(57)【要約】  本発明は、１，３−ＰＤＯ生成能を有し、３−ＨＰ生成能が阻害された組換えコリネバクテリウム及びこれを用いた１，３−ＰＤＯの製造方法に関し、本発明に係る変異コリネバクテリウム・グルタミクムを用いれば、安価のグリセロールを炭素源として副産物である３−ＨＰの生産能が抑制され、高効率で１，３−ＰＤＯを生産できる。【選択図】  図１
2021523731.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネバクテリウム・グルタミクムに、（ｉ）グリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子、（ｉｉ）グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、（ｉｉｉ）グリセロールデヒドラターゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードする遺伝子、（ｉｖ）グリセロールレアクティバーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）をコードする遺伝子、及び（ｖ）１，３−ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が導入されており、そしてコリネバクテリウム・グルタミクムからアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失又は弱化しており、３−ＨＰ生産能が欠失又は弱化し、そしてグリセロールから１，３−ＰＤＯを生成する変異微生物。
【請求項２】
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ＮＣｇｌ００４９、ＮＣｇｌ０１５７、Ｎｃｇｌ０４３７、ＮＣｇｌ０４６３、ＮＣｇｌ０５２１、ＮＣｇｌ０５２３、ＮＣｇｌ０９００、ＮＣｇｌ２２７２、ＮＣｇｌ２５７８、ＮＣｇｌ２６１９及びＮＣｇｌ２６９８からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の変異微生物。
【請求項３】
前記グリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、及びグリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、ｇｌｐＦ、ｇｌｐＫ、及びｇｌｐＤであることを特徴とする、請求項１に記載の変異微生物。
【請求項４】
前記グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子及びグリセロールレアクティバーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）をコードする遺伝子は、ｐｄｕＣＤＥＧＨクラスターであり、１，３−ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、ｙｑｈＤであることを特徴とする、請求項１に記載の変異微生物。
【請求項５】
前記導入される遺伝子は、ｔａｃ，ｔｒｃ及びｔｕｆからなる群から選ばれる強いプロモーターによって過発現することを特徴とする、請求項１に記載の変異微生物。
【請求項６】
次の段階を含むグリセロールから１，３−ＰＤＯを製造する方法：
（ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異微生物をグリセロール含有培地で培養して１，３−ＰＤＯを生成させる段階；及び
（ｂ）前記生成された１，３−ＰＤＯを得る段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，３−ＰＤＯ（１，３−プロパンジオール）生成能を有し、３−ＨＰ生成能が阻害された組換えコリネバクテリウム及びこれを用いた１，３−ＰＤＯの製造方法に関し、より詳細には、コリネバクテリウム・グルタミクムにおいて、グリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードする遺伝子、グリセロールレアクティバーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）をコードする遺伝子、及び１，３−ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が導入されており、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失又は弱化しており、３−ＨＰ生産能が欠失又は弱化し、グリセロールから１，３−ＰＤＯを生成する変異微生物及びこれを用いた１，３−ＰＤＯの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，３−プロパンジオール（１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ，１，３−ＰＤＯ）は、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）のような高分子合成の単量体として用いられる化学物質である。１，３−ＰＤＯに対する既存の生産方法は、主に化学的な合成方法が用いられており、アクロレイン（ａｃｒｏｌｅｉｎ）を水和したり、エチレンオキシドをホスフィン（ｐｈｏｓｏｈｉｎｅ）の存在下でヒドロホルミル化（ｈｙｄｒｏｆｏｒｍｙｌａｔｉｏｎ）したり、或いはグリセロールを酵素的に転換する方法などが用いられている。このような化学的な生産方法は、高費用、及び環境有害生産工程が含まれている点から限界がある（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  ａｎｄ  Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，４２（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｃ）：９６３−９７２；米国登録特許８，２３６，９９４Ｂ２）。
【０００３】
生物学的な方法は、微生物を用いて１，３−ＰＤＯを生産する方法であり、主にクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、クロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバシリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）などの微生物を用いて行う。これらはいずれも、グリセロールを連続した２代謝回路を経て１，３−ＰＤＯに直接転換し、グリセロールデヒドラターゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）でグリセロールを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｒｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ，３−ＨＰＡ）に転換した後、１，３−ＰＤＯオキシドレダクターゼで３−ＨＰＡを１，３−ＰＤＯに還元させる代謝回路である（図１）。デュポン社は既に、前記代謝回路を大腸菌に導入して１，３−ＰＤＯの商業化に成功した。しかし、１，３−ＰＤＯを生合成する大腸菌を含む前記大部分の微生物は、ホルメート、アセテート、ラクテート、エタノール、２，３−ブタンジオールなどの種々の副産物が共に生産されるという短所がある。
【０００４】
コリネバクテリウム・グルタミクムは、グラム陽性の通性嫌気性菌であり、アミノ酸生産発酵工程に広く用いられており、また、コリネバクテリウム・グルタミクムを用いて種々の化学物質、燃料などを生産するために、ブドウ糖、キシロースなどの種々の炭素源を摂取できるように代謝工学的に多く研究が行われたが、１，３−ＰＤＯを生産する研究は殆どなく、コリネバクテリウム・グルタミクムにおいて、ブドウ糖とグリセロールを炭素源とし、ブドウ糖で細胞成長を図り、グリセロールで１，３−ＰＤＯを生産して、グルタミン酸を同時生産する研究が報告されている（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，７：４２２４６，２０１７）。
【０００５】
しかしながら、１，３−ＰＤＯ生合成代謝回路において、中間体である３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ，３−ＨＰＡ）は、細胞内蓄積時に毒性（ｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を引き起こし、１，３−ＰＤＯの副産物の一つである３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，３−ＨＰ）の前駆体として働くこともある。３−ＨＰは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素によって３−ＨＰＡに転換され、これは既に、コリネバクテリウム・グルタミクム内にカプリアビダスネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ＧａｂＤ４の変異酵素であるＧａｂＤ４（Ｅ２０９Ｑ／Ｅ２６９Ｑ）を過発現させて３−ＨＰを生産した研究にも報告されたことがある（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３９：１５１，２０１７）。しかし、これは外来酵素の過発現による効果であり、まだ、コリネバクテリウム・グルタミクム内に自然的に存在するアルデヒドデヒドロゲナーゼのうち３−ＨＰＡを特異的に基質として取り込んで３−ＨＰ生合成に関与する遺伝子についての報告は存在しない。
【０００６】
そこで、本発明者らは、生物学的な経路を通じてより効率的に１，３−ＰＤＯを生産しようと鋭意努力した結果、１，３−ＰＤＯ生産能を有しながら、３−ＨＰ生産能が阻害又は欠失した変異コリネバクテリウム・グルタミクムを製作するために、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子、グリセロールレアクティバーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）をコードする遺伝子、及び１，３−ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を導入して、１，３−ＰＤＯの生産能を与えると同時に、コリネバクテリウム・グルタミクム内に存在する候補アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失によって３−ＨＰＡ生産能を阻害した変異コリネバクテリウム・グルタミクムを培養する場合、３−ＨＰ生成能が抑制され、１，３−ＰＤＯを効率的に生産することを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、３−ＨＰ生成能が抑制され、１，３−ＰＤＯを効率的に生産できる変異コリネバクテリウム・グルタミクムを提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記変異コリネバクテリウム・グルタミクムを培養することを特徴とする１，３−ＰＤＯの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、コリネバクテリウム・グルタミクムにおいて、（ｉ）グリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子、（ｉｉ）グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、（ｉｉｉ）グリセロールデヒドラターゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードする遺伝子、（ｉｖ）グリセロールレアクティバーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）をコードする遺伝子、及び（ｖ）１，３−ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が導入されており、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失又は弱化しており、３−ＨＰ生産能が欠失又は弱化し、グリセロールから１，３−ＰＤＯを生成する変異微生物を提供する。
【００１０】
本発明はまた、（ａ）前記変異微生物をグリセロール含有培地で培養して１，３−ＰＤＯを生成させる段階；及び（ｂ）前記生成された１，３−ＰＤＯを得る段階を含む、グリセロールから１，３−ＰＤＯを製造する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明に係る変異コリネバクテリウム・グルタミクムの１，３−ＰＤＯ生合成代謝回路、３−ＨＰ生合成代謝回路及びグリセロール分解代謝回路を含む全体的な代謝回路の模式図である。
【００１２】
【図２】グリセロール分解代謝回路をコードするｇｌｐＦ、ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ遺伝子が挿入されたｐＣＳｇｌｐＦＫＤ組換えベクターを示す図である。
【００１３】
【図３】１３種のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）候補のうち、ＮＣｇｌ００４９遺伝子を欠失するために作製したｐＣＧ−９ｔｓ−ＡＬＤ１組換えベクターを示す図である。
【００１４】
【図４】３−ＨＰＡ生合成代謝回路の構築のために、グリセロールデヒドラターゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードするｐｄｕＣＤＥＧＨ遺伝子クラスターを挿入して製造したｐＥＫ−ｐｄｕ組換えベクターを示す図である。
【００１５】
【図５】１，３−ＰＤＯ生合成代謝回路の構築のために、大腸菌１，３−ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードするｙｑｈＤ遺伝子をｐＥＫ−ｐｄｕベクターに挿入して製造したｐＥＫ−ｐｄｕｙＥ組換えベクターを示す図である。
【００１６】
【図６】任意の１１種のアルデヒドデヒドロゲナーゼが欠失したコリネバクテリウム・グルタミクム菌株にｐＣＳｇｌｐＦＫＤ、ｐＥＫ−ｐｄｕｙＥベクターを導入し、グリセロールを単一炭素源として活用する時の３−ＨＰ生産結果を示す図である。
【００１７】
【図７】任意の１１種のアルデヒドデヒドロゲナーゼが欠失したコリネバクテリウム・グルタミクム菌株にｐＣＳｇｌｐＦＫＤ及びｐＥＫ−ｐｄｕｙＥベクターを導入し、グリセロールを単一炭素源として活用する時の１，３−ＰＤＯ生産結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
特に定義されない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で用いられる命名法は、本技術分野においてよく知られており、通常用いられているものである。
【００１９】
本発明では、１，３−ＰＤＯ生産能を有する変異コリネバクテリウム・グルタミクムを用いた１，３−ＰＤＯ収率を向上させるために、前記変異コリネバクテリウム・グルタミクムにおいて１，３−ＰＤＯの前駆体である３−ＨＰＡと同じ前駆体から転換される３−ＨＰの生産能を阻害し、１，３−ＰＤＯ生産が増加した変異コリネバクテリウム・グルタミクムを作製した。
【００２０】
本発明において、前記１，３−ＰＤＯ生産能を有する変異コリネバクテリウム・グルタミクムは、自然的に１，３−ＰＤＯ生産能を持たないコリネバクテリウム・グルタミクムに、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードする遺伝子、グリセロールレアクティバーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）をコードする遺伝子、及び１，３−ＰＤＯオキシドレダクターゼ（１，３−ＰＤＯ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子を導入し、１，３−ＰＤＯ生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミクムを作製した。
【００２１】
本発明において、前記グリセロールデヒドラターゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードする遺伝子、グリセロールレアクティバーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）をコードする遺伝子、及び１，３−ＰＤＯオキシドレダクターゼ（１，３−ＰＤＯ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子は、クレブシエラニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来ｐｄｕＣＤＥＧＨ、大腸菌由来ｙｑｈＤを使用しており、これらの遺伝子をコリネバクテリウム・グルタミクムに導入し、１，３−ＰＤＯ生産能を確認した。
【００２２】
本発明で使用しているコリネバクテリウム・グルタミクムは、自然的にグリセロール拡散は可能な微生物であるが、グリセロールを単一炭素源として活用時に細胞成長が不可能なため、グリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子及びグリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入し、グリセロール炭素源において細胞成長を有するコリネバクテリウム・グルタミクムを作製した。
【００２３】
本発明において、前記グリセロールファシリテーターをコードする遺伝子、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子及びグリセロールデヒドロゲナーゼはそれぞれ、大腸菌由来ｇｌｐＦ、ｇｌｐＫ、ｇｌｐＤを導入した。
【００２４】
本発明において、１，３−ＰＤＯ生合成代謝回路が導入されたコリネバクテリウム・グルタミクムは、１，３−ＰＤＯの他に３−ＨＰ（３−ヒドロキシプロピオン酸）を主副産物として生産し、３−ＨＰは、１，３−ＰＤＯと同じ前駆体である３−ＨＰＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ）から、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）酵素によって転換される。コリネバクテリウム・グルタミクム内に存在するアルデヒドデヒドロゲナーゼの候補酵素に対して３−ＨＰＡに特異的に高く反応する酵素を糾明し、ｉｎ  ｖｉｖｏ培養を通じて現れる効果を確認した。
【００２５】
したがって、本発明は、一観点において、コリネバクテリウム・グルタミクムにおいて、（ｉ）グリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子、（ｉｉ）グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、（ｉｉｉ）グリセロールデヒドラターゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードする遺伝子、（ｉｖ）グリセロールレアクティバーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）をコードする遺伝子、及び（ｖ）１，３−ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が導入されており、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失又は弱化しており、３−ＨＰ生産能が欠失又は弱化し、グリセロールから１，３−ＰＤＯを生成する変異微生物に関する。
【００２６】
本発明において、３−ＨＰ生産能が阻害される変異コリネバクテリウム・グルタミクムを提供するのに関与する酵素であるアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミクム内に存在する１１種の候補遺伝子であり、これはそれぞれ、ＮＣｇｌ００４９、ＮＣｇｌ０１５７、Ｎｃｇｌ０４３７、ＮＣｇｌ０４６３、ＮＣｇｌ０５２１、ＮＣｇｌ０５２３、ＮＣｇｌ０９００、ＮＣｇｌ２２７２、ＮＣｇｌ２５７８、ＮＣｇｌ２６１９、ＮＣｇｌ２６９８である。
【００２７】
本発明において、３−ＨＰ生合成阻害のために選択した前記１１種の候補遺伝子の欠失を通じて３−ＨＰ生産変化を確認し、１，３−ＰＤＯ生産能が増加した変異コリネバクテリウム・グルタミクムを製造した。
【００２８】
本発明において、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のうち一つ以上の遺伝子が欠失又は弱化していることを特徴とし得る。
【００２９】
本発明において、前記グリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、及びグリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、ｇｌｐＦ、ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤであることを特徴とし、前記グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子とグリセロールレアクティバーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）をコードする遺伝子、及び１，３−ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードする遺伝子はそれぞれ、ｐｄｕＣＤＥＧ及びｙｑｈＤであることを特徴とし得る。
【００３０】
本発明において、前記導入される遺伝子は、ｔａｃ、ｔｒｃ、及びｔｕｆからなる群から選ばれる強いプロモーターによって過発現することを特徴とし得る。
【００３１】
本発明で使われる用語“内在的活性”とは、本来微生物が変形されていない状態で持っている酵素の活性状態を意味し、“内在的活性に比べて強化されるように変形”されるという意味は、変形前状態の酵素活性と比較して、当該活性が新規に導入されたり、或いはより向上したことを意味する。
【００３２】
本発明において“酵素活性の強化”とは、酵素自体の活性が新しく導入されたり増大して本来機能以上の効果を導出することを含むだけでなく、内在的遺伝子活性の増加、内部又は外部要因から内在的遺伝子の増幅、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失、遺伝子コピー数の増加、外部からの遺伝子導入、発現調節配列の変形、特に、プロモーター交替又は変形及び遺伝子内突然変異による酵素活性の増加などによってその活性が増加することを含む。
【００３３】
本発明において、“内在的活性に比べて強化されるように変形”されたということは、活性を示す遺伝子が導入されたり又は当該遺伝子のコピー数の増加、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失又は発現調節配列の変形、例えば、改良されたプロモーターの使用などのような操作がなされる前の微生物が持つ活性に比べて、操作がなされた後の微生物が持つ活性が増加した状態を意味する。
【００３４】
本発明において“欠失”とは、該当遺伝子の一部又は全部の塩基を変異、置換又は削除させる方法によって該当遺伝子が発現しないようにしたり、或いは発現するとしても酵素活性を示さないようにすることを包括する概念で、該当遺伝子の酵素が関与する生合成経路を遮断する全てのことを含む。
【００３５】
本発明において“過発現”とは、通常の状態で細胞内に該当遺伝子が発現するレベルよりも高いレベルの発現を指し、遺伝体上に存在する遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換したり、或いは発現ベクターに該当遺伝子をクローニングして細胞に形質転換させる方法によって発現量を増加させることなどを含む概念である。
【００３６】
本発明で使われる用語“ベクター”は、適切な宿主内で目的タンパク質を発現させ得るように適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。ベクターは適当な宿主細胞内に形質転換されたた後、宿主ゲノムに関係なく複製又は機能でき、ゲノム自体に統合され得る。
【００３７】
現在、プラスミドがベクターの最も一般的に用いられる形態であり、よって、本発明の明細書において“プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）”及び“ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）”は相互互換的に使用されてもよい。本発明の目的上、プラスミドベクターを用いることが好ましい。このような目的に利用可能な典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞ごとに数百個のプラスミドベクターを含むように複製を効率的に起こさせる複製起点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞を選抜可能にする抗生剤耐性遺伝子、及び（ｃ）外来ＤＮＡ切片が挿入され得る制限酵素切断部位を含む構造を有している。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用すると、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することができる。
【００３８】
ライゲーション後に、ベクターは適切な宿主細胞に形質転換される必要がある。本発明において、選好される宿主細胞は原核細胞である。適切な原核宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ２１などを含む。しかし、ＦＭＢ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８及びＮＭ５３９のようなＥ．ｃｏｌｉ菌株及び他の原核生物の種（ｓｐｅｉｃｅｓ）及び属（ｇｅｎｅｒａ）なども使用可能である。前述したＥ．ｃｏｌｉに加えて、アグロバクテリウムＡ４のようなアグロバクテリウム属菌株、バチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなバシリ（ｂａｃｉｌｌｉ）、サルモネラチフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）又はセラチアマルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のような他の腸内細菌及び様々なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属菌株が宿主細胞として利用可能である。
【００３９】
原核細胞の形質転換は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａの１．８２セクションに記述されたカルシウムクロリド方法を用いて容易に達成できる。選択的に、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１：８４１，１９８２）も、上記のような細胞の形質転換に使用可能である。
【００４０】
本発明に係る遺伝子の過発現のために用いられるベクターは、当業界に公知の発現ベクターを使用でき、ｐＥＴ系列ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用することが好ましい。前記ｐＥＴ系列ベクターを用いてクローニングを行うと、発現するタンパク質の末端にヒスチジン基が結合して出るので、前記タンパク質を効果的に精製できる。クローニングされた遺伝子から発現したタンパク質を分離するためには当業界に公知の通常の方法を用いることができ、具体的に、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｈｉｓ−結合レジン（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用するクロマトグラフィー方法を用いて分離できる。本発明において、前記組換えベクターはｐＥＴ−ＳＬＴＩ６６であることを特徴とし、前記宿主細胞は大腸菌又はアグロバクテリウムであることを特徴とし得る。
【００４１】
本発明において“発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）”という表現は、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコーディング配列の発現に必須であるＤＮＡ配列を意味する。このような調節配列は、転写を実施するためのプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適切な調節配列は、プロモーター、任意にオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーがそれに含まれる。プラスミドにおいて遺伝子の発現量に最も影響を及ぼす因子はプロモーターである。高発現用のプロモーターとして、ＳＲαプロモーターとサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）由来プロモーターなどが好ましく用いられる。本発明のＤＮＡ配列を発現させるために、非常に様々な発現調節配列中のいかなる配列もベクターに使用可能である。有用な発現調節配列には、例えば、ＳＶ４０又はアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣ又はＴＲＣシステム、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコードタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセレートキナーゼ又は他のグリコール分解酵素に対するプロモーター、前記ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母アルファ−交配システムのプロモーター及び原核細胞又は真核細胞又はウイルスの遺伝子発現を調節するものとして知られたその他配列及びこれらの様々な組合せが含まれる。Ｔ７プロモーターは、大腸菌において本発明のタンパク質を発現させるのに有用に使用可能である。
【００４２】
核酸は他の核酸配列と機能的関係で配置される時に“作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）”される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合するとき、遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であり得る。例えば、前配列（ｐｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又は分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加するタンパク質として発現する場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されたり；又はリボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されたり；又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コーディング配列に作動可能に連結される。一般に、“作動可能に連結された”とは、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また、分泌リーダーの場合、接触しリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）は、接触する必要がない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位においてライゲーション（連結）によって行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用する。
【００４３】
本願明細書に使われた用語“発現ベクター”は、通常、異種のＤＮＡの断片が挿入された組換えキャリア（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃａｒｒｉｅｒ）であり、一般に、二本鎖ＤＮＡの断片を意味する。ここで、異種ＤＮＡは、宿主細胞から天然的に発見されないＤＮＡである異型ＤＮＡを意味する。発現ベクターは、一応、宿主細胞内にあると、宿主染色体ＤＮＡに関係なく複製でき、ベクターの数個のコピー及びその挿入された（異種）ＤＮＡが生成され得る。
【００４４】
当業界に周知のように、宿主細胞において形質感染遺伝子の発現レベルを高めるためには、当該遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解読発現調節配列に作動可能に連結される必要がある。好ましくは、発現調節配列及び該当遺伝子は、細菌選択マーカー及び複製起点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）を共に含んでいる一つの発現ベクター内に含まれる。宿主細胞が真核細胞である場合には、発現ベクターは真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含まなければならない。
【００４５】
上述した発現ベクターによって形質転換又は形質感染された宿主細胞は、本発明のさらに他の側面を構成する。本願明細書に使われた用語“形質転換”は、ＤＮＡを宿主に導入し、ＤＮＡが染色体外因子として又は染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。本願明細書に使われた用語“形質感染”は、任意のコーディング配列が実際に発現しようがしまいが、発現ベクターが宿主細胞によって受容されることを意味する。
【００４６】
勿論、全てのベクターと発現調節配列が本発明のＤＮＡ配列を発現するのにいずれも同等に機能を発揮するわけではないということを理解すべきである。同様に、全ての宿主が同じ発現システムに対して同一に機能を発揮するわけではない。しかし、当業者であれば、過度な実験的負担無しに本発明の範囲から逸脱することなく、様々なベクター、発現調節配列及び宿主の中から適切な選択を行うことができる。例えば、ベクターを選択するに当たっては宿主を考慮する必要があるが、これは、ベクターが宿主内で複製されなければならないためである。ベクターの複製数、複製数を調節できる能力及び当該ベクターによってコードされる他のタンパク質、例えば、抗生剤マーカーの発現も考慮される必要がある。発現調節配列を選定するに当たっても、様々な因子を考慮しなければならない。例えば、配列の相対的強度、調節可能性及び本発明のＤＮＡ配列との相溶性など、特に、可能性がある二次構造と関連して考慮しなければならない。単細胞宿主は、選定されたベクター、本発明のＤＮＡ配列によってコードされる産物の毒性、分泌特性、タンパク質を正確にフォールディングさせ得る能力、培養及び発酵要件、本発明ＤＮＡ配列によってコードされる産物を宿主から精製することの容易性などの因子を考慮して選定される必要がある。それらの変数の範囲内で、当業者は、本発明のＤＮＡ配列を発酵又は大規模の動物培養において発現させ得る各種のベクター／発現調節配列／宿主組合せを選定することができる。発現クローニングによって本発明に係るタンパク質のｃＤＮＡをクローニングしようとする時のスクリーニング法として、バインディング法（ｂｉｎｄｉｎｇ法）、パンニング法（ｐａｎｎｉｎｇ法）、フィルムエマルジョン法（ｆｉｌｍ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ法）などを適用できる。
【００４７】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものとして解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【００４８】
下記実施例では、導入対象遺伝子として、特定菌株由来の遺伝子だけを例示したが、導入される宿主細胞で発現して同じ活性を示す限り、特に制限がないということは、当業者には明らかであろう。
【００４９】
実施例１：グリセロールを単一炭素源として成長可能な変異コリネバクテリウム・グルタミクムの製造のためのｐＣＳｇｌｐＦＫＤベクターの作製
【００５０】
１−１：グリセロール分解代謝回路構築のためのｐＣＳｇｌｐＦＫＤベクターの作製
【００５１】
コリネバクテリウム・グルタミクムは、グリセロールを単一炭素源として用いて細胞成長できないものとして知られている。したがって、グリセロール分解代謝回路を構築するために、まず、大腸菌Ｗ３１１０由来のグリセロール分解代謝回路を担当する酵素をコードする遺伝子を、コリネバクテリウム・グルタミクムシャトルベクターであるｐＣＥＳ２０８ｓ−Ｈ３６−Ｓ３を用いて発現させた。
【００５２】
大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ３９９３６）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１及び２のプライマーでＰＣＲを行って、グリセロールファシリテーターとグリセロールキナーゼオペロン酵素をコードするｇｌｐＦＫ遺伝子切片を得、配列番号３及び４のプライマーでＰＣＲを行って、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードするｇｌｐＤ遺伝子切片を得た。前記ｇｌｐＦＫ遺伝子切片と前記ｇｌｐＤ遺伝子切片を接合させるために配列番号１及び４のプライマーでオーバーラッピングＰＣＲを行い、ｇｌｐＦＫＤ遺伝子切片（配列番号５３）を作製した。ｐＣＥＳ２０８ｓ−Ｈ３６−Ｓ３ベクター（ｐＣＥＳ２０８−Ｈ３６ベクター（大韓民国特許公開第１０−２０１３−００２２６９１号又はＹｉｍ  ＳＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：２９５９，２０１３、配列番号５４）のＫｍ抗生剤をスペクチノマイシン抗生剤に置換したベクター、配列番号２１）を線形化させるために、配列番号５及び６のプライマーを用いてＰＣＲを行い、前記製造されたｇｌｐＦＫＤ遺伝子切片とギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）方法を用いてｐＣＳｇｌｐＦＫＤベクターを作製した（図２）。
【００５３】
【表１】
2021523731.tif 000003
【００５４】
実施例２：３−ＨＰ生合成阻害のためのアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠失ベクターの作製
【００５５】
グリセロールから１，３−ＰＤＯを生産する場合、生産される前駆体である３−ＨＰＡは、細胞内に存在するアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素によって３−ＨＰに転換される。しかし、コリネバクテリウム・グルタミクム内に当該前駆体を基質として取り込む反応を触媒する酵素は報告されたことがない。したがって、当該反応を媒介するアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素を糾明し、当該酵素をコードする遺伝子を菌株のゲノム上で欠失させて３−ＨＰ生合成を阻害するために、まず、コリネバクテリウム・グルタミクム内に存在する１３種の任意のアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素を選別した（表２）。
【００５６】
その後、当該１３種の任意のアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子（配列番号５６〜６８）の欠失による３−ＨＰ生合成阻害効果を確認するために、まず、コリネバクテリウム・グルタミクムにｐＴａｃＣＣ１−ＨｒＴベクターが形質転換された菌株を作製した（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４２：１５７−１６７，２０１７）。その後、前記作製されたコリネバクテリウム・グルタミクム菌株に対して、ｉ）１２種の遺伝子のｓｇＲＮＡ配列をそれぞれ含むｐＣＧ９ｔｓ−ｓｅｒｉｅｓ、ｉｉ）１３種の遺伝子にそれぞれ結合するｓｓＯＤＮを作製し、コリネバクテリウム・グルタミクムに対する遺伝子欠失を試みた。
【００５７】
２−１：１３種の遺伝子のｓｇＲＮＡ案内配列を含むｐＣＧ９ｔｓ−ｓｅｒｉｅｓベクターの製造
【００５８】
まず、ｓｇＲＮＡの案内配列の非特異的標的を分析して最適のｓｇＲＮＡ案内配列を提供するオンラインプログラムＣＲＩＳＰｙ−ｗｅｂ（Ｂｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１（２）：１１８−１２１，２０１６）を用いて、オフターゲット効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔ）の低い最適の案内配列（ｇｕｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を次のように選別した（表２）。
【００５９】
【表２】
2021523731.tif 000004
【００６０】
前記ｓｇＲＮＡ案内配列（配列番号７〜１９）を含むｐＣＧ９ｔｓ−ｓｅｒｉｅｓベクターを製造するために、ｐＵＣ１９−ｓｇＲＮＡベクター（大韓民国特許出願第２０１７−００４２１２４号；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４２：１５７−１６７，２０１７、配列番号５５）を鋳型とし、配列番号２０及び２３のプライマーを用いてＮＣｇｌ００４９遺伝子を標的にしながらｓｇＲＮＡ−Ｔ１／ＴＥ配列（大韓民国特許出願第２０１７−００４２１２４号；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４２：１５７−１６７，２０１７）をコードするＤＮＡ切片を増幅した。増幅したＤＮＡ切片を、配列番号２１及び２２のプライマーでＰＣＲを行ってさらに増幅した。ｐＥＫｔｓ−Ｃａｓ９ベクター（大韓民国特許出願第２０１７−００４２１２４号；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４２：１５７−１６７，２０１７、配列番号６６）をＳｔｕＩの酵素処理した後、前記増幅された切片とギブソンアセンブリ方法を用いて、最終的に、Ｃａｓ９タンパク質と共に、ＮＣｇｌ００４９遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを発現するｐＣＧ９ｔｓ−ＡＬＤ１ベクターを製造した。その後、同一の方法で、各１３種の任意の酵素をコードする遺伝子を標的する切片を作製し（配列番号２０、２１、２２は同一。各遺伝子に対して配列番号２４〜３５の順にＰＣＲを行う。）、ｐＣＧ９ｔｓ−  ＡＬＤ２、ｐＣＧ９ｔｓ−ＡＬＤ３、ｐＣＧ９ｔｓ−ＡＬＤ４、ｐＣＧ９ｔｓ−ＡＬＤ５、ｐＣＧ９ｔｓ−ＡＬＤ６、ｐＣＧ９ｔｓ−ＡＬＤ７、ｐＣＧ９ｔｓ−ＡＬＤ８、ｐＣＧ９ｔｓ−ＡＬＤ９、ｐＣＧ９ｔｓ−ＡＬＤ１０、ｐＣＧ９ｔｓ−ＡＬＤ１１、ｐＣＧ９ｔｓ−ＡＬＤ１２及びｐＣＧ９ｔｓ−ＡＬＤ１３ベクターを作製した。
【００６１】
【表３】
2021523731.tif 000005
【００６２】
【表４】
2021523731.tif 000006
【００６３】
２−２：１３種の遺伝子にそれぞれ結合するｓｓＯＤＮの製造
【００６４】
１３種の任意のターゲット遺伝子を欠失させるためのｓｓＯＤＮは、ｓｇＲＮＡの案内配列が結合する位置がｓｓＯＤＮの２つの結合配列間の区間に位置するように選定し、その長さが合計８０ヌクレオチドになるようにデザインした（表５）。このとき、ｓｓＯＤＮは、５’−ホモロジーアーム及び３’−ホモロジーアームで構成され、各ホモロジーアームは４０塩基対であり、ｓｇＲＮＡの案内配列と相補的な配列を含むターゲット遺伝子領域の両末端外側に結合できるようにデザインした。ｓｓＯＤＮがターゲットと結合すればループ構造が形成され、この部位が、欠失する領域となる、前記欠失領域の長さは、ＰＣＲによって標的遺伝子欠失の有無が把握し易いように、１００塩基対となるようにデザインした。
【００６５】
【表５】
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【００６６】
実施例３：３−ＨＰ生産能が阻害され、１，３−ＰＤＯ生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミクムの製造及び確認
【００６７】
３−１：３−ＨＰ生産能が阻害されたコリネバクテリウム・グルタミクムの製造
【００６８】
３−ＨＰ生合成に関与するものと考えられる任意の１３種のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をゲノム上で欠失させるために、実施例２−１及び２−２で作製されたｐＣＧ９ｔｓ−ＡＬＤベクターとｓｓＯＤＮをそれぞれ、野生型コリネバクテリウム・グルタミクム（ＡＴＣＣ１３０３２）に形質転換した。その後、形質転換された変異コリネバクテリウム・グルタミクム菌株に対して、ｐＴａｃＣＣ１−ＨｒＴベクター（大韓民国特許出願第２０１７−００４２１２４号；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４２：１５７−１６７，２０１、配列番号５７）とｐＣＧ９ｔｓ−ＡＬＤベクターを、３７℃  ＢＨＩプレートでキュアリング（ｃｕｒｉｎｇ）作業で除去した。この過程によって作製された菌株は、表６に示す通りである。しかし、ＷＡＨ３菌株とＷＡＨ９菌株は作製されていないが、当該両遺伝子は、細胞生存に必要な必須遺伝子と判断される。
【００６９】
【表６】
2021523731.tif 000008
【００７０】
３−２：１，３−ＰＤＯ生合成代謝回路構築のためのｐＥＫ−ｐｄｕｙＥベクターの作製
【００７１】
１，３−ＰＤＯ生合成代謝回路を構築するために、コリネバクテリウム・グルタミクムのｐＥＫＥｘ１シャトルベクター（Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０２：９３，１９９１、配列番号５８）を用いてクレブシエラニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＤＳＭＺ２０２６（ＫＣＴＣ４９５２）と大腸菌Ｗ３１１０由来の外来酵素を発現させた。
【００７２】
まず、クレブシエラニューモニエＤＳＭＺ２０２６菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号４９及び５０のプライマーでＰＣＲを行って、グリセロールデヒドラターゼとグリセロールレアクティバーゼをコードするｐｄｕＣＤＥＧＨ遺伝子クラスター切片（配列番号５９）を得た。該得られたｐｄｕＣＤＥＧＨ遺伝子切片をシャトルベクターｐＥＫＥｘ１ベクターに接合させるために制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで処理した後、ギブソンアセンブリで接合させてｐＥＫ−ｐｄｕベクター（図４）を作製した。
【００７３】
その後、ｐＴａｃ１５ｋｙｑｈＤ組換えベクター（ｐＴａｃ１５ｋベクター（ｐ１５Ａ  ｏｒｉｇｉｎ、ｔａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＫｍＲ）にＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０由来ｙｑｈＤが挿入されている組換えベクター、配列番号６０）を鋳型とし、配列番号５１及び５２のプライマーでＰＣＲを行って、１，３−ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードするｙｑｈＤ遺伝子切片を得た。
【００７４】
該得られた遺伝子切片をｐＥＫ−ｐｄｕベクターに接合させるために、制限酵素ＤｒａＩを処理し、ギブソンアセンブリで接合させてｐＥＫ−ｐｄｕｙＥベクター（図５）を作製した。
【００７５】
【表７】
2021523731.tif 000009
【００７６】
３−３： ｉｎ  ｖｉｖｏ培養による３−ＨＰ生産能阻害及び１，３−ＰＤＯ生産能向上の確認
【００７７】
実施例３−１に作製されたそれぞれの菌株に、グリセロール分解代謝回路構築のためのｐＣＳｇｌｐＦＫＤベクターと１，３−ＰＤＯ生合成代謝回路構築のためのｐＥＫ−ｐｄｕｙＥを共に形質転換した。その後、２５μｇ／Ｌカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）及び２００μｇ／Ｌスペクチノマイシン（Ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）が添加されたＢＨＩＳ平板培地（組成は、３７ｇ／Ｌ  ＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、９１ｇ／Ｌソルビトール、１５ｇ／Ｌ寒天）で選別した。前記形質転換された１１種の変異微生物を、１０ｍＬ  ＢＨＩＳ培地（組成は、３７ｇ／Ｌ  ＢＨＩ、９１ｇ／Ｌソルビトール）が含まれた試験管（ｔｅｓｔ  ｔｕｂｅ）に接種して３０℃で１６時間前培養を行った後、前培養した培養液１ｍＬを２５０ｍＬバッフルフラスコに２５ｍＬのＣＧＸＩＩ培地（表８）に接種して培養した。初期グリセロール濃度は４０ｇ／Ｌに設定し、培地内の酵母抽出物１０ｇ／Ｌを追加し、３倍数フラスコ培養を４８時間行った。
【００７８】
【表８】
2021523731.tif 000010
【００７９】
３−ＨＰ濃度測定のために使用したＨＰＬＣ条件は、次の通りである。まず、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣ機器を使用し、検出器とカラムとしてＤＡＤ検出器、ａｇｉｌｅｎｔ  ＭｅｔａＣａｒｂ  ８７Ｈカラム、ＵＶ２１０ｎｍ（他の検出器）を用い、この時、バッファーとしては０．１％  Ｈ３ＰＯ４を４０℃条件下に流量（ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ）０．５ｍＬ／ｍｉｎで流して測定した。次に、１．３−ＰＤＯ測定のためにＷａｔｅｒｓ  １５１５高速液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ  １  Ｃｏ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用し、この時、検出器とカラムは、Ｗａｔｅｒｓ  ２４１４示差屈折率検出器とＡ  ＭｅｔａＣａｒｂ  ８７Ｈカラム（３００  ｂｙ  ７．８ｍｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いた。このとき、バッファーとしては０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を３５℃条件下に流量０．５ｍＬ／ｍｉｎで流して測定した。
【００８０】
その結果、図６及び図７に示すように、ＷＡＨ１３菌株内にｐＣＳｇｌｐＦＫＤベクターとｐＥＫ−ｐｄｕｙＥベクターが形質転換された菌株において３−ＨＰ生産が最も阻害され、これに応じて１，３−ＰＤＯ生産量が最も増加することを確認した。また、ＷＡＨ１、ＷＡＨ２、ＷＡＨ５、ＷＡＨ６、及びＷＡＨ７も共に、３−ＨＰ生産が阻害され、１，３−ＰＤＯ生産量が増加することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明に係る変異コリネバクテリウム・グルタミクムを用いれば、安価のグリセロールを炭素源として副産物である３−ＨＰの生産能が抑制され、高効率で１，３−ＰＤＯを生産することができる。
【００８２】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述してきたが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は好ましい実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びそれらの等価物によって定義されると言えよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021523731.tif 000019
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