(57)【要約】試料の処理および／またはデータ分析のための、組成物、方法、およびシステムを本明細書において提供する。試料の処理は、核酸試料の処理、およびその後の配列決定を含み得る。本開示の方法およびシステムは、例えば、ヒト、非ヒト、およびその組合せ由来の核酸試料の分析のために使用することができる。本明細書に開示される方法は、これらの課題に対処し、単一試料中のヒトおよび非ヒトゲノムに分析を拡大する、特定の配列決定プロトコールまたは技術を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の生体試料を処理するための方法であって、
（ａ）核酸プローブのプールを使用して、前記生体試料から核酸分子のサブセットを生成するステップであって、前記プローブが、（ｉ）ヒトゲノムのエレメントを標的にするように構成された第１の複数の核酸プローブ、および（ｉｉ）１つまたは複数の非ヒトゲノムのエレメントを標的にするように構成された第２の複数の核酸プローブを含む、ステップ；ならびに
（ｂ）前記核酸分子のサブセットをアッセイに付して、（ｉ）前記対象からの前記生体試料由来のヒト核酸、および（ｉｉ）前記対象の前記生体試料由来の非ヒト核酸の配列を含む配列情報を得るステップ
を含む、方法。
【請求項２】
（ｉ）の前記第１の複数の核酸プローブが、前記ヒトゲノムに由来するエレメントを標的にするように構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２の複数の核酸プローブが、ウイルス、細菌、細菌のファージ、真菌、原生生物、古細菌、アメーバ、蠕虫、藻類、遺伝子改変細胞、および遺伝子改変ベクターからなる群より選択される１つまたは複数の種の非ヒトゲノム配列由来のエレメントを標的にするように構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生体試料から前記核酸分子のサブセットを生成するステップが、１つまたは複数のハイブリダイゼーション反応を実施するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象から前記生体試料を得るステップをさらに含み、前記生体試料が、腫瘍生検材料、全血、または血漿に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸分子のサブセットの前記配列を１つまたは複数の参照配列と整列させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１つまたは複数の参照配列が、複数の参照配列を含み、前記複数の参照配列が、２つまたはそれよりも多くの異なる種に対応する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記整列に基づいて、前記サブセット中の前記核酸分子の起源を特定するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記生体試料中の前記核酸分子の前記起源を含む出力を生成するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２の複数の核酸プローブの濃度が、前記核酸プローブのプール中の前記第１の複数の核酸プローブの濃度よりも高い、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブのプール中の前記第２の複数の核酸プローブの濃度が、前記核酸プローブのプール中の前記第１の複数の核酸プローブの濃度よりも高い、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の複数の核酸プローブが、ヒトエクソーム捕捉用プローブセットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の複数の核酸プローブが、ヒトＶ（Ｄ）Ｊの再編成または組換えによって作出されるジャンクション配列を標的にするように構成されたプローブを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の複数の核酸プローブが、ヒトパピローマウイルスのＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子、および／または細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の１つもしくは複数のエレメントを標的にするように構成された１つまたは複数のプローブを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
（ｂ）の前記アッセイが、配列決定を行って、１３０塩基〜２８０塩基の長さのペアエンドリード配列を生成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）候補腫瘍ネオ抗原、（ｉｉ）検出される非ヒト種、（ｉｉｉ）検出される相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択されるデータの１つまたは複数のセットを含む１つまたは複数の生物医学レポートを生成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出される非ヒト種が、抗原であり、前記ＣＤＲ３配列が、抗原に結合する能力を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つまたは複数の生物医学レポートが、（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか２つを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
対象の生体試料を処理するための方法であって、
（ａ）前記生体試料から核酸分子のサブセットを生成するステップであって、前記核酸分子のサブセットが、（ｉ）前記対象由来の第１の複数の核酸分子、および（ｉｉ）前記対象由来ではない第２の複数の核酸分子を含み、前記第１の複数の核酸分子の存在量が、前記生体試料中の前記第２の複数の核酸分子の存在量よりも多い、ステップ；ならびに
（ｂ）前記核酸分子のサブセットをアッセイに付して、（ｉ）前記第１の複数の核酸分子、および（ｉｉ）前記第２の複数の核酸分子の配列を含む配列情報を得るステップ
を含む、方法。
【請求項２０】
（ｉ）の前記核酸分子が、前記対象のゲノムに由来する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象由来ではない前記第２の複数の核酸分子が、ウイルス、細菌、細菌のファージ、真菌、原生生物、古細菌、アメーバ、蠕虫、藻類、遺伝子改変細胞、および遺伝子改変ベクターからなる群より選択される１つまたは複数のメンバーを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体試料から前記核酸分子のサブセットを生成するステップが、１つまたは複数のハイブリダイゼーション反応を実施することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象から前記生体試料を得るステップをさらに含み、前記生体試料が、腫瘍生検材料、全血、または血漿に由来する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸分子のサブセットの前記配列を１つまたは複数の参照配列と整列させるステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記１つまたは複数の参照配列が、複数の参照配列を含み、前記複数の参照配列が、２つまたはそれよりも多くの異なる種に対応する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記整列に基づいて、前記サブセット中の前記核酸分子の起源を特定するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記生体試料中の核酸分子の特定された前記起源を含む出力を生成するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の複数の核酸分子の存在量が、前記生体試料中の前記第１の複数の核酸分子の存在量よりも多い、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記サブセット中の前記第２の複数の核酸分子の相対存在量が、前記サブセット中の前記第１の複数の核酸分子の相対存在量よりも多い、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
対象の生体試料を処理するためのシステムであって、
核酸分子のサブセットをアッセイに付して、（ｉ）前記対象からの前記生体試料由来のヒト核酸、および（ｉｉ）前記対象の前記生体試料由来の非ヒト核酸の配列を含む配列情報を得るように、個々にまたは集合的にプログラムされた１つまたは複数のコンピュータプロセッサーを含むプロセシングユニットであって、前記核酸分子のサブセットが、核酸プローブのプールを使用して、前記生体試料から生成され、前記プローブが、（ｉ）ヒトゲノムのエレメントを標的にするように構成された第１の複数の核酸プローブ、および（ｉｉ）１つまたは複数の非ヒトゲノムのエレメントを標的にするように構成された第２の複数の核酸プローブを含む、プロセシングユニット；ならびに
前記配列情報を保存するように構成されたコンピュータメモリ
を含む、システム。
【請求項３１】
前記１つまたは複数のコンピュータプロセッサーが、前記配列と１つまたは複数の参照配列との整列を生成するようにプログラムされる、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
前記１つまたは複数の参照配列が、複数の参照配列を含み、前記複数の参照配列が、２つまたはそれよりも多くの異なる種に対応する、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記１つまたは複数のコンピュータプロセッサーが、前記整列に基づいて、前記サブセット中の前記核酸分子の起源を特定するようにプログラムされる、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３４】
前記１つまたは複数のコンピュータプロセッサーが、前記生体試料中の前記核酸分子の前記起源を含む出力を生成するようにプログラムされる、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
前記１つまたは複数のコンピュータプロセッサーが、（ｉ）候補腫瘍ネオ抗原、（ｉｉ）検出される非ヒト種、（ｉｉｉ）検出される相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される情報を含む１つまたは複数の生物医学レポートを生成するようにプログラムされる、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３６】
対象の生体試料を処理するためのシステムであって、
核酸分子のサブセットをアッセイに付して、（ｉ）前記第１の複数の核酸分子、および（ｉｉ）前記第２の複数の核酸分子の配列を含む配列情報を得るように、個々にまたは集合的にプログラムされた１つまたは複数のコンピュータプロセッサーを含むプロセシングユニットであって、前記核酸分子のサブセットが、前記生体試料から生成され、前記核酸分子のサブセットが、（ｉ）前記対象由来の第１の複数の核酸分子、および（ｉｉ）前記対象由来ではない第２の複数の核酸分子を含み、前記第１の複数の核酸分子の存在量が、前記生体試料中の前記第２の複数の核酸分子の存在量よりも多い、プロセシングユニット；ならびに
前記配列情報を保存するように構成されたコンピュータメモリ
を含む、システム。
【請求項３７】
前記１つまたは複数のコンピュータプロセッサーが、前記配列と１つまたは複数の参照配列との整列を生成するようにプログラムされる、請求項３６に記載のシステム。
【請求項３８】
前記１つまたは複数の参照配列が、複数の参照配列を含み、前記複数の参照配列が、２つまたはそれよりも多くの異なる種に対応する、請求項３７に記載のシステム。
【請求項３９】
前記１つまたは複数のコンピュータプロセッサーが、前記整列に基づいて、前記サブセット中の前記核酸分子の起源を特定するようにプログラムされる、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４０】
前記１つまたは複数のコンピュータプロセッサーが、前記生体試料中の前記核酸分子の前記起源を含む出力を生成するようにプログラムされる、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４１】
前記１つまたは複数のコンピュータプロセッサーが、（ｉ）候補腫瘍ネオ抗原、（ｉｉ）検出される非ヒト種、（ｉｉｉ）検出される相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される情報を含む１つまたは複数の生物医学レポートを生成するようにプログラムされる、請求項３６に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１８年８月７日に出願された米国特許出願第１６／０５６，９８２号、および２０１８年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／６７８，４７５号に対する優先権を主張し、これらは、全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
全ゲノムおよび／またはエクソームの配列決定の現在の方法は、費用がかかり、多くの生物医学的に重要な変異体を捕捉することができない場合がある。例えば、市販のエクソーム濃縮キット（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑエクソーム濃縮、およびＡｇｉｌｅｎｔのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔエクソーム濃縮）は、生物医学的に興味深い非エクソーム領域およびエクソーム領域を標的にすることができない場合がある。多くの場合、標準的な配列決定法を使用する全ゲノムおよび／またはエクソームの配列決定は、非常に高いＣＧ含量（＞７０％）を有する含量範囲において、成績が悪い。さらにまた、全ゲノムおよび／またはエクソームの配列決定は、ゲノム中の反復エレメントの適切なおよび／または費用効率がよい配列決定を提供することもできない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本明細書に開示される方法は、これらの課題に対処し、単一試料中のヒトおよび非ヒトゲノムに分析を拡大する、特定の配列決定プロトコールまたは技術を提供する。
【０００４】
本明細書において、対象から得られた生体試料を処理するための方法であって、（ａ）核酸プローブのプールを使用して、生体試料から核酸分子のサブセットを生成することであって、プローブが、（ｉ）ヒトゲノムのエレメントを標的にするように構成された第１の複数の核酸プローブ、および（ｉｉ）１つまたは複数の非ヒトゲノムのエレメントを標的にするように構成された第２の複数の核酸プローブを含むこと；ならびに（ｂ）核酸分子のサブセットをアッセイに付して、（ｉ）対象からの生体試料由来のヒト核酸、および（ｉｉ）対象の生体試料由来の非ヒト核酸の配列を含む配列情報を得ることを含む、方法を開示する。一部の場合では、（ｉ）の第１の複数の核酸プローブは、ヒトゲノムに由来するエレメントを標的にするように構成される。一部の場合では、対象はヒトであり得る。一部の場合では、第２の複数の核酸プローブは、ウイルス、細菌、細菌のファージ、真菌、原生生物、古細菌、アメーバ、蠕虫、藻類、遺伝子改変細胞、および遺伝子改変ベクターからなる群より選択される１つまたは複数の種の非ヒトゲノム配列由来のエレメントを標的にするように構成される。態様では、生体試料から核酸分子のサブセットを生成することは、１つまたは複数のハイブリダイゼーション反応を実施することを含む。一部の場合では、方法は、対象から生体試料を得ることをさらに含む。一部の場合では、対象の生体試料は、腫瘍生検材料、全血、または血漿に由来し得る。一部の態様では、方法は、核酸分子のサブセットの配列を１つまたは複数の参照配列と整列させることをさらに含む。一部の場合では、１つまたは複数の参照配列は、複数の参照配列を含む。一部の場合では、複数の参照配列は、２つまたはそれよりも多くの異なる種に対応する。方法は、整列に基づいて、サブセット中の核酸分子の起源を特定することをさらに含むことができる。一部の場合では、方法は、生体試料中の核酸分子の特定された起源を含む出力を生成することをさらに含むことができる。一部の場合では、第２の複数の核酸プローブの濃度は、核酸プローブのプール中の第１の複数の核酸プローブの濃度よりも高い。態様では、プローブのプール中の第２の複数の核酸プローブの相対濃度は、核酸プローブのプール中の第１の複数の核酸プローブの相対濃度よりも高い。態様では、第１の複数の核酸プローブは、ヒトエクソーム捕捉用プローブセットを含む。一部の場合では、第１の複数の核酸プローブは、ヒトＶ（Ｄ）Ｊの再編成または組換えによって作出されるジャンクション配列を標的にするように構成されたプローブを含む。一部の場合では、第２の複数の核酸プローブは、ヒトパピローマウイルスのＥ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子を標的にするように構成された１つまたは複数のプローブを含む。一部の場合では、第２の複数の核酸プローブは、細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の１つまたは複数のエレメントを標的にするように構成されたプローブを含む。態様では、（ｂ）のアッセイは、配列決定を行って、１３０塩基〜２８０塩基の長さのペアエンドリード配列を生成することを含む。態様では、方法は、（ｉ）候補腫瘍ネオ抗原、（ｉｉ）検出される非ヒト種、（ｉｉｉ）検出されるＣＤＲ３配列、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択されるデータの１つまたは複数のセットを含む１つまたは複数の生物医学レポートを生成することをさらに含むことができる。態様では、検出される非ヒト種は抗原である。一部の場合では、ＣＤＲ３配列は、Ｖ（Ｄ）Ｊの再編成または組換えによって生成される。一部の場合では、ＣＤＲ３配列は、抗原に対する免疫応答に対応する。一部の場合では、１つまたは複数の生物医学レポートは、（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む。
【０００５】
本明細書において、対象から得られた生体試料を処理するための方法であって、（ａ）生体試料から核酸分子のサブセットを生成することであって、核酸分子のサブセットが、（ｉ）対象由来の第１の複数の核酸分子、および（ｉｉ）対象由来ではない第２の複数の核酸分子を含み、第１の複数の核酸分子の存在量が、生体試料中の第２の複数の核酸分子の存在量よりも多いこと；ならびに（ｂ）核酸分子のサブセットをアッセイに付して、（ｉ）第１の複数の核酸分子、および（ｉｉ）第２の複数の核酸分子の配列を含む配列情報を得ることを含む、方法を開示する。一部の場合では、（ｉ）の核酸分子は、対象のゲノムに由来する。一部の場合では、対象はヒトである。一部の場合では、対象由来ではない第２の複数の核酸分子は、ウイルス、細菌、細菌のファージ、真菌、原生生物、古細菌、アメーバ、蠕虫、藻類、遺伝子改変細胞、および遺伝子改変ベクターからなる群より選択される１つまたは複数のメンバーを含む。態様では、生体試料から核酸分子のサブセットを生成することは、１つまたは複数のハイブリダイゼーション反応を実施することを含む。態様では、方法は、対象から生体試料を得ることをさらに含む。一部の場合では、対象の生体試料は、腫瘍生検材料、全血、または血漿に由来する。態様では、方法は、核酸分子のサブセットの配列を１つまたは複数の参照配列と整列させることをさらに含む。態様では、１つまたは複数の参照配列は、複数の参照配列を含む。態様では、複数の参照配列は、２つまたはそれよりも多くの異なる種に対応する。方法は、整列に基づいて、サブセット中の核酸分子の起源を特定することをさらに含むことができる。態様では、方法は、生体試料中の核酸分子の特定された起源を含む出力を生成することをさらに含む。一部の場合では、第１の複数の核酸分子の存在量は、生体試料中の第１の複数の核酸分子の存在量よりも多い。一部の場合では、サブセット中の第２の複数の核酸分子の相対存在量は、サブセット中の第１の複数の核酸分子の相対存在量よりも多い。
【０００６】
本明細書において、（ｉ）対象由来の１つまたは複数のヒト配列、および（ｉｉ）対象由来の１つまたは複数の非ヒト配列とハイブリダイズするように構成されたプローブのプールを含む組成物を開示する。態様では、プローブのプールは、複数の捕捉用プローブである。態様では、プローブのプールは、複数の増幅用プローブである。
【０００７】
本明細書において、対象の生体試料を処理するためのシステムであって、核酸分子のサブセットをアッセイに付して、（ｉ）対象からの生体試料由来のヒト核酸、および（ｉｉ）対象の生体試料由来の非ヒト核酸の配列を含む配列情報を得るように、個々にまたは集合的にプログラムされた１つまたは複数のコンピュータプロセッサーを含むプロセシングユニットであって、核酸分子のサブセットが、核酸プローブのプールを使用して、生体試料から生成され、プローブが、（ｉ）ヒトゲノムのエレメントを標的にするように構成された第１の複数の核酸プローブ、および（ｉｉ）１つまたは複数の非ヒトゲノムのエレメントを標的にするように構成された第２の複数の核酸プローブを含む、プロセシングユニット；ならびに配列情報を保存するように構成されたコンピュータメモリを含む、システムを開示する。一部の実施形態では、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーは、配列と１つまたは複数の参照配列との整列を生成するようにプログラムされる。一部の実施形態では、１つまたは複数の参照配列は、複数の参照配列を含み、複数の参照配列は、２つまたはそれよりも多くの異なる種に対応する。一部の実施形態では、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーは、整列に基づいて、サブセット中の核酸分子の起源を特定するようにプログラムされる。一部の実施形態では、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーは、（ｉ）候補腫瘍ネオ抗原、（ｉｉ）検出される非ヒト種、（ｉｉｉ）検出される相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される情報を含む１つまたは複数の生物医学レポートを生成するようにプログラムされる。
【０００８】
本明細書において、対象の生体試料を処理するためのシステムであって、核酸分子のサブセットをアッセイに付して、（ｉ）第１の複数の核酸分子、および（ｉｉ）第２の複数の核酸分子の配列を含む配列情報を得るように、個々にまたは集合的にプログラムされた１つまたは複数のコンピュータプロセッサーを含むプロセシングユニットであって、核酸分子のサブセットが、生体試料から生成され、核酸分子のサブセットが、（ｉ）対象由来の第１の複数の核酸分子、および（ｉｉ）対象由来ではない第２の複数の核酸分子を含み、第１の複数の核酸分子の存在量が、生体試料中の第２の複数の核酸分子の存在量よりも多い、プロセシングユニット；ならびに配列情報を保存するように構成されたコンピュータメモリを含む、システムを開示する。一部の実施形態では、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーは、配列と１つまたは複数の参照配列との整列を生成するようにプログラムされる。一部の実施形態では、１つまたは複数の参照配列は、複数の参照配列を含み、複数の参照配列は、２つまたはそれよりも多くの異なる種に対応する。一部の実施形態では、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーは、整列に基づいて、サブセット中の核酸分子の起源を特定するようにプログラムされる。一部の実施形態では、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーは、（ｉ）候補腫瘍ネオ抗原、（ｉｉ）検出される非ヒト種、（ｉｉｉ）検出される相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される情報を含む１つまたは複数の生物医学レポートを生成するようにプログラムされる。
【０００９】
本開示の別の態様は、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーによる実行の際に、上記または本明細書の他の場所の方法のいずれかを実行する、機械実行可能コードを含む非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。
【００１０】
本開示の別の態様は、１つまたは複数のコンピュータプロセッサー、およびそれらに連結されたコンピュータメモリを含むシステムを提供する。コンピュータメモリは、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーによる実行の際に、上記または本明細書の他の場所の方法のいずれかを実行する、機械実行可能コードを含む。
【００１１】
本開示の追加の態様および利点は、本開示の例示的な実施形態のみを示し、説明する、以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかになるだろう。理解されるように、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、すべて開示から逸脱することなく、さまざまな自明な点において改変することが可能である。したがって、図面および説明は、実質的に例示的なものと見なされるべきであり、限定的なものと見なされるべきではない。
参照による組込み
【００１２】
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が、参照によって組み込まれることが具体的かつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１３】
本発明の新規な特徴を、添付の特許請求の範囲において詳細に説明する。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態、および添付の図面（drawing）（本明細書において「図面（Figure）」および「図（FIG.）」とも）を説明する以下の詳細な説明を参照することによって得られるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、第１の複数の核酸プローブおよび第２の複数の核酸プローブを使用する、核酸分子のサブセットを生成するための方法を模式的に図示する。
【００１５】
【図２】図２は、第１の複数の核酸プローブおよび第２の複数の核酸プローブを使用する、核酸分子のサブセットを生成するための方法を模式的に図示する。第１の複数の核酸プローブは、非ヒトゲノムに結合し得る。
【００１６】
【図３】図３は、第１の複数の核酸プローブおよび第２の複数の核酸プローブを使用する、核酸分子のサブセットを生成するための方法を模式的に図示する。第１の複数の核酸プローブは、セグメント化トランスクリプトームに結合し得る。
【００１７】
【図４】図４は、複数の核酸プローブを使用する、核酸分子のサブセットを生成するための方法を模式的に図示する。複数の核酸プローブは、対象のエクソームを標的にするプローブセット、および非対象核酸配列を標的にするプローブセットを含み得る。
【００１８】
【図５】図５は、本開示の方法を実行するようにプログラムされたか、またはそうでなければ構成された、コンピュータシステムを示す。
【００１９】
【図６】図６Ａは、ワークフローの概略図を示す。調製１および調製２は、核酸のサブセットを指す。アッセイ１、分析１および出力は、本明細書に記載の任意のアッセイ、分析および出力を指す。図６Ｂは、ワークフローの概略図を示す。調製１および調製２は、核酸のサブセットを指す。アッセイ１、アッセイ２、分析１および出力は、本明細書に記載の任意のアッセイ、分析および出力を指す。図６Ｃは、ワークフローの概略図を示す。調製１および調製２は、核酸のサブセットを指す。アッセイ１、アッセイ２、分析１、分析２および出力は、本明細書に記載の任意のアッセイ、分析および出力を指す。図６Ｄは、（１）いくつかのプロトコールにより処理されたいくつかのサブセットへの核酸試料の分離を含むワークフローの概略図を示す。これらのプロトコールは、異なるゲノム領域または非ゲノム領域についての濃縮を含んでいてもよく、アッセイのための核酸分子のライブラリーを調製するための１つまたは複数の異なる増幅操作を含んでいてもよい。これらのライブラリーの一部は、アッセイのために（２）と組み合わせてもよい。一部のアッセイの結果は、その後の分析のために（３）と組み合わせてもよい。変異体コール、または配列もしくは遺伝的状態の他の評価は、（４）とさらに組み合わせて、アッセイによって対処された東の遺伝子座での複合評価を生成してもよい。プロトコール１〜４は、本明細書に記載の任意の方法を指す。アッセイ１、アッセイ２、アッセイ３、分析１、分析２および出力は、本明細書に記載の任意のアッセイ、分析および出力を指す。
【００２０】
【図７】図７は、本明細書に記載のアッセイのワークフローの例を表す。
【００２１】
【図８】図８は、本開示のワークフローの概略図を示す。
【００２２】
【図９】図９は、本開示のワークフローの概略図を示す。
【００２３】
【図１０】図１０は、断片サイズに対する剪断時間の効果を示す。
【００２４】
【図１１】図１１は、断片サイズに対するビーズ比の効果を示す。
【００２５】
【図１２】図１２は、断片サイズに対する剪断時間の効果を示す。
【００２６】
【図１３】図１３は、核酸ライブラリー構築のワークフローの概略図を表す。
【００２７】
【図１４】図１４は、複数の生物医学的適用に対処するマルチスレッド化アッセイを開発するための方法を示す。
【００２８】
【図１５】図１５は、異なるゲノム領域について濃縮されたＤＮＡの複数のサブセットを含み、配列決定アッセイのために組み合わされる前に、一部の独立した処理操作を受ける、アッセイのワークフローの例を表す。２つまたはそれよりも多くのサブセットからの読み取りデータは、ａ）配列決定デバイスにおいて、ｂ）その後のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ（例えば、１つまたは複数のアルゴリズムを使用する）のいずれかで組み合わせて、２つまたはそれよりも多くのサブセットの連合によって対処される領域についての単一の試験結果を生成し、１つまたは複数の生物医学レポートのために使用され得るデータプールをもたらす。補充引き抜きは、ヒト標的配列および非ヒト標的配列を含んでいてもよい。
【００２９】
【図１６】図１６は、異なるゲノム領域について濃縮されたＤＮＡの複数のサブセットを含み、独立して配列決定され、変異体について分析される前に、一部の独立した処理操作を受ける、アッセイのワークフローの例を表す。２つのサブセットからの変異体は、マージされて、２つまたはそれよりも多くのサブセットの連合によって対処される領域についての結果を生成し得、１つまたは複数の生物医学レポートのために使用され得るデータプールをもたらす。補充引き抜きは、ヒト標的配列および非ヒト標的配列を含んでいてもよい。
【００３０】
【図１７】図１７は、異なるゲノム領域について濃縮されたＤＮＡの複数のサブセットを含み、独立して配列決定され、配列読み取りデータを含み得る一次データを生成する前に、一部の独立した処理操作を受ける、アッセイのワークフローの例を表す。２つまたはそれよりも多くのアッセイからの一次データは、組み合わされ、分析されて（例えば、１つまたは複数のソフトウェアプログラムまたはアルゴリズムによる）、２つまたはそれよりも多くのサブセットの連合によって対処されるすべての領域についての結果を生成し、１つまたは複数の生物医学レポートのために使用され得るデータプールをもたらす。補充引き抜きは、ヒト標的配列および非ヒト標的配列を含んでいてもよい。
【００３１】
【図１８】図１８は、サイズ選択によって生成され、ＧＣ含量に基づいて異なるゲノム領域について濃縮されたＤＮＡの２つのサブセットにさらに分割された、ＤＮＡの２つのサブセットを含むマルチスレッド化アッセイを表す。より長い分子は、より長い分子に適した技術を使用する配列決定を受け得る。２つのより短い分子のサブセットは、さらに調製され、サブセットのＴｍに適したプロトコールに基づいて増幅され、次いで、ハイスループットの短いリードシーケンサーのＨｉＳｅｑにおける配列決定のためにプールされ得る。配列決定からの一次データは、マージされ、分析されて（例えば、１つまたは複数のソフトウェアプログラムまたはアルゴリズムによる）、サブセットによって対処されるすべての領域についての単一の最良の結果を生成し得、１つまたは複数の生物医学レポートのために使用され得るデータプールをもたらす。補充引き抜きは、ヒト標的配列および非ヒト標的配列を含んでいてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明のさまざまな実施形態を本明細書に示し、説明するが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは、当業者には自明であろう。多数の変形、変化および置換は、本発明から逸脱することなく、当業者に起こり得る。本明細書に記載される本発明の実施形態に対するさまざまな代替物を用いてもよいことが理解されるべきである。
【００３３】
ヒト身体は、高い頻度で、多数の微生物種、一部の場合では、１，０００を超える微生物種を内部に持つ。これらは、ヒトマイクロバイオームプロジェクトおよび他の研究によって立証されており、多数のウイルス、細菌、細菌のファージ、真菌、原生生物、古細菌、および一部のアメーバ、蠕虫、および藻類を含むことができる。これらの非ヒト種は、有益であり得るが、これらはまた、がんを含む疾患を引き起こすことができ、またはモジュレートすることができる。これらの効果は、直接的（例えば、ヒト細胞における突然変異を引き起こし、このようにしてがんをもたらす）、または間接的（例えば、疾患と戦うためのその能力に影響を及ぼす免疫系を刺激する）であり得る。個体中の微生物種は、人々の試料から抽出された核酸を配列決定することによって、特定および特徴付けることができる。これらの微生物の多くは、身体とその周囲環境との境界面（例えば、皮膚、唾液、鼻孔、消化管、腸、生殖器）で生きている。これらは、拭き取り、生検、糞便もしくは尿、唾液または類似の方法のいずれかによって、それらの境界面から試料採取することができる。複数の方法が、これらの試料由来の微生物の核酸の配列分析のために開発されている。これらとしては、標的ＰＣＲ増幅（例えば、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のサブセクションの）、およびディープシークエンシングを使用する非標的（メタゲノミクス）法の両方が挙げられる。これらの方法の多くは、意図する微生物標的に対する感受性を最適化するために、ヒトＤＮＡの量を最小化しようとする、試料の種類および／または濃縮方法を含む。ヒトゲノム（約３０億塩基）は、典型的な細菌のゲノム（１００万未満の塩基から最大で数１００万）よりも約１，０００倍大きく、大部分のウイルスゲノムのサイズ（典型的には、数千から最大で数万の塩基）よりも数千倍大きい。したがって、これを回避または低減する試料採取法またはアッセイ技術なしでは、ヒトＤＮＡ含量は、アッセイの能力の大部分を占め得る。
【００３４】
多くの疾患の進行は、ヒト細胞のジェネティクスによっても影響される。これは、遺伝する遺伝的変異体、がんにおける体細胞変異体、免疫細胞におけるＶＤＪ組換え、異なる細胞型における差次的遺伝子発現、および他の性質を含むことができる。これらは、典型的には、血液（最も一般的には、ＰＢＭＣまたは無細胞ＤＮＡ）由来、または罹患組織（例えば、腫瘍生検材料）由来のいずれかの核酸の配列決定によってアッセイすることもできる。複数の方法は、アンプリコンパネル（典型的には、最大で、数百遺伝子のため）、ハイブリッド捕捉（典型的には、エクソームを含む、多くの数の遺伝子のため）、および非標的法（全ゲノム配列決定）を含む、これらの試料由来の核酸の配列分析のために開発されている。これらの方法の多くは、それらの意図するヒト核酸標的について最適化された試料の種類および／または濃縮方法を含む。
【００３５】
微生物分析のための試料の種類は、ヒト遺伝分析のために使用されるものと異なっていてもよい。糞便試料は、消化管のマイクロバイオームの分析のために使用されてもよいが、例えば、これは、嚢胞性線維症などの遺伝するヒト遺伝性疾患についての試験において、不十分な試料であり得る。血液（ＰＢＭＣ）由来の白血球は、遺伝する遺伝性疾患の原因を探すために配列決定され得るが、免疫系が血液から細菌をほとんど除去するので、通常、細菌分析のための不十分な選択であり得る。ヒトおよび微生物分析のためのアッセイ方法も異なる。例えば、いずれもＰＣＲを使用し得るが、ＰＣＲは、非常に狭く焦点が絞られた結果が得られるので（すなわち、アンプリコンは、それぞれ、一般に、標的種のゲノムのごく一部を表す）、ヒトおよび微生物の標的は、一般に、単一のＰＣＲ系アッセイに組み込まれない。非標的アッセイは、ヒトジェネティクス（すなわち、全ヒトゲノム配列決定）および微生物のメタゲノミクスの両方のために使用することができるが、上記で言及したゲノムサイズにおける非常に大きな相違のために、一般に、それぞれについて最適化された起源の材料およびアッセイを用いて、それぞれを別々にアッセイすることが最適である。同じ理由のために、ハイブリッド捕捉アッセイ技術（例えば、エクソーム）は、特定の（一般に、哺乳動物）種（例えば、ヒトエクソーム、またはウシエクソーム）のために開発されている。
【００３６】
がんは、特殊な場合であり得る。多くの腫瘍は、免疫系を部分的または完全に排除する、チェックポイント遺伝子および他の方法を使用する。そのため、腫瘍に首尾よく浸潤することができた微生物は、生存し、さらにそこで力強く成長することが可能であり得る。完全な生きた細菌（例えば、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が、多くのがん細胞で見つかっており、細胞分裂のサイクルおよび転移を含んで、完全にその中で生きている。細菌は、がんを引き起こす場合があり（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉは胃がんの原因である）、それらは、がんの進行、およびがん治療薬（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）に対する応答に影響を及ぼし得る。ウイルスも、細胞に進入する場合があり、一部の場合では、がんの原因であり、および／またはヒト染色体にそれらのゲノムを組み込み得る。このため、腫瘍生検材料は、ヒトおよびマイクロバイオーム種の両方、ならびにそれらの核酸を含有し得る。これらの細胞が死ぬと、それらの複数種の核酸が、それらの周囲に排出され得、最終的に、血漿中の無細胞核酸として検出可能であり得る。
【００３７】
腫瘍生検からの試料の量は、多くの場合、非常に限定されており、同じ試料から、ヒトに対する微生物の遺伝的標的についての複数の異なるアッセイを実施することをより困難にする。ヒトおよびマイクロバイオーム種の両方からの配列データを同時に提供することができる統合アッセイは、試料の量が限定されている場合に有利であり得る。血漿からの無細胞ＤＮＡおよびＲＮＡも、多くの場合、量が非常に限定される。単一の少量の血漿試料由来のヒトおよびマイクロバイオーム種の両方から配列データを同時に提供することができる統合アッセイも有利であり得る。
【００３８】
本明細書において、同時に同じ試料からのマイクロバイオームのデータを用いて、幅広いヒト遺伝的データの同時検出を裏付けるアッセイを開示する。同等のヒトのみのアッセイのために必要とし得るよりもより多くの試料を必要としない単一アッセイを行うことができる。このアッセイは、ヒトエクソーム捕捉キット（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｘｏｍｅ  ｖ２）を使用することができる。プローブのプールのキットまたは組成物は、それが標的にするヒト配列に対して相補的であるハイブリダイゼーションプローブを用いることができる。５０，０００を超える捕捉用プローブを使用することにより、方法、キットまたは組成物は、所定のヒト遺伝子の大部分のエクソンを標的にすることができる。例えば、がん試料由来の核酸とこのキットのプローブとのハイブリダイゼーション反応を実施する前に、我々は、我々が非ヒト配列を標的にするように設計した捕捉用プローブの追加のセットを添加する。非ヒト配列は、ウイルス、細菌、真菌または古細菌のゲノム由来、すなわち、ヒトマイクロバイオーム由来であり得る。ヒトエクソームプローブを非ヒトマイクロバイオームプローブと組み合わせると、プローブ混合物を、患者試料から抽出された核酸との単一のハイブリダイゼーションに基づく捕捉反応のために使用することができる（図２）。その後、捕捉された核酸を配列決定することができる。我々の研究室では、この配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｏｖａＳｅｑ−６０００  ＤＮＡ配列決定装置を使用して行われる。
【００３９】
このようなプロセスから得られる混合（ヒトおよび非ヒト）ＤＮＡ配列は、ヒトおよびマイクロバイオーム−種参照配列との整列によって分離することができる。ヒトゲノムが進化の過程で微生物ゲノムから非常に大幅に分岐しているので、整列による配列の分離が可能である。
【００４０】
捕捉用プローブを使用することは、複数の遺伝子を同時に標的にするＰＣＲの困難さに起因して、目的の配列を濃縮し、標的にするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイに対して有利であり得る。複数の遺伝子を標的にするために、ＰＣＲは、５０，０００配列を増幅および標的にするために、多数のプライマー、例えば、最大で潜在的に１００，０００のプライマーが必要であり得、特定のための核酸分子を生成するために、酵素操作が必要であり得る。複数の遺伝子のＰＣＲプライマーの比を最適化することはまた、困難であり得、偏りのある増幅をもたらす場合があり、核酸試料中の標的核酸の相対量を表さない場合がある。
【００４１】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、複数形の参照を含む。例えば、「キメラ膜貫通受容体ポリペプチド」という用語は、複数のキメラ膜貫通受容体ポリペプチドを含む。
【００４２】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対して許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、一部分において、値が測定または決定される方法、すなわち、測定系の限界に依存する。例えば、「約」は、当技術分野における実施ごとに、１または１よりも多い標準偏差内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大で２０％まで、最大で１０％まで、最大で５％まで、または最大で１％までの範囲を意味し得る。あるいは、例えば、生物学的系またはプロセスに関して、この用語は、値の大きさの一桁以内、または５倍以内、または２倍以内であることを意味し得る。特定の値が、本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記されていない限り、特定の値についての許容される誤差範囲内を意味する「約」という用語を想定すべきである。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「細胞」は、一般に、生体細胞を指す。細胞は、生命体の基本的な構造、機能および／または生物学的単位であり得る。細胞は、１つまたは複数の細胞を有するあらゆる生物が起源であり得る。一部の非限定的な例としては、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞の真核生物の細胞、原生動物細胞、植物由来の細胞（例えば、植物作物、果物、野菜、穀物、大豆、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、小麦、種子、トマト、コメ、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、干し草、ジャガイモ、ワタ、大麻、タバコ、顕花植物、針葉樹、裸子植物、シダ、ヒカゲノカズラ類、ツノゴケ類、苔類、蘚類）、藻類の細胞（例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｐａｔｅｎｓ  Ｃ．Ａｇａｒｄｈなど）、海藻（例えば、ケルプ）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、キノコ由来の細胞）、動物細胞、無脊椎動物由来の細胞（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物など）、脊椎動物由来の細胞（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）、哺乳動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）由来の細胞などが挙げられる。細胞は、天然の生物が起源でない場合がある（例えば、細胞は、合成的に作製され得、人工細胞と称される場合がある）。
【００４４】
「ヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、塩基−糖−リン酸の組合せを指す。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドアナログを含むことができる。ヌクレオチドは、モノマー単位の核酸配列であり得る（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ））。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）およびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはそれらの誘導体などのデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含むことができる。そのような誘導体としては、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴＰ、ならびにそれらを含有する核酸分子にヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体を挙げることができる。本明細書で使用されるヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびそれらの誘導体を指し得る。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例示的な例としては、限定されるものではないが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰを挙げることができる。ヌクレオチドは、無標識であり得るか、または検出可能に標識され得る。標識化は、量子ドットを用いて行うこともできる。検出可能な標識としては、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、および酵素標識を挙げることができる。ヌクレオチドの蛍光標識としては、限定されないが、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、カスケードブルー、オレゴングリーン、テキサスレッド、シアニン、および５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−ｌ−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を挙げることができる。蛍光標識ヌクレオチドの具体例としては、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆから入手可能な、［Ｒ６Ｇ］ｄＵＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＵＴＰ、［Ｒ１１０］ｄＣＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＣＴＰ、［ＪＯＥ］ｄｄＡＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ＦＡＭ］ｄｄＣＴＰ、［Ｒ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、［ＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ、［ｄＲ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ｄＲ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ｄＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、および［ｄＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌ．から入手可能なＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋデオキシヌクレオチドの、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｃｙ５−ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｆｌｕｏｒ  Ｘ−ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、およびＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｃｙ５−ｄＵＴＰ；���ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄから入手可能なフルオレセイン−１５−ｄＡＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、テトラメチル−ローダミン−６−ｄＵＴＰ、ＩＲ７７０−９−ｄＡＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、およびフルオレセイン−１５−２’−ｄＡＴＰ；ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇから入手可能な染色体標識ヌクレオチドの、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−１４−ｄＵＴＰ、カスケードブルー−７−ＵＴＰ、カスケードブルー−７−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、オレゴングリーン４８８−５−ｄＵＴＰ、ローダミングリーン−５−ＵＴＰ、ローダミングリーン−５−ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、テキサスレッド−５−ＵＴＰ、テキサスレッド−５−ｄＵＴＰ、およびテキサスレッド−１２−ｄＵＴＰを挙げることができる。ヌクレオチドは、化学修飾によって標識またはマークすることもできる。化学修飾された単一ヌクレオチドは、ビオチン−ｄＮＴＰであり得る。ビオチン化ｄＮＴＰの一部の非限定的例としては、ビオチン−ｄＡＴＰ（例えば、ｂｉｏ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ、ビオチン−１４−ｄＡＴＰ）、ビオチン−ｄＣＴＰ（例えば、ビオチン−１１−ｄＣＴＰ、ビオチン−１４−ｄＣＴＰ）、およびビオチン−ｄＵＴＰ（例えば、ビオチン−１１−ｄＵＴＰ、ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、ビオチン−２０−ｄＵＴＰ）を挙げることができる。
【００４５】
「ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）」および「ゲノム（ｇｅｎｏｍｅｓ）」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、対象のゲノムの一部、または対象のゲノムの全体を指すために使用される。例えば、ゲノムは、対象の遺伝子配列を指す場合がある。ゲノムは、対象の全ゲノム配列を指す場合がある。
【００４６】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さの高分子型のヌクレオチド、または一本鎖型、二本鎖型もしくは複数本鎖型のいずれかのそのアナログを指すために、互換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、細胞にとって外因性または内在性であり得る。ポリヌクレオチドは、無細胞環境に存在することができる。ポリヌクレオチドは、遺伝子またはその断片であり得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり得る。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり得る。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、任意の機能を果たすことができる。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のアナログ（例えば、変化した主鎖、糖または核酸塩基）を含むことができる。ヌクレオチド構造への修飾は、存在する場合、高分子の構築の前または後に付与することができる。アナログの一部の非限定的な例としては、５−ブロモウラシル、ペプチド核酸、キセノ核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コルジセピン、７−デアザ−ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に連結されたローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン連結ヌクレオチド、蛍光塩基アナログ、ＣｐＧアイランド、メチル−７−グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、プソイドウリジン（pseudourdine）、ジヒドロウリジン、キューオシン、およびワイオシンが挙げられる。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子もしくは遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から規定される遺伝子座（ｌｏｃｉ）（遺伝子座（ｌｏｃｕｓ））、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を含む無細胞ポリヌクレオチド、核酸プローブ、ならびにプライマーが挙げられる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。前述の核酸分子のいずれかは、操作されていてもよく、または合成されていてもよい。
【００４７】
「遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ転写物のコーディングに関与する核酸（例えば、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡなどのＤＮＡ）およびその対応するそのヌクレオチド配列を指す。ゲノムＤＮＡに関して本明細書で使用されるこの用語は、介在領域、非コード領域だけでなく、調節領域を含み、５’および３’末端を含むことができる。一部の使用では、この用語は、５’および３’非翻訳領域（５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲ）、エクソンおよびイントロンを含む転写配列を包含する。一部の遺伝子では、転写領域は、ポリペプチドをコードする「オープンリーディングフレーム」を含有する。この用語の一部の使用では、「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするために必要なコード配列（例えば、「オープンリーディングフレーム」または「コード領域」）のみを含む。一部の場合では、遺伝子は、ポリペプチド、例えば、リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＲＮＡ）およびトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）遺伝子をコードしない。一部の場合では、「遺伝子」という用語は、転写配列だけなく、さらに、上流および下流の調節領域、エンハンサーおよびプロモーターを含む、非転写領域も含む。遺伝子は、生物のゲノムにおいてその本来の場所にある「内在性遺伝子」またはネイティブ遺伝子を指すことができる。遺伝子は「外因性遺伝子」または非ネイティブ遺伝子を指すことができる。非ネイティブ遺伝子は、宿主生物中に通常は見出されないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入される遺伝子を指すことができる。非ネイティブ遺伝子は、遺伝子改変された生物などの生物のゲノムにおいてその本来の場所にない遺伝子を指すこともできる。非ネイティブ遺伝子は、突然変異、挿入および／または欠失を含む天然に存在する核酸またはポリペプチド配列（例えば、非ネイティブ配列）を指すこともできる。
【００４８】
「同一性パーセント（％）」という用語は、本明細書で使用される場合、最大の同一性パーセントが達成されるように配列を整列させ、必要により、ギャップを導入した後に（すなわち、最適の整列のために、候補配列および参照配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較の目的のために、非相同配列を無視することができる）、参照配列のアミノ酸残基または核酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基または核酸残基のパーセンテージを指す。同一性パーセントを決定する目的のために、整列は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどのコンピュータソフトウェアを使用するなどの、さまざまな方法で達成することができる。２つの配列の同一性パーセントは、ＢＬＡＳＴを使用して、試験配列を比較配列と整列させ、比較配列の同じ位置にあるアミノ酸またはヌクレオチドと同一である、整列させた試験配列中のアミノ酸またはヌクレオチドの数を決定し、同一のアミノ酸またはヌクレオチドの数を比較配列中のアミノ酸またはヌクレオチドの数で割ることによって、計算することができる。
【００４９】
「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、あらゆる動物、例えば、哺乳動物または有袋類を指す。対象は患者であり得る。対象は、疾患または病気に関して、症候性または無症候性であり得る。対象は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザルまたは他の種類のマカク）、イヌ、ネコ、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラットおよび家禽であり得る。哺乳動物としては、限定されるものではないが、マウス、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物および愛玩動物が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｖｏで得られるか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される、生物学的実体の組織、細胞およびそれらの子孫も包含される。宿主は、非宿主を内部に持つことができる生物である。対象は、疾患に関して無症候性であり得る。代替として、対象は、疾患に関して無症候性ではない。
【００５０】
「処置」および「処置する」という用語は、本明細書で使用される場合、限定されないが、治療利益および／または予防利益を含む、有益なまたは望ましい結果を得るためのアプローチを指す。例えば、処置は、本明細書に開示されるシステムまたは細胞集団を投与することを含むことができる。治療利益とは、処置下にある１つまたは複数の疾患、状態または症状における任意の治療に関連する改善、またはそれらに対する効果を意味する。予防利益のためには、特定の疾患、状態もしくは症状を発症する危険性がある対象に、または疾患の生理学的症状の１つもしくは複数を報告する対象に、疾患、状態または症状がまだ発現していない場合であっても、組成物を投与することができる。
【００５１】
一部の場合では、本開示は、生体試料を処理および分析するための組成物および方法も提供する。一部の場合では、対象由来の生体試料は、対象由来の核酸、および対象由来ではない核酸分子を含むことができる。一部の場合では、生体試料は、ヒトおよび非ヒトゲノム由来の核酸を含むことができる。一部の場合では、非ヒトゲノムは、ウイルス、細菌、細菌のファージ、真菌、原生生物、古細菌、アメーバ、蠕虫、藻類、またはそれらの組合せ由来であり得る。一部の場合では、非ヒトゲノムの起源は、ヒト宿主に対して有益であり得る。一部の場合では、非ヒトゲノムの起源は、がんなどの疾患のモジュレートに関与し得る。一部の場合では、非ヒトゲノムを含む非ヒト生物の起源は、ヒト細胞における突然変異を引き起こし、それによって、対象にがんを引き起こすことにより、直接的に振る舞うことができる。一部の場合では、非ヒトゲノムの起源は、例えば、疾患と戦うためのその能力に影響を及ぼすヒト宿主の免疫系を刺激することによって、間接的に振る舞うことができる。一部の場合では、本開示は、試料中の非ヒトゲノムおよびヒトゲノムの存在を特定することを含む方法も提供する。
【００５２】
試料は、皮膚、唾液、鼻孔、消化管、腸、生殖器、またはそれらの組合せ由来であり得る。一部の場合では、試料は、拭き取り、生検、糞便の採取、尿の採取、唾液の採取などによって取得することができる。
【００５３】
ヒトゲノム（約３０億塩基）は、非ヒトゲノム、例えば、細菌のゲノムより約１，０００倍大きく、大部分のウイルスゲノムのサイズの数千倍である。一部の場合では、方法は、混合試料中の非ヒトゲノムを濃縮するための試料採取方法を含むことができる。
【００５４】
本開示は、試料由来の微生物の核酸の配列（または配列決定）分析を含む方法も提供する。配列決定分析は、例えば、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のサブセクションのＰＣＲ増幅、およびディープシークエンシングを使用する非標的メタゲノミクス法を含むことができる。方法は、非ヒトゲノムに対する感受性を最適化するために、ヒトゲノムの量を最小化しようとし得る、試料の種類および／または濃縮方法の選択を含むことができる。
【００５５】
一態様では、第１の複数の核酸分子は、対象由来であり得る。対象は、ヒトであり得、そのため、本開示は、ヒトの核酸分子も提供する。本開示は、ヒトゲノム由来であり得る複数の核酸プローブを使用する、第１のサブセットまたは生成物も提供する。本開示は、ヒトゲノムも提供する。一部の場合では、ヒトゲノムは、例えば、遺伝する遺伝的変異体、体細胞変異体、免疫細胞におけるＶＤＪ組換え、異なる細胞型における差次的遺伝子発現、および他の性質を含み得る。前述の少なくとも一部は、対象における疾患（例えば、がんにおける体細胞変異体）に寄与し得るか、または関連し得る。ゲノムは、遺伝子、エクソン、ＵＴＲ、調節領域、スプライス部位、再構築遺伝子、代替配列、再構築遺伝子、遺伝子フェージング、外因性配列などを含み得る。
【００５６】
一部の場合では、生体試料中の核酸は、配列決定によって分析することができる。一部の場合では、典型的には、血液または罹患組織由来の核酸の配列決定を行うことができる。一部の場合では、血液試料は、末梢血単核細胞、無細胞ＤＮＡまたはそれらの組合せを含むことができる。一部の場合では、罹患組織は、がんを含むことができる。一部の場合では、血液試料または罹患組織試料由来の核酸の配列分析は、アンプリコンパネルの生成、ハイブリッド捕捉、および全ゲノム配列決定などの非標的法を含むことができる。一部の場合では、方法は、試料の種類、ヒトゲノムの濃縮法およびそれらの組合せの選択を含むことができる。
【００５７】
一部の場合では、生体試料は、対象の核酸、非対象の核酸およびそれらの組合せを含むことができる。一部の場合では、生体試料は、宿主の核酸、非宿主の核酸およびそれらの組合せを含むことができる。一部の場合では、生体試料は、受容体をコードするゲノムを含むことができる。一部の場合では、受容体は、免疫細胞由来であり得る。一部の場合では、免疫細胞由来の受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などであり得る。
【００５８】
一部の場合では、本明細書に提供される方法は、核酸分子をアッセイに付して、配列情報を得ることを含む。アッセイは、ＶＤＪ再編成またはＶＤＪ組換えを含む核酸を配列決定することを含むことができる。一部の場合では、ＶＤＪ再編成または組換えは、細胞受容体を指すことができる。例えば、体細胞高頻度突然変異は、抗原の顕著な多様性のために、抗体をコードするＢ細胞受容体（ＢＣＲ）配列を生じさせることができる。一部の場合では、ＢＣＲを配列決定することができる。本明細書に提供される方法は、どのようにして抗体が発生するかを解明するためにＢＣＲを配列決定することを含むことができる。例えば、方法は、Ｖ、ＤもしくはＪ遺伝子の特定の１つに由来する、またはＮ付加（別名：非鋳型挿入）に由来すると、それぞれの塩基に注釈を付ける配列分析を含むことができる。一部の場合では、ＶＤＪ組換えは、ＣＤＲ３配列を生成し得る。一部の場合では、ＣＤＲ３配列は、抗原、例えば、腫瘍抗原に結合するポリペプチドを生成し得る。一部の場合では、ＣＤＲ３配列は、抗原、例えば、ネオ抗原に結合するポリペプチドを生成し得る。
【００５９】
一部の場合では、本明細書に提供される方法は、候補腫瘍ネオ抗原をコードするか、または関連する、核酸を配列決定することを含むことができる。一部の場合では、本明細書に提供される方法は、検出されるＣＤＲ３配列を配列決定することを含むことができる。一部の態様では、対象のＴＣＲは、各種の方法を使用して特定することができる。一部の場合では、ＴＣＲは、全エクソーム配列決定を使用して特定することができる。例えば、ＴＣＲは、標的細胞の全エクソーム配列決定によって特定されるネオ抗原またはネオエピトープを標的にすることができる。あるいは、ＴＣＲは、自家、同種間または異種間のレパートリーから特定することができる。一部の場合では、ネオ抗原またはネオエピトープを生じさせる突然変異を含み得る遺伝子は、ＡＢＬ１、ＡＣＯｌ  １９９７、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＦＰ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＡＬＰＰＬ２、ＡＮＡＰＣ１、ＡＰＣ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲ、ＡＲ−ｖ７、ＡＳＣＬ２、β２Μ、ＢＲＡＦ、ＢＴＫ、Ｃ１５ＯＲＦ４０、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ６、ＣＮＯＴ１、ＣＴ４５Ａ５、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＤＣＴ、ＤＫＫ４、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＥＦ１ＤＰ３、ＥＧＦＲ、ＥＩＦ２Ｂ３、ｅｎｖ、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＳＲ１、ＥＳＲＰ１、ＦＡＭ１１  ＩＢ、ＦＧＦＲ３、ＦＲＧ１Ｂ、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ  １０、ＧＡＴＡ３、ＧＢＰ３、ＨＥＲ２、ＩＤＨ１、ＪＡＫ１、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＭＡＮ１、ＭＡＢＥＢ  １６、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥＢ  １７、ＭＡＧＥＢ４、ＭＡＧＥＣ１、ＭＥＫ、ＭＬＡＮＡ、ＭＬＬ２、ＭＭＰ１３、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＹＣ、ＮＤＵＦＣ２、ＮＲＡＳ、ＮＹ−ＥＳＯ、ＰＡＧＥ２、ＰＡＧＥ５、ＰＤＧＦＲａ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＭＥＬ、ｐｏｌタンパク質、ＰＯＬＥ、ＰＴＥＮ、ＲＡＣ１、ＲＢＭ２７、ＲＮＦ４３、ＲＰＬ２２、ＲＵＮＸ１、ＳＥＣ３１Ａ、ＳＥＣ６３、ＳＦ３Ｂ  １、ＳＬＣ３５Ｆ５、ＳＬＣ４５Ａ２、ＳＭＡＰ１、ＳＭＡＰ１、ＳＰＯＰ、ＴＦＡＭ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＡＰ５、ＴＰ５３、ＴＴＫ、ＴＹＲ、ＵＢＲ５、ＶＨＬ、ＸＰＯＴであり得る。
【００６０】
本開示は、１つまたは複数のゲノムを含む核酸試料または核酸分子のサブセットを得ること、または用意することを含む方法も提供する。本明細書に開示される方法は、生体試料から生成された核酸分子の核のサブセットを分析し得る。サブセットは、対象由来の核酸分子、および対象由来ではない核酸分子を含み得る。例えば、ヒトおよび微生物の配列は、標的捕捉および配列を使用して、濃縮されてもよい。１つまたは複数のゲノムは、１つまたは複数のゲノムの特徴を含み得る。
【００６１】
ゲノムの特徴は、全ゲノムまたはその部分を含み得る。ゲノムの特徴は、全エクソームまたはその部分を含み得る。ゲノムの特徴は、遺伝子の１つまたは複数のセットを含み得る。ゲノムの特徴は、１つまたは複数の遺伝子を含み得る。ゲノムの特徴は、調節エレメントの１つまたは複数のセットを含み得る。ゲノムの特徴は、１つまたは複数の調節エレメントを含み得る。ゲノムの特徴は、多型のセットを含み得る。ゲノムの特徴は、１つまたは複数の多型を含み得る。一部の場合では、多型は、遺伝子型における突然変異を指す。多型は、１つもしくは複数の塩基の変化、挿入、繰り返し、または１つもしくは複数の塩基の欠失を含み得る。ゲノムの特徴は、コピー数変異体（ＣＮＶ）、トランスバージョン、他の再編成、および他の形態の遺伝的変異を含むことができる。一部の場合では、核酸試料のサブセットの１つまたは複数の特徴は、制限断片長多型、縦列反復配列多型（ＶＮＴＲ’ｓ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純反復配列、およびＡｌｕなどの挿入エレメントを含む、多型マーカーであり得る。一部の場合では、核酸分子の第１のサブセットおよび核酸分子の第２のサブセットの間の相違は、制限断片長多型、縦列反復配列多型（ＶＮＴＲ’ｓ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純反復配列、およびＡｌｕなどの挿入エレメントを含む、多型マーカーであり得る。選択された集団において最も頻繁に生じる対立遺伝子形態を野生型形態と称する場合がある。二倍体生物は、対立遺伝子形態について、ホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。２対立遺伝子多型は、２つの形態を有する。３対立遺伝子多型は、３つの形態を有する。多型は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得る。本開示の一部の態様では、１つまたは複数の多型は、１つまたは複数の一塩基多様性、ＩｎＤｅｌ、小挿入、小欠失、構造変異体ジャンクション、可変長タンデム反復、フランキング配列またはそれらの組合せを含む。１つまたは複数の多型は、コード領域および／または非コード領域内に位置していてもよい。１つまたは複数の多型は、遺伝子、エクソン、イントロン、スプライス部位、非翻訳領域またはそれらの組合せ内、それらの周囲、またはそれらに近接して位置していてもよい。１つまたは複数の多型は、遺伝子、エクソン、イントロン、非翻訳領域の少なくとも一部に及んでいてもよい。一部の場合では、ゲノムの特徴は、ＧＣ含量、複雑さ、および／または１つもしくは複数の核酸分子のマッピング可能性に関連し得る。ゲノムの特徴は、１つもしくは複数の単純タンデム反復（ＳＴＲ）、不安定な伸長反復、セグメント重複、シングルおよびペアリード変性マッピングスコア、ＧＲＣｈ３８もしくはＧＲＣｈ３７パッチ、またはそれらの組合せを含み得る。ゲノムの特徴は、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）からの１つまたは複数の低平均カバー領域、ＷＧＳからのゼロ平均カバー領域、有効な圧縮、またはそれらの組合せを含み得る。ゲノムの特徴は、１つまたは複数の代替配列または非参照配列を含み得る。
【００６２】
ゲノムの特徴は、１つまたは複数の遺伝子フェージングおよび再構築遺伝子を含み得る。フェージングおよび再構築遺伝子の例としては、限定されるものではないが、１つまたは複数の主要組織適合遺伝子複合体、血液タイピング、およびアミラーゼ（amaylase）遺伝子ファミリーが挙げられる。一部の場合では、遺伝子フェージングおよび／または再構築遺伝子は、血液タイピングに関連する遺伝子を含み得る。血液タイピング遺伝子は、ＡＢＯ、ＲＨＤ、ＲＨＣＥ、またはそれらの組合せを含み得る。
【００６３】
一部の場合では、ゲノムの特徴は、再構築遺伝子を含み得る。再構築遺伝子は、免疫応答に関与する遺伝子を含むことができる。免疫応答に関与する遺伝子は、主要組織適合遺伝子複合体、免疫応答、および細胞機能に関与する遺伝子を含むことができる。１つまたは複数の主要組織適合遺伝子複合体は、１つもしくは複数のＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩ、またはそれらの組合せを含み得る。ＨＬＡクラスＩは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、またはそれらの組合せのいずれか１つであり得る。ＨＬＡクラスＩＩは、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、またはそれらの組合せのいずれか１つであり得る。免疫応答に関与する遺伝子は、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、およびそれらの組合せであり得る。一部の場合では、再構築遺伝子は、ＶＤＪ組換えに関与する遺伝子を含み得る。例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞受容体（ＢＣＲおよびＴＣＲ）において多様性を確立するために、遺伝子は、既存の遺伝子セグメントを組み換えることによって、作出することができる。一部の場合では、遺伝子セグメントの有限集合の異なる組合せは、限定されない数の外来ゲノムまたは非ヒトゲノムを認識することができる受容体を生じさせることができる。ＶＤＪ組換えは、組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を含むＤＮＡを切断することを含むことができる。一部の場合では、断片化配列は、細胞修復機構を使用して再構築することができる。本開示は、ＶＤＪ組換えからゲノムの断片化セクションを配列決定することを含む方法も提供する。例えば、本開示は、ＶＤＪ組換えの部位で配列決定することを含む方法を提供する。
【００６４】
本開示の一部の態様では、１つまたは複数のゲノムの特徴は、相互に排他的ではなくてもよい。例えば、全ゲノムまたはその部分を含むゲノムの特徴は、全エクソームまたはその部分、１つまたは複数の遺伝子、１つまたは複数の調節エレメントなどの追加のゲノムの特徴と重なり合うことができる。あるいは、１つまたは複数のゲノムの特徴は、相互に排他的であってもよい。例えば、全ゲノムの非コード部分を含むゲノムは、エクソームもしくはその部分、または遺伝子のコード部分などのゲノムの特徴と重なり合わなくてもよい。代わりに、または加えて、１つまたは複数のゲノムの特徴は、部分的に排他的であるか、または部分的に包括的である。例えば、全エクソームまたはその部分を含むゲノムは、遺伝子のエクソン部分を含むゲノムと部分的に重なり合うことができる。しかしながら、全エクソームまたはその部分を含むゲノムは、遺伝子のイントロン部分を含むゲノムと重なり合わなくてもよい。したがって、遺伝子またはその部分を含むゲノムの特徴は、全エクソームまたはその部分を含むゲノムの特徴を、部分的に排除してもよく、および／または部分的に含んでいてもよい。一部の場合では、遺伝子の特徴は、１つより多くの種を区別することができるように、種に関連し得る。一部の場合では、遺伝子の特徴は、ヒト遺伝子の特徴および細菌遺伝子の特徴を区別することができるように、種に関連し得る。一部の場合では、核酸分子の第１のサブセットは、１つの種に特異的であり、核酸分子の第２のサブセットは、第２の種に特異的である。
【００６５】
生体試料は、ヒトゲノム、非ヒトゲノム、またはそれらの組合せを含むことができる。一部の場合では、生体試料を処理することができる。一部の場合では、生体試料は、対象、例えば、ヒトの核酸配列について濃縮され得るか、または対象由来ではない（例えば、非ヒト）核酸配列について、試料由来のヒトゲノムおよび非ヒトゲノムの同時検出を行うことができる。生体試料は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または無細胞ＲＮＡなどの無細胞核酸分子を含み得る。無細胞核酸分子は、循環腫瘍核酸分子（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ）であり得る。無細胞ＤＮＡは、がんなどの疾患を示し得るか、関連し得るか、または関係し得る突然変異を含んでいてもよい。
【００６６】
生体試料は、操作された配列を含む核酸分子を有していてもよい。例えば、生体試料中の核酸は、２〜３例挙げると、タグなどの外因性配列または代替配列、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの外因性受容体、プラスミド配列、およびネオ抗原特異的配列を含み得る。一部の場合では、操作された配列は、診断マーカーとして利用されてもよい。一部の場合では、操作された配列を利用して、治療薬が腫瘍標的などの標的に輸送されるかを決定してもよい。代替配列は、外因性または内在性であり得る。一部の場合では、代替配列は、プラスミド配列由来を含み得る。プラスミド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。一部の場合では、プラスミド配列は、ＤＮＡの小環状配列またはドギーボーン配列（doggy bone sequence）でもあり得る。
【００６７】
本開示は、１つまたは複数のトランスクリプトームを含む核酸試料または核酸分子のサブセットを得ること、または用意することを含む方法も提供する。核酸試料は、ｍＲＮＡを含んでいてもよい。ｍＲＮＡは、対象における異なる組織由来であってもよい。試料中のｍＲＮＡの量は、組織および対象に特異的な方法で、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを分析するために使用され得る。例えば、試料中のｍＲＮＡの量は、対象中の特定の特徴または疾患（例えば、がん）に関連し得る。加えて、試料中のｍＲＮＡの量は、対象中の特定の組織型における発現における変化または相対的相違を示し得る。一部の場合では、ｍＲＮＡは、処理されて、ｃＤＮＡを形成し得る。例えば、ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡ分子を合成する逆転写を使用する逆転写に付されてもよい。ｃＤＮＡ分子は、本明細書の他の箇所で記載の核酸において行い得る、捕捉、単離、濃縮、増幅、配列決定、または他の反応に付され得る。
【００６８】
対象および非対象配列を含有する生体試料由来の核酸は、単一プールにおいて、濃縮および配列決定され得、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで分離され得る。例えば、混合されたヒトゲノムおよび非ヒトゲノムは、ヒトおよび非ヒト種の参照配列との整列によって分離することができる。ヒトゲノムが進化の過程で微生物ゲノムから分岐しているので、整列による配列の分離が可能であり得る。微生物種などの非ヒトゲノム由来のゲノム、例えば、ＤＮＡは、一般に、ヒトゲノムに対して整列されず、逆もまた同様である。微生物ゲノムなどの非ヒトゲノムは、他の非ヒトゲノムと共通または類似のセグメントを有していてもよい。ヒトゲノムおよび非ヒトゲノムの混合物中の１つより多くの非ヒトゲノムは、非ヒト種を特定するための追加の整列が必要であり得る。
【００６９】
一部の場合では、方法は、生体試料から核酸分子のサブセットを生成することを含むことができる。一部の場合では、方法は、１つまたは複数のハイブリダイゼーション反応を実施することによって、生体試料から核酸分子のサブセットを生成することを含むことができる。ハイブリダイゼーション反応は、濃縮を含むことができる。一部の場合では、濃縮を行うことができる。濃縮は、さまざまな方法によって行うことができる。一部の場合では、濃縮は、ハイブリッド捕捉、アレイ捕捉、ビーズ捕捉などによって行うことができる。一部の場合では、ハイブリッド捕捉は、溶液中、またはアレイ上などの固体担体上であり得る。一部の場合では、濃縮は、分子反転プローブ（ＭＩＰ）によって行うことができる。濃縮は、例えば、ＰＣＲを使用する、増幅によって行うことができる。一部の場合では、方法は、濃縮の目的のために、ヒトゲノムまたは非ヒトゲノムの増幅によって、核酸のサブセットを生成することを含むことができる。一部の場合では、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく手法（例えば、固相ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、ナノＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲなど）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および任意の他の適切な増幅手法のうちの１つを含むことができる。
【００７０】
核酸プローブのプールは、ヒトエクソーム捕捉キット、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｘｏｍｅ  ｖ２（図１）を含むことができる。核酸プローブのプールは、それが標的にするヒト配列に対して相補的であるハイブリダイゼーションプローブを含むことができる。核酸プローブのプールは、所定のヒト遺伝子などの大部分のゲノムを標的にするために、約５０，０００個の捕捉用プローブから含むことができる。捕捉用プローブは、遺伝子、エクソン、ＵＴＲ、調節領域、スプライス部位、再構築遺伝子、代替配列、および追加のゲノム含量を標的にするように設計することができる。一部の場合では、方法は、非ヒト配列を標的にするように設計された核酸プローブのプールを含むことができる。一部の場合では、核酸プローブのプールは、ウイルス、細菌、真菌または古細菌のゲノム由来、すなわち、ヒトマイクロバイオーム由来のような非ヒトゲノムに特異的であり得る。一部の場合では、核酸プローブのプールは、核酸プローブの第１のプールと比較して、第２の種に特異的であり得る核酸プローブの第２のプールと組み合わせることができる（図２）。核酸プローブのプールは、ヒト配列および非ヒト配列に結合するように構成することができ、核酸プローブのプールは、セグメント化トランスクリプトーム由来の配列に結合することができる（図３）。一部の場合では、核酸プローブのプールは、ヒト配列に結合することができ、核酸プローブのプールは、非ヒト配列に結合することができる（図４）。一部の場合では、核酸プローブのプールは、患者試料から抽出された核酸との単一ハイブリダイゼーションに基づく捕捉反応のために使用することができる。一部の場合では、方法は、捕捉されている核酸のプールを配列決定することを含むことができる。捕捉または濃縮された核酸は、ヒト、非ヒト、またはヒトおよび非ヒト配列であり得、配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｏｖａＳｅｑ−６０００  ＤＮＡ配列決定装置を含むことができる。一部の場合では、微生物種を標的にする捕捉用プローブは、１つもしくは複数の種が異なるか、または１つもしくは複数の種が異なる領域、例えば、非ヒトまたはヒトの領域に直ぐ隣接する微生物種配列の領域を標的にするように設計され得る。一部の場合では、方法は、微生物配列などの非ヒト配列の間の相違の領域を標的にし、それによって、少数の捕捉用プローブで、多数の可能性がある非ヒト微生物種由来の核酸の捕捉を可能にすることを含む。共有の配列領域を含み得るが、可変領域に隣接する捕捉用プローブを使用することによって、捕捉することができる多くの非ヒト配列は、両方に及び得る。
【００７１】
一部の場合では、非ヒトゲノム由来の配列は、次いで、１つまたは複数の種に固有の領域によって、それらの起源種に割り当てることができる。例えば、ほぼすべての細菌中に存在する１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は、配列が種ごとに異なり、共有配列の領域と交互配置された約９つの領域を有する。一部の場合では、配列がこれらの共有領域から可変領域に伸長した捕捉された分子は、次いで、可変領域部由来の配列に基づくそれらの起源の種に割り当てることができる。真菌核酸配列は、真菌ゲノムの大きなサブユニットのリボソームＲＮＡ遺伝子の部分的に保存されたＤ２領域を使用することによって、同様に評価することができる。ゲノムのエクソームを分析することができる。ゲノムのイントロン領域を分析することができる。エクソームは、主に、ヒトゲノムのコード領域を標的にし、全ヒトゲノムの２％未満を表し得る。ヒトゲノムのイントロン部分および遺伝子間部分の大部分を除外することによって、ヒト配列の量は、約９８％低減され得る。エクソームは、非コード含量を含むように増大され得る。がんなどにおけるエクソームの配列決定は、ディープシークエンシングを可能にし得、それにより、低対立遺伝子頻度で体細胞変異体の検出を改善すること、また試料から共捕捉された非ヒト配列の検出を改善することを可能にし得る。
【００７２】
本開示は、生体試料を処理するための組成物および方法も提供する。生体試料は、成人または小児などの対象から得ることができる。一部の場合では、生体試料を処理するための方法は、（ａ）核酸プローブのプールを使用して、生体試料から核酸分子のサブセットを生成することであって、プローブが、（ｉ）ヒトゲノムのエレメントを標的にするように構成された第１の複数の核酸プローブ、および（ｉｉ）１つまたは複数の非ヒトゲノムのエレメントを標的にするように構成された第２の複数の核酸プローブを含むこと；ならびに（ｂ）核酸分子のサブセットをアッセイに付して、（ｉ）対象からの生体試料由来のヒト核酸、および（ｉｉ）対象の生体試料由来の非ヒト核酸の配列を含む配列情報を得ることを含む。
【００７３】
開示される方法は、１つもしくは複数の非ヒト核酸分子、または１つもしくは複数の非ヒトゲノムもしくは非宿主ゲノムによって引き起こされる１つもしくは複数の疾患または状態を、検出すること、モニタリングすること、定量化すること、または評価することを含み得る。一部の場合では、捕捉用プローブは、異なる属の間を標的にすることができる。一部の場合では、捕捉用プローブは、異なる種の間を標的にすることができる。一部の態様では、捕捉用プローブは、異なる目の１つより多くの生物の間を標的にすることができる。一部の場合では、捕捉用プローブは、植物界、動物界、真菌、原生動物（protest）、真正細菌、および／または古細菌を標的にすることができる。一部の場合では、捕捉用プローブは、ウイルス、細菌、細菌のファージ、真菌、原生生物、古細菌、アメーバ、蠕虫、藻類、遺伝子改変細胞、遺伝子改変ベクター、およびそれらの組合せを標的にすることができる。一部の場合では、非ヒト配列は細菌であり得る。例えば、細菌配列は、ａｃｉｄｉｏｂａｃｔｅｒｉａ、ａｃｔｉｎｉｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ、ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−ｔｈｅｒｍｕｓ、ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ、ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ、ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ、ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉａ、ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、および／またはｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ由来であり得る。一部の場合では、非ヒト配列は、限定されるものではないが、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｖｉｂｒｉｏ、またはＹｅｒｓｉｎｉａ由来であり得る。追加の病原体としては、限定されるものではないが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａが挙げられる。一部の場合では、捕捉用プローブは、ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｏｍｙｃｏｔａ、ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ、Ｔａｐｈｒｉｎｏｍｙｃｏｔｉｎａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ、Ｐｕｃｃｉｎｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ、Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｍｙｃｏｔｉｎａ、Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ、Ｋｉｃｋｘｅｌｌｏｍｙｃｏｔｉｎａ、Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ、Ｚｏｏｐａｇｏｍｙｃｏｔｉｎａなどの真菌を標的にすることができる。一部の場合では、非ヒトまたは非宿主は、ウシ、ウマ、魚類、ロバ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ヘビ、ヒツジ、ヤギなど由来であり得る。
【００７４】
１つまたは複数の非ヒトゲノムによって引き起こされるか、またはこれらと関連する、疾患または状態は、結核、肺炎、経口感染病、破傷風、腸チフス、ジフテリア、梅毒、ハンセン病、細菌性腟症、細菌性髄膜炎、細菌性肺炎、尿路感染症、細菌性胃腸炎、細菌性皮膚感染症、またはそれらの任意の組合せを含み得る。細菌性皮膚感染症の例としては、限定されるものではないが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓによって引き起こされ得る膿痂疹；リンパ液の伝搬による深部表皮のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌感染症によって引き起こされ得る丹毒；および正常な皮膚細菌叢または外因性細菌によって引き起こされ得る蜂巣炎が挙げられる。
【００７５】
非対象核酸配列は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、ＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓおよびＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓなどの真菌に由来していてもよい。真菌によって引き起こされる疾患または状態の例としては、限定されるものではないが、頑癬、カンジダ症、白癬および水虫が挙げられる。
【００７６】
一部の場合では、非対象または非宿主の核酸配列は、原生生物由来であり得る。原生生物は、原生動物、原生植物、カビ、およびそれらの組合せを含むことができる。原生生物は、ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａであり得る。ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａは、ＲｈｏｄｏｐｈｙｔａまたはＧｌａｕｃｏｐｈｙｔａであり得る。原生生物は、ＳａｒまたはＨａｒｏｓａであり得る。ＳＡＲは、ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、ａｌｖｅｏｌａｔｅｓおよびＲｈｉｚａｒｉａ（ＳＡＲ）を含むクレードであり得る。加えて、クレードＳＡＲは、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、Ａｌｖｅｏｌａｔａ、Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ、Ｃｉｌｉｏｐｈｏｒａ、Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ、Ｒｈｉｚａｒｉａ、Ｃｅｒｃｏｚｏａ、Ｆｏｒａｍｉｎｉｆｅｒａ、Ｒａｄｉｏｌａｒｉａ、およびそれらの組合せを含むことができる。一部の場合では、原生生物は、Ｅｘｃａｖａｔａであり得る。Ｅｘｃａｖａｔａは、Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ、Ｐｅｒｃｏｌｏｚｏａ、Ｍｅｔａｍｏｎａｄａ、およびそれらの組合せであり得る。一部の場合では、非宿主は、Ａｍｏｅｂｏｚｏａ、Ｈａｃｒｏｂｉａ、Ａｐｕｓｏｚｏａ、Ｏｐｉｓｔｈｏｋｏｎｔａおよび／またはＣｈｏａｎｏｚｏａであり得る。
【００７７】
非対象核酸配列は、ウイルスに由来していてもよい。ウイルスの例としては、限定されるものではないが、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エプスタインバーウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎）、単純ヘルペスウイルス（１型および２型）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、呼吸器多核体ウイルス、風疹ウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスが挙げられる。ウイルスによって引き起こされる疾患または状態の例としては、限定されるものではないが、風邪、インフルエンザ、肝炎、ＡＩＤＳ、水疱、風疹、流行性耳下腺炎、麻疹、疣贅および灰白髄炎が挙げられる。
【００７８】
非対象核酸は、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ（例えば、Ａ．ａｓｔｒｏｎｙｘｉｓ、Ａ．ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ、Ａ．ｃｕｌｂｅｒｔｓｏｎｉ、Ａ．ｈａｔｃｈｅｔｔｉ、Ａ．ｐｏｌｙｐｈａｇａ、Ａ．ｒｈｙｓｏｄｅｓ、Ａ．ｈｅａｌｙｉ、Ａ．ｄｉｖｉｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｂｒａｃｈｉｏｌａ（例えば、Ｂ  ｃｏｎｎｏｒｉ、Ｂ．ｖｅｓｉｃｕｌａｒｕｍ）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ（例えば、Ｃ．ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ）、Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ（例えば、Ｅ．ｃｕｎｉｃｕｌｉ、Ｅ．ｈｅｌｌｅｍ、Ｅ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ（例えば、Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ（例えば、Ｅ．ｂｉｅｎｅｕｓｉ）、Ｇｉａｒｄｉａ（例えば、Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ）、Ｉｓｏｓｐｏｒａ（例えば、Ｉ．ｂｅｌｌｉ）、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｃｅｙｌｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ（例えば、Ｎ．ｆｏｗｌｅｒｉ）、Ｎｏｓｅｍａ（例えば、Ｎ．ａｌｇｅｒａｅ、Ｎ．ｏｃｕｌａｒｕｍ）、Ｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ、Ｔｒａｃｈｉｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ（例えば、Ｔ．ａｎｔｈｒｏｐｏｐｈｔｈｅｒａ、Ｔ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、およびＶｉｔｔａｆｏｒｍａ（例えば、Ｖ．ｃｏｒｎｅａｅ）などの原生動物に由来していてもよい。
【００７９】
核酸は、例えば、細胞画分の単離を行うことによって、対象由来の生体試料から抽出および／または単離することができる。変形では、試料の処理は、したがって、試料の溶解、試料の細胞における膜の破壊、試料からの望ましくないエレメント（例えば、ＲＮＡ、タンパク質）の分離、試料の非ヒト、マイクロバイオームの核酸含量およびヒトゲノムの核酸含量を含む核酸試料を生成するための試料中の核酸（例えば、ＤＮＡ）の精製、核酸試料由来の核酸の増幅、核酸試料の増幅された核酸のさらなる精製、核酸試料の増幅された核酸の配列決定、ならびにそれらの任意の組合せのいずれか１つまたは複数を含むことができる。変形では、試料の溶解、および／または試料の細胞における膜の破壊は、細胞溶解／膜破壊の物理的方法（例えば、ビーズ叩打、窒素減圧、均質化、超音波処理）を含むことができ、これは、配列決定の際にある特定の微生物群の提示におけるバイアスが生じるある特定の試薬を取り除く。加えて、または代わりに、溶解または破壊は、化学的方法（例えば、洗剤を使用する、溶媒を使用する、界面活性剤を使用するなど）を含むことができる。
【００８０】
変形では、試料由来の望ましくないエレメントの分離は、ＲＮアーゼを使用するＲＮＡの除去、および／またはプロテアーゼを使用するタンパク質の除去を含むことができる。変形では、核酸試料を生成するための試料中の核酸の精製は、生体試料から核酸の沈殿（例えば、アルコール系沈殿法を使用する）、液−液系精製手法（例えば、フェノール−クロロホルム抽出）、クロマトグラフィー系精製手法（例えば、カラム吸着）、核酸に結合するように構成され、溶出環境（例えば、溶出溶液を有する、ｐＨ変化を提供する、温度変化を提供するなど）の存在中で核酸を放出するように構成された、結合部分−結合粒子（例えば、磁気ビーズ、浮遊ビーズ、サイズ分布を有するビーズ、超音波応答性ビーズなど）の使用を含む精製手法、ならびに任意の他の適切な精製手法の１つまたは複数を含むことができる。
【００８１】
核酸は、抽出および単離するために生体試料から抽出および／または単離することができ、ならびに／あるいは、単離を、任意の混入物質（例えば、試料中の核酸に影響を与え得るか、または核酸の夾雑物に寄与し得る物質）の無菌環境（例えば、無菌実験フード、無菌室）において実施することができ、環境は、温度を制御することができ、酸素含量について制御することができ、二酸化炭素含量について制御することができ、および／または光曝露（例えば、紫外光への曝露）について制御することができる。抽出は、細胞膜を破壊し、生体試料中の細胞からの核酸の放出を促進する溶解を含むことができる。非限定的な一例では、溶解は、試料と混合され、試料の生物学的含量を撹拌するように機能するビーズとの使用のために構成されたビーズミル装置（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｅｒ）を含むことができる。一部の場合では、生体試料の処理は、溶解試薬（例えば、プロテイナーゼ）、熱モジュール、および溶解のための任意の他の適切な装置（複数可）の１つまたは複数の組合せを含むことができる。
【００８２】
溶解試料からの核酸の単離のために、試料の非核酸含量は、試料の核酸含量から分離される。試料を処理する方法の精製モジュールは、力に基づく分離、サイズに基づく分離、結合部分に基づく分離（例えば、磁気結合部分による、浮遊結合部分によるなど）、および／または任意の他の適切な分離の形式を含むことができる。例えば、方法の精製操作は、上清の抽出を促進する遠心分離、フィルター（例えば、濾過プレート）、溶解試料を試料の核酸含量および／または廃棄物に結合する部分と組み合わせるように構成された液体送達モジュール、洗浄試薬送達システム、溶出試薬送達システム、および試料からの核酸含量の精製のための任意の他の適切な装置の１つまたは複数を含むことができる。
【００８３】
核酸分子のサブセットをアッセイに付して、配列情報を得ることができる。配列情報を与えるアッセイは、配列決定反応を含むことができる。一部の場合では、配列決定は、ＲＮＡの配列決定であり得る。例えば、配列決定は、ＲＮＡ転写の配列決定であり得る。ＲＮＡの配列決定は、ＲＮＡ精製によるクロマチン単離（ＣｈＩＲＰ−Ｓｅｑ）、グローバルランオン配列決定（ＧＲＯ−Ｓｅｑ）、リボソームプロファイリング配列決定（Ｒｉｂｏ−Ｓｅｑ）／ＡＲＴｓｅｑ（商標）、ＲＮＡ免疫沈降配列決定（ＲＩＰ−Ｓｅｑ）、ＣＬＩＰ  ｃＤＮＡライブラリーのハイスループット配列決定（ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ）、架橋および免疫沈降配列決定（ＣＬＩＰ−Ｓｅｑ）、光活性化可能リボヌクレオシドが増強する架橋および免疫沈降（ＰＡＲ−ＣＬＩＰ）、個々のヌクレオチドの解像度のＣＬＩＰ（ｉＣＬＩＰ）、ネイティブ伸長転写物配列決定（ＮＥＴ−Ｓｅｑ）、ポリソームｍＲＮＡの標的精製（ＴＲＡＰ−Ｓｅｑ）、ハイブリッドの架橋、ライゲーションおよび配列決定（ＣＬＡＳＨ−Ｓｅｑ）、ＲＮＡエンド配列決定のパラレル分析（ＰＡＲＥ−Ｓｅｑ）、非キャップ転写物のゲノムワイドマッピング（ＧＭＵＣＴ）、転写物アイソフォーム配列決定（ＴＩＦ−Ｓｅｑ）、ＴＳＳのペアエンド分析（ＰＥＡＴ）、ならびにそれらの任意の組合せのいずれか１つを含むことができる。一部の場合では、配列決定は、ＲＮＡ構造を含むことができる。ＲＮＡ構造の配列決定は、プライマー伸長配列決定によって分析される選択的２’−ヒドロキシルアシル化（ＳＨＡＰＥ−Ｓｅｑ）、ＲＮＡ構造のパラレル分析（ＰＡＲＳ−Ｓｅｑ）、断片化配列決定（ＦＲＡＧ−Ｓｅｑ）、ＣＸＸＣアフィニティー精製配列決定（ＣＡＰ−Ｓｅｑ）、アルカリホスファターゼ、仔ウシ腸−タバコ酸ピロホスファターゼ配列決定（ＣＩＰ−ＴＡＰ）、イノシン化学的消去配列決定（ＩＣＥ）、ｍ６Ａ−特異的メチル化ＲＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＲＩＰ−Ｓｅｑ）、およびそれらの任意の組合せのいずれか１つを含むことができる。一部の場合では、配列決定は、低レベルＲＮＡ検出を含むことができる。低レベルＲＮＡ検出は、デジタルＲＮＡ配列決定、単一細胞についての全転写物増幅（Ｑｕａｒｔｚ−Ｓｅｑ）、設計プライマーに基づくＲＮＡ配列決定（ＤＰ−Ｓｅｑ）、ＲＮＡ鋳型の５’末端でのスイッチ機構（Ｓｍａｒｔ−Ｓｅｑ）、ＲＮＡ鋳型の５’末端でのスイッチ機構バージョン２（Ｓｍａｒｔ−Ｓｅｑ２）、固有分子識別子（ＵＭＩ）、線形増幅配列決定による細胞発現（ＣＥＬ−Ｓｅｑ）、単一細胞タグ化逆転写配列決定（ＳＴＲＴ−Ｓｅｑ）、およびそれらの任意の組合せを含むことができる。一部の場合では、配列決定は、ＤＮＡの配列決定であり得る。ＤＮＡ配列決定は、低レベルＤＮＡ検出を含むことができる。低レベルＤＮＡ検出を含むＤＮＡ配列決定は、単一分子の分子反転プローブ（ｓｍＭＩＰ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、多重アニーリングおよびルーピングに基づく増幅サイクル（ＭＡＬＢＡＣ）、オリゴヌクレオチド選択的配列決定（ＯＳ−Ｓｅｑ）、デュプレックス配列決定（Ｄｕｐｌｅｘ−Ｓｅｑ）、およびそれらの任意の組合せの少なくとも１つを含むことができる。一部の態様では、配列決定���、ＤＮＡメチル化を含むことができる。ＤＮＡメチル化は、亜硫酸水素塩配列決定（ＢＳ−Ｓｅｑ）、ポスト亜硫酸水素塩アダプタータグ付け（ＰＢＡＴ）、タグメンテーションに基づく全ゲノム亜硫酸水素塩配列決定（Ｔ−ＷＧＢＳ）、酸化的亜硫酸水素塩配列決定（ｏｘＢＳ−Ｓｅｑ）、Ｔｅｔ支援亜硫酸水素塩配列決定（ＴＡＢ−Ｓｅｑ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＤＩＰ−Ｓｅｑ）、メチル化捕捉（ＭｅｔｈｙｌＣａｐ）配列決定、メチル結合ドメイン捕捉（ＭＢＤＣａｐ）配列決定、還元提示亜硫酸水素塩配列決定（ＲＲＢＳ−Ｓｅｑ）、およびそれらの組合せの少なくとも１つを含むことができる。一部の場合では、配列決定は、ＤＮＡ−タンパク質相互作用を含むことができる。例えば、ＤＮＡ−タンパク質相互作用を含む配列決定は、ＤＮアーゼｌ超感受性部位配列決定（ＤＮａｓｅ−Ｓｅｑ）、ヌクレオソーム配列決定のＭＮアーゼ支援単離（ＭＡＩＮＥ−Ｓｅｑ）、クロマチン免疫沈降配列決定（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ）、調節エレメントのホルムアルデヒド支援単離（ＦＡＩＲＥ−Ｓｅｑ）、トランスポザーゼ−アクセス可能なクロマチン配列決定のためのアッセイ（ＡＴＡＣ−Ｓｅｑ）、ペアエンドタグ配列決定によるクロマチン相互作用分析（ＣｈＩＡ−ＰＥＴ）、クロマチンコンフォメーション捕捉（Ｈｉ−Ｃ／３Ｃ−Ｓｅｑ）、環状クロマチンコンフォメーション捕捉（４−Ｃまたは４Ｃ−Ｓｅｑ）、クロマチンコンフォメーション捕捉カーボンコピー（５−Ｃ）、およびそれらの組合せを含むことができる。一部の場合では、配列決定は、再編成を含むことができる。配列再編成の配列決定は、レトロトランスポゾン捕捉配列決定（ＲＣ−Ｓｅｑ）、トランスポゾン配列決定（Ｔｎ−Ｓｅｑ）または挿入配列決定（ＩＮＳｅｑ）、転位捕捉配列決定（ＴＣ−Ｓｅｑ）、およびそれらの組合せの少なくとも１つを含むことができる。
【００８４】
配列決定分析は、例えば、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のサブセクションのＰＣＲ増幅、およびディープシークエンシングを使用する非標的メタゲノミクス法を含むことができる。一部の実施形態では、方法は、次世代の増幅のためのプロセスを含むことができ、配列決定は、同時に、微生物のそれぞれのセットについての全１６Ｓ領域を増幅すること、微生物のそれぞれのセットについての全１６Ｓ領域のアンプリコンを断片化して、アンプリコン断片のセットを生成すること、およびアンプリコン断片のセットに基づいて分析を生成することを含むことができ、ここで、分析は、微生物集団の特性、微生物種の特定、および特定された標的微生物配列の少なくとも１つを含む。一部の場合では、全エクソーム配列決定を利用することができる。
【００８５】
一部の場合では、方法は、非ヒトゲノムの遺伝子レベルでの整列を含むことができる。例えば、整列は、１８Ｓ配列に関して、ＩＴＳ配列に関してなどで、１６Ｓ配列を整列させることを含むことができる。したがって、出力は、生体試料の微生物の特性を明らかにするために使用することができる目的の特徴を特定するために使用することができ、ここで、特徴は、非ヒトの（例えば、細菌の属の存在）、遺伝子に基づき（例えば、特定の遺伝子領域および／または配列の提示に基づく）、および／または任意の他の適切なスケールに基づくことができる。
【００８６】
変形では、参照の非ヒトゲノム、例えば、細菌のゲノム（例えば、全米バイオテクノロジー情報センターによって提供される）に対する整列およびマッピングは、グローバル整列のスコア化（例えば、挿入、欠失、マッチ、ミスマッチの観点）に基づく停止条件を用いる、２つの読み取りデータ（例えば、配列読み取りデータおよび参照読み取りデータ）のグローバル整列を行うＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム；ローカル整列のスコア化（例えば、挿入、欠失、マッチ、ミスマッチの観点）を用いる、２つの読み取りデータ（例えば、配列読み取りデータおよび参照読み取りデータ）のローカル整列を行うＳｍｉｔｈ−ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム；配列の間（例えば、配列読み取りデータおよび参照読み取りデータ）のローカル類似の領域を特定する基本的なローカル整列検索ツール（ＢＬＡＳＴ）；ＦＰＧＡ加速整列ツール；ＢＷＡツールを用いるＢＷＴインデックス化；ＳＯＡＰツールを用いるＢＷＴインデックス化；Ｂｏｗｔｉｅツールを用いるＢＷＴインデックス化；ワードハッシュ法およびダイナミックプログラミングを使用する、ゲノム参照配列に対して核酸配列読み取りデータをマップ化するＨａｓｈｉｎｇアルゴリズムによる配列検索および整列（ＳＳＡＨＡ２）；ならびに任意の他の適切な整列アルゴリズムの１つまたは複数を含む、整列アルゴリズムを使用して行うことができる。未同定配列のマッピングは、個体のマイクロバイオームのウイルスおよび／または真菌成分をさらに特定するために、参照のウイルスゲノムおよび／または真菌ゲノムへのマッピングをさらに含むことができる。例えば、ＰＣＲは、並行して、または順次、複数のマーカー（例えば、第１のマーカー、第２のマーカー、第３のマーカー、第Ｎのマーカー）を用いて行うことができ、細菌マーカー、真菌マーカーおよび真核生物マーカーの１つまたは複数と関連することができる。さらにまた、重複した読み取りデータ（例えば、ペアエンド配列決定によって生成される）は、整列アルゴリズムの出力に基づいて構築することができ、または、整列した配列読み取りデータは、参照配列とマージすることができる（例えば、隠れＭａｒｋｏｖモデルのバンド形成手法を使用する、Ｄｕｒｂｉｎ−Ｈｏｌｍｅｓ手法を使用する）。しかしながら、整列およびマッピングは、任意の他の適切なアルゴリズムまたは手法を実行することができる。一部の場合では、配列読み取りデータは、コード化して、行われる整列およびマッピング操作を促進することができる。一例では、配列のそれぞれの塩基は、配置００００ＴＧＣＡに従ってバイトとしてコード化することができ、それにより、最下位ビットは、塩基が、おそらく塩基Ａを含有するとして配列決定される場合、１であり（例えば、Ａは０００００００１として表される）、次の有効ビットは、塩基が、おそらく塩基Ｃを含有するとして配列決定される場合、１であり（例えば、Ｃは００００００１０として表される）、次の有効ビットは、塩基が、おそらく塩基Ｇを含有するとして配列決定される場合、１であり（例えば、Ｇは０００００１００として表される）、次の有効ビットは、塩基が、おそらく塩基Ｔを含有するとして配列決定される場合、１である（例えば、Ｔは００００１０００として表される）。例では、４つの最上位ビットは、ゼロに設定される。しかしながら、この例の代替の変形は、任意の他の適切な方法で塩基をコード化することができる。さらにまた、増幅の間に使用されるプライマーの所定の配列を使用して、配列読み取りデータを整えて、プライマー配列を除外して、整列およびマッピングの効率を増加させることができる。
【００８７】
核酸分子のサブセットは、本明細書に開示される１つまたは複数のゲノムを含んでいてもよい。核酸分子のサブセットは、１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、１１もしくはそれよりも多く、１２もしくはそれよりも多く、１３もしくはそれよりも多く、１４もしくはそれよりも多く、１５もしくはそれよりも多く、２０もしくはそれよりも多く、２５もしくはそれよりも多く、３０もしくはそれよりも多く、３５もしくはそれよりも多く、４０もしくはそれよりも多く、５０もしくはそれよりも多く、６０もしくはそれよりも多く、７０もしくはそれよりも多く、８０もしくはそれよりも多く、９０もしくはそれよりも多く、または１００もしくはそれよりも多くのゲノムを含んでいてもよい。１つまたは複数のゲノムは、同一であってもよく、類似であってもよく、異なっていてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。一部の場合では、核酸の２つのサブセットが存在する（図６Ａ）。
【００８８】
核酸分子のサブセットは、本明細書に開示される１つまたは複数のゲノムの特徴を含んでいてもよい。核酸分子のサブセットは、１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、１１もしくはそれよりも多く、１２もしくはそれよりも多く、１３もしくはそれよりも多く、１４もしくはそれよりも多く、１５もしくはそれよりも多く、２０もしくはそれよりも多く、２５もしくはそれよりも多く、３０もしくはそれよりも多く、３５もしくはそれよりも多く、４０もしくはそれよりも多く、５０もしくはそれよりも多く、６０もしくはそれよりも多く、７０もしくはそれよりも多く、８０もしくはそれよりも多く、９０もしくはそれよりも多く、または１００もしくはそれよりも多くのゲノムの特徴を含んでいてもよい。１つまたは複数のゲノムの特徴は、同一であってもよく、類似であってもよく、異なっていてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
【００８９】
核酸分子のサブセットは、異なるサイズの核酸分子を含んでいてもよい。核酸分子のサブセット中の核酸分子の長さは、核酸分子のサイズと称される場合がある。核酸分子のサブセット中の核酸分子の平均長さは、核酸分子の平均サイズと称される場合がある。本明細書で使用される場合、「核酸分子のサイズ」、「核酸分子の平均サイズ」、「分子サイズ」および「平均分子サイズ」という用語は、互換可能に使用され得る。核酸分子のサイズは、核酸分子の２つまたはそれよりも多くのサブセットを区別するために使用され得る。核酸分子のサブセット中の核酸分子の平均サイズ、および核酸分子の別のサブセット中の核酸分子の平均サイズにおける相違は、核酸分子の２つのサブセットを区別するために使用され得る。核酸分子の１つのサブセット中の核酸分子の平均サイズは、核酸分子の少なくとも１つの他のサブセット中の核酸分子の平均サイズよりも大きくてもよい。核酸分子の１つのサブセット中の核酸分子の平均サイズは、核酸分子の少なくとも１つの他のサブセット中の核酸分子の平均サイズよりも小さくてもよい。核酸分子の２つまたはそれよりも多くのサブセットの間の平均分子サイズにおける相違は、少なくとも約５０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２２５；２５０；２７５；３００；３５０；４００；４５０；５００；５５０；６００；６５０；７００；７５０；８００；８５０；９００；９５０；１，０００；１１００；１２００；１３００；１４００；１５００；１６００；１７００；１８００；１９００；２，０００；３，０００；４，０００；５，０００；６，０００；７，０００；８，０００；９，０００；１０，０００；１５，０００；２０，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；６０，０００；７０，０００；８０，０００；９０，０００；１００，０００、またはそれよりも多くの塩基または塩基対であり得る。本開示の一部の態様では、核酸分子の２つまたはそれよりも多くのサブセットの間の平均分子サイズにおける相違は、少なくとも約２００塩基または塩基対である。あるいは、核酸分子の２つまたはそれよりも多くのサブセットの間の平均分子サイズにおける相違は、少なくとも約３００塩基または塩基対である。
【００９０】
核酸分子のサブセットは、異なる配列決定サイズの核酸分子を含んでいてもよい。配列決定される核酸分子のサブセット中の核酸分子の長さは、核酸分子の配列決定サイズと称される場合がある。核酸分子のサブセット中の核酸分子の平均長さは、核酸分子の平均配列決定サイズと称される場合がある。本明細書で使用される場合、「核酸分子の配列決定サイズ」、「核酸分子の平均配列決定サイズ」、「分子配列決定サイズ」および「平均分子配列決定サイズ」という用語は、互換可能に使用され得る。核酸分子の１つまたは複数のサブセットの平均分子配列決定サイズは、少なくとも約５０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２２５；２５０；２７５；３００；３５０；４００；４５０；５００；５５０；６００；６５０；７００；７５０；８００；８５０；９００；９５０；１，０００；１１００；１２００；１３００；１４００；１５００；１６００；１７００；１８００；１９００；２，０００；３，０００；４，０００；５，０００；６，０００；７，０００；８，０００；９，０００；１０，０００；１５，０００；２０，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；６０，０００；７０，０００；８０，０００；９０，０００；１００，０００、またはそれよりも多くの塩基または塩基対であり得る。核酸分子の配列決定サイズは、核酸分子の２つまたはそれよりも多くのサブセットを区別するために使用され得る。核酸分子のサブセット中の核酸分子の平均配列決定サイズ、および核酸分子の別のサブセット中の核酸分子の平均配列決定サイズにおける相違は、核酸分子の２つのサブセットを区別するために使用され得る。核酸分子の１つのサブセット中の核酸分子の平均配列決定サイズは、核酸分子の少なくとも１つの他のサブセット中の核酸分子の平均配列決定サイズよりも大きくてもよい。核酸分子の１つのサブセット中の核酸分子の平均配列決定サイズは、核酸分子の少なくとも１つの他のサブセット中の核酸分子の平均配列決定サイズよりも小さくてもよい。核酸分子の２つまたはそれよりも多くのサブセットの間の平均分子配列決定サイズにおける相違は、少なくとも約５０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２２５；２５０；２７５；３００；３５０；４００；４５０；５００；５５０；６００；６５０；７００；７５０；８００；８５０；９００；９５０；１，０００；１１００；１２００；１３００；１４００；１５００；１６００；１７００；１８００；１９００；２，０００；３，０００；４，０００；５，０００；６，０００；７，０００；８，０００；９，０００；１０，０００；１５，０００；２０，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；６０，０００；７０，０００；８０，０００；９０，０００；１００，０００、またはそれよりも多くの塩基または塩基対であり得る。本開示の一部の態様では、核酸分子の２つまたはそれよりも多くのサブセットの間の平均分子配列決定サイズにおける相違は、少なくとも約２００塩基または塩基対である。あるいは、核酸分子の２つまたはそれよりも多くのサブセットの間の平均分子配列決定サイズにおける相違は、少なくとも約３００塩基または塩基対である。
【００９１】
本明細書に開示される方法は、１つもしくは複数の捕捉用プローブ、複数の捕捉用プローブ、または１つもしくは複数の捕捉用プローブセットを含んでいてもよい。典型的には、捕捉用プローブは、核酸結合部位を含む。捕捉用プローブは、捕捉された核酸とハイブリダイズしてもよい。捕捉用プローブは、捕捉された核酸と相補的である核酸配列を含んでいてもよい。一部の場合では、捕捉用プローブは、捕捉された核酸の部分と完全に相補的である核酸配列を含んでいてもよい。例えば、捕捉用プローブ中のそれぞれの核酸は、捕捉された核酸中の塩基と相補的であってもよい。捕捉用プローブは、捕捉用核酸より長くてもよい。例えば、捕捉された核酸中のそれぞれの塩基は、捕捉用プローブ中の塩基と相補的であってもよいが、捕捉用プローブ中のすべての塩基が、捕捉された核酸中の塩基と相補的であるわけではない。捕捉用プローブは、捕捉された核酸よりも短くてもよい。例えば、捕捉用プローブ中のそれぞれの塩基は、捕捉された核酸の塩基と相補的であってもよいが、捕捉された核酸中のすべての塩基が、捕捉用プローブと相補的でなくてもよい。
【００９２】
捕捉用プローブは、溶液中で捕捉反応を行ってもよい。捕捉用プローブは、溶液中にあってもよく、溶液中の核酸を捕捉してもよい。捕捉された核酸は、その後、本明細書の他の場所で記載されるようにして、単離および／または溶出させてもよい。捕捉用プローブは、溶液中で核酸を捕捉してもよく、次いで、捕捉用プローブは、その後、固体支持体（例えば、アレイまたはビーズ）などの支持体に付着されてもよい。一部の状況では、支持体は、半固体物質（例えば、ゲル）の形態であり得る。
【００９３】
支持体への付着は、非共有結合的な付着であってもよい。例えば、核酸は、ビオチン化プローブによって捕捉されてもよく、これは、その後、アビジン／ストレプトアビジンビーズに結合し、それによって、捕捉された核酸複合体は、アビジン／ストレプトアビジンビーズに付着する。他の結合のペアを使用して、捕捉用プローブを表面に付着させてもよい。捕捉用プローブは、支持体に共有結合的に付着させることができる。例えば、支持体は、捕捉用プローブが支持体に共有結合的に連結されるように、捕捉用プローブと反応し得る化学反応性リンカーを有していてもよい。
【００９４】
捕捉用プローブは、支持体に付着されてもよく、捕捉反応を行ってもよい。例えば、捕捉用プローブは、支持体とカップリングしてもよく、その後、核酸分子を捕捉してもよい。支持体は、固体または半固体（例えば、ゲル）の物質であり得る。支持体の例としては、限定されないが、ビーズ、スライドおよびチップが挙げられる。支持体は、例えば、ガラス、シリカ、ケイ素、プラスチック（ポリスチレンなど）、寒天またはアガロースであり得る。
【００９５】
捕捉用プローブは、１つまたは複数のリンカーをさらに含んでいてもよい。捕捉用プローブは、１つまたは複数の標識をさらに含んでいてもよい。１つまたは複数のリンカーは、１つまたは複数の標識を核酸結合部位に付着してもよい。一部の場合では、捕捉用プローブは、１６Ｓ遺伝子配列の共有領域とハイブリダイズするように設計されてもよい。１６Ｓ遺伝子配列の共有領域を標的にするように設計され得る捕捉用プローブは、未だに特定および特性が明らかにされていない種でさえも、幅広い種類の種由来の核酸分子を捕捉するために、使用することができる。一部の場合では、方法は、ヒトゲノム配列のエレメントを標的にするように構成された第１の複数の核酸プローブを含むことができる。一部の場合では、方法は、非ヒト種のゲノム配列由来のエレメントを標的にするように構成された第２の複数の核酸プローブを含むことができる。
【００９６】
本明細書に開示される方法は、１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、２０もしくはそれよりも多く、３０もしくはそれよりも多く、４０もしくはそれよりも多く、５０もしくはそれよりも多く、６０もしくはそれよりも多く、７０もしくはそれよりも多く、８０もしくはそれよりも多く、９０もしくはそれよりも多く、１００もしくはそれよりも多く、１２５もしくはそれよりも多く、１５０もしくはそれよりも多く、１７５もしくはそれよりも多く、２００もしくはそれよりも多く、２５０もしくはそれよりも多く、３００もしくはそれよりも多く、３５０もしくはそれよりも多く、４００もしくはそれよりも多く、５００もしくはそれよりも多く、６００もしくはそれよりも多く、７００もしくはそれよりも多く、８００もしくはそれよりも多く、９００もしくはそれよりも多く、１０００もしくはそれよりも多く、５０００もしくはそれよりも多く、１０，０００もしくはそれよりも多く、２０，０００もしくはそれよりも多く、３０，０００もしくはそれよりも多く、４０，０００もしくはそれよりも多く、５０，０００もしくはそれよりも多く、６０，０００もしくはそれよりも多く、７０，０００もしくはそれよりも多く、８０，０００もしくはそれよりも多く、９０，０００もしくはそれよりも多く、１００，００００もしくはそれよりも多くの捕捉用プローブまたは捕捉用プローブセットを含んでいてもよい。一部の場合では、方法は、約５０，０００の捕捉用プローブを含むことができる。１つまたは複数の捕捉用プローブまたは捕捉用プローブセットは、異なっていてもよく、類似であってもよく、同一であってもよく、またはそれらの組合せであってもよい。１つまたは複数の捕捉用プローブまたは捕捉用プローブセットは、他の捕捉用プローブと比較して、種々の相対濃度であり得る。例えば、一部の捕捉用プローブは、捕捉するのが困難であり得る核酸（例えば、高ＧＣ含量を有する配列、配列組換えの結果である配列、多くの数の突然変異を有する配列、高い突然変異比率を有する配列）を捕捉するために、より高い濃度であり得、それによって、特定の核酸を捕捉する可能性を増加させ得る。
【００９７】
１つまたは複数の捕捉用プローブは、試料中の１つもしくは複数の核酸分子またはそれらの変異体もしくは誘導体、あるいは核酸分子のサブセットの少なくとも一部とハイブリダイズする、核酸結合部位を含んでいてもよい。捕捉用プローブは、１つまたは複数のゲノムとハイブリダイズする核酸結合部位を含んでいてもよい。捕捉用プローブは、異なるか、類似するか、および／または同一のゲノムとハイブリダイズしてもよい。１つまたは複数の捕捉用プローブは、１つもしくは複数の核酸分子またはそれらの変異体もしくは誘導体に対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれよりも高い相補性であってもよい。
【００９８】
捕捉用プローブは、１つまたは複数のヌクレオチドを含んでいてもよい。捕捉用プローブは、１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、２０もしくはそれよりも多く、３０もしくはそれよりも多く、４０もしくはそれよりも多く、５０もしくはそれよりも多く、６０もしくはそれよりも多く、７０もしくはそれよりも多く、８０もしくはそれよりも多く、９０もしくはそれよりも多く、１００もしくはそれよりも多く、１２５もしくはそれよりも多く、１５０もしくはそれよりも多く、１７５もしくはそれよりも多く、２００もしくはそれよりも多く、２５０もしくはそれよりも多く、３００もしくはそれよりも多く、３５０もしくはそれよりも多く、４００もしくはそれよりも多く、５００もしくはそれよりも多く、６００もしくはそれよりも多く、７００もしくはそれよりも多く、８００もしくはそれよりも多く、９００もしくはそれよりも多く、または１０００もしくはそれよりも多くのヌクレオチドを含んでいてもよい。捕捉用プローブは、約１００のヌクレオチドを含んでいてもよい。捕捉用プローブは、約１０〜約５００の間のヌクレオチド、約２０〜約４５０の間のヌクレオチド、約３０〜約４００の間のヌクレオチド、約４０〜約３５０の間のヌクレオチド、約５０〜約３００の間のヌクレオチド、約６０〜約２５０の間のヌクレオチド、約７０〜約２００ヌクレオチド、または約８０〜約１５０の間のヌクレオチドを含んでいてもよい。本開示の一部の態様では、捕捉用プローブは、約８０のヌクレオチド〜約１００のヌクレオチドの間を含む。
【００９９】
複数の捕捉用プローブまたは捕捉用プローブセットは、同一であるか、類似であるか、および／または異なる核酸結合部位配列、リンカーおよび／または標識を有する２つまたはそれよりも多くの捕捉用プローブを含んでいてもよい。例えば、２つまたはそれよりも多くの捕捉用プローブは、同一の核酸結合部位を含む。別の例では、２つまたはそれよりも多くの捕捉用プローブは、類似の核酸結合部位を含む。さらに別の例では、２つまたはそれよりも多くの捕捉用プローブは、異なる核酸結合部位を含む。２つまたはそれよりも多くの捕捉用プローブは、１つまたは複数のリンカーをさらに含んでいてもよい。２つまたはそれよりも多くの捕捉用プローブは、異なるリンカーをさらに含んでいてもよい。２つまたはそれよりも多くの捕捉用プローブは、類似のリンカーをさらに含んでいてもよい。２つまたはそれよりも多くの捕捉用プローブは、同一のリンカーをさらに含んでいてもよい。２つまたはそれよりも多くの捕捉用プローブは、１つまたは複数の標識をさらに含んでいてもよい。２つまたはそれよりも多くの捕捉用プローブは、異なる標識をさらに含んでいてもよい。２つまたはそれよりも多くの捕捉用プローブは、類似の標識をさらに含んでいてもよい。２つまたはそれよりも多くの捕捉用プローブは、同一の標識をさらに含んでいてもよい。
【０１００】
アッセイとしては、限定されるものではないが、１つまたは複数の核酸分子の、配列決定、増幅、ハイブリダイゼーション、濃縮、単離、溶出、断片化、検出、定量化を挙げることができる。アッセイは、１つまたは複数の核酸分子を調製するための方法を含んでいてもよい。アッセイは、従来のアッセイ、長い読み取りデータ、高ＧＣ含量、およびハイブリダイゼーションアッセイを含んでいてもよい（図９）。任意の数のアッセイを行ってもよい。アッセイの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大で１０のアッセイであり得る。例えば、図６Ｂは、２つのアッセイの利用を示す概略図を図示する。同様に、１つまたは複数のアッセイからのデータの任意の数の分析を行ってもよい。分析の数は、１つまたは複数のアッセイからのデータの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大で１０の分析であり得る。例えば、図６Ｃは、行われる２つの異なる分析を図示する。一部の場合では、分析は、バイオインフォマティクス分析である（図８）。アッセイは、任意の数のプロトコールを使用して行ってもよい。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大で１０のプロトコールを利用してもよい。図６Ｄは、４つのプロトコールを利用する概略図を提供する。
【０１０１】
本明細書に開示される方法は、試料中の１つまたは複数の核酸分子における１つまたは複数の配列決定反応を実施することを含んでいてもよい。本明細書に開示される方法は、試料中の１つまたは複数の核酸分子における１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、１５もしくはそれよりも多く、２０もしくはそれよりも多く、３０もしくはそれよりも多く、４０もしくはそれよりも多く、５０もしくはそれよりも多く、６０もしくはそれよりも多く、７０もしくはそれよりも多く、８０もしくはそれよりも多く、９０もしくはそれよりも多く、１００もしくはそれよりも多く、２００もしくはそれよりも多く、３００もしくはそれよりも多く、４００もしくはそれよりも多く、５００もしくはそれよりも多く、６００もしくはそれよりも多く、７００もしくはそれよりも多く、８００もしくはそれよりも多く、９００もしくはそれよりも多く、または１０００もしくはそれよりも多くの配列決定反応を実施することを含んでいてもよい。配列決定反応は、同時、連続して、またはそれらの組合せで行ってもよい。配列決定反応は、全ゲノム配列決定またはエクソーム配列決定を含んでいてもよい。配列決定反応は、Ｍａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ、連鎖停止、またはハイスループットシステムを含んでいてもよい。代わりに、または加えて、配列決定反応は、Ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｅ（商標）単一分子配列決定、ナノポアＤＮＡ配列決定、Ｌｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ’  Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ配列決定（ＭＰＳＳ）、４５４パイロシークエンシング、単一分子リアルタイム（ＲＮＡＰ）配列決定、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、イオン半導体配列決定、単一分子ＳＭＲＴ（ＴＭ）配列決定、Ｐｏｌｏｎｙ配列決定、ＤＮＡナノボール配列決定、ＶｉｓｉＧｅｎ生物工学アプローチ、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。代わりに、または加えて、配列決定反応は、限定されるものではないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって提供されるＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘ、ＨｉＳｅｑ、およびＭｉＳｅｑ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって提供されるＰａｃＢｉｏ  ＲＳシステムおよびＳｏｌｅｘａシーケンサーなどの単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））技術、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）によって提供されるＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）シーケンサーなどのＴｒｕｅ単一分子配列決定（ｔＳＭＳ（商標））技術を含む、１つまたは複数の配列決定プラットフォームを含むことができる。配列決定反応はまた、電子顕微鏡法または化学的高感度電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイを含んでいてもよい。本開示の一部の態様では、配列決定反応は、キャピラリー配列決定、次世代配列決定、サンガー配列決定、合成による配列決定、ライゲーションに���る配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、単一分子配列決定、またはそれらの組合せを含む。合成による配列決定は、可逆的ターミネーター配列決定、プログレッシブ単一分子配列決定、シーケンシャルフロー配列決定、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。シーケンシャルフロー配列決定は、パイロシークエンシング、ｐＨ媒介配列決定、半導体配列決定、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
【０１０２】
本明細書に開示される方法は、少なくとも１つの長読み取りデータの配列決定反応および少なくとも１つの短読み取りデータの配列決定反応を実施することを含んでいてもよい。長読み取りデータおよび短読み取りデータの配列決定を含む方法の例を図１８に図示する。長読み取りデータの配列決定反応および／または短読み取りデータの配列決定反応は、核酸分子のサブセットの少なくとも一部において実施してもよい。長読み取りデータの配列決定反応および／または短読み取りデータの配列決定反応は、核酸分子の２つまたはそれよりも多くのサブセットの少なくとも一部において実施してもよい。長読み取りデータの配列決定反応および短読み取りデータの配列決定反応は両方とも、核酸分子の１つまたは複数のサブセットの少なくとも一部において実施してもよい。
【０１０３】
１つまたは複数の核酸分子またはそのサブセットの配列決定は、少なくとも約５；１０；１５；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；６０；７０；８０；９０；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１，０００；１５００；２，０００；２５００；３，０００；３５００；４，０００；４５００；５，０００；５５００；６，０００；６５００；７，０００；７５００；８，０００；８５００；９，０００；１０，０００；２５，０００；５０，０００；７５，０００；１００，０００；２５０，０００；５００，０００；７５０，０００；１０，０００，０００；２５，０００，０００；５０，０００，０００；１００，０００，０００；２５０，０００，０００；５００，０００，０００；７５０，０００，０００；１，０００，０００，０００またはそれよりも多くの配列読み取りデータを含んでいてもよい。
【０１０４】
配列決定反応は、１つまたは複数の核酸分子の少なくとも約５０；６０；７０；８０；９０；１００；１１０；１２０；１３０；１４０；１５０；１６０；１７０；１８０；１９０；２００；２１０；２２０；２３０；２４０；２５０；２６０；２７０；２８０；２９０；３００；３２５；３５０；３７５；４００；４２５；４５０；４７５；５００；６００；７００；８００；９００；１，０００；１５００；２，０００；２５００；３，０００；３５００；４，０００；４５００；５，０００；５５００；６，０００；６５００；７，０００；７５００；８，０００；８５００；９，０００；１０，０００；２０，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；６０，０００；７０，０００；８０，０００；９０，０００；１００，０００またはそれよりも多くの塩基または塩基対の配列決定を含んでいてもよい。配列決定反応は、１つまたは複数の核酸分子の少なくとも約５０；６０；７０；８０；９０；１００；１１０；１２０；１３０；１４０；１５０；１６０；１７０；１８０；１９０；２００；２１０；２２０；２３０；２４０；２５０；２６０；２７０；２８０；２９０；３００；３２５；３５０；３７５；４００；４２５；４５０；４７５；５００；６００；７００；８００；９００；１，０００；１５００；２，０００；２５００；３，０００；３５００；４，０００；４５００；５，０００；５５００；６，０００；６５００；７，０００；７５００；８，０００；８５００；９，０００；１０，０００；２０，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；６０，０００；７０，０００；８０，０００；９０，０００；１００，０００またはそれよりも多くの連続した塩基または塩基対の配列決定を含んでいてもよい。
【０１０５】
本開示の方法において使用される配列決定手法は、ランあたり少なくとも１００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも２００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも３００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも４００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも５００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも６００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも７００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも８００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも９００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも１０００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも５，０００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも１０，０００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも５０，０００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも１００，０００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも５００，０００の読み取りデータ、またはランあたり少なくとも１，０００，０００の読み取りデータを生成してもよい。あるいは、本開示の方法において使用される配列決定手法は、ランあたり少なくとも１，５００，０００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも２，０００，０００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも２，５００，０００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも３，０００，０００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも３，５００，０００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも４，０００，０００の読み取りデータ、ランあたり少なくとも４，５００，０００の読み取りデータ、またはランあたり少なくとも５，０００，０００の読み取りデータを生成してもよい。
【０１０６】
本開示の方法において使用される配列決定手法は、読み取りデータあたり、少なくとも約３０の塩基対、少なくとも約４０の塩基対、少なくとも約５０の塩基対、少なくとも約６０の塩基対、少なくとも約７０の塩基対、少なくとも約８０の塩基対、少なくとも約９０の塩基対、少なくとも約１００の塩基対、少なくとも約１１０塩基対、少なくとも約１２０の塩基対、少なくとも約１５０の塩基対、少なくとも約２００の塩基対、少なくとも約２５０の塩基対、少なくとも約３００の塩基対、少なくとも約３５０の塩基対、少なくとも約４００の塩基対、少なくとも約４５０の塩基対、少なくとも約５００の塩基対、少なくとも約５５０の塩基対、少なくとも約６００の塩基対、少なくとも約７００の塩基対、少なくとも約８００の塩基対、少なくとも約９００の塩基対、または少なくとも約１，０００の塩基対を生成してもよい。あるいは、本開示の方法において使用される配列決定手法は、長い配列読み取りデータを生成し得る。一部の例では、本開示の方法において使用される配列決定手法は、読み取りデータあたり少なくとも約１，２００の塩基対、読み取りデータあたり少なくとも約１，５００の塩基対、読み取りデータあたり少なくとも約１，８００の塩基対、読み取りデータあたり少なくとも約２，０００の塩基対、読み取りデータあたり少なくとも約２，５００の塩基対、読み取りデータあたり少なくとも約３，０００の塩基対、読み取りデータあたり少なくとも約３，５００の塩基対、読み取りデータあたり少なくとも約４，０００の塩基対、読み取りデータあたり少なくとも約４，５００の塩基対、読み取りデータあたり少なくとも約５，０００の塩基対、読み取りデータあたり少なくとも約６，０００の塩基対、読み取りデータあたり少なくとも約７，０００の塩基対、読み取りデータあたり少なくとも約８，０００の塩基対、読み取りデータあたり少なくとも約９，０００の塩基対、読み取りデータあたり少なくとも約１０，０００の塩基対、読み取りデータあたり２０，０００の塩基対、読み取りデータあたり３０，０００の塩基対、読み取りデータあたり４０，０００の塩基対、読み取りデータあたり５０，０００の塩基対、読み取りデータあたり６０，０００の塩基対、読み取りデータあたり７０，０００の塩基対、読み取りデータあたり８０，０００の塩基対、読み取りデータあたり９０，０００の塩基対、または読み取りデータあたり１００，０００の塩基対を生成してもよい。
【０１０７】
ハイスループット配列決定システムは、成長する鎖に組み込まれた直後または組み込まれるときに、配列決定されるヌクレオチドの検出、すなわち、リアルタイムまたは実質的にリアルタイムで配列の検出を可能にし得る。一部の場合では、ハイスループット配列決定は、１時間あたり、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、または少なくとも５００，０００の配列読み取りデータを生成し、それぞれの読み取りデータは、読み取りデータあたり、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、または少なくとも５００の塩基である。配列決定は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ転写物に由来するｃＤＮＡ、または鋳型としてのＲＮＡなどの本明細書に記載の核酸を使用して行うことができる。
【０１０８】
本明細書に開示される方法は、試料中の１つまたは複数の核酸分子における１つまたは複数の増幅反応を実施することを含んでいてもよい。「増幅」という用語は、核酸分子の少なくとも１つのコピーを生成する任意のプロセスを指す。「アプリコン」および「増幅された核酸分子」という用語は、核酸分子のコピーを指し、互換可能に使用することができる。増幅反応は、ＰＣＲに基づく方法、ＰＣＲに基づかない方法、またはそれらの組合せを含むことができる。ＰＣＲに基づかない方法の例としては、限定されるものではないが、多重置換増幅（ＭＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ローリングサークル増幅、またはサークル−サークル増幅が挙げられる。ＰＣＲ系の方法としては、限定されるものではないが、ＰＣＲ、ＨＤ−ＰＣＲ、Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎ  ＰＣＲ、デジタルＲＴＡ、またはそれらの任意の組合せが挙げられ得る。追加のＰＣＲ法としては、限定されるものではないが、線形増幅、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、Ａｌｕ  ＰＣＲ、アセンブリＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ドロップレットＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、ヘリカーゼ依存性増幅ＨＤＡ、ホットスタートＰＣＲ、インバースＰＣＲ、指数関数後線形（ＬＡＴＥ）−ＰＣＲ、ロングＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、半ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、単一細胞ＰＣＲ、およびタッチダウンＰＣＲが挙げられる。
【０１０９】
本明細書に開示される方法は、試料中の１つまたは複数の核酸分子における１つまたは複数のハイブリダイゼーション反応を実施することを含んでいてもよい。ハイブリダイゼーション反応は、１つまたは複数の捕捉用プローブの、試料中の１つもしくは複数の核酸分子または核酸分子のサブセットとのハイブリダイゼーションを含んでいてもよい。ハイブリダイゼーション反応は、１つまたは複数の捕捉用プローブセットを、試料中の１つもしくは複数の核酸分子または核酸分子のサブセットとハイブリダイズすることを含んでいてもよい。ハイブリダイゼーション反応は、１つもしくは複数のハイブリダイゼーションアレイ、マルチプレックスハイブリダイゼーション反応、ハイブリダイゼーション連鎖反応、等温ハイブリダイゼーション反応、核酸ハイブリダイゼーション反応、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。１つまたは複数のハイブリダイゼーションアレイは、ハイブリダイゼーションアレイジェノタイピング、ハイブリダイゼーションアレイ比例センシング、ＤＮＡハイブリダイゼーションアレイ、マクロアレイ、マイクロアレイ、高密度オリゴヌクレオチドアレイ、ゲノムハイブリダイゼーションアレイ、比較ハイブリダイゼーションアレイ、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。ハイブリダイゼーション反応は、１つもしくは複数の捕捉用プローブ、１つもしくは複数のビーズ、１つもしくは複数の標識、核酸分子の１つもしくは複数のサブセット、１つもしくは複数の核酸試料、１つもしくは複数の試薬、１つもしくは複数の洗浄緩衝液、１つもしくは複数の溶出緩衝液、１つもしくは複数のハイブリダイゼーション緩衝液、１つもしくは複数のハイブリダイゼーションチャンバー、１つもしくは複数のインキュベーター、１つもしくは複数の分離器、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
【０１１０】
本明細書に開示される方法は、試料中の１つまたは複数の核酸分子における１つまたは複数の濃縮反応を実施することを含んでいてもよい。濃縮反応は、試料を１つまたは複数のビーズまたはビーズセットと接触させることを含んでいてもよい。濃縮反応は、１つまたは複数のゲノムの特徴に基づく、核酸分子の２つまたはそれよりも多くのサブセットの差次的増幅を含んでいてもよい。例えば、濃縮反応は、ＧＣ含量に基づく、核酸分子の２つまたはそれよりも多くのサブセットの差次的増幅を含む。代わりに、または加えて、濃縮反応は、メチル化状態に基づく、核酸分子の２つまたはそれよりも多くのサブセットの差次的増幅を含む。濃縮反応は、１つまたは複数のハイブリダイゼーション反応を含んでいてもよい。濃縮反応は、１つもしくは複数のハイブリダイズされた核酸分子、１つもしくは複数のビーズ結合核酸分子、１つもしくは複数の遊離核酸分子（例えば、捕捉用プローブを含まない核酸分子、ビーズを含まない核酸分子）、１つもしくは複数の標識化核酸分子、１つもしくは複数の非標識化核酸分子、１つもしくは複数のアンプリコン、１つもしくは複数の非増幅核酸分子、またはそれらの組合せの単離および／または精製をさらに含んでいてもよい。代わりに、または加えて、濃縮反応は、試料中の１つまたは複数の細胞型について濃縮することを含んでいてもよい。１つまたは複数の細胞型は、フローサイトメトリーによって濃縮されてもよい。
【０１１１】
１つまたは複数の濃縮反応は、１つまたは複数の濃縮された核酸分子を生成し得る。濃縮された核酸分子は、核酸分子、またはその変異体もしくは誘導体を含んでいてもよい。例えば、濃縮された核酸分子は、１つもしくは複数のハイブリダイズされた核酸分子、１つもしくは複数のビーズ結合核酸分子、１つもしくは複数の遊離核酸分子（例えば、捕捉用プローブを含まない核酸分子、ビーズを含まない核酸分子）、１つもしくは複数の標識化核酸分子、１つもしくは複数の非標識化核酸分子、１つもしくは複数のアンプリコン、１つもしくは複数の非増幅核酸分子、またはそれらの組合せを含む。濃縮された核酸分子は、ＧＣ含量、分子サイズ、ゲノム、ゲノムの特徴、またはそれらの組合せによって、濃縮されていない核酸分子から区別されてもよい。濃縮された核酸分子は、１つもしくは複数のアッセイ、上清、溶出液、またはそれらの組合せに由来していてもよい。濃縮された核酸分子は、平均サイズ、平均ＧＣ含量、ゲノム、またはそれらの組合せによって、濃縮されていない核酸分子と異なっていてもよい。一部の場合では、濃縮は、異なるゲノム領域について濃縮されたＤＮＡの複数のサブセットを含んでいてもよく、配列決定アッセイのために組み合わされる前に、独立した処理操作を受ける（図１５）。一部の場合では、濃縮は、異なるゲノム領域について濃縮されたＤＮＡの複数のサブセットを含んでいてもよく、独立して配列決定および分析される前に、独立した処理操作を受ける（図１６）。
【０１１２】
本明細書に開示される方法は、試料中の１つまたは複数の核酸分子における１つまたは複数の単離または精製反応を実施することを含んでいてもよい。単離または精製反応は、試料を１つまたは複数のビーズまたはビーズセットと接触させることを含んでいてもよい。単離または精製反応は、１つもしくは複数のハイブリダイゼーション反応、濃縮反応、増幅反応、配列決定反応、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。単離または精製反応は、１つまたは複数の分離器の使用を含んでいてもよい。１つまたは複数の分離器は、磁気分離器を含んでいてもよい。単離または精製反応は、ビーズを含まない核酸分子から、ビーズに結合した核酸分子を分離することを含んでいてもよい。単離または精製反応は、捕捉用プローブを含まない核酸分子から、捕捉用プローブとハイブリダイズした核酸分子を分離することを含んでいてもよい。単離または精製反応は、核酸分子の第２のサブセットから核酸分子の第１のサブセットを分離することを含んでいてもよく、核酸分子の第１のサブセットは、平均サイズ、平均ＧＣ含量、ゲノム、またはそれらの組合せによって、核酸分子における第２のサブセットと異なる。
【０１１３】
本明細書に開示される方法は、試料中の１つまたは複数の核酸分子における１つまたは複数の溶出反応を実施することを含んでいてもよい。溶出反応は、試料を１つまたは複数のビーズまたはビーズセットと接触させることを含んでいてもよい。溶出反応は、ビーズを含まない核酸分子から、ビーズに結合した核酸分子を分離することを含んでいてもよい。溶出反応は、捕捉用プローブを含まない核酸分子から、捕捉用プローブとハイブリダイズした核酸分子を分離することを含んでいてもよい。溶出反応は、核酸分子の第２のサブセットから核酸分子の第１のサブセットを分離することを含んでいてもよく、核酸分子の第１のサブセットは、平均サイズ、平均ＧＣ含量、ゲノム、またはそれらの組合せによって、核酸分子における第２のサブセットと異なる。
【０１１４】
本明細書に開示される方法は、１つまたは複数の断片化反応を含んでいてもよい。断片化反応は、試料中の１つもしくは複数の核酸分子、または核酸分子のサブセットを断片化して、１つまたは複数の断片化核酸分子を生成することを含んでいてもよい。１つまたは複数の核酸分子は、超音波処理、ニードル剪断、噴霧、剪断（例えば、音響剪断、機械的剪断、ポイントシンク剪断）、フレンチ圧力セルの通過、または酵素消化によって、断片化されてもよい。酵素消化は、ヌクレアーゼ消化（例えば、小球菌ヌクレアーゼ消化、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＲＮアーゼＨまたはＤＮアーゼＩ）によって起こってもよい。１つまたは複数の核酸分子の断片化は、約１００塩基対〜約２０００塩基対、約２００塩基対〜約１５００塩基対、約２００塩基対〜約１０００塩基対、約２００塩基対〜約５００塩基対、約５００塩基対〜約１５００塩基対、および約５００塩基対〜約１０００塩基対のサイズの断片をもたらしてもよい。１つまたは複数の断片化反応は、約５０塩基対〜約１０００塩基対のサイズの断片をもたらしてもよい。１つまたは複数の断片化反応は、約１００塩基対、１５０塩基対、２００塩基対、２５０塩基対、３００塩基対、３５０塩基対、４００塩基対、４５０塩基対、５００塩基対、５５０塩基対、６００塩基対、６５０塩基対、７００塩基対、７５０塩基対、８００塩基対、８５０塩基対、９００塩基対、９５０塩基対、１０００塩基対、またはそれよりも大きいサイズの断片をもたらしてもよい。
【０１１５】
１つまたは複数の核酸分子の断片化は、一定時間、試料中の１つまたは複数の核酸分子の機械的剪断を含んでいてもよい。断片化反応は、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００秒、またはそれよりも長く起こってもよい。
【０１１６】
１つまたは複数の核酸分子の断片化は、核酸試料を１つまたは複数のビーズと接触させることを含んでいてもよい。１つまたは複数の核酸分子の断片化は、核酸試料を複数のビーズと接触させることを含んでいてもよく、複数のビーズの体積の核酸試料の体積に対する比は、約０．１０、０．２０、０．３０、０．４０、０．５０、０．６０、０．７０、０．８０、０．９０、１．００、１．１０、１．２０、１．３０、１．４０、１．５０、１．６０、１．７０、１．８０、１．９０、２．００であるか、またはそれよりも大きい。１つまたは複数の核酸分子の断片化は、核酸試料を複数のビーズと接触させることを含んでいてもよく、複数のビーズの体積の核酸の体積に対する比は、約２．００、１．９０、１．８０、１．７０、１．６０、１．５０、１．４０、１．３０、１．２０、１．１０、１．００、０．９０、０．８０、０．７０、０．６０、０．５０、０．４０、０．３０、０．２０、０．１０、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１であるか、またはそれよりも小さい。
【０１１７】
本明細書に開示される方法は、試料中の１つまたは複数の核酸分子における１つまたは複数の検出反応を実施することを含んでいてもよい。検出反応は、１つまたは複数の配列決定反応を含んでいてもよい。あるいは、検出反応の実施は、光学的センシング、電気的センシング、またはそれらの組合せを含む。光学的センシングは、光ルミネセンス光子放出、蛍光光子放出、ピロホスフェート光子放出、化学ルミネセンス光子放出、またはそれらの組合せの光学的センシングを含んでいてもよい。電気的センシングは、イオン濃度、イオン電流変調、ヌクレオチド電界、ヌクレオチドトンネル電流、またはそれらの組合せの電気的センシングを含んでいてもよい。
【０１１８】
本明細書に開示される方法は、試料中の１つまたは複数の核酸分子における１つまたは複数の定量化反応を実施することを含んでいてもよい。定量化反応は、配列決定、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
【０１１９】
本明細書に開示される方法は、１つまたは複数の試料を含んでいてもよい。本明細書に開示される方法は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、またはそれよりも多くの試料を含んでいてもよい。試料は、対象に由来していてもよい。２つまたはそれよりも多くの試料は、単一の対象に由来していてもよい。２つまたはそれよりも多くの試料は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、またはそれよりも多くの異なる対象に由来していてもよい。対象は、哺乳動物、爬虫類、両生類、鳥類および魚類であり得る。哺乳動物は、ヒト、類人猿、オランウータン、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、ウマ、げっ歯類、イヌ、ネコ、または他の動物であり得る。爬虫類は、トカゲ、ヘビ、アリゲータ、カメ（ｔｕｒｔｌｅ）、クロコダイル、およびカメ（ｔｏｒｔｏｉｓｅ）であり得る。両生類は、ヒキガエル、カエル、イモリ、およびサンショウウオであり得る。鳥類の例としては、限定されるものではないが、アヒル、ガチョウ、ペンギン、ダチョウ、およびフクロウが挙げられる。魚類の例としては、限定されるものではないが、ナマズ、ウナギ、サメ、およびメカジキが挙げられる。対象はヒトであり得る。対象は、疾患または状態を患っていてもよい。
【０１２０】
２つまたはそれよりも多くの試料は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれより多くの時点にわたって採取してもよい。時点は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０またはそれよりも多くの時間の期間にわたって存在してもよい。時点は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０またはそれよりも多くの日の期間にわたって存在してもよい。時点は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０またはそれよりも多くの週の期間にわたって存在してもよい。時点は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０またはそれよりも多くの月の期間にわたって存在してもよい。時点は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０またはそれよりも多くの年の期間にわたって存在してもよい。
【０１２１】
一部の場合では、方法は、対象から生体試料を得ることを含むことができる。対象は、ヒトまたは非ヒトであり得る。対象は、成人または小児であり得る。一部の場合では、成人対象は、１８歳、または１８歳を超え得る。一部の場合では、対象の生体試料は、腫瘍生検、全血、または血漿に由来し得る。一部の場合では、生体試料は、体液、細胞、皮膚、組織、器官、またはそれらの組合せ由来であり得る。試料は、血液、血漿、血液画分、唾液、痰、尿、精液、腟液、脳脊髄液、糞便、細胞、または組織生検であり得る。試料は、副腎、虫垂、膀胱、脳、耳、食道、眼、胆嚢、心臓、腎臓、大腸、肝臓、肺、口、筋肉、鼻、膵臓、副甲状腺、松果体、下垂体、皮膚、小腸、脾臓、胃、胸腺、甲状腺、気管、子宮、虫垂、角膜、皮膚、心臓弁、動脈、または静脈由来であり得る。
【０１２２】
試料は、１つまたは複数の核酸分子を含んでいてもよい。核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。ＤＮＡ分子の例としては、限定されるものではないが、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡヘアピン、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが挙げられる。核酸は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ＲＮＡヘアピン、およびｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子であり得る。ｎｃＲＮＡの例としては、限定されるものではないが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｉＲＮＡ、ＰＡＳＲ、ＴＡＳＲ、ａＴＡＳＲ、ＴＳＳａ−ＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＲＥ−ＲＮＡ、ｕａＲＮＡ、ｘ−ｎｃＲＮＡ、ｈＹ  ＲＮＡ、ｕｓＲＮＡ、ｓｎａＲ、およびｖｔＲＮＡが挙げられる。
【０１２３】
本明細書に開示される方法は、１つまたは複数の容器を含んでいてもよい。本明細書に開示される方法は、１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、２０もしくはそれよりも多く、３０もしくはそれよりも多く、４０もしくはそれよりも多く、５０もしくはそれよりも多く、６０もしくはそれよりも多く、７０もしくはそれよりも多く、８０もしくはそれよりも多く、９０もしくはそれよりも多く、１００もしくはそれよりも多く、１２５もしくはそれよりも多く、１５０もしくはそれよりも多く、１７５もしくはそれよりも多く、２００もしくはそれよりも多く、２５０もしくはそれよりも多く、３００もしくはそれよりも多く、３５０もしくはそれよりも多く、４００もしくはそれよりも多く、５００もしくはそれよりも多く、６００もしくはそれよりも多く、７００もしくはそれよりも多く、８００もしくはそれよりも多く、９００もしくはそれよりも多く、または１０００もしくはそれよりも多くの容器を含んでいてもよい。１つまたは複数の容器は、異なっていてもよく、類似であってもよく、同一であってもよく、またはそれらの組合せであってもよい。容器の例としては、限定されるものではないが、プレート、マイクロプレート、ＰＣＲプレート、ウェル、マイクロウェル、チューブ、エッペンドルフチューブ、バイアル、アレイ、マイクロアレイ、およびチップが挙げられる。
【０１２４】
本明細書に開示される方法は、１つまたは複数の試薬を含んでいてもよい。本明細書に開示される方法は、１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、２０もしくはそれよりも多く、３０もしくはそれよりも多く、４０もしくはそれよりも多く、５０もしくはそれよりも多く、６０もしくはそれよりも多く、７０もしくはそれよりも多く、８０もしくはそれよりも多く、９０もしくはそれよりも多く、１００もしくはそれよりも多く、１２５もしくはそれよりも多く、１５０もしくはそれよりも多く、１７５もしくはそれよりも多く、２００もしくはそれよりも多く、２５０もしくはそれよりも多く、３００もしくはそれよりも多く、３５０もしくはそれよりも多く、４００もしくはそれよりも多く、５００もしくはそれよりも多く、６００もしくはそれよりも多く、７００もしくはそれよりも多く、８００もしくはそれよりも多く、９００もしくはそれよりも多く、または１０００もしくはそれよりも多くの試薬を含んでいてもよい。１つまたは複数の試薬は、異なっていてもよく、類似であってもよく、同一であってもよく、またはそれらの組合せであってもよい。試薬は、１つまたは複数のアッセイの効率を改善してもよい。試薬は、核酸分子、またはその変異体もしくは誘導体の安定性を改善してもよい。試薬としては、限定されるものではないが、酵素、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、分子、ポリメラーゼ、逆転写酵素、リガーゼ、および化学化合物が挙げられ得る。本明細書に開示される方法は、１つまたは複数の抗酸化剤を含むアッセイを実施することを含んでいてもよい。一般に、抗酸化剤は、別の分子の酸化を阻害する分子である。抗酸化剤の例としては、限定されるものではないが、アスコルビン酸（例えば、ビタミンＣ）、グルタチオン、リポ酸、尿酸、カロテン、α−トコフェロール（例えば、ビタミンＥ）、ユビキノール（例えば、コエンザイムＱ）、およびビタミンＡが挙げられる。
【０１２５】
本明細書に開示される方法は、１つまたは複数の緩衝液または溶液を含んでいてもよい。本明細書に開示される方法は、１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、２０もしくはそれよりも多く、３０もしくはそれよりも多く、４０もしくはそれよりも多く、５０もしくはそれよりも多く、６０もしくはそれよりも多く、７０もしくはそれよりも多く、８０もしくはそれよりも多く、９０もしくはそれよりも多く、１００もしくはそれよりも多く、１２５もしくはそれよりも多く、１５０もしくはそれよりも多く、１７５もしくはそれよりも多く、２００もしくはそれよりも多く、２５０もしくはそれよりも多く、３００もしくはそれよりも多く、３５０もしくはそれよりも多く、４００もしくはそれよりも多く、５００もしくはそれよりも多く、６００もしくはそれよりも多く、７００もしくはそれよりも多く、８００もしくはそれよりも多く、９００もしくはそれよりも多く、または１０００もしくはそれよりも多くの緩衝液または溶液を含んでいてもよい。１つまたは複数の緩衝液または溶液は、異なっていてもよく、類似であってもよく、同一であってもよく、またはそれらの組合せであってもよい。緩衝液または溶液は、１つまたは複数のアッセイの効率を改善してもよい。緩衝液または溶液は、核酸分子、またはその変異体もしくは誘導体の安定性を改善してもよい。緩衝液または溶液としては、限定されるものではないが、洗浄緩衝液、溶出緩衝液、およびハイブリダイゼーション緩衝液が挙げられ得る。
【０１２６】
本明細書に開示される方法は、１つもしくは複数のビーズ、複数のビーズ、または１つもしくはビーズセットを含んでいてもよい。本明細書に開示される方法は、１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、２０もしくはそれよりも多く、３０もしくはそれよりも多く、４０もしくはそれよりも多く、５０もしくはそれよりも多く、６０もしくはそれよりも多く、７０もしくはそれよりも多く、８０もしくはそれよりも多く、９０もしくはそれよりも多く、１００もしくはそれよりも多く、１２５もしくはそれよりも多く、１５０もしくはそれよりも多く、１７５もしくはそれよりも多く、２００もしくはそれよりも多く、２５０もしくはそれよりも多く、３００もしくはそれよりも多く、３５０もしくはそれよりも多く、４００もしくはそれよりも多く、５００もしくはそれよりも多く、６００もしくはそれよりも多く、７００もしくはそれよりも多く、８００もしくはそれよりも多く、９００もしくはそれよりも多く、または１０００もしくはそれよりも多くのビーズまたはビーズセットを含んでいてもよい。１つまたは複数のビーズまたはビーズセットは、異なっていてもよく、類似であってもよく、同一であってもよく、またはそれらの組合せであってもよい。ビーズは、磁気、抗体コーティング、プロテインＡ架橋、プロテインＧ架橋、ストレプトアビジンコーティング、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、シリカコーティング、またはそれらの組合せであってもよい。ビーズの例としては、限定されるものではないが、Ａｍｐｕｒｅビーズ、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ、抗体コンジュゲートビーズ（例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ）、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ−ｄＴコンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、およびＢｃＭａｇ（商標）カルボキシ終端磁気ビーズが挙げられる。本開示の一部の態様では、１つまたは複数のビーズは、１つまたは複数のＡｍｐｕｒｅビーズを含む。代わりに、または加えて、１つまたは複数のビーズは、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを含む。
【０１２７】
本明細書に開示される方法は、１つもしくは複数のプライマー、複数のプライマー、または１つもしくは複数のプライマーセットを含んでいてもよい。プライマーは、１つまたは複数のリンカーをさらに含んでいてもよい。プライマーは、１つまたは複数の標識をさらに含んでいてもよい。プライマーは、１つまたは複数のアッセイにおいて使用されてもよい。例えば、プライマーは、１つもしくは複数の配列決定反応、増幅反応、またはそれらの組合せにおいて使用される。本明細書に開示される方法は、１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、２０もしくはそれよりも多く、３０もしくはそれよりも多く、４０もしくはそれよりも多く、５０もしくはそれよりも多く、６０もしくはそれよりも多く、７０もしくはそれよりも多く、８０もしくはそれよりも多く、９０もしくはそれよりも多く、１００もしくはそれよりも多く、１２５もしくはそれよりも多く、１５０もしくはそれよりも多く、１７５もしくはそれよりも多く、２００もしくはそれよりも多く、２５０もしくはそれよりも多く、３００もしくはそれよりも多く、３５０もしくはそれよりも多く、４００もしくはそれよりも多く、５００もしくはそれよりも多く、６００もしくはそれよりも多く、７００もしくはそれよりも多く、８００もしくはそれよりも多く、９００もしくはそれよりも多く、または１０００もしくはそれよりも多くのプライマーまたはプライマーセットを含んでいてもよい。プライマーは、約１００のヌクレオチドを含んでいてもよい。プライマーは、約１０〜約５００の間のヌクレオチド、約２０〜約４５０の間のヌクレオチド、約３０〜約４００の間のヌクレオチド、約４０〜約３５０の間のヌクレオチド、約５０〜約３００の間のヌクレオチド、約６０〜約２５０の間のヌクレオチド、約７０〜約２００の間のヌクレオチド、または約８０〜約１５０の間のヌクレオチドを含んでいてもよい。本開示の一部の態様では、プライマーは、約８０のヌクレオチド〜約１００のヌクレオチドの間を含む。１つまたは複数のプライマーまたはプライマーセットは、異なっていてもよく、類似であってもよく、同一であってもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
【０１２８】
プライマーは、試料中の１つもしくは複数の核酸分子またはそれらの変異体もしくは誘導体、あるいは核酸分子のサブセットの少なくとも一部とハイブリダイズしてもよい。プライマーは、１つまたは複数のゲノムとハイブリダイズしてもよい。プライマーは、異なるか、類似するか、および／または同一のゲノムとハイブリダイズしてもよい。１つまたは複数のプライマーは、１つもしくは複数の核酸分子またはそれらの変異体もしくは誘導体に対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれよりも高い相補性であってもよい。
【０１２９】
プライマーは、１つまたは複数のヌクレオチドを含んでいてもよい。プライマーは、１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、２０もしくはそれよりも多く、３０もしくはそれよりも多く、４０もしくはそれよりも多く、５０もしくはそれよりも多く、６０もしくはそれよりも多く、７０もしくはそれよりも多く、８０もしくはそれよりも多く、９０もしくはそれよりも多く、１００もしくはそれよりも多く、１２５もしくはそれよりも多く、１５０もしくはそれよりも多く、１７５もしくはそれよりも多く、２００もしくはそれよりも多く、２５０もしくはそれよりも多く、３００もしくはそれよりも多く、３５０もしくはそれよりも多く、４００もしくはそれよりも多く、５００もしくはそれよりも多く、６００もしくはそれよりも多く、７００もしくはそれよりも多く、８００もしくはそれよりも多く、９００もしくはそれよりも多く、または１０００もしくはそれよりも多くのヌクレオチドを含んでいてもよい。プライマーは、約１００のヌクレオチドを含んでいてもよい。プライマーは、約１０〜約５００の間のヌクレオチド、約２０〜約４５０の間のヌクレオチド、約３０〜約４００の間のヌクレオチド、約４０〜約３５０の間のヌクレオチド、約５０〜約３００の間のヌクレオチド、約６０〜約２５０の間のヌクレオチド、約７０〜約２００の間のヌクレオチド、または約８０〜約１５０の間のヌクレオチドを含んでいてもよい。本開示の一部の態様では、プライマーは、約８０のヌクレオチド〜約１００のヌクレオチドの間を含む。
【０１３０】
複数のプライマーまたはプライマーセットは、同一、類似、および／または異なる配列、リンカーおよび／または標識を有する２つまたはそれよりも多くのプライマーを含んでいてもよい。例えば、２つまたはそれよりも多くのプライマーは、同一の配列を含む。別の例では、２つまたはそれよりも多くのプライマーは、類似の配列を含む。さらに別の例では、２つまたはそれよりも多くのプライマーは、異なる配列を含む。２つまたはそれよりも多くのプライマーは、１つまたは複数のリンカーをさらに含んでいてもよい。２つまたはそれよりも多くのプライマーは、異なるリンカーをさらに含んでいてもよい。２つまたはそれよりも多くのプライマーは、類似のリンカーをさらに含んでいてもよい。２つまたはそれよりも多くのプライマーは、同一のリンカーをさらに含んでいてもよい。２つまたはそれよりも多くのプライマーは、１つまたは複数の標識をさらに含んでいてもよい。２つまたはそれよりも多くのプライマーは、異なる標識をさらに含んでいてもよい。２つまたはそれよりも多くのプライマーは、類似の標識をさらに含んでいてもよい。２つまたはそれよりも多くのプライマーは、同一の標識をさらに含んでいてもよい。
【０１３１】
一部の場合では、汎用プライマーを利用することができ、８Ｆプライマー、２７Ｆプライマー、ＣＣ［Ｆ］プライマー、３５７Ｆプライマー、５１５Ｆプライマー、５３３Ｆプライマー、１６Ｓ．１１００．Ｆ１６プライマー、１２３７Ｆプライマー、５１９Ｒプライマー、ＣＤ［Ｒ］プライマー、９０７Ｒプライマー、１３９１Ｒプライマー、１４９２Ｒ（Ｉ）プライマー、１４９２Ｒ（ｓ）プライマー、Ｕ１４９２Ｒプライマー、９２８Ｆプライマー、３３６Ｒプライマー、１１００Ｆプライマー、１１００Ｒプライマー、３３７Ｆプライマー、７８５Ｆプライマー、８０５Ｒプライマー、５１８Ｒプライマー、および任意の他の適切な汎用プライマーの１つまたは複数を含むことができる。あるいは、特異的なプライマーが適切であり得る試料のためには、増幅は、特異的プライマーを用いて行うことができる。例では、特異的プライマーとしては、ＣＹＡ１０６プライマー（シアノバクテリアのため）、ＣＹＡ３５９Ｆプライマー（シアノバクテリアのため）、８９５Ｆプライマー（プラスチドおよびシアノバクテリアを除く細菌のため）、ＣＹＡ７８１Ｒプライマー（シアノバクテリアのため）、９０２Ｒプライマー（プラスチドおよびシアノバクテリアを除く細菌のため）、９０４Ｒプライマー（プラスチドおよびシアノバクテリアを除く細菌のため）、１１００Ｒプライマー（細菌のため）、１１８５ｍＲプライマー（プラスチドおよびシアノバクテリアを除く細菌のため）、１１８５ａＲプライマー（苔癬関連Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓのため）、１３８１Ｒプライマー（Ａｓｔｅｒｏｃｈｌｏｒｉｓ種プラスチドを除く細菌のため）、または任意の他の適切な特異的プライマーが挙げられ得る。
【０１３２】
捕捉用プローブ、プライマー、標識、および／またはビーズは、１つまたは複数のヌクレオチドを含んでいてもよい。１つまたは複数のヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡ残基の混合物、または２’−ＯＭｅもしくは２’−フルオロ（２’−Ｆ）などのそれらの修飾アナログ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、あるいは非塩基部位を含んでいてもよい。
【０１３３】
本明細書に開示される方法は、１つまたは複数の標識を含んでいてもよい。本明細書に開示される方法は、１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、２０もしくはそれよりも多く、３０もしくはそれよりも多く、４０もしくはそれよりも多く、５０もしくはそれよりも多く、６０もしくはそれよりも多く、７０もしくはそれよりも多く、８０もしくはそれよりも多く、９０もしくはそれよりも多く、１００もしくはそれよりも多く、１２５もしくはそれよりも多く、１５０もしくはそれよりも多く、１７５もしくはそれよりも多く、２００もしくはそれよりも多く、２５０もしくはそれよりも多く、３００もしくはそれよりも多く、３５０もしくはそれよりも多く、４００もしくはそれよりも多く、５００もしくはそれよりも多く、６００もしくはそれよりも多く、７００もしくはそれよりも多く、８００もしくはそれよりも多く、９００もしくはそれよりも多く、または１０００もしくはそれよりも多くの標識を含んでいてもよい。１つまたは複数の標識は、異なっていてもよく、類似であってもよく、同一であってもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
【０１３４】
標識の例としては、限定されるものではないが、化学標識、生化学標識、生物学標識、発色標識、酵素標識、蛍光標識、およびルミネセンス標識が挙げられる。標識は、色素、光架橋剤、細胞傷害性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、抗体もしくは抗体断片、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的もしくは非共有結合的に相互作用する基、光ケージ化部分、アクチン放射線励起部分、リガンド、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチンアナログ、重原子組込み部分、化学切断可能基、光切断可能基、酸化還元活性剤、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、高電子密度基、磁気基、挿入基、発色団、エネルギー移動剤、生物活性剤、検出可能な標識、またはそれらの組合せを含む。
【０１３５】
標識は、化学標識であり得る。化学標識の例としては、限定されるものではないが、ビオチンおよび放射性同位元素（例えば、ヨウ素、炭素、リン、水素）を挙げることができる。
【０１３６】
本明細書に開示される方法、キットおよび組成物は、生物学標識を含んでいてもよい。生物学標識は、限定されるものではないが、生体直交型アジド修飾アミノ酸、糖、および他の化合物を含む代謝標識を含んでいてもよい。
【０１３７】
本明細書に開示される方法、キットおよび組成物は、酵素標識を含んでいてもよい。酵素標識としては、限定されるものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼを挙げることができる。酵素標識はルシフェラーゼであってもよい。
【０１３８】
本明細書に開示される方法、キットおよび組成物は、蛍光標識を含んでいてもよい。蛍光標識は、有機色素（例えば、ＦＩＴＣ）、生物学的フルオロフォア（例えば、緑色蛍光タンパク質）、または量子ドットであり得る。蛍光標識の非限定的リストとしては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒｓ、フルオレセイン、ローダミン（テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ＴＲＩＴＣ）、クマリン、Ｌｕｃｉｆｅｒ  ＹｅｌｌｏｗおよびＢＯＤＩＰＹが挙げられる。標識はフルオロフォアであり得る。フルオロフォアの例としては、限定されるものではないが、インドカルボシアニン（Ｃ３）、インドジカルボシアニン（Ｃ５）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、テキサスレッド、パシフィックブルー、オレゴングリーン４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）−３５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、ＪＯＥ、リサミン、ローダミングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、フィコエリトリン、ローダミン、ジクロロローダミン（ｄローダミン）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ（商標））、ＬＩＺ（商標）、ＶＩＣ（商標）、ＮＥＤ（商標）、ＰＥＴ（商標）、ＳＹＢＲ、ピコグリーン、リボグリーンなどが挙げられる。蛍光標識は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質、フィコビリンタンパク質（例えば、アロフィコシアニン、フィコシアニン、フィコエリトリン、およびフィコエリトロシアニン）であり得る。
【０１３９】
本明細書に開示される方法は、１つまたは複数のリンカーを含んでいてもよい。本明細書に開示される方法は、１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、２０もしくはそれよりも多く、３０もしくはそれよりも多く、４０もしくはそれよりも多く、５０もしくはそれよりも多く、６０もしくはそれよりも多く、７０もしくはそれよりも多く、８０もしくはそれよりも多く、９０もしくはそれよりも多く、１００もしくはそれよりも多く、１２５もしくはそれよりも多く、１５０もしくはそれよりも多く、１７５もしくはそれよりも多く、２００もしくはそれよりも多く、２５０もしくはそれよりも多く、３００もしくはそれよりも多く、３５０もしくはそれよりも多く、４００もしくはそれよりも多く、５００もしくはそれよりも多く、６００もしくはそれよりも多く、７００もしくはそれよりも多く、８００もしくはそれよりも多く、９００もしくはそれよりも多く、または１０００もしくはそれよりも多くのリンカーを含んでいてもよい。１つまたは複数のリンカーは、異なっていてもよく、類似であってもよく、同一であってもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
【０１４０】
適切なリンカーは、本明細書に開示される標識、プライマーおよび／もしくは捕捉用プローブに付着する能力を有する、任意の化学化合物または生体化合物を含む。リンカーが標識およびプライマーまたは捕捉用プローブの両方に付着する場合、その結果、適切なリンカーは、標識およびプライマーまたは捕捉用プローブを十分に分離する能力を有していてもよい。適切なリンカーは、核酸分子、その部分、またはそれらの変異体もしくは誘導体とハイブリダイズするプライマーおよび／または捕捉用プローブの能力を顕著に妨げない場合がある。適切なリンカーは、検出される標識の能力を顕著に妨げない場合がある。リンカーは剛性であり得る。リンカーは柔軟性であり得る。リンカーは半剛性であり得る。リンカーは、タンパク分解に安定（例えば、タンパク質切断に対して耐性）であり得る。リンカーは、タンパク分解に不安定（例えば、タンパク質切断に対して感受性）であり得る。リンカーはらせん状であり得る。リンカーは非らせん状であり得る。リンカーはコイル状であり得る。リンカーはβ−ストランドであり得る。リンカーはターン配座を含んでいてもよい。リンカーは一本鎖であり得る。リンカーは長鎖であり得る。リンカーは短鎖であり得る。リンカーは、少なくとも約５残基、少なくとも約１０残基、少なくとも約１５残基、少なくとも約２０残基、少なくとも約２５残基、少なくとも約３０残基、もしくは少なくとも約４０残基、またはそれよりも多くを含んでいてもよい。
【０１４１】
リンカーの例としては、限定されるものではないが、ヒドラゾン、ジスルフィド、チオエーテル、およびペプチドリンカーが挙げられる。リンカーはペプチドリンカーであり得る。ペプチドリンカーはプロリン残基を含んでいてもよい。ペプチドリンカーは、アルギニン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、グルタミン酸塩、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。リンカーはヘテロ二官能性架橋剤であり得る。
【０１４２】
本明細書に開示される方法は、１または複数の核酸分子を含む試料において、１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、１１もしくはそれよりも多く、１２もしくはそれよりも多く、１３もしくはそれよりも多く、１４もしくはそれよりも多く、１５もしくはそれよりも多く、２０もしくはそれよりも多く、２５もしくはそれよりも多く、３０もしくはそれよりも多く、３５もしくはそれよりも多く、４０もしくはそれよりも多く、４５もしくはそれよりも多く、または５０もしくはそれよりも多くのアッセイを実施することを含んでいてもよい。２つまたはそれよりも多くのアッセイは、異なっていてもよく、類似であってもよく、同一であってもよく、またはそれらの組合せであってもよい。例えば、本明細書に開示される方法は、２つまたはそれよりも多くの配列決定反応を実施することを含む。別の例では、本明細書に開示される方法は、２つまたはそれよりも多くのアッセイを実施することを含み、２つまたはそれよりも多くのアッセイの少なくとも１つは、配列決定反応を含む。さらに別の例では、本明細書に開示される方法は、２つまたはそれよりも多くのアッセイを実施することを含み、２つまたはそれよりも多くのアッセイの少なくとも２つは、配列決定反応およびハイブリダイゼーション反応を含む。２つまたはそれよりも多くのアッセイは、連続して、同時に、またはそれらの組合せで行ってもよい。例えば、２つまたはそれよりも多くの配列決定反応は、同時に行ってもよい。別の例では、本明細書に開示される方法は、ハイブリダイゼーション反応、続いて配列決定反応を実施することを含む。さらに別の例では、本明細書に開示される方法は、同時に２つまたはそれよりも多くのハイブリダイゼーション反応を実施すること、続いて同時に２つまたはそれよりも多くの配列決定反応を実施することを含む。２つまたはそれよりも多くのアッセイは、１つまたは複数のデバイスによって行ってもよい。例えば、２つまたはそれよりも多くの増幅反応は、ＰＣＲ機によって行ってもよい。別の例では、２つまたはそれよりも多くの配列決定反応は、２つまたはそれよりも多くのシーケンサーによって行ってもよい。
【０１４３】
本明細書に開示される方法は、１つまたは複数のデバイスを含んでいてもよい。本明細書に開示される方法は、１つまたは複数のデバイスを含む１つまたは複数のアッセイを含んでいてもよい。本明細書に開示される方法は、１つまたは複数の操作またはアッセイを行う１つまたは複数のデバイスの使用を含んでいてもよい。本明細書に開示される方法は、１つまたは複数の操作またはアッセイにおける１つまたは複数のデバイスの使用を含んでいてもよい。例えば、配列決定反応の実施は、１つまたは複数のシーケンサーを含んでいてもよい。別の例では、核酸分子のサブセットの生成は、１つまたは複数の磁気分離器の使用を含んでいてもよい。さらに別の例では、１つまたは複数のプロセッサーは、１つまたは複数の核酸試料の分析において使用してもよい。デバイスの例としては、限定されるものではないが、シーケンサー、サーモサイクラー、リアルタイムＰＣＲ装置、磁気分離器、伝送デバイス、ハイブリダイゼーションチャンバー、電気泳動機器、遠心分離機、顕微鏡、撮像装置、蛍光光度計、発光光度計、プレートリーダー、コンピュータ、プロセッサー、およびバイオアナライザーが挙げられる。
【０１４４】
本明細書に開示される方法は、１つまたは複数のシーケンサーを含んでいてもよい。１つまたは複数のシーケンサーは、１つもしくは複数のＨｉＳｅｑ、ＭｉＳｅｑ、ＨｉＳｃａｎ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘ、ＳＯＬｉＤ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ、４５４  ＧＳジュニア、Ｐａｃ  Ｂｉｏ  ＲＳ、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。１つまたは複数のシーケンサーは、１つまたは複数の配列決定プラットフォームを含んでいてもよい。１つまたは複数の配列決定プラットフォームは、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＲｏｃｈｅによるＧＳ  ＦＬＸ、Ｓｏｌｅｘａ／ＩｌｌｕｍｉｎａによるＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるＳＯＬｉＤ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＧｅｎｏｍｉｃｓによるＣＧＡ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ、Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによるＰａｃＢｉｏ  ＲＳ、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
【０１４５】
本明細書に開示される方法は、１つまたは複数のサーモサイクラーを含んでいてもよい。１つまたは複数のサーモサイクラーは、１つまたは複数の核酸分子を増幅するために使用されてもよい。本明細書に開示される方法は、１つまたは複数のリアルタイムＰＣＲ装置を含んでいてもよい。１つまたは複数のリアルタイムＰＣＲ装置は、サーマルサイクラーおよび蛍光光度計を含んでいてもよい。１つまたは複数のサーモサイクラーは、１つまたは複数の核酸分子を増幅および検出するために使用されてもよい。
【０１４６】
本明細書に開示される方法は、１つまたは複数の磁気分離器を含んでいてもよい。１つまたは複数の磁気分離器は、懸濁液からの常磁性および強磁性粒子の分離のために使用されてもよい。１つまたは複数の磁気分離器は、１つもしくは複数のＬｉｆｅＳｔｅｐ（商標）ｂｉｏｍａｇｎｅｔｉｃ分離器、ＳＰＨＥＲＯ（商標）ＦｌｅｘｉＭａｇ分離器、ＳＰＨＥＲＯ（商標）ＭｉｃｒｏＭａｇ分離器、ＳＰＨＥＲＯ（商標）ＨａｎｄｉＭａｇ分離器、ＳＰＨＥＲＯ（商標）ＭｉｎｉＴｕｂｅ  Ｍａｇ分離器、ＳＰＨＥＲＯ（商標）ＵｌｔｒａＭａｇ分離器、ＤｙｎａＭａｇ（商標）マグネット、ＤｙｎａＭａｇ（商標）−２マグネット、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
【０１４７】
本明細書に開示される方法は、１つまたは複数のバイオアナライザーを含んでいてもよい。一部の場合では、バイオアナライザーは、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質を分析することができるチップに基づくキャピラリー電気泳動機である。１つまたは複数のバイオアナライザーは、Ａｇｉｌｅｎｔ’ｓ  ２１００バイオアナライザーを含んでいてもよい。
【０１４８】
本明細書に開示される方法は、１つまたは複数のプロセッサーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプロセッサーは、１つもしくは複数のアッセイからの１つもしくは複数のデータおよび／もしくは結果、１つもしくは複数のアッセイに基づくか、もしくはそれらに由来する１つもしくは複数のデータおよび／もしくは結果、１つもしくは複数のアッセイからの１つもしくは複数の出力、１つもしくは複数のアッセイに基づくか、もしくはそれらに由来する１つもしくは複数の出力、１つもしくは複数のデータおよび／もしくは結果からの１つもしくは複数の出力、１つもしくは複数のデータおよび／もしくは結果に基づくか、もしくはそれらに由来する１つもしくは複数の出力、またはそれらの組合せを、分析し、コンパイルし、保存し、ソートし、組み合わせ、評価し、またはそうでなければ処理してもよい。一部の場合では、本明細書に開示される方法は、図１７に示されるような、分析のためのデータを組み合わせることを含むことができる。１つまたは複数のプロセッサーは、１つもしくは複数のアッセイからの１つもしくは複数のデータ、結果もしくは出力、１つもしくは複数のアッセイに基づくか、もしくはそれらに由来する１つもしくは複数のデータ、結果もしくは出力、１つもしくは複数のデータもしくは結果からの１つもしくは複数の出力、１つもしくは複数のデータもしくは結果に基づくか、もしくはそれらに由来する１つもしくは複数の出力、またはそれらの組合せを、伝送してもよい。１つまたは複数のプロセッサーは、ユーザーから要求を受信および／または保存してもよい。１つまたは複数のプロセッサーは、１つまたは複数のデータ、結果、出力を生成または生成してもよい。１つまたは複数のプロセッサーは、１つまたは複数の生物医学レポートを生成または生成してもよい。１つまたは複数のプロセッサーは、１つまたは複数の生物医学レポートを伝送してもよい。１つまたは複数のプロセッサーは、１つもしくは複数のデータベース、１つもしくは複数のデータもしくは結果、１つもしくは複数の出力、またはそれらの組合せからの情報を、分析し、コンパイルし、保存し、ソートし、組み合わせ、評価し、またはそうでなければ処理してもよい。１つもしくは複数のプロセッサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、またはそれよりも多くのデータベースからの情報を、分析し、コンパイルし、保存し、ソートし、組み合わせ、評価し、またはそうでなければ処理してもよい。１つまたは複数のプロセッサーは、１つまたは複数の要求、データ、結果、出力および／または情報を、１つもしくは複数のユーザー、プロセッサー、コンピュータ、コンピュータシステム、メモリロケーション、デバイス、データベース、またはそれらの組合せに伝送してもよい。１つまたは複数のプロセッサーは、１つまたは複数の要求、データ、結果、出力および／または情報を、１つもしくは複数のユーザー、プロセッサー、コンピュータ、コンピュータシステム、メモリロケーション、デバイス、データベース、またはそれらの組合せから受信してもよい。１つまたは複数のプロセッサーは、１つまたは複数の要求、データ、結果、出力および／または情報を、１つもしくは複数のユーザー、プロセッサー、コンピュータ、コンピュータシステム、メモリロケーション、デバイス、データベース、またはそれらの組合せから取り込んでもよい。本開示は、複数の生物医学適用のために利用することができる方法も提供する。一部の場合では、変異体、遺伝子、再構築遺伝子、エクソン、ＵＴＲ、調節領域、スプライス部位、代替配列、およびヒトまたは非ヒトのゲノムの目的の他の含量は、複数の生物医学レポートに適用可能な含量の集約セットを生成するために、いくつかのデータベースから組み合わせることができる。この含量は、次いで、ローカルまたはグローバルのゲノム状況、ヌクレオチド含量、配列決定の性能、および解釈の必要に基づいて分類することができ、次いで、その後に、特定のプロトコール、アッセイの進行などについてのサブセットにグループ分けすることができる。一部の場合では、変異体、遺伝子、エクソン、ＵＴＲ、調節領域、スプライス部位、代替配列、および目的の他の含量は、複数の生物医学レポートに適用可能な含量の集約セットを生成するために、いくつかのデータベースから組み合わされる。この含量は、次いで、ローカルもしくはグローバルのゲノム状況、ヌクレオチド含量、配列決定の性能、および解釈の必要に基づいて分類され、次いで、その後に、特定のプロトコールおよびアッセイの進行についてのサブセットにグループ分けされる（図１４）。一部の場合では、プロトコールおよび／またはアッセイは、補充引き抜きを含んでいてもよい。補充引き抜きは、ヒト標的配列、非ヒト標的配列、およびそれらの組合せを含んでいてもよい。補充引き抜きは、対象由来の（例えば、対象の組織に由来する細胞が起源である）核酸分子、および対象由来ではない（例えば、微生物（共生または寄生）、病原体または移植）核酸分子を含んでいてもよい。図１５〜１７は、異なるゲノム領域について濃縮されたＤＮＡの複数のサブセットの１つまたは複数についての補充引き抜きを含むアッセイのワークフローの例を提供する。
【０１４９】
本明細書に開示される方法は、１つまたは複数のメモリロケーションを含んでいてもよい。１つまたは複数のメモリロケーションは、情報、データ、結果、出力、要求、またはそれらの組合せを保存してもよい。１つまたは複数のメモリロケーションは、情報、データ、結果、出力、要求、またはそれらの組合せを、１つもしくは複数のユーザー、プロセッサー、コンピュータ、コンピュータシステム、デバイス、またはそれらの組合せから受信してもよい。
【０１５０】
本明細書に記載の方法は、１つまたは複数のコンピュータおよび／またはコンピュータシステムの補助により実行することができる。コンピュータまたはコンピュータシステムは、本開示において提供される方法を実行するための機械実行可能コードを有する電子保存場所（例えば、データベース、メモリ）、および機械実行可能コードを実行するための１つまたは複数のプロセッサーを含んでいてもよい。
【０１５１】
本明細書に開示される方法は、１つまたは複数の生物医学出力に基づいて、対象における疾患または状態を処置および／または予防することを含んでいてもよい。１つまたは複数の生物医学出力は、１つまたは複数の治療を推奨してもよい。１つまたは複数の生物医学出力は、疾患または状態の処置の経過および／または予防を、提案し、選択し、指示し、推奨し、またはそうでなければ決定してもよい。１つまたは複数の生物医学出力は、１つまたは複数の治療の修飾または継続を推奨してもよい。１つまたは複数の治療の修飾は、１つまたは複数の治療を、投与すること、開始すること、低減すること、増加させること、および／または終了することを含んでいてもよい。１つまたは複数の治療は、抗がん治療、抗ウイルス治療、抗細菌治療、抗真菌治療、免疫抑制治療、またはそれらの組合せを含む。１つまたは複数の治療は、１つまたは複数の疾患または徴候を、処置、軽減または予防してもよい。
【０１５２】
抗がん治療の例としては、限定されるものではないが、手術、化学療法、放射線療法、免疫療法／生物学的療法、光線力学的療法が挙げられる。抗がん治療は、化学療法剤、モノクローナル抗体（例えば、リツキシマブ、トラスツズマブ）、がんワクチン（例えば、治療ワクチン、予防ワクチン）、遺伝子治療、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
【０１５３】
１つまたは複数の治療は、抗菌剤を含んでいてもよい。一般に、抗菌剤は、細菌、真菌、ウイルスまたは原生動物などの微生物を死滅させるか、またはその成長を阻害する物質を指す。抗菌薬は、微生物を死滅させる（殺菌的）か、または微生物の成長を防ぐ（静菌的）のいずれかである。天然源から得られるもの（例えば、抗生物質、タンパク質合成阻害剤（アミノグリコシド、マクロライド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ポリペプチドなど））、および合成薬剤（例えば、スルホンアミド、コトリモキサゾール、キノロン）の主に２つのクラスの抗菌薬がある。一部の例では、抗菌薬は、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗マラリア剤、抗結核薬、抗ハンセン病剤、または抗原虫剤である。
【０１５４】
抗生物質は、一般に、細菌感染症を処置するために使用される。抗生物質は、殺菌性抗生物質および静菌性抗生物質の２つのカテゴリーに分けられ得る。一般に、殺菌性は、細菌を直接死滅させ得、静菌性は、それらが分裂するのを予防し得る。抗生物質は、生命体に由来していてもよく、またはスルホンアミドなどの合成抗菌剤を含んでいてもよい。抗生物質としては、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、およびパロモマイシンなどのアミノグリコシドが挙げられ得る。あるいは、抗生物質は、アンサマイシン（例えば、ゲルダナマイシン、ハービマイシン）、カバセフェム（例えば、ロラカルベフ）、カルバペネム（例えば、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム、シラスタチン、メロペネム）、グリコペプチド（例えば、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン）、リンコサミド（例えば、クリンダマイシン、リンコマイシン、ダプトマイシン）、マクロライド（例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スペクチノマイシン、スピラマイシン）、ニトロフラン（例えば、フラゾリドン、ニトロフラントイン）、およびポリペプチド（例えば、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ）であり得る。
【０１５５】
一部の例では、抗生物質治療としては、セファロスポリン、例えば、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファレキシン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、セフタロリンフォサミル、およびセフトビプロールが挙げられる。
【０１５６】
抗生物質治療としては、ペニシリンも挙げられ得る。ペニシリンの例としては、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンｇ、ペニシリンｖ、ピペラシリン、テモシリン、およびチカルシリンが挙げられる。
【０１５７】
あるいは、キノリンを、細菌感染症を処置するために使用してもよい。キノリン（quinilones）の例としては、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、およびテマフロキサシンが挙げられる。
【０１５８】
一部の例では、抗生物質治療は、２つまたはそれよりも多くの治療の組合せを含む。例えば、アモキシシリンおよびクラブラン酸塩、アンピシリンおよびスルバクタム、ピペラシリンおよびタゾバクタム、またはチカルシリンおよびクラブラン酸塩を、細菌感染症を処置するために使用してもよい。
【０１５９】
スルホンアミドを、細菌感染症を処置するために使用してもよい。スルホンアミドの例としては、限定されるものではないが、マフェニド、スルホンアミドクリソイジン、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルイミド、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム、およびトリメトプリム−スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ｔｍｐ−ｓｍｘ）が挙げられる。
【０１６０】
テトラサイクリンは、抗生物質の別の例である。テトラサイクリンは、ｍＲＮＡ翻訳複合体中で３０Ｓリボソームサブユニットに結合することによって、アミノアシル−ｔＲＮＡのｍＲＮＡリボソーム複合体への結合を阻害してもよい。テトラサイクリンとしては、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、およびテトラサイクリンが挙げられる。細菌感染症を処置するために使用され得る追加の構成物質としては、アルスフェナミン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、フシジン酸、リネゾリド、メトロニダゾール、ムピロシン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、リファキシミン、チアンフェニコール、チゲサイクリン、チニダゾール、クロファジミン、ダプソン、カプレオマイシン、サイクロセリン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド、ピラジナミド、リファンピシン、リファマイシン、リファブチン、リファペンチン、およびストレプトマイシンが挙げられる。
【０１６１】
抗ウイルス治療は、ウイルス感染症を処置するために特異的に使用される医薬のクラスである。抗生物質のように、特定の抗ウイルス剤が、特定のウイルスのために使用される。それらは、宿主に対して比較的無害であり、したがって、感染症を処置するために使用することができる。抗ウイルス治療は、ウイルスのライフサイクルのさまざまな段階を阻害し得る。例えば、抗ウイルス治療は、ウイルスの細胞受容体への付着を阻害してもよい。そのような抗ウイルス治療としては、ウイルス関連タンパク質（ＶＡＰ）を模倣し、細胞受容体に結合する薬剤が挙げられ得る。他の抗ウイルス治療は、ウイルスの侵入、ウイルスの脱殻（例えば、アマンタジン、リマンタジン、プレコナリル）、ウイルス合成、ウイルス組込み、ウイルス転写、またはウイルス翻訳（例えば、ホミビルセン）を阻害してもよい。一部の例では、抗ウイルス治療はモルホリノアンチセンスである。抗ウイルス治療は、身体の外側でウイルス粒子を積極的に不活性化する殺ウイルス剤と区別されなければならない。
【０１６２】
利用可能な多くの抗ウイルス薬は、レトロウイルス、大抵はＨＩＶによる感染症を処置するために設計される。抗レトロウイルス薬は、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、およびインテグラーゼ阻害剤のクラスを含み得る。ＨＩＶを処置するための薬物としては、プロテアーゼ阻害剤（例えば、インビラーゼ、サキナビル、カレトラ、ロピナビル、レクシヴァ、ホスアンプレナビル、ノービア、リトナビル、プリジスタ、ダルナビル（duranavir）、レイアタッツ、ビラセプト）、インテグラーゼ阻害剤（例えば、ラルテグラビル）、転写酵素阻害剤（例えば、アバカビル、ザイアジェン、アゲネラーゼ、アンプレナビル、アプティバス、チプラナビル、クリキシバン、インジナビル、フォートベイス、サキナビル、Ｉｎｔｅｌｅｎｃｅ（商標）、エトラビリン、アイセントレス、ビリアード）、逆転写酵素阻害剤（例えば、デラビルジン、エファビレンツ、エピビル、ハイビッド、ネビラピン、レトロビル、ＡＺＴ、スタブジン（stuvadine）、ツルバダ、ヴァイデックス）、融合阻害剤（例えば、フゼオン、エンフビルチド）、ケモカイン共受容体アンタゴニスト（例えば、シーエルセントリ、エムトリバ、エムトリシタビン、エプジコム、またはトリジビル）が挙げられ得る。あるいは、抗レトロウイルス治療は、アトリプラ（例えば、エファビレンツ、エムトリシタビン、およびテノホビル（tenofovira）ジソプロキシルフマル酸塩）およびコンプリーター（エムトリシタビン（embricitabine）、リルピビリン、およびテノホビルジソプロキシルフマル酸塩）などの併用療法であり得る。単純ヘルペスおよび陰部ヘルペスを引き起こし得るヘルペスウイルスは、通常、ヌクレオシドアナログのアシクロビルで処置される。ウイルス性肝炎（Ａ〜Ｅ）は、５つの別個の肝臓指向性ウイルスによって引き起こされ、また、一般に、感染症の種類に応じて、抗ウイルス薬で処置される。Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスは、オセルタミビルなどの既存のノイラミニダーゼ阻害剤に対する耐性を克服する新たなインフルエンザ処置の開発のための重要な標的である。
【０１６３】
一部の例では、抗ウイルス治療は、逆転写酵素阻害剤を含んでいてもよい。逆転写酵素阻害剤は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、または非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤であり得る。ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤としては、限定されるものではないが、コンビビル、エムトリバ、エピビル、エプジコム、ハイビッド、レトロビル、トリジビル、ツルバダ、ヴァイデックスｅｃ、ヴァイデックス、ビリアード、ゼリット、およびザイアジェンが挙げられ得る。非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤は、エジュラント、インテレンス、レスクリプター、サスティバ、およびビラミューン（即時放出または持続放出）を含み得る。
【０１６４】
プロテアーゼ阻害剤は、抗ウイルス薬の別の例であり、限定されるものではないが、アゲネラーゼ、アプティバス、クリキシバン、フォートベイス、インビラーゼ、カレトラ、レクシヴァ、ノービア、プリジスタ、レイアタッツ、およびビラセプトが挙げられ得る。あるいは、抗ウイルス治療は、融合阻害剤（例えば、エンフビルチド（enfuviride）、または侵入阻害剤（例えば、マラビロク）を含み得る。
【０１６５】
抗ウイルス薬の追加の例としては、アバカビル、アシクロビル、アデホビル、アマンタジン、アンプレナビル、アンプリジェン、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、ボセプレビル、シドホビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、融合阻害剤、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、インターフェロン（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型インターフェロン）、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、マラビロク、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル、ヌクレオシドアナログ、オセルタミビル、ｐｅｇ−インターフェロンアルファ−２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、プロテアーゼ阻害剤、ラルテグラビル、逆転写酵素阻害剤、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピラミジン、サキナビル、スタブジン、ティーツリー油、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル、およびジドブジンが挙げられる。
【０１６６】
抗真菌薬は、水虫、白癬、カンジダ症（鵞口瘡）、クリプトコッカス髄膜炎などの深刻な全身感染症などの真菌感染症を処置するために使用され得る医薬である。抗真菌剤は、真菌生物を死滅させる哺乳動物および真菌細胞の間の相違を利用することによって働く。細菌とは違って、真菌およびヒトは両方とも真核生物である。したがって、真菌細胞およびヒト細胞は、分子レベルで類似しており、これは、感染した生物中において存在もしない、攻撃する抗真菌薬についての標的を見出すことをより困難にする。
【０１６７】
抗寄生虫剤は、線形動物、条虫、吸虫、感染性原生動物、およびアメーバなどの寄生生物による感染症の処置のために示される医薬のクラスである。抗真菌剤のように、それらは、宿主に対して深刻な損傷なく、感染した有害生物を死滅させなければならない。
【０１６８】
本開示の方法は、システム、キット、ライブラリー、またはそれらの組合せによって実行することができる。本開示の方法は、１つまたは複数のシステムを含んでいてもよい。本開示のシステムは、キット、ライブラリー、またはそれらの両方によって実行することができる。システムは、本方法のいずれか、または本明細書に開示される方法の操作のいずれかを行うための１つまたは複数の構成要素を含んでいてもよい。例えば、システムは、１つもしくは複数のキット、デバイス、ライブラリー、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。システムは、１つもしくは複数のシーケンサー、プロセッサー、メモリロケーション、コンピュータ、コンピュータシステム、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。システムは、伝送デバイスを含んでいてもよい。
【０１６９】
キットは、試料の処理および／または分析操作を含む、本明細書に開示されるさまざまな操作を実行するためのさまざまな試薬を含んでいてもよい。キットは、本明細書に開示される操作の少なくとも一部を実行するための使用説明書を含んでいてもよい。キットは、１つもしくは複数の捕捉用プローブ、１つもしくは複数のビーズ、１つもしくは複数の標識、１つもしくは複数のリンカー、１つもしくは複数のデバイス、１つもしくは複数の試薬、１つもしくは複数の緩衝剤、１つもしくは複数の試料、１つもしくは複数のデータベース、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
【０１７０】
ライブラリーは、１つまたは複数の捕捉用プローブを含んでいてもよい。ライブラリーは、核酸分子の１つまたは複数のサブセットを含んでいてもよい。ライブラリーは、１つまたは複数のデータベースを含んでいてもよい。ライブラリーは、本明細書に開示される方法、キットまたはシステムのいずれかから、生成または生成されてもよい。データベースライブラリーは、１つまたは複数のデータベースから生成されてもよい。１つまたは複数のライブラリーを生成するための方法は、（ａ）集約されたデータセットを生成するための１つまたは複数のデータベースからの情報を集約すること；（ｂ）集約されたデータセットを分析すること；ならびに（ｃ）集約されたデータセットから１つまたは複数のデータベースライブラリーを生成することを含んでいてもよい。図１３は、ライブラリー構築ワークフローの例を提供する。一部の場合では、ライブラリーは、プールされてもよい（図７）。
コンピュータシステム
【０１７１】
本開示は、本開示の方法を実行するようにプログラムされたコンピュータシステムを提供する。図５は、核酸分子の起源（例えば、ヒトまたは非ヒト、宿主または非宿主）を特定するため、１つもしくは複数の特徴（例えば、遺伝的変異体）を特定するため、またはそれらの任意の組合せのために、配列読み取りデータをマッピングおよび／または整列させるように、プログラムされたか、またはそうでなければ構成されたコンピュータシステム５０１を示す。コンピュータシステム５０１は、例えば、生体試料中の核酸配列の起源を特定するために配列読み取りデータを１つまたは複数の参照配列と整列させるなどの、本開示において提供される配列決定情報を処理するさまざまな態様を調節することができる。コンピュータシステム５０１は、ユーザーの電子デバイス、または電子デバイスに関して遠隔設置されたコンピュータシステムであり得る。電子デバイスは、モバイル電子デバイスであり得る。
【０１７２】
コンピュータシステム５０１は、中央演算処理装置（ＣＰＵ、また、本明細書において「プロセッサー」および「コンピュータプロセッサー」）５０５を含み、これは、単一のコアもしくは複数のコアプロセッサー、または並列処理のための複数のプロセッサーであり得る。コンピュータシステム５０１は、メモリまたはメモリロケーション５１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置５１５（例えば、ハードディスク）、１つまたは複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース５２０（例えば、ネットワークアダプター）、ならびにキャッシュ、他のメモリ、データストレージおよび／または電子ディスプレイアダプターなどの周辺デバイス５２５も含む。メモリ５１０、記憶装置５１５、インターフェース５２０、および周辺デバイス５２５は、マザーボードなどのコミュニケーションバス（実線）を通してＣＰＵ５０５と通信する。記憶装置５１５は、データを保存するためのデータ記憶装置（またはデータリポジトリ）であり得る。コンピュータシステム５０１は、通信インターフェース５２０の補助によりコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）５３０と動作可能に連結され得る。ネットワーク５３０は、インターネット、インターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはインターネットで通信するイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであり得る。ネットワーク５３０は、一部の場合では、電気通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク５３０は、１つまたは複数のコンピュータサーバーを含むことができ、これは、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にし得る。一部の場合では、コンピュータシステム５０１の補助を有するネットワーク５３０は、ピアツーピアネットワークを実行することができ、これは、コンピュータシステム５０１に連結したデバイスがクライアントまたはサーバーとして挙動することを可能にし得る。
【０１７３】
ＣＰＵ５０５は、一連の機械可読命令を実行することができ、これは、プログラムまたはソフトウェアで具体化することができる。命令は、メモリ５１０などのメモリロケーションに保存されていてもよい。命令は、ＣＰＵ５０５に向けることができ、これは、その後、本開示の方法を実行するためにＣＰＵ５０５をプログラムするか、またはそうでなければ構成することができる。ＣＰＵ５０５によって行われる操作の例としては、フェッチ、デコード、実行、およびライトバックが挙げられ得る。
【０１７４】
ＣＰＵ５０５は、集積回路などの回路の部分であり得る。システム５０１の１つまたは複数の他の構成要素は、回路に含まれ得る。一部の場合では、回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
【０１７５】
記憶装置５１５は、ドライバー、ライブラリーおよびセーブされたプログラムなどのファイルを保存することができる。記憶装置５１５は、ユーザーのデータ、例えば、ユーザー選択およびユーザープログラムを保存することができる。コンピュータシステム５０１は、一部の場合では、イントラネットまたはインターネットを通してコンピュータシステム５０１と通信するリモートサーバー上に配置されるなど、コンピュータシステム５０１の外部にある１つまたは複数の追加のデータ記憶装置を含むことができる。
【０１７６】
コンピュータシステム５０１は、ネットワーク５３０を通して１つまたは複数のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム５０１は、ユーザー（例えば、ヘルスケア提供者）のリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例としては、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートもしくはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）ＧａｌａｘｙＴａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、またはパーソナルデジタルアシスタントが挙げられる。ユーザーは、ネットワーク１１３０を介してコンピュータシステム５０１にアクセスすることができる。
【０１７７】
本明細書に記載の方法は、例えば、メモリ５１０または電子記憶装置５１５などのコンピュータシステム５０１の電子保存場所に保存された機械（例えば、コンピュータプロセッサー）実行可能コードによって実行することができる。機械実行可能コードまたは機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供され得る。使用の間に、コードは、プロセッサー５０５によって実行され得る。一部の場合では、コードは、プロセッサー５０５によるアクセスの準備のために、記憶装置５１５から読み出すことができ、メモリ５１０に保存することができる。一部の状況では、電子記憶装置５１５を除外することができ、機械実行可能命令はメモリ５１０に保存される。
【０１７８】
コードは、事前にコンパイルすることができ、コードを実行するように適合されたプロセッサーを有する機械による使用のために構成することができ、またはランタイムの間にコンパイルすることができる。コードは、事前コンパイルされたか、またはコンパイルされた様式でコードを実行できるように選択され得るプログラミング言語で提供することができる。
【０１７９】
コンピュータシステム５０１などの本明細書において提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングに具体化することができる。技術のさまざまな態様は、典型的には、機械（またはプロセッサー）実行可能コードおよび／または機械可読媒体のタイプで行われるか、もしくは具体化される関連データの形式の「製品」または「製造品」と考えられ得る。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクなどの電子記憶装置に保存することができる。「保存」型媒体としては、コンピュータ、プロセッサーなどの有形メモリのいずれかもしくはすべて、またはさまざまな半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどのそれらの関連モジュールを挙げることができ、これは、ソフトウェアプログラミングのために任意の時に非一時的保存を提供し得る。ソフトウェアのすべてまたは部分は、時には、インターネットまたはさまざまな他の電気通信ネットワークを通して通信してもよい。このような通信は、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサーから別のものに、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームに、ソフトウェアのロードを可能にし得る。したがって、ソフトウェア要素を有し得る別の種類の媒体は、有線および光の地上通信ネットワーク、ならびにさまざまなエアリンクによる、例えば、ローカルデバイスの間の物理インターフェースにわたって使用される、光、電気および電磁波を含む。有線または無線リンク、光リンクなどのこのような波を運ぶ物理的要素はまた、ソフトウェアを有する媒体として考えられ得る。本明細書で使用される場合、非一時的有形「保存」媒体に制限されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサーへの命令の提供するに関与する任意の媒体を指す。
【０１８０】
そのため、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、限定されるものではないが、有形保存媒体、搬送波媒体、または物理的伝送媒体を含む、多くの形態をとり得る。非揮発性保存媒体としては、例えば、任意のコンピュータ（複数可）中の保存デバイスのいずれかなどの光学もしくは磁気ディスクが挙げられ、例えば、図面に示されるデータベースなどを実行するために使用され得る。揮発性保存媒体としては、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリが挙げられる。有形伝送媒体としては、同軸ケーブル；コンピュータシステム内のバスを含むワイヤを含む銅線および光ファイバーが挙げられる。搬送波伝送媒体は、電気もしくは電磁信号、またはラジオ波（ＲＦ）および赤外（ＩＲ）データ通信の間に生成されるものなどの音波もしくは光波の形態をとってもよい。したがって、コンピュータ可読媒体の通常の形態としては、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード穿孔紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理保存媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を運ぶ搬送波、そのような搬送波を運ぶケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読み取り得る任意の他の媒体が挙げられる。コンピュータ可読媒体のこれらの形態の多くは、実行のためのプロセッサーに対する一連のまたは複数の連なりの１つまたは複数の命令を運ぶことに関与し得る。
【０１８１】
コンピュータシステム５０１は、例えば、（ｉ）候補腫瘍ネオ抗原、（ｉｉ）検出される非ヒト種、（ｉｉｉ）検出されるＣＤＲ３配列、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択されるデータの１つまたは複数のセットを含む１つまたは複数の生物医学レポートを提供するためのユーザーインターフェース（ＵＩ）５４０を含む、電子ディスプレイ５３５を含み得るか、またはディスプレイ５３５と通信し得る。ＵＩの例としては、限定されないが、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブベースのユーザーインターフェースが挙げられる。
【０１８２】
本開示の方法およびシステムは、１つまたは複数のアルゴリズムによって実行することができる。アルゴリズムは、中央演算処理装置５０５による実行の際に、ソフトウェアによって実行することができる。アルゴリズムは、例えば、配列読み取りデータをマッピングおよび／もしくは整列させることができ、変異体をコールすることができ、配列情報に注釈を付けることができ、またはそれらの任意の組合せを行うことができる。
【実施例】
【０１８３】
（実施例１）
ゲノムＤＮＡの調製
以下の操作を使用して、ゲノムＤＮＡを含む試料由来の核酸分子のサブセットを調製した。
【０１８４】
１．  ゲノムＤＮＡを含む試料を、１５〜３５秒間、Ｍ２２０で剪断する。
【０１８５】
２．  断片化ｇＤＮＡを、ライゲーション後にＳＰＲＩビーズを用いて精製し（ＳＰＲＩビーズのＤＮＡ試料に対する体積の比は１であった）、ＤＮＡを１００μＬの溶出緩衝液（ＥＢ）に溶出させた。
【０１８６】
３．  ５０μＬのＳＰＲＩビーズを１００μＬのＤＮＡに添加した。
【０１８７】
４．  上清を新しいチューブに移した。
【０１８８】
５．  残ったビーズ結合ＤＮＡからＤＮＡを溶出させた。この溶出ＤＮＡを長挿入物と呼んだ。
【０１８９】
６．  １０μＬのＳＰＲＩビーズを、操作４からの上清に添加した。
【０１９０】
７．  操作６からの上清を新しいチューブに移した。
【０１９１】
８．  操作６の残ったビーズ結合ＤＮＡからＤＮＡを溶出させた。この溶出ＤＮＡを中挿入物と呼んだ。
【０１９２】
９．  ２０μＬのＳＰＲＩビーズを、操作７からの上清に添加した。
【０１９３】
１０．  操作９からの上清を新しいチューブに移した。
【０１９４】
１１．  操作９の残ったビーズ結合ＤＮＡからＤＮＡを溶出させた。この溶出ＤＮＡを短挿入物と呼んだ。
【０１９５】
（実施例２）
生体試料の入手
評価可能な転移性がんを有する対象は、腫瘍の切除を受ける。腫瘍由来のリンパ球である腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を成長させ、増やす。ＴＩＬの複数の個々の断片または複数の個々の培養物を成長させる。個々の培養物を別々に増やし、ＴＩＬの十分な収率（およそ１０８個の細胞）がそれぞれの培養物から増えたときに、ＴＩＬを凍結保存し、アリコートを免疫学的試験のために取る。起源の腫瘍のアリコートを、エクソームおよびトランスクリプトームの配列決定に付して、正常細胞と比較して、腫瘍中に固有で存在する突然変異を特定する。配列決定は、微生物を含む非ヒトゲノムの存在および同一性も特定する。
【０１９６】
（実施例３）
生体試料からのゲノム材料の抽出
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）および総ＲＮＡを、製造者の提案に従って、ＱＩＡＧＥＮ  ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡキット（カタログ番号８０２０４）を使用して、さまざまな腫瘍から精製し、正常なアフェレーシス試料とマッチさせる。腫瘍試料を、ホルマリン固定し、パラフィン包埋し（ＦＦＰＥ）、ｇＤＮＡを、製造者の指示の通り、Ｃｏｖａｒｉｓ  ｔｒｕＸＴＲＡＣＴＭ  ＦＦＰＥ  ＤＮＡキットを使用して抽出する。
【０１９７】
（実施例４）
生体試料の配列決定分析
およそ２０，０００コード遺伝子の全エクソームライブラリーの構築およびエクソン捕捉を、Ｈｕｍａｎ  Ａｌｌ  Ｅｘｓｏｎ  Ｖ６  ＲＮＡベイト（カタログ番号５１９０−８８６３）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、米国）およびＢａｃｔｅｒｉａｌ  ＲＮＡベイトとカップリングしたペアエンドライブラリーのために、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔシステム（カタログ番号５１９０−８６４６）を使用して調製する。全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）ライブラリーを、その後、ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００卓上シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）において配列決定する。ライブラリーを、新鮮な腫瘍組織試料由来の３μｇのｇＤＮＡ、およびＦＦＰＥ腫瘍試料由来の２００ｎｇのｇＤＮＡを使用して、製造者のプロトコールに従って、調製する。ペアエンド配列決定を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ高出力フローセルキット（３００サイクル）（カタログ番号ＦＣ−４０４−２００４）を用いて行う。Ｔｕ−１、Ｔｕ−２ＡおよびＴｕ−２Ｂ試料を、最初に、試薬／フローセルキットのｖ１で実行し、同じライブラリー調製のその後の実行を、試薬／フローセルキットのｖ２を使用して行う。腫瘍試料を、ｖ２試薬／フローセルキットで実行する。各試料における平均配列決定深度および腫瘍のパーセンテージ（腫瘍純度）を、バイオインフォマティクスプログラムの腫瘍の対立遺伝子特異的コピー数分析（ＡＳＣＡＴ）１を用いて推定される通り、決定する。ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを、２μｇの総ＲＮＡを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ標準ライブラリー調製キットを用いて、製造者のプロトコールに従って調製する。ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを、ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００卓上シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）においてペアエンド配列決定する。整列、処理および変異体呼び出し。ＷＥＳのために、整列を、ヒトゲノムビルドｈｇ１９に対して、ｎｏｖｏｃｒａｆｔ（http://www.novocraft.com/）からのｎｏｖｏａｌｉｇｎ  ＭＰＩを使用して行う。重複を、Ｐｉｃａｒｄ’ｓ  ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓツールを使用してマークする。Ｉｎ／ｄｅｌ再配列および塩基再較正を、ＧＡＴＫベストプラクティスワークフロー（https://www.broadinstitute.org/gatk/）に従って行う。データのクリーンアップ後、ｓａｍｔｏｏｌｓ（http://samtools.sourceforge.net）を使用して、パイルアップファイルを作出し、Ｖａｒｓｃａｎ２（http://varscan.sourceforge.net）を使用して、以下の基準：腫瘍および正常読み取りデータカウントが１０またはそれよりも高い、変異体対立遺伝子頻度が１０％またはそれよりも高い、および腫瘍変異体読み取りデータが４またはそれよりも高い、を使用して、体細胞変異体を呼び出す。次いで、これらの変異体をＡｎｎｏｖａｒ（http://annovar.openbioinformatics.org）を使用して注釈を付ける。ＲＮＡ−ｓｅｑのために、整列を、ヒトゲノムビルドｈｇ１９に対して、ＳＴＡＲ（https://github.com/alexdobin/STAR）２パス法を使用して行う。重複を、Ｐｉｃａｒｄ’ｓ  ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓツールを使用してマークする。読���取りデータを分割し、ＧＡＴＫ  ＳｐｌｉｔＮＴｒｉｍツールを使用してトリミングする。その後、Ｉｎ／ｄｅｌ再配列および塩基再較正を、ＧＡＴＫツールボックスを使用して行う。パイルアップファイルを、最終の再較正ｂａｍファイルおよびｓａｍｔｏｏｌｓ  ｍｐｉｌｅｕｐを使用して、作出する。最後に、変異体を、Ｖａｒｓｃａｎ２を使用して呼び出す。
【０１９８】
（実施例５）
非ヒトゲノムの配列の整列
配列決定分析から抽出されたゲノム情報を、リボソームＲＮＡ遺伝子の１６Ｓのゲノム参照に対して、整列させる。１６Ｓ遺伝子と完全にマッチした読み取りデータを特定する。１６Ｓ遺伝子の共有領域とハイブリダイズするように設計された捕捉用プローブを、未だに特定および特性が明らかにされていない種でさえも、幅広い種類の種由来の核酸分子を捕捉するために、使用することができる。配列がこれらの共有領域から可変領域に伸長した捕捉された分子は、可変領域部由来の配列に基づくそれらの起源の種に割り当てられる。
【０１９９】
（実施例６）
剪断時間および断片サイズ
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、Ｃｏｖａｒｉｓの設定の剪断時間を変えることによって、剪断した。次いで、さまざまな剪断時間によって生成したｇＤＮＡ断片を分析した。結果を図１０および表１に示す。
【表１】
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【０２００】
（実施例７）
ビーズ比および断片サイズ
ビーズの体積の核酸試料の体積に対する比は、変更され、平均断片サイズに対するこれらの比の効果を分析した。図１１において見ることができるように、ビーズの体積の核酸試料の体積に対する比を０．８（ライン１）、０．７（ライン２）、０．６（ライン３）、０．５（ライン４）および０．４（ライン５）に変更すると、ＤＮＡ断片の平均サイズの変化がもたらされた。一般に、比が低くなると、平均断片サイズが大きくなると思われた。
【０２０１】
（実施例８）
ライゲーション反応および断片サイズ
２つの異なる剪断時間および３つの異なるライゲーション反応の組合せを、核酸試料において実施した。試料１は、２５秒間剪断し、ライゲーション反応を、長挿入ＤＮＡにおいて行った。試料２は、３２秒間剪断し、ライゲーション反応を、長挿入ＤＮＡにおいて行った。試料３は、２５秒間剪断し、ライゲーション反応を、中挿入ＤＮＡにおいて行った。試料４は、３２秒間剪断し、ライゲーション反応を、中挿入ＤＮＡにおいて行った。試料５は、２５秒間剪断し、ライゲーション反応を、短挿入ＤＮＡにおいて行った。試料６は、３２秒間剪断し、ライゲーション反応を、短挿入ＤＮＡにおいて行った。図１２は、６つの反応についての平均断片サイズを示す。
（実施例９）
目的の核酸の捕捉
核酸試料を対象から得る。試料を２つの別々の試料に分けることができ、それぞれ別々の試料をプローブの異なるプールおよび条件に付すことができる。ビオチン化捕捉用プローブの第１のプールを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｘｏｍｅキット（ＧＲＣｈ３７参照ゲノムにおけるエクソームに基づく）を、ＧＲＣｈ３８参照配列に対応するエクソーム領域、ＨＬＡ特異的プローブ、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体組換え特異的プローブ（すなわち、Ｖ（Ｄ）Ｊ領域に対応する領域）、マイクロサテライト不安定性の領域、ならびにオンコウイルス配列を含む、追加の目的のプローブと組み合わせることによって、生成する。追加のプローブを、プールに滴定して、核酸の相対捕捉速度を調整する。これは、捕捉された核酸のセットについての配列決定深度または感受性を増加させる下流の配列決定反応のために有益であり得る。プローブの第２のプール（例えば、特異的配列を標的にするプローブの「ブーストセット」、または配列のサブセット）は、捕捉することが困難である配列により、核酸を捕捉することができる。ブーストセットのプローブは、高ＧＣ含量を有するＧＲＣｈ３７およびＧＲＣｈ３８参照配列のエクソーム、がん治療に関するプローブ、追加のＴ細胞受容体およびＢ細胞組換え特異的プローブを含むことができる。第１のプールによって捕捉された核酸分子、および第２のプールによって捕捉された核酸分子を組み合わせて、捕捉用プローブおよび捕捉された核酸の組合せプールを作出する。組合せプールは、それぞれのプールに対応する捕捉された核酸の相対量を調整するために、異なる比の捕捉された分子の２つのプールを組み合わせることによって作出することができる。これは、捕捉用核酸のセットについての深度または感受性を増加させる下流の配列決定反応のために有益であり得る。ハイブリダイズされた捕捉用プローブおよび捕捉用核酸を、磁気ストレプトアビジンビーズとともにインキュベートする。磁気分離器を、試料を含有するチューブの外側に配置し、捕捉用プローブが磁気ストレプトアビジンビーズを固定化することが可能になる。液体をデカントし、追加の緩衝液を添加してビーズを洗浄し、任意の未結合核酸を除去する。捕捉された核酸を増幅反応に付して、さらに下流の配列決定反応のためのアダプターを付加する。
【０２０２】
（実施例１０）
マイクロバイオームおよびオンコウイルスの特定
核酸試料を対象から得る。試料を２つの別々の試料に分けることができ、それぞれ別々の試料をプローブの異なるプールおよび条件に付すことができる。ビオチン化捕捉用プローブの第１のプールを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｘｏｍｅキット（ＧＲＣｈ３７参照ゲノムにおけるエクソームに基づく）を、ＧＲＣｈ３８参照配列に対応するエクソーム領域、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉおよびＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの遺伝子を含む、細菌、真菌、古細菌および原生生物の遺伝子の１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域と相同性を有するプローブ、ウイルス遺伝子（ヒトパピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスを含む）に対するプローブ、ならびに病原性に関する遺伝子に対するプローブを含む追加の目的のプローブと組み合わせることによって、生成する。追加のプローブを、プールに滴定して、核酸の相対捕捉速度を調整する。プローブの第２のプール（例えば、特異的配列を標的にするプローブの「ブーストセット」、または配列のサブセット）は、捕捉することが困難である配列により、核酸を捕捉することができる。ブーストセットのプローブは、高ＧＣ含量、または複数の代替遺伝子配列もしくは高突然変異比率を有する遺伝子に起因する遺伝子に対する低相同性を有するＧＲＣｈ３７およびＧＲＣｈ３８参照配列のエクソームを含むことができる。第１のプールによって捕捉された核酸分子、および第２のプールによって捕捉された核酸分子を組み合わせて、核酸の組合せプールを作出する。これらの２つのプールを組み合わせ、異なる比で滴定して、他のプールに対する１つのプールの感受性を増加させる。ハイブリダイズされた捕捉用プローブおよび捕捉用核酸を、磁気ストレプトアビジンビーズとともにインキュベートする。磁気分離器を、試料および捕捉用プローブを含有するチューブの外側に配置し、磁気ストレプトアビジンビーズを固定化することが可能になる。液体をデカントし、追加の緩衝液を添加してビーズを洗浄し、任意の未結合核酸を除去する。捕捉された核酸を増幅反応に付して、さらに下流の配列決定反応のためのアダプターを付加する。配列を参照配列と整列させて、対象のマイクロバイオーム中の特定の微生物の存在を特定するか、または任意の疾患を引き起こす病原体を特定する。
【０２０３】
（実施例１１）
ＣＡＲ−Ｔ細胞の特定
対象由来の核酸試料を得る。プローブの２つのプールを、ビオチン化されたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｘｏｍｅキットのプローブで構成された第１のプールを用いて生成する。ビオチン化プローブの補充セットを、ＣＡＲ−Ｔ細胞において見られるキメラ抗原受容体に特異的な配列を含む第１のプールに添加する。ビオチン化捕捉用プローブの第２のプール（例えば、特異的配列を標的にするプローブの「ブーストセット」、または配列のサブセット）は、高ＧＣ含量を有するＣＡＲ配列、および／または突然変異もしくは組換えに起因する捕捉された核酸とより低い全体の配列相同性を有し得る配列に向けられる配列を含有する。試料を２つの試料プールに分け、第１の試料プールをプローブの第１のプールに付し、第２の試料プールをプローブの第２のプールに付して、捕捉用プローブが試料プールのそれぞれに由来の核酸を捕捉することを可能にする。捕捉された核酸とハイブリダイズされたプローブの第１のプールおよび第２のプールを組み合わせる。磁気ストレプトアビジンビーズを混合物に添加し、ビオチン化プローブをビーズに結合させる。磁気分離器を、試料および捕捉用プローブを含有するチューブの外側に配置し、磁気ストレプトアビジンビーズを固定化することが可能になる。液体をデカントし、追加の緩衝液を添加してビーズを洗浄し、任意の未結合核酸を除去する。捕捉された核酸を、新鮮な緩衝液に再懸濁させ、増幅反応に付して、アダプターを付加し、その後、捕捉された核酸を配列決定する。配列読み取りデータを、分析し、ＣＡＲ−Ｔ遺伝子参照配列に対して整列させて、ＣＡＲ−Ｔ関連核酸の存在を特定する。
【０２０４】
（実施例１２）
セグメント化トランスクリプトームの特定
試料を、対象から、異なる組織型から得る。試料を、酵素消化によって処理して、ＤＮＡおよび複数の種類のＲＮＡ分子（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を除去する。ｍＲＮＡは、未消化で残り、逆転写に付されて、ｃＤＮＡ分子を生成する。およそ２０，０００遺伝子に対する配列相同性を有するビオチン化プローブセットを生成し、ｃＤＮＡ試料と混合する。磁気ストレプトアビジンビーズを混合物に添加し、ビオチン化プローブをビーズに結合させる。磁気分離器を、試料および捕捉用プローブを含有するチューブの外側に配置し、磁気ストレプトアビジンビーズを固定化することが可能になる。液体をデカントし、追加の緩衝液を添加してビーズを洗浄し、任意の未結合核酸を除去する。捕捉された核酸を、新鮮な緩衝液に再懸濁させ、増幅反応に付して、アダプターを付加し、その後、捕捉された核酸を配列決定する。配列読み取りデータを、分析し、参照配列に対して整列させて、各試料中の遺伝子の同一性を決定し、試料の組織型に関連付ける。ビオチン化プローブが異なる比で滴定される、試料の複数の複製を実行する。試料に提供されたプローブの量に関連する核酸の特異的シグナルを分析することによって、それぞれの遺伝子の発現レベルを決定することができる。トランスクリプトーム分析を、エクソームまたはゲノム分析と並行して実行することができる。エクソームまたはゲノムのプローブは、プローブの第１のプールとして使用してもよく、ｃＤＮＡ捕捉用プローブを第２のプールとして使用することができる。この場合における試料は、部分に分割することができ、ＤＮＡ特異的反応またはｍＲＮＡ特異的反応に付すことができる。前の実施例に開示するように、捕捉された核酸は、一緒にプールすることができ、配列決定反応に付して、核酸の同一性を決定することができる。
【０２０５】
（実施例１３）
がんに関する無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の特定および捕捉
全血または血清由来の核酸試料抽出物を得る。血液試料の細胞を遠心分離により除去し、無細胞試料を得る。およそ２０，０００遺伝子に対する配列相同性を有するビオチン化プローブセットを生成し、無細胞試料と混合する。ビオチン化捕捉用プローブの第１のプールを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｘｏｍｅキット（ＧＲＣｈ３７参照ゲノムにおけるエクソームに基づく）を、ＧＲＣｈ３８参照配列に対応するエクソーム領域を含む追加の目的のプローブ、およびがんに関連する遺伝子に対する相同性を有するプローブと組み合わせることによって、生成する。追加のプローブを、プールに滴定して、核酸の相対捕捉速度を調整する。プローブの第２のプール（例えば、特異的配列を標的にするプローブの「ブーストセット」、または配列のサブセット）は、捕捉するのが困難である配列により、核酸を捕捉することができる。ブーストセットのプローブは、高ＧＣ含量、または複数の代替遺伝子配列もしくは高突然変異比率を有する遺伝子に起因する遺伝子に対する低相同性を有するＧＲＣｈ３７およびＧＲＣｈ３８参照配列のエクソームを含むことができる。磁気ストレプトアビジンビーズを混合物に添加し、ビオチン化プローブをビーズに結合させる。磁気分離器を、試料および捕捉用プローブを含有するチューブの外側に配置し、磁気ストレプトアビジンビーズを固定化することが可能になる。液体をデカントし、追加の緩衝液を添加してビーズを洗浄し、任意の未結合核酸を除去する。捕捉された核酸を、新鮮な緩衝液に再懸濁させ、増幅反応に付して、アダプターを付加し、その後、捕捉された核酸を配列決定する。配列読み取りデータを、分析し、参照配列に対して整列させて、各試料中の遺伝子の同一性を決定する。ｃｆＤＮＡ分析を、ｃｆＤＮＡで行われるようにして、ゲノムＤＮＡを同じまたは類似のプローブセットに適用することによって、ゲノムＤＮＡのエクソーム配列決定と並行して実行することができる。
【０２０６】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは、当業者には自明であろう。本発明が本明細書内で提供される特定の実施例によって限定されることを意図していない。本発明は、前述の明細書を参照して記載してきたが、本明細書における実施形態の記載および図示は、限定的な意味で解釈されることを意味しない。多数の変形、変化および置換は、ここに、本発明から逸脱することなく、当業者は気付くだろう。さらにまた、本発明のすべての態様が、各種の条件および変数に依存する、本明細書において説明する特定の表現、配置または相対的な割合に限定されないことが理解されるべきである。本明細書に記載される本発明の実施形態に対するさまざまな代替を本発明の実施において用いてもよいことが理解されるべきである。したがって、本発明が、任意のそのような代替、改変、変形または均等物も包含するものとすることを企図する。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの均等物がそれによって包含されることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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