(57)【要約】本開示は、ヒトＩＬ−４Ｒ結合抗体、その抗原結合フラグメント、およびそれらの医学的使用に関する。ヒトＩＬ−４Ｒ結合抗体およびその抗原結合フラグメント由来のＣＤＲ領域を含むキメラ抗体およびヒト化抗体、前記ヒトＩＬ−４Ｒ結合抗体およびその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、ならびにアレルギー性疾患を処置する薬物としてのそれらの使用が提供される。ＩＬ−４Ｒ媒介性の疾患または病気を処置するために使用される薬物を調製する際の前記ヒト化抗体ＩＬ−４Ｒ結合抗体の使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域は、
（Ｉ）配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；または
（ＩＩ）配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；
を含み、かつ／または、軽鎖可変領域は、
（Ｉ）配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；または
（ＩＩ）配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；または
（ＩＩＩ）配列番号３８、配列番号７および配列番号４０にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；または
（ＩＶ）配列番号４２、配列番号３９および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；
を含む、抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
以下の（Ｉ）〜（ＩＶ）から選択されるいずれか１つを含む、請求項１に記載の抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント：
（Ｉ）配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および
配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ＩＩ）配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および
配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ＩＩＩ）配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および
配列番号３８、配列番号７および配列番号４０にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ＩＶ）配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および
配列番号４２、配列番号３９および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
【請求項３】
ヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ３−１１＊０１に由来するＦＲ領域配列；および
ヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ３−１１＊０１に由来するＦＲ領域に対して少なくとも９５％の同一性を有する復帰突然変異配列；
からなる群から選択されるフラグメントまたはそれらの組み合わせをさらに含み；
好ましくは、当該復帰突然変異は、Ｌ４６Ｐ、Ｌ４７ＷおよびＦ７１Ｙからなる群、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
かつ／または、前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、
ヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ３−４８＊０１に由来するＦＲ領域配列；および
ヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ３−４８＊０１に由来するＦＲ領域に対して少なくとも９５％の同一性を有する復帰突然変異配列；
からなる群から選択されるフラグメントまたはそれらの組み合わせをさらに含み；
好ましくは、当該復帰突然変異は、Ｓ４９Ａ、Ｆ６７ＳおよびＡ９３Ｔからなる群、ま
たはそれらの組み合わせから選択される、抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０１に由来するＦＲ領域配列；および
ヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０１に由来するＦＲ領域に対して少なくとも９５％の同一性を有する復帰突然変異配列；
からなる群から選択されるフラグメントまたはそれらの組み合わせをさらに含み；
好ましくは、当該復帰突然変異は、Ｍ４Ｌおよび／またはＶ５８Ｉからなる群から選択される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
かつ／または、前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、
ヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ１−２＊０２に由来するＦＲ領域配列；および
ヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ１−２＊０２に由来するＦＲ領域に対して少なくとも９５％の同一性を有する復帰突然変異配列；
からなる群から選択されるフラグメントまたはそれらの組み合わせをさらに含み；
好ましくは、当該復帰突然変異は、Ｍ６９Ｌ、Ｒ７１Ｉ、Ｔ７３ＫおよびＲ９４Ｋからなる群、またはそれらの組み合わせから選択される、抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよび（Ｆａｂ’）２フラグメントからなる群から選択され；
前記抗体の前記重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４またはそれらのバリアントの重鎖フレームワーク領域を含み；好ましくは、前記抗体の前記重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の重鎖フレームワーク領域を含み；
より好ましくは、前記抗体の前記重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ４の重鎖フレームワーク領域を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
重鎖可変領域は、
（Ｉ）配列番号１に示される配列、または配列番号１に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩ）配列番号９に示される配列、または配列番号９に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩＩ）配列番号４３に示される配列、または配列番号４３に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列；
を含み、かつ／または、軽鎖可変領域は、
（Ｉ）配列番号２に示される配列、または配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩ）配列番号１０に示される配列、または配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩＩ）配列番号３７に示される配列、または配列番号３７に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＶ）配列番号４１に示される配列、または配列番号４１に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列；
を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
好ましくは、前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、
配列番号１に示される重鎖可変領域および配列番号２に示される軽鎖可変領域；または
配列番号９に示される重鎖可変領域および配列番号１０に示される軽鎖可変領域；また
は
配列番号４３に示される重鎖可変領域および配列番号３７に示される軽鎖可変領域；または
配列番号４３に示される重鎖可変領域および配列番号４１に示される軽鎖可変領域
を含む、抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
重鎖可変領域は、
（Ｉ）配列番号２５〜２７のうちの１つに示される配列、または配列番号２５〜２７のうちの１つに対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩ）配列番号３１〜３３のうちの１つに示される配列、または配列番号３１〜３３のうちの１つに対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；
を含み、かつ／または、軽鎖可変領域は、
（Ｉ）配列番号２８〜３０のうちの１つに示される配列、または配列番号２８〜３０のうちの１つに対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩ）配列番号３４〜３６のうちの１つに示される配列、または配列番号３４〜３６のうちの１つに対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；
を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
重鎖は、
（Ｉ）配列番号１７に示される配列、または配列番号１７に対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩ）配列番号１９に示される配列、または配列番号１９に対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩＩ）配列番号４４に示される配列、または配列番号４４に対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列； 
を含み、かつ／または、軽鎖は、
（Ｉ）配列番号１８に示される配列、または配列番号１８に対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩ）配列番号２０に示される配列、または配列番号２０に対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩＩ）配列番号４５に示される配列、または配列番号４５に対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＶ）配列番号４６に示される配列、または配列番号４６に対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；
を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
好ましくは、以下からなる群から選択されるいずれか１つを含む、抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント：
配列番号１７に示される重鎖および配列番号１８に示される軽鎖; または
配列番号１９に示される重鎖および配列番号２０に示される軽鎖; または
配列番号４４に示される重鎖および配列番号４５に示される軽鎖; または
配列番号４４に示される重鎖および配列番号４６に示される軽鎖。
【請求項９】
マウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはそれらのフラグメントである、請求項１〜２のいずれか一項に記載の抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント
。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記ベクターは、真核生物発現ベクター、原核生物発現ベクターまたはウイルスベクターである、ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞であって、
好ましくは、前記宿主細胞は、細菌、酵母および哺乳動物細胞からなる群から選択され、
より好ましくは、前記宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞およびヒト胎児腎臓２９３細胞からなる群から選択される、宿主細胞。
【請求項１３】
ＩＬ−４Ｒを検出または測定するための方法であって、前記方法は、サンプルを請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させるステップを含む、方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、試薬。
【請求項１５】
ヒトＩＬ−４Ｒ陽性細胞に関連する疾患の診断に使用するための、請求項１４に記載の試薬。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと、
薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
ＩＬ−４Ｒ媒介性の疾患または状態を処置または予防するための、または免疫疾患または状態を処置または予防するための薬剤の調製における、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項１０に記載のポリヌクレオチド、および請求項１６に記載の医薬組成物からなる群から選択されるいずれか１つの使用であって、
好ましくは、前記疾患または状態は、喘息、鼻ポリープ、慢性副鼻腔炎、アレルギー性皮膚疾患、好酸球性食道炎、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、関節炎、炎症性疾患、アレルギー反応、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性溶血性貧血、バレット食道、自己免疫性ブドウ膜炎、結核および腎症からなる群から選択され；
より好ましくは、前記疾患または状態は、喘息またはアレルギー性皮膚疾患である、使用。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項１６に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、ＩＬ−４Ｒ媒介性の疾患または状態を処置または予防するための、および／または免疫疾患または状態を処置または予防するための方法であって、
好ましくは、前記疾患または状態は、喘息、鼻ポリープ、慢性副鼻腔炎、アレルギー性皮膚疾患、好酸球性食道炎、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、関節炎、炎症性疾患、アレルギー反応、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性溶血性貧血、バレット食道、自己免疫性ブドウ膜炎、結核および腎症からなる群から選択され；より好ましくは、前
記疾患または状態は、喘息またはアレルギー性皮膚疾患である、方法。
【請求項１９】
以下のステップを含む、抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを調製するための方法：
請求項１２に記載の宿主細胞において、前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させるステップ、および
前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを前記宿主細胞から単離するステップ。
【発明の詳細な説明】
【優先権の主張】
【０００１】
本出願は、２０１８年８月２４日に出願された中国出願ＣＮ２０１８１０９７１２６９．２、２０１８年１２月４日に出願された中国出願ＣＮ２０１８１１４７２７５２．２、２０１９年３月２２日に出願された中国出願ＣＮ２０１９１０２２１３１１．３、および２０１９年５月１５日に出願された中国出願ＣＮ２０１９１０４０１９２３．０の優先権を主張する。上記の各出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体およびその抗原結合フラグメントに関する。本開示はまた、上記抗体由来のＣＤＲ領域を含むキメラ抗体またはヒト化抗体、ならびにヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、ならびに自己免疫疾患を処置するための薬剤としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
アレルギー性疾患は、一定期間かけて治癒され得る生命を脅かさないアレルギー反応、および生命を脅かすアレルギー性疾患を含む深刻な病状である。
【０００４】
アレルギーを処置するための現在の方法には、アレルゲンの回避、症状の薬物処置、およびアレルゲン特異的免疫療法による予防が含まれる。
【０００５】
インターロイキン−４（ＩＬ−４、Ｂ細胞刺激因子またはＢＳＦ−１としても知られている）は、低濃度の抗表面免疫グロブリン抗体に応答してＢ細胞増殖を刺激するその能力によって特徴づけられる。ＩＬ−４は、Ｔ細胞、肥満細胞、顆粒球、巨核球および赤血球などの増殖を刺激することを含む、幅広い生物学的活性を有することが証明されている。ＩＬ−４は、休止状態のＢ細胞におけるＭＨＣ−ＩＩの発現を誘導し、活性化されたＢ細胞による免疫グロブリンＩｇＥおよびＩｇＧ１の分泌を増強する。
【０００６】
ＩＬ−４の生物学的活性は、特異的な細胞表面ＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒ）によって媒介される。ＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒ）は８０２アミノ酸残基からなり、ＩＬ−４ＲはＴ細胞、Ｂ細胞、胸腺細胞、骨髄細胞、マクロファージおよび肥満細胞の表面に発現している。ＩＬ−４Ｒのα鎖はＩＬ−１３受容体（ＩＬ−１３Ｒ）の成分でもあるため、ＩＬ−４ＲはＩＬ−１３の生物学的活性も媒介することができる。新しい治療方法として、対象がアレルゲンに曝露されるかアレルギー症状を示す前、アレルゲンに曝露されているかアレルギー症状を示している間、またはアレルゲンに曝露されたかアレルギー症状を示した後に、ＩＬ−４Ｒアンタゴニストを含む薬剤または組成物が対象に投与され得る。
【０００７】
現在、さまざまな国の多くの製薬会社が、さまざまな関連するアレルギー性疾患の処置のために、ＩＬ−４Ｒに対するモノクローナル抗体を開発している。関連する特許出願には、例えば、ＷＯ２０１００５３７５１、ＷＯ２００１０９２３４０、ＷＯ２００８０５４６０６、ＷＯ２０１４０３１６１０などが含まれる。それらの中で、サノフィ・リジェネロン（Ｓａｎｏｆｉ  Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）が開発した喘息治療薬であるデュピルマブが、皮膚炎の適用のために販売が承認されている。喘息の適用については、第ＩＩＩ相臨床試験も完了し、販売承認段階に入った。
【０００８】
既存の処置戦略は効果的ではないか、またはより大きなリスクを有する。したがって、高い親和性でｈＩＬに結合し、ＩＬ−４Ｒの生物学的活性を中和する（ＩＬ−４Ｒとの相
互作用を遮断することを含む）ことによって、ＩＬ−４Ｒ媒介性のアレルギー性疾患を処置できる薬物および組成物、ならびに治療法を提供するために、高い選択性および高い生物学的活性でヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体を提供することが当技術分野において依然として必要である。
【発明の概要】
【０００９】
いくつかの実施形態では、
重鎖可変領域は、
（Ｉ）配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；または、配列番号３、４および５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と比較した場合に、３、２または１個のアミノ酸の違いを有するＨＣＤＲバリアント；または
（ＩＩ）配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；または、配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と比較した場合に、３、２または１個のアミノ酸の違いを有するＨＣＤＲバリアント；
を含み、かつ／または、軽鎖可変領域は、
（Ｉ）配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；または、配列番号６、７および８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と比較した場合に、３、２または１個のアミノ酸の違いを有するＬＣＤＲバリアント；または
（ＩＩ）配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；または、配列番号１４、１５および１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と比較した場合に、３、２または１個のアミノ酸の違いを有するＬＣＤＲバリアント；または
（ＩＩＩ）配列番号３８、配列番号７および配列番号４０にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；または、配列番号３８、７および４０にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と比較した場合に、３、２または１個のアミノ酸の違いを有するＬＣＤＲバリアント；または
（ＩＶ）配列番号４２、配列番号３９および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；または、配列番号４２、３９および８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と比較した場合に、３、２または１個のアミノ酸の違いを有するＬＣＤＲバリアント；
を含む、ＩＬ−４Ｒに特異的に結合する抗体（ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体、抗ヒトＩＬ−４Ｒ抗体とも呼ばれる）またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、前記ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の（Ｉ）〜（ＩＶ）からなる群から選択されるいずれか１つを含む：
（Ｉ）配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および
配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ＩＩ）配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および
配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ＩＩＩ）配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および
配列番号３８、配列番号７および配列番号４０にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびに
（ＩＶ）配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および
配列番号４２、配列番号３９および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
【００１１】
前記ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、
重鎖可変領域は、
（Ｉ）配列番号１に示される配列、または配列番号１に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩ）配列番号９に示される配列、または配列番号９に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩＩ）配列番号４３に示される配列、または配列番号４３に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列；
を含み、かつ／または、軽鎖可変領域は、
（Ｉ）配列番号２に示される配列、または配列番号２に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩ）配列番号１０に示される配列、または配列番号１０に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩＩ）配列番号３７に示される配列、または配列番号３７に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＶ）配列番号４１に示される配列、または配列番号４１に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列；
を含む。
【００１２】
前記ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの少なくとも１つの実施形態では、
重鎖可変領域は配列番号１に示され、かつ軽鎖可変領域は配列番号２に示されるか；または
重鎖可変領域は配列番号９に示され、かつ軽鎖可変領域は配列番号１０に示されるか；または
重鎖可変領域は配列番号４３に示され、かつ軽鎖可変領域は配列番号３７に示されるか；または
重鎖可変領域は配列番号４３に示され、かつ軽鎖可変領域は配列番号４１に示される。
【００１３】
前記ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、
重鎖可変領域は、
（Ｉ）配列番号２５〜２７のうちの１つに示される配列、または配列番号２５〜２７のうちの１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩ）配列番号３１〜３３のうちの１つに示される配列、または配列番号３１〜３３のうちの１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；
を含み、かつ／または、軽鎖可変領域は、
（Ｉ）配列番号２８〜３０のうちの１つに示される配列、または配列番号２８〜３０のうちの１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩ）配列番号３４〜３６のうちの１つに示される配列、または配列番号３４〜３６のうちの１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％
の同一性を有する配列；
を含む。
【００１４】
いくつかの特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２５〜２７のうちの１つに示されるとおりであり、軽鎖可変領域は、配列番号２８〜３０のうちの１つに示されるとおりである。
【００１５】
他の特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３１〜３３のうちの１つに示されるとおりであり、軽鎖可変領域は、配列番号３４〜３６のうちの１つに示されるとおりである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、前記ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖は、
（Ｉ）配列番号１７に示される配列、または配列番号１７に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩ）配列番号１９に示される配列、または配列番号１９に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩＩ）配列番号４４に示される配列、または配列番号４４に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列； を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、前記ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖は、
（Ｉ）配列番号１８に示される配列、または配列番号１８に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩ）配列番号２０に示される配列、または配列番号２０に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＩＩ）配列番号４５に示される配列、または配列番号４５に対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；または
（ＩＶ）配列番号４６に示される配列、または配列番号４６に対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列；を含む。
【００１８】
少なくとも１つの実施形態では、重鎖は、配列番号１７に示されるとおりであり、軽鎖は、配列番号１８に示されるとおりである。
【００１９】
別の実施形態では、重鎖は、配列番号１９に示されるとおりであり、軽鎖は、配列番号２０に示されるとおりである。
【００２０】
別の実施形態では、重鎖は、配列番号４４に示されるとおりであり、軽鎖は、配列番号４５に示されるとおりである。
【００２１】
別の実施形態では、重鎖は、配列番号４４に示されるとおりであり、軽鎖は、配列番号４６に示されるとおりである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体または抗原結合フラグメントは、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはそれらのフラグメントである。
【００２３】
いくつかの特定の実施形態では、前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体または抗原結合フラグメントは、ヒト化されている。
【００２４】
いくつかの実施形態では、前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、
ヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ３−１１＊０１に由来するＦＲ領域配列；および
ヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ３−１１＊０１に由来するＦＲ領域に対して少なくとも９５％の同一性を有する復帰突然変異配列；
からなる群から選択されるフラグメントまたはそれらの組み合わせを含む。いくつかの特定の実施形態では、当該復帰突然変異は、Ｌ４６Ｐ、Ｌ４７ＷおよびＦ７１Ｙからなる群から選択されるいずれか１つ、またはそれらの組み合わせである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、
ヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ３−４８＊０１に由来するＦＲ領域配列；および
ヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ３−４８＊０１に由来するＦＲ領域に対して少なくとも９５％の同一性を有する復帰突然変異配列；
からなる群から選択されるフラグメントまたはそれらの組み合わせを含む。いくつかの特定の実施形態では、当該復帰突然変異は、Ｓ４９Ａ、Ｆ６７ＳおよびＡ９３Ｔからなる群から選択されるいずれか１つ、またはそれらの組み合わせである。
【００２６】
いくつかの実施形態では、前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、
ヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０１に由来するＦＲ領域配列；および
ヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０１に由来するＦＲ領域に対して少なくとも９５％の同一性を有する復帰突然変異配列；
からなる群から選択されるフラグメントまたはそれらの組み合わせを含む。いくつかの特定の実施形態では、当該復帰突然変異は、Ｍ４Ｌおよび／またはＶ５８Ｉからなる群から選択される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、
ヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ１−２＊０２に由来するＦＲ領域配列；および
ヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ１−２＊０２に由来するＦＲ領域に対して少なくとも９５％の同一性を有する復帰突然変異配列；
からなる群から選択されるフラグメントまたはそれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの特定の実施形態では、当該復帰突然変異は、Ｍ６９Ｌ、Ｒ７１Ｉ、Ｔ７３ＫおよびＲ９４Ｋからなる群から選択されるいずれか１つ、またはそれらの組み合わせである。
【００２８】
いくつかの実施形態では、前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの前記重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４またはそれらのバリアントの重鎖フレームワーク領域を含む。いくつかの特定の実施形態では、前記重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ１またはそのバリアントの重鎖フレームワーク領域、例えば、配列番号４３に示される重鎖可変領域または配列番号４３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する重鎖可変領域バリアントを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトκ、λ鎖またはそのバリアントの定常領域、例えば、配列番号４４に示される軽鎖可変領域または配列番号４４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域バリアントを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、上述したヒト化ＩＬ−４Ｒ抗体またはそのフラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４またはそれらのバリアントの重鎖定常領域をさらに含む。
【００３１】
少なくとも１つの実施形態では、前記抗体は、ヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４の重鎖定常領域を含む。ＩｇＧ２またはＩｇＧ４は、ＡＤＣＣ毒性を有さない。あるいは、アミノ酸突然変異後のＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害）毒性のないＩｇＧ１が使用され
得る。
【００３２】
少なくとも１つの実施形態では、前記バリアントは、以下からなる群から選択される重鎖定常領域の突然変異を含む：ＡＤＣＣ機能を低下させるか、ＡＤＣＣ機能の喪失を引き起こす突然変異、例えば、限定されないが、ＩｇＧ１のＮ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ。
【００３３】
前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記抗体はヒト化抗体であり、重鎖配列は配列番号１７に示されるとおりであるか、または配列番号１７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し；軽鎖配列は、配列番号１８に示されるとおりであるか、または配列番号１８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【００３４】
前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記抗体はヒト化抗体であり、重鎖配列は配列番号１９に示されるとおりであるか、または配列番号１９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し；軽鎖配列は、配列番号２０に示されるとおりであるか、または配列番号２０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【００３５】
前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記抗体はヒト化抗体であり、重鎖配列は配列番号４４に示されるとおりであるか、または配列番号４４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し；軽鎖配列は、配列番号４５に示されるとおりであるか、または配列番号４５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【００３６】
前記抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記抗体はヒト化抗体であり、重鎖配列は配列番号４４に示されるとおりであるか、または配列番号４４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し；軽鎖配列は、配列番号４６に示されるとおりであるか、または配列番号４６に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ヒトＩＬ−４Ｒへの結合について、上述したいずれかのヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと競合することを特徴とする、単離された抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本出願に係るヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む、二重特異性抗体または多重特異性抗体が提供される。
【００３９】
他の実施形態では、本出願に係るヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む、一本鎖抗体が提供される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本出願に係るヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、ポリヌクレオチドが提供される。
【００４１】
他の実施形態では、本出願に係るヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと競合的に、ＩＬ−４Ｒまたはそのエピトープに結合する抗体をコードする、ポリヌクレオチドが提供される。
【００４２】
他の実施形態では、上述した二重特異性抗体、多重特異性抗体または一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本出願に係るポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、上述したポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記ベクターは、真核生物発現ベクター、原核生物発現ベクターまたはウイルスベクターである、ベクターが提供される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、上述したベクターで形質転換された宿主細胞であって、原核細胞および真核細胞からなる群から選択される、宿主細胞が提供される。
【００４６】
少なくとも１つの実施形態では、前記原核細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌から選択される。
【００４７】
少なくとも１つの実施形態では、前記真核細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはＣＨＯ細胞などの、酵母および哺乳動物細胞からなる群から選択される。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−４Ｒを検出または測定するための方法であって、前記方法は、サンプルを上述した抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させるステップを含む、方法が提供される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ヒトＩＬ−４Ｒを検出または測定するための試薬であって、上述した抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、試薬が提供される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ヒトＩＬ−４Ｒを検出または測定するための試薬であって、本出願に係るヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと競合的に、ＩＬ−４Ｒまたはそのエピトープに結合する抗体を含む、試薬が提供される。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ヒトＩＬ−４Ｒを検出または測定するための試薬であって、上述した二重特異性抗体、多重特異性抗体および一本鎖抗体を含む、試薬が提供される。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ヒトＩＬ−４Ｒ陽性細胞に関連する疾患を診断するための診断薬であって、上述した抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、診断薬が提供される。他の実施形態では、前記診断薬は、本出願に係るヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと競合的に、ＩＬ−４Ｒまたはそのエピトープに結合する抗体を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、
本出願に係るヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと、
薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と
を含む、医薬組成物が提供される。
【００５４】
いくつかの特定の実施形態では、前記医薬組成物の用量単位は、１ｍｇ〜１０００ｍｇの本出願に係るＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【００５５】
いくつかの特定の実施形態では、前記医薬組成物に含まれる前記ＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度は、１ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌである。
【００５６】
いくつかの特定の実施形態では、前記医薬組成物は緩衝液を含み、当該緩衝液の含有量は１ｍＭ〜１０００ｍＭである。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−４Ｒ媒介性の疾患または状態を処置または予防するための薬剤の調製における、上述したヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの使用が提供される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−４Ｒ媒介性の疾患または状態を処置または予防するための薬剤の調製における、上述した医薬組成物の使用が提供される。
【００５９】
いくつかの実施形態では、疾患または状態の処置または予防に使用するための、上述したヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、疾患または状態の処置または予防に使用するための、上述した医薬組成物が提供される。
【００６１】
本出願の文脈において、前記状態または疾患は、免疫疾患または状態であり得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、前記疾患または状態は、喘息、鼻ポリープ、慢性副鼻腔炎、アレルギー性皮膚疾患、好酸球性食道炎、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、関節炎、炎症性疾患、アレルギー反応、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性溶血性貧血、バレット食道、自己免疫性ブドウ膜炎、結核および腎症からなる群から選択される。
【００６３】
少なくとも１つの実施形態では、前記疾患または状態は喘息である。
【００６４】
他の実施形態では、前記疾患または状態はアレルギー性皮膚疾患である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはＦ（ａｂ’）２である、ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、治療有効量（または予防有効量）の上述したヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを、それを必要とする患者（または対象）に投与することを含む、ＩＬ−４Ｒ媒介性の疾患または状態を処置および／または予防するための方法が提供される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、治療有効量（または予防有効量）の上述した医薬組成物を、それを必要とする患者（または対象）に投与することを含む、ＩＬ−４Ｒ媒介性の疾患または状態を処置および／または予防するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、治療有効量（または予防有効量）の上述したヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは医薬組成物を、それを必要とする患者（または対象）に投与することを含む、免疫疾患を処置および／または予防するための方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
・用語
本開示がより容易に理解され得るようにするために、特定の技術的および科学的用語を以下に具体的に定義する。本明細書の他の場所で特に定義されない限り、本明細書で使用される他のすべての技術的および科学的用語は、本出願が関係する当業者によって一般に理解される意味を有する。
【００６９】
「ヒトＩＬ−４Ｒ（ｈＩＬ−４Ｒ）」とは、インターロイキン−４（ＩＬ−４）に特異的に結合するヒトサイトカイン受容体、ＩＬ−４Ｒαを意味する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、アミノ酸の３文字コードおよび１文字コードは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２４３，（１９６８年）３５５８頁に記載されているとおりである。
【００７１】
「抗体」という用語は免疫グロブリンを指し、該免疫グロブリンは、鎖間ジスルフィド結合によって２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖を連結することによって形成される４本のペプチド鎖構造である。異なる免疫グロブリンの重鎖定常領域は、異なるアミノ酸組成および配列配置を示し、それにより異なる抗原性を示す。したがって、免疫グロブリンは５つのカテゴリー（または免疫グロブリンアイソタイプと呼ばれる）、すなわちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥに分類することができ、それらの重鎖はそれぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖およびε鎖である。ヒンジ領域のアミノ酸組成ならびに重鎖ジスルフィド結合の数および位置に応じて、同じタイプのＩｇを異なるサブカテゴリにさらに分類することができる；例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に分類することができる。軽鎖は、異なる定常領域を考慮して、κ鎖またはλ鎖に分類することができる。５つのＩｇのそれぞれは、κ鎖またはλ鎖を有し得る。
【００７２】
抗体軽鎖は軽鎖定常領域をさらに含み、当該軽鎖定常領域はヒトまたはマウスのκ、λ鎖またはそれらのバリアントを含む。
【００７３】
抗体重鎖は重鎖定常領域をさらに含み、当該重鎖定常領域はヒトまたはマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらのバリアントを含む。
【００７４】
抗体の重鎖および軽鎖配列のＮ末端付近では、約１１０アミノ酸の配列が大きく異なり、可変領域（Ｖ領域）として知られている；Ｃ末端近くの残りのアミノ酸配列は比較的安定しており、定常領域（Ｃ領域）として知られている。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と比較的保存された配列を有する４つのフレームワーク領域（ＦＲ）とを含む。３つの超可変領域は抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られている。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および各重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシル末端への順番は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４である。３つの軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を指す；３つの重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を指す。
【００７５】
抗体には、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および組換えによって取得され得るヒト抗体が含まれ、例えば、親和性成熟によって得られた組換えヒト抗体であり得る。
【００７６】
「組換えヒト抗体」という用語は、組換え法によって調製、発現、作製または単離されたヒト抗体を含み、関連する技術および方法は当技術分野で周知であり、例えば以下が挙げられる：（１）ヒト免疫グロブリン遺伝子トランスジェニック動物または染色体導入された（ｔｒａｎｓ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）動物（例えば、マウス）から単離された抗体、またはそれらから調製されたハイブリドーマ；（２）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離された抗体；（３）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体；および（４）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を別のＤＮＡ配列などにスプライシングすることによって調製、発現、作製または単離された抗体。そのような組換えヒト抗体は、可変領域および定常領域を含み、そのような領域は、生殖細胞系列遺伝子によってコードされる特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列を含むが、抗体成熟中に生じるものなどの
その後の再編成および突然変異も含む。
【００７７】
本明細書における「マウス抗体」という用語は、当技術分野における知識および技術に従って調製される、ヒトＩＬ−４Ｒに対するモノクローナル抗体を指す。調製中、試験対象にＩＬ−４Ｒ抗原またはそのエピトープを含むポリペプチドを注入し、次いで、所望の配列または機能的特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマを分離する。いくつかの特定の実施形態において、マウスＩＬ−４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスκ、λ鎖またはそのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含むか、またはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、またはそのバリアントの重鎖定常領域をさらに含む。
【００７８】
「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を含む。本出願のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発によって、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、他の哺乳動物種（マウスなど）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体（すなわち、「ヒト化抗体」）を含まない。
【００７９】
ＣＤＲ移植抗体としても知られる「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種のＣＤＲ配列をヒト抗体の可変領域フレームワークに移植することによって生成される抗体を指す。ヒト化抗体は、大量の異種タンパク質成分を保有するキメラ抗体によって誘発される強力な抗体反応を克服する。免疫原性の低下に伴う活性の低下を回避するために、ヒト抗体の可変領域は、活性を維持するために最小限の復帰突然変異を受けるであろう。
【００８０】
「キメラ抗体」という用語は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合することによって形成される抗体であり、キメラ抗体は、マウス抗体によって誘導される免疫応答を軽減することができる。キメラ抗体を確立するために、特定のマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを最初に確立し、次に可変領域遺伝子をマウスハイブリドーマ細胞からクローン化し、次にヒト抗体の定常領域遺伝子を必要に応じてクローン化し、該マウス可変領域遺伝子を該ヒト定常領域遺伝子にライゲーションして、ヒトベクターに挿入できるキメラ遺伝子を形成し、最後に、キメラ抗体分子を真核生物または原核生物の産業用システムで発現させる。ヒト抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４またはそれらのバリアントの重鎖定常領域、好ましくはヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４、またはアミノ酸突然変異後にＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害）を有さないＩｇＧ１の重鎖定常領域から選択される。
【００８１】
「抗原結合フラグメント」は、抗原結合活性を有するＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒトＩＬ−４Ｒに結合するＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ならびに上記のフラグメントを含むポリペプチドまたはタンパク質を指す。上述の「抗原結合フラグメント」は、本出願に係る抗体の１つ以上のＣＤＲを含む。Ｆｖフラグメントは、すべての抗原結合部位を保有する最小の抗体フラグメントであり、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含むが、定常領域はない。一般に、Ｆｖ抗体は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、抗原結合に必要な構造を形成することができる。また、異なるリンカーを使用して、２つの抗体の可変領域を接続してポリペプチド鎖、すなわち一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成することができる。
【００８２】
「ＩＬ−４Ｒへの結合」は、ヒトＩＬ−４Ｒと相互作用する能力を指す。本明細書で使用される「抗原結合部位」という用語は、本出願の抗体または抗原結合フラグメントによ
って認識される三次元的な部位を指す。
【００８３】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体に特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、隣接するアミノ酸によって、またはタンパク質の三次フォールディングによって近づけられた非隣接アミノ酸によって形成され得る。隣接するアミノ酸によって形成されるエピトープは、通常、変性溶媒への曝露後に保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、通常、変性溶媒での処理後には存在しない。エピトープは、通常、固有の空間的コンフォメーションにおいて少なくとも３〜１５個のアミノ酸を含む。所与の抗体によって結合されるエピトープを決定するための方法は、当技術分野で周知であり、免疫ブロッティングおよび免疫沈降アッセイなどを含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定するための方法には、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴などの当技術分野の技術および本明細書に記載の技術が含まれる。
【００８４】
「特異的に結合する」および「選択的に結合する」という用語は、所定の抗原上のエピトープへの抗体の結合を指す。典型的には、抗体は、約１０−７Ｍ未満またはさらにそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で所定の抗原に結合し、組換えヒトＩＬ−４Ｒを分析物として使用し、抗体をリガンドとして使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を介して機器で測定した場合、所定の抗原への結合についての抗体の親和性は、所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（ＢＳＡなど）への結合についての抗体の親和性よりも少なくとも２倍高い。「抗原を認識する抗体」という用語は、本明細書では、「特異的に結合する抗体」という用語と交換可能に使用され得る。
【００８５】
「交差反応」という用語は、異なる種由来のＩＬ−４Ｒに結合する本出願の抗体の能力を指す。例えば、ヒトＩＬ−４Ｒに結合する本出願の抗体は、別の種由来のＩＬ−４Ｒにも結合することができる。交差反応性は、結合アッセイ（例えば、ＳＰＲおよびＥＬＩＳＡ）で精製抗原との特異的反応性を検出するか、ＩＬ−４Ｒを生理学的に発現している細胞との結合または機能的相互作用を検出することによって測定される。交差反応性を決定するための方法には、表面プラズモン共鳴分析（ＳＰＲ）またはフローサイトメトリーなどの、本明細書に記載されるような標準的な結合アッセイが含まれる。
【００８６】
「中和」または「遮断」抗体という用語は、ｈＩＬ−４Ｒに結合し、ｈＩＬ−４および／またはｈＩＬ−３の生物学的活性の阻害をもたらす抗体を指す。このｈＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の生物学的活性の阻害は、ｈＩＬ−４および／またはｈＩＬ−１３によって誘導される細胞活性化ならびにｈＩＬ−４のｈＩＬ−４Ｒへの結合、例えば、ＣＮ１０３７３９７１１Ａに記載のものなどの、当技術分野で周知のｈＩＬ−４および／またはｈＩＬ−１３の生物学的活性の１つ以上の指標を測定することによって評価することができる。「増殖の阻害」（例えば、細胞に言及する場合）は、任意の測定可能な細胞増殖の低下を含むことを意図している。
【００８７】
「免疫応答を誘導する」および「免疫応答を増強する」という用語は交換可能に使用され、特定の抗原の刺激に対する免疫応答（すなわち、受動的または適応的）を指す。ＣＤＣまたはＡＤＣＣに関する「誘導」という用語は、細胞を直接的に殺すための特定のメカニズムを刺激することを指す。
【００８８】
「ＡＤＣＣ」（抗体依存性細胞介在性細胞傷害）という用語は、Ｆｃ受容体を発現する細胞が、抗体のＦｃセグメントを認識することにより、該抗体でコーティングされた標的細胞を直接的に殺すことを指す。抗体のＡＤＣＣエフェクター機能は、ＩｇＧのＦｃセグメントの改変によって低減または排除され得る。改変とは、ＩｇＧ１のＮ２９７Ａ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａからなる群から選択される突然変異、ＩｇＧ２／４キメラ、ならびにＩｇＧ４のＦ２３５ＥまたはＬ２３４Ａ／Ｅ２３５Ａ突然変異などの、抗体の重鎖定
常領域で行われる突然変異を指す。
【００８９】
融合タンパク質は、ＤＮＡ組換えを介して２つの遺伝子によって共発現されるタンパク質産物である。組換えＩＬ−４Ｒ細胞外領域Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ−４Ｒの細胞外領域をヒト抗体のＦｃフラグメントとＤＮＡ組換えによって共発現させることにより得られる融合タンパク質である。ＩＬ−４Ｒの細胞外領域とは、細胞膜の外側で発現するＩＬ−４Ｒタンパク質の一部を指す。
【００９０】
抗体および抗原結合フラグメントを産生および精製するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，
Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  第５〜８章および第１５章に見出すことができる。例えば、マウスをヒトＩＬ−４Ｒまたはそのフラグメントで免疫化することができ、次いで、得られた抗体を、当技術分野で周知の従来の方法を使用して、再生、精製、および配列決定することができる。抗原結合フラグメントは、従来の方法によっても調製することができる。本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントは、１つ以上のヒトＦＲを非ヒトＣＤＲに付加するように遺伝子操作される。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、Ｗｅｂサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒを介してＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）から、またはＴｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ，  ２００１ＩＳＢＮ０１２４４１３５１から取得することができる。
【００９１】
操作された抗体または抗原結合フラグメントは、従来の方法を使用して調製および精製することができる。例えば、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、ＧＳ発現ベクターに組み込むことができる。次に、組換え免疫グロブリン発現ベクターをＣＨＯ細胞に安定的にトランスフェクトすることができる。本明細書のヒト化抗体の配列は、分子クローニング技術によって対応する発現ベクターに挿入され、対応するヒト化抗体は、ＨＥＫ２９３細胞発現系での発現によって得られる。当技術分野でより推奨される方法として、哺乳動物発現系は、典型的にはＦｃ領域の高度に保存されたＮ末端で、抗体のグリコシル化をもたらし得る。安定なクローンは、ヒト抗原に特異的に結合する抗体の発現を通じて取得され得る。陽性クローンは、バイオリアクターでの抗体産生のために無血清培地中で増殖され得る。抗体が分泌された培養培地は、従来の技術により回収および精製され得る。抗体は、一般的な技術を使用して濾過および濃縮に供することができる。可溶性混合物および多量体は、モレキュラーシーブまたはイオン交換などの一般的な技術によって効果的に除去することができる。得られた製品は、例えば−７０℃で直ちに凍結するか、凍結乾燥することができる。
【００９２】
抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり得、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、限定されないが、真核生物、原核生物またはファージクローン細胞株である単一の細胞株から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントは、例えば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術（例えば、ＣＤＲ移植）、または当技術分野で知られている他の技術によって得ることができる。
【００９３】
抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性の抗体であり得る。多重特異性抗体は、標的ペプチドの異なるエピトープに対して特異性を示すか、または複数の標的ペプチドに対して特異性を示す抗原結合ドメインを含み得る。ヒト抗ＩＬ−４Ｒ抗体は、別の機能性分子（別のペプチドまたはタンパク質など）に結合させることができるか、または別の機能性分子（別のペプチドまたはタンパク質など）と共発現させることができる。例えば、抗体またはそのフラグメントを、１つ以上の他の分子（例えば、別の抗体または抗原結合フラグメント）に機能的に（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合または他の手段によって）接続して、第二の結合特性を有する二重特異性抗体または多重特異性抗体を産生することができる。
【００９４】
「投与」、「投与すること」および「処置」は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器、または生体液に適用される場合、外因性の医薬品、治療薬、診断薬または組成物を、該動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器、または生体液と接触させることを指す。「投与」、「投与すること」および「処置」は、治療方法、薬物動態方法、診断方法、研究方法および実験方法などを指すことができる。細胞の処置は、試薬を細胞と接触させること、ならびに試薬を流体と接触させることを含み、ここで、前記流体は細胞と接触している。「投与」、「投与すること」および「処置」は、例えば試薬、診断、結合組成物を使用することによる、または別の細胞を使用することによる細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏでの処置も意味する。「処置」は、ヒト、獣医学的対象または研究対象に適用される場合、治療的処置、予防的措置（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅｓ）、研究、ならびに診断的応用を指す。
【００９５】
「処置する」とは、患者（または対象）への治療薬（本出願の抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかを含む組成物など）の内部または外部投与を意味し、ここで、該患者は、該治療薬が既知の治療活性を有する１つ以上の疾患症状を有するか、該治療薬が既知の治療活性を有する１つ以上の疾患症状を有すると疑われるか、または該治療薬が既知の治療活性を有する１つ以上の疾患症状にかかりやすい。典型的には、治療薬は、そのような症状の退行を誘発することによって、またはそのような症状の進行を任意の臨床的に測定可能な程度に阻害することによって、処置される患者（または対象）または集団における１つ以上の疾患症状を軽減するのに有効な量で投与される。任意の特定の疾患症状を緩和するのに有効な治療薬の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、患者（または対象）の病状、年齢および体重、ならびに患者（または対象）において所望の効果を引き出す薬剤の能力などの要因によって異なり得る。疾患の症状が緩和されたかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価するために医師または他の熟練した医療提供者によって通常使用される任意の臨床測定によって評価することができます。本出願の一実施形態（例えば、処置方法または製造品）は、各患者（または対象）における目的の疾患症状を軽減するのに効果的ではないかもしれないが、当技術分野で知られている任意の統計的検定（スチューデントのｔ検定、カイ２乗検定、マン・ホイットニーのＵ検定、クラスカル・ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール−タプストラ検定、およびウィルコクソン検定など）によって決定される統計的に有意な数の患者（または対象）における目的の標的疾患の症状を軽減するはずである。
【００９６】
「保存的改変（Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」または「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｒ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、タンパク質の生物学的活性を変えることなく該改変を頻繁に行うことができるように、タンパク質中のアミノ酸を同様の特性（電荷、側鎖のサイズ、疎水性／親水性、主鎖のコンフォメーションおよび剛性など）を示す他のアミノ酸で置換することを意味する。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は、生物学的活性を実質的に変化させないことを知っている（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７年）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，  Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ出版社，２２４頁（第４版）を参照）。さらに、同様の構造または機能を有するアミノ酸の置換が、生物学的活性を破壊する可能性は低い。
【００９７】
「有効量」とは、医学的状態の症状または徴候を改善または予防するのに十分な量を含む。有効量とは、診断を可能または容易にするのに十分な量も意味する。特定の対象または獣医学的対象についての有効量は、処置される状態、対象の一般的な健康状態、投与の経路および用量、ならびに副作用の重症度などの要因に応じて変化し得る。有効量は、重大な副作用または毒性作用を回避する最大用量または投与プロトコルであり得る。
【００９８】
「外因性」とは、文脈に応じて、生物、細胞、または人体の外部で産生される物質を指す。
【００９９】
「内因性」とは、文脈に応じて、細胞、生物、または人体の中で産生される物質を指す。
【０１００】
「相同性」または「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド間の配列類似性を指す。比較される２つの配列中のある位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々の中のある位置がアデニンによって占められている場合、それらの分子はこの位置で相同である。２つの配列間の同一性のパーセントは、２つの配列によって共有される一致した／相同な位置の数を比較される位置の数で割った後、×１００％を掛けた関数である。例えば、２つの配列中の１０個の位置のうち６個が、それらの配列を最適にアラインメントしたときに、一致または相同である場合、それらの２つの配列は６０％の同一性を共有する。一般に、比較は、最大の同一性パーセントを与えるように２つの配列がアラインメントされたときに行われる。本明細書で使用される場合、「少なくとも８５％の配列同一性」とは、バリアントが親配列に対して少なくとも８５％の相同性を有し、２つの配列が少なくとも８５％の相同性を共有することを意味する。いくつかの実施形態では、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有する；いくつかの特定の実施形態では、９０％、９５％または９９％以上の配列相同性を有する；他の特定の実施形態では、少なくとも９５％の配列相同性を有する。少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、親配列と比較した場合、１つ以上のアミノ酸欠失、挿入、または置換突然変異を含む。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という表現は交換可能に使用され、そのようなすべての呼称はその子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という用語は、継代数を考慮せずに、主要な対象細胞およびそれに由来する培養物を含む。意図的またはランダムな突然変異のために、すべての子孫がＤＮＡの内容において正確に同一ではない可能性があることも理解される。最初に形質転換された細胞と同じ機能または生物学的活性を有する、スクリーニングによって得られた突然変異体の子孫もまた企図される。
【０１０２】
「任意の」または「任意に」とは、続いて記載した出来事または状況が発生する可能性があるが、必ずしも発生するとは限らないことを意味する。そのような記載には、出来事または状況が発生する場合と発生しない場合が含まれる。例えば、「任意に１〜３個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列を有する該抗体重鎖可変領域が存在し得るが、必ずしも存在するとは限らないことを意味する。
【０１０３】
「医薬組成物」は、本明細書に記載の１つ以上の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはその生理学的／薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグの混合物を、他の化学成分、ならびに生理学的／薬学的に許容される担体および賦形剤などの追加の成分と共に含む組成物を指す。医薬組成物は、生物への投与を促進し、有効成分の吸収を促進し、それによって生物学的効果を発揮することを目的としている。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】皮膚炎マウスモデルにおいて、アセトンで感作した後、ヒト化抗体ｈｕ２５Ｇ７−Ａ、ｈｕ２５Ｇ７−Ｂおよび陽性参照抗体デュピルマブを週に２回皮下投与し、２７日目にマウスの耳の厚さを測定した。結果は、対照群と比較して、ｈｕ２５Ｇ７−Ａ、ｈｕ２５Ｇ７−Ｂおよびデュピルマブがマウスの耳の厚さを効果的に減少させることができ、ｈｕ２５Ｇ７−Ｂがデュピルマブよりも優れた効果を示すことを示している。
【実施例】
【０１０５】
以下、実施例を参照して本開示をさらに説明する。しかしながら、本開示の範囲はそれに限定されない。具体的な条件が記載されていない実施例では、実験は一般に、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒによるＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌに記載されている従来の条件下、または材料もしくは製品の製造業者によって提案された条件下で行われる。試薬の供給元が具体的に示されていない場合、その試薬は市販されている。
【０１０６】
（実施例１：マウスの免疫化および試験）
ｈｉｓタグ付きヒトＩＬ−４Ｒ（ｈ−ＩＬ−４Ｒ−ｈｉｓ）組換えタンパク質、ｈｉｓタグ付きマウスＩＬ−４Ｒ（ｍ−ＩＬ−４Ｒ−ｈｉｓ）組換えタンパク質、およびｈｉｓタグ付きアカゲザルＩＬ−４Ｒ（ｒｈｅｓｕｓ−ＩＬ−４Ｒ−ｈｉｓ）組換えタンパク質は、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって合成され、ＨＥＫ２９３で発現され、そして精製された。
【０１０７】
ヒトＦｃタグ付きのヒトＩＬ−４Ｒの組換えタンパク質（ｈ−ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ）は、自社で設計、発現および精製を行った。精製したタンパク質を、実施例における以下の各実験で使用した。
【０１０８】
この実施例における抗体または抗原結合フラグメントのＶＬおよびＶＨ領域中のＣＤＲアミノ酸残基の数および位置は、既知のＫａｂａｔナンバリングシステムに準拠している（ＬＣＤＲ１−３、ＨＣＤＲ２−３）か、ＫａｂａｔおよびＣＨＯＴＨＩＡ（ＡＢＭ）ナンバリングシステムに準拠している（ＨＣＤＲ１）。
【０１０９】
【表１】
2021533792.tif 000002
【０１１０】
抗ヒトＩＬ４Ｒモノクローナル抗体は、マウスを免疫化することによって産生された。実験には、６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（ＪＯＩＮＮ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｕｚｈｏｕ）Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ有限公司、動物生産ライセンス番号：２０１５０３０５２）を使用した。
【０１１１】
給餌環境：ＳＰＦレベル。購入後、マウスを実験室環境で１週間保管し、温度２０〜２５℃、湿度４０〜６０％で１２／１２時間の明／暗サイクルに順応させた。順応させたマウスを３つのケージに分け、各ケージに５匹ずつ入れた。免疫抗原は、Ｆｃタグ付きのヒトＩＬ−４Ｒ組換えタンパク質（ｈ−ＩＬ４Ｒ−Ｆｃ、濃度０．７３ｍｇ／ｍｌ）であった。抗原はフロイントアジュバント（ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｆ５８８１）で乳化した：最初の免疫化には完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号７７１４０）を使用し、残りの追加免疫化には核酸アジュバント（ＣｐＧ、Ｓｈａｎｇ
ｈａｉ  Ｓａｎｇｏｎ）とアルミニウムアジュバント（Ａｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号７７１６１）を使用した。
【０１１２】
０日目に、７０μｇ／マウスの乳化抗原を腹腔内（ＩＰ）注射した。１４、２８、４２、５６、７７日目に、背中の腫瘤と腹部膨満に応じて、抗原を背中と腹腔内に注射した（各注射０．１ｍｌ）。血液検査のために、２１、３５、４９、６３および８４日目に採血した。試験実施例１に従ってマウス血清に対してＥＬＩＳＡアッセイを実施して、マウス血清中の抗体力価を決定した。４回目の免疫化後、血清中の抗体力価が高く、該力価がプラトーに達する傾向のあるマウスを脾臓細胞融合用に選択した；融合の３日前に追加免疫化を行った：リン酸緩衝液を用いて調製した抗原溶液を１０μｇ／マウスで腹腔内注射した。最適化されたＰＥＧを介した融合ステップを使用して、脾臓リンパ球と骨髄腫細胞Ｓｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−８２８７（商標））を融合させてハイブリドーマを得た。
【０１１３】
（実施例２：ＥＬＩＳＡ試験と抗体のスクリーニング）
１．ＥＬＩＳＡ結合試験：
ＥＬＩＳＡ試験を使用してＩＬ−４Ｒ抗体の結合特性を検出した。ｈｉｓ標識ＩＬ−４Ｒ組換えタンパク質で直接コーティングされたマイクロタイタープレートを使用し、抗体を各ウェルに添加し、次に該抗体の抗原への結合活性を、二次抗体（ＨＲＰコンジュゲート抗一次抗体Ｆｃ）とＨＲＰ基質のＴＭＢとを添加することにより検出した。
【０１１４】
ヒトまたはアカゲザルのＩＬ−４Ｒ−ｈｉｓタンパク質を９６ウェルマイクロタイタープレートに、濃度０．５μｇ／ｍｌでウェルあたり１００μｌコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをウェルあたり２５０μｌの洗浄液で３回洗浄した。十分な洗浄を保証するために、各洗浄ステップは１０秒間振とうしながら行った。２００μｌ／ウェルのブロッキング溶液を加え、室温で２時間インキュベートした。プレートをウェルあたり２５０μｌの洗浄液で３回洗浄した。十分な洗浄を保証するために、各洗浄ステップは１０秒間振とうしながら行った。希釈剤で希釈した試験対象の抗ＩＬ−４Ｒ抗体１００μｌを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをウェルあたり２５０μｌの洗浄液で３回洗浄した。１００μｌのＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（希釈剤で１：２００００に希釈）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをウェルあたり２５０μｌの洗浄液で３回洗浄した。１００μｌのＴＭＢを各ウェルに加え、反応を暗所で１５分間維持した。０．１６Ｍ／Ｌの硫酸５０μｌを各ウェルに加えた。Ｔｈｅｒｍｏ  ＭｕｌｔｉＳｋａｎＦｃマイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍのＯＤ値を取得し、ＩＬ−４Ｒ抗体のＩＬ−４Ｒへの結合のＥＣ５０値を算出した。
【０１１５】
２．ＥＬＩＳＡ遮断試験：
この試験では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遮断実験により、選択された抗ヒトＩＬ−４Ｒ抗体によるヒトＩＬ−４ＲのヒトＩＬ−４への結合の遮断を検出した。具体的には、Ｆｃタグ付きＩＬ−４Ｒ組換えタンパク質を９６ウェルマイクロタイタープレートにコーティングし、ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体を加えてエピトープに完全に結合させた後、ＩＬ−４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号５７４００４）を添加し、ビオチンコンジュゲート抗ＩＬ−４抗体とニュートラアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３１００１）を使用して、ＩＬ−４がＩＬ−４Ｒに結合できるかどうかを検出し、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒ結合を遮断するＩＬ−４Ｒ抗体のＩＣ５０値を算出した。
【０１１６】
ヒトＩＬ−４Ｒ−Ｆｃタンパク質を９６ウェルマイクロタイタープレートに、濃度０．５μｇ／ｍｌでウェルあたり１００μｌコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをウェルあたり２５０μｌの洗浄液で３回洗浄した。十分な洗浄を保証するた
めに、各洗浄ステップは１０秒間振とうしながら行った。２００μｌ／ウェルのブロッキング溶液を加え、室温で２時間インキュベートした。プレートをウェルあたり２５０μｌの洗浄液で３回洗浄した。十分な洗浄を保証するために、各洗浄ステップは１０秒間振とうしながら行った。希釈剤で希釈した試験対象の抗ＩＬ−４Ｒ抗体１００μｌを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをウェルあたり２５０μｌの洗浄液で３回洗浄した。１００μｌの希釈されたＩＬ−４を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄液で３回洗浄した。１００μｌの希釈されたビオチンコンジュゲート抗ＩＬ−４抗体を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄液で３回洗浄した。ＨＲＰ標識ニュートラアビジン（希釈液で１：５０００に希釈）を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをウェルあたり２５０μｌの洗浄液で３回洗浄した。１００μｌのＴＭＢを各ウェルに加え、反応を暗所で１５分間維持した。０．１６Ｍ／Ｌの硫酸５０μｌを各ウェルに加えた。Ｔｈｅｒｍｏ  ＭｕｌｔｉＳｋａｎＦｃマイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍのＯＤ値を取得し、ＩＬ−４ＲのＩＬ−４への結合を遮断するＩＬ−４Ｒ抗体のＩＣ５０値を算出した。
【０１１７】
（実施例３：ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体のレポーター細胞活性実験）
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−４細胞はＩｎｖｉｖｏｇｅｎ（カタログ番号ｈｋｂ−ｓｔａｔ６）から購入した。該細胞は、ヒトＩＬ−４Ｒ遺伝子とＳＴＡＴ６を介したＳＥＡＰゲノムで安定的にトランスフェクトされた。上清に分泌されたＳＥＡＰは、ＳＥＡＰ基質のＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅによって検出され、ＩＬ−４Ｒシグナル伝達経路の活性化レベルを特性評価することができる。
【０１１８】
この実験では、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−４細胞の活性化を検出し、ＩＬ−４Ｒ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞活性をＩＣ５０に従って評価した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−４細胞を、１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ番号ａｎｔ−ｚｎ−０５）および１０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ番号ａｎｔ−ｂｌ−０５）を含有するＤＭＥＭ培地で培養した；細胞を１：５または１：１０の比率で週に２〜３回継代培養した。継代培養では、培地を除去し、細胞層を５ｍｌの０．２５％トリプシンで洗浄した後、トリプシンを除去し、細胞をインキュベーターに３〜５分間置き、そして新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁した。１００μＬの細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートに５×１０５細胞／ｍｌの密度で添加し、培地は１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌのゼオシンおよび３０μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含有するＤＭＥＭで、９６ウェルプレートの周りに１００μｌの滅菌水を加えた。培養プレートをインキュベーター内で２４時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。細胞が壁に付着したら、段階希釈した試験対象の抗体１００μｌを各ウェルに加えた。培養プレートをインキュベーター内で２０〜２４時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。２０μｌの細胞上清を各ウェルから新しい９６ウェル平底プレートに移し、１８０μｌのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ基質溶液を加え、そして培養プレートをインキュベーター内で暗所にて１〜３時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ
ＭｕｌｔｉＳｋａｎＦｃ）を使用して、６２０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１１９】
（実施例４：ヒトＩＬ−４Ｒに結合する抗体は、ＴＦ−１細胞の増殖を阻害する）
ＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２００３）は、ＩＬ−４Ｒを発現し、ＩＬ−４／ＩＬ−１３などのサイトカインに感受性のあるリンパ腫細胞である。ＩＬ−４は、ＧＭ−ＣＳＦの非存在下でＴＦ−１細胞を刺激して増殖させることができる。さまざまなＩＬ−４Ｒ抗体の中和活性を、中和抗体を添加してＩＬ−４の経路を遮断し、ＴＦ−１細胞の増殖を阻害することによって実験で比較した。ＴＦ−１細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号２１５−ＧＭ−０１０）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養した；細胞を１：１０の比率で週に２〜３回継代培養した。１００μＬの細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートに２×１０５細胞／ｍｌの密度で添加し、培地
は１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で、９６ウェルプレートの周りに１００μｌの滅菌水を加えた。段階希釈した試験対象の抗体５０μｌと最終濃度０．７ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号２０４−ＩＬ−０５０）５０μｌとを各ウェルに加え、培養プレートをインキュベーター内で７２時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。培養が終了したら、ＣＴＧキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７２）を使用して細胞増殖を検出した。
【０１２０】
（実施例５：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性および速度論的実験）
Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ装置を使用して、ヒトＩＬ−４Ｒに対するヒト化抗体のヒトＩＬ−４Ｒへの結合親和性を決定した。
【０１２１】
ヒト抗キャプチャーキット（カタログ番号ＢＲ−１００８−３９、ＧＥ）の説明書に記載されている方法に従って、ヒト抗キャプチャー抗体を、Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００、ＧＥ）のバイオセンシングチップＣＭ５に共有結合させ、それにより、試験対象の抗体の一定量が親和性によって捕捉された；ＩＬ−４Ｒ抗原（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入したＩＬ−４Ｒ抗原、カタログ番号ＩＬＲ−Ｈ５２２１）の一連の濃度勾配がチップの表面を流れ、Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００、ＧＥ）を使用して反応シグナルをリアルタイムで検出し、結合および解離曲線を取得した。各サイクルの解離が完了した後、バイオチップを洗浄し、ヒト抗キャプチャーキット内に提供された再生溶液で再生した。実験に使用したアミノカップリングキットはＧＥから購入し（カタログ番号ＢＲ−１０００−５０、ＧＥ）、緩衝液は、脱イオン水で１×（ｐＨ７．４）に希釈したＨＢＳ−ＥＰ＋１０×ｂｕｆｆｅｒ溶液（カタログ番号ＢＲ−１００６−６９、ＧＥ）であった。
【０１２２】
ＢｉａｃｏｒｅＸ１００評価ソフトウェア２．０  ＧＥを使用して、（１：１）結合モデルに実験から得られたデータをフィッティングし、親和性値を取得した。
【０１２３】
（実施例６：抗体の配列および調製）
上記の実施例２のＥＬＩＳＡ結合実験（ヒトＩＬ−４Ｒ−ｈｉｓのＥＬＩＳＡ結合）およびＥＬＩＳＡ遮断実験（ｈＩＬ−４／ＩＬ−４ＲのＥＬＩＳＡ遮断）、実施例３のＩＬ−４によって刺激されたＨＥＫ２９３−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−４細胞の活性化を阻害する試験、ならびに実施例４のＩＬ−４によって刺激されたＴＦ−１細胞の増殖を阻害する試験により、最高のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示す２つのモノクローナルハイブリドーマ細胞株を選択した。活性試験の結果を表２に示す。
【０１２４】
【表２】
2021533792.tif 000003
【０１２５】
最高のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を有するモノクローナルハイブリドーマ細胞株２５Ｇ７および７Ｂ１０を選択し、それらからモノクローナル抗体配列をクローニングした。ハイブリドーマから配列をクローニングするプロセスは次のとおりである。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を回収し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６−０１８）でＲＮＡを抽出し（キットの説明書に従って）、逆転写を行った（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素、タカラ、カタログ番号２６８０Ａ）。逆転写により得られたｃＤＮＡを、マウスＩｇ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＴＢ３２６  Ｒｅｖ．  Ｂ０５０３）を用いたＰＣＲにより増幅し、シーケンシング会社に送付してシーケンシングを行い、得られた抗体配列を解析した。
【０１２６】
マウスモノクローナル抗体２５Ｇ７の重鎖および軽鎖可変領域配列は次のとおりである：
【化１】
2021533792.tif 000004
【０１２７】
それらの中に含まれるＣＤＲ配列を表３に示す。
【０１２８】
【表３】
2021533792.tif 000005
【０１２９】
マウスモノクローナル抗体７Ｂ１０の重鎖および軽鎖可変領域配列は次のとおりである：
【化２】
2021533792.tif 000006
【０１３０】
それらの中に含まれるＣＤＲ配列を表４に示す。
【０１３１】
【表４】
2021533792.tif 000007
【０１３２】
得られた可変領域配列をヒト定常領域配列に連結して、ヒト−マウスキメラ抗体配列を得た。分子クローニング技術を使用して、キメラ抗体配列を対応する発現ベクターに挿入した。ＨＥＫ２９３細胞発現系を使用して、ヒト−マウスキメラ抗体２５Ｇ７−Ｃおよび７Ｂ１０−Ｃを取得することができる。
【０１３３】
実施例２〜５の方法に従って、精製されたキメラ抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性について試験した。データを表５に示す。結果は、抗体２５Ｇ７−Ｃについて、ＩＬ−４結合に対する遮断効果と細胞増殖に対する阻害効果の両方が、（ＷＨＯ医薬品情報、Ｖｏｌ．２６、Ｎｏ．４、２０１２年の合成に従って合成された）参照抗体デュピルマブよりも有意に優れていることを示した。
【０１３４】
【表５】
2021533792.tif 000008
【０１３５】
（実施例７：マウス抗体のヒト化実験）
得られたマウス抗体の中で最も強い機能的活性を示す２つの株（２５Ｇ７および７Ｂ１０）をヒト化した。得られたマウス抗体ＶＨ／ＶＬＣＤＲの典型的な構造に基づいて、重鎖、軽鎖可変領域配列を抗体生殖細胞系列データベースにアラインメントし、高い相同性を有するヒト生殖細胞系列テンプレートを得た。それらの中で、ヒト生殖細胞系列軽鎖フレームワーク領域は、ヒトカッパ軽鎖遺伝子、好ましくはヒト生殖細胞系列軽鎖テンプレートＩＧＫＶ３−１１＊０１（配列番号２２、抗体２５Ｇ７の場合、）およびＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０１（配列番号２４、抗体７Ｂ１０の場合、）に由来する。ヒト生殖細胞系列重鎖フレームワーク領域は、ヒト重鎖、好ましくはヒト生殖細胞系列重鎖テンプレートＩＧＨＶ３−４８＊０１（配列番号２１、抗体２５Ｇ７の場合、）およびＩＧＨＶ１−２＊０２（配列番号２３、抗体７Ｂ１０の場合）に由来する。
【０１３６】
ヒト生殖細胞系列テンプレート配列を以下に示す。
【化３】
2021533792.tif 000009
【０１３７】
マウス抗体のＣＤＲ領域を、選択されたヒト化テンプレートに移植して、ヒト化可変領域を置換し、その後、ＩｇＧ定常領域と再結合させた。次に、マウス抗体の三次元構造に基づいて、埋め込まれた（ｅｍｂｅｄｄｅｄ）残基、ＣＤＲ領域と直接相互作用する残基、およびＶＬとＶＨのコンフォメーションに重要な影響を与える残基を復帰変異させて、一連のヒト化分子を得た。
【０１３８】
それらの中で、Ｈｕ７Ｂ１０−ＶＨ−ａ、ｈｕ７Ｂ１０−ＶＨ−ｂ、およびｈｕ７Ｂ１０−ＶＨ−ｃは、製薬目的で改変され、重鎖ヒト生殖細胞系列テンプレートの最初の位置がＱからＥに変更された。ｈｕ２５Ｇ７も製薬目的で改変された。２つのヒト化抗体の重鎖可変領域配列は、それぞれ、配列番号２５〜２７および配列番号３１〜３３に示されるとおりである；軽鎖可変領域配列は、それぞれ、配列番号２８〜３０および配列番号３４〜３６に示されるとおりである。
【化４−１】
2021533792.tif 000010
【化４−２】
2021533792.tif 000011
【０１３９】
ハイブリドーマクローン２５Ｇ７についてのテンプレートの選択と復帰突然変異の設計を表６に示す。
【０１４０】
【表６】
2021533792.tif 000012
【０１４１】
ハイブリドーマクローン７Ｂ１０についてのテンプレートの選択と復帰突然変異の設計を以下の表７に示す：
【０１４２】
【表７】
2021533792.tif 000013
【０１４３】
上記の軽鎖および重鎖の組み合わせのスモールスケール発現試験と復帰突然変異の数の比較の後、最終的なヒト化抗体ｈｕ２５Ｇ７（ＶＨ−ｃ重鎖およびＶＬ−ａ軽鎖を有する）および抗体ｈｕ７Ｂ１０分子（ＶＨ−ｂ重鎖およびＶＬ−ｂ軽鎖を有する）が包括的に評価され、選択された；それらのそれぞれの完全な軽鎖配列および重鎖配列は、配列番号１７〜２０に示されるとおりである。
【化５】
2021533792.tif 000014
【０１４４】
ヒト化抗体の配列を分子クローニング技術によって対応する発現ベクターに挿入し、ＨＥＫ２９３細胞発現系での発現によって対応するヒト化抗体を得た。
【０１４５】
（実施例８：ヒト化抗体の活性データ）
ヒト化抗体ｈｕ２５Ｇ７およびｈｕ７Ｂ１０を実施例２〜５に記載されているようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験し、その試験結果を表８に示す。結果は、ｈｕ２５Ｇ７とｈｕ７Ｂ
１０の両方がヒトＩＬ−４Ｒにのみ結合し、アカゲザルＩＬ−４Ｒには結合しないことを示し、両方の抗体がアカゲザルＩＬ−４Ｒと相同ではないヒトＩＬ−４Ｒのエピトープに結合し、ヒトＩＬ−４Ｒに特異的に結合できることを示している。どちらの抗体もＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒ結合と細胞内シグナル伝達経路を遮断することができ、ＩＬ−４活性化効果を中和し、ＴＦ−１細胞の増殖を阻害する。ｈｕ２５Ｇ７の遮断および阻害活性は、参照抗体デュピルマブのそれよりも依然として有意に優れているが、親和性ＫＤ値は比較的低い。
【０１４６】
【表８】
2021533792.tif 000015
【０１４７】
（実施例９：ヒト化抗体ｈｕ２５Ｇ７の親和性成熟実験）
より効果的な抗ヒトＩＬ−４Ｒ抗体を得るために、２５Ｇ７抗体を酵母ディスプレイプラットフォーム技術による親和性成熟に供し、６つのＣＤＲを標的とする親和性成熟酵母ライブラリーをｈｕ２５Ｇ７抗体に基づいて設計および調製し、縮重プライマーを設計した。設計された変異アミノ酸は、ＰＣＲおよび相同組換えによってｈｕ２５Ｇ７−ｓｃＦｖ抗体ライブラリーに導入され；各ライブラリーのサイズは約１０９であった。構築された酵母ライブラリーは、ライブラリーの多様性を確認するために、第２世代のシーケンシング（ＧＥＮＥＷＩＺ）法によって検証された。
【０１４８】
ビオチン標識ヒトＩＬ−４Ｒを使用して、ｈｕ２５Ｇ７−ｓｃＦｖ酵母ライブラリーから高親和性抗体を選択した。２ラウンドのＭＡＣＳスクリーニング（ストレプトマイシン磁気ビーズ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２ラウンドのＦＡＣＳスクリーニング（ＢＤ
ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＦＵＳＩＯＮ）の後、酵母単一クローンがモノクローナル培養および発現誘導のために選択された。ＦＡＣＳ（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ）を使用して、単一酵母クローンのヒトＩＬ−４Ｒへの結合を検出し、野生型２５Ｇ７抗体よりも親和性の高い単一酵母クローンをシーケンシング検証用に選択した。シーケンシングクローンのアラインメントおよび分析の後、冗長配列を除去し、非冗長配列を哺乳動物細胞での発現のために全長のヒト抗体分子に変換した。アフィニティー精製後の全長抗体をＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｘ−１００（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して親和性について試験し、ヒトＩＬ−４Ｒに対してより高い親和性を有する候補抗体分子を以下のように選択した。これらの抗体分子のヒトＩＬ−４Ｒに対する親和性は、野生型ｈｕ２５Ｇ７抗体のそれよりも高く、ｈｕ２５Ｇ７−Ａ抗体分子の親和性はデュピルマブの親和性と同等であるが、ｈｕ２５Ｇ７−Ｂ分子の親和性はデュピルマブの親和性よりも大幅に優れている。
【０１４９】
親和性成熟後、抗体ｈｕ２５Ｇ７−Ａの軽鎖可変領域配列は次のとおりである：
【化６】
2021533792.tif 000016
【０１５０】
その中に含まれるＣＤＲ配列を表９に示す。
【０１５１】
【表９】
2021533792.tif 000017
【０１５２】
抗体ｈｕ２５Ｇ７−Ｂの軽鎖可変領域配列は次のとおりである：
【化７】
2021533792.tif 000018
【０１５３】
その中に含まれるＣＤＲ配列を表１０に示す。
【０１５４】
【表１０】
2021533792.tif 000019
【０１５５】
上記の軽鎖可変領域ｈｕ２５Ｇ７−Ａ  ＬＣＶＲをｈｕ２５Ｇ７軽鎖定常領域と再結合して、ｈｕ２５Ｇ７−Ａ抗体軽鎖を得た；上記の軽鎖可変領域ｈｕ２５Ｇ７−Ｂ  ＬＣＶＲをｈｕ２５Ｇ７軽鎖定常領域と再結合して、ｈｕ２５Ｇ７−Ｂ抗体軽鎖を得た。
【０１５６】
ｈｕ２５Ｇ７−ＶＨ−ｃ中の不安定なアミノ酸残基は、創薬可能性を高めるために最適
化され、重鎖可変領域ｈｕ２５Ｇ７−ＶＨが得られた：
【化８】
2021533792.tif 000020
【０１５７】
上記の重鎖可変領域は、ｈｕ２５Ｇ７重鎖定常領域と再結合させることができ、その結果、ｈｕ２５Ｇ７−Ａ／ｈｕ２５Ｇ７−Ｂ抗体重鎖が得られる。
【０１５８】
ｈｕ２５Ｇ７−Ａおよびｈｕ２５Ｇ７−Ｂの全長重鎖配列を配列番号４４に示す。
【化９】
2021533792.tif 000021
【０１５９】
全長軽鎖配列のそれぞれを配列番号４５〜４６に示す。
【化１０】
2021533792.tif 000022
【０１６０】
（実施例１０：ヒト化抗体の親和性成熟活性データ）
実施例３および実施例４に記載されるように、２つの抗体ｈｕ２５Ｇ７−Ａおよびｈｕ２５Ｇ７−Ｂを試験した；ｈｕ２５Ｇ７−Ａとｈｕ２５Ｇ７−Ｂの両方の抗体は、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒの結合、および細胞内シグナル伝達経路を遮断することができ、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の活性化効果の中和、およびＴＦ−１細胞の増殖の阻害をもたらす；活性データを表１１に示す。
【０１６１】
【表１１】
2021533792.tif 000023
【０１６２】
ＩＬ−１３刺激によるＴＦ−１細胞の増殖を阻害する実験では、ｈｕ２５Ｇ７−Ａとｈｕ２５Ｇ７−Ｂの両方が有益な効果を示した。効果を繰り返し検証した結果、同じ条件下で、ＴＦ−１細胞のＩＬ−１３刺激増殖に対するｈｕ２５Ｇ７−Ａの阻害（ＩＣ５０）値は１１．６８であり、ＴＦ−１細胞のＩＬ−１３刺激増殖に対する対照デュピルマブの阻害（ＩＣ５０）値は２２．８５であった。デュピルマブと比較した場合、ｈｕ２５Ｇ７は、ＩＬ−４、ＩＬ−１３のＩＬ−４Ｒへの結合、およびそのような結合によって引き起こされる細胞増殖を遮断する効果が大幅に向上している。
【０１６３】
（実施例１１：マウス皮膚炎に対するヒト化抗体の効果に関する研究）
マウス皮膚炎モデルを確立するために、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαトランスジェニックマウス（Ｃｙａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔａｉｃａｎｇ）有限公司から購入）を使用した。感作のために、１００μＬの１．５％ＯＸＺアセトンオリーブオイル溶液（アセトン：オリーブオイル＝４：１）を各マウスの腹部に約３ｃｍ×３ｃｍ以上で均等に塗布した。感作の日をＤ０（０日目）としてカウントした。７日目に、２０μＬの１％ＯＸＺアセトンオリーブオイル溶液をマウスの両耳（両側）に均等に塗布してチャレンジし、７２時間毎に１回チャレンジした。
【０１６４】
この実験では、（アセトンオリーブオイル溶液のみが感作およびチャレンジのために塗布された）正常対照群、モデル対照群、ｈｕ２５Ｇ７−Ａ、ｈｕ２５Ｇ７−Ｂおよびデュピルマブ群を含む合計５群を設定し、１群あたり３〜５匹のマウスを使用した。投与群に対する投与量は５０ｍｇ／ｋｇ、投与経路は週２回の皮下投与であった（詳細については表１２を参照）。２７日目に耳の厚さをノギスで測定し、その結果を図１２に示す。
【０１６５】
【表１２】
2021533792.tif 000024
【０１６６】
その結果、モデル対照群のマウスの耳は明らかな病理学的損傷を示し、耳の厚さは正常対照群の耳の厚さよりも有意に高かった。ｈｕ２５Ｇ７−Ａ、ｈｕ２５Ｇ７−Ｂおよびデュピルマブ群のマウスの耳の厚さは、２７日目に、モデル対照群のマウスの耳の厚さよりも有意に低かった。すなわち、ｈｕ２５Ｇ７−Ａ、ｈｕ２５Ｇ７−Ｂおよびデュピルマブは皮膚炎の処置に使用でき、ｈｕ２５Ｇ７−Ｂはデュピルマブよりも効果的である。
【図１】
2021533792.tif 000025
【国際調査報告】
2021533792.tif 000026
2021533792.tif 000027
2021533792.tif 000028
2021533792.tif 000029
2021533792.tif 000030
2021533792.tif 000031
2021533792.tif 000032
2021533792.tif 000033
2021533792.tif 000034
2021533792.tif 000035
2021533792.tif 000036