(57)【要約】特定の実施形態において、本発明は、試料における抗薬物抗体（ＡＤＡ）を検出する方法であって、ａ）高温で試料を前処理し、試料中のＡＤＡ：薬物免疫複合体を解離させること；ｂ）マトリックスにより試料からＡＤＡを単離すること；ｃ）バッファーを使用してマトリックスからＡＤＡを回収すること；およびｄ）細胞ベースのアッセイまたはインビトロアッセイにおいてＡＤＡを検出することを含む方法を提供する。
2021533366.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料における抗薬物抗体（ＡＤＡ）を検出する方法であって、
ａ）高温で試料を前処理し、試料中のＡＤＡ：薬物免疫複合体を解離させること；
ｂ）マトリックスにより試料からＡＤＡを単離すること；
ｃ）バッファーを使用してマトリックスからＡＤＡを回収すること；および
ｄ）細胞ベースのアッセイまたはインビトロアッセイにおいてＡＤＡを検出すること
を含む、方法。
【請求項２】
高温が、６０℃から６８℃の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
高温が、約６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、または６８℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
試料が、約３０分から２時間の期間、高温で前処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＡＤＡが、酸処理に感受性である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
薬物が、ＡＤＡより低い熱安定性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
薬物が、抗体またはそのフラグメント、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質、または小分子化合物から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
試料が、体液、粘液分泌物、唾液、血液、全血、血漿、および血清から選択される生物学的試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＡＤＡが、ビオチン化薬物、続いてストレプトアビジンでコーティングされたマトリックスと接触することにより試料から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＤＡが、薬物と結合したマトリックスにより試料から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
マトリックスが、磁気ビーズである、請求項９−１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
回収されたＡＤＡが、細胞ベースのアッセイにおいて検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ｉ）薬物の存在下で、回収されたＡＤＡを細胞に加えること；およびｉｉ）細胞に対する薬物の活性の低下を測定することによりＡＤＡを検出することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
回収されたＡＤＡが、インビトロアッセイにおいて検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ｉ）回収されたＡＤＡを、検出可能な標識で標識された薬物と接触させること；およびｉｉ）検出可能な標識を測定することによりＡＤＡを検出することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
検出可能な標識が、放射性同位体、酵素、蛍光標識、化学発光標識、および電気化学発光標識から選択される標識、並びに酵素検出反応のための基質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
薬物が、ドメイン抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
薬物が、ペグ化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
薬物が、ルリズマブである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
高温が、約６２℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
試料が、血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
試料が、薬物で処理された対象からのものである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への参照
この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１８年８月３日に出願された米国仮出願第６２／７１４，１８３号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的治療薬は外来抗原であり、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成をもたらす免疫応答を潜在的に誘導でき、これは次に幅広い副作用を引き起こす可能性がある。中和抗体（ＮＡｂ）は、治療薬の薬理学的活性領域に結合してその臨床効果を阻害または完全に中和することができるＡＤＡのサブセットに属する。細胞ベースの機能的ＮＡｂアッセイは、その中和活性を特徴付けるために好ましい。しかしながら、細胞ベースのＮＡｂアッセイは、しばしば、薬物干渉、並びに成長因子および疾患関連サイトカインを含むがこれらに限定されない多数の血清因子からの干渉に対して脆弱である。酸解離によるビーズ抽出（Bead Extraction with Acid Dissociation)（ＢＥＡＤ）は、循環薬物および／または他の干渉因子をヒト血清試料から除去し、それによりＡＤＡ／ＮＡｂを濃縮するためにうまく適用されている。しかしながら、抽出手順において使用される過酷な(harsh)酸は、ＮＡｂの不可逆的な変性を引き起こし、過小評価されたＮＡｂ測定値をもたらす可能性がある。したがって、中和抗薬物抗体を検出するための新規な方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００３】
特定の実施形態において、本発明は、試料における抗薬物抗体（ＡＤＡ）を検出する方法を提供する。かかる方法は、ａ）高温で試料を前処理し、試料中のＡＤＡ：薬物免疫複合体を解離させること；ｂ）マトリックスにより試料からＡＤＡを単離すること；ｃ）バッファーを使用してマトリックスからＡＤＡを回収すること；およびｄ）細胞ベースのアッセイまたはインビトロアッセイにおいてＡＤＡを検出することを含む。所望により、高温は６０℃から６８℃の間である（例えば、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、または約６８℃である）。所望により、試料は、約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０分などの約３０分から約２時間（例えば、約３０−６０分）の期間、高温で前処理される。
【０００４】
特定の特異的な実施形態において、ＡＤＡは酸処理に感受性である。特定の特異的な実施形態において、薬物はＡＤＡより低い熱安定性を有する。
【０００５】
所望により、薬物は、抗体またはそのフラグメント、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質、または小分子化合物から選択される。所望により、試料は、体液、粘液分泌物、唾液、血液、全血、血漿、および血清から選択される生物学的試料である。所望により、試料は、薬物で処理された対象からのものである。
【０００６】
特定の特異的な実施形態において、ＡＤＡは、ビオチン化薬物、続いてストレプトアビジンでコーティングされたマトリックスと接触することにより試料から単離される。あるいは、ＡＤＡは、薬物と結合したマトリックスにより試料から単離される。例えば、マトリックスは磁気ビーズである。
【０００７】
特定の特異的な実施形態において、回収されたＡＤＡは、細胞ベースのアッセイにおいて検出される。例えば、かかるアッセイは、ｉ）薬物の存在下で、回収されたＡＤＡを細胞に加えること；およびｉｉ）細胞に対する薬物の活性の低下を測定することによりＡＤＡを検出することを含む。
【０００８】
特定の特異的な実施形態において、回収されたＡＤＡは、インビトロアッセイにおいて検出される。例えば、かかるアッセイは、ｉ）回収されたＡＤＡを、検出可能な標識で標識された薬物と接触させること；およびｉｉ）検出可能な標識を測定することによりＡＤＡを検出することを含む。説明のために、検出可能な標識は、放射性同位体、酵素、蛍光標識、化学発光標識、および電気化学発光標識から選択される標識、並びに酵素検出反応のための基質である。
【０００９】
特定の特異的な実施形態において、薬物は、ドメイン抗体などの抗体フラグメントである。特定の特異的な実施形態において、薬物は、ペグ化されている。
【００１０】
特定の特異的な実施形態において、薬物はルリズマブ（すなわち、ペグ化された抗ＣＤ２８ドメイン抗体）である。例えば、この薬物は約６２℃の高温で前処理される。例えば、ＡＤＡは血清試料において検出される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１．ルリズマブは、連続培養からの細胞または解凍したばかりの細胞のいずれかを用いたＪｕｒｋａｔ．ＣＡおよびＲａｊｉデュアル細胞バイオアッセイにおいて、Ｔ細胞活性化およびＩＬ−２駆動ルシフェラーゼレポーター製造を用量依存的に阻害した。Ａ）．連続培養からの細胞。異なる色の線は、ウェルごとの異なる細胞数を示す（単位：×１０３）。Ｂ）．解凍した凍結細胞（ｆｚ）は、連続培養からの新鮮な細胞（ｆｓ）と比較して優れた性能を示した。曲線は、デュプリケートウェルからＳｏｆｔｍａｘを用いて生成された。
【図２】図２．Ａ）．ＮＡｂ  ＰＣは、ルリズマブにより阻害されたＩＬ−２製造をレスキューした。赤：２．２２のＥＣ５０を有するウサギポリクローナルＡｂ；青：１．４５のＥＣ５０を有するマウスｍＡｂクローン１３Ｈ４。Ｂ）．異なる量のルリズマブの存在下でのＮＡｂ  ＰＣ曲線（マウスｍＡｂクローン１３Ｈ４）。（青、赤および緑の線は、それぞれ０．５３、０．９６および１．０９のＥＣ５０を有する０．２、０．２５および０．３μｇ／ｍＬのルリズマブを表す）。
【図３】図３．１０の個々のＳＬＥ血清は、アッセイ培地において１０倍に希釈され、次いで細胞アッセイに加えられた。エラーバーは、重複(duplication)ウェルからの標準偏差を表す。
【図４】図４．ルリズマブおよび抗ルリズマブＮＡｂ  ＰＣの熱安定性。Ａ）.異なるタンパク質の融解温度を比較するために、ＵＮｃｌｅプラットフォームで測定された示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）。オレンジ色の縦棒は６２℃を示す。Ｂ）.ルリズマブ；Ｃ）.抗ルリズマブＮＡｂ  ＰＣは、異なる温度で３０分間加熱され、冷却され、次いで細胞ベースのアッセイに加えられた。ＮＡｂ活性は、０．２５μｇ／ｍＬ薬物の存在下でテストされた。生の値は、０μｇ／ｍＬ群に正規化され、相対活性が示された。本明細書ではウサギｐＡｂのみが示されるが、ｍＡｂクローン１３Ｈ４は同様の結果を有した。Ｄ）.ＮＡｂ  ＰＣのｐＨ安定性。ウサギｐＡｂまたはマウスｍＡｂクローン１３Ｈ４  ＮＡｂ  ＰＣは、異なるｐＨで６０分間処理され、中和され、次いで細胞アッセイに加えられた。生の値は、ｐＨ７．０群に正規化され、相対活性が示された。
【図５】図５．アッセイ感度の決定。ＮＡｂ  ＰＣは、プールされた正常なヒト血清中にスパイクされ、ＢＥＨＤ抽出され、細胞ベースのアッセイにおいて分析された。エラーバーは、６セットのデータからの標準偏差を示す。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、試料からＡＤＡを定性的および／または定量的に検出するための新規なアプローチに関する。
【００１３】
特定の実施形態において、本発明は、試料における抗薬物抗体（ＡＤＡ）を検出する方法を提供する。かかる方法は、ａ）高温で試料を前処理し、試料中のＡＤＡ：薬物免疫複合体を解離させること；ｂ）マトリックスにより試料からＡＤＡを単離すること；ｃ）バッファーを使用してマトリックスからＡＤＡを回収すること；およびｄ）細胞ベースのアッセイまたはインビトロアッセイにおいてＡＤＡを検出することを含む。所望により、高温は６０℃から６８℃の間である（例えば、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、または約６８℃）。所望により、試料は、約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０分などの約３０分から約２時間（例えば、約３０−６０分）の期間、高温で前処理される。
【００１４】
特定の特異的な実施形態において、ＡＤＡは、酸処理に感受性である。特定の特異的な実施形態において、薬物は、ＡＤＡより低い熱安定性を有する。所望により、薬物は、抗体またはそのフラグメント、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質、または小分子化合物から選択される。所望により、試料は、体液、粘液分泌物、唾液、血液、全血、血漿、および血清から選択される生物学的試料である。所望により、試料は、薬物で処理された対象からのものである。
【００１５】
特定の特異的な実施形態において、ＡＤＡは、ビオチン化薬物、続いてストレプトアビジンでコーティングされたマトリックスと接触することにより試料から単離される。あるいは、ＡＤＡは、薬物と結合したマトリックスにより試料から単離される。例えば、マトリックスは磁気ビーズである。
【００１６】
特定の特異的な実施形態において、回収されたＡＤＡは、細胞ベースのアッセイにおいて検出される。例えば、かかるアッセイは、ｉ）薬物の存在下で、回収されたＡＤＡを細胞に加えること；およびｉｉ）細胞に対する薬物の活性の低下を測定することによりＡＤＡを検出することを含む。
【００１７】
特定の特異的な実施形態において、回収されたＡＤＡは、インビトロアッセイにおいて検出される。例えば、かかるアッセイは、ｉ）回収されたＡＤＡを、検出可能な標識で標識された薬物と接触させること；およびｉｉ）検出可能な標識を測定することによりＡＤＡを検出することを含む。説明のために、検出可能な標識は、放射性同位体、酵素、蛍光標識、化学発光標識、および電気化学発光標識から選択される標識、並びに酵素検出反応のための基質である。
【００１８】
特定の特異的な実施形態において、薬物は、ドメイン抗体などの抗体フラグメントである。特定の特異的な実施形態において、薬物は、ペグ化されている。
【００１９】
特定の特異的な実施形態において、薬物はルリズマブ（すなわち、ペグ化抗ＣＤ２８ドメイン抗体；ＢＭＳ−９３１６９９とも呼ばれる）である。例えば、この薬物は、約６２℃の高温で前処理される。例えば、ＡＤＡは、血清試料において検出される。
【００２０】
本発明がより容易に理解されてもよいように、特定の語は最初に定義される。追加の定義は、詳細な説明を通して記載される。
【００２１】
「抗薬物抗体」または「ＡＤＡ」は、薬物の任意の領域に特異的に結合する抗体である。例えば、抗薬物抗体は、薬物抗体の任意の領域、例えば、抗体の可変ドメイン、定常ドメイン、または糖構造に対して向けられてもよい抗体またはそのフラグメントであってもよい。かかる抗薬物抗体は、患者の免疫原性反応として薬物療法中に発生してもよい。ＡＤＡは、任意のヒト免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ）またはＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、２、３、および４）の１つであってもよい。ＡＤＡは、例えばヒトまたは非ヒト動物（例えば、獣(veterinary））供給源を含む、任意の動物供給源からのＡＤＡを含む。
【００２２】
本明細書の目的のために、「Ｎａｂ」または「中和抗体」なる語は、治療薬物の薬理学的活性領域に結合してその臨床効果を阻害または完全に中和することができるＡＤＡのサブセットを指す。
【００２３】
本発明の文脈において、「患者」なる語は、疾患を有するかまたは疾患を有する疑いのある任意の対象、好ましくは哺乳動物、およびより好ましくはヒトを指す。本明細書で使用される場合、「対象」なる語は、任意の動物（例えば、ヒトまたは非ヒト動物対象）を指す。場合により、対象は哺乳動物である。場合により、本明細書で使用される場合、「対象」なる語は、ヒト（例えば、男性、女性、または子供）を指す。場合により、本明細書で使用される場合、「対象」なる語は、動物モデル研究の実験動物を指す。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「生物学的試料」または「試料」なる語は、患者由来の免疫グロブリンを含み、したがって免疫グロブリン試料と呼ばれてもよい患者から得られたかまたは患者に由来する試料を指す。一例として、生物学的試料は、体液、血液、全血、血漿、血清、粘液分泌物、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、眼液（例えば、硝子体液、房水）、リンパ液、リンパ節組織、脾臓組織、骨髄、およびこれらの組織の1つまたは複数に由来する免疫グロブリンに富む画分からなる群から選択される材料を含む。いくつかの実施形態において、試料は、血清であるか、または血清を含むか、または血清または血液に由来する免疫グロブリンに富む画分である。試料は、体液または体組織であるか、またはそれらに由来する（それらから得られる）ことができる。いくつかの実施形態において、試料は、同じ薬物に繰り返し曝露されるなど、薬物に曝露されている対象から得られる。他の実施形態において、試料は、最近薬物に曝露されていない対象から得られるか、または薬物の計画された投与の前に対象から得られる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、ルリズマブは、自己免疫および炎症性疾患（例えば、全身性ループス紅斑症）の皮下（ＳＣ）処置のために開発されている、４０ｋＤａ分岐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でフォーマットされた抗ヒトＣＤ２８受容体アンタゴニストＶｋドメイン抗体（ｄＡｂ）である。例えば、ルリズマブは、米国特許第８，１６８，７５９号、第８，４５４，９５９号、および第９，０８５，６２９号において参照されている。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８活性」は、ＣＤ８０、ＣＤ８６および／または別のリガンドのＣＤ２８への結合に関わるかまたはその結果として生じる活性であり、ＣＤ２８媒介細胞シグナル伝達の活性化を含むが、これに限定されない。ＣＤ２８活性は、Ｔ細胞増殖の誘導およびＴ細胞によるサイトカイン分泌、例えばインターロイキン２（ＩＬ−２）の誘導も含む。
【００２７】
「ドメイン抗体」は、抗体の重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）いずれかの免疫グロブリン可変ドメインに特徴的な配列を含み、抗原に特異的に結合する折りたたまれたポリペプチドドメインを意味する。したがって、「ドメイン抗体」は、完全な抗体可変ドメイン、並びに、例えば１つまたは複数のループが抗体可変ドメインに特徴的でない配列により置き換えられている改変可変ドメイン、または短縮されているかまたはＮまたはＣ末端伸長を含む抗体可変ドメイン、並びに可変ドメインの折りたたまれたフラグメントおよび完全長ドメインの標的抗原特異性を含む。「ｄＡｂ」は、本明細書では「ドメイン抗体」と互換的に使用される。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「標識された」なる語により修飾される物質(entity)（例えば、抗体、抗薬物抗体、薬物、タンパク質、酵素、抗体、抗体フラグメント、複数ドメイン生物治療薬（例えば、抗体薬物コンジュゲート）、または関連種）は、実験的に検出可能な別の分子または化学物質（例えば、「検出可能な標識」）とコンジュゲートしている任意の物質を含む。標識された物質についての標識として適切な化学種は、酵素、蛍光色素；量子ドット；光学色素；発光色素；および放射性核種を含むが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明は、さらなる限定として解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに説明される。この出願を通して引用された全ての図および全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
実施例１
１．導入
生物学的治療薬、または生物治療薬は、多くの病状の処置に承認されている。従来の小分子に勝る多くの利点にも関わらず、生物治療薬は、典型的に免疫原性と呼ばれるそれ自体に対する免疫応答を誘導する可能性を有する（１）。免疫原性は人体の自然な防御機構であり、通常は保護的である。適応免疫応答の一部として、宿主が感染性病原体、腫瘍抗原またはワクチンなどの外因性タンパク質または変化した自己抗原に遭遇すると、体はこれらの外来／変化した自己タンパク質に対する抗体を開発してもよい。しかしながら、生物治療薬の場合、一般に抗薬物抗体（ＡＤＡ）と呼ばれるこれらの薬物特異的抗体は、局所的なインフュージョンリアクションから生命を脅かす過敏症および赤芽球癆、ＰＲＣＡなどのより深刻な有害事象に至るまで幅広い安全関連の事象を誘導することができる（２、３）。さらに、ＡＤＡは、低下した薬効をもたらすことができる（４−６）。
【００３１】
ＡＤＡにより誘導される低下した薬効は、加速した薬物クリアランス、またはＡＤＡ、中和ＡＤＡまたはＮＡｂの特別な亜集団いずれかによるものであり、これは、立体障害により薬物が標的に結合するのを防ぐかまたは結合時に下流のシグナル伝達を阻害するかのいずれかにより、治療効果を低下させる。現在、ＡＤＡの中和能の特徴付けのために可能な限り機能的な細胞ベースのＮＡｂアッセイを実施することが、保健当局により推奨される（７）。従来の細胞ベースの機能的ＮＡｂアッセイにおいて、システム薬物として指定された一定量の薬物が対照として細胞に加えられ；ＮＡｂの存在による統計的に有意な任意のシグナル変化は、試料中の中和活性の存在を意味する。処理からの循環薬物の存在下で、試料中の薬物に対するＮＡｂのモル比によっては、ＮＡｂは、薬物と複合体を形成し、バイオアッセイにおいてシステム薬物に結合するためにもはや入手可能でなくてもよく；このことは、低下したまたは偽陰性のＮＡｂ検出をもたらす。患者試料中の高レベルのｍＡｂ治療薬は、機能的な細胞ベースのＮＡｂバイオアッセイにとって特に問題がある（８）。
【００３２】
さらに、臨床血清試料は、しばしば細胞に直接影響し、ＮＡｂの存在に関わらず機能アッセイの読み取りに影響を与えてもよいマトリックス成分（成長因子、サイトカインなど）を含有してもよい。機能的バイオアッセイの読み出しにおける干渉因子からの小さな摂動(perturbation）は許容可能であってもよいが、対象ごとの時間的変動は、ＮＡｂの存在について試料を正確に特徴付けることを不可能にしてもよい。
【００３３】
酸解離によるビーズ抽出（ＢＥＡＤ）試料前処理手順は、酸を使用して薬物／ＡＤＡ免疫複合体を解離し、続いて過剰なビオチン化薬物を加えてＡＤＡ結合について競合することにより、薬物およびマトリックス干渉の両方を処理するように変更および最適化されている。次いで、ビオチン化薬物／ＡＤＡ複合体は、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズにより捕捉され、一方で血清因子および薬物は洗浄により除去される（９）。複数のプロジェクトにうまく適用されている（１０）が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコンジュゲートされた生物治療薬は、ルリズマブの場合のように、この酸解離ベースの抽出と互換性がなくてもよい。ルリズマブは、４０キロダルトン（ｋＤａ）分岐ＰＥＧでフォーマットされた分化２８（ＣＤ２８）受容体アンタゴニスト免疫グロブリン軽鎖可変領域（Ｖκ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）の抗ヒトクラスターである。あるいは、薬物／ＡＤＡ免疫複合体を破壊しただけでなく、ドメインＡｂ薬物を選択的に変性させた試料を６２℃で加熱することにより、ドメインＡｂのより低い熱安定性を利用した。薬物／ＡＤＡ複合体を破壊するための最初の工程として、ＢＥＡＤ方法において酸が使用され；中和時に、過剰な循環薬物は、ＡＤＡ結合についてビオチン薬物と競合し、このことは該薬物を打ち負かすためにはるかに高い量のビオチン薬物を必要とする。したがって、６２℃でのドメインＡｂ薬物の不可逆的変性は、はるかに少ないビオチン薬物が必要とされるため、酸ベースのＢＥＡＤ方法より優れている。さらに、酸処理の最初の工程を排除するための過酷な酸の代わりの熱の使用は、酸に感受性なＮＡｂ種を保存してもよい。
【００３４】
２．材料および方法
２．１．試薬
ＲＰＭＩ−１６４０、熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｇ４１８、ＨＥＰＥＳおよびピルビン酸ナトリウムを、Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（グランドアイランド、ＮＹ）から購入した。ＮｅｏＬｉｔｅ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（ウォルサム、ＭＡ）から購入し、Ｈｉ−Ｓｕｒ  Ｍａｇ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｂｅａｄを、ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ（サンディエゴ、ＣＡ）から購入した。プールされたヒト血清、個々の正常なヒト血清、および個々の罹患ループスヒト血清を、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ（ヒクスビル、ＮＹ）から購入した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞およびＲａｊｉ  Ｂ細胞株をＡＴＣＣから元は得て、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞をさらに改変し、ＩＬ−２駆動ルシフェラーゼを安定して発現するＪｕｒｋａｔ．ＣＡ細胞を生成した。中和陽性対照は、医薬品に対する独自のモノクローナルマウスアフィニティー精製抗体である。
【００３５】
２．２．細胞培養
ＩＬ−２駆動ルシフェラーゼを発現する安定的にトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ．ＣＡ）およびＲａｊｉ細胞を、ベントキャップ細胞培養フラスコ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、フランクリンレイクス、ＮＪ）中で３７℃、５％ＣＯ２および９５％相対湿度（ＲＨ）で増殖させた。増殖培地は、両方の細胞について１０％熱不活化ＦＢＳを有するＲＰＭＩ  １６４０であった。Ｊｕｒｋａｔ．ＣＡ細胞株増殖培地は、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８、ＨＥＰＥＳおよびピルビン酸ナトリウムも含有した。両方の細胞株についての低温培地は、１０％ＤＭＳＯを補足した純粋なＦＢＳであった。解凍時、細胞を１回洗浄し、バイオアッセイ培地（１０％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地）中に再懸濁し、バイオアッセイにおいて直接使用した。
【００３６】
２．３ビーズ抽出および酸解離（ＢＥＡＤ）手順のためのテスト対照の調製
異なる濃度のＮＡｂ  ＰＣを、５μｇ／ｍｌの医薬品ありまたはなしで、プールされたまたは個々の健康なヒト血清中にスパイクし、室温で４時間回転させてインキュベートし、免疫複合体を形成させた。異なる濃度の医薬品も、同じ方法でヒト血清中にスパイクし、調製した。次いで、試料を分注し、使用するまで−７０℃で凍結した。
【００３７】
２．４．ビーズ抽出および酸解離（ＢＥＡＤ）およびビーズ抽出および加熱解離（ＢＥＨＤ）手順
以前に公開された酸解離による固相またはビーズ抽出（ＢＥＡＤ）手順を採用して、わずかに変更してＡＤＡを抽出した（９）。簡単に説明すると、上記で調製した１００μＬのヒト血清試料および対照試料を、最初に等量の４００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０と混合し、室温（ＲＴ）で６０分間、シェーカー（Ｌａｂｎｅｔ  Ｏｒｂｉｔ  Ｐ４、ウッドブリッジ、ＮＪ）で１２００ｒｐｍでインキュベートした。次いで、各試料を、５０μｇ／ｍＬビオチン化薬物を含有する２８μＬの１．８Ｍ  Ｔｒｉｚｍａ  Ｂａｓｅ（ｐＨ８．８）で中和し、シェーカーで９０分間１２００ｒｐｍでインキュベートした。あるいは、１００μＬの対照および試料を、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ  Ｄｅｅｐウェル９６ウェルポリプロピレンプレートに加え、プレートシーラーで覆い、６２℃に設定され４００ｒｐｍで振とうするＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ中で４０−６０分間インキュベートした。ディープウェルプレートを〜１５分間冷却した後、２８μＬのビオチン化薬物（ＤＰＢＳ中の１％ＢＳＡで希釈した５０μｇ／ｍＬ）を加え、次いで試料プレートを、１０００ｒｐｍで振とうしながら２−８℃で一晩インキュベートした。次いで、医薬品から解離され、酸または加熱処理のいずれかからのビオチン薬物に結合したＡＤＡを、２５０μｇのストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ（１０ｍｇ／ｍＬで加え、１０００−１２００ｒｐｍで振とうしながらＲＴで６０分間インキュベートした２５μＬ）上に固定した。次いで、ビーズ複合体を、磁気プレートにより捕捉し、６００μＬのＰＢＳＴで２回洗浄し、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ  Ｆｌｅｘ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ）を使用して６０μＬの２ｘＲＰＭＩ−１６４０、ｐＨ２．３で溶出した。５０μＬの最終溶出溶液を、２２μＬの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．２を含有する新しい９６ウェルポリプロピレンプレートに移した。
【００３８】
２．５．中和活性を検出するためのバイオアッセイ
ＩＬ−２−ルシフェラーゼバイオアッセイを使用して、試料中の抗治療タンパク質中和抗体の不在、存在、または相対レベルを評価した。簡単に説明すると、セクション２．４からの３０μＬの中和されたＢＥＡＤ溶出液を、１５μＬの２５０ｎｇ／ｍＬのシステム薬物とともに、９６ウェルハーフエリア白色プレート中でＲＴで２０−４０分間インキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ．ＣＡ細胞を解凍、洗浄し、バイオアッセイ培地（ＲＰＭＩ  １６４０中の１０％ＦＢＳ）中で最終濃度３．０ｘ１０６細胞／ｍＬに再懸濁し、１５μＬをプレートに加え、ＲＴでさらに２０分間インキュベートした。最後の工程で、Ｒａｊｉ細胞を解凍、洗浄し、２．５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３Ａｂを含有するバイオアッセイ培地中で最終濃度１．５ｘ１０６細胞／ｍＬに再懸濁し、これの１５μＬをプレートに加え、混合し、次いで３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度に設定されたインキュベーターに４時間移した。インキュベーション後、７５μＬのＮｅｏｌｉｔｅ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ溶液を各ウェルに加え、混合し、５００ｒｐｍで振とうしながら暗所ＲＴインキュベーター中に入れ、遠心分離し、次いでデフォルト９６ウェル発光プロトコルを有するＥｎＳｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ウォルサム、ＭＡ）プレートリーダーを使用して読み取った。
【００３９】
２．６．タンパク質熱安定性についてのＤＳＦ
同時静的光散乱による示差走査蛍光測定を、ＵＮｃｌｅプラットフォーム（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）で実行した。簡単に説明すると、精製タンパク質試料をＤＰＢＳバッファー、ｐＨ７．２（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）中で１ｍｇ／ｍＬに希釈し、それぞれの９μＬをマイクロキュベットアレイ中に３重にロードした。試料凝集の程度を、分析開始前にオンライン動的光散乱により決定した。温度により誘導されるタンパク質アンフォールディングを、各工程で３０秒の温度安定化を伴う１℃の工程勾配を使用して、２０℃から８５℃までの加熱による固有蛍光の変化を測定することにより決定した。Ｔｍ（融解温度に対応するアンフォールディング曲線の中点）を、摂氏温度の関数として、ナノメートルの重心蛍光を使用して、ＵＮｃｌｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにおいて計算した。実験の過程の間、凝集体形成について検出および制御するために、２６６ｎｍおよび４７３ｎｍでの同時静的光散乱を記録した。
【００４０】
２．７統計的方法
２．７．１対照精度評価
分散分析（ＡＮＯＶＡ）モデルの文脈における分散成分法を使用して、対照試料について精度の推定値を計算した（１１）。ＡＮＯＶＡモデルは、日内に(within day）分析者、アッセイ日およびアッセイプレートについての要素を含んだ。分析者間、日間、プレート間およびプレート内の分散の推定値を、ＡＮＯＶＡモデルにおいて算出し、それぞれを標準偏差（ＳＤ）として表し、次いで変動係数（ＣＶ［％］＝１００＊ＳＤ／平均）として表した。総標準偏差（Ｔｏｔａｌ  ＳＤ）を、これらの分散推定値の合計の平方根として算出した。総ＣＶ（％）（１００＊Ｔｏｔａｌ  ＳＤ／平均）を使用してプレート許容(acceptance)を設定した。
【００４１】
２．７．２カットポイント評価
各ループス患者試料を、３人の分析者により２回、６つの異なる機会にアッセイした。ＮＡｂアッセイカットポイントを、公開された方法を使用して計算した（１２）。日に渡るＲＬＵのプレート間の変動を補正するために、患者試料ＲＬＵとプレートＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮｅｇＣ）ＲＬＵ（それぞれについての平均デュプリケート）の比を算出した。カットポイント評価のために比を使用したため、同じプレートからの患者試料ＲＬＵとＮｅｇＣ  ＲＬＵの間の相関を計算し、データをプロットした。正の相関は、比計算方法の使用を支持する。
【００４２】
ＮＡｂアッセイカットポイントを計算するために、試料比の分布の正規性を評価した。外れ値を、各患者試料についての個々の比に基づいて評価した。値が分布の２５パーセンタイルから四分位範囲の３倍を引いた値を下回った場合、または分布の７５パーセンタイルに四分位範囲の３倍を加えた値を超えた場合、値を外れ値と見なした。
【００４３】
外れ値の除外および正規性への対数変換の後、ＮＡｂアッセイカットポイントを、比についての片側パラメトリック９９％間隔の下限として計算した。使用した方程式の形式は次のとおりである。
【化１】
2021533366.tif 000003
【００４４】
該式において、「ＭｅａｎＲａｔｉｏ」は、外れ値の除外の後の対数比の平均であり；「ｚ」は、正規曲線下の下１％テール領域に対応する正規分布からの「ｚスコア」の値であり（２．３３）；「ＴｏｔａｌＳＤＲａｔｉｏ」は、外れ値の除外の後の比の対数についての総標準偏差の推定値である。「ＥＸＰ」は式の真数である。
【００４５】
３．結果
３．１．細胞アッセイにおけるＩＬ−２製造の治療誘導阻害
ルリズマブは、４０ｋＤａの分岐ＰＥＧでフォーマットされた抗ヒトＣＤ２８拮抗免疫グロブリン軽鎖可変領域（Ｖκ）ｄＡｂである。それは、Ｔ細胞活性化の強力な阻害剤であり、インビトロアゴニスト、共刺激、および架橋実験により決定される純粋なアンタゴニストである（１３−１５）。図１Ａに示すように、連続培養からのＪｕｒｋａｔ．ＣＡ細胞は、アゴニスト抗ＣＤ３ＡｂおよびＲａｊｉ  Ｂ細胞（ＣＤ８０／ＣＤ８６を提供してＪｕｒｋａｔ．ＣＡ細胞上のＣＤ２８に関与させる）により活性化されると、高レベルのＩＬ−２プロモーター駆動ルシフェラーゼレポーターを製造した。ルリズマブは、Ｔ細胞活性化およびルシフェラーゼレポーター製造を用量依存的に阻害した（図１Ａ）。
【００４６】
下流の試料テストを容易にするために、凍結細胞を解凍し、すぐにアッセイにおいて使用して、凍結細胞をすぐに播種できる試薬として使用できるかどうかを見、このことは、凍結細胞が回復して継続的な細胞培養の維持を開始するためのおよそ３−７日の待ち時間についての必要性を排除した。連続培養からの細胞と比較して、解凍したばかりの細胞においてはるかに高い生シグナルを見出した（図１Ｂ）。異なる数および比のＪｕｒｋａｔ．ＣＡ細胞およびＲａｊｉ細胞は、各曲線のＥＣ５０により示されるように、異なる生シグナル、応答ウィンドウ、並びに感受性を示した。必要とされる生シグナルおよび総細胞数のバランスのためのさらなるアッセイ開発および最適化のために、ウェルあたり４５，０００個のＪｕｒｋａｔ．ＣＡ細胞および２２,５００個のＲａｊｉ細胞を選択した（図１Ｂおよび表１）。
【表１】
2021533366.tif 000004
【００４７】
３．２．ルリズマブに対する中和ＡｂはＩＬ−２製造をレスキューした
潜在的なＮＡｂ陽性対照（ＰＣ）のパネルを細胞アッセイにおいてスクリーニングし、最も強力なクローンを選択した。図２Ａに示すように、ウサギポリクローナル抗体（ｐＡｂ）ＰＣおよびマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＰＣ両方が、０．４μｇ／ｍＬのルリズマブ（すなわち、細胞アッセイにおける薬物の最終濃度であるシステム薬物）の存在下で用量依存的にルシフェラーゼレポーターの発現をレスキューした。最も感度の高いＮＡｂアッセイを行うには、良好なシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）および低い変動係数（ＣＶ）をなお維持しながら、システムの薬物レベルを可能な限り低くする必要がある。予想通り、薬物濃度が高いほど、ＮＡｂ  ＰＣの不在下でのルシフェラーゼレポーターのシグナルは低くなる（図２Ｂおよび表９）。０．３μｇ／ｍＬのシステム薬物はＮＡｂ曲線全体で最高のＳ／Ｎを示したが、ＮＡｂアッセイの感度が決定されたＮＡｂ曲線の下端に注意を払う必要がある。したがって、０．２５μｇ／ｍＬのシステム薬物を、さらなるアッセイの最適化のために選択し；このシステム薬物レベルでは、０．１２５、０．２５および０．５μｇ／ｍＬのＮＡｂは一貫して他の２つの薬物濃度より高いＳ／Ｎを有した（表２）。
【表２】
2021533366.tif 000005
【００４８】
３．３ＢＥＡＤ処理によるルリズマブの存在下でのＮＡｂの低い回収
ルリズマブは、自己免疫疾患および炎症性疾患の処置のために開発されており、患者は循環中に高い量の炎症性サイトカインをしばしば発現する（１４）。図３に示すように、１０の個々の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）血清を、アッセイ培地中に１０倍に希釈し、細胞ベースのアッセイに加えると、１つの試料（Ｓ８）は５０％を超える増加を有し、４つの試料（Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５＆Ｓ９）は、培地のみの対照試料と比較して、ルシフェラーゼ生シグナルの５０％を超える阻害を有した。このことは、１０倍希釈はＳＬＥ血清中の全ての干渉因子を希釈するのに十分ではないことを示唆する。しかしながら、試料中のＮＡｂも希釈されるため、さらなる希釈はＮＡｂアッセイの低下した感度をもたらす。例えば、アッセイが２０倍希釈を必要とし、かつアッセイが希釈後に０．５μｇ／ｍＬ  ＮＡｂしか検出できない場合、ＮＡｂアッセイの感度は純粋なテスト血清において１０μｇ／ｍＬと高くなる可能性が潜在的にある。臨床試料において予想されるルリズマブレベルは５μｇ／ｍＬと高く、これは試料を希釈して抽出せずにアッセイに加えた場合、１５μｇ／ｍＬ未満のＮＡｂは検出されなくてもよいことを意味する（ルリズマブの分子量は約５０ＫＤａであり、１５μｇ／ｍＬのＮＡｂは全て、５μｇ／ｍＬのルリズマブと１：１のモル比で免疫複合体を形成し、アッセイにおいてシステム薬物に結合できなくなる）。酸解離によるビーズ抽出（ＢＥＡＤ）を最初にテストして、ＮＡｂ  ＰＣが酸処理、続いてビオチン化薬物／ビーズ複合体に結合させること、およびストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズから溶出されることにより試料中の薬物から解離できるかどうかを見た。この抽出は、試料中の過剰な量の薬物だけでなく、アッセイに干渉する可能性のあるマトリックス因子も除去する。ＢＥＡＤは複数の細胞ベースの機能的ＮＡｂアッセイにうまく適用されているが、ＢＥＡＤ処理後のＮＡｂ活性は、ルリズマブＮＡｂアッセイについて不十分であった。相対ＮＡｂ活性の任意カットポイントを１．３に設定すると、５μｇ／ｍＬの薬物の存在下でのＮＡｂ検出の感度は８μｇ／ｍＬあたりになる（表２およびデータは示さず）。クローン１３Ｈ４が酸安定性であること、およびビオチン薬物の増加した量、ストレプトアビジン磁性ビーズの増加した量、並びにさまざまなｐＨでの酸処理の可変の長さなど抽出の各重要な工程の最適化を確認した後、何も改善を達成しなかった（データは示さず）。ルリズマブは小さな１２ｋＤａのタンパク質骨格を有するが、それは５００ｋＤａのタンパク質のものと同等の巨大なスペースを占める４０ｋＤａの分岐ＰＥＧ部分を有する。低ｐＨ下で分岐ＰＥＧ部分が、ＮＡｂおよびビオチン化ルリズマブタンパク質の相互作用を（例えば立体障害により）防ぎ、最終的にＮＡｂの低い回収をもたらしてもよいとの仮説を立てた。
【００４９】
３．４ルリズマブおよび陽性対照の熱安定性
非ペグ化ルリズマブは、１５０ｋＤａのＮＡｂ  ＰＣと比較してわずか１２ｋＤａと非常に小さい。このことにより、加熱時にルリズマブが選択的かつ不可逆的に変性され、ビオチン化非ペグ化薬物により抽出されるべきインタクトなＮＡｂが残ってもよいかどうかを調べた。最初に、ペグ化または非ペグ化いずれかのルリズマブ、並びにＵＮｃｌｅプラットフォームで示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）を使用してＰＢＳで調製された抗ルリズマブＮＡｂ  ＰＣのパネルの熱安定性を比較した。図４Ａ＆表３に示すように、ＰＥＧ部分を有するまたは有しないルリズマブははるかに低い融解温度を有し、そのためそれらのほとんどは６２℃ですでに変性した一方、ｐＡｂおよびｍＡｂ両方を含む全てのＮＡｂ  ＰＣはこの温度下で変性し始めているのみであった。
【表３】
2021533366.tif 000006
【００５０】
ルリズマブおよびＮＡｂ  ＰＣの異なる熱安定性をさらに確認するために、ウサギｐＡｂ＃１およびクローン１３Ｈ４を異なる温度で５０−６０分間加熱し、次いで細胞ベースのアッセイに加えて残りの活性をテストした。６２℃下で加熱された薬物について、特に薬物濃度が低い場合（０．５μｇ／ｍＬあたり以下）に有意な活性が失われたが、テストされた全てのＮＡｂ  ＰＣは、テストされた全ての温度下でその活性を維持した（図４Ｂおよび４Ｃ）。これらの結果は、６２℃下で、テストした全てのＮＡｂ  ＰＣが活性なままである一方でほとんどの薬物が不可逆的に変性したことを示唆する。興味深いことに、ＮＡｂ  ＰＣのｐＨ安定性をテストした場合、マウスｍＡｂクローン１３Ｈ４は、ＢＥＡＤの最初の酸処理に使用されたのと同じｐＨであるｐＨ２．１に対する耐性を示した一方、ウサギｐＡｂは、ｐＨ２．１処理後にほぼ６０％の活性を失った（図４Ｄ）。他のプロジェクトにおいて、ポリクローナルＮＡｂ  ＰＣについての同様の不十分なｐＨ安定性を観察した（データは示さず）。同じウサギｐＡｂが６２℃で加熱された場合にほとんど全ての活性を維持したという事実は、加熱がｐＨ感受性ＡＤＡ／ＮＡｂ解離についての潜在的な代替手段である可能性があることを示唆した。
【００５１】
３．５．酸処理の代わりの加熱が抗ルリズマブＮＡｂ回収を増加させた
薬物とＮＡｂ  ＰＣの間の有意差を示す有望な熱安定性データを用いて、ＢＥＡＤ抽出における酸解離の効果のない最初の工程の代わりとして６２℃での加熱を評価した。血清中の異なる濃度のウサギｐＡｂまたはマウスｍＡｂクローン１３Ｈ４を、５μｇ／ｍＬルリズマブありまたはなしでＲＴで少なくとも４時間インキュベートして、免疫複合体の形成を確実にした。次いで、試料を予熱した６２℃のヒートブロック中でインキュベートし、３０分間カバーし；または４００ｍＭグリシン、ｐＨ２．０で６０分間処理した。次いで、ｐＨ８．８である１％ＢＳＡを含むＰＢＳまたは１．８Ｍ  Ｔｒｉｓのいずれかで調製したルリズマブのビオチン化タンパク質骨格（５０μｇ／ｍＬ）２８μＬを、それぞれ冷却プレートまたは酸処理プレートに加えた。４℃で一晩インキュベートした後、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを加えて、ビオチン−薬物／ＮＡｂ複合体をプルダウンした。ビーズ洗浄後、ＮＡｂをビーズから酸溶出し、中和し、最後に細胞ベースのアッセイに加えた。表４に示すように、薬物／ＮＡｂ免疫複合体を解離するための加熱は、酸解離よりはるかに優れたＮＡｂ回収を有し、この新しい手順を、ビーズ抽出および加熱解離（Ｂｅａｄ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅａｔｉｎｇ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＢＥＨＤ）と呼ぶ。ウサギｐＡｂ  ＰＣについて、加熱は、薬物群ありまたはなしの両方において、４μｇ／ｍＬ  ＮＡｂで１．５を超える相対ＮＡｂ活性を達成したが；酸処理群において、１６μｇ／ｍＬのＮＡｂのみが１．５を超える相対ＮＡｂ活性を達成した。同様に、４μｇ／ｍＬのクローン１３Ｈ４は、加熱により処理した場合に１．６を超える相対ＮＡｂ活性を達成したが、同じレベルの１．６を超える相対ＮＡｂ活性は、酸処理群において８−１６μｇ／ｍＬでのみ発生した。
【表４】
2021533366.tif 000007
【００５２】
３．６．アッセイ検証
最適化された細胞アッセイおよびＢＥＨＤ抽出を用いて、アッセイを次のパラメーターを用いて検証した：カットポイント、精度、感度、薬物干渉、選択性および安定性。
【００５３】
３．６．１カットポイント
カットポイントを、５０の研究中の処置歴のないＳＬＥ患者の血清試料を使用して評価した。各試料を、２日間にわたって３人の分析者により２つのプレート上でデュプリケートで分析した。ＳＬＥ患者試料に加えて、各プレートは対照試料を含有した。陽性対照クローン１３Ｈ４（ＰＣ）を、抗ルリズマブＮＡｂを健康なドナーからのプールされた血清中にスパイクすることにより調製した。ＬＰＣは、血清中の３μｇ／ｍＬ（ＬＰＣ−１）または２．５μｇ／ｍＬ（ＬＰＣ−２）の低陽性対照中和抗体であった。該方法はＢＥＨＤ抽出の前処理を有するため、ＬＰＣ−１およびＬＰＣ−２も、ＬＰＣ抽出対照（ＬＰＣ−ＥＸＣ）として５μｇ／ｍＬルリズマブの存在下で調製し、各分析においてＢＥＨＤ抽出をモニターした。ＨＰＣは、１０μｇ／ｍＬの高陽性対照中和抗体であった。ＮｅｇＣは、ＰＣを有さない健康なドナーからの同じプール血清である。ＰＣおよびＮｅｇＣ試料を、各プレート上でそれぞれ２および３セットのデュプリケートとして分析した。各プレートについての許容基準は、変動係数、各ＰＣの３０．０％以下のＣＶ（％）として設定された。さらに、ＮｅｇＣの平均生相対発光単位（ＲＬＵ）値は、ＬＰＣ、ＬＰＣ−ＥＸＣ、およびＨＰＣの値より低い必要がある。６個のＰＣ（ＨＰＣ、ＬＰＣ、およびＬＰＣ−ＥＸＣ）の少なくとも４個および各レベルで少なくとも１個は、プレート許容を満たす必要がある。３個のＮｅｇＣデュプリケートの少なくとも２個は、％ＣＶ基準を満たす必要がある。
【００５４】
ＮｅｇＣを、対照および患者試料と同じように処理した。プレートに渡るＲＬＵの可能性のある変動を説明するために、ＳＬＥ患者試料カットポイントを、試料ＲＬＵとプレートＮｅｇＣ  ＲＬＵの比（比＝ＲＬＵ／ＮｅｇＣ  ＲＬＵ）を使用して計算した。プレートに渡るＳＬＥ試料ＲＬＵ対ＮｅｇＣ  ＲＬＵの間の強い相関関係を観察し（ピアソン「ｒ」＝０．９６）、これはプレート間のＲＬＵの変動を補正するためのＮｅｇＣ  ＲＬＵの使用を支持する。
【００５５】
正規性仮定を、シャピロ−ウィルク検定により確認した。外れ値の除去の後、試料ＲＬＵ／ＮｅｇＣ  ＲＬＵの比に基づくＮＡｂアッセイカットポイントを、１．６１と決定した（９９％信頼レベル、表５）。１．６１以上の平均ＲＬＵ／ＮｅｇＣ  ＲＬＵ値を生成する試料を、中和性であると見なす。
【表５】
2021533366.tif 000008
【００５６】
３．６．２．精度
精度評価（ＣＶ［％］）を、ＰＣ比（ＰＣ／ＮｅｇＣ  ＲＬＵ比）についての全ての１２回の分析に渡って実行した。表６を参照のこと。分析を、セクション２．７．１で説明されるように、各対象試料およびドナー試料について別々に実行した。総精度を含む全ての精度の推定値は、全ての対照試料に渡って１８．４％（％ＣＶ）以内であった。ＨＰＣ／ＮｅｇＣのみがカットポイント１．６１より高い片側９９％予測区間の下限を有するため、ＨＰＣ／ＮｅｇＣについての許容基準は１．９４以上であるが、他の全てのＰＣはカットポイント(cup point)１．６１以上である。
【表６】
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【００５７】
３．６．３選択性
選択性を、２０の個々のＳＬＥヒト血清研究試料を用いて評価した。試料を、スパイクせずにおよびＬＰＣレベルの抗ルリズマブ（３μｇ／ｍＬ）でスパイクして分析した。スパイクされていない試料の７５％が陰性で、ＬＰＣでスパイクされた試料の１００％が陽性であった（表７）。
【表７】
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【００５８】
３．６．４選択性
アッセイ感度を、アフィニティー精製されたマウス抗ルリズマブＮＡｂ  ＰＣがカットポイント１．６１以上で一貫して結果を製造する最低濃度として定義する。ＰＣ抗体を、プールされた正常なヒト血清中に４０、２０、１０、４、２、１および０．５μｇ／ｍＬでスパイクした。カットポイント評価中に、３人の分析者が２日間で合計６個の曲線を分析した。これら全ての分析において陽性と確実にテストされたＰＣの最低濃度は、２．０μｇ／ｍＬであることが見出された。全ての６つの曲線を４パラメーターロジスティック（４ＰＬ）関数を用いて分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍａソフトウェアを使用して１．６１で補間した。中央値(media value)は１．３１であるため、アッセイの推定感度は１．３１μｇ／ｍＬに設定される（図５）。
【００５９】
３．６．５薬物干渉
３μｇ／ｍＬのＬＰＣ−１およびＮｅｇＣを、１０、５、２．５および１μｇ／ｍＬのルリズマブでスパイクして、アッセイの薬物耐性を推定した。ルリズマブでスパイクしたＬＰＣは、テストした最高濃度（１０μｇ／ｍＬ）で陽性反応を製造することができ、ルリズマブでスパイクした全てのＮｅｇＣ試料は陰性（非中和）結果を製造したため、アッセイはＬＰＣ−１レベルの１０μｇ／ｍＬを超える薬物に耐えることができる（表８）。
【表８】
2021533366.tif 000011
【００６０】
３．６．６ＮＡｂ  ＰＣの安定性
ヒト血清中の抗ルリズマブＮＡｂ  ＰＣの室温および凍結融解安定性を、ＨＰＣ、ＬＰＣ−１およびＬＰＣ−１−ＥＸＣレベルを使用して評価した。各対照レベルの３つのアリコートを、周囲室温に２４時間さらすかまたは１０回の凍結融解サイクルにかけた。試料をアッセイし、カットポイントに関して分類した。全ての試料は、ＮＡｂ  ＰＣが周囲室温で２４時間、または最大１０回の凍結融解サイクルで安定していることを確認する各条件でスクリーニング基準を満たした（表９）。
【表９】
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【００６１】
４．ディスカッション
細胞ベースの機能的ＮＡｂアッセイについて、特にｍＡｂ生物療法についての主な課題の１つは、細胞ベースのアッセイにおいてＮＡｂの検出にしばしば干渉する、患者のテスト試料中に存在する高い量の薬物である（１６、１７）。
【００６２】
典型的なＡＤＡアッセイにおいて、ビオチンコンジュゲート薬物およびＨＲＰまたはルテニウム標識薬物をテスト試料に加えて、試料中のＡＤＡについての循環薬物と競合させる。十分なＡＤＡが標識薬物と複合体を形成できる限り、試料は架橋アッセイにおいてＡＤＡ陽性としてテストされる。言い換えれば、過剰な標識薬物の存在下で、平衡をシフトして、ＡＤＡ循環薬物複合体よりＡＤＡ標識薬物複合体形成を優先することが可能である（１８）。しかしながら、細胞ベースのＮＡｂアッセイにおいて、細胞は、試料中の薬物対ビオチン化薬物などの加えられた薬物を区別できない：存在する全ての薬物が、細胞に直接または間接的に影響を与えることができる。したがって、薬物レベルがＮＡｂに対して１：１のモル比を超える場合、細胞ベースのアッセイに加える前に過剰な薬物を除去しない限り、ＮＡｂは検出されない。免疫原性テストのための高い量の薬物を除去するための最初の成功した方法は、ＳＰＥＡＤ、酸解離による固相抽出(Solid Phase Extraction with Acid Dissociation)である：薬物／ＡＤＡ免疫複合体を含有する試料を、最初にビオチン化薬物と一晩インキュベートして、ビオチン−薬物／ＡＤＡ複合体を形成させ；次いで、これらの複合体を、高結合のストレプトアビジンでコーティングされたプレートにより捕捉する。洗浄後、ＡＤＡを、酸を使用してビオチン薬物から溶出する（１９）。この元のＳＰＥＡＤ方法に対する２つの制限がある：１）一部のＡＤＡ／ＮＡｂ  ＰＣは非常に低いオフレートとともに高い親和性を有し、そのため一晩のインキュベーションはビオチン−薬物／ＡＤＡ複合体に有利な新しい平衡を形成するのに十分でない。２）さらに、高結合のプレートは制限された結合能力を有し、これは加えるべきビオチン化薬物の量を制限し；テスト試料中の薬物が高すぎる場合、加えられたビオチン化薬物の限られた量が、小さいパーセンテージのＡＤＡ／ＮＡｂを回収することしかできず、このことは低い薬物耐性および低いＮＡｂ検出をもたらす。これらの理由から、ＢＥＡＤは、ＳＰＥＡＤから進化した。酸解離工程を加えて酸を用いない一晩のインキュベーションを置き換え、より多くのビオチン薬物を加えられるようにストレプトアビジンでコーティングされた結合表面がはるかに多い磁気ビーズを使用してプレートを置き換え、このことはＡＤＡ／ＮＡｂ結合についてのより効率的な競合をもたらした（１０）。
【００６３】
ＢＥＡＤ方法は複数のＮＡｂアッセイにうまく適用されているが、最近、テストした１５個のＮＡｂ  ＰＣのパネルの４０％もが酸に不安定であり、過酷な酸処理に耐えることができず、このことが低いＮＡｂ回収をもたらすことを見出した（データは準備中）。このことは、実際のテスト試料中のＮＡｂ種の少なくとも一部も酸に感受性である可能性があり、ＢＥＡＤ抽出後に検出されなくてもよいことを意味する。
【００６４】
本原稿において、ＰＥＧ化ドメインＡｂなどの生物治療薬の新しい様式がＢＥＡＤ抽出と互換性がなくてもよいことを、さらに実証する。本ケーススタディにおいて、完全な１５０ｋＤａのＮＡｂと比較して、ルリズマブの低い融解温度を利用した。６２℃の加熱工程は、ＮＡｂ／薬物複合体を解離してＢＥＡＤの過酷な酸処理に置き換わるだけでなく、テスト試料中の薬物の大部分を不可逆的に変性させ、このことは非ペグ化ビオチン−ルリズマブにより抽出されるべきインタクトなＮＡｂを残す。試料中の低下した量の機能性薬物は、ＡＤＡ／ビオチン化薬物複合体への平衡を促進し、このことは抽出されたＡＤＡの増加した収量をもたらすため、薬物の不可逆的な変性が望まれる。特に、不十分な低いｐＨ安定性を有するウサギｐＡｂ  ＮＡｂ  ＰＣは、６２℃での加熱に耐え、このことは加熱がｐＨ感受性ＡＤＡ／ＮＡｂ解離の潜在的な代替手段である可能性があることを示唆する。
【００６５】
優れた正確さ、精度および感度によりアッセイを検証することができた。ＢＥＨＤと名付けた加熱解離方法による同じビーズ抽出は、完全なヒトＡｂより十分に低い融解温度を有する任意の他の生物治療薬に適用される可能性がある。知る限り、これは、免疫原性テストにおいてＡＤＡ／ＮＡｂの抽出を容易にするために熱を使用した最初の報告である。
【００６６】
５．参照
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【００６７】
等価物
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するかまたは確認することができる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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