(57)【要約】脊髄損傷を処置するための方法および組成物が本明細書において記載される。本発明の複数の局面は、KCC2を上方調節する作用物質を対象に投与することに関する。本発明の別の局面は、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減する作用物質を対象に投与することに関する。これらの作用物質を含む組成物が本明細書においてさらに記載される。2021525707.tif 000021
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊髄損傷を有する対象に、ニューロン特異的K+-Cl-共輸送体(KCC2)を上方調節する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
【請求項２】
KCC2を上方調節する前記作用物質が、小分子、ペプチド、遺伝子編集システム、および、KCC2をコードする発現ベクターからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記小分子がCLP290である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記ベクターが非組み込み型または組み込み型である、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記ベクターがウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
前記非組み込み型ベクターが、エピソームベクター、EBNA1ベクター、ミニサークルベクター、非組み込み型アデノウイルス、非組み込み型RNA、およびセンダイウイルスからなる群より選択される、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルスからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
前記非ウイルスベクターが、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性重合体、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、およびリポスフィア（liposphere）からなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
【請求項９】
前記ベクターが血液脳関門を通過する、請求項4〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
KCC2が、適切な対照と比較して少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、または少なくとも10倍上方調節される、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記脊髄損傷が重症脊髄損傷である、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象がヒトである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が脊髄損傷と診断されたことがある、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が脊髄損傷の処置を以前に受けている、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
投与する段階の前に、前記対象が脊髄損傷を有すると診断されている、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置をさらに実施する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象に少なくとも第2の治療用化合物をさらに投与する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第2の治療用化合物が、オステオポンチン、成長因子、または4-アミノプリジンからなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
脊髄損傷を有する対象に、Na+/2Cl-/K+共輸送体(NKCC)を阻害する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
【請求項２０】
NKCCを阻害する前記作用物質が、小分子、抗体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNAiからなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記RNAiがマイクロRNA、siRNA、またはshRNAである、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記小分子がブメタニドである、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
前記作用物質がベクター中に含まれる、請求項19〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
脊髄損傷を有する対象に、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
【請求項２５】
前記作用物質が阻害性Gi共役受容体Gi-DREADDを上方調節する、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記作用物質が、Gi-DREADDをコードする発現ベクターである、請求項24または25に記載の方法。
【請求項２７】
前記作用物質が、Kir2.1をコードする発現ベクターである、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
前記作用物質と実質的に同時にクロザピンN-オキシドを投与する段階をさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２９】
前記ベクターが血液脳関門を通過する、請求項25〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
抑制性介在ニューロンの前記興奮性が、適切な対照と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90、少なくとも99%、またはそれ以上低減される、請求項24〜29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
投与する段階の前に、前記対象が脊髄損傷を有すると診断されている、請求項24に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置を実施する、請求項24〜31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
脊髄損傷を有する対象に、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減する電気刺激の有効量を与える段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
【請求項３４】
前記作用物質と実質的に同時にクロザピンN-オキシドを投与する段階をさらに含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
前記電気刺激が脊髄に直接適用される、請求項33に記載の方法。
【請求項３６】
前記電気刺激が損傷部位において脊髄に直接適用される、請求項33に記載の方法。
【請求項３７】
抑制性介在ニューロンの前記興奮性が、適切な対照と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90、少なくとも99%、またはそれ以上低減される、請求項33〜36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
投与する段階の前に、前記対象が脊髄損傷を有すると診断されている、請求項33に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置を実施する、請求項33〜38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
脊髄損傷の処置に用いるための、KCC2ポリペプチドのまたは該KCC2ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項４１】
前記KCC2ポリペプチドがSEQ ID NO: 1の配列を含む、請求項40に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
前記KCC2ポリペプチドが、SEQ ID NO: 1との少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、かつSEQ ID NO: 1のKCC2の生物学的活性の少なくとも80%を保持している、請求項40または41に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む、請求項40〜42のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
脊髄損傷の処置に用いるための、Gi-DREADDポリペプチドのまたは該Gi-DREADDポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項４５】
前記Gi-DREADDポリペプチドが、最適化されたGi-DREADDポリペプチドである、請求項44に記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
前記Gi-DREADDポリペプチドがSEQ ID NO: 2の配列を含む、請求項44または45に記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
前記Gi-DREADDポリペプチドが、SEQ ID NO: 2との少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、かつSEQ ID NO: 2のGi-DREADDの生物学的活性の少なくとも80%を保持している、請求項44〜46のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
クロザピンN-オキシドをさらに含む、請求項44〜47のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項４９】
少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む、請求項44〜47のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項５０】
脊髄損傷の処置に用いるための、Kir2.1ポリペプチドのまたは該Kir2.1ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項５１】
前記Kir2.1ポリペプチドがSEQ ID NO: 3の配列を含む、請求項50に記載の薬学的組成物。
【請求項５２】
前記Kir2.1ポリペプチドが、SEQ ID NO: 3との少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、かつSEQ ID NO: 3のKir2.1の生物学的活性の少なくとも80%を保持している、請求項50または51に記載の薬学的組成物。
【請求項５３】
クロザピンN-オキシドをさらに含む、請求項50〜52のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項５４】
少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む、請求項50〜52のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項５５】
脊髄損傷の処置に用いるための、請求項19〜21のいずれか一項に記載の作用物質の有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項５６】
少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む、請求項55に記載の薬学的組成物。
【請求項５７】
脊髄損傷を有する対象にCLP290の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
【請求項５８】
CLP290が血液脳関門を通過する、請求項1に記載の方法。
【請求項５９】
前記脊髄損傷が重度の脊髄損傷である、請求項1に記載の方法。
【請求項６０】
前記対象がヒトである、請求項57〜59のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記対象が脊髄損傷と診断されたことがある、請求項57〜60のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記対象が脊髄損傷の処置を以前に受けている、請求項57〜61のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
投与する段階の前に、前記対象が脊髄損傷を有すると診断されている、請求項1に記載の方法。
【請求項６４】
前記対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置をさらに実施する、請求項57〜63のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記対象に少なくとも第2の治療用化合物をさらに投与する、請求項57〜63のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記第2の治療用化合物が、オステオポンチン、成長因子、または4-アミノプリジンからなる群より選択される、請求項65に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2018年5月25日付で出願された米国仮特許出願第62/676,464号の米国特許法第119条(e)項の下での恩典を主張する国際出願であり、該米国仮特許出願の内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野は、脊髄損傷の処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
多くのヒト脊髄損傷は、解剖学的構造上では不完全であるが、完全麻痺を呈する。これらの場合、スペアの軸索が機能回復を媒介できない理由は不明である。そのような損傷に対する現行の治療法は限られており、脊髄損傷の機能回復を再生しない場合が多い。したがって、効果的な処置を開発するには、軸索再生をよりよく理解する必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本明細書において記載される本発明は、部分的に、ニューロン特異的K+-Cl-共輸送体(KCC2)活性および/またはレベルを上方調節する作用物質、例えばCLP290が、ジグザグ状の両側性半切断(staggered bilateral hemisection)を有するマウス、例えば、重症脊髄損傷モデルにおいてステッピング機能を回復することができたという発見に関する。さらに、KCC2の過剰発現は、このステッピングの回復を再現した。Na+/2Cl-/K+共輸送体(NKCC)の阻害がステッピング能力をさらに回復するということが本明細書においてさらに示される。
【０００５】
さらに、本明細書において記載される研究は、クロザピンN-オキシドと組み合わせて介在ニューロンの興奮性を低減する作用物質が、ジグザグ状の両側性半切断の後、この能力を以前に失っていたマウスのステッピング能力をさらに回復することを示す。そのような作用物質は、抑制性介在ニューロンでの発現のために最適化されたGi-DREADD、およびKir2.1を上方調節する作用物質を含む。
【０００６】
さらに、脊髄損傷の処置などに用いられる、KCC2、NKCC、Gi-DREADD、およびKir2.1を調節するための作用物質を含む組成物が、本明細書において記載される。
【０００７】
したがって、本明細書において記載される本発明の1つの局面は、脊髄損傷を有する対象に、KCC2を上方調節する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法を提供する。
【０００８】
いずれかの局面の1つの態様において、KCC2を上方調節する作用物質は、小分子、ペプチド、遺伝子編集システム、および、KCC2をコードする発現ベクターからなる群より選択される。
【０００９】
いずれかの局面の1つの態様において、小分子はCLP290である。
【００１０】
いずれかの局面の1つの態様において、ベクターは非組み込み型または組み込み型である。いずれかの局面の別の態様において、ベクターはウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである。
【００１１】
例示的な非組み込み型ベクターは、エピソームベクター、EBNA1ベクター、ミニサークルベクター、非組み込み型アデノウイルス、非組み込み型RNA、およびセンダイウイルスを含むが、これらに限定されることはない。
【００１２】
例示的なウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを含むが、これらに限定されることはない。
【００１３】
例示的な非ウイルスベクターは、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性重合体、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、およびリポスフィア（liposphere）を含むが、これらに限定されることはない。
【００１４】
いずれかの局面の1つの態様において、ベクターは血液脳関門を通過する。
【００１５】
いずれかの局面の1つの態様において、KCC2は、適切な対照と比較して少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍上方調節される。
【００１６】
いずれかの局面の1つの態様において、脊髄損傷は重症脊髄損傷である。
【００１７】
いずれかの局面の1つの態様において、対象はヒトである。いずれかの局面の1つの態様において、対象は脊髄損傷と診断されたことがある。いずれかの局面の1つの態様において、対象は脊髄損傷と以前に診断されている。いずれかの局面の1つの態様において、対象は脊髄損傷の処置を以前に受けている。
【００１８】
いずれかの局面の1つの態様において、投与する前に、対象は脊髄損傷を有すると診断されている。
【００１９】
いずれかの局面の1つの態様において、対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置をさらに実施する。いずれかの局面の1つの態様において、対象に少なくとも第2の治療用化合物をさらに投与する。例示的な第2の治療用化合物は、オステオポンチン、成長因子、または4-アミノプリジンを含むが、これらに限定されることはない。
【００２０】
本明細書において記載される本発明の別の局面は、脊髄損傷を有する対象に、Na+/2Cl-/K+共輸送体(NKCC)を阻害する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法を提供する。
【００２１】
いずれかの局面の1つの態様において、Na+/2Cl-/K+共輸送体(NKCC)を阻害する作用物質は、小分子、抗体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNAiからなる群より選択される。いずれかの局面の1つの態様において、RNAiはマイクロRNA、siRNA、またはshRNAである。いずれかの局面の1つの態様において、小分子はブメタニドである。
【００２２】
いずれかの局面の1つの態様において、作用物質はベクター中に含まれる。
【００２３】
本明細書において記載される本発明のさらに別の局面は、脊髄損傷を有する対象に、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法を提供する。
【００２４】
いずれかの局面の1つの態様において、作用物質は阻害性Gi共役受容体Gi-DREADDを上方調節する。
【００２５】
いずれかの局面の1つの態様において、作用物質は、Gi-DREADDをコードする発現ベクターである。いずれかの局面の1つの態様において、作用物質は、Kir2.1をコードする発現ベクターである。
【００２６】
いずれかの局面の1つの態様において、方法は、作用物質と実質的に同時にクロザピンN-オキシドを投与する段階をさらに含む。
【００２７】
いずれかの局面の1つの態様において、抑制性介在ニューロンの興奮性は、適切な対照と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90、少なくとも99%、またはそれ以上低減される。
【００２８】
本明細書において記載される本発明の別の局面は、脊髄損傷を有する対象に、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減する電気刺激の有効量を与える段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法を提供する。いずれかの局面の1つの態様において、方法は、クロザピンN-オキシドを投与する段階をさらに含む。
【００２９】
いずれかの局面の1つの態様において、電気刺激は脊髄に直接適用される。いずれかの局面の1つの態様において、電気刺激は損傷部位において脊髄に直接適用される。
【００３０】
いずれかの局面の1つの態様において、抑制性介在ニューロンの興奮性は、適切な対照と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90、少なくとも99%、またはそれ以上低減される。
【００３１】
本明細書において記載される本発明の別の局面は、脊髄損傷の処置に用いるための、KCC2ポリペプチドのまたはKCC2ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【００３２】
いずれかの局面の1つの態様において、KCC2ポリペプチドは、SEQ ID NO: 1との少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するか、それらを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になり、かつSEQ ID NO: 1のKCC2の生物学的活性の少なくとも80%を保持している。
【００３３】
いずれかの局面の1つの態様において、組成物は少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む。
【００３４】
本明細書において記載される本発明の別の局面は、脊髄損傷の処置に用いるための、Gi-DREADDポリペプチドのまたはGi-DREADDポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【００３５】
いずれかの局面の1つの態様において、Gi-DREADDポリペプチドは最適化されたGi-DREADDポリペプチドである。いずれかの局面の1つの態様において、Gi-DREADDポリペプチドはSEQ ID NO: 2の配列を含む。
【００３６】
いずれかの局面の1つの態様において、Gi-DREADDポリペプチドは、SEQ ID NO: 2との少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するか、それらを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になり、かつSEQ ID NO: 2のGi-DREADDの生物学的活性の少なくとも80%を保持している。
【００３７】
いずれかの局面の1つの態様において、組成物は少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む。いずれかの局面の1つの態様において、組成物はクロザピンN-オキシドをさらに含む。
【００３８】
本明細書において記載される本発明の別の局面は、脊髄損傷の処置に用いるための、Kir2.1ポリペプチドのまたはKir2.1ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【００３９】
いずれかの局面の1つの態様において、Kir2.1ポリペプチドはSEQ ID NO: 3の配列を含む。
【００４０】
いずれかの局面の1つの態様において、Kir2.1ポリペプチドは、SEQ ID NO: 3との少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するか、それらを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になり、かつSEQ ID NO: 3のKir2.1の生物学的活性の少なくとも80%を保持している。
【００４１】
いずれかの局面の1つの態様において、組成物はクロザピンN-オキシドをさらに含む。いずれかの局面の1つの態様において、組成物は少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む。
【００４２】
本明細書において記載される本発明の別の局面は、脊髄損傷の処置に用いるための、本明細書において記載されるNKCCを阻害する作用物質のうちのいずれかの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。いずれかの局面の1つの態様において、組成物は少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む。
【００４３】
本明細書において記載される本発明の別の局面は、脊髄損傷を有する対象に、CLP290の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法を提供する。
【００４４】
いずれかの局面の1つの態様において、CLP290は血液脳関門を通過する。例えば、CLP290は、血液脳関門を通過することが可能となるように製剤化される。
【００４５】
いずれかの局面の1つの態様において、対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置をさらに実施する。いずれかの局面の1つの態様において、対象に少なくとも第2の治療用化合物をさらに投与する。いずれかの局面の1つの態様において、第2の治療用化合物は、オステオポンチン、成長因子、または4-アミノプリジンからなる群より選択される。
【００４６】
定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において用いられるいくつかの用語および語句の意味が、以下に提供される。特に明記しない限り、または文脈から暗に示されない限り、以下の用語および語句は以下に示す意味を含む。本技術の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため、定義は、特定の態様を説明するのを助けるために提供し、主張する本発明を限定する意図はない。特に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本技術が属する分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。当技術分野における用語の用法と、本明細書において提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、本明細書内に提供される定義が優先されるものとする。
【００４７】
本明細書において用いられる場合、「処置する」、「処置」、「処置すること」、または「改善」という用語は、目的が脊椎損傷と関連した状態の進行または重症度を、反転させる、軽減する、改善する、阻害する、遅らせる、または阻止することである、治療的処置をいう。「処置すること」という用語は、脊椎損傷、例えば、部分的または完全な麻痺の少なくとも1つの有害作用または症状を低減することまたは軽減することを含む。処置は一般に、1つまたは複数の症状または臨床マーカーが低減されるなら、「有効」である。あるいは、疾患の進行が低減または停止されるなら、処置は「有効」である。つまり、「処置」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置がない場合に予想されるものと比べて症状の進行または悪化の、休止または少なくとも緩徐化も含む。有益なまたは所望の臨床結果には、1つもしくは複数の症状の軽減、疾患の程度の縮減、安定化した(すなわち、悪化していない)脊椎損傷状態、脊椎損傷の進行の遅延もしくは緩徐化、損傷状態の改善もしくは緩和、寛解(部分的であれ全体的であれ)、および/または検出可能であれ検出不能であれ、死亡率の減少が含まれるが、これらに限定されることはない。脊椎損傷の「処置」という用語はまた、疾患の症状または副作用からの解放の供与(待機的処置を含む)を含む。
【００４８】
本明細書において用いられる場合、「投与すること」という用語は、対象への作用物質の少なくとも部分送達をもたらす方法または経路により、本明細書において開示される治療用物質(例えば、KCC2を上方調節するかまたは抑制性介在ニューロンの興奮性を低減する、作用物質)または薬学的組成物を対象中に配置することをいう。本明細書において開示される作用物質を含む薬学的組成物は、対象において有効な処置をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。
【００４９】
本明細書において用いられる場合、「対象」はヒトまたは動物を意味する。通常、動物は霊長類、げっ歯類、家畜、または狩猟動物のような脊椎動物である。霊長類には、例えば、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザル(Rhesus)が含まれる。げっ歯類には、例えば、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物には、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ科の種、例えば、家ネコ、イヌ科の種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥科の種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚類、例えば、マス、ナマズ、およびサケが含まれる。いくつかの態様において、対象は哺乳類、例えば霊長類、例えばヒトである。「個体」、「患者」、および「対象」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。
【００５０】
好ましくは、対象は哺乳類である。哺乳類はヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであることができるが、これらの例に限定されることはない。ヒト以外の哺乳類を、脊椎損傷の動物モデルに相当する対象として有利に用いることができる。対象は雄性または雌性であることができる。
【００５１】
対象は、以前に、脊椎損傷またはそのような損傷に関連した1つもしくは複数の合併症を患っているまたはそれらを有すると診断されたあるいは同定された、かつ任意で、脊椎損傷の処置または該損傷に関連した1つもしくは複数の合併症の処置を既に受けた対象であることができる。あるいは、対象はまた、そのような脊椎損傷または関連した合併症を有すると以前に診断されていない対象であることができる。例えば、対象は、脊髄損傷の1つもしくは複数のリスク因子を示す対象、例えば、脊髄損傷をもたらす可能性が高い活動、例えば、フルコンタクトスポーツ、例えば、アメリカンフットボールに参加する対象、または脊髄損傷に関連した1つもしくは複数の合併症の1つもしくは複数のリスク因子を示す対象、あるいはリスク因子を示さない対象であることができる。
【００５２】
本明細書において記載される方法および組成物は、脊髄損傷の処置に用いられる。本明細書において用いられる場合、「脊髄損傷」は、脊髄の任意の領域、例えば、頸椎、胸椎、腰椎、仙椎、仙骨、または尾骨に対する任意の傷害をいう。「脊髄損傷」は、可動性に及ぼす影響なし、例えば、歩行能力の維持から、対麻痺(例えば、脚および下半身の麻痺)、および四肢麻痺(例えば、全4つの四肢の筋力低下)に及ぶ、さまざまな重症度をもたらしうる。「脊髄損傷」は、完全脊髄損傷、例えば、損傷部位下の全ての運動および感覚機能の完全な喪失をもたらす損傷であることができる。「脊髄損傷」は、例えば、損傷の主要部位下にいくつかの運動機能が残っている不完全脊髄損傷であることができる。不完全脊髄損傷の非限定的な例としては、脊髄前方症候群、脊髄中心症候群、およびブラウン・セカール症候群が挙げられるが、これらに限定されることはない。「脊髄損傷」は、脊髄振とうまたは脊髄挫傷、例えば、1日または2日で自然に解消する損傷であることができる。脊椎の振とうまたは挫傷は、完全または不完全であることができる。
【００５３】
本明細書において用いられる場合、「作用物質」は、例えば、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの発現を阻害するか、またはポリペプチドもしくはポリヌクレオチドに結合するか、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの刺激を部分的にもしくは完全に遮断するか、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの活性化を低下させるか、抑止するか、遅延させるか、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを不活性化するか、脱感作するか、またはポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの活性を下方制御する、分子、タンパク質、ペプチド、抗体、または核酸をいう。NKCCを阻害する作用物質は、例えば、ポリペプチドの発現、例えば、翻訳、翻訳後プロセッシング、安定性、分解、または核もしくは細胞質局在化、あるいはポリヌクレオチドの転写、転写後プロセッシング、安定性、または分解を阻害するか、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドに結合するか、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの刺激、DNA結合、転写因子活性、もしくは酵素活性を部分的にもしくは完全に遮断するか、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの活性化を低下させるか、抑止するか、遅延させるか、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを不活性化するか、脱感作するか、またはポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの活性を下方制御する。作用物質は直接的または間接的に作用することができる。
【００５４】
本明細書において用いられる「作用物質」という用語は、限定されるものではないが、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオンなどのような任意の化合物または物質を意味する。「作用物質」は、合成および天然に存在するタンパク性および非タンパク性の実体を含むがこれらに限定されない、任意の化学的な、実体または部分であることができる。いくつかの態様において、作用物質は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、DNAザイム、糖タンパク質、RNAi (例えば、マイクロRNA、siRNA、およびshRNA)、リポタンパク質、アプタマー、ならびにそれらの修飾および組み合わせを含むがこれらに限定されない核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸、または炭水化物である。ある特定の態様において、作用物質は、化学的な部分を有する小分子である。例えば、化学的な部分には、マクロライド、レプトマイシン、および関連する天然物またはそれらの類似体を含む、非置換もしくは置換アルキル、芳香族、またはヘテロシクリル部分が含まれる。化合物は、所望の活性および/もしくは特性を有することが知られていてもよいか、または多様な化合物のライブラリから選択されてもよい。
【００５５】
前記作用物質は、1つまたは複数の化学クラスからの分子、例えば、有機分子であることができ、これには有機金属分子、無機分子、遺伝子配列などが含まれうる。作用物質はまた、1つまたは複数のタンパク質、キメラタンパク質(例えば関連分子もしくは相違分子の機能的に重要な領域のドメインスイッチングもしくは相同組み換え)からの融合タンパク質、合成タンパク質、または置換、欠失、挿入、および他の変種を含む他のタンパク質変種でありうる。
【００５６】
本明細書において用いられる場合、「小分子」という用語は、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、1モルあたり約10,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物(例えば、ヘテロ有機および有機金属化合物を含む)、1モルあたり約5,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、1モルあたり約1,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、1モルあたり約500グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態を含みうるが、これらに限定されない、化学的作用物質をいう。
【００５７】
本明細書において記載される方法および組成物は、KCC2のレベルが上方調節されることを必要とする。本明細書において用いられる場合、「K+-Cl-共輸送体(KCC2)」は、電気化学的平衡電位よりも低い細胞内塩化物濃度を有するタンパク質をいう。KCC2は、カリウムおよび塩化物の化学濃度勾配に応じて、正味の流出経路または流入経路のいずれかで機能することができる。溶質担体ファミリー12メンバー5としても知られるKCC2の配列は、いくつかの種、例えば、ヒトKCC2 (NCBI Gene ID: 57468)ポリペプチド(例えば、NCBI Ref Seq NP_001128243.1)およびmRNA (例えば、NCBI Ref Seq NM_001134771.1)で知られている。KCC2は、天然に存在する変種、分子、およびそれらの対立遺伝子を含む、ヒトKCC2をいうことができる。KCC2は、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの、哺乳類KCC2をいう。SEQ ID NO:1の核酸配列は、ラットKCC2をコードする核酸配列を含む。
【００５８】
本明細書において記載される方法および組成物は、NKCCのレベルおよび/または活性が阻害されることを必要とする。本明細書において用いられる場合、「Na+/2Cl-/K+共輸送体(NKCC)」は、例えば、ナトリウムおよび塩化物の輸送および再吸収を媒介することにより、適切なイオンバランスおよび細胞体積を維持するために必要なタンパク質をいう。溶質担体ファミリー12メンバー2およびNKCC1としても知られるNKCCの配列は、いくつかの種、例えば、ヒトNKCC (NCBI Gene ID: 6558)ポリペプチド(例えば、NCBI Ref Seq NP_001037.1)およびmRNA (例えば、NCBI Ref Seq NM_001046.2)で知られている。NKCCは、天然に存在する変種、分子、およびそれらの対立遺伝子を含む、ヒトNKCCをいうことができる。NKCCは、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの、哺乳類NKCCをいう。SEQ ID NO:4の核酸配列は、NKCCをコードする核酸配列を含む。
【００５９】
本明細書において記載される方法および組成物は、Kir2.1.のレベルおよび/または活性が増加されることを必要とする。本明細書において用いられる場合、「Kir2.1」は、カリウムが細胞からではなく細胞に流入することを可能にするいっそう高い傾向を有することを特徴とするカリウム電位依存性チャネルサブファミリーJメンバー2をいう。Kir2.1は、神経および筋肉組織の活動電位波形と興奮性の確立に関与しうる。Kir2.1配列は、いくつかの種、例えば、ヒトKir2.1 (NCBI Gene ID: 3759)ポリペプチド(例えば、NCBI Ref Seq NP_000882.1)およびmRNA (例えば、NCBI Ref Seq NM_000891.2)で知られています。Kir2.1は、天然に存在する変種、分子、およびそれらの対立遺伝子を含む、ヒトKir2.1をいうことができる。Kir2.1は、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの、哺乳類Kir2.1をいう。SEQ ID NO:3の核酸配列は、ヒトKir2.1をコードするアミノ酸配列を含む。SEQ ID NO:5の核酸配列は、マウスKir2.1をコードするアミノ酸配列を含む。
【００６０】
本明細書において用いられる「上方調節」および「上方調節する」という用語は、(例えば、KCC2、Gi-DREADD、またはKir2.1の)生物学的活性の増加をもたらす変化または改変をいう。上方調節は、活動の刺激または促進を含むが、これらに限定されることはない。上方調節は、活性および/もしくはレベルの変化、結合特性の変化、あるいはタンパク質、経路、システム、または活性および/もしくはレベルのその増加をもたらす関心対象の他の生物学的標的の活性に関連した生物学的、機能的、または免疫学的特性の任意の他の変化でありうる。いくつかの態様において、「上方調節する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10%の増加、例えば参照レベルと比較して少なくとも約20%、もしくは少なくとも約30%、もしくは少なくとも約40%、もしくは少なくとも約50%、もしくは少なくとも約60%、もしくは少なくとも約70%、もしくは少なくとも約80%、もしくは少なくとも約90%の増加または100%を含むそれ以下の増加または10〜100%の任意の増加あるいは適切な対照と比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍もしくは少なくとも約10倍の増加、20倍の増加、30倍の増加、40倍の増加、50倍の増加、60倍の増加、75倍の増加、100倍の増加など、または2倍〜10倍もしくはそれ以上の間の任意の増加を意味することができる。
【００６１】
「減少する」、「低減した」、「低減」、または「阻害する」という用語は全て、統計的に有意な量の減少を意味するように本明細書において用いられる。いくつかの態様において、「減少する」、「低減した」、「低減」、または「阻害する」は典型的には、適切な対照(例えば所与の処置のないこと)と比較して少なくとも10%の減少を意味し、例えば、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、またはそれ以上の減少を含むことができる。本明細書において用いられる場合、「低減」または「阻害」は、参照レベルと比較して完全な阻害も低減も包含しない。「完全阻害」は、適切な対照と比較して100%の阻害である。
【００６２】
「増加する」、「増強する」、または「活性化する」という用語は全て、再現可能な統計的に有意な量の増加を意味するように本明細書において用いられる。いくつかの態様において、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10%の増加、例えば参照レベルと比較して少なくとも約20%、もしくは少なくとも約30%、もしくは少なくとも約40%、もしくは少なくとも約50%、もしくは少なくとも約60%、もしくは少なくとも約70%、もしくは少なくとも約80%、もしくは少なくとも約90%の増加または100%を含むそれ以下の増加または10〜100%の任意の増加あるいは適切な対照と比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍もしくは少なくとも約10倍の増加、20倍の増加、30倍の増加、40倍の増加、50倍の増加、6倍の増加、75倍の増加、100倍の増加など、または2倍〜10倍もしくはそれ以上の間の任意の増加を意味することができる。マーカーとの関連で、「増加する」は、そのようなレベルでの再現可能な統計的に有意な増加である。
【００６３】
本明細書において用いられる場合、「適切な対照」は、未処理の、そうでなければ同一の細胞または集団(例えば、非対照患者と比較して、本明細書において記載される作用物質を投与されなかった患者、または本明細書において記載される作用物質のサブセットのみによって投与された患者)をいう。
【００６４】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」という用語は、対象の身体における標的となる場所への有効成分(例えば、細胞)の運搬または輸送に関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料のような、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性があるという意味で「許容され」なければならず、対象、例えばヒトへの投与と適合性がある。
【００６５】
「統計学的に有意な」または「有意に」という用語は、統計的有意性をいい、一般には2標準偏差(2SD)またはそれ以上の差異をいう。
【００６６】
本明細書において用いられる場合、「含む(comprising)」または「含む(comprises)」という用語は、方法または組成物に不可欠である、組成物、方法、およびその各成分に関連して用いられるが、不可欠であるかどうかにかかわらず、明記されていない要素の包含も受け入れる。
【００６７】
本明細書において用いられる場合、「本質的に〜からなる」という用語は、所与の態様に必要とされる要素をいう。この用語は、その態様の基本的かつ新規または機能的な特徴に著しく影響を及ぼさない、要素の存在を許容する。「からなる」という用語は、態様のその説明において列挙されていない任意の要素を除く、本明細書において記載される組成物、方法、および各成分をいう。
【００６８】
単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈によって明らかに別のことが示される場合を除き、複数形の言及されるものを含む。同様に、「または」という語は、文脈によって明らかに別のことが示される場合を除き、「および」を含むものと意図される。本明細書において記載されるものと同様または同等な方法および材料を、本開示の実践または試験において用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。「例えば(e.g.)」という略号は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、非限定的な例を示すために本明細書において用いられる。したがって「例えば(e.g.)」という略号は「例えば(for example)」という用語と同義である。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図1A〜1Kは、ジグザグ状病変(staggered lesion)を有するマウスの機能回復につながる化合物としてのCLP290の同定を示すデータを提示する。(図1A) T7およびT10でのジグザグ状の外側性半切断の概略図。矢印は病変を示し、L = 左側、R = 右側。(図1B) 過ジグザグ状(over-stagger)病変10週間後の抗GFAP染色脊髄切片の代表的な画像。破線は正中線を示す。スケールバー: 500 μm。(図1C) ジグザグ状病変2週間後のマウスのT5 (病変の吻側)、T8 (病変間)、およびL2 (病変の尾側)からの抗5HT染色横断切片の代表的な画像スタック。スケールバー: 100 μm。(図1D) 実験スキーム。各BMS試験を毎日の化合物処理24時間前に実施した。(図1E) CLP290 (35mg/kg)およびビヒクル溶液の連続処置による損傷マウスでのBMSスコア。二元反復測定ANOVAとそれに続く事後ボンフェローニ補正。両群をn = 10として開始し、9週目(終了時点)には、ビヒクルおよびCLP290それぞれについてn = 8および10であった。＊P＜0.05; ＊＊＊P＜0.0001。エラーバー: SEM。(図1F) ステッピングに達したマウスの割合。ジグザグ状損傷(staggered injury) 9週間後のCLP290 vs ビヒクル(ビヒクルおよびCLP290群それぞれについてn = 8および10)。(図1G) 10週処置のマウスにおけるCLP290除去後の持続的な行動改善。BMSを化合物の除去後1、2、3、7、および14日目に試験した(n = 7)。二元反復測定ANOVAとそれに続く事後ボンフェローニ補正。＊＊p＜0.01。エラーバー: SEM。(図1H) スイング、スタンス(無傷群)、ドラッギング(ビヒクル群)、およびステッピング(CLP290群)中のマウス右後肢の動きの色分けされたスティックビュー分解。(図1Iおよび図1J) ジグザグ状損傷9週間後のマウスの体重支持(図1I)およびストライド長(図1J)の定量化(ビヒクルおよびCLP290群それぞれについてn = 8および10)。スチューデントのt検定(両側、対応のない)。＊p＜0.05; ＊＊p＜0.01。エラーバー: SEM。(図1K) 代表的な右後肢の膝および足首の角度の振動追跡ならびに前脛骨筋(TA)および内側腓腹筋(GS)からの同時EMG記録。
【図２】図2A〜2Hは、広範なKCC2発現がCLP290の効果を模倣して機能回復を促進することを示すデータを提示する。(図2A) 実験スキーム。(図2B) ジグザグ状損傷8週間後にマウスから採取され、(HA-KCC2タンパク質を検出するために)抗HAで染色された縦方向(上側)および横方向(下側)脊髄切片の代表的な画像スタック。スケールバー: 500 μm (上側)および100 μm (下側)。(図2C) 実験(AAV-PHP.B-HA-KCC2)群および対照(AAV-PHP.B-H2B-GFP)群におけるBMS性能。二元反復測定ANOVAとそれに続く事後ボンフェローニ補正。＊p＜0.05。(図2D) 損傷8週間後にステッピングに達したマウスの割合。(図2Eおよび図2F) 8週時の体重支持(図2E)およびストライド長(図2F)の定量化(1群あたりn = 10)。スチューデントのt検定(両側、対応のない)を適用した。＊p＜0.05; ＊＊p＜0.01。エラーバー: SEM。(図2G) ドラッギング(AAV-PHP.B-H2B-GFP群)およびステッピング(AAV-PHP.B-HA-KCC2群)中のマウス右後肢の動きの色分けされたスティックビュー分解。(図2H) 損傷8週間後のマウスの代表的な右後肢の膝および足首の角度の振動追跡ならびに同時EMG記録。
【図３】図3A〜3Eは、抑制性ニューロンにおけるKCC2発現が機能回復につながることを示すデータを提示する。(図3A, 3B) AAV-PHP.B-CAG-Flex-H2B-GFP (図3A)またはAAV-PHP.B-Syn-Flex-HA-KCC2 (図3B)の尾静脈注射を伴う示されたトランスジェニックマウスのT8脊髄におけるGFP (図3A)またはHA-KCC2 (図3B)の発現を示す代表的な画像スタック。スケールバー: 100 μm。(図3C) 示された群におけるBMS性能。二元反復測定ANOVAとそれに続く事後ボンフェローニ補正。＊p＜0.05; ＊＊＊＊p＜0.0001。エラーバー: SEM。(図3D) 損傷8週間後の示された処置群のBMSスコアの内訳。(図3E) 損傷8週間後に足底または背側ステッピングに達したマウスの割合。
【図４】図4A〜4Hは、KCC2が病変間および病変周辺の脊髄節の抑制性ニューロンに作用することを示すデータを提示する。(図4A) 図4B〜図4Dの実験スキーム。(図4B) 8週時の胸椎および腰髄の抗HA染色横断切片の代表的な画像。スケールバー: 100 μm。(図4Cおよび図4D) 左側, 野生型マウス(図4C)およびVgat-Creマウス(図4D)の異なる処置群におけるBMS性能。右側, WTマウス(図4C)およびVgat-Creマウス(図4D)においてステッピングに達したマウスの割合。ANOVAとそれに続く事後ボンフェローニ補正。エラーバー: SEM。(図4E) 図4F〜図4Hの実験スキーム。(図4F) 損傷8週間後の胸椎および腰髄の抗HA染色横断切片の代表的な画像。スケールバー: 100 μm。(図4Gおよび図4H) 左側, WTマウス(図4G)およびVgat-Creマウス(図4H)の実験群および対照群におけるBMS性能。右側, WTマウス(図4G)およびVgat-Creマウス(図4H)においてステッピングに達したマウスの割合。ANOVAとそれに続く事後ボンフェローニ補正。＊p＜0.05。エラーバー: SEM。
【図５】図5A〜5Fは、CLP290/KCC2によって促進されるニューロンの活性化パターンおよび中継形成の変化を示すデータを提示する。(図5A) ビヒクル、CLP290、AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2またはL838,417処置による無傷マウスおよび損傷マウスにおける1時間の連続運動後のT8/9節におけるc-Fos発現パターンを示す横断脊髄切片の概略図。各スポットは、c-FosとNeuNの両方で陽性に染色された細胞を表す。代表的な生画像を図11Aに示す。(図5B) 全群での背側ゾーンまたは中間ゾーンおよび腹側ゾーンの1切片あたりのc-Fos+ニューロンの平均数。一元ANOVAとそれに続くボンフェローニ事後検定(ビヒクル、CLP290、AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2またはL838,417処置群における背側または中間/腹側ゾーンのc-Fos+ NeuN+数をそれぞれ、無傷群のそれと比較した)。マウス1匹あたりn = 3の切片、1群あたりn = 3のマウス。＊p＜0.05; ＊＊＊P＜0.001; ＊＊＊＊P＜0.0001; n.s. 有意ではない。エラーバー: SEM。(図5C) 全群でのラミナ(Laminae) 1〜5 (背側)またはラミナ6〜10 (腹側間)の1切片あたりのc-Fos+ニューロンの平均割合。一元ANOVAとそれに続くボンフェローニ事後検定(ビヒクル、CLP290、AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2またはL838,417処置群における背側または中間/腹側ゾーンのc-Fos+ NeuN+割合をそれぞれ、無傷群のそれと比較した)。マウス1匹あたりn = 3の切片、1群あたりn = 3のマウス, ＊p＜0.05; ＊＊P＜ 0.01; ＊＊＊P＜0.001; n.s. 有意ではない。エラーバー: SEM。(図5D) 左側, 皮質刺激およびTA筋肉EMG実験の概略図。右側, STA対照、AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2、CLP290処置、完全切断、および無傷群における一連の硬膜外運動皮質刺激によって誘発された右TA筋肉での代表的な応答。(図5E) 示された群からの右TA筋肉EMG応答振幅。一元ANOVAとそれに続くボンフェローニ事後検定。マウス1匹あたりn = 3の試行、1群あたりn = 3のマウス, ＊＊＊p＜0.001; n.s. 有意ではない; エラーバー, SEM。(図5F) 示された群からの右TA筋肉EMG応答潜時。一元ANOVAとそれに続くボンフェローニ事後検定。マウス1匹あたりn = 3の試行、1群あたりn = 3のマウス, ＊＊＊p＜0.001; n.s. 有意ではない。エラーバー: SEM。
【図６】図6A〜6Fは、病変間および病変周辺の抑制性介在ニューロンにおけるGi-DREADD発現がKCC2/CLP290の効果を模倣することを示すデータを提示する。(図6A) 実験スキーム。(図6B) hM4Di DREADD発現を示すために抗RFPで免疫染色されたSCI後8週間での胸髄および腰髄の横断切片の代表的な画像。スケールバー: 100 μm。(図6C) Vgat-CreマウスのGi-DREADDおよびGFP群におけるSCIおよびウイルス注射後の経時的なBMS性能。ANOVAとそれに続く事後ボンフェローニ補正。＊＊p＜0.001, ＊＊＊＊p＜0.0001, エラーバー, SEM。(図6D) AAV-9-Syn-Gi-DREADD処置マウス(背側/足底ステッピング)およびAAV-9-Syn-GFPマウス群(ドラッギング)における1時間の連続運動後のT8/9節におけるc-Fos陽性ニューロンを示す横断脊髄切片の概略図。(図6E) 示された群における1切片あたりのc-Fos+ニューロン(全てのラミナ)の平均数。スチューデントのt検定(両側、対応のない)。マウス1匹あたりn = 3の切片、1群あたりn = 3のマウス。n.s. 有意ではない。エラーバー: SEM。(図6F) 示された群でのラミナ1〜5またはラミナ6〜10におけるc-Fos+ニューロンの割合。スチューデントのt検定(両側、対応のない)。1群あたりn = 9の試料スライド、1群あたりn = 3のマウス。＊＊P＜0.01; n.s. 有意ではない。エラーバー: SEM。
【図７】図7A〜7Fは、ジグザグ状脊髄損傷または完全脊髄損傷を有するマウスにおける小分子化合物の効果を示すデータを提示する。(図7A) 示された化合物の連続処置によるジグザグ状病変マウスにおける化合物投与の24時間後に測定されたBMSスコア。反復測定ANOVAとそれに続く事後ボンフェローニ補正。全ての群をn = 10として開始し、9週目(終了時点)で、生理食塩水、CP101606 (10 mg/Kg)、ブメタニド(0.3 mg/Kg)、バクロフェン(1 mg/Kg)、L838,417 (1 mg/Kg)、8-OH-DPAT (0.1 mg/Kg)、およびキパジン(0.2 mg/Kg)それぞれについてn = 8、10、3、8、4、7、および7であった。エラーバー, SEM。(図7B) SCI 8週間後のジグザグ状病変マウスにおいて化合物処理後(化合物投与後10、30、30、60および120分)に急性的に測定されたBMSスコア。二元反復測定ANOVAとそれに続く事後ボンフェローニ補正。全群 n = 5, ＊＊＊＊P＜0.0001; エラーバー, SEM。(図7C) ジグザグ状損傷後10週間でCLP290処置による損傷マウスのL2脊髄レベルからの、抗5HT抗体で染色された、横断切片の代表的な共焦点画像。スケールバー: 100μm。(図7D) 左側, T8での完全離断(FT)の概略図。矢印は病変を示す。右上: 抗GFAPで免疫染色されたFT病変10週間後の縦方向脊髄切片(T5からT12)の代表的な共焦点画像スタック。破線は正中線を示す。スケールバー: 500 μm。右下: 抗5HT (セロトニン作動性軸索)で免疫染色された過ジグザグ状病変8週間後の、胸髄および腰髄(T5、病変の吻側、T9およびL2、病変の尾側)の横断切片の代表的な共焦点画像スタック。スケールバー: 100 μm。(図7E) 完全離断を有するマウスにおけるビヒクルまたはCLP290投与の24時間後に測定されたBMSスコア。反復測定ANOVAとそれに続く事後ボンフェローニ補正。両群をn = 10として開始し、9週目(終了時点)には、ビヒクルおよびCLP290それぞれについてn = 8および10であった。エラーバー, SEM。(図7F) 長期処置なしの完全離断後のマウスにおける8週間時の化合物処置後(化合物投与後10、30、30、60、および120分)に急性的に測定されたBMSスコア。反復測定ANOVAとそれに続く事後ボンフェローニ補正。全群 n = 5, ＊＊＊＊P＜0.0001; エラーバー, SEM。
【図８】図8A〜8Fは、軸索の成長(逆行性標識)に及ぼすCLP290の有意な効果を示さないデータを提示する。(図8A) 左側: 右側腰髄(L2〜4)への下行性突起を伴う逆行性標識された脊髄固有ニューロンおよび脳ニューロンへのHiRet-mCherry注射の概略図。マウスに損傷後1日(急性)または8週間(慢性)のいずれかでHiRet-mCherry注射を行った。組織学的分析のために、ウイルス注射の2週間後にマウスを終結処理した。中央: 急性期および慢性期に標識された脊髄固有ニューロンの縦方向表現。各ドットは5つのニューロンを表す。右側: 抗RFPで染色されたジグザグ状損傷10週間後のT8 (病変間)とT13 (病変下)の横断切片の代表的な共焦点画像スタック。スケールバー: 100 μm。下側: 同側追跡PN: 同側追跡脊髄固有ニューロン、正中線交差PN: 中線交差脊髄固有ニューロン(注射部位に対して)。(図8Bおよび図8C) Aからの脳および脊髄における標識ニューロンの定量化。急性および慢性期にビヒクル処置を受けたマウス(図8B)または慢性期にビヒクルもしくはCLP290処置を受けたマウス(図8C)での異なる脳領域および脊髄節における逆行性標識ニューロンの数を、無傷マウスでの逆行性標識ニューロンのものに対して正規化した。吻側: 上T7; 中間, T8〜T10; 尾側: T10〜L1。L: 左側, R: 右側。スチューデントのt検定; 無傷、急性、および慢性SCIマウスについて各n = 3。＊P＜0.05, n.s. 有意ではない。エラーバー: SEM。(図8D) 左側: 左側腰髄(L2〜4)への下行性突起を伴う逆行性標識された脊髄固有ニューロンおよび脳ニューロンへのHiRet-mCherry注射の概略図。動物にジグザグ状損傷後1日(急性)または8週間(慢性)のいずれかでHiRet-mCherry注射を受けさせた。組織学的分析のために、ウイルス注射2週間後にマウスを終結処理した。中央: 急性期および慢性期に標識された脊髄固有ニューロンの縦方向表現。各ドットは5つのニューロンを表す。右側: 抗RFPで染色されたジグザグ状損傷10週間後のT8 (病変間)とT13 (病変下)の横断切片の代表的な共焦点画像スタック。スケールバー: 100 μm。下側: 同側追跡PN: 同側追跡脊髄固有ニューロン、正中線交差PN: 中線交差脊髄固有ニューロン(注射部位に対して)。(図8Eおよび図8F) Dからの脳および脊髄における標識ニューロンの定量化。急性および慢性期にビヒクル処置を受けたマウス(図8E)または慢性期にビヒクルもしくはCLP290処置を受けたマウス(図8F)での異なる脊髄節におけるmCherry標識の脳および脊髄固有ニューロンの数を、無傷マウスでの逆行性標識ニューロンのものに対して正規化した。吻側: 上T7; 中間, T8〜T10; 尾側: T10〜L1。L: 左側, R: 右側。スチューデントのt検定; 無傷、急性、および慢性SCIマウスについて各n = 3。＊P＜0.05, n.s. 有意ではない。エラーバー: SEM。
【図９】図9A〜9Iは、下行性軸索の軸索成長に及ぼすCLP290の効果を示さないデータを提示する。(図9A) 左側: 脳幹網様体からのニューロンの順行性標識のためのAAV注射戦略の概略図。動物に損傷後1日(急性)または8週間(慢性)のいずれかでAAV-ChR2-mCherry (左)およびAAV-ChR2-GFP (右側)の注射を受けさせた。組織学的分析のために、ウイルス注射の2週間後にマウスを終結処理した。黒線: 左側の網様体から下行する軸索; 灰色線：右側の網様体から下行する軸索。右側: 抗RFPおよび抗GFPで染色された損傷後2週間および10週間の胸髄および腰髄の横断切片の代表的な共焦点画像スタック。スケールバー: 100 μm。(図9B) ビヒクル処置群におけるジグザグ状損傷後2週間および10週間でのmCherryおよびGFP免疫染色の蛍光強度。全ての画像は、同一の画像化パラメータおよびスキャン設定を用いて取得された。いずれの場合も、強度は吻側レベルでのジグザグ状損傷後2週間に対して正規化された。スチューデントのt検定; マウス1匹あたりn = 3の切片および1群あたりn = 3のマウス。＊p＜0.05およびns, 有意ではない。エラーバー: SEM。(図9C) ビヒクル処置群およびCLP290処置群におけるジグザグ状損傷後10週間でのmCherryおよびGFP免疫染色の蛍光強度。全ての画像は、同一の画像化パラメータおよびスキャン設定を用いて取得された。いずれの場合も、強度は吻側レベルでのジグザグ状損傷後2週間に対して正規化された。スチューデントのt検定; マウス1匹あたりn = 3の切片および1群あたりn = 3のマウス。＊p＜0.05およびns, 有意ではない。エラーバー: SEM。(図9D) CLP290処置の有無にかかわらず損傷後2週間または10週間から採取された脊髄の異なるレベルのセロトニン作動性軸索を示す概略図および画像。(図9E, 図9F) 5-HT免疫染色の蛍光強度を、ビヒクル処置群について急性期および慢性期で比較し(図9E)、また、ビヒクルおよびCLP290処置群の間、慢性期で比較した(図9F)。スチューデントのt検定; マウス1匹あたりn = 3の切片および1群あたりn = 3のマウス。＊p＜0.05およびns, 有意ではない。エラーバー: SEM。(図9G〜図9I) (図9G) AAV-ChR2-GFPを右皮質に注入して、CLP290処置の有無にかかわらず、損傷後2週間または10週間で異なる脊髄レベルのCST軸索終結を追跡した。抗GFP免疫染色の蛍光強度を、ビヒクル処置マウスの急性期と慢性期の間(図9H)で、および損傷後10週間でのビヒクルまたはCLP290処置群の間で比較した(図9I)。スケールバー: 100 μm。スチューデントのt検定; マウス1匹あたりn = 3の切片および1群あたりn = 3のマウス。ns, 有意ではない。エラーバー: SEM。
【図１０】図10A〜10Eは、脊髄ニューロンにおけるAAVを介したKCC2発現およびその行動の結果を示すデータを提示する。(図10A, 図10B) 損傷後10週間で、AAV-PHP.B-FLEX-GFPまたはAAV-PHP.B-HA-KCC2のいずれかにより処置された無傷マウスまたはジグザグ状病変マウスの病変領域間(T8/9) (図10A)および腰髄(L2〜4) (図10B)におけるKCC2タンパク質レベルを示す代表的なウエスタンブロッティング画像および定量化。負荷対照としてのアクチン。無傷群、AAV-PHP.B-GFP群およびAAV-PHP.B-HA-KCC2群それぞれについてn = 6、5および5のマウス。スチューデントのt検定; ＊P＜0.05; ＊＊P＜0.01; エラーバー: SEM。(図10C) 左側, 実験計画の概略図。AAVウイルスを、実験マウス(AAV-1-Syn-HA-KCC2)および対照マウス(AAV-1-Syn-GFP-H2B)の腰部分節(L2〜4)に脊髄内注射した。右側, ウイルスにより発現されたKCC2を標識するために抗HAで免疫染色したジグザグ状損傷後10週間の縦方向の脊髄切片(T5からS1)の代表的な共焦点画像スタック。(図10D) 左側, 実験計画の概略図。AAVウイルスを実験(AAV-9-Syn-HA-KCC2)マウスおよび対照(AAV-9-Syn-GFP-H2B)マウスの尾静脈に注射した。右側, ウイルスにより発現されたKCC2を標識するために抗HAで免疫染色したジグザグ状損傷後10週間の縦方向の脊髄切片(T5からL3)の代表的な共焦点画像スタック。スケールバー: 500 μm。(図10E) AAV-9-Syn-HA-KCC2の尾静脈注射およびビヒクルまたはCLP290の処置を伴うVgat-Creマウスにおいて24時間の時点で測定されたBMSスコア。両群をn = 8として開始し、ビヒクルとCLP290の両方でそれぞれ9週目(終了時点)には、n = 6であった。反復測定ANOVAとそれに続く事後ボンフェローニ補正。＊＊P＜0.01; エラーバー, SEM。
【図１１】図11A〜11Dは、異なる処置によるジグザグ状病変マウスのT8/9におけるc-Fos発現パターンの変化を示すデータを提示する。(図11A) c-Fos、NeuN、またはc-FosおよびNeuNの両方に対する抗体で染色された損傷後8週間でのT8/9脊髄からの横断切片の代表的な共焦点画像スタック。スケールバー: 100 μm。(図11B) 個別の処置(ビヒクル対照、CLP290、AAV-PHP.B-HA-KCC2、およびL838,417)による無傷マウスまたは損傷マウスにおけるc-fos+細胞中のNeuN+細胞の割合。一元ANOVAとそれに続くボンフェローニ事後検定。マウス1匹あたりn = 3の切片、1群あたりn = 3のマウス。n.s. 有意ではない。エラーバー: SEM。(図11C) ビヒクルの処置(STA)、継続的CLP290処置(CLP290)およびCLP290除去2週間後(CLP290除去)のジグザグ状病変マウスの背側ゾーンまたは中間および腹側ゾーンの1切片あたりのc-Fos+ニューロンの平均数。一元ANOVAとそれに続くボンフェローニ事後検定(CLP290またはCLP290除去群における背側または中間/腹側ゾーンのc-Fos+ NeuN+数をそれぞれ、ビヒクル群のそれと比較した)。マウス1匹あたりn = 3の切片、1群あたりn = 3のマウス。＊p＜0.05; ＊＊P＜ 0.01; n.s. 有意ではない。エラーバー: SEM。(図11D) ビヒクルの処置(STA)、継続的CLP290処置(CLP290)およびCLP290除去2週間後(CLP290除去)によるジグザグ状病変マウスにおけるラミナ1〜5またはラミナ6〜10の1切片あたりのc-Fos+ニューロンの平均割合。一元ANOVAとそれに続くボンフェローニ事後検定(CLP290またはCLP290除去群における背側または中間/腹側ゾーンのc-Fos+ NeuN+割合をそれぞれ、ビヒクル群のそれと比較した)。マウス1匹あたりn = 3の切片、1群あたりn = 3のマウス, ＊＊P＜ 0.01; n.s. 有意ではない。エラーバー: SEM。
【図１２】図12A〜12Cは、Gq-DREADD発現を示すデータを提示する。(図12A) hM3D DREADD発現を示すために抗RFPで免疫染色されたジグザグ状損傷後8週間での胸髄および腰髄の横断切片の代表的な共焦点画像。スケールバー: 100 μm。(図12B) AAV9-Syn-FLEX-GFPまたはAAV9-FLEX-hM3Dq-mCherryウイルス注射によるジグザグ状損傷Vglut2-CreマウスのBMSスコア。反復測定ANOVAとそれに続く事後ボンフェローニ補正。各群についてn = 5。エラーバー: SEM。(図12C) SCI 8週間後のジグザグ状病変vGlut2-Creマウスにおいて化合物処理後(CNO投与後10、30、60、120、および180分)に急性的に測定されたBMSスコア。反復測定ANOVAとそれに続く事後ボンフェローニ補正。n = 5, ＊P＜0.05; ＊＊＊P＜0.001; エラーバー, SEM。
【図１３】図13A〜13Cは、脊髄損傷モデルにおけるAAV-PHP.B-HA-KCC2による処置の有効性を示すデータを提示する。(図13A) KCC2処置(AAV-PHP.B-HA-KCC2)および対照によるT10挫傷損傷マウスにおけるBMSスコア。二元反復測定ANOVAとそれに続く事後ボンフェローニ補正。＊ P＜0.05, ＊＊P＜0.01。エラーバー, SEM。(対照群ではn=11, KCC2群ではn=10)。(図13B) 挫傷損傷8週間後の体重支持(上)およびステップ高さ(下)の定量化(対照群ではn=11, KCC2群ではn=10)。スチューデントのt検定(両側、対応のない)を適用した。＊p＜0.05; ＊＊p＜0.01。エラーバー, SEM。(図13C) 損傷後8週間でステッピングに達したマウスの割合(上)。損傷後8週間で痙性を示したマウスの割合(下)。損傷マウスを、50%超のBMSスコアリング時間でけいれんを示した場合に「痙性が強い」と分類した(対照群ではn=11, KCC2群ではn=10)。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
詳細な説明
本明細書において記載される本発明は部分的に、例えば、腰髄が全ての直接的な脳由来の神経支配を奪われているが、しかし休止状態の中継回路が残っている損傷など、ジグザグ状の両側性半切断を有するマウスにおいて、KCC2アゴニストがステッピング機能を回復したという発見に基づく。さらに、ステッピング能力のこの回復は、KCC2の選択的発現によって、またはジグザグ状の脊髄病変間およびジグザグ状の脊髄病変周囲の抑制性介在ニューロンにおいてDREADDを過分極させること（例えば、最適化されたGi-DREADD）によってさらに模倣されることができることがわかった。
【００７１】
さらに、NKCCの阻害またはKir2.1の発現は、ステッピング能力の増加を、例えば、ジグザグ状の両側性半切断のため、以前にこの能力を失ったマウスにおいてもたらすことを示す証拠が本明細書において提供される。機構的に、これらの処置は、この損傷によって誘発された機能不全の脊髄回路を機能的な状態に変換し、腰髄への脳由来のコマンドの中継を容易にした。
【００７２】
したがって、脊髄損傷を有する患者において、KCC2、Gi-DREADD、もしくはKir2.1の発現を増加させるための方法、またはNKCCを阻害するための方法が本明細書において提供される。さらに、KCC2、Gi-DREADD、もしくはKir2.1の発現を増加させる、またはNKCCを阻害するのに有用な作用物質を含む組成物が本明細書において記載される。脊髄損傷の処置の使用のためにKCC2、NKCC、Gi-DREAD、またはKir2.1を調節する作用物質を含む組成物が本明細書においてさらに提供される。
【００７３】
脊髄損傷の処置
本明細書において提供される方法は、脊髄損傷の処置を対象とする。1つの態様において、脊髄損傷は重度の脊髄損傷である。脊髄損傷は、脊椎の機能に対して悪影響を引き起こす、例えば、手足の感覚の可動性を低減する、脊髄の任意の領域、例えば、頸椎、胸椎、腰椎、仙椎、仙骨、または尾骨に対する任意の傷害をいう。脊髄損傷の重症度は、例えば、可動性に及ぼす影響なし、例えば、歩行能力の維持から、対麻痺(例えば、脚および下半身の麻痺)、および四肢麻痺(例えば、全4つの四肢の筋力低下)に及ぶ、損傷の結果のレベルで測定される。1つの態様において、本明細書において記載される方法および組成物は、重度の脊髄損傷を処置するために用いられる。本明細書において用いられる場合、「重度の脊髄損傷」は、損傷レベル下の全ての運動および感覚機能の完全な喪失をもたらす完全または不完全脊髄損傷をいう。
【００７４】
本発明の1つの局面は、脊髄損傷を有する対象に、ニューロン特異的K+-Cl-共輸送体(KCC2)を上方調節する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法を提供する。
【００７５】
本発明の第2の局面は、脊髄損傷を有する対象に、Na+/2Cl-/K+-共輸送体(NKCC)を阻害する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法を提供する。
【００７６】
本発明の第3の局面は、脊髄損傷を有する対象に、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減させる作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法を提供する。1つの態様において、作用物質は、阻害性Gi共役受容体Gi-DREADDを上方調節する。Gi共役DREADDは、デザイナードラッグ(DREADD)によって排他的に活性化されるデザイナー受容体をいう。Gi-DREADDは特定の局在で発現されることができ、例えば、抑制性介在ニューロンで発現されることができ、例えば、そのアゴニストまたはアンタゴニストを介して制御されることができる。DREADDは、例えば、Saloman, JL, et al. Journal of neuroscience. 19 Oct 2016: 36 (42); 10769-10781においてさらに記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００７７】
抑制性介在ニューロンでの発現のために最適化されたGi-DREADDが本明細書において用いられる。1つの態様において、Gi-DREADDは脊髄において発現される。1つの態様において、Gi-DREADDは損傷部位で発現される。1つの態様において、Gi-DREADDは抑制性介在ニューロンに発現される。さらに別の態様において、作用物質は、Gi-DREADDのアゴニスト、例えば、クロザピンN-オキシドと実質的に同時に投与される。別の態様において、作用物質はKir2.1を上方調節する。
【００７８】
本発明の第4の局面は、脊髄損傷を有する対象に、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減する電気刺激の有効量を与える段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法を提供する。硬膜外脊髄電気刺激としても知られる電気刺激は、例えば、脊髄損傷のため、慢性疼痛または重度の中枢運動障害に苦しむ対象のための処置における方法である。電気刺激は、例えば、脊髄の硬膜(例えば、保護コーティング)上に埋め込まれたチップを介して、脊髄の下部に連続電流を適用することである。チップは、例えば、リモートを介して制御され、電流の周波数および強度を変化させる。1つの態様において、電気刺激は、脊髄に直接適用されるが、損傷部位(例えば、脊髄の損傷していない部分)には適用されない。別の態様において、電気刺激は、脊髄の損傷部位に直接適用される。1つの態様において、方法は、Gi-DREADDのアゴニスト、例えば、クロザピンN-オキシドを投与する段階をさらに含む。
【００７９】
1つの態様において、本明細書において記載される電気刺激は、適切な対照と比較して、抑制性介在ニューロンの興奮性を少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90、少なくとも99%、またはそれ以上低減する。この文脈において用いられる場合、適切な対照は、刺激されていない抑制性介在ニューロンの興奮性をいう。
【００８０】
さまざまな局面の1つの態様において、投与の前に、対象は脊髄損傷と診断されている。熟練した臨床医は、例えば、身体検査、またはX線、コンピュータ断層撮影(CT)スキャン、および/もしくは磁気共鳴画像(MRI)スキャンのような、放射線診断アプローチを介して、脊髄損傷を有すると対象を診断することができる。
【００８１】
さまざまな態様において、対象は、脊髄損傷を有すると以前に診断されていてもよく、脊髄損傷の処置が以前に行われていてもよい。
【００８２】
作用物質
KCC2を上方調節する作用物質が本明細書において記載される。1つの態様において、KCC2を上方調節する作用物質は、小分子、ペプチド、遺伝子編集システム、または、KCC2をコードする発現ベクターである。1つの態様において、KCC2を上方調節する小分子は、CLP290、またはその誘導体である。作用物質は、例えば、投与時に、細胞内のKCC2の存在、量、活性、および/またはレベルを増加させる場合、KCC2を上方調節するのに有効であると見なされる。1つの態様において、KCC2は、参照レベルと比較して少なくとも10%、例えば参照レベルと比較して少なくとも約20%、もしくは少なくとも約30%、もしくは少なくとも約40%、もしくは少なくとも約50%、もしくは少なくとも約60%、もしくは少なくとも約70%、もしくは少なくとも約80%、もしくは少なくとも約90%の増加または100%を含むそれ以下の増加または10〜100%の任意の増加あるいは適切な対照と比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍もしくは少なくとも約10倍の増加、20倍の増加、30倍の増加、40倍の増加、50倍の増加、60倍の増加、75倍の増加、100倍の増加など、または2倍〜10倍もしくはそれ以上の間の任意の増加、上方調節される。この文脈で本明細書において用いられる場合、適切な対照は、未処理細胞におけるKCC2のレベルをいう。当業者は、本明細書において記載される技法、例えば、KCC2タンパク質またはmRNAレベルを、それぞれ、評価するためのウエスタンブロッティング法またはPCRに基づくアッセイ法を用いてKCC2のレベルを測定することができる。
【００８３】
CLP290は、KCC2活性の小分子エンハンサである。CLP290は当技術分野において、[5-フルオロ-2-[(Z)-(2-ヘキサヒドロピリダジン-1-イル-4-オキソ-チアゾール-5-イリデン)メチル]フェニル]ピロリジン-1-カルボキシレートとしても知られ、
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である構造を有する。
【００８４】
さらに、1つの態様において、小分子は、本明細書において記載される小分子のいずれかの誘導体、変種、または類似体、例えばCLP290である。分子は、通常は分子の一部ではない追加の化学的な部分を含む場合、および/または化学的に修飾されている場合、別の分子の「誘導体」であると言われる。そのような部分は、分子の発現レベル、酵素活性、溶解性、吸収、生物学的半減期などを改善することができる。あるいは、部分は、分子の毒性を減少させ、分子の望ましくない副作用などを排除または軽減することができる。そのような効果を媒介することができる部分は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., MackPubl., Easton, PA (l990)に開示されている。分子の「変種」は、分子全体またはその断片のいずれかと構造および機能が実質的に類似している分子をいうよう意図される。両方の分子が実質的に類似した構造を有する場合、および/または両方の分子が類似の生物学的活性を保有する場合、分子は別の分子と「実質的に類似している」と言われる。したがって、2つの分子が同様の活性を保有するならば、一方の分子の構造が他方に見られない場合、または構造が同一でない場合でも、その用語が本明細書において用いられる場合、それらは変種と見なされる。分子の「類似体」は、分子全体またはその断片のいずれかと機能が実質的に類似している分子をいうよう意図される。
【００８５】
NKCCを阻害する作用物質も本明細書において記載される。1つの態様において、NKCCを阻害する作用物質は、小分子、抗体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはRNAiである。1つの態様において、KCC2を上方調節する小分子は、ブメタニドまたはその誘導体である。作用物質は、例えば、投与時に、細胞内のNKCCの存在、量、活性、および/またはレベルを阻害する場合、NKCCを阻害するのに有効であると見なされる。1つの態様において、NKCCは適切な対照と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90、少なくとも99%、またはそれ以上阻害される。この文脈で本明細書において用いられる場合、適切な対照は、未処理細胞におけるNKCCのレベルをいう。当業者は、本明細書において記載される技法、例えば、NKCCタンパク質またはmRNAレベルを、それぞれ、評価するためのウエスタンブロッティング法またはPCRに基づくアッセイ法を用いてNKCCのレベルを測定することができる。
【００８６】
さらに、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減するために抑制性介在ニューロンにおいてGi-DREADDを発現させるためのGi-DREADDをコードする発現ベクターが本明細書において記載される。発現ベクターは、例えば、投与時に、細胞内のGi-DREADDの存在、量、活性、および/またはレベルを増加させる場合、Gi-DREADDを発現させるのに有効であると見なされる。1つの態様において、Gi-DREADDの発現は、適切な対照と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90、少なくとも99%、またはそれ以上抑制性介在ニューロンの興奮性を低減する。この文脈で本明細書において用いられる場合、適切な対照は、他の点では同一な未処理の抑制性介在ニューロンの集団をいう。当業者は、本明細書において記載される技法、例えば、Gi-DREADDタンパク質またはmRNAレベルを、それぞれ、評価するためのウエスタンブロッティング法またはPCRに基づくアッセイ法を用いてGi-DREADDのレベルを測定することができる。当業者は、例えば、生体試料の免疫染色、または電気生理学的記録(例えば、ニューロン、例えば抑制性介在ニューロンの電気的活動の直接測定)を介して、興奮性および抑制性介在ニューロンの核において発現されるc-fosレベルを測定することにより、抑制性介在ニューロンの興奮性を測定することができる。c-Fosレベルの低減は、抑制性介在ニューロンの興奮性の低減が達成されたことを示すと考えられる。例えばニューロンにおいて、電気生理学的記録を実施するための方法は、例えば、Du C., et al. ASC Biomater. Sci. Eng. 2017, 3(10), pp 2235-2246においてさらに概説されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００８７】
さらに、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減させるために抑制性介在ニューロンにおいてKir2.1を発現させるためのKir2.1をコードする発現ベクターが本明細書において記載される。発現ベクターは、例えば、投与時に、細胞内のKir2.1の存在、量、活性、および/またはレベルを増加させる場合、Kir2.1を発現させるのに有効であると見なされる。1つの態様において、Kir2.1の発現は、適切な対照と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90、少なくとも99%、またはそれ以上抑制性介在ニューロンの興奮性を低減する。この文脈で本明細書において用いられる場合、適切な対照は、他の点では同一な未処理の抑制性介在ニューロンの集団をいう。当業者は、本明細書において記載される技法、例えば、Kir2.1タンパク質またはmRNAレベルを、それぞれ、評価するためのウエスタンブロッティング法またはPCRに基づくアッセイ法を用いてKir2.1のレベルを測定することができる。当業者は、本明細書において上述されたように抑制性介在ニューロンの興奮性を測定することができる。
【００８８】
作用物質は、例えば、細胞内のNKCCの転写または翻訳を阻害することができる。作用物質は、細胞内でのNKCCの活性(例えば、NKCCの発現)を(例えば、活性がもはや生じないか、または低減された比率で生じるように)阻害し、または活性を変化しうる。
【００８９】
作用物質は、例えば、細胞内のKCC2、Gi-DREADDまたはKir2.1の転写または翻訳を増加させることができる。作用物質は、例えば、細胞内でのKCC2、Gi-DREADD、またはKir2.1の活性(例えば、KCC2、Gi-DREADD、またはKir2.1の発現)を(例えば、活性がより頻繁に生じるか、または増加された比率で生じるように)増加させうるか、または該活性を変化しうる。
【００９０】
前記作用物質は、それが投与される形態で直接機能しうる。あるいは、作用物質は、細胞への核酸配列の導入ならびに例えばNKCCの核酸および/もしくはタンパク質阻害因子、または細胞内でKCC2、Gi-DREADDもしくはKir2.1を上方調節する核酸および/もしくはタンパク質の、産生を引き起こすその転写のような、例えば、KCC2、Gi-DREADDもしくはKir2.1を上方調節する、またはNKCCを阻害するものが生じるように細胞内で修飾されてもまたは用いられてもよい。いくつかの態様において、作用物質は、合成および天然に存在する非タンパク性の実体を含むがこれらに限定されない、任意の化学的な、実体または部分である。ある特定の態様において、作用物質は、化学的な部分を有する小分子である。例えば、化学的な部分には、マクロライド、レプトマイシン、および関連する天然物またはそれらの類似体を含む、非置換もしくは置換アルキル、芳香族、またはヘテロシクリル部分が含まれる。作用物質は、所望の活性および/もしくは特性を有することが知られていてもよいか、または多様な化合物のライブラリから同定されてもよい。
【００９１】
さまざまな態様において、作用物質は、KCC2を上方調節する、またはNKCCを阻害する小分子である。小分子をスクリーニングするための方法は当技術分野において公知であり、例えば、所望の標的(例えば、KCC2またはNKCC)を所与として、病原性CD4細胞の細胞死を誘導するのに効率的な小分子を同定するために用いることができる。
【００９２】
さまざまな態様において、NKCCを阻害する作用物質は、NKCCに特異的な抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体試薬である。本明細書において用いられる場合、「抗体試薬」という用語は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、かつ所与の抗原に特異的に結合するポリペプチドをいう。抗体試薬は、抗体または抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含むことができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、抗体試薬は、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含むことができる。例えば、抗体は、重(H)鎖可変領域(本明細書においてVHと略記される)および軽(L)鎖可変領域(本明細書においてVLと略記される)を含むことができる。別の例において、抗体は、2つの重(H)鎖可変領域および2つの軽(L)鎖可変領域を含む。「抗体試薬」という用語は、抗体の抗原結合断片(例えば、一本鎖抗体、FabおよびsFab断片、F(ab')2、Fd断片、Fv断片、scFv、CDR、およびドメイン抗体(dAb)断片(例えば、de Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26(3):629-39を参照されたい; これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる))ならびに完全抗体を包含する。抗体は、IgA、IgG、IgE、IgD、またはIgM (ならびにそれらのサブタイプおよび組み合わせ)の構造的特徴を有することができる。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラットおよび霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）を含む任意の供給源に由来することができ、霊長類化抗体であることもできる。抗体はまた、ミディボディ、ナノボディ、ヒト化抗体、キメラ抗体などを含む。
【００９３】
NKCCはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書において用いられる場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、マイクロRNAの配列のような、DNAまたはmRNA配列に相補的な合成された核酸配列をいう。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、標的に結合し、転写、翻訳、またはスプライシングのレベルで発現を停止することにより、DNAまたはRNA標的の発現をブロックするように設計されている。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞条件下で遺伝子、例えば、NKCCとハイブリダイズするように設計された相補的核酸配列である。したがって、標的に対して十分に相補的である、すなわち、細胞環境の状況において十分によくハイブリダイズし、十分な特異性を有して、所望の効果を与えるオリゴヌクレオチドが選択される。例えば、NKCCを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それぞれ、ヒトNKCC遺伝子のコード配列(例えば、SEQ ID NO: 4)の一部分に相補的な少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、またはそれ以上の塩基を含みうる。
【００９４】
SEQ ID NO: 4は、NKCCをコードする核酸配列である。
2021525707.tif 000004
2021525707.tif 000005
【００９５】
1つの態様において、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、TALENS、メガヌクレアーゼ、およびCRISPR/Casシステムを含むが、これらに限定されない、任意のゲノム編集システムを用いて、NKCCが細胞のゲノムから欠失されるか、またはKCC2、本明細書において記載される最適化されたGi-DREADもしくはKir2.1が細胞のゲノムにおいて上方調節される。1つの態様において、1つまたは複数のガイドRNAをコードする核酸を細胞のゲノムに組み込むために用いられるゲノム編集システムは、CRISPR/Casシステムではなく; これにより、少量のCas酵素/タンパク質を保持する細胞での望ましくない細胞死を抑止することができる。本明細書においてCas酵素またはsgRNAのいずれかがそれぞれ異なる誘導性プロモーターの制御下で発現され、それによってそれぞれの一時的な発現がそのような干渉を抑止することを可能にすることも企図される。
【００９６】
1つまたは複数のsgRNAをコードする核酸およびRNA誘導エンドヌクレアーゼをコードする核酸がそれぞれインビボで投与される必要がある場合、アデノウイルス関連ベクター(AAV)の使用が特に企図される。ゲノム編集/断片化システムの両方の構成要素(例えば、sgRNA、RNA誘導エンドヌクレアーゼ)に核酸を同時に送達するための他のベクターは、エプスタインバーウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、およびB型肝炎ウイルス(HBV)のような、レンチウイルスベクターを含む。RNA誘導ゲノム編集システムの各構成要素(例えば、sgRNAおよびエンドヌクレアーゼ)は、当技術分野において公知のようにまたは本明細書において記載のように別個のベクターで送達することができる。
【００９７】
1つの態様において、作用物質はRNA阻害(RNAi)によってNKCCを阻害する。所与の遺伝子の発現阻害剤は、阻害性核酸であることができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、阻害性核酸は阻害性RNA (iRNA)である。RNAiは一本鎖または二本鎖であることができる。
【００９８】
iRNAは、siRNA、shRNA、内因性マイクロRNA (miRNA)、または人工miRNAであることができる。1つの態様において、本明細書において記載のiRNAは標的、例えばNKCCの発現および/または活性の阻害をもたらす。いずれかの局面のいくつかの態様において、作用物質は、NKCCを阻害するsiRNAである。いずれかの局面のいくつかの態様において、作用物質は、NKCCを阻害するshRNAである。
【００９９】
当業者は、例えば公的に使用可能な設計ツールを用いてNKCCの核酸配列(例えばSEQ ID NO: 4)を標的化するようにsiRNA、shRNA、またはmiRNAを設計することができよう。siRNA、shRNA、またはmiRNAは通常、Dharmacon (Layfayette, CO)またはSigma Aldrich (St. Louis, MO)のような企業を使って作製される。
【０１００】
いずれかの局面のいくつかの態様において、iRNAはdsRNAであることができる。dsRNAには、dsRNAが使用される条件の下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成するのに十分に相補的な2本のRNA鎖が含まれる。dsRNAの1つの鎖(アンチセンス鎖)は、標的配列に対して実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である相補性の領域を含む。標的配列は、標的の発現中に形成されたmRNAの配列に由来することができる。他鎖(センス鎖)には、適切な条件の下で組み合わされると、2本の鎖がハイブリダイズして二本鎖構造を形成するような、アンチセンス鎖に相補的な領域が含まれる。
【０１０１】
iRNAのRNAは、安定性または他の有益な特性を増強するために化学的に修飾することができる。本発明において重要な役割と果たす核酸は、参照により本明細書に組み入れられる「Current protocols in nucleic acid chemistry」, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されているものなどの、当技術分野において十分に確立された方法によって合成および/または修飾されうる。
【０１０２】
1つの態様において、作用物質は、NKCCを阻害するmiRNAである。マイクロRNAは、22ヌクレオチドの平均長を有する小さな非コードRNAである。これらの分子は、通常は3'非翻訳(3'UTR)領域にある、mRNA分子内の相補配列に結合することによって作用し、それによって標的mRNAの分解またはmRNA翻訳の阻害を促進する。マイクロRNAとmRNAとの間の相互作用は、不完全なワトソン・クリック塩基対合を通じてmRNAへの配列特異的結合を指令するマイクロRNAの6〜8ヌクレオチド領域である「シード配列」として知られるものによって媒介される。900種類超のマイクロRNAが哺乳類において発現されることが知られている。これらの多くは、そのシード配列に基づいてファミリーに分類され、それによって類似のマイクロRNAの「クラスタ」を同定することができる。miRNAは細胞内で、例えば、裸のDNAとして発現されうる。miRNAは、細胞内で発現される核酸によって、例えば、裸のDNAとしてコードされうるか、またはベクター内に含まれる核酸によってコードされうる。
【０１０３】
前記作用物質は、RNAi分子(例えば、siRNAまたはmiRNA)などを用いて、標的遺伝子(例えば、NKCC)の遺伝子サイレンシングをもたらしうる。これは、作用物質の存在なしで細胞に見出されるmRNAレベルの少なくとも約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、約100%の標的に対する細胞内のmRNAレベルの減少を伴う。1つの好ましい態様において、mRNAレベルは少なくとも約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、約100%低減する。当業者は、例えば、siRNA、shRNA、またはmiRNAを細胞にトランスフェクションし、ウエスタンブロッティングを介して細胞内に見出される遺伝子(例えば、NKCC)のレベルを検出することにより、siRNA、shRNA、またはmiRNAが、例えばNKCCを、その下方制御について効果的に標的化するかどうかを容易に評価することができよう。
【０１０４】
前記作用物質は、ベクター中に含まれてもよく、したがってベクターをさらに含んでもよい。外因性遺伝子を標的哺乳類細胞に移入するのに有用な多くのそのようなベクターが使用可能である。ベクターはエピソーム、例えばプラスミド、サイトメガロウイルス、アデノウイルスなどのようなウイルス由来ベクターであってもよいか、または相同組み換えもしくはランダム組み込み、例えばMMLV、HIV-1、ALVなどのようなレトロウイルス由来ベクターを通じて、標的細胞ゲノムに組み込まれてもよい。いくつかの態様において、レトロウイルスおよび適切なパッケージング細胞株の組み合わせもまた、キャプシドタンパク質が標的細胞に感染するために機能する場合に、用途がありうる。通常、細胞およびウイルスは培地中で少なくとも約24時間インキュベートされる。次に、細胞は、いくつかの用途において、例えば24〜73時間の、短い間隔で、または少なくとも2週間、培地中で増殖させられ、分析前に、5週またはそれ以上の間、増殖させられうる。一般的に用いられるレトロウイルスベクターは「欠損が」あり、すなわち増殖性感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。ベクターの複製には、パッケージング細胞株での増殖が必要とされる。
【０１０５】
本明細書において用いられる「ベクター」という用語は、宿主細胞への送達または異なる宿主細胞の間の移入のために設計された核酸コンストラクトをいう。本明細書において用いられる場合、ベクターは、ウイルス性または非ウイルス性であることができる。「ベクター」という用語は、適切な制御要素に連結された場合に複製が可能であり、細胞に遺伝子配列を移入することができる、任意の遺伝要素を包含する。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどを含むことができるが、これらに限定されることはない。
【０１０６】
本明細書において用いられる場合、「発現ベクター」という用語は、その中に含まれ、ベクター上の転写調節配列と連結されている核酸配列からのRNAまたはポリペプチド(例えば、KCC2、Gi-DREADD、またはKir2.1)の発現を指令するベクターをいう。発現される配列は、多くの場合に細胞に対して異種であるが、必ずしも異種であるわけではない。発現ベクターは、追加的な要素を含む場合があり、例えば、発現ベクターは、2つの複製システムを有することで、それが2つの生物に、例えば発現についてヒト細胞に、ならびにクローニングおよび増幅について原核生物宿主に維持されることを可能にしうる。「発現」という用語は、RNAおよびタンパク質を産生することならびに適宜、タンパク質を分泌することに関与する細胞過程をいい、この細胞過程は、該当する場合、非限定的に例えば、転写、転写産物プロセッシング、翻訳ならびにタンパク質の折り畳み、修飾およびプロセッシングを含む。「発現産物」は、遺伝子から転写されたRNA、および遺伝子から転写されたmRNAの翻訳によって得られるポリペプチドを含む。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列と機能的に連結される場合にインビトロまたはインビボでRNAに転写される核酸配列(DNA)を意味する。遺伝子は、コード領域、例えば5'非翻訳(5'UTR)配列または「リーダー」配列および3'UTR配列または「トレーラー(trailer)」配列、ならびに個々のコードセグメント(エクソン)の間の介在配列(イントロン)に先行および後続する領域を含む場合または含まない場合がある。
【０１０７】
組み込みベクターは、その送達されるRNA/DNAが宿主細胞染色体に恒久的に組み入れられている。非組み込みベクターはエピソームのままであり、これは、その中に含まれる核酸が宿主細胞染色体に組み込まれることは決してないことを意味する。組み込みベクターの例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ハイブリッドアデノウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。
【０１０８】
非組み込み型ベクターの一例は、非組み込み型ウイルスベクターである。非組み込み型ウイルスベクターは、そのゲノムを宿主DNAに組み込まないため、組み込み型レトロウイルスがもたらすリスクを排除する。一例はエプスタインバーoriP/核抗原-1 (「EBNA1」)ベクターであり、これは、自己複製の制限を可能にし、哺乳類細胞において機能することが知られている。エプスタインバーウイルスの2つの要素oriPおよびEBNA1を含むため、EBNA1タンパク質のウイルスレプリコン領域oriPへの結合は、哺乳類細胞におけるプラスミドの比較的長期間のエピソーム存在を維持する。oriP/EBNA1ベクターのこの特定の特徴により、組み込みのないiPSCの作出に理想的である。別の非組み込み型ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。
【０１０９】
別の非組み込み型ウイルスベクターはRNAセンダイウイルスベクターであり、これは感染細胞の核に侵入することなくタンパク質を産生することができる。F欠損センダイウイルスベクターは2、3回の継代の間、感染細胞の細胞質に残存するが、数回の継代(例えば、10回の継代)後に急速に希釈され、完全に失われる。
【０１１０】
非組み込み型ベクターの別の例は、ミニサークルベクターである。ミニサークルベクターは、プラスミド骨格が放出され、発現される真核生物プロモーターおよびcDNAのみが残っている環状ベクターである。
【０１１１】
さまざまな態様において、ベクターは血液脳関門を通過する。他の態様において、本明細書において記載される任意の作用物質は、血液脳関門を通過するように製剤化される。血液脳関門は、中枢神経系(CNS)の脳細胞外液から循環血液を分離する、選択性の高い半透膜関門である。CNSに送達される必要のある治療用物質の場合、熟練した臨床医が脊柱管に治療用物質を直接送達することができる。脊柱管への直接投与の場合、本明細書において記載される化合物および組成物は、熟練した臨床医による髄腔内投与を介して投与される。髄腔内投与は、薬物が脊髄管またはくも膜下腔に直接注射され、脳脊髄液(CSF)に直接到達することを可能にする薬物投与の経路である。髄腔内投与を介して投与される他の薬物の非限定的な例は、脊椎麻酔、化学療法剤、疼痛管理薬、および血液脳関門を通過できない治療用物質である。ベクターは、血液脳関門を透過性にする少なくとも第2の作用物質とともにパッケージ化することができる。当業者は、例えば、投与後にベクターが例えば髄液中で検出されるかどうかを決定することによって、ベクターが血液脳関門を通過したかどうかを決定することができる。
【０１１２】
薬学的組成物
本明細書において記載される組成物は、脊髄損傷の処置に用いることを対象にしている。これらの組成物の投与方法は、本明細書において以下でさらに記載される。さまざまな態様において、本明細書において記載される任意の薬学的組成物は、少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む。1つの態様において、第2の治療用化合物は、脊髄損傷の処置に有用である。
【０１１３】
本発明の1つの局面は、脊髄損傷の処置に用いるための、KCC2ポリペプチドのまたはKCC2ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。1つの態様において、KCC2ポリペプチドは、哺乳類KCC2、例えば、ラットKCC2の核酸配列を含む。
【０１１４】
1つの態様において、KCC2ポリペプチドは、SEQ ID NO: 1の配列を含む。
【０１１５】
SEQ ID NO:1は、ラットKCC2をコードする核酸配列である。
2021525707.tif 000006
2021525707.tif 000007
【０１１６】
1つの態様において、KCC2ポリペプチドは、SEQ ID NO: 1との少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するか、それらを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になり、かつSEQ ID NO: 1のKCC2の生物学的活性の少なくとも80%を保持している。本明細書において用いられる場合、KCC2の生物学的活性は、カリウムおよび塩化物勾配を媒介するその機能をいうが、これに限定されることはない。
【０１１７】
本発明の別の局面は、脊髄損傷の処置に用いるための、Gi-DREADDポリペプチドのまたはGi-DREADDポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。1つの態様において、Gi-DREADDポリペプチドは、抑制性介在ニューロンにおける発現のために最適化される。1つの態様において、組成物はクロザピンN-オキシドをさらに含む。
【０１１８】
1つの態様において、Gi-DREADDポリペプチドは、SEQ ID NO: 2の配列を含む。
【０１１９】
SEQ ID NO: 2は、最適化されたGi-DREADDをコードする核酸配列である。
2021525707.tif 000008
【０１２０】
いずれかの局面の1つの態様において、Gi-DREADDポリペプチドは、SEQ ID NO: 2との少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するか、それらを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になり、かつSEQ ID NO: 2のGi-DREADDの生物学的活性の少なくとも80%を保持している。
【０１２１】
本発明のさらに別の局面は、脊髄損傷の処置に用いるための、Kir2.1ポリペプチドのまたはKir2.1ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【０１２２】
1つの態様において、Kir2.1ポリペプチドはSEQ ID NO: 3の配列を含む。
【０１２３】
SEQ ID NO: 3は、ヒトKir2.1ポリペプチドをコードするアミノ酸配列である。
2021525707.tif 000009
【０１２４】
1つの態様において、Kir2.1ポリペプチドは、SEQ ID NO: 3との少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するか、それらを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になり、かつSEQ ID NO: 3のKir2.1の生物学的活性の少なくとも80%を保持している。
【０１２５】
1つの態様において、Kir2.1ポリペプチドはSEQ ID NO: 5の配列を含む。
【０１２６】
SEQ ID NO: 5は、マウスKir2.1ポリペプチドをコードするアミノ酸配列である。
2021525707.tif 000010
【０１２７】
1つの態様において、Kir2.1ポリペプチドは、SEQ ID NO: 5との少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するか、それらを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になり、かつSEQ ID NO: 5のKir2.1の生物学的活性の少なくとも80%を保持している。
【０１２８】
本発明の別の局面は、脊髄損傷の処置に用いるための、有効量の本明細書において記載されるNKCCを阻害する作用物質のうちのいずれかと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。いずれかの局面の1つの態様において、組成物は少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む。
【０１２９】
1つの態様において、組成物は、KCC2、NKCC、本明細書に記載の最適化されたGi-DREAD、またはKir2.1を調節する本明細書において記載される任意の作用物質を含む。
【０１３０】
本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される」という用語は、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な利益/リスク比に見合いながらも、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒトおよび動物の組織との接触に用いるのに適した化合物、材料、組成物、および/または剤形をいう。
【０１３１】
本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、対象化合物をある器官または身体の部分から別の器官または身体の部分に運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤(例えば、滑沢剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくは亜鉛、またはステアリン酸)、または溶媒封入材料のような、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、患者に害を及ぼさないという意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として働きうる材料のいくつかの例としては、(1) ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖類; (2) トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンのようなデンプン; (3) セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロース; (4) 粉末トラガカント; (5) 麦芽; (6) ゼラチン; (7) ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクのような滑沢剤; (8) カカオ脂および坐剤ワックスのような賦形剤; (9) 落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油のような油; (10) プロピレングリコールのようなグリコール; (11) グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール(PEG)のようなポリオール; (12) オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル; (13) 寒天; (14) 水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤; (15) アルギン酸; (16) 発熱物質を含まない水; (17) 等張食塩水; (18) リンゲル液; (19) エチルアルコール; (20) pH緩衝化溶液; (21) ポリエステル、ポリカーボネートおよび/またはポリ無水物; (22) ポリペプチドおよびアミノ酸のような増量剤、(23) 血清アルブミン、HDLおよびLDLのような血清成分; (22) エタノールのようなC2〜C12アルコール; ならびに(23) 薬学的製剤中に用いられる他の無毒性の適合物質が挙げられるが、これらに限定されることはない。湿潤剤、結合剤、充填剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、着香剤、芳香剤、保存料、水、塩溶液、アルコール、抗酸化剤、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなども、製剤中に存在することができる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などのような用語は、本明細書において互換的に用いられる。
【０１３２】
本明細書において記載される1つの局面において、本明細書において記載される組成物は、血液脳関門の通過を容易にする作用物質をさらに含む。1つの態様において、薬学的に許容されるものは、血液脳関門を通過するのを容易にするか、または通過する能力を有する。
【０１３３】
投与
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法は、本明細書において記載されるKCC2を上方調節する作用物質を投与する段階を含む、脊髄損傷を有するまたは有すると診断された対象の処置に関する。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法は、本明細書において記載されるNKCCを阻害する作用物質を投与する段階を含む、脊髄損傷を有するまたは有すると診断された対象の処置に関する。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法は、本明細書において記載されるGi-DREADDを上方調節する作用物質を投与する段階を含む、脊髄損傷を有するまたは有すると診断された対象の処置に関する。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法は、本明細書において記載されるKir2.1を上方調節する作用物質を投与する段階を含む、脊髄損傷を有するまたは有すると診断された対象の処置に関する。脊髄損傷を有する対象は、医師により状態を診断する現行の方法を用いて同定することができる。脊髄損傷を特徴付け、かつ診断に役立つ、この損傷の症状および/または合併症は、当技術分野において周知であり、四肢の可動性の喪失または低減を含むが、これらに限定されることはない。例えば脊髄損傷の、診断に役立ちうる試験は、X線、MRIスキャン、またはCTスキャンを含むが、これらに限定されることはない。
【０１３４】
本明細書において記載される作用物質(例えば、KCC2、Gi-DREADDを上方調節する作用物質、例えば、本明細書において記載の最適化されたGi-DREADD)、もしくはKir2.1、またはNKCCを阻害する作用物質)は、脊髄損傷を有するまたは有すると診断された対象に投与することができる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法は、脊髄損傷の少なくとも1つの症状を軽減するために、有効量の作用物質を対象に投与する段階を含む。本明細書において用いられる場合、「脊髄損傷の少なくとも1つの症状を軽減すること」は、脊髄損傷に関連する任意の状態または症状(例えば、四肢の感覚または可動性の喪失)を改善することである。同等の未処理対照と比較して、そのような低減は、任意の標準的な技法により測定された場合、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、またはそれ以上である。本明細書において記載される作用物質を対象に投与するための種々の手段が、当業者に知られている。1つの態様において、作用物質は全身的または局所的に(例えば、脊髄に、または脊髄の損傷部位に)投与される。1つの態様において、作用物質は静脈内に投与される。1つの態様において、作用物質は連続的に、間隔を置いて、または散発的に投与される。作用物質の投与経路は、送達される作用物質のタイプ(例えば、抗体、小分子、RNAi)に合わせて最適化され、熟練した施術者が決定することができる。
【０１３５】
本明細書において用いられる「有効量」という用語は、脊髄損傷の少なくとも1つまたは複数の症状を軽減するために必要な脊髄損傷を有するまたは有すると診断された対象に投与されうる作用物質(例えば、KCC2、Gi-DREADD、もしくはKir2.1を上方調節する作用物質、またはNKCCを阻害する作用物質)の量をいう。「治療的有効量」という用語はそれゆえ、典型的な対象への投与時に特定の抗脊髄損傷効果をもたらすのに十分である作用物質の量をいう。本明細書において用いられる有効量はまた、さまざまな状況で、脊髄損傷の症状の発現を遅延させるのに、脊髄損傷の症状の経過を変化させるのに(例えば、四肢の感覚もしくは可動性の喪失の進行を遅らせるのに)、または脊髄損傷の症状を反転させるのに(例えば、以前に低減もしくは喪失された四肢の感覚もしくは可動性を回復させるのに)十分な作用物質の量を含む。したがって、正確な「有効量」を指定することは一般に実用的ではない。しかしながら、任意の所与の場合に、当業者は日常の実験のみを用いて適切な「有効量」を判定することができる。
【０１３６】
1つの態様において、作用物質は、脊髄損傷の発生後、少なくとも1分、少なくとも2分、少なくとも3分、少なくとも4分、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも15分、少なくとも20分、少なくとも25分、少なくとも30分、少なくとも35分、少なくとも40分、少なくとも45分、少なくとも50分、少なくとも55分、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも12時間、少なくとも18時間、少なくとも24時間、少なくとも36時間、少なくとも48時間、少なくとも60時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも1週、少なくとも2週、少なくとも3週、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも7ヶ月、少なくとも8ヶ月、少なくとも9ヶ月、少なくとも10ヶ月、少なくとも11ヶ月、少なくとも12ヶ月、少なくとも2年、少なくとも3年、少なくとも4年、もしくは少なくとも5年、またはそれ以上のうちに投与される。
【０１３７】
1つの態様において、作用物質は、約0.001〜25 mg/kg体重または約0.005〜8 mg/kg体重または約0.01〜6 mg/kg体重または約0.1〜0.2 mg/kg体重または約1〜2 mg/kg体重の量で用いることができる。いくつかの態様において、作用物質は、約0.1〜1000 μg/kg体重または約1〜100 μg/kg体重または約10〜50 μg/kg体重の量で用いることができる。1つの態様において、作用物質は、1用量あたり0.01 μg〜15 mg/kg体重、例えば、1用量あたり10、1、0.1、0.01、0.001、または0.00001 mg/kg体重に及ぶ量で用いることができる。[本発明者ら - どのような範囲を使用する予定ですか？]
【０１３８】
有効量、毒性、および治療有効性は、細胞培養物または実験動物における標準の薬学的手法によって評価することができる。投与量は、用いられる剤形および用いられる投与経路に依って変化しうる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、これはLD50/ED50比として表すことができる。大きい治療指数を示す組成物および方法が好ましい。治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイ法から最初に推定することができる。また、ある用量を動物モデルにおいて処方して、細胞培養または適切な動物モデルにおいて判定された通りのIC50 (すなわち、症状の半最大阻害を達成する作用物質濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成することができる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投与量の効果は、例えば、数ある中でも、四肢の可能性の測定する、反射神経を測定する、適切なバイオアッセイ法によってモニターすることができる。投与量は、医師が判定し、必要に応じて調整し、認められる処置効果に合わせることができる。
【０１３９】
投与量
「単位剤形」は、この用語が本明細書において用いられる場合、適切な1回の投与のための投薬量をいう。例として、単位剤形は、送達デバイス、例えば、シリンジまたは静脈内点滴バッグに配置された治療用物質の量であることができる。1つの態様において、単位剤形は、単回投与で投与される。別の態様において、2つ以上の単位剤形を同時に投与することができる。
【０１４０】
本明細書において記載される作用物質の投与量は、医師が判定し、必要に応じて調整し、認められる処置効果に合わせることができる。処置の期間および頻度に関して、熟練した臨床医は、処置がいつ治療効果をもたらすかを決定するために対象をモニターし、さらに細胞を投与するか、処置を中断するか、処置を再開するか、または処置計画に対して他の変更を行うかを決定するのが一般的である。投与量は、サイトカイン放出症候群のような、有害な副作用を引き起こすほど多くてはならない。一般に、投与量は、患者の年齢、状態、および性別によって異なり、当業者によって決定されることができる。いずれかの合併症が発生した場合、個々の医師が投与量を調整することもできる。
【０１４１】
併用療法
1つの態様において、本明細書において記載される作用物質は、単剤療法として用いられる。1つの態様において、本明細書において記載される作用物質は、脊髄損傷のための他の公知の作用物質および治療法と組み合わせて用いることができる。本明細書において用いられる「組み合わせて」投与されるとは、損傷による対象の苦痛の経過中に2つ(またはそれ以上)の異なる処置が対象に送達される、例えば、対象が損傷と診断された後に、かつ損傷が治癒されもしくは取り除かれる前に、または他の理由で処置が打ち切られる前に、2つまたはそれ以上の処置が送達されることを意味する。いくつかの態様において、1つの処置の送達は、第2の処置の送達が始まる時に依然として行われているので、投与という点で重複している。これは本明細書において「同時」、「実質的に同時に」または「同時送達」といわれることもある。他の態様において、一方の処置の送達は、他方の処置の送達が始まる前に終了する。いずれかの場合のいくつかの態様において、処置は、併用投与のためにより効果的である。例えば、第2の処置はより効果的であり、例えば、第2の処置を少なくしても同等の効果が見られるか、または第2の処置が第1の処置の非存在下で実施された場合に見られるよりも大幅に、第2の処置が症状を低減するか、または第1の処置で同様の状況が見られる。いくつかの態様において、送達は、症状の低減、または損傷に関連する他のパラメータが、他方の非存在下で送達された一方の処置で観察されるものよりも大きいようなものである。2つの処理の効果は、部分的に相加的、完全に相加的、または相加的超であることができる。送達は、送達された第1の処置の効果が、第2の処置が送達される時に依然として検出可能であるようなものであることができる。本明細書において記載される作用物質および少なくとも1つのさらなる治療は同時に、同じもしくは別々の組成物中で、または連続的に与えることができる。連続投与の場合、本明細書において記載される作用物質を最初に投与することができ、さらなる作用物質を2番目に投与することができるか、または投与の順序を逆にすることができる。作用物質は、別の処置の前に、処置と同時に、処置後に、または障害の寛解中に投与することができる。
【０１４２】
脊髄損傷を処置するために現在用いられている処置は、理学療法、電気刺激、損傷した脊髄を修復するための手術、幹細胞治療、高圧酸素療法を含むが、これらに限定されることはない。脊髄損傷を処置するために用いられる薬理学的処置は、コルチコステロイド(例えば、デキサメタゾンおよびメチルプレドニゾロン)、ガングリオシド、チリラザド、ナロキソンを含むが、これらに限定されることはない。
【０１４３】
本明細書において記載される作用物質とともに投与することができるさらなる化合物は、軸索再生プロモーター(オステオポンチン、および成長因子のような)、ならびに4-アミノプリジンを含むが、これらに限定されることはない。
【０１４４】
骨シアロタンパク質I (BSP-1またはBNSP)、初期Tリンパ球活性化(ETA-1)、分泌型リンタンパク質1 (SPP1)、2ar、およびリケッチア耐性(Ric)としても知られるオステオポンチンは、分泌型リンタンパク質1 (SPP1)遺伝子によってコードされる。オステオポンチンは、例えば、バイン(bine)において発現され、細胞外構造タンパク質として機能する。オステオポンチン（OPN）の配列は、いくつかの種、例えば、ヒトオステオポンチン(NCBI Gene ID: 6696)ポリペプチド(例えば、NCBI Ref Seq NP_000573.1)およびmRNA (例えば、NCBI Ref Seq NM_000582.2)について当技術分野において公知である。オステオポンチンは、天然に存在するその変種、分子、および対立遺伝子を含めて、ヒトオステオポンチンをいうことができる。オステオポンチンは、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳類オステオポンチンをいう。オステオポンチンの投与は、例えば、国際出願番号WO/1999033415、US2004/0142865およびWO/2003046135; または米国特許出願番号US11/936,623; または米国特許番号US6,686,444または同5,695,761に記載されており、これらの内容はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１４５】
処方箋が必要な筋強化剤である4-アミノプリジンは、当技術分野においてC5H4N-NH2としても知られており、
2021525707.tif 000011
である構造を有する。
【０１４６】
組み合わせて投与される場合、作用物質およびさらなる作用物質(例えば、第2もしくは第3の作用物質)、または全ては、個別に、例えば単剤療法として、用いられる各作用物質の量もしくは投与量よりも多い、少ない、またはその量もしくは投与量と同じ量または用量で投与することができる。ある特定の態様において、作用物質、さらなる作用物質(例えば、第2もしくは第3の作用物質)、または全ての投与される量または投与量は、個別に用いられる各作用物質の量または投与量よりも低い(例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%)。他の態様において、所望の効果(例えば、脊髄損傷の処置)をもたらす作用物質、さらなる作用物質(例えば、第2もしくは第3の作用物質)、または全ての量または投与量は、同じ治療効果を達成するために個別に必要とされる各作用物質の量または投与量よりも低い(例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%低い)。
【０１４７】
非経口剤形
本明細書において記載される作用物質の非経口剤形は、硬膜外注射、皮下、静脈内(ボーラス注射を含む)、筋肉内、および動脈内を含むが、これらに限定されない、さまざまな経路によって対象に投与することができる。非経口剤形の投与は、通常、混入物に対する患者の自然防御を回避するので、非経口剤形は、好ましくは、無菌であるか、または患者への投与の前に滅菌することができる。非経口剤形の例としては、注射の準備ができている溶液、注射用の薬学的に許容されるビヒクルに溶解または懸濁される準備ができている乾燥製品、注射の準備ができている懸濁液、制御放出性の非経口剤形、および乳濁液が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１４８】
本開示の非経口剤形を提供するために用いられうる適切なビヒクルは、当業者には周知である。例としては、非限定的に、滅菌水; 注射用水USP; 生理食塩溶液; グルコース溶液; 限定されることはないが、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、ならびに乳酸加リンゲル注射液のような、水性ビヒクル; 限定されることはないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールのような、水混和性ビヒクル; ならびに限定されることはないが、トウモロコシ油、綿実油、落花生油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルのような、非水性ビヒクルが挙げられる。
【０１４９】
制御放出性および遅延放出性の剤形
本明細書において記載される局面のいくつかの態様において、作用物質は、制御放出性または遅延放出性の手段によって対象に投与される。理想的には、医療処置での最適に設計された制御放出調製物の使用は、最少量の薬物を用いて最小限の時間で状態を治癒または制御することを特徴とする。制御放出製剤の利点には、(1) 薬物の活性延長; (2) 投薬頻度の低減; (3) 患者のコンプライアンス増大; (4) 合計薬物の使用減少; (5) 局所または全身副作用の低減; (6) 薬物蓄積の最小化; (7) 血中レベルの変動低減; (8) 処置の有効性の改善; (9) 薬物活性の増強または消失の低減; および(10) 疾患または状態の制御速度の改善が挙げられる。(Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000))。制御放出製剤を用いて、式(I)の化合物の作用の発現、作用の持続期間、治療ウィンドウ内の血漿中レベル、およびピーク血中レベルを制御することができる。特に、制御放出性または延長放出性の剤形または製剤を用いて、作用物質の最大の有効性を達成する一方で、薬物の過少投与(すなわち、最低治療レベルを下回る)および薬物の毒性レベルの超過の両方から起こりうる、可能性のある有害作用および安全性の問題を最小限にすることを確実にできる。
【０１５０】
種々の公知の制御放出性または持続放出性の剤形、製剤、および装置は、本明細書において記載されるいずれかの作用物質ともに用いるのに適合されうる。例としては、米国特許第3,845,770号; 同第3,916,899号; 同第3,536,809号; 同第3,598,123号; 同第4,008,719号; 同第5674,533号; 同第5,059,595号; 同第5,591,767号; 同第5,120,548号; 同第5,073,543号; 同第5,639,476号; 同第5,354,556号; 同第5,733,566号; および同第6,365,185号に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されることはなく、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。これらの剤形は、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他の重合体マトリックス、ゲル、透過性膜、浸透性システム(OROS (登録商標) (Alza Corporation, Mountain View, Calif. USA)のような)、多層コーティング、微粒子、リポソームもしくはミクロスフェア、またはこれらの組み合わせを用い1種類または複数種類の活性成分の遅延放出または制御放出を提供して、さまざまな比率での所望の放出特性を提供することができる。さらに、イオン交換材料を用いて、開示された化合物の固定化され、吸着された塩形態を調製することができ、したがって薬物の制御送達をもたらすことができる。特定の陰イオン交換体の例としては、DUOLITE(登録商標) A568およびDUOLITE(登録商標) AP143 (Rohm&Haas, Spring House, Pa. USA)が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１５１】
有効性
例えば、脊髄損傷の処置のための、本明細書において記載される作用物質の有効性は、当業者によって決定されることができる。しかしながら、脊髄損傷の兆候もしくは症状の1つもしくは複数が有益な方法で変化するなら、他の臨床的に認められた症状が改善され、もしくはさらに好転されるなら、または所望の応答が、例えば、本明細書において記載される方法による処置後に少なくとも10%誘導されるなら、「有効な処置」という用語が本明細書において用いられるように、処置は「有効な処置」と見なされる。有効性は、例えば、マーカー、指標、症状、および/もしくは本明細書において記載される方法によって処置される損傷の発生率または適切な任意の他の測定可能なパラメータ、例えば、四肢の感覚および/もしくは可動性を測定することにより評価することができる。有効性は、入院によって評価されるように個体が悪化しないこと、または医学的介入の必要性(すなわち、四肢の感覚または可動性の喪失の進行)によって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に知られており、および/または本明細書において記載されている。
【０１５２】
有効性は、例えば、本明細書において記載される状態の動物モデル、場合によっては、脊髄損傷のマウスモデルまたは適切な動物モデルにおいて評価することができる。実験動物モデルを用いる場合、例えば、可動性喪失後の四肢可動性の増加など、マーカーの統計的に有意な変化が観察される場合に、処置の有効性が証明される。
【０１５３】
特定される全ての特許、特許出願、および刊行物は、例えば、本発明に関連して用いられうるこのような刊行物において記載されている方法を記載かつ開示することを目的として明確に参照により本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、単にこれらの開示が本出願の出願日以前であるために提供されるものである。これに関していかなる内容も、先行発明であるとの理由でまたは何らかの他の理由で本発明者らがそのような開示に先行する権利を有しないことの承認と解釈されるべきではない。これらの文献の内容に関する日付または表現についての全ての言明は、本出願人らに入手可能な情報に基づいており、これらの文献の日付または内容の正確さに関する承認をなすものではない。
【０１５４】
本発明は、以下の番号が付けられた項目のいずれかにおいて定義されることができる。
(1) 脊髄損傷を有する対象に、ニューロン特異的K+-Cl-共輸送体(KCC2)を上方調節する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
(2) KCC2を上方調節する前記作用物質が、小分子、ペプチド、遺伝子編集システム、および、KCC2をコードする発現ベクターからなる群より選択される、項目1の方法。
(3) 前記小分子がCLP290である、前記項目のいずれかの方法。
(4) 前記ベクターが非組み込み型または組み込み型である、前記項目のいずれかの方法。
(5) 前記ベクターがウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、前記項目のいずれかの方法。
(6) 前記非組み込み型ベクターが、エピソームベクター、EBNA1ベクター、ミニサークルベクター、非組み込み型アデノウイルス、非組み込み型RNA、およびセンダイウイルスからなる群より選択される、前記項目のいずれかの方法。
(7) 前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルスからなる群より選択される、前記項目のいずれかの方法。
(8) 前記非ウイルスベクターが、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性重合体、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、およびリポスフィアからなる群より選択される、前記項目のいずれかの方法。
(9) 前記ベクターが血液脳関門を通過する、前記項目のいずれかの方法。
(10) KCC2が、適切な対照と比較して少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、または少なくとも10倍上方調節される、前記項目のいずれかの方法。
(11) 前記脊髄損傷が重症脊髄損傷である、前記項目のいずれかの方法。
(12) 前記対象がヒトである、前記項目のいずれかの方法。
(13) 前記対象が脊髄損傷と診断されたことがある、前記項目のいずれかの方法。
(14) 前記対象が脊髄損傷の処置を以前に受けている、前記項目のいずれかの方法。
(15) 投与する段階の前に、前記対象が脊髄損傷を有すると診断されている、前記項目のいずれかの方法。
(16) 前記対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置をさらに実施する、前記項目のいずれかの方法。
(17) 前記対象に少なくとも第2の治療用化合物をさらに投与する、前記項目のいずれかの方法。
(18) 前記第2の治療用化合物が、オステオポンチン、成長因子、または4-アミノプリジンからなる群より選択される、前記項目のいずれかの方法。
(19) 脊髄損傷を有する対象に、Na+/2Cl-/K+共輸送体(NKCC)を阻害する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
(20) NKCCを阻害する前記作用物質が、小分子、抗体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNAiからなる群より選択される、項目19の方法。
(21) 前記RNAiがマイクロRNA、siRNA、またはshRNAである、前記項目のいずれかの方法。
(22) 前記小分子がブメタニドである、前記項目のいずれかの方法。
(23) 前記作用物質がベクター中に含まれる、前記項目のいずれかの方法。
(24) 脊髄損傷を有する対象に、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
(25) 前記作用物質が阻害性Gi共役受容体Gi-DREADDを上方調節する、前記項目のいずれかの方法。
(26) 前記作用物質が、Gi-DREADDをコードする発現ベクターである、前記項目のいずれかの方法。
(27) 前記作用物質が、Kir2.1をコードする発現ベクターである、前記項目のいずれかの方法。
(28) 前記作用物質と実質的に同時にクロザピンN-オキシドを投与する段階をさらに含む、前記項目のいずれかの方法。
(29) 前記ベクターが血液脳関門を通過する、前記項目のいずれかの方法。
(30) 抑制性介在ニューロンの前記興奮性が、適切な対照と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90、少なくとも99%、またはそれ以上低減される、前記項目のいずれかの方法。
(31) 投与する段階の前に、前記対象が脊髄損傷を有すると診断されている、前記項目のいずれかの方法。
(32) 前記対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置を実施する、前記項目のいずれかの方法。
(33) 脊髄損傷を有する対象に、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減する電気刺激の有効量を与える段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
(34) 前記作用物質と実質的に同時にクロザピンN-オキシドを投与する段階をさらに含む、前記項目のいずれかの方法。
(35) 前記電気刺激が脊髄に直接適用される、前記項目のいずれかの方法。
(36) 前記電気刺激が損傷部位において脊髄に直接適用される、前記項目のいずれかの方法。
(37) 抑制性介在ニューロンの前記興奮性が、適切な対照と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90、少なくとも99%、またはそれ以上低減される、前記項目のいずれかの方法。
(38) 投与する段階の前に、前記対象が脊髄損傷を有すると診断されている、前記項目のいずれかの方法。
(39) 前記対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置を実施する、前記項目のいずれかの方法。
(40) 脊髄損傷の処置に用いるための、KCC2ポリペプチドのまたは該KCC2ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
(41) 前記KCC2ポリペプチドがSEQ ID NO: 1の配列を含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(42) 前記KCC2ポリペプチドが、SEQ ID NO: 1との少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、かつSEQ ID NO: 1のKCC2の生物学的活性の少なくとも80%を保持している、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(43) 少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(44) 脊髄損傷の処置に用いるための、Gi-DREADDポリペプチドのまたは該Gi-DREADDポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
(45) 前記Gi-DREADDポリペプチドが、最適化されたGi-DREADDポリペプチドである、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(46) 前記Gi-DREADDポリペプチドがSEQ ID NO: 2の配列を含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(47) 前記Gi-DREADDポリペプチドが、SEQ ID NO: 2との少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、かつSEQ ID NO: 2のGi-DREADDの生物学的活性の少なくとも80%を保持している、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(48) クロザピンN-オキシドをさらに含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(49) 少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(50) 脊髄損傷の処置に用いるための、Kir2.1ポリペプチドのまたは該Kir2.1ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
(51) 前記Kir2.1ポリペプチドがSEQ ID NO: 3の配列を含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(52) 前記Kir2.1ポリペプチドが、SEQ ID NO: 3との少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、かつSEQ ID NO: 3のKir2.1の生物学的活性の少なくとも80%を保持している、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(53) クロザピンN-オキシドをさらに含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(54) 少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(55) 脊髄損傷の処置に用いるための、項目19〜21のいずれかの作用物質の有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
(56) 少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(57) 脊髄損傷を有する対象にCLP290の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
(58) CLP290が血液脳関門を通過する、前記項目のいずれかの方法。
(59) 前記脊髄損傷が重度の脊髄損傷である、前記項目のいずれかの方法。
(60) 前記対象がヒトである、前記項目のいずれかの方法。
(61) 前記対象が脊髄損傷と診断されたことがある、前記項目のいずれかの方法。
(62) 前記対象が脊髄損傷の処置を以前に受けている、前記項目のいずれかの方法。
(63) 投与する段階の前に、前記対象が脊髄損傷を有すると診断されている、前記項目のいずれかの方法。
(64) 前記対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置をさらに実施する、前記項目のいずれかの方法。
(65) 前記対象に少なくとも第2の治療用化合物をさらに投与する、前記項目のいずれかの方法。
(66) 前記第2の治療用化合物が、オステオポンチン、成長因子、または4-アミノプリジンからなる群より選択される、前記項目のいずれかの方法。
【実施例】
【０１５５】
序論
大部分のヒト脊髄損傷(SCI)は解剖学的に不完全であり、損傷した脊椎分節にスペアの軸索がまたがっている。しかしながら、これらの患者の約半数は、損傷レベル下の筋肉制御および感覚の完全な喪失を有し(Fawcett et al., 2007; Kakulas, 1999)、スペアの接続が機能的に休止していることを示唆している。注目すべきことに、最近の研究では、硬膜外刺激とリハビリトレーニングを組み合わせることで、慢性的に麻痺したSCI患者が自発的な動きを取り戻せることが実証されている(Angeli et al., 2014; Harkema et al., 2011)。想定される機構は、これらの操作がそのような休止状態の脊椎回路を再活性化し、脳由来のシグナルを脊髄に伝えられるようにすることである。しかしながら、このスペアの脊椎回路がSCI後に機能不全になる理由、およびそれを再活性化することができる最適な方法はほとんど不明である。
【０１５６】
後肢機能の場合、基本的な運動を実行するための脊椎中心である中枢パターン発生器(CPG)は、主に腰髄に位置している(Frigon and Rossignol, 2008; Gerasimenko et al., 2008; Grillner and Wallen, 1985; Kiehn, 2016)。新生児動物から分離された脊髄を用いた古典的研究によって、ニューロンの興奮性の薬理学的操作が遠心性パターンを開始および調節できることが示された(Cazalets et al., 1992; Cowley and Schmidt, 1995; Kiehn, 2006)。無傷の動物では、腰椎運動中枢の出力は、脳からの下行性コマンドによって部分的に制御される。SCIによってこれらの入力を奪われた後、感覚求心路が無傷であっても、腰髄は運動機能を開始することができない。SCI後に機能を回復するには、下行性入力と腰髄の間の接続を再確立することが重要である。例えば、代償性軸索の再成長とシナプスの再編成は、SCI後にさまざまな脊髄レベルでそのような接続を増強する可能性がある(Ballermann and Fouad, 2006; Bareyre et al., 2004; Courtine et al., 2008; Filous and Schwab, 2017; He and Jin, 2016; Jankowska and Edgley, 2006; Rosenzweig et al., 2010; Takeoka et al., 2014; van den Brand et al., 2012; Zaporozhets et al., 2011)。下行性脊髄投射経路(descending spinal-projecting pathways)の大部分が損傷している重度の脊髄損傷では、単一の脊髄分節に限定された局所介在ニューロンと、軸索が多くの脊髄分節を横切る投射脊髄固有ニューロンからなる脊髄内回路網の関与が、間接的な中継経路として機能し、脳由来の運動コマンドを受信して腰髄に送信しうる(O'Shea et al., 2017; Zaporozhets et al., 2011)。
【０１５７】
スペア接続はSCI後に代償する能力が限られている理由を説明するために、さまざまな仮説が提唱されている。例えば、スペアの下行性軸索を有するニューロンの発火特性および伝導特性が損なわれる可能性がある(Edgerton et al., 2008; Arvanian et al., 2009; Sawada et al., 2015)。あるいは、局所脊髄回路が損傷によって機能しなくなる可能性があり、その結果、スペアの下行性入力を中継または統合できなくなる可能性がある(Courtine et al., 2008; Edgerton et al., 2008; Rossignol and Frigon, 2011)。これらのおよびその他の要因の寄与はまだ特徴決定されていない。さらに、スペアの脊髄ニューロンの興奮性を阻害または増強することが、SCI後の機能回復に有益であるかどうかさえ明らかではない。
【０１５８】
ニューロンの興奮性を調節する細胞および分子機構の決定において、目覚ましい進歩が見られた。その結果、イオンチャネルおよび受容体などの主要な調節因子を標的とするいくつかの小分子化合物が開発され、それらの薬理学的特性が十分に特徴決定されている。重要なことに、これらの化合物の多くは、血液脳関門(BBB)を効率的に通過できるため、これらの小分子の全身投与により、SCI動物モデルにおいてその効果を分析することが可能になる。したがって、本明細書において提示されるのは、SCIモデルにおいて、休止中の脊髄回路を再活性化し、最終的に機能回復を媒介しうるニューロン活動調節因子を同定するためのバイアスのない化合物スクリーニングアプローチである。
【０１５９】
結果
CLP290はジグザグ状病変を有する麻痺マウスにおいて一貫したステッピング能力を回復する
ジグザグ状病変のパラダイムを最適化し、既述のモデル(Courtine 2008; van den Brand, 2012)と同様に、胸部(T) 7およびT10レベルで同時に2つの外側性半切断を実施した(図1Aおよび1B)。T10病変は、脊髄正中線で終わる外側性半切断であり、T10病変の反対側にあるT7病変は、正中線をわずかに超えて延びている(図1A)。この二重半切断手技では、T10を通過する全ての下行性軸索が切断され、T7とT10の間の正中線を通過する軸索のみがそのまま残る(図1C)。実際、セロトニン作動性軸索を標識する抗5-HT抗体を用いた免疫組織化学により、下行性セロトニン作動性軸索を、病変間の脊髄分節において検出することができたが、腰髄では検出できなかった(図1C)。したがって、下行性軸索が終結し、一部の脊髄固有ニューロンが腰椎ニューロンとの接続を維持する病変(T7およびT10)の間および周辺に中継ゾーンが残る(本明細書において以下を参照のこと)。
【０１６０】
このジグザグ状病変を有するマウスは、ほぼ完全かつ永続的な後肢麻痺を示した(図1Eおよび1F)。損傷後10週間の間、損傷マウスは足首の動きをほとんど示さず、確立されたオープンフィールド運動試験であるバッソマウススケール(BMS)にて0.5または1のスコアで、いかなるタイプのステッピングも呈しなかった(Basso et al., 2006)。したがって、T7とT10の間のスペアの中継経路は休止状態のままである必要がある。
【０１６１】
この二重半切断SCIモデルを用いて、地面移動中の後肢運動性能をモニタリングすることにより、スペアの、しかし休止状態の、脊椎接続を再活性化できる小分子化合物を探索した。この目的のために、損傷1週間後に毎日の化合物処置を開始し、その後、前日の化合物処置の約24時間後にBMSスコアを毎週モニターした(図1D)。これらの時点で観察された行動の結果は、処置の持続的な効果を反映している可能性が高く、臨床的に関連性がある。
【０１６２】
候補化合物を、全身送達時にニューロンの興奮性を調節するその能力に基づいて選択した。それらには以下が含まれた: GABA受容体アゴニストであるバクロフェン; Na+/2Cl-/K+共輸送体(NKCC)の阻害剤であるブメタニド; SLC12A5とも呼ばれる、ニューロン特異的K+-Cl-共輸送体(KCC2)のアゴニストであるCLP290;GABAA陽性アロステリック調節因子であるL838,417; NMDA受容体(treceptor)アンタゴニストであるCP101606; 5HT1A/7アゴニストである8-OHDPAT; および5HT2A/Cアゴニストであるキパジン(図1E、7A)。これらの処置の1つは、毎日の処置後の最初の2〜3週間以内にステッピング能力の大幅な改善をもたらした。しかしながら、CLP290で処置したマウスでは、機能回復は最初に4〜5週間で現れ、処置後7週間から有意になった(図1E)。ブメタニドもいくつかの効果を示したが、統計的有意性はなかった(図7A)。したがって、さらなる分析では、CLP290で処置されたSCIマウスに焦点を合わせた。
【０１６３】
CLP290で処置したマウスの大部分(80%)は、麻痺した後肢を主に示した、対照マウスおよび他の化合物で処置したマウスとは対照的に、一貫した後肢足底の配置、および体重負荷のステッピング(ほとんどが背側ステッピングで、一部は足底ステッピングで; 図1F)を回復した。重度損傷モデルにおける機能回復の制限段階としてステッピング能力が関係しているため、この回復の程度は機能的に重要である(Schucht et al., 2002)。ステッピング中、CLP290で処置したマウスはその体重を部分的に支えることができ、大幅に増加した後肢関節の振動を示した(図1H〜1K)。対照の損傷マウスの筋電図(EMG)記録(図1K)により、足首屈筋前脛骨筋(ankle flexor tibialis anterior muscle) (TA)はめったに活動しなかったが、伸筋腓腹筋(GS)の活動は観察されないことが分かった。対照的に、CLP290で処置したマウスはTAとGSの両方の活動を示した(図1K)。その結果、CLP290で処置したマウスの後肢の総ストライド長は大幅に増加した(図1J)。興味深いことに、ステッピング歩行中にTA (遊脚期)およびGS (立脚期)の交互活動を有する無傷マウスとは異なり、CLP290で処置したSCIマウスは遊脚期中にTAおよびGSの同時活動、つまり準最適な体重支持の兆候を示した(図1K)。
【０１６４】
さらに、CLP290によって回復したマウスでは、BMSスコアは処置を停止した後1〜2週間、対照よりも有意に高いままであり(図1G)、持続的な機能回復がCLP290処置から生じたことを示唆している。これらの実験の終わりに、抗5-HT抗体による免疫染色は腰部で観察されず、これらのマウスにおけるジグザグ状病変の奏功を確認した(図7C)。総合して、これらの結果は、CLP290処置により、ほとんどの麻痺したマウスは持続的な方法で体重を支えるステッピング能力を回復することが可能とされることを実証している。
【０１６５】
完全病変を有するマウスの機能改善はCLP290処置によって誘導されない
CLP290の効果は、SCI後に脊髄内のスペアの休止中の下行性接続を再活性化することから生じる可能性がある。しかしながら、下行性入力とは関係なく、腰髄に直接作用することもありうる。これらの可能性を区別するために、同じCLP290処置を、軸索が病変部位を横切らない完全なT8脊髄切断を行ったマウスに適用し(図7D)、CLP290が有意な機能回復を促進できなかったことを見出した(図7E)。逆に、5-HT受容体アゴニストのキパジンは、ジグザグ状病変(図7B)とT8完全切断モデル(図7F)の両方で、急速ではあるが一過性のBMS改善(10分から始まり2時間未満続く)をもたらした。それゆえ、腰髄に直接作用するこの一過性のエフェクタとは異なり、機能改善に及ぼすCLP290の効果は、スペアの接続に依存する。
【０１６６】
CLP290は軸索再成長に影響を与えない
ジグザグ状病変または完全病変のいずれかを有するマウスは、同様のSCI関連行動障害(疼痛および痙縮)を呈するため、本明細書において提示される結果は、CLP290がジグザグ状病変を有するマウスにおいて機能回復を誘導することを示し、CLP290の機能改善はそのような鎮痛効果および抗痙攣効果とは無関係である可能性が高いことを示唆しているにすぎない。したがって、CLP290について可能な機構は、例えば軸索の発芽を促進することによって、および/または腰髄への中継経路シグナルの忠実度を高めることによって、スペアの中継経路に依存する可能性が高い。
【０１６７】
これらの可能性を試験するために、CLP290がスペアの脊髄固有軸索および/または脳からのそれらの接続軸索の再成長を増加させるかどうかを決定した。各条件で後肢運動制御中心へのニューロンの投射を分析するために、mCherry (HiRet-mCherry)を発現する逆行性追跡偽型レンチウイルスベクター(HiRet) (Kato et al., 2011; Wang et al., 2017; Liu et al., 2017)を腰膨大(L2〜L4)に注射した。損傷後2週間で、ほとんどの逆行性標識ニューロンは病変間および病変周辺の脊髄分節に見られ、病変の上にはほとんど見られず、脳には見られなかった(図82)。脊髄内の逆行性に追跡されたニューロンの数は、既報(Courtine et al., 2008)と一致して、損傷後10週間増加したが、CLP290処置はこれらの測定に影響を与えなかった(図8Cおよび8F)。同様に、AAV-ChR2-mCherryおよびAAV-ChR2-GFPを用いた脳からの順行性追跡では、損傷後2週間および10週間のCLP290処置マウスの脊髄における、下行性脳幹網様体脊髄軸索(図9A〜9C)または皮質脊髄軸索(図9G〜9I)の発芽の増加を明らかにすることができなかった。同様に、5-HT免疫組織化学によって検出されたセロトニン作動性軸索の発芽もCLP290処置の影響を受けなかった(図9D〜9F)。したがって、CLP290が、脳由来の下行性軸索の中継ゾーンへの再成長、または腰髄に突出する脊髄固有軸索の再成長を促進することによって作用する可能性は低い。
【０１６８】
KCC2発現は機能回復を促進するようにCLP290の効果を模倣する
CLP290は、K+-Cl-共輸送体KCC2の活性化因子として同定されたが、他の標的にも作用しうる(Gagnon et al., 2013)。したがって、CNSニューロンにおけるKCC2の過剰発現が、ジグザグ状病変マウスにおいてCLP290と同様の効果を有するかどうかを決定した。成体マウスにおいてBBBを通過できるAAV-PHP.Bベクター(Deverman et al., 2016)を用いて、ヒトシナプシンプロモーターの制御下でKCC2を発現するAAV-PHP.B (AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2)を尾静脈に注射した。KCC2が検出可能に発現するまでに1〜2週間かかったため、注射は損傷の直後に実施した。次に、毎週の行動モニタリングを実施した(図2A)。図2Bに示されるように、AAV-PHP.B-KCC2処置は、損傷後8週間で分析したところ、全ての脊髄分節でHAタグ付きKCC2の広範な発現をもたらした。対照のAAV-PHP.B-H2B-GFPとは対照的に、AAV-PHP.B-KCC2処置は、CLP290 (図1E〜1J)と同程度か、それ以上の程度まで、有意な機能回復をもたらした(図2C〜2H)。実際、AAV-KCC2処置後8週間で、これらのマウスの80%は、TAおよびGSを伴う足首関節の動きでステップすることができ、これらのマウスの約半分は、足首と膝の両方の動きで足底ステッピングを達成することができた(図2Dおよび2H)。さらに、AAV-KCC2で処置したマウスは、立脚期に頻繁にGSを発火させることで、体重を部分的に支えることができた(図2EおよびH)。
【０１６９】
この実験の終了時(損傷後9〜10週間)に、脊髄におけるKCC2の発現レベルをウエスタンブロッティングによって分析した。対照マウスにおいて、KCC2は、既報(Boulenguez et al., 2010; Cote et al., 2014)と一致して、損傷後の腰椎および病変間脊髄分節において有意に低減される(図10Aおよび10B)。しかしながら、AAV-KCC2処置により、KCC2の発現は、AAV-GFP対照と比べて無傷マウスに大幅に近いレベルにまで回復した(図10Aおよび10B)。したがって、AAV-KCC2は、SCIで誘導されるKCC2の下方制御を打ち消すことによって作用する可能性が高い。
【０１７０】
抑制性介在ニューロンにおける選択的KCC2発現は機能回復につながる
次に、特定のタイプのニューロンにおけるKCC2発現が、観察された機能回復を説明するかどうかを評価した。これを行うために、AAV-PHP.B-FLEX-KCC2 (Cre依存性KCC2発現)を、損傷直後にVglut2-Cre (興奮性ニューロンの場合(Tong et al., 2007))、Vgat-Cre (抑制性ニューロンの場合(Vong et al., 2011))またはChat-Cre (運動ニューロンおよび一部の介在ニューロンの場合(Rossi et al., 2011))の成体マウスの尾静脈に注射した(図3Aおよび3B)。Chat-CreおよびVglut2-Creマウスとは対照的に、AAV-PHP.B-FLEX-KCC2を注射したVgat-Creマウスは、CLP290処置(図1)、または非選択的KCC2発現(図2)と同様の程度まで、有意な機能回復(図3C〜3E)を示した。したがって、これらの結果は、抑制性介在ニューロンにおけるKCC2の機能不全または下方制御が、ジグザグ状病変マウスにおける後肢の機能回復を制限することを示唆している。
【０１７１】
KCC2はジグザグ状病変の間および周辺の脊髄分節における抑制性介在ニューロンを通じて作用して機能回復を誘導する
図7および8に示されるように、ジグザグ状病変の間および下の脊髄分節からなる中継ゾーンにおける脊髄固有ニューロンは、脳由来のシグナルを腰椎に中継する可能性が高い。したがって、ジグザグ状病変マウスにおけるKCC2を介した後肢の機能回復には2つの可能性のある機構が存在する: (1) KCC2が、腰椎分節(L2〜5)における抑制性介在ニューロンに作用して、脊髄固有入力の統合を促進すること; ならびに/または(2) KCC2が、腰髄の上の中継ゾーンにおける抑制性ニューロンに作用して、下行性経路からの脳由来の入力の統合、および/もしくは腰髄へのその中継を促進すること。
【０１７２】
これらの可能性を試験するために、AAV-KCC2またはAAV-FLEX-KCC2を野生型マウスまたはVgat-Creマウスの腰部分節(L2〜5)に局所的に注射した(図4A〜Bおよび10C)。これらの処置は有意な機能回復をもたらさず(図4C〜D)、腰髄における抑制性ニューロンがKCC2の機能回復効果を媒介する可能性が低いことを示唆している。
【０１７３】
ジグザグ状病変の間および周辺の脊髄分節にKCC2を導入するために、損傷後の急性期に損なわれた病変部位周辺の血液脊髄障壁を用いた。AAV-KCC2またはAAV-FLEX-KCC2を、過ジグザグ状病変の3時間後に、それぞれ、野生型またはVgat-Creマウスの尾静脈に注射した(図4E)。その結果、KCC2発現はT5とT12の間に広がった(図4Fおよび10D)。これらの動物では、AAV-PHP.B-KCC2処置(図2)に匹敵する程度まで、BMS性能の向上を伴う有意かつ持続的な機能回復が両群のマウスにおいて観察された(図4Gおよび4H)。AAV-FLEX-KCC2を有するこれらのVgat-Creマウスでは、CLP290処置の付随により、ほとんどの時点で機能回復が有意に増強されず(図10E)、CLP290の効果がこれらの抑制性介在ニューロンでKCC2を活性化することによって主に媒介されるという考えと一致している。したがって、KCC2/CLP290は主に、胸髄レベルでの病変部位間のおよび病変部位に隣接の、中継ゾーンにおける抑制性ニューロンを通じて作用し、後肢の機能回復を促進する。
【０１７４】
CLP290/KCC2は興奮性および中継形成を変化させる
成熟したニューロンにおいて、GABAおよびグリシンは、塩化物チャネルを開き、塩化物イオンの流入を可能にして過分極を引き起こすため、抑制性である。対照的に、発生中、細胞内塩化物レベルの上昇は、GABAAおよびグリシンを介した電流を脱分極させ、一般的に興奮性にさせる。出生後早期に、出生後のニューロンにおけるKCC2の上方制御は、細胞内の塩化物濃度を低減させ、興奮を抑制に変えるために重要である(Ben-Ari et al., 2012; Kaila et al., 2014)。したがって、損傷により誘導されるKCC2の下方制御(Boulenguez et al., 2010; Cote et al., 2014)は、GABAおよびグリシン受容体がニューロンを脱分極しうる未熟な状態を回復するものと予想される。このシナリオでは、脊髄抑制性ニューロンにおけるKCC2活性化は、中継ゾーンにおける局所回路をより生理学的な状態に変え、下行性入力を受け入れやすい。これを調べるために、c-Fos免疫反応性を損傷8週間後、および1時間のトレッドミル上の歩行後、T7とT10の間の脊髄分節におけるニューロン活動の代理として用いた。各群において、これらの脊髄分節におけるc-Fos陽性細胞の大部分も、ニューロンマーカーであるNeuNで陽性に染色された(図11A、11B)。c-Fos/NeuN二重陽性細胞の代表的な複合材料を図5Aに示す。処置なしの損傷マウスでは、c-Fos陽性ニューロンは脊髄の後角に集中しており(図5A〜5C)、おそらくこれらの損傷マウスでの末梢感覚入力に対する過敏症を反映している。CLP290またはAAV-KCC2処置では、c-Fos陽性ニューロンの分布が大きく異なっており、後角(ラミナI〜V)が低減し、中間/腹側脊髄が大幅に増加した(図5A〜5C)。このKCC2で変換された分布パターンは、歩行に応答して、無傷マウスで検出されたものと類似している(図5A〜5C)。CLP290処置の中止から2週間後、c-Fosパターンは処置なしで見られたものに戻り(図11Cおよび11D)、行動の結果と一致した(図1G)。まとめると、これらの所見は、KCC2活性を増加させることで、より生理学的なニューロン活動パターンが局所脊髄回路に回復されることを示唆している。
【０１７５】
対照として、神経因性疼痛を低減することが示されているGABAアゴニストのL838,417による長期処置後、ジグザグ状損傷マウスの脊髄においてc-Fos免疫反応性を調べた(Knabl et al., 2008)。図5A〜5Bに示されるように、L838,417は後角におけるc-Fos陽性ニューロンを低減させたが、中間ゾーンおよび腹方部におけるニューロンを増加させることはなく、L838,417処置が機能的運動回復を促進することができなかったという結果を裏付けている(図7A)。中間脊椎および腹側脊髄は下行性入力の主要な終結ゾーンであるため、L838,417処置ではなく、CLP290/KCC2処置後のこの領域でのニューロン活動の増加は、下行性入力に対する応答の改善を反映している可能性が高い。したがって、これらの結果は、長期的KCC2/CLP290処置が、SCIで誘導された、感覚集中型の(sensory-centralized)中継ゾーン活性化パターンを、感覚経路と下行性経路の両方の制御下にある状態に変換することを示唆している。
【０１７６】
処置した脊髄が下行性入力を腰髄に効率的に中継できるかどうかを直接試験するために、皮質刺激を実施し、TA筋のEMG応答を記録した(図5D)。皮質刺激反応の潜時は、無傷マウスと比べてSCIマウスにおいて有意に遅延し、KCC2関連の処置は刺激応答の潜時を短縮することができなかった(図5Dおよび5E)。これらの結果は、損傷マウスの腰椎における運動ニューロンに皮質刺激を中継するKCC2活性化回路に複数のシナプス接続が存在するという考えと一致している。一方、誘発されたEMGシグナルの振幅は、対照と比べて、AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2またはCLP290処置を受けた損傷マウスにおいて有意に増加し(図5Dおよび5F)、KCC2がこの脊髄回路の中継効率を増強したことを示唆している。したがって、KCC2処置は、脳から腰髄への下行性入力の伝達を促進する。
【０１７７】
DREADD支援による抑制性ニューロン興奮性の調節はKCC2/CLP290の効果を模倣する
抑制性介在ニューロンの興奮性を低減させることでKCC2およびCPL290の効果を模倣することができるかどうかを試験するために、損傷の3時間後にVgat-Creマウスの尾静脈にAAV9ベクター(AAV9-FLEX-hM4Di-mCherryまたはAAV9-GFP)を注射することにより病変間および病変周辺の抑制性介在ニューロンにおいて、抑制性Gi共役受容体Gi-DREADD (Krashes et al., 2011)であるhM4Di-mCherryを発現させた(図6A)。Gi-DREADDを選択的に活性化するクロザピンN-オキシド(CNO) (Roth, 2017)を毎日投与し、毎週行動をモニターした。CNO投与の24時間後に(CLP290の場合と同じ処置スケジュールを用いて)試験した場合、GFPではなく、hM4Diで損傷したマウスは、CLP290またはKCC2処置で観察されたのと同程度の持続的な機能回復を示すことが分かった(図6C)。さらに、hM4DiおよびCNOで処置したマウスは、連続歩行後のKCC2関連処置で観察されたものと同様のc-Fos発現パターンを示した(図6D〜Fおよび図5A)。したがって、これらの結果は、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減させることの有益な効果を検証するものであった。
【０１７８】
hM4Diを介したSCIマウスの病変間分節(inter-lesion segment)内の全体的な脱抑制、およびKCC2関連の処置が興奮性ニューロンの活動を増加させうることを考慮して、興奮性介在ニューロンの直接活性化が抑制性介在ニューロンの抑制効果を模倣しうるかどうかを問うた。AAV9-GFPまたはAAV9-FLEX-hM3Dq-mCherryを、ジグザグ状病変の直後にVglut2-Creマウスの尾静脈に注射した(図12A)。図12Bに示すように、興奮性脊髄ニューロンでのこの脱分極hM3Dq (Vglut2-Cre中のAAV9-FLEX-hM3Dq-mCherry)の発現は、毎日のCNO送達と組み合わせて、毎日のCNO処置8週間以内に機能回復を誘発する(illicit)ことができなかった。興味深いことに、CNO投与直後に、一過性の機能改善が認められたが、後肢痙縮があり(図12C、データは示されていない)、これはキパジン処置後に見られたものと同様である(図7B)。したがって、脊髄における抑制性介在ニューロンの興奮性を直接低減させるが、興奮性介在ニューロンの興奮性を直接増加させないことは、下行性入力に対する応答性を増強させ、重度SCI後の持続的な機能回復を最終的に促進する強力な戦略である。
【０１７９】
考察
腰仙髄への全ての脊柱上の下行性接続を取り除く両側性半切断モデルを用いて、薬理学的またはAAV支援遺伝子送達のいずれかによる長期KCC2活性化が、休止状態のスペア回路を再活性化し、持続的な後肢ステッピングをもたらすことが実証された。病変間および腰髄上の脊髄分節における抑制性介在ニューロンが、この効果を主に媒介する。損傷によって誘導されたKCC2の下方制御を打ち消すことにより、これらの処置は中継ゾーンにおけるニューロンの興奮性を調節し、損傷によって機能しなくされていた脊髄回路を蘇生させることが提唱されている。その結果、これらの局所回路は、より良好に下行性突起から腰髄へコマンドを中継することができ、行動回復の改善をもたらす。
【０１８０】
機構の相違および他の処置との関連性。以前の研究では、完全な胸部SCIでさえ、セロトニン作動性およびドーパミン作動性アゴニストならびにGABA/グリシン受容体のアンタゴニストのような、薬理学的アプローチにより、即時性ではあるが一過性の、後肢運動を誘導できることが示された(Courtine et al., 2009; de Leon et al., 1999; Edgerton et al., 2008; Robinson and Goldberger, 1986; Rossignol and Barbeau, 1993)。これらの「脊髄動物」では腰髄が脳から完全に切り離されているため、このような薬理学的処置は、脊髄回路の興奮性を変化させ、感覚入力のみに応答できるようにすることで作用する可能性が高い。一貫して、セロトニン作動性アゴニストは急性であるが、しかし一過性の運動のみを誘発し(化合物投与後最大2〜3時間)、完全病変モデルとジグザグ状病変モデルの両方で持続的な改善のないことが分かった。対照的に、CLP290は、完全病変ではないが、ジグザグ状病変を有するマウスにおいて持続的な機能回復を誘導した。このように、セロトニン作動性調節因子は腰髄における局所的な感覚駆動回路に作用する可能性が高いが、CLP290はSCI後に脳から休止中のスペアの接続を動員する。
【０１８１】
さらに、硬膜外刺激とリハビリテーションの併用処置は、(セロトニン作動性およびドーパミン作動性アゴニストの薬理学的カクテルとともに)ジグザグ状病変を有するラットで(van den Brand et al., 2012)、ならびに一部の慢性SCI患者でさえ(Angeli et al., 2014; Harkema et al., 2011)、ある程度の自発的運動を誘導することも示されている。これらのラットでは広範な軸索の発芽が観察されているが(van den Brand et al., 2012)、軸索の発芽が機能の改善に因果関係を有するかどうかは不明である。最近の研究では、腰部の背側面に適用される電気的神経調節が、固有受容性フィードバック回路に主に関与することが示唆されている(Capogrosso et al., 2013; Hofstoetter et al., 2015; Wenger et al., 2014)。しかしながら、これがどのようにして下行性入力依存の自発的運動の機能回復につながるのかは不明のままである。腰髄の上の中継ゾーンでの抑制性介在ニューロンの興奮性を低減させることで、この脊髄回路が脳由来のコマンドを腰髄に中継することを可能とするのに十分なことを示すこれらの結果に照らして、硬膜外刺激、および/または併用処置も、そのような抑制性介在ニューロンを関与させて、それらの機能的効果を媒介するかどうかを試験することは興味深いであろう。
【０１８２】
KCC2および脊髄運動回路の均衡化。損傷は、局所的KCC2下方制御のような、脊髄の一連の変化を引き起こす。本明細書において提示される結果は、抑制性介在ニューロンにおけるKCC2の再活性化が、SCI後の脊髄回路網全体の興奮/抑制比(E/I比)を再確立しうることを示唆している。これは、抑制性入力が神経回路網内の特定の発火パターンを形作るためだけでなく、回路網活動が機能不全になるのを防ぐためにも重要であるという考えと一致している(Mohler et al., 2004)。重要なことには、全ての抑制増強操作が効果的であるとは限らない。KCC2またはGi-DREADDとは対照的に、GABA受容体アゴニストは、脊髄全体の全体的な活性化パターンを低減させるように見えるが、より生理学的な活性化パターンを再確立することができず、または機能改善を促進することができない。これは、L838,417処置により、重要な腹側運動関連ラミナを含む、全ての脊髄領域におけるニューロン活性化レベルが低減し、全体的な運動制御の質を低下させると予想されるため、その直接的かつ非選択的な抑制が原因である可能性がある。最後に、脊髄興奮性介在ニューロンの直接興奮は、SCI後の持続的な機能回復を誘導することができなかった。したがって、興奮性または抑制性神経伝達を広く標的化する代わりに、抑制性介在ニューロンの興奮性を微調整することは、運動機能の回復を成功させるために、脊椎回路網を、下行性入力と感覚入力の両方を受け入れるようにさせるためのより効果的な戦略であると考えられる。
【０１８３】
翻訳的視点。高速大量処理スクリーニングから同定された選択的KCC2活性化因子に基づいて、CLP290は全身投与用に最適化され(Gagnon et al., 2013)、動物モデルにおいて神経障害性疼痛を効果的に処置することが示されている(Ferrini et al., 2017; Gagnon et al., 2013)。本研究において試験された他の化合物とは異なり、CLP290は高用量でさえ無視できるほどの副作用を示した(データは示されていない)。SCI患者の大多数はいくつかのスペアの軸索を有するので、これらの結果は、このBBB透過性小分子CLP290がこれらの場合に有望な処置である可能性があることを示唆している。これにもかかわらず、後肢機能の全ての面がこれらの実験で回復したわけではなかった。したがって、将来の研究では、SCI後の後肢回復に及ぼす、追加のリハビリトレーニングのような、他の処置とCLP290を組み合わせた治療効果を調査する必要がある。
【０１８４】
材料および方法
（表１）本明細書において記載される実験において用いられた重要な試薬
2021525707.tif 000012
2021525707.tif 000013
2021525707.tif 000014
【０１８５】
マウス系統。全ての実験手法は、ボストン小児病院の施設内動物管理使用委員会によって承認された動物プロトコールに準拠して実施された。本研究において用いられたマウスには、以下が含まれた: C57BL/6野生型(WT)マウス(Charles River, 系統コード番号027); ならびにC57BL/6の遺伝的背景に維持されているVgat-Cre (Jax#28862)、VGlut2-Cre (Jax#28863)およびChAT-Cre (Jax#28861)マウス系統。行動測定の場合、用いられた全ての実験動物は異なる同腹仔からのものであった。19〜21 gの成体雌性マウスが、損傷の前に異なる処置群に無作為化および割り当てられ、動物研究には他の特定の無作為化は用いられなかった。行動試験は盲目的に調べられた。
【０１８６】
化学物質および抗体。全身投与(i.p.)の場合:キパジン[Sigma (Q1004), 0.2 mg/kg)]および8-OH-DPAT [Tocris (0529), 0.1 mg/kg)]を0.9% NaClに懸濁し; バクロフェン[Tocris (0417), 1 mg/kg)]を100 mM NaOHその後0.9% NaClに懸濁し; CP101606 [Sigma (SML0053), 10 mg/kg)]をDMSOその後0.9% NaClに懸濁し; CLP290 [PharmaBlockにより合成された, 25 mg/kg]をDMSOその後20% 2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンに懸濁し; L838,417 [PharmaBlockにより合成された, 1 mg/kg]を0.5%メチルセルロースおよび0.9% NaClに懸濁し; ならびにブメタニド[Tocris, (3108), 0.3 mg/kg)]を15% DMSOに懸濁した。免疫染色およびウエスタンブロッティングの場合、用いた一次抗体は以下であった: ニワトリ抗GFP [Abcam (カタログ番号ab13970)]、ウサギ抗RFP [Abcam (カタログ番号ab34771)]、ウサギ抗GFAP [DAKO (Z0334)]、ウサギ抗5-HT [Immunostar (20080)]、ラット抗HA [Sigma (11867423001)]、ウサギ抗c-Fos [Cell signaling (2250s)]、マウス抗NeuN [Millipore (MAB377)]; およびウサギ抗KCC2 [Milipore (07-432)]。
【０１８７】
外科手術法。T7およびT10両側性半切断の手技は、他所(Courtine et al., 2008; van den Brand et al., 2012)に記載されている手技と同様であった。手短に言えば、胸椎に正中切開を行い、続いてT7-10椎弓切除術を行った。T7右半側切断の場合、メスとマイクロ剪刀を慎重に用いて、T7で両側後柱を遮断し、対側部位の腹側経路が温存されないようにした(図1A)。T10左側半切除の場合、メスとマイクロ剪刀を慎重に用いて、正中線まで脊髄の左側のみを遮断した。次に、筋層を縫合し、皮膚を創傷クリップで固定した。全ての動物は事後組織学的分析を受け、腰髄(L2〜5)に5HT軸索が温存されているものは、行動分析から除外された(図7)。
【０１８８】
T8完全離断の手技は、他所(Courtine et al., 2009)に記載されている手技と同様であった。手短に言えば、胸椎に正中切開を行い、続いてT8椎弓切除術を行った。次に、メスとマイクロ剪刀の両方を用いて、完全T8離断を慎重に実施した。次に、筋層を縫合し、皮膚を創傷クリップで固定した。
【０１８９】
EMG記録および皮質刺激。自由行動している動物でのEMG記録の手技は、既述(Pearson et al., 2005)の手技と同様であった。手短に言えば、手術後9週の時点で、各群のマウス5匹(対照、CLP290およびAAV-KCC2処理マウス)に、選択した後肢筋肉へのカスタマイズされた双極電極の移植を行ってEMG活動を記録した。電極(793200, A-M Systems)に30ゲージの注射針をつなぎ、右後肢の内側腓腹筋(GS)および前脛骨筋(TA)の中腹に挿入した。共通のアース線を頸肩域に皮下挿入した。マウスの頭蓋骨にしっかり固定された小さな経皮的コネクタへ背中から皮下に配線した。EMGシグナルは、10〜1000 Hzろ過を備えた差動AC増幅器(1700, A-M Systems, WA)を用いて取得し、デジタイザ(PowerLab 16/35, ADInstruments)を用いて4 kHzでサンプリングし、LabChart 8 (ADInstruments)により分析した。
【０１９０】
硬膜外刺激およびEMG記録の場合、カスタマイズされたヘッドプレートを頭蓋骨の上に固定し、単極刺激電極(SSM33A05, World Precision Instruments, Inc.)を左運動皮質の代表的な後肢領域上に硬膜外配置した。一連の電気刺激(0.2 ms二相パルス、100 msパルス列、20 Hz, 0.5〜1.5 mA)をパルス発生器および断路器(Master 9およびIso-Flex, A.M.P.I.)によって生成し、完全に覚醒した状態で四足立位の間に送った。試験は、電気化学的刺激の有無にかかわらず実施した。誘発応答のピーク間の振幅および潜時を、右TA筋のEMG記録から計算した。
【０１９１】
ウイルス産生および注射。KCC2過剰発現ウイルスの注射法の場合、AAV2/PHP.B-Syn-HA-KCC2およびAAV2/9-Syn-HA-KCC2をWTマウスの尾静脈に注射した。Vgat-Cre、Vglut2-CreおよびChAT-Creマウス尾静脈に、AAV2/PHP.B-Syn-FLEX-HA-KCC2を注射した。WT、Vgat-CreまたはVglut2-creマウス尾静脈に、AAV2/9-Syn-HA-KCC2およびAAV2/9-Syn-FLEX-HA-KCC2、AAV2/9-Syn-FLEX-hM4Di-mCherryおよびAV2/9-Syn-FLEX-hM3Dq-mCherryを注射した。既述(Deverman et al., 2016)のように、SCIの3時間後に、尾静脈ウイルス注射を実施した(AAV力価は注射用に4〜5×1013コピー/mlに調整され、ボストン小児病院のウイルスコア(The Viral Core, Boston Children’s Hospital)によって作出された)。AAV2/1-Syn-HA-KCC2およびAAV2/1-Syn-FLEX-HA-KCC2をそれぞれ、WTおよびVgat-Creマウスの腰椎レベル(L2〜4)に脊髄内注射した。腰椎レベルの脊髄内注射によって引き起こされる可能性のある行動上の欠陥を排除するために、SCI手技の1日前に腰椎レベルの脊髄内ウイルス注射を実施した(AAV力価は注射用に0.5〜1×1013コピー/mlに調整され、ボストン小児病院のウイルスコアによって作出された)。
【０１９２】
網様体脊髄路の追跡実験(手法は既述(Esposito et al., 2014)されている)の場合、AAV2/8-ChR2-YFPおよびAAV2/8-ChR2-mCherryを、それぞれ脳幹のマウス右および左網様体に注射した。CST追跡実験(手法は既述(Liu et al., 2010; Liu et al., 2017)されている)の場合、AAV2/8-ChR2-mCherryをマウスの右感覚運動皮質に注射した(全てのAAV力価は注射用に0.5〜5×1013コピー/mlに調整され、ボストン小児病院のウイルスコアによって作出された)。腰椎レベルの逆行性追跡の場合、HiRet-mCherryベクター(レンチウイルス力価を注射用に1.6〜2×1012コピー/mlに調整した)をHiRet-レンチ骨格に基づいて構築した(Kinoshita et al., 2012)。注入手法は既述(Wang et al., 2017)されており、そこではHiRet-mCherryが左または右腰髄2〜4節に注射されている。
【０１９３】
免疫組織化学および画像化。パラホルムアルデヒド(PFA)固定組織を、30%スクロースで凍結保護し、クリオスタットを用いて処理した(脊髄の切片厚40 μm)。染色前に、切片を、0.5 % Triton-100を有する10%正常ロバ血清を含有するブロッキング溶液により室温で2時間処理した。用いた一次抗体(4□、終夜)は以下であった: ウサギ抗GFAP [DAKO (Z0334), 1:600]; ウサギ抗5-HT [Immunostar (20080), 1: 5,000]; ニワトリ抗GFP [Abcam (ab13970), 1:400]; ウサギ抗RFP [Abcam (ab34771), 1:400]; ウサギ抗PKCγ [Santa Cruz (sc211),1:100]; ラット抗HA [Sigma (11867423001), 1:200]; ウサギ抗c-Fos [Cell signaling (2250s), 1:100]; およびマウス抗NeuN [Millipore (MAB377), 1:400]。二次抗体(室温、2時間)には以下が含まれた: Alexa Fluor 488結合ロバ抗ニワトリおよびウサギ; ならびにAlexa Fluor 594結合ロバ抗ウサギ(全てInvitrogenから)。脊髄ニューロンのc-Fos免疫反応性は、1時間の連続四足自由歩行(無傷)、ステッピング(CLP290もしくはAAV-KCC2処理マウス)またはドラッギング(ビヒクルもしくはAAV-GFP処理マウス)後に、既述(Courtine et al., 2009)のように決定された。マウスをケージに戻し、次いで麻酔をかけ、約2時間後にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中4%のPFA (重量/体積)の心臓内灌流によって殺処理した。
【０１９４】
脊髄の横断切片および水平切片を共焦点レーザー走査顕微鏡(Zeiss 700またはZeiss 710)で画像化した。異なる横断脊髄分節面での、網様体脊髄路投射(RFP+およびGFP+)、および皮質脊髄路(CST)投射(GFP+)の蛍光強度の定量化および比較(図10Aおよび10C); ならびに5HT軸索染色(図10B)。複数の条件下での分析に用いた、全ての画像は、飽和を避けるために同じ光学パラメータを用いて撮影された。バックグラウンドに対して閾値下処理(sub-thresholded)し、面積で正規化した後に、FIJIソフトウェアを用いることによりデンシトメトリー測定を行った。
【０１９５】
さまざまな処置における脊髄ニューロンの逆行性HiRet標識細胞体を定量化および比較するために、全ての画像を個々のチャネルおよび平面に分解した。カスタム開発されたMATLABコードを用いて、それらを整列および定量化した。HiRet標識ニューロンには手動で座標を割り当てた。
【０１９６】
ウエスタンブロッティング。イソフルラン麻酔後、断頭により動物を殺処理した。脊髄をT5からL1まで素早くバラバラにし、350 μmのスライスに分けた。20 mmol/Lトリス(pH 7.4)、125 mmol/L NaCl、10%グリセロール、1% Triton X-100、0.5% DCA、0.1% SDS、20 mmol/L NaF、1 mmol/Lフェニルメチルスルホニルフルオリド、4 μg/mLアプロチニン、4 μg/mLロイペプチン、および1 mmol/L Na3VO4を含有する冷溶解緩衝液中で試料をホモジナイズした。次に試料を13,000 gで10分間4℃にて遠心分離した。上清中のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸タンパク質アッセイキット(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて評価した。等量のタンパク質抽出物を4〜20% SDS-PAGEによって分離し、ポリフッ化ビニリデン膜(Millipore, Bedford, MA)に電気転写した。トリス緩衝生理食塩水に加えて3% BSA中でのブロック後、膜をブロッキング溶液中で、500分の1に希釈したポリクローナルウサギKCC2特異的抗体(Millipore)、または2000分の1に希釈したポリクローナルウサギβ-アクチン抗体(cell signaling)に4℃で終夜曝露した。化学発光検出には、ImmunoPureヤギ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ特異的抗体を用いた(ブロッキング溶液中で500分の1、22℃で1時間) (Pierce Biotech)。
【０１９７】
行動実験。運動機能を、バッソマウススケール(Basso Mouse Scale; BMS)の自発運動オープンフィールド評価尺度で評価した。一過性の薬理学的処置の場合、行動試験(接地歩行、この全てを個別に実施)の10〜15分前 (van den Brand et al., 2012)に、マウスに上記の神経調節因子の系統的投与(i.p.)を行った。1回の腹腔内注射で、血漿CNOレベルは15分でピークに達し、注射後2時間までに非常に低くなることに留意することが重要である(Guettier et al., 2009)。長期の薬理学的処置の場合、行動試験の24時間前に、マウスに上記の化合物の系統的投与を行った。全ての行動試験を1〜3時間以内に完了した。詳細な後肢の運動学的分析の場合、異なる群のマウスをMotoRater (TSE Systems, (Zorner et al., 2010))に配置し、全ての運動学的分析をMotoRaterによって収集されたデータに基づき実施した。
【０１９８】
定量化および統計分析。正規性および分散の類似性は、パラメトリック試験を適用する前に、STATA (バージョン12, College station, TX, USA)によって測定した。2つの群間の単一の比較には、両側スチューデントのt検定を用いた。残りのデータは、適切な設計に応じて、一元または二元ANOVAを用いて分析した。事後比較は、主要な測定値が統計的有意性を示した場合にのみ実行した。多重比較のP値は、ボンフェローニの補正を用いて調整した。全ての図のエラーバーは平均±S.E.Mを表す。異なる同腹仔、体重および性別を有するマウスを、無作為化して異なる処置群に割り当て、動物実験には他の特定の無作為化を用いなかった。
【０１９９】
参照文献
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年1月27日(2021.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021525707000001.app
【国際調査報告】
2021525707.tif 000067
2021525707.tif 000068
2021525707.tif 000069
2021525707.tif 000070