(57)【要約】  本発明は、ニキビ緩和及び予防用パッチに関するものであって、ＭｇａＺｎｂＸｃ（式中、ａ、ｂ及びｃは各成分の重量％であって、ａ＋ｂ＋ｃ＝１００重量％であり、０≦ａ≦１００、０≦ｂ≦１００、０≦ｃ≦１０の範囲の中でａ又はｂが最も大きく、ＸはＣａ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｎａ、Ｚｒ、Ｃｅ及びＰよりなる群から選択される１種以上である。）で表示される生体分解性金属に対して抗ニキビ菌の活性を解明することにより、ニキビ緩和及び予防用パッチとしての新規用途を提示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表示され且つ抗ニキビ菌効果を有する生体分解性金属を含む、ニキビ緩和及び予防用パッチ。
［化学式１］
ＭｇａＺｎｂＸｃ
（式中、ａ、ｂ及びｃは各成分の重量％であって、ａ＋ｂ＋ｃ＝１００重量％であり、０≦ａ≦１００、０≦ｂ≦１００、０≦ｃ≦１０の範囲の中でａ又はｂが最も大きく、ＸはＣａ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｎａ、Ｚｒ、Ｃｅ及びＰよりなる群から選択される１種以上である。）
【請求項２】
前記生体分解性金属はマイクロニードルタイプで含まれることを特徴とする、請求項１に記載のニキビ緩和及び予防用パッチ。
【請求項３】
前記生体分解性金属は薄板タイプで含まれることを特徴とする、請求項１に記載のニキビ緩和及び予防用パッチ。
【請求項４】
前記化学式１において、ａ、ｂ及びｃは、各成分の重量％であって、ａ＋ｂ＋ｃ＝１００重量％であり、ｉ）９０≦ａ≦１００、０≦ｂ≦１０、０≦ｃ≦１０又はｉｉ）０≦ａ≦１０、９０≦ｂ≦１００、０≦ｃ≦１０であり、ＸはＣａ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｎａ、Ｚｒ、Ｃｅ及びＰよりなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載のニキビ緩和及び予防用パッチ。
【請求項５】
前記生体分解性金属は、不可避的不純物を含む純度９５％以上の純Ｍｇであることを特徴とする、請求項１に記載のニキビ緩和及び予防用パッチ。
【請求項６】
前記生体分解性金属は、２以上の金属相（ｐｈａｓｅ）がガルバニック回路を生成して分解速度が加速化されることを特徴とする、請求項１に記載のニキビ緩和及び予防用パッチ。
【請求項７】
前記生体分解性金属はＭｇ２Ｃａ相を含むことを特徴とする、請求項６に記載のニキビ緩和及び予防用パッチ。
【請求項８】
前記生体分解性金属はＭｇＺｎ相を含むことを特徴とする、請求項６に記載のニキビ緩和及び予防用パッチ。
【請求項９】
前記生体分解性金属はＣａ２Ｍｇ６Ｚｎ３相を含むことを特徴とする、請求項６に記載のニキビ緩和及び予防用パッチ。
【請求項１０】
前記生体分解性金属は、金属の表面に異なる種類の第２の金属がコートされたことを特徴とする、請求項１に記載のニキビ緩和及び予防用パッチ。
【請求項１１】
前記第２の金属は、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、鉄、ニッケル、亜鉛、ガリウム、セレン、ストロンチウム、ジルコニウム、モリブデン、ニオブ、タンタル、チタン、ケイ素、銀、金、マンガン及びカルシウムよりなる群から選択される１種以上の金属であることを特徴とする、請求項１０に記載のニキビ緩和及び予防用パッチ。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のニキビ緩和及び予防用パッチをニキビ皮膚に付着させて使用する方法。
【請求項１３】
ニキビ緩和及び予防用パッチをニキビ皮膚に付着させる前に、水分供給ステップ又は皮膚鎮静ステップを行うことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニキビ緩和及び予防用パッチに係り、より詳細には、マグネシウムを主成分として含む生体分解性金属の新規用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロニードルは、１９９８年に米国ジョージア工科大学のプラウスニッツグループで半導体プロセス技術を利用してシリコン素子でマイクロニードルアレイを作って薬物送達への応用可能性を提示したことを始めとして、多くの研究が盛んに行われている。マイクロニードルは、皮膚に挿入するとき、マイクロニードルが曲がったり折れたりすることなく挿入できるように十分に高い物理的強度を維持しなければならないので、それに適した強度及び形状の制御が可能な特性が要求される。このような特性を満足させるために、マイクロニードルの素材としてステンレス鋼（ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  ｓｔｅｅｌ）が使用されたが、小さい粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅ）が体に残る場合、炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）が発生するという問題点があり、ポリマー（ＰＬＡ、ＰＧＡ、生分解性コポリマー）の場合、侵襲（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）がなされないという問題点があった。
【０００３】
韓国公開特許第２０１６−００５８２６１号は、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリラクチド−グリコリド共重合体（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ペクチンなどを素材とした水溶性マイクロニードル及びその製造方法を開示しており、韓国登録特許第１６２２３８８号は、シリコンマイクロニードルスタンプ及びその製造方法を開示しており、韓国公開特許第２０１５−０１２１０５３号は、シリコン、二酸化ケイ素、セラミック、金属（ステンレス鋼、チタン、ニッケル、モリブデン、クロム、コバルトなど）、及び合成又は天然の樹脂を素材にして日本脳炎ワクチン抗原をコートしたマイクロニードルを開示した。
【０００４】
上述したように、これまでのマイクロニードルは、経口投与による薬物送達方式又は注射による薬物送達方式を代替することができる代案的薬物投与手段であって、皮膚に分布した痛覚神経を刺激せずに表皮を透過して薬物を送達することができる機器、すなわち一種の薬物送達体として使用されてきた。
【０００５】
一方、本出願人によって既に出願されて公開された韓国公開特許第２０１７−０１１５４４９号には、生体分解性金属を用いたマイクロニードル及びこれを含むパッチが開示されているが、ここでは、薬物送達体としての有用性と共に、これがミネラルとして作用して自体的にしわの改善にも効果を発現することを確認したことがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来の薬物送達手段として開発されたマイクロニードルの主成分である生体分解性金属の新規用途を提供しようとする。
【０００７】
本発明は、特に、別途の薬物を含まなくても、マイクロニードルの主成分として使用された生体分解性金属自体がニキビ原因菌に対する抗菌活性を発現することを確認することにより、特定の生体分解性金属のニキビ緩和及び予防用としての新規用途を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、化学式１で表示される生体分解性金属であり、抗ニキビ菌効果を有する、ニキビ緩和及び予防用パッチを提供する。
【０００９】
［化学式１］
【００１０】
ＭｇａＺｎｂＸｃ
【００１１】
式中、ａ、ｂ及びｃは各成分の重量％であって、ａ＋ｂ＋ｃ＝１００重量％であり、０≦ａ≦１００、０≦ｂ≦１００、０≦ｃ≦１０の範囲の中でａ又はｂが最も大きく、ＸはＣａ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｎａ、Ｚｒ、Ｃｅ及びＰよりなる群から選択される１種以上である。
【００１２】
このようなニキビ緩和及び予防用パッチにおいて、生体分解性金属は、マイクロニードルタイプで含まれるか、あるいは薄板タイプで含まれ得る。
【００１３】
本発明の好適な一実施形態によるニキビ緩和及び予防用パッチにおいて、生体分解性金属は、前記化学式１中、ａ、ｂ及びｃは、各成分の重量％であって、ａ＋ｂ＋ｃ＝１００重量％であり、ｉ）９０≦ａ≦１００、０≦ｂ≦１０、０≦ｃ≦１０又はｉｉ）０≦ａ≦１０、９０≦ｂ≦１００、０≦ｃ≦１０であり、ＸはＣａ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｎａ、Ｚｒ、Ｃｅ及びＰよりなる群から選択される１種以上であり得る。
【００１４】
最も好適な一実施形態によるニキビ緩和及び予防用パッチにおいて、前記生体分解性金属は、不可避的不純物を含む純度９５％以上の純Ｍｇであり得る。
【００１５】
本発明の一実施形態によるニキビ緩和及び予防用パッチにおいて、生体分解性金属は、２以上の金属相（ｐｈａｓｅ）がガルバニック回路を生成して分解速度が加速化されるものであり得る。このような生体分解性金属は、Ｍｇ２Ｃａ相を含むもの、ＭｇＺｎ相を含むもの、又はＣａ２Ｍｇ６Ｚｎ３相を含むものであり得る。
【００１６】
本発明の一実施形態によるニキビ緩和及び予防用パッチにおいて、生体分解性金属は、ガルバニック回路を形成させるために、金属の表面に異なる種類の第２の金属がコートされたものであり得る。この時、前記第２の金属は、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、鉄、ニッケル、亜鉛、ガリウム、セレン、ストロンチウム、ジルコニウム、モリブデン、ニオブ、タンタル、チタン、ケイ素、銀、金、マンガン及びカルシウムよりなる群から選択される１種以上の金属であり得る。
【００１７】
本発明の他の一実施形態では、上述したニキビ緩和及び予防用パッチをニキビ皮膚に付着させて使用する方法を提供する。
【００１８】
より好適な一実施形態による方法において、ニキビ緩和及び予防用パッチをニキビ皮膚に付着させる前に、水分供給ステップ又は皮膚鎮静ステップを行うことができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の生体分解性金属を適用したパッチは、別途の薬物の担持なしで自体的にニキビ原因菌に対する抗菌活性を持ってニキビ緩和及び予防用として有用であり、これを様々な形で製作して皮膚に適用する簡易な方法によってニキビを予防するか、或いは誘発されたニキビに対する緩和効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】生体分解性金属で構成されシートにマイクロニードルを加工したマイクロニードルの展開図である。
【００２１】
【図２】加工されたマイクロニードルを曲げ加工したマイクロニードルの概略図である。
【００２２】
【図３】チップ形態のマイクロニードルとマイクロニードルホルダーの概略図である。
【００２３】
【図４】本発明のマイクロニードルの試作品写真（Ａ）及びその屈曲特性を示す写真（Ｂ）である。
【００２４】
【図５】本発明のマイクロニードルパッチの写真である（Ａ：使用前、Ｂ：使用後）。
【００２５】
【図６】抗菌試験に提供した本発明のマイクロニードルの試験片の写真である。
【００２６】
【図７−９】抗菌ないし抗真菌試験結果写真であって、図７はＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ  ＡＴＣＣ  ６９１９に対する試験結果であり、図８はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  １２２２８に対する試験結果であり、図９はＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ  ＡＴＣＣ  ２８１８８に対する試験結果である。
【００２７】
【図１０−１１】本発明のマイクロニードルパッチの様々な形状を例示して示す概略図である。
【００２８】
【図１２】本発明のマイクロニードルパッチを適用して官能評価した結果の写真であって、付着前（左）、付着状態（中央）及び付着後８時間経過時点の皮膚状態（右側）を示す。
【００２９】
【図１３】本発明のマイクロニードルパッチを適用した臨床試験において試験対象者に付着した一例を示す写真である。
【００３０】
【図１４】臨床試験においてニキビ重症度システム（Ｇｌｏｂａｌ  Ａｃｎｅ  Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＧＡＧＳ）による評価で顔部位を６つの区間に分けた試験部位を示すイメージである。
【００３１】
【図１５】臨床試験においてニキビ重症度システム（Ｇｌｏｂａｌ  Ａｃｎｅ  Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＧＡＧＳ）による評価で図１４に示した各区間の固有ファクター（ｆａｃｔｏｒ）及びグローバルスコア（ｇｌｏｂａｌ  ｓｃｏｒｅ）を示す表である。
【００３２】
【図１６】臨床試験において皮膚刺激評価で異常反応有無及び等級を分類した表である。
【００３３】
【図１７】臨床試験において試験対象にマグネシウムマイクロニードルパッチを付着させて試験期間の経過に伴う写真撮影の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
ニキビとは、毛皮脂腺単位の慢性炎症疾患であって、面皰（Ｃｏｍｅｄｏｎｅ、毛包の中に溜まって硬くなった皮脂）、丘疹（Ｐａｐｕｌｅ、直径１ｃｍ未満の皮膚の隆起病変）、膿疱、結節、偽性嚢胞などのさまざまな皮膚変化が現れ、これに伴う後遺症として、凹んだ傷跡又は拡大した傷跡を残すこともある。皮脂腺が集まっている顔、首、胸などに多く発生し、毛を作る毛包に付いている皮脂腺に炎症が生じる疾患をいう。
【００３５】
ニキビの正確な原因は明らかに解明されていないが、一つの原因ではなく、様々な原因が複合的に作用し、その一つの原因として、思春期に男性ホルモンの過剰により皮脂腺の分泌が盛んになり、毛包の上皮が異角化症（不完全で未熟な角質化を示す異常角質化）を起こし、毛包が詰まってニキビの基本病変である面皰が形成されることがある。
【００３６】
このうち、バクテリアによるニキビの発振は、毛包内に常駐する菌のうち、特にプロピオニバクテリウムアクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）がその原因菌として知られている。このニキビ原因菌は、皮脂を食べて育ちながらトラブル発生の主な原因になるが、健常者では、この菌が皮膚に存在しても全く問題を起こさないが、毛包が詰まって皮脂が毛包内に蓄積されてからは皮脂を食べて速く育つ。
【００３７】
また、このニキビ原因菌は、脂肪（トリグリセリド）を食べた後、バターのような物質、すなわち脂肪酸を排泄する。このような化学的変化は、健康な弱酸性皮膚が油分のｐＨバランスが崩れながらアルカリ化され、結局は皮膚自体の機能が低下し、皮膚の悪循環をもたらす。このようなプロピオニバクテリウムアクネスによって誘発されるニキビを予防及び緩和させるために、通常、塗る薬又は飲む薬の治療方法が提案されてきたのはいうまでもよい。
【００３８】
一方、本出願人は、生体分解性金属を用いたマイクロニードルを開発したことがあり、これに対して既に出願したことがある（韓国公開特許第２０１７−０１１５４４９号）。
【００３９】
本発明は、このように開発されたマイクロニードルに対して多角的な研究を行い続けた結果として得られたもので、当該生体分解性金属がニキビ原因菌としてのプロピオニバクテリウムアクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）に対して抗菌活性を発現することを解明することにより、このような生体分解性金属の新規用途を案出したのである。
【００４０】
本発明において生体適合性金属に関連する記載、これをマイクロニードルのタイプに製造する方法に関連する記載、及び皮膚で起こる一連の金属的反応に関連する記載は、韓国公開特許第２０１７−０１１５４４９号に記載された内容による。
【００４１】
ただし、本発明において、生体分解性金属は、薬物送達体として提案されたマイクロニードルに限定されるものではなく、それ自体がニキビ原因菌に対する抗菌活性を有する機能的な構成として単独で作用するものであることを解明する。
【００４２】
本発明では、マグネシウム又は亜鉛を単独素材にした生体分解性金属と前記金属にカルシウムなどの異なる種類の金属を混合した生体分解性金属を薄板タイプ又はマイクロニードルタイプに製造し、これらのニキビ原因菌に対する抗菌活性を評価した。その結果、マグネシウム、カルシウム又は亜鉛を単独素材にして製造された生体分解性金属又は前記金属に異なる種類の金属が特定の範囲で混合された合金は、別途の薬物封入なしでもそれ自体が抗菌活性を有することを確認することができた。
【００４３】
したがって、本発明は、ある観点から、化学式１で表示される生体分解性金属であり、抗ニキビ菌効果を有する、ニキビ緩和及び予防用パッチを提供する。
【００４４】
［化学式１］
【００４５】
ＭｇａＺｎｂＸｃ
【００４６】
式中、ａ、ｂ及びｃは、各成分の重量％であって、ａ＋ｂ＋ｃ＝１００重量％であり、０≦ａ≦１００、０≦ｂ≦１００、０≦ｃ≦１０の範囲の中でａ又はｂが最も大きく、ＸはＣａ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｎａ、Ｚｒ、Ｃｅ及びＰよりなる群から選択される１種以上である。
【００４７】
前記生体分解性金属は、マグネシウム又は亜鉛を最も多く含むことが好ましい。したがって、前記化学式１中、ａ、ｂ及びｃは、各成分の重量％であって、ａ＋ｂ＋ｃ＝１００重量％であり、ｉ）９０≦ａ≦１００、０≦ｂ≦１０、０≦ｃ≦１０又はｉｉ）０≦ａ≦１０、９０≦ｂ≦１００、０≦ｃ≦１０であり、ＸはＣａ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｎａ、Ｚｒ、Ｃｅ及びＰよりなる群から選択される１種以上であることが好ましいことが分かる。
【００４８】
本発明に係る生体分解性金属は、皮下又は上皮に付着又は挿入された後、吸収及び分解され、金属イオン及び分解酸化物を体内に放出する特性を有する金属であって、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）、亜鉛（Ｚｎ）などは、アルカリ土類金属系の生体分解性金属であって、下記反応式１〜３で表したように、水と反応して水素ガスを放出するカニズムを有する。
【００４９】
［反応式１］
【００５０】
Ｍｇ＋２Ｈ２Ｏ→Ｍｇ（ＯＨ）２＋Ｈ２（ガス）
【００５１】
［反応式２］
【００５２】
Ｃａ＋２Ｈ２Ｏ→Ｃａ（ＯＨ）２＋Ｈ２（ガス）
【００５３】
［反応式３］
【００５４】
Ｚｎ＋２Ｈ２Ｏ→Ｚｎ（ＯＨ）２＋Ｈ２（ガス）
【００５５】
本発明において、前記生体分解性金属は、マグネシウム（Ｍｇ）、亜鉛（Ｚｎ）などを単独素材にして製造されることが好ましく、特に生体適合性に優れ且つ正常細胞又は組織で毒性を示さない観点から最も好ましくは、マグネシウム単独素材である生体分解性金属であり得る。ここで、マグネシウム単独素材又は亜鉛単独素材という用語は、金属生産過程で発生する不可避的不純物を含むこと以外に、純度９５％以上の純マグネシウム又は純亜鉛を意味する。
【００５６】
他方で、生体分解性金属は、皮下又は上皮における分解速度を加速化させるために、すなわちガルバニック回路を生成させるために、２以上の金属を素材にして製造できる。本発明において、前記生体分解性金属は、ガルバニック回路を生成するために、前記化学式１で表示される生体分解性金属の表面に異なる種類の第２の金属がコートされたものであり得る。この時、第２の金属は、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、鉄、ニッケル、亜鉛、ガリウム、セレン、ストロンチウム、ジルコニウム、モリブデン、ニオブ、タンタル、チタン、ケイ素、銀、金、マンガン、カルシウムなどを例示することができるが、これに限定されるものではない。この時、前記鉄（Ｆｅ）を含む場合、特にクロムやニッケルが含まれてはならない。
【００５７】
本発明のニキビ緩和及び予防用パッチにおける生体分解性金属は、薄板タイプ又はマイクロニードタイプで含まれ得るが、一例として、マイクロニードルは、レーザーカッティング、板金工程、キャスティング工法、エッチング工法などの業界の通常的な溶解性マイクロニードルを製造する方法で製造でき、その製造方法は、特に限定されない。例えば、図１に示すように、生体分解性金属で構成された薄板型シート１０を製造した後、レーザーカッティング機（マーキング機）を用いて一定の形状に成形した後、治具プレスで曲げることにより、マイクロニードルを製造することができる。
【００５８】
本発明では、このような生体分解性金属を含むパッチは、別途の薬物コーティングや担持なしに、それ自体でニキビ緩和及び予防用の目的で使用することができる。
【００５９】
図２は加工されたマイクロニードルを皮膚貫通のために曲げ加工したマイクロニードル１１の概略図である。
【００６０】
本発明に係るマイクロニードルは、一体型で構成されるか、或いは図３に示すようにマイクロニードル２０とマイクロニードルホルダー２１で構成され得る。マイクロニードルホルダー２１の形態を活用したマイクロニードルは、ニードルが挿入された後、ねじれを加えて人為的にニードルが皮下に残存するようにすることもできる。
【００６１】
図４は本発明の一実施形態によって製造されたマイクロニードルの試作品写真（Ａ）及びその屈曲特性を示す写真（Ｂ）である。
【００６２】
本発明によれば、このようなマイクロニードルを皮膚に適用することを容易にする観点から、パッチタイプに製作することができる。
【００６３】
図５に示すように、前記マイクロニードルパッチは、マイクロニードルを皮膚に固定させるためのものであって、マイクロニードル、及び前記マイクロニードルの反対面に形成されたパッチ部で構成されている。前記パッチ部の大きさ、形状及び素材は、特別な制限なく利用可能である。図５のＢに示すように、使用されたマイクロニードルは、皮下でイオン化されて変色することがある。
【００６４】
本発明の生体分解性金属を含むパッチを皮膚に適用する際には、他の薬物の封入や塗布なしにも、それ自体で抗ニキビ効果を発現するが、その効果を倍加させるか或いは効果発現時間を短縮させる意味で、本発明のパッチを付着させる前に、水分供給ステップや皮膚鎮静ステップを伴うことが好ましい。ここで、水分供給ステップは、様々な保湿用化粧品、例えばトナー又は水分供給用ミストなどの塗布によって行われてもよく、皮膚鎮静ステップは、皮膚紅潮又はニキビを鎮静させることが知られている機能性化粧品又は医薬品を塗布する方法によって行われ得るが、これに限定されるものではない。
【００６５】
このような水分供給ステップ又は皮膚鎮静ステップは、単に、本発明の生体分解性金属を含むパッチの抗ニキビ効果を補助する役割を果たすだけであり、このようなステップが先行されてこそ本発明のパッチの効果が実現されるのではないのはいうまでもよい。
【００６６】
本発明は、マイクロニードルのタイプで適用された生体分解性金属のニキビ緩和及び予防用としての新規用途を開発したものであり、このような用途は、以下に記載される実施例を介して、上述した生体分解性金属を試験片にして、皮膚に存在する様々な菌に対してその活性を評価し、それが択一的にニキビ原因菌に対してのみ活性を示すことを解明する方法によって確認しようとする。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００６８】
＜実施例１＞
【００６９】
本発明の生体分解性金属に対する抗ニキビ菌活性を評価するために、韓国化学融合試験研究院に試料を提供して、次の方法で抗菌及び抗真菌試験を行った。
【００７０】
このとき、提供した試料は、製造時に発生する不可避的不純物を含む純Ｍｇ（純度９５％以上のマグネシウム）を用いてシートを製作（厚さ１００μｍ）したものであって、図６の写真のように所定の規格に切断して実験の試料として使用した。
【００７１】
＜試験装置及び材料＞
【００７２】
（１）試験装置
【００７３】
オートクレーブ（コアテック製、韓国）
【００７４】
乾燥器（Ｊｉｓｉｃｏ製、韓国）
【００７５】
水浴（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ製、米国）
【００７６】
インキュベーター（Ｍｅｍｍｅｒｔ製、ドイツ）
【００７７】
ｐＨメーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｏｒｉｏｎ製、米国）
【００７８】
ストップウォッチ（Ｔｉｍｅ  Ａｒｔ製、日本）
【００７９】
ボルテックスミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ製、米国）
【００８０】
コンテナー（いわきパイレックス（登録商標）製、日本）
【００８１】
滅菌ピペット（Ｆａｌｃｏｎ製、米国）
【００８２】
ペトリー皿（ＳＰＬ製、韓国）
【００８３】
容量フラスコ（Ｍｙｕｎｇ  Ｓｕｎｇ製、韓国）
【００８４】
メカニカルシェーカー（Ｊｉｓｉｃｏ製、韓国）
【００８５】
クリーンベンチ（スゴンヤンヘン製、韓国）
【００８６】
コロニー計数器（徳友科学製、韓国）
【００８７】
嫌気性容器（Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）（ＤＩＦＣＯ製、米国）
【００８８】
（２）試験材料
【００８９】
１）試験菌株
【００９０】
韓国微生物保存センターから分譲を受ける。
【００９１】
−Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ  ＡＴＣＣ  ６９１９
【００９２】
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  １２２２８
【００９３】
−Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ  ＡＴＣＣ  ２８１８８
【００９４】
２）培地及び試薬
【００９５】
−強化クロストリジア培地ブロス（Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ｂｒｏｔｈ）（ＤＩＦＣＯ製、米国）
【００９６】
−ブレインハートインフュージョンブロス（Ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｂｒｏｔｈ）（ＤＩＦＣＯ製、米国）
【００９７】
−サブローデキストロースブロス（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ｂｒｏｔｈ）（ＤＩＦＣＯ製、米国）
【００９８】
−強化クロストリジア寒天培地（Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ａｇａｒ）（ＤＩＦＣＯ製、米国）
【００９９】
−トリプシンソイ寒天培地（Ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ａｇａｒ）（ＤＩＦＣＯ製、米国）
【０１００】
−サブローデキストロース寒天培地（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ａｇａｒ）（ＤＩＦＣＯ製、米国）
【０１０１】
−Ｇａｓｐａｋ  ＴＭ  ＥＺ（ＤＩＦＣＯ製、米国）
【０１０２】
−０．０５％ポリソルベート８０溶液
【０１０３】
−滅菌流動パラフィン
【０１０４】
（３）試験方法（Ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄ）
【０１０５】
１）試験方法
【０１０６】
ａ．試験菌の前培養及び調製
【０１０７】
Ｐ．ａｃｎｅｓは、強化クロストリジア培地（ＲＣＭ）ブロス（Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ｂｒｏｔｈ）に接種して（３５±１）℃で３日間培養した。培養された菌液を新しいＲＣＭブロスに接種し、上記と同様の条件で培養した後、この過程を１回さらに繰り返し行った。菌株のすべての培養過程で滅菌流動パラフィンを用いて嫌気的条件を維持させた。その後、試験菌液として使用した。
【０１０８】
Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、ブレインハートインフュージョンブロス（Ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｂｒｏｔｈ）に接種して（３５±１）℃で（１８〜２４）時間培養した後、試験菌液として使用した。
【０１０９】
Ｔ．ｒｕｂｒｕｍは、サブローデキストロース寒天培地（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ａｇａｒ）に接種して（２５±１）℃で１４日間培養した。試験菌が育った固体培地上に０．０５％ポリソルベート８０溶液（０．０５％  ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を分注し、スプレッダー（ｓｐｒｅａｄｅｒ）を用いて胞子を外した後、ガーゼを通過させて菌糸を除去した。このような方式で調製された胞子液（ｓｐｏｒｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を（１〜９）×１０７ＣＦＵ／ｍＬとなるように調整して試験菌液として使用した。
【０１１０】
ｂ．試験手順
【０１１１】
予め用意された強化クロストリジア寒天培地（Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ａｇａｒ）、トリプシンソイ寒天培地（Ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ａｇａｒ）及びサブローデキストロース寒天培地（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ａｇａｒ）上にそれぞれの菌培養液を滅菌された綿棒で均等に接種し、培地の中央に、用意された試料（２０ｍｍ×２０ｍｍ）をのせた。その後、Ｐ．ａｃｎｅｓは嫌気条件（３５±１）℃で５日間培養し、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは（３５±１）℃で（２４±２）時間、Ｔ．ｒｕｂｒｕｍは（２５±１）℃で７日間培養した。その後、試料周囲の菌成長阻止帯（Ｚｏｎｅ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を測定する方式で試験を行った。
【０１１２】
２）結果の判読
【０１１３】
次の式１に基づいて成長阻止帯の幅（Ｗ）を計算した。
【０１１４】
＜式１＞
【０１１５】
Ｗ＝（Ｔ−Ｄ）／２
【０１１６】
Ｗ：阻止帯の幅（ｍｍ）
【０１１７】
Ｔ：試料と阻止帯の全体直径（ｍｍ）
【０１１８】
Ｄ：試料の直径（ｍｍ）
【０１１９】
【表１】
2021523211.tif 000002
【０１２０】
上記表１にまとめたように、Ｐ．ａｃｎｅｓに対する抗菌効果の結果、試料と阻止帯の全体直径（Ｔ）は３２ｍｍ、試料の直径（Ｄ）は２０ｍｍと観察された。よって、上記の計算式に基づいて、阻止帯の幅（Ｗ）は６．０ｍｍと確認された（図７参照）。
【０１２１】
Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに対する抗菌効果の結果、試料と阻止帯の全体直径（Ｔ）は２０ｍｍ、試料の直径（Ｄ）は２０ｍｍと観察された。したがって、上記の計算式に基づいて、阻止帯の幅（Ｗ）は０．０ｍｍと確認された（図８参照）。
【０１２２】
Ｔ．ｒｕｂｒｕｍに対する抗真菌効果の結果、試料と阻止帯の全体直径（Ｔ）は２０ｍｍ、試料の直径（Ｄ）は２０ｍｍと観察された。したがって、上記の計算式に基づいて、阻止帯の幅（Ｗ）は０．０ｍｍと確認された（図９参照）。
【０１２３】
本試験条件の下で、試料［Ｍｇ  Ｍｉｃｒｏ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｍｕｌｔｉ  Ｃａｒｅと命名］に対するＰ．ａｃｎｅｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ及びＴ．ｒｕｂｒｕｍの阻止帯は、それぞれ６．０ｍｍ、０．０ｍｍ及び０．０ｍｍであった。
【０１２４】
その結果、本発明の生体分解性金属は、ニキビ原因菌に対してのみ抗菌活性を有し、残りは抗菌ないし抗真菌効果が観察されなかった。
【０１２５】
＜実施例２＞マイクロニードル及びパッチの製作
【０１２６】
前記実施例１の抗菌活性の評価時に提供したシートと同じ生体分解性金属シートを作製した後、レーザーマーキング機（ＪＴＹ  ＦＩＢＥＲ  ＭＡ２０、ＪＴＷシステム）を用いてマイクロニードルを製作した。この時、マイクロニードルの先端角は１５°、３０°及び３５°とし、ニードルの高さは０．５ｍｍ、１．０ｍｍ及び１．５ｍｍとした。
【０１２７】
マイクロニードルの針が生成された反対側の面に接着剤の塗布されたハイドロコロイドパッチを付着させてマイクロニードルパッチを製造した。製造されたマイクロニードルパッチは、包装及び滅菌させた。
【０１２８】
このようなマイクロニードルパッチは、ニキビの緩和及び予防のための観点から様々な形状に製作できるが、図１０及び図１１に示したような形状を一例として挙げることができる。
【０１２９】
こうして得られたマイクロニードルパッチを、ニキビ皮膚を持っている１５歳の男子学生７人が洗顔後、顔のニキビ部位のいずれか一箇所に付着するようにした後、ニキビ緩和効果を７日間観察した。
【０１３０】
評価基準として、ニキビ治療効果が著しい場合、つまり、ニキビ皮膚の面積が明らかに減少し且つニキビ炎症程度も明らかに減る場合には５点、このような改善程度が中等度である場合には４点、軽度である場合には３点、不変である場合には２点、ニキビが悪化した場合には１点にして評価した後、合計点をもって総合判定を行った。その結果を下記表２に示す。
【０１３１】
【表２】
2021523211.tif 000003
【０１３２】
【０１３３】
上記表２から分かるように、評価結果、殆どの被験者の評価結果が５点を示して、実質的にニキビ緩和に大きな影響を与える。
【０１３４】
一方、図１２は額のニキビを持つ被験者のマイクロニードルパッチ付着前の皮膚状態（左側）、付着状態（中央）、及び付着後８時間経過後の皮膚状態（右側）を示す写真であって、この写真から、本発明のマイクロニードルパッチ付着８時間後に即時ニキビ緩和効果を確認することができる。
【０１３５】
＜実施例３＞臨床試験
【０１３６】
本発明の生体分解性金属に対するニキビ性皮膚適合性を評価するために、韓国の忠清北道化粧品臨床研究支援センターに依頼して次の方法で臨床評価を行った。
【０１３７】
（１）試験方法
【０１３８】
満１８〜４０歳の成人男女を対象とした。試験部位に１日１回試験製品を定められた使用方法に従って使用するようにした。目視評価によって効果を評価した。評価は、センターの内部指針書（ＳＯＰ）に準じて行った。食品医薬品安全処の告示に規定していない事項は、参考文献を参照して行った。試験部位は、試験対象者の顔面部位とした。
【０１３９】
定められた使用方法は、次のとおりである。
【０１４０】
［１］きれいに洗顔した後、皮膚を整える。
【０１４１】
［２］高濃度のセンテラアンプル（水分供給ないし鎮静効果）入りの注射器の栓を分離する。
【０１４２】
［３］マグネシウムパッチ（純度９５％以上のマグネシウムで製作）のマイクロキャリアに高濃度のセンテラアンプルを適量滴定する。
【０１４３】
［４］マグネシウムパッチに手が触れないように保護フィルムを除去する。
【０１４４】
［５］就寝の前、パッチをケアの必要なところに位置するように密着させた後、刺激を感じることができるように複数回押す。
【０１４５】
［６］翌日の朝、パッチを取り外す。
【０１４６】
［７］パッチを取り外した位置にハイドロコロイドバンドを付着させて昼間に維持するようにする。
【０１４７】
試験者にマグネシウムパッチを適用した一例は、図１３のとおりである。
【０１４８】
試験対象者は、選定基準に適合し、除外基準が適用されない者である２０人を選定した。
【０１４９】
試験対象者の選定・除外基準に基づいて研究に適した試験対象者を選定し、試験対象者の皮膚状態を確認した後、目視評価及び写真撮影（ＶＩＳＩＡ−ＣＲ）をそれぞれ製品使用前（０日）、製品使用１日後、製品使用３日後、製品使用４日後及び製品使用５日後に実施した
【０１５０】
（２）測定及び評価方法
【０１５１】
１）準備ステップ
【０１５２】
評価のために、試験対象者は恒温・恒湿（２２±２℃、ＲＨ４０〜６０％）条件の待機室で３０分間安定をとり、皮膚表面の温度と湿度を測定空間の環境に適応するようにした。客観的測定のために、機器評価は、研究者１人が毎測定時に同じ部位を測定した。目視評価は、研究者２人が評価した。
【０１５３】
【０１５４】
２）写真撮影
【０１５５】
写真撮影は、カメラ（Ｃａｎｏｎ製、ＥＯＳ６Ｄ、日本）が取り付けられた顔面撮影機（ＶＩＳＩＡ−ＣＲ、Ｃａｎｆｉｅｌｄ、米国）を用いた顔全面写真撮影を行った。撮影にはＳｔａｎｄａｒｄ２測定モードを使用した。顔面撮影機（ＶＩＳＩＡ−ＣＲ、Ｃａｎｆｉｅｌｄ）は、試験対象者の動きを最小限に抑えるために額と顎を固定し、撮影時の光の変化を知ることができるようにグレーカード（ｇｒａｙ  ｃａｒｄ）が一緒に撮影される。測定は、製品使用前（０日）、製品使用１日後、製品使用３日後、製品使用５日後に行った。同じ部位の撮影のためにオーバーレイ（ｏｖｅｒｌａｙ）機能を使用した。本研究では、イメージのみを活用した。
【０１５６】
３）目視評価
【０１５７】
目視評価は、二人の玄人によって、二重盲検試験（Ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｔｅｓｔ）で評価した。
【０１５８】
二人の玄人の評価に差がある場合には、適合性は低い段階、皮膚異常反応は高い段階をそれぞれ選択して評価した。
【０１５９】
目視評価は、ニキビ重症度システム（Ｇｌｏｂａｌ  Ａｃｎｅ  Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＧＡＧＳ）を介して評価した。ＧＡＧＳは、顔面部位、顔及び背部位を毛皮脂腺単位（Ｐｉｌｏｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｕｎｉｔｓ）の表面積分布及び密度によって６つの区間に分けて分析し、各区間ごとに固有ファクター（ｆａｃｔｏｒ）を付与した後、病変部位に応じてローカルスコア（Ｌｏｃａｌ  ｓｃｏｒｅ）を与えてグローバルスコア（Ｇｌｏｂａｌ  ｓｃｏｒｅ）に反映し、評価を定めて評価した。６つの区間は、図１４に示したとおりである。
【０１６０】
また、各区間の固有ファクター（ｆａｃｔｏｒ）及びグローバルスコア（ｇｌｏｂａｌ  ｓｃｏｒｅ）は、図１５に示したとおりである。
【０１６１】
４）アンケート評価
【０１６２】
アンケートは、試験対象者の訪問（製品使用５日後）の際にそれぞれの試験対象者を対象に、試験製品の一般的評価（使用感）、使用後の変化評価、製品に対する満足度、異常反応などをアンケート調査した。
【０１６３】
ａ．有効性評価アンケート調査（Ｇｌｏｂａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ）
【０１６４】
試験対象者によるアンケート評価は、試験製品の使用後の測定項目に対して、非常に満足（５）、満足（４）、普通（３）、不満足（２）、非常に不満足（１）の５つの段階で直接アンケート調査に答えるようにした。研究者は、各答弁に対する試験対象者数の百分率を求めて試験製品の効能有無を判断した。
【０１６５】
ｂ．製品記号度のアンケート調査
【０１６６】
試験製品と使用後の製品使用感について試験対象者が直接アンケート調査に答えるようにした。評価項目は、一般的評価（使用感）と製品に対する満足度について非常に満足（５）、満足（４）、普通（３）、不満足（２）及び非常に不満（１）の５段階で評価するようにした。
【０１６７】
５）順応度評価
【０１６８】
製品使用の開始日から終了時点まで順応日誌に製品塗布有無及び異常反応有無を作成するようにした。
【０１６９】
６）皮膚刺激評価
【０１７０】
試験製品に対して異常反応である紅斑（Ｅｒｙｔｈｅｍａ）、浮腫（Ｅｄｅｍａ）、鱗屑（Ｓｃａｌｉｎｇ）、掻痒（Ｉｔｃｈｉｎｇ）、刺痛（Ｓｔｉｎｇｉｎｇ）、灼熱感（Ｂｕｒｎｉｎｇ）、こわばり（Ｔｉｇｈｔｎｅｓｓ）、チクチクする痛み（Ｐｒｉｃｋｌｉｎｇ）又は他の異常反応が発生すか否かを綿密に観察し、皮膚異常反応が現れるとき、重症度によって等級を表示し、これに対する検査所見を作成した。訪問日ではなくても、テストにそれ以上参加することができなくなる場合は、本人の署名が添付された「試験参加放棄同意書」を書くようにした。
【０１７１】
異常反応有無及び等級分類表は、図１６のとおりである。
【０１７２】
（３）結果分析
【０１７３】
１）目視評価
【０１７４】
目視評価は、製品の使用前後の差を比較して行った。評価方法は、前記（２）の３）項目に記載された方法を用いて行った。
【０１７５】
２）統計分析
【０１７６】
評価結果は、製品の使用前後の変化について対応のあるｔ−検定（ｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）法を用いた。統計結果は、生物学的統計分析で最も多く使用する有意差５％（ｐ＜０．０５）のとき、統計的有意性があると見なした。
【０１７７】
３）アンケート評価
【０１７８】
有効性評価アンケート調査の結果と製品嗜好度評価アンケート調査の結果に基づいて評価した。
【０１７９】
４）統計分析プログラムは、ＳＰＳＳバージョン１０．０ソフトウェアを使用した。
【０１８０】
（４）結果
【０１８１】
人体適用試験に参加した試験対象者は、平均年齢２１．９±２．９の２０人の健康な成人男女を選定した。参加した試験対象者２０人が途中で脱落せずに最終試験を完了した。
【０１８２】
１）目視評価結果
【０１８３】
目視評価の結果、グローバルスコア（Ｇｌｏｂａｌ  ｓｃｏｒｅ）による評価等級は、一部試験者の場合にはｍｏｄｅｒａｔｅからｍｉｌｄに減少することを確認することができた。全体試験対象者のグローバルスコア（Ｇｌｏｂａｌ  ｓｃｏｒｅ）による評価は、ｍｉｌｄであって、有意な変化はなかった。
【０１８４】
一方、試験製品は、製品使用前（０日）と比較して試験製品使用１日後、製品使用３日後、製品使用５日後で統計的に有意差があることが確認された（ｐ＜０．０５）。
【０１８５】
評価期間の間、試験製品による皮膚有害事例は発生しなかった。分析結果は下記表３のとおりである。
【０１８６】
【表３】
2021523211.tif 000004
【０１８７】
２）アンケート調査の結果
【０１８８】
ａ．有効性評価アンケート調査の結果
【０１８９】
試験製品使用後の測定項目についてのアンケート調査の結果は、下記表４のとおりである。
【０１９０】
【表４】
2021523211.tif 000005
【０１９１】
（注）＊５：非常に満足、４：満足、３：普通、２：不満足、１：非常に不満足
【０１９２】
アンケート評価の結果、ニキビ改善効果項目について試験対象者の１００％が満足以上と評価した。
【０１９３】
ｂ．嗜好度アンケート調査の結果
【０１９４】
製品使用後の製品の満足度、使用感、使用後の変化について試験対象者が感じる嗜好度を調査した。調査結果は、下記表５のとおりである。
【０１９５】
【表５】
2021523211.tif 000006
【０１９６】
（注）＊５：非常に満足、４：満足、３：普通、２：不満足、１：非常に不満足
【０１９７】
アンケート評価の結果、製品の満足度部分の色、粘度項目について試験対象者
【０１９８】
の１００％が普通以上と評価した。使用感部分では、刺激程度項目について試験対象者の１００％が普通以上と評価し、皮膚吸収程度、接着項目について試験対象者の９５％が普通以上と評価した。そして、使用後の変化部分では、柔らかさ、しっとり、皮脂改善効果項目について試験対象者の１００％が普通以上と評価した。
【０１９９】
３）皮膚刺激評価
【０２００】
試験対象者に対する皮膚刺激評価（自己評価）の結果は、下記表６のとおりである。
【０２０１】
【表６】
2021523211.tif 000007
【０２０２】
試験対象者は、異常反応が発生し次第に研究者に報告するようにした。また、アンケート用紙上の皮膚刺激有無項目に表記するようにした。本試験の進行中に試験対象者を対象にしたアンケート調査の結果、試験対象者全員の試験製品に対する皮膚異常反応が観察されなかった。
【０２０３】
また、研究者による目視評価においても、皮膚異常反応は観察されなかった。
【０２０４】
４）写真撮影の結果
【０２０５】
試験対象者の全てに対して写真撮影を行ったが、ここではすべてを図示せず、その一部だけを図１７に示した。
【０２０６】
図１７から、試験材料として使用されたマグネシウムパッチの形状や付着のタイプについて確認することができ、ニキビ緩和効果の目視観測の根拠を確認することができるのはもちろんである。
【０２０７】
本発明のニキビ緩和及び予防用マイクロニードル及びマイクロニードルパッチに対する皮膚刺激評価及び皮膚侵襲効果は、本出願人によって既に出願されて公開された韓国公開特許第２０１７−０１１５４４９号の実験によって解明したことがあり、これにより本発明の生体分解性金属を含むパッチは、正常細胞又は組織で毒性を示さずに、皮膚への刺激なしで侵襲してニキビ原因菌に対する抗菌活性を発現することができることにより、簡易で安全なニキビ緩和及び予防に寄与することができる。
【０２０８】
一方、このような生体適合性に優れた毒性のない生体分解性金属を含むパッチの選択的抗ニキビ菌活性効果は、反応式１〜３で表される金属の分解過程で発生するＯＨ−イオンによる局地的ｐＨの増加が重要な原因であると予測され、純マグネシウム又は純亜鉛金属に前記化学式１による成分が含まれて分解速度が加速化される場合には、より迅速な抗菌効果が期待される。
【０２０９】
【産業上の利用可能性】
【０２１０】
本発明の生体分解性金属を適用したパッチは、別途の薬物の担持なしで自体的にニキビ原因菌に対する抗菌活性を持つため、ニキビ緩和及び予防のために有用であり、これを様々なタイプに製作して皮膚に適用する簡易な方法によってニキビを予防するか、或いは誘発されたニキビに対する緩和用パッチとして有用であり得る。
【図１】
2021523211.tif 000008
【図２】
2021523211.tif 000009
【図３】
2021523211.tif 000010
【図４】
2021523211.tif 000011
【図５】
2021523211.tif 000012
【図６】
2021523211.tif 000013
【図７】
2021523211.tif 000014
【図８】
2021523211.tif 000015
【図９】
2021523211.tif 000016
【図１０】
2021523211.tif 000017
【図１１】
2021523211.tif 000018
【図１２】
2021523211.tif 000019
【図１３】
2021523211.tif 000020
【図１４】
2021523211.tif 000021
【図１５】
2021523211.tif 000022
【図１６】
2021523211.tif 000023
【図１７】
2021523211.tif 000024
【国際調査報告】
2021523211.tif 000025
2021523211.tif 000026
2021523211.tif 000027
2021523211.tif 000028
2021523211.tif 000029
2021523211.tif 000030
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