(57)【要約】  （ｉ）好ましくは１：１のモル比の、ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）、または（ｉｉ）ＬＯＸおよびＣＡＴの両方、例えばＬＯＸＣＡＴを含む融合ポリペプチドを含む組成物、ならびに対象における血中ラクテートレベルを低減させ、血中ピルベートレベルを増加させ、および／または血中ラクテート／ピルベート比を減少させるためにそれを使用する方法。【選択図】図３−２
2021505662.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における血中ラクテートレベルを低減させ、血中ピルベートレベルを増加させ、および／または血中ラクテート／ピルベート比を減少させる方法であって、前記対象に治療有効量の
（ｉ）好ましくは１：１のモル比の、ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）、または
（ｉｉ）アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）を任意選択で含む、ＬＯＸおよびＣＡＴの両方、任意選択でＬＯＸＣＡＴを含む融合ポリペプチド
を投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記対象が、急性乳酸アシドーシス（任意選択で敗血症において）；Ｄ−乳酸毒性（任意選択で短腸症候群において）；ミトコンドリア障害；がん；虚血再灌流傷害；外傷性脳傷害；心停止；または２型糖尿病を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記投与するステップが、（ａ）赤血球（ＲＢＣ）カプセル化；（ｂ）ＲＢＣ外面への酵素付着；（ｃ）操作された骨髄移植；または（ｄ）適切に製剤化された精製酵素の直接注射による、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）、任意選択でＬＯＸＣＡＴを含む融合ポリペプチド。
【請求項５】
アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）を含み、赤血球（ＲＢＣ）にカプセル化され、ＲＢＣ外面に付着され、および／または精製酵素である、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
（ａ）赤血球（ＲＢＣ）カプセル化；（ｂ）ＲＢＣ外面への酵素付着；（ｃ）操作された骨髄移植；または（ｄ）適切に製剤化された精製酵素の直接注射による対象への投与のために製剤化されている、請求項４または５に記載の融合ポリペプチドを含む組成物。
【請求項７】
対象における血中ラクテートレベルを低減させる方法に使用するための、
（ｉ）好ましくは１：１のモル比の、ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）、または
（ｉｉ）ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）の両方、任意選択でＬＯＸＣＡＴを含む融合ポリペプチド
を含む組成物。
【請求項８】
前記対象が、乳酸アシドーシス（任意選択で敗血症において）；Ｄ−乳酸毒性（任意選択で短腸症候群において）；ミトコンドリア障害；がん；または２型糖尿病を有する、請求項７に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
対象を処置する方法であって、
（ａ）対象から血液試料を得ること；
前記試料中の血中ラクテートレベル、血中ピルベートレベル、および／または血中ラクテート／ピルベート比のうちの１つまたは複数を決定すること；ならびに
閾値を超える血中ラクテートレベル、閾値未満の血中ピルベートレベル、および／または閾値を超える血中ラクテート／ピルベート比を有する対象を選択すること
を含む方法によって対象を選択するステップ；ならびに
（ｂ）前記対象に治療有効量の
（ｉ）好ましくは１：１のモル比の、ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）；または
（ｉｉ）ＬＯＸおよびＣＡＴの両方、任意選択でＬＯＸＣＡＴを含む融合ポリペプチド
を含む処置を投与するステップ
を含む、方法。
【請求項１０】
前記対象が、急性乳酸アシドーシス（任意選択で敗血症において）；Ｄ−乳酸毒性（任意選択で短腸症候群において）；ミトコンドリア障害；がん；外傷性脳傷害；心停止；または２型糖尿病を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記投与するステップが、（ａ）赤血球（ＲＢＣ）カプセル化；（ｂ）ＲＢＣ外面への酵素付着；（ｃ）操作された骨髄移植；または（ｄ）適切に製剤化された精製酵素の直接注射による、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記処置が、閾値未満に血中ラクテートレベルを減少させ、閾値を超えて血中ピルベートレベルを増加させ、および／または閾値未満に血中ラクテート／ピルベート比を減少させるのに十分な量および時間で投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＬＯＸＣＡＴ融合ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸４５〜１１９９と少なくとも９０％同一である、請求項１〜１２のいずれか。
【請求項１４】
ＬＯＸＣＡＴ融合ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸４５〜１１９９を含む、請求項１〜１３のいずれか。
【請求項１５】
ＬＯＸＣＡＴ融合ポリペプチドが、アルブミン結合ペプチドを含む、請求項１〜１４のいずれか。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１７年１２月４日に出願された米国特許仮出願第６２／５９４，３２３号、および２０１８年２月１３日に出願された同第６２／６３０，０９３号の利益を主張する。前述の全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による支援を受けた研究または開発
本発明は、国立衛生研究所によって認められた認可番号ＧＭ０９９６８３の下で政府の支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
（ｉ）好ましくは１：１のモル比の、ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）；または（ｉｉ）ＬＯＸおよびＣＡＴの両方、例えばＬＯＸＣＡＴを含む融合ポリペプチドを含む組成物、ならびに対象における血中ラクテートレベルを低減させ、血中ピルベートレベルを増加させ、および／または血中ラクテート／ピルベートおよびＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋を低減させるためにそれを使用する方法が、本明細書に記載されている。
【背景技術】
【０００４】
変化した還元−酸化（酸化還元）均衡によって特徴付けられたヒト疾患の大きなクラスが存在する。これらの疾患には、とりわけ、ミトコンドリア機能不全；ラクテート上昇に関連する障害（例えば、乳酸アシドーシス、がん）、および増加した［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］比に関連する障害；ならびに加齢が含まれる。ミトコンドリア呼吸鎖の疾患は、およそ５０００出生に１人の頻度で生じ、先天性代謝異常の最も大きなグループを構成する（Vafai and Mootha, 2012；Munnich et al., in Scriver’s Online Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease (eds Valle, D. et al.) Ch. 99, dx.doi.org/10.1036/ommbid.127 (McGraw-Hill, 2006)；Shoffner, in Scriver’s Online Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease (eds Valle, D. et al.) Ch. 104, dx.doi.org/10.1036/ommbid.127 (McGraw-Hill, 2006)）。現在、酸化還元不均衡に関連する障害に対する証明された治療は存在していない。代わりに、緩和ケアおよび栄養補助食品が、この疾患に対する標準治療である。
【発明の概要】
【０００５】
対象における血中ラクテートレベルを低減させ、血中ピルベートレベルを増加させ、および／または血中ラクテート／ピルベート比を減少させる（すなわち、ラクテートを減少させ、および／またはピエルベートを増加させる）ための方法が、本明細書において提供される。この方法は、対象に治療有効量の
（ｉ）好ましくは１：１のモル比の、ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）；ならびに／または
（ｉｉ）ＬＯＸおよびＣＡＴの両方、例えばＬＯＸＣＡＴを含む融合ポリペプチド
を投与するステップを含む。
【０００６】
また、対象を処置する方法も本明細書に提供される。この方法は、（ａ）対象から血液試料を得ること；試料中の血中ラクテートレベル、血中ピルベートレベル、および／または血中ラクテート／ピルベート比のうちの１つまたは複数を決定すること；ならびに閾値を超える血中ラクテートレベル、閾値未満の血中ピルベートレベル、および／または閾値を超える血中ラクテート／ピルベート比を有する対象を選択することを含む方法によって対象を選択するステップ；ならびに（ｂ）対象に治療有効量の（ｉ）好ましくは１：１のモル比の、ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）；または（ｉｉ）ＬＯＸおよびＣＡＴの両方、例えばＬＯＸＣＡＴを含む融合ポリペプチドを含む処置を投与するステップを含む。一部の実施形態では、処置は、閾値未満に血中ラクテートレベルを減少させ、閾値を超えて血中ピルベートレベルを増加させ、および／または閾値未満に血中ラクテート／ピルベート比を減少させるのに十分な量および時間で投与される。
【０００７】
一部の実施形態では、対象は、急性乳酸アシドーシス（例えば、敗血症において）；Ｄ−乳酸毒性（例えば、短腸症候群において）；ミトコンドリア障害；がん；虚血再灌流傷害（例えば、脳、心臓、腸、腎臓、肝臓、または他の臓器の）；外傷性脳傷害；心停止；または２型糖尿病を有する。
【０００８】
一部の実施形態では、投与するステップは、（ａ）赤血球（ＲＢＣ）カプセル化；（ｂ）ＲＢＣ外面への酵素付着；（ｃ）操作された骨髄移植；または（ｄ）適切に製剤化された精製酵素の直接注射による。
【０００９】
ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）、例えばＬＯＸＣＡＴを含む融合ポリペプチドもまた、本明細書に提供される。一部の実施形態では、融合ポリペプチドはアルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）を含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、赤血球（ＲＢＣ）にカプセル化されるか、ＲＢＣ外面に付着されるか、または精製酵素である。
【００１０】
（ａ）赤血球（ＲＢＣ）カプセル化；（ｂ）ＲＢＣ外面への酵素付着；（ｃ）操作された骨髄移植；（ｄ）適切に製剤化された精製酵素の直接注射による、対象への投与のために製剤化されている、本明細書に記載されている融合ポリペプチドを含む組成物もまた、本明細書に提供される。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）修飾ＬＯＸＣＡＴであるか、またはそれを含む。
【００１１】
さらに、例えば、対象における血中ラクテートレベルを低減させる方法に使用するための、（ｉ）好ましくは１：１のモル比の、ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）；または（ｉｉ）ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）の両方、例えばＬＯＸＣＡＴを含む融合ポリペプチドを含む組成物が本明細書に提供される。一部の実施形態では、対象は、乳酸アシドーシス（例えば、敗血症において）；Ｄ−乳酸毒性（例えば、短腸症候群において）；ミトコンドリア障害；がん；または２型糖尿病を有する。
【００１２】
一部の実施形態では、本明細書に記載されているＬＯＸＣＡＴ融合ポリペプチドは、Ｎ末端においてカタラーゼ（例えば、大腸菌（E.coli）由来）およびＣ末端においてラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）（例えば、アエロコッカス・ビリダンス（Aerococcus viridans）由来）を含み、他の配向（ＬＯＸはＮ末端にあり、カタラーゼはＣ末端にある）もまた使用されてもよい。
【００１３】
一部の実施形態では、本明細書に記載されているＬＯＸＣＡＴ融合ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸４５〜１１９９と少なくとも９０％同一である。
【００１４】
一部の実施形態では、ＬＯＸＣＡＴ融合ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸４５〜１１９９を含む。
【００１５】
本明細書に使用される場合、「［ラクテート］／［ピルベート］」および「［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］」という表現では、括弧は、比が絶対濃度であることを意味する。
【００１６】
別途定義されない限り、本明細書に使用されている全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明に使用するための方法および材料が本明細書に記載されており、当技術分野において公知の他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および実施例は、例示にすぎず、限定されることを意図するものではない。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。
【００１７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】（Ａ）還元ストレスを軽減するための提案されたスキームの例示的な概略図である。細胞質ＮＡＤＨの大部分は通常、酸化的リン酸化においてＡＴＰを産生するためにミトコンドリア呼吸鎖によって酸化される。しかしながら、呼吸鎖機能不全では、細胞はそれらのＡＴＰ供給について解糖に依存し、ピルベートからラクテートを産生するＬＤＨ反応においてそれらのＮＡＤＨを酸化する。次いでラクテートは血流（細胞外空間）中に拡散する。本発明者らは、ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）の作用を介して細胞外ラクテートをピルベートに変換して戻すことを提案する。次いでこの細胞外ピルベートは、ＮＡＤＨをさらに酸化するためにＬＤＨ反応に関与する。（Ｂ）ラクテートオキシダーゼ反応は１モルのラクテートおよび１モルの酸素を１モルのピルベートに変換し、１モルの望ましくない有毒な副産物である過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を産生する。第２の酵素であるカタラーゼは、Ｈ２Ｏ２を水および酸素に変換することによってＨ２Ｏ２を無毒化する。これらの２つの酵素の組合せの反応全体は、２モルの水を産生するために１モルの酸素を消費している間の、２モルのラクテートから２モルのピルベートへの変換である。
【図２−１】ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）の複合細胞外作用は細胞内ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比をモジュレートする。（Ａ）細胞外［ラクテート］／［ピルベート］比と細胞質［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］比の関係を示す概略図である。細胞外［ラクテート］／［ピルベート］比が減少すると、細胞質［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］が減少する。細胞外ＬＯＸおよびカタラーゼの組合せは、（Ｂ）培地［ラクテート］／［ピルベート］比および（Ｃ）細胞質［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］をアンチマイシン処理した細胞から１．７倍低減させる。［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］比のこの変化は、培地中の１ｍＭピルビン酸ナトリウムの添加と同等である。データは平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３である。スチューデントのｔ検定＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図３−１】細胞外ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）の複合作用は、ミトコンドリア機能不全の化学的および遺伝的モデルにおける増殖欠損を回復させる。ミトコンドリア呼吸鎖機能不全（ＲＣＤ）を有する細胞は、増殖のためにそれらの培地中にピルベートを必要とする。このアッセイでは、ＲＣＤを有する細胞を、ピルベートを含まない培地中でＬＯＸまたは／およびＣＡＴの存在下で７２時間成長させ、細胞数を計数した。（Ａ）このアッセイにおいて使用される異なるミトコンドリア電子伝達鎖阻害剤を示す。（Ｂ）細胞外ＬＯＸおよびＣＡＴの併用は、アンチマイシン（複合体ＩＩＩ阻害剤）処理細胞における成長速度を救出する。ＬＯＸおよびＣＡＴを補充した培地は、（Ｃ）異なるミトコンドリア電子伝達鎖阻害剤によって誘導される増殖欠損、（Ｄ）異なる細胞株における増殖欠損および（Ｅ）ミトコンドリアＲＣＤの遺伝的モデルにおける増殖欠損を回復させる。データは平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３である。スチューデントのｔ検定＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図３−３】図３−１の続きである。
【図４−１】ＬＯＸＣＡＴ：ラクテートオキシダーゼおよびカタラーゼの例示的な操作された融合物。（Ａ）Ｈｉｓ６タグ化融合ＬＯＸＣＡＴおよびＬＯＸＣＡＴｍｕｔ構築物の設計。（Ｂ）組換え野生型ＬＯＸＣＡＴおよび触媒不活性化ＬＯＸＣＡＴｍｕｔは、大腸菌（E.coli）における過剰発現後に精製することができる。（Ｃ）ＬＯＸＣＡＴｍｕｔではなく、精製したＬＯＸＣＡＴは、ラクテートをピルベートに変換する。（Ｄ）ＬＯＸＣＡＴは、アンプレックスレッド（amplex red）蛍光アッセイにおいて測定した、ＲＣＤ患者の血中で検出される濃度よりも高い濃度である、１０ｍＭまでのラクテートで有意なＨ２Ｏ２を産生しない。しかしながら、カタラーゼの阻害剤であるアジ化ナトリウムをＬＯＸＣＡＴおよびラクテートの反応においてインキュベートした場合、アンプレックスレッド蛍光において大幅な増加が観察された。（Ｅ）組換えＬＯＸＣＡＴは、アジ化ナトリウム感受性様式において１００μＭのＨ２Ｏ２をクエンチすることができる。（Ｆ）触媒的に効力のなくなったバリアントＬＯＸＣＡＴｍｕｔではなく、野生型ＬＯＸＣＡＴのみが、ラクテートの存在下で酸素を消費することができる。この酸素消費はカタラーゼ感受性である。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図４−３】図４−１の続きである。
【図４−４】図４−１の続きである。
【図４−５】図４−１の続きである。
【図５−１】単一の操作されたポリペプチドＬＯＸＣＡＴによる還元ストレスの克服。培地に添加した精製ＬＯＸＣＡＴは、アンチマイシン処理したＨｅＬａ細胞において（Ａ）細胞外［ラクテート］／［ピルベート］および（Ｂ）全細胞［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］比を低減させる。（Ｃ）細胞をＬＯＸＣＡＴｍｕｔではなく、ＬＯＸＣＡＴとインキュベートする場合、ＨｅＬａ細胞におけるアンチマイシンによって誘導される増殖欠損は救出される。培地中のＬＯＸＣＡＴもまた、（Ｄ）アンチマイシンで処理したＫ５６２細胞、（Ｅ）ＲＣＤの遺伝的モデルならびに（Ｆ）ピエリシジンおよびオリゴマイシンで処理したＨｅＬａ細胞における細胞増殖を救出する。これらの救出は１ｍＭピルベート媒介細胞成長救出と同等である。データは平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３である。スチューデントのｔ検定＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図５−２】図５−１の続きである。
【図５−３】図５−１の続きである。
【図５−４】図５−１の続きである。
【図６−１】ＬＯＸＣＡＴのｅｘ  ｖｉｖｏ有効性。（Ａ）抗Ｈｉｓ６ウェスタンブロットにより、野生型Ｈｉｓ６−ＬＯＸＣＡＴおよび突然変異体Ｈｉｓ６−ＬＯＸＣＡＴｍｕｔの両方の完全性が２４時間までディッシュにおいて血中で完全なままであることが示される。（Ｂ）ＬＯＸＣＡＴｍｕｔではなく、精製ＬＯＸＣＡＴは、経時的に全血中の［ラクテート］／［ピルベート］比を低減させる。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図７−１】ＬＯＸＣＡＴのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。（Ａ）ＬＯＸＣＡＴは血流中で３０分間安定である。図７Ａは、注射後３０分でのマウス血中のＨｉｓ６−ＬＯＸＣＡＴを検出するためのＨｉｓ６に対するウェスタンブロットを示す。図７Ａ−１は、ウェスタンブロットでの比較のために添加したＨｉｓ６−ＬＯＸＣＡＴ標準物を示すのに対して、図７Ａ−２および図７Ａ−３は、ＬＯＸＣＡＴ標準物と同じ分子量でのＨｉｓ６に対する注射後３０分および３時間での血液試料からのバンドを示す。（Ｂ）ＬＯＸＣＡＴｍｕｔではなく、ＬＯＸＣＡＴは、注射後１５分においてマウス血中の［ラクテート］／［ピルベート］を低減させる。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図８】ＬＯＸＣＡＴは乳酸アシドーシスを低減させることができる。ＮＡＤＨ酸化の方向へのＬＤＨ反応は細胞質プロトン濃度を低減させるので、ＬＤＨ反応をよりＮＡＤＨ酸化に向かって進めることは、血液ｐＨを増加させることによって乳酸アシドーシスを低減させることができる。細胞質の酸性度に寄与するプロトンは、大きな太い灰色のフォントで示されている。
【図９−１】心停止（ＣＡ）／心肺蘇生（ＣＰＲ）モデルに対するＬＯＸＣＡＴの効果：心拍再開（ＲＯＳＣ）後６０分における循環（Ａ）ラクテート／ピルベート比、（Ｂ）ラクテート、および（Ｃ）ピルベートに対するＬＯＸＣＡＴの効果。（Ｄ）ＣＡ／ＣＰＲ後の生存に対するＬＯＸＣＡＴの効果。データは平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝１０である。スチューデントのｔ検定＊Ｐ＜０．０５および＊＊＊＊＊Ｐ＜０．００００１。
【図９−２】図９−１の続きである。
【図９−３】図９−１の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ミトコンドリア呼吸鎖は、細胞代謝において２つの主要な目的を果たす。第１に、それは大部分の細胞のエネルギー供給ＡＴＰを生成する。第２に、それは、他の細胞代謝経路、最も顕著にはトリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルおよび解糖によって生成されたＮＡＤＨを、ＮＡＤＨから酸素へ電子を移動させて水を生じることによって酸化する。これらの二重の役割を考慮して、呼吸鎖機能不全（ＲＣＤ）から生じる著しい代謝異常は、エネルギーストレス（ＡＴＰ産生の低減）および還元ストレス（すなわち、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比の上昇）の両方をもたらす可能性がある。さらに、ＲＣＤは、例えば、ピリミジン生合成経路を含む多くのさらなる経路において複数の二次欠損を引き起こすことが知られている（King and Attardi, 1989）。理想的には、ＲＣＤの治癒は患者のミトコンドリアにおける原発性遺伝病変を修正する。しかしながら、このような処置は、多数の患者組織および細胞を標的とするための遺伝子治療またはタンパク質補充療法を必要とする。さらに、このような「生物学的」療法は、ミトコンドリア疾患の１５０個の異なる遺伝型の各々について特異的に開発される必要があり、それらの各々は非常に稀である。ＲＣＤに対処するためのより一般的な解決策を見つけるために、本発明者らは、還元ストレス成分を軽減するという構想を探求している。
【００２０】
ＡＴＰ（すなわち、エネルギー）不足はＲＣＤ関連疾患の主要な原因であると古典的に考えられているが、本研究は病因の代替的寄与因子としての還元ストレス（ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋の増加）の役割を調査する。還元ストレスが重要な疾患原因機構であると考えるいくつかの理由が存在する：（ａ）ＲＣＤを有する患者は、ＡＴＰの欠損を和らげるために細胞エネルギーの代替源として解糖に切り替えることができる（von Kleist-Retzow et al., 2007）。（ｂ）ＮＡＤＨの再酸化はこの経路を活性化することが知られているので、還元ストレス自体は解糖を阻害することができる（Martinus et al., 1993）。したがって、還元ストレスは、解糖ＡＴＰの生成さえも阻止することによって最終的にエネルギーストレスの原因となる可能性がある。（ｃ）還元ストレスは、多くの生合成経路、例えば、ピリミジン生合成を遮断し、したがって細胞増殖を遮断することができる（Khutornenko et al., 2010；Morais et al., 1982）。以前に実証されているように、水を形成するＮＡＤＨオキシダーゼの細胞内発現は、それらの呼吸鎖が化学的に損傷を受けている場合でさえ、細胞が増殖することを可能にするために還元ストレスを軽減することができる（Titov et al., 2016）。
【００２１】
本方法は、細胞外酵素、すなわち、ＬＯＸおよびＣＡＴまたはＬＯＸおよびＣＡＴを含有する単一のポリペプチドであるＬＯＸＣＡＴの導入に関連し、ＬＯＸおよびＣＡＴの両方は、細胞内還元ストレスを間接的に軽減する。このストラテジーは、ミトコンドリアの根本的な病変を修正せず、むしろ細胞外ラクテート／ピルベート比を酵素的に操作して、細胞内ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比を二次的に調節する。ラクテートは、細胞質酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）によるピルベートの還元によって産生される。この反応は、ＮＡＤＨ分子のＮＡＤ＋への酸化を必要とする（図１Ａ）。ラクテートおよびピルベートの両方は、モノカルボン酸輸送体（ＭＣＴ）によって細胞膜を通って輸送される（Halestrap, 2012）。ＲＣＤにおいてミトコンドリアで産生されたＡＴＰが存在しない場合、細胞はそのエネルギーの必要性を満たすために主に解糖に依存する（Vafai et al., 2016）。解糖はＮＡＤ＋の一定の供給を必要とするので、これらの条件下の細胞はＬＤＨ反応をＮＡＤＨ酸化の方向にさらに進め、最終的には過剰量のラクテートを産生する。実際に、血中ラクテートレベルは、多くの場合、ミトコンドリア疾患において上昇している（Shaham et al., 2010）。古典的に、細胞外ラクテート／ピルベート比は、細胞内ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比に対する代理として使用される（Williamson et al., 1967）。さらに、培地中にこれらの２つの化学物質を過剰に添加することによって細胞外ラクテート／ピルベート比を固定することは、細胞内ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比に影響を及ぼし得ることも示されている（Bucher et al., 1972；Hung et al., 2011）。
【００２２】
本方法は、解糖によって産生された細胞外ラクテートをピルベートに酵素的に変換して戻し、次いでピルベートを細胞に侵入させてＬＤＨ反応に関与させて、ＮＡＤＨのさらなる酸化を可能にすることに基づく。このようなピルベート再生の最終産生物は、細胞外で酸化されたラクテート１モルあたり１モルのＮＡＤＨの酸化である（図１Ａ）。本方法は、ラクテートおよび酸素をピルベートおよび過酸化水素に変換する細菌酵素である、ラクテートオキシダーゼを使用する（図１Ｂ）。第２の酵素であるカタラーゼは、潜在的に有毒な分子である過酸化水素を水および酸素に変換するために使用される（図１Ｂ）。したがって、内因性ＬＤＨと組み合わせた細胞外ＬＯＸおよびＣＡＴの全体的効果は、ミトコンドリア呼吸鎖が正常な細胞において果たす機能である、ＮＡＤＨからＯ２へ電子を移動させて水を生成することである。
【００２３】
ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比は、様々なミトコンドリア疾患（Thompson Legault et al., 2015）および糖尿病（Williamson et al., 1993）を含む、多数のヒト疾患において上昇するので、細胞の酸化還元状態に影響を与えるための細胞によって放出される細胞外代謝産物の酵素的操作は多くの治療的応用を有する。このストラテジーは細胞外で使用することができるので、細胞内修飾またはターゲティングを必要としなくてもよい。この方法は、細胞外ラクテートをピルベートに効果的に変換して細胞酸化還元ホメオスタシスを回復させるために、酵素系を（適切な製剤中で）、例えば静脈内に投与するステップを含むことができる。また、ピルベートおよびラクテートの両方は血液脳関門を横切るので（Boumezbeur et al., 2010；Cremer et al., 1979）、この方法はまた、ＣＮＳ組織における還元ストレスを低減させるために使用することもできる。ヒト疾患を処置するための血中の細菌酵素の使用に関して先例が存在し、例えば、腫瘍細胞にとって必須アミノ酸であるが、健康な細胞にとってはそうではない、血中アスパラギンを枯渇させるアスパラギナーゼが、急性リンパ芽球性白血病を処置するために臨床的に使用される（Muller and Boos, 1998；Mashburn and Wriston, Arch Biochem Biophys. 1964 May;105:450-2;）。
【００２４】
以前は、他のアプローチが、細胞内ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比をモジュレートするために使用されてきた。哺乳動物細胞コンパートメントにおけるラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）（ＬｂＮＯＸと命名）由来の酵素ＮＡＤＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）の発現が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞質またはミトコンドリアＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比のいずれかを特異的に低減させる、酵素ベースのアプローチが記載されている（Titov et al., 2016）。ＬｂＮＯＸ酵素は、ＮＡＤＨ  １モルあたり１モルの酸素を消費し、副産物として水を生成しながら、ＮＡＤＨをＮＡＤ＋に直接変換することによってＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比を乱す。しかしながら、このストラテジーは、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨが細胞透過性ではないので、患者組織の各々にＬｂＮＯＸを導入するための遺伝子治療を必要とするので、その治療的応用において制限される。同様に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性オキシドレダクターゼである、ＮＱＯ１の小分子基質が、細胞内ＮＡＤＨを酸化するために使用されてきた。１つのこのような分子は、ＮＱＯ１によって活性化されて不安定なヒドロキノンになる天然産生物のβ−ラパコンであり、そのヒドロキノンは、２段階の酸化を急速に受けて親化合物に戻り、効果のない酸化還元サイクル（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化）を継続し、このプロセスにおいて毒性スーパーオキシドを生成する（Hwang et al., 2009；Pink et al., 2000；Zhao et al., 2015）。残念ながら、β−ラパコンは低い溶解度およびｉｎ  ｖｉｖｏ半減期（約２０分）を有する（Blanco et al., 2010）。同様に、Ｚｈａｏらは、ＮＱＯ１を介してＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比を減少させる、がん細胞特異的細胞傷害性小分子ＫＰ３７２−１を発見した（Zhao et al., 2015）。β−ラパコンおよびＫＰ３７２−１の両方は、スーパーオキシドおよび過酸化水素を産生することによって重度の酸化ストレスを誘発することが知られている。さらに、Ｋ３７２−１は当初、阻害剤キナーゼＡｋｔとして報告されており（Koul et al., 2006）、この分子が細胞内に複数の標的を有することを示唆している。本組成物および方法は、（ａ）ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋が細胞外でモジュレートされ、いかなる細胞内遺伝子操作も必要とせず、（ｂ）酵素が小分子よりも特異的な効果を有し、（ｃ）有毒な活性酸素種を生成しないので、ＬｂＮＯＸ、β−ラパコンおよびＫＰ３７２−１の欠点を回避する。
【００２５】
ＬＯＸ＋ＣＡＴまたはＬＯＸＣＡＴ
本方法は、好ましくは１：１のモル比でラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）を含む組成物の投与を含む。一部の実施形態では、この方法は、ＬＯＸおよびＣＡＴの両方、例えば、本明細書に記載されているＬＯＸＣＡＴを含む融合ポリペプチドを含む組成物の投与を含む。
【００２６】
ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）
本方法において使用され得るＬＯＸ配列は、オルソログ、ホモログであるか、または配列番号６の全長と少なくとも８０％の同一性を示し、ラクテートおよび酸素をピルベートおよび過酸化水素に変換することができる配列を含む。一部の実施形態では、ＬＯＸ配列は、配列番号６の全長と少なくとも８５％、９０％、９５％、または９９％同一であり、例えば、最大で４１、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、または１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を有する。他の例示的なＬＯＸ配列には、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）（ＧｅｎｅＢａｎｋ：ＡＰＲ２８６２１．１）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＳ４２７９７．１）およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＴＩ７２７９３．１）由来のＬ−ＬＯＸが含まれる。あるいは、グラム陰性土壌細菌ＫＹ６（Xu et al., et al. Appl Biochem Biotechnol (1996) 56: 277）由来またはザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）（Kalnenieks et al., 1998）由来のＤ−ラクテートオキシダーゼを使用することができる。
【００２７】
カタラーゼ（ＣＡＴ）
本方法において使用され得るＣＡＴ配列は、オルソログ、ホモログであるか、または配列番号４と少なくとも８０％の同一性を示し、潜在的毒性分子である過酸化水素を水および酸素に変換することができる配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＴ配列は、配列番号６の全長と少なくとも８５％、９０％、９５％、または９９％同一であり、例えば、最大で１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、または１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を有する。他の例示的なＣＡＴ配列には、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１７４３．１）、ハツカネズミ（Mus musculus）（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０３３９３４．２）、およびカエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１２９３５４０．１）由来のカタラーゼが含まれる。
【００２８】
配列同一性
２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列を最適な比較目的のためにアラインメントする（例えば、ギャップを最適なアラインメントのための第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入することができ、非相同配列は比較目的のために無視することができる）。好ましい実施形態では、比較目的のためにアラインメントされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％であり、一部の実施形態では少なくとも９０％または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置において同一である（本明細書に使用される場合、アミノ酸または核酸「同一性」はアミノ酸または核酸「相同性」と等価である）。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある、ギャップの数、および各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００２９】
配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、デフォルトパラメーター、例えば、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティと共にＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリクスを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｇｃｇ．ｃｏｍにてワールド・ワイド・ウェブで利用可能）におけるＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（(1970) J. Mol. Biol. 48:444-453）アルゴリズムを使用して決定することができる。
【００３０】
ＬＯＸＣＡＴ
一部の実施形態では、任意選択のリンカー、および任意選択にＬＯＸとＣＡＴとの間またはＮ末端もしくはＣ末端に１つまたは複数のさらなる配列を有する、ＬＯＸＣＡＴ融合タンパク質、例えば、本明細書に記載されているＬＯＸ配列およびＣＡＴ配列を含む融合タンパク質が使用される。
【００３１】
好ましい実施形態では、１〜５０アミノ酸のリンカー、例えば、フレキシブルリンカーがＬＯＸとＣＡＴとの間に存在する。これらの融合タンパク質において（または連結構造における融合タンパク質の間で）使用され得るリンカーは、融合タンパク質の機能を妨げない任意の配列を含んでもよい。好ましい実施形態では、リンカーは短く、例えば２〜２０アミノ酸であり、典型的にフレキシブルである（すなわち、グリシン、アラニン、およびセリンなどの高い自由度を有するアミノ酸を含む）。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号７）またはＧＧＧＧＳ（配列番号８）からなる１つまたは複数の単位、例えば、ＧＧＧＳ（配列番号７）またはＧＧＧＧＳ（配列番号８）単位の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリピートを含む。他のリンカー配列も使用することができる。一部の実施形態では、２０アミノ酸のＬ−リンカー（ＡＳＧＡＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＴＳＧＡＴ（配列番号５））を含むリンカーが使用される。
【００３２】
一部の実施形態では、バリアントは、リガンドに対して高い親和性を有する部分、例えば、ＧＳＴ、ＦＬＡＧまたはヘキサヒスチジン配列を含む。このような親和性タグは、組換えバリアントタンパク質の精製を容易にすることができる。
【００３３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、１つまたは複数の酵素切断部位、例えば、トロンビンＬＶＰＲＧＳ（配列番号２）またはエンテロキナーゼ／エンテロペプチダーゼＤＤＤＤＫ（配列番号３）切断部位を含む。他の切断部位、例えば、ヒトライノウイルス（Human Rhinovirus）３Ｃプロテアーゼ；第Ｘａ因子（ＦＸａ）；またはタバコエッチウイルス（Tobacco Etch Virus）プロテアーゼ（ＴＥＶ）も使用することができる。これらの切断部位は、例えば、親和性精製後にタンパク質を回収するために使用することができる。例えば、Waugh et al., Protein Expr Purif. 2011 Dec; 80(2): 283-293を参照のこと。
【００３４】
Ｎ末端において大腸菌（E.coli）由来のカタラーゼおよびＣ末端においてアエロコッカス・ビリダンス（Aerococcus viridans）ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）を組み合わせることによって例示的なＬＯＸＣＡＴ配列を設計した。他の配向（ＬＯＸがＮ末端にあり、カタラーゼがＣ末端にある）も使用することができる。これらの２つのポリペプチドは、Ｌ−２０リンカーとして知られている、２０アミノ酸リンカーによって一緒に融合された。
【００３５】
操作されたＬＯＸＣＡＴ融合ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列：
【００３６】
【化１】
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【００３７】
ＬＯＸＣＡＴを含有するアルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）。
一部の実施形態では、融合タンパク質はアルブミン結合ペプチドを含む。アルブミンは、１９日の半減期を有する血流中の最も豊富なタンパク質（約４５％）である。ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）は、種々の臨床応用のための薬物担体として研究されている。それはまた、最近、より高いｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を生物製剤に付与するために使用されている。アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）（配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＥＷＥＤ（配列番号９））タグ化タンパク質は、血流中で改善された安定性を示した（J Biol Chem. 2002 Sep 20;277(38):35035-43, PLoS ONE 9, e106422 (2014)およびProtein Engineering, Design & Selection vol. 17 no. 10 pp. 731-739, 2004）。融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかにおけるこのアルブミン結合ペプチド配列の付着は、ＬＯＸＣＡＴの血清安定性を改善するために使用することができる。一部の実施形態では、ＡＢＰはＬＯＸＣＡＴ融合タンパク質のＮ末端に含まれる。
【００３８】
ＬＯＸ＋ＣＡＴまたはＬＯＸＣＡＴを患者に送達する方法
いくつかの送達様式のうちのいずれかを、本明細書に記載されているＬＯＸＣＡＴベースの治療のために使用することができる。例えば、（ａ）赤血球（ＲＢＣ）カプセル化（例えば、Muzykantov, 2010に記載されている）、または（ｂ）ＲＢＣ外面への酵素付着（例えば、Shi et al., 2014に記載されている）、または（ｃ）操作された骨髄移植、または（ｄ）適切に製剤化された精製酵素の直接注射（例えば、Pisal et al., 2010に記載されている）を使用して融合ＬＯＸＣＡＴを送達することができる。
【００３９】
Ａ．ＲＢＣカプセル化
ＲＢＣカプセル化アプローチでは、低張透析を使用することによって精製酵素を赤血球に負荷する（Alpar and Lewis, 1985）。このようなカプセル化された酵素は、製剤化された酵素の直接注射と比較して、循環中での半減期の増大を示し、さらに免疫反応を減少させる。ＲＢＣ内の酵素は、通常、他のストラテジーとは異なり、数日間活性を保持し、それによりバイオ医薬品の投薬量を減らすことができる（Muzykantov, 2010）。ＲＢＣカプセル化は、過剰な尿酸を解毒するためのアルペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）由来の尿酸オキシダーゼ（Ihler et al., 1975）およびがん細胞を死滅させるために血液からＬ−アスパラギンを除去するための大腸菌（E.coli）由来のアスパラギナーゼ（Alpar and Lewis, 1985；Domenech et al., 2011；Updike et al., 1976；Agrawal et al., Protein & Peptide Letters, 2013, 20, 392-402）のような非ヒト酵素を使用して血中代謝産物を枯渇させるために使用されている。以前に、ラクテートオキシダーゼはＲＢＣ中にカプセル化することに成功している。ＧａｒｉｎらのＲＢＣは、高ラクテート血症（hyperlactataemia）において過剰なラクテートを枯渇させる目的で２０：１の比にて乳酸モノオキシゲナーゼ（ＬＭＯ）およびラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）の混合物をカプセル化した（Garin et al., 1995）。この酵素ＬＭＯは、１モルの酸素を消費し、副産物として１モルのＣＯ２および１モルのＨ２Ｏを産生している間に１モルのラクテートから１モルのアセテートへの変換を触媒する。Ｇａｒｉｎらは、ＬＭＯおよびＬＯＸのこの組合せが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１〜３０ｍＭの濃度範囲でラクテートを異化することができることを示した。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏでの試みは成功せず、それはおそらく、酵素の酸素容量が高く（両方の酵素は基質１モルあたり１モルの酸素を消費する）、ラクテート代謝が高いからである。Ｇａｒｉｎらの方法は、ラクテートをピルベート、アセテート、Ｈ２Ｏ、Ｈ２Ｏ２およびＣＯ２の混合物に変換した。Ｈ２Ｏ２の血中濃度の増加は酸化的障害をもたらす可能性があり、ＣＯ２濃度の増加は血液ｐＨ不均衡をもたらす可能性がある。
【００４０】
対照的に、ＬＯＸＣＡＴ融合タンパク質を含む本方法は、ラクテートおよび酸素からピルベートおよび水を産生する。ＬＯＸＣＡＴは有毒なＨ２Ｏ２副産物を産生せず、２モルのラクテートあたり１モルの酸素しか消費しない。Ｇａｒｉｎらは、ＬＯＸのＲＢＣカプセル化が可能であり、酵素が活性のままであることを示唆している。同様に、Ｈａｍａｒａｔ  Ｂａｙｓａｌらは、Ｈ２Ｏ２を無毒化するためにカタラーゼおよびＰＥＧ化カタラーゼをＲＢＣ内にカプセル化し（Hamarat Baysal and Uslan, 2001）、機能的カタラーゼもＲＢＣ内に捕捉され得ることを示している。さらに、ＲＢＣはモノカルボン酸輸送体を発現し、ラクテートを取り込むことが知られており（Smith et al., 1997）、したがって本酵素を包囲することにより、循環するラクテートを処理するそれらの能力を妨げてはならない。
【００４１】
一部の実施形態では、ＬＯＸＣＡＴ融合タンパク質は、例えば、Kwon et al., Journal of Controlled Release 139 (2009) 182-189に記載されているように膜転位低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ）を使用してカプセル化され、したがってＬＭＷＰ−ＬＯＸＣＡＴコンジュゲートが本明細書に含まれる。
【００４２】
Ｂ．ＲＢＣの外面への酵素付着
別の送達選択肢は、ＬＯＸＣＡＴをそれらの外面に付着させ、次いでこれらの修飾されたＲＢＣを対象に導入するために、操作されたＲＢＣを使用することである。ＲＢＣは、ソルターゼ反応に適しているＣ末端ＬＰＸＴＧタグを有する膜タンパク質Ｋｅｌｌを発現するように操作されている（Shi et al., 2014）。ソルターゼ反応は、３つのＮ末端グリシン残基を含有する限り、これらの組換えＫｅｌｌ発現ＲＢＣの外面への異なる酵素の付着を可能にする。このようなＲＢＣ付着は、酵素が免疫系を回避し、改善されたタンパク質分解安定性を付与するのに役立つことができる。ＬＯＸ＋ＣＡＴまたはＬＯＸＣＡＴのＮ末端における３つのグリシン残基の付加は、ＲＢＣへの付着のために使用され得、したがってＧＧＧ−ＬＯＸＣＡＴ融合タンパク質が本明細書に含まれる。
【００４３】
Ｃ．操作された骨髄
ＬＯＸ＋ＣＡＴまたはＬＯＸＣＡＴを送達するための別の同様のストラテジーは、操作された骨髄を使用することである。このアプローチでは、最初に対象由来の骨髄を、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、標的酵素遺伝子（ＬＯＸ＋ＣＡＴまたはＬＯＸＣＡＴ）と共に操作する。次いで、対象の成熟した血液細胞の集団が標的酵素を運搬するように、操作された骨髄を対象に再移植する。このストラテジーはＲＢＣカプセル化と同じ利点を有し得る。
【００４４】
Ｄ．非経口投与
直接投与アプローチは、生物製剤を血流に送達するための最も一般的なストラテジーである。医薬組成物は、典型的に、その意図される投与経路と適合するように製剤化されている。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、筋肉内、および皮下が含まれる。
【００４５】
適切な医薬組成物を製剤化する方法は当技術分野において公知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005；およびthe books in the series Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)を参照のこと。例えば、非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；アセテート、シトレートまたはホスフェートなどの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性調節剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口的製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回投与バイアル中に封入することができる。
【００４６】
注射可能な使用に適した医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を含むことができる。静脈内投与に関して、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォール（Cremophor）ＥＬ（商標）（BASF, Parsippany, NJ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合、組成物は無菌でなければならず、容易な注射可能性（syringability）が存在する程度まで流動性でなければならない。組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合、必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の阻止は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
【００４７】
滅菌注射溶液は、必要に応じて、上記に列挙した成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒中に必要な量の活性化合物を組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含有する、滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それらにより、活性成分の粉末に加えて、以前に滅菌濾過されたその溶液から任意のさらなる所望の成分が得られる。
【００４８】
一実施形態では、治療化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤などの、身体からの迅速排出から治療化合物を保護する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性の生体適合性ポリマーが使用されてもよい。このような製剤は、標準的な技術を使用して調製することができるか、または例えばＡｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に得ることができる。リポソーム懸濁液（細胞性抗原に対するモノクローナル抗体を有する選択された細胞を標的とするリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。一部の実施形態では、酵素はＰＥＧ化を用いて製剤化されている（Pisal et al., 2010）。
【００４９】
医薬組成物は、投与のための説明書と一緒に、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。
【００５０】
処置方法
本明細書に記載されている方法は、呼吸鎖機能不全（ＲＣＤ）に関連する障害を処置するための方法を含む。一部の実施形態では、障害は、乳酸アシドーシス（例えば、敗血症において）；Ｄ−乳酸毒性（例えば、短腸症候群において）；ミトコンドリア障害；がん；虚血再灌流傷害；心停止；または２型糖尿病である。一般に、この方法は、このような処置を必要とするか、またはこのような処置を必要とすると決定されている対象に、本明細書に記載されている治療有効量のＬＯＸＣＡＴまたはＬＯＸ＋ＣＡＴを投与することを含む。
【００５１】
この文脈で使用される場合、「処置する」とは、ＲＣＤに関連する障害のうちの少なくとも１つの症状を改善することを意味する。多くの場合、ＲＣＤは過剰量のラクテート蓄積を生じ、したがって処置は、ラクテートレベルの低減、閾値未満の血中ピルベートレベルの増加、および／または血中ラクテート／ピルベート比の減少を生じ得る。増加または減少は、所望の量だけであってもよいか、または閾値を超えるもしくは閾値未満のレベルもしくは比（ration）をもたらすのに十分な量だけであってもよい。ＲＣＤに関連する状態を処置するための本明細書に記載されている治療有効量の化合物の投与は、減少した還元された血中ラクテートレベルを生じる。
【００５２】
この方法は、ラクテートおよびピルベートの一方または両方を測定すること、および任意選択でラクテート／ピルベート比を計算することを含むことができる。例えば、酵素検出、分光法、ＮＭＲ、質量分析（ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、およびそれらの組合せ、例えば、ＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを含む、対象の血中のラクテートおよび／またはピルベートのレベルを測定するための多くの方法が当技術分野において公知である。血中ピルベートレベルについての正常範囲は、使用されるアッセイに応じて変化する可能性があるが、通常、ヒトおよびマウスの両方において５０〜１００μＭである（例えば、Hui et al., Nature. 2017 Nov 2;551(7678):115-118およびHuman Metabolome Database (HMDB, online at hmdb.ca/metabolites/HMDB0000243を参照のこと）。マウス血液中に注射されたＬＯＸＣＡＴは、ピルベート濃度を１５分で５００μＭを上回って増加した。血中ラクテートレベルについての正常範囲は、使用されるアッセイに応じて変化する可能性があるが、約０．３〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌであり、約２．１ｍＭの上昇がミトコンドリア疾患の潜在的マーカーとして見られる（Haas et al., Mol Genet Metab. 2008 May; 94(1):16-37）。ピルベートは、過剰なＮＡＤＨ、Ｈ＋、および乳酸デヒドロゲナーゼの存在下で、ラクテートに還元される。反応は化学量論的であり、３４０ｎｍでの吸光度の減少はピルベートの濃度に正比例する（Standard Methods of Clinical Chemistry, 1979;6:245-259；Huckabee, J Clin Invest 1958;37:244-254）。Foster et al., Clin Chem. 1978 Sep;24(9):1568-72；Debray et al., Clin Chem. 2007 May;53(5):916-21；Chariot et al., Arthritis & Rheumatism 1994; 37(4):583-586も参照のこと。
【００５３】
血中ラクテート負荷を低減させることによって細胞質の酸化還元均衡を変化させることは、おそらく、以下を含む、種々の疾患および状態において非常に治療的有用性であり得る。
【００５４】
乳酸アシドーシス：この状態は、血中ラクテート濃度＞４〜５ｍＭおよびｐＨ＜７．３５によって定義され、ミトコンドリア機能不全、敗血症（Bakker et al., 1991）などを含む、様々な基礎疾患から生じる可能性がある。典型的に、ストレスを受けていない患者における正常な血中ラクテート濃度は０．５〜１ｍｍｏｌ／Ｌである。重篤な疾患を有する患者は、２ｍｍｏｌ／Ｌ未満の正常なラクテート濃度を有するとみなすことができる。高ラクテート血症は、代謝性アシドーシスを伴わない血中ラクテート濃度の軽度から中等度の持続的増加（２〜４ｍｍｏｌ／Ｌ）と定義されるが、乳酸アシドーシスは、代謝性アシドーシスに関連する血中ラクテートレベルの持続的増加（通常４〜５ｍｍｏｌ／Ｌ超）によって特徴付けられる。例えば、Cohen and Woods, Clinical and Biochemical Aspects of Lactic Acidosis. London, United Kingdom: Blackwell Scientific Publications; 1976；Mizock and Falk, Crit Care Med. 1992 Jan. 20(1):80-93；およびSeheult et al., Clin Chem Lab Med. 2017 Mar 1. 55 (3):322-33を参照のこと。
【００５５】
現在、臨床において乳酸アシドーシスを処置または管理する良好な方法は存在しない。理想的には、乳酸アシドーシスにつながる根本原因を是正したいが、急性乳酸アシドーシスのエピソードに対しては、血中ラクテートおよび酸性度の両方を低減させることができる速効性の治療が命を救うことができる。ＬＯＸＣＡＴ／ＬＯＸ＋ＣＡＴは、このような急性乳酸アシドーシスエピソードを管理するために使用することができ、なぜならこれは、血中ラクテートレベルを低減させること、およびサイトゾルにおいてプロトンの数を低減させるＮＡＤＨの酸化の方向にＬＤＨ反応を進めることの両方をするからである（図８）。ＮＡＤＨ酸化反応は媒体中のプロトンの還元を伴い、最終的にｐＨを増加させる。ピルベート濃度の増加またはラクテートの枯渇のいずれか、またはその両方は、ＮＡＤＨ酸化の方向にＬＤＨ反応を誘導することができる。マウスにおいて、ＮＡＤＨ酸化の方向にＬＤＨ反応を進めることにより、乳酸アシドーシスを軽減することができることが以前に示されている（Acharya et al., 2014）。したがって、ＬＯＸＣＡＴ／ＬＯＸ＋ＣＡＴは、おそらくＬＤＨ反応を推進することによってＮＡＤＨの酸化を誘導するので、同じ結果がＬＯＸＣＡＴ／ＬＯＸ＋ＣＡＴで予想される。したがって、ＬＯＸＣＡＴ／ＬＯＸ＋ＣＡＴは、臨床において乳酸アシドーシスを管理する際の治療として使用することができる。
【００５６】
糖尿病：異常な細胞質ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比は、多くの糖尿病の病因の根底にあると考えられている（Williamson et al., 1993；Yan, J Diabetes Res. 2014;2014:137919）。したがって、ＬＯＸＣＡＴ／ＬＯＸ＋ＣＡＴ投与は、糖尿病を有する対象を処置する際、または例えば、慢性的に栄養過多であり、高いＢＭＩ（例えば、２５もしくはそれ以上、または２９もしくはそれ以上のＢＭＩ）を有するか、または慢性的高血糖（例えば、数週間または数カ月間続く１００ｍｇ／ｄＬを超える血糖値）を有するが、まだ本格的な糖尿病ではない対象において糖尿病を発症するリスクを低減させる際に有益であり得る。
【００５７】
がん／がん免疫療法：ラクテートは免疫抑制剤として報告されている。現在の仮説によれば、がん細胞によって放出されるラクテートは、エフェクターＴ細胞ががん細胞を攻撃し、死滅させることを回避する（Brand et al., 2016；Fischer et al., 2007）。これは、現在利用可能な免疫療法が、がん微小環境における過剰なラクテート濃度に注意を払わないため、がん免疫療法が一部の場合において失敗する１つの理由であり得る。がん微小環境からのラクテートの枯渇はがん免疫療法を改善する可能性がある。この状況において、ＬＯＸＣＡＴ／ＬＯＸ＋ＣＡＴは、単独で、または改善された転帰のために現在利用可能な免疫療法と組み合わせて使用することができる。また、がん細胞は、より高いＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比を示し、ある特定の抗がん薬は、この比を低下させることによってがん細胞を特異的に死滅させる（Zhao et al., 2015）。したがって、ＬＯＸＣＡＴ／ＬＯＸ＋ＣＡＴはまた、細胞におけるＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比を低下させるその能力のために、抗がん治療剤として有効であり得る。
【００５８】
Ｄ−乳酸毒性：乳酸は２つの立体異性体：Ｌ−およびＤ−乳酸を有する。Ｄ−およびＬ−ラクテートの両方は、対応するＬＤＨ反応（Ｌ−ＬＤＨはＬ−ラクテートを産生し、Ｄ−ＬＤＨはＤ−ラクテートを産生する）によって立体異性体を有さないピルベートから産生することができる。反対に、対応するＬＤＨまたはＬＯＸを使用することによって、Ｌ−およびＤ−ラクテートの両方をピルベートに変換することができる。Ｌ−ラクテートは、Ｌ−ＬＤＨのみを有しているため、ヒトおよび動物において優勢型であるが、Ｄ−乳酸は、細菌がＤ−ＬＤＨを有しているため、ほとんど細菌によって産生される。しかしながら、現在、ヒトが、グリオキサラーゼ系として知られている経路においてＤ−乳酸を産生することもできることが明らかになっており、この経路では、毒性が高い解糖副産物であるメチルグリオキサールが、酵素ＧＬＯ１およびＧＬＯ２の作用によって、毒性が低いＤ−ラクテートに変換される。ある特定の条件下で、Ｄ−ラクテートの濃度の増加は、いくつかの重要な代謝経路を阻害し得るので、ヒトに対して毒性であることが報告されている（Ling et al., 2012）。このＤ−ラクテートは、ヒト細胞由来またはヒト腸内微生物叢由来のいずれであってもよい。例えば、短腸症候群は重度のＤ−乳酸アシドーシスにおいて現れる（Kowlgi and Chhabra, 2015）。操作されたＬＯＸＣＡＴ／ＬＯＸ＋ＣＡＴは、Ｄ−乳酸アシドーシスにおける毒性量のＤ−ラクテートを枯渇させるために使用することができる。記載されているＬＯＸＣＡＴの例示的な型は、Ｌ−ラクテートをピルベートに変換するＬ−ＬＯＸを含有するが、Ｌ−ＬＯＸは、血中のＤ−ラクテートを解毒するためにＬＯＸＣＡＴにおいてＤ−ＬＯＸと置き換えることができる。Ｄ−ＬＯＸは、細菌ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）において天然に存在する（Kalnenieks et al., 1998）。この提案されたＤ−ＬＯＸＣＡＴ（またはＤ−ＬＯＸ＋ＣＡＴ）は、Ｌ−ラクテートの場合と同様に、Ｄ−ラクテートの酸化がピルベートを産生するので、ＬＤＨ反応において、より多くのＮＡＤＨを酸化することによって、毒性のＤ−ラクテートを分解すること、およびアシドーシスを低減させることの両方ができるべきである。
【００５９】
ミトコンドリア病。リー症候群（Leigh Syndrome）（Legault et al., 2015, Cell Reports 13, 981-989）、ミトコンドリア筋症、脳症、乳酸アシドーシスおよび脳卒中様症候群（ＭＥＬＡＳ）およびレーバー遺伝性視神経萎縮症（Leber’s hereditary optical neuropathy）（ＬＥＯＮ）を含む、１５０を超える異なる遺伝的ミトコンドリア症候群が定義されており、多くはＲＣＤに関連している（例えば、Vafai and Mootha, 2012；Munnich et al., in Scriver’s Online Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease (eds Valle, D. et al.) Ch. 99, dx.doi.org/10.1036/ommbid.127 (McGraw-Hill, 2006)；Shoffner, in Scriver’s Online Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease (eds Valle, D. et al.) Ch. 104, dx.doi.org/10.1036/ommbid.127 (McGraw-Hill, 2006)を参照のこと）。これらの疾患は全て、増加した血中ラクテートを伴う［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］の不均衡として現れる（例えば、血漿濃度は０．５〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌのおおよその基準範囲を超えたままである）。ＬＯＸＣＡＴは、［ラクテート］／［ピルベート］および［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］の両方を低減させることができるので、これらの障害に対する治療薬として使用することができる。
【００６０】
加齢および神経変性疾患。ＮＡＤ＋不足は加齢の主要な原因であると仮定されており（Haigis and Guarente, 2006）、変化したＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比は、カロリー制限が寿命を延ばす機構として提案されている（Lin et al., 2004）。また、脳内ラクテート濃度は加齢と共に増加し（Ross et al., 2010）、ピルビン酸補充は、加齢およびアルツハイマー病のマウスモデルにおいて有益であることが示されている（Koivisto et al., 2016）。まとめると、ＬＯＸＣＡＴ／ＬＯＸ＋ＣＡＴは、加齢関連および神経変性障害において、加齢の症状を低減させるか、または遅延させる潜在的な治療薬である。
【００６１】
虚血再潅流傷害。虚血はラクテートを増加させ（Chouchani et al., Nature. 2014 Nov 20;515(7527):431-435；Kintu-Luwaga et al., Int J Emerg Med. 2013; 6(1):44 (intestinal ischemia)）、再潅流は非常に急激に過酸化水素を産生する（Chouchani et al., Nature. 2014 Nov 20;515(7527):431-435およびChouchani et al., Cell Metab. 2016 Feb 9;23(2):254-63）。血中のＬＯＸＣＡＴは、再潅流段階の間、ラクテートを急激に低減させ、ピルベートを増加させるために使用することができる。また、ＬＯＸＣＡＴは、カタラーゼを有し、ピルベートが過酸化水素と非酵素的に反応して水を生成するので、反動の間に産生された過酸化水素を急激にクエンチするために使用することができる。ピルベートは虚血再潅流において有益であることが既に示されている（Ryou et al., Stroke. 2012 Apr;43(4):1101-7 (brain)およびCicalese et al., Am J Surg. 1996 Jan;171(1):97-100; discussion 100-1 (intestine)）。
【００６２】
心停止。この適応症における、より高い血中ラクテートは、より高い死亡率と臨床的に相関しており（Donnino et al., Crit Care Med 42, 1804-181 (2014)）、動物モデルにおけるピルベート注入は、代謝および神経機能を改善することが示されている（Sharma et al., Resuscitation 76, 108-119 (2008)；Sharma et al., Resuscitation 66, 71-81 (2005)）。また、心停止後症候群に対する唯一の利用可能な処置である治療的低体温は、循環ラクテート／ピルベート比を低減させることが示されている（Nordmark et al., Resuscitation 80, 573-579 (2009)）。心停止後症候群（ＰＣＡＳ）とは、心肺蘇生（ＣＰＲ）成功後の心拍再開（ＲＯＳＣ）の病態生理学的結果を指し、通常、重度の脳傷害および心血管不安定性として現れる。ＣＰＲが成功した患者の１０〜２０％のみが退院まで生存し、脳傷害はＲＯＳＣ後の死亡の３分の２を占める。さらに、脳ミトコンドリア機能不全はＰＣＡＳの間の脳傷害に関与しており、ミトコンドリアＤＮＡコピー数は心不全のリスクと関連している（Jiang et al., Biomed Res Int 2014, 192769 (2014)；Gazmuri and Radhakrishnan, Crit Care Clin 28, 245-270 (2012)；Zhang et al., Eur Heart J 38, 3443-3448 (2017)）。病院外心停止では毎年２５０，０００人の米国人が死亡し、世界中で病院外心停止患者の約６％のみが生存している。ＰＣＡＳについての実験的治療である低体温法を除いて、この適応症に利用可能な他の処置は存在していない。しかしながら、低体温処置は、通常２４時間以上続く、この労働集約的プロセスを備えた施設への迅速なアクセスを必要とする。一方、本明細書に示されているように、ＬＯＸＣＡＴ処置は低体温法と同様の生存率を示し、ＣＰＲを実施する前にそのシングルショットを必要とするだけである。さらに、ＬＯＸＣＡＴは、低体温処置への迅速なアクセスが制限されている場所で利用可能にすることができる。したがって、ＬＯＸＣＡＴは、心停止後症候群に対する可能性のある薬物を、より入手しやすく、投与しやすいものとすることができる。
【００６３】
外傷性脳傷害（ＴＢＩ）。ＴＢＩは、身体的および心理学的欠陥に至る脳に対する激しい傷害によって引き起こされる。現在、ＴＢＩに利用可能な治療は存在していない。臨床的に、上昇した脳細胞外ラクテート（Carpenter, et al., Front Neurosci 9, 112 (2015)）およびラクテート／ピルベート比は、転帰の悪化と相関する（Timofeev et al., Brain : a journal of neurology 134:484-494 (2011)）。ピルベート処置は、動物モデルにおいて脳代謝を改善し、神経細胞死を低減させることが示されている（Moro and Sutton, Exp Neurol 225:391-401 (2010)）。ＴＢＩはまた、ミトコンドリア機能不全に至る（Xiong et al., J Neurotrauma 14:23-34 (1997)）。ラクテートおよびピルベートの両方は数分以内に血液脳関門を横切るので（Knudsen et al., J Cereb Blood Flow Metab 11, 581-586 (1991)；Miller and Oldendorf, J Neurochem 46, 1412-1416 (1986)）、ＬＯＸＣＡＴは、脳のラクテート／ピルベート比も同様に低減させることができる。したがって、ＬＯＸＡＣＴは、ＴＢＩ関連損傷のための潜在的な治療として使用することができる。
【００６４】
投薬量
「有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。例えば、治療量は所望の治療効果を達成する量である。この量は、疾患または疾患症状の発症を予防する（リスクを低減する）のに必要な量である、予防的に有効な量と同じであっても異なっていてもよい。有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬量で投与することができる。治療化合物の治療有効量（すなわち、有効投薬量）は、選択される治療化合物に依存する。組成物は、１日おきに１回を含む、１日あたり１回または複数回から１週間あたり１回または複数回まで投与することができる。当業者は、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の全体的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、特定の因子が、対象を効果的に処置するために必要とされる投薬量および時期に影響を及ぼすことがあることを理解する。さらに、本明細書に記載されている治療化合物の治療有効量による対象の処置は、単一の処置または一連の処置を含むことができる。
【００６５】
治療化合物の投薬量、毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果との用量比は治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物が使用されることがあるが、非罹患細胞に対する潜在的な損傷を最小限にし、それによって副作用を低減させるために、このような化合物を罹患組織の部位へ標的化する送達システムを設計するように注意が払われるべきである。
【００６６】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を製剤化する際に使用することができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、採用される投薬形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変化することがある。本発明の方法に使用される任意の化合物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養物において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて製剤化することができる。このような情報を、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。例えば、血漿中のレベルは高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【実施例】
【００６７】
本発明は、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定しない、以下の実施例にさらに記載されている。
【００６８】
材料および方法
以下の材料および方法を以下の実施例に使用した。
【００６９】
化学試薬
アンチマイシンＡ、オリゴマイシンＡ、ＦＭＮ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、およびＡＴＰは、ｓｉｇｍａから購入した。ＤＴＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｒ０８６２）、プロテアーゼ阻害剤、ＥＤＴＡフリー（Ｒｏｃｈｅ１１８７３５８０００１）。
【００７０】
ＤＮＡ構築物の調製
ベクターｐＥＴ３０ａへのＬＯＸＣＡＴおよびＬＯＸＣＡＴｍｕｔのクローニング
ベクターｐＥＴ３０ａ内にＬＯＸＣＡＴおよびＬＯＸＣＡＴｍｕｔ遺伝子を含有するプラスミドは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。
【００７１】
細胞増殖アッセイ
５０，０００個のＨｅＬａもしくはＫ５６２細胞／ウェル、または２５，０００個のＣ２Ｃ１２  ＮＤＵＦＳ４  ＫＯ細胞／ウェルを、ピルベートを含まない培地（５ｍＭグルコース、ピルベートなし、２００μＭウリジン、ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％透析ＦＢＳ）入りの６ウェルプレートにプレーティングした。ＥＴＣ阻害剤またはピルベートまたは酵素を添加し、細胞を５％ＣＯ２において３７℃にて７２時間インキュベートした。７２時間において、細胞を２ｍｌのＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ２コールターカウンターを使用して計数した。
【００７２】
ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋測定アッセイ
全細胞ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋を、ＮＡＤＨ−ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ９０７１）を使用して測定した。２００，０００個の細胞／ウェルを、ピルベートを含まない培地（５ｍＭグルコース、ピルベートなし、２００μＭウリジン、ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％透析ＦＢＳ）入りの６ウェルプレートにプレーティングした。翌日、ＥＴＣ阻害剤またはピルベートまたは酵素を培地に添加し、細胞を５％ＣＯ２において３７℃にて２４時間インキュベートした。２４時間において、細胞を１ｍｌの氷冷ＰＢＳで迅速に洗浄し、５００μｌの１％ＤＴＡＢ溶液を添加して細胞を溶解した。ここから製造業者の説明書に従った。簡潔に述べると、次いでこの５０μｌを、２５μｌの０．４Ｍ  ＨＣｌ（ＮＡＤ＋測定のため）を含有するＰＣＲチューブまたは空のＰＣＲチューブ（ＮＡＤＨ測定のため）に移した。これらの試料の両方を６０℃にて１５分間加熱してＮＡＤ＋またはＮＡＤＨを枯渇させた。次いで試料をベンチに１０分間静置させて室温まで冷却し、その後、中和溶液を添加した（ＮＡＤ＋試料に２５μｌの０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基およびＮＡＤＨ試料に５０μｌの１：１＝０．４Ｍ  ＨＣｌ：０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基）。次いで試料をボルテックスし、その３０μｌを３０μｌのルシフェラーゼ再構成溶液に添加し、室温にて３０分間インキュベートした。次いで試料の発光を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１４０マルチプレートリーダーで測定した。ＮＡＤＨおよびＮＡＤ＋の絶対濃度を標準曲線に対して決定した。
【００７３】
ＬＣＭＳを使用した培地［ラクテート］／［ピルベート］測定
ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋測定実験からの５００μｌの培地を、細胞を溶解する直前に採取した。次いで培地を直ちに１０ｋＤａカットオフフィルター５００μｌ遠心分離管（Ａｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＵＦＣ５０１０９６）を通して濾過して、活性酵素を全て除去した。この培地５０μｌに４５０μｌの７０％アセトニトリル／水を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。次いで試料を１４８００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、１５０μｌの遠心分離した試料をＬＣＭＳバイアルに移した。ＬＣＭＳ分析を、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に連結したＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＰＬＣシステムにおいて実施した。ラクテートおよびピルベートの絶対濃度を標準曲線に対して決定した。
【００７４】
大腸菌（E.coli）におけるＬＯＸＣＡＴおよびＬＯＸＣＡＴｍｕｔの精製
ＬＯＸＣＡＴ（アエロコッカス・ビリダンス（Aerococcus viridans）由来のＬＯＸおよび大腸菌（E.coli）由来のカタラーゼ）またはＬＯＸＣＡＴｍｕｔ遺伝子を含有するｐＥＴ３０ａベクターにより形質転換した大腸菌（E.Coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｃ６０１０−０３）の１Ｌ培養物を、０．４〜０．６のＯ．Ｄ．（６００ｎｍ）まで３７℃にて２．５Ｌフラスコ（ＩＢＩ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＳＳ−８００３）中で成長させた。次いで培養物を４℃にて少なくとも１時間置いた後、それを、２５０μＭの１−チオ−β−ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ  Ｉ５５０２）での一晩の誘導のために１８℃のインキュベータに戻した。ＩＰＴＧと共に、細胞に１ｍＭの５−アミノレブリン酸（aminoluvilinic acid）（Ｓｉｇｍａ  ０８３３９）および３００μＭの硫酸第一鉄アンモニウム（Ｓｉｇｍａ  ０９７１９−２５０Ｇ）を補充してヘム生合成を補助した。翌朝、細胞を回収し、精製するまで凍結しておいた。精製のために、細胞を、培養物１リットルあたり４０ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、３０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ  ＤＴＴ、２００μＭ  ＦＭＮ、１つのプロテアーゼ阻害剤コンプリートＥＤＴＡフリー（Ｒｏｃｈｅ  １１８７３５８０００１）、２．５μｌベンゾナーゼおよび１ｍｇ／ｍｌリゾチーム）に再懸濁し、超音波処理によって溶解した。４℃で３０分間、２０，０００ｒｐｍにて溶解物を清澄化した後、溶解物を、１Ｌの培養物あたり５ｍｌのＮｉ−セファロースビーズに結合させ、１０カラム体積の洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、３０ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ  ＡＴＰ）により洗浄し、溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール）により溶出した。次いで溶出画分を濃縮し、１００ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌ勾配でＨｉＴｒａｐＱＦＦイオン交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＧＥ１７−５１５６−０１）に流した。次いでイオン交換からのプールした画分を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００増加カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通した。ゲル濾過からの純粋画分を、１５ｍｌの１００ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルター遠心分離管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ９１００２４）を使用して濃縮し、液体窒素中で瞬間凍結し、−８０℃にて凍結しておいた。イオン交換およびゲル濾過を、ＡＫＴＡ純粋ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において実施した。
【００７５】
Ｈ２Ｏ２をクエンチするＬＯＸＣＡＴの能力の測定
Ｈ２Ｏ２の産生を、アンプレックスレッドアッセイを使用してモニターした。Ｈ２Ｏ２はＨＰＲの存在下でアンプレックスレッド染料と反応して、５７０ｍＭにて吸光度を測定することによってその形成をモニターすることができる着色化合物であるレゾルフィンを産生した。基質としてラクテートを使用したＬＯＸＣＡＴにおいてＬＯＸによって産生されたＨ２Ｏ２をクエンチするカタラーゼの能力を測定するために、増加濃度のラクテートを、３７℃にて２０分間、緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０）中のＬＯＸＣＡＴとインキュベートし、アンプレックスアッセイを使用してＨ２Ｏ２の産生を測定した。アジドはカタラーゼを不活性化するので、対照として、１ｍＭのアジ化ナトリウムを反応混合物に添加した。別の実験では、Ｈ２Ｏ２を分解するカタラーゼ能を評価するために、５０μＭのＨ２Ｏ２をＬＯＸＣＡＴとインキュベートし、インキュベーションの２０分後にＨ２Ｏ２濃度を測定した。
【００７６】
ラクテートをピルベートに変換するＬＯＸＣＡＴの能力の測定
ラクテートをピルベートに変換するＬＯＸＣＡＴにおけるラクテートオキシダーゼの能力を、増加濃度のラクテートを、緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０）中のＬＯＸＣＡＴと３７℃にて２０分間インキュベートすることによって評価し、続いて反応の終わりにＬＣＭＳを使用してピルベート濃度を測定した。
【００７７】
マウス血中のＬＯＸＣＡＴのｅｘ  ｖｉｖｏ活性の測定
２５０μｌのＥＤＴＡ処置したマウス血液を、２４ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。次いで緩衝液、ＬＯＸＣＡＴまたはＬＯＸＣＡＴｍｕｔ（各々４０μｇ）をウェルに添加した。異なる時点において、この血液試料２５μｌを採取し、４５０μｌの７０％アセトニトリル／水を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。次に試料を１３０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、１５０μｌをＬＣＭＳバイアルに移した。ＬＣＭＳ分析を、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に連結したＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＰＬＣシステムにおいて実施した。ラクテートおよびピルベートの絶対濃度を標準曲線に対して決定した。
【００７８】
マウス血中のＬＯＸＣＡＴのｅｘ  ｖｉｖｏ安定性
２５０μｌのＥＤＴＡ処置したマウス血液を２４ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。この試料に、緩衝液、ＬＯＸＣＡＴまたはＬＯＸＣＡＴｍｕｔ（各々４０μｇ）を添加した。異なる時点において、５μｌのこの血液試料を採取し、ＬＯＸＣＡＴおよびＬＯＸＣＡＴｍｕｔがＮ末端Ｈｉｓ６−タグを含有するので、抗ｈｉｓ６抗体に対するウェスタンブロットによってＬＯＸＣＡＴの完全性を試験した。
【００７９】
マウス血中のＬＯＸＣＡＴのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
動物実験は、ＭＧＨ動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従った。様々なバックグラウンドの野生型マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。麻酔した（セボフルラン）動物の尾静脈に、対照としてＬＯＸＣＡＴを溶解した２５０μｌの緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）、または２５０μｌ（４１ｍｇ／ｋｇ）のＬＯＸＣＡＴもしくは２５０μｌ（４１ｍｇ／ｋｇ）のＬＯＸＣＡＴｍｕｔのいずれかを注射した。次いで動物をさらに１５分間麻酔下に維持して酵素を反応させた。１５分にて、血液を尾の切り取りによって採取し、直ちに７０％氷冷アセトニトリルに添加してあらゆる酵素反応をクエンチした。次いでこの試料を氷上でさらに３０分間インキュベートしてタンパク質を沈殿させた。次いで試料を１４０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、上清を、血中ラクテートおよびピルベートの質量分光分析のために回収した。ラクテートおよびピルベートの絶対濃度は、それらを標準曲線と比較することによって得た。
【００８０】
心停止（ＣＡ）／心肺蘇生（ＣＰＲ）モデル
動物実験は、ＭＧＨ動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従った。心停止（ＣＡ）および心肺蘇生（ＣＰＲ）は、若干の改良をして以前に記載されているように実施した（Ikeda et al）。簡潔に述べると、ブラック６／ｊマウスを、１００％酸素中の５％イソフルランにより麻酔し、挿管した。マウスに空気を通し（ＭｉｎｉＶｅｎｔ  ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）、１．５％イソフルランで維持した。カテーテル（ＰＥ−１０、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を、正中大腿切開を介して左大腿動脈および静脈に挿入した。左大腿動脈ラインを介して動脈圧を測定した。血圧、体温、およびニードルプローブＥＣＧモニタリングデータを記録した。
【００８１】
ＣＡを、左大腿静脈を介して塩化カリウム（０．０８ｍｇ／ｇ体重）の注射によって誘導し、通気を停止させた。マウスをＣＡに供し、左大腿静脈を介して無作為化および盲検様式でＣＰＲの２分前に、１５０μｇ／ｇ体重のＬＯＸＣＡＴ、ＬＯＸＣＡＴｍｕｔ、またはビヒクルのいずれかを与えた。ＣＡの８分後、胸部圧迫を３００〜３５０ｂｐｍの速度にて指で行った。１００％酸素による通気およびエピネフリン（０．６μｇ／分）の注入をＣＰＲの３０秒前に開始し、心拍数が３００ｂｐｍ超になるまで注入を継続した。心拍再開（ＲＯＳＣ）は、平均動脈圧＞４０ｍｍＨｇが少なくとも１０秒間持続する洞調律の復帰と定義した。中核体温は、ＲＯＳＣの１時間後まで外科手術の間を通してランプにより３７．０±０．２℃に維持した。マウスを抜管し、カテーテルをＲＯＳＣの１時間後に除去した。次いでマウスを、ランプにより３０℃で２時間維持したケージに移した。次いでマウスを次の１０日間生存についてモニターした。
【００８２】
[実施例１]
細胞外ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）の組合せは、培地のラクテート／ピルベートおよび全細胞ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋を低減させる：
本発明者らは、最初に、細胞外ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）の組合せが、細胞外［ラクテート］／［ピルベート］比に影響を及ぼすことによって、全細胞［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］をモジュレートすることができるかどうかを試験した。図２（Ｂ）に見られるように、ミトコンドリア電子伝達鎖複合体ＩＩＩの阻害剤であるアンチマイシンは、細胞外［ラクテート］／［ピルベート］比を２４時間で１．５倍増加させ、なぜならこれらの条件下で細胞はＡＴＰ生成のための解糖に依存し、これによりＬＤＨ反応による過剰なラクテート産生がもたらされて、解糖を行うための正常なＮＡＤ＋濃度を維持するからである（図１（Ａ））。ピルベートの添加は、アンチマイシン処理した細胞においてこの比を１８倍低減させることができる。それに対し、細胞外に添加されたＬＯＸまたはＬＯＸおよびＣＡＴは、この比をほぼ２３０倍低減させることができ、ＬＯＸが細胞外ラクテートの大部分をピルベートに効果的に変換していることを意味する。本発明者らが予想したように、カタラーゼ単独ではラクテート／ピルベート比に影響を及ぼさない。［ラクテート］／［ピルベート］比のこれらの変化は、上記実験からの細胞における全細胞［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］の変化と十分に相関する。図２（Ｃ）は、アンチマイシン処理が２４時間で全細胞［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］比を２倍増加させることを示す。この比はピルベートによって約１．５倍低減し、［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］比における同様の倍率低減が、ＬＯＸおよびＣＡＴ処理細胞において観察された。［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］比は、ＬＯＸのみで処理された細胞では、おそらくＬＯＸ反応において産生された有毒なＨ２Ｏ２のために、ほとんどの細胞が死に、ＮＡＤＨおよびＮＡＤ＋の濃度が正確に検出するには低すぎるので、計算することができなかった。カタラーゼ単独では［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］比に影響を及ぼさない。これらのデータは、本発明者らが仮定したように、細胞外ＬＯＸおよびＣＡＴが、ＬＤＨ反応の平衡をラクテート産生に転換することによって起こり得る細胞外［ラクテート］／［ピルベート］比を操作することによって、全細胞［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］比をモジュレートすることができることを示唆する。
【００８３】
[実施例２]
細胞外ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）の組合せは、ミトコンドリア機能不全における増殖性欠損を回復させる：
次に本発明者らは、細胞外ＬＯＸおよびＣＡＴによる［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］比の低減が、ミトコンドリア機能不全の状況において細胞増殖を救出することができるかどうかを決定しようとした。この目的のために、本発明者らは、化学的に誘導されたＲＣＤを用いてＨｅＬａ細胞における増殖性欠損を救出することができるかどうかを試験した。ＲＣＤを有する細胞は、ピルベートを補充しない限り、ほとんど増殖しない（King and Attardi, 1989）。ＲＣ機能を有さない細胞におけるこのピルベート栄養要求性は、ＬＤＨ反応における細胞質ＮＡＤＨを再酸化する際のピルベートの役割に起因すると考えられる（Titov et al., 2016）。本発明者らは、呼吸鎖を最大限阻害する用量において、ミトコンドリア呼吸鎖複合体ＩＩＩの阻害剤であるアンチマイシンを含有するピルベートを含まない培地において野生型ＨｅＬａ細胞を成長させた（図３（Ａ））。図３（Ｂ）において見ることができるように、ピルベートが培地に補充されない限り、細胞は成長することができない。培地に添加されたＬＯＸ（アエロコッカス・ビリダンス（Aerococcus viridans）由来）単独は、おそらくＨ２Ｏ２生成に起因してアンチマイシン毒性を悪化させ、カタラーゼ（ウシ肝臓由来）単独は影響を及ぼさない。しかしながら、培地中のＬＯＸおよびＣＡＴの組合せは、４日までの間、細胞成長を有意に救出する（図３（Ｂ））。このことは、ラクテートオキシダーゼおよびカタラーゼの組合せが、細胞増殖のためのＲＣＤモデルにおける補充ピルベートに対する必要性を置き換えることができることを証明する。
【００８４】
複合体Ｉ阻害剤ピエリシジンおよび複合体ＩＶ阻害剤オリゴマイシンにより処理したＨｅＬａ細胞（図３（Ａ））は、ＬＯＸおよびＣＡＴをそれらの培地に添加した場合、有意な細胞増殖救出を示し（図３（Ｃ））、ＬＯＸおよびＣＡＴ媒介細胞救出が、複合体Ｉだけに特異的ではないことが示唆される。本発明者らはまた、アンチマイシン処理した骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２において同等の救出効果を観察した（図３（Ｄ））。同様に、培地中のＬＯＸおよびＣＡＴもまた、ミトコンドリア機能不全の遺伝的モデルにおける成長欠損を修正した（図３（Ｅ））。これらのデータは、本発明者らのアプローチが、１つの細胞型のみまたは特定の型のミトコンドリア機能不全のみに限定されないことを示唆している。
【００８５】
[実施例３]
ｉｎ  ｖｉｖｏ適用のためのラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）を含有する単一ポリペプチドの設計：
将来のｉｎ  ｖｉｖｏ適用を促すために、本発明者らは、ＬＯＸＣＡＴと呼ぶ単一ポリペプチドへのラクテートオキシダーゼおよびカタラーゼの融合を操作した（図４（Ａ））（Andre et al., 2013; Li et al., 2007；Melik-Adamyan et al., 2001；Taurino, 2013）。本発明者らは、（１）ＬＯＸおよびＣＡＴが異なる拡散速度を有することができ、（２）カタラーゼがＬＯＸよりも速く血流から除去され得るので、２つの酵素の操作された融合物が、ラクテートオキシダーゼ反応からの潜在的なＨ２Ｏ２漏出をクエンチする際により効果的であると仮定した。このＬＯＸＣＡＴ構築物は、大腸菌（E.coli）由来のカタラーゼ（分子量８４ｋＤａ）のＮ末端においてＨｉｓ６−タグを含有し、これは次いでＬ２０リンカーを使用してアエロコッカス・ビリダンス（Aerococcus viridans）由来のラクテートオキシダーゼ（分子量４０ｋＤａ）のＮ末端に連結される（Andre et al., 2013；Martin et al., 2005）（図４（Ａ））。この融合タンパク質のアミノ酸残基の配列を上記に示す。本発明者らは、ＩＰＴＧ誘導時の細菌におけるこの組換えタンパク質の過剰発現を観察し（図４（Ｂ））、緩衝液中でラクテートをピルベートに変換する際にその活性を測定することができた（図４（Ｃ））。この精製された構築物は、ミトコンドリア機能不全においてさえ、通常の血中ラクテート濃度より高い濃度である１０ｍＭまでのラクテートでＨ２Ｏ２を全く産生しない（図４（Ｄ））。融合タンパク質におけるカタラーゼが、ラクテートをインキュベートしたときのＨ２Ｏ２の無毒化に関与しているかどうかを試験するために、本発明者らは、カタラーゼの阻害剤であるアジ化ナトリウムの存在下で反応を繰り返し、反応からのＨ２Ｏ２漏出の有意な増加を調べた（図４（Ｄ））。また、この構築物は、試験した条件においてカタラーゼと同程度に１０分で５０μＭのＨ２Ｏ２をクエンチすることができた（図４（Ｅ））。これらのデータは、設計されたＬＯＸＣＡＴがラクテートをピルベートに効果的に変換することができ、これらの実験条件下で検出可能なＨ２Ｏ２を全く産生せず、またこのタンパク質構築物が外部から添加された過酸化水素をクエンチすることができ、融合タンパク質におけるＬＯＸおよびＣＡＴの両方が活性であることを意味することを示唆している。
【００８６】
次に本発明者らは、触媒的に重要な残基であるヒスチジン２６５およびアルギニン２６８をアラニン残基（Ｈ２６５ＡおよびＲ２６８Ａ）に突然変異させることによってＬＯＸが不活性化される、ＬＯＸＣＡＴの酵素不活性化したものを設計した（図４（Ａ））。この突然変異体ＬＯＸＣＡＴは、本発明者らの細胞アッセイのための陰性対照として役立つことができる。図４（Ｃ）および４（Ｆ）に見られるように、突然変異体型ではなく、野生型ＬＯＸＣＡＴのみが乳酸をピルビン酸に変換することができる。
【００８７】
[実施例４]
操作された単一ポリペプチドＬＯＸＣＡＴは、［ラクテート］／［ピルベート］、［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］を低減させ、ミトコンドリア機能不全において増殖欠損を回復させる：
このタンパク質構築物が細胞培養物において活性であるかどうかを調べるために、本発明者らは、ＬＯＸＣＡＴが、細胞外ラクテートをピルベートに変換することによって、細胞における[ＮＡＤＨ]／[ＮＡＤ＋]比を低減させることができるかどうかを試験した。本発明者らは、融合ＬＯＸＣＡＴが、細胞外［ラクテート］／［ピルベート］に影響を及ぼし（図５（Ａ））、それによってアンチマイシン処理したＨｅＬａ細胞から［ＮＡＤＨ］／［ＮＡＤ＋］比を１．３倍低減させ、別々に添加されたＬＯＸおよびＣＡＴの効果を再現することができることを観察した（図５（Ｂ））。特に、突然変異体ＬＯＸＣＡＴ（ＬＯＸＣＡＴｍｕｔ）は、アンチマイシン処理した対照細胞から［ラクテート］／［ピルベート］および[ＮＡＤＨ]/[ＮＡＤ＋]比を変化させない（図５（Ａ）および（Ｂ））。次に、本発明者らは、アンチマイシンを含有するピルベートを含まない培地中で、精製された野生型および突然変異体ＬＯＸＣＡＴをＨｅＬａ細胞とインキュベートした。図５（Ｃ）に示したように、アンチマイシン処理した細胞は、成長速度を著しく低減させ、ピルベートはこの成長表現型を救出することができた。本発明者らの融合野生型ＬＯＸＣＡＴは、ピルベートと同程度に成長速度を救出することができたが、突然変異体型はそうするのに効果がない（図５（Ｃ））。さらに、ＬＯＸＣＡＴは、異なる細胞株（図５（Ｄ））、ミトコンドリア機能不全の一般的モデル（図５（Ｅ））、ならびにピエリシジンおよびオリゴマイシンにより処理したＨｅＬａ細胞（図５（Ｆ））における細胞増殖を救出することができ、ＬＯＸＣＡＴが、異なるミトコンドリア機能不全における、および異なる細胞株にわたる増殖欠損を救出することができることを示す。ＬＯＸＣＡＴｍｕｔは、上記の実験のいずれにおいても細胞増殖を救出することができなかったことは注目に値する。これらの結果は、設計した融合タンパク質が、ミトコンドリア機能不全における還元ストレスを改善することができることを示唆している。この構築物は、本発明者らのアプローチのさらなるｉｎ  ｖｉｖｏ試験のために使用することができる。
【００８８】
[実施例５]
融合酵素のｅｘ  ｖｉｖｏ有効性：
このプロジェクトの最終目標は、ミトコンドリア機能不全を含む特定の疾患における乳酸負荷および還元ストレスを低減させるために、ＬＯＸＣＡＴを患者血液に静脈内投与することである。ｉｎ  ｖｉｖｏで試験する前に、本発明者らは、酵素が、ｅｘ  ｖｉｖｏで新鮮なマウス血液中で活性かつ安定であるかどうかを調べることを望んだ。本発明者らは、野生型マウスから採取した２５０μｌの血液中の４０μｇのＬＯＸＣＡＴまたはＬＯＸＣＡＴｍｕｔをインキュベートし、［ラクテート］／［ピルベート］比をモニターし、ウェスタンブロットを使用して経時的にタンパク質分解を試験した。本発明者らは、異なる時点でのラクテートおよびピルベートの絶対濃度を測定するためにＬＣＭＳ、およびＬＯＸＣＡＴはＮ末端Ｈｉｓ６−タグを含有するのでウェスタンブロットのための抗Ｈｉｓ６抗体を使用した。図６（Ａ）に見られるように、本発明者らは、２４時間でさえ有意な量のＬＯＸＣＡＴおよびＬＯＸＣＡＴｍｕｔの両方を検出することができた。このことは、血液プロテアーゼがこの実験において使用される全血中で依然として活性であるはずであるので、内因性血液プロテアーゼに対する融合ＬＯＸＣＡＴの強固な安定性を実証する。また、本発明者らは、［ラクテート］／［ピルベート］の経時的な劇的な減少も発見した（図６（Ｂ））。突然変異体の対照は、酵素処理していない血液試料から［ラクテート］／［ピルベート］比を変化させなかった。この予備データは、ＬＯＸＣＡＴが少なくとも２４時間までマウス全血中で安定であり、［ラクテート］／［ピルベート］比を２４時間で少なくとも１０倍低減させることができることを示唆している。
【００８９】
[実施例６]
融合酵素のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性：
ｉｎ  ｖｉｖｏでＬＯＸＣＡＴ酵素の有効性を試験するために、本発明者らは最初に、注射後の血流中で酵素がどのくらいの期間インタクトであるのかを評価した。本発明者らは、酵素が少なくとも３０分間循環中に残存することを観察した（図７Ａ）。次に、本発明者らは、ＬＯＸＣＡＴの注射が、本発明者らが仮定したように、血中［ラクテート］／［ピルベート］比を低減させることができるかどうかを試験した。本発明者らは、注射後１５分でのＬＯＸＣＡＴの効果を調べることを決定した。なぜなら本発明者らは、この時点でＬＯＸＣＡＴの最も大きな影響が見られると仮定したからである。本発明者らは、ＬＯＸＣＡＴが注射後１５分において対照（緩衝液を注射した）マウスから血中［ラクテート］／［ピルベート］比を６倍低減させることを観察する（図７Ｂ）。図７Ｂに示されるように、ＬＯＸＣＡＴｍｕｔは血中［ラクテート］／［ピルベート］を低減させない。酵素を注射したマウスは正常な体温および心拍数を維持した。
【００９０】
ＬＯＸＣＡＴは３時間で血流からほぼ消失する（図７Ａ）。本発明者らは現在、血流中の酵素の半減期を延ばそうと試みている。この目的のために、本発明者らは、アルブミン結合ペプチドによりタグ化したＬＯＸＣＡＴの血清安定性を試験している。
【００９１】
「ＬＯＸ＋ＣＡＴまたはＬＯＸＣＡＴを患者に送達する方法」の節に記載されているストラテジーの１つを使用して最適な血清安定性を得た後、ＬＯＸＣＡＴの有効性を、急性乳酸アシドーシス、敗血症、ミトコンドリア機能不全のモデルなどの様々な疾患モデルにおいて試験する。本発明者らは、ミトコンドリア機能不全についてのモデルとしてＮＤＵＦＳ４ノックアウトマウスを使用する。これらのマウスはミトコンドリア複合体Ｉの機能を欠き、最も一般的な小児ミトコンドリア機能不全であるリー症候群の表現型を再現する（Quintana et al., 2010）。最近、低酸素症は、これらのマウスにおけるミトコンドリア疾患のための治療選択肢として評価されている（Jain et al., 2016）。ＮＤＵＦＳ４  ＫＯマウスは約４０日で疾患表現型を提示し、通常５０〜６０日以内に死亡する。本発明者らは、野生型マウスを用いた最初の研究から得られた投薬量を使用して４０日目にＬＯＸＣＡＴを投与し、酵素が、ＮＤＵＦＳ４  ＫＯマウスにおいて寿命を延ばし、体重および体温の回復を助け、失明およびニューロン活性の喪失を阻止することができるかどうかをモニターする。敗血症に関しては、本発明者らは、リポ多糖（ＬＰＳ）誘発性敗血症マウスモデルを使用し、ＬＯＸＣＡＴ注射後の血液ｐＨおよび［ラクテート］／［ピルベート］をモニターする。
【００９２】
[実施例７]
心停止
血中ラクテート／ピルベート比の急激な低減が疾患モデルにおいて利益をもたらすかどうかを試験するために、本発明者らは、循環ラクテート／ピルベート比の低減がＣＡ／ＣＰＲモデルにおいて生存を改善するかどうかを試験する実験を実施した。本発明者らは、塩化カリウム（０．０８ｍｇ／ｇ体重）をブラック６／Ｊマウスの大腿静脈に注射することによって心停止を誘導し、Ｉｋｅｄａら（Resuscitation 105, 138-144 (2017)）によって以前に記載されているように心肺蘇生（ＣＰＲ）を実施した。このモデルでは、ＣＰＲ後のマウスの３０％のみが１０日目に生存した。ＣＰＲを実施する２分前に、ＬＯＸＣＡＴ（１５０μｇ／ｇ）またはビヒクルを大腿静脈に注射した。また、血液を、循環ラクテート／ピルベート比を測定し、ＬＯＸＣＡＴ活性を確実にするために左大腿動脈からＲＯＳＣの６０分後に採取した。
【００９３】
この結果により、ＬＯＸＣＡＴが、ラクテート濃度を１．３倍低減させること、およびピルベート濃度を２．５倍増加させること（図９Ｂおよび９Ｃ）の両方によって、循環ラクテート／ピルベート比を８．３から２．５に低減させたこと（図９Ａ）が示された。ＬＯＸＣＡＴ処置マウスは、ビヒクルにおける２５％から１０日で７０％まで生存率を改善した（図９Ｄ）。この実験は、急性適応症に対するＬＯＸＣＡＴのｉｎ  ｖｉｖｏでの可能性を示した。
【００９４】
参考文献
【００９５】
【表１−１】
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【００９６】
【表１−２】
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【００９７】
【表１−３】
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【００９８】
【表１−４】
2021505662.tif 000007
【００９９】
【表１−５】
2021505662.tif 000008
【０１００】
【表１−６】
2021505662.tif 000009
【０１０１】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載してきたが、前述の説明は例示することを意図し、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解されるものとする。他の態様、利点、および変更形態も、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
2021505662.tif 000010
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【配列表】
2021505662000001.app
【国際調査報告】
2021505662.tif 000033
2021505662.tif 000034