(57)【要約】  本発明は、細胞透過性物質が融合したアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体及びその用途に関するものである。具体的には、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体は、長鎖および短鎖リン脂質を含み、細胞透過性物質が融合したアプチドを捕集しつつ、特に長鎖および短鎖リン脂質が、特定のモル比で含まれる場合に、前記の脂質ナノ粒子複合体が円板状（discoid）構造を示す。また、前記脂質ナノ粒子複合体のアプチドとしてSTATタンパク質に対するアプチドが捕集されている場合、アプチドだけを処理した場合に比べて、細胞または皮膚細胞透過能に優れ、前記アプチドを真皮層まで伝達して副作用なしに乾癬治療効果を示し、TGF-βによって増加した線維化関連遺伝子の発現を抑制することにより、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体は、様々なアプチドの伝達体として有用に用いることができる。
2021529153.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞透過性物質が融合したアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体。
【請求項２】
前記脂質ナノ粒子複合体が、長鎖および短鎖リン脂質を含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子複合体。
【請求項３】
前記長鎖および短鎖リン脂質が、0.5〜7：1のモル比で含まれる、請求項２に記載の脂質ナノ粒子複合体。
【請求項４】
前記長鎖リン脂質が、
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dilauroyl-sn-glucero-3-phosphocholine, 12：0 PC, DLPC）、
1,2-ジトリデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-ditridecanoyl-sn-glycero-3-phophocholine, 13：0  PC）、
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 14：0  PC, DMPC）、
1,2-ジペンタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dipentadecanoyl-sn-glycero-3-phophocholine, 15：0 PC）、
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16：0 PC, DPPC）、
1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-ホスホコリン（1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 4ME 16：0 PC）、
1,2-ジヘプタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dihentadecanoyl-sn-glycero-3-phophocholine, 17：0 PC）、
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 18：0 PC, DSPC）、
1,2-ジノナデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phophocholine, 19：0 PC）、
1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-diarachidoyl-sn-glycero-phosphocholine, 20：0 PC）、
1,2-ジヘンアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dihenarachidoyl-sn-glycero-phosphocholine, 21：0 PC）、
1,2-ジベヘノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dibehenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 22：0 PC）、
1,2-ジトリコサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-ditricosanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 23：0 PC）、
1,2-ジリグノセロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dilignoceroyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 24：0 PC）、
1-パルミトイル-2-オレオイル-5,w-グリセロ-3-ホスホコリン（1-palmitoyl-2-oleoyl-5,w-glycero-3-phosphocholine, POPC）、および
1-パルミトイル-2-ステアロイル-5,w-グリセロ-3-ホスホコリン（1-palmitoyl-2-stearoyl-5,w-glycero-3-phosphocholine, PSPC）からなる群から選択されるいずれか一つ以上である、請求項２に記載の脂質ナノ粒子複合体。
【請求項５】
前記短鎖リン脂質が、
1,2-ジプロピオニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dipropionyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 3：0 PC）、
1,2-ジブチリル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dibutyryl-sn-glycero-3-phosphocholine, 4：0 PC）、
1,2-ジペンタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dipentanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 5：0 PC）、
1,2-ジヘキサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 6：0 PC, DHPC）、
1,2-ジヘプタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 7：0 PC, DHPC）および
1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dioctanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 8：0 PC）からなる群から選択されるいずれか一つ以上である、請求項２に記載の脂質ナノ粒子複合体。
【請求項６】
前記脂質ナノ粒子複合体が、円板形（discoid）である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子複合体。
【請求項７】
前記細胞透過性物質が、ペプチドおよび化合物からなる群から選択されるいずれか一つ以上である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子複合体。
【請求項８】
前記脂質ナノ粒子複合体が、10〜500nmの直径を有する、請求項１に記載の脂質ナノ粒子複合体。
【請求項９】
細胞透過性物質が融合したアプチドが、脂質ナノ粒子複合体の総重量に対して0.2〜30重量％で含まれる、請求項１に記載の脂質ナノ粒子複合体。
【請求項１０】
前記脂質ナノ粒子複合体が、水溶液中でコロイド安定性（colloidal stability）が1時間以上維持される、請求項１に記載の脂質ナノ粒子複合体。
【請求項１１】
請求項１に記載の脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含む炎症性皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含む炎症性皮膚疾患の予防または治療用皮膚外用剤。
【請求項１３】
請求項１に記載の脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含む炎症性皮膚疾患の予防または改善用化粧料組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含む線維化の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含む線維化の予防または改善用健康機能食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞透過性物質が融合したアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体及びその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、人体に無害で、薬物の開発期間が短い抗体が治療剤として多く開発されている。しかし、抗体は、体内で外来抗原として認識されてアレルギー反応または過敏反応のような副作用を起こしたりし、また、抗体を用いた治療剤は、生産単価が高いという問題がある。また、抗体のような標的型ペプチド薬物を用いた局所塗布製剤は、報告されていない。
【０００３】
したがって、このような問題を解決するために抗体の代替タンパク質の開発が開始された。抗体の代替タンパク質は、抗体のように不変領域と可変領域を有するように作製された組換えタンパク質でありサイズが小さく、安定である。抗体の代替タンパク質は、一定の部分をランダム配列のアミノ酸に置換して作製されたライブラリから標的物質に対する高い特異性および親和性を有するタンパク質を選別して作製する。これに関連し、韓国公開特許第10-2015-0118252号は、環状のβ-ヘアピン両末端にランダムにペプチドを融合させて、前記ペプチドがターゲット分子に結合することにより、その活性を示すことができる環状のβ-ヘアピン基盤ペプチドバインダーを開示している。
【０００４】
一方、STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）タンパク質は、様々な種類のサイトカインおよび成長因子の信号を核内に伝達する転写調節因子であり、生命維持に不可欠である。
【０００５】
特に、乾癬患者の角質細胞にSTAT3が過発現していて、STAT3が過発現した遺伝子組み換えマウスでは乾癬のような症状が発生し、STAT3タンパク質阻害剤が乾癬動物モデルで乾癬の症状を改善する効果があることが報告された。また、乾癬の病因に関連するTh17細胞の分化、増幅、および安定化だけでなく、活性化したTh17細胞からのIL-17分泌過程でSTAT3タンパク質が重要な転写因子であることが報告された。したがって、前記からSTAT3タンパク質が乾癬の病態生理に核心的に関与することが分かった。
【０００６】
乾癬は悪化と好転が繰り返される慢性炎症性皮膚疾患であり発症の原因がまだはっきりと明らかにされていないが、通常、体の免疫学的異常によって発生することが知られている。乾癬が最初に発症すると、皮膚に粟のような赤い色の発疹ができ、その上に白い角質（鱗屑）で覆わるようになり、このような発疹の大きさは、ひどい場合には、手のひらほどの大きさにまで拡大する。
【０００７】
乾癬は、人種、民族、地理的な位置などによって発症する頻度に違いが見られるが、全世界のどこでも見ることができる皮膚疾患であり、世界的に約3％の有病率を示す。韓国も同様の水準である人口比3％、約150万人内外の乾癬患者がいると推定され、有病率は着実に増加傾向にある。乾癬は、すべての年齢層で発症し得るが、20代に最も多く発症し、10代、30代の順で発病率が高い。
【０００８】
一般的な乾癬の治療方法としては、局所治療、全身治療および光治療などがあり、最近では乾癬の病因に基づいた免疫生物学製剤が開発された。その他にも乾癬の治療効果は高めながら副作用を減少させるために、前記のような治療方法を適切に併用する複合療法が多く用いられている。その中で、軟膏、ローション、ゲル形態のように、皮膚に直接塗る局所治療剤は、乾癬患者の必須治療剤として、乾癬の症状を調節するために、最初に、最も多く用いられる。特に、局所治療剤をうまく活用すれば軽い乾癬は、他の治療がなくてもよい効果を得ることができる。患者が消化器系疾患、腎臓疾患のような他の疾患がある場合は、経口薬よりも塗布用薬を用いることがより安全で有効である。局所治療剤としては、ビタミンD軟膏剤、ビタミンD配合剤であるゲル製剤、ステロイド軟膏剤、ビタミンA軟膏剤、タール製剤などが市販されている。これに関連して、韓国登録特許第10-1755407号は、1種以上のビタミンDまたはビタミンD類似体を含む第1薬理学的活性成分、1種以上のコルチコステロイドを含む第2薬理学的活性成分および非水性溶媒を含む乾癬治療のための皮膚外用剤組成物を開示している。
【０００９】
乾癬は、角質細胞と、様々な免疫細胞との間の非正常的に過活性化された相互作用によって発症することが知られている。様々な種類の内因性または外因性因子によって刺激を受けた角質細胞が過増殖および異常分化を起こし角質細胞の交換周期が短くなってその時に分泌されるDNA-LL37複合体、RNA-LL37複合体などが樹状細胞やマクロファージなどの様々な炎症性細胞の活性化を誘導する。活性化した樹状細胞やマクロファージは、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23、IL-36のような因子を分泌し、このように因子は連鎖的にT細胞の活性化を誘導する。特に、IL-1β、IL-6、IL-12およびIL-23は、乾癬の病因の核心であるTh17細胞への分化を誘導し、活性化したTh17細胞から分泌されるIL-17によって再び角質細胞が刺激される悪循環が繰り返される。
【００１０】
一方、線維化（fibrosis）は、何らかの理由で、臓器の一部が固まる現象を意味し、腎臓線維化、肺線維化、肝線維化などが代表的に知られている。腎臓の線維化は糸球体腎炎、間質性腎炎、糖尿病性腎症などの疾患の有病期間が長期化して誘発され、末期腎疾患の患者は、透析や腎臓移植を介してのみ、これを治療することができる。また、肝臓の線維化は、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、脂肪肝炎の有病期間が長期化して誘発され、肝線維化が進行した肝臓は、肝機能不全や肝がんの発症率が増加する。さらに、肺線維化は、遺伝的または環境的要因によって発生し、肺線維化が進行すると、ほとんどの期待寿命が3年未満であり、肺移植によってのみ、これを治療することができる。
【００１１】
このように、様々な臓器に発生可能な線維化は、線維芽細胞が非正常的に活性化され、細胞外基質（extracellular matrix）であるコラーゲン1a1（Col1a1）、αSMA（α-smooth muscle actin）、フィブロネクチン（fibronectin）などを分泌することにより進行する。また、TGF-βシグナル伝達機序は線維化の進行過程で最もよく知られている機序の一つである。
【００１２】
そこで、本発明者らはSTAT3タンパク質に対するアプチドを安定的かつ経済的に伝達することができる伝達体を開発するために努力していた中、細胞透過性物質であるノナアルギニンまたはコリンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドを捕集する脂質ナノ粒子複合体を作製し、前記ナノ粒子複合体が、皮膚透過能および皮膚細胞透過能があり、乾癬の動物モデルで乾癬による炎症を改善するのみならず、線維芽細胞株でTGF-βによって誘導される線維化関連遺伝子の発現を抑制することを確認することで、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】韓国公開特許 第10-2015-0118252号
【特許文献２】韓国登録特許 第10-1755407号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、細胞透過性物質が融合したアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体および、前記脂質ナノ粒子複合体の用途を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は、細胞透過性物質が融合したアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体を提供する。
【００１６】
また、本発明は、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含む炎症性皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
また、本発明は、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含む炎症性皮膚疾患の予防または治療用皮膚外用剤を提供する。
【００１８】
また、本発明は、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含む炎症性皮膚疾患の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
【００１９】
また、本発明は、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含む線維化の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００２０】
さらに、本発明は、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含む線維化の予防または改善用健康機能食品を提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係る脂質ナノ粒子複合体は、長鎖および短鎖リン脂質を含み、細胞透過性物質が融合したアプチドを捕集しつつ、特に長鎖および短鎖リン脂質が、特定のモル比で含まれる場合に、前記の脂質ナノ粒子複合体が円板状（discoid）構造を示す。また、前記脂質ナノ粒子複合体のアプチドとしてSTATタンパク質に対するアプチドが捕集される場合、アプチドだけを処理した場合に比べて、細胞または皮膚細胞透過能に優れ、前記アプチドを真皮層まで伝達して副作用なしに乾癬治療効果を示し、TGF-βによって増加した線維化関連遺伝子の発現を抑制することにより、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体は、様々なアプチドの伝達体として有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集されたり捕集されていない脂質ナノ粒子複合体のナノ粒子複合体を構成するDMPCおよびDHPCの混合モル比による構造を透過電子顕微鏡で観察した結果図である。
【図２】図2a及び図2bは、本発明の一実施例で作製したコール酸が融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体（図2a）とノナアルギニンが融合したVEGFタンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体（図2b）の構造を透過電子顕微鏡で観察した結果図である。
【図３】本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集されたり捕集されていない脂質ナノ粒子複合体のナノ粒子複合体を構成するDMPCおよびDHPCの混合モル比による流体力学的直径を確認した結果のグラフである。
【図４】本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集されたり捕集されていない脂質ナノ粒子複合体のナノ粒子複合体を構成するDMPCおよびDHPCの混合モル比による流体力学的直径を確認した結果のグラフである。
【図５】本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集されたり捕集されていない脂質ナノ粒子複合体の表面電荷を確認した結果を示すグラフである。
【図６】乾癬の動物モデルで、本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体（[FITC-APT]-LNCs）がノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチド融合体（FITC-APT）とは異なり、皮膚透過能があることを塗布1、6、または12時間後に共焦点顕微鏡で確認した結果図である。
【図７】通常の動物モデルで、本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体（[FITC-APT]-LNCs）がノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチド融合体（FITC-APT）とは異なり、皮膚透過能があることを２光子顕微鏡で確認した結果図である。
【図８】乾癬の動物モデルで、本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体（[FITC-APT]-LNCs）がノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチド融合体（FITC-APT）とは異なり、皮膚透過能があることを皮膚表皮から6、12、18、24、30、36、および42μmの深さで２光子顕微鏡で確認した結果図である。
【図９】乾癬の動物モデルで、本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体（[FITC-APT]-LNCs）がノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチド融合体（FITC-APT）とは異なり、皮膚透過能があることを皮膚断面で確認した結果図である。
【図１０】乾癬の動物モデルで、本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体（[FITC-APT]-LNCs）とノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチド融合体（FITC-APT）から測定された蛍光シグナルの相対的な強さによって透過した深さを定量的に示したグラフである。
【図１１】本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体（[FITC-APT]-LNCs）の処理濃度による皮膚細胞透過能を確認した結果図である。
【図１２】本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体（[FITC-APT]-LNCs）の処理時間による皮膚細胞透過能を確認した結果図である。
【図１３】本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体が、HaCaTおよびNIH3T3細胞を透過して細胞質内に位置したことを確認した結果図である。
【図１４】本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体を用いて、乾癬の動物モデルで炎症効果を確認するための実験日程を示した模式図である。
【図１５】図15a〜図15cは、乾癬の動物モデルで、本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体による耳の厚さ（図15a）、PASIスコア（図15b）および耳のパンチ生検重量（図15c）の変化を確認した結果のグラフである（Control：ワセリン塗布群、IMQ + DW：IMQおよびDW塗布群、IMQ + LNCs：IMQおよび比較例3のナノ粒子複合体塗布群、IMQ + [FITC-APT]-LNCs：IMQ及び実施例3のナノ粒子複合体塗布群、IMQ + CLQ：IMQおよびCLQ塗布群）。
【図１６】乾癬の動物モデルにおいて、本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体による乾癬の治療効果を撮影した写真（Gross）およびH＆E染色の結果（H＆E）を示した図である（IMQ：IMQ塗布群、Control：ワセリン塗布群、DW：DW塗布群、LNCs：比較例3のナノ粒子複合体塗布群、[APTstat3-9R]-LNCs：実施例3のナノ粒子複合体塗布群、CLQ：CLQ塗布群）。
【図１７】図17a及び図17bは、乾癬動物モデルにおいて、本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体が表皮の厚さ（図17a; IMQ：IMQ塗布群、Ctrl：ワセリン塗布群、DW：DW塗布群、LNCs：比較例3のナノ粒子複合体塗布群、[APT]-LNCs：実施例3のナノ粒子複合体塗布群、CLQ：CLQ塗布群）および、組織内のサイトカイン生成（図17b; Control：ワセリン塗布群、IMQ + DW：IMQおよびDW塗布群、IMQ + LNCs：IMQおよび比較例3のナノ粒子複合体塗布群、IMQ + [APT]-LNCs：IMQ及び実施例3のナノ粒子複合体塗布群、IMQ + CLQ：IMQとCLQ塗布群）の変化を確認した結果のグラフである。
【図１８】図18a及び図18bは、乾癬動物モデルで、本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体が脾臓の大きさ（図18a）および重量（図18b）には影響を及ぼさないことを確認した結果の図である（Control：ワセリン塗布群、IMQ + DW：IMQおよびDW塗布群、IMQ + LNCs：IMQおよび比較例3のナノ粒子複合体塗布群、IMQ + [FITC-APT]-LNCs：IMQ及び実施例3のナノ粒子複合体塗布群、IMQ + CLQ：IMQとCLQ塗布群）。
【図１９】線維芽細胞株でTGF-βによって増加したCol1a1またはαSMA遺伝子の発現が、本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体によって抑制されること、リアルタイムPCRで確認した結果のグラフである。
【図２０】図20a及び図20bは、本発明の一実施例で作製したノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体が、作製後にも凝集体が形成されず（図20a）、約30nmの円板状を維持すること（図20b）を確認した結果図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明は、本発明は、細胞透過性物質が融合したアプチドが捕集された脂質ナノ粒子複合体を提供する。
【００２５】
本明細書で使用する用語、「アプチド（aptide）」は、標的に対する親和度は維持しながら、安定性が改善されたアプタマー類似ペプチド（aptamer-like peptide）を意味する。前記アプチドは、環状のβ-ヘアピンベースのペプチドバインダーで構成されたスキャフォールドと前記スキャフォールドの両末端に、n個のアミノ酸が含まれる構成で、これは、特定の生物学的標的と結合することができる。アプチドは、さまざまなライブラリの構築が可能な標的結合部位（target-binding region）を含むことができる。前記アプチドはL-アミノ酸およびD-アミノ酸からなる群から選択されるいずれか一つ以上のアミノ酸で構成され得る。前記用語、「安定性」は、アプチドの物理的、化学的、および生物学的安定性を含むことができ、具体的には、生物学的安定性を意味することができる。つまり、生物学的に安定なアプチドは、生体内でのタンパク質分解酵素の作用に対する耐性を有することができる。
【００２６】
本発明に係るアプチドは、STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）タンパク質に特異的に結合するアプチドであり得、具体的に配列番号2で記載されるアミノ酸配列で構成され得る。前記STAT3タンパク質に対するアプチドは、約5kDaのサイズで安定的であり、STAT3タンパク質に対して200nMの高い親和度で結合することができる。前記STAT3タンパク質に対するアプチドは、STAT3タンパク質のSH2ドメインに結合してリン酸化を抑制することにより、STAT3タンパク質の活性化を抑制することができる。このような機序は、JAK阻害機序を利用して、STAT3タンパク質の活性化を抑制する従来のJAK阻害剤に比べて不正確な標的への影響が少ないことがあり得る。
【００２７】
前記アプチドは、本発明によるアプチドの構造および活性に影響を及ぼさない範囲内でアミノ酸残基の欠失、挿入、置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有するアプチドの変異体または断片であり得る。分子の活性を全体的に変更させないタンパク質またはペプチドでのアミノ酸交換は、通常の技術分野に公知されている。場合によっては、リン酸化、硫化、アクリル化、糖化、メチル化、ファルネシル化などで修飾することができる。前記アプチドは、配列番号2に記載されているアミノ酸配列と70、80、85、90、95または98％の相同性を有することができる。
【００２８】
本発明に係る脂質ナノ粒子複合体は、リン脂質で構成することができる。前記用語、「リン脂質（phospholipid）」は、複合脂質の一種でリン酸エステル及びリン酸エステルを有する脂質の総称を意味する。前記リン脂質は、ホスファチジルコリン（phosphatidylcoline）で構成された親水性部分および脂肪酸で構成された疎水性部分を含むことができ、疎水性部分である脂肪酸の長さによって、長鎖および短鎖リン脂質に区別することができる。前記脂質ナノ粒子複合体は、長鎖および短鎖リン脂質を含むことができ、具体的に、前記長鎖および短鎖リン脂質は、0.5〜7：1、0.5〜5：1、0.5〜4：1、1〜7：1、1 〜5：1、1〜4：1、2〜7：1、2〜5：1または2〜4：1のモル比で含むことができる。前記脂質ナノ粒子複合体は、直径が10〜500nm、10〜450nm、10〜400nm、20〜400nm、30〜350nm、40〜300nm、50〜250nm、60nm〜200nm、100〜 200nm、150〜250nm、200〜300nm、250〜350nm、300〜400nm、350〜450nm、400〜500nm、10〜350nm、10〜300nm、10〜250nm、10〜200nm、10〜150nm、10〜100nm、15〜100nm、20〜100nm、10〜80nm、15〜80nm、20〜80nm、10〜60nm、15〜60nm、20〜60nm、10〜50nm、15〜50nm、20〜50nm、10〜40nm、15〜40nm、20〜40nm、10〜35nm、15〜35nmまたは20〜35nmであり得る。
【００２９】
また、前記長鎖および短鎖リン脂質は、通常の技術者が適切に選択して適用することができ、通常の技術分野に知られている長鎖または短鎖リン脂質をすべて含むことができる。前記長鎖および短鎖リン脂質変形されたものであり得、具体的にPEG（polyethylene glycol）が標識されたものであり得る。前記PEGは、通常の技術分野に知られているすべてのPEGを含むことができ、これは具体的にPEG500、PEG2000などであり得る。また、前記長鎖および短鎖リン脂質は、蛍光物質が標識されたものであり得る。前記蛍光物質は、通常の技術分野に知られているすべての蛍光物質を含むことができ、具体的にPE（phycoerythrin）およびFITC（fluorescein isothiocyanate）を含むことができる。さらに、本発明に係る長鎖および短鎖リン脂質は、ガドリニウム（gadolinium）が標識されたものであり得る。ガドリニウムで標識された本発明の脂質ナノ粒子複合体は、MRI造影剤として用いることができる。
【００３０】
前記長鎖リン脂質は、
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dilauroyl-sn-glucero-3-phosphocholine, 12：0 PC, DLPC）、
1,2-ジトリデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-ditridecanoyl-sn-glycero-3-phophocholine, 13：0  PC）、
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 14：0  PC, DMPC）、
1,2-ジペンタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dipentadecanoyl-sn-glycero-3-phophocholine, 15：0 PC）、
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16：0 PC, DPPC）、
1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-ホスホコリン（1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 4ME 16：0 PC）、
1,2-ジヘプタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dihentadecanoyl-sn-glycero-3-phophocholine, 17：0 PC）、
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 18：0 PC, DSPC）、
1,2-ジノナデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phophocholine, 19：0 PC）、
1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-diarachidoyl-sn-glycero-phosphocholine, 20：0 PC）、
1,2-ジヘンアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dihenarachidoyl-sn-glycero-phosphocholine, 21：0 PC）、
1,2-ジベヘノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dibehenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 22：0 PC）、
1,2-ジトリコサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-ditricosanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 23：0 PC）、
1,2-ジリグノセロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dilignoceroyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 24：0 PC）、
1-パルミトイル-2-オレオイル-5,w-グリセロ-3-ホスホコリン（1-palmitoyl-2-oleoyl-5,w-glycero-3-phosphocholine, POPC）、
および1-パルミトイル-2-ステアロイル-5,w-グリセロ-3-ホスホコリン（1-palmitoyl-2-stearoyl-5,w-glycero-3-phosphocholine, PSPC）からなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。一方、前記短鎖リン脂質は、
1,2-ジプロピオニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dipropionyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 3：0 PC）、
1,2-ジブチリル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dibutyryl-sn-glycero-3-phosphocholine, 4：0 PC）、
1,2-ジペンタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dipentanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 5：0 PC）、
1,2-ジヘキサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 6：0 PC, DHPC）、
1,2-ジヘプタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 7：0 PC, DHPC）および
1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（1,2-dioctanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 8：0 PC）からなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。
【００３１】
本発明に係る脂質ナノ粒子複合体は、円板状構造を示すことができる。前記円板状構造を有する脂質ナノ粒子複合体は、皮膚を構成する角質細胞間の狭い間隔を通過することができ、細胞層および細胞層間の移動が球形の粒子よりも速いという利点を有することができる。また、前記円板状構造を有する脂質ナノ粒子複合体は、表面グリップ（adhesiveness）に優れ、皮膚の角質層内の脂質の流動性を増加させることで皮膚内浸透速度を加速させることができる。
【００３２】
前記細胞透過性物質は、細胞を透過するもので、通常の技術分野で知られている物質であれば、すべて含むことができる。一例として、前記細胞透過性物質は、ペプチドおよび化合物からなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。前記細胞透過性物質が融合したアプチドは、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体の総重量に対して0.2〜30重量％、1〜30重量％、5〜30重量％、0.2〜25重量％、1〜25重量％、5〜25重量％、0.2〜20重量％、1〜20重量％、5〜20重量％、0.2〜15重量％、1〜15重量％、または5〜15重量％で含むことができる。
【００３３】
具体的には、前記ペプチドは、ポリアルギニン、Tat、SPACE（skin penetration and cell entering peptide）、TD-1（transdermal peptide-1）、DLP（dermis localizing peptide）、およびLP-12（linear peptide-12 mer）からなる群から選択されるされるいずれか一つ以上のペプチドであり得る。例えば、前記のポリアルギニンは、配列番号3で記載されるアミノ酸配列で構成されるペプチドであり得、Tatは配列番号4で記載されるアミノ酸配列で構成されているペプチドであり得、SPACEは、配列番号5で記載されるアミノ酸配列で構成されるペプチドであり得、TD-1は、配列番号6で記載されるアミノ酸配列で構成されるペプチドであり得、DLPは配列番号7で記載されるアミノ酸配列で構成されるペプチドであり得、LP-12は、配列番号8で記載されるアミノ酸配列で構成されるペプチドであり得る。一方、前記化合物は、コール酸（cholic acid）、オレイン酸（oleic acid）、およびこれらの誘導体からなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。前記化合物は、細胞透過能を維持する限り、通常の技術者によって適切に変形することができる。
【００３４】
本発明の具体的な実施例で、本発明者らは、長鎖および短鎖リン脂質を1：1、2：1または3：1のモル比で含むナノ粒子複合体を薄膜水和方法で作製した。具体的には、前記長鎖リン脂質としてはDMPCを、短鎖リン脂質としてはDHPCを用い、DMPCおよびDHPCの混合物をノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドを含む溶液を用いて水和させることで、細胞透過性ペプチドが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドを捕集する脂質ナノ粒子複合体を作製した。
【００３５】
前記作製されたナノ粒子複合体の粒子サイズおよびゼータ電位を確認して、ナノ粒子複合体に用いた長鎖および短鎖リン脂質のモル比が増加するほど、ナノ粒子複合体が円板状を示し、特に長鎖および短鎖リン脂質が3：1のモル比で含まれたナノ粒子複合体が明確な円板状構造を示すことを確認した（図1参照）。また、前記ナノ粒子複合体を透過電子顕微鏡下で確認した平均直径および厚さは、それぞれ31.3±6.8nmおよび7.7±1.4nmであり、流体力学的直径は、約20〜30nmで（図3及び4参照）、その表面が正電荷を帯びることを確認した（図5参照）。さらに、細胞透過性ペプチドの代わりにコール酸を利用したり、STAT3タンパク質に対するアプチド代わりにVEGFタンパク質に対するアプチドを用いて作製した場合でも、約30nm直径の安定的な円板状ナノ粒子複合体を形成した（図2aおよび図2bを参照）。
【００３６】
また、前記脂質ナノ粒子複合体は、作製後も長時間凝集体を形成せずに、均一な大きさの安定した円板状ナノ粒子複合体を維持した（図20aおよび図20bを参照）。
【００３７】
したがって、前記から、本発明者らは、細胞透過性物質が融合したアプチドを含む円板状の脂質ナノ粒子複合体を作製したことを知ることができた。
【００３８】
また、本発明は、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含む炎症性皮膚疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００３９】
本発明に係る薬学的組成物は、上述したような脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含むことができる。一例として、前記脂質ナノ粒子複合体は、細胞透過性物質が融合したアプチドであり得、具体的に前記アプチドはSTAT3タンパク質に特異的に結合するアプチドであり得る。ここで、STAT3タンパク質に特異的に結合するアプチドは、本発明に係る薬学的組成物で生理活性を示す物質であり得る。一方、前記細胞透過性物質は、通常の技術分野で細胞を透過することが知られているすべての物質を含むことができる。
【００４０】
また、前記脂質ナノ粒子複合体は、長鎖および短鎖リン脂質を含むことができ、具体的に前記長鎖および短鎖リン脂質は、0.5〜7：1、0.5〜5：1、0.5〜4：1、1〜7：1、1〜5：1、1〜4：1、2〜7：1、2〜5：1または2〜4：1のモル比で含むことができる。前記長鎖および短鎖リン脂質は、通常の技術者であれば、適切に選択して適用することができる。具体的には、前記長鎖リン脂質は、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジトリデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジペンタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-ホスホコリン、1,2-ジヘプタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジノナデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジヘンアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジベヘノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジトリコサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジリグノセロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-パルミトイル-2-オレオイル-5,w-グリセロ-3-ホスホコリンおよび1-パルミトイル-2-ステアロイル-5,w-グリセロ-3-ホスホコリンからなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。一方、前記短鎖リン脂質は、1,2-ジプロピオニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジブチリル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジペンタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジヘキサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジヘプタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンおよび1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンからなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。
【００４１】
本発明の具体的な実施例では、本発明者らはノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドを捕集する脂質ナノ粒子複合体を作製し、前記複合体を皮膚に塗布したとき、皮膚を透過して真皮層まで生理活性物質であるアプチドを伝達することを共焦点顕微鏡（図6参照）および２光子顕微鏡（図7〜10参照）を用いて確認した。
【００４２】
また、前記脂質ナノ粒子複合体は、処理濃度および処理時間によって、皮膚細胞透過能が増加し（図11及び12を参照）、細胞に処理された脂質ナノ粒子複合体は、細胞質に位置することを確認した（図13参照） 。
【００４３】
さらに、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を、乾癬が誘発された動物モデルの皮膚に塗布したとき、耳の厚さ、PSAIスコアおよび耳パンチ生検重量が有意に減少し（図15a〜図15cを参照）。肉眼観察やH＆E染色の結果も前記の結果と同様に脂質ナノ粒子複合体を処理した動物モデルで乾癬が改善されたことを確認した（図16参照）。また、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を塗布した動物モデルは、表皮の過形成および炎症細胞の浸潤が改善され、（図17a参照）、乾癬に関連するサイトカインであるIL-17、IL-12/23p40およびIL-1βの生成が有意に減少した（図17b参照）。一方、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を塗布した動物モデルは、脾臓の大きさおよび重量が増加したが、CLQを塗布した動物モデルは、脾臓が萎縮したことから、全身の免疫システムに影響を与えたように見えた（図18a〜図18bを参照）。
【００４４】
したがって、前記から、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体は、全身の副作用なしに炎症性皮膚疾患を予防または治療するのに有用に用いることができる。
【００４５】
本発明に係る薬学的組成物は、組成物全体の重量に対して有効成分である脂質ナノ粒子複合体を10〜95重量％で含むことができる。また、本発明の薬学的組成物は、前記の有効成分に加えて、追加で同一または類似の機能を示す有効成分を1種以上さらに含むことができる。
【００４６】
本発明の薬学的組成物は、生物学的製剤に通常使用される担体、希釈剤、賦形剤、またはそれらの混合物を含むことができる。薬学的に許容可能な担体は、組成物を生体内に伝達するのに適したものであればすべて用いることができる。具体的には、前記担体は、Merck Index, 13th ed., Merck＆Co. Inc.に記載された化合物、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールまたはそれらの混合物であり得る。また、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など、通常の添加剤を添加することができる。
【００４７】
前記組成物を製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を添加することができる。
【００４８】
本発明の組成物は、経口用製剤または非経口製剤に製剤化することができる。経口用製剤としては、固形製剤及び液状製剤を含むことができる。前記固形製剤は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤またはトローチ剤であり得、このような固形製剤は、前記組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤を添加して調製することができる。前記賦形剤は、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチン、またはそれらの混合物であり得る。また、前記固形製剤は、潤滑剤を含むことができ、その例としては、マグネシウムスティレート、タルクなどがある。一方、前記液状製剤は、懸濁剤、内用液剤、乳剤またはシロップ剤であり得る。ここで、前記液状製剤には、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などの賦形剤を含むことができる。
【００４９】
前記非経口製剤は、注射剤、坐剤、呼吸器吸入用粉末、スプレー用エアゾール剤、パウダーおよびクリームなどを含むことができる。前記注射剤は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁溶剤、乳剤などを含むことができる。ここで、非水性溶剤または懸濁溶剤としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油や、オレイン酸エチルのよう注射可能なエステルなどを用いることができる。
【００５０】
本発明の組成物は、所望の方法に応じて、経口または非経口投与することができる。非経口投与は、腹腔内、直腸内、皮下、静脈、筋肉内、または胸部内注射の方法を含むことができる。
【００５１】
前記組成物は、薬剤学的に有効な量で投与することができる。これは疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する患者の敏感度、投与時間、投与経路、治療期間、同時に使用される薬物などによって異なり得る。しかし、好ましい効果のために、本発明に係る薬学的組成物に含まれる有効成分の量は、前記薬学的組成物を塗布する場合には、1〜100μg/cm2、具体的に10〜50μg/cm2であり得、投与する場合には、0.1〜100mg/kg、具体的に1〜10mg/kgであり得、吸入する場合には、1〜1,000μg、具体的に10〜100μgであり得る。本発明の組成物は、単独または他の治療薬と併用して投与することができる。併用投与時、投与は、順次にまたは同時であり得る。
【００５２】
また、本発明は、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含む炎症性皮膚疾患の予防または治療用皮膚外用剤を提供する。
【００５３】
本発明に係る皮膚外用剤は、上述したような脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含むことができる。一例として、前記脂質ナノ粒子複合体は、細胞透過性物質が融合したアプチドであり得、具体的に前記アプチドはSTAT3タンパク質に特異的に結合するアプチドであり得る。ここで、STAT3タンパク質に特異的に結合するアプチドは、本発明に係る皮膚外用剤で生理活性を示す物質であり得る。一方、前記細胞透過性物質は、通常の技術分野で細胞を透過することが知られているすべての物質を含むことができる。
【００５４】
また、前記脂質ナノ粒子複合体は、長鎖および短鎖リン脂質を含むことができ、具体的に前記長鎖および短鎖リン脂質は、0.5〜7：1、0.5〜5：1、0.5〜4：1、1〜7：1、1〜5：1、1〜4：1、2〜7：1、2〜5：1または2〜4：1のモル比で含むことができる。前記長鎖および短鎖リン脂質は、通常の技術者であれば、適切に選択して適用することができる。具体的には、前記長鎖リン脂質は、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジトリデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジペンタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-ホスホコリン、1,2-ジヘプタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジノナデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジヘンアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジベヘノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジトリコサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジリグノセロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-パルミトイル-2-オレオイル-5,w-グリセロ-3-ホスホコリンと1-パルミトイル-2-ステアロイル-5,w-グリセロ-3-ホスホコリンからなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。一方、前記短鎖リン脂質は、1,2-ジプロピオニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジブチリル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジペンタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジヘキサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジヘプタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンと1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンからなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。
【００５５】
本発明の具体的な実施例では、本発明者らはノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドを捕集する脂質ナノ粒子複合体を作製し、前記複合体を皮膚に塗布したとき、皮膚を透過して真皮層まで生理活性物質であるアプチドを伝達することを共焦点顕微鏡（図6参照）および２光子顕微鏡（図7〜10参照）を用いて確認した。
【００５６】
また、前記脂質ナノ粒子複合体は、処理濃度と処理時間によって皮膚細胞透過能が増加し（図11及び12を参照）、細胞に処理された脂質ナノ粒子複合体は、細胞質に位置することを確認した（図13参照）。
【００５７】
さらに、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を、乾癬が誘発された動物モデルの皮膚に塗布したとき、耳の厚さ、PSAIスコアおよび耳パンチ生検重量が有意に減少し（図15a〜図15cを参照）。肉眼観察やH＆E染色の結果も前記の結果と同様に脂質ナノ粒子複合体を処理した動物モデルで乾癬が改善されたことを確認した（図16参照）。また、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を塗布した動物モデルは、表皮の過形成および炎症細胞の浸潤が改善され、（図17a参照）、乾癬に関連するサイトカインであるIL-17、IL-12 / 23p40およびIL-1βの生成が有意に減少した（図17b参照）。一方、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を塗布した動物モデルは、脾臓の大きさおよび重量が増加したが、CLQを塗布した動物モデルは、脾臓が萎縮したことから、全身の免疫システムに影響を与えたように見えた（図18a及び図18bを参照）。
【００５８】
したがって、前記から、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体は、全身の副作用なしに皮膚に塗布して炎症性皮膚疾患を予防または治療するのに有用に用いることができる。
【００５９】
本発明の皮膚外用剤は、薬学的に許容可能な担体および賦形剤を含むことができる。前記担体および賦形剤は、防腐剤、安定化剤、水和剤、乳化促進剤および緩衝剤などを含むことができる。具体的には、前記賦形剤は、乳糖、デキストリン、澱粉、マンニトール、ソルビトール、グルコース、サッカロース、微結晶セルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドンまたはそれらの混合物であり得る。前記皮膚外用剤は、当業界でよく知られている方法によって適切に製造することができる。前記皮膚外用剤は、パウダー、ジェル、軟膏、クリーム、液体、エアロゾルの形態で製造することができる。
【００６０】
また、本発明は、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含む炎症性皮膚疾患の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
【００６１】
本発明に係る化粧料組成物は、上述したような脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含むことができる。一例として、前記脂質ナノ粒子複合体は、細胞透過性物質が融合したアプチドであり得、具体的に前記アプチドはSTAT3タンパク質に特異的に結合するアプチドであり得る。ここで、STAT3タンパク質に特異的に結合するアプチドは、本発明に係る化粧料組成物で生理活性を示す物質であり得る。一方、前記細胞透過性物質は、通常の技術分野で細胞を透過することが知られているすべての物質を含むことができる。
【００６２】
また、前記脂質ナノ粒子複合体は、長鎖および短鎖リン脂質を含むことができ、具体的に前記長鎖および短鎖リン脂質は、0.5〜7：1、0.5〜5：1、0.5〜4：1、1〜7：1、1〜5：1、1〜4：1、2〜7：1、2〜5：1または2〜4：1のモル比で含むことができる。前記長鎖および短鎖リン脂質は、通常の技術者であれば、適切に選択して適用することができる。具体的には、前記長鎖リン脂質は、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジトリデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジペンタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-ホスホコリン、1,2-ジヘプタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジノナデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジヘンアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジベヘノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジトリコサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジリグノセロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-パルミトイル-2-オレオイル-5,w-グリセロ-3-ホスホコリンと1-パルミトイル-2-ステアロイル-5,w-グリセロ-3-ホスホコリンからなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。一方、前記短鎖リン脂質は、1,2-ジプロピオニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジブチリル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジペンタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジヘキサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジヘプタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンと1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンからなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。
【００６３】
本発明の具体的な実施例では、本発明者らはノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドを捕集する脂質ナノ粒子複合体を作製し、前記複合体を皮膚に塗布したとき、皮膚を透過して真皮層まで生理活性物質であるアプチドを伝達することを共焦点顕微鏡（図6参照）および２光子顕微鏡（図7〜10参照）を用いて確認した。
【００６４】
また、前記脂質ナノ粒子複合体は、処理濃度および処理時間によって皮膚細胞透過能が増加し（図11及び12を参照）、細胞に処理された脂質ナノ粒子複合体は、細胞質に位置することを確認した（図13参照） 。
【００６５】
さらに、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を、乾癬が誘発された動物モデルの皮膚に塗布したとき、耳の厚さ、PSAIスコアおよび耳パンチ生検重量が有意に減少し（図15a〜図15cを参照）。肉眼観察やH＆E染色の結果も前記の結果と同様に脂質ナノ粒子複合体を処理した動物モデルで乾癬が改善されたことを確認した（図16参照）。また、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を塗布した動物モデルは、表皮の過形成および炎症細胞の浸潤が改善され、（図17a参照）、乾癬に関連するサイトカインであるIL-17、IL-12 / 23p40およびIL-1βの生成が有意に減少した（図17b参照）。一方、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を塗布した動物モデルは、脾臓の大きさおよび重量が増加したが、CLQを塗布した動物モデルは、脾臓が萎縮したことから、全身の免疫システムに影響を与えたように見えた（図18a及び図18bを参照）。
【００６６】
したがって、前記から、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体は、全身の副作用なしに皮膚に塗布して炎症性皮膚疾患を予防または改善するのに有用に用いることができる。
【００６７】
本発明の化粧料組成物は、前記の脂質ナノ粒子複合体を0.1〜50重量％、具体的に1〜10重量％で含むことができる。前記化粧料組成物は、乾癬の改善を目的として、皮膚に直接塗布することができる。
【００６８】
化粧料組成物は、一般的に製造される化粧料剤形で製剤化することができる。前記化粧料組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、ローション、クリーム、パウダー、石鹸、界面活性剤-含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤形化することができる。具体的には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーであり得る。
【００６９】
本発明の化粧料組成物の剤形がペースト、クリームまたはゲルの場合には、担体として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛、またはそれらの混合物を含むことができる。また、前記化粧料組成物の剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、ポリアミドパウダー、またはそれらの混合物を含むことができる。特に、スプレーの場合には、さらにクロロフルオロハイドロカーボン、プロパン/ブタンまたはジメチルエーテルなどをさらに含むことができる。
【００７０】
本発明の化粧料組成物の剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体として、溶媒、溶媒化剤、乳濁剤またはそれらの混合物を含むことができる。その例としては、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、1,3-ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステルなどがある。
【００７１】
本発明の化粧料組成物の剤形が懸濁液である場合には、担体として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー、トラガカントまたはそれらの混合物を含むことができる。また、前記化粧料組成物の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体として脂肪族アルコール硫酸、脂肪族アルコールエーテル硫酸、スルホンコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルファート、アルカリアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、エトキシ化グリセロール脂肪酸エステル、またはそれらの混合物を含むことができる。
【００７２】
本発明の化粧料組成物は、担体成分に加えて、補助剤として抗酸化剤、安定化剤、溶解剤、保湿剤、顔料、香料、紫外線遮断剤、発色剤、界面活性剤またはそれらの混合物を含むことができる。前記補助剤は、化粧料組成物の製造に通常使用される物質であれば、すべて使用可能である。
【００７３】
また、本発明は、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含む線維化の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００７４】
本発明に係る薬学的組成物は、上述したような脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含むことができる。一例として、前記脂質ナノ粒子複合体は、細胞透過性物質が融合したアプチドであり得、具体的に前記アプチドは、STAT3タンパク質に特異的に結合するアプチドであり得る。ここで、STAT3タンパク質に特異的に結合するアプチドは、本発明に係る薬学的組成物で生理活性を示す物質であり得る。一方、前記細胞透過性物質は、通常の技術分野で細胞を透過することが知られているすべての物質を含むことができる。
【００７５】
また、前記脂質ナノ粒子複合体は、長鎖および短鎖リン脂質を含むことができ、具体的に前記長鎖および短鎖リン脂質は、0.5〜7：1、0.5〜5：1、0.5〜4：1、1〜7：1、1〜5：1、1〜4：1、2〜7：1、2〜5：1または2〜4：1のモル比で含むことができる。前記長鎖および短鎖リン脂質は、通常の技術者であれば、適切に選択して適用することができる。具体的には、前記長鎖リン脂質は、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジトリデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジペンタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-ホスホコリン、1,2-ジヘプタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジノナデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジヘンアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジベヘノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジトリコサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジリグノセロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-パルミトイル-2-オレオイル-5,w-グリセロ-3-ホスホコリンおよび1-パルミトイル-2-ステアロイル-5,w-グリセロ-3-ホスホコリンからなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。一方、前記短鎖リン脂質は、1,2-ジプロピオニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジブチリル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジペンタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジヘキサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジヘプタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンおよび1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンからなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。
【００７６】
本発明に係る薬学的組成物は、上述したような剤形、投与量、投与方法などを含むことができる。
【００７７】
本発明の具体的な実施例では、本発明者らはノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドを捕集する脂質ナノ粒子複合体を作製し、前記脂質ナノ粒子複合体がTGF-βによって増加した線維化関連遺伝子の発現を抑制することを確認した（図19参照）。
【００７８】
したがって、前記から、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体は、全身に副作用なしに線維化を予防または治療することに有用に用いることができる。
【００７９】
さらに、本発明は、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含む線維化の予防または改善用健康機能食品を提供する。
【００８０】
本発明に係る健康機能食品は、上述したような脂質ナノ粒子複合体を有効成分として含むことができる。一例として、前記脂質ナノ粒子複合体は、細胞透過性物質が融合したアプチドであり得、具体的に前記アプチドは、STAT3タンパク質に特異的に結合するアプチドであり得る。ここで、STAT3タンパク質に特異的に結合するアプチドは、本発明に係る健康機能食品で生理活性を示す物質であり得る。一方、前記細胞透過性物質は、通常の技術分野で細胞を透過することが知られているすべての物質を含むことができる。
【００８１】
また、前記脂質ナノ粒子複合体は、長鎖および短鎖リン脂質を含むことができ、具体的に前記長鎖および短鎖リン脂質は、0.5〜7：1、0.5〜5：1、0.5〜4：1、1〜7：1、1〜5：1、1〜4：1、2〜7：1、2〜5：1または2〜4：1のモル比で含むことができる。前記長鎖および短鎖リン脂質は、通常の技術者であれば、適切に選択して適用することができる。具体的には、前記長鎖リン脂質は、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジトリデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジペンタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-ホスホコリン、1,2-ジヘプタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジノナデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジヘンアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジベヘノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジトリコサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジリグノセロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-パルミトイル-2-オレオイル-5,w-グリセロ-3-ホスホコリンおよび1-パルミトイル-2-ステアロイル-5,w-グリセロ-3-ホスホコリンからなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。一方、前記短鎖リン脂質は、1,2-ジプロピオニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジブチリル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジペンタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジヘキサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジヘプタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンおよび1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンからなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。
【００８２】
本発明の具体的な実施例では、本発明者らはノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドを捕集する脂質ナノ粒子複合体を作製し、前記脂質ナノ粒子複合体がTGF-βによって増加した線維化関連遺伝子の発現を抑制することを確認した（図19参照）。
【００８３】
したがって、前記から、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体は、全身に副作用なしに線維化を予防または改善することに有用に用いることができる。
【００８４】
本発明の脂質ナノ粒子複合体は、食品にそのまま添加したり、他の食品または食品成分と一緒に用いることができる。ここで、添加される有効成分の含有量は、目的に応じて決定することができ、一般的には、全体の食品の重量の0.01〜90重量部であり得る。
【００８５】
健康機能食品の形態および種類は、特に制限されない。具体的には、前記の健康機能食品は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状及び丸薬であり得る。前記の健康機能食品は、追加成分として、さまざまな香味剤、甘味料または天然炭水化物を含むことができる。前記甘味料は、天然または合成甘味料であり得、天然甘味料の例としては、タウマチン、ステビア抽出物などがある。一方、合成甘味料の例としては、サッカリン、アスパルテームなどがある。また、前記天然炭水化物は、単糖類、ニ糖類、多糖類、オリゴ糖および糖アルコールなどであり得る。
【００８６】
本発明の健康機能食品は、上述した追加成分のほかに、栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコールなどをさらに含むことができる。このような成分は、独立的に、または組み合わせて用いることができる。前記添加剤の割合は、本発明の組成物の100重量部当0.01〜0.1重量部の範囲から選択することができる。
【００８７】
（発明を実施するための形態）
以下、本発明を下記の実施例により詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明がこれらによって制限されるものではない。
【００８８】
実施例1.STAT3タンパク質に対するアプチドおよびノナアルギニンを捕集し、長鎖および短鎖リン脂質を1：1のモル比で含むナノ粒子複合体の作製
【００８９】
STAT3タンパク質に対するアプチドおよび細胞透過性ペプチドを捕集する脂質ナノ粒子複合体を薄膜水和方法（thin-film hydration）で作製した。ここで、長鎖および短鎖リン脂質を1：1のモル比で混合して、ナノ粒子複合体を作製した。
【００９０】
具体的には、長鎖リン脂質であるDMPC（1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）および短鎖リン脂質であるDHPC（1,2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）をそれぞれクロロホルムに溶解させた。溶解したDMPCおよびDHPCを1：1のモル比で混合し、前記混合物をボルテクシングして混合した。混合物から脂質薄膜（thin lipid film）を得るためには、窒素ガス下で蒸発させた。一方、細胞透過性ペプチドであるノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチド（配列番号1）は、エニジェン社（韓国）に依頼して作製した。得られた薄膜を、前記アプチドを含んだ溶液を用いて、全体脂質に対してアプチドが10％（w/w）になるまで水和させた。室温で水和した薄膜が透明な溶液に変わるまで超音波処理することにより、細胞透過性ペプチドが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドを捕集する脂質ナノ粒子複合体を作製した。
【００９１】
実施例2. STAT3タンパク質に対するアプチドおよびノナアルギニンを捕集し、長鎖および短鎖リン脂質を2：1のモル比で含むナノ粒子複合体の作製
【００９２】
DMPCおよびDHPCを2：1のモル比で混合したことを除いて、前記実施例1と同じ条件及び方法で、ナノ粒子複合体を作製した。
【００９３】
実施例3. STAT3タンパク質に対するアプチドおよびノナアルギニンを捕集し、長鎖および短鎖リン脂質を3：1のモル比で含むナノ粒子複合体の作製
【００９４】
DMPCおよびDHPCを3：1のモル比で混合したことを除いては、前記実施例1と同じ条件及び方法で、ナノ粒子複合体を作製した。
【００９５】
実施例4. STAT3タンパク質に対するアプチドおよびコール酸（cholic acid）を捕集し、長鎖および短鎖リン脂質を3：1のモル比で含んだナノ粒子複合体の作製
【００９６】
STAT3タンパク質に対するアプチドに細胞透過性物質としてコール酸を融合させ、これを長鎖および短鎖リン脂質を3：1のモル比で含んだナノ粒子複合体を作製した。実験は、細胞透過性ペプチドの代わりにコール酸を添加したことを除いて、実施例1と同じ条件及び方法で行った。
【００９７】
実施例5. VEGFタンパク質に対するアプチドおよびノナアルギニンを捕集し、長鎖および短鎖リン脂質を3：1のモル比で含むナノ粒子複合体の作製
【００９８】
ノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドの代わりにノナアルギニンが融合したVEGFタンパク質に対するアプチド（配列番号10）を用いたことを除いて、実施例3と同じ条件及び方法で、ナノ粒子複合体を作製した。
【００９９】
比較例1. STAT3タンパク質に対するアプチドおよび細胞透過ペプチドを捕集することなく、長鎖および短鎖リン脂質を1：1のモル比で含むナノ粒子複合体の作製
【０１００】
STAT3タンパク質に対するアプチドおよびノナアルギニンが含まれている溶液の代わりに蒸留水を用いて水和させたことを除いて、前記実施例1と同様の方法でSTAT3タンパク質に対するアプチドおよび細胞透過性ペプチドを捕集することなく、長鎖および短鎖リン脂質を1：1のモル比で含んだナノ粒子複合体を作製した。
【０１０１】
比較例2. STAT3タンパク質に対するアプチドおよび細胞透過ペプチドを捕集することなく、長鎖および短鎖リン脂質を2：1のモル比で含むナノ粒子複合体の作製
【０１０２】
DMPCおよびDHPCを2：1のモル比で混合したことを除いて、前記比較例1と同じ条件及び方法で、ナノ粒子複合体を作製した。
【０１０３】
比較例3. STAT3タンパク質に対するアプチドおよび細胞透過ペプチドを捕集することなく、長鎖および短鎖リン脂質を3：1のモル比で含むナノ粒子複合体の作製
【０１０４】
DMPCおよびDHPCを3：1のモル比で混合したことを除いて、前記比較例1と同じ条件及び方法で、ナノ粒子複合体を作製した。
【０１０５】
実験例1. ナノ粒子複合体の粒子サイズおよびゼータ電位の確認
【０１０６】
実施例1〜5及び比較例1〜3で作製したナノ粒子複合体の粒子サイズおよびゼータ電位を動的光散乱（dynamic light scattering,DLS）分析を用いて確認した。実験は、ナノサイザーZS90（Nanosizer ZS90,Malvern Instruments,Ltd.,英国）を用いて行った。また、ナノ粒子複合体の形状は、透過電子顕微鏡（transmission electron microscopy）であるJEM-3011システム（JEOL Ltd.,日本）を用いて、300kVの条件で確認した。ナノ粒子複合体の平均直径は、イメージJソフトウェア、バージョン1.49（image J software,version 1.49,National Institute of Health,米国）を用いて、少なくとも200個のナノ粒子複合体のサイズを測定して算出した。
【０１０７】
その結果、図1に示すように、ナノ粒子複合体の作製に用いた長鎖および短鎖リン脂質のモル比が増加するほど、作製されたナノ粒子複合体が球状から円板状に変わった。これはSTAT3タンパク質に対するアプチドおよび細胞透過性ペプチドの存在有無とは関係がなかったが、実施例1〜3で作製されたナノ粒子複合体は、さらに小さくて多く、明確な円板状の構造を示した。一方、比較例1〜3で作製されたナノ粒子複合体は、容易に凝集した。特に、長鎖および短鎖リン脂質を3：1のモル比で混合して作製されたナノ粒子複合体が最も小さい円板状構造を形成し、透過電子顕微鏡下で観察された前記ナノ粒子複合体の平均直径および厚さは、それぞれ31.3±6.8nmおよび7.7±1.4nmだった（図1）。
【０１０８】
実施例4および5で作製されたナノ粒子複合体もTEMで観察した結果、直径30nm内外の安定なナノ粒子を形成した（図2a及び図2b）。
【０１０９】
また、図3および4に示すように、動的光散乱分析を介して流体力学的直径（hydrodynamic diameter）は約20〜30nmであることを確認した（図3及び4）。
【０１１０】
一方、図5に示すように、比較例1〜3で作製されたナノ粒子複合体は、表面が負電荷を帯びる一方、実施例1〜3で作製されたナノ粒子複合体は、正電荷を示した（図5）。
【０１１１】
実験例2. ナノ粒子複合体の皮膚透過能確認
【０１１２】
2-1.共焦点顕微鏡を用いた皮膚透過能の確認
【０１１３】
実験例1で最も小さく、安定的な形態を形成したことが確認された実施例3で作製されたナノ粒子複合体を用いて、皮膚塗布による皮膚透過能を確認した。
【０１１４】
まず、FITCが標識されたノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチドを用いたことを除いては、実施例3と同じ条件及び方法でナノ粒子複合体（[FITC-APT]-LNC）を作製した。ここで、対照群としては、FITCが標識されたノナアルギニンが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチド（FITC-APT）を準備した。一方、乾癬が誘発されたねずみ科動物モデルの耳の毛を除去して準備した。前記準備した[FITC-APT]-LNCおよびFITC-APTを前記乾癬動物モデルの耳に50μgの量でそれぞれ塗布した。[FITC-APT]-LNCおよびFITC-APTを塗布した後、1、6、または12時間目に、動物モデルの耳組織をそれぞれ垂直断面で得て、これを冷凍保管した。得られた耳の組織を共焦点顕微鏡を用いて、[FITC-APT]-LNCまたはFITC-APT標識されたFITCの緑色蛍光を観察した。観察した結果を撮影して図5に示した。
【０１１５】
図6に示すように、[FITC-APT]-LNCを塗布した耳組織では、塗布1時間後から緑色蛍光が皮膚組織内に拡散し、塗布6時間および12時間後には緑色蛍光が上部真皮（upper dermis）で観察された。しかし、FITC-APTを塗布した場合には、真皮で有意な緑色蛍光が観察されなかった。また、このような緑色蛍光の一部は、毛嚢で観察された（図6）。
【０１１６】
したがって、前記から細胞透過性ペプチドが融合したSTAT3タンパク質に対するアプチド自体は、皮膚透過能がないが、これを含む本発明によるナノ粒子複合体は、皮膚透過能があることが分かった。
【０１１７】
2-2.２光子顕微鏡を用いた皮膚透過能確認
【０１１８】
次に、２光子（two-photon）顕微鏡を用いて、本発明に係るナノ粒子複合体の皮膚透過能を確認した。実験は、共焦点顕微鏡を用いた代わりに、２光子顕微鏡を用いて、通常の動物モデルおよび乾癬の動物モデルを用いたことを除いては、実験例2-1と同様の条件及び方法で行った。ここで、２光子顕微鏡は、２光子励起（excitation）のために690〜1,020nmの範囲で波長を調整することができるモード-ロック調整可能なTi：サファイアレーザー（mode-locked tunable Ti：sapphire laser,Chameleon Ultra,Coherent）を用いた。2D視野（field of view）は、25x対物レンズ（CFI75 Apo LWD 25XW,NA1.1,Nikon）を用いたとき、約400x400μmであった。ここで、3種類の異なる蛍光信号であるCFP/SHG、GFPまたはRRPは、3種類の周波数幅フィルタ（bandpass filters,FF01-420/5,FF01-525/45,FF01-585/40,Semrock）および3種類の光電子倍増管（photomultiplier tube,R7518,Hamamatsu）により同時に検出することができる。2Dイメージは、使用者作製ソフトウェア（custom-written software）で処理した。
【０１１９】
その結果、図7に示すように、正常動物モデルの[FITC-APT]-LNCを塗布した耳組織でFITC-APTを塗布した耳組織に比べて、より深く均一に蛍光シグナルが観察された。また、このような蛍光シグナルは、角質細胞の典型的な多角形構造を示し、表皮から約20μmより深い組織で真皮層の標識である赤線維構造として表示されるコラーゲンの2次調和波発生（second-harmonic generation,SHG）信号を示した。特に、皮膚に塗布された[FITC-APT]-LNCは、上部真皮まで蛍光シグナルが観察された反面、FITC-APTは大部分角質層に残った（図7）。
【０１２０】
一方、図8および9に示すように、乾癬動物モデルの細胞は、ケラチン細胞の異常な増殖のために細胞の極性が消えて、皮膚の表面に複数の異なる構造の細胞が現れた。これらの皮膚から[FITC-APT]-LNCの蛍光シグナルは、約40〜60μmの深さで、FITC-APTの蛍光シグナルは、約10〜20μmの深さで観察された（図8および9）。さらに、前記の結果をもとに、[FITC-APT]-LNCおよびFITC-APTの蛍光シグナルを深さおよび強度によってグラフに表した結果、図10に示すように、[FITC-APT]-LNCを塗布した場合に蛍光シグナルが強く、これは最大60μmの深さでも観察された（図10）。
【０１２１】
実験例3.ナノ粒子複合体の処理濃度による皮膚細胞透過能確認
【０１２２】
まず、ケラチン細胞（keratinocyte）であるHaCaT細胞は、10％牛胎児血清および1％ペニシリンおよびストレプトマイシンを含んだDMEM培養培地を用いて培養した。培養された細胞を12ウェルプレートにウェル当り1x105個になるように分注して5％CO2および37℃の条件下で培養した。培養した細胞に1、5または10μMの濃度で実験例2で作製した[FITC-APT]-LNCを処理した。ここで、対照群としては、何も処理していない陰性対照群を用いた。[FITC-APT]-LNCを処理して90分後、フローサイトメトリーを用いてHaCaT細胞に対する[FITC-APT]-LNCの細胞透過率を確認した。
【０１２３】
その結果、図11に示すように、[FITC-APT]-LNCの濃度に比例して蛍光強度が増加した（図11）。
【０１２４】
実験例4.ナノ粒子複合体の処理時間による皮膚細胞透過能確認
【０１２５】
10μMの濃度で実験例2で作製した[FITC-APT]-LNCを処理し、0.25、0.5、1、2、4、または8時間後にフローサイトメトリーを用いてHaCaT細胞に対する細胞透過率を確認したことを除いて、実験例3と同じ条件及び方法で、ナノ粒子複合体を処理する時間による皮膚細胞透過能を確認した。
【０１２６】
その結果、図12に示すように、[FITC-APT]-LNCの処理時間に比例して蛍光強度が増加し、蛍光強度の強さは投与2〜4時間後に最も強かった（図12）。
【０１２７】
実験例5.ナノ粒子複合体の細胞内伝達確認
【０１２８】
ケラチン細胞（keratinocyte）であるHaCaT細胞および線維芽細胞（fibroblast）のNIH3T3細胞に10μMの濃度で実験例2で作製した[FITC-APT]-LNCを処理したことを除いて、実験は6時間経過後に顕微鏡を用いて観察したことを除いて、実験例3と同じ条件及び方法で行った。ここで、対照群としては、PBSを添加したものを用いた。[FITC-APT]-LNCが処理された細胞を共焦点顕微鏡で観察した写真を図13に示した。
【０１２９】
図13に示すように、[FITC-APT]-LNCが細胞を透過して細胞質および核内に位置した（図13）。
【０１３０】
実験例6.ナノ粒子複合体の乾癬による炎症抑制効果確認
【０１３１】
実施例3で作製したナノ粒子複合体を乾癬動物モデルの皮膚に塗布することにより、乾癬による炎症抑制効果を確認した。
【０１３２】
まず、マウスの耳の部分の毛を除去し、翌日から6日間連続で、イミキモド（imiquimod）を20mg/cm2の量で処理して乾癬を誘発させた。一方、イミキモドの処理2〜6日目に実施例3または比較例3のナノ粒子複合体のナノ粒子複合体を一回当たり50μgずつ、合計100μgの量で塗布した。イミキモドと治療薬を一緒に処理する日には、各薬物間の相互作用を防ぐために、イミキモドの塗布4時間前後に治療薬を塗布した。ここで、陰性対照群としては、ワセリンを処理したコントロール（control）群およびDW処理群を、陽性対照群としては、20mg/cm2のクロベタゾールプロピオネート（clobetasol propionate,CLQ）を塗布した。6日目までにナノ粒子複合体の塗布を完了し、7日目に、前記動物モデルを用いて、炎症抑制効果を確認した（図14）。具体的には、炎症抑制効果は、動物モデルの耳の厚さ、パンチ生検重量、組織H＆E検査、組織粉砕後ELISA、脾臓摘出後重量などを測定して確認した。すべての実験は、通常の方法で行った。
【０１３３】
その結果、図15a〜図15cに示すように、陰性対照群に比べて、実施例3のナノ粒子複合体を処理した動物モデルでの耳の厚さ、PSAIスコアおよび耳パンチ生検重量が有意に減少した（図15a〜図15c）。前記の結果と一貫して、図16に示すように、肉眼的所見もまた実施例3のナノ粒子複合体を処理した動物モデルで改善された（図16）。
【０１３４】
また、図17aに示すように、組織学的分析の蒸留水または比較例3のナノ粒子複合体を処理した動物モデルは、表皮の過形成および炎症細胞の浸潤が表れたのに対し、実施例3のナノ粒子複合体を処理した動物モデルは、このような病理学的特性が有意に減少した（図17a参照）。さらに、図17bに示すように、実施例3のナノ粒子複合体を処理した動物モデルは、乾癬に関連するサイトカインであるIL-17、IL-12/23p40およびIL-1βの生成が有意に減少した（図17b）。
【０１３５】
さらに、図18a及び図18bに示すように、CLQを処理した群を除いた他の実験群の動物モデルは、すべての脾臓の大きさおよび重量が増加した。しかし、CLQ処理群は、脾臓が萎縮さすることによって、CLQが全身の免疫システムに影響を与えたように見えた。一方、乾癬の局所治療効果は、実施例3のナノ粒子複合体が陽性対照群であるCLQと類似であった（図18aおよび図18b）。
【０１３６】
したがって、前記から、本発明に係るナノ粒子複合体は、皮膚に塗布しても、乾癬による炎症を副作用なしに効率的に緩和させることが分かった。
【０１３７】
実験例7.ナノ粒子複合体の抗線維化効果確認
【０１３８】
実施例3で作製したナノ粒子複合体による線維症関連遺伝子であるCol1a1（collagen 1a1）およびαSMA（α-smooth muscle actin）の発現変化を、次のような方法で確認した。
【０１３９】
まず、マウス胚線維芽細胞株のNIH3T3細胞を10％牛胎児血清（FBS）および1％の抗生物質を含むDMEM培地を用いて準備した。準備した細胞を12ウェルプレートにウェル当たり1.5x104個になるように分注して、一晩培養した。培養した細胞の培地を牛胎児血清を含まない培養培地と交換し、24時間培養した後、そこに10ng/mlのTGF-βを処理した。18時間後、10μMの実施例3の脂質ナノ複合体を処理し、これを6時間さらに培養した。ここで、対照群としては、配列番号9で記載されるアミノ酸配列で構成されるアプチドを用いたことを除いては、実施例3と同様の方法で作製された脂質ナノ粒子複合体（APTscr-9R）を用いた。培養が終わった後、細胞だけを収得し、下記の表1に記載されたプライマーを用いて、通常の方法でリアルタイムPCRを行い、Col1a1およびαSMA遺伝子の発現変化を確認し、その結果をGAPDH遺伝子の発現量を基準に標準化して図19に示した。
【０１４０】
【表１】
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【０１４１】
図19に示すように、線維化誘導サイトカインとして知られているCol1a1およびαSMA遺伝子の発現がTGF-βによって2倍程度増加したが、本発明による脂質ナノ粒子複合体を処理することにより、これらの遺伝子の発現が正常レベルに減少した（図19）。
【０１４２】
このような結果は、STAT3タンパク質阻害剤が腎臓、肝臓または肺の線維化を抑制することができるという従来の報告と一貫しており（Kidney International,2010; Clin Cancer Res,2017; EMBO Mol Med,2012）、このことから、本発明にによる脂質ナノ複合体が線維化（fibrosis）の治療にも使用できることを確認した。
【０１４３】
実験例8.ナノ粒子複合体のコロイド安定性確認
【０１４４】
実施例3で作製した脂質ナノ粒子複合体のコロイド安定性を、以下のような方法で確認した。
【０１４５】
まず、実施例3で作製した脂質ナノ粒子複合体を作製し、これを用いて実施例1と同じ条件及び方法でDLS分析を行った。DLS分析は、作製15日後まで行い、その結果、確認された脂質ナノ粒子複合体の大きさを図20bに示した。ここで、対照群としては、比較例3で作製した脂質ナノ粒子複合体を作製した。
【０１４６】
図20aに示すように、比較例3で作製した脂質ナノ粒子複合体（左）は、作製6時間後から凝集体が形成されたが、実施例3で作製した脂質ナノ粒子複合体（右）は、凝集体を形成しなかった（図20a）。また、図20bに示すように、作製15日後にも実施例3で作製した脂質ナノ粒子複合体は、約30nm直径の円板状を維持した（図20b）。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明に係る脂質ナノ粒子複合体は、長鎖および短鎖リン脂質を含み、細胞透過性物質が融合したアプチドを捕集しつつ、特に長鎖および短鎖リン脂質が、特定のモル比で含まれる場合に、前記の脂質ナノ粒子複合体が円板状（discoid）構造を示す。また、前記脂質ナノ粒子複合体にアプチドとしてSTATタンパク質に対するアプチドが捕集される場合、アプチドだけ処理した場合に比べて、細胞または皮膚細胞透過能に優れ、前記アプチドを真皮層まで伝達して副作用なしに乾癬治療効果を示し、TGF-βによって増加した線維化関連遺伝子の発現を抑制することにより、本発明に係る脂質ナノ粒子複合体は、様々なアプチドの伝達体として有用に用いることができる。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
2021529153.tif 000007
【図４】
2021529153.tif 000008
【図５】
2021529153.tif 000009
【図６】
2021529153.tif 000010
【図７】
2021529153.tif 000011
【図８】
2021529153.tif 000012
【図９】
2021529153.tif 000013
【図１０】
2021529153.tif 000014
【図１１】
2021529153.tif 000015
【図１２】
2021529153.tif 000016
【図１３】
2021529153.tif 000017
【図１４】
2021529153.tif 000018
【図１５ａ】
2021529153.tif 000019
【図１５ｂ】
2021529153.tif 000020
【図１５ｃ】
2021529153.tif 000021
【図１６】
2021529153.tif 000022
【図１７ａ】
2021529153.tif 000023
【図１７ｂ】
2021529153.tif 000024
【図１８ａ】
2021529153.tif 000025
【図１８ｂ】
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【図１９】
2021529153.tif 000027
【図２０ａ】
2021529153.tif 000028
【図２０ｂ】
2021529153.tif 000029
【配列表】
2021529153000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月28日(2020.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2021529153.tif 000030
【図２ａ】
2021529153.tif 000031
【図２ｂ】
2021529153.tif 000032
【図３】
2021529153.tif 000033
【図４】
2021529153.tif 000034
【図５】
2021529153.tif 000035
【図６】
2021529153.tif 000036
【図７】
2021529153.tif 000037
【図８】
2021529153.tif 000038
【図９】
2021529153.tif 000039
【図１０】
2021529153.tif 000040
【図１１】
2021529153.tif 000041
【図１２】
2021529153.tif 000042
【図１３】
2021529153.tif 000043
【図１４】
2021529153.tif 000044
【図１５ａ】
2021529153.tif 000045
【図１５ｂ】
2021529153.tif 000046
【図１５ｃ】
2021529153.tif 000047
【図１６】
2021529153.tif 000048
【図１７ａ】
2021529153.tif 000049
【図１７ｂ】
2021529153.tif 000050
【図１８】
2021529153.tif 000051
【図１９】
2021529153.tif 000052
【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
2021529153.tif 000054
【国際調査報告】
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2021529153.tif 000056
2021529153.tif 000057
2021529153.tif 000058
2021529153.tif 000059
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