(57)【要約】乾燥種子からの成熟した胚外植片へ送達するための、１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードする配列を含む組換えＤＮＡコンストラクトによりコーティングされたか、それらにより処理されたか、またはそれらを適用されたマイクロプロジェクタイル粒子を含む、植物中のゲノム編集及び部位指向性組込みのための組成物が提供される。開示される組成物を使用する、植物の少なくとも１つの細胞中のゲノム編集及び部位指向性組込みのための方法、ならびに開示される方法によって産生される、編集されたゲノムまたは部位指向性組込みを含む植物、植物の部分、及び種子がさらに提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物のゲノムを編集する方法であって、
ａ）部位特異的ヌクレアーゼをコードする配列を含み、前記配列が植物発現可能なプロモーターへ作動可能に連結された、組換えＤＮＡコンストラクトを成熟した植物胚外植片へ送達すること；及び
ｂ）前記成熟した植物胚外植片から植物を再生し、前記再生植物が、前記再生植物の少なくとも１つの細胞の前記ゲノム中で前記部位特異的ヌクレアーゼの標的部位でまたはその付近で編集または部位指向性組込みを含むこと、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記組換えＤＮＡコンストラクトが、細菌媒介性形質転換経由で前記成熟した植物胚外植片へ送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組換えＤＮＡコンストラクトが、アグロバクテリウム媒介性形質転換経由で前記成熟した植物胚外植片へ送達される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組換えＤＮＡコンストラクトを含むＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターが、前記成熟した植物胚外植片へ送達される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記組換えＤＮＡコンストラクトが、粒子衝撃経由で前記成熟した植物胚外植片へ送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組換えＤＮＡコンストラクトによりコーティングされたかまたはそれらを適用された粒子が、粒子衝撃経由で前記成熟した植物胚外植片へ送達される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記粒子が、タングステン粒子、白金粒子または金粒子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記粒子が、約０．５μｍ〜約１．５μｍの間のサイズを有する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記粒子が、約０．６μｍ、約０．７μｍ、または約１．３μｍサイズを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換えＤＮＡ分子によりコーティングされたかまたはそれらを適用された複数の粒子が、粒子衝撃経由で前記成熟した植物胚外植片へ送達される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記外植片へ送達される粒子の量が、約５０μｇ〜約５０００μｇの間、または約５０μｇ〜約５０００μｇの間、または約５０μｇ〜約２０００μｇの間、または約５０μｇ〜約１０００μｇの間、または約５０μｇ〜約５００μｇの間、または約１００μｇ〜約５００μｇの間である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｃ）前記部位特異的ヌクレアーゼの標的部位でまたはその付近で前記編集または部位指向性組込みを含む少なくとも１つの細胞を有する再生植物を同定すること、
をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記同定ステップが、前記編集または部位指向性組込みを有する再生植物を、表現型または形質に基づいて同定することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記同定ステップが、前記編集または部位指向性組込みを有する再生植物を、分子アッセイに基づいて同定することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、リボヌクレオタンパク質である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記粒子が、ガイドＲＮＡによりさらにコーティングされるかまたはそれらをさらに適用される、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ１、Ｃｓｘ１２、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、ＣａｓＺ、もしくはアルゴノートタンパク質、またはそれらのホモログもしくは修飾バージョンである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１タンパク質である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ガイド型ヌクレアーゼではない、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、リコンビナーゼ、トランスポゼース、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記送達ステップが、第２の組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子を前記成熟した植物胚外植片へ送達することをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記粒子が、第２の組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子によりさらにコーティングされるかまたはそれらをさらに適用される、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子が、ドナー鋳型である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ドナー鋳型が、前記部位特異的ヌクレアーゼの標的部位でまたはその付近で前記植物の前記ゲノム中に突然変異を鋳型媒介性修復を介して導入するための前記突然変異を含む相同配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ドナー鋳型が、前記部位特異的ヌクレアーゼの標的部位でまたはその付近で前記植物の前記ゲノムの中へ挿入配列を組み込むための前記挿入配列及び少なくとも１つの相同配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記挿入配列が、植物で発現可能なプロモーターへ作動可能に連結された、コーディング配列または転写可能ＤＮＡ配列を含む導入遺伝子を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記導入遺伝子が、関心の遺伝子を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記導入遺伝子が、タンパク質コーディング配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記導入遺伝子が、非コーディングＲＮＡ分子をコードする転写可能ＤＮＡ配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記導入遺伝子が、マーカー遺伝子を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２の組換えＤＮＡ分子が、マーカー遺伝子を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記マーカー遺伝子が、選択可能マーカー遺伝子である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記選択可能マーカー遺伝子が、アデニリルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ、ｈｐｈまたはａｐｈ  ＩＶ）、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子、またはジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）遺伝子、またはビアラホス耐性（ｂａｒ）もしくはホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｔ）遺伝子を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記選択可能マーカー遺伝子が、アデニリルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記マーカー遺伝子が、スクリーニング可能なマーカー遺伝子である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記スクリーニング可能なマーカー遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子またはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２の組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子が、ドナー鋳型領域、及びコーディング配列または転写可能ＤＮＡ配列を含む導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子が、前記第２の組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子の前記ドナー鋳型領域の外側に所在する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項４０】
前記第２の組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子が、ガイドＲＮＡをコードする転写可能ＤＮＡ配列を含み、前記転写可能ＤＮＡ配列が、植物で発現可能なプロモーターへ作動可能に連結される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項４１】
前記組換えＤＮＡコンストラクトが、マーカー遺伝子をさらに含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記マーカー遺伝子が、選択可能マーカー遺伝子である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記選択可能マーカー遺伝子が、アデニリルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ、ｈｐｈまたはａｐｈ  ＩＶ）、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子、またはジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）遺伝子、またはビアラホス耐性（ｂａｒ）もしくはホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｔ）遺伝子を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記選択可能マーカー遺伝子が、アデニリルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記マーカー遺伝子が、スクリーニング可能なマーカー遺伝子である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記スクリーニング可能なマーカー遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子またはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記組換えＤＮＡコンストラクトが、ガイドＲＮＡをコードする転写可能ＤＮＡ配列をさらに含み、前記転写可能ＤＮＡ配列が、第２の植物で発現可能なプロモーターへ作動可能に連結される、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記組換えＤＮＡコンストラクトが、ドナー鋳型領域をさらに含む、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ドナー鋳型領域が、前記部位特異的ヌクレアーゼの標的部位でまたはその付近で前記植物の前記ゲノム中に突然変異を鋳型媒介性修復を介して導入するための前記突然変異を含む相同配列を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ドナー鋳型領域が、前記部位特異的ヌクレアーゼの標的部位でまたはその付近で前記植物の前記ゲノムの中へ挿入配列を組み込むための前記挿入配列及び少なくとも１つの相同配列を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記挿入配列が、植物で発現可能なプロモーターへ作動可能に連結された、コーディング配列または転写可能ＤＮＡ配列を含む導入遺伝子を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記導入遺伝子が、関心の遺伝子を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記導入遺伝子が、タンパク質コーディング配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記導入遺伝子が、非コーディングＲＮＡ分子をコードする転写可能ＤＮＡ配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記導入遺伝子が、マーカー遺伝子を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
ｄ）マーカー遺伝子を有する再生植物を選択し、前記マーカー遺伝子が前記組換えＤＮＡ分子と共に共送達されること、
をさらに含む、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記マーカー遺伝子が、選択可能なマーカー遺伝子である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記選択ステップが、前記成熟した胚外植片、または芽及び／または根の培養物、あるいはそれらから再生した小植物を選択薬剤により処理することを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記選択可能マーカー遺伝子が、アデニリルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記植物が双子葉植物である、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記植物がダイズ植物である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記成熟した胚外植片が、前記送達ステップの前に、以下の：（ｉ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｉｉ）導入遺伝子もしくはマーカー遺伝子を含むポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）非コーディングＲＮＡ分子もしくはガイドＲＮＡをコードする導入遺伝子を含むポリヌクレオチド、及び／または（ｉｖ）ドナー鋳型、のうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記成熟した胚外植片が、乾燥切除された（ｄｒｙ  ｅｘｃｉｓｅｄ）外植片である、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記成熟した胚外植片が、湿潤胚外植片、乾燥された湿潤胚外植片、または湿潤切除された（ｗｅｔ  ｅｘｃｉｓｅｄ）胚外植片である、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記成熟した胚外植片が、約３％〜約２５％の範囲内の水分含有量を有する、請求項１〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記成熟した胚外植片が、約３％〜約２５％の範囲内の水分含有量を有する植物種子から切除される、請求項１〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記送達ステップが、前記組換えＤＮＡコンストラクト及び前記第２の組換えＤＮＡコンストラクトを含むＤＮＡ分子またはベクターを前記成熟した植物胚外植片へ送達することを含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月２４日に出願された米国仮出願第６２／６７６，２２８号の利益を主張し、その全体は参照により本明細書において援用される。
【０００２】
配列表の援用
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ操作システムで４キロバイトと測定され、２０１９年５月２３日に生成されたファイル名「ＭＯＮＳ４４４ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」中に含まれる配列表は、本明細書と共に電子出願され、参照により本明細書に援用される。
【０００３】
技術分野
本開示は、ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡ分子による植物におけるゲノム編集のための組成物、及びそれらの使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
正確なゲノム編集技術は、遺伝子の発現及び機能の操作のための強力なツールであり、農業を改善する潜在能が有ると見込まれている。植物のゲノムの効果的且つ効率的な編集に使用され得る新規の組成物及び方法の開発についての継続的な必要性が、当技術分野において存在する。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本開示は、部位特異的ヌクレアーゼをコードする配列を含み、配列が植物で発現可能なプロモーターへ作動可能に連結された、組換えＤＮＡコンストラクトを成熟した植物胚外植片へ送達すること、及び成熟した植物胚外植片から植物を再生し、再生植物が、再生植物の少なくとも１つの細胞のゲノム中の部位特異的ヌクレアーゼの標的部位でまたはその付近で編集または部位指向性組込みを含むこと、を含む、植物のゲノムを編集する方法を提供する。ある特定の実施形態において、組換えＤＮＡコンストラクトは、細菌媒介性形質転換経由で成熟した植物胚外植片へ送達される。他の実施形態において、組換えＤＮＡコンストラクトは、アグロバクテリウム媒介性形質転換経由で成熟した植物胚外植片へ送達される。いくつかの実施形態において、組換えＤＮＡコンストラクトを含むＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターは、成熟した植物胚外植片へ送達される。
【０００６】
追加の実施形態において、組換えＤＮＡコンストラクトは、粒子衝撃経由で成熟した植物胚外植片へ送達される。いくつかの実施形態において、組換えＤＮＡコンストラクトによりコーティングされたかまたはそれらを適用された粒子は、粒子衝撃経由で成熟した植物胚外植片へ送達される。ある特定の実施形態において、粒子は、タングステン粒子、白金粒子または金粒子である。他の実施形態において、粒子は、約０．５μｍ〜約１．５μｍの間のサイズを有する。さらに他の実施形態において、粒子は、約０．６μｍ、約０．７μｍ、または約１．３μｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、組換えＤＮＡ分子によりコーティングされたかまたはそれらを適用された複数の粒子は、粒子衝撃経由で成熟した植物胚外植片へ送達される。ある特定の実施形態において、外植片へ送達される粒子の量は、約５０μｇ〜約５０００μｇの間、または約５０μｇ〜約５０００μｇの間、または約５０μｇ〜約２０００μｇの間、または約５０μｇ〜約１０００μｇの間、または約５０μｇ〜約５００μｇの間、または約１００μｇ〜約５００μｇの間である。
【０００７】
ある特定の実施形態において、方法は、部位特異的ヌクレアーゼの標的部位でまたはその付近で編集または部位指向性組込みを含む少なくとも１つの細胞を有する再生植物を同定することを、さらに含む。いくつかの実施形態において、同定ステップは、編集または部位指向性組込みを有する再生植物を、表現型または形質に基づいて同定することを含む。他の実施形態において、同定ステップは、編集または部位指向性組込みを有する再生植物を、分子アッセイに基づいて同定することを含む。
【０００８】
さらなる実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、ガイド型ヌクレアーゼ（ｇｕｉｄｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質等）である。他の実施形態において、粒子は、ガイド核酸によりさらにコーティングされるかまたはそれらをさらに適用される。いくつかの実施形態において、ガイド型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ１、Ｃｓｘ１２、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、ＣａｓＺ、もしくはアルゴノートタンパク質、またはそれらのホモログもしくは修飾バージョンである。さらに他の実施形態において、ガイド型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質である。さらに別の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からである。追加の実施形態において、ガイド型ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１タンパク質である。ある特定の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、ガイド型ヌクレアーゼではない。いくつかの実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、リコンビナーゼ、トランスポゼース、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。
【０００９】
ある特定の実施形態において、送達ステップは、第２の組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子を成熟した植物胚外植片へ送達することを、さらに含む。いくつかの実施形態において、粒子は、第２の組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子によりさらにコーティングされるかまたはそれらをさらに適用される。追加の実施形態において、第２の組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子は、ドナー鋳型である。他の実施形態において、ドナー鋳型は、部位特異的ヌクレアーゼの標的部位でまたはその付近で植物のゲノム中に突然変異を鋳型媒介性修復を介して導入するための突然変異を含む相同配列を含む。さらに他の実施形態において、ドナー鋳型は、部位特異的ヌクレアーゼの標的部位でまたはその付近で植物のゲノムの中へ挿入配列を組み込むための挿入配列及び少なくとも１つの相同配列を含む。
【００１０】
特定の実施形態において、挿入配列は、植物で発現可能なプロモーターへ作動可能に連結された、コーディング配列または転写可能ＤＮＡ配列を含む導入遺伝子を含む。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、関心の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、タンパク質コーディング配列を含む。他の実施形態において、導入遺伝子は、非コーディングＲＮＡ分子をコードする転写可能ＤＮＡ配列を含む。さらに他の実施形態において、導入遺伝子は、マーカー遺伝子を含む。さらなる実施形態において、第２の組換えＤＮＡ分子は、マーカー遺伝子を含む。ある特定の実施形態において、マーカー遺伝子は、選択可能マーカー遺伝子である。いくつかの実施形態において、選択可能マーカー遺伝子は、アデニリルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ、ｈｐｈまたはａｐｈ  ＩＶ）、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子、またはジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）遺伝子、またはビアラホス耐性（ｂａｒ）もしくはホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｔ）遺伝子を含む。別の実施形態において、選択可能マーカー遺伝子は、アデニリルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子を含む。追加の実施形態において、マーカー遺伝子は、スクリーニング可能なマーカー遺伝子である。様々な実施形態において、スクリーニング可能なマーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子またはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を含む。
【００１１】
さらなる実施形態において、第２の組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子は、ドナー鋳型領域、及びコーディング配列または転写可能ＤＮＡ配列を含む導入遺伝子を含み、導入遺伝子は、第２の組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子のドナー鋳型領域の外側に所在する。いくつかの実施形態において、第２の組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子は、ガイド核酸をコードする転写可能ＤＮＡ配列を含み、転写可能ＤＮＡ配列は、植物で発現可能なプロモーターへ作動可能に連結される。ある特定の実施形態において、組換えＤＮＡコンストラクトは、マーカー遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態において、マーカー遺伝子は、選択可能マーカー遺伝子である。様々な実施形態において、選択可能マーカー遺伝子は、アデニリルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ、ｈｐｈまたはａｐｈ  ＩＶ）、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子、またはジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）遺伝子、またはビアラホス耐性（ｂａｒ）もしくはホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｔ）遺伝子を含む。別の実施形態において、選択可能マーカー遺伝子は、アデニリルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子を含む。他の実施形態において、マーカー遺伝子は、スクリーニング可能なマーカー遺伝子である。さらに他の実施形態において、スクリーニング可能なマーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子またはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、組換えＤＮＡコンストラクトは、ガイド核酸をコードする転写可能ＤＮＡ配列をさらに含み、転写可能ＤＮＡ配列は、第２の植物で発現可能なプロモーターへ作動可能に連結される。他の実施形態において、組換えＤＮＡコンストラクトは、ドナー鋳型領域をさらに含む。ある特定の実施形態において、ドナー鋳型領域は、部位特異的ヌクレアーゼの標的部位でまたはその付近で植物のゲノム中に突然変異を鋳型媒介性修復を介して導入するための突然変異を含む相同配列を含む。さらに他の実施形態において、ドナー鋳型領域は、部位特異的ヌクレアーゼの標的部位でまたはその付近で植物のゲノムの中へ挿入配列を組み込むための挿入配列及び少なくとも１つの相同配列を含む。さらに別の実施形態において、挿入配列は、植物で発現可能なプロモーターへ作動可能に連結された、コーディング配列または転写可能ＤＮＡ配列を含む導入遺伝子を含む。追加の実施形態において、導入遺伝子は、関心の遺伝子を含む。特定の実施形態において、導入遺伝子は、タンパク質コーディング配列を含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、非コーディングＲＮＡ分子をコードする転写可能ＤＮＡ配列を含む。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、マーカー遺伝子を含む。
【００１３】
追加の実施形態において、方法は、マーカー遺伝子を有する再生植物を選択し、マーカー遺伝子が組換えＤＮＡ分子と共に共送達されることを、さらに含む。いくつかの実施形態において、マーカー遺伝子は、選択可能マーカー遺伝子である。他の実施形態において、選択ステップは、成熟した胚外植片、または芽及び／または根の培養物、あるいはそれらから再生した小植物を選択薬剤により処理することを含む。ある特定の実施形態において、選択可能マーカー遺伝子は、アデニリルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子である。
【００１４】
複数の実施形態は、ａ）１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードする配列を含み、配列が植物で発現可能なプロモーターへ作動可能に連結された、組換えＤＮＡコンストラクトを成熟した植物胚外植片へ送達すること；及びｂ）成熟した植物胚外植片から植物を再生し、再生植物が、再生植物の少なくとも１つの細胞のゲノム中の標的部位でまたはその付近で編集または部位指向性組込みを含むこと、を含む、植物のゲノムを編集する方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、標的部位でまたはその付近で編集または部位指向性組込みを含む少なくとも１つの細胞を有する再生植物を同定することを、さらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、マーカー遺伝子を有する再生植物を選択し、マーカー遺伝子が組換えＤＮＡ分子と共に共送達されることを、さらに含む。いくつかの実施形態において、組換えＤＮＡコンストラクトは、細菌媒介性形質転換経由で成熟した植物胚外植片へ送達される。いくつかの実施形態において、組換えＤＮＡコンストラクトは、アグロバクテリウム媒介性形質転換経由で成熟した植物胚外植片へ送達される。いくつかの実施形態において、組換えＤＮＡコンストラクトは、Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクター中で、成熟した植物胚外植片へ送達される。いくつかの実施形態において、組換えＤＮＡコンストラクトは、粒子衝撃経由で成熟した植物胚外植片へ送達される。いくつかの実施形態において、粒子は、タングステン粒子、白金粒子または金粒子である。いくつかの実施形態において、粒子は、約０．５μｍ、約０．６μｍ、約０．７μｍ、約０．８μｍ、約０．９μｍ、約１μｍ、１．１μｍ、約１．２μｍ、約１．３μｍ、約１．４μｍ、または１．５μｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、粒子は、第２の組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子によりさらにコーティングされるかまたはそれらをさらに適用される。いくつかの実施形態において、第２の組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子は、ドナー鋳型である。
【００１５】
ある特定の実施形態において、植物は双子葉植物である。特定の実施形態において、植物はダイズ植物である。他の実施形態において、植物は単子葉植物である。追加の実施形態において、成熟した胚外植片は、送達ステップの前に、以下の：（ｉ）ガイド核酸、（ｉｉ）導入遺伝子もしくはマーカー遺伝子を含むポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）非コーディングＲＮＡ分子もしくはガイド核酸をコードする導入遺伝子を含むポリヌクレオチド、及び／または（ｉｖ）ドナー鋳型、のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態において、成熟した胚外植片は、乾燥切除された外植片である。他の実施形態において、成熟した胚外植片は、湿潤胚外植片、乾燥された湿潤胚外植片、または湿潤切除された（ｗｅｔ  ｅｘｃｉｓｅｄ）胚外植片である。さらに他の実施形態において、成熟した胚外植片は、約３％〜約２５％の範囲内の水分含有量を有する。さらに別の実施形態において、成熟した胚外植片は、約３％〜約２５％の範囲内の水分含有量を有する植物種子から切除される。さらなる実施形態において、送達ステップは、組換えＤＮＡコンストラクト及び第２の組換えＤＮＡコンストラクトを含むＤＮＡ分子またはベクターを成熟した植物胚外植片へ送達することを含む。
【００１６】
図面の簡単な説明
以下の図面は、本明細書の一部分を形成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本開示は、本明細書において提示される具体的な実施形態の詳細な記載と組み合わせて、これらの図面のうちの１つまたは複数への参照によってより深く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】１１番染色体（Ｃｈ１１）及び１８番染色体（Ｃｈ１８）上のダイズにおける２つのＰＤＳ遺伝子座を、示された３つのガイドＲＮＡについての標的部位所在位置と共に示す図解である。
【００１８】
【図１Ｂ】ｇｕｓマーカー遺伝子及びａａｄＡマーカー遺伝子、Ｃａｓ９ヌクレアーゼならびにガイドＲＮＡのために発現カセットを有するベクターから切除されたＮｏｔＩ／Ｉ−ＣｅｕＩ制限断片を示す図解であり、それは外植片の粒子衝撃のために使用されて、ＰＤＳ遺伝子座位内の標的部位でゲノム編集を生成する。
【００１９】
【図１Ｃ】ＰＤＳ遺伝子座の中への、完全なＮｏｔＩ／Ｉ−ＣｅｕＩ制限断片の挿入についての異なる可能な向きを、各々の向きについて示されるＰＣＲプライマー（３９６５、３９６６、２４３８及び４００５）についての結合部位と共に示す図解である。
【００２０】
【図２】異なるプライマーペア（３９６５及び４００５または３９６６及び４００５）を使用して生成されたＰＣＲ産物を示すゲルの画像であり、試験した編集されたサンプルの中での、２つの部位指向性組込み（ＳＤＩ）事象（事象＃２０及び事象＃４８）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
ゲノム編集技術を使用する遺伝子機能分析及び作物改良は、農業の改善において非常に見込みがある。ゲノム編集試薬はＤＮＡの形態で培養可能な植物細胞へ送達されるが、ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡを成熟した植物胚外植片へ送達して、編集された植物を再生または発生させることは、記載されていない。ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡにより形質転換された植物細胞及び組織は、再生能が限定される可能性があり、多くの植物の遺伝資源はこれらの培養方法に適していないかもしれない。実際、多くの作物植物及び栽培品種は、カルス組織、懸濁培養物、またはプロトプラストを効果的に形成することができない。したがって、既存のゲノム編集方法は、外植片のタイプ及び培養の要求性に応じて、種依存的及び遺伝子型依存的である場合があり、多くの事例において、農業経済学的に重要な作物のあまり商業的でない遺伝資源及び栽培品種に限定され、それらは、所望される遺伝的背景の中へゲノム編集または部位指向性組込みを移入するために、有望ドナー系統との複数ラウンドの戻し交配を要求する。
【００２２】
本開示は、細菌媒介性形質転換経由で送達され得るかまたは外植片への微粒子銃送達のために粒子の上へコーティングされ得る、ゲノム編集試薬（ヌクレアーゼタンパク質またはガイド核酸等）をコードするＤＮＡとして、成熟した胚外植片または乾燥切除された胚外植片（ＤＥＥ）の中へ、ゲノム編集試薬を送達する方法を提供することによって、当技術分野における欠損を克服する。「乾燥切除された外植片」は、成熟した乾燥種子から採取または切除された成熟した胚外植片である。植物種子は、その成熟プロセスの間に自然に乾燥する。さらに以下で記載されるように、他のタイプの外植片は、それらの処理（乾燥種子の湿潤、吸収などの後等）に依存して成熟した種子から採取または切除され得、外植片は、乾燥種子からの切除の後に湿潤、吸収などさせられ得る。編集または部位指向性組込みは、事前のカルス形成ステップ無しに、メリステムに関する組織（胚のメリステム組織等）の１つまたは複数の細胞へゲノム編集試薬（ヌクレアーゼタンパク質またはガイド核酸等）をコードするＤＮＡを送達することによって生成され得る。本方法に従って標的化された外植片の１つまたは複数の細胞の中へのゲノム編集試薬の送達の前のカルス相についての必要性を回避することによって、従来の方法による遺伝子型依存性及び種依存性は低減または排除され、それらの標的化された外植片の中へのゲノム編集試薬（ヌクレアーゼタンパク質またはガイド核酸等）をコードするＤＮＡの有効な送達が達成され得る。したがって、ゲノム編集試薬送達のために本明細書で開示される方法は、様々な植物遺伝資源（農業経済学的に重要な作物種の有望遺伝資源系統が挙げられる）へと直接的に実行することができ、それは、標的化された編集または挿入配列もしくは導入遺伝子の部位指向性組込みを含有する所望される遺伝資源の植物の直接的な再生を可能にし得る。
【００２３】
所望される編集または配列もしくは導入遺伝子の部位指向性組込みの有る乾燥切除された外植片は、本開示のゲノム編集方法に従って生成され、それは、わずかな培養ステップ及び／または再生ステップのみにより、所望される編集または部位指向性組込みを含有する成体Ｒ０植物へとむしろ正常に発生することが可能にされ得る。かかるＲ０植物は、胚発生培養またはカルス培養についての必要性無しに、外植片から発生または再生させることができる。本開示の方法によって産生されたＲ０植物における標的化された編集または部位指向性組込みは、生殖細胞系列中にさらに伝達されて、ゲノム編集されたＲ１の種子及び植物に加えて、所望される編集または部位指向性組込みを有する種子及び植物の後続する世代を産生することができる。
【００２４】
ゲノム編集試薬（ヌクレアーゼタンパク質またはガイド核酸等）の導入の前に乾燥切除された外植片を大規模に培養すること無しに、ゲノム編集されたＲ０植物を生成する能力は、本開示の方法がより迅速且つ効率的に実行されることを可能にし、したがってゲノム編集された作物植物の大スケールでの商業的な産生における実装についての潜在能力を有効にする。乾燥切除された外植片は、種子から採取され、ゲノム編集または部位指向性組込みのための標的としてほとんど直接的に使用され得る。いくつかの実施形態によれば、乾燥切除された外植片は、成熟した乾燥種子から採取され、恐らく、最少の湿潤、水和または前培養ステップのみにより編集のための標的として使用され得る。したがって、貯蔵可能な乾燥種子から乾燥切除された外植片は、ゲノム編集または挿入配列もしくは導入遺伝子の部位指向性組込みのための標的として好都合には利用され得る。乾燥切除された外植片への代替物として、「湿潤」胚外植片、または「乾燥された湿潤」胚外植片（例えばプライミングされた胚外植片または発芽した胚外植片が挙げられる）は、ゲノム編集のための標的として使用され得る。かかる「湿潤」胚外植片は、編集酵素を受理する前に湿潤、水和、吸収または他の最少の培養ステップが行われる、乾燥切除された外植片である。同様に、吸収させた種子または水和させた種子から「湿潤切除された」外植片も標的として使用され得る。「湿潤」胚外植片は、種子からの切除後に水和または吸収させられるが、「湿潤切除された」胚外植片は、既に水和させた種子または吸収させた種子から切除される。
【００２５】
Ｉ．形質転換の方法
本開示の実施形態は、植物の乾燥種子から乾燥切除された外植片（ＤＥＥ）のゲノムを編集する方法であって、外植片の少なくとも１つの細胞の中への粒子媒介性微粒子銃または細菌媒介性（例えばアグロバクテリウム媒介性）送達等の経由の形質転換のための、ドナー鋳型と共に提供され得る、ゲノム編集試薬（ヌクレアーゼタンパク質またはガイド核酸等）をコードするＤＮＡを導入して、外植片の少なくとも１つの細胞のゲノム編集または部位指向性組込みを産生することを含む、方法を提供する。本開示の方法は、１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡの送達の前に外植片を大規模に培養すること無しに、収穫した種子から乾燥切除された胚外植片を標的化することによって実行され得る。かかる外植片は貯蔵可能な乾燥種子から切除され得るか、または「湿潤」胚外植片、「乾燥された湿潤」胚外植片、もしくは「湿潤切除された」胚外植片であり得る。
【００２６】
いくつかの実施形態によれば、植物種子から切除された乾燥外植片は、ゲノム編集試薬（ヌクレアーゼタンパク質またはガイド核酸等）をコードするＤＮＡを外植片へ送達する前の限定的な時間に水性培地中で随意に前培養され得る。かかる前培養培地は、様々な塩（複数可）（例えばＭＳ基本塩、Ｂ５塩など）及び他の成分（様々な浸透圧調節物質（複数可）、糖（複数可）、抗微生物剤（複数可）など等）を含み得る。前培養培地は固体または液体であり得、１つまたは複数の植物増殖調節物質または植物ホルモン（オーキシン（複数可）、サイトカイニン（複数可）などが挙げられる）をさらに含み得る。いくつかの実施形態によれば、複数の外植片は、同じ培地または容器中で一緒に前培養され得る。例えば、２〜１００の範囲の外植片（約２５の外植片、約５０の外植片、約７５の外植片、または約１００の外植片等）は、同じ前培養培地上でまたはその中でプレーティングされ得るが、外植片のタイプ、容器のサイズ、ディッシュなどに依存して、より多くの数の外植片が一緒に前培養され得る。いくつかの実施形態によれば、前培養培地は、オーキシン（２，４−Ｄ、インドール酢酸（ＩＡＡ）、ジカンバ、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）など等）、及びサイトカイニンまたは類似する増殖調節物質（チジアズロン（ＴＤＺ）、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、ゼアチン、またはゼアチンリボシドなど等）を含み得る。かかる前培養または前培養ステップは、外植片を編集及び／または再生する能力を促進し得る。外植片からのカルス形成を回避しつつ（場合によっては延長された期間にわたって）、編集及び／または再生の成功が改善されるように、前培養培地中のオーキシン及びサイトカイニン（または類似する増殖調節物質）の相対量は制御され得るかまたはあらかじめ決定され得る。いくつかの実施形態によれば、前培養培地は、オーキシン（２，４−Ｄ等）及びサイトカイニン（ＴＤＺ等）の両方を含み得る。例えば、前培養培地中のサイトカイニン（ＴＤＺ等）の濃度は（存在するならば）、ゼロ（０）〜約５ｐｐｍの範囲（約０．３〜約４百万分率（ｐｐｍ）、約０．５〜約３ｐｐｍ、約１〜約２等）中で、または他の中間範囲の濃度内であり得る。ある特定の態様において、前培養培地中のサイトカイニンの濃度は、０、約０．１ｐｐｍ、約０．２ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ、約０．４ｐｐｍ、約０．５ｐｐｍ、約０．６ｐｐｍ、約０．７ｐｐｍ、約０．８ｐｐｍ、約０．９ｐｐｍ、約１．０ｐｐｍ、約１．２５ｐｐｍ、約１．５ｐｐｍ、約１．７５ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、約２．５ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約３．５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約４．５ｐｐｍ、または約５ｐｐｍであり得る。ＴＤＺの事例において、濃度は、好ましくは２ｐｐｍ未満、もしくは約０．７〜約１．３ｐｐｍ、もしくは約０．５〜約１ｐｐｍの範囲、または約０．３ｐｐｍもしくは約１．５ｐｐｍであり得る。ある特定の態様において、ＴＤＺの濃度は、約０．１ｐｐｍ、約０．２ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ、約０．４ｐｐｍ、約０．５ｐｐｍ、約０．６ｐｐｍ、約０．７ｐｐｍ、約０．８ｐｐｍ、約０．９ｐｐｍ、約１．０ｐｐｍ、約１．１ｐｐｍ、約１．２ｐｐｍ、約１．３ｐｐｍ、約１．４ｐｐｍ、約１．５ｐｐｍ、約１．６ｐｐｍ、約１．７ｐｐｍ、約１．８ｐｐｍ、または約１．９ｐｐｍである。オーキシン（２，４−Ｄ等）の濃度は、ゼロ（０）〜約２ｐｐｍ、もしくは約０．１ｐｐｍ〜約１ｐｐｍ、もしくは約０．１ｐｐｍ〜約０．５ｐｐｍの範囲中で、または他の中間範囲の濃度内であり得る。ある特定の態様において、オーキシンの濃度は、約０．１ｐｐｍ、約０．２ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ、約０．４ｐｐｍ、約０．５ｐｐｍ、約０．６ｐｐｍ、約０．７ｐｐｍ、約０．８ｐｐｍ、約０．９ｐｐｍ、約１．０ｐｐｍ、約１．１ｐｐｍ、約１．２ｐｐｍ、約１．３ｐｐｍ、約１．４ｐｐｍ、約１．５ｐｐｍ、約１．６ｐｐｍ、約１．７ｐｐｍ、約１．８ｐｐｍ、または約１．９ｐｐｍである。
【００２７】
前培養の培地及び／または外植片の周囲の温度に部分的に依存して、前培養ステップのための期間は変動し得る。概して、前培養ステップのための期間も制御され、約１または２時間〜約５日（約１２時間〜約６０時間または約１２時間〜約４８時間等）の範囲内で、またはその中の他の期間の範囲へ限定され得る。前培養ステップのための時間の量の限定により、植物増殖調節物質の存在にもかかわらず、カルス形成も回避することができる。最適な前培養継続期間は植物再生頻度も改善し得る。前培養ステップの間に、外植片は同じ培地で維持され得るか、または新鮮培地（複数可）へ１または複数回移行され得る。随意の前培養ステップの照明及び／または温度の条件も制御され得る。例えば、外植片は、前培養ステップの間に１６／８時間の光周期曝露へ、またはおそらく様々な他の明暗のサイクルまたは期間へ曝露され得る。代替的に、前培養ステップは、暗所または弱光の条件において実行され得る。外植片の前培養培地及び環境の温度も、約１８℃〜約３５℃、または約２５℃〜約３０℃、または約２８℃で変動し、すべての中間の範囲及び値が含まれ得る。
【００２８】
いくつかの実施形態によれば、及び前培養ステップが遂行されるかどうかにかかわらず、形質転換のために乾燥切除された外植片は、前培養及び／またはゲノム編集試薬への曝露の前の限定的な時間で水和培地または吸収培地へ随意に曝露され得る。かかる水和または水和ステップは、乾燥種子または乾燥された種子からの外植片を、編集または部位指向性組込みへより適するようにし得る。実際、水和ステップまたは吸収ステップは、形質転換の前の分離した前培養ステップ無しに遂行され得る。水和培地は水のみからなり得るか、または、１つもしくは複数の公知の浸透圧調節物質（複数可）（糖（複数可）（例えばスクロースなど）、ポリエチレングリコールなど（ＰＥＧ）等）をさらに含み得る。例えば、水和培地は、約１０％のスクロース及び／または約２０％のＰＥＧを含み得る。任意の理論により束縛されるものではないが、浸透圧調節物質は、外植片の水和速度を調節または減速し得る。他の成分も水和培地中に含まれ得る（様々な塩など等）。水和ステップのための期間は、概して短い（約２分間〜約１２時間、または約２０分間〜約６時間、または約３０分間〜約２時間、または約１時間等）だろう。外植片の発芽または少なくとも任意の観察可能な発芽もしくは発生変化が起こらないように、水和ステップまたは吸収ステップは十分に短い時間であり得る。代替的に、胚外植片は、ゲノム編集試薬の送達の前に、発芽についてプライミングされ得るか、または場合によっては発芽させられ得る。例えば、胚外植片は、湿潤によって発芽についてプライミングされ、次いで外植片を乾燥し（「乾燥された湿潤」胚外植片を産生するため）、発芽を停止することができる。さらに、「湿潤切除された」胚（水和種子または湿潤種子から切除された胚外植片）も、形質転換のための標的として使用され得る。水和ステップ（複数可）及び／または前培養ステップ（複数可）のうちの任意のものの前、その後、及び／またはその間に、様々なリンスステップも遂行され得る。
【００２９】
いくつかの実施形態によれば、水和ステップ（複数可）及び／または前培養ステップ（複数可）が形質転換の前に含まれて、特に乾燥（または乾燥された）外植片（成熟及び／または乾燥（または乾燥された）種子から採取されたもの等）のための編集を改善するが、これらのステップのいずれかまたは両方は、水分含有量及び／または編集のための標的として使用される外植片のタイプに随意に依存し得る。しかしながら、「湿潤」胚外植片または「湿潤切除された」胚外植片が、特に標的として使用される場合に、これらの外植片に十分な水和レベルまたは水分含有量を既に有し得るので、水和ステップ及び／または前培養ステップは、随意であり得、含まれないかまたは遂行されない。
【００３０】
水和ステップ（複数可）及び／または前培養ステップ（複数可）遂行されるか否かにかかわらず、外植片に、微粒子銃送達のために粒子の上へコーティングされ得るか、または形質転換のためにベクター（例えばＴ‐ＤＮＡベクター）の中へ取り込まれ得る、ゲノム編集試薬（ヌクレアーゼタンパク質またはガイド核酸等）をコードするＤＮＡ分子による形質転換を行って、少なくとも１つのゲノム編集された細胞を有する外植片を産生することができる。ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡの送達または形質転換に続いて、次いで外植片は、選択圧下で植物へと増殖、発生、再生などされて、外植片のゲノム編集された細胞（複数可）の増殖及び発生のために選択することができる。ある特定の実施形態において、１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡは、ゲノム編集された細胞の生存、増殖及び発生が対応する選択薬剤の存在下において有利であり得るように、選択可能マーカー遺伝子と共に共形質転換または共送達され得る。いくつかの実施形態によれば、１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡは、挿入配列または導入遺伝子（例えば関心の遺伝子）の部位指向性組込みのためのドナー鋳型分子と共に植物細胞のゲノムに共形質転換または共送達され得る。部位指向性組込みのためのドナー鋳型分子は、選択のためのベースとして使用され得る選択可能マーカー遺伝子をさらに含み得る。いくつかの実施形態によれば、１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡは、ガイド核酸、またはガイド核酸をコードするＤＮＡと共に共形質転換または共送達され得る。いくつかの実施形態によれば、外植片へ形質転換または送達される１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡは、ドナー鋳型配列及び／または選択可能マーカー遺伝子のうちの１つまたは複数も含み得る。
【００３１】
本開示の特定の実施形態によれば、１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡを取り込んだ形質転換ベクター、または、表面上に、当該ＤＮＡを有するかもしくは当該ＤＮＡによりコーティングされたかもしくは当該ＤＮＡを適用された粒子は、外植片の形質転換または粒子媒介性衝撃経由で標的外植片の少なくとも１つの細胞の中へ導入される。かかる粒子媒介性衝撃は、当技術分野において公知の任意の好適なパーティクルガンデバイス（ヘリウムパーティクルガン、電動パーティクルガンなど等）を利用し得る。衝撃の前に、粒子は、１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡコンストラクトまたは分子のコピー、ならびに随意にガイドＲＮＡ、マーカー遺伝子、及び／またはドナー鋳型により装填され得るか、それらを適用され得るか、あるいはそれらによりコーティングされ得る。１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡコンストラクトまたは分子は、ガイドＲＮＡ、マーカー遺伝子、及び／またはドナー鋳型をコードする配列を含み得る。粒子それ自体としては、金ビーズまたはタングステンビーズなど等の当技術分野において公知の任意の好適なタイプの粒子またはビーズが挙げられ得る。パーティクルガンのための吹き付け（ｂｌａｓｔｉｎｇ）条件は当技術分野において周知であり、様々な従来のスクリーン、破裂板などはヘリウムパーティクルガン等のために使用され得る。電動ガンは、形質転換のために必要とされる時間の量の低減で及びプロセスにおいて少ない消耗品を使用することで、いくつかの利点を提供し得る。
【００３２】
粒子衝撃のために、乾燥胚外植片は、外植片を適所に保持し、吹き付けのために適切に方向付けることが可能な、標的培地または基質の上へプレーティングされ得る。かかる標的培地または基質は、例えばゲル化剤（アガー及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等）を含有して、培地または基質の粘度を制御することができる。液体中の（水和培地、前培養培地またはリンス培地等中の）外植片のプレーティングは、外植片の伸展及びポジショニングを促進し得る。特定の実施形態に従って粒子衝撃のために標的化された外植片は、外植片のメリステムに関する組織が優先的に吹き付けの粒子を受理するようにポジショニングされ得る。例えば、外植片は、それらのメリステムが上を向くように表面上に置かれて、コーティングされた粒子を衝撃の間に優先的に受理することができる。各々の外植片は、様々な圧力、力、及び／または単回もしくは複数回でも、コーティングされた粒子により吹き付けられ得る。
【００３３】
選択可能マーカー遺伝子が１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡ配列と共に共送達される本開示の実施形態によれば、標的化された外植片は、衝撃または形質転換後に後培養の選択培地（または選択培地のシリーズ）上で（またはそれらの中で）培養されて、選択可能マーカー遺伝子を含有する外植片の細胞及び組織を可能にするかまたは選択して、植物または植物の部分（根及び／または芽等）へと再生または発生させことができる。選択可能マーカー遺伝子は、１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡ配列と共に共送達されて、選択可能マーカー遺伝子と一緒に１つまたは複数のゲノム編集試薬の発現をし得る細胞について選択することができる。概して、選択培地は、選択薬剤を含有して、外植片の少なくとも１つの細胞へ送達された選択可能マーカー遺伝子の発現に基づいて、外植片の細胞の生存、増殖、分裂増殖、及び／または発生にバイアスをかけるかまたはそれらを支援するだろう（レシピエント細胞（複数可）及びその子孫細胞中で発現された場合に、選択可能マーカー遺伝子は、選択薬剤への耐性を提供する）。いくつかの実施形態によれば、しかしながら、衝撃を受けたかまたは形質転換された外植片は選択圧にかけられなくてもよく、発生した植物または再生された植物は、標的部位での編集または突然変異の存在について最終的にスクリーニングされ得る。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、しかしながら、外植片は、標的外植片の形質転換または衝撃の直後に、第１の期間で選択薬剤を欠如する第１の後培養の休止培地上で（またはそれらの中で）随意に培養されて外植片が回復すること、及び／または選択可能マーカー遺伝子を発現し始めることが可能とされ得る。かかる休止ステップは、約１時間〜約２４時間、または約６時間〜約１８時間、または約１０時間〜約１５時間の範囲中の期間（例えば約１２時間または一晩）であり得る。編集された植物の回復は、回復のために非選択的期間を設けること（例えば休止培地上の培養）によって改善され得るが、選択があまりにも遅く（例えば衝撃後１８〜２４時間を超える時間）開始されるならば、編集された植物が回収される頻度は低下し得る。後培養培地、選択培地、または休止培地の各々は、標準的な植物組織培養培地成分（塩、糖、植物増殖調節物質など等）を含み、これらの培地上の培養は、標準的なまたは変更された温度（例えば２８℃）及び照明条件（例えば１６／８時間の光周期）で実行され得る。しかしながら、第１の後培養ステップまたは休止ステップは、編集頻度及び選択スキーム（使用される特定の選択可能マーカー遺伝子及び選択薬剤等）に依存して、選択の前に含まれるかまたは省かれ得る。
【００３５】
第１の非選択的休止培地上での外植片の任意の初期の回復及び培養に続いて、外植片は、随意に促進ステップを受け得る。これらの実施形態によれば、外植片は、浸透圧調節物質（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など等）及び／またはカルシウム含有塩化合物（硝酸カルシウム［Ｃａ（ＮＯ３）２］など等）を含む、第２の後培養培地または促進培地へ曝露される、それらの上に（またはそれらの中に）置かれるなどであり得る。例えば、硝酸カルシウムの濃度は約０．１Ｍ及びＰＥＧの濃度は約２０％であり得るが、それらの濃度は変動し得る。この促進培地も選択薬剤を欠如し得る。衝撃を受けた外植片の促進培地への曝露は、コーティングされた粒子、及び／または１つもしくは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡ及びマーカー遺伝子コンストラクト（もし使用されるならば）を、外植片細胞の中へさらに駆動するように機能し得る。外植片は、短時間の期間で（約３０分間〜約２時間の範囲または約１時間等で）のみ、促進培地中にまたはその上に置かれ、次いでリンスステップ（複数可）が続き、その後に、任意のさらなる培養ステップまたは選択ステップがあり得る。
【００３６】
上記のように、衝撃を受けた外植片または形質転換された外植片を、選択薬剤を含有する１つまたは複数の選択培地と接触させて、共形質転換のために使用された選択可能マーカー遺伝子コンストラクトの発現を有する細胞の生存、増殖、分裂増殖、及び／または発生にバイアスをかけることができる。選択可能マーカー遺伝子は概して、選択可能マーカー遺伝子が選択薬剤による選択への耐性を付与するように、選択のために使用される選択薬剤と対にされるだろう。例えば、選択可能マーカー遺伝子は、選択薬剤としてのスペクチノマイシンまたはストレプトマイシンへの耐性を付与するアデニリルトランスフェラーゼ遺伝子（ａａｄＡ）であり得る。
【００３７】
植物選択可能マーカーの遺伝子または導入遺伝子は、植物選択可能マーカー導入遺伝子により形質転換された植物細胞が、選択薬剤によって課された選択圧に耐え持ちこたえ得るように、対応する選択薬剤への耐性を付与する任意の遺伝子を含み得る。その結果として、選択可能マーカー遺伝子を受理する外植片の細胞は、選択下の増殖、分裂増殖、及び発生などに有利である。植物選択可能マーカー遺伝子は概して、選択薬剤への耐性を付与するために使用されるが、追加のスクリーニング可能なマーカーまたはレポーター遺伝子（複数可）も使用され得る。かかるスクリーニング可能なマーカーまたはレポーター遺伝子としては、例えばβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ；例えば米国特許第５，５９９，６７０号中で例えば記載される）、または緑色蛍光タンパク質及びそのバリアント（例えば米国特許第５，４９１，０８４号及び同第６，１４６，８２６号中で記載されるＧＦＰ）が挙げられ得る。植物、植物の部分、または植物細胞において検出可能な様々なスクリーニング可能なマーカーまたはレポーター遺伝子は当技術分野において公知であり、ルシフェラーゼ、他の非ＧＦＰ蛍光タンパク質、及び植物、植物の部分または種子において検出可能な表現型を付与する遺伝子（例えばフィトネネ（ｐｈｙｔｏｎｅｎｅ）シンターゼなど）等である。スクリーニング可能なマーカーの追加の例としては、その発現が形質転換された細胞の同定のための手段として検出することができる分子（複数可）の分泌を引き起こす、分泌可能マーカー（オパインシンターゼ遺伝子など等）が挙げられ得る。
【００３８】
植物選択可能マーカー遺伝子は、除草剤（グリホサート及びグルホシネート等）への耐性または抵抗性を提供または付与するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。有用な植物選択可能マーカー遺伝子は当技術分野において公知であり、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシン（例えばアデニリルトランスフェラーゼ、ａａｄＡ、またはｓｐｅｃ／ｓｔｒｅｐ）、カナマイシン（例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシンＢ（例えばハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、ｈｐｔ、ｈｐｈまたはａｐｈ  ＩＶ）、ゲンタマイシン（例えばａａｃ３及びａａｃＣ４）、及びクロラムフェニコール（例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはＣＡＴ）への抵抗性または耐性を付与する、タンパク質をコードするものが挙げられ得る。除草剤の抵抗性または耐性を付与するタンパク質をコードする公知の植物選択可能マーカー遺伝子の追加の例としては、例えば５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−リン酸（ＥＰＳＰ）シンターゼをコードする転写可能ＤＮＡ分子（グリホサート耐性のためのＥＰＳＰＳ；例えば米国特許第５，６２７，０６１号；同第５，６３３，４３５号；同第６，０４０，４９７号；及び同第５，０９４，９４５号中で記載される）；グリホサート酸化還元酵素及びグリホサート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする転写可能ＤＮＡ分子（ＧＯＸ；例えば米国特許第５，４６３，１７５号中で記載される；ＧＡＴ、米国特許公開第２００３／００８３４８０号中で記載される）；フィトエンデサチュラーゼをコードする転写可能ＤＮＡ分子（ｃｒｔＩ；例えばノルフルラゾン耐性のための、Ｍｉｓａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，４：８３３−８４０（１９９３）及びＭｉｓａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，６：４８１−４８９（１９９４）中で記載される）；ジカンバ耐性のためのジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）遺伝子をコードする転写可能ＤＮＡ分子（例えば米国特許出願第２００３／０１１５６２６号及び同第２００３／０１３５８７９号；ならびにＢｅｈｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６（５８２８）：１１８５  ２００７）；及びグルホシネート及びビアラホス耐性のためのビアラホス抵抗性（ｂａｒ）または、ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｔ）遺伝子（例えばＤｅＢｌｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，６：２５１３−２５１９（１９８７）中で記載される）が挙げられる。
【００３９】
選択ステップ（複数可）を行うために、外植片は、選択薬剤を含有する１つまたは複数の選択培地と接触させられ得るか、またはそれらの上に（またはそれらの中に）置かれ得る。選択圧の適用に加えて、選択培地は、衝撃を受けた外植片から、芽、根及び／または植物全体の再生または発生を同時に提供し得る。代替的に、再生培地は、選択薬剤の存在無しで１つまたは複数の芽及び／または根の発生または再生のために使用され得る。再生培地及び／または選択培地は、様々な標準的な植物組織培養成分（塩（例えばＭＳまたはＢ５塩）、糖（複数可）など等）を含有し得る。再生培地及び／または選択培地は、随意に植物増殖調節物質（複数可）（オーキシン及び／またはサイトカイニン等）を含み、それは、芽及び／または根（及び最終的に全体の植物）の発生、伸長または再生を増進または援助し得る。再生ステップ（複数可）及び／または選択ステップ（複数可）は、標準的なまたは変動された温度（例えば２８℃）及び照明条件（例えば１６／８の光周期）の範囲内で実行され得る。衝撃を受けた外植片からのゲノム編集されたＲ０植物の選択培地上でのかかる発生は、大部分は発芽及び植物発生の正常なプロセスに類似し得るが、メリステムの若干の再編成は選択圧に応答して起こって、芽及び／または根ならびに成体植物の他の植物の部分が形成され得る。重要なことには、衝撃ステップまたは形質転換ステップの前にカルス相が回避されるだけではなく、外植片は、形質転換後に外植片からの胚発生カルスを形成せずに、ゲノム編集されたＲ０植物へとさらに発生または再生し得る。
【００４０】
本開示の実施形態によれば、外植片は、緑色の芽が形成されるまで、第１の選択培地（または選択培地のシリーズ）中で培養され、次いでそれは採取または切断され、新しい選択培地へ移行され得る。移行プロセスまたは継代培養プロセスは、１回または複数回（例えば２、３、４、または５回）反復されて、複数ラウンドの移行、継代培養、及び／または選択を提供し得る。選択圧下での外植片から芽の複数ラウンドの移行、継代培養、及び／または選択は、後の発生または再生されたゲノム編集されたＲ０植物の全体にわたって、ゲノム編集された細胞の数、比率、及び／または遍在を拡大または増加させ得ると考えられている。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、再生培地（それは、上で記載される選択培地のうちの１つまたは複数のもの等の選択培地でもあり得る）は、発根培地としても機能して、移行もしくは継代培養された芽（複数可）からの根（複数可）の形成及び発生を引き起こすか、またはそれらを可能にし、それは、１つまたは複数の植物増殖調節物質（複数可）（オーキシン及び／またはサイトカイニン等）を含み得る。発根培地（複数可）は各々選択培地でもあり、１つまたは複数の植物増殖調節物質に加えて選択薬剤を含み得る。衝撃を受けた外植片から発生または再生された発根小植物（選択圧下での連続的な移行または継代培養を介して）は、最終的には、ゲノム編集されたＲ０植物の継続的な発生のためにＰｌａｎｔＣｏｎ（商標）もしくは他の好適な容器及び／または鉢の土壌へ移行され、次いでゲノムに編集されたＲ１種子は、それらのゲノムに編集されたＲ０植物から収穫され得る。最初に衝撃を受けた外植片または形質転換された外植片に由来する緑色の芽の、少数のラウンドのみの選択圧下での逐次的継代培養（及び最終的な発根）は、ゲノム編集されたＲ１植物及び種子を産生する稔性のある植物へとさらに発達し得るゲノム編集されたＲ０小植物を形成するのに十分であり得る。本開示は、異なる植物遺伝資源において合理的な頻度でのゲノム編集された植物の産生を提供することによって、当技術分野における有意な進歩及び改善を示す。実際は、本開示の方法は、衝撃または形質転換のために乾燥切除された外植片を調製し、次いで衝撃を受けた外植片または形質転換された外植片からゲノム編集されたＲ０植物を発生または再生させるプロセスを通して、任意のステージでのカルス相についての必要性を回避する。本開示とは対照的に、ゲノム編集のための既存の方法は、概してより大規模な培養ステップに適する特定の外植片タイプならびに植物遺伝資源及び栽培品種に限定される。
【００４２】
本開示の実施形態によれば、１つまたは複数の選択ステップ（複数可）は単一選択培地中で遂行され得るか、またはより好ましくは選択ステップもしくは培地のシリーズにおいて実行され得る。選択培地中の選択薬剤の量または濃度は、使用される特定の選択薬剤に依存して変動し得る。例えば、選択可能マーカー遺伝子ａａｄＡのために使用されるスペクチノマイシンの量は、約５０ｐｐｍ〜約２５０ｐｐｍの範囲中、または約１００ｐｐｍもしくは約１５０ｐｐｍであり得る。いくつかの実施形態によれば、選択薬剤の量もしくは濃度は選択のための期間を通して一定のままであり得るか、または選択薬剤の量もしくは濃度は選択期間にわたってステップアップもしくは増加され得る。ステップ状アプローチは、形質転換された外植片細胞（複数可）が選択可能マーカー遺伝子のより着実な発現を達成してより強い選択圧に持ちこたえることができるまで回復するためのより多くの時間を考慮し得る。しかしながら、選択可能マーカー遺伝子の発現は初期の選択圧の時間で十分であり得、その結果、ステップ状選択アプローチは不必要だろう。いずれのアプローチによっても、外植片は、新鮮な選択培地へ周期的に移行もしくは継代培養され得るか、または、選択培地は新しい選択培地により周期的に置き換えられ新たにされ得る。いくつかの実施形態によれば、外植片は、次の培地へ移行または継代培養される前に、約数日（例えば２日または３日）〜数週間（例えば３〜４週間）、もしくは約１週間〜約３週間の範囲中、または約２週間の期間で、選択培地の各々中でまたはそれらの上で維持され得る。選択薬剤としてスペクチノマイシンの使用を伴う特異的な実施形態によれば、スペクチノマイシンの濃度は、約５０ｐｐｍ〜約５００ｐｐｍのステップ状方式で増加され得るか、または代替的に、スペクチノマイシンの量濃度は、比較的一定に（例えば約１００ｐｐｍ、約１５０ｐｐｍまたは約２００ｐｐｍで）維持され得る。
【００４３】
いくつかの実施形態によれば、ゲノム編集のための１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡは、当技術分野において公知の任意の形質転換方法を使用して、成熟した胚外植片の少なくとも１つの細胞の中へ形質転換され得る。植物の組織の中へ遺伝子を移行させるための様々な方法が公知であり、高速度マイクロプロジェクション、顕微注射、エレクトロポレーション、直接的ＤＮＡ取込み、及び細菌媒介性形質転換が挙げられる。いくつかの実施形態によれば、ゲノム編集のための１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡは、細菌媒介性形質転換経由で、成熟した胚外植片の少なくとも１つの細胞の中へ形質転換され得る。植物細胞の形質転換を媒介することが公知の細菌としては、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ科及びＲｈｉｚｏｂｉａ科の多数の種が挙げられ、それらには、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の種、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属の種、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属の種とＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ種（参照、例えばＢｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；及び米国特許出願公開第２００７／０２７１６２７号及び同第２００８／０２８０３６１号）が含まれるがこれらに限定されない。
【００４４】
ＤＮＡ分子の細菌媒介性送達（例えばアグロバクテリウム媒介性送達；例えば米国特許第５，５６３，０５５号；同第５，５９１，６１６号；同第５，６９３，５１２号；同第５，８２４，８７７号；及び同第５，９８１，８４０号も参照）は、種子（ダイズ及び他の作物種子等）から切除された胚の生きたメリステム中の細胞に行われる。メリステムに関する領域は選択薬剤の存在下において培養されて、ＤＮＡ分子により形質転換された１つまたは複数の細胞有するＲ０植物を再生し得る。芽及び／または根の形成が様々な培養培地中で起こって、１つまたは複数の外植片細胞から植物を再生することができ、それは形質転換されたメリステムに関する細胞を含み得る。
【００４５】
可能な選択薬剤としてはオーキシン様除草剤（ジカンバまたは２，４−Ｄ、ＭＣＰＡ等）、グルホシネート、アセト乳酸シンターゼ阻害物質、プロトポルフィリノーゲン酸化酵素阻害物質及びヒドロキシフェニル−ピルベート−ジオキシゲナーゼ阻害物質、ネオマイシン、カナマイシン、パラモマイシン（ｐａｒａｍｏｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、アミノグリコシド、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、ハイグロマイシンＢ、ブレオマイシン、フレオマイシン、スルホンアミド、ストレプトトリシン、クロラムフェニコール、メトトレキサート、２−デオキシグルコース、ベタインアルデヒド、Ｓ−アミノエチルＬ‐システイン、４−メチルトリプトファン、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、ベンジルアデニン−Ｎ−３−グルクロニダーゼが挙げられ得る。これらの選択薬剤に対する抵抗性を提供する選択可能マーカー遺伝子の例も、当技術分野において公知である。
【００４６】
適切に補足された場合に植物組織の増殖及び発生（切除されたメリステムまたは胚からの成熟した植物の形成が挙げられる）を支持する、多様な組織培養培地が公知である。これらの組織培養培地は、商業的な調製物として購入されるかまたはカスタム調製されるかのいずれであり得、当業者によって修飾され得る。かかる培地の例としては、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，（１９６２）；Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７５）；Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，（１９６５）；Ｕｃｈｉｍｉｙａ  ａｎｄ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，（１９６２）；Ｇａｍｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９６８）；Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）；ＭｃＣｏｗｎ  ａｎｄ  Ｌｌｏｙｄ，（１９８１）；Ｎｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｎｉｔｓｃｈ，（１９６９）；及びＳｃｈｅｎｋ  ａｎｄ  Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ，（１９７２）によって記載されるもの、またはそれに応じて補足されたこれらの培地の誘導物が挙げられるがこれらに限定されない。当業者は、関心の特定の標的作物または変種のための培地及び培地補足物（形質転換及び再生における使用のための栄養素及び増殖調節物質等）が、通常最適化されることを承知している。試薬は市販で入手可能であり、多数の供給業者から購入され得る（例えばＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、及びＰｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｈａｗｎｅｅ  Ｍｉｓｓｉｏｎ、Ｋａｎｓ．を参照）。
【００４７】
共培養及び後続のステップは、暗所条件において、または照明付きＰｅｒｃｉｖａｌインキュベーター中で、例えば１６時間の明８時間の暗の光周期で、２〜５日間遂行され得る。一実施形態において、光強度は、例えばおよそ２３〜２５℃の温度で及び約３５℃までで遂行されて正常な色素体発生を可能にする、少なくとも約５μＥ（約１０μＥまたは２５μＥを包含し、少なくとも約５ｕＥ〜約２００ｕＥの間を包含する）または他の照明条件であり得る。
【００４８】
本開示の方法は、大規模な培養についての必要性無しに１つまたは複数の衝撃を受けた外植片または形質転換された外植片からの候補のゲノム編集された植物の再生及び／または発生を可能にし、したがって１つまたは複数のゲノム編集された細胞を含む芽及び植物の同定及び増殖における効率を増加させ、所望される変種または遺伝資源のゲノム編集された植物を産生するのに必要な費用及び労力を低減する。例えば、選択マーカーを使用して推定上の形質転換体が同定された後に、小植物は、選択薬剤の存在または非存在下において、土壌中または土壌代替物上（発根培地上等）に置かれ得る。選択された外植片または再生された外植片から伸長する芽は、分子的技法を使用して、標的部位でのゲノム編集の存在についてアッセイされ得る。ゲノム編集されたＲ０植物は、ゲノム編集されたＲ１植物及び種子をさらに生じ、それらもゲノム編集された後続する子孫植物及び種子を産生し得る。ゲノム編集されたＲ０植物は、ほとんどまたは全く選択圧無しで本開示の方法によって産生され得るが、適切な選択薬剤による選択の維持は、１つまたは複数の培養ステップまたは再生ステップにわたって維持され得る。所望される標的部位で１つまたは複数のゲノム編集を有することが決定されたＲ１植物は、別の植物と交配され、ホモ接合のゲノム編集された植物は、後続する世代のゲノム編集（複数可）または突然変異（複数可）の遺伝的継承に関して固定された突然変異（複数可）または編集（複数可）を有する後続する世代において、選択され得る（子孫植物における編集（複数可）または突然変異（複数可）の分離無しに、且つ自己交配による子孫におけるホモ接合性の安定的な維持有りで）。上記のように、Ｒ０植物におけるゲノム編集された細胞の増殖、生存及び発生などは、外植片の培養、継代培養、芽伸長、及び／または発根のステップ（複数可）の間に選択薬剤による選択圧をかけることによっても、選択的にまたは優先的に達成または支援されて、選択可能マーカー遺伝子の共送達に起因してゲノム編集（複数可）または突然変異（複数可）を有する細胞をより高い比率で有するＲ０植物を産生し得るが、選択圧は、初期の培養後に、及び／またはＲ０植物の残りの寿命の間に、代替的に継続（例えば周期的になど）され得る（例えば局所用スプレー、土壌または種子の適用などとして）。
【００４９】
適切に補足された場合に植物組織の増殖及び発生（切除された植物の組織からの成熟した植物の形成が挙げられる）を支持する、多様な組織培養培地が公知である。これらの組織培養培地は、商業的な調製物として購入されるかまたはカスタム調製されるかのいずれであり得、当業者によって修飾され得る。かかる培地の例としては、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  １５：４７３−４９７，１９６２）；Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｓｃｉｅｎｔｉａ  Ｓｉｎｉｃａ  １８：６５９−６６８，１９７５）；Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，（Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  １８：１００−１２７，１９６５）；Ｕｃｈｉｍｉｙａ  ａｎｄ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．５７：４２４−４２９，１９７６；Ｇａｍｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．５０：１５１−１５８，１９６８；Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  １６５：３２２−３３２，１９８５；ＭｃＣｏｗｎ  ａｎｄ  Ｌｌｏｙｄ，ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ  １６：４５３，１９８１；Ｎｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｎｉｔｓｃｈ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４：１７４７−１７４８，１９６９；及びＳｃｈｅｎｋ  ａｎｄ  Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｏｔ．５０：１９９−２０４，１９７２によって記載されるもの、またはそれに応じて補足されたこれらの培地の誘導物が挙げられるがこれらに限定されない。当業者は、関心の特定の標的作物または変種のための培地及び培地補足物（形質転換、選択及び再生における使用のための栄養素及び植物増殖調節物質等）が、通常最適化されることを承知している。組織培養培地は、炭水化物（グルコース、スクロース、マルトース、マンノース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、及び／またはデキストロース等であるがこれらに限定されないもの）または炭水化物の比率により補足され得る。試薬は市販で入手可能であり、多数の供給業者から購入され得る（例えばＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；及びＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｈａｗｎｅｅ  Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳを参照）。これらの組織培養培地は、選択薬剤のさらなる添加により休止培地としてもしくは選択培地として、及び／または、もし１つまたは複数の植物増殖調節物質により補足されれば再生培地として使用され得る。
【００５０】
本開示の実施形態は、標的部位でまたはその付近で１つまたは複数の編集（複数可）または突然変異（複数可）を含む、本開示の形質転換方法によって産生された、ゲノム編集された植物、植物の部分、及び種子も提供する。植物の部分としては、果実、種子、胚乳、胚珠、花粉、葉、茎、及び根が限定されずに挙げられる。本開示の特定の実施形態において、植物または植物の部分は種子である。
【００５１】
ＩＩ．形質転換可能な外植片
本開示の方法は、形質転換の前に任意の好適な手動式方法または自動化方法によって植物種子から少なくとも植物胚の一部を切除するためのステップ（複数可）またはそれの切除をさらに含み得る。本開示の実施形態によれば、好適な胚外植片は、胚のメリステムもしくはメリステムに関する組織、または少なくともメリステムの一部、または胚外植片の少なくとも１つのメリステムに関する細胞をさらに含むが、その理由は、１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡの送達のための形質転換のための外植片のメリステムに関する細胞の標的化が、ゲノム編集された植物の有効な生成及び発生もしくは再生を改善し得るか、またはそれらに必要であり得るからである。胚外植片は、それが少なくとも胚メリステムの一部を保持する限り、１つまたは複数の胚組織（子葉（複数可）、胚軸（複数可）、幼根など等）を欠いてもよい。乾燥種子から切除された成熟した胚外植片の使用は、本開示の多くの実施形態によれば好ましいが、それらは、形質転換の前に水和ステップ（複数可）及び／または前培養ステップ（複数可）を要求し得る。
【００５２】
任意の植物種子から胚外植片を産生または切除するために好適な方法は、本開示の実施形態と併用して使用され得る。これらの方法は、自動化され得る及び／または手動で遂行され得る、単一化プロセスまたはバルクプロセスを含み得る。多くの実施形態によれば、胚外植片は、乾燥成熟した植物種子から採取または切除された成熟した胚外植片（またはその部分）であり得る。植物の任意の所与の種について、成熟した種子または胚は、植物の同じ種の未熟な種子または胚を識別するために、受粉後の特定の日数（ＤＡＰ）以上であるという点で定義され得るが、所与の植物種について、未成熟の胚から成熟した胚への移行は漸進的であり得る。概して、当技術分野において公知であるように、未成熟の胚から成熟した胚への移行には、種子及び胚の乾燥または脱水の天然プロセス（他の発生変化に加えて）が随伴する。
【００５３】
種子及び胚の発生または成熟には乾燥が随伴するので、本開示の方法において使用される成熟した種子または胚の外植片は、その水分含有量の点からも定義され得る。さらに、胚外植片は、それが切除される種子の水分含有量の点から定義され得る。例えば、本方法によれば使用される種子または胚の外植片は、最初に約３％〜約２５％、もしくは約４％〜約２５％、もしくは約３％もしくは４％〜約２０％の範囲でまたはそれら内の、あるいは、植物の特定の種に依存して、かかるより幅広いパーセンテージ範囲内の任意のパーセンテージ値もしくは範囲でまたはそれら内の水分含有量を有し得る（約５％〜約２０％、約５％〜約１５％、約８％〜約１５％、及び約８％〜約１３％等）。実際に、種子及び胚が、生存能力を維持し、且つ植物の形質転換及び発生または再生についてコンピテントである限り、植物種子は、本開示の方法実施形態における使用の前の胚外植片の切除の前に、人工的に乾燥または脱水され得る。種子の乾燥は、種子からの胚外植片の切除及び／または保存を促進し得る。代替的にまたは追加で、種子は、外植片の切除の前に水和または吸収させられて、切除ステップの間に、胚を促進、胚を軟化、胚への損傷を低減、及び／または胚の生存率を維持する等を行うことができる。しかしながら、種子または外植片が後続して乾燥または脱水されたとしても、種子または外植片の水和は、種子または外植片の貯蔵性を低減または消失させ得る。
【００５４】
以前に水和、プライミング、または発芽させられた、乾燥種子、乾燥された種子、及び／または成熟した種子から胚外植片を切除するための胚外植片及び方法のさらなる記載については、例えば米国特許第８，４６６，３４５号、同第８，３６２，３１７号、同第８，０４４，２６０号、及び米国特許公開第２０１６／０２６４９８３号を参照されたい。使用される種子のタイプ、及び種子から胚外植片を機械的に切除する正確な方法にかかわらず、追加のステップ及びプロセス（滅菌、間引きなど等）も遂行されて、粒子衝撃のために使用される外植片を調製及び／またはエンリッチすることができる。乾燥胚外植片または乾燥された胚外植片も、それらの切除後であるが形質転換ステップの前に水和、プライミング、及び／または発芽させられ得る。
【００５５】
本開示により使用される胚の外植片は、本方法における使用の１日未満前（使用の約１〜２４時間前等であり、使用の約２、６、１２、１８または２２時間前が挙げられる）に種子から取り出され得る。他の実施形態によれば、しかしながら、種子及び／または外植片は、種子及び／または外植片の生存率の維持に使用される貯蔵条件に依存して、より長い期間保存され得、それらの使用の前の数日間、数週間、数か月間、または場合によっては数年間が挙げられる。ゲノム編集に好適な胚外植片の産生または切除のための源として乾燥の成熟した種子を使用することの利点及び利益は、乾燥の成熟した種子及び／または外植片が乾燥条件下で貯蔵可能であり得るということ（貯蔵の間に、発芽せず、且つ生存能力を維持し、且つ形質転換についてコンピテントであること）である。かかる乾燥貯蔵条件は、本形質転換方法における使用の前の所望される時間長（約１時間〜約２年間、または約２４時間〜約１年間、またはそれらのより幅広い時間の範囲内の、任意の特定の期間もしくは期間の範囲等）で、保存された種子及び／または外植片が発芽せず、且つ生存能力を維持し、且つ形質転換についてコンピテントであるように、十分に低い水分量または湿度を有する環境または周囲において保存されることとして定義され得る。貯蔵可能な種子または外植片の使用によって、ドナー植物の必要無しに、種子または外植片原材料の信頼できる供給が可能であろう。成熟した乾燥種子を保存する能力は、乾燥の成熟した種子及び胚の天然特性に関する。換言すれば、乾燥の成熟した種子及び／または胚外植片は、静止（ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ）、静止（ｓｔａｓｉｓ）、または低い代謝の状態または活性の点からも定義され得る。したがって、本開示の方法に従って使用される乾燥種子または外植片は、種子または胚の後の水和及び発芽までの、低い代謝状態の点から、及び／または代謝的もしくは発生的な静止（ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ）もしくは静止（ｓｔａｓｉｓ）の状態によって、定義され得る。
【００５６】
いくつかの実施形態によれば、胚外植片または種子の水和または発芽は、種子からの胚外植片の切除の前またはその後に、遂行され得る。換言すれば、任意の前培養ステップとは別に、種子は、吸収または水和させられて、種子が胚外植片の切除の前に発芽及び／または発生を開始することを可能にすることができるか、あるいは代替的に、乾燥胚外植片は種子から切除され、次いで吸収または水和させられて、胚外植片の発芽及び／または発生の引き金となる。次いでプライミングまたは発芽した種子に、標的組織の事前の緑化無しに形質転換へ行い、それは、粒子衝撃ステップの前の時間の量及び／または限定的な光への曝露によって制御され得る。しかしながら、上述のように、水和ステップはその代りに、乾燥胚外植片を水和するためのみ使用されて、「湿潤させた」外植片を、胚の発芽またはさらなる発生無しに、１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡの粒子衝撃及び送達により適するようにし得る（例えば水和ステップまたは吸収ステップは、胚外植片の顕著な発生変化及び／または発芽が衝撃の前に起こらないような時間内に限定され得る）。
【００５７】
本明細書において提供される方法の実施形態による使用のための外植片としては、農業用作物種（トウモロコシ、コムギ、コメ、ソルガム、カラスムギ、オオムギ、サトウキビ、ギニアアブラヤシ、スイッチグラス植物、ワタ、キャノーラ、サトウダイコン、アルファルファ、ダイズ、及び他のＦａｂａｃｅａｅ科植物またはマメ科植物等）を包含する、様々な単子葉の（ｍｏｎｏｃｏｔ）植物及び双子葉の（ｄｉｃｏｔ）植物からの外植片が挙げられ得る。
【００５８】
ＩＩＩ．ゲノム編集
本開示の細胞、植物、植物の部分、及び種子は、部位特異的組込みまたはゲノム編集を使用する、ゲノム修飾を介して産生される。ゲノム編集を介する植物ゲノムの標的化された修飾を使用して、形質を改善した作物植物を生成することができる。ゲノム編集を使用して、植物のゲノム中の所望される標的部位で１つまたは複数の編集（複数可）または突然変異（複数可）を作製する（１つもしくは複数の遺伝子の発現及び／または活性を変化させる、あるいは植物ゲノム中の所望される所在位置で挿入配列または導入遺伝子を組み込む等）ことができる。本明細書において使用される時、「部位指向性組込み」は、植物ゲノムの中へポリヌクレオチド（例えば挿入配列、調節エレメント、または導入遺伝子）の標的化された組込みまたは挿入を可能にするゲノム編集の方法及び技法を指す。本明細書において提供されるように、１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡ分子は、外植片のレシピエント細胞（外植片のメリステムに関する細胞等）へ送達され得る。ガイド核酸、及び／または１つもしくは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡは、レシピエント細胞のゲノムの中へポリヌクレオチドまたは導入遺伝子を組み込まないかまたは取り込まずに、形質転換方法を経由して外植片のレシピエント細胞へ送達され得る。１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードするＤＮＡ分子は、（ｉ）ガイド型ヌクレアーゼのためのガイド核酸をコードする転写可能ＤＮＡ配列、（ｉｉ）マーカー遺伝子もしくは導入遺伝子（選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子等）、及び／または（ｉｉｉ）ドナー鋳型を、さらに含み得る。
【００５９】
多くの実施形態によれば、組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子は、１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードする配列を含んで提供され、配列はプロモーターに作動可能に連結される。プロモーターは、部位特異的ヌクレアーゼをコードする配列に対して異種であり得る。プロモーターは、植物で発現可能なプロモーター（構成的プロモーター、組織特異的プロモーターもしくは組織優先的プロモーター、発生ステージプロモーター、または誘導可能プロモーター等）であり得る。いくつかの実施形態によれば、組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子は、（ｉ）第２の配列、もしくはガイド核酸をコードする転写可能ＤＮＡ配列（第２の配列は、第２のプロモーターに作動可能に連結される）、及び／または（ｉｉ）マーカー遺伝子もしくは導入遺伝子（それは選択可能もしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子であり得る）を、さらに含み得る。第２のプロモーターは、ガイド核酸をコードする配列に対して異種であり得る。第２のプロモーターは、植物で発現可能なプロモーター（構成的プロモーター、組織特異的プロモーターもしくは組織優先的プロモーター、発生ステージプロモーター、または誘導可能プロモーター等）であり得る。マーカー遺伝子または導入遺伝子は、プロモーター（異種プロモーター及び／または植物で発現可能なプロモーター等）に作動可能に連結されたコーディング配列を含み得る。いくつかの実施形態によれば、組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子は、ドナー鋳型領域をさらに含み得る。本開示の組換えＤＮＡコンストラクトは、当技術分野において公知の任意の形質転換方法（粒子衝撃または細菌媒介性形質転換等）を経由してレシピエント外植片細胞へ送達され得る。
【００６０】
多くの実施形態によれば、１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードする配列（配列は、プロモーターに作動可能に連結される）を含む、組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子は、微粒子銃送達のための粒子またはビーズへ適用されるかまたはそれらの上へコーティングされるか、あるいは外植片または外植片の細胞もしくは組織の中への形質転換のための形質転換ベクターの中へ取り込まれる。プロモーターは、ゲノム編集試薬をコードする配列に対して異種であり得る。プロモーターは、植物で発現可能なプロモーター（構成的プロモーター、組織特異的プロモーターもしくは組織優先的プロモーター、発生ステージプロモーター、または誘導可能プロモーター等）であり得る。いくつかの実施形態によれば、組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子は、第２の配列、またはガイド核酸をコードする転写可能ＤＮＡ配列（第２の配列は、第２のプロモーターに作動可能に連結される）をさらに含み得る。第２のプロモーターは、ガイド核酸をコードする配列に対して異種であり得る。第２のプロモーターは、植物で発現可能なプロモーター（構成的プロモーター、組織特異的プロモーターもしくは組織優先的プロモーター、発生ステージプロモーター、または誘導可能プロモーター等）であり得る。いくつかの実施形態によれば、１つまたは複数のゲノム編集試薬をコードする配列（配列は、プロモーターに作動可能に連結される）、ならびにガイド核酸、マーカー遺伝子、及び／またはドナーＤＮＡ鋳型のうちの１つまたは複数を含む、組換えＤＮＡコンストラクトまたは分子は、外植片または外植片の細胞もしくは組織への微粒子銃送達のための粒子またはビーズへ適用されるかまたはそれらの上へコーティングされる。
【００６１】
任意の好適なゲノム編集試薬（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ガイド型ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポゼース、またはその任意の組み合わせ等）をコードするＤＮＡコンストラクトまたは分子は、本明細書において提供される方法に従って外植片の細胞へ送達されて、外植片細胞及び／またはその子孫細胞のゲノム内の標的部位でゲノム編集または部位指向性組込みを引き起こし得る。ガイド型ヌクレアーゼ（クラスター化規則的散在型短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）酵素等）の事例において、ＤＮＡコンストラクトまたは分子はガイド核酸と共に共送達されて、標的部位へガイド型ヌクレアーゼを指向させることができる。ガイド型ヌクレアーゼとしては、保存されたアミノ酸を共有し、それぞれのタンパク質配列に関してより高いパーセント同一性（例えばそれらのアライメント長にわたるそれらのタンパク質配列において、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性）を有する、任意の公知のガイド型ヌクレアーゼのホモログまたは修飾バージョンも挙げられ得る。
【００６２】
いくつかの実施形態によれば、ゲノム編集試薬によって生成された二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックの修復を介して所望される標的部位で所望される編集、突然変異または挿入をゲノムに作製するための鋳型として供するために、ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡコンストラクトまたは分子は、ドナー鋳型分子と共に共送達され得る。いくつかの実施形態によれば、ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡコンストラクトまたは分子は、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含むＤＮＡ分子と共に共送達され得る。各々の事例において、ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡコンストラクトまたは分子に加えて、随意にガイド核酸、ドナー鋳型分子、及び／または選択可能もしくはスクリーニング可能なマーカーをコードするＤＮＡ分子のうちの１つまたは複数は、外植片のレシピエント細胞への微粒子銃または粒子送達のために使用される粒子へ適用され得るかまたはそれらの上へコーティングされ得る。いくつかの実施形態によれば、ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡコンストラクトまたは分子は、微粒子銃もしくは粒子送達のために使用される粒子へ適用され得るかもしくはそれらの上へコーティングされ得るか、または外植片の１つもしくは複数のレシピエント細胞の中への形質転換のためのベクターの中へ取り込まれ、外植片の１つまたは複数のレシピエント細胞は、粒子衝撃または形質転換の前に、レシピエント細胞のゲノムの中へ安定的に形質転換され得る１つまたは複数のＤＮＡ分子（複数可）及び／または導入遺伝子（複数可）を含み、そこで、かかるＤＮＡ分子（複数可）及び／または導入遺伝子（複数可）は、以下の：（ｉ）所望される標的部位での所望される編集、突然変異もしくは挿入をゲノムに作製するための鋳型として供される、ドナー鋳型分子、（ｉｉ）選択可能もしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子、及び／または（ｉｉｉ）所望される標的部位へガイド型ヌクレアーゼを指向させる、ガイド核酸のうちの１つまたは複数を含むかまたはコードする。
【００６３】
ゲノム編集試薬は、ガイド型ヌクレアーゼであり得、それはガイドＲＮＡとのリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体として機能し得る。いくつかの実施形態によれば、ガイド型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても公知である）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、ＣａｓＺ、及びそれらのホモログまたは修飾バージョン、アルゴノート（アルゴノートタンパク質の非限定的例としては、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルゴノート（ＴｔＡｇｏ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓアルゴノート（ＰｆＡｇｏ）、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉアルゴノート（ＮｇＡｇｏ）、及びそれらのホモログまたは修飾バージョンが挙げられる）からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態によれば、ガイド型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９酵素またはＣｐｆ１酵素である。ガイド型ヌクレアーゼをコードするＤＮＡコンストラクトまたは分子は、ガイド核酸有りまたは無しで送達され得る。
【００６４】
ガイド型ヌクレアーゼのために、ガイド核酸分子は、塩基対またはハイブリダイゼーション経由で植物のゲノム中の標的部位へガイド型ヌクレアーゼを指向させて、標的部位でまたはその付近でＤＳＢまたはニックを引き起こすためにさらに提供され得る。ガイド核酸は、ガイド核酸分子として、またはプロモーターもしくは植物で発現可能なプロモーターへ作動可能に連結されたガイド核酸をコードする転写可能ＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡ分子、コンストラクトもしくはベクターとして、植物の細胞または組織の中へ形質転換または導入され得る。プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターもしくは組織優先的プロモーター、発生ステージプロモーター、または誘導可能プロモーターであり得る。
【００６５】
本明細書において使用される時、「ガイド核酸」という用語は、標的核酸中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント、及びガイド型ヌクレアーゼタンパク質と相互作用する第２のセグメントを含む核酸を指す。いくつかの実施形態において、標的核酸中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含むガイドの第１のセグメントは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ反復またはｃｒＲＮＡ反復）に対応する。いくつかの実施形態において、ガイド型ヌクレアーゼタンパク質と相互作用する核酸配列を含むガイドの第２のセグメントは、トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に対応する。いくつかの実施形態において、ガイド核酸は、互いとハイブリダイズする２つの分離した核酸分子（標的核酸中の配列に相補的なポリヌクレオチド、及びガイド型ヌクレアーゼタンパク質と相互作用するポリヌクレオチド）を含み、「二重ガイド」または「２分子ガイド」と本明細書において称される。いくつかの実施形態において、二重ガイドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ及びＲＮＡの組み合わせを含み得る。他の実施形態において、ガイド核酸は、単一のポリヌクレオチドであり、「単一分子ガイド」または「単一ガイド」と本明細書において称される。いくつかの実施形態において、単一ガイドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ及びＲＮＡの組み合わせを含み得る。「ガイド核酸」という用語は包含的であり、二重分子ガイド及び単一分子ガイドの両方を指す。
【００６６】
プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は、ガイドＲＮＡ  −の標的化配列に相補的なゲノム標的部位配列の５’端に直接隣接しその上流（当技術分野において公知であるようにゲノム標的部位のセンス（＋）鎖の直接下流（３’）（ガイドＲＮＡの標的化配列に比べて））で、ゲノム中に存在し得る。例えばＷｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ，”Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２（２）：５９−７０（２０１４）を参照されたい。標的部位に隣接するセンス（＋）鎖上のゲノムＰＡＭ配列（ガイドＲＮＡの標的化配列に比べて）は、５’−ＮＧＧ−３’を含み得る。しかしながら、概してガイド核酸の対応する配列（ガイドＲＮＡの標的化配列の直接下流（３’））は、ゲノムＰＡＭ配列に相補的でなくてもよい。
【００６７】
ガイド核酸は、典型的にはタンパク質をコードしない非コーディングＲＮＡ分子であり得る。ガイド核酸のターゲッター配列は、長さで少なくとも１０ヌクレオチド（長さで、１２〜４０ヌクレオチド、１２〜３０ヌクレオチド、１２〜２０ヌクレオチド、１２〜３５ヌクレオチド、１２〜３０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド、１７〜３０ヌクレオチド、もしくは１７〜２５ヌクレオチド、または長さで約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれ以上のヌクレオチド等）であり得る。ターゲッター配列は、ゲノムの標的部位でのＤＮＡ配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、またはそれ以上の一続きのヌクレオチドに、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一または相補的であり得る。
【００６８】
ターゲッター配列に加えて、ガイド核酸は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼと結合または相互作用し得る、１つまたは複数の他の構造配列（複数可）またはスキャフォールド配列（複数可）をさらに含み得る。かかるスキャフォールド配列または構造配列は、他のＲＮＡ分子（例えばｔｒａｃｒＲＮＡ）とさらに相互作用し得る。ガイド型ヌクレアーゼを使用する、植物のゲノム内の標的部位でのゲノム編集及び部位指向性組込みのために、標的化コンストラクト及びガイド核酸をデザインする方法及び技法は、当技術分野において公知である。
【００６９】
複数の部位特異的ヌクレアーゼ（リコンビナーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ及びＴＡＬＥＮ等）は核酸によりガイドされず、その代りに、ＤＳＢもしくはニックを引き起こすためにそれらの標的部位を決定するそれらのタンパク質構造に頼るか、またはそれらはＤＮＡ結合タンパク質ドメインまたはモチーフへ融合、連結もしくは添付される。部位特異的ヌクレアーゼ（または融合／添付もしくは連結されたＤＮＡ結合ドメイン）のタンパク質構造は、部位特異的ヌクレアーゼを標的部位へ標的化し得る。これらの実施形態の多くによれば、核酸によりガイドされない部位特異的ヌクレアーゼ（リコンビナーゼ及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＴＡＬＥＮ等）は、公知の方法に従ってデザイン、操作及び構築されて、植物の内在性遺伝子のゲノム遺伝子座でまたはその付近での標的部位を標的化しそれへ結合して、かかるゲノム遺伝子座でＤＳＢまたはニックを生成してＤＳＢまたはニックの修復（それは、ドナー鋳型分子によってガイドされ得る細胞修復機構を介する、ＤＳＢまたはニックの部位での配列の突然変異または挿入の生成を導き得る）経由で、遺伝子の発現をノックアウトまたはノックダウンする。
【００７０】
いくつかの実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、リコンビナーゼである。リコンビナーゼは、ＤＮＡ認識モチーフへ添付されるセリンリコンビナーゼ、ＤＮＡ認識モチーフへ添付されるチロシンリコンビナーゼ、または当技術分野において公知の他のリコンビナーゼ酵素であり得る。リコンビナーゼまたはトランスポゼースは、ＤＮＡ結合ドメインへ添付または融合されたＤＮＡトランスポゼースまたはリコンビナーゼであり得る。リコンビナーゼの非限定的例としては、本明細書において提供されるＤＮＡ認識モチーフへ添付されるなどのチロシンリコンビナーゼが挙げられ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｇｉｎリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、及びＴｎｐ１リコンビナーゼからなる群から選択される。一態様において、本明細書において提供されるＣｒｅリコンビナーゼまたはＧｉｎリコンビナーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン、またはＣａｓ９ヌクレアーゼへ連結される。別の態様において、本明細書において提供されるＤＮＡ認識モチーフへ添付されるセリンリコンビナーゼは、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、及びＴＰ−９０１インテグラーゼからなる群から選択される。別の態様において、本明細書において提供されるＤＮＡ結合ドメインへ添付されるＤＮＡトランスポゼースは、ＴＡＬＥ−ｐｉｇｇｙＢａｃ及びＴＡＬＥ突然変異誘発因子からなる群から選択される。
【００７１】
部位特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり得る。ＺＦＮは、制限酵素（例えばＦｏｋＩ）に由来し得る切断ドメイン（または切断ドメインの半分）へ融合させた、操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる合成タンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、カノニカル（Ｃ２Ｈ２）または非カノニカ（例えばＣ３ＨまたはＣ４）であり得る。ＤＮＡ結合ドメインは、標的部位に依存する１つまたは複数のジンクフィンガー（例えば２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ以上のジンクフィンガー）を含み得る。ＤＮＡ結合ドメイン中の複数ジンクフィンガーはリンカー配列（複数可）によって分離され得る。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの修飾によって二本鎖ＤＮＡのほとんど任意のストレッチを切断するようにデザインされ得る。ＺＦＮは、標的部位ＤＮＡ配列を結合するように操作されたジンクフィンガーアレイを含むＤＮＡ結合ドメインへ融合させた、非特異的ＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼに由来する）から構成された単量体から二量体を形成する。ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には３〜４（またはそれ以上）のジンクフィンガーから構成され得る。ジンクフィンガーα−ヘリックスの開始点に比べて、位置−１、＋２、＋３及び＋６でのアミノ酸（それらは標的部位への部位特異的結合に寄与する）は、特異的標的配列にフィットするように、変化及びカスタマイズされ得る。他のアミノ酸はコンセンサス骨格を形成して、異なる配列特異性を備えたＺＦＮを生成し得る。
【００７２】
特異的標的配列を標的化しそれらへ結合するためにＺＦＮをデザインする方法及び法則は当技術分野において公知である。例えば米国特許出願第２００５／００６４４７４号、同第２００９／０１１７６１７号、及び同第２０１２／０１４２０６２号を参照されたい。ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインはＤＮＡを切断するために二量体化を要求し、したがってＣ末端領域を備えた２つのＺＦＮが、切断部位の反対のＤＮＡ鎖を結合するために必要である（５〜７ｂｐで分離される）。２つのＺＦ結合部位がパリンドロームならば、ＺＦＮ単量体は標的部位を切断することができる。ＺＦＮは、本明細書において使用される時、別のＺＦＮからの援助無しに二本鎖ＤＮＡを切断することができる単量体のＺＦＮを幅広く包含する。ＺＦＮという用語は、一緒に働いて同じ部位でＤＮＡを切断するように操作された１ペアのＺＦＮのうちの１つまたは両方のメンバーを指すようにも使用され得る。任意の理論により限定されるものではないが、ジンクフィンガードメインのＤＮＡ結合特異性は様々な方法のうちの１つを使用して再操作され得るので、カスタマイズされたＺＦＮは、理論的にはほとんどあらゆる標的配列（例えば植物ゲノム中の遺伝子でまたはその付近で）を標的化するように構築され得る。ジンクフィンガードメインを操作するための公的に利用可能な方法としては、Ｃｏｎｔｅｘｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＣｏＤＡ）、Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚｅｄ  Ｐｏｏｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＯＰＥＮ）、及びＭｏｄｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｙが挙げられる。一態様において、本明細書において提供される方法及び／または組成物は、１以上、２以上、３以上、４以上、または５以上のＺＦＮを含む。別の態様において、本明細書において提供されるＺＦＮは、標的化されたＤＳＢまたはニックを生成することが可能である。
【００７３】
部位特異的ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮ酵素であり得る。ＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼドメイン（例えばＦｏｋＩ）への転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインの融合によって生成された人工制限酵素である。ＴＡＬＥＮペアの各々のメンバーが標的部位に近接するＤＮＡ部位へ結合する場合に、ＦｏｋＩ単量体は二量体化し、標的部位で二本鎖ＤＮＡの切断を引き起こす。野生型のＦｏｋＩ切断ドメイン以外に、突然変異を備えたＦｏｋＩ切断ドメインのバリアントは、切断特異性及び切断活性を改善するようにデザインされている。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、適切な向き及び間隔での、標的ゲノム中の部位のためのユニークなＤＮＡ結合ドメインを備えた２つのコンストラクトを要求する。ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数、及び２つの個別のＴＡＬＥＮ結合部位間の塩基の数の両方は、高レベルの活性の達成のためのパラメーターである。
【００７４】
ＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼドメインへの転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインの融合によって生成された人工制限酵素である。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、ＰｖｕＩＩ、ＭｕｔＨ、ＴｅｖＩ、ＦｏｋＩ、ＡｌｗＩ、ＭｌｙＩ、ＳｂｆＩ、ＳｄａＩ、ＳｔｓＩ、ＣｌｅＤＯＲＦ、Ｃｌｏ０５１、及びＰｅｐｔ０７１からなる群から選択される。ＴＡＬＥＮペアの各々のメンバーが標的部位に近接するＤＮＡ部位へ結合する場合に、ＦｏｋＩ単量体は二量体化し、標的部位で二本鎖ＤＮＡの切断を引き起こす。ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書において使用される時、別のＴＡＬＥＮからの援助無しに二本鎖ＤＮＡを切断することができる単量体のＴＡＬＥＮを幅広く包含する。ＴＡＬＥＮという用語は、一緒に働いて同じ部位でＤＮＡを切断する、１ペアのＴＡＬＥＮのうちの１つまたは両方のメンバーも指す。
【００７５】
転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、事実上あらゆるＤＮＡ配列（植物中の遺伝子のゲノム遺伝子座でまたはその付近で等）を結合するように操作され得る。ＴＡＬＥは、３３〜３４アミノ酸の１３〜２８の反復単量体から構成される中央のＤＮＡ結合ドメインを有する。各々の単量体のアミノ酸は、位置１２及び１３での超可変アミノ酸残基以外は、高度に保存される。２つの可変アミノ酸は、反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる。ＲＶＤのアミノ酸ペアのＮＩ、ＮＧ、ＨＤ、及びＮＮは、優先的にアデニン、チミン、シトシン、及びグアニン／アデニンをそれぞれ認識し、ＲＶＤの調整により一続きのＤＮＡ塩基を認識することができる。アミノ酸配列とＤＮＡ認識との間のこの単純な関係性は、適切なＲＶＤを含有する反復セグメントの組み合わせの選択によって、特異的なＤＮＡ結合ドメインを操作することを可能にした。
【００７６】
野生型のＦｏｋＩ切断ドメイン以外に、突然変異を備えたＦｏｋＩ切断ドメインのバリアントは、切断特異性及び切断活性を改善するようにデザインされている。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、適切な向き及び間隔での、標的ゲノム中の部位のためのユニークなＤＮＡ結合ドメインを備えた２つのコンストラクトを要求する。ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数、及び２つの個別のＴＡＬＥＮ結合部位間の塩基の数の両方は、高レベルの活性の達成のためのパラメーターである。ＰｖｕＩＩ、ＭｕｔＨ及びＴｅｖＩの切断ドメインは、ＴＡＬＥによる使用のためのＦｏｋＩ及びＦｏｋＩのバリアントの有用な代替物である。ＰｖｕＩＩは、ＴＡＬＥにカップリングされた場合に高度に特異的な切断ドメインとして機能する（Ｙａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．８：ｅ８２５３９を参照）。ＭｕｔＨは、ＤＮＡ中の鎖に特異的ニックを導入することが可能である（Ｇａｂｓａｌｉｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４１：ｅ８３を参照）。ＴｅｖＩは、ＤＮＡ中の二本鎖切断を標的化された部位で導入する（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．４：１７６２を参照）。
【００７７】
ＴＡＬＥ結合ドメインのアミノ酸配列とＤＮＡ認識との間の関係性は、デザイン可能なタンパク質を可能にする。ＤＮＡＷｏｒｋｓ等のソフトウエアプログラムを使用してＴＡＬＥコンストラクトをデザインすることができる。ＴＡＬＥコンストラクトをデザインする他の方法は、当業者に公知である。Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１２）４０：Ｗ１１７−１２２．；Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）３９：ｅ８２；及びｔａｌｅ−ｎｔ．ｃａｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ａｂｏｕｔを参照されたい。別の態様において、本明細書において提供されるＴＡＬＥＮは、標的化されたＤＳＢを生成することが可能である。
【００７８】
部位特異的ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼであり得る。微生物において通常同定されるメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー等）は、高い活性及び長い認識配列（＞１４ｂｐ）を備え、標的ＤＮＡの部位特異的消化をもたらす、ユニークな酵素である。天然に存在するメガヌクレアーゼの操作されたバージョンは典型的には、延長されたＤＮＡ認識配列（例えば１４〜４０ｂｐ）を有する。いくつかの実施形態によれば、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、及びＩ−ＤｍｏＩからなる群から選択される、スキャフォールドまたはベースの酵素を含み得る。メガヌクレアーゼのＤＮＡの認識及び切断の機能が単一ドメイン中で絡み合うので、メガヌクレアーゼの操作はＺＦＮ及びＴＡＬＥＮよりも困難であり得る。突然変異誘発及びハイスループットスクリーニングの特殊な方法は、ユニーク配列を認識し、改善されたヌクレアーゼ活性を保持する新規のメガヌクレアーゼバリアントを生成するために使用されている。したがって、メガヌクレアーゼは、植物中のゲノム標的配列（遺伝子のゲノム遺伝子座でまたはその付近で等）へ結合するように選択または操作され得る。別の態様において、本明細書において提供されるメガヌクレアーゼは、標的化されたＤＳＢを生成することが可能である。
【００７９】
いくつかの実施形態によれば、ドナー鋳型は、ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡコンストラクトまたは分子と共に、外植片のレシピエント細胞へ共送達されて、ゲノム編集試薬によるレシピエント細胞のゲノムの標的部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックの修復の間に所望される編集を生成するための鋳型として供され得る。代替的に、ドナー鋳型は、外植片のレシピエント細胞中に既に存在し得る。同様に、ガイド型ヌクレアーゼについては、ガイド核酸をコードする転写可能ＤＮＡ配列または導入遺伝子も、ガイド型ヌクレアーゼをコードするＤＮＡコンストラクトまたは分子と共に、外植片のレシピエント細胞へ共送達されて、ガイド型ヌクレアーゼを指向させるガイドとして供されて、レシピエント細胞ゲノム中で所望される遺伝子座または標的部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを作製し得る。代替的に、ガイド核酸、及び／またはガイド核酸をコードする転写可能ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子もしくは導入遺伝子は、既に存在し得る及び／または外植片のレシピエント細胞によって発現され得る。
【００８０】
いくつかの実施形態によれば、（ｉ）ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡコンストラクトまたは分子、ガイド核酸、及びドナー鋳型は、レシピエント細胞への微粒子銃送達のために粒子へ適用され得るかもしくはそれらの上へコーティングされ得るか、あるいは（ｉｉ）ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡコンストラクトもしくは分子、及び／またはガイドＲＮＡは、レシピエント細胞への微粒子銃送達のために粒子へ適用され得るかまたはそれらの上へコーティングされ得、ドナー鋳型はレシピエント細胞中に随意に存在し得るかまたは発現され得るか、あるいは（ｉｉｉ）ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡコンストラクトもしくは分子、及び／またはドナー鋳型は、レシピエント細胞への微粒子銃送達のために粒子へ適用され得るかまたはそれらの上へコーティングされ得、ガイド核酸はレシピエント細胞中に随意に存在し得るかまたは発現され得るか、あるいは（ｉｖ）ガイド核酸及び／またはドナー鋳型は、レシピエント細胞への微粒子銃送達のために粒子へ適用され得るかまたはそれらの上へコーティングされ得、ゲノム編集試薬、またはゲノム編集試薬をコードするＤＮＡコンストラクトもしくは分子は、レシピエント細胞中に存在し得るかまたは発現され得、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の各々の事例において、ゲノム編集試薬によってレシピエント細胞ゲノム中の所望される遺伝子座または標的部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを作製して、レシピエント植物細胞のゲノム中の所望される所在位置で鋳型によるかまたは鋳型によらない編集または突然変異を生成する。
【００８１】
植物のゲノム内の任意の部位または遺伝子座は、導入遺伝子、コンストラクト、または転写可能ＤＮＡ配列のゲノム編集（または遺伝子編集）または部位指向性組込みを作製するための可能性として選択され得る。ゲノム編集及び部位指向性組込みのために、二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックは、選択されたゲノム遺伝子座で、ゲノム編集試薬（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、操作されたもしくは生来のメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥエンドヌクレアーゼ、またはガイド型エンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９またはＣｐｆ１）等）により最初に作製され得る。部位指向性組込みのための当技術分野において公知の任意の方法が使用され得る。挿入配列を備えたドナー鋳型分子の存在下において、ＤＳＢまたはニックは、ドナー鋳型と植物ゲノムの相同アーム（複数可）との間の相同組換えによって、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復され、植物ゲノムの中への挿入配列の部位指向性組込みをもたらして、ＤＳＢまたはニックの部位で標的化された挿入事象を生成し得る。したがって、導入遺伝子、転写可能ＤＮＡ配列、コンストラクトまたは配列が、ドナー鋳型の挿入配列中に所在するならば、導入遺伝子、転写可能ＤＮＡ配列、コンストラクトまたは配列の部位特異的な挿入または組込みが達成され得る。
【００８２】
ＤＳＢまたはニックの導入を使用して、植物のゲノム中の標的化された突然変異を導入することもできる。このアプローチに従って、突然変異（欠失、挿入、逆位、及び／または置換等）は、ＤＳＢまたはニックの不完全な修復経由で標的部位で導入されて、遺伝子のノックアウトまたはノックダウンを産生し得る。かかる突然変異は、場合によってはドナー鋳型分子の使用無しに、標的化された遺伝子座の不完全な修復によって生成され得る。遺伝子の「ノックアウト」は、タンパク質の非発現または非機能的タンパク質の発現をもたらす、遺伝子の内在性遺伝子座でまたはその付近でのＤＳＢまたはニックを誘導することによって達成され得るが、遺伝子の「ノックダウン」は、コードされたタンパク質の機能を消失させる様式で遺伝子のコーディング配列に影響しない部位で不完全に修復される、遺伝子の内在性遺伝子座でまたはその付近でのＤＳＢまたはニックを誘導することによって、類似する様式で達成され得る。例えば、内在性遺伝子座内のＤＳＢまたはニックの部位は、遺伝子の上流または５’領域（例えばプロモーター及び／またはエンハンサー配列）中に存在して、発現のレベルに影響または低減し得る。同様に、遺伝子のかかる標的化されたノックアウトまたはノックダウンの突然変異は、ＤＳＢまたはニックの修復経由で標的部位でまたはその付近で特定のまたは所望される突然変異を指向させるドナー鋳型分子により生成され得る。ドナー鋳型分子は、挿入配列有りまたは無しにかかわらず、標的化されたゲノム配列に比べて１つまたは複数の突然変異（１つまたは複数の欠失、挿入、逆位及び／または置換等）をＤＳＢまたはニックの部位でまたはその付近で含む、相同配列を含み得る。例えば、遺伝子の標的化されたノックアウト突然変異は、少なくとも遺伝子の一部を置換、挿入、欠失、または逆位させることによって（遺伝子のコーディング配列の中へフレームシフトまたは未成熟終止コドンを導入すること等によって）達成され得る。遺伝子の一部の欠失は、２つの標的部位でＤＳＢまたはニックを生成し、標的部位が近接する介在する標的領域の欠失を引き起こすことによっても導入され得る。
【００８３】
本明細書において使用される時、組換えポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡのドナー鋳型または配列であり得る、「ドナー分子」、「ドナー鋳型」、または「ドナー鋳型分子」（まとめて「ドナー鋳型」）は、相同核酸鋳型もしくは配列（例えば相同配列）及び／または植物細胞のゲノム中のニックもしくは二本鎖ＤＮＡ切断の修復経由の植物細胞のゲノムの中への部位指向性の標的化された挿入もしくは組換えのための挿入配列を有する、核酸分子として、定義される。ドナー鋳型は、１つもしくは複数の相同配列（複数可）及び／または標的化された組込みのための挿入配列を含む分離したＤＮＡ分子であり得るか、あるいはドナー鋳型は、１つまたは複数の他の発現カセット、遺伝子／導入遺伝子、及び／または転写可能ＤＮＡ配列をさらに含むＤＮＡ分子の配列部分（ドナー鋳型領域）であり得る。例えば、「ドナー鋳型」は、導入遺伝子もしくは抑制コンストラクトの部位指向性組込みのために、または植物のゲノム内の標的部位の中へ突然変異（挿入、欠失、置換など等）を導入する鋳型として、使用され得る。本明細書において提供される標的化されたゲノム編集技法は、１以上、２以上、３以上、４以上、または５以上のドナー分子または鋳型の使用を含み得る。「ドナー鋳型」は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの分子またはプラスミドであり得る。ドナー鋳型の「挿入配列」は、植物細胞のゲノムの中への標的化された挿入のためにデザインされた配列であり、それは任意の好適な長さであり得る。例えば、ドナー鋳型の挿入配列は、２〜５０，０００の間、２〜１０，０００の間、２〜５０００の間、２〜１０００の間、２〜５００の間、２〜２５０の間、２〜１００の間、２〜５０の間、２〜３０の間、１５〜５０の間、１５〜１００の間、１５〜５００の間、１５〜１０００の間、１５〜５０００の間、１８〜３０の間、１８〜２６の間、２０〜２６の間、２０〜５０の間、２０〜１００の間、２０〜２５０の間、２０〜５００の間、２０〜１０００の間、２０〜５０００の間、２０〜１０，０００の間、５０〜２５０の間、５０〜５００の間、５０〜１０００の間、５０〜５０００の間、５０〜１０，０００の間、１００〜２５０の間、１００〜５００の間、１００〜１０００の間、１００〜５０００の間、１００〜１０，０００の間、２５０〜５００の間、２５０〜１０００の間、２５０〜５０００の間、または２５０〜１０，０００の間のヌクレオチドまたは塩基対の長さであり得る。ドナー鋳型は、相同組換え経由で植物のゲノム内の標的部位の中への突然変異または挿入配列の組込みを指向させるように少なくとも１つの相同配列または相同アーム（２つの相同アーム等）も有し、相同配列または相同アーム（複数可）は、同一もしくは相補的であるか、または、植物のゲノム内の標的部位でもしくはその付近での配列へのパーセント同一性もしくはパーセント相補性を有する。ドナー鋳型が相同アーム（複数可）及び挿入配列を含む場合に、相同アーム（複数可）は、ドナー鋳型の挿入配列に近接するかまたはそれを取り囲むだろう。
【００８４】
いくつかの実施形態によれば、ドナー鋳型は、挿入配列の部位特異的組込みまたは鋳型媒介性修復のためのドナー鋳型として機能する、組換えポリヌクレオチド分子またはコンストラクトの「ドナー鋳型領域」を含み、組換えポリヌクレオチド分子またはコンストラクトは、ドナー鋳型に非依存性であり得るドナー鋳型領域の外側の他のエレメントをさらに含む。例えば、組換えポリヌクレオチド分子またはコンストラクトは、「ドナー鋳型領域」、ならびに１つまたは複数の導入遺伝子（複数可）（選択可能マーカー等）及び／または非コーディングＲＮＡ分子をコードする転写可能ＤＮＡ配列（ガイドＲＮＡまたは標的遺伝子の抑制のためのＲＮＡ分子等）を含み得る。
【００８５】
ドナー鋳型の挿入配列は、転写される非コーディングＲＮＡもしくはｍＲＮＡの配列及び／または翻訳されるタンパク質配列を各々コードする、１つまたは複数の遺伝子または配列を含み得る。ドナー鋳型の転写される配列または遺伝子は、タンパク質または非コーディングＲＮＡ分子をコードし得る。非コーディングＲＮＡ分子は、例えばガイドＲＮＡ、または遺伝子を抑制のために標的化するＲＮＡ分子（例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ鎖、逆向き反復など）であり得る。ドナー鋳型の挿入配列は、機能遺伝子または全体の遺伝子配列を含まないポリヌクレオチド配列を含み得る（例えばドナー鋳型は単純に、プロモーター配列等の調節配列、または遺伝子もしくはコーディング配列の一部のみを含み得る）か、または、同定可能な遺伝子発現エレメントもしくは任意の活発に転写される遺伝子配列を含有しない可能性がある。さらに、ドナー鋳型は、直線状もしくは環状であり得るか、または一本鎖もしくは二本鎖であり得る。ドナー鋳型は、導入遺伝子から発現されたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子として細胞へ送達され得る。ドナー鋳型は、裸の核酸分子として、または１つもしくは複数の送達薬剤（例えばリポソーム、タンパク質、ポロキサマー、タンパク質によりカプセル化されたＴ鎖など）との複合体として細胞へ送達され得る。本明細書において提供されるドナー鋳型の挿入配列は、ＲＮＡ分子（それは非コーディングまたはタンパク質コーディングであり得る）へと転写され得る転写可能ＤＮＡ配列を含み、転写可能ＤＮＡ配列は、プロモーター及び／または他の調節配列（構成的、誘導可能または組織特異的プロモーター等）へ作動可能に連結され得る。
【００８６】
いくつかの実施形態によれば、ドナー鋳型は挿入配列を含まなくてもよく、その代りに、植物のゲノム内の標的部位で（植物のゲノム内の遺伝子でまたはその付近で等）、ゲノム配列に比べて、１つまたは複数の突然変異（挿入、欠失、置換など等）を含む、１つまたは複数の相同配列を含み得る。代替的に、ドナー鋳型は、コーディング配列または転写可能なＤＮＡ配列を含まない挿入配列を含み、挿入配列を使用して、植物のゲノム内の標的部位（植物のゲノム内の遺伝子でまたはその付近で等）の中へ１つまたは複数の突然変異を導入することができる。
【００８７】
本明細書において提供されるドナー鋳型は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０の遺伝子（複数可）もしくは導入遺伝子（複数可）及び／または転写可能ＤＮＡ配列（複数可）を含み得る。代替的に、ドナー鋳型は、遺伝子、導入遺伝子、または転写可能ＤＮＡ配列を含まなくてもよい。限定するものではないが、遺伝子／導入遺伝子またはドナー鋳型の転写可能ＤＮＡ配列としては、例えば殺虫剤抵抗性遺伝子、除草剤抵抗性遺伝子、窒素使用効率遺伝子、水使用効率遺伝子、収率促進遺伝子、栄養価遺伝子、ＤＮＡ結合遺伝子、選択可能マーカー遺伝子、ＲＮＡｉもしくは抑制コンストラクト、ゲノム編集試薬、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の単一ガイドＲＮＡ、ジェミニウイルスベースの発現カセット、または植物ウイルス発現ベクター系が挙げられ得る。他の実施形態によれば、ドナー鋳型の挿入配列は、タンパク質をコードする配列、または内在性遺伝子を抑制のために標的化し得る非コーディングＲＮＡ分子をコードする転写可能ＤＮＡ配列を含み得る。ドナー鋳型は、コーディング配列、遺伝子、または転写可能ＤＮＡ配列へ作動可能に連結されたプロモーター（構成的プロモーター、組織特異的プロモーターもしくは組織優先的プロモーター、発生ステージプロモーター、または誘導可能プロモーター等）を含み得る。ドナー鋳型は、リーダー、エンハンサー、プロモーター、転写開始部位、５’−ＵＴＲ、１つもしくは複数のエクソン（複数可）、１つもしくは複数のイントロン（複数可）、転写終結の部位、領域もしくは配列、３’−ＵＴＲ、及び／またはポリアデニル化シグナル（それらは各々、コーディング配列へ作動可能に連結され得る）、遺伝子（または導入遺伝子）、あるいは非コーディングＲＮＡ、ガイド核酸、ｍＲＮＡ及び／またはタンパク質をコードする転写可能ＤＮＡ配列を含み得る。
【００８８】
本実施形態によれば、組換えドナー鋳型ポリヌクレオチド分子（挿入配列）の一部は、ゲノム編集を介して、植物ゲノム内の所望される部位または遺伝子座で挿入されるかまたは組み込まれ得る。ドナー鋳型の挿入配列は、導入遺伝子またはコンストラクト（タンパク質をコードする導入遺伝子、または内在性遺伝子を抑制のために標的化する非コーディングＲＮＡ分子をコードする転写可能ＤＮＡ配列等）を含み得る。ドナー鋳型は挿入配列に近接する１つまたは２つの相同アームも有して、相同組換え及び／または相同指向性修復を介する標的化された挿入事象を増進することができる。各々の相同アームは、植物細胞のゲノム内の標的ＤＮＡ配列のうちの連続する少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２５００、または少なくとも５０００のヌクレオチドへ、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一または相補的である。いくつかの実施形態によれば、植物のゲノムの中への、挿入配列の部位指向性もしくは標的化された組込み、及び／または相同配列（複数可）の組換えのための、組換えＤＮＡドナー鋳型分子は、ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡコンストラクトまたは分子と共に共送達され得、その挿入配列は、導入遺伝子またはコンストラクト（導入遺伝子、または内在性遺伝子を抑制のために標的化する非コーディングＲＮＡ分子をコードする転写可能ＤＮＡ配列等）を含み得る。組換えＤＮＡドナー鋳型は、選択可能もしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子及び／またはガイド核酸をコードする導入遺伝子も含み、マーカー遺伝子及びガイド核酸をコードする導入遺伝子は各々、植物で発現可能なプロモーター及び／または他の発現調節エレメントへ作動可能に連結され得る。
【００８９】
本明細書において使用される時、ゲノム編集または部位指向性組込みのための「標的部位」は、ゲノム編集試薬によって結合及び切断されて、植物ゲノム内のポリヌクレオチド配列の核酸骨格及び／またはその相補ＤＮＡ鎖の中へ二本鎖切断、一本鎖ニック、または他の修飾（脱アミノ化等）が導入される、植物ゲノム内のポリヌクレオチド配列の所在位置を指す。標的部位は、連続少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２９、または少なくとも３０のヌクレオチドを含み得る。ガイド型ヌクレアーゼのための「標的部位」は、標的部位での二本鎖核酸（ＤＮＡ）分子または染色体のいずれかの相補鎖の配列を含み得る。部位特異的ヌクレアーゼは、非コーディングガイド核酸（例えば限定にされずに、本明細書においてさらに記載されるようなＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）または単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））経由等で、標的部位へ結合し得る。本明細書において提供されるガイド核酸のターゲッター配列は、標的部位へ相補的（例えば標的部位での二本鎖核酸分子または染色体のいずれかの鎖へ相補的）であり得る。標的部位へ結合するかまたはハイブリダイズするために、ガイド核酸のターゲッター配列についての完璧な同一性または相補性が要求されなくてもよいことが、認識されるだろう。例えば、標的部位とガイド核酸のターゲッター配列との間で、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８のミスマッチ（またはそれ以上）が許容され得る。「標的部位」は、ガイド核酸分子によってガイドされなくてもよい他の任意のゲノム編集試薬（メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）など等）によって結合及び切断されて、ポリヌクレオチド配列及び／またはその相補ＤＮＡ鎖の中へ二本鎖切断、一本鎖ニックまたは他の修飾が導入される、植物ゲノム内のポリヌクレオチド配列の所在位置も指す。
【００９０】
本明細書において使用される時、「標的領域」または「標的化された領域」は、２つ以上の標的部位が近接するポリヌクレオチドの配列または領域を指す。限定するものではないが、いくつかの実施形態において、標的領域に、２つの標的部位での二本鎖切断またはニックの修復に続いて、突然変異、塩基修飾、欠失、挿入または逆位が行われ得る。本明細書において使用される時、「近接する」は、ポリヌクレオチドの配列または分子の標的領域を記載するのに使用される場合に、標的領域の各々の側の１つの標的部位と共に、標的領域を囲むポリヌクレオチドの配列または分子の２つ以上の標的部位を指す。
【００９１】
成熟した及び／または乾燥切除された外植片の少なくとも１つの細胞の中へゲノム編集試薬をコードするＤＮＡコンストラクトまたは分子の送達経由で、遺伝子導入されたかまたはゲノム編集された植物、植物の部分、及び種子を作製する方法が、ゲノム編集されたかまたは遺伝子導入された植物を発生または再生する、本明細書において記載される様々な培養ステップ及び処理ステップと一緒に、本明細書において提供される。本方法に従って作製された、遺伝子導入されたかまたはゲノムに編集された植物、植物の部分、及び種子がさらに提供される。本開示の一態様によれば、ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡコンストラクトまたは分子により、粒子衝撃または形質転換を行った外植片から発生または再生された植物またはその子孫植物は、発生または再生された植物またはその子孫植物、植物の部分もしくは種子において、編集もしくは突然変異によって、または挿入配列、導入遺伝子などの部位指向性組込みによって、産生されたマーカー、形質または表現型に基づいて、スクリーニングまたは選択され得る。所与の突然変異、編集、形質または表現型が劣性であるならば、形質または表現型を観察することができるように、初期のＲ０植物からの１つまたは複数の世代または交配（例えば自配）が、編集または突然変異のためのホモ接合の植物を産生するのに必要であり得る。子孫植物（Ｒ１種子から増殖させた植物または後続世代中の植物等）は、任意の公知の接合性アッセイを使用して（ヘテロ接合体とホモ接合体と野生型植物との間の区別を可能にする、ＳＮＰアッセイ、ＤＮＡ塩基配列決定、熱増幅もしくはＰＣＲ、及び／またはサザンブロッティング等の使用によって）、接合性について試験され得る。
【００９２】
さらなる実施形態において、ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡによる粒子衝撃もしくは形質転換を行った外植片から発生もしくは再生された植物の、またはその子孫植物の、または前述の植物の部分もしくは種子の、１つまたは複数の組織または細胞は、編集もしくは突然変異、または挿入配列、導入遺伝子などの部位指向性組込みの存在を検出する分子アッセイに基づいて、スクリーニングまたは選択され得る。編集もしくは突然変異または部位指向性組込みによって導入された導入遺伝子の存在を検出するのに使用され得るアッセイとしては、例えば分子生物学アッセイ（サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＰＣＲ、ＦＬＡ、ならびにＤＮＡ塩基配列決定等）；生化学アッセイ（例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）によって、または酵素機能もしくはインビトロ分析によって、タンパク質産物の存在を検出すること等）が挙げられる。代替的に、ゲノム編集試薬をコードするＤＮＡによる粒子衝撃もしくは形質転換を行った外植片から発生もしくは再生された植物、またはその子孫植物もしくは種子は、所望または予測される表現型または形質であり得る表現型または形質に基づいて、スクリーニングするか選択され得る。
【００９３】
ＩＶ．定義
以下の定義は、本明細書において使用される本開示の関連の実施形態を参照して、これらの用語の意味を定義し明確にするために、及び本開示の理解において当業者を導くために提供される。別段断りのない限り、用語は、関連の技術分野における、特に分子生物学及び植物形質転換の分野における、それらの従来の意味及び用法に従って理解されるべきである。
【００９４】
「胚」は、成体植物のすべてまたは部分へと発生し得る前駆体組織（例えばメリステムに関する組織）からなる、植物種子の部分である。「胚」は、植物胚の一部をさらに包含し得る。
【００９５】
「メリステム」または「メリステムに関する組織」は未分化細胞またはメリステムに関する細胞を含み、それらは、１つまたは複数のタイプの植物の部分、組織または構造（芽、茎、根、葉、種子のすべてまたは部分など等）を産生するように分化することが可能である。
【００９６】
本明細書において使用される時、「ゲノム編集試薬」という用語は、配列特異的様式でヌクレオチド配列を修飾することができる任意の酵素を指す。いくつかの実施形態において、ゲノム編集試薬は、一本鎖切断の誘導によってゲノムを修飾する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集試薬は、二本鎖切断の誘導によってゲノムを修飾する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集試薬は、シチジンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態において、ゲノム編集試薬は、アデニンデアミナーゼを含む。本開示において、ゲノム編集試薬としては、エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポゼース、デアミナーゼ、ヘリカーゼ、及びその任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、ゲノム編集試薬は、配列特異的ヌクレアーゼである。
【００９７】
一態様において、ゲノム編集試薬は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、アルゴノート（アルゴノートタンパク質の非限定的例としては、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルゴノート（ＴｔＡｇｏ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓアルゴノート（ＰｆＡｇｏ）、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉアルゴノート（ＮｇＡｇｏ）が挙げられる）、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ等のガイド型ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼの非限定的例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても公知である）、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても公知である）、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、そのホモログ、またはその修飾バージョンが挙げられる）から選択されるエンドヌクレアーゼである。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ゲノム編集試薬は、デアミナーゼへ作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集試薬は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＧＩ）を含む。いくつかの実施形態において、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼである。いくつかの実施形態において、デアミナーゼは、アデニンデアミナーゼである。いくつかの実施形態において、デアミナーゼは、ＡＰＯＰＥＣデアミナーゼである。いくつかの実施形態において、デアミナーゼは、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、触媒的に不活性なＣａｓ９ヌクレアーゼ、触媒的に不活性なＣｐｆ１ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ニッカーゼ、またはＣｐｆ１ニッカーゼである。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ゲノム編集試薬は、リコンビナーゼである。リコンビナーゼの非限定的例としては、本明細書において提供されるＤＮＡ認識モチーフへ添付されるチロシンリコンビナーゼが挙げられ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｇｉｎリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、及びＴｎｐ１リコンビナーゼからなる群から選択される。一態様において、本明細書において提供されるＣｒｅリコンビナーゼまたはＧｉｎリコンビナーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン、またはＣａｓ９ヌクレアーゼへ連結される。別の態様において、本明細書において提供されるＤＮＡ認識モチーフへ添付されるセリンリコンビナーゼは、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、及びＴＰ−９０１インテグラーゼからなる群から選択される。別の態様において、本明細書において提供されるＤＮＡ結合ドメインへ添付されるＤＮＡトランスポゼースは、ＴＡＬＥ−ｐｉｇｇｙＢａｃ及びＴＡＬＥ突然変異誘発遺伝子からなる群から選択される。
【０１００】
「再生」及び「再生すること」という用語は、１つまたは複数の植物細胞から１つまたは複数の培養ステップを介して植物を増殖または発生させるプロセスを指す。
【０１０１】
ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子、タンパク質、コンストラクト、ベクターなどを参照して、「組換え」という用語は、人工であり、通常は天然で見出されない、及び／またはそれが通常は天然で見出されない情況で存在する、ポリヌクレオチドまたはタンパク質の分子または配列を指し、人間の介入無しには同じ様式で天然に存在しない２つ以上のポリヌクレオチドまたはタンパク質配列の組み合わせを一緒に含む、ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子、タンパク質、コンストラクトなどを包含し、作動可能に連結されるが、互いに対して異種の少なくとも２つのポリヌクレオチドまたはタンパク質配列を含む、ポリヌクレオチド分子、タンパク質、コンストラクトなど等である。例えば、「組換え」という用語は、同じ分子（例えばプラスミド、コンストラクト、ベクター、染色体、タンパク質など）中の２つ以上のＤＮＡまたはタンパク質の配列の任意の組み合わせであって、かかる組み合わせは人工であり、通常は天然で見出されないものを指し得る。この定義において使用される時、「通常は天然で見出されない」という語句は、人間による導入無しでは天然で見出されないことを意味する。組換えポリヌクレオチドまたはタンパク質の分子、コンストラクトなどは、（ｉ）天然では互いに接近して存在する他のポリヌクレオチドまたはタンパク質の配列（複数可）から分離される、及び／または（ｉｉ）天然に互いと接近していない他のポリヌクレオチドまたはタンパク質の配列（複数可）に隣接（またはそれらと連続）する、ポリヌクレオチドまたはタンパク質の配列（複数可）を含み得る。かかる組換えポリヌクレオチド分子、タンパク質、コンストラクトなどは、細胞の外側で、遺伝子操作された及び／または構築されたポリヌクレオチドまたはタンパク質分子、または配列も指し得る。例えば、組換えＤＮＡ分子は、任意の操作されたプラスミドかまたは人工プラスミド、ベクターなどを含むことができ、直線状分子または環状ＤＮＡ分子を包含し得る。かかるプラスミド、ベクターなどは、原核生物の複製起点及び選択可能マーカーだけでなく、１つまたは複数の導入遺伝子または発現カセットに加えて、恐らく植物選択可能マーカー遺伝子などを包含する様々な維持エレメントを含有し得る。
【０１０２】
「作動可能に連結された」という用語は、プロモーターなどが作動または機能して、少なくとも特定の細胞（複数可）、組織（複数可）、発生ステージ（複数可）、及び／または条件（複数可）において、関連する転写可能ＤＮＡ配列またはコーディング配列の転写及び発現を開始する、援助する、影響する、引き起こす、及び／または促進するような、プロモーターまたは他の調節エレメントと関連する転写可能ＤＮＡ配列または遺伝子のコーディング配列（または導入遺伝子）との間の機能的なリンケージを指す。
【０１０３】
通常当技術分野において理解されるように、「プロモーター」という用語は概して、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、及び／またはＴＡＴＡボックスを含有し、関連する転写可能ポリヌクレオチド配列及び／または遺伝子（または導入遺伝子）の転写及び発現を支援または増進するＤＮＡ配列を、指し得る。プロモーターは、公知のもしくは天然に存在するプロモーター配列または他のプロモーター配列から合成的に産生され得るか、それらから変更され得るか、またはそれらに由来し得る。プロモーターは、２つ以上の異種の配列の組み合わせを含むキメラプロモーターも包含し得る。本開示のプロモーターは、したがって公知のまたは本明細書において提供される他のプロモーター配列（複数可）に組成で類似するが同一ではないプロモーター配列のバリアントを包含し得る。プロモーターは、プロモーターへ作動可能に連結された、関連するコーディング配列もしくは転写可能配列または遺伝子（導入遺伝子を包含する）の発現のパターンに関する様々な基準に従って分類され得、構成的、発生的、組織特異的、誘導可能など等である。植物のすべてまたは大部分の組織において発現を駆動するプロモーターは、「構成的」プロモーターと称される。発生のある特定の期間またはステージの間に発現を駆動するプロモーターは、「発生的」プロモーターと称される。他の植物の組織に比べて植物のある特定の組織において促進された発現を駆動するプロモーターは、「組織促進的」プロモーターまたは「組織優先的」プロモーターと称される。したがって、「組織優先的」プロモーターは、植物の特異的組織（複数可）中の比較的より高いかまたは選択的な発現を引き起こすが、植物の他の組織（複数可）中のより低いレベルの発現を伴う。植物の特異的組織（複数可）内で発現し、植物の他の組織中でほとんどまたは全く発現しないプロモーターは、「組織特異的」プロモーターと称される。「誘導可能」プロモーターは、環境刺激（寒冷、渇水または光等）または他の刺激（創傷または化学物質適用等）に応答して転写を開始するプロモーターである。プロモーターは、その起源（異種、同種、キメラ、合成など等）の点からも分類され得る。
【０１０４】
本明細書において使用される時、「植物で発現可能なプロモーター」は、植物細胞または組織において関連する転写可能ＤＮＡ配列、コーディング配列、または遺伝子の転写及び発現を開始する、援助する、影響する、引き起こす、及び／または促進することができる、プロモーターを指す。
【０１０５】
関連するポリヌクレオチド配列（例えば転写可能ＤＮＡ配列またはコーディング配列もしくは遺伝子）に関してプロモーターまたは他の調節配列を参照して、「異種の」という用語は、人間による導入無しでは天然で、かかる関連するポリヌクレオチド配列へ作動可能に連結されない（例えばプロモーターもしくは調節配列は、関連するポリヌクレオチド配列に比べて異なる起源を有する、及び／または、プロモーターもしくは調節配列は、プロモーターもしくは調節配列により形質転換される植物種中に天然に存在しない）、プロモーターまたは調節配列である。同様に、関連するポリヌクレオチド配列（導入遺伝子、コーディング配列または転写可能ＤＮＡ配列等）に関しての「異種のプロモーター」または「異種の、植物で発現可能なプロモーター」は、人間による導入無しでは天然で、関連するポリヌクレオチド配列に隣接して及び／または作動可能に連結されて存在しない、プロモーターまたは植物で発現可能なプロモーターを意味する。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という用語、ならびに特定の実施形態を記載する文脈において（特に以下の請求項のうちの特定の文脈において）使用される類似する参照物は、別段具体的に指摘されない限り、単数及び複数の両方をカバーすると解釈され得る。いくつかの実施形態において、「または」という用語は、代替物のみを指すかまたは代替物が相互に排他的であることが明示的に指摘されない限り、「及び／または」を意味するように本明細書において使用される。
【０１０７】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」「有する（ｈａｖｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語は、オープンエンドの連結動詞である。これらの動詞のうちの１つまたは複数の任意の形態または時制（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等）もオープンエンドである。例えば、１つまたは複数のステップを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」か、「有する（ｈａｓ）」か、または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、任意の方法は、それらの１つまたは複数のステップをのみ保持することに限定されず、他のリストされないステップもカバーし得る。同様に、１つまたは複数の特色を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」か、「有する（ｈａｓ）」か、または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、任意の組成物またはデバイスは、それらの１つまたは複数の特色をのみ保持することに限定されず、他のリストされない特色もカバーし得る。
【０１０８】
２つ以上のヌクレオチド配列またはタンパク質配列を参照して、「パーセント同一性」、「％同一性」または「同一のパーセント」という用語は、本明細書において使用される時、（ｉ）比較のウィンドウにわたって２つの最適にアライメントさせた配列を比較すること、（ｉｉ）同一の核酸塩基（ヌクレオチド配列について）またはアミノ酸残基（タンパク質について）が、両方の配列中で生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を得ること、（ｉｉｉ）一致した位置の数を比較のウィンドウ中の位置の数の合計によって割ること、及び（ｉｖ）この商に１００％を掛けてパーセント同一性を得ることによって、計算されるものである。「パーセント同一性」が、特定の比較ウィンドウが規定されること無しに参照配列に関して計算されるならば、そのとき、パーセント同一性は、アライメントの領域にわたって一致した位置の数を参照配列の長さの合計によって割ることによって決定される。例えば、「比較ウィンドウ」は、アライメントの領域として定義され得、その事例において、「パーセント同一性」は「アライメントパーセント同一性」とも称される。したがって、本明細書において使用される時、２つの配列（クエリ及びサブジェクト）が最適にアライメントされる（それらのアライメントにおいてギャップのための許容値有りで）場合に、クエリ配列についての「パーセント同一性」は、２つの配列の間の同一の位置の数を、その長さ（または比較ウィンドウ）にわたるクエリ配列中の位置の数の合計によって割って、次いでそれに１００％を掛けたものに等しい。
【０１０９】
いくつかの実施形態によれば、粒子の複合体または組成の組成物及び製剤は、植物のゲノムを編集するための「有効量」または「有効濃度」の部位特異的ヌクレアーゼをコードするＤＮＡコンストラクトまたは分子を、恐らく他の構成要素と一緒に含み得る。粒子の組成物または製剤の有効量または濃度は、多数の因子に依存し、例えばプレアセンブルされたヌクレアーゼ組成物または製剤が適用される粒子のタイプ、サイズ及び量、所望されるゲノム編集の効率、組成物または製剤中の他の成分の同一性及び量、特定の植物種、使用される植物材料のタイプ（例えば乾燥切除された外植片、湿潤切除された胚など）、ならびに組成物または製剤が植物材料へ適用される具体的な条件（例えば温度、培養など）等である。
【０１１０】
いくつかの実施形態における組成物は、粒子組成物と組み合わせて農業的に許容可能な担体または材料をさらに含み得る。本明細書において使用される時、担体または材料を参照して、「農業的に許容可能である」という用語は、担体または材料が、事例に応じて、（ｉ）少なくとも粒子／ヌクレアーゼ組成物が使用される目的のために、粒子／ヌクレアーゼ組成物の他の成分と適合性がある、（ｉｉ）植物材料（例えば乾燥切除された外植片）へ粒子組成物を有効且つ実行可能に送達するように粒子組成物中に含まれ得る、ならび（ｉｉｉ）組成物が適用される植物材料に有害ではない（それが、少なくとも植物材料へ適用されるかまたは植物材料と関連する様式及び量で）ことを意味する。
【０１１１】
本明細書において記述されるすべての方法は、本明細書において別段の指示のないかまたは明らかに文脈と矛盾しない限り、任意の好適な順序で遂行され得る。任意の及びすべての実施例、または本明細書におけるある特定の実施形態に関して提供される例示的な文言（例えば「等の」）の使用は、本開示を明らかにすることを単に意図し、請求項に記載されない限り、本開示の範囲に対する限定をもたらさない。
【０１１２】
本開示を詳細に記載してきたが、添付の請求項中でさらに定義される本開示の趣旨及び範囲から逸脱せずに、修飾物、変動物、及び同等な実施形態が可能であることは明らかであろう。さらに、以下のものを包含する本開示中のすべての実施例が、非限定的実施例として提供されることが認識されるべきである。
【実施例】
【０１１３】
実施例１．ダイズ外植片の衝撃のためのビーズ及びキャリアシートの調製
以下のものは、外植片に衝撃を受けさせるためのビーズ及びキャリアシートの調製についてのプロトコールの実施例である。ＰＤＳ１０００ヘリウムパーティクルガンを使用するダイズ種子から乾燥切除された胚外植片の衝撃のための粒子またはビーズ及びキャリアシートを、以下のプロトコールに従って調製する。５０ｍｇの金粒子またはタングステン粒子を、清浄なＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ不含有チューブの中へ計量する。１ｍｌの１００％のエタノールによる超音波処理によって洗浄した後に、粒子を短時間の遠心分離によってペレットにし、エタノールを除去する。粒子を１ｍｌの１００％のエタノール中で再懸濁し、後の使用のために−２０℃で保存する。使用の前に、粒子を超音波処理によって再懸濁する。４２μｌの金粒子またはタングステン粒子を新しいチューブへ移行し、遠心分離によってペレットにし、エタノールを除去する。５００μｌの滅菌水を添加し、粒子を超音波処理によって再懸濁する。粒子を遠心分離によってペレットにし、水を除去する。２５μｌの水をチューブへ添加し、粒子をピペットチップにより洗浄し、その後、超音波処理によって再懸濁する。
【０１１４】
ダイズにおいて、１１番染色体（ｃｈｒ１１）及び１８番染色体（ｃｈｒ１８）上に所在する２つのＰＤＳ遺伝子ＧｍＰＤＳ１１（Ｇｌｙｍａ．１１Ｇ２５３０００、配列番号：１）及びＧｍＰＤＳ１８（Ｇｌｙｍａ．１８Ｇ００３９００、配列番号：２）がそれぞれある。３つのガイドＲＮＡ（それぞれｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２またはｇＲＮＡ３（配列番号：３〜５））のうちの１つをコードする転写可能ＤＮＡ配列を各々含む、３つの組換えＤＮＡコンストラクトを、図１Ａ中で示されるＧｍＰＤＳ１１及びＧｍＰＤＳ１８の保存された領域を標的化するようにデザインした。図１Ｂ中で示されるように、強い構成的プロモーター下でＣａｓ９をコードする発現カセットまたは導入遺伝子及びダイズＵ６プロモーター下で３つのｇＲＮＡのうちの１つをコードする転写可能ＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡ分子または断片を作製した。図１Ｂ中でさらに示されるように、これらの組換えＤＮＡ分子は、ＧＵＳ及びａａｄＡについての発現カセットまたは導入遺伝子も含有していた。Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、ＧＵＳ及びａａｄＡ発現のための組換えＤＮＡ分子を、ＮｏｔＩ制限酵素及びＩ−ＣｅｕＩ制限酵素によって、組換えＤＮＡコンストラクトを含むＤＮＡベクターから直線状断片として放出させた。左側境界（ＬＢ）及び右側境界（ＲＢ）の存在は、これらのＤＮＡ分子または断片がＴ−ＤＮＡベクターから切除されることから示されるが、断片が粒子衝撃経由で外植片細胞へ送達されるので、これらの実験に影響を与えるべきでない。
【０１１５】
組換えＤＮＡ分子、コンストラクトまたは断片を、恐らく他の組換えＤＮＡ分子（複数可）及び／または非コーディングＲＮＡと一緒に、チューブへ添加する（例えば約２．６μｇのＤＮＡ）。ＤＮＡ及び／またはＲＮＡを添加した直後に、氷冷滅菌水を添加して、ＤＮＡ及び粒子混合物の最終体積を２４５μｌにする。混合物を当該体積にした直後に、２５０μｌの２．５Ｍの氷冷ＣａＣｌ２溶液及び５０μｌの０．１Ｍの滅菌スペルミジンを添加する。次いでこの溶液を低速ボルテックスの撹拌によって混合する。チューブを少なくとも４５分間氷上でインキュベートして、粒子のコーティングを達成する。いくつかの実験においてはより良好な結果のために、溶液を５〜１０分ごとに混合する。粒子を、低速遠心分離によって（例えばＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１５微量遠心分離機を８００〜１０００ｒｐｍで２分間使用することによって）ペレットにする。ペレットを１ｍｌのエタノールにより洗浄し、粒子をピペットチップにより洗浄し、遠心分離によってペレットにする。エタノールを除去し、３６μｌの１００％のエタノールを添加して、低速ボルテックスでの撹拌により粒子を再懸濁する。５μｌのこの調製物をヘリウムパーティクルガンによる各々の衝撃のために使用する。電動ガン（Ａｃｃｅｌｌ）については、この調製物を、シンチレーションバイアル中で３６μｌのビーズ／粒子調製物の１０個を組み合わせ、１００％のＥｔＯＨを添加して２０ｍｌの最終体積をもたらすことによって修飾することができる。
【０１１６】
上記の超音波処理ステップを４５〜５５ｋＨｚで１分間遂行することができ；ビーズのコーティングの前の遠心分離のステップをＩＥＣ微量遠心機で５０００ｒｐｍ（２３００ｇ）で１０秒間実行することができ；ビーズのＤＮＡコーティング後の遠心分離のステップをＩＥＣ微量遠心機で１０００ｒｐｍ（１００ｇ）で２分間遂行することができる。
【０１１７】
粒子衝撃のために、滅菌水による３回の洗浄後に、所望される量のタングステン粒子（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を５０μｌの滅菌水中で再懸濁する。次いで２μｌのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）２０２０（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＬＣ）ならびに上で提供されるように調製した３０μｌのＤＮＡ及び／またはＲＮＡを粒子へ添加し、少なくとも１０分間氷上で穏やかに混合した。次いでコーティングしたタングステン粒子を微量遠心機中で８０００×ｇで３０秒間ペレット化し、上清画分を除去した。ペレットを短時間の超音波処理によって１８０μｌの滅菌水中で再懸濁した。超音波処理の直後に、コーティングした粒子を６×マクロキャリア（各々３０μｌ）の上へ装填し、およそ２〜３時間風乾させた。
【０１１８】
実施例２．粒子衝撃のためのダイズ外植片の前培養
以下のものは、衝撃のための外植片の前培養のプロトコールの実施例である。乾燥切除されたダイズ胚外植片を、粒子衝撃の前に前培養する。成熟した胚外植片を、例えば概して米国特許第８，３６２，３１７号中で記載されるように、乾燥ダイズ種子から切除する。外植片を吹き付けのために計量し、２０％のＰＥＧ４０００（Ｌｙｎｘ  ３０１７；例えば米国特許出願公開第２０１６／０２６４９８３号を参照）または１０％のスクロース培地のいずれか中で１時間再水和させ、十分にリンスする。Ｌｙｎｘ  １５９５（例えば米国特許出願公開第２０１６／０２６４９８３号を参照）培地（または３０ｐｐｍのＣｌｅａｒｙを含有するＬｙｎｘ  １５９５）も、このステップにおいて使用することができる。１プレートあたりおよそ５０の外植片を、ＥＪＷ  １培地またはＥＪＷ  ２培地上で前培養する（例えば米国特許出願公開第２０１６／０２６４９８３号を参照）。およそ０．５ｐｐｍ〜２ｐｐｍの範囲中のレベルのＴＤＺも、ＥＪＷ（ＬＩＭＳ  ４８５９）培地中で使用する。外植片を、１６／８時間の光周期または暗所のいずれかにおいて２８℃で１〜２日間前培養する。外植片を、約３日間前培養することもできる。
【０１１９】
実施例３．外植片の粒子衝撃
以下のプロトコールは、ＰＤＳ１０００ヘリウムパーティクルガンにより使用することができる。ガンの構成要素（ストップスクリーン、破裂板及びマクロキャリアホルダー等）を、７０％のＥｔＯＨ（またはキャリアシートのためにはイソプロパノール）を使用して、約１分間消毒する。破裂板（例えばおよそ６５０〜２２００ｐｓｉの範囲で使用される板、例えば１３５０ｐｓｉ板が挙げられる）を、破裂板の保持キャップの中へ装填し、気体加速チャンバーの中へネジ留めする。ストップスクリーンを、真鍮製の調整可能なネスト上に置く。上で記載される５μｌのヘリウムガン調製物を、各々の衝撃のために各々のキャリアシートの上へ分注する。キャリアシートを風乾し、その後、それらを裏返し、真鍮製のネスト上のストップスクリーンまたは保持スクリーンの上部に置く。マクロキャリア発射アセンブリをアセンブルし、破裂板下に直接置く。破裂板とマクロキャリア発射アセンブリとの間のギャップ距離はおよそ１ｃｍである。
【０１２０】
前培養したダイズ外植片を、メリステムの中心を上に向けて標的プレート培地＃４２（ＴＰＭ４２）上にポジショニングし、吹き付ける。４Ｌのビーカーの中へ２リットルの蒸留水を測定し、１６ｇの洗浄したアガーを添加し、次いでそれを２５分間オートクレーブして、アガーを溶液にすることによって、ＴＰＭ４２培地を調製する。ＴＰＭ４２は、低粘度用に８％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（または高粘度用に２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ））及び０．４％の洗浄したアガーを含有し得る。溶液をわずかに冷却し、４Ｌのブレンダーの中へ注ぎ、次いで３２０ｇのＣＭＣ（低粘度）または８０ｇのＣＭＣ（高粘度）を２Ｌの水と一緒に添加する。混合物をブレンドし、４Ｌのプラスチックビーカーへ移行させ、次いでそれを混合し、３０分間オートクレーブし、４本の１Ｌのボトルへと分割する。次いでＴＰＭ４２溶液をさらに２５分間オートクレーブし、約６０℃へ冷却し、その後、プレートの中へ注ぐ。６０ｍｍのプレートあたり約１２〜１５ｍｌを注いで約３００の標的プレートを作製することができ、それらは４℃または−２０℃で保存することができる。
【０１２１】
以下のものは、ＡＣＣＥＬＬ電動パーティクルガンの使用のためのプロトコールの実施例である。ビーズ調製物を室温にし、ボルテックスで撹拌する。０．５ミルの３．２ｃｍ２のマイラーシートを、随意に減湿装置ユニット中で、小さなプラスチックディッシュの上へ置き、３２０μｌのビーズ調製物をシートの上へ置く。各々のシートを風乾する。前培養したダイズ外植片を、メリステムの中心を上に向けてＴＰＭ４２プレート上にポジショニングする。最初の吹き付けのエネルギーに一貫性が無いので、ブランクの吹き付けを最初に行う。標的を、キャリアシート上に直接置いた保持スクリーンの上に置く。部分的なヘリウム真空（Ｈｇで１３．５）下で、１０μＬの水滴を１７．５〜２０ｋＶでコンデンサーを放電することによって蒸発させる。蒸発する液滴によって形成された衝撃波は、シートを保持スクリーンの中へ推進し、それは大部分のマイラーを止めるが、金ビーズがダイズ外植片メリステムに侵入することを可能にする。吹き付け間で、一滴のミネラルオイルをポイントの間に懸濁し、次いで除去して浄化する。前と同じように、１０μＬの水をポイントの間に懸濁する。アークチャンバーをＰＶＣブロックによりカバーし、マイラーシートを正方形の開口上に置き、スクリーンフードをシート及びポイントの上に置く。スクリーンをシートの上にアライメントさせる。メリステムを上方に向け、重量がディッシュ上に課されるように、標的ディッシュを保持スクリーンの上に上下逆さまで置く。装置を鐘形ジャーによりカバーし、真空にする。１５秒後に、Ｈｇで１３．５の真空を読み取り、ガンを発射する。
【０１２２】
実施例４．粒子衝撃に続く外植片の培養
衝撃を受けた外植片を、ＥＪＷ  １培地の表面上に一晩プレーティングする（他の前培養培地も使用され得る）。一例において、プレートを１６／８時間の光周期により２８℃でインキュベーションする。外植片を、５０〜５００ｐｐｍのスペクチノマイシン含有のＢ５培地（修飾されたスペクチノマイシンレベルのＬＩＭＳ  ３４８５；例えば米国特許出願公開第２０１６／０２６４９８３号を参照）の表面上にプレーティングするかまたは埋め込み、再生プロセスを通して１６／８時間の光周期により２８℃で維持する。一例において、Ｂ５培地中で２５０ｐｐｍのスペクチノマイシンを使用する。ａａｄＡ選択可能マーカー遺伝子の存在は、選択薬剤としてのスペクチノマイシンへの抵抗性または耐性を提供する。２４．５ｇのＢ５カスタム培地混合物は、３．２１ｇのＧａｍｂｏｒｇのＢ５培地、２０ｇのスクロース及び１．２９ｇのグルコン酸カルシウムを含む。培養を芽／緑化についてモニタリングし、必要に応じて継代培養する。
【０１２３】
実施例５．粒子送達及び再生後の編集されたＰＤＳ突然変異の同定
１ショットあたり０．０２または０．０４ｐｍｏｌｅのいずれかに相当する図１Ｂ中で示されるＤＮＡ断片を、微粒子銃送達のための粒子の上へ装填した。衝撃を受けた外植片から再生された植物を、ａａｄＡマーカーの存在についてスクリーニングした。リアルタイム定量的ＰＣＲによって決定されるａａｄＡマーカー遺伝子について陽性の植物を、Ｃａｓ９を発現する組換えＤＮＡ及びＰＤＳ遺伝子座位を標的化するｇＲＮＡの共送達に起因する編集の存在についてさらに試験した。ゲノムＤＮＡを衝撃後の２週間後に再生された小植物の葉サンプルから抽出し、１つまたは両方のＰＤＳ遺伝子座での編集の存在を断片長分析（ＦＬＡ）によって検出した。ＦＬＡは、野生型参照からのアンプリコンへ、ＰＣＲ断片長の変動を比較して、野生型参照に比べて１つまたは複数の突然変異を有するサンプルを同定する、ＰＣＲベースの分子的な分析である。製造元の指示に従って、５’ＦＡＭ標識プライマー、標準的なプライマー、及びＰｈｕｓｉｏｎ（商標）ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＰＣＲ反応を実行して、２００〜５００ｂｐのＰＣＲ断片を生成した。配列番号：６及び７中で記載されるＧｍＰＤＳ遺伝子のためのＦＬＡプライマーは、ＧｍＰＤＳ１１について４２８ｂｐのＰＣＲ断片及びＧｍＰＤＳ１８について３８４ｂｐのＰＣＲ断片を生じさせる。これらの期待されるサイズとは異なるＰＣＲ断片は、突然変異または編集された対立遺伝子と判断される。図１中で示されるように、編集頻度は、衝撃後にＧｍＰＤＳ遺伝子座で１７．６％〜４２．５％への範囲であることが観察された。
【表１】
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【０１２４】
実施例６．１８染色体番上でのＰＤＳ遺伝子座の中への部位指向性組込み（ＳＤＩ）事象の同定。
挿入配列を含むドナー鋳型と共にＣａｓ９及びｇＲＮＡを送達することは、ｇＲＮＡについての標的部位で挿入配列の部位指向性組込み（ＳＤＩ）を導き得る。いくつかの事例において、ゲノム編集構成要素（例えば部位特異的ヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、及び／またはマーカー遺伝子）のうちの１つまたは複数をコードするＤＮＡ分子または断片は、部位指向性組込みのための鋳型としても供され得る。たとえＤＮＡ分子または断片が、相同媒介性修復のための相同配列（複数可）を含有していなくても、ＤＮＡ分子または断片の挿入が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して起こり得る。上記の実施例５は、図１Ｂ中で提供されるＤＮＡ断片による粒子衝撃を介して多数のゲノム編集が産生されることを示す。この実施例におけるゲノム編集構成要素を送達するのに使用される図１Ｂ中のＤＮＡ断片は、ＮＨＥＪを介してもｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的切断部位で挿入することができた。この実験において、２つの組込み事象が、図１ＢのＤＮＡ断片中のｇＲＮＡ標的部位で検出された。
【０１２５】
４つのＰＣＲアッセイを挿入配列の存在を検出するために確立し、挿入配列の存在は、図１Ｃ中で図示されるような２つの異なる向きで起こり得た。１ショットあたり０．０２または０．０４ｐｍｏｌｅのいずれかのＣａｓ９及びｇＲＮＡ２（配列番号：４）をコードする実施例５からのＤＮＡ断片を、ビーズに装填した。図中で１Ｃ示されるように、プライマー３９６５（配列番号：８）及び２４３８（配列番号：９）を使用するＰＣＲ、及び／またはプライマー４００５（配列番号：１０）及び３９６６（配列番号：１１を使用するＰＣＲを使用して、ＤＮＡ断片のＳＤＩ挿入の１つの向きを検出する一方で、プライマー３９６６及び２４３８を使用するＰＣＲ、及び／またはプライマー４００５及び３９６５を使用するＰＣＲを使用して、他のＳＤＩの向きを検出した。
【０１２６】
少なくともＤＮＡ断片の一部の挿入を含有する事象＃４８及び＃２０が、ＰＣＲによって見出され（図２を参照）、それは、組込みジャンクションを介するシーケンシングによってさらに確認された。事象＃２０は挿入の端部でインタクトなＮｏｔＩ配列を有するが、断片の他のＩ−ＣｅｕＩ端部はＰＣＲによって検出されず、ＰＣＲ増幅を阻止する欠失または構造的な変化がこの端部で起こったことが指摘された。事象＃２０が１８染色体番上のＰＤＳ遺伝子座で起こり、Ｔａｑｍａｎ分析により、４コピー超のＤＮＡ断片のすべてまたは部分が当該部位で組み込まれたことがさらに明らかにされた。事象＃４８は、プライマー３９６６及び４００５によるＰＣＲによって検出される挿入の端部（Ｉ−ＣｅｕＩ末端）で欠失を有することが決定された。事象＃４８の挿入の他の端部はＰＣＲによって検出されず、ＰＣＲ増幅を阻止する欠失または構造的な変化がこの端部で起こったことが指摘された。事象＃２０に類似して、事象＃４８が１８染色体番上のＰＤＳ遺伝子座で起こり、Ｔａｑｍａｎ分析により、４コピー超のＤＮＡ断片のすべてまたは部分が当該部位で組み込まれたことがさらに明らかにされた。
【０１２７】
ＧｍＰＤＳ（Ｃｈｒ１８）遺伝子座中でのＳＤＩの事象の数及び頻度を、表２中で提供する。ＰＤＳ遺伝子中の突然変異は、白色化した葉の表現型を引き起こすことができ、このことはＰＤＳ遺伝子への編集が起こった可能性がある、及び／または当該編集がそれらの組織中に存在することを指摘し得る。
【表２】
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【０１２８】
実施例７．成熟した種子外植片の中へのＣｐｆ１、ｇＲＮＡ及びｓｓＤＮＡの送達
ＬｂＣｐｆ１はＴＴＴＶ  ＰＡＭ配列についての優先を示すので、標的部位ＧｍＴＳ１を、各々の標的配列の上流の適切なＰＡＭ配列の出現に基づいて選択した。ＬｂＣｐｆ１タンパク質を標的部位へガイドするように、ガイドＲＮＡをデザインした。ＬｂＣｐｆ１タンパク質、ガイドＲＮＡ及びａａｄＡを発現させるための組換えＤＮＡを、クローン化した。
【０１２９】
さらに、５’ＴＥＧ修飾された７０ｂｐ長のｓｓＤＮＡ（単一鎖ＤＮＡ）鋳型をデザインした。ＴＥＧ修飾ｓｓＤＮＡ鋳型を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、製品１１８４、修飾コード：／５Ｓｐ９／）から取り寄せた。この鋳型は、３０ｂｐの５’相同アーム及び３０ｂｐの３’相同アーム（それらは、ＧｍＴＳ１部位に近接するＤＮＡ配列に同一であるようにデザインされる）がそれぞれ近接するＢａｍＨＩ認識配列を含有する１０ｂｐのシグネチャー配列を有する。ＧｎＴＳ１部位での対応する野生型配列は、５’相同アームと３’相同アームとの間に８ｂｐの内在性配列を有する。この一本鎖ＤＮＡ鋳型（ｓｓＤＮＡ鋳型）を、ＬｂＣｐｆ１タンパク質、ｃｒＲＮＡｓ及びａａｄＡの発現のための組換えＤＮＡへ添加した。具体的には、８０ｐｍｏｌのｓｓＤＮＡ鋳型、０．８ｐｍｏｌの組換えＤＮＡを、コーティング試薬としてＴｒａｎｓＩＴ−２０２０を使用して、０．６ｕｍの金粒子（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；約６６ｕｇ／ショット）の上にコーティングした。混合物を氷上で≧１５分間維持し、５分間ごとに優しく混合した。コーティングした金粒子を短時間の遠心分離によってペレットにし、上清を除去した。コーティングした金粒子を再懸濁し、１ｍＬの１００％の予冷エタノールにより洗浄し、続いて短時間遠心分離してエタノールを除去した。コーティングした金粒子を３０ｕｌの１００％の予冷エタノールの中へ再懸濁し、次いでマイクロキャリアーディスクの上に充填し（１ショットあたり５ｕｌ）、１０分間乾燥させた。
【０１３０】
乾燥切除されたダイズ胚外植片を、ＬＩＭＳ  ３９９０（１グラム／ＬのＫＮＯ３、０．０３グラム／ＬのＣｌｅａｒｙｓ  ３３３６  ＷＰ、３．９グラム／ＬのＭＥＳ（ｐＨを５．６へ）を含有する、３０グラム／ＬのＢ５カスタム培地）中で１時間再水和させ、滅菌Ｈ２Ｏにより十分にリンスし、１日間の１６／８時間の光周期で２８℃で培地ＬＩＭＳ  ４８５９中で培養した。これらの前培養された成熟したダイズ胚外植片の衝撃を実施例３に従って実行した。衝撃後に、胚外植片を培地ＬＩＭＳ  ４８５９の上へ移行させ、暗所で２８℃または３７℃で２日間培養した。
【０１３１】
表３中で示されるように、２８℃での１５実験にわたって、突然変異（デザインされたＣｐｆ１切断部位のまわりの小さな挿入または欠失）率は、４１．７％であり、完璧な鋳型編集（相同アームによって画成される５’ジャンクション及び３’ジャンクションが近接するＢａｍＨＩ認識配列を含有する１０ｂｐのシグネチャー配列を有する）率は、０．２５％であった。３７℃での１５実験にわたって、突然変異（小さな挿入または欠失）率は、４９．９％であり、完璧な鋳型編集（相同アームによって画成される５’ジャンクション及び３’ジャンクションが近接するＢａｍＨＩ認識配列を含有する１０ｂｐのシグネチャー配列を有する）率は、０．３５％であった。
【表３】
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【０１３２】
本発明はある特定の実施形態を参照して開示されてきたが、本明細書において開示され、添付の請求項によって提供される、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに、修飾及び変動が可能であることは明らかであろう。さらに、本開示中のすべての実施例は、本発明の実施形態を例証するものであるが、非限定的実施例として提供され、したがってそのように例証された様々な態様を限定するものとして見なされるべきではないことが認識されるべきである。本開示中で引用されるすべての参照文献は、それらの全体を参照することによって本明細書に援用される。本発明は、本開示、以下の請求項の文言、及び任意のその均等物によって定義される完全な範囲を有することが意図される。したがって、図面及び発明を実施するための形態は例証として見なされるべきであり、制限として見なされるべきではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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