(57)【要約】  本発明は、ｉｎｖ（１６）白血病の治療のための方法および組成物に関し、特に、急性骨髄性白血病の治療に関する。ｉｎｖ（１６）白血病を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、ａ）式（１）（１）の化合物と、ｂ）ＪＱ１、ＣｅＭＭＥＣＺ、ｌ−ＢＥＴ  １５１（またはＧＳＫ１２１０１５１Ａ）、ｌ−ＢＥＴ  ７６２（またはＧＳＫ５２５７６２）、ＰＦＩ−１、ブロモスポリン、ＯＴＸ−０１５（またはＭＫ−８６２８）、ＴＥＮ−０１０、ＣＰＩ−２０３、ＣＰＩ−０６１０、ＲＶＸ−２０８、ＢＩ２５３６、ＴＧ１０１３４８、ＬＹ２９４００２、ＡＢＢＶ−０７５（またはミベブレシブ）、ＦＴ−１１０１、ＺＥＮ００３６９４、薬学的に許容される塩、およびそれらの混合物からなる群から選択されるＢＲＤ４阻害剤との治療上有効な組み合わせを投与するステップを含む、方法が開示される。治療上有効な組み合わせが、ｉｎｖ（１６）白血病細胞の増殖を相乗的に阻害する。本発明はまた、式（１）の化合物とＢＲＤ４阻害剤との治療上有効な組み合わせ、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物に関する。【化１】2021525280.tif 000027【選択図】図３F
2021525280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎｖ（１６）白血病を治療する方法であって、
治療を必要とする対象に、
ａ）式（１）の化合物であって、
【化１】
2021525280.tif 000019
式中、Ｙが、Ｏ、ＮＨ、またはＮＲであり、Ｒは、メチルまたはエチルであり、
ｎが、１〜１０の整数である、化合物、
またはその薬学的に許容される塩と、
ｂ）ＪＱ１、ＣｅＭＭＥＣ２、ｌ−ＢＥＴ  １５１（またはＧＳＫ１２１０１５１Ａ）、ｌ−ＢＥＴ  ７６２（またはＧＳＫ５２５７６２）、ＰＦＩ−１、ブロモスポリン、ＯＴＸ−０１５（またはＭＫ−８６２８）、ＴＥＮ−０１０、ＣＰＩ−２０３、ＣＰＩ−０６１０、ＲＶＸ−２０８、ＢＩ２５３６、ＴＧ１０１３４８、ＬＹ２９４００２、ＡＢＢＶ−０７５（またはミベブレシブ）、ＦＴ−１１０１、ＺＥＮ００３６９４、薬学的に許容される塩、およびそれらの混合物からなる群から選択されるブロモドメイン４（ＢＲＤ４）阻害剤との治療上有効な組み合わせを投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
Ｙが、Ｏである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｙが、Ｎ−ＣＨ３である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｎが、１〜５の整数である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記式（１）の化合物が、
【化２】
2021525280.tif 000020
【化３】
2021525280.tif 000021
【化４】
2021525280.tif 000022
および
【化５】
2021525280.tif 000023
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記式（１）の化合物が、
【化６】
2021525280.tif 000024
である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記式（１）の化合物および前記ＢＲＤ４阻害剤が、前記式（１）の化合物、前記ＢＲＤ４阻害剤、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物で投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＢＲＤ４阻害剤が、ＡＢＢＶ−０７５、ＯＴＸ０１５、もしくはＪＱ１、またはその薬学的に許容される塩から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＢＲＤ４阻害剤が、ＪＱ１である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｉｎｖ（１６）白血病が、急性骨髄性白血病である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記式（１）の化合物および前記ＢＲＤ４阻害剤が、同時にまたは順次投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記式（１）の化合物および前記ＢＲＤ４阻害剤が、同時に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｉｎｖ（１６）白血病を治療する方法であって、
治療を必要とする対象に、
ａ）式（１ａ）の化合物
【化７】
2021525280.tif 000025
またはその薬学的に許容される塩と、
ｂ）ＡＢＢＶ−０７５、ＯＴＸ０１５、もしくはＪＱ１、またはその薬学的に許容される塩から選択されるＢＲＤ４阻害剤との治療上有効な組み合わせを投与するステップを含み、
前記式（１ａ）の化合物と前記ＢＲＤ４阻害剤との前記治療上有効な組み合わせが、ｉｎｖ（１６）白血病細胞の増殖を相乗的に阻害する、方法。
【請求項１４】
薬学的組成物であって、
薬学的に許容される担体と、
ａ）式（１）の化合物であって、
【化８】
2021525280.tif 000026
式中、Ｙが、Ｏ、ＮＨ、またはＮＲであり、Ｒは、メチルまたはエチルであり、
ｎが、１〜１０の整数である、化合物、
またはその薬学的に許容される塩、ならびに
ｂ）ＪＱ１、ＣｅＭＭＥＣ２、ｌ−ＢＥＴ  １５１（もしくはＧＳＫ１２１０１５１Ａ）、ｌ−ＢＥＴ  ７６２（もしくはＧＳＫ５２５７６２）、ＰＦＩ−１、ブロモスポリン、ＯＴＸ−０１５（もしくはＭＫ−８６２８）、ＴＥＮ−０１０、ＣＰＩ−２０３、ＣＰＩ−０６１０、ＲＶＸ−２０８、ＢＩ２５３６、ＴＧ１０１３４８、ＬＹ２９４００２、ＡＢＢＶ−０７５（もしくはミベブレシブ）、ＦＴ−１１０１、ＺＥＮ００３６９４、またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択されるＢＲＤ４阻害剤の治療上有効な組み合わせと、
薬学的に許容される賦形剤と、を含み、
前記式（１）の化合物および前記ＢＲＤ４阻害剤が、ｉｎｖ（１６）白血病細胞の増殖を阻害するのに相乗的に有効な組み合わせ量で存在する、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦支援による研究または開発に関する声明
本発明は、ＮＩＨ助成金Ｒ０１  ＣＡ２０４９７９およびＲ０１  ＣＡ１４０３９８の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月２４日に出願された米国出願第６２／６７６，０２５号に対する優先権を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、概して、白血病を治療するための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、特定の転写因子阻害剤およびクロマチン活性を標的とする阻害剤の相乗的組み合わせを使用する組成物および治療方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
がん細胞は、転写因子およびクロマチン関連因子の機能を変化させる突然変異に適応して生存する。白血病では、これらの因子は、白血病の開始および維持を促進することが多い。転写因子複合体コア結合因子（ＣＢＦ）は、安定化サブユニットＣＢＦβおよびＤＮＡ結合サブユニットＲＵＮＸ（３つの遺伝子：ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、およびＲＵＮＸ３によってコードされた）で構成されたヘテロ二量体因子である。造血において、ＲＵＮＸ１はすべての系統で発現し、赤血球形成中にのみ抑制される（Ｌｏｒｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｎｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＲＵＮＸ１／ＣＢＦβは、増殖、生存、および分化に関連する経路を調節する（Ｂｌｙｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＣＢＦβおよびＲＵＮＸ１をコードする遺伝子は、血液悪性腫瘍における突然変異の頻繁な標的である。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）症例の８％に見られる染色体逆位ｉｎｖ（１６）（ｐ１３；ｑ２２）は、ＣＢＦＢおよびＭＹＨ１１遺伝子を融合して、白血病腫瘍性タンパク質ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣを産生する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。この融合タンパク質は、天然ＣＢＦβと比較してＲＵＮＸ１に対して著しく高い親和性および変化した化学量論を有するため、インビトロで野生型ＣＢＦβを打ち負かす（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｋａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｌｕｋａｓｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。発達中、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ発現は、二次造血をブロックし、胚は妊娠中期に死滅し（Ｃａｓｔｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、Ｒｕｎｘ１−およびＣｂｆｂ−ノックアウト胚の表現型と同様の表現型である（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ａ、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ｂ）。これらの所見は、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣがＣＢＦ機能にドミナントネガティブな効果を有することを暗示する。
【０００５】
成体造血において、対立遺伝子ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ発現は、造血幹細胞（ＨＳＣ）分化を変化させ、短期ＨＳＣおよび多潜在的前駆体のクローン拡大を伴う（Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。これらの前駆体は、前白血病骨髄性前駆体の拡大およびリンパ分化の顕著な低減を引き起こす（Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。骨髄性前白血病前駆体は、マウスにおいて骨髄性白血病を誘導するための協力的突然変異を得る白血病前駆体である（Ｃａｓｔｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０００６】
ＲＵＮＸ１は、造血におけるヒストンデアセチラーゼ（Ｄｕｒｓｔ  ａｎｄ  Ｈｉｅｂｅｒｔ，２００４、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，２０１１）、アセチルトランスフェラーゼ（Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、およびメチルトランスフェラーゼ（Ｒｅｅｄ−Ｉｎｄｅｒｂｉｔｚｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｖｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）を含む、クロマチン修飾タンパク質と会合する。これらの相互作用は、ＤＮＡに対するＲＵＮＸ１親和性およびその転写活性を調節し、活性化および抑制クロマチン複合体とのその会合を調節する（Ｌｉｃｈｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。しかしながら、ＡＭＬ細胞の生存を維持するクロマチン関連複合体の確立におけるＲＵＮＸ１の役割、およびそれらが白血病維持をどのように調節するかは、あまり理解されていないままである。
【０００７】
ＳＷＩｔｃｈ／スクロース非発酵性（ＳＷＩ／ＳＮＦ）タンパク質複合体は、ヒストン−ＤＮＡ相互作用をリモデリングし、プロモーターおよびエンハンサーを含むゲノムの活性調節領域と関連付けられる。この多タンパク質複合体の成分は、がんにおいて突然変異される（Ｋａｄｏｃｈ  ａｎｄ  Ｃｒａｂｔｒｅｅ，２０１５）。ＡＭＬにおいて、ＳＷＩ／ＳＮＦおよびブロモドメイン（「ＢＲＤ」）タンパク質のＢＥＴファミリーを含むクロマチン関連複合体は、白血病開始細胞の生存を媒介するためのエンハンサー活性を促進する（Ｂｌｏｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｚｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。逆に、ポリコーム抑制複合体（ＰＲＣ１およびＰＲＣ２）の蓄積は、抑制されたクロマチンと関連付けられ、ヒストンＨ３（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）中のリジン−２７のトリメチル化をもたらし、それによってエンハンサーの周囲のクロマチン構造の局所的圧縮を促進し、標的遺伝子の発現をサイレンシングする（Ｄｉ  Ｃｒｏｃｅ  ａｎｄ  Ｈｅｌｉｎ，２０１３）。造血の恒常性は、これらのタンパク質がＨＳＣの自己更新および分化を調節するため、ＰＲＣ機能に重大に依存する（Ｌｅｓｓａｒｄ  ａｎｄ  Ｓａｕｖａｇｅａｕ，２００３、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｕｇｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、ならびにマウスにおける骨髄性前駆細胞の分化および増殖を阻害する（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０００８】
がん原性遺伝子ＭＹＣは、ＨＳＣの自己更新と分化との間のバランスを調節する（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）とともに、リンパ系（ｄｅ  Ａｌｂｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）および巨核細胞／赤血球の発達に不可欠である（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。しかしながら、ＭＹＣ発現は、ＭＹＣ抑制が顆粒球形成を促進する一方で、異所性発現が顆粒球形成をブロックするため、骨髄分化中に下方調節される必要がある（Ｇｏｗｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、Ｊｏｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。新たな証拠は、エンハンサー活性のエピジェネティック調節が、骨髄分化および白血病において重要な役割を果たすことを示す。ＳＷＩ／ＳＮＦおよびＢＲＤ４複合体は、その転写開始部位（ＴＳＳ、（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｙａｓｈｉｒｏ−Ｏｈｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４））から１．７メガ塩基（Ｍｂ）下流の遠位スーパーエンハンサーＢＤＭＥ（ＢＲＤ４依存性ＭＹＣエンハンサー）からのＭＹＣ発現を調節し、各々がいくつかの骨髄性転写因子によって占有される５つのエンハンサーエレメントで構成される。白血病において、ＭＹＣは高レベルで発現され、その正常な高親和性標的および新しい標的セットの発現を腫瘍型特異的様式で調節する（Ｋｒｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。正常な顆粒球形成に必要なＳＷＩ／ＳＮＦ  ＡＴＰａｓｅサブユニットＢＲＧ１（Ｂｒａｈｍａ関連遺伝子１）は、混合系統ＡＭＬ細胞におけるＭＹＣレベルを維持するためにＢＤＭＥと会合する（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｖｒａｄｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。加えて、ＢＤＭＥ機能は、ＧＳＩ耐性Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病における白血病維持に重要であると思われる（Ｙａｓｈｉｒｏ−Ｏｈｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０００９】
発がん性ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ機能の基礎となる機序、およびｉｎｖ（１６）ＡＭＬの維持におけるエピジェネティック複合体の役割は、さらなる調査が必要である。ＲＵＮＸ１へのＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ結合を破壊し、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞のアポトーシスを特異的に誘導する二価阻害剤であるＡＩ−１０−４９は、以前に開発された（Ｉｌｌｅｎｄｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＡＩ−１０−４９処理されたｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞のトランスクリプトーム分析は、ＭＹＣ発現および機能が劇的に抑制されることを明らかにした。以下に記載されるように、薬理学的分析は、ＡＩ−１０−４９およびＢＲＤ４阻害剤ＪＱ１が相乗作用して、インビトロおよびインビボでｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞のアポトーシスを誘導することを明らかにする。ディープシーケンシング（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）およびＣｈＩＰ定量的ＰＣＲ（ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）と結合したクロマチン免疫沈降を利用したＲＵＮＸ１結合およびエピジェネティックマークのゲノム解析は、ＡＩ−１０−４９が、ＢＤＭＥ−Ｅ３、ならびにＭＥ１およびＭＥ２と呼ばれる２つの新しい領域を含む３つの遠位ＭＹＣエンハンサーへのＲＵＮＸ１会合の増加を誘導することを判定した。これは、これらのエンハンサーにおけるＰＲＣ１成分ＲＩＮＧ１Ｂおよび抑制性マークヒストンＨ３Ｋ２７ｍｅ３の増加と同時に、ＢＲＧ１および活性エンハンサーマークヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ１の枯渇と相関する。ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ活性が、ＭＹＣレベルおよびｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞の生存を維持し、ＡＩ−１０−４９が、ＭＹＣ発現を抑制することによってアポトーシスを誘発することも以下に示される。最後に、カーボンコピー染色体コンフォメーションキャプチャ（５Ｃ）およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術を使用して、ＲＵＮＸ１関連エンハンサーをＭＹＣ発現および細胞生存率と物理的かつ機能的に関与させた。本明細書に記載されるこれらの研究は、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣが、３つの遠位エンハンサーからのＭＹＣレベルを維持することによってｉｎｖ（１６）ＡＭＬの生存を促進し、融合タンパク質の薬理学的阻害がＭＹＣ発現のエピジェネティック抑制に起因するアポトーシスを誘導することを実証する。さらに、本明細書の結果は、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬの治療のためのＡＩ−１０−４９とＢＲＤ４阻害剤との組み合わせの有効性の向上の証拠を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特にｉｎｖ（１６）融合を伴う急性骨髄性白血病の予防および治療に有用な組成物および方法が、当該技術分野において長年必要とされている。本発明は、これらのニーズに対応する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、概して、ｉｎｖ（１６）白血病の治療のための方法および組成物に関する。特に、本発明は、ｉｎｖ（１６）白血病を治療する方法であって、
治療を必要とする対象に、
ａ）式（１）の化合物であって、
【化１】
2021525280.tif 000003
式中、Ｙが、Ｏ、ＮＨ、またはＮＲであり、Ｒは、メチルまたはエチルであり、
ｎが、１〜１０の整数である、化合物、
またはその薬学的に許容される塩と、
ｂ）ＪＱ１、ＣｅＭＭＥＣ２、ｌ−ＢＥＴ  １５１（またはＧＳＫ１２１０１５１Ａ）、ｌ−ＢＥＴ  ７６２（またはＧＳＫ５２５７６２）、ＰＦＩ−１、ブロモスポリン、ＯＴＸ−０１５（またはＭＫ−８６２８）、ＴＥＮ−０１０、ＣＰＩ−２０３、ＣＰＩ−０６１０、ＲＶＸ−２０８、ＢＩ２５３６、ＴＧ１０１３４８、ＬＹ２９４００２、ＡＢＢＶ−０７５（またはミベブレシブ）、ＦＴ−１１０１、ＺＥＮ００３６９４、薬学的に許容される塩、およびそれらの混合物からなる群から選択されるブロモドメイン４（ＢＲＤ４）阻害剤との治療上有効な組み合わせを投与するステップを含む、方法に関する。式（１）の化合物とＢＲＤ４阻害剤との治療上有効な組み合わせは、ｉｎｖ（１６）白血病細胞の増殖を相乗的に阻害する。本発明による方法では、式（１）の化合物およびＢＲＤ４阻害剤は、同時にまたは順次投与される。
【００１２】
本発明はまた、式（１）の化合物とＢＲＤ４阻害剤との治療上有効な組み合わせ、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物に関する。いくつかの実施形態では、式（１）の化合物とＢＲＤ４阻害剤との治療上有効な組み合わせは、ｉｎｖ（１６）白血病細胞の増殖を阻害するのに相乗的に有効な組み合わせ量である。
【００１３】
本発明の好ましい方法および薬学的組成物では、式（１）の化合物は、式（１ａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、
【化２】
2021525280.tif 000004
ＢＲＤ４阻害剤は、ＪＱ１またはその薬学的に許容される塩である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１（Ａ−Ｆ）】ＡＩ−１０−４９が、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞においてＭＹＣ転写プログラムを阻害することを示す。（Ａ）３つの独立した実験から、ＤＭＳＯとＡＩ−１０−４９（１μＭ）６時間処理したＭＥ−１細胞との間のＲＮＡ−ｓｅｑ分析における差次的に発現した遺伝子のヒートマップ表現を示す。合計５９１遺伝子（赤色）がＡＩ−１０−４９と正の相関を持ち、６９６遺伝子（青色）が負の相関を持つ（２を超える倍率変化、ＦＤＲ＜０．０１）。上位の上方および下方調節遺伝子を示す。（Ｂ）ＭＥ−１細胞におけるＡＩ−１０−４９処理と相関する生物学的プロセスおよびシグナル伝達経路を示す遺伝子セット濃縮分析を示す。（ＦＤＲ）偽発見率、（ＮＥＳ）正規化した濃縮スコア。（Ｃ）ＡＩ−１０−４９が、ＭＥ−１細胞におけるＭＹＣ転写物レベルを阻害することを示す。細胞を、１μＭのＡＩ−１０−４９で６時間処理し、ＭＹＣのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。三連の実験の結果が示されている。エラーバーは、標準偏差を表す。（Ｄ）ＡＩ−１０−４９が、ＭＥ−１細胞におけるＭＹＣタンパク質レベルを阻害することを示す。細胞をＡＩ−１０−４９で６時間処理し、全細胞溶解物についてウェスタンブロットした。（Ｅ、Ｆ）野生型系統陰性マウス骨髄細胞（Ｅ、左）および系統陰性マウスＣｂｆｂ＋／ＭＹＨ１１白血病細胞（Ｅ、右）、ならびにヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞（Ｆ、左）およびヒト初代ｉｎｖ（１６）白血病ＣＤ３４＋細胞（Ｆ、右）におけるＭＹＣ転写レベル。マウスおよびヒト細胞を、５μＭのＡＩ−１０−４９で２４時間処理した。各記号は、三連の処理からの個々の試料の平均を表す。パネルＣ、Ｅ、およびＦについて、有意性は、対応のないｔ検定として計算した。＊Ｐ＜０．０５または＊＊Ｐ＜０．００５。図Ｓ１も参照されたい。
【図２（Ａ−Ｆ）】ＭＹＣが、ｉｎｖ（１６）細胞の生存に必要であることを示す。（Ａ〜Ｂ）ＭＹＣサイレンシングが、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞の生存率を低減したことを示す。ＭＥ−１細胞株（Ａ）および初代マウスＣｂｆｂ＋／ＭＹＨ１１（ｍＣＭ−ＬＫ）白血病細胞（Ｂ）をスクランブルまたはＭＹＣ  ｓｈＲＮＡで形質導入し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖアッセイによって生細胞（７ＡＡＤ−Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−）を評価した。Ａｎｎｅｘｉｎアッセイを、ＭＥ−１細胞（Ａ）についてはウイルス感染の１４日後、または初代マウス白血病細胞（Ｂ）については７日後に実施した。各データ点は、三連の実験の平均を表し、エラーバーは、標準偏差を表す。（Ｃ）ＭＹＣ−ＥＲによるＭＹＣ過剰発現が、ＡＩ−１０−４９で処理したＭＥ−１細胞の生存率を部分的に救済したことを示す。ＭＹＣ−ＥＲを発現する細胞を、エタノールまたは５００ｎＭの４−ＨＴで９時間処理した後、ＤＭＳＯまたはＡＩ−１０−４９（１μＭ）で２４時間処理し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖアッセイによって生細胞（７ＡＡＤ−Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−）を評価した。各データ点は、三連の実験の平均を表し、エラーバーは、標準偏差を表す。（Ｄ〜Ｅ）白血病細胞を、示されたｓｈＲＮＡを用いて形質導入し、ＧＦＰ＋白血病細胞を野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移植し、移植の５日後に骨髄中のＧＦＰ＋細胞を分析し（Ｄ）、レトロウイルス感染の２８日後に末梢血中のｃ−ｋｉｔ＋細胞を分析した（Ｅ）。（Ｆ）対照／Ｍｙｃ  ｓｈＲＮＡ形質導入白血病細胞を移植したマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。パネルＡ〜Ｅについて、有意性は、ルビーン検定として計算した。＊Ｐ＜０．０５または＊＊Ｐ＜０．００５。パネルＦについては、ログランク検定を使用して有意性を計算した。図Ｓ２も参照されたい。
【図３（Ａ−Ｆ）】ＡＩ−１０−４９によるＭＹＣの阻害を示し、ＪＱ１は、ｉｎｖ（１６）白血病細胞生存に対する相乗効果をもたらす。（Ａ）ｑＲＴ−ＰＣＲによる、ＢＲＤ４  ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１およびｓｈ２）で形質導入されたＭＥ−１細胞におけるＭＹＣ転写物レベル分析を示す。（Ｂ）ＡＩ−１０−４９およびＪＱ１による用量応答処理後のＭＹＣ転写物レベル分析を示す。（Ｃ）併用処理におけるＡＩ−１０−４９とＪＱ１との間の相乗効果を示すアイソボログラムプロットである。（ＤおよびＥ）ＡＩ−１０−４９およびＪＱ１で処理した初代ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞（Ｄ）およびマウス白血病細胞（Ｅ）の生存率分析を示す。（Ｆ）マウス白血病細胞を移植され、ＤＭＳＯ（黒色線）、ＪＱ１（青色線）、ＡＩ−１０−４９（赤色線）、またはＪＱ１およびＡＩ−１０−４９（緑色線）で処置されたマウスのカプラン・マイヤー生存曲線（グループあたりｎ＝５−５）である。エラーバーは、標準偏差を表す。有意性は、対応のないｔ検定（Ａ）、ルビーン検定（Ｂ〜Ｅ）、またはログランク検定（Ｆ）を使用して計算した。＊ｐ＜０．０５または＊＊ｐ＜０．００５。パネルＥについては、ログランク検定を使用して有意性を計算した。
【図４（Ａ−Ｄ）】ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞におけるクロマチンへのＲＵＮＸ１会合の全体的な修飾を示す。（Ａ、Ｂ）ＤＭＳＯ（黒色）または１μＭのＡＩ−１０−４９（赤色）処理で６時間処理されたＭＥ−１細胞におけるＨ３Ｋ２７ａｃ（Ａ）およびＲＵＮＸ１（Ｂ）ピークの重複を表すピーク中心からのＶｅｎｎ図（上）およびピーク分布（下）を示す。（Ｃ）ＡＩ−１０−４９で処理したＭＥ−１細胞におけるゲノム全体でのＲＵＮＸ１会合ピークのモチーフ分析である。（Ｄ）ＤＭＳＯおよびＡＩ−１０−４９で処理したＭＥ−１細胞におけるＡＴＡＣ−ｓｅｑ分析によるオープンクロマチンピークを表す散乱プロットである。
【図５（Ａ−Ｄ）】ＲＵＮＸ１が、ｉｎｖ（１６）細胞中の３つの遠位ＭＹＣにおけるクロマチンとの会合を増加させることを示す。（Ａ）ＭＹＣの下流の２Ｍｂゲノム領域におけるＡＴＡＣ−ｓｅｑおよびＫ３Ｋ２７ａｃおよびＲＵＮＸ１  ＣｈＩＰ−ｓｅｑプロファイルを示す。ツリーエンハンサー領域（ＭＥ１、ＭＥ２、およびＢＤＭＥ）を緑色でプロファイルの下に示す。（Ｂ〜Ｄ）ＤＭＳＯまたはＡＩ−１０−４９で処理した細胞（Ｂ）およびＤＭＳＯまたはＡＩ−１０−４９で処理したヒト初代ＣＤ３４＋ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞（Ｃ）中のＲＵＮＸ１についてのＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ分析、ならびにＤＭＳＯまたはＡＩ−１０−４９で処理したＭＥ１（Ｄ）中のｐ３００についてのＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ分析である。有意性は、対応のないｔ検定として計算した。＊Ｐ＜０．０５、または＊＊Ｐ＜０．００５。
【図６（Ａ−Ｂ）】ＭＹＣ遺伝子座におけるロングレンジＤＮＡ相互作用分析を示す。（Ａ）ＤＭＳＯ（対照、左パネル）およびＡＩ−１０−４９（中央パネル）で６時間処理したＭＥ−１細胞のＭＹＣ遺伝子座についての５Ｃ相互作用マトリックスを示す。右パネルは、相互作用マトリックスのｌｏｇ２（ＡＩ−１０−４９／ＤＭＳＯ）比（青色スキーム：ＤＭＳＯで処理した細胞におけるより高い相互作用頻度、オレンジ色スキーム：ＡＩ−１０−４９で処理した細胞におけるより高い相互作用頻度）を示す。矢印はＴＡＤ境界を示し、矢じりは、ＣＴＣＦ−ＣＴＣＦルーピング相互作用の例を指す。（Ｂ）ＤＭＳＯおよびＡＩ−１０−４９で処理した細胞のＭＹＣプロモーター（Ｍｙｃ−Ｐｒ）、ＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３／Ｅ５エンハンサーを含有する１５Ｋｂビン（アンカービン）の４Ｃスタイルプロットを示す。アンカービンは、オレンジ色で示され、実線黒線は、ＬＯＷＥＳＳ平均（ゲノム距離の関数としての予想される相互作用頻度）を表し、点線黒線は、ＬＯＷＥＳＳ±１標準偏差である。赤色線は、観察された５Ｃ相互作用頻度である。緑色の点および垂直な点線は、Ｍｙｃ−Ｐｒ、ＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３間の位置と相互作用を強調する。矢じりは、ＢＤＭＥスーパーエンハンサー周辺のＣＴＣＦ部位との相互作用を示す。矢印は、Ｍｙｃ−Ｐｒ、ＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３と相互作用する遺伝子座を指す相互作用のピークを示す。ＣＴＣＦ結合データは、Ｋ５６２細胞において以前に報告されたＣｈＩＰ−ｓｅｑデータ（ＧＳＥ７０７６４；（Ｐｕｇａｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５））から使用した。
【図７（Ａ−Ｈ）】ＡＩ−１０−４９がＲＵＮＸ１関連ＭＹＣエンハンサーにおける抑制マークの活性化に置き換わることを示す。（ＡおよびＢ）ＢＲＧ１（Ａ）およびＨ３Ｋ４ｍｅ１（Ｂ）のプロモーター（ＰＲ）ならびに８つのＭＹＣエンハンサー（ＭＥ１、ＭＥ２、Ｎ−Ｍｅ、およびＢＤＭＥエレメントＥ１〜Ｅ５）における処理されたＭＥ−１細胞のＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ分析を示す。（Ｃ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって推定される、スクランブル（Ｓｃｒ）またはＳＭＡＲＣＡ４  ｓｈＲＮＡ（ｓｈ３およびｓｈ４）で形質導入したＭＥ−１細胞におけるＭＹＣ転写物レベル分析を示す。（ＤおよびＥ）ＲＩＮＧ１Ｂ（Ｄ）およびＨ３Ｋ２７Ｍｅ３マーク（Ｅ）についてのＭＹＣプロモーターおよびＭＹＣエンハンサーにおける処理されたＭＥ−１細胞のＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ分析を示す。（Ｆ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって推定される、スクランブル（Ｓｃｒ）またはＲＮＦ２  ｓｈＲＮＡ（ｓｈ２およびｓｈ４）で形質導入され、ＤＭＳＯ（Ｄ）またはＡＩ−１０−４９（４９）で処理されたＭＥ−１細胞におけるＭＹＣ転写物レベル分析を示す。（Ｇ）処理したＭＥ−１中のＥ３におけるＲＵＮＸ１、ＲＩＮＧ１Ｂ、およびＢＲＧ１結合の経時的ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ分析である。（Ｈ）Ｅ３エンハンサーにおける、ＲＵＮＸ１についての処理したＭＥ−１  ＣｈＩＰｅｄ、またはＩｇＧ（赤色）、ＲＩＮＧ１Ｂ（紫色）、もしくはＢＲＧ１（青色）についての免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）およびｒｅ−ＣｈＩＰｅｄの定量的ＣｈＩＰ−ｒｅ−ＣｈＩＰである。三連の実験の結果が示されている。エラーバーは、標準偏差を表す。有意性は、対応のないｔ検定を使用して計算した。＊ｐ＜０．０５または＊＊ｐ＜０．００５。
【図８（Ａ−Ｃ）】３つのＲＵＮＸ１関連ＭＹＣエンハンサーエレメントの欠失が、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬのＭＹＣ発現および生存率を損なうことを示す。（Ａ）ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９トランスフェクトＭＥ−１細胞の選別後４８時間におけるＭＹＣエンハンサーエレメントのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性欠失（上）、ならびに各エレメント（下）における主要欠失（ｄｅｌ）、失われたＲＵＮＸ１結合部位（ＲＢＳ）による欠失、および野生型（ｗｔ）対立遺伝子のシーケンシングによる頻度推定の概略図である。（Ｂ）ＭＥ−１細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲによるＭＹＣ発現を示す。（Ｃ）選別の１４日後のＭＥ−１細胞の生存率（７ＡＡＤ−、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−）を示す。三連の実験の結果が示されている。エラーバーは、標準偏差を表す。パネルＢについて、有意性は、対応のないｔ検定として計算した。＊＊Ｐ＜０．００５。パネルＣについて、有意性は、ルビーン検定として計算した。＊＊Ｐ＜０．００５。
【図９（Ａ−Ｄ）】ＡＩ−１０−４９媒介性ＭＹＣ転写変化が、ｉｎｖ（１６）細胞に特異的であることを示す。（Ａ、Ｂ）ＭＥ−１細胞におけるＡＩ−１０−４９と正の相関を持つピリミジン代謝、細胞周期およびリボソーム生体発生（Ａ）、ならびに経路シグネチャ（Ｂ）を示す遺伝子セット濃縮分析を示す。（ＦＤＲ）偽発見率、（ＮＥＳ）正規化した濃縮スコア。（Ｃ）ＤＭＳＯまたは１μＭのＡＩ−１０−４９で６時間処理した非ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞（Ｕ９３７、Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋａｓｕｍｉ−１、およびＴＨＰ−１）におけるＭＹＣ転写レベルを示す。（Ｄ）１μＭのＡＩ−１０−４９で０時間、２時間、４時間、６時間、および８時間処理したＭＥ−１細胞におけるＭＹＣおよびＧＡＰＤＨタンパク質レベルを示す免疫ブロットである。
【図１０（Ａ−Ｇ）】ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞におけるＭＹＣサイレンシングの効果を示す。（Ａ）スクランブル（Ｓｃｒ）または２つのＭＹＣ  ｓｈＲＮＡで形質導入したＭＥ−１細胞における細胞生存率（７ＡＡＤ−Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−）の経時的分析を示す。（Ｂ）１４日目のＭＹＣ  ｓｈＲＮＡで形質導入したＭＥ−１細胞における顆粒球分化のフローサイトメトリー分析を示す。（ＣおよびＤ）ＭＹＣ  ｓｈＲＮＡによる形質導入の１４日後、ＡＭＬ細胞株Ｋａｓｕｍｉ−１、ＮＢ４、ＭＥ−１、ＴＨＰ１、ＭＶ４：１１、およびＫ５６２のウエスタンブロット分析（Ｃ）および細胞生存率（７ＡＡＤ−Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−、Ｄ）によって評価されたＭＹＣタンパク質レベルの分析を示し、各データ点は、三連の実験の平均を表し、エラーバーは、標準偏差を表す。（Ｅ）Ｒｅｎｉｌａ（Ｒｅｎ）またはＭｙｃ  ｓｈＲＮＡ１および２で形質導入したＭｙｃおよびＧａｐｄｈタンパク質レベルマウスＣｂｆｂ＋／ＭＹＨ１１白血病細胞の免疫ブロット分析である。（Ｆ）Ｍｙｃ  ｓｈＲＮＡノックダウン実験のインビボ評価のための実験設計の概略図である。（Ｇ）図２Ｇに示す二次移植アッセイからの白血病マウス（Ｒｅｎ、ｓｈＭｙｃ１、およびｓｈＭｙｃ２群）のＣｂｆｂ＋／ＭＹＨ１１白血病細胞におけるＭｙｃおよびＧａｐｄｈタンパク質レベルの免疫ブロット分析。各バンドは、単一のマウスから単離した白血病細胞のＭｙｃ総タンパク質レベルを表す。有意性は、ルビーン検定（Ｄ）を使用して計算した。＊ｐ＜０．０５または＊＊ｐ＜０．００５。
【図１１（Ａ−Ｊ）】ｉｎｖ（１６）細胞および非（ｉｎｖ１６）細胞におけるＪＱ１媒介性ＭＹＣサイレンシングの効果を示す。（Ａ）スクランブル（Ｓｃｒ）または２つのＢＲＤ４  ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１およびｓｈ２）で形質導入したＭＥ−１細胞におけるＢＲＤ４転写物レベルのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。（Ｂ）ＢＥＴ阻害剤ＪＱ１で６時間処理したＭＥ−１細胞におけるＭＹＣおよびＧＡＰＤＨタンパク質レベルの免疫ブロット分析を示す。（Ｃ）ＡＩ−１０−４９および／またはＪＱ１で７２時間処理したＭＥ−１細胞の用量応答生存率分析（ＭＴＴアッセイ）であり、各化合物のＬＤ５０は、いずれも９５％信頼区間において、ＡＩ−１０−４９−ＬＤ５０＝０．４６８ｍＭ、範囲＝０．３９８〜０．５３７ｍＭ、ＪＱ１−ＬＤ５０＝０．３４４ｍＭ、範囲＝０．２２８〜０．４６０ｍＭである。（Ｄ）フローサイトメトリーによって評価した各群における移植の２５日後の末梢血中のｃ−ｋｉｔ＋（白血病）細胞のパーセンテージを示す。（Ｅ）示される濃度でのＡＩ−１０−４９および／またはＪＱ１による処理の４８時間後のヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞におけるＪＱ１およびＡＩ−１０−４９の生存率分析（ＭＴＴアッセイ）を示す。（Ｆ〜Ｊ）１日用量のＤＭＳＯ（緑色）または２００ｍｇ／ｋｇ／日のＡＩ−１０−４９（１０日）および５０ｍｇ／ｋｇ／日のＪＱ１（２１日）（４９＋ＪＱ１、緑色）で処置した野生型マウスの毒性分析である。最後の処置用量の１日後にマウスを分析した。体重（Ｆ）、脾臓重量（Ｇ）、骨髄細胞性（Ｈ）、骨髄（Ｉ）中の幹細胞および初期前駆細胞のパーセンテージ［ＬＳＫ＋：Ｌｉｎ（−）Ｓｃａ１（＋）ｃ−ｋｉｔ（＋）］、ＬＳＫ−細胞（Ｊ）中の共通骨髄系前駆体の前駆体細胞区画のパーセンテージ［ＣＭＰ：ＬＳＫ−、ＣＤ３４（＋）ＣＤ１６／３２（−）］、巨核球／赤血球前駆体［ＭＥＰ：ＬＳＫ−、ＣＤ３４（−）ＣＤ１６／３２（−）］、および顆粒球／単球前駆体［ＧＭＰ：ＬＳＫ−、ＣＤ３４（＋）ＣＤ１６／３２（＋）］。各記号は、３匹の動物からの値の平均を表し、エラーバーは、標準偏差を表す。有意性は、対応のないｔ検定（Ａ）またはルビーン検定（Ｄ）を使用して計算した。＊ｐ＜０．０５または＊＊ｐ＜０．００５。
【図１２（Ａ−Ｂ）】ＡＩ−１０−４９が、ｉｎｖ（１６）細胞におけるゲノム幅ＲＵＮＸ１結合をもたらすことを示す。（Ａ）ＲＵＮＸ１ピーク中心からの距離（左）および転写開始部位までの距離（右）に関して、ＲＵＮＸ１ピークにおける結合強度を示す。（Ｂ）ＤＭＳＯ（左）またはＡＩ−１０−４９（右）で処理したＭＥ−１細胞におけるＨ３Ｋ２７Ａｃ（上）およびＲＵＮＸ１（下）ピークの遺伝子分布を示す。
【図１３（Ａ−Ｂ）】ＡＩ−１０−４９を有するＭＹＣエンハンサーエレメントにおけるＲＵＮＸ１媒介性クロマチン変化を示す。（Ａ）ＭＹＣ＋１．７Ｍｂゲノム領域におけるＫ３Ｋ２７ａｃおよびＲＵＮＸ１のＡＴＡＣ−ｓｅｑおよびＣｈＩＰ−ｓｅｑプロファイルを示す。プロファイルの下に示される５つの以前に報告されたエンハンサー領域（Ｅ１〜Ｅ５）。（Ｂ）ＭＹＣ−ＴＳＳの上流の２Ｍｂゲノム領域において、ＤＭＳＯ（青色）またはＡＩ−１０−４９（赤色）で処理したＭＥ−１細胞におけるＫ３Ｋ２７ａｃおよびＲＵＮＸ１ピークのＣｈＩＰ−ｓｅｑプロファイルを示す。
【図１４】ＭＹＣ遺伝子座における転写因子ＣｈＩＰ−Ｓｅｑの分析を示す。転写因子ＣｈＩＰ−ｓｅｑ分析は、ＭＹＣ  ＴＳＳの下流の２ＭｂにおけるＧＥＯ：ＧＳＥ４６０４４（Ｍａｎｄｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）に由来する。ＭＹＣプロモーター（青色）ならびにＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３（黒色）のピーク位置を点線の枠として示す。
【図１５（Ａ−Ｅ）】ＡＩ−１０−４９が、ＲＵＮＸ１関連ＭＹＣエンハンサーにおける抑制マークの活性化の代わりとなることを示す。（Ａ）２〜８時間で１ｍＭのＡＩ−１０−４９により処理したＭＥ−１細胞の溶解物中のＢＲＧ１、ＲＩＮＧ１Ｂ、およびＧＡＰＤＨの免疫ブロット分析を示す。（ＢおよびＣ）スクランブル（Ｓｃｒ）または２つの遺伝子特異的ｓｈＲＮＡで形質導入したＭＥ−１細胞におけるＳＭＡＲＣＡ４（Ｂ）およびＲＮＦ２（Ｃ）転写物レベルのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。三連の実験の結果が示されている。エラーバーは、標準偏差を表す。（Ｄ）ＲＩＮＧ１Ｂ阻害剤ＰＲＴ  ４１６５で８日間処理した後、ＤＭＳＯ／ＡＩ−１０−４９（０．６ｍＭ）で６時間処理したＭＥ−１細胞におけるＭＹＣ転写物レベルの評価であり、ＭＹＣ相対発現レベル（ＲＥＬ）をｑＲＴ−ＰＣＲを用いて推定した。三連の実験の結果が示されている。エラーバーは、標準偏差を表す。（Ｅ）ＤＭＳＯ／ＡＩ−１０−４９で６時間処理したＭＥ−１細胞からの核抽出物中のＢＲＧ１およびＲＩＮＧ１ＢへのＲＵＮＸ１結合の共免疫沈降分析を示す。有意性を、対応のないｔ検定（Ｂ〜Ｄ）として計算した。
【図１６（Ａ−Ｄ）】ＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３について、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡで処理したｉｎｖ（１６）ＡＭＬ  ＭＥ−１細胞における、サイズによる欠失（Ａ）および位置による欠失（Ｂ）の配列分析を示す。ＣＲＩＳＰＲ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒを利用して分析を行った（Ｇｕｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。（Ｃ）Ｎ−Ｍｅについての欠失の分析を示し、（Ｄ）は、Ｎ−Ｍｅについての位置別の分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の概要
本発明は、ｉｎｖ（１６）白血病の治療方法であって、治療を必要とする対象に、
ａ）式（１）の化合物であって、
【化３】
2021525280.tif 000005
式中、Ｙが、Ｏ、ＮＨ、またはＮＲであり、Ｒは、メチルまたはエチルであり、
ｎが、１〜１０の整数である、化合物、
またはその薬学的に許容される塩と、
ｂ）ＪＱ１、ＣｅＭＭＥＣ２、ｌ−ＢＥＴ  １５１（またはＧＳＫ１２１０１５１Ａ）、ｌ−ＢＥＴ  ７６２（またはＧＳＫ５２５７６２）、ＰＦＩ−１、ブロモスポリン、ＯＴＸ−０１５（またはＭＫ−８６２８）、ＴＥＮ−０１０、ＣＰＩ−２０３、ＣＰＩ−０６１０、ＲＶＸ−２０８、ＢＩ２５３６、ＴＧ１０１３４８、ＬＹ２９４００２、ＡＢＢＶ−０７５（またはミベブレシブ）、ＦＴ−１１０１、ＺＥＮ００３６９４、薬学的に許容される塩、およびそれらの混合物からなる群から選択されるブロモドメイン４（ＢＲＤ４）阻害剤との治療上有効な組み合わせを投与することを含む、方法に関する。
【００１６】
転写因子機能を変化させる突然変異は、白血病誘発において重要な役割を果たす。第１６染色体逆位を有する白血病症例で発現される融合腫瘍性タンパク質ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣは、転写因子ＲＵＮＸ１の活性を変化させることによって、白血病の発生および維持を促進する。細胞生存率は、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ媒介性機序を介してＭＹＣ発現のＲＵＮＸ１抑制を中和することによって維持される。ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ／ＲＵＮＸ１相互作用の薬理学的阻害の際に、ＲＵＮＸ１は、３つのＭＹＣ遠位下流エンハンサーとの会合を増加させ、ＭＹＣ発現を抑制する。同時に、これらの部位におけるＳＷＩ／ＳＮＦ活性化複合体成分ＢＲＧ１、およびＨ３Ｋ４ｍｅ１マークは、ポリコーム抑制複合体成分ＲＩＮＧ１Ｂ、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３マークによって置換される。ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ阻害は、ＢＥＴ阻害剤ＪＱ１と協同して、マウスにおける白血病細胞を排除し、白血病潜時を遅らせる。エンハンサー相互作用の分析は、３つのＭＹＣエンハンサーが、ＭＹＣプロモーターと物理的に接続され、ゲノム編集分析は、３つすべてがＭＹＣ発現の調節および細胞生存率に機能的に関与することを実証した。以下の実施例における研究は、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣが白血病の維持を促進し、クロマチン活性を標的とする阻害剤を用いたｉｎｖ（１６）白血病療法における有効性を支持する機序を明らかにする。
【００１７】
式（１）の化合物とＢＲＤ４阻害剤との治療上有効な組み合わせは、ｉｎｖ（１６）白血病細胞の増殖を相乗的に阻害する。本発明の方法は、１種類のｉｎｖ（１６）白血病である急性骨髄性白血病の治療に特に有用である。「治療」または「治療すること」は、特定の障害もしくは病態の予防、または特定の障害もしくは病態に関連する症状の軽減、および／またはそれらの症状の予防もしくは排除を含む。
【００１８】
発がん性ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ融合タンパク質の直接阻害は、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬの潜在的に有効な治療アプローチとして示されている。（Ｉｌｌｅｎｄｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．）５−メトキシ−２−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール、ＡＩ−４−５７は、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ融合タンパク質のＣＢＦβ部分に結合し、ＲＵＮＸタンパク質のＲｕｎｔドメインへのその結合を阻害する化合物として報告された（Ｉｌｌｅｎｄｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．）トリフルオロメトキシ（ＣＦ３Ｏ）誘導体、２−（ピリジン−２−イル）−５−（トリフルオロメトキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール、Ａ−１０−４７は、メトキシ化合物と比較して増強された代謝安定性を示した。（Ｉｌｌｅｎｄｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．）ポリエチレングリコール系リンカーを使用して、５、７、１０、および１６原子リンカー長を有する二価誘導体を作成した。（Ｉｌｌｅｎｄｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．）５原子リンカー化合物は、活性が低かったが、より長いリンカー化合物は、強力な阻害を示す。７原子リンカーであるＡＩ−４−８３を有する化合物は、一価化合物よりも６３倍の増強を示した。加えて、ＡＩ−４−８３は、飽和濃度でＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣおよびＲＵＮＸ１  Ｒｕｎｔドメインの１０倍超の解離を達成した。（Ｉｌｌｅｎｄｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．）
【００１９】
本明細書において化合物（１ａ）とも称される７原子リンカーＡＩ−１０−４９を有するトリフルオロメトキシ誘導体は、
【化４】
2021525280.tif 000006
ｉｎｖ（１６）を有する白血病細胞株であるＭＥ−１細胞株において細胞死を誘導した強力かつＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ特異的化合物であることが示された。（Ｉｌｌｅｎｄｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．）ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣは、オリゴマーである一方で、ＣＢＦβはモノマーである。ＡＩ−１０−４９は、ＣＢＦβ機能に最小限の効果を有しながら、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ活性を阻害する。（Ｉｌｌｅｎｄｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．）
【００２０】
本発明による方法では、式（１）の化合物は、リンカーＯ−［ＣＨ２ＣＨ２Ｙ］ｎ−Ｏ−により結合した２つの２−（ピリジン−２−イル）−５−（トリフルオロメトキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール基を含有する。式（１）の化合物では、リンカーは、分子の２つの結合部分を接続する。二量体または二価阻害剤は、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣのオリゴマー性を利用し、所望の選択性を達成するために、多価性の原理を適用する（Ｍａｍｍｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２００６）。極端なＣ末端を欠くＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣの切断形態は、溶液中に二量体を形成することが示されている。（Ｌｕｋａｓｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，２００２．）全長タンパク質の場合、これらの二量体は、次いでオリゴマー化して高次オリゴマーを形成する。（Ｓｈｉｇｅｓａｄａ，ｅｔ  ａｌ．２００４．）対照的に、ＣＢＦβは、溶液中で単量体である。オリゴマー化におけるこの差は、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ対ＣＢＦβの選択的阻害を達成する手段を提供する。
【００２１】
本発明の方法によれば、式（１）の化合物では、Ｙは、Ｏ、ＮＨ、またはＳである。本発明の方法では、Ｙは、Ｏである。本発明の別の方法では、Ｙは、Ｎ−ＣＨ３である。ｎが１より大きい場合、Ｙは、同じであり得るか、または異なり得る。
【００２２】
本発明の方法によれば、式（１）の化合物では、ｎは、１〜１０の整数である。本発明による方法および組成物では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。好ましくは、ｎは、１〜５である。式（１）の化合物では、リンカーは、式（１）の二価化合物が、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ−リガンド相互作用対一価ＣＢＦβ−リガンド相互作用によって結合強化を達成することを可能にするのに十分な長さでなければならない。米国特許第９，２２１，７６４号、図５を参照されたい。単量体ＣＢＦβに結合する一価化合物の解離定数は、Ｋｄ（単量体）に等しい。この化合物のホモ二量体は、Ｋｄ（単量体）／２に等しい解離定数で単量体ＣＢＦβタンパク質に結合する。しかしながら、この同じホモ二量体は、二量体ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣタンパク質上の２つの部位と相互作用し、（Ｋｄ（単量体））２／Ｃｅｆｆに等しいＫｄ（二量体）を有し、式中、Ｃｅｆｆは、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ上の２つの結合部位を互いに係留したことから生じる有効濃度である。（Ｍｕｌｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）
【００２３】
式（１）内の非限定的な例示的化合物としては、以下が挙げられる。
【化５】
2021525280.tif 000007
【化６】
2021525280.tif 000008
【化７】
2021525280.tif 000009
および
【化８】
2021525280.tif 000010
【００２４】
本発明による好ましい方法では、式（１）の化合物は、
【化９】
2021525280.tif 000011
である。
参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，２２１，７６４号は、ポリエチレングリコール系リンカーを有する特定の二価阻害剤の構造および合成経路を開示している。
【００２５】
本発明による別の方法では、式（１）の化合物は、
【化１０】
2021525280.tif 000012
である。
【００２６】
ＢＲＤ４阻害剤は、例えば、ＪＱ１、ＣｅＭＭＥＣ２、ｌ−ＢＥＴ  １５１（もしくはＧＳＫ１２１０１５１Ａ）、ｌ−ＢＥＴ  ７６２（もしくはＧＳＫ５２５７６２）、ＰＦＩ−１、ブロモスポリン、ＯＴＸ−０１５（もしくはＭＫ−８６２８）、ＴＥＮ−０１０、ＣＰＩ−２０３、ＣＰＩ−０６１０、ＲＶＸ−２０８、ＢＩ２５３６、ＴＧ１０１３４８、ＬＹ２９４００２、ＡＢＢＶ−０７５（もしくはミベブレシブ）、ＦＴ−１１０１、ＺＥＮ００３６９４、またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される。これらの化合物は市販されており、かつ／またはそれらの合成が文献に記載されている。ＢＲＤ４阻害剤はまた、ＷＯ２０１２／１７４４８７、ＷＯ２０１４／０７６１４６、ＵＳ２０１４／０１３５３３６、ＷＯ２０１４／１３４５８３、ＷＯ２０１４／１９１８９４、ＷＯ２０１４／１９１８９６、ＵＳ２０１４／０３４９９９０、ＷＯ２０１４／１９１９０６、またはＷＯ２０１８／０８７４０１号、または参照文献Ａｌｑａｈｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１９に開示される化合物のうちのいずれか１つであってもよく、これらの各々は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。いくつかのＢＲＤ４阻害剤が、臨床試験中である。（例えば、Ａｌｑａｈｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１９、表２を参照）。本発明のいくつかの方法では、ＢＲＤ４阻害剤は、ＪＱ１である。本発明の好ましい方法では、ＢＲＤ４阻害剤は、ＡＢＢＶ−０７５またはＯＴＸ０１５である。
【００２７】
上述のように、本発明で使用される式（１）の化合物またはＢＲＤ４阻害剤は、本発明の化合物の生物学的有効性および特性を保持し、生物学的または別様に望ましくない塩を指す「薬学的に許容される塩」の形態をとってもよい。多くの場合、本発明の方法で投与される化合物は、アミノおよび／またはカルボキシル基またはそれに類似する基の存在によって酸および／または塩基塩を形成する。薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸および有機酸から調製され得る。無機酸に由来する塩としては、限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等が挙げられる。薬学的に許容される塩基付加塩は、無機塩基および有機塩基から調製することができる。無機塩基に由来する塩としては、単なる例として、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、およびマグネシウム塩が挙げられる。有機塩基に由来する塩としては、限定されないが、第一級、第二級、および第三級アミンの塩が挙げられる。
【００２８】
本発明による方法では、化合物（１ａ）などの式（１）の化合物、およびＪＱ１などのＢＲＤ４阻害剤の量の治療上有効な組み合わせは、ｉｎｖ（１６）白血病細胞の増殖を相乗的に阻害するために投与される。「阻害する」という用語は、本発明の化合物が、細胞増殖などの記載の機能を低減または阻害する能力を指す。好ましくは、阻害は、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、さらにより好ましくは少なくとも５０％であり、最も好ましくは、機能は、少なくとも７５％阻害される。
【００２９】
ＢＲＤ４阻害剤および式（１）の化合物は、別個に、ｉｎｖ（１６）白血病細胞の増殖を阻害するのに有効であることが示されているが、組み合わせると、結果は、添加剤よりも多いが、それは驚くべきことに、相乗的である。例えば、図３および図１１を参照されたい。本発明による治療の方法で使用するために必要とされる式（１）の化合物と、ＢＲＤ４阻害剤またはその塩との相乗的な組み合わせの量は、投与経路、治療される病態の性質、ならびに患者の年齢および病態によって変化し得、最終的には、主治医または臨床医の裁量によって変化するであろう。式（１）の化合物の投与期間は、当業者によって決定し、必要に応じて続けてもよい。本発明で使用される相乗的な組み合わせは、１日投与量のＢＲＤ４阻害剤対１日投与量の式（１）の化合物の重量対重量比が、約０．０００１：１〜約１０００：１の範囲である。比率は、約０．００１：１〜約１００：１、例えば、約０．０１：１〜約１０：１、例えば、約０．１：１〜約１：１であり得る。毎日の投与は、同時投与、連続投与、または不連続投与であり得る。
【００３０】
本発明による治療の方法では、式（１）の化合物およびＢＲＤ４阻害剤は、最初に式（１）の化合物を投与し、続いてＢＲＤ４阻害剤を投与することによって同時にまたは順次投与される。本発明による治療の方法では、式（１）の化合物およびＢＲＤ４阻害剤も同時に投与することができる。本発明による代替方法では、式（１）の化合物およびＢＲＤ４阻害剤は、最初に式（１）の化合物を投与した後にＢＲＤ４阻害剤を投与することによって順次投与してもよい。あるいは、ＢＲＤ４阻害剤を投与し、次いで式（１）の化合物を投与する。本発明の治療方法の別の例として、式（１）の化合物およびＢＲＤ４阻害剤を同時に投与し、続いて式（１）の化合物を１日以上、毎日投与する。
【００３１】
所望の用量は、好都合に、単回用量で、または適切な間隔で投与される分割用量として、例えば、１日あたり２、３、４回以上のサブ用量として提示され得る。サブ用量自体は、例えば、複数回注入など、いくつかの離散したゆるい間隔の投与にさらに分割され得る。
【００３２】
本発明による方法では、ｉｎｖ（１６）白血病に罹患している対象からの細胞の増殖の程度は、当業者に既知の技法を用いて測定される。ｉｎｖ（１６）白血病のマウスモデルを使用して、白血病開始細胞と称される特定の細胞集団が同定され、適切な動物モデルとして受け入れられている。（Ｋｕｏ，Ｙ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，２００６．）この細胞集団は、ｉｎｖ（１６）を保持するが、疾患に関連する二次突然変異を有しない。そのような二次突然変異を獲得すると、これらの細胞は、明らかな白血病に進行し得る。これらの細胞はまた、典型的には、従来の細胞傷害性化学療法に対してより耐性があり、したがって、再発が起こり得る細胞のプールを表す。細胞は、血液、脾臓、骨髄、および／または脊髄液から測定するために抽出することができる。例えば、ｉｎｖ（１６）白血病を有する対象から抽出されたＬｉｎ−Ｓｃａ−Ｋｉｔ＋細胞の集団を、フローサイトメトリーを使用して測定する。Ｌｉｎ−Ｓｃａ１−ｃ−Ｋｉｔ＋細胞集団は、白血病開始細胞（ＬＩＣ）および白血病幹細胞（ＬＳＣ）集団で濃縮される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、式（１）の化合物およびＢＲＤ４阻害剤は、式（１）の化合物、ＢＲＤ４阻害剤、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物で投与される。本発明による他の治療方法では、式（１）の化合物は、式（１）の化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物で投与され、その後、ＢＲＤ４阻害剤は、ＢＲＤ４阻害剤および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物で投与される。本発明によるいくつかの方法では、医薬の投薬製剤は、同じであり得るか、または異なり得る。例えば、ＢＲＤ４阻害剤および式（１）の化合物の両方が、非経口送達のための溶液として製剤化される。あるいは、ＢＲＤ４阻害剤は、溶液として製剤化され、式（１）の化合物は、錠剤として製剤化される。
【００３４】
本発明の別個の実施形態は、薬学的に許容される担体、ならびに
ａ）式（１）の化合物であって、
【化１２】
2021525280.tif 000013
式中、Ｙが、Ｏ、ＮＨ、またはＮＲであり、Ｒは、メチルまたはエチルであり、
ｎが、１〜１０の整数である、化合物、
またはその薬学的に許容される塩と、
ｂ）ＪＱ１、ＣｅＭＭＥＣ２、ｌ−ＢＥＴ  １５１（もしくはＧＳＫ１２１０１５１Ａ）、ｌ−ＢＥＴ  ７６２（もしくはＧＳＫ５２５７６２）、ＰＦＩ−１、ブロモスポリン、ＯＴＸ−０１５（もしくはＭＫ−８６２８）、ＴＥＮ−０１０、ＣＰＩ−２０３、ＣＰＩ−０６１０、ＲＶＸ−２０８、ＢＩ２５３６、ＴＧ１０１３４８、ＬＹ２９４００２、ＡＢＢＶ−０７５（もしくはミベブレシブ）、ＦＴ−１１０１、ＺＥＮ００３６９４、またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択されるＢＲＤ４阻害剤との治療上有効な組み合わせを含む薬学的組成物であって、
式（１）の化合物およびＢＲＤ４阻害剤は、ｉｎｖ（１６）白血病細胞の成長を阻害するのに相乗的に有効な組み合わせ量で存在する。
【００３５】
本発明による薬学的組成物は、式（１）の化合物とＢＲＤ４阻害剤との相乗的な組み合わせを含有する任意の薬学的形態であってもよい。薬学的組成物は、例えば、錠剤、カプセル、液体懸濁液、注入可能な組成物、局所用組成物、吸入性組成物、または経皮組成物であり得る。液体薬学的組成物を調製してもよい。薬学的組成物は、概して、例えば、約０．１重量％〜約９９．９重量％の式（１）の化合物とＢＲＤ４阻害剤との組み合わせ量、例えば、約０．５重量％〜約９９重量％の式（１）の化合物とＢＲＤ４阻害剤との組み合わせ量、および例えば、９９．５重量％〜０．５重量％の少なくとも１つの好適な薬学的賦形剤を含有する。一実施形態では、組成物は、以下で考察されるように、約５重量％〜約７５重量％の式（１）の化合物とＢＲＤ４阻害剤との組み合わせ量であってもよく、残りは、少なくとも１つの好適な薬学的賦形剤または少なくとも１つの他のアジュバントである。
【００３６】
薬学的組成物の種類に応じて、薬学的に許容される担体は、当該技術分野で既知の担体のうちの任意の１つまたはその組み合わせから選択され得る。薬学的に許容される担体の選択は、使用される薬学的形態および所望の投与方法に依存する。
【００３７】
好適な液体薬学的組成物は、薬物水溶性を改善する可溶化剤、例えば、シクロデキストリンなどを含有する。シクロデキストリンの非限定的な一例は、β−シクロデキストリン（β−ＣＤ）のポリアニオン性可変置換スルホブチルエーテル（Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標））である。
【００３８】
本発明の固体薬学的組成物について、固体薬学的組成物中の担体は、式（１）の化合物またはＢＲＤ４阻害剤のいずれかを実質的に変化させてはならない。また、担体は、例えば任意の望ましくない生物学的作用を産生すること、または他の方法で薬学的組成物の任意の他の成分（複数可）と有害な様式で相互作用することによって、式（１）の化合物または使用されるＢＲＤ４阻害剤と他の方法で不適合であってはならない。
【００３９】
本発明の薬学的組成物は、薬学的製剤技術分野で既知の方法によって調製され得る、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）を参照されたい。本発明の薬学的組成物の好適な固体剤形としては、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤（例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムなど）、または（ａ）（ａ）充填剤もしくは増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸など）、（ｂ）結合剤（例えば、セルロース誘導体、デンプン、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシアゴムなど）、（ｃ）湿潤剤（例えば、グリセロールなど）、（ｄ）崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、クロスカルメロースナトリウム、複合ケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなど）、（ｅ）溶解遅延剤（例えば、パラフィンなど）、（ｆ）吸着促進剤（例えば、四級アンモニウム化合物など）、（ｇ）湿潤剤（例えば、セチルアルコール、およびモノステアリン酸グリセロール、ステアリン酸マグネシウム等）、（ｈ）吸着剤（例えば、カオリンおよびベントナイトなど）、ならびに（ｉ）滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはそれらの混合物など）が挙げられる。カプセル、錠剤、および丸薬の場合、剤形は、緩衝剤も含み得る。
【００４０】
薬学的製剤技術分野において既知の薬学的に許容されるアジュバントは、本発明の薬学的組成物において使用することもできる。これらには、限定されないが、保存剤、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、香味剤、香料、乳化剤、および分注剤が含まれる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の包含によって確実となり得る。糖類、塩化ナトリウム等の等張剤を含めることが望ましい場合もある。所望される場合、本発明の薬学的組成物はまた、少量の補助物質、例えば、クエン酸、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレイン酸塩、ブチルヒドロキシトルエン等の湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、抗酸化剤等も含有し得る。
【００４１】
上述の固体剤形は、腸溶性コーティングなどのコーティングおよびシェルで調製することができ、薬学的分野で知られている。それらは、鎮静剤を含有していてもよく、遅延様式で腸管のある特定の部分で有効な化合物（複数可）を放出するような組成物であり得る。使用され得る包埋組成物の非限定的な例は、ポリマー物質およびワックスである。活性化合物は、適切な場合、上述の賦形剤のうちの１つ以上を含むマイクロカプセル化形態であってもよい。
【００４２】
好適な懸濁液は、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、またはこれらの物質の混合物等の懸濁化剤を含んでもよい。液体剤形は、水性であってもよく、限定されないが、緩衝剤、香味剤、甘味剤、防腐剤、および安定化剤を含む、当該技術分野で既知の従来の液体剤形賦形剤と同様に、薬学的に許容される溶媒を含んでもよい。
【００４３】
カプセル、錠剤、丸薬、粉末、顆粒、および懸濁液を含む経口投与のための剤形を使用してもよい。本発明による好適な薬学的組成物はまた、液体または注入可能な薬学的組成物として製剤化され得る。投与は、同様のユーティリティを提供するための許容される投与モードまたは薬剤のいずれかを介して行われ得る。したがって、投与は、例えば、経口、口腔、または非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、もしくは皮下）であってもよく、例えば、錠剤、丸薬、軟質弾性および硬質ゼラチンカプセル、粉末、溶液、懸濁液、またはエアロゾル等の固体、半固体、凍結乾燥粉末、または液体剤形の形態であってもよく、例えば、正確な投与量の単純投与に好適な単位剤形であってもよい。１つの投与経路は、治療される病態の重症度に応じて調整することができる好都合な１日投与レジメンを使用した経口投与であってもよい。
【００４４】
一般に、本発明による薬学的組成物では、注入可能な溶液などの液体組成物中の式（１）の化合物と本発明のＢＲＤ４阻害剤との組み合わせ濃度は、約０．１〜２５重量％、好ましくは約０．５〜１０重量％である。ゲルまたは粉末などの半固体または固体組成物中の濃度は、約０．１〜５重量％、好ましくは約０．５〜２．５重量％である。
【実施例】
【００４５】
実験モデルおよび対象の詳細。本明細書に記載される実施例では、以下のリソース、材料、および方法を利用した。
【表１−１】
2021525280.tif 000014
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【００４６】
マウス。すべての動物実験は、マサチューセッツ大学動物実験委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によってレビューおよび承認されたプロトコルに従って実施した。Ｃｂｆｂ＋／ＭＹＨ１１およびＮｒａｓ＋／Ｇ１２Ｄ発がん性対立遺伝子におけるノックを担持するマウスは、以前に記載されており（Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、マサチューセッツ大学医学部の動物施設において、マサチューセッツ大学医学部動物実験委員会によって承認されたすべてのプロトコル（証明書Ａ１２６６）で維持されている。移植および毒性実験のためのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から取得した。
【００４７】
細胞株。ＭＥ−１細胞（ＤＳＭＺ）を、２０％ウシ胎児血清、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１μｌ／ｍｌのプラスモシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した。２９３Ｔ細胞（ＤＳＭＺ）を、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１μｌ／ｍｌのプラスモシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ中で培養した。
【００４８】
初代造血細胞培養。ＵＭＡＳＳ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒからヒト臍帯血試料を収集し、ＣＤ３４＋細胞をＣＤ３４  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。研究目的のための臍帯血試料の使用は、マサチューセッツ大学医学部の倫理委員会によって承認された。ヒトＡＭＬ試料を、Ｍａｒｔｉｎ  Ｐｅｔｅｒ  Ｃａｒｒｏｌｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）およびＣａｒｓｔｅｎ  Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｔｉｄｏｗ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から受領した。造血ＣＤ３４＋細胞を、ＣＤ３４  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ヒトＡＭＬ骨髄試料から単離した。すべての患者は、試料の使用について書面で同意した。ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞、ならびにヒト初代白血病細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのヒト組み換えＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍＬのヒト組み換えＦＬＴ３Ｌ（１０ｎｇ／ｍＬ）、１００ｎｇ／ｍＬのヒト組み換えＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍＬのヒト組み換えＩＬ３、および２０ｎｇ／ｍＬのヒト組み換えＩＬ−６で補充したＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ  ＩＩ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。
【００４９】
マウスの後足の大腿骨および脛骨を破砕することによって、マウス骨髄細胞を単離した。野生型マウス骨髄細胞を、６ｎｇ／ｍｌのマウス組み換えＩＬ３、１０ｎｇ／ｍｌのマウス組み換えＩＬ６、および５０ｎｇ／ｍｌのマウス組み換えＳＣＦで補充されたＳｔｅｍＳｐａｎ無血清拡張培地（ＳＦＥＭ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。Ｃｂｆｂ＋／ＭＹＨ１１およびＮｒａｓ＋Ｇ１２Ｄ白血病骨髄および脾臓細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのマウス組み換えＩＬ３および５０ｎｇ／ｍｌのマウス組み換えＳＣＦで補充されたＳｔｅｍＳｐａｎ無血清拡張培地（ＳＦＥＭ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。
【００５０】
方法の詳細
ｓｈＲＮＡ構築物の生成。レンチウイルスプラスミドを、ＵＭＭＳ  ＲＮＡｉ中核施設から受領した。ｐＬＫＯプラスミド中のピューロマイシン耐性カセットを、標準的なクローニング技法を使用して、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に置き換えた。
【００５１】
レトロウイルス産生および形質導入。ｉｎｖ（１６）白血病細胞におけるＭｙｃサイレンシングを研究するために、２９３Ｔパッケージング細胞を、ＧＦＰを共発現する８μｇのレトロウイルス構築物（ｃ−Ｍｙｃ（ｓｈＭｙｃ）またはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ｓｈＲｅｎ）、（Ｒｏｄｅｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４））および４μｇ−Ｅｃｏｐａｃパッケージングプラスミドで、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトした。レトロウイルス上清を４０時間および６４時間で収集し、プールし、製造業者の指示書に従って、Ｒｅｔｒｏ−Ｘ濃縮試薬（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用して濃縮した。製造業者の指示書に従って、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）マウス造血前駆細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、マウスにおける条件付きＣｂｆｂ＋／ＭＹＨ１１およびＮｒａｓ＋／Ｇ１２Ｄノック由来の白血病脾臓細胞を系統枯渇させた。１〜２×１０６系統陰性細胞を、２４時間の時間ギャップを有するｓｈＲＮＡレトロウイルスによるスピン感染によって２回形質導入した。ＧＦＰ＋を発現する細胞を、第２の感染の２４時間後に選別した。Ｃｂｆｂ＋／５６Ｍ／ＣｒｅまたはＣｂｆｂ＋／５６Ｍの条件付きノックインマウスを、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ｐＩｐＣ）で処置した。両群のマウス由来の骨髄系統陰性細胞を、レトロウイルス上清で２回スピン感染させた。
【００５２】
レンチウイルス産生および形質導入。２９３Ｔパッケージング細胞を、６μｇのＧＦＰを共発現するレンチウイルス構築物［ｐＬＫＯスクランブルまたはｐＬＫＯ  ＭＹＣ  ｓｈＲＮＡ）、６μｇのパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１２２６０）、および３μｇのエンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１２２５９）を、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬でトランスフェクトした。レンチウイルス上清を４０時間および６４時間で収集し、プールし、製造業者の指示書に従って、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ濃縮試薬（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用して濃縮した。２〜３×１０６ＭＥ−１細胞を、２４時間の時間ギャップを有するレトロウイルスによるスピン感染によって２回形質導入した。ＧＦＰを発現する細胞を、第２の感染の２  ４時間後に選別した。
【００５３】
エンハンサー領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性欠失。目的の領域に対する５´に特異的なｓｇＲＮＡを、ｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２（Ａｄｄｇｅｎｅ＃５２９６１）中でクローニングした。目的の領域に対する３´に対応するｓｇＲＮＡを、ｐＤｅｃｋｏ−ｍＣｈｅｒｒｙ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃７８５３４）中でクローニングした。ｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２中のピューロマイシン耐性カセットを、標準的なクローニング技法を使用して、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に置き換えた。すべてのｓｇＲＮＡクローニングは、標準的なガイドＲＮＡクローニング方法を使用してそれぞれのプラスミドで行われた。簡潔には、上部および下部鎖ガイドＲＮＡオリゴを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を使用してリン酸化し、アニールし、ＢｓｍＢ１部位のベクターに挿入した。ｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２ＧＦＰ内でクローニングしたガイドＲＮＡを、製造業者の指示書に従ってＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６方法を使用して２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲを実施して目的の領域を増幅した。ＰＣＲ産生物を再アニールし、製造業者の指示書に従ってＴ７エンドヌクレアーゼ（ＮＥＢ）で処理した。反応物を２％アガロースゲル上で後に分解し、産生物を分析した。オリゴヌクレオチド名および配列（５´−３´）を主要リソース表に列挙する。２〜３×１０６ＭＥ−１細胞を、プログラムＸ−０１およびＡｍａｘａ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）キットＶを用いて、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）技術（Ｌｏｎｚａ）を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミド（各２μｇ）でヌクレオフェクトした。試料を、２４時間後にフローサイトメトリーによって選別した。細胞を一晩培養し、死細胞除去キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって死細胞を排除した。
【００５４】
Ｍｉ−Ｓｅｑ分析。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドによる欠失パターンを同定するために、４８時間のインキュベーション後に選別された細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを単離した。好適なプライマーを使用して、目的のゲノム領域を増幅するために第１ラウンドのＰＣＲを行い、産生物をゲル精製した。プライマーを使用して第２ラウンドのＰＣＲを行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列の一部分を導入し、産生物をゲル精製した。第３ラウンドのＰＣＲを実施して、試料インデックスを導入し、得られた産生物（１００〜２００ｂｐ）をゲル精製し、ライブラリ中で組み合わせ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉ−Ｓｅｑ（１５０ｂｐ対の末端）によってシーケンシングした。
【００５５】
細胞生存率アッセイ。細胞生存率を、ＭＴＴキット、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＰＡ）を使用して推定した。２０，０００細胞／ウェルを、９６ウェルプレートに３連で播種した。２４〜７２時間後、２０μｌのＭＴＴ試薬を細胞または培地を含有するウェルに添加し（ブランク）、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４９０ｎｍでの吸収を測定した。
【００５６】
ＭＹＣ−ＥＲを使用したＭＹＣの誘導発現。２ｘ１０６ＭＥ−１細胞を、６μｇのＳｃａＩ直鎖化ＭＹＣ−ＥＲプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１９１２８、（Ｒｉｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４））を用いるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）技術（Ｌｏｎｚａ）でヌクレオフェクトし、チャコール処理されたウシ胎児血清を含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ／１０％を含む６ウェルプレート上に播種した。３μｇ／ｍｌのピューロマイシンでの選択は、トランスフェクションの４８時間後に開始し、４８時間継続した後、死細胞除去キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）による死細胞除去を行った。ＭＹＣ−ＥＲを、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＨＴ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で９時間、５００ｎＭの最終濃度で処理することによって誘導した。
【００５７】
マウスにおける白血病移植研究。白血病生存におけるＡＩ−１０−４９およびＪＱ１の有効性を試験するために、１×１０３Ｃｂｆｂ＋／ＭＹＨ１１、Ｎｒａｓ＋／Ｇ１２Ｄ白血病細胞を、６〜８週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスの亜致死的照射（６５０ｒａｄｓ）に移植した。ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ＡＩ−１０−４９、ＪＱ１、または両方による治療は、腹腔内注入を介して５日目に開始した。ＡＩ−１０−４９を、５日目から１４日目まで２００ｍｇ／ｋｇ／日で投与した。ＪＱ１を、５日目から２５日目まで５０ｍｇ／ｋｇ／日で投与した。ＡＭＬの目に見える特徴（運動およびグルーミング活性の低減、丸まった背中、および青ざめた足（貧血）を含む）が現れた後、マウスを屠殺した。白血病細胞を脾臓から抽出し、前述のように安楽死の時点で分析した（Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００５８】
ＡＩ−１０−４９およびＪＱ１シナジー分析。下限が０に設定されたＲにおけるｄｒｃパッケージを使用して、ＩＣ５０を推定した（Ｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＣＩを、式ａ／Ａ＋ｂ／Ｂを使用して計算した。併用治療アッセイの相乗作用、付加効果、および拮抗作用は、Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ法を利用して、それぞれＣＩ＜１、ＣＩ＝１、およびＣＩ＞１として定義される（Ｃｈｏｕ，２０１０）。
【００５９】
毒性研究。６〜８週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ＡＩ−１０−４９、ＪＱ１、または両方で腹腔内注入により処置した。ＡＩ−１０−４９を２００ｍｇ／ｋｇ／日で１０日間投与した。ＪＱ１を５０ｍｇ／ｋｇ／日で２１日間投与した。マウスを、グルーミング、運動、および体重を含む毒性の徴候について評価した。最後の注入の２４時間後、フローサイトメトリーによって末梢血細胞を分析した。次いで、マウスを脾臓および骨髄分析のために安楽死させた。
【００６０】
フローサイトメトリー。フローサイトメトリーについては、２×１０５細胞をＰＢＳ中の２％  ＦＢＳで２回洗浄し、暗闇中４℃で２０〜６０分間染色し、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。骨髄造血幹および多系統前駆体を、ＬＳＫ＋：Ｌｉｎ（−）、ｋｉｔ（＋）、Ｓｃａ１（＋）；一般的な骨髄性前駆体、ＣＭＰ：Ｌｉｎ（−）Ｓｃａ１（−）ｋｉｔ（＋）ＣＤ３４（＋）ＣＤ１６／３２（−）；顆粒球／単球前駆体、ＧＭＰ：Ｌｉｎ（−）Ｓｃａ１（−）ｋｉｔ（＋）ＣＤ３４（＋）ＣＤ１６／３２（＋）；および巨核細胞／赤血球前駆体、ＭＥＰ：Ｌｉｎ（−）Ｓｃａ１（−）ｋｉｔ（＋）ＣＤ３４（−）ＣＤ１６／３２（−）として分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、フローサイトメトリー分析を行った。
【００６１】
Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖアッセイ。アポトーシス細胞死の検出のために、製造業者の指示書に従って、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖアポトーシス検出キットＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。簡潔に述べると、細胞を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１００μＬの１Ｘ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ結合緩衝液中に再懸濁し、５μｌのＡｎｎｅｘｉｎ−ＰＥおよび１０μｌの７ＡＡＤを添加し、暗闇中で室温にて１５分間インキュベートし、続いて５００μｌの１Ｘ  Ａｎｎｅｘｉｎ結合緩衝液を添加した。細胞生存率を、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いた７−ＡＡＤ陰性／Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ陰性細胞のパーセントとして決定した。
【００６２】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。ｍＲＮＡをＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡミニキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で調製し、製造業者の指示書に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓシステム上で定量的ＰＣＲ分析を実施した。ΔＣｔ法で発現レベルを決定し、βアクチンおよび／またはＧＡＰＤＨに正規化した。プライマーの配列を主要リソース表に提供する。
【００６３】
ＲＮＡシーケンシング。ＲＮＡシーケンシングのためのＲＮＡを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡミニキットで調製した。ＲＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量化した。ＲＮＡの完全性を、ＲＮＡ  ６０００キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する２１００バイオアナライザーを用いて評価した。ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡライブラリ調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でライブラリを調製した。ライブラリをｑＰＣＲによって定量化し、正規化し、プールした後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００上のペアエンド９０−ｂｐ読み取りを用いて三連でシーケンシングした。
【００６４】
ＲＮＡ−ｓｅｑデータ分析。ＲＮＡ−ｓｅｑ実験からの生の読み取りを、ｆａｓｔｑｃを使用してそれらの品質について評価し、続いてｔｏｐｈａｔ  ｖ２．０．９、ｂｏｗｔｉｅ２／２．１．０（Ｔｒａｐｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）を使用して、参照ヒトゲノム（ｈｇ１９）へのアライメントを、以下のパラメータを除いてデフォルト設定で評価した。−−ｂ２−ｖｅｒｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ−−ｍａｔｅ−ｉｎｎｅｒ−ｄｉｓｔ  １６０−−ｍａｔｅ−ｓｔｄ−ｄｅｖ  ８０−−ｎｏ−ｃｏｖｅｒａｇｅ−ｓｅａｒｃｈ−−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ−ｉｎｄｅｘ＝ｈｇ１９＿ｋｎｏｗｎＧｅｎｅ＿ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ＿ｄａｔａｃｕｆｆｌｉｎｋｓ  ｖ２．２．０によって差次的遺伝子発現分析を行った（Ｔｒａｐｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。０．０５未満の偽発見率および２を超える倍率変化を有する遺伝子は、有意に差次的に発現され、後続の分析に使用されると考えられた。
【００６５】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）。ＭＥ−１細胞をＤＭＳＯまたはＡＩ−１０−４９（１μＭ）で６時間処理した。タンパク質のＤＮＡへの架橋を、１％ホルムアルデヒドを１０分間、培養細胞に室温で添加することによって達成した。グリシンで中和した後、細胞を、プロテアーゼ阻害剤を用いた溶解緩衝液中で溶解し、試料を、ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を用いて２００〜４００ｂｐの平均ＤＮＡ長に超音波処理した。超音波処理後、クロマチンを１０μｇの目的の抗体を用いて４℃で一晩免疫沈降させた。抗体結合複合体を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で単離した。ＤＮＡを、フェノール−クロロホルムイソアミルアルコール法を使用して精製した。免疫沈降したＤＮＡを、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックスを用いたＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上のシーケンシング（以下で説明）またはｑＰＣＲによって分析し、入力の％として計算した。プライマーの配列を表１に提供する。
【００６６】
ｉｎｖ（１６）を有するヒト初代ＡＭＬ試料中のＣｈＩＰ  ＰＣＲについて、ＣＤ３４＋細胞を、ＣＤ３４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して濃縮し、一晩培養した後、死細胞除去キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）による死細胞除去を行った。細胞をＤＭＳＯ／ＡＩ−１０−４９（５μＭ）で８時間処理し、続いて上述のＣｈＩＰ手順を行った。
【００６７】
クロマチン免疫沈降に続くシーケンシング（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）。ＤＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量化した。ＤＮＡの完全性を、２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で評価した。ハウスＣｈＩＰ−Ｓｅｑライブラリ調製キットでライブラリを調製した。ライブラリをｑＰＣＲによって定量化し、正規化し、プールした後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ４０００上のシングルエンド５０−ｂｐ読み取りを用いてシーケンシングした。
【００６８】
ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータ分析。ＣｈＩＰ−ｓｅｑ読み取りを、Ｂｏｗｔｉｅ２  ｖ２．１．０（Ｌａｎｇｍｅａｄ  ａｎｄ  Ｓａｌｚｂｅｒｇ，２０１２）を標準デフォルト設定でヒトゲノム（ｈｇ１９）に整列させた。マッピング品質が２０を超える読み取りのみを保持し、重複した読み取りを、ｐｉｃａｒｄ  ｔｏｏｌｓ  ｖ１．９６（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄ／）を使用して除去した。ＭＡＣＳ２  ｖ２．１．０（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）を用いて、デフォルトパラメータでピーク呼び出しを行った。入力をピーク呼び出しのための対照として使用した。ｎａｒｒｏｗＰｅａｋファイルは、０．０１のｑ値閾値を有するｍａｃｓ２によって生成され、ｂｉｇｗｉｇファイルは、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔａｏｌｉｕ／ＭＡＣＳ／ｗｉｋｉ／Ｂｕｉｌｄ−Ｓｉｇｎａｌ−Ｔｒａｃｋでの手順に従って、ｍａｃｓ２による倍率濃縮としてシグナルを用いて生成された。
【００６９】
シーケンシングを伴うトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイ（ＡＴＡＣ−ｓｅｑ）。アクセス可能なクロマチン領域についてプロファイルするために、ＡＴＡＣ−ｓｅｑを、他の箇所に記載されるように（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、以下の修正を伴って使用した。ＭＥ−１細胞（５０，０００）を、ＤＭＳＯまたはＡＩ−１０−４９（１μＭ）で６時間処理し、続いて低加速およびブレーキ設定で、５００×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離により、１×ＰＢＳで１回洗浄した。細胞ペレットを５０μＬの冷溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０）に再懸濁し、核を５００ｘｇ、４Ｃで１０分間遠心分離することによってペレット化した。上清を廃棄し、核を２．５μｌのＴｎ５トランスポザーゼおよび１２．５μｌのＴＤ緩衝液（Ｎｅｘｔｅｒａ試料調製キット、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を含有する２５μｌの反応緩衝液に再懸濁した。反応物を３７℃で４５分間インキュベートした。転位の直後に、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キットを使用して、タグ付きＤＮＡを精製した。ライブラリ増幅のために、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＩｎｄｅｘキットおよびＮＥＢＮｅｘｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２Ｘ  ＰＣＲマスターミックスに含まれるインデックスプライマーを用いて、２つの連続ＰＣＲを実施した。第１のＰＣＲの後、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ５ｍＬキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用することによって、６００ｂｐ未満の断片についてライブラリを濃縮した。類似の設定で第２のＰＣＲを実施し、続いてＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭｐｕｒｅ  ＸＰ  ５ｍＬキットによるサイズ濃縮を行った。ＤＮＡを溶出し、Ｑｕｂｉｔフルオロメーター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で濃度を測定し、２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ライブラリ品質を評価した。１００ｂｐの配列がＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００上でペアエンドするライブラリ。
【００７０】
ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータ分析。ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータの前処理は、報告どおりに行った（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。アダプターを、ｃｕｔａｄａｐｔプログラムｖ１．３を使用して除去した（Ｍａｒｔｉｎ，２０１１）。次いで、読み取りを、Ｂｏｗｔｉｅ２（Ｌａｎｇｍｅａｄ  ａｎｄ  Ｓａｌｚｂｅｒｇ，２０１２）を使用して、ヒトゲノムｈｇ１９アセンブリにマッピングした。標準のデフォルト設定を、最大２ｋｂのマッピングされたペアエンド断片を可能にするように修正した。マッピング品質が２０を超える読み取りのみを保持し、ｐｉｃａｒｄ  ｔｏｏｌｓ  ｖ１．９６（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄ／）を使用して重複した読み取りを除去し、ミトコンドリアからの読み取りも除去した。マッピングされた読み取りを可視化するために、ｂｉｇｗｉｇファイルを、ｄｅｅｐＴｏｏｌｓ２を使用して生成した（Ｒａｍｉｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータの品質評価は、ＡＴＡＣｓｅｑＱＣを使用して行った（Ｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。読み取り濃縮は、挿入サイズが１００ｂｐ未満の読み取りをヌクレオソーム不含領域として使用して、デフォルトパラメータを用いてＭＡＣＳ２  ｖ２．１．０（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）によって呼び出した。
【００７１】
遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）。ＧＳＥＡ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）を使用して、ＡＩ−１０−４９処置による統計学的に有意な分子シグネチャを決定した。ＧＳＥＡの入力データは、ｃｕｆｆｄｉｆｆ結果からのｔｅｓｔ＿ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓによってランク付けされた遺伝子の完全な表、および分子シグネチャーデータベース（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｖ６．０、ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｇｓｅａ／ｍｓｉｇｄｂ／ｍｓｉｇｄｂ＿ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）からの機能遺伝子セットのカタログであった。デフォルトパラメータを使用した。偽発見率が０．２５未満の遺伝子セットが含まれた。
【００７２】
免疫ブロッティング。ＭＥ−１細胞を、ホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）およびプロテアーゼ阻害剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む修飾ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１細胞％  ＮＰ４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で１５分間、氷中で溶解し、続いて遠心分離した。核分画および細胞質分画を、製造業者の指示書に従って、細胞内タンパク質分画キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して単離した。Ｂｉｏｒａｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）でタンパク質濃度を決定した。タンパク質を、Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ電気泳動システムを使用して、６０〜８０Ｖでプレキャスト８〜１２％  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＴＧＸゲル上で分離し、Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｃｅｌｌにおいて９０分間、１００ＶでＰＶＤＦ膜上にブロットした。すべての抗体は、製造業者によって推奨され、主要リソース表に記載されるとおりに使用した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、相対バンド強度を定量化した。
【００７３】
カーボンコピー染色体コンフォメーションキャプチャ（５Ｃ）。実験設計：３Ｃライブラリは、以下の修正を伴い、前に記載されるように生成した（Ｈｎｉｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｎａｕｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。１）ＨｉｎｄＩＩＩ消化後、制限酵素不活性化のためにＳＤＳを添加しなかった。２）ライゲーション体積は、５×１０６細胞の場合１．２ｍＬとしてであり、５Ｃライブラリ調製物あたり合計３×１０７ＭＥ−１細胞を使用した。５Ｃを、１つの修正を伴って前述のように行った（Ｄｏｓｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｆｅｒｒａｉｕｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。アダプターライゲーション後のゲル精製を、Ａｍｐｕｒｅステップに置き換えて、ライゲーションされていないＤＮＡを除去した。５Ｃプライマーを、ＭＹＣ遺伝子座周辺の３．９８Ｍｂ領域（ｃｈｒ８：１２７，７５３，６６１〜１３１，７３７，５２１）に対して設計した。以前に公開された公的に入手可能な５Ｃプライマー設計ツールを使用して、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で５Ｃプライマーを設計した（Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。プライマーは、すべて前述のとおりに二重交互スキームに従って設計した（Ｈｎｉｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。各ＨｉｎｄＩＩＩ断片に対してプライマーを設計した。１つのプライマーは、断片の５´末端上で設計され、１つは３´末端上で設計された。断片について、右５´順方向（ＦＯＲ）および左３´逆方向（ＬＲＥＶ）プライマー、または右５´ＲＥＶおよび左３´ＬＦＯＲプライマーのいずれかを設計した。これらの２つのプライマー設計は、目的の領域全体にわたって連続した断片に沿って交互になる。この設計は、すべての断片間のすべての対間相互作用の取り調べを可能にし、これは以前に使用されたより単純な交互設計では不可能である（Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【００７４】
プライマー設定：Ｕ−ＢＬＡＳＴ，３、Ｓ−ＢＬＡＳＴ，５０，１５−ＭＥＲ，８００，ＭＩＮ＿ＦＳＩＺＥ，１００、ＭＡＸ＿ＦＳＩＺＥ，５０，０００、ＯＰＴ＿ＴＭ，６５、ＯＰＴ＿ＰＳＩＺＥ，４０。５  Ｃプライマーテールは、以下のとおりであった。ＦＯＲ／ＬＦＯＲ：Ｔ７配列５´−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＣ−３´（配列番号３９）、ＲＥＶ／ＬＲＥＶ：Ｔ３配列５´−ＴＣＣＣＴＴＴＡＧＴＧＡＧＧＧＴＴＡＡＴＡ−３´（配列番号４０）。すべてのＦＯＲ／ＬＦＯＲプライマーの全長は、６０塩基であり、すべてのＲＥＶ／ＬＲＥＶの長さは、６１塩基であった。合計で、３５９の順方向（ＦＯＲ）、３６７の左順方向（ＬＦＯＲ）、３６７の逆方向（ＲＥＶ）、および３６７の左逆方向（ＬＲＥＶ）プライマーを設計し、これらを組み合わせて５３２，１５８ロングレンジクロマチン相互作用を調べた。プライマー配列を表１に列挙する。
【００７５】
５Ｃライブラリの生成。５Ｃ多重プライマーアニーリング反応を５０℃で一晩行った。アニールした５Ｃプライマーの対を、同じ温度でＴａｑ−ＤＮＡリガーゼを使用して１時間ライゲーションした。ＡＩ−１０−４９処理細胞の第２の生物学的複製を除いて（１４回のライゲーション反応を行った）、７回のライゲーション反応を行って、５Ｃライブラリを生成した。ＡＩ−１０−４９処理細胞の第２の生物学的複製を除いて（４×１０５ゲノムコピーを含有した）、各ライゲーションは、６×１０５ゲノムコピーを含有した。各プライマーを、０．３２５ｆｍｏｌｅの最終量に添加した。次いで、３Ｃライブラリにおける特異的なライゲーション接合部、したがって２つの対応する遺伝子座間のロングレンジ相互作用を表すライゲーションされた５Ｃプライマー対を、５Ｃ順方向および逆方向プライマーの共通テールを認識するＴ７およびＴ３Ｒユニバーサルテールプライマーを用いた２０サイクルのＰＣＲを使用して増幅した。上記の各アニーリング反応について４つの別個の増幅反応を行い、各ライブラリのすべてのＰＣＲ産生物を一緒にプールした。このプールは、５Ｃライブラリを構成する。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター−０．５ｍｌ３０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してライブラリを濃縮し、ＱｉａｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットで精製した。
【００７６】
５Ｃ読み取りマッピング。５Ｃライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ４０００機器上でシーケンシングし、読み取りをマッピングし（ＮｏｖｏａｌｉｇｎマッピングアルゴリズムＶ３．０２．００を用いて）、５Ｃ相互作用を前に記載したとおりに組み立てた（Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｓａｎｙａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。２つの生物学的複製からのデータをプールし、ＤＭＳＯ処理細胞、およびＡＩ−１０−４９処理細胞についての単一の相互作用マップを生成した。各５Ｃライブラリの要約統計および読み取り深度は、補足表２に見出すことができる。
【００７７】
５Ｃフィルタリングおよび分析。５Ｃマトリックスを、前述の方法を使用して処理した（Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｓａｎｙａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。簡潔に述べると、まず、自己ライゲーション制限断片を表す５Ｃ相互作用を除去した。第２に、５Ｃ  ＰＣＲでは、個々の対間相互作用（外れ値）の過剰増幅をもたらし得る。これらを除去するために、まず、Ｓａｎｙａｌら（Ｓａｎｙａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）に記載されるように、ＬＯＷＥＳＳ平滑化を使用して、それらのゲノム距離の関数として、すべての対間相互作用の平均相互作用頻度および標準偏差を計算した。この平均値は、一対の遺伝子座についての予想される相互作用頻度を表す。次いで、各相互作用について観察された／予想される比率を計算し、これをｚスコアとして表した（（観察された−予想される）／標準偏差；（Ｓａｎｙａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２））を計算した。次いで、外れ値は、各データセットにおいて２０を超えるｚスコアとの相互作用として定義された。４つの５Ｃデータセットで特定されたすべての外れ値の結合を取り、４つすべてのデータセットからこれらの相互作用を除去した。第３に、いくつかのプライマーは、期待される性能をはるかに上回るか、または下回り、強力に濃縮または枯渇した相互作用の行をもたらす。これらのプライマーを同定するために、５Ｃプライマーの各々で検出されたすべての相互作用の和を計算した。次いで、期待される性能を上回るプライマーおよび下回るプライマーを、（すべての行／列和の分布の）四分位間の１．５倍の範囲外の和を有するものとして定義した。次いで、４つの５Ｃマトリックスにわたるすべてのフラグ付きプライマーの結合を取り、これらを４つのデータセットすべてから除去した。第４に、同じ総読み取り（５×１０７）に対する４つのマトリックスをスケールした。第５に、各行と各列の和が等しくなるように、ＩＣＥ法に従ってマトリックスを平衡させた（Ｉｍａｋａｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。第６に、データを単一遺伝子座の相互作用プロファイルとしてプロットしたとき（４Ｃスタイルプロット）、２０Ｋｂ（中央値）において２．５Ｋｂステップを有するスライドウィンドウで、または１５Ｋｂ（中央値）において２．５Ｋｂステップを有するスライドウィンドウでビニングした。第７に、マトリックスは、ビニング後に再び平衡させた。
【００７８】
４Ｃスタイルプロット。Ｍｙｃプロモーターと重複する対応するビンについて選択された遺伝子座行の相互作用プロファイル（４Ｃスタイルプロット）を表示するために、１５Ｋｂのビニングされた５Ｃ相互作用マトリックスからＭＥ１−、ＭＥ２−およびＥ３エンハンサーを抽出した。ゲノム距離（予想される５Ｃシグナルを表す）の関数としての５ＣシグナルのＬＯＷＥＳＳ平滑化平均±１標準偏差を計算し、プロットした。
【００７９】
ハイスループットデータの統合分析。すべての下流分析を、Ｒ  ｖ３．４．１（Ｒ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ，２０１６）およびＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｖ３．４（Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）を使用して行った。探索的分析および差次的遺伝子発現分析を、ＣｕｍｍｅＲｂｕｎｄパッケージｖ２．７．４（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｍｐｂｉｏ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｕｍｍｅＲｂｕｎｄ／）を用いて行った。ＣＨＩＰ−ｓｅｑおよびＡＴＡＣ−ｓｅｑの濃縮領域／ピークについて、ＣｈＩＰｐｅｋＡｎｎｏを用いてｈｇ１９ゲノム特徴に注釈を付けた（Ｚｈｕ，２０１３、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ヒートマップおよび密度プロットもまた、ＣｈＩＰｐｐｅａｋＡｎｏで生成した。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｄｉｆｆｂｉｎｄパッケージｖ２．４．８（Ｒｏｓｓ−Ｉｎｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）を使用して、対照とＡＩ−１０−４９処理試料との間のＡＴＡＣ−ＳｅｑまたはＣＨＩＰｄｓｅｑ読み取りによる差次的結合を有するゲノム領域を定量化および同定した。ＲＵＮＸ１結合部位に関連するモチーフを同定するために、様々な転写因子の異なるコンセンサス結合部位の重量マトリックスを、Ｊａｓｐａｒデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｊａｓｐａｒ．ｇｅｎｅｒｅｇ．ｎｅｔ／）から取得した。ＲＵＮＸ１結合モチーフを有するピークと、他の結合モチーフを有するピークとの重複を、ＣｈＩＰｐｅａｋＡｎｎｏによって分析した。すべてのゲノムデータを可視化するために、ｎａｒｒｏｗＰｅａｋまたはｂｉｇｗｉｇファイルをＵＣＳＣゲノムブラウザにアップロードした。すべてのゲノムデータは、遺伝子発現オムニバスでアクセス可能である（受託番号：処理中）。
【００８０】
統計分析。分析は、統計計算およびグラフィックスのためのシステムであるＲを使用して行った（Ｉｈａｋａ  ａｎｄ  Ｇｅｎｔｌｅｌｍａｎ，１９９６）。マウス白血病生存分析のために、白血病潜時およびＰ値を、ＲにおけるＳｕｒｖｉｖａｌパッケージを使用して推定した。群間のＰ値を、ログランク検定を使用して計算した。生存細胞の割合として測定された相対細胞生存率を、分散を均質化するために最初にアークサイン形質転換した。ルビーン検定は、分散の均質性の前提が満たされていることを示す。一方向ＡＮＯＶＡ、続いて、図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、４Ｄ、および７Ｃについて所定のコントラストを行った。双方向ＡＮＯＶＡ、続いて、図３Ｃについてテューキーのｈｏｎｅｓｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ検定を行った。応答曲線を比較するために（図３Ａおよび３Ｄ）、指標変数を作成して、２薬物治療と単一薬物治療のうちの１つを区別した。双方向ＡＮＯＶＡを行って、単剤治療と２薬物治療とを比較した。
【００８１】
実施例１：ＡＩ−１０−４９によるＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ活性の阻害は、ＭＹＣ転写物発現を抑制する。ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣの発現は、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ芽球生存にとって重要であり、小分子阻害剤ＡＩ−１０−４９は、ヒトおよびマウスｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞のアポトーシスを選択的に誘発する（Ｉｌｌｅｎｄｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。アポトーシス促進性ＡＩ−１０−４９標的を同定するために、ＡＩ−１０−４９で６時間処理したヒトｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞株ＭＥ−１においてＲＮＡシーケンシング分析を行った。三連の試料の発現分析は、５９１個の上方調節遺伝子および６９６個の下方調節遺伝子を同定した（２を超える倍率変化、ＦＤＲ＜０．０１；図１（Ａ））。上位の抑制された遺伝子の中で、ＭＹＣレベルは１０倍、Ｅ２Ｆ１は３倍を超えて抑制された。ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットの遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）は、ＡＩ−１０−４９処理が、ＭＹＣおよびＥ２Ｆシグネチャ（図１Ｂ）、ならびに細胞周期、アミノ酸代謝、およびリボソーム生体発生を含むＭＹＣ関連経路と関連していることを明らかにした（図９Ａおよび９Ｂ）。
【００８２】
ＡＩ−１０−４９は、ＭＥ−１細胞においてＭＹＣ転写レベル（図１（Ｃ））の強力な（１０倍）抑制を誘導するが、非ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞株においては誘導しない（図９Ｃ）。したがって、ＭＹＣタンパク質レベルは、０．１μＭで有意に枯渇し（およそ２０倍）、ＭＥ−１細胞において濃度が高かった（図１Ｄおよび図９Ｄ）。これらの結果と一致して、ＭＹＣ発現は、マウスＣｂｆｂ＋／ＭＹＨ１１およびヒト初代ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞においてＡＩ−１０−４９によって低減した（図１Ｅおよび１Ｆ）。初代マウス骨髄およびヒトＣＤ３４＋造血細胞由来の正常な造血細胞は、ＡＩ−１０−４９処理の影響を受けず、ＭＹＣ発現のＡＩ−１０−４９媒介性調節が、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ発現ＡＭＬ細胞に特異的であることをさらに確認した。
【００８３】
実施例２：ＭＹＣは、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞の維持および生存に必要である。ｃ−ＭＹＣレベルは、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬにおける生存の調節について分析した。ＭＹＣ−ｓｈＲＮＡを使用したＭＹＣのノックダウンは、ＭＥ−１細胞の生存率を６６％、初代マウスＣｂｆｂ＋／ＭＹＨ１１白血病細胞を７０％低減した（図２Ａ、２Ｂ、ならびに図１０Ａおよび１０Ｂ）。さらに、ＭＹＣ−ＥＲ系を使用した異所性ＭＹＣ発現（Ｒｉｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）は、ＡＩ−１０−４９媒介性アポトーシスの部分的な救出をもたらした（図２Ｃ）。これらの結果は、低減したＭＹＣレベルが、ＡＩ−１０−４９誘導アポトーシスを媒介することを示唆する。骨髄系細胞の顆粒球分化にはＭＹＣサイレンシングが必要であることを考慮して（Ｊｏｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ＭＥ−１細胞におけるＭＹＣノックダウンを調査した。形質導入の１４日後に骨髄マーカー（ＣＤ１５＋およびＣＤ１１ｂ＋）を有する細胞の分画は、有意に変化しなかった（図１０Ｃ）。これは、ＭＹＣ抑制が主にアポトーシスを誘導し、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞の分化を誘導しないことを示唆している。
【００８４】
ｉｎｖ（１６）白血病の生存におけるＭｙｃ機能の要件を、ＧＦＰを発現するレトロウイルス中のＲｅｎｉｌｌａ−または２つのＭｙｃ−ｓｈＲＮＡで形質導入されたＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ発現白血病細胞（Ｎｒａｓ＋／ＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ、Ｃｂｆｂ＋／５６Ｍ、Ｍｘ１Ｃｒｅ；Ｎｒａｓ／ＣＭ；（Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４））を移植したマウスにおいて試験した（図１０Ｄ）。移植５日後の骨髄におけるＧＦＰ＋白血病細胞の移植効率は、群間で同様であった（図２Ｄ）。しかしながら、移植の２８日後の末梢血中の白血病細胞の分画は、Ｍｙｃ  ｓｈＲＮＡで移植されたマウスの著しい低減を明らかにし、Ｍｙｃがｉｎｖ（１６）白血病細胞の維持に必要であることを示唆した（図２Ｅ）。さらに、Ｍｙｃレベルが低減したマウスにおける白血病の中央潜時は、６２日（Ｒｅｎｉｌｌａ群）から不完全浸透（ｓｈＭｙｃ１）および９６日（ｓｈＭｙｃ２；ｐ＝０．００１８４、図２  Ｆ）まで有意に延長された。いずれかのＭｙｃ−ｓｈＲＮＡ群からの白血病細胞におけるＭｙｃレベルは、Ｒｅｎｉｌｌａ群のレベルと類似しており（図１０Ｅ）、これらのクローンにおいてＭｙｃレベルの持続的な低減が失われたことを示唆した。したがって、マウスにおけるこれらのインビトロおよびインビボ実験は、ＭＹＣがん遺伝子レベルの調節が、ｉｎｖ（１６）白血病細胞の生存および増殖に重要であることを実証する。
【００８５】
実施例３：ＡＩ−１０−４９は、ＪＱ１と協同して、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞生存率を低減する。ブロモドメイン（ＢＲＤ）タンパク質は、ＭＹＣなどの発がん性転写因子の主要ドライバーとして確立されている（Ｄｅｌｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＪＱ１およびＩ−ＢＥＴ１５１などのＢＲＤ阻害剤のＢＥＴファミリーは、ＭＹＣレベルを抑制する強力なＢＲＤ阻害剤であり（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｄｅｌｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、第２世代のＢＲＤ阻害剤が、診療所で試験されている。ＡＩ−１０−４９がＭＹＣ転写を抑制することを発見した際に、ＡＩ−１０−４９およびＪＱ１による併用処理に対するｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞の感受性を調査した。ＭＹＣ発現は、ＢＲＤ４ノックダウン時にＭＥ−１細胞中のＭＹＣレベルを推定することによって、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ中のＢＲＤ４に依存する（図３Ａおよび１１Ａ）。ＭＹＣ転写物およびタンパク質レベルは、ＭＥ−１細胞のＡＩ−１０−４９およびＪＱ１処理によって容易に低減され、併用処理は、ＭＹＣ転写物レベルにおいて協力的な効果を示した（図３Ｂおよび１１Ｂ）。注目すべきことに、２薬剤の様々な濃度でのＡＩ−１０−４９とＪＱ１との組み合わせ処置の組み合わせ指標（ＣＩ）分析（Ｃｈｏｕ，２０１０）は、１未満のＣＩ値を一貫して示し（図３Ｃおよび１１Ｃ）、ＭＥ−１細胞成長に対するＪＱ１およびＡＩ−１０−４９の実質的な相乗効果を示す。これらの阻害剤間の協同性は、初代ヒトｉｎｖ（１６）ＡＭＬおよびマウスｉｎｖ（１６）白血病細胞においてさらに実証された（それぞれ、図３Ｄおよび３Ｅ）。逆に、ヒトＣＤ３４＋臍帯血細胞の生存率は、ＡＩ−１０−４９およびＪＱ１（図１１Ｅ）による併用処置の影響を受けず、ＡＩ−１０−４９およびＪＱ１の協同効果が、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞に特異的であることを示唆している。
【００８６】
治療値ＡＩ−１０−４９およびＪＱ１併用処置をインビボで試験するために、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ発現（Ｎｒａｓ＋／ＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／Ｃｂｆｂ＋／５６Ｍ／Ｍｘ１Ｃｒｅ、Ｎｒａｓ／ＣＭ）白血病細胞を移植したマウスの白血病潜時を分析した。移植の５日後、マウスを４つの群に無作為化し、ビヒクル（ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯ）、ＡＩ−１０−４９で１０日間、ＪＱ１で２１日間、またはＡＩ−１０−４９およびＪＱ１の併用処置で処置した（図３Ｆ）。白血病の中央潜時は、１つの薬物で処置した場合（ｐ＝０．００１８４）、２５日（ＤＭＳＯ）から３２日（ＪＱ１）および３９日（ＡＩ−１０−４９）、ならびに両方の阻害剤で処置した場合（ｐ＝０００１７）、５５日まで延長した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＡＩ−１０−４９およびＪＱ１の処置は、測定可能な毒性を明らかにしなかった（図１１Ｆおよび１１Ｊ）。まとめると、これらの所見は、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬにおけるＡＩ−１０−４９およびＢＥＴ阻害剤の有効性を実証する。
【００８７】
実施例４．ＡＩ−１０−４９は、ゲノムワイドＲＵＮＸ１  ＤＮＡ結合を増強する。ＡＩ−１０−４９は、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ／ＲＵＮＸ１結合を阻害し、選択されたＲＵＮＸ標的遺伝子プロモーターに対するＲＵＮＸ１の占有率を増加させる（Ｉｌｌｅｎｄｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。クロマチンとのＲＵＮＸ１会合におけるＡＩ−１０−４９の影響を理解するために、クロマチン免疫沈殿、続いてＡＩ−１０−４９で６時間処置されたＭＥ−１細胞における次世代シーケンシング（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）を実施した。転写活性領域をマークするヒストン３−リジン２７アセチル化（Ｈ３Ｋ２７ａｃ）ピークの分析は、陽性ピークの有意な減少を示した（ＤＭＳＯについては３１，１０２、ＡＩ−１０−４９については２４，１５７）（図４Ａ）。ＡＩ−１０−４９は、ピークの一般的な低減を促進した。これらの結果は、ＡＩ−１０−４９が転写活性のグローバルな低減を誘発することを示唆している。
【００８８】
ＲＵＮＸ１についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ分析は、ＡＩ−１０−４９処置が、標的調節エレメントへのＲＵＮＸ１結合において７倍の増加（ＤＭＳＯについては９９１部位、ＡＩ−１０−４９については６，６５２部位）を誘導することを明らかにした（図４Ｂ）。ピーク中心および最寄りのＴＳＳにおけるＲＵＮＸ１結合の頻度分布の調査は、ＲＵＮＸ１シグナル強度の明白な増加を明らかにした（図４Ｂおよび１２Ａ）。ピーク分布の分析は、プロモーター領域の相対的な濃縮を示した（図１２Ｂ）。これらの結果は、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣからのＲＵＮＸ１のＡＩ−１０−４９媒介性急性放出が、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞内の調節領域へのＲＵＮＸ１再局在化を誘発し得ることを明らかにした。
【００８９】
モチーフ分析は、ＲＵＮＸ１占有エレメントが、ＥＴＳおよびＡＰ−１結合モチーフに関して高度に濃縮されたことを明らかにした（図４Ｃ）。ＲＵＮＸ１とＥＴＳ因子との会合は、ＲＵＮＸ１−ＥＴＯ陽性白血病細胞において報告されている（Ｐｔａｓｉｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＡＰ−１転写因子は、巨核細胞分化中にＲＵＮＸ１によって上方調節され、ＡＰ−１モチーフを欠くＲＵＮＸ１占有部位に動員された（Ｐｅｎｃｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。これらのデータは、ＲＵＮＸ１がＥＴＳ因子と協同して、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞におけるＡＩ−１０−４９処置中の遺伝子発現を調節し得ることを示唆する。
【００９０】
ＲＵＮＸ１は、マウスにおける骨髄分化中のクロマチンリモデリングを調節することができる（Ｈｏｏｇｅｎｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＡＩ−１０−４９がＤＮＡとのＲＵＮＸ１会合を増加させることが観察されたため、ＡＩ−１０−４９は、高スループットシーケンシングを有するトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイを使用して、ＭＥ−１細胞におけるクロマチンアクセシビリティを調節できるかどうかについて評価した（ＡＴＡＣ−ｓｅｑ、（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３））。ＤＭＳＯまたはＡＩ−１０−４９で処理した細胞におけるＡＴＡＣ−ｓｅｑデータの分析は、ＡＩ−１０−４９がクロマチンアクセシビリティの有意な低減を誘導したことを明らかにした（図４Ｄ）。これらの結果は、ＡＩ−１０−４９媒介性ＲＵＮＸ１活性が、クロマチンアクセシビリティの全体的な低減を促進することを示唆している。
【００９１】
実施例５：ＲＵＮＸ１は、３つの下流エンハンサーエレメントでの直接結合を介してＭＹＣ発現を抑制する。活性エンハンサーは、固形腫瘍における発がん性ＭＹＣ発現を調節する腫瘍型特異的遠位エンハンサー（Ｈｎｉｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｌｏｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）および白血病（Ｆｕｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｈｅｒｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を含む、がんにおけるがん遺伝子発現を調節する。ＭＹＣプロモーターでのＲＵＮＸ１結合の予備分析は、ＡＩ−１０−４９で処理したｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞におけるプロモーター占有を介してＲＵＮＸ１が、ＭＹＣ発現を直接調節し得る可能性を排除した。ＡＩ−１０−４９媒介性ＲＵＮＸ１機能が、活性遠位エンハンサーを乱すことによってＭＹＣ発現を抑制し得ると仮定した。この仮説を試験するために、ＭＹＣ−ＴＳＳを取り囲む３Ｍｂゲノム領域を分析した。２Ｍｂ下流領域の分析は、ＡＩ−１０−４９処理が（ＡＴＡＣ−ｓｅｑによる）クロマチンアクセシビリティを有意に変化させず、Ｈ３Ｋ２７ａｃマークの小さな低減を明らかにしたことを明らかにした（図５Ａおよび１３Ａ）。この領域におけるＲＵＮＸ１  ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータの分析は、ＡＩ−１０−４９処理細胞においてＲＵＮＸ１ピークが著しく増加した３つのエレメントを同定した。初代ＲＵＮＸ１ピークは、ＭＹＣ  ＴＳＳの１．７Ｍｂ下流のＢＤＭＥスーパーエンハンサー（ＢＲＤ４媒介性ＭＹＣエンハンサー）内に位置した（図５Ａ）。５つのエレメント（Ｅ１〜Ｅ５、図１３Ａ）で構成されるＢＤＭＥは、ＳＷＩ／ＳＮＦタンパク質ＢＲＧ１およびＢＲＤ４と会合して、骨髄系細胞および混合血統白血病におけるＭＹＣ発現を調節することが示されている（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。この初代ＲＵＮＸ１ピークは、ＲＵＮＸ１コンセンサス結合部位を含むＥ３に対応する。ＭＹＣエンハンサー１および２（ＭＥ１およびＭＥ２）と呼ばれる２つの他のＲＵＮＸ１ピークは、それぞれＭＹＣ−ＴＳＳの０．１８Ｍｂ、０．５Ｍｂ下流に位置した。我々は、ＭＹＣの上流の２Ｍｂ領域においてＲＵＮＸ１ピークの有意な変化を検出しなかった（図１３Ｂ）。
【００９２】
ＲＵＮＸ１コンセンサス結合部位（ＴＧＹＧＧＴ）を、ＭＹＣプロモーター、ＭＥ１、ＭＥ２、およびＢＤＭＥエレメントＥ１、Ｅ３、およびＥ５で同定した。ＭＹＣプロモーター、ＭＥ１、およびＭＥ２エンハンサー、ならびに５つのＢＤＭＥエレメントを含む８つの部位におけるＲＵＮＸ１ピークにおけるＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ変化を評価した。加えて、＋１．４Ｍｂ  Ｎ−ＭＥ（ＮＤＭＥとも称されるＴ細胞白血病関連ＮＯＴＣＨ依存性ＭＹＣエンハンサー；（Ｈｅｒｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｙａｓｈｉｒｏ−Ｏｈｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４））を非骨髄性対照エンハンサーとして試験した。ＲＵＮＸ１ピークは、ＭＥ１（５倍）、ＭＥ２（３倍）、およびＢＤＭＥ−Ｅ３（８倍）、およびＥ５（１．８倍）エレメントでのＡＩ−１０−４９処理によって有意に増加したが、ＭＹＣプロモーター、Ｎ−ＭＥ、ならびにＢＤＭＥ  Ｅ１、Ｅ２、およびＥ４では有意に増加しなかった（図５Ｂ）。Ｎ−ＭＥではなく、３つのエレメントでのＲＵＮＸ１ピークの増強は、ヒト初代ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ試料においても観察された（図５Ｃ）。
【００９３】
ｉｎｖ（１６）ＡＭＬにおけるＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３エレメントの活性をさらに調査するために、ＭＥ−１細胞において以前に報告されたＭＹＣの下流の転写因子結合プロファイルを分析した（Ｍａｎｄｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。３つの部位におけるＲＵＮＸ１ピークの存在が確認され、ＲＵＮＸ１補因子ｐ３００、ＨＤＡＣ１、およびＥ−ｂｏｘ転写因子ＨＥＢもまた、ＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３で見出されたことが決定された（図１４）。これらのデータは、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞におけるＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３のエンハンサー活性、ならびにＲＵＮＸ１複合体の会合をさらに支持する。
【００９４】
実施例６：ＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３エンハンサーは、ＭＹＣプロモーターと物理的に相互作用する。ＭＹＣ発現の調節におけるエンハンサー活性の重要な決定因子は、調節エレメント間の物理的相互作用の同定である。遠位ＭＹＣエンハンサーが様々ながんにおいてＭＹＣの上流および下流に報告されていることを考慮して、ＭＹＣ  ＴＳＳの１Ｍｂ上流および３Ｍｂ下流を含むＭＹＣ遺伝子座の周囲の４Ｍｂ領域におけるＤＮＡ相互作用を、ＤＭＳＯまたはＡＩ−１０−４９で６時間処理したＭＥ−１細胞中の染色体コンフォメーションキャプチャカーボンコピー（５Ｃ、（Ｄｏｓｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６））を利用して分析した。この領域のクロマチン相互作用マップは、一連のトポロジー的に関連するドメイン（ＴＡＤ、（Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｎｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２））の存在を示した。ＴＡＤは、より少ない相互作用が生じるＣＴＣＦ結合部位をしばしば含有する境界（図６Ａ、矢印）によって分離された一般的に上昇した相互作用頻度を有する連続領域である。ＭＹＣ遺伝子は、いくつかのサブ領域を含有する大きなＴＡＤの左境界付近に位置し、１つはＭＥ１およびＭＥ２エンハンサーを含有し、もう１つはＣＴＣＦ部位およびＥ３／Ｅ５を包含するＢＤＭＥスーパーエンハンサーを含有する。ＭＹＣプロモーターの相互作用を、プロモーターの５Ｃ相互作用頻度を４Ｃスタイル相互作用プロットにおいてドメイン全体とプロットすることによって、より詳細に分析した（図６Ｂ）。相互作用頻度は、一般に、予想どおりゲノム距離の関数として減少する。この一般的な傾向に重畳したいくつかのピークが観察され、特定のルーピング相互作用を表した（Ｄｅｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＭＥ１、ＭＥ２、およびＢＤＭＥスーパーエンハンサーとのＭＹＣプロモーターの有意な相互作用が同定された。スーパーエンハンサー内で、上昇した相互作用の３つのピークも同定され、そのうちの最も強い２つは、ＣＴＣＦ結合部位を含有した（図６Ｂ、矢じり）。これらの相互作用は、ＭＹＣプロモーター付近のスーパーエンハンサーとＣＴＣＦ部位との間の相互作用を伴い得る。加えて、ＭＹＣプロモーターとＥ３／Ｅ５エンハンサーとの間で局所的な相互作用ピークが観察される。これらの結果は、ＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３とドメイン全体との間の相互作用をプロットすることによって確認し（図６Ｂ）、これらのエレメントのすべてが互いに相互作用することを示した。ＭＥ１とＭＥ２との間に位置する２つの遺伝子座はまた、これらのエレメントと相互作用し（図６Ｂ、矢印）、これらは、オープンクロマチンおよびＨ３Ｋ２７Ａｃの部位と一致するが、ＲＵＮＸ１ピークとは一致せず（図５Ａ）、局所相互作用を有する追加の機能的エレメントの存在を示唆する。これらの実験は、ＭＹＣプロモーターが、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞においてＲＵＮＸ１関連エンハンサーＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３と物理的に相互作用するという重要な証拠を提供する。さらに、これらの遠位エレメントはまた、物理的に互いに相互作用する。
【００９５】
ＡＩ−１０−４９処置細胞では、領域の全体的なコンフォメーションは変化しなかった（図６Ａ、左パネルおよび中央パネル）。しかしながら、定量的差異が観察された。まず、ＡＩ−１０−４９処理細胞および対照細胞で得られた相互作用マップの比をプロットするとき、隣接するＴＡＤに位置する遺伝子座間の相互作用の上昇が観察され（図６Ａ、右パネル）、ＴＡＤ境界の強度の弱化を示した。これは、ＡＩ−１０−４９処理培養物中のＧ１細胞の適度な低減の結果であり得る。第２に、ＭＹＣプロモーター、ＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３間の相互作用がより顕著に出現した一方で、ＭＹＣプロモーターと、ＣＴＣＦにより結合された部位を含有するＢＤＭＥスーパーエンハンサーの他のエレメントとの相互作用が低減した。これらの実験は、ＭＹＣプロモーターがエンハンサーと物理的に相互作用し、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞におけるＲＵＮＸ１占有率の増加を示す重要な証拠を提供する。
【００９６】
実施例７：ＡＩ−１０−４９は、ＡＭＬ関連ＭＹＣエンハンサーでのＳＷＩ−ＳＮＦ活性複合体のＰＲＣ抑制複合体への切り替えを誘導する。ＲＵＮＸ１ピークの増加は、これらのエンハンサーにおける活性クロマチン複合体を変化させ得ると仮定した。したがって、ＢＤＭＥ媒介性ＭＹＣ発現に関与するＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の成分であるＢＲＧ１におけるＡＩ−１０−４９媒介性変化を評価した（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＭＥ−１細胞におけるＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ分析は、ＢＲＧ１がＭＹＣプロモーターならびにＭＥ１、ＭＥ２、およびＢＤＭＥ調節エレメントから置換されることを明らかにしたが（図７Ａ）、総ＢＲＧ１レベルは変化しなかった（図１５Ａ）。加えて、活性エンハンサー特異的ヒストンマークであるヒストン３  Ｌｙｓ４モノメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１）における変化についてのＣｈＩＰ−ＰＣＲ分析（Ｌｏｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）もまた、ＭＥ１、ＭＥ２、およびＭＥ３エンハンサーの有意な低減を明らかにしたが、Ｎ−ＭＥおよびＭＹＣプロモーターでは明らかにしなかった（図７Ｂ）。これらの結果は、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ活性の薬理学的阻害が、ＭＹＣ遠位エンハンサー内のＳＷＩ／ＳＮＦ活性化複合体の除去につながることを明らかにした。
【００９７】
エンハンサーにおけるポリコーム抑制タンパク質複合体ＰＲＣ１とＰＲＣ２との組み合わせ活性は、ヒストンＨ３（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）のリジン２７のトリメチル化およびヒストンＨ２リジン１１９ユビキチン化（Ｈ２Ｋ１１９ｕｂ、（Ｂｌａｃｋｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）による遺伝子サイレンシングを滴下することができる。ＲＵＮＸ１が造血分化中にＰＲＣ１サブユニットＲＩＮＧ１Ｂをクロマチンに動員することを考慮して（Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、ＲＵＮＸ１がｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞においてＰＲＣ１とクロマチンとの会合を誘発し得ると仮定した。したがって、ＲＩＮＧ１ＢおよびＨ３Ｋ２７ｍｅ３を含む抑制性クロマチンに関連する特徴が、ＭＹＣ遺伝子座においてＡＩ−１０−４９によって修飾されたかどうかを評価した。ＣｈｉＰ−ｑＰＣＲ分析は、ＲＩＮＧ１ＢがＲＵＮＸ１結合エンハンサーＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３に特異的に動員されるが、Ｎ−ＭＥでは動員されないことを明らかにした（図７Ｄ）。ｉｎｖ（１６）ＡＭＬにおけるＡＩ−１０−４９処理に関連するクロマチン複合体置換の動態を定義するために、ＡＩ−１０−４９処理されたＭＥ−１細胞におけるＥ３におけるＲＵＮＸ１、ＲＩＮＧ１Ｂ、およびＢＲＧ１の経時的ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ（図７Ｇ）を行った。ＲＵＮＸ１およびＲＩＮＧ１Ｂ結合は、類似のパターンを示し、およそ２．５時間で増加し、５時間で９０％の占有率に達した。逆に、ＢＲＧ１結合は、４〜６時間の処理の間で低減した。ＲＵＮＸ１／ＲＩＮＧ１Ｂ占有率とＥ３におけるＢＲＧ１の低減との間の観察された遅延は、複雑な置換モデルを支持する。加えて、Ｅ３におけるＲＵＮＸ１とＢＲＧ１またはＲＩＮＧ１Ｂとの間の相互作用を、ＣｈＩＰ−ｒｅ−ＣｈＩＰ技法を用いて評価した。この分析は、ＲＵＮＸ１がＲＩＮＧ１Ｂと特異的に相互作用するが、Ｅ３におけるＢＲＧ１とは相互作用しないこと、およびこの相互作用がＡＩ−１０−４９処理によって誘導されることを明らかにした（図６Ｈ）。さらに、ＭＥ−１核溶解物の共免疫沈降分析は、ＲＵＮＸ１が、ＢＲＧ１およびＲＩＮＧ１Ｂに結合することができることを確認した（図１５Ｅ）。これらの結果は、ＡＩ−１０−４９が、ＭＹＣエンハンサーへのＰＲＣ抑制複合体のＲＵＮＸ１指向性動員によるＭＹＣ発現のＲＵＮＸ１媒介性抑制を誘導し、それによってＳＷＩ／ＳＮＦ活性化複合体を除去することを示す。さらに、これらの結果は、クロマチン複合体とのＲＵＮＸ１相互作用が遺伝子座特異的であり得ることを示唆する。
【００９８】
ＰＲＣ１がＰＲＣ２動員に寄与するため、ＭＥ−１細胞のＡＩ−１０−４９処理は、これらの部位でＨ３Ｋ２７ｍｅ３マークに影響を及ぼす可能性があるかどうかを調査した。ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ実験は、Ｎ−ＭＥを除いて、エンハンサーエレメントでＨ３Ｋ２７ｍｅ３会合の有意な増加を明らかにした（図７Ｅ）。これらの結果は、ＡＩ−１０−４９が、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体を干渉し、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ関連ＭＹＣエンハンサーにＰＲＣ抑制複合体を動員することによって、ＭＹＣ発現のＲＵＮＸ１媒介性抑制を誘導し得ることを示唆する。
【００９９】
実施例８．ＭＹＣ発現およびｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞の生存率は、３つの遠位エンハンサーＭＥ１、ＭＥ２、およびＢＤＭＥ−Ｅ３の活性に依存する。ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞において同定された３つのエンハンサーの機能的意義を確立するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を利用した各エンハンサーの単一欠失を、ＭＹＣ発現および機能を変化させるのに十分であるかどうかについて評価した。各エンハンサーについて、Ｃａｓ９および２ｓｇＲＮＡでトランスフェクトしてエンハンサー内のＲＵＮＸ１結合部位を取り囲む小さな欠失を生成したＭＥ−１細胞の配列分析は、最も頻繁な欠失が、細胞の６０％〜７０％において４１ｂｐ（ＭＥ１）、６７ｂｐ（ＭＥ２）、および２９５ｂｐ（Ｅ３）であったことを明らかにした（図８Ａおよび１６Ａ）。突然変異コンセンサスＲＵＮＸ結合部位（ＲＢＳ）を有する対立遺伝子の全体的な頻度は、７４％〜９３％の範囲であった。ＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３エンハンサーエレメント内のこれらの配列の個々の欠失は、ＭＹＣ発現の４０％〜５０％低減をもたらした（図８Ｂ）。同時に、選別の１４日後に細胞生存率を６０％〜７０％低減した（図８Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３が、ＭＹＣ発現レベルおよびｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞の生存率を維持するためのエンハンサーとして機能することを実証する。
【０１００】
薬理学的、ゲノム的、生化学的、および遺伝的アプローチは、ＲＵＮＸ１転写因子の急性放出が、ＭＹＣ遠位エンハンサーエレメントにおけるクロマチンリモデリング複合体の位置決めを変化させ、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞のアポトーシスを誘導することを実証する。ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣは、ＭＹＣ発現および細胞生存を維持し、この機能は、ＲＵＮＸ１依存性である。融合タンパク質は、造血およびＡＭＬにおいてＲＵＮＸ１依存的または独立した機能を有し得るが（Ｈｙｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｋａｍｉｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｍａｎｄｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、白血病維持におけるＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ発がん性機能の基礎となる機序は依然として捉えられない。ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞において、融合タンパク質は、ＲＵＮＸ１の大部分をクロマチンにアクセスできないようにし（Ｋａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｌｕｋａｓｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ＲＵＮＸ１の基底レベルのみがクロマチンと関連付けられていることが見出される。ＲＵＮＸ１のさらなる抑制が細胞死を誘導し、Ｒｕｎｘ１Δ／Δ、Ｃｂｆｂ＋／ＭＹＨ１１マウスの白血病潜時を遅らせるため、そのような基礎ＲＵＮＸ１機能は、白血病維持に不可欠であると思われる（Ｂｅｎ−Ａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｈｙｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。用量依存性発がん活性はまた、Ｃ−ＥＢＰαおよびＰＵ．１などのＡＭＬに関連する他の転写因子についても報告されている（Ｋｉｒｓｔｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｒｏｓｅｎｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。上記の研究は、有効な転写因子レベルがどのように白血病維持を決定することができるかについての新しい洞察を提供する。ＲＵＮＸ１発現は、ＡＩ−１０−４９処理の影響を受けないが（Ｉｌｌｅｎｄｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、代わりに、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ多量体からのＲＵＮＸ１の急性放出は、ＭＹＣ発現およびその発がんプログラムの調節を崩壊させ、白血病開始細胞に悪影響を及ぼす。この研究は、ＭＹＣ抑制がＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ阻害の主な結果であることを明らかにするが、クロマチン関連ＲＵＮＸ１ピークのゲノム全体の増加に関する上記所見は、他のＲＵＮＸ１標的遺伝子が、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ白血病維持の規制緩和に関与し得ることを示唆している。
【０１０１】
また、ＲＵＮＸ１は、３つの下流エンハンサー（ＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３）でのその占有率を増加させ、クロマチン複合体を抑制することへの活性化の切り替えを促進することによって、ＭＹＣ発現を抑制すると結論付けることができる。ＳＷＩ／ＳＮＦとＰＲＣエピジェネティック複合体との間のバランスは、エンハンサー活性および発がん性形質転換を調節する。ＳＷＩ／ＳＮＦは、クロマチンからＰＲＣ１を迅速に除去することができ、そのＡＴＰａｓｅサブユニットＢＲＧ１の喪失は、この機能を阻害する（Ｓｔａｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体は、ｔ（９；１１）ＡＭＬにおいて発がん機能を有し、ＢＲＧ１は、ＭＹＣ発現を維持するために遠位ＢＤＭＥスーパーエンハンサーと関連付けられる（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＢＤＭＥスーパーエンハンサー（エレメントＥ３）は、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬにおいても活性であり、ＢＤＭＥが多くのＡＭＬサブタイプにおいて機能し得るため、「ｐａｎ−ＡＭＬ」エンハンサーであり得ることを示唆する。このモデルを支持するために、ＢＤＭＥは、最近、ｔ（９：２２）骨髄芽球／赤血球性白血病Ｋ５６２細胞株におけるＭＹＣ発現を調節するために、ＣＲＩＳＰＲスクリーンにおいて同定された（Ｆｕｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。加えて、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬにおけるＭＹＣ発現は、他のＡＭＬサブタイプにおいて同定されていないため、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬに特異的であると思われる２つの追加のエンハンサー（ＭＥ１およびＭＥ２）に依存する。
【０１０２】
上記研究からの別の結論は、急性ＲＵＮＸ１放出が、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬにおけるＭＹＣ発現と直接関連することである。ＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３エンハンサーにおけるＲＵＮＸ１ピークの急性増加は、ＢＲＧ１枯渇、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１の減少、ならびにＲＩＮＧ１ｂおよびＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制マークの増加と相関する。ＲＵＮＸ１が造血幹および巨核細胞分化中にＲＩＮＧ１Ｂを調節領域に動員することを考慮すると（Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、ＲＵＮＸ１は、ＳＷＩ／ＳＮＦ−ＰＲＣ１切り替えを促進して、ＭＹＣ関連エンハンサーにＰＲＣ１複合体をもたらし、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞のアポトーシスを誘導し得る。二連の証拠が、ＭＹＣ抑制におけるＲＵＮＸ１の直接的な役割を強化する。第１に、５−Ｃアッセイは、ｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞におけるＭＹＣプロモーターによるＭＥ１、ＭＥ２、およびＥ３の物理的ルーピングを検証し、第２に、これらのエンハンサーの各々におけるＲＵＮＸ１結合部位を含む小区間の個々のＣＲＩＳＰＲ欠失は、ＭＹＣ発現を低減し、アポトーシスを誘導するのに十分である。
【０１０３】
上記の研究は、対処する必要がある白血病における転写因子機能とクロマチンリモデリング複合体との間の動的バランスに関する独自の洞察を提供する。まず、転写因子機能の標的阻害剤は、がん治療において独自のパラダイムを提示し得る。急性ＲＵＮＸ１放出がＳＷＩ／ＳＮＦからＰＲＣ１への切り替えを誘発し、白血病開始細胞を排除できることが顕著であるため、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病におけるＮＯＴＣＨレベルの急性変化によるＨ３Ｋ２７Ａｃ変化に類似する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｙａｓｈｉｒｏ−Ｏｈｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。第２に、我々の現在の理解は、ＳＷＩ−ＳＮＦ活性がＢＲＧ１依存性であり、活性クロマチンエレメントからＰＲＣ１を除去することである。この研究がＲＵＮＸ１をこの切り替えの媒介物として配置するため、急性ＲＵＮＸ１占有がＳＷＩ／ＳＮＦ置換ＢＲＧ１に直接干渉し、次いで利用可能なエンハンサーがＰＲＣ１によって占有されるか、またはＲＵＮＸ１／ＲＩＮＧ１Ｂ複合体が活性ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体を置換するかどうかを判定するために、機械的研究が必要である。第３に、上記の所見は、白血病関連転写因子およびクロマチン活性の成分を標的とする阻害剤との併用治療の設計に直接的な治療的意味を有する。加えて、ＡＩ−１０−４９などの標的療法が、クロマチンリモデリング複合体に関連する成分の他の阻害剤と組み合わせても有効であり得ることを示唆している。最後に、上記の研究は、ＲＵＮＸ１機能の薬理学的緩和が、他のＡＭＬサブタイプにおいて治療的に有効であり得ることを示唆する。
【０１０４】
結論として、この研究は、腫瘍性タンパク質ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣが、ＭＹＣ発現を維持するために３つのエンハンサーエレメントで活性クロマチン複合体を維持することによってｉｎｖ（１６）ＡＭＬ細胞の生存率を維持し、ＣＢＦβ−ＳＭＭＨＣ／ＲＵＮＸ１相互作用の急性破壊が、ＭＹＣ遺伝子座内のクロマチン複合体の切り替えを促進し、ＭＹＣの下方調節、およびＲＵＮＸ１依存性アポトーシスをもたらすことを実証する。
【０１０５】
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Ｄｉｘｏｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｅｌｖａｒａｊ，Ｓ．，Ｙｕｅ，Ｆ．，Ｋｉｍ，Ａ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｓｈｅｎ，Ｙ．，Ｈｕ，Ｍ．，Ｌｉｕ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｒｅｎ，Ｂ．（２０１２）．Ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８５，３７６−３８０．
Ｄｏｓｔｉｅ，Ｊ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｔ．Ａ．，Ａｒｎａｏｕｔ，Ｒ．Ａ．，Ｓｅｌｚｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｌｅｅ，Ｗ．Ｌ．，Ｈｏｎａｎ，Ｔ．Ａ．，Ｒｕｂｉｏ，Ｅ．Ｄ．，Ｋｒｕｍｍ，Ａ．，Ｌａｍｂ，Ｊ．，Ｎｕｓｂａｕｍ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｐｙ  （５Ｃ）：ａ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６，１２９９−１３０９．
Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｎ．Ｃ．，Ｊａｃｏｂｓ，Ｈ．，Ｂｏｔｈｗｅｌｌ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｈａｙｄａｙ，Ａ．Ｃ．（２００１）．Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃ−Ｍｙｃ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２，３０７−３１５．
Ｄｕｒｓｔ，Ｋ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｈｉｅｂｅｒｔ，Ｓ．Ｗ．（２００４）．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＲＵＮＸ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３，４２２０−４２２４．
Ｆｅｒｒａｉｕｏｌｏ，Ｍ．Ａ．，Ｓａｎｙａｌ，Ａ．，Ｎａｕｍｏｖａ，Ｎ．，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｄｏｓｔｉｅ，Ｊ．（２０１２）．Ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ：ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ｓｎａｐｓｈｏｔｓ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ５Ｃ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５８，２５５−２６７．
Ｆｕｌｃｏ，Ｃ．Ｐ．，Ｍｕｎｓｃｈａｕｅｒ，Ｍ．，Ａｎｙｏｈａ，Ｒ．，Ｍｕｎｓｏｎ，Ｇ．，Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｓ．Ｒ．，Ｐｅｒｅｚ，Ｅ．Ｍ．，Ｋａｎｅ，Ｍ．，Ｃｌｅａｒｙ，Ｂ．，Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｅｎｇｒｅｉｔｚ，Ｊ．Ｍ．（２０１６）．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５４，７６９−７７３．
Ｇｏｗｄａ，Ｓ．Ｄ．，Ｋｏｌｅｒ，Ｒ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｂａｇｂｙ，Ｇ．Ｃ．，Ｊｒ．（１９８６）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ−ｍｙｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ７７，２７１−２７８．
Ｇｕｅｌｌ，Ｍ．，Ｙａｎｇ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．（２０１４）．Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （ＣＲＩＳＰＲ−ＧＡ）．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０，２９６８−２９７０．
Ｇｕｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ａ．Ｄ．（２０１１）．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＵＮＸ１  ｂｙ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＨＤＡＣ１  ａｎｄ  ＨＤＡＣ３．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６，２０８−２１５．
Ｇｕｏ，Ｙ．，Ｎｉｕ，Ｃ．，Ｂｒｅｓｌｉｎ，Ｐ．，Ｔａｎｇ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，Ｗｅｉ，Ｗ．，Ｋｉｎｉ，Ａ．Ｒ．，Ｐａｎｅｒ，Ｇ．Ｐ．，Ａｌｋａｎ，Ｓ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｓ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．ｃ−Ｍｙｃ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ  ｉｎ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１４，２０９７−２１０６．
Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｄ．，Ａｍｂｅｓｉ−Ｉｍｐｉｏｍｂａｔｏ，Ａ．，Ｐａｌｏｍｅｒｏ，Ｔ．，Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｓ．Ａ．，Ｂｅｌｖｅｒ，Ｌ．，Ｗｅｎｄｏｒｆｆ，Ａ．Ａ．，Ｘｕ，Ｌ．，Ｃａｓｔｉｌｌｏ−Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．，Ｌｌｏｂｅｔ−Ｎａｖａｓ，Ｄ．，Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ａ  ＮＯＴＣＨ１−ｄｒｉｖｅｎ  ＭＹＣ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０，１１３０−１１３７．
Ｈｎｉｓｚ，Ｄ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｔ．Ｉ．，Ｌａｕ，Ａ．，Ｓａｉｎｔ−Ａｎｄｒｅ，Ｖ．，Ｓｉｇｏｖａ，Ａ．Ａ．，Ｈｏｋｅ，Ｈ．Ａ．，ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．（２０１３）．Ｓｕｐｅｒ−ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ  １５５，９３４−９４７．
Ｈｎｉｓｚ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ａ．Ｓ．，Ｄａｙ，Ｄ．Ｓ．，Ｖａｌｔｏｎ，Ａ．Ｌ．，Ｂａｋ，Ｒ．Ｏ．，Ｌｉ，Ｃ．Ｈ．，Ｇｏｌｄｍａｎｎ，Ｊ．，Ｌａｊｏｉｅ，Ｂ．Ｒ．，Ｆａｎ，Ｚ．Ｐ．，Ｓｉｇｏｖａ，Ａ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１，１４５４−１４５８．
Ｈｏｌｔ，Ｊ．Ｔ．，Ｒｅｄｎｅｒ，Ｒ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｎｉｅｎｈｕｉｓ，Ａ．Ｗ．（１９８８）．Ａｎ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｔｏ  ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬ−６０  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８，９６３−９７３．
Ｈｏｏｇｅｎｋａｍｐ，Ｍ．，Ｌｉｃｈｔｉｎｇｅｒ，Ｍ．，Ｋｒｙｓｉｎｓｋａ，Ｈ．，Ｌａｎｃｒｉｎ，Ｃ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ａ．，Ｍａｚｚａｒｅｌｌａ，Ｌ．，Ｉｎｇｒａｍ，Ｒ．，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｈ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｅａｒｌｙ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｂｙ  ＲＵＮＸ１：ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ．Ｂｌｏｏｄ  １１４，２９９−３０９．
Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．，Ｃａｒｅｙ，Ｖ．Ｊ．，Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ，Ｒ．，Ａｎｄｅｒｓ，Ｓ．，Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｍ．，Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ｂ．Ｓ．，Ｂｒａｖｏ，Ｈ．Ｃ．，Ｄａｖｉｓ，Ｓ．，Ｇａｔｔｏ，Ｌ．，Ｇｉｒｋｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  １２，１１５−１２１．
Ｈｙｄｅ，Ｒ．Ｋ．，Ｋａｍｉｋｕｂｏ，Ｙ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．，Ｋｉｒｂｙ，Ｍ．，Ａｌｅｍｕ，Ｌ．，Ｚｈａｏ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｐ．Ｐ．（２０１０）．Ｃｂｆｂ／Ｒｕｎｘ１  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｌｏｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｓｆ２ｒｂ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｃｂｆｂ−ＭＹＨ１１．Ｂｌｏｏｄ  １１５，１４３３−１４４３．
Ｈｙｄｅ，Ｒ．Ｋ．，Ｚｈａｏ，Ｌ．，Ａｌｅｍｕ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｐ．Ｐ．（２０１５）．Ｒｕｎｘ１  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｃｂｆｂ−ＭＹＨ１１  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２９，１７７１−１７７８．
Ｉｈａｋａ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ，Ｒ．（１９９６）．Ｒ：Ａ  ｌａｎｇｕａｇｅ  ｆｏｒ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｇｒａｐｈｉｃｓ．Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｇｒａｐｈ  Ｓｔａｔ  ５，５．
Ｉｌｌｅｎｄｕｌａ，Ａ．，Ｐｕｌｉｋｋａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｚｏｎｇ，Ｈ．，Ｇｒｅｍｂｅｃｋａ，Ｊ．，Ｘｕｅ，Ｌ．，Ｓｅｎ，Ｓ．，Ｚｈｏｕ，Ｙ．，Ｂｏｕｌｔｏｎ，Ａ．，Ｋｕｎｔｉｍａｄｄｉ，Ａ．，Ｇａｏ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＣＢＦｂｅｔａ−ＳＭＭＨＣ  ｄｅｌａｙｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４７，７７９−７８４．
Ｉｍａｋａｅｖ，Ｍ．，Ｆｕｄｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．，ＭｃＣｏｒｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｎａｕｍｏｖａ，Ｎ．，Ｇｏｌｏｂｏｒｏｄｋｏ，Ａ．，Ｌａｊｏｉｅ，Ｂ．Ｒ．，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｍｉｒｎｙ，Ｌ．Ａ．（２０１２）．Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉ−Ｃ  ｄａｔａ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，９９９−１００３．
Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｌ．Ｍ．，Ｉｗａｍａ，Ａ．，Ｌｏｄｉｅ，Ｔ．Ａ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｋ．，Ｆｅｌｓｈｅｒ，Ｄ．Ｗ．，Ｇｏｌｕｂ，Ｔ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｔｅｎｅｎ，Ｄ．Ｇ．（２００１）．ｃ−Ｍｙｃ  ｉｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｃ／ＥＢＰａｌｐｈａ  ｉｎ  ｇｒａｎｕｌｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１，３７８９−３８０６．
Ｋａｄｏｃｈ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｇ．Ｒ．（２０１５）．Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＳＷＩ／ＳＮＦ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｇａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｓｃｉ  Ａｄｖ  １，ｅ１５００４４７．
Ｋａｍｉｋｕｂｏ，Ｙ．，Ｚｈａｏ，Ｌ．，Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｍ．，Ｃｏｒｐｏｒａ，Ｔ．，Ｈｙｄｅ，Ｒ．Ｋ．，Ｐａｕｌ，Ｔ．Ａ．，Ｋｕｎｄｕ，Ｍ．，Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｌ．，Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｓ．，Ｈｕａｎｇ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｌｅｕｋｅｍｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ＣＢＦ  ｂｅｔａ−ＳＭＭＨＣ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＲＵＮＸ１．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １７，４５５−４６８．
Ｋａｎｎｏ，Ｙ．，Ｋａｎｎｏ，Ｔ．，Ｓａｋａｋｕｒａ，Ｃ．，Ｂａｅ，Ｓ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｉｔｏ，Ｙ．（１９９８）．Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  （ＰＥＢＰ２）／ｃｏｒｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  （ＣＢＦａｌｐｈａ）  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＰＥＢＰ２／ＣＢＦｂｅｔａ−ＳＭＭＨＣ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＰＥＢＰ２／ＣＢＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８，４２５２−４２６１．
Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｌ．Ｌ．，Ｊ．Ｅ．Ｇｅｓｔｗｉｃｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ４５（１５）：２３４８−２３６８．
Ｋｉｍ，Ｄ．，Ｐｅｒｔｅａ，Ｇ．，Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｐｉｍｅｎｔｅｌ，Ｈ．，Ｋｅｌｌｅｙ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．（２０１３）．ＴｏｐＨａｔ２：ａｃｃｕｒａｔｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ，ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １４，Ｒ３６．
Ｋｉｒｓｔｅｔｔｅｒ，Ｐ．，Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｍ．Ｂ．，Ｂｅｒｅｓｈｃｈｅｎｋｏ，Ｏ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｓ．，Ｄｖｉｎｇｅ，Ｈ．，Ｋｕｒｚ，Ｅ．，Ｔｈｅｉｌｇａａｒｄ−Ｍｏｎｃｈ，Ｋ．，Ｍａｎｓｓｏｎ，Ｒ．，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｔ．Ａ．，Ｐａｂｓｔ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｃ／ＥＢＰａｌｐｈａ  ｍｕｔａｎｔ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １３，２９９−３１０．
Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ，Ｉ．，Ａｉｋａｗａ，Ｙ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｌ．Ａ．，Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｏｈｋｉ，Ｍ．（２００１）．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＭＬ１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ＭＯＺ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＭＯＺ−ＣＢＰ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０，７１８４−７１９６．
Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ，Ｉ．，Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ａ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｏｈｋｉ，Ｍ．（１９９８）．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ  ＡＭＬ１  ａｎｄ  ｐ３００  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １７，２９９４−３００４．
Ｋｒｅｓｓ，Ｔ．Ｒ．，Ｓａｂｏ，Ａ．，ａｎｄ  Ａｍａｔｉ，Ｂ．（２０１５）．ＭＹＣ：ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｏ  ｇｌｏｂａｌ  ＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １５，５９３−６０７．
Ｋｕｏ，Ｙ．Ｈ．，Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｃａｓｔｉｌｌａ，Ｌ．Ｈ．（２００８）．Ｃｂｆｂｅｔａ−ＳＭＭＨＣ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＲＵＮＸ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｂｌｏｏｄ  １１１，１５４３−１５５１．
Ｋｕｏ，Ｙ．Ｈ．，Ｌａｎｄｒｅｔｔｅ，Ｓ．Ｆ．，Ｈｅｉｌｍａｎ，Ｓ．Ａ．，Ｐｅｒｒａｔ，Ｐ．Ｎ．，Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｐ．Ｐ．，Ｌｅ  Ｂｅａｕ，Ｍ．Ｍ．，Ｋｏｇａｎ，Ｓ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｃａｓｔｉｌｌａ，Ｌ．Ｈ．（２００６）．Ｃｂｆ  ｂｅｔａ−ＳＭＭＨＣ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｂｌｅ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ９，５７−６８．
Ｌａｊｏｉｅ，Ｂ．Ｒ．，ｖａｎ  Ｂｅｒｋｕｍ，Ｎ．Ｌ．，Ｓａｎｙａｌ，Ａ．，ａｎｄ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｊ．（２００９）．Ｍｙ５Ｃ：ｗｅｂ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ６，６９０−６９１．
Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．（２０１２）．Ｆａｓｔ  ｇａｐｐｅｄ−ｒｅａｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｗｔｉｅ  ２．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，３５７−３５９．
Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｓａｕｖａｇｅａｕ，Ｇ．（２００３）．Ｂｍｉ−１  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２３，２５５−２６０．
Ｌｉｃｈｔｉｎｇｅｒ，Ｍ．，Ｈｏｏｇｅｎｋａｍｐ，Ｍ．，Ｋｒｙｓｉｎｓｋａ，Ｈ．，Ｉｎｇｒａｍ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｂｏｎｉｆｅｒ，Ｃ．（２０１０）．Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＵＮＸ１．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ  Ｄｉｓ  ４４，２８７−２９０．
Ｌｉｕ，Ｐ．，Ｔａｒｌｅ，Ｓ．Ａ．，Ｈａｊｒａ，Ａ．，Ｃｌａｘｔｏｎ，Ｄ．Ｆ．，Ｍａｒｌｔｏｎ，Ｐ．，Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｍ．，Ｓｉｃｉｌｉａｎｏ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｆ．Ｓ．（１９９３）．Ｆｕｓｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＣＢＦ  ｂｅｔａ／ＰＥＢＰ２  ｂｅｔａ  ａｎｄ  ａ  ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，１０４１−１０４４．
Ｌｏｒｓｂａｃｈ，Ｒ．Ｂ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．，Ａｎｇ，Ｓ．Ｏ．，Ｓｕｎ，Ｗ．，Ｌｅｎｎｙ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．（２００４）．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＲＵＮＸ１  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＵＮＸ１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  １０３，２５２２−２５２９．
Ｌｏｖｅｎ，Ｊ．，Ｈｏｋｅ，Ｈ．Ａ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｌａｕ，Ａ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｄ．Ａ．，Ｖａｋｏｃ，Ｃ．Ｒ．，Ｂｒａｄｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｌｅｅ，Ｔ．Ｉ．，ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．（２０１３）．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒ−ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．Ｃｅｌｌ  １５３，３２０−３３４．
Ｌｕｋａｓｉｋ，Ｓ．Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｃｏｒｐｏｒａ，Ｔ．，Ｔｏｍａｎｉｃｅｋ，Ｓ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｋｕｎｄｕ，Ｍ．，Ｈａｒｔｍａｎ，Ｋ．，Ｌｉｕ，Ｐ．Ｐ．，Ｌａｕｅ，Ｔ．Ｍ．，Ｂｉｌｔｏｎｅｎ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ａｌｔｅｒｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ＣＢＦ  ｂｅｔａ−ＳＭＭＨＣ  ｆｏｒ  Ｒｕｎｘ１  ｅｘｐｌａｉｎｓ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｌｅｕｋｅｍｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９，６７４−６７９．
Ｍａｍｍｅｎ，Ｍ．，Ｓ．Ｋ．Ｃｈｏｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ３７（２０）：２７５５−２７９４．
Ｍａｎｄｏｌｉ，Ａ．，Ｓｉｎｇｈ，Ａ．Ａ．，Ｊａｎｓｅｎ，Ｐ．Ｗ．，Ｗｉｅｒｅｎｇａ，Ａ．Ｔ．，Ｒｉａｈｉ，Ｈ．，Ｆｒａｎｃｉ，Ｇ．，Ｐｒａｎｇｅ，Ｋ．，Ｓａｅｅｄ，Ｓ．，Ｖｅｌｌｅｎｇａ，Ｅ．，Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１／ＲＵＮＸ１  ｔｏｇｅｔｈｅｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ，ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  ｂａｓａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｃｃｕｐｉｅｓ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｉｎｖ（１６）  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２８，７７０−７７８．
Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．（２０１１）．Ｃｕｔａｄａｐｔ  ｒｅｍｏｖｅｓ  ａｄａｐｔｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｓ．２０１１  １７．
Ｍｕｌｄｅｒ，Ａ．，Ｔ．Ａｕｌｅｔｔａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２６（２１）：６６２７−６６３６．
Ｎａｕｍｏｖａ，Ｎ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｍ．，Ｚｈａｎ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｊ．（２０１２）．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５８，１９２−２０３．
Ｎｏｒａ，Ｅ．Ｐ．，Ｌａｊｏｉｅ，Ｂ．Ｒ．，Ｓｃｈｕｌｚ，Ｅ．Ｇ．，Ｇｉｏｒｇｅｔｔｉ，Ｌ．，Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｓｅｒｖａｎｔ，Ｎ．，Ｐｉｏｌｏｔ，Ｔ．，ｖａｎ  Ｂｅｒｋｕｍ，Ｎ．Ｌ．，Ｍｅｉｓｉｇ，Ｊ．，Ｓｅｄａｔ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｓｐａｔｉａｌ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｘ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃｅｎｔｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８５，３８１−３８５．
Ｎｏｒｔｈ，Ｔ．Ｅ．，Ｓｔａｃｙ，Ｔ．，Ｍａｔｈｅｎｙ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｐｅｃｋ，Ｎ．Ａ．，ａｎｄ  ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎ，Ｍ．Ｆ．（２００４）．Ｒｕｎｘ１  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎ  ｍａｔｕｒｉｎｇ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２，１５８−１６８．
Ｏｕ，Ｊ．，Ｙｕ，Ｊ．，Ｋｅｌｌｉｈｅｒ，Ｍ．，Ｃａｓｔｉｌｌａ，Ｌ．，Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｚｈｕ，Ｌ．Ｊ．（２０１７）．ＡＴＡＣ−ｓｅｑ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．
Ｐｅｎｃｏｖｉｃｈ，Ｎ．，Ｊａｓｃｈｅｋ，Ｒ．，Ｔａｎａｙ，Ａ．，ａｎｄ  Ｇｒｏｎｅｒ，Ｙ．（２０１１）．Ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＲＵＮＸ１  ａｎｄ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｐａｒｔｎｅｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１７，ｅ１−１４．
Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ，Ｍ．Ｍ．，Ａｈｍａｄｉｙｅｈ，Ｎ．，Ｊｉａ，Ｌ．，Ｈｅｒｍａｎ，Ｐ．，Ｖｅｒｚｉ，Ｍ．Ｐ．，Ｄｏｄｄａｐａｎｅｎｉ，Ｈ．，Ｂｅｃｋｗｉｔｈ，Ｃ．Ａ．，Ｃｈａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｈｉｌｌｓ，Ａ．，Ｄａｖｉｓ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｔｈｅ  ８ｑ２４  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋ  ｖａｒｉａｎｔ  ｒｓ６９８３２６７  ｓｈｏｗｓ  ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＭＹＣ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４１，８８２−８８４．
Ｐｔａｓｉｎｓｋａ，Ａ．，Ａｓｓｉ，Ｓ．Ａ．，Ｍａｎｎａｒｉ，Ｄ．，Ｊａｍｅｓ，Ｓ．Ｒ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｄ．，Ｄｕｎｎｅ，Ｊ．，Ｈｏｏｇｅｎｋａｍｐ，Ｍ．，Ｗｕ，Ｍ．，Ｃａｒｅ，Ｍ．，ＭｃＮｅｉｌｌ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＵＮＸ１／ＥＴＯ  ｉｎ  ｔ（８；２１）  ＡＭＬ  ｃｅｌｌｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２６，１８２９−１８４１．
Ｐｕｇａｃｈｅｖａ，Ｅ．Ｍ．，Ｒｉｖｅｒｏ−Ｈｉｎｏｊｏｓａ，Ｓ．，Ｅｓｐｉｎｏｚａ，Ｃ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｚ−Ｃａｔａｌａ，Ｃ．Ｆ．，Ｋａｎｇ，Ｓ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｋｏｓａｋａ−Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｓ．，Ｎａｇａｒａｊａｎ，Ｖ．，Ｙｅ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ＣＴＣＦ  ａｎｄ  ＢＯＲＩＳ  ｏｃｃｕｐａｎｃｉｅｓ  ｕｎｃｏｖｅｒ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ＣＴＣＦ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １６，１６１．
Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｆ．，Ｒｙａｎ，Ｄ．Ｐ．，Ｇｒｕｎｉｎｇ，Ｂ．，Ｂｈａｒｄｗａｊ，Ｖ．，Ｋｉｌｐｅｒｔ，Ｆ．，Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ａ．Ｓ．，Ｈｅｙｎｅ，Ｓ．，Ｄｕｎｄａｒ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｋｅ，Ｔ．（２０１６）．ｄｅｅｐＴｏｏｌｓ２：ａ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｄｅｅｐ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４，Ｗ１６０−１６５．
Ｒｅｅｄ−Ｉｎｄｅｒｂｉｔｚｉｎ，Ｅ．，Ｍｏｒｅｎｏ−Ｍｉｒａｌｌｅｓ，Ｉ．，Ｖａｎｄｅｎ−Ｅｙｎｄｅｎ，Ｓ．Ｋ．，Ｘｉｅ，Ｊ．，Ｌｕｔｔｅｒｂａｃｈ，Ｂ．，Ｄｕｒｓｔ−Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｌｕｃｅ，Ｋ．Ｓ．，Ｉｒｖｉｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｃｌｅａｒｙ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｒａｎｄｔ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．ＲＵＮＸ１  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ  ａｎｄ  ＳＵＶ３９Ｈ１  ｔｏ  ｒｅｐｒｅｓｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５，５７７７−５７８６．
Ｒｉｃｃｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｊｉｎ，Ｚ．，Ｄｅｗｓ，Ｍ．，Ｙｕ，Ｄ．，Ｔｈｏｍａｓ−Ｔｉｋｈｏｎｅｎｋｏ，Ａ．，Ｄｉｃｋｅｒ，Ｄ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ，Ｗ．Ｓ．（２００４）．Ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＦＬＩＰ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｃ−ｍｙｃ  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ＴＲＡＩＬ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２４，８５４１−８５５５．
Ｒｉｔｚ，Ｃ．，Ｂａｔｙ，Ｆ．，Ｓｔｒｅｉｂｉｇ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｇｅｒｈａｒｄ，Ｄ．（２０１５）．Ｄｏｓｅ−Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  １０，ｅ０１４６０２１．
Ｒｏｄｅｒｉｃｋ，Ｊ．Ｅ．，Ｔｅｓｅｌｌ，Ｊ．，Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．，Ｂｒｅｈｍ，Ｍ．Ａ．，Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｂ．，Ｓａｌｌａｎ，Ｓ．Ｅ．，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ａ．，Ｌｏｏｋ，Ａ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．ｃ−Ｍｙｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｔ−ＡＬＬ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １２３，１０４０−１０５０．
Ｒｏｓｅｎｂａｕｅｒ，Ｆ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｋ．，Ｋｕｔｏｋ，Ｊ．Ｌ．，Ｉｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｌｅ  Ｂｅａｕ，Ｍ．Ｍ．，Ｏｋｕｎｏ，Ｙ．，Ａｋａｓｈｉ，Ｋ．，Ｆｉｅｒｉｎｇ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｔｅｎｅｎ，Ｄ．Ｇ．（２００４）．Ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｇｒａｄｅｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ，ＰＵ．１．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３６，６２４−６３０．
Ｒｏｓｓ，Ｋ．，Ｓｅｄｅｌｌｏ，Ａ．Ｋ．，Ｔｏｄｄ，Ｇ．Ｐ．，Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ−Ｒｏｇａｃｚ，Ｍ．，Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｗ．，Ｄｉｎｇ，Ｌ．，Ｇｒｉｎｅｎｋｏ，Ｔ．，Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｋ．，Ｈｕｂｎｅｒ，Ｎ．，Ｍａｎｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ｇｒｏｕｐ  ｒｉｎｇ  ｆｉｎｇｅｒ  １  ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｕｎｘ１  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１９，４１５２−４１６１．
Ｒｏｓｓ−Ｉｎｎｅｓ，Ｃ．Ｓ．，Ｓｔａｒｋ，Ｒ．，Ｔｅｓｃｈｅｎｄｏｒｆｆ，Ａ．Ｅ．，Ｈｏｌｍｅｓ，Ｋ．Ａ．，Ａｌｉ，Ｈ．Ｒ．，Ｄｕｎｎｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｇ．Ｄ．，Ｇｏｊｉｓ，Ｏ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｉ．Ｏ．，Ｇｒｅｅｎ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８１，３８９−３９３．
Ｓａｎｙａｌ，Ａ．，Ｌａｊｏｉｅ，Ｂ．Ｒ．，Ｊａｉｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｊ．（２０１２）．Ｔｈｅ  ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８９，１０９−１１３．
Ｓｈｉ，Ｊ．，Ｗｈｙｔｅ，Ｗ．Ａ．，Ｚｅｐｅｄａ−Ｍｅｎｄｏｚａ，Ｃ．Ｊ．，Ｍｉｌａｚｚｏ，Ｊ．Ｐ．，Ｓｈｅｎ，Ｃ．，Ｒｏｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｉｎｄｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｍｅｒｃａｎ，Ｆ．，Ｗａｎｇ，Ｅ．，Ｅｃｋｅｒｓｌｅｙ−Ｍａｓｌｉｎ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＳＷＩ／ＳＮＦ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｍｙｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２７，２６４８−２６６２．
Ｓｈｉｇｅｓａｄａ，Ｋ．，Ｂ．ｖａｎ  ｄｅ  Ｓｌｕｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３（２４）：４２９７−３０７．
Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｂ．Ｚ．，Ｈｏｄｇｅｓ，Ｃ．，Ｃａｌａｒｃｏ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｒａｕｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｋｕ，Ｗ．Ｌ．，Ｋａｄｏｃｈ，Ｃ．，Ｚｈａｏ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｇ．Ｒ．（２０１７）．Ｓｍａｒｃａ４  ＡＴＰａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｄｉｓｒｕｐｔ  ｄｉｒｅｃｔ  ｅｖｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＲＣ１  ｆｒｏｍ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４９，２８２−２８８．
Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ａ．，Ｔａｍａｙｏ，Ｐ．，Ｍｏｏｔｈａ，Ｖ．Ｋ．，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｓ．，Ｅｂｅｒｔ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｉｌｌｅｔｔｅ，Ｍ．Ａ．，Ｐａｕｌｏｖｉｃｈ，Ａ．，Ｐｏｍｅｒｏｙ，Ｓ．Ｌ．，Ｇｏｌｕｂ，Ｔ．Ｒ．，Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｇｅｎｅ  ｓｅｔ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０２，１５５４５−１５５５０．
Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｐａｃｈｔｅｒ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．（２００９）．ＴｏｐＨａｔ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ  ｓｐｌｉｃｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，１１０５−１１１１．
Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．，Ｇｏｆｆ，Ｌ．，Ｐｅｒｔｅａ，Ｇ．，Ｋｉｍ，Ｄ．，Ｋｅｌｌｅｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｐｉｍｅｎｔｅｌ，Ｈ．，Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．，Ｒｉｎｎ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｐａｃｈｔｅｒ，Ｌ．（２０１２）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＴｏｐＨａｔ  ａｎｄ  Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ７，５６２−５７８．
Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂ．Ａ．，Ｐｅｒｔｅａ，Ｇ．，Ｍｏｒｔａｚａｖｉ，Ａ．，Ｋｗａｎ，Ｇ．，ｖａｎ  Ｂａｒｅｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．，Ｗｏｌｄ，Ｂ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｐａｃｈｔｅｒ，Ｌ．（２０１０）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｕｎａｎｎｏｔａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ａｎｄ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２８，５１１−５１５．
ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｕｇｔ，Ｎ．Ｍ．，Ｄｏｍｅｎ，Ｊ．，Ｌｉｎｄｅｒｓ，Ｋ．，ｖａｎ  Ｒｏｏｎ，Ｍ．，Ｒｏｂａｎｕｓ−Ｍａａｎｄａｇ，Ｅ．，ｔｅ  Ｒｉｅｌｅ，Ｈ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖａｌｋ，Ｍ．，Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ，Ｊ．，Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗ，Ｍ．，ｖａｎ  Ｌｏｈｕｉｚｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ，ａｎｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｍｉ−１  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ８，７５７−７６９．
Ｖｒａｄｉｉ，Ｄ．，Ｚａｉｄｉ，Ｓ．Ｋ．，Ｌｉａｎ，Ｊ．Ｂ．，ｖａｎ  Ｗｉｊｎｅｎ，Ａ．Ｊ．，Ｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｓ．（２００５）．Ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＡＭＬ１  ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ｓｕｂｎｕｃｌｅａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０２，７１７４−７１７９．
Ｖｕ，Ｌ．Ｐ．，Ｐｅｒｎａ，Ｆ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｖｏｚａ，Ｆ．，Ｆｉｇｕｅｒｏａ，Ｍ．Ｅ．，Ｔｅｍｐｓｔ，Ｐ．，Ｅｒｄｊｕｍｅｎｔ−Ｂｒｏｍａｇｅ，Ｈ．，Ｇａｏ，Ｒ．，Ｃｈｅｎ，Ｓ．，Ｐａｉｅｔｔａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．ＰＲＭＴ４  ｂｌｏｃｋｓ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ａ  ｍｅｔｈｙｌ−ＲＵＮＸ１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ５，１６２５−１６３８．
Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｚａｎｇ，Ｃ．，Ｔａｉｎｇ，Ｌ．，Ａｒｎｅｔｔ，Ｋ．Ｌ．，Ｗｏｎｇ，Ｙ．Ｊ．，Ｐｅａｒ，Ｗ．Ｓ．，Ｂｌａｃｋｌｏｗ，Ｓ．Ｃ．，Ｌｉｕ，Ｘ．Ｓ．，ａｎｄ  Ａｓｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．（２０１４）．ＮＯＴＣＨ１−ＲＢＰＪ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｄｒｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｅｒｅｎｈａｎｃｅｒｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １１１，７０５−７１０．
Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｓｔａｃｙ，Ｔ．，Ｂｉｎｄｅｒ，Ｍ．，Ｍａｒｉｎ−Ｐａｄｉｌｌａ，Ｍ．，Ｓｈａｒｐｅ，Ａ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｐｅｃｋ，Ｎ．Ａ．（１９９６ａ）．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｂｆａ２  ｇｅｎｅ  ｃａｕｓｅｓ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｂｌｏｃｋｓ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９３，３４４４−３４４９．
Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｓｔａｃｙ，Ｔ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｌｅｗｉｓ，Ａ．Ｆ．，Ｇｕ，Ｔ．Ｌ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．，Ｂｕｓｈｗｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｂｏｒｉｅｓ，Ｊ．Ｃ．，Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．，Ｒｙａｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６ｂ）．Ｔｈｅ  ＣＢＦｂｅｔａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ＣＢＦａｌｐｈａ２  （ＡＭＬ１）  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｃｅｌｌ  ８７，６９７−７０８．
Ｗｉｌｓｏｎ，Ａ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｏｓｋａｒｓｓｏｎ，Ｔ．，Ｋａｌｏｕｌｉｓ，Ｋ．，Ｂｅｔｔｅｓｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｏｓｅｒ，Ｇ．Ｍ．，Ｐａｓｃｈｅ，Ａ．Ｃ．，Ｋｎａｂｅｎｈａｎｓ，Ｃ．，Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｈ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｔｒｕｍｐｐ，Ａ．（２００４）．ｃ−Ｍｙｃ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １８，２７４７−２７６３．
Ｘｕｅ，Ｌ．，Ｐｕｌｉｋｋａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｖａｌｋ，Ｐ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｃａｓｔｉｌｌａ，Ｌ．Ｈ．（２０１４）．ＮｒａｓＧ１２Ｄ  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｅｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｃｂｆｂｅｔａ−ＳＭＭＨＣ  ｖｉａ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＥＫ／ＥＲＫ  ａｘｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  １２４，４２６−４３６．
Ｙａｓｈｉｒｏ−Ｏｈｔａｎｉ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｚａｎｇ，Ｃ．，Ａｒｎｅｔｔ，Ｋ．Ｌ．，Ｂａｉｌｉｓ，Ｗ．，Ｈｏ，Ｙ．，Ｋｎｏｅｃｈｅｌ，Ｂ．，Ｌａｎａｕｚｅ，Ｃ．，Ｌｏｕｉｓ，Ｌ．，Ｆｏｒｓｙｔｈ，Ｋ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  Ｍｙｃ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  Ｎｏｔｃｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １１１，Ｅ４９４６−４９５３．
Ｙｕ，Ｍ．，Ｍａｚｏｒ，Ｔ．，Ｈｕａｎｇ，Ｈ．，Ｈｕａｎｇ，Ｈ．Ｔ．，Ｋａｔｈｒｅｉｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｗｏｏ，Ａ．Ｊ．，Ｃｈｏｕｉｎａｒｄ，Ｃ．Ｒ．，Ｌａｂａｄｏｒｆ，Ａ．，Ａｋｉｅ，Ｔ．Ｅ．，Ｍｏｒａｎ，Ｔ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  １  ｔｏ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｂｙ  ｃｏｒｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ４５，３３０−３４３．
Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｔ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｅｅｃｋｈｏｕｔｅ，Ｊ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｎｕｓｂａｕｍ，Ｃ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．，Ｌｉ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｍｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ  （ＭＡＣＳ）．Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ９，Ｒ１３７．
Ｚｈａｏ，Ｌ．，Ｃａｎｎｏｎｓ，Ｊ．Ｌ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．，Ｋｉｒｂｙ，Ｍ．，Ｘｕ，Ｌ．，Ｃａｓｔｉｌｌａ，Ｌ．Ｈ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ，Ｐ．Ｌ．，Ｂｏｓｓｅｌｕｔ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｐ．Ｐ．（２００７）．ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１  ｈｉｎｄｅｒｓ  ｅａｒｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍａｓｓｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｙｍｕｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０９，３４３２−３４４０．
Ｚｈａｏ，Ｘ．，Ｊａｎｋｏｖｉｃ，Ｖ．，Ｇｕｒａｌ，Ａ．，Ｈｕａｎｇ，Ｇ．，Ｐａｒｄａｎａｎｉ，Ａ．，Ｍｅｎｅｎｄｅｚ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｄｕｎｎｅ，Ｒ．，Ｘｉａｏ，Ａ．，Ｅｒｄｊｕｍｅｎｔ−Ｂｒｏｍａｇｅ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＵＮＸ１  ｂｙ  ＰＲＭＴ１  ａｂｒｏｇａｔｅｓ  ＳＩＮ３Ａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ｉｔｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２２，６４０−６５３．
Ｚｈｕ，Ｌ．Ｊ．（２０１３）．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＣｈＩＰ−ｃｈｉｐ  ａｎｄ  ＣｈＩＰ−ｓｅｑ  ｄａｔａｓｅｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １０６７，１０５−１２４．
Ｚｈｕ，Ｌ．Ｊ．，Ｇａｚｉｎ，Ｃ．，Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．，Ｐａｇｅｓ，Ｈ．，Ｌｉｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｌａｐｏｉｎｔｅ，Ｄ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．（２０１０）．ＣｈＩＰｐｅａｋＡｎｎｏ：ａ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｔｏ  ａｎｎｏｔａｔｅ  ＣｈＩＰ−ｓｅｑ  ａｎｄ  ＣｈＩＰ−ｃｈｉｐ  ｄａｔａ．ＢＭＣ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １１，２３７．
Ｚｕｂｅｒ，Ｊ．，Ｓｈｉ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｅ．，Ｒａｐｐａｐｏｒｔ，Ａ．Ｒ．，Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｈ．，Ｓｉｓｏｎ，Ｅ．Ａ．，Ｍａｇｏｏｎ，Ｄ．，Ｑｉ，Ｊ．，Ｂｌａｔｔ，Ｋ．，Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．ＲＮＡｉ  ｓｃｒｅｅｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  Ｂｒｄ４  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７８，５２４−５２８．
【図１Ａ】
2021525280.tif 000028
【図１Ｂ】
2021525280.tif 000029
【図１Ｃ】
2021525280.tif 000030
【図１Ｄ】
2021525280.tif 000031
【図１Ｅ】
2021525280.tif 000032
【図１Ｆ】
2021525280.tif 000033
【図２Ａ】
2021525280.tif 000034
【図２Ｂ】
2021525280.tif 000035
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
2021525280.tif 000038
【図２Ｆ】
2021525280.tif 000039
【図３Ａ】
2021525280.tif 000040
【図３Ｂ】
2021525280.tif 000041
【図３Ｃ】
2021525280.tif 000042
【図３Ｄ】
2021525280.tif 000043
【図３Ｅ】
2021525280.tif 000044
【図３Ｆ】
2021525280.tif 000045
【図４Ａ】
2021525280.tif 000046
【図４Ｂ】
2021525280.tif 000047
【図４Ｃ】
2021525280.tif 000048
【図４Ｄ】
2021525280.tif 000049
【図５Ａ】
2021525280.tif 000050
【図５Ｂ】
2021525280.tif 000051
【図５Ｃ】
2021525280.tif 000052
【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
2021525280.tif 000054
【図６Ｂ】
2021525280.tif 000055
【図７Ａ】
2021525280.tif 000056
【図７Ｂ】
2021525280.tif 000057
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2021525280.tif 000059
【図７Ｅ】
2021525280.tif 000060
【図７Ｆ】
2021525280.tif 000061
【図７Ｇ】
2021525280.tif 000062
【図７Ｈ】
2021525280.tif 000063
【図８Ａ】
2021525280.tif 000064
【図８Ｂ】
2021525280.tif 000065
【図８Ｃ】
2021525280.tif 000066
【図９Ａ】
2021525280.tif 000067
【図９Ｂ】
2021525280.tif 000068
【図９Ｃ】
2021525280.tif 000069
【図９Ｄ】
2021525280.tif 000070
【図１０Ａ】
2021525280.tif 000071
【図１０Ｂ】
2021525280.tif 000072
【図１０Ｃ】
2021525280.tif 000073
【図１０Ｄ】
2021525280.tif 000074
【図１０Ｅ】
2021525280.tif 000075
【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
2021525280.tif 000077
【図１１Ａ】
2021525280.tif 000078
【図１１Ｂ】
2021525280.tif 000079
【図１１Ｃ】
2021525280.tif 000080
【図１１Ｄ】
2021525280.tif 000081
【図１１Ｅ】
2021525280.tif 000082
【図１１Ｆ】
2021525280.tif 000083
【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
2021525280.tif 000085
【図１１Ｉ】
2021525280.tif 000086
【図１１Ｊ】
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【図１２Ａ】
2021525280.tif 000088
【図１２Ｂ】
2021525280.tif 000089
【図１３Ａ】
2021525280.tif 000090
【図１３Ｂ】
2021525280.tif 000091
【図１４】
2021525280.tif 000092
【図１５Ａ】
2021525280.tif 000093
【図１５Ｂ】
2021525280.tif 000094
【図１５Ｃ】
2021525280.tif 000095
【図１５Ｄ】
2021525280.tif 000096
【図１５Ｅ】
2021525280.tif 000097
【図１６Ａ】
2021525280.tif 000098
【図１６Ｂ】
2021525280.tif 000099
【図１６Ｃ】
2021525280.tif 000100
【図１６Ｄ】
2021525280.tif 000101
【配列表】
2021525280000001.app
【国際調査報告】
2021525280.tif 000102
2021525280.tif 000103
2021525280.tif 000104
2021525280.tif 000105