(57)【要約】  本発明は、ツムスタチンの検出を用途としたアッセイに関するほか、肺癌、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、ならびに慢性腎臓病（ＣＫＤ）、例えば糖尿病、ループス腎炎（ＬＮ）および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に起因するＣＫＤを評価する際の、本アッセイの使用に関する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の生体液試料中のＮ末端アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）を有するペプチドを定量化するためのイムノアッセイ法であって、前記患者の生体液試料を、前記Ｎ末端アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）に対し特異的に反応するモノクローナル抗体に接触させることと、前記モノクローナル抗体と前記Ｎ末端アミノ酸配列との間の結合量を算定することと、を含む、イムノアッセイ法。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを、特異的に認識することもないし、また結合することもない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者の生体液試料が、血液、尿、滑液、血清または血漿である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
患者における肺癌の検出を用途とした、イムノアッセイ法であって、患者の生体液試料をＮ末端アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）に対し特異的に反応するモノクローナル抗体に接触させることと、前記モノクローナル抗体と前記Ｎ末端アミノ酸配列含有ペプチドとの間の結合量を算定することと、前記結合量を、ｉ）正常な健常被験対象に関連する値および／またはｉｉ）既知の肺癌の重篤度に関連する値および／またはｉｉｉ）以前の時点で前記患者から得られた値、および／またはｉｖ）所定のカットオフ値と相関させることと、を含む、イムノアッセイ法。
【請求項５】
前記肺癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記所定のカットオフ値が少なくとも２．００ｎｇ／ｍＬである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを特異的に認識することもないし、また結合することもない、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記患者の生体液試料が、血液、尿、滑液、血清または血漿である、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
患者における慢性腎臓病（ＣＫＤ）の検出を用途とした、イムノアッセイ法であって、患者の生体液試料をＮ末端アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）に対し特異的に反応するモノクローナル抗体に接触させることと、前記モノクローナル抗体と前記Ｎ末端アミノ酸配列含有ペプチドとの間の結合量を算定することと、前記結合量を、正常な健常被験対象に関連する値および／または既知のＣＫＤの重篤度に関連する値および／または以前の時点で前記患者から得られた値、および／または所定のカットオフ値と相関させることと、を含む、イムノアッセイ法。
【請求項１０】
前記慢性腎臓病が、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎または糖尿病に起因する慢性腎臓病である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記モノクローナル抗体が、前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを特異的に認識することもないし、また結合することもない、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記患者の生体液試料が、血液、尿、滑液、血清または血漿である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
患者における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）またはループス腎炎（ＬＮ）の検出を用途とした、イムノアッセイ法であって、患者の生体液試料をＮ末端アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）に対し特異的に反応するモノクローナル抗体に接触させることと、前記モノクローナル抗体と前記Ｎ末端アミノ酸配列含有ペプチドとの間の結合量を算定することと、前記結合量を、正常な健常被験対象に関連する値および／または既知のＳＬＥもしくはＬＮの重篤度に関連する値および／または以前の時点で前記患者から得られた値、および／または所定のカットオフ値と相関させることと、を含む、イムノアッセイ法。
【請求項１４】
前記モノクローナル抗体が、前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを、特異的に認識することもないし、また結合することもない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者の生体液試料が、血液、尿、滑液、血清または血漿である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｎ末端アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）に対し特異的に反応する、モノクローナル抗体。
【請求項１７】
前記モノクローナル抗体が、前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを特異的に認識することもないし、また結合することもない、請求項１６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
アッセイキットであって、Ｎ末端アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）に対し特異的に反応するモノクローナル抗体と、少なくとも以下：
−  ストレプトアビジン被覆ウェルプレート、
−  ビオチン化ペプチドＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ−Ｌ−ビオチン（配列番号：６）（配列中：Ｌは任意選択的なリンカーである）、
−  サンドイッチイムノアッセイにおいて使用される二次抗体、
−  配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）を含むキャリブレーターペプチド、
−  抗体ビオチン化キット
−  抗体ＨＲＰ標識キット
−  抗体放射性標識キット
−  アッセイ可視化キット、のいずれか１つと、を具備する、アッセイキット。
【請求項１９】
前記モノクローナル抗体が、前記アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）を有する合成ペプチドに対して惹起される、請求項１８に記載のアッセイキット。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体が、前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを特異的に認識することもないし、また結合することもない、請求項１８または１９に記載のアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ツムスタチンの検出を用途としたアッセイに関するほか、肺癌、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、ならびに慢性腎臓病（ＣＫＤ）、例えば糖尿病、ループス腎炎（ＬＮ）および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に起因するＣＫＤを評価する際の、本アッセイの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
基底膜（ＢＭ）は、上皮細胞および内皮細胞の足場として機能し、且つ組織間のバリアとして作用する、特殊な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）である（１、２）。主要なＢＭタンパク質を２つ挙げるとすれば、それらはＩＶ型コラーゲンおよびラミニンである。これら両方のＢＭタンパク質は、一緒になって、ニドゲンおよびヘパリン硫酸プロテオグリカンを介して一体的に連結された別個のネットワークを形成する（２〜５）。ＩＶ型コラーゲンには、６つの異なるα鎖（α１〜６）があり、哺乳類のＢＭで発現するヘテロ三量体を形成する（６）。ＩＶ型コラーゲンのα３鎖（ＣＯＬ４α３）は、ＢＭ全体に分布が制限されているものと報告されてきた。このα３鎖は、通例、肺と腎臓に見られる（７）。ＣＯＬ４α３の構造的役割は、アルポート症候群、グッドパスチャー症候群、および肺と腎臓のＢＭを標的としたいくつかの自己免疫疾患の臨床症状により、例証される。これらの疾患は、ＢＭの漏出を引き起こす突然変異または免疫攻撃のいずれかによるＣＯＬ４α３に対する損傷を特徴とする（８〜１１）。ＢＭは、細胞浸潤のバリアとして機能する。ＢＭの破れおよびＢＭの完全性喪失は、浸潤性癌の表現型と関連している（１２）。それゆえ、したがって、ＢＭの破れおよび崩壊に関連する、癌バイオマーカーが必要とされている。
【０００３】
ツムスタチン（ＴＵＭ）は、αｖβ３インテグリンを介して内皮細胞に結合する、ＣＯＬ４α３の２８ｋＤａ断片である（１３）。これは、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）によって生成されるマトリカインであり、病的理学な血管新生および腫瘍の増殖を抑えることが公知である（１３〜１５）。ＣＯＬ４α３からツムスタチンを開裂させて、ツムスタチンが保護マトリカインとして機能できるようにするうえで必要とされるのが、ＭＭＰ−９である。ＭＭＰ−９の欠如は、ＭＭＰ−９ノックアウトマウスにおける腫瘍の増殖を加速する。ＣＯＬ４α３ｍＲＮＡが高レベルであったことは、肺癌患者の予後不良と関連していた（１５、１６）。いくつかの研究により推測されてきたように、マトリカインは、治療面で将来性のある有望なバイオマーカーであると見なされる（１０、１７〜１９）。
【０００４】
Luo et al（２０）が開発したサンドイッチＥＬＩＳＡは、ヒト血清および組織抽出物中のＣＯＬ４α３／ツムスタチンの定量化を用途としたものである。しかしながら、転移性疾患のない肺癌患者の場合、健常対照と比較して有意差が見られず、転移性肺癌のない患者と比較して、転移性肺癌患者ではＣＯＬ４α３／ツムスタチンレベルが低下していたことが、唯一の関連所見とされた。ゆえに、ルオ（Luo）のＥＬＩＳＡでは、ヒトの血清および組織抽出物中のＣＯＬ４α３／ツムスタチンを定量化できる可能性があるが、そのアッセイの診断ユーティリティは或る程度制限されていることが明らかにされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らによって開発されたツムスタチンアッセイは、現在、優れた診断ユーティリティであることが実証されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ゆえに、第１の態様において、本発明は、患者の生体液試料中のＮ末端アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）を有するペプチドを定量化するためのイムノアッセイ法に関するものであり、本イムノアッセイ法は、前述の患者の生体液試料を、前述のＮ末端アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）に対し特異的に反応するモノクローナル抗体に接触させることと、前述のモノクローナル抗体と前述のＮ末端アミノ酸配列との間の結合量を算定することと、を含む。
【０００７】
モノクローナル抗体は、前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを特異的に認識することもないし、また結合することもないものが、好ましい。この点に関して、「前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョン」は、配列Ｈ２Ｎ−ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）のＮ末端を超えて延在する、１つ以上のアミノ酸を意味する。例えば、Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）がロイシン残基で伸長された場合、対応する「Ｎ延在伸長バージョン」はＨ２Ｎ−ＬＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：２）となる。同様に、「前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョン」は、配列Ｈ２Ｎ−ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）のＮ末端から除去された１つ以上のアミノ酸を意味する。例えば、Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）が１アミノ酸残基だけ短縮された場合、対応する「Ｎ切断短縮バージョン」はＨ２Ｎ−ＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：３）となる。
【０００８】
第２の態様において、本発明は、患者における肺癌の検出を用途とした、イムノアッセイ法に関するものであり、本イムノアッセイ法は、患者の生体液試料をＮ末端アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）に対し特異的に反応するモノクローナル抗体に接触させることと、前述のモノクローナル抗体と前述のＮ末端アミノ酸配列含有ペプチドとの間の結合量を算定することと、前述の結合量を、ｉ）正常な健常被験対象に関連する値および／またはｉｉ）既知の肺癌の重篤度に関連する値および／またはｉｉｉ）以前の時点で前述の患者から得られた値、および／またはｉｖ）所定のカットオフ値と相関させることと、を含む。
【０００９】
肺癌としては、限定されるものではないが、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を挙げることができる。
【００１０】
所定のカットオフ値を、少なくとも２．００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２．３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも２．６０ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも３．００ｎｇ／ｍＬとしてもよい。この点に関して、様々な統計分析を併用することによって見出されてきたように、モノクローナル抗体（上記）とＮ末端バイオマーカーの間の結合量の測定値が少なくとも２．００ｎｇ／ｍＬ以上の場合、ＮＳＣＬＣなどの肺癌の存在を判別することが可能とされている。統計的カットオフ値を、少なくとも２．００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２．３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも２．６０ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも３．００ｎｇ／ｍＬとすることにより、本発明の方法を利用して、肺癌を高い信頼レベルにて診断することが可能である。あるいは、統計的カットオフ値を本発明の方法に適用することは特に有利である、とも言い換えられる。そうすることにより、スタンドアロン型の診断アッセイに帰結する、すなわち、健常者および／または疾患重篤度が既知である患者と直接比較する必要無しに、診断の結論に到達することが可能となるからである。また、このことが特に有利とされるのは、アッセイを利用して、概ね肺癌を示唆する（例えば、身体診察および／または医療専門家との相談により判別された）医学的徴候または症状を既往とする患者を評価する場合である。これは、初期の予後を確証するための迅速且つ最も信頼のおけるツールとして機能し、それにより、内視鏡検査および／または生検のような侵襲性の高い手技の必要性をなくし、好適なレジメンの開始を早めることが可能となる。肺癌の特定の事例において、迅速な決定的診断により、疾患が早期に検出される可能性があり、ひいては、生存の全般的確率が向上することが見込まれる。
【００１１】
上記の方法で使用されるモノクローナル抗体は、前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを特異的に認識することもないし、また結合することもないものが、好ましい。
【００１２】
第３の態様において、本発明は、患者における慢性腎臓病（ＣＫＤ）の検出を用途とした、イムノアッセイの方法に関するものであり、本イムノアッセイ法は、患者の生体液試料をＮ末端アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）に対し特異的に反応するモノクローナル抗体に接触させることと、前述のモノクローナル抗体と前述のＮ末端アミノ酸配列含有ペプチドとの間の結合量を算定することと、前述の結合量を、ｉ）正常な健常被験対象に関連する値および／またはｉｉ）既知のＣＫＤの重篤度に関連する値および／またはｉｉｉ）以前の時点で前述の患者から得られた値、および／またはｉｖ）所定のカットオフ値と相関させることと、を含む。
【００１３】
ＣＫＤは、限定されるものではないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎（ＬＮ）または糖尿病に起因する、ＣＫＤであり得る。
【００１４】
所定のカットオフ値を、少なくとも２．００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２．３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも２．６０ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも３．００ｎｇ／ｍＬとしてもよい。
【００１５】
モノクローナル抗体は、前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを特異的に認識することもないし、また結合することもないものが、好ましい。
【００１６】
第４の態様において、本発明は、患者における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）またはループス腎炎（ＬＮ）の検出を用途とした、イムノアッセイの方法に関するものであり、本イムノアッセイ法は、患者の生体液試料をＮ末端アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）に対し特異的に反応するモノクローナル抗体に接触させることと、前述のモノクローナル抗体と前述のＮ末端アミノ酸配列含有ペプチドとの間の結合量を算定することと、前述の結合量を、ｉ）正常な健常被験対象に関連する値および／またはｉｉ）既知のＳＬＥもしくはＬＮの重篤度に関連する値および／またはｉｉｉ）以前の時点で前述の患者から得られた値、および／またはｉｖ）所定のカットオフ値と相関させることと、を含む。
【００１７】
所定のカットオフ値を、少なくとも２．００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２．３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも２．６０ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも３．００ｎｇ／ｍＬとしてもよい。
【００１８】
モノクローナル抗体は、前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを特異的に認識することもないし、また結合することもないものが、好ましい。
【００１９】
本発明の第１〜第４の態様のいずれかによる上記の方法の全てにおける患者の生体液試料としては、限定されるものではないが、血液、尿、滑液、血清または血漿を挙げることができる。或る特定の好ましい実施形態において、生体液試料を尿または血清とする場合がある。慢性腎臓病（ＣＫＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）またはループス腎炎（ＬＮ）の検出を用途としたイムノアッセイ法では、生体液試料を尿とするのが、特に好ましい場合がある。
【００２０】
第５の態様において、本発明は、Ｎ末端アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）に対し特異的に反応するモノクローナル抗体に関連する。
【００２１】
モノクローナル抗体は、前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを特異的に認識することもないし、また結合することもないものが、好ましい。
【００２２】
第６の態様において、本発明は、Ｎ末端アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）に対し特異的に反応するモノクローナル抗体と、少なくとも以下：
−  ストレプトアビジン被覆ウェルプレート、
−  ビオチン化ペプチドＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ−Ｌ−ビオチン（配列番号：６）（配列中：Ｌは任意選択的なリンカーである）、
−  サンドイッチイムノアッセイにおいて使用される二次抗体、
−  配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）を含むキャリブレーターペプチド、
−  抗体ビオチン化キット
−  抗体ＨＲＰ標識キット
−  抗体放射性標識キット
−  アッセイ可視化キット、のいずれか１つと、を具備するアッセイキットに関する。
【００２３】
モノクローナル抗体は、前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを特異的に認識することもないし、また結合することもないものが、好ましい。
【００２４】
上記および／またはアッセイキットに付属しているモノクローナル抗体は、アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）を有する合成ペプチドに対して惹起され得る。
定義
【００２５】
本明細書中に使用されている「Ｎ末端」という用語は、ポリペプチドの先端、すなわち、該ポリペプチドのＮ末端端部を指し、その一般的な方向における意味として解釈すべきではない。
【００２６】
本明細書中に使用されている「競合的ＥＬＩＳＡ」という用語は、競合的酵素結合免疫吸着アッセイを指し、本技術は、当業者に公知とされている。
【００２７】
本明細書中に使用されている「サンドイッチイムノアッセイ」という用語は、試料中の抗原の検出を用途とした少なくとも２つの抗体を使用することを指し、本技術は、当業者に公知とされている。
【００２８】
本明細書中に使用されている「結合量」という用語は、抗体とバイオマーカーとの間の結合の定量化を指し、前述の定量化は、生体液試料中のバイオマーカーの測定値を検量曲線と比較することによって算定されたものであり、この検量曲線は、バイオマーカーの既知濃度の標準試料を使用して作成されたたものである。本明細書中に開示されている特定のアッセイでは、Ｎ末端アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）を有するＮ末端バイオマーカーが、生体液中で測定され、この検量曲線は、既知濃度の検量ペプチドＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）の標準試料を使用して作成される。生体液試料にて測定された値を、検量曲線と比較することによって、試料中のバイオマーカーの実際の量が算定される。本発明では、分光光度分析を利用して、標準曲線を作成し、生体液試料中の結合量を測定する。下掲の例において、本方法では、ＨＲＰおよびＴＭＢを使用して、測定可能な色強度を生成する。この色強度は結合量に比例する強度であると共に、分光光度計での読取りも可能な強度とされる。当然のことながら、任意の好適な分析方法を使用しても差し支えない。
【００２９】
本明細書中に使用されている「カットオフ値」は、患者における疾患（例えば、ＮＳＣＬＣなどの肺癌、または慢性腎臓病、全身性エリテマトーデス、またはループス腎炎）の尤度が高いことを示唆するものと統計的に判別される結合量を意味する。ここで、患者試料のバイオマーカーの測定値は、統計的カットオフ値に到達しているか、または統計的カットオフ値を超えていて、疾患（例：ＮＳＣＬＣなどの肺癌、慢性腎臓病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎）の存在または尤度の少なくとも７０％の確率、好ましくは少なくとも８０％の確率、好ましくは少なくとも８５％の確率、より好ましくは少なくとも９０％の確率、最も好ましくは少なくとも９５％の確率に対応している。
【００３０】
本明細書中に使用されている「正常な健常被験対象に関連する値および／または既知の疾患に関連する値重篤度」とは、健康であると見なされる、すなわち疾患を有さない（例えば、ＮＳＣＬＣなどの肺癌に患確していない、または慢性腎臓病、全身性エリテマトーデス、またはループス腎炎に患確していない）と見なされる被験対象を対象として上記の方法より算定されたツムスタチンの標準化量、および／または、既知の重篤度の疾患（例えば、ＮＳＣＬＣなどの肺癌、または慢性腎臓病、全身性エリテマトーデス、またはループス腎炎）を有することが知られている被験対象を対象として上記の方法により算定されたツムスタチンの標準化量を意味する。
【００３１】
本明細書において、「ＴＵＭ  ＥＬＩＳＡ」は、本明細書中に開示されている特定の競合的ＥＬＩＳＡで、試料中のＮ末端アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）を有するペプチドの量を定量化するものを指す。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】典型的な標準曲線、ならびにヒトの血清および尿に対する生来的な反応性を図示した、ＴＵＭ  ＥＬＩＳＡである。標準ペプチドは、開始濃度２０ｎｇ／ｍＬを、２倍に希釈した。示されているように、試料は、まず無希釈状態にて、次いで、最大８倍まで希釈して、泳動させた。
【図２】アッセイ特異性。ＴＵＭアッセイにて、標準ペプチド（ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ；配列番号：１）、伸長ペプチド（ＬＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ；配列番号：２）、切断ペプチド（ＧＬＫＧＫＲＧＤＳ；配列番号：３）、およびナンセンスペプチド（ＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲ；配列番号：４））に対する反応性を、試験した。
【図３】コホート１の結果。健常対照（ｎ＝８）、ならびにＩＰＦ（ｎ＝７）、ＣＯＰＤ（ｎ＝８）およびＮＳＣＬＣ（ｎ＝８）の患者における、血清ＴＵＭレベルを評価した。データ分析には、クラスカルウォリス（Kruskal-Wallis）検定をダンの多重比較検定用に調整したものを使用した。データは、テューキー（Tukey）ボックスプロットとして表されている。有意水準：＊：ｐ＜０．０５、および＊＊：ｐ＜０．００１。
【図４】コホート２の結果。健常対照（ｎ＝２０）、およびＮＳＣＬＣ（ｎ＝４０）の患者における、血清ＴＵＭレベルを評価した。データ分析には、マンホイットニーｔ検定を使用した。データは、テューキー（Tukey）ボックスプロットとして表されている。有意水準：＊：ｐ＜０．０５。
【図５】健常者およびループス腎炎（ＬＮ）患者における、尿（ｎｇ／ｍｇクレアチニン）および血清（ｎｇ／ｍｌ）試料中のＴＵＭレベル。＊＊ｐ＜０．０１。
【図６】健常者、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者における、血清試料中のＴＵＭレベル（ｎｇ／ｍｌ）。
【図７】糖尿病性腎臓病のラットモデルにおける、尿試料中のＴＵＭレベル。
【実施例】
【００３３】
本開示の実施形態は、下記実施例において記載されている本開示を理解する一助となるように説明されたものであって、下掲の特許請求の範囲において定義されている開示の範囲を限定するものと解釈すべきではない。下記実施例は、記載されている実施形態を作製し使用する方法に関する完全な開示および説明を当業者に提供することを目的に提示されたものであって、本開示の範囲を限定することを意図したものではないし、また、下記実験は、実施された全ての実験、または実施された唯一の実験であることを表明することを意図したものでもない。使用されている数値（例えば、量、温度など）に関する精確性を期すための努力が為されてきたが、或る程度の実験誤差および偏差を考慮に入れる必要がある。別途明記されていない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、且つ圧力は大気圧または大気圧に近似する。
【００３４】
下記実施例において使用されている材料および方法は、以下の通りである。
【００３５】
材料および方法
実験に使用された試薬はいずれも、米国ミズーリ州のセントルイスのシグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich）、および米国ニュージャージー州ホワイトハウスステーションのメルク社（Merck）などの企業製の高品質基準であった。免疫化およびアッセイの開発に使用された合成ペプチドは、米国ニュージャージー州のゲンスクリプト社（Genscript）から購入された。
【００３６】
モノクローナル抗体の作製
アミノ酸配列１４２６’ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ’１４３６（配列番号：１）は、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖に位置する。この配列は、ヒトのツムスタチンに対して生成される。ラットではアミノ酸（ＡＡ）６位にミスマッチがあり、マウスではＡＡ５位にミスマッチがある。フロイントの不完全アジュバントを使用して、４〜６週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスに２００μＬの乳化抗原および５０μｇの免疫原性ペプチド（ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ−ＧＧＣ−ＫＬＨ；配列番号：５）を皮下注射することにより、免疫を開始した。予防接種は、安定した血清抗体価レベルに到達するまで、２週間ごとに繰り返した。血清力価が最も高いマウスを融合用に選択し、１か月間休息させた。続いて、細胞融合用に脾臓を単離する３日前に、マウスを０．９％ＮａＣｌ溶液１００μＬ中の５０μｇ免疫原性ペプチドで静脈内追加免疫した。ハイブリドーマ細胞を作製するため、マウス脾臓細胞は、Gefter et alにより記載されたようにＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合された。ハイブリドーマ細胞を、半固体培地法を使用して、培養皿にクローン化した。次いで、クローンを９６ウェルマイクロタイタープレートに平板播種し、更に増殖させ、限界希釈法を適用してモノクローナル増殖を促進した。ストレプトアビジンで被覆されたプレートに対して実施された間接ＥＬＩＳＡを、上清の反応性スクリーニングに使用した。ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ−Ｋ−ビオチン（配列番号：６）をスクリーニングペプチドとして使用し、標準ペプチドＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）をクローンの特異性の更なる試験に使用した。ハイブリドーマ細胞から上清を収集し、製造元の指示書に従って、HiTrapアフィニティカラム（英国バッキンガムシャー州リトルチャルフロントのGEヘルスケアライフサイエンス社（GE Healthcare Life Science）を使用して精製した。マウスにおいて実施されたモノクローナル抗体の作製は、承認番号2013-15-2934-00956下で国家当局（動物実験検査局（Animal Experiments Inspectorate））によって承認された。全ての動物を、動物福祉ガイドラインに従って、処置した。
【００３７】
クローンの特性評価
標準ペプチドに対するネイティブの反応性およびペプチド親和性は、商業供給者（米国バージニア州22602のバレーバイオメディカル（Valley Biomedical）から購入したヒト血清およびヒト尿を使用して評価した。抗体特異性の試験は、予備アッセイにて切断ペプチド（ＧＬＫＧＫＲＧＤＳ；配列番号：３）および伸長ペプチド（ＬＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ；配列番号：２）を使用して行った。モノクローナル抗体のアイソタイプは、Clonotyping System-HRPキット、カタログ番号5300-05（米国アラバマ州バーミングハムのサザンバイオテック社（Southern Biotech））を使用して判別した。
【００３８】
ＴＵＭ  ＥＬＩＳＡ
ＴＵＭ競合的ＥＬＩＳＡの手順は、以下の通り：
９６ウェルのストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレート（ロッシュ社（Roche）製、カタログ番号11940279）を、アッセイバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＢＴＢ２ｇ、ＮａＣｌ／Ｌ、ｐＨ８．０、１００μＬ／ウェル）内で溶解された１０ｎｇ／ｍＬビオチン化ペプチドＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ−Ｋ−ビオチン（配列番号：６）で被覆し、暗所で２０℃、３００ｒｐｍにて３０分間振盪させて、インキュベートした。プレートを洗浄バッファー（２０ｍＭ  ＴＲＩＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）にて５回洗浄した。続いて、標準ペプチドまたは試料２０μＬを適切なウェルに加え、７ｎｇ／ｍＬホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識モノクローナル抗体溶液１００μＬを加えた。プレートを振盪させながら２０℃で１時間インキュベートし、続いて洗浄バッファー中で洗浄した。最後に、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジニジン（ＴＭＢ）（Kem-En-Tecカタログ番号438OH）１００μＬを添加し、２０℃にて１５分間インキュベートした。ＴＭＢの酵素反応を停止するため、停止液（１％Ｈ２ＳＯ４）１００μＬを加えた。プレートを、ＥＬＩＳＡリーダー（米国カリフォルニア州バーサマックスのモレキュラーデバイス社（Molecular Devices）で、６５０ｎｍを基準として用い、４５０ｎｍで分析した。標準曲線は、標準ペプチドの段階希釈により実施し、４パラメータの数学的適合モデルを使用して、プロットした。標準濃度は、０ｎｇ／ｍＬ、０．３１２５ｎｇ／ｍＬ、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、および２０ｎｇ／ｍＬであった。各プレートには、アッセイ間変動をモニターするための、５つのキット対照が含まれていた。全ての試料は、アッセイの範囲内で測定した。測定範囲の下限（ＬＬＭＲ）未満の試料はいずれも、ＬＬＭＲの値として報告した。
【００３９】
技術評価
４つのヒト血清およびヒト尿試料の２倍希釈を用いて、直線性を評価した。直線性は、未希釈試料の回収率（パーセンテージ）として計算した。
【００４０】
抗体特異性は、標準ペプチド（ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ；配列番号：１）、伸長ペプチド（ＬＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ；配列番号：２）、切断ペプチド（ＧＬＫＧＫＲＧＤＳ；配列番号：３）およびナンセンスペプチド（ＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲ；配列番号：４）の２倍希釈によるシグナル阻害のパーセンテージとして計算した。検出下限（ＬＬＯＤ）は、最低基準（バッファー）を２１回にわたって測定することにより、推定した。ＬＬＯＤは平均値−３＊標準偏差（ＳＤ）として計算した。検出の上限（ＵＬＯＤ）は、標準Ａの１０回にわたる測定の平均±３＊ＳＤとして算定した。アッセイ内変動およびアッセイ間変動の算定は、５つの品質管理（ＱＣ）を１０回にわたって個別に泳動させ、２つのキット対照を二重測定にて泳動させることにより行った。アッセイの精度は、標準ペプチドが添加された健常ヒト血清／尿試料、および既知の高タムスタチン濃度の血清／尿試料において測定し、バッファー中の血清／尿の回収率として計算した。次いで、バッファー中のスパイク血清の回収率を計算することにより、スパイク回収率を算定した。干渉は、ビオチン（低＝３０ｎｇ／ｍｌ、高＝９０ｎｇ／ｍｌ）、ヘモグロビン（低＝０．１５５ｍＭ、高＝０．３１０ｍＭ）、または脂質（低＝４．８３ｍＭ、高＝１０．９８ｍＭ）のいずれかが添加された、健常ヒト血清において測定した。干渉は、無添加血清中の検体の回収率として計算した。更に、干渉を研究するために、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）パネルが使用した。５つの健常ヒト血清試料を、ＨＡＭＡパネルに加えた。これらの試料を、希釈バッファー中に５％Ｌｉｑ  ＩＩ含有の場合および不含の場合とで分析した。塩干渉は、ｐＨ７．０および８．０にて濃度８．１４ｇ／Ｌ  ＮａＣｌの塩試料を測定することにより、試験した。ツムスタチンの標準濃度を規定するため、試料提供者の年齢および性別に関連して、３２個の健常ヒト血清試料を分析することにより、正常範囲を算定した。測定範囲の下限（ＬＬＭＲ）および測定範囲の上限（ＵＬＭＲ）は、アッセイ内変動およびアッセイ間変動を基にした１０通りの標準曲線を基準にして計算した。３つの健常ヒト血清試料における検体安定性を測定した。これら３つの試料は、４℃または２０℃にてそれぞれ２時間、４時間および２４時間インキュベートされたものである。試料の安定性評価は、−２０℃に保たれた試料（０時間目の試料）に比例した変動率を計算することによって行った。更になお、４回にわたる凍結および解凍サイクルに供された３つの健常ヒト血清試料を対象として、検体安定性を算定した。検体安定性を評価するため、凍結／解凍サイクルに１回だけ供された試料から回収率（パーセンテージ）を計算した。
【００４１】
肺癌バイオマーカーとしてのＴＵＭの生物学的検証
２つの異なるコホートからの血清試料中のＴＵＭを測定した。両方のコホートは、商業ベンダー（米国カリフォルニア州カルバーシティのプロテゲネックス社（Proteogenex）から得たものである。コホート１には、ＩＰＦ、ＣＯＰＤ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と診断された患者と、症候性疾患または慢性疾患に罹患していない結腸鏡検査陰性の対照とが、含まれていた。患者の人口統計を、表１に示す。コホート２には、癌の病期（Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期およびＩＶ期）にありＮＳＣＬＣと診断された患者と、症状または慢性疾患のない結腸鏡検査陰性対照とが、含まれていた。このコホートの患者の人口統計は、表２に見出すことができる。
【００４２】
別途明記されていない限り、データは平均値（ＳＤ）として表されている。年齢、性別およびＢＭＩの比較は、ダンの多重比較検定用に調整されたクラスカルウォリス（Kruskal-Wallis）を使用して実施した。一方、予測値のＦＥＶ１％およびＦＥＶ１／ＦＶＣ比（％）の比較は、マンホイットニーの対応のないｔ検定を使用して計算した。ｐ値で０．０５未満のものは、有意値と見なした。略語：ＢＭＩ（肥満度指数）、ＩＰＦ（特発性肺線維症）、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、ＦＥＶ１（１秒当たりの強制呼気量）、ＦＶＣ（強制肺活量）。
【表１】
2021507243.tif 000003
【００４３】
別途明記されていない限り、データは平均値（ＳＤ）として表されている。年齢、性別およびＢＭＩの比較は、マンホイットニーのｔ検定を使用して実施した。ｐ値で０．０５未満のものは、有意値と見なした。略語：ＢＭＩ（肥満度指数）。
【表２】
2021507243.tif 000004
【００４４】
統計分析
血清試料中のＴＵＭレベルは、ダンの多重比較検定（ノンパラメトリックデータ）用に調整されたクラスカルウォリス（Kruskal-Wallis）を使用して比較した。結果は、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表されている。
【００４５】
ＴＵＭの診断能力は、受信者操作特性（ＡＵＲＯＣ）曲線下の領域にて調査した。統計分析およびグラフは、GraphPad Prismバージョン7（米国カリフォルニア州のグラフパッドソフトウェア社（GraphPad Software, Inc.,））を使用して実施した。
【００４６】
ＣＫＤ、ＳＬＥ、およびＬＮのバイオマーカーとしての生物学的検証−ＴＵＭ
２つの異なる患者コホートにおいてＴＵＭを測定した。コホート１（患者１８例）には、ループス腎炎（ＬＮ）および健常対照が含まれていた。ＴＵＭレベルは、血清試料および尿試料の両方について測定した。コホート２（患者１２６例）には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および健常対照が含まれていた。ＴＵＭレベルは、血清試料についてのみ測定した。コホート１の患者の人口統計を、下表３に示す。
【表３】
2021507243.tif 000005
【００４７】
加えて、糖尿病性腎臓病のラットモデルにおいてＴＵＭを測定したスプラーグドーリーラット（ｎ＝８）の尾静脈にストレプトゾシン（ＳＴＺ）を注射して糖尿病を誘発させ、４８時間後に、ラットの血糖値が１５ミリモル毎リットル（mmol L-1）を超えた場合、糖尿病であると見なした。２週間後に、ＳＴＺ処置済みラットを虚血性再灌流傷害（ＩＲＩ）に供した。対照ラット（ｎ＝７）を偽手術に供した。ＩＲＩ手術または偽手術後０日目、１日目、５日目および８日目にラットから尿試料を採取し、尿試料中のＴＵＭレベルを測定した。
【００４８】
結果
クローンの特性評価
競合的ＥＬＩＳＡで、最良の抗体産生ハイブリドーマを、標準ペプチドおよび天然物質に対する反応性に関してスクリーニングした。クローンＮＢＨ１３４＃１０２−３ＧＦを、反応性に基づき、開発されたアッセイ用に選択した。このクローンは、ＩｇＧ１サブタイプであると断定された。ヒト血清および尿において生来的な反応性が観察された（図１）一方、伸長ペプチド、切断ペプチド、ナンセンス標準ペプチド、およびナンセンスコーターに対する反応性は全く見られなかった（図２）。
【００４９】
ＴＵＭ  ＥＬＩＳＡアッセイの技術評価
ＴＵＭ  ＥＬＩＳＡアッセイを評価するための、一連の技術検証を実施した。検証データの概要は、表４に見出すことができる。アッセイの測定範囲（ＬＬＭＲ−ＵＬＭＲ）は、０．２６〜９．９２ｎｇ／ｍＬと算定した。アッセイ間変動およびアッセイ内変動はそれぞれ、８．０４％および１０．９６％であった。ヒト試料の直線性の観察は、ヒト血清では無希釈ないし１：４であるとされ、ヒト尿では無希釈ないし１：２であるとされた。スパイクにより、ヒト血清中のトグ（tog）標準ペプチド、およびヒト血清中のヒト血清を回収する。結果として、平均回収率はそれぞれ９０％および９９％となった。ヘモグロビン、脂質またはビオチンのいずれも、ヒト血清中のＴＵＭ検体の測定を妨げなかった。４℃および２０℃（１０２．４％および８０．１％）でのヒト血清試料の長期保管時と、凍結／解凍サイクル（８０．８％）の両方において、検体安定性は許容範囲内であった。
【表４】
2021507243.tif 000006
【００５０】
肺癌バイオマーカーとしてのＴＵＭの生物学的検証
２つの異なる患者コホート（コホート１およびコホート２）においてＴＵＭを測定した。
【００５１】
コホート１は、健常対照と、ＩＰＦ、ＣＯＰＤおよびＮＳＣＬＣであると診断された患者とから構成される。結果は、図３に示されている。コホート１の結果から明らかにされたように、ＮＳＣＬＣ患者由来の血清中ＴＵＭは、健常対照、ＩＰＦ患者およびＣＯＰＤ患者と比較して有意に上昇していた（それぞれｐ＝０．００７、ｐ＝０．０３、ｐ＝０．００１）。健常対照、ＩＰＦ患者およびＣＯＰＤ患者間では、有意差が見られなかった。このことから、ＴＵＭはＮＳＣＬＣにおいて役目を果たし得るが、線維性肺疾患においては機能しないことが示唆される。
【００５２】
コホート２における健常対照およびＮＳＣＬＣ患者由来の試料中のＴＵＭを測定した（図４を参照）。ここで、ＮＳＣＬＣ患者においてＴＵＭは、健常対照と比較して有意に上方制御された（ｐ＝０．００２）。癌の病期ごとの有意差は認められなかった。
【００５３】
ＡＵＲＯＣを用いて、ＮＳＣＬＣおよび健常対照との関連においてＴＵＭの識別力を評価した。
【００５４】
表５に示すように、ＡＵＲＯＣ＝０．９７のＮＳＣＬＣ患者およびコホート１の健常対照、ＡＵＲＯＣ＝０．９８のＮＳＣＬＣ患者およびＩＰＦ患者、ならびにＡＵＲＯＣ＝１．００のＮＳＣＬＣ患者およびＣＯＰＤ患者を、ＴＵＭにより識別できた。コホート２では、ＡＵＲＯＣ＝０．７３を用い、健常対照からＮＳＣＬＣ患者をＴＵＭにより同定できた。これらの所見から示唆されるように、ＴＵＭレベルにより、健常対照およびＮＳＣＬＣ患者を、高度な診断精度で識別できる。
【表５】
2021507243.tif 000007
【００５５】
ＣＫＤ、ＳＬＥ、およびＬＮのバイオマーカーとしての生物学的検証−ＴＵＭ
２つの異なる患者コホート（コホート１およびコホート２）においてＴＵＭを測定した。コホート１における健常対照、およびループス腎炎（ＬＮ）患者由来の血清試料および尿試料中のＴＵＭを測定した（図５を参照）。コホート２における健常対照および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者由来の血清試料中のＴＵＭを測定した。結果を図６に示す。ＴＵＭレベルは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者およびループス腎炎（ＬＮ）患者の血清では、最大２倍上方制御され、ＬＮ患者の尿では、１０倍上方制御されることが判明した。
【００５６】
同様に、糖尿病性腎臓病のラットラットモデルにおいても、ＴＵＭを測定した。その結果を図７に示す。尿中のＴＵＭレベルは、糖尿病ラット（１型糖尿病）の方が対照と比較して高くなり。糖尿病ラットでは時系列に増加していき、虚血性再灌流障害（ＩＲＩ）の５日後にピークに達したことが、見出された。
【００５７】
結論
ツムスタチンの検出を目的として、モノクローナル抗体を用いた新規な競合的ＥＬＩＳＡ（本明細書中では「ＴＵＭ  ＥＬＩＳＡ」と呼ばれる）が、開発されてきた。このアッセイは、技術的に堅牢であり、アミノ酸配列ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳ（配列番号：１）に対して特異的であった。ＴＵＭ断片は、ヒト血清および尿中で検出可能とされた。ＮＳＣＬＣ患者では、ＩＰＦ、ＣＯＰＤおよび健常対照と比較して、有意に上昇していることが判明した。ＳＬＥ患者またはＬＮ患者では、健常対照と比較して有意に上昇し、糖尿病性腎疾患のラットモデルでは有意に上昇した。
【００５８】
本明細書において明らかにされているように、ＴＵＭ  ＥＬＩＳＡは、肺癌、特にＮＳＣＬＣの診断において診断の将来性を有し、これらの患者を肺線維症患者から分離できる。高度な診断精度に基づけば、これを肺癌におけるＢＭ再モデリングバイオマーカーとしても差し支えない。同様に、本明細書において明らかにされてきたように、ＴＵＭ  ＥＬＩＳＡは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎（ＬＮ）、慢性糖尿病、特に糖尿病、ＳＬＥまたはＬＮに起因する慢性腎臓病の診断において診断の将来性を有する。
【００５９】
本明細書中で別途明記されていない限り、「または」という単語は、指定された条件のいずれかまたは両方が満たされたときに真の値を返す演算子の意味で使用されている。これは、一方の条件のみが満たされることを要求する「排他的論理和」演算子とは対照を為す。「含む」という用語は、「からなる」という意味ではなく寧ろ「含む」という意味で使用されている。上記に承認された先行する諸教示はいずれも、本明細書において参照により援用されている。
【００６０】
参考文献
1. Colorado PC, Torre A, Kamphaus G, et al. Anti-angiogenic cues from vascular basement membrane collagen. Cancer Res. 2000;60(9):2520-2526.
2. Pozzi A, Yurchenco PD, Iozzo R V. The nature and biology of basement membranes. Matrix Biol. 2017;57-58:1-11. doi:10.1016/j.matbio.2016.12.009.
3. Miner JH. Laminins and their roles in mammals. Microsc Res Tech. 2008;71(5):349-356. doi:10.1002/jemt.20563.
4. Sannes PL, Wang J. Basement membranes and pulmonary development. Exp Lung Res. 23(2):101-108. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9088920. Accessed October 17, 2017.
5. Randles MJ, Humphries MJ, Lennon R. Proteomic definitions of basement membrane composition in health and disease. Matrix Biol. 2017;57-58:12-28. doi:10.1016/j.matbio.2016.08.006.
6. Gelse K. Collagens-structure, function, and biosynthesis. Adv Drug Deliv Rev. 2003;55(12):1531-1546. doi:10.1016/j.addr.2003.08.002.
7. Sand JM, Larsen L, Hogaboam C, et al. MMP mediated degradation of type IV collagen alpha 1 and alpha 3 chains reflects basement membrane remodeling in experimental and clinical fibrosis--validation of two novel biomarker assays. PLoS One. 2013;8(12):e84934. doi:10.1371/journal.pone.0084934.
8. Jarad G, Knutsen RH, Mecham RP, Miner JH. Albumin contributes to kidney disease progression in Alport syndrome. Am J Physiol - Ren Physiol. 2016;311(1):F120-F130. doi:10.1152/ajprenal.00456.2015.
9. Foster MH. Basement membranes and autoimmune diseases. Matrix Biol. 2017;57-58:149-168. doi:10.1016/J.MATBIO.2016.07.008.
10. Hamano Y, Zeisberg M, Sugimoto H, et al. Physiological levels of tumstatin, a fragment of collagen IV a3 chain, are generated by MMP-9 proteolysis and suppress angiogenesis via IVa3 integrin. Cancer Cell. 2003;3(6):589-601. doi:10.1016/S1535-6108(03)00133-8.
11. Sand JMB, Martinez G, Midjord A-K, Karsdal MA, Leeming DJ, Lange P. Characterization of serological neo-epitope biomarkers reflecting collagen remodeling in clinically stable chronic obstructive pulmonary disease. Clin Biochem. 2016;49(15):1144-1151. doi:10.1016/j.clinbiochem.2016.09.003.
12. Glentis A, Gurchenkov V, Matic Vignjevic D. Assembly, heterogeneity, and breaching of the basement membranes. Cell Adh Migr. 2014;8(3):236-245. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24727304. Accessed October 17, 2017.
13. Eikesdal HP, Sugimoto H, Birrane G, et al. Identification of amino acids essential for the antiangiogenic activity of tumstatin and its use in combination antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105:15040-15045. doi:10.1073/pnas.0807055105.
14. Gu Q, Zhang T, Luo J, Wang F. Expression, purification, and bioactivity of human tumstatin from Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2006;47:461-466. doi:10.1016/j.pep.2006.01.011.
15. Hamano Y, Kalluri R. Tumstatin, the NC1 domain of α3 chain of type IV collagen, is an endogenous inhibitor of pathological angiogenesis and suppresses tumor growth. Biochem Biophys Res Commun. 2005;333:292-298. doi:10.1016/j.bbrc.2005.05.130.
16. Jiang C-P, Wu B-H, Chen S-P, et al. High COL4A3 expression correlates with poor prognosis after cisplatin plus gemcitabine chemotherapy in non-small cell lung cancer. Tumor Biol. 2013;34(1):415-420. doi:10.1007/s13277-012-0565-2.
17. Murphy SL, Xu J, Kochanek KD, Statistics V. National Vital Statistics Reports Deaths: Final Data for 2010. 2013;61(4).
18. Van der Velden J, Harkness LM, Barker DM, et al. The Effects of Tumstatin on Vascularity, Airway Inflammation and Lung Function in an Experimental Sheep Model of Chronic Asthma. Sci Rep. 2016;6:26309. doi:10.1038/srep26309.
19. Burgess JK, Boustany S, Moir LM, et al. Reduction of Tumstatin in Asthmatic Airways Contributes to Angiogenesis, Inflammation, and Hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 2010;181(2):106-115. doi:10.1164/rccm.200904-0631OC.
20.Luo Y-Q, Yao L-J, Zhao L, Sun A-Y, Dong H, Du J-P, Wu S-Z, Hu W, Development of an ELISA for quantification of tumstatin in serum samples and tissue extracts of patients with lung carcinoma. Clin. Chim. Acta 2010;411:510-515. doi: 10.1016/j.cca.2010.01.001.
【図１】
2021507243.tif 000008
【図２】
2021507243.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
2021507243.tif 000012
【図６】
2021507243.tif 000013
【図７】
2021507243.tif 000014
【配列表】
2021507243000001.app
【国際調査報告】
2021507243.tif 000015
2021507243.tif 000016
2021507243.tif 000017
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