(57)【要約】  本明細書は、回収スキッドでのタンパク質濾過中にサンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングすることを含む、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物中のタンパク質の収量をコントロール、調節、増大、または改善する方法を開示する。
2021519298.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物中の目的タンパク質の濃度（力価）をリアルタイムでモニタリングする方法であって、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングし、確立されたモデルを使用して、濾過ベースのセルカルチャー回収プロセス中にＵＶシグナルを目的タンパク質の力価に自動的に変換することを含む、方法。
【請求項２】
濾過ベースのセルカルチャー回収プロセス中にサンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングすることを含む、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物における目的タンパク質回収をコントロールし、タンパク質の収量を改善する方法。
【請求項３】
確立されたモデルおよび自動制御に従って、ＵＶシグナルが目的タンパク質の力価に連続的に変換される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
目的タンパク質の力価が、少なくとも約０．０１ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０２ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０３ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０４ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０５ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０６ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０７ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０８ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０９ｇ／Ｌ、少なくとも約０．１ｇ／Ｌ、少なくとも約０．２ｇ／Ｌ、少なくとも約０．３ｇ／Ｌ、少なくとも約０．４ｇ／Ｌ、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約０．６ｇ／Ｌ、少なくとも約０．７ｇ／Ｌ、少なくとも約０．８ｇ／Ｌ、少なくとも約０．９ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約１．５ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約２．５ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約３．５ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約４．５ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約５．５ｇ／Ｌ、少なくとも約６ｇ／Ｌ、少なくとも約６．５ｇ／Ｌ、少なくとも約７ｇ／Ｌ、少なくとも約７．５ｇ／Ｌ、少なくとも約８ｇ／Ｌ、少なくとも約８．５ｇ／Ｌ、少なくとも約９ｇ／Ｌ、少なくとも約９．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１１ｇ／Ｌ、少なくとも約１１．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１２ｇ／Ｌ、少なくとも約１２．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１３ｇ／Ｌ、少なくとも約１３．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１４ｇ／Ｌ、少なくとも約１４．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約１５．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１６ｇ／Ｌ、少なくとも約１６．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１７ｇ／Ｌ、少なくとも約１７．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１８ｇ／Ｌ、少なくとも約１８．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１９ｇ／Ｌ、少なくとも約１９．５ｇ／Ｌ、または少なくとも約２０ｇ／Ｌである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
力価が少なくとも約０．０５ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０６ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０７ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０８ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０９ｇ／Ｌ、少なくとも約０．１ｇ／Ｌ、少なくとも約０．２ｇ／Ｌ、少なくとも約０．３ｇ／Ｌ、少なくとも約０．４ｇ／Ｌ、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約０．６ｇ／Ｌ、少なくとも約０．７ｇ／Ｌ、少なくとも約０．８ｇ／Ｌ、少なくとも約０．９ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約１．５ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約２．５ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約３．５ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約４．５ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約５．５ｇ／Ｌ、少なくとも約６ｇ／Ｌ、少なくとも約６．５ｇ／Ｌ、少なくとも約７ｇ／Ｌ、少なくとも約７．５ｇ／Ｌ、少なくとも約８ｇ／Ｌ、少なくとも約８．５ｇ／Ｌ、少なくとも約９ｇ／Ｌ、少なくとも約９．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１１ｇ／Ｌ、少なくとも約１１．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１２ｇ／Ｌ、少なくとも約１２．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１３ｇ／Ｌ、少なくとも約１３．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１４ｇ／Ｌ、少なくとも約１４．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約１５．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１６ｇ／Ｌ、少なくとも約１６．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１７ｇ／Ｌ、少なくとも約１７．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１８ｇ／Ｌ、少なくとも約１８．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１９ｇ／Ｌ、少なくとも約１９．５ｇ／Ｌ、または少なくとも約２０ｇ／Ｌであるときに目的タンパク質の回収を開始することをさらに含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
目的タンパク質が回収される力価が、約０．０５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．６ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．９ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．６ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．９ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、または約１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．６ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．９ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、または約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
力価が約０．１ｇ／Ｌまたは０．２ｇ／Ｌ未満になったときに目的タンパク質の回収を停止することをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
目的タンパク質の収量が、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合と比べて、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、または少なくとも約２０％増大する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
目的タンパク質が、少なくとも約１×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約５×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約１×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも約１．５×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも約２×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも約２．５×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも約３×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも約３．５×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも約４×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも約４．５×１０７細胞／ｍＬ、または少なくとも約５×１０７細胞／ｍＬの細胞密度を有する培地から回収される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質濾過がデプス濾過である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
デプス濾過が一次デプスフィルターおよび／または二次デプスフィルターを含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
モニタリングの前にサンプル混合物をロードすることをさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
セルカルチャーをロードする前にデプスフィルターを水または緩衝液でフラッシュし、セルカルチャーをロードした後にデプスフィルターをチェイスすることをさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または他の緩衝液でサンプル混合物をチェイスすることをさらに含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
濾過ベースのセルカルチャー回収プロセスが回収スキッドを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
回収スキッドが、設定された力価が達成されるとタンパク質の回収を自動的に開始するコントロールシステムを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
回収スキッドが、設定された力価が達成されるとタンパク質の回収を自動的に停止するコントロールシステムを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
コントロールシステムが、回収スキッドを通過する液体の流速を調節する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
コントロールシステムが、ポンプを自動的に駆動して、回収スキッドの流速を上方制御する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
コントロールシステムが、ポンプを自動的に駆動して、回収スキッドの流速を下方制御する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
エアブローダウンのステップを含まない、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
目的タンパク質の力価またはタンパク質の収量が体積によらない、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物中のタンパク質の収量を増大、コントロール、または調節する方法であって、
（ａ）回収スキッドを水でフラッシュする；
（ｂ）サンプルを回収スキッドにロードする；
（ｃ）回収スキッドでのタンパク質濾過中のサンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルを測定し、リアルタイムのタンパク質の力価にする；
（ｄ）ＵＶ測定とリアルタイムのタンパク質の力価に基づいてタンパク質の回収を開始する；
（ｅ）ＰＢＳでタンパク質をチェイスする；
（ｆ）ＵＶ測定とリアルタイムのタンパク質の力価に基づいてタンパク質の回収を停止する
ことを含んでなり、ＵＶシグナルが濾過中のリアルタイムのタンパク質の力価と相関している、方法。
【請求項２４】
圧力、濁度、温度、流速、またはそれらの任意の組み合わせを測定することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
圧力センサーを使用して圧力を測定することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
測定される圧力が、−１０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）〜５０ｐｓｉ、−１０ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、−９ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、−８ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、−７ｐｓｉ〜３０ｐｓｉ、−６ｐｓｉ〜−２０ｐｓｉ、−７ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、−８ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、−９ｐｓｉ〜４５ｐｓｉ、−１０ｐｓｉ〜−４５ｐｓｉ、または−７ｐｓｉ〜−４５ｐｓｉの範囲である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
濁度を測定することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
測定される濁度が、０吸光度単位（ＡＵ）〜２ＡＵの範囲である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
温度を測定することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
測定される温度が、０℃〜７０℃、０℃〜６０℃、０℃〜５０℃、０℃〜４０℃、５℃〜７０℃、１０℃〜７０℃、１５℃〜７０℃、２０℃〜７０℃、１０℃〜６０℃、２０℃〜５０℃、２０℃〜４０℃、２０℃〜４５℃、３０℃〜４０℃、３５℃〜４０℃、２０℃〜３０℃、３５℃〜４０℃、または２５℃〜４５℃の範囲である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
流速を測定することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
測定される流速が、０Ｌ／分〜２０Ｌ／分、０Ｌ／分〜３０Ｌ／分、０Ｌ／分〜４０Ｌ／分、０Ｌ／分〜５０Ｌ／分、０Ｌ／分〜６０Ｌ／分、０Ｌ／分〜７０Ｌ／分、０Ｌ／分〜８０Ｌ／分、０Ｌ／分〜９０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１００Ｌ／分、０Ｌ／分〜１１０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１２０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１３０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１４０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１５０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１６０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１７０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１８０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１９０Ｌ／分、０Ｌ／分〜２００Ｌ／分、０Ｌ／分〜２５０Ｌ／分、または０Ｌ／分〜３００Ｌ／分の範囲である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
回収スキッドが１つ以上のフィルターを含んでなる、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
フィルターが一次デプスフィルターおよび二次デプスフィルターを含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
サンプル混合物が、純粋なタンパク質サンプル、清澄化されたバルクタンパク質サンプル、セルカルチャーサンプル、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
タンパク質が哺乳動物細胞を含む培養物において産生される、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、マウス骨髄腫（ＮＳ０）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、サル腎臓線維芽細胞（ＣＯＳ−７）、Madin-Darbyウシ腎臓細胞（ＭＤＢＫ）またはそれらの任意の組み合わせである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、ＣＨＯＺＮ細胞、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ−ＫＯ細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
哺乳動物細胞がＣＨＯ−ＤＧ４４であり、目的タンパク質の濃度がモデル予測力価を用いて作成され、モデル予測力価が定数（ａ）および（ｂ）を含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
（ａ）が−０．３５であり、（ｂ）が２．８８である、請求項３８〜４０のいずれかに記載の方法。．
【請求項４２】
哺乳動物細胞がＣＨＯ−ＤＧ４４であり、目的タンパク質の濃度がモデル予測力価を用いて作成され、モデル予測力価が定数（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を含んでなる、請求項３８〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
（Ａ）が−０．９５、（Ｂ）が０．８６、（Ｃ）が１．２１である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
哺乳動物細胞がＣＨＯＺＮであり、目的タンパク質の濃度がモデル予測力価を用いて作成され、モデル予測力価が定数（ａ）および（ｂ）を含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
（ａ）が−０．６９であり、（ｂ）が４．０６である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
哺乳動物細胞がＣＨＯＺＮであり、目的タンパク質の濃度がモデル予測力価を用いて作成され、モデル予測力価が定数（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を含んでなる、請求項３８、４４および４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
（Ａ）が０．０２、（Ｂ）が０．１３、（Ｃ）が２．４１である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
タンパク質が抗体または融合タンパク質を含んでなる、請求項１〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
タンパク質が、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＬＡＧ３抗体または抗ＩＬ８抗体である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
タンパク質がアバタセプトまたはベラタセプトである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
タンパク質の収量をリアルタイムでモニタリングおよびコントロールするためのシステムであって、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物のリアルタイムＵＶシグナルを測定するセンサーを含むシステム。
【請求項５２】
システムが、圧力、濁度、温度、流速、重量またはそれらの任意の組み合わせを測定するセンサーをさらに含む、請求項５１に記載のシステム。
【請求項５３】
請求項１〜５０のいずれかに記載の方法に使用するための、請求項５１または５２に記載のシステム。
【請求項５４】
目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物のＵＶシグナルを測定するように構成されたセンサーを含む装置。
【請求項５５】
目的タンパク質の回収をコントロールするように構成されたプロセッサーをさらに含む、請求項５４に記載の装置。
【請求項５６】
プロセッサーが目的タンパク質の力価を使用するように構成されている、請求項５４または５５のいずれかに記載の装置。
【請求項５７】
プロセッサーが、確立されたモデルを使用してセルカルチャー回収プロセスを決定するように構成されている、請求項５４〜５６のいずれかに記載の装置。
【請求項５８】
セルカルチャー回収プロセスが、濾過ベースのセルカルチャー回収プロセスを含んでなる、請求項５４〜５７のいずれかに記載の装置。
【請求項５９】
システムが請求項５４〜５８のいずれかに記載の装置を含んでなる、請求項５１〜５３のいずれかに記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、組成物中の生体分子（例えばタンパク質）の濃度をモニタリングする方法に関する。具体的には、本開示は、タンパク質の濾過中にリアルタイム紫外線シグナルを使用して、組成物からのタンパク質の収量をモニタリングする、コントロールする、調節する、または増大させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
何百もの治療用タンパク質（モノクローナル抗体（ｍＡｂ）など）が現在開発中であり、開発品として多くの企業が複数の抗体を保有している。目的のタンパク質を精製するため、回収などの基本的な単位操作に加え、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーや更なる精製工程が利用される。
【０００３】
上流の回収操作は、セルカルチャーと回収のプロセス両方における治療用タンパク質の高い生産性を目指しており、バイオプロセシング操作をモニタリングするためのさまざまなオンライン形態を利用することができる。Whitford W., Julien C. Bioprocess Int. (5), S32-S45 (2007)を参照。最近、セルカルチャープロセスのリアルタイムのモニタリングとコントロールが行われている。ＣＨＯ培養細胞における生存不能な亜集団の増加によって定常期の開始を予測できることが示されており、これは完全に自動化されたセルカルチャープロセスの機会、並びに培養物拡大に際しバッチ追加の信頼性と再現性のある制御を明らかにするものである。Sitton G., Srienc F. J. Biotechnol., 135 (2008), 174-180.そのほか、一次回収プロセスにおいて、バイオマスを除去して下流のカラムクロマトグラフィーの供給ストリームを浄化する複数のステップが利用されている。Bink L.R., Furey J. BioProcess Int. 8(3) 2010, 44-49, 57 (2010).
【０００４】
下流での収率を上げるため、上流のステップのタンパク質の収量を改善するという取り組みがいくつかなされている。たとえば、蠕動ポンプとダイアフラムポンプを使用して、磁気浮上式のベアリングレス遠心ポンプによって引き起こされるＣＨＯ細胞への機械的応力を低下させようという試みがなされた。Blaschczok K., et al. Chemie Ingenieur Technik, (85), 144-152 (2013). さらに、遠心分離、デプス濾過、プロテインＡ捕捉クロマトグラフィーなどの回収や初期の下流プロセス中に、モノクローナル抗体産生細胞株の上清中の宿主細胞タンパク質のダイナミクスと運命を調べることによって、プロテオミクスアプローチが評価された。Hogwood, C.E.M., et al. Biotechnol. Bioeng. 2013(110), 240-251.ただし、一部のプロセスは、精製プロセス中にタンパク質の濃度と収率を特定するための、蛍光標識などの追加のステップを必要とする。Ignatova and Gierasch, Proc Natl Acad Sci U S A.; 101(2):523-8 (2004).さらなる不純物が加わると、収率に影響を与える可能性のある追加の精製ステップが必要になる場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、回収率とプロセスの信頼性を高め、上流のパフォーマンスを迅速に評価し、バッチプロセスまたはよりクリティカルな連続プロセスでの迅速な下流処理を容易にするために、回収プロセスのリアルタイムのモニタリングとコントロールが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書は、いくつかの治療用タンパク質の濾過ベースのセルカルチャー回収プロセス、例えばデプス濾過回収、のために設計および検査された、新規のリアルタイムのモニタリングおよびコントロールのプロセスとシステムである。本明細書に記載の方法は、従来技術に勝るいくつかの利点をもたらす。第一に、回収スキッドの設計は、重要なプロセスパラメーターと品質属性をリアルタイムでモニタリングしコントロールすることが可能である。第二に、モデリング手法を使用して、清澄化されたバルクのオンラインＵＶシグナルを目的物のリアルタイム力価に変換する。第三に、この回収スキッドとリアルタイムの力価を用いて回収プロセスを自動的にコントロールし、プロセスの収率、信頼性および一貫性を改善する。最後に、力価情報を用いて、セルカルチャーのパフォーマンスを明らかにし、下流の精製の迅速な処理をガイドする。
【０００７】
この新技術の核心は、回収プロセス中のＵＶシグナルのリアルタイムのモニタリングと、オンラインＵＶシグナルのリアルタイムの目的タンパク質の濃度への変換の適用である。本明細書に開示するモデルは、異なる細胞特性と生産性レベルを有するプロセスに適用することができる。このシステムを使用すると、清澄なバルク回収の開始と終了を定量的に決定できるため、回収の信頼性とタンパク質の収量が大幅に向上する。
【０００８】
本明細書に開示する方法は、セルカルチャーの清澄化プロセスにおける回収スキッドの適用についての深い洞察を提供する。本明細書に開示する新規の回収プロセスは、拡大可能で、自動制御可能であり、そして幅広い特性を有する複数の製品に適用可能でありながら、タンパク質の収量を改善する。リアルタイムの力価情報を用いてセルカルチャーのパフォーマンスを明らかにし、迅速に下流処理をガイドすることができる。
【０００９】
本明細書は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングし、確立されたモデルを使用して、濾過ベースのセルカルチャー回収プロセス中にＵＶシグナルを自動的に目的タンパク質の力価に変換することを含んでなる、目的のタンパク質および不純物を含むサンプル混合物中の目的タンパク質の濃度（力価）をリアルタイムでモニタリングする方法を開示する。
【００１０】
さらに、本明細書は、濾過ベースのセルカルチャー回収プロセス中にサンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングすることを含んでなる、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物における目的タンパク質の回収をコントロールし、タンパク質の収量を改善する方法を開示する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＵＶシグナルは、確立されたモデルと自動制御に従って、目的タンパク質の力価に連続的に変換される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、目的タンパク質の力価は、少なくとも約０．０１ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０２ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０３ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０４ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０５ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０６ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０７ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０８ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０９ｇ／Ｌ、少なくとも約０．１ｇ／Ｌ、少なくとも約０．２ｇ／Ｌ、少なくとも約０．３ｇ／Ｌ、少なくとも約０．４ｇ／Ｌ、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約０．６ｇ／Ｌ、少なくとも約０．７ｇ／Ｌ、少なくとも約０．８ｇ／Ｌ、少なくとも約０．９ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約１．５ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約２．５ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約３．５ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約４．５ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約５．５ｇ／Ｌ、少なくとも約６ｇ／Ｌ、少なくとも約６．５ｇ／Ｌ、少なくとも約７ｇ／Ｌ、少なくとも約７．５ｇ／Ｌ、少なくとも約８ｇ／Ｌ、少なくとも約８．５ｇ／Ｌ、少なくとも約９ｇ／Ｌ、少なくとも約９．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１１ｇ／Ｌ、少なくとも約１１．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１２ｇ／Ｌ、少なくとも約１２．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１３ｇ／Ｌ、少なくとも約１３．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１４ｇ／Ｌ、少なくとも約１４．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約１５．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１６ｇ／Ｌ、少なくとも約１６．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１７ｇ／Ｌ、少なくとも約１７．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１８ｇ／Ｌ、少なくとも約１８．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１９ｇ／Ｌ、少なくとも約１９．５ｇ／Ｌ、または少なくとも約２０ｇ／Ｌである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、力価が少なくとも約０．０５ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０６ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０７ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０８ｇ／Ｌ、少なくとも約０．０９ｇ／Ｌ、少なくとも約０．１ｇ／Ｌ、少なくとも約０．２ｇ／Ｌ、少なくとも約０．３ｇ／Ｌ、少なくとも約０．４ｇ／Ｌ、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約０．６ｇ／Ｌ、少なくとも約０．７ｇ／Ｌ、少なくとも約０．８ｇ／Ｌ、少なくとも約０．９ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約１．５ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約２．５ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約３．５ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約４．５ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約５．５ｇ／Ｌ、少なくとも約６ｇ／Ｌ、少なくとも約６．５ｇ／Ｌ、少なくとも約７ｇ／Ｌ、少なくとも約７．５ｇ／Ｌ、少なくとも約８ｇ／Ｌ、少なくとも約８．５ｇ／Ｌ、少なくとも約９ｇ／Ｌ、少なくとも約９．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１１ｇ／Ｌ、少なくとも約１１．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１２ｇ／Ｌ、少なくとも約１２．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１３ｇ／Ｌ、少なくとも約１３．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１４ｇ／Ｌ、少なくとも約１４．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約１５．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１６ｇ／Ｌ、少なくとも約１６．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１７ｇ／Ｌ、少なくとも約１７．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１８ｇ／Ｌ、少なくとも約１８．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１９ｇ／Ｌ、少なくとも約１９．５ｇ／Ｌ、または少なくとも約２０ｇ／Ｌであるときに目的タンパク質の回収を開始することをさらに含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．０５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．６ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．９ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．６ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．９ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、または約１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．６ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．９ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、または約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、回収力価が約０．１または０．２ｇ／Ｌ未満であるときに目的タンパク質の回収を停止することをさらに含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合と比べて、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、または少なくとも約２０％増大する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、少なくとも約１×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約５×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約１×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも約１．５×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも約２×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも約２．５×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも約３×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも約３．５×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも約４×１０７細胞／ｍＬ、少なくとも約４．５×１０７細胞／ｍＬ、または少なくとも約５×１０７細胞／ｍＬの細胞密度を有する培地から回収される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、タンパク質濾過はデプス濾過である。いくつかの実施形態では、デプス濾過は、一次デプスフィルターおよび／または二次デプスフィルターを含んでなる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、モニタリングの前にサンプル混合物をロードすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、セルカルチャーをロードする前にデプスフィルターを水または緩衝液でフラッシュし、セルカルチャーをロードした後にデプスフィルターをチェイスすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または他の緩衝液でサンプル混合物をチェイスすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、濾過ベースのセルカルチャー回収プロセスは、回収スキッドを含む。いくつかの実施形態では、回収スキッドは、設定された力価が達成されるとタンパク質の回収を自動的に開始するコントロールシステムを含む。いくつかの実施形態では、回収スキッドは、設定された力価が達成されるとタンパク質の回収を自動的に停止するコントロールシステムを含む。いくつかの実施形態では、コントロールシステムは、回収スキッドを通過する液体の流速を調節する。いくつかの実施形態では、コントロールシステムは、ポンプを自動的に駆動して、回収スキッドの流速を上方制御する。いくつかの実施形態では、コントロールシステムは、ポンプを自動的に駆動して、回収スキッドの流速を下方制御する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、エアブローダウンのステップを含まない。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の力価またはタンパク質の収量は体積によらない。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本明細書が開示する方法は、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物中のタンパク質の収量を増大、コントロール、または調節する方法であって、（ａ）回収スキッドを水でフラッシュする；（ｂ）サンプルを回収スキッドにロードする；（ｃ）回収スキッドでのタンパク質濾過中のサンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルを測定し、リアルタイムのタンパク質の力価にする；（ｄ）ＵＶ測定とリアルタイムのタンパク質の力価に基づいてタンパク質の回収を開始する；（ｅ）ＰＢＳでタンパク質をチェイスする；（ｆ）ＵＶ測定とリアルタイムのタンパク質の力価に基づいてタンパク質の回収を停止する、ことを含んでなり、ここで、ＵＶシグナルは、濾過中のリアルタイムのタンパク質の力価と相関している、方法である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本方法は、圧力、濁度、温度、流速、またはそれらの任意の組み合わせを測定することをさらに含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本方法は、圧力センサーを使用して圧力を測定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、測定される圧力は、−１０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）〜５０ｐｓｉ、−１０ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、−９ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、−８ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、−７ｐｓｉ〜３０ｐｓｉ、−６ｐｓｉ〜−２０ｐｓｉ、−７ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、−８ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、−９ｐｓｉ〜４５ｐｓｉ、−１０ｐｓｉ〜−４５ｐｓｉ、または−７ｐｓｉ〜−４５ｐｓｉの範囲である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本方法は、濁度を測定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、測定される濁度は、０吸光度単位（ＡＵ）〜２ＡＵの範囲である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本方法は、温度を測定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、測定される温度は、０℃〜７０℃、０℃〜６０℃、０℃〜５０℃、０℃〜４０℃、５℃〜７０℃、１０℃〜７０℃、１５℃〜７０℃、２０℃〜７０℃、１０℃〜６０℃、２０℃〜５０℃、２０℃〜４０℃、２０℃〜４５℃、３０℃〜４０℃、３５℃〜４０℃、２０℃〜３０℃、３５℃〜４０℃、または２５℃〜４５℃の範囲である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本方法は、流速を測定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、測定される流速は、０Ｌ／分〜２０Ｌ／分、０Ｌ／分〜３０Ｌ／分、０Ｌ／分〜４０Ｌ／分、０Ｌ／分〜５０Ｌ／分、０Ｌ／分〜６０Ｌ／分、０Ｌ／分〜７０Ｌ／分、０Ｌ／分〜８０Ｌ／分、０Ｌ／分〜９０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１００Ｌ／分、０Ｌ／分〜１１０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１２０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１３０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１４０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１５０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１６０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１７０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１８０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１９０Ｌ／分、０Ｌ／分〜２００Ｌ／分、０Ｌ／分〜２５０Ｌ／分、または０Ｌ／分〜３００Ｌ／分の範囲である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、回収スキッドは、１つ以上のフィルターを含んでなる。いくつかの実施形態では、フィルターは、一次デプスフィルターおよび二次デプスフィルターを含んでなる。いくつかの実施形態では、サンプル混合物は、純粋なタンパク質サンプル、清澄化されたバルクタンパク質サンプル、セルカルチャーサンプル、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、哺乳動物細胞を含む培養物において産生される。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、マウス骨髄腫（ＮＳ０）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、サル腎臓線維芽細胞（ＣＯＳ−７）、Madin-Darbyウシ腎臓細胞（ＭＤＢＫ）またはそれらの任意の組み合わせである。
【００２８】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体または融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＬＡＧ３抗体および抗ＩＬ８抗体である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本明細書は、タンパク質の収量のリアルタイムのモニタリングとコントロールのためのシステムを開示し、該システムは、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物のリアルタイムＵＶシグナルを測定するセンサーを含んでなる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、システムは、圧力、濁度、温度、流速、重量、またはそれらの任意の組み合わせを測定するセンサーをさらに含んでなる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、装置は、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物のＵＶシグナルを測定するように構成されたセンサーを含んでなる。いくつかの実施形態では、プロセッサーは、目的タンパク質の回収をコントロールするように構成される。いくつかの実施形態では、プロセッサーは、目的タンパク質の力価を使用するように構成される。いくつかの実施形態では、プロセッサーは、確立されたモデルを使用してセルカルチャーの回収プロセスを決定するように構成される。いくつかの実施形態では、セルカルチャーの回収プロセスは、濾過ベースのセルカルチャー回収プロセスを含んでなる。いくつかの実施形態では、システムは、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物のＵＶシグナルを測定するように構成されたセンサーを含む装置を含んでなる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、開示されるシステムは、本明細書に記載の方法に使用するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１Ａは、例示的な回収スキッドの設計図である。数値はすべてインチで示す。図１Ｂは、回収スキッドの写真である。
【００３４】
図２は、新規の回収スキッドを用いたセルカルチャー回収プロセスのプロセスフローチャートを示す。種々のボックスは、オンライン測定センサー、コントロールモジュール、および物理機器を示す。
【００３５】
図３は、製品力価に対するＵＶシグナルをモデリングするための本明細書に記載の実験計画を示す。
【００３６】
図４は、従来の回収方法と新規の回収方法のグラフによる比較を示す。従来の方法と比較して、新規の方法はエアブローダウンステップが排除されている。一方、新規の方法における清澄化されたバルクの回収の開始と終了は、オンラインＵＶ測定値と計算された力価に基づいて自動的にコントロールできる。より具体的には、回収プロセス中のリアルタイムの目的タンパク質の濃度は、ここで作成され試験されたモデルを使用して、オンラインＵＶセンサーの読み取り値によって計算できる。したがって、バルク回収のカットオフは、計算されたオンラインの目的タンパク質の濃度に基づいて直接決定できる。計算アルゴリズムをDelta V（商標）コントロールシステムに統合して、清澄化されたバルク回収の自動化されたカットオフを達成することができる。
【００３７】
図５は、ＧＩＴＲセルカルチャーの段階希釈サンプルを使用したオンラインＵＶシグナルに対するオフライン力価測定を示す。
【００３８】
図６Ａおよび図６Ｂは、純粋なタンパク質（図６Ａ）および清澄化されたバルク（図６Ｂ）を使用する小規模の回収プロセスでのオンラインＵＶシグナルに対するオフライン力価測定を示す。試験回収プロセス中のオンラインＵＶおよびオフライン力価値をプロットした。
【００３９】
図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃは、抗ＧＩＴＲ抗体セルカルチャー（図７Ａ）、アバタセプトセルカルチャー（図７Ｂ）、および抗ＣＸＣＲ４抗体セルカルチャー（図７Ｃ）を用いた大規模な回収プロセスでのオンラインＵＶシグナルに対するオフライン力価測定を示す。
【００４０】
図８Ａおよび図８Ｂは、オンラインＵＶ値に対するオフライン力価測定値の線形フィット（図８Ａ）；実際の力価に対するＵＶに基づく予測力価の線形フィット（図８Ｂ）を示す。
【００４１】
図９Ａおよび図９Bは、オンラインＵＶ値に対するオフライン力価測定値の非線形フィット（図９Ａ）；実際の力価に対するＵＶに基づく予測力価の線形フィット（図９Ｂ）を示す。
【００４２】
図１０は、Ａｂａ Ｊ、抗ＣＤ７３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＩＬ８抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＯＸ４０抗体および抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む、試験した７つの分子についてのモデル予測力価と実際の力価（ＨＰＬＣ分析）との間の平均差を示す。
【００４３】
図１１は、オンラインＵＶトレース、ＵＶシグナルからのモデリングによって達成された力価トレース、およびオフラインで決定された力価の比較を示している。Ｙ軸はオフラインで測定された力価（ｇ／Ｌ）またはＵＶに基づいてモデリングされた力価（ｇ／Ｌ）を示し、Ｘ軸は時間（分）を示す。三角形の線はオンラインＵＶを示し、四角の線はＵＶに基づいてモデリングされた力価（ｇ／Ｌ）を示し、ひし形の線はオフラインの力価（ｇ／Ｌ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
詳細な記載
タンパク質の収量のコントロール、調節、または増大させるために使用できる様々な方法が提供される。本方法には、精製ステップ中のサンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルのリアルタイム測定を使用したタンパク質の収量のコントロール、調節、または増大が含まれる（例：回収スキッドでのタンパク質濾過）。本方法は、ＵＶシグナルを利用して、本明細書に開示する式に従って目的タンパク質の力価を求め、これは、回収がローディングの開始からローディングの終了までか、またはローディングの終了後かに基づいて異なる。
【００４５】
また、本明細書で提供される方法に関連する様々なシステムおよびデバイスも本明細書で開示される。
【００４６】
ａ．用語
「ａ」または「ａｎ」が付いた用語は、１つまたは複数を指す。例えば、「ヌクレオチド配列（a ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、１つ以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ」、及び「ａｔ ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ」という用語は、本明細書で互換的に使用され得る。
【００４７】
さらに、本明細書で使用される「ａｎｄ／ｏｒ」は、もう一方を有するか、または有さない２つの特定された特徴または成分のそれぞれの特定の開示であるとされる。したがって、本明細書で「Ａ ａｎｄ／ｏｒ Ｂ」などの語句において使用される「ａｎｄ／ｏｒ」という用語は、「Ａ ａｎｄ Ｂ」、「Ａ ｏｒ Ｂ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、ａｎｄ／ｏｒＣ」などの語句において使用される「ａｎｄ／ｏｒ」という用語は、下記の態様：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）のそれぞれを包含することを意図する。
【００４８】
同様に、「または」という語は、文脈が明確に別のことを示さない限り、「および」を含むことを意図している。さらに、核酸またはポリペプチドについて記載された塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および分子量または分子質量の値はすべて概数であり、説明のために記載されたものであることを理解されたい。
【００４９】
態様が「含む」という言葉で本明細書に記載されている場合はいつでも、そうでなければ「からなる」および／または「本質的にからなる」に関して記載されている類似の態様も提供されているものと理解される。
【００５０】
他で定義されていない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本開示に関連する当業者によって一般に理解される用語と同一の意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本開示で用いられる多くの用語の一般的な辞書の技術の１つを提供する。
【００５１】
単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められた形で表示される。数字範囲は、その範囲を定義する数字が含まれる。特に断りがなければ、アミノ酸配列は、アミノ基からカルボキシ基の方向に左から右に記載される。本明細書で提供される表題は、様々な態様を限定するものではなく、本明細書を全体として参照しうる。よって、すぐ下に定義されている用語は、明細書全体を参照して十分に定義されている。
【００５２】
「約」という用語は、本明細書では、おおよそ、大まかに、その周辺、またはの領域を意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲と組み合わせて使用される場合、それは、示された数値の上下の境界を拡張することによってその範囲を変更する。即ち、「約１０〜２０」は「約１０〜約２０」を意味する。一般に、「約」という用語は、ある上下（より高いまたはより低い）の変動（例えば、１０パーセント）によって、記載された値の上下の数値を変更することができる。
【００５３】
「モデリング」または「タンパク質モデリング」は、試験タンパク質の力価（例えば、ｇ／Ｌ）を決定するための線形適合を確立する方法を指す。一実施形態では、モデリングは、回収の開始からロードの終了までの方法を含む（例えば、inclineモデリング）。別の実施形態では、モデリングは、チェイスの開始から回収の終了を含む（例えば、declineモデリング）。他の実施形態では、モデリングは、inclineモデリングとdeclineモデリングの両方を含む。
【００５４】
「タンパク質の収量」または「収量」は、本明細書に開示されたプロセスの後に回収されたタンパク質の総量を指す。タンパク質の収量は、グラム単位または固定容量の最終濃度（mg/mlなど）として測定できる。さらに、パーセント収量を、出発タンパク質（例えば、バルク酵素）の量の百分率として測定することができる。
【００５５】
本明細書で使用される「タンパク質の収量のコントロール」という用語は、本明細書に開示するプロセス中に回収された最終生成物（例えば、タンパク質）を調節、試験、または検証することを指す。いくつかの実施形態では、タンパク質の収量のコントロールは、ＵＶシグナルをリアルタイムで変更して、重要なプロセスパラメーターと品質属性に影響を与え、タンパク質の収量を調節することで実現される。いくつかの実施形態では、タンパク質の収量のコントロールは、所望のタンパク質の収量を達成するために、本明細書に開示する方法の間、一定のＵＶシグナルを維持することを意味する。
【００５６】
本明細書で使用される「タンパク質の収量の調節」という用語は、本明細書に開示するプロセス中に回収された最終産物（例えば、タンパク質）の変更を指す。タンパク質の収量を調節すると、タンパク質の最終産物の収量が変化（増大、減少、または阻止）し得る。いくつかの実施形態では、本プロセスはタンパク質の収量を調節し、その結果、タンパク質の収量が増大する。タンパク質の収量の調節は、ＵＶシグナルをリアルタイムで変更して、重要なプロセスパラメーターと品質属性に影響を与え、タンパク質の収量を調整することで実現される。
【００５７】
本明細書に記載の回収スキッドは、リアルタイムの清澄化およびタンパク質の収量の増大のための複数のセンサーを含んでなる。回収スキッド、または「スキッド」は、１つ以上の圧力センサー、１つ以上のフローセンサー、１つ以上の紫外線（ＵＶ）センサー、１つ以上の重量センサー、１つ以上の濁度センサー、および／または１つ以上の温度センサーを含んでなる。
【００５８】
「力価」とは、溶液中の物質の量または濃度を指す。力価は、本明細書に記載するように、inclineモデリングとdeclineモデリングの両方を用いて決定される。
【００５９】
本明細書で使用される、「ｕｇ」および「ｕＭ」という用語は、それぞれ「μｇ」および「μＭ」と交換可能に使用される。
【００６０】
本明細書に記載する様々な態様については、次のサブセクションでさらに詳しく記載する。
【００６１】
ｂ．  方法と使用
本開示は、重要なプロセスパラメーターおよび品質属性のリアルタイムのＵＶモニタリングおよびコントロールの能力に基づいている。本方法は、モデリング方法を使用して、清澄化されたバルクのオンラインＵＶシグナルを目的物のリアルタイムの力価に変換することを可能にする。次に、本方法を使用して、回収プロセスを自動的にコントロールし、プロセスの収率、信頼性、および一貫性を向上させることができる。力価情報は、セルカルチャーのパフォーマンスを明らかにし、下流の精製の迅速処理をガイドするためにも使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書は、回収スキッドにおけるタンパク質濾過中のサンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングすることを含む、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物中のタンパク質の収量をコントロールまたは調節する方法を開示する。
【００６２】
一実施形態では、本開示は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングし、濾過ベースのセルカルチャー回収プロセス中に確立されたモデルを使用してＵＶシグナルを目的タンパク質の力価に自動的に変換することを含む、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物中の目的タンパク質の濃度（力価）をリアルタイムでモニタリングする方法を含む。別の実施形態では、本開示は、濾過ベースのセルカルチャー回収プロセス中にサンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングすることを含む、目的タンパク質の回収をコントロールし、不純物を含むサンプル混合物における目的タンパク質の収量を改善する方法を提供する。
【００６３】
本明細書はまた、濾過ベースのセルカルチャー回収プロセス（例えば、回収スキッドでのタンパク質濾過）中にサンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングすることを含む、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物中のタンパク質の収量を増大または改善する方法を開示する。
【００６４】
タンパク質の回収／精製には、タンパク質および不純物（細胞、セルカルチャー培地、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他のタンパク質など）との混合物から目的タンパク質を単離または精製するための複数のステップが含まれる。細胞培養液の清澄化は、目的タンパク質を精製するために必要な一連の精巧なステップでの最初の下流ユニットでの操作であり得る。その操作には、遠心分離および／または濾過（例えば、デプス濾過）の組み合わせが使用される。リアルタイムでタンパク質濃度をモニタリングできる大規模な濾過技術、たとえばデプス濾過が利用できることで、下流のプロセスを改善および簡素化することが可能になる。
【００６５】
大規模なデプス濾過システムは、バイオプロセス業界では一般的である。いくつかの実施形態では、デプス濾過システムは、図２に示すように、回収スキッドを利用することができる。回収前に、デプスフィルターを水または適切なバッファーでフラッシュして、フィルター製造プロセスから遊離した粒子や抽出物を除去する。回収スキッドは、１つのフィルターまたは複数のフィルター（例えば、一次デプスフィルターおよび第２のデプスフィルター）を含んでなり得る。目的タンパク質を含むセルカルチャーメディアは、バイオリアクターから得ることができ、１つ以上のフィルター（例えば、一次フィルターおよび二次フィルター）にロードする（またはポンプで送る）ことができる。次いで、ロードされたセルカルチャーメディアがフィルターシステム（例えば、一次フィルターまたは二次フィルター）を通過後、リアルタイムＵＶシグナルを測定することができる。次いで、濾過された生成物は、１つ以上のタンクで得ることができる。回収が完了すると、ハウジングに保持されている貴重な生成物を回収するためフィルターは再びフラッシュされる。使用後にフラッングを行い、生成物の損失を最小限に抑えることで、５０％から９０％の回収率を達成できる。したがって、本発明の方法は、タンパク質の回収率を少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、または少なくとも２５％改善することを意図している。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ＵＶシグナルは、ローディングの開始からローディングの終了まで、および／またはローディングの終了後から濾過の終了までの目的タンパク質の力価を提供する。いくつかの実施形態では、ローディングの開始からローディングの終了までの目的タンパク質の力価は、式（Ｉ）に従って計算することができる。
モデル予測力価＝ ａ ＋ ｂ＊（オンラインＵＶシグナル）        （Ｉ）
【００６７】
いくつかの実施形態では、ローディングの開始からローディングの終了までの目的タンパク質の力価は、定数（ａ）および（ｂ）を含む式（Ｉ）に従って計算することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、（ａ）は、０〜−１．０の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ａ）は、−０．１〜−０．９の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ａ）は、−０．２〜−０．８の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ａ）は、−０．３〜−０．７の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ａ）は、−０．４〜−０．６の間の数値である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、（ａ）は、−０．２〜−０．５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ａ）は、−０．２５〜−０．４５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ａ）は、−０．３０〜−０．４０の間の数値である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、（ａ）は、−０．５〜−０．９の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ａ）は、−０．５５〜−０．８５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ａ）は、−０．６０〜−０．８０の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ａ）は、−０．６５〜−０．７５の間の数値である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．１である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．１５である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．２である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．２５である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．３である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．３５である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．４である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．４５である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．５である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．５５である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．６である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．６５である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．７である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．７５である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．８である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．８５である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．９である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−０．９５である。いくつかの実施形態では、（ａ）は約−１．０である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、（ａ）は−０．３５である。いくつかの実施形態では、（ａ）は−０．６９である。一実施形態では、細胞型はＤＧ４４であり、（ａ）は−０．３５である。一実施形態では、細胞型はＣＨＯＺＮであり、（ａ）は−０．６９である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、（ｂ）は、１．０〜５．０の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は、１．５〜４．５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は、２．０〜４．０の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は、２．５〜３．５の間の数値である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、（ｂ）は２．０〜３．６の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は２．１〜３．５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は２．２〜３．４の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は２．３〜３．３の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は２．４〜３．２の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は２．５〜３．１の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は２．６〜３．０の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は２．７〜２．９の間の数値である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、（ｂ）は３．３〜４．８の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は３．４〜４．７の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は３．５〜４．６の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は３．６〜４．５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は３．７〜４．４の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は３．８〜４．３の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は３．９〜４．２の間の数値である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は４．０〜４．１の間の数値である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、（ｂ）は約２．０である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約２．１である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約２．２である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約２．３である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約２．４である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約２．５である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約２．６である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約２．７である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約２．８である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約２．９である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約３．０である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約３．１である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約３．２である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約３．３である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約３．４である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約３．５である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約３．６である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約３．７である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約３．８である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約３．９である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約４．０である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約４．１である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約４．２である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約４．３である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約４．４である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約４．５である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約４．６である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約４．７である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約４．８である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約４．９である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は約５．０である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、（ｂ）は２．８８である。いくつかの実施形態では、（ｂ）は４．０６である。一実施形態では、細胞型はＤＧ４４であり、（ｂ）は２．８８である。一実施形態では、細胞型はＣＨＯＺＮ，であり、（ｂ）は４．０６である。いくつかの実施形態では、（ａ）は−０．３５であり、（ｂ）は２．８８である。いくつかの実施形態では、（ａ）は−０．６９であり、（ｂ）は４．０６である。一実施形態では、細胞型はＤＧ４４であり、（ａ）は−０．３５であり、（ｂ）は２．８８である。一実施形態では、細胞型はＣＨＯＺＮであり、（ａ）は−０．６９であり、（ｂ）は４．０６である。
【００７８】
他の実施形態では、ローディングの終了後から濾過の終了までの目的タンパク質の力価は、式（ＩＩ）に従って計算することができる。
モデル予測力価＝ Ａ ＋ Ｂ＊ｅｘｐ（Ｃ＊オンラインＵＶシグナル）        （ＩＩ）
【００７９】
いくつかの実施形態では、ローディングの開始からローディングの終了までの目的タンパク質の力価は、定数（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）を含む式（ＩＩ）に従って計算することができる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、（Ａ）は、−２．５〜１．０の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は、−２．０〜０．５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は、−１．５〜０．０の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は−１．０〜−０．５の間の数値である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、（Ａ）は−１．５〜−０．４の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は−１．４〜−０．５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は−１．３〜−０．６の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は−１．２〜−０．７の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は−１．１〜−０．８の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は−１．０〜−０．９の間の数値である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、（Ａ）は−１．０〜１．０の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は−０．９〜０．９の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は−０．８〜０．８の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は−０．７〜０．７の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は−０．６〜０．６の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は−０．５〜０．５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は−０．４〜０．４の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は−０．３〜０．３の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は−０．２〜０．２の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は−０．１〜０．１の間の数値である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−２．０である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−１．９である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−１．８である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−１．７である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−１．６である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−１．５である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−１．４である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−１．３である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−１．２である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−１．１である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−１．０である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−０．９である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−０．８である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−０．７である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−０．６である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−０．５である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−０．４である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−０．３である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−０．２である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約−０．１である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約０．１である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約０．２である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約０．３である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約０．４である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約０．５である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約０．６である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約０．７である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約０．８である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約０．９である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は約１．０である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、（Ａ）は−０．９５である。いくつかの実施形態では、（Ａ）は０．０２である。いくつかの実施形態では、細胞型はＤＧ４４であり、（Ａ）は−０．９５である。いくつかの実施形態では、細胞型はＣＨＯＺＮであり、（Ａ）は０．０２である。
【００８５】
いくつかの実施形態では（Ｂ）は−１．５〜２．５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は−１．０〜２．０の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は−０．５〜１．５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は０〜１．０の間の数値である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、（Ｂ）は−０．５〜−０．４の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は−０．４〜−０．３の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は−０．３〜−０．２の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は−０．２〜−０．１の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は−０．１〜０．０の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は０．０〜０．１の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は０．１〜０．２の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は０．２〜０．３の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は０．３〜０．４の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は０．４〜０．５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は０．５〜０．６の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は０．６〜０．７の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は０．７〜０．８の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は０．８〜０．９の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は０．９〜１．０の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は１．０〜１．１の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は１．１〜１．２の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は１．２〜１．３の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は１．３〜１．４の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は１．４〜１．５の間の数値である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約−１．５である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約−１．４である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約−１．３である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約−１．２である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約−１．１である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約−１．０である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約−０．９である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約−０．８である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約−０．７である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約−０．６である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約−０．５である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約−０．４である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約−０．３である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約−０．２である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約−０．１である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約０．１である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約０．２である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約０．３である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約０．４である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約０．５である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約０．６である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約０．７である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約０．８である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約０．９である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約１．０である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約１．１である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約１．２である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約１．３である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約１．４である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約１．５である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約１．６である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約１．７である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約１．８である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約１．９である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は約２．０である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、（Ｂ）は０．８６である。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は０．１３である。いくつかの実施形態では、細胞型はＤＧ４４であり、（Ｂ）は０．８６である。いくつかの実施形態では、細胞型はＣＨＯＺＮであり、（Ｂ）は０．１３である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、（Ｃ）は０〜４．０の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は０．５〜３．５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は１．０〜３．０の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は１．５〜２．５の間の数値である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、（Ｃ）は０．０〜０．１の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は０．１〜０．２の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は０．２〜０．３の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は０．３〜０．４の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は０．４〜０．５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は０．５〜０．６の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は０．６〜０．７の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は０．７〜０．８の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は０．８〜０．９の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は０．９〜１．０の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は１．０〜１．１の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は１．１〜１．２の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は１．２〜１．３の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は１．３〜１．４の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は１．４〜１．５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は１．５〜１．６の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は１．６〜１．７の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は１．７〜１．８の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は１．８〜１．９の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は１．９〜２．０の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は２．０〜２．１の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は２．１〜２．２の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は２．２〜２．３の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は２．３〜２．４の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は２．４〜２．５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は２．５〜２．６の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は２．６〜２．７の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は２．７〜２．８の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は２．８〜２．９の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は２．９〜３．０の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は３．０〜３．１の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は３．１〜３．２の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は３．２〜３．３の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は３．３〜３．４の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は３．４〜３．５の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は３．５〜３．６の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は３．６〜３．７の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は３．７〜３．８の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は３．８〜３．９の間の数値である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は３．９〜４．０の間の数値である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、（Ｃ）は１．２１である。いくつかの実施形態では、（Ｃ）は２．４１である。いくつかの実施形態では、細胞型はＤＧ４４であり、（Ｃ）は１．２１である。いくつかの実施形態では、細胞型はＣＨＯＺＮであり、（Ｃ）は２．４１である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、Ａ＝  −０．９５，  Ｂ  ＝  ０．８６、およびＣ  ＝  １．２１である。いくつかの実施形態では、Ａ  ＝  ０．０２，  Ｂ＝０．１３、およびＣ＝２．４１である。一実施形態では、細胞型はＤＧ４４であり、（ａ）は−０．９５、（Ｂ）は０．８６、（Ｃ）は１．２１である。一実施形態では、細胞型はＣＨＯＺＮ，であり、（ａ）は０．０２、（Ｂ）は０．１３、（Ｃ）は２．４１である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本明細書は、（ａ）回収スキッドを水でフラッシングする；（ｂ）サンプルを回収スキッドにロードする；（ｃ）回収スキッドでのタンパク質濾過中にサンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルを測定し、リアルタイムのタンパク質の力価にする；（ｄ）ＵＶ測定値とリアルタイムのタンパク質の力価に基づいてタンパク質の回収を開始する；（ｅ）ＰＢＳでタンパク質をチェイスする；（ｆ）ＵＶ測定値とリアルタイムのタンパク質の力価に基づいてタンパク質の回収を停止することを含んでなり、濾過中のＵＶシグナルがリアルタイムのタンパク質の力価と相関している、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物中のタンパク質の収量を増大、コントロール、または調節する方法を開示する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、水（例えば、ＲＯＤＩ）フラッシュを含んでなる。いくつかの実施形態では、本方法は、タンパク質サンプルをロードし、オンライン力価に基づいて回収を開始することを含んでなる。いくつかの実施形態では、本方法は、ＰＢＳチェイスとオンライン力価に基づく回収の終了を含んでなる。他の方法と比較して、本明細書に開示する方法は、エアブローダウンステップを含まない。
【００９５】
いくつかの実施形態では、サンプルの回収の開始と終了は、オンラインのＵＶ測定値と計算された力価に基づいて自動的にコントロールされる。特定の実施形態では、回収プロセス中のリアルタイムの目的タンパク質の濃度は、モデリングを使用して、オンラインＵＶセンサーの読み取りによって計算される。いくつかの実施形態では、バルク回収のカットオフは、計算されたオンライン目的タンパク質の濃度に直接基づいて決定される。いくつかの実施形態では、タンパク質回収の自動カットオフを実現するため、計算アルゴリズムはDelta V（商標）コントロールシステムに統合されている。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、モデリングのステップを含む。いくつかの実施形態では、モデリングは、ＵＶシグナルと力価の間の線形相関を確立するために、段階希釈サンプルを使用したオンラインＵＶシグナルに対するオフライン力価測定を含む。いくつかの実施形態では、モデリングに使用されるサンプルは、精製されたタンパク質である。いくつかの実施形態では、モデリングに使用されるサンプルは、不純物を含むバルクタンパク質である。いくつかの実施形態では、次いでモデリングを使用して、タンパク質の収量をコントロール、調節、増大および／または改善する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、力価が少なくとも約０．０１ｇ／Ｌである目的タンパク質の収量をコントロール、調節または改善することを含む。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．０２ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．０３ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．０４ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．０５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．０６ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．０７ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．０８ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．０９ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．１ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．２ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．３ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．４ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．６ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．７ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．８ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約０．９ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約２ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約２．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約３ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約３．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約４ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約４．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約５．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約６ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約６．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約７ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約７．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約８ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約８．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約９ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約９．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１０ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１０．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１１ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１１．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１２ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１２．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１３ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１３．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１４ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１４．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１５．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１６ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１６．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１７ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１７．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１８ｇ／Ｌ、少なくとも約１８．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１９ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約１９．５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、力価は少なくとも約２０ｇ／Ｌである。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、目的タンパク質の力価に依存する、目的タンパク質の回収を含む。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約０．０５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約０．０６ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約０．０７ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約０．０８ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約０．０９ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約０．１ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約０．２ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約０．３ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約０．４ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約０．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約０．６ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約０．７ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約０．８ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約０．９ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約２ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約２．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約３ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約３．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約４ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約４．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約５．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約６ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約６．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約７ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約７．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約８ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約８．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約９ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約９．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１０ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１０．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１１ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１１．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１２ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１２．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１３ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１３．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１４ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１４．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１５．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１６ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１６．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１７ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１７．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１８ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１８．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１９ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約１９．５ｇ／Ｌであるときに開始する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の回収は、力価が少なくとも約２０ｇ／Ｌであるときに開始する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、目的タンパク質がある範囲の力価を有する、目的タンパク質の回収を含む。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．０５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．２ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．３ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．４ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．６ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．７ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．８ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．９ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．０５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．２ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．３ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．４ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．６ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．７ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．８ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．９ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．０５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．２ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．４ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．６ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．７ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．８ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約０．９ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質が回収される力価は、約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、回収力価が約０．５ｇ／Ｌ未満であるときに目的タンパク質の回収を停止することをさらに含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、本明細書に開示する方法によって増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約１％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約２％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約３％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約４％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約５％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約６％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約７％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約８％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約９％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約１０％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約１１％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約１２％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約１３％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約１４％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約１５％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約１６％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約１７％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約１８％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約１９％増大する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質の収量は、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングしない場合のタンパク質の収量と比較して、少なくとも約２０％増大する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルは、０〜２ＡＵで測定される。いくつかの実施形態では、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルは、約０．１ＡＵ、約０．２ＡＵ、約０．３ＡＵ、約０．４ＡＵ、約０．５ＡＵ、約０．６ＡＵ、約０．７ＡＵ、約０．８ＡＵ、約０．９ＡＵ、約１．０ＡＵ、約１．１ＡＵ、約１．２ＡＵ、約１．３ＡＵ、約１．４ＡＵ、約１．５ＡＵ、約１．６ＡＵ、約１．７ＡＵ、約１．８ＡＵ、約１．９ＡＵまたは約２．０ＡＵで測定される。
【０１０３】
本明細書に開示するいくつかの実施形態では、本方法はタンパク質濾過を含む。いくつかの実施形態では、本方法は１つ以上のフィルターを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質濾過はデプス濾過である。いくつかの実施形態では、デプス濾過は、一次デプスフィルターと二次デプスフィルターを含んでなる。いくつかの実施形態では、デプス濾過は一次デプスフィルターを含んでなる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本方法は、モニタリングの前にサンプル混合物をロードすることを含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本方法は、セルカルチャーをロードする前にデプスフィルターをバッファーでフラッシュすること、およびセルカルチャーをロードした後にデプスフィルターをチェイスすることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でサンプル混合物をチェイスすることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、コントロールシステムを含む回収スキッドを含んでなり、該コントロールシステムは、力価が０．５ｇ／Ｌを超えると、タンパク質の回収を自動的に開始する。いくつかの実施形態では、本方法は、力価が０．５ｇ／Ｌ未満になると、コントロールシステムがタンパク質の回収を自動的に停止するコントロールシステムを備えている。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本方法は、回収スキッドを通過する液体の流量を調節するコントロールシステムを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ポンプを自動的に駆動して回収スキッドを通過する流量を上方制御するコントロールシステムを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ポンプを自動的に駆動して回収スキッドを通過する流量を下方制御するコントロールシステムを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、エアブローダウンのステップを含まない。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本方法は、体積によらないタンパク質の収量を回収するステップを含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、圧力、濁度、温度、流速またはそれらの任意の組み合わせを測定することを含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本方法は、圧力センサーを使用して圧力を測定することを含む。いくつかの実施形態では、圧力は、−１０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）〜５０ｐｓｉ、−１０ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、−９ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、−８ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、−７ｐｓｉ〜３０ｐｓｉ、−６ｐｓｉ〜−２０ｐｓｉ、−７ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、−８ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、−９ｐｓｉ〜４５ｐｓｉ、−１０ｐｓｉ〜−４５ｐｓｉ、または−７ｐｓｉ〜−４５ｐｓｉの範囲で測定される。他の実施形態では、圧力は、少なくとも１回、２回、３回、４回または５回、例えば、一次フィルターの前、一次フィルターの後および二次フィルターの前、二次フィルターの後、排出後、またはそれらの任意の組み合わせで測定され得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本方法は、濁度を測定することを含む。いくつかの実施形態では、濁度は、０吸光度単位（ＡＵ）〜２ＡＵの範囲で測定される。他の実施形態では、濁度は約０．１ＡＵ、約０．２ＡＵ、約０．３ＡＵ、約０．４ＡＵ、約０．５ＡＵ、約０．６ＡＵ、約０．７ＡＵ、約０．８ＡＵ、約０．９ＡＵ、約１．０ＡＵ、約１．１ＡＵ、約１．２ＡＵ、約１．３ＡＵ、約１．４ＡＵ、約１．５ＡＵ、約１．６ＡＵ、約１．７ＡＵ、約１．８ＡＵ、約１．９ＡＵ、または約２．０ＡＵで測定される。いくつかの実施形態では、濁度は濾過プロセス中に少なくとも１回、２回、３回、４回または５回、例えば、一次フィルターの後、二次フィルターの後、または一次フィルターの後および二次フィルターの後で測定され得る。図２を参照。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本方法は、温度を測定することを含む。いくつかの実施形態では、温度は０℃〜７０℃、０℃〜６０℃、０℃〜５０℃、０℃〜４０℃、５℃〜７０℃、１０℃〜７０℃、１５℃〜７０℃、２０℃〜７０℃、１０℃〜６０℃、２０℃〜５０℃、２０℃〜４０℃、２０℃〜４５℃、３０℃〜４０℃、３５℃〜４０℃、２０℃〜３０℃、３５℃〜４０℃、または２５℃〜４５℃の範囲で測定される。他の実施形態では、濾過プロセス中に少なくとも１回、２回、３回、４回または５回、例えば、一次フィルターの後、二次フィルターの後、または一次フィルターの後および二次フィルターの後で測定され得る。図２を参照。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本方法は流速を測定することを含む。いくつかの実施形態では、流速は、０Ｌ／分〜２０Ｌ／分、．０Ｌ／分〜３０Ｌ／分、０Ｌ／分〜４０Ｌ／分、０Ｌ／分〜５０Ｌ／分、０Ｌ／分〜６０Ｌ／分、０Ｌ／分〜７０Ｌ／分、０Ｌ／分〜８０Ｌ／分、０Ｌ／分〜９０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１００Ｌ／分、０Ｌ／分〜１１０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１２０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１３０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１４０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１５０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１６０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１７０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１８０Ｌ／分、０Ｌ／分〜１９０Ｌ／分、０Ｌ／分〜２００Ｌ／分、０Ｌ／分〜２５０Ｌ／分、または０Ｌ／分〜３００Ｌ／分の範囲で測定される。他の実施形態では、流速は濾過プロセス中の任意の時点：一次フィルターの前、一次フィルターの後、二次フィルターの前、二次フィルターの後、またはそれらの任意の組み合わせ、で測定される。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、水源／バイオリアクター／ＰＢＳ源からの液体は、ＬＥＶＩＴＲＯＮＩＸ（登録商標）重力ポンプによって一次デプスフィルターに送られる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、例えばDelta V（商標）などのシステムを利用してオンラインフローセンサーの読み取り値から流量指示計（フロートータライザー）の体積を計算できる。いくつかの実施形態では、フロートータライザーの体積を用いて、水のフラッシング終了時を決定する。いくつかの実施形態では、一次デプスフィルター、二次デプスフィルター、プレフィルター、滅菌フィルターの前に４つの圧力センサーが配置されている。圧力フローコントロールループは、一次デプスフィルター前のリアルタイムの圧力値に基づいて機能する。圧力値が特定のしきい値を超えると、Delta V（商標）が自動的にポンプを駆動して流量をダウンレギュレートする。いくつかの実施形態では、濾過品質の指標として、一次および二次デプスフィルターの後に２つの濁度センサーが配置されている。いくつかの実施形態では、１つのＵＶセンサーが二次デプスフィルターの後に配置されており、その値はオンラインの目的タンパク質の濃度を計算し、清澄化されたバルク回収のカットオフをコントロールするために使用される。Delta V（商標）上でリアルタイムの上流の供給源と下流の受け入れベッセルの重量がモニタリングされ表示された。いくつかの実施形態では、重量は０〜５５０ｋｇのモニターで、測定精度は０．０１ｋｇである。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、タンパク質は供給源から分離されている。いくつかの実施形態では、サンプル混合物は、純粋なタンパク質サンプル、清澄化されたバルクタンパク質サンプル、セルカルチャーサンプル、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、供給源は培養細胞から選択される。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、細胞は原核生物である。細菌系では、発現されるタンパク質分子の用途に応じて、いくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、タンパク質分子の医薬組成物を生成するために、そのようなタンパク質を大量に生産する場合、容易に精製される高レベルのタンパク質産物の発現を指揮するベクターが望ましい。
【０１１７】
他の実施形態では、細胞は真核生物である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、マウス骨髄腫（ＮＳ０）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、サル腎臓線維芽細胞（ＣＯＳ−７）、Madin-Darbyウシ腎臓細胞（ＭＤＢＫ）、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。一実施形態では、細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は昆虫細胞（例えば、Spodoptera frugiperda細胞）である。
【０１１８】
他の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。そのような哺乳動物細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ ２９３、ＮＩＨ ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、ＢＭＴ１０およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ＣＨＯ細胞である。，いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞はＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯＺＮ、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−、ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ−ＫＯ、またはＣＨＯ−Ｓである。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞はＣＨＯ−ＤＧ４である。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞はＣＨＯＺＮである。
【０１２０】
本明細書に開示する他の適切なＣＨＯ細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ、ＣＨＯ−Ｋ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１）、ＣＨＯ ｐｒｏ３−、ＣＨＯ Ｐ１２、ＣＨＯ−Ｋ１／ＳＦ、ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ ＤＵＫＸ；ＰＡ−ＤＵＫＸ；ＣＨＯ ｐｒｏ５；ＤＵＫ−ＢＩＩまたはそれらの派生物が挙げられる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、細胞密度が約１×１０６細胞／ｍＬ以上の培地から回収される。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、細胞密度が約５×１０６細胞／ｍＬ以上の培地から回収される。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、細胞密度が約１×１０７細胞／ｍＬ以上の培地から回収される。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、細胞密度が約１．５×１０７細胞／ｍＬ以上の培地から回収される。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、細胞密度が約２×１０７細胞／ｍＬ以上の培地から回収される。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、細胞密度が約２．５×１０７細胞／ｍＬ以上の培地から回収される。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、細胞密度が約３×１０７細胞／ｍＬ以上の培地から回収される。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、細胞密度が約３．５×１０７細胞／ｍＬ以上の培地から回収される。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、細胞密度が約４×１０７細胞／ｍＬ以上の培地から回収される。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、細胞密度が約４．５×１０７細胞／ｍＬ以上の培地から回収される。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、細胞密度が約５×１０７細胞／ｍＬ以上の培地から回収される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、タンパク質の供給源はバルクタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質の供給源は、タンパク質成分と非タンパク質成分を含む組成物である。非タンパク質成分には、ＤＮＡやその他の汚染物質が含まれ得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、タンパク質の供給源は動物に由来する。いくつかの実施形態では、動物は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）または霊長類（例えば、サルまたはヒト）などの哺乳動物である。いくつかの実施形態では、供給源は、ヒト由来の組織または細胞である。特定の実施形態では、そのような用語は、非ヒト動物（例えば、ブタ、ウマ、ウシ、ネコまたはイヌなどの非ヒト動物）を指す。いくつかの実施形態では、そのような用語は、ペットまたは家畜を指す。特定の実施形態では、そのような用語はヒトを指す。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって精製されるタンパク質は、融合タンパク質である。「融合」または「融合タンパク質」は、それが自然界では連結されていない第２のアミノ酸配列がインフレームで連結している第１のアミノ酸配列を含んでなる。通常は別々のタンパク質に存在するアミノ酸配列を融合ポリペプチドにおいて一緒にすることができ、または通常同じタンパク質に存在するアミノ酸配列を融合ポリペプチドにおいて新しい配置で位置させることができる。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされているポリヌクレオチドを作成および翻訳することによって作成される。融合タンパク質は、共有結合、非ペプチド結合、または非共有結合によって第１のアミノ酸配列に関連する第２のアミノ酸配列をさらに含み得る。転写／翻訳によって、単一のタンパク質が作られる。このようにして、複数のタンパク質またはそのフラグメントを単一のポリペプチドに組み込むことができる。「作動可能なように連結している」とは、２つ以上のエレメント間の機能的な連結を意味することを意図する。例えば、２つのポリペプチド間の作動可能な結合は、両方のポリペプチドをフレーム内で共に融合して単一のポリペプチド融合タンパク質を生成する。特定の態様では、融合タンパク質は、以下でさらに詳細に記載されるように、リンカー配列を含むことができる第３のポリペプチドをさらに含んでなる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって精製されるタンパク質は抗体である。抗体には、例えば、モノクローナル抗体、組換えで産生した抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、２つの重鎖および２つの軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖モノマー、抗体重鎖モノマー、抗体軽鎖ダイマー、抗体重鎖ダイマー、抗体軽鎖−抗体重鎖ペア、イントラボディ、ヘテロコンジュゲート抗体、単一ドメイン抗体、一価抗体、単鎖抗体または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体（camelized antibodies）、アフィボディ、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗抗Ｉｄ抗体）、および上記のいずれかの抗原結合フラグメントが含まれる。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ポリクローナル抗体集団を指す。抗体は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例：ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＹなど）、任意のクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２など）または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ）であり得る。特定の実施形態では、抗体はヒト化モノクローナル抗体である。別の特定の実施形態では、抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり、好ましくは、免疫グロブリンである。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質は、「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、「抗原結合フラグメント」や類似する用語であり、これらは、抗体分子に抗体分子の抗原に対する特異性（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ））を付与するアミノ酸残基を含む抗体分子の一部を指す。抗原結合領域は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、またはハムスター）やヒトなどの任意の動物種に由来し得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＮＫＧ２ａ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＴＧＦβ抗体、抗ＩＬ−１０抗体、抗Ｂ７−Ｈ４抗体、抗Ｆａｓリガンド抗体、抗メソテリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＩＬ８抗体、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、タンパク質はアバタセプトＮＧＰである。他の実施形態では、タンパク質はベラタセプトＮＧＰである。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘発腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連遺伝子）抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、６Ｃ８のＣＤＲ配列を有する、例えば、６Ｃ８のＣＤＲを有するヒト化抗体（例えば、ＷＯ２００６／１０５０２１に記載）；例えばＷＯ２０１１／０２８６８３に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体；ＪＰ２００８２７８８１４に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体、ＷＯ２０１５／０３１６６７、ＷＯ２０１５／１８７８３５、ＷＯ２０１５／１８４０９９、ＷＯ２０１６／０５４６３８、ＷＯ２０１６／０５７８４１、ＷＯ２０１６／０５７８４６、またはＷＯ２０１８／０１３８１８に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体、または本明細書に記載または参照される他の抗ＧＩＴＲ抗体であり、これらはすべて、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
他の実施形態では、タンパク質は抗ＬＡＧ３抗体である。ＬＡＧ−３としても知られるリンパ球活性化遺伝子３は、ヒトではＬＡＧ３遺伝子によってコードされるタンパク質である。１９９０年に発見されたＬＡＧ３は、Ｔ細胞機能に多様な生物学的効果をもたらす細胞表面分子である。これは免疫チェックポイント受容体であり、癌や自己免疫疾患の新しい治療法を開発しようとしている製薬会社によるさまざまな医薬品開発プログラムのターゲットとなっている。可溶型では、それ自体が抗がん剤としても開発されている。抗ＬＡＧ３抗体の例としては、ＷＯ ２０１７／０８７９０１ Ａ２、ＷＯ ２０１６／０２８６７２ Ａ１、ＷＯ ２０１７／１０６１２９ Ａ１、ＷＯ ２０１７／１９８７４１ Ａ１、ＵＳ ２０１７／００９７３３３ Ａ１、ＵＳ ２０１７／０２９０９１４ Ａ１およびＵＳ２０１７／０２６７７５９ Ａ１に記載の抗体が挙げられるが、これらに限定されず、これらはすべて本明細書にその全体が組み込まれる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、タンパク質は抗ＣＸＣＲ４抗体である。ＣＸＣＲ４は、Ｇ１と結合した７回膜貫通タンパク質である。ＣＸＣＲ４は造血細胞起源の細胞で広く発現し、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）の主要なＣＤ４＋補助受容体である。Feng, Y., Broeder, C.C., Kennedy, P. E., and Berger, E. A. (1996) Science 272, 872-877参照。抗ＣＸＣＲ４抗体の例としては、ＷＯ ２００９／１４０１２４ Ａ１、ＵＳ ２０１４／０２８６９３６ Ａ１、ＷＯ ２０１０／１２５１６２ Ａ１、ＷＯ ２０１２／０４７３３９ Ａ２、ＷＯ ２０１３／０１３０２５ Ａ２、ＷＯ ２０１５／０６９８７４ Ａ１、ＷＯ ２００８／１４２３０３ Ａ２、ＷＯ ２０１１／１２１０４０ Ａ１、ＷＯ ２０１１／１５４５８０ Ａ１、ＷＯ ２０１３／０７１０６８ Ａ２、およびＷＯ ２０１２／１７５５７６ Ａ１の抗体が挙げられる、これらに限定されず、これらはすべて本明細書にその全体が組み込まれる。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、タンパク質は抗ＣＤ７３（エクト−５’−ヌクレオチダーゼ）抗体である。抗ＣＤ７３抗体はアデノシンの形成を阻害する。ＡＭＰのアデノシンへの分解は、癌の発症と進行を促進する腫瘍微小環境内での免疫抑制された血管新生促進ニッチの生成をもたらす。抗ＣＤ７３抗体の例としては、ＷＯ ２０１７／１００６７０ Ａ１、ＷＯ ２０１８／０１３６１１ Ａ１、ＷＯ ２０１７／１５２０８５ Ａ１、およびＷＯ ２０１６／０７５１７６ Ａ１に記載の抗体が挙げられるが、これらに限定されず、これらはすべて本明細書にその全体が組み込まれる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、タンパク質は抗ＴＩＧＩＴ（ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）抗体である。ＴＩＧＩＴは、免疫グロブリンタンパク質のＰＶＲ（ポリオウイルス受容体）ファミリーのメンバーである。ＴＩＧＩＴは、濾胞性ＢヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ）を含むいくつかのクラスのＴ細胞に発現している。このタンパク質は、ＰＶＲに高い親和性で結合することが示されており、この結合は、ＴＦＨと樹状細胞間の相互作用を助けてＴ細胞依存性Ｂ細胞応答を調節すると考えられている。抗ＴＩＧＩＴ抗体の例としては、ＷＯ ２０１６／０２８６５６ Ａ１、ＷＯ ２０１７／０３０８２３ Ａ２、ＷＯ ２０１７／０５３７４８ Ａ２、ＷＯ ２０１８／０３３７９８ Ａ１、ＷＯ ２０１７／０５９０９５ Ａ１、およびＷＯ ２０１６／ ０１１２６４ Ａ１に記載の抗体が挙げられるが、これらに限定されず、これらはすべて本明細書にその全体が組み込まれる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、タンパク質は抗ＯＸ４０（すなわち、ＣＤ１３４）抗体である。ＯＸ４０は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドファミリーのサイトカインである。ＯＸ４０はＴ細胞抗原提示細胞（ＡＰＣ）相互作用において機能し、活性化Ｔ細胞の内皮細胞への接着を仲介する。抗ＯＸ４０抗体の例としては、ＷＯ ２０１８／０３１４９０ Ａ２， ＷＯ ２０１５／１５３５１３ Ａ１， ＷＯ ２０１７／０２１９１２ Ａ１， ＷＯ ２０１７／０５０７２９ Ａ１， ＷＯ ２０１７／０９６１８２ Ａ１， ＷＯ ２０１７／１３４２９２ Ａ１， ＷＯ ２０１３／０３８１９１ Ａ２， ＷＯ ２０１７／０９６２８１ Ａ１， ＷＯ ２０１３／０２８２３１ Ａ１， ＷＯ ２０１６／０５７６６７ Ａ１， ＷＯ ２０１４／１４８８９５ Ａ１， ＷＯ ２０１６／２００８３６ Ａ１， ＷＯ ２０１６／１００９２９ Ａ１， ＷＯ ２０１５／１５３５１４ Ａ１， ＷＯ ２０１６／００２８２０ Ａ１， およびＷＯ ２０１６／２００８３５ Ａ１に記載の抗体が挙げられるが、これらに限定されず、これらはすべて本明細書にその全体が組み込まれる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、タンパク質は抗ＩＬ８抗体である。ＩＬ−８は、好中球、好塩基球、Ｔ細胞を誘引する走化性因子であるが、単球は誘引しない。また、好中球の活性化にも関与する。ＩＬ−８は、炎症性刺激に反応して、いくつかの細胞タイプから放出される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、タンパク質はアバタセプト（ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標）として販売）である。アバタセプト（本明細書ではＡｂａとも略される）は、Ｔ細胞の免疫活性を妨害することにより、関節リウマチなどの自己免疫疾患を治療するために使用される薬剤である。アバタセプトは、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインに融合した免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ領域から構成される融合タンパク質である。Ｔ細胞が活性化されて免疫応答を生じるためには、抗原提示細胞がＴ細胞に２つのシグナルを提示しなければならない。これらシグナルの１つは、抗原と結合した主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）であり、もう１つのシグナルはＣＤ８０またはＣＤ８６分子（Ｂ７−１およびＢ７−２としても知られている）である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、タンパク質はベラタセプト（商品名ＮＵＬＯＪＩＸ（登録商標））である。ベラタセプトは、Ｔ細胞の共刺激の調節に重要な分子であるＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインに結合したヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃフラグメントから構成される融合タンパク質であり、Ｔ細胞の活性化プロセスを選択的にブロックする。これは、カルシニューリン阻害剤などの標準的な免疫抑制療法によって生じる毒性を制限しながら、移植片の生存を延長することを企図している。アバタセプト（ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標））とはアミノ酸２つが異なるのみである。
【０１３７】
ｃ．システム
いくつかの実施形態では、本明細書は、回収スキッドでのタンパク質濾過中に、サンプル混合物の紫外線（ＵＶ）シグナルをリアルタイムでモニタリングすることを含んでなる、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物におけるタンパク質の収量のコントロール、調節、増大または改善のためのシステムを開示する。
【０１３８】
本明細書に開示するシステムは、１つ以上のセンサーを含んでなる。いくつかの実施形態では、センサーは、圧力センサー、ＵＶセンサー、濁度センサー、温度センサー、フローセンサー、およびそれらの任意の組み合わせを含んでなる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、回収スキッドは、圧力センサー（４）、ＵＶセンサー（１）、濁度センサー（２）、温度センサー（２）、フローセンサー（１）を含むすべてのセンサーを１つのカートに統合するように設計されている。いくつかの実施形態では、システムは３つのＰＭＡＴ（Pressure Monitor Alarm Transmitter：圧力モニタリング警報送信機）コントローラーを含んでなる。いくつかの実施形態では、ＰＭＡＴコントローラーはカート上にビルトオンされており、合計１０個の異なるセンサーに対応する。いくつかの実施形態では、重力ポンプ（例えば、ＬＥＶＩＴＲＯＮＩＸ（登録商標）重力ポンプなど）は、液体をデプスフィルターに送るために使用され、スキッドカートに取り付けられている。いくつかの実施形態では、システムは、移動可能、ロック可能、および／または停止可能である。
【０１４０】
また、本明細書では、上記の方法で使用することができるシステム（例えば、デバイス、例えば、回収スキッド）も提供される。一実施形態では、システムまたはデバイスは、図１ａおよび／または図１ｂの実施形態を含んでなる。一実施形態では、システムまたはデバイスは、図２の実施形態を含んでなる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本明細書は、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物中のタンパク質の収量のコントロール、調節、増大または改善するための装置を開示する。装置は、１つ以上のセンサーを含んでなる。センサーは、圧力センサー、ＵＶセンサー、濁度センサー、温度センサー、フローセンサー、およびそれらの任意の組み合わせを含んでなる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、装置は、圧力センサー（４）、ＵＶセンサー（１）、濁度センサー（２）、温度センサー（２）、フローセンサー（１）を含むすべてのセンサーをこの装置に統合するように設計されている。いくつかの実施形態では、装置は３つのＰＭＡＴ（Pressure Monitor Alarm Transmitter：圧力モニタリング警報送信機）コントローラーを含んでなる。いくつかの実施形態では、ＰＭＡＴコントローラーはカート上にビルトインされており、合計１０個の異なるセンサーに対応する。いくつかの実施形態では、重力ポンプ（例えば、ＬＥＶＩＴＲＯＮＩＸ（登録商標）重力ポンプなど）は、液体をデプスフィルターに送るために使用され、装置に取り付けられている。いくつかの実施形態では、システムは、移動可能、ロック可能、および／または電気的に停止可能である。装置はまた、目的タンパク質の回収をコントロールするように構成されたプロセッサーを含んでなり得る。さらに、プロセッサーは装置の状態、例えば、温度、圧力、濁度、または流速、を変更するように構成され得る。プロセッサーはまた、目的タンパク質の回収をコントロールするように構成され得る。いくつかの実施形態では、プロセッサーは、確立されたモデルを使用して、培養物の回収プロセスを決定することができる。セルカルチャー回収プロセスは、濾過ベースのセルカルチャー回収プロセスを含み得る。プロセッサーは、目的タンパク質の力価を使用するように構成することができる。装置は、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物中のタンパク質の収量のコントロール、調節、増大または改善のためのシステムに組み込むことができる。
【０１４３】
ｄ．プロセス
一実施形態では、システムまたはデバイスは、回収スキッドを使用したプロセスフローを示す図２の実施形態を含んでなる。水源／バイオリアクター／ＰＢＳ源からの液体は、ＬＥＶＩＴＲＯＮＩＸ（登録商標）重力ポンプによってデプスフィルターに送られた。ＬＥＶＩＴＲＯＮＩＸ（登録商標）フローセンサーはポンプの後に配置した。Delta V（商標）は、オンラインフローセンサーの読み取り値からフロートータライザーの体積を計算した。フロートータライザーの体積を使用して、水のフラッシング終了時を決定した。一次デプスフィルター、二次デプスフィルター、プレフィルター、滅菌フィルターの前に４つの圧力センサーを配置した。圧力フローコントロールループは、一次デプスフィルター前のリアルタイムの圧力値に基づいて機能した。ろ液品質の指標として、２つの濁度センサーを一次および二次デプスフィルターの後に配置した。１つのＵＶセンサーは、二次デプスフィルターの後に配置し、オンライン目的タンパク質の濃度を計算し、清澄化されたバルクコレクションのカットオフをコントロールするために使用した。Delta V（商標）上でリアルタイムの上流の供給源とおよび下流の受け入れベッセルの重量をモニタリングし表示した。
【０１４４】
以下の実施例は、限定ではなく説明のために記載される。
【実施例】
【０１４５】
実施例１：  回収スキッドの設計
いくつかの実施形態では、サンプル中のタンパク質の収量のコントロール、調節、増大または改善のために、回収スキッドを利用した。図１に、回収スキッドの概略図を示す。この回収スキッドは、圧力センサー（４）、ＵＶセンサー（１）、濁度センサー（２）、温度センサー（２）、およびフローセンサー（１）を含むすべてのセンサーを１つのカートに統合するように設計した。図２を参照。合計１０個の異なるセンサーに対応するために、３つのＰＭＡＴコントローラーをカート上に構築した。液体をデプスフィルターに送るために使用されるＬＥＶＩＴＲＯＮＩＸ（登録商標）重力ポンプもスキッドカートに取り付けた。この回収スキッドは、移動可能、ロック可能、および電子的に停止可能なように設計した。
【表１】
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【表２】
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【０１４６】
回収に使用したセンサーは、個別の機能を有する。圧力センサーは、プロセス中の圧力をモニタリングし、ポンプへの流入量を継続的にコントロールし、圧力が高すぎる場合はポンプ流入の流速を下げる。ＵＶセンサーは、プロセス中のデプス濾過後のＵＶシグナルをモニタリングし、タンパク質濃度に変換してバルク回収の開始と終了をコントロールする。ＵＶは２８０ｎｍでの測定値である。
【０１４７】
重量センサーは、プロセス中に上流のバイオリアクターと下流のレシーバーの重量をモニタリングし、ロードとチェイスのステップをコントロールする。バイオリアクターとレシーバーのロードセル値は、回収スキッドコントロールシステムに統合されている。８８０  ｎｍでの濁度を測定する濁度センサーは、プロセス中のデプス濾過の前後の濁度をモニタリングする。デプスフィルターが汚れていると、濁度の急上昇が観察される。温度センサーは、プロセス中の温度をモニタリングする。ここでの回収プロセスは、周囲（室温）温度で動作する。
【０１４８】
回収スキッドプロセスを、セルカルチャーから目的のタンパク質を精製するために使用した。水源／バイオリアクター／ＰＢＳ源からの液体は、ＬＥＶＩＴＲＯＮＩＸ（登録商標）重力ポンプによって一次デプスフィルターに送った。ＬＥＶＩＴＲＯＮＩＸ（登録商標）重力ポンプは、ＣＨＯセルカルチャーでの細胞死が蠕動ポンプＰ３Ｐよりも少ないことが証明された。ＬＥＶＩＴＲＯＮＩＸ（登録商標）フローセンサーをポンプの後に配置した。Delta V（商標）は、オンラインフローセンサーの読み取り値からフロートータライザーの量を計算した。フロートータライザーの体積を使用して、水のフラッシング終了時を決定した。一次デプスフィルター、二次デプスフィルター、プレフィルター、滅菌フィルターＰ４Ｐの前に４つの圧力センサーを配置した。圧力フローコントロールループは、一次デプスフィルターの前のリアルタイムの圧力値に基づいて機能した。圧力値が特定のしきい値を超えると、Delta V（商標）が自動的にポンプを駆動してポンプ速度をダウンレギュレートする。ろ液品質の指標として、２つの濁度センサーを一次および二次デプスフィルターの後に配置した。１つのＵＶセンサーは、二次デプスフィルターの後に配置し、その値をオンライン目的タンパク質の濃度を計算し、清澄化されたバルク回収のカットオフをコントロールするために使用した。Delta V（商標）上でリアルタイムの上流の供給源と下流の受け入れベッセルの重量がモニタリング、表示された。
【０１４９】
本明細書に開示する各実施例について、回収スキッドは、各センサーを以下の範囲と精度で値を検出するために使用する。
【表３】
2021519298.tif 000005
【０１５０】
実施例２．  ＵＶシグナルのタンパク質濃度への変換
従来の方法と比べ、本明細書に開示した方法では、エアブローダウンステップを排除した。一方、清澄化されたバルクの回収の開始と終了は、オンラインのＵＶ測定値と計算された力価に基づいて自動的にコントロールした。図３を参照。より具体的には、回収プロセス中のリアルタイムの目的タンパク質の濃度は、作成したモデルを使用して、オンラインＵＶセンサーの読み取り値によって計算した。したがって、バルク回収のカットオフは、計算されたオンライン目的タンパク質の濃度に直接基づいて決定した。清澄化されたバルク回収の自動化されたカットオフを実現するため、計算アルゴリズムをDelta V（商標）コントロールシステムに統合した。
【０１５１】
この回収スキッドで使用したオンラインＵＶセンサーの出力吸光度は、０〜２ＡＵであった。このＵＶセンサーの光路長は、０〜２ＡＵの範囲で０〜６ｇ／Ｌの総目的タンパク質の濃度に対応するように調整した。より高い濃度測定には他のＵＶセンサーまたはFlow VPE（C-technologies）を使用することができる。
【０１５２】
オンラインＵＶシグナルをプロセス中の目的タンパク質の濃度に変換するため、図４に示すように一連のステップを実行した。
【０１５３】
最初のステップでは、Ｄ１２ ＧＩＴＲセルカルチャーの段階希釈サンプルを使用してオンラインＵＶシグナルに対するオフライン力価を測定した。目的タンパク質、ＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）および培地色素を含むセルカルチャーサンプル中のいくつかの成分は、ＵＶ吸光度シグナルに寄与し得る。実際の回収プロセス（ＵＶセンサーがこれらすべての成分からの総吸光度を測定する）を模倣するために、純粋なタンパク質の代わりにセルカルチャーサンプル（Ｄ１２ ＧＩＴＲセルカルチャー）を段階希釈し、ＵＶセンサーの経路長調整に使用した。
【０１５４】
図５に示すように、ＵＶセンサーの光路長は、回収プロセス中に観察され得る広範囲の目的タンパク質の濃度をカバーするように調整した。２ＡＵ（最大出力）に近いＵＶ読み取り値は精度が低いため、光路長を調整して、５ｇ／Ｌの力価でＵＶ読み取り値が約１．６になるようにした。Ｒ２が０．９７で、良好な直線性が観察された。したがって、セルカルチャーサンプルの段階希釈は、ＵＶ測定値と力価の間に強い相関関係をもたらす。
【０１５５】
実施例３．  純粋なタンパク質と清澄化されたバルクを使用した小規模試験
小規模の試験を、力価５．２ｇ／Ｌの２Ｌの純粋なタンパク質（ｅＴａｕ）を使用して実施した。デプスフィルターは、６０Ｌ／ｍ２（一次フィルターあたり）のロード量に基づいて縮小した。二次デプスフィルター後のオフラインサンプルは、回収プロセス中に回収した。回収プロセス中の純粋なタンパク質濃度とオンラインＵＶシグナルの関係を理解するために、オフライン力価の読み取り値をオンラインＵＶセンサー値でプロットした。
【０１５６】
力価５ｇ／Ｌの２Ｌの清澄化バルク（細胞を除去したｅＴａｕセルカルチャー）を使用して、さらなる小規模回収試験を実施した。デプスフィルターは、６０Ｌ／ｍ２（一次フィルターあたり）のロード量に基づいて縮小した。二次デプスフィルター後のオフラインサンプルは、回収プロセス中に回収した。回収プロセス中の目的タンパク質の濃度（培養成分の混合物中）とオンラインのＵＶシグナルとの関係を理解するために、オフライン力価の読み取り値をオンラインＵＶセンサー値でプロットした。
【０１５７】
試験した回収プロセス中のオンラインＵＶおよびオフライン力価の値を図６ａおよび図６ｂにプロットした。「incline」のデータ系列は、バルク回収の開始からロード終了まで収集した。一方、「decline」のデータ系列は、チェイスの開始からバルク回収の終了まで収集した。図６ａおよび図６ｂに示すように、両プロセスでデータのinclineとdecline部分の両方について良好な直線性が観察された。したがって、セルカルチャーサンプルの段階希釈は、他のサンプルを測定するときにＵＶ測定値と力価の間に強い相関関係をもたらす（たとえば、図６ａの純粋なタンパク質と図６ｂの清澄化バルクタンパク質）。
【０１５８】
ただし、inclineとdecline部分では傾斜が異なっており、回収プロセスにおける異なるステップで別々のモデルが必要になり得ることを示唆している。
【０１５９】
実施例４．  ３つの大規模セルカルチャープロセスを使用したモデルの確立
モデルの確立に、３つの異なる細胞株を使用した。これらの細胞株は、異なる特性（細胞密度、生存率、力価、バックグラウンドノイズなど）を有する、異なる大規模セルカルチャープロセス（Ａｂａ ＮＧＰ、ＧＩＴＲ、およびＮｅｘｔ Ｇｅｎ ＣＸＣＲ４）で構成した。モデル確立のためのデータを作成するために、この回収スキッドを使用して細胞株を回収した。デプスフィルターの規模は、６０〜６５Ｌ／ｍ２（一次フィルターあたり）のロード量に基づいて決定した。二次デプスフィルター後のオフラインサンプルは、回収プロセス中に回収した。モデルを作成するため、オフラインの力価測定値と対応するオンラインＵＶセンサー値がＪＭＰソフトウェアに入力された。ＵＶおよび力価の値を図７ａ、図７ｂ、および図７ｃにプロットした。データのincline部分では、依然として良好な直線性が観察された。ただし、decline部分については曲率が見られた。
【０１６０】
セルカルチャー材料のロード中、細胞、目的タンパク質、バックグラウンドノイズタンパク質はすべてデプスフィルターメンブレンのスペースを占有した。ＰＢＳでチェイスを開始すると、目的タンパク質が洗い流された。ＰＢＳのチェイスが進むにつれて、デプスフィルターメンブレンに緩く結合したＨＣＰなどのバックグラウンドノイズタンパク質が目的タンパク質と共に洗い流され始めた。同時に、細胞破片からのＨＣＰの放出も、バックグラウンドノイズのパーセンテージＰ５Ｐの増大に寄与した。これは、清澄化されたバルクサンプルとセルカルチャーサンプルの間のＵＶプロファイルの違いの理由であり得る。言い換えれば、複合的な細胞含有材料の場合、ＰＢＳのチェイスが進むにつれて、バックグラウンドノイズの増大と共に、目的タンパク質が総ＵＶシグナルに与える影響はますます少なくなった。
【０１６１】
これらの結果に基づいて、オンラインＵＶシグナルを使用して目的タンパク質の濃度を予測するために２つの別々のモデルを確立した。１つはincline部分（回収の開始からロード終了まで）のデータにフィットさせる線形モデルであり、もう１つはdecline部分（チェイスの開始から回収の終了まで）のデータにフィットさせる非線形モデルである。
【０１６２】
Ａ．incline部分のモデルフィット。
データのincline部分については、モデルに合計２２のサンプルを含めた。図８に、オフラインの力価値をオンラインのＵＶ値に対してプロットした。線形フィットをデータに適用した。線形フィットのＲ２値は０．９８であった。このモデルを使用して、予測力価を計算し、実際の力価と比較した。図８ａと図８ｂに示すように、フィットの傾きは１に非常に近く、Ｒ２は０．９８であった。
【０１６３】
回収の開始からロード終了までの目的タンパク質の濃度を予測するために、線形モデルを作成した。モデル予測力価＝ ａ ＋ ｂ＊（オンラインＵＶシグナル）。モデル定数ａおよびｂは、力価レベルに依存する。力価が約３．５ｇ／Ｌ以下の場合、ａ ＝ −０．３５、ｂ ＝ ２．８８。力価が約３．５ｇ／Ｌ以上の場合、ａ ＝ −０．６９、ｂ ＝ ４．０６。
【０１６４】
Ｂ．decline部分のモデルフィット
データのdecline部分については、モデルに合計４１のサンプルを含めた。図１０に、オフラインの力価値をオンラインのＵＶ値に対してプロットした。非線形フィットをデータに適用した。非線形フィットのＲＭＳＥ値は、ＣＨＯＺＮおよびＤＧ４４細胞株でそれぞれ０．２６および０．０４であった。このモデルを使用して、予測力価を計算し、実際の力価と比較した（図９ａおよび図９ｂ）。フィットの傾きは１に近く、Ｒ２は０．９７と０．９９であった。図９ａおよび図９ｂ。
【０１６５】
チェイスの開始から回収の終了までの目的タンパク質の濃度を予測するために、非線形モデルを作成した。モデル予測力価＝ Ａ ＋ Ｂ＊ｅｘｐ（Ｃ＊オンラインＵＶシグナル）。モデル定数Ａ、Ｂ、およびＣは、力価レベルに依存する。力価が約３．５ｇ／Ｌ以下の場合、Ａ＝−０．９５、Ｂ＝０．８６、Ｃ＝１．２１。力価が約３．５ｇ／Ｌ以上の場合、Ａ＝０．０２、Ｂ＝０．１３、Ｃ＝２．４１。
【０１６６】
実施例５．  ４つの大規模なセルカルチャープロセスを使用したテストモデル
４つの大規模（５００Ｌ）セルカルチャープロセス（ＣＤ７３、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ、ＩＬ８）を回収した。デプスフィルターは、小規模の予備データに基づいてスケールアップした。実際の力価測定のために、二次デプスフィルター後のオフラインサンプルを回収プロセス中に回収した。オンラインＵＶセンサー値をＪＭＰソフトウェアに入力した。モデルを使用して、オンラインＵＶセンサー値に基づいて予測力価値を計算し、オフライン力価測定値と比較した。
【表４】
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【表５】
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【０１６７】
上で作成したモデルを、４つの異なる大規模（５００Ｌ）セルカルチャー回収プロセスを用いて試験した（開始力価０〜０．１ｇ／Ｌ、終了力価０．１〜０．２ｇ／Ｌ）。このモデルは、０．０１ＡｕのＵＶシグナルで最低０．０１ｇ／Ｌまで試験可能である。ＪＭＰソフトウェアを使用してモデルの予測力価を実際の力価と比較した。各プロセスのモデル適合ＲＭＳＥ値を図１０に示した。
【０１６８】
モデルの予測値と実際の力価の値の差を計算した。この差を、試験した各プロセスについて図１２に示す。差の全体の平均は０．０７〜０．３６ｇ／Ｌの範囲であり、表２に示すように様々な特性を有する異なったプロセスにこのモデルを確実に適用できることを示唆している。
Ａ．回収プロセスコントロールのためのオンラインセンサーの使用および回収率の向上
【表６】
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【０１６９】
回収プロセスの収率は、次式を用いて計算した。
【数１】
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【０１７０】
表６に示すように、新規の回収スキッドを使用した場合の収率は、従来の方法を使用した場合よりも２〜５％高かった。
【０１７１】
この試験では、回収スキッドのリアルタイムのモニタリングとコントロールを設計し、いくつかの治療用タンパク質のデプス濾過回収について調べた。
【０１７２】
重要なプロセスパラメーターの自動モニタリングとコントロールを実現するため、オンラインセンサーをこの回収スキッドに組み込み、それらのリアルタイムの読み取り値をDelta V（商標）システムに統合した。回収プロセスの種々の段階でオンラインＵＶシグナルをリアルタイムの目的タンパク質の濃度に変換するモデルは、実験の一連のステップ（ＵＶセンサーの光路長の調整、純粋なタンパク質の試験、複合的なセルカルチャーサンプルの試験）で作成した。次いで、このモデルを、バックグラウンドノイズレベル、製品レベル、総細胞密度、生存率など、幅広いプロセス特性を備えたいくつかの大規模な回収プロセスで成功裏に試験された。
【０１７３】
この研究で作成されたこの新規の回収スキッドと統計モデルにより、セルカルチャーの清澄化プロセスを定量的にモニタリングおよびコントロールされ、回収の信頼性とタンパク質の収量が大幅に改善した。オンライン力価の情報自体は、セルカルチャーのパフォーマンスの重要な指標であり、下流での処理におけるプロテインＡクロマトグラフィーの迅速なロード量の決定に使用できる。
【０１７４】
実施例６．  タンパク質回収中の新規のタンパク質のリアルタイムモニタリングプロセス
この回収スキッドを使用して清澄化する新しい目的タンパク質を選択する。まず、回収プロセス中の圧力、流速、ＵＶ、濁度および温度をモニタリングするため、回収スキッド上のすべてのセンサーを、図２に示されているようにインラインで接続する。第二に、水源はＬＥＶＩＴＲＯＮＩＸ（登録商標）重力ポンプに接続する。デプスフィルターのフラッシング工程をコントロールするため、Delta V（商標）に総流量と流速を入力する。総流量に達した後、バイオリアクター供給源をＬＥＶＩＴＲＯＮＩＸ（登録商標）重力ポンプに接続し、デプスフィルターへのセルカルチャーのロードを開始する。第三に、incline部分のＵＶ予測モデル定数をDelta V（商標）に入力し；回収開始カットオフしきい値をDelta V（商標）に入力する。オンラインＵＶシグナルは、ロード中に目的タンパク質の濃度に変換される。しきい値に達すると、受け入れベッセルを滅菌フィルターに接続し、清澄化されたバルクを回収する。第四に、バイオリアクターが空になった後、ＰＢＳ供給源をＬＥＶＩＴＲＯＮＩＸ（登録商標）重力ポンプに接続して、チェイスステップを開始する。decline部分のＵＶ予測モデル定数を、細胞株タイプに基づきDelta V（商標）に入力し；回収終了カットオフしきい値を、Delta V（商標）に入力する。オンラインＵＶシグナルは、チェイス中に目的タンパク質の濃度に変換される。しきい値に達すると、受け入れベッセルをプロセスストリームから切り離す。コントロール不能な問題を示すため、回収プロセス全体を通して圧力、濁度および温度をモニタリングする。
【０１７５】
実施例７．  オフライン力価分析によるオンラインＵＶシグナルからのオンライン予測力価の確認
回収プロセスをデプスフィルターの注入用水（ＷＦＩ）フラッシュにより開始した。二次デプスフィルターの出口にＵＶセンサーを接続した。濾過が安定すると、出口から透明な液体の流れが見られ；その時点でＵＶセンサーの値はゼロになった。所望の量のＷＦＩでフィルターをフラッシュした後、セルカルチャーメディアをフィルター入口に接続してロードを開始した。ローディングと共にメディアのオンラインＵＶトレースをモニタリングした。ろ液サンプルをローディング中に採取し、力価アッセイによってオフラインで分析した。図１１は、モデリングにより、ＵＶシグナルから力価トレースが達成されたことを示している。モデリングによる力価トレースは、オフラインの力価アッセイの結果とよく一致しており、プロセスの信頼性と収率向上のための回収の開始と終了に使用できる。
【０１７６】
本開示の実施は、他に示されない限り、当分野の技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の慣用技術を用いる。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooks, Antisense drug Technology: Principles, strategies and applications, 2nd Ed. CRC Press (2007) and in Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)を参照。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、本明細書は、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物中のタンパク質の収率をコントロール、調節、増大、または改善するための装置を開示する。装置は、１つ以上のセンサーを含んでなり得る。センサーは、圧力センサー、ＵＶセンサー、濁度センサー、温度センサー、フローセンサー、およびそれらの任意の組み合わせを含んでなり得る。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、装置は、圧力センサー（４）、ＵＶセンサー（１）、濁度センサー（２）、温度センサー（２）、フローセンサー（１）を含むすべてのセンサーをこの装置に統合するように設計されている。いくつかの実施形態では、装置は３つのＰＭＡＴ（Pressure Monitor Alarm Transmitter：圧力モニタリング警報送信機）コントローラーを含んでなる。いくつかの実施形態では、ＰＭＡＴコントローラーはカート上にビルトインされており、合計１０個の異なるセンサーに対応する。いくつかの実施形態では、重力ポンプ（例えば、ＬＥＶＩＴＲＯＮＩＸ（登録商標）重力ポンプなど）は、液体をデプスフィルターに送るために使用され、装置に取り付けられている。いくつかの実施形態では、システムは、移動可能、ロック可能、および／または電気的に停止可能である。装置はまた、目的タンパク質の回収をコントロールするように構成されたプロセッサーを含んでなり得る。さらに、プロセッサーは装置の状態、例えば、温度、圧力、濁度、または流速、を変更するように構成され得る。プロセッサーはまた、目的タンパク質の回収をコントロールするように構成され得る。いくつかの実施形態では、プロセッサーは、確立されたモデルを使用して、培養物の回収プロセスを決定することができる。セルカルチャー回収プロセスは、濾過ベースのセルカルチャー回収プロセスを含み得る。プロセッサーは、目的タンパク質の力価を使用するように構成することができる。装置は、目的タンパク質および不純物を含むサンプル混合物中のタンパク質の収率のコントロール、調節、増大または改善のためのシステムに組み込むことができる。
【０１７９】
上で引用されたすべての参考文献、ならびに本明細書で引用されたすべての参考文献、およびアミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、GenBank番号および/またはUniprot番号）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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