(57)【要約】  本開示は、クロマトグラフィーシステムの移動相フローストリームに試料を注入して複合フローストリームを生成することを含むリサイクリングクロマトグラフィー方法に関する。試料には、ＡＰＩ及び少なくとも１種の不純物が含まれる。クロマトグラフィーシステムは、第１のカラム及び連続したカラム、第１及び第２のクロマトグラフィーカラムと流体連通する第１の弁、第１及び第２のクロマトグラフィーカラムと連通するヒーター、第１及び第２のクロマトグラフィーカラムと流体連通するフラクションコレクター、並びにフラクションコレクターの前に配置された第２の弁を含む。複合フローストリームは、ベースライン分解能が達成されて少なくとも１種の不純物をＡＰＩから分離するまで、第１の弁を切り替えることにより、第１のクロマトグラフィーカラムから第２のクロマトグラフィーカラムへ、またその逆へリサイクルされる。前記少なくとも１種の不純物はフラクションコレクターに回収される。
2021525872.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リサイクリングクロマトグラフィー方法であって、以下の工程、すなわち、
（ｉ）  クロマトグラフィーシステムの移動相フローストリームに試料を注入して複合フローストリームを生成する工程であって、前記試料が活性医薬成分及び少なくとも１種の不純物を含み、前記クロマトグラフィーシステムが、
連続して配置された第１のクロマトグラフィーカラム及び第２のクロマトグラフィーカラム、
前記第１のクロマトグラフィーカラム及び前記第２のクロマトグラフィーカラムと流体連通する第１の弁、
前記第１のクロマトグラフィーカラム及び前記第２のクロマトグラフィーカラムと連通するヒーター、
前記第１のクロマトグラフィーカラム及び前記第２のクロマトグラフィーカラムと流体連通するフラクションコレクター、及び
前記フラクションコレクターの前に配置された第２の弁
を含む
工程、
（ｉｉ）  ベースライン分解能が達成されて前記少なくとも１種の不純物を前記活性医薬成分から分離するまで、前記第１の弁を切り替えることにより、前記第１のクロマトグラフィーカラムから前記第２のクロマトグラフィーカラムへ、及び前記第２のクロマトグラフィーカラムから前記第１のクロマトグラフィーカラムへと前記複合フローストリームをリサイクルする工程、及び
（ｉｉｉ）  前記フラクションコレクターに前記少なくとも１種の不純物を回収する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記クロマトグラフィーシステムが、液体クロマトグラフィーシステム、ガスクロマトグラフィーシステム、超臨界流体クロマトグラフィーシステム、又はキャピラリー電気泳動クロマトグラフィーシステムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クロマトグラフィーシステムがセミ分取クロマトグラフィーシステムである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記クロマトグラフィーシステムが、セミ分取高速液体クロマトグラフィーシステムである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のクロマトグラフィーカラム及び前記第２のクロマトグラフィーカラムが同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の弁が６ポート弁又は８ポート弁である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の弁が４ポート弁である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１種の不純物が微量不純物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
フラクションコレクターが、約１ｍｇの前記少なくとも１種の不純物を少なくとも９０％の純度レベルで回収する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１種の不純物の化学構造を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１種の不純物の化学構造が、核磁気共鳴によって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１種の不純物を前記活性医薬成分から分離するために、前記ベースライン分解能を達成するように、複数の弁スイッチを予め決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
約１ｍｇの前記少なくとも１つの不純物が前記フラクションコレクター中に回収されるまで、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記活性医薬成分及び前記少なくとも１種の不純物の選択係数が１．２未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒーターが約２０℃〜約１００℃のカラム温度を維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記複合フローストリームが約０．５ｍＬ／分〜約２ｍＬ／分の流速を有し、前記第１のクロマトグラフィーカラム及び前記第２のクロマトグラフィーカラムが、それぞれ約４．６ｍｍの内径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記複合フローストリームが約２ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分の流速を有し、前記第１のクロマトグラフィーカラム及び前記第２のクロマトグラフィーカラムが、それぞれ約１ｃｍの内径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記クロマトグラフィーシステムが、前記第１のクロマトグラフィーカラムと前記第２のクロマトグラフィーカラムとの間に配置された検出器をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記クロマトグラフィーシステムが、前記フラクションコレクターの前に配置された検出器をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
回収された前記少なくとも１種の不純物が、約９０％の純度である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
回収された前記少なくとも１種の不純物が、約９５％の純度である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
回収された前記少なくとも１種の不純物が、約９９％の純度である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
活性医薬成分及び少なくとも１種の不純物を分離するためのリサイクリングクロマトグラフィーシステムであって、
移動相フローストリームに試料を注入して複合フローストリームを生成するインジェクタ、
連続してインジェクタの下流に配置された第１のクロマトグラフィーカラム及び第２のクロマトグラフィーカラム、
前記第１のクロマトグラフィーカラム及び前記第２のクロマトグラフィーカラムと流体連通する第１の弁、
前記第１のクロマトグラフィーカラム及び前記第２のクロマトグラフィーカラムと連通するヒーター、
前記第１のクロマトグラフィーカラム及び前記第２のクロマトグラフィーカラムと流体連通するフラクションコレクター、及び
前記フラクションコレクターの前に配置された第２の弁
を含むリサイクリングクロマトグラフィーシステム。
【請求項２４】
前記第１のクロマトグラフィーカラムと前記第２のクロマトグラフィーカラムとの間に配置された検出器をさらに含む、請求項２３に記載のリサイクリングクロマトグラフィーシステム。
【請求項２５】
前記フラクションコレクターの前に配置された検出器をさらに含む、請求項２３に記載のリサイクリングクロマトグラフィーシステム。
【請求項２６】
前記クロマトグラフィーシステムが、液体クロマトグラフィーシステム、ガスクロマトグラフィーシステム、超臨界流体クロマトグラフィーシステム、又はキャピラリー電気泳動クロマトグラフィーシステムである、請求項２３に記載のリサイクリングクロマトグラフィーシステム。
【請求項２７】
前記クロマトグラフィーシステムがセミ分取クロマトグラフィーシステムである、請求項２６に記載のリサイクリングクロマトグラフィーシステム。
【請求項２８】
前記クロマトグラフィーシステムが、セミ分取高速液体クロマトグラフィーシステムである、請求項２３に記載のリサイクリングクロマトグラフィーシステム。
【請求項２９】
前記第１のクロマトグラフィーカラム及び前記第２のクロマトグラフィーカラムが同一である、請求項２３に記載のリサイクリングクロマトグラフィーシステム。
【請求項３０】
前記第１の弁が６ポート弁又は８ポート弁である、請求項２３に記載のリサイクリングクロマトグラフィーシステム。
【請求項３１】
前記第２の弁が４ポート弁である、請求項２３に記載のリサイクリングクロマトグラフィーシステム。
【請求項３２】
前記ヒーターが約２０℃から約１００℃のカラム温度を維持する、請求項２３に記載のリサイクリングクロマトグラフィーシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、「医薬品中の未知微量不純物の単離及び分取のための高分解能セミ分取リサイクリングクロマトグラフィーシステム」と題した２０１８年５月３１日に提出された米国仮特許出願第６２／６７８，４６９号（その内容全体は本明細書に援用される）の利益及び優先権を主張する。
【０００２】
技術の分野
本開示は、医薬品中の未知微量不純物の単離及び分取のための高分解能セミ分取リサイクリングクロマトグラフィー方法及びシステムに関する。より具体的には、本開示は、活性医薬成分（「ＡＰＩ」）の濃縮溶液から未知微量不純物を単離し、分取するための統合されたクロマトグラフィー装置の集合に基づく方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
濃縮薬物溶液中に存在する約１ｍｇの未知不純物の単離及び分取は、同定のために製薬業界によって求められている。材料約１ｍｇの液体状態核磁気共鳴（ＮＭＲ）実験により、明確な構造の解明が一般に達成される。しかし、標的とする不純物が活性医薬成分とほぼ共溶出し、その相対存在量が非常に少なく（例えば、約１／１００未満）、試料希釈剤が溶離液よりもはるかに濃く、ビスカスフィンガリング（ｖｉｓｃｏｕｓ  ｆｉｎｇｅｒｉｎｇ）が起こり、収率が９９％より大きくなるべきである場合、及びＮＭＲ実験の成功に必要な純度レベルが９０％より大きい場合には、深刻な分離及び製造の問題が生じる。十分な分解能が欠けているため、バッチクロマトグラフィー、疑似移動床（ＳＭＢ）、定常状態リサイクリング（ＳＳＲ）、又はマルチカラム向流溶媒勾配のような標準的な分取法は、この問題を完全に解決することができない。
【発明の概要】
【０００４】
要約
本技術は、高分解能性能とセミ分取能力を組み合わせて単一の精製方法とすることにより、先行技術の問題を解決する。本質的には、これら２つの特徴は競争的なものである。分取クロマトグラフィーは大容量及び高濃度に向いているが、高分解能クロマトグラフィーは少量で希釈された試料を扱う。複雑な分離問題は、交互のポンプ輸送又はツインカラムリサイクリング液体クロマトグラフィー（ＴＣＲＬＣ）により解決できる。ＴＣＲＬＣの一般的な原理は、最適速度及び標準圧でまだ動作している間にカラム長を実質的に伸ばすことである。このような不連続的なＴＣＲＬＣの生産率は連続的ＳＭＢ又は半連続的ＳＳＲ方法の生産率よりも明らかに低いが、それは、（１）実験装置を容易に組み立てることができる、（２）極めて困難な分離問題（分析物対分析物存在比＜１／１００で選択係数α＜１．２）を解決できる、（３）十分な数のサイクルを適用することにより濃い試料希釈剤及びビスカスフィンガリング効果に対処できる、（４）溶離液及びカラム温度を定常に維持することによりその長時間自動化を維持できることをはじめとするいくつかの利点を有している。これらの理由から、フラクションコレクターと連結したＴＣＲＬＣ方法は、製薬業界が直面するような深刻な分離問題に対する解決策である。
【０００５】
一態様では、この技術は、複合フローストリームを生成するために、クロマトグラフィーシステムの移動相フローストリームに試料を注入する工程を含むリサイクリングクロマトグラフィー方法に関する。試料には、活性医薬成分及び少なくとも１種の不純物が含まれる。このクロマトグラフィーシステムは、（１）連続して配置された第１のクロマトグラフィーカラム及び第２のクロマトグラフィーカラム、（２）第１のクロマトグラフィーカラム及び第２のクロマトグラフィーカラムと流体連通する第１の弁、（３）第１のクロマトグラフィーカラム及び第２のクロマトグラフィーカラムと連通するヒーター、（４）第１のクロマトグラフィーカラム及び第２のクロマトグラフィーカラムと流体連通するフラクションコレクター、及び（５）フラクションコレクターの前に配置された第２の弁を含む。複合フローストリームは、ベースライン分解能が達成されて少なくとも１種の不純物を活性医薬成分から分離するまで、第１の弁を切り替えることにより、第１のクロマトグラフィーカラムから第２のクロマトグラフィーカラムへ、及び第２のクロマトグラフィーカラムから第１のクロマトグラフィーカラムへと、リサイクルされる。前記少なくとも１種の不純物はフラクションコレクターに回収される。リサイクリングクロマトグラフィー方法は、以下の実施形態の１つ以上を含むことができる。
【０００６】
クロマトグラフィーシステムは、液体クロマトグラフィーシステム、ガスクロマトグラフィーシステム、超臨界流体クロマトグラフィーシステム、又はキャピラリー電気泳動クロマトグラフィーシステムであることができる。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーシステムはセミ分取クロマトグラフィーシステムである。クロマトグラフィーシステムは、セミ分取高速液体クロマトグラフィーシステムであることができる。
【０００７】
いくつかの実施形態において、第１のクロマトグラフィーカラム及び第２のクロマトグラフィーカラムは同一である。
【０００８】
第１の弁は６ポート弁又は８ポート弁であることができる。いくつかの実施形態では、２つのカラムの間で検出が行われない場合には、第１の弁は６ポート弁であり、検出セルが２つのカラムの間に配置される場合には、第１の弁は８ポート弁である。第２の弁は４ポート弁であることができる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１種の不純物は微量不純物である。
【００１０】
フラクションコレクターは、少なくとも９０％の純度レベルで、約１ｍｇの少なくとも１種の不純物を回収することができる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本方法はまた、少なくとも１種の不純物の化学構造を決定することを含む。少なくとも１種の不純物の化学構造は核磁気共鳴によって決定することができる。
【００１２】
また、この方法は、少なくとも１種の不純物を活性医薬成分から分離するようベースライン分解能を達成するために、複数の弁スイッチを事前に決定することを含むことができる。いくつかの実施形態において、この方法はまた、約１ｍｇの少なくとも１種の不純物がフラクションコレクター中に回収されるまで、注入、リサイクリング及び回収ステップを繰り返すことを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、活性医薬成分及び少なくとも１種の不純物の選択係数は＜１．２である。他の実施形態において、活性医薬成分及び少なくとも１種の不純物の選択係数は＜１．１である。
【００１４】
ヒーターはカラム温度を約２０〜約１００℃に維持できる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、複合フローストリームは約０．５ｍＬ／分〜約２ｍＬ／分の流速を有し、第１のクロマトグラフィーカラム及び第２のクロマトグラフィーカラムは、それぞれ約４．６ｍｍの内径を有する。いくつかの実施形態において、複合フローストリームは、約２ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分の流速を有し、第１のクロマトグラフィーカラム及び第２のクロマトグラフィーカラムは、それぞれ約１ｃｍの内径を有する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーシステムは、第１のクロマトグラフィーカラムと第２のクロマトグラフィーカラムとの間に配置された検出器も含む。クロマトグラフィーシステムは、フラクションコレクターの前に配置された検出器も含むことができる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、回収された少なくとも１種の不純物の純度は、約９０％である。回収された少なくとも１種の不純物の純度は約９５％であることができる。いくつかの実施形態において、回収された少なくとも１種の不純物の純度は約９９％である。
【００１８】
別の態様において、本技術は、活性医薬成分及び少なくとも１種の不純物を分離するためのリサイクリングクロマトグラフィーシステムに関する。リサイクリングクロマトグラフィーシステムは、移動相フローストリームに試料を注入して複合フローストリームを生成するための注入器を含む。リサイクリングクロマトグラフィーシステムはまた、連続して注入器の下流に配置された第１のクロマトグラフィーカラム及び第２のクロマトグラフィーカラムを含む。第１の弁は、第１のクロマトグラフィーカラム及び第２のクロマトグラフィーカラムと流体連通する。ヒーターは、第１のクロマトグラフィーカラム及び第２のクロマトグラフィーカラムと連通する。リサイクリングクロマトグラフィーシステムはまた、第１のクロマトグラフィーカラム及び第２のクロマトグラフィーカラムと流体連通するフラクションコレクターを含む。第２の弁はフラクションコレクターの前に配置される。リサイクリングクロマトグラフィーシステムは、本明細書に記載される１つ以上の実施形態を含むことができる。
【００１９】
リサイクリングクロマトグラフィーシステムはまた、第１のクロマトグラフィーカラムと第２のクロマトグラフィーカラムとの間に配置された検出器を含むことができる。
【００２０】
クロマトグラフィーシステムは、液体クロマトグラフィーシステム、ガスクロマトグラフィーシステム、超臨界流体クロマトグラフィーシステム、又はキャピラリー電気泳動クロマトグラフィーシステムであることができる。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーシステムはセミ分取クロマトグラフィーシステムである。リサイクリングクロマトグラフィーシステムは、セミ分取高速液体クロマトグラフィーシステムであることができる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、第１のクロマトグラフィーカラム及び第２のクロマトグラフィーカラムは同一である。例えば第１のクロマトグラフィーカラム及び第２のクロマトグラフィーカラムは、同じ長さ及び内径を有し、同じ固定相材料を有することができる。
【００２２】
第１の弁は６ポート弁又は８ポート弁であることができる。いくつかの実施形態では、２つのカラムの間で検出が行われない場合には、第１の弁は６ポート弁であり、検出セルが２つのカラムの間に配置される場合には、第１の弁は８ポート弁である。第２の弁は４ポート弁であることができる。
【００２３】
ヒーターはカラム温度を約２０〜約１００℃に維持できる。
【００２４】
本技術は、以下の添付図と併せて以下の詳細な説明からより完全に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本技術の例示的な実施形態によるセミ分取高分解能ツインカラムリサイクリング液体クロマトグラフィーシステムの模式図である。
【図２】本技術の例示的な実施形態によるリサイクリングクロマトグラフィー方法のフローチャートである。
【図３】本技術の例示的な実施形態による、１．５から２．０、２．５、３．５、５．０、７．５及び１０μｍにサイズが増大する粒子を詰め込んだ長さＬ＝１５ｃｍの２つのツインカラムについて、４０００ｐｓｉの一定の圧力低下でリサイクリングプロセスの計算された速度−分解能又は速度論プロットを示すグラフである。
【図４】本技術の例示的な実施形態による、ちょうど１サイクル後に６μＬのＡＰＩストック溶液を注入した後に記録されたクロマトグラムである。
【図５】本技術の例示的な実施形態による、ＡＰＩストック（ｓｏｔｃｋ）溶液の注入容量を３から６、１２、２４、４８、７４、及び１００μＬに増加させた以外は図４と同じクロマトグラムである。
【図６】本技術の例示的な実施形態による、移動相における試料希釈剤の体積分率の関数としての、標的不純物（四角）及びＡＰＩ（丸）の両方の保持係数ｋ’の変動のグラフである。
【図７】本技術の例示的な実施形態による、試料希釈剤の溶出強度が溶離液の溶出強度よりもはるかに強い場合の、標的不純物（低濃度）及びＡＰＩ（高濃度）の計算された濃度プロファイルのクロマトグラムである。
【図８】本技術の例示的な実施形態による、試料希釈剤の溶出強度が溶離液の溶出強度よりもはるかに強い場合のサイクル数の関数としての、標的不純物の最大生産率（９９．７％の収率及び９９．０％の純度）の予測を示すグラフである。
【図９】本技術の例示的な実施形態による、最初の５サイクル（一番上のクロマトグラム）後のリサイクリング低分散検出セル及び最後かつ６回目のサイクル後の回収検出セル（一番下のクロマトグラム）によって記録された、標的不純物（低未知濃度）及びＡＰＩ（１０ｇ／Ｌ）の実験的クロマトグラム（サイクル数＝６、ストック溶液の注入量＝１００μＬ）である。
【図１０】本技術の例示的な実施形態による、ｔ＝２０．３分からｔ＝２１．３分までの１分間の回収期間中の６回目のサイクル後に回収検出器によって記録された３０の連続した実験クロマトグラムの再現性を示すクロマトグラムである。
【図１１】本技術の例示的な実施形態による、ＡＰＩストック溶液１０２０について記録された元のクロマトグラムと、未知不純物１０１０の濃縮画分について記録されたクロマトグラムとの比較である。
【図１２Ａ】本技術の例示的な実施形態による、未知標的不純物の分子イオンの質量を明白に明らかにする勾配ＬＣ単一イオン監視ＭＳ実験である。図１２Ａは、光ダイオードアレイの最大プロットを示す。
【図１２Ｂ】本技術の例示的な実施形態による、未知標的不純物の分子イオンの質量を明白に明らかにする勾配ＬＣ単一イオン監視ＭＳ実験である。図１２Ｂは全イオンクロマトグラムを示す。
【図１２Ｃ】本技術の例示的な実施形態による、未知標的不純物の脱水形態の分子イオンの質量を明白に明らかにする勾配ＬＣ単一イオン監視ＭＳ実験である。図１２Ｃは、単一イオン監視（ＳＩＭ）クロマトグラムを示す。
【図１２Ｄ】本技術の例示的な実施形態による、未知標的不純物の脱水形態の分子イオンの質量を明白に明らかにする勾配ＬＣ単一イオン監視ＭＳ実験である。図１２Ｄは単一イオン監視（ＳＩＭ）クロマトグラムを示す
【図１３Ａ】本技術の例示的な実施形態によるエストラジオールストック溶液中の単一不純物のクロマトグラムである。
【図１３Ｂ】本技術の例示的な実施形態による、２６９．３のｍ／ｚを有するエストラジオールストック溶液中の単一不純物の質量スペクトルである。
【図１４】本技術の例示的な実施形態による、回収された不純物がエストロンではないことを示す１Ｈ−１３Ｃ  ＮＭＲである。
【図１５Ａ】本技術の例示的な実施形態による、図１５Ｂと比較した場合の２７９．６ｎｍから２６０．７ｎｍへの最大ＵＶ吸収波長のシフトから、エストロンのエノール互変異性体として未知標的不純物を明白に同定したことを示す。
【図１５Ｂ】本技術の例示的な実施形態による、図１５Ａと比較した場合の２７９．６ｎｍから２６０．７ｎｍへの最大ＵＶ吸収波長のシフトから、エストロンのエノール互変異性体として未知標的不純物を明白に同定したことを示す。
【図１６】本技術の例示的な実施形態による、５０μＬの分析注入下での不純物及びＡＰＩの保持時間の測定を示すクロマトグラムである。
【図１７】本技術の例示的な実施形態による、分取条件下での、半分の高さでのＡＰＩバンドの前部及び後部の両方の保持時間の測定のクロマトグラムを示す。
【図１８】本技術の例示的な実施形態による、８サイクル後に０．５分超離れた不純物及びＡＰＩバンドのクロマトグラムを示す。
【図１９】本技術の例示的な実施形態による、少なくとも９０％の純度で１ｍｇの不純物を得るための不純物の回収の開始時間及び終了時間を示すクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本技術は、高分解能性能及びセミ分取能を組み合わせて、単一の精製方法とするクロマトグラフィー方法及びシステムに関する。本質的には、これら２つの特徴は競争的なものである。分取クロマトグラフィーは大容量及び高濃度に向いているが、高分解能クロマトグラフィーは少量かつ希釈された試料を扱う。複雑な分離問題は、交互のポンプ輸送又はツインカラムリサイクリング液体クロマトグラフィー（ＴＣＲＬＣ）により解決できる。ＴＣＲＬＣの一般的な原理は、最適速度及び標準圧でまだ動作している間にカラム長を実質的に伸ばすことである。フラクションコレクターと連結したＴＣＲＬＣ方法は、製薬業界が直面するような深刻な分離問題に対する解決策である。
【００２７】
図１は、セミ分取高分解能のツインカラムリサイクリングクロマトグラフィーシステム１００の模式図である。システム１００は、液体クロマトグラフィーシステム、ガスクロマトグラフィーシステム、超臨界流体クロマトグラフィーシステム、又はキャピラリー電気泳動クロマトグラフィーシステムであることができる。システム１００は、分析用クロマトグラフィーシステム又はセミ分取クロマトグラフィーシステムであることができる。いくつかの実施形態において、システム１００は、セミ分取高速液体クロマトグラフィーシステムである。
【００２８】
システム１００は、３つのサブユニット、すなわち、注入サブユニット１０２、リサイクリングサブユニット１０４、及び回収サブユニット１０６からなる。注入サブユニット１０２は、試料バイアル１１０又は試料マネジャー（図示せず）から試料を移動相フローストリーム１１２に注入するための注入器１０８を備える。試料マネジャーを使用する実施形態では、試料マネジャーは例えば１０ｍＬの試料バイアルを含むことができる。
【００２９】
移動相は、ポンプ１１４によってシステム１００にポンプ輸送され、注入弁１１６に流入する。ポンプ１１４は、約６００ｂａｒの最大圧で約５ｍＬ／分の移動相をクロマトグラフィーシステムにポンプ輸送することができる二元溶媒ポンプであることができる。
【００３０】
注入弁１１６は、例えば回転弁であることができ、６つのポートを有することができる。注入弁１１６は、スプール弁、リニア弁、又は回転弁であることができる。弁１１６は、例えば回転剪断弁とすることができる。弁１１６は、低分散弁とすることができる。注入弁１１６は、クロマトグラフィーカラムに入る前に、試料を移動相フローストリーム１１２と混合し、複合フローストリーム１１８を形成することができる。移動相を引き上げるための第１の位置、及び試料を注入し、クロマトグラフィーの実施の間に洗浄液１２０を引き上げるための第２の位置に注入弁１１６を駆動させることができる。いくつかの実施形態において、注入サブユニット１０２は、延長ループ１２２を含む。延長ループ１２２は、サンプリングされる体積を増加させるために使用することができる。
【００３１】
リサイクリングサブユニット１０４は、第１のクロマトグラフィーカラム１２４及び第２のクロマトグラフィーカラム１２６を含む。第１及び第２のクロマトグラフィーカラム１２４、１２６は、注入器１０８の下流、及び試料及び移動相を混合して複合フローストリーム１１８を形成した後に位置する。クロマトグラフィーカラム１２４、１２６は、同一であってもよいし、実質的に同一であってもよい。例えば第１及び第２のクロマトグラフィーカラム１２４、１２６は、同じ長さ、内径及び充填材料を有することができる。カラム１２４、１２６の特定の長さ、内径、充填材料、及び他のパラメータは、実施されるべき特定の分離に基づいて、当業者に知られるであろう。例えば複合フローストリーム１１８が約０．５ｍＬ／分〜約２ｍＬ／分の流速を有する場合、第１及び第２のクロマトグラフィーカラム１２４、１２６は、それぞれ、約４．６ｍｍの内径を有することができる。別の例では、複合フローストリーム１１８が約２ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分の流速を有する場合、第１及び第２のクロマトグラフィーカラム１２４、１２６は、それぞれ、約１ｃｍの内径を有することができる。カラムには３〜５μｍの粒子を充填することができる。
【００３２】
リサイクリング（又は第１の）弁１２８は、第１及び第２のカラム１２４、１２６の間に位置することができ、第１及び第２のカラム１２４、第１２６と流体連通することができる。弁１２８は、例えば回転弁であることができる。弁１２８は、スプール弁、リニア弁、又は回転弁であることができる。弁１２８は、例えば回転剪断弁とすることができる。弁１２８は、ベースライン分解能が達成されるまで、第１の位置と第２の位置との間で駆動されて、第１のクロマトグラフィーカラム１２４から第２のクロマトグラフィーカラム１２６へ、及び第２のクロマトグラフィーカラム１２６から第１のクロマトグラフィーカラム１２４へ、複合フローストリーム１１８をリサイクルさせることができる。これは、いまだ最適な速度及び低圧で運転することができる無限に長いカラムを再現する。標的不純物のクロマトグラフィーバンド全体は、主要な薬物及び他の非標的不純物のバンドのクロマトグラフィーバンド全体と完全に分離するまで、必要な限り多くの回数ツインカラム間でリサイクルさせることができる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、第１のクロマトグラフィーカラム１２４と第２のクロマトグラフィーカラム１２６との間に、リサイクリング検出器１３０を配置することができる。検出器１３０は、例えば試料が分離されたかどうかを決定するために使用することができる。検出器１３０はまた、弁の移動時間を規定するために使用することができる。タイミングが設定されると、検出器１３０をシステムから取り外すことができる。検出器１３０がクロマトグラフィーシステム１００に使用される場合、弁１２８は８ポート弁とすることができる。検出器が２つのカラム１２４、１２６の間に配置されない実施形態では、弁１２８は６ポート弁とすることができる。弁のスイッチの数が実験データ又は理論的計算に基づいて予め決定されている場合、クロマトグラフィーカラム間の検出器をなくすことができる。
【００３４】
クロマトグラフィーシステムは、第１及び第２のクロマトグラフィーカラム１２４、１２６と連通するヒーター（図示せず）を含むことができる。ヒーターは、例えば、活性な溶離液プレヒーターを有する２カラムオーブンとすることができる。ヒーターはカラムの温度を約２０〜約１００℃の間に維持できる。ヒーターは、２０℃、２１℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃にカラムの温度を維持できる。これらの値は、範囲を形成するために使用することができる。
【００３５】
クロマトグラフィーシステムには、第１及び第２のクロマトグラフィーカラム１２４、１２６、ヒーター及び弁１２８に連通するカラムマネジャー（図示せず）も含めることができる。カラムマネジャーは、たとえば弁切り替え時間及びカラムの温度をカラムマネジャーが管理できるようにするソフトウェアを搭載したコンピュータを含むことができる。カラムマネジャーはカラム及びカラムに入る移動相の温度を約０．１℃の精度で管理及び維持することができる。その結果、２つのカラムに複数回通し、約１２時間程度の分析時間をかけても、不純物及びＡＰＩの両方の保持時間は０．１％程度の相対標準偏差で非常に再現性が高い。
【００３６】
回収サブユニット１０６は、第１及び第２のクロマトグラフィーカラム１２４、１２６と流体連通するフラクションコレクター又は回収バイアル１３２を含む。フラクションコレクター１３２は、ＡＰＩから不純物を完全に分離した後、及びカラム１２４、１２６から不純物が溶出する際に、不純物を回収するために使用することができる。回収（又は第２の）弁１３４はフラクションコレクター１３２の前に配置される。回収弁１３４は、例えば回転弁であることができる。回収弁１３４は、スプール弁、リニア弁、又は回転弁であることができる。弁１３４は、例えば回転剪断弁であってもよく、回収弁１３４は４ポート弁であってもよい。弁１３４が第１の位置にあるとき、カラム１２４、１２６からの流れは廃液ボトル１３６に流れる。弁１３４が第２の位置にあるとき、カラム１２４、１２６からの流れはフラクションコレクター１３２に流れる。
【００３７】
回収サブユニット１０６は、また、フラクションコレクター１３２の前に配置された回収検出器１３８を含むことができる。回収検出器１３８は、弁１３４の前に配置することができる。検出器１３８は、例えばＵＶ−Ｖｉｓダイオードアレイ検出器又は質量分析計であることができる。他のあらゆる種類の検出器も同様に用いることができる。選択した検出器がシステム圧力に耐えられない場合、分割流アプローチを使用して、選択した検出器がその典型的な圧力制限内で作動できるようにすることができる。検出器１３８からの情報は、フラクションコレクター１３２内で回収されつつあるものを決定するために使用することができる。さらに、検出器１３８は、未知標的不純物の回収された画分の純度を制御することができる。
【００３８】
図２はリサイクリングクロマトグラフィー方法２００のフローチャートである。方法２００は、複合フローストリームを生成するために、クロマトグラフィーシステムの移動相フローストリームに試料２０５を注入することを含む。試料には、活性医薬成分（ＡＰＩ）及び少なくとも１種の不純物が含まれる。例えば試料には、１種、２種、３種、４種、５種、６種、又はそれ以上の不純物を含むことができる。不純物は微量不純物であることができる。微量不純物とは、ＡＰＩ以外の意図しない少量の物質であり、すなわち検出及び／又は測定がしばしば困難である。微量不純物は、例えばＡＰＲの濃縮溶液（約１０ｇ／Ｌ）中で約０．０１ｇ／Ｌ未満の濃度を有することができる。活性医薬成分及び不純物の選択係数は約１．２未満である。
【００３９】
試料はクロマトグラフィーシステムに注入される。クロマトグラフィーシステムは、例えば本明細書に記載された任意の実施形態を含む図１のクロマトグラフィーシステムであることができる。
【００４０】
ベースライン分解能が達成されてＡＰＩから少なくとも１種の不純物を分離するまで、弁（例えば図１の弁１２８）を切り替えることにより、第１のクロマトグラフィーカラムから第２のクロマトグラフィーカラム（例えば、図１のクロマトグラフィーカラム１２４、１２６）へ、及び第２のクロマトグラフィーカラムから第１のクロマトグラフィーカラムへ複合フローストリームはリサイクルされる（２１０）。いくつかの実施形態において、ベースライン分解能に到達するのに必要な弁スイッチの数は、試料がクロマトグラフィーシステムに注入される前に予め定められる（２１３）。ベースライン分解能に到達するのに必要な弁スイッチの数は、事前の較正実験によって、又は当業者に知られた計算によって予め決定することができる。その後、これらの既知の切り替え時間をカラムマネジャーのタイムテーブルにプログラムすることができ、これを使用して必要な時間で弁を切り替えることができる。その後、最終サイクルの終了時に不純物バンドを回収する。さらに、画分マネジャーの既知の開始時間及び終了時間を画分マネジャーのタイムテーブルに入力することができる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ステップ２１０は、所定の純度レベルに達しているか否かを決定するための試験ループを含む。例えば試験ループは、未知の不純物が９０％の純度レベルに達したかどうかを判定することができる。「はい」の場合、システムはステップ２１５に移行する。そうでなければ、予め決定された純度が達成されるまで、フローストリームはリサイクルされる。
【００４２】
これは、いまだ最適な速度及び低圧で運転することができる無限に長いカラムを再現している。標的不純物のクロマトグラフィーバンド全体は、それが主要な薬物及び他の非標的不純物のクロマトグラフィーバンド全体から完全に分離されるまで、必要な限り多くの回数ツインカラム間でリサイクルさせることができる。
【００４３】
次に、少なくとも１種の不純物をフラクションコレクター（例えば図１のフラクションコレクター１３２）に回収する（２１５）。いくつかの実施形態において、さらなる試験のために一定量の不純物が必要である。例えば１ｍｇの不純物が、核磁気共鳴（ＮＭＲ）により不純物の化学構造２２０を決定するのに必要である。したがって、少なくとも１種の不純物を回収した後（２１５）、必要量の不純物が回収されたかどうかを判定する（２２５）。必要量（例えばＮＭＲ分析のために１ｍｇ）の不純物が回収された場合、少なくとも１種の不純物の化学構造を決定することができる（２２０）。例えば１ｍｇ未満の不純物が回収されているなど、必要量がまだ回収されていない場合には、必要量の不純物を回収するために、注入ステップ（２０５）、リサイクリングステップ（２１０）及び回収ステップ（２１５）を必要な限り多くの回数繰り返す。
【００４４】
ＮＭＲからの情報は、不純物の構造を決定するために、クロマトグラフィーシステム、内の他の検出器、例えば図１の検出器１３８と併せて使用することができる。
【００４５】
不純物は様々な純度で回収することができる。例えば回収された不純物の純度は９０％、９５％又は９９％とすることができる。いくつかの実施形態において、回収された不純物の純度は、９１％、９２％、９３％、９４％、９６％、９７％、又は９８％である。一実施形態では、例えばＮＭＲを使用して化学構造の解明が必要とされる場合、フラクションコレクターは、少なくとも約９０％の純度レベルで約１ｍｇの不純物を回収する。
【００４６】
また、上記の方法では、約１００％の収率が得られ、すなわち、注入された不純物の質量は、ほぼ全て回収される。いくつかの実施形態において、不純物の収率は、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。
【００４７】
この方法は、移動相溶離液の組成が一定で均一に保たれているアイソクラティック条件下で行うことができる。この方法は、不純物及びＡＰＩがほぼ共溶出する場合に特に有用であるが、任意の不純物／ＡＰＩ溶出プロファイルに使用することができる。
【００４８】
本明細書に記載されたシステム及び方法は、（主ＡＰＩとほぼ共溶出する未知微量不純物の分離のための）超高分解能性能及び（所定量（例えば１ｍｇ）の微量不純物の分取のための）セミ分取能を組み合わせる。さらに、本システム及び方法は、（１）試料希釈剤の溶出強度と溶離液の溶出強度との不一致（重度のバンド歪み及びバンド分解能の損失を引き起こす）、及び（２）試料希釈剤の粘度と溶離液の粘度の不一致（弱い方法ロバストネス及び分解能損失につながる歪んだ及び再生不可能なバンド形状を引き起こす）をはじめとする、分取クロマトグラフィーで遭遇するあらゆる望ましくない問題を解決する。
【００４９】
本明細書中に記載されたシステム及び方法は、モノクローナル抗体の少量（約１ｍｇ）の低存在量同位体、エナンチオマー、異性体、ポリマー、及び凝集体の困難な分離及び分取のために使用され得る。このシステム及び方法は、異なる分取スケール（内径約２．１ｍｍ〜３ｃｍのカラム）及び任意のクロマトグラフィー保持モード（例えば逆相液体クロマトグラフィー、順相液体クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、又はサイズ排除クロマトグラフィー）、並びに移動相の任意の物理的状態（例えばガス、液体、又は超臨界流体（例えば二酸化炭素））で適用することができる。
【００５０】
本明細書に記載の技術は、全てのその初期（試料前に溶出する）及び後期（試料後に溶出する）不純物から試料を清浄化するために使用することができる。
【実施例】
【００５１】
［実施例１（理論上）］
この実施例では、セミ分取ＴＣＲＳＰの生産率を理論的な観点から最適化した。第１のステップでは、標的不純物をＡＰＩから分離するために使用されるＴＣＲＳＰの分解能を、それぞれが固定長Ｌ−１５ｃｍを有する２つのツインカラム（ΔＰ＝４０００ｐｓｉ）に沿った課せられた最大圧力低下での速度−分解能プロットの構築から最適化する。次に、精製方法について、市販されている最良の粒子径ｄｐ，ｏｐｔを決定する。第２のステップでは、収率及び純度レベルをそれぞれ少なくとも９９．７％及び９９．０％とし、を最適サイクル数（内径（ｉ．ｄ．）４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍの２つのカラムを用いて最大注入量（Ｖｐ，ｏｐｔ（ｎｏｐｔ））を見つけることにより、生産率を最大にする。計算では、不純物及びＡＰＩの両方の吸着等温線は線状であると仮定される。
【００５２】
＜超高分解能クロマトグラフィー：リサイクリングシステムの性能の最適化＞
【００５３】
ＴＣＲＳＰは、一方のカラムからもう一方のツインカラムへ、標的分離ゾーン（微量不純物のバンド全体及び画分ＡＰＩバンド）を複数回リサイクルさせることに基づいている。観測された２つのツインカラムに沿った圧力低下ΔＰ及び各カラムの固定長Ｌに基づいて、分解能又は速度−分解能性能のいずれかを最大にする最適粒子サイズｄｐ，ｏｐｔを明確に決定することができる。ｄｐ，ｏｐｔの選択に必要な全ての詳細は、Ｆ．Ｇｒｉｔｔｉ、Ｓ．Ｃｏｒｍｉｅｒ、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  １５３２（２０１８）７４−８８に記載されている。この実施例では主な結果をまとめた。
【００５４】
この方法は、ＴＣＲＳＰのための速度−分解能プロットの構築に基づいている。理想的な条件（サイクルの累積によるカラム効率の損失なし）では、ｎサイクル後に期待される分解係数Ｒｓ（ｎ）を式１に示す。
【数１】
2021525872.tif 000003
式中、
【数２】
2021525872.tif 000004
は観察された選択係数であり、
【数３】
2021525872.tif 000005
は分離される２つの化合物の平均保持係数であり、ｋ’Ａ＝０．７２は、最も保持されていない化合物Ａの保持係数である。この例では、下付き文字Ａ及びＢは、それぞれ不純物及びＡＰＩを指す。式１の板の高さＨは、典型的には、ＲＰＬＣ中に弱く保持される小分子（拡散係数Ｄｍ約１．５×１０−５ｃｍ２／秒）のものである。古典的なＫｎｏｘ板高さモデルに基づいて、換算された板の高さｈ＝Ｈ／ｄｐを式２に記述する。
【数４】
2021525872.tif 000006
式中、Ｂ＝３．０、Ａ＝１．０及びＣ＝０．０１は３．５μｍのＳｕｎｆｉｒｅ−Ｃ１８完全多孔性粒子（平均孔径１００Å）が充填され、この実施例（０．７ｍＬ／分の流速、Ｔ＝３０℃、及びアセトニトリル／水移動相６５／３５ｖ／ｖでＡＰＩ及び不純物の両方についてＮ＝１８０００）で使用された４．６ｍｍ×１５０ｍｍカラムの観察された効率と一致している。ｖは換算された間隙線速度（式３）である。
【数５】
2021525872.tif 000007
【００５５】
式４において、ｕは間隙線速度である。
【数６】
2021525872.tif 000008
式中、Ｆｖ＝０．７ｍＬ／分は適用流速であり、εｅ＝０．３８はクロマトグラフィー床の外部有孔度であり、ｒｃ＝０．２３ｃｍはカラムの内側半径である。
【００５６】
ＴＣＲＳＰにおけるｕ、ｄｐ、ΔＰ及びＬの関係は式５に示したＫｏｚｅｎｙ−Ｃａｒｍａｎ関係によって与えられる。
【数７】
2021525872.tif 000009
式中、Ｋｃ＝１４８は、線速度の関数として余分なカラム圧力に対して補正された圧力低下のプロットからのＫｏｚｅｎｙ−Ｃａｒｍａｎ定数の測定値である。
【００５７】
分解係数の単位あたりのホールドアップ時間ｔ０／Ｒｓは式６で与えられる。
【数８】
2021525872.tif 000010
式中、εｔ＝０．５８は移動相におけるチオ尿素の保持時間から推定したカラムの全有孔度である。
【００５８】
ｔ０／Ｒｓ（ｎ）対Ｒｓ（ｎ）の速度−分解能プロットは、線形条件下でＴＣＲＳＰのサイクルの最大数ｎｍａｘまで作り上げられる。その最大サイクル数を超えると、分離ゾーンの空間幅は１カラムの長さを超えるであろう。対称なガウス分布ピーク及び２ｍσのベースラインピーク幅（ｍ＝３、σはピーク標準偏差）を仮定すると、ｎｍａｘは式７によって与えられる。
【数９】
2021525872.tif 000011
式中、Δは式８によって与えられる。
【数１０】
2021525872.tif 000012
式中、係数ｆ＜０．５は、２つの化合物の移動速度の合計に対する最も保持された化合物Ｂの移動速度の比である。
【００５９】
＜セミ分取クロマグラフィー：生産率の最適化＞
【００６０】
微量不純物を不連続ＴＣＲＳＰで抽出しなければならない出発ＡＰＩストック溶液（液体状態ＮＭＲによる明白な構造同定では最大回収に対して収率＞９９．７％、純度＞９０．０％）は、ＡＰＩピークの前後に溶出する数種の不純物を含む濃縮ＡＰＩ溶液（ＣＡＰＩ＝１０ｇ／Ｌ）である。この例では、標的不純物はＡＰＩの直前に溶出する（選択係数α＝１．１６６）。この共溶出不純物の最大量を可能な限り短時間（最大生産率）で回収することを目標とする。ＡＰＩストック溶液中に注入された不純物は微量で存在し、ＮＭＲ解析には１ｍｇの材料が必要であるため、収率は９９．７％程度とする。さらに、ＮＭＲによる明確な構造解明のためには、純度が９０．０％を超えていなければならない。計算では、純度は９９．０％とした。波長λ＝２５４ｎｍにおいて、ＡＰＩのものに対する未知不純物が検出された。この比はストック溶液に対し１／６７である。まさに第一近似値において、不純物及びＡＰＩの吸光係数を最大吸光度（不純物の場合はλ＝２６０．７ｎｍ、原薬の場合はλ＝２７９．６ｎｍ）で同程度と仮定すると、原液中の不純物濃度を計算において０．０１７５ｇ／Ｌと推定した。
【００６１】
連続して接続した二つのツインカラムに沿った適用された圧力低下ΔＰ＝４０００ｐｓｉ、それらの長さＬ＝１５ｃｍ、それらの内側半径ｒｃ＝０．２３ｃｍ、及び予め決定された最適粒径ｄｐ、ｏｐｔが与えられたとき、２つの最後の実験パラメータはセミ分取方法で依然として選択されなければならない状態にある。１）ＴＣＲＳＰにおける最適サイクル数ｎｏｐｔ、及び２）収率及び純度の制約を考えると生産率を最大にする最大許容注入量Ｖｐ、ｏｐｔ（ｎｏｐｔ）がある。ｎサイクル後に９９．７％を超える収率で注入及び回収できる最大試料体積Ｖｐ、ｍａｘ（ｎ）は、不純物のカラムホールドアップ体積Ｖ０、保持係数ｋ’Ａ及びカラム効率Ｎから予測できる。その結果は、式９によって与えられる。
【数１１】
2021525872.tif 000013
式中、Ｖ０＝１．４３ｍＬは各ツインカラムのホールドアップ体積、ｋ’Ａ＝０．７２、及びＮ＝１８０００である。
【００６２】
次の小区分では、試料希釈剤の溶出強度が移動相の溶出強度と正確に一致することを前提とする。２つ目の小区分では、バンド変形（バンドフロンティング（ｆｒｏｎｔｉｎｇ））の観点から、試料希釈剤（強）と溶離液（弱）の溶出強度間の不一致を考慮する。溶出強度の不一致は、不純物及びＡＰＩバンドの両方の前部が、注入容量が増加するにつれてより低い溶出時間に向かって伸びるため、深刻なバンド変形を引き起こす。
【００６３】
＜試料希釈剤及び溶離液の溶出強度の理想的一致＞
【００６４】
式１０はストック溶液の可変注入時間であるｔｐを示す。
【数１２】
2021525872.tif 000014
線形条件下では、式１１に示す誤差関数により、任意のサイクル数ｎについて不純物の濃度プロファイルが与えられる。
【数１３】
2021525872.tif 000015
式中、ｔ’はダミー変数、ｔＡは単一カラム上の不純物の保持時間、σＡはｔｐがゼロに向かう傾向にある場合の不純物の濃度分布の経時的標準偏差である。
【００６５】
同様に、ＡＰＩの濃度プロファイルは式１２によって与えられる。
【数１４】
2021525872.tif 000016
式中、ｔＡＰＩは単一カラム上のＡＰＩの保持時間であり、σＢは、ｔｐがゼロに向かう傾向にある場合のＡＰＩの濃度分布の対応する経時的標準偏差である。
【００６６】
【数１５】
2021525872.tif 000017
及び
【数１６】
2021525872.tif 000018
の間の不純物の回収は、収率が９９．７％を超えることを保証する。純度Ｐは、回収された総質量に対する不純物の回収質量と定義される。それは式１３により与えられる。
【数１７】
2021525872.tif 000019
【００６７】
いずれの固定サイクル数ｎについても、目的とするＰ＞９９．０％を満たすように、注入できるストック溶液の最大体積Ｖｐ、ｍａｘ（ｎ）を明確に求める。
【００６８】
生産率Ｐｒ（ｎ）は、ｎ回のサイクルを適用したときの単位時間当たりに回収された不純物の質量として定義される。したがって、それは式１４に示すように記述される。
【数１８】
2021525872.tif 000020
式中、ｔＤｅｌａｙ=１０秒は、実施の終了から試料抜き取り事象の開始の間の遅延時間であり、ＦＤｒａｗ＝１００μＬ／分は、試料体積が注入ループに送達される流速である。ｎｏｐｔはＰｒ（ｎ）の最大値で定義される。
【００６９】
＜試料希釈剤及び溶離液の溶出強度間の不一致＞
【００７０】
この小区分では、不純物及びＡＰＩの保持係数は、試料希釈剤注入（アセトニトリル／メタノール、５０／５０、ｖ／ｖ）の溶離液（アセトニトリル／水６５／３５、ｖ／ｖ）への体積分率φに依存する。実験データから、以下の経験的関係（式１５及び１６）が最も正確であることが分かる（図６参照）。
【数１９】
2021525872.tif 000021
式中、ＳＡ＝０．６３５９及びＴＡ＝０．６５９９は、不純物に関連する正の経験的な２つのパラメータである。
【数２０】
2021525872.tif 000022
式中、ＳＢ＝０．６２７６及びＴＢ＝０．７０６３は、ＡＰＩに関連する正の経験的な２つのパラメータである。図６では、純粋な移動相（ｋ’約０．８、弱い）から純粋な希釈剤（ｋ’約０．２、より強い）への約４分の１の減少に注目されたい。
【００７１】
次に、不純物及びＡＰＩの歪んだ濃度バンドプロファイルを、クロマトグラフィーの平衡分散（ＥＤ）モデルから、溶離液中の３つの異なる成分、すなわち１）不純物（化合物Ａ）、２）ＡＰＩ（化合物Ｂ）及び３）希釈剤（体積分率φ）を考慮して計算する。実験観察に基づいて、不純物及びＡＰＩの両方の吸着等温線は線形であると仮定する。式１７及び式１８を参照されたい。
【数２１】
2021525872.tif 000023
希釈剤の混合物は保持されないと考えられる。
【００７２】
ＥＤモデルにおける見かけの軸方向分散係数Ｄａは、式１９に示す長さ１５ｃｍのカラムの測定効率Ｎ＝１８０００から固定される。
【数２２】
2021525872.tif 000024
【００７３】
それぞれ９９．７％及び９９．０％に等しい収率及び純度レベルに対し計算した生産率（式１４）を最大化することにより、新たな最適サイクル数（ｎｏｐｔ）及び注入量（Ｖｐ、ｏｐｔ（ｎｏｐｔ））を最終的に決定する。
【００７４】
＜試料希釈剤及び溶離液の溶出強度及び粘度の間の不一致＞
【００７５】
試料希釈剤及び溶離液の溶出強度の相違の他に、それらの粘度も異なる。また、多孔質媒体に沿った注入された試料希釈剤（低粘度０．３４ｃＰ）及び溶離液（高粘度０．５９ｃＰ）の境界の不安定性により、ビスカスフィンガリングはバンド形状に影響を及ぼす可能性がある。さらに、弱く保持された化合物（ｋ’＜１）バンドの前面は、試料希釈剤が移動相に指状体を形成するにつれてランダムに変形する。この現象は正確に予測することは困難であり、実験的研究において容易に観察されるであろう。
【００７６】
［実施例２（実験）］
＜リサイクリング実験＞
【００７７】
液体状態ＮＭＲによる構造解明から約１ｍｇの薬物不純物（純度＞９０％）を分取するために高速液体クロマトグラフィーシステムを構築した。このシステムは、交互ポンプ輸送（又はツインカラム）リサイクリング液体クロマトグラフィーに基づく。それはフラクションコレクターに連結され、以下の厳しい実験上の制約、すなわち、不純物はＡＰＩからほとんど分離されない（分解能が低い）、薬剤希釈剤が溶離液に比べて濃い（バンドにフロンティングさせる）、ビスカスフィンガリングが生じる（ランダムなバンド変形を引き起こす）、不純物対薬剤比が極めて小さい（１／１００未満）、必要とされる収率及び純度レベルがそれぞれ９９％及び９０％を超えることに対処するように設計されている。ツインカラムの充填に使用する粒径、サイクル数、及び試料注入量は全て、ツインカラムリサイクリング分離方法（ＴＣＲＬＰ）の生産率を最大化するために最適化される。
【００７８】
実験は、不純物単離のための自動ＴＣＲＳＰシステム（２つのカラムマネジャー）及び不純物回収のための分析画分マネジャーを実装した改良ＵＨＰＬＣ（Ｒ）装置（マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）で行った。このシステムは、セミ分取（内径４．６ｍｍのカラム）、高分解能のツインカラム（４．６mm×１５０ｍｍの３．５μｍのＳｕｎｆｉｒｅ−Ｃ１８カラム２つ）リサイクリング液体クロマトグラフィーシステムを含む。それらは二元（ｂｉｎｄａｒｙ）溶媒ポンプ混合物、１０ｍＬバイアル、３０μＬループ、１００μＬ延長ループを備えたフロースルー針試料マネジャー、２つの位置（各カラムにつき１つ）の２カラムオーブンコンパートメント、低分散８ポートリサイクリング弁、１０ｍＬ回収バイアル及び２つの位置（廃棄物及び回収物）の４ポート弁を備えた画分マネジャー分析器、２つの低分散（５０ｎＬ体積）検出セルとそのモジュールボックス（光源、光ダイオード、光を運ぶための光ファイバ）を含む。全てのコンポーネントを、Ｚｅｎｆｉｔ完全接続（フェイスシール）チューブにより接続する。システム全体は、Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェア（マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）によって自動化されている。
【００７９】
試料溶液はエストラジオール（１０ｇ／Ｌ）をアセトニトリル及びメタノールの混合物（５０／５０、ｖ／ｖ、強い溶出強度）に溶かしたストック溶液である。移動相はアセトニトリル及び水の混合物（６５／３５、ｖ／ｖ、より弱い溶出強度）である。流速は０．７ｍＬ／分に設定する。オーブン及び溶離液の温度を３０±０．１℃に維持する。２つのカラムに沿った圧力低下を４０００ｐｓｉ付近で測定する。４．６mm×１５０ｍｍのツインカラムに３．５μｍのＳｕｎｆｉｒｅ−Ｃ１８粒子を充填し、それにより４０００ｐｓｉの圧力低下でＴＣＲＬＣ処理の速度−分解能性能が最大になる（図３参照）。図３は、１．５から２．０、２．５、３．５、５．０、７．５、及び１０μｍにサイズが増大する粒子を充填した長さＬ＝１５ｃｍの２つのツインカラムについて、４０００ｐｓｉの一定の圧力低下でリサイクリングプロセスの速度−分解能又は速度論プロットの計算値を示すグラフである。各空円は、１から最大許容サイクル数までの特定のサイクル（ｓｙｃｌｅ）数（又は１つのカラム長を通る通過の数）を説明する。ｘ軸は、あらゆるサイクル数ｎの分解係数を表す。ｙ軸は、分解係数に対するホールドアップ時間の比を表す。太い黒の実線は、最大許容サイクル数に対して期待される最高の分解係数を示す。分解能を最大化し、実線の黒線と垂直ターゲット（図示せず）との唯一の交点に位置する、第１の最適粒径に注目されたい。これは、２．５μｍの粒径に対応するであろう。また、速度−分解能性能を最大にし、実線の黒線と対数−対数目盛でのスロー（ｓｌｏｗ）＋１（図示せず）の接線との間の唯一の交点に位置する第２の最適粒径に注目されたい。これは約５．０μｍの粒径に相当するであろう。この例では、３．５μｍの粒径が選択された。
【００８０】
ｎ＝６でサイクル数を固定し、１００μＬで最大の注入量を固定することにより、ＴＣＲＬＣ処理の生産率を最大化した。試料の内容物をｔ＝１．０分〜ｔ＝２．９分及びｔ＝４．０分〜ｔ＝８．８分（初期及び後期の非標的不純物の排除）で廃棄物に送る。標的不純物及びほぼ共溶出する不純物及びＡＰＩをｔ＝２．９分〜ｔ＝４．０分までカラム間で初回の移送をする。このゾーン全体を、ツインカラム間でさらに４回移動させる。単離された不純物をｔ＝２０．３分〜ｔ＝２１．３分の６サイクル後に最終的に回収する。このまったく同じ方法を１．５週間の非停止期間にわたって６００回繰り返し、エストラジオールの６０ｍＬストック溶液中に存在する標的不純物の全質量を回収した。
【００８１】
＜勾配ＬＣ−ＵＶ−ＭＳ実験＞
【００８２】
クロマトグラフィーによる分離は、ＡＣＱＵＩＴＹ（Ｒ）  ＣＳＨ  Ｃ１８カラム（２．１ｍｍ×１００ｍｍ、１．７μｍ）（マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）で行った。ｖＨＰＬＣシステムはＡｇｉｌｅｎｔ  １２９０（ニュージャージ州ピスカタウェイ）であった。カラム温度は４０℃で制御した。移動相は溶媒Ａ（水中の０．１％ギ酸）及び溶媒Ｂ（アセトニトリル）で構成した。ｖＨＰＬＣポンプ勾配は以下のとおりであった。初期条件は５／９５溶媒Ｂ／溶媒Ａ（ｖ／ｖ）を１．０分間、続いて９５／５溶媒Ｂ／溶媒Ａの直線勾配を６．０分間、０．１分間で初期条件に戻し、カラム再平衡を１．９分間とした。流速は０．４ｍＬ／分に設定した。試料をＴｈｅｒｍｏ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｌｕｍｏｓ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ニューヨーク州グランドアイランド）で分析した。この質量分析計は、アッセイ感度を高めるために加熱されたエレクトロスプレイイオン化プローブ（ＨＥＳＩ）を装備した。分析物を、フルマススキャンの１５０〜１０００ｄａｌｔｏｎの範囲の正イオンモードで検出し、分解能は６０，０００であった。発生源温度は３５０℃に設定し、イオンスプレー電圧は３５００Ｖであった。気化器温度はシースガス流量２０Ｌ／分、補助ガス１５Ｌ／分、スイープガス２Ｌ／分で１００℃とした。
【００８３】
＜結果と考察＞
【００８４】
＜リサイクリングなしの体積過負荷（ｎ＝１）＞
【００８５】
図４に、活性医薬成分（ＡＰＩ）エストラジオール（１０ｇ／Ｌ）及び多くの未知の不純物を含むストック溶液の分析クロマトグラム（６μＬ注入）を示す。ＵＶ波長は、標的とする不純物対エストラジオールシグナル比（１対６７）を最大にするため、λ＝２５４ｎｍに設定する。標的不純物はｔ＝３．５５分で溶出するが、ＡＰＩエストラジオールは３．７９分で検出される（ホールドアップ時間ｔ０＝２．０４分）。したがって、選択係数はα＝１．１６である。いくつかの非標的不純物が、標的不純物の溶出の前後（図示せず）に検出され、ＴＣＲＬＣ処理の間に全て排除されて廃棄物となる。図５は、注入された試料体積が３から６、１２、２４、４８、７４及び１００μＬに増加することを除いて、図３と同じクロマトグラムを示す。図５は、分析者が直面する深刻な分離問題を示す。すなわち、そのバンドがＡＰＩバンドの下にますます埋没する（バンドは、試料希釈剤及びビスカスフィンガリング効果のために著しくフロンティングを起こし、歪がんだ）ため、単一のカラムバッチ処理で標的不純物の適切な生産率を得ることは不可能である。不純物及びエストラジオールの保持係数は、移動相を試料希釈剤に置き換えると、両者とも約４分の１に低下する。
【００８６】
＜理論的リサイクリング及び生産率の最適化（ｎ＝ｎｏｐｔ）＞
【００８７】
次に、ＴＣＲＬＣ処理の生産率を最大化するために、少量（及び多数回）又は多量（少数回）の試料量を注入すべきかどうかを知ることが問題となる。その疑問に答えるために、標的不純物及びエストラジオールの濃度プロファイルの計算を、１から１４（３．５μｍ粒子について図３に示す最大許容サイクル数）までの一連のサイクル数について行った。各サイクル数について、注入量を最大にし、収率及び純度レベルがそれぞれ少なくとも９９．７％及び９９．０％になるようにする。計算が、濃い検体希釈剤が標的不純物及びＡＰＩの保持に及ぼす影響を考慮していることを思い起こすことが重要である。したがって、計算されたバンドは観察されたバンドに近い。結果を、０．０１７５ｇ／Ｌの不純物濃度対１０ｇ／Ｌのエストラジオール濃度について図７に示す。その計算から、注入試料量が約５０μＬ（２より大きいサイクル数）より大きくなると、バンド形状がフロンティングすることが明らかになった。図８は、生産率の対応する変動を関数ｎとして示す。生産率は最初約３μｇ／時間（ｎ＝１）から約５．５μｇ／時間（ｎ＝６）に急速に増加し、その後プラトーになり、最後に７より大きいサイクル数ではわずかに減少することが分かる。絶対的に、５．６μｇ／時間でｎ＝７に対して最大の生産率が予想される。対応する注入量は１５９μＬである。したがって、次の実験では、注入量１００μＬのｎ＝６サイクルを選択する（使用する試料マネジャーには１００μＬの延長ループが装備されている）。
【００８８】
＜実験的リサイクリング＞
【００８９】
図９は、ｎ＝６サイクル及び１００μＬ注入量（２３分間の実施）についてのリサイクリング実験を示す。一番上及び一番下のクロマトグラムを、２つのツインカラム間のリサイクリング弁に接続された低分散セル（標的不純物及びＡＰＩエストラジオールの間の分離の進行をリアルタイムで監視する図１のリサイクルＵＶセル１３０を参照のこと）によって、及びリサイクリング弁と回収弁との間に配置された第２の低分散セル（廃棄物又は反応回収の直前の分離状態をリアルタイムで監視する図１の回収ＵＶセル１３８を参照のこと）によって、それぞれ記録した。ｔ＝２．９分及びｔ＝４．０分の垂直の点線で示されるように、標的不純物にｔ＝２．９分からｔ＝４．０分までカラム間を移動させ、一方、一番下のクロマトグラムからわかるように非標的不純物を前後で排除し、廃棄物とする。リサイクリング弁をｔ＝８．９分、１２．４分及び１５．９分で作動させることにより、標的不純物をさらに４回移動させる。一番上のクロマトグラムから、不純物バンドの頂点が見えるようになった後第４回目のサイクルが完了するまで、不純物がＡＰＩバンドに完全に埋没していることを観察することは特筆すべきことである。５サイクル目以降は、不純物はＡＰＩから離れたほぼベースラインであり、そのバンドは計算から予測されるように明らかにフロンティングしている。６サイクル目以降（一番下のクロマトグラム）、不純物バンドはエストラジオールバンド（ＵＶ波長λ＝２５４ｎｍで記録された吸収シグナルに基づく）から分離されたベースラインである。縦の実線で示されるように、ｔ＝２０．３分及びｔ＝２１．３分から不純物バンドを回収する分取が整っている。
【００９０】
＜ＴＣＲＳＰの再現性、生産率、達成された純度レベル＞
【００９１】
エストラジオールの６０ｍＬストック溶液中に存在する全ての標的不純物を回収するために、６００回のリサイクリングの実施を連続的に繰り返した。優れた純度レベルを達成するためには、リサイクリングの実施の再現性が極めて重要である。図１０は、ｔ＝２０．３分〜２１．３分に記録された３０回の連続回収クロマトグラムを示す。不純物の採取バンドの頂点で観察される保持時間の相対標準偏差は、ツインカラムの温度及び移動相の温度が３０±１℃で活発に制御されるため、０．１％と低い。
【００９２】
回収した画分は全て、アセトニトリル及び水をそれぞれ低減圧と適度な加熱（６０℃）下で４５分間それぞれ完全蒸発後及び部分蒸発後に約２０分の１に濃縮した。図１１は、濃縮画分の６μＬ注入後に記録されたクロマトグラム１０１０を示す（全部で１２の回収された画分又は１２×１分×０．７ｍＬ／分＝８．４ｍＬを純水中で０．４２ｍＬの濃縮画分に減少させた）。参照クロマトグラム１０２０は、ＡＰＩストック溶液６μＬの注入に対するものである。ＡＰＩに対する不純物のピーク面積は、１／６７（ＡＰＩ溶液中）から２６／１（回収された画分中）に増加し、例えば標的不純物はＡＰＩに対して約１７５０倍濃縮された。しかし、ＵＶシグナルはλ＝２５４ｎｍ（不純物対エストラジオールの吸光度を最大にする）で記録されるため、回収された画分の純度はまだ不明である。図１２Ａ〜Ｄに示された相補的なＬＣ−ＵＶ−ＭＳ実験は、回収された画分の純度レベルがかなり５０％に近いと推定する（図１２Ａ及びＢの総ＰＤＡスキャン及び総イオンクロマトグラムを参照のこと）。回収された画分全てを完全に乾燥させた後、総質量残留量２２０μｇを測定した結果、ＡＰＩ溶液中の不純物の濃度は約０．５×２２０μｇ／０．０６０Ｌ＝１．８５ｍｇ／Ｌであることが示された。それから実際の生産率は約１２０μｇ／２５２時間であり、これは約０．５μｇ／時間である。次に、エストラジオールに対する不純物の相対的存在量は、ストック溶液中で約１／５５００である。
【００９３】
＜標的不純物の同定＞
【００９４】
１０ｇ／Ｌエストラジオールストック溶液から抽出した標的不純物の総量及び純度は、それぞれ１１０μｇ及び５０％である。これは明確な構造解明のために信頼できるＮＭＲ実験を行うには明らかに不十分である。なぜならば、最低１ｍｇの質量及び少なくとも９０％の純度が必要だからである。あるいは、勾配ＬＣ−ＭＳ（単一イオン監視）実験を行い、不純物の質量を測定した。図１２Ｃ及びＤの質量分析図から、ｍ／ｚ＝２５３．１５８８及び２７１．１６９１の実験質量が不純物の溶出時間と一致することが明らかになった。後者の質量は、二重結合が単結合に置き換わり、２つの水素原子が脱離するエストラジオールの誘導体であるエストロンの正確な質量（Ｍ＝２７１．１６９２６）と一致する。図１３Ａはエストラジオールストック溶液中の単一不純物のクロマトグラムを示し、図１３Ｂは２６９．３のｍ／ｚを有するエストラジオールストック溶液中の単一不純物の質量スペクトルを示す。
【００９５】
図１４は、エストロンのＮＭＲデータ１４１０と、スペクトル上の残りの標識されていないシグナルである未知不純物のＮＭＲデータとが一致しないため、回収された不純物がエストロンではないことを示す１Ｈ−１３Ｃ  ＮＭＲである。
【００９６】
相補的なＵＶ吸収スペクトル（図１５Ａ〜Ｂ参照）から、標的不純物はエストロンではないことが実証されている。なぜならば、その二次最大吸収波長は２７９．６ｎｍではなく２６０．７ｎｍであるからである。おそらく、標的不純物はエストロンのエノール互変異性体であり、エストラジオールの合成反応の中間体又は副生成物のいずれかである。
【００９７】
＜結論＞
【００９８】
この実施例は、分析フラクションコレクターに結合された高分解能のツインカラムリサイクリングクロマトグラフィーシステムが、濃縮されたＡＰＩ溶液中に存在する微量不純物のかなりの量を連続的に単離することを実験的に実証した。このシステムは、分解能レベルの低さ（選択性の低さ、効率の低さ）、不純物対原薬の相対的存在量の低さ、試料体積過負荷及び濃い試料希釈剤、ビスカスフィンガリング、高収率、及び高純度レベルを同時に伴う非常に困難な分離問題を解決するのに特によく適している。内径４．６mm×１５０ｍｍのツインカラムにより送達される最適生産率は、約２ｍｇ／Ｌ不純物濃度及びＡＰＩ（１０ｇ／Ｌ）とほぼ共溶出するもの（選択係数１．１６）に対して約０．５μｇ／時間である。
【００９９】
より高い生産率の送達は、分離／回収リサイクリングシステムがより大きな内径のカラム（内径１ｃｍ×２５０ｍｍ、２．５μｍ粒子）で作動するようにスケールアップされている場合にのみ可能であろう。このタスクを以下の実施例３に示す。
【０１００】
この実施例の方法は、未知の不純物約１ｍｇを長期間（日）にわたって分取するために自動化することができる。注入回数を増やして、約１ｍｇの未知不純物を分取することができる。
【０１０１】
この実施例の方法は、ＮＭＲ分析を可能にするために、少なくとも９０％の純度を有する不純物を回収するように改変することができる（図１４を参照されたい）。例えばピーク採取窓をより狭くして（すなわち不純物の回収時間を短縮して）、ＮＭＲ分析用の純粋な試料を回収することができる。別の例では、固定した回収時間窓のためにサイクル数を増やすことができる。
［実施例３（実験：スケールアップ）
【０１０２】
実施例２を、より大きなカラム、より速い流速、及びより大きな試料体積で作業できるように前記システム及び方法をスケールアップするために、少数の変更を加えて繰り返した。実施例２で使用した内径４．６ｍｍのカラムの代わりに、内径７．８ｍｍのカラムをこの実施例に使用した。さらに、５ｍＬ／分のより速い流速を使用し、１回あたり１ｍＬのより大きな試料量を注入した。また、実施例２からの機器ポンプを、この実施例のためにＡＣＱＵＩＴＹ  ＡＲＣ（Ｒ）ポンプ（マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）に変更し、フラクションコレクターは自動フラクションコレクターではなく、代わりにバイアルであった。いくつかの実施形態において、単一の標的不純物を回収し、残りの部分を廃棄処理に送る場合、単一のバイアルを使用してこの単一の標的不純物を回収することができる。他の実施形態では、複数の標的不純物がＡＰＩ試料中にある場合、一連のリサイクリングシーケンス（不純物の数と同数）をフラクションコレクター（又は複数のバイアル）と同様に用いることができる。
【０１０３】
カラムサイズ、流量及び試料体積というこれら３つの増加を組み合わせることによって、純粋な不純物の生産率を５０倍増加させることができ、少なくとも９０％の純度を有する１ｍｇの不純物の回収を約１５時間で完了させることができる。残りのパラメータは、実施例２と同じである。
【０１０４】
標準操作手順は４段階の方法である。最初に、ユーザーは、分析条件下（例えば５０μＬ注入）で不純物及びＡＰＩの両方の保持時間を測定する。図１４は、５０μＬの分析注入下での不純物及びＡＰＩの保持時間の測定を示すクロマトグラムである。
【０１０５】
次にユーザーは、分取条件（例えば１０００μＬ注入）におけるＡＰＩバンドの前部と後部の両方の保持時間を半分の高さで測定する。図１５Ａ〜Ｂは、分取条件で、ＡＰＩバンドの前部と後部の両方の保持時間を半分の高さで測定したクロマトグラムを示す。
【０１０６】
その後、ユーザーは３回のサイクル（Ｎ＝３）のリサイクリングプロセスを試験する。リサイクリング時間及び回収時間のリストは、実行する方法で自動的に与えられる。次に、ＡＰＩバンドから０．５分以上分離している不純物バンドの下でサイクル数を２つ増やしてリサイクリングプロセスを試験する。図１６は、８サイクル後に０．５分超離れた不純物及びＡＰＩバンドのクロマトグラムを示す。
【０１０７】
次に、ユーザーは、少なくとも純度９０％の不純物１ｍｇを得るのに必要な回数、最後に成功した操作を繰り返す。図１７は、少なくとも９０％の純度を有する不純物１ｍｇを得るための不純物の回収の開始時間及び終了時間を示すクロマトグラムである。
【０１０８】
スケールアップしたシステムは、アセンブリが容易なシステムとなるように統合することができる。例えばリサイクリングシステムは、既存の４つのモジュール、すなわちポンプモジュール、インジェクタモジュール、２カラムオーブンモジュール及びＰＤＡ検出器モジュールから作ることができる。リサイクリング弁及び回収弁は、２カラムオーブンモジュール内に位置する。例えば図１は、モジュール、又はサブユニットのうちの３つ、すなわち注入サブユニット（例えばインジェクタモジュール）１０２、リサイクリングサブユニット（例えば２カラムオーブンモジュール）１０４、及び回収サブユニット（例えば、ＰＤＡ検出器モジュール）１０６を示す。ポンプ１１４は、図１に、注入サブユニット１０２の一部であることが示されている。いくつかの実施形態において、ポンプは別個のモジュール／サブユニットである。
【０１０９】
当業者は、本明細書に記載された特定の手順に対する多数の均等物を、ただの日常的な実験を使用して認識するか、又は確認することができるであろう。このような均等物は、本技術の範囲内であると考えられ、以下の請求項に包含される。本願を通して引用されている内容又は全ての参考文献、発行された特許、公表されている特許出願は、参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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