(57)【要約】本発明は特に、核酸含有ナノ粒子を酵素をコードするｍＲＮＡと共に製剤化し、対象となる細胞または組織に皮下投与を介してペイロードを効率よく送達できるようにする方法に関する。得られたペイロードは、治療された対象の肝臓および他の器官または組織に効率よく送達され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をそれを必要とする対象に皮下送達するための方法であって、前記方法が、前記対象に、
タンパク質またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡと、
ヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡと、を含む組成物を皮下投与することを含む、方法。
【請求項２】
タンパク質またはポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが治療用ｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒアルロニダーゼが哺乳類ヒアルロニダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳類ヒアルロニダーゼがウシヒアルロニダーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳類ヒアルロニダーゼがヒトヒアルロニダーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒアルロニダーゼｍＲＮＡが、配列番号９、１０、および１２のいずれか一つから選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記治療用ｍＲＮＡまたはヒアルロニダーゼｍＲＮＡが、一つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記治療用ｍＲＮＡまたは前記ヒアルロニダーゼｍＲＮＡが、個別にキャップされ、テールされる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記治療用ｍＲＮＡおよび前記ヒアルロニダーゼｍＲＮＡが、一つ以上の脂質ナノ粒子に封入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記一つ以上の脂質ナノ粒子がカチオン性脂質を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記カチオン性脂質が、ｃＫＫ−Ｅ１２（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）、ＯＦ−０２、ターゲット２３、ターゲット２４、ＩＣＥ、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイニル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ジアルキルアミノ系、イミダゾール系、およびグアニジニウム系カチオン性脂質からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記一つ以上の脂質ナノ粒子がＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＥＧ修飾脂質が、前記脂質内の総脂質ナノ粒子の総脂質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％を構成する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記脂質ナノ粒子がリポソームを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療用ｍＲＮＡおよび前記ヒアルロニダーゼｍＲＮＡが、単一のリポソームに封入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療用ｍＲＮＡが、前記ヒアルロニダーゼｍＲＮＡ組成物とは別の組成物で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療用ｍＲＮＡおよび前記ヒアルロニダーゼｍＲＮＡが、単一の製剤で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療用ｍＲＮＡおよび前記ヒアルロニダーゼｍＲＮＡが、個別の製剤で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療用ｍＲＮＡおよび前記ヒアルロニダーゼｍＲＮＡが、個別に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒアルロニダーゼｍＲＮＡ  ｍＲＮＡが、前記治療用ｍＲＮＡ組成物の投与前に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡは、前記治療用ｍＲＮＡ組成物の投与の０．１時間、０．２時間、０．３時間、０．４時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、または６時間前に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡは、第一のｍＲＮＡ組成物の投与の１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、または６時間前に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療用ｍＲＮＡが、肝臓で発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療用ｍＲＮＡが、肺で発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記治療用ｍＲＮＡが、腎臓で発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記治療用ｍＲＮＡが、皮下組織で発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療用ｍＲＮＡが、血清で発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｍＲＮＡを皮下投与することが、皮下注射を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヒアルロニダーゼｍＲＮＡを皮下投与することが、局所投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
ｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質発現のためのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）送達方法であって、
対象に皮下注射を介して
ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡと、
ｂ）ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡと、を投与することを含む、方法。
【請求項３１】
対象における疾患、障害、または症状を治療するための方法であって、タンパク質またはポリペプチドをコードする治療用ｍＲＮＡ、およびヒアルロニダーゼをコードするヘルパーｍＲＮＡを前記対象に皮下送達することを含み、前記治療用ｍＲＮＡをコードするタンパク質またはポリペプチドが前記対象において欠損している、方法。
【請求項３２】
前記治療用ｍＲＮＡが、肝臓で発現される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療用ｍＲＮＡが、肺で発現される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記疾患、障害、または症状が、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）欠損症（フェニルケトン尿症、ＰＫＵ）、アルギニノコハク酸シンターゼ１（ＡＳＳ１）欠損症、エリスロポエチン（ＥＰＯ）欠損症、ファブリー病；血友病性疾患（例えば、血友病Ｂ（ＦＩＸ）、血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ））；ＳＭＮ１関連脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）；筋萎縮性側方硬化症（ＡＬＳ）；ＧＡＬＴ関連ガラクトース血症；アルポート症候群を含むＣＯＬ４Ａ５関連障害；ガラクトセレブロシダーゼ欠損症；Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー；フリートライヒ運動失調症；ペリツェウス・メルツバッハ病；ＴＳＣ１およびＴＳＣ２関連結節性（脳）硬化症；サンフィリポＢ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＢ）；脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ関連振戦／失調症候群、および脆弱Ｘ早期卵巣不全症候群を含むＦＭＲ１関連障害；プラダー・ウィリー症候群；遺伝性出血性毛細管拡張症（ＡＴ）；ニーマン・ピック病タイプＣ１；若年型神経セロイドリポフスチノーシス（ＪＮＣＬ）、若年バッテン病、サンタヴォリ・ハルティア病、ヤンスキー・ビールショースキー病、ならびにＰＴＴ−１およびＴＰＰ１欠損症を含む、神経セロイドリポフスチン症関連疾患；中枢神経系ミエリン形成不全／白質消失病を伴うＥＩＦ２Ｂ１、ＥＩＦ２Ｂ２、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２Ｂ４、およびＥＩＦ２Ｂ５関連小児期運動失調；ＣＡＣＮＡ１ＡおよびＣＡＣＮＢ４関連一過性運動失調症２型；古典的レット症候群、ＭＥＣＰ２関連重度新生児脳症、およびＰＰＭ−Ｘ症候群を含むＭＥＣＰ２関連障害；ＣＤＫＬ５関連非定型レット症候群；ケネディ病（ＳＢＭＡ）；皮質下梗塞および白質脳症（ＣＡＤＡＳＩＬ）を伴うノッチ−３関連常染色体優性脳動脈症；ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１Ｂ関連の発作障害；アルパーズ・フッテンロッハー症候群、ＰＯＬＧ関連感覚性運動失調型ニューロパチー、構音障害、および眼麻痺、ならびにミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性および劣性の進行性外眼筋麻痺を含む、ポリメラーゼＧ関連障害；Ｘ連鎖副腎低形成；Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症；ウィルソン病から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患がオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記治療用ｍＲＮＡが、ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）をコードする、請求項１または３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月１５日に出願された米国仮出願第６２／６７１，８２０号に対する優先権を主張するものであり、当該出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本明細書は、（「ＭＲＴ−１２５２ＷＯ＿ＳＴ２５」という名称のテキスト（．ｔｘｔ）ファイルとして２０１９年５月１３日に電子的に提出された）配列表を参照する。当該テキストファイルは、２０１９年５月１３日に作成されたものであり、サイズは２６，１６９バイトである。配列表の全内容が、参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
メッセンジャーＲＮＡ療法（ＭＲＴ）は、様々な疾患の治療にますます重要なアプローチとなっている。ＭＲＴは、治療を必要とする患者にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与し、患者体内でｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を産生するものである。脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡの効率的なｉｎ  ｖｉｖｏ送達のため、ｍＲＮＡを送達するために一般的に使用されており、現在では、特定のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を静脈内送達を介して全身送達することが可能となっている。しかしながら、患者の快適性及びコンプライアンスを高めるためには、治療用ｍＲＮＡの皮下送達方法の改善が非常に必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、とりわけ、皮下投与を介してｍＲＮＡを効果的にｉｎ  ｖｉｖｏで送達するための改善された方法および組成物を提供する。詳細には、治療用ｍＲＮＡの循環への効率的な曝露のため、治療対象のタンパク質をコードするｍＲＮＡを、ヒアルロニダーゼなどの細胞外基質を分解できる酵素をコードするｍＲＮＡと共に皮下注射する。本明細書に記載されるように、ヒアルロニダーゼをコードする第二のｍＲＮＡと共に投与されるとき、治療対象タンパク質をコードする第一のｍＲＮＡは、特に肝臓において、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその効率的なタンパク質発現を伴う、第一の治療用ｍＲＮＡの予想外に効率的な送達をもたらす。ｍＲＮＡは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入されている。一部の実施形態では、治療用ｍＲＮＡは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入されている。一部の実施形態では、治療用ｍＲＮＡおよびヒアルロニダーゼの両方は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入されている。ヒアルロニダーゼは小分子およびタンパク質薬剤の皮下送達を増強するために使用されているが、ヒアルロニダーゼが、ｍＲＮＡ、特に脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入されたｍＲＮＡの皮下送達を促進させるのに効果的であるかどうかは、ＬＮＰ−ｍＲＮＡ製剤のサイズがかなり異なることやその複雑性の観点から、発明者による最近の調査の前にはわからなかった。多くのｍＲＮＡ担持ＬＮＰは、約１００ｎｍに近いか、または約１００ｎｍのサイズを持ち、これは典型的なタンパク質（典型的な抗体を含有するタンパク質は平均２０ｎｍ未満のサイズを有する）の少なくとも五倍大きいサイズである。ヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡの存在下でのｍＲＮＡ−ＬＮＰの送達が、ｍＲＮＡ−ＬＮＰの皮下取込みおよび送達を増強するのに有効であるかどうかはさらに不明であった。出願人の出願である（参照により本明細書に全体が援用される）２０１７年１０月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１７／６１１７６において最近初めて報告された、ヒアルロニダーゼ酵素を用いた皮下送達後の効率的なｍＲＮＡ送達及び肝臓における高いタンパク質発現を考慮すると、本発明は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症などの代謝性疾患の治療に特に有用である。治療用ｍＲＮＡを送達するために、同じまたは別個の製剤中のヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡを使用すると、治療用ｍＲＮＡの堅牢かつ持続的な送達および分布を、驚くべき容易さと費用対効果とともに達成することができる。理論に拘束されることを望まないが、ヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡは、投与部位で容易に分布し、翻訳され、次いで、ｉｎ  ｓｉｔｕで翻訳されたヒアルロニダーゼの機能の結果として、治療用ｍＲＮＡの取り込みおよび効率的な分布を助ける可能性が高い。本出願で提供されるヒアルロニダーゼを用いる投与は、ｍＲＮＡの皮下送達の効率を増加させ、これは、静脈内（ＩＶ）または筋肉内（ＩＭ）などの他の投与経路に比べてより患者にやさしく、医療コストを削減し、病院における患者のコンプライアンスおよびスループットを向上させることができる。
【０００５】
一態様では、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、それを必要とする対象に皮下送達するための方法を提供し、方法は、当該対象に、タンパク質またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、およびヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物を皮下投与することを含む。
【０００６】
一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、治療用ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはポリペプチド、すなわち、本明細書に記載される治療用ｍＲＮＡは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、アルギニノコハク酸シンターゼ１（ＡＳＳ１）、α１−抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、カルボキシペプチダーゼＮ、アルファガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＴＣ）、ヒト成長ホルモン（ｈＯｔｔ）、ＳＬＣ３Ａ１コードタンパク質、ＳＬＣ３Ａ９コードタンパク質、ＣＯＬ４Ａ５コードタンパク質、ＦＸＮコードタンパク質、ＧＮＳコードタンパク質、ＨＧＳＮＡＴコードタンパク質、ＮＡＧＬＵコードタンパク質、ＳＧＳＨコードタンパク質、ＭＵＴコードタンパク質メチルマロニルＣｏＡムターゼおよびＡＴＰ７Ｂコードタンパク質ＡＴＰａｓｅ  ２からなる群から選択されるタンパク質またはポリペプチドをコードする。
【０００７】
一部の実施形態では、治療用ｍＲＮＡである、タンパク質またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、または１５ｋｂ以上の長さを有する。
【０００８】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡは、ウシヒアルロニダーゼ、ブタヒアルロニダーゼ、ウマヒアルロニダーゼ、ヒツジヒアルロニダーゼおよびヒトヒアルロニダーゼから選択される哺乳類ヒアルロニダーゼをコードする、ヘルパーｍＲＮＡである。
【０００９】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡは、配列番号９、１０、または１２に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよびヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、個別にキャップされ、テールされる。
【００１１】
一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよびヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入されている。
【００１２】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、ｃＫＫ−Ｅ１２（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）、ＯＦ−０２、ターゲット２３、ターゲット２４、ＩＣＥ、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、Ｋ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ジアルキルアミノ系、イミダゾール系、およびグアニジン系カチオン性脂質からなる群から選択されるカチオン性脂質を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、一つ以上の非カチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、該一つ以上の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１４】
一部の実施形態では、リポソームはＰＥＧ化脂質を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、リポソーム内の総脂質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、リポソーム内の総脂質の少なくとも５％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、リポソーム内の総脂質の約５％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、リポソーム内の総脂質の１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、または３％以下を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、リポソーム内の総脂質の５％以下を構成する。
【００１５】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、非修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、一個以上の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、該一個以上の修飾ヌクレオチドは、シュードウリジン、Ｎ−１−メチル−シュードウリジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、４’チオウリジン、４’−チオシチジン、および／または２−チオシチジンを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよびヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入されている。一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよびヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、別個のＬＮＰ内に封入されている。一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよびヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、非同一の組成物を有する別個のＬＮＰ内に封入されている。
【００１７】
一部の実施形態では、治療用ｍＲＮＡおよびヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡは、同時に投与される。一部の実施形態では、治療用ｍＲＮＡおよびヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡは、連続して投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡは、治療用ｍＲＮＡ組成物の投与の０．１時間、０．２時間、０．３時間、０．４時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、または６時間前に投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡは、治療用ｍＲＮＡ組成物の投与の１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、または６時間前に投与される。
【００１８】
一部の実施形態では、治療用ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は肝臓で発現される。一部の実施形態では、治療用ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は、腎臓内で発現される。一部の実施形態では、治療用ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は、肺内で発現される。一部の実施形態では、治療用ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は、血清中で検出可能である。一部の実施形態では、治療用ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、単回投与の少なくとも２４時間後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、または１週間後に検出可能である。
【００１９】
一部の実施形態では、治療用ｍＲＮＡは、体重で、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、治療用ｍＲＮＡは、体重で、約１ｍｇ／Ｋｇ、約２ｍｇ／Ｋｇ、約３ｍｇ／Ｋｇ、約４ｍｇ／Ｋｇ、約５ｍｇ／Ｋｇ、約６ｍｇ／Ｋｇ、約７ｍｇ／Ｋｇ、約８ｍｇ／Ｋｇ、約９ｍｇ／Ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／Ｋｇ、約１２ｍｇ／Ｋｇ、約１３ｍｇ／Ｋｇ、約１４ｍｇ／Ｋｇ、約１５ｍｇ／Ｋｇ、約１６ｍｇ／Ｋｇ、約１７ｍｇ／Ｋｇ、約１８ｍｇ／Ｋｇ、約１９ｍｇ／Ｋｇ、約２０ｍｇ／Ｋｇ、約２５ｍｇ／Ｋｇ、約３０ｍｇ／Ｋｇ、または約５０ｍｇ／Ｋｇで投与される。
【００２０】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードする約０．１〜１００ｍｇのｍＲＮＡが投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードする約０．５〜９０ｍｇのｍＲＮＡが投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードする約１〜８０ｍｇのｍＲＮＡが投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードする約２〜７０ｍｇのｍＲＮＡが投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードする約３〜６０ｍｇのｍＲＮＡが投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードする約４〜５０ｍｇのｍＲＮＡが投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードする約５〜５０ｍｇのｍＲＮＡが投与される。
【００２１】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡは、送達される治療用ＲＮＡ  １ｍｇ当たり少なくとも約１Ｕのヒアルロニダーゼ酵素の予想量を生成する翻訳のため、同等の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼｍＲＮＡは、少なくとも２Ｕ／ｍｇの送達される治療用ＲＮＡ、少なくとも５Ｕ／ｍｇの治療用ＲＮＡ、少なくとも１０Ｕ／ｍｇの治療用ＲＮＡ、少なくとも２０Ｕ／ｍｇの治療用ＲＮＡ、少なくとも３０Ｕ／ｍｇの治療用ＲＮＡ、少なくとも４０Ｕの治療用ＲＮＡ、少なくとも５０Ｕの治療用ＲＮＡ、少なくとも１００Ｕの治療用ＲＮＡ、少なくとも２００Ｕの治療用ＲＮＡ、少なくとも３００Ｕの治療用ＲＮＡ、少なくとも４００Ｕの治療用ＲＮＡ、少なくとも５００Ｕの治療用ＲＮＡ、少なくとも１０００Ｕの治療用ＲＮＡ、少なくとも２０００Ｕの治療用ＲＮＡ、少なくとも３０００Ｕの治療用ＲＮＡ、少なくとも４０００Ｕの治療用ＲＮＡ、少なくとも５０００Ｕの治療用ＲＮＡと同等の用量で投与される。一態様では、本発明は、対象における疾患、障害、または症状を治療するための方法であって、タンパク質またはポリペプチドをコードする治療用ｍＲＮＡ、およびヒアルロニダーゼをコードするヘルパーｍＲＮＡを該対象に皮下送達することを含み、治療用ｍＲＮＡコードタンパク質またはポリペプチドは対象において欠損している、方法を提供する。本明細書における疾患、障害、または症状は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）欠損症（フェニルケトン尿症、ＰＫＵ）、アルギニノコハク酸シンターゼ１（ＡＳＳ１）欠損症、エリスロポエチン（ＥＰＯ）欠損症、ファブリー病；血友病性疾患（例えば、血友病Ｂ（ＦＩＸ）、血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ））；ＳＭＮ１関連脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）；筋萎縮性側方硬化症（ＡＬＳ）；ＧＡＬＴ関連ガラクトース血症；アルポート症候群を含むＣＯＬ４Ａ５関連障害；ガラクトセレブロシダーゼ欠損症；Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー；フリートライヒ運動失調症；ペリツェウス・メルツバッハ病；ＴＳＣ１およびＴＳＣ２関連結節性（脳）硬化症；サンフィリポＢ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＢ）；脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ関連振戦／失調症候群、および脆弱Ｘ早期卵巣不全症候群を含むＦＭＲ１関連障害；プラダー・ウィリー症候群；遺伝性出血性毛細管拡張症（ＡＴ）；ニーマン・ピック病タイプＣ１；若年型神経セロイドリポフスチノーシス（ＪＮＣＬ）、若年バッテン病、サンタヴォリ・ハルティア病、ヤンスキー・ビールショースキー病、ならびにＰＴＴ−１およびＴＰＰ１欠損症を含む、神経セロイドリポフスチン症関連疾患；中枢神経系ミエリン形成不全／白質消失病を伴うＥＩＦ２Ｂ１、ＥＩＦ２Ｂ２、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２Ｂ４、およびＥＩＦ２Ｂ５関連小児期運動失調；ＣＡＣＮＡ１ＡおよびＣＡＣＮＢ４関連一過性運動失調症２型；古典的レット症候群、ＭＥＣＰ２関連重度新生児脳症、およびＰＰＭ−Ｘ症候群を含むＭＥＣＰ２関連障害；ＣＤＫＬ５関連非定型レット症候群；ケネディ病（ＳＢＭＡ）；皮質下梗塞および白質脳症（ＣＡＤＡＳＩＬ）を伴うノッチ−３関連常染色体優性脳動脈症；ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１��関連の発作障害；アルパーズ・フッテンロッハー症候群、ＰＯＬＧ関連感覚性運動失調型ニューロパチー、構音障害、および眼麻痺、ならびにミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性および劣性の進行性外眼筋麻痺を含む、ポリメラーゼＧ関連障害；Ｘ連鎖副腎低形成；Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症；ウィルソン病から選択される。
【００２２】
一態様では、本開示は、ｍＲＮＡ療法によるオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症の治療方法を提供する。本方法は、ＯＴＣタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡおよびヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡを含む皮下送達用の組成物を、治療を必要とする対象に投与することを含む。
【００２３】
一部の実施形態では、ＯＴＣ  ｍＲＮＡはナノ粒子内に封入されている。一部の実施形態では、ナノ粒子は脂質ベースまたはポリマーベースのナノ粒子である。一部の実施形態では、脂質ベースのナノ粒子はリポソームである。
【００２４】
一部の実施形態では、皮下注射は、対象の肝臓においてＯＴＣタンパク質の発現をもたらす。
【００２５】
一部の実施形態では、皮下注射はｍＲＮＡを肝細胞に送達する。一部の実施形態では、皮下注射は、肝細胞におけるＯＴＣ発現をもたらす。
【００２６】
一部の実施形態では、皮下注射は、対象の血清中においてＯＴＣタンパク質の発現をもたらす。
【００２７】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、投与の少なくとも２４時間後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、または１カ月後に検出可能である。
【００２８】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ投与後のＯＴＣ発現は、機能的アッセイにより検出され得る。
【００２９】
一部の実施形態では、当該組成物の投与は、対照レベルと比較して、対象血清中のＯＴＣタンパク質の発現レベルまたは活性レベルの増加を生じさせる。一部の実施形態では、対照レベルは、治療前の対象におけるベースライン血清ＯＴＣタンパク質の発現レベルまたは活性レベルである。一部の実施形態では、対照レベルは、治療を行わないＯＴＣ患者における血清ＯＴＣタンパク質の平均の発現レベルまたは活性レベルを示す参照値である。
【００３０】
一部の実施形態では、当該組成物の投与は、対照のオロチン酸値と比較して、対象における尿オロチン酸値の低下を生じさせる。一部の実施形態では、対照オロチン酸値は、治療前の対象におけるベースライン尿オロチン酸値である。一部の実施形態では、対照オロチン酸値は、治療を行わないＯＴＣ患者における平均尿オロチン酸値を示す参照値である。
【００３１】
一部の実施形態では、当該組成物の投与は、対照シトルリン値と比較して、対象血清中のシトルリン値の増加を生じさせる。一部の実施形態では、対照シトルリン値は、治療前の対象におけるベースライン血清シトルリン値である。一部の実施形態では、対照シトルリン値は、治療を行わないＯＴＣ患者における平均血清シトルリン値を示す参照値である。
【００３２】
一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡおよびヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡが、同時に注射される。
【００３３】
一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡおよびヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡが、一つの組成物で注射される。
【００３４】
一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡおよびヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡが、個別の組成物で注射される。
【００３５】
一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡおよびヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡが、連続的に注射される。
【００３６】
一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡおよびヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡが、２０ｍｌ未満、１５ｍｌ未満、１０ｍｌ未満、５ｍｌ未満、４ｍｌ未満、３ｍｌ未満、２ｍｌ未満、または１ｍｌ未満の体積で注射される。
【００３７】
一部の実施形態では、皮下注射は、週に一回以下の頻度で実施される。一部の実施形態では、皮下注射は、月に二回以下の頻度で実施される。一部の実施形態では、皮下注射は月に一回以下の頻度で実施される。
【００３８】
別の態様では、本発明は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするｍＲＮＡと、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡとを含む、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を治療するための組成物を提供する。
【００３９】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、２０ｍｇ／ｍＬ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、１８ｍｇ／ｍＬ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、１６ｍｇ／ｍＬ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、１４ｍｇ／ｍＬ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、１２ｍｇ／ｍＬ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、１０ｍｇ／ｍＬ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、９ｍｇ／ｍＬ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、８ｍｇ／ｍＬ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、７ｍｇ／ｍＬ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、６ｍｇ／ｍＬ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、５ｍｇ／ｍＬ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、４ｍｇ／ｍＬ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、３ｍｇ／ｍＬ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、２ｍｇ／ｍＬ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、１ｍｇ／ｍＬ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素をコードするｍＲＮＡは、１〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲の用量で投与される。
【００４０】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡはナノ粒子内に封入されている。
【００４１】
一部の実施形態では、ナノ粒子は脂質ベースまたはポリマーベースのナノ粒子である。
【００４２】
一部の実施形態では、組成物は液体形態である。
【００４３】
別の実施形態では、組成物は凍結乾燥粉末である。
【００４４】
一態様では、本発明は上述の組成物を含む容器を提供する。容器はバイアルまたはシリンジである。シリンジは、単一皮下投与のために予め充填されていてもよい。バイアルは、組成物の凍結乾燥粉末または液体形態を含んでもよい。
【００４５】
本出願において、「または」の使用は、他に記載がない限り、「および／または」を意味する。本出願において使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの用語の変化形は、他の添加物、成分、整数、または工程を除外することを意図するものではない。本出願において使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は同意語として用いられている。両方の用語は、当業者によって理解される任意の通常のゆらぎを網羅することを意味する。
【００４６】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲において明らかになる。しかしながら、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示すが、単に例示のために与えられるものであり、制限するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、当業者には明らかになるであろう。
【００４７】
定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、明細書全体を通して定められている。
【００４８】
動物：本明細書で使用される場合、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階でのヒトを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階での非ヒト動物を意味する。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、ゲッ齒類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／または蠕虫類が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組換え動物、及び／またはクローンであり得る。
【００４９】
およそまたは約：本明細書で使用される場合、対象となる一つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、記述された参照値に類似する値を指す。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に明記しない限り、または文脈からそうでないことが明らかでない限り（そのような数が可能値の１００％を超える場合を除く）、記述された参照値のいずれかの方向（より大きいかまたは小さい）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の値の範囲を指す。
【００５０】
送達：本明細書で使用される際に、用語「送達」は、局所送達および全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、そのコードされたタンパク質が発現され、そしてその標的組織内で保持される状況（「局所分布」または「局所送達」とも称される）、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、そのコードされたタンパク質が発現され、そして患者の循環系（例えば、血清）内に分泌され、そして全身に分布され、他の組織によって取り込まれる状況（「全身分布」または「全身送達」とも称される）を包含する。
【００５１】
封入：本明細書で使用される場合、用語「封入」または文法上の相当語句は、ナノ粒子内に個々のｍＲＮＡ分子を閉じ込めるプロセスを指す。
【００５２】
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、ｍＲＮＡをポリペプチドへと翻訳すること、複数のポリペプチドをインタクトなタンパク質（例えば、酵素）へと構築すること、及び／またはポリペプチドもしくは完全に構築されたタンパク質（例えば、酵素）の翻訳後修飾をすることを指す。この用途において、用語「発現」及び「産生」ならびに文法的等価物は互換的に使用される。
【００５３】
半減期：本明細書で使用される場合、用語「半減期」は、核酸またはタンパク質の濃度または活性などの量が、ある期間の開始時に測定された値の半分まで下がるのに要する時間である。
【００５４】
ヒアルロニダーゼ：本明細書で使用される場合、用語「ヒアルロニダーゼ」は、ヒアルロン酸（ヒアルロナン）を分解することができる酵素のファミリーを指す。
【００５５】
改善する、増加させる、または低減する：本明細書で使用される場合、「改善」、「増加」、もしくは「低減」という用語、または文法的等価物は、本明細書に記載される治療の開始前の同一個体での測定値、または本明細書に記載される治療を受けていない対照被験体（または複数の対照被験体）での測定値などのベースライン測定値に対する相対的な値を示唆するものである。「対照被験体」とは、治療を受けている対象と同じ疾患形態を患っており、治療を受けている対象とほぼ同じ年齢の対象のことである。
【００５６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、多細胞生物体内ではなく、例えば、試験管または反応容器中、細胞培養液中などの人工的な環境で生じる事象を意味する。
【００５７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物体内で生じる事象を意味する。細胞型系の文脈において、該用語は、生細胞内で生じる事象を意味するのに（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ系の対語として）使用され得る。
【００５８】
局所分布または局所送達：本明細書において使用される場合、「局所分布」、「局所送達」またはその文法的に均等な用語は、組織特異的な送達または分布を指す。典型的には、局所分布または局所送達は、細胞内で翻訳および発現される、または分泌が限定的で、患者の循環系へ入ることを回避する、ｍＲＮＡにコードされるタンパク質（たとえば酵素）を必要とする。
【００５９】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも一つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾および未修飾の両方のＲＮＡを包含する。ｍＲＮＡは一つ以上のコード領域および非コード領域を含み得る。ｍＲＮＡは、自然源から精製されてもよく、組換え発現系を用いて産生されてもよく、また任意選択的に精製、化学合成などをされてもよい。必要に応じて、例えば、化学的に合成された分子の場合、ｍＲＮＡは、化学修飾された塩基または糖類、骨格修飾などを有する類似体といった、ヌクレオシド類似体を含み得る。ｍＲＮＡ配列は、別段に示されない限り、５’から３’の方向に提示される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、２−チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；介在塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ  ｂａｓｅ）；修飾された糖類（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）；ならびに／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）を含む。
【００６０】
患者：本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、提供される組成物が、例えば、実験、診断、予防、美容、及び／または治療目的のために投与され得る任意の生物体を意味する。典型的な患者としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、および／またはヒトなどの哺乳類）が挙げられる。一部の実施形態では、患者はヒトである。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。
【００６１】
医薬的に許容される：本明細書で使用される際に、用語「医薬的に許容される」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、炎症刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、合理的なベネフィット／リスクの比率に相応で、ヒトおよび動物の組織に接触させて使用することに適した物質を指す。
【００６２】
皮下投与：本明細書で使用される場合、「皮下投与」または「皮下注射」という用語は、皮膚と筋肉の間の組織層である皮下組織へのボーラス注射を意味する。
【００６３】
対象：本明細書で使用される際に、用語「対象」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は患者である場合があり、これは、疾患の診断または治療のために医療機関に来院するヒトを意味する。用語「対象」は、本明細書において「個体」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患または障害に罹患している可能性があるか、またはそれに感受性を有するが、疾患または障害の症状を表していてもいなくてもよい。
【００６４】
実質的に：本明細書で使用される際に、用語「実質的に」は、目的の特徴または特性の全てもしくはほぼ全ての範囲または程度を示す、定性的な状態を意味する。生物学分野の当業者であれば、生物学的および化学的な現象が、完了することおよび／もしくは完了の域に到達すること、または絶対的な結果を達成もしくは回避することが、仮にあったとしても稀であることを理解するであろう。したがって、用語「実質的に」は、本明細書において、多くの生物学的および化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を捉えるのに用いられる。
【００６５】
全身分布または全身送達：本明細書で使用される際に、用語「全身分布」、「全身送達」、または文法的等価物は、全身もしくは生物体全体に影響を及ぼす送達または分布のメカニズムまたはアプローチを意味する。典型的には、全身分布または全身送達は、身体の循環系、例えば、血流を介して成し遂げられる。「局所分布または局所送達」の定義と比較される。
【００６６】
標的組織：本明細書で使用される場合、用語「標的組織」は、治療されるべき疾患の影響を受ける任意の組織を意味する。一部の実施形態では、標的組織には、疾患に関連する病態、症状、または特徴を呈する組織が含まれる。
【００６７】
治療用ｍＲＮＡ：本明細書で使用される場合、治療用ｍＲＮＡという用語は、ｍＲＮＡ療法向けのｍＲＮＡを指すために使用される。治療用ｍＲＮＡは、治療を必要とする対象において欠損しているタンパク質またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを指しうる。それは、例えば第二のｍＲＮＡに対する送達の時系列に関するいかなる推定も含まずに、本明細書全体を通して「第一のｍＲＮＡ」という用語と互換的に使用される。
【００６８】
治療有効量：本明細書で使用される際に、「治療有効量」の治療剤という用語は、疾患、障害、および／もしくは状態に罹患しているか、または感受性を有する対象に投与される場合に、その疾患、障害、および／または状態を治療する、診断する、予防する、および／またはその開始を遅延させるのに十分な量を意味する。当業者は、治療有効量が典型的には少なくとも一つの単位用量を含む投与レジメンによって投与されることを理解するものとなる。
【００６９】
治療：本明細書で使用される際に、用語「治療する」、「治療」または「治療している」とは、特定の疾患、障害、および／または状態のうち一つまたは複数の症状または特徴を、部分的にまたは完全に軽減する、寛解させる、緩和する、抑制する、予防する、その開始を遅延させる、その重症度を低減する、および／またはその発症率を低減するために使用される任意の方法を指す。疾患の徴候を示していない対象、および／または疾患の初期の徴候のみを示している対象に対して、その疾患に関連する病態を発症させるリスクを減少させることを目的として、治療が行われる場合がある。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
本発明は特に、対象のｍＲＮＡ（第一のｍＲＮＡ）をヒアルロニダーゼ酵素をコードする第二のｍＲＮＡとともに投与することによる、皮下経路を介したメッセンジャーＲＮＡ療法のための改善されたｍＲＮＡ送達方法および組成物を提供する。第二のｍＲＮＡは、細胞の取り込みおよびｍＲＮＡの分布を助けるか、または増強する。ｍＲＮＡペイロードは、処置した動物の肝臓（および他の器官または組織）に効率的に送達された。こうしたヒアルロニダーゼを用いる方法は、それを用いなければ不耐性となる薬剤の新規な送達プロファイルを作成するのに大きな利点を有する。
【００７１】
本発明は特に、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするｍＲＮＡおよびヒアルロニダーゼ酵素をコードする第二のｍＲＮＡを、治療を必要とする対象に皮下注射を介して投与することによって、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を治療するための方法および組成物を提供する。また、本発明を使用して、様々な他の疾患、障害、および症状、特に代謝の疾患、障害、および症状を治療することができる。
【００７２】
本発明の様々な態様は、以下のセクションで詳細に説明される。セクションの使用は、本発明を限定することを意味しない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願において、「または」の使用は、他に記載がない限り、「および／または」を意味する。
【００７３】
ヒアルロニダーゼ酵素
様々なヒアルロニダーゼ酵素を使用して、本発明を実施してもよい。例えば、ヒアルロニダーゼには作用機序に基づく三つの群がある。それらの群のうちの二つはエンド−β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ類である。一つの群には、基質の加水分解を利用する脊椎動物酵素類が含まれる。脊椎動物のヒアルロニダーゼ類（ＥＣ  ３．２．１．３５）は、触媒として基質の加水分解を利用するエンド−β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ類である。脊椎動物のヒアルロナン類はまた、トランスグリコシダーゼ活性を有し、ＨＡ鎖を架橋する能力と、ＨＡ鎖とＣｈＳまたはＣｈとを架橋し得る能力を持つ。脊椎動物のヒアルロニダーゼ類は、非進行性のエンド分解（ｅｎｄｏｌｙｔｉｃ）プロセスを通してＨＡを分解し、多くの場合、四糖類を生成する。哺乳類のヒアルロニダーゼ類は、グリコシダーゼファミリー５６と呼ばれる炭水化物活性酵素（ＣＡＺｙ）群のメンバーであり、β１，４グリコシド結合においてＨＡの触媒作用で加水分解を利用するエンド−β−アセチル−ヘキソサミニダーゼ類として定義される。
【００７４】
第二の群は、主に細菌性であり、グリコシド結合をβ脱離して不飽和結合を導入する機能を有するエリミナーゼ類を含む。また、細菌性ヒアルロニダーゼ類は、エンド−β−アセチル−ヘキソサミニダーゼ類であるが、リアーゼ機構を利用する。これらは異なるＣＡＺｙファミリーに属し、多糖類リアーゼファミリー８に属する。一般的に、これらの多糖類リアーゼ類（ＥＣ  ４．２．２．＊）はβ脱離によって切断し、新しい非還元末端に二重結合をもたらす。ヒアルロン酸リアーゼ類（ＥＣ  ４．２．２．１；細菌性Ｈｙａｌ）は、ファミリー８内の一つのサブグループのみからなり、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ類（ＥＣ  ４．２．２．４）、コンドロイチンＡＣリアーゼ類（ＥＣ  ４．２．２．５）、およびキサンタンリアーゼ類（ＥＣ  ４．２．２．１２）も含む。これらの細菌性酵素類、ヒアルロニダーゼ類、コンドロイチナーゼ類、およびキサンタナーゼ類は全て、有意な配列的、構造的および機械的な相同性を共有している。
【００７５】
第三の群はエンドβ−グルクロニダーゼ類である。これらは、環形動物のヒルや特定の甲殻類で見られる。
【００７６】
また、ヒトゲノムのヒアルロニダーゼ様配列であるＨｙａｌ−１、Ｈｙａｌ−２、Ｈｙａｌ−３、Ｈｙａｌ−４、およびＰＨ−２０／Ｓｐａｍ１、ならびに偽遺伝子Ｐｈｙａｌ１（翻訳されず）をコードする六つの既知の遺伝子があり、その全ての相同性の程度が高い。マウスは同様に、ヒト遺伝子と高い相同性の程度を有するヒアルロニダーゼ類をコードする六つの遺伝子を持つ（Ｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００６，１０６（３）：８１８−８３９）。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼはまた、他の任意の動物性物質を含まない滅菌調製物としてウシまたはブタから得ることができる。
【００７７】
ウシＰＨ−２０は一般的に使用されるヒアルロニダーゼであり、適度に純粋な形態で市販されている（シグマカタログ番号Ｈ３６３１、タイプＶＩ−Ｓ、ウシ精巣由来、３，０００〜１５，０００ＮＦＵ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  Ｕｎｉｔ）単位／ｍｇの活性有）。
【００７８】
注射用ヒアルロニダーゼは、粉末形態または溶液で市販されている。例えば、ＦＤＡ承認されたウシ精巣ヒアルロニダーゼ酵素は、無色無臭の溶液として入手可能である。
【００７９】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼの国際単位は、０．１ｍｇの国際標準調製物の活性として定義されてもよく、以下の反応に基づく１混濁度軽減単位（ＴＲＵ）（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆｏｒ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ，”Ｂｕｌｌ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．１９５７；１６（２）：２９１−２９４）に等しい：
ヒアルロニダーゼ
ヒアルロン酸−−−−−−−−−−−−−−−−−＞二糖類と単糖類＋小ヒアルロン酸断片
したがって、ヒアルロニダーゼ活性の一単位は、２．０ｍｌの反応混合物において、ｐＨ５．３にて３７℃で毎分０．３３０のＡ６００の変化を引き起こす（４５分アッセイ）。％透過率は６００ｎｍで算出され、光経路は１ｃｍである。
【００８０】
一部の実施形態では、人工的に合成されたウシヒアルロニダーゼＰＨ−２０  ｍＲＮＡを本目的のために使用しうる。
【００８１】
一部の実施形態では、本明細書で使用されるウシヒアルロニダーゼｍＲＮＡは、配列番号９（ＧｅｎＢａｎｋＩＤ番号：ＢＣ１１０１８３．１）に対する８０％を超える配列同一性を有する。一部の実施形態では、本明細書で使用されるウシヒアルロニダーゼｍＲＮＡは、配列番号９に対する９０％を超える配列同一性を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号９に対する、９１％を超える、９２％を超える、９３％を超える、９４％を超える、９５％を超える、または９８％を超える配列同一性を有する。一部の実施形態では、本明細書で使用されるウシヒアルロニダーゼｍＲＮＡは、配列番号９に対する１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、ウシヒアルロニダーゼｍＲＮＡは、配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋＩＤ番号：ＢＣ１１０１８３．１、ｃｄｓ配列）に対し、約９０％同一であるＰＨ−２０ヒアルロニダーゼをコードする。一部の実施形態では、ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼをコードしたｍＲＮＡは、配列番号１０の配列に対する、９１％を超える、９２％を超える、９３％を超える、９４％を超える、９５％を超える、または９８％を超える配列同一性を有する。一部の実施形態では、ウシヒアルロニダーゼは、配列番号１０に対する１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、ウシヒアルロニダーゼｍＲＮＡは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ番号：ＡＡＩ１０１８４．１）。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１１に対する、９１％を超える、９２％を超える、９３％を超える、９４％を超える、９５％を超える、または９８％を超える配列同一性を有するアミノ酸を有するタンパク質をコードする。
例示的なウシヒアルロニダーゼｍＲＮＡ配列を以下に示す。
ＧＧＴＴＴＡＴＣＴＣＴＧＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡＡＴＴＧＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＣＡＴＣＣＧＣ  ＧＡＧＧＧＴＡＡＡＴＧＴＧ  ＣＴＣＡＧＣＴＣＴＴ  ＴＡＴＧＧＡＧＴＡＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＣＡＡＣＴＴＧＣＡＡＡＡＣＡＴＴＣＣＴＡＡＡＴＡＣＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＴＣＡＴＣＡＴＴＡＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＴＧＴＧＴＴＣＡＴＡＴＣＴＴＧＣＡＴＣＡＡＡＴＡＴＴＡＧＧＴＡＣＡＣＣＡＡＡＧＣＧＴＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＴＧＣＣＴＴＴＣＡＣＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＣＴＴＴＧＴＧＡＴＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧＡＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＴＣＧＧＡＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＴＣＴＡＧＣＧＧＡＡＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＡＧＴＧＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＧＴＴＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＡＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＡＡＡＣＡＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＧＡＡＣＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＡＡＣＴＡＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＡＡＡＡＧＧＡＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＴＧＣＴＡＣＣＧＧＡＣＡＡＴＴＴＡＴＴＡＣＡＴＴＡＴＴＴＴＡＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＴＴＧＧＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＣＡＴＡＴＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＣＡＧＧＣＡＡＡＡＣＣＧＴＡＴＴＣＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＧＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＴＡＡＡＡＡＧＴＣＡＴＡＴＧＧＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＡＴＴＡＣＡＴＡＣＣＡＡＡＴＧＡＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＴＴＧＧＣＧＧＴＣＡＴＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＣＣＴＡＡＡＧＡＴＧＴＴＴＡＣＡＧＧＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＴＴＧＡＧＴＴＧＧＴＴＣＴＧＣＡＡＡＡＡＡＡＴＣＣＧＣＡＡＣＴＣＡＧＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＴＧＧＡＴＴＴＴＧＡＧＡＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＧＴＴＴＣＡＴＧＣＡＡＧＡＧＡＣＴＴＴＡＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＣＧＧＣＣＡＡＡＴＣＡＣＴＴＡＴＧＧＧＧＴＴＡＴＴＡＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＴＧＴＴＡＣＡＡＴＣＡＴＡＡＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡＣＣＴＡＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＡＡＡＴＴＧＣＣＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＣＴＧＣＣＣＴＴＴＴＣＣＣＴＴＣＴＧＴＴＴＡＴＴＴＧＡＡＴＡＴＣＡＧＧＴＴＡＡＡＡＴＣＴＡＣＴＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＣＣＴＴＧＴＡＴＧＴＴＣＧＴＡＡＴＣＧＴＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＴＴＣＧＧＴＴＧＴＣＴＡＡＡＡＴＡＧＣＧＡＧＴＧＴＣＧＡＡＡＧＴＣＣＡＣＴＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＧＣＣＣＧＴＣＣＡＧＴＴＴＴＴＡＣＴＧＡＴＧＧＧＴＣＴＴＣＡＡＣＡＴＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＡＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＡＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＧＧＡＴＴＡＴＡＡＴＧＴＧＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＡＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＡＴＣＴＡＴＧＣＡＡＴＣＴＴＧＣＡＴＧＡＡＣＣＴＡＧＧＣＡＣＴ
ＴＡＣＴＴＧＡＡＣＡＣＴＡＣＡＣＴＧＡＡＴＣＣＴＴＡＣＡＴＡＡＴＣＡＡＣＧＴＣＡＣＣＣＴＡＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＴＧＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣＡＡＴＧＡＡＧＧＡＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＧＡＣＴＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＧＡＡＴＴＴＴＧＣＴＡＴＴＣＡＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＣＡＧＴＡＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＴＧＡＡＧＡＣＴＴＧＣＡＡＡＡＧＴＴＴＴＣＴＧＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＴＴＧＴＴＡＴＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＴＡＡＧＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＴＧＴＴＣＡＴＡＧＴＧＴＴＡＡＣＧＴＧＴＧＴＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＡＣＡＧＣＣＣＴＧＴＧＡＡＧＴＴＡＣＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＴＡＣＡＡＣＴＧＣＣＡＣＡＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＴＡＣＴＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＡＧＴＧＣＣＴＣＡＡＡＧＴＣＡＧＧＴＧＴＴＣＧＧＡＡＧＴＣＡＴＣＣＣＣＡＡＣＧＴＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧＣＧＴＧＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＴＡＴＣＡＧＴＣＡＣＣＴＡＴＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＴＡＴＴＡＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＣＡＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号９）
ウシヒアルロニダーゼｍＲＮＡ配列の別の例は以下の通り。
ＡＴＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧＡＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＴＣＧＧＡＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＴＣＴＡＧＣＧＧＡＡＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＡＧＴＧＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＧＴＴＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＡＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＡＡＡＣＡＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＧＡＡＣＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＡＡＣＴＡＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＡＡＡＡＧＧＡＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＴＧＣＴＡＣＣＧＧＡＣＡＡＴＴＴＡＴＴＡＣＡＴＴＡＴＴＴＴＡＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＴＴＧＧＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＣＡＴＡＴＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＣＡＧＧＣＡＡＡＡＣＣＧＴＡＴＴＣＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＧＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＴＡＡＡＡＡＧＴＣＡＴＡＴＧＧＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＡＴＴＡＣＡＴＡＣＣＡＡＡＴＧＡＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＴＴＧＧＣＧＧＴＣＡＴＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＣＣＴＡＡＡＧＡＴＧＴＴＴＡＣＡＧＧＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＴＴＧＡＧＴＴＧＧＴＴＣＴＧＣＡＡＡＡＡＡＡＴＣＣＧＣＡＡＣＴＣＡＧＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＴＧＧＡＴＴＴＴＧＡＧＡＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＧＴＴＴＣＡＴＧＣＡＡＧＡＧＡＣＴＴＴＡＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＣＧＧＣＣＡＡＡＴＣＡＣＴＴＡＴＧＧＧＧＴＴＡＴＴＡＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＴＧＴＴ
ＡＣＡＡＴＣＡＴＡＡＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡＣＣＴＡＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＡＡＡＴＴＧＣＣＣＴＧＡＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＣＴＧＣＣＣＴＴＴＴＣＣＣＴＴＣＴＧＴＴＴＡＴＴＴＧＡＡＴＡＴＣＡＧＧＴＴＡＡＡＡＴＣＴＡＣＴＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＣＣＴＴＧＴＡＴＧＴＴＣＧＴＡＡＴＣＧＴＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＴＴＣＧＧＴＴＧＴＣＴＡＡＡＡＴＡＧＣＧＡＧＴＧＴＣＧＡＡＡＧＴＣＣＡＣＴＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＧＣＣＣＧＴＣＣＡＧＴＴＴＴＴＡＣＴＧＡＴＧＧＧＴＣＴＴＣＡＡＣＡＴＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＡＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＡＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＧＧＡＴＴＡＴＡＡＴＧＴＧＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＡＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＡＴＣＴＡＴＧＣＡＡＴＣＴＴＧＣＡＴＧＡＡＣＣＴＡＧＧＣＡＣＴＴＡＣＴＴＧＡＡＣＡＣＴＡＣＡＣＴＧＡＡＴＣＣＴＴＡＣＡＴＡＡＴＣＡＡＣＧＴＣＡＣＣＣＴＡＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＴＧＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣＡＡＴＧＡＡＧＧＡＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＧＡＣＴＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＧＡＡＴＴＴＴＧＣＴＡＴＴＣＡＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＣＡＧＴＡＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＴＧＡＡＧＡＣＴＴＧＣＡＡＡＡＧＴＴＴＴＣＴＧＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＴＴＧＴＴＡＴＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＴＡＡＧＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＴＧＴＴＣＡＴＡＧＴＧＴＴＡＡＣＧＴＧＴＧＴＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＡＣＡＧＣＣＣＴＧＴＧＡＡＧＴＴＡＣＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＴＡＣＡＡＣＴＧＣＣＡＣＡＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＴＡＣＴＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＡＧＴＧＣＣＴＣＡＡＡＧＴＣＡＧＧＴＧＴＴＣＧＧＡＡＧＴＣＡＴＣＣＣＣＡＡＣＧＴＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧＣＧＴＧＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＴＡＴＣＡＧＴＣＡＣＣＴＡＴＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＴＡＴＴＡ（配列番号１０）
例示的な翻訳されたタンパク質配列は以下の通り：
ＭＲＭＬＲＲＨＨＩＳＦＲＳＦＡＧＳＳＧＴＰＱＡＶＦＴＦＬＬＬＰＣＣＬＡＬＤＦＲＡＰＰＬＩＳＮＴＳＦＬＷＡＷＮＡＰＶＥＲＣＶＮＲＲＦＱＬＰＰＤＬＲＬＦＳＶＫＧＳＰＱＫＳＡＴＧＱＦＩＴＬＦＹＡＤＲＬＧＹＹＰＨＩＤＥＫＴＧＫＴＶＦＧＧＩＰＱＬＧＮＬＫＳＨＭＥＫＡＫＮＤＩＡＹＹＩＰＮＤＳＶＧＬＡＶＩＤＷＥＮＷＲＰＴＷＡＲＮＷＫＰＫＤＶＹＲＤＥＳＶＥＬＶＬＱＫＮＰＱＬＳＦＰＥＡＳＫＩＡＫＶＤＦＥＴＡＧＫＳＦＭＱＥＴＬＫＬＧＫＬＬＲＰＮＨＬＷＧＹＹＬＦＰＤＣＹＮＨＮＨＮＱＰＴＹＮＧＮＣＰＤＶＥＫＲＲＮＤＤＬＥＷＬＷＫＥＳＴＡＬＦＰＳＶＹＬＮＩＲＬＫＳＴＱＮＡＡＬＹＶＲＮＲＶＱＥＡＩＲＬＳＫＩＡＳＶＥＳＰＬＰＶＦＶＹＡＲＰＶＦＴＤＧＳＳＴＹＬＳＱＧＤＬＶＮＳＶＧＥＩＶＳＬＧＡＳＧＩＩＭＷＧＳＬＮＬＳＬＳＭＱＳＣＭＮＬＧＴＹＬＮＴＴＬＮＰＹＩＩＮＶＴＬＡＡＫＭＣＳＱＶＬＣＨＮＥＧＶＣＴＲＫＨＷＮＳＳＤＹＬＨＬＮＰＭＮＦＡＩＱＴＧＥＧＧＫＹＴＶＰＧＴＶＴＬＥＤＬＱＫＦＳＤＴＦＹＣＳＣＹＡＮＩＨＣＫＫＲＶＤＩＫＮＶＨＳＶＮＶＣＭＡＥＤＩＣＩＤＳＰＶＫＬＱＰＳＤＨＳＳＳＱＥＡＳＴＴＴＦＳＳＩＳＰＳＴＴＴＡＴＶＳＰＣＴＰＥＫＨＳＰＥＣＬＫＶＲＣＳＥＶＩＰＮＶＴＱＫＡＣＱＳＶＫＬＫＮＩＳＹＱＳＰＩＱＮＩＫＮＱＴＴＹ（配列番号１１）。
【００８２】
一部の実施形態では、人工的に合成されたヒトヒアルロニダーゼｍＲＮＡは、治療用ｍＲＮＡの皮下送達のために投与される。治療用ｍＲＮＡの皮下送達のために投与されるヒトヒアルロニダーゼｍＲＮＡは、配列番号１２（ＧｅｎＢａｎｋＩＤ番号：ＡＦ０４０７１０）に対する８０％を超える配列同一性を有する。一部の実施形態では、本明細書で使用されるヒトヒアルロニダーゼｍＲＮＡは、配列番号１２に対する９０％を超える配列同一性を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１２に対する、９１％を超える、９２％を超える、９３％を超える、９４％を超える、９５％を超える、または９８％を超える配列同一性を有する。一部の実施形態では、本明細書で使用されるヒトヒアルロニダーゼｍＲＮＡは、配列番号１２に対する１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、ヒトヒアルロニダーゼｍＲＮＡは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ番号：ＡＡＣ７０９１５．１）。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１３に対する、９１％を超える、９２％を超える、９３％を超える、９４％を超える、９５％を超える、または９８％を超える配列同一性を有するアミノ酸を有するタンパク質をコードする。
例示的なヒトヒアルロニダーゼｍＲＮＡ配列を以下に示す。
ＡＴＧＡＣＣＡＣＧＣＡＡＣＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＡＣＣＡＣＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＡＣＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＴＧＡＧＧＣＣＣＧＣＴＴＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣＡＡＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＴＡＧＣＣＡＡＣＣＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＣＡＣＧＧＴＣＡＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＡＴＴＴＴＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＣＴＣＧＧＣＣＴＣＴＡＴＣＣＣＴＡＣＴＴＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＡＴＣＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＣＴＴＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＣＴＡＣＣＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＣＴＧＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＴＴＧＧＧＡＧＧＡＧＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＴＣＴＴＧＧＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＴＡＴＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＴＡＴＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡＣＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＧＧＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡＣＴＡＣＧＧＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＡＣＴＡＣＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＣＡＡＴＧＧＣＴＧＧＣＡＴＡＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＣＡＡＣＴＡＴＡＣＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＡＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＡＡＣＡＣＴＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＣＴＡＣＣＴＣＣＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＧＣＣＴＴＴＧＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＣＣＣＴＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＣＣＣＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧＣＣＴＡＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＴＧＡＣＣＴＴＧＴＧＣＡＧＴＣＣＡＴＴＧＧＴＧＴＧＡＧＴＧＣＡＧＣＡＣＴＡＧＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＣＧＴＧＧＴＧＣＴＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＴＧＡＣＴＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣＴＴＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＧＴＧＡＴＣＡＡＴＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＣＣＡＧＣＧＧＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＧＧＧＣＧＣＴＧＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＣＡＧＡＣＧＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧＡＧＡＴＴＧＧＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＣＴＧＣＣＡＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＣＴＧＣＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＴＡＴＡＡＡＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＡＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＡＣＴＣＴＧＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＧＣＴＣＴＡＴＴＣＡＧＴＴＴＡＣＡＧＴＣＡＡＣＣＣＴＣＣＣＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＣＣＧＣＴＴＣＣＣＴＴＧＧＡＡＴＣＣＣＴＧＡ（配列番号１２）
例示的なヒトヒアルロニダーゼタンパク質配列を以下に示す。
ＭＴＴＱＬＧＰＡＬＶＬＧＶＡＬＣＬＧＣＧＱＰＬＰＱＶＰＥＲＰＦＳＶＬＷＮＶＰＳＡＨＣＥＡＲＦＧＶＨＬＰＬＮＡＬＧＩＩＡＮＲＧＱＨＦＨＧＱＮＭＴＩＦＹＫＮＱＬＧＬＹＰＹＦＧＰＲＧＴＡＨＮＧＧＩＰＱＡＬＰＬＤＲＨＬＡＬＡＡＹＱＩＨＨＳＬＲＰＧＦＡＧＰＡＶＬＤＷＥＥＷＣＰＬＷＡＧＮＷＧＲＲＲＡＹＱＡＡＳＷＡＷＡＱＱＶＦＰＤＬＤＰＱＥＱＬＹＫＡＹＴＧＦＥＱＡＡＲＡＬＭＥＤＴＬＲＶＡＱＡＬＲＰＨＧＬＷＧＦＹＨＹＰＡＣＧＮＧＷＨＳＭＡＳＮＹＴＧＲＣＨＡＡＴＬＡＲＮＴＱＬＨＷＬＷＡＡＳＳＡＬＦＰＳＩＹＬＰＰＲＬＰＰＡＨＨＱＡＦＶＲＨＲＬＥＥＡＦＲＶＡＬＶＧＨＲＨＰＬＰＶＬＡＹＶＲＬＴＨＲＲＳＧＲＦＬＳＱＤＤＬＶＱＳＩＧＶＳＡＡＬＧＡＡＧＶＶＬＷＧＤＬＳＬＳＳＳＥＥＥＣＷＨＬＨＤＹＬＶＤＴＬＧＰＹＶＩＮＶＴＲＡＡＭＡＣＳＨＱＲＣＨＧＨＧＲＣＡＲＲＤＰＧＱＭＥＡＦＬＨＬＷＰＤＧＳＬＧＤＷＫＳＦＳＣＨＣＹＷＧＷＡＧＰＴＣＱＥＰＳＬＧＬＫＫＱＹＫＡＲＡＰＡＴＡＳＳＦＰＣＣＨＦＳＳＰＧＴＴＬＳＨＳＣＳＩＱＦＴＶＮＰＰＫＨＴＰＲＦＰＷＮＰ（配列番号１３）
【００８３】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼの全長または断片をコードするｍＲＮＡが使用される。
【００８４】
ヒアルロニダーゼの例示的な組換えヒアルロニダーゼ用量は、約１単位〜５０，０００単位である。したがって、ヒアルロニダーゼｍＲＮＡは、４０，０００Ｕ未満、３０，０００Ｕ未満、２０，０００Ｕ未満、１０，０００Ｕ未満、９０００Ｕ未満、８０００Ｕ未満、７０００Ｕ未満、６０００Ｕ未満、５０００Ｕ未満、４０００Ｕ未満、３０００Ｕ未満、２０００Ｕ未満、１０００Ｕ未満、９００Ｕ未満、８００Ｕ未満、７００Ｕ未満、６００Ｕ未満、または５００Ｕ未満、の量のタンパク質に翻訳されるように同等の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼｍＲＮＡは、少なくとも１Ｕ、少なくとも５Ｕ、少なくとも１０Ｕ、少なくとも２０Ｕ、少なくとも３０Ｕ、少なくとも４０Ｕ、少なくとも５０Ｕ、少なくとも６０Ｕ、少なくとも７０Ｕ、少なくとも８０Ｕ、少なくとも１００Ｕ、または少なくとも１５０Ｕのタンパク質に翻訳されるように同等の用量で投与される。他の一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼｍＲＮＡは、少なくとも１６０Ｕ、少なくとも１８０Ｕ、少なくとも２００Ｕ、少なくとも２２０Ｕ、少なくとも２４０Ｕ、少なくとも２６０Ｕ、少なくとも２８０Ｕ、少なくとも３００Ｕ、少なくとも３２０Ｕ、少なくとも３４０Ｕ、少なくとも３６０Ｕ、少なくとも３８０Ｕ、または少なくとも４００Ｕのタンパク質に翻訳されるように同等の用量で投与される。一つ以上の実施形態では、ブタ（豚）ヒアルロニダーゼを１単位〜５０，０００単位の範囲の用量で使用する。ヒアルロニダーゼｍＲＮＡは、４０，０００Ｕ未満、３０，０００Ｕ未満、２０，０００Ｕ未満、１０，０００Ｕ未満、９０００Ｕ未満、８０００Ｕ未満、７０００Ｕ未満、６０００Ｕ未満、５０００Ｕ未満、４０００Ｕ未満、３０００Ｕ未満、２０００Ｕ未満、１０００Ｕ未満、９００Ｕ未満、８００Ｕ未満、７００Ｕ未満、６００Ｕ未満、または５００Ｕ未満、の量のタンパク質に翻訳されるように同等の用量で投与される。ヒアルロニダーゼｍＲＮＡが、少なくとも１Ｕ、少なくとも５Ｕ、少なくとも１０Ｕ、少なくとも２０Ｕ、少なくとも３０Ｕ、少なくとも４０Ｕ、少なくとも５０Ｕ、少なくとも６０Ｕ、少なくとも７０Ｕ、少なくとも８０Ｕ、少なくとも１００Ｕ、または少なくとも１５０Ｕのタンパク質に翻訳されるように同等の用量で投与される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。他の一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼｍＲＮＡは、少なくとも１６０Ｕ、少なくとも１８０Ｕ、少なくとも２００Ｕ、少なくとも２２０Ｕ、少なくとも２４０Ｕ、少なくとも２６０Ｕ、少なくとも２８０Ｕ、少なくとも３００Ｕ、少なくとも３２０Ｕ、少なくとも３４０Ｕ、少なくとも３６０Ｕ、少なくとも３８０Ｕ、または少なくとも４００Ｕのタンパク質に翻訳されるように同等の用量で投与される。
【００８５】
一つ以上の実施形態では、ヒアルロニダーゼは治療用ｍＲＮＡと同時に投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼは、ｍＲＮＡの投与の前に投与され得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とは同一製剤の一部である。一部の実施形態では、ＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とは、別個の製剤として注射される。
【００８６】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡは、水溶液で投与され得る。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡは生理食塩水中にある。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素はｍＲＮＡ製剤の一部であり、同じ溶液中に含まれ、この溶液はｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ封入脂質とヒアルロニダーゼ酵素とを含む凍結乾燥調製物が治療用途のために製剤化される。
【００８７】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：
本発明を使用して、任意のｍＲＮＡを送達することができる。本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡは、コードされるタンパク質を翻訳するためにＤＮＡからリボソームに情報を伝えるタイプのＲＮＡである。ｍＲＮＡは様々な公知の方法のいずれかにより合成され得る。たとえば本発明に従うｍＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を介して合成することができる。簡潔に述べると、ＩＶＴは多くの場合、プロモーターを含む直線状または環状のＤＮＡ鋳型、一群のリボヌクレオチド三リン酸塩、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含み得る緩衝系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（たとえば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅＩ、ピロホスファターゼ、ならびに／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて行われる。厳密な条件は具体的なアプリケーションに従い変化するであろう。
【００８８】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたｍＲＮＡは、製剤および封入前に精製されて、ｍＲＮＡ合成中に使用された様々な酵素および他の試薬を含む望ましくない不純物が除去されてもよい。
【００８９】
本発明を使用して、様々な長さのｍＲＮＡを送達することができる。一部の実施形態では、本発明を使用して、長さ約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、または２０ｋｂ以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを送達することができる。一部の実施形態では、本発明を使用して、長さ約１〜２０ｋｂ、約１〜１５ｋｂ、約１〜１０ｋｂ、約５〜２０ｋｂ、約５〜１５ｋｂ、約５〜１２ｋｂ、約５〜１０ｋｂ、約８〜２０ｋｂ、または約８〜１５ｋｂの範囲のｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを送達することができる。
【００９０】
本発明を使用して、未修飾のｍＲＮＡ、または安定性を一般的に強化する一つ以上の修飾を含むｍＲＮＡを送達することができる。一部の実施形態では、修飾は、修飾ヌクレオチド、修飾糖リン酸骨格、ならびに５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）から選択される。
【００９１】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡの修飾は、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含み得る。本発明による修飾ｍＲＮＡは、たとえば骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含み得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、以下に限定されないが、プリン類（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））またはピリミジン類（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））をはじめとする天然ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）から合成されてもよく、ならびに例えば１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニル−アデニン、Ｎ６−メチル−アデニン、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン、２−チオ−シトシン、３−メチル−シトシン、４−アセチル−シトシン、５−メチル−シトシン、２，６−ジアミノプリン、１−メチル−グアニン、２−メチル−グアニン、２，２−ジメチル−グアニン、７−メチル−グアニン、イノシン、１−メチル−イノシン、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）（５−ウラシル）、ジヒドロウラシル、２−チオ−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、５−メチル−２−チオ−ウラシル、５−メチル−ウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、５−メチルアミノメチル−ウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５’−メトキシカルボニルメチル−ウラシル、５−メトキシ−ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、１−メチルシュードウラシル、キューオシン、ベータ−Ｄ−マンノシル−キューオシン、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、ならびにホスホロアミデート類、ホスホロチオエート類、ペプチドヌクレオチド類、メチルホスホネート類、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシンおよびイノシンなどのプリン類ならびにピリミジン類の修飾ヌクレオチド類似体または誘導体として合成されてもよい。こうした類似体の調製は、米国特許第４，３７３，０７１号、同第４，４０１，７９６号、同第４，４１５，７３２号、同第４，４５８，０６６号、同第４，５００，７０７号、同第４，６６８，７７７号、同第４，９７３，６７９号、同第５，０４７，５２４号、同第５，１３２，４１８号、同第５，１５３，３１９号、第５，２６２，５３０号および第５，７００，６４２号（その開示は参照によりその全範囲において本明細書に含まれる）から当業者に公知である。
【００９２】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡはＲＮＡ骨格修飾を含んでもよい。典型的には、骨格修飾は、ＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸塩が化学的に修飾される修飾である。例示的な骨格修飾として、典型的には、以下に限定されないが、メチルホスホネート、メチルホスホルアミデート、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート（例えば、シチジン５’−Ｏ−（１−チオフォスフェート））、ボラノリン酸塩、正荷電グアニジウム基などからなる群由来の修飾が挙げられ、これは、ホスホジエステル結合を他のアニオン基、カチオン基、または中性基で置き換えることに基づくことを意味する。
【００９３】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは糖修飾を含み得る。典型的な糖修飾は、ｍＲＮＡが有するヌクレオチドの糖の化学修飾であり、糖修飾として、以下に限定されないが、２’−デオキシ−２’−フルオロ−オリゴリボヌクレオチド（２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）、２’−デオキシ−２’−デアミン−オリゴリボヌクレオチド（２’−アミノ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルシチジン５’−三リン酸、２’−メチルウリジン５’−三リン酸）、２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、及びこれらの異性体（２’−アラシチジン５’−三リン酸、２’−アラウリジン５’−三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’−アジド−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）からなる群から選択される糖修飾が挙げられる。
【００９４】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡはヌクレオチドの塩基の修飾（塩基修飾）を含み得る。塩基修飾を含む修飾されたヌクレオチドは、塩基修飾ヌクレオチドとも称される。こうした塩基修飾ヌクレオチドの例として、以下に限定されないが、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド５’−三リン酸、２−アミノアデノシン５’−三リン酸、２−チオシチジン５’−三リン酸、２−チオウリジン５’−三リン酸、４−チオウリジン５’−三リン酸、５−アミノアリルシチジン５’−三リン酸、５−アミノアリルウリジン５’−三リン酸、５−ブロモシチジン５’−三リン酸、５−ブロモウリジン５’−三リン酸、５−ヨードシチジン５’−三リン酸、５−ヨードウリジン５’−三リン酸、５−メチルシチジン５’−三リン酸、５−メチルウリジン５’−三リン酸、６−アザシチジン５’−三リン酸、６−アザウリジン５’−三リン酸、６−クロロプリンリボシド５’−三リン酸、７−デアザアデノシン５’−三リン酸、７−デアザグアノシン５’−三リン酸、８−アザアデノシン５’−三リン酸、８−アジドアデノシン５’−三リン酸、ベンゾイミダゾールリボシド５’−三リン酸、Ｎ１−メチルアデノシン５’−三リン酸、Ｎ１−メチルグアノシン５’−三リン酸、Ｎ６−メチルアデノシン５’−三リン酸、Ｏ６−メチルグアノシン５’−三リン酸、プソイドウリジン５’−三リン酸、ピューロマイシン５’−三リン酸、またはキサントシン５’−三リン酸が挙げられる。
【００９５】
ｍＲＮＡ合成には、５’末端への「キャップ」及び３’末端への「テール」の付加が含まれるのが典型的である。キャップの存在は、大半の真核生物細胞に見られるヌクレアーゼへの耐性を付与するのに重要である。「テール」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護するのに役立つものである。
【００９６】
したがって、一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には次のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの一つを除去して二つの末端リン酸を残し、次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加されて５−’５’逆三リン酸結合を生成し、次いで、グアニンの７−窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。２’−Ｏ−メチル化は、７−メチルグアノシン三リン酸塩残基の後の第一の塩基および／または第二の塩基で生じうる。キャップ構造の例には、ｍ７ＧｐｐｐＮｐ−ＲＮＡ、ｍ７ＧｐｐｐＮｍｐ−ＲＮＡおよびｍ７ＧｐｐｐＮｍｐＮｍｐ−ＲＮＡ（式中、ｍは２’−Ｏ−メチル残基を示す）が含まれるが、これに限定されない。
【００９７】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端のポリＡテールは多くの場合、約１０〜３００個のアデノシンヌクレオチド（例えば、約１０〜２００個のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１５０個のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１００個のアデノシンヌクレオチド、約２０〜７０個のアデノシンヌクレオチド、または約２０〜６０個のアデノシンヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは３’ポリ（Ｃ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端の好適なポリＣテールは多くの場合、約１０〜２００個のシトシンヌクレオチド（例えば、約１０〜１５０個のシトシンヌクレオチド、約１０〜１００個のシトシンヌクレオチド、約２０〜７０個のシトシンヌクレオチド、約２０〜６０個のシトシンヌクレオチド、または約１０〜４０個のシトシンヌクレオチド）を含む。ポリＣテールは、ポリＡテールに付加され得るか、またはポリＡテールを置換し得る。
【００９８】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’および／または３’非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域には、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす一つ以上の要素、例えば、鉄応答要素が含まれる。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、長さ約５０〜５００のヌクレオチドであり得る。
【００９９】
一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞中のｍＲＮＡの位置の安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの一つ以上の結合部位のうちの一つ以上を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、長さ約５０〜５００ヌクレオチドであるか、またはそれ以上の長さであり得る。
【０１００】
キャップ構造
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には次のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの一つを除去して二つの末端リン酸を残し、次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加されて５’−５’逆三リン酸結合を生成し、次いで、グアニンの７−窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。キャップ構造の例としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
天然に存在するキャップ構造は７−メチルグアノシンを含み、これは、三リン酸架橋を介して第一の転写ヌクレオチドの５’末端に連結され、その結果、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（Ｎは任意のヌクレオシドである）のジヌクレオチドキャップをもたらす。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、キャップは酵素を用いて付加される。キャップは、核に付加され、酵素グアニリルトランスフェラーゼによる触媒作用を受ける。ＲＮＡの５’末端へのキャップの付加は、転写の開始直後に生じる。末端ヌクレオシドは、グアノシンであるのが典型的であり、全ての他のヌクレオチドとは逆の方向になっており、すなわち、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧｐＮｐＮｐである。
【０１０２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により生成されたｍＲＮＡに対する普遍的なキャップは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇであり、これをｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写においてジヌクレオチドキャップとして使用し、その５’末端にキャップ構造を有するＲＮＡが取得される。キャップされたｍＲＮＡの一般的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成方法では、転写の開始因子として、形態がｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（「ｍ７ＧｐｐｐＧ」）である予め形成されたジヌクレオチドが用いられている。
【０１０３】
従来より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳実験に使用される合成ジヌクレオチドキャップの通常の形態は、アンチリバースキャップ類似体（「ＡＲＣＡ」）または修飾されたＡＲＣＡであり、これは、２’ＯＨ基または３’ＯＨ基が−ＯＣＨ３で置換される、修飾されたキャップ類似体であるのが一般的である。
【０１０４】
さらなるキャップ類似体として、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ；非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）；ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、またはアンチリバースキャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ；ｍ７、２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧ、及びそれらの四リン酸誘導体）からなる群から選択される化学構造が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ  ‘ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ’  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３）を参照のこと）。
【０１０５】
一部の実施形態では、好適なキャップは７−メチルグアニル酸（「ｍ７Ｇ」）であり、これは、三リン酸架橋を介して第一の転写ヌクレオチドの５’末端に連結され、その結果、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（Ｎは任意のヌクレオシドである）をもたらすものである。本発明の実施形態に利用されるｍ７Ｇキャップの好適な実施形態は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである。
【０１０６】
一部の実施形態では、キャップはキャップ０構造である。キャップ０構造は、塩基１及び塩基２に結合したリボースの２’−Ｏ−メチル残基を欠く。一部の実施形態では、キャップはキャップ１構造である。キャップ１構造は、塩基２に２’−Ｏ−メチル残基を有する。一部の実施形態では、キャップはキャップ２構造である。キャップ２構造は、塩基２及び塩基３の両方に結合した２’−Ｏ−メチル残基を有する。
【０１０７】
様々なｍ７Ｇキャップ類似体が当該技術分野において公知であり、その多くは市販されている。これらには、上述のｍ７ＧｐｐｐＧ、ならびにＡＲＣＡ  ３’−ＯＣＨ３及び２’−ＯＣＨ３キャップ類似体が含まれる（Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３））。本発明の実施形態において使用するためのさらなるキャップ類似体として、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１０：１４７９−１４８７（２００４）に記載）、ホスホロチオエートキャップ類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１３：１７４５−１７５５（２００７）に記載）、ならびに米国特許第８，０９３，３６７号及び同第８，３０４，５２９号（参照により本明細書に援用される）に記載されるキャップ類似体（ビオチン化キャップ類似体を含む）が挙げられる。
【０１０８】
テール構造
多くの場合、「テール」の存在はエキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護するという役割を果たす。ポリＡテールは、天然のメッセンジャーセンスＲＮＡおよび合成センスＲＮＡを安定させると考えられている。したがって、ある実施形態では、長いポリＡテールをｍＲＮＡ分子に付加することにより、そのＲＮＡをさらに安定化することができる。ポリＡテールは、当該技術分野において認識されている様々な技術を使用して付加することができる。例えば、長いポリＡテールは、ポリＡポリメラーゼを使用して合成ＲＮＡまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡに付加することができる（Ｙｏｋｏｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２−１２５６）。転写ベクターが、長いポリＡテールをコードすることもできる。加えて、ポリＡテールは、ＰＣＲ産物から直接転写することによって付加することができる。ポリＡは、ＲＮＡリガーゼを用いてセンスＲＮＡの３’末端にライゲーションすることもできる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９９１  ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと）。
【０１０９】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは３’テール構造を含む。テール構造は典型的に、ポリ（Ａ）テールおよび／またはポリ（Ｃ）テールを含む。ｍＲＮＡの３’末端上のポリＡテールまたはポリＣテールは、典型的には、少なくとも５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも１５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、または少なくとも１ｋｂのアデノシヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチドをそれぞれ含む。一部の実施形態では、ポリＡテールまたはポリＣテールはそれぞれ、約１０〜８００個のアデノシンヌクレオチドまたはシトシンヌクレオチド（例えば、約１０〜２００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜３００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜４００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜５００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜５５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約５０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１００〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１５０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２００〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２５０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約３００〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約３５０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約４００〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約４５０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約５００〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜１５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜１００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２０〜７０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、または約２０〜６０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド）であり得る。一部の実施形態では、テール構造は、本明細書に記載の様々な長さを有するポリ（Ａ）テールおよびポリ（Ｃ）テールの組み合わせを含む。一部の実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアデノシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のシトシンヌクレオチドを含む。
【０１１０】
一部の実施形態では、ポリＡテールまたはポリＣテールの長さを調節して、本発明の修飾センスｍＲＮＡ分子の安定性を制御し、それにともなってタンパク質の転写を制御する。例えば、ポリＡテールの長さはセンスｍＲＮＡ分子の半減期に影響を及ぼし得るため、ポリＡテールの長さを調節して、ヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの耐性のレベルを改変し、それによって、標的細胞におけるポリヌクレオチドの発現及び／またはポリペプチドの産生の時間経過を制御してもよい。
【０１１１】
５’および３’の非翻訳領域
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’および／または３’非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域には、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす一つ以上の要素、例えば、鉄応答要素が含まれる。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、長さ約５０〜５００のヌクレオチドであり得る。
【０１１２】
一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞中のｍＲＮＡの位置の安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの一つ以上の結合部位のうちの一つ以上を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、長さ約５０〜５００ヌクレオチドであるか、またはそれ以上の長さであり得る。
【０１１３】
例示的な３’および／または５’のＵＴＲ配列は、センスｍＲＮＡ分子の安定性を強化するために、安定なｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路酵素）から誘導されてもよい。例えば、５’ＵＴＲ配列は、ヌクレアーゼ耐性を改善するため、及び／またはポリヌクレオチドの半減期を改善するために、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子またはその断片の部分配列を含み得る。ポリヌクレオチドをさらに安定化させるために、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端または非翻訳領域にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）またはその断片をコードする配列を含めることも想定される。一般に、これらの修飾は、ポリヌクレオチドの安定性及び／または薬物動態特性（例えば、半減期）を、それらの未修飾の対応物に比べて改善するものであり、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏヌクレアーゼ消化に対するポリヌクレオチド耐性を改善するように行われる修飾を含む。
【０１１４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応からもたらされたｍＲＮＡが、一部の実施形態で望ましい一方、細菌、真菌、植物、および／または動物から産生されたｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡの他の供給源が、本発明の範囲内であると意図される。
【０１１５】
本発明を使用して、様々なタンパク質をコードするｍＲＮＡを送達することができる。本発明に適したｍＲＮＡの非限定的な例には、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、およびオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）などの標的タンパク質をコードするｍＲＮＡが含まれる。
【０１１６】
ｍＲＮＡ配列の例
一部の実施形態では、本発明は、標的タンパク質欠損の治療を目的に、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡを対象に送達するための方法および組成物を提供する。例示的なｍＲＮＡ配列を以下に示す。
コンストラクト設計：
Ｘ−ｍＲＮＡコード配列−Ｙ
５’および３’のＵＴＲ配列
Ｘ（５’ＵＴＲ配列）＝
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ（配列番号１）
Ｙ（３’ＵＴＲ配列）＝
ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＧＣＵ（配列番号２）
または
ＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＡＧＣＵ（配列番号３）
コドン最適化されたヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）メッセンジャーＲＮＡ配列の全長の例を以下に示す：
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧＡＵＧＣＵＧＵＵＣＡＡＣＣＵＵＣＧＧＡＵＣＵＵＧＣＵＧＡＡＣＡＡＣＧＣＵＧＣＧＵＵＣＣＧＧＡＡＵＧＧＵＣＡＣＡＡＣＵＵＣＡＵＧＧＵＣＣＧＧＡＡＣＵＵＣＡＧＡＵＧＣＧＧＣＣＡＧＣＣＧＣＵＣＣＡＧＡＡＣＡＡＧＧＵＧＣＡＧＣＵＣＡＡＧＧＧＧＡＧＧＧＡＣＣＵＣＣＵＣＡＣＣＣＵＧＡＡＡＡＡＣＵＵＣＡＣＣＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＵＣＡＡＧＵＡＣＡＵＧＣＵＧＵＧＧＣＵＧＵＣＡＧＣＣＧＡＣＣＵＣＡＡＡＵＵＣＣＧＧＡＵＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＡＵＡＣＣＵＵＣＣＵＵＵＧＣＵＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧＵＣＣＣＵＧＧＧＧＡＵＧＡＵＣＵＵＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＡＧＣＡＣＵＣＧＣＡＣＵＡＧＡＣＵＧＵＣＡＡＣＵＧＡＡＡＣＣＧＧＣＵＵＣＧＣＧＣＵＧＣＵＧＧＧＡＧＧＡＣＡＣＣＣＣＵＧＣＵＵＣＣＵＧＡＣＣＡＣＣＣＡＡＧＡＵＡＵＣＣＡＵＣＵＧＧＧＵＧＵＧＡＡＣＧＡＡＵＣＣＣＵＣＡＣＣＧＡＣＡＣＡＧＣＧＣＧＧＧＵＧＣＵＧＵＣＧＵＣＣＡＵＧＧＣＡＧＡＣＧＣＧＧＵＣＣＵＣＧＣＣＣＧＣＧＵＧＵＡＣＡＡＧＣＡＧＵＣＵＧＡＵＣＵＧＧＡＣＡＣＵＣＵＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＧＣＣＵＣＣＡＵＵＣＣＵＡＵＣＡＵＵＡＡＵＧＧＡＵＵＧＵＣＣＧＡＣＣＵＣＵＡＣＣＡＵＣＣＣＡＵＣＣＡＧＡＵＵＣＵＧＧＣＣＧＡＵＵＡＵＣＵＧＡＣＵＣＵＧＣＡＡＧＡＡＣＡＵＵＡＣＡＧＣＵＣＣＣＵＧＡＡＧＧＧＧＣＵＵＡＣＣＣＵＵＵＣＧＵＧＧＡＵＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＣＡＵＵＡＵＧＡＵＧＡＧＣＧＣＵＧＣＣＡＡＧＵＵＵＧＧＡＡＵＧＣＡＣＣＵＣＣＡＡＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＣＧＡＡＧＧＧＡＵＡＣＧＡＧＣＣＡＧＡＣＧＣＣＵＣＣＧＵＧＡＣＧＡＡＧＣＵＧＧＣＵＧＡＧＣＡＧＵＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＧＧＣＡＣＵＡＡＧＣＵＧＣＵＧＣＵＣＡＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＵＣＵＣＧＡＡＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＧＵＧＧＣＡＡＣＧＵＧＣＵＧＡＵＣＡＣＣＧＡＵＡＣＣＵＧＧＡＵＣＵＣＣＡＵＧＧＧＡＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣＣＵＧＣＡＡＧＣＡＵＵＵＣＡＧＧＧＧＵＡＣＣＡＧＧＵＧＡＣＵＡＵＧＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＧＵＣＧＣＣＧＣＣＵＣＧＧＡＣＵＧＧＡＣＣＵＵＣＵＵＧＣＡＣＵＧＵＣＵＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣＧＡＡＧＡＧＧＵＧＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＵＧＵＵＣＵＡＣＡＧＣＣＣＧＣＧＧＵＣＧＣＵＧＧＵＣＵＵＵＣＣＧＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＵＧＧＡＣＵＡＵＣＡＵＧＧＣＣＧＵＧＡＵＧＧＵＧＵＣＣＣＵＧＣＵＧＡＣＣＧＡＵＵＡＣＵＣＣＣＣＧＣＡＧＣＵＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＡＡＧＵＵＣＵＧＡＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＧＣＵ（配列番号４）。
コドン最適化されたヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）メッセンジャーＲＮＡ配列の全長の例を以下に示す：
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧＡＵＧＣＵＧＵＵＣＡＡＣＣＵＵＣＧＧＡＵＣＵＵＧＣＵＧＡＡＣＡＡＣＧＣＵＧＣＧＵＵＣＣＧＧＡＡＵＧＧＵＣＡＣＡＡＣＵＵＣＡＵＧＧＵＣＣＧＧＡＡＣＵＵＣＡＧＡＵＧＣＧＧＣＣＡＧＣＣＧＣＵＣＣＡＧＡＡＣＡＡＧＧＵＧＣＡＧＣＵＣＡＡＧＧＧＧＡＧＧＧＡＣＣＵＣＣＵＣＡＣＣＣＵＧＡＡＡＡＡＣＵＵＣＡＣＣＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＵＣＡＡＧＵＡＣＡＵＧＣＵＧＵＧＧＣＵＧＵＣＡＧＣＣＧＡＣＣＵＣＡＡＡＵＵＣＣＧＧＡＵＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＡＵＡＣＣＵＵＣＣＵＵＵＧＣＵＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧＵＣＣＣＵＧＧＧＧＡＵＧＡＵＣＵＵＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＡＧＣＡＣＵＣＧＣＡＣＵＡＧＡＣＵＧＵＣＡＡＣＵＧＡＡＡＣＣＧＧＣＵＵＣＧＣＧＣＵＧＣＵＧＧＧＡＧＧＡＣＡＣＣＣＣＵＧＣＵＵＣＣＵＧＡＣＣＡＣＣＣＡＡＧＡＵＡＵＣＣＡＵＣＵＧＧＧＵＧＵＧＡＡＣＧＡＡＵＣＣＣＵＣＡＣＣＧＡＣＡＣＡＧＣＧＣＧＧＧＵＧＣＵＧＵＣＧＵＣＣＡＵＧＧＣＡＧＡＣＧＣＧＧＵＣＣＵＣＧＣＣＣＧＣＧＵＧＵＡＣＡＡＧＣＡＧＵＣＵＧＡＵＣＵＧＧＡＣＡＣＵＣＵＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＧＣＣＵＣＣＡＵＵＣＣＵＡＵＣＡＵＵＡＡＵＧＧＡＵＵＧＵＣＣＧＡＣＣＵＣＵＡＣＣＡＵＣＣＣＡＵＣＣＡＧＡＵＵＣＵＧＧＣＣＧＡＵＵＡＵＣＵＧＡＣＵＣＵＧＣＡＡＧＡＡＣＡＵＵＡＣＡＧＣＵＣＣＣＵＧＡＡＧＧＧＧＣＵＵＡＣＣＣＵＵＵＣＧＵＧＧＡＵＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＣＡＵＵＡＵＧＡＵＧＡＧＣＧＣＵＧＣＣＡＡＧＵＵＵＧＧＡＡＵＧＣＡＣＣＵＣＣＡＡＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＣＧＡＡＧＧＧＡＵＡＣＧＡＧＣＣＡＧＡＣＧＣＣＵＣＣＧＵＧＡＣＧＡＡＧＣＵＧＧＣＵＧＡＧＣＡＧＵＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＧＧＣＡＣＵＡＡＧＣＵＧＣＵＧＣＵＣＡＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＵＣＵＣＧＡＡＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＧＵＧＧＣＡＡＣＧＵＧＣＵＧＡＵＣＡＣＣＧＡＵＡＣＣＵＧＧＡＵＣＵＣＣＡＵＧＧＧＡＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣＣＵＧＣＡＡＧＣＡＵＵＵＣＡＧＧＧＧＵＡＣＣＡＧＧＵＧＡＣＵＡＵＧＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＧＵＣＧＣＣＧＣＣＵＣＧＧＡＣＵＧＧＡＣＣＵＵＣＵＵＧＣＡＣＵＧＵＣＵＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣＧＡＡＧＡＧＧＵＧＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＵＧＵＵＣＵＡＣＡＧＣＣＣＧＣＧＧＵＣＧＣＵＧＧＵＣＵＵＵＣＣＧＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＵＧＧＡＣＵＡＵＣＡＵＧＧＣＣＧＵＧＡＵＧＧＵＧＵＣＣＣＵＧＣＵＧＡＣＣＧＡＵＵＡＣＵＣＣＣＣＧＣＡＧＣＵＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＡＡＧＵＵＣＵＧＡＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＡＧＣＵ（配列番号５）。
コドン最適化されたヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）メッセンジャーＲＮＡ配列全長の別の例を以下に示す：
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧＡＵＧＣＵＧＵＵＵＡＡＣＣＵＧＡＧＡＡＵＵＣＵＧＣＵＧＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＵＵＣＡＧＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＵＵＵＣＡＵＧＧＵＣＣＧＣＡＡＣＵＵＵＡＧＡＵＧＣＧＧＡＣＡＧＣＣＵＣＵＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＧＵＣＣＡＧＣＵＣＡＡＧＧＧＧＣＧＧＧＡＣＵＵＧＣＵＧＡＣＣＣＵＵＡＡＧＡＡＣＵＵＵＡＣＣＧＧＣＧＡＡＧＡＧＡＵＣＡＡＧＵＡＣＡＵＧＣＵＧＵＧＧＵＵＧＵＣＡＧＣＧＧＡＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＣＧＣＡＵＣＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＧＵＡＵＣＵＧＣＣＧＣＵＧＣＵＣＣＡＡＧＧＡＡＡＧＵＣＧＣＵＣＧＧＣＡＵＧＡＵＣＵＵＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＵＣＧＡＣＣＡＧＡＡＣＣＣＧＧＣＵＧＵＣＣＡＣＵＧＡＡＡＣＵＧＧＵＵＵＣＧＣＣＣＵＵＣＵＧＧＧＵＧＧＡＣＡＣＣＣＵＵＧＵＵＵＣＣＵＧＡＣＡＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＵＣＣＡＵＣＵＧＧＧＣＧＵＧＡＡＣＧＡＡＡＧＣＣＵＣＡＣＵＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＧＧＵＧＣＵＧＡＧＣＵＣＣＡＵＧＧＣＣＧＡＣＧＣＵＧＵＣＣＵＵＧＣＣＣＧＧＧＵＧＵＡＣＡＡＧＣＡＧＵＣＣＧＡＵＣＵＧＧＡＣＡＣＵＣＵＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＧＣＧＵＣＣＡＵＣＣＣＧＡＵＣＡＵＵＡＡＣＧＧＡＣＵＧＵＣＣＧＡＣＣＵＧＵＡＣＣＡＣＣＣＧＡＵＣＣＡＧＡＵＵＣＵＧＧＣＣＧＡＣＵＡＣＣＵＧＡＣＣＵＵＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＣＡＣＵＧＡＡＧＧＧＣＵＵＧＡＣＣＣＵＧＡＧＣＵＧＧＡＵＣＧＧＣＧＡＣＧＧＡＡＡＣＡＡＣＡＵＵＣＵＧＣＡＵＵＣＧＡＵＣＡＵＧＡＵＧＵＣＣＧＣＧＧＣＣＡＡＧＵＵＣＧＧＡＡＵＧＣＡＵＣＵＧＣＡＧＧＣＣＧＣＡＡＣＵＣＣＣＡＡＧＧＧＡＵＡＣＧＡＡＣＣＵＧＡＵＧＣＧＵＣＣＧＵＧＡＣＵＡＡＧＣＵＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＵＡＣＧＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＡＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＧＣＵＣＧＡＡＧＣＵＧＣＣＣＡＣＧＧＡＧＧＧＡＡＣＧＵＧＣＵＣＡＵＵＡＣＣＧＡＣＡＣＵＵＧＧＡＵＣＵＣＣＡＵＧＧＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＣＵＣＣＡＧＧＣＡＵＵＣＣＡＧＧＧＵＵＡＣＣＡＧＧＵＣＡＣＣＡＵＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＡＡＡＧＵＧＧＣＣＧＣＵＵＣＧＧＡＵＵＧＧＡＣＵＵＵＣＣＵＣＣＡＣＵＧＣＣＵＵＣＣＣＣＧＣＡＡＡＣＣＵＧＡＧＧＡＡＧＵＧＧＡＵＧＡＵＧＡＡＧＵＧＵＵＣＵＡＣＵＣＣＣＣＡＣＧＣＵＣＣＣＵＣＧＵＧＵＵＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＵＣＧＧＡＡＧＵＧＧＡＣＣＡＵＵＡＵＧＧＣＣＧＵＧＡＵＧＧＵＧＵＣＡＣＵＧＣＵＧＡＣＣＧＡＣＵＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＡＣＵＧＣＡＡＡＡＧＣＣＧＡＡＧＵＵＣＵＧＡＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＧＣＵ（配列番号６）
コドン最適化ヒトＡＳＳ１（ＣＯ−ｈＡＳＳ１）コード配列の例
ＡＵＧＡＧＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＧＵＧＧＵＧＣＵＧＧＣＣＵＡＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＣＵＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＵＧＣＡＵＣＣＵＧＧＵＧＵＧＧＣＵＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＧＧＣＵＡＣＧＡＣＧＵＧＡＵＣＧＣＣＵＡＣＣＵＧＧＣＣＡＡＣＡＵＣＧＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＵＵＣＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＧＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＣＵＧＡＡＧＣＵＧＧＧＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＵＧＵＵＣＡＵＣＧＡＧＧＡＣＧＵＧＡＧＣＣＧＣＧＡＧＵＵＣＧＵＧＧＡＧＧＡＧＵＵＣＡＵＣＵＧＧＣＣＣＧＣＣＡＵＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＣＣＣＵＧＵＡＣＧＡＧＧＡＣＣＧＣＵＡＣＣＵＧＣＵＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＵＧＧＣＣＣＧＣＣＣＣＵＧＣＡＵＣＧＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＧＧＵＧＧＡＧＡＵＣＧＣＣＣＡＧＣＧＣＧＡＧＧＧＣＧＣＣＡＡＧＵＡＣＧＵＧＡＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧＧＵＧＣＧＣＵＵＣＧＡＧＣＵＧＡＧＣＵＧＣＵＡＣＡＧＣＣＵＧＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＵＣＡＡＧＧＵＧＡＵＣＧＣＣＣＣＣＵＧＧＣＧＣＡＵＧＣＣＣＧＡＧＵＵＣＵＡＣＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＡＡＣＧＡＣＣＵＧＡＵＧＧＡＧＵＡＣＧＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＧＣＡＵＣＣＣＣＡＵＣＣＣＣＧＵＧＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣＵＧＧＡＧＣＡＵＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣＣＵＧＡＵＧＣＡＣＡＵＣＡＧＣＵＡＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＡＵＣＣＵＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＣＵＧＵＡＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＣＣＣＧＡＣＡＵＣＣＵＧＧＡＧＡＵＣＧＡＧＵＵＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＵＧＣＣＣＧＵＧＡＡＧＧＵＧＡＣＣＡＡＣＧＵＧＡＡＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＣＵＧＧＡＧＣＵＧＵＵＣＡＵＧＵＡＣＣＵＧＡＡＣＧＡＧＧＵＧＧＣＣＧＧＣＡＡＧＣＡＣＧＧＣＧＵＧＧＧＣＣＧＣＡＵＣＧＡＣＡＵＣＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＵＣＧＧＣＡＵＧＡＡＧＡＧＣＣＧＣＧＧＣＡＵＣＵＡＣＧＡＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＧＧＣＡＣＣＡＵＣＣＵＧＵＡＣＣＡＣＧＣＣＣＡＣＣＵＧＧＡＣＡＵＣＧＡＧＧＣＣＵＵＣＡＣＣＡＵＧＧＡＣＣＧＣＧＡＧＧＵＧＣＧＣＡＡＧＡＵＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＵＧＧＧＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＧＡＧＣＵＧＧＵＧＵＡＣＡＣＣＧＧＣＵＵＣＵＧＧＣＡＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＵＧＣＧＡＧＵＵＣＧＵＧＣＧＣＣＡＣＵＧＣＡＵＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＧＵＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＧＵＧＣＡＧＧＵＧＡＧＣＧＵＧＣＵＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＧＵＧＵＡＣＡＵＣＣＵＧＧＧＣＣＧＣＧＡＧＡＧＣＣＣＣＣＵＧＡＧＣＣＵＧＵＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡＧＣＵＧＧＵＧＡＧＣＡＵＧＡＡＣＧＵＧＣＡＧＧＧＣＧＡＣＵＡＣＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＵＵＣＡＵＣＡＡＣＡＵＣＡＡＣＡＧＣＣＵＧＣＧＣＣＵＧＡＡＧＧＡＧＵＡＣＣＡＣＣＧＣＣＵＧＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＵＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＵＧＡ（配列番号７）
コドン最適化ヒトＰＡＨ（ＣＯ−ｈＰＡＨ）コード配列の例
ＡＵＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＧＵＧＣＵＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧＣＣＵＧＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＵＧＡＧＣＧＡＣＵＵＣＧＧＣＣＡＧＧＡＧＡＣＣＡＧＣＵＡＣＡＵＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＧＧＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＣＵＧＡＵＣＵＵＣＡＧＣＣＵＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＵＧＧＧＣＧＣＣＣＵＧＧＣＣＡＡＧＧＵＧＣＵＧＣＧＣＣＵＧＵＵＣＧＡＧＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＵＧＡＡＣＣＵＧＡＣＣＣＡＣＡＵＣＧＡＧＡＧＣＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＣＵＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＧＡＧＵＡＣＧＡＧＵＵＣＵＵＣＡＣＣＣＡＣＣＵＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＡＧＣＣＵＧＣＣＣＧＣＣＣＵＧＡＣＣＡＡＣＡＵＣＡＵＣＡＡＧＡＵＣＣＵＧＣＧＣＣＡＣＧＡＣＡＵＣＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＵＧＣＡＣＧＡＧＣＵＧＡＧＣＣＧＣＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＡＣＣＧＵＧＣＣＣＵＧＧＵＵＣＣＣＣＣＧＣＡＣＣＡＵＣＣＡＧＧＡＧＣＵＧＧＡＣＣＧＣＵＵＣＧＣＣＡＡＣＣＡＧＡＵＣＣＵＧＡＧＣＵＡＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＣＵＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＣＣＣＧＧＣＵＵＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＧＵＧＵＡＣＣＧＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＡＡＧＣＡＧＵＵＣＧＣＣＧＡＣＡＵＣＧＣＣＵＡＣＡＡＣＵＡＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＵＣＣＣＣＣＧＣＧＵＧＧＡＧＵＡＣＡＵＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＵＧＧＧＧＣＡＣＣＧＵＧＵＵＣＡＡＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＡＧＣＣＵＧＵＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＣＵＧＣＵＡＣＧＡＧＵＡＣＡＡＣＣＡＣＡＵＣＵＵＣＣＣＣＣＵＧＣＵＧＧＡＧＡＡＧＵＡＣＵＧＣＧＧＣＵＵＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＡＵＣＣＣＣＣＡＧＣＵＧＧＡＧＧＡＣＧＵＧＡＧＣＣＡＧＵＵＣＣＵＧＣＡＧＡＣＣＵＧＣＡＣＣＧＧＣＵＵＣＣＧＣＣＵＧＣＧＣＣＣＣＧＵＧＧＣＣＧＧＣＣＵＧＣＵＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＡＣＵＵＣＣＵＧＧＧＣＧＧＣＣＵＧＧＣＣＵＵＣＣＧＣＧＵＧＵＵＣＣＡＣＵＧＣＡＣＣＣＡＧＵＡＣＡＵＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＡＵＧＵＡＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＡＣＡＵＣＵＧＣＣＡＣＧＡＧＣＵＧＣＵＧＧＧＣＣＡＣＧＵＧＣＣＣＣＵＧＵＵＣＡＧＣＧＡＣＣＧＣＡＧＣＵＵＣＧＣＣＣＡＧＵＵＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＵＣＧＧＣＣＵＧＧＣＣＡＧＣＣＵＧＧＧＣＧＣＣＣＣＣＧＡＣＧＡＧＵＡＣＡＵＣＧＡＧＡＡＧＣＵＧＧＣＣＡＣＣＡＵＣＵＡＣＵＧＧＵＵＣＡＣＣＧＵＧＧＡＧＵＵＣＧＧＣＣＵＧＵＧＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＧＡＣＡＧＣＡＵＣＡＡＧＧＣＣＵＡＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＣＵＧＣＵＧＡＧＣＡＧＣＵＵＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＣＡＧＵＡＣＵＧＣＣＵＧＡＧＣＧＡＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＵＧＣＵＧＣＣＣＣＵＧＧＡＧＣＵＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＧＣＣＡＵＣＣＡＧＡＡＣＵＡＣＡＣＣＧＵＧＡＣＣＧＡＧＵＵＣＣＡＧＣＣＣＣＵＧＵＡＣＵＡＣＧＵＧＧＣＣＧＡＧＡＧＣＵＵＣＡＡＣＧＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＵＧＣＧＣＡＡＣＵＵＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＵＵＣＡＧＣＧＵＧＣＧＣＵＡＣＧＡＣＣＣＣＵＡＣＡＣＣＣＡＧＣＧＣＡＵＣＧＡＧＧＵＧＣＵＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＡＧＣＡＧＣＵＧＡＡＧＡＵＣＣＵＧＧＣＣＧＡＣＡＧＣＡＵＣＡＡＣＡＧＣＧＡＧＡＵＣＧＧＣＡＵＣＣＵＧＵＧＣＡＧＣＧＣＣＣＵＧＣＡＧＡＡＧＡＵＣＡＡＧＵＡＡ（配列番号８）
【０１１７】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は、標的タンパク質の相同体または類似体をコードし得る。例えば、標的タンパク質の相同体または類似体は、実質的な標的タンパク質の活性を保持しながら、野生型または天然型の標的タンパク質と比較した場合に一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む修飾標的タンパク質であってもよい。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、上記の例示的な配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、標的タンパク質と実質的に同一であるタンパク質をコードする。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、上記の例示的な配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、標的タンパク質の断片または一部をコードする。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは標的タンパク質の断片または一部をコードし、該タンパク質の断片または一部は、野生型タンパク質と類似した標的活性を依然として維持している。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、上記の例示的な配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を有する。
【０１１８】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、別のタンパク質に融合した標的タンパク質（例えばＮ末端またはＣ末端融合物）の全長、断片、または一部を含む融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、標的タンパク質の全長、断片、または一部をコードするｍＲＮＡに融合したタンパク質は、シグナル配列または細胞標的化配列をコードする。
【０１１９】
脂質ナノ粒子
本発明によると、ｍＲＮＡはナノ粒子に封入されるかまたは複合体化され得る。一部の実施形態では、ナノ粒子は、「送達ビヒクル」、「移送ビヒクル」、またはそれらの文法的等価物とも称される。
【０１２０】
様々な実施形態によると、好適なナノ粒子として、以下に限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリマー系担体、脂質ナノ粒子およびリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然および合成由来のエキソソーム、天然層状体、合成層状体および半合成層状体、ナノ粒子、カルシウムリン−ケイ酸塩ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、微結晶微粒子、半導体ナノ粒子、ポリ（Ｄ−アルギニン）、ゾルゲル、ナノデンドリマー、デンプンベース送達系、ミセル、エマルジョン、ニオソーム、多ドメインブロックポリマー（ビニルポリマー、ポリプロピルアクリル酸ポリマー、動的多抱合体）、乾燥粉末製剤、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、ならびに他の指向性タグが挙げられる。
【０１２１】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは一個以上のリポソーム内に封入される。本明細書において使用される場合、「リポソーム」という用語は、任意の層状、多重層状、または固形のナノ粒子小胞を指す。典型的には、本明細書において使用されるリポソームは、一種以上の脂質を混合することにより、または一種以上の脂質とポリマーを混合することにより形成され得る。ゆえに本明細書において使用される「リポソーム」という用語は、脂質系ナノ粒子およびポリマー系ナノ粒子の両方を包含する。一部の実施形態では、本発明に適したリポソームは、カチオン性または非カチオン性脂質、コレステロール系脂質、および／またはＰＥＧ修飾脂質を含む。
【０１２２】
ＰＥＧ化脂質
一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、一種以上のＰＥＧ化脂質を含む。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質およびＮ−オクタノイル−スフィンゴシン−ｌ−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８  ＰＥＧ−２０００セラミド）を含めた誘導体化されたセラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）などの誘導体化脂質も、本発明により企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質は、長さがＣ６〜Ｃ２０のアルキル鎖を有する脂質に共有結合された長さ最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖を含むが、これに限定されない。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ−２Ｋである。一部の実施形態では、特定の有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧセラミドである。
【０１２３】
ＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化脂質は、リポソーム内の総脂質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％を構成し得る。
【０１２４】
カチオン性脂質
本明細書で使用される場合、語句「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有する多数の脂質種のいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質は文献に記載されており、その多くは市販されている。本発明の組成物及び方法で使用するのに特に好適なカチオン性脂質は、国際特許公開第２０１０／０５３５７２号（具体的には、段落［００２２５］に記載されているＣ１２−２００）及び国際公開第２０１２／１７０９３０号に記載されているものを含み、その両方の文献は、参照により本明細書に援用される。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法に適したカチオン性脂質は、例えば、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−ｌ−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−ｌ−アミン（ＨＧＴ５００１）、及び（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−１−アミン（ＨＧＴ５００２）などの、２０１２年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたイオン化可能なカチオン性脂質を含む。
【０１２５】
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適したカチオン性脂質は、３，６−ビス（４−（ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−２−ヒドロキシオクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン（ＯＦ−０２）などのカチオン性脂質を含む。
【０１２６】
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適したカチオン性脂質は、３−（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）−６−（４−（（２−ヒドロキシドデシル）（２−ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（ターゲット２３）、３−（５−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン−２−イル）−６−（５−（（２−ヒドロキシドデシル）（２−ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン−２−イル）−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（ターゲット２４）などの名称「核酸の送達のための生分解性脂質」の国際公開第２０１５／１８４２５６号Ａ２（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるカチオン性脂質を含む。
【０１２７】
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適したカチオン性脂質は、名称「メッセンジャーＲＮＡの送達のための脂質製剤」の国際公開第２０１３／０６３４６８号と米国仮出願に記載されるカチオン性脂質を含み、その両方の文献は、参照により本明細書に援用される。
【０１２８】
一部の実施形態では、本発明に適した一種以上のカチオン性脂質は、Ｎ−［ｌ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、または「ＤＯＴＭＡ」であってもよい。（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号）。他の好適なカチオン性脂質として、例えば、５−カルボキシスペルミルグリジンジオクタデシルアミド（ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）すなわち「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｌ−プロパンアミニウムすなわち「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）；米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、ｌ，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパンすなわち「ＤＯＤＡＰ」、ｌ，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンすなわち「ＤＯＴＡＰ」が挙げられる。
【０１２９】
さらなる例示的なカチオン性脂質として、ｌ，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＯＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、ｌ，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＤＡＢ」、Ｎ−（ｌ，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−ｌ−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパンまたは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−［５’−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−ｌ−（シス，シス−９’，ｌ−２’−オクタデカジエノキシ）プロパンまたは「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンまたは「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミンまたは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、ｌ，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、ｌ，２−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［ｌ，３］−ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ−ＤＭＡ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［ｌ，３］−ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」、及び２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，ｌ  ２−ジエン−１−イル）−ｌ，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ））（国際公開第２０１０／０４２８７７号；Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２−１７６（２０１０）を参照のこと）、またはこれらの混合物が挙げられる。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７：２７６−２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３−１００７（２００５）；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１号）。一部の実施形態では、カチオン性脂質のうちの一つ以上は、イミダゾール部分、ジアルキルアミノ部分、またはグアニジウム部分のうちの少なくとも一つを含む。
【０１３０】
一部の実施形態では、一つ以上のカチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル  ４−（ジメチルアミノ）ブタノアート）、ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン））、ＮＣ９８−５（４，７，１３−トリス（３−オキソ−３−（ウンデシルアミノ）プロピル）−Ｎ１，Ｎ１６−ジウンデシル−４，７，１０，１３−テトラアザヘキサデカン−１，１６−ジアミド）から選択されてもよい。
【０１３１】
用語「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有する多数の脂質またはリピドイドのいずれかを指す。
【０１３２】
本発明の組成物および方法で使用するための適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１０／１４４７４号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、カチオン性脂質、以下の化合物構造を有する、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル  ４−（ジメチルアミノ）ブタン酸塩：
【化１】
2021523916.tif 000002
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１３３】
本発明の組成物および方法で使用するためのその他の適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される、国際特許公開第２０１３／１４９１４０号に記載されるイオン化可能なカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のうちの一つのカチオン性脂質
【化２】
2021523916.tif 000003
またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素、任意で置換された、可変飽和または不飽和Ｃ１−Ｃ２０アルキル、および任意で置換された、可変飽和または不飽和Ｃ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、式中、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して水素、任意で置換されたＣ１−Ｃ３０アルキル、任意で置換された可変不飽和Ｃ１−Ｃ３０アルケニル、および任意で置換されたＣ１−Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され、式中、ｍおよびｏはそれぞれ独立して、ゼロおよび任意の正の整数（例えば、ｍは３）であり、式中、ｎはゼロまたは任意の正の整数（例えば、ｎは１）である。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ、１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−ｌ−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン（「ＨＧＴ５０００」）：
【化３】
2021523916.tif 000004
（ＨＧＴ−５０００）
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ、１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−ｌ−アミン（「ＨＧＴ５００１」）：
【化４】
2021523916.tif 000005
（ＨＧＴ−５００１）
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質および（１５Ｚ、１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−１−アミン（「ＨＧＴ５００２」）：
【化５】
2021523916.tif 000006
（ＨＧＴ−５００２）
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１３４】
本発明の組成物および方法で使用するためのその他の適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される、国際特許公開第２０１０／０５３５７２号に、アミノアルコールリピドイドとして記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化６】
2021523916.tif 000007
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１３５】
本発明の組成物および方法で使用するための他の適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１６／１１８７２５号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化７】
2021523916.tif 000008
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１３６】
本発明の組成物および方法で使用するための他の適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１６／１１８７２４号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化８】
2021523916.tif 000009
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１３７】
本発明の組成物および方法において使用するための他の好適なカチオン性脂質は、１４，２５−ジトリデシル１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタンの式を有するカチオン性脂質、およびその薬学的に許容可能な塩を含む。
【０１３８】
本発明の組成物および方法で使用するための他の適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１３／０６３４６８号および国際特許公開第２０１６／２０５６９１号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
【化９】
2021523916.tif 000010
またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、ＲＬは独立して任意で置換されたＣ６−Ｃ４０アルケニルである。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化１０】
2021523916.tif 000011
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化１１】
2021523916.tif 000012
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化１２】
2021523916.tif 000013
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化１３】
2021523916.tif 000014
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１３９】
本発明の組成物および方法で使用するための他の適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１５／１８４２５６号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
【化１４】
2021523916.tif 000015
またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、各Ｘは独立してＯまたはＳであり；各Ｙは独立してＯまたはＳであり；各ｍは独立して０〜２０であり；各ｎは独立して１〜６であり；各ＲＡは独立して水素、任意で置換されるＣ１−５０アルキル、任意で置換されるＣ２−５０アルケニル、任意で置換されるＣ２−５０アルキニル、任意で置換されるＣ３−１０カルボシクリル、任意で置換される３〜１４員のヘテロシクリル、任意で置換されるＣ６−１４アリール、任意で置換される５〜１４員のヘテロアリールまたはハロゲンであり、各ＲＢは独立して水素、任意で置換されるＣ１−５０アルキルと、任意で置換されるＣ２−５０アルケニル、任意で置換されるＣ２−５０アルキニル、任意で置換されるＣ３−１０カルボシクリル、任意で置換される３〜１４員のヘテロシクリル、任意で置換されるＣ６−１４アリール、任意選択的に置換される５〜１４員のヘテロアリールまたはハロゲンである。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ターゲット２３」：
【化１５】
2021523916.tif 000016
（ターゲット２３）
【０１４０】
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１４１】
本発明の組成物および方法で使用するための他の適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１６／００４２０２号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化１６】
2021523916.tif 000017
またはその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化１７】
2021523916.tif 000018
またはその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化１８】
2021523916.tif 000019
またはその薬学的に許容可能な塩を含む。
【０１４２】
本発明の組成物および方法で使用するためのその他の適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照により援用される、Ｊ．ＭｃＣｌｅｌｌａｎ，Ｍ．Ｃ．Ｋｉｎｇ，Ｃｅｌｌ  ２０１０，１４１，２１０−２１７およびＷｈｉｔｅｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１４）５：４２７７に記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化１９】
2021523916.tif 000020
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１４３】
本発明の組成物および方法で使用するための他の適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１５／１９９９５２号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２０】
2021523916.tif 000021
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２１】
2021523916.tif 000022
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２２】
2021523916.tif 000023
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２３】
2021523916.tif 000024
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２４】
2021523916.tif 000025
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２５】
2021523916.tif 000026
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２６】
2021523916.tif 000027
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２７】
2021523916.tif 000028
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２８】
2021523916.tif 000029
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化２９】
2021523916.tif 000030
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３０】
2021523916.tif 000031
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３１】
2021523916.tif 000032
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３２】
2021523916.tif 000033
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１４４】
本発明の組成物および方法で使用するための他の適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１７／００４１４３号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３３】
2021523916.tif 000034
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３４】
2021523916.tif 000035
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３５】
2021523916.tif 000036
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３６】
2021523916.tif 000037
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３７】
2021523916.tif 000038
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３８】
2021523916.tif 000039
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化３９】
2021523916.tif 000040
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４０】
2021523916.tif 000041
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４１】
2021523916.tif 000042
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４２】
2021523916.tif 000043
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４３】
2021523916.tif 000044
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４４】
2021523916.tif 000045
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４５】
2021523916.tif 000046
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４６】
2021523916.tif 000047
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４７】
2021523916.tif 000048
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４８】
2021523916.tif 000049
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化４９】
2021523916.tif 000050
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１４５】
本発明の組成物および方法で使用するための他の適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１７／０７５５３１号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
【化５０】
2021523916.tif 000051
またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、Ｌ１またはＬ２のうちの一つは、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、または−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−であり；もう一つのＬ１またはＬ２は、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）  ｘ、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−または−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−または直接結合であり；  Ｇ１およびＧ２は、それぞれ独立して非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキレンまたはＣ１−Ｃ１２  アルケニレンであり；Ｇ３はＣ１−Ｃ２４アルキレン、Ｃ１−Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルケニレンであり；ＲａはＨまたはＣ１−Ｃ１２アルキルであり；Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＣ６−Ｃ２４アルキルまたはＣ６−Ｃ２４アルケニルであり；Ｒ３はＨ、ＯＲ５、ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または−ＮＲ５  Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４はＣ１−Ｃ１２アルキルであり；Ｒ５はＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルであり；ｘは０、１または２である。
【０１４６】
本発明の組成物および方法で使用するための他の適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１７／１１７５２８号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化５１】
2021523916.tif 000052
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化５２】
2021523916.tif 000053
およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化５３】
2021523916.tif 000054
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１４７】
本発明の組成物および方法で使用するための他の適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１７／０４９２４５号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の式のうちの一つのカチオン性脂質：
【化５４】
2021523916.tif 000055
およびその薬学的に許容される塩を含む。これら四つの式のうちのいずれか一つについて、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱおよび−（ＣＨ２）  ｎＣＨＱＲから独立して選択され、Ｑは、−ＯＲ、−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、および複素環からなる群から選択され、ｎは１、２または３である。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化５５】
2021523916.tif 000056
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化５６】
2021523916.tif 000057
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化５７】
2021523916.tif 000058
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化５８】
2021523916.tif 000059
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１４８】
本発明の組成物および方法で使用するための他の適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１７／１７３０５４号および国際特許公開第２０１５／０９５３４０号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化５９】
2021523916.tif 000060
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化６０】
2021523916.tif 000061
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化６１】
2021523916.tif 000062
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化６２】
2021523916.tif 000063
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１４９】
本発明の組成物および方法で使用するためのその他の適切なカチオン性脂質は、コレステロール系カチオン性脂質を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するイミダゾールコレステロールエステルまたは「ＩＣＥ」：
【化６３】
2021523916.tif 000064
（ＩＣＥ）
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１５０】
本発明の組成物および方法で使用するための他の適切なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって援用される国際特許公開第２０１２／１７０８８９号に記載される切断可能カチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
【化６４】
2021523916.tif 000065
，
を含み、式中、Ｒ１は、イミダゾール、グアニジン、アミノ、イミン、エナミン、任意で置換されるアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノなどのアルキルアミノ）およびピリジルからなる群から選択され、Ｒ２は、以下の二つの式のうちの一つからなる群から選択され：
【化６５】
2021523916.tif 000066
式中、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、任意で置換される可変飽和または不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルキルおよび任意で置換される可変飽和または不飽和Ｃ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、式中、ｎは、０または任意の正の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）である。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００１」：
【化６６】
2021523916.tif 000067
（ＨＧＴ４００１）
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００２」：
【化６７】
2021523916.tif 000068
（ＨＧＴ４００２）
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００３」：
【化６８】
2021523916.tif 000069
（ＨＧＴ４００３）
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００４」：
【化６９】
2021523916.tif 000070
（ＨＧＴ４００４）
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００５」：
【化７０】
2021523916.tif 000071
（ＨＧＴ４００５）
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０１５１】
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、カチオン性脂質、Ｎ−［ｌ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）を含む。（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；本明細書に参照によって援用される、米国特許第４，８９７，３５５号）。本発明の組成物および方法のための他の好適なカチオン性脂質は、例えば、５−カルボキシスペルミルグリジンジオクタデシルアミド（ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｌ−プロパンアミニウム「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）；米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、ｌ，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン「ＤＯＤＡＰ」、ｌ，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン「ＤＯＴＡＰ」を含む。
【０１５２】
本発明の組成物および方法に適した追加の例示的なカチオン性脂質はまた、ｌ，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（「ＤＳＤＭＡ」）；１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（「ＤＯＤＭＡ」）、１，２−ジリノレイロキシオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（「ＤＬｉｎＤＭＡ」）、ｌ，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（「ＤＬｅｎＤＭＡ」）、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアルネルノニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）、Ｎ−（ｌ，２−ジミリチルチルオキシプロップ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−ｌ−（シス，シス−９，１２−オクタデカデノキシ）プロパン（「ＣＬｉｎＤＭＡ」）；  ２−［５’−（コレステロール−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチｌ−ｌ−（シス，シス−９’，ｌ２’−オクタデカデノキシ）プロパン（「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」）；  Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（「ＤＭＯＢＡ」）；  １，２−Ｎ、Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」）；  ２，３−ジリノレオイロイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミン（「ＤＬｉｎＤＡＰ」）、ｌ，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」）；  ｌ，２−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」）；２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［ｌ，３］−ジオキソラン（「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ」）；２−（（８−［（３Ｐ）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル）オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（「オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）」）；（２Ｒ）−２−（（８−［（３Ｐ）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル）オキシ）−Ｎ，ｆｓｌ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（「オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）」）；（２Ｓ）−２−（（８−［（３Ｐ）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル）オキシ）−Ｎ、ｆｓｌ−ジメチ３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（「オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）」）；２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［ｌ，３］−ジオキソラン（「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」）、および２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，ｌ  ２−ジエン−  １−イル）−ｌ，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（「ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ」）を含む（本明細書に参照によって援用される国際公開第２０１０／０４２８７７号参照；Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２−１７６（２０１０））。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７：２７６−２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３−１００７（２００５）；国際特許公開ＷＯ２００５／１２１３４８）。一部の実施形態では、カチオン性脂質のうちの一つ以上は、イミダゾール部分、ジアルキルアミノ部分、またはグアニジウム部分のうちの少なくとも一つを含む。
【０１５３】
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適した一つ以上のカチオン性脂質は、２，２−ジリノール−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（「ＸＴＣ」）；（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（「ＡＬＮＹ−１００」）および／または４，７，１３−トリス（３−オキソ−３−（ウンデシルアミノ）プロピル）−Ｎ１，Ｎ１６−ジウンデシル−４，７，１０，１３−テトラアザヘキサデカン−１，１６−ジアミド（「ＮＣ９８−５」）を含む。
【０１５４】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子の重量で測定して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する一つ以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子のモル％で測定して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する一つ以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子の重量で測定して、約３０〜７０％（例えば、約３０〜６５％、約３０〜６０％、約３０〜５５％、約３０〜５０％、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する一つ以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子のモル％で測定して、約３０〜７０％（例えば、約３０〜６５％、約３０〜６０％、約３０〜５５％、約３０〜５０％、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する一つ以上のカチオン性脂質を含む。
【０１５５】
非カチオン性／ヘルパー脂質
本明細書で使用される場合、語句「非カチオン性脂質」は、任意の中性脂質、双性イオン性脂質、または陰イオン性脂質を意味する。本明細書で使用される場合、語句「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の負電荷を運ぶ多数の脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質として、以下に限定されないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、ｌ−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が挙げられる。
【０１５６】
一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、重量またはモルで、適切な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％を構成しうる。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、重量またはモルで、適切な脂質溶液中の総脂質の約３０〜５０％（例えば、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。
【０１５７】
コレステロール系脂質
一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、一種以上のコレステロール系脂質を含む。例として、好適なコレステロール系カチオン性脂質として、例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥが挙げられる。一部の実施形態では、コレステロール系脂質は、重量またはモルで、適切な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％を構成する。一部の実施形態では、コレステロール系脂質は、重量またはモルで、適切な脂質溶液中の総脂質の約３０〜５０％（例えば、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。
【０１５８】
カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質、およびＰＥＧ修飾脂質の例示的組み合わせが実施例のセクションに記載されている。例えば、適切な脂質溶液は、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２−２００、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；またはＨＧＴ５００１、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含み得る。脂質混合物を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び／またはＰＥＧ修飾脂質の選択、ならびにこれらの脂質の相互の相対的モル比は、選択される脂質の特徴、ならびに封入されるべきｍＲＮＡの性質および特徴に基づく。さらなる考慮すべき事項には、例えば、選択される脂質のアルキル鎖の飽和度、ならびに大きさ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合性、及び毒性が含まれる。したがって、モル割合はそれらに応じて調節され得る。
【０１５９】
ｍＲＮＡ担持ナノ粒子
任意の望ましい脂質は、ｍＲＮＡの封入に適した任意の比で混合されうる。一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール、および／またはＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。
【０１６０】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子にｍＲＮＡを封入するプロセスは、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合することを含み、該ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液は、混合前に周囲温度よりも高い所定温度に加熱されて、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子を形成する（２０１５年７月２日に出願された「Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ」と題する米国特許出願公開第１４／７９０，５６２号、および２０１４年７月２日に出願された米国仮特許出願第６２／０２０，１６３号を参照されたく、これらの開示はその全体が本明細書に援用される）。
【０１６１】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子にｍＲＮＡを封入するプロセスは、予め形成した脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することを含む（２０１６年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４２０，４１３号、および２０１７年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６２／５８０，１５５号を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することで、ｍＲＮＡを細胞内に送達する効率を改善する脂質ナノ粒子が生じる。一部の実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することで、極めて高い封入効率（すなわち、９０〜９５％の範囲）でｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入することになる。一部の実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子とｍＲＮＡとを、プロセス全体にわたって脂質／ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を一定に維持し、かつ量産化を容易にするポンプシステムを用いて混合している。
【０１６２】
本発明による好適なリポソームは、様々な大きさに作製することができる。一部の実施形態では、提供されるリポソームは、従来から知られているｍＲＮＡ封入リポソームよりも小さく作製され得る。一部の実施形態では、リポソームの大きさが減少すると、ｍＲＮＡの送達効率が高くなる。適切なリポソームの大きさは、標的細胞または標的組織の部位を考慮し、また作製されるリポソームの用途をある程度考慮して選択することができる。
【０１６３】
一部の実施形態では、適切な大きさのリポソームを選択して、ｍＲＮＡによりコードされる抗体の全身分布を促進する。一部の実施形態では、特定の細胞または組織へのｍＲＮＡのトランスフェクションを限定することが望ましい場合がある。例えば、肝細胞を標的とするには、リポソームは、その寸法が肝臓の肝類洞を覆う内皮層の開窓よりも小さくなるように寸法決定されてもよく、こうした場合、リポソームは、その内皮開窓を容易に貫通して、標的肝細胞に達することができようになる。
【０１６４】
あるいはまたは加えて、リポソームは、リポソームの寸法が特定の細胞もしくは組織内への分布を制限するか、または意図的に分布しないようにするのに十分な直径であるように寸法決定されてもよい。例えば、リポソームは、その寸法が肝類洞を覆う内皮層の開窓より大きくなるように寸法決定されてもよく、それによって、リポソームの肝細胞への分布を制限する。
【０１６５】
一部の実施形態では、リポソームの大きさは、リポソーム粒子の最大直径の長さによって決定される。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約２５０ｎｍ以下（例えば、約２２５ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、または５０ｎｍ以下）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１０〜２５０ｎｍの範囲（例えば、約１０〜２２５ｎｍ、１０〜２００ｎｍ、１０〜１７５ｎｍ、１０〜１５０ｎｍ、１０〜１２５ｎｍ、１０〜１００ｎｍ、１０〜７５ｎｍ、または１０〜５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１００〜２５０ｎｍの範囲（例えば、約１００〜２２５ｎｍ、１００〜２００ｎｍ、１００〜１７５ｎｍ、１００〜１５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１０〜１００ｎｍの範囲（例えば、約１０〜９０ｎｍ、１０〜８０ｎｍ、１０〜７０ｎｍ、１０〜６０ｎｍ、または１０〜５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。特定の実施形態では、好適なリポソームは、約１００ｎｍ未満の大きさを有する。
【０１６６】
リポソーム集団の寸法決定に対して、当該技術分野において既知の様々な別の方法を利用することができる。こうした寸法決定方法の一つは、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、この文献は参照によって本明細書に援用される。バス超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかによるリポソーム懸濁液の超音波処理によって、直径が約０．０５マイクロメートル未満の小さいＵＬＶまでサイズ漸減する。ホモジナイゼーションは別の方法であり、大きいリポソームをより小さいものに断片化するのに剪断エネルギーを利用する。典型的なホモジナイゼーション手順において、ＭＬＶは、選択されたリポソームの大きさ、典型的には約０．１〜０．５マイクロメートルの大きさが観察されるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーを用いて再循環される。リポソームの大きさは、本明細書に参照によって援用される，Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１−１５０（１９８１）に記載された準電気光散乱（ＱＥＬＳ）によって算出され得る。平均リポソーム直径を、形成されたリポソームを超音波処理することによって減少させることができる。断続的な超音波処理サイクルをＱＥＬＳ評価と交互に行って、効率的なリポソーム合成を導くことができる。
【０１６７】
医薬組成物
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍＲＮＡの発現を促進するために、リポソームを含めた脂質ナノ粒子などの送達ビヒクルは、一つ以上の追加の核酸、担体、標的化リガンドまたは安定化試薬と組み合わせて製剤化されても、好適な賦形剤と混合されている薬理学的組成物に製剤化されてもよい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子は、ヒアルロニダーゼと同時に投与される。薬物の製剤化及び投与の技術は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎで知ることができる。
【０１６８】
提供されるリポソーム封入ｍＲＮＡ、またはリポソーム結合ｍＲＮＡ、及びそれを含む組成物は、対象の臨床状態、投与の部位及び投与方法、投与スケジュール、対象の年齢、性別、体重、ならびに当該技術分野の臨床医に関連する他の要因を考慮して、現在の医療行為に従い投与及び投薬され得る。本明細書における目的に適う「有効量」は、実験臨床研究、薬理学、臨床、及び医療分野の当業者に既知のこうした適切な考慮すべき事項により決定され得る。一部の実施形態では、投与される量は、症状や、当業者によって疾患の進行、退行、または改善の適切な基準として選択される他の指標を、少なくともいくらか安定化、改善、または排除するのに有効である。例えば、好適な量及び投薬レジメンは、少なくとも一過性タンパク質（例えば、酵素）の産生をもたらすものである。
【０１６９】
本発明は、皮下組織（皮膚と筋肉の間の組織層）へのボーラス注射といった皮下送達に焦点を当てているが、その他の適切な投与経路として、例えば、経口投与、直腸投与、膣投与、経粘膜投与、気管内もしくは吸入を含む肺投与、または腸投与；皮内注射、経皮（局所）注射、筋肉内注射、髄内注射、ならびにくも膜下腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、もしくは鼻腔内を含めた非経口送達が挙げられる。特定の実施形態では、筋肉内投与は、骨格筋、平滑筋、及び心筋からなる群から選択される筋肉に行う。一部の実施形態では、投与の結果、ｍＲＮＡが筋細胞に送達される。一部の実施形態では、投与の結果、ｍＲＮＡが肝細胞（すなわち肝臓細胞）に送達される。特定の実施形態では、筋肉内投与の結果、ｍＲＮＡが筋細胞に送達される。
【０１７０】
代替的または追加的に、本発明のリポソームに封入されたｍＲＮＡおよび組成物は、全身的な方法ではなく局所的な方法で投与され得る。
【０１７１】
本発明の提供される方法は、本明細書に記載される治療剤（例えば、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡ）の治療有効量の単回投与ならびに複数回投与を企図する。治療剤は、対象の状態（たとえばＯＴＣ欠損症）の性質、重篤度、及び程度によって規則的な間隔で投与されてもよい。一部の実施形態では、本発明の治療剤（例えば、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡ）の治療有効量を、規則的な間隔で（例えば、年に一回、六カ月に一回、五カ月に一回、三カ月に一回、隔月（二カ月に一回）、毎月（毎月一回）、隔週（二週間に一回）、月二回、３０日に一回、２８日に一回、１４日に一回、１０日に一回、７日に一回、毎週、週二回、毎日、または連続して）、周期的に皮下投与してもよい。
【０１７２】
一部の実施形態では、提供されるリポソーム及び／または組成物は、その中に含まれるｍＲＮＡの徐放に適するように製剤化される。こうした徐放性組成物は、投薬間隔を延長させて対象に適宜投与することができる。例えば、一部の実施形態では、本発明の組成物は、一日二回、毎日、または一日おきに対象に投与される。好適な実施形態では、本発明の組成物は、週二回、週一回、７日に一回、１０日に一回、１４日に一回、２８日に一回、３０日に一回、二週間に一回、三週間に一回もしくはより好ましくは四週間に一回、一か月に一回、一か月に二回、六週間に一回、八週間に一回、隔月に一回、三か月に一回、四か月に一回、六か月に一回、八か月に一回、九か月に一回、または毎年対象に投与される。長期間にわたるｍＲＮＡの送達または放出のいずれかを行うために、デポ投与（例えば、筋肉内、皮下、硝子体内）用に製剤化される組成物およびリポソームも企図される。好ましくは、採用される徐放手段は、安定性を強化するためにｍＲＮＡに施される修飾と組み合わされる。
【０１７３】
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、主として、本発明の医薬組成物に含まれる治療剤の総量に基づいている。一般に、治療有効量は、対象に対して意義のある利益を得る（例えば、ＯＴＣ欠損症を治療、調節、治癒、防止、及び／または改善する）のに十分な量である。例えば、治療有効量は、所望の治療作用及び／または予防作用を得るのに十分な量であり得る。通常、それを必要とする対象に投与される治療剤（例えば、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡ）の量は、該対象の特徴によって異なる。このような特徴には、対象の状態、疾患重篤度、全般的健康、年齢、性別および体重が含まれる。当業者は、これらおよび他の関連因子に応じて適切な用量を容易に決定することができるであろう。さらに、最適な投薬量範囲を同定するために、客観的および主観的アッセイの両方を任意に用いることができる。
【０１７４】
治療有効量は、複数の単位用量を含み得る投薬レジメンで一般的に投与される。任意の特定の治療用タンパク質について、治療有効（および／または有効な投与レジメン内の適切な単位投与量）は、例えば、投与経路に応じて、他の医薬品と組み合わせて変化し得る。また、任意の特定の患者に固有の治療有効量（及び／または単位用量）は、治療される障害及び障害の重篤度；採用される特定の医薬作用剤の活性；採用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事；投与時間、投与経路、及び／または採用される特定のタンパク質の排出または代謝速度；治療期間；ならびに医療分野において周知の類似要因を含む様々な要因に依存し得る。
【０１７５】
一部の実施形態では、治療有効投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）、例えば、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜４００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜３００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜９０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜８０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜７０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜６０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜４０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜３０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲である。
【０１７６】
一部の実施形態では、治療有効投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約６０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約７０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約８０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約９０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５００ｍｇ／ｋｇ（体重）超である。特定の実施形態では、治療有効投与量は１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）である。一部の実施形態では、１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）の治療有効投与量が筋肉内または静脈内に投与される。
【０１７７】
また、本明細書に開示されるリポソームのうちの一つ以上を含む凍結乾燥された医薬組成物と、例えば、２０１２年６月８日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／４１６６３に開示されるような、かかる組成物を使用するための関連方法も、本明細書において企図される。当該出願の教示内容はその全体で参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本発明による凍結乾燥された医薬組成物は、投与前に戻されるか、またはｉｎ  ｖｉｖｏ．で戻され得る。例えば、凍結乾燥された医薬組成物は、適切な剤形（例えば、ディスク、ロッド、または膜などの皮内剤形）に製剤化され、剤形が個体の体液によってｉｎ  ｖｉｖｏで経時的に再水和されるように投与され得る。
【０１７８】
提供されるリポソーム及び組成物は、任意の所望の組織に投与され得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを含む提供されるリポソームおよび組成物は皮下に送達され、ｍＲＮＡは皮下組織以外の細胞または組織型で発現する。一部の実施形態では、提供されるリポソームまたは組成物によって送達される標的タンパク質をコードするｍＲＮＡは、リポソームおよび／または組成物が投与された組織で発現する。一部の実施形態では、送達されるｍＲＮＡは、リポソーム及び／または組成物が投与された組織とは異なる組織で発現される。送達されるｍＲＮＡが送達および／または発現され得る場所となる組織の例としては、限定されないが、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、血清、脳、骨格筋、リンパ節、皮膚、および／または脳脊髄液が挙げられる。
【０１７９】
一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、投与されるｍＲＮＡの発現が増加するか、または対象由来の生体試料におけるｍＲＮＡコードタンパク質の活性レベルが、治療もしくは投与前のベースライン発現レベルもしくは活性レベルと比較して増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象由来の生体試料において、提供される組成物のｍＲＮＡによりコードされる治療用タンパク質の発現レベルまたは活性レベルが、治療前のベースライン発現レベルまたは活性レベルと比較して増加する。通例、ベースラインレベルは、治療直前に測定される。生体試料としては、例えば、全血、血清、血漿、尿、及び組織試料（例えば、筋肉、肝臓、皮膚線維芽細胞）が含まれる。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、治療用タンパク質（投与されたｍＲＮＡによってコードされるタンパク質）の発現レベルまたは活性レベルが、治療直前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象由来の生体試料におけるｍＲＮＡ発現レベルまたは活性レベルが、治療されていない対象と比較して増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象由来の生体試料において、提供される組成物のｍＲＮＡによってコードされる治療用タンパク質の発現レベルまたは活性レベルが、治療されていない対象と比較して増加する。
【０１８０】
様々な実施形態によると、送達されるｍＲＮＡの発現の時期を、特定の医学的要求に合うように調整することができる。一部の実施形態では、送達されるｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、提供されるリポソーム及び／または組成物の投与の１時間、２時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、または１カ月後に検出可能である。
【０１８１】
一部の実施形態では、提供される組成物の治療有効投与量は、定期的に投与された場合、対象において、治療前のベースラインのシトルリン産生と比較してシトルリン産生の増加をもたらす。典型的には、治療前または治療後のシトルリン値は、例えば血液、血漿もしくは血清、尿、または固形組織抽出物などの対象から取得された生体試料において測定され得る。一部の実施形態では、本発明に従う治療により、生体試料（例えば血漿、血清または尿）中のシトルリン値が、ベースラインのシトルリン値と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、または３倍増加する。
【０１８２】
本発明によると、提供される組成物の治療有効投与量は、定期的に投与された場合、タンパク質欠損症の少なくとも一つの症状または特徴の強度、重篤度、もしくは頻度の低下をもたらすか、または発症の遅延をもたらす。
【０１８３】
治療用途
本発明を使用して、様々な疾患、障害、および症状を治療することができる。特に、単一遺伝子障害および、タンパク質をコードするｍＲＮＡを投与することにより、一つ以上の疾患関連症状を低減、または疾患症状を改善させる障害が、本発明を用いた治療用途の候補となる。本出願開示に詳述される皮下投与用の例示的な治療用メッセンジャーＲＮＡは、関連する機能を有する、又は記載される疾患または状態に関与する、表１、２、３、４、５または６に列挙される対応する例示的な遺伝子のいずれかから選択され得る。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【表６−８】
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【表６−９】
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【表６−１０】
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【表６−１１】
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【表６−１２】
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【表６−１３】
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【表６−１４】
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【表６−１５】
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【表６−１６】
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【表６−１７】
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【表６−１８】
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【表６−１９】
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【表６−２０】
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【表６−２１】
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【表６−２２】
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【表６−２３】
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【表６−２４】
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【表６−２５】
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【表６−２６】
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【表６−２７】
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【表６−２８】
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【表６−２９】
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【表６−３０】
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【表６−３１】
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【表６−３２】
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【表６−３３】
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【表６−３４】
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【表６−３５】
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【表６−３６】
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【表６−３７】
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【表６−３８】
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【表６−３９】
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【表６−４０】
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【表６−４１】
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【表６−４２】
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【表６−４３】
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【表６−４４】
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【表６−４５】
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【表６−４６】
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【０１８４】
一部の実施形態では、本発明は、表１に列挙される疾患または障害の治療に有用である。
【０１８５】
一部の実施形態では、本発明は、ワクチンの送達に有用である。皮下送達されるワクチンは、限定するものではないが、ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ炎、麻疹、ムンプス、おたふく風邪、風疹、インフルエンザ菌感染症ｂ型、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、肺炎球菌感染症、コレラ、Ａ型肝炎、髄膜炎菌性疾患、ペスト、狂犬病、コウモリリッサウイルス、黄熱、日本脳炎、Ｑ熱、結核、腸チフスおよび水痘帯状疱疹を含む感染症に対するワクチンを含む。皮下送達されるワクチンは、癌などの細胞増殖性障害に対するワクチンも含み得る。一部の実施形態では、皮下送達されるワクチンは、リンパ増殖性疾患のための癌ワクチンを含む。一部の実施形態では、癌ワクチンは、本発明の方法を使用して、癌細胞に対する細胞免疫応答を誘導する免疫原性物質をコードする、皮下送達されるｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、一つ以上の癌抗原性エピトープを含むＭＨＣクラス特異的ペプチドをコードするｍＲＮＡを含むワクチンは、ヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡと共に皮下投与され、これはワクチンの優れた全身送達およびより強力な抗原応答をもたらし得る。
【０１８６】
一部の実施形態では、本発明は、肝疾患、例えばＯＴＣ欠損症の治療に有用である。ヒアルロニダーゼ酵素と、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡとの同時注射により、対象の肝臓細胞（例えば、肝細胞）におけるＯＴＣ酵素（タンパク質）のレベルが、治療前のベースラインレベルと比較して増加する。典型的には、ベースラインレベルは、治療前に（例えば、治療の１２カ月前まで、一部の場合においては治療の直前に）測定される。一部の実施形態では、本発明の皮下注射により、肝細胞におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％増加する。一部の実施形態では、本発明の皮下注射により、肝細胞におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療をしていない対象の肝臓細胞におけるＯＴＣタンパク質のレベルと比較して増加する。
【０１８７】
一部の実施形態では、本発明の皮下注射により、対象の血漿または血清におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療前のベースラインのレベルと比較して増加する。典型的には、ベースラインレベルは、治療前に（例えば、治療の１２カ月前まで、一部の場合においては治療の直前に）測定される。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、血漿または血清におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療直前のベースラインのレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、血漿または血清におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療をしていない対象の血漿または血清におけるＯＴＣタンパク質のレベルと比較して増加する。
【０１８８】
本発明の組成物および方法は、多数の障害を治療するためのｍＲＮＡの送達を提供する。特に、本発明の組成物および方法は、肝臓に排出または分泌されるタンパク質および／または酵素の欠損に関する疾患または障害の治療に適している。これらの疾患または障害には、以下に限定されないが、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）欠損症（フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）として従来より知られている）、肝臓の尿素サイクル異常シトルリン血症を引き起こすアルギニノコハク酸シンテターゼ１（ＡＳＳ１）欠損症、貧血を引き起こすエリスロポエチン（ＥＰＯ）欠損症（エリスロポエチンは腎臓内および肝臓内の両方で産生されるタンパク質）が含まれる。
【０１８９】
本発明が有用となる障害には、以下に限定されないが、ファブリー病などの障害；血友病性疾患（例えば、血友病Ｂ（ＦＩＸ）、血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ））；ＳＭＮ１関連脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）；筋萎縮性側方硬化症（ＡＬＳ）；ＧＡＬＴ関連ガラクトース血症；アルポート症候群を含むＣＯＬ４Ａ５関連障害；ガラクトセレブロシダーゼ欠損症；Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー；フリートライヒ運動失調症；ペリツェウス・メルツバッハ病；ＴＳＣ１およびＴＳＣ２関連結節性（脳）硬化症；サンフィリポＢ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＢ）；脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ関連振戦／失調症候群、および脆弱Ｘ早期卵巣不全症候群を含むＦＭＲ１関連障害；プラダー・ウィリー症候群；遺伝性出血性毛細管拡張症（ＡＴ）；ニーマン・ピック病タイプＣ１；若年型神経セロイドリポフスチノーシス（ＪＮＣＬ）、若年バッテン病、サンタヴォリ・ハルティア病、ヤンスキー・ビールショースキー病、ならびにＰＴＴ−１およびＴＰＰ１欠損症を含む、神経セロイドリポフスチン症関連疾患；中枢神経系ミエリン形成不全／白質消失病を伴うＥＩＦ２Ｂ１、ＥＩＦ２Ｂ２、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２Ｂ４、およびＥＩＦ２Ｂ５関連小児期運動失調；ＣＡＣＮＡ１ＡおよびＣＡＣＮＢ４関連一過性運動失調症２型；古典的レット症候群、ＭＥＣＰ２関連重度新生児脳症、およびＰＰＭ−Ｘ症候群を含むＭＥＣＰ２関連障害；ＣＤＫＬ５関連非定型レット症候群；ケネディ病（ＳＢＭＡ）；皮質下梗塞および白質脳症（ＣＡＤＡＳＩＬ）を伴うノッチ−３関連常染色体優性脳動脈症；ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１Ｂ関連の発作障害；アルパーズ・フッテンロッハー症候群、ＰＯＬＧ関連感覚性運動失調型ニューロパチー、構音障害、および眼麻痺、ならびにミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性および劣性の進行性外眼筋麻痺を含む、ポリメラーゼＧ関連障害；Ｘ連鎖副腎低形成；Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症；ウィルソン病が含まれる。
【０１９０】
一部の実施形態では、本発明の核酸、特にｍＲＮＡは、細胞外空間に分泌される機能的タンパク質または酵素をコードしてもよい。例えば、分泌されたタンパク質には、クロッティング因子、補体経路成分、サイトカイン、ケモカイン、ケモアトラクタント、タンパク質ホルモン（例えば、ＥＧＦ、ＰＤＦ）、血清のタンパク質成分、抗体、分泌トール様受容体などが含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物は、エリスロポエチン、α１−アンチトリプシン、カルボキシペプチダーゼＮ、またはヒト成長ホルモンをコードするｍＲＮＡを含み得る。
【実施例】
【０１９１】
本発明の特定の化合物、組成物、及び方法について、特定の実施形態に従って具体的に説明してきたが、以下の実施例は、本発明の化合物を単に説明するという役割を果たすものであり、それを制限することを意図するものではない。
【０１９２】
脂質材料
以下の実施例に記載される製剤は、特に記載しない限り、種々の核酸材料を封入するように設計された、一種以上のカチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば非カチオン性脂質および／またはコレステロール系脂質）、およびＰＥＧ化脂質を用いた様々な比率の多成分脂質混合物を含む。プロセス用のカチオン性脂質としては、以下に限定されないが、ｃＫＫ−Ｅ１２（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）、ＯＦ−０２、Ｔａｒｇｅｔ２３、Ｔａｒｇｅｔ２４、ＩＣＥ、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ”  Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６−２８７）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２−１７６）、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．“Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”  ＰＮＡＳ  ２０１０，１０７，１８６４−１８６９）、ジアルキルアミノ系、イミダゾール系、グアニジニウム系などが挙げられ得る。ヘルパー脂質としては、以下に限定されないが、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン）、コレステロールなどが挙げられ得る。ＰＥＧ化脂質は、限定するものではないが、Ｃ６−Ｃ２０の長さのアルキル鎖を有する脂質に共有結合された、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含み得る。
【０１９３】
ｍＲＮＡ材料
一部の実施形態では、標的タンパク質をコードするコドン最適化されたメッセンジャーＲＮＡを、遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ鋳型からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により合成し、次いで、５’キャップ構造（Ｃａｐ１）（ＦＦｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．；  Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｃａｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００５，８６，１２３９−１２４９）および３’ポリ（Ａ）を付加した。各ｍＲＮＡ生成物に存在する５’および３’非翻訳領域はそれぞれＸおよびＹとして表され、上述の通り定義される。
【０１９４】
実施例１．マウスにおけるホタルルシフェラーゼタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現
本実施例は、ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ担持ＬＮＰを投与する例示的な方法、および標的組織におけるホタルルシフェラーゼをｉｎ  ｖｉｖｏで分析するための方法を示す。２０ｍｇ／ｋｇのヒアルロニダーゼｍＲＮＡと共に製剤化された２０ｍｇ／ｋｇのＦＦＬをコードするｍＲＮＡ封入ＬＮＰで、野生型マウスを皮下送達により処置した。ＦＦＬタンパク質によって産生された発光が、皮下投与３、２４、４８時間後に観察された。
これらのマウスの肝臓における活性ＦＦＬタンパク質が首尾よく産生したことを表す顕著な発光が観察された。さらに、持続的ＦＦＬ活性が少なくとも２４時間維持され、強度の減少はわずかか、または全くなかった。
【０１９５】
実施例２．マウスにおける発現ｈＯＴＣのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
本実施例は、ＯＴＣ  ＫＯ  ｓｐｆａｓｈマウスにおける、ヒトＯＴＣ（ｈＯＴＣ）ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を用いた、ヒアルロニダーゼ無しの静脈内投与とヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡ有り・無しでの皮下投与の比較を示す。この実施例では、ｈＯＴＣおよびヒアルロニダーゼｍＲＮＡは同じ製剤中に存在し、したがって同時に投与される。カスタムｅｘ  ｖｉｖｏ活性アッセイを使用したシトルリン産生レベルの測定から決定される通り、ｈＯＴＣタンパク質は酵素的に活性であることが示される。一般的に、シトルリンの産生を使用して、発現したｈＯＴＣタンパク質の活性を評価することができる。ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子の２０ｍｇ／ｋｇでの単回用量を、ヒアルロニダーゼ有り・無しで皮下送達（２０ｍｇ／ｋｇ）した２４時間後に、マウスの肝臓抽出物におけるｈＯＴＣタンパク質のシトルリン活性を測定した。生理食塩水で処理したＯＴＣ  ＫＯマウスの肝臓におけるシトルリン活性も測定した。ヒアルロニダーゼｍＲＮＡ共製剤なしのｈＯＴＣ  ｍＲＮＡの皮下投与後には、有意なｈＯＴＣタンパク質活性が観察されなかった。これらの動物におけるｈＯＴＣタンパク質活性は、生理食塩水で処理された動物に見られる活性と同様であった。対照的に、ｈＯＴＣタンパク質活性（シトルリンタンパク質レベルによって証明される）は、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ組成物を静脈内投与したマウスの肝臓と、ヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡと共製剤化されたｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ組成物を皮下投与したマウスの肝臓において同様であった。ＯＴＣ  ｍＲＮＡ発現の頑健性に対するヒアルロニダーゼｍＲＮＡ用量依存性は、様々な用量の製剤中のヒアルロニダーゼｍＲＮＡを使用して試験しうる。
【０１９６】
実施例３．マウスにおけるＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ送達のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性
本実施例は、ＯＴＣ  ＫＯ  ｓｐｆａｓｈマウスにおいて、ＣＯ−ｈＯＴＣ（コドン最適化されたヒトＯＴＣ）ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を用いた、ヒアルロニダーゼ無しの静脈内投与対、ヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡ有り・無しでの皮下投与の比較を示す。皮下送達された、ヒアルロニダーゼｍＲＮＡと共製剤化されたＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、皮下送達されたヒアルロニダーゼをコードするｍＲＮＡ無しのｍＲＮＡ脂質ナノ粒子よりも効果的である。
【０１９７】
様々な治療群の肝臓におけるＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡコピー数を比較することによって、投与の効率を算出した。マウスの肝臓におけるＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡコピー数を、２０ｍｇ／ｋｇのＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡおよび２０ｍｇ／ｋｇのヒアルロニダーゼｍＲＮＡ（配列番号１２）ＬＮＰ製剤の単回皮下投与の２４時間後に測定した。対照セットは、ヒアルロニダーゼｍＲＮＡ無しのＯＴＣ  ｍＲＮＡを含む。比較のため、ＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡコピー数はまた、ＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ溶液が０．５０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射された２４時間後に、マウスの肝臓において測定された。生理食塩水で処理した野生型（ＷＴ）マウス、生理食塩水で処理したＯＴＣ  ＫＯマウス、およびｈＯＴＣ  ＬＮＰ溶液を用いて静脈内で、ヒアルロニダーゼを含まないｈＯＴＣ  ＬＮＰ製剤を用いて皮下で、またはヒアルロニダーゼと共製剤化されたｈＯＴＣ  ＬＮＰを用いて皮下で処置されたＯＴＣ  ＫＯマウスの肝臓において、ｍＯＴＣ  ｍＲＮＡコピー数を測定した。
【０１９８】
実施例４．マウスにおけるヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）のｉｎ  ｖｉｖｏ発現
本実施例は、開示された方法を用いて、ｍＲＮＡをコードするｈＥＰＯの皮下投与後のヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質発現の例示的な時間経過を、同一のものを静脈内投与した場合と比較して示す。
【０１９９】
雄のＣＤ１マウスに、１日目に一回、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を投与量１ｍｇ／ｋｇで静脈内投与するか、または５ｍｇ／ｋｇのヒアルロニダーゼ  ｍＲＮＡと共製剤化したｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。ヒトＥＰＯタンパク質発現を、ｈＥＰＯ特異的ＥＬＩＳＡにより血清試料で４日間検査した。
【０２００】
ｍＲＮＡ投与（１日目）の６時間後および２日目でのマウスの静脈内投与群と皮下投与群の両方で、高レベルのＥＰＯタンパク質発現が観察された。この発現レベルは、同じｍＲＮＡ  ＬＮＰの静脈内投与と比較される。
【０２０１】
均等物
当業者は、日常的な実験作業を越えない手法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認できるものとなる。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることは意図されず、むしろ以下の特許請求の範囲に記述されるとおりである。
【配列表】
2021523916000001.app
【国際調査報告】
2021523916.tif 000145
2021523916.tif 000146
2021523916.tif 000147