(57)【要約】本開示は、例えば、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）バイオリアクターシステムにおける低圧縮マクロキャリア上での接着様式で生育させた細胞のリン酸カルシウムトランスフェクションにより、接着型バイオリアクターにおいて組換えレンチウイルスベクターを製造するための方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、組換えレンチウイルスベクターを製造する方法：
ａ．プロデューサー細胞が所定の細胞密度を達成するまで、層高とリアクター容積とを有する接着型バイオリアクターにおいて、低圧縮マクロキャリアを含むマトリックス上での接着様式で培地中で前記プロデューサー細胞を培養する段階；
ｂ．前記プロデューサー細胞にトランスフェクション試薬混合物をトランスフェクトする段階であって、前記トランスフェクション試薬混合物が、１種類又は複数種類のＤＮＡポリヌクレオチド、中性ｐＨのリン酸カルシウム（ＣａＰｈｏ）、及び緩衝生理食塩水（任意に、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）を含む、前記段階；並びに
ｃ．前記組換えレンチウイルスベクターを回収する段階であって、それにより、回収された材料が生じる、前記段階。
【請求項２】
前記接着型バイオリアクターが、モジュール型固定層を有するｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）バイオリアクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記低圧縮マクロキャリアの層高が、２ｃｍ、４ｃｍ、又は１０ｃｍである、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記トランスフェクトする段階に先立って達成された前記所定の細胞密度が、１５０〜３００×１０６細胞／ｃｍ２である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記トランスフェクション試薬混合物が、約１２５ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．２のｐＨを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記トランスフェクション試薬混合物が、約２０μｇ／ｍＬの前記１種類又は複数種類のＤＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記トランスフェクトする段階が、培地 ３体積ごとに前記トランスフェクション試薬混合物 約１体積を、前記接着型バイオリアクターに添加することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記トランスフェクトする段階の後、前記ｐＨを約７．２に保持しながら、前記培地を前記マトリックス中少なくとも約５〜７時間、再循環させる段階を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記回収する段階が、前記培地のｐＨを約ｐＨ７．０未満に保持することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記回収する段階が、約４リアクター容積の回収培地で約２４、約４８、約６０、又は約７２時間にわたり前記マトリックスを灌流することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
半閉鎖系又は閉鎖系を用いて前記回収された材料を処理する段階であって、それにより、精製された材料が生じる、前記段階を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記処理する段階が、イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーのうちの１つ又は複数を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記処理する段階が、１つ又は複数の遠心濃縮機において前記回収された材料の遠心分離により前記組換えレンチウイルスベクターを濃縮することを含む、請求項１１又は請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記処理する段階が、タンジェンシャルフロー濾過により前記組換えレンチウイルスベクターを濃縮することを含む、請求項１１又は請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記組換えレンチウイルスベクターの感染力価を測定するために前記精製された材料をアッセイする段階を含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法により製造された前記組換えレンチウイルスベクターが、工程パラメータの最適化なしに製造された組換えレンチウイルスベクターと比較して、約２０％増加したウイルス形質導入効率を呈する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが、ＲＰＫ、ＩＴＧＢ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＧ、ＴＣＩＲＧ１、ＣＬＣＮ７、ＴＮＦＳＦ１１、ＰＬＥＫＨＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、及びＯＳＴＭ１からなる群から任意に選択される関心対象の遺伝子又は関心対象のポリペプチドをコードする遺伝子を含むレンチウイルスベクター遺伝子発現カセットをコードする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法により生成されたレンチウイルスベクターが、対象に投与された場合に、遺伝子改変細胞の１０％を超える生着及び再増殖を達成することが可能である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記レンチウイルスベクターが、ＨＩＶ由来のレンチウイルスベクターである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記プロデューサー細胞が、ＨＥＫ２９３細胞又はその派生物、任意にＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はその派生物である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法により生成された組換えレンチウイルスベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載の組換えレンチウイルスベクターと、医薬的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２３】
複数の細胞がレンチウイルスベクターにより形質導入されている、細胞の集団を含む医薬組成物。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを細胞に提供するための、請求項２１に記載の組換えレンチウイルスベクター又は請求項２２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２５】
それを必要とする哺乳動物対象における疾患又は障害を処置するための、請求項２１に記載の組換えレンチウイルスベクター又は請求項２２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２６】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法における使用に適合している接着型バイオリアクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、全体として参照により本明細書中に取り込まれる２０１８年８月１６日出願の米国特許仮出願第６２／７６５，１１２号の優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、全体的に、組換えレンチウイルスベクターを製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
接着型バイオリアクターにおける組換えレンチウイルスベクターの好成績での製造は、収率が数多くの工程パラメータに依存すること、及びパブリックドメインから入手可能である最適化工程パラメータのレポートがほとんどないことから、難題になる可能性がある。トランスフェクション試薬としてのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の使用がリン酸カルシウム（ＣａＰｈｏ）沈殿を基にしたトランスフェクションよりも優れた収率を達成することが、近年になり報告された。Ｖａｌｋａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１８）２５４，３９−４６（２０１８）（非特許文献１）。そのような報告にもかかわらず、本発明者らは、ＣａＰｈｏトランスフェクションに依拠する最適化法を開発した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｖａｌｋａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１８）２５４，３９−４６（２０１８）
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】本開示の方法の例証的な非限定的態様を表した工程図を示す。
【図２】ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）バイオリアクターのベンチスケール（Ｎａｎｏ）及び製造スケール（５００）を示す。ＬＣ＝低圧縮；ＨＣ＝高圧縮。出典：ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｔｅｃｈ．ｐａｌｌ．ｃｏｍ／。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、組換えレンチウイルスベクターを製造する方法を提供し、この方法は、プロデューサー細胞が所定の細胞密度を達成するまで、層高とリアクター容積とを有する接着型バイオリアクターにおいて、低圧縮マクロキャリアを含むマトリックス上での接着様式で培地中でこのプロデューサー細胞を培養する段階；このプロデューサー細胞にトランスフェクション試薬混合物をトランスフェクトする段階であって、このトランスフェクション試薬混合物が、１種類又は複数種類のＤＮＡポリヌクレオチド、中性ｐＨのリン酸カルシウム、及び緩衝生理食塩水（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）を含む、段階；並びに、この組換えレンチウイルスベクターを回収する段階であって、それにより、回収された材料が生じる、段階を含む。幾つかの態様において、この方法は、半閉鎖系又は閉鎖系を用いて、回収された材料を処理する段階であって、それにより、精製された材料が生じる、段階を含む。
【０００７】
本発明の他の特色及び利点は、以下の詳細な記載及び特許請求の範囲から明白となり、それらに包含されることになる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
詳細な説明
本開示は、とりわけ、組換えレンチウイルスベクターを製造する方法を提供し、この方法は、プロデューサー細胞が所定の細胞密度を達成するまで、層高とリアクター容積とを有する接着型バイオリアクターにおいて、低圧縮マクロキャリアを含むマトリックス上での接着様式で培地中でこのプロデューサー細胞を培養する段階；このプロデューサー細胞にトランスフェクション試薬混合物をトランスフェクトする段階であって、このトランスフェクション試薬混合物が、１種類又は複数種類のＤＮＡポリヌクレオチド、中性ｐＨのリン酸カルシウム、及び緩衝生理食塩水（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）を含む、段階；並びに、この組換えレンチウイルスベクターを回収する段階であって、それにより、回収された材料が生じる、段階を含む。本開示はまた、本明細書に開示された方法により生成された組換えレンチウイルスベクターに加え、医薬組成物、並びにレンチウイルスベクター及び医薬組成物の使用を提供する。
【０００９】
本開示の組成物及び方法は、単一遺伝子疾患及び障害の処置をはじめとする遺伝子治療の適用に特に適する。製造における組換えレンチウイルスベクターの低収率をはじめとする、限定された遺伝子治療の成功を有する要因が、本明細書で提供される組成物及び方法により解決される。
【００１０】
他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通して理解されるものと同様の意味を有する。本明細書に記載されたものと類似又は同等な方法及び材料が、本発明の実践で用いられ得るが、適切な方法及び材料が、以下に記載される。本明細書で言及された全ての発行物、特許出願、特許、及び他の参考資料は、全体として参照により明白に取り込まれる。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が、支配することになる。加えて、本明細書に記載された材料、方法、及び実施例は、例証に過ぎず、限定を意図するものではない。
【００１１】
本明細書で企図される様々な態様は、相反することが具体的に示されない限り、当該技術分野の技能の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、及び細胞生物学の従来法を用いることになり、それらの多くは、例証を目的として以下に記載される。そのような技術は、文献の中で完全に説明されている。例えば、それぞれが参照により本明細書中に明白に取り込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００８年７月に最新版）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４），Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａ��ｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）；Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；及びＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの機関紙の研究論文を参照されたい。
【００１２】
以下の記載は、特定の具体的詳細が、本明細書で企図される本発明の様々な例証的態様の徹底した理解を提供するために明記されている。しかし当業者は、特有の例証的態様がこれらの詳細を用いずに実践され得ることを理解するであろう。加えて、本明細書に記載された構造及び置換基の様々な組み合わせに由来する個々のベクター又はベクター群が、各ベクター又はベクター群が個々に明記されるのと同程度に本出願により開示されることが、理解されなければならない。したがって特有のベクター構造又は特有の置換基の選択は、本開示の範囲内である。
【００１３】
定義
本明細書で用いられる用語「約」又は「およそ」は、参照の分量、レベル、値、数、頻度、パーセント値、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１％だけ変動する分量、レベル、値、数、頻度、パーセント値、寸法、サイズ、量、重量又は長さをいう。特有の態様において、用語「約」又は「およそ」は、数値の前にある場合、この値のプラス又はマイナス１５％、プラス又はマイナス１０％、プラス又はマイナス５％、又はプラス又はマイナス１％の範囲を示す。
【００１４】
「トランスフェクション」は、非ウイルス法によりネイキッドＤＮＡを細胞内に導入する工程をいう。
【００１５】
「感染」は、ウイルスベクターを用いて外来ＤＮＡを細胞内に導入する工程をいう。
【００１６】
「形質導入」は、ウイルスベクターを用いた細胞内への外来ＤＮＡの導入をいう。
【００１７】
「ベクターコピー数」又は「ＶＣＮ」は、細胞の数で割られた、試料中のベクターのコピー数をいう。一般にベクターのコピー数は、組み込まれたプロウイルスのＰｓｉ配列に対するプローブを用いた定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により決定され、細胞数は、細胞あたり２コピー（染色体あたり１つ）存在することになるヒトハウスキーピング遺伝子に対するプローブを用いたｑＰＣＲにより決定される。
【００１８】
「形質導入効率」は、少なくとも１つのプロウイルスコピーで形質導入された細胞のパーセント値をいう。例えば１×１０６細胞が、ウイルスに暴露され、０．５×１０６細胞が、それらのゲノム内に少なくとも１コピーのウイルスを有するように決定された場合、形質導入効率は、５０％である。形質導入効率を決定するための例証的方法は、フローサイトメトリーである。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「レトロウイルス」又は「レトロウイルスの」は、ゲノムＲＮＡを直鎖状二本鎖ＤＮＡコピー内に逆転写し、次にそのゲノムＤＮＡを宿主ゲノム内に共有結合で組み込む、ＲＮＡウイルスをいう。レトロウイルスベクターは、遺伝子送達のための共通のツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ．３５７：４５５−４６０）。一旦、ウイルスが、宿主ゲノムに組み込まれたら、それは、「プロウイルス」と称される。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための鋳型として働き、ウイルスによりコードされたＲＮＡ分子の発現を指導する。例証的なレトロウイルス（レトロウイルス科）としては、（１）例えばモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、及び猫白血病ウイルス（ＦＬＶ）などのガンマレトロウイルス属、（２）例えばサル泡沫状ウイルスなどのスープマウイルス属、並びに（３）例えばヒト免疫不全ウイルス１型及びサル免疫不全ウイルスなどのレンチウイルス属が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「レンチウイルスの」又は「レンチウイルス」は、複雑レトロウイルスの群（又は属）をいう。例証的なレンチウイルスとしては、ＨＩＶ型及びＨＩＶ２型をはじめとするヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）のウイルス；山羊関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；馬伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；牛免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；並びにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、ＨＩＶを基にしたベクターバックボーン（即ち、ＨＩＶシス作用配列エレメント）が、役立てられる。
【００２１】
レトロウイルスベクター、そして特有の態様においてレンチウイルスベクターが、本発明を実践する上で用いられてもよい。したがって本明細書で用いられる用語「レトロウイルスベクター」は、「レンチウイルスベクター」を包含することを意味し、用語「レトロウイルス」は、「レンチウイルス」を包含することを意味する。
【００２２】
用語「ベクター」は、本明細書において、別の核酸分子を転移又は輸送することが可能な核酸分子をいうために用いられる。転移された核酸は、概して、ベクター核酸分子に連結される、例えばその分子の中に挿入される。ベクターは、細胞内の自律複製若しくは逆転写を指導する配列を含んでいてもよく、又は宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに充分な配列を含んでいてもよい。有用なベクターとしては、ウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、例えば複製欠損レトロウイルス及びレンチウイルスが挙げられる。
【００２３】
用語「ウイルスベクター」は、核酸を細胞内に転移することが可能なウイルスを基にしたベクター若しくはベクター粒子、又は転移された核酸そのもののいずれかをいう場合がある。ウイルスベクターは、主としてウイルスに由来する構造的及び／又は機能的遺伝因子を含有する。用語「レトロウイルスベクター」は、主としてレトロウイルスに由来する構造的及び機能的遺伝因子又はその一部を含有するウイルスベクターをいう。
【００２４】
用語「レンチウイルスベクター」は、主としてレンチウイルスに由来する構造的及び機能的遺伝因子又はその一部を含有するウイルスベクターをいう。用語「ハイブリッド」は、両方のレトロウイルス、例えばレンチウイルスの配列及び非レンチウイルスのウイルス配列を含有するベクター、ＬＴＲ又は他の核酸をいう。一態様において、ハイブリッドベクターは、逆転写、複製、組み込み及び／又はパッケージングのためのレトロウイルス、例えばレンチウイルスの配列を含む。
【００２５】
特有の態様において、用語「レンチウイルスベクター」及び「レンチウイルス発現ベクター」は、レンチウイルス転移プラスミド及び／又は感染性レンチウイルス粒子をいうために用いられる場合がある。本明細書で、クローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸ほかなどのエレメントへの参照が行われる場合、これらのエレメントの配列が本発明のレンチウイルス粒子内ではＲＮＡ形態で存在し、本発明のＤＮＡプラスミド内ではＤＮＡ形態で存在することが、理解されなければならない。
【００２６】
特定の具体的態様によれば、ウイルスベクターバックボーン配列のほとんど又は全てが、レンチウイルス、例えばＨＩＶ−１に由来する。しかし、レンチウイルス配列の多くの異なる供給源が用いられ得ること、並びに本明細書に記載された機能を実施する転移ベクターの能力を減じることなく、特定のレンチウイルス配列内の数多くの置換及び変更が適応され得ることが、理解されなければならない。その上、種々のレンチウイルスベクターが、当該技術分野で知られており、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６ａ，１９９６ｂ，ａｎｄ  １９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）；Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，米国特許第６，０１３，５１６号；及び同第５，９９４，１３６号を参照されたく、それらの多くが、本発明のウイルスベクター又は転移プラスミドを生成するように適合化されてもよい。
【００２７】
本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、ＤＮＡ及びＲＮＡ、例えばゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＤＮＡをいう。ポリヌクレオチドとしては、組換え、合成又は単離のいずれかの一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドが挙げられる。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））をいう。本明細書で用いられる用語「ポリリボヌクレオチド」又は「リボ核酸」もまた、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））をいう。好ましくは本発明のポリヌクレオチドは、典型的には変異体が本明細書に記載された参照配列（例えば、配列表を参照）の少なくとも１つの生物活性を保持する場合、その参照配列のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド又は変異体を包含する。様々な例証的態様において、ウイルスベクター及び転移プラスミドポリヌクレオチド配列、並びにそれらを含む組成物が、企図される。特有の態様において、関心対象の１種類又は複数種類の治療性ポリペプチド及び／又は他の遺伝子をコードするポリヌクレオチドが、企図される。特有の態様において、非限定的にＲＰＫ、ＩＴＧＢ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＧ、ＴＣＩＲＧ１、ＣＬＣＮ７、ＴＮＦＳＦ１１、ＰＬＥＫＨＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、及びＯＳＴＭ１遺伝子をはじめとする治療性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。特有の態様において、治療性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその領域が、コドン最適化される。
【００２８】
「強化する」又は「促進する」又は「増加する」又は「拡張する」は、概して、対照条件下、接着型バイオリアクター内で実施された方法と比較して、より高い細胞数、より高い形質導入細胞数、又はより高いウイルス収率を誘起、誘発、又は生成するために本明細書で企図される組成物及び／又は方法の能力をいう。「増加」又は「増大」された収率は、典型的には「統計学的に有意な」量であり、対照条件下での接着型バイオリアクターの収率の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２００倍、又はそれより大きな倍率（例えば、５００、１０００倍）（１と１を超える値の間の全ての整数及び少数点、例えば１．５、１．６、１．７、１．８ほかを含む）の増加を含んでいてもよい。
【００２９】
本明細書で用いられる「対照条件」は、最適化に先立つ工程条件をいう。対照条件は、例えば表Ａ内の例１（Ｅｘ．１）又はその同一条件をいう場合がある。
【００３０】
「減少する」又は「低下する」又は「少なくする」又は「低減する」又は「和らげる」は、概して、対照条件下、接着型バイオリアクター内で実施される方法と比較して、比較的より少ない総細胞、より少ない形質導入細胞、又はより低い収率をもたらす組成物又は方法をいう。「減少する」又は「低減された」収率は、典型的には「統計学的に有意な」量であり、対照条件下での接着型バイオリアクターの収率と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、又はそれより大きなパーセント（例えば、４０％、５０％、６０％）（１と１を超える値の間の全ての整数及び少数点、例えば１．５、１．６、１．７、１．８ほかを含む）減少された減少を含んでいてもよい。
【００３１】
本明細書で用いられる「ＣＦＣ」は、コロニー形成細胞をいう。コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイは、半固形培地中でコロニーを形成する能力により造血性前駆体の増殖及び分化パターンを研究するために用いられる。一定数の投入細胞により形成されたコロニーの数及び形態は、分化及び増殖する前駆体の能力についての予備的情報を提供する。例示的なアッセイが、Ｓａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ（ＣＦＣ）ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１０  Ｄｅｃ  １８；（４６）に提供されている。
【００３２】
本明細書で用いられる「ＣＦＵ」は、コロニー形成単位をいう。ＣＦＵは、ＣＦＣと同義と理解されるが、時には、半固形培地中で生育するＣＦＵの型に関連して用いられる。
【００３３】
本明細書で用いられる「ＴＵ」は、形質導入単位をいう。ＴＵ／ｍＬは、レトロウイルス（レンチウイルス）調製物の機能的力価の共通の尺度である。
【００３４】
本明細書で用いられる「ＭＯＩ」は、感染多重度をいう。
【００３５】
本明細書で用いられる用語「投与すること」又は「導入すること」は、対象への、レンチウイルスベクターの送達又はレンチウイルスベクターで形質導入された細胞の送達をいう。
【００３６】
典型的には細胞は、ウイルスベクター又はベクター粒子が異種ＤＮＡ（例えば、このベクター）を細胞に導入した場合に、「形質導入された」と称される。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「宿主細胞」は、ウイルスベクター又はベクター粒子で形質導入された細胞をいう。用語「宿主細胞」が元の形質導入細胞及びその子孫をいうことは、察知されよう。
【００３８】
用語「処置」、「処置すること」及び同様のものは、本明細書において、概して所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味するために用いられる。この効果は、疾患若しくはその症状を完全若しくは部分的に予防すること、例えば疾患若しくはその症状が対象で起こる見込みを低減することに関連して防護的であってもよく、そして／又は疾患及び／若しくはこの疾患に起因する有害作用の部分的若しくは完全な治癒に関連して治療的であってもよい。本明細書で用いられる「処置」は、哺乳動物での疾患のいずれかの処置に及び、（ａ）疾患に罹り易いかもしれないが疾患を有するとまだ診断されていない対象において疾患が起こるのを予防すること；（ｂ）疾患を阻害すること、即ち、疾患の発症を停止させること；又は（ｃ）疾患を緩和すること、即ち疾患の退縮を誘発すること、を包含する。治療薬は、疾患又は障害の発病の前、発病の間、発病後に投与されてもよい。患者の望ましくない臨床症状を安定化又は低減する、進行中の疾患の処置が、特に関心対象である。そのような処置は、所望なら罹患した組織の完全な機能喪失に先立って実施される。対象の治療は、所望なら疾患の症候期の間に、そして幾つかの例では疾患の症候期の後に、施されるであろう。
【００３９】
用語「個体」、「宿主」、「対象」及び「患者」は、本明細書では互換的に用いられ、非限定的に、サル及びヒトをはじめとするヒト及び非ヒト霊長類；競技用哺乳動物（例えば、ウマ）；畜産用哺乳動物（例えば、ヒツジ、ヤギほか）；愛玩用哺乳動物（イヌ、ネコほか）；及びげっ歯類（例えば、マウス、ラットほか）をはじめとする哺乳動物をいう。
【００４０】
製造の方法
一態様において、本開示は、組換えレンチウイルスベクターを製造する方法を提供し、プロデューサー細胞が所定の細胞密度を達成するまで、層高とリアクター容積とを有する接着型バイオリアクターにおいて、このプロデューサー細胞は、マトリックス上での接着様式で培地中で培養され、ここでこのマトリックスは低圧縮マクロキャリアを含み；このプロデューサー細胞にトランスフェクション試薬混合物がトランスフェクトされ；そして組換えレンチウイルスベクターがこのトランスフェクト細胞から回収される。幾つかの態様において、トランスフェクション試薬混合物は、１種類若しくは複数種類のＤＮＡポリヌクレオチド、中性ｐＨのリン酸カルシウム、及び／又はＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水を含む。この組換えレンチウイルスベクターは、「回収された材料」と称されてもよい。
【００４１】
一態様において、トランスフェクトする段階は、トランスフェクション試薬混合物と培地とを合わせた１００％体積ごとに約５〜約５０体積％のトランスフェクション試薬混合物を、接着型バイオリアクターに添加することを含む。一態様において、トランスフェクトする段階は、トランスフェクション試薬混合物と培地とを合わせた１００％体積ごとに約１０〜約４０体積％のトランスフェクション試薬混合物を、接着型バイオリアクターに添加することを含む。一態様において、トランスフェクトする段階は、トランスフェクション試薬混合物と培地とを合わせた１００％体積ごとに約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、又は約４０体積％のトランスフェクション試薬混合物を、接着型バイオリアクターに添加することを含む。一態様において、トランスフェクトする段階は、培地 ３体積ごとにトランスフェクション試薬混合物 約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、又は約１．２体積を、接着型バイオリアクターに添加することを含む。一態様において、トランスフェクトする段階は、培地 ３体積ごとにトランスフェクション試薬混合物 体積約１を、接着型バイオリアクターに添加することを含む。
【００４２】
一態様において、この方法は、トランスフェクトする段階の後、回収する段階の前に少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、若しくは少なくとも約１４時間、又はそれより長く、例えば４〜２４時間、８〜２４時間、８〜１４時間、４〜１２時間、又は５〜７時間の期間、例えばウイルスベクターの生成を可能にするのに充分な時間、待機する段階を含む。
【００４３】
一態様において、この方法は、トランスフェクトする段階の後、ｐＨを約ｐＨ６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、又は７．４などの一定のｐＨに保持しながら、培地を、マトリックス中、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、若しくは少なくとも約１４時間、又はそれより長く再循環させる段階を含む。一態様において、この方法は、トランスフェクトする段階の後、ｐＨを約７．２に保持しながら、培地をマトリックス中少なくとも約５〜７時間、再循環させる段階をさらに含む。
【００４４】
一態様において、回収する段階は、培地のｐＨを、培養する段階のｐＨよりも低いか又はわずかに低く、例えば約６．０〜約７．３のほぼ範囲内のｐＨに保持することを含む。一態様において、回収する段階は、培地のｐＨを、培養する段階のｐＨよりも低いか又はわずかに低く、例えばｐＨ６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、又は７．２に保持することを含む。一態様において、回収する段階は、培地のｐＨを約ｐＨ７．０未満に保持することを含む。
【００４５】
一態様において、回収する段階は、少なくとも約４リアクター容積の回収培地で少なくとも約２４、少なくとも約４８、少なくとも約６０、若しくは少なくとも約７２時間、又は２４〜７２時間の範囲内、マトリックスを灌流することを含む。一態様において、回収する段階は、約４リアクター容積の回収培地で約６０時間マトリックスを灌流することを含む。一態様において、回収する段階は、回収培地で約６０時間マトリックスを灌流すること、及び培地又はその一部を定期的な時間間隔で、例えば１２、２４、３６、又は４８時間ごとに採取することを含む。
【００４６】
一態様において、この方法は、半閉鎖系又は閉鎖系を用いて、回収された材料を処理する段階であって、それにより、精製された材料が生じる、段階を含む。
【００４７】
一態様において、処理する段階は、イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーのうちの１つ又は複数を含む。
【００４８】
一態様において、処理する段階は、１つ又は複数の遠心濃縮機において回収された材料の遠心分離により組換えレンチウイルスベクターを濃縮することを含む。一態様において、処理する段階は、タンジェンシャルフロー濾過により組換えレンチウイルスベクターを濃縮することを含む。
【００４９】
一態様において、この方法は、精製された材料を組換えレンチウイルスベクターの感染力価についてアッセイする段階を含む。一態様において、この方法により製造された組換えレンチウイルスベクターは、そのように製造されていない組換えレンチウイルスベクターと比較して少なくとも約２０％増加したウイルス形質導入効率を呈する。一態様において、この方法により製造された組換えレンチウイルスベクターは、本明細書に記載された通りの、例えば実施例１に記載された実行１のバイオリアクター１〜４の通りの、工程パラメータの最適化なしに製造された組換えレンチウイルスベクターと比較して少なくとも約２０％増加したウイルス形質導入効率を呈する。
【００５０】
レンチウイルスベクターを精製するための様々な他の方法論が、用いられ得る。
【００５１】
バイオリアクター、マクロキャリア、及び生成システム
本開示の特定の形態は、細胞を固定層で培養するための方法に関する。例証的な細胞培養デバイスは、米国特許第８，５９７，９３９号、米国特許第８，１３７，９５９号、米国特許付与前公開（ＵＳ  ＰＧ  Ｐｕｂ）第２００８／０２４８５５２号、及び国際公開公報第２０１４０９３４４４号で参照され、市販されている（例えば、Ｎａｎｏ及び５００／１００バイオリアクターなど、ニューヨーク州ポートワシントンにあるＰａｌｌ（登録商標）Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）バイオリアクター）。ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）バイオリアクターは、感知できるほどの結果の変化を生じずにＮａｎｏバイオリアクターからより大型のバイオリアクターへの製造条件の規模変更を可能にするように設計されている。したがってＮａｎｏバイオリアクターで開発された製造条件は、いずれかのｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）バイオリアクターに変換される。本開示の方法において、他の現行の、又は将来を見越して創作された固定層バイオリアクターを使用することも可能である。幾つかの態様において、細胞は、固定層バイオリアクターで培養される。固定層バイオリアクターは、細胞接着及び生育を促進するために、固定又は充填層を形成する据え付けの充填材料の形態の担体を含む。固定層の充填材料の配列は、局所の流体、熱、及び物質移動に影響を及ぼし、通常、所与の空間において細胞の養成を最大にするために非常に密集している。一態様において、リアクターは、細胞の接着及び生育を促進するために、充填材料（繊維、ビーズ、球体、又は同様のものなど）で構成された充填又は固定層で内部を形成する壁を含む。この材料は、リアクターの内部の区画内に配置され、区画は、中空で垂直に延在する管の上部を含んでいてもよい。第二の区画が、少なくとも一部が固定層を形成する区画の材料へ、及びこの区画の材料から流体を運搬するために、リアクターの内部に提供されている。典型的には充填材料は、細胞生育のために表面積を最大にするように配列されなければならず、１，０００平方メートルが、表面積の有利な量と見なされる（例えば、メディカルグレードのポリエステルマイクロファイバーを充填材料として用いて達成されてもよい）。一態様において、均等分布された培地循環が、内蔵された磁気駆動式インペラにより成し遂げられて、低いせん断応力及び高い細胞生存力を確実にしてもよい。細胞培地は、固定層を通って底部から最上部に流れる。最上部では、培地は、薄膜として外壁を落下し、そこでＯ２を取り込んでバイオリアクター内の高いＫＬａを保持する。この滝状の酸素化が、穏やかなかき混ぜ及びバイオマス不動化と一緒になって、バイオリアクターに高い細胞密度を達成及び保持させる。
【００５２】
本明細書で用いられる「層高」は、バイオリアクター、又はバイオリアクターのいわゆる固定層（バイオリアクターが固定層を使用する場合）のいずれかのパラメータである。多くの商業的な接着型バイオリアクターシステムにおいて、マクロキャリアの層は、単回使用（使い捨ての）システムのバイオリアクターと共に提供され、それゆえバイオリアクターの層高と固定層の層高は、概ね同義語である。２ｃｍ、４ｃｍ、又は１０ｃｍの層高が、図２に例証されている。
【００５３】
幾つかの態様において、バイオリアクターは、約１ｃｍ〜約１５ｃｍの範囲内、又は約２ｃｍ〜約１２ｃｍの範囲内の層高を有する。幾つかの態様において、バイオリアクターは、約２ｃｍ、約３ｃｍ、約４ｃｍ、約５ｃｍ、約６ｃｍ、約７ｃｍ、約８ｃｍ、約９ｃｍ、約８ｃｍ、約９ｃｍ、約１０ｃｍ、約１１ｃｍ、又は約１２ｃｍの層高を有する。幾つかの態様において、バイオリアクターは、約２ｃｍの層高を有する。他の態様において、バイオリアクターは、約１０ｃｍの層高を有する。特定の態様において、バイオリアクターは、５００ｍｌ〜１５００ｍｌ、５００〜１００ｍｌ、約５００ｍｌ、約６００ｍｌ、約７００ｍｌ、約８００ｍｌ、約９００ｍｌ、約１，０００ｍｌ、約１，１００ｍｌ、約１，２００ｍｌ、又は約１，５００ｍｌのリアクター容積を有する。
【００５４】
幾つかの態様において、固定層は、約１ｃｍ〜約１５ｃｍの範囲内、又は約２ｃｍ〜約１２ｃｍの範囲内の層高を有する。幾つかの態様において、固定層は、約２ｃｍ、約３ｃｍ、約４ｃｍ、約５ｃｍ、約６ｃｍ、約７ｃｍ、約８ｃｍ、約９ｃｍ、約８ｃｍ、約９ｃｍ、約１０ｃｍ、約１１ｃｍ、又は約１２ｃｍの層高を有する。幾つかの態様において、固定層は、約２ｃｍの層高を有する。他の態様において、固定層は、約１０ｃｍの層高を有する。特定の態様において、固定層は、５００ｍｌ〜１５００ｍｌ、５００〜１００ｍｌ、約５００ｍｌ、約６００ｍｌ、約７００ｍｌ、約８００ｍｌ、約９００ｍｌ、約１，０００ｍｌ、約１，１００ｍｌ、約１，２００ｍｌ、又は約１，５００ｍｌのリアクター容積を有する。
【００５５】
ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）バイオリアクターのための例示的パラメータが、表Ａに提供されている。図２は、層高と、径と、容積と、圧縮との関連性を例証している。
【００５６】
（表Ａ）小規模及び製造規模でのｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）バイオリアクターの構成
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出典：ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｔｅｃｈ．ｐａｌｌ．ｃｏｍ／
【００５７】
幾つかの態様において、固定層は、マクロキャリア（例えば、マトリックス）を含有する。幾つかの態様において、マクロキャリアは、繊維マトリックスである。幾つかの態様において、マクロキャリアは、炭素繊維マトリックスである。このマクロキャリアは、織物又は不織布のマイクロファイバー、ポリエステルマイクロファイバー（例えば、メディカルグレードのポリエステルマイクロファイバー）多孔質炭素、及びキトサンのマトリックスから選択されてもよい。マイクロファイバーは、任意に、ＰＥＴ、又はいずれか他のポリマー若しくはバイオポリマーで作製されてもよい。幾つかの態様において、マクロキャリアは、ビーズを含む。このポリマーは、細胞培養と両立するように処理されてもよいが、それは、そのような処理が必要な場合である。使用され得る適切な低圧縮マクロキャリアとしては、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）バイオリアクターシステムと共に提供される商標登録されたマクロキャリアが挙げられるが、当該技術分野で知られる、又は将来を見越して開発された他の適切な低圧縮マクロキャリアが、代用され得る。
【００５８】
適切なマクロキャリア、マトリックス又は「担体材料」は、ケイ酸塩、リン酸カルシウムなどの鉱物担体、多孔質炭素などの有機化合物、キトサンなどの天然産物、細胞生育と両立するポリマー又はバイオポリマーである。このマトリックスは、規則的若しくは不規則な構造を有するビーズの形態を有することができ、又は細胞生育と両立するポリマー若しくはいずれか他の材料の織物若しくは不識布のマイクロファイバーを含んでいてもよい。この充填物は、細孔及び／又は溝を有する一体成形物としても提供され得る。レシピエント内のこの充填物は、種々の形態及び寸法を有し得る。幾つかの態様において、マトリックスは、固体又は多孔質の球体、フレーク、多角形の微粒子材料である。典型的にはマトリックスの充分な量が、使用の際にレシピエント内でのマトリックス粒子の移動を回避するために用いられ、それは、この移動が細胞を損傷する場合があり、そして気体及び／又は培地の循環に影響を有する場合があるためである。或いはマトリックスは、内部レシピエントに、又はレシピエントの区画にはまる、適当な多孔性及び表面を有する要素からなる。この例が、Ｃｉｎｖｅｎｔｉｏｎ（ドイツ）により製造された炭素マトリックス（Ｃａｒｂｏｓｃａｌｅ）である。幾つかの態様において、繊維マトリックスは、約１５０ｃｍ２／ｃｍ３〜約１０００ｃｍ２／ｃｍ３の間の細胞に接近可能な表面積を有する。幾つかの態様において、低圧縮マクロキャリアの層高は、２ｃｍ、４ｃｍ、又は１０ｃｍである。
【００５９】
幾つかの態様において、接着型バイオリアクターは、モジュール型固定層を有するｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）バイオリアクターである。ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）バイオリアクターにおけるウイルスベクターの製造は、例えば全体として参照により本明細書中に取り込まれる国際公開公報第２０１８００７８７３Ａ１号及び米国特許出願公開第２０１８０１９５０４８Ａ１号に記載されている。ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）Ｎａｎｏ及び５００／１００バイオリアクター（ニューヨーク州ポートワシントンにあるＰａｌｌ（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの市販のバイオリアクターとしては、コンパクトなバイオリアクター容積の中に大きな生育表面積を提供する着脱式、使い捨て、又は単回使用の固定層を有するバイオリアクターシステムを挙げてもよい。マイクロキャリアを用いた標準の撹拌槽型バイオリアクターと比較して、そのようなシステムは、マイクロキャリアの手動操作、滅菌及び水素添加、並びに予備培養から最終工程までのビーズ間移動をはじめとする複数の繊細で時間を費やす手順を回避する。本明細書に記載された通り、そのようなバイオリアクターは、大規模な（例えば、５００平方メータ）培養面積相当での処理、及び最大１５００〜２０００Ｌの流体体積の回収を可能にしてもよく、それはウイルスの工業規模生成に（例えば、レンチウイルス生成における使用に）有利である。本明細書で例示された通り、そのようなデバイスは、少ない細胞接種；短かい予備培養期間で感染に最適な細胞密度に達すること；並びに／又は細胞生育期の間のＭＯＩ、培地、及び血清濃度の最適化などのさらなる利点を可能にしてもよい。例えば、細胞の９０％以上が同じ培地環境を受けるように、そのようなデバイスは、培養する細胞の迅速な灌流を可能にするように構成されてもよい。その上、そして理論に束縛されるのを望むものではないが、単回使用又は使い捨ての固定層が、効率化された下流の処理を可能にして生産性を最大にし、そして複数の大規模従来型培養器と同等なスケールアップがあっても処理面積のフットプリントを低減することができる。そのようにして有利な生産性及び純度が、最小限の段階及びコストで達成されてもよい。
【００６０】
幾つかの態様において、トランスフェクトする段階に先立って達成された所定の細胞密度は、１〜１０，０００×１０３細胞／ｃｍ２である。幾つかの態様において、トランスフェクトする段階に先立って達成された所定の細胞密度は、１〜１，０００×１０３細胞／ｃｍ２、１，０００〜２，０００×１０３細胞／ｃｍ２、２，０００〜３，０００×１０３細胞／ｃｍ２、３，０００〜４，０００×１０３細胞／ｃｍ２、４，０００〜５，０００×１０３細胞／ｃｍ２、５，０００〜６，０００×１０３細胞／ｃｍ２、又は６，０００〜７，０００×１０３細胞／ｃｍ２である。幾つかの態様において、トランスフェクトする段階に先立って達成された所定の細胞密度は、１〜１００×１０３細胞／ｃｍ２、１００〜２００×１０３細胞／ｃｍ２、２００〜３００×１０３細胞／ｃｍ２、３００〜４００×１０３細胞／ｃｍ２、４００〜５００×１０３細胞／ｃｍ２、５００〜６００×１０３細胞／ｃｍ２、又は６００〜７００×１０３細胞／ｃｍ２である。幾つかの態様において、トランスフェクトする段階に先立って達成された所定の細胞密度は、１５０〜３００×１０３細胞／ｃｍ２である。幾つかの態様において、トランスフェクトする段階に先立って達成された所定の細胞密度は、１５０〜２００×１０３細胞／ｃｍ２、２００〜２５０×１０３細胞／ｃｍ２、又は２５０〜３００×１０３細胞／ｃｍ２である。
【００６１】
プロデューサー細胞及び細胞培養
このプロデューサー細胞は、レンチウイルスベクターの生成に適し、接着様式での生育に適合している又は適合可能である、いずれのプロデューサー細胞又は細胞株であってもよい。一態様において、プロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３細胞又はその派生物、任意にＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はその派生物である。一態様において、プロデューサー細胞は、接着性ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
【００６２】
プロデューサー細胞、例えばＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）２９３、又はＰｒｏ２９３（商標）培地などの種々の細胞培地で培養されてもよい。上記の細胞型をはじめとするプロデューサー細胞の培養条件は、公知で、種々の発行物に記載されており、或いは培地、補助物質、及び条件が、例えばＣａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（ニュージャージー州イーストラザフォード）のカタログ及び追加的文献に記載される通り、商業的に購入されてもよい。特定の態様において、プロデューサー細胞は、無血清培地中で培養される。用いられ得る公知の無血清培地としては、イスコフ培地、Ｕｌｔｒａ−ＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）又はＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が挙げられる。普通の血清含有培地としては、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）又は最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））又はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ又はＥＤＭ）が挙げられ、それらは普通、最大１０％のウシ胎児血清又は類似の添加剤と共に用いられる。任意に、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））又はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ又はＥＤＭ）は、いずれかの血清含有補助物質を含まずに用いられてもよい。ＰＦ−ＣＨＯ（ＪＨＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のようなタンパク質不含培地、ＰｒｏＣＨＯ  ４ＣＤＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）若しくはＳＭＩＦ  ７（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のような化学的に定義された培地、及びＰｒｉｍａｃｔｏｎｅ、Ｐｅｐｔｉｃａｓｅ若しくはＨｙＰｅｐ（商標）（全てＱｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのもの）のような分裂促進性ペプチド、又はラクトアルブミン加水分解産物（Ｇｉｂｃｏ及び他の製造業者）もまた、先行技術で適当に知られている。植物加水分解産物に基づく培地添加剤は、ウイルス、マイコプラズマ又は未知の感染性物質の混入が無視され得るという特別な利点を有する。
【００６３】
幾つかの態様において、プロデューサー細胞は、ウイルス複製を容易にする１種類又は複数種類のポリヌクレオチド（例えば、Ｇａｇ−ｐｏｌ、Ｒｅｖ、及び／又はｅｎｖ遺伝子をコードするポリヌクレオチド）を含む。幾つかの態様において、プロデューサー細胞は、パッケージング細胞株に由来する。幾つかの態様において、プロデューサー細胞は、パッケージング細胞株に由来しない。一態様において、細胞株は、ヘルパープラスミドを用いずにＧａｇ−ｐｏｌ、ｒｅｖ、及びＥｎｖ（ＶＳＶＧ）のうちの１つ又は複数を発現するように遺伝子操作されている。適当なＧａｇ−ｐｏｌ、Ｒｅｖ、及びＥｎｖポリペプチド、これらをコードするプラスミド、並びにこれらのポリペプチドを発現するパッケージング細胞株は、当該技術分野で公知であり入手できる。
【００６４】
トランスフェクション試薬
特定の態様において、トランスフェクション試薬は、リン酸カルシウムであり、幾つかの態様において、他のトランスフェクション試薬が、用いられる。適切なトランスフェクション試薬は、例えばＰＥＩＰｒｏ（商標）（ＰｏｌｙＰｌｕｓ）、ＪｅｔＰＥＩ（商標）、直鎖状ＰＥＩ若しくはいずれかのポリエチレンイミン誘導体、又はいずれか他の機能的に同等なトランスフェクション試薬であり得る。一態様において、トランスフェクション試薬は、カチオン性ポリマー、例えばＬｅｎｔｉｆｅｃｔｉｎ（商標）である。複数の態様において、トランスフェクション試薬混合物は、非限定的にホスファターゼ、クエン酸塩−リン酸塩、又は４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤をはじめとする、細胞培養での使用に適したいずれかの緩衝剤を含む。一態様において、緩衝剤は、ＨＥＰＥＳであり、混合物は、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（例えば、ＵｌｔｒａＳＡＬＩＮＥ  Ａ）中で調製される。幾つかの態様において、緩衝剤は、当該技術分野で知られていてリン酸カルシウムトランスフェクション試薬と両立する、細胞培養に適したいずれかの緩衝剤である。特定の態様において、緩衝剤は、緩衝生理食塩水、例えばＵｌｔｒａＳＡＬＩＮＥ  ＡなどのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水である。特定の態様において、緩衝剤は、（（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸）（ＢＥＳ）である。複数の態様において、トランスフェクション試薬混合物は、中性ｐＨ、例えばｐＨ６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、若しくは７．８、又はｐＨ６．５〜７．８の範囲内を有する。特定の態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約７．２又は約７．４のｐＨである。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約７．２のｐＨである。
【００６５】
一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約９０〜２００ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．０〜７．６のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１１０ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．２のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１２０ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．２のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１２５ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．２のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１３０ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．２のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１４０ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．２のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１５０ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．２のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１６０ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．２のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１７０ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．２のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１８０ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．２のｐＨを有する。
【００６６】
一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１１０ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．４のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１２０ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．４のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１２５ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．４のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１３０ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．４のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１４０ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．４のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１５０ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．４のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１６０ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．４のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１７０ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．４のｐＨを有する。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１８０ｍＭのＣａＰｈｏを含み、３７℃で約７．４のｐＨを有する。
【００６７】
一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１〜約１５０μｇ／ｍＬの１種類又は複数種類のＤＮＡポリヌクレオチドを含む。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１〜約１２０μｇ／ｍＬの１種類又は複数種類のＤＮＡポリヌクレオチドを含む。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、又は約９０μｇ／ｍＬの１種類又は複数種類のＤＮＡポリヌクレオチドを含む。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約１０、約２０、又は約３０μｇ／ｍＬの１種類又は複数種類のＤＮＡポリヌクレオチドを含む。一態様において、トランスフェクション試薬混合物は、約２０μｇ／ｍＬの１種類又は複数種類のＤＮＡポリヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、２×２０μｇ／ｍＬの１種類又は複数種類のＤＮＡポリヌクレオチドが、細胞に送達されるように、トランスフェクション試薬混合物は、２倍又は少なくとも２倍適用される。
【００６８】
様々な態様において、工程条件は、表Ｂに提供された例の列挙から選択される。条件の他の組み合わせが、可能である。例えば幾つかの態様において、ｐＨは、７．２又は７．４である。幾つかの態様において、リン酸カルシウムの濃度は、１２５ｍＭ又は１８０ｍＭである。幾つかの態様において、トランスフェクション試薬混合物中のＤＮＡ濃度は、２０μｇ／ｍＬ又は２０μｇ／ｍＬである。幾つかの態様において、トランスフェクション試薬混合物は、１回又は２回添加される。
【００６９】
（表Ｂ）実行条件の非限定的例
2021533831.tif 000004
【００７０】
特定の態様において、本開示の方法は、参照方法と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約２５％の細胞計数の増加をもたらす。特定の態様において、本開示の方法は、参照方法と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約２５％の力価の増加をもたらす。特定の態様において、本開示の方法は、参照方法と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約２５％の形質導入単位／リットルの増加をもたらす。特定の態様において、本開示の方法は、参照方法と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約２５％のベクターコピー数／リットルの増加をもたらす。特定の態様において、本開示の方法は、参照方法と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約２５％のベクターゲノム／リットルの増加をもたらす。特定の態様において、本開示の方法は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約２５％の感染力価の増加をもたらす。幾つかの態様において、参照方法は、ＣａＰｈｏ以外のトランスフェクション試薬でのトランスフェクションを含む。幾つかの態様において、参照方法は、約８０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１８０ｍＭ、又は約２００ｍＭのＣａＰｈｏを含むトランスフェクション試薬混合物でのトランスフェクションを含む。幾つかの態様において、参照方法は、約６．４、約６．６、約６．８、約７．０、約７．４、約７．６、又は約７．８のｐＨを有するトランスフェクション試薬混合物でのトランスフェクションを含む。
【００７１】
特定の態様において、ＨＥＫ２９３細胞は、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）バイオリアクターにおいて、体積 約８００ｍＬの３７℃のＤＭＥＭ細胞培地中で培養される。総体積 約２００ｍＬの、ｐＨ７．２のＵｌｔｒａＳＡＬＩＮＥ  Ａ、１２５ｍＭのＣａＰｈｏ及び約２０μｇ／ｍＬのＣｈｉｍ．ＣＤ１８−ＬＶベクタープラスミドと共にＤＭＥＭ細胞培地を含むトランスフェクション試薬混合物が、バイオリアクターに添加される。約６時間後に、培地の連続回収が開始し、約６０時間にわたり少しずつ継続する。回収の後、回収された材料は、さらなる精製のために貯蔵される。
【００７２】
ポリヌクレオチド
様々な態様において、プロデューサー細胞に、１種類又は複数種類のポリヌクレオチドがトランスフェクト又は形質導入される。幾つかの態様において、それらに、発現カセット、例えば治療性ポリペプチド又は治療性ＲＮＡなどの関心対象のポリペプチド又はポリヌクレオチドをコードする発現カセットを含むポリヌクレオチドがトランスフェクト又は形質導入される。特有の態様において、それらに、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを作製するために必要な又は望ましいウイルスタンパク質をコードする１種類又は複数種類のポリヌクレオチドがトランスフェクトされる。
【００７３】
一態様において、ポリヌクレオチドは、Ｒ型特異性ピルビン酸キナーゼ（ＲＰＫ）、インテグリンサブユニットベータ２（ＩＴＧＢ２）、ファンコニ貧血相補群Ａ（ＦＡＮＣＡ）、ファンコニ貧血相補群Ｃ（ＦＡＮＣＣ）、ファンコニ貧血相補群Ｇ（ＦＡＮＣＧ）、Ｔ細胞免疫制御因子１（ＴＣＩＲＧ１）、電位依存性塩化物イオンチャネル７（ＣＬＣＮ７）、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、プレクストリン相同ドメインＭ１（Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  ＲＵＮ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍ１）（ＰＬＥＫＨＭ１）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１１ａ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、及び破骨細胞発生関連膜貫通型タンパク質１（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １）（ＯＳＴＭ１）、又はそれらの機能性断片若しくは変異体からなる群から任意に選択される関心対象の遺伝子又は関心対象のポリペプチドをコードする遺伝子を含むレンチウイルスベクター遺伝子発現カセットを含む。
【００７４】
幾つかの態様において、プロデューサー細胞は、ウイルス複製を容易にする１種類又は複数種類のポリヌクレオチド（例えば、Ｇａｇ−ｐｏｌ、Ｒｅｖ、及び／又はｅｎｖ遺伝子をコードするポリヌクレオチド）を含む。幾つかの態様において、プロデューサー細胞は、パッケージング細胞株に由来する。一態様において、プロデューサー細胞は、ヘルパープラスミドを用いずにＧａｇ−ｐｏｌ、ｒｅｖ、及びＥｎｖ（ＶＳＶＧ）のうちの１つ又は複数を発現するように遺伝子操作されている。したがって特定の態様において、プロデューサー細胞に、関心対象の遺伝子又は関心対象のポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現カセットを含むプラスミドがトランスフェクトされるに過ぎない。
【００７５】
幾つかの態様において、ウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子が、関心対象の遺伝子又は関心対象のポリペプチドをコードする遺伝子を含む遺伝子発現カセットと同一又は異なるポリヌクレオチド上でプロデューサー細胞に提供される。例えばその細胞に、Ｇａｇ−ｐｏｌ、ｒｅｖ、及び／又はＥｎｖ（ＶＳＶＧ）を発現する１、２、３、又は４つのプラスミドがトランスフェクトされてもよい。特有の態様において、細胞に、４つのプラスミドがトランスフェクトされ、１つのプラスミドはＧａｇ−ｐｏｌをコードし、１つのプラスミドはＲｅｖをコードし、１つのプラスミドはＥｎｖをコードし、１つのプラスミドは、関心対象の遺伝子又は関心対象のポリペプチド、例えば治療性ポリペプチドをコードする遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む。適切なＧａｇ−ｐｏｌ、Ｒｅｖ、及びＥｎｖポリペプチド、これらをコードするプラスミド、並びにこれらのポリペプチドを発現するパッケージング細胞株は、当該技術分野において公知であり入手できる。
【００７６】
レンチウイルスベクター、その医薬組成物及び使用
幾つかの態様において、本開示は、本開示のいずれかの方法により生成された組換えレンチウイルスベクターを提供する。
【００７７】
幾つかの態様において、本開示は、本開示のいずれかの方法により生成された組換えレンチウイルスベクターと、医薬的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【００７８】
幾つかの態様において、本開示は、レンチウイルスベクター又はベクター粒子を含む医薬組成物であって、このベクター粒子が、１×１０７〜１×１０９個のベクター粒子（ｖｐ）／ｍＬの間の濃度である、医薬組成物を提供する。幾つかの態様において、医薬組成物は、少なくとも約１×１０７、少なくとも約１×１０７、少なくとも約１×１０８、少なくとも約１×１０９、少なくとも約１×１０１０、又は少なくとも約１×１０１１のベクター粒子（ｖｐ）／ｍＬの濃度のベクター粒子を含む。幾つかの態様において、医薬組成物は、少なくとも１×１０７、少なくとも１×１０７、少なくとも１×１０８、少なくとも１×１０９、少なくとも１×１０１０、又は少なくとも１×１０１１のベクター粒子（ｖｐ）／ｍＬの濃度のベクター粒子を含む。幾つかの態様において、医薬組成物は、約１×１０７、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、又は約１×１０１１のベクター粒子（ｖｐ）／ｍＬの濃度のベクター粒子を含む。特定の態様において、組換えレンチウイルスベクターは、本開示のいずれかの方法により生成された。
【００７９】
特定の態様において、組換えレンチウイルスベクターは、本開示のいずれかの方法により生成された。
【００８０】
特有の態様において、本開示は、複数の細胞が、組換えレンチウイルスベクターにより形質導入されている、細胞の集団を含む医薬組成物を提供する。幾つかの態様において、細胞の集団は、本開示のいずれかの方法により生成された組換えレンチウイルスベクターに接触又は感染された。
【００８１】
本発明は、本明細書に記載されたベクターと、医薬的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む、医薬組成物及び製剤を包含する。このベクターは、概ね安全で非毒性かつ望ましく、霊長類の使用に許容できる賦形剤を含む、製剤を調製する上で有用な医薬的に許容できる担体、希釈剤、及び試薬と組み合わせられ得る。そのような賦形剤、担体、又は希釈剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。補助的活性化合物もまた、製剤に組み入れられ得る。製剤に用いられる溶液又は懸濁液としては、注射用の水、生理食塩液、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌性化合物；アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化合物；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤；凝集を予防するＴｗｅｅｎ２０などの洗浄剤；及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張度の調整のための化合物が挙げられ得る。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整され得る。特有の態様において、製剤は、滅菌されている。
【００８２】
幾つかの態様において、この方法は、現行適正製造規範に従って実施される。現行適正製造規範に従って製造されるとは、投与のために調製された製剤が管理規制及び政府認可の下でヒト対象への投与を許可するのに充分、安全であることを意味する。一般に、管理規制及び認可は、製剤が同一性、強度、品質、及び純度に関して事前承認された許容基準に適合することを要求することになる。許容基準としては、製剤が現行適正製造規範に適合するか否かを判定するために用いられる試験結果の数多くの限定、範囲又は他の適切な尺度が挙げられる。仕様書が、許容基準との規格適合性を試験するために用いられる分析手順を明記している。製剤は、バッチ内で評価され得る。バッチは、許容基準の順守を確実にするために試験された製剤の具体的分量である。
【００８３】
前記組成物又は製剤は、コンテナ、パック又はディスペンサ、例えばシリンジ、例えばプレフィルドシリンジの中に、投与の説明書と一緒に含まれ得る。
【００８４】
必要又は有益ならば、組成物及び製剤は、注射部位の疼痛を軽減するリドカインなどの局所麻酔を含み得る。
【００８５】
幾つかの態様において、本明細書で提供される医薬組成物及び製剤は、医薬的に許容できる担体及び／又は賦形剤、例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸塩及びアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝剤、防腐剤、並びに他のタンパク質との混合物中に、本明細書に開示されたウイルスベクターの治療有効量を含む。例示的なアミノ酸、ポリマー及び糖、並びに同様のものは、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアレート化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース、フルクトース、デキストロース、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシ又はヒト血清アルブミン、クエン酸塩、酢酸塩、リンゲル及びハンクス液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リジン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、並びにグリコールである。好ましくは製剤は、４℃で６か月間安定している。
【００８６】
幾つかの態様において、本明細書で提供される医薬組成物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝剤、グリシン緩衝剤、滅菌水、及びＧｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：４６７に記載されるものなどの当業者に知られる他の緩衝剤などの緩衝剤を含む。アデノウイルスベクター送達システム中に含有される腫瘍サプレッサ遺伝子を含む医薬組成物中の緩衝剤のｐＨは、６．５〜７．７５、好ましくは７〜７．５、最も好ましくは７．２〜７，４の範囲内であってもよい。
【００８７】
生成されたレンチウイルスベクター及び医薬組成物は、直接使用されても、又は貯蔵されてもよい。
【００８８】
レンチウイルスベクター及び医薬組成物は、例えばそれらを対象に投与することにより、又は間接的に、例えば細胞をレンチウイルスベクターに感染させ、その後、その細胞を治療性細胞として対象に投与することにより、それを必要とする対象における疾患又は障害を処置又は予防するために用いられてもよい。特有の態様において、細胞は、レンチウイルスベクターに感染される前に、対象から得られた。
【００８９】
幾つかの態様において、本開示は、ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを細胞に提供するための、本開示のいずれかの方法又は本開示の医薬組成物により生成された組換えレンチウイルスベクターの使用を提供する。
【００９０】
幾つかの態様において、本開示は、それを必要とする哺乳動物対象における疾患又は障害を処置するための、本開示のいずれかの方法又は本開示の医薬組成物により生成された組換えレンチウイルスベクターの使用を提供する。幾つかの態様において、疾患又は障害は、ピルビン酸キナーゼ欠乏症、白血球接着不全症、ファンコニ貧血、及び／又は大理石骨病である。
【００９１】
本明細書で言及された全ての発行物は、その発行物が引用されことに関連する方法及び／又は材料を開示及び記載するために、参照により本明細書中に取り込まれる。齟齬が存在する限り、本開示が取り込まれた発行物のいずれかの開示に優先することが、理解されたい。
【００９２】
さらに、特許請求の範囲がいずれか任意の要素を除外するために立案され得ることに、留意されたい。そのようにしてこの陳述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連して「単に」、「唯一の」及び同様のもののような排他的用語法の使用又は「否定的」限定の使用のための先行詞として働くものとする。
【００９３】
本明細書で議論された発行物は、単に本出願の提出日に先立つそれらの発行物の開示のために提供されている。さらに、提供された発行物の日付は、実際の発行日と異なっていてもよく、実際の発行日は、独立して確定される必要があってもよい。
【００９４】
本開示は、以下の実施例にさらに記載されており、実施例は、特許請求の範囲に記載された開示の範囲を限定しない。
【実施例】
【００９５】
実施例１
ｉＣＥＬＬｉｓリアクターにおけるレンチウイルスベクターの最適化された製造
以下の実施例は、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）システムにおいてレンチウイルスベクターの生成のために用いられたパラメータの最適化を実証している。試験パラメータが、表１に提供されている。
【００９６】
（表１）実行パラメータ
2021533831.tif 000005
【００９７】
実行１〜３では、システムを試験するレンチウイルスベクターを生成するために用いられたプラスミドは、蛍光強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）トランスジーンをコードしている。実行４では、用いられたプラスミドは、ＣＤ１８トランスジーンをコードするＣｈｉｍ．ＣＤ１８−ＬＶベクターであった。
【００９８】
各実行において、４種類のバイオリアクターが用いられた。それらは、０．５３、０．８、２．６、又は４型で構成されていたため、マクロキャリアの表面積は、ｉＣＥＬＬｉｓ  Ｎａｎｏにおいて０．５３、０．８、２．６、又は４平方メートルであった。細胞は、１，５００又は２，０００細胞／ｃｍ２で播種され、細胞密度が１５０〜２００，０００細胞／ｃｍ２に達するまで生育させ、その時点で、１ｃｍ／秒で連続混合されながら、トランスフェクション試薬混合物が６時間にわたり添加された。トランスフェクション及び実行終了の際の細胞計数が、表２に提供されている。
【００９９】
（表２）トランスフェクション及び実行終了の際の細胞計数
2021533831.tif 000006
ＮＤ＝非測定  Ｎ／Ａ＝非適用
【０１００】
表１に示される通り、トランスフェクション試薬混合物は、２０又は４０μｇ／ｍＬのいずれかのＤＮＡを、ｐＨ７．２又は７．４の１２５又は１８０ｍＭのいずれかのリン酸カルシウムと共に含有した。「２ｘ」により示された場合、２倍体積のトランスフェクション試薬混合物が、用いられた。トランスフェクション試薬とＤＮＡが、室温又は３７℃のいずれかで混合された。トランスフェクション試薬混合物は、溶液を緩衝するために用いられたＵｌｔｒａＳＡＬＩＮＥ  Ａ（ＨＥＰＥＳに基づく生理食塩液）を含むＤＭＥＭ細胞培地中で作製された。２００、４００、６００、又は１，０００ｍＬのトランスフェクション試薬混合物が、総体積 ８００又は１，０００ｍＬになるまで反応物に添加された。
【０１０１】
６時間後に、培地の回収が開始された。この時点で、バイオリアクターが空になり、８００ｍｌの予備加温された培地が、バイオリアクターに添加された。灌流培地（５Ｌ）が接続され、灌流が開始した。回収が、６０時間かけて少しずつ実施され、その結果、合計でリアクター容積の４〜５倍（大体２，４００〜６，３００ｍＬ）が添加された。回収の後、回収された材料が、室温（ＲＴ）又は４℃で貯蔵された。
【０１０２】
表２（上記）及び表３〜６に要約される通り、採取された材料は、総細胞計数；ＧＦＰ＋細胞のパーセント値（ＧＦＰ％）及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）（ＥＧＦＰベクターが用いられた場合）；ベクターゲノム中で測定された逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）に基づく物理的な力価（ｖｇ）；ｐ２４レベルに基づくウイルス粒子（ｖｐ）；形質導入単位（ＴＵ）；及びベクターコピー数（ＶＣＮ）について評価された。ｐ２４レベルが、Ｔａｋａｒａ（登録商標）のＬｅｎｔｉ−Ｘ（商標）ｐ２５  Ｒａｐｉｄ  Ｔｉｔｅｒ  Ｋｉｔを用いて酵素免疫測定法により測定された。レンチウイルス粒子の力価は、レンチウイルス粒子（ＬＰ）あたりおよそ２０００分子のｐ２４が存在すると仮定し、それゆえ１ＬＰが２，０００×２４×１０３／（６×１０２３）ｇのｐ２４＝８×１０−５ｐｇのｐ２４を含有する；又は１ｎｇのｐ２４＝１．２５×１０７ＬＰと仮定することにより決定された。
【０１０３】
実行１３は、実施された１６の実行のうち最高の収率をもたらした。回収された材料は、室温又は４℃のいずれかで貯蔵された。
【０１０４】
（表３）ＲＴｑＰＣＲによる物理的な力価（ＶＧ）
2021533831.tif 000007
【０１０５】
（表４）ｐ２４  ＥＬＩＳＡによる物理的な粒子力価（ＶＰ）
2021533831.tif 000008
【０１０６】
（表５）感染力価 − ＧＦＰによる形質導入単位力価（ＴＵ）
2021533831.tif 000009
【０１０７】
（表６）感染力価 − ｑＰＣＲによるベクターコピー数（ＶＣＮ）
2021533831.tif 000010
【図１】
2021533831.tif 000011
【図２】
2021533831.tif 000012
【国際調査報告】
2021533831.tif 000013
2021533831.tif 000014