄｒｕｇｇａｂｉｌｉｔｙ）の面で非常に優れた特徴と言える。
【００６３】
ＡＮＳ試薬に対する抗体の蛍光値変異率は、低温条件（例、４℃）で測定した蛍光値と、高温条件（例、６２℃）で測定した蛍光値との差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を、低温条件で測定した蛍光値で割った値を意味する。
［数式］
蛍光値変異率＝（高温条件で測定した蛍光値−低温条件で測定した蛍光値）／（低温条件で測定した蛍光値）
【００６４】
具体的な抗体蛍光値変異率を得る方法として、冷蔵条件（４℃）および６２℃温度でそれぞれ４時間放置した後にＡＮＳ試薬反応性を蛍光リーダーで分析して蛍光値で表示し、前記数式を用いて蛍光値変異率を測定することができる。
【００６５】
本発明によるヒト化抗体の一例は、配列番号９〜１３のアミノ酸配列を含む重鎖または軽鎖可変領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を含むことができ、追加的にマウス抗体またはキメラ抗体の一例は、配列番号１〜３のアミノ酸配列を含むＶＨ領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列および配列番号４〜６のアミノ酸配列を含むＶＬ領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を含む抗体であり得る。
【００６６】
具体的に、ヒト化抗体の一例は、配列番号１または９のアミノ酸配列を含むＶＨ領域のＣＤＲ１を決定するアミノ酸配列、配列番号２または１０のアミノ酸配列を含むＶＨ領域のＣＤＲ２を決定するアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨ領域のＣＤＲ３を決定するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域であり得る。
【００６７】
またヒト化抗体の一例は、配列番号４、１１または１２のアミノ酸配列を含むＶＬ領域のＣＤＲ１を決定するアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬ領域のＣＤＲ２を決定するアミノ酸配列、配列番号６または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ領域のＣＤＲ３を決定するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域であり得る。
【００６８】
ヒト化抗体の一例は、配列番号７および配列番号１４〜１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域からなる群より選択された重鎖可変領域と、配列番号８および配列番号１９〜２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域からなる群より選択された軽鎖可変領域を含むことができ、但し、配列番号７および配列番号８を含む抗体は除外される。
【００６９】
前記ヒト化抗体の一例によるＣＤＲ配列と可変領域配列を下記表１に整理する。
【表１】
2021523193.tif 000003
2021523193.tif 000004
【００７０】
本発明によるヒト化抗体の一例のフレームワーク配列を下記表２および３に示し、前記抗体は、重鎖可変領域のフレームワーク１〜４、および軽鎖可変領域のフレームワーク１〜４からなる群より選択された１種以上のフレームワークを含む抗体であり得る。
【００７１】
具体的に、重鎖可変領域でフレームワーク１のアミノ酸配列は配列番号２３〜２７を含むことができ、フレームワーク２のアミノ酸配列は配列番号３２〜３７を含むことができ、フレームワーク３のアミノ酸配列は配列番号４３〜４７を含むことができ、およびフレームワーク４のアミノ酸配列は配列番号５３〜５７を含むことができる。
【００７２】
軽鎖可変領域でフレームワーク１のアミノ酸配列は配列番号２９〜３１を含むことができ、フレームワーク２のアミノ酸配列は配列番号３９〜４１を含むことができ、フレームワーク３のアミノ酸配列は配列番号４９〜５１を含むことができ、およびフレームワーク４のアミノ酸配列は配列番号５９〜６１を含むことができる。前記ヒト化抗体の一例によるフレームワーク配列を下記表に示す。
【００７３】
【表２】
2021523193.tif 000005
【００７４】
【表３】
2021523193.tif 000006
【００７５】
前記ヒト化抗体は、配列番号１４〜１８のアミノ酸配列からなる群より選択されるＶＨ領域および配列番号１９〜２１のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含むものであり得る。具体的に、前記ヒト化抗体の例は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２１のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ８＋ＶＨ６）、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２１のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ８＋ＶＨ１１）、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号１９のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ５＋ＶＨ７）、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２０のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ７＋ＶＨ６）、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２０のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ７＋ＶＨ１０）、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２０のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む（Ｖｋ７＋ＶＨ７）、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２０のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ７＋ＶＨ５）、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２１のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ８＋ＶＨ７）であり得る。前記抗体の具体的な組み合わせおよびアミノ酸配列は、下記表６に示す。前記抗体の好ましい一例は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ８＋ＶＨ６）、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２１のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ８＋ＶＨ１１）、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号１９のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ５＋ＶＨ７）、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２０のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ７＋ＶＨ６）、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２０のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ７＋ＶＨ１０）であり得る。
【００７６】
ＣＤ６６Ｃ抗体または抗体切片は、多様な標識基（ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、毒性物質または抗腫瘍剤と結合することができる。当該技術分野において周知方法により本発明の抗体は前記標識基、毒素、または抗腫瘍剤と結合できることは当業者に明らかである。このような結合は、抗体または抗原の発現後、付着部位に化学的に行うことも可能であり、あるいはＤＮＡレベルで本発明の抗体または抗原内に結合産物を操作して入れてもよい。次いで、本明細書において以下に記載する適切な宿主系においてＤＮＡを発現させ、そして発現させた蛋白質を回収して、必要によって再生させる。結合は当該技術水準において知られたリンカーを通じて達成してもよい。特にこの技術と共に酸性条件あるいは還元条件下でまたは特定のプロテアーゼに対する露出時に毒素または抗腫瘍剤を放出する、多様なリンカーを用いることができる。特定の様態においては標識基、毒素、または抗腫瘍剤を多様な長さのスペーサアームにより結合させ、潜在的な立体障害を減少させることが好ましい場合もある。
【００７７】
ＣＤ６６ｃの抗原決定部位に対する抗体または抗体切片は、ＣＤ６６ｃ蛋白質、ＣＤ６６ｃの抗原決定部位、ＣＤ６６ｃの抗原決定部位を含むＣＤ６６ｃ蛋白質一部、またはＣＤ６６ｃの抗原決定部位を発現する細胞を抗原として用いて通常の方法で製造可能である。一例として、ＣＤ６６ｃ抗体製造方法は、（ａ）ＣＤ６６ｃ蛋白質、ＣＤ６６ｃの抗原決定部位、ＣＤ６６ｃの抗原決定部位を含むＣＤ６６ｃ蛋白質一部、またはＣＤ６６ｃの抗原決定部位を発現する細胞を動物に注入して免疫化させる段階、（ｂ）ＣＤ６６ｃに特異的な抗体を生産する脾臓細胞を収得する段階および（ｃ）前記脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ＣＤ６６ｃに対する抗体を生産するハイブリードマ細胞を選別する段階を含むＣＤ６６ｃ抗体を生産する生産株製造方法を通じて実施可能である。前記生産株は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で培養するか、生体内に注入して抗体を分離することができる。一例として、マウスの腹腔内に挿入して腹水から分離、精製する。単クローン抗体の分離および精製は、培養上澄液または腹水をイオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２など）、抗免疫グロブリンカラムまたはプロテインＡカラムなどのアフィニティークロマトグラフィーを用いて実施することができる。
【００７８】
本発明による抗体が結合する抗原決定部位は、ＭＤＳＣ特異的な発現を示す。したがって、抗−ＣＤ６６ｃ抗体はＭＤＳＣの検出に有用に使用できるだけでなく、毒性物質を含ませてＭＤＳＣだけを特異的に細胞殺傷（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）させることができる。
【００７９】
他の例は、本発明による抗体のＣＤ６６ｃを含むＭＤＳＣの検出のためのマーカとしての用途を提供し、そこで、ＣＤ６６ｃに対する抗体またはその抗原結合断片を用いてＭＤＳＣ検出およびＭＤＳＣ関連疾患の診断用途または診断の情報を提供する用途で使用され得る。
【００８０】
例えば、ＣＤ６６ｃに対する抗体またはその抗原結合断片を用いて前記抗体の抗原決定部位と相互作用する物質を含むＭＤＳＣの検出用組成物を提供する。前記相互作用する物質は、ＣＤ６６ｃに位置する抗原決定部位と相互作用可能な全ての物質、例えば、化学物質（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）、抗体、抗体の抗原結合断片、アプタマーなどからなる群おり選択された１種以上であり得る。
【００８１】
本発明の診断組成物は、多様な細胞、組織または他の適切な試料における、ＣＤ６６ｃの好ましくない発現または過剰発現の検出として、試料を本発明の抗体と接触させることおよび試料においてＣＤ６６ｃの存在を検出することを含む検出に有用である。したがって、本発明の診断組成物を以下で定義する発病または疾患状態を評価するために用いてもよい。特にＣＤ６６ｃを発現する、ＭＤＳＣを本発明の抗体、抗体断片または誘導体でターゲッティングしてもよい。本発明の抗体が結合した細胞は、したがって補体系などの免疫系機能によって、または細胞介在性細胞毒性によって攻撃され、したがって、ＣＤ６６ｃの好ましくない発現または過剰発現を示す細胞の数が減少するか、またはこのような細胞が死滅する。
【００８２】
具体的な例として、本発明によるＣＤ６６ｃに対する抗体またはその抗原結合断片を用いたＭＤＳＣ関連疾患の診断方法または診断用組成物を提供する。
【００８３】
ＭＤＳＣ関連疾患、例えば癌を診断するために、本発明によるＣＤ６６ｃに対する抗体またはその抗原結合断片を用いる場合、癌組織または癌細胞の自体でのＣＥＡＣＡＭ６抗原発現と関係なく癌組織周辺の浸潤されたＭＤＳＣを標的にして診断および治療に活用することができる。本発明によるＣＤ６６ｃに対する抗体は固形癌細胞で発現するＣＤ６６ｃに結合するだけでなく、固形癌でＣＤ６６ｃを発現しない癌でも、癌によるＭＤＳＣ増加状態をＭＤＳＣで発現するＣＤ６６ｃを標的にして探知して癌を探知することができる。具体的に、癌細胞でＣＥＡＣＡＭ６が陽性である肺腺癌（ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）と癌細胞自体ではＣＥＡＣＡＭ６が陰性である扁平上皮癌（ｌｕｎｇ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、泌尿器系癌（Ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）および皮膚癌（Ｍｅｌａｎｏｍａ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）組織にＣＥＡＣＡＭ６免疫そめた結果、癌組織の非腫瘍部位にＣＥＡＣＡＭ６陽性であるＭＤＳＣがあることを確認した（図１３）。
【００８４】
したがって、癌細胞の細胞表面のＣＥＡＣＡＭ６陽性度と関係なく、癌患者ではＭＤＳＣが増加する傾向を示し、これは実施例８の結果のように微細腫瘍環境に浸潤されているＭＤＳＣを検出して確認できる。これはＭＤＳＣを選択的に溶解可能であることを示した実施例５．２の結果と共に考慮した時、癌細胞上のＣＥＡＣＡＭ６陽性度と関係なくＭＤＳＣを標的にして診断および治療目的に使用できることを示す。癌種により癌細胞の細胞表面のＣＥＡＣＡＭ６発現有無は異なり得るが、これと関係なく大部分の癌種でＭＤＳＣは増加するため、本願発明によるＣＤ６６ｃ抗体を用いてＭＤＳＣを標的治療を通じて大部分の癌種を対象にした汎用の診断および治療的目的で用いることができる。
【００８５】
本発明の一様態においては本発明の抗体、抗体断片または誘導体を標識基に結合させる。このような抗体は診断アプリケーションに特に適合する。
【００８６】
本発明による組成物は、単独活性薬剤として投与することができ、または他の薬剤と組み合わせて投与することができる。
【００８７】
ＭＤＳＣ検査方法は、（ａ）ＣＤ６６ｃ抗体をＭＤＳＣを含む試料に反応させ、（ｂ）前記抗体に対して陽性反応を示す試料をＭＤＳＣと判断することである。前記試料は、リンパ液、骨髄、血液または血球であってもよいが、これに限定されるのではない。前記ＣＤ６６ｃ抗体を用いてＭＤＳＣ関連疾患を検査する場合、前記ＣＤ６６ｃ抗体は、抗原−抗体反応性を確認できる物質で標識されたものであり得る。使用可能な前記物質としては、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、クロモゲン（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）、またはその他染色物質などがある。
【００８８】
また本発明のＣＤ６６ｃ抗体は、ＭＤＳＣ疾患を診断するための診断キットとして提供されてもよい。前記診断キットは、ＣＤ６６ｃ抗体以外に、抗原−抗体反応検出手段を含むことができる。前記検出手段は、フローサイトメトリー、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｏｒｅｓｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）および発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）からなる群より選択された方法を実施するための通常の物質であり得る。
【００８９】
前記固形癌の治療効果は、癌細胞（特に、癌幹細胞）またはこれを含む癌組織の成長抑制（量的減少）、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）効果だけでなく、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、浸湿（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）などを抑制し、これによる癌の悪化を抑制する効果を含む。本発明による抗体は、ＳＴＩＮＧ  ａｇｏｎｉｓｔまたは５−Ｆｕと併用処理して効果を極大化するために、本発明の抗体と併用処理時により高い効果を得ると期待できる。
【００９０】
本明細書で、“対象”または“患者”は、ＭＤＳＣ関連疾患の軽減、予防および／または治療を必要とする患者を意味するものであって、全ての哺乳類、例えば人間、猿などの霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類であってもよく、ＭＤＳＣ関連疾患を患っているか、ＭＤＳＣ関連疾患の症状を有するか、ＭＤＳＣ関連疾患発病の危険がある患者であってもよい。
【００９１】
本発明による抗体あるいは抗体切片の投与は、許容された全ての薬物投与方法により施行できる。具体的に例えば、ＣＤ６６ｃ抗体を有効性分として含む治療剤をＭＤＳＣ関連疾患を有する対象、つまり、人間または動物に経口または非経口、好ましくは非経口で投与することである。前記治療剤は薬理学的に許容可能な賦形剤を含んでもよく、その投与量は患者の状態により適切に調節することが好ましいが、一例として、１日３ｍｇ〜６，０００ｍｇであってもよい。治療剤の剤型は、液剤、散剤、乳剤、懸濁剤または注射剤であってもよいが、これに限定されるのではない。
【００９２】
本発明は、ＣＤ６６ｃ抗原決定部位に対する抗体、抗体切片（Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂおよびＦｖなど）、およびリガンドからなる群より選択された抗体を用いてＭＤＳＣ関連疾患を治療する方法を提供する。抗体あるいは抗体切片は、好ましくは単クローンまたは多クローン抗体からなる群より選択され、好ましくはヒトと動物で由来したものである。前記ＣＤ６６ｃ抗体または抗体切片は、前記で言及した毒素物質がさらに含まれたものであってもよい。毒素物質は、抗体に融合、接合、結合、またはリンクされてもよく、これは公知の技術で実施可能である。
【００９３】
本発明の医薬組成物は、単独活性薬剤として投与してもよく、またはその他薬剤と組み合わせて、好ましくは当該技術分野において問題の疾患の治療に適したものが知られているものと組み合わせて投与してもよい。また、本発明の抗体を投与する方法は、他の抗癌治療、例えば化学的療法、放射線療法、細胞治療剤と並行して行うことができる。前記化学的療法または細胞治療剤に使用される多様なＭＤＳＣ関連疾患を治療と知られた治療剤を使用することができる。
【発明の効果】
【００９４】
本発明は、骨髄由来抑制細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌ、ＭＤＳＣ）で発現するＣＤ６６ｃに対する抗体またはその抗原結合断片を含む免疫活性増強剤、および前記免疫活性増強剤を用いたＭＤＳＣ関連疾患の予防、治療または改善に関する用途を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】マウス８Ｆ５抗体から抗体遺伝子をクローニングしてキメラ組換え抗体で発現させて、ＣＤ６６ｃ抗原陽性であるＡ５４９細胞表面に結合することを示す結果である。
【図２ａ】９６種のヒト化組換え抗体の中から１次選定された８種のヒト化組換え抗体に対するＨＰＬＣ分析結果であって、各抗体別に左側ＯＤ２２０ｎｍ、右側ＯＤ２８０ｎｍ分析した結果を示している。抗体の凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）および切片などの抗体由来不純物を含むか否かを示す結果である。
【図２ｂ】９６種のヒト化組換え抗体の中から１次選定された８種のヒト化組換え抗体に対するＨＰＬＣ分析結果であって、各抗体別に左側ＯＤ２２０ｎｍ、右側ＯＤ２８０ｎｍ分析した結果を示している。抗体の凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）および切片などの抗体由来不純物を含むか否かを示す結果である。
【図２ｃ】９６種のヒト化組換え抗体の中から１次選定された８種のヒト化組換え抗体に対するＨＰＬＣ分析結果であって、各抗体別に左側ＯＤ２２０ｎｍ、右側ＯＤ２８０ｎｍ分析した結果を示している。抗体の凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）および切片などの抗体由来不純物を含むか否かを示す結果である。
【図３ａ】９６種のヒト化組換え抗体の中から１次選定された８種のヒト化組換え抗体に対するＣＤ６６ｃ抗原陽性細胞表面結合を確認した結果であって、キメラ抗体と比較して類似した程度の細胞表面結合を示す。
【図３ｂ】９６種のヒト化組換え抗体の中から１次選定された８種のヒト化組換え抗体に対するＣＤ６６ｃ抗原陽性細胞表面結合を確認した結果であって、キメラ抗体と比較して類似した程度の細胞表面結合を示す。
【図３ｃ】９６種のヒト化組換え抗体の中から１次選定された８種のヒト化組換え抗体に対するＣＤ６６ｃ抗原陽性細胞表面結合を確認した結果であって、キメラ抗体と比較して類似した程度の細胞表面結合を示す。
【図３ｄ】９６種のヒト化組換え抗体の中から１次選定された８種のヒト化組換え抗体に対するＣＤ６６ｃ抗原陽性細胞表面結合を確認した結果であって、キメラ抗体と比較して類似した程度の細胞表面結合を示す。
【図３ｅ】９６種のヒト化組換え抗体の中から１次選定された８種のヒト化組換え抗体に対するＣＤ６６ｃ抗原陽性細胞表面結合を確認した結果であって、キメラ抗体と比較して類似した程度の細胞表面結合を示す。
【図４ａ】９６種のヒト化組換え抗体の中から選定された５種のヒト化組換え抗体に対するＣＤ６６ｃ抗原に対する結合力をＥＬＩＳＡ通じて確認した結果であって、図４ａはＣＥＣＡＣＡＭ６（ＣＤ６６ｃ）抗原に対する結果であり、図４ｂはＣＥＡＣＡＭ１（ＣＤ６６ａ）抗原に対する結果である。
【図４ｂ】９６種のヒト化組換え抗体の中から選定された５種のヒト化組換え抗体に対するＣＤ６６ｃ抗原に対する結合力をＥＬＩＳＡ通じて確認した結果であって、図４ａはＣＥＣＡＣＡＭ６（ＣＤ６６ｃ）抗原に対する結果であり、図４ｂはＣＥＡＣＡＭ１（ＣＤ６６ａ）抗原に対する結果である。
【図５ａ】９６種のヒト化組換え抗体の中から選定された５種のヒト化組換え抗体に対する苛酷温度条件での抗体安定性を確認した結果である。
【図５ｂ】９６種のヒト化組換え抗体の中から選定された５種のヒト化組換え抗体に対する苛酷温度条件での抗体安定性を確認した結果である。
【図６ａ】ＣＨＯで発現させたヒト化組換え抗体のＣＤ６６ｃ抗原陽性細胞Ａ５４９の細胞表面結合を示す結果である。
【図６ｂ】ＣＨＯで発現させたヒト化組換え抗体のＣＤ６６ｃ抗原陽性細胞Ａ５４９の細胞表面結合を示す結果である。
【図６ｃ】ＣＨＯで発現させたヒト化組換え抗体のＣＤ６６ｃ抗原陽性細胞Ａ５４９の細胞表面結合を示す結果である。
【図６ｄ】ＣＨＯで発現させたヒト化組換え抗体のＣＤ６６ｃ抗原陽性細胞Ａ５４９の細胞表面結合を示す結果である。
【図７】上段はＭＤＳＣ分析方法に対する理解を助けるための模式図であって、点図表（ｄｏｔ  ｐｌｏｔ）で細胞の大きさによりリンパ球を除いて単核球と顆粒球領域のみを指定した後に、ＨＬＡ−ＤＲの発現がないかまたは低い群を選択し、その群よりＣＤ１１ｂとＣＤ３３に陽性であるグループをＭＤＳＣで特定した点図表模式図であり、下段は指定されたＭＤＳＣ群よりＤＮＰ００２の陽性率を確認した結果である。
【図８】ＤＮＰ００２処理後、ＭＤＳＣ死滅効果を分析した代表的な結果であって、脱フコースＤＮＰ００２によりＭＤＳＣが顕著に減少したことを示す。ＣＤ６６ｂは多核球性（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ）ＭＤＳＣで発現するが、単核球性（ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ）ＭＤＳＣで発現しないため、ＭＤＳＣ亜型区分に使用する。図８で特定のＭＤＳＣの大部分はＣＤ６６ｂ陽性であるため、多核球性ＭＤＳＣと区分でき、ＤＮＰ００２処理により多核球性ＭＤＳＣが顕著に減少した。
【図９】５人の患者で脱フコースＤＮＰ００２処理後、ＭＤＳＣ死滅効果を分析したものであって、５人の患者の全てでＤＮＰ００２によりＭＤＳＣ群の数が対照群と比較して減少することを百分率で比較して示す結果として、グラフで横軸に記載されたＰ＃１はｐａｔｉｅｎｔ’ｓ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ＃１を意味し、縦軸は相対的なＭＤＳＣ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ％変化を意味する。
【図１０】胃癌患者の血液で分離されたＰＢＭＣにＤＮＰ００２抗体を処理した後、ＭＤＳＣ死滅効果をフローサイトメーターを用いて分析した結果を示す。
【図１１ａ】ＤＮＰ００２のｉｓｏｔｙｐｅによるＭＤＳＣ死滅効果を比較した結果であって、脱フコース（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ＩｇＧ１タイプのＤＮＰ００２が血液内ＭＤＳＣ死滅を最も効果的に誘発する現像を確認した結果である。
【図１１ｂ】５人の胃癌患者でＤＮＰ００２のｉｓｏｔｙｐｅによるＭＤＳＣ死滅効果を比較した結果であって、患者の全てで脱フコース（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ＩｇＧ１タイプのＤＮＰ００２が血液内ＭＤＳＣ死滅を最も高く示したことを対照群と比較して百分率で比較して示す結果として、グラフで横軸に記載されたＰ＃１はｐａｔｉｅｎｔ’ｓ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ＃１を意味し、縦軸は相対的なＭＤＳＣ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ％変化を意味する。
【図１２ａ】ＤＮＰ００２のターゲット抗原であるＣＥＡＣＡＭ６が陽性である胃癌細胞株Ａ５４９と膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ−１にＤＮＰ００２抗体単独、ＮＫ細胞単独、およびＤＮＰ００２抗体とＮＫ細胞の併用条件で分析した細胞死滅効果に対する結果である。
【図１２ｂ】ＤＮＰ００２のターゲット抗原であるＣＥＡＣＡＭ６が陽性である胃癌細胞株Ａ５４９と膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ−１にＤＮＰ００２抗体単独、ＮＫ細胞単独、およびＤＮＰ００２抗体とＮＫ細胞の併用条件で分析した細胞死滅効果に対する結果である。
【図１３】癌細胞でＣＥＡＣＡＭ６が陽性である肺腺癌（ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）と癌細胞自体ではＣＥＡＣＡＭ６が陰性である扁平上皮癌（ｌｕｎｇ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、泌尿器系（Ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）および皮膚癌（Ｍｅｌａｎｏｍａ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）組織にＣＥＡＣＡＭ６免疫染色した結果、癌組織の非腫瘍部位にＣＥＡＣＡＭ６陽性であるＭＤＳＣがあることを確認した写真である。
【実施例】
【００９６】
下記の実施例を挙げて本発明をより詳しく説明するが、発明の権利範囲が下記の実施例に限定されるのではない。
【００９７】
＜実施例１＞抗−ＣＤ６６ｃキメラ抗体の製造
１．１．  抗−ＣＤ６６ｃ抗体遺伝子配列クローニング
８Ｆ５抗体遺伝子は、Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．＃：６９８３１）を用いてクローニングした。８Ｆ５ハイブリードマから分離したＲＮＡからＭｏｕｓｅ  Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔを用いてＰＣＲを行い、これをｐＧｅｍ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．＃：Ａ３６００）に挿入した後、シーケンシングを通じてＤＮＡ塩基配列を確認し、ＩＭＧＴ  ｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を通じてマウス抗体遺伝子を確認した。分析された８Ｆ５抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列は次の通りである。
【００９８】
【表４】
2021523193.tif 000007
【００９９】
１−２．キメラ抗体製造
前記製作された抗−ＣＤ６６ｃマウス抗体８Ｆ５のアミノ酸配列に基づいて、抗−ＣＤ６６ｃキメラ抗体を製作した。
【０１００】
１−２−１．  プラスミド製作
抗−ＣＤ６６ｃキメラ抗体の発現のために、重鎖発現用プラスミドと軽鎖発現用プラスミドをそれぞれ製作した。軽鎖発現用プラスミドはｐＯｐｔｉＶＥＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ベクターを使用し、重鎖発現用プラスミドはｐｃＤＮＡ３．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ベクターを使用した。
【０１０１】
追加的なアミノ酸挿入なく抗体それぞれの可変領域コーディングｃＤＮＡと不変領域コーディングｃＤＮＡを連続的なアミノ酸配列として発現されるようにするために、前記クローニングした可変領域のコーディング塩基配列と知られたヒト（ｈｕｍａｎ）ＩｇＧ１不変領域（重鎖）およびカッパ（ｋａｐｐａ）不変領域（軽鎖）コーディング塩基配列を連結した遺伝子切片のそれぞれを合成（Ｂｉｏｎｅｅｒ社）した。このように合成した重鎖および軽鎖発現遺伝子は制限酵素Ｘｈｏ  ＩとＳａｌ  Ｉに切断した後、軽鎖遺伝子切片はｐＯｐｔｉＶｅｃベクターに、重鎖遺伝子切片はｐｃＤＮＡ３．３ベクターにそれぞれライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）して完全な抗体発現用プラスミドを製作した（ｐｃＤＮＡ３．３−ａｎｔｉ−ＣＤ６６ｃ重鎖発現プラスミドおよびｐＯｐｔｉＶＥＣ−ａｎｔｉ−ＣＤ６６ｃ軽鎖発現プラスミド）。
【０１０２】
１−２−２．  形質転換
前記製作されたｐｃＤＮＡ３．３−ａｎｔｉ−ＣＤ６６ｃ重鎖発現プラスミドとｐＯｐｔｉＶＥＣ−ａｎｔｉ−ＣＤ６６ｃ軽鎖発現プラスミドをＣＨＯ細胞由来のＤＧ４４細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させて形質転換過程を行った。
【０１０３】
先ず、トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）３日前に浮遊状態のＤＧ４４細胞を５％ＦＢＳが含まれているＭＥＭａ培地に適応させることによって付着状態細胞に変換させて形質転換効率を高めることができるように適応させた。形質転換はＶｉａＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．＃：Ｅ４９８１）を使用して６ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）で行った。形質転換一日前に１Ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で継代培養して付着状態で適応されたＤＧ４４細胞を準備し、形質転換に使用されたＤＮＡの量はｐｃＤＮＡ３．３−ａｎｔｉ−ＣＤ６６ｃ重鎖発現プラスミドとｐＯｐｔｉＶＥＣ−ａｎｔｉ−ＣＤ６６ｃ軽鎖発現プラスミドそれぞれ２ｕｇ、１．５ｕｇずつ１．５：１比率の組み合わせで使用した。形質転換は４８時間行った。形質転換された細胞群を分析するためにフローサイトメーター（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いた。図１のようにキメラ抗体の発現はＡ５４９非小細胞肺癌細胞株で確認した。図１は、マウス８Ｆ５抗体から抗体遺伝子をクローニングしてキメラ組換え抗体で発現させて、ＣＤ６６ｃ抗原陽性であるＡ５４９細胞表面に結合することを示す結果である。
【０１０４】
＜実施例２＞ヒト化抗−ＣＤ６６ｃ単クローン抗体の製作
２．１  Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎによる組換え抗体配列選定
マウスＣＤ６６ｃ抗体、８Ｆ５（重鎖アミノ酸配列：７重鎖コーディングＤＮＡ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２；軽鎖アミノ酸配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；軽鎖コーディングＤＮＡ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）の重鎖、軽鎖それぞれのＣＤＲ部位配列（ＣＤＲＨ１：ＡＳＧＹＳＦＴＤＹＴＭＮ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＣＤＲＨ２：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＬＩＮＰＦＨＧＧＴＶＳＮＱＲＦＫＶ）；ＣＤＲＨ３：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＶＲＧＤＰＶＲＨＹＹＡＬＡＹ）；ＣＤＲＬ１：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ＧＡＳＥＮＶＹＧＴＬ）；ＣＤＲＬ２：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（ＧＡＴＮＬＡＤ）；ＣＤＲＬ３：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（ＶＡＴＹＹＣＱＮＶＬＳＡＰＹＴ）をできるだけ類似するように維持して抗原結合力が同等であるか優れていれば、ヒト抗体遺伝子をコーディングしている生殖細胞系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）の配列を基盤にしてフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）に対する部位配列を組換えたヒト化抗体配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ方法で選別した。マウスＣＤ６６ｃ抗体８Ｆ５の重鎖、軽鎖のそれぞれ配列と最も類似性が高くてヒト化組換え抗体配列の主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）で使用したヒト抗体生殖細胞系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子は下表５の通りである。前記マウスＣＤ６６ｃ抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列と核酸配列、そして重鎖可変領域と軽鎖可変領域のＣＤＲ配列を下記表６に示す。
【０１０５】
【表５】
2021523193.tif 000008
【０１０６】
前記ヒト抗体生殖細胞系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子配列を用いて選定したヒト化８Ｆ５抗体配列として、重鎖可変領域１２種、軽鎖可変領域８種を選別し、当該配列は下表３の通りであり、前記選別されたヒト化抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列、ＣＤＲ配列およびフレームワーク配列を下記表６〜表８に示し、キメラ抗体とヒト化抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表１に示した。マウス抗体とヒト化抗体は、重鎖ＣＤＲ３と軽鎖ＣＤＲ２配列が同一であることが好ましい。下記表６で太字および下線で表示した部分はＣＤＲ抗体配列である。表７で太字および下線で表示した部分は変更されたアミノ酸を示す。
【０１０７】
【表６】
2021523193.tif 000009
2021523193.tif 000010
【０１０８】
【表７】
2021523193.tif 000011
【０１０９】
【表８】
2021523193.tif 000012
【０１１０】
２．２ヒト化組換え抗体の発現および分析
選別された抗体配列は、それぞれヒトＩｇＧ１重鎖不変領域とカッパ（ｋａｐｐａ）軽鎖不変領域と連結してヒトＩｇＧ１形態に２９３Ｔ細胞で発現させた。トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、７日後に培養液はＫａｎＣａｐ  Ａ  ｒｅｓｉｎ（Ｋａｎｅｃａ社）を用いてヒト化組換え抗体を精製した。
【０１１１】
精製した抗体はＯＤ２８０ｎｍ測定で定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。また、Ｓｅｐａｘ  Ｚｅｎｉｘ−Ｃ  ＳＥＣ−３００  ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｓｅｐａｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）でＨＰＬＣを行って２８０ｎｍと２２０ｎｍで分析することによって、抗体の純度および凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）の有無を分析した（図２ａ〜図２ｃ）
【０１１２】
２．３  ヒト化組換え抗体の細胞結合および抗原結合分析
２−３−１  細胞結合分析
発現させた９６種のヒト化組換え抗体をそれぞれ同量（１ｕｇ）をＣＤ６６ｃ陽性細胞であるＡ５４９非小細胞肺癌細胞株が入っている試験管に入れて４℃で３０分間反応させた後にＰＢＳで水洗し、ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（ＤｉＮｏｎａ  Ｉｎｃ、Ｋｏｒｅａ）を入れて４℃で１５分間反応した。再びＰＢＳで水洗した後、フローサイトメーター（Ｓｔｒａｔｅｄｉｇｍ、Ｓ１０００ＥＸｉ）で分析してその結果を下記に記載した。
【０１１３】
９６種のヒト化組換え抗体候補の中から発現程度と凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）の有無、細胞結合程度を基準にして８種を一次選定した（表９および表１０、図３ａ〜図３ｅ）。下記表９および表１０は１次選定された抗ＣＤ６６ｃヒト化抗体およびキメラ８Ｆ５の分析結果であって、表１０はフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）の分析結果を示す。
【０１１４】
【表９】
2021523193.tif 000013
【０１１５】
【表１０】
2021523193.tif 000014
【０１１６】
前記選定された８種の抗体は発現程度と凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）有無、細胞結合程度を表９に示し、具体的に１次選定された８種抗体に対する発現程度と分子量を整理したものである。また、表１０のフローサイトメトリー結果をみると、８種のヒト化組換え抗体がキメラ抗体と比較して±２０％の細胞結合力を示してキメラ抗体と非常に類似した細胞結合力を示すことを確認した。これによって９６種のヒト化候補抗体の中から発現が正常に行われ、蛋白質自体の不安定性により形成される凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が少なく、またターゲット抗原陽性の細胞に結合する能力がキメラ抗体と類似したヒト化抗体８種を１次選別した。
【０１１７】
特に細胞株結合力は数値上では差があるように見えるが、図３のように実際細胞結合様相はキメラ抗体と類似した水準であって、抗体陽性率（％ｇａｔｅｄ）と蛍光平均値（ｍｅａｎ）をかけ、これをキメラ抗体と相対比較して±２０％範囲内に含まれる８種を選別したものであり、通常ヒト化抗体生成時、ヒト化抗体のフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）にマウス抗体ＣＤＲ部位配列を挿入した時に元の蛋白質構造の変更で抗体結合力が急激に低下するという結果を考慮した時、非常に優れたヒト化抗体を選別したと言える。
【０１１８】
２−３−２  抗原結合分析
前記のように選定した８種のヒト化組換え抗体の中から、キメラ抗体に比べて細胞結合力を基準にして高い結合力を示す５種類のヒト化組換え抗体を選択し、これらをＥＬＩＳＡ方法でＣＤ６６ｃ抗原および類似ＣＤ６６抗原に対する結合力分析を実施した。
【０１１９】
【表１１】
2021523193.tif 000015
【０１２０】
ＣＤ６６ｃ（ＣＥＡＣＡＭ６；ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）とＣＥＡＣＡＭ１抗原（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）にウェル当たり１００ｎｇずつコーティングした後、ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。一次抗体量は１０ｕｇ／ｍｌから３倍ずつ希釈して３７℃温度で１時間結合させ、二次抗体としてｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｉｇ−ＨＲＰ接合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を１：１００００で希釈して３７℃温度で３０分間結合させた。各段階の間は３回ずつ水洗過程を経てＴＭＢ反応した。１Ｎ    Ｈ２ＳＯ４溶液でＴＭＢ溶液と同量（１００ｕｌ）処理して反応中止した後、４５０ｎｍでＯＤ値を測定した。
【０１２１】
前記実験結果として９６種のヒト化組換え抗体の中から選定された５種のヒト化組換え抗体に対するＣＤ６６ｃ抗原に対する結合力を図４ａ、表１２および図４ｂ、表１３に示し、図４ａと表１２はＣＥＣＡＣＡＭ６（ＣＤ６６ｃ）抗原に対する結果であり、図４ｂと表１３はＣＥＡＣＡＭ１（ＣＤ６６ａ）抗原に対する結果である。
【０１２２】
図４ａ、表１２および図４ｂ、表１３の抗原に対する結合力結果から、ＣＥＡＣＡＭ６に対しては全ての抗体がキメラ抗体と類似した結合様相を示し、ＣＥＡＣＡＭ１に対しては弱い結合と結合しないグループに両分された。
【０１２３】
【表１２】
2021523193.tif 000016
【０１２４】
【表１３】
2021523193.tif 000017
【０１２５】
２．４ヒト化組換え抗体の安定性分析
前記抗原および細胞結合様相を通じて選定した、前記実施例３．３の５種のヒト化組換え抗体を高い温度条件に放置して抗体の安定性を分析する実験を行った。
【０１２６】
安定性測定は８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（８−ａｎｉｌｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（以下、ＡＮＳ；Ｓｉｇｍａ社）を用いた結合実験を通じて確認した。ＡＮＳは、蛋白質変性時に露出される疎水性部位に結合する時とそうではない時との蛍光波長が異なるため、このような波長変化を測定することによって蛋白質の変性有無を確認することができる化合物である。
【０１２７】
ヒト化組換え抗体をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）を用いて０．２ｍｇ／ｍｌ濃度に全て合わせた後、苛酷条件として５０℃温度で４時間放置した。０．２ｍｇ／ｍｌのＡＮＳ溶液を、測定するための抗体希釈液５００ｕｌ当たり２０ｕｌ入れて混合した後、５分後に蛍光リーダーで励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）、４６０ｎｍ蛍光（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）条件で分析した。追加的に７０℃温度で３０分間さらに放置した条件でもＡＮＳ試薬反応を測定した。
【０１２８】
前記表１１に示す５種のヒト化組換え抗体に対する苛酷温度条件での抗体安定性を確認した結果を図５ａおよび図５ｂに示した。つまり、苛酷条件として５０℃温度で４時間抗体を放置した後にＡＮＳ試薬反応性を蛍光で測定し、追加的に７０℃温度で３０分間さらに放置した条件でもＡＮＳ試薬反応を測定した結果を示す。図５ａの実験結果に示したように、５０℃温度で４時間放置条件では５種の抗体の大部分がＡＮＳ反応が微小であったが、７０℃温度で追加３０分放置条件では大部分の抗体の蛍光値が大きく増加した。その中ではｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ：３０５８組換え抗体が最も低い蛍光値増加傾向を示して、５種類の組換えヒト化抗体の中で温度変化に対して最も安定した結果を示した。
【０１２９】
また、ＡＮＳ試薬反応性変化率を測定するために、冷蔵条件（４±２℃）および６２℃温度でそれぞれ４時間放置した後にＡＮＳ試薬反応性を前記と同様な方法で蛍光リーダーで分析した。また、ＡＮＳ試薬に対する抗体の蛍光値変異率は、低温条件（例、４℃）で測定した蛍光値と、高温条件（例、６２℃）で測定した蛍光値との差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を、低温条件で測定した蛍光値で割った値を意味する。
【０１３０】
［数式］
蛍光値変異率＝（高温条件で測定した蛍光値−低温条件で測定した蛍光値）／（低温条件で測定した蛍光値）
【０１３１】
図５ｂのように苛酷条件の温度（５０℃）で温度をさらに上げた６２℃温度で４時間放置後、ＡＮＳ試薬反応性を確認した。５種が組換えヒト化抗体とキメラ抗体の両方とも冷蔵条件ではＡＮＳ反応値が微小であったが、温度を上昇することによってＡＮＳ蛍光値が増加した。しかし、キメラ８Ｆ５は６２℃温度条件保管実験によりＡＮＳ試薬反応性が１，４０６％まで増加し、同時に沈殿物が発生して不安定な結果を示した。しかし、ヒト化抗体５種はキメラ抗体よりＡＮＳ試薬反応性変化が顕著に低く測定され、沈殿物が発生しなかった。特に、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  ３０１９ヒト化抗体とＰｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  ３０５８ヒト化抗体は、それぞれ１１４％、１３３％にＡＮＳ反応性の変化が測定されて最も安定な抗体と評価された。ＡＮＳ試薬反応性が大きくなるという意味は蛋白質構造上内側に配置されていた疎水性アミノ酸の露出が増加するという意味であり、これは蛋白質構造の変性とこれによる蛋白質凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、つまり、沈殿物生成の原因になる。本発明によるヒト化抗体は、ＡＮＳ反応性変異％が２００％未満で安定な抗体であり、２００％未満は変化が非常に微小であると見なされ、それ以上は有意義な蛋白質構造変更が行われてＡＮＳ反応性が観察されたと解釈できる。したがって、本発明によるヒト化抗体は、キメラ抗体に比べて類似した抗原結合力および細胞結合力を有し、抗体蛋白質自体の物理的安定性が増加し、このような事実は治療用抗体のドラッガビリティ（ｄｒｕｇｇａｂｉｌｉｔｙ）の面で非常に優れた特徴と言える。
【０１３２】
２．５  ヒト化組換え抗体のＣＨＯ細胞発現および分析
前記実施例２．３で選定された５種のヒト化組換え抗体を実際大部分の治療用抗体を発現させるために使用するＣＨＯ細胞に発現させて分析した。選定された５種のヒト化組換え抗体を構成するための軽鎖および重鎖可変領域ＤＮＡ配列をコドン最適化過程を経た後、合成してヒトＩｇＧ１不変領域遺伝子とｏｖｅｒｌａｙ  ＰＣＲ方法で連結してＸｈｏＩとＥｃｏＲＩ遺伝子切片でｐｃＤＮＡ３．４ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）にクローニングした。前記表１１は、ＣＨＯ細胞発現のために選別されたヒト化抗体の軽鎖および重鎖組み合わせを示す。
【０１３３】
可変−不変領域遺伝子ＰＣＲのために使用したＤＮＡ  ｐｒｉｍｅｒ配列は下表１４の通りである。
【表１４】
2021523193.tif 000018
【０１３４】
５種のヒト化組換え抗体は、ＥｘｐｉＣＨＯ（ｔｒａｄｅｍａｒｋ）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社；Ｃａｔ．Ｎｏ：Ａ２９１３３）を用いて一過性トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、発現させた抗体は図６ａ〜図６ｃのようにＣＤ６６ｃ陽性細胞であるＡ５４９非小細胞肺癌細胞株に結合させてフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で分析した。５種類のヒト化組換え抗体は全てキメラ抗体と類似した結合力を示した。前記測定したフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）蛍光値をＣＨＯ培養液の抗体発現量で割って、相対的な抗体発現量に対する細胞表面結合力（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）を表示したものを図式化すれば図６ｄの通りであった。したがって、ヒト化組換え抗体は、ＣＨＯ細胞でも適切に発現することを確認した。抗体の細胞表面結合力を求め、これを１００％にして相対的な変化を示したものが図６ｄである。
【０１３５】
＜実施例３＞ＤＮＰ００２抗体のＣＨＯ細胞発現および分析
大部分の治療用抗体を発現させるために使用するＣＨＯ細胞で抗ＣＤ６６ｃに対するヒト化抗体であるＤＮＰ００２を発現させて分析した。ＤＮＰ００２抗体の亜型による機能差を確認するためにＩｇＧ１タイプとＩｇＧ２タイプの抗体を製造した。
【０１３６】
ヒト化組換え抗体を構成するための軽鎖および重鎖可変領域ＤＮＡ配列をコドン（ｃｏｄｏｎ）最適化過程を経た後、合成してヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２不変領域遺伝子とｏｖｅｒｌａｙＰＣＲ方法で連結し、ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩ遺伝子切片でｐｃＤＮＡ３．４ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）にクローニングした。
【０１３７】
【表１５】
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2021523193.tif 000020
【０１３８】
脱フコース（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ＤＮＰ００２ヒト化抗体を製造するために、ＤＮＰ００２  ＩｇＧ１タイプの抗体発現時、２Ｆ−ＰＦ（２Ｆ−Ｐｅｒａｃｅｔｙｌ−Ｆｕｃｏｓｅ；Ｍｅｒｃｋ、Ｃａｔ＃：３４４８２７）を培養液に５０ｕＭで投与して培養し、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  ｓｕｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ＃：１１００３４９４）使用して精製した。精製した抗体はリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で透析し、２８０ｎｍ吸光値を吸光係数１．４で割って“ｍｇ／ｍＬ”濃度単位に変換し、その後、試験に使用した。
【０１３９】
脱フコース化はフコースに結合特性があるＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ＃：Ｂ−１０４５）反応性を相対的に比較して評価した。フコースが結合されているＩｇＧ１  ＤＮＰ００２は、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎと反応し、ＳＡ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃：０１６−０３０−０８４）によりＴＭＢ発色を誘導したが、脱フコース化ＤＮＰ００２は相対的な発色が微小であった（表１６）。
【０１４０】
【表１６】
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【０１４１】
＜実施例４＞ＭＤＳＣでＤＮＰ００２抗体の反応性調査
ＭＤＳＣに対するＤＮＰ００２抗体の反応性をフローサイトメトリー分析（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を通じて確認した。
【０１４２】
具体的に胃癌患者の血液を準備した後、各蛍光が異なって結合されたＭＤＳＣの標識抗原に対する抗体（抗−ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ、ＣＤ１１ｂ−ＰＥ、ＣＤ３３−ＰＥ抗体）と共に、ＡＰＣが結合されたＤＮＰ００２抗体を全血１００ｕＬに添加して２０分間４℃で反応させた。赤血球溶解バッファー１Ｘ  ＲＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ＃：００−４３３３−５７）５ｍｌを添加して室温で３０分間反応させた後、遠心分離して分解されたＲＢＣを除去し、再びＰＢＳで水洗した後、フローサイトメトリー分析を施行した。染色強度は蛍光強度に対するｌｏｇで測定し、１０乗単位で表示した。
【０１４３】
結果分析は、点図表（ｄｏｔ  ｐｌｏｔ）で細胞の大きさによりリンパ球を除いて単核球と顆粒球領域のみを指定した後、ＨＬＡ−ＤＲの発現がないかまたは低い群を選択し、その群でＣＤ１１ｂとＣＤ３３に陽性であるグループをＭＤＳＣと指定した。指定されたＭＤＳＣ群でＤＮＰ００２の陽性率を確認した（図７）。
【０１４４】
具体的に、図７で上段に示すグラフの中で左側から右側方向に、１）ＦＳＣおよびＳＳＣ点図表（ｄｏｔ  ｐｌｏｔ）でｍｏｎｏｃｙｔｅｓとｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓのみを区画化（ｇａｔｉｎｇ）、つまり、ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓを除外。（ＦＳＣ：ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ、分析する細胞のサイズを示す変数、ＳＳＣ：ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ、分析する細胞のｇｒａｎｕｌａｒｉｔｙを示す変数として、細胞内ｇｒａｎｕｌｅがある程度を示す変数）であり、２）ＨＬＡ−ＤＲ  Ｌｏｗあるいは（−）グループを区画化したものであり、３）前記１番、２番区画化の中でＣＤ１１ｂとＣＤ３３が陽性であるグループがＭＤＳＣである。ＤＮＰ００２陽性であるＭＤＳＣは９０．９％（図７の右側点図表（ｄｏｔ  ｐｌｏｔ）内で右上部位）であり、ＤＮＰ００２陰性であるＭＤＳＣは４．４％（図７の右側点図表（ｄｏｔ  ｐｌｏｔ）内で左上部位）である。ＭＤＳＣは単核球性ＭＤＣＳと多核球性（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ）ＭＤＳＣに亜型に区分され、多核球性ＭＤＳＣはＣＤ６６ｂを発現するが、単核球性ＭＤＣＳはＣＤ６６ｂを発現せず、ＭＤＳＣ亜型区分にＣＤ６６ｂ発現有無は有用に使用することができる。
【０１４５】
図７は、ＭＤＳＣを特定する方法（リンパ球除外、ＨＬＡ−ＤＲ  Ｌｏｗ／（−）、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ３３＋）と特定のＭＤＳＣでＤＮＰ００２（ａｎｔｉ−ＣＤ６６ｃ）が反応していることを証明する結果である。ＭＤＳＣにＤＮＰ００２が結合するため、ＭＤＳＣ特定する方法でＤＮＰ００２を使用することができ（図７）、ＤＮＰ００２はＡＤＣＣ効果を誘発してＭＤＳＣを除去することができる（図８）。下記試験結果でＤＮＰ００２が結合したＭＤＳＣは９０．９％である。
【０１４６】
図８は、ＣＤ６６ｂ陽性である多核球性ＭＤＳＣがＤＮＰ００２処理により殺傷され、その比率が減少した現像を示す。図８で上段（ｃｏｎｔｒｏｌ）の点図表はＤＮＰ００２を処理する前の試料であり、下段（ＤＮＰ００２）はＤＮＰ００２処理後にＭＤＳＣが減少した結果である。ＣＤ６６ｂは単核球性（ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ）ＭＤＳＣと多核球性（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ）ＭＤＳＣを区分できるマーカである。下記試験結果で大部分のＭＤＳＣはＣＤ６６ｂ陽性である多核球性ＭＤＳＣであり、多核球性ＭＤＳＣがＤＮＰ００２により効果的に殺傷された。
【０１４７】
胃癌患者１９人の血液を分析した結果、全体ＰＢＭＣ内ＭＤＳＣ上のＤＮＰ００２の陽性率は平均３４．３〜７６．７％に示され、平均５５．１％の陽性率を示した。下記表１７は、１９人の胃癌患者サンプルをもってＤＮＰ００２抗体のＭＤＳＣ反応性を分析したものである。
【０１４８】
【表１７】
2021523193.tif 000022
【０１４９】
＜実施例５＞ＤＮＰ００２によるＭＤＳＣ溶解効果
５．１．全体血液細胞（ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ）内ＤＮＰ００２によるＭＤＳＣ溶解効果
ＤＮＰ００２によるＭＤＳＣ殺害効果を確認するために５人の胃癌患者血液に赤血球溶解バッファー１Ｘ  ＲＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ＃：００−４３３３−５７）を添加して赤血球を溶解させた後、１２ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）にウェル当たり１Ｘ１０５ずつ分注して準備した。ＤＮＰ００２抗体を各ウェルに１０ｕｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃インキュベータで一日培養した。培養後、ＰＢＳで洗浄し、各蛍光が異なって結合されたＭＤＳＣ標識抗原に対する抗体（抗ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３抗体）と２０分間４℃で反応させた。ＰＢＳで水洗した後、フローサイトメトリー分析を施行した。染色強度は蛍光強度に対するｌｏｇで測定し、１０乗単位で表示した。
【０１５０】
前記実験結果として、図８は、ＤＮＰ００２抗体が血液内ＭＤＳＣの細胞死滅を効果的に誘導してＤＮＰ００２抗体処理前に比べてＭＤＳＣ比率が顕著に減少した代表的な結果を示す。図９は、図８と同一の試験を５人の胃癌患者血液試料でそれぞれ試験して図表化した結果である。Ｏｐｅｎ  ｂａｒはＤＮＰ００２処理前のＭＤＳＣ比率を意味し、ｃｌｏｓｅｄ  ｂａｒはＤＮＰ００２処理後のＭＤＳＣの相対的比率を意味する。ＤＮＰ００２処理後に５人の患者試料の全てでＭＤＳＣ比率が明白に減少したことを確認できる。
【０１５１】
５．２．ＰＢＭＣ（末梢血液単核細胞）内ＤＮＰ００２によるＭＤＳＣ溶解効果
ＤＮＰ００２抗体のＭＤＳＣターゲット殺害能力をより明確にするために、成熟した好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）を除いてＭＤＳＣのみを得て、好中球による影響なくＤＮＰ００２抗体のＭＤＳＣ死滅効果を確認した。
【０１５２】
具体的に、２人の胃癌患者血液をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ｇｅ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃：１７−１４４０−０２）溶液を用いてＭＤＳＣが含まれているＰＢＭＣ層のみを分離した。このようなＦｉｃｏｌｌ溶液を通じた血液細胞の比重分離は効果的に成熟好中球を除外させてより正確なＭＤＳＣ死滅効果を確認できるようにする。準備されたＰＢＭＣは１２ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）にウェル当たり１Ｘ１０５ずつ分注し、ＤＮＰ００２抗体を各ウェルに１０μｇ／ｍＬになるように添加して３７℃インキュベータで４８時間培養した。この時、ＰＤ−１に対する抗体であるＮｉｖｏｌｕｍａｂ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）を対照群として用いてＭＤＳＣ殺害能を比較した。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリー分析を通じてＭＤＳＣ群の増減を確認した（図１０）。
【０１５３】
フローサイトメトリー分析結果、ＤＮＰ００２を処理した群はそうではない群と比較して平均約４９％の細胞死滅効果を示した。反面、対照群として用いたＮｉｖｏｌｕｍａｂは約２４％のＭＤＳＣ死滅効果を示すにとどまった。ＭＤＳＣ死滅効果は２人の患者から分離したＭＤＳＣの全てで同一に示された。したがって、本実験を通じてＤＮＰ００２抗体によるＭＤＳＣ殺傷効果が相当であることを確認できる。
【０１５４】
ＤＮＰ００２によるＭＤＳＣの溶解効果を全血（実施例５．１）とＰＢＭＣ（末梢血液単核細胞；実施例５．２）のそれぞれに対して確認した。全血およびＰＢＭＣにはＡＤＣＣを誘発できる患者本人のＮＫ細胞があり、ＤＮＰ００２を媒介としてＣＥＡＣＡＭ６陽性である細胞をＡＤＣＣで溶解することができる。しかし、全血にはＣＥＡＣＡＭ６ターゲット抗原が陽性である好中球とＭＤＳＣが混合されており、ＭＤＳＣのみを選択的に溶解したとみることは難しい。ＤＮＰ００２によるＭＤＳＣの選択的な溶解を明確にするために、好中球を遠心分離で層分離させてなくしたＰＢＭＣを対象として追加実験した（実施例５．２）。そこで、ＤＮＰ００２によるＭＤＳＣ溶解が明確であることを確認した。
【０１５５】
＜実施例６＞抗体ｉｓｏｔｙｐｅによるＭＤＳＣ溶解効果
ＤＮＰ００２抗体のＭＤＳＣターゲット殺害能力を確認するために３つの類型のＤＮＰ００２抗体製剤を準備した。抗体はｉｓｏｔｙｐｅによりＮＫ細胞に発現したＦｃｒＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の親和度に差が発生し、親和度に比例して抗体依存性細胞介在性細胞毒性（ＡＤＣＣ）が増加する。ＩｇＧ２  ｉｓｏｔｙｐｅはＦｃｒＲＩＩＩに対する親和度が非常に低いため、ＡＤＣＣ効能がない反面、ＩｇＧ１  ｉｓｏｔｙｐｅはＦｃｒＲＩＩＩに対する親和度が高いため、ＡＤＣＣ効能に優れている。抗体のＡＤＣＣ効能はｉｓｏｔｙｐｅだけでなく、抗体２９７番目アスパラギンアミノ酸に連結された糖鎖構造により変わるとみており、特に糖鎖にフコースがない場合、ＡＤＣＣ効能が増加する（Ｓｈｉｔａｒａ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｈｔｏｄｓ．  ２００５  Ｎｏｖ  ３０；３０６（１−２）  ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｆｕｃｏｓｅ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｆｒｏｍ  Ａｓｎ２９７−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）。
【０１５６】
ＤＮＰ００２抗体のｉｓｏｔｙｐｅおよび脱フコースによるＭＤＳＣターゲット殺傷能力を確認するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を行った。５人の胃癌患者血液に赤血球溶解バッファー１Ｘ  ＲＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ＃：００−４３３３−５７）を添加してＲＢＣ溶解した後、１２ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）にウェル当たり１Ｘ１０５ずつ分注して準備した。ＤＮＰ００２  ＩｇＧ１タイプとＩｇＧ２タイプおよび脱フコース（ａｆｌｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ＩｇＧ１タイプの３種類の抗体をそれぞれウェルに１０ｕｇ／ｍＬになるように添加して３７℃インキュベータで一晩培養した。培養後、ＰＢＳで洗浄し、各蛍光が異なって結合されたＭＤＳＣ標識抗原に対する抗体（抗ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３抗体）と２０分間４℃で反応させた。ＰＢＳで水洗した後、フローサイトメトリー分析を施行した。染色強度は蛍光強度に対するｌｏｇで測定し、１０乗単位で表示した。
【０１５７】
試験対象である胃癌患者５人の全てでＩｇＧ２、ＩｇＧ１、脱フコース（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ＩｇＧ１タイプの順にＭＤＳＣ死滅効果が増加することと観察された（図１１ａ、１１ｂ）。Ｉｓｏｔｙｐｅと脱フコース（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ、フコース含有量が１０％以下）によりＭＤＳＣ死滅効果に差が発生することは抗体とＦｃｒＲＩＩＩ間の親和度による差と判断され、ＮＫ細胞によるＡＤＣＣ効果によりＭＤＳＣが殺傷されたと理解できる。
【０１５８】
図１１ａに示したように、ＭＤＳＣを効果的に除去できるＤＮＰ００２製剤類型を確認した代表的な試験結果である。上段（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較してＤＮＰ００２  ＩｇＧ２は相当部分のＭＤＳＣが残存しているが、ＤＮＰ００２  ＩｇＧ１はＭＤＳＣ比率を顕著に減少させた。本試験でＤＮＰ００２  ＩｇＧ１によるＭＤＳＣ殺傷効果が相当であるが、ＩｇＧ２による殺傷効果は微小であることを確認でき、ＩｇＧ２  ｉｓｏｔｙｐｅはＡＤＣＣ効能がＩｇＧ１  ｉｓｏｔｙｐｅに比べてないか／非常に低いため、ＤＮＰ００２  ＩｇＧ１によるＭＤＳＣ殺傷効果はＡＤＣＣによると推論することができる。
【０１５９】
図１１ｂに示したように、図９と同一の試験を５人の胃癌患者血液試料で試験して図表化した結果であり、グラフの横軸は５人の胃癌患者のそれぞれを示す（Ｐ＃１、Ｐ＃２、Ｐ＃３、Ｐ＃４、Ｐ＃５）。Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１−ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄの順にＭＤＳＣ殺傷効果が観察された。ＩｇＧ２  ｉｓｏｔｙｐｅはＡＤＣＣ機能がないため、ＭＤＳＣ殺傷効果がないかまたは微小であるが、ＡＤＣＣ機能があるＩｇＧ１と脱フコース化によりＡＤＣＣ機能を強化したＩｇＧ１−ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄではＭＤＳＣ殺傷効果に優れている。
【０１６０】
＜実施例７＞ＤＮＰ００２とナチュラルキラー細胞の併用による癌細胞死滅効果
ＤＮＰ００２抗体とナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）の併用効果を確認するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を行った。３人の正常血液からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ｇｅ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃：１７−１４４０−０２）溶液を用いてＰＢＭＣを分離した後、ＣＤ５６  ｍｉｃｒｏ  ｂｅａｄ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ＃：１３０−０５０−４０１）を用いてＣＤ５６陽性ナチュラルキラー細胞のみを分離した。図１２ａおよび図１２ｂで横軸はそれぞれ前記ナチュラルキラー細胞の起源である血液の供与者（ｄｏｎｏｒ）３人を意味する。
【０１６１】
９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）にＤＮＰ００２のターゲット抗原であるＣＥＡＣＡＭ６が陽性である胃癌細胞株Ａ５４９と膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ−１をウェル当たり１ｘ１０４ずつ分注して準備した後、先に分離したナチュラルキラー細胞をウェル当たり２ｘ１０５ずつ分注してＤＮＰ００２抗体を１０μｇ／ｍＬになるように処理して３７℃で６時間培養した。
【０１６２】
ＥＺ−ｃｙｔｏｘ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｋｉｔ（Ｄａｅｉｌ  Ｌａｂ）を用いて細胞生存率を測定した結果、２種の癌細胞株の全てでＤＮＰ００２抗体とナチュラルキラー細胞の併用による細胞死滅効果が単独処理時と比較して増加すると確認された（図１２ａおよび図１２ｂ）。
【０１６３】
これはＤＮＰ００２の癌細胞殺害能がナチュラルキラー細胞との併用により相当に増幅したことを示す。これによって、ＣＥＡＣＡＭ６陽性である癌細胞だけでなく、またＣＥＡＣＡＭ６陽性であるＭＤＳＣの効果的な除去のためにＮＫ細胞またはＮＫ細胞治療剤との併用処理が優れることを示す。
【０１６４】
実施例５．２結果のようにＤＮＰ００２によるＭＤＳＣの選択的溶解結果と実施例７のＮＫ細胞またはＮＫ細胞治療剤の併用効果を通じて、ＣＥＡＣＡＭ６陽性である癌細胞およびＣＥＡＣＡＭ６陽性であるＭＤＳＣを全て標的にして除去できることが分かる。実施例５．２と実施例７がそれぞれＭＤＳＣと癌細胞で、他の標的細胞に対してＡＤＣＣを示したが、実際２種類の細胞が共に増加されている癌患者の場合、ＤＮＰ００２で２種類の標的を同時に除去することができ、また癌細胞およびＭＤＳＣ標的を同時除去する効能を倍加するためにＮＫ細胞治療剤との併用が可能であることを示す。
【０１６５】
＜実施例８＞ＣＥＡＣＡＭ６が陰性である癌患者の微細腫瘍環境でＭＤＳＣの検出
ＣＥＡＣＡＭ６抗原は癌細胞だけでなく、ＭＤＳＣにも発現するため、ＤＮＰ００２抗体を用いて癌細胞だけでなく、ＭＤＳＣを検出することができる。これを確認するためにＣＥＡＣＡＭ６抗原が陽性であるか陰性である癌患者組織で癌細胞でなく、ＭＤＳＣが検出されるのかを免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）法で確認した。
【０１６６】
免疫組織化学染色法は次のような方法で行った。キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）に１０分ずつ３回、１００％アルコール（ａｌｃｏｈｏｌ）に１０分ずつ２回、８０％、７０％アルコール（ａｌｃｏｈｏｌ）に５分、３分間脱パラフィン（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎ）し、３次蒸溜水に洗浄する。次いで、０．０３％  Ｈ２Ｏ２で室温で１０分間浸漬してペルオキシダーゼブロッキング（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）後、３次蒸溜水で洗浄する。直ちに１Ｘクエン酸緩衝液（Ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ６．０）にスライドを入れて２０分間沸かして水道水に重湯して徐々に冷ました後、３次蒸溜水で洗浄し、再び１Ｘ  ＰＢＳで一回洗浄後、組織がある部位にＤＮＰ００２のモクローンである８Ｆ５抗体をスライド１枚当たり１５０ｕｌ（１０ｕｇ／ｍｌ）ずつ室温で９０±５分間反応させる。反応後、１Ｘ  ＰＢＳで５分ずつ４回洗浄する。二次抗体をスライド１枚当たり１００ｕｌずつ室温で２０分間反応させ、反応後、１Ｘ  ＰＢＳＴで５分ずつ４回洗浄してＤＡＢクロモゲン（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）をスライド１枚当たり１００ｕｌずつ室温で３分間発色させて水道水に１０分間洗浄する。マイヤーヘマトキシリン（Ｍａｙｅｒ’ｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）をスライド１枚当たり１００ｕｌずつ室温で３分間対比染色して流れる水道水に１０分間洗浄する。次いで、脱水（ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）した後にマウンティング（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）をする。
【０１６７】
癌細胞でＣＥＡＣＡＭ６が陽性である肺腺癌（ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）と癌細胞自体ではＣＥＡＣＡＭ６が陰性である扁平上皮癌（ｌｕｎｇ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、泌尿器系癌（Ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）および皮膚癌（Ｍｅｌａｎｏｍａ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）組織にＣＥＡＣＡＭ６免疫染色した結果、癌組織の非腫瘍部位にＣＥＡＣＡＭ６陽性であるＭＤＳＣがあることを確認した（図１３）。これは癌組織または癌細胞の自体でのＣＥＡＣＡＭ６抗原発現と関係なく癌組織周辺の浸潤されたＭＤＳＣを標的にして診断および治療に活用できることを示す。
【０１６８】
癌細胞の細胞表面のＣＥＡＣＡＭ６陽性度と関係なく、癌患者ではＭＤＳＣが増加する傾向を示し、これは実施例８の結果のように微細腫瘍環境に浸潤されているＭＤＳＣを検出して確認できる。これはＭＤＳＣを選択的に溶解できることを示した実施例５．２の結果と共に考慮した時、癌細胞上のＣＥＡＣＡＭ６陽性度と関係なくＭＤＳＣを標的にして診断および治療目的に使用できることを示す。癌種により癌細胞の細胞表面のＣＥＡＣＡＭ６発現有無が異なり得るが、これと関係なく大部分の癌種でＭＤＳＣは増加するため、ＤＮＰ００２を用いてＭＤＳＣを標的治療を通じて大部分の癌種を対象にした汎用の診断および治療的目的で利用できることを示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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