(57)【要約】本開示は、概括的には細胞培養システムに関し、詳細には、細胞ミエリン形成を含む、イン・ビボ末梢線維の構造的特性及び機能的特性を模倣する構造的特性及び機能的特性の両方を促進する神経細胞の３次元細胞培養システムに関する。本開示は、二重のヒドロゲル構築物及び神経細胞を含むスフェロイドを用いて、細胞内及び細胞外の電気生理学的測定及び記録が可能である、イン・ビトロでの空間的に制御された３次元モデルのための、方法、装置、及びシステムを提供する。上記３次元ヒドロゲル構築物により、組み込む細胞型、幾何学的な製作、及び電気的な操作が可能になり、生理学的に妥当性のある結果を伴う、生体模倣型の神経伸長の培養、撹乱、及び試験を実施可能なシステムを提供する。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞、神経節、幹細胞、及び免疫細胞から選択される細胞ならびに／もしくは組織の１種または組み合わせを含む細胞のスフェロイドを含む組成物。
【請求項２】
前記スフェロイドが後根神経節及び三叉神経節から選択される組織を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記スフェロイドが、グリア細胞、胚細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞由来の細胞、交感ニューロン、副交感ニューロン、脊髄運動ニューロン、中枢神経系ニューロン、末梢神経系ニューロン、腸管神経系ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロン、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、介在ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、三叉神経節、星状細胞、乏突起膠細胞、シュワン細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、放射状グリア細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞、下垂体細胞、及びそれらの組み合わせから選択される１種以上の細胞を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記スフェロイドが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、星状細胞、及びそれらの組み合わせから選択される１種以上の免疫細胞を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記スフェロイドが、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される１種以上の幹細胞を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記神経細胞が、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選択される幹細胞に由来する、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記スフェロイドの径が約２００ミクロン〜約７００ミクロンである、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記スフェロイドが、１種以上の神経細胞及び１種以上のシュワン細胞を、１個のシュワン細胞当り約４個の神経細胞に等しい細胞型の比で含む、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記スフェロイドが、１種以上の神経細胞及び１種以上の星状細胞を、１個の星状細胞当り約４個の神経細胞の比で含む、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記スフェロイドが、１種以上の神経細胞及び１種以上の星状細胞を、１個の星状細胞当り約１個の神経細胞の比で含む、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記スフェロイドが、１種以上の神経細胞及び１種以上のシュワン細胞を、１個のシュワン細胞当り約１０個の神経細胞の比で含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記スフェロイドが、１種以上の神経細胞及び１種以上のグリア細胞を、１個のグリア細胞当り約４個の神経細胞に等しい比で含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記細胞のいずれか１種以上が人工多能性幹細胞から分化している、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記スフェロイドが人工多能性幹細胞及び／または免疫細胞を含まない、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記スフェロイドが未分化幹細胞を含まない、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記スフェロイドが、約３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２２５，０００、または２５０，０００個以上の細胞を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
前記スフェロイドが７５，０００個以上の細胞を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記スフェロイドが１種以上の磁性粒子を更に含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
（ｉ）ヒドロゲルを備える細胞培養容器と、
（ｉｉ）１種以上の神経細胞及び／または単離された組織外植片を含む１個以上のスフェロイドと、
（ｉｉｉ）電流発生器を備える増幅器と、
（ｉｖ）電圧計及び／または電流計と、
（ｖ）少なくとも第１の刺激用電極及び少なくとも第１の記録用電極と
を備えるシステムであって、
前記増幅器と、電圧計及び／または電流計と、電極とが、電流が前記増幅器から前記少なくとも１つの刺激用電極に供給され、電流が前記記録用電極で受け取られ、前記電圧計及び／または電流計に供給される回路を介して、互いに電気的に接続されており、
前記細胞培養容器全体にわたって電場が確立されるように、前記刺激用電極が、前記神経細胞及び／または単離された組織外植片の１個以上の細胞体にあるいはそれに近接して配置され、前記記録用電極が、前記細胞体に対して遠位の所定の距離に配置される
前記システム。
【請求項２０】
前記スフェロイドが請求項１〜１８のいずれか１項に記載のスフェロイドである、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記培養容器が、９６、１９２、３８４個、もしくはそれを超える内部チャンバを備える、請求項１９または２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記９６、１９２、３８４個、またはそれを超える内部チャンバが、１種以上の単離されたシュワン細胞または１種以上の乏突起膠細胞が、前記１種以上の単離された組織外植片及び／または前記１種以上の神経細胞からの軸索伸長に対してミエリンを蓄積させるように、前記組織外植片及び／もしくは神経細胞に十分近接した前記シュワン細胞ならびに／または前記乏突起膠細胞を備える、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
固体基材であって、その上に前記ヒドロゲルマトリクスが架橋されている前記固体基材を更に備え、前記固体基材が、約１ミクロン〜約５ミクロンの径の細孔を有する少なくとも１つのプラスチック表面を備える、請求項１９〜２２のいずれかに記載のシステム。
【請求項２４】
前記固体基材が連続する外表面と内表面とを備え、かかる固体基材は、円筒形または実質的に円筒形の少なくとも１つの部分と、少なくとも１つの中空の内部であって、前記中空の内部の端部において、前記内表面の少なくとも１つの部分によって画成された前記中空の内部とを備え、前記内表面は、径が約０．１ミクロン〜約１．０ミクロンの１つ以上の細孔を備え、
前記固体基材の前記中空の内部は、前記固体基材の外部の点から少なくとも１つの開口部を通してアクセス可能であり、
前記中空の内部部分は、前記開口部に近接した第１の部分と、前記開口部の遠位の少なくとも第２の部分とを備え、
前記１種以上の神経細胞及び／または前記１種以上の組織外植片は、前記中空の内部の前記第１の部分にまたはそれに近接して配置され、前記ヒドロゲルマトリクスと物理的に接触しており、
前記少なくとも１つの中空の内部の前記第２の部分は、軸索が、前記１種以上の神経細胞及び／または前記１種以上の組織外植片から前記中空の内部の前記第２の内部部分中へと成長できるように、前記第１の部分と流体連通している、
請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記組成物がスポンジを含まない、請求項１９〜２４のいずれかに記載のシステム。
【請求項２６】
前記ヒドロゲルが、少なくとも、第１の細胞が貫入不能なポリマー及び第１の細胞が貫入可能なポリマーを含む、請求項１９〜２５のいずれかに記載のシステム。
【請求項２７】
前記少なくとも１種の、細胞が貫入不能なポリマーが含むＰＥＧが約１５％以下であり、前記少なくとも１種の、細胞が貫入可能なポリマーが、約０．０５％〜約１．００％の、ＲＡＤ  １６−Ｉ、ＲＡＤ  １６−ＩＩ、ＥＡＫ  １６−Ｉ、ＥＡＫ１６−ＩＩ、及びｄＥＡＫ  １６から選択される自己組織化性ペプチドの１種または組み合わせを含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記組成物がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含まない、請求項１９〜２４のいずれかに記載のシステム。
【請求項２９】
前記ヒドロゲルが第１の領域及び第２の領域を備え、前記第１の領域が、円柱または直方体であって、その長手方向の軸が前記細胞培養容器の上面及び底面を貫通する方向を向いた前記円柱または直方体の形状に形成され、前記円柱または直方体のそれぞれが、前記円柱または直方体の内表面によって画成される空間を備え、前記空間及び前記細胞培養容器の上面を貫く１つ以上の開口部によりアクセス可能であり；
前記第２の領域が、前記第１の領域に隣接し、且つ第１の領域と流体連通する、その側部に開口部を有する、第２の領域の内壁の形状に形成された空間を備える、
請求項１９〜２８のいずれかに記載のシステム。
【請求項３０】
ミリリットル当り約５〜約２０ピコグラムの濃度の神経成長因子（ＮＧＦ）及び／または約０．００１重量／体積％〜約０．０１重量／体積％の範囲の濃度のアスコルビン酸を含む細胞培地を更に備える、請求項１９〜２９のいずれかに記載のシステム。
【請求項３１】
前記１個以上のスフェロイドが、グリア細胞、胚細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞由来の細胞、交感ニューロン、副交感ニューロン、脊髄運動ニューロン、中枢神経系ニューロン、末梢神経系ニューロン、腸管神経系ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロン、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、介在ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、三叉神経節ニューロン、星状細胞、乏突起膠細胞、シュワン細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、放射状グリア細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞、及び下垂体細胞から選択される細胞の少なくとも１種または組み合わせ含む、請求項１９〜３０のいずれかに記載のシステム。
【請求項３２】
幹細胞、多能性細胞、筋芽細胞、及び骨芽細胞の１種以上を更に備える、請求項１９〜３１のいずれかに記載のシステム。
【請求項３３】
前記１種以上の神経細胞が、哺乳動物の末梢神経系由来の初代哺乳動物細胞を含む、請求項１９〜３２のいずれかに記載のシステム。
【請求項３４】
前記ヒドロゲルが少なくとも１％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項１９〜３３のいずれかに記載のシステム。
【請求項３５】
前記スフェロイドが約３、３０、９０、または３６５日以上培養されている、請求項１９〜３４のいずれかに記載のシステム。
【請求項３６】
前記固体基材の少なくとも一部が、前記固体基材の前記内表面の少なくとも一部が、前記スフェロイドが配置されている円筒形または実質的に円筒形の中空の内部チャンバを画成するように円筒形または実質的に円筒形である、請求項１９〜３５のいずれかに記載のシステム。
【請求項３７】
前記１個以上のスフェロイドが、幅が約１００ミクロン〜約５００ミクロン、長さが約０．１１〜約１０，０００ミクロンの軸索成長を有する１種以上の神経細胞を含む、請求項１９〜３６のいずれかに記載のシステム。
【請求項３８】
前記ヒドロゲルが、一連のチャネルによって互いに流体連通する一連の２つ以上の空洞を備え、少なくとも１つの空洞がスフェロイドを備え、少なくとも第２の空洞が第２のスフェロイド、細胞の懸濁液、またはＤＲＧを備え、前記スフェロイド及び前記第２のスフェロイド、細胞の懸濁液、またはＤＲＧが３次元軸索によって連結されている、請求項１９〜３７のいずれかに記載のシステム。
【請求項３９】
前記３次元軸索の高さが、その最低点において少なくとも約１０ミクロンであるか、または少なくとも細胞単層の３層である、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
前記空洞が、前記固体基材の水平なもしくは実質的に水平な面に配置されたＵ字形または円形のウェルを有するウェルであり、各チャネルが１個以上のスフェロイドに連結した１個以上の軸索を備える、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４１】
（ｉ）１種以上の神経細胞、及び／または
（ｉｉ）１種以上のシュワン細胞または乏突起膠細胞
を含む第１のスフェロイドと、
（ｉ）１種以上の末梢ニューロン
を含む第２のスフェロイドと
を備え、
各スフェロイドが前記空洞中に配置されている、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４２】
第１、第２、及び第３の空洞であって、それぞれがスフェロイド及び少なくとも５０マイクロリットルの細胞培養培地を保持するように構成された前記空洞を備え、
前記第１の空洞が前記第２の空洞の近位に且つ前記第３の空洞の遠位に配置されるように、前記空洞が整列している、
請求項４０記載のシステム。
【請求項４３】
少なくとも第４の空洞を備え、各空洞が正方形の角を画定するようなパターンで空洞が配置された、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４４】
前記空洞が、前記第１の空洞中の前記第１のスフェロイドから生じた軸索が前記第２の空洞まで伸長し、前記第２の空洞中の前記スフェロイドからの軸索が前記第３の空洞中の軸索まで伸長するように一列に整列している、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４５】
固体基材を備える培養容器中における、１個以上のスフェロイドの３次元培養物の製造方法であって、
（ａ）１種以上の神経細胞を、前記固体基材であって、少なくとも１つの外表面、少なくとも１つの内表面、及び前記少なくとも１つの内表面によって画成され、且つ少なくとも１つの開口部を通して前記固体基材の外部の点からアクセス可能な少なくとも１つの内部チャンバを備える前記固体基材に接触させることと、
（ｂ）神経細胞を含む１個以上のスフェロイドを、前記少なくとも１つの内部チャンバに配置することと、
（ｃ）細胞培地を、前記少なくとも１個のスフェロイドを覆うのに十分な量の細胞培地によって前記培養容器中に印加することと
を含み、
前記内表面の少なくとも一部が、第１の細胞が貫入不能なポリマー及び第１の細胞が貫入可能なポリマーを備える前記方法。
【請求項４６】
ステップ（ｂ）が、単離された後根神経節、脊髄外植片、網膜外植片、及び皮質外植片の１種または組み合わせから選択される組織外植片を含むスフェロイドを配置することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記スフェロイドが、任意選択で幹細胞に由来する、運動ニューロン、感覚ニューロン、交感神経ニューロン、副交感神経ニューロン、皮質ニューロン、脊髄ニューロン、末梢ニューロンの１種または組み合わせから選択される神経細胞の懸濁液として形成される、請求項４５または求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記スフェロイドが、単離されたシュワン細胞及び／または乏突起膠細胞を更に含む、請求項４５〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
（ｄ）前記スフェロイドに、ステップ（ｃ）の後に約１２時間〜約１年間、神経突起及び／または軸索を成長させるステップを更に含む、請求項４５〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
（ｉ）ステップ（ａ）の前に試料から１種以上の神経細胞を単離するステップ、及び／または
（ｉｉ）前記１個以上のスフェロイドが後根神経節（ＤＲＧ）を含む場合、ステップ（ｂ）の前に１種以上の哺乳動物からＤＲＧを単離するステップ、及び／または
（ｉｉｉ）前記１個以上のスフェロイドがシュワン細胞または乏突起膠細胞を含む場合、１種以上のシュワン細胞及び／または１種以上の乏突起膠細胞を単離するステップ
を更に含む、請求項４５〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記刺激用電極に電流を導入した際に、前記記録用電極が、前記記録用電極において測定することができる１種以上の電気生理学的メトリクスに対応する信号を受信できるように、
少なくとも１つの刺激用電極を前記１種以上の神経細胞または組織外植片の細胞体にまたはそれに近接して配置することと、
少なくとも１つの記録用電極を、軸索にまたはそれに近接して、前記細胞体から最も遠位の点で配置することと
を更に含み、
前記１種以上の電気生理学的メトリクスが、電気伝導速度、活動電位、１種以上の神経細胞の膜に沿った電気インパルスの通過に伴う波の振幅、１種以上の神経細胞の膜に沿った電気インパルスの幅、１種以上の神経細胞の膜に沿った前記電気インパルスの潜時、及び１種以上の神経細胞の膜に沿った前記電気インパルスのエンベロープの１種または組み合わせである、
請求項４５〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
（ａ）請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）少なくとも１種の薬剤を前記１個以上のスフェロイドに曝露することと、
（ｃ）前記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化及び／もしくは１種以上の電気生理学的メトリクスを測定及び／または観測することと
を含む、薬剤の毒性ならびに／あるいは神経保護作用の評価方法。
【請求項５３】
１個以上のスフェロイドの１個以上の軸索のミエリン形成または脱ミエリン形成の判定方法であって、
（ａ）少なくとも１個の軸索を成長させるのに十分な時間及び条件下、薬剤の存在下または非存在下で、請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）前記１個以上のスフェロイド由来の１個以上の軸索におけるミエリン形成の量を検出することと
を含み、
検出することが任意選択で、
（ｉ）薬剤の存在下または非存在下において、前記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化及び／もしくは１種以上の電気生理学的メトリクスを測定及び／または観測するステップと、
（ｉｉ）薬剤の存在下または非存在下における、前記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化及び／もしくは１種以上の電気生理学的メトリクスを、前記スフェロイドのミエリン形成の定量的または定性的変化と相関させるステップと
を含む前記方法。
【請求項５４】
（ａ）１個以上のスフェロイド及び／もしくはスフェロイドから成長した軸索の数または密度を定量化することと、
（ｂ）請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｃ）前記スフェロイドを、前記スフェロイド中で前記１個以上の軸索を成長させるまたは細胞を成長させるのに十分な期間培養した後で、前記スフェロイド内の細胞の数及び／または前記組成物中のスフェロイドから成長した軸索の数もしくは密度を計算することと
を含み、
ステップ（ｂ）が任意選択で、前記１個以上のスフェロイドを１種以上の薬剤と接触させることを含み、
ステップ（ｃ）が任意選択で、１個以上のスフェロイドを培養した後で、かかる１個以上のスフェロイドの内部及び／もしくは外部の記録を検出することと、前記記録を既知のもしくは対照の数の細胞に対応する同様の記録の測定値と相関させることとを含むか、または、
ステップ（ｃ）が任意選択で、
（ｉ）前記１個以上のスフェロイドを１種以上の薬剤と接触させる前記ステップの前後における細胞内及び／もしくは細胞外の記録ならびに／または形態計測上の変化を測定する更なるステップと、
（ｉｉ）前記１個以上のスフェロイドを前記１種以上の薬剤と接触させた後の、前記記録及び／もしく形態計測上の変化に対する前記１個以上のスフェロイドを前記１種以上の薬剤と接触させる前の、前記記録及び／もしく形態計測上の変化の差異を、細胞数及び／または軸索の数または密度の変化と相関させるステップと
を含む、神経細胞成長及び／または軸索変性の検出ならびに／あるいは定量化方法。
【請求項５５】
薬剤の神経調節作用の測定または定量方法であって、
（ａ）前記薬剤の存在下及び非存在下で、請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）前記薬剤の存在下及び非存在下で、前記１個以上のスフェロイド全体にわたって電位を印加することと、
（ｃ）前記薬剤の存在下及び非存在下で、前記１個以上のスフェロイドからの１種以上の電気生理学的メトリクスを測定することと、
（ｄ）前記１個以上のスフェロイドによる１種以上の電気生理学的メトリクスの前記差異を前記薬剤の神経調節作用と相関させ、その結果、前記薬剤の存在下での電気生理学的メトリクスが前記薬剤の非存在下で測定された前記電気生理学的メトリクスと比較して変化することが神経調節作用を示し、前記薬剤の存在下での電気生理学的メトリクスが前記薬剤の非存在下で測定された前記電気生理学的メトリクスと比較して変化しないことが、前記薬剤が神経調節作用を与えないことを示すことと
を含むか、または、
（ａ）前記薬剤の存在下及び非存在下で、請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）前記薬剤の存在下及び非存在下で、前記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化を測定及び／もしくは観測することと、
（ｃ）前記１種以上の形態計測上の変化を前記薬剤の神経調節作用と相関させ、その結果、前記薬剤の存在下での電気生理学的メトリクスが前記薬剤の非存在下で測定及び／もしくは観測される前記電気生理学的メトリクスと比較して変化することが神経調節作用を示し、前記薬剤の存在下での電気生理学的メトリクスが前記薬剤の非存在下で測定及び／もしくは観測される前記電気生理学的メトリクスと比較して変化しないことが、前記薬剤が神経調節作用を与えないことを示すことと
を含む前記方法。
【請求項５６】
請求項１９〜３７のいずれかに記載のシステムの製造方法であって、
（ａ）神経細胞を、前記細胞がスフェロイドを形成するのに十分な期間、細胞培養培地中で培養することと、
（ｂ）前記スフェロイドを前記ヒドロゲル内に配置することと、
（ｃ）神経突起または軸索を成長させるのに十分な期間、前記スフェロイドを細胞培養培地に曝露することと
を含む前記方法。
【請求項５７】
ステップ（ａ）が前記神経細胞を１種以上の磁性粒子と混合することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ステップ（ｂ）が磁力を使用して、前記スフェロイドを前記ヒドロゲルの空洞内に配置することを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ステップ（ｂ）が、超音波による力、機械的力、または流体による力を使用して、前記ヒドロゲルの空洞内に配置することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記スフェロイドが、請求項１〜１８に記載のいずれかの組成物中に開示されているスフェロイドである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記１個以上のスフェロイドの１種以上の１種以上の形態計測上の変化及び／または１種以上の電気生理学的メトリクスを前記薬剤の毒性と相関させ、その結果、前記形態計測上の変化及び／または電気生理学的メトリクスが、細胞生存率が低下することを示す場合には、前記薬剤は有毒であると特徴付けられ、前記形態計測上の変化及び／または電気生理学的メトリクスが、細胞生存率が変化しないまたは増加することを示す場合には、前記薬剤は無毒及び／または神経保護作用があると特徴付けられることを更に含む、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による支援を受けた研究に関する表示
本発明は、ＮＩＨ  ＳＴＴＲの補助金第Ｒ４２−ＴＲ００１２７０号に基づく政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は米国を指定国とする国際出願であり、米国特許法第１２０条に基づき出願され、２０１７年１２月４日出願の米国仮出願第６２／５９４，５２５号の優先権を主張し、該仮出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００３】
本開示は、概括的には細胞培養システムに関し、詳細には、細胞ミエリン形成及び複合活動電位の伝播を含む、イン・ビボ神経線維の構造的特性及び機能的特性を模倣する構造的特性及び機能的特性の両方を促進するスフェロイドの３次元細胞培養システムに関する。
【背景技術】
【０００４】
長距離にわたる生体電気伝導が最も関連性のある生理学上の結果の１つである末梢神経組織に関しては、卓上型装置を用いた評価として生理学の機能面での再現を行うことは特に困難である。このため、末梢神経の３次元組織モデルは、可溶性の分析対象物が適当な評価尺度（メトリクス）として機能する上皮組織、代謝組織、及び腫瘍組織のモデルと比較して遅れている。最近、多電極アレイ技術によって、環境毒素のスクリーニング、ならびに疾患のモデル化及び治療のための試験への電気生理学的技法の利用が可能になっている。この技法の利用は、末梢神経系（ＰＮＳ）用途及び中枢神経系（ＣＮＳ）用途の研究にとって画期的であるが、上記培養物は解離性の性格をもつことから、集団レベルの環境及び末梢組織として重要なメトリクスを再現することはできない。それに代わって、末梢神経障害及び神経保護を調べる臨床的な方法としては、複合活動電位（ＣＡＰ）の測定による神経伝導検査及び皮膚生検の形態計測的分析を用いた神経線維密度（ＮＦＤ）が挙げられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、特定の組織のみならず３次元構築物も提供する神経系の微小生理学的（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ）モデルに関する。他のモデル系では、どちらか一方しか提供することができない傾向にある。器官型の組織片は、天然の組織のみならず３次元構築物も提供できるが、これらのモデルは非常に高速処理の分析には適していない。
【０００６】
本開示は、神経細胞、神経節、幹細胞、及び免疫細胞から選択される細胞ならびに／もしくは組織の１種または組み合わせを含む細胞のスフェロイドを含む組成物に関する。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは後根神経節及び三叉神経節から選択される組織を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、グリア細胞、胚細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞由来の細胞、交感ニューロン、副交感ニューロン、脊髄運動ニューロン、中枢神経系ニューロン、末梢神経系ニューロン、腸管神経系ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロン、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、介在ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、三叉神経節、星状細胞、乏突起膠細胞、シュワン細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、放射状グリア細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞、及び下垂体細胞から選択される１種以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上のグリア細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の胚細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の間葉系幹細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の人工多能性幹細胞由来の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の副交感ニューロンを含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の脊髄運動ニューロンを含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の中枢神経系ニューロンを含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の末梢神経系ニューロンを含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の腸管神経系ニューロンを含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の運動ニューロンを含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の感覚ニューロンを含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の介在ニューロンを含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上のコリン作動性ニューロンを含む。上記スフェロイドは１種以上のＧＡＢＡ作動性ニューロンを含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上のグルタミン酸作動性ニューロンを含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上のドーパミン作動性ニューロンを含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上のセロトニン作動性ニューロンを含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の三叉神経節細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の星状細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の乏突起膠細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上のシュワン細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上のミクログリア細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の上衣細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の放射状グリア細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の衛星細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の腸管グリア細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の下垂体細胞を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及び星状細胞から選択される免疫細胞の１種または組み合わせの１種以上を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選択される幹細胞の１種または組み合わせの１種以上を含む。いくつかの実施形態において、上記神経細胞は、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選択される幹細胞に由来する。実施形態は、上述の細胞型のそれぞれを、互いに個別にまたは組み合わせで含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの径は約２００ミクロン〜約７００ミクロンである。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの径は約１５０ミクロン〜約８００ミクロンである。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの径は約２００ミクロンである。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの径は約３００ミクロンである。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの径は約４００ミクロンである。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの径は約５００ミクロンである。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの径は約６００ミクロンである。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの径は約７００ミクロンである。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの径は約８００ミクロンである。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの径は約９００ミクロンである。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの径は約３５０ミクロンである。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの径は約４５０ミクロンである。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの径は約５５０ミクロンである。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの径は約６５０ミクロンである。
【０００９】
いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、１種以上の神経細胞及び１種以上のシュワン細胞を、１個のシュワン細胞当り約４個の神経細胞に等しい細胞型の比で含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、１種以上の神経細胞及び１種以上の星状細胞を、１個の星状細胞当り約４個の神経細胞の比で含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、１種以上の神経細胞及び１種以上の星状細胞を、１個の星状細胞当り約１個の神経細胞の比で含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、１種以上の神経細胞及び１種以上のシュワン細胞を、１個のシュワン細胞当り約１０個の神経細胞の比で含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、１種以上の神経細胞及び１種以上のグリア細胞を、１個のグリア細胞当り約４個の神経細胞に等しい比で含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞のいずれか１種以上は人工多能性幹細胞から分化している。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは人工多能性幹細胞及び／または免疫細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは未分化幹細胞を含まない。
【００１１】
いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、約３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、または７５，０００個以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは約７５，０００個以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは約６５，０００個以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは約６０，０００個以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは約１００，０００個以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは約１２５，０００個以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは約１５０，０００個以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは約１７５，０００個以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは約２００，０００個以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは約２２５，０００個以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは約２５０，０００個以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは約１２，５００個以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは約１２，５００個の細胞〜約２５０，０００個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは約１２，５００個の細胞〜約１００，０００個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは約１２，５００個の細胞〜約７５，０００個の細胞を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは１種以上の磁性粒子を更に含む。いくつかの実施形態において、上記磁性粒子は１つ以上の中空の内部を備える。いくつかの実施形態において、上記磁性粒子は、１つ以上のポリマーの層であって、上記細胞がその上にスフェロイドを形成する上記ポリマーの層を備える。
【００１３】
本開示はまた、
（ｉ）ヒドロゲルを備える細胞培養容器と、
（ｉｉ）１種以上の神経細胞及び／または単離された組織外植片を含む１個以上のスフェロイドと、
（ｉｉｉ）電流発生器を備える増幅器と、
（ｉｖ）電圧計及び／または電流計と、
（ｖ）少なくとも第１の刺激用電極及び少なくとも第１の記録用電極と
を備えるシステムであって、
上記増幅器と、電圧計及び／または電流計と、電極とが、電流が上記増幅器から上記少なくとも１つの刺激用電極に供給され、電流が上記記録用電極で受け取られ、上記電圧計及び／または電流計に供給される回路を介して、互いに電気的に接続されており、
上記細胞培養容器全体にわたって電場が確立されるように、上記刺激用電極が、上記神経細胞及び／または単離された組織外植片の１個以上の細胞体にあるいはそれに近接して配置され、上記記録用電極が、上記細胞体に対して遠位の所定の距離に配置される上記システムにも関する。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは本明細書に記載のいずれかのスフェロイドである。
【００１４】
いくつかの実施形態において、上記培養容器は、９６、１９２、３８４個、もしくはそれを超える内部チャンバを備える。いくつかの実施形態において、上記９６、１９２、３８４個、またはそれを超える内部チャンバは、１種以上の単離されたシュワン細胞または１種以上の乏突起膠細胞が、上記１種以上の単離された組織外植片及び／または上記１種以上の神経細胞からの軸索伸長に対してミエリンを蓄積させるように、上記組織外植片及び／もしくは神経細胞に十分近接した上記シュワン細胞ならびに／または上記乏突起膠細胞を備える。
【００１５】
いくつかの実施形態において、上記システムは、固体基材であって、その上に上記ヒドロゲルマトリクスが架橋されている上記固体基材を更に備え、上記固体基材は、約１ミクロン〜約５ミクロンの径の細孔を有する少なくとも１つのプラスチック表面を備える。いくつかの実施形態において、上記固体基材は連続する外表面と内表面とを備え、かかる固体基材は、円筒形または実質的に円筒形の少なくとも１つの部分と、少なくとも１つの中空の内部であって、上記中空の内部の端部において、上記内表面の少なくとも１つの部分によって画成された上記中空の内部とを備え、上記内表面は、径が約０．１ミクロン〜約１．０ミクロンの１つ以上の細孔を備え、
上記固体基材の上記中空の内部は、上記固体基材の外部の点から少なくとも１つの開口部を通してアクセス可能であり、
上記中空の内部部分は、上記開口部に近接する第１の部分と、上記開口部の遠位の少なくとも第２の部分とを備え、
上記１種以上の神経細胞及び／または上記１種以上の組織外植片は、上記中空の内部の上記第１の部分にまたはそれに近接して配置され、上記ヒドロゲルマトリクスと物理的に接触しており、
上記少なくとも１つの中空の内部の上記第２の部分は、軸索が、上記１種以上の神経細胞及び／または上記１種以上の組織外植片から上記中空の内部の上記第２の内部部分中へと成長できるように、上記第１の部分と流体連通している。
【００１６】
いくつかの実施形態において、上記システムまたは組成物は、それぞれスポンジを備えていないまたはスポンジを含まない。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、少なくとも、第１の細胞が貫入不能なポリマー及び第１の細胞が貫入可能なポリマーを含む。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の、細胞が貫入不能なポリマーが含むＰＥＧは約１５％以下であり、上記少なくとも１種の、細胞が貫入可能なポリマーは、約０．０５％〜約１．００％の、ＲＡＤ  １６−Ｉ、ＲＡＤ  １６−ＩＩ、ＥＡＫ  １６−Ｉ、ＥＡＫ１６−ＩＩ、及びｄＥＡＫ  １６から選択される自己組織化性ペプチドの１種または組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、上記組成物はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含まない。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは第１の領域及び第２の領域を備え、上記第１の領域は、円柱または直方体であって、その長手方向の軸が上記細胞培養容器の上面及び底面を貫通する方向を向いた上記円柱または直方体の形状に形成され、上記円柱または直方体のそれぞれは、上記円柱または直方体の内表面によって画成される空間を備え、上記空間及び上記細胞培養容器の上面を貫く１つ以上の開口部によりアクセス可能であり；
上記第２の領域は、上記第１の領域に隣接し、且つ第１の領域と流体連通する、その側部に開口部を有する、第２の領域の内壁の形状に形成された空間を備える。いくつかの実施形態において、上記組成物は少なくとも１％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記システムは、ミリリットル当り約５〜約２０ピコグラムの濃度の神経成長因子（ＮＧＦ）及び／または約０．００１重量／体積％〜約０．０１重量／体積％の範囲の濃度のアスコルビン酸を含む細胞培地を更に備える。
【００１８】
いくつかの実施形態において、上記システムは、グリア細胞、胚細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞由来の細胞、交感ニューロン、副交感ニューロン、脊髄運動ニューロン、中枢神経系ニューロン、末梢神経系ニューロン、腸管神経系ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロン、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、介在ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、三叉神経節ニューロン、星状細胞、乏突起膠細胞、シュワン細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、放射状グリア細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞、及び下垂体細胞から選択される細胞の少なくとも１種または組み合わせを含む１個以上のスフェロイドを備える。いくつかの実施形態において、上記システムは、幹細胞、多能性細胞、筋芽細胞、及び骨芽細胞の１種以上を更に備える。いくつかの実施形態において、上記１種以上の神経細胞は哺乳動物の末梢神経系由来の初代哺乳動物細胞を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは約３、３０、９０、または３６５日以上培養されている。
【００２０】
いくつかの実施形態において、上記固体基材の少なくとも一部は、上記固体基材の上記内表面の少なくとも一部が、上記スフェロイドが配置されている円筒形または実質的に円筒形の中空の内部チャンバを画成するように円筒形または実質的に円筒形である。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、一連のチャネルによって互いに流体連通する一連の２つ以上の空洞（ｃａｖｉｔｙ）を備え、少なくとも１つの空洞がスフェロイドを備え、少なくとも第２の空洞が第２のスフェロイド、細胞の懸濁液、またはＤＲＧを備え、上記スフェロイド及び上記第２のスフェロイド、細胞の懸濁液、またはＤＲＧが３次元軸索によって連結されている。いくつかの実施形態において、上記空洞は、上記固体基材の水平なもしくは実質的に水平な面に配置されたＵ字形または円形のウェルを有するウェルであり、各チャネルが１個以上のスフェロイドに連結した１個以上の軸索を備える。
【００２１】
いくつかの実施形態において、上記１個以上のスフェロイドは、幅が約１００ミクロン〜約５００ミクロン、長さが約０．１１〜約１００００ミクロンの軸索成長を有する１種以上の神経細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記３次元軸索の高さは、その最低点において少なくとも約１０ミクロンであるか、または少なくとも細胞単層の３層である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、上記システムは、
（ｉ）１種以上の神経細胞、及び／または
（ｉｉ）１種以上のシュワン細胞または乏突起膠細胞
を含む第１のスフェロイドと、
（ｉ）１種以上の末梢ニューロン
を含む第２のスフェロイドと
を備え、各スフェロイドは上記空洞中に配置されている。いくつかの実施形態において、上記システムは、第１、第２、及び第３の空洞であって、それぞれがスフェロイド及び少なくとも５０マイクロリットルの細胞培養培地を保持するように構成された上記空洞を備え、上記第１の空洞が上記第２の空洞の近位に且つ上記第３の空洞の遠位に配置されるように、上記空洞が整列している。いくつかの実施形態において、上記システムは、少なくとも第４の空洞を備え、各空洞が正方形の角を画定するようなパターンで空洞が配置される。いくつかの実施形態において、上記空洞は、上記第１の空洞中の上記第１のスフェロイドから生じた軸索が上記第２の空洞まで伸長し、上記第２の空洞中の上記スフェロイドからの軸索が上記第３の空洞中の軸索まで伸長するように一列に整列している。
【００２３】
本開示はまた、培養容器中における１個以上のスフェロイドの３次元培養物の製造方法にも関する。いくつかの実施形態において、上記方法は、
（ａ）１種以上の神経細胞を、上記固体基材であって、少なくとも１つの外表面、少なくとも１つの内表面、及び上記少なくとも１つの内表面によって画成され、且つ少なくとも１つの開口部を通して上記固体基材の外部の点からアクセス可能な少なくとも１つの内部チャンバを備える上記固体基材に接触させることと、
（ｂ）神経細胞を含む１個以上のスフェロイドを、上記少なくとも１つの内部チャンバに配置することと、
（ｃ）細胞培地を、上記少なくとも１個のスフェロイドを覆うのに十分な量の細胞培地によって上記培養容器中に印加することと
を含み、
上記内表面の少なくとも一部は、第１の細胞が貫入不能なポリマー及び第１の細胞が貫入可能なポリマーを備える。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）は、単離された後根神経節、脊髄外植片、網膜外植片、及び皮質外植片の１種または組み合わせから選択される組織外植片を含むスフェロイドを配置することを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、任意選択で幹細胞に由来する、運動ニューロン、感覚ニューロン、交感神経ニューロン、副交感神経ニューロン、皮質ニューロン、脊髄ニューロン、末梢ニューロンの１種または組み合わせから選択される神経細胞の懸濁液として形成される。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、任意選択で幹細胞に由来する、運動ニューロン、感覚ニューロン、交感神経ニューロン、副交感神経ニューロン、皮質ニューロン、脊髄ニューロン、末梢ニューロンの１種または組み合わせから選択される神経細胞の懸濁液から形成される。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、単離されたシュワン細胞及び／または乏突起膠細胞を更に含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、上記方法は、（ｄ）上記スフェロイドに、ステップ（ｃ）の後に約１２時間〜約１年間、神経突起及び／または軸索を成長させるステップを更に含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、ステップ（ａ）の前に試料から１種以上の神経細胞を単離するステップ、及び／または上記１個以上のスフェロイドが後根神経節（ＤＲＧ）を含む場合、ステップ（ｂ）の前に１種以上の哺乳動物からＤＲＧを単離するステップ、及び／または上記１個以上のスフェロイドがシュワン細胞または乏突起膠細胞を含む場合、１種以上のシュワン細胞及び／または１種以上の乏突起膠細胞を単離するステップを更に含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記刺激用電極に電流を導入した際に、上記記録用電極が、上記記録用電極において測定することができる１種以上の電気生理学的メトリクスに対応する信号を受信できるように、
少なくとも１つの刺激用電極を上記１種以上の神経細胞または組織外植片の細胞体にまたはそれに近接して配置することと、
少なくとも１つの記録用電極を、軸索にまたはそれに近接して、上記細胞体から最も遠位の点で配置することと
を更に含み、
上記１種以上の電気生理学的メトリクスは、電気伝導速度、活動電位、１種以上の神経細胞の膜に沿った電気インパルスの通過に伴う波の振幅、１種以上の神経細胞の膜に沿った電気インパルスの幅、１種以上の神経細胞の膜に沿った上記電気インパルスの潜時、及び１種以上の神経細胞の膜に沿った上記電気インパルスのエンベロープの１種または組み合わせである。
【００２７】
本開示はまた、
（ａ）本明細書に開示のいずれかの組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）少なくとも１種の薬剤を上記１個以上のスフェロイドに曝露することと、
（ｃ）上記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化及び／もしくは１種以上の電気生理学的メトリクスを測定及び／または観測することと、
（ｄ）上記１個以上のスフェロイドの１種以上の１種以上の形態計測上の変化及び／または１種以上の電気生理学的メトリクスを上記薬剤の毒性と相関させ、その結果、上記形態計測上の変化及び／または電気生理学的メトリクスが、細胞生存率が低下することを示す場合には、上記薬剤は有毒であると特徴付けられ、上記形態計測上の変化及び／または電気生理学的メトリクスが、細胞生存率が変化しないまたは増加することを示す場合には、上記薬剤は無毒及び／または神経保護作用があると特徴付けられることと
を含む、薬剤の毒性ならびに／あるいは神経保護作用の評価方法にも関する。
【００２８】
本開示はまた、１個以上のスフェロイドの１個以上の軸索のミエリン形成または脱ミエリン形成の判定方法であって、
（ａ）少なくとも１個の軸索を成長させるのに十分な時間及び条件下、薬剤の存在下または非存在下で、本明細書に開示のいずれかの組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）上記１個以上のスフェロイド由来の１個以上の軸索におけるミエリン形成の量を検出することと
を含み、
検出することが任意選択で、
（ｉ）薬剤の存在下または非存在下において、上記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化及び／もしくは１種以上の電気生理学的メトリクスを測定及び／または観測するステップと、
（ｉｉ）薬剤の存在下または非存在下における、上記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化及び／もしくは１種以上の電気生理学的メトリクスを、上記スフェロイドのミエリン形成の定量的または定性的変化と相関させるステップと
を含む上記方法にも関する。
【００２９】
本開示はまた、
（ａ）１個以上のスフェロイド及び／もしくはスフェロイドから成長した軸索の数または密度を定量化することと、
（ｂ）本明細書に開示のいずれかの組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｃ）上記スフェロイドを、上記スフェロイド中で上記１個以上の軸索を成長させるまたは細胞を成長させるのに十分な期間培養した後で、上記スフェロイド内の細胞の数及び／または上記組成物中のスフェロイドから成長した軸索の数もしくは密度を計算することと
を含む、神経細胞成長及び／または軸索変性の検出ならびに／あるいは定量化方法のも関する。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）は任意選択で、上記１個以上のスフェロイドを１種以上の薬剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は任意選択で、１個以上のスフェロイドを培養した後で、かかる１個以上のスフェロイドの内部及び／もしくは外部の記録を検出することと、上記記録を既知のもしくは対照の数の細胞に対応する同様の記録の測定値と相関させることとを含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は任意選択で、
（ｉ）上記１個以上のスフェロイドを１種以上の薬剤と接触させる上記ステップの前後における細胞内及び／もしくは細胞外の記録ならびに／または形態計測上の変化を測定する更なるステップと、
（ｉｉ）上記１個以上のスフェロイドを上記１種以上の薬剤と接触させた後の、上記記録及び／もしく形態計測上の変化に対する上記１個以上のスフェロイドを上記１種以上の薬剤と接触させる前の、上記記録及び／もしく形態計測上の変化の差異を、細胞数及び／または軸索の数または密度の変化と相関させるステップと
を含む。
【００３０】
本開示はまた、薬剤の神経調節作用の測定または定量方法であって、
（ａ）上記薬剤の存在下及び非存在下で、本明細書に開示のいずれかの組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）上記薬剤の存在下及び非存在下で、上記１個以上のスフェロイド全体にわたって電位を印加することと、
（ｃ）上記薬剤の存在下及び非存在下で、上記１個以上のスフェロイドからの１種以上の電気生理学的メトリクスを測定することと、
（ｄ）上記１個以上のスフェロイドによる１種以上の電気生理学的メトリクスの上記差異を上記薬剤の神経調節作用と相関させ、その結果、上記薬剤の存在下での電気生理学的メトリクスが上記薬剤の非存在下で測定された上記電気生理学的メトリクスと比較して変化することが神経調節作用を示し、上記薬剤の存在下での電気生理学的メトリクスが上記薬剤の非存在下で測定された上記電気生理学的メトリクスと比較して変化しないことが、上記薬剤が神経調節作用を与えないことを示すことと
を含む上記方法にも関する。
【００３１】
本開示はまた、薬剤の神経調節作用の測定または定量方法であって、
（ａ）上記薬剤の存在下及び非存在下で、本明細書に開示のいずれかの組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）上記薬剤の存在下及び非存在下で、上記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化を測定及び／もしくは観測することと、
（ｃ）上記１種以上の形態計測上の変化を上記薬剤の神経調節作用と相関させ、その結果、上記薬剤の存在下での電気生理学的メトリクスが上記薬剤の非存在下で測定及び／もしくは観測される上記電気生理学的メトリクスと比較して変化することが神経調節作用を示し、上記薬剤の存在下での電気生理学的メトリクスが上記薬剤の非存在下で測定及び／もしくは観測される上記電気生理学的メトリクスと比較して変化しないことが、上記薬剤が神経調節作用を与えないことを示すことと
を含む上記方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】Ａ及びＢはＮｅｒｖｅ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ設計用に作製した３次元ヒドロゲルスキャフォールディングを示す図である。
【図２】上記ヒドロゲル内の代表的なスフェロイド及び軸索成長を示す図である。上記ヒドロゲル構築物は、神経線維路を模倣するために、３次元軸索の成長及び細胞の配置を誘導及び制限することができる。
【図３】後根神経節の神経節において、近位の神経路において、神経路の中間点において、及び遠位の神経路において得ることができる形態学的及び生理学的測定値の一覧である。
【図４】神経突起を示すためのβ−ＩＩＩチューブリン、核を示すためのＤＡＰＩ、及びシュワン細胞を示すためのＳ１００で染色した、後根神経節に近位の、中間点の、及び神経節から遠位の無髄神経線維路の共焦点画像スタックである。
【図５】３次元神経突起密度を表示する共焦点深度マップである。
【図６】Ａ〜Ｃは神経培養物の断面の透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）を示す図である。Ａは、神経節から約１．８７５ｍｍのチャネル内の、高密度の並行な、束状化した無髄神経突起を示す。Ｂは、神経節から約１ｍｍの、シュワン細胞（ＳＣ）で覆われた軸索（Ａｘ）を中心とする焦点を示す。Ｃは２５日間の培養物における個々の神経線維の周りのミエリン鞘を示す。
【図７】Ａ及びＢは３次元表現した共焦点画像である。ＡはＭＢＰタンパク質の免疫組織化学を示す。ＢはＭＡＧの免疫組織化学を示す。両者の培養物の厚さは１９０μｍであり、本イン・ビトロシステムの３次元ミエリン形成能力が確認される。
【図８】人工多能性幹細胞由来のヒトニューロンから形成されたスフェロイドからの神経突起伸長を示す図である。神経突起は、星状細胞（左）及びシュワン細胞（右）と共培養されたヒト運動ニューロンのスフェロイドから２次元表面上で伸長する。
【図９】上記３次元ヒドロゲル系中で成長した運動ニューロン及び星状細胞のスフェロイドを示す図である。これらのスフェロイドは堅牢な３次元神経突起伸長（約５ｍｍ）を示した。
【図１０】ヒト運動ニューロン／シュワン細胞スフェロイド（上）及びヒト感覚ニューロン（下）から３次元で伸長する神経突起を示す図である。
【図１１】９６ウェル・スフェロイドプリンティング装置を示す図である。９６ウェルプレートが上記装置の上に設置され、各ウェルの実質的に中央に１つの磁石を配置する。次いで磁化した細胞を磁石に引き付け、凝集させてスフェロイドを形成させる。
【図１２】ラット脊髄スフェロイドを作製するためのプロトコルを示す図である。培養した細胞に磁性ナノ粒子を添加し、磁石の上の非接着性プレート中で該細胞を培養することによりスフェロイドを形成することができる。（図示せず：磁性ナノ粒子共存下、非接着性丸底プレート中で回転させることによってもスフェロイドを形成することができる。）ヒドロゲル伸長マトリクスを加えても、磁石により１個以上の磁性をもつ細胞スフェロイドを所定の位置に保持することができる。
【図１３】磁性をもつスフェロイドをヒドロゲルの空隙（ｖｏｉｄ）中に配置するための器具を示す図である。この図案の外側の部分の中央には磁石がある。暗灰色の部分は、ｙ方向に可動性であり、内側／一番上の部分にスライドガラスが収納し、インサートの位置を調整し、ｘ方向に可動性である。上記中央の単一の磁石により、構築物の形状にかかわらず、単一の磁石を必要とする構築物の配置を制御することができる。他の器具の設計としては、連結されたウェルにスフェロイドを配置するための複数の磁石を備えるものがある。
【図１４】Ａ及びＢは、ヒドロゲル構築物中におけるスフェロイドの配置を示す図である。β−ＩＩＩチューブリン染色によって示されるラット胚性脊髄スフェロイドからの神経突起伸長は、外型のヒドロゲルパターンと一致する。Ａは、磁石を用いなかった場合の、不適切なスフェロイドの配置を示す。Ｂは、図１３に示す器具を用いた場合の、適切な配置を示す。
【図１５】スフェロイド生成の再現性を示す棒グラフである。同一のスフェロイド形成方法を用いると、バッチ間で一貫性が得られた。２７，０００個の細胞のスフェロイドの平均径は０．４７±０．０３ｍｍであり、ｘｙ方向の真円度は０．７２±０．１５であった。
【図１６】Ａ及びＢは、細胞スフェロイドの代表的な位相像及び生育力を示す図である。これらは、一貫した大きさ及び形状を示す、初代胚性ラット脊髄の細胞からの、再現性のある、適切に形成されたスフェロイドの形成の例を示す。
【図１７】１：２０で希釈したマトリゲル中におけるスフェロイドからの神経突起伸長を示す図である。神経突起は３次元環境内の、伸長が可能なチャネルに拘束されたままの状態である。神経突起は厚さ約１００〜１５０μｍに伸長した。
【図１８】ゼラチン−メタクリル酸エステルヒドロゲル中でシュワン細胞スフェロイドと組み合わせた後根神経節（ＤＲＧ）外植片を用いて作製した、画成された回路を示す図である。この構成により、単方向のＤＲＧ神経突起伸長が可能になった。
【図１９】１：２０で希釈したマトリゲル中で、複数のシュワン細胞スフェロイドを用いて作製した、長方形の形態に配置された、画成された回路を示す図である。
【図２０】磁性をもつスフェロイドを用いた神経微小生理学的システムの製造方法の概略図である。デジタル投影リソグラフィーを用いて、伸長が可能なヒドロゲルが含まれるヒドロゲル「型」を硬化させることができる。
【図２１】ナノシャトルを使用してスフェロイドをマイクロパターン化されたヒドロゲル内に配置する３次元スフェロイド播種を示す図である。スフェロイドは、培養した細胞に磁性ナノ粒子を添加し、磁石の上の非接着性プレート中で培養することによって形成することができる。ヒドロゲル伸長マトリクスを加えても、１つ以上の磁性をもつ細胞スフェロイドを、磁石を用いて所定の位置に保持することができる。
【図２２】播種された細胞の数がスフェロイドの径に影響を与えることを示す棒グラフである。
【図２３】Ａ及びＢはスフェロイドの生育力及び３次元構造を示す図である。Ａ：初代ラット胚性脊髄組織から形成されたスフェロイド中の細胞の生育力が高いことを示すカルセイン染色。Ｂ：蛍光シート顕微鏡法で得られたヒドロゲル構築物中のβ−ＩＩＩチューブリン染色スフェロイドの断面図は、スフェロイドの３次元構造を示す。
【図２４】異なる細胞型が組み込まれたスフェロイドを示す図である。このスフェロイド中には、抗体染色によって示されるニューロン（β−ＩＩＩ）、乏突起膠細胞系譜細胞（Ｏｌｉｇ２）、星状細胞（ＧＦＡＰ）、ならびにミクログリア及びマクロファージ（ＣＤＩＩｂ）が存在する。
【図２５】スフェロイド及びミクロパターン化ヒドロゲルを用いた３次元神経回路網の形成を示す図である。ラット胚性ＤＲＧ細胞（左）から形成されたスフェロイドは、メタクリル酸エステル化ゼラチン中を脊髄スフェロイド（右）に向かって、カルセイン染色によって示される神経突起を伸長するが、その逆は起こらない。
【図２６】複数の脊髄スフェロイドの固定された位置における配置、及び外型の幾何学に従った神経回路網を示す図である。
【図２７】ヒト筋肉の筋細胞及び筋管の上で伸長した共培養されたｉＰＳＣ由来の運動ニューロンの共焦点画像（上１０倍、下２０倍）である。筋細胞を増殖培地中で３日間分化させ、次いで運動ニューロンを添加し、培地を運動ニューロン培地に交換した。
【図２８】重鎖ミオシンを発現する３次元の鞘を形成する成熟筋管の２次元培養物の共焦点画像（１０倍）である。筋管は、増殖培地中で３日間、分化培地中で７日間、残りを増殖培地中で、計３週間培養した。
【図２９】３週間培養後の、５％ＧｅｌＭＡ中に封入された３次元筋細胞の１０倍の位相コントラスト画像である。
【図３０】３週間培養後の、デスミン発現ヒト骨格筋管の２５５μＭでの１０倍の最大強度投影Ｚスタックである。
【図３１】３週間のＧｅｌＭＡ培養後の、重鎖ミオシン発現ヒト骨格筋管の９６μＭでの１０倍の最大強度投影Ｚスタックである。
【図３２】異なる播種密度の誘導ニューロンでの、ハンギングドロップ法における３次元スフェロイドの生成を示す図である。
【図３３】異なる播種密度の誘導ニューロンでの、Ｕ字底ウェル中での３次元スフェロイドの生成を示す図である。
【図３４】異なる播種密度の運動ニューロンでの、ハンギングドロップ法における３次元スフェロイドの生成を示す図である。
【図３５】異なる播種密度の運動ニューロンでの、Ｕ字底ウェル中での３次元スフェロイドの生成を示す図である。
【図３６】２４時間または４８時間にわたる、異なる播種密度の運動ニューロンでの、ハンギングドロップ法における３次元スフェロイドの生成を示す図である。
【図３７】２４時間または４８時間にわたる、異なる播種密度の運動ニューロンでの、Ｕ字底ウェル中での３次元スフェロイドの生成を示す図である。
【図３８】２５，０００個のｉＰＳＣ由来の運動ニューロン及び２５，０００個の星状細胞で播種されたハンギングドロップスフェロイドの、４日後の成長を示す図である。
【図３９】２５，０００個のｉＰＳＣ由来の運動ニューロン及び２５，０００個の星状細胞で播種されたＵ字底ウェルスフェロイドの、４日後の成長を示す図である。
【図４０】４０，０００個のｉＰＳＣ由来の運動ニューロン及び１０，０００個の星状細胞で播種されたハンギングドロップスフェロイドの、４日後の成長を示す図である。
【図４１】２４時間にわたるニューロンとグリア細胞との種々の組み合わせを示す図である。
【図４２】乏突起膠細胞前駆細胞のスフェロイドを示す図である（４倍（上）及び１０倍（下））。
【図４３−１】Ａ〜Ｊは、イン・ビトロで２日後の、ヒトニューロン（ｈＮ）及び／またはヒトシュワン細胞（ｈＳＣ）からなるスフェロイドの生成を示す図である。ｈＮ単独の条件では２日間でスフェロイドは形成されなかった一方、ｈＳＣが存在する共培養系ではスフェロイド形成が促進された。ｈＳＣスフェロイドは３種の異なる細胞密度、すなわち２５，０００個（ａ）、５０，０００個（ｂ）、及び７５，０００個（ｃ）で作製した。共培養スフェロイドは一定のｈＮ密度（７５，０００個）で、但しｈＳＣ密度を変化させて、すなわち２５，０００個（ｄ）、５０，０００（ｅ）個、及び７５，０００個（ｆ）で作製した。並行して、ｈＮスフェロイドを３種の異なる密度、すなわち５０，０００個（ｇ）、７５，０００個（ｈ）、及び１００，０００個（ｉ）で作製した。（ｊ）異なるスフェロイドの直径を比較すると、共培養スフェロイドは単独培養スフェロイドと比較してよりコンパクトであることが明らかになり、このことは、ｈＮに対するｈＳＣの親和性によってより密に充填された細胞クラスターが生じることを示している。Ｋ：千の倍数。Ｎ＝４であり、誤差棒は平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。スケールバー：１００μｍ。＊＊＊＊：ｐ値≦０．０００１、＊＊＊：ｐ値≦０．００１、＊＊：ｐ値≦０．０１、＊：ｐ値≦０．０５。
【図４３−２】同上。
【図４４】ヒトニューロン（ｈＮ）単独からなるスフェロイドの形成を示す図である。ｈＮの単独培養の開始後２日を超える時点での定性的な検査では、細胞の総数が増加するにつれて（２５Ｋ、５０Ｋ、７５Ｋ、１００Ｋ）、スフェロイドの大きさが一貫して大幅に増加した。個々のスフェロイドの径を比較したグラフは、定性的な検査結果を支持した。Ｋ：千の倍数。Ｎ＝４であり、誤差棒は平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。スケールバー：１００μｍ。＊＊＊＊：ｐ値≦０．０００１、＊＊：ｐ値≦０．０１。
【図４５】Ａ及びＢは、スフェロイドから遊走し、軸索に沿って伸長したシュワン細胞を示す図である。（Ａ）ｈＳＣマーカーＳ１００を染色（淡灰色）したヒトシュワン細胞（ｈＳＣ）が、４週間にわたってβＩＩＩチューブリンを染色（灰色）した軸索の伸長と共にスフェロイド外に遊走した状況を示す画像。核はＤＡＰＩで標識した（暗灰色）。スケールバー：１０００μｍ。（Ｂ）画像Ａの挿入図の高倍率画像。スケールバー：２５μｍ。
【図４６】Ａ〜Ｃは培養中のスフェロイドから伸長した軸索の記録を示す図である。Ｂ’及びＢ’’は収集した記録をグラフで表したものである。これらのグラフは、メートル／秒の単位で測定した２個のスフェロイドの神経伝導速度（ＮＣＶ）の経時変化を示す。Ｃは、２つの時点、すなわち電流開始の開始及びピークにおけるＮＣＶを示す棒グラフで、上記と同一のＮＣＶ実験を示す。
【図４７】Ａ〜Ｆはイン・ビトロで再構成されたヒト神経で観察されたミエリン形成の様々な段階を示す図である。（Ａ）コンパクトでないミエリン。（Ｂ）コンパクトなミエリン。（Ｃ）コンパクト化の過程のミエリン。（Ｄ）軸索なしでのミエリン形成。（Ｅ）細胞質内の層板小体。（Ｆ）裸（無髄）の軸索。
【図４８】Ａ〜Ｄは後角スフェロイドのキャラクタリゼーションを示す図である。（Ａ）１４ＤＩＶ（イン・ビトロで１４日間）での典型的なＤＲＧからＤＨシナプスへの培養を示顕微鏡写真である。（Ｂ）２８ＤＩＶでのシナプス培養のβ３−チューブリン染色を示す蛍光画像。（Ｃ）電気生理学リグ上でのシナプス培養を示す顕微鏡写真である。青色の矢印は刺激用電極と記録用電極との間の距離を示し、その距離は３．１ｍｍであった。この画像は、ＤＲＧ軸索の位置の刺激用電極とＤＨスフェロイドの位置の記録用電極を示す。（Ｄ）ＤＲＧ軸索への２０Ｖの刺激に応答した電気的活性をＤＨスフェロイドにおいて記録した。Ｘ軸の単位はミリ秒であり、ｙ軸の単位はミリボルトである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本明細書及び特許請求の範囲を通じて、本開示の方法及び他の態様に関する様々な用語が用いられる。かかる用語は、別段の指示がない限り、当技術分野におけるそれらの通常の意味をもつものとする。他の明確に定義された用語は、本明細書においてなされた定義と一致する形で解釈されるものとする。
【００３４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、当該の内容が明確に別段の指示をしない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を包含する。
【００３５】
本明細書では、用語「２を超える」とは、数字２より大きな任意且つ全ての整数、例えば３、４、または５として定義される。
【００３６】
本明細書では、用語「約」とは、量、持続期間などの測定可能な値に言及する場合に、明示された値からの±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．９％、±０．８％、±０．７％、±０．６％、±０．５％、±０．４％、±０．３％、±０．２％、または±０．１％の変動を包含することを意味し、それは、かかる変動は、開示される方法を実行するのに妥当なものであることによる。
【００３７】
本明細書及び特許請求の範囲では、語句「及び／または」とは、該語句によって結合される要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素を意味すると理解されたい。「及び／または」節によって明確に特定された要素以外の他の要素は、それに反することが明示されない限り、それらの明確に特定された要素に関連するか否かにかかわらず、任意選択で存在していてもよい。したがって、非限定的な例として、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの非限定型（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）の言葉との組み合わせで用いられる場合の「Ａ及び／またはＢ」への言及は、一実施形態において、Ｂを含まないＡ（任意選択でＢ以外の要素を含む）を指してもよく、別の実施形態において、Ａを含まないＢ（任意選択でＡ以外の要素を含む）を指してもよく、更に別の実施形態において、Ａ及びＢの両方（任意選択で他の要素を含む）を指してもよく、別の実施形態において、Ａを含まないＢ（任意選択でＡ以外の要素を含む）を指してもよい、等々。
【００３８】
本明細書及び特許請求の範囲では、「または」は、上記で定義した「及び／または」と同様の意味を有すると理解されたい。例えば、列挙中の項目を区切る場合、「または」または「及び／または」は包括的（ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ）である、すなわち、数字または要素の列挙の少なくとも１つを含むのみならず、それらの複数、及び任意選択で、列挙されていない更なる項目も包含すると解釈されるべきものである。「〜の１つのみ」もしくは「〜の１つだけ」、または特許請求の範囲における「〜からなる」などの、上記に反することが明示されたそれのみの用語は、数字または要素の列挙の要素の１つだけを含むことを指すこととなる。本明細書では、概括的には、用語「または」は、排他的用語である「どちらか」、「〜の１つ」、「〜の１つのみ」、または「〜の１つだけ」がその前にある場合には、排他的な択一（すなわち「一方または他方であって両方ではない」）を示すとしてのみ解釈されるべきものである。「〜から本質的になる」が特許請求の範囲で用いられる場合には、特許法の分野で使用される通常の意味を有するべきものである。
【００３９】
本明細書では、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（及び、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（及び、「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」などの有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態）は、包括的（ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ）すなわち非限定的（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）であり、追加の列挙されていない要素または方法のステップを排除するものではない。
【００４０】
本明細書では、語句「Ｘ〜Ｙの整数」とは端点を含む任意の整数を意味する。すなわち、範囲が開示される場合、端点を含む当該範囲内の各整数が開示される。例えば、語句「Ｘ〜Ｙの整数」とは、１、２、３、４、または５、ならびに１〜５の範囲を開示する。
【００４１】
本明細書では、用語「複数」とは、１つよりも多い任意の量または１よりも大きい任意の数として定義される。
【００４２】
本明細書では、「実質的に等しい」とは、例えば、所与の測定したメトリクスにおいて、異常または正常範囲と相関することが知られている範囲内にあることであってよい。例えば、対照試料が罹患した患者由来である場合、実質的に等しいとは異常範囲内にあることである。対照試料が、試験を受けている疾病に罹患していないことが分かっている患者からのものである場合、実質的に等しいとは、当該の所与のメトリクスの正常範囲内にあることである。
【００４３】
本開示は、概括的には、３次元培養において１個以上のスフェロイドを収納及び培養することができるシステムに関する。いくつかの実施形態において、本システムは、細孔を備えた、プラスチックまたは類似のポリマーなどの固体基材であって、該基材の上に任意の形状または大きさのヒドロゲルを載置することができる上記基材を使用する。本システムの上記ヒドロゲルは、いくつかの実施形態において、スフェロイドの形態または懸濁液中を問わず、神経系の成熟細胞が軸索を伸長、分裂、及び／または成長させるのに十分な条件下で、本開示の細胞が神経突起を伸長及び成長させ、且つ／または軸索を形成するための支持体として機能する。いくつかの実施形態において、本システムは、少なくとも２つの領域、すなわち、第１の領域であって、平底または湾曲した底及び上記販売された支持体の長手方向の面を横切る径を有する、ウェルに類似し、該領域の上面にある本システムの外部のアクセスが可能な開口部、及び第２の領域と流体連通する第１領域の少なくとも１つの側面にある開口部も備える、上記第１の領域を有する空洞を形成するヒドロゲルを備える。いくつかの実施形態において、第１の領域の径は約１ｍｍ以下である。第２の領域は、第１の領域から横方向に延在するチャネルの形態であり、側部が該チャネルの高さを画定する。いくつかの実施形態において、上記チャネルの幅は約１０〜約７５０ミクロンである。いくつかの実施形態において、上記チャネルの長さは約１００〜約１０，０００ミクロンである。本開示で特定される細胞のいずれか１種または組み合わせからスフェロイドを成長させた後、これらのスフェロイドを細胞培養培地を収納した上記第１の領域に配置してもよい。配置後、神経突起が自発的に伸長するか、または１種以上の成長刺激分子に曝露することによって伸長を促す。神経突起及び／または軸索の伸長は、本システムの上記第１の領域で発出し、上記ヒドロゲルの側面の上記少なくとも１つの開口部を通過し、上記第２の領域に入って、第２の領域で起こる場合もある。神経突起または軸索が所望の長さに伸長した後、薬剤を細胞の培養物に曝露して、その薬剤が上記軸索もしくは神経突起の伸長、形態学、または活動電位に及ぼす影響の状況を判定してもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態において、上記スフェロイドを保持し、且つ第１の領域を画定する上記空洞またはウェルは、スフェロイドが、１個以上の該スフェロイドから伸長する軸索のチャネルによって連結されたような、対応する第２の領域によって連結されたパターンまたはネットワークであってもよい。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、各スフェロイドの間に配置されたチャネルによって連結された正方形または長方形のパターンである。いくつかの実施形態において、上記パターンは「Ｌ字」の形状であり、スフェロイドがその「Ｌ字」の形状の端部及び角部を画定する。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、三角形、すなわち、スフェロイドを収納した３つの空洞のそれぞれの間に３つのチャネルを有する角をもつパターンで配置されていてもよい。ヒドロゲルネットワークの一端において、第１の空洞に中枢神経系の特徴を持つスフェロイドが入っていてもよい。これらの実施形態においては、中枢神経系に通常存在する細胞が上記スフェロイドを構成する。かかる細胞は、個々の神経細胞を含む任意の組み合わせまたは組成物から選択することができ、星状細胞または免疫細胞を含んでいてもよい。同一の実施形態において、第１の空洞から最も遠位の空洞は、感覚ニューロンを含むスフェロイドなどの感覚特性を有するスフェロイドを保持していてもよい。したがって、第１のスフェロイドと第１のスフェロイドから最も遠位のスフェロイドとの間の軸索による連結は、軸索が中枢神経系の特徴を有するスフェロイドから末梢感覚ニューロンを含むスフェロイドまで延びる感覚神経線維のモデルとなる。かかるスフェロイド間の電気生理学的測定は、回路の両端に電極を配置し、記録を測定することによって行うことができる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは神経細胞と非神経細胞との混合物を含む。非神経細胞としては、骨格筋細胞、心筋細胞、及び平滑筋細胞が挙げられる。非神経細胞としては、腎細胞、肝細胞、及び膵細胞などの臓器組織由来の細胞も挙げられる。非神経細胞の例としては、内皮細胞、皮膚の上皮細胞、及び目の角膜細胞も挙げられる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、哺乳動物細胞、非ヒト動物細胞、またはヒト細胞である。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの上記細胞の何れか１種以上が初代ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、上記細胞はヒトの対象から採取される。いくつかの実施形態において、上記細胞はラットまたはマウス細胞である。いくつかの実施形態において、上記細胞は、非ヒト霊長動物細胞、ブタ細胞、イヌ細胞、またはウシ細胞である。いくつかの実施形態において、いずれの開示されるシステムも、非神経細胞と混合されたまたは混合されていない神経細胞のスフェロイドを備えていてもよい。
【００４６】
本開示の方法は、本明細書に開示のスフェロイドの培養方法、ならびに、毒素、薬物、治療薬、生体分子、もしくは汚染物質の毒性または生物学的作用の測定方法であって、本システム中で、かかる分子、薬物、または治療薬がスフェロイド及びかかるスフェロイドから伸長する軸索または神経突起の培養物に曝露された場合の上記方法を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、第１のスフェロイドから第２のスフェロイドへの、培養における軸索及び／または神経突起の一方向伸長の生起方法を含む。いくつかの実施形態において、本開示のシステムのいずれも、培養における神経突起及び／または軸索の伸長を刺激する、加速する、減速する、または停止させる薬剤を含む。いくつかの実施形態において、いずれの本開示の方法も、培養において軸索の方向伸長を刺激することを含む。いくつかの実施形態において、薬剤を使用して、軸索及び／もしくは神経突起の伸長のガイダンスを引き付けるか、または軸索及び／もしくはニューロンの伸長に反発させるかのいずれかを行う。いくつかの実施形態において、ネトリン、ニューロトロフィン、接着性細胞外マトリクスタンパク質、細胞接着受容体（カドヘリン、Ｉｇ−ＣＡＭ、またはインテグリンなど）から選択される誘引性ガイダンスタンパク質が本システムに添加され、これらのタンパク質の推定される結合部位を模倣するペプチドを用いることもできる。いくつかの実施形態において、軸索及び／または神経突起の伸長に反発するタンパク質は本システムの構成要素である。反発性タンパク質としては、エフリン（時々）、セマフォリン（ほとんどの場合）、スリット、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンなどが挙げられる。
【００４７】
磁性粒子または磁性ビーズを含むまたは含まないスフェロイドの製造方法も開示される。磁性粒子がスフェロイドの構成要素である場合、磁石を備える任意の装置を用いて、１個以上のスフェロイドを、ヒドロゲルの壁によって形成された開示される１つの空洞内の位置に配置することができる。本開示は、概括的には、可動性フレームを備える装置に関し、上記可動性フレームは、上記装置が動作している水平面に平行な任意の横方向に可動性である。上記フレームは、磁性粒子を含むスフェロイドを引き付けるのに十分な磁力で１つ以上の磁石に取り付けられている。いくつかの実施形態において、上記装置の長手方向の平面のｘ及びｙ方向に可動性の上記フレームは、該フレームを動かすことによって、磁石であって、スフェロイドが該磁石の磁場内にある場合、上記スフェロイドを任意の方向に動かすのに十分な磁力をもつ上記磁石が動くように、接着剤、ポリマー、または留め具によって磁石に機械的に取り付けられている。いくつかの実施形態において、上記装置は、第１のフレーム及び第２のフレームを備え、第１または第２のフレームの少なくとも一方は、上記装置の長手方向の平面に平行な横方向に可動性であり、且つ上記装置上で水平であるかまたは実質的に水平である。
【００４８】
用語「バイオリアクター」とは、容器または部分的な容器であって、その中で細胞が、任意選択で懸濁液中で、培養される上記容器をいう。いくつかの実施形態において、上記バイオリアクターとは、容器または部分的な容器であって、その中で、細胞が培養され、該細胞が、懸濁液中に存在し、あるいは、固体成長支持材料を含む、但しこれに限定されない別の非液体基材に接触して、上記基材上で、または上記基材中で伸長していてもよい上記容器をいう。いくつかの実施形態において、上記固体成長支持材料または固体基材は、シリカ、プラスチック、金属、炭化水素、もしくはゲルの少なくとも１種または組み合わせを含む。本開示は、１基以上の培養容器であって、その中で、存在または細胞増殖培地中で神経細胞が培養されてもよい上記培養容器を備えるバイオリアクターを備えるシステムに関する。
【００４９】
本明細書では、用語「培養容器」は、細胞を成長させる（ｇｒｏｗｉｎｇ）、培養する（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）、培養する（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）、増殖させる（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ）、増殖させる（ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ）、またはその他同様に操作するのに適した任意の容器であってよい。培養容器は、本明細書では「培養インサート」と呼ばれることもある。いくつかの実施形態において、上記培養容器は、生体適合性プラスチック及び／またはガラス製である。いくつかの実施形態において、上記プラスチックは、１つ以上の細孔であって、該細孔を通して、タンパク質、核酸、栄養素（重金属及びホルモンなど）、抗生物質、及び他の細胞培養培地成分が拡散することが可能である上記細孔を備えるプラスチックの薄層である。いくつかの実施形態において、上記細孔の幅は、約０．１、０．５、１．０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０ミクロン以下である。いくつかの実施形態において、上記培養容器はヒドロゲルマトリクス中にあり、塩基または他のいかなる構造も含まない。いくつかの実施形態において、上記培養容器は、ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクス及び様々な培養培地を収納するように設計される。いくつかの実施形態において、上記培養容器は、ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスからなるか、またはそれらから本質的になる。いくつかの実施形態において、上記培養容器の唯一のプラスチック構成要素は、細胞成長のウェルまたはゾーンの体積を外部の点から分離する上記培養容器の側壁及び／または底部を構成する上記培養容器の構成要素である。いくつかの実施形態において、上記培養容器は、ヒドロゲル及び１個以上の単離されたグリア細胞を備える。いくつかの実施形態において、上記培養容器は、ヒドロゲル及び１個以上の単離されたグリア細胞であって、ここに１個以上の神経細胞が播種された上記ヒドロゲル及びグリア細胞を備える。
【００５０】
用語「電気的刺激」とは、上記細胞が交流（ＡＣ）または直流（ＤＣ）のいずれかの電流に曝露されている過程をいう。上記電流は、上記固体基材中に導入されるか、または細胞培養培地もしくは本細胞培養システムの他の適宜の構成要素を介して印加されてもよい。いくつかの実施形態において、上記電気的刺激は、本装置またはシステム内の異なる位置に１つ以上の電極を配置し、細胞培養容器全体に電位を生じさせることによって本装置またはシステムに与えられる。上記電極は、１本以上の電線によって、増幅器、電圧計、電流計、及び／または電気化学システム（電池または発電機など）の１つ以上と動作可能に接続されている。かかる機器及び電線により、回路であって、該回路を通って電流が生じ、該回路によって本組織培養システム全体に電位が生じる上記回路が形成される。
【００５１】
本明細書では、用語「ヒドロゲル」は、例えば、水で満たされているかまたは水で満たすことができるポリマー鎖間の空隙を有する、任意の水に不溶性な、架橋された、ポリマー鎖の３次元ネットワークであってよい。本明細書では、用語「ヒドロゲルマトリクス」とは、例えば、任意の３次元ヒドロゲル構築物、システム、装置、または類似の構造体をいう。ヒドロゲル及びヒドロゲルマトリクスは当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，７００，２８９号及び第６，１２９，７６１号、ならびにＣｕｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，  ２０１１；Ｃｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；Ｉｒｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；及びＴｉｂｂｉｔｔ  ａｎｄ  Ａｎｓｅｔｈ，  ２００９（それらのそれぞれは、その全体が参照により援用される）に、様々な種類が記載されている。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスは、液化プレゲル溶液を、紫外光、可視光、または波長が約３００ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、もしくは５００ｎｍを超える任意の光に曝露することにより固化させることができる。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスを、様々な形状、例えば、神経路を模倣するように設計された二股に分岐した形状に固化してもよい。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスはポリ（エチレングリコール）ジメタクリラート（ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスはＰｕｒａＭａｔｒｉｘを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスはグリシジルメタクリラート−デキストラン（ＭｅＤｅｘ）を含む。いくつかの実施形態において、神経細胞が上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクス中に組み込まれる。いくつかの実施形態において、神経系由来の細胞が上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクス中に組み込まれる。いくつかの実施形態において、上記神経系由来の細胞はシュワン細胞及び／または乏突起膠細胞である。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスは、動物（哺乳動物など）の神経系由来の組織外植片、及び上記神経系に由来する細胞ではあるが、単離し培養して、培養物中の該細胞の集団を濃縮した上記細胞の補助的集団を含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスは、網膜組織外植片、ＤＲＧ、または脊髄組織外植片などの組織外植片、ならびに単離及び培養されたシュワン細胞、乏突起膠細胞、及び／またはミクログリア細胞の集団を含む。いくつかの実施形態において、２種以上のヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスが細胞培養容器中で同時に使用される。いくつかの実施形態において、２種以上のヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスが同一の細胞培養容器中で同時に使用されるが、上記ヒドロゲルは、組織培養容器中に、独立して対処可能なウェルなどの微小環境を形成する壁によって分離される。多重化組織培養容器において、いくつかの実施形態が、１つのウェルもしくは場所の中のヒドロゲルマトリクスが、上記細胞培養容器の別のウェルもしくは場所の中のヒドロゲルマトリクスと異なるまたは同一となるような、上記細胞培養容器内の任意の数の上述のウェルまたは独立して対処可能な場所を備えることが可能である。
【００５２】
本明細書では、用語「免疫細胞」とは、例えば、感染症または感染症の症状から対象を防御すること、あるいは対象の細胞から、機能不全の細胞もしくは病原体を攻撃する、除去する、または別な形態で排除すること、あるいは病原体によって生じる疾患の症状を改善することを含む、対象の免疫活性に関与する任意の細胞であってよい。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｂ細胞；Ｔ細胞；星状細胞、樹状細胞、及びマクロファージなどの抗原提示細胞；星細胞；顆粒球；単球；好塩基球；好酸球；及び／または肥満細胞の１種以上を含む。いくつかの実施形態において、上記免疫細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８及び１種以上の免疫調節分子を発現する。いくつかの実施形態において、上記免疫調節分子は、以下、すなわち、ＩＬ−２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＲ−Ｉα、ＭＩＰ−Ｉβ、ＩＬ−８、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、Ｃａｓｐａｓｅ  ＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、Ｉｎａｃｔｉｖｅ  ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰｌ、ＴＡＰ２及びそれらの機能性フラグメント、またはそれらの組み合わせから選択される。免疫調節タンパク質は米国特許第８，００８，２６５号に例示される。
【００５３】
用語「免疫調節性の」とは、免疫系に対して調節効果を有する物質をいう。かかる物質は、サイトカインの分泌、抗体の産生、ＮＫ細胞の活性化、及びＴ細胞の増殖などの免疫応答の様々な側面を示す標準的なアッセイを使用して容易に識別することができる。例えば、ＷＯ９７／２８２５９、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９９／１１２７５、Ｋｒｉｅｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−５４９；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：４０７２−７６；Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５７：１８４０−４５；Ｋｌｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：３６３５−３９；Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２−３５４；Ｐｉｓｅｔｓｋｙ  （１９９６）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５６：４２１−４２３；Ｓｈｉｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７７：８０８−８１６；Ｃｏｗｄｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５６：４５７０−７５；Ｒｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ３：８４９−８５４；Ｌｉｐｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７ａ）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２７：２３４０−４４、ＷＯ９８／５５４９５、及びＷＯ００／６１１５１を参照されたい。したがって、これら及びその他の方法を用いて、免疫刺激性ヌクレオチド、免疫刺激性の単離された核酸などの免疫刺激性物質を識別する、試験する、及び／または確認することができる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、上記２種以上のヒドロゲルは、異なる量のＰＥＧ及び／またはＰｕｒａｍａｔｒｉｘを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、上記２種以上のヒドロゲルの密度は様々であってよい。いくつかの実施形態において、上記２種以上のヒドロゲルは、細胞が該ヒドロゲル内を伸長することが可能になる様々な貫入性を有していてもよい。いくつかの実施形態において、上記２種以上のヒドロゲルの柔軟性は様々であってよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバイオリアクター、細胞培養装置、または組成物は、ポリマー、すなわち細胞が貫入可能なポリマー及び細胞が貫入不能なポリマーの２層を備えるヒドロゲルを備える。いくつかの実施形態において、上記細胞が貫入可能な層は上記細胞が貫入不能な層の上面の少なくとも１つの領域に積層される。
【００５５】
用語「細胞が貫入可能なポリマー」とは、固体基材上で、固体または半固体状態で架橋する際に空間が生じるのに十分な濃度及び／もしくは密度で、同一のまたは混合したモノマーユニットを有する親水性ポリマーをいい、かかる空間は、培養において細胞または細胞の一部が伸長することができるように十分に生体適合性である。
【００５６】
用語「細胞が貫入不能なポリマー」とは、固体基材上で、固体または半固体状態で架橋する際に空間または区画が生じないようにするのに十分な濃度及び／もしくは密度で、同一のまたは混合したモノマーユニットを有する親水性ポリマーをいう。換言すれば、細胞が貫入不能なポリマーは、架橋後に、特定の濃度及び／または密度で、培養中の細胞または細胞の一部の伸長を支援することができないポリマーである。
【００５７】
用語「機能性フラグメント」とは、ポリペプチドまたは核酸配列の任意の部分であって、それぞれの全長のポリペプチドまたは核酸が関係し、該フラグメントの基となる上記全長のポリペプチドまたは核酸と少なくとも類似のまたは実質的に類似の生物学的影響を与えるのに十分な長さがあり、且つ十分な構造を有する上記部分であってよい。いくつかの実施形態において、機能性フラグメントは、本明細書に開示される核酸配列のいずれか１種をコードする全長のまたは野生型の核酸配列の一部であり、上記部分は、全長より短いが、当該の全長のまたは野生型のタンパク質と比較してなおも生物学的に機能するドメインをエンコードする、ある長さ及び／または構造のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、上記機能性フラグメントは、該フラグメントの基となる野生型のまたは全長のポリペプチド配列と比較して、生物学的活性が低下する、生物学的活性がほぼ同等である、または生物学的活性が向上していてもよい。いくつかの実施形態において、上記機能性フラグメントはヒトなどの生物の配列に由来する。かかる実施形態において、上記機能性フラグメントは、当該の配列が由来する野生型のヒト配列に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％の配列同一性を保持していてもよい。いくつかの実施形態において、上記機能性フラグメントは、当該の配列が由来する野生型のヒト配列に対して８７％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、または６０％の配列相同性を保持していてもよい。
【００５８】
当業者であれば、細胞が貫入不能なポリマー及び細胞が貫入可能なポリマーは同一のまたは実質的に同一のポリマーを含んでいてもよいが、架橋後の濃度または密度の違いによって、培養における細胞または細胞の部分の伸長を助長する一部の部分を有するヒドロゲルマトリクスが生じることを理解することができよう。
【００５９】
いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは様々であってよい。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約８００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１５０μｍ〜約８００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約２００μｍ〜約８００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約２５０μｍ〜約８００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約３００μｍ〜約８００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約３５０μｍ〜約８００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約４００μｍ〜約８００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約４５０μｍ〜約８００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約５００μｍ〜約８００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約５５０μｍ〜約８００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約６００μｍ〜約８００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約６５０μｍ〜約８００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約７００μｍ〜約８００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約７５０μｍ〜約８００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約７５０μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約７００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約６５０μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約６００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約５５０μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約５００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約４５０μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約４００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約３５０μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約３００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約２５０μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約２００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約１５０μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約３００μｍ〜約６００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約４００μｍ〜約５００μｍである。
【００６０】
いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは様々であってよい。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１０μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１５０μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約２００μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約２５０μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約３００μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約３５０μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約４００μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約４５０μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約５００μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約５５０μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約６００μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約６５０μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約７００μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約７５０μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約８００μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約８５０μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約９００μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約９５０μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１０００μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１５００μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約２０００μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約２５００μｍ〜約３０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約２５００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００��ｍ〜約２０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約１５００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約１０００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約９５０μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約９００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約８５０μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約８００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約７５０μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約７００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約６５０μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約６００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約５５０μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約５００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約４５０μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約４００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約３５０μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約３００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約２５０μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約２００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約１００μｍ〜約１５０μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約３００μｍ〜約６００μｍである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスの厚さは約４００μｍ〜約５００μｍである。
【００６１】
いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスは１種以上の合成ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスは、以下の合成ポリマー、すなわち、ポリエチレングリコール（ポリエチレンオキシド）、ポリビニルアルコール、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリアクリルアミド、シリコーン、及びそれらの任意の誘導体または組み合わせの１種以上を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスは１種以上の合成及び／または天然の多糖を含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスは以下の多糖、すなわち、ヒアルロン酸、硫酸ヘパリン、ヘパリン、デキストラン、アガロース、キトサン、アルギン酸塩、及びそれらの任意の誘導体または組み合わせの１種以上を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスは１種以上のタンパク質及び／または糖タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスは以下のタンパク質、すなわち、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、チチン、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリン、ケラチン、絹フィブロイン、及びそれらの任意の誘導体または組み合わせの１種以上を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスは１種以上の合成及び／または天然のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスは以下のポリペプチド、すなわち、ポリリシン、ポリグルタミン酸塩、またはポリグリシンの１種以上を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、Ｋｈｏｓｈａｋｈｌａｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｐｈｏｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｕｒａｍａｔｒｉｘ  ａｓ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｉｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ”  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，  Ｊａｎｕａｒｙ  ２１，  ２０１５に公表されているヒドロゲルから選択されるポリマーの１種または組み合わせを含む。
【００６６】
細胞成長に好適な任意のヒドロゲルは、本明細書に開示されるポリマーのいずれか１種または組み合わせを、２つの別個の密度の架橋ポリマー、すなわち、１種の細胞が貫入可能な架橋ポリマー及び１種の細胞が貫入不能な架橋ポリマーを生じさせるのに十分な時間、十分な濃度及び十分な条件下におくことによって形成することができる。上記ポリマーは、合成ポリマー、多糖、天然タンパク質、もしくは糖タンパク質、及び／または以下から選択されるものなどのポリペプチドであってよい。
合成ポリマー
ポリエチレングリコール（ポリエチレンオキシド）、ポリビニルアルコール、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリアクリルアミド、シリコーン、それらの組み合わせ、及びそれらの誘導体など。
多糖（合成または天然供給源由来のいずれでもよい）
ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、デキストラン、アガロース、キトサン、アルギン酸塩、それらの組み合わせ、及びそれらの誘導体など。
天然のタンパク質または糖タンパク質
コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、チチン、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリン、ケラチン、絹フィブロイン、それらの組み合わせ、及びそれらの誘導体など。
ポリペプチド（合成または天然供給源）
ポリリシン、及び既に列挙している全てのＲＡＤ及びＥＡＫペプチドなど。
【００６７】
本明細書では、用語「３次元（ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ」または「３次元（３Ｄ）」とは、例えば、互いに隣接して増殖する細胞の少なくとも３つの層が存在するような細胞の培養物の厚さを意味する。一部の実施形態において、用語３次元とは、本開示のシステムの文脈において、神経突起及び／もしくは軸索の厚さまたは高さが約１０〜約１０００ミクロンであることを意味する。いくつかの実施形態において、用語３次元とは、本開示のシステムの文脈において、神経突起及び／もしくは軸索の厚さまたは高さが約１０〜約１００ミクロンであることを意味する。
【００６８】
用語「単離されたニューロン」とは、神経細胞であって、生物もしくは培養物であり、該神経細胞が当初該生物もしくは培養物から成長した上記生物もしくは培養物から取り出されたまたは切り離された上記神経細胞をいう。いくつかの実施形態において、単離されたニューロンは懸濁液中のニューロンである。いくつかの実施形態において、単離されたニューロンは、組織試料または非神経細胞を伴う懸濁液を含む細胞のより大きな混合物の成分である。いくつかの実施形態において、神経細胞は、組織外植片の場合のように、該神経細胞が由来する動物から取り出された段階で単離された状態になる。いくつかの実施形態において、単離されたニューロンは動物から切除されたＤＲＧ中のニューロンである。いくつかの実施形態において、上記単離されたニューロンは、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、ウマ細胞、ウシ細胞、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ブタ細胞、または他の非ヒト哺乳動物から選択される１つの種もしくは種の組み合わせに由来する少なくとも１個または複数個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記単離されたニューロンはヒト細胞である。いくつかの実施形態において、上記単離されたニューロンは、ヒト神経細胞と同様のまたは実質的に同様の分化した表現型を有するように前処理された幹細胞である。いくつかの実施形態において、上記単離されたニューロンはヒト細胞である。いくつかの実施形態において、上記単離されたニューロンは、非ヒト神経細胞と同様のまたは実質的に同様の分化した表現型を有するように前処理された幹細胞である。いくつかの実施形態において、上記幹細胞は、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、哺乳動物の臍帯から単離された幹細胞、または内胚葉幹細胞から選択される。
【００６９】
用語「神経変性疾患」は、本明細書全体を通して、中枢神経系及び／または末梢神経系への損傷によって生じる疾患を記述するために用いられる。開示されるモデル、システム、または装置を用いて研究することができる疾患の例となり得る例示的な神経変性疾患としては、例えば、パーキンソン病；ハンチントン病；筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）；アルツハイマー病；リソソーム蓄積症（例えば、Ｆｏｌｋｅｒｔｈ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏ．，  ５８，  ９，  Ｓｅｐ．，  １９９９によって記載されている「白質疾患」またはグリア／脱髄疾患）；テイ・サックス病（β−ヘキソサミニダーゼ欠損症）；他の遺伝性疾患；多発性硬化症；虚血、事故、環境的な傷害などに起因する脳損傷または外傷；脊髄損傷；運動失調症、及びアルコール依存症が挙げられる。更に、神経変性疾患の治療の研究のために、本発明を用いて、培養中の神経細胞に対する薬剤の効力、毒性、または神経変性作用を試験してもよい。用語神経変性疾患には、とりわけ、例えば自閉症及び関連する神経学的疾患（統合失調症など）を始めとする神経発達障害も含まれる。
【００７０】
本明細書では、用語「神経細胞」とは、例えば、樹状突起、軸索、及び細胞体の少なくとも１種または組み合わせを含む細胞、あるいは、神経系組織から単離された任意の細胞または細胞群をいう。いくつかの実施形態において、神経細胞は軸索を含むかまたは軸索を形成することができる任意の細胞である。いくつかの実施形態において、上記神経細胞は、シュワン細胞、グリア細胞、神経膠細胞、皮質ニューロン、神経組織から単離されたもしくは神経組織に由来する胚細胞、またはニューロンの表現型もしくは神経細胞の表現型と実質的に類似する表現型を有する細胞へと分化した胚細胞、ニューロンの表現型へと分化した多能性幹細胞（ｉＰＳ）、あるいは神経組織に由来するかまたはニューロンの表現型へと分化した間葉系幹細胞である。いくつかの実施形態において、神経細胞は、後根神経節（ＤＲＧ）組織、網膜組織、脊髄組織、または成体、青年期、幼年期、または胎児の対象由来の脳組織由来のニューロンである。いくつかの実施形態において、神経細胞は、対象の神経組織から単離された任意の１種以上の細胞である。いくつかの実施形態において、上記神経細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、上記細胞はヒト細胞及び／またはラット細胞である。いくつかの実施形態において、上記細胞は非ヒト哺乳動物細胞であるか、または非ヒト哺乳動物から単離された細胞に由来する。上記神経細胞は、該細胞が由来する元の動物から単離または切り離された場合、複数の種から単離されたニューロンを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドはＤＲＧ組織を含まない。
【００７１】
いくつかの実施形態において、神経細胞は、以下、すなわち、中枢神経系ニューロン、末梢神経系ニューロン、交感神経ニューロン、副交感神経ニューロン、腸神経系ニューロン、脊髄運動ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロン、自律神経ニューロン、体性ニューロン、後根神経節、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、介在ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、及び三叉神経節の１種以上である。いくつかの実施形態において、グリア細胞は、以下、すなわち、星状細胞、乏突起膠細胞、シュワン細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、放射状グリア細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞、及び下垂体細胞の１種以上である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、以下、すなわち、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、白血球、リンパ球、単球、肥満細胞、好中球、ナチュラルキラー細胞、及び好塩基球の１種以上である。いくつかの実施形態において、幹細胞は、以下、すなわち、造血幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、人工多能性幹細胞、星状細胞由来人工多能性幹細胞、線維芽細胞由来人工多能性幹細胞、腎上皮由来人工多能性幹細胞、ケラチノサイト由来人工多能性幹細胞、末梢血由来人工多能性幹細胞、肝細胞由来人工多能性幹細胞、間葉由来人工多能性幹細胞、神経幹細胞由来人工多能性幹細胞、脂肪幹細胞由来人工多能性幹細胞、前脂肪細胞由来人工多能性幹細胞、軟骨細胞由来人工多能性幹細胞、及び骨格筋由来人工多能性幹細胞の１種以上である。いくつかの実施形態において、スフェロイドはまた、ケラチノサイトまたは内皮細胞などの他の細胞型を含んでいてもよい。
【００７２】
本明細書では、用語「神経細胞培養培地」または単に「培養培地」とは、神経細胞の成長、培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ）、培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ）、増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ）、または他の形態での操作を支援するのに適した任意の栄養物質であってもよい。いくつかの実施形態において、上記培地は、神経成長因子（ＮＧＦ）が補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を含む。いくつかの実施形態において、上記培地はウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む。いくつかの実施形態において、上記培地はＬ−グルタミンを含む。いくつかの実施形態において、上記培地はアスコルビン酸を約０．００１重量／容積％〜約０．０１重量／容積％の範囲の濃度で含む。いくつかの実施形態において、上記培地はアスコルビン酸を約０．００１重量／容積％〜約０．００８重量／容積％の範囲の濃度で含む。いくつかの実施形態において、上記培地はアスコルビン酸を約０．００１重量／容積％〜約０．００６重量／容積％の範囲の濃度で含む。いくつかの実施形態において、上記培地はアスコルビン酸を約０．００１重量／容積％〜約０．００４重量／容積％の範囲の濃度で含む。いくつかの実施形態において、上記培地はアスコルビン酸を約０．００２重量／容積％〜約０．０１重量／容積％の範囲の濃度で含む。いくつかの実施形態において、上記培地はアスコルビン酸を約０．００３重量／容積％〜約０．０１重量／容積％の範囲の濃度で含む。いくつかの実施形態において、上記培地はアスコルビン酸を約０．００４重量／容積％〜約０．０１重量／容積％の範囲の濃度で含む。いくつかの実施形態において、上記培地はアスコルビン酸を約０．００６重量／容積％〜約０．０１重量／容積％の範囲の濃度で含む。いくつかの実施形態において、上記培地はアスコルビン酸を約０．００８重量／容積％〜約０．０１重量／容積％の範囲の濃度で含む。いくつかの実施形態において、上記培地はアスコルビン酸を約０．００２重量／容積％〜約０．００６重量／容積％の範囲の濃度で含む。いくつかの実施形態において、上記培地はアスコルビン酸を、約０．００３重量／容積％〜約０．００５重量／容積％の範囲の濃度で含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ヒドロゲル、ヒドロゲルマトリクス、及び／または神経細胞培養培地は、以下の成分、すなわち、アルテミン、アスコルビン酸、ＡＴＰ、β−エンドルフィン、ＢＤＮＦ、ウシ血清、ウシ血清アルブミン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、カプサイシン、カラギーナン、ＣＣＬ２、毛様体神経栄養因子、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、Ｄ−セリン、ウシ胎児血清、フルオロクエン酸塩、ホルマリン、グリア細胞株由来神経栄養因子、グリア線維性酸性タンパク質、グルタミン酸塩、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インスリン、ラミニン、リポキシン、ｍａｃ−１−サポリン、メチオニンスルホキシミン、ミノサイクリン、ニューレグリン−１、ニューロプロテクチン、ニュールツリン、ＮＧＦ、一酸化窒素、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ペルセフィン、血小板溶解物、ＰＭＸ５３、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、プロペントフィリン、レゾルビン、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｂ、セレン、Ｐ物質、ＴＮＦ−α、Ｉ〜Ｖ型コラーゲン、及びザイモサンのいずれか１種以上を含む。
【００７４】
本明細書では、用語「光遺伝学」とは、光感受性イオンチャネルを発現するように遺伝子組み換えがなされた生体組織、一般的にはニューロンにおける、細胞を制御するための光の使用を含む生物学的技法をいう。光遺伝学は、神経科学において用いられる神経調節方法であって、光学と遺伝学の技法を組み合わせて用いて、生きている組織中の（自由に移動している動物内でさえも）個々のニューロンの活動を制御及び監視し、これらの遺伝子操作の効果をリアルタイムで正確に測定する上記方法である。光遺伝学で用いられる主要な試薬は光感受性タンパク質である。チャネルロドプシン、ハロロドプシン、アーケロドプシンなどの光遺伝学的アクチュエータを用いて空間的に正確なニューロンの制御を実現すると同時に、カルシウムに対する（エクオリン、カメレオン、ＧＣａＭＰ）、塩化物に対する（クロメレオン）、または膜電圧に対する（マーメイド）光遺伝学的センサーを活用して時間的に正確な記録を作成することができる。いくつかの実施形態において、光遺伝学的アクチュエータ及び／またはセンサーを用いて組み換えを行った神経細胞が、本明細書に記載の培養システムにおいて使用される。
【００７５】
用語「プラスチック」とは、炭化水素を含む生体適合性ポリマーをいう。いくつかの実施形態において、上記プラスチックは、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリブタジエン、ポリビニルブチラール（ＰＶＢ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリビニルメチルエーテル（ＰＶＭＥ）、ポリ乳酸−共−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（ｌ−乳酸）、ポリエステル、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリアニリン（ＰＡＮＩ）、ポリフルオレン、ポリピロール（ＰＰＹ）、ポリエチレンジオキシチオフェン（ＰＥＤＯＴ）、及び任意の２種以上の上述のポリマーの混合物からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記プラスチックは、３、４、５、６、７、８種またはそれを超えるポリマーの混合物である。
【００７６】
本明細書では、用語「播種」とは、例えば、ある量の細胞を新たな培養容器に移すことをいう。上記の量は規定されてもよく、該量としては細胞の容積または数ベースの量を用いてもよい。上記細胞は懸濁液の一部であってもよい。
【００７７】
本明細書では、用語「配列同一性」とは、２種以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、指定された領域にわたって同一である残基の指定されたパーセンテージをいう。この用語は別の配列に対する「配列相同性」または別の配列と「相同」である配列の類義語である。上記パーセンテージは、当該の２つの配列を最適に整列させることと、指定された領域にわたって上記２つの配列を比較することと、両方の配列で同一の残基が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を得ることと、上記一致した位置の数を指定された領域中の位置の総数で除すことと、その結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、上記パーセンテージを算出することができる。２つの配列の長さが異なる、または配列比較によって１つ以上の付着末端が生じ、指定された比較領域に単一の配列のみが含まれる場合、単一の配列の残基は計算の分母には含めるが分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡとを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）とは同等と見なしてもよい。同一性は手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを用いることによって実施することができる。
【００７８】
本明細書では、用語「固体基材」とは、細胞毒素を含まないかまたは実質的に含まない固体支持体である任意の物質をいう。いくつかの実施形態において、上記固体基材は、シリカ、プラスチック、及び金属の１種または組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、上記固体基材は、細胞培養培地の存在下で、タンパク質、栄養素、及び気体が該固体基材を通して拡散するまたは非能動的に輸送されるのに十分な大きさ及び形状の細孔を備える。いくつかの実施形態において、上記細孔の大きさは、径で約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ミクロン以下である。当業者であれば、上記細胞培養培地の内容物及び特定の微小環境における上記固体基材上で成長する細胞の曝露に基づいて、孔径の大きさがどれほど必要かを決定することができる。例えば、当業者であれば、本システムまたはデバイス中の任意の培養される細胞が、固体基材が様々な径の細孔を備える条件下で生存可能であるかどうかが判る。いくつかの実施形態において、上記固体基材は、外表面及び内表面の形状を画定する所定の形状を有する基部を備える。いくつかの実施形態において、上記基部は、シリカ、プラスチック、セラミック、または金属の１種または組み合わせを備え、上記基部は、第１の細胞が貫入不能なポリマー及び第１の細胞が貫入可能なポリマーが上記基部の内表面を被覆し、円筒形または実質的に円筒形の内部チャンバを画定するような、円筒形または実質的に円筒形に類似の形状であり、開口部は上記円筒形の一端に位置する。いくつかの実施形態において、上記基部は、細胞培養培地の存在下で上記固体基材を通してタンパク質、栄養素、及び酸素が拡散するのに十分な大きさ及び形状の１つ以上の細孔を備える。いくつかの実施形態において、上記固体基材は、細孔径が１ミクロン以下のプラスチック基部を備え、少なくとも１つのヒドロゲルマトリクス層を備え、上記ヒドロゲルマトリクスは、少なくとも第１の細胞が貫入不能なポリマー及び少なくとも第１の細胞が貫入可能なポリマーを含み、上記基部は、所定の形状であって、その周囲に第１の細胞が貫入不能なポリマー及び少なくとも第１の細胞が貫入可能なポリマーが物理的に接着するまたは化学的に結合する上記形状を備え、上記固体基材は、少なくとも部分的に上記固体基材の内表面の形状によって画定され、任意選択で上記固体基材の一端に配置された開口部によって上記固体基材の外側の点からアクセス可能な少なくとも１つの区画を備える。いくつかの実施形態において、上記固体基材が少なくとも１つの内表面によって画定される中空の内部を備える場合、上記細胞が、成長する前に上記固体基材の内表面の少なくとも一部に接着することができるように、上記開口部またはその近傍に細胞を配置することによって、懸濁液または組織外植片中の上記細胞を播種してもよい。上記固体基材の上記少なくとも１つの区画または中空の内部によって、上記細胞を上記内表面固体基材の形状によって画成される特定の３次元形状へ封じ込めることができ、上記開口部から外に出る上記細胞の方向性をもった成長が助長される。神経細胞の場合、上記少なくとも１つの区画の封じ込めの程度及び形状によって、上記少なくとも１つの区画内及び上記開口部にまたはそれに近接して配置された細胞体からの軸索の伸長が助長される。いくつかの実施形態において、上記内部区画の形状が円筒形または部分的に円筒形となるように、上記固体基材は、円筒形、管状、または実質的に管状もしくは円筒形である。いくつかの実施形態において、上記固体基材は、１つ以上の分岐した管状の内部区画を備える。いくつかの実施形態において、上記固体の上記中空の内部の二股に分岐したまたは多重に二股分岐した形状は、軸索が多分岐パターンで伸長するように構成されるか、または上記形状により軸索が多分岐パターンで伸長することが可能になる。もし電極が軸索の遠位端にまたはそれに近接して、及び神経細胞の細胞体にまたはそれに近接して配置されている場合には、細胞内活動電位などの電気生理学的メトリクスを本装置またはシステム内で測定することができる。いくつかの実施形態において、上記電極は、電圧計、電流計、及び／または装置であって、上記電極を上記電圧計、電流計、及び／または装置に物理的に接続するある長さの電線上に電流を発生させることができる上記装置に、動作可能に連結されている。
【００７９】
本開示は、細胞が貫入可能なポリマーと細胞が貫入不能なポリマーとの両方の混合物を含む、適宜に充填されたヒドロゲルに関する。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルは、約１０％〜約２０％のＰＥＧを含み、全体の弾性率は約０．１〜約２００Ｐａである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルの弾性率は約０．５Ｐａである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルの弾性率は約１０Ｐａである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルの弾性率は約５０Ｐａである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルの弾性率は約７５Ｐａである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルの弾性率は約９０Ｐａである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルの弾性率は約１００Ｐａである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルの弾性率は約１２５Ｐａである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルの弾性率は約１５０Ｐａである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルの弾性率は約１７５Ｐａである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルの弾性率は約２００Ｐａである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルの弾性率は約２３０Ｐａ以下である。
【００８０】
スフェロイド
本明細書では、「スフェロイド」または「細胞スフェロイド」とは、例えば、概括的には、その主軸（長軸または短軸）の１つを中心に回転する楕円もしくは円または凸円弧もしくは凹円弧に対応する３次元形状の、任意の細胞の集団であってよく、３次元の卵形、偏球形及び長球形、球形、レンズ形、または実質的に同等の形状が挙げられる。
【００８１】
本発明のスフェロイドの幅、長さ、厚さ、及び／または径は任意且つ適宜であってよい。いくつかの実施形態において、スフェロイドの幅、長さ、厚さ、及び／または径は、約１０μｍ〜約５０，０００μｍの範囲、または約１０μｍ〜約９００μｍ、約１００μｍ〜約７００μｍ、約３００μｍ〜約６００μｍ、約４００μｍ〜約５００μｍ、約５００μｍ〜約１，０００μｍ、約６００μｍ〜約１，０００μｍ、約７００μｍ〜約１，０００μｍ、約８００μｍ〜約１，０００μｍ、約９００μｍ〜約１，０００μｍ、約７５０μｍ〜約１，５００μｍ、約１，０００μｍ〜約５，０００μｍ、約１，０００μｍ〜約１０，０００μｍ、約２，０００〜約５０，０００μｍ、約２５，０００μｍ〜約４０，０００μｍ、または約３，０００μｍ〜約１５，０００μｍなどの、但しこれらに限定されない、上記範囲中の任意の範囲であってよい。いくつかの実施形態において、スフェロイドの幅、長さ、厚さ、及び／または径は、約５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、１，０００μｍ、５，０００μｍ、１０，０００μｍ、２０，０００μｍ、３０，０００μｍ、４０，０００μｍ、または５０，０００μｍであってよい。いくつかの実施形態において、複数のスフェロイドが生成し、上記複数のスフェロイドのそれぞれの幅、長さ、厚さ、及び／または径は、約２０％未満、例えば、約１５％、１０％、または５％未満変化してもよい。いくつかの実施形態において、上記複数のスフェロイドのそれぞれの幅、長さ、厚さ、及び／または径は、上記のいずれかの範囲の内であってよい。
【００８２】
スフェロイド中の細胞は特定の方向性を有していてもよい。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは内部コア及び外表面を備えていてもよい。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは中空であってもよい（すなわち、内部に細胞を含んでいなくてもよい）。いくつかの実施形態において、内部コアの細胞及び外表面の細胞は異なる種類の細胞である。いくつかの実施形態において、上記内部コアは、磁性ナノ粒子を含む。
【００８３】
上記スフェロイドの、例えば弾性率（パスカル、Ｐａ）で測定した剛性は様々であってよい。特定の実施形態において、上記スフェロイドの弾性率は、約１００Ｐａ〜約１０，０００Ｐａ、例えば、約１００Ｐａ〜約１２，０００Ｐａ、または約１００Ｐａ〜約，４８００Ｐａの範囲である。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの弾性率は、約１２００Ｐａであってよい。別な例として、上記スフェロイドの弾性率は、少なくとも約１０Ｐａ、少なくとも約１００Ｐａ、少なくとも約１５０Ｐａ、少なくとも約２００Ｐａ、または少なくとも約４５０Ｐａから変化してもよい。いくつかの実施形態において、本開示の組成物または装置は１つ以上のウェルを備え、それぞれのウェルは１種以上の異なるスフェロイド、第１の、第２の、第３の、第４の、もしくは第５のスフェロイド、またはより多くのスフェロイドの集団を含む／備える。一実施形態において、第１のスフェロイドは約１００Ｐａ〜約３００Ｐａの弾性率を含み、第２のスフェロイドは約４００Ｐａ〜約８００Ｐａの弾性率を含む。別の例において、第１のスフェロイドは約５０〜約２００Ｐａの弾性率を特徴とし、第２のスフェロイドは約２５０Ｐａ〜約５００Ｐａの弾性率を特徴とする。
【００８４】
いくつかの実施形態において、スフェロイドは、１種以上の神経細胞型及び／または１種以上の幹細胞型を含む、１種、２種、３種、またはそれを超える異なる細胞型から構成されてもよい。いくつかの実施形態において、上記内部コアの細胞は、１種、２種、３種、またはそれを超える異なる細胞型から構成されてもよい。いくつかの実施形態において、上記外表面の細胞は、１種、２種、３種、またはそれを超える異なる細胞型から構成されてもよい。
【００８５】
いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは少なくとも２種類の細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは神経細胞と非神経細胞とを含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、約５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１の神経細胞対星状細胞の比で、神経細胞と星状細胞とを含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、約５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１の比で神経細胞と非神経細胞とを含む。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは、約１：５：１：４、１：３、または１：２の比で神経細胞と非神経細胞とを含む。本明細書に開示の細胞型の任意の組み合わせを、本開示のスフェロイド内において、上記に特定された比率で用いてもよい。
【００８６】
特定の実施形態に応じて、細胞の群を、任意且つ適宜の形状、幾何学、及び／またはパターンに従って配置してもよい。いくつかの実施形態において、上記細胞は、中実もしくは中空のコアを有するビーズまたはナノ粒子の表面積全体にわたる球面に配置される。例えば、独立した細胞の群をスフェロイドとして沈着させ、上記スフェロイドを３次元グリッドまたは他の任意且つ適宜の３次元パターン内に配置してもよい。上記独立したスフェロイドは全てほぼ同一の数の細胞を含み、ほぼ同一の大きさであってもよく、あるいは、異なるスフェロイドは異なる数の細胞及び異なる大きさを有していてもよい。いくつかの実施形態において、複数のスフェロイドが、Ｌ字形もしくはＴ字形などの形状に、単一の点もしくは複数の点から放射状に、単一の線または平行な線状に連続するスフェロイド、管、円柱、円環体、階層的に分岐した血管網、高アスペクト比の物体、薄く閉じたシェル、オルガノイドなどの形状、または組織、血管、もしくはその他の生物学的構造の幾何学に対応することができるその他の複雑な形状に配置されていてもよい。
【００８７】
本開示の方法において、上記スフェロイドの任意且つ適宜の生理学的応答が、判定、評価、測定、及び／または識別されてもよい。いくつかの実施形態において、本開示の方法において、上記スフェロイドの１種、２種、３種、４種、またはそれを超える種類の生理学的応答（複数可）が、判定、評価、測定、及び／または識別されてもよい。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの生理学的応答は、当該スフェロイドの形態学の変化であってもよい。本方法は、上記スフェロイドの形態学の変化を測定することを含んでいてもよく、該測定することは、該スフェロイドを化学的及び／または生物学的化合物などの薬剤に接触させる前に少なくとも１種の形態学パラメータを評価することと、該スフェロイドを上記薬剤に接触させた後に上記少なくとも１種の形態学パラメータを評価することと、該スフェロイドを上記薬剤に接触させる前後での上記少なくとも１種の形態学パラメータの間の差異を算出して、該スフェロイドの形態学の変化を得ることを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの上記生理学的応答は、薬剤との接触に応答した該スフェロイドの収縮または膨張であってもよい。上記スフェロイドの形態学は、偏心度及び／または断面積の定量化などの、但しこれらに限定されない、当業者に公知の任意の方法を用いて測定してもよい。
【００８８】
いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの上記生理学的応答は、当該スフェロイドの体積の変化であってもよい。本方法は、当該スフェロイドの体積の変化を測定することを含んでいてもよく、該測定することは、該スフェロイドを薬剤に接触させる前に第１の体積を評価することと、該スフェロイドを上記薬剤に接触させた後に第２の体積を評価することと、第１の体積と第２の体積の間の差異を算出して、該スフェロイドの体積の変化を得ることとを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの上記生理学的応答は、薬剤との接触に応答した該スフェロイドの収縮または膨張であってもよい。
【００８９】
上記薬剤は、例えば、有機化合物、小分子化合物（例えば、小分子有機化合物）、タンパク質、抗体、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）、遺伝子治療ビヒクル（例えば、ウイルスベクター）、及びそれらの任意の組み合わせなどの任意且つ適宜の化合物であってよい。本発明の方法においては、１種以上の（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、またはそれを超える種類の）薬剤を用いてもよい。例えば、本発明の方法は、本発明のスフェロイドを２種以上の異なる薬剤に接触させることを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、例えば、本発明のスフェロイドを遺伝子治療ビヒクル（例えば、ウイルスベクター）に接触させることによるなどして、スフェロイドの活性を間接的に調節してもよい。
【００９０】
本発明の方法は、細胞及び／またはスフェロイドを培養することを含んでいてもよい。培養は、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。いくつかの実施形態において、細胞及び／またはスフェロイドを、数時間、数日、数週間、または数ヶ月などの、但しこれらに限定されない任意の所望の期間培養してもよい。いくつかの実施形態において、細胞及び／またはスフェロイドを、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、もしくは７日間、あるいは約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、または１１週間以上培養してもよい。
【００９１】
本発明の方法に好適な細胞培養培地は当技術分野で公知であり、ＢＥＧＭ（商標）気管支上皮細胞増殖培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地高グルコース（ＤＭＥＭ−Ｈ）、ＭｃＣｏｙ  ５Ａ改変培地、ＲＰΜＩ、ハム培地、培地１９９、ｍＴｅＳＲなどが挙げられるが、これらに限定はされない。上記細胞培養培地には、ビタミン、ミネラル、塩、成長因子、炭水化物、タンパク質、血清、アミノ酸、接着因子、サイトカイン、成長因子、ホルモン、抗生物質、治療薬、緩衝剤などの、但しこれらに限定されない更なる成分が補充されていてもよい。上記細胞培養成分及び／または条件は、特定の細胞の特徴及び／もしくは特性を高める及び／または刺激するように選択し、ならびに／あるいは本発明の方法中に変更してもよい。播種法及び細胞培養法の例は、米国特許第５，２６６，４８０号、第５，７７０，４１７号、第６，５３７，５６７号、及び第６，９６２，８１４号、ならびにＯｂｅｒｐｅｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｂｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１４９−１５５  （１９９９）（これらは参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）に記載される。いくつかの実施形態において、上記細胞培養培地は、培養物における軸索のミエリン形成を促進するように段階的に変更される。ミエリン形成前培地及びミエリン形成培地は以下の成分を含む。
【表１−１】
2021505193.tif 000003
【００９２】
いくつかの実施形態において、上記固体基材、細胞培養装置、またはナノ粒子は、本明細書に開示される１種以上の細胞型を含むスフェロイドを備える／含む。本出願では、上記粒子のいずれも、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、もしくはそれを超える種類の細胞型のいずれか１種または組み合わせを含んでいてもよい。
【００９３】
用語「ナノ粒子」または「ナノシャトル」とは（それぞれの用語が同義で用いられる場合があることから）、少なくとも１つの領域を含む粒子である。約０．７〜約１．５ミクロンの範囲の磁性粒子が、例として、米国特許第３，９７０，５１８号、第４，０１８，８８６号、第４，２３０，６８５号、第４，２６７，２３４号、第４，４５２，７７３号、第４，５５４，０８８号、第４，６５９，６７８号、第６，６２３，９８２号、第６，６４５、７３１号、及び米国出願第２０１１０２５０１４６号（これらのそれぞれは、それらのそれぞれの全体が参照により援用される）を含む特許文献に記載される。上記ナノ粒子を用いて、本明細書に記載される任意の細胞またはスフェロイドを磁化する、すなわち、磁場に対して応答性とすることができる。本開示のいくつかの組成物及び／またはシステムは、磁気応答性元素に接触している細胞または磁気応答性元素を含むスフェロイドを含む／備える。いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び／またはシステムは、１種以上の磁性ナノ粒子と接触する細胞または１種以上の磁性ナノ粒子を含むスフェロイドを含む／備える。本明細書では、「磁気応答性元素」とは磁場に応答する任意の元素または分子であってよい。１種以上の上記ナノ粒子は磁気応答性元素を含有するか、または磁気応答性元素である必要がある。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、本明細書に記載されるいずれかの細胞に取り込まれるか、または吸着されてもよい。いくつかの実施形態において、磁場を用いて、細胞またはスフェロイドの位置、形状、パターンまたは動きを操作することができる。
【００９４】
いくつかの実施形態において、荷電ナノ粒子の大きさはナノスケールである。いくつかの実施形態において、本開示のナノ粒子の大きさは約５ｎｍ〜約１０００ｎｍ、またはその中の任意の範囲である。いくつかの実施形態において、上記ナノ粒子の径は、約５ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約２５ｎｍ〜約２２５ｎｍ、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約７５ｎｍ〜約１５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、上記ナノ粒子の径は、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約４０ｎｍ、約６０ｎｍ、約８０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１８０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約４００ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍ、または約１０００ｎｍである。いくつかの実施形態において、上記ナノ粒子の径は、約５ｎｍ以下、約１０ｎｍ以下、約２０ｎｍ以下、約４０ｎｍ以下、約６０ｎｍ以下、約８０ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、約１２０ｎｍ以下、約１４０ｎｍ以下、約１６０ｎｍ以下、１８０ｎｍ以下、約２００ｎｍ以下、約２５０ｎｍ以下、約３００ｎｍ以下、約４００ｎｍ以下、約５００ｎｍ以下、約６００ｎｍ以下、約７００ｎｍ以下、約８００ｎｍ以下、約９００ｎｍ以下、または約１０００ｎｍ以下である。いくつかの実施形態において、ナノ粒子の大きさは実質的に均一である。いくつかの実施形態において、ナノ粒子の大きさは様々である。いくつかの実施形態において、上記ナノ粒子の大きさは、使用されている細胞の種類に依存することとなる。
【００９５】
上記「磁気応答性元素」とは磁場に応答することとなる任意の元素または分子であってよい。いくつかの実施形態において、上記磁気応答性元素は、例えばサマリウムコバルト（ＳｍＣｏ）またはネオジム鉄ホウ素（ＮｄＦｅＢ）などの希土類磁石である。いくつかの実施形態において、上記磁気応答性元素は、例えばストロンチウムフェライトなどのセラミック磁石材料である。いくつかの実施形態において、上記磁気応答性元素は、例えば、鉄、コバルト、ニッケル、またはそれらの任意の合金もしくは酸化物などの磁性元素である。いくつかの実施形態において、上記磁気応答性元素は金を含む。いくつかの実施形態において、上記磁気応答性元素は磁場に反応する常磁性材料ではあるが、それ自体は磁石ではなく、これはこれにより材料の組み立てが容易になるからである。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、例えば、酸化鉄（ＩＩＩ）、α−Ｆｅ２Ｏ３、γ−Ｆｅ２Ｏ３、β−Ｆｅ２Ｏ３、ε−Ｆｅ２Ｏ３、酸化鉄（ＩＩ）、または酸化鉄（ＩＩ、ＩＩＩ）を含む１種以上の酸化鉄を含む。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は金、酸化鉄、及びポリリシンの１種以上を含む。
【００９７】
本開示のいくつかの態様において、磁性材料のナノ粒子コアと、上記磁性コアに対する生体高分子の非特異的結合を妨げるのに十分な量の、上記磁性コア上のベースコーティング材料とを含む、被覆された磁性粒子が提供される。これらの磁性粒子は、本明細書に開示のニューロンまたはその他の細胞型などの、非常に希少な細胞を効果的に分離するために必要な濃縮レベルを達成するために不可欠な、非特異的結合が極めて低いことならびにターゲットキャプチャが非常に効率的であることを特徴とする。これに替わる実施形態において、以下、すなわち、
ｉ．磁性材料のナノ粒子コアと、
ｉｉ．上記磁性コア上に不連続なコーティングを形成するベースコーティング材料であって、アクセス可能な場合に、上記ベースコート粒子の生体高分子に対する非特異的結合に寄与する少なくとも１箇所の不連続領域を与える上記ベースコーティング材料と、
ｉｉｉ．生体高分子による不連続領域へのアクセスを妨げる更なるコーティング材料と
を含む被覆された磁性粒子が提供される。直上に記載された粒子の磁性コア材料は、少なくとも１種の遷移金属酸化物を含んでいてもよく、好適なベースコーティング材料はタンパク質を含む。磁性粒子をコーティングするのに好適なタンパク質としては、ウシ血清アルブミン及びカゼインが挙げられるが、これらに限定はされない。上記更なるコーティング材料は、当初のコーティングタンパク質、または上記磁性コア上のベース材料に結合する特異的結合対の一方の構成因子であってよい。例示的な特異的結合対としては、ビオチン−ストレプトアビジン、抗原−抗体、受容体−ホルモン、受容体−リガンド、アゴニスト−アンタゴニスト、レクチン−炭水化物、プロテインＡ−抗体Ｆｃ、及びアビジン−ビオチンが挙げられる。一実施形態において、上記特異的結合対の上記構成因子は、二官能性連結化合物を介してベースコーティング材料に結合する。例示的な二官能性連結化合物としては、スクシンイミジル−プロピオノ−ジチオピリジン（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）が挙げられる。但し、その他の種々のかかるヘテロ二官能性リンカー化合物がＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌ．）より入手可能である。
【００９８】
本発明の被覆された磁性粒子の磁気質量は好ましくは７０〜９０％である。いくつかの実施形態において、上記磁性粒子の主たる部分の粒径は約９０〜約１５０ｎｍの範囲である。粒子は、該粒子がより単分散、例えば、約９０〜約１２０ｎｍまたは約１２０〜約１５０ｎｍの範囲になるように合成されてもよい。本発明の粒子は、一般的には生物学的に適合する媒体中に懸濁されている。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子を支持分子と組み合わせてもよい。「支持分子」は一般に、ナノ粒子と細胞を緊密な混合物中に共に保持する働きをするポリマーまたは他の長い分子である。上記支持分子は、正に荷電していても、負に荷電していても、電荷が混合していても、または中性であってもよく、複数の支持分子の組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態において、上記支持分子は、天然ポリマーまたは細胞由来のポリマーである。かかるポリマーの非限定的な例としては、ペプチド、多糖、及び核酸が挙げられる。他の実施形態において、上記支持分子は合成ポリマーである。いくつかの実施形態において、上記ポリマーはポリリシンである。いくつかの実施形態において、上記支持分子は、ポリリシン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ＢＳＡ、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、アニオン性、非硫酸化グリコサミノグリカン、ゼラチン、核酸、細胞外マトリクスタンパク質混合物、マトリゲル、抗体、ならびにそれらの混合物及び誘導体の１種以上であってよい。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、デキストラン被覆超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）から構成される材料であるＦｅｒｉｄｅｘを含む。
【０１００】
ナノ粒子は正または負のいずれかに荷電していてもよい。いくつかの実施形態において、上記負に荷電したナノ粒子は電荷安定化金属（例えば、銀、銅、白金、パラジウム、金）を含有する。いくつかの実施形態において、上記負に荷電したナノ粒子は金を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、上記正に荷電したナノ粒子は界面活性剤またはポリマーで安定化された、または被覆された合金及び／または酸化物（例えば、元素の鉄、鉄−コバルト、酸化ニッケル、酸化鉄）を含有する。いくつかの実施形態において、上記正に荷電したナノ粒子は酸化鉄を含有する。
【０１０２】
本開示はまた、
（ｉ）ヒドロゲルマトリクスと、
（ｉｉ）１個以上のスフェロイドと、
（ｉｉｉ）発電器と、
（ｉｖ）電圧計及び／または電流計と、
（ｖ）少なくとも第１の刺激用電極及び少なくとも第１の記録用電極と
を備えるシステムであって、
上記発電器と、電圧計及び／または電流計と、電極とが、電流が上記発電器から上記少なくとも１つの刺激用電極に供給され、電流が上記記録用電極で受け取られ、上記電圧計及び／または電流計に供給される回路を介して、互いに電気的に接続されており、
上記細胞培養容器全体にわたって電位が確立されるように、上記刺激用電極が、上記神経細胞の１個以上の細胞体にあるいはそれに近接して配置され、上記記録用電極が、上記細胞体に対して遠位の所定の距離に配置される上記システムにも関する。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、上記固体基材はヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスからなる。いくつかの実施形態において、上記固体基材はヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスからなり、ガラス、金属、またはセラミックを含まない。いくつかの実施形態において、上記固体基材は、軸索伸長に好適な特定の大きさの細胞を播種するための所定の形態または型に成形される。いくつかの実施形態において、上記固体基材または少なくとも１つのベース部分は、任意選択で管の位置が組織外植片または神経細胞が播種される位置からより遠位になるほど径が小さくなる、少なくとも１つの分岐した内部管状構造を有する形状である。例えば、本開示は、外表面の開口部または孔によって固体基材の外部の点にアクセス可能な、固体基材の半円筒形または円筒形部分の一端の焦点を企図する。上記開口部または穴を使用して、上記焦点に細胞（開示された細胞のいずれか１種または組み合わせのいずれか１種以上）を配置または播種することができる。培養中に上記細胞が数日間にわたって増殖する間に、該細胞は、神経細胞から軸索が伸長するのに十分な濃度の本明細書に開示される成分のいずれかを含む培地に、上記にとって十分な期間曝露される。上記細胞がミエリン形成される、または研究のためにミエリン形成が所望される場合、神経細胞または外植片を添加する前に、グリア細胞を同一の孔を通して導入し、播種してもよい。軸索が上記半円柱状または管状の構造中で伸長するにつれて、軸索突起の伸長は上記焦点からますます遠位で起こることが可能になる。上記焦点（または播種する点）からますます遠位になる点における固体基材中の開口部またはアクセスポイントを用いて、軸索の状態の軸索の伸長に対処するまたは観察することができる。この開示は、軸索の伸長を促進するために任意の形態を取る上記固体基材の構造を企図する。いくつかの実施形態において、上記軸索突起を収納する内部チャンバまたは区画は、半円形または実質的に円筒形の直径を備える。いくつかの実施形態において、上記固体基材は、上記焦点から遠位の点で２つ以上の内部区画に分岐している。いくつかの実施形態において、この分岐は、互いに流体連通する２個、３個、４個、５個、６個、７個、もしくは８個以上の管状または実質的に円筒形の内部チャンバが存在する鍵穴形状またはツリーに類似していてもよく、その結果、軸索の伸長は１個以上の細胞体を播種した点から生じ、内部チャンバに沿って長手方向に、いずれかの１つ以上の分枝まで延びる。いくつかの実施形態において、軸索の長さに沿った１ヶ所以上の位置にわたって記録をとることができるように、１つ以上の電極を１つ以上の開口部にまたはそれに近接して配置しもよい。これを用いて、軸索の長さに沿った１ヶ所以上の位置を調べることもできる。
【０１０４】
本開示は、人工中枢神経系の節と末梢神経系の節との間の記録を正確に測定するためのシステムに関し、このシステムは、少なくとも第１のスフェロイド及び第２のスフェロイドを備え、第１のスフェロイドは、後根神経節または中枢神経系由来の神経細胞または哺乳動物の胚細胞を含み、第２のスフェロイドは、末梢神経系由来の少なくとも１種の神経細胞または初代哺乳動物幹細胞を含む。本開示は、磁性物質を含む少なくとも第１または第２のスフェロイドを、ヒドロゲルによって画成されるウェルまたはチャネル中に配置し、磁石を上記ウェルまたはチャネルの位置にまたはそれに隣接して整列させることにより第１または第２のスフェロイドを移動させることによる、本明細書に開示のいずれかのシステムの製造に関する。本システムが中枢神経系の節または細胞の群と末梢神経系の節または細胞の群との間を走る軸索を模倣する場合、いくつかの実施形態において、第１のスフェロイドは第１のウェルもしくはチャネルまたはその近傍に配置され、第２のスフェロイドは第２のウェルもしくはチャネルであって、細胞培養培地に曝露後に上記２つのスフェロイド間での軸索の伸長が可能になるのに十分な距離の上記第２のウェルもしくはチャネルまたはその近傍に配置される。本開示は、中枢神経の節または細胞の群と末梢の節または細胞の群との間の記録の測定に関し、上記方法は、電極を第１のスフェロイドにまたはその近傍に配置することと、電極を第２のスフェロイドにまたはその近傍に配置することと、刺激することを含む。発電機を備える増幅器または発電機を用いて電流により上記システムを刺激することとを含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、電気生理学的応答を測定することを更に含む。
【０１０５】
本明細書では、用語「記録」とは、例えば、１種以上の神経細胞の応答を測定することをいう。かかる応答は、例えば、パッチクランプ電気生理学的記録またはフィールド電位記録などの電気生理学的応答であってもよい。
【０１０６】
本開示は、臨床的な神経伝導及びＮＦＤ試験を模倣するイン・ビトロ神経組織のミクロスケール器官型モデルの生理学的測定値を得るための方法及び装置を開示する。これらの方法及び装置を使用して得られる結果は臨床転帰をより良好に予測することができ、開発の後期段階での成功の可能性がより高い有望なリード化合物を選択するためのより費用効果の高いアプローチが可能になる。本開示は、独自に高密度で高度に平行な神経線維路の伸長が可能になる３次元マイクロエンジニアリングシステムの製造及び利用を含む。上記神経線維路の限局された性質に起因して、このイン・ビトロモデルはＣＡＰと細胞内パッチクランプ記録の両方を測定することができる。更に、その後の共焦点及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析により、ＮＦＤを含む定量的な構造分析が可能になる。まとめると、本イン・ビトロモデルシステムは、組織形態計測及び集団電気生理学を評価する、臨床組織病理学及び神経伝導検査に類似する新規な機能を有する。
【０１０７】
本開示はまた、本明細書に記載のイン・ビトロモデルを使用して生じた軸索のミエリン形成の測定方法も提供する。ヒト求心性末梢神経の構造と同様に、これらのイン・ビトロ構築物における後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンは、長く、平行な、束状化された軸索を末梢に突出させる。天然の組織においては、種々の径及びミエリン形成の程度の軸索が、感覚情報を様々な速度で中枢神経系に伝導して戻す。シュワン細胞は、軸索をミエリン形成し、より迅速に伝導させるために絶縁することによって感覚リレーを支援する。同様に、このイン・ビトロ構築物によって誘発される３次元伸長は、最大で３ｍｍの距離にまたがる密で平行な方向性の種々の径の軸索を含む。共焦点及びＴＥＭ画像化において、シュワン細胞の存在及び鞘形成が観測された。
【０１０８】
ニューロンの形態学は表現型の成熟度の有用な指標ではあるが、健全なニューロンであることのより明確な表示は、ニューロンの活動電位を伝導する能力である。細胞死が現れる前に多くの病理学的変化が起こる場合があることから、細胞死単独ではニューロンの健全性の完全な尺度にはならない。活動電位発生の電気生理学的検討により、観測された構造が予測された機能を支援するかどうかを判定することができ、臨床的に関連する評価項目を測定することができれば、より予知的な結果を得られる。同様に、ＣＡＰの測定はミエリンの全般的な健全性を示し、様々な薬剤または対象となる化合物の毒性及び神経保護機序を更に洞察する一方、画像化から集められた情報はミエリン形成の程度に関する定量的なメトリクスを判定することができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の薬剤は小さな化合物を含む。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の薬剤は少なくとも１種の環境または産業汚染物質を含む。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の薬剤は、化学療法剤、鎮痛剤、心血管調節剤、コレステロール、神経保護剤、神経調節剤、免疫調節剤、抗炎症剤、及び抗菌剤から選択される小さい化学化合物の１種または組み合わせを含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の薬剤は、アクチノマイシン、アリトレチノイン、全トランス型レチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カペシタビン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イリニテカン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ロミデプシン、タフルポシド、テモゾロミド（経口ダカルバジン）、テニポシド、チオグアニン（Ｔｉｏｇｕａｎｉｎｅ）（以前のチオグアニン（Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ））、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビスモデギブ、及びボリノスタットから選択される化学療法剤の１種または組み合わせを含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の薬剤は、パラセトアモール、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ＣＯＸ−２阻害剤、オピオイド、フルピルチン、三環系抗うつ薬、カルバマセピン、ガバペンチン、及びプレガバリンから選択される鎮痛薬の１つまたは組み合わせを含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の薬剤は、ネピカスタット、コレステロール、ナイアシン、スクテラリア、プレニルアミン、デヒドロエピアンドロステロン、モナテピル、エスケタミン、ニグルジピン、アセナピン、アトモキセチン、フルナリジン、ミルナシプラン、メキシレチン、アンフェタミン、チオペンタールナトリウム、フラボノイド、ブレチリウム、オキサゼパム、及びホノキオールから選択される心血管調節剤の１種または組み合わせを含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の薬剤は、トリプタミン、ガラニン受容体２、フェニルアラニン、フェネチルアミン、Ｎ−メチルフェネチルアミン、アデノシン、キョートルフィン（ｋｙｏｔｏｒｐｈｉｎ）、物質Ｐ、３−メトキシチラミン、カテコールアミン、ドーパミン、ＧＡＢＡ、カルシウム、アセチルコリン、エピネフリン、ノルエピネフリン、及びセロトニンから選択される神経保護剤及び／または神経調節剤の１種または組み合わせを含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の薬剤は、クレノリキシマブ（ｃｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂ）、エノチクマブ、リゲリズマブ、シムツズマブ、バテリズマブ、パルサツズマブ、イマガツマブ、トレガリズマブ（ｔｒｅｇａｌｉｚｕｍａｂ）、パテクリズマブ、ナムルマブ、ペラキズマブ、ファラリモマブ、パトリツマブ、アチヌマブ、ウブリツキシマブ、フツシキマブ（ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、及びデュリゴツマブから選択される免疫調節剤の１種または組み合わせを含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の薬剤は、イブプロフェン、アスピリン、ケトプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、エトドラク、フェノプロフェン、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、ケトロラク、ピロキシカム、インドメタシン、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、オキサプロジン、ケトプロフェン、ファモチジン、メクロフェナマート、トルメチン、サルサラートから選択される抗炎症剤の１種または組み合わせを含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の薬剤は、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、熱、放射線、及びオゾンから選択される抗菌剤の１種または組み合わせを含む。
【０１１７】
本開示は更に、３次元培養物プラットフォームにおける生体模倣神経組織の細胞内及び細胞外の両方の記録の測定方法を開示する。これまでは、電気生理学的実験は解離表面播種培養または器官型切片標本のいずれかで行われ、それぞれの方法には固有の制限があった。解離細胞培養物における検討は、器官型標本であれば存在する組織化された多細胞神経突起構造がないため、通常は単一細胞の記録に限定される。器官型標本は完全な神経回路を有し、細胞内及び細胞外の両方の検討が可能である。ただし、急性脳切片では、個々の因子を制御する手段がない、複雑で同時多発的な変数が示され、したがって本質的に処理速度が制限される可能性がある。
【０１１８】
イン・ビトロ３次元培養物における細胞内での記録はこれまでに実証されている。但し、神経細胞の成長は、空間的に細胞外の集団の検討を支援するだけの解剖学的に妥当性のある構造には限定されていなかった。集団レベルの電気生理学的挙動の試験が可能になるためには、より生体模倣型の３次元神経培養物が求められる。本開示は、全細胞パッチクランプ技法及び３次元幾何学における限定された神経突起伸長に由来する細胞外フィールド記録における同期的な集団レベルの事象を支持する。本開示以前には、臨床的な神経伝導試験に直接的に類似したこれらの評価項目の測定は、純粋に細胞によるイン・ビトロでの研究ではこれまで実証されていなかった。
【０１１９】
本明細書に開示の方法及び装置を使用し、フィールド記録を用いて、リクルートされた全ての繊維における信号伝導によって生じる電位の複合的な細胞外の変化を測定する。電気刺激によって誘発される集団応答がＣＡＰである。電気的に誘発された集団のスパイクは、本質的に段階的であり、遅い繊維と速い繊維における活動電位の複合効果を含む。スパイクは、ＣＡＰの特徴である迅速な立ち上がり及び短い持続時間の単一で集中的な事象またはシナプス入力が存在しない場合には迅速な信号伝導を伴う、活動電位のみで構成される応答である。本開示によって開示される３次元神経構築物はまた、神経突起路またはチャネルに沿ったより遠い距離からの刺激を受けるＣＡＰも支持し、これは求心性末梢神経のように遠隔刺激からの信号を迅速に搬送する神経培養物の能力を実証している。本開示の３次元神経培養物は伝導特性を測定するために有用な近位及び遠位刺激技法を支持する。
【０１２０】
本開示は、神経線維路において一般的的であるように、多数の線維型のリクルートを誘発する１種以上の成長因子と共に使用してもよい。特に、神経成長因子（ＮＧＦ）は、本明細書に示すデータで実証されるように、多くの場合痛みの信号伝達に関連する小径線維を優先的にリクルートする。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及び神経栄養因子３（ＮＴ−３）は、より大きな径の固有受容性線維の伸長を優先的に支援することが明らかになっている。生物活性分子及び薬理作用物質などの成長に影響を与える因子に電気生理学的検討を組み入れて、機序の検討のための条件を体系的に操作できるようにしてもよい。
【０１２１】
本開示を用いて生み出された３次元神経培養物は、既知の髄鞘形成不全を起こす物質、神経障害を誘発する培養条件、及び毒性の神経障害誘発性化合物の本神経培養物に対する影響を調べることにより、ミエリン障害性疾患及び末梢神経障害の根底にある機序を検討するためのプラットフォームとして用いることができる。本開示によって、毒性条件下及び治療条件下におけるミエリンならびに神経線維の完全性の機能的尺度として伝導速度を用いることが可能になり、これにより薬物の安全性及び有効性に関する研究が促進される。本明細書に開示の技法を用いて生み出される神経培養物に遺伝子変異及び薬物を組み込むことによって、制御された形態で疾患の現象を再現することが可能になり、このことは神経変性のより良い理解及び可能性のある治療法につながる可能性がある。
【０１２２】
本開示は、天然の神経組織の解剖学的構造を模倣するように設計された、マイクロエンジニアリングによって構成された神経細胞及び神経網の生成、維持、及び生理学的調査を含む装置、方法、及びシステムを提供する。いくつかの実施形態において、本装置及びシステムは、固体基材を備える細胞培養容器中で１種以上の神経細胞と接触している、１種以上の培養もしくは単離されたシュワン細胞及び／または１種以上の培養もしくは単離された乏突起膠細胞を備え、上記基材は、少なくとも１つの外表面と、少なくとも１つの内表面と、少なくとも１つの内部チャンバとを備え、上記内部チャンバの形状は、少なくとも部分的には、上記少なくとも１つの内表面によって規定され、上記外表面の少なくとも１つの開口部を介して上記固体基材の外部の点からアクセス可能であり、上記１種以上の神経細胞の細胞体は上記内部チャンバの一端に配置され、軸索は、軸索の先端の位置が上記細胞体から遠位に伸長するように、上記内部チャンバの少なくとも１つの長さに沿って該内部チャンバ内を伸長することができる。いくつかの実施形態において、上記固体基材の上記内表面は円筒形または実質的に円筒形であり、その結果、上記神経細胞の上記細胞体は、上記円筒形または実質的に円筒形の内表面の一端の開口部に近接して配置され、上記神経細胞の軸索は、上記細胞体の端の点から上記細胞体から遠位の点まで上記内表面の長さに沿って延在するある長さの細胞物質を含む。いくつかの実施形態において、上記固体基材の上記内表面は円筒形または実質的に円筒形であり、その結果、上記神経細胞の上記細胞体は、上記円筒形または実質的に円筒形の内表面の一端の開口部に近接して配置され、上記神経細胞の軸索は、上記細胞体の端の点から上記細胞体から遠位の点まで上記内表面の長さに沿って延在するある長さの細胞物質を含む。いくつかの実施形態において、上記固体基材の上記内表面は円筒形または実質的に円筒形であり、その結果、上記神経細胞の上記細胞体は、上記円筒形または実質的に円筒形の内表面の一端の開口部に近接して配置され、上記神経細胞の軸索は、上記細胞体の端の点から上記細胞体から遠位の点まで上記内表面の長さに沿って延在するある長さの細胞物質を含み、上記細胞培養容器に複数種の神経細胞が入っている場合、複数の軸索が、細胞体から上記内表面の長さに沿って遠位に伸長することができる軸索の束を画成するように、上記複数の軸索が上記複数の細胞体（ｓｏｍａｔａ）（または細胞体（ｓｏｍａ）から延在する。いくつかの実施形態において、上記神経細胞は上記貫入可能なポリマー上及び該内で伸長する。いくつかの実施形態において、１種以上の神経細胞の長さの全体にわたって電位が確立されるように、１つ以上の電極が、少なくとも１つの軸索の先端にまたはそれに近接して配置され、１つ以上の電極が、上記細胞体にまたはそれに近接して配置される。
【０１２３】
本開示の別の目的は、化学的及び生物学的薬剤の薬理学的及び／または毒物学的特性のスクリーニングのための、神経学的機能の中〜高速処理アッセイを提供することである。いくつかの実施形態において、上記薬剤は、本明細書に開示される任意の種類の細胞などの細胞、または臨床上の疾患を治療するために使用される抗体などの抗体である。いくつかの実施形態において、上記薬剤は、毒性、効果、または神経調節を、提案されている哺乳動物の治療薬である新規の薬剤と既存のヒトの疾患からの治療薬の間で比較することができるような、ヒトの疾患を治療するために使用される任意の薬物または薬剤である。いくつかの実施形態において、ヒトの疾患の治療のための新規な薬剤は神経変性疾患の治療薬であり、神経変性疾患の既存の治療薬と比較される。非限定的な例としての多発性硬化症の場合、新規な薬剤（改変された細胞、抗体、または小さな化合物）の効果を、Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｒｅｂｉｆ、他のインターフェロン治療薬、Ｔｙｓａｂｒｉ、フマル酸ジメチル、フィンゴリモド、テリフルノミド、ミトキサントロン、プレドニゾン、チザニジン、バクロフェンなどの多発性硬化症の既存の治療薬    発性硬化症の既存の治療の同じ効果と比較及び対比される。
【０１２４】
本開示の別の目的は、電気生理学的刺激及び神経細胞集団の記録と併せて、２次元及び３次元のマイクロエンジニアリングによる神経束などの独自の技術のアセンブリを使用することである。
【０１２５】
本開示の別の目的は、複合活動電位（ＣＡＰ）を臨床的に類似したメトリクスとして使用し、現在の方法で得られる結果よりもヒトの生理学により敏感で且つ予知的な結果を得て、神経生理学をイン・ビトロで評価する新規な手法を提供することである。
【０１２６】
本開示の別の目的は、天然の解剖学的及び生理学的特徴を模倣し、高速処理の電気生理学的刺激及び記録法を使用した評価に対して敏感な、マイクロエンジニアリングによる神経組織を提供することである。
【０１２７】
本開示の別の目的は、ミエリン障害性疾患及び末梢神経障害の根底にある機序の複製、操作、改変、及び評価方法を提供することである。
【０１２８】
本開示の別の目的は、化学的及び生物学的薬剤の薬理学的ならびに／または毒物学的活性のスクリーニングのために、ヒト神経細胞における神経調節の中〜高速処理アッセイを可能にすることである。
【０１２９】
本開示の別の目的は、光学的及び電気化学的刺激ならびにヒト神経細胞集団の記録と併せて、２次元及び３次元マイクロエンジニアリングによる神経束などの技術の独自のアセンブリを使用することである。
【０１３０】
本開示の別の目的は、生体模倣の、設計された視床皮質回路における誘発されたシナプス後電位を定量化することである。本発明者らの、神経路における逆行的に生成した集団スパイクの観測は、それらが複合活動電位及びシナプス後電位の伝導などの集団レベルの生理学が可能であることを示唆している。
【０１３１】
本開示の別の目的は、照明の光遺伝学的方法、照明のハードウェア及びソフトウェア制御、ならびに蛍光画像化を利用して、神経回路における誘発電位に対する非侵襲的刺激及びマルチユニット生理学的応答の記録を可能にすることである。
【０１３２】
本開示の別の目的は、選択的５−ＨＴ再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）及び第２世代抗精神病薬の試験においてマイクロエンジニアリングによる回路を使用して、上記薬剤が上記回路の発生上の成熟を変化させるかどうかを調べることである。
【０１３３】
一実施形態において、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を用いた投影フォトリソグラフィーを使用して、図１に示すように、ポリエチレングリコールジメタクリラートとＰｕｒａｍａｔｒｉｘヒドロゲルとの組み合わせを微細パターン化する。この方法により、１種以上のヒドロゲルを従来の細胞培養材料上に直接迅速に微細パターン化することができる。フォトマスクは決してゲル材料と接触しないため、複数のヒドロゲルを連続して急速に硬化させることができ、これにより自動化することなく、１時間で数十のゲル構築物を作製することができる。この手法により、機械的に堅牢な、細胞伸長抑制ゲルであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して、神経突起の伸長を生体模倣の伸長促進ゲル内に拘束することができる。いくつかの実施形態において、この伸長促進ゲルは、Ｐｕｒａｍａｔｒｉｘ、アガロース、またはメタクリル化デキストランであってよい。胚性後根神経節（ＤＲＧ）外植片がこの拘束された３次元環境で伸長する場合、軸索は、図５及び図６に示すように、神経節から高密で且つ束状化して伸長する。軸索の大部分は、２〜４週間で１ｍｍに近い長さに伸長する、小径の非ミエリン形成繊維として現れる。神経節から伸びる密で高度に平行な３次元神経線維路を有するこの培養物モデルの構造は、おおまかには末梢神経構造に類似する。その形態学は神経形態計測を用いて評価することができ、従来の細胞アッセイでは利用できない臨床的に類似した評価が可能になる。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、上記培養物モデルは、複合活動電位（ＣＡＰ）から生じる電気的に誘発された集団場電位を記録する能力を提供する。例示的な記録曲線は、特徴的な、均一で、速く、短い潜時の、集団スパイク応答を示し、これは図８のＢに示すように、高い周波数（１００Ｈｚ）の刺激において一貫性を維持する。図８のＥ及び８のＦに示すように、ＣＡＰはテトロドトキシン（ＴＴＸ）により可逆的に消失し、このことは、薬物を印加することができ、かつ薬物が効果を示すことができることを実証している。図８のＣ及び８のＤに示す、遠位路刺激に伴う立ち上がりまでの遅延が測定可能に増加する。上記応答は神経伝達物質遮断薬に非感受性であり、このことは、誘発された応答が、図１０に示すシナプス電位ではなく、主としてＣＡＰであることを示している。胚ＤＲＧ培養物は、何十年もの間末梢神経生物学のモデルとして効果的に使用されてきた。従来のＤＲＧ培養物は、モデルシステムとしては非常に有用である一方、従来の細胞生存率アッセイで評価した場合、臨床的毒性を十分に予測できないことがわかっている。ＤＲＧ培養物において単一細胞パッチクランプ記録を実行することは可能である一方で、組織構造がないため、ＣＡＰの記録に関する報告はない。好ましい実施形態において、本開示は、臨床組織病理学及び神経伝導試験と同様に、組織形態計測及び集団電気生理学を評価する能力を提供する。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、本開示は、ヒト神経細胞を使用して、神経細胞体が一緒に束ねられ、軸索線維路とは異なる位置に配置されて、天然の神経構造を模倣し、ＣＡＰを含む、形態計測及び電気生理学的データの測定を可能にする三次元環境において神経組織を成長させる。いくつかの実施形態において、本開示は、初代ヒト組織に由来する神経細胞及びグリア細胞を使用する。他の実施形態において、神経細胞及びグリア細胞は、人工多能性幹細胞を含むヒト幹細胞に由来てもよい。
【０１３６】
別の実施形態において、本開示は、毒性件下及び治療条件下での神経組織の状態の機能的尺度として伝導速度を使用する。ミエリン化の程度、ミエリンの健全性、軸索輸送、ｍＲＮＡ転写、及びニューロン損傷に関する情報は、電気生理学的分析から判定することができる。神経密度、ミエリン形成率、及び神経線維型の形態計測分析と組み合わせて、対象となる化合物の作用機序を判定することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示の装置、方法、及びシステムは、遺伝子変異及び薬物を組み込んで、制御された形態で疾患の現象を再現し、神経変性及び可能な治療方法のより良い理解につながる。
【０１３７】
本開示は、開示される組成物のいずれかを備えるシステム、及び２次元組織培養システムまたは複数の細胞型を使用しないシステムを用いて収集されたデータよりも生理学的に関連性のある周囲のデータを得るためにこれらのシステムを使用する方法に関する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示のシステムまたは組成物は、任意の変異を含む１種以上の細胞を備える／含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１種、１００種、５００種、１０００種、またはそれ超える種類の細胞が、ヒトの疾患の特定のモデルに関連する変異を含む。開示されるシステムのいずれも、この後に記載の表Ｂに開示される変異を有する細胞を備えていてもよい。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、表Ｂに開示される内因性変異タンパク質または少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の変異タンパク質を含むかまたは発現する。そこで、これらのモデルシステムは、該システムに添加された特定の薬物、生体分子、もしくはその他の治療薬の効能または毒性を試験するのに有用である場合がある。上記モデルはまた、環境汚染物質、病原体、または内因的に発現するタンパク質、及びかかる分子の神経系への作用の形態の文脈における基礎的な生物学を、軸索伸長、ミエリン形成、及び脱髄を伴う物質への応答、または細胞自体の形態学的変化などの情報に基づいて、理解するのにも有用である場合がある。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−９８】
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【表３−９９】
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【表３−１００】
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【表３−１０１】
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【表３−１０３】
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【表３−１０４】
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【０１３８】
いくつかの実施形態において、開示されるシステムの少なくとも１種の細胞は、表Ｂにおいて特定される遺伝子座に任意の１つ以上の変異を含む。表ＢがｍＲＮＡ配列を開示する場合、上記細胞の上記１つ以上の変異は、上記のＧｅｎＢａｎｋ配列に開示される相補的な内因性ＤＮＡ配列中に存在してもよい。いくつかの実施形態において、上記細胞は、上記で特定した表Ｂの配列、または少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の、表Ｂに開示されるいずれかの配列との同一性を含む配列の１つ以上の変異を含み、あるいは上記配列がｍＲＮＡ配列である場合、上記細胞は、表Ｂにおいて特定されるこれらの配列の１つ以上の相補的ＤＮＡ配列の変異、または少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の、表Ｂに開示される配列のいずれかとの配列同一性を含む配列であるか、または上記配列に相補的である変異を含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるスフェロイドは、表Ｂにおいて特定される遺伝子に２個、３個、４個、もしくは５個、またはそれを超える変異を含む。表Ｂにおいて特定される特定の変異を含むスフェロイドが本明細書に開示のシステム内で使用される場合、対応するシステムは、上記で特定された対応する病状のイン・ビトロモデルとして使用されてもよい。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５００６１に記載されるいずれの組成物、システム、または方法も、本開示の実施形態に使用してもよい。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、本方法は、細胞を培養するためのシステム、培養プレート、または装置の製造方法であって、
人工多能性幹細胞などの幹細胞を得ることと、
上記細胞を１種以上の細胞増殖因子に曝露することと、
上記幹細胞を神経細胞に分化させることと、
上記細胞を、第１及び／もしくは第２の空洞またはウェルを備える固体基材中に播種することと
を含む上記方法に関する。いくつかの実施形態において、第１及び／または第２の空洞は、Ｕ字底ウェル、湾曲底ウェル、または平底ウェルである。いくつかの実施形態において、上記方法は、約１００００個、１５０００個、２００００個、２５０００個、３００００個、３５０００個、４００００個、４５０００個、５００００個、５５０００個、６００００個、６５０００個、７００００個、７５０００個、８００００個、９００００個、１０００００個、１２５０００個、１５００００個、１７５０００個、２０００００個、２２５０００個、または２５００００個の細胞を播種することを含む。いくつかの実施形態において、上記細胞を播種する上記ステップは、固体基材内に分離され、それぞれに細胞培養培地を収納した一連の空洞またはウェル中に、１種以上のｆ細胞を播種することを含む。いくつかの実施形態において、上記空洞またはウェルを播種する上記ステップは、各ウェルが細胞のスフェロイドを収納し、各スフェロイドが懸濁液またはハンギングドロップ形式で成長するように、上記固体基材内に配置されたパターンに上記細胞を播種することを含む。いくつかの実施形態において、上記細胞を培養するためのシステム、培養プレート、または装置の製造方法は、上記細胞が自発的に１個以上のスフェロイドを形成するのに十分な時間、上記細胞を乱すことなく培養することを含む。
【０１４２】
本開示はまた、空洞上または固体基材内の空洞もしくはウェル上または空洞もしくはウェル内の１個以上のスフェロイドに薬剤を曝露することによる、薬剤の毒性の試験方法にも関する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記薬剤が上記１個以上のスフェロイドの１種以上の細胞に吸収された状態になるのに十分な時間、上記薬剤を上記１個以上のスフェロイドに曝露させることと、次いで形態学的変化の記録、観測、または両方の組み合わせによって、上記細胞の生存率を測定することを更に含む。
【０１４３】
本開示はまた、幹細胞に由来する細胞または対象の神経系由来の細胞のスフェロイドの形成方法に関する。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドの形成方法は、
（ｉ）細胞を、幹細胞から、神経細胞、星状細胞、シュワン細胞、もしくは本明細書に開示される任意の他の細胞の１種または組み合わせである１種以上の細胞型へと分化させることと、次いで
（ｉｉ）上記１種以上の細胞を、スフェロイドを形成するのに十分な時間混合することと
を含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、スフェロイドが形成された後に、いずれの細胞をも分化させるステップを含まない。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記スフェロイドまたは任意の細胞を１種以上のＤＲＧに曝露することを含まない。
【０１４４】
以下の実施例は、本出願に開示する実施形態の製造及び使用方法の非限定的な例であることを意図する。実施例または明細書の本文に開示される刊行物、特許、または特許出願は、それらの全体が参照により援用される。
【実施例】
【０１４５】
実施例１：臨床前神経毒性試験用のチップ上のヒト運動神経（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｔｏｒ−Ｎｅｒｖｅ−Ｏｎ−Ａ−Ｃｈｉｐ）
目的は、末梢神経の形態学を模倣し、臨床的に類似した生理学的測定を支援する器官型の微小生理学的モデルを開発することであった。Ｎｅｒｖｅ−Ｏｎ−Ａ−Ｃｈｉｐの設計をマイクロエンジニアリングによるヒドロゲルスキャフォールドを用いて作り上げた（図１のＡ及びＢ）。
【０１４６】
この設計の目標は、３次元軸索の伸長及び細胞の配置を指示及び制限して、神経線維路を模倣することであった（図２）。堅牢な神経の成長、束形成、及びグリア相互作用は、神経毒性及び薬理学的操作のハイコンテントスクリーニングアッセイとして、形態学的及び生理学的アウトプットを容易にした（図３）。
【０１４７】
結果は天然の末梢神経の解剖学に類似した構造を示した。これにより、神経密度、線維型、及びミエリン形成の試験、ならびに軸索伸長、細胞遊走、及びグリア分化の検討が可能になった（図４〜図７）。
実施例２：ラット脊髄のナノシャトルスフェロイドプロトコル
１日目（図１２）：
１．Ｅ１５ラットの子から６個の脊髄を単離し、全ての後根神経節を確実に
除去する。
２．スプリングハンドル式ハサミを用いて、６個の脊髄全てを小さな塊に切断する。
３．１０００μＬピペットを用いて小塊にした脊髄及び培地を１．５ｍＬの微小遠沈管に移す。
４．７００ｒｃｆで２分３０秒間遠心分離することにより、脊髄塊をペレット化する。
５．ペレットを崩さないように注意しながら、上記微小遠沈管から上清を取り除く。
６．１ｍＬの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを上記微小遠沈管に添加し、ペレットを砕いてトリプシン中に懸濁させる。
７．３７℃で１５分間インキュベートする。
８．１．５ｍＬのトリプシン阻害剤溶液が入った１５ｍＬの管にトリプシン＋細胞懸濁液を添加することによってトリプシン−ＥＤＴＡをクエンチする。
９．７００ｒｃｆで５分間遠心分離して、脊髄塊をペレット化する。
１０．ペレットを崩さないように注意しながら、１５ｍＬコニカル管から上清を取り除く。
１１．ペレットが入った上記１５ｍＬコニカル管に２ｍＬの脊髄播種培地を添加する。
１２．１００μＬピペットを用いて１５回粉砕して（ピペットを１ｍＬの容量に設定）、塊を砕く。
１３．解離させた脊髄の溶液に更に３ｍＬの脊髄播種培地を添加する。
１４．解離させた脊髄の溶液５ｍＬを全て、４０μｍのセルストレーナーに通し、漉した培地をペトリ皿に収取する。
１５．各ｌ２ウェルＰＬＬカバーグラス上に３００μＬの解離させた脊髄溶液を添加する。この培地はカバーグラス上で泡立ったままとし、カバーグラスの端を越えてウェルを液で満たすことにならないようにする必要がある。カバーグラスを確実に完全に覆うために、１２ウェルプレートを静かに傾けて、解離させた脊髄溶液がカバーグラス全体に広がるようにする。必要に応じて、更に別な方向に傾けることを繰り返し、完全に覆うようにする。
１６．上記播種した細胞を３７℃で２時間インキュベートする。
１７．２時間後に播種培地を静かに取り除き、７００μＬのＮ２：ＮＧ培地と交換する。当該ウェルの横にＮ２：ＮＧ培地を添加して、流体の流れによって播種した細胞が基材から除去されるのを防ぐ。
２日目：
１．ウェルに０．５ｍＬの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを添加することにより、１つのウェルの播種した細胞を犠牲にして計数を行う。
２．３７℃で４分間インキュベートする。
３．基材から吸い上げたトリプシン及び細胞を０．５ｍＬの神経基礎培地が入った１．５ｍＬの微小遠沈管に移し、トリプシンを希釈する。
４．１０回粉砕して、細胞間接着を破壊し、細胞溶液を得る。
５．トリパンブルー及び血球計算盤を用いて、上記ウェル中に存在する細胞の計数を行う。
６．残余のウェルに６０，０００細胞当り１μＬの割合でナノシャトルを添加する。カバーグラスの全領域にナノシャトル溶液を分散させるようにする。
７．これをインキュベータに戻し、更にインキュベートする。
３日目：
１．各ウェルに０．５ｍＬの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを添加する。
２．３７℃で４分間インキュベートする。
３．基材から吸い上げたトリプシン及び細胞を、トリプシンを希釈する量に等しい量のＮ２：ＮＧ培地が入った１５ｍＬコニカル管に移す。
４．上記細胞溶液を７００ｒｃｆで５分間遠心分離する。
５．上清を除去し、２ｍＬのＮ２：ＮＧ培地と交換する。
６．１ｍＬの注射器及び２０ゲージの針を用いて５回粉砕することにより、細胞ペレットを砕く。
７．上記細胞懸濁液に更に５．２ｍＬのＮ２：ＮＧ培地を添加する（合計７．２ｍＬ）。
８．この細胞懸濁液から１０μＬの試料をとり、トリパンブルー及び血球計算盤を用いて、ｍＬ当たりの細胞の数を算出する。
９．９６ウェルの各ウェルへの添加に必要な細胞懸濁液の量を計算する。
例えば、ウェル当り５００，０００細胞、４００，０００細胞、または３００，０００細胞
１０．非接着性９６ウェルプレートを確実に磁気駆動装置の上に載置した状態とし（図１１）、次いで上記非接着性９６ウェルの各ウェルに適宜の量の細胞溶液を添加する。必要に応じて、上記９６ウェルのそれぞれにおける容量が１５０μＬとなるように、上記ウェルにＮ２：ＮＧ培地を追加する。
１１．上記９６ウェルプレートをインキュベータに戻し、２日間、スフェロイドを崩さずに形成させる。
５日目：
１．ＰＥＧ構築物を作製する。手引きが必要な場合は他のプロトコルを参照のこと。
２．２％  ａｎｔｉ／ａｎｔｉ洗浄溶液で３回洗浄する。
３．３７℃で終夜、洗浄液中に保存する。
６日目：
１．磁気駆動装置の上から９６ウェルプレートを取り外す。
２．１０００μＬピペット（１００μＬに設定）を用いて、９６ウェルの各ウェル中の液体を静かに吸い上げ／吐き出しして、スフェロイドを懸濁させる。
３．１０μＬピペット（１０μＬに設定）を用いて、スフェロイドを９６ウェルから取り出す。
４．氷上のペトリ皿中の２ｍＬの培地に上記スフェロイドを添加する。
５．上記スフェロイドを氷上の空のペトリ皿に再度移す。４μＬに設定した１０μＬピペットを用いる。この操作は、９６ウェルから移ってきた何らかの細胞片を除去するのに役立つ。
６．細胞を封入するためのマトリゲルの１：２０希釈液を、ゲル化を防止するために必ず全ての溶液を氷上（１０℃未満）に保ちながら、マトリゲルをＮ２：ＮＧ培地と混合することによって調製する（スフェロイドの移動によって加えられた培地を考慮する必要がある）。
例：４個のスフェロイドを含む２００μＬの１：２０マトリゲル希釈液に関しては、１０μＬのマトリゲル、１７８μＬのＮ２：ＮＧ培地、及びスフェロイドと共に移された１２μＬの培地を含む。したがってこのステップでは、１０μＬのマトリゲルを１７８μＬのＮ２：ＮＧ培地に添加する。
７．上気空のペトリ皿中のスフェロイドに、上記混合したマトリゲル及びＮ２：ＮＧ培地を添加する。
８．Ｒａｉｎ−Ｘを塗布したスライドグラスを上記磁気位置決め装置に取り付ける（図１３）。
９．上記スライドグラスの上に上記ＰＥＧ構築物を含むＴｒａｎｓｗｅｌｌインサートを載置する。
１０．上記磁気駆動装置を操作して、スフェロイドを配置したい空隙の下に磁石の位置を調節する。
１１．１０μＬに設定したピペットを用いて、スフェロイド及び１：２０マトリゲル溶液を上記空隙に移す。磁石の上でスフェロイドを放す（図１４のＢ）。
１２．Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート中の全ての構築物について、手順１０及び１１を繰り返す。
１３．３７℃で３０分間、マトリゲルをゲル化させる。
１４．上記インサートの下にＮ２：ＮＧ培地を添加する。
１５．所望するように培養する。
【０１４８】
実施例３：神経突起の方向性のある伸長のためのスフェロイド
丸底／Ｕ字底プレート：１種の分化細胞型または分化細胞型の組み合わせのいずれかに対して、９６ウェルの、透明な「Ｕ字」丸底の、未処理のスフェロイドマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＲＥＦ：４４１５）を用いた。血球計算盤を用いて、再懸濁した細胞を再度計数する。それに従って、マイクロピペッタを用いて、５０００細胞から最大で１０万細胞の各スフェロイドに必要な密度を各ウェルに添加する。次いでこのスフェロイドマイクロプレートを、懸濁液で、当該の細胞型に対応する遠心分離速度で５分間遠心分離し、２４時間以上、スフェロイドが形成されるまで３７℃のインキュベータ中に載置する。
【０１４９】
ハンギングドロッププレート：３Ｄ  ｂｉｏｍａｔｒｉｘのＰｅｒｆｅｃｔａ３Ｄハンギングドロッププレートをスフェロイドの作製に用いた。５，０００〜１００，０００個程度の、既知の量の分化人工多能性細胞由来のニューロン及びグリア細胞を少量の培地中に懸濁させた。分化細胞の比率を、スフェロイドの形成ならびにスフェロイド形成後の成長特性が可能になるように変化させた。細胞を４０ｕｌの容量中で懸濁させ、上記プレート上部のアクセス孔にピペットで移した。次いで、細胞を従来の５％  ＣＯ２インキュベータ中で少なくとも２４時間静置して自己組織化させ、スフェロイドを形成できるようにした。
【０１５０】
以下の表はスフェロイド製造の種々の方法を示す。
【表１−２】
2021505193.tif 000108
【表２−１】
2021505193.tif 000109
【表２−２】
2021505193.tif 000110
【０１５１】
スフェロイドのＮｅｒｖｅ−Ｏｎ−Ａ−Ｃｈｉｐ構築物への移動
３次元構築物の配置とするためにスフェロイドを移動するには、６ウェルの組織培養処理プレート（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、径が２４ｍｍ、孔径が０．４ｕｍ、ＲＥＦ：３４５０−透明）内で、各ウェルについて、使用した計１５００ｕｌのＰＢＳの５００ｕｌを除去することよって構築物を乾燥し、ここでメンブレンの上部はスフェロイドを配置するために部分的に乾燥している。次いで８％のマトリゲルを３次元構造の内部に添加し、その後３７℃のインキュベータ中に３０分間載置する。
【０１５２】
次に、ｐ１０００ピペッタを用いて上記スフェロイドを取り出し、３５ｍｍの組織培養処理したディッシュ（Ｃｅｌｌ  Ｔｒｅａｔ  カタログ番号：２２９６３５）上に液滴として載置した。次いで滅菌したＤｕｍｏｎｔ  ４号ピンセット（長さ１１ｃｍ、標準の０．１３×０．０８ｍｍ  Ｄｕｍｏｓｔａｒ  １１２９４−００）を用いて、スフェロイドを３次元構築物の「バルブ部分」中に配置した。次いで１５００ｕｌの培地を上記６ウェルプレートのメンブレンの下に入れ、３７℃のインキュベータ中に載置した。
【０１５３】
実施例４：神経筋接合部（ＮＭＪ）の３次元筋細胞カプセル化部分
未分化の初代ヒト筋芽細胞を非コーティング組織培養容器上に販売元指定の密度で播種し、１日目、２日目、４日目等々に血清を含む成長培地を供給し、６０％の培養密度に達するまで細胞分裂をトリガーする。６０％の培養密度に達したときには、細胞はトリプシンにより継代６まで継代されている。継代６（Ｐ６）及び６０％の培養密度に達したところで、初代ヒト筋芽細胞をトリプシンと共に培養容器から取り出し、遠心分離し、計数のために培地中に再懸濁し、２回目の遠沈を行い、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中に８００万細胞／ｍＬの濃度になるように再懸濁する。
【０１５４】
５％  ＧｅｌＭＡ、添加したラミニン及びｎ−ビニルピロリドンを含む０．０５％  ＬＡＰ溶液の溶液を作成し、細胞が２００万細胞／ｍＬの濃度になるように細胞懸濁液と混合する。筋芽細胞／ＧｅｌＭＡ／ＬＡＰ溶液を、前もって作製した、細胞が貫入不能なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構築物の特定のチャンバにピペットで移し、上記構築物において、上記チャンバは、運動ニューロンを収納したいずれのチャンバからも離れている。２００万細胞／ｍＬを含有する細胞搭載ＧｅｌＭＡ／ＬＡＰの重合を、チャンバ中の溶液をＵＶ光に曝露することによって実現する。
【０１５５】
これに代わる別の方法は、上記細胞を２００万細胞／ｍＬの濃度に、上記ＧｅｌＭＡ／ＬＡＰ溶液中に直接再懸濁することを必要とする。（培地中への懸濁及び２回目の遠心分離のステップは割愛される）。
【０１５６】
３次元における筋芽細胞の分化は培地交換によって実現する。１〜３日目には、上記と同一の成長培地を上記構築物に供給する必要がある。４日目の培地交換は、培地をＤＭＥＭ／Ｆ１２及びウマ血清からなる分化培地に変更する。
【０１５７】
高密度カプセル化の方法により、培地の結果として構築物は最大３週間にわたって分化し、パラクリン型シグナル伝達が実現する。
【０１５８】
分化は、抗デスミン及び抗アルファ重鎖ミオシンならびにＤＡＰＩを含む多核筋管によってのみ発現されるタンパク質に対する抗体で筋細胞を蛍光標識することを含む組織学的手法を用いるか、または単一の細胞体に２つ以上の核が含まれているかどうかを確認することによって確認される。
【０１５９】
実施例５：スフェロイドの検討
この検討において、統合神経伝導速度（ＮＣＶ）及び組織病理学的評価に好適なデータを提供することができる、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のニューロン（ｈＮ）及び初代ヒトシュワン細胞（ｈＳＣ）から構成される、イン・ビトロ、マイクロエンジニアリングによる、生体模倣の、全ヒト末梢神経（Ｈｕｍａｎ−Ｎｅｒｖｅ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ［ＨＮｏａＣ］）について説明する。この全ヒトシステムは、本発明者らが以前に、胚性ラット後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン及びラットＳＣを用いて開発したイン・ビトロ「Ｎｅｒｖｅ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ」（ＮｏａＣ）プラットフォーム５の重要な拡張である。本発明者らの知る限り、このｈＮとｈＳＣとの組み合わせは、これまでに如何なる他の幹細胞に基くイン・ビトロ神経系でも達成されていない。このモデルは、堅牢な軸索伸長（約５ｍｍ）を模倣し、ヒトｉＰＳＣ由来のニューロンのヒトシュワン細胞のミエリン形成の最初の証拠及び、イン・ビトロモデルのような全ヒトイン・ビトロシステムにおける神経伝導速度の試験の最初の証拠を示した。したがって、上記革新的なヒト末梢神経のＨＮｏａＣモデルは、ヒトの疾患モデル化、創薬、及び毒性スクリーニングの分野を加速する可能性がある。
【０１６０】
シュワン細胞の培養
Ｔ−７５培養フラスコ（３５３１３６；Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｃｏｒｎｉｎｇ，  ＮＹ）を、滅菌ろ過した０．１％ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）の滅菌水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）溶液で被覆することによって用意した。次いでこのフラスコを滅菌水で４回洗浄した。７．５ｍＬの１０μｇ／ｍＬラミニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｃａｉｓｓｏｎ  Ｌａｂｓ，  Ｓｍｉｔｈｆｉｅｌｄ，  ＵＴ）溶液を上記フラスコに加え、これを４℃で終夜その状態に保った。ラミニン溶液を吸引し、１５ｍＬの培養液をこのＴ−７５培養フラスコに直接入れ、３７℃のインキュベータ中で平衡化した後に細胞播種を行った。ヒトシュワン細胞（ｈＳＣ）培地はＳｃｉｅｎＣｅｌｌ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。ヒトシュワン細胞株（カタログ番号１７００；ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）は冷結保存バイアル入りで受け入れ、報告によれば５×１０５細胞／ｍＬ超であった。このバイアルを凍結保存から取り出し、３７℃水浴中で解凍した。バイアルの内容物を上記ＰＬＯ／ラミニンで被覆したＴ−７５フラスコ上に均一に分配させた。培養物を５％  ＣＯ２雰囲気中、３７℃で少なくとも１６時間静置して、付着及び増殖を促進させた。培地は２４時間毎に交換した。８０％の培養密度に達したところで、ｈＳＣを３ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いることによって継代し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を３７℃で３分間フラスコに添加した。細胞が完全に剥離したところで、８ｍＬのｈＳＣ培地をフラスコに入れた。剥離したｈＳＣの１１ｍＬの溶液を１５ｍＬのコニカル管に移し、２００×ｇ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０Ｒ遠心分離機、半径１８ｃｍ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，  Ｈａｍｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、室温（ＲＴ、約２２℃）で５分間遠心した。上清を吸引し、ペレットを１ｍＬのｈＳＣ培養培地中に再懸濁させた。従来の血球計算盤（Ｈａｕｓｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｈｏｒｓｈａｍ，  ＰＡ）を用いて細胞を計数した。
【０１６１】
運動ニューロンの培養
【０１６２】
ｉＣｅｌｌ（登録商標）運動ニューロン（ｈＮ）培地は、２ｍＬのｉＣｅｌｌ（登録商標）Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ａ  （ＦＵＪＩＦＩＬＭ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，  Ｉｎｃ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）及び１ｍＬのｉＣｅｌｌ（登録商標）Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  （ＦＵＪＩＦＩＬＭ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，  Ｉｎｃ）を補充した１００ｍＬのｉＣｅｌｌ（登録商標）Ｎｅｕｒｏｎｓ  Ｂａｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＦＵＪＩＦＩＬＭ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，  Ｉｎｃ）を用いて調製した。運動ニューロンの解凍を準備するために、ｈＮ培地を室温まで加温し、１ｍＬのｈＮ培地を滅菌した５０ｍＬコニカル管に添加した。１バイアルのｉＣｅｌｌ（登録商標）ヒト運動ニューロン（ｈＮ；ＦＵＪＩＦＩＬＭ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，  Ｉｎｃ）を３７℃の水浴中で約２分３０秒間解凍した。このバイアルの内容物を、細胞溶液を完全に混合し、且つ解凍した細胞への浸透圧ショックを最小限に抑えるために、旋回させる動きで滴下することにより、１ｍＬのｈＮ培地が入った５０ｍＬコニカル管に移した。次いでこの細胞バイアルを１ｍＬのｈＮ培地ですすぎ、５０ｍＬ管に移した。次に、この５０ｍＬ遠沈管にｈＮ培地を旋回させながらゆっくりと滴加する（２〜３滴／秒）ことによって、この溶液の容量を１０ｍＬとした。次いで、この細胞溶液を１５ｍＬコニカル管に移し、２００×ｇ、室温で５分間遠心分離した。上清を吸引し、管を指で弾き、次いでピペットで２〜３回吸い上げ／吐き出しすることにより、細胞を１ｍＬのｈＮ培地中に再懸濁した。次に、細胞溶液の１０μＬ試料を採取し、血球計算盤を用いて細胞の計数を行った。
【０１６３】
スフェロイドの作製
【０１６４】
未処理、透明、「Ｕ字」丸底、９６ウェルのスフェロイドマイクロプレート（４５１５；Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、ヒトニューロン（ｈＮ）及びヒトシュワン細胞（ｈＳＣ）の両方の単独培養ならびにｈＮ／ｈＳＣの共培養に用いた。細胞／μＬ−培地で表した濃度をｈＳＣ及びｈＮの両方について計算し、以下の大きさ及び組成、すなわち、ｈＮの単独培養−１０００００、７５０００、５００００、または２５０００個；ｈＳＣの単独培養−７５０００、５００００、または２５０００個；共培養、７５０００個のｈＮと７５０００、５００００、または２５０００個のｈＳＣのいずれかのスフェロイドを生成させるために必要な容量を計算できるようにした。計算された容量をマイクロウェルプレートに添加し、３７℃に加温した培地を添加することにより、各ウェルの容量を２００μＬとした。次いでこのスフェロイドマイクロプレートを２００×ｇで５分間遠心分離し、スフェロイドの形成が観察されるまで（通常は約４８時間）、３７℃、５％  ＣＯ２雰囲気のインキュベータ中に載置した。ｈＮ培地を、隔日で、半量の９５μＬを換え、１００μＬの新たな加温した（３７℃）ｈＮ培地に置換して補充した。
【０１６５】
３次元二重ヒドロゲル神経成長構築物
【０１６６】
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサートのメンブレン（０．４μｍ／ＰＥＳ；Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に、既報６の方法と類似のマイクロフォトリソグラフィー技法を用いて、二重ヒドロゲルスキャフォールドを作製した。別段の記載がない限り、全ての溶液は無菌ろ過ＰＢＳを用いて調製した。外側の細胞を制限する（すなわち、成長抵抗性）ｐｈｏｔｏ−ｔｒａｎｓｌｉｎｋａｂｌｅヒドロゲルは、ポリエチレングリコールジメタクリラート１０００（ＰＥＧＤＭＡ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，  ＰＡ）及びフェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液を用いて調製した。最初に、１０％  ｗ／ｖＰＥＧＤＭＡ溶液及び１．１ｍＭ  ＬＡＰ溶液を調製し、１：１溶液に混合した。得られた溶液を滅菌ろ過し、０．６ｍＬの容量でＲａｉｎ−Ｘ  （ＩＴＷ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｂｒａｎｄｓ，  Ｇｌｅｎｖｉｅｗ，  ＩＬ）で処理したスライドグラス上に載置したＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサートに、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ，  ＰＲＯ４５００  Ｗｉｎｔｅｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｄｙ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅ；Ｗｉｎｔｅｃｈ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）のレンズの下に配置しながら添加した（図１）。マスク及び重合パラメータは市販のソフトウェア（ＤＬＰ  Ｌｉｇｈｔｃｒａｆｔｅｒ  ４５００  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｄａｌｌａｓ，  ＴＸ）を用いて選択し、ｐｈｏｔｏ−ｔｒａｎｓｌｉｎｋａｂｌｅ溶液の照射を、波長３８５ｎｍの紫外光を用いて２８〜３２秒間行った。処理後に、上記インサート及びフォトマスクによって生み出された空隙内から過剰なＰＥＧＤＭＡ／ＬＡＰ溶液を除去した。次いで、２％抗生物質／抗真菌剤洗浄緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｏｎ，  ＭＡ）を用いて、この構築物を、インサートの上部と下部でそれぞれ１０分間、３回洗浄した。インサート及び内部の鍵穴形のチャンネルから洗浄緩衝液を除去した。細胞が透過可能なスキャホールドを作製するために、上記空隙に８％の成長因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリクス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を慎重に充填し、３７℃のインキュベータ中で重合させた。
【０１６７】
スフェロイドのヒドロゲル構築物への移動
３次元構築物におけるミエリン形成を誘導するために、ｈＮ培地（上記）を用いて２種の培地を調製した。ミエリン化前培地は、ｈＮ培地、１０％  ＨｙＣｌｏｎｅウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＬａＣｅｌｌ  ＬＬＣ，  Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，  ＬＡ）、及び１％抗生物質−抗真菌剤緩衝液を用いて調製した。ミエリン化培地は、ｈＮ培地、１０％  ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬの組換えラットβ神経成長因子（ＮＧＦ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）、及び５０μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて調製。スフェロイドを形成後に、ピペットを用いてマイクロプレートから移し、ｈＮ培地の液滴として３５ｍｍの組織培養処理ディッシュ（Ｃｅｌｌ  Ｔｒｅａｔ，  Ｐｅｐｐｅｒｅｌｌ，  ＭＡ）上に載置した。次いで滅菌したＤｕｍｏｎｔ  ５号の先端の細いピンセット（１１２９５−１０；Ｄｕｍｏｎｔ，  Ｍｏｎｔｉｇｎｅｚ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、スフェロイドをマトリゲル内の３次元構築物「バルブ部分」に配置した。最後に１．５ｍＬのミエリン化前培地を上記６ウェルプレートのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）メンブレンの下に入れ、搭載したヒドロゲル構築物を５％  ＣＯ２雰囲気、３７℃のインキュベータ中に載置し、培養を行った。隔日で培地の半量の交換を行った。上記構築物をミエリン化前培地中に１週間保持した後、ミエリン化培地に交換して３週間保持した。
【０１６８】
免疫細胞化学
上記６ウェル培養プレートの全てのウェルを、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｈａｔｆｉｅｌｄ，  ＰＡ）、ｐＨ７．４を用いて室温で３０分間固定化し、次いでＰＢＳで４回、各１５分間洗浄した。次に、固定化した試料を、ＰＢＳ、５％ヤギ正常血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  ＰＡ）、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び０．４％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む１×ブロッキング溶液中に室温で１時間入れ、それに続いて、ブロッキング溶液中、４℃で終夜、以下の１次抗体、すなわち、ウサギ−α−ｓｌ００（ａｂ８６８，  １：４００；Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）、またはマウス−α−βＩＩＩチューブリン（ａｂ７８０７８，  １：５００；Ａｂｃａｍ）で標識する。別の試行において、ウサギ−α−ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ，  ａｂ１３３６２０，  １：５００；Ａｂｃａｍ）も同一のインキュベーション条件下で使用した。翌日、ウェルをＰＢＳで４回、室温で各８分間洗浄した。次いでこのプレートを、２次抗体、Ａｌｅｘａ  ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：３００，  Ａｂａｍ）またはＡｌｅｘａ  ５６８ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：３００，  Ａｂａｍ）、及びＤＡＰＩ（１：２００，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて標識した。２次抗体及びＤＡＰＩをＩ×ブロッカー溶液に室温、暗所で９０分間溶解した。このプレートを室温、暗所にてＰＢＳで５回、各８分間洗浄した。次に、このプレートをパラフィルムで密封し、金属箔で覆い、４℃に維持し、その後Ｎｉｋｏｎ  Ａｌ共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を用いて顕微鏡観察を行った。
【０１６９】
プラスチック樹脂による包埋
包埋に使用した全ての材料は、別段の記載がない限り、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、ドラフト下で取り扱い、推奨される個人用保護具を装着して使用した。ヒドロゲル構築物を培養物から取り出し、膜貫通型ウェルの両側を、室温でＰＢＳにより３回洗浄し、その後固定化を行った。次いでこのヒドロゲル構築物を、室温で３０分間、４％  ＰＦＡ／０．５％グルタルアルデヒドの溶液中に浸漬した。細胞脂質の２次固定化及び染色を、１％四酸化オスミウムのＰＢＳ、ｐＨ７．４溶液を用いた、室温、暗条件下での２時間の後固定により実現した。次いで上記構築物をＰＢＳで３回、１５分間洗浄した後、２％酢酸ウラニル水溶液を用い、室温、暗条件下で３０分間対比染色した。５０％エタノール／ＰＢＳでの１０分の洗浄から始めて、７０％エタノール／ＰＢＳでの１０分の洗浄、及び９０％エタノール／ＰＢＳでの終夜の洗浄による室温での段階的エタノール洗浄によって脱水を行った。翌日、この構築物を１００％エタノールで２回、室温で３０分間洗浄した。解剖顕微鏡下、メスを用いて、ＰＥＧＤＭＡを除去せずに、膜貫通型ウェルからヒドロゲル構築物を個別に解剖した。構築物を平面包埋型（ＥＭＳ  ７０９０２，  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に配置した。上記固定化ヒドロゲルから残存エタノールを蒸発させる時間を設けた後に、Ｓｐｕｒｒ樹脂（低粘度包埋培地Ｓｐｕｒｒキット；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とプロピレンオキシドの１：１混合物からなる浸透培地で置換した。浸透培地を７５分間静置した後、１００％のＳｐｕｒｒ樹脂で置換し、これを７０℃のオーブン中で終夜、且つ室温で４８時間硬化した後、ウルトラミクロトームによる薄片作製を行った。
切片作製及び透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
切片作製及びＴＥＭによる評価をルイジアナ州立大学（Ｂａｔｏｎ  Ｒｏｕｇｅ，  ＬＡ）の共有機器施設（ＳＩＦ）で実施した。ＨＮｏａＣ標本内、すなわち、組織のバルブ内（但し、上記バルブにおいて、上記バブルは、上記チャネル及び上記近位チャネル（すなわちバルブの近く）、ならびに遠位チャネルと交わる）の４箇所で超薄切片を８０〜１００ｎｍの厚さに切り出した。切片をＦｏｒｍｖａｒカーボン被覆銅グリッド、２００メッシュ上に配置し、室温で２０分間、２％酢酸ウラニルの液滴上に浮遊させることにより金属を含浸させた。次いでこれらの切片を脱イオン水の水滴で３回、１分間すすいだ。視覚化するために、ＪＥＯＬ  １４００  ＴＥＭ（Ｐｅａｂｏｄｙ，  ＭＡ）を１２０ｋＶの加速電圧において、種々の倍率で使用した。
【０１７０】
組織形態計測分析
ＨＮｏａＣ断面のＴＥＭ画像から取得したメトリクスとしては、軸索径及びＧ比（すなわち、軸索径と繊維全体［軸索＋ミエリン鞘］の径の比）を含んでいた。軸索径及びＧ比は、二人の異なる独立した盲検化した研究者が、無髄軸索と３層以上の暗色のミエリンラッピング（ｍｙｅｌｉｎ  ｗｒａｐｐｉｎｇ）によって囲まれた軸索の両方を測定することによって明らかになった。Ｇ比及び軸索径は、Ｆｉｊｉ７におけるスケール、しきい値、測定機能を用いて測定した。Ｇ比メトリクスは、無作為に１０の画像をサンプリングして、３つ以上のミエリン膜（ｍｙｅｌｉｎ  ｌａｍｉｎａｅ）を有する軸索を見い出すことによって計算した一方、無髄繊維は、遠位チャネルから１０の軸索の画像を無作為にサンプリングすることによって測定した。軸索径は、軸索の総面積を見い出すためのしきい値関数を用いることにより測定した。次いで、軸索が円形であると仮定して、面積から径を算出した。Ｇ比の計算は、内部の軸索の径の単純な線形予測に基づいた一方、繊維全体の外径（軸索と周囲を囲む暗色に染色されたミエリン膜（ｍｙｅｌｉｎ  ｌａｍｅｌｌａｅ）からなる）は、所与の神経線維の最小径と最大径との平均値を採用することによって計算した。ミエリン層が近接しいていることがミエリン鞘の全周にわたって一貫していないために、外径を得るためのこの平均化手法が必要であった。Ｇ比は、平均の外径に対する内部の径を採用することによって計算た。ミエリン鞘の外側の範囲を測定する際に、シュワン細胞の大きな有核体は除外した。
【０１７１】
電気生理学
共培養において１ヶ月後に、再構成された神経を有するＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサートを電気生理学的検査用のステージ上に載置した。２つのチューブ（一方は供給用、他方は吸引用）をＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサートの縁部に沿って配置し、酸素化人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）５を組織試料に灌流させた。複合活動電位（ＣＡＰ）を記録するために、ガラスキャピラリマイクロピペット電極（１〜４ＭΩ）をクラスター化細胞体の近傍のチャネルのバルブに挿入し、チャネル中を伸長する軸索を、上記バルブから１〜３ｍｍ遠位に配置した同心円双極白金−イリジウム電極を用いて刺激した。白金記録用電極をＡＣＳＦ充填ガラス製マイクロピペット中に配置し、１００倍のゲイン及び０．１Ｈｚのハイパスフィルタリング〜３ｋＨｚのローパスフィルタリングに設定した増幅器に接続した。刺激パルスの高さ及び幅は、それぞれ１０ボルト及び２００μ秒に維持した。試料を１Ｈｚの最大繰り返し速度で刺激し、試料当り少なくとも５０回の刺激を印加した。アナログ／デジタルコンバータ（ＰｏｗｅｒＬａｂ；ＡＤ  Ｉｎｓｔｍｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，  ＣＯ）を用いてＣＡＰ波形を視覚化し、更にＬａｂＣｈａｒｔソフトウェア（ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて保存した。ＣＡＰを記録した後、実体顕微鏡及びカメラを用いて、刺激用電極及び記録用電極のスナップショットを撮影し、神経伝導速度（ＮＣＶ）の計算用に上記電極間の距離を測定した。ＣＡＰピーク位置から刺激アーティファクトの位置を減じることによって潜時を決定した。有髄ｈＭＮ／ｈＳＣ共培養物及び無髄ｈＭＮ単独培養物のＮＣＶは、刺激用電極と記録用電極の間の距離を潜時で除すことによって評価した。
【０１７２】
統計処理
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて、Ｔｕｋｅｙポストホック検定による一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施し、異なる種類のスフェロイド間の大きさの違いを評価した。電気生理学の解析のために、平均値及び標準偏差を計算し、独立２群のｔ検定を行った（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。平均値間が有意差であることを指定するのにｐ値≦０．０５を用いた。
【０１７３】
結果
シュワン細胞はニューロンのスフェロイドへのアセンブリを向上させた
本発明者らは、Ｎｅｒｖｅ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ（ＮｏａＣ）システムの寸法内に適切に収まるスフェロイド（すなわち、径が１，０００μＭ未満であり、且つ多数の細胞を維持する）を作製するために、種々の細胞密度をもつスフェロイドを作製した。本発明者らはまた、種々のスフェロイドの大きさを比較して、ｈＮとｈＳＣとの間の相互作用を理解した。低接着性丸底プレート中に所望の数の細胞を入れた後、スフェロイドの形成を毎日監視した。ｈＳＣの単独培養では、約２日以内にスフェロイドが形成され、常に鋭利な縁部を有する形状であることが判明した（図４３のａ〜ｃ）。対照的に、ｈＮの単独培養では、２日間ではスフェロイドに自己組織化せず、代わりに多くのより小さな球状構造体が形成された（図４３のｇ〜ｉ）。共培養では、ｈＮのみから形成されたスフェロイド（約３〜９日、図４４）と比較した場合、ｈＳＣはスフェロイドへのｈＮの取り込みを促進した（約２日）。共培養スフェロイドの縁部（図４３のｄ〜ｆ）は、おそらく共培養スフェロイドの不均一な性質に起因して、ｈＳＣのみを含有するスフェロイドと比較して、あまり明確に画定されていなかった。興味深いことに、７５，０００ｈＮと７５，０００ｈＳＣとから構成される共培養スフェロイドの大きさ（１０２５±５２μｍ）は、７５，０００ｈＳＣのみの大きさ（９６７±５１μｍ）と非常に類似することが判明し、このことは、共培養スフェロイドの方がより密に充填されていることを示唆し、それ故に上記２種の細胞型が互いに親和性を有していることが確認される。
【０１７４】
本発明者らは、種々のスフェロイド型（図４３及び図４４）のそれぞれの径を測定することにより、７５，０００個のニューロンを有することが、ｈＮｏａＣシステムを構成するのに最適なｈＮの数であると判定した。というのは、本発明者らが、２５，０００個、５０，０００個、及び７５，０００個のｈＳＣを用いて共培養スフェロイドを作製した際に、スフェロイドの大きさがそれぞれ約８３３±１０８、９４８±３９、及び１０２５±５２μｍであることが判明したことによる。ニューロンのみの培養においては、細胞の数が増加するに伴い、スフェロイドの大きさが予想通りに増加することが明らかになった。４つのｈＮの条件全て（図４４）によって、スフェロイドの大きさが連続的に、顕著に増加することが明らかになり、このことから、４つのスフェロイド（２５Ｋ、５０Ｋ、７５Ｋ、及び１００Ｋ）全体にわたって充填密度が実質的に変化しないこと、及びスフェロイド中の様々な細胞型間の相互作用よりも、細胞の総数の方がスフェロイドの大きさにより大きく寄与することが明確になった。
【０１７５】
共培養スフェロイドはＮｏａＣシステムにおいて堅牢な神経突起伸長を示した
二重ヒドロゲルシステムの外側部分は成長抵抗性の１０％  ＰＥＧＤＭＡで構成されている一方、チャネルの内側部分は、成長促進基材としての完全に濃厚な（８〜１２ｍｇ／ｍＬ）マトリゲルが充填されている。ゲル形成後、スフェロイドをチャネルのバルブ部分の上に静かに移し、１０％  ＦＢＳを含有する培地中で増殖させたが、ｈＮからの神経突起伸長を遅延させつつｈＳＣの増殖及び移動を促進するためのＮＧＦを含んでいなかった。１週間後、上記インキュベーション溶液をＮＧＦ及びＬ−アスコルビン酸を補充した培地に交換して、伸長中の軸索と接触しているｈＳＣによる神経突起の伸長及びミエリン形成を促進させた。
【０１７６】
共焦点画像により、上記再構成されたイン・ビトロ神経の３次元特性が明確になり、細胞体と軸索の両方がチャネルの深さ全体に存在することが明らかになった（図４５）。神経突起は毎週平均約１ｍｍ伸長した。アスコルビン酸を含むが、ＦＢＳを含まない基本培地はｈＳＣの遊走及びミエリン形成を支援しない（データ非表示）ことから、ＦＢＳの添加は、ミエリン形成を最適化する上で重要な因子であった。４週間後にＳ１００で免疫染色することにより、ｈＳＣ細胞がスフェロイドの外側に約１〜１．５ｍｍ遊走し、伸長する軸索に沿って成長することが明らかになった（図４５のＡ〜Ｃ）一方、軸索はマトリゲルが充填されたチャネルの最末端（約５ｍｍ）に達した。興味深いことに、多くの共培養物試料に関しては、スフェロイドが軸索の伸長に影響を与え、その結果、軸索がある程度の距離を伸長した後に折り返してきたように思われ、おそらくこれは、スフェロイド中のｈＳＣから放出された成長因子によって生じた走化性作用に起因する。スフェロイド中のｈＳＣの数が増加するにつれて、軸索への作用がより顕著になった。
【０１７７】
イン・ビトロヒト神経のミエリン形成及び神経線維の構造
最後に、免疫染色及び共焦点顕微鏡観察と共に、プラスチック樹脂による包埋及び薄片作製を行い、ＴＥＭにより、上記システム中におけるミエリン形成のレベル及び質を評価した。上記システムにおける効果的なミエリン形成の証拠としては、コンパクトでないミエリン（図４７のＡ）、コンパクトなミエリン（図４７のＢ）、及びコンパクト化の過程のミエリン（図４７のＣ）が挙げられたが、これらに限定されなかった。ミエリン形成の証拠が見られた軸索に関しては、有髄神経線維のＧ比は０．５７±０．１６であった。有髄及び無髄軸索の軸索径は、それぞれ０．５５±０．３３及び０．４０±０．１５μｍであった。また、軸索なしでの層状ミエリン形成（図４７のＤ）、細胞質内の層板小体の存在（図４７のＥ）、及び裸（無髄）の軸索（図４７のＦ）の証拠も見られた。比較的規則的な間隔のらせん状膜（ｍｅｍｂｒａｎｅｎ  ｗｈｏｒｌ）からなる細胞質内の層板小体の出現は、老化細胞小器官の再循環と一致するオートファゴソーム産生を表すと解釈された。層板小体の分布はまばらで、アポトーシス核は観察されず、これのことは、影響を受けた細胞がプログラムされた細胞死に関与していないことを示している。
【０１７８】
イン・ビトロヒト神経は効果的な組成依存性電気伝導度を示す
ヒトシュワン細胞（ｈＳＣ）が存在する場合としない場合で、ｉＰＳＣ由来のヒトニューロン（ｈＮ）の神経伝導速度（ＮＣＶ）を測定することができるかどうかを判断するために、脳切片電気生理学と類似の技法を用いた。チャネル内の軸索を刺激し、細胞体からの複合活動電位（ＣＡＰ）を記録した（図４６のＡ）。軸索を細胞体から約１〜３ｍｍ離れた箇所で刺激し、刺激用電極と記録用電極の間のインパルスの移動距離を計算した。最速のシグナルとピークシグナルとの間の差異を判定するために、２種類のＮＣＶ、すなわち開始ＮＣＶとピークＮＣＶとを評価した（図４６のＢ’及びＢ’’）。驚くべきことに、ｈＮ／ｈＳＣ共培養物試料を用いた場合の開始及びピークＮＣＶは、ｈＮ単独培養物試料と比較してより遅いことが判明した。７５Ｋ  ｈＮ単独培養及び７５Ｋ／２５Ｋ  ｈＮ／ｈＳＣ共培養物の開始ＮＣＶは、それぞれ０．２８±０．０７及び０．２０±０．０２ｍ／ｓと測定される一方、ピークＮＣＶは、それぞれ０．１８±０．０４及び０．１３±０．０２ｍ／ｓであることが判った（図４６のＣ）。ＳＣの数が多い試料（７５Ｋ／７５Ｋ及び７５Ｋ／５０ＫでのｈＮ／ＳＣの共培養物）については、開始及びピークＮＣＶの測定が困難であった。これらの試料の定性的な試験により、共培養物試料では神経突起伸長の密度がやや低くなることが明らかになっており、このことから、ＮＣＶが低下する可能性がある。
【０１７９】
本研究において、本発明者らは、Ｎｅｒｖｅ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ（ＮｏａＣ）プラットフォームとしてアセンブルされた、初の生体模倣の、末梢神経の全ヒトイン・ビトロモデルを提示している。このマイクロエンジニアリングによる二重ヒドロゲルシステムは、上記神経細胞体を画定された場所に保持し（すなわち「神経節」）、密な３次元軸索伸長を、クラスター化細胞体から外に向かって直線的に延在する狭いチャネル内に拘束する（すなわち「神経」）。このシステムは、増大する医学的懸念を代表する末梢神経障害に関連する神経病理学的疾病の評価に必要な、現在の「ゴールドスタンダード」である、機能的な（例えば、電気生理学的検査）及び構造的な（例えば、定性的及び定量的な顕微鏡分析）評価項目を支援する。この研究の革新的な側面としては、ニューロン／シュワン細胞共培養スフェロイドの再現性のある製造、イン・ビトロでの堅牢な生存性（約４週間）及び広範な神経突起伸長（約５ｍｍ）、初代ヒトシュワン細胞（ｈＳＣ）によるヒトｉＰＳＣ由来ニューロン（ｈＮ）の効果的なミエリン形成、ならびにヒトの疾患のモデル化、創薬、及び毒性スクリーニングに適した、イン・ビトロ環境において神経伝導速度（ＮＣＶ）を測定する能力が挙げられる。
イン・ビトロ神経システムの製造における課題
初代ｈＳＣを用いたイン・ビトロミエリン形成は、成人の神経からのｈＳＣの抽出８、９、線維芽細胞による汚染８〜１０、及びイン・ビトロでの増殖性／非ミエリン形成性表現型へのＳＣの形質転換１１、１２に伴う複雑な問題に一部起因して、長らく課題であった。胚性、新生児期、及び成体のげっ歯動物ＳＣによるラット後根神経節（ＤＲＧ）感覚ニューロンのミエリン形成に関しては、共培養条件は十分に確立されている１３〜１５。しかしながら、同様の共培養条件では、ラットＤＲＧニューロンと共に培養したヒトＳＣを用いてミエリン形成を再現できない１１。初代ヒトＳＣを厳密に精製するまたはヒト幹細胞もしくはヒト線維芽細胞をＳＣ様細胞へと分化させると、ラット感覚ニューロンのミエリン形成のレベルが制限されるという結果を招くが、混合種培養物で見られる上記制限の程度は、胚性ラットＳＣを用いて生じる上記制限の程度に比較して大幅に小さくなり１１、１６、それはおそらく、種の違い、または軸索の数と比較したＳＣの密度に起因すると思われる。最近、Ｃｌａｒｋ及びその共同研究者ら１７は、ラット幹細胞によるヒト幹細胞由来の感覚ニューロンのミエリン形成の実証に成功した。それでも、ヒトシュワン細胞によるヒトｉＰＳＣ由来ニューロンのミエリン形成を示すイン・ビトロシステムは、依然としてとらえどころがない。
【０１８０】
過去数年間、多くの研究が神経膠細胞オルガノイドの作製に焦点を当て、イン・ビトロで脳様組織を作製していた１８〜２２。興味深いことに、全てのこれら戦略は、神経前駆細胞の集合体をより画成された神経構造体へと分化させることに焦点を当てていた。対照的に、本発明者らは、２種の分化した細胞型を組み合わせて、互いの間の相互作用及び自己組織化の可能性を評価することにより、このプロセスをリバースエンジニアリングした。イン・ビトロでの胚性後根神経節（ＤＲＧ）の成長を模倣するために、超低接着性９６ウェルプレートを用いてニューロン／シュワン細胞スフェロイドを生成させ、ＳＣのミエリン形成性表現型への分化にとって重要である軸索とＳＣ間のクロストーク２３、２４を促進させ、したがって、３次元スフェロイド中で軸索とＳＣとを互いに近接させることによって、クロスコミュニケーション及び良好なミエリン形成の可能性を高めた。抗酸化剤であるアスコルビン酸の添加に続いて、初代ヒトシュワン細胞による幹細胞由来ヒトニューロンのイン・ビトロミエリン形成の初の証拠を観測した。ｈＮ及びｈＳＣの両方において、自己組織化速度及びスフェロイドの作製速度は個別に異なっていたが、両者を組み合わせると、ｈＳＣは、ニューロンのみの条件と比較して品質を向上させ、且つスフェロイドの自己組織化の速度を向上させた。スフェロイドの径に基づいて、共培養スフェロイドは、ｈＮまたはｈＳＣのスフェロイドのいずれと比較してもよりコンパクトであることが判明し、このことは、これらの２種の細胞型間の相互作用が高められたことを示している。
【０１８１】
スフェロイドからのシュワン細胞の遊走
シュワン細胞の遊走は、発生及び損傷後の末梢神経再生の間の重要な現象である２５。神経堤細胞の運命をシュワン細胞前駆体に、最終的にはシュワン細胞に向ける手がかりはほとんど知られていない。しかしながら、前駆細胞とシュワン細胞の両方が、分化、増殖、及び機能的成熟に関して、伸長する軸索に依存していることは数十年前から知られている２６。本明細書において、本発明者らが初めて、ｈＮとｈＳＣから構成されるこのミニ神経節を作製することにより、イン・ビトロでのヒトの起源の組織へのこの遊走を観測することができた。軸索は、このプロセスで伸長する軸索に同調する、遊走するｈＳＣと連動して外側に伸長した。ｈＳＣは、約５ｍｍの全軸索伸長と比較して、スフェロイドの外側約１ｍｍまでしか遊走していなかったことを観測したことは興味深いことであった。このことは、通例ではより小さい２次元領域中に１００，０００個を超えるシュワン細胞を添加する一般的な２次元共培養実験１７、２７と比較して、これらの実験中に添加した、ニューロンと比較したｈＳＣの数が少ないことに起因する可能性がある。軸索伸長と比較して控えめなこのｈＳＣの伸長は、ミエリン形成前の期間が僅かに１週間であることと、培養の第１週の後に培地にＮＧＦを添加した結果である可能性もある。ＮＧＦによってニューロン−シュワン細胞間の相互作用及びミエリン形成も亢進することが明らかになっており２８、そのことから、ＮＧＦはＳＣの遊走を低下させる因子である可能性がある。上記スフェロイド外のヒトＳＣの遊走に基づいて、このＨＮｏａＣモデルは、治療薬分子の存在下でのＳＣの遊走の潜在的能力を研究するためにも使用することができ、したがって末梢神経損傷の患者に対する治療薬の候補を創出することができる。
【０１８２】
分裂促進因子及び成長因子に対するｈＳＣの反応性、ならびにｈＳＣがミエリン形成を再現することができないという点で、ｈＳＣは、ラットシュワン細胞と比較して、イン・ビトロで異なる挙動をすることが知られている２９。本発明者らのヒト神経の３次元スフェロイドモデルは、剖検または生検の処置で取得した神経において観測された神経幹の一般的な特徴を示した。軸索は、細胞骨格フィラメント及びミトコンドリアを含むオルガネラの完全な補体を有し、多くの場合（但し常にではい）、密接に近接したミエリン膜を特徴とするミエリンの鞘と関連付けられた。ミエリン層の接触（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）は神経線維の間で異なり、場合によっては、軸索の非存在下で層状ミエリンが形成され、これらの知見は両方とも、イン・ビボで採取された分化した神経ではめったに見られず、このことは、分化状態のいくつかの差異が培養において（予想どおりに）実際に起こることを示している。とはいえ、混合培養システムのミニ神経部分に十分な数の有髄軸索が観測され、これは混合体性神経（すなわち、密にミエリン形成した軸索、疎にミエリン形成した軸索、及び無髄軸索を含む体性神経）の好適な代替物になる。
【０１８３】
神経伝導速度（ＮＣＶ）の評価
様々な神経障害が、様々な種類の神経生理学的特徴を示すことで知られている３０。したがって、イン・ビトロでのマイクロエンジニアリングによる神経は、探索的な及び機構的な毒性学的研究を行うための手段として、電気生理学的変化を明らかにすることができるはずである。初めてヒトｉＰＳＣ由来のニューロンを用いて神経伝導を検討したこの研究では、有髄及び無髄ヒト軸索間での神経伝導速度（ＮＣＶ）の差異を確認でき、このことから、このシステムが神経機能を評価するのに十分に敏感であることがあきらかである。驚くべきことに、有髄ｈＮ／ｈＳＣ共培養物試料では、無髄のｈＮのみの単独培養物試料と比較して、ＮＣＶがより遅いことが明らかになった。この培養物の定性的な調査により、当該スフェロイド中のｈＳＣの数がＨＮｏａＣのチャネル中での伸長及び軸索密度を低下させていた可能性があり、それがＮＣＶの低下につながりやすいことが明らかになった。また、高ＳＣ（５０Ｋ及び７５Ｋ）密度の共培養物では、多くの軸索が折り返しているように見えたことから、ＮＣＶ計算に影響を与える可能性のある刺激を与えた点と記録した点との間の最適な長さを測定することができなかった。更に、共培養スフェロイド中に非神経細胞体が存在すると、適切に刺激された細胞体からの記録の確率が低下する。重要なことに、ｈＮからのＮＣＶは、ヒトの患者において得られたＮＣＶ値と比較してかなり低いことが判明した３１〜３３。これは、室温の、イン・ビボで評価した神経の成熟した有髄軸索と比較して成熟度が低いｉＰＳＣ由来のニューロンで構成されるイン・ビトロシステムを考慮すれば、特段驚くべきことではない。
【０１８４】
この全ヒトＮｏａＣシステムの単純な設計は、技術の橋渡しの研究において新しい道を開く。このプラットフォームは、臨床的に関連する電気生理学的及び組織病理学的メトリクスに基づいて薬物候補をスクリーニングするためだけでなく、中毒疾患、脱髄性疾患、及び他の神経変性疾患を含む、但しこれらに限定されない神経疾患を引き起こす基本的な機序の研究にも用いることができる。特定の処置または治療に関し、本発明者らの、概念的に同一なラットＮｏａＣ６及びヒトＮｏａＣから取得したデータを比較することにより、非臨床試験と、ヒトにおける反応及び潜在的な安全リスクを予測する本発明の能力との間のギャップを埋めるのに役立つこととなろう。
【０１８５】
引用文献
１  Ｈｕｈ，  Ｄ．，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｇ．  Ａ．  ＆  Ｉｎｇｂｅｒ，  Ｄ．  Ｅ．  Ｆｒｏｍ  ３Ｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｏ  ｏｒｇａｎｓ−ｏｎ−ｃｈｉｐｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１，  ７４５−７５４，  ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｔｃｂ．２０１１．０９．００５  （２０１１）．
２  Ｈｕｈ，  Ｄ．，  Ｔｏｒｉｓａｗａ，  Ｙ．−ｓ．，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｇ．  Ａ．，  Ｋｉｍ，  Ｈ．  Ｊ．  ＆  Ｉｎｇｂｅｒ，  Ｄ．  Ｅ．  Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂｉｏｍｉｍｉｃｒｙ：  Ｏｒｇａｎｓ−ｏｎ−Ｃｈｉｐｓ．  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ  １２，  ２１５６−２１６４，  ｄｏｉ：１０．１０３９／Ｃ２ＬＣ４００８９Ｈ  （２０１２）．
３  Ｐａｎｋｅｖｉｃｈ，  Ｄｉａｎａ  Ｅ．，  Ａｌｔｅｖｏｇｔ，  Ｂｒｕｃｅ  Ｍ．，  Ｄｕｎｌｏｐ，  Ｊ．，  Ｇａｇｅ，  Ｆｒｅｄ  Ｈ．  ＆  Ｈｙｍａｎ，  Ｓｔｅｖｅ  Ｅ．  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｎｅｕｒｏｎ  ８４，  ５４６−５５３，  ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１４．１０．００７  （２０１４）．
４  Ｂｅｓｐａｌｏｖ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｆａｉｌｅｄ  ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｄｏ  ｎｏｔ  ｎｅｃｅｓｓａｒｉｌｙ  ｉｎｖａｌｉｄａｔｅ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １５，  ５１６，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ．２０１６．８８
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｎｒｄ．２０１６．８８＃ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ−ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （２０１６）．
５  Ｈｕｖａｌ，  Ｒ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ．  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ  １５，  ２２２１−２２３２，  ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ４ｌｃ０１５１３ｄ  （２０１５）．
６  Ｐａｒａｓｔｏｏ，  Ｋ．，  Ａｓｈｗｉｎ，  Ｓ．，  Ｌａｕｒｅｎ，  Ａ．  Ｐ．，  Ｄａｎｉｅｌ，  Ｗ．  Ｓ．  ＆  Ｍｉｃｈａｅｌ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ３Ｄ  ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １５，  ０６４００１  （２０１８）．
７  Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｉｊｉ：  ａｎ  ｏｐｅｎ−ｓｏｕｒｃｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ−ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，  ６７６−６８２，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２０１９  （２０１２）．
８  Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，  Ｔ．  Ｋ．，  Ｋｌｅｉｔｍａｎ，  Ｎ．  ＆  Ｂｕｎｇｅ，  Ｒ．  Ｐ．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １１，  ２４３３−２４４２  （１９９１）．
９  Ｓｃａｒｐｉｎｉ，  Ｅ．，  Ｋｒｅｉｄｅｒ，  Ｂ．  Ｑ．，  Ｌｉｓａｋ，  Ｒ．  Ｐ．  ＆  Ｐｌｅａｓｕｒｅ，  Ｄ．  Ｅ．  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅｓ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １０２，  １６７−１７６，  ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／００１４−４８８６（８８）９００９０−８  （１９８８）．
１０  Ｓｃａｒｐｉｎｉ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｆｅｔａｌ  ｎｅｒｖｅｓ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４０，  ２６１−２６６，  ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０００６−８９９３（８８）９０９９４−８  （１９８８）．
１１  Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，  Ｔ．  Ｋ．，  Ｋｌｅｉｔｍａｎ，  Ｎ．  ＆  Ｂｕｎｇｅ，  Ｒ．  Ｐ．  Ｈｕｍａｎ  Ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  ＩＩ．  Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ａｘｏｎｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ２８，  １９０−２０１，  ｄｏｉ：１０．１００２／ｎｅｕ．４８０２８０２０６  （１９９５）．
１２  Ｐｏｒｔｅｒ，  Ｓ．，  Ｇｌａｓｅｒ，  Ｌ．  ＆  Ｂｕｎｇｅ，  Ｒ．  Ｐ．  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｙ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  Ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８４，  ７７６８  （１９８７）．
１３  Ｐｏｄｒａｔｚ，  Ｊ．  Ｌ．，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ｅ．  Ｈ．  ＆  Ｗｉｎｄｅｂａｎｋ，  Ａ．  Ｊ．  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ａｒｅ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ，  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｇｌｉａ  ４５，  ５４−５８，  ｄｏｉ：ｄｏｉ：１０．１００２／ｇｌｉａ．１０３０２  （２００４）．
１４  Ｗｉｎｄｅｂａｎｋ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｗｏｏｄ，  Ｐ．，  Ｂｕｎｇｅ，  Ｒ．  Ｐ．  ＆  Ｄｙｃｋ，  Ｐ．  Ｊ．  Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｃａｌｉｂｅｒ  ｏｆ  ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ５，  １５６３−１５６９  （１９８５）．
１５  Ｐａｉｖａｌａｉｎｅｎ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ／Ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌ  ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３７，  ５６８−５７８，  ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｃｎ．２００７．１２．００５  （２００８）．
１６  Ｌｅｈｍａｎｎ，  Ｈ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  Ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｔａｉｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ  ２１，  ４２３−４３１，  ｄｏｉ：１０．１０８９／ｓｃｄ．２０１０．０５１３  （２０１２）．
１７  Ｃｌａｒｋ，  Ａ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ．  Ｂｒａｉｎ  １４０，  ８９８−９１３，  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｒａｉｎ／ａｗｘ０１２  （２０１７）．
１８  Ｋｏｉｔｏ，  Ｈ．  ＆  Ｌｉ，  Ｊ．  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｎ  ａｎｄ  Ｇｌｉａ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ：  ＪｏＶＥ，  １３０４，  ｄｏｉ：１０．３７９１／１３０４  （２００９）．
１９  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，  Ｂ．  Ａ．  ＆  Ｗｅｉｓｓ，  Ｓ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．）  ２５５，  １７０７−１７１０  （１９９２）．
２０  Ｐａｓｃａ，  Ａ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ３Ｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，  ６７１−６７８，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３４１５  （２０１５）．
２１  Ｂａｅ，  Ｂ．  Ｉ．  ＆  Ｗａｌｓｈ，  Ｃ．  Ａ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．  Ｗｈａｔ  ａｒｅ  ｍｉｎｉ−ｂｒａｉｎｓ？  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．）  ３４２，  ２００−２０１，  ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４５８１２  （２０１３）．
２２  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  Ｍ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  ｍｏｄｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｃｅｐｈａｌｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５０１，  ３７３−３７９，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２５１７  （２０１３）．
２３  Ｓｕｌａｉｍａｎ，  Ｏ．  Ａ．  Ｒ．  ＆  Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｔ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ−  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  Ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，  ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｓｉｚｅ．  Ｇｌｉａ  ３２，  ２３４−２４６，  ｄｏｉ：ｄｏｉ：１０．１００２／１０９８−１１３６（２０００１２）３２：３＜２３４：：ＡＩＤ−ＧＬＩＡ４０＞３．０．ＣＯ；２−３  （２０００）．
２４  Ｓａｌｚｅｒ，  Ｊ．  Ｌ．  Ｓｃｈｗａｎｎ  Ｃｅｌｌ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，  ｄｏｉ：１０．１１０１／ｃｓｈｐｅｒｓｐｅｃｔ．ａ０２０５２９  （２０１５）．
２５  Ａｎｔｏｎ，  Ｅ．  Ｓ．，  Ｈａｄｊｉａｒｇｙｒｏｕ，  Ｍ．，  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，  Ｐ．  Ｈ．  ＆  Ｍａｔｔｈｅｗ，  Ｗ．  Ｄ．  ＣＤ９  ｐｌａｙｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １５，  ５８４  （１９９５）．
２６  Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，  Ａ．，  Ｂｒａｃｋｅｎｂｕｒｙ，  Ｒ．  ＆  Ｒａｔｎｅｒ，  Ｎ．  Ａｘｏｎｓ  ａｒｒｅｓｔ  ｔｈｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）  １２０，  １４１１−１４２０  （１９９４）．
２７  Ｚａｎａｚｚｉ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ／Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｓｃｈｗａｎｎ  Ｃｅｌｌ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５２，  １２８９  （２００１）．
２８  Ｃｈａｎ，  Ｊ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  ＮＧＦ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ａｘｏｎａｌ  Ｒｅｃｅｐｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｃｈｗａｎｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｏｒ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ．  Ｎｅｕｒｏｎ  ４３，  １８３−１９１，  ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２００４．０６．０２４  （２００４）．
２９  Ｍｏｎｊｅ，  Ｐ．  Ｖ．，  Ｓａｎｔ，  Ｄ．  ＆  Ｗａｎｇ，  Ｇ．  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｃｈｗａｎｎ  Ｃｅｌｌｓ  ａｓ  Ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  ＲＮＡ−ＳＥＱ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５５，  ６６３７−６６６０，  ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０３５−０１７−０８３７−３  （２０１８）．
３０  Ｆｕｌｌｅｒ，  Ｇ．  Ｈｏｗ  ｔｏ  ｇｅｔ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｏｕｔ  ｏｆ  ｎｅｒｖｅ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｍｙｏｇｒａｐｈｙ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ＆ａｍｐ；ａｍｐ；Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ７６，  ｉｉ４１  （２００５）．
３１  Ｂｕｃｈｔｈａｌ，  Ｆ．  ＆  Ｒｏｓｅｎｆａｌｃｋ，  Ａ．  Ｅｖｏｋｅｄ  ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｒｖｅｓ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３，  ｖ−１２２，  ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０００６−８９９３（６６）９００５６−４  （１９６６）．
３２  Ｐａｌｖｅ，  Ｓ．  Ｓ．  ＆  Ｐａｌｖｅ，  Ｓ．  Ｂ．  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  ｏｎ  Ｎｅｒｖｅ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｖｅｌｏｃｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｔｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｒｕｒａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ９，  １１２−１１６，  ｄｏｉ：１０．４１０３／ｊｎｒｐ．ｊｎｒｐ＿３２３＿１７  （２０１８）．
３３  Ｍａｌｌｉｋ，  Ａ．  ＆  Ｗｅｉｒ，  Ａ．  Ｉ．  Ｎｅｒｖｅ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ：  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ａｎｄ  ｐｉｔｆａｌｌｓ  ｉｎ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ＆ａｍｐ；ａｍｐ；Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ７６，  ｉｉ２３  （２００５）．
【０１８６】
実施例６：感覚シナプスモデル
【０１８７】
ラット後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンとラット脊髄の後角（ＤＨ）の細胞との共培養は既報である（Ｏｈｓｈｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；Ｖｉｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。共培養すると、上記ＤＲＧニューロンは後角細胞上にシナプス形成する。このラットＤＲＧからＤＨへのシナプスモデルの３次元形式での開発は、ヒト脊髄ＤＨ求心性感覚シナプスモデルの開発への第一歩となろう。
【０１８８】
この実験の重要な点は、ＤＲＧニューロンがＧｅｌＭＡを通って軸索を伸長し、ＤＨニューロン上にシナプス形成することである。研究室における過去の実験では、脊髄スフェロイドの成長はゲルの剛性によって制御することができ、ＧｅｌＭａ中ではうまく成長しないことが明らかになっている。本発明者らは、この特徴を用いて、ＤＨ軸索がＧｅｌＭＡ中には伸長しないが、複合活動電位（ＣＡＰ）を記録することができるマトリゲル全体を通して伸長する、一方向性神経回路の作製を目指す。
【０１８９】
上記後角及びＤＲＧは、胚性１５日齢ラットの脊髄から単離し、解離させた。次いで細胞を９６ウェルＵ字底プレート中のスフェロイド培養物中で個別に培養した。播種の２日後、スフェロイドが形成され、次にこれを、３次元でのニューロンの成長を可能にするために二重ヒドロゲル構築物中に配置した（図４８のＡ）。ＤＲＧを上記構築物の底部の鍵穴中のＧｅｌＭＡ中に配置した一方、ＤＨスフェロイドを中央の鍵穴中のマトリゲル中に配置した。この培養物をβ３−チューブリンで染色すると、２８ＤＩＶで培養物中の両方のスフェロイドから軸索が伸長していることが確認された（図４８のＢ）。刺激用電極はＤＲＧ軸索上に配置し、ＣＡＰの記録はＤＨスフェロイドでとった。この距離は、この培養物に関する上記電極間でのこの距離はで３．１ｍｍと測定された（図４８のＣ）。ＣＡＰの記録曲線の例は、ＤＲＧ軸索を刺激したときのＤＨスフェロイドにおける応答を示していた（図４８のＤ）。これは、ＤＲＧが、ＤＨニューロンであって、該ＤＨニューロンからのＣＡＰ応答を記録する上記ＤＨニューロン上にシナプス形成し、且つ該ＤＨニューロンを活性化していることを示唆する。更なる実験では、これらのシナプスの形成を確認し、このモデルをヒト形式に変換することに焦点を当てることとなる。
【０１９０】
Ｏｈｓｈｉｒｏ  Ｈ，  Ｏｇａｗａ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｓｈｉｎｊｏ  Ｋ．  Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｏｒｓａｌ  ｈｏｒｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｍａｇｉｎｇ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２００７，  １６５：  ４９−５４．
【０１９１】
Ｖｉｋｍａｎ  Ｋ，  Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ  Ｅ，  Ｋｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ  Ｋ，  ａｎｄ  Ｈｉｌｌ  Ｒ．  Ａ  ｔｗｏ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１；１０５：  １７５−１８４．
【図１】
2021505193.tif 000111
【図２】
2021505193.tif 000112
【図３】
2021505193.tif 000113
【図４】
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【図５】
2021505193.tif 000115
【図６】
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【図７】
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【図８】
2021505193.tif 000118
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【配列表】
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【誤訳訂正書】
【提出日】令和2年9月15日(2020.9.15)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞、神経節、幹細胞、免疫細胞、後根神経節、及び三叉神経節から選択される細胞ならびに／もしくは組織の１種または組み合わせを含む細胞のスフェロイドを含む組成物。
【請求項２】
前記スフェロイドが、グリア細胞、胚細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞由来の細胞、交感ニューロン、副交感ニューロン、脊髄運動ニューロン、中枢神経系ニューロン、末梢神経系ニューロン、腸管神経系ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロン、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、介在ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、三叉神経節、星状細胞、乏突起膠細胞、シュワン細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、放射状グリア細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞、下垂体細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及びそれらの組み合わせから選択される１種以上の細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記神経細胞が、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選択される幹細胞に由来する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
（ａ）前記スフェロイドの径が約２００ミクロン〜約７００ミクロンであり；
（ｂ）前記スフェロイドが、
（ｉ）神経細胞及び１種以上のシュワン細胞を、１個のシュワン細胞当り約４個の神経細胞に等しい細胞型の比で；または
（ｉｉ）神経細胞及び１種以上の星状細胞を、１個の星状細胞当り約４個の神経細胞の比で；または
（ｉｉｉ）神経細胞及び１種以上のシュワン細胞を、１個のシュワン細胞当り約１０個の神経細胞の比で；または
（ｉｖ）神経細胞及び１種以上のグリア細胞を、１個のグリア細胞当り約４個の神経細胞に等しい比で、
の１つ以上を含む、
請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記スフェロイドが、人工多能性幹細胞から分化した１種以上の細胞を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記スフェロイドが、人工多能性幹細胞、未分化幹細胞及び／または免疫細胞を含まない、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記スフェロイドが、約３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２２５，０００、または２５０，０００個以上の細胞を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
（ｉ）ヒドロゲルを備える細胞培養容器と、
（ｉｉ）１種以上の神経細胞及び／または単離された組織外植片を含む１個以上のスフェロイドと、
（ｉｉｉ）電流発生器を備える増幅器と、
（ｉｖ）電圧計及び／または電流計と、
（ｖ）少なくとも第１の刺激用電極及び少なくとも第１の記録用電極と
を備えるシステムであって、
前記増幅器と、電圧計及び／または電流計と、電極とが、電流が前記増幅器から前記少なくとも１つの刺激用電極に供給され、電流が前記記録用電極で受け取られ、前記電圧計及び／または電流計に供給される回路を介して、互いに電気的に接続されており、前記細胞培養容器全体にわたって電場が確立されるように、前記刺激用電極が、前記神経細胞及び／または単離された組織外植片の１個以上の細胞体にあるいはそれに近接して配置され、前記記録用電極が、前記細胞体に対して遠位の所定の距離に配置される
前記システム。
【請求項９】
前記培養容器が、１種以上の単離されたシュワン細胞または１種以上の乏突起膠細胞が、前記１種以上の単離された組織外植片及び／または前記１種以上の神経細胞からの軸索伸長に対してミエリンを蓄積させるように、前記組織外植片及び／もしくは神経細胞に十分近接した前記シュワン細胞ならびに／または前記乏突起膠細胞を備える９６、１９２、３８４個、またはそれを超える内部チャンバを含む、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
固体基材であって、その上に前記ヒドロゲルマトリクスが架橋されている前記固体基材を更に備え、前記固体基材が、約１ミクロン〜約５ミクロンの径の細孔を有する少なくとも１つのプラスチック表面を備える、請求項８または９に記載のシステムであって、必要に応じて、
（ａ）前記固体基材が連続する外表面と内表面とを備え、かかる固体基材は、円筒形または実質的に円筒形の少なくとも１つの部分と、少なくとも１つの中空の内部であって、前記中空の内部の端部において、前記内表面の少なくとも１つの部分によって画成された前記中空の内部とを備え、前記内表面は、径が約０．１ミクロン〜約１．０ミクロンの１つ以上の細孔を備え、前記固体基材の前記中空の内部は、前記固体基材の外部の点から少なくとも１つの開口部を通してアクセス可能であり；前記中空の内部部分は、前記開口部に近接した第１の部分と、前記開口部の遠位の少なくとも第２の部分とを備え；前記１種以上の神経細胞及び／または前記１種以上の組織外植片は、前記中空の内部の前記第１の部分にまたはそれに近接して配置され、前記ヒドロゲルマトリクスと物理的に接触しており；前記少なくとも１つの中空の内部の前記第２の部分は、軸索が、前記１種以上の神経細胞及び／または前記１種以上の組織外植片から前記中空の内部の前記第２の内部部分中へと成長できるように、前記第１の部分と流体連通している、かつ／または
（ｂ）前記固体基材の少なくとも一部が、前記固体基材の前記内表面の少なくとも一部が、前記スフェロイドが配置されている円筒形または実質的に円筒形の中空の内部チャンバを画成するように円筒形または実質的に円筒形である、
システム。
【請求項１１】
前記ヒドロゲルが、
（ａ）少なくとも、第１の細胞が貫入不能なポリマー及び第１の細胞が貫入可能なポリマー；
（ｂ）少なくとも、約１５％以下のＰＥＧを含む細胞が貫入不能なポリマー、及び約０．０５％〜約１．００％の、ＲＡＤ  １６−Ｉ、ＲＡＤ  １６−ＩＩ、ＥＡＫ  １６−Ｉ、ＥＡＫ１６−ＩＩ、及びｄＥＡＫ  １６から選択される自己組織化性ペプチドの１種または組み合わせを含む細胞が貫入可能なポリマー；
（ｃ）第１の領域及び第２の領域を備え、前記第１の領域が、円柱または直方体であって、その長手方向の軸が前記細胞培養容器の上面及び底面を貫通する方向を向いた前記円柱または直方体の形状に形成され、前記円柱または直方体のそれぞれが、前記円柱または直方体の内表面によって画成される空間を備え、前記空間及び前記細胞培養容器の上面を貫く１つ以上の開口部によりアクセス可能であり；前記第２の領域が、前記第１の領域に隣接し、且つ第１の領域と流体連通する、その側部に開口部を有する、第２の領域の内壁の形状に形成された空間；及び／または
（ｄ）少なくとも１％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
を含む、請求項７〜１０のいずれかに記載のシステム。
【請求項１２】
前記ヒドロゲルが、一連のチャネルによって互いに流体連通する一連の２つ以上の空洞を備え、少なくとも１つの空洞がスフェロイドを備え、少なくとも第２の空洞が第２のスフェロイド、細胞の懸濁液、またはＤＲＧを備え、前記スフェロイド及び前記第２のスフェロイド、細胞の懸濁液、またはＤＲＧが３次元軸索によって連結されている、請求項７〜１１のいずれかに記載のシステム。
【請求項１３】
（ａ）前記３次元軸索の高さが、その最低点において少なくとも約１０ミクロンであるか、または少なくとも細胞単層の３層である；かつ／または
（ｂ）前記空洞が、前記固体基材の水平なもしくは実質的に水平な面に配置されたＵ字形または円形のウェルを有するウェルであり、各チャネルが１個以上のスフェロイドに連結した１個以上の軸索を備える、
請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
（ａ）
（ｉ）１種以上の神経細胞、及び／または
（ｉｉ）１種以上のシュワン細胞または乏突起膠細胞
を含む第１のスフェロイドと、
（ｉ）１種以上の末梢ニューロン
を含む第２のスフェロイドと
を備え、
各スフェロイドが前記空洞中に配置されている；または
（ｂ）第１、第２、及び第３の空洞であって、それぞれがスフェロイド及び少なくとも５０マイクロリットルの細胞培養培地を保持するように構成された前記空洞を備え、前記第１の空洞が前記第２の空洞の近位に且つ前記第３の空洞の遠位に配置されるように、前記空洞が整列しており、必要に応じて、
（ｉ）少なくとも第４の空洞をさらに備え、各空洞が正方形の角を画定するようなパターンで空洞が配置される；もしくは
（ｉｉ）前記空洞が、前記第１の空洞中の前記第１のスフェロイドから生じた軸索が前記第２の空洞まで伸長し、前記第２の空洞中の前記スフェロイドからの軸索が前記第３の空洞中の軸索まで伸長するように一列に整列している、
請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
固体基材を備える培養容器中における、１個以上のスフェロイドの３次元培養物の製造方法であって、
（ａ）１種以上の神経細胞を、前記固体基材であって、少なくとも１つの外表面、少なくとも１つの内表面、及び前記少なくとも１つの内表面によって画成され、且つ少なくとも１つの開口部を通して前記固体基材の外部の点からアクセス可能な少なくとも１つの内部チャンバを備える前記固体基材に接触させることと、
（ｂ）神経細胞、及び／または単離された後根神経節、脊髄外植片、網膜外植片、及び皮質外植片の１種または組み合わせから選択される組織外植片を含む１個以上のスフェロイドを、前記少なくとも１つの内部チャンバに配置することと、
（ｃ）細胞培地を、前記少なくとも１個のスフェロイドを覆うのに十分な量の細胞培地によって前記培養容器中に印加することと
を含み、
前記内表面の少なくとも一部が、第１の細胞が貫入不能なポリマー及び第１の細胞が貫入可能なポリマーを備える前記方法。
【請求項１６】
前記スフェロイドが、
（ａ）任意選択で幹細胞に由来する、運動ニューロン、感覚ニューロン、交感神経ニューロン、副交感神経ニューロン、皮質ニューロン、脊髄ニューロン、末梢ニューロンの１種または組み合わせから選択される神経細胞の懸濁液として形成される；且つ／または
（ｂ）単離されたシュワン細胞及び／または乏突起膠細胞を更に含む、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）（ｄ）前記スフェロイドに、ステップ（ｃ）の後に約１２時間〜約１年間、神経突起及び／または軸索を成長させるステップを更に含む；且つ／または
（ｂ）
（ｉ）ステップ（ａ）の前に試料から１種以上の神経細胞を単離するステップ、及び／または
（ｉｉ）前記１個以上のスフェロイドが後根神経節（ＤＲＧ）を含む場合、ステップ（ｂ）の前に１種以上の哺乳動物からＤＲＧを単離するステップ、及び／または
（ｉｉｉ）前記１個以上のスフェロイドがシュワン細胞または乏突起膠細胞を含む場合、１種以上のシュワン細胞及び／または１種以上の乏突起膠細胞を単離するステップを更に含む；且つ／または
（ｃ）前記刺激用電極に電流を導入した際に、前記記録用電極が、前記記録用電極において測定することができる１種以上の電気生理学的メトリクスに対応する信号を受信できるように、少なくとも１つの刺激用電極を前記１種以上の神経細胞または組織外植片の細胞体にまたはそれに近接して配置することと、少なくとも１つの記録用電極を、軸索にまたはそれに近接して、前記細胞体から最も遠位の点で配置することと、を更に含み、前記１種以上の電気生理学的メトリクスが、電気伝導速度、活動電位、１種以上の神経細胞の膜に沿った電気インパルスの通過に伴う波の振幅、１種以上の神経細胞の膜に沿った電気インパルスの幅、１種以上の神経細胞の膜に沿った前記電気インパルスの潜時、及び１種以上の神経細胞の膜に沿った前記電気インパルスのエンベロープの１種または組み合わせである、
請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）請求項１〜４のいずれかに記載の組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）少なくとも１種の薬剤を前記１個以上のスフェロイドに曝露することと、
（ｃ）前記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化及び／もしくは１種以上の電気生理学的メトリクスを測定及び／または観測することと
を含み；
必要に応じて、前記１個以上のスフェロイドの１種以上の１種以上の形態計測上の変化及び／または１種以上の電気生理学的メトリクスを前記薬剤の毒性と相関させ、その結果、前記形態計測上の変化及び／または電気生理学的メトリクスが、細胞生存率が低下することを示す場合には、前記薬剤は有毒であると特徴付けられ、前記形態計測上の変化及び／または電気生理学的メトリクスが、細胞生存率が変化しないまたは増加することを示す場合には、前記薬剤は無毒及び／または神経保護作用があると特徴付けられることを更に含む、
薬剤の毒性ならびに／あるいは神経保護作用の評価方法。
【請求項１９】
１個以上のスフェロイドの１個以上の軸索のミエリン形成または脱ミエリン形成の判定方法であって、
（ａ）少なくとも１個の軸索を成長させるのに十分な時間及び条件下、薬剤の存在下または非存在下で、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）前記１個以上のスフェロイド由来の１個以上の軸索におけるミエリン形成の量を検出することと
を含み、
検出することが任意選択で、
（ｉ）薬剤の存在下または非存在下において、前記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化及び／もしくは１種以上の電気生理学的メトリクスを測定及び／または観測するステップと、
（ｉｉ）薬剤の存在下または非存在下における、前記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化及び／もしくは１種以上の電気生理学的メトリクスを、前記スフェロイドのミエリン形成の定量的または定性的変化と相関させるステップと
を含む前記方法。
【請求項２０】
（ａ）１個以上のスフェロイド及び／もしくはスフェロイドから成長した軸索の数または密度を定量化することと、
（ｂ）請求項１〜４のいずれかに記載の組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｃ）前記スフェロイドを、前記スフェロイド中で前記１個以上の軸索を成長させるまたは細胞を成長させるのに十分な期間培養した後で、前記スフェロイド内の細胞の数及び／または前記組成物中のスフェロイドから成長した軸索の数もしくは密度を計算することと
を含み、
ステップ（ｂ）が任意選択で、前記１個以上のスフェロイドを１種以上の薬剤と接触させることを含み、
ステップ（ｃ）が任意選択で、１個以上のスフェロイドを培養した後で、かかる１個以上のスフェロイドの内部及び／もしくは外部の記録を検出することと、前記記録を既知のもしくは対照の数の細胞に対応する同様の記録の測定値と相関させることとを含むか、または、
ステップ（ｃ）が任意選択で、
（ｉ）前記１個以上のスフェロイドを１種以上の薬剤と接触させる前記ステップの前後における細胞内及び／もしくは細胞外の記録ならびに／または形態計測上の変化を測定する更なるステップと、
（ｉｉ）前記１個以上のスフェロイドを前記１種以上の薬剤と接触させた後の、前記記録及び／もしく形態計測上の変化に対する前記１個以上のスフェロイドを前記１種以上の薬剤と接触させる前の、前記記録及び／もしく形態計測上の変化の差異を、細胞数及び／または軸索の数または密度の変化と相関させるステップと
を含む、神経細胞成長及び／または軸索変性の検出ならびに／あるいは定量化方法。
【請求項２１】
薬剤の神経調節作用の測定または定量方法であって、
（ａ）前記薬剤の存在下及び非存在下で、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）前記薬剤の存在下及び非存在下で、前記１個以上のスフェロイド全体にわたって電位を印加することと、
（ｃ）前記薬剤の存在下及び非存在下で、前記１個以上のスフェロイドからの１種以上の電気生理学的メトリクスを測定することと、
（ｄ）前記１個以上のスフェロイドによる１種以上の電気生理学的メトリクスの前記差異を前記薬剤の神経調節作用と相関させ、その結果、前記薬剤の存在下での電気生理学的メトリクスが前記薬剤の非存在下で測定された前記電気生理学的メトリクスと比較して変化することが神経調節作用を示し、前記薬剤の存在下での電気生理学的メトリクスが前記薬剤の非存在下で測定された前記電気生理学的メトリクスと比較して変化しないことが、前記薬剤が神経調節作用を与えないことを示すことと
を含むか、または、
（ａ）前記薬剤の存在下及び非存在下で、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）前記薬剤の存在下及び非存在下で、前記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化を測定及び／もしくは観測することと、
（ｃ）前記１種以上の形態計測上の変化を前記薬剤の神経調節作用と相関させ、その結果、前記薬剤の存在下での形態学的メトリクスが前記薬剤の非存在下で測定及び／もしくは観測される前記形態学的メトリクスと比較して変化することが神経調節作用を示し、前記薬剤の存在下での形態学的メトリクスが前記薬剤の非存在下で測定及び／もしくは観測される前記形態学的メトリクスと比較して変化しないことが、前記薬剤が神経調節作用を与えないことを示すことと
を含む前記方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３１】
本開示はまた、薬剤の神経調節作用の測定または定量方法であって、
（ａ）上記薬剤の存在下及び非存在下で、本明細書に開示のいずれかの組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）上記薬剤の存在下及び非存在下で、上記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化を測定及び／もしくは観測することと、
（ｃ）上記１種以上の形態計測上の変化を上記薬剤の神経調節作用と相関させ、その結果、上記薬剤の存在下での形態学的メトリクスが上記薬剤の非存在下で測定及び／もしくは観測される上記形態学的メトリクスと比較して変化することが神経調節作用を示し、上記薬剤の存在下での形態学的メトリクスが上記薬剤の非存在下で測定及び／もしくは観測される上記形態学的メトリクスと比較して変化しないことが、上記薬剤が神経調節作用を与えないことを示すことと
を含む上記方法にも関する。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
神経細胞、神経節、幹細胞、及び免疫細胞から選択される細胞ならびに／もしくは組織の１種または組み合わせを含む細胞のスフェロイドを含む組成物。
（項目２）
前記スフェロイドが後根神経節及び三叉神経節から選択される組織を含む、項目１記載の組成物。
（項目３）
前記スフェロイドが、グリア細胞、胚細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞由来の細胞、交感ニューロン、副交感ニューロン、脊髄運動ニューロン、中枢神経系ニューロン、末梢神経系ニューロン、腸管神経系ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロン、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、介在ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、三叉神経節、星状細胞、乏突起膠細胞、シュワン細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、放射状グリア細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞、下垂体細胞、及びそれらの組み合わせから選択される１種以上の細胞を含む、項目１または２に記載の組成物。
（項目４）
前記スフェロイドが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、星状細胞、及びそれらの組み合わせから選択される１種以上の免疫細胞を含む、項目１〜３のいずれかに記載の組成物。
（項目５）
前記スフェロイドが、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される１種以上の幹細胞を含む、項目１〜４のいずれかに記載の組成物。
（項目６）
前記神経細胞が、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選択される幹細胞に由来する、項目１〜５のいずれかに記載の組成物。
（項目７）
前記スフェロイドの径が約２００ミクロン〜約７００ミクロンである、項目１〜６のいずれかに記載の組成物。
（項目８）
前記スフェロイドが、１種以上の神経細胞及び１種以上のシュワン細胞を、１個のシュワン細胞当り約４個の神経細胞に等しい細胞型の比で含む、項目１〜７のいずれかに記載の組成物。
（項目９）
前記スフェロイドが、１種以上の神経細胞及び１種以上の星状細胞を、１個の星状細胞当り約４個の神経細胞の比で含む、項目１〜８のいずれかに記載の組成物。
（項目１０）
前記スフェロイドが、１種以上の神経細胞及び１種以上の星状細胞を、１個の星状細胞当り約１個の神経細胞の比で含む、項目１〜９のいずれかに記載の組成物。
（項目１１）
前記スフェロイドが、１種以上の神経細胞及び１種以上のシュワン細胞を、１個のシュワン細胞当り約１０個の神経細胞の比で含む、項目１〜１０のいずれかに記載の組成物。
（項目１２）
前記スフェロイドが、１種以上の神経細胞及び１種以上のグリア細胞を、１個のグリア細胞当り約４個の神経細胞に等しい比で含む、項目１〜１１のいずれかに記載の組成物。
（項目１３）
前記細胞のいずれか１種以上が人工多能性幹細胞から分化している、項目１〜１２のいずれかに記載の組成物。
（項目１４）
前記スフェロイドが人工多能性幹細胞及び／または免疫細胞を含まない、項目１〜１３のいずれかに記載の組成物。
（項目１５）
前記スフェロイドが未分化幹細胞を含まない、項目１〜１４のいずれかに記載の組成物。
（項目１６）
前記スフェロイドが、約３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２２５，０００、または２５０，０００個以上の細胞を含む、項目１〜１５のいずれかに記載の組成物。
（項目１７）
前記スフェロイドが７５，０００個以上の細胞を含む、項目１〜１６のいずれかに記載の組成物。
（項目１８）
前記スフェロイドが１種以上の磁性粒子を更に含む、項目１〜１７のいずれかに記載の組成物。
（項目１９）
（ｉ）ヒドロゲルを備える細胞培養容器と、
（ｉｉ）１種以上の神経細胞及び／または単離された組織外植片を含む１個以上のスフェロイドと、
（ｉｉｉ）電流発生器を備える増幅器と、
（ｉｖ）電圧計及び／または電流計と、
（ｖ）少なくとも第１の刺激用電極及び少なくとも第１の記録用電極と
を備えるシステムであって、
前記増幅器と、電圧計及び／または電流計と、電極とが、電流が前記増幅器から前記少なくとも１つの刺激用電極に供給され、電流が前記記録用電極で受け取られ、前記電圧計及び／または電流計に供給される回路を介して、互いに電気的に接続されており、
前記細胞培養容器全体にわたって電場が確立されるように、前記刺激用電極が、前記神経細胞及び／または単離された組織外植片の１個以上の細胞体にあるいはそれに近接して配置され、前記記録用電極が、前記細胞体に対して遠位の所定の距離に配置される
前記システム。
（項目２０）
前記スフェロイドが項目１〜１８のいずれか１項に記載のスフェロイドである、項目１９に記載のシステム。
（項目２１）
前記培養容器が、９６、１９２、３８４個、もしくはそれを超える内部チャンバを備える、項目１９または２０に記載のシステム。
（項目２２）
前記９６、１９２、３８４個、またはそれを超える内部チャンバが、１種以上の単離されたシュワン細胞または１種以上の乏突起膠細胞が、前記１種以上の単離された組織外植片及び／または前記１種以上の神経細胞からの軸索伸長に対してミエリンを蓄積させるように、前記組織外植片及び／もしくは神経細胞に十分近接した前記シュワン細胞ならびに／または前記乏突起膠細胞を備える、項目２１に記載のシステム。
（項目２３）
固体基材であって、その上に前記ヒドロゲルマトリクスが架橋されている前記固体基材を更に備え、前記固体基材が、約１ミクロン〜約５ミクロンの径の細孔を有する少なくとも１つのプラスチック表面を備える、項目１９〜２２のいずれかに記載のシステム。
（項目２４）
前記固体基材が連続する外表面と内表面とを備え、かかる固体基材は、円筒形または実質的に円筒形の少なくとも１つの部分と、少なくとも１つの中空の内部であって、前記中空の内部の端部において、前記内表面の少なくとも１つの部分によって画成された前記中空の内部とを備え、前記内表面は、径が約０．１ミクロン〜約１．０ミクロンの１つ以上の細孔を備え、
前記固体基材の前記中空の内部は、前記固体基材の外部の点から少なくとも１つの開口部を通してアクセス可能であり、
前記中空の内部部分は、前記開口部に近接した第１の部分と、前記開口部の遠位の少なくとも第２の部分とを備え、
前記１種以上の神経細胞及び／または前記１種以上の組織外植片は、前記中空の内部の前記第１の部分にまたはそれに近接して配置され、前記ヒドロゲルマトリクスと物理的に接触しており、
前記少なくとも１つの中空の内部の前記第２の部分は、軸索が、前記１種以上の神経細胞及び／または前記１種以上の組織外植片から前記中空の内部の前記第２の内部部分中へと成長できるように、前記第１の部分と流体連通している、
項目２３に記載のシステム。
（項目２５）
前記組成物がスポンジを含まない、項目１９〜２４のいずれかに記載のシステム。
（項目２６）
前記ヒドロゲルが、少なくとも、第１の細胞が貫入不能なポリマー及び第１の細胞が貫入可能なポリマーを含む、項目１９〜２５のいずれかに記載のシステム。
（項目２７）
前記少なくとも１種の、細胞が貫入不能なポリマーが含むＰＥＧが約１５％以下であり、前記少なくとも１種の、細胞が貫入可能なポリマーが、約０．０５％〜約１．００％の、ＲＡＤ  １６−Ｉ、ＲＡＤ  １６−ＩＩ、ＥＡＫ  １６−Ｉ、ＥＡＫ１６−ＩＩ、及びｄＥＡＫ  １６から選択される自己組織化性ペプチドの１種または組み合わせを含む、項目２６に記載のシステム。
（項目２８）
前記組成物がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含まない、項目１９〜２４のいずれかに記載のシステム。
（項目２９）
前記ヒドロゲルが第１の領域及び第２の領域を備え、前記第１の領域が、円柱または直方体であって、その長手方向の軸が前記細胞培養容器の上面及び底面を貫通する方向を向いた前記円柱または直方体の形状に形成され、前記円柱または直方体のそれぞれが、前記円柱または直方体の内表面によって画成される空間を備え、前記空間及び前記細胞培養容器の上面を貫く１つ以上の開口部によりアクセス可能であり；
前記第２の領域が、前記第１の領域に隣接し、且つ第１の領域と流体連通する、その側部に開口部を有する、第２の領域の内壁の形状に形成された空間を備える、
項目１９〜２８のいずれかに記載のシステム。
（項目３０）
ミリリットル当り約５〜約２０ピコグラムの濃度の神経成長因子（ＮＧＦ）及び／または約０．００１重量／体積％〜約０．０１重量／体積％の範囲の濃度のアスコルビン酸を含む細胞培地を更に備える、項目１９〜２９のいずれかに記載のシステム。
（項目３１）
前記１個以上のスフェロイドが、グリア細胞、胚細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞由来の細胞、交感ニューロン、副交感ニューロン、脊髄運動ニューロン、中枢神経系ニューロン、末梢神経系ニューロン、腸管神経系ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロン、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、介在ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、三叉神経節ニューロン、星状細胞、乏突起膠細胞、シュワン細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、放射状グリア細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞、及び下垂体細胞から選択される細胞の少なくとも１種または組み合わせ含む、項目１９〜３０のいずれかに記載のシステム。
（項目３２）
幹細胞、多能性細胞、筋芽細胞、及び骨芽細胞の１種以上を更に備える、項目１９〜３１のいずれかに記載のシステム。
（項目３３）
前記１種以上の神経細胞が、哺乳動物の末梢神経系由来の初代哺乳動物細胞を含む、項目１９〜３２のいずれかに記載のシステム。
（項目３４）
前記ヒドロゲルが少なくとも１％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、項目１９〜３３のいずれかに記載のシステム。
（項目３５）
前記スフェロイドが約３、３０、９０、または３６５日以上培養されている、項目１９〜３４のいずれかに記載のシステム。
（項目３６）
前記固体基材の少なくとも一部が、前記固体基材の前記内表面の少なくとも一部が、前記スフェロイドが配置されている円筒形または実質的に円筒形の中空の内部チャンバを画成するように円筒形または実質的に円筒形である、項目１９〜３５のいずれかに記載のシステム。
（項目３７）
前記１個以上のスフェロイドが、幅が約１００ミクロン〜約５００ミクロン、長さが約０．１１〜約１０，０００ミクロンの軸索成長を有する１種以上の神経細胞を含む、項目１９〜３６のいずれかに記載のシステム。
（項目３８）
前記ヒドロゲルが、一連のチャネルによって互いに流体連通する一連の２つ以上の空洞を備え、少なくとも１つの空洞がスフェロイドを備え、少なくとも第２の空洞が第２のスフェロイド、細胞の懸濁液、またはＤＲＧを備え、前記スフェロイド及び前記第２のスフェロイド、細胞の懸濁液、またはＤＲＧが３次元軸索によって連結されている、項目１９〜３７のいずれかに記載のシステム。
（項目３９）
前記３次元軸索の高さが、その最低点において少なくとも約１０ミクロンであるか、または少なくとも細胞単層の３層である、項目３８に記載のシステム。
（項目４０）
前記空洞が、前記固体基材の水平なもしくは実質的に水平な面に配置されたＵ字形または円形のウェルを有するウェルであり、各チャネルが１個以上のスフェロイドに連結した１個以上の軸索を備える、項目３８に記載のシステム。
（項目４１）
（ｉ）１種以上の神経細胞、及び／または
（ｉｉ）１種以上のシュワン細胞または乏突起膠細胞
を含む第１のスフェロイドと、
（ｉ）１種以上の末梢ニューロン
を含む第２のスフェロイドと
を備え、
各スフェロイドが前記空洞中に配置されている、項目４０に記載のシステム。
（項目４２）
第１、第２、及び第３の空洞であって、それぞれがスフェロイド及び少なくとも５０マイクロリットルの細胞培養培地を保持するように構成された前記空洞を備え、
前記第１の空洞が前記第２の空洞の近位に且つ前記第３の空洞の遠位に配置されるように、前記空洞が整列している、
項目４０記載のシステム。
（項目４３）
少なくとも第４の空洞を備え、各空洞が正方形の角を画定するようなパターンで空洞が配置された、項目４２に記載のシステム。
（項目４４）
前記空洞が、前記第１の空洞中の前記第１のスフェロイドから生じた軸索が前記第２の空洞まで伸長し、前記第２の空洞中の前記スフェロイドからの軸索が前記第３の空洞中の軸索まで伸長するように一列に整列している、項目４２に記載のシステム。
（項目４５）
固体基材を備える培養容器中における、１個以上のスフェロイドの３次元培養物の製造方法であって、
（ａ）１種以上の神経細胞を、前記固体基材であって、少なくとも１つの外表面、少なくとも１つの内表面、及び前記少なくとも１つの内表面によって画成され、且つ少なくとも１つの開口部を通して前記固体基材の外部の点からアクセス可能な少なくとも１つの内部チャンバを備える前記固体基材に接触させることと、
（ｂ）神経細胞を含む１個以上のスフェロイドを、前記少なくとも１つの内部チャンバに配置することと、
（ｃ）細胞培地を、前記少なくとも１個のスフェロイドを覆うのに十分な量の細胞培地によって前記培養容器中に印加することと
を含み、
前記内表面の少なくとも一部が、第１の細胞が貫入不能なポリマー及び第１の細胞が貫入可能なポリマーを備える前記方法。
（項目４６）
ステップ（ｂ）が、単離された後根神経節、脊髄外植片、網膜外植片、及び皮質外植片の１種または組み合わせから選択される組織外植片を含むスフェロイドを配置することを含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記スフェロイドが、任意選択で幹細胞に由来する、運動ニューロン、感覚ニューロン、交感神経ニューロン、副交感神経ニューロン、皮質ニューロン、脊髄ニューロン、末梢ニューロンの１種または組み合わせから選択される神経細胞の懸濁液として形成される、項目４５または項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記スフェロイドが、単離されたシュワン細胞及び／または乏突起膠細胞を更に含む、項目４５〜４７のいずれかに記載の方法。
（項目４９）
（ｄ）前記スフェロイドに、ステップ（ｃ）の後に約１２時間〜約１年間、神経突起及び／または軸索を成長させるステップを更に含む、項目４５〜４８のいずれかに記載の方法。
（項目５０）
（ｉ）ステップ（ａ）の前に試料から１種以上の神経細胞を単離するステップ、及び／または
（ｉｉ）前記１個以上のスフェロイドが後根神経節（ＤＲＧ）を含む場合、ステップ（ｂ）の前に１種以上の哺乳動物からＤＲＧを単離するステップ、及び／または
（ｉｉｉ）前記１個以上のスフェロイドがシュワン細胞または乏突起膠細胞を含む場合、１種以上のシュワン細胞及び／または１種以上の乏突起膠細胞を単離するステップ
を更に含む、項目４５〜４９のいずれかに記載の方法。
（項目５１）
前記刺激用電極に電流を導入した際に、前記記録用電極が、前記記録用電極において測定することができる１種以上の電気生理学的メトリクスに対応する信号を受信できるように、
少なくとも１つの刺激用電極を前記１種以上の神経細胞または組織外植片の細胞体にまたはそれに近接して配置することと、
少なくとも１つの記録用電極を、軸索にまたはそれに近接して、前記細胞体から最も遠位の点で配置することと
を更に含み、
前記１種以上の電気生理学的メトリクスが、電気伝導速度、活動電位、１種以上の神経細胞の膜に沿った電気インパルスの通過に伴う波の振幅、１種以上の神経細胞の膜に沿った電気インパルスの幅、１種以上の神経細胞の膜に沿った前記電気インパルスの潜時、及び１種以上の神経細胞の膜に沿った前記電気インパルスのエンベロープの１種または組み合わせである、
項目４５〜５０のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
（ａ）項目１〜１８のいずれかに記載の組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）少なくとも１種の薬剤を前記１個以上のスフェロイドに曝露することと、
（ｃ）前記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化及び／もしくは１種以上の電気生理学的メトリクスを測定及び／または観測することと
を含む、薬剤の毒性ならびに／あるいは神経保護作用の評価方法。
（項目５３）
１個以上のスフェロイドの１個以上の軸索のミエリン形成または脱ミエリン形成の判定方法であって、
（ａ）少なくとも１個の軸索を成長させるのに十分な時間及び条件下、薬剤の存在下または非存在下で、項目１〜１８のいずれかに記載の組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）前記１個以上のスフェロイド由来の１個以上の軸索におけるミエリン形成の量を検出することと
を含み、
検出することが任意選択で、
（ｉ）薬剤の存在下または非存在下において、前記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化及び／もしくは１種以上の電気生理学的メトリクスを測定及び／または観測するステップと、
（ｉｉ）薬剤の存在下または非存在下における、前記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化及び／もしくは１種以上の電気生理学的メトリクスを、前記スフェロイドのミエリン形成の定量的または定性的変化と相関させるステップと
を含む前記方法。
（項目５４）
（ａ）１個以上のスフェロイド及び／もしくはスフェロイドから成長した軸索の数または密度を定量化することと、
（ｂ）項目１〜１８のいずれかに記載の組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｃ）前記スフェロイドを、前記スフェロイド中で前記１個以上の軸索を成長させるまたは細胞を成長させるのに十分な期間培養した後で、前記スフェロイド内の細胞の数及び／または前記組成物中のスフェロイドから成長した軸索の数もしくは密度を計算することと
を含み、
ステップ（ｂ）が任意選択で、前記１個以上のスフェロイドを１種以上の薬剤と接触させることを含み、
ステップ（ｃ）が任意選択で、１個以上のスフェロイドを培養した後で、かかる１個以上のスフェロイドの内部及び／もしくは外部の記録を検出することと、前記記録を既知のもしくは対照の数の細胞に対応する同様の記録の測定値と相関させることとを含むか、または、
ステップ（ｃ）が任意選択で、
（ｉ）前記１個以上のスフェロイドを１種以上の薬剤と接触させる前記ステップの前後における細胞内及び／もしくは細胞外の記録ならびに／または形態計測上の変化を測定する更なるステップと、
（ｉｉ）前記１個以上のスフェロイドを前記１種以上の薬剤と接触させた後の、前記記録及び／もしく形態計測上の変化に対する前記１個以上のスフェロイドを前記１種以上の薬剤と接触させる前の、前記記録及び／もしく形態計測上の変化の差異を、細胞数及び／または軸索の数または密度の変化と相関させるステップと
を含む、神経細胞成長及び／または軸索変性の検出ならびに／あるいは定量化方法。
（項目５５）
薬剤の神経調節作用の測定または定量方法であって、
（ａ）前記薬剤の存在下及び非存在下で、項目１〜１８のいずれかに記載の組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）前記薬剤の存在下及び非存在下で、前記１個以上のスフェロイド全体にわたって電位を印加することと、
（ｃ）前記薬剤の存在下及び非存在下で、前記１個以上のスフェロイドからの１種以上の電気生理学的メトリクスを測定することと、
（ｄ）前記１個以上のスフェロイドによる１種以上の電気生理学的メトリクスの前記差異を前記薬剤の神経調節作用と相関させ、その結果、前記薬剤の存在下での電気生理学的メトリクスが前記薬剤の非存在下で測定された前記電気生理学的メトリクスと比較して変化することが神経調節作用を示し、前記薬剤の存在下での電気生理学的メトリクスが前記薬剤の非存在下で測定された前記電気生理学的メトリクスと比較して変化しないことが、前記薬剤が神経調節作用を与えないことを示すことと
を含むか、または、
（ａ）前記薬剤の存在下及び非存在下で、項目１〜１８のいずれかに記載の組成物中の１個以上のスフェロイドを培養することと、
（ｂ）前記薬剤の存在下及び非存在下で、前記１個以上のスフェロイドの１種以上の形態計測上の変化を測定及び／もしくは観測することと、
（ｃ）前記１種以上の形態計測上の変化を前記薬剤の神経調節作用と相関させ、その結果、前記薬剤の存在下での形態学的メトリクスが前記薬剤の非存在下で測定及び／もしくは観測される前記形態学的メトリクスと比較して変化することが神経調節作用を示し、前記薬剤の存在下での形態学的メトリクスが前記薬剤の非存在下で測定及び／もしくは観測される前記形態学的メトリクスと比較して変化しないことが、前記薬剤が神経調節作用を与えないことを示すことと
を含む前記方法。
（項目５６）
項目１９〜３７のいずれかに記載のシステムの製造方法であって、
（ａ）神経細胞を、前記細胞がスフェロイドを形成するのに十分な期間、細胞培養培地中で培養することと、
（ｂ）前記スフェロイドを前記ヒドロゲル内に配置することと、
（ｃ）神経突起または軸索を成長させるのに十分な期間、前記スフェロイドを細胞培養培地に曝露することと
を含む前記方法。
（項目５７）
ステップ（ａ）が前記神経細胞を１種以上の磁性粒子と混合することを含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
ステップ（ｂ）が磁力を使用して、前記スフェロイドを前記ヒドロゲルの空洞内に配置することを含む、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
ステップ（ｂ）が、超音波による力、機械的力、または流体による力を使用して、前記ヒドロゲルの空洞内に配置することを含む、項目５６に記載の方法。
（項目６０）
前記スフェロイドが、項目１〜１８に記載のいずれかの組成物中に開示されているスフェロイドである、項目５６に記載の方法。
（項目６１）
前記１個以上のスフェロイドの１種以上の１種以上の形態計測上の変化及び／または１種以上の電気生理学的メトリクスを前記薬剤の毒性と相関させ、その結果、前記形態計測上の変化及び／または電気生理学的メトリクスが、細胞生存率が低下することを示す場合には、前記薬剤は有毒であると特徴付けられ、前記形態計測上の変化及び／または電気生理学的メトリクスが、細胞生存率が変化しないまたは増加することを示す場合には、前記薬剤は無毒及び／または神経保護作用があると特徴付けられることを更に含む、項目５２に記載の方法。
【国際調査報告】
2021505193.tif 000160
2021505193.tif 000161