(57)【要約】  単離された抗体であって、配列番号１、配列番号７又は配列番号１４の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）；配列番号２又は配列番号１５の配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）；配列番号３、配列番号８、配列番号２１又は配列番号２４の配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）；配列番号４、配列番号９、配列番号１１、配列番号１６又は配列番号２５の配列を有する重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）；配列番号５、配列番号１２、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２２又は配列番号２６の配列を有する重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）；及び配列番号６、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２３又は配列番号２７の配列を有する重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含み、前記抗体がＡβ１−４２又はそのＮ末端修飾形態に特異的に結合する、単離された抗体。【選択図】図１ＡＢ
2021525512.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗体であって、配列番号１、配列番号７又は配列番号１４の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）；配列番号２又は配列番号１５の配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）；配列番号３、配列番号８、配列番号２１又は配列番号２４の配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）；配列番号４、配列番号９、配列番号１１、配列番号１６又は配列番号２５の配列を有する重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）；配列番号５、配列番号１２、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２２又は配列番号２６の配列を有する重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）；及び配列番号６、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２３又は配列番号２７の配列を有する重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含み、前記抗体がＡβ１−４２又はそのＮ末端修飾形態に特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項２】
前記Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号１６の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号１９の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号２０の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号１４の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号１５の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号３の配列を有する、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
前記Ｎ末端修飾Ａβ１−４２がピログルタミン酸Ａβ（ｐＥ−Ａβ３−４２）である、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項４】
前記Ｎ末端修飾Ａβ１−４２がピログルタミン酸Ａβ（ｐＥ−Ａβ３−４２）である、請求項２に記載の単離された抗体。
【請求項５】
前記Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号４の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号５の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号６の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号１の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号２の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号３の配列を有する、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項６】
前記Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号９の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号５の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号１０の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号７の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号２の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号８の配列を有する、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項７】
前記Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号１１の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号１２の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号１３の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号７の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号２の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号３の配列を有する、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項８】
前記Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号１６の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号１７の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号１８の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号１４の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号１５の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号３の配列を有する、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項９】
前記Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号９の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号２２の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号２３の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号７の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号２の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号２１の配列を有する、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項１０】
前記Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号２５の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号２６の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号２７の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号７の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号２の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号２４の配列を有する、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、Ｆｃ領域を含む抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、ｓｃＦＶ多量体、モノクローナル抗体、一価抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
前記抗体が、配列番号１６の配列を有するＨ−ＣＤＲ１と、配列番号１９の配列を有するＨ−ＣＤＲ２と、配列番号２０の配列を有するＨ−ＣＤＲ３と、配列番号１４の配列を有するＬ−ＣＤＲ１と、配列番号１５の配列を有するＬ−ＣＤＲ２と、配列番号３の配列を有するＬ−ＣＤＲ３とを含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体又はその成分をコードする核酸コンストラクト。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸コンストラクトを含む組換え細胞。
【請求項１６】
被験体においてアルツハイマー病を治療する方法であって、アルツハイマー病に罹患している被験体を識別する工程と、前記被験体に有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体を投与する工程とを含む、方法。
【請求項１７】
前記抗体が、配列番号１６の配列を有するＨ−ＣＤＲ１と、配列番号１９の配列を有するＨ−ＣＤＲ２と、配列番号２０の配列を有するＨ−ＣＤＲ３と、配列番号１４の配列を有するＬ−ＣＤＲ１と、配列番号１５の配列を有するＬ−ＣＤＲ２と、配列番号３の配列を有するＬ−ＣＤＲ３とを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記識別する工程が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体を前記被験体に投与すること、及び前記被験体において末梢血Ａβタンパク質レベルを測定することを含み、前記末梢血レベルが脳Ａβタンパク質レベルと正に相関する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
被験体において脳Ａβタンパク質を検出する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体を前記被験体に投与する工程と、前記被験体において末梢血Ａβタンパク質レベルを測定する工程とを含み、前記末梢血レベルが脳Ａβタンパク質レベルと正に相関する、方法。
【請求項２０】
前記抗体が、配列番号１６の配列を有するＨ−ＣＤＲ１と、配列番号１９の配列を有するＨ−ＣＤＲ２と、配列番号２０の配列を有するＨ−ＣＤＲ３と、配列番号１４の配列を有するＬ−ＣＤＲ１と、配列番号１５の配列を有するＬ−ＣＤＲ２と、配列番号３の配列を有するＬ−ＣＤＲ３とを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
被験体においてＡβプラークを標識する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体を検出可能な標識で標識する工程と、該標識抗体を被験体に投与する工程と、前記被験体において前記標識の位置を検出する工程とを含む、方法。
【請求項２２】
前記標識が放射性であり、前記検出が陽電子放出断層撮影によって行われる、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１８年５月３０日付けで出願された米国仮特許出願第６２／６７８，０８０号に対する優先権を主張するものであり、その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ：Alzheimer's disease）は、進行性の記憶喪失及び認知機能障害を臨床上の特徴とする。主にＡβで構成される細胞外老人性アミロイドプラークは、その病理学的特徴の一部である。例えば、非特許文献１を参照されたい。ＡＤ症例の大部分は孤発性であり、ＡＤの病因は疾患起源の多様性のためにほとんど不明のままである。一時的な症状の緩和を標的とする現在の治療法では、この病気は治癒しない。
【０００３】
ＡＤでは、脳内でのＡβ沈着が、炎症促進型のグリア活性化を誘発し、Ａβの制御不能な蓄積は、結果として神経炎症を悪化させ、タウ過リン酸化を促進して、神経細胞の脱落につながる。今日まで、この壊滅的な疾患を治癒する方法はない。多くの疾患修飾アプローチの中で、Ａβに対する抗体を用いる受動免疫療法は、ＡＤの発病を予防又は遅延させるための有望なアプローチである。例えば、非特許文献２、特許文献１及び特許文献２を参照されたい。有益な効果は、Ａβへのミクログリア食作用を促進することによってＡβの蓄積を緩和する抗体の効果に起因すると考えられている。しかしながら、免疫療法の多くの臨床試験は、主にＡβクリアランスの改善の欠如及び／又は重篤な有害作用の発生のため、治療上の利点を検証することができなかった。
【０００４】
上記のように、ミクログリアはＡＤの発病において重要な役割を果たすと考えられ、ＡＤでは、ミクログリアは活性化され、形態学的変化及び様々なエフェクターの生成を特徴とし、それらの組み合わせによっては、脳機能に有益にも又は有害にもなり得る。ミクログリア媒介神経炎症の減少とＡβクリアランスの増強との好ましい組み合わせがＡＤ療法において重要となり得るというコンセンサスが高まりつつある。抗炎症特性を持ちながら、ミクログリア食作用活性及び神経機能を促進する任意の手段は、疾患の治療に有益となるはずである。ＡＤの予防及び治療のための多くの戦略は、アミロイド蓄積を防ぐか、又はそのクリアランスを増強することを目的としている。実際、Ａβモノクローナル抗体である３Ｄ６の全身送達は、トランスジェニックマウスモデルにおいて治療効果を有することが示された。例えば、非特許文献３を参照されたい。臨床試験では、この抗体のヒト化バージョンであるバピネオズマブが、アミロイドＰＥＴイメージングによって脳内の低いＡβ負荷を示したが、臨床試験は、有意な臨床有益性がなく、重篤な有害作用が発生したために失敗した。さらに、ＡＤの臨床所見が検出可能になる何年も前に、僅かではあるが重大な神経炎症が脳に現れることがある。慢性及び自己推進型の（self-propelling）神経炎症は、それまでに脳機能を著しく損なうため、ＡＤ治療がより困難になる。したがって、疾患の初期段階での多機能の効果を伴う介入が、有望な治療パラダイムとして浮上している。しかしながら、前臨床段階でのＡＤの早期診断及びＡＤに対する効果的な治療は利用できていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０１４２２７０号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１５／０３１５２６７号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Wang et al., Nat Rev Neurol. 2017, 13(10):612-623
【非特許文献２】Barrera-Ocampo A and Lopera F. Colomb Med (Cali). 2016 Dec 30;47(4):203-212
【非特許文献３】Bacskai BJ et al., J Neurosci. 2002 Sep 15;22(18):7873-8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＡＤ療法における満たされていない要求を充足するには、ＡＤ様病態を減弱する、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡβクリアランスの増強、及び動物における神経細胞の機能促進といった多面的な機能を持つ新規抗体が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様では、単離された抗体が本明細書に記載される。該抗体は、配列番号１、配列番号７又は配列番号１４の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）；配列番号２又は配列番号１５の配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）；配列番号３、配列番号８、配列番号２１又は配列番号２４の配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）；配列番号４、配列番号９、配列番号１１、配列番号１６又は配列番号２５の配列を有する重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）；配列番号５、配列番号１２、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２２又は配列番号２６の配列を有する重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）；及び配列番号６、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２３又は配列番号２７の配列を有する重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含み、前記抗体がＡβ１−４２又はそのＮ末端修飾形態に特異的に結合する。幾つかの実施の形態では、前記Ｎ末端修飾Ａβ１−４２は、ピログルタミン酸Ａβ（ｐＥ−Ａβ３−４２）である。前記抗体は、Ｆｃ領域を含む抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、ｓｃＦＶ多量体、モノクローナル抗体、一価抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。
【０００９】
幾つかの実施の形態では、前記Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号１６の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号１９の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号２０の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号１４の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号１５の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号３の配列を有する。
【００１０】
幾つかの実施の形態では、前記Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号４の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号５の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号６の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号１の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号２の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号３の配列を有する。
【００１１】
幾つかの実施の形態では、前記Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号９の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号５の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号１０の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号７の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号２の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号８の配列を有する。
【００１２】
幾つかの実施の形態では、前記Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号１１の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号１２の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号１３の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号７の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号２の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号３の配列を有する。
【００１３】
幾つかの実施の形態では、前記Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号１６の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号１７の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号１８の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号１４の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号１５の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号３の配列を有する。
【００１４】
幾つかの実施の形態では、前記Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号９の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号２２の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号２３の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号７の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号２の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号２１の配列を有する。
【００１５】
幾つかの実施の形態では、前記Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号２５の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号２６の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号２７の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号７の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号２の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号２４の配列を有する。
【００１６】
別の態様では、本明細書に記載される抗体及び薬学的に許容可能な担体のいずれかを含む医薬組成物が本明細書に記載される。
【００１７】
更に別の態様では、本明細書に記載される抗体のいずれか、又はその成分をコードする核酸コンストラクトが本明細書に記載される。
【００１８】
一態様では、核酸コンストラクトを含む組換え細胞が本明細書に記載される。
【００１９】
別の態様では、被験体においてアルツハイマー病を治療する方法であって、アルツハイマー病に罹患している被験体を識別する工程と、前記被験体に有効量の本明細書に記載される抗体のいずれかを投与する工程とを含む、方法が本明細書で企図される。
【００２０】
幾つかの実施の形態では、前記識別する工程は、本明細書に記載される抗体のいずれかを前記被験体に投与することと、前記被験体において末梢血Ａβタンパク質レベルを測定することとを含み、前記末梢血レベルが脳Ａβタンパク質レベルと正に相関する。
【００２１】
更に別の態様では、被験体において脳Ａβタンパク質を検出する方法であって、本明細書に記載される抗体のいずれかを前記被験体に投与する工程と、前記被験体において末梢血Ａβタンパク質レベルを測定する工程とを含み、前記末梢血レベルが脳Ａβタンパク質レベルと正に相関する、方法が本明細書に記載される。
【００２２】
一態様では、被験体においてＡβプラークを標識する方法であって、本明細書に記載される抗体のいずれかを検出可能な標識で標識する工程と、該標識抗体を被験体に投与する工程と、前記被験体において前記標識の位置を検出する工程とを含む、方法が本明細書に記載される。幾つかの実施の形態では、前記標識が放射性であり、前記検出が陽電子放出断層撮影によって行われる。
【００２３】
１つ以上の実施形態の詳細を添付の図面及び下記明細書に記載する。本実施形態の他の特徴、目的、及び利点は、明細書及び図面及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１ＡＢ】マウスモノクローナルハイブリドーマに由来するＡβに対する抗体の特性を示す図である。Ａβに特異的な抗体を分泌するハイブリドーマの７個の異なるクローンを生成した。抗体のＡβ結合親和性を評価するため、ＥＬＩＳＡを実施した（Ａ）。これらの抗体は、ＡβΝ３−１０に同様の結合エピトープを共有し（Β）、ＣＤＲ−Ｈ３にある７つの特有な配列の組み合わせと共に、全てのマウスＩｇＧアイソタイプを含んでいた（Ｃ）。
【図１Ｃ】マウスモノクローナルハイブリドーマに由来するＡβに対する抗体の特性を示す図である。Ａβに特異的な抗体を分泌するハイブリドーマの７個の異なるクローンを生成した。抗体のＡβ結合親和性を評価するため、ＥＬＩＳＡを実施した（Ａ）。これらの抗体は、ＡβΝ３−１０に同様の結合エピトープを共有し（Β）、ＣＤＲ−Ｈ３にある７つの特有な配列の組み合わせと共に、全てのマウスＩｇＧアイソタイプを含んでいた（Ｃ）。
【図２】キメラ抗体の特性を示す図である。マウス抗体のＩｇＧ可変ドメインをヒトＩｇＧ１骨格の中に構築してキメラ抗体を生成した。キメラ抗体の結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した（Ａ）。ミクログリアＡβ取り込みを評価したところ、キメラバージョンのリード抗体（lead antibody）であるｃｈＡβ１０がＡβ取り込みで最高スコアを示した（Ｂ）。
【図３ＡＢ】リード抗体のヒト化バージョンであるｈｚＡβ−１０の特性を示す図である。リード抗体の溶解度をＦＰＬＣによって試験した（Ａ）。結合親和性を、ＥＬＩＳＡ（Ｂ）及びＳＰＲ（Ｃ）によって評価した。
【図３Ｃ】リード抗体のヒト化バージョンであるｈｚＡβ−１０の特性を示す図である。リード抗体の溶解度をＦＰＬＣによって試験した（Ａ）。結合親和性を、ＥＬＩＳＡ（Ｂ）及びＳＰＲ（Ｃ）によって評価した。
【図４Ａ】リード抗体がｐＥ−Ａβ３−４２も認識したことを示す図である。分子動力学的モデリングは、ｐＥ−Ａβ３−４２に対する結合を予測し（Ａ）、これはＳＰＲ（Ｂ）及びＥＬＩＳＡ（Ｃ）によって確認された。
【図４ＢＣ】リード抗体がｐＥ−Ａβ３−４２も認識したことを示す図である。分子動力学的モデリングは、ｐＥ−Ａβ３−４２に対する結合を予測し（Ａ）、これはＳＰＲ（Ｂ）及びＥＬＩＳＡ（Ｃ）によって確認された。
【図５】［１２４Ｉ］ｍＡβ−１０が脳Ａβを検出したことを示す図である。陽電子放出断層撮影／コンピュータ断層撮影解析では、ｍＡβ−１０が血液脳関門を通過し、脳内のＡβ沈着の診断プローブとなり得ることを示した。
【図６】リード抗体を用いて、循環している抗体誘導性Ａβを監視することにより脳内のＡβレベルを予測することができたことを示す図である。リード抗体の腹腔内注射は、血液中への脳Ａβのロバストな流出を引き起こした。血清中のＡβレベルの上昇は、Ａβプラークの有無にかかわらず、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳Ａβレベルと正に相関した。
【図７】ｍＡβ−１０を注射したマウスに由来する海馬における遺伝子発現のＮｅｘｔＧｅｎ  ＲＮＡシーケンシング解析を要約する図である。驚くべきことに、抗体治療はＡＤに対して有益な多くの遺伝子のトリガーとなったが、神経炎症の徴候は認められなかった。
【図８ＡＢ】アデュカヌマブとリード抗体との比較を示す図である。ＣＤＲ配列同一性（Ａ）、ＥＬＩＳＡによるＡβへの結合親和性（Ｂ）、Ａβプラークの検出（Ｃ）、及びミクログリアＡβ食作用（Ｄ）を比較した。
【図８Ｃ】アデュカヌマブとリード抗体との比較を示す図である。ＣＤＲ配列同一性（Ａ）、ＥＬＩＳＡによるＡβへの結合親和性（Ｂ）、Ａβプラークの検出（Ｃ）、及びミクログリアＡβ食作用（Ｄ）を比較した。
【図８Ｄ】アデュカヌマブとリード抗体との比較を示す図である。ＣＤＲ配列同一性（Ａ）、ＥＬＩＳＡによるＡβへの結合親和性（Ｂ）、Ａβプラークの検出（Ｃ）、及びミクログリアＡβ食作用（Ｄ）を比較した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書には、様々なＡβ種及びＮ末端修飾ピログルタミン酸Ａβを認識する新規抗体が記載される。
【００２６】
各抗体は、配列番号１、配列番号７又は配列番号１４の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）；配列番号２又は配列番号１５の配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）；配列番号３、配列番号８、配列番号２１又は配列番号２４の配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）；配列番号４、配列番号９、配列番号１１、配列番号１６又は配列番号２５の配列を有する重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）；配列番号５、配列番号１２、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２２又は配列番号２６の配列を有する重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）；及び配列番号６、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２３又は配列番号２７の配列を有する重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む。各抗体は、Ａβ１−４２又はそのＮ末端修飾形態に特異的に結合する。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、全長抗体又はそのフラグメント、Ｆｃ領域を含む抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、ｓｃＦＶ多量体、一価抗体、多価抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体を含む、抗原結合活性を有する様々な抗体構造を含む。
【００２８】
本明細書で開示される抗体ＣＤＲ配列に基づいて、熟練した専門家は、当該技術分野で知られている方法、例えば組換え法を用いて、様々な形態の抗Ａβ抗体を製造することができる。
【００２９】
以下に記載するデータは、これらの抗体が、ＡＤの治療及び脳Ａβレベルの早期検出に使用することができることを示唆している。Ｎ−末端修飾ピログルタミン酸Ａβ（ｐＥ−Ａβ３−４２）は非常に凝集しやすく、Ａβプラーク形成に重要となる可能性がある。これらの抗体の結合エピトープは、様々な形態のＡβ種及びｐＥ−Ａβ３−４２を特異的に認識するＡβペプチドのＮ−末端にマップされることが示された。したがって、これらの抗体は、Ａβクリアランスにおいてより有効であり得る。
【００３０】
例えば、データは、抗体の少なくとも１つが、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡＤ様病態を減弱させる多面的な機能を持ち、血液脳関門を横断して脳内のＡβプラークを結合する一方で、過剰に活性化されたミクログリアを健全で機能的な形態を有する分岐型（ramified）ミクログリアに変換することを実証した。さらに、このデータは、抗体を用いる治療がミクログリアＡβ食作用を増強し、神経機能を改善することができることを示した。
【００３１】
さらに、抗体の１つを腹腔内注射することにより循環への脳Ａβのロバストな流出を引き起こすため、血液中のＡβレベルの増加は、Ａβプラークの負荷がかかった又はＡβプラークを持たないＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳内のＡβレベルと正に相関することが示された。言い換えれば、末梢血Ａβのレベルの上昇は、脳Ａβレベルの上昇を示す。したがって、抗体によって誘導される末梢血（例えば、血清又は血漿サンプル）におけるＡβレベルの測定は、ＡＤの全ての病期における脳Ａβレベルを予測するために使用することができる。この革新的なアプローチは、ＡＤのリスクがある患者に対する前臨床診断としてはたらき、介入中のＡＤ患者におけるＡβ病態の監視を支援することができる。反応機構研究による知見は、さらに、グリアの再活性化（glial rejuvenation）及びアストロサイトトランスサイレチンの増加は、少なくとも一部は、治療及び早期診断の両方の二重有効性に寄与する可能性があることを明らかにした。以下に挙げる研究は、新規抗体がＡＤにセラノスティックである可能性を有していることを示唆する。
【００３２】
被験体においてＡＤを診断するため又はＡＤの病期を決定するために、本明細書に記載される抗体の１つを被験体に投与した後、末梢血Ａβレベルを決定することができる。決定されたレベルを、対照レベル（例えば、ＡＤ又はＡβプラークのない被験体で認められるレベル）又は以前の時点で被験体において決定されたレベルと比較することができる。比較に基づいて、被験体がＡＤを有しているかどうか、又はＡＤの重症度を評定することができる。被験体におけるＡＤ治療の有効性を監視するため、被験体の末梢血Ａβレベルを、治療の開始前及び治療中の１つ以上の点において、本明細書に記載されている方法を用いて決定することができる。末梢血Ａβレベルの低下は、治療が有効であることを示す。
【００３３】
本明細書に記載されている抗Ａβ抗体はいずれも、様々な投与経路、例えば、静脈内、関節内、結膜、頭蓋内、腹腔内、胸膜内、筋肉内、髄腔内又は皮下の投与経路に適した医薬組成物として配合することができる。医薬組成物は、水溶液又は凍結乾燥製剤であり得る。医薬組成物に、薬学的に許容可能な担体、例えばバッファー、賦形剤、安定剤又は防腐剤を含めることができる。医薬組成物は、抗Ａβ抗体と一緒に作用する他の有効成分、例えば、別の治療剤又はアジュバントを含み得る。
【００３４】
更に詳述しなくても、当業者であれば本明細書における説明に基づき、最大限に本発明を使用することができると思われる。以下の特定の実施例は単なる例示と解釈されるべきであり、それ以外の開示を何ら限定するものではない。本明細書に引用される全ての参照文献は、引用することでそれらの全体が本明細書の一部をなす。
【実施例】
【００３５】
実施例１：ハイブリドーマからの７クローンのＡβ特異的抗体の生産
ハイブリドーマを生成するため、マウスの免疫にはオリゴマーＡβ（ｏＡβ）を用いた。合成Ａβ１−４２を、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）に溶解し、その後蒸発させた。乾燥メンブレンを１×ＰＢＳで再溶解し、続いて遠心分離により繊維状に（fibrillary）凝集したＡβを除去した。調製されたｏＡβオリゴマーを、市販のＡβ抗体である６Ｅ１０を用いたウェスタンブロットにより特性評価した。結果は、調製したｏＡβオリゴマーが、単量体、二量体、及び３７ｋＤａ〜２５０ｋＤａの範囲の分子量を有する様々な順番のｏＡβ種の構造を含む、Ａβ種の混合物を構成したことを示した。調製したｏＡβオリゴマーを、モノクローナルハイブリドーマの産生のため、LTK Biolaboratoriesによって免疫が行われるまで、−８０℃で保存した。抗体を、ＥＬＩＳＡ（図１Ａ）及び免疫組織化学（データは示されていない）によるＡβ結合親和性の解析に供した。抗体のエピトープマッピングを行った。図１Ｂを参照されたい。Ａβに特異的な抗体を分泌した、ハイブリドーマの７種類の異なるクローンを生成した。結果は、これらの抗体はいずれも、ＡβＮ３−１０に同様の結合エピトープを有するＩｇＧアイソタイプであることを示した。各モノクローナル抗体の全ＣＤＲ配列を決定するため、ハイブリドーマの配列決定を行った。アイソタイプ及びＣＤＲ配列を図１Ｃに示す。
【００３６】
実施例２：キメラ抗体の生成
ヒトＩｇＧ１骨格にマウスＩｇＧ可変ドメインを挿入し、キメラ抗体を生成した。７種類のキメラ抗体のＡβ結合親和性を評価するため、Biacoreによる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を実施した。図２Ａを参照されたい。抗体増強ミクログリアＡβ取り込みをｉｎ  ｖｉｔｒｏで行った。データは、全ての抗体がミクログリアＡβの取り込みを増強し、同時にリード抗体はアッセイで最も高いスコアを有しているようである。図２Ｂを参照されたい。
【００３７】
実施例３：ｍＡβ−１０のヒト化
リード抗体のヒト化バージョン（ｈｚＡβ−１０）を、ヒトＩｇＧ１フレームワークを用いてキメラ抗体から構築した。タンパク質溶解性の解析には高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を用い（図３Ａ）、Ａβ結合の性質をＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳切片に対する免疫蛍光組織化学（データは示していない）、ＥＬＩＳＡ（図３Ｂ）及びＳＰＲ（図３Ｃ）で調査した。データは、ｈｚＡβ−１０が優れたＡβ結合親和性及び非常に高いタンパク質溶解性の優れた特性を呈したことを示し、これは細胞株の発生に適している。
【００３８】
実施例４：新規Ａβ抗体はｐＥ−Ａβ３−４２も認識する
Ｎ−末端修飾ピログルタミン酸Ａβ（ｐＥ−Ａβ３−４２）は非常に凝集しやすく、Ａβプラーク形成に重要である可能性がある。これらの抗体の結合エピトープは、分子動力学的モデリングで予測されるように、様々な形態のＡβ種及びｐＥ−Ａβ３−４２を特異的に認識するＡβペプチドのＮ−末端にマップされる。図４Ａを参照されたい。Biacore（図４Ｂ）及びＥＬＩＳＡ（図４Ｃ）のデータにより、リード抗体がＡβ１−４２及びｐＥ−Ａβ３−４２を標的としたことが確認され、Ａβクリアランスにおいてより効果的となり得ることが示唆された。
【００３９】
実施例５：［１２４Ｉ］ｍＡβ−１０は脳Ａβを検出した
ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスは、同位体標識抗体（［１２４Ｉ］ｍＡβ−１０）をｉ．ｐ．によって受け、ＰＥＴ／ＣＴ解析に供された。図５に示すように、結果は、ｍＡβ−１０が血液脳関門を通過してＡβプラークに結合することができたことを示し、脳内のＡβ沈着の診断プローブとしてｍＡβ−１０を開発することができることを示唆した。
【００４０】
実施例６：血清中の抗体誘導性Ａβを測定することによる早期ＡＤ診断
脳Ａβの血液中へのロバストな輸送は、２回のｍＡβ−１０治療によって誘発され、次第に上昇する血清Ａβレベルは、Ａβプラークの負荷がかかった（laden）及びＡβプラークを持たないＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける対応するＡβレベルと非常に相関していた。図６を参照されたい。血液サンプルの調査を通して、この新規抗体を使用することで、血清Ａβを評価することによって疾患の様々な段階における脳Ａβの量を示すこと、及びＡβプラーク形成を予測することが可能であった。さらに、血清Ａβは循環抗体が下降すると減少し、末梢Ａβのクリアランスにおける抗体の関与を示唆した。図６を参照されたい。この革新的なアプローチは、ＡＤのリスクがあるか又は前臨床段階にある患者に対する早期診断の開発を実施し得て、介入中のＡＤ患者におけるＡβ病態の監視を支援し得る。
【００４１】
実施例７：トランスクリプトーム解析
ｍＡβ−１０注射後の遺伝子発現プロファイルを調べるために、海馬のＮｅｘｔＧｅｎシーケンシングＲＮＡ−Ｓｅｑ解析、すなわちトランスクリプトーム解析を行った。結果は、合計４７７１７個の遺伝子が発現レベルの増加又は減少を見せたことを示した。図７に提示すように、有意な発現上昇を伴う多くの遺伝子はＡＤにとって有益であるように見え、一方で毒性及びストレスに関与する遺伝子は発現減少された。
【００４２】
実施例８．ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるｈｚＡβ−１０再活性化ミクログリアによる治療
共焦点イメージングは、明らかな食作用活性のない不完全な（frustrated）ミクログリアの存在が老齢ＡＰＰ／ＰＳ１マウスで観察されたことを示し、一方、（１７日間で）４回の投与をｉ．ｐ．注射で行った用量３０ｍｇ／ｋｇのｈｚＡβ−１０による治療は、機能性／分岐型ミクログリアに類似する形態の劇的な変化を伴って、Ｉｂａ１免疫応答を次第に増大させた（データは示されていない）。これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｈｚＡβ−１０再活性化ミクログリアの治療及びＡβプラークのクリアランスの促進を示した。
【００４３】
実施例９：ｍＡβ−１０による治療は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるアストロサイトＴＴＲを増加させ、神経機能を改善し、アミロイドプラークを減少させた
共焦点画像は、２回の投与をｉｐ注射で行った３０ｍｇ／ｋｇのｍＡβ−１０による治療がアストロサイトトランスサイレチン（ＴＴＲ）のレベルを増加させたのに対し、年齢を一致させたＡＰＰ／ＰＳ１マウスのアストロサイトではＴＴＲの含有量が低いことを示した（データは示されていない）。共局在データはまた、アストロサイトエンドフィート（end-feet）内でのＴＴＲの局在を確認した（データは示されていない）。結果は、アストロサイトにおける抗体誘導性ＴＴＲがｍＡβ−１０によって引き起こされるＡβ流出に関与する可能性を示唆した。驚くべきことに、ｍＡβ−１０はまた、ＡＰＰ／ＰＳ１の海馬におけるＭＡＰ２及びＰＳＤ９５の免疫応答を高め、ｍＡβ−１０が神経機能を増強したことを示唆した（データは示されていない）。さらに、３９週間に亘る週１回のｍＡβ−１０による治療は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるアミロイドプラークの減少につながった（データは示されていない）。
【００４４】
実施例１０：アデュカヌマブとリード抗体との比較
アデュカヌマブ（BiogenによるＢＩＩＢ０３７）は現在、ＡＤ療法の第ＩＩＩ相臨床試験に入っている。ｈｚＡβ−１０のＣＤＲ配列及びアデュカヌマブのそれらの配列は非常に低い同一性を共有した。図８Ａを参照されたい。アデュカヌマブ（Creative Biolabsから購入）と比較して、マウス又はヒトバージョンいずれかのリード抗体は、オリゴマーＡβ（ｏＡβ）及び凝集Ａβに対する親和性がより強かった。図８Ｂを参照されたい。凝集Ａβに対するアデュカヌマブの結合優先度とは対照的に、リード抗体は両形態のＡβに対して同様の結合親和性を示した。図８Ｂを参照されたい。蛍光組織化学に続く共焦点イメージングを用いて、１４ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳内にＡβプラークを検出した。図８Ｃを参照されたい。２つの抗体（０．２ｍｇ／ｍｌ又は１ｍｇ／ｍｌ）間の比較のため、連続した切片を使用した。結果は、脳Ａβプラークの検出において、ｈｚＡβ−１０はアデュカヌマブよりも感度が高いことを示した。ミクログリアＡβ食作用を、２４時間に亘る可溶性の又は凝集したＡβ−ＦＩＴＣの処置の後、フローサイトメトリーによって評価した。結果は、ｈｚＡβ−１０が、ミクログリアＡβ食作用の増強においてアデュカヌマブよりも性能が良好であることを示した。図８Ｄを参照されたい。
【００４５】
他の実施形態
本明細書に開示の特徴は全て、任意に組み合わせて併用することができる。本明細書に開示のそれぞれの特徴は、同じ、同等又は同様の目的に役立つ代替の特徴に置き換えることができる。したがって、他に明記されない限り、開示のそれぞれの特徴は、一般的な一連の同等又は同様の特徴の一例に過ぎない。
【００４６】
上記の説明から、当業者であれば本発明の本質的な特徴を容易に解明することができ、その趣旨及び範囲を逸脱することなく、様々な用途及び条件に合うように本発明の種々の変化及び変更を適用させることができる。したがって、他の実施形態も添付の特許請求の範囲内である。
【図１ＡＢ】
2021525512.tif 000003
【図１Ｃ】
2021525512.tif 000004
【図２】
2021525512.tif 000005
【図３ＡＢ】
2021525512.tif 000006
【図３Ｃ】
2021525512.tif 000007
【図４Ａ】
2021525512.tif 000008
【図４ＢＣ】
2021525512.tif 000009
【図５】
2021525512.tif 000010
【図６】
2021525512.tif 000011
【図７】
2021525512.tif 000012
【図８ＡＢ】
2021525512.tif 000013
【図８Ｃ】
2021525512.tif 000014
【図８Ｄ】
2021525512.tif 000015
【配列表】
2021525512000001.app
【国際調査報告】
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