(57)【要約】  本発明は、標的細胞におけるＴａｕの発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチドはＭＡＰＴ  ｍＲＮＡにハイブリダイズする。本発明は更に、タウオパチ、アルツハイマ（Ａｌｚｈｅｉｍｚｅｒ）病、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ＦＴＤＰ−１７、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、慢性外傷性脳症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ＣＴＥ）、大脳皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｎｉｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＣＢＤ）、てんかん、ドラベ症候群、抑鬱、発作性障害、及び運動障害の治療のための、オリゴヌクレオチド及び医薬組成物のコンジュゲート並びに方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０から３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号１の１２０５１〜１２１１１位、３９５６２〜３９５９３位、又は７２８３７〜７２９４０位内の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の相補性である少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を備える、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記連続ヌクレオチド配列で、少なくとも１６ヌクレオチドであり、配列番号１の１２０６０〜１２０７８位、３９５７３〜３９５９２位、又は７２８６２〜７２８９０位内の連続するヌクレオチドに１００％相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドで、配列番号９、１１、４９、５３、５６、及び６２からなる群より選択される配列を備える、請求項１又は２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドで、Ｔａｕの発現を低減することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記連続ヌクレオチド配列で、１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを備える、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドで、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ、及びＬＮＡヌクレオシドからなる群より独立して選択される、請求項５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記連続ヌクレオチド配列で、４〜８個のＬＮＡヌクレオシドを備える、請求項５又は６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも８０％が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドで、ＲＮａｓｅ  Ｈを動員することができる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列で、式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’のギャップマからなるか又はそれを含み、式中、領域Ｆ及びＦ’が独立して１〜８個のヌクレオシドを含み、そのうち２〜５個が２’糖修飾され、Ｆ及びＦ’領域の５’及び３’末端を規定し、ＧがＲＮａｓｅ  Ｈを動員することができる６〜１６個のヌクレオシドの領域、例えば６〜１６個のＤＮＡヌクレオシドを含む領域である、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドで、
ＣＴＴｔＡＡＴｔｔａａｔｃａｃｔｃＡＴ  配列番号９；ＣＭＰ番号９＿１０２
ＣＴＴＴａａｔｔｔａａｔｃａｃＴＣＡＴ  配列番号９；ＣＭＰ番号９＿１０３
ＣＴＴＴａａｔｔｔａａｔｃａＣｔＣＡＴ  配列番号９；ＣＭＰ番号９＿１０４
ＣＴＴＴａａｔｔｔａａｔｃａＣＴＣＡ  配列番号１１；ＣＭＰ番号１１＿１
ＴｔａａＣＴＣＡａａｔｃａａＴｔｃｔＣＡ  配列番号４９；ＣＭＰ番号４９＿３８
ＴｔａＡｃｔＣＡａａｔｃａａｔｔＣＴＣＡ  配列番号４９；ＣＭＰ番号４９＿５１
ＴＴＡａｃｔＣａａａｔｃａａｔＴＣｔＣＡ  配列番号４９；ＣＭＰ番号４９＿１７９
ＴＴＡＡｃｔｃａａａｔｃａａｔｔＣＴＣＡ  配列番号４９；ＣＭＰ番号４９＿１８９
ＣＡＡＣａｃｃｔｔｔｔａａｔｔｃＡＴＴＡ  配列番号５３；ＣＭＰ番号５３＿１
ＣＴＣＡｔｃａａｃａｃｃｔｔｔｔａａＴＴ  配列番号５６；ＣＭＰ番号５６＿１
ＴＴＡａｃｔｃａｔｃａａｃａＣＣＴＴ  配列番号６２；ＣＭＰ番号６２＿１からなる群より選択れる化合物であって、
ここで、大文字がβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字がＤＮＡヌクレオシドであり、全ＬＮＡ  Ｃが５−メチルシトシンであり、全ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドで、図２に示されるようにＣＭＰ番号９＿１０３である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドで、図３に示されるようにＣＭＰ番号９＿１０４である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドで、図４に示されるようにＣＭＰ番号１１＿１である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドで、図５に示されるようにＣＭＰ番号４９＿３８である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドで、図６に示されるようにＣＭＰ番号４９＿１８９である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分を含むコンジュゲート。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項１７に記載のコンジュゲートの、薬学的に許容される塩。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項１７に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又はアジュバンドを含む医薬組成物。
【請求項２０】
Ｔａｕを発現している標的細胞におけるＴａｕ発現を調節するためのインビトロ又はインビボ方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項１７に記載のコンジュゲート、又は請求項１９に記載の医薬組成物を、有効量で前記細胞に投与することを含む方法。
【請求項２１】
疾患の治療又は予防方法であって、治療的又は予防的に有効な量である請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項１７に記載のコンジュゲート、又は請求項１９に記載の医薬組成物を、前記疾患に罹患する又は罹り易い対象に投与することを含む方法。
【請求項２２】
前記疾患が、アルツハイマ病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｌｓｙ：ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏ−  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ：ＦＴＤ）、又はＦＴＤＰ−１７からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患が、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
医薬として使用するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項１７に記載のコンジュゲート、又は請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
アルツハイマ病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、又はＦＴＤＰ−１７の前記治療又は予防に使用するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項１７に記載のコンジュゲート、又は請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記疾患が、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）である、請求項２５に記載の治療に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、又は医薬組成物。
【請求項２７】
アルツハイマ病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、又はＦＴＤＰ−１７の治療又は予防のための薬品を調製するための、請求項１〜１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項１７に記載のコンジュゲート、又は請求項１９に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小管関連タンパク質Ｔａｕ（ＭＡＰＴ）転写物に相補的であり、Ｔａｕの発現の低下をもたらすオリゴヌクレオチド（オリゴマー）に関する。ＭＡＰＴ転写物及び／又はＴａｕタンパク質発現の低下は、タウオパチ、アルツハイマ（Ａｌｚｈｅｉｍｚｅｒ）病、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ：ＦＴＤ）、ＦＴＤＰ−１７、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｌｓｙ：ＰＳＰ）、慢性外傷性脳症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ＣＴＥ）、大脳皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｎｉｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＣＢＤ）、てんかん、ドラベ症候群、抑鬱、発作性障害、及び運動障害といった医的障害に有益である。
【背景技術】
【０００２】
Ｔａｕはチューブリンと相互作用する微小管関連タンパク質（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＡＰ）であり、微小管の集合及び安定化に関与する。微小管は細胞骨格の重要な構造要素であり、有糸分裂、細胞質分裂、及び小胞輸送を含む様々な細胞過程に関与する。Ｔａｕタンパク質は複数の細胞及び組織型に存在するが、軸索輸送及び機能の調節に重要な役割を果たすニューロンに特に豊富に存在する。
【０００３】
Ｔａｕ発現レベル及び／又は機能の変化は、様々な神経変性障害の病態生理に寄与する。例えば、ミスフォールドした及び高リン酸化したＴａｕの凝集体は、アルツハイマ病（ＡＤ）と、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）及び１７番染色体連鎖したパーキンソニズムを伴うＦＴＤ（ＦＴＤ  ｗｉｔｈ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １７：ＦＴＤＰ−１７）、ピック病（Ｐｉｃｋ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＰｉＤ）、嗜銀性顆粒病（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｒａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＧＤ）、変化優位型老年認知症（ｔａｎｇｌｅ−ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｎｉｌｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ：ＴＰＳＤ）、原発性年齢関連タウオパチ（ｐｒｉｍａｒｙ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔａｕｏｐａｔｈｙ：ＰＡＲＴ）、ダウン症候群、並びにリティコ−ボディグ病（ｌｙｔｉｃｏ−ｂｏｄｉｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）などの関連タウオパチと関連する神経原線維封入体に見出される。病理学的Ｔａｕのアップレギュレーションは、一側性巨脳症（ｈｅｍｉｍｅｇａｌｅｎｃｅｐｈａｌｙ：ＨＭＥ）、結節性硬化症、限局性皮質異形成２ｂ型、及び神経節膠腫を含む小児タウオパチ（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  Ｔａｕｏｐａｔｈｉｅｓ）と関連する。加えて、異常なＴａｕ発現及び／又は機能は、脳内鉄沈着を伴う神経変性症１型（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｂｒａｉｎ  ｉｒｏｎ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｙｐｅ  １：ＮＢＩＡ１）としても知られるハラーホルデン・スパッツ症候群、神経節細胞腫、及び亜急性硬化性全脳炎のような他の疾患とも関連する可能性がある。Ｔａｕはまた、発作性障害（例えば、てんかん）、ネットワーク機能障害（例えば、抑鬱）、及び運動障害（例えば、パーキンソン病）においても役割を果たし得る。
【０００４】
アンチセンス分子及びｓｉＲＮＡ分子は、ＭＡＰＴプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ転写物を標的とすることによってＴａｕタンパク質レベルを低減することができることが記載されている。例えば、Ｄｅ  Ｖｏｓら（２０１３年）「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ」第３３巻第１２８８７頁、国際公開第ＷＯ２０１３／１４８２６０号、同第ＷＯ２０１４／１５３２３６号、同第ＷＯ２０１５／０１０１３５号、同第ＷＯ２０１６／１２６９９５号、同第ＷＯ２０１６／１５１５２３号、同第ＷＯ２０１７／０９６７９号、及び同第ＷＯ２０１８／０６４５９３号を参照されたい。ＭＡＰＴ転写物のスプライス調節を誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、Ｓｕｄら（２０１４年）「Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ」第３巻第ｅ１８０頁及び国際公開第ＷＯ２０１６／０１９０６３号に記載されている。
【０００５】
ＡＤのようなＴａｕ関連障害は、高齢者における認知症の最も一般的な原因であって、タウオパチ、発作性障害、及び運動障害を含む、ＡＤ及び関連神経変性疾患の治療のための強力かつ効果的な薬剤が、大いに必要とされている。
【０００６】
発明の目的
本発明は、インビボ及びインビトロの両方でＴａｕを低減するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、有効なＴａｕ阻害を与えるためにアンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的化され得る、ヒトＭＡＰＴプレｍＲＮＡのイントロン１又は２に位置するＭＡＰＴプレｍＲＮＡにおける３つの特異的標的領域を同定した。特に、配列番号１の標的位置１２０５１〜１２１１１、３９５６２〜３９５９３、及び／又は７２８３７〜７２９４０は、Ｔａｕを低減する点で有利である。本発明はまた、Ｔａｕを低減することができる有効なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列及び化合物、並びにタウオパチ、アルツハイマ病、ＦＴＤＰ−１７、発作性障害、及び運動障害を含む神経変性疾患などの疾患又は障害の治療におけるそれらの使用を提供する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、Ｔａｕの発現を調節することができるＴａｕコード化核酸を標的とするオリゴヌクレオチドと、Ｔａｕの機能に関連した疾患を治療又は予防するためのオリゴヌクレオチドの使用と、に関する。
【０００８】
したがって、第１の態様では、本発明は、１０〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであって、配列番号３、４、及び５で表されるＭＡＰＴの特定の領域に対して少なくとも９０％の相補性を有する少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。
【０００９】
オリゴヌクレオチドは、好ましくはギャップマ設計を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の切断によりＴａｕの発現を阻害することができる。切断は、好ましくは、ヌクレアーゼ動員を介して達成される。
【００１０】
更なる態様では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、及び／又はアジュバントと、を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
更なる態様では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物を該細胞に有効量で投与することによる、Ｔａｕを発現している標的細胞におけるＴａｕ発現調節用インビボ又はインビトロ方法のための方法を提供する。
【００１２】
本発明の更なる態様では、本発明は、治療的又は予防的に有効な量の本発明のオリゴヌクレオチドを、疾患、障害、又は機能障害に罹患する又は罹り易い対象に投与することを含む、Ｔａｕのインビボ活性に関連した疾患、障害、又は機能障害の治療又は予防方法を提供する。
【００１３】
更なる態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物は、アルツハイマ病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、又はＦＴＤＰ−１７の治療又は予防のために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】スクリーニングは、ＭＡＰＴ上の全イントロン領域をカバーするオリゴヌクレオチドライブラリ（実施例１）から得られる。各点はオリゴヌクレオチド化合物を表し、ｘ軸はＭＡＰＴ転写物上のその位置を図示し、ｙ軸は対照（低値はＭＡＰＴの大幅な低下に相当する）と比較した場合に残るＭＡＰＴ  ｍＲＮＡの量を示す。Ａ、Ｂ、及びＣは、更なるオリゴヌクレオチド化合物のための標的領域として選択されるＭＡＰＴ転写物上の３つの領域を示す。
【図２】化合物９＿１０３（核酸塩基の配列は配列番号９に示す）
【図３】化合物９＿１０４（核酸塩基の配列は配列番号９に示す）
【図４】化合物１１＿１（核酸塩基の配列は配列番号１１に示す）
【図５】化合物４９＿３８（核酸塩基の配列は配列番号４９に示す）
【図６】化合物４９＿１８９（核酸塩基の配列は配列番号４９に示す）
【００１５】
図２、３、４、５、及び６に図示する化合物はプロトン化形態で示されており、すなわちホスホロチオエート結合上のＳ原子はプロトン化されている。プロトンの存在は、分子の環境の酸性度と、代替的なカチオン（例えば、オリゴヌクレオチドが塩形態である場合）の存在とに依存することが理解されるであろう。プロトン化されたホスホロチオエートは互変異性型として存在する。
【００１６】
定義
オリゴヌクレオチド
用語「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、それが当業者により、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として一般的に理解されているように定義される。そのような共有結合ヌクレオシドは、核酸分子又はオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製及び単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列若しくは順序、又はその修飾が参照される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であって化学的に合成され、典型的には精製又は単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含んでもよい。
【００１７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）又は相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二重鎖）を形成できることが理解される。
【００１８】
有利には、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性を低減するためＲＮＡヌクレオシドを含まない。
【００１９】
有利には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む。更に、修飾されていないヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドであることは有利である。
【００２０】
連続ヌクレオチド配列
用語「連続ヌクレオチド配列」とは、標的核酸又は標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で用語「連続核酸塩基配列」及び用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列、例えばＦ−Ｇ−Ｆ’ギャップマ領域を含み、場合により更なるヌクレオチド、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカ領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカ領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、それ自体としてオリゴヌクレオチドより長くなることはできないことと、オリゴヌクレオチドは連続ヌクレオチド配列より短くなることはできないことと、が理解される。
【００２１】
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチド及び天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む。本来、ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドに存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、「単位」又は「モノマー」と互換的に称されてもよい。
【００２２】
修飾ヌクレオシド
用語「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」とは、本明細書で使用される場合、等価なＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。用語修飾ヌクレオシドはまた、用語「ヌクレオシド類似体」又は修飾「単位」又は修飾「モノマー」と本明細書では互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域における修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対合が可能であれば、依然として一般にＤＮＡ又はＲＮＡと称される。
【００２３】
修飾ヌクレオシド間結合
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者により一般的に理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増大させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間のホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボ使用のためのオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの領域、例えばギャップマオリゴヌクレオチドのギャップ領域Ｇ内、並びに領域Ｆ及びＦ’などの修飾ヌクレオシドの領域におけるヌクレアーゼ切断から保護する役割を果たし得る。
【００２４】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合が、例えばヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性であるように、天然のホスホジエステルから修飾された１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることにより、又はヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えば、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を用いることにより決定することができ、これらの両方は当該技術分野で周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させることができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と称される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合が修飾されており、例えばオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の、少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、又は例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、修飾されている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部が修飾されている。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドを例えばコンジュゲートなどの非ヌクレオチド官能基に結合するヌクレオシドは、ホスホジエステルであり得ることが認識されるであろう。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。
【００２５】
修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、及びボラノホスフェートを含む群より選択され得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、本発明のオリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、又はボラノホスフェートのＲＮａｓｅ  Ｈ動員と適合する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合など硫黄（Ｓ）を備える。
【００２７】
本発明のオリゴヌクレオチドでは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を用いることが有利である。
【００２８】
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態、及び製造の容易さのため特に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチド又はそのヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％又は例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部は、ホスホロチオエートである。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロジチオエート結合（複数可）に加えて、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合と、２、３、又は４ホスホジエステル結合などの少なくとも１つのホスホジエステル結合との両方を含む。ギャップマオリゴヌクレオチドにおいて、ホスホジエステル結合は、存在する場合、ギャップ領域Ｇ内の連続ＤＮＡヌクレオシド間に好適には位置しない。
【００３０】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の中性ヌクレオシド間結合、特にホスホトリエステル、メチルホスホネート、ＭＭＩ、アミド−３、ホルマアセタール、又はチオホルマアセタールから選択されるヌクレオシド間結合を含む。
【００３１】
更なるヌクレオシド間結合は国際公開第ＷＯ２００９／１２４２３８号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。一実施形態では、ヌクレオシド間結合は、国際公開第ＷＯ２００７／０３１０９１号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるリンカから選択される。特に、ヌクレオシド間結合は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（ＲＨ）−Ｏ−、０−ＰＯ（ＯＣＨ３）−０−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−から選択することができるか、及び／又はヌクレオシド間リンカは、以下：−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨＣＯ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−ＣＨ２−ＮＣＨ３−Ｏ−ＣＨ２−からなる群から選択されてもよく、ここで、ＲＨは水素及びＣ１−４−アルキルから選択される。
【００３２】
ホスホルチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、標的核酸と二重鎖を形成するときにヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域、例えばギャップマの領域Ｇにおいて特に有用である。しかしながら、ホスホロチオエート結合はまた、非ヌクレアーゼ動員領域及び／又は親和性増強領域、例えばギャップマの領域Ｆ及びＦ’においても有用であり得る。ギャップマオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、領域Ｆ若しくはＦ’、又は領域Ｆ及びＦ’の両方に１つ以上のホスホジエステル結合を含んでもよく、領域Ｇのヌクレオシド間結合の全てはホスホロチオエートであり得る。
【００３３】
有利には、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の全ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであるか、又はオリゴヌクレオチドの全ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
【００３４】
核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えば、ウラシル、チミン、及びシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語はまた、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能性である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンと、天然に存在しないバリアントとの両方を指す。そのようなバリアントは、例えば、Ｈｉｒａｏら（２０１２年）「Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」第４５巻第２０５５頁、及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９年）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｕｐｐｌ．」第３７巻第１．４．１頁に記載されている。
【００３５】
いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを修飾プリン又はピリミジン、例えば置換プリン又は置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５−メチルシトシン、５−チアゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、２’チオ−チミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、及び２−クロロ−６−アミノプリンから選択される核酸塩基に変えることにより修飾される。
【００３６】
核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵにより示され、ここで、各文字は、等価な機能の修飾核酸塩基を場合により含み得る。例えば、例示したオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５−メチルシトシンから選択される。場合により、ＬＮＡギャップマについて、５−メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
【００３７】
修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖−修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記述する。用語「キメラ」オリゴヌクレオチドとは、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。
【００３８】
相補性
用語「相補性」とは、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対合の能力を説明する。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば５−メチルシトシンは度々シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾及び修飾核酸塩基の間のワトソン・クリック塩基対合を包含することが理解されるであろう（例えば、平尾ら（２０１２年）「Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」第４５巻第２０５５頁及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９年）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｕｐｐｌ．」第３７巻第１．４．１頁を参照されたい）。
【００３９】
用語「％相補的」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、標的配列又は配列モチーフ）に相補的である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセント）を指す。したがって、相補性のパーセンテージは、２つの配列間（標的配列５’−３’と３’−５’からのオリゴヌクレオチド配列とを整列させた場合）で相補的である（ワトソン・クリック塩基対から）整列した核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。相補性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５−メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
【００４０】
用語「完全に相補的な」とは、１００％の相補性を指す。
【００４１】
以下は、標的核酸に完全に相補的なオリゴヌクレオチドの例である。
【００４２】
以下は、標的核酸（配列番号４）に完全に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号４９）の例である。
【００４３】
５’ｇａａｇｇｔｔｇａａａｔｇａｇａａｔｔｇａｔｔｔｇａｇｔｔａａａ３’（配列番号４）
３’ａｃｔｃｔｔａａｃｔａａａｃｔｃａａｔｔ５’（配列番号４９）
【００４４】
同一性
用語「同一性」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）に同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列及び参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性のパーセンテージ＝（一致×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージの計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５−メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
【００４５】
ハイブリダイゼーション
用語「ハイブリダイズしている」又は「ハイブリダイズする」とは、本明細書で使用される場合、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向する鎖上の塩基対の間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成することとして理解するべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、度々、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔｍ）によって記述される。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ及びＬａｃｒｏｉｘ（２００３年）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」第１３巻第５１５〜５３７頁）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝−ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）に関連付けられ、ここでＲは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映する。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃の反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは自発的反応であり、自発的反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎら（１９６５年）「Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．」第３６〜３８巻及びＨｏｌｄｇａｔｅら（２００５年）「Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．」に記載されているように、等温滴定熱量測定（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ：ＩＴＣ）法を用いて実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°はまた、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ（１９９８年）「Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ」第９５巻第１４６０〜１４６５頁に記載されているように、杉本ら（１９９５年）「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第３４巻第１１２１１〜１１２１６頁及びＭｃＴｉｇｕｅら（２００４年）「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第４３巻第５３８８〜５４０５頁に記載されている、適切に誘導した熱力学パラメータを使用して、最近接モデル（ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｍｏｄｅｌ）を用いることにより数値的に推定することもできる。ハイブリダイゼーションによってその意図された核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば−１５ｋｃａｌ未満、例えば−２０ｋｃａｌ未満、及び例えば−２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、−１０〜−６０ｋｃａｌ、例えば−１２〜−４０、例えば−１５〜−３０ｋｃａｌ、又は−１６〜−２７ｋｃａｌ、例えば−１８〜−２５��ｃａｌの推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。
【００４６】
標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物Ｔａｕをコードする核酸であり、例えば遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列であり得る。したがって、標的は、Ｔａｕ標的核酸又はＭＡＰＴ標的核酸と称され得、これらの用語は互換的に使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、哺乳動物ＭＡＰＴの標的エクソン領域を標的とし得るか、又は例えばＭＡＰＴプレｍＲＮＡのイントロン領域を標的とし得る（表１参照）。
【００４７】
【表１】
2021529525.tif 000002
【００４８】
好適には、標的核酸は、Ｔａｕタンパク質、特に哺乳動物Ｔａｕ、例えばヒトＴａｕをコードする（例えば、ヒト及びサルＴａｕについてのプレｍＲＮＡ配列を提供する表２及び３を参照されたい）。
【００４９】
いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１及び２、又はその天然に存在するバリアント（例えば、哺乳動物Ｔａｕタンパク質をコードする配列）からなる群より選択される。本発明のオリゴヌクレオチドを研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡに由来するｃＤＮＡ又は合成核酸であり得る。
【００５０】
インビボ又はインビトロ適用のために、本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には、ＭＡＰＴ標的核酸を発現している細胞におけるＴａｕタンパク質の発現を阻害することができる。本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、典型的には、オリゴヌクレオチドの長さにわたって測定され、場合により１つ又は２つのミスマッチを除いて、また場合により、オリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの任意の官能基に結合し得るヌクレオチドベースのリンカ領域、又は他の非相補的末端ヌクレオチド（例えば、Ｄ’又はＤ’’）を除いて、ＭＡＰＴ標的核酸に相補的である。標的核酸は、いくつかの実施形態では、成熟ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡなどのメッセンジャＲＮＡといったＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、標的核酸は、ヒトＴａｕなどの哺乳動物Ｔａｕタンパク質、例えば配列番号１として開示されているようなヒトＭＡＰＴプレｍＲＮＡ配列をコードするＲＮＡ又はＤＮＡである。例示的な標的核酸に関する更なる情報は、表２及び３に提供される。
【００５２】
【表２】
2021529525.tif 000003
【００５３】
Ｆｗｄ＝順鎖  ゲノム座標は、プレｍＲＮＡ配列（ゲノム配列）を提供する。ＮＣＢＩ参照は、ｍＲＮＡ配列（ｃＤＮＡ配列）を提供する。
【００５４】
＊アメリカ国立生物工学情報センター参照配列データベースは、ゲノム、転写物、及びタンパク質を含む、包括的で統合された、冗長性のない、十分に注釈が付けられた参照配列のセットである。これはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｆｓｅｑで主催されている。
【００５５】
【表３】
2021529525.tif 000004
【００５６】
標的配列
用語「標的配列」とは、本明細書で使用される場合、標的核酸に存在するヌクレオチドの配列を指し、これは本発明のオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列、又は標的領域と称され得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、単一オリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドによって標的化され得る標的核酸の好ましい領域を表すことができる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、標的配列は、表４（Ｒ＿１−Ｒ＿２２５４）のいずれかの領域から選択される配列である。特に、標的配列は、Ｒ＿２２３、Ｒ＿７３８、又はＲ＿１２９８からなる領域の群内の領域のうち１つから選択され得る。
【００５８】
【表４−１】
2021529525.tif 000005
【表４−２】
2021529525.tif 000006
【表４−３】
2021529525.tif 000007
【表４−４】
2021529525.tif 000008
【表４−５】
2021529525.tif 000009
【表４−６】
2021529525.tif 000010
【表４−７】
2021529525.tif 000011
【表４−８】
2021529525.tif 000012
【表４−９】
2021529525.tif 000013
【表４−１０】
2021529525.tif 000014
【表４−１１】
2021529525.tif 000015
【表４−１２】
2021529525.tif 000016
【表４−１３】
2021529525.tif 000017
【表４−１４】
2021529525.tif 000018
【表４−１５】
2021529525.tif 000019
【表４−１６】
2021529525.tif 000020
【表４−１７】
2021529525.tif 000021
【表４−１８】
2021529525.tif 000022
【表４−１９】
2021529525.tif 000023
【表４−２０】
2021529525.tif 000024
【表４−２１】
2021529525.tif 000025
【表４−２２】
2021529525.tif 000026
【表４−２３】
2021529525.tif 000027
【表４−２４】
2021529525.tif 000028
【表４−２５】
2021529525.tif 000029
【表４−２６】
2021529525.tif 000030
【表４−２７】
2021529525.tif 000031
【表４−２８】
2021529525.tif 000032
【表４−２９】
2021529525.tif 000033
【００５９】
いくつかの実施形態では、標的配列は、ＴａｕヒトｍＲＮＡイントロン１又は２などのヒトＭＡＰＴ  ｍＲＮＡイントロンから選択される配列である（上記の表１を参照）。
【００６０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸、例えば本明細書に記載される標的配列に相補的又はハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。
【００６１】
オリゴヌクレオチドが相補的又はハイブリダイズする標的配列は、一般に、少なくとも１０ヌクレオチドの連続核酸塩基配列を含む。連続ヌクレオチド配列は、１０〜１００ヌクレオチド、例えば１２〜６０、例えば１３〜５０、例えば１４〜３０、例えば１５〜２５、例えば１６〜２０連続ヌクレオチドである。
【００６２】
本発明の一実施形態では、標的配列は、領域Ａに対応する配列番号３である。ある特定の実施形態では、標的配列は、配列番号１の１２０５１〜１２１１１位、例えば配列番号１の１２０５１〜１２０７９位、１２０８５〜１２１１１位、又は１２０６０〜１２０７８位から選択される。
【００６３】
本発明の一実施形態では、標的配列は、領域Ｂに対応する配列番号４である。ある特定の実施形態では、標的配列は、配列番号１の３９５６２〜３９５９３位、例えば配列番号１の３９５７３〜３９５９２位から選択される。
【００６４】
本発明の一実施形態では、標的配列は、領域Ｃに対応する配列番号５である。ある特定の実施形態では、標的配列は、配列番号１の７２８３７〜７２９４０位、例えば配列番号１の７２８６１〜７２８９１位又は７２８６２〜７２８９０位から選択される。
【００６５】
標的細胞
用語「標的細胞」とは、本明細書で使用される場合、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビボ又はインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞若しくはラット細胞、又は霊長類細胞、例えばサル細胞若しくはヒト細胞である。
【００６６】
好ましい実施形態では、標的細胞は、ＴａｕプレｍＲＮＡ又はＴａｕ成熟ｍＲＮＡなどのＴａｕ  ｍＲＮＡを発現する。Ｔａｕ  ｍＲＮＡのポリＡテールは、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化では無視される。
【００６７】
天然に存在するバリアント
用語「天然に存在するバリアント」とは、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、又はプレｍＲＮＡの選択的スプライシング若しくは例えば一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）などの多型の存在に起因して異なり得る、ＭＡＰＴ遺伝子又は転写物のバリアントと、対立遺伝子バリアントとを指す。オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的な配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、標的核酸及びその天然に存在するバリアントを標的とし得る。
【００６８】
いくつかの実施形態では、天然に存在するバリアントは、哺乳動物ＭＡＰＴ標的核酸、例えば配列番号１及び２からなる群より選択される標的核酸に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％又は少なくとも９９％相同性を有する。いくつかの実施形態では、天然に存在するバリアントは、配列番号１のヒトＭＡＰＴ標的核酸に対して少なくとも９９％相同性を有する。
【００６９】
発現の調節
用語「発現の調節」は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドの投与前のＴａｕの量と比較した場合、Ｔａｕの量を変更するオリゴヌクレオチドの能力の総称として理解されるべきである。あるいは、発現の調節は、対照実験を参照することによって決定され得る。対照は、生理食塩水組成物で処理された個体若しくは標的細胞、又は非標的化オリゴヌクレオチド（モック）で処理された個体若しくは標的細胞であると一般的に理解されている。
【００７０】
調節の１つのタイプは、例えばｍＲＮＡの分解又は転写の遮断による、Ｔａｕの発現を阻害、ダウンレギュレート、低減、抑制、除去、停止、遮断、防止、減少、低下、回避、又は終了するオリゴヌクレオチドの能力である。別のタイプの調節は、例えばスプライス部位の修復若しくはスプライシングの防止、又はマイクロＲＮＡ抑制などの阻害メカニズムの除去若しくは遮断による、Ｔａｕの発現を回復、増加、又は増強するオリゴヌクレオチドの能力である。
【００７１】
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５〜＋１２℃、より好ましくは＋１．５〜＋１０℃、最も好ましくは＋３〜＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野にて既知であり、例えば、多くの２’置換ヌクレオシド及びロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ、「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．」（１９９７年）第２５巻第４４２９〜４４４３頁及びＵｈｌｍａｎｎ、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（２０００年）第３巻第２号第２９３〜２１３頁を参照されたい）。
【００７２】
糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。
【００７３】
リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが、親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善することを主な目的として作製されている。
【００７４】
そのような修飾には、例えばヘキソース環（ＨＮＡ）若しくは二環式環（典型的には、リボース環（ＬＮＡ）のＣ２及びＣ４炭素の間にバイラジカル架橋を有する）、又は非結合リボース環（典型的には、Ｃ２及びＣ３炭素の間の結合を欠く（例えば、ＵＮＡ））で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第ＷＯ２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（国際公開第ＷＯ２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合には、糖部分が非糖部分で置き換えられているヌクレオシド、又はモルホリノ核酸も含まれる。
【００７５】
糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を水素以外の基、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシドに天然に存在する２’−ＯＨ基に変更することによる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’、又は５’位で導入され得る。
【００７６】
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ若しくは−ＯＨ以外の置換基を有し（２’置換ヌクレオシド）、又は２’炭素とリボース環の第２の炭素との間に架橋を形成できる２’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’−４’バイラジカル架橋）である。
【００７７】
実際、２’糖置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、数多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、向上された結合親和性、及び／又は増大されたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドに提供することができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、及び２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドである。更なる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．」（１９９７年）第２５巻第４４２９〜４４４３頁及びＵｈｌｍａｎｎ；「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（２０００年）第３巻第２号第２９３〜２１３頁、及びＤｅｌｅａｖｅｙ及びＤａｍｈａ、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（２０１２年）第１９巻第９３７頁を参照されたい。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの説明である。
【００７８】
2021529525.tif 000034
【００７９】
本発明に関して、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡのような２’架橋ヌクレオシドを含まない。
【００８０】
ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、該ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合するバイラジカル（「２’−４’架橋」とも称される）を含む２’糖修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限又は固定する。これらのヌクレオシドはまた、文献にて架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖安定化）に関連している。これはオリゴヌクレオチド／補完二重鎖の融解温度を測定することにより日常的に決定され得る。
【００８１】
非限定的に、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第ＷＯ９９／０１４２２６号、国際公開第ＷＯ００／６６６０４号、国際公開第ＷＯ９８／０３９３５２号、国際公開第ＷＯ２００４／０４６１６０号、国際公開第ＷＯ００／０４７５９９号、国際公開第ＷＯ２００７／１３４１８１号、国際公開第ＷＯ２０１０／０７７５７８号、国際公開第ＷＯ２０１０／０３６６９８号、国際公開第ＷＯ２００７／０９００７１号、国際公開第ＷＯ２００９／００６４７８号、国際公開第ＷＯ２０１１／１５６２０２号、国際公開第ＷＯ２００８／１５４４０１号、国際公開第ＷＯ２００９／０６７６４７号、国際公開第ＷＯ２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａら、「Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．」第１２巻第７３〜７６頁；Ｓｅｔｈら、「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」（２０１０年）第７５巻第５号第１５６９〜８１頁；Ｍｉｔｓｕｏｋａら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（２００９年）第３７巻第４号第１２２５〜１２３８頁；並びに、Ｗａｎ及びＳｅｔｈ、「Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（２０１６年）第５９巻第９６４５〜９６６７頁に開示されている。
【００８２】
２’−４’架橋は、２〜４個の架橋原子を含み、特に式−Ｘ−Ｙ−で表され、式中、
Ｘは、酸素、硫黄、−ＣＲａＲｂ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（＝ＣＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−ＳＯ２−、−ＮＲａ−；−Ｏ−ＮＲａ−、−ＮＲａ−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｊ）−、Ｓｅ、−Ｏ−ＮＲａ−、−ＮＲａ−ＣＲａＲｂ−、−Ｎ（Ｒａ）−Ｏ−、又は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり；
Ｙは、酸素、硫黄、−（ＣＲａＲｂ）ｎ−、−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−ＳＯ２−、−ＮＲａ−、−Ｃ（＝Ｊ）−、Ｓｅ、−Ｏ−ＮＲａ−、−ＮＲａ−ＣＲａＲｂ−、−Ｎ（Ｒａ）−Ｏ−、又は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であるが；
ただし、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−Ｏ−、Ｓｉ（Ｒａ）２−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−ＳＯ２−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、又は−Ｓｅ−Ｓｅ−ではなく；
Ｊは、酸素、硫黄、＝ＣＨ２、又は＝Ｎ（Ｒａ）であり；
Ｒａ及びＲｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、−ＯＣ（＝Ｘａ）Ｒｃ、−ＯＣ（＝Ｘａ）ＮＲｃＲｄ、及び−ＮＲｅＣ（＝Ｘａ）ＮＲｃＲｄから独立して選択され；
又は、２つのジェミナルなＲａ及びＲｂは、一緒になって、任意に置換されたメチレンを形成し；
又は、２つのジェミナルなＲａ及びＲｂは、結合している炭素原子と共にシクロアルキル又はハロシクロアルキルを形成し、−Ｘ−Ｙ−の炭素原子は１個だけであり；
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシ、及び置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシリル、アリール、及びヘテロアリールから独立して選択される１〜３個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、及びメチレンであり；
Ｘａは、酸素、硫黄、又は−ＮＲｃであり；
Ｒｃ、Ｒｄ、及びＲｅは、水素及びアルキルから独立して選択され；並びに、
ｎは、１、２、又は３である。
【００８３】
本発明の更に特定の実施形態では、Ｘは、酸素、硫黄、−ＮＲａ−、−ＣＲａＲｂ−、又は−Ｃ（＝ＣＲａＲｂ）−、特に酸素、硫黄、−ＮＨ−、−ＣＨ２−、又は−Ｃ（＝ＣＨ２）−、特に酸素である。
【００８４】
本発明の別の特定の実施形態では、Ｙは、−ＣＲａＲｂ−、−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−、又は−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−、特に−ＣＨ２−ＣＨＣＨ３−、−ＣＨＣＨ３−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、又は−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００８５】
本発明の具体的な実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−（ＣＲａＲｂ）ｎ−、−Ｓ−ＣＲａＲｂ−、−Ｎ（Ｒａ）ＣＲａＲｂ−、−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−、−Ｏ−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、−Ｃ（＝ＣＲａＲｂ）−ＣＲａＲｂ−、−Ｎ（Ｒａ）ＣＲａＲｂ−、−Ｏ−Ｎ（Ｒａ）−ＣＲａＲｂ−、又は−Ｎ（Ｒａ）−Ｏ−ＣＲａＲｂ−である。
【００８６】
本発明の具体的な実施形態では、Ｒａ及びＲｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、及びアルコキシアルキル、特に水素、ハロゲン、アルキル、及びアルコキシアルキルからなる群より独立して選択される。
【００８７】
本発明の一実施形態では、Ｒａ及びＲｂは、水素、フルオロ、ヒドロキシル、メチル、及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、特に水素、フルオロ、メチル、及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３からなる群より独立して選択される。
【００８８】
有利には、−Ｘ−Ｙ−のＲａ及びＲｂの一方は上記に定義された通りであり、他方は全て同時に水素である。
【００８９】
本発明の更に特定の実施形態では、Ｒａは、水素又はアルキル、特に水素又はメチルである。
【００９０】
本発明の別の特定の実施形態では、Ｒｂは、水素又はアルキル、特に水素又はメチルである。
【００９１】
本発明の具体的な実施形態では、Ｒａ及びＲｂの一方又は両方は、水素である。
【００９２】
本発明の具体的な実施形態では、Ｒａ及びＲｂの一方のみが、水素である。
【００９３】
本発明の特定の一実施形態では、Ｒａ及びＲｂの一方はメチルであり、他方は水素である。
【００９４】
本発明の具体的な実施形態では、Ｒａ及びＲｂは、両方とも同時にメチルである。
【００９５】
本発明の具体的な実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３）−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｃ（＝ＣＨ２）ＣＨ２−、−Ｃ（＝ＣＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｎ（ＯＣＨ３）ＣＨ２−、又は−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２−である。
【００９６】
本発明の具体的な実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、式中、Ｒａ及びＲｂは、水素、アルキル、及びアルコキシアルキル、特に水素、メチル、及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３からなる群より独立して選択される。
【００９７】
具体的な実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−、特に−Ｏ−ＣＨ２−である。
【００９８】
２’−４’架橋は、それぞれ式（Ａ）及び式（Ｂ）に図示するように、リボース環の平面の下（β−Ｄ−立体配置）又は環の平面の上（α−Ｌ−立体配置）のいずれかに位置し得る。
【００９９】
本発明に係るＬＮＡヌクレオシドは、特に、式（Ａ）又は式（Ｂ）であり、
2021529525.tif 000035
式中、
Ｗは、酸素、硫黄、−Ｎ（Ｒａ）−又は−ＣＲａＲｂ−、特に酸素であり；
Ｂは、核酸塩基又は修飾核酸塩基であり；
Ｚは、隣接するヌクレオシド又は５’末端基へのヌクレオシド間結合であり；
Ｚ＊は、隣接するヌクレオシド又は３’末端基へのヌクレオシド間結合であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は、水素、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アジド、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、及びアリールから独立して選択され；並びに、
Ｘ、Ｙ、Ｒａ、及びＲｂは、上で定義した通りである。
【０１００】
具体的な実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒａは、水素又はアルキル、特に水素又はメチルである。別の具体的な実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒｂは、水素又はアルキル、特に水素又はメチルである。更なる具体的な実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒａ及びＲｂの一方又は両方は、水素である。具体的な実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒａ及びＲｂの一方のみが、水素である。特定の一実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒａ及びＲｂの一方はメチルであり、他方は水素である。具体的な実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒａ及びＲｂは、両方とも同時にメチルである。
【０１０１】
更なる具体的な実施形態では、Ｘの定義において、Ｒａは、水素又はアルキル、特に水素又はメチルである。別の具体的な実施形態では、Ｘの定義において、Ｒｂは、水素又はアルキル、特に水素又はメチルである。具体的な実施形態では、Ｘの定義において、Ｒａ及びＲｂの一方又は両方は、水素である。具体的な実施形態では、Ｘの定義において、Ｒａ及びＲｂの一方のみが、水素である。特定の一実施形態では、Ｘの定義において、Ｒａ及びＲｂの一方はメチルであり、他方は水素である。具体的な実施形態では、Ｘの定義において、Ｒａ及びＲｂは、両方とも同時にメチルである。
【０１０２】
更なる具体的な実施形態では、Ｙの定義において、Ｒａは、水素又はアルキル、特に水素又はメチルである。別の具体的な実施形態では、Ｙの定義において、Ｒｂは、水素又はアルキル、特に水素又はメチルである。具体的な実施形態では、Ｙの定義において、Ｒａ及びＲｂの一方又は両方は、水素である。具体的な実施形態では、Ｙの定義において、Ｒａ及びＲｂの一方のみが、水素である。特定の一実施形態では、Ｙの定義において、Ｒａ及びＲｂの一方はメチルであり、他方は水素である。具体的な実施形態では、Ｙの定義において、Ｒａ及びＲｂは、両方とも同時にメチルである。
【０１０３】
本発明の特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は、水素及びアルキル、特に水素及びメチルから独立して選択される。
【０１０４】
本発明の更に特定の有利な実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は、全て同時に水素である。
【０１０５】
本発明の別の特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て同時に水素であり、Ｒ５及びＲ５＊の一方は水素であり、他方は上記で定義した通り、特にアルキル、より具体的にはメチルである。
【０１０６】
本発明の具体的な実施形態では、Ｒ５及びＲ５＊は、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシアルキル、及びアジド、特に水素、フルオロ、メチル、メトキシエチル、及びアジドから独立して選択される。本発明の特定の有利な実施形態では、Ｒ５及びＲ５＊の一方は水素であり、他方はアルキル、特にメチル、ハロゲン、特にフルオロ、アルコキシアルキル、特にメトキシエチル若しくはアジドであるか、又はＲ５及びＲ５＊は、同時に水素若しくはハロゲン、特に同時にフルオロの水素である。そのような特定の実施形態では、Ｗは有利には酸素であり得、−Ｘ−Ｙ−有利には−Ｏ−ＣＨ２−であり得る。
【０１０７】
本発明の具体的な実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は、全て同時に水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第ＷＯ９９／０１４２２６号、同第ＷＯ００／６６６０４号、同第ＷＯ９８／０３９３５２号、及び同第ＷＯ２００４／０４６１６０号に開示され、これらは全て参照により本明細書に組み込まれており、β−Ｄ−オキシＬＮＡ及びα−Ｌ−オキシＬＮＡヌクレオシドとして当該技術分野で一般的に知られているものを含む。
【０１０８】
本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は、全て同時に水素である。そのようなチオＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれている国際公開第ＷＯ９９／０１４２２６号及び同第ＷＯ２００４／０４６１６０号に開示されている。
【０１０９】
本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−ＮＨ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は、全て同時に水素である。そのようなアミノＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれている国際公開第ＷＯ９９／０１４２２６号及び同第ＷＯ２００４／０４６１６０号に開示されている。
【０１１０】
本本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−又は−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は、全て同時に水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第ＷＯ００／０４７５９９号、及びＭｏｒｉｔａら、「Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．」第１２巻第７３〜７６頁に開示され、これらは参照により本明細書に組み入れられており、２’−Ｏ−４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）として当該技術分野で一般に知られているものを含む。
【０１１１】
本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て同時に水素であり、Ｒ５及びＲ５＊の一方は水素であり、他方はアルキル、例えばメチルなどの水素ではない。そのような５’置換ＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００７／１３４１８１号に開示されている。
【０１１２】
本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、ここで、Ｒａ及びＲｂの一方又は両方は水素、特にメチルなどのアルキルではなく、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て同時に水素であり、Ｒ５及びＲ５＊の一方は水素であり、他方は水素、特に例えばメチルなどのアルキルではない。このようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１０／０７７５７８号に開示されている。
【０１１３】
本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨＲａ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は、全て同時に水素である。そのような６’置換ＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第ＷＯ２０１０／０３６６９８号及び同第ＷＯ２００７／０９００７１号に開示されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。そのような６’−置換ＬＮＡヌクレオシドにおいて、Ｒａは、特に、メチルなどのＣ１−Ｃ６アルキルである。
【０１１４】
本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３）−（「２’Ｏ−メトキシエチル二環式核酸」、Ｓｅｔｈら、「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」（２０１０年）第７５巻第５号第１５６９〜８１頁）である。
【０１１５】
本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−（「２’Ｏ−エチル二環式核酸」、Ｓｅｔｈら、「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」（２０１０年）第７５巻第５号第１５６９〜８１頁）である。
【０１１６】
本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３）−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は、全て同時に水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドは、当該技術分野では環状ＭＯＥ（ｃＭＯＥ）としても知られており、国際公開第ＷＯ２００７／０９００７１号に開示されている。
【０１１７】
本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−である。
【０１１８】
本発明の別の特定の実施形態では、本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−である（Ｓｅｔｈら、「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ」（２０１０年）、前掲）。
【０１１９】
本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は全て同時に水素である。このような６’−メチルＬＮＡヌクレオシドは、当該技術分野ではｃＥＴヌクレオシドとしても知られており、両方とも参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００７／０９００７１号（β−Ｄ）及び国際公開第ＷＯ２０１０／０３６６９８号（α−Ｌ）に開示されているように、（Ｓ）−ｃＥＴ又は（Ｒ）−ｃＥＴジアステレオ異性体のいずれかであり得る。
【０１２０】
本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、ここで、ＲａもＲｂも水素ではなく、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は全て同時に水素である。具体的な実施形態では、Ｒａ及びＲｂは両方とも同時にアルキル、特に両方とも同時にメチルである。そのような６’−ジ−置換ＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００９／００６４７８号に開示されている。
【０１２１】
本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨＲａ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は、全て同時に水素である。そのような６’置換チオＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１／１５６２０２号に開示されている。このような６’置換チオＬＮＡの特定の実施形態では、Ｒａは、アルキル、特にメチルである。
【０１２２】
本発明の具体的な実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｃ（＝ＣＨ２）Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（＝ＣＨＦ）Ｃ（ＲａＲｂ）−、又は−Ｃ（＝ＣＦ２）Ｃ（ＲａＲｂ）−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は全て同時に水素である。Ｒａ及びＲｂは、有利には、水素、ハロゲン、アルキル、及びアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロ、及びメトキシメチルから独立して選択される。Ｒａ及びＲｂは特に同時に水素又はメチルの両方であるか、又はＲａとＲｂの一方が水素であり、他方がメチルである。そのようなビニルカルボＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第ＷＯ２００８／１５４４０１号及び同第ＷＯ２００９／０６７６４７号に開示されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
本発明の具体的な実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｎ（ＯＲａ）−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は全て同時に水素である。具体的な実施形態では、Ｒａは、メチルなどのアルキルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドはまた、Ｎ置換ＬＮＡとしても知られており、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００８／１５０７２９号に開示されている。
【０１２４】
本発明の具体的な実施形態では、−Ｘ−Ｙ−、−Ｏ−Ｎ（Ｒａ）−、−Ｎ（Ｒａ）−Ｏ−、−ＮＲａ−ＣＲａＲｂ−ＣＲａＲｂ−、又は−ＮＲａ−ＣＲａＲｂ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は全て同時に水素である。Ｒａ及びＲｂは、有利には、水素、ハロゲン、アルキル、及びアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロ、及びメトキシメチルから独立して選択される。具体的な実施形態では、Ｒａはアルキル、例えばメチルであり、Ｒｂは水素又はメチル、特に水素である。（Ｓｅｔｈら、「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ」（２０１０年）、前掲）。
【０１２５】
本発明の具体的な実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−である（Ｓｅｔｈら、「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ」（２０１０年）、前掲）。
【０１２６】
本発明の具体的な実施形態では、Ｒ５及びＲ５＊は、両方とも同時に水素である。本発明の別の特定の実施形態では、Ｒ５及びＲ５＊の一方は水素であり、他方はメチルなどのアルキルである。そのような実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、特に水素であり得、−Ｘ−Ｙ−は、特に−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−ＣＨＣ（Ｒａ）３−、例えば−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−などであり得る。
【０１２７】
本発明の具体的な実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、例えば−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は、全て同時に水素である。そのような特定の実施形態では、Ｒａは、特にアルキル、例えばメチルであり、Ｒｂは、水素又はメチル、特に水素であり得る。そのようなＬＮＡヌクレオシドはまた、立体配座制限ヌクレオチド（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ＣＲＮ）としても知られており、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３／０３６８６８号に開示されている。
【０１２８】
本発明の具体的な実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−、例えば−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は、全て同時に水素である。Ｒａ及びＲｂは、有利には、水素、ハロゲン、アルキル、及びアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロ、及びメトキシメチルから独立して選択される。そのような特定の実施形態では、Ｒａは、特にアルキル、例えばメチルであり得、Ｒｂは、水素又はメチル、特に水素であり得る。そのようなＬＮＡヌクレオシドはまた、ＣＯＣヌクレオチドとしても知られており、参照により本明細書に組み込まれるＭｉｔｓｕｏｋａら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（２００９年）第３７巻第４号第１２２５〜１２３８頁に開示されている。
【０１２９】
特に指定しない限り、ＬＮＡヌクレオシドはβ−Ｄ又はα−Ｌステレオアイソフォーム（ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｆｏｒｍ）であり得ると認識される。
【０１３０】
本発明のＬＮＡヌクレオシドの特定の例をスキーム１に示す（式中、Ｂは上で定義した通りである）。
【０１３１】
スキーム１
2021529525.tif 000036
【０１３２】
特定のＬＮＡヌクレオシドは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、６’−メチル−β−Ｄ−オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）−６’−メチル−β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡである。
【０１３３】
本発明の出発物質又は化合物が、１つ以上の反応工程の反応条件下で安定でないか又は反応性である１つ以上の官能基を含む場合、適切な保護基（例えば、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、第３版（１９９９年）、Ｗｉｌｅｙ、ニューヨークに記載）を、当技術分野で周知の重要な工程適用方法の前に導入することができる。そのような保護基は、文献に記載の標準的な方法を用いて、合成の後の段階で除去することができる。保護基の例は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、及びｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）である。
【０１３４】
本明細書に記載される化合物は、数個の不斉中心を含むことができ、光学的に純粋な鏡像異性体、例えばラセミ体などの鏡像異性体の混合物、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性体ラセミ体、又はジアステレオ異性体ラセミ体の混合物として存在することができる。
【０１３５】
用語「不斉炭素原子」は、４つの異なる置換基を有する炭素原子を意味する。カーン・インゴルド・プレローグ順位則によれば、不斉炭素原子は、「Ｒ」又は「Ｓ」立体配置のものであり得る。
【０１３６】
化学基の定義
本明細書において、用語「アルキル」は、単独又は組合せで、１〜８個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基、特に１〜６個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基、より具体的には１〜４個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基を意味する。直鎖及び分岐鎖Ｃ１−Ｃ８アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、異性体ペンチル、異性体ヘキシル、異性体ヘプチル、及び異性体オクチル、特にメチル、エチル、プロピル、ブチル、及びペンチルである。アルキルの特定の例は、メチル、エチル、及びプロピルである。
【０１３７】
用語「シクロアルキル」は、単独又は組合せで、３〜８個の炭素原子を有するシクロアルキル環、特に３〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル環を意味する。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチル、より具体的にはシクロプロピル及びシクロブチルである。「シクロアルキル」の特定の例は、シクロプロピルである。
【０１３８】
用語「アルコキシ」は、単独又は組合せで、式アルキル−Ｏ−の基を意味し、用語「アルキル」は、以前付与した意味、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ．ブトキシ、及びｔｅｒｔ．ブトキシを意味する。特定の「アルコキシ」は、メトキシ及びエトキシである。メトキシエトキシは、「アルコキシアルコキシ」の特定の例である。
【０１３９】
用語「オキシ」は、単独又は組合せで、−Ｏ−基を意味する。
【０１４０】
用語「アルケニル」は、単独又は組合せで、オレフィン結合と、最大８個まで、好ましくは最大６個まで、特に好ましくは最大４個までの炭素原子とを含む直鎖又は分岐鎖炭化水素残基を意味する。アルケニル基の例は、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、及びイソブテニルである。
【０１４１】
用語「アルキニル」は、単独又は組合せで、三重結合と、最大８個まで、好ましくは最大６個まで、特に好ましくは最大４個までの炭素原子とを含む直鎖又は分岐鎖炭化水素残基を意味する。
【０１４２】
用語「ハロゲン」又は「ハロ」は、単独又は組合せで、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素、特にフッ素、塩素、又は臭素、より具体的にはフッ素を意味する。用語「ハロ」は、別の基と組合わせて、少なくとも１つのハロゲン、特に１〜５個のハロゲン、特に１〜４個のハロゲン、すなわち１個、２個、３個、又は４個のハロゲンで置換された該基の置換を示す。
【０１４３】
用語「ハロアルキル」は、単独又は組合せで、少なくとも１つのハロゲン、特に１〜５個のハロゲン、特に１〜３個のハロゲンで置換されたアルキル基を意味する。ハロアルキルの例には、モノフルオロ−、ジフルオロ−、又はトリフルオロ−メチル、−エチル、又は−プロピル、例えば３，３，３−トリフルオロプロピル、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、フルオロエチル、又はトリフルオロメチルが含まれる。フルオロメチル、ジフルオロメチル、及びトリフルオロメチルは、特定の「ハロアルキル」である。
【０１４４】
用語「ハロシクロアルキル」は、単独又は組合せで、少なくとも１つのハロゲンで置換された、特に１〜５個のハロゲン、特に１〜３個のハロゲンで置換された、上記に定義したシクロアルキル基を意味する。「ハロシクロアルキル」の特定の例は、ハロシクロプロピル、特にフルオロシクロプロピル、ジフルオロシクロプロピル、及びトリフルオロシクロプロピルである。
【０１４５】
用語「ヒドロキシル」及び「ヒドロキシ」は、単独又は組合せで、−ＯＨ基を意味する。
【０１４６】
用語「チオヒドロキシル」及び「チオヒドロキシ」は、単独又は組合せで、−ＳＨ基を意味する。
【０１４７】
用語「カルボニル」は、単独又は組合せで、−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。
【０１４８】
用語「カルボキシ」又は「カルボキシル」は、単独又は組合せで、−ＣＯＯＨ基を意味する。
【０１４９】
用語「アミノ」は、単独又は組合せで、第一級アミノ基（−ＮＨ２）、第二級アミノ基（−ＮＨ−）、又は第三級アミノ基（−Ｎ−）を意味する。
【０１５０】
用語「アルキルアミノ」は、単独又は組合せで、１個又は２個の上記に定義したアルキル基で置換された、上記に定義したアミノ基を意味する。
【０１５１】
用語「スルホニル」は、単独又は組合せで、−ＳＯ２基を意味する。
【０１５２】
用語「スルフィニル」は、単独又は組合せで、−ＳＯ−基を意味する。
【０１５３】
用語「スルファニル」は、単独又は組合せで、−Ｓ−基を意味する。
【０１５４】
用語「シアノ」は、単独又は組合せで、−ＣＮ基を意味する。
【０１５５】
用語「アジド」は、単独又は組合せで、−Ｎ３基を意味する。
【０１５６】
用語「ニトロ」は、単独又は組合せで、ＮＯ２基を意味する。
【０１５７】
用語「ホルミル」は、単独又は組合せで、−Ｃ（Ｏ）Ｈ基を意味する。
【０１５８】
用語「カルバモイル」は、単独又は組合せで、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２基を意味する。
【０１５９】
用語「カバミド」は、単独又は組合せで、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２基を意味する。
【０１６０】
用語「アリール」は、単独又は組合せで、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、及びホルミルから独立して選択される１〜３個の置換基で場合により置換された、６〜１０個の炭素環原子を含む、一価芳香族炭素環式単環又は二環式環系を示す。アリールの例には、フェニル及びナフチル、特にフェニルが含まれる。
【０１６１】
用語「ヘテロアリール」は、単独又は組合せで、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１、２、３、又は４個のヘテロ原子を含み、残りの環原子は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル及びホルミルから独立して選択される１〜３個の置換基で場合により置換された炭素である、５〜１２個の環原子の一価芳香族複素環式単環又は二環式環系を示す。ヘテロアリールの例には、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、イソオキサゾリル、ベンゾフラニル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、カルバゾリル又はアクリジニルが含まれる。
【０１６２】
用語「ヘテロシクリル」は、単独又は組合せで、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１、２、３、又は４個の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、及びホルミルから独立して選択される１〜３個の置換基で場合により置換された炭素である、４〜１２、特に４〜９個の環原子の一価飽和又は部分不飽和単環又は二環式環系を意味する。単環式飽和ヘテロシクリルの例には、アゼチジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロ−チエニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、チアゾリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル、アゼパニル、ジアゼパニル、ホモピペラジニル、又はオキサゼパニルが含まれる。二環式飽和ヘテロシクロアルキルの例は、８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、キヌクリジニル、８−オキサ−３−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル、３−オキサ−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル、又は３−チア−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニルである。部分不飽和ヘテロシクロアルキルの例は、ジヒドロフリル、イミダゾリニル、ジヒドロ−オキサゾリル、テトラヒドロ−ピリジニル、又はジヒドロピラニルである。
【０１６３】
薬学的に許容される塩
用語「薬学的に許容される塩」は、生物学的に又は別様に望ましくないものではない、遊離塩基又は遊離酸の生物学的有効性及び特性を保持する塩を指す。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、特に塩酸、及び酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ−アセチルシステインなどの有機酸と共に形成される。加えて、これらの塩は、無機塩基又は有機塩基を遊離酸に加えることにより調製され得る。無機塩基から誘導される塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩が含まれるがこれらに限定されない。有機塩基から誘導される塩には、第一級、第二級、及び第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環式アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リシン、アルギニン、Ｎ−エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂の塩が含まれるがこれらに限定されない。式（Ｉ）の化合物は、双性イオンの形態で存在することもできる。特に好ましくは、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、及びメタンスルホン酸の塩である。
【０１６４】
保護基
用語「保護基」は、単独又は組合せで、化学反応が別の非保護の反応性部位で選択的に行われ得るように、多官能化合物の反応性部位を選択的に遮断する基を意味する。保護基は、除去することができる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基、又はヒドロキシ保護基である。
【０１６５】
ヌクレアーゼ媒介分解
ヌクレアーゼ媒介分解は、相補的なヌクレオチド配列と二重鎖を形成するときに、そのような配列の分解を媒介することができるオリゴヌクレオチドを指す。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ媒介分解を介して機能し得、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはＲＮａｓｅ  Ｈなどのエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を動員することができる。ヌクレアーゼ媒介メカニズムを介して機能するオリゴヌクレオチド設計の例は、少なくとも５又は６の連続（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ）ＤＮＡヌクレオシドの領域を典型的に含み、親和性増強ヌクレオシド、例えばギャップマ、ヘッドマ（ｈｅａｄｍｅｒ）、及びテイルマ（ｔａｉｌｍｅｒ）が片側又は両側に隣接するオリゴヌクレオチドである。
【０１６７】
ＲＮａｓｅ  Ｈ活性及び動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ  Ｈ活性とは、相補的ＲＮＡ分子と二重鎖を形成するときにＲＮａｓｅ  Ｈを動員するその能力を指す。国際公開第ＷＯ０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を決定するインビトロ法を提供し、これはＲＮａｓｅＨを動員する能力の決定に使用され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸が提供された場合、ｐｍｏｌ／Ｌ／分で測定して、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチドの全モノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドを使用し、そして国際公開第ＷＯ０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１〜９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期率の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％又は２０％超を有する場合に、ＲＮａｓｅ  Ｈを動員することができると見なされる。ＲＨａｓｅ  Ｈ活性の決定に使用するために、組換えヒトＲＮａｓｅ  Ｈ１がＬｕｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ、Ｌｕｃｅｒｎｅ（スイス）から入手可能である。
【０１６８】
ギャップマ
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列はギャップマであってもよく、また、ギャップマオリゴヌクレオチド又はギャップマ設計とも称され得る。アンチセンスギャップマは、通常、ＲＮａｓｅ  Ｈ媒介分解を介して標的核酸を阻害するのに使用される。ギャップマオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの区別される構造領域、５’−フランク、ギャップ及び３’−フランク、Ｆ−Ｇ−Ｆ’を５’−＞３’配向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ  Ｈを動員することを可能にする連続ＤＮＡヌクレオチドのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を含む。ギャップ領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’隣接領域（Ｆ）と、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’隣接領域（Ｆ’）とが隣接する。領域Ｆ及びＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する（すなわち、これは親和性増強糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡ及び２’−ＭＯＥから独立して選択される、例えば高親和性２’糖修飾である。
【０１６９】
ギャップマ設計において、ギャップ領域の最も５’及び３’のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、各々、５’（Ｆ）又は３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して位置する。フランクは更に、ギャップ領域から最も遠い端、すなわち５’フランクの５’末端及び３’フランクの３’末端に少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義してもよい。
【０１７０】
領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’は、連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ−Ｇ−Ｆ’のギャップマ領域を含んでもよい。
【０１７１】
ギャップマ設計Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長は、例えば１２〜３２ヌクレオシド、例えば１３〜２４、例えば１４〜２２ヌクレオシド、例えば１４〜１７、例えば１６〜１８ヌクレオシド、例えば１６〜２０ヌクロチド（ｎｕｃｌｏｔｉｄｅ）であってもよい。
【０１７２】
例として、本発明のギャップマオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ１−８−Ｇ６−１６−Ｆ’２−８、例えば
Ｆ２−８−Ｇ６−１４−Ｆ’２−８、例えば
Ｆ３−８−Ｇ６−１４−Ｆ’２−８
ただし、ギャップマ領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長は、少なくとも１０、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。
【０１７３】
本発明の一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’のギャップマからなるか又はそれを含み、式中、領域Ｆ及びＦ’が独立して１〜８個のヌクレオシドを含むか又はそれらからなり、そのうち２〜４個が２’糖修飾され、Ｆ及びＦ’領域の５’及び３’末端を規定し、ＧがＲＮａｓｅ  Ｈを動員することができる６〜１６個のヌクレオシドの領域である。
【０１７４】
領域Ｆ、Ｇ、及びＦ’は、更に以下に定義され、Ｆ−Ｇ−Ｆ’式に組み込むことができる。
【０１７５】
ギャップマ−領域Ｇ
ギャップマの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ  Ｈ、例えばヒトＲＮａｓｅ  Ｈ１を動員することを可能にするヌクレオシド、典型的にはＤＮＡヌクレオシドの領域である。ＲＮａｓｅ  Ｈは、ＤＮＡとＲＮＡとの間の二重鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素的に切断する細胞酵素である。好適には、ギャップマは、少なくとも５又は６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば５〜１６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば６〜１５連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば７〜１４連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば８〜１２連続ＤＮＡヌクレオチド、例えば８〜１２連続ＤＮＡヌクレオチド長のギャップ領域（Ｇ）を有し得る。ギャップ領域Ｇは、いくつかの実施形態では、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６連続ＤＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。ギャップ領域のシトシン（Ｃ）ＤＮＡは、いくつかの場合においてメチル化されていてもよく、そのような残基には５’−メチル−シトシン（ｍｅＣ、又はｃの代わりにｅ）と注釈が付けられる。ギャップ中のシトシンＤＮＡのメチル化は、ｃｇジヌクレオチドが潜在的な毒性を低減するようにギャップ中に存在する場合に有利であり、修飾はオリゴヌクレオチドの効力に有意な影響を及ぼさない。５’メチルＤＮＡヌクレオシドのような５’置換ＤＮＡヌクレオシドは、ＤＮＡギャップ領域での使用が報告されている（欧州特許出願公開第ＥＰ２７４２１３６号）。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ギャップ領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６連続ホスホロチオエート結合ＤＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。いくつかの実施形態では、ギャップ内の全ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【０１７７】
従来のギャップマはＤＮＡギャップ領域を有するが、ギャップ領域内で使用される場合にＲＮａｓｅ  Ｈ動員を可能にする修飾ヌクレオシドの多数の例が存在する。ギャップ領域内に含まれる場合にＲＮａｓｅＨの動員が可能であるとして報告されている修飾ヌクレオシドには、例えば、α−Ｌ−ＬＮＡ、Ｃ４’−アルキル化ＤＮＡ（国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９号及びＶｅｓｔｅｒら、「Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．」第１８号（２００８年）第２２９６〜２３００頁に記載されている通り、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）、ＡＮＡ及び２’Ｆ−ＡＮＡのようなアラビノース由来ヌクレオシド（Ｍａｎｇｏｓら（２００３年）「Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．」第１２５巻第６５４〜６６１頁）、ＵＮＡ（アンロックド核酸）（参照により本明細書に組み込まれるＦｌｕｉｔｅｒら、「Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．」（２００９年）第１０巻第１０３９頁に記載されている通り）が含まれる。ＵＮＡは、典型的には、リボースのＣ２とＣ３の間の結合が除去され、アンロックド「糖」残基を形成しているアンロックド核酸である。そのようなギャップマに使用されている修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域内に導入された際に２’エンド（ｅｎｄｏ）（ＤＮＡ様）構造を採択する（すなわち、ＲＮａｓｅ  Ｈ動員を可能にする修飾）ヌクレオシドであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡギャップ領域（Ｇ）は、場合により、ギャップ領域内に導入された際に２’エンド（ＤＮＡ様）構造を採択する１〜３糖修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
【０１７８】
領域Ｇ−「ギャップブレーカ」
あるいは、いくつかのＲＮａｓｅ  Ｈ活性を保持しながら、ギャップマのギャップ領域に３’エンド立体配座を付与する修飾ヌクレオシドの挿入についての多くの報告が存在する。１つ以上の３’エンド修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を有するそのようなギャップマは、「ギャップブレーカ」又は「ギャップ破壊」ギャップマと称される。例えば、国際公開第ＷＯ２０１３／０２２９８４号を参照されたい。ギャップブレーカオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ  Ｈ動員を可能にするために、ギャップ領域内にＤＮＡヌクレオシドの十分な領域を保持する。ギャップブレーカオリゴヌクレオチド設計がＲＮａｓｅ  Ｈを動員する能力は、典型的には、配列又は化合物固有である（Ｒｕｋｏｖら（２０１５年）「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」第４３巻第８４７６〜８４８７頁を参照されたい）。これは、いくつかの場合、標的ＲＮＡのより特異的な切断を提供するＲＮａｓｅ  Ｈを動員する「ギャップブレーカ」オリゴヌクレオチドを開示している。ギャップブレーカオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で使用される修飾ヌクレオシドは、例えば、３’エンド確証（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を付与する修飾ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−メチル（ＯＭｅ）若しくは２’−Ｏ−ＭＯＥ（ＭＯＥ）ヌクレオシド、又はβ−Ｄ  ＬＮＡヌクレオシド（ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’との間の架橋が、β立体配座である）、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡ若しくはＳｃＥＴヌクレオシドであってもよい。
【０１７９】
上述した領域Ｇを含むギャップマと同様に、ギャップブレーカ又はギャップ破壊ギャップマのギャップ領域は、ギャップの５’末端に（領域Ｆの３’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有し、ギャップの３’末端に（領域Ｆの５’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有する。破壊ギャップを含むギャップマは、典型的には、ギャップ領域の５’末端又は３’末端のいずれかに少なくとも３又は４連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を保持する。
【０１８０】
ギャップブレーカオリゴヌクレオチドの例示的な設計は、
Ｆ１−８−［Ｄ３−４−Ｅ１−Ｄ３−４］−Ｆ’１−８
Ｆ１−８−［Ｄ１−４−Ｅ１−Ｄ３−４］−Ｆ’１−８
Ｆ１−８−［Ｄ３−４−Ｅ１−Ｄ１−４］−Ｆ’１−８
を含み、領域Ｇは、［Ｄｎ−Ｅｒ−Ｄｍ］内であり、ＤがＤＮＡヌクレオシドの連続配列であり、Ｅが修飾ヌクレオシド（ギャップブレーカ又はギャップ破壊ヌクレオシド）であり、Ｆ及びＦ’が本明細書に定義した隣接領域であるが、ただし、ギャップマ領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ギャップ破壊ギャップマの領域Ｇは、少なくとも６ＤＮＡヌクレオシド、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６ＤＮＡヌクレオシドを含む。上述したように、ＤＮＡヌクレオシドは連続であってもよいか、又は場合により１つ以上の修飾ヌクレオシドが散在してもよいが、ただし、ギャップ領域Ｇは、ＲＮａｓｅ  Ｈ動員を媒介できることを条件とする。
【０１８２】
ギャップマ−隣接領域、Ｆ及びＦ’
領域Ｆは、領域Ｇの５’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、又はＬＮＡヌクレオシドである。
【０１８３】
領域Ｆ’は、領域Ｇの３’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆ’の最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、又はＬＮＡヌクレオシドである。
【０１８４】
領域Ｆは、１〜８連続ヌクレオチド長、例えば２〜６、例えば３〜４連続ヌクレオチド長である。有利には、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば２つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。
【０１８５】
領域Ｆ’は、２〜８連続ヌクレオチド長、例えば３〜６、例えば４〜５連続ヌクレオチド長である。有利には、領域Ｆ’の最も３’の実施形態は、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば２つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。
【０１８６】
領域Ｆ又は領域Ｆ’の長さが１である場合、それはＬＮＡヌクレオシドであることに留意するべきである。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、領域Ｆ及び領域Ｆ’は、独立して、糖修飾ヌクレオシドの連続配列からなるか又はそれを含む。いくつかの実施形態では、領域Ｆの糖修飾ヌクレオシドは、独立して、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、及び２’−フルオロ−ＡＮＡ単位から選択されてもよい。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、領域Ｆ及び領域Ｆ’は、独立して、ＬＮＡ及び２’置換修飾ヌクレオシドの両方を含む（混合ウイング設計）。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、領域Ｆ及び領域Ｆ’は、１タイプのみの糖修飾ヌクレオシド、例えばＭＯＥのみ、又はβ−Ｄ−オキシＬＮＡのみ、又はＳｃＥＴのみからなる。このような設計はまた、均一フランク又は均一ギャップマ設計とも称される。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、領域Ｆ若しくはＦ’の全ヌクレオシド、又はＦ及びＦ’は、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡ、ＥＮＡ、又はＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択される、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆは、１〜５、例えば２〜４、例えば３〜４、例えば１、２、３、４、又は５連続ＬＮＡヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の全ヌクレシドは、β−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドである。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、領域Ｆ若しくはＦ’の全ヌクレシド、又はＦ及びＦ’は、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥである。いくつかの実施形態では、領域Ｆは、１、２、３、４、５、６、７、又は８連続ＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、隣接領域の１つのみが、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドからなり得る。いくつかの実施形態では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドからなるのは５’（Ｆ）隣接領域であり、一方で、３’（Ｆ’）隣接領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド又はｃＥＴヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドからなるのは３’（Ｆ’）隣接領域であり、一方で、５’（Ｆ）隣接領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド又はｃＥＴヌクレオシドを含む。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の全修飾ヌクレオシドが、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡ、ＥＮＡ、又はＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択されるようなＬＮＡヌクレオシドであり、ここで、領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦ及びＦ’は、場合によりＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい（交互フランク、詳細にはこれらの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の全修飾ヌクレオシドはβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、ここで、領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦ及びＦ’は、場合によりＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい（交互フランク、詳細にはこれらの定義を参照されたい）。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の最も５’及び最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド又はＳｃＥＴヌクレオシドである。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、領域Ｆと領域Ｇとの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｇとの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ又はＦ’、Ｆ及びＦ’の間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０１９５】
ＬＮＡギャップマ
ＬＮＡギャップマは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方のいずれかが、ＬＮＡヌクレオシドを含むか又はそれらからなるギャップマである。β−Ｄ−オキシギャップマは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方のいずれかが、β−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか又はそれらからなるギャップマである。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマは、式：［ＬＮＡ］１−５−［領域Ｇ］−［ＬＮＡ］１−５のものであり、ここで、領域Ｇはギャップマ領域Ｇの定義に規定した通りである。
【０１９７】
一実施形態では、ＬＮＡギャップマは、式［ＬＮＡ］４−［領域Ｇ］１０−１２−［ＬＮＡ］４のものである。
【０１９８】
ＭＯＥギャップマ
ＭＯＥギャップマは、領域Ｆ及びＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマである。いくつかの実施形態では、ＭＯＥギャップマは、設計［ＭＯＥ］１−８−［領域Ｇ］５−１６−［ＭＯＥ］１−８、例えば［ＭＯＥ］２−７−［了解Ｇ］６−１４−［ＭＯＥ］２−７、例えば［ＭＯＥ］３−６−［領域Ｇ］８−１２−［ＭＯＥ］３−６のものであり、ここで、領域Ｇはギャップマの定義に規定した通りである。５−１０−５設計（ＭＯＥ−ＤＮＡ−ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマは、当該技術分野で広く使用されている。
【０１９９】
混合ウイングギャップマ
混合ウイングギャップマは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、及び２’−フルオロ−ＡＮＡ単位からなる群より独立して選択される２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含み、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群より独立して選択される。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が、少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含み、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群より独立して選択される。いくつかの混合ウイング実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方が、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドを更に含んでもよい。
【０２００】
混合ウイングギャップマ設計は、国際公開第ＷＯ２００８／０４９０８５号及び国際公開第ＷＯ２０１２／１０９３９５号（これらの両方は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０２０１】
交互フランクギャップマ
隣接領域は、ＬＮＡ及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含み得、それらがＬＮＡ−ＤＮＡ−ＬＮＡヌクレオシドの交互モチーフを含むので、「交互フランク」と称される。このような交互フランクを含むギャップマは、「交互フランクギャップマ」と称される。「交互フランクギャップマ」はＬＮＡギャップマオリゴヌクレオチドであり、フランクの少なくとも一方（Ｆ又はＦ’）が、ＬＮＡヌクレオシド（複数可）に加えてＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、領域Ｆ若しくはＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方は、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施形態では、隣接領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦ及びＦ’の両方は、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、ここで、Ｆ及び／又はＦ’領域の最も５’及び３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。
【０２０２】
交互フランクＬＮＡギャップマは、国際公開第ＷＯ２０１６／１２７００２号に開示されている。
【０２０３】
交互フランク領域は、１〜２個、又は１個、又は２個、又は３個の連続したＤＮＡヌクレオシドといった最大３個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含むことができる。
【０２０４】
交互フラック（ｆｌａｋ）は、いくつかのＬＮＡヌクレオシド（Ｌ）、それに続くいくつかのＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）、例えば、
［Ｌ］１−３−［Ｄ］１−４−［Ｌ］１−３
［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−２−［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−２−［Ｌ］１−２を表す一連の整数として注解することができる。
【０２０５】
オリゴヌクレオチド設計においては、これらは、２−２−１が５’［Ｌ］２−［Ｄ］２−［Ｌ］３’を表し、１−１−１−１−１が５’［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］３’を表すような数として表されることが多い。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドにおけるフランクの長さ（領域Ｆ及びＦ’）は、独立して、３〜１０ヌクレオシド、例えば４〜８ヌクレオシド、例えば５〜６ヌクレオシド、例えば４、５、６、又は７個の修飾ヌクレオシドであり得る。いくつかの実施形態では、ギャップマオリゴヌクレオチド中のフランクの一方のみが交互であるが、他方はＬＮＡヌクレオチドから構成される。更なるエキソヌクレアーゼ耐性を付与するために、３’フランク（Ｆ’）の３’末端に少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを有することが有利であり得る。一実施形態では、交互フランクギャップマ内のフランクは、全長５〜８個のヌクレオシドを有し、そのうちの３〜５個はＬＮＡヌクレオシドである。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドのいくつかの例は：
［Ｌ］１−５−［Ｄ］１−４−［Ｌ］１−３−［Ｇ］５−１６−［Ｌ］２−６
［Ｌ］１−２−［Ｄ］２−３−［Ｌ］３−４−−［Ｇ］５−７−［Ｌ］１−２−［Ｄ］２−３−［Ｌ］２−３
［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−２−［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−２−［Ｌ］１−２−［Ｇ］５−１６−［Ｌ］１−２−［Ｄ］１−３−［Ｌ］２−４
［Ｌ］１−５−［Ｇ］５−１６−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］２
［Ｌ］４−［Ｇ］６−１０−［Ｌ］−［Ｄ］３−［Ｌ］２であるが、
ただし、ギャップマの全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。
【０２０６】
オリゴヌクレオチドにおける領域Ｄ’又はＤ’’
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマＦ−Ｇ−Ｆ’、並びに更に５’及び／又は３’ヌクレオシドを含むか又はそれからなり得る。更なる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であってもよく、又は完全に相補的でなくてもよい。このような更なる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、本明細書で領域Ｄ’及びＤ’’と称され得る。
【０２０７】
領域Ｄ’又はＤ’’の追加は、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマなどをコンジュゲート部分又は別の官能基に連結することを目的として用いられ得る。連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分に連結するのに使用される場合、生体切断可能なリンカとしての役割を果たし得る。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏａｓｅ）保護を提供するために、又は合成若しくは製造を容易にするために使用され得る。
【０２０８】
領域Ｄ’及びＤ’’は、各々、領域Ｆの５’末端又は領域Ｆ’の３’末端に結合され得、以下の式Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’又は
【０２０９】
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’の設計を生成することができる。この場合、Ｆ−Ｇ−Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマ部分であり、領域Ｄ’又はＤ’’はオリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。
【０２１０】
領域Ｄ’又はＤ’’は、独立して、１、２、３、４、又は５個の追加のヌクレオチドを含むか又はそれからなり、これは標的核酸に相補的であっても、又は相補的でなくてもよい。Ｆ又はＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はこれらの塩基修飾バージョンなどの糖修飾ヌクレオチドではない。Ｄ’及びＤ’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカとしての役割を果たし得る（リンカの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で連結され、ＤＮＡ又はＲＮＡである。領域Ｄ’及びＤ’’としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカは、国際公開第ＷＯ２０１４／０７６１９５号に開示されており、これは例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを含む。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカの使用は国際公開第ＷＯ２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物（例えば、ギャップマ領域）を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。
【０２１１】
一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’及び／又はＤ’’を含む。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ−Ｇ−Ｆ’；特に、Ｆ２−８−Ｇ６−１６−Ｆ’２−８
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、特にＤ’２−３−Ｆ１−８−Ｇ６−１６−Ｆ’２−８
Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’、特にＦ２−８−Ｇ６−１６−Ｆ’２−８−Ｄ’’１−３
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’、特にＤ’１−３−Ｆ２−８−Ｇ６−１６−Ｆ’２−８−Ｄ’’１−３
【０２１３】
いくつかの実施形態では、領域Ｄ’と領域Ｆとの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｄ’’との間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。
【０２１４】
コンジュゲート
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）。
【０２１５】
１つ以上の非ヌクレオチド部分に対する本発明のオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取込み、又は安定性に影響を及ぼすことにより、オリゴヌクレオチドの薬理学を改善することができる。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、浸透性、及び／又は細胞取込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を調節又は向上させる。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織、又は細胞型に標的化し、それにより、その器官、組織、又は細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を増強し得る。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織、又は器官内のオリゴヌクレオチドの活性を低減するのに役立ち得る（例えば、非標的細胞型、組織、又は器官内のオフターゲット活性又は活性）。
【０２１６】
オリゴヌクレオチドコンジュゲート及びそれらの合成は、Ｍａｎｏｈａｒａｎ、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ編、第１６章、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（２００１年）及びＭａｎｏｈａｒａｎ、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（２００２年）第１２巻第１０３頁による包括的レビューにおいても報告されており、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２１７】
一実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）、又はそれらの組合せからなる群より選択される。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２／１４３３７９号に開示されているような、トランスフェリン受容体に対して特異的親和性を有する抗体又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分は、抗体又は抗体断片、例えば血液脳関門を通る送達を促進する抗体又は抗体断片、特にトランスフェリン受容体を標的とする抗体又は抗体断片である。
【０２１９】
リンカ
結合又はリンカは、１つ以上の共有結合を介して目的の１つの化学基又はセグメントを目的の別の化学基又はセグメントに結合する、２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接、又は結合部分（例えば、リンカ又はテザー）を介してオリゴヌクレオチドに付着させることができる。リンカは、例えばコンジュゲート部分などの第３の領域（領域Ｃ）を、例えば標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列などの第１の領域（領域Ａ）に共有結合的に連結するのに役立つ。
【０２２０】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、場合により、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ又は第１の領域）の間に位置するリンカ領域（第２の領域又は領域Ｂ及び／又は領域Ｙ）と、コンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）とを含み得る。
【０２２１】
領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇する又は遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか又はそれからなる、生体切断可能なリンカを指す。生理学的に不安定なリンカが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化若しくは還元条件、又は薬剤などの化学条件、及び哺乳動物細胞で見られる又は遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件にはまた、タンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ感受性リンカは、１〜１０のヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のヌクレオシドを含み、より好ましくは２〜６のヌクレオシドを含み、最も好ましくは２〜４の連結されたヌクレオシドを含み、これは少なくとも３又は４又は５の連続したホスホジエステル結合といった少なくとも２つの連続ホスホジエステル結合を含む。好ましくは、ヌクレオシドはＤＮＡ又はＲＮＡである。ホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカは、国際公開第ＷＯ２０１４／０７６１９５号（参照により本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されている。
【０２２２】
領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａ又は第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカを指す。領域Ｙリンカは、エチレングリコール、アミノ酸単位、又はアミノアルキル基などの反復単位の鎖構造又はオリゴマーを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の領域要素Ａ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｙ−Ｃ、Ａ−Ｙ−Ｂ−Ｃ、又はＡ−Ｙ−Ｃから構築することができる。いくつかの実施形態では、リンカ（領域Ｙ）は、例えばＣ２−Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルであり、例えば、Ｃ６−Ｃ１２アミノアルキル基を含む。好ましい実施形態では、リンカ（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。
【０２２３】
治療
用語「治療」とは、本明細書で使用される場合、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患又は障害）の治療、又は疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施形態では、予防的であり得ることが認識されるであろう。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、治療は、タウオパチ、アルツハイマ病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）及び１７番染色体連鎖しパーキンソニズムを伴うＦＴＤ（ＦＴＤＰ−１７）、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀性顆粒病（ＡＧＤ）、変化優位型老年認知症（ＴＰＳＤ）、原発性年齢関連タウオパチ（ＰＡＲＴ）、ダウン症候群、並びにリティコ−ボディグ病を含む神経変性疾患からなる群より選択された神経学的障害などの、神経学的障害と診断されている患者に実施される。病理学的Ｔａｕのアップレギュレーションは、一側性巨脳症（ｈｅｍｉｍｅｇａｌｅｎｃｅｐｈａｌｙ：ＨＭＥ）、結節性硬化症、限局性皮質異形成２ｂ型、及び神経節膠腫を含む小児タウオパチ（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  Ｔａｕｏｐａｔｈｉｅｓ）と関連する。加えて、異常なＴａｕ発現及び／又は機能は、脳内鉄沈着を伴う神経変性症１型（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｂｒａｉｎ  ｉｒｏｎ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｙｐｅ  １：ＮＢＩＡ１）としても知られるハラーホルデン・スパッツ症候群、神経節細胞腫、及び亜急性硬化性全脳炎のような他の疾患とも関連する可能性がある。Ｔａｕはまた、発作性障害（例えば、てんかん）、ネットワーク機能障害（例えば、抑鬱）、及び運動障害（例えば、パーキンソン病）においても役割を果たし得る。
【発明を実施するための形態】
【０２２５】
本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、Ｔａｕの発現を調節する、例えばＴａｕを阻害（ダウンレギュレート）することができるオリゴヌクレオチドに関する。この調節は、Ｔａｕをコードする標的核酸にハイブリダイズすることによって達成される。標的核酸は、配列番号１及び２からなる群より選択される配列などの哺乳動物ＭＡＰＴ  ｍＲＮＡ配列であり得る。
【０２２６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｔａｕ発現の低下をもたらすＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的の発現を阻害又はダウンレギュレートすることにより調節することができる。好ましくは、そのような調節は、標的の正常な発現レベルと比較して標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０％、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の阻害をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、初代神経細胞への５μＭオリゴヌクレオチドの適用後、インビトロで少なくとも６０％又は７０％だけＴａｕ  ｍＲＮＡの発現レベルを阻害することができる。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、初代神経細胞への０．５μＭオリゴヌクレオチドの適用後、インビトロで少なくとも５０％だけＴａｕタンパク質の発現レベルを阻害することができる。好適には、実施例は、Ｔａｕ  ＲＮＡ又はタンパク質阻害を測定するために用いられ得るアッセイを提供する（例えば、実施例１及び実施例３）。標的調節は、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、Ｔａｕ発現の所望の調節を示すのに更に十分であり得る。ミスマッチから生じる結合親和性の低下は、オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド数の増加、及び／又は、標的への結合親和性を増加させることができる修飾ヌクレオシドの数、例えばオリゴヌクレオチド配列内に存在する、ＬＮＡを含む２’糖修飾ヌクレオシドの数の増加により有利に補償され得る。
【０２２８】
本発明の一態様は、配列番号３、４、又は５に対して少なくとも９０％の相補性を有する１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜３０ヌクレオチド長の連続配列を含み、これは、標的核酸又は標的配列の領域と、少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、又は１００％相補的である。
【０２３０】
本発明のオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域に完全に相補的（１００％相補的）である場合、又はいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に１つ又は２つのミスマッチを含み得る場合に有利である。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の１２０５１〜１２１１１位、３９５６２〜３９５９３位、又は７２８３７〜７２９４０位内の連続ヌクレオチドに完全に（又は１００％）相補的であるなど、少なくとも９０％相補的である、１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１及び配列番号２に存在する対応する標的核酸領域に対して１００％相補的である。
【０２３３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表４に列挙された領域の１つから選択される標的配列に相補的である場合に有利である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、少なくとも９０％相補的であり、例えば選択されたＲ１−Ｒ２２５４標的配列（表４）に対して完全に相補的である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、Ｒ＿２２３、Ｒ＿７３８、又はＲ＿１２９８（表４参照）に対して１００％相補的である。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域に対して９０％相補的、例えば完全に相補的である。ここで、該標的核酸領域は、配列番号１の１２０５１〜１２１１１位、例えば配列番号１の１２０５１〜１２０７９位、１２０８５〜１２１１１位、又は１２０６０〜１２０７８位からなる群より選択される。
【０２３５】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域に対して９０％相補的、例えば完全に相補的である。ここで、該標的核酸領域は、配列番号１の３９５６２〜３９５９３位、例えば配列番号１の３９５７３〜３９５９２位からなる群より選択される。
【０２３６】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域に対して９０％相補的、例えば完全に相補的である。ここで、該標的核酸領域は、配列番号１の７２８３７−７２９４０位、例えば配列番号１の７２８６１〜７２８９１位又は７２８６２〜７２８９０位からなる群より選択される。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の１２０６０〜１２０７８位、又は３９５７３〜３９５９２位、又は７２８６２〜７２８９０位内の連続ヌクレオチドに１００％相補的な長さで１６〜２２ヌクレオチド、例えば１６〜２０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜３５ヌクレオチド長、例えば１０〜３０、例えば１１〜２５、例えば１２〜２２、例えば１４〜２０、又は１４〜１８連続ヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６〜２２ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６〜２０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、２２以下のヌクレオチド、例えば２０以下のヌクレオチド、例えば１６、１７、１８、１９、又は２０のヌクレオチドを含むか又はそれからなる。本明細書で提供されるいずれの範囲も、範囲の終点を含むことを理解するべきである。したがって、オリゴヌクレオチドが１０〜３０ヌクレオチドを含むと記される場合、１０ヌクレオチド及び３０ヌクレオチドの両方が含まれる。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０連続ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、表５に列挙された配列からなる群より選択される配列を含むか又はそれからなる（材料及び方法セクション）。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号６〜６５（表５に列挙したモチーフ配列を参照）からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一性、好ましくは１００％同一性である１０〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号９、１１、４９、５３、５６、及び６２（表５に列挙したモチーフ配列を参照）からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一性、好ましくは１００％同一性である１０〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号６〜３７（表５に列挙したモチーフ配列を参照）からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一性、好ましくは１００％同一性である１０〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号９又は１１（表５に列挙したモチーフ配列を参照）の配列と少なくとも９０％同一性、好ましくは１００％同一性である１０〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号３８〜５１（表５に列挙したモチーフ配列を参照）からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一性、好ましくは１００％同一性である１０〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号４９又は５１（表５に列挙したモチーフ配列を参照）の配列と少なくとも９０％同一性、好ましくは１００％同一性である１０〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号５２〜６５（表５に列挙したモチーフ配列を参照）からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一性、好ましくは１００％同一性である１０〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号５６又は６２（表５に列挙したモチーフ配列を参照）の配列と少なくとも９０％同一性、好ましくは１００％同一性である１０〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
【０２５０】
連続核酸塩基配列（モチーフ配列）は、例えばヌクレアーゼ耐性及び／又は標的核酸に対する結合親和性を増大させるために修飾され得ることが理解される。
【０２５１】
修飾ヌクレオシド（高親和性修飾ヌクレオシドなど）がオリゴヌクレオチド配列に組み込まれるパターンは、一般にオリゴヌクレオチド設計と称される。
【０２５２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを用いて設計される。高親和性修飾ヌクレオシドを用いることが有利である。
【０２５３】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、又は少なくとも１６個の修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１〜１０個の修飾ヌクレオシド、例えば２〜９個の修飾ヌクレオシド、例えば３〜８個の修飾ヌクレオシド、例えば４〜７個の修飾ヌクレオシド、例えば６又は７個の修飾ヌクレオシドを含む。好適な修飾は、「修飾ヌクレオシド」、「高親和性修飾ヌクレオシド」、「糖修飾」、「２’糖修飾」、及びロックド核酸（ＬＮＡ）の「定義」セクションに記載されている。
【０２５４】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含む。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ、及びＬＮＡヌクレオシドからなる群より独立して選択される１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。修飾ヌクレオシド（複数可）の１つ以上がロックド核酸（ＬＮＡ）である場合、有利である。
【０２５５】
更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。好適なヌクレオシド間修飾は、「修飾ヌクレオシド間結合」の「定義」セクションに記載されている。連続ヌクレオチド配列内の少なくとも７５％、例えば８０％、例えば全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート又はボラノホスフェートヌクレオシド間結合である場合、有利である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続配列中の全ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、又は８個のＬＮＡヌクレオシド、例えば２〜６個のＬＮＡヌクレオシド、例えば３〜７個のＬＮＡヌクレオシド、４〜８個のＬＮＡヌクレオシド、又は３、４、５、６、７、若しくは８個のＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドにおける修飾ヌクレオシドの少なくとも７５％はＬＮＡヌクレオシドであり、修飾ヌクレオシドの例えば８０％、例えば８５％、例えば９０％は、ＬＮＡヌクレオシド、特にβ−Ｄ−オキシＬＮＡ又はＳｃＥＴである。尚更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシドの全ては、ＬＮＡヌクレオシドである。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡと、以下のＬＮＡヌクレオシド：β−Ｄ又はα−Ｌ立体配置のいずれかのチオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、ＳｃＥＴ、及び／又はＥＮＡの１つ以上との両方、又はそれらの組合せを含んでもよい。更なる実施形態では、全ＬＮＡシトシン単位は、５−メチル−シトシンである。オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列のヌクレアーゼ安定性にとって、ヌクレオチド配列の５’末端に少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドと３’末端に少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドとを有することが有利である。
【０２５７】
本発明の一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ  Ｈを動員することが可能である。
【０２５８】
本発明において、有利な構造設計は、例えば、「ギャップマ」、「ＬＮＡギャップマ」、「ＭＯＥギャップマ」、及び「混合ウイングギャップマ」、「交互フランクギャップマ」の「定義」セクションに記載されているギャップマ設計である。ギャップマ設計には、均一フランク、混合ウイングフランク、交互フランク、及びギャップブレーカ設計のギャップマが含まれる。本発明では、本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｆ−Ｇ−Ｆ’設計のギャップマ、特に式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’のギャップマである場合に有利であり、ここで、領域Ｆ及びＦ’は独立して１〜８個のヌクレオシドを含み、そのうちの２〜５個は２’糖修飾され、Ｆ及びＦ’領域の５’及び３’末端を規定し、ＧはＲＮａｓｅ  Ｈを動員することができる６〜１６個のヌクレオシドの領域、例えば６〜１６個のＤＮＡヌクレオシドを含む領域である。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、ギャップマは、ＬＮＡギャップマである。
【０２６０】
本発明のいくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマは、以下の均一なフランク設計４−１０−４、３−１１−４、４−１１−４、４−１２−４、又は４−１４−２から選択される。
【０２６１】
本発明のいくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマは、以下の交互フランク設計３−１−３−１０−２、１−３−４−６−１−３−２、１−２−１−２−２−８−４、又は３−３−１−８−２−１−２から選択される。
【０２６２】
表５（材料及び方法セクション）は、各モチーフ配列の好ましい設計を列挙する。
【０２６３】
全ての場合において、Ｆ−Ｇ−Ｆ’設計は、「オリゴヌクレオチド中の領域Ｄ’又はＤ’’」の「定義」セクションに記載されるように、領域Ｄ’及び／又はＤ’’を更に含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマ領域の５’末端又は３’末端に、１、２、又は３個のホスホジエステル結合ヌクレオシド単位、例えばＤＮＡ単位を有する。
【０２６４】
本発明のいくつかの実施形態について、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ番号６＿１、７＿１、８＿１、９＿１、９＿２、９＿３、９＿４、９＿５、９＿６、９＿７、９＿８、９＿９、９＿１０、９＿１１、９＿１２、９＿１３、９＿１４、９＿１５、９＿１６、９＿１７、９＿１８、９＿１９、９＿２０、９＿２１、９＿２２、９＿２３、９＿２４、９＿２５、９＿２６、９＿２７、９＿２８、９＿２９、９＿３０、９＿３１、９＿３２、９＿３３、９＿３４、９＿３５、９＿３６、９＿３７、９＿３８、９＿３９、９＿４０、９＿４１、９＿４２、９＿４３、９＿４４、９＿４５、９＿４６、９＿４７、９＿４８、９＿４９、９＿５０、９＿５１、９＿５２、９＿５３、９＿５４、９＿５５、９＿５６、９＿５７、９＿５８、９＿５９、９＿６０、９＿６１、９＿６２、９＿６３、９＿６４、９＿６５、９＿６６、９＿６７、９＿６８、９＿６９、９＿７０、９＿７１、９＿７２、９＿７３、９＿７４、９＿７５、９＿７６、９＿７７、９＿７８、９＿７９、９＿８０、９＿８１、９＿８２、９＿８３、９＿８４、９＿８５、９＿８６、９＿８７、９＿８８、９＿８９、９＿９０、９＿９１、９＿９２、９＿９３、９＿９４、９＿９５、９＿９６、９＿９７、９＿９８、９＿９９、９＿１００、９＿１０１、９＿１０２、９＿１０３、９＿１０４、９＿１０５、９＿１０６、１０＿１、１０＿２、１０＿３、１０＿４、１０＿５、１０＿６、１０＿７、１０＿８、１０＿９、１０＿１０、１０＿１１、１０＿１２、１０＿１３、１０＿１４、１０＿１５、１０＿１６、１０＿１７、１０＿１８、１０＿１９、１０＿２０、１０＿２１、１０＿２２、１０＿２３、１０＿２４、１０＿２５、１０＿２６、１０＿２７、１０＿２８、１０＿２９、１０＿３０、１０＿３１、１０＿３２、１０＿３３、１０＿３４、１０＿３５、１０＿３６、１０＿３７、１０＿３８、１０＿３９、１０＿４０、１０＿４１、１０＿４２、１０＿４３、１０＿４４、１０＿４５、１０＿４６、１０＿４７、１０＿４８、１０＿４９、１０＿５０、１０＿５１、１０＿５２、１０＿５３、１０＿５４、１０＿５５、１０＿５６、１０＿５７、１０＿５８、１０＿５９、１０＿６０、１０＿６１、１０＿６２、１０＿６３、１０＿６４、１０＿６５、１０＿６６、１０＿６７、１０＿６８、１０＿６９、１０＿７０、１０＿７１、１０＿７２、１０＿７３、１０＿７４、１０＿７５、１０＿７６、１０＿７７、１０＿７８、１０＿７９、１０＿８０、１０＿８１、１０＿８２、１０＿８３、１０＿８４、１０＿８５、１０＿８６、１０＿８７、１０＿８８、１０＿８９、１１＿１、１２＿１、１３＿１、１４＿１、１５＿１、１６＿１、１７＿１、１８＿１、１９＿１、２０＿１、２１＿１、２２＿１、２３＿１、２４＿１、２４＿２、２４＿３、２４＿４、２４＿５、２４＿６、２４＿７、２４＿８、２４＿９、２４＿１０、２４＿１１、２４＿１２、２４＿１３、２４＿１４、２４＿１５、２４＿１６、２４＿１７、２４＿１８、２４＿１９、２４＿２０、２４＿２１、２４＿２２、２４＿２３、２４＿２４、２４＿２５、２４＿２６、２４＿２７、２４＿２８、２４＿２９、２４＿３０、２４＿３１、２４＿３２、２４＿３３、２４＿３４、２４＿３５、２４＿３６、２４＿３７、２４＿３８、２４＿３９、２４＿４０、２４＿４１、２４＿４２、２４＿４３、２４＿４４、２４＿４５、２４＿４６、２４＿４７、２４＿４８、２４＿４９、２４＿５０、２４＿５１、２４＿５２、２４＿５３、２４＿５４、２４＿５５、２４＿５６、２４＿５７、２４＿５８、２４＿５９、２４＿６０、２４＿６１、２４＿６２、２５＿１、２５＿２、２５＿３、２５＿４、２５＿５、２５＿６、２５＿７、２５＿８、２５＿９、２５＿１０、２５＿１１、２５＿１２、２５＿１３、２５＿１４、２５＿１５、２５＿１６、２５＿１７、２５＿１８、２５＿１９、２５＿２０、２５＿２１、２５＿２２、２５＿２３、２５＿２４、２５＿２５、２５＿２６、２５＿２７、２５＿２８、２５＿２９、２５＿３０、２５＿３１、２５＿３２、２５＿３３、２５＿３４、２５＿３５、２５＿３６、２５＿３７、２５＿３８、２５＿３９、２５＿４０、２５＿４１、２５＿４２、２５＿４３、２６＿１、２６＿２、２６＿３、２６＿４、２６＿５、２６＿６、２６＿７、２６＿８、２６＿９、２６＿１０、２６＿１１、２６＿１２、２６＿１３、２６＿１４、２６＿１５、２６＿１６、２６＿１７、２６＿１８、２６＿１９、２６＿２０、２６＿２１、２６＿２２、２６＿２３、２６＿２４、２６＿２５、２６＿２６、２６＿２７、２６＿２８、２６＿２９、２６＿３０、２６＿３１、２７＿１、２８＿１、２８＿２、２８＿３、２８＿４、２８＿５、２８＿６、２８＿７、２８＿８、２８＿９、２８＿１０、２８＿１１、２８＿１２、２８＿１３、２８＿１４、２８＿１５、２８＿１６、２８＿１７、２８＿１８、２８＿１９、２８＿２０、２８＿２１、２８＿２２、２８＿２３、２８＿２４、２８＿２５、２８＿２６、２８＿２７、２８＿２８、２８＿２９、２８＿３０、２８＿３１、２８＿３２、２８＿３３、２９＿１、２９＿２、２９＿３、２９＿４、２９＿５、２９＿６、２９＿７、２９＿８、２９＿９、２９＿１０、２９＿１１、２９＿１２、２９＿１３、２９＿１４、３０＿１、３０＿２、３０＿３、３０＿４、３０＿５、３０＿６、３０＿７、３０＿８、３０＿９、３０＿１０、３０＿１１、３０＿１２、３０＿１３、３０＿１４、３０＿１５、３０＿１６、３０＿１７、３０＿１８、３０＿１９、３０＿２０、３０＿２１、３０＿２２、３０＿２３、３０＿２４、３０＿２５、３１＿１、３１＿２、３１＿３、３２＿１、３２＿２、３２＿３、３２＿４、３２＿５、３２＿６、３２＿７、３２＿８、３２＿９、３２＿１０、３２＿１１、３２＿１２、３２＿１３、３２＿１４、３２＿１５、３２＿１６、３２＿１７、３２＿１８、３２＿１９、３２＿２０、３２＿２１、３２＿２２、３２＿２３、３２＿２４、３２＿２５、３２＿２６、３２＿２７、３２＿２８、３２＿２９、３２＿３０、３２＿３１、３２＿３２、３２＿３３、３２＿３４、３２＿３５、３２＿３６、３２＿３７、３２＿３８、３２＿３９、３２＿４０、３２＿４１、３２＿４２、３２＿４３、３２＿４４、３２＿４５、３２＿４６、３２＿４７、３２＿４８、３２＿４９、３２＿５０、３２＿５１、３３＿１、３３＿２、３３＿３、３３＿４、３３＿５、３３＿６、３３＿７、３３＿８、３３＿９、３３＿１０、３３＿１１、３３＿１２、３３＿１３、３３＿１４、３３＿１５、３３＿１６、３３＿１７、３３＿１８、３３＿１９、３３＿２０、３３＿２１、３３＿２２、３３＿２３、３３＿２４、３３＿２５、３３＿２６、３３＿２７、３３＿２８、３３＿２９、３３＿３０、３３＿３１、３３＿３２、３３＿３３、３４＿１、３５＿１、３５＿２、３５＿３、３６＿１、３７＿１、３８＿１、３９＿１、４０＿１、４１＿１、４２＿１、４３＿１、４４＿１、４５＿１、４６＿１、４７＿１、４８＿１、４９＿１、４９＿２、４９＿３、４９＿４、４９＿５、４９＿６、４９＿７、４９＿８、４９＿９、４９＿１０、４９＿１１、４９＿１２、４９＿１３、４９＿１４、４９＿１５、４９＿１６、４９＿１７、４９＿１８、４９＿１９、４９＿２０、４９＿２１、４９＿２２、４９＿２３、４９＿２４、４９＿２５、４９＿２６、４９＿２７、４９＿２８、４９＿２９、４９＿３０、４９＿３１、４９＿３２、４９＿３３、４９＿３４、４９＿３５、４９＿３６、４９＿３７、４９＿３８、４９＿３９、４９＿４０、４９＿４１、４９＿４２、４９＿４３、４９＿４４、４９＿４５、４９＿４６、４９＿４７、４９＿４８、４９＿４９、４９＿５０、４９＿５１、４９＿５２、４９＿５３、４９＿５４、４９＿５５、４９＿５６、４９＿５７、４９＿５８、４９＿５９、４９＿６０、４９＿６１、４９＿６２、４９＿６３、４９＿６４、４９＿６５、４９＿６６、４９＿６７、４９＿６８、４９＿６９、４９＿７０、４９＿７１、４９＿７２、４９＿７３、４９＿７４、４９＿７５、４９＿７６、４９＿７７、４９＿７８、４９＿７９、４９＿８０、４９＿８１、４９＿８２、４９＿８３、４９＿８４、４９＿８５、４９＿８６、４９＿８７、４９＿８８、４９＿８９、４９＿９０、４９＿９１、４９＿９２、４９＿９３、４９＿９４、４９＿９５、４９＿９６、４９＿９７、４９＿９８、４９＿９９、４９＿１００、４９＿１０１、４９＿１０２、４９＿１０３、４９＿１０４、４９＿１０５、４９＿１０６、４９＿１０７、４９＿１０８、４９＿１０９、４９＿１１０、４９＿１１１、４９＿１１２、４９＿１１３、４９＿１１４、４９＿１１５、４９＿１１６、４９＿１１７、４９＿１１８、４９＿１１９、４９＿１２０、４９＿１２１、４９＿１２２、４９＿１２３、４９＿１２４、４９＿１２５、４９＿１２６、４９＿１２７、４９＿１２８、４９＿１２９、４９＿１３０、４９＿１３１、４９＿１３２、４９＿１３３、４９＿１３４、４９＿１３５、４９＿１３６、４９＿１３７、４９＿１３８、４９＿１３９、４９＿１４０、４９＿１４１、４９＿１４２、４９＿１４３、４９＿１４４、４９＿１４５、４９＿１４６、４９＿１４７、４９＿１４８、４９＿１４９、４９＿１５０、４９＿１５１、４９＿１５２、４９＿１５３、４９＿１５４、４９＿１５５、４９＿１５６、４９＿１５７、４９＿１５８、４９＿１５９、４９＿１６０、４９＿１６１、４９＿１６２、４９＿１６３、４９＿１６４、４９＿１６５、４９＿１６６、４９＿１６７、４９＿１６８、４９＿１６９、４９＿１７０、４９＿１７１、４９＿１７２、４９＿１７３、４９＿１７４、４９＿１７５、４９＿１７６、４９＿１７７、４９＿１７８、４９＿１７９、４９＿１８０、４９＿１８１、４９＿１８２、４９＿１８３、４９＿１８４、４９＿１８５、４９＿１８６、４９＿１８７、４９＿１８８、４９＿１８９、４９＿１９０、４９＿１９１、４９＿１９２、５０＿１、５１＿１、５２＿１、５３＿１、５４＿１、５５＿１、５６＿１、５７＿１、５８＿１、５９＿１、６０＿１、６１＿１、６２＿１、６３＿１、６４＿１、及び６５＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物の群から選択される。
【０２６５】
本発明のある特定の実施形態について、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ番号９＿１０２、９＿１０３、９＿１０４、１１＿１、４９＿３８、４９＿５１、４９＿１７９、４９＿１８９、５３＿１、５６＿１、及び６２＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物からなる群から選択される。
【０２６６】
本発明のある特定の実施形態について、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ番号９＿１０２、９＿１０３、９＿１０４、及び１１＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物からなる群から選択される。
【０２６７】
本発明のある特定の実施形態について、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ番号４９＿３８、４９＿５１、４９＿１７９、及び４９＿１８９を有するオリゴヌクレオチド化合物からなる群から選択される。
【０２６８】
本発明のある特定の実施形態について、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ番号５３＿１、５６＿１、及び６２＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物からなる群から選択される。
本発明の文脈における特定の有利なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
2021529525.tif 000037
からなる群より選択されるオリゴヌクレオチド化合物である。
【０２６９】
ここで、大文字がβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字がＤＮＡヌクレオシドであり、全ＬＮＡ  Ｃが５−メチルシトシンであり、全ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０２７０】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、図２に示すように、ＣＭＰ番号９＿１０３である。
【０２７１】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、図３に示すように、ＣＭＰ番号９＿１０４である。
【０２７２】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、図４に示すように、ＣＭＰ番号１１＿１である。
【０２７３】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、図５に示すように、ＣＭＰ番号４９＿３８である。
【０２７４】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、図６に示すように、ＣＭＰ番号４９＿１８９である。
【０２７５】
製造方法
更なる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドからなる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホロアミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら（１９８７年）「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１５４巻第２８７〜３１３頁を参照のこと）。更なる実施形態では、この方法は、連続ヌクレオチド配列を結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることを更に含む。更なる態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又は結合オリゴヌクレオチドを薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又はアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造する方法が提供される。
【０２７６】
薬学的塩
本発明に係る化合物は、それらの薬学的に許容される塩の形態で存在し得る。用語「薬学的に許容される塩」とは、本発明の化合物の生物学的有効性及び特性を保持し、適切な非毒性の有機若しくは無機酸又は有機若しくは無機塩基から形成される従来の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。酸付加塩には、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸及び硝酸などの無機酸に由来するもの、並びにｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸などの有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、及び第四級アンモニウム水酸化物、例えばテトラメチルアンモニウム水酸化物から誘導されるものが含まれる。医薬化合物の塩への化学修飾は、化合物の物理的及び化学的安定性、吸湿性、流動性、及び溶解性を向上させるために、薬剤師によく知られている手法である。これは例えば、Ｂａｓｔｉｎ、「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（２０００年）第４巻第４２７〜４３５頁、又はＡｎｓｅｌ、「Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」第６版（１９９５年）第１９６頁及び第１４５６〜１４５７頁に記載されている。例えば、本明細書で提供される化合物の薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩であり得る。
【０２７７】
更なる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの薬学的に許容される塩を提供する。好ましい実施形態では、薬学的に許容される塩は、ナトリウム又はカリウム塩である。
【０２７８】
医薬組成物
更なる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドコンジュゲート又はその塩のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５０〜３００μＭ溶液の濃度で薬学的に許容される希釈剤中で使用される。
【０２７９】
本発明での使用に適した製剤は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ペンシルベニア州フィラデルフィア）第１７版（１９８５年）に見られる。薬物送達の方法の簡単なレビューについては、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第２４９巻第１５２７〜１５３３頁（１９９０年））を参照のこと。国際公開第ＷＯ２００７／０３１０９１号は、薬学的に許容される希釈剤、担体及びアジュバントの更に適切で好ましい例を提供する（参照により本明細書に組み込まれる）。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療薬との組合せ、プロドラッグ製剤もまた、国際公開第ＷＯ２００７／０３１０９１号に提供されている。
【０２８０】
本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、医薬組成物又は製剤の調製のために、薬学的に許容される活性又は不活性物質と混合されてもよい。医薬組成物の処方のための組成物及び方法は、限定されるものではないが、投与経路、疾患の程度、又は投与される用量を含む多くの基準に依存する。
【０２８１】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得るか、又は滅菌してフィルタにかけられ得る。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装するか、又は凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３〜１１、より好ましくは５〜９又は６〜８、最も好ましくは７〜８、例えば７〜７．５であろう。得られた固体形態の組成物は、錠剤又はカプセルの密封パッケージなどのように、各々が上記の薬剤又は薬剤群の固定量を含む複数の単回用量単位で包装することができる。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリーム又は軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなどの柔軟な量の容器に包装することもできる。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートはプロドラッグである。特にオリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分はオリゴヌクレオチドから切断される。
【０２８３】
用途
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療及び予防のための研究試薬として利用され得る。
【０２８４】
研究では、そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、細胞（例えば、インビトロ細胞培養物）及び実験動物におけるＴａｕタンパク質の合成を特異的に調節し、それによって標的の機能分析又は治療的介入の標的としてのその有用性の評価を促進することができる。典型的には、標的調節は、タンパク質を生成するｍＲＮＡを分解又は阻害し、それによりタンパク質形成を防止することによって、又はタンパク質を生成する遺伝子若しくはｍＲＮＡのモジュレータを分解若しくは阻害することによって達成される。
【０２８５】
本発明のオリゴヌクレオチドを研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡに由来するｃＤＮＡ又は合成核酸であり得る。
【０２８６】
本発明は、Ｔａｕを発現している標的細胞におけるＴａｕ発現調節用インビボ又はインビトロ方法を提供し、該方法は、本発明のオリゴヌクレオチドを該細胞に有効量で投与することを含む。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、哺乳動物の組織の一部を形成するインビトロ細胞培養物又はインビボ細胞であってよい。好ましい実施形態では、標的細胞は、脳又は中枢神経系に存在する。特に、脳幹、小脳、大脳皮質（ｃｅｒｅｂａｌ  ｃｏｒｔｅｘ）、前頭皮質、髄質／能橋及び中脳、並びに脊髄の細胞は、関連する標的領域である。進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｌｓｙ：ＰＳＰ）の治療には、脳領域の髄質／能橋及び中脳における標的縮小が有利である。アルツハイマの治療には、能領域の大脳皮質、髄質／能橋、中脳領域の標的縮小が有利である。特にニューロンでは、神経細胞、神経細胞、軸索、及び基底核が重要な細胞型である。
【０２８８】
診断では、オリゴヌクレオチドを使用して、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、又は同様の技術により、細胞及び組織におけるＭＡＰＴ発現を検出及び定量することができる。
【０２８９】
治療のために、オリゴヌクレオチドは、Ｔａｕの発現を調節することによって治療することができる疾患又は障害を有することが疑われる動物又はヒトに投与することができる。
【０２９０】
本発明は、治療的又は予防的に有効な量の本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物を、疾患に罹患する又は罹り易い対象に投与することを含む、疾患の治療又は予防方法を提供する。
【０２９１】
本発明はまた、薬品として使用するための、本明細書で定義されるオリゴヌクレオチド、組成物、又はコンジュゲートに関する。
【０２９２】
本発明に係るオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物は、典型的には有効量で投与される。
【０２９３】
本発明はまた、本明細書で言及される障害の治療のための薬品の製造のため、又は本明細書で言及される障害の治療の方法のために記載される本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。
【０２９４】
本明細書で言及される疾患又は障害は、Ｔａｕの発現に関連している。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、Ｔａｕ遺伝子、又はそのタンパク質産物がＴａｕと関連するか又は相互作用する遺伝子における突然変異と関連し得る。したがって、いくつかの実施形態では、標的核酸はＴａｕ配列の変異形態であり、他の実施形態では、標的核酸はＴａｕ配列の調節因子である。
【０２９５】
本発明の方法は、好ましくは、Ｔａｕの異常なレベル及び／又は活性によって引き起こされる疾患の治療又は予防のために使用される。
【０２９６】
本発明は更に、Ｔａｕの異常なレベル及び／又は活性を治療するための薬品を製造するための、本明細書で定義されるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物の使用に関する。
【０２９７】
一実施形態では、本発明は、以下から選択される疾患又は障害の治療に使用するためのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物に関する。ここで、該疾患は、タウオパチ、アルツハイマ病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ＦＴＤＰ−１７、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀性顆粒病（ＡＧＤ）、変化優位型老年認知症（ＴＰＳＤ）、原発性年齢関連タウオパチ（ＰＡＲＴ）、ダウン症候群、リティコ−ボディグ病、小児タウオパチ（一側性巨脳症（ＨＭＥ）、結節性硬化症、限局性皮質異形成２ｂ型、神経節膠腫、ハラーホルデン・スパッツ症候群、脳内鉄沈着を伴う神経変性症１型（ＮＢＩＡ１）、神経節細胞腫、亜急性硬化性全脳炎、発作性障害（例えば、てんかん）、ネットワーク機能障害（例えば、抑鬱）、及び運動障害（例えば、パーキンソン病）を含む）から選択される。
【０２９８】
ある特定の実施形態では、該疾患は、アルツハイマ病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、又はＦＴＤＰ−１７から選択される。
【０２９９】
投与
本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、非経口（静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、眼内、又は髄腔内投与など）を介して投与することができる。
【０３００】
いくつかの実施形態では、投与は、髄腔内投与を介する。
【０３０１】
有利には、例えば神経学的障害の治療のために、本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、髄腔内又は頭蓋内に、例えば脳内又は脳室内投与を介して投与される。
【０３０２】
本発明はまた、皮下投与用の剤形である薬品の製造のための、本発明の薬学的塩又は組成物などのオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの使用を提供する。
【０３０３】
本発明はまた、髄腔内投与用の剤形である薬品の製造のための、本発明の薬学的塩又は組成物などの、本発明のオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの使用を提供する。
【０３０４】
本発明はまた、髄腔内投与用の剤形である薬品の製造のために記載されるような本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。
【０３０５】
併用療法
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物は、別の治療薬との併用治療で使用するためのものである。治療薬は、例えば、上記の疾患又は障害の標準的な治療薬であり得る。
【０３０６】
実施形態
本発明の以下の実施形態は、本明細書に記載される任意の他の実施形態と組み合わせて使用することができる。
【０３０７】
１．１０〜５０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、表４（Ｒ＿１〜Ｒ＿２２５４）のいずれかの標的配列に対して少なくとも９０％相補性、例えば１００％相補性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０３０８】
２．該標的配列が、標的領域Ｒ＿２２３、Ｒ＿７３８、又はＲ＿１２９８のいずれかから選択され、それぞれ配列番号３、４、又は５に対応する、実施形態１に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３０９】
３．該連続ヌクレオチド配列が、配列番号１の１２０５１〜１２１１１位、３９５６２〜３９５９３位、又は７２８３７〜７２９４０位内の連続ヌクレオチドに１００％相補的である、実施形態１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３１０】
４．該連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１６ヌクレオチドであり、配列番号１の１２０６０〜１２０７８位、３９５７３〜３９５９２位、又は７２８６２〜７２８９０位内の連続するヌクレオチドに１００％相補的である、実施形態１〜３に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３１１】
５．該オリゴヌクレオチドが、配列番号６〜６５からなる群より選択される配列を備える、実施形態１〜４に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３１２】
６．該オリゴヌクレオチドが、配列番号９又は１１の配列を備える、実施形態１〜５に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３１３】
７．該オリゴヌクレオチドが、配列番号４９の配列を備える、実施形態１〜５に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３１４】
８．該オリゴヌクレオチドが、配列番号５３、５６、及び６２からなる群より選択される配列を備える、実施形態１〜５に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３１５】
９．該連続ヌクレオチド配列が、それが相補的である該標的配列と比較して、０〜３個のミスマッチを有する、実施形態１、２、又は５、又６に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３１６】
１０．該連続ヌクレオチド配列が、該標的配列と比較して１つのミスマッチを有する、実施形態９に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３１７】
１１．該連続ヌクレオチド配列が、該標的配列と比較して２つのミスマッチを有する、実施形態９に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３１８】
１２．該連続ヌクレオチド配列が、該標的配列に対して完全に相補的である、実施形態９に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３１９】
１３．該オリゴヌクレオチドが、Ｔａｕの発現を調節することができる、実施形態１〜１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３２０】
１４．該オリゴヌクレオチドが、Ｔａｕの発現を低減することができる、実施形態１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３２１】
１５．該オリゴヌクレオチドが、−１０ｋｃａｌ未満のΔＧ°で該標的配列とハイブリダイズすることができる、実施形態１〜１４のオリゴヌクレオチド。
【０３２２】
１６．該標的配列が、ＲＮＡに位置する、実施形態１〜１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３２３】
１７．該ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、実施形態１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３２４】
１８．該ｍＲＮＡが、プレｍＲＮＡである、実施形態１７に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３２５】
１９．該連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１４連続ヌクレオチド、特に１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２連続ヌクレオチドを含むか又はそれらからなる、実施形態１〜１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３２６】
２０．該連続ヌクレオチド配列が、１６〜２２個のヌクレオチドを含むか又はそれらからなる、実施形態１〜１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３２７】
２１．該連続ヌクレオチド配列が、１８〜２０個のヌクレオチドを含むか又はそれらからなる、実施形態２０に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３２８】
２２．該オリゴヌクレオチドが、１４〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる、実施形態１〜２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３２９】
２３．該オリゴヌクレオチドが、１６〜２４ヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる、実施形態２２に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３３０】
２４．該オリゴヌクレオチドが、１８〜２０ヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる、実施形態２２又は２４に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３３１】
２５．該オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列が、一本鎖である、実施形態１〜２４に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３３２】
２６．該オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡでも自己相補的でもない、実施形態１〜２５に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３３３】
２７．１個以上の修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１〜２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３３４】
２８．該１個以上の修飾ヌクレオシドが、高親和性修飾ヌクレオシドである、実施形態２７に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３３５】
２９．該１個以上の修飾ヌクレオシドが、２’糖修飾ヌクレオシドである、実施形態２７又は２８に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３３６】
３０．該１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＡＮＡ、及びＬＮＡヌクレオシドからなる群より独立して選択される、実施形態２９に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３３７】
３１．該１個以上の２’糖修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態２９又は３０に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３３８】
３２．該ＬＮＡヌクレオシドが、オキシ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、ｃＥＴ、及びＥＮＡから選択される、実施形態３１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０３３９】
３３．該修飾ＬＮＡヌクレオシドが、以下の２’−４’架橋−Ｏ−ＣＨ２−を有するオキシ−ＬＮＡである、実施形態３１又は３２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０３４０】
３４．該オキシ−ＬＮＡが、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、実施形態３３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０３４１】
３５．該修飾ＬＮＡヌクレオシドが、以下の２’−４’架橋−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−を有するｃＥＴである、実施形態３１又は３２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０３４２】
３６．該ｃＥＴが、（Ｓ）ｃＥＴ、すなわち６’（Ｓ）メチル−β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、実施形態３５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０３４３】
３７．該ＬＮＡが、以下の２’−４’架橋−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−を有するＥＮＡである、実施形態３１又は３２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０３４４】
３８．該１個以上の２’糖修飾ヌクレオシドが、ＭＯＥヌクレオシドである、実施形態２９又は３０に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３４５】
３９．該オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態１〜３８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３４６】
４０．該修飾ヌクレオシド間結合が、ヌクレアーゼ耐性である、実施形態３９のオリゴヌクレオチド。
【０３４７】
４１．該連続ヌクレオチド配列内の該ヌクレオシド間結合の少なくとも５０％が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合又はボラノホスフェートヌクレオシド間結合である、実施形態３９又は４０に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３４８】
４２．該連続ヌクレオチド配列内の該ヌクレオシド間結合の８０％が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態３９又は４１に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３４９】
４３．該連続ヌクレオチド配列内の該ヌクレオシド間結合の全てが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態３９〜４２に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３５０】
４４．該オリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ  Ｈを動員することができる、実施形態１〜４３に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３５１】
４５．該オリゴヌクレオチド又は該連続ヌクレオチド配列が、ギャップマである、実施形態４４に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３５２】
４６．該ギャップマが、式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’を有し、ここで、該Ｆ及びＦ’ウイング領域が独立して１〜８個のヌクレオシドを含むか又はそれらからなり、そのうちの２〜５個が実施形態３２〜３８に記載の２’糖修飾ヌクレオシドであり、ＧはＲＮａｓｅ  Ｈを動員することができる６〜１６個のヌクレオシドの領域である、実施形態４５に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３５３】
４７．各ウイング領域（Ｆ及びＦ’）が、該ウイングの５’末端及び３’末端に少なくとも１つの２’糖修飾ヌクレオシドを有することを特徴とし、該Ｇ領域が、該ウィング領域（例えば、該Ｇ領域の５’末端及び３’末端）に隣接して少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシドを有する、実施形態４６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０３５４】
４８．領域Ｆ及びＦ’内の該２’糖修飾ヌクレオシドの全てが、同一のＬＮＡヌクレオシドである、実施形態４６又は４７に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３５５】
４９．該ＬＮＡヌクレオシドの全てが、オキシ−ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態４８のオリゴヌクレオチド。
【０３５６】
５０．領域Ｆ及びＦ’内の該２’糖修飾ヌクレオシドの全てが、同一のＭＯＥヌクレオシドである、実施形態４６又は４７に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３５７】
５１．ａ．該Ｆ’領域が３〜８ヌクレオチド長であり、３〜５個の同一ＬＮＡヌクレオシド及び０〜４個のＤＮＡヌクレオシドからなり、
ｂ．該Ｆ’領域が２〜６ヌクレオチド長であり、２〜４個の同一ＬＮＡヌクレオシド及び０〜２個のＤＮＡヌクレオシドからなり、
ｃ．領域Ｇが６〜１４個のＤＮＡヌクレオチドである、実施形態４６〜５０に記載のオリコヌクレオチド。
【０３５８】
５２．領域Ｆ又はＦ’の少なくとも一方が、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、及び２’−フルオロ−ＤＮＡからなる群より独立して選択される少なくとも１つの２’置換修飾ヌクレオシドを更に含む、実施形態４６又は４７に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３５９】
５３．領域Ｇにおける該ＲＮａｓｅ  Ｈ動員ヌクレオシドが、ＤＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ、ＡＮＡ及び２’Ｆ−ＡＮＡ、並びにＵＮＡから独立して選択される、実施形態４６〜５０又は５２に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３６０】
５４．領域Ｇ内の該ヌクレオシドが、ＤＮＡ及び／又はα−Ｌ−ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５３に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３６１】
５５．領域Ｇが、少なくとも７５％のＤＮＡヌクレオシドからなる、実施形態５３又は５４に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３６２】
５６．該Ｇ領域の該ヌクレオチドの全てが、ＤＮＡである、実施形態５３〜５５のオリゴヌクレオチド。
【０３６３】
５７．該オリゴヌクレオチドが、ＣＭＰ番号９＿１０２、９＿１０３、９＿１０４、１１＿１、４９＿３８、４９＿５１、４９＿１７９、４９＿１８９、５３＿１、５６＿１、及び６２＿１から選択される、実施形態１〜５６に記載のオリゴヌクレオチド。
５８．該オリゴヌクレオチドが、
2021529525.tif 000038
からなる群より選択される化合物であって、ここで、大文字がβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字がＤＮＡヌクレオシドであり、全ＬＮＡ  Ｃが５−メチルシトシンであり、全ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態５７に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３６４】
５９．該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、図２に示されるようにＣＭＰ番号９＿１０３である、実施形態１〜５８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０３６５】
６０．該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、図３に示されるようにＣＭＰ番号９＿１０４である、実施形態１〜５８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０３６６】
６１．該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、図４に示されるようにＣＭＰ番号１１＿１である、実施形態１〜５８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０３６７】
６２．該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、図５に示されるようにＣＭＰ番号４９＿３８である、実施形態１〜５８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０３６８】
６３該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、図６に示されるようにＣＭＰ番号４９＿１８９である、実施形態１〜５８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０３６９】
６４．請求項１〜５８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分と、を含むコンジュゲート。
【０３７０】
６５．該コンジュゲート部分が、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素、ビタミン、ウイルスタンパク質又はそれらの組合せから選択される、実施形態５９に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【０３７１】
６６．該コンジュゲートが、脳血液関門を通過する送達を促進する、実施形態５９又は６５に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【０３７２】
６７．該コンジュゲートが、トランスフェリン受容体を標的とする抗体又は抗体断片である、実施形態６６に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【０３７３】
６８．該オリゴヌクレオチドと該コンジュゲート部分との間に位置するリンカを含む、実施形態５９〜６７に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【０３７４】
６９．該リンカが、生理学的に不安定なリンカである、実施形態６８に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【０３７５】
７０．実施形態１〜５８に記載のオリゴヌクレオチド又は実施形態５９〜６９に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、及び／又はアジュバントと、を含む医薬組成物。
【０３７６】
７１．ヌクレオチド単位を反応させ、それによって該オリゴヌクレオチドからなる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、実施形態１〜５８に記載のオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。
【０３７７】
７２．該連続ヌクレオチド配列を非ヌクレオチドコンジュゲーション部分と反応させることを更に含む、実施形態７１に記載の方法。
【０３７８】
７３．該オリゴヌクレオチドを、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、及び／又はアジュバントと混合することを含む、実施形態７０に記載の組成物を製造する方法。
【０３７９】
７４．Ｔａｕを発現している標的細胞におけるＴａｕ発現調節用インビトロ又はインビボ方法であって、実施形態１〜５７に記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態５９〜６９に記載のコンジュゲート、又は実施形態７０に記載の医薬組成物を、有効量で該細胞に投与することを含む、方法。
【０３８０】
７５．疾患の治療又は予防方法であって、治療的又は予防的に有効な量である実施形態１〜５８に記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態５９〜６９に記載のコンジュゲート、又は実施形態７０に記載の医薬組成物を、該疾患に罹患する又は罹り易い対象に投与することを含む、方法。
【０３８１】
７６．対象における疾患の治療又は予防のための薬品として使用するための、実施形態１〜５７に記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態５９〜６９に記載のコンジュゲート、又は実施形態７０に記載の医薬組成物。
【０３８２】
７７．対象における疾患の治療又は予防のための薬品の調製のための、実施形態１〜５８のオリゴヌクレオチド、又は実施形態５９〜６９のコンジュゲートの使用。
【０３８３】
７８．該疾患が、Ｔａｕのインビボ活性と関連する、実施形態７５〜７７に記載の方法、オリゴヌクレオチド、又は使用。
【０３８４】
７９．該疾患が、Ｔａｕの過剰発現及び／又はＴａｕの異常レベルと関連する、実施形態７５〜７８に記載の方法、オリゴヌクレオチド、又は使用。
【０３８５】
８０．該Ｔａｕが、実施形態１〜５８に記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態５９〜６９に記載のコンジュゲート、又は実施形態７０に記載の医薬組成物を含まない該発現と比較して、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低減する、実施形態７９に記載の方法、オリゴヌクレオチド、又は使用。
【０３８６】
８１．該疾患が、タウオパチ、アルツハイマ病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ＦＴＤＰ−１７、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀性顆粒病（ＡＧＤ）、変化優位型老年認知症（ＴＰＳＤ）、原発性年齢関連タウオパチ（ＰＡＲＴ）、ダウン症候群、リティコ−ボディグ病、小児タウオパチ（一側性巨脳症（ＨＭＥ）、結節性硬化症、限局性皮質異形成２ｂ型、神経節膠腫、ハラーホルデン・スパッツ症候群、脳内鉄沈着を伴う神経変性症１型（ＮＢＩＡ１）、神経節細胞腫、亜急性硬化性全脳炎、発作性障害（例えば、てんかん）、ネットワーク機能障害（例えば、抑鬱）、及び運動障害（例えば、パーキンソン病）を含む）から選択される、実施形態７５〜７９に記載の方法、オリゴヌクレオチド、又は使用。
【０３８７】
８２．該疾患が、アルツハイマ病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、又はＦＴＤＰ−１７から選択される、実施形態７５〜７９に記載の方法、オリゴヌクレオチド、又は使用。
【０３８８】
８３．該対象が、哺乳動物である、実施形態７５〜８２に記載の方法、オリゴヌクレオチド、又は使用。
【０３８９】
８４．該哺乳動物が、ヒトである、実施形態８３に記載の方法、オリゴヌクレオチド、又は使用。
【実施例】
【０３９０】
材料及び方法
オリゴヌクレオチドモチーフ配列及びオリゴヌクレオチド化合物
【０３９１】
【表５−１】
2021529525.tif 000039
【表５−２】
2021529525.tif 000040
【表５−３】
2021529525.tif 000041
【表５−４】
2021529525.tif 000042
【表５−５】
2021529525.tif 000043
【表５−６】
2021529525.tif 000044
【表５−７】
2021529525.tif 000045
【表５−８】
2021529525.tif 000046
【表５−９】
2021529525.tif 000047
【表５−１０】
2021529525.tif 000048
【表５−１１】
2021529525.tif 000049
【表５−１２】
2021529525.tif 000050
【表５−１３】
2021529525.tif 000051
【表５−１４】
2021529525.tif 000052
【表５−１５】
2021529525.tif 000053
【表５−１６】
2021529525.tif 000054
【表５−１７】
2021529525.tif 000055
【表５−１８】
2021529525.tif 000056
【表５−１９】
2021529525.tif 000057
【表５−２０】
2021529525.tif 000058
【表５−２１】
2021529525.tif 000059
【表５−２２】
2021529525.tif 000060
【表５−２３】
2021529525.tif 000061
【表５−２４】
2021529525.tif 000062
【表５−２５】
2021529525.tif 000063
【表５−２６】
2021529525.tif 000064
【表５−２７】
2021529525.tif 000065
【表５−２８】
2021529525.tif 000066
【表５−２９】
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【表５−３０】
2021529525.tif 000068
【表５−３１】
2021529525.tif 000069
【表５−３２】
2021529525.tif 000070
【表５−３３】
2021529525.tif 000071
【表５−３４】
2021529525.tif 000072
【表５−３５】
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【表５−３６】
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【表５−３７】
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【表５−３８】
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【表５−３９】
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【０３９２】
設計は、ギャップマ設計であるＦ−Ｇ−Ｆ’を指す。古典的なギャップマ設計、例えば３−１０−３では、フランク内の全ヌクレオチド（Ｆ及びＦ’）は、同じ２’糖修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡ、ｃＥＴ、又はＭＯＥと、ギャップ（Ｇ）を形成する中央のＤＮＡストレッチとで構成される。交互フランク設計のギャップマでは、オリゴヌクレオチドのフランクは一連の整数として注釈が付けられ、いくつかの２’糖修飾ヌクレオシド（Ｍ）の後にいくつかのＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）が続くことを表す。例えば、２−２−１モチーフのフランクは５’［Ｍ］２−［Ｄ］２−［Ｍ］３’を表し、１−１−１−１−１モチーフは５’［Ｍ］−［Ｄ］−［Ｍ］−［Ｄ］−［Ｍ］３’を表す。両方のフランクは５’末端及び３’末端に２’糖修飾ヌクレオシドを有する。ギャップ領域（Ｇ）は、フランクの間に位置するいくつかのＤＮＡヌクレオシド（典型的には、６〜１６個）で構成されている。
【０３９３】
表中の見出し「オリゴヌクレオチド化合物」とは、モチーフ配列の特定の設計を表す。大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、下線付きの大文字はＭＯＥヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全ＬＮＡ  Ｃは５−メチルシトシンであり、ｅは５−メチルシトシンＤＮＡを表し、全ヌクレオシド間結合は、ヌクレオチド間の下付き文字でマークされない限りホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、下付きのｏはホスホジエステル結合を表す。
【０３９４】
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成は当該技術分野で一般に知られている。以下は、適用できるプロトコルである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用される装置、支持体、及び濃度に関してわずかに異なる方法によって、生成されている場合がある。
【０３９５】
オリゴヌクレオチドは、Ｏｌｉｇｏｍａｋｅｒ  ４８のホスホロアミダイトアプローチを１μｍｏｌスケールで用いて、ウリジンユニバーサル支持体上で合成される。合成の最後に、オリゴヌクレオチドを、水性アンモニアを用いて５〜１６時間６０℃で固相支持体をから切断する。オリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）又は固相抽出によって精製し、ＵＰＬＣによって特徴付け、分子量をＥＳＩ−ＭＳによって更に確認する。
【０３９６】
オリゴヌクレオチドの伸長：
β−シアノエチル−ホスホロアミダイトのカップリング（ＤＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ−Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｔ、ＬＮＡ−５−メチル−Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ｇ（ｄｍｆ）、又はＬＮＡ−Ｔ）は、アセトニトリル中の０．１Ｍの５’−Ｏ−ＤＭＴ保護アミダイト及びアセトニトリル（０．２５Ｍ）中のＤＣＩ（４，５−ジシアノイミダゾール）の溶液を活性剤として用いて行われる。最終サイクルでは、所望の修飾を有するホスホロアミダイト、例えばコンジュゲート基を結合するためのＣ６リンカ、又はそのようなコンジュゲート基を使用できる。ホスホルチオエート結合を導入するためのチオール化は、水素化キサンタン（アセトニトリル／ピリジン９：１中０．０１Ｍ）を用いることにより行われる。ホスホジエステル結合は、ＴＨＦ／ピリジン／水７：２：１中の０．０２Ｍヨウ素を用いて導入できる。残りの試薬はオリゴヌクレオチド合成に典型的に使用される試薬である。
【０３９７】
固相合成後のコンジュゲーションでは、市販のＣ６アミノリンカホルホラミダイト（ｐｈｏｒｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）を固相合成の最後のサイクルで使用することができ、脱保護及び固相支持体からの切断後、アミノ結合脱保護オリゴヌクレオチドが単離される。コンジュゲートは標準的な合成方法を使用した官能基の活性化によって導入される。
【０３９８】
ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製：
粗化合物は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８  １０μ  １５０×１０ｍｍカラムでの分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製される。０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ８及びアセトニトリルを５ｍＬ／分の流速で緩衝液として使用する。収集された画分を凍結乾燥して、精製された化合物を典型的には白色固体として得る。
【０３９９】
省略語：
ＤＣＩ：４，５−ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィ
【０４００】
Ｔｍアッセイ：
オリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的（リン酸結合、ＰＯ）二重鎖を、５００ｍＬのＲＮａｓｅフリー水で３ｍＭに希釈し、５００ｍＬの２倍Ｔｍ緩衝液（２００ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭリン酸、ｐＨ７．０）と混合する。この溶液を９５℃で３分間加熱し、次いで、室温で３０分間アニールする。二重鎖の融解温度（Ｔｍ）は、ＰＥ  Ｔｅｍｐｌａｂソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、ペルチェ温度プログラマＰＴＰ６を備えたＬａｍｂｄａ  ４０  ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で測定する。温度を２０℃から９５℃に上昇させ、次いで２５℃に低下させ、２６０ｎｍで吸収を記録する。一次導関数と、融解及びアニーリングの両方の極大値とを使用して、二重鎖Ｔｍを評価する。
【０４０１】
初代神経細胞培養物
初代ニューロン培養物を、マウスＴａｕノックアウトバックグラウンドでヒトＴａｕ導入遺伝子を発現するＥ１８トランスジェニックマウスの前脳から確立した。（Ａｎｄｏｒｆｅｒら、「Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ」第８６巻第５８２〜５９０頁（２００３年））。初代ニューロンは、製造者のプロトコルに従ってパパイン消化により生成した（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＬＫ００３１０５０）。簡単に述べれば、マウスＭＡＰＴヌルバックグラウンド上でヒト微小管関連タンパク質Ｔａｕ（ＭＡＰＴ）遺伝子全体を発現するｈＴａｕマウスＥ１８  ＢＡＣ−Ｔｇ胚から前脳を解剖し、パパイン／ＤＮアーゼ／イーグル平衡塩溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）溶液中で３７℃にて３０〜４５分間インキュベートした。細胞ペレットの粉砕及び遠心分離後、反応をＥＢＳＳ含有プロテアーゼ阻害剤、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）、及びＤＮアーゼとのインキュベーションにより停止した。細胞を粉砕し、２％Ｂ−２７、１００μｇ／ｍＬペニシリン、８５μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び０．５ｍＭグルタミンを補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄した。
【０４０２】
トランスジェニックＴａｕマウス（ｈＴａｕマウス）
ヒトＰＡＣ由来のＴａｕ導入遺伝子、Ｔａｕプロモータにより駆動されるＨ１ハプロタイプ（Ｐｏｌｙｄｏｒｏら、「Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（２００９年）第２９巻第３４号第１０７４１〜９頁）を発現し、天然マウスＴａｕ遺伝子を欠失した雌雄トランスジェニックマウス（３０〜４０ｇ）を使用して、忍容性、薬力学的エンドポイント、及び組織薬剤濃度を評価した。
【０４０３】
動物を一定の温度（２１±２℃）及び湿度（５０±１０％）に維持したコロニー室で保持し、１２時間／日照射した（０６００時間点灯）。全ての動物は試験期間中、自由に食物及び水を摂取することができた。行動学的研究は０７００〜１５００時間実施された。
【０４０４】
脳室内（ＩＣＶ）注射は、Ｈａｌｅｙ  ａｎｄ  ＭｃＣｏｒｍｉｃｋの方法に従って、２７又は３０ゲージ針を装着したハミルトン・マイクロ・シリンジを用いて実施した。針は、脳への侵入を制限するため、先端から２．５ｍｍにポリエチレンガードを装着した。マウスはイソフルラン麻酔薬（１．５〜４％）を用いて麻酔した。注射されるマウスは、片手の親指と人差し指とで首の後ろのたるんだ皮膚を保持した。次いで、優しくではあるがしっかりとした圧力をかけ、動物の頭部をしっかりした平らな表面に押し付けることによって固定した。次いで、針の先端を、頭皮及び頭蓋骨を通して、十字縫合の約１ｍｍ外側及び１ｍｍ尾側に挿入した。針を位置決めして、生理食塩水ビヒクル中に５マイクロリットルの体積でＡＳＯを投与し、右（又は左）側脳室に２０〜３０秒かけて注入した。針を１０秒間留置した後、抜去した。この処置は手術又は切開を必要としない。処置から回復するまで動物を加熱パッドで温めた。
【０４０５】
投与３日後及び／又は４週間後、マウスをイソフルラン過量投与、続いて急速に断頭することで屠殺し、脳組織（右前頭皮質領域）を後のＴａｕ  ｑＰＣＲのためにドライアイス上で採取した。
【０４０６】
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【０４０７】
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【０４０８】
実施例１
ＡＳＯ標的化ＭＡＰＴイントロンのインビトロスクリーニング
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＡＳＯ）スクリーニングを、８０７のＡＳＯの標的化ＭＡＰＴイントロンを用いて、ヒト化Ｔａｕマウス由来の初代神経細胞で実施した。
【０４０９】
インビトロでＭＡＰＴ  ｍＲＮＡを低減するＡＳＯの能力を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）分析によって測定した。各Ｔａｕ  ｍＲＮＡ低減は、アッセイのバックグラウンドシグナルを差し引き、ハウスキーピング遺伝子チューブリンｍＲＮＡシグナルを介して各ウェルを正常化することによって標準化した。
【０４１０】
初代神経細胞培養物を、「材料及び方法」セクションに記載されている通りに調製し、ポリ−Ｄ−リジンで被覆した３８４ウェルプレート上に１０，０００細胞／ウェルで播種し、Ｂ２７、ＧｌｕｔａＭＡＸ、及びペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で維持した。ＡＳＯを水で希釈し、ＤＩＶ０１で細胞に加えて、最終濃度０．５μＭにした。ＡＳＯ添加後、ニューロンを３７℃及び５％ＣＯ２で５日間インキュベートして、ｍＲＮＡの定常状態低減を達成した。培地を除去し、細胞をＤＰＢＳ中で１回洗浄した。溶解物メッセンジャＲＮＡの測定は、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）２．０試薬システム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標））を用いて行った。これは、特異的に設計されたＲＮＡ捕捉プローブセットに依存する分岐ＤＮＡ−シグナル増幅方法を用いてＲＮＡを定量する。５０μＬのプロテイナーゼＫを予め加温した溶解混合物（Ｌｙｓｉｓ  ｍｉｘ）５ｍＬに加えて作製した作動細胞溶解緩衝液を用いて細胞を溶解し、ｄＨ２０で１：４の最終希釈に希釈した。作動溶解緩衝液をプレート（４５μＬ／ウェル）に加え、粉砕して混合し、密封し、５５℃で３０分間インキュベートした。溶解後、ウェルを−８０℃で保存するか、又は直ちにアッセイした。
【０４１１】
溶解物を、使用した特異的捕捉プローブ（Ｔａｕ又はチューブリン）に応じて、溶解混合物中で希釈した。次いで、合計２７μＬ／ウェルを捕捉プレート（捕捉プローブで被覆された３８４ウェルのポリスチレンプレート）に加えた。２．２ｍＬのヌクレアーゼフリー水、１．２ｍＬの溶解混合物、１８４μＬのブロッキング試薬、並びに６６．８μＬの特異的２．０プローブセットのヒトＭＡＰＴ（カタログ番号１５４８６）及びマウスβ３チューブリン（カタログ番号ＳＢ−１７２４５）を、製造者の指示（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）２．０  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標））に従って合わせることによって、作動プローブセット試薬を生成した。次いで、７μＬの作動プローブセット試薬を、捕捉プレート上の２７μｌの溶解物希釈液（又はバックグラウンド試料用の溶解混合物２７μＬ）に加えた。プレートを遠心分離し、次いで１６〜２０時間５５℃でインキュベートして、ハイブリダイズした（標的ＲＮＡ捕捉）。標的ＲＮＡのシグナル増幅及び検出は、未結合材料を除去するために、緩衝液で３回プレートを洗浄することによって開始した。２．０プレ増幅ハイブリダイゼーション試薬（３０μＬ／ウェル）を加え、５５℃で１時間インキュベートし、次いで吸引し、洗浄緩衝液を加え、３回吸引した。次いで、２．０増幅ハイブリダイゼーション試薬を記載の通りに加え（３０μＬ／ウェル）、５５℃で１時間インキュベートし、前述の通りに洗浄を繰り返した。次に、２．０ラベル・プローブ・ハイブリダイゼーション試薬を加え（３０μＬ／ウェル）、５０℃で１時間インキュベートし、前述の通りに洗浄を繰り返した。最後に、プレートを遠心分離して過剰な洗浄緩衝液を全て除去し、２．０基質（３０μＬ／ウェル）を加えた。プレートを室温で５分間インキュベートし、プレートをルミノメータモードのＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルリーダ上で１５分以内に画像化した。
【０４１２】
目的の遺伝子について、平均アッセイ・バックグラウンド・シグナルを、各技術的反復の平均シグナルから差し引いた。バックグラウンドで差し引かれた目的遺伝子の平均シグナルを、ハウスキーピングチューブリンＲＮＡのバックグラウンドで差し引かれた平均シグナルで割る。処理試料に対する阻害パーセントを、未処理試料に対して計算した（すなわち、値が低いほど阻害は増大する）。未処理試料のバックグラウンドの可変性は、バックグラウンドと等しい又はバックグラウンドより高い処理試料のパーセント阻害をもたらし得る。これらの場合、パーセント阻害は、対照の１００％阻害として表される（すなわち、阻害なし）。
【０４１３】
図１は、全８０７のＡＳＯによって達成されたＭＡＰＴ  ｍＲＮＡ低減を示す。図では、ＭＡＰＴ標的核酸上の３つの領域Ａ、Ｂ、及びＣが示されている。これらの領域ではＡＳＯの分布率が高く、対照（１００％）と比較して標的を４０％以下に低減している。
【０４１４】
実施例２
ＭＡＰＴ上の選択された領域を標的とするＡＳＯのインビトロスクリーニング
実施例１のスクリーニングに基づいて、ＡＳＯの新規ライブラリを、図１に示される通り領域Ａ、Ｂ、及びＣを標的とするように設計した。モチーフ配列及びオリゴヌクレオチド化合物を上記の表５に示す。
【０４１５】
スクリーニングは実施例１に記載の通り行った。結果を表６に示す。
【０４１６】
【表６−１】
2021529525.tif 000080
【表６−２】
2021529525.tif 000081
【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
2021529525.tif 000084
【表６−６】
2021529525.tif 000085
【表６−７】
2021529525.tif 000086
【表６−８】
2021529525.tif 000087
【表６−９】
2021529525.tif 000088
【表６−１０】
2021529525.tif 000089
【表６−１１】
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【表６−１２】
2021529525.tif 000091
【表６−１３】
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【０４１７】
実施例３
選択されたオリゴヌクレオチドのＩＣ５０値
実施例２からのいくつかの最良性能のオリゴヌクレオチドのＩＣ５０を、９６ウェルアッセイを用いて初代神経細胞中においてインビトロで決定した。
【０４１８】
初代神経細胞培養物を、「材料及び方法」セクションに記載されている通りに調製し、ポリ−Ｄ−リジンで被覆した９６ウェルプレート上に５０，０００細胞／ウェルで播種し、Ｂ２７、ＧｌｕｔａＭＡＸ、及びペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で維持した。ＡＳＯを水（ＩＣ５０決定用）で希釈し、播種から１日後（ＤＩＶ０１）に細胞へ加えた。ＩＣ５０決定のために、ニューロンを０．５〜５μＭの最高濃度で処理し、約１：４の濃度反応希釈を使用してＩＣ５０を決定した。国際公開第ＷＯ２０１６／１２６９９５号のＡＳＯ−００１９３３に対応するＣＭＰ番号６６＿１を、陽性対照として含めた。ＡＳＯ処理後、ニューロンを３７℃で５日間インキュベートして、ｍＲＮＡの定常状態低減を達成した。培地を除去し、細胞を以下の通りに溶解した。溶解物メッセンジャＲＮＡの測定は、ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ（登録商標）２．０試薬システム（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標））を用いて行った。これは、特異的に設計されたＲＮＡ捕捉プローブセットに依存する分岐ＤＮＡ−シグナル増幅方法を用いてＲＮＡを定量する。作動細胞溶解緩衝液を、５０μＬのプロテイナーゼＫを予め加温した溶解混合物５ｍＬに加えて作製し、ｄＨ２０で１：４の最終希釈に希釈した。作動溶解緩衝液をプレート（１５０μＬ／ウェル）に加え、粉砕して混合し、密封し、５５℃で３０分間インキュベートした。溶解後、ウェルを−８０℃で保存するか、又は直ちにアッセイした。
【０４１９】
溶解物を、使用した特異的捕捉プローブ（Ｔａｕ又はチューブリン）に応じて、溶解混合物中で希釈した。次いで、合計８０μＬ／ウェルを捕捉プレート（捕捉プローブで被覆された９６ウェルのポリスチレンプレート）に加えた。１２．１μＬのヌクレアーゼフリー水、６．６μＬの溶解混合物、１μＬのブロッキング試薬、ヒトＭＡＰＴ（カタログ番号１５４８６）及びマウスβ３チューブリン（カタログ番号ＳＢ−１７２４５）のいずれかの０．３μＬの特異的２．０プローブセットを、製造者の指示（ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ（登録商標）２．０  ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標））に従って合わせることによって、作動プローブセット試薬を生成した。次いで、２０μＬの作動プローブセット試薬を、捕捉プレート上の８０μｌの溶解物希釈液（又はバックグラウンド試料用の溶解混合物８０μＬ）に加えた。プレートを遠心分離し、次いで１６〜２０時間５５℃でインキュベートして、ハイブリダイズした（標的ＲＮＡ捕捉）。標的ＲＮＡのシグナル増幅及び検出を、未結合材料を除去するために、緩衝液で３回プレートを洗浄することによって開始した。２．０プレ増幅ハイブリダイゼーション試薬（１００μＬ／ウェル）を加え、５５℃で１時間インキュベートし、次いで吸引し、洗浄緩衝液を加え、３回吸引した。次いで、２．０増幅ハイブリダイゼーション試薬を記載の通りに加え（１００μＬ／ウェル）、５５℃で１時間インキュベートし、前述の通りに洗浄を繰り返した。次に、２．０ラベル・プローブ・ハイブリダイゼーション試薬を加え（１００μＬ／ウェル）、５０℃で１時間インキュベートし、前述の通りに洗浄を繰り返した。最後に、プレートを遠心分離して過剰な洗浄緩衝液を全て除去し、２．０基質（１００μＬ／ウェル）を加えた。プレートを室温で５分間インキュベートし、プレートをルミノメータモードのＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルリーダ上で１５分以内に画像化した。
【０４２０】
データ決定：目的の遺伝子について、平均アッセイ・バックグラウンド・シグナルを、各技術的反復の平均シグナルから差し引いた。バックグラウンドで差し引かれた目的遺伝子の平均シグナルを、ハウスキーピングチューブリンＲＮＡのバックグラウンドで差し引かれた平均シグナルで割る。処理試料に対する阻害パーセントを、未処理試料に対して計算した（すなわち、値が低いほど阻害は増大する）。未処理試料のバックグラウンドの可変性は、バックグラウンドと等しい又はバックグラウンドより高い処理試料のパーセント阻害をもたらし得る。これらの場合、パーセント阻害は、対照の１００％阻害として表される（すなわち、阻害なし）。結果を表７に示す。
【０４２１】
【表７】
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【０４２２】
実施例４
インビボ忍容性及びインビボＴａｕ  ｍＲＮＡ低減
実施例２からの最良性能のオリゴヌクレオチドのいくつかを、ヒト化Ｔａｕマウスにおいてインビボで試験して、ＣＮＳにおける急性忍容性と、単回注射の３日後又は２８日後のＭＡＰＴ  ｍＲＮＡ低減とを評価した。
【０４２３】
トランスジェニックＴａｕマウスに、１００μｇのＡＳＯを脳室内（ＩＣＶ）注射（材料及び方法、トランスジェニックＴａｕマウスのセクションを参照）によって投与した。国際公開第ＷＯ２０１６／１２６９９５号のＡＳＯ−００１９３３に対応するＣＭＰ番号６６＿１を、陽性対照として含めた。ＡＳＯのＩＣＶ単回注射から１時間、動物の行動学的副作用を観察した。副作用の重篤度に対する急性忍容性は、０（副作用なし）〜２０（安楽死につながる痙攣）のスケールでスコア化した。忍容性スケールを５つの神経行動学的カテゴリに分けた：（１）運動亢進、（２）活動性及び覚醒の低下、（３）運動機能障害／運動失調、（４）異常な姿勢及び呼吸、並びに（５）振戦／痙攣。各カテゴリを０〜４のスケールでスコア化し、最低総スコアは２０であった。ホームケージ中での動物を行動の変化について観察し、その後、握力及び正向反射の測定を含むより詳細な観察のため、ホームケージから取り出した。本発明のＡＳＯの急性忍容性からのデータを表８に示す。
【０４２４】
右前頭皮質領域におけるＭＡＰＴ  ｍＲＮＡ低減を、以下の通りにｑＰＣＲによって分析した。収集したマウス脳組織（材料及び方法セクション、トランスジェニックＴａｕマウスを参照）を、Ｑｕｉａｇｅｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｚｅｒ  ＩＩを用いて、ホスファターゼ阻害剤カクテルセット２及び３、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、並びに完全プロテアーゼ阻害剤カクテルＥＤＴＡフリー（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）を補充した１０倍体積の高塩濃度／ショ糖緩衝液（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、８００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ショ糖（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ）中で均質化した。ホモジネートを２０，０００×ｇで２０分間４℃にて遠心分離した。上清を１００，０００ｘｇで１時間４℃にて遠心分離した。
【０４２５】
ｃＤＮＡ合成及びその後のＰＣＲのために、脳組織上清からの３００ｎｇのＲＮＡを、１ウェルの９６ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ、ＰＣＲ−９６−Ｃ−Ｓ）に加えた。各ウェルに、７．５μＬのマスタミックス（２．５ｍＭ  ＮＴＰ混合物５μＬ及び反応当たり２．５μＬのランダムプライマ）を加え、プレートを１０００ｒｐｍで遠心分離し、サーモサイクラ中に３分間７０℃で放置した。プレートを直ちに氷上で冷却し、４μＬの反応マスタミックスを加えた。ＰＣＲの前に、プレートを簡単に遠心分離して、ウェルの底に試料を収集した。ｃＤＮＡ合成を４２℃で６０分間、９５℃で１０分間行い、その後４℃で保持した。ｃＤＮＡ試料を分子生物学グレードの水で１：３に希釈し、更に使用するまで−２０℃で保存した。
【０４２６】
ＰＣＲについては、各試料を２つのプローブセットで３回実施した（ＭＡＰＴ：Ｔａｑｍａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｈｓ００９０２１９３＿ｍ１；ＧＡＰＤＨ  ＧＡＰＤＨ  Ｔａｑｍａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａａｓｓａｙ  Ｈｓ０１９２２８７６＿ｕ１）。各反応物に、予め希釈した４μＬのｃＤＮＡ及び６μＬのマスタミックスを加え、プレートを遠心分離した。試料を９５℃で２０秒間インキュベートした後、９５℃で１秒間及び６０℃で２０秒間の４０サイクルでインキュベートした。
【０４２７】
データはΔΔＣｔ法を用いて分析した。ここで、各試料は最初にＧＡＰＤＨに標準化し、次いで未処理対照のパーセントとして表した（パーセント阻害）。パーセント阻害が対照細胞と同等又はそれ以上である場合、パーセント阻害は０阻害として表した。
【０４２８】
【表８−１】
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【表８−２】
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【０４２９】
実施例５
ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ｈＥＳＣ）由来ニューロンにおけるインビトロ有効性
実施例２から選択したＡＳＯを、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来ニューロンを用いた代替的インビトロアッセイにおいて、３つの異なる濃度（２００ｎＭ、８ｎＭ、及び０．３２ｎＭ）で試験した。比較目的のために、ＭＡＰＴを標的とする２つの先行技術のオリゴヌクレオチド、すなわち、国際公開第ＷＯ２０１６／１２６９９５号のＡＳＯ−００１９３３に対応するＣＭＰ番号６６＿１及び同第ＷＯ２０１８／０６４５９３号の化合物第８１４９０７号に対応するＣＭＰ番号６７：１が含まれた。
【０４３０】
ヒト胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳＣ）の培養及びＡＳＯ処理：
神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＮＳＣ）を、公開された手順（Ｃｈａｍｂｅｒｓら（２００９年）「Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．」第７巻第２７５〜２８０頁）に従ってヒトＥＳＣから誘導した。神経幹細胞（ＮＳＣ）を、ＳＦＡ培地中において１週間で腹側化前駆細胞に増殖し、次いで、６週間でＢＧＡＡ培地中においてニューロンに分化した。培地含量については材料及び方法のセクションを参照されたい。
【０４３１】
細胞を、１０，０００細胞／ｃｍ２の密度で、ポリオルニチン及びラミニンで被覆したフラスコ内のＮ２Ｂ２７＋ＳＦＡ培地中に播種した。４日目に培地を交換した。７日後、Ｎ２Ｂ２７＋ＳＦＡ培地中で細胞をトリプシン処理し、Ｎ２Ｂ２７＋ＢＧＡＡ培地中で腹側化前駆細胞として、５０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート中に播種した。
【０４３２】
培地を週２回交換し、最初の培地交換時にＡＳＯによる処置を開始し、６週間続けた。次いで、細胞を以下に記載する通りに採取した。
【０４３３】
ｑＰＣＲ分析：
処理したニューロンを以下の通りに採取した：培地を除去し、続いて１２５μＬのＰＵＲＥＬＩＮＫ（登録商標）Ｐｒｏ  ９６溶解緩衝液及び１２５μＬの７０％エタノールを加えた。製造者の指示書に従ってＲＮＡを精製し、最終容積５０μＬの水で溶出した結果、ＲＮＡ濃度は１０〜２０ｎｇ／μＬであった。次いで、ワンステップｑＰＣＲ反応の前に、ＲＮＡを水で１０倍に希釈した。
【０４３４】
ワンステップｑＰＣＲ反応では、ｑＰＣＲミックス（ＱａｕｎｔａＢｉｏ製ｑＳｃｒｉｐｔＴＭＸＬＥ  １−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ｑＰＣＲ  ＴＯＵＧＨＭＩＸ（登録商標）Ｌｏｗ  ＲＯＸ）を２つのＴａｑｍａｎプローブと１０：１：１の比率で混合して（ｑＰＣＲミックス：プローブ１：プローブ２）、マスタミックスを生成した。ｑＰＣＲを技術的反復として実施し、ＴａｑｍａｎプローブをＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した：ＭＡＰＴ＿Ｈｓ００９０２１９３＿ｍ１；ＧＡＰＤＨ  ４３２５７９２（標準化に使用したハウスキーピング遺伝子）。
【０４３５】
次いで、マスタミックス（６μＬ）及びＲＮＡ（４μＬ、１〜２ｎｇ／μＬ）を、ｑＰＣＲプレート（ＭＩＣＲＯＡＭＰ（登録商標）光学３８４ウェル、カタログ番号４３０９８４９）中で混合した。プレートに播種後、プレートを室温で１分間１０００ｇ急速に回転し、Ｖｉｉａ（商標）７システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ）に移した。以下のＰＣＲ条件を使用した：５０℃で１５分間；９５℃で３分間；以下の４０サイクル：９５℃で５秒間、その後１．６℃／秒の減温、続いて６０℃で４５秒間。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）リアルタイムＰＣＲソフトウェアを使用してデータを分析した。ＡＳＯ処理試料のパーセント阻害を、対照処理試料と比較して産出した（低い値はＭＡＰＴの高い減少を示す）。結果は表９に２回の技術的反復の平均として示す。
【０４３６】
ｈＥＳＣニューロンにおけるＴａｕタンパク質及びｐＴａｕタンパク質の測定
ＰＢＳで洗浄した細胞を、Ｃｙｔｏｂｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（メルクミリポア、第７１００９号）、１％のＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  ３（Ｓｉｇｍａ、第Ｐ００４４号）、１％のＰｒｏｔｅａｓｅｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｓｅｔ  ＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、第５３９１３４号）、１％のＤＮＡｓｅ−Ｉ（Ｒｏｃｈｅ、第４５３６２８２００１号）、及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む緩衝液中に抽出した。細胞抽出物を上下にピペッティングして溶解し、その後、使用するまで−２０℃で保存した。
【０４３７】
細胞抽出物中の総Ｔａｕレベルは、Ｔａｕ特異的抗体５Ａ６（ＤＳＨＢ抗体レジストリ番号：ＡＢ＿５２８４８７）及びＲｏｃｈｅインハウスＴａｕモノクローナル抗体Ｔａｕ  ４／２を含むインハウス・アッセイ・フォーマットを用いて、ＡｌｐｈａＬＩＳＡにより測定した。後者の抗体は、マウスをヒト全長Ｔａｕ、すなわち最長ヒト脳アイソフォームであるアミノ酸４４１個で免疫化することによって作製した。Ｔａｕ  ４／２は、アミノ酸３６９と４４１の間に位置するＴａｕのＣ末端エピトープに結合する。簡単に述べれば、細胞抽出物をＡｌｐｈａＬＩＳＡ  ＨｉＢｌｏｃｋアッセイ緩衝液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＡＬ００４Ｃ）中に希釈し、ビオチン化５Ａ６及びＴａｕ  ４／２−被覆ＡｌｐｈａＬＩＳＡ受容体ビーズと混合した。室温で１時間インキュベートした後、ストレプトアビジン被覆ドナービーズを混合物に加える。３０分間インキュベートした後、試料をＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダ（励起６８０ｎｍ、蛍光６１５ｎｍ）で測定した。組換えヒトＴａｕ（メルクミリポア、第ＡＧ９６０号）を用いて標準曲線を作成した。
【０４３８】
細胞抽出物中のリン酸化Ｔａｕ（Ｔａｕ−ｐＳ４２２）レベルを、Ｔａｕ特異的抗体５Ａ６（ＤＳＨＢ抗体レジストリＩＤ：ＡＢ＿５２８４８７）及びＴａｕ−ｐＳ４２２特異的抗体５．６．１１（国際公開第ＷＯ２０１０／１４２４２３号、及びＣｏｌｌｉｎら（２０１４年）「Ｂｒａｉｎ」第１３７巻第２８３４〜２８４６頁に記載）を含むＲｏｃｈｅインハウス・アッセイ・フォーマットを用いてＡｌｐｈａＬＩＳＡにより測定した。細胞抽出物をアッセイ前にアッセイ緩衝液Ｂ中へ希釈する。緩衝液Ｂは、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％Ｔｏｐ  Ｂｌｏｃｋ（ＬｕＢｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１ｍｇ／ｍＬデキストラン５００、１０％ＥＬＩＳＡブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ）を含む。以下の通りに調製したＥＲＫリン酸化Ｔａｕを用いて標準曲線を調製した：組換えヒトＴａｕを、Ｇｒｕｅｎｉｎｇｅｒら（「Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ」第３７巻（２０１０年）第２９４〜３０６頁）に記載されている通りに作製した。組換えＨｉｓ標識ＥＲＫ２（自主制作）は、活性化ＭＥＫＫ１（自主制作）とのインキュベーションにより活性化された。次いで、活性化ＥＲＫ２を、２ｍＭ  ＡＴＰを含有する緩衝液中で１：５０のモル比でＴａｕとインキュベートした。続いて、ＥＲｋ２をＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）上を通して除去した。その後、Ｓ４２２でのリン酸化の程度を質量分析により決定した。
【０４３９】
結果を表９に示す。
【０４４０】
【表９】
2021529525.tif 000096
【０４４１】
実施例６
実施例５の選択された化合物のＩＣ５０
実施例５からの有効なＡＳＯの選択を、２つの先行技術の対照（ＣＭＰ番号６６＿１及びＣＭＰ番号６７＿１）と共に同じｈＥＳＣ由来ニューロンアッセイで試験して、標的ｍＲＮＡ低減及びＴａｕタンパク質低減のＩＣ５０を決定した。
【０４４２】
実験は、以下のオリゴヌクレオチド濃度を用いて実施例５に記載した通りに行った：１０００、２００、４０、８、１．６、０．３２、０．０６４、０．０１２８、０．００２５６ｎＭ。
【０４４３】
ＩＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いて適合させた。結果を表１０に示す。
【０４４４】
【表１０】
2021529525.tif 000097
【０４４５】
これらのデータから、本発明のＣＭＰ番号９＿１０３及び４９＿３８はより効果的であり、全てのパラメータに関して従来技術の化合物よりも良好なＩＣ５０を有するが、一方でＣＭＰ番号５３＿１は、先行技術の化合物よりも優れた最大ノックダウンと、ＣＭＰ番号６６＿１と同様のＩＣ５０とを有するようである。
【０４４６】
実施例７
ｈＴａｕマウスの特定の脳領域におけるインビボ活性
実施例５からのＡＳＯの選択を、単回低用量ＩＣＶ投与の４週間後に、ヒト化Ｔａｕマウス（ｈＴａｕマウス）の特定の脳領域においてインビボで標的を低減するそれらの能力について試験した。
【０４４７】
本実施例で使用したヒト化Ｔａｕマウスは、マウスＴａｕバックグラウンド上に点突然変異Ｐ３０１Ｓを伴うヒトＴａｕ（最長ヒト脳アイソフォーム）を過剰発現するインハウスＲｏｃｈｅ  ｈＴａｕ  Ｐ３０１Ｓトランスジェニックマウス系統である。
【０４４８】
ヒト化Ｔａｕマウスに２５μｇのＡＳＯを下記の通りに脳室内（ＩＣＶ）注射によって投与した。国際公開第ＷＯ２０１６／１２６９９５号のＡＳＯ−００１９３３に対応するＣＭＰ番号６６＿１を比較の目的で含めた。
【０４４９】
インビボＩＣＶマウス評価：
動物飼育：
体重１６〜２３グラムである雌雄混合の動物を、一定の温度（２２±２℃）及び湿度（５５±１０％）に維持したコロニー室で保持し、１２時間／日照射した（０６００時間点灯）。全ての動物は試験期間中、自由に食物及び水を摂取することができた。全てのマウスプロトコルは、デンマーク動物実験国内倫理委員会（Ｄａｎｉｓｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｅｔｈｉｃｓ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）によって承認された。
【０４５０】
脳室内注射：
化合物を脳室内（ＩＣＶ）注射によりマウスに投与した。雌雄混合の６〜８匹のマウスを各処置群に含めた。ＩＣＶ投与前にマウスの体重を測定し、イソフルラン又はプロポフォールで麻酔した（３０ｍｇ／ｋｇ）。脳室内注射は、皮膚及び頭蓋骨を通り右側脳室中へ正確な距離（３．９ｍｍ）を貫通するように調節されたスタンドに固定された２３ゲージ針を装着したＦＥＰカテーテルを有する、ハミルトン・マイクロ・シリンジを用いて行った。注射されるマウスは、片手の親指と人差し指とで首のひだを保持した。優しくではあるがしっかりとした圧力をかけ、針が頭蓋骨の正中線の右１〜２ｍｍ（内側外側）と目の後ろ１〜２ｍｍとを貫通するように頭を上に押した。試験化合物又はビヒクルの５μＬボーラスを、予め決定した注入速度で３０秒かけて注入した。還流を避けるために、マウスを更に５秒間この位置で保持した後、針から離れるように注意深く下方に引き抜いた。この処置は手術又は切開を必要としない。処置から回復するまで動物を加熱ランプ下に置いた。
【０４５１】
試験終了時（４週間）、脳組織（皮質、髄質／能橋、及び中脳）を、Ｔａｕ  ｍＲＮＡ及びタンパク質の分析のためドライアイス上に採取した。
【０４５２】
組織均質化：
マウス脳組織試料を、ＱｉａｇｅｎのＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ  ＩＩを用いてＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）中で均質化した。ホモジネートを完全に溶解させるため室温で３０分間インキュベートした。溶解後、ホモジネートを３分間１３０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を分析に使用した。
【０４５３】
組織からのＲＮＡ精製：
ＲＮＡを、キットＣｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｋｉｔを用いるＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ９６  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）を用いて、３５０μＬの上清から精製した。ＲＮＡ試料を、ＲＮａｓｅフリー水中で２ｎｇ／μＬに標準化し、及び更なる使用まで−２０℃で保存した。実施例５に記載した通りにＭＡＰＴ  ｍＲＮＡレベルを定量した。
【０４５４】
マウス脳組織からのＴａｕタンパク質測定：
予め秤量した凍結組織を、１０ｍＭトリスＣｌ  ｐＨ７．４、８００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０％ショ糖、１％のＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  ３（Ｓｉｇｍａ、第Ｐ００４４号）、１％のＰｒｏｔｅａｓｅｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｓｅｔ  ＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、第５３９１３４号）を含む１０体積（ｗｔ／ｖｏｌ）の抽出緩衝液で抽出した。ＰｒｅＣｅｌｌｙｓ組織破壊剤（２０秒、６５００ｒｐｍ）を用いてホモジネートを調製した。次いで、ホモジネートを１０’０００ｘｇで２０分間４℃にて遠心分離し、上清を分析のために保持した。
【０４５５】
抽出物中のＴａｕレベルを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（カタログ番号ＡＬ２７１Ｃ）によって提供された総Ｔａｕ  ＡｌｐｈａＬＩＳＡキットを用いてＡｌｐｈａＬＩＳＡによって測定した。このアッセイに使用した抗体はキットと共に提供されたＢＴ２及びＴａｕ−１２であり、両方ともＴａｕの中央領域に結合する。抽出物をＨｉＢｌｏｃｋアッセイ緩衝液中に希釈し、次いで、各試料５μｌをアッセイに使用した。アッセイは、供給者によって記載された通りに他の方法で実施した。
【０４５６】
ｍＲＮＡ及びタンパク質の定量の結果を表１１に示す。
【０４５７】
【表１１】
2021529525.tif 000098
【０４５８】
これらのデータから、２５μｇのかなり低い協議（ｃｏｎｃｅｒｔａｔｉｏｎ）でさえ、対照化合物がこの濃度で標的の減少を事実上示さない場合、本発明の化合物のほとんどの脳領域において２０％以上の低減が見られることが観察され得る。
【０４５９】
実施例８
ｈＴａｕマウスにおけるインビボ用量反応及び時間経過
２つのＡＳＯ（ＣＭＰ番号９＿１０３及び４９＿１８９）の用量反応性を、３つの異なる用量（２５、５０、及び１００μｇ）を用いて評価し、投与から１週間後及び４週間後に特定の脳領域で標的低減を測定した。比較目的のために、２つの先行技術化合物（ＣＭＰ番号６６＿１＿１０３及び６７＿１）を、１週間試験のいくつかの用量に含めた。
【０４６０】
実験は実施例７に記載した通りに本質的に実施した。しかしながら、Ｔａｕタンパク質は１週間を超える半減期を有するため、１週間実施された用量反応試験では、Ｔａｕタンパク質は測定されなかった。結果を表１２及び表１３に示す。
【０４６１】
【表１２】
2021529525.tif 000099
【０４６２】
【表１３】
2021529525.tif 000100
【０４６３】
表１２及び１３のデータから、本発明の化合物は、特に１００μｇを投与した場合に、先行技術の化合物よりも有意に優れた性能を示すことが見て取ることができる。ＭＡＰＴ低減は４週間にわたって維持されることもまた見て取ることができる。更に、本発明の化合物は、化合物１００μｇの単回投与による４週間の処置後に、Ｔａｕタンパク質の有意な低減を示す。
【図１】
2021529525.tif 000101
【図２】
2021529525.tif 000102
【図３】
2021529525.tif 000103
【図４】
2021529525.tif 000104
【図５】
2021529525.tif 000105
【図６】
2021529525.tif 000106
【配列表】
2021529525000001.app
【国際調査報告】
2021529525.tif 000107
2021529525.tif 000108
2021529525.tif 000109
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