(57)【要約】  本発明は、５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの結晶塩であって、５−メチル−（６S）−テトラヒドロ葉酸とL−バリンエチルエステルとのモル比が１：０．３〜１：３．０（モル／モル）の結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物、並びにそれらを製造する方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルを含む結晶塩であって、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とL−バリンエチルエステルとのモル比が１：０．３〜１：３．０（モル／モル）である結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。
【請求項２】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とL−バリンエチルエステルとのモル比が、１：０．５〜１：２．５（モル／モル）である請求項1に記載の結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。
【請求項３】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とL−バリンエチルエステルのモル比が、１：０．７５〜１：１．２５（モル／モル）である請求項１または２に記載の結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。
【請求項４】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とL−バリンエチルエステルのモル比が、約１：１（モル／モル）である先行する請求項の少なくとも1項に記載の結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。
【請求項５】
前記塩が、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの塩であり、５．８、６．９、１４．０、１９．０、１９．３、２２．２および２５．９に位置するピークから選択される少なくとも1つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）、ことを特徴とする請求項１〜４の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項６】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−ロイシンエチルエステルの塩であり、５．８、６．９、１４．０、１９．０、１９．３、２２．２および２５．９に特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）、ことを特徴とする請求項１〜５の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項７】
前記塩が、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの塩であり、５．８、６．９、１２．６、１４．０、１４．９、１７．５、１８．０、１９．０、１９．３、２０．０、２２．２および２５．９に位置するピークから選択される少なくとも1つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）、ことを特徴とする請求項１〜６の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項８】
塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの塩であり、実質的に図１に示されるようなＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）、ことを特徴とする請求項１〜７の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項９】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの塩であり、４．９、７．４、８．５、１４．１、１５．８、１６．３、１７．２、１８．６、２２．２および２４．５に少なくとも1つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）、ことを特徴とする請求項１〜４の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項１０】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−ロイシンエチルエステルの塩であり、４．９、７．４、８．５、１４．１、１５．８、１６．３、１７．２、１８．６、２２．２および２４．５にピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）、ことを特徴とする請求項１〜４または９の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項１１】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの塩であり、４．９、７．４、８．５、１４．１、１５．８、１７．２、１８．４、１８．６、２０．３、２０．９、２１．1、２２．２、２４．５および２５．７に少なくとも1つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）、ことを特徴とする請求項1〜4または９〜１０の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項１２】
前記塩が、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの塩であり、実質的に図２に示されるようなＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）、ことを特徴とする請求項１〜４、９または１１の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項１３】
少なくとも９９重量％以上の化学的および／または立体異性的純度を有する、先行する請求項の少なくとも1項に記載の結晶塩。
【請求項１４】
５−メチル−（６Ｓ）テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルを含む、請求項１〜１３の少なくとも1項に記載の結晶塩を製造する方法であって、以下の工程、
i) ５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とL−バリンエチルエステルの混合物を、任意選択で適当な溶媒または溶媒の混合物中で、準備する工程、
ii) 塩基を、任意選択で適切な溶媒または溶媒の混合物中で、添加して化合物を溶解させる工程、
iii) 組成物を少なくとも６０℃に加熱し、任意選択で清澄濾過を行う工程、
iv) 混合物を結晶化させ、１℃〜３０℃の間の温度に冷却し、任意選択でより多くの溶媒または溶媒の混合物を添加する工程、
v) 得られた固体物質を単離し、任意選択で生成物を乾燥させる工程、
を含む方法。
【請求項１５】
工程i)における５−メチル−（６Ｓ）テトラヒドロ葉酸とL−バリンエチルエステルとのモル比が１：１〜１：３の範囲であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶媒が水であることを特徴とする、請求項１４または１５の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１７】
工程iii）および／またはiv）において種結晶が添加されることを特徴とする請求項１４〜１６の少なくとも1項に記載の方法。
【請求項１８】
L−バリンエチルエステルがL−バリンエチルエステル塩酸塩として使用されることを特徴とする請求項１４〜１７の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１３の少なくとも１項に記載の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルを含む結晶塩、ならびに任意選択で１以上の許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物、食品添加物および／または製剤。
【請求項２０】
錠剤、カプセル、経口液体製剤、粉末、凍結乾燥物、顆粒、ロゼンジ、再構成可能な粉末、注射可能または注入可能な溶液または懸濁液または坐剤の形態である請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
少なくとも１つの追加の治療薬をさらに含む、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
経口、非経口、筋肉内、脊髄内、髄腔内、歯周、局所または直腸投与の医薬組成物である請求項１９〜２１の少なくとも１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１３の少なくとも１項に記載の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルを含む結晶塩の、薬物の製造のための成分としての、および／または食品添加物としての使用。
【請求項２４】
貧血、神経管欠損、心血管疾患、うつ病、認知障害、アルツハイマー病および骨粗鬆症のホモシステイン低下の治療に使用するための、および／または低血漿および／または低赤血球および／または低脳脊髄液および／または低末梢もしくは中枢神経系葉酸の食事管理に使用するための、請求項１〜１３の少なくとも１項に記載の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルを含む結晶塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルを含む結晶塩であって、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とL−バリンエチルエステルとのモル比が１：０．３〜１：３．０（モル／モル）および／またはその水和物および／またはその溶媒和物である結晶塩に関する。
【背景技術】
【０００２】
テトラヒドロ葉酸塩は、主に５−ホルミルテトラヒドロ葉酸（ロイコボリンおよびロボロイコボリン）のカルシウム塩として、５−メチルテトラヒドロ葉酸（メタフォリン（登録商標））のカルシウム塩として、または５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸（モデュフォリン（登録商標））の硫酸塩として使用される。最も突出した使用分野は、巨赤芽球性葉酸貧血の治療のために、葉酸アンタゴニスト、特に癌治療におけるアミノプテリンおよびメトトレキセートの適合性を増加させるための解毒剤として（「葉酸拮抗剤レスキュー」）、フッ化ピリミジンの治療効果を増加させるために、および乾癬および関節リウマチのような自己免疫疾患の治療のために、例えばトリメトプリム−スルファメトキサゾールのような突然変異に対するある種の駆虫剤の適合性を増加させるために、および化学療法におけるジデアザテトラヒドロ葉酸の毒性を減少させるために、使用される。
【０００３】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩は特に、薬物として、および食品添加物として、ビタミン調剤として、神経管欠損の予防のために、うつ病の治療のために、およびホモシステインレベルに影響を及ぼすために使用される。
【０００４】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびその塩は、極めて不安定であることが知られている。特に、それらは、酸化に対して非常に敏感であり（この点に関して、A. L. Fitzhugh、Pteridines 4（4），187−191(1993）も参照のこと）、したがって、医薬活性成分または食品添加物に許容される純度レベルで製造することが困難である。
【０００５】
５−メチルテトラヒドロ葉酸およびその塩の不安定性を克服するために、酸素をできるだけ完全に排除する、またはアスコルビン酸もしくは還元Ｌ−グルタチオンなどの酸化防止剤を添加するなどの様々な方法が使用されてきた。
【０００６】
米国特許第６，４４１，１６８号は、５−メチルテトラヒドロ葉酸のアルカリ土類塩、特にカルシウム塩、その結晶化およびその使用を開示している。５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のこのような結晶性カルシウム塩の欠点は、それが４つまでの多形変異の結晶形態で存在することである。従って、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩の製造方法は、非常に正確に制御されなければならない。さらに、米国特許第６，４４１，１６８号の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩は、典型的には結晶格子中に、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸１当量当たり少なくとも１当量であるが４当量までの水をそのすべての多形形態で含有する。
【０００７】
ＵＳ ２,０１６,２０７,９２５ Ａ１は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と共にＬ−アスパラギンまたはＬ−アルギニンを含む噴霧乾燥または沸騰組成物を特許請求している。しかしながら、開示された組成物は単純な非化学量論的混合物であり、非晶質状態で存在する。
【０００８】
薬学的に有用な化合物の新しい結晶形態は、薬学的および／またはビタミン／医学的食品の性能プロフィールを改善する機会を提供する。それは、製剤科学者が改善された特性を有する新しい投薬形態を設計するために利用可能な材料の蓄積を広げる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の根底にある技術的課題は、当該技術分野で知られている５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩の欠点を克服する、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸を含む結晶形態の提供である。
【００１０】
さらに、新しい結晶形態はしばしば、所望の異なる物理的性質および／または生物学的特性を示し、これは、規制の承認に必要とされる純度レベルおよび均一性まで、活性化合物の製造または処方を補助し得る。
【００１１】
テトラヒドロ葉酸塩の安定性のために、貯蔵時に低い吸水性を有し、製造中に十分に乾燥させることができる化合物を提供することが常に目標である。加えて、周囲条件下で多量の水を吸収しない薬剤物質が非常に望まれている。特に、環境の相対湿度の変化による含水量の大きな変化が剤形に関して高い精度を達成することをより困難にするため、環境の相対湿度が変化したときに含水量を変化させない物質が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルを含み、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とL−バリンエチルエステルとのモル比が１：０．３〜１：３．０（モル／モル）である結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物に関する。
【００１３】
この技術的課題は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルを含む結晶塩であって、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とL−バリンエチルエステルとのモル比が１：０．３〜１：３．０（モル／モル）および／またはその水和物および／またはその溶媒和物である結晶塩によって解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルを含む結晶塩１：１（形態Ａ）の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。
【図２】５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸塩およびL−バリンエチルエステルを含む結晶塩１：１（形態Ｂ）の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。垂直矢印は、カプトン箔からの反射を示す。
【図３】５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルを含む結晶塩の動的水蒸気収着結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の固体形態は改善された薬理学的特徴を有し、したがって、改善された薬物生成物を調節および設計するための強化された可能性を提供する。当該技術分野で知られている５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の結晶性多形形態と比較して、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−バリンエチルエステルの結晶塩の水吸着は、有意に低く、変化する相対湿度条件下での吸着水の量の変化は有意にそれほど顕著ではないため、製剤中の標的剤形レベルに対する実質的に改善された制御をもたらす。
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−バリンエチルエステルの結晶塩の別の有利な態様は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の高い化学的および光学的純度が１回の結晶化工程で達成され得ることである。
【００１６】
薬物が経口投与される場合、高い速度論的溶解度を有し、改善された、そしてより速いバイオアベイラビリティーをもたらす場合、有利である。その結果、薬剤は、より容易に機能することができる。
【００１７】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸は水にほとんど溶けない。カルシウム塩（形態ＩＩＩ）の熱力学的に安定な形態は約２．５ｍｇ／ｍｌの水溶解度を示すことが知られており、準安定形態Ｉの溶解度は、室温で約１０ｍｇ／ｍｌである。特定のｐＨ条件下、特に環境のｐＨが所与の塩の平衡ｐＨより低い場合、塩は潜在的に遊離酸に不均化し、その結果、溶解度は実質的に低下する。したがって、中性〜低いｐＨ値での特許請求された塩の熱力学的溶解度は塩の不均化が遅い（難溶性遊離酸の形成）ために、アクセスできない。しかしながら、バイオアベイラビリティーは、速度論的効果によって支配される。固形の製剤を投与した後、溶解し、最初の溶解工程の後、薬物を体液で希釈し、分配する。したがって、最初に溶解した原薬は容易に希釈され輸送されるため、速度論的溶解度はバイオアベイラビリティーに影響を及ぼす重要なパラメータである。５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンの塩については、驚くべきことに、既知のカルシウム塩（準安定形態I）に対して、速度論的溶解度が約５０％改善されることが見出された。カルシウム塩の熱力学的に安定な形態（形態III）に対する本発明の塩の速度論的溶解度の差は、おそらくさらに大きいであろう。したがって、一時的にはるかに高い原薬濃度を達成することができる。
【００１８】
好ましくは、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とL−バリンエチルエステルのモル比が１：０．５〜１：２．５（モル／モル）である。
【００１９】
さらにより好ましくは、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とL−バリンエチルエステルのモル比が１：０．７５〜１：１．２５（モル／モル）である。
【００２０】
最も好ましくは、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とL−バリンエチルエステルの比が約１：１（モル／モル）および／またはその水和物および／またはその溶媒和物である。
【００２１】
好ましくは、本発明の塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの結晶塩であり、５．８、６．９、１４．０、１９．０、１９．３、２２．２および２５．９（形態Ａ）に位置するピークから選択される少なくとも1つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する。
【００２２】
より好ましくは、本発明の塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの結晶塩であり、５．８、６．９、１４．０、１９．０、１９．３、２２．２および２５．９（形態Ａ）に位置するピークから選択される少なくとも３つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有し、さらにより好ましくは本発明の塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの結晶塩であり、５．８、６．９、１４．０、１９．０、１９．３、２２．２および２５．９（形態Ａ）に特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する。
【００２３】
さらにより好ましくは、本発明の塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの結晶塩であり、５．８、６．９、１２．６、１４．０、１４．９、１７．５、１８．０、１９．０、１９．３、２０．０、２２．２および２５．９に位置する以下のピークから選択される少なくとも１つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）。
【００２４】
最も好ましくは、本発明の塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの結晶塩であり、実質的に図１に示されるようなＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）。
【００２５】
好ましくは、本発明の塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの結晶塩であり、４．９、７．４、８．５、１４．１、１５．８、１６．３、１７．２、１８．６、２２．２および２４．５に位置するピークから選択される少なくとも1つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）。
【００２６】
より好ましくは本発明の塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの結晶塩であり、４．９、７．４、８．５、１４．１、１５．８、１６．３、１７．２、１８．６、２２．２および２４．５に位置するピークから選択される少なくとも３つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有し、より好ましくは本発明の塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの結晶塩であり、４．９、７．４、８．５、１４．１、１５．８、１６．３、１７．２、１８．６、２２．２および２４．５（形態Ｂ）にピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）。
【００２７】
さらにより好ましくは、本発明の塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの結晶塩であり、４．９、７．４、８．５、１４．１、１５．８、１７．２、１８．４、１８．６、１８．６、２０．３、２０．９、２１．１、２２．２、２４．５および２５．７に位置するピークから選択される少なくとも1つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有し（形態Ｂ）、最も好ましくは本発明の塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの結晶塩であり、実質的に図２に示されるようなＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）。
【００２８】
さらにより好ましくは、前述の結晶塩が、少なくとも９９重量％以上の化学的および／または立体異性的純度を有する。
【００２９】
本発明のさらなる側面は、５−メチル−（６Ｓ）テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルを含む結晶塩を製造する方法であり、以下の工程、
i) ５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸とL−バリンエチルエステルの混合物を、任意選択で適当な溶媒または溶媒の混合物中で、準備する工程、
ii) 塩基を、任意選択で適切な溶媒または溶媒の混合物中で、添加して化合物を溶解させる工程、
iii) 組成物を少なくとも６０℃に加熱し、任意選択で清澄濾過を行う工程、
iv) 混合物を結晶化させ、１℃〜３０℃の間の温度に冷却し、任意選択でより多くの溶媒または溶媒の混合物を添加する工程、
v) 得られた固体物質を単離し、任意選択で生成物を乾燥させる工程、
を含む方法である。
【００３０】
好ましくは、工程i）における５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステル塩酸塩のモル比は１：１〜１：３の範囲である。
【００３１】
より好ましくは、溶媒は水である。
【００３２】
工程iii）および／またはiv）において、種結晶を添加してもよい。
【００３３】
好ましくは、L−バリンエチルエステルは、L−バリンエチルエステル塩酸塩として使用される。
【００３４】
また、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルを含む結晶塩、および任意選択で１以上の許容される賦形剤を含む、医薬組成物、食品添加物および／または調製物は、本発明の一部である。
【００３５】
医薬組成物は、錠剤、カプセル、経口液体調製物、粉末、凍結乾燥物、顆粒、ロゼンジ、再構成可能な粉末、注射可能または注入可能な溶液または懸濁液または坐剤の形態であり得る。
【００３６】
医薬組成物は少なくとも1つの追加の治療薬をさらに含んでもよく、好ましくは経口、非経口、筋肉内、脊髄内、髄腔内、歯周、局所または直腸投与の医薬組成物である。
【００３７】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルを含む結晶塩を、薬物の製造のための成分として、および／または食品添加物として使用することもまた、本発明に包含される。
【００３８】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルを含む結晶塩は、貧血、神経管欠損、心血管疾患、うつ病、認知障害、アルツハイマー病および骨粗鬆症のホモシステイン低下、ならびに／または低血漿および／または低赤血球および／または低脳脊髄液および／または低末梢もしくは中枢神経系葉酸の食事管理に使用することができる。
【００３９】
要約すると、本発明の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの結晶塩によって提供される特性のプロフィールは、薬剤または食品添加物としての使用に有利である。特に、２０％〜７５％の相対湿度の環境における水分含量の低い変化は、当業者によっては予見することができなかった。
【００４０】
さらに、速度論的溶解度はより大きく、これはまた、当業者によって予想され得なかった。
【実施例】
【００４１】
粉末Ｘ線回折
Ｍｙｔｈｅｎ１Ｋ検出器を備えたStoe Stadi P；Cu−Ｋα１放射線；標準測定条件：伝送； ４０ ｋＶおよび４０ｍＡ管出力；湾曲Ｇｅモノクロメーター；０．０２°２θステップサイズ、４８秒ステップ時間、１．５〜５０．５°２θ走査範囲；検出器モ−ド：ステップ走査；１°２θ検出器ステップ；標準試料調製：１０〜２０ｍｇ試料を２つのアセテートフォイルの間に置く；試料ホルダー： Stoe透過試料ホルダー；測定中に試料を回転させた。全ての試料の調製および測定は、周囲空気雰囲気中で行った。
【００４２】
ＴＧ−ＦＴＩＲ
熱重量測定は、Bruker FTIR分光計ベクタ−２２（ピンホールを有する試料パン、Ｎ２大気、熱速度１０ Ｋ／分）に連結したNetzsch Thermo−Microbalance TG ２０９を用いて行った。
ＤＶＳ
ＤＶＳ測定は、代表的には、ＰｒｏＵｍｉｄ(以前の"Projekt Messtechnik")、August-Nagel-Str.23, 89079 Ulm (ドイツ）製のＳＰＳ１１−１００n "Sorptions Prufsystem"を用いて実施した。
DVS測定は以下のように行った：試料を微量天秤の上のアルミニウムホルダー上に置き、所定の湿度プログラムを開始する前に５０％ ＲＨで平衡化させた：
(1)  ５０％一定相対湿度（RH）に２時間保ち、次いで、
(2)  毎時５％の割合でＲＨを９５％に上げ、
(3)  ＲＨを９５％に５時間維持し、
(4)  毎時５％の割合でRHを０％に低減し、
(5)  ＲＨを０％に５時間維持し、
(6)  毎時５％の割合でＲＨを９５％に上げ、
(7)  ＲＨを９５％に５時間維持し、
(8)  毎時５％の割合でＲＨを０％に低減し、
(9)  ＲＨを0％に５時間維持し、
(10) 毎時５％の割合でＲＨを５０％まで上げ、
(11) ＲＨを５０％に約１時間維持した。
【００４３】
実施例１：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリン−エチルエステルの塩のシーディングなしの調製
４７８mgの５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸一水和物を室温で２．００mLの１．００モル水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、５４６mgのL−バリンエチルエステル塩酸塩を添加した。溶液を室温で約２０分間撹拌し、０．３００mLの１．００モル塩酸水溶液を添加した。撹拌しながら、溶液は徐々に濃厚な懸濁液に変化した。１．００mLの水を加え、懸濁液を超音波処理した。追加の０．３００mLの1モル塩酸水溶液を添加し、懸濁液を再び超音波処理した。懸濁液を室温で約７０分間撹拌し、周囲条件下での遠心濾過によって固体物質を分離した。０．５mLの水を、濾過遠心分離装置中の湿った固体材料に添加し、遠心分離を繰り返した。この洗浄工程を、それぞれ０．５０mLおよび１．００mLの水を用いてさらに２回繰り返した。湿った濾過ケーキをフリットガラス濾過に移し、周囲空気（約２２℃／約３４％ r.h.)をガラス濾過に通して約２０分間引くことによって空気乾燥させた。乾燥した物質を１H−ＮＭＲで調べ、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸・L−バリンエチルエステル１：１塩として同定した。ＴＧ−ＦＴＩＲによるサンプルの分析は、約０．５％の含水率を示した。粉末Ｘ線回折を実施し、実質的に図１に示すようなL−バリンエチルエステル塩の形態ＡのＰＸＲＤパターンを得た。
【００４４】
実施例２：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの塩の真空乾燥
実施例１による結晶性材料約１１２mgを室温および約１０mbarで約１時間真空乾燥し、続いて周囲空気を用いて換気した（約２２℃／約２３％r.h.)。ＴＧ−ＦＴＩＲによるサンプルの分析は、約０．３％の含水率を示した。
【００４５】
サンプルのアリコートを、室温および約２５％相対湿度でＰＸＲＤのための２つのアセテート箔の間に調製する。粉末Ｘ線回折を行い、図１に示すように、L−バリンエチルエステル塩形態ＡのＰＸＲＤパターンを得たが、これは表１に列挙した２θ角でピークを示した。
【００４６】
【表１−１】
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【００４７】
【表１−２】
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【００４８】
実施例３：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの塩の水和物形成
実施例1に従って製造した結晶性材料約１００mgを室温および７５％相対湿度で１４日間貯蔵した。試料のアリコートを、室温および約５５％相対湿度で２つのカプトン箔の間でＰＸＲＤのために調製した。粉末Ｘ線回折を実施し、図２に示すように、L−バリンエチルエステル塩の形態ＢのＰＸＲＤパターンを得たが、これは表２に列挙した２θ角でピークを示した。
【００４９】
【表２−１】
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【００５０】
【表２−２】
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【００５１】
実施例４：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリン−エチルエステルの塩の調製
４．７８gの５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸一水和物（分析９４．６％、（６Ｓ）−含有量９７．６％）を室温で２０．０mLの１．０モル水酸化ナトリウム水溶液に溶解した。５．４７gのL−バリンエチルエステル塩酸塩を添加した。この溶液に、１．０モルの塩酸水溶液３．０mLを加えた。撹拌しながら、溶液は徐々に軽い懸濁液に変化した。さらに２．０mLの１．０モルの塩酸水溶液を０．５mLずつ添加した。実施例1で得られたように、軽い懸濁液に結晶を播種した。さらに１．０モルの塩酸水溶液１．０mLを加えた。固体物質を濾過により分離し、３．０mLの水で洗浄した。受け取った固体を３６℃／０〜１０mbarで乾燥した。乾燥した物質（２．６１g、４３％修正分析収率に相当）をＰＸＲＤおよびHPLCによって調べた。５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の分析は７４．８％w／wであった。ほぼ図１に示すような粉末Ｘ線回折パターン（形態Ａ）が得られた。ＨＰＬＣは９９．９％の（６Ｓ）−含有量を示した。
実施例５：吸湿性および含水量（DVS実験）
実施例２による５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの塩２１mgを、DVS測定のためにアルミニウムサンプルパンに秤量した。DVS測定は、ProUmid、August-Nagel-Str. 23, 89079 Ulm (ドイツ）製のSPS11-100n「Sorptions Prufsystem」を用いて行った。相対湿度（ＲＨ）スキャンでは、１時間当たり５％の変化率を使用した。試料パンを装置に入れ、以下の工程に従って、規定の相対湿度変化プログラムを開始した：
(1) ＲＨを５０％で２時間維持し、次いで
(2) 毎時５％の速度でＲＨを５０ →０％へ走査し、ＲＨを０％で５時間維持し、次いで
(3) 毎時５％の速度でＲＨを０→７５％へ走査し、ＲＨを５時間７５％に維持し、次いで
(4) 毎時５％の速度でＲＨを７５→０％へ走査し、ＲＨを０％で５時間維持し、次いで
(5) 毎時５％の速度でＲＨを０→７５％へ走査し、ＲＨを５時間７５％に維持し、次いで
(6) 毎時５％の速度でＲＨを７５→０％へ走査し、ＲＨを０％で２時間維持する。
【００５２】
これと並行して、対照としてカルシウム塩のサンプルに全く同じプロトコールを適用し、その結果を図３に示す。相対湿度０〜５５％の範囲内で、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびＬ−バリンエチルエステルの塩（実線）の相対サンプル質量は１％未満しか変化しないが、カルシウム塩（破線）の相対サンプル質量は約６％変化した。
【００５３】
実施例６：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびL−バリンエチルエステルの結晶塩の速度論的溶解度
実施例２による結晶性５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸L−バリンエチルエステル塩（形態Ａ）の無水形態４２．５mgを、スクリューキャップ付きの７mLガラスバイアル中に秤量した。２．００mLの精製／脱イオン水（例えば、ガスクロマトグラフィー用水）を、調整可能な容量ピペットを用いて固体に添加した。混合物を室温で１分間激しく撹拌した。１分後、希釈懸濁液が観察され、試料の大部分が溶解したことが示唆された。希釈懸濁液を遠心濾過によって濾過し、水溶液１．５０mLを風袋を量ったガラスバイアル（約１０mL容量）に移した。水を空気乾燥機中で４０℃で約１５時間、次いで５０℃で約８時間蒸発させ、続いて５０℃で真空下（１０〜２０mbar）で約１３時間乾燥を完了させた。溶解度は、固体残渣の重量評価によって決定した。溶解度は、１mL当たり１２．５mgの５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸であった。
参考例１：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の速度論的溶解度
無水形態の結晶性５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩４２．５mgを、スクリューキャップ付きの７mLガラスバイアル中に秤量した。２．００mLの精製／脱イオン水（例えば、ガスクロマトグラフィー用水）を、調整可能な容量ピペットを用いて固体に添加した。混合物を室温で１分間激しく撹拌した。１分後、懸濁液が観察された。懸濁液を遠心濾過によって濾過し、１．５０mLの水溶液を風袋を量ったガラスバイアル（約１０mL容量）に移した。水を空気乾燥機中で４０℃で約１５時間、次いで５０℃で約８時間蒸発させ、続いて５０℃で真空下（10〜20mbar）で約１３時間乾燥を完了させた。溶解度は、固体残渣の重量評価によって決定した。溶解度は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸９．０mg／mLであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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