(57)【要約】  本発明は、勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料及びその調製方法を開示するものであり、本発明は、天然組織由来の骨組織に対して免疫原性の除去処理を行い（即ち、脱細胞化）、得られた脱細胞化骨に対して勾配脱灰処理を行って、勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料を得るものである。本発明は、骨マトリックス材料の空隙率及びその表面コラーゲンの露出度を拡大させ、効果的に成長因子を放出させ、細胞への材料の粘着を増加させ、細胞再生に関連する遺伝子とタンパク質のアップレギュレーションを調節する。天然の骨ＥＣＭ足場のバイオメカニクスの特性と三次元ミクロ構造を十分に保持するだけではなく、より重要なことは、骨形成、血管新生及び骨折初期のコラーゲンの鉱化に対して積極的な役割を果たし、細胞の定着付着を増加させ、細胞の分化誘導を促進する。天然組織由来の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料は、非脱灰または完全脱灰された骨マトリックス材料よりも間葉系幹細胞の分化と骨形成を促進する面でより大きな可能性を示す。【選択図】図１（Ｂ）
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然組織由来の骨組織に対して免疫原性の除去処理を行い、即ち脱細胞化を行い、得られた脱細胞化骨に対して勾配脱灰処理を行い、勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料を得ることを特徴とする勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
【請求項２】
哺乳動物の全身の任意の骨組織を取り、ドリルで骨を取り出し、メスで円筒形の骨ブロックに切るステップ１と、
材料を得た後、滅菌生理食塩水で２時間洗浄してから照射滅菌を行い、前記照射の照射量は５〜４０ｗであるステップ２と、
プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水ですすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去するステップ３であって、前記プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水において、プロテアーゼ阻害剤の濃度は１０〜５０ＫＩＵ／ｍｌであり、脱イオン水での洗浄回数は２〜６回で、毎回の洗浄時間は３〜２０分であるステップ３と、
骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、包埋カセットを、アセトンを含む脱イオン水溶液に入れ、１〜４時間振とうするステップ４であって、前記アセトンを含む脱イオン水溶液において、アセトンの脱イオン水に対する体積割合は好ましくは１０〜２０％であるステップ４と、
包埋カセットを、リン酸トリブチルを含む脱イオン水溶液に入れ、１〜４時間振とうするステップ５であって、前記リン酸トリブチルを含む脱イオン水溶液において、リン酸トリブチルの脱イオン水に対する体積割合は１％〜５％であるステップ５と、
包埋カセットを、プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液に入れ、４℃で、シェーカーにて２４〜４８時間振とうした後、液体窒素で２〜６サイクル凍結融解するステップ６であって、各サイクルは−８０℃〜３７℃で、シェーカー速度は好ましくは５０〜３００ｒｐｍであるステップ６と、
包埋カセットをＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む緩衝液に入れ、恒温シェーカーにて２４時間振とうし、前記Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度は０．５〜５％であるステップ７と、
ＳＤＳを含む緩衝液において、恒温シェーカーにて３６時間振とうし、前記ＳＤＳの濃度は０．５〜１０％であるステップ８と、
塩化カリウムを０．１〜１Ｍの濃度で含むＰＢＳ緩衝液において、４℃の温度で、シェーカーを使用して１００ｒｐｍで２〜１２時間振とうするステップ９と、
ヨウ化カリウムを含むＰＢＳ緩衝液において、４℃の温度で、シェーカーを使用して１００ｒｐｍで２〜１２時間振とうし、脱イオン水における前記ヨウ化カリウムの濃度は１〜１．５Ｍであるステップ１０と、
ＥＤＴＡ２ＮａとＮａＯＨを含む緩衝液において、４℃〜１０℃の条件下で、それぞれ４、８、１２、２４時間の勾配脱灰処理を行い、１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料を取得するステップ１１と、
得られた材料を再度照射滅菌するステップ１２と、を含み、
ステップ４〜ステップ１１において、各ステップが完了した後、ステップ間はいずれも脱イオン水で６時間すすぐ、ことを特徴とする請求項１に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
【請求項３】
前記プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水において、プロテアーゼ阻害剤の濃度は２０〜４０ＫＩＵであることを特徴とする請求項２に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
【請求項４】
前記アセトンを含む脱イオン水溶液において、アセトンの脱イオン水に対する体積割合は１３％〜１８％であることを特徴とする請求項２に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
【請求項５】
前記リン酸トリブチルを含む脱イオン水溶液において、リン酸トリブチルの脱イオン水に対する体積割合は２％〜５％であることを特徴とする請求項２に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
【請求項６】
シェーカー速度は３０〜１８０ｒｐｍであることを特徴とする請求項２に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
【請求項７】
前記Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度は０．５〜３％であることを特徴とする請求項２に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
【請求項８】
前記ＳＤＳの濃度は０．５〜５％であることを特徴とする請求項２に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
【請求項９】
脱イオン水における前記塩化カリウムの濃度は０．３〜１Ｍであることを特徴とする請求項２に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
【請求項１０】
脱イオン水における前記ヨウ化カリウムの濃度は１〜１．４Ｍであることを特徴とする請求項２に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨組織の修復及び再生の技術分野に属するものであり、具体的には、天然組織由来の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料及びその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨の再生修復は、長い過程である。特に、重度の骨欠損は、自己修復が比較的難しい。現在、骨移植片材料は幅広い応用が見込まれる代替治療として認められている。その中で、天然骨組織、特に天然海綿骨の細胞外マトリックス（Ｃａｎｃｅｌｌｏｕｓ  ｂｏｎｅ  ｍａｔｒｉｘ，ＣＢＭ）には、細胞の成長及び骨組織の修復を促進するための豊富なコラーゲン、成長因子などが含まれている。それだけでなく、大量のミネラル（Ｃａ２＋、ＰＯ４−３、Ｍｇ２＋等のイオンを含む）も含まれている。近年、ミネラルイオン（Ｃａ２＋、ＰＯ４−３、Ｍｇ２＋など）が新生骨組織の修復、骨形成関連の血管新生、コラーゲン鉱化などに非常に重要な調節と促進効果をもたらすことが、ますます多くの研究で示されている［１〜５］。さらに、ミネラルの含有量は材料の三次元構造、空隙率、マイクロバイオメカニクスの特性などにも影響し、上記の材料の特性評価は、骨の修復再生に対して明らかな調節効果を持っている［６］。例えば、材料の硬度及び弾性係数は骨芽細胞の行動誘導及び骨の修復能力に明らかな促進効果をもたらすことが、研究で示されている［７］。バイオコラーゲンの鉱化は骨形成効果及び骨組織の再生過程を明らかに促進できることも、より多くの学者によって認められている［８］。
【０００３】
近年、天然の骨マトリックス由来に基づくバイオ材料が徐々に調製され、臨床に使い始められているが、初期の骨修復の理論的なメカニズムに関する研究が不足していたため、現在の一般的な骨マトリックス材料には特定の欠陥が存在している。例えば、免疫原性を低下させて骨修復を促進させる目的を達成するために、天然の骨マトリックスの細胞成分を完全に除去して海綿骨ＥＣＭ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）足場材料を調製したことが報告されている［９］。しかし、骨修復の過程は、血腫の組織化段階、骨カルスの形成段階、骨カルスの成形段階などの段階を経る必要があるが、生体材料の応用は、しばしば血腫の組織化段階の前後に行われるため、成熟して緻密になり、完全に鉱化された骨ＥＣＭ材料は、再生を促進するために新しい骨と十分に融合することができなくなる。完全な脱灰骨マトリックス材料を採用して骨組織の修復再生に使用することも、文献に報告されているが、従来の処理プロセスにおいて強酸及び長期ＥＤＴＡ−２Ｎａで浸漬することで脱灰することは［１０］、しばしば天然の骨ＥＣＭ足場材料への不可逆的な損傷をもたらし、バイオメカニクスの特性を低下させ、ミネラルや成長活性因子の損失及び三次元ミクロ構造の変化をもたらし、足場の生物学的な再生と修復活性に深刻な影響を与える。
【０００４】
従って、上記の背景に基づいて、本特許は、天然の骨修復の過程で必要とされる再生微小環境をよりよくシミュレートでき、損傷した骨組織に対し、「適切なタイミング及び適切な方法」でよりよく再生及び修復を促進することができる材料を提案している。天然組織由来の骨材料を使用し、免疫原性の除去技術及び精密・低温・快速な超音波による軟化法を使用して、特定の正確に勾配鉱化された骨ＥＣＭ材料を調製する。該当材料は、免疫原性が低いことに加えて、生物活性成分が豊富で、バイオメカニクスの特性が優れ、三次元ミクロ構造及び特定の程度のミネラル富化（Ｃａ２＋、ＰＯ４−３など）があり、新生骨組織の優れた再生と血管新生を達成するために非常に優れた促進効果を有する［１１−１３］。さらに、本発明は、バイオミネラル化材料の研究のために、天然の骨マトリックスに基づく正確に勾配鉱化された新規な材料システムを提供することもできる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、先行技術の欠陥に対して、天然組織由来の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料（Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ  ｃａｎｃｅｌｌｏｕｓ  ｂｏｎｅ  ｍａｔｒｉｘ，ＤＣＢＭ）及びその調製方法を提供する。
【０００６】
本発明に係る勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法は、具体的には、天然組織由来の骨組織に対して免疫原性の除去処理を行い（即ち、脱細胞化）、得られた脱細胞化骨に対して勾配脱灰処理を行い、勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料を得ることにある。
【０００７】
具体的には、以下のステップ１〜１２を含む。
【０００８】
ステップ１では、哺乳動物の全身の任意の骨組織を取り、ドリルで骨を取り出し、メスで円筒形の骨ブロックに切る。
【０００９】
ステップ２では、材料が得られたら、滅菌生理食塩水で２時間洗浄した後、照射滅菌を行う。前記照射の照射量は５〜４０ｗである。
【００１０】
ステップ３では、プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水ですすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。前記プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水において、プロテアーゼ阻害剤の濃度は１０〜５０ＫＩＵ／ｍｌである。脱イオン水の洗浄回数は２〜６回で、毎回の洗浄時間は３〜２０分である。
【００１１】
ステップ４では、骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、包埋カセットを、アセトンを含む脱イオン水溶液に入れ、１〜４時間振とうする。前記アセトンを含む脱イオン水溶液において、アセトンの脱イオン水に対する体積割合は好ましくは１０〜２０％である。
【００１２】
ステップ５では、包埋カセットを、リン酸トリブチルを含む脱イオン水溶液に入れ、１〜４時間振とうする。前記リン酸トリブチルを含む脱イオン水溶液において、リン酸トリブチルの脱イオン水に対する体積割合は１％〜５％である。
【００１３】
ステップ６では、包埋カセットを、プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液に入れ、４℃で、シェーカーにて２４〜４８時間振とうした後、液体窒素で２〜６サイクル凍結融解し、各サイクルは−８０℃〜３７℃で、シェーカー速度は好ましくは５０〜３００ｒｐｍである。
【００１４】
ステップ７では、包埋カセットを、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む緩衝液に入れ、恒温シェーカーにて２４時間振とうする。前記Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度は０．５〜５％である。
【００１５】
ステップ８では、ＳＤＳを含む緩衝液において、恒温シェーカーにて３６時間振とうする。前記ＳＤＳの濃度は０．５〜１０％である。
【００１６】
ステップ９では、塩化カリウムを０．１〜１Ｍの濃度で含むＰＢＳ緩衝液において、４℃の温度で、シェーカーを使用して１００ｒｐｍで２〜１２時間振とうする。
【００１７】
ステップ１０では、ヨウ化カリウムを含むＰＢＳ緩衝液において、４℃の温度で、シェーカーを使用して１００ｒｐｍで２〜１２時間振とうする。脱イオン水における前記ヨウ化カリウムの濃度は１〜１．５Ｍである。
【００１８】
ステップ１１では、ＥＤＴＡ２ＮａとＮａＯＨを含む緩衝液において、４℃〜１０℃の条件下で、それぞれ４、８、１２、２４時間の勾配脱灰処理を行う。１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料を得る。
【００１９】
ステップ１２では、得られた材料を再度照射滅菌する。
【００２０】
ステップ４〜ステップ１１において、各ステップの完了後、ステップ間はいずれも脱イオン水で６時間すすぐ。
【００２１】
好ましくは、前記プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水において、プロテアーゼ阻害剤の濃度は２０〜４０ＫＩＵである。
【００２２】
好ましくは、前記アセトンを含む脱イオン水溶液において、アセトンの脱イオン水に対する体積割合は１３％〜１８％である。
【００２３】
好ましくは、前記リン酸トリブチルを含む脱イオン水溶液において、リン酸トリブチルの脱イオン水に対する体積割合は２％〜５％である。
【００２４】
好ましくは、シェーカー速度は３０〜１８０ｒｐｍである。
【００２５】
好ましくは、前記Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度は０．５〜３％である。
【００２６】
好ましくは、前記ＳＤＳの濃度は０．５〜５％である。
【００２７】
好ましくは、脱イオン水における前記塩化カリウムの濃度は０．３〜１Ｍである。
【００２８】
好ましくは、脱イオン水における前記ヨウ化カリウムの濃度は１〜１．４Ｍである。
【００２９】
また、本発明は、特定の勾配鉱化された骨ＥＣＭ足場材料を提供する。
【００３０】
好ましくは、勾配鉱化された骨ＥＣＭ材料の鉱化の程度は９０％と６０％である。
【００３１】
好ましくは、材料源はブタの肩甲骨である。
【発明の効果】
【００３２】
本発明は、低温で正確かつ迅速な超音波勾配脱灰処理により、より優れた再生と修復効果を持つ天然組織由来の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料を調製するものであり、免疫原性が低く、生物活性成分が豊富で、バイオメカニクスの特性が優れ、三次元ミクロ構造及び特定の程度のミネラル富化（Ｃａ２＋、ＰＯ４−３など）があり、新生骨組織の優れた再生と血管新生を達成するために非常に優れた促進効果を有する。臨床的にさまざまな原因によって引き起こされる骨欠損、骨不接合などの骨再生障害を修復するために使用できる。さらに、バイオミネラル化材料の研究のために、天然の骨マトリックスに基づく正確に勾配鉱化された新規な材料システムを提供することもできる。
【００３３】
既存の非脱灰または完全脱灰された天然の骨マトリックス製品と比較して、本発明（９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料）の明らかな進歩は、次の通りである。
１）特定の低温における正確な部分的な脱灰処理は、骨マトリックス材料の空隙率及びその表面コラーゲンの露出度を拡大させ、効果的に成長因子を放出させ、細胞への材料の粘着度をよりよく増加させ、細胞再生に関連する遺伝子とタンパク質のアップレギュレーションを調節する。
２）一方、特定の程度のミネラル富化（Ｃａ２＋、ＰＯ４−３など）は天然の骨ＥＣＭ足場のバイオメカニクスの特性と三次元ミクロ構造を十分に保持するだけではなく、より重要なことは、骨形成、血管新生及び骨折初期（血腫の組織化段階）のコラーゲンの鉱化に対して積極的な役割を果たし、細胞の定着付着を増加させ、細胞の分化誘導を促進する。
３）天然組織由来の勾配鉱化された（９０％と６０％の鉱化の程度）骨の細胞外マトリックス材料は、非脱灰または完全脱灰された骨マトリックス材料よりも間葉系幹細胞の分化と骨形成を促進する面でより大きな可能性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１で、Ａ−Ｂは、新規な勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の脱細胞化及び鉱化の一般的な外観図を示す。Ｃは、脱細胞化された後の材料のＤＮＡ含有量が明らかに減少し、細胞成分と免疫原性の物質をほとんど含まないことを示す。Ｄは、勾配脱灰を経て、１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の材料を得ることを示す。Ｅは、ＥＤＳ分析により、材料の鉱化の程度が減少した後、カルシウムとリンの含有量が明らかに減少したことを示す。Ｆは、マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）染色により、材料の鉱化の程度が減少した後、鉱化された未熟コラーゲン線維の露出が増加し、脱細胞化された後、各グループの細胞が完全に除去され、明らかな免疫原性物質がなくなったことを示す。
【図２】図２で、Ａは、走査型電子顕微鏡の５００倍の視野で、骨ＥＣＭ材料の鉱化の程度が減少した後、表面がより滑らかになり、カルシウム結節の分布が減少したこと、５０００倍の視野では、鉱化の程度が減少した後、コラーゲン線維の露出が増加したことを示す。Ｂは、免疫組織化学の染色図で、鉱化の程度が減少した後、材料におけるＢＭＰ−２の露出が徐々に増加したことを示す。
【図３】図３で、Ａ−Ｂは、骨ＥＣＭ材料の鉱化の程度が減少した後、空隙率が増加し、抵抗変形能力の指数である剛性が減少したことを示す。Ｃは、異なる鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料のピークフォース差の変化図（スケールは１μｍ）を示す。Ｄは、骨ＥＣＭ材料のミクロ力学特性の変化図で、鉱化の程度が減少するに伴い、表面のヤング率（Ｙｏｕｎｇ‘ｓ  ｍｏｄｕｌｕｓ）が減少し、変形量が増加し、粘着力が減少したことを示す。
【図４】図４は、骨ＥＣＭ材料に細胞を移植した後の細胞粘着効果を示す。Ａ−Ｂは、ＤＡＰＩ染色及び電子顕微鏡の５０００倍の視野で、９０％、６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料の細胞粘着能力と細胞の伸展が良好であるが、１００％、０％の骨材料の細胞粘着能力は減少し、細胞の伸展が不良であることを示す。
【図５】図５で、Ａは、異なる濃度の骨ＥＣＭ材料の浸出液で骨間葉系幹細胞を１〜５日間培養したところ、９０％、６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料は間葉系幹細胞の増殖活性に対して明らかな影響がないことを示唆する。Ｂは、異なる鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料に間葉系幹細胞を再度移植した後、細胞内におけるＣｏｌ−１α、ＡＬＰ、ＢＭＰ−２遺伝子の相対的な発現状態をｑＰＣＲで検出したところ、９０％、６０％の鉱化の程度の材料の骨形成誘導タンパク質の発現量がより高かったことを示す。
【図６】図６で、Ａ−Ｂは、異なる鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料に再移植した２週間と４週間後、間葉系幹細胞におけるＢＭＰ−２、ＭＥＫ−１遺伝子の相対的な発現レベルを免疫蛍光染色で検出したところ、９０％、６０％の鉱化の程度の材料におけるＢＭＰ−２及びＭＥＫ−１の発現が多いため、該当材料によるＢＭＰ−２発現の促進は適切な濃度のカルシウムイオンの刺激に関連する可能性があることを示唆する。
【図７】図７で、Ａは、骨ＥＣＭ材料をウサギの大腿骨の骨欠損モデルに埋め込んで２週間と４週間後、骨欠損部位のマッソン（Ｍａｓｓｏｎ）３色染色図で、９０％、６０％の鉱化の程度の材料による骨小柱と血管成長を促進する能力が優れていることを示唆する。Ｂは、免疫組織化学染色により、移植した２週間後、欠損部位におけるＩＩ型コラーゲンの発現状態を示し、骨ＥＣＭ材料による骨修復の促進は軟骨内の骨形成過程に係る可能性があることを示唆する。
【図８】図８で、Ａは、骨ＥＣＭ材料を骨欠損モデルに埋め込んで２週間後、骨欠損部位における血管新生状態であって、９０％、６０％の鉱化の程度の材料による血管新生を促進する能力が優れることがわかる。Ｂは、骨ＥＣＭ材料を骨欠損モデルに埋め込んで２週間後、骨欠損部位におけるＶＥＧＦＡタンパク質の発現レベルであり、９０％、６０％の鉱化の程度の材料によるＶＥＧＦＡタンパク質発現を促進する能力が優れることがわかる。Ｃは、それぞれ、骨ＥＣＭ材料を骨欠損モデルに埋め込んで２週間と４週間後、新生血管の数、面積、及び厚さの定量化図であって、９０％、６０％の鉱化の程度の骨による血管の成長及び成熟を促進する能力が大きいことがわかる。
【図９】図９で、Ａ−Ｂは、骨ＥＣＭ材料を骨欠損モデルに埋め込んで２週間と４週間後、ＭｉｃｒｏＣＴでスキャンされ再構成された三次元合成画像であり、９０％、６０％の鉱化の程度の材料による骨修復の能力は１００％及び０％より優れることを示す。Ｃは、骨ＥＣＭ材料を骨欠損モデルに埋め込んで２週間と４週間後、新生した骨小柱の数と厚さであり、９０％、６０％の鉱化の程度の材料による骨小柱の成長を促進する能力がより優れることを示す。
【図１０】図１０で、Ａ−Ｂは、骨ＥＣＭ材料を骨欠損モデルに埋め込んで２週間と４週間後、骨欠損部位におけるＨ＆Ｅ染色及び修復面積の定量化図であり、異なる鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料はいずれも骨欠損の修復を促進できるが、９０％、６０％の鉱化の程度の材料による修復能力は、１００％、０％の材料より優れることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、天然組織由来の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料及びその調製方法を提供する。
【００３６】
以下、実施例と併せて、本発明によって提供される天然組織由来の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料及びその調製方法を詳細に説明するが、それらは本発明の保護範囲を限定するものとして理解されるべきではない。
【００３７】
実施例１．ブタの肩甲骨の特定部分による脱灰海綿骨ＥＣＭ材料の調製
１）新鮮なブタの肩甲骨を取り、滅菌生理食塩水で４回洗浄し、６ｍｍのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約２ｍｍの円筒形の骨ブロックに切る。
２）材料が得られたら、滅菌生理食塩水で２時間洗浄した後、照射センターに送り、２５Ｗの照射量で照射滅菌を行う。
３）２０ＫＩＵ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で各回１０分間ずつ３回すすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。
４）５００ｍｌの脱イオン水を含む高温滅菌した１Ｌガラス瓶及び２０個の包埋カセットを準備する。滅菌操作台で滅菌手袋を装着し、３つの滅菌後の骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、１５％のアセトンを含む脱イオン水溶液１０ｍｌに入れ、１０℃で２時間恒温振とうする。
５）包埋カセットを、２％のリン酸トリブチルを含有する脱イオン水溶液５ｍｌに入れ、１０℃で４時間恒温振とうする。
６）包埋カセットを、プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液中に入れ、４℃で、シェーカーを使用して５０ｒｐｍで２４時間振とうした後、液体窒素で３サイクル（−８０℃／３７℃）凍結融解する。
７）包埋カセットを５ｍＬの２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に入れ、１０℃の恒温シェーカーに入れ、１００ｒｐｍで２４時間振とうする。
８）包埋カセットを、５％のＳＤＳを含む脱イオン水に入れ、１０℃の恒温シェーカーを使用して、１００ｒｐｍで３６時間振とうする。
９）０．５Ｍの塩化カリウムを含むＰＢＳ緩衝液において、４℃で、シェーカーを使用して１００ｒｐｍで６時間振とうする。
１０）１Ｍのヨウ化カリウムを含むＰＢＳ緩衝液において、４℃の温度で、シェーカーを使用して１００ｒｐｍで６時間振とうし、脱細胞化された骨ＥＣＭ材料を得る（図１Ａ）。
１１）脱灰溶液（脱イオン水１７５０ｍｌ＋ＥＤＴＡ−２Ｎａ  ４５０ｇ＋ＮａＯＨ  ３５ｇ）を調製する。骨ブロックを取り出し、２５０ｋＨｚ，４℃の条件下で、脱灰装置において、それぞれ４、８、１２、２４時間の脱灰を行う。
１２）ステップ（４）〜（１１）において、各ステップが完了した後、ステップ間はいずれも脱イオン水で６時間すすぐ。
１３）骨ブロックを取り出し、１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料を得る（図１Ｂ）。材料を２５ｗで再度照射滅菌する。
【００３８】
実施例２．ブタの肩甲骨による９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料の測定
１）新鮮なブタの肩甲骨を取り、滅菌生理食塩水で４回洗浄し、６ｍｍのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約２ｍｍの円筒形の骨ブロックに切る。
２）材料が得られたら、滅菌生理食塩水で２時間洗浄した後、照射センターに送り、４０Ｗの照射量で照射滅菌を行う。
３）１０ＫＩＵ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で各回２０分間ずつ３回すすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。
４）５００ｍｌの脱イオン水を含む高温滅菌した１Ｌガラス瓶及び２０個の包埋カセットを準備する。滅菌操作台で滅菌手袋を装着し、３つの滅菌後の骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、１５％のアセトンを含む脱イオン水溶液１０ｍｌに入れ、１０℃で４時間恒温振とうする。
５）包埋カセットを、２％のリン酸トリブチルを含有する脱イオン水溶液５ｍｌに入れ、１０℃で４時間恒温振とうする。
６）プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液において、４℃で、シェーカーを使用して１００ｒｐｍで２４時間振とうした後、液体窒素で３サイクル（−８０℃／３７℃）凍結融解する。
７）包埋カセットを５ｍＬの２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に入れ、１０℃の恒温シェーカーに入れ、１００ｒｐｍで２４時間振とうする。
８）包埋カセットを、５％のＳＤＳを含む脱イオン水に入れ、１０℃の恒温シェーカーを使用して、１００ｒｐｍで３６時間振とうする。
９）０．５Ｍの塩化カリウムを含むＰＢＳ緩衝液において、４℃で、シェーカーを使用して１００ｒｐｍで６時間振とうする。
１０）１Ｍのヨウ化カリウムを含むＰＢＳ緩衝液において、４℃の温度で、シェーカーを使用して１００ｒｐｍで６時間振とうし、脱細胞化された骨ＥＣＭ材料を得る（図１Ａ）。
１１）脱灰溶液（脱イオン水１７５０ｍｌ＋ＥＤＴＡ−２Ｎａ  ４５０ｇ＋ＮａＯＨ  ３５ｇ）を調製する。骨ブロックを取り出し、２５０ｋＨｚ，４℃の条件下で、脱灰装置において、それぞれ４、８、１２、２４時間の脱灰を行う。
１２）ステップ（４）〜（１１）において、各ステップが完了した後、ステップ間はいずれも脱イオン水で６時間すすぐ。
１３）骨ブロックを取り出し、１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料を得る（図１Ｂ）。材料を２５ｗで再度照射滅菌する。
１４）脱細胞化処理後、材料のＤＮＡ含有量の検出量は非常に少ない（図１Ｃ）。
１５）１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料の鉱化含有量（カルシウムイオンの含有量を例とする）を検出する。具体的には、９０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料（４時間の脱灰処理）グループは４．５８±０．０１ｍｍｏｌ／ｍｇで、６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料（８時間の脱灰処理）グループは３．２６±０．３８ｍｍｏｌ／ｍｇで、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料（１２時間の脱灰処理）にはカルシウムイオンがほとんど含まれていない（１００％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料（即ち、脱灰前の材料）におけるカルシウムイオンの含有量は４．９９±０．２２ｍｍｏｌ／ｍｇである）（図１Ｄ）。
１６）１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料の空隙率を測定する。脱灰時間の増加に伴い、空隙率が増加する（図３Ａ）。
１７）１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料の剛性を測定する。剛性とは、圧力、変形に対する耐性の指標であって、鉱化の程度の減少に伴い対応する鉱化の程度の材料の剛性は順に減少し、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料（脱灰４時間、８時間、１２時間）の剛性はそれぞれ５．７１±０．４６Ｎ／ｍｍ、３．６８±０．１８Ｎ／ｍｍ、及び２．５３±１．６２Ｎ／ｍｍである（１００％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料（即ち、脱灰前の材料）の剛性は２１．５５±１．６２Ｎ／ｍｍである）（図３Ｂ）。
【００３９】
実施例３．ブタの肩甲骨による９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料の特性評価
１）新鮮なブタの肩甲骨を取り、滅菌生理食塩水で４回洗浄し、６ｍｍのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約２ｍｍの円筒形の骨ブロックに切る。
２）材料が得られたら、滅菌生理食塩水で２時間洗浄した後、照射センターに送り、５Ｗの照射量で照射滅菌を行う。
３）５０ＫＩＵ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で毎回１０分間ずつ２回すすぎ、血液、脂肪組織、及びその他の不純物を除去する。
４）５００ｍｌの脱イオン水を含む高温滅菌した１Ｌガラス瓶及び２０個の包埋カセットを準備する。滅菌操作台で滅菌手袋を装着し、３つの滅菌後の骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、１０％のアセトンを含む脱イオン水溶液１０ｍｌに入れ、１０℃で１時間恒温振とうする。
５）包埋カセットを５％のリン酸トリブチルを含有する脱イオン水溶液５ｍＬに入れ、１０℃で３時間恒温振とうする。
６）プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液中において、４℃で、シェーカーを使用して５０ｒｐｍで３６時間振とうした後、液体窒素で２サイクル（−８０℃／３７℃）凍結融解する。
７）包埋カセットを５ｍＬの２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に入れ、１０℃の恒温シェーカーに入れ、１００ｒｐｍで２４時間振とうする。
８）包埋カセットを、５％のＳＤＳを含む脱イオン水に入れ、１０℃の恒温シェーカーを使用して、１００ｒｐｍで３６時間振とうする。
９）０．５Ｍの塩化カリウムを含むＰＢＳ緩衝液において、４℃で、シェーカーを使用して１００ｒｐｍで６時間振とうする。
１０）１Ｍのヨウ化カリウムを含むＰＢＳ緩衝液において、４℃の温度で、シェーカーを使用して１００ｒｐｍで６時間振とうし、脱細胞化された骨ＥＣＭ材料を得る（図１Ａ）。
１１）脱灰溶液（脱イオン水１７５０ｍｌ＋ＥＤＴＡ−２Ｎａ  ４５０ｇ＋ＮａＯＨ  ３５ｇ）を調製する。骨ブロックを取り出し、２５０ｋＨｚ，４℃の条件下で、脱灰装置において、それぞれ４、８、１２、２４時間の脱灰を行う。
１２）ステップ（４）〜（１１）において、各ステップが完了した後、ステップ間はいずれも脱イオン水で６時間すすぐ。
１３）骨ブロックを取り出し、１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料を得る（図１Ｂ）。材料を２５ｗで再度照射滅菌する。
１４）走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の観察により、１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料の超微細構造の特徴を得る。他のグループと比較して、１００％と９０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料（即ち、脱灰０及び４時間）の表面はより粗く、空隙はより小さい。また、４つのグループ間のコラーゲン線維の構造と配列にも差異が存在する。１００％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料（即ち、脱灰前の材料）のグループにおいては、ほとんどのコラーゲン線維は表面に覆われているが、９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料（脱灰４時間及び８時間）の表面は、コラーゲン線維の露出が多く、配列規則が良好で、細胞のためにより多くの接着滞留位置が形成されている。しかしながら、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料（脱灰１２時間）は、コラーゲン原線維の構造がより無秩序で、緻密性がより悪く、細胞の滞留に不利である（図２Ａ）。
１５）原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）も、同じく、１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料における表面露出コラーゲンがより多いことを示している（図３Ｃ〜Ｄ）。
１６）免疫組織化学的染色は、９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料の表面におけるＢＭＰ−２の発現量が増加することを示している（図２Ｂ）。
１７）ＥＤＳ法によって、１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料の特定の領域におけるＣ、Ｐ、Ｃａ（炭素、リン、カルシウム）の比率を測定した（図１Ｅ、Ｆ）。Ｃをレファレンスとして、選択性電極法で測定されたＣａ濃度によれば、材料の鉱化の程度が減少するに伴い、Ｃａ密度はより分散される。また、リン含有量の変化はカルシウムの変化と一致し、鉱化の程度が減少するに伴い、分散度は増加する。ＡＦＭにより、１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料の超微細機械的特性を評価した。天然の骨ＥＣＭ由来の材料の鉱化の程度の違いにより、我々は、９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料は、より多くの原線維が表面に露出し、細胞粘着のために多くのＲＧＤリガンドを提供していることが見いだされた。
【００４０】
実施例４．骨髄間葉系幹細胞を９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料に移植
１）新鮮なブタの肩甲骨を取り、滅菌生理食塩水で４回洗浄し、６ｍｍのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約２ｍｍの円筒形の骨ブロックに切る。
２）材料が得られたら、滅菌生理食塩水で２時間洗浄した後、照射センターに送り、２５Ｗの照射量で照射滅菌を行う。
３）２０ＫＩＵ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で各回１０分間ずつ３回すすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。
４）５００ｍｌの脱イオン水を含む高温滅菌した１Ｌガラス瓶及び２０個の包埋カセットを準備する。滅菌操作台で滅菌手袋を装着し、３つの滅菌後の骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、１５％のアセトンを含む脱イオン水溶液１０ｍｌに入れ、１０℃で２時間恒温振とうする。
５）包埋カセットを、２％のリン酸トリブチルを含有する脱イオン水溶液５ｍｌに入れ、１０℃で４時間恒温振とうする。
６）プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液において、４℃で、シェーカーを使用して２４時間振とうした後、液体窒素で３サイクル（−８０℃／３７℃）凍結融解する。
７）包埋カセットを５ｍＬの２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に入れ、１０℃の恒温シェーカーに入れ、１００ｒｐｍで２４時間振とうする。
８）包埋カセットを、５％のＳＤＳを含む脱イオン水に入れ、１０℃の恒温シェーカーを使用して、１００ｒｐｍで３６時間振とうする。
９）０．５Ｍの塩化カリウムを含むＰＢＳ緩衝液において、４℃で、シェーカーを使用して１００ｒｐｍで６時間振とうする。
１０）１Ｍのヨウ化カリウムを含むＰＢＳ緩衝液において、４℃の温度で、シェーカーを使用して１００ｒｐｍで６時間振とうし、脱細胞化された骨ＥＣＭ材料を得る（図１Ａ）。
１１）脱灰溶液（脱イオン水１７５０ｍｌ＋ＥＤＴＡ−２Ｎａ  ４５０ｇ＋ＮａＯＨ  ３５ｇ）を調製する。骨ブロックを取り出し、２５０ｋＨｚ，４℃の条件下で、脱灰装置において、それぞれ４、８、１２、２４時間の脱灰を行う。
１２）ステップ（４）〜（１１）において、各ステップが完了した後、ステップ間はいずれも脱イオン水で６時間すすぐ。
１３）骨ブロックを取り出し、１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料を得る（図１Ｂ）。材料を２５ｗで再度照射滅菌する。
１４）特定の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料の浸出液（９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料からの浸出液）で骨間葉系幹細胞を１〜５日間培養したところ、その結果、細胞の成長が良好であることが示された。それは、材料の安全性、無毒性が高いことを示す（図５Ａ）。
１５）骨髄間葉系幹細胞を１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料に移植した三日後、共焦点顕微鏡の視野で、細胞が足場に粘着されていることが観察された（図４Ａ）。走査型電子顕微鏡の１０００倍の視野で、鉱化の程度が１００％の骨髄ＥＣＭ材料に比較して、９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料の骨髄間葉系幹細胞がより多いことが観察され、それは本特許に係る材料は細胞粘着定着及び細胞増殖を効果的に促進できることを示している。図４Ｂに示すように、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料の細胞の数も比較的に少ない。
１６）その後、１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料に定着された骨髄間葉系幹細胞における骨形成遺伝子の相対的な発現状況を比較した（図５Ｂ）。ＡＬＰとは、骨髄間葉系幹細胞の早期の最も重要な骨形成指標の１つである。その結果、９０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料で１週間培養された細胞内におけるＡＬＰが非脱灰グループより１７倍アップレギュレートされていることが示された。Ｃｏｌ−１α１も同じ傾向である。培養の２週目と４週目に、９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料、特に９０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料における細胞のＢＭＰ−２発現レベルが高くなった（図６Ａ）。また、ＭＡＰＫシグナル経路はＣａ２＋仲介の骨形成と分化を促進する過程において役割を果たし、その結果、１００％及び０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料骨グループに比較して、９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料におけるＭＥＫ−１発現がアップレギュレートされていることを見いだした（図６Ｂ）。要約すると、１００％及び０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料に比較して、９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料、特に９０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料は、骨髄間葉系幹細胞の骨形成と分化を促進するより良い効果を示した。
【００４１】
実施例５．生体内実験において、９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料は、早期の骨欠損の修復を明らかに促進する
１）新鮮なブタの肩甲骨を取り、滅菌生理食塩水で４回洗浄し、６ｍｍのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約２ｍｍの円筒形の骨ブロックに切る。
２）材料が得られたら、滅菌生理食塩水で２時間洗浄した後、照射センターに送り、２５Ｗの照射量で照射滅菌を行う。
３）２０ＫＩＵ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で各回１０分間ずつ３回すすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。
４）５００ｍｌの脱イオン水を含む高温滅菌した１Ｌガラス瓶及び２０個の包埋カセットを準備する。滅菌操作台で滅菌手袋を装着し、３つの滅菌後の骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、２０％のアセトンを含む脱イオン水溶液１０ｍｌに入れ、１０℃で４時間恒温振とうする。
５）包埋カセットを、１％のリン酸トリブチルを含有する脱イオン水溶液５ｍｌに入れ、１０℃で１時間恒温振とうする。
６）プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液中において、４℃で、シェーカーを使用して、３００ｒｐｍで４８時間振とうした後、液体窒素で６サイクル（−８０℃／３７℃）凍結融解する。
７）包埋カセットを０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ５ｍｌに入れ、１０℃の恒温シェーカーに入れ、１００ｒｐｍで２４時間振とうする。
８）包埋カセットを、５％のＳＤＳを含む脱イオン水に入れ、１０℃の恒温シェーカーを使用して、１００ｒｐｍで３６時間振とうする。
９）０．５Ｍの塩化カリウムを含むＰＢＳ緩衝液において、４℃で、シェーカーを使用して、１００ｒｐｍで２時間振とうする。
１０）１．２Ｍのヨウ化カリウムを含むＰＢＳ緩衝液において、４℃の温度で、シェーカーを使用して、１００ｒｐｍで１２時間振とうし、脱細胞化された骨ＥＣＭ材料を得る（図１Ａ）。
１１）脱灰溶液（脱イオン水１７５０ｍｌ＋ＥＤＴＡ−２Ｎａ  ４５０ｇ＋ＮａＯＨ  ３５ｇ）を調製する。骨ブロックを取り出し、２５０ｋＨｚ，４℃の条件下で、脱灰装置において、それぞれ４、８、１２、２４時間の脱灰を行う。
１２）ステップ（４）〜（１１）において、各ステップが完了した後、ステップ間はいずれも脱イオン水で６時間すすぐ。
１３）骨ブロックを取り出し、１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料を得る（図１Ｂ）。材料を２５ｗで再度照射滅菌する。
１４）ウサギの大腿骨上顆の両側の欠損モデルを確立し、１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料を埋め込み、それらの治療効果を評価した。
１５）マイクロＣＴ分析（図９Ａ〜Ｂ）により、移植術の４週間後、９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料グループの骨欠損部位はほとんど新生骨小柱で充填されたが、非脱灰および完全脱灰材料グループの充填効果は小さいことが示された。１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料は、それぞれ１．２３±０．１４／ｍｍ、２．１６±０．０３／ｍｍ、１．５７±０．２１／ｍｍ、０．９４±０．２２／ｍｍで、骨小柱の厚さは、それぞれ０．１６±０．０３μｍ、０．２４±０．０４μｍ、０．１８±０．０１μｍ、０．１４±０．０２μｍであった。９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料による生体自身の新生骨小柱の成長を促進する効果は他のグループより優れていた（図９Ｃ）。
１６）Ｈ＆Ｅ染色後（図１０Ａ〜Ｂ）、明らかな炎症または炎症性細胞が見い出せなかった。これは、材料の安全性を示している。
１７）移植術の４週間後、９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料は、部分的に分解され、新生骨が成長した。新生骨組織におけるコラーゲン線維の鉱化は、多くは未熟な状態の鉱物材料の表面コラーゲンである（図７Ａ、Ｂ）。
【００４２】
実施例６．生体内実験において、９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料は、骨欠損部分における血管の形成を明らかに促進する
１）新鮮なブタの肩甲骨を取り、滅菌生理食塩水で４回洗浄し、６ｍｍのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約２ｍｍの円筒形の骨ブロックに切る。
２）材料が得られたら、滅菌生理食塩水で２時間洗浄した後、照射センターに送り、２５Ｗの照射量で照射滅菌を行う。
３）２０ＫＩＵ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で各回１０分間ずつ３回すすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。
４）５００ｍｌの脱イオン水を含む高温滅菌した１Ｌガラス瓶及び２０個の包埋カセットを準備する。滅菌操作台で滅菌手袋を装着し、３つの滅菌後の骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、１５％のアセトンを含む脱イオン水溶液１０ｍｌに入れ、１０℃で２時間恒温振とうする。
５）包埋カセットを、５％のリン酸トリブチルを含有する脱イオン水溶液５ｍｌに入れ、１０℃で４時間恒温振とうする。
６）プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液において、４℃で、シェーカーを使用して２４時間振とうした後、液体窒素で３サイクル（−８０℃／３７℃）凍結融解する。
７）包埋カセットを５ｍＬの２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に入れ、１０℃の恒温シェーカーに入れ、１００ｒｐｍで２４時間振とうする。
８）包埋カセットを、１０％のＳＤＳを含む脱イオン水に入れ、１０℃の恒温シェーカーを使用して、１００ｒｐｍで３６時間振とうする。
９）０．１Ｍの塩化カリウムを含むＰＢＳ緩衝液において、４℃で、シェーカーを使用して、１００ｒｐｍで１２時間振とうする。
１０）１Ｍのヨウ化カリウムを含むＰＢＳ緩衝液において、４℃の温度で、シェーカーを使用して１００ｒｐｍで２時間振とうし、脱細胞化された骨ＥＣＭ材料を得る（図１Ａ）。
１１）脱灰溶液（脱イオン水１７５０ｍｌ＋ＥＤＴＡ−２Ｎａ  ４５０ｇ＋ＮａＯＨ  ３５ｇ）を調製する。骨ブロックを取り出し、２５０ｋＨｚ，４℃の条件下で、脱灰装置において、それぞれ４、８、１２、２４時間の脱灰を行う。
１２）ステップ（４）〜（１１）において、各ステップが完了した後、ステップ間はいずれも脱イオン水で６時間すすぐ。
１３）骨ブロックを取り出し、１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料を得る（図１Ｂ）。材料を２５ｗで再度照射滅菌する。
１４）血管形成を促進する面においては、新生血管が骨小柱の間に分布していることが観察され、移植術の２週間後、ほとんどは未熟な新生血管が形成された。その中で、１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料の新生血管の数は、それぞれ５．５±１．３／５００μｍ２、８．０±１．６／５００μｍ２、８．０±１．８／５００μｍ２、及び５．０±１．６／５００μｍ２で、血管面積はそれぞれ２３．９２±７．２５μｍ２、３８．９５±８．１２μｍ２、４５．５４±８．７０μｍ２、及び１８．８６±９．４３μｍ２であった。その中で、９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料グループの新生血管の厚さは、それぞれ４．８６±０．１５μｍ、５．０７±０．２０μｍで、１００％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料（４．２９±０．３８μｍ）と０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料グループ（４．４１±０．２６μｍ）より高かった。移植術の４週間後、主に成熟した新生血管が形成され、１００％、９０％、６０％、０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料の数は、それぞれ３．５±０．６／５００μｍ２、５．８±１．０／５００μｍ２、５．０±０．８／５００μｍ２、及び２．８±１．５／５００μｍ２で、血管面積はそれぞれ４１．２６±５．６９μｍ２、６９．９２±１１．２６μｍ２、６０．７６±８．６６μｍ２、及び２４．８７±８．１８μｍ２であった。厚さは、移植術の２週間時点と比較して、各グループはいずれも増加しており、その中で、９０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料（１２．１８±０．５４μｍ）及び６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料（１２．１８±０．３２μｍ）グループは、依然として１００％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料グループ（１１．８３±０．４９μｍ）と０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料グループ（９．６８±１．８３μｍ）より高かった。９０％と６０％の鉱化の程度の骨ＥＣＭ材料グループは、他の２つのグループと比較して、新生血管、微小血管の変性、大血管の安定した成長が速くなっていることを示すとともに、欠陥組織における血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）の分布はアップレギュレートされ、より良い修復効果があった（図８Ａ〜Ｅ）。
【００４３】
実施例７．勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料及びその調製方法の研究及び評価
１）新鮮な牛の肩甲骨を取り、滅菌生理食塩水で４回洗浄し、６ｍｍのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約２ｍｍの円筒形の骨ブロックに切る。
２）材料が得られたら、滅菌生理食塩水で２時間洗浄し、照射センターに送り、２５Ｗの照射量で照射滅菌を行う。
３）５０ＫＩＵ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で毎回５分間ずつ２回すすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。
４）残りの後続の操作は、実施例１の方法を参照して実行し、勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料を得る。
【００４４】
実施例８．勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料及びその調製方法の研究及び評価
１）新鮮な豚の肋骨を取り、滅菌生理食塩水で４回洗浄し、６ｍｍのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約２ｍｍの円筒形の骨ブロックに切る。
２）材料が得られたら、滅菌生理食塩水で２時間洗浄し、照射センターに送り、２５Ｗの照射量で照射滅菌を行う。
３）１０ＫＩＵ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で毎回５分間ずつ５回すすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。
４）残りの後続の操作は、実施例１の方法を参照して実行され、勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料を得る。
【００４５】
実施例９．勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料及びその調製方法の研究及び評価
１）新鮮なブタの肩甲骨を取り、滅菌生理食塩水で４回洗浄し、６ｍｍのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約２ｍｍの円筒形の骨ブロックに切る。
２）材料が得られたら、滅菌生理食塩水で２時間洗浄した後、照射センターに送り、２５Ｗの照射量で照射滅菌を行う。
３）２０ＫＩＵ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で各回１０分間ずつ３回すすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。
４）５００ｍｌの脱イオン水を含む高温滅菌した１Ｌガラス瓶及び２０個の包埋カセットを準備する。滅菌操作台で滅菌手袋を装着し、３つの滅菌後の骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、１０％のアセトンを含む脱イオン水溶液１０ｍｌに入れ、１０℃で１時間恒温振とうする。
５）包埋カセットを、２％のリン酸トリブチルを含有する脱イオン水溶液５ｍｌに入れ、１０℃で４時間恒温振とうする。
６）プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液において、４℃で、シェーカーを使用して２４時間振とうした後、液体窒素で３サイクル（−８０℃／３７℃）凍結融解する。
７）包埋カセットを、５ｍｌの２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に入れ、１０℃の恒温シェーカーに入れ、１００ｒｐｍで２４時間振とうする。
８）包埋カセットを、５％のＳＤＳを含む脱イオン水に入れ、１０℃の恒温シェーカーを使用して、１００ｒｐｍで３６時間振とうする。
９）０．５Ｍの塩化カリウムを含むＰＢＳ緩衝液において、４℃で、シェーカーを使用して、１００ｒｐｍで６時間振とうする。
１０）１Ｍのヨウ化カリウムを含むＰＢＳ緩衝液において、４℃の温度で、シェーカーを使用して、１００ｒｐｍで６時間振とうし、脱細胞化された骨ＥＣＭ材料を得る（図１Ａ）。
１１）脱灰溶液を調製する（脱イオン水１７５０ｍｌ＋ＥＤＴＡ−２Ｎａ  ４５０ｇ＋ＮａＯＨ  １０ｇ）。骨ブロックを取り出し、３５０ｋＨｚ、４℃で、脱灰装置でそれぞれ４、８、１２、２４時間脱灰する。
１２）残りの後続の操作は、実施例１の方法を参照して実行し、勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料を得る。
【００４６】
実施例７〜９で得られた勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料について、組織学的な評価、カルシウムとリン含有量の計測、材料の表面コラーゲンの形態及び含有量の計測、機械的な測定を行った。その結果、実施列１で勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の結果と同様であった。これは、最適化後に決定された試薬と処理時間の調整を通じて、同様の効果を持つ勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製を実現できることを示している。また、該当材料について、組織学的な評価、細胞培養実験、及び材料の生体内修復実験の評価を行ったところ、実施例７〜９で得られた９０％、６０％の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料は、良好な修復再生効果を有することが観察され、臨床的に筋肉の欠損と病変の修復と再生を促進するための安全で信頼性が高く、効果的で迅速な生体材料として使用できることを示した。
【００４７】
上記の実施例からわかるように、本発明によって提供される天然組織由来の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料及びその調製方法は、細胞接着をよりよく促進し、定着細胞の分化及び増殖を誘導し、血管形成を促進し、新生骨小柱の成長を促進することにより、より良い修復効果及びより小さな炎症反応を達成することができる。そのため、有望な骨欠損移植材料である。
【００４８】
上記は、本発明の好ましい実施形態に過ぎない。当技術分野の通常の技術者にとって、本発明の原理から逸脱しない前提下で、いくつかの改善及び修正を行うことができ、これらの改善および修正も本発明の保護範囲と見なされるべきである。
【００４９】
参考文献：
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［６］Ａ．Ｓｚｃｚｅｓ，Ｌ．Ｈｏｌｙｓｚ，Ｅ．Ｃｈｉｂｏｗｓｋｉ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｆｏｒｂｉｏｍｅｄｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡｄｖＣｏｌｌｏｉｄＩｎｔｅｒｆａｃｅＳｃｉ２４９（２０１７）３２１−３３０．
［７］Ｑ．Ｈｕ，Ｍ．Ｌｉｕ，Ｇ．Ｃｈｅｎ，Ｚ．Ｘｕ，Ｙ．Ｌｖ，ＤｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄＢｏｎｅＳｃａｆｆｏｌｄｓｗｉｔｈＴｕｎａｂｌｅＭａｔｒｉｘＳｔｉｆｆｎｅｓｓｆｏｒＥｆｆｉｃｉｅｎｔＢｏｎｅＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ＡＣＳＡｐｐｌＭａｔｅｒＩｎｔｅｒｆａｃｅｓ１０（３３）（２０１８）２７６６９−２７６８０．
［８］Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ａｚａｉｓ，Ｍ．Ｒｏｂｉｎ，Ａ．Ｖａｌｌｅｅ，Ｃ．Ｃａｔａｎｉａ，Ｐ．Ｌｅｇｒｉｅｌ，Ｇ．Ｐｅｈａｕ−Ａｒｎａｕｄｅｔ，Ｆ．Ｂａｂｏｎｎｅａｕ，Ｍ．Ｍ．Ｇｉｒａｕｄ−Ｇｕｉｌｌｅ，Ｎ．Ｎａｓｓｉｆ，Ｔｈｅｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｒｏｌｅｏｆｃｏｌｌａｇｅｎｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ，ｇｒｏｗｔｈ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｂｏｎｅａｐａｔｉｔｅ，ＮａｔＭａｔｅｒ１１（８）（２０１２）７２４−３３．
［９］Ｗ．Ｌ．Ｇｒａｙｓｏｎ，Ｓ．Ｂｈｕｍｉｒａｔａｎａ，Ｃ．Ｃａｎｎｉｚｚａｒｏ，Ｐ．Ｈ．Ｃｈａｏ，Ｄ．Ｐ．Ｌｅｎｎｏｎ，Ａ．Ｉ．Ｃａｐｌａｎ，Ｇ．Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ，Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｎｉｔｉａｌｓｅｅｄｉｎｇｄｅｎｓｉｔｙａｎｄｆｌｕｉｄｐｅｒｆｕｓｉｏｎｒａｔｅｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｂｏｎｅ，ＴｉｓｓｕｅＥｎｇＰａｒｔＡ１４（１１）（２００８）１８０９−２０．
［１０］Ｆ．Ｍ．Ｓａｖｉ，Ｇ．Ｉ．Ｂｒｉｅｒｌｙ，Ｊ．Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｃ．Ｔｈｅｏｄｏｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｍ．Ａ．Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＤｉｆｆｅｒｅｎｔＤｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓＵｓｉｎｇＲａｔＭａｎｄｉｂｌｅｓａｓａＭｏｄｅｌ，ＪＨｉｓｔｏｃｈｅｍＣｙｔｏｃｈｅｍ６５（１２）（２０１７）７０５−７２２．
［１１］Ｓ．Ｈ．Ｙｕ，Ｈ．Ｌ．Ｃｈａｎ，Ｌ．Ｙ．Ｃｈｏｎｇ，Ｙ．Ｈ．Ｊｈｅｎｇ，Ｐ．Ｃ．Ｃｈａｎｇ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−ｒｉｃｈｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄｂｏｎｅｍａｔｒｉｘｉｎｖｉｖｏ，ＪＰｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ８６（１）（２０１５）３６−４３．
［１２］Ｒ．Ｕ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｎ．Ｋｅｍｐｅｒ，Ｅ．Ｂｒｅａｔｈｗａｉｔｅ，Ｓ．Ｍ．Ｄｕｔｔａ，Ｅ．Ｌ．Ｈｓｕ，Ｗ．Ｋ．Ｈｓｕ，Ｍ．Ｐ．Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄｂｏｎｅｍａｔｒｉｘｆｉｂｅｒｓｆｏｒｍａｂｌｅａｓｇｅｎｅｒａｌａｎｄｃｕｓｔｏｍ３Ｄｐｒｉｎｔｅｄｍｏｌｄ−ｂａｓｅｄｉｍｐｌａｎｔｓｆｏｒｐｒｏｍｏｔｉｎｇｂｏｎｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ８（３）（２０１６）０３５００７．
［１３］Ｅ．Ｈｕｂｅｒ，Ａ．Ｍ．Ｐｏｂｌｏｔｈ，Ｎ．Ｂｏｒｍａｎｎ，Ｎ．Ｋｏｌａｒｃｚｉｋ，Ｋ．Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｂｌｅｅｋ，Ｈ．Ｓｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｓｃｈｗａｂｅ，Ｇ．Ｎ．Ｄｕｄａ，Ｂ．Ｗｉｌｄｅｍａｎｎ，（＊）ＤｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄＢｏｎｅＭａｔｒｉｘａｓａＣａｒｒｉｅｒｆｏｒＢｏｎｅＭｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃＰｒｏｔｅｉｎ−２：ＢｕｒｓｔＲｅｌｅａｓｅＣｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＬｏｎｇ−ＴｅｒｍＢｉｎｄｉｎｇａｎｄＯｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅＡｃｔｉｖｉｔｙＥｖａｌｕａｔｅｄＩｎＶｉｔｒｏａｎｄＩｎＶｉｖｏ，ＴｉｓｓｕｅＥｎｇＰａｒｔＡ２３（２３−２４）（２０１７）１３２１−１３３０．
【図１（Ａ）】
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【図１（Ｂ）】
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【図１（Ｃ）】
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【図１（Ｄ）】
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【図１（Ｅ）】
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【図１（Ｆ）】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図３（Ｃ）】
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【図３（Ｄ）】
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【図４（Ａ）】
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【図４（Ｂ）】
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【図５（Ａ）】
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【図５（Ｂ）】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
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【図７（Ａ）】
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【図７（Ｂ）】
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【図８（Ａ）】
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【図８（Ｂ）】
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【図８（Ｃ）】
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【図８（Ｄ）】
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【図８（Ｅ）】
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【図９（Ａ）】
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【図９（Ｂ）】
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【図９（Ｃ）】
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【図１０（Ａ）】
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【図１０（Ｂ）】
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【国際調査報告】
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2021523749.tif 000034
2021523749.tif 000035
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