(57)【要約】本開示は、疾患の治療のための様々な治療方法のいずれかにおいて使用することができる、Ｗｎｔ経路のアゴニスト及び関連の組成物を提供する。
2021529796.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多特異性Ｗｎｔ代替分子であって、
（ｉ）１又は複数のＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ）受容体エピトープの組にそれぞれが特異的に結合する複数の領域（Ｆｚｄ結合領域）であって、少なくとも２つのＦｚｄ結合領域が１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組に結合するものである、当該複数の領域（Ｆｚｄ結合領域）と、
（ｉｉ）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）及び／又はＬＤＬ受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に特異的に結合する１又は複数の領域（ＬＲＰ５／６結合領域）とを含む、多特異性Ｗｎｔ代替分子。
【請求項２】
前記少なくとも２つのＦｚｄ結合領域が、１もしくは複数のＦｚｄ受容体の異なる組、１もしくは複数のＦｚｄ受容体の同一の組内の１もしくは複数のエピトープの異なる組、又はその組み合わせに結合する、請求項１記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項３】
各Ｆｚｄ結合領域が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１（Ｆｚｄ１）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２（Ｆｚｄ２）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３（Ｆｚｄ３）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４（Ｆｚｄ４）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ５（Ｆｚｄ５）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ６（Ｆｚｄ６）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７（Ｆｚｄ７）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８（Ｆｚｄ８）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ９（Ｆｚｄ９）、及びＦｒｉｚｚｌｅｄ１０（Ｆｚｄ１０）のうちの１又は複数に結合する、請求項１から２のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項４】
少なくとも１つのＦｚｄ結合領域が、（ｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ９；（ｉｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２及びＦｚｄ７；（ｉｉｉ）Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８；（ｉｖ）Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８；（ｖ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８；（ｖｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８；（ｖｉｉ）Ｆｚｄ４及びＦｚｄ９；（ｖｉｉｉ）Ｆｚｄ９及びＦｚｄ１０；（ｉｘ）Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ８及びＦｚｄ１０；（ｘ）Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８；又は（ｘｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８に結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項５】
複数のＦｚｄ結合領域が、
（ｉ）１又は複数のＦｚｄ受容体の第１の組に結合する第１のＦｚｄ結合領域と、
（ｉｉ）１又は複数のＦｚｄ受容体の異なる第２の組に結合する第２のＦｚｄ結合領域とを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項６】
（ｉ）前記第１のＦｚｄ結合領域が、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ３、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ８、Ｆｚｄ９、及びＦｚｄ１０のうちの１又は複数に結合し、また
（ｉｉ）第２のＦｚｄ結合領域が、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ３、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ８、Ｆｚｄ９、及びＦｚｄ１０のうちの１又は複数に結合する、請求項５記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項７】
前記第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ４に結合し、また第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ９に結合する、請求項５記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項８】
複数のＦｚｄ結合領域が、
（ｉ）１又は複数のＦｚｄ受容体の組内の、１又は複数のエピトープの第１の組に結合する第１のＦｚｄ結合領域と、
（ｉｉ）１又は複数のＦｚｄ受容体の同一の組内の、１又は複数のエピトープの異なる第２の組に結合する第２のＦｚｄ結合領域とを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項９】
ａ）前記第１のＦｚｄ結合領域が、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を誘発する少なくとも１つのＦｚｄ受容体に結合し、また
ｂ）前記第２のＦｚｄ結合領域が、古典的Ｗｎｔシグナル伝達を誘発する少なくとも１つのＦｚｄ受容体に結合する、請求項８記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項１０】
前記第１のＦｚｄ受容体と前記第２のＦｚｄ受容体とが結合することにより、
ａ．古典的Ｗｎｔシグナル伝達、又は
ｂ．非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を結果的にもたらす、請求項９記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項１１】
少なくとも１つのＦｚｄ結合領域が、単一のＦｚｄ受容体に単一特異的に結合する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのＦｚｄ結合領域が、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ３、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ８、Ｆｚｄ９、又はＦｚｄ１０に単一特異的に結合する、請求項１１記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項１３】
少なくとも１つのＦｚｄ結合領域が、（ｉ）Ｆｚｄ受容体の高システインドメイン（ＣＲＤ）を含まない、又は（ｉｉ）ＦＺＤ受容体のＣＲＤ全体未満を含む、又は（ｉｉｉ）Ｆｚｄ受容体のＣＲＤと重複する、Ｆｚｄ受容体の領域に結合する、請求項１から１２のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのＦｚｄ結合領域が、前記Ｆｚｄ受容体のヒンジ領域に結合する、請求項１３記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項１５】
前記ヒンジ領域が、配列番号９８〜１０７に記載の配列のいずれかに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのＦｚｄ結合領域が、前記Ｆｚｄ受容体のＣＲＤの上流のＮ末端領域に結合する、請求項１３記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項１７】
前記Ｎ末端領域が、配列番号１０８に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１６記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項１８】
Ｆｚｄ結合領域の少なくとも１つが、抗体の１又は複数の抗原結合性フラグメントを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項１９】
前記１又は複数の抗原結合性フラグメントは、ＩｇＧ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＶＨＨ又はｓｄＡｂからなる群から選択される、請求項１８記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項２０】
前記１又は複数の抗原結合性フラグメントは、ヒト化される、請求項１８から１９のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項２１】
少なくとも１つのＦｚｄ結合領域が、表１Ａ、表１Ｂ、又は配列番号１〜７３に記載の配列のいずれか又はその抗原結合性フラグメントに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項２２】
１又は複数のＬＲＰ５／６結合領域が、抗体の１又は複数の抗原結合性フラグメントを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項２３】
前記１又は複数の抗原結合性フラグメントは、ＩｇＧ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＶＨＨ又はｓｄＡｂからなる群から選択される、請求項２２記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項２４】
前記１又は複数の抗原結合性フラグメントは、ヒト化される、請求項２２から２３のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項２５】
少なくとも１又は複数のＬＲＰ５／６結合領域が、表２Ａ、表２Ｂ、又は配列番号７４〜９７に記載の配列のいずれか又はその抗原結合性フラグメントに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項２６】
１又は複数のＬＲＰ５／６結合領域を含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項２７】
Ｆｚｄ結合領域及びＬＲＰ５／６結合領域は、Ｆｚｄｎ：ＬＲＰ５／６ｎ（Ｆｎ：Ｌｎ）の比で存在するものであって、ここでＦ及びＬは、１及び９を含めた１から９の間の整数であり、またｎは、１及び４を含めた１から４の間の整数である、請求項１から２６のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項２８】
Ｆｚｄ結合領域及びＬＲＰ５／６結合領域は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、２：１、２：３、２：５、２：７、７：２、５：２、３：２、３：４、３：５、３：７、３：８、８：３、７：３、５：３、４：３、４：５、４：７、４：９、９：４、７：４、５：４、６：７、７：６、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、２：１（２つのＦｚｄバインダーと１つのＬＲＰバインダーとを伴う）、１：２（１つのＦｚｄバインダーと２つのＬＲＰバインダーとを伴う）、２：１：１（２つの異なるＬＲＰバインダーを伴う）、１：１：２（２つの異なるＦｚｄバインダーを伴う）、１：１：１（２つの異なるＦｚｄバインダーと１つのＬＲＰバインダーとを伴うか又は１つのＦｚｄバインダーと２つの異なるＬＲＰバインダーとを伴う）及び１：１：１：１（全ての異なるＦｚｄバインダーとＬＲＰバインダー）からなる群から選択される、Ｆｚｄ：ＬＲＰ５／６の比で存在する、請求項１から２７のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項２９】
Ｆｚｄ結合領域のＬＲＰ５／６結合領域に対する比（Ｆｚｄ：ＬＲＰ５／６）は、
ａ）２つのＦｚｄ結合領域と２つのＬＲＰ５／６結合領域；
ｂ）２つのＦｚｄ結合領域と１つのＬＲＰ５／６結合領域；及び
ｃ）１つのＦｚｄ結合領域と２つのＬＲＰ５／６結合領域、を含む、請求項２８記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項３０】
Ｆｚｄ結合領域のＬＲＰ５／６結合領域に対する比（Ｆｚｄ：ＬＲＰ５／６）は、
ａ）第１のＦｚｄ結合領域、第２のＦｚｄ結合領域、及び１つのＬＲＰ５／６結合領域、又は
ｂ）第１のＦｚｄ結合領域、第２のＦｚｄ結合領域、第１のＬＲＰ５／６結合領域、及び第２のＬＲＰ５／６結合領域、を含むものであって、
前記第１のＦｚｄ結合領域及び前記第２のＦｚｄ結合領域が、同一もしくは異なるＦｚｄ受容体に結合するか、又は異なる領域／エピトープにおける同一のＦｚｄ受容体に結合し、また前記第１のＬＲＰ５／６結合領域及び前記第２のＬＲＰ５／６結合領域が、異なるエピトープに、又は同一もしくは異なるＬＲＰタンパク質に結合する、請求項２８記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項３１】
２以上のＬＲＰ結合領域が、
（ｉ）１又は複数のＬＲＰ受容体の第１の組に結合する第１のＬＲＰ結合領域と、
（ｉｉ）１又は複数のＬＲＰ受容体の異なる第２の組に結合する第２のＬＲＰ結合領域とを含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項３２】
ヘテロ−Ｉｇ、ダイアボディ（ＤＡＲＴ）、タンデムダイアボディ（ＤＡＲＴ）、ダイアボディ−Ｆｃ、タンデム型Ｆａｂ（Ｆａｂｓ−ｉｎ−ｔａｎｄｅｍ）、タンデム型Ｆａｂ  ＩｇＧ（Ｆａｂｓ−ｉｎ−ｔａｎｄｅｍ  ＩｇＧ）（ＦＩＴ−Ｉｇ）、Ｆｖ−ＩｇＧ、及びタンデムｓｃＦｖからなる群から選択された構造形態を含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項３３】
（ｉ）第１のＦｚｄ結合領域を形成する、第１の軽鎖及び第１の重鎖と、（ｉｉ）第２のＦｚｄ結合領域を形成する、第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含み、前記第１のＦｚｄ結合領域及び前記第２のＦｚｄ結合領域が、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの同一の組又は異なる組に結合する、請求項１から３２のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項３４】
前記第１の軽鎖のＮ末端か、前記第１の軽鎖のＣ末端か、前記第１の重鎖のＮ末端か、又は前記第１の重鎖のＣ末端かに融合する第１のＬＲＰ５／６結合領域を含む、請求項３３記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項３５】
前記第２の軽鎖のＮ末端か、前記第２の軽鎖のＣ末端か、前記第２の重鎖のＮ末端か、又は前記第２の重鎖のＣ末端かに融合する第２のＬＲＰ５／６結合領域を含む、請求項３３から３４のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項３６】
前記第１の重鎖及び前記第２の重鎖が、互いに結合している、請求項３３から３５のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項３７】
前記第１の重鎖が、第１のＣＨ３ドメインを含み、前記第２の重鎖が、第２のＣＨ３ドメインを含み、また前記第１のＣＨ３ドメイン及び前記第２のＣＨ３ドメインが、互いに結合／相互作用している、請求項３６記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項３８】
前記第１のＣＨ３ドメイン及び前記第２のＣＨ３ドメインが、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ変異を介して互いに結合している、請求項３７記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項３９】
（ｉ）前記第１の重鎖及び／又は前記第２の重鎖が、配列番号１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、及び１２２に記載の配列のうちのいずれかに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、また（ｉｉ）前記第１の軽鎖及び／又は前記第２の軽鎖が、配列番号１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、及び１２１に記載の配列のうちのいずれかに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３から３８のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項４０】
表５又は表６Ａに記載の１又は複数の配列を含む、請求項１記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項４１】
表６Ｂに記載するような構造を有する、請求項４１記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項４２】
細胞において、随意に哺乳動物細胞において、Ｗｎｔシグナル伝達経路を調節する、請求項１から４１のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項４３】
細胞において、Ｗｎｔシグナル伝達経路を介したシグナル伝達を増加させる、請求項４２記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項４４】
前記Ｗｎｔシグナル伝達経路は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路である、請求項４２から４３のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項４５】
前記Ｗｎｔシグナル伝達経路は、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路である、請求項４２から４３のいずれか一項に記載のＷｎｔ代替分子。
【請求項４６】
薬理学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、又は担体と、請求項１から４５のいずれかに記載の前記Ｗｎｔ代替分子とを含む、医薬組成物。
【請求項４７】
細胞においてＷｎｔシグナル伝達経路を作動させる（ａｇｏｎｉｚｉｎｇ）方法であって、当該細胞を、請求項１から４５のいずれかに記載の前記Ｗｎｔ代替分子と又は請求項４５の前記医薬組成物と接触させることを含み、前記Ｗｎｔ代替分子が、Ｗｎｔシグナル伝達経路のアゴニストである、方法。
【請求項４８】
疾患又は障害を有する対象を治療する方法であって、請求項１から４５のいずれかに記載の前記Ｗｎｔ代替分子の又は請求項４４記載の医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含み、前記Ｗｎｔ代替分子が、Ｗｎｔシグナル伝達経路のアゴニストである、方法。
【請求項４９】
前記疾患又は障害が、Ｗｎｔシグナル伝達の低下もしくは障害と関連しており、及び／又は前記対象にとって、Ｗｎｔシグナル伝達の増加が有益となることとなる、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記疾患又は障害は、骨折、疲労骨折、脊椎圧迫骨折、骨粗しょう症、骨粗しょう症性骨折、骨折癒合不良（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）、遷延治癒骨折（ｄｅｌａｙｅｄ  ｕｎｉｏｎ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）、脊椎融合症（ｓｐｉｎａｌ  ｆｕｓｉｏｎ）、脊椎外科手術のための術前最適化、骨壊死、移植片又は矯正器具の骨結合、骨形成不全症、骨移植、腱修復、腱と骨の統合、歯の成長及び再生、顎顔面外科手術、歯科インプラント、歯周病、顎顔面の再建、顎、股関節又は大腿骨頭の骨壊死、虚血壊死、脱毛症、聴覚障害、前庭機能不全、黄斑変性、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、硝子体網膜症、網膜症、糖尿病性網膜症、網膜変性の疾患、フックスジストロフィー、角膜疾患、脳卒中、外傷性脳障害、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、筋肉減少症又は悪液質が原因の筋萎縮症、血液脳関門（ＢＢＢ）に影響を及ぼす疾患、脊髄損傷、脊髄疾患、口腔粘膜炎、短腸症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、メタボリックシンドローム、糖尿病、脂質代謝異常、膵炎、膵外分泌不全、創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍、褥瘡、静脈性下腿潰瘍、表皮水疱症、皮膚形成不全、心筋梗塞、冠動脈疾患、心不全、造血細胞障害、免疫不全症、移植片対宿主病、急性腎損傷、慢性腎臓病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症、あらゆる原因の急性肝不全、薬物誘発性の急性肝不全、アルコール性肝疾患、あらゆる原因の慢性肝不全、肝硬変、あらゆる原因の肝線維症、門脈圧亢進症、あらゆる原因の慢性肝不全、非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）（脂肪肝）、アルコール性肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＢＶ）、他のウイルス性肝炎（例えば、Ａ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＡＶ）及びＤ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＤＶ））、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、肝臓の（ｌｉｖｅｒｙ）外科手術、肝損傷、肝移植、肝臓の外科手術及び移植における「過小グラフト（ｓｍａｌｌ  ｆｏｒ  ｓｉｚｅ）」症候群、先天性の肝疾患及び肝障害、その他の、遺伝性疾患、変性、加齢、薬物及び損傷によりもたらされる、肝疾患ならびに肝障害からなる群から選択される、請求項４８から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記疾患又は障害は、骨の疾患又は障害である、請求項４８から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｗｎｔ代替分子が、（ｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２及びＦｚｄ７に；又は（ｉｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８に結合する、請求項５１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１８年７月５日出願の米国仮出願第６２／６９４，３３９号、２０１８年１２月１９日出願の米国仮出願第６２／７８２，１２２号、及び２０１９年１月２８日出願の米国仮出願第６２／７９７，７７２号の優先権を請求し、そのそれぞれを全体として、本明細書において参照により援用する。
【０００２】
配列表に関する記載
本願と関連する配列表は、紙の写しの代わりにテキスト形式で提供され、またここで本明細書に参照により援用する。配列表を含有するこのテキストファイルの名称は、ＳＲＺＮ＿００８＿０３ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは８７８ＫＢ、また２０１９年７月５日に作成されたものであり、そしてＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出する。
【０００３】
本開示は、概して、Ｗｎｔシグナル伝達経路アゴニストの分子、組成物及びその使用方法に関する。こうした分子は、例えばＷｎｔシグナル伝達経路を調節する際に有用である。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の記載
Ｗｎｔ（「ウイングレス関連統合部位」又は「ウイングレス及びＩｎｔ−１」又は「ウイングレス−Ｉｎｔ」）リガンド及びそれらのシグナルは、骨、肝臓、皮膚、胃、腸、腎臓、中枢神経系、乳腺、味蕾、卵巣、蝸牛及び多数の他の組織を含めた、多数の重要な器官及び組織の発達、ホメオスタシス、ならびに再生の制御において重要な役割を果たす（例えば、Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｌｏｈ，ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅ，２０１４；３４６：１２４８０１２により概説される）。Ｗｎｔシグナル伝達経路の調節は、退行性の疾患及び組織損傷を治療する可能性を有する。
【０００５】
治療としてＷｎｔシグナル伝達を調節するための課題のひとつとして、多数の組織が複数の重複するＦｚｄを発現する状態で、複数のＷｎｔリガンド及びＷｎｔ受容体Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１〜１０（Ｆｚｄ１〜１０）が存在することがある。古典的Ｗｎｔシグナルはまた、共受容体として低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）又は低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に関与し、これらは、Ｆｚｄに加えて、種々の組織において広く発現する。ＬＲＰ結合部分に対するＦｚｄの比は、シグナル伝達レベルを調節するか、ならびに組織特異性及び／又は機能的特異性を与えるかがこれまでに探索されてこなかった。
【０００６】
Ｗｎｔシグナル伝達経路は、古典的（β−カテニン依存性）経路と、非古典的（β−カテニン非依存性）経路とに細分化される。非古典的経路はさらに、平面内細胞極性（ＰＣＰ）経路及びＷｎｔ／Ｃａ２＋経路の２つに別個に枝分かれさせることが可能である。あるＷｎｔリガンドと、あるＦｚｄ受容体又はＦｚｄ受容体の組み合わせとの結合により、様々な経路の契機となり得るか、ならびに／又は組織特異性及び機能的特異性を与え得る。
【０００７】
したがって、１又は複数のＦｚｄ、ＬＲＰ５又はＬＲＰ６に特異的に結合して様々なＷｎｔシグナル伝達経路を調節する結合部分が、当技術分野において、明らかに要望されている。また、シグナル伝達レベルを調節するため、ならびに組織特異性及び／又は機能的特異性を与えるために、特定の比の共受容体（例えば、Ｆｚｄ受容体及びＬＲＰ受容体）を伴う結合部分を生成するという要望が存在する。本開示は、これら要望に対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
様々な実施形態においては、本開示は、Ｗｎｔ代替分子及びその関連の使用を提供する。
【０００９】
一態様においては、本開示は、多特異性Ｗｎｔ代替分子を提供するものであって、当該Ｗｎｔ代替分子は、（ｉ）１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの組にそれぞれが特異的に結合する複数の領域（Ｆｚｄ結合領域）であって、少なくとも２つのＦｚｄ結合領域が１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの同一の組又は異なる組に結合するものである、当該複数の領域（Ｆｚｄ結合領域）と、（ｉｉ）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）及び／又はＬＤＬ受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に特異的に結合する１又は複数の領域（ＬＲＰ５／６結合領域）とを含む。
【００１０】
一部の実施形態においては、少なくとも２つのＦｚｄ結合領域が、１もしくは複数のＦｚｄ受容体の異なる組、１もしくは複数のＦｚｄ受容体の同一の組内の１もしくは複数のエピトープの異なる組、又はその組み合わせに結合する。
【００１１】
一部の実施形態においては、各Ｆｚｄ結合領域が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１（Ｆｚｄ１）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２（Ｆｚｄ２）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３（Ｆｚｄ３）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４（Ｆｚｄ４）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ５（Ｆｚｄ５）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ６（Ｆｚｄ６）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７（Ｆｚｄ７）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８（Ｆｚｄ８）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ９（Ｆｚｄ９）、及びＦｒｉｚｚｌｅｄ１０（Ｆｚｄ１０）のうちの１又は複数に結合する。
【００１２】
一部の実施形態においては、少なくとも１つのＦｚｄ結合領域が、（ｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ９；（ｉｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２及びＦｚｄ７；（ｉｉｉ）Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８；（ｉｖ）Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８；（ｖ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８；（ｖｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８；（ｖｉｉ）Ｆｚｄ４及びＦｚｄ９；（ｖｉｉｉ）Ｆｚｄ９及びＦｚｄ１０；（ｉｘ）Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ８及びＦｚｄ１０；（ｘ）Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８；又は（ｘｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８に結合する。
【００１３】
一部の実施形態においては、複数のＦｚｄ結合領域が、（ｉ）１又は複数のＦｚｄ受容体の第１の組に結合する第１のＦｚｄ結合領域と、（ｉｉ）１又は複数のＦｚｄ受容体の異なる第２の組に結合する第２のＦｚｄ結合領域とを含む。一部の実施形態においては、第１のＦｚｄ結合領域が、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ３、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ８、Ｆｚｄ９及びＦｚｄ１０のうちの１又は複数に結合し、また第２のＦｚｄ結合領域が、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ３、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ８、Ｆｚｄ９及びＦｚｄ１０のうちの１又は複数に結合する。一部の実施形態においては、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ４に結合し、また第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ９に結合する。
【００１４】
一部の実施形態においては、複数のＦｚｄ結合領域が、（ｉ）１又は複数のＦｚｄ受容体の組内の、１又は複数のエピトープの第１の組に結合する第１のＦｚｄ結合領域と、（ｉｉ）１又は複数のＦｚｄ受容体の同一の組内の、１又は複数のエピトープの異なる第２の組に結合する第２のＦｚｄ結合領域とを含む。
【００１５】
一部の実施形態においては、Ｗｎｔ代替物が、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を誘発する少なくとも１つのＦｚｄ受容体に結合し、また第２のＦｚｄ結合領域が、古典的Ｗｎｔシグナル伝達を誘発する少なくとも１つのＦｚｄ受容体に結合する。さらなる実施形態においては、第１のＦｚｄ受容体及び第２のＦｚｄ受容体に結合するＷｎｔ代替物が、古典的Ｗｎｔシグナル伝達、又は非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を結果的にもたらす。
【００１６】
一部の実施形態においては、少なくとも１つのＦｚｄ結合領域が、単一のＦｚｄ受容体に単一特異的に結合する。一部の実施形態においては、少なくとも１つのＦｚｄ結合領域が、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ３、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ８、Ｆｚｄ９、又はＦｚｄ１０に単一特異的に結合する。
【００１７】
一部の実施形態においては、少なくとも１つのＦｚｄ結合領域が、（ｉ）Ｆｚｄ受容体の高システインドメイン（ＣＲＤ）を含まない、又は（ｉｉ）ＦＺＤ受容体のＣＲＤ全体未満を含む、又は（ｉｉｉ）ＦＺＤ受容体のＣＲＤと部分的に重複する、Ｆｚｄ受容体の領域に結合する。
【００１８】
一部の実施形態においては、少なくとも１つのＦｚｄ結合領域が、Ｆｚｄ受容体のヒンジ領域に結合する。一部の実施形態においては、ヒンジ領域が、配列番号９８〜１０７に記載の配列のうちのいずれかに対して少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、又は少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１９】
一部の実施形態においては、少なくとも１つのＦｚｄ結合領域が、Ｆｚｄ受容体のＣＲＤの上流のＮ末端領域に結合する。一部の実施形態においては、Ｎ末端領域が、配列番号１０８に対して少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、又は少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２０】
一部の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域の少なくとも１つが、抗体の１又は複数の抗原結合性フラグメントを含む。一部の実施形態においては、１又は複数の抗原結合性フラグメントは、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＶＨＨ又はｓｄＡｂからなる群から選択される。一部の実施形態においては、１又は複数の抗原結合性フラグメントは、ヒト化される。
【００２１】
一部の実施形態においては、少なくとも１つのＦｚｄ結合領域が、表１Ａ、表１Ｂ、配列番号１〜７３に記載の配列のいずれか又はその抗原結合性フラグメントに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２２】
一部の実施形態においては、１又は複数のＬＲＰ５／６結合領域が、抗体の１又は複数の抗原結合性フラグメントを含む。一部の実施形態においては、１又は複数の抗原結合性フラグメントは、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＶＨＨ又はｓｄＡｂからなる群から選択される。一部の実施形態においては、１又は複数の抗原結合性フラグメントは、ヒト化される。
【００２３】
一部の実施形態においては、１又は複数のＬＲＰ５／６結合領域が、表２Ａ、表２Ｂ、又は配列番号７４〜９７に記載の配列のいずれか又はその抗原結合性フラグメントに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２４】
一部の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、２以上のＬＲＰ５／６結合領域を含む。
【００２５】
一部の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域及びＬＲＰ５／６結合領域は、Ｆｚｄ：ＬＲＰ５／６の比で存在する。
【００２６】
一部の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域及びＬＲＰ５／６結合領域は、Ｆｚｄｎ：ＬＲＰ５／６ｎ（Ｆｎ：Ｌｎ）の比で存在するものであって、ここでＦ及びＬは、１及び９を含めた１から９の間の整数であり、またｎは、１及び４を含めた１から４の間の整数である。
【００２７】
一部の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域及びＬＲＰ５／６結合領域は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、２：１、２：３、２：５、２：７、７：２、５：２、３：２、３：４、３：５、３：７、３：８、８：３、７：３、５：３、４：３、４：５、４：７、４：９、９：４、７：４、５：４、６：７、７：６、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、２：１（２つのＦｚｄバインダーと１つのＬＲＰバインダーとを伴う）、１：２（１つのＦｚｄバインダーと２つのＬＲＰバインダーとを伴う）、２：１：１（２つの異なるＬＲＰバインダーを伴う）、１：１：２（２つの異なるＦｚｄバインダーを伴う）、１：１：１（２つの異なるＦｚｄバインダーと１つのＬＲＰバインダーとを伴う又は１つのＦｚｄバインダーと２つの異なるＬＲＰバインダーとを伴う）及び１：１：１：１（全ての異なるＦｚｄバインダーとＬＲＰバインダー）からなる群から選択される、Ｆｚｄ：ＬＲＰ５／６の比で存在する。
【００２８】
一部の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域のＬＲＰ５／６結合領域に対する比（Ｆｚｄ：ＬＲＰ５／６）は、２つのＦｚｄ結合領域と２つのＬＲＰ５／６結合領域；２つのＦｚｄ結合領域と１つのＬＲＰ５／６結合領域；又は１つのＦｚｄ結合領域と２つのＬＲＰ５／６結合領域、を含む。
【００２９】
一部の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域のＬＲＰ５／６結合領域に対する比（Ｆｚｄ：ＬＲＰ５／６）は、第１のＦｚｄ結合領域、第２のＦｚｄ結合領域、及び１つのＬＲＰ５／６結合領域；又は第１のＦｚｄ結合領域、第２のＦｚｄ結合領域、第１のＬＲＰ５／６結合領域及び第２のＬＲＰ５／６結合領域、を含む。さらなる実施形態においては、第１のＦｚｄ結合領域及び第２のＦｚｄ結合領域が、異なるＦｚｄ受容体に結合するか、又は異なる領域／エピトープにおける同一のＦｚｄ受容体に結合し、また第１のＬＲＰ５／６結合領域及び第２のＬＲＰ５／６結合領域が、異なるエピトープに、又は異なるＬＲＰタンパク質に結合する。
【００３０】
一部の実施形態においては、ＬＲＰ結合領域が、１又は複数のＬＲＰ受容体の第１の組に結合する第１のＬＲＰ結合領域と、１又は複数のＬＲＰ受容体の異なる第２の組に結合する第２のＬＲＰ結合領域とを含む。
【００３１】
一部の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、ヘテロ−Ｉｇ、ダイアボディ（ＤＡＲＴ）、タンデムダイアボディ（ＤＡＲＴ）、ダイアボディ−Ｆｃ、タンデム型Ｆａｂ（Ｆａｂｓ−ｉｎ−ｔａｎｄｅｍ）、タンデム型Ｆａｂ  ＩｇＧ（Ｆａｂｓ−ｉｎ−ｔａｎｄｅｍ  ＩｇＧ）（ＦＩＴ−Ｉｇ）、Ｆｖ−ＩｇＧ、及びタンデムｓｃＦｖからなる群から選択された構造形態を含む。
【００３２】
一部の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、（ｉ）第１のＦｚｄ結合領域を形成する、第１の軽鎖及び第１の重鎖と、（ｉｉ）第２のＦｚｄ結合領域を形成する、第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含み、当該第１のＦｚｄ結合領域及び当該第２のＦｚｄ結合領域が、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組に結合する。
【００３３】
一部の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、第１の軽鎖のＮ末端か、第１の軽鎖のＣ末端か、第１の重鎖のＮ末端か、又は第１の重鎖のＣ末端かに融合する第１のＬＲＰ５／６結合領域を含む。一部の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、第２の軽鎖のＮ末端か、第２の軽鎖のＣ末端か、第２の重鎖のＮ末端か、又は第２の重鎖のＣ末端かに融合する第２のＬＲＰ５／６結合領域を含む。
【００３４】
一部の実施形態においては、第１の重鎖及び第２の重鎖が、互いに結合している。一部の実施形態においては、第１の重鎖が、第１のＣＨ３ドメインを含み、第２の重鎖が、第２のＣＨ３ドメインを含み、また第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインが、互いに結合している。一部の実施形態においては、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインが、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ変異を介して互いに結合している。一部の実施形態においては、第１の重鎖及び／又は第２の重鎖が、配列番号１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、又は１２２（又は表５又は表６Ａに示す）に記載の配列のうちのいずれかに対して少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、又は少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、また（ｉｉ）第１の軽鎖及び／又は第２の軽鎖が、配列番号１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、又は１２１（又は表５又は表６Ａに示す）に記載の配列のうちのいずれかに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、表５又は表６Ａに開示の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する１又は複数の配列（例えば、２又は３の配列）を含む。特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、表５もしくは表６Ａに開示のいずれかのＷｎｔ代替分子に関して記載した配列か、又は当該配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列かを含む。
【００３５】
別の態様においては、Ｗｎｔ代替分子が、表６Ｂに記載するような構造を有する。
【００３６】
一部の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、細胞において、随意に哺乳動物細胞において、Ｗｎｔシグナル伝達経路を調節する。一部の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、細胞において、Ｗｎｔシグナル伝達経路を介したシグナル伝達を増加させる。一部の実施形態においては、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路である。一部の実施形態においては、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路である。
【００３７】
別の態様においては、本開示は、薬理学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、又は担体と、本明細書の実施形態のいずれかに係るＷｎｔ代替分子とを含む医薬組成物を提供する。
【００３８】
別の態様においては、本開示は、細胞においてＷｎｔシグナル伝達経路を作動させる（ａｇｏｎｉｚｉｎｇ）方法であって、当該細胞を、本明細書の実施形態のうちのいずれかに係るＷｎｔ代替分子と接触させることを含み、当該Ｗｎｔ代替分子が、Ｗｎｔシグナル伝達経路のアゴニストである、当該方法を提供する。
【００３９】
別の態様においては、本開示は、疾患又は障害を有する対象を治療する方法であって、本明細書の実施形態のうちのいずれかの医薬組成物の有効量を当該対象に投与することを含み、Ｗｎｔ代替分子が、Ｗｎｔシグナル伝達経路のアゴニストである、当該方法を提供する。
【００４０】
一部の実施形態においては、疾患又は障害が、Ｗｎｔシグナル伝達の低下もしくは障害と関連しており、及び／又は当該対象にとって、Ｗｎｔシグナル伝達の増加が有益となることとなる。一部の実施形態においては、疾患又は障害は、骨折、疲労骨折、脊椎圧迫骨折、骨粗しょう症、骨粗しょう症性骨折、骨折癒合不良（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）、遷延治癒骨折（ｄｅｌａｙｅｄ  ｕｎｉｏｎ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）、脊椎融合症（ｓｐｉｎａｌ  ｆｕｓｉｏｎ）、脊椎外科手術のための術前最適化、骨壊死、移植片又は矯正器具の骨結合、骨形成不全症、骨移植、腱修復、腱と骨の統合、歯の成長及び再生、顎顔面外科手術、歯科インプラント、歯周病、顎顔面の再建、顎、股関節又は大腿骨頭の骨壊死、虚血壊死、脱毛症、聴覚障害、前庭機能不全、黄斑変性、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、硝子体網膜症、網膜症、糖尿病性網膜症、網膜変性の疾患、フックスジストロフィー、角膜疾患、脳卒中、外傷性脳障害、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、筋肉減少症又は悪液質が原因の筋萎縮症、血液脳関門（ＢＢＢ）に影響を及ぼす疾患、脊髄損傷、脊髄疾患、口腔粘膜炎、短腸症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、メタボリックシンドローム、糖尿病、脂質代謝異常、膵炎、膵外分泌不全、創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍、褥瘡、静脈性下腿潰瘍、表皮水疱症、皮膚形成不全、心筋梗塞、冠動脈疾患、心不全、造血細胞障害、免疫不全症、移植片対宿主病、急性腎損傷、慢性腎臓病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症、あらゆる原因の急性肝不全、薬物誘発性の急性肝不全、アルコール性肝疾患、あらゆる原因の慢性肝不全、肝硬変、あらゆる原因の肝線維症、門脈圧亢進症、あらゆる原因の慢性肝不全、非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）（脂肪肝）、アルコール性肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＢＶ）、他のウイルス性肝炎（例えば、Ａ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＡＶ）及びＤ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＤＶ））、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、肝臓の（ｌｉｖｅｒｙ）外科手術、肝損傷、肝移植、肝臓の外科手術及び移植における「過小グラフト（ｓｍａｌｌ  ｆｏｒ  ｓｉｚｅ）」症候群、先天性の肝疾患及び肝障害、その他の、遺伝性疾患、変性、加齢、薬物及び損傷によりもたらされる、肝疾患ならびに肝障害からなる群から選択される。
【００４１】
一部の実施形態においては、疾患又は傷害が、骨の疾患又は障害である。一部の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、（ｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２及びＦｚｄ７に；又は（ｉｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８に結合する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
この特許又は出願書類は、色付きで作成された少なくとも１つの図面を含有する。色付きの図面を伴ったこの特許又は特許出願の公開公報の写しは、申請及び必要な料金の支払いをすると特許庁により提供されることとなる。
【００４３】
【図１】図１は、Ｗｎｔ代替分子の説明的形態の概略図である。異なるＶＨＨ、Ｆｖ又はｓｃＦｖ、ダイアボディ、又は異なるＦｚｄ受容体及びＬＲＰ受容体に対する様々なＶＬならびにＶＨ領域を含有するＦａｂを、様々な比で組み合わせる。異なる色が、異なるバインダー（同一の標的又は異なる標的に結合することが可能である）を表す。
【図２】図２Ａは、高システインドメイン（ＣＲＤ）、ヒンジ領域、及びＮ末端領域を含む、Ｆｚｄ受容体の概略図である。図２Ｂは、Ｆｚｄ受容体ヒンジ領域に対して結合特異性をもつＷｎｔ代替分子の概略図である。図２Ｃは、Ｗｎｔ代替分子１７９１−３及び１２９１−３の結合反応速度である。図２Ｄは、Ｗｎｔ代替分子１７９１−３及び１２９１−３のインビトロ活性である。
【図３−１】図３Ａは、単一特異性Ｗｎｔ代替分子及び多特異性Ｗｎｔ代替分子の概略図である。
【図３−２】図３Ｂは、２９３ＳＴＦ細胞におけるＷｎｔ代替分子のインビトロ活性である。図３Ｃは、Ｆｚｄ４を過剰発現する２９３ＳＴＦ細胞（２９３ＳＴＦ  Ｆｚｄ４ＯＥ）におけるＷｎｔ代替分子のインビトロ活性である。図３Ｄは、Ｆｚｄ９を過剰発現する２９３ＳＴＦ細胞（２９３ＳＴＦ  Ｆｚｄ９ＯＥ）におけるＷｎｔ代替分子のインビトロ活性である。図３Ｃは、Ｆｚｄ４及びＦｚｄ９を過剰発現する２９３ＳＴＦ細胞（２９３ＳＴＦ  Ｆｚｄ４ＯＥ＋Ｆｚｄ９ＯＥ）におけるＷｎｔ代替分子のインビトロ活性である。
【図４−１】図４Ａから４Ｅは、様々なＦｚｄのヒンジ領域（配列番号２２５１〜２２６０）の配列アラインメントを示す。
【図４−２】同上。
【図４−３】同上。
【図５】図５Ａから図５Ｃは、共にＬｒｐ５を含む異なるＦｚｄ受容体に関する可溶性リガンドを含有する非相同分子の構造と、２９３ＳＴＦ細胞におけるそれらのインビトロ活性とを示す。
【図６−１】図６Ａから図６Ｅは、ＦｚｄのＬＲＰバインダーに対する比が異なる、Ｗｎｔ代替分子の構造と、ベータ−カテニン依存性シグナル伝達のＷｎｔ３ａ活性化に対するそれらの影響とを示す。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図７−１】図７Ａから図７Ｄは、共にＦｚｄバインダーをもつ２つの異なるＬｒｐバインダーのヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚｉｏｎ）を含有する構造と、２９３ＳＴＦ細胞におけるそれらのインビトロ活性とを示す。
【図７−２】同上。
【図８−１】図８Ａから図８Ｊは、β−カテニン依存性ＷＮＴシグナル伝達を活性化する際に、１：１の二価二重特異性Ｌ１／Ｆ１タンデムｓｃＦｖ分子が有効でないことを示す。（Ａ）１：１の二価二重特異性Ｌ１／Ｆ１タンデムｓｃＦｖコンストラクトの図である。各円は、ｓｃＦｖドメインを表し、各分子の末端の細い黒線は、６ｘＨｉｓタグを表す。（Ｂ）Ｎｉ樹脂で精製したタンデムｓｃＦｖ分子を、４〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。左側パネルは、左から右に向かって、以下のとおりである：還元条件下（Ｒ、レーン１〜３）又は非還元条件下（ＮＲ、レーン４〜６）での、５−ｍｅｒ、１０−ｍｅｒ及び１５−ｍｅｒのリンカーをもつＬ１−Ｆ１タンデムｓｃＦｖ。右側パネルは、左から右に向かって、還元条件下（Ｒ、レーン１〜３）又は非還元条件下（ＮＲ、レーン４〜６）での、５−ｍｅｒ、１０−ｍｅｒ及び１５−ｍｅｒのリンカーをもつＦ１−Ｌ１タンデムｓｃＦｖである。Ｃ）及びＤ）は、Ｆ１のＮ−末端と融合したＬ１を伴う（Ｃ）、又はＬ１のＮ末端と融合したＦ１を伴う（Ｄ）、Ｎｉ樹脂で精製したタンデムｓｃＦｖの用量依存的なＳＴＦ活性である。Ｅ）は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で精製した、Ｆ１のＮ−末端と融合したＬ１を伴うタンデムｓｃＦｖからの、単量体ピーク画分の用量依存的ＳＴＦ活性である。Ｆ）は、ＳＥＣで精製した、Ｌ１のＮ−末端と融合したＦ１を伴うタンデムｓｃＦｖからの、単量体ピーク画分の用量依存的ＳＴＦ活性である。Ｇ）及びＨ）は、様々なタンデムｓｃＦｖのＳＥＣ画分全体にわたるＳＴＦ活性である。各パネルの矢印は、単量体のタンデムｓｃＦｖタンパク質の位置を示す。Ｉ）はＳＥＣカラムにおける基準タンパク質の溶離プロファイルであり、太い矢印は、単量体形態のタンデムｓｃＦｖ分子の予想される位置を示す。Ｊ）では、Ｌ１：５：Ｆ１への抗Ｈｉｓ抗体の添加が、β−カテニン依存性ＷＮＴシグナル伝達の有意な活性化を誘発した。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【図８−４】同上。
【図９】図９は、β−カテニン依存性ＷＮＴシグナル伝達を活性化する際に、１：１の二価二重特異性Ｌ１／Ｆ１タンデムｓｃＦｖ分子が有効でないことを示す。Ｎｉカラム単独で精製したか又は追加的にＳＥＣカラムで精製したかである、Ｆ１のＮ末端と融合したＬ１及びＬ１のＮ末端に融合したＦ１を伴う、タンデムｓｃＦｖの用量依存的ＳＴＦ活性を、組換え型ＷＮＴ３Ａ及び代替ＷＮＴ、１８Ｒ５−ＤＫＫ１ｃと比較する。これらデータは、陽性対照分子のデータが含まれていることを除いて、図１Ｃから１Ｆと一致する。
【図１０−１】図１０Ａから１０Ｆは、Ｆｃドメインに融合することによるＬ１及びＦ１のタンデムｓｃＦｖの価数の増加により、Ｗｎｔシグナルの活性が有意に増加した。Ａ）Ｆ１及びＬ１のタンデムｓｃＦｖがＦｃドメインに融合して、２：２の四価二重特異性形態を生成した図である。Ｂ〜Ｃ）は、タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ分子のＳＥＣの画分全体にわたるＳＴＦ活性である。Ｄ）はＳＥＣカラムにおける基準タンパク質の溶離プロファイルであり、太い矢印は、単量体形態のタンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ分子の予想される位置を示す。Ｅ〜Ｆ）は、ＳＥＣカラムからの単量体形態の分子に相当する、タンパク質のピーク画分からのタンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ分子の用量依存的ＳＴＦ活性である。
【図１０−２】同上。
【図１１−１】図１１Ａから１１Ｂは、２：２の四価二重特異性Ｆ１／Ｌ１分子の、ＳＴＦ活性及びＯｃｔｅｔ結合プロファイルである。Ａ）単量体形態に相当するタンパク質のピーク画分からのＦ１／Ｌ１二価タンデムｓｃＦｖ分子の用量依存的ＳＴＦ活性を、組換えＷＮＴ３Ａ及び１８Ｒ５−ＤＫＫ１ｃと比較する。これらデータは、陽性対照分子のデータが含まれていることを除いて、図２Ｅ及び２Ｆと一致する。Ｂ）Ｏｃｔｅｔで測定した、種々の２：２の四価二重特異性タンデムｓｃＦｖ分子の、ＦＺＤ１及びＬＲＰ６Ｅ１Ｅ２に対する結合親和性である。
【図１１−２】同上。
【図１２−１】図１２Ａから１２Ｅでは、２つのＦ１及び２つのＬ２の結合アームからなる２：２の四価二重特異性分子が、Ｗｎｔシグナル伝達を誘発するのに非常に強力である。Ａ）ＦＺＤバインダーＦ１と、ＬＲＰ６Ｅ３Ｅ４バインダーＬ２とからなる、２：２の四価二重特異性分子形態を表す図である。当該形態の図の下に、これら種々の２：２分子のＳＥＣ画分全体にわたるＳＴＦ活性を示している。Ｂ〜Ｃ）は、ＳＥＣカラムからの各分子の単量体形態に相当するタンパク質ピーク画分からの、両配置のＦ１及びＬ２の結合アームからなる、２：２の四価二重特異性分子の用量依存的ＳＴＦ活性である。Ｄ）では、中性の抗ＧＦＰのｓｃＦｖフラグメントによって何れかの結合アームを置換することにより結果的に活性なしをもたらすため、Ｆ１及びＬ２の組み合わせからの２：２の四価二重特異性分子の活性にはＦＺＤ及びＬＲＰ６の両結合アームの存在が必要である。Ｅ）では、Ｄ）からの分子のそれらそれぞれの受容体との相互作用を、Ｏｃｔｅｔで求めた。ＩｇＧ１形態におけるバインダーＬ１、Ｌ２及びＦ１も、比較対象として含まれた。
【図１２−２】同上。
【図１２−３】同上。
【図１２−４】同上。
【図１３−１】１３Ａから１３Ｂでは、β−カテニン依存性ＷＮＴシグナル伝達を活性化するのに、１：１の二価二重特異性Ｌ２／Ｆ１タンデムｓｃＦｖ分子が有効でない。Ａ）は、両配置のＦ１／Ｌ２間の１：１の二価二重特異性タンデムｓｃＦｖ分子のＳＥＣ画分全体にわたるＳＴＦ活性である。分子形態の図もまた上に示している。各パネルの矢印は、単量体形態のタンパク質の位置を示す。Ｂ）は、ＳＥＣカラムからの各分子の単量体形態に相当する、タンパク質のピーク画分からの、Ａ）で示した分子の用量依存的ＳＴＦ活性である。
【図１３−２】同上。
【図１４−１】図１４Ａから１４Ｉでは、２つのＦ２及び２つのＬ１又はＬ２の結合アームからなる２：２の四価二重特異性分子が、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化する。Ａ）Ｆ２及びＬ１の結合アームからなる２：２四価二重特異性分子の分子形態の図と、これら種々の代替ＷＮＴ分子のＳＥＣカラム全体にわたるＳＴＦ活性とである。各パネルの矢印は、単量体形態のタンパク質の位置を示す。Ｂ）は、ＳＥＣカラムからの各分子の単量体形態に相当するタンパク質ピーク画分からの、両配置のＦ２及びＬ１の結合アームからなる、２：２の四価二重特異性分子の用量依存的ＳＴＦ活性である。これら代替ＷＮＴアゴニストは、Ｗｎｔシグナルを活性化するのに、ＷＮＴ３Ａと比較して、より高い効力を有するが、効能はより低い。Ｃ）及びＤ）は、１：１二価二重特異性分子の形態と、両配置のＦ２及びＬ２の組み合わせからなる分子に関するＳＥＣカラム画分全体にわたるＳＴＦ活性とである。Ｆ２−Ｌ２配置は、活性ではないようであるが、一方で逆のＬ２−Ｆ２配置は、１：１形態で活性であるように見える。各パネルの矢印は、単量体形態のタンパク質の位置を示す。Ｅ）は、ＳＥＣカラムからの各分子の単量体形態に相当する、タンパク質ピーク画分からの、１：１二価二重特異性Ｌ２−Ｆ２分子の用量依存的ＳＴＦ活性である。Ｆ）及びＨ）は、２：２四価二重特異性分子の形態と、両配置でのＦ２及びＬ２の組み合わせからなる分子に関するＳＥＣカラム画分全体にわたるＳＴＦ活性とである。各パネルの矢印は、単量体形態のタンパク質の位置を示す。Ｇ）及びＩ）は、ＳＥＣカラムからの各分子の単量体形態に相当する、タンパク質ピーク画分からの、Ｆ）及びＨ）の２：２四価二重特異性Ｌ２／Ｆ２分子の用量依存的ＳＴＦ活性である。
【図１４−２】同上。
【図１４−３】同上。
【図１４−４】同上。
【図１４−５】同上。
【図１４−６】同上。
【図１５−１】図１５Ａから１５Ｂは、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３のＦＺＤ特異性プロファイルと、１：１二価二重特異性Ｆ２／Ｌ１分子のＳＴＦ活性とである。Ａ）は、Ｏｃｔｅｔで測定した１０個のＦＺＤ全てに対する、Ｆ１、Ｆ２及びＦ３の結合親和性ならびに特異性である。Ｂ）は、両配置でのＦ２／Ｌ１間の１：１の二価二重特異性タンデムｓｃＦｖ分子のＳＥＣ画分全体にわたるＳＴＦ活性である。分子形態の図もまた上に示している。各パネルの矢印は、単量体形態のタンパク質の位置を示す。１：１の二価二重特異性形態は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を誘発するのに有効でない。
【図１５−２】同上。
【図１６−１】図１６Ａから１６Ｄでは、２つのＦ３及び２つのＬ１又はＬ２の結合アームからなる２：２の四価二重特異性分子が、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化する。Ａ）ＦＺＤバインダーＦ３と、ＬＲＰ６バインダーＬ１又はＬ２とからなる、２：２の四価二重特異性分子の形態を表す図であって、ＦＺＤバインダーは、ＬＲＰバインダーのＮ末端に結合している。形態の図の下に、これら２つの２：２分子のＳＥＣ画分全体にわたるＳＴＦ活性を示している。Ｂ）ＦＺＤバインダーＦ３と、ＬＲＰ６バインダーＬ１又はＬ２とからなる、２：２の四価二重特異性分子の形態を表す図であって、ＬＲＰバインダーは、ＦＺＤバインダーのＮ末端に結合していて、Ａ）の分子とは逆配置である。形態の図の下に、これら２つの２：２分子のＳＥＣ画分全体にわたるＳＴＦ活性を示している。Ｃ、Ｄ）は、ＳＥＣカラムからの各分子の単量体形態に相当する、タンパク質のピーク画分からの、２：２四価二重特異性分子の用量依存的ＳＴＦ活性である。Ｃ）及びＤ）は、それぞれＡ）及びＢ）からの分子に相当する。
【図１６−２】同上。
【図１６−３】同上。
【図１７】図１７は、１：１の二価二重特異性Ｌ１／Ｆ３又はＬ２／Ｆ３のタンデムｓｃＦｖ分子は、β−カテニン依存性ＷＮＴシグナル伝達を活性化するのに有効でない。両配置でのＦ３／Ｌ１又はＦ３／Ｌ２間の１：１の二価二重特異性タンデムｓｃＦｖ分子のＳＥＣ画分全体にわたるＳＴＦ活性である。分子形態の図もまた上に示している。各パネルの矢印は、単量体形態のタンパク質の位置を示す。１：１の二価二重特異性形態は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を誘発するのに有効でない。
【図１８】図１８Ａから１８Ｂでは、２：２の四価二重特異性ダンベル形態は、２：２の四価二重特異性タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ形態と同様の活性を有する。Ａ）は、ＳＥＣカラムからの各分子の単量体形態に相当する、タンパク質のピーク画分の用量依存的ＳＴＦ活性である。ここで試験した代替ＷＮＴアゴニストは、２：２四価二重特異性ダンベル型形態でのＦ１及びＬ１の組み合わせである。この形態は活性であるが、ＷＮＴ３Ａと比較してはるかに低い効能を示す。ＦｃのＮ末端には、Ｌ１に対する選択性がある。Ｂ）は、ＳＥＣカラムからの各分子の単量体形態に相当する、タンパク質のピーク画分の用量依存的ＳＴＦ活性である。ここで試験した代替ＷＮＴアゴニストは、２：２四価二重特異性ダンベル型形態でのＦ１及びＬ２の組み合わせである。またＦｃのＮ末端には、Ｌ２に対する選択性がある。
【図１９−１】図１９Ａから１９Ｃでは、種々の１：１の二価二重特異性タンデムｓｃＦｖ分子が、活性なしかそれに近いことを示す。Ａ）Ｏｃｔｅｔでの、後に１：１の二価二重特異性タンデムｓｃＦｖ分子Ｆ３：５：Ｌ２及びＬ２：５：Ｆ３が続き、次いでその後ＬＲＰ６Ｅ３Ｅ４の付加が続く、ＦＺＤ８の連続的な結合が、１：１タンデムｓｃＦｖ分子がＦＺＤ及びＬＲＰの両方を同時に結合可能であることを示す。Ｂ）ＦＺＤバインダー及びＬＲＰバインダー間で１：１の化学量論である種々の分子の図である。Ｃ）Ｂ）における種々の分子の用量反応が、ＳＴＦシグナルを誘発しないことを示した。
【図１９−２】同上。
【図２０−１】図２０Ａから２０Ｂでは、種々の１：１二重特異性ｓｃＦｖ分子が、活性なしかそれに近いことを示す。Ｆ３／Ｌ２バインダーとＦ２／Ｌ２バインダーとの対間の１：１二価二重特異性ｓｃＦｖ分子の種々の組み合わせの図である。Ｂ）Ａ、Ｂ）に示した種々の分子の用量反応が、ＳＴＦシグナルを誘発しないことを示した。
【図２０−２】同上。
【図２１−１】図２１Ａから２１Ｋは、２：２の四価多特異性形態における、ＦＺＤバインダー及びＬＲＰバインダーの様々な化学量論と、様々な受容体特異性のバインダー又はエピトープの組み合わせの探索である。Ａ、Ｄ）では、例えば２つのＦＺＤバインダーと１つのＬＲＰバインダー（２：１）又は１つのＦＺＤバインダー及び２つのＬＲＰバインダー（１：２）である、ＦＺＤバインダー及びＬＲＰバインダー間で様々な化学量論である分子の図である。Ｂ、Ｃ）ＳＴＦレポーターアッセイにおける、Ａ）の分子の用量反応である。Ｅ、Ｆ）ＳＴＦレポーターアッセイにおける、Ｄ）の分子の用量反応である。Ｇ）２：２四価三重特異性分子の分子形態であり、２つのＦＺＤバインダーが、異なるＦＺＤ特異性のものである（１：１：２）。Ｈ）ＳＴＦレポーターアッセイにおける、Ｇ）の分子の用量反応である。Ｉ）２：２四価三重特異性分子の分子形態であり、２つのＦＺＤバインダーが、１つのみのＬＲＰバインダーを共に含む異なるＦＺＤ特異性のものである（１：１：１：０）。Ｊ）ＳＴＦレポーターアッセイにおける、Ｉ）の分子の用量反応である。Ｋ）２：２四価三重特異性分子の分子形態であり、２つのＦＺＤバインダー及び２つのＬＲＰバインダーが、全ての異なるＦＺＤ特異性又はＬＲＰ特異性のものである（１：１：１：１）。Ｈ）ＳＴＦレポーターアッセイにおける、Ｋ）の分子の用量反応である。
【図２１−２】同上。
【図２１−３】同上。
【図２１−４】同上。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本開示は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を調節するために、複数の異なるＦｚｄ受容体及びエピトープとならびにＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６と特異的に結合する、多特異性Ｗｎｔ代替分子に関する。特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化するか、又はＷｎｔシグナル伝達経路を介したシグナル伝達を増加させる。ある態様においては、本開示のＷｎｔ代替分子は、（ｉ）本明細書において「Ｆｚｄ結合領域」と呼ぶ、１又は複数のＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ）受容体及び／又はエピトープの組にそれぞれが特異的に結合する複数の領域と、（ｉｉ）本明細書において「ＬＲＰ５／６結合領域」と呼ぶ、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６と特異的に結合する１又は複数の領域とを有する。ある実施形態は、Ｗｎｔシグナル伝達経路と、例えばＷｎｔシグナル伝達に関連する疾患及び障害の治療のためである、関連の生物学的効果とを調節する際に有利であるＦｚｄ結合領域及びＬＲＰ５／６結合領域の特定の構造形態又は配置を包含する。
【００４５】
特定の実施形態においては、本明細書で開示するＷｎｔ代替分子が、異なるＦｚｄ受容体及び／又はエピトープに関して結合特異性をもつ複数のＦｚｄ結合領域を含む。例えば、Ｗｎｔ代替分子は、少なくとも２つのＦｚｄ結合領域であって、１もしくは複数のＦｚｄ受容体の異なる組、１もしくは複数のＦｚｄ受容体の同一の組内の１もしくは複数のエピトープの異なる組、又はその組み合わせにそれぞれが結合する、当該少なくとも２つのＦｚｄ結合領域を含んでもよい。各Ｆｚｄ結合領域は、異なるＦｚｄ受容体エピトープ又は複数のＦｚｄ受容体エピトープに対して、単一特異性、二重特異性、三重特異性等であり得る。こうした多特異性Ｗｎｔ代替分子は、非標的のＦｚｄ受容体の活性化を低下又は除去しつつ、特定の組み合わせのＦｚｄ受容体を選択的に活性化することが可能である。本開示の実施形態は、例えばオフターゲット効果を低下させることによって、標的の細胞型においてＷｎｔシグナル伝達を選択的に調節するため及び／又は特定の疾患もしくは障害の治療のために有利である。
【００４６】
本発明の実施形態は、Ｗｎｔシグナル伝達経路と関連する疾患及び障害の診断、評価ならびに治療に関する、Ｗｎｔ代替分子の使用に関する。ある実施形態においては、主題のＷｎｔ代替分子を用いて、細胞又は組織においてＷｎｔシグナル伝達経路を調節する。ある実施形態においては、異常な又は無秩序な（例えば、低下した）Ｗｎｔシグナル伝達と関連する、又は例えば増加させることであるＷｎｔシグナル伝達の調節により治療効果が得られることとなる、疾患及び障害の治療又は予防において、主題のＷｎｔ代替分子を用いる。
【００４７】
本開示の実施では、特に反対のことを示していない限り、当技術の範囲内の、ウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学及び組換えＤＮＡ技術の従来の方法を採用することとするが、その多くを説明の目的で以下に記載する。こうした技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００９）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）及び他の同様の参考文献を参照されたい。
【００４８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形の“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、内容が明らかに別を述べているものでない限り、複数形を含む。
【００４９】
本明細書で用いる場合、「Ａ及び／又はＢ」は、Ａ又はＢのうちの１又は複数と、例えばＡ及びＢ等である、その組み合わせとを包含する。
【００５０】
本明細書の全体を通して、文脈が別段に要求していない限り、「含む」の語又は「含む」もしくは「含むこと」等の変化形は、述べている要素もしくは整数又は要素もしくは整数の群を含有するが、その他の要素もしくは整数又は要素もしくは整数の群を除外しない、ということを示唆するものであることが理解されるであろう。
【００５１】
本明細書における各実施形態は、別段に明示しない限り、全ての他の実施形態に対して、必要な変更を加えて適用されるものである。
【００５２】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織の培養及び形質転換（例えば、電気穿孔法、リポフェクション法）に関して、標準技術を用いることが可能である。酵素反応及び精製技術は、メーカーの規格に従って、又は当技術において通常なされるとおりに、もしくは本明細書に記載するとおりに、実施され得る。これらの関連する技術及び手順は、概して、当技術において周知の従来の方法に従って、また本明細書全体を通して引用して議論する種々の全般的且つより具体的な参考文献に記載のとおりに、実施され得る。具体的な定義が提供されていない限り、本明細書で記載する分子生物学、分析化学、合成有機化学ならびに医療及び製薬の化学に関連して利用される命名法と、これらの実験室的な手順及び技術とは、当技術において周知であり通常用いられるものである。組換え技術、分子生物学的な、微生物学的な、化学的な合成、化学分析、医薬品の調製、製剤及び送達、ならびに対象の治療に関して、標準技術を用いてもよい。
【００５３】
本開示の実施形態は、１又は複数のＦｚｄ受容体に結合する、抗体及びその抗原結合性フラグメントに関する。説明的な抗体、又は抗原結合性フラグメント、又はその相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を、配列番号１〜７３、表１Ａ及び１Ｂ、ならびに表５に記載する。
【００５４】
本開示の実施形態は、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に結合する、抗体及びその抗原結合性フラグメントに関する。説明的な抗体、又は抗原結合性フラグメント又はその相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を、配列番号７４〜９７、表２Ａ及び２Ｂ、ならびに表５に記載する。
【００５５】
当技術で周知であるように、抗体は免疫グロブリン分子であって、当該免疫グロブリン分子の可変領域に位置した、少なくとも１つのエピトープ認識部位を介して、例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等である標的に特異的に結合することが可能である免疫グロブリン分子である。本明細書で用いる場合、当該語は、インタクトなポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のみならず、そのフラグメント（ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）、単鎖（ｓｃＦｖ）、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））（Ｎａｂ；ＶＨＨ又は単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）とも呼ばれる）、その合成バリアント、天然のバリアント、抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び必要な特異性の抗原結合部位又はフラグメント（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子のその他の改変された構成もまた包含する。遺伝子融合によって構成された、「ダイアボディ」、多価又は多特異性のフラグメント（国際公開第９４／１３８０４号；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８，１９９３）もまた、本明細書で検討される抗体の特定の形態である。ＣＨ３ドメインと結合するｓｃＦｖを含むミニボディもまた、本明細書に含まれる（Ｓ．Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１，１９９６）。例えば、Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９）；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８）；ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号；国際公開第９４／１３８０４号；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８，１９９３；Ｙ．Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９−１２４５，１９９６；Ｓ．Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１，１９９６を参照されたい。
【００５６】
本明細書で用いる場合「抗原結合性フラグメント」の語は、関心の抗原に、特に１又は複数のＦｚｄ受容体に又はＬＲＰ５及び／もしくはＬＲＰ６に結合する、免疫グロブリンの重鎖及び／もしくは軽鎖の又はＶＨＨもしくはｓｄＡｂのうちの少なくとも１つのＣＤＲを含有するポリペプチドフラグメントを指す。この点において、本明細書に記載の抗体の抗原結合性フラグメントは、１又は複数のＦｚｄ受容体又はＬＲＰ５及び／もしくはＬＲＰ６に結合する抗体からの本明細書において記載するＶＨ及びＶＬの配列の、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ全てのＣＤＲを含み得る。特定の実施形態においては、抗原結合性フラグメントは、３つ全てのＶＨ  ＣＤＲ又は３つ全てのＶＬ  ＣＤＲを含み得る。同様に、その抗原結合性フラグメントは、ＶＨＨ又はｓｄＡｂの３つ全てのＣＤＲを含み得る。Ｆｚｄに特異的な抗体の抗原結合性フラグメントは、Ｆｚｄ受容体に結合することが可能である。ＬＲＰ５／６に特異的な抗体の抗原結合性フラグメントは、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６の受容体に結合することが可能である。本明細書で用いる場合、当該語は、単離されたフラグメントのみならず、例えば１又は複数のＦｚｄ受容体に結合するＶＨＨ又はｓｄＡｂならびにＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に結合するＶＨＨ又はｓｄＡｂを含む融合タンパク質等、例えば本明細書で開示する抗体の抗原結合性フラグメントを含む融合タンパク質等である、本明細書で開示する抗体の抗原結合性フラグメントを含むポリペプチドもまた包含する。
【００５７】
「抗原」の語は、例えば抗体である選択的結合剤が結合可能であり、さらに動物において用いられて、その抗原のエピトープに結合可能である抗体を産生することが可能である、分子又は分子の部分を指す。ある実施形態においては、結合剤（例えば、Ｗｎｔ代替分子又はその結合領域）は、それがその標的の抗原を、タンパク質及び／又はマクロ分子の複合体混合物において優先的に認識するときに、抗原に特異的に結合するといわれる。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子又はその結合領域（例えば、抗体又はその抗原結合性フラグメント）は、平衡解離定数が≦１０−７又は≦１０−８Ｍであるときに、抗原に特異的に結合するといわれる。一部の実施形態においては、平衡解離定数は、≦１０−９Ｍ又は≦１０−１０Ｍであり得る。
【００５８】
ある実施形態においては、本明細書に記載するような抗体及びその抗原結合性フラグメントは、重鎖及び軽鎖のＣＤＲの組であって、当該ＣＤＲに対する支持を提供して互いに相対的に当該ＣＤＲの空間的関係を規定する重鎖及び軽鎖のフレームワーク領域（ＦＲ）の組の間にそれぞれ入れられる、当該重鎖及び軽鎖のＣＤＲの組を含む。本明細書で用いる場合、「ＣＤＲの組」の語は、重鎖又は軽鎖のＶ領域の３つの高頻度可変領域を指す。重鎖又は軽鎖のＮ末端から先では、これら領域は、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」及び「ＣＤＲ３」と示す。したがって、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖のＶ領域のそれぞれよりのＣＤＲの組を含む、６つのＣＤＲを含む。単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書において「分子認識ユニット」と呼ぶ。いくつかの抗原−抗体複合体の結晶解析により、ＣＤＲのアミノ酸残基が結合抗原との幅広い接触を形成するものであって、最も広範である抗原の接触は、重鎖ＣＤＲ３によるものであるということが示されている。すなわち、分子認識ユニットが、抗原結合部位の特異性の主要な原因である。
【００５９】
本明細書で用いる場合、「ＦＲの組」の語は、重鎖又は軽鎖のＶ領域によるあるＣＤＲの組のうちのＣＤＲを組み立てる、隣接する４つのアミノ酸配列を指す。一部のＦＲ残基は、結合抗原と接触し得るが、ＦＲは、Ｖ領域の抗原結合部位へのフォールディングの主要な原因であり、特に、ＦＲ残基はＣＤＲと直接隣接する。ＦＲ内では、あるアミノ酸残基及びある構造的特徴が、非常に高度に保存される。この点において、全てのＶ領域の配列が、約９０個のアミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含有する。Ｖ領域が、結合部位内にフォールディングされるとき、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成するループモチーフを突出するようにディスプレイされる。概して、正確なＣＤＲアミノ酸配列にかかわらず、ある「古典的」構造にフォールディングされたＣＤＲループの形状に影響を及ぼすような、ＦＲの保存された構造領域が存在するということが認識される。さらに、あるＦＲ残基が、抗体の重鎖及び軽鎖の相互作用を安定化する、非共有結合性のドメイン間接触に関与することがわかっている。
【００６０】
免疫グロブリンのＣＤＲ及び可変ドメインの構造ならびに位置は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．１９８７、及びその改訂版を参照することにより求めることができ、現在インターネット上で利用可能である（ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）。Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ｂｉｏ社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）よりのＡｂｇｅｎｅｓｉｓソフトウェアを用いて、本明細書で開示する抗体の特異性決定領域をマッピングしたが、これはＣＤＲについてのＫａｂａｔの規定を含んでいる  （Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９，１３３−１３９（１９９５））。
【００６１】
「モノクローナル抗体」は、均質な抗体集団であって、そこではモノクローナル抗体が、エピトープの選択的結合に関与するアミノ酸（天然及び非天然の）からなるものである、均質な抗体集団を指す。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一のエピトープに対するものである。「モノクローナル抗体」の語は、インタクトなモノクローナル抗体及び完全長のモノクローナル抗体のみならず、そのフラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）、単鎖（ｓｃＦｖ）、ＶＨＨ又はｓｄＡｂ、そのバリアント、モノクローナル抗体の抗原結合性フラグメントを含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及び必要な特異性の抗原結合性フラグメント（エピトープ認識部位）と、エピトープに結合する能力とを含む免疫グロブリン分子のその他の改変された構成もまた包含し、本明細書で開示するＷｎｔ代替分子を含む。当該抗体の源又はその製造手法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選別、組換え発現、遺伝子導入動物による等）に関して限定する意図はない。当該語には、免疫グロブリン全体のみならず、「抗体」の定義の下で上記に記載したフラグメント等が含まれる。
【００６２】
タンパク質分解酵素パパインが、ＩｇＧ分子を優先的に切断していくつかのフラグメントが得られるが、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）フラグメント）がそれぞれ、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合性のヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２フラグメントを含めた、いくつかのフラグメントを提供することが可能である。本開示のある実施形態に従って用いるＦｖフラグメントは、ＩｇＭの、及び稀な場合ではＩｇＧ又はＩｇＡの免疫グロブリン分子、の優先的なタンパク質分解性の切断によって産生可能である。しかしながら、Ｆｖフラグメントは、当技術で公知の組換え技術を用いて誘導するのがより一般的である。Ｆｖフラグメントには、天然の抗体分子の抗原認識能及び抗原結合能の大部分を保持する抗原結合部位を含む非共有結合性ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体が含まれる。Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６−２７１０；及びＥｈｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６。
【００６３】
ある実施形態においては、単鎖Ｆｖ又はｓｃＦＶの抗体が、検討される。例えば、Ｋａｐｐａボディ（Ｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：９４９−５７（１９９７））；ミニボディ（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：５３０５−９（１９９４））；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９０：６４４４−８（１９９３））；又はＪａｎｕｓｉｎ（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：３６５５−５９（１９９１）及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．７：５１−５２（１９９２））が、所望の特異性を有する抗体の選択に関して、本願の教示に従った標準の分子生物学的技術を用いて調製され得る。さらに他の実施形態においては、本開示のリガンドを包含するような二重特異性又はキメラの抗体が作られ得る。例えば、キメラ抗体は、異なる抗体からのＣＤＲ及びフレームワーク領域を含み得、一方で二重特異性抗体は、第１の結合ドメインを介して１又は複数のＦｚｄ受容体に、及び第２の結合ドメインを介して第２の分子に、特異的に結合するものが生成され得る。これら抗体は、組換え分子の生物学的技術により産生され得るか、又は物理的に共に結合され得る。
【００６４】
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーによって連結したＶＨコード遺伝子及びＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合から発現される、共有結合的に連結したＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１６）：５８７９−５８８３。天然に凝集している−が化学的に分離される−、抗体Ｖ領域からのポリペプチド軽鎖及びポリペプチド重鎖の、抗原結合部位の構造と実質的に同様である三次元構造へとフォールディングすることとなるｓｃＦｖ分子への転換に関する化学的構造を識別するために、いくつかの方法が記載されている。例えばＨｕｓｔｏｎらに対する米国特許第第５，０９１，５１３号及び第５，１３２，４０５号；ならびにＬａｄｎｅｒらに対する米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい。
【００６５】
ある実施形態においては、本明細書に記載する抗体は、ダイアボディの形態である。ダイアボディは、ポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメインと、免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインとを含み、当該２つのドメインは（例えば、ペプチドリンカーによって）連結しているが、互いに結合して抗原結合部位を形成することができないものであって、当該抗原結合部位は、多量体の内部の１つのポリペプチドの第１のドメインが多量体の内部の別のポリペプチドの第２のドメインと結合することによって形成される（国際公開第９４／１３８０４号）。
【００６６】
抗体のｄＡｂフラグメントは、ＶＨドメインからなる（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））。
【００６７】
二重特異性抗体が用いられようとする場合、これらは、様々な方法で製造することが可能であり（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４，４４６−４４９（１９９３））、例えば化学的にもしくは雑種ハイブリドーマから調製されるような、従来の二重特異性抗体とすることができ、又は上記した二重特異性抗体フラグメントのいずれかであるものとすることができる。ダイアボディ及びｓｃＦｖは、可変ドメインのみを用いて、Ｆｃ領域なしで構築することが可能であり、抗イディオタイプ反応の影響を軽減する可能性がある。
【００６８】
二重特異性のダイアボディはまた、二重特異性の全抗体とは対照的に、特に有用であり得るが、これはそれらが大腸菌において容易に構築及び発現可能であるからである。適切な結合特異性のダイアボディ（及び抗体フラグメント等の多数の他のポリペプチド）は、ファージディスプレイ法（国際公開第９４／１３８０４号）を用いてライブラリから容易に選択可能である。ダイアボディの一方のアームが、例えば抗原Ｘに対する特異性で一定が保たれていれば、他方のアームが変動して適切な特異性の抗体が選択されるライブラリを作ることが可能である。二重特異性の全抗体は、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓエンジニアリング（Ｊ．Ｂ．Ｂ．Ｒｉｄｇｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９，６１６−６２１（１９９６））により作られ得る。
【００６９】
ある実施形態においては、本明細書に記載する抗体は、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の形態で提供され得る。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、ヒンジ領域を除去したＩｇＧ４抗体である（ＧｅｎＭａｂ社、オランダ国ユトレヒトを参照；例えば米国特許出願公開公報第２００９０２２６４２１号も参照）。この登録商標をもつ抗体の技術が、現在の小さい抗体の形態よりも長い予想治療域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）を伴った、安定なより小さい抗体の形態を作り出す。ＩｇＧ４抗体は、不活性であると考えられているため、免疫系と相互に作用しない。完全ヒトＩｇＧ４抗体は、抗体のヒンジ領域を除去することによって改変されて、対応するインタクトなＩｇＧ４（ＧｅｎＭａｂ社、ユトレヒト）と比較して歴然とした安定性を有する半分子フラグメントを獲得することができる。このＩｇＧ４分子を有することで、同種抗原（例えば、疾患の標的）に結合することが可能である、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）上の１つのみの領域が残るため、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）が、標的細胞上の１つのみの部位に一価で結合する。
【００７０】
ある実施形態においては、本開示の抗体は、ＶＨＨ又はｓｄＡｂの形態を取り得る。ＶＨＨ又はｓｄＡｂの技術は元来、ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄａｅ）（例えば、ラクダ及びラマ）は重鎖のみからなるために軽鎖を欠いている完全に機能的な抗体を所有するという発見及び特定の後で開発された。これら重鎖のみの抗体は、１つの可変ドメイン（ＶＨＨ）と、２つの定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３）とを含有する。クローン化されて単離された当該単一の可変ドメインは、完全な抗原結合能を有して、また非常に安定である。これら単一の可変ドメインは、それらの固有の構造的及び機能的な特徴を伴って、「ＶＨＨ又はｓｄＡｂ」の基礎を形成する。ＶＨＨ又はｓｄＡｂは、単一の遺伝子によってコードされ、またほぼ全ての原核生物及び真核生物の宿主、例えば大腸菌（例えば米国特許第６，７６５，０８７号を参照）、カビ（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ））及び酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）（例えば、米国特許第６，８３８，２５４号を参照）、において効率よく産生される。産生過程は拡張性があるので、数キログラム量のＶＨＨ又はｓｄＡｂが産生されてきた。ＶＨＨ又はｓｄＡｂは、長い貯蔵寿命を有する直ぐに使用できる溶液として調製してもよい。Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ（登録商標）法（例えば、国際公開第０６／０７９３７２号を参照）が、所望の標的に対するＶＨＨ又はｓｄＡｂを生成するための登録商標をもつ方法であり、自動化されたＢ細胞のハイスループット選択に基づく。ＶＨＨ又はｓｄＡｂは、ラクダ科特異性の重鎖のみの抗体の単一ドメイン抗原結合性フラグメントである。ＶＨＨ又はｓｄＡｂは、典型的には、約１５ｋＤａの小さいサイズである。
【００７１】
ある実施形態においては、本明細書で開示する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ヒト化される。これは、概して組換え技術を用いて調製されたキメラ分子であって、非ヒトである種よりの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位とヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく分子のうちの残りの免疫グロブリン構造とを有する、当該キメラ分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合した完全可変ドメインか、又は可変ドメインにおける適切なフレームワーク領域上に移植されたＣＤＲのみのいずれかを含み得る。エピトープ結合部位は、野生型であってもよく、又は１もしくは複数のアミノ酸置換によって改変されていてもよい。これは、ヒト個体における免疫原としての定常領域を除去するが、外来の可変領域に対する免疫応答能力は残したままである（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９８８）８６：１００２９−１００３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３２：３２３−３２７）。本明細書で開示する抗Ｆｚｄ抗体のヒト化のための説明的な方法は、米国特許第  ７，４６２，６９７号に記載の方法を含む。
【００７２】
別のアプローチでは、ヒト由来の定常領域を提供することのみならず、ヒト形態にできる限り近いように可変領域を再構成するように、可変領域も改変することにも焦点を当てている。重鎖及び軽鎖両方の可変領域は、当該エピトープに応じて変動して結合能を決定するものである３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有し、所与の種において比較的保存されていて、またＣＤＲのための足場を提供するといわれている４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接する、ということがわかっている。非ヒト抗体が、特定のエピトープに対して調製される場合、可変領域は、改変しようとするヒト抗体に存在するＦＲ上に非ヒト抗体由来のＣＤＲを移植することによって、「再構成」又は「ヒト化」することが可能である。このアプローチを様々な抗体に適用することは、Ｓａｔｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：８５１−８５６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：７７３−３７８３；Ｍａｅｄａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：１２４−１３４；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：４１８１−４１８５；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：２８６９−２８７３；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５−４２８９；及びＣｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１１４９−１１５４によって報告されている。一部の実施形態においては、ヒト化抗体は、全てのＣＤＲ配列を保存している（例えば、マウス抗体からの６つ全てのＣＤＲを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態においては、ヒト化抗体は、元の抗体と比べて変えられている１又は複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）を有し、これは、元の抗体よりの１又は複数のＣＤＲに「由来する」１又は複数のＣＤＲとも呼ぶ。
【００７３】
ある実施形態においては、本開示の抗体は、キメラ抗体であり得る。この点において、キメラ抗体は、異なる抗体の異種Ｆｃ部分と操作可能に連結又はそうでなければ融合された、抗体の抗原結合性フラグメントから構成される。ある実施形態においては、この異種Ｆｃドメインはヒト起源のものである。他の実施形態においては、異種Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む）及びＩｇＭを含む、親抗体からの異なるＩｇクラスよりのものであり得る。さらなる実施形態においては、異種Ｆｃドメインは、異なるＩｇクラスのうちの１又は複数よりのＣＨ２及びＣＨ３ドメインから構成され得る。ヒト化抗体に関して上記したとおり、キメラ抗体の抗原結合性フラグメントは、本明細書に記載する抗体のＣＤＲのうちの１のみもしくは複数（例えば、本明細書に記載する抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＣＤＲ）を含み得、又は、可変ドメイン全体（ＶＬ、ＶＨ又は両方）を含み得る。
【００７４】
Ｗｎｔ代替物
本開示は、ある態様においては、１又は複数のＦｚｄ受容体と、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６のうちの一方又は両方との両方に結合するＷｎｔ代替分子を提供する。Ｗｎｔ代替分子はまた、「Ｗｎｔ代替物」又は「Ｗｎｔ模倣物」と呼び得る。特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、１又は複数のヒトＦｚｄ受容体と、ヒトＬＲＰ５及び／又はヒトＬＲＰ６のうちの一方又は両方とに結合する。
【００７５】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、Ｗｎｔ代替分子と接触させた細胞において、Ｗｎｔシグナル伝達事象を改変することができる、又は改変する。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、Ｗｎｔシグナル伝達を、例えば古典的Ｗｎｔ／β−カテニン経路を介して、増加させる。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、ヒトＷｎｔシグナル伝達経路の生物学的活性を、特異的に改変する。
【００７６】
本開示のＷｎｔ代替分子は、１又は複数のＦｚｄ受容体、及びＬＲＰ５及びＬＲＰ６のうちの１又は複数に結合する際において、ならびにＷｎｔシグナル伝達の活性化において、生物学的に活性であり、すなわちＷｎｔ代替分子は、Ｗｎｔアゴニストである。「Ｗｎｔアゴニスト活性」の語は、アゴニストの、Ｆｚｄ受容体及び／又はＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６に結合するＷｎｔタンパク質の影響又は活性を模倣する能力を指す。本明細書に開示するＷｎｔ代替分子及び他のＷｎｔアゴニストの、Ｗｎｔの活性を模倣する能力は、いくつかのアッセイで確認することが可能である。Ｗｎｔアゴニストは、典型的に、受容体の天然のリガンドによって開始されるものと同様又は同一である反応又は活性を開始する。特に、本明細書で開示するＷｎｔアゴニストは、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を、活性化、増強又は増加させる。本明細書で用いる場合、「増強する」の語は、例えば本明細書で開示するＷｎｔ代替分子であるＷｎｔアゴニストが不在下でのレベルと比較して、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達のレベルが測定可能に増加することを指す。特定の実施形態においては、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達のレベルの増加は、例えば同一の細胞型における、Ｗｎｔアゴニストの不在下でのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達のレベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍である。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を測定する方法は、当技術において公知であり、また本明細書に記載するものを含む。本明細書で開示するＷｎｔ代替分子は、多特異性であり、すなわち、当該Ｗｎｔ代替分子は、２又は複数の異なるエピトープに特異的に結合する。少なくとも１つのエピトープは、１又は複数のＦｚｄ受容体の範囲内にあり、また少なくとも１つのエピトープはＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に結合する。特定の実施形態においては、多特異性Ｗｎｔ代替分子は、Ｆｚｄ受容体結合に対して多特異性であり、すなわちそれらは、Ｆｚｄ受容体の２以上の異なる型に、単一の型のＦｚｄ受容体内の２以上の異なるエピトープに、又はそれらの組み合わせに、特異的に結合する。例えば、多特異性Ｗｎｔ代替分子は、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ３、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ８、Ｆｚｄ９及びＦｚｄ１０のうちの２以上に結合し得る。ある実施形態においては、多特異性Ｗｎｔ代替分子が、（ｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ９；（ｉｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２及びＦｚｄ７；（ｉｉｉ）Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８；（ｉｖ）Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８；（ｖ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８；（ｖｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８；（ｖｉｉ）Ｆｚｄ４及びＦｚｄ９；（ｖｉｉｉ）Ｆｚｄ９及びＦｚｄ１０；（ｉｘ）Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ８及びＦｚｄ１０；（ｘ）Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８；又は（ｘｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８に結合する。
【００７７】
ある実施形態においては、Ｆｚｄ結合に対して多特異性であるＷｎｔ代替分子は、例えば異なるＦｚｄ受容体内のエピトープ、同一のＦｚｄ受容体内の異なるエピトープ、又はその組み合わせである、複数の異なるＦｚｄ受容体エピトープに結合する少なくとも１つのＦｚｄ結合領域を含む。例えば、Ｗｎｔ代替分子は、２以上のＦｚｄ受容体、例えばＦｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ３、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ８、Ｆｚｄ９及びＦｚｄ１０のうちの２以上、に結合する少なくとも１つのＦｚｄ結合領域を含み得る。別の例としては、Ｗｎｔ代替分子が、（ｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ９；（ｉｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２及びＦｚｄ７；（ｉｉｉ）Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８；（ｉｖ）Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８；（ｖ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８；（ｖｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８；（ｖｉｉ）Ｆｚｄ４及びＦｚｄ９；（ｖｉｉｉ）Ｆｚｄ９及びＦｚｄ１０；（ｉｘ）Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ８及びＦｚｄ１０；（ｘ）Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８；又は（ｘｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８に結合する少なくとも１つのＦｚｄ結合領域を含み得る。
【００７８】
あるいは、又は組み合わせて、ある実施形態においては、Ｆｚｄ結合に対して多特異性であるＷｎｔ代替分子は、例えば異なるＦｚｄ受容体内のエピトープ、同一のＦｚｄ受容体内の異なるエピトープ、又はその組み合わせである、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組にそれぞれが結合する少なくとも２つのＦｚｄ結合領域を含む。１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの組は、各Ｆｚｄ結合領域が単一特異性、二重特異性、三重特異性、四重特異性等であり得るように、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のＦｚｄ受容体エピトープを含み得る。
【００７９】
ある実施形態においては、多特異性Ｗｎｔ代替物が２以上のＦｚｄ結合領域を含むものであって、これらＦｚｄ結合領域のうちの１又は複数が、１つのみのＦｚｄ受容体又は受容体エピトープに特異的に結合する。ある実施形態においては、多特異性Ｗｎｔ代替物内の２以上、３以上又は４以上のＦｚｄ結合領域が、それぞれ特異的に１つのみのＦｚｄ受容体又は受容体エピトープに結合するものであって、Ｆｚｄ結合領域のうちの少なくとも２以上、少なくとも３以上、又は少なくとも４以上が、異なるＦｚｄ受容体及び／又は受容体エピトープに特異的に結合する。
【００８０】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの第１の組に結合する第１のＦｚｄ結合領域と、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる第２の組に結合する第２のＦｚｄ結合領域とを含む。例えば、第１のＦｚｄ結合領域は、１又は複数のＦｚｄ受容体の第１の組に結合し得、また第２のＦｚｄ結合領域は、１又は複数のＦｚｄ受容体の異なる第２の組に結合し得る。あるいは、又は組み合わせて、第１のＦｚｄ結合領域は、１又は複数のＦｚｄ受容体の組内の、１又は複数のエピトープの第１の組に結合し得、また第２のＦｚｄ結合領域は、１又は複数のＦｚｄ受容体の同一の組内の、１又は複数のエピトープの異なる第２の組に結合し得る。ある実施形態においては、第１のＦｚｄ結合領域が、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ３、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ８、Ｆｚｄ９、及びＦｚｄ１０のうちの１又は複数に結合する。ある実施形態においては、第２のＦｚｄ結合領域が、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ３、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ８、Ｆｚｄ９、及びＦｚｄ１０のうちの１又は複数に結合する。
【００８１】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、第１のＦｚｄ結合領域と第２のＦｚｄ結合領域とを含むものであって、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ２に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ３に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ４に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ５に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ６に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ７に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ８に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ９に結合するか、又は第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１０に結合する。
【００８２】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、第１のＦｚｄ結合領域と第２のＦｚｄ結合領域とを含むものであって、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ２に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ３に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ２に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ４に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ２に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ５に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ２に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ６に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ２に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ７に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ２に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ８に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ２に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ９に結合するか、又は第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ２に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１０に結合する。
【００８３】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、第１のＦｚｄ結合領域と第２のＦｚｄ結合領域とを含むものであって、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ３に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ４に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ３に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ５に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ３に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ６に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ３に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ７に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ３に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ８に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ３に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ９に結合するか、又は第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ３に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１０に結合する。
【００８４】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、第１のＦｚｄ結合領域と第２のＦｚｄ結合領域とを含むものであって、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ４に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ５に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ４に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ６に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ４に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ７に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ４に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ８に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ４に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ９に結合するか、又は第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ４に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１０に結合する。
【００８５】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、第１のＦｚｄ結合領域と第２のＦｚｄ結合領域とを含むものであって、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ５に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ６に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ５に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ７に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ５に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ８に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ５に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ９に結合するか、又は第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ５に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１０に結合する。
【００８６】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、第１のＦｚｄ結合領域と第２のＦｚｄ結合領域とを含むものであって、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ６に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ７に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ６に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ８に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ６に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ９に結合するか、又は第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ６に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１０に結合する。
【００８７】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、第１のＦｚｄ結合領域と第２のＦｚｄ結合領域とを含むものであって、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ７に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ８に結合するか、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ７に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ９に結合するか、又は第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ７に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１０に結合する。
【００８８】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、第１のＦｚｄ結合領域と第２のＦｚｄ結合領域とを含むものであって、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ８に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ９に結合するか、又は第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ８に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１０に結合する。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、第１のＦｚｄ結合領域と第２のＦｚｄ結合領域とを含むものであって、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ９に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１０に結合する。
【００８９】
上記に開示したＦｚｄ受容体の組み合わせのそれぞれに関して、ある実施形態においては、第１の結合領域又は第２の結合領域が、示したＦｚｄのみに特異的に結合し得るか、又はそれがさらなるＦｚｄに結合し得るということが理解される。例えば、第１のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ１に結合し、かつ第２のＦｚｄ結合領域がＦｚｄ２に結合する場合、第１のＦｚｄ結合領域はＦｚｄ１のみに特異的に結合してもよいし、又はそれはまたＦｚｄ１に加えて１又は複数の他のＦｚｄに結合してもよい。同様に、第２のＦｚｄ結合領域は、Ｆｚｄ２のみに特異的に結合してもよいし、又は、Ｆｚｄ２に加えて１又は複数の他のＦｚｄに結合してもよい。しかしながら、第１のＦｚｄ結合領域及び第２のＦｚｄ結合領域は、Ｆｚｄ受容体の異なる組に結合する。
【００９０】
ある実施形態においては、第１の結合領域及び第２の結合領域は、同一のＦｚｄ受容体内の異なるエピトープに特異的に結合し得る。例えば、第１の結合領域は、Ｆｚｄ１内の第１のエピトープに結合し得、また第２の結合領域は、Ｆｚｄ１内の異なる第２のエピトープに結合し得る。第１の結合領域は、Ｆｚｄ２内の第１のエピトープに結合し得、また第２の結合領域は、Ｆｚｄ２内の異なる第２のエピトープに結合し得る。第１の結合領域は、Ｆｚｄ３内の第１のエピトープに結合し得、また第２の結合領域は、Ｆｚｄ３内の異なる第２のエピトープに結合し得る。第１の結合領域は、Ｆｚｄ４内の第１のエピトープに結合し得、また第２の結合領域は、Ｆｚｄ４内の異なる第２のエピトープに結合し得る。第１の結合領域は、Ｆｚｄ５内の第１のエピトープに結合し得、また第２の結合領域は、Ｆｚｄ５内の異なる第２のエピトープに結合し得る。第１の結合領域は、Ｆｚｄ６内の第１のエピトープに結合し得、また第２の結合領域は、Ｆｚｄ６内の異なる第２のエピトープに結合し得る。第１の結合領域は、Ｆｚｄ７内の第１のエピトープに結合し得、また第２の結合領域は、Ｆｚｄ７内の異なる第２のエピトープに結合し得る。第１の結合領域は、Ｆｚｄ８内の第１のエピトープに結合し得、また第２の結合領域は、Ｆｚｄ８内の異なる第２のエピトープに結合し得る。第１の結合領域は、Ｆｚｄ９内の第１のエピトープに結合し得、また第２の結合領域は、Ｆｚｄ９内の異なる第２のエピトープに結合し得る。第１の結合領域は、Ｆｚｄ１０内の第１のエピトープに結合し得、また第２の結合領域は、Ｆｚｄ１０内の異なる第２のエピトープに結合し得る。
【００９１】
上記に開示したＦｚｄ受容体エピトープの組み合わせのそれぞれに関して、ある実施形態においては、第１の結合領域又は第２の結合領域が、示したエピトープのみに特異的に結合し得るか、又はさらなるエピトープに結合し得るということが理解される。例えば、第１の結合領域が、Ｆｚｄ１内の第１のエピトープに結合し、かつ第２の結合領域がＦｚｄ１内の異なる第２のエピトープに結合する場合、第１の結合領域はＦｚｄ１内の第１のエピトープのみに特異的に結合してもよいし、又はそれはまた、Ｆｚｄ１内の１もしくは複数の他のエピトープ又は他のＦｚｄ受容体に結合してもよい。同様に、第２のＦｚｄ結合領域は、Ｆｚｄ１内の第２のエピトープのみに特異的に結合してもよいし、又は、Ｆｚｄ１内の１もしくは複数の他のエピトープもしくは他のＦｚｄ受容体に結合してもよい。第１の結合領域及び第２の結合領域が、同一のＦｚｄ受容体に特異的に結合する実施形態においては、第１の結合領域及び第２の結合領域は、同一の受容体内の異なるエピトープに結合する。
【００９２】
特定の実施形態においては、多特異性Ｗｎｔ代替分子は、ＬＲＰ５／６結合に対して多特異性であり、すなわちそれらは、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６内の２以上の異なるエピトープに特異的に結合する。ある実施形態においては、多特異性Ｗｎｔ代替分子は、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６内の第１のエピトープに結合する第１のＬＲＰ５／６結合領域と、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６内の異なる第２のエピトープに結合する第２のＬＲＰ５／６結合領域とを含む。
【００９３】
ＬＲＰ受容体エピトープの組み合わせのそれぞれに関して、ある実施形態においては、第１の結合領域又は第２の結合領域が、示したエピトープのみに特異的に結合し得るか、又はさらなるエピトープに結合し得るということが理解される。例えば、第１の結合領域が、ＬＲＰ５Ｅ１Ｅ２内の第１のエピトープに結合し、かつ第２の結合領域がＬＲＰ５Ｅ１Ｅ２内の異なる第２のエピトープに結合する場合、第１の結合領域はＬＲＰ５Ｅ１Ｅ２内の第１のエピトープのみに特異的に結合してもよいし、又はそれはまた、ＬＲＰ５Ｅ１Ｅ２内の１もしくは複数の他のエピトープもしくは他のＬＲＰ受容体に結合してもよい。同様に、第２のＬＲＰ結合領域は、ＬＲＰ５Ｅ１Ｅ２内の第２のエピトープのみに特異的に結合してもよいし、又は、ＬＲＰ５Ｅ１Ｅ２内の１もしくは複数の他のエピトープもしくは他のＬＲＰ受容体に結合してもよい。第１の結合領域及び第２の結合領域が、同一のＬＲＰ受容体に特異的に結合する実施形態においては、第１の結合領域及び第２の結合領域は、同一の受容体内の異なるエピトープに結合する。同様のエピトープ結合が、ＬＲＰ５Ｅ３Ｅ４、ＬＲＰ６Ｅ１Ｅ２及びＬＲＰ６Ｅ３Ｅ４に関して発生可能である。特定の実施形態においては、多特異性Ｗｎｔ代替分子は、Ｆｚｄ結合とＬＲＰ５／６結合との両方に対して多特異性である。例えば、Ｗｎｔ代替分子は、１又は複数のＦｚｄ受容体の異なる組にそれぞれが特異的に結合する複数のＦｚｄ結合領域と、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６内の異なるエピトープにそれぞれが特異的に結合する複数のＬＲＰ５／６結合領域とを含み得る。本明細書で開示するＦｚｄ結合領域及びＬＲＰ５／６結合領域の様々な実施形態は、Ｆｚｄ及びＬＲＰ５／６の結合特異性の任意の所望の組み合わせを伴う多特異性Ｗｎｔ代替分子を生成するためのいくつかの方法において組み合わせることができる、ということが理解されるものである。
【００９４】
特定の実施形態においては、本明細書に開示するＷｎｔ代替分子は、多特異性であり、例えばそれらは、同一のエピトープにそれぞれが特異的に結合する２以上の領域、例えば１もしくは複数のＦｚｄ受容体内のエピトープに結合する２以上の領域、及び／又はＬＲＰ５及び／もしくはＬＲＰ６内のエピトープに結合する２以上の領域、を含む。特定の実施形態においては、それらは、１又は複数のＦｚｄ受容体内のエピトープに結合する２以上の領域と、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６内のエピトープに結合する２以上の領域とを含む。
【００９５】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、Ｆｚｄ結合領域とＬＲＰ５／６結合領域とを、Ｆｚｄｎ：ＬＲＰ５／６ｎ（Ｆｎ：Ｌｎ）の比で含むものであって、ここでＦ及びＬは、１及び９を含めた１から９の間の整数であり、またｎは、１及び４を含めた１から４の間の整数である。
【００９６】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、１又は複数のＦｚｄ受容体に結合する領域の数の、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に結合する領域の数に対する比を、以下のとおり、又はほぼ以下のとおりとして含む：１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、２：１、２：３、２：５、２：７、７：２、５：２、３：２、３：４、３：５、３：７、３：８、８：３、７：３、５：３、４：３、４：５、４：７、４：９、９：４、７：４、５：４、６：７、７：６、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、２：１（２つのＦｚｄバインダーと１つのＬＲＰバインダーとを伴う）、１：２（１つのＦｚｄバインダーと２つのＬＲＰバインダーとを伴う）、２：１：１（２つの異なるＬＲＰバインダーを伴う）、１：１：２（２つの異なるＦｚｄバインダーを伴う）、１：１：１（２つの異なるＦｚｄバインダーと１つのＬＲＰバインダーとを伴うか又は１つのＦｚｄバインダーと２つの異なるＬＲＰバインダーとを伴う）及び１：１：１：１（全ての異なるＦｚｄバインダーとＬＲＰバインダー）。Ｆｚｄ結合部分のＬＲＰ５／６結合部分に対する比を変えることで、組織及び／又は機能的な特異性を与えて、シグナル伝達レベルを調節することが可能である。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、多特異性であり多価である。
【００９７】
本明細書で開示するＷｎｔ代替分子は、種々の異なる構造形態又は構成のいずれかを有し得る。Ｗｎｔ代替分子は、ポリペプチド、及び／又は非ポリペプチドの結合部分、例えば小分子、を含み得る。特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、ポリペプチド領域と、非ポリペプチドの結合部分との両方を含む。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、単一のポリペプチドを含み得るか、又は２以上、３以上もしくは４以上のポリペプチドを含み得る。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替物は、例えば互いに連結もしくは結合している、又は互いに融合している、１つ、２つ、３つ又は４つのポリペプチドを含む。
【００９８】
Ｗｎｔ代替分子が単一のポリペプチドを含む場合、当該分子は、１又は複数のＦｚｄ結合領域（本明細書においては、「Ｆｚｄ結合ドメイン」とも呼ぶ）と、１又は複数のＬＲＰ５／６結合領域（本明細書においては、「ＬＲＰ５／６結合ドメイン」とも呼ぶ）とを含む融合タンパク質であり得る。結合領域同士は、直接融合し得るか、又は本明細書に開示するもののいずれかを含むがこれに限定されない、例えばポリペプチドリンカー又は化学リンカーであるリンカーを介して結合し得る。
【００９９】
Ｗｎｔ代替分子が２以上のポリペプチドを含む場合、ポリペプチド同士は、例えばジスルフィド結合等である共有結合を介して、及び／又は非共有結合的な相互作用を介して、連結し得る。例えば、ヒト免疫グロブリンＩｇＧの重鎖は、当該重鎖のＣＨ３ドメインレベルで直接相互作用し、一方で、当該重鎖は、当該重鎖のＣＨ２ドメインレベルで、ＤＥターンにおけるアスパラギン（Ａｓｎ）Ｎ８４．４に結合する炭水化物を介して相互作用する。
【０１００】
Ｗｎｔ代替ポリペプチドは、２つのポリペプチド間の結合を促進するように改変してもよい。例えば、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓのアミノ酸改変を、２つの異なるポリペプチドに導入して、それらの結合を促進してもよい。ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓのアミノ酸（ＡＡ）の変更は、二重特異性のＩｇＧ抗体の産生において重鎖のヘテロ二量体形成に用いられる、抗体の遺伝子工学で開発された合理的な設計戦略である。第１の抗体からの重鎖のＣＨ３上にｋｎｏｂを、そして第２の抗体からの重鎖のＣＨ３上にｈｏｌｅを形成するために、ＡＡの変更が操作される。ｋｎｏｂは、「非常に大きな」ＩＭＧＴボリュームクラスのＡＡに属するチロシン（Ｙ）で表すことができ、一方でｈｏｌｅは、「小さな」ＩＭＧＴボリュームクラスに属するトレオニン（Ｔ）で表すことができる。改変をポリペプチドに導入してそれらの結合を促進する他の手段は、当技術において公知であり、また利用可能である。例えば、システイン等である、特定のアミノ酸を導入して架橋に用いて、分子間のジスルフィド結合を形成することができる。
【０１０１】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、抗体又はその抗原結合性フラグメント、例えば抗体の重鎖又は抗体の軽鎖又はそのフラグメント、に由来する１又は複数の結合領域を含む。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子の１又は複数のポリペプチドは、抗体又はその抗原結合性フラグメントである。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替物は、例えば１又は複数のＦｚｄ受容体に結合するものと、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に結合するものとである、２つの抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替物は、例えば１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの第１の組に結合するものと、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる第２の組に結合するものと、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に結合するものとである、３つの抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替物は、例えば１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの第１の組に結合するものと、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる第２の組に結合するものと、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６内の第１のエピトープに結合するものと、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６内の異なる第２のエピトープに結合するものとである、４つの抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む。
【０１０２】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、１又は複数のジスルフィド結合を介して共に結合する２つの抗体の重鎖領域（例えばヒンジ領域）を含むポリペプチドを含む。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、１又は複数のジスルフィド結合を介して共に結合する抗体の軽鎖領域（例えば、ＣＬ領域）と抗体の重鎖領域（例えば、ＣＨ１領域）とを含むポリペプチドを含む。
【０１０３】
Ｗｎｔ代替分子は、図１に示すものを含むがこれに限定されない、種々の異なる構造形態を有し得る。
【０１０４】
一実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、ＶＨＨ又はｓｄＡｂ又はその抗原結合性フラグメントに融合する、ｓｃＦｖ又はその抗原結合性フラグメントを含む。ある実施形態においては、ｓｃＦｖは、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープに特異的に結合し、またＶＨＨ又はｓｄＡｂは、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に特異的に結合する。ある実施形態においては、ｓｃＦｖは、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に特異的に結合し、またＶＨＨ又はｓｄＡｂは、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープに特異的に結合する。特定の実施形態においては、ｓｃＦｖ又はその抗原結合性フラグメントは、ＶＨＨ又はｓｄＡｂ又はその抗原結合性フラグメントに直接融合して、一方で他の実施形態においては、２つの結合領域は、リンカー部分を介して融合する。特定の実施形態においては、ＶＨＨ又はｓｄＡｂは、ｓｃＦＶのＮ末端に融合し、一方で他の実施形態においては、ＶＨＨ又はｓｄＡｂは、ｓｃＦｖのＣ末端に融合する。特定の実施形態においては、ｓｃＦｖは、本明細書に記載されており、又は本明細書に記載のＣＤＲの組のいずれかを含む。特定の実施形態においては、ＶＨＨ又はｓｄＡｂは、本明細書に記載されており、又は本明細書に開示するＣＤＲの組のいずれかを含む。
【０１０５】
様々な実施形態においては、図１に示すものを含むがこれに限定されることなく、Ｗｎｔ代替分子は、１又は複数のＦａｂ又はその抗原結合性フラグメントと、１又は複数のＶＨＨ又はｓｄＡｂ又はその抗原結合性フラグメント（又はあるいは、１又は複数のｓｃＦｖ又はその抗原結合性フラグメント）とを含む。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替物は、２以上のＦａｂを含み、そのそれぞれが１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組に特異的に結合し、またＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に特異的に結合する。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替物は、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に特異的に結合するＦａｂと、２以上のＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）であって、そのそれぞれが１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組に特異的に結合する２以上のＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）とを含む。ある実施形態においては、ＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、ＦａｂのＮ末端に融合し、一方で一部の実施形態においては、ＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、ＦａｂのＣ末端に融合する。特定の実施形態においては、Ｆａｂは、完全ＩｇＧ形態で存在し、またＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、ＩｇＧ軽鎖のＮ末端及び／又はＣ末端に融合する。特定の実施形態においては、Ｆａｂは、完全ＩｇＧ形態で存在し、またＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、ＩｇＧ重鎖のＮ末端及び／又はＣ末端に融合する。特定の実施形態においては、２以上のＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、これら位置の任意の組み合わせにおいてＩｇＧに融合するものであって、２以上のＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）のそれぞれは、Ｆｚｄの異なる組に結合する。
【０１０６】
Ｆａｂは、例えばＦｃ領域に融合するＦａｂを含む融合ポリペプチドを生成する遺伝子工学を用いて、Ｆａｂ及びＦｃのフラグメント両方を含む完全ＩｇＧ形態に変換され得、すなわちＦａｂは、完全ＩｇＧ形態で存在する。完全ＩｇＧ形態のＦｃ領域は、種々の異なるＦｃのいずれかに由来し得、野生型の又は改変されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又は他のアイソタイプであって、例えば野生型の又は改変されたヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＧ４Ｐｒｏ（ＩｇＧ４半分子の形成を防止する、コアヒンジ領域内の変異を含む）、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＥ、ヒトＩｇＭ、又はＩｇＧ１  ＬＡＬＡＰＧとも呼ばれる改変されたＩｇＧ１を含むが、これに限定されない。Ｌ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ，Ｐ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ−ＰＧ）バリアントは、マウスＩｇＧ２ａ及びヒトＩｇＧ１の両方において補体の結合及び固定を除去するのみならず、Ｆｃ−γ依存性抗体依存性細胞が介在する細胞毒性（ＡＤＣＣ）を除去することが示されている。これらＬＡＬＡ−ＰＧ置換が、マウス及び哺乳動物間の「エフェクタなし」抗体フレームワークの足場により生成された結果物のより正確な翻訳を可能にする。本明細書で開示するＩｇＧのいずれかの特定の実施形態においては、ＩｇＧは、以下のアミノ酸置換のうちの１又は複数を含む：Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｅ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ又はＰ２３６Ｇ。
【０１０７】
１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープとＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６との両方に対して二価である、二価で二重特異性のＷｎｔ代替分子の非限定的な例は、図１に示す上の４つの構造として提供されるが、ここでＶＨＨ又はｓｄＡｂ又はｓｃＦｖは、赤色、青色又は黄色で塗りつぶした１つの楕円として示され、またＦａｂ又はＩｇＧは青で示される。図示するように、ＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、両方の軽鎖のＮ末端、両方の重鎖のＮ末端、両方の軽鎖のＣ末端、又は両方の重鎖のＣ末端、に融合し得る。例えば、ＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、重鎖及び／もしくは軽鎖のＮ末端ならびにＣ末端の両方に、軽鎖及び重鎖のＮ末端に、重鎖及び軽鎖のＣ末端に、重鎖のＮ末端及び軽鎖のＣ末端に、又は重鎖のＣ末端及び軽鎖のＮ末端に、融合することができるということもさらに検討する。他の関連の実施形態においては、２以上のＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、随意にリンカー部分を介して、共に融合し得、またこれら位置のうちの１又は複数においてＦａｂ又はＩｇＧに融合し得る。特定の実施形態においては、２以上のＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組にそれぞれが結合し得る。
【０１０８】
関連の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、ヘテロ−Ｉｇ形態を有し、一方で、Ｆａｂは半抗体として存在し、また１又は複数のＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、ＦｃのＮ末端、ＦａｂのＮ末端、ＦｃのＣ末端、又はＦａｂのＣ末端のうちの１又は複数に融合する。特定の実施形態においては、２以上のＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、ＦｃのＮ末端、ＦａｂのＮ末端、ＦｃのＣ末端、又はＦａｂのＣ末端に融合するものであって、ＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）のそれぞれは、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組に結合する。各受容体のこの形態のバージョンに対して二重特異性であるが一価のものを、図１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆに示しているが、これは２以上のＦｚｄ結合領域を含めるように改変してもよいものであって、ここで当該Ｆｚｄ結合領域のうちの少なくとも２つは、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組に結合する。ある実施形態においては、Ｆａｂ又はその抗原結合性フラグメント（又はＩｇＧ）は、ＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）又はその抗原結合性フラグメントに直接融合して、一方で他の実施形態においては、結合領域は、リンカー部分を介して融合する。特定の実施形態においては、Ｆａｂは、本明細書に記載されており、又は本明細書に記載のＣＤＲの組のいずれかを含む。特定の実施形態においては、ＶＨＨ又はｓｄＡｂ又はｓｃＦｖは、本明細書に記載されており、又は本明細書に記載のＣＤＲの組のいずれかを含む。
【０１０９】
様々な実施形態においては、図１Ｖ、１Ｗ、１Ｘ、１ＡＡに示すものを含むがこれに限定されることなく、Ｗｎｔ代替分子は、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープに結合する１又は複数のＦａｂ又はその抗原結合性フラグメントと、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に結合する１又は複数のＦａｂ又はその抗原結合性フラグメントとを含む。ある実施形態においては、１もしくは複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組に結合する２つのＦａｂもしくはその抗原結合性フラグメント、ならびに／又は、ＬＲＰ５及び／もしくはＬＲＰ６に結合する２つのＦａｂもしくは抗原結合性フラグメントを含む。特定の実施形態においては、Ｆａｂのうちの１又は複数が完全ＩｇＧ形態で存在し、またある実施形態においては、両Ｆａｂが完全ＩｇＧ形態で存在する。ある実施形態においては、完全ＩｇＧ形態のＦａｂは、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープに特異的に結合し、また他のＦａｂは、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に特異的に結合する。ある実施形態においては、Ｆａｂは、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組に特異的に結合し、また完全ＩｇＧ形態のＦａｂは、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に特異的に結合する。ある実施形態においては、ＦａｂはＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に特異的に結合し、また完全ＩｇＧ形態のＦａｂは、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組に特異的に結合する。ある実施形態においては、Ｆａｂは、ＩｇＧのＮ末端に、すなわち、随意にリンカーを介して、重鎖又は軽鎖のＮ末端に、融合する。ある実施形態においては、Ｆａｂは、ＩｇＧの重鎖のＮ末端に融合し、そして軽鎖に融合しない。特定の実施形態においては、２つの重鎖は、直接又はリンカーを介して、共に融合可能である。両受容体に関してこうした二重特異性かつ二価であるものの例を、図１Ｖ、１Ｗ、１Ｘ及び１ＡＡに示す。他の関連の実施形態においては、２以上のＶＨＨ又はｓｄＡｂは、随意にリンカー部分を介して、共に融合し得、またこれら位置のうちの１又は複数においてＦａｂ又はＩｇＧに融合し得る。関連の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、ヘテロ−ＩｇＧ形態であり、一方で、Ｆａｂのうちの１つは半抗体として存在し、また他のＦａｂは、ＦｃのＮ末端、ＦａｂのＮ末端、又はＦｃのＣ末端のうちの１又は複数に融合する。各受容体のこの形態のバージョンに対して二重特異性であるが一価のものを、図１Ｄに示しているが、これは１又は複数のさらなるＦａｂを含めるように改変してもよいものであって、ここで２以上のＦａｂが、Ｆｚｄ受容体エピトープの異なる組に結合する。ある実施形態においては、Ｆａｂ又はその抗原結合性フラグメントは、他のＦａｂ又はＩｇＧ又はその抗原結合性フラグメントに直接融合して、一方で他の実施形態においては、結合領域は、リンカー部分を介して融合する。特定の実施形態においては、２つのＦａｂのうちの一方又は両方は、本明細書に記載されており、又は本明細書に記載のＣＤＲの組のいずれかを含む。
【０１１０】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、例えばタンデム型Ｆａｂ  ＩｇＧ（Ｆａｂｓ−ｉｎ−ｔａｎｄｅｍ  ＩｇＧ）（ＦＩＴ−ＩＧ）形態である、ＰＣＴ出願公開公報の国際公開第２０１７／１３６８２０号に記載のような形態を有する。Ｓｈｉｙｏｎｇ  Ｇｏｎｇ、Ｆａｎｇ  Ｒｅｎ、Ｄａｎｑｉｎｇ  Ｗｕ、Ｘｕａｎ  Ｗｕ及びＣｈｅｎｇｂｉｎ  Ｗｕ（２０１７年）。ＦＩＴ−ＩＧはまた、“Ｆａｂｓ−ｉｎ−ｔａｎｄｅｍ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｅｎｇａｇｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ”ｍＡｂｓ，９：７，１１１８−１１２８，ＤＯＩ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１７．１３４５４０１、に開示される形態を含む。ある実施形態においては、ＦＩＴ−ＩＧは、２つの親モノクローナル抗体のＤＮＡ配列を２又は３のコンストラクトに再配列することと、それらを哺乳動物細胞において共発現することとによって、２つの抗体の機能を１つの分子へと組み合わせる。ＦＩＴ−ＩＧの形態及びコンストラクトの例としては、ＰＣＴ出願公開公報の国際公開第２０１７／１３６８２０号の図１Ａ及び１Ｂ及び図２Ａ及び２Ｂに提供される。ある実施形態においては、ＦＩＴ−ＩＧは、Ｆｃ変異、ｓｃＦｖ成分及びリンカー又はペプチドコネクターを必要としない。各アームにおけるＦａｂ−ドメインは、それらの親抗体の生物学的機能を保持する４つの活性かつ独立である抗原結合部位をもつ四価二重特異性抗体を形成する「タンデム型」で作用する。特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替物は、Ｆａｂ及びＩｇＧを含む。ある実施形態においては、ＦａｂバインダーＬＣは、例えば間にある様々な長さのリンカーによって、ＩｇＧのＨＣに融合する。様々な実施形態においては、ＦａｂバインダーＨＣは、ＩｇＧのＬＣに、融合する又は融合しないものであり得る。この形態のバリエーションは、タンデム型Ｆａｂ  ＩｇＧ（Ｆａｂｓ−ｉｎ−ｔａｎｄｅｍ  ＩｇＧ）（又はＦＩＴ−Ｉｇ）と呼ばれてきた。ある実施形態においては、ＦＩＴ−Ｉｇが、２以上のＦｚｄ結合ドメインを含むものであって、少なくとも２以上のＦｚｄ結合領域が、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組、例えば１もしくは複数のＦｚｄ受容体の異なる組、又は同一のＦｚｄ受容体内の１もしくは複数のエピトープの異なる組、に結合する。
【０１１１】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープに結合する少なくとも１つのものと、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に結合する少なくとも１つのものとを含めた、２以上のＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）を含む。ある実施形態においては、結合領域のうちの一方はＶＨＨ又はｓｄＡｂであり、またもう一方はｓｃＦｖである。特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組に結合する少なくとも２つのものと、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に結合する少なくとも１つのものとを含めた、３以上のＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）を含む。２以上のＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）を含むＷｎｔ代替分子は、図１Ｋ、１Ｌ、１Ｍ、１Ｎ、１Ｏ、１Ｐ、１Ｑ、１Ｓ、１Ｔに示したものを含むがこれに限定されない、種々の構成にされ得る。ある二重特異性で二価の形態においては、２以上のＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、タンデム型で融合され、又は随意に１又は複数のリンカーを介して、あるＦｃの２つの異なる末端に融合される。リンカーが存在する場合、リンカーとその長さは、ＶＨＨもしくはｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）と他のＶＨＨもしくはｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）との間で又はＶＨＨもしくはｓｄＡｂとＦｃとの間で、同一であるか又は異なるものであり得る。例えば、ある実施形態においては、ＶＨＨ又はｓｄＡｂは、ＩｇＧ重鎖のＮ末端及び／又はＣ末端に融合する。特定の実施形態においては、２以上のＶＨＨ又はｓｄＡｂは、これら位置の任意の組み合わせにおいてＩｇＧに融合する。この形態の二価で二重特異性のＷｎｔ代替分子の非限定的な例としては、図１Ｋ、１Ｌ、１Ｍ、１Ｎ、１Ｏ、１Ｐ、１Ｑに示す構造が示されるが、ここで第１のＶＨＨ又はｓｄＡｂは青で示しており、Ｆｃ又はＩｇＧは青で示しており、また第２のＶＨＨ又はｓｄＡｂは赤で示している。様々な実施形態においては、両方のＶＨＨもしくはｓｄＡｂは、ＦｃのＮ末端に、ＦｃのＣ末端に融合し得、又は１もしくは複数のＶＨＨもしくはｓｄＡｂは、ＦｃのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかもしくは両方に融合し得る。関連の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、ヘテロ−ＩｇＧ形態を有し、一方で、一方のＶＨＨ又はｓｄＡｂは、半抗体として存在し、またもう一方は、ＦｃのＮ末端又はＦｃのＣ末端に融合する。各受容体のこの形態のバージョンに対して二重特異性であるが一価のものを、図１Ｅに示す。ある実施形態においては、ＶＨＨ又はｓｄＡｂは、他方のＶＨＨ又はｓｄＡｂに直接融合し、一方で、他の実施形態においては、結合領域は、リンカー部分を介して融合する。特定の実施形態においては、ＶＨＨ又はｓｄＡｂは、本明細書に記載されており、又は本明細書に記載のＣＤＲの組のいずれかを含む。様々な実施形態においては、これら形態のいずれかは、１又は複数のＶＨＨ又はｓｄＡｂの代わりに１又は複数のｓｃＦｖを含んでもよい。
【０１１２】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、ダイアボディとして構成される。図１Ｒに示すように、Ｆｚｄ及びＬＲＰに対するバインダーはまた、ダイアボディ（又はＤＡＲＴ）の構成内で共に連結可能である。ダイアボディはまた、単一鎖の構成であり得る。ダイアボディがＦｃに融合する場合、これにより、二価二重特異性の形態が形成されることとなる。これは、Ｆｃに融合することなしに、一価二重特異性の形態となることとなる。  ある実施形態においては、ダイアボディは、小ペプチドリンカーが連結させる、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域とからなる非共有結合性二量体のｓｃＦｖフラグメントである。ダイアボディの別の形態は、２つのｓｃＦｖフラグメントが互いに共有結合的に連結しているものである単鎖（Ｆｖ）２である。特定の実施形態においては、ダイアボディは、２以上のＦｚｄ結合領域を含むものであって、Ｆｚｄ結合領域のうちの少なくとも２つが、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組に結合する。
【０１１３】
ある実施形態においては、２以上のダイアボディ、ｓｃＦｖ、及び／又はＶＨＨもしくはｓｄＡｂは、Ｆｃに融合して又は融合せずに、多価形態のタンデム型に融合可能である（図１Ａ、１Ｂ、１Ｆ、１Ｕ）。特定の実施形態においては、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、及び／又はＶＨＨもしくはｓｄＡｂのうちの少なくとも１つが、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープに結合し、またダイアボディ、ｓｃＦｖ、及び／又はＶＨＨもしくはｓｄＡｂのうちの少なくとも１つが、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に結合する。
【０１１４】
様々な実施形態においては、図１Ｇ又は１Ｈに示すものを含むがこれに限定されることなく、Ｗｎｔ代替分子は、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組にそれぞれが結合する２以上のＦａｂ又はその抗原結合性フラグメントと、例えばＬＲＰ５／６に結合する、１又は複数のＶＨＨ又はｓｄＡｂ又はその抗原結合性フラグメント（又はあるいは、もしくは組み合わせて、１又は複数のｓｃＦｖ又はその抗原結合性フラグメント）とを含む。ある実施形態においては、第１のＦａｂは、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの第１の組に特異的に結合し、第２のＦａｂは、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる第２の組に特異的に結合し、またＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に特異的に結合する。ある実施形態においては、ＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、ＦａｂのＮ末端に融合し、一方で一部の実施形態においては、ＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、ＦａｂのＣ末端に融合する。特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、図１Ｇ、１Ｈ、１ＡＧに示すようにヘテロ−Ｉｇ形態を有し、そこで第１のＦａｂ及び第２のＦａｂがそれぞれ半抗体として存在し、また１又は複数のＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）は、ＦｃのＮ末端、ＦａｂのＮ末端、ＦｃのＣ末端（例えば、図１Ｙ）、又はＦａｂのＣ末端のうちの１又は複数に融合する。第１のＦａｂ及び第２のＦａｂは、それらそれぞれのＦｃ内の、例えばＣＨ３ドメイン内の、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ変異を介して互いに結合し得る。
【０１１５】
論じるように、様々な実施形態におけるＷｎｔ代替分子は、本明細書で開示する１又は複数の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む。すなわち、特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替物は２つのポリペプチドを含むものであって、各ポリペプチドが、ＬＲＰ５／６に結合するＶＨＨ又はｓｄＡｂ又はｓｃＦｖと、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープに結合するＶＨＨ又はｓｄＡｂ又はｓｃＦｖとを含み、随意に、結合ドメインのうちの一方がｓｃＦｖであり、他方がＶＨＨ又はｓｄＡｂである。特定の実施形態においては、各ポリペプチドは、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組に結合するＦｚｄ結合領域を含む。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替物は３つのポリペプチドを含むものであって、第１のポリペプチドが、抗体の重鎖を含み、また第２のポリペプチドが抗体の軽鎖を含み、当該抗体の重鎖及び軽鎖がＬＲＰ５／６又は１もしくは複数のＦｚｄ受容体エピトープに結合し、そして第３のポリペプチドが、重鎖Ｆｃ領域と融合するＶＨＨ又はｓｄＡｂを含み、当該ＶＨＨ又はｓｄＡｂが、ＬＲＰ５／６又は１もしくは複数のＦｚｄ受容体エピトープのいずれかに結合する。他の実施形態においては、Ｗｎｔポリペプチドが、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとを含む４つのポリペプチドを含むものであって、２つの重鎖及び２つの軽鎖が、ＬＲＰ５／６又は１もしくは複数のＦｚｄ受容体エピトープに結合し、また重鎖及び／又は軽鎖のうちの１又は複数に融合する１又は複数のＶＨＨ又はｓｄＡｂ又はｓｃＦｖをさらに含み、当該ＶＨＨ又はｓｄＡｂ又はｓｃＦｖは、ＬＲＰ５／６又は１もしくは複数のＦｚｄ受容体エピトープに結合する。別の説明的な実施形態においては、Ｗｎｔ代替物は、ＬＲＰ５／６又は１もしくは複数のＦｚｄ受容体エピトープのいずれかに結合する２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとを含む少なくとも４つのポリペプチドを含むものであって、当該Ｗｎｔ代替物は、ＬＲＰ５／６又は１もしくは複数のＦｚｄ受容体エピトープのいずれかに結合するＦａｂをさらに含む。例えば、Ｆａｂは、２つのポリペプチドであって２つの重鎖ポリペプチドのうちの一方とそれぞれ融合する当該２つのポリペプチドと、２つのポリペプチドであって２つの軽鎖ポリペプチドのうちの一方とそれぞれ融合する当該２つのポリペプチドとを含み得るか、又は、Ｆａｂは、２つのポリペプチドであって２つの重鎖ポリペプチドのうちの一方とそれぞれ融合する当該２つのポリペプチドと、２つのさらなるポリペプチドであって重鎖ポリペプチドに融合する２つのポリペプチドのうちの一方にそれぞれ融合する当該２つのさらなるポリペプチドとを含み得るものであり、それによって第２のＦａｂを生成する。他の構成を用いて、本明細書で開示するＷｎｔ代替物を産生してもよい。これら形態のうちのいずれかの特定の実施形態においては、それらは、Ｆｚｄ受容体エピトープの異なる組にそれぞれが結合する少なくとも２以上のＦｚｄ結合領域を含む。
【０１１６】
一部の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域のＬＲＰ結合領域に対する様々な比（Ｆｚｄ：ＬＲＰ）を、図１ＡＢ、１ＡＣ、１ＡＤ、１ＡＥ、１ＡＦ、１ＡＧ、１ＡＨ、１ＡＩ、１ＡＪ、１ＡＫ、１ＡＬ、１ＡＭに表す。特定の実施形態においては、１又は複数のＦａｂが、１又は複数のＦｚｄ受容体に又は同一のＦｚｄ受容体内の異なるエピトープに結合し、また１又は複数のＶＨＨ又はｓｄＡｂ（又はｓｃＦｖ）が、１もしくは複数のＬＲＰ受容体に、又は同一のＬＲＰ受容体内の異なるエピトープに結合する。
【０１１７】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、第１のＦｚｄ結合領域を形成する、第１の軽鎖及び第１の重鎖と、第２のＦｚｄ結合領域を形成する、第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含み、当該第１のＦｚｄ結合領域及び当該第２のＦｚｄ結合領域が、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープの異なる組に結合している状態である。ある実施形態においては、第１の重鎖及び第２の重鎖が、互いに結合している。例えば、第１の重鎖が第１のＣＨ３ドメインを含み得、第２の重鎖が第２のＣＨ３ドメインを含み得、また第１及び第２のＣＨ３ドメインが、例えばｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ変異を介して、互いに結合し得る。ある実施形態においては、第１の重鎖及び／又は第２の重鎖が、配列番号１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０及び１２２に記載する配列のいずれかに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態においては、第１の軽鎖及び／又は第２の軽鎖が、配列番号１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、及び１２１に記載する配列のいずれかに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては、１又は複数の重鎖は、表５に開示する配列のうちのいずれかに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては、１又は複数の軽鎖は、表５に開示する配列のうちのいずれかに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１８】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、第１のＬＲＰ５／６結合領域及び／又は第２のＬＲＰ５／６結合領域を含み、そのそれぞれがＦａｂもしくはｓｃＦｖであり得るか、又はＦａｂもしくはｓｃＦｖを含み得る。第１及び第２のＬＲＰ５／６結合領域は、ＬＲＰ５／６内の同一のエピトープに結合し得、又はＬＲＰ５／６内の異なるエピトープに結合し得る。第１のＬＲＰ５／６結合領域が、第１の軽鎖のＮ末端か、第１の軽鎖のＣ末端か、第１の重鎖のＮ末端か、又は第１の重鎖のＣ末端かに融合し得る。第２のＬＲＰ５／６結合領域が、第２の軽鎖のＮ末端か、第２の軽鎖のＣ末端か、第２の重鎖のＮ末端か、又は第２の重鎖のＣ末端かに融合し得る。
【０１１９】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、１又は複数のＦｚｄ受容体に特異的に結合するポリペプチドに融合又は結合する、例えば抗Ｆｚｄ抗体又はその抗原結合性フラグメントである、Ｆｚｄ結合領域を含む。  特定の実施形態においては、１又は複数のＦｚｄ受容体に特異的に結合するポリペプチドが、抗体又はその抗原結合性フラグメントである。ある実施形態においては、それは、本明細書において又は２０１７年１２月１９日出願で表題を「抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ抗体及び使用方法（Ａｎｔｉ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ）」とする米国仮特許出願第６２／６０７，８７７号、代理人書類番号ＳＲＺＮ−００４／００ＵＳであってその全体が参照により本明細書で援用される当該米国仮特許出願において開示される、抗体又はその抗原結合性フラグメントである。
【０１２０】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子の少なくとも１つのＦｚｄ結合領域は、抗体の１又は複数の抗原結合性フラグメントを含む。例えば、当該１又は複数の抗原結合性フラグメントは、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ又はＶＨＨもしくはｓｄＡｂであり得るか又はこれらに由来し得る。ある実施形態においては、当該１又は複数の抗原結合性フラグメントは、ヒト化される。
【０１２１】
特定の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、表１Ａで提供する１又は複数のＦｚｄ受容体に結合する説明的な抗体又はそのフラグメントのいずれかに関して開示された、３つの重鎖ＣＤＲ及び／又は３つの軽鎖ＣＤＲを含む。特定の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、表１Ａで提供する１又は複数のＦｚｄ受容体に結合する説明的な抗体又はそのフラグメントのいずれかに関して開示された、３つの重鎖ＣＤＲ及び／又は３つの軽鎖ＣＤＲを含むものであって、当該ＣＤＲは、例えば置換、欠失又は付加である、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つのアミノ酸の改変をまとめて含む。ある実施形態においては、当該Ｆｚｄ結合領域は、ＶＨＨもしくはｓｄＡｂであるか、又はＶＨＨもしくはｓｄＡｂ由来であったため、表１Ａには３つの重鎖のＣＤＲのみを含める。特定の実施形態においては、当該Ｆｚｄ結合領域は、表１Ａで提供する３つのＣＤＲ  ＨＣ配列又はバリアントを含むものであって、ＣＤＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つのアミノ酸の改変をまとめて含む。
【０１２２】
特定の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、表１Ｂ又は配列番号１〜７３で提供される１又は複数のＦｚｄ受容体（又はいずれかの抗原結合性フラグメントもしくはバリアント）に結合する、説明的な抗体又はそのフラグメントのいずれかの重鎖フラグメント及び／又は軽鎖フラグメントを含む。ある実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、Ｆａｂであるか、又はＦａｂ由来であったため、表１Ｂの重鎖には、ＶＨ及びＣＨ１の配列を含めるが、ＣＨ２又はＣＨ３の配列は含めない。ある実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、ＶＨＨもしくはｓｄＡｂであるか、又はＶＨＨもしくはｓｄＡｂ由来であったため、表１ＢにはＶＨＨドメインを含める。ある実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、例えば抗体又はその抗原結合性フラグメントであるポリペプチドであって、これは１つ又は複数のＦｚｄ受容体に結合するためにこれら抗体のうちのいずれかと競合する。
【０１２３】
特定の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域が、表１Ａ、表１Ｂ、又は配列番号１〜７３に記載の配列のいずれか又はその抗原結合性フラグメントに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。表１Ｂに列記したクローンの結合特性を決定したので、表１Ｂに示している。重鎖ＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３で示され、また軽鎖ＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３で示される。
【表１Ａ−１】
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【表１Ａ−２】
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【表１Ａ−３】
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【表１Ａ−４】
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【表１Ａ−５】
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【表１Ａ−６】
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【表１Ａ−７】
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【表１Ａ−８】
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【表１Ａ−９】
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【表１Ａ−１０】
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【表１Ａ−１１】
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【表１Ａ−１２】
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【表１Ａ−１３】
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【表１Ａ−１４】
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【表１Ａ−１５】
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【表１Ａ−１６】
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【表１Ａ−１７】
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【表１Ａ−１８】
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【表１Ａ−１９】
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【表１Ａ−２０】
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【表１Ａ−２１】
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【表１Ａ−２２】
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【表１Ａ−２３】
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【表１Ａ−２４】
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【表１Ａ−２５】
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【表１Ａ−２６】
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【表１Ｂ−１】
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【表１Ｂ−２】
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【表１Ｂ−３】
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【表１Ｂ−４】
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【０１２４】
ある実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、例えば、ＫＤが少なくとも約１×１０−４Ｍ、少なくとも約１×１０−５Ｍ、少なくとも約１×１０−６Ｍ、少なくとも約１×１０−７Ｍ、少なくとも約１×１０−８Ｍ、少なくとも約１×１０−９Ｍ、少なくとも約１×１０−１０Ｍ、少なくとも約１×１０−１１Ｍ、少なくとも約１×１０−１２Ｍ、少なくとも約１×１０−１３Ｍ、少なくとも約１×１０−１４Ｍ、又は少なくとも約１×１０−１５Ｍ、である親和性でＦｚｄ受容体エピトープに結合する任意の結合ドメインから選択され得る。ある実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、例えば、ＫＤが約１×１０−７Ｍ未満、約１×１０−８Ｍ未満、約１×１０−９Ｍ未満、約１×１０−１０Ｍ未満、約１×１０−１１Ｍ未満、約１×１０−１２Ｍ未満、約１×１０−１３Ｍ未満、約１×１０−１４Ｍ未満、又は約１×１０−１５Ｍ未満、である高い親和性で１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープに結合する任意の結合ドメインから選択され得る。ある実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、Ｗｎｔ代替分子の文脈で、例えば、ＫＤが約１×１０−４Ｍ以下、約１×１０−５Ｍ以下、約１×１０−６Ｍ以下、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、約１×１０−１２Ｍ以下、約１×１０−１３Ｍ以下、約１×１０−１４Ｍ以下、又は約１×１０−１５Ｍ以下、である高い親和性でＦｚｄ受容体エピトープに結合する任意の結合ドメインから選択され得る。
【０１２５】
好適なＦｚｄ結合領域は、限定するものではないが、デノボ設計のＦｚｄ結合タンパク質、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ等である抗体由来の結合タンパク質、ならびに１又は複数のＦｚｄタンパク質、ＶＨＨ又はｓｄＡｂ由来の結合ドメイン、ｋｎｏｔｔｉｎ系の改変足場、ｎｏｒｒｉｎ及びそれに由来する遺伝子操作された結合フラグメント、天然のＦｚｄ結合ドメイン等に特異的に結合する抗体の他の部分、を含む。Ｆｚｄ結合ドメインは、例えば組織選択性を提供するために、所望のＦｚｄタンパク質又は複数のＦｚｄタンパク質への結合を増強するように選択された親和性であり得る。
【０１２６】
一部の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の異なるＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質、例えばヒトＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ３、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ８、Ｆｚｄ９及びＦｚｄ１０のうちの１又は複数、に結合する。一部の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２及びＦｚｄ  ７に結合する。一部の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８に結合する。他の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、関心の１又は複数のＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質に対して選択的であり、例えば、他のＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質と比較して、少なくとも１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍又はそれ以上である１又は複数の所望のＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質に対する特異性を有する。
【０１２７】
ある実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、ｐａｎ抗体であるＦｒｉｚｚｌｅｄ抗体（ｐａｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）ＯＭＰ−１８Ｒ５（バンチクツマブ（ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ））の６つのＣＤＲ領域を含む。ある実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、ｐａｎ抗体であるＦｒｉｚｚｌｅｄ抗体ＯＭＰ−１８Ｒ５（バンチクツマブ）の６つのＣＤＲ領域を含むｓｃＦｖである。例えば、本明細書において参照により詳細に援用される、米国特許第８，５０７，４４２号を参照されたい。例えば、ＯＭＰ−１８Ｒ５のＣＤＲ配列は、（ｉ）ＧＦＴＦＳＨＹＴＬＳ（配列番号２７０）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＶＩＳＧＤＧＳＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６７７）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びＮＦＩＫＹＶＦＡＮ（配列番号１０３３）を含む重鎖ＣＤＲ３と、（ｉｉ）ＳＧＤＫＬＧＫＫＹＡＳ（配列番号１１５２）又はＳＧＤＮＩＧＳＦＹＶＨ（配列番号１１５３）を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＥＫＤＮＲＰＳＧ（配列番号１２００）又はＤＫＳＮＲＰＳＧ（配列番号１２０１）を含む軽鎖ＣＤＲ２、及びＳＳＦＡＧＮＳＬＥ（配列番号１４３５）又はＱＳＹＡＮＴＬＳＬ（配列番号１４３６）を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む。特定の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、抗体又はその誘導体であり、限定するものではないが、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ＶＨＨ又はｓｄＡｂ、及びこれらＣＤＲ配列のいずれかを含む様々な抗体模倣物を含む。ある実施形態においては、これらＣＤＲ配列は、１又は複数のアミノ酸改変を含む。
【０１２８】
ある実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、抗ＦＺＤ７−１７９１又は抗ＦＺＤ７−１２９１の６つのＣＤＲ領域を含む。抗ＦＺＤ７−１７９１及び抗ＦＺＤ７−１２９１は、Ｆｚｄ７のヒンジ領域内の異なるエピトープに結合する抗体であり、ＰＣＴ特許出願公開公報の国際公開第２０１６／２０５５５１号及び国際公開第２０１６／２０５５６６号に記載されるとおりであり、本明細書において参照により詳細に援用する。ある実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、抗ＦＺＤ７−１７９１又は抗ＦＺＤ７−１２９１の６つのＣＤＲ領域を含むｓｃＦｖである。例えば、抗ＦＺＤ７−１７９１のＣＤＲ配列は、（ｉ）ＴＹＡＭＨ（配列番号２１９０）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＫＮＹＤＤＳＶＫＤ（配列番号２１９３）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びＥＮＹＧＧＲＦＤＹ（配列番号２１９６）を含む重鎖ＣＤＲ３と、（ｉｉ）ＫＡＳＥＮＶＬＮＹＶＳ（配列番号２１９９）を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＧＡＳＮＲＹＴ（配列番号２２０２）を含む軽鎖ＣＤＲ２、及びＧＱＳＹＲＹＰ（配列番号２２０５）を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む。抗ＦＺＤ７−１７９１の重鎖配列は、配列番号７０を含み、また抗ＦＺＤ７−１７９１の軽鎖配列は、配列番号７１を含む。別の例においては、抗ＦＺＤ７−１２９１のＣＤＲ配列は、（ｉ）ＳＹＡＭＳ（配列番号２１９１）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＴＩＳＤＧＧＳＹＴＲＹＰＤＫＬＫＧ（配列番号２１９４）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びＶＧＧＲＲＤＹＦＤＹ（配列番号２１９７）を含む重鎖ＣＤＲ３と、（ｉｉ）ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷ（配列番号２２００）を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号２２０３）を含む軽鎖ＣＤＲ２、及びＱＱＹＹＳＹＰ（配列番号２２０６）を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む。抗ＦＺＤ７−１２９１の重鎖配列は、配列番号７２を含み、また抗ＦＺＤ７−１２９１の軽鎖配列は、配列番号７３を含む。一部の実施形態においては、特定の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、抗体又はその誘導体であり、限定するものではないが、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ＶＨＨ又はｓｄＡｂ、及びこれらＣＤＲ配列のいずれかを含む様々な抗体模倣物を含む。ある実施形態においては、これらＣＤＲ配列は、１又は複数のアミノ酸改変を含む。
【０１２９】
他の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、いくつかのＦｒｉｚｚｌｅｄ特異性抗体のいずれかよりの、可変領域配列又はそのＣＤＲを含むが、これは当技術で公知であり、かつ、市販されているか、又はデノボで生成可能である。Ｆｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドのいずれかを、免疫原として、又は抗体を開発するための選別アッセイにおいて、用いることが可能である。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合ドメインの非限定的な例としては、例えばヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ４（ＣＤ３４４）に特異的なクローンＣＨ３Ａ４Ａ７；ヒトＦｚｄ９（ＣＤ３４９）に特異的なクローンＷ３Ｃ４Ｅ１１である、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社より利用可能な抗体；例えばＦｚｄ７に特異的なａｂ６４６３６；ヒトＦｚｄ４に特異的なａｂ８３０４２；ヒトＦｚｄ７に特異的なａｂ７７３７９；ヒトＦｚｄ８に特異的なａｂ７５２３５；ヒトＦｚｄ９に特異的なａｂ１０２９５６である、Ａｂｃａｍ社より利用可能な抗体等が挙げられる。好適な抗体の他の例としては、とりわけ、米国特許出願第２０１４０１０５９１７号；米国特許出願第２０１３０２３０５２１号；米国特許出願第２００８０２６７９５５号；米国特許出願第２００８００３８２７２号；米国特許出願第２００３００４４４０９号等に記載されており、それぞれ、本明細書において参照により詳細に援用する。
【０１３０】
Ｗｎｔ代替分子のＦｚｄ結合領域は、Ｗｎｔタンパク質のＦｒｉｚｚｌｅｄ結合領域に対する構造的相同性のために選択される遺伝子操作されたタンパク質であり得る。こうしたタンパク質は、相同性に関する構造データベースをスクリーニングすることによって特定可能である。すなわち、特定される最初のタンパク質は、例えば、微生物Ｂｈ１４７８タンパク質である。当該天然タンパク質は、その後遺伝子操作されて、親和性を増加させるアミノ酸置換がもたらされて、そして所望のＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質への結合における親和性及び選択性を増加させるために親和性成熟によってさらに選択され得る。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合部分の非限定的な例としては、Ｆｚ２７及びＦｚ２７−Ｂ１２のタンパク質が挙げられる。
【０１３１】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープに特異的に結合するポリペプチドに融合する、例えば抗ＬＲＰ５／６抗体又はその抗原結合性フラグメントである、ＬＲＰ５／６結合領域を含む。  特定の実施形態においては、ＬＲＰ５／６に特異的に結合するポリペプチドが、抗体又はその抗原結合性フラグメントである。ある実施形態の場合、それは、２０１７年１２月１９日出願で表題を「抗ＬＲ５／６抗体及び使用方法（“Ａｎｔｉ−ＬＲ５／６  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ”）」とする米国仮特許出願第６２／６０７，８７９号、代理人書類番号ＳＲＺＮ−００５／００ＵＳであってその全体が参照により本明細書で援用される当該米国仮特許出願で開示される、抗体又はその抗原結合性フラグメントである。
【０１３２】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子の少なくとも１つのＬＲＰ５／６結合領域は、抗体の１又は複数の抗原結合性フラグメントを含む。例えば、当該１又は複数の抗原結合性フラグメントは、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ又はＶＨＨもしくはｓｄＡｂであり得るか又はこれらに由来し得る。ある実施形態においては、１又は複数の抗原結合性フラグメントは、ヒト化される。
【０１３３】
特定の実施形態においては、ＬＲＰ５／６結合領域は、表２Ａで提供するＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に結合する説明的な抗体又はそのフラグメントのいずれかに関して開示された、３つの重鎖ＣＤＲ及び／又は３つの軽鎖ＣＤＲを含む。特定の実施形態においては、ＬＲＰ５／６結合領域は、表２Ａで提供するＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に結合する説明的な抗体又はそのフラグメントのいずれかに関して開示された、３つの重鎖ＣＤＲ及び／又は３つの軽鎖ＣＤＲを含むものであって、当該ＣＤＲは、例えば置換、欠失又は付加である、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つのアミノ酸の改変をまとめて含む。ある実施形態においては、ＬＲＰ５／６結合領域は、ＶＨＨもしくはｓｄＡｂであるか、又はＶＨＨもしくはｓｄＡｂ由来であったため、表２Ａには３つの重鎖のＣＤＲのみを含める。ある実施形態においては、ＬＲＰ５／６結合領域は、表２Ａで示す３つの重鎖ＣＤＲ又はバリアントを含むものであって、当該ＣＤＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つのアミノ酸の改変をまとめて含む。特定の実施形態においては、ＬＲＰ５／６結合領域は、表２Ｂ又は配列番号７４〜９７で提供されるＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６（又はいずれかの抗原結合性フラグメントもしくはバリアント）に結合する、説明的な抗体又はそのフラグメントのいずれかの重鎖フラグメント及び／又は軽鎖フラグメントを含む。ある実施形態においては、ＬＲＰ５／６結合領域は、Ｆａｂであるか、又はＦａｂ由来であったため、表２Ｂには、ＶＨ及びＣＨ１の配列を含めるが、ＣＨ２又はＣＨ３の配列は含めない。ある実施形態においては、ＬＲＰ５／６結合領域は、ＶＨＨもしくはｓｄＡｂであるか、又はＶＨＨもしくはｓｄＡｂ由来であったため、表２ＢにはＶＨＨドメインを含める。ある実施形態においては、ＬＲＰ５／６結合領域は、例えば抗体又はその抗原結合性フラグメントであるポリペプチドであって、これはＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に結合するためにこれら抗体のうちの１つと競合する。
【０１３４】
特定の実施形態においては、ＬＲＰ５／６結合領域が、表２Ａ、表２Ｂ、又は配列番号７４〜９７に記載の配列のいずれか又はその抗原結合性フラグメントに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。表２Ｂに列記したクローンの結合特性を決定したので、表２Ｂに示している。
【表２Ａ−１】
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【表２Ａ−２】
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【表２Ａ−３】
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【表２Ａ−４】
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【表２Ａ−５】
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【表２Ａ−６】
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【表２Ａ−７】
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【表２Ａ−８】
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【表２Ａ−９】
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【表２Ａ−１０】
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【表２Ａ−１１】
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【表２Ａ−１２】
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【０１３５】
【表２Ａ−１３】
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【表２Ａ−１４】
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【表２Ａ−１５】
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【表２Ａ−１６】
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【表２Ａ−１７】
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【表２Ａ−１８】
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【表２Ａ−１９】
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【表２Ａ−２０】
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【表２Ａ−２１】
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【表２Ａ−２２】
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【表２Ａ−２３】
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【表２Ａ−２４】
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【表２Ａ−２５】
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【表２Ａ−２６】
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【表２Ａ−２７】
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【表２Ａ−２８】
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【表２Ａ−２９】
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【表２Ａ−３０】
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【表２Ａ−３１】
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【表２Ｂ】
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【０１３６】
ある実施形態においては、ＬＲＰ５／６結合領域は、Ｗｎｔ代替分子の文脈において、ＫＤが約１×１０−４Ｍ以下、約１×１０−５Ｍ以下、約１×１０−６Ｍ以下、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、約１×１０−１２Ｍ以下、約１×１０−１３Ｍ以下、約１×１０−１４Ｍ以下、又は約１×１０−１５Ｍ以下で、ＬＲＰ５又はＬＲＰ６に結合する任意の結合ドメインから選択され得る。ある実施形態においては、ＬＲＰ５／６結合領域は、Ｗｎｔ代替分子の文脈において、ＫＤが約１×１０−４Ｍ以上、約１×１０−５Ｍ以上、約１×１０−６Ｍ以上、約１×１０−７Ｍ以上、約１×１０−８Ｍ以上、約１×１０−９Ｍ以上、約１×１０−１０Ｍ以上、約１×１０−１１Ｍ以上、約１×１０−１２Ｍ以上、約１×１０−１３Ｍ以上、約１×１０−１４Ｍ以上、又は約１×１０−１５Ｍ以上で、ＬＲＰ５又はＬＲＰ６に結合する任意の結合ドメインから選択され得る。ある実施形態においては、ＬＲＰ５／６結合領域は、例えばＫＤが約１×１０−７Ｍ未満、約１×１０−８Ｍ未満、約１×１０−９Ｍ未満、又は約１×１０−１０Ｍ未満である、高い親和性でＬＲＰ５又はＬＲＰ６に結合する任意の結合ドメインから選択され得る。
【０１３７】
他の好適なＬＲＰ５／６結合領域は、限定するものではないが、デノボ設計のＬＲＰ５／６結合タンパク質、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ等である抗体由来の結合タンパク質、ならびに１又は複数のＦｚｄタンパク質、ＶＨＨ又はｓｄＡｂ由来の結合ドメイン、ｋｎｏｔｔｉｎ系の改変足場、限定するものではないがＤＫＫ１、ＤＫＫ２、ＤＫＫ３、ＤＫＫ４、スクレロスチンを含む天然のＬＲＰ５／６、Ｗｉｓｅ、上記のいずれかを含む融合タンパク質、上記のいずれかの誘導体、上記のいずれかのバリアント、及び上記のいずれかの生物学的活性なフラグメント等に特異的に結合する抗体の他の部分、を含む。ＬＲＰ５／６結合領域は、結合を増強するように選択された親和性であり得る。
【０１３８】
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（ＤＫＫ）遺伝子ファミリーのメンバー（Ｋｒｕｐｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｇｅｎｅ  ２３８（２）：３０１−１３を参照）は、ＤＫＫ−１、ＤＫＫ−２、ＤＫＫ−３及びＤＫＫ−４、ならびにＤＫＫ−３関連タンパク質Ｓｏｇｇｙ（Ｓｇｙ）を含む。ｈＤＫＫ１〜４は、１０個のシステイン残基の位置をファミリーメンバー間で高度に保存しているものである２つの別個の高システインドメインを含有する。ヒトＤｋｋの遺伝子及びタンパク質の例示的な配列は、公に利用可能であり、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４４１９（ｓｏｇｇｙ−１）；ＮＭ＿０１４４２０（ＤＫＫ４）；ＡＦ１７７３９４（ＤＫＫ−１）；ＡＦ１７７３９５（ＤＫＫ−２）；ＮＭ＿０１５８８１（ＤＫＫ３）；及びＮＭ＿０１４４２１（ＤＫＫ２）である。本開示の一部の実施形態においては、ＬＲＰ６結合部分は、ＤＫＫ１ペプチドであって、限定するものではないがヒトＤＫＫ１のＣ末端ドメインを含む。このＣ末端ドメインは、以下の配列を含み得る：KMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRH（配列番号２２４９）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３６３７４を参照）又はその生物学的活性なフラグメント。
【０１３９】
ＤＫＫタンパク質のＬＲＰ５／６への結合は、例えば、Ｂｒｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｏｋｏｌ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２（１７），６１００−６１１０（２００２）；及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（８），５９７７−５９８１（２００２）で議論されており、それぞれ、参照により本明細書において詳細に援用される。ヒトＤＫＫ２（ＧｅｎｂａｎｋリファレンスＮＰ＿０５５２３６）の対応する領域は、以下の配列を含み得る：KMSHIKGHEGDPCLRSSDCIEGFCCARHFWTKICKPVLHQGEVCTKQRKKGSHGLEIFQRCDCAKGLSCKVWKDATYSSKARLHVCQK（配列番号２２５０）、又はその生物学的活性なフラグメント。
【０１４０】
ＬＲＰ５又はＬＲＰ６に特異的に結合する抗体は、当技術において公知であり、また市販されており、又はデノボで生成可能である。ＬＲＰ５、ＬＲＰ６又はそのフラグメントは、免疫原として、又は抗体を開発するための選別アッセイにおいて、用いることが可能である。公知の抗体の例としては、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．５（９）：ｅ１２６８２；Ｅｔｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０７（３５）：１５４７３−８に開示されるもの、ならびにヒト起源の合成ＬＲＰ５／６に対して生じてマウス及びヒト起源のＬＲＰ６及びＬＲＰ５の完全長かつタンパク質分解性のフラグメントの両方に結合する、例えばＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の抗体クローン１Ａ１２；モノクローナル抗体２Ｂ１１；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＬＲＰ５に特異的な抗体（Ｄ８０Ｆ２）、カタログ番号５７３１等、市販のものが挙げられるがこれに限定されない。
【０１４１】
ある実施形態においては、本明細書に開示のＷｎｔ代替分子は、２以上の結合領域を含む１又は複数のポリペプチドを含む。例えば、当該２以上の結合領域は、２以上のＦｚｄ結合領域もしくは２以上のＬＲＰ５／６結合領域であり得るか、又は１もしくは複数のＦｚｄ結合領域及び１もしくは複数のＬＲＰ５／６結合領域を含み得る。各結合領域は、直接連結するか、もしくは隣接し得、又は例えばポリペプチドリンカーもしくは非ペプチドのリンカー等であるリンカーによって分離され得る。リンカーの長さ、すなわち結合ドメイン間の間隔は、シグナル強度を調節するために用いることが可能であり、またＷｎｔ代替分子の所望の使用に応じて選択可能である。実施される結合ドメイン間の距離は、変動可能であるが、ある実施形態においては、約１００オングストローム未満、約９０オングストローム未満、約８０オングストローム未満、約７０オングストローム未満、約６０オングストローム未満、又は約５０オングストローム未満であり得る。一部の実施形態においては、リンカーは、剛直なリンカーであり、他の実施形態においては、リンカーは、フレキシブルなリンカーである。ある実施形態においては、リンカーがペプチドリンカーである場合、それは、長さが約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０  ２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上のアミノ酸よりであり得、また結合ドメイン間の距離を保つのに十分である長さかつアミノ酸組成のものである。一部の実施形態においては、リンカーは、１もしくは複数のグリシン及び／もしくはセリンの残基を含むか、又は１もしくは複数のグリシン及び／もしくはセリンの残基からなる。
【０１４２】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、配列番号１０９〜１２４もしくは１２５〜１５７のいずれかに開示するポリペプチド配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するか、又は、配列番号１０９〜１２４もしくは１２５〜１５７のいずれかに開示するポリペプチド配列の抗原結合性フラグメントに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する、ポリペプチド配列を含む。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、配列番号１０９〜１２４もしくは１２５〜１４７のいずれかに記載のポリペプチド配列もしくはその抗原結合性フラグメントを含むか、又は当該ポリペプチド配列もしくはその抗原結合性フラグメントからなる。特定の実施形態においては、抗原結合性フラグメントは、１又は複数のＦｚｄ受容体に結合し、またＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６にも結合する。
【０１４３】
Ｗｎｔ代替分子は、例えばＦｃドメインを介して、連結、コイルドコイル、ポリペプチドジッパー（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｚｉｐｐｅｒ）、ビオチン／アビジン又はストレプトアビジンの多量体形成等によって、多量体形成可能である。Ｗｎｔ代替分子はまた、インビボでの安定性を増強するために、当技術で公知であるように、例えばＰＥＧ、Ｆｃ等の部分に連結可能である。
【０１４４】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、１又は複数のＦｚｄタンパク質及びＬＲＰ５／６への結合を介して、特に例えばヒト細胞の表面である、細胞表面上のこれらタンパク質への結合によって、古典的Ｗｎｔシグナル伝達を直接活性化させる。Ｗｎｔ代替分子によるＷｎｔシグナル伝達の直接の活性化は、天然のＷｎｔタンパク質が存在するときにだけ活性が増強するＷｎｔのシグナル伝達の増強とは対照的である。
【０１４５】
Ｗｎｔ代替分子は、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質に結合するＷｎｔタンパク質の影響又は活性を模倣することによって、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化し得る。本開示のＷｎｔ代替分子の、Ｗｎｔの活性を模倣する能力は、いくつかのアッセイで確認することが可能である。Ｗｎｔ代替分子は、典型的に、受容体の天然リガンドによって開始されるものと同様又は同一である反応又は活性を開始する。特に、本開示のＷｎｔ代替分子は、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を増強する。本明細書で用いる場合、「増強する」の語は、本開示のＷｎｔ代替分子が不在下でのレベルと比較して、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達のレベルが測定可能に増加することを指す。
【０１４６】
古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達のレベルを測定するための種々の方法が、当技術で公知である。これらは、以下を測定するアッセイを含むが、これに限定されない：Ｗｎｔ／β−カテニン標的遺伝子発現；ＴＣＦレポーター遺伝子発現；β−カテニン安定性；ＬＲＰリン酸化；細胞質から細胞膜へのＡｘｉｎの移動及びＬＲＰへの結合。古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路は、最終的に、転写因子ＴＣＦ７、ＴＣＦ７Ｌ１、ＴＣＦ７Ｌ２及びＬＥＦを介して、遺伝子発現での変化を招く。Ｗｎｔ活性化に対する転写反応は、細胞及び組織の数で特徴付けられてきた。このように、当技術において周知である方法による包括的な転写プロファイリングを用いて、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化又は阻害を評価することが可能である。
【０１４７】
Ｗｎｔ反応性遺伝子発現における変化は、概して、ＴＣＦ及びＬＥＦの転写因子が介在する。ＴＣＦレポーターアッセイにより、ＴＣＦ／ＬＥＦで制御される遺伝子の転写における変化を評価して、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達のレベルを求める。ＴＣＦレポーターアッセイは、はじめに、Ｋｏｒｉｎｅｋ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７により記述された。ＴＯＰ／ＦＯＰとしても知られるこの方法は、ルシフェラーゼ発現を駆動する最小のｃ−Ｆｏｓプロモーターの上流に、最適なＴＣＦモチーフＣＣＴＴＴＧＡＴＣの３つのコピー又は変異モチーフＣＣＴＴＴＧＧＣＣの３つのコピーを用いて（それぞれ、ｐＴＯＰＦＩ＿ＡＳＨ及びｐＦＯＰＦＩ＿ＡＳＨ）、内因性のｐ−カテニン／ＴＣＦ４のトランス活性的な活性を求めることに関与する。これら２つのレポーター活性の比（ＴＯＰ／ＦＯＰ）が高い方が、より高いβ−カテニン／ＴＣＦ４活性を示し、一方で、これら２つのレポーター活性の比が低い方が、より低いβ−カテニン／ＴＣＦ４活性を示す。
【０１４８】
Ｗｎｔシグナルに応答する種々の他のレポーター導入遺伝子は、動物においてインタクトに存在するため、内因性のＷｎｔシグナル伝達に、有効に反映される。これらレポーターは、ＬａｃＺ又はＧＦＰの発現を駆動する多量体形成されたＴＣＦ結合部位に基づいており、これらレポーターは、当技術において公知の方法で容易に検出可能である。これらレポーター遺伝子は、以下を含む：ＴＯＰ−ＧＡＬ、ＢＡＴ−ＧＡＬ、ｉｎｓ−ＴＯＰＥＧＦＰ、ｉｎｓ−ＴＯＰＧＡＬ、ＬＥＦ−ＥＧＦＰ、Ａｘｉｎ２−ＬａｃＺ、Ａｘｉｎ２−ｄ２ＥＧＦＰ、Ｌｇｒ５ｔｍ１（ｃｒｅ／ＥＲＴ２）、ＴＯＰｄＧＦＰ。
【０１４９】
一部の場合においてＴＣＦ転写因子及びＴＮＩＫを伴う複合体形成が介在する、脱リン酸化β−カテニンの膜への取り込み、β−カテニンの安定及びリン酸化状態、ならびにβ−カテニンの核への移動（Ｋｌａｐｈｏｌｚ−Ｂｒｏｗｎ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２（９）ｅ９４５，２００７）は、Ｗｎｔシグナル伝達経路における重要なステップである。安定化は、「破壊」複合体を阻害するＤｉｓｈｅｖｅｌｅｄファミリータンパク質によって介在されるため、細胞内β−カテニンの分解が低減し、そしてβ−カテニンの核への移動が、その後に続く。したがって、細胞内のβ−カテニンのレベル及び位置を測定することが、Ｗｎｔ／β−カテニンのシグナル伝達のレベルを良好に反映している。こうしたアッセイの非限定的な例は、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のＣ末端に融合したヒトβ−カテニンを安定に発現する組換えＵ２０Ｓ細胞を提供する「Ｂｉｏｌｍａｇｅ  β−Ｃａｔｅｎｉｎ  Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ＡＳＳＡＹ」（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）である。画像化及び解析は、可視化しようとするＥＧＦＰ−β−カテニンのレベル及び分布を考慮する蛍光顕微鏡又はＨＣＳプラットフォームで実行する。
【０１５０】
破壊複合体を阻害する別の方法としては、Ｗｎｔ共受容体ＬＲＰの細胞質側末端に対するＡｘｉｎの取り込みによるＡｘｉｎの除去による。Ａｘｉｎは、ＬＲＰ尾部のリン酸化形態に優先的に結合することが示されている。したがって、例えばＧＦＰ−Ａｘｉｎ融合タンパク質による、Ａｘｉｎの移動の可視化が、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達のレベルを評価するための別の方法である。
【０１５１】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、上記したアッセイで測定されたとき、例えばＴＯＰＦＩａｓｈアッセイで測定されたとき、中立の物質又は負の対照により誘発されたβ−カテニンシグナル伝達と比較して、古典的Ｗｎｔ経路シグナル伝達を、例えばβ−カテニンシグナル伝達を、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、又は５００％だけ増強又は増加させる。負の対照は、これらアッセイに含まれ得る。特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、上記したアッセイで測定されたとき、例えばＴＯＰＦＩａｓｈアッセイ又は本明細書で言及した他のアッセイのいずれかで測定されたとき、Ｗｎｔ代替分子が不在下での活性と比較して、β−カテニンシグナル伝達が２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍、又はそれ以上増強され得る。
【０１５２】
本明細書で用いる場合、「Ｗｎｔ遺伝子産物」又は「Ｗｎｔポリペプチド」には、天然配列のＷｎｔポリペプチド、Ｗｎｔポリペプチドバリアント、Ｗｎｔポリペプチドフラグメント、及びキメラＷｎｔポリペプチドを包含する。特定の実施形態においては、Ｗｎｔポリペプチドは、天然のヒト完全長成熟Ｗｎｔタンパク質である。
【０１５３】
例えば、本願において関心のヒト天然配列のＷｎｔタンパク質は、以下のものを含む：Ｗｎｔ−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５４３０）；Ｗｎｔ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９１）；Ｗｎｔ−２Ｂ（Ｗｎｔ−１３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４１８５（アイソフォーム１）、ＮＭ＿０２４４９４．２（アイソフォーム２））、Ｗｎｔ−３（ＲｅｆＳｅｑ．：ＮＭ＿０３０７５３）、Ｗｎｔ３ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３３１３１）、Ｗｎｔ−４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３０７６１）、Ｗｎｔ−５Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９２）、Ｗｎｔ−５Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２６４２）、Ｗｎｔ−６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６５２２）、Ｗｎｔ−７Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４６２５）、Ｗｎｔ−７Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０５８２３８）、Ｗｎｔ−８Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０５８２４４）、Ｗｎｔ−８Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９３）、Ｗｎｔ−９Ａ（Ｗｎｔ−１４）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９５）、Ｗｎｔ−９Ｂ（Ｗｎｔ−１５）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９６）、Ｗｎｔ−１ＯＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２５２１６）、Ｗｎｔ−１０Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９４）、Ｗｎｔ−１１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４６２６）、Ｗｎｔ−１６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６０８７））。各メンバーは、ファミリーとの様々な程度の配列同一性を有するが、その間隔が高度に保存されている２３〜２４個の保存されたシステイン残基を含有する小分子の（すなわち、３９〜４６ｋＤ）、アシル化され、パルミトイル化され、分泌された糖タンパク質を、全てのメンバーがコードする（ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１９９２；８：２３６−２４２；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ  Ｒ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００２；３（１）：３００１．１−３００１．１５）。関心の他の天然配列のＷｎｔポリペプチドは、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、カエル、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、虫（ｗｏｒｍ）等の、家畜、及び動物園動物、実験動物又は愛玩動物を含む、任意の哺乳動物よりの上記のオルソログを含む。
【０１５４】
本明細書で「Ｗｎｔシグナル伝達経路」又は「Ｗｎｔシグナル伝達」を用いて、それによって生物学的活性のＷｎｔが細胞上でその効果を発揮して、細胞の活性を調節するものである機序を指す。Ｗｎｔタンパク質は、Ｗｎｔ受容体に結合することによって細胞活性を調節するものであり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ）ファミリーのタンパク質よりのタンパク質、ＲＯＲファミリーのタンパク質よりのタンパク質、ＬＲＰファミリーのタンパク質よりのタンパク質ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、タンパク質ＦＲＬ１／ｃｒｙｐｔｏ、及びタンパク質Ｄｅｒａｉｌｅｄ／Ｒｙｋを含む。Ｗｎｔ結合によって活性化されると、Ｗｎｔ受容体は、１又は複数の細胞内シグナル伝達カスケードを活性化することとなる。これらには、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路；Ｗｎｔ／平面内細胞極性（Ｗｎｔ／ＰＣＰ）経路；Ｗｎｔ−カルシウム（Ｗｎｔ／Ｃａ２＋）経路（Ｇｉｌｅｓ，ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６５３，１−２４；Ｐｅｉｆｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０：３６９−３８０；Ｐａｐｋｏｆｆ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９９６）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６：２１２８−２１３４；Ｖｅｅｍａｎ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ５：３６７−３７７）；及び当技術で周知であるような他のＷｎｔシグナル伝達経路が含まれる。
【０１５５】
例えば、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化により、細胞内タンパク質β−カテニンのリン酸化を阻害することが結果としてもたらされ、細胞基質内のβ−カテニンの蓄積と、それに続く、それが例えばＴＣＦ／ＬＥＦである転写因子と相互作用して標的遺伝子を活性化させる、核への移動とを招く。Ｗｎｔ／ＰＣＰ経路の活性化により、ＲｈｏＡ、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）及びｎｅｍｏ−ｌｉｋｅキナーゼ（ＮＬＫ）のシグナル伝達カスケードが活性化されて、組織極性と細胞運動としてのこうした生物学的プロセスが制御される。例えばＷｎｔ−４、Ｗｎｔ−５Ａ又はＷｎｔ−１１の結合による、Ｗｎｔ／Ｃａ２＋の活性化により、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、カルシウム・カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）又はカルシニューリン（ＣａＣＮ）のようなカルシウム感受性酵素を活性化するカルシウムイオンの細胞内放出が引き出される。上記シグナル伝達経路の活性を分析することによって、抗体又はその抗原結合性フラグメント、例えばＷｎｔ代替分子、の生物学的活性を容易に求めることが可能である。
【０１５６】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子の機能的特徴は、当業者にとって公知の種々の方法を用いて評価することができ、例えば、本明細書に記載のいずれかを含むがこれに限定されない、親和性／結合性アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴、競合阻害アッセイ）、細胞傷害性アッセイ、細胞生存率アッセイ、インビトロもしくはインビボのモデルを用いたＷｎｔ、癌細胞及び／もしくは腫瘍増殖の阻害に応じた細胞増殖又は細胞分化のアッセイを含む。本明細書に記載のＷｎｔ代替分子はまた、Ｆｚｄ受容体の内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）に対する効果、インビトロ及びインビボでの効能等を試験してもよい。こうしたアッセイは、当業者にとって公知の実績のあるプロトコール（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ  ２００１  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹを参照されたい）；又は、市販のキットを用いて実施され得る。
【０１５７】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子のＦｚｄ結合領域（例えば、抗Ｆｚｄ抗体の抗原結合性フラグメント）は、本明細書に記載の抗Ｆｚｄ抗体のＣＤＲのうちの１又は複数を含む。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子のＬＲＰ５／６結合領域（例えば、抗ＬＲＰ５／６抗体の抗原結合性フラグメント）は、本明細書に記載の抗ＬＲＰ５／６抗体のＣＤＲのうちの１又は複数を含む。この点において、一部の場合、所望の特異的な結合を保持したままにしつつ、抗体のＶＨＣＤＲ３のみの移動を実施可能であるということが示されている（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９５）９２：２５２９−２５３３）。ＭｃＬａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９５）９２：５２１４−５２１８，Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：２１６１−２１６２もまた参照されたい。
【０１５８】
本明細書においては、Ｆｚｄ受容体に特異的である抗体又は抗原結合ドメインを取得する方法であって、本明細書で説明したＶＨドメイン又は当該ＶＨドメインのアミノ酸配列のバリアントであるＶＨドメインのアミノ酸配列における、１又は複数のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入によって提供することと、随意にＶＨドメインを組み合わせてそれにより１又は複数のＶＬドメインを備えることと、ＶＨドメイン又はＶＨ／ＶＬの組み合わせを試験して、１又は複数のＦｚｄ受容体に対して特異的かつ随意に１又は複数の所望の特徴を伴う特異的な結合メンバー又は抗体抗原結合ドメインを特定することを含む、当該方法も開示される。ＶＬドメインは、実質的に本明細書で説明したようなアミノ酸配列を有し得る。本明細書で開示するＶＬドメインの１又は複数の配列のバリアントを、１又は複数のＶＨドメインと組み合わせるような、類似の方法を採用してもよい。
【０１５９】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子は、水溶性である。「水溶性」とは、界面活性剤の不在下で水性緩衝液中で可溶性である、通常、生物学的に有効量のポリペプチドを提供する濃度で可溶性である、組成物を意味する。水溶性である組成物は、実質的に均質な組成物であって、当該組成物がそれから精製されたものである開始物質の少なくとも約５％、通常では、開始物質の少なくとも約１０％、２０％又は３０％、より通常では、開始物質の約４０％、５０％又は６０％である、また約５０％、約９０％又はそれを超えるものであってもよい、比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有する実質的に均質な組成物を形成する。本明細書に開示するＷｎｔ代替分子は、典型的には、少なくとも２５μΜ以上の濃度で、例えば少なくとも２５μΜ、４０μΜ又は５０μΜ、通常では、少なくとも６０μΜ、７０μΜ、８０μΜ又は９０μΜであり、１００μΜ、１２０μΜ又は１５０μΜ程度であることもある濃度で、実質的に均質な水溶液を形成する。言い換えると、本明細書で開示するＷｎｔ代替分子は、典型的には、約０．１ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度で、実質的に均質な水溶液を形成する。
【０１６０】
抗体又はその抗原結合性フラグメントに「特異的に結合」又は「優先的に結合」（本明細書においては区別なく用いる）する抗原又はエピトープは、当分野においてよく理解された語であり、こうした特異的又は優先的な結合を決定する方法もまた、当分野において周知である。例えばＷｎｔ代替分子である分子は、それが、代替的な細胞又は物質との場合よりも、より頻繁に、より急速に、より長い持続時間で及び／又はより高い親和性で、特定の細胞又は物質と反応又は結合する場合に、「特異的な結合」又は「優先的な結合」を呈するという。例えばＷｎｔ代替分子又はその結合領域である、分子又はその結合領域は、それが他の物質に結合する場合よりもより高い親和性、アビディティで、より容易に、及び／又はより長い持続時間で結合する場合に、例えばＦｚｄ受容体である標的抗原に「特異的に結合」又は「優先的に結合」する。例えば、Ｆｚｄ１受容体に特異的に又は優先的に結合するＷｎｔ代替分子又はその結合領域は、それが他のＦｚｄ受容体又は非Ｆｚｄタンパク質と結合する場合よりも、より高い親和性、アビディティで、より容易に、及び／又はより長い持続時間でＦｚｄ１受容体に結合する抗体である。またこの定義を読むことで、例えば第１の標的に特異的に又は優先的に結合するＷｎｔ代替分子又はその結合領域は、第２の標的に特異的に又は優先的に結合し得る又は結合し得ないということも理解される。このように、「特異的に結合すること」又は「優先的に結合すること」は、必ずしも排他的な結合を要求しない（含むこともできるが）。概して、必ずしもではないが、結合への言及は、優先的な結合を意味する。
【０１６１】
一部の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子の１又は複数のＦｚｄ結合領域のいずれかは、１、２、３、４、５又はそれ以上の異なるＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に、例えばヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ３、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ８、Ｆｚｄ９、Ｆｚｄ１０のうちの１又は複数に、結合する。一部の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域のいずれかは、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８に結合する。様々な実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域のいずれかが、（ｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ９；（ｉｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２及びＦｚｄ７；（ｉｉｉ）Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８；（ｉｖ）Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８；（ｖ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８；（ｖｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８；（ｖｉｉ）Ｆｚｄ４及びＦｚｄ９；（ｖｉｉｉ）Ｆｚｄ９及びＦｚｄ１０；（ｉｘ）Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ８及びＦｚｄ１０；（ｘ）Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８；又は（ｘｉ）Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８に結合する。
【０１６２】
一部の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域は、関心の１又は複数のＦｚｄ受容体に対して選択的であり、例えば、他のＦｚｄ受容体と比較して、少なくとも１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍又はそれ以上である１又は複数の所望のＦｚｄ受容体に対する特異性を有する。一部の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子の１又は複数のＦｚｄ結合領域のいずれかは、多特異性であり、また複数のＦｚｄ受容体に、例えばＦｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ３、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ８、Ｆｚｄ９又はＦｚｄ１０のうちの２以上に、結合又は特異的に結合する。例えば、１又は複数のＦｚｄ結合領域のいずれかは、二重特異性、三重特異性、四重特異性等であり得る。一部の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子の１又は複数のＦｚｄ結合領域のいずれかは、単一特異性であり、また単一のＦｚｄ受容体に、例えばＦｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ３、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ８、Ｆｚｄ９又はＦｚｄ１０のうちの１つのみに、結合又は特異的に結合する。
【０１６３】
一部の実施形態においては、単一特異性のＦｚｄ結合領域が、Ｆｚｄ受容体の高システインドメイン（ＣＲＤ）を含まない、又はＦＺＤ受容体のＣＲＤ全体未満を含む、Ｆｚｄ受容体の領域に結合する。図２Ａに示すように、ＣＲＤ内の配列は、１０個のＦｚｄ受容体間で強い相同性を示し、相同性はサブファミリーのメンバー間でさらに高い状態である。したがって、本明細書で開示する単一特異性のＦｚｄ結合領域のある実施形態は、ＣＲＤに結合しないか、又はＣＲＤのサブセットにのみ結合する。
【０１６４】
一部の実施形態においては、Ｆｚｄ結合領域、例えば単一特異性のＦｚｄ結合領域は、本明細書においてＦｚｄ受容体の「ヒンジ領域」と呼ばれる、ＣＲＤの後に細胞外ドメインの少なくとも一部を含むエピトープに結合する（図２Ａを参照）。特定の実施形態においては、エピトープのうち、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％が、Ｆｚｄ受容体のヒンジ領域内に存在する。図４Ａから４Ｅに示すように、Ｆｚｄ受容体の細胞外ドメインのヒンジ領域は、非常に様々な配列を示す。説明的なＦｚｄ受容体ヒンジ領域の配列は、配列番号９８〜１０７及び以下の表３に記載する。ある実施形態においては、ヒンジ領域が、配列番号９８〜１０７に記載の配列のうちのいずれかに対して、少なくとも９０％の、少なくとも９５％の、少なくとも９８％の、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【表３】
2021529796.tif 000065
【０１６５】
一部の実施形態においては、単一特異性のＦｚｄ結合領域が、Ｆｚｄ受容体のＣＲＤの上流のＮ末端領域の少なくとも一部を含むエピトープに結合する（図２Ａ）。特定の実施形態においては、エピトープのうち、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％が、Ｆｚｄ受容体のＮ末端領域内に存在する。説明的なＮ末端領域の配列は、配列番号１０８及び以下の表４に記載する。ある実施形態においては、Ｎ末端領域が、配列番号１０８に対して、少なくとも９０％の、少なくとも９５％の、少なくとも９８％の、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【表４】
2021529796.tif 000066
【０１６６】
一部の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子の１又は複数のＬＲＰ５／６結合領域のいずれかが、ＬＲＰ５／６のうちの一方又は両方に結合する。便宜上、「ＬＲＰ５／６」の語は、ＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６のいずれか又は両方をまとめて指すために用いる。
【０１６７】
免疫学的結合は、概して、免疫グロブリン分子とそれに対して免疫グロブリン特異的であるような抗原との間で生じる種類の非共有結合的な相互作用を指し、例えば、説明的であって限定するものではない例としては、静電的、イオン的、親水的、及び／又は疎水的な誘引力又は反発力、立体化学的な力、水素結合、ファンデルワールス力、及び他の相互作用の結果としてである。免疫学的結合の相互作用の強度又は親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）によって表現可能であり、Ｋｄが小さいほど、大きい親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合の特性は、当技術において周知の方法を用いて定量化可能である。こうした方法のひとつは、抗原結合部位／抗原の複合体の形成及び解離の速度を測定することを伴い、ここでそれら速度は、複合体の相手方の濃度、相互作用の親和性、及び両方向においてその速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメータに依存する。すなわち、「ｏｎ速度定数」（Ｋｏｎ）と「ｏｆｆ速度定数」（Ｋｏｆｆ）との両方を、会合及び解離の濃度ならびに実際の速度の算出によって求めることが可能である。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関連しない全てのパラメータの解除（ｃａｎｃｅｌｌａｔｉｏｎ）することができ、そのため解離定数Ｋｄと等しい。概して、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３を参照されたい。
【０１６８】
ある実施形態においては、本明細書に記載するＷｎｔ代替分子又はその結合領域は、親和性が、約１０，０００ｎＭ未満、約１０００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．１ｎＭ未満、約０．０１ｎＭ未満、約０．００１ｎＭ未満、約０．０００１ｎＭ未満、約０．００００１ｎＭ未満、又は約０．０００００１ｎＭ未満であり、また一部の実施形態においては、抗体は、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープ又はＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６受容体に対してさらに高い親和性を有し得る。
【０１６９】
免疫グロブリンの定常領域は、可変領域よりも小さい配列多様性を示し、またいくつかの天然のタンパク質に結合して重要な生化学的事象を引き出すことに貢献する。ヒトにおいては、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む）及びＩｇＭを含む５つの異なるクラスの抗体がある。これら抗体のクラス間で際立った特徴はそれらの定常領域であるが、Ｖ領域にわずかな差異が存在することもある。
【０１７０】
抗体のＦｃ領域は、いくつかのＦｃ受容体及びリガンドと相互作用して、エフェクタ機能と呼ばれる一連の重要な機能的能力を与える。ＩｇＧに関しては、Ｆｃ領域が、ＩｇドメインＣＨ２及びＣＨ３と、ＣＨ２に至るＮ末端ヒンジとを含む。ＩｇＧクラスに関するＦｃ受容体の重要なファミリーはＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）である。これら受容体は、抗体と免疫系の細胞アームとの伝達を介在する（Ｒａｇｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １２：１８１−２２０；Ｒａｖｅｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：２７５−２９０）。ヒトにおいては、このタンパク質ファミリーには、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ及びＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１及びＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１及びＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）及びＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびに、アイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８及びＦ１５８を含む）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１及びＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が含まれる（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５）。これら受容体は、典型的に、Ｆｃへの結合を介在する細胞外ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内の一部のシグナル伝達事象を介在し得る細胞内ドメインを有する。これら受容体は、単核細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＴ細胞を含む、様々な免疫細胞において発現する。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成が、結合した抗原の部位にこれらエフェクタ細胞を取り込み、典型的には、細胞内のシグナル伝達事象、ならびにそれに続く、例えば炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用及び細胞傷害性攻撃（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｔｔａｃｋ）等である重要な免疫応答を結果としてもたらす。
【０１７１】
細胞傷害性及び食作用のエフェクタ機能を介在する能力は、それによって抗体が標的細胞を破壊するものである潜在的機序である。ＦｃγＲを発現する非特異的な細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合した抗体を認識して、次いで当該標的細胞の溶解を引き起こすものである細胞介在性の反応は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれる（Ｒａｇｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １２：１８１−２２０；Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：７３９−７６６；Ｒａｖｅｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：２７５−２９０）。ＦｃγＲを発現する非特異的な細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合した抗体を認識して、次いで当該標的細胞の食作用を引き起こすものである細胞介在性の反応は、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）と呼ばれる。全てのＦｃγＲは、Ｃｇ２（ＣＨ２）ドメインのＮ末端と前述のヒンジとにおいて、Ｆｃ上の同一の領域に結合する。この相互作用は、構造的に良好に特徴づけられ（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０９：７３７−７４９）、またヒトＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインに結合するヒトＦｃのいくつかの構造は解明されている（ｐｄｂアクセッションコード１Ｅ４Ｋ）（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：２６７−２７３．）（ｐｄｂアクセッションコード１ＩＩＳ及び１ＩＩＸ）（Ｒａｄａｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１６４６９−１６４７７．）。
【０１７２】
異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに対して異なる親和性を有し、典型的には、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりも実質的に良好に受容体に結合する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５）。全てのＦｃγＲは、ＩｇＧ  Ｆｃ上の同一の領域に結合するが、以下のとおり異なる親和性で結合する：高親和性バインダーＦｃγＲＩはＩｇＧ１に対するＫｄが１０−８Ｍ−１であり、一方で、低親和性受容体ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは概して、それぞれ１０−６及び１０−５で結合する。ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインは９６％同一であるが、ＦｃγＲＩＩＩｂは、細胞内シグナル伝達ドメインを有していない。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ及びＦｃγＲＩＩＩａは、免疫複合体が誘発する活性化の正の調節因子であり、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することによって特徴づけられる一方で、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を有するため、抑制性である。すなわち、前者は活性化受容体と呼ばれ、ＦｃγＲＩＩｂは抑制性受容体と呼ばれる。受容体はまた、発現パターンと、異なる免疫細胞に対するレベルとの点で異なる。さらに別のレベルの複雑性は、ヒトプロテオーム内にいくつかのＦｃγＲ多型が存在することである。臨床的有意性をもつ特に関連の多型は、Ｖ１５８／Ｆ１５８  ＦｃγＲＩＩＩａである。ヒトＩｇＧ１は、Ｆ１５８アロタイプよりも、Ｖ１５８アロタイプに対してより高い親和性で結合する。この親和性における差異と、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰに対する推定されるその影響とが、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の登録商標）の効能の有意な決定因子であることが示されている。Ｖ１５８アロタイプをもつ対象は、リツキシマブによる治療に対して有利に反応したが、より低い親和性のＦ１５８アロタイプをもつ対象は、不十分な反応である（Ｃａｒｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９：７５４−７５８）。ヒトの約１０〜２０％が、Ｖ１５８／Ｖ１５８ホモ接合であり、４５％が、Ｖ１５８／Ｆ１５８ヘテロ接合であり、またヒトの３５〜４５％が、Ｆ１５８／Ｆ１５８ホモ接合である（Ｌｅｈｒｎｂｅｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｌｏｏｄ  ９４：４２２０−４２３２；Ｃａｒｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９：７５４−７５８）。よって、ヒトの８０〜９０％が、低反応者であり、すなわち彼らは、Ｆ１５８  ＦｃγＲＩＩＩａの少なくとも１つの対立遺伝子を有する。
【０１７３】
Ｆｃ領域はまた、補体カスケードの活性化に関与する。古典的補体経路においては、Ｃ１は、そのＣ１ｑサブユニットにより、抗原を伴う複合体を形成しているＩｇＧ又はＩｇＭのＦｃフラグメントに結合する。本開示のある実施形態においては、Ｆｃ領域に対する改変は、本明細書に記載するＦｚｄ特異的な抗体の、補体系を活性化する能力を変える（増強するか又は低減するかのいずれか）改変を含む（例えば、米国特許第７，７４０，８４７号を参照）。補体活性化を評価するために、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイを実施してもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６）を参照）。
【０１７４】
すなわち、ある実施形態においては、本開示は、例えば低減もしくは増強されたＣＤＣ、ＡＤＣＣ、もしくはＡＤＣＰの活性又は特異的なＦｃγＲに対する増強された結合親和性又は増加した血中半減期等である、変更された機能的特徴を伴う改変されたＦｃ領域を有する抗Ｆｚｄ抗体を提供する。本明細書で検討される他の改変されたＦｃ領域は、例えば発行された米国特許第７，３１７，０９１号；第７，６５７，３８０号；第７，６６２，９２５号；第６，５３８，１２４号；第６，５２８，６２４号；第７，２９７，７７５号；第７，３６４，７３１号；公開された米国特許出願公開第２００９０９２５９９号；第２００８０１３１４３５号；第２００８０１３８３４４号；及び公開された国際出願の国際公開第２００６／１０５３３８号；国際公開第２００４／０６３３５１号；国際公開第２００６／０８８４９４号；国際公開第２００７／０２４２４９号に記載されている。
【０１７５】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子が、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する所望の結合特異性を伴う抗体可変ドメインを含む。ある実施形態においては、当該融合は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３の領域の少なくとも一部を含むＩｇ重鎖定常ドメインとによる。特定の実施形態においては、軽鎖の結合に必要である部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、融合のうちの少なくとも１つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡと、所望であれば免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡとは、別個の発現ベクターに挿入されて、また好適な宿主細胞内に共形質移入される。このことが、構成内で用いられる平等でない比の３つのポリペプチド鎖により所望の二重特異性抗体の最適な収量を提供する実施形態において、３つのポリペプチドフラグメントの相互の割合を調節する際により大きい柔軟性をもたらす。しかしながら、少なくとも２つのポリペプチド鎖の平等な比での発現が結果的に高収量をもたらす場合に、又は当該比が、所望の鎖状結合の収量に有意に影響しない場合に、２又は３つ全てのポリペプチド鎖についてのコード配列を単一の発現ベクター内に挿入することが可能である。
【０１７６】
本明細書に開示するＷｎｔ代替分子はまた、例えば精製又は診断の用途での使用のために、エピトープのタグ又は標識を含むように改変してもよい。例えば米国特許第５，２０８，０２０号又は欧州特許第０  ４２５  ２３５  Ｂ１号、及びＣｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示されるものを含む、抗体複合体を作るための当技術で公知の連結基が多数ある。  連結基には、上記で特定した特許に開示されるような、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、光解離性基、ペプチダーゼに不安定な基、又はエステラーゼに不安定な基が含まれるが、ジスルフィド基、及びチオエーテル基が好ましい。
【０１７７】
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子内に存在する抗ＬＲＰ５／６抗体及びその抗原結合性フラグメントならびに／又は抗Ｆｚｄ抗体及びその抗原結合性フラグメントは、単クローン性である。ある実施形態においては、それらはヒト化される。
【０１７８】
本開示は、ある実施形態においては、本明細書に開示するＷｎｔ代替分子内に存在するポリペプチドをコードする単離された核酸をさらに提供する。核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。これらの関連する実施形態では、本明細書に記載するような１又は複数のＦｚｄ受容体及び／又はＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６に結合する抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含み得る。本明細書で用いる場合、「単離されたポリヌクレオチド」の語は、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、又は合成起源の又はそれらの一部の組み合わせのポリヌクレオチドを意味するものであり、これは、その起源に基づき、単離されたポリヌクレオチドは、（１）単離されたポリヌクレオチドは天然に存在するようなあるポリヌクレオチドの全て又は一部と結合していないか、（２）天然には連結していないあるポリヌクレオチドと連結するか、又は（３）より大きい配列の一部として天然に発生しない。単離されたポリヌクレオチドは、天然の配列及び／又は人工の配列を含み得る。
【０１７９】
「操作可能に連結する」の語は、当該語が適用された構成要素が、好適な条件下でそれらの本来の機能を実行することが当該構成要素に許容されるような関係性であることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「操作可能に連結」した転写制御配列は、タンパク質コード配列の発現が、当該制御配列の転写活性と互換性がある条件下で達成されるように、それに連結される。
【０１８０】
本明細書で用いる場合、「制御配列」の語は、ポリヌクレオチド配列であって、それらが結合されるか又は操作可能に連結されるコード配列の、発現、プロセッシング又は細胞内局在に影響する可能性があるポリヌクレオチド配列を指す。こうした制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態においては、原核生物のための転写制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含み得る。他の特定の実施形態においては、真核生物のための転写制御配列は、１又は複数の転写制御因子認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列、転写終結配列及びポリアデニル化配列を含み得る。ある実施形態においては、「制御配列」は、リーダー配列及び／又は融合パートナー配列を含むことが可能である。
【０１８１】
本明細書でいう「ポリヌクレオチド」の語は、一本鎖又は二本鎖の核酸高分子を意味する。ある実施形態においては、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又はいずれかの種類のヌクレオチドの改変形態であり得る。当該改変は、ブロモウリジン等の塩基改変、アラビノシド及び２’，３’−ジデオキシリボース等のリボース改変、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロジセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、及びホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）等のヌクレオチド間リンケージの改変を含む。「ポリヌクレオチド」の語は、特に、ＤＮＡの一本鎖形態及び二本鎖形態を含む。
【０１８２】
「天然のヌクレオチド」の語は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む。「改変ヌクレオチド」の語は、改変された又は置換された糖類等を伴うヌクレオチドを含む。「オリゴヌクレオチドリンケージ」の語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロアミデート等のオリゴヌクレオチドリンケージを含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：９０８１；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６：６０７７；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：３２０９；Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  ＤＥＳＩＧＮ，６：５３９；Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｅｄ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｔｅｃらの米国特許第  ５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ，１９９０，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３を参照されたく、また当該開示は、任意の目的の参照により本明細書で援用される。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド又はそのハイブリダイゼーションの検出を可能にする検出可能レベルを含み得る。
【０１８３】
「ベクター」の語は、コード情報を宿主細胞に移動させるために用いる任意の分子（例えば、核酸、プラスミド又はウイルス）を指すために用いる。「発現ベクター」の語は、宿主細胞の形質転換に好適であり、また挿入された非相同の核酸配列の発現を司る及び／又は制御する核酸配列を含有する、ベクターを指す。発現は、転写、翻訳、及びイントロンが存在すればＲＮＡスプライシング等であるプロセスを含むが、これに限定されない。
【０１８４】
当業者により理解することとなるように、ポリヌクレオチドは、遺伝子配列、ゲノム外かつプラスミドにコードされた配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ペプチド等を発現、又は発現するように構成され得る、より小さい改変遺伝子断片を含み得る。こうした断片は、天然に単離され得、又は当業者によって合成的に改変され得る。
【０１８５】
当業者によってまた認識されることとなるように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード又はアンチセンス）又は二本鎖であり得、及びＤＮＡ分子（ゲノムの、ｃＤＮＡ又は合成の）又はＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有して一対一でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子と、イントロンを含有しないｍＲＮＡ分子とを含み得る。さらなるコード配列又は非コード配列は、必ずしもではないが、本開示によるポリヌクレオチド内に存在し得、またポリヌクレオチドは、必ずしもではないが、他の分子及び／又は支持材料に連結し得る。ポリヌクレオチドは、天然配列を含み得るか、又は、こうした配列のバリアント又は誘導体をコードする配列を含み得る。
【０１８６】
遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載する抗体をコードするヌクレオチド配列が多数あるということを、当業者は認識するであろう。これらポリヌクレオチドには、Ｗｎｔ代替分子内のポリペプチドをコードする天然の又は元来のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列に対して最小限の配列同一性を有するものもある。それでもなお、コドン使用頻度における差異に起因して変動するポリヌクレオチドが、本開示によって明示的に検討される。ある実施形態においては、特に、哺乳動物発現に関してコドン最適化された配列が検討される。
【０１８７】
したがって、本開示の別の実施形態においては、本明細書に記載するポリペプチドのバリアント及び／又は誘導体を調製するために、例えば部位特異的変異等である変異誘発アプローチを用いてもよい。このアプローチによって、ポリペプチド配列における特定の改変を、それらをコードする基礎になるポリヌクレオチドの変異誘発を介して行うことが可能である。これら技術により、配列バリアントを調製及び試験するための直接のアプローチが提供されるが、例えば、１又は複数のヌクレオチド配列の変更をポリヌクレオチドに導入することによって、先述の検討のうちの１又は複数を組み入れている。
【０１８８】
部位特異的な変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特異的なオリゴヌクレオチド配列のみならず十分な数の隣接するヌクレオチドの使用を介して、変異体の産生を可能にし、十分な大きさと配列の複雑度とであるプライマー配列を提供し、交差している欠失接合部の両側において安定の二本鎖を形成する。選択されたポリヌクレオチド配列において変異を用いて、ポリヌクレオチド自体の特徴を、改善、変更、低減、改変もしくはそうでなければ変化させてもよく、及び／又は、コードされたポリペプチドの特徴、活性、組成、安定性もしくは一次配列を変更してもよい。
【０１８９】
ある実施形態においては、発明者は、例えば結合親和性等であるコードされたポリペプチドの１もしくは複数の特徴、又は特定のＦｃ領域の機能、又は特定のＦｃγＲに対するＦｃ領域の親和性を変更するような、Ｗｎｔ代替分子に存在するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変異誘発を検討する。部位特異的な変異誘発の技術は、当技術分野で周知であり、またポリペプチド及びポリヌクレオチドの両方のバリアントを生成するために広く用いられいてる。例えば部位特異的な変異誘発は、ＤＮＡ分子の特定の部分を変更するのに用いられることがよくある。こうした実施形態においては、典型的には長さが約１４ヌクレオチドから約２５ヌクレオチド等であるプライマーを採用するが、これは配列の接合部の両側にある約５から約１０の残基が変更されている状態である。
【０１９０】
当業者により理解されることとなるように、部位特異的な変異誘発技術はしばしば、一本鎖及び二本鎖の両方の形態で存在するファージベクターを採用してきた。部位特異的な変異誘発で有用な典型的なベクターには、Ｍ１３ファージ等であるベクターが含まれる。これらファージは、容易に商業的に利用可能であり、またそれらの使用は、概して、当業者にとって周知である。二本鎖プラスミドもまた、関心の遺伝子がプラスミドからファージへと移動するステップを除去する、部位特異的な変異誘発において採用されるのが通例である。
【０１９１】
部位特異的な変異誘発による選択されたペプチドコードＤＮＡ断片の配列バリアントの調製により、潜在的に有用である種を産生する手段が提供され、またペプチドの配列バリアントとそれらをコードするＤＮＡ配列とが取得され得る他の方法の存在を制限することを意味するものではない。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターを、ヒドロキシルアミン等の突然変異誘発物質で処理して、配列バリアントを取得することができる。これら方法及びプロトコールに関する特定の詳細は、Ｍａｌｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｓｅｇａｌ，１９７６；Ｐｒｏｋｏｐ  ａｎｄ  Ｂａｊｐａｉ，１９９１；Ｋｕｂｙ，１９９４；及びＭａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２の技術で見られ、それぞれ、その目的のために参照により本明細書で援用する。
【０１９２】
多数の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子のポリペプチドをコードする１又は複数の核酸が、宿主細胞に直接導入されて、当該細胞は、コードされたポリペプチドの発現を誘発するのに十分な条件下でインキュベートした。この開示のＷｎｔ代替ポリペプチドは、本明細書で提供されるポリペプチド及び核酸の配列と組み合わせて、当業者にとって周知の標準技術を用いて調製され得る。ポリペプチド配列を用いて、それによって開示される特定のポリペプチドをコードする適切な核酸配列を決定することができる。核酸配列は、当業者にとって周知である標準の方法に従う種々の発現系に対するコドンの「選択性（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」を特に反映させるように最適化され得る。
【０１９３】
ある関連の実施形態によれば、例えばＷｎｔ代替分子又はそのポリペプチドをコードする核酸を含むベクターである、本明細書に記載する１又は複数のコンストラクトを含む組換え宿主細胞と、コードされる産物を産生する方法であって、そのためにコード核酸より発現することを含む、当該方法とが提供される。発現は、好都合に、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって達成され得る。発現による産生に次いで、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、任意の好適な技術により単離及び／又は精製されて、その後所望のように使用され得る。
【０１９４】
ポリペプチド及びコード核酸分子及びベクターは、実質的に純粋もしくは均質な形態で、又は、核酸の場合には所望の機能を伴うポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸もしくは遺伝子を含まずもしくは実質的に含まずに、例えばそれらの天然の環境から単離及び／又は精製され得る。核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得、また完全に又は部分的に合成によるものであり得る。本明細書で記載するヌクレオチド配列への言及には、特定の配列を伴うＤＮＡ分子を包含し、また特定の配列を伴うＲＮＡ分子を包含するものであって、文脈が別を要求していない限り、ＵはＴで置換されている。
【０１９５】
種々の異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニング及び発現するための系は周知である。好適な宿主細胞には、バクテリア、哺乳動物細胞、酵母及びバキュロウイルスの系が含まれる。異種ポリペプチドの発現に関する技術において利用可能である哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞、及びその他多数が含まれる。よくある、好ましい細菌性の宿主は、大腸菌である。
【０１９６】
例えば大腸菌等である原核細胞における、例えば抗体及びその抗原結合性フラグメントであるポリペプチドの発現は、当技術において確立されている。検討のために、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５−５５１（１９９１）を参照されたい。培養での真核細胞の発現はまた、抗体又はその抗原結合性フラグメントの産生のための選択肢として当業者にとって利用可能であり、最近のレビューとして、例えばＲｅｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３−５７６；Ｔｒｉｌｌ  Ｊ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６：５５３−５６０を参照されたい。
【０１９７】
好適なベクターを選択又は構築することが可能であり、それは、プロモーター配列、転写終結配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、標識遺伝子及び必要に応じて他の配列を含む、適切な調節配列を含有する。ベクターは、プラスミドであり得、必要に応じて、ウイルス性、例えばファージであり、又はファージミドである。さらに詳細に関しては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。例えば核酸コンストラクトの調製、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現、ならびにタンパク質の解析における、核酸の操作のための多数の公知の技術及びプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２、又はその後の改訂に、詳細に記載されている。
【０１９８】
「宿主細胞」の語は、本明細書に記載のポリペプチドの１又は複数をコードする核酸配列を、その中に導入されたものである細胞、又はそれに導入することが可能である細胞であって、本明細書に記載の任意のポリペプチドをコードする遺伝子等である関心の選択された遺伝子を、さらに発現する又は発現することが可能である細胞を指すために用いる。この語には、親細胞の子孫が含まれるものであって、当該子孫が、形態学的に又は遺伝子構造的に元の親と一致するか否かのいずれにしても、当該選択された遺伝子が存在する限り、親細胞の子孫が含まれる。したがって、こうした核酸を宿主細胞に導入することを含む方法も検討される。当該導入は、任意の利用可能な技術を採用することができる。真核細胞に関しては、好適な技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔法、リポソーム介在性トランスフェクション、及び、レトロウイルスや、又は例えばワクシニア、又は昆虫細胞に関してはバキュロウイルスである他のウイルスを用いた、形質導入が含まれ得る。細菌細胞に関しては、好適な技術には、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔法、及びバクテリオファージを用いたトランスフェクションが含まれ得る。当該導入の後には、例えば遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することによる、核酸から発現を引き起こす又は可能にすることが続き得る。一実施形態においては、核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に組み込まれる。組込みは、標準の技術に従った、ゲノムを用いた組換えを促進する配列の統合によって促進され得る。
【０１９９】
本開示はまた、ある実施形態においては、本明細書に記載するＷｎｔ模倣分子等の特定のポリペプチドを発現するために、発現系において上記に記載したコンストラクトを用いることを含む方法を提供する。「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」の語は、通常はファージによる、１つのバクテリアから別のバクテリアへの遺伝子の移動を指すために用いる。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物細胞配列の獲得及び移動も指す。「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」の語は、細胞による外来性ＤＮＡ又は外因性ＤＮＡの取り込みを指すために用い、また細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されたときに、「トランスフェクト」されるものである。いくつかのトランスフェクション技術が、当技術で周知であり、本明細書で開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；及び、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照されたい。こうした技術を用いて、１又は複数の外因性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞内に導入することが可能である。
【０２００】
本明細書で用いる場合、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」の語は、細胞の遺伝的特性における変化を指し、また細胞は、それが新しいＤＮＡを含有するように改変されたときに、形質転換されるものである。例えば、細胞は形質転換されて、そこで当該細胞はその天然状態から遺伝子改変される。トランスフェクション又は形質導入の後で、形質転換ＤＮＡが、細胞の染色体内に物理的に組み込まれることによって、細胞のＤＮＡと組み換えされ得るか、又は複製されることなくエピソーム要素として一時的に維持され得るか、又はプラスミドとして独立して複製し得る。細胞は、当該細胞の分裂によりＤＮＡが複製されるときに、安定的に形質転換されたものとみなされる。「天然の（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」又は「天然（ｎａｔｉｖｅ）」の語は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞等の生物学的物質と組み合わせて用いる場合、天然に存在し、かつ、ヒトによって操作されていない物質を指す。同様に、本明細書で用いる場合「非天然の（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」又は「非天然（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）」は、天然に存在しない物質、又は、ヒトによって構造的に改変もしくは合成された物質を指す。
【０２０１】
「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」及び「糖タンパク質」の語は、区別なく用いられて、任意の特定の長さに限定されないアミノ酸の高分子を意味する。当該語は、例えばミリスチル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化、及びシグナル配列の付加又は欠失等の改変を除外しない。「ポリペプチド」又は「タンパク質」の語は、１又は複数のアミノ酸鎖を意味するものであって、各鎖は、ペプチド結合で共有結合的に連結したアミノ酸を含み、また前記ポリペプチド又はタンパク質は、天然タンパク質、すなわち天然のかつ特に非組換え細胞又は遺伝子改変されたもしくは組換えの細胞により産生したタンパク質、の配列を有する、ペプチド結合によって共に非共有結合的に及び／又は共有結合的に連結した複数の鎖を含むことが可能であり、また天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、又は天然配列から１もしくは複数のアミノ酸が欠失している、天然配列に１もしくは複数のアミノ酸が付加している、及び／もしくは天然配列の１もしくは複数のアミノ酸が置換している分子を含むことが可能である。「ポリペプチド」及び「タンパク質」の語は特に、Ｗｎｔ代替分子、そのＦｚｄ結合領域、そのＬＲＰ５／６結合領域、本明細書に開示するＦｚｄ受容体もしくはＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６受容体に結合する抗体及びその抗原結合性フラグメント、又はこれらポリペプチドのいずれかから１もしくは複数のアミノ酸が欠失している、これらポリペプチドのいずれかに１もしくは複数のアミノ酸が付加している、及び／もしくはこれらポリペプチドのいずれかの１もしくは複数のアミノ酸が置換している配列、を包含する。すなわち、「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、１つのアミノ酸鎖（「単量体」と呼ぶ）又は複数のアミノ酸鎖（「多量体」と呼ぶ）を含むことが可能である。
【０２０２】
本明細書でいう「単離されたタンパク質」、「単離されたＷｎｔ代替分子」又は「単離された抗体」は、主題のタンパク質、Ｗｎｔ代替分子、又は抗体が、（１）典型的にはそれが天然に存在しないであろう少なくとも一部の他のタンパク質を含まないか、（２）例えば同一の種からである、同一の源からの他のタンパク質を実質的に含まないか、（３）異なる種からの細胞によって発現されるか、（４）少なくとも約５０パーセントの、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくはそれが天然で関連している他の物質から分離されたか、（５）「単離されたタンパク質」が天然に結合しているタンパク質の一部と結合していないか（共有結合性又は非共有結合性の相互作用によって）、（６）それが天然に結合していないポリペプチドと操作可能に結合しているか（共有結合性又は非共有結合性の相互作用によって）、又は（７）天然に発生しない、ということを意味する。こうした単離されたタンパク質は、ゲノムのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは他のＲＮＡによってコード可能であり、又は合成起源のものであり得るか、又はそれらのいずれかの組み合わせであり得る。ある実施形態においては、単離されたタンパク質は、天然のポリペプチド配列及び／又は人工のポリペプチド配列を含み得る。ある実施形態においては、単離されたタンパク質は、その使用（治療、診断、予防、調査、又はその他）に干渉することとなる、その天然環境に存在するタンパク質又はポリペプチド又は他の汚染物質を実質的に含まない。
【０２０３】
本明細書に記載するポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ代替分子又はそのＦｚｄ結合領域もしくはＬＲＰ５／６結合領域）のいずれかのアミノ酸配列の改変が検討される。例えば、Ｗｎｔ代替分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特徴を向上させることが望ましいものであり得る。例えば、Ｗｎｔ代替分子のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするポリヌクレオチド内もしくはその鎖内に適切なヌクレオチドの変更を導入することによって、又はペプチド合成によって、調製してもよい。こうした改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は当該残基への挿入、及び／又は当該残基の置換が含まれる。欠失、挿入及び置換のいずれかの組み合わせを行って、最終的なＷｎｔ代替分子に到達し得るが、最終的なコンストラクトが所望の特性（例えば、１又は複数のＦｚｄ及び／又はＬＲＰ５／６受容体に対する結合の高い親和性）を保有する。アミノ酸の変更はまた、例えばグリコシル化部位の数又は位置を変更すること等である、抗体の翻訳後プロセスを変え得る。本開示のポリペプチドに関する上記に記載した変形及び改変のいずれかが、本開示の抗体に含まれ得る。
【０２０４】
本開示は、本明細書に開示するポリペプチドのいずれかのバリアントを提供する（例えば、Ｗｎｔ代替分子、又はそのＦｚｄ結合領域もしくはＬＲＰ５／６結合領域、又は抗体もしくはその抗原結合性フラグメント）。ある実施形態においては、バリアントは、本明細書に開示するポリペプチドに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する。ある実施形態においては、こうしたバリアントのポリペプチドは、１もしくは複数のＦｚｄ受容体に、及び／又は１もしくは複数のＬＲＰ５／６受容体に、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％で結合し、またある実施形態においては、本明細書に特に記載したＷｎｔ代替分子と同様に少なくとも約９０％で、結合する。さらなる実施形態においては、こうしたバリアントのＷｎｔ代替分子は、本明細書に記載したＷｎｔ代替分子よりも高い親和性で、１もしくは複数のＦｚｄ受容体及び／又は１もしくは複数のＬＲＰ５／６受容体に結合し、例えば、本明細書に特に記載した抗体配列と同様に、定量的に、少なくとも約１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％又は１１０％結合する。
【０２０５】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子又はその結合領域、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ又はＶＨＨもしくはｓｄＡｂは、ａ）ｉ．本明細書に記載した選択された抗体の重鎖ＣＤＲ１領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ１領域と；ｉｉ．選択された抗体の重鎖ＣＤＲ２領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ２領域と；ｉｉｉ．選択された抗体の重鎖ＣＤＲ３領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ３領域と、を含む重鎖可変領域、及び／又はｂ）ｉ．選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ１領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ１領域と；ｉｉ．選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ２領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ２領域と；ｉｉｉ．選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ３領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ３領域と、を含む軽鎖可変ドメインを含み得るものであって、当該抗体が、選択された標的（例えば、１又は複数のＦｚｄ受容体エピトープ又はＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６受容体）を特異的に結合する。さらなる実施形態においては、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、バリアント抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、当該バリアントは、ＶＨ領域及びＶＬ領域のＣＤＲ領域において、最大で８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上のアミノ酸の置換があることを除き、選択された抗体と同一である重鎖及び軽鎖を含む。この点において、１、２、３、４、５、６、７、８、又はある実施形態においては、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上のアミノ酸置換が、選択された抗体のＣＤＲ領域に存在し得る。置換は、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のいずれかにおける、ＣＤＲ内にあり得る。（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ，１９９８，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：１１５３−１１６７を参照）。
【０２０６】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子又はその結合領域、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ又はＶＨＨもしくはｓｄＡｂは、ａ）本明細書に記載する抗体もしくはその抗原結合性フラグメントの重鎖可変領域に対して、少なくとも８０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び／又はｂ）本明細書に記載する抗体もしくはその抗原結合性フラグメントの軽鎖可変領域に対して、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、を有し得る。説明的なその抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列は、配列番号１〜９７及び１０９〜１５７に記載している。
【０２０７】
ポリペプチドは、別のポリペプチドに対するある特定のパーセント「配列同一性」を有し、これは、アラインしたときに、２つの配列を比較して同一であるアミノ酸の百分率を意味する。配列類似性は、いくつかの異なる手法で決定することが可能である。配列同一性を決定するために、ワールドワイドウェブを介してｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で利用可能であるＢＬＡＳＴを含めた方法及びコンピュータプログラムを用いて、配列をアラインすることが可能である。別のアラインメントアルゴリズムはＦＡＳＴＡであり、これはＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ社の完全所有子会社である、米国ウィスコンシン州マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）のパッケージで利用可能である。アラインメントのための他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡに記載されている。配列内のギャップを許容するアラインメントプログラムが特に関心のものである。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメント内のギャップを許容するアルゴリズムの１つのタイプである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）を参照されたい。またＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメント法を用いたＧＡＰプログラムを利用して配列をアラインすることも可能である。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）を参照されたい。
【０２０８】
ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１））の配列同一性を決定するための局所的相同性アルゴリズムを用いたＢｅｓｔＦｉｔプログラムも関心のものである。ギャップ生成ペナルティは、概して、１から５の範囲に及ぶこととなり、通常は２から４であり、また多くの実施形態においては３となることとなる。ギャップ伸長ペナルティは、概して、約０．０１から０．２０の範囲に及ぶこととなり、また多くの実施例においては０．１０となることとなる。プログラムは、比較対象である入力された配列によって決定されるデフォルトパラメータを有する。好ましくは、配列同一性は、プログラムによって決定されるデフォルトパラメータを用いて決定する。このプログラムもまた、米国ウィスコンシン州マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）のパッケージから利用可能である。
【０２０９】
別の関心のプログラムは、ＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１２７−１４９，１９８８，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。パーセント配列同一性は、以下のパラメータに基づいてＦａｓｔＤＢで算出される：ミスマッチペナルティ：１．００；ギャップペナルティ：１．００；ギャップサイズペナルティ：０．３３；及びジョイニングペナルティ（Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ）：３０．０。
【０２１０】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子又はその結合領域、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ又はＶＨＨもしくはｓｄＡｂは、ａ）ｉ．本明細書に記載した選択された抗体の重鎖ＣＤＲ１領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ１領域と；ｉｉ．選択された抗体の重鎖ＣＤＲ２領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ２領域と；ｉｉｉ．選択された抗体の重鎖ＣＤＲ３領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ３領域と、を含む重鎖可変領域、及びｂ）ｉ．選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ１領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ１領域と；ｉｉ．選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ２領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ２領域と；ｉｉｉ．選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ３領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ３領域と、を含む軽鎖可変ドメインを含み得るものであって、当該抗体が、選択された標的（例えば、Ｆｚｄ１等であるＦｚｄ受容体）に特異的に結合する。さらなる実施形態においては、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、バリアント抗体であって、当該バリアントは、ＶＨ領域及びＶＬ領域のＣＤＲ領域において、最大で８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上のアミノ酸置換があることを除き、選択された抗体と同一である重鎖及び軽鎖を含む。この点において、１、２、３、４、５、６、７、８、又はある実施形態においては、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のアミノ酸置換が、選択された抗体のＣＤＲ領域に存在し得る。置換は、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のいずれかにおける、ＣＤＲ内にあり得る。（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ，１９９８，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：１１５３−１１６７を参照）。
【０２１１】
代表的なポリペプチド（例えば、本明細書で提供するＷｎｔ代替分子の、バリアントのＦｚｄ結合領域又はＬＲＰ５／６結合領域）の三次元構造の決定は、選択された天然又は非天然のアミノ酸による１又は複数のアミノ酸の置換、付加、欠失又は挿入が、そのように誘導された構造バリアントがここに開示する種の空間充填特性を保持するか否かを判断する目的で、仮想的にモデル化可能であるように、通例の方法論により行うことができる。例えば、Ｄｏｎａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．３：２３７８；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：１８６８−１８７１（２００５）；Ｓｃｈｕｅｌｅｒ−Ｆｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：６３８（２００５）；Ｄｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：１２４４（２００６）；Ｄｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：１７６（２００７）；Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：２５９（２００７）；Ｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１０１４−１０１８（２０１０）を参照されたい。例えば結合領域の合理的設計のため等であるこれらの関連の実施形態で用いることができるコンピュータアルゴリズムの一部のさらなる非限定的な例には、３Ｄグラフィックスとビルトインスクリプト記述とを用いた、大きい生体分子系をディスプレイし、動画にし、及び解析するための分子可視化プログラムであるＶＭＤを含む（イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校のＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐのウェブサイト、ｋｓ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｖｍｄ／を参照）。多数の他のコンピュータプログラムが、当技術で公知であり、当業者にとって利用可能であり、またそれはエネルギーが最小されたコンホメーションの空間充填モデルよりの原子寸法（ファンデルワールス半径）を決定することを可能にし、それには、結合を増強させような様々な化学基に関して高い親和性の領域を決定しようとするＧＲＩＤ、数学的アラインメントを算出するモンテカルロ探索、ならびに力場計算を評価して分析するＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．４：１８７−２１７）及びＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８１）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１０６：７６５）がある（Ｅｉｓｅｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６１：Ｃ３７６−３８６；Ｌｙｂｒａｎｄ（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｅｌｇ．４６：４９−５４；Ｆｒｏｉｍｏｗｉｔｚ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：６４０−６４４；Ｂｕｒｂａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７：９９−１１１；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ（１９８５）Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．６１：１８５−１９０；及びＫｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．９：４７５−４８８も参照）。例えばＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社（ドイツ国ミュンヘン）等より、種々の適切な計算的コンピュータプログラムもまた市販されている。
【０２１２】
組成物
本明細書に記載のＷｎｔ代替分子、及び１又は複数の薬理学的に許容可能な希釈剤、担体、又は賦形剤を含む医薬組成物もまた開示する。特定の実施形態においては、医薬組成物は、１又は複数のＷｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをさらに含む。
【０２１３】
さらなる実施形態においては、本明細書に記載のＷｎｔ代替分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、及び１又は複数の薬理学的に許容可能な希釈剤、担体、又は賦形剤を含む医薬組成物もまた開示する。特定の実施形態においては、医薬組成物は、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含む１又は複数のポリヌクレオチドをさらに含む。ある実施形態においては、ポリヌクレオチドはＤＮＡ又はｍＲＮＡであって、例えば改変されたｍＲＮＡである。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列及び／又は３’テール（ｔａｉｌｉｎｇ）配列、例えばポリＡ尾部、をさらに含む改変ｍＲＮＡである。他の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、コード配列と作動的に連結したプロモーターを含む発現カセットである。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列とが、同一のポリヌクレオチド内に存在する。
【０２１４】
さらなる実施形態においては、本明細書に記載のＷｎｔ代替分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、例えばウイルスベクターである発現ベクターと、１又は複数の薬理学的に許容可能な希釈剤、担体、又は賦形剤とを含む医薬組成物もまた開示する。特定の実施形態においては、医薬組成物は、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、例えばウイルスベクターである発現ベクターをさらに含む。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列とが、例えば発現カセットである同一のポリヌクレオチド内に存在する。
【０２１５】
本開示は、Ｗｎｔ代替分子をコードする核酸に作動的に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞と、１又は複数の薬理学的に許容可能な希釈剤、担体、又は賦形剤とを含む医薬組成物をさらに検討する。特定の実施形態においては、医薬組成物は、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列に作動的に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞をさらに含む。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列とが、例えば発現カセットである同一のポリヌクレオチド内に、及び／又は同一の細胞内に、存在する。特定の実施形態においては、細胞は、異種細胞であるか、又は処置しようとする対象から取得した自己細胞である。特定の実施形態においては、細胞は、幹細胞であり、例えば脂肪由来の幹細胞又は造血幹細胞である。
【０２１６】
本開示は、第１の活性薬剤としてのＷｎｔ代替分子を送達するための第１の分子と、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドを送達するための第２の分子とを含む医薬組成物を検討する。第１の分子及び第２の分子は、同一の種類の分子であってもよく、又は異なる種類の分子であってもよい。例えば、ある実施形態においては、第１の分子及び第２の分子は、以下の種類の分子からそれぞれ独立に選択され得る：ポリペプチド、有機小分子、第１の活性薬剤又は第２の活性薬剤をコードする核酸（随意にＤＮＡ、又はｍＲＮＡ、随意に改変ＲＮＡ）、第１の活性薬剤又は第２の活性薬剤をコードする核酸配列を含むベクター（随意に、発現ベクター又はウイルスベクター）、及び第１の活性薬剤又は第２の活性薬剤をコードする核酸配列を含む細胞（随意に発現カセット）。
【０２１７】
主題の分子は、単独で又は組み合わせて、概して安全で、無毒性で及び所望であり、また例えばヒト又は霊長類である哺乳動物での使用に容認可能である賦形剤を含む製剤を調製する際に有用である、薬理学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤ならびに薬剤と組み合わせることが可能である。こうした賦形剤は、固体、液体、半固体、又はエアロゾル組成物である場合には気体のものとすることが可能である。こうした担体、希釈剤及び賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これに限定されない。補足的に活性化合物を、製剤中に取り入れることも可能である。製剤に用いる溶液又は懸濁剤としては、例えば注射用蒸留水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒等である滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベン等である抗菌化合物；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム等である抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等であるキレート化号物；酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩等の緩衝液；凝集を防止する、Ｔｗｅｅｎ２０等である界面活性剤；及び、塩化ナトリウム、又はブドウ糖等である張度調整用の化合物を挙げることができる。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウム等である酸又は塩基で調節可能である。特定の実施形態においては、医薬組成物は無菌である。
【０２１８】
医薬組成物は、滅菌の水溶液又は分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）と、滅菌の注射可能な水溶液又は分散剤の即時調製のため滅菌粉末とをさらに含み得る。静脈内投与に関して、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。一部の場合においては、組成物は、無菌であり、またそれをシリンジ内に吸い込むことができるように、又はシリンジから対象に送達するすることができるように、液体である必要がある。ある実施形態においては、当該組成物は、製造及び保存条件下で安定であり、また例えば細菌及びカビ等の微生物の汚染作用に対抗して保存される。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）及びそれらの好適な混合物を含有する、例えば溶媒又は分散媒であり得る。例えば、レシチン等のコーティングを用いることによって、分散の場合は必要な粒径を保持することによって、及び界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持することが可能である。例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等である様々な抗菌剤及び抗真菌剤によって、微生物の作用を防止することが可能である。多くの場合においては、例えば糖類、マンニトール、ソルビトール等である多価アルコール、塩化ナトリウムである等張剤を組成物中に含むことが好ましいこととなる。例えばステアリン酸アルミニウム及びゼラチンである、吸収を遅延させる薬剤を組成物中に含ませることによって、体内での組成物の吸収を長引かせることが可能である。
【０２１９】
滅菌溶液は、上記で列挙した成分の１つ又は組み合わせと、適切な溶媒中で必要量の抗Ｆｚｄ抗体又はその抗原結合性フラグメント（又はコードポリヌクレオチドもしくはそれを含む細胞）を合わせて、必要に応じて濾過滅菌を次いで行うことによって、調製可能である。概して、分散剤は、基礎分散媒と、上記に列挙したものよりの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクル内に、活性化合物を合わせることによって調製可能である。滅菌注射液の調製のための滅菌粉剤の場合、調製方法は、予め濾過滅菌したその溶液から、いずれかのさらなる所望の成分が加わった活性成分の粉末を生じるものである、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０２２０】
一実施形態においては、医薬組成物は、体からの急速な排除から抗体又はその抗原結合性フラグメントを保護することとなるような担体と共に調製され、例えば、植込錠及びマイクロカプセル化送達システムを含めた放出制御製剤等である。例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等である、生分解性の、生体適合性の高分子を用いることが可能である。こうした製剤の調製方法は、当業者にとって明らかであろう。物質はまた、市販のものを取得することもできる。リポソーム懸濁液もまた、薬理学的に許容可能な担体として使用可能である。これらは、当業者にとって公知である方法に従って調製可能である。
【０２２１】
投与し易さ及び投与量の均一性のために、投与単位形態で医薬組成物を製剤化することが有利であり得る。本明細書で用いる場合、投与単位形態は、処置しようとする対象に対して、単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された活性抗体又はその抗原結合性フラグメントの所定の量を含有する。投与単位形態に関する規格は、抗体又はその抗原結合性フラグメントの固有の特性及び達成しようとする特定の治療効果、ならびに個体の治療のためのこうした抗体又はその抗原結合性フラグメントを調剤する技術が本来もつ制限によって決まり、またこれらに直接依存する。
【０２２２】
医薬組成物は、投与指示書と共に、容器、パック、又は例えばシリンジ、例えば事前充填シリンジである分注器の中に含めることが可能である。
【０２２３】
本開示の医薬組成物は、任意の薬理学的に許容可能な塩、エステル、もしくは当該エステルの塩、又はヒトを含めた動物に投与すると生物学的に活性な抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供（直接又は間接的に）することが可能である任意の他の化合物を包含する。
【０２２４】
本開示は、本明細書に記載するＷｎｔ代替分子の薬理学的に許容可能な塩を含む。「薬理学的に許容可能な塩」の語は、本開示の化合物の生理学的又は薬理学的に許容可能な塩を指し、すなわち、親化合物の所望の生物活性を保持して、それに対して望まない毒性効果は与えない塩である。様々な薬理学的に許容可能な塩が当技術で公知であり、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄ．），Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ，１９８５（及びそのより最近の版）に、“Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊａｍｅｓ  Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ（Ｅｄ．），Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＳＡ（Ｉｎｃ．），ＮＹ，ＵＳＡ，２００７に、及びＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：２（１９７７）に記載されている。また、好適な塩の検討のためには、Ｓｔａｈｌ及びＷｅｒｍｕｔｈによる“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ”（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）を参照されたい。
【０２２５】
薬理学的に許容可能な塩基添加塩は、アルカリ金属及びアルカリ土類金属もしくは有機アミン等の金属又はアミンにより形成される。陽イオンとして用いられる金属には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等が含まれる。アミンには、Ｎ−Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジクロロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、及びプロカインが含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”、Ｊ．Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１１９を参照）。当該酸性化合物の塩基添加塩は、遊離酸形態を、従来の方法で塩を生じるのに十分な量の所望の塩基と接触させることによって調製される。この遊離酸形態は、当該塩形態をある酸と接触させて、従来の方法で遊離酸を単離することによって元に戻すことができる。遊離酸形態は、例えば極性溶媒中での溶解度等である特定の物性がそれらのそれぞれの塩形態といくらか相違するが、当該塩は、本開示の目的でのそれらのそれぞれの遊離酸と等価である。
【０２２６】
一部の実施形態においては、本明細書で提供する医薬組成物は、例えば生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、リン酸塩及びアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝液、防腐剤及び他のタンパク質である薬理学的に許容可能な担体、希釈剤ならびに／又は賦形剤との混合物中に、治療有効量のＷｎｔ代替分子又はその薬理学的に許容可能な塩を含む。例示的なアミノ酸、ポリマー及び糖等には、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアレート化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖、果糖、ブドウ糖、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、乳糖、トレハロース、ウシ又はヒト血清アルブミン、クエン酸塩、酢酸塩、リンゲル液及びハンクス液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リシン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン及びグリコールがある。この製剤は、４℃で少なくとも６ヶ月間安定であることが好ましい。
【０２２７】
一部の実施形態においては、本明細書で提供する医薬組成物は、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、及び例えばＧｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９６６）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：４６７に記載のもの等の当業者に公知である他の緩衝液である、緩衝液を含む。゜★緩衝液のｐＨは、６．５から７．７５、好ましくは７から７．５、及び最も好ましくは７．２から７．４の範囲内にあり得る。
【０２２８】
使用方法
本開示はまた、例えばＷｎｔシグナル伝達経路を調節するため、例えばＷｎｔシグナル伝達を増加させるために、本明細書に開示するＷｎｔ代替分子を用いる方法と、種々の治療環境において本明細書に開示するＷｎｔ代替分子を投与する方法とを提供する。本明細書では、Ｗｎｔ代替分子を用いた治療の方法を提供する。一実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子を、例えばＷｎｔシグナル伝達の低下である、不適当又は無秩序なＷｎｔシグナル伝達を伴う疾患を患う対象に提供する。
【０２２９】
Ｗｎｔシグナル伝達経路の作動方法及び関連の治療方法
ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子を用いて、組織又は細胞においてＷｎｔシグナル伝達経路を作動させる。Ｗｎｔシグナル伝達経路を作動させることには、組織又は細胞において、例えばＷｎｔシグナル伝達を増加させること又はＷｎｔシグナル伝達を増強することが含まれ得る。すなわち、一部の態様においては、本開示は、細胞においてＷｎｔシグナル伝達経路を作動させる方法であって、当該組織又は細胞を、本明細書に開示する有効量のＷｎｔ代替分子又はその薬理学的に許容可能な塩と接触させることを含み、当該Ｗｎｔ代替分子が、Ｗｎｔシグナル伝達経路アゴニストである、当該方法を提供する。一部の実施形態においては、接触させることは、インビトロ、エキソビボ、又はインビボで生じる。特定の実施形態においては、細胞は、培養細胞であり、また接触させることはインビトロで生じる。ある実施形態においては、方法は、組織又は細胞を、１又は複数のＷｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドとさらに接触させることを含む。
【０２３０】
関連の態様においては、本開示は、組織又は細胞においてＷｎｔシグナル伝達を作動させる方法であって、当該組織又は細胞を、本明細書で開示するＷｎｔ代替分子を含む有効量のポリヌクレオチドと接触させることを含む、当該方法を提供する。ある実施形態においては、標的の組織又は細胞はまた、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと接触させる。ある実施形態においては、ポリヌクレオチドはＤＮＡ又はｍＲＮＡであって、例えば改変されたｍＲＮＡである。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列及び／又は３’テール（ｔａｉｌｉｎｇ）配列、例えばポリＡ尾部、をさらに含む改変ｍＲＮＡである。他の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、コード配列と作動的に連結したプロモーターを含む発現カセットである。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列とが、同一のポリヌクレオチド内に存在する。
【０２３１】
関連の態様においては、本開示は、組織又は細胞においてＷｎｔシグナル伝達を作動させる方法であって、当該組織又は細胞を、Ｗｎｔ代替分子をコードする核酸配列を含む有効量のベクターと接触させることを含む、当該方法を提供する。ある実施形態においては、組織又は細胞はまた、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターと接触させる。ある実施形態においては、ベクターは発現ベクターであり、また核酸配列と作動的に連結したプロモーターを含み得る。特定の実施形態においては、ベクターはウイルスベクターである。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列とが、例えば同一の発現カセット内である、同一のベクター内に存在する。
【０２３２】
関連の態様においては、本開示は、組織においてＷｎｔシグナル伝達を作動させる方法であって、当該組織を、本開示のＷｎｔ代替分子をコードする核酸配列を含む有効量の細胞と接触させることを含む、当該方法を提供する。ある実施形態においては、組織はまた、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含む細胞と接触させる。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列とが、同一の細胞内に存在する。特定の実施形態においては、細胞は、異種細胞であるか、又は処置しようとする対象から取得した自己細胞である。ある実施形態においては、細胞は、Ｗｎｔ代替分子又はＷｎｔポリペプチドもしくはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする発現カセットを含むベクターにより形質導入された。特定の実施形態においては、細胞は、幹細胞であり、例えば脂肪由来の幹細胞又は造血幹細胞である。
【０２３３】
本明細書に開示するＷｎｔ代替分子は、例えば、標的とする細胞、組織又は器官においてＷｎｔシグナル伝達を作動させることによって、例えば増加させることによって、疾患、障害又は症状を治療することに用い得る。すなわち、一部の態様においては、本開示は、それを必要とする対象において、例えばＷｎｔシグナル伝達の低減もしくは障害と関連する、及び／又はそれに対してＷｎｔシグナル伝達の増加が治療効果をもたらすことになるような疾患又は障害である、疾患又は症状を治療する方法であって、当該対象を、本開示の有効量の組成物と接触させることを含む、当該方法を提供する。特定の実施形態においては、組成物は、Ｗｎｔ代替分子；Ｗｎｔ代替分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、例えばＤＮＡもしくはｍＲＮＡ、随意に改変ｍＲＮＡ；Ｗｎｔ代替分子をコードする核酸配列を含むベクターであって、例えば発現ベクターもしくは発現ウイルスベクター；又は、Ｗｎｔ代替分子をコードする核酸配列を含む細胞であって、例えばＷｎｔ代替分子をコードする発現ベクターもしくは発現ウイルスベクターにより形質導入した細胞、のうちのいずれかを含む医薬組成物である。特定の実施形態においては、疾患又は症状は、病理学的な疾患もしくは障害であるか、又は、損傷であって、例えば負傷の結果による損傷である。ある実施形態においては、当該負傷は、別の治療的な処置の結果であり得る。ある実施形態においては、疾患又は症状は、組織の修復、治癒もしくは再生の不良を含むか、又は組織の修復、治癒もしくは再生を増すことが有益となることとなる。一部の実施形態においては、接触させることはインビボで生じるものであり、すなわち主題の組成物を対象に投与する。
【０２３４】
ある実施形態においては、方法は、対象を、１又は複数のＷｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドを含む医薬組成物とさらに接触させることを含む。本開示は、第１の活性薬剤としてのＷｎｔ代替分子を送達するための第１の分子と、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドを送達するための第２の分子とを対象に接触させることを検討する。第１の分子及び第２の分子は、同一の種類の分子であってもよく、又は異なる種類の分子であってもよい。例えば、ある実施形態においては、第１の分子及び第２の分子は、以下の種類の分子からそれぞれ独立に選択され得る：ポリペプチド、有機小分子、第１の活性薬剤又は第２の活性薬剤をコードする核酸（随意にＤＮＡ、又はｍＲＮＡ、随意に改変ＲＮＡ）、第１の活性薬剤又は第２の活性薬剤をコードする核酸配列を含むベクター（随意に、発現ベクター又は発現ウイルスベクター）、及び第１の活性薬剤又は第２の活性薬剤をコードする核酸配列を含む細胞（随意に発現カセット）。
【０２３５】
関連の態様においては、本開示は、例えばＷｎｔシグナル伝達の低下と関連する、又はそれに対してＷｎｔシグナル伝達の増加が治療効果をもたらすことになるような疾患又は障害である、疾患又は症状を治療する方法であって、それを必要とする対象を、本明細書に開示するＷｎｔ代替分子をコードする核酸配列を含む有効量のポリヌクレオチドを含む医薬組成物と接触させることを含む、当該方法を提供する。ある実施形態においては、当該対象はまた、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含む有効量のポリヌクレオチドを含む医薬組成物と接触させる。ある実施形態においては、ポリヌクレオチドはＤＮＡ又はｍＲＮＡであって、例えば改変されたｍＲＮＡである。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列及び／又は３’テール（ｔａｉｌｉｎｇ）配列、例えばポリＡ尾部、をさらに含む改変ｍＲＮＡである。他の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、コード配列と作動的に連結したプロモーターを含む発現カセットである。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列とが、同一のポリヌクレオチド内に存在する。
【０２３６】
関連の態様においては、本開示は、例えばＷｎｔシグナル伝達の低下と関連する、又はそれに対してＷｎｔシグナル伝達の増加が治療効果をもたらすことになるような疾患又は障害である、疾患又は症状を治療する方法であって、それを必要とする対象を、Ｗｎｔ代替分子をコードする核酸配列を含む有効量のベクターを含む医薬組成物と接触させることを含む、当該方法を提供する。ある実施形態においては、当該対象はまた、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含む有効量のベクターを含む医薬組成物と接触させる。ある実施形態においては、ベクターは発現ベクターであり、また核酸配列と作動的に連結したプロモーターを含み得る。特定の実施形態においては、ベクターはウイルスベクターである。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列とが、例えば同一の発現カセット内である、同一のベクター内に存在する。
【０２３７】
関連の態様においては、本開示は、例えばＷｎｔシグナル伝達の低下と関連する、又はそれに対してＷｎｔシグナル伝達の増加が治療効果をもたらすことになるような疾患又は障害である、疾患又は症状を治療する方法であって、それを必要とする対象を、Ｗｎｔ代替分子をコードする核酸配列を含む有効量の細胞を含む医薬組成物と接触させることを含む、当該方法を提供する。ある実施形態においては、対象はまた、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含む細胞と接触させる。ある実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド又はＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列とが、同一の細胞内に存在する。特定の実施形態においては、細胞は、異種細胞であるか、又は処置しようとする対象から取得した自己細胞である。ある実施形態においては、細胞は、Ｗｎｔ代替分子又はＷｎｔポリペプチドもしくはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする発現カセットを含むベクターにより形質導入された。特定の実施形態においては、細胞は、幹細胞であり、例えば脂肪由来の幹細胞又は造血幹細胞である。
【０２３８】
Ｗｎｔシグナル伝達は、幹細胞の発達プロセスと維持において重要な役割を担う。損傷又は疾患の後の大部分の組織の再生と修復に、Ｗｎｔシグナルの再活性化が関連する。Ｗｎｔ代替分子の分子は、損傷又は疾患に応じる治癒及び組織修復の利益をもたらすことが期待される。組織の損傷及び喪失の原因には、加齢、変性、遺伝性疾患、感染及び炎症、  外傷、毒素／代謝による毒性、又は他の病状が挙げられるが、これに限定されない。Ｗｎｔシグナル及びＷｎｔシグナルのエンハンサーが、成人の組織常在性の幹細胞を活性化することが示されている。一部の実施形態においては、本開示の化合物は、疾患の又は損傷した組織の治療での使用、組織の再生での使用、及び細胞成長及び増殖での使用、ならびに／又はティッシュエンジニアリングでの使用のために、投与される。
【０２３９】
Ｗｎｔ経路の変異と関連するヒトの疾患が、疾患の治療及び予防におけるＷｎｔシグナルの増強に関して大きなエビデンスを提供する。インビボ及びインビトロでの前臨床試験により、多数の病状におけるＷｎｔシグナルの関与のさらなるエビデンスが提供され、また種々のヒト疾患におけるＷｎｔ代替分子の利用がさらに裏付けられる。例えば、本開示の組成物を用いて、骨の成長又は再生、骨移植、骨折、疲労骨折、脊椎圧迫骨折の治癒、骨粗しょう症及び骨粗しょう症性骨折の治療、脊椎融合症、整形外科的デバイスの骨結合（ｏｓｓｅｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、腱−骨の統合、歯の成長及び再生、歯科インプラント、歯周病、顎顔面の再建、ならびに顎の骨壊死、を促進又は増加させることができる。それらはまた、脱毛症の治療で；例えば聴覚障害の治療、前庭機能不全の治療、黄斑変性の治療、硝子体網膜症、網膜変性の他の疾患、フックスジストロフィー、他の角膜疾患の治療等、感覚器官の再生の増強で；脳卒中、外傷性脳障害、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、筋肉減少症又は悪液質が原因の筋萎縮症、及び血液脳関門に影響を及ぼす他の症状の治療で；脊髄損傷、他の脊髄疾患の治療で、用いてもよい。本開示の組成物は、口腔粘膜炎の治療、短腸症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、他の胃腸障害の治療で；メタボリックシンドロームの治療で；糖尿病、脂質代謝異常の治療、膵炎、膵外分泌部又は膵内分泌部の組織の損傷の症状の治療で；表皮再生の増強が望まれる症状で、例えば上皮の創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍、歯、爪又は皮膚の形成不全等に関与する症候群、血管新生が有効である症状の治療；心筋梗塞、冠動脈疾患、心不全の治療；造血細胞の増殖の増強、例えば骨髄、誘導末梢血（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ）からの造血幹細胞移植の増強、免疫不全症、移植片対宿主病等の治療；急性腎損傷、慢性腎臓病の治療；肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の治療、肺組織の再生の増強で、用いてもよい。本開示の組成物はまた、肝細胞の再生の増強、例えば肝再生、肝硬変の治療、肝移植の増強、急性肝不全の治療、Ｃ型肝炎もしくはＢ型肝炎ウイルス感染による又は抗ウイルス薬療法後の慢性肝疾患、アルコール性肝疾患、アルコール性肝炎、脂肪肝又は脂肪性肝炎による非アルコール性肝疾患（ＮＡＳＨ）等の治療で、用いてもよい。本開示の組成物は、新生細胞の増殖が望まれる症状を含むがこれに限定されない疾患及び障害を治療することができる。
【０２４０】
Ｗｎｔシグナル伝達成分における機能喪失型変異又は機能獲得型変異に関与するヒトの遺伝学により、骨成長のためにＷｎｔシグナルが増強されることを裏付ける大きなエビデンスが示される。骨成長の増強が望まれる症状には、骨折、移植、人工装具周辺の内方成長、骨粗しょう症、骨粗しょう症性骨折、脊椎融合症、顎の骨壊死、歯科インプラント、歯周病、顎顔面の再建等を挙げることができるがこれに限定されない。Ｗｎｔ代替分子は、骨再生を促進するのに重要であるＷｎｔシグナルを増強及び促進する。骨組織の再生方法は、本開示の化合物の投与により利益を受けるものであり、当該投与は、全身的又は局所的とすることが可能である。一部の実施形態においては、骨髄細胞を、本開示の分子に曝露することで、骨髄内の幹細胞が活性化することとなる。
【０２４１】
一部の実施形態においては、骨再生は、例えば骨髄、骨前駆細胞、骨幹細胞等の反応性細胞集団を、本明細書に開示する有効量のＷｎｔ代替分子と接触させることによって増強される。骨組織の再生方法は、全身的又は局所的とすることが可能である、Ｗｎｔ代替分子の投与により利益を受けるものである。一部のこうした実施形態においては、接触させることは、インビボで実施する。他のこうした実施形態においては、接触させることは、エキソビボで実施する。分子は、例えば、随意に生分解性であり、また随意に活性薬剤の徐放をもたらすような基剤に充填することによって、作用部位に局在化させてもよい。基剤担体としては、吸収性コラーゲンスポンジ、セラミックス、ハイドロゲル、重合体ミクロスフェア、ナノ粒子、骨セメント等が挙げられるが、これに限定されない。
【０２４２】
特定の実施形態においては、本明細書に開示する１又は複数のＷｎｔ代替分子（又は、Ｗｎｔ代替分子をコードするポリヌクレオチド、又はＷｎｔ代替分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターもしくは細胞）を含む組成物を用いて、以下のいずれかを含むがこれに限定されない骨の疾患もしくは障害を治療もしくは予防するか、又は、以下のいずれかに関連するがこれに限定されない損傷を治療もしくは予防する：骨粗しょう症、骨粗しょう症性骨折、骨折、骨折癒合不良、遷延治癒骨折、脊椎融合症、骨壊死、顎、股関節、大腿骨頭等の骨壊死、移植片（例えば、人工膝関節の一部もしくは全置換又は人工股関節の一部もしくは全置換の後の回復を促進するための）の骨結合、骨形成不全症、骨移植、腱修復、顎顔面外科手術、歯科インプラント、遺伝性疾患、変性、加齢、薬剤又は負傷がもたらした全ての他の骨の障害又は欠陥。一実施形態においては、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２及びＦｚｄ７ならびにまたＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に結合するＷｎｔ代替分子を用いて、任意の骨の疾患もしくは障害を治療又は予防する。一実施形態においては、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８ならびにまたＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６に結合するＷｎｔ代替分子を用いて、任意の骨の疾患又は障害を治療又は予防する。
【０２４３】
特定の実施形態においては、本明細書に開示する組成物及び方法を用いて、対象において、骨密度を増加させること、骨量（例えば、脛骨骨量及び／又は大腿骨骨量）を増加させること、皮質厚（例えば、骨梁部の又は大腿骨中央骨幹の）を増加させること、骨石灰化速度を増加させること、オステブラスト（ｏｓｔｅｂｌａｓｔ）の数を増加させること及び／もしくは破骨細胞の数を減少させること（例えば、骨における）、骨の硬度を増加させること、破断点に対する極限荷重を増加させること、骨折に対する骨の耐性を向上させること、骨粗しょう症と関連する骨量減少を低減すること、又は、骨の生化学的な強度を増加させることができる。一実施形態においては、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２及びＦｚｄ７に結合するＷｎｔ代替分子は、示したこれらの用途のいずれかで用いられる。一実施形態においては、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７及びＦｚｄ８に結合するＷｎｔ代替分子は、示したこれらの用途のいずれかで用いられる。
【０２４４】
本明細書に開示する１又は複数のＷｎｔ代替分子（又はＷｎｔ代替分子をコードするポリヌクレオチドもしくはＷｎｔ代替分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターもしくは細胞）を含む組成物を、骨格組織欠乏症のインビボでの治療に用いることが可能である。「骨格組織欠乏症」は、例えば外科手術的介入の結果、腫瘍の除去、潰瘍、植込み、骨折、又は他の外傷的もしくは変性による症状のいずれであるかのような、どのように欠乏症が発生したかにかかわらず、骨又は結合組織を修復することが望まれる任意の部位での骨又は他の骨格の結合組織における欠乏症を意味する。本開示の組成物は、変性性の磨耗及び関節炎、組織に対する外傷、半月板断裂の置換、半月板切除、靱帯損傷による関節脱臼、関節のアラインメント不良、骨折等の、又は遺伝性疾患による、軟骨組織における欠陥又は損傷の修復のため、結合細胞に軟骨機能を修復するためのレジメンの一部として用いることが可能である。
【０２４５】
Ｗｎｔ代替分子はまた、歯周病の治療に用いてもよい。歯周病は、歯の喪失の主要原因であり、また複数の全身症状に関連する。一部の実施形態においては、歯の再生又は根底にある骨の再生は、反応性細胞集団を接触させることによって増強される。一部のこうした実施形態においては、接触させることは、インビボで実施する。他のこうした実施形態においては、接触させることは、エキソビボで実施し、その後、活性化された幹細胞又は前駆細胞の植込みを伴う。分子は、例えば、随意に生分解性であり、また随意に活性薬剤の徐放をもたらすような基剤に充填することによって、作用部位に局在化させてもよい。基剤担体としては、吸収性コラーゲンスポンジ、セラミックス、ハイドロゲル、骨セメント、重合体ミクロスフェア、ナノ粒子等が挙げられるが、これに限定されない。
【０２４６】
Ｗｎｔシグナル伝達及びＲ−ｓｐｏｎｄｉｎの生物学は、損傷、加齢又は変性の後に内耳の感覚有毛細胞の再生を促進することができるということが研究により示されてきた。聴覚障害又は前庭機能不全に関与する内耳の感覚有毛細胞の喪失もまた、本開示の組成物により利益を受け得る。内耳においては、聴覚器官が、音の振動を電気インパルスに変換するために必要な機械受容性の有毛細胞を収容する。半規管（ＳＳＣ）、卵形嚢及び球形嚢からなる前庭の器官もまた、頭部の位置及び動作を感知するための感覚有毛細胞を含有する。本開示の組成物は、聴覚の再生を増強するために、耳への、例えば注入、基剤もしくは他の徐放性製剤の系、又は他の局所的な適用、で用いることが可能である。
【０２４７】
Ｗｎｔ代替分子はまた、網膜組織の再生で用いてもよい。成人哺乳動物の網膜においては、例えばインビボでの神経毒性の損傷の後で、ミューラーグリア細胞は視細胞を含めて網膜細胞を再生することが可能である。Ｗｎｔシグナル伝達及びＷｎｔシグナルのエンハンサーにより、損傷後又は変性中のミューラーグリア細胞由来の網膜前駆細胞の増殖を促進することが可能である。本開示の組成物はまた、目の組織及び他の細胞型の再生で用てもよい。例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、他の網膜変性疾患、角膜の疾患、フックスジストロフィー、硝子体網膜症、遺伝性疾患等は、本開示の組成物より利益を受けることが可能である。ＡＭＤは、中心視覚及び視力の進行性低下を特徴とする。フックスジストロフィーは、角膜の内皮細胞の進行性喪失を特徴とする。Ｗｎｔシグナルと、Ｗｎｔシグナルの増強とにより、目の組織において、角膜の内皮細胞、網膜の上皮細胞等の再生を促進することが可能である。他の実施形態においては、本開示の組成物を、網膜の再生及び黄斑変性の治療のために、目への、例えば注入、基剤もしくは他の徐放性製剤の系、又は他の局所的な適用、で用いることが可能である。
【０２４８】
肝細胞の恒常的再生のための増殖細胞の特定の集団は、系列追跡研究を通して特定されており、例えば、中心静脈周囲（ｐｅｒｉ−ｃｅｎｔｒａｌ）領域におけるＡｘｉｎ２陽性細胞である。系列追跡研究によれば、さらなる潜在的な肝前駆細胞も特定されており、Ｌｇｒ−陽性細胞が含まれるがこれに限定されない。Ｌｇｒ５−陽性細胞及びＡｘｉｎ２−陽性細胞を含む、自己再生性の肝細胞及び潜在的な他の前駆細胞の集団は、損傷後にＷｎｔシグナル及び／又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎに応答して再生することが可能であることが特定されている。急性の肝損傷及び肝不全ならびに慢性の肝疾患の多数の前臨床モデルが、Ｗｎｔシグナルの増強により利益を受ける肝細胞の回復と再生とを見せた。
【０２４９】
ある実施形態においては、本明細書に開示するＷｎｔ代替分子（又はＷｎｔ代替分子をコードするポリヌクレオチド、もしくはＷｎｔ代替分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターもしくは細胞）を含む組成物を用いて、肝臓の再生が促進し、線維症が減少し、及び／又は肝機能が向上する。ある実施形態においては、本明細書に開示する組成物及び方法を用いて、肝重量が増加する、肝臓の体重に対する比が増加する、肝臓中のＰＣＮＡ及びｐＨ３の陽性核の数が増加する、肝臓におけるＫｉ６７及び／もしくはＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１の発現が増加する、肝細胞の増殖及び／もしくは有糸分裂が増加する、慢性の肝損傷後の線維症が減少する、又は、肝細胞機能が増加する。
【０２５０】
特定の実施形態においては、本開示の組成物は、急性肝不全、急性アルコール性肝障害の治療、Ｃ型肝炎もしくはＢ型肝炎ウイルス感染による又は抗ウイルス薬療法後の慢性肝疾患、慢性アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療、あらゆる原因の肝硬変及び重症慢性肝疾患の治療で用いて、また肝細胞の再生を増強することができる。肝組織の再生方法は、本開示の化合物の投与により利益を受けるものであり、当該投与は、全身的又は局所的とすることが可能である。これらには、例えば幹細胞への注入による、肝臓に至る静脈又は血管への注入による、徐放性製剤の植込みによる等、全身的投与方法及び局所的投与方法が含まれるが、これに限定されない。
【０２５１】
特定の実施形態においては、本明細書に開示のＷｎｔ代替分子（又はＷｎｔ代替分子をコードするポリヌクレオチドもしくはＷｎｔ代替分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターもしくは細胞）を含む組成物を用いて、肝臓の疾患又は障害を治療又は予防するものであり、これには、以下のいずれかがもたらした肝臓の損傷又は障害を治療する又は予防することが含まれるがこれに限定されない：急性肝不全（あらゆる原因）、慢性肝不全（あらゆる原因）、肝硬変、肝線維症（あらゆる原因）、門脈圧亢進症、非アルコール性のｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｓｉｓ（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）（脂肪肝）、アルコール性肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス誘発性肝疾患（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス誘発性肝疾患（ＨＢＶ）、他のウイルス性肝炎（例えば、Ａ型肝炎ウイルス誘発性肝疾患（ＨＡＶ）及びＤ型肝炎ウイルス誘発性肝疾患（ＨＤＶ））、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、肝臓の外科手術、肝損傷、肝移植、肝臓の外科手術及び移植における「過小グラフト（ｓｍａｌｌ  ｆｏｒ  ｓｉｚｅ）」症候群、先天性の肝疾患及び肝障害、その他の、遺伝性疾患、変性、加齢、薬物又は損傷によりもたらされる肝障害又は肝障害。
【０２５２】
Ｗｎｔシグナルは、種々の上皮組織の再生において重要な役割を果たす。種々の上皮の症状は、本開示の化合物による治療により利益を得る。胃腸管内を被覆する急速に分化した上皮細胞の崩壊があったときに粘膜炎が発生するが、これは粘膜組織を潰瘍及び感染を受けやすいままにさせる。口腔粘膜と呼ばれる口腔内を覆う上皮被覆層の一部は、身体のうちで最も感度が高い部分のひとつであり、特に化学療法及び放射線に対して脆弱である。口腔粘膜炎は、特に化学療法及び放射線であるガン治療の、おそらく最もよくある消耗性の合併症である。さらに、本開示の組成物はまた、短腸症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）又は他の胃腸障害の治療に有益であり得る。他の上皮の症状には、表皮の創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍、歯、爪又は皮膚の形成不全を伴う症候群等が含まれる。本開示の分子は、これら全ての症状で用いられてよいものであり、再生性の細胞を、本開示の化合物と接触させる。上皮組織の再生方法は、本開示の化合物の施与により利益を受けるものであり、当該施与は、全身的又は局所的とすることが可能である。接触させることは、ゲル、ローション、クリーム等で、例えば、皮内、皮下的に、標的部位に適用する等を含めて局所的とすることが可能である。
【０２５３】
ＷｎｔシグナルならびにＷｎｔシグナルの増強及び促進はまた、皮膚及び胃腸管に加えて、前臨床モデルの膵臓、腎臓及び肺を含めた、組織の修復ならびに再生で重要な役割を果たす。Ｗｎｔ代替分子は、膵外分泌部及び膵内分泌部、腎臓又は肺に関与する種々の病状に有益であり得る。Ｗｎｔ代替分子は、メタボリックシンドロームの治療；糖尿病の治療、急性又は慢性の膵炎、膵外分泌不全の治療、急性腎損傷、慢性腎臓病の治療、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）や肺上皮組織喪失が原因の他の症状を含めるがこれに限定されない肺疾患の治療で用いることができる。これら組織の再生方法は、本開示の化合物の投与により利益を受けるものであり、当該投与は、全身的又は局所的とすることが可能である。
【０２５４】
上皮のＷｎｔシグナル伝達は、他の発生因子を介したシグナル伝達と協働して、成人の毛包再生に重要である。脱毛はよくある問題であり、しばしば男性型禿頭症と呼ばれる男性型脱毛症は、男性における脱毛の最もよくある形態である。一部の実施形態においては、毛包再生は、反応性細胞集団を本開示の分子と接触させることによって増強される。一部のこうした実施形態においては、接触させることは、インビボで実施する。他のこうした実施形態においては、接触させることは、エキソビボで実施する。分子は、例えば外用のローション、ゲル、クリーム等、作用部位に局在化させてもよい。
【０２５５】
脳卒中、外傷性脳障害、アルツハイマー病、多発性硬化症、及び、血液脳関門（ＢＢＢ）に影響を及ぼす他の症状を、Ｗｎｔ代替分子で治療することができる。血管新生は、全身にわたって多数の組織への酸素及び栄養素の供給を確実にするために重要であり、また神経組織は低酸素症及び虚血に対して極めて敏感であるため、ＣＮＳにとって特に重要である。ＢＢＢを形成するＣＮＳ内皮細胞は、接着結合により共に結合している非常に分極した細胞であって、特異的なトランスポーターを発現するという点で、非神経組織における内皮細胞と異なる。Ｗｎｔシグナル伝達は、ＣＮＳの血管形成及び／又は機能を調節する。ＢＢＢが危険に晒される症状は、本開示の化合物の投与により利益を受けることが可能であり、当該投与は、例えば直接の注入、くも膜下腔内注射、徐放性製剤の植込み等による、全身的又は局所的とすることが可能である。さらに、Ｗｎｔシグナルは、神経形成に積極的に関与し、損傷後の神経保護という重要な役割を果たす。本開示の組成物はまた、脊髄損傷、他の脊髄疾患、脳卒中、外傷性脳障害等の治療で用いてもよい。
【０２５６】
Ｗｎｔシグナルはまた、血管新生に役立つ。Ｗｎｔ代替分子は、血管新生が心筋梗塞、冠動脈疾患、心不全等の有益な治療となるような症状、及び遺伝性疾患の症状、に有益であり得る。これら組織の再生方法は、本開示の化合物の投与により利益を受けるものであり、当該投与は、全身的又は局所的とすることが可能である。
【０２５７】
ある実施形態においては、本開示の方法が、例えば、損傷又は組織もしくは細胞の減少もしくは喪失を被った組織において、組織の再生を促進する。喪失又は損傷は、疾患又は傷害を含めて、細胞数を減少させるあらゆるものである得る。例えば、事故、自己免疫障害、治療の副作用、又は心的外傷を構成する可能性がある病状である。組織の再生により、組織内の細胞数を増加させて、また好ましくは再び樹立しようする組織の細胞間の結合を可能にし、またより好ましくは、組織の機能性を取り戻させることを可能にする。
【０２５８】
本明細書で用いる場合、「投与すること」又は「導入すること」又は「提供すること」の語は、組成物を、対象の、ある細胞へ、細胞へ、組織へ及び／又は器官へ、又は対象へ送達することを指す。こうした投与すること又は導入することは、インビボで、インビトロで、又はエキソビボで実施され得る。
【０２５９】
特定の実施形態においては、医薬組成物は、例えば静脈内に非経口的に、口腔内に、直腸に、又は注入によって、投与される。一部の実施形態においては、例えば局所に又は筋肉内に、局所的に投与される。一部の実施形態においては、組成物は、例えば骨、関節、耳の組織、目の組織、胃腸管、皮膚、創傷部位、又は脊髄である、標的組織に投与される。本開示の方法は、インビボで又はエキソビボで実施され得る。一部の実施形態においては、標的の細胞又は組織をＷｎｔ代替分子と接触させることは、エキソビボで実施されて、その後に、例えば活性化された幹細胞又は前駆細胞である当該細胞又は細胞の、対象への植込みが続く。当業者は、治療する疾患又は障害に基づいて、適切な投与部位及び投与経路を決定することが可能である。
【０２６０】
用法及び投与計画は、例えば疾患又は障害の性質、対象の特性、及び対象の病歴等である、医師によって容易に決定される種々の因子に依存し得る。特定の実施形態においては、対象に投与又は提供されるＷｎｔ代替分子の量は、対象の体重に対して約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇ、又は約０．１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの範囲にある。
【０２６１】
「治療」、「治療すること」等の語は、概して、所望の薬理学的効果及び／又は生理的効果を獲得することを意味するために本明細書で用いる。当該効果は、疾患もしくはその症状が対象において発症する可能性を軽減することである、当該疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防する点において予防的であり得、ならびに／又は、疾患及び／もしくは疾患に帰する悪影響の部分的もしくは完全な治癒の点で治療的であり得る。本明細書で用いる場合、「治療」は、哺乳動物における疾患のあらゆる治療をカバーし、また（ａ）疾患にかかり易い可能性があるがまだ罹患していると診断されていない対象において疾患が生じるのを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその成長を抑制すること、又は（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち疾患の退行を引き起こすこと、を含む。治療薬（例えば、Ｗｎｔ代替分子）は、疾患又は損傷の発症前、発症中又は発症後に投与され得る。患者の望ましくない臨床症状が治療により安定化する又は軽減するような、進行中の疾患の治療が、特に関心のものである。こうした治療は、影響を受ける組織における機能の喪失が完了する前に実施することが望ましい。主題の療法は、疾患の徴候段階の間に、また一部の場合では疾患の徴候段階の後で、投与することが望ましいこととなる。一部の実施形態においては、主題の方法は治療効果を結果的にもたらすものであり、例えば障害の発達を予防する、障害の進行を止める、障害の進行を退行させること等である。一部の実施形態においては、主題の方法は、治療効果が達成されたことを検出するステップを含む。当業者によれば、治療効果のこうした測定が、改変しようとする特定の疾患に適用可能であるだろうということを理解することとなり、また治療効果を測定するために用いる適切な検出方法を認識することとなる。
【０２６２】
他の実施形態は、例えば細胞又は組織を、随意にＮｏｒｒｉｎ又はＲｓｐｏｎｄｉｎポリペプチドと組み合わせて１又は複数のＷｎｔ代替物と接触させることによって、細胞、組織及び細胞小器官の成長又は増殖を促進又は増強する本明細書に開示するＷｎｔ代替分子の使用に部分的に関する。ある実施形態においては、細胞又は組織は、エキソビボ、インビトロ、又はインビボで接触させる。当該方法を用いて、治療用途で細胞、組織又は細胞小器官を生成して、例えば対象に移植するようにしてもよい。また当該方法を使用して、調査用途で細胞、組織又は細胞小器官を生成してもよい。Ｗｎｔ代替分子は、例えばインビトロでの調査方法である、非治療の方法において広範な用途がある。
【０２６３】
本開示は、例えば上記で述べた細胞である損傷した組織の組織再生方法であって、Ｗｎｔ代替分子を細胞に投与することを含む当該方法を提供する。Ｗｎｔ代替分子は、インビボで細胞に直接投与され得るか、対象に経口、静脈内もしくは当技術で公知の他の方法によって投与され得るか、又はエキソビボで細胞に投与され得る。一部の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子がエキソビボで細胞に投与される場合、これら細胞は、Ｗｎｔ代替分子の投与前に、投与後に又は投与中に、対象に移植されてもい。
【０２６４】
Ｗｎｔシグナル伝達は、幹細胞培養の重要な構成要素である。例えば、国際公開第２０１０／０９０５１３号、国際公開２０１２／０１４０７６号、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１（ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ  ２０１  １；１４１：１７６２−１７７２）及びＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９（Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，２６２−５）に記載されるような幹細胞培地である。本明細書に開示のＷｎｔ代替分子は、これら幹細胞培地で使用するＲｓｐｏｎｄｉｎに対する好適な代替物であり、又はＲｓｐｏｎｄｉｎと組み合わせてもよい。
【０２６５】
したがって、一実施形態においては、本開示は、幹細胞を本明細書で開示する１又は複数のＷｎｔ代替分子と接触させることを含む幹細胞の増殖を増強する方法を提供する。一実施形態においては、本開示は、本明細書で開示する１又は複数のＷｎｔ代替分子を含む細胞培地を提供する。一部の実施形態においては、細胞培地は、通常Ｗｎｔ又はＲｓｐｏｎｄｉｎを含むが、当該Ｗｎｔ又はＲｓｐｏｎｄｉｎが本明細書に開示するＷｎｔ代替分子で置換（完全に又は部分的に）される又は当該Ｗｎｔ代替分子が補われた、当技術で既に公知の任意の細胞培地であり得る。例えば、培養培地は、その全体として参照によってここに援用される、国際公開第２０１０／０９０５１３号、国際公開第２０１２／０１４０７６、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１（ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ  ２０１  １；１４１：１７６２−１７７２）及びＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９（Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，２６２−５）に記載されているものであり得る。
【０２６６】
幹細胞培地は、さらなる成長因子を含むことが多い。すなわち、この方法は、幹細胞に成長因子を供給することを追加的に含み得る。細胞培地で通常用いられる成長因子には、上皮増殖因子（ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ−アルファ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、Ｒ＆Ｄシステムズ社）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）及び角化細胞増殖因子（ＫＧＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、ＦＧＦ７としても知られる）が含まれる。ＥＧＦは、種々の培養される外胚葉細胞及び中胚葉細胞にとって強力なマイトジェニック因子であり、またインビボ及びインビトロでの特定の細胞の、ならびに細胞培養液中で一部の線維芽細胞の分化に極めて大きな影響を有する。ＥＧＦ前駆体は、タンパク分解性の切断がなされて細胞を刺激する５３−アミノ酸ペプチドホルモンを生成する膜結合型分子として存在する。したがってＥＧＦ又は他のマイトジェニック増殖因子が、幹細胞に供給されてもよい。幹細胞の培養中、マイトジェニック増殖因子は、１日置きに培地に添加され得、一方で培地は、好ましくは３日置きに新しくする。概してマイトジェニック増殖因子は、ｉ）ＥＧＦ、ＴＧＦ−アルファ及びＫＧＦ、ｉｉ）ＥＧＦ、ＴＧＦ−アルファ及びＦＧＦ７、ｉｉｉ）ＥＧＦ、ＴＧＦ−アルファ及びＦＧＦ、ｉｖ）ＥＧＦ及びＫＧＦ、ｖ）ＥＧＦ及びＦＧＦ７、ｖｉ）ＥＧＦ及びＦＧＦ、ｖｉｉ）ＴＧＦ−アルファ及びＫＧＦ、ｖｉｉｉ）ＴＧＦ−アルファ及びＦＧＦ７から、又はｉｘ）ＴＧＦ−アルファ及びＦＧＦからなる群から選択される。ある実施形態においては、本開示は、例えば随意に本明細書に記載の成長因子のうちの１もしくは複数又はその組み合わせと組み合わせて、本明細書に開示するＷｎｔ代替分子を含む幹細胞培地を含む。
【０２６７】
幹細胞の増殖を増強するこれら方法を用いて、例えば国際公開第２０１０／０９０５１３号、国際公開第２０１２／０１４０７６号、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１  １（ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ  ２０１１；１４１：１７６２−１７７２）及びＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９（Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，２６２−５）に記載されるように、幹細胞からの新しい細胞小器官及び組織を成長させることが可能である。
【０２６８】
一部の実施形態においては、Ｗｎｔ代替分子を用いて、幹細胞の再生を増強する。説明的な関心の幹細胞には、筋肉の衛星細胞、造血幹細胞及びそれらに由来する前駆細胞（米国特許第５，０６１，６２０号）、神経幹細胞（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｃｅｌｌ  ９６：７３７−７４９を参照）、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、中胚葉幹細胞、肝幹細胞、脂肪組織由来の幹細胞等、が含まれるがこれに限定されない。
【０２６９】
本開示の他の実施形態は、１又は複数のＦｚｄ受容体又はＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６受容体を発現する細胞又は組織の存在を検出する診断用途に部分的に関する。すなわち、本開示は、例えばＦｚｄ１を発現する細胞又は組織の検出等である、試料中の、１又は複数のＦｚｄ受容体又はＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６受容体を検出する方法を提供する。こうした方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、全組織ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＷＩＳＨ）、蛍光ＤＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、フローサイトメトリー、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）及び酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を含むがこれに限定されない種々の公知の検出フォーマットに適用可能であり、例えばＷｎｔ代替分子の結合を検出することによる。
【０２７０】
ＩＳＨは、標識された相補ＤＮＡ鎖又は相補ＲＮＡ鎖（すなわち、一次結合剤（ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ））を用いて、細胞又は組織の一部又は切片で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）、又は組織が十分に小さければ組織全体で（全組織ＩＳＨ）、特異的なＤＮＡ又はＲＮＡ配列を局在化するハイブリダイゼーションの型である。当業者であれば、これが、一次結合剤として抗体を用いて組織切片中でタンパク質を局在化する免疫組織化学的測定法とは区別されることが理解されるであろう。ゲノムＤＮＡに対してＤＮＡ  ＩＳＨを用いて、染色体の構造を決定することができる。蛍光ＤＮＡ  ＩＳＨ（ＦＩＳＨ）を、例えば医学的診断で用いて、染色体の完全性を評価することができる。ＲＮＡ  ＩＳＨ（ハイブリダイゼーション組織化学）を用いて、組織切片内又は全組織内でｍＲＮＡ及び他の転写物が測定ならびに局在化される。
【０２７１】
種々の実施形態においては、本明細書に記載のＷｎｔ代替分子を、直接又は間接的に検出され得る検出可能な標識に結合する。この点において、抗体「複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、検出可能な標識に共有結合的に連結するＷｎｔ代替分子を指す。本開示においては、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、モノクローナル抗体、その抗原結合性フラグメント、及び例えば単鎖可変フラグメント抗体等であるその抗体誘導体、又は、エピトープ標識した抗体は全て、検出可能な標識に共有結合的に連結し得る。「直接検出」では、１つのみの検出可能な抗体、すなわち一次検出可能抗体、を用いる。すなわち、直接検出は、検出可能な標識に結合する抗体を、第二の抗体（二次抗体）の添加の必要なしに、それ自体は検出できるということを意味する。
【０２７２】
「検出可能な標識」は、試料中の標識の存在及び／又は濃度を示す検出可能（例えば、視覚的に、電子的に、又はその他等）な信号を生じることができる分子又は物質である。検出可能な標識は、抗体に結合した場合、特異性抗体が向かう標的を局在化及び／又は定量するのに用いることが可能である。それによって、試料中の標的の存在及び／又は濃度を、検出可能な標識により生じた信号を検出することによって検出可能である。検出可能な標識は、直接又は間接的に検出することが可能であり、また異なる特異性抗体に結合したいくつかの異なる検出可能な標識を組み合わせて用いて、１又は複数の標的を検出することが可能である。
【０２７３】
直接検出できる検出可能な標識の例としては、蛍光色素及び放射性物質及び金属粒子が挙げられる。一方、間接的な検出では、一次抗体の添加後に、１又は複数のさらなる抗体、すなわち二次抗体、の添加が必要である。すなわち、検出は、二次抗体又は二次結合剤の一次検出可能抗体への結合の検出によって行われる。二次結合剤又は二次抗体の添加を必要とする、検出可能な一次結合剤又は一次抗体の例としては、酵素的に検出可能な結合剤及びハプテン検出可能な結合剤又は抗体が挙げられる。
【０２７４】
一部の実施形態においては、検出可能な標識は、第１の結合剤を含む核酸高分子に結合する（例えば、ＩＳＨ、ＷＩＳＨ、又はＦＩＳＨプロセスにおいて）。他の実施形態においては、検出可能な標識は、第１の結合剤を含む抗体に結合する（例えば、ＩＨＣプロセスにおいて）。
【０２７５】
本開示の方法で用いるＷｎｔ代替分子に結合できる検出可能な標識の例としては、蛍光標識、酵素標識、放射性同位体、化学発光標識、電気化学発光標識、生物発光標識、高分子、高分子粒子、金属粒子、ハプテン及び色素が挙げられる。
【０２７６】
蛍光標識の例としては、５−（及び６）−カルボキシフルオレセイン、５−又は６−カルボキシフルオレセイン、６−（フルオレセイン）−５−（及び６）−カルボキサミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、及びＣｙ２、Ｃｙ３及びＣｙ５等の色素、ＡＭＣＡ、ＰｅｒＣＰを含む置換されていてもよいクマリン、Ｒ−フィコエリスリン（ＲＰＥ）及びアロフィコエリスリン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）（ＡＰＣ）を含むフィコビリタンパク質、テキサスレッド、プリンストンレッド、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びその類似体、ならびに、Ｒ−フィコエリスリン又はアロフィコエリスリンの複合体、被覆ＣｄＳｅのナノ微結晶のような半導体材料をもとにした粒子等の無機蛍光標識が挙げられる。
【０２７７】
高分子粒子標識の例としては、蛍光色素を埋め込むことが可能である、ポリスチレン、ＰＭＭＡもしくはシリカの微小粒子もしくはラテックス粒子、又は色素、酵素もしくは基質を含有する、高分子ミセルもしくはカプセルが挙げられる。
【０２７８】
金属粒子標識の例としては、金粒子及び被覆金粒子が挙げられ、これは銀染色に変えることが可能である。ハプテンの例としては、ＤＮＰ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ビオチン及びジゴキシゲニンが挙げられる。酵素標識の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ又はＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、β−Ｎ−アセチルグルコサミミダーゼ（ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｍｉｄａｓｅ）、β−グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ及びグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）が挙げられる。西洋ワサビペルオキシダーゼについてよく用いられる基質の例としては、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ニッケル増強したジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、ベンジジンジヒドロクロライド（ＢＤＨＣ）、ハンカーイエー試薬（Ｈａｎｋｅｒ−Ｙａｔｅｓ  ｒｅａｇｅｎｔ）（ＨＹＲ）、インドファンブルー（Ｉｎｄｏｐｈａｎｅ  ｂｌｕｅ）（ＩＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、４−クロロ−１−ナフトール（ＣＮ）、．アルファ．−ナフトールピロニン（．ａｌｐｈａ．−ＮＰ）、ｏ−ジアニシジン（ＯＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、２−（ｐ−インドフェニル）−３−ｐ−ニトロフェニル−５−フェニルテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、テトラニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド／フェロ−フェリシアニド（ＢＣＩＧ／ＦＦ）が挙げられる。
【０２７９】
アルカリホスファターゼについてよく用いられる基質の例としては、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−リン酸塩／ファストレッドＴＲ（ＮＡＢＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−リン酸塩／ファストレッドＴＲ（ＮＡＭＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−リン酸塩／−ファストレッドＴＲ（ＮＡＢＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−リン酸塩／ファストレッドＴＲ（ＮＡＭＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−リン酸塩／ニューフシン（ｎｅｗ  ｆｕｓｃｈｉｎ）（ＮＡＢＰ／ＮＦ）、ブロモクロロインドリルリン酸塩／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−−ｄ−ガラクトピラノシド（ＢＣＩＧ）が挙げられる。
【０２８０】
蛍光標識の例としては、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、１，２−ジオキセタン及びピリドピリダジンが挙げられる。電気化学発光の標識の例としては、ルテニウム誘導体が挙げられる。放射活性の標識の例としては、ヨウ素の、コバルト、セレン、トリチウム、炭素、硫黄及びリンの、放射性同位体が挙げられる。
【０２８１】
検出可能な標識は、本明細書に記載の抗体に、又は例えば抗体、核酸プローブもしくは高分子である関心の生物学的標識に特異的に結合するその他の分子に連結し得る。さらに、当業者であれば、検出可能な標識はまた、第２及び／又は第３、及び／又は第４、及び／又は第５の、結合剤又は抗体等に結合可能であるということを理解するであろう。さらに、当業者であれば、さらなる結合剤又は抗体のそれぞれを用いて関心の生物学的標識を特徴決定することが、信号の増幅ステップとして機能し得るということを理解するであろう。生物学的標識は、例えば光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、検出可能物質が例えば色素、コロイド性金粒子、発光試薬である電子顕微鏡法を用いて、視覚的に検出できる。生物学的標識に結合した視覚的に検出可能な物質はまた、分光光度計を用いて検出してもよい。検出可能な物質が放射性同位体である場合、オートラジオグラフィーによる視覚的な検出とする、又はシンチレーションカウンターによる非視覚的な検出とすることが可能である。例えば、Ｌａｒｓｓｏｎ，１９８８，Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．８０  １９９８，Ｊｏｈｎ  Ｄ．Ｐｏｕｎｄ（ｅｄ．）（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）を参照されたい。
【０２８２】
本開示は、試料中の、１もしくは複数のＦｚｄもしくはＬＲＰ５／６受容体、又は１もしくは複数のＦｚｄもしくはＬＲＰ５／６受容体を発現する細胞もしくは組織を検出するキットであって、本明細書に記載する少なくとも１つの抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター又は宿主細胞を含有する当該キットをさらに提供する。ある実施形態においては、キットは、緩衝液、酵素、標識、基質、本開示の抗体が付着するビーズ又は他の表面等と、使用説明書とを含み得る。
【０２８３】
本明細書で言及した、ならびに／又は出願データシートに列記した、上記した米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許出版物の全ては、それらの全体として、参照により本明細書で援用する。
【０２８４】
先述より、本開示の特定の実施形態を説明の目的で本明細書に記載してきたが、本開示の趣旨及び範囲を逸脱することなく様々な変形がなされ得る、ということが理解されるであろう。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲以外によっては、限定されない。
【実施例】
【０２８５】
実施例１
多特異性Ｗｎｔ代替分子
以下の実施例にさらに記載するように、様々な構成を表すいくつかの多特異性Ｗｎｔ代替分子を産生した。これらは、配列番号１０９〜１５７に記載する配列を含む、以下の表５に開示するＷｎｔ代替分子を含んだ。これら実施例で表すＷｎｔ代替分子に用いた特異的なＦｚｄ及びＬＲＰ結合要素を、表１Ａ及び１Ｂ及び２Ａ及び２Ｂに列記する。
【表５−１】
2021529796.tif 000067
【表５−２】
2021529796.tif 000068
【表５−３】
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【表５−４】
2021529796.tif 000070
【表５−５】
2021529796.tif 000071
【表５−６】
2021529796.tif 000072
【表５−７】
2021529796.tif 000073
【表５−８】
2021529796.tif 000074
【表５−９】
2021529796.tif 000075
【表５−１０】
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【表５−１１】
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【表５−１２】
2021529796.tif 000078
【表５−１３】
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【０２８６】
実施例２
Ｆｚｄ受容体ヒンジ領域に対して結合特異性をもつＷｎｔ代替分子の生成
Ｆｚｄ受容体ヒンジ領域に結合するＦｚｄバインダー（図２Ａを参照）及びＬＲＰバインダーの様々な組み合わせを含めて、活性なＷｎｔ代替分子を生成した。Ｆｚｄ７のヒンジ領域に結合する２つの抗体、抗ＦＺＤ７−１７９１（配列番号７０〜７１）及び抗ＦＺＤ７−１２９１（配列番号７２〜７３）が、国際公開第２０１６／２０５５５１号及び国際公開第２０１６／２０５５６６号に記載されている。これら２つの抗体を用いて、Ｆｚｄヒンジ領域に対するバインダーが活性なＷｎｔ代替分子を産生するということが示された。
【０２８７】
抗ＦＺＤ７−１７９１及び抗ＦＺＤ７−１２９１のいずれもが、ＦｃにＬＡＬＡ−ＰＧ変異を伴うヒトＩｇＧ１フレームワークにクローン化したことで、エフェクタ機能が低下した。ＬＲＰ５バインダー＃３（００８Ｓ−Ｄ０１；配列番号９７）を、図２Ｂに示す両抗体の軽鎖のＮ末端に対して、フレーム内でクローン化した。それぞれ１７９１−３（配列番号１１３〜１１４）及び１２９１−３（配列番号１１１〜１１２）という名称であるさらなる組換えＩｇＧタンパク質の両方を、それぞれの発現ベクターをメーカーの指示に従ってＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）内へのトランスフェクションによって調製した。簡潔には、トランスフェクション４日後に、細胞ペレットを遠心沈殿させてから細胞培地を回収した。当該培地を、ヒトＩｇＧ−Ｆｃ部分を含有するタンパク質を回収するためのプロテインＡ樹脂（ＲＥＰＬＩＧＥＮ社、マサチューセッツ州ウォルサム）と共にインキュベートした。タンパク質を、１０ｍＭグリシン、ｐＨ３．５でプロテインＡ樹脂から溶離した。次いで、当該タンパク質の溶離液を、サイズ排除クロマトグラフィー法（ＳＥＣ）で分取してさらに精製した。ＳＥＣは、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ペンシルベニア州ピッツバーグ）を用いて、高速タンパク質液体クロマトグラフィーにより実施した。ピークの画分を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で解析して、内容物を確認した。
【０２８８】
Ｆｚｄ１及びＦｚｄ２のヒンジ領域に結合する抗体を利用して、Ｆｚｄ７ヒンジに加えて、他のＦｚｄヒンジ領域もまた活性なＷｎｔ代替分子を産生するということが示された。これら抗体の組換えＦａｂフラグメントは、一過性導入によりＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）より産生した。当該Ｆａｂは、ニッケル樹脂により培地から精製して、さらにサイズ排除クロマトグラフィー法（ＳＥＣ）によりさらに精製した。
【０２８９】
抗ＦＺＤ１ヒンジ抗体及び抗ＦＺＤ２ヒンジ抗体が、ＦｃにＬＡＬＡ−ＰＧ変異を伴うヒトＩｇＧ１フレームワークにクローン化したことで、エフェクタ機能が低下した。ＬＲＰ５バインダー＃３（００８Ｓ−Ｄ０１；配列番号９７）又はＬＲＰ５／６バインダー＃３６（０１３Ｓ−Ｄ０５；配列番号９１及び９６）を、図２Ｂに示すそれぞれの抗体の軽鎖のＮ末端に対して、フレーム内でクローン化した。さらなる組換えＩｇＧタンパク質を、それぞれの発現ベクターをメーカーの指示に従ってＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）内にトランスフェクションによって調製した。簡潔には、トランスフェクション４日後に、細胞ペレットを遠心沈殿させてから細胞培地を回収した。当該培地を、ヒトＩｇＧ−Ｆｃ部分を含有するタンパク質を回収するためのプロテインＡ樹脂（ＲＥＰＬＩＧＥＮ社、マサチューセッツ州ウォルサム）と共にインキュベートした。タンパク質を、１０ｍＭグリシン、ｐＨ３．５でタンパク質Ａ樹脂から溶離した。次いで、当該タンパク質の溶離液を、サイズ排除クロマトグラフィー法（ＳＥＣ）で分取してさらに精製した。ＳＥＣは、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ペンシルベニア州ピッツバーグ）を用いて、高速タンパク質液体クロマトグラフィーにより実施した。ピークの画分を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で解析して、内容物を確認した。この結果により、これら抗体もまた活性なＷｎｔ代替分子を産生したということが示された。
【０２９０】
実施例３
ヒンジ領域特異的なＷｎｔ代替分子の結合動態
１７９１−３及び１２９１−３の、Ｆｚｄ７  ＣＲＤ又は細胞外ヒンジ領域配列を伴うＦｚｄ７  ＣＲＤ（Ｆｚｄ７  ＣＲＤ＋ヒンジ）のいずれかに対する結合動態を、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ９６（ＰＡＬＬ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ社、カリフォルニア州フレモント）機器を用いて、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーで、３０℃、１０００ｒｐｍで、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により求めた。Ｎ末端ビオチン化したＦｚｄ７  ＣＲＤタンパク質及びＦｚｄ７  ＣＲＤ＋ヒンジのタンパク質を、ＳＡバイオセンサーに捕捉させた。ビオチン化したＦｚｄ７の捕捉後、ビオチン化Ｆｚｄ７を捕捉させたＳＡバイオセンサーを、ランニング緩衝液中に７つの異なる濃度で関連する抗体を含有するウェル中と、参照チャネルとしてランニング緩衝液のみを含んだウェル中とに、浸漬させた。ＫＤは、グローバルフィッティングにより求めた。図２Ｃに示すように、これら抗体融合タンパク質のどちらも、ヒンジ領域を伴うＦｚｄ７タンパク質にのみ結合し、Ｆｚｄ７  ＣＲＤドメインのみのものには結合しなかった。
【０２９１】
実施例４
ヒンジ領域特異的なＷｎｔ代替分子のインビトロ活性
１７９１−３及び１２９１−３の、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化する能力は、β−カテニンルシフェラーゼレポータープラスミドＳｕｐｅｒ  ＴＯＰ  Ｆｌａｓｈ（ＳＴＦ）を安定に組み込んだ２９３  ＳＴＦ細胞株中で評価した。図２Ｄに示すように、１７９１−３及び１２９１−３のどちらもが、２０ｎＭのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２（ＲＰＳＯ）の存在下でこれら細胞中にルシフェラーゼレポーターが導入されることで判断したときにＷｎｔシグナル伝達を活性化した。１２９１−３はＦｚｄ７  ＣＲＤ＋ヒンジに対して高い親和性を有していたにもかかわらず、１７９１−３が、１２９１−３よりも高い活性を示したが、これは２つの抗体間での幾何学上の潜在的な相違が、活性の違いに寄与している可能性を示唆する。Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８に結合することが可能である、別のＷｎｔ代替分子Ｒ２Ｍ３−３（Ｆｚｄバインダー００１Ｓ−Ａ０４；Ｌｒｐバインダー００８Ｓ−Ｄ０１；配列番号１０９〜１１０）もまた、試験した。図２Ｄに示すように、１７９１−３よりの最大効果が、雑種の特異性Ｒ２Ｍ３−３のそれに接近しつつある。
【０２９２】
Ｆｚｄ１又はＦｚｄ２ヒンジ領域に結合する抗体を含むＷｎｔ代替物の、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化する能力は、Ｆｚｄ１又はＦｚｄ２のいずれかを過剰発現する、β−カテニンルシフェラーゼレポータープラスミドＳｕｐｅｒ  ＴＯＰ  Ｆｌａｓｈ（ＳＴＦ）を安定に組み込んだ２９３  ＳＴＦ細胞株中で評価した。ルシフェラーゼレポーターアッセイのために、９６ウェルプレートのそれぞれに、１００万個の細胞を播種し、ＩＷＰ２（ｗｎｔシグナル伝達阻害剤）を３μＭの最終濃度で添加した。播種の２６時間後、９６ウェルプレートに３つ組みで、１００ｎＭから１０倍連続希釈で化合物を添加し、最大濃度を５００ｎＭとする。１８時間後、細胞を１００μｌの溶解緩衝液で溶解させた。当該溶解細胞から、２０ｕｌの試料を、不透明な９６ウェルプレートに移した。各ウェルに対して、１０μｌのルシフェラーゼ基質を添加した。プレートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社のＬｕｍ９６プレートリーダーに直ちに載置し、ルシフェラーゼ発光信号を集めた。データはＰｒｉｓｍ７で処理した。これら抗体は、２０ｎＭのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２（ＲＰＳＯ）の存在下でのＦｚｄ１又はＦｚｄ２いずれかの過剰発現を伴うこれら細胞中にルシフェラーゼレポーターが導入されることで判断したときに、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化した。これら結果により、ＬＲＰバインダーと合わせた場合にＦｚｄヒンジ結合抗体がＷｎｔシグナル伝達の活性を誘発することが可能であることが示された。
【０２９３】
実施例５
多特異性Ｗｎｔ代替分子の生成
単一特異性Ｗｎｔ代替分子からの配列を組み合わせて、Ｆｚｄ結合特異性の所望の組み合わせを伴う多特異性Ｗｎｔ代替分子を生成した。図３Ａに示すように、Ｆｚｄ４に結合する４ＳＤ１−３（Ｆｚｄバインダー００４Ｓ−Ｄ０１；Ｌｒｐバインダー００８Ｓ−Ｄ０１；配列番号１１５〜１１６）と、Ｆｚｄ９に結合する１４ＳＢ６−３（Ｆｚｄバインダー０１４Ｓ−Ｂ０６；Ｌｒｐバインダー００８Ｓ−Ｄ０１；配列番号１１７〜１１８）とである２つの単一特異性Ｗｎｔ代替分子を、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ技術を用いて、ヘテロＩｇ  Ｗｎｔ代替分子であるヘテロＩｇ  ４ＳＤ１−３＋１４ＳＢ６−３（配列番号１２０及び１２２）へと合わせた。ヘテロＩｇ分子の半分は、ＣＨ３ドメイン内に「ｈｏｌｅｓ」変異を導入した４ＳＤ１−３に由来した（配列番号１２０）。この当該分子の半分は、Ｆｚｄ４に対する１つの結合アームと、ＬＲＰ５に対する１つの結合アームとを含有した。ヘテロＩｇ分子のもう半分は、ＣＨ３ドメイン内に「ｋｎｏｂｓ」変異を導入した１４ＳＢ６−３に由来した（配列番号１２２）。この当該分子の半分は、Ｆｚｄ９に対する１つの結合アームと、ＬＲＰ５に対する１つの結合アームとを含有した。最後のＷｎｔ代替物、ヘテロＩｇ４ＳＤ１−３＋１４ＳＢ６−３は、Ｆｚｄ４に対する１つの結合アームと、Ｆｚｄ９に対する１つの結合アームと、ＬＲＰ５に対する２つの結合アームとを含有する、四価三重特異性分子であった。
【０２９４】
以下の２つの対照分子もまた生成した：一価二重特異性の４ＳＤ１−３（配列番号１２０及び１２３）及び一価二重特性の１４ＳＢ６−３（図３Ａ）配列番号１２２及び１２４）。一価二重特異性分子４ＳＤ１−３は、「ｋｎｏｂｓ」変異を伴うＦｃ（配列番号１２３）と対をなす、「ｈｏｌｅｓ」変異を伴うが、Ｆａｂアームを含まない、ヘテロＩｇの４ＳＤ１−３半分を含有し（配列番号１２０）、したがってこの分子はＦｚｄ４及びＬＲＰ５に対して二重特異性であるが一価であった。一価二重特異性の１４ＳＢ６−３は、「ｈｏｌｅｓ」変異を伴うＦｃ（配列番号１２４）と対をなす、「ｋｎｏｂｓ」変異を伴うが、Ｆａｂアームを含まない、ヘテロＩｇの１４ＳＢ６−３半分を含有し（配列番号１２２）、したがってこの分子はＦｚｄ９及びＬＲＰ５に対して二重特異性であるが一価であった。
【０２９５】
ヘテロ−Ｉｇ  ４ＳＤ１−３＋１４ＳＢ６−３、一価二重特異性４ＳＤ１−３、及び一価二重特異性１４ＳＢ６−３は、４段階の精製プロセスを経て精製した。「ｋｎｏｂｓ」変異を含有するＦｃはまた、ＦＬＡＧタグを含有し、また「ｈｏｌｅｓ」変異を含有するＦｃはまた、Ｈｉｓタグを含有するため、これらタンパク質は、はじめにプロテインＡ及びＮｉ−ＮＴＡアフィニティ精製ステップで精製して、次いでＳＥＣステップで精製して、最終精製ステップとして抗ＦＬＡＧ  Ｍ２ビーズを用いた。
【０２９６】
実施例６
多特異性Ｗｎｔ代替分子の特性決定
ヘテロ−Ｉｇ  ４ＳＤ１−３＋１４ＳＢ６−３、一価二重特異性４ＳＤ１−３及び一価二重特異性１４ＳＢ６−３の、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化する能力は、２０ｎＭのＲＰＳＯの存在下又は不在下での、Ｗｎｔ−反応性２９３ＳＴＦレポーター細胞において評価した（ＲＰＳＯ存在下でのデータのみを図３Ｂ〜３Ｅに示している）。Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ５及びＦｚｄ８に結合可能であるＲ２Ｍ３−３もまた、試験した。
【０２９７】
２９３ＳＴＦ細胞株が、低レベルのＦｚｄ４を発現し、またＦｚｄ９の発現はＱＰＣＲにより検出されなかった。Ｒ２Ｍ３−３以外の全ての分子は、親２９３ＳＴＦ細胞における活性を、ほとんど示さないか又は全く示さなかった（図３Ｂ）。
【０２９８】
レトロウイルス系のＦｚｄ４過剰発現２９３ＳＴＦ安定発現株を生成した（２９３ＳＴＦ  Ｆｚｄ４ＯＥ）。この細胞株において、Ｒ２Ｍ３−３及び４ＳＤ１−３（Ｆｚｄ４単一特異性）の両方が、Ｗｎｔシグナル伝達を強力に活性化し、一方で、ヘテロ−Ｉｇ  ４ＳＤ１−３＋１４ＳＢ６−３は非常に弱い活性を示し、またＦｚｄ９単一特異性分子１４ＳＢ６−３は不活性であった（図３Ｃ）。
【０２９９】
Ｆｚｄ９を、一過性導入により親２９３ＳＴＦ細胞に導入して２９３ＳＴＦ  Ｆｚｄ９ＯＥ細胞株を生成した。この細胞株において、Ｒ２Ｍ３−３及び１４ＳＢ６−３（Ｆｚｄ９単一特異性）の両方が、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することができ、一方で、ヘテロ−Ｉｇ  ４ＳＤ１−３＋１４ＳＢ６−３は非常に弱い活性を示し、またＦｚｄ４単一特異性分子４ＳＤ１−３は不活性であった（図３Ｄ）。
【０３００】
Ｆｚｄ４及びＦｚｄ９は、レトロウイルスＦｚｄ４の送達及びＦｚｄ９一過性導入の組み合わせを経て２９３ＳＴＦ細胞内に共に導入されて、２９３ＳＴＦ  Ｆｚｄ４ＯＥ＋Ｆｚｄ９ＯＥ細胞株を生成した。この細胞株においては、Ｒ２Ｍ３−３、４ＳＤ１−３、１４ＳＢ６−３及びヘテロ−Ｉｇ  ４ＳＤ１−３＋１４ＳＢ６−３は全て完全に活性であった（図３Ｅ）。
【０３０１】
２つの一価二重特異性分子である、一価二重特異性４ＳＤ１−３及び一価二重特異性１４ＳＢ６−３は、全ての細胞において不活性であった（図３Ｂ〜３Ｅ）。これら結果により、２つの単一特異性バインダーに関して、一価二重特異性をＬＲＰ５バインダーと組み合わせることは、Ｗｎｔシグナル伝達を誘発できないか、又は有効に誘発することができないということが示された。したがって、ヘテロ−Ｉｇ  ４ＳＤ１−３＋１４ＳＢ６−３で観察された活性は、確かに、Ｆｚｄ４及びＦｚｄ９タンパク質の両方がＬＲＰと共に結合することの結果であった。これら結果は、このアプローチを異なる特異性の２以上のＦｚｄバインダーの任意の組み合わせに適用することが可能であり、それによってこのプロセスによるＦｚｄ特異性の任意の所望の組み合わせの生成を可能にさせるということをさらに示した。
【０３０２】
この実施例では、異なる特異性の２つのＦｚｄバインダーをヘテロ−Ｉｇ形態で合わせて、異なる特異性のＷｎｔ代替分子を生成することが可能であることが示された。この概念はまた、２つの異なるエピトープ上の同一のＦｚｄに対して２つのＦｚｄバインダーを使用することに拡張させることができる。得られたヘテロ−Ｉｇ  Ｗｎｔ代替分子は、さらなる受容体のクラスター形成及びＷｎｔシグナル伝達の活性化に有益であり得る、二重パラトピック分子となるであろう。
【０３０３】
実施例７
ベータ−カテニン依存性シグナル伝達の活性化を招く、ＬＲＰ受容体結合を伴う古典的及び非古典的シグナル伝達Ｆｚｄ受容体のヘテロ二量体形成
Ｗｎｔシグナル伝達は、ベータ−カテニン依存性（古典的）経路及びベータ−カテニン非依存性（非古典的）経路が介在することが可能である。例えばＦｚｄ６等の、ベータ−カテニン非依存性シグナル伝達を活性化することが報告されているＦｚｄ受容体が存在する一方で、他のＦｚｄ受容体が、ベータ−カテニン依存性シグナル伝達を活性化する。Ｌｒｐとの非古典的Ｆｚｄ受容体の強制的二量体形成又はＬｒｐとの古典的及び非古典的Ｆｚｄ受容体のヘテロ二量体形成のいずれが、ベータ−カテニン依存性シグナル伝達又はベータ−カテニン非依存性シグナル伝達を招くことができるのかがこれまで検討されてこなかった。これら着想を試験するために、以下の実施例が生まれた。
【０３０４】
はじめに、Ｆｚｄ６に対する二価の結合アーム（００４Ｓ−Ｃ１０）、非古典的受容体からなる多価分子を、Ｌｒｐ５に対する二価の結合アーム（３；００４Ｓ−Ｄ０１）と合わせた。この分子は、４ＳＣ１０−３という名称である（図５Ａ、上方パネル）。こうした形態が、Ｆｚｄバインダーが古典的Ｆｚｄ受容体に向けられる場合に、ベータ−カテニン依存性シグナル伝達を活性化することを示した。しかしながら、図５Ａの下方パネルに示すように、Ｆｚｄ１、２、７、５、８に結合する陽性対照分子Ｒ２Ｍ３−２６（Ｆｚｄバインダー００１Ｓ−Ａ０４；Ｌｒｐバインダー００９Ｓ−Ｅ０４）とは対照的に、４ＳＣ１０−３は、２９３ＳＴＦレポーター細胞において（２０ｎＭのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎの存在下で）ベータ−カテニン依存性シグナル伝達を有効に活性化することができなかった。
【０３０５】
次に、４ＳＣ１０と、Ｆｚｄ１、２、７に結合する別のＦｚｄ結合アーム、１ＲＣ０７（００１Ｓ−  Ｂ０３）（古典的Ｆｚｄ受容体）とからなる多価分子を、Ｌｒｐ５に対する二価結合アーム（３）と合わせた。この分子は、ヘテロＩｇ  ４ＳＣ１０−３＋１ＲＣ０７−３という名称であり（図５Ｂ、上方パネル）、２９３ＳＴＦレポーター細胞においてベータ−カテニン依存性シグナル伝達を活性化した。１ＲＣ０７−３アーム単独でシグナル伝達を活性化できるという可能性を除外するために、図５Ｃの上方パネルに示す一価二重特異性分子１ＲＣ０７−３も試験した。図５Ｃに示すように、一価二重特異性分子１ＲＣ０７−３は、シグナル伝達を有効に活性化することができない。これら結果により、古典的及び非古典的のＦｚｄ受容体をＬｒｐと合わせることで、ベータ−カテニン依存性シグナル伝達を招くことが可能であるということがはじめて示された。
【０３０６】
実施例８
ベータ−カテニン依存性シグナル伝達に対する、Ｗｎｔ代替分子におけるＦｚｄのＬｒｐバインダーに対する様々な比の影響の探索
多価形態により、強力かつ非常に有効なＷｎｔシグナル伝達活性化因子が産生された。当該形態の、内因性Ｗｎｔシグナル伝達に対する影響を試験するように、実験を設計した。二価／多価のＬｒｐ結合アームの内因性Ｗｎｔリガンドへの影響を理解するために、Ｒ２Ｍ３のｎｕｌｌ変異体、Ｒ２Ｍ３ｍｕｔ（Ｙ９Ａ）を伴い、Ｌｒｐバインダー３又は２６のいずれかに融合した不活性の代替分子を生成して、それぞれ名称をＲ２Ｍ３ｍｕｔ−３又はＲ２Ｍ３ｍｕｔ−２６とした。図６Ａに示すように、野生型Ｒ２Ｍ３代替物Ｒ２Ｍ３−３及びＲ２Ｍ３−２６は、２０ｎＭのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎの存在下で、２９３ＳＴＦのＷｎｔレポーター細胞株において完全に活性であるが、Ｒ２Ｍ３ｍｕｔ−３及びＲ２Ｍ３ｍｕｔ−２６は不活性である。代替分子内の二価Ｌｒｐアームの内因性Ｗｎｔシグナル伝達への影響を試験するために、これら２つの不活性代替分子を、Ｗｎｔ３Ａを含有する２０％馴化培地の存在下で２９３ＳＴＦのＷｎｔレポーター細胞株において試験した。図６Ｂに示すように、Ｒ２Ｍ３ｍｕｔ−３及びＲ２Ｍ３ｍｕｔ−２６は、それぞれ単独では不活性であるが、Ｒ２Ｍ３ｍｕｔ−３は用量反応的にＷｎｔ３ａと相乗作用を示し、またＲ２Ｍ３ｍｕｔ−２６は用量反応的にＷｎｔ３ａと拮抗した。このことにより、多価形態が、内因性Ｗｎｔリガンドと相互作用する可能性を有し得るということが示された。
【０３０７】
内因性Ｗｎｔとの潜在的な相互作用が減少する形態を理解し、活性なシグナル伝達のために必要な受容体バインダーの数をさらに理解するために、多価代替分子において、様々な数及び比のＦｚｄバインダー及びＬｒｐバインダーを探索した。
【０３０８】
Ｌｒｐ結合アームが二価であることが、内因性Ｗｎｔとの相乗作用を招き得ることから、１つのＬｒｐ結合アームを除去することを試験したが、そのため最終的な分子においては、２つのＦｚｄバインダー及び１つのＬｒｐバインダーが存在するものであり、この分子を２：１と呼ぶ。元の分子形態は、２つのＦｚｄバインダーと２つのＬｒｐ結合アームとが存在することから、２：２となる。２：１分子の一例、１ＲＣ０７−３（２：１）を、２：２形態と比較で図６Ｃの左方パネルに示している。図６Ｃの右方パネルに示すように、１ＲＣ０７−３（２：１）は、活性であり、また２９３ＳＴＦレポーター細胞においてＷｎｔシグナル伝達を誘発することができる。この形態は、原則的に、Ｌｒｐ共受容体の架橋結合を介して内因性Ｗｎｔリガンドとの相乗作用を示す能力を欠いているはずである。図６Ｄのいくつかの形態で例示するように、１つのＦｚｄバインダー及び２つのＬｒｐバインダーの比を逆転させたものもまた、構築した。概して、これら分子が示したのは、よくても中程度のシグナル伝達の誘発であった（図６Ｄ）。
【０３０９】
Ｆｚｄを２：２形態でヘテロ二量体形成することにより、Ｗｎｔシグナル伝達を誘発することができることから（図３及び図５に示す）、２つの異なるＦｚｄバインダーと１つのＬｒｐバインダー（１：１：１）のヘテロ二量体形成による形態で分子を構築して、Ｗｎｔシグナル伝達を与える能力について試験した。図６Ｅに示すように、１：１：１分子のいくつかの例の全てが、２９３ＳＴＦレポーター細胞においてＷｎｔシグナル伝達を活性化した。この構造で試験したＦｚｄバインダーには、Ｒ２Ｍ３（００１Ｓ−Ａ０４）、１ＲＣ０７（００１Ｓ−Ｂ０３）、Ｒ２Ｍ１３（００４Ｓ−Ｇ０６）及び５Ｓ−Ｈ５（００５Ｓ−Ｈ０５）が含まれる。
【０３１０】
実施例９
Ｗｎｔシグナル伝達の活性化を招く、Ｆｚｄ結合を伴うＬｒｐバインダーのヘテロ二量体形成
異なるＦｚｄ受容体バインダーをヘテロ二量体形成／多量体形成することに加えて、異なるＬｒｐ共受容体バインダーをヘテロ二量体形成／多量体形成することによるＷｎｔシグナル伝達への影響もまた試験した。上記に示すように、２つのＦｚｄ：１つのＬｒｐの形態では、内因性Ｗｎｔリガンドとの相乗効果が軽減された。Ｌｒｐ上の２つの異なる領域に向けられたヘテロ二量体形成／多量体形成されたＬｒｐバインダーもまた、内因性Ｗｎｔリガンド上の二価Ｌｒｐバインダー形態の相乗効果を軽減し得るか否かを判断することが試験された。図７Ａに示すように、２：１：１比でのいくつかの例を構築したが、２つの異なるＬｒｐバインダー（一方はＬｒｐ５Ｅ１Ｅ２に結合し、もう一方はＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４に結合）がそれぞれ、Ｆｚｄバインダー１ＲＣ０７の軽鎖のＮ末端と融合したものを１ＲＣ０７−３−２６ＮＬ（２：１：１）とし、また１ＲＣ０７重鎖のＮ末端と融合したものを１ＲＣ０７−３−２６ＮＨ（２：１：１）とした。両分子は、２９３ＳＴＦのＷｎｔ反応性レポーター細胞において検出されたときに、Ｗｎｔシグナル伝達を誘発するのに非常に活性である（図７Ｂ）。
【０３１１】
最後に、図７Ｃに示した１：１：１：１形態という名称の、２つの別個のＦｚｄ結合アームと２つの別個のＬｒｐ結合アームとを伴う多価分子を、生成した。１ＲＣ０７−２６＋４ＳＤ１−３（１：１：１：１）の組み合わせ及びＲ２Ｍ９−２６＋１ＲＣ０７−３（１：１：１：１）の組み合わせの両方が、結果としてＷｎｔシグナル伝達の強力な誘発をもたらした（図７Ｄ）。Ｒ２Ｍ９構造は、Ｆｚｄ結合要素００３Ｓ−Ｅ０７を含有する。
【０３１２】
図５〜７に示す実施例は、古典的又は非古典的のＷｎｔシグナル伝達（又は両方）を誘発するための種々の構造と、標的組織内の内因性Ｗｎｔリガンドを介して、影響を受けないシグナル伝達との相乗作用を示す、当該シグナル伝達を拮抗する又は当該シグナル伝達を残す能力とを説明する。溶解性Ｗｎｔ代替リガンドの万能な集合を、最大の治療効果と最小限の副作用とを可能にし得るような適合させたＷｎｔシグナル伝達による療法に用いることができる。
【０３１３】
実施例１０
異なる化学量論比のＦｚｄバインダー及びＬＲＰバインダーを含有するＷｎｔ代替分子の構造−機能解析
ＦＺＤバインダー（ｓｃＦｖ形態の１８Ｒ５抗体）とＤｉｃｋｋｏｐｆのＣ末端部分（ＤＫＫ１ｃ）とを単一のポリペプチド鎖に連結することによって生成した代替ＷＮＴアゴニスト（１８Ｒ５−ＤＫＫ１ｃ）が、ＷＮＴ／β−カテニンシグナル伝達を活性化する能力を呈した（Ｊａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｎａｔｕｒｅ，５４５（７６５３）：２３４−２３７）。この概念に基づいて、様々なＦＺＤ及びＬＲＰの結合抗体フラグメントの組み合わせを生成した。
【０３１４】
Ｆ１、Ｆ２及びＦ３と呼ぶＦｚｄ結合性ｓｃＦｖ、ならびにＬ１及びＬ２と呼ぶＬＲＰのｓｃＦｖの配列と、それらに結合するために用いたリンカー配列とを、表６Ａに示している。これら分子は、それぞれの標的に対して一価の結合アームを有することから、この形態を二価二重特異性形態と呼ぶ（１：１と示して１つのＦＺＤと１つのＬＲＰ分子との結合の化学量論を表す）。
【０３１５】
タンデムｓｃＦｖコンストラクトについてさらなる化学量論を試験した。この解析で用いた、組み合わせのＷｎｔ代替コンストラクトの概要を、表６Ｂに示す。
【表６Ａ−１】
2021529796.tif 000080
【表６Ａ−２】
2021529796.tif 000081
【表６Ａ−３】
2021529796.tif 000082
【表６Ｂ−１】
2021529796.tif 000083
【表６Ｂ−２】
2021529796.tif 000084
【０３１６】
タンデムｓｃＦｖ分子を生成するために、ｓｃＦｖ形態で、１８Ｒ５−ＤＫＫ１ｃ分子内のＤＫＫ１ｃ成分（Ｊａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｎａｔｕｒｅ，５４５（７６５３）：２３４−２３７）をＬＲＰ結合性抗体フラグメントで置換して生成した分子の組を、図８Ａに示す。ＬＲＰバインダーはＬＲＰ６  Ｅ１Ｅ２ドメインのバインダー１１１５．３（米国特許第８，７１５，９４１  Ｂ２号）であり、本明細書においてはＬ１と呼ぶ。構造の、活性への影響を試験するために、Ｌ１を、中間に５、１０又は１５アミノ酸リンカーを伴うようにして１８Ｒ５  ｓｃＦｖ（本明細書においてはＦ１と呼ぶ）のＮ末端又はＣ末端のいずれかと融合させた。この６タンパク質の組は、Ｎｉアフィニティカラムによりほぼ均質に精製して（図８Ｂ）、ＷＮＴ反応性２９３  ＳＴＦレポーター細胞において試験した。リンカー長が、活性に対して有意に影響を及ぼす様子はなかったが、ＬＲＰ６バインダーをＦＺＤバインダーのＮ末端に融合させることが、他の配置よりもはるかに高い活性を結果的にもたらした（図８Ｃと図８Ｄの比較、ｙ軸が異なっていることに留意されたい）。これら新規の代替分子の全てが、並行して試験したＷＮＴ３Ａ及び１８Ｒ５−ＤＫＫ１ｃの両方が示したよりも低いＥｍａｘ（最大の反応）を示した（図９）。
【０３１７】
ｓｃＦｖフラグメントが高分子量の凝集体を形成する傾向があることから、代替ＷＮＴ活性がタンデムｓｃＦｖ分子の単量体形態に由来したか否かを確認するために、これら６タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー法（ＳＥＣ）で精製して、単量体形態に相当するピーク画分を２９３  ＳＴＦレポーター細胞において試験した。ＳＥＣ前にＮｉ精製した物質とは対照的に、ＳＥＣ精製したタンパク質は、活性を有意に喪失していた（図８Ｅ及び８Ｆと８Ｃ及び８Ｄの比較）。ＳＥＣを行った全ての画分を、２９３  ＳＴＦレポーター細胞において分析した。カラム画分の全体にわたって、活性のピークを特定したが、ＳＴＦ活性のピークは、単量体分子のタンパク質のピークと一致しなかった。代わりに、全ての場合において、ＳＴＦ活性は、より高分子量の画分でピークとなり（図８Ｇ及び８Ｈ、ＳＥＣの分子量標準は図８Ｉに示す）、これは１：１タンデムｓｃＦｖ分子が、β−カテニン依存性シグナル伝達を誘発するのに有効でなかったことを示唆する。これら結果は、ＷＮＴシグナル伝達の有効な活性化には、受容体複合体の多量体形成が必要であることを示唆する。６ｘＨｉｓタグを含有するタンデムｓｃＦｖ分子は、抗Ｈｉｓ抗体と人工的に架橋結合しており、２９３  ＳＴＦレポーターアッセイで試験した。図８Ｊに示すように、単量体画分のみからのＬ１：５：Ｆ１は、アイソタイプ対照（抗ＧＦＰ）抗体の存在下でβ−カテニン依存性シグナル伝達を活性化するのに有効でなかったが、抗Ｈｉｓ抗体の添加が、シグナル伝達を有意に誘発し、これは受容体複合体の多量体形成がシグナル伝達に必要であり得るという着想を裏付けている。
【０３１８】
図１０Ａに示すようにＬ１及びＦ１のタンデムｓｃＦｖ融合をＦｃフラグメントのＮ末端に結合させて、四価二重特異性形態を精製することによって、より明確で容易に産生される形態で多価分子を産生した。この形態では、それぞれの受容体標的に対する２つの結合部位が存在する（後の項目において２：２とも示して、２つのＦＺＤと２つのＬＲＰとの化学量論比を表す）。これらタンパク質は、プロテインＡアフィニティステップとその後のＳＥＣとによって精製した。図１０Ｂ及び１０Ｃに示すように、ＳＥＣ画分全体にわたる２９３  ＳＴＦアッセイよりの活性のピークが、図１０Ａに示す単量体型の分子に相当するタンパク質のピークと一致した。ＳＥＣ分子量標準を図１０Ｄに示す。これら新規の構成により、ＳＴＦのピークと主要なタンパク質ピークとの間の相関が示された。ピーク画分の用量反応曲線もまた実施したが、リンカー長が、活性に対して有意に影響を及ぼす様子はなかった一方で、２つのバインダーの相対的な配置は、活性に影響を及ぼした。Ｌ１をＦ１のＮ末端に融合させることは、これら２つのバインダーの組み合わせの好ましい配置である（図１０Ｅ及び１０Ｆのｙ軸を比較）。ＷＮＴ３Ａ及び１８Ｒ５−ＤＫＫ１ｃと比較して、これら多価二重特異性ＦＺＤ／ＬＲＰ結合分子の活性の相対的なＥｍａｘは、図８に示すＳＥＣ前の物質のものと同様である（図１１）。この四価二重特異性形態での、それらのそれぞれの受容体に対する結合アームの親和性は、Ｏｃｔｅｔ機器でのバイオレイヤー干渉法を用いて決定した。図１１Ｂに示すように、相対的な配置及びリンカー長は、それらの標的受容体に対するそれぞれのアームの親和性に対して影響がなかったが、これは配置によるレポーター活性への影響が、形態による結合への影響に起因するのではなく、むしろ代替分子によって構築された受容体の構造に起因することを示唆する。
【０３１９】
ＤＫＫ１ｃは、主として、ＬＲＰ  Ｅ３Ｅ４ドメインに結合する（Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＬＲＰエピトープの、活性への影響を理解するために、本明細書においてＬ２と呼ぶ、ＬＲＰ６Ｅ３Ｅ４バインダー、ＹＷ２１１．３１．５７（米国特許第８，８４６，０４１  Ｂ２号）とのＦ１の融合を、１：１タンデムｓｃＦｖ形態で試験したが、ここでＬ２は、中間に５、１０又は１５アミノ酸リンカーを伴うようにしてＦ１  ｓｃＦｖのＮ末端又はＣ末端のいずれかと融合させた。これら融合タンパク質は、Ｌ１／Ｆ１融合タンパク質と比較して、あまり機能せずまたより低いレベルで発現したが（図１３Ａ）、図８に示すＬ１／Ｆ１融合タンパク質と同様に、Ｌ２／Ｆ１融合の１：１タンデムｓｃＦｖもまた、２９３  ＳＴＦレポーター細胞においてβ−カテニン依存性シグナル伝達を誘発するのに有効でなかったが、これはＳＥＣカラム全体にわたる活性試験と（図１３Ａ）、ＳＥＣカラムよりの単量体ピーク画分の力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）との両方において見られたとおりであった（図１３Ｂ）。２：２の四価二重特異性分子を生成するタンデムｓｃＦｖ  Ｌ２／Ｆ１分子のＦｃフラグメントとの融合は、古典的ＷＮＴシグナル伝達を有効に活性化した。図１２Ａに示すように、ＳＥＣ画分全体にわたる２９３  ＳＴＦアッセイよりのピークが、単量体型に相当するタンパク質のピークと一致した。これらＬ２／Ｆ１融合分子は、ＷＮＴ３Ａと同様の範囲にあるＥｍａｘを有するＬ１／Ｆ１融合分子よりもはるかに活性であり、またＷＮＴ３Ａ及び１８Ｒ５−ＤＫＫ１ｃの両方を超えて効力が有意に向上した（図１２Ｂ）。Ｌ２及びＦ１の組み合わせは、配置に対して感受性が低く、どちらの配置も同様のＥｍａｘを結果としてもたらした一方で、１５ｍｅｒのリンカーをもつＦ１のＮ末端上にＬ２を有することで、より高い効力が得られた（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。
【０３２０】
２：２の四価二重特異性分子がＷＮＴシグナル伝達を活性化することを検証するための対照が、ＦＺＤ受容体及びＬＲＰ受容体の両方への結合を必要とするため、ＦＺＤバインダー（Ｆ１）又はＬＲＰバインダー（Ｌ１又はＬ２）のいずれかを、２：２の四価二重特異性形態でＧＦＰに結合するｓｃＦｖフラグメントで置換した。これら分子を、四価単一特異性形態又は２：０形態もしくは０：２形態と呼ぶ。図１２Ｄ及び１２Ｅに示すように、これら分子の全てがそれらのそれぞれの受容体に結合するが、これら四価単一特異性分子のいずれも活性でなく、これはＷＮＴシグナル伝達を活性化する能力は、ＦＺＤ及びＬＲＰの両方への結合を必要とするということを示す。
【０３２１】
異なるＦＺＤ特異性をもつＷＮＴ代替分子を生成するため、及びＷＮＴシグナル伝達のために多価であることの要件が、ＦＺＤバインダーＦ１（ＦＺＤ１、２、７、５、８に結合する。Ｇｕｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）を越える全般的な要件であるか否かを理解するために、２つのＬＲＰ６バインダーＬ１及びＬ２を伴う、本明細書においてＦ２と呼ぶ、ＦＺＤ１、２、７に結合するＲ２Ｈ１（米国特許出願公開第２０１６／０１９４３９４  Ａ１号）と、本明細書においてＦ３と呼ぶ、ＦＺＤ５、８に結合する２９１９（国際公開第２０１７／１２７９３３Ａ１号）とであるさらなるＦＺＤバインダーの間で、融合タンパク質を生成した。Ｆ２及びＦ３の特異性は、Ｏｃｔｅｔ結合アッセイで検証した（図１５Ａ）。
【０３２２】
１：１タンデムｓｃＦｖ形態でのＦ２／Ｌ１の組み合わせは、５ｍｅｒ及び１５ｍｅｒのリンカーにより構築した。図８のＦ１融合データと同様に、ＳＥＣカラムの全体にわたるピークのＳＴＦ活性は、より高分子量の画分で広く分布しており、また単量体形態の分子のピークと一致していなかった（図１５Ｂ）。対照的に、ＳＥＣカラム全体にわたるピークのＳＴＦ活性は、タンデムｓｃＦｖが２：２の四価二重特異性形態でＦｃフラグメントと融合した場合に単量体形態と一致した（図１４Ａ）。ＳＥＣカラムにおける第２のＳＴＦ活性ピークもまた、Ｆ１融合分子では観察されなかったより高分子量の画分で観察された（図１４Ａ）。２９３  ＳＴＦレポーター細胞における単量体ＳＥＣピーク画分よりの用量反応曲線により、Ｆ１との融合（図１０）と同様に、より高い活性のために、Ｆ２のＮ末端へのＬ１の融合がわずかに優先であることが示された（図１４Ｂ）。
【０３２３】
Ｆ２及びＬ２間の融合もまた、様々な形態で構築した（表６Ｂ）。ＳＥＣカラムにおいて、ピークのＳＴＦ活性が、１：１形態でのＬ２のＮ末端と融合したＦ２の単量体形態と一致しなかったが（図１４Ｃ）、Ｌ２がＦ２のＮ末端と融合した反転した配置の単量体１：１形態が活性であったようである（図１４Ｄ）。この配置でのピーク画分の用量反応により、５ｍｅｒリンカーに対する選択性をもつＷＮＴ３Ａと比較してより弱い活性が示された（図１４Ｅ）。これらタンデムｓｃＦｖのＦｃのＮ末端との融合よりの２：２の四価二重特異性形態により、非常に強力な分子が産生された。ＳＥＣカラムにおいて、ピークのＳＴＦ活性が、単量体形態と一致しているタンパク質ピークと一致して（図１４Ｆ及び１４Ｈ）、また２９３  ＳＴＦレポーター細胞における用量反応が、強力かつ有効な分子を示して、図３に示したＦ１／Ｌ２融合の活性を上回った（図１４Ｇ及び１４Ｉ）。
【０３２４】
１：１の二価二重特異性タンデムｓｃＦｖ形態及び２：２の四価二重特異性Ｆｃ融合はまた、Ｆ３と２つのＬＲＰバインダーとの間に構築した。図８に示したＦ１融合での観察と同様に、Ｆ３とＬ１又はＬ２との間の１：１タンデムｓｃＦｖ融合分子に関して、頑健な活性は何も観察されなかった（図１７）。対照的に、ＳＥＣカラム画分からの２：２の四価二重特異性形態でのＦ３、ＬＲＰバインダー及びＦｃ間の融合分子の２９３  ＳＴＦレポーターの活性が、当該分子の単量体形態のタンパク質のピークと一致した（図１６Ａ及び１６Ｂ）。興味深いことに、Ｆ１及びＦ２との融合と同様に、ピークＳＥＣ画分の用量反応により、Ｌ２−Ｆ３融合がどちらの配置でも非常に活性である一方で、Ｌ１−Ｆ３融合は活性がほとんどなく、またＦ３のＮ末端上でＬ１への選択性を示すということが示されるということに留意されたい（図１６Ｃ及び１６Ｄ）。これら結果の全ては、合わせて、２つのＦＺＤ及び２つのＬＲＰの化学量論をもって結合するＦＺＤならびにＬＲＰが多価であることが、少なくとも試験したバインダーを伴う、β−カテニン依存性シグナル伝達の一貫して有効な活性化に必要であるということを示唆する。
【０３２５】
古典的ＷＮＴシグナル伝達の有効な誘発のために多価であることの要件が確立されたことで、図１８Ａ及び１８Ｂに示すあるＦｃフラグメントの２末端の２つに、２つのｓｃＦｖバインダーが結合するような代替的な２：２の四価二重特異性形態を探索した（ダンベル型と呼ぶ）。このダンベル形態でのＦ１のＬ１との融合が、レポーターアッセイにおいてＷＮＴシグナル伝達を最小限に活性化した（図１８Ａ）。興味深いことに、またＬ１分子の配置に関する選択性が存在し、ここでそのＣ末端のＦｃへの結合が活性に影響を及ぼした。この形態でのＦ１及びＬ２の融合はまた、ＬＲＰ結合アームに関して配置における同様の選択性をもってＷＮＴシグナル伝達を活性化した（図１８Ｂ）。またこれら分子に関して、ＳＥＣカラム全体にわたって活性を試験し、そして図１８Ｃに示すように、ピークのＳＴＦレポーター活性が、一価形態のタンパク質に相当するタンパク質のピークと一致した。
【０３２６】
２：２の四価二重特異性形態よりの活性は、同一の代替分子の複数のＦＺＤ及びＬＲＰへの同時の結合に起因しているのかどうか、又はそれは、受容体に対する多価の結合を必要としない形態によってもたらされる固有の構造に起因するのかどうかを理解するために、Ｏｃｔｅｔ結合試験により、１：１のタンデムｓｃＦｖ形態が、ＦＺＤ及びＬＲＰの両方への同時の結合を許容するか否かを評価する。図１９Ａに示すように、センサー表面に対してＦＺＤ８  ＣＲＤ、次いで１：１タンデムｓｃＦｖのＬ２：５：Ｆ３又はＦ３：５：Ｌ２、またその後ＬＲＰ６  Ｅ３Ｅ４を順次結合させることによって、結合信号の段階的な増加を観察した。これにより、１：１タンデムｓｃＦｖ分子が両受容体に同時に結合することができ、したがってＷＮＴシグナル伝達を誘発する際にこれら分子よりの活性が欠如することは、ＦＺＤ及びＬＲＰ受容体を架橋結合することができないことに起因するものではないということが示唆される。
【０３２７】
２：２の四価二重特異性形態が、１：１の様式で、しかしながら１：１タンデムｓｃＦｖ形態で提供されないシグナル伝達を許容する固有の構造を介して、受容体を結合したままであるかどうかを判断するために。図１９Ｂ及び図２０に示すように、２：２の四価二重特異性分子のフレームワーク上に可能性のある１：１構造の４つの異なる変形体を構築した。これら４つの分子のいずれもが、ＷＮＴシグナル伝達を誘発しなかったが（図１９Ｃ及び図２０Ａ）、これは有効なシグナル伝達には受容体の複数のコピーを架橋結合することが必要であることを示唆する。
【０３２８】
必要とされる、ＦＺＤ受容体のＬＲＰ受容体に対する比をさらに理解するために、２つのＦＺＤバインダーと１つのＬＲＰバインダー（２：１）又は１つのＦＺＤバインダーと組み合わせた２つのＬＲＰバインダー（１：２）のいずれかを、図２１Ａ及び２１Ｄに示すように構築した。図２１に示すように、２：２形態から１つのＦＺＤバインダー又は１つのＬＲＰバインダーを除去してもまだ、β−カテニン依存性シグナル伝達は活性化された。図１９に示す１：１形態は、シグナル伝達を活性化しなかったことから、これら結果は、複数のＦＺＤ及びＬＲＰの同時の結合が、有効なシグナル伝達に必要であるという見解をさらに支持する。１つのＬＲＰバインダーの除去は、１つのＦＺＤバインダーの除去よりも活性への影響がずっと少ないため、これら結果はまた、ＦＺＤ受容体の二量体形成が、シグナル伝達複合体の形成にとってより重要であるということを示唆する。
【０３２９】
古典的ＷＮＴシグナル伝達の有効な誘発のために多価であることの要件が確立されたが、代替分子内のＦＺＤ結合アームのそれぞれが、いくつかの異なるＦＺＤ受容体に対する特異性を有するために、シグナル伝達が異なるＦＺＤ受容体のヘテロ二量体形成から生じ得るか否かが明らかでない。この疑問に対処するために、特異性が重複しない２つのＦＺＤバインダーＦ２及びＦ３を、図２１Ｇに示すように、１つの分子として合わせた。１：２形態（１つのＦＺＤバインダーとＬＲＰバインダーの２つのコピーとを組み合わせた、図２１Ｂ及び２１Ｃ）でのＦ２又はＦ３のいずれかが、それぞれ、２９３ＳＴＦレポーター細胞において低い〜非常に低い活性を示したが、Ｆ２及びＦ３を共にＬＲＰバインダーＬ２の２つのコピーと１つの分子として合わせたもの（これを１：１：２形態と呼び、これは化学量論が１つのＦＺＤと１つの異なるＦＺＤと２つのＬＲＰとである）より、非常に強力で有効な代替分子が産生された（図２１Ｈ）。このことをさらに確認するために、Ｆ２及びＦ３と、ＬＲＰバインダーＬ２の１つのコピーとを伴う分子を構築した（１：１：１：０形態であり、これは化学量論が１つのＦＺＤと１つの異なるＦＺＤと１つのＬＲＰバインダーとである。表６Ｂ及び図２１Ｉ）。Ｆ２又はＦ３単独でＬ２の１つのコピーを伴うものであっても活性を示さなかったにもかかわらず（図２０）、この分子は非常に活性でもある（図２１Ｊ）。Ｆ２及びＦ３は異なるＦＺＤに結合することから、これら結果は、ＦＺＤのヘテロ二量体形成がβ−カテニン依存性シグナル伝達を招くということを示唆する。
【０３３０】
最終的な構成として、図２１Ｋに示すように、２つの異なるＦＺＤ結合アームと２つの異なるＬＲＰ結合アームとをもつ代替分子（１：１：１：１形態）も構築した。興味深いことに、ＬＲＰバインダーＬ１を含有する代替分子が、ＷＮＴ３Ａと比較してずっと低いＥｍａｘを一貫して生じたが、１：１：１：１形態の文脈でＬ２と合わせた場合には、非常に強力で有効な分子を産生したことに留意されたい（図２１Ｌ）。
【０３３１】
観察した全ては、合わせて、柔軟である新規の代替的なＷＮＴプラットフォームが、あらゆるＦＺＤ／ＬＲＰ特異性の組み合わせを生じることが可能であり、そして非常に強力で活性な分子を生成可能であるということを示す。
【０３３２】
上記に記載した様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することが可能である。本明細書で言及した、ならびに／又は出願データシートに列記した、米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許出版物の全ては、それらの全体として、参照により本明細書で援用する。実施形態の態様は、様々な特許、出願及び公開公報の概念を採用するために必要であれば、変形して、さらなる実施形態を提供することが可能である。上記の詳細な説明を踏まえて、実施形態に対してこれら変更及び他の変更をなすことが可能である。
【０３３３】
概して、以下の特許請求の範囲において用いた語は、明細書及び特許請求の範囲に開示する特定の実施形態に請求項を限定するように解釈されるべきではないが、当該請求項に与えられるものと均等の全範囲に加えて、全てのあり得る実施形態を含めるように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
2021529796.tif 000087
【図３−２】
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【図４−１】
2021529796.tif 000089
【図４−２】
2021529796.tif 000090
【図４−３】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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