(57)【要約】  ＮＫ細胞を遺伝子操作するための組成物および方法が開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫ細胞を遺伝子改変する方法であって、
ａ）標的ＤＮＡ配列に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を得ることと、
ｂ）エレクトロポレーションを介して、標的ＮＫ細胞に、前記ＮＫ細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を導入することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記ＮＫ細胞の前記ゲノムが、１つ以上の塩基対の挿入もしくは欠失によって、異種ＤＮＡ断片（例えば、ドナーポリヌクレオチド）の挿入によって、内因性ＤＮＡ断片の欠失によって、内因性ＤＮＡ断片の反転もしくは転座によって、またはこれらの組み合わせによって改変される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＮＫ細胞が、初代または増殖ＮＫ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記初代ＮＫ細胞を、エレクトロポレーションの前に、ＩＬ−２の存在下で、２、３、または４日間インキュベートする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記初代ＮＫ細胞を、エレクトロポレーションの前に、照射されたフィーダー細胞の存在下で、４日間増殖させる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記改変ＮＫ細胞を、エレクトロポレーションの後に、照射されたｍｂＩＬ−２１発現フィーダー細胞と共に増殖させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、３６μＭのｃａｓ９を２００μＭのｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃｅｒＲＮＡの溶液に希釈することによって、前記ＲＮＰ複合体を形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法によって改変された、ＮＫ細胞。
【請求項９】
形質転換成長因子β受容体２（ＴＧＦＢＲ２）またはヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）をコードする遺伝子のノックアウトを含む、遺伝子改変ＮＫ細胞。
【請求項１０】
操作されたＮＫ細胞を、それを必要とする対象に養子移植する方法であって、
ａ）改変される標的ＮＫ細胞を得ることと、
ｂ）標的ＤＮＡ配列に特異的なｇＲＮＡを得ることと、
ｃ）エレクトロポレーションを介して、前記標的ＮＫ細胞に、前記標的ＮＫ細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むＲＮＰ複合体を導入して、操作されたＮＫ細胞を生成することと、
ｄ）前記操作されたＮＫ細胞を前記対象に移植することと、を含む、方法。
【請求項１１】
前記対象が、癌を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＮＫ細胞が、エクスビボで改変され、かつ改変後に前記対象に移植される初代ＮＫ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮＫ細胞が、自己ＮＫ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＮＫ細胞が、同種異系ドナー源由来である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＫ細胞を、前記対象に投与する前に、照射されたｍｂＩＬ−２１発現フィーダー細胞と共に増殖させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象への前記ＮＫ細胞の移植後に、前記ＮＫ細胞を、ＩＬ−２１または照射されたｍｂＩＬ−２１発現フィーダー細胞の投与を介して、前記対象において増殖させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＮＰ複合体が、前記ＴＧＦＲＢ２またはＨＰＲＴ１遺伝子を標的にする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
対象において癌を治療する方法であって、前記対象に、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のノックアウトを含むように改変されたＮＫ細胞を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
癌免疫療法は、近年進歩している。遺伝子改変キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、癌免疫療法で正常に展開された操作された免疫細胞の優れた例である。これらの細胞は、最近、ＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍に対する治療のためにＦＤＡによって承認されたが、これまでのところ、成功は、少数の標的化可能な抗原を有する疾患に限定され、そのような限られた抗原レパートリーを標的にすることは、免疫逃避によって失敗する傾向がある。さらに、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、同種異系Ｔ細胞によって引き起こされる移植片対宿主病のリスクのために、自己Ｔ細胞の使用に焦点が当てられてきた。対照的に、ＮＫ細胞は、抗原非依存的な様式で腫瘍標的を死滅させることができ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こさないため、癌免疫療法の優れた候補となる。
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術は、最近、免疫細胞の操作に使用されているが、プラスミドでＮＫ細胞を遺伝的に再プログラムすることは、常に困難であった。これは、レンチウイルス形質導入およびレトロウイルス形質導入などのＤＮＡ依存的な様式での導入遺伝子の送達は、実質的な手順関連ＮＫ細胞アポトーシスを引き起こし、遺伝子操作されたＮＫ細胞の産生を限定するため、困難であった。ＮＫ細胞を遺伝子操作する新しい方法が、必要とされる。
【発明の概要】
【０００３】
遺伝子改変ＮＫ細胞に関連する方法および組成物が、開示される。
【０００４】
一態様では、ＮＫ細胞（例えば、初代または増殖ＮＫ細胞など）を遺伝子改変する方法が本明細書に開示され、この方法は、ＮＫ細胞の標的ＤＮＡ配列に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（例えば、形質転換成長因子−β受容体２（ＴＧＦＢＲ２）またはヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）など）を得ることと、ｂ）エレクトロポレーションを介して、標的ＮＫ細胞に、ＮＫ細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を導入することと、を含む。
【０００５】
また、任意の先行する態様の方法であって、ＮＫ細胞のゲノムが、１つ以上の塩基対の挿入もしくは欠失によって、異種ＤＮＡ断片（例えば、ドナーポリヌクレオチド）の挿入によって、内因性ＤＮＡ断片の欠失によって、内因性ＤＮＡ断片の反転もしくは転座によって、またはこれらの組み合わせによって改変される方法も、本明細書に開示される。
【０００６】
一態様では、任意の先行する態様のＮＫ細胞を遺伝子改変する方法であって、ＮＫ細胞（例えば、初代または増殖ＮＫ細胞）が、形質導入（エレクトロポレーションなど）の前の４、５、６、または７日間、ＩＬ−２および／または照射されたフィーダー細胞の存在下でインキュベートされる方法が、本明細書に開示される。
【０００７】
また、任意の先行する態様のＮＫ細胞を遺伝子改変する方法であって、エレクトロポレーション後に、照射された膜結合インターロイキン−２１（ｍｂＩＬ−２１）発現フィーダー細胞と共に、改変ＮＫ細胞を増殖することをさらに含む方法も、本明細書に開示される。
【０００８】
一態様では、任意の先行する態様の方法で作製される改変ＮＫ細胞が、本明細書に開示される。一態様では、改変ＮＫ細胞は、形質転換成長因子−β受容体２（ＴＧＦＢＲ２）またはヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）をコードする遺伝子のノックアウトを含むことができる。
【０００９】
また、癌を有する対象に、任意の先行する態様の改変ＮＫ細胞を投与することを含む、癌を治療する方法も、本明細書に開示される。
【００１０】
一態様では、操作されたＮＫ細胞を、それを必要とする対象に養子移植する方法が本明細書に開示され、当該方法は、ａ）改変される標的ＮＫ細胞（初代ＮＫ細胞または増殖ＮＫ細胞など）を得ることと、ｂ）標的ＤＮＡ配列に特異的なｇＲＮＡを得ることと、ｃ）エレクトロポレーションを介して、標的ＮＫ細胞に、標的ＮＫ細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｇＲＮＡと複合体化したクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（ＣＡＳ９）を含むＲＮＰ複合体を導入して、操作されたＮＫ細胞を生成することと、ｄ）操作されたＮＫ細胞を対象に移植することと、を含む。
【００１１】
また、操作されたＮＫ細胞を、それを必要とする対象に養子移植する方法も本明細書に開示され、ＮＫ細胞は、初代ＮＫ細胞（例えば、自己ＮＫ細胞、または同種異系ドナー源由来のＮＫ細胞など）であり、エクスビボで改変され、そして改変後に対象に移植される。
【００１２】
一態様では、操作されたＮＫ細胞を、任意の先行する態様の操作されたＮＫ細胞を必要とする対象に養子移植する方法が本明細書に開示され、ＮＫ細胞は、対象に改変ＮＫ細胞を投与する前、投与すると同時に、もしくは投与した後に、照射されたｍｂＩＬ−２１発現フィーダー細胞と共に、またはＩＬ−２１の投与と共に増殖される。
【００１３】
一態様では、操作されたＮＫ細胞を、それを必要とする対象に養子移植する方法が本明細書に開示され、養子移植された改変ＮＫ細胞を受ける対象は、癌を有する。
【００１４】
本明細書に組み込まれ、かつその一部を構成する添付の図面は、一部の実施形態を例示し、また説明と共に、開示される組成物および方法を例示する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＥＮ−１３８プログラムを使用したＮＫ細胞におけるｓｉＲＮＡおよびプラスミドＤＮＡ発現ＧＦＰのエレクトロポレーション効率を示す。ここで分かるように、ＮＫ細胞生存率は７７．５％であり、生細胞の３５％がＧＦＰ陽性であった。
【図２】エレクトロポレーション最適化のために試験された１６個のプログラム（ＤＮ−１００）のうちの別の１つの生存率および効率を示す。
【図３】消費（ａ）初代ＮＫ細胞における、（ｂ）Ｔ７Ｅ１変異アッセイによって測定した、Ｃａｓ９／ＲＮＰ媒介性ＴＧＦＢＲ２ノックアウトを示す。Ｔ７Ｅ１酵素は、ミスマッチＤＮＡを認識し、切断する。各小さなバンド（青い矢印）は、インデルを担持する消化されたＤＮＡ断片を表す。
【図４】Ｔ７Ｅ１変異アッセイによって測定した、増殖ＮＫ細胞におけるＣａｓ９／ＲＮＰ媒介性ＨＰＲＴ破壊を示す。
【図５】ＲＴ−ＰＣＲを使用してＣａｓ９／ＲＮＰ（ｇＲＮＡ１＋ｇＲＮＡ２）によって導入されたＣＲＩＳＰＲ改変ＮＫ細胞におけるＴＧＦＢＲ２外部ドメインのｍＲＮＡ発現レベルを示す。ＧＡＰＤＨを、内因性対照遺伝子として使用した。ＲＮＡレベルの低下は、ＴＧＦＢＲ２遺伝子の破壊を示す。
【図６Ａ】Ｃａｓ９／ＲＮＰ改変細胞（ｇＲＮＡ１＋ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ２およびｇＲＮＡ３）の細胞毒性アッセイが、細胞をＴＧＦＢで一晩インキュベートしても、ＤＡＯＹ細胞を溶解するそれらの能力が有意に低下しないことを示す。
【図６Ｂ】非改変ＮＫ細胞と比較した場合、Ｃａｓ９／ＲＮＰ改変細胞（ｇＲＮＡ２およびｇＲＮＡ３）は、ＴＧＦＢに対して感受性が低いことを示す。
【図７】ＳＯＣＳ３遺伝子のエクソン２およびＳＯＣＳ３遺伝子のエクソン２を標的にするために使用したｇＲＮＡを示す。
【図８】ノックアウトしたＮＫ細胞におけるＳｏｃｓ３の相対正規化発現レベルを、野生型ＮＫと比較して示す。
【図９Ａ−９Ｄ】ＳＯＣＳ３−ＫＯ  ＮＫ細胞のより良好な増殖および細胞毒性を示す。図９Ａは、ＡＭＬに対するＳＯＣＳ３−ＫＯ  ＮＫ細胞のＩｎｃｕｃｙｔｅ結果を示す。図９Ｂおよび９Ｃは、ＤＡＯＹ細胞（９Ｂ）および神経芽細胞腫の細胞株ＮＢ１６４３（９Ｃ）に対する３ドナーからの細胞毒性の結果を示す。図９Ｄは、図９Ｂおよび図９Ｃにおける、各細胞株の実際の死細胞数および処理条件を示す。
【図１０】ＮＫ細胞の増殖に対するＳＯＣＳ３  ＫＯの効果を示す増殖分析を示す。
【図１１】野生型およびＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞でのＣＤ３８の発現を示す。
【図１２】ダラツムマブ媒介フラトリサイドに対する耐性を示す。
【図１３】Ｃａｓ９／ＲＮＰプラットフォームが、ＮＫ細胞内のＡＡＶＳ１遺伝子座を正常に標的にすることを示す。
【図１４】ＰＣＲを使用して評価した、ヒト初代ＮＫ細胞のＡＡＶＳ１遺伝子座へのｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子の組み込みを示す。
【図１５】フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡を使用して調べた、増殖および選別後のｍＣｈｅｒｒｙの安定した遺伝子発現を示す。＊結果は、１２個の設計されたＡＡＶ構築物のうち２個を表す。
【図１６】フローサイトメトリーを使用して評価した、異なる培養条件を使用したヒト初代ＮＫ細胞の増殖および選別後のｍＣｈｅｒｒｙの安定した遺伝子発現を示す。初代ＮＫ細胞をＣＡＳ９／ＲＮＰでエレクトロポレーションし、３００，０００ＭＯＩのＡＡＶ６  ＳＳ８００−ｍＣｈｅｒｒｙで形質導入し、ＲＰＭＩ培地＋ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）または無血清ＡＩＭＶ培地中で培養した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法を開示および説明する前に、それらは、特に明記しない限り、特定の合成方法または特定の組換えバイオテクノロジー方法に限定されず、特に明記しない限り、特定の試薬に限定されず、当然のことながら、異なる場合があることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【００１７】
Ａ．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの」（「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」）は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「医薬担体」への言及は、２つ以上のそのような担体の混合物、およびこれに類するものを含む。
【００１８】
本明細書では、範囲は、「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、のように表現することができる。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、ある特定の値から、および／または他の特定の値まで、を含む。同様に、値が近似値として表現される場合、先行詞の「約」を使用することによって、特定の値は別の実施形態を形成することが理解されよう。さらに、範囲の各々の終点は、その他の終点と関連して、およびその他の終点とは独立して、の両方で有意であることが理解されよう。本明細書に開示されるいくつかの値が存在し、各値はまた、値自体に加えて、その特定の値を「約」として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、次いで「約１０」も開示される。当業者によって適切に理解されるように、値がある値「以下」であることが開示される場合、「その値以上」およびそれらの値の間の可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０以下」ならびに「１０以上」も開示される。また、本出願全体にわたって、データは、いくつかの異なる形式で提供され、このデータは、終点および始点、ならびにデータポイントの任意の組み合わせの範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント１５が開示される場合、１０と１５の間に加えて、１０および１５超、１０および１５以上、１０および１５未満、１０および１５以下、および１０および１５に等しいが開示されると見なされることが理解される。また、２つの特定のユニット間の各ユニットも開示されることが理解される。例えば、１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３、および１４も開示される。
【００１９】
本明細書および後続の特許請求の範囲では、以下の意味を有するべく定義されたいくつかの用語を参照されたい。
【００２０】
「任意選択的」または「任意選択的に」とは、後で説明する事象または状況が生じる場合があり、または生じない場合があることを意味し、説明は、当該事象または状況が生じる事例および生じない事例を含む。
【００２１】
「プライマー」は、ある種の酵素マニピュレーションを支持することができ、酵素マニピュレーションを生じることができるように標的核酸とハイブリダイズすることができるプローブのサブセットである。プライマーは、酵素マニピュレーションを妨げない、当該技術分野で入手可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または類似体の任意の組み合わせから作製することができる。
【００２２】
「プローブ」は、典型的には、例えばハイブリダイゼーションを通して、配列特異的な様式で標的核酸と相互作用することができる分子である。核酸のハイブリダイゼーションは、当該技術分野で十分に理解され、かつ本明細書で論じられる。典型的には、プローブは、当該技術分野で入手可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または類似体の任意の組み合わせから作製することができる。
【００２３】
特定のＲＮＡを「コードする」ＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されたＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードしてもよく（したがって、ＤＮＡおよびｍＲＮＡはともにタンパク質をコードする）、またはＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、「非コード」ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡなど）をコードしてもよい。
【００２４】
「タンパク質コード配列」または特定のタンパク質またはポリペプチドをコードする配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、ｍＲＮＡに転写され、（ＤＮＡの場合）、かつインビトロまたはインビボでポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、５’末端（Ｎ末端）での開始コドンおよび３’末端（Ｃ末端）での翻訳停止ナンセンスコドンによって決定される。コード配列としては、原核生物または真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成核酸を挙げることができるが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コード配列の３’に位置する。
【００２５】
本明細書で使用される場合、核酸、ポリペプチド、細胞、または生物に適用される「天然に存在する」または「未改変」または「野生型」という用語は、天然に見出される核酸、ポリペプチド、細胞、または生物を指す。例えば、自然界の供給源から単離することができ、かつ実験室内でヒトによって意図的に改変されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、野生型である（および天然に存在する）。
【００２６】
「対象への投与」には、対象に薬剤を導入または送達する任意の経路が含まれる。投与は、経口、局所、静脈内、皮下、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、筋肉内、関節内、非経口、動脈内、皮内、心室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣、吸入による、移植リザーバー経由、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、腹腔内、肝臓内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技術）、ならびにこれに類するものを含む、任意の好適な経路によって実施することができる。本明細書で使用される場合、「同時投与（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」、「組み合わせ投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」、「同時投与（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」、または「同時に投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）」は、化合物が、時間的に同じ時点で投与されるか、または本質的に互いに直後に投与されることを意味する。後者の場合、２つの化合物は、観察された結果が、時間的に同じ時点で投与された場合に得られる結果と区別できないような十分近い時間に投与される。「全身投与」とは、例えば、循環系またはリンパ系への入口を通して、対象の身体の広範な領域（例えば、身体の５０％超の領域）に薬剤を導入または送達する経路を介して、対象に薬剤を導入または送達することを指す。対照的に、「局所投与」は、投与点の領域またはそれに直接隣接する領域に薬剤を導入または送達し、治療上有意な量で薬剤を全身的に導入しない経路を介して、対象に薬剤を導入または送達することを指す。例えば、局所投与される薬剤は、投与点の局所的な近傍で容易に検出可能であるが、対象の身体の遠位部分では検出不能であるか、または無視できる量で検出可能である。投与には、自己投与および他者による投与が含まれる。
【００２７】
薬剤の「有効量」とは、所望の効果を提供するのに十分な量の薬剤を指す。「有効」である薬剤の量は、対象の年齢および一般状態、特定の薬剤（複数可）、ならびにこれに類するものなどの多くの要因に応じて、対象によって異なるであろう。したがって、定量化された「有効量」を指定することは必ずしも可能ではない。しかしながら、任意の対象の場合における適切な「有効量」は、日常的な実験を使用して当業者によって決定されてもよい。また、本明細書で使用される場合、かつ特に明記しない限り、薬剤の「有効量」とは、治療上有効量および予防上有効量の両方をカバーする量も指すことができる。治療効果を達成するのに必要な薬剤の「有効量」は、対象の年齢、性別、および体重などの要因に従って変化する場合がある。投与計画は、最適な治療応答を提供するように調整することができる。例えば、いくつかに分割された用量を毎日投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例して減らしてもよい。
【００２８】
「薬学的に許容される」構成成分は、生物学的または他の理由で望ましくないものではない構成成分、すなわち、著しく望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含有される製剤の他の構成成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、本発明の医薬製剤に組み込まれ、かつ本明細書に記載のように対象に投与されてもよい構成成分を指すことができる。ヒトへの投与に関して使用される場合、この用語は、一般に、構成成分が必要とされる毒性試験および製造試験の基準を満たしている、またはそれが、米国食品医薬品局によって作成された不活性成分ガイドに含まれていることを意味する。
【００２９】
「薬学的に許容される担体」（「担体」と称されることがある）は、一般に安全かつ無毒の薬学的組成物または治療的組成物の調製において有用な担体または賦形剤を意味し、また獣医学的および／またはヒトの薬学的使用または治療的使用が許容される担体を含む。「担体」または「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝食塩水、水、エマルジョン（油／水もしくは水／油エマルジョンなど）、および／または様々な種類の湿潤剤を含むことができるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤、または医薬製剤で使用するために当該技術分野で周知の材料、および本明細書にさらに記載される材料を包含するが、これらに限定されない。
【００３０】
「薬理学的活性」（または単に「活性」）は、「薬理学的活性」誘導体または類似体において、親化合物と同じ種類の薬理学的活性を有し、かつ程度がほぼ同等な誘導体または類似体（例えば、塩、エステル、アミド、複合体、代謝産物、異性体、断片など）を指すことができる。
【００３１】
「治療剤」は、有益な生物学的効果を有する任意の組成物を指す。有益な生物学的効果としては、治療効果、例えば、障害または他の望ましくない生理学的状態の治療、および予防効果、例えば、障害または他の望ましくない生理学的状態（例えば、非免疫原性癌）の予防の両方が挙げられる。これらの用語はまた、本明細書に具体的に言及される有益な薬剤の薬学的に許容される薬理学的に活性な誘導体を包含し、塩、エステル、アミド、前駆薬剤、活性代謝産物、異性体、断片、類似体、およびこれに類するものを含むが、これらに限定されない。「治療剤」という用語が使用される場合、または特定の薬剤が具体的に特定される場合、この用語は、薬剤自体、ならびに薬学的に許容される薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、前駆薬剤、複合体、活性代謝産物、異性体、断片、類似体などを含むことを理解されたい。
【００３２】
組成物（例えば、薬剤を含む組成物）の「治療上有効量」または「治療上有効用量」は、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。一部の実施形態では、所望の治療結果は、Ｉ型糖尿病の制御である。一部の実施形態では、所望の治療結果は、肥満の制御である。所与の治療剤の治療上有効量は、典型的には、治療される障害または疾患の種類および重症度、ならびに対象の年齢、性別、および体重などの要因に関して異なるであろう。この用語はまた、疼痛緩和などの所望の治療効果を促進するのに有効な、治療剤の量、または治療剤の送達の速度（例えば、経時的な量）を指すこともできる。正確な所望の治療効果は、治療される状態、対象の耐容性、投与される薬剤および／または薬剤製剤（例えば、治療剤の効力、製剤中の薬剤の濃度、およびこれに類するもの）、ならびに当業者によって理解される様々な他の因子に従って異なるであろう。場合によっては、所望の生物学的応答または医学的応答は、数日、数週間、または数年にわたって、対象に対して組成物の複数の用量を投与した後に達成される。
【００３３】
本出願全体を通して、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物全体の開示は、本出願に関係する技術水準をより完全に説明するために参照により本出願に援用される。開示される参考文献はまた、参考文献に依る文章で論じられ、それらに含まれる材料について、個別にかつ具体的に参照により本明細書に援用される。
【００３４】
Ｂ．ＮＫ細胞を遺伝子改変する方法
プラスミドを用いてＮＫ細胞を遺伝的に再プログラムすることは、レンチウイルス形質導入およびレトロウイルス形質導入などのＤＮＡ依存的な様式での導入遺伝子送達が、実質的な手順関連ＮＫ細胞アポトーシスを引き起こし、遺伝子操作されたＮＫ細胞の産生を限定することから、常に困難であった。エンドヌクレアーゼリボ核タンパク質複合体（例えば、Ｃａｓ９／ＲＮＰなど）を利用してＮＫ細胞を再プログラムする（すなわち、操作するまたは改変する）、初代および増殖ヒトＮＫ細胞のＤＮＡを含まないゲノム編集を使用する方法が、本明細書に記載される。
【００３５】
エンドヌクレアーゼ／ＲＮＰ（例えば、Ｃａｓ９／ＲＮＰ）は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と複合体化した３成分性の組換えエンドヌクレアーゼタンパク質（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）からなる。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と複合体化したエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと称することができる。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、標的配列と複合体化した相補的反復ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス相補的反復ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にハイブリダイズすることができるＲＮＡからなる合成単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドであり、対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。これらのＣａｓ９／ＲＮＰは、機能複合体としてのそれらの送達に起因して、外来ＤＮＡに依存したアプローチと比較して、より高い効率でゲノム標的を切断することができる。加えて、細胞からのＣａｓ９／ＲＮＰの迅速なクリアランスは、アポトーシスの誘導などのオフターゲット効果を低減することができる。したがって、一態様では、ＮＫ細胞を遺伝子改変する方法が本明細書に開示され、ＮＫ細胞の標的ＤＮＡ配列に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を得ることと、ｂ）ＮＫ細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を、標的ＮＫ細胞に形質導入する（例えば、エレクトロポレーションを介して導入する）ことと、を含む。
【００３６】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を標的部位に標的化し、またドナープラスミドを切断して、ドナー導入遺伝子の宿主ＤＮＡへの組み換えを可能にするために、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用することが理解され、本明細書で企図される。場合によっては、ｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡと組み合わせて、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成する。開示されるプラスミドは、ＡＡＶＳ１と称される、ヒト染色体１９上のタンパク質ホスファターゼ１の調節サブユニット１２Ｃ（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子のイントロン１を、導入遺伝子の組み込みの標的部位とした、ＡＡＶ組み込みを使用する。この遺伝子座は、「セーフハーバー遺伝子」であり、多くの細胞型において安定した長期の導入遺伝子発現を可能にする。ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃの破壊は、いかなる既知の疾患とも関連しないため、ＡＡＶＳ１遺伝子座は、導入遺伝子の標的化のためのセーフハーバーと見なされることが多い。ＡＡＶＳ１部位が標的位置として使用されているため、ＣＲＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、当該ＤＮＡを標的にしなければならない。ここで、開示されるプラスミドで使用されるガイドＲＮＡは、ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ（配列番号９）、またはその任意の１０ヌクレオチドのセンスもしくはアンチセンスの連続した断片を含む。ＡＡＶＳ１は、本明細書で例示的な目的のために使用されるが、他の「セーフハーバー遺伝子」を、同等の結果で使用することができ、またトランスフェクトされる特定の細胞型または導入遺伝子を考慮してより適切であれば、ＡＡＶＳ１に対して置換することができることが理解され、本明細書で企図される。他のセーフハーバー遺伝子の例としては、Ｃ−Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、およびＴＲＡＣ、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
標的ゲノムに送達されるドナー導入遺伝子構築物のサイズには、サイズ制限が存在する可能性があることが理解され、本明細書で企図される。導入遺伝子の許容サイズを増加させる１つの方法は、典型的に使用されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）のＣａｓ９を、異なる細菌源からの合成Ｃａｓ９またはＣａｓ９に交換することによって、追加の余地を生成することである。Ｃａｓ９の置換を使用して、標的特異性を増やすこともできるため、ｇＲＮＡを使用する必要がより少なくなる。したがって、例えば、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属種（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃａｓｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＬｂＣｐｆ１）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮｍＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＳｔＣａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊＣａｓ９）、強化ＳｐＣａｓ９（ｅＳｐＣａｓ９）、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、Ｆｏｋｌ融合ｄＣａｓ９、増殖Ｃａｓ９（ｘＣａｓ９）、および／または触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、に由来することができる。
【００３８】
特定のＣａｓ９を使用すると、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（または代替物）を使用して標的をスクリーニングするＰＡＭ配列を変えることができることが理解され、本明細書で企図される。本明細書で使用される場合、好適なＰＡＭ配列は、ＮＧＧ（ＳｐＣａｓ９  ＰＡＭ）ＮＮＧＲＲＴ（ＳａＣａｓ９  ＰＡＭ）ＮＮＮＮＧＡＴＴ（ＮｍＣＡｓ９  ＰＡＭ）、ＮＮＮＮＲＹＡＣ（ＣｊＣａｓ９  ＰＡＭ）、ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｓｔ）、ＴＴＴＶ（ＬｂＣｐｆ１  ＰＡＭおよびＡｓＣｐｆ１  ＰＡＭ）；ＴＹＣＶ（ＬｂＣｐｆ１  ＰＡＭバリアントおよびＡｓＣｐｆ１  ＰＡＭバリアント）を含み、式中、Ｎは、任意のヌクレオチドとし；Ｖ＝Ａ、ＣまたはＧとし；Ｙ＝ＣまたはＴとし；Ｗ＝ＡまたはＴとし；かつＲ＝ＡまたはＧとすることができる。
【００３９】
ＲＮＰ複合体を作製するために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを、約５０μＭ〜約５００μＭ（例えば、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００μＭ）、好ましくは１００μＭ〜約３００μＭ、最も好ましくは約２００μＭの濃度の１：１、２：１、１：２の比で、９５℃で約５分間混合して、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（すなわち、ガイドＲＮＡ）を形成することができる。次いで、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の最終希釈が約２０μＭ〜約５０μＭ（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０μＭ）で、混合することができる。
【００４０】
標的細胞中の標的配列に結合すると、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、標的ＤＮＡに、１つ以上の塩基対の挿入もしくは欠失の導入によって、異種ＤＮＡ断片（例えば、ドナーポリヌクレオチド）の挿入によって、内因性ＤＮＡ断片の欠失によって、内因性ＤＮＡ断片の反転もしくは転座によって、またはそれらの組み合わせによってゲノムを改変することができる。したがって、相同組換えのためにＤＮＡと組み合わせた場合、ノックアウトまたはノックインを生成するために、本開示の方法を使用することができる。本明細書では、エレクトロポレーションを介したＣａｓ９／ＲＮＰの形質導入は、ＮＫ細胞における遺伝子改変の以前の制約を克服する容易かつ比較的効率的な方法であることが示される。
【００４１】
本開示の方法は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋肉細胞を含む任意の細胞型で利用できることが理解され、本明細書で企図される。ヒトＮＫ細胞は、ＣＤ５６またはＣＤ１６の発現およびＴ細胞受容体（ＣＤ３）の不在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットである。ＮＫ細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ分子を欠く標的細胞を感知し、死滅させる。ＮＫ細胞活性化受容体には、とりわけ、自然細胞毒性受容体（ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６）、ならびにレクチン様受容体ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１が含まれる。それらのリガンドは、ストレスを受けた細胞、形質転換した細胞、または感染した細胞で発現されるが、正常細胞では発現されないため、正常細胞を、ＮＫ細胞殺傷に対して耐性にさせる。ＮＫ細胞の活性化は、キラー免疫グロビン（Ｉｇ）様受容体（ＫＩＲ）、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４、ＴＧＦβ、および白血球Ｉｇ様受容体−１（ＬＩＲ−１）などの抑制性受容体を介して負に調節される。一態様では、標的細胞は、ドナー源（例えば、養子移植療法のための同種異系ドナー源もしくは自己ドナー源（すなわち、改変ＮＫ細胞の最終レシピエント）、ＮＫ細胞株（ＮＫ  ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２、およびＥＢＶ−ＬＣＬを含むが、これらに限定されない）などから、または初代ＮＫ細胞源もしくはＮＫ細胞株に由来する増殖ＮＫ細胞源からの初代ＮＫ細胞であり得る。
【００４２】
ＮＫ細胞の形質導入の前に、ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞の増殖に好適な培地中でインキュベートすることができる。培養条件は、サイトカイン、抗体、および／またはフィーダー細胞の添加を含むことができることが理解され、本明細書で企図される。したがって、一態様では、ＮＫ細胞を遺伝子改変する方法であって、ＮＫ細胞の増殖を支持する培地中で細胞を形質導入する前に、ＮＫ細胞を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間インキュベートすることをさらに含み、培地が、サイトカイン、抗体、および／またはフィーダー細胞をさらに含む、方法が、本明細書に開示される。例えば、培地は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、および／またはＩＬ−２１を含むことができる。一態様では、培地はまた、抗ＣＤ３抗体を含むことができる。一態様では、フィーダー細胞は、ＮＫ細胞を刺激するフィーダー細胞から精製することができる。本明細書に開示される、特許請求される発明において使用するためのＮＫ細胞刺激フィーダー細胞は、照射された自己もしくは同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または照射されていない自己もしくはＰＢＭＣ；ＲＰＭＩ８８６６；ＨＦＷＴ、Ｋ５６２；膜結合ＩＬ−１５および４１ＢＢＬ、もしくはＩＬ−２１、もしくはこれらの任意の組み合わせでトランスフェクトされたＫ５６２細胞；あるいはＥＢＶ−ＬＣＬ、のいずれかとすることができる。一部の態様では、ＮＫ細胞フィーダー細胞は、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、および／または４１ＢＢＬの溶液と組み合わせて提供される。フィーダー細胞は、１：２、１：１、または２：１の比率で、ＮＫ細胞の培養に播種することができる。培養期間は、エレクトロポレーション後１〜１４日間（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間）、好ましくは３〜７日間、最も好ましくは４〜６日間とすることができることが理解され、本明細書で企図される。
【００４３】
初代ＮＫ細胞および増殖ＮＫ細胞のインキュベーション条件は、異なる場合があることが理解され、本明細書で企図される。一態様では、エレクトロポレーション前の初代ＮＫ細胞の培養は、培地、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、および／またはＩＬ−２１など）、および／または抗ＣＤ３抗体を、５日間未満（例えば、１、２、３、または４日間）含む。増殖ＮＫ細胞について、培養は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、および／またはＩＬ−２１など）および／または抗ＣＤ３抗体に加えて、またはそれに代えて、ＮＫフィーダー細胞の存在下で（例えば、１：１の比率で）行うことができる。増殖ＮＫ細胞の培養は、形質導入前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間行うことができる。したがって、一態様では、ＮＫ細胞を遺伝子改変する方法が、本明細書に開示され、エレクトロポレーションの前に、初代ＮＫ細胞を、ＩＬ−２の存在下で４日間インキュベートすること、またはエレクトロポレーションの前に、照射されたフィーダー細胞の存在下で、増殖ＮＫ細胞を、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０時間、３、４、５、６、または７日間インキュベートすること、を含む。
【００４４】
本開示の方法において、ＮＫ細胞を改変するために形質導入する方法が限定されることが理解され、本明細書で企図される。それらの免疫機能により、ＮＫ細胞は、ウイルスおよび細菌ベクター、ならびに当該ベクターによるＮＫ細胞のアポトーシスの誘導に耐性がある。したがって、本方法以前は、ＮＫ細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ改変は成功していなかった。ウイルスベクターに関する問題を回避するために、開示される方法は、エレクトロポレーションを使用して標的ＮＫ細胞を形質転換する。エレクトロポレーションは、細胞に電場を印加して、細胞膜の透過性を増加させる技法である。電場の印加は、細胞膜を横切る電荷勾配を引き起こし、細胞膜を横切って核酸などの電荷分子を引き出す。したがって、一態様では、ＮＫ細胞を遺伝子改変する方法が本明細書に開示され、ＮＫ細胞の標的ＤＮＡ配列に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を得ることと、ｂ）ＮＫ細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡで複合体化したクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を、標的ＮＫ細胞にエレクトロポレーションを介して導入することと、を含む。
【００４５】
ＮＫ細胞の形質導入（例えば、エレクトロポレーション）後、改変ＮＫ細胞は、ようやく、改変ＮＫ細胞を刺激するフィーダー細胞を含む培地で増殖させることができる。したがって、改変細胞は、照射されたフィーダー細胞を使用してエレクトロポレーション後に増殖することができるため、生存能および増殖可能性を保持する。本明細書に開示される、特許請求される発明において使用するためのＮＫ細胞刺激フィーダー細胞は、照射された自己もしくは同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または照射されていない自己もしくはＰＢＭＣ；ＲＰＭＩ８８６６；ＨＦＷＴ、Ｋ５６２；膜結合ＩＬ−１５、および４１ＢＢＬ、もしくはＩＬ−２１、もしくはこれらの任意の組み合わせでトランスフェクトされたＫ５６２細胞；あるいはＥＢＶ−ＬＣＬ、のいずれかとすることができる。一部の態様では、ＮＫ細胞フィーダー細胞は、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、および／または４１ＢＢＬの溶液と組み合わせて提供される。フィーダー細胞は、１：２、１：１、または２：１の比率で、ＮＫ細胞の培養に播種することができる。培養期間は、エレクトロポレーション後１〜１４日間（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間）、好ましくは３〜７日間、最も好ましくは４〜６日間とすることができることが理解され、本明細書で企図される。一部の態様では、改変ＮＫ細胞を培養するための培地は、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、および／またはＩＬ−２１などのサイトカインをさらに含むことができる。
【００４６】
一態様では、ＮＫ細胞を遺伝子改変する開示された方法の１つの目的は、改変ＮＫ細胞を生成することであることが理解され、本明細書において企図される。したがって、開示される方法によって作製される改変ＮＫ細胞が、本明細書に開示される。
【００４７】
上述のように、ＮＫ細胞活性化は、キラー免疫グロビン（Ｉｇ）様受容体（ＫＩＲ）、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４、ＴＧＦβ、および白血球Ｉｇ様受容体−１（ＬＩＲ−１）などの抑制性受容体を介して負に調節される。標的の溶解を防止するには、１つの抑制性受容体の関与で十分であり得る。したがって、ＮＫ細胞は、多くのストレス誘発リガンドを発現し、かつＭＨＣクラスＩリガンドをほとんど発現しない細胞を、効率的に標的にする。ＴＧＦβは、ＮＫ細胞の活性化および機能を阻害する主要な免疫抑制サイトカインである。したがって、有利であることになるＮＫ細胞の１つの改変は、ＮＫ細胞の負の調節が抑制されるように、キラー免疫グロビン（Ｉｇ）様受容体（ＫＩＲ）、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４、ＴＧＦβ、および白血球Ｉｇ様受容体−１（ＬＩＲ−１）などの抑制性受容体の抑制であることが理解され、本明細書で企図される。かかる改変細胞は、ＮＫ細胞の添加で治療される可能性がある任意の疾患または状態の免疫療法において、非常に有用であることになる。したがって、一態様では、形質転換成長因子β受容体２（ＴＧＦＢＲ２）またはヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）をコードする遺伝子のノックアウトを含む遺伝子改変ＮＫ細胞が、本明細書に開示される。
【００４８】
本開示全体を通して指摘されるように、開示される改変ＮＫ細胞は、理想的には、改変（すなわち、操作された）ＮＫ細胞を、それ必要とする対象に養子移植するなどの免疫療法における使用に好適である。したがって、一態様では、操作されたＮＫ細胞をそれを必要とする対象に養子移植する方法が、本明細書に開示され、当該方法は、ａ）改変される標的ＮＫ細胞を得ることと、ｂ）標的ＤＮＡ配列に特異的なｇＲＮＡを得ることと、ｃ）エレクトロポレーションを介して、標的ＮＫ細胞に、標的ＮＫ細胞のゲノムＤＮＡ内で標的配列にハイブリダイズする対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｇＲＮＡと複合体化したクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むＲＮＰ複合体を導入して、操作されたＮＫ細胞を生成することと、ｄ）操作されたＮＫ細胞を対象に移植することと、を含む。
【００４９】
一態様では、本開示の免疫療法の方法で使用される改変ＮＫ細胞は、ドナー源（例えば、養子移植療法のための同種異系ドナー源もしくは自己ドナー源（すなわち、改変ＮＫ細胞の最終レシピエント）など、ＮＫ細胞株（ＮＫ  ＲＰＭＩ８８６６；ＨＦＷＴ、Ｋ５６２、およびＥＢＶ−ＬＣＬを含むが、これらに限定されない）、または初代ＮＫ細胞源もしくはＮＫ細胞株に由来する増殖ＮＫ細胞の供与源からの初代ＮＫ細胞であり得る。初代ＮＫ細胞を使用することができるため、ＮＫ細胞の開示された改変がエクスビボまたはインビトロで生じることができることが理解され、本明細書で企図される。
【００５０】
ＮＫ細胞の形質導入後、改変ＮＫ細胞を、改変（すなわち、操作された）ＮＫ細胞を対象に投与する前に増殖および刺激することができる。例えば、ＮＫ細胞を、それを必要とする対象に養子移植する方法が本明細書に開示され、ＮＫ細胞を、対象に投与する前に照射されたｍｂＩＬ−２１発現フィーダー細胞と共に増殖させる。一部の態様では、改変された（すなわち、操作された）ＮＫ細胞のｅｈ刺激および増殖は、対象への改変ＮＫ細胞の投与後または投与と同時に、インビボで生じる可能性があることが理解され、本明細書で企図される。したがって、ＩＬ−２１または照射されたｍｂＩＬ−２１発現フィーダー細胞の投与を介して対象にＮＫ細胞を移植した後で、対象においてＮＫ細胞を増殖させる免疫療法の方法が、本明細書に開示される。
【００５１】
ＴＧＦβ経路を標的にすることにより、免疫細胞機能が増加することができることが示されている。ＴＧＦβに結合するＴＧＢＲ２の外部ドメインをコードする領域を、標的にした。代表的な結果は、この遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの有意な減少を示し、改変ＮＫ細胞がＴＧＦβに対して耐性になることをさらに実証する。したがって、ＲＮＰ複合体がＴＧＦＲＢ２またはＨＰＲＴ１遺伝子を標的にする、免疫療法の方法が、本明細書に開示される。
【００５２】
開示される改変ＮＫ細胞および改変ＮＫ細胞の養子移植の方法は、癌に対する効果的な免疫療法である可能であることが理解され、本明細書で企図される。本開示の方法および組成物を使用して、癌などの未制御な細胞増殖が生じる任意の疾患を治療することができる。異なる種類の癌（ｃａｎｃｅｒｓ）の非限定的なリストは、以下の通りである：リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、白血病、癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、固形組織の癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、肉腫、神経膠腫、高悪性度神経膠腫、芽細胞腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、低酸素腫瘍、骨髄腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫もしくは肉腫、転移性癌、または一般的な癌。
【００５３】
治療するために開示される組成物を用いることができる代表的であるが、非限定的な癌のリストは、以下の通りである：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌などの肺癌、神経芽細胞腫／神経膠芽腫、卵巣癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口、咽頭、喉頭癌、および肺の扁平上皮細胞癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌、ならびに上皮癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、または膵臓癌。したがって、一態様では、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のノックアウトを含むように改変されたＮＫ細胞を対象に投与することを含む、対象における癌を治療する方法が、本明細書に開示される。
【００５４】
「治療する」、「治療すること」、「治療」、およびそれらの文法的変形は、本明細書で使用される場合、１つ以上の疾患または状態の強度または頻度、疾患または状態の症状、あるいは疾患または状態の根本的な原因を、部分的または完全に防止、遅延、治癒、快癒、緩和、軽減、変化、治療、寛解、改善、安定化、軽減、および／または低減することを、意図または目的とする組成物の投与を含む。本発明による治療は、防止的、予防的、緩和的、または治療的に適用されてもよい。予防的治療は、発症前（例えば、癌の明らかな兆候の前）、早期発症中（例えば、癌の初期の兆候および症状時）、または確立された癌の発達後に対象に投与される。予防的投与は、感染症の症状の発現の前に、１日（数日）から数年の間行うことができる。
【００５５】
１．ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションという用語は、典型的には、プライマーまたはプローブと遺伝子などの、少なくとも２つの核酸分子間の、配列駆動性の相互作用を意味する。配列駆動性の相互作用とは、２つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体もしくはヌクレオチド誘導体間で、ヌクレオチド特異的な様式で生じる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧ、またはＴと相互作用するＡは、配列駆動性の相互作用である。典型的には、配列駆動性の相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面またはフーグスティーン面上で生じる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に既知のいくつかの条件およびパラメータによって影響される。例えば、反応の塩濃度、ｐＨ、および温度は全て、２つの核酸分子がハイブリダイズするかどうかに影響する。
【００５６】
２つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションのパラメータは、当業者に既知である。例えば、一部の実施形態では、選択的ハイブリダイゼーションの条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として定義することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションステップおよび洗浄ステップのいずれかまたは両方の温度および塩濃度の両方によって制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（分子の半分がそれらのハイブリダイゼーションパートナーから解離する融解温度）より約１２〜２５℃低い温度での高イオン強度溶液（６ＸＳＳＣまたは６ＸＳＳＰＥ）中のハイブリダイゼーション、続いて、洗浄温度がＴｍより約５℃〜２０℃低いように選択される温度および塩濃度の組み合わせでの洗浄、を伴ってもよい。フィルタ上に固定化された参照ＤＮＡの試料を目的の標識核酸にハイブリダイズし、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄する予備実験において、温度および塩条件を容易に経験的に決定する。ハイブリダイゼーション温度は、典型的には、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションに対してより高い。上述のようにストリンジェンシーを達成するために、または当該技術分野で知られているように、これらの条件を使用することができる。ＤＮＡに対する好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件：ＤＮＡハイブリダイゼーションを６ＸＳＳＣまたは６ＸＳＳＰＥ中で約６８℃（水溶液中）にて、続いて６８℃で洗浄することができる。所望により、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望の相補性の程度が減少するにつれて、さらに、可変性が検索される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに応じて、適宜に低減させることができる。同様に、すべて当該技術分野で既知であるように、所望により、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望される相同性が増加するにつれて、さらに、高相同性が所望される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔ豊富さに応じて、適宜に増加させることができる。
【００５７】
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は、他方の核酸に結合した核酸の一方の量（パーセンテージ）を調べることによるものである。例えば、一部の実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、制限核酸の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％が非制限核酸に結合されるときであることになる。典型的には、非制限プライマーは、例えば、１０または１００または１０００倍過剰である。この種類のアッセイは、制限プライマーおよび非制限プライマーの両方が、例えば、それらのｋｄを１０倍もしくは１００倍もしくは１０００倍下回る、または核酸分子のうちの１つのみが１０倍もしくは１００倍もしくは１０００倍であるか、または一方もしくは両方の核酸分子がそれらのｋｄを上回る条件下で実施することができる。
【００５８】
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は、ハイブリダイゼーションが所望の酵素マニピュレーションを促進するために必要とされる条件下で、酵素的にマニピュレートされるプライマーのパーセンテージを調べることによるものである。例えば、一部の実施形態では、選択的ハイブリダイゼーションの条件は、プライマーの少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％が酵素マニピュレーションを促進する条件下で酵素的にマニピュレートされるときであることになり、例えば、酵素操作がＤＮＡ伸長である場合、選択的ハイブリダイゼーションの条件は、プライマー分子の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％が伸長されるときであることになる。また、好ましい条件には、製造業者によって示唆される条件、またはマニピュレーションを行う酵素に適切な当該技術分野で示された条件、も含まれる。
【００５９】
正に相同性と同様に、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションのレベルを決定するための様々な方法が、本明細書に開示されていることが理解される。これらの方法および条件は、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションの異なる割合を提供する場合があることが理解されるものの、特に指示しない限り、いずれかの方法のパラメータを満たすことは十分であろう。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが必要とされる場合、これらの方法のいずれか１つで必要なパラメータ内で、ハイブリダイゼーションが生じる限り、本明細書に開示されているものと見なされる。
【００６０】
組成物または方法が、いずれか集合的にまたは個別に、ハイブリダイゼーションを決定するためのこれらの基準のいずれか１つを満たす場合、それが、本明細書に開示された組成物または方法であることを当業者が理解することが理解される。
【００６１】
２．核酸
核酸に基づく本明細書に開示される様々な分子が存在し、例えば、核酸（例えば、ＴＧＦβＲ２をコードする核酸、またはＴＧＦＲβ２ノックアウトを作製するための本明細書に開示される核酸のいずれか）、またはその断片、ならびに様々な機能性核酸が含まれる。開示される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物から作製されている。これらおよび他の分子の非限定的な例が、本明細書で論じられる。例えば、ベクターが細胞内で発現される場合、発現したｍＲＮＡは典型的にはＡ、Ｃ、Ｇ、およびＵから作製されていることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば外因性送達を通して細胞または細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子が、細胞環境中のアンチセンス分子の分解を低減するヌクレオチド類似体から構成されることが有利であることが理解される。
【００６２】
ａ）ヌクレオチドおよび関連分子
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、およびリン酸部分を含有する分子である。ヌクレオチドは、それらのリン酸部分および糖部分を通して、一緒に連結され、ヌクレオシド間結合を生成することができる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）、およびチミン−１−イル（Ｔ）とすることができる。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価リン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）であることになる。当該技術分野で入手可能であり、本明細書で入手可能である、多種多様なこれらの種類の分子が存在する。
【００６３】
ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、またはリン酸部分のいずれかに、何らかの種類の改変を含有するヌクレオチドである。ヌクレオチドに対する改変は、当該技術分野で周知であり、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、および２−アミノアデニン、ならびに糖またはリン酸部分における改変を含むことになる。当該技術分野で入手可能であり、本明細書で入手可能である、多種多様なこれらの種類の分子が存在する。
【００６４】
ヌクレオチド代替物は、ヌクレオチドと同様の機能特性を有するが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのリン酸部分を含まない分子である。ヌクレオチド代替物は、ワトソン−クリックまたはフーグスティーン様式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を通して一緒に連結される分子である。ヌクレオチド代替物は、適切な標的核酸と相互作用するときに、二重らせん型構造に適合することができる。当該技術分野で入手可能であり、本明細書で入手可能である、多種多様なこれらの種類の分子が存在する。
【００６５】
他の種類の分子（複合体）をヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に連結して、例えば、細胞取り込みを増強することも可能である。複合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に化学的に連結することができる。そのような複合体としては、コレステロール部分などの脂質部分が挙げられるが、これらに限定されない（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）。当該技術分野で入手可能であり、本明細書で入手可能である、多種多様なこれらの種類の分子が存在する。
【００６６】
ワトソン−クリック相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物のワトソン−クリック面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物のワトソン−クリック面は、プリン系のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物のＣ２、Ｎ１、およびＣ６位、ならびにピリミジン系のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物のＣ２、Ｎ３、Ｃ４位を含む。
【００６７】
フーグスティーン相互作用は、二重鎖ＤＮＡの主溝に曝されるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のフーグスティーン面上で起こる相互作用である。フーグスティーン面は、プリンヌクレオチドのＮ７位およびＣ６位の反応性基（ＮＨ２またはＯ）を含む。
【００６８】
ｂ）配列
本明細書に開示されるシグナル伝達経路に関与するタンパク質分子、例えば、ＴＧＦβＲ２、に関連する様々な配列が存在し、これらの全ては、核酸によってコードされるか、または核酸である。これらの遺伝子のヒト類似体、ならびに他の類似体、およびこれらの遺伝子のアレル、ならびにスプライスバリアントおよび他の種類のバリアントの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋを含む様々なタンパク質および遺伝子データベースで入手可能である。当業者は、配列の不一致および相違を解析する方法、ならびに特定の配列に関連する組成物および方法を、他の関連配列に対して調整する方法を理解している。プライマーおよび／またはプローブは、本明細書に開示され当該技術分野で既知の情報を考慮して任意の所与の配列について設計することができる。
【００６９】
ｃ）プライマーおよびプローブ
本明細書に開示されるＴＧＦβＲ２および／またはＨＰＲＴ１などの開示される核酸と相互作用することができるプライマーおよびプローブを含む組成物が開示される。特定の実施形態では、プライマーを使用して、ＤＮＡ増幅反応を支持する。典型的には、プライマーは、配列特異的な様式で伸長することができるであろう。配列特異的な様式でのプライマーの伸長は、プライマーがハイブリダイズするかもしくは別途会合する核酸分子の配列および／または組成物が、プライマーの伸長によって産生される産物の組成物もしくは配列を誘導または影響する任意の方法を含む。したがって、配列特異的な様式でのプライマーの伸長には、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、または逆転写が含まれるが、これらに限定されない。配列特異的な様式でプライマーを増幅する技法および条件が好ましい。特定の実施形態では、プライマーは、ＰＣＲまたは直接配列決定などのＤＮＡ増幅反応に使用される。特定の実施形態では、プライマーはまた、非酵素技術を使用して伸長することができ、例えば、プライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、それらが化学反応して配列特異的な様式でプライマーを伸長するように改変されることが理解される。典型的には、開示されるプライマーは、開示される核酸もしくは核酸の領域でハイブリダイズするか、またはそれらは、核酸の相補体もしくは核酸の領域の相補体とハイブリダイズする。
【００７０】
特定の実施形態では、核酸と相互作用するためのプライマーもしくはプローブのサイズは、ＤＮＡ増幅、またはプローブもしくはプライマーの単なるハイブリダイゼーションなどのプライマーの所望の酵素マニピュレーションを支持する任意のサイズとすることができる。典型的なプライマーまたはプローブは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長になることになる。
【００７１】
他の実施形態では、プライマーまたはプローブは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長以下とすることができる。
【００７２】
ＴＧＦβＲ２およびＨＰＲＴ１遺伝子のプライマーは、典型的には、ＴＧＦβＲ２およびＨＰＲＴ１遺伝子の領域または完全な遺伝子を含有する増幅ＤＮＡ産物を産生するために使用される。一般に、典型的には、この産物のサイズは、サイズが３ヌクレオチド以内、または２ヌクレオチド以内、または１ヌクレオチド以内に正確に決定することができるようになるであろう。
【００７３】
特定の実施形態では、この産物は、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長である。
【００７４】
他の実施形態では、産物は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長以下である。
【００７５】
３．発現系
細胞に送達される核酸は、典型的には、発現制御系を含有する。例えば、ウイルスおよびレトロウイルス系における挿入遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現を制御するのに役立つプロモーター、および／またはエンハンサーを含有する。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して相対的に固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列（複数可）である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要なコア要素を含有してもよく、また上流要素および応答要素を含有してもよい。
【００７６】
ａ）ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主細胞内のベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々な供給源、例えば、ポリオーマ、シミアウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えば、ベータアクチンプロモーターから得られる場合がある。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる（Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として好都合に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８：３５５−３６０（１９８２））。当然のことながら、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも、本明細書で有用である。
【００７７】
エンハンサーは、一般に、転写開始部位から一定距離になくても機能し、転写単位に対して５’側（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））または３’側（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかとすることができるＤＮＡの配列を指す。さらに、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３３：７２９（１９８３））、およびコード配列自体内（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））とすることができる。これらは、通常、長さが１０〜３００ｂｐで、シスで機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、しばしば、転写の調節を媒介する応答エレメントを含有する。プロモーターは、転写の調節を媒介する応答エレメントも含有することができる。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現の調節を決定する。多くのエンハンサー配列は、現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、およびインスリン）から既知であるが、典型的には、一般的な発現用に真核生物細胞のウイルス由来のエンハンサーを使用することになる。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターのエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマのエンハンサー、およびアデノウイルスのエンハンサーである。
【００７８】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それらの機能を引き起こす光または特定の化学的事象のいずれかによって特異的に活性化され得る。系は、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって、調節することができる。また、ガンマ線照射などの照射への曝露、またはアルキル化の化学療法薬によって、ウイルスベクターの遺伝子発現を増強する方法も存在する。
【００７９】
特定の実施形態では、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、転写される転写単位の領域の発現を最大化するための構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして作用することができる。特定の構築物では、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、特定の時間に特定の種類の細胞でのみ発現する場合であっても、全ての真核生物の細胞型において活性である。この種類の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターのＬＴＲである。
【００８０】
全ての特定の調節エレメントは、クローニングすることができ、黒色腫細胞などの特定の細胞型において選択的に発現される発現ベクターを構築するために使用することができることが示されてきた。グリア線維酢酸タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア起源の細胞で、遺伝子を選択的に発現するために使用されてきた。
【００８１】
また、真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞）で使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡの発現に影響を及ぼし得る転写の終結に必要な配列を含有してもよい。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分において、ポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域には、転写終結部位も含まれる。転写単位は、ポリアデニル化領域も含有することが好ましい。この領域の利点の１つは、転写ユニットが、ｍＲＮＡのようにプロセシングおよび輸送される可能性を増加させることである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。相同的なポリアデニル化シグナルが、導入遺伝子構築物に使用されることが好ましい。特定の転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。また、転写単位は、単独で、または上記配列と組み合わせて、構築物からの発現または構築物の安定性を改善する、他の標準的な配列を含有することも好ましい。
【００８２】
ｂ）マーカー
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達されているかどうか、そして送達されていたら発現されているかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼをコードするＥ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質である。
【００８３】
一部の実施形態では、マーカーは、選択可能なマーカーであってもよい。哺乳動物細胞に好適な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ヒドロマイシン、およびピューロマイシンである。このような選択可能なマーカーが哺乳動物宿主細胞に正常に移行されると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合、生存することができる。選択的レジームには、広く使用される２つの異なるカテゴリが存在する。第１のカテゴリは、細胞の代謝、および補充培地から独立して成長する能力を欠く変異細胞株の使用、に基づく。２つの例としては：ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞およびマウスＬＴＫ細胞、がある。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素を添加せずに成長する能力を欠いている。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子を欠いているため、欠損したヌクレオチドが補充培地に提供されない限り、生存することはできない。培地を補充する代替手段は、それぞれの遺伝子を欠く細胞に、無傷のＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を導入することで、したがって、それらの成長要件を変化させる。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補充培地において生存することができないであろう。
【００８４】
第２のカテゴリは、任意の細胞型で使用される選択スキームを指し、変異細胞株の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の成長を停止するために薬物を使用する。新規遺伝子を有するそれらの細胞は、薬剤耐性を伝達するタンパク質を発現することになり、選択で生き残るであろう。このような優性選択の例は、薬物のネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３（１９８５））を使用する。３つの実施例は、真核細胞の制御下の細菌遺伝子を用いて、それぞれ適切な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）またはハイグロマイシンへの耐性を伝達する。他には、ネオマイシン類似体Ｇ４１８およびピュラマイシンが含まれる。
【００８５】
４．ペプチド
ａ）タンパク質バリアント
タンパク質バリアントおよび誘導体は、当業者によく理解され、またアミノ酸配列改変が関与する可能性がある。例えば、アミノ酸配列改変は、典型的には、置換、挿入、または欠失バリアントの３つのクラスのうちの１つ以上に分類される。挿入には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一もしくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。挿入は、通常、例えば、１〜４個の残基程度で、アミノ末端またはカルボキシル末端の融合の挿入よりは小さいことになる。実施例に記載されるものなどの免疫原性融合タンパク質の誘導体は、インビトロで架橋することによって、またはその融合体をコードするＤＮＡで形質転換された組換え細胞培養物によって、標的配列に免疫原性を付与するのに十分な大きさのポリペプチドを融合することによって作製される。欠失は、タンパク質の配列から、１個以上のアミノ酸残基を除去することを特徴とする。典型的には、約２〜６個以下の残基が、タンパク質分子内の任意の１つの部位で欠失される。これらのバリアントは、通常、タンパク質をコードするＤＮＡ内のヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって調製され、それによって、バリアントをコードするＤＮＡを産生し、その後、組換え細胞培養物中でＤＮＡを発現する。既知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位で置換変異を作製するための技法、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発は周知である。アミノ酸置換は、典型的には、単一残基のものであるが、一度にいくつかの異なる場所で生じる可能性があり、挿入は、通常、約１〜１０個のアミノ酸残基程度であり、欠失は約１〜３０個の残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは、隣接する対、すなわち、２個の残基の欠失または２個の残基の挿入で行われる。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組み合わせ、を組み合わせて、最終構築物に到達することができる。変異は、配列をリーディングフレームから外れさせてはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を産生する可能性がある相補的領域を生成しないことになる。置換バリアントは、少なくとも１個の残基が除去され、その位置に、異なる残基が挿入されているバリアントである。このような置換は、概して、以下の表１および２に従って行われ、保存的置換と称される。
【表１】
2021523725.tif 000003
【表２】
2021523725.tif 000004
【００８６】
機能または免疫学的同一性の実質的な変化は、表２のものよりも保存性が低い置換を選択することによって、すなわち、（ａ）例えば、シートもしくはらせん構造としての置換エリアにおけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩、を維持することに対するそれらの効果が著しく異なる残基、を選択することによって行われる。一般に、タンパク質特性において最大の変化をもたらすことが予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルまたはスレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニルに（またはそれによって）置換される；（ｂ）システインまたはプロリンが、任意の他の残基に（またはそれによって）置換される；（ｃ）電気陽性側鎖、例えば、リシル、アルギニル、またはヒスチジルを有する残基が、電気陰性残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルに（またはそれによって）置換される；あるいは（ｄ）嵩張る側鎖、例えば、フェニルアラニンを有する残基が、側鎖を有しない残基、例えば、グリシンに（またはそれによって）置換され、この場合、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化の部位の数を増加させることによって置換される、置換であろう。
【００８７】
例えば、あるアミノ酸残基を、生物学的および／または化学的に類似する別のアミノ酸残基に置き換えることは、保存的置換として当業者には既知である。例えば、保存的置換は、１つの疎水性残基を別の疎水性残基に置き換えること、または１つの極性残基を別の極性残基に置き換えることである。置換は、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせを含む。このような、各明示的に開示された配列の保存的に置換されたバリエーションは、本明細書に提供されるモザイクポリペプチドに含まれる。
【００８８】
置換または欠失変異誘発を用いて、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）のための部位を挿入することができる。システインまたは他の不安定な残基の欠失も望ましい場合がある。潜在的なタンパク質分解部位（例えば、Ａｒｇ）の欠失または置換は、例えば、塩基性残基のうちの１つを欠失させるか、またはグルタミニルまたはヒスチジル残基で置換することによって達成される。
【００８９】
特定の翻訳後の誘導体化は、発現したポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、翻訳後、対応するグルタミルおよびアスパリル残基にしばしば脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｐｐ  ７９−８６［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、および、場合によっては、Ｃ末端カルボキシルのアミド化、が挙げられる。
【００９０】
本明細書に開示されるタンパク質のバリアントおよび誘導体を定義する１つの方法は、特定の既知の配列に対する相同性／同一性の観点からバリアントおよび誘導体を定義することによるものであることが理解される。記載の配列と、少なくとも７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％の相同性を有する、これらのバリアントおよび本明細書に開示される他のタンパク質が、具体的に開示される。当業者は、２つのタンパク質の相同性を決定する方法を、容易に理解する。例えば、相同性は、相同性が最も高いレベルにあるように、２つの配列を整列した後に計算することができる。
【００９１】
相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比較のための配列の最適アライメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または検査によって行ってもよい。
【００９２】
核酸に関して、同じ種類の相同性は、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９、Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９に開示されているアルゴリズムによって、得ることができる。
【００９３】
保存的変異および相同性の説明は、任意の組み合わせで、例えば、バリアントが保存的変異である特定の配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する実施形態のように、一緒に組み合わせることができることが理解される。
【００９４】
本明細書は、様々なタンパク質およびタンパク質配列を論じるため、それらのタンパク質配列をコードすることができる核酸もまた開示されることが理解される。これには、特定のタンパク質配列に関連する全ての縮重配列、すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有する全ての核酸、ならびにタンパク質配列の開示されたバリアントおよび誘導体をコードする縮重核酸を含む全ての核酸、が含まれることになる。したがって、各特定の核酸配列は本明細書に記載されていない場合があるが、各配列および全ての配列は、開示されたタンパク質配列を介して、実際に本明細書に開示され、かつ記載されていることが理解される。また、どの特定のＤＮＡ配列が生物内のタンパク質をコードするのかを示すいかなるアミノ酸配列もないが、開示されたタンパク質の特定のバリアントが本明細書に開示されている場合、そのタンパク質をコードする既知の核酸配列もまた既知であり、そして本明細書に開示され、かつ記載されることも理解される。
【００９５】
開示された組成物に組み込むことができる多数のアミノ酸およびペプチド類似体が存在することが理解される。例えば、表１および表２に示されるアミノ酸とは異なる機能的置換基を有する多数のＤアミノ酸またはアミノ酸が存在する。天然に存在するペプチドの反対の立体異性体、ならびにペプチド類似体の立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子に選択したアミノ酸を負荷することによって、および、例えば、アンバーコドンを利用して、部位特異的な方法で、類似体アミノ酸をペプチド鎖に挿入する遺伝子構築物を操作することによって、容易にポリペプチド鎖に組み込むことができる。
【００９６】
ペプチドに似ているが、天然のペプチド結合を介して結合されていない分子を産生することができる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体についての結合としては、ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨＨ２ＳＯ−が挙げられる（これらおよび他のものは、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ  １９８３），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ  ３，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（ｇｅｎｅｒａｌ  ｒｅｖｉｅｗ）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ（１９８０）ｐｐ．４６３−４６８；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ  １４：１７７−１８５（１９７９）（−−ＣＨ２ＮＨ−−、ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−−ＣＨＨ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ  ３０７−３１４（１９８２）（−−ＣＨ−−ＣＨ−−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２３：２５３３（１９８２）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｓｚｅｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｐｐｌｎ，ＥＰ  ４５６６５  ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ  ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）、およびＨｒｕｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３１：１８９−１９９（１９８２）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）；の中に見出され、これらの各々は、参照により本明細書に援用される。特に好ましい非ペプチド結合は、−−ＣＨ２ＮＨ−−である。ペプチド類似体は、ｂ−アラニン、ｇ−アミノ酪酸およびこれに類するものの結合原子間に２つ以上の原子を有することができることが理解される。
【００９７】
アミノ酸類似体および類似体ならびにペプチド類似体は、しばしば、より経済的な生成、より大きな化学的安定性、より強化された薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性など）、特異性の変化（例えば、広域の生物学的活性）、抗原性の低下などの強化された特性、または所望の特性を有する。
【００９８】
Ｄ−アミノ酸は、ペプチダーゼなどによって認識されないため、Ｄ−アミノ酸は、より安定なペプチドを生成するために使用することができる。より安定なペプチドを生成するために、コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の同じ種類のＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）を用いた系統的な置換を使用することができる。システイン残基は、２つ以上のペプチドを一緒に環化するまたは結合するために使用することができる。これは、ペプチドを、特定の立体構造に拘束するのに有益である可能性がある。
【００９９】
５．医薬担体／医薬製品の送達
上述のように、組成物は、薬学的に許容される担体中でインビボで投与することもできる。「薬学的に許容される」とは、いかなる望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはこの材料がその中に含有される医薬組成物のその他の構成成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、生物学的にまたは別の方法で望ましくないものではない材料、すなわち、核酸またはベクターと共に、対象に投与されてもよい材料、を意味する。担体は、当業者には周知のように、活性成分のあらゆる分解を最小限に抑え、かつ対象におけるあらゆる有害な副作用を最小限に抑えるように、当然選択されることになる。
【０１００】
組成物は、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外的に、局所的に（局所鼻腔内投与または吸入剤による投与を含む）、またはこれに類するものによって、投与されてもよい。本明細書で使用される場合、「局所鼻腔内投与」とは、鼻孔の一方または両方を介して組成物を鼻および鼻道に送達することを意味し、噴霧機構もしくは液滴機構による、または核酸もしくはベクターのエアロゾル化による送達を含むことができる。吸入剤による組成物の投与は、噴霧または液滴機構による送達を介して鼻または口を通して行うことができる。送達は、挿管を介して呼吸器系の任意の領域（例えば、肺）に直接送達することもできる。必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重、および一般状態、治療されるアレルギー障害の重症度、使用される特定の核酸またはベクター、その投与方法、ならびにこれに類するものに応じて、対象によって異なるであろう。したがって、すべての組成物に対して正確な量を指定することは不可能である。しかしながら、適切な量は、本明細書の教示を考慮し日常的な実験のみを使用して、当業者によって決定することができる。
【０１０１】
組成物の非経口投与は、使用される場合、一般に、注射を特徴とする。注射剤は、液体溶液または懸濁液、注射前に液体中の懸濁液の溶解のために好適な固体形態、あるいはエマルジョンのいずれかとして、従来の形態で調製することができる。最近改訂された非経口投与のアプローチでは、一定の投薬量が維持されるような徐放系または持続放出系の使用に関与する。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。
【０１０２】
材料は、溶液、懸濁液（例えば、微小粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれる）の状態であってもよい。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して、特定の細胞型を標的にしてもよい。以下の参考文献は、腫瘍組織に特異的なタンパク質を標的にするための本技術の使用例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）、Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）、Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）、Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）、Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）、Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）、およびＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。「ステルス」および他の抗体複合体リポソーム（結腸癌に対する脂質媒介性薬物標的化を含む）、細胞特異的リガンドを介したＤＮＡの受容体媒介性標的化、リンパ球特異的腫瘍標的化、ならびにインビボでのマウス神経膠腫細胞の高度に特異的な治療用レトロウイルス標的化などのビヒクル。以下の参考文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質を標的にするための本技術の使用例である（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）、およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般に、受容体は、構成的またはリガンド誘導のいずれかのエンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体は、クラスリン被覆ピット内でクラスター化し、クラスリン被覆小胞を介して細胞内に入り、受容体が選別される酸性化エンドソームを通過し、次いで細胞表面にリサイクルされるか、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソーム中で分解されるかのいずれかである。内部移行経路は、栄養素の取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見進入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルの調節などの様々な機能を果たす。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンド価、およびリガンド濃度に応じて、２つ以上の細胞内経路に従う。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子機構および細胞機構が概説されている（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
【実施例】
【０１０３】
以下の実施例は、当業者に、本明細書で特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法の作製方法および評価方法の完全な開示および説明を提供するために示されるものであり、純粋に例示的であることを意図するものであって、本開示を限定するものではない。数値（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するように努力がなされてはいるが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。特に指定しない限り、部（ｐａｒｔｓ）は重量部であり、温度は℃、または周囲温度であり、圧力は、大気圧またはその付近である。
【０１０４】
１．実施例１
ａ）方法
（１）ヒトＮＫ細胞の精製および増殖
供給源材料として、健康なドナーのバフィーコートを、Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｏｈｉｏ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓから得た。この研究は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌによって免除研究であると判断された。
【０１０５】
ＰＢＭＣをバフィーコートから単離する。簡潔に述べると、１５ｍｌのＦｉｃｏｌ−Ｐａｑｕｅ上に３５ｍＬのバフィーコート試料を重層する。ブレーキを用いずに４００ｘｇで２０分間遠心分離する。回収したＰＢＭＣを、ＰＢＳで３回洗浄する。ＮＫ細胞は、この段階でＲｏｓｅｔｔｅｓＳｅｐによって単離することができる。
【０１０６】
０、７、および１４日目に、照射した１０×１０６ｍｂＩＬ２１発現フィーダー細胞で刺激することによって、ＮＫ細胞を増殖する。培地を、１０％ＦＢＳ、１％グルタミン、１％ペニシリン・ストレプトマイシン、および１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含有する新鮮なＡＩＭＶまたはＲＰＭＩを用いて、培地の容積全体について１日おきに交換する。
【０１０７】
（２）ｇＲＮＡの設計および選択
オンラインツール、例えば、ＮＣＢＩ、Ｅｎｓｅｍｂｌｅを使用して、標的にする特定のゲノム遺伝子座を選択する。例として、形質転換成長因子β受容体２（ＴＧＦＢＲＲ２）外部ドメインを使用する。Ｖｉｅｗ  ｒｅｃｏｒｄ：ＰＦ０８９１７、Ｖｉｅｗ  ＩｎｔｅｒＰｒｏ：ＩＰＲ０１５０１３、位置：４９−１５７ａａ。標的配列：ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエクソン４（ＥＮＳＧ０００００１６３５１３）
【０１０８】
ｇＲＮＡを設計するには、ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕおよび「Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ．ｃｏｍ」などのＣＲＩＳＰＲデザインＷｅｂツールを使用する。ステップ２．１で選択したＤＮＡ配列を入力する。標的ゲノムとして、ヒト（ｈｇ１９）を選択する。ＣＲＩＳＰＲガイド（２０ヌクレオチド、続いてＰＡＭ配列：ＮＧＧ）を、先に入力した配列からスキャンする。これはまた、選択されたゲノム全体にわたって可能なオフターゲットのマッチも示す。オンターゲットとオフターゲットの割合に基づいて、最も高いスコアを有する最良の３つのｇＲＮＡを選択する。
【０１０９】
表１は、ＣＲＩＳＰＲ設計ウェブツールによって示されるＴＧＦＢＲ２遺伝子のエクソン４を標的にするように設計されたＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡを示す。
【表３】
2021523725.tif 000005
【０１１０】
ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡを合成配列特異的ｃｒＲＮＡとしてオーダーし、保存されたトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をオーダーして、ｃｒＲＮＡとの部分的相同性を通して相互作用させる。
【０１１１】
（３）欠失スクリーニングプライマーの設計
Ｔ７Ｅ１変異アッセイのためのｇＲＮＡ切断部位にまたがるプライマーを設計する。予測切断部位から少なくとも１００ｂｐ離れたプライマーを使用して、変異アッセイ後に、１．５％アガロースゲル上で、ｓｇＲＮＡ標的部位において小さな挿入欠失（インデル）を確保する。表２は、ＴＧＦＢＲ２外部ドメインを増幅するために使用されたプライマーを示す。
【表４】
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【０１１２】
（４）ヒト初代および増殖ＮＫ細胞の形質導入
Ｃａｓ９／ＲＮＰエレメントのＮＫへの形質導入は、以下のように、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍを使用したエレクトロポレーションによって行われる。
【０１１３】
（５）細胞の調製
初代ＮＫ細胞については、新たに単離したＮＫ細胞を、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２の存在下、ＲＰＭＩまたはＡＩＭＶ培地中で４日間インキュベートし、５日目に、エレクトロポレーションを実施する（培地を、前述の通り１日おき、および形質導入の前日に交換する）。これは、増殖ＮＫ細胞用に修正することができる。増殖ＮＫ細胞については、０日目に、細胞を、照射されたフィーダー細胞（１：１の比率）で刺激し、５日目または６日目または７日目にエレクトロポレーションを実施する。（培地を、前述の通り１日おき、および形質導入の前日に交換する）。エレクトロポレーションの日に、エレクトロポレーションを受ける細胞のために、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含有する８ｍｌの新鮮なＲＰＭＩが充填されたＴ２５フラスコを準備し、そして加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター内で、フラスコをプレインキュベートする。解凍された細胞または第２または第３の刺激を受けた細胞を、記載のように、それらの回復した後は、いつでもエレクトロポレーションすることができる。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液中のＮＫ細胞が非常に高い濃度であると、形質導入率が増加するため、２６μＬの形質導入混合物について、１つの条件あたり３〜４×１０６個の細胞を用いる。細胞を、ＰＢＳで３回洗浄して、すべてのＦＢＳ（通常、ＲＮＡアーゼ活性を含んでいる）を除去する。毎回、３００ｇで８分間遠沈する。Ｃａｓ／ＲＮＰについて、７つのエレクトロポレーションの条件、単一のｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ３）および２つのｇＲＮＡの組み合わせ（ｇＲＮＡ１＋ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ１＋ｇＲＮＡ３、ｇＲＮＡ２＋ｇＲＮＡ３）およびＣＡＳ９／ＲＮＰを含まない１つの対照、を考慮する。
【０１１４】
（６）ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｅｒＲＮＡ／複合体の形成
ｃｒＲＮＡ（ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２およびｇＲＮＡ３）およびＴｒａｃｅｒＲＮＡを１×ＴＥ溶液中で再懸濁して、最終濃度２００μＭにする。表３に示すように、２．２μｌのｇＲＮＡ（各２００μＭ）を、２００μＭのＴｒａｃｅｒＲＮＡと混合する。試料を、９５℃で５分間加熱し、ベンチトップで室温（１５〜２５℃）まで冷却する。後で使用するために、再懸濁したＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｅｒＲＮＡ／複合体を、−２０℃で保管する。
【表５】
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【０１１５】
（７）ＲＮＰ複合体の形成
時間を節約するために、洗浄ステップ中に、ＲＮＰ複合体を形成する。単一ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖反応について、表４で言及されるように、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを、３６μＭに希釈する。
【表６】
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【０１１６】
ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖の組み合わせ形質導入のために、表５に示されるように、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを３６μＭに希釈する。
【表７】
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【０１１７】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖に、３０秒〜１分かけて、ピペット先端を旋回させながらゆっくりと添加する。混合物を室温で１５〜２０分間インキュベートする。インキュベーション後に混合物を使用する準備ができていない場合は、混合物を使用するまで氷上に保つ。
【０１１８】
（８）エレクトロポレーション
全ての補充物を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｐ３に添加し、室温に保つ。細胞ペレットを、２０μｌのＰ３  Ｐｒｉｍａｒｙ  ４Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に再懸濁する（３〜４×１０６細胞）。ピペッティング中は、気泡を避ける。細胞は、Ｐ３溶液中に長時間放置しないようにする。細胞懸濁液に、５μＬのＲＮＰ複合体を直ちに添加する。Ｃａｓ９／ＲＮＰ／細胞混合物に、１μｌの１００μＭのＣＡＳ９エレクトロポレーションエンハンサーを添加する。Ｃａｓ９／ＲＮＰ／細胞混合物を、２０μｌのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ  Ｓｔｒｉｐに移す。Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅストリップを軽く叩いて、試料がストリップの底部を覆っていることを確認する。４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムを起動し、ＥＮ−１３８プログラムを選択する。
【０１１９】
（９）形質導入後
細胞をストリップで３分間休ませる。８０μＬの予め平衡化した培養培地をキュベットに添加し、試料をフラスコに穏やかに移す。形質導入して４８時間後、遺伝子欠失のスクリーニングのために、５×１０５細胞からゲノムＤＮＡを抽出する。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼキットを用いて、ステップ３．２で設計されたプライマーを使用して目的の遺伝子を増幅する。Ｔ７ＥＩ消化のために、ＰＣＲアンプリコンのヘテロ二重鎖を形成し、生成物をＴ７ＥＩ酵素と共に３７℃で３０〜６０分間インキュベートする。Ｔ７ＥＩアッセイは、迅速で単純であり、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用する場合と比較して、きれいな電気泳動結果を提供するため、スクリーニングに好ましい。しかしながら、この方法は、Ｃａｓ９ＲＮＰ実験において非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性によって生成される２つ以下の塩基の挿入および欠失を検出することができない。
【０１２０】
消化されたＤＮＡを、１１０Ｖで３０〜４５分間、１．５％アガロースゲル上で実行し、１５分ごとにゲルを視覚化する。残りの細胞を、ｍｂＩＬ２１発現フィーダー細胞で１：１の割合で刺激する。刺激して５日後、ｑＰＣＲを使用した遺伝子発現レベルのために、ＲＮＡを抽出する。
【０１２１】
以前報告されているように、カルセインアッセイを実施する。簡潔に述べると、標的細胞に、カルセインＡＭを負荷する（示された例では、３μｇ／ｍＬ／１，０００，０００ＤＡＯＹ細胞を使用した）。ＩＬ２（１００ＩＵ／ｍＬ）プラスまたはマイナス１０ｎｇ／ｍＬの可溶性ＴＧＦβ中で、一晩休ませることによって、細胞毒性アッセイ用にＮＫ細胞を調製する。ＮＫ細胞を一晩休ませた同じサイトカイン中でカルセインアッセイを行う。
【０１２２】
ｂ）結果：
（１）エレクトロポレーション効率：
Ｃａｓ９／ＲＮＰエレクトロポレーションの４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎを最適化するために、１６個の異なるプログラムを、ＧＦＰ非標的ｓｉＲＮＡおよびＤＮＡプラスミドをＮＫ細胞に形質導入することで、試験した。フローサイトメトリーアッセイは、両方の粒子について、ＥＮ−１３８が、最も高い割合の細胞生存率および形質導入効率を有したことを示した（３５％生ＧＦＰ陽性細胞）。（図１および図２）。興味深いことに、Ｃａｓ９／ＲＮＰのエレクトロポレーションについて、このプログラムを使用すると効率がより高く、ＴＧＦＢＲ２  ｍＲＮＡ発現レベルで、６０％の低下が観察された（図５）。
【０１２３】
（２）変異アッセイ
ＧＲＮＡ２、ｇＲＮＡ１＋ｇＲＮＡ２およびｇＲＮＡ３を含有するＣａｓ９／ＲＮＰは、ＴＧＦＢＲ２外部ドメイン遺伝子を正常にノックアウトしたが、ｇＲＮＡ１単独では、Ｔ７Ｅ１検出可能なインデルが一切作製されなかった（図３）。さらに、図４は、市販のｇＲＮＡを使用して、増殖ヒトＮＫ細胞でヒトＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）を正常にノックアウトしたことを示す。
【０１２４】
（３）遺伝子発現レベルのアッセイ
結果の代表として、図５は、ＲＴ−ＰＣＲによって分析したＴＧＦＢＲ２外部ドメインのｍＲＮＡ産生レベルに対するＣａｓ９／ＲＮＰ（ｇＲＮＡ１＋ｇＲＮＡ２）の効果を示す。グラフから分かるように、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは有意に低下した。
【０１２５】
（４）細胞毒性
図６から分かるように、ｇＲＮＡ１＋ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ２およびｇＲＮＡ３  Ｃａｓ９／ＲＮＰ改変細胞を、ＴＧＦＢとインキュベートし、ＤＡＯＹ細胞と共培養した後、改変細胞は、培地中で一晩ＩＬ−２を有した対照群と比較して、それらの細胞毒性レベルでいかなる有意な減少も示さなかった。この結果は、Ｃａｓ９／ＲＮＰ改変細胞がＴＧＦＢの存在下でそれらの細胞毒性機能を保持し、改変細胞がＴＧＦＢ耐性になったことを示す。
【０１２６】
（５）ＲＮＡ配列の分析
ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞におけるＲＮＡ配列の分析は、ＩＬ−２１増殖ＮＫ細胞における能動的ＤＮＡ修復および複製機構を強調した。これは、消費されたＮＫ細胞が、Ｃａｓ９／ＲＮＰ系を使用する遺伝子マニピュレーションに対してよりオープンである可能性があることを示す。
【０１２７】
ｃ）考察：
Ｃａｓ９媒介ゲノム操作は、実験医学と臨床医学に革命をもたらした。この技法の使用は、Ｔ細胞で成功しているが、ＮＫ細胞のＤＮＡ依存性改変は困難であった。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系において、得られる転写プロセスは、必要であるか、または望ましいかのいずれかであるため、ｓｇＲＮＡのコード配列を担うＤＮＡベクターを、Ｕ６またはＨ１プロモーターの制御下に置く。レンチウイルスおよびレトロウイルストランスフェクションなどのＤＮＡ依存性導入遺伝子送達は、遺伝子操作されたＮＫ細胞の効率的な産生を制限する、実質的な手順関連ＮＫ細胞アポトーシスのために不十分である。
【０１２８】
したがって、合成的に予め形成したリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体およびＣａｓ９タンパク質を、精製タンパク質として初代および増殖ＮＫ細胞に導入した。
【０１２９】
この方法は、ＤＮＡ依存性形質導入の方法で生じると考えられる実質的な手順関連ＮＫ細胞アポトーシスを引き起こす可能性があるＲＮＡポリメラーゼＩＩによって開始されるキャップ形成、テール形成、ならびに他の転写および翻訳プロセスの排除を可能にした。加えて、本明細書で報告される方法は、精製されたＣａｓ９タンパク質を使用し、Ｃａｓ９／ＲＮＰがエレクトロポレーション直後で活性であり、また同様に迅速に分解されるため、オンターゲット効果を増加させ、かつオフターゲットの影響を減少させ、現在のプロトコルへと改善を導く。
【０１３０】
要約すると、上に記載の方法を利用した癌免疫療法の目的で、ヒト初代および増殖ＮＫ細胞を遺伝子改変するために、Ｃａｓ９／ＲＮＰを使用することができる。この結果はまた、ＴＧＦＢＲ２外部ドメイン遺伝子の正常なノックアウトが、これらの改変ＮＫ細胞をＴＧＦＢ耐性にすることにつながることも実証した。
【０１３１】
ＲＮＰ送達を鋳型ＤＮＡの供給源（天然組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ドナーベクターなど）と組み合わせることで、相同組換えによる部位特異的遺伝子挿入を可能にすることができる。
【０１３２】
２．実施例２：サイトカインシグナル抑制因子３（ＳＯＣＳ３）
癌免疫療法を増強するためのＮＫ細胞の遺伝子改変は、広範囲の癌を治療するための用途を有する。最近、エレクトロポレーションを介して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エレメントをリボ核タンパク質（ＲＮＰ）としてＮＫ細胞に導入し、続いて４−１ＢＢＬおよび膜結合ＩＬ−２１を発現するフィーダー細胞上で増殖させて多数の遺伝子改変ＮＫ細胞を生成する新しい戦略が開発された。この方法を使用して、サイトカインシグナル抑制因子３（ＳＯＣＳ３）を含む初代および増殖ＮＫ細胞のいくつかの遺伝子を遺伝子改変した。ＳＯＣＳ３は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を通して、サイトカインシグナル伝達を負に調節する。Ｃａｓ９／ＲＮＰを使用した初代ＮＫ細胞におけるＳＯＣＳ３の破壊が、ＳＴＡＴ３シグナル伝達レベルを維持し、続いて、それらの増殖および細胞毒性機能を増加させることができる、という仮説を立てた。
【０１３３】
ｇＲＮＡを、ＳＯＣＳ３遺伝子のエクソン２（図７）を標的にするように設計し、Ｌｏｎｚａ４Ｄエレクトロポレーターを使用して、Ｃａｓ９タンパク質と共に（Ｃａｓ９／ＲＮＰとして）、初代ＮＫ細胞にエレクトロポレーションした。ｇＲＮＡの６つの異なる条件を、単独で、または組み合わせて、試験した。対照群のＮＫ細胞を、Ｃａｓ９／ＲＮＰなしでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を、１００ＩＵのヒトＩＬ−２を補充した培養培地中で４８時間休ませた後、照射されたフィーダー細胞を使用して増殖させた。７日目に、同数の細胞を、照射されたフィーダー細胞で再刺激して、増殖に対するＳＯＣＳ３  ＫＯの効果を試験した。ウェスタンブロットを使用して、タンパク質レベルで、ノックアウトの有効性をアッセイした。カルセインアッセイおよびＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｚｏｏｍ（Ｅｓｓｅｎ）を行って、２つの癌細胞株Ｋ５６２およびＤａｏｙに対する細胞毒性を測定した。
【０１３４】
結果は、３つの条件（ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ３、およびｇＲＮＡ１＋ｇＲＮＡ３）において、ＳＯＣＳ３タンパク質レベルが、対照群と比較して、有意な減少を示した。ＳＯＣＳ３の相対正規化発現を、図８に示す。カルセインアッセイおよびＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｚｏｏｍでは、改変されたＳＯＣＳ３  ＫＯ  ＮＫ細胞が、ＡＭＬおよびＤａｏｙ癌細胞株における対照と比較して、より効率的に腫瘍を死滅させることができることを示した（図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、および９Ｄ）。ｇＲＮＡ１（Ｇ１）は、陰性対照（ＮＣ）の２倍の死滅を示した。特に、ＮＣは、１０：１で８０％の死滅を示し、Ｇ１は、５：１で８０％の死滅を示している（図９Ｂおよび９Ｄ）。神経芽細胞腫の細胞は、ＳＯＣＳ３ノックアウトにおいて、より速い速度で死滅することはなかった（図９Ｃおよび９Ｄ）。増殖データは、ＳＯＣＳ３  ＫＯ細胞が、対照群よりも速く成長することができることを示した（図１０）。
【０１３５】
結論として、データは、ＮＫ細胞機能におけるＳＯＣＳ３およびＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の役割を実証し、ＳＯＣＳ３が、ＮＫ細胞を使用して癌免疫療法を改善するための遺伝子改変の良好な標的であることを示す。
【０１３６】
３．実施例３：フラトリサイドを克服し、ＡＤＣＣを増強するための、ＣＤ３８−ＫＯ  ＮＫ細胞の生成
ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体であるダラツマブ（ＤＡＲＡ）による、ＣＤ３８発現多発性骨髄腫（ＭＭ）の標的化において重要な役割を果たす。ＤＡＲＡ療法におけるＮＫ細胞のフラトリサイドを克服するために、Ｃａｓ９／ＲＮＰを使用したノックアウトＮＫ細胞を生成した。エクスビボ増殖自己ノックアウトＮＫ細胞とＤＡＲＡとの併用療法は、ＤＡＲＡ誘導性の腫瘍細胞の死滅において有意な改善を示した（図１１および１２）。
【０１３７】
４．実施例４：ＡＡＶＳ１
この方法論を使用して、初代ＮＫ細胞のゲノムへのＣＡＲおよびレポーター遺伝子を含む任意の目的の遺伝子の組み込み部位として使用されるセーフハーバーとしてＡＡＶＳ１遺伝子を標的にした。
【０１３８】
ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の干渉）は、Ｃａｓ９／ＲＮＰを使用して、高効率の目的の遺伝子の標的化を示した。ＡＡＶＳ１の標的化で、初代ＮＫ細胞の細胞毒性効果は変わらない（図１３）。
使用したｇＲＮＡ：ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ（配列番号９）
【０１３９】
５．実施例５：Ｃａｓ９／ＲＮＰドナーを使用したＣＡＲ−ＮＫ生成の概念の証明としての、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性初代ＮＫ細胞の生成
このアプローチを使用して、ｍＣｈｅｒｒｙ発現ヒト初代ＮＫ細胞を生成した。さらに、これらの改変初代ＮＫ細胞を、照射されたｍｂＩＬ２１発現フィーダー細胞で刺激することによって増殖させ、レポーター遺伝子の安定した発現を実証した（図１４、１５、および１６）。これにより、初代および増殖したＣＡＲ−ＮＫ細胞の生成が確認される。
使用したｇＲＮＡ：ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ（配列番号９）
【０１４０】
６．実施例６：オフターゲット効果の試験
ＮＫ細胞でＣａｓ９／ＲＮＰを使用した後のオフターゲット効果を特定するために、正常および改変ＮＫ細胞（ＣＤ３８−ＫＯ）の全ゲノム配列決定を行った。ＷＧＳは、候補遺伝子を予測するために使用されるアルゴリズムに基づいて、オフターゲットがないか、または非常に低い（２個の遺伝子）ことを示した。
【０１４１】
Ｂｅｎｃｈｉｎｇ．ｃｏｍによって生成されたオフターゲット候補遺伝子のリストを、ＣＤ−３８を標的にするために使用されたｇＲＮＡについて調査した。（５’−ＣＴＧＡＡＣＴＣＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＡＴ−３’（配列番号１１））であり、いかなるオフターゲットも現われなかった。（表６に示されるオフターゲット候補遺伝子のリスト）
【表８−１】
2021523725.tif 000010
【表８−２】
2021523725.tif 000011
【表８−３】
2021523725.tif 000012
Ｄ．参考文献
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【図１】
2021523725.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
2021523725.tif 000022
【図９Ｂ】
2021523725.tif 000023
【図９Ｃ】
2021523725.tif 000024
【図９Ｄ】
2021523725.tif 000025
【図１０】
2021523725.tif 000026
【図１１】
2021523725.tif 000027
【図１２】
2021523725.tif 000028
【図１３】
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【配列表】
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