(57)【要約】  本発明は、ＬＳＤ１阻害剤である化合物ＩＩＩ及びその結晶型、並びに当該化合物及びＬＳＤ１関連疾患を治療する医薬の製造におけるその結晶型の使用を開示する。2021530565.tif 000015【選択図】なし
2021530565.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
2021530565.tif 000014
以上の式に示す化合物ＩＩＩ。
【請求項２】
Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンは、以下の２θ角度、即ち４．７２±０．２°、１４．２４±０．２°及び２１．７８±０．２°で特徴的回折ピークを有する、化合物ＩＩＩの結晶型Ａ。
【請求項３】
Ｘ線粉末回折パターンは、以下の２θ角度、即ち４．７２±０．２°、１４．２４±０．２°、１６．２８±０．２°、１７．１４±０．２°、２０．７２±０．２°、２１．７８±０．２°、２３．９８±０．２°及び２４．９６±０．２°で特徴的回折ピークを有する、請求項２記載の結晶型Ａ。
【請求項４】
Ｘ線粉末回折パターンは、以下の２θ角度、即ち４．７２±０．２°、１４．２４±０．２°、１６．２８±０．２°、１７．１４±０．２°、１７．５８±０．２°、１８．７０±０．２°、２０．７２±０．２°、２１．７８±０．２°、２３．９８±０．２°、２４．９６±０．２°及び２６．２２±０．２°で特徴的回折ピークを有する、請求項３記載の結晶型Ａ。
【請求項５】
Ｘ線粉末回折パターンは、以下の２θ角度、即ち４．７２１°、９．４７９°、１４．２４２°、１６．２７９°、１７．１４１°、１７．５８１°、１８．０８２°、１８．７０２°、２０．７１９°、２１．７８０°、２２．２７８°、２３．９７８°、２４．９５９°、２６．２２°、２６．７７９°、２７．３５８°、２７．９７８°、２８．６５６°、２９．２４４°、３０．７３８°、３２．６９９°、３３．１５９°、３３．９４０°、３５．２０１°及び３７．６３７°で特徴的回折ピークを有する、請求項４記載の結晶型Ａ。
【請求項６】
ＸＲＰＤパターンは、基本的に図１に示すようなものである、請求項５記載の結晶型Ａ。
【請求項７】
示差走査熱量曲線（ＤＳＣ）は、１９４．６６±３℃で１つの放熱ピークの開始点を有する、請求項２〜６のいずれか一項記載の結晶型Ａ。
【請求項８】
ＤＳＣサーモグラムは、基本的に図２に示すようなものである、請求項７記載の結晶型Ａ。
【請求項９】
熱重量解析曲線（ＴＧＡ）は、１９４．２１±３℃で重量損失が１．３３１％となる、請求項２〜６のいずれか一項記載の結晶型Ａ。
【請求項１０】
ＴＧＡサーモグラムは、基本的に図３に示すようなものである、請求項９記載の結晶型Ａ。
【請求項１１】
ＬＳＤ１関連疾患を治療する医薬の製造における、請求項１記載の化合物ＩＩＩ或いは請求項２〜１０のいずれか一項記載の結晶型Ａの使用。
【請求項１２】
肺癌、特に小細胞肺癌を治療する医薬の製造における、請求項１記載の化合物ＩＩＩ或いは請求項２〜１０のいずれか一項記載の結晶型Ａの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＳＤ１阻害剤である化合物ＩＩＩ及びその結晶型、並びにＬＳＤ１関連疾患を治療する医薬の製造における当該化合物及びその結晶型の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願は、出願日２０１８年７月２０日付き出願されたＣＮ２０１８１０８０４０６８．３に基づいて、優先権を主張する。
【０００３】
エピジェネティクスは、メチル化や脱メチル化などのようなヒストンに対する共有修飾、メチル化やメチロール化などようなＤＮＡに対する共有修飾、及び核クロマチンの組み換えを含む様々なメカニズムによって遺伝子の発現を制御する。これらの修飾はＤＮＡの基礎配列を変えないが、このようなエピジェネティクスの変化は、細胞分裂によって細胞ライフサイクル全体または細胞反復過程に持続的に存在する可能性がある［Ａｄｒｉａｎ  Ｂｉｒｄ，Ｎａｔｕｒｅ，２００７，３９６−３９８］。そのため、エピジェネティクス機能異常は、様々な実体腫瘍、血液腫瘍、ウイルス感染、神経異常などの様々な疾患の病理過程を引き起こし、関与する。そのため、エピジェネティクスは、現在、医薬開発分野の研究の焦点となっている。リシン特異的脱メチル化酵素（ＬＳＤ１はＫＤＭ１Ａとも呼ばれる）は、２００４年に発見された初めての脱メチル化酵素であり、フラビンアデニディヌクレオチド（ＦＡＤ）依存のアミノオキシダーゼファミリーに属する。ＬＳＤ１の構造は、Ｎ−末端のＳＷＩＲＭドメイン、Ｃ−末端のアミノオキシダーゼドメイン（ＡＯＬ）、及び中央に突出するＴｏｗｅｒドメインという３つの主要部分を含む。Ｃ−末端のアミノオキシダーゼドメインは２つの活性ポケットを含み、１つはＦＤＡと結合するためのサイトであり、もう１つは基質を識別してそれと結合するためのサイトである。ＳＷＩＲＭドメインの機能について、明確な結論はないが、ＦＡＤや基質との結合に直接関与していないもの、この領域の変異や除去はＬＳＤ１の活性を低下させるため、この領域は配座を調整することにより活性領域の作用に影響を及ぼす可能性があると推察される。ＴｏｗｅｒドメインはＬＳＤ１と他のタンパク質因子との結合ドメインである。ＬＳＤ１は異なるタンパク質因子と結合した後、異なる基質に作用することにより、ヒストン及び遺伝子の発現にそれぞれの制御作用を果たす。例えば、ＬＳＤ１はＣｏＲＥＳＴと結合すると、ヒストンＨ３Ｋ４に優先的に作用し、脱メチル化により活性化に関与するヒストンマーカーを除去し、遺伝子転写を阻害する。一方、アンドロゲン受容体タンパク質と結合すると、組換えされたＬＳＤ１がＨ３Ｋ９に優先的に作用し、脱メチル化によりアンドロゲン受容体に関連する遺伝子転写が活性化される。また、ＬＳＤ１には、ｐ５３、Ｅ２Ｆ１、ＤＮＭＴ１、ＭＹＰＴ１などの非ヒストン受容体もある。
【０００４】
ＬＳＤ１はＦＡＤ依存のアミノオキシダーゼであり、その中、プロトン転移が最も可能な酸化機構であると考えられる。まず、プロトン転移により基質のＮ−ＣＨ3結合がイミド結合に変換され、このイミドイオン中間体が加水分解反応を起こし、メチル除去されたアミンを生成しながら、ホルムアルデヒドを生成する。この触媒サイクルの過程で、ＦＡＤはＦＡＤＨ2に還元され、その後、一分子の酸素によりＦＡＤに酸化され、同時に一分子のＨ2Ｏ2が生成される。
【０００５】
ＬＳＤ１はエピジェネティクスに不可欠なレギュレータであり、脱メチル化作用によりヒストンを修飾するため、生体内の「消しゴム」酵素とも呼ばれている。ＬＳＤ１は遺伝子の発現を制御し、さらに細胞の増殖と分化過程を制御することができる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、化合物ＩＩＩを提供する。
【０００７】
【化２】
2021530565.tif 000003
【０００８】
本発明は、さらに、Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンが以下の２θ角度で特徴的回折ピークを有する化合物ＩＩＩの結晶型Ａを提供する：４．７２±０．２°、１４．２４±０．２°及び２１．７８±０．２°。
【０００９】
本発明のいくつかの形態では、上記の結晶型ＡのＸ線粉末回折パターンは、以下の２θ角度で特徴的回折ピークを有する：４．７２±０．２°、１４．２４±０．２°、１６．２８±０．２°、１７．１４±０．２°、２０．７２±０．２°、２１．７８±０．２°、２３．９８±０．２°及び２４．９６±０．２°。
【００１０】
本発明のいくつかの形態では、上記の結晶型ＡのＸ線粉末回折パターンは、以下の２θ角度で特徴的回折ピークを有する：４．７２±０．２°、１４．２４±０．２°、１６．２８±０．２°、１７．１４±０．２°、１７．５８±０．２°、１８．７０±０．２°、２０．７２±０．２°、２１．７８±０．２°、２３．９８±０．２°、２４．９６±０．２°及び２６．２２±０．２°。
【００１１】
本発明のいくつかの形態では、上記の結晶型ＡのＸ線粉末回折パターンは、以下の２θ角度で特徴的回折ピークを有する：４．７２１°、９．４７９°、１４．２４２°、１６．２７９°、１７．１４１°、１７．５８１°、１８．０８２°、１８．７０２°、２０．７１９°、２１．７８０°、２２．２７８°、２３．９７８°、２４．９５９°、２６．２２°、２６．７７９°、２７．３５８°、２７．９７８°、２８．６５６°、２９．２４４°、３０．７３８°、３２．６９９°、３３．１５９°、３３．９４０°、３５．２０１°及び３７．６３７°。
【００１２】
本発明のいくつかの形態では、上記の結晶型ＡのＸＲＰＤパターンは、基本的に図１に示すようなものである。
本発明のいくつかの形態では、上記の結晶型ＡのＸＲＰＤパターンの解析データは、表１に示すようなものである。
【００１３】
【表１−１】
2021530565.tif 000004
【００１４】
本発明のいくつかの形態では、上記の結晶型Ａの示差走査熱量曲線（ＤＳＣ）は、１９４．６６±３℃で放熱ピークの開始点を有する。
本発明のいくつかの形態では、上記の結晶型ＡのＤＳＣサーモグラムは、基本的に図２に示すようなものである。
【００１５】
本発明のいくつかの形態では、上記の結晶型Ａの熱重量解析曲線（ＴＧＡ）は、１９４．２１±３℃で重量損失が１．３３１％となる。
本発明のいくつかの形態では、上記の結晶型ＡのＴＧＡサーモグラムは、基本的に図３に示すようなものである。
【００１６】
本発明は、さらに、ＬＳＤ１関連疾患を治療する医薬の製造における上記の化合物ＩＩＩ或上記の結晶型Ａの使用を提供する。
本発明は、さらに、肺癌、特に小細胞肺癌を治療する医薬の製造における上記の化合物ＩＩＩ或上記の結晶型Ａの使用を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明化合物ＩＩＩ及びその結晶型Ａは、良好なＬＳＤ１阻害活性及び優れた体内投与効力を有し、かつ、そのフリー塩基及びその他の塩と比較して、良好な安定性を有し、光・熱・湿度による影響が小さく、溶解性が非常によく、製薬における見込みが良い。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】化合物ＩＩＩの結晶型ＡのＣｕ−Ｋα照射によるＸＲＰＤパターンである。
【図２】化合物ＩＩＩの結晶型ＡのＤＳＣサーモグラムである。
【図３】化合物ＩＩＩの結晶型ＡのＴＧＡサーモグラム。
【図４】化合物ＩＩＩの結晶型ＡのＤＶＳ等温線である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義及び説明
特に明記されていない限り、本明細書で使用する以下の用語及び語句は以下の意味を含むことを目的とする。一つの特定な語句又は用語が特に定義されない場合、未確定又は不明瞭とされるべきでなく、一般的な意味に従って理解されるべきである。商品名が現れた場合、それに対応する商品又はその活性成分を指すことを目的とする。
【００２０】
本発明の中間体化合物は、以下に挙げられる具体的な実施形態、それとその他の化学合成方法とを組み合わせてなる実施形態、及び当業者によく知られる同等な組み替え形態を含む、当業者によく知られる複数の合成方法により製造されることができ、好ましい実施形態は、本発明の実施例を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明の具体的な実施形態の化学反応は、適切な溶媒において完成されるものであり、前記の溶媒は、本発明の化学変化及び必要な試薬及び材料に適する必要がある。本発明の化合物を取得するために、当業者は、場合によって、既知の実施形態に基づいて合成工程又は反応の流れを改変又は選択する必要がある。
【００２２】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は、本発明になんらかの限定をするものではない。
本発明で使用される全ての溶媒は、市販のものであり、さらなる精製を必要なく使用することができる。
【００２３】
本発明で使用される溶媒は、市販により入手することができる。本発明では、以下の略称を採用する。ＤＣＭは、ジクロロメタン；ＤＭＦは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシド；ＥｔＯＨは、エタノール；ＭｅＯＨは、メタノール；ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸；ＴｓＯＨは、ｐ−トシル酸；ｍｐは、融点；ＥｔＳＯ3Ｈは、エタンスルホン酸；ＭｅＳＯ3Ｈは、メタンスルホン酸；ＡＴＰは、アデノシン三リン酸；ＨＥＰＥＳは、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸；ＥＧＴＡは、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）テトラ酢酸；ＭｇＣｌ2は、二塩化マグネシウム；ＭｎＣｌ2は、二塩化マンガン；ＤＴＴは、ジチオトレイトール；ＤＣＣは、ジシクロヘキシルカルボジイミド；ＤＭＡＰは、４−ジメチルアミノピリジンを示す。
【００２４】
本発明のＸ線粉末回折（Ｘ−ｒａｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ，ＸＲＰＤ）法
機器型番：ＤＸ−２７００ＢＨ  Ｘ線回折機
測定方法：約１０〜２０ｍｇ試料をＸＲＰＤ検出に使用する。
詳細なＸＲＰＤパラメータは、以下の通りである。
線源：  Ｃｕ，ｋ−Ａｌｐｈａｌ  （λ＝１．５４１８４A）
管電圧：４０ｋＶ，管電流：３０ｍＡ
発散スリット：１ｍｍ
第１のソーラースリット：２８ｍｍ，第２のソーラースリット：２８ｍｍ
受光スリット：０．３ｍｍ，散乱防止スリット：１ｍｍ
測定時間：０．５  ｓ
スキャン角度範囲：３〜４０ｄｅｇ
ステップ角度：０．０２ｄｅｇ
【００２５】
本発明の示差熱量解析（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ，ＤＳＣ）方法
機器型番：ＴＡ  Ｑ２０００示差走査熱量計
測定方法：試料（〜１ｍｇ）をとり、ＤＳＣアルミパン内に置いて測定を行い、５０ｍＬ／ｍｉｎ  Ｎ2条件で、以１０℃／ｍｉｎの昇温速率で試料を３０℃（室温）から３００℃（又は３５０℃）まで加熱する。
【００２６】
本発明の熱重量解析（Ｔｈｅｒｍａｌｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＴＧＡ）方法
機器型番：ＴＡ  Ｑ５０００熱重量解析計
測定方法：試料（２〜５ｍｇ）をとり、ＴＧＡプラチナパン内に置いて測定を行い、２５ｍＬ／ｍｉｎ  Ｎ2条件で、以１０℃／ｍｉｎの昇温速率で試料を室温から３００℃又は重量損失２０％となるまで加熱する。
【００２７】
本発明の動的蒸気吸着解析（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｖａｐｏｒ  Ｓｏｒｐｔｉｏｎ，ＤＶＳ）方法
機器型番：ＳＭＳ  ＤＶＳ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ動的蒸気吸着計
測定条件：試料（１０〜１５ｍｇ）をとり、ＤＶＳ試料プレートに置いて測定を行う。
【００２８】
詳細なＤＶＳパラメータは、以下の通りである。
温度：２５℃
バランス：ｄｍ／ｄｔ＝０．０１  ％／ｍｉｎ（最短：１０ｍｉｎ，最長：１８０ｍｉｎ）
乾燥：０％ＲＨで１２０ｍｉｎ乾燥する
ＲＨ（％）測定勾配：１０％
ＲＨ（％）測定勾配範囲：０％−９０％−０％
吸湿性評価の分類は以下の通りである。
【００２９】
【表１−２】
2021530565.tif 000005
【００３０】
注：ΔＷ％は、被験品が２５±１℃及び８０±２％ＲＨでの吸湿による重量増加である。
【実施例】
【００３１】
本発明の内容をより理解させるために、以下に具体的な実施例を参照しながらさらに説明するが、具体的な実施形態は、本発明の内容に限定するものでない。
実施例１：化合物Ｉの製造
【００３２】
【化３】
2021530565.tif 000006
【００３３】
化合物水酸化ナトリウム（２７９ｇ，６．９９ｍｏｌ）を水（３．００Ｌ）に溶解して、温度を１０℃程度に制御しながら化合物Ａ（９９７ｇ，３．４９ｍｏｌ）を段階的に分けて添加し、固体が完全に溶解し、酢酸エチル（２．００Ｌｘ２）で抽出し、有機相を合併し、有機相を順次に水（１．５０Ｌ）、飽和食塩水（１．５０Ｌ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、ろ液を減圧濃縮し、化合物Ｉを得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．１８−７．１４（ｍ，２Ｈ）７．０７−７．０５（ｍ，１Ｈ）６．９４−６．９２（ｍ，２Ｈ）２．４７−２．４４（ｍ，１Ｈ）１．７８−１．７６（ｍ，１Ｈ）０．９７−０．９４（ｍ，１Ｈ）０．９２−０．８９（ｍ，１Ｈ）。
【００３４】
実施例２：化合物ＩＩの製造
【００３５】
【化４】
2021530565.tif 000007
【００３６】
第１工程
化合物１（２６０ｇ，１．８７ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２．００Ｌ）及びメタノール（２００ｍＬ）に溶解して、温度を２０℃に制御しながら水素化ホウ素ナトリウム（７０．８ｇ，１．８７ｍｏｌ）を段階的に分けて添加し、反応液を２０℃で１８時間撹拌した。０℃で飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２．００Ｌ）を滴下し、気泡の生成が停止するまで反応をクエンチングし、少量の固体が生成した。濾過し、固体残渣を酢酸エチル（１．００Ｌｘ２）で洗浄し、ろ液に飽和となるまで固体塩化ナトリウムを添加し、液相分離し、有機相を飽和食塩水（１．００Ｌ）で洗浄した。合併された水相を酢酸エチル及びテトラヒドロフランの混合溶液（酢酸エチル：テトラヒドロフラン＝１０:１，１．００Ｌｘ３）で抽出し、合併された有機相を飽和食塩水（１．００Ｌ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧濃縮し、化合物２を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ３．６３（ｓ，２Ｈ）２．２０（ｓ，１Ｈ）１．２９（ｄｄ，Ｊ1＝５．２  Ｈｚ，Ｊ2＝２．０  Ｈｚ，２Ｈ）０．９９（ｄｄ，Ｊ1＝５．２  Ｈｚ，Ｊ2＝２．０  Ｈｚ，２Ｈ）。
【００３７】
第２工程
化合物２（１０１ｇ，１．０４ｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（１．５０Ｌ）に溶解して、温度を５℃から１０℃まで制御しながら、デスマーチン試薬（４８６ｇ，１．１４ｍｏｌ）を段階的に分けて添加し、反応液を２５℃で１２時間撹拌し、温度を１５℃に制御しながら、反応液にゆっくり飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（４．００Ｌ）を添加し、さらにゆっくりと飽和硫代硫酸ナトリウム溶液（４．００Ｌ）を添加し、３０分解撹拌し、静置で液相分離し、水相をジクロロメタン（１．００Ｌｘ３）で抽出し、有機相を合併し、有機相を順次に水（１．００Ｌｘ１）、飽和食塩水（１．００Ｌｘ１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧濃縮し、化合物３を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ９．３１（ｓ，１Ｈ）１．７１−１．６８（ｍ，４Ｈ）。
【００３８】
第３工程
化合物Ｉ（９７．５ｇ，７３２ｍｍｏｌ）及び化合物３（８３．５ｇ，８７８ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（１．５０Ｌ）に溶解して、酢酸（４．４０ｇ，７３．２ｍｍｏｌ）を反応液に添加し、反応液を２６℃で４時間撹拌し、トリアセチルオキシ水素化ホウ素ナトリウム（２３２ｇ，１．１０ｍｏｌ）を添加し、反応液を２５℃で１２時間撹拌し、反応液に気泡の生成が停止するまでゆっくりと飽和炭酸水素ナトリウム溶液（３．５０Ｌ）を添加し、静置で液相分離し、水相をジクロロメタン（１．００Ｌｘ１）で抽出し、有機相を合併し、減圧濃縮で有機溶媒を除去し，残留物に水（８００ｍＬ）を添加し、塩酸水溶液（１Ｍ）でｐＨ３まで調整し、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（８００ｍＬｘ２）で抽出し、水相を飽和炭酸水素ナトリウムでｐＨ８まで調整し、ジクロロメタン（１．００Ｌｘ２）で抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮し、化合物４を得た。
【００３９】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．２９−７．２６（ｍ，２Ｈ）７．１９−７．１６（ｍ，１Ｈ）７．０６−７．０４（ｍ，２Ｈ）２．８３（ｓ，２Ｈ）２．５１−２．４８（ｍ，１Ｈ）２．０１−１．９６（ｍ，１Ｈ）１．２８−１．２４（ｍ，２Ｈ）１．１８−１．１３（ｍ，１Ｈ）１．０５−１．０１（ｍ，１Ｈ）０．８８−０．７９（ｍ，２Ｈ）。
ＭＳ−ＥＳＩ  計算値［Ｍ＋Ｈ］+  ２１３，実測値２１３。
【００４０】
第４工程
化合物４（１１３ｇ，５３４ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１．２０Ｌ）及び水（３００ｍＬ）に溶解して、ジｔ−ブチルジカルボネート（１２８ｇ，５８８ｍｍｏｌ）及び一水和水酸化リチウム（２６．９ｇ，６４１ｍｍｏｌ）を反応液に添加し、反応液を２５℃で１２時間撹拌し、塩酸水溶液（１Ｍ）でｐＨ３まで調整し、酢酸エチル（８００ｍＬｘ２）で抽出し、有機相を飽和食塩水（１．００Ｌｘ１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮し、残留物にｎ−ヘプタン（１．００Ｌ）を添加し、１２時間撹拌し、大量な白色固体が生成し、濾過し、濾過ケーキを減圧乾燥して、化合物ＩＩを得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．２３−７．２１（ｍ，２Ｈ）７．１３−７．１０（ｍ，１Ｈ）７．０７−７．０５（ｍ，２Ｈ）３．４２−３．３１（ｍ，２Ｈ）２．９０−２．８８（ｍ，１Ｈ）２．１０−２．０５（ｍ，１Ｈ）１．３７（ｓ，９Ｈ）１．２８−１．１６（ｍ，４Ｈ）１．００−０．９０（ｍ，２Ｈ）。ＭＳ−ＥＳＩ  計算値［Ｍ＋Ｈ］+  ３１３，実測値３１３。
【００４１】
実施例３：化合物ＩＩＩ及びその結晶型Ａの製造
【００４２】
【化５】
2021530565.tif 000008
【００４３】
第１工程
室温条件で、化合物ＩＩ（２０２ｇ，６４７ｍｍｏｌ）を無水エタノール（５００ｍＬ）に溶解して、撹拌しながらジイソプロピルエチルアミン（２０９ｇ，１．６２ｍｏｌ）及び塩酸ヒドロキシアミン（９０．０ｇ，１．３０ｍｏｌ）を添加した。反応液を８０℃まで昇温し、撹拌しながら１６時間反応した。反応液を室温まで冷却し、減圧濃縮してエタノールを除去し、残留物を酢酸エチル（２．００Ｌ）で溶解し、有機相を水（５００ｍＬｘ３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、ろ液を濃縮し、濃縮物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で溶解し、撹拌条件で混合物にｎ−ヘプタン（２．００Ｌ）を添加し、１２時間撹拌し、白色固体が析出し、濾過し、濾過ケーキをｎ−ヘプタン（２００ｍＬ）で洗浄し、濾過ケーキを４５℃条件で１２時間真空乾燥し、化合物５を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ８．９２（ｓ，１Ｈ）７．２７−７．２３（ｍ，２Ｈ）７．１６−７．０８（ｍ，３Ｈ）５．２６（ｓ，２Ｈ）３．５３−３．５０（ｍ，１Ｈ）３．３２−３．２８（ｍ，１Ｈ）２．７８−２．７６（ｍ，１Ｈ）２．０３−２．００（ｍ，１Ｈ）１．３３（ｓ，９Ｈ）１．１４−１．１１（ｍ，２Ｈ）０．７１−０．５９（ｍ，４Ｈ）。ＭＳ−ＥＳＩ  計算値［Ｍ＋Ｈ］+  ３４６，実測値３４６。
【００４４】
第２工程
化合物６（１２６ｇ，５３２ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．４０Ｌ）に溶解して、３０℃で窒素保護でカルボニルジイミダゾール（８８．８ｇ，５５７ｍｍｏｌ）を添加し、そして３時間撹拌し、反応液に化合物５（１７５ｇ，５０６ｍｍｏｌ）を添加し、反応液を１１０℃まで昇温し、１２時間撹拌反応した。反応液を室温まで冷却し、反応液を撹拌条件でゆっくりと水（１４Ｌ）に添加し、大量な白色固体が析出し、濾過し、濾過ケーキを水（３Ｌｘ３）で洗浄し、濾過ケーキを３０℃条件で真空乾燥し、化合物７を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．２８−７．２３（ｍ，２Ｈ）７．１７−７．１４（ｍ，１Ｈ）７．０６−７．０５（ｍ，２Ｈ）４．４３−４．４１（ｍ，１Ｈ）３．８８−３．７０（ｍ，２Ｈ）３．４８−３．４７（ｍ，１Ｈ）２．７６−２．７３（ｍ，２Ｈ）２．１４−２．０７（ｍ，５Ｈ）１．６４−１．６１（ｍ，２Ｈ）１．４６（ｓ，９Ｈ）１．４１（ｓ，９Ｈ）１．２４−１．００（ｍ，７Ｈ）。ＭＳ−ＥＳＩ  計算値［Ｍ＋Ｎａ］+  ５７５，実測値５７５。
【００４５】
第３工程
化合物７（２４０ｇ，４３４ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２４０ｍＬ）に溶解して、０℃で撹拌条件で塩酸酢酸エチル溶液（４Ｍ，８２０ｍＬ）を添加し、０℃〜２５℃で３時間撹拌反応し、大量な白色固体が析出し、濾過し、濾過ケーキを酢酸エチル（５００ｍＬｘ５）で洗浄し、濾過ケーキを４０℃条件で真空乾燥し、化合物ＩＩＩを得た。化合物ＩＩＩを無水エタノール（１．２０Ｌ）に添加し、撹拌しながら昇温し、固体が全部溶解するまで還流し、熱のまま濾過して、機械的不純物を除去し、ろ液に少量の固体が析出し、引き続き固体が全部溶解するまで還流し、撹拌を停止し、ろ液を１から２時間ごとに１０℃〜２０℃降温し、４５℃まで降温した後に１２時間温度を維持し、大量な白色固体が析出し、ろ液を再び１から２時間ごとに１０℃〜２０℃降温し、２５℃まで降温し、均一に撹拌し、濾過し、濾過ケーキをイソプロパノール（２６０ｍＬｘ３）で洗浄し、濾過ケーキを４５℃条件で真空乾燥し、ＸＲＰＤにより検出し、化合物ＩＩＩの結晶型Ａを得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ  ７．３２−７．２９（ｍ，２Ｈ）７．２５−７．２１（ｍ，１Ｈ）７．１７−７．１４（ｍ，２Ｈ）３．７０−３．６２（ｍ，２Ｈ）３．２１−３．１４（ｍ，１Ｈ）３．０９−３．０５（ｍ，１Ｈ）３．０１−２．９５（ｍ，１Ｈ）２．５７−２．５２（ｍ，１Ｈ）２．２６−２．２２（ｍ，２Ｈ）２．１８−２．１５（ｍ，２Ｈ）１．７５−１．６４（ｍ，２Ｈ）１．６１−１．５４（ｍ，３Ｈ）１．４４−１．４１（ｍ，２Ｈ）１．３９−１．３６（ｍ，１Ｈ）１．３４−１．３２（ｍ，２Ｈ）。ＭＳ−ＥＳＩ  計算値［Ｍ＋Ｈ］+  ３５３，実測値３５３。
【００４６】
実施例４：化合物ＩＩＩの結晶型Ａクロリドイオン含有量試験
実験機器：
イオンクロマトグラフィーＩＣＳ５０００
クロマトグラフィーパラメータ：
保護カラム  Ｄｉｏｎｅｘ  ＩｏｎＰａｃ  ＡＧ１１−ＨＣ、４ｘ５０ｍｍ  ｇｕａｒｄ  ｃｏｌｕｍｎ
クロマトグラフィーカラム  Ｄｉｏｎｅｘ  ＩｏｎＰａｃ  ＡＳ１１−ＨＣ、４ｘ２５０ｍｍ  ｇｕａｒｄ  ｃｏｌｕｍｎ
カラム温度  ３０℃
検出モード  導電率検出
流速  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
ＡＳＲＳ−４ｍｍ  抑制器  １８  ｍＡ
サンプル注入体積  ２５  μＬ
解析時間２０  ｍｉｎ
移動相  ７  ｍＭ  ＫＯＨ
【００４７】
試料調製：
３つの５０ｍｇ化合物ＩＩＩの結晶型Ａ試料を正確的に量り、それぞれ試料１、試料２、試料３として標識した。脱イオン水を溶解して定容し、０．２ｍｇ／ｍＬの３つの溶液を調製した。
実験結果：
【００４８】
【表２】
2021530565.tif 000009
【００４９】
実験結論：
化合物ＩＩＩの結晶型Ａクロリドイオン含有量の実測値は、理論値と一致し、実測値と理論値との誤差が０．３％未満であり、本試料は、２つの塩酸塩を含有する。
【００５０】
実施例５：化合物ＩＩＩの結晶型Ａの吸湿性研究
実験材料：
ＳＭＳ  ＤＶＳ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  動的蒸気吸着計
実験方法
化合物ＩＩＩの結晶型Ａ１０〜１５ｍｇをとり、ＤＶＳ試料プレートに置いて測定を行った。
【００５１】
実験結果：
化合物ＩＩＩの結晶型ＡのＤＶＳパターンは、図４に示すように、△Ｗ＝１．１４％であった。
【００５２】
実験結論：
化合物ＩＩＩの結晶型Ａは、２５℃及び８０％ＲＨでの吸湿による重量増加が１．１４％であり、吸湿性ややありとされた。
【００５３】
実施例６：化合物ＩＩＩの結晶型Ａの固体安定性試験
「原薬及び製剤安定性試験指導原則」（中国薬局方２０１５版四部通則９００１）に準じて、化合物ＩＩＩの結晶型Ａの高温（６０℃，開口）高湿（室温／相対的湿度９２．５％，開口）及び光照（合計照度＝１．２×１０6Ｌｕｘ・ｈｒ／近紫外＝２００ｗ・ｈｒ／ｍ2，開口）条件での安定性を考察した。
【００５４】
それぞれ化合物ＩＩＩの結晶型Ａを１０ｍｇ量り、ガラス試料瓶の底部に置いて、薄い一層となるように広げた。高温（６０℃）及び高湿（相対的湿度９２．５％ＲＨ）条件で放置された試料は、アルミホイルで瓶の口を封じ、試料が外気と十分に接触できるように、アルミホイルにいくつかの小穴を刺し開け、相応の定温定湿ケースに置いた。光照試料（開口，アルミホイルカバーなし）及び光照対照品（試料瓶ごとにアルミホイルによりカバーされたもの）を光照ケースに置いた。各時点でそれぞれ２つを量り、本測定の被験試料とした。別に、化合物ＩＩＩの結晶型Ａを約５０ｍｇ量り、ＸＲＰＤ測定に用いて、試料瓶をアルミホイルを包んで小穴を開けて、同様に相応の定温定湿ケースに置いた。試料を５日目、１０日目でサンプリング検出（ＸＲＰＤ）され、検出結果は、０日目の初期検出結果と比較して、その試験結果は、以下の表３に示した。
【００５５】
【表３】
2021530565.tif 000010
【００５６】
結論：化合物ＩＩＩの結晶型Ａは、高温、高湿、強い光照条件で良好な安定性を有した。
【００５７】
実施例７：化合物ＩＩＩの結晶型Ａの溶媒安定性試験
適量の化合物ＩＩＩを量り、それぞれ異なるガラスバイアルに添加し、それぞれ適量の溶媒又は溶媒混合物を添加し、懸濁液となった。磁気ローターを添加し、室温に置いた後、上記の試料を定温ホモミキサー（４０℃）に置いて２日間（遮光）震盪した。試料がなるべく懸濁となるように、実験過程中、試験現象によって化合物量及び溶媒量、引いて実験に用いた容器を交換した。（完全溶解の試料は自然的に揮発された）。試験結果は、以下の表４に示した。
【００５８】
【表４】
2021530565.tif 000011
【００５９】
結論：化合物ＩＩＩの結晶型Ａは、溶媒において良好な安定性を有した。
【００６０】
実験例１：化合物ＩＩＩの結晶型ＡのＬＳＤ１に対する阻害作用研究
１．１  実験目的：
本実験の目的は、化合物ＩＩＩの結晶型Ａが１０つの濃度でＬＳＤ１に対する阻害ＩＣ50を評価することにある。二重複で、開始濃度１０μＭ、３倍勾配希釈、異なる日付で二回繰り返した。
【００６１】
１．２  測定条件：
ＬＳＤ１緩衝液成分：５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ７．５，０．０５％ＣＨＡＰＳ，１％ＤＭＳＯ。
反応時間：室温で１時間反応した。
反応過程：
１．２．１  酵素を新鮮に製造された緩衝液に添加した。
【００６２】
１．２．２  ナノリットル級のＡｃｏｕｓｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｃｈｏ  ５５０，ＬａｂＣｙｔｅ  Ｉｎｃ．  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、化合物のＤＭＳＯ溶液を酵素混合物に添加し、室温で３０分間インキュベートした。
【００６３】
１．２．３  基質を新鮮に製造された緩衝液に添加した。
１．２．４  室温で１時間インキュベートした。
１．２．５  検出混合液を用意した。
【００６４】
１．２．６  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎでデータを読み取った。
１．２．７  Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトでデータを解析した。
１．３  測定結果：
【００６５】
【表５】
2021530565.tif 000012
【００６６】
結論：本実験は、酵素蛍光カプリング法で化合物ＩＩＩの結晶型ＡのＬＳＤ１に対する阻害作用を解析し、結果として、化合物ＩＩＩの結晶型ＡがＬＳＤ１に著しい阻害作用を有し、ＩＣ50＝８ｎＭであったことを示した。
【００６７】
実験例２：化合物ＩＩＩの結晶型Ａのヒト小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ１４１７細胞皮下異種移植腫瘍ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスモデルに対する体内薬力学的研究
２．１  実験目的
本実験の目的は、本発明化合物ＩＩＩの結晶型Ａのヒト小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ１４１７細胞皮下異種移植腫瘍に対するＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスモデルでの体内薬力についての評価を研究することにある。
【００６８】
２．２実験動物：
種属：マウス
品系：ＣＢ−１７  ＳＣＩＤ  マウス
週齢及び体重：６−８週齢、体重：１６−２１グラム
性別：メス
サプライヤー：上海霊暢生物科技有限公司
【００６９】
２．３実験方法及び工程
２．３．１  細胞培養
ヒト小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ１４１７細胞を体外で単層培養し、培養条件として、ＲＰＭＩ−１６４０培地に１０％ウシ胎児血清を加えて、３７℃  ５％ＣＯ2で継代培養した。細胞の飽和度が８０％−９０％となるとき、パンクレアチン−ＥＤＴＡで細胞を消化して回収し、カウントし、１０×１０7個細胞／ｍＬとなるように調整して、ＰＢＳに再懸濁した。
【００７０】
２．３．２  腫瘍細胞接種
０．２ｍＬ（１０×１０6個）ＮＣＩ−Ｈ１４１７細胞（マトリックス添加、体積１：１）を皮下でそれぞれのマウスの右背中に接種し、腫瘍平均体積が約１００−１５０ｍｍ3となる際に投与群を分け始め、ランダムに群を分けて投与を開始した。
【００７１】
２．３．３  被験物の調製
実験用溶媒が０．５％メチルセルロース溶液であり、５ｇメチルセルロースを量り、８００ｍＬ超純水に溶解し、均一に撹拌した後に超純水で１０００ｍＬまでに定容した。被験物を溶媒で溶解し、一定の濃度の均一な溶液を調製し、４℃で保存した。
【００７２】
２．３．４  腫瘍測定及び実験指標
実験指標は、腫瘍の成長が阻害され、延滞され、又は治癒されるかを考察することである。週２回ノギスで腫瘍の直径を測定した。腫瘍体積の計算公式は、：Ｖ＝０．５ａ×ｂ2であり、ａ及びｂは、それぞれ腫瘍の長径及び短径を示した。
化合物の腫瘍阻害効力は、ＴＧＩ（％）で示した。ＴＧＩ（％）は、腫瘍成長の阻害率を反映した。ＴＧＩ（％）＝［（１−（某処理群投与終了際の平均腫瘍体積−当該処理群開始投与際の平均腫瘍体積））／（溶媒対照群治療終了際の平均腫瘍体積−溶媒対照群治療開始際の平均腫瘍体積）］×１００％。溶媒対照群：Ｖｅｈｉｃｌｅ（０．５％メチルセルロース溶液）。
【００７３】
【表６】
2021530565.tif 000013
【００７４】
結論：本発明化合物ＩＩＩの結晶型Ａは、ヒト小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ１４１７異種移植腫瘍モデルに対して、優れた腫瘍阻害効果を有した。
【図１】
2021530565.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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