(57)【要約】本開示は、態様の中でもとりわけ、哺乳動物細胞における発現のための第ＶＩＩＩ因子変異体をコードするコドン改変型ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、血友病Ａを治療するための哺乳動物遺伝子療法ベクター及び方法も提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えばコドン改変型ポリヌクレオチドを血友病Ａ患者に投薬する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血友病Ａと診断されたヒト対象に、前記ヒト対象の体重１キログラムあたり２×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を静脈内輸注することを含む、血友病Ａを治療する方法であって、前記ＡＡＶ粒子が、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を含むポリヌクレオチドを含む、前記方法。
【請求項２】
血友病Ａと診断されたヒト対象に、前記ヒト対象の体重１キログラムあたり６×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を静脈内輸注することを含む、血友病Ａを治療する方法であって、前記ＡＡＶ粒子が、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を含むポリヌクレオチドを含む、前記方法。
【請求項３】
血友病Ａと診断された前記ヒト対象に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンのクールを施すことをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
プレドニゾロンまたはプレドニゾンの前記クールが前記ＡＡＶ粒子の輸注の後に施される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
プレドニゾロンまたはプレドニゾンの前記クールを施すことが、
前記ＡＡＶ粒子の輸注の直後の第１週の間、１日あたり６０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること、
前記ＡＡＶ粒子の輸注の直後の第２週の間、１日あたり４０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること、及び
前記ＡＡＶ粒子の輸注の直後の第３週の間、１日あたり３０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること
を含む、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＡＡＶ粒子の輸注の直後の第３週の後に、漸減用量のプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記漸減用量のプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与することが、
プレドニゾロンまたはプレドニゾンの初回クールの完了直後の連続する５日間にわたって、１日あたり２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること、
２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与した前記５日間の直後の連続する３日間にわたって、１日あたり１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること、
１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与した前記３日間の直後の連続する３日間にわたって、１日あたり１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること、及び
１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与した前記３日間の直後の連続する３日間にわたって、１日あたり５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記漸減用量のプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与することが、
プレドニゾロンまたはプレドニゾンの前記初回クールの完了直後の連続する７日間にわたって、１日あたり３０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること、
３０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与した前記７日間の直後の連続する７日間にわたって、１日あたり２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること、
２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与した前記７日間の直後の連続する５日間にわたって、１日あたり１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること、
１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与した前記５日間の直後の連続する５日間にわたって、１日あたり１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること、及び
１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与した前記５日間の直後の連続する５日間にわたって、１日あたり５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を血友病Ａと診断されたヒト対象に投与した後、かつ前記ヒト対象がグルココルチコイドステロイド治療の初回クールを受けている間に、前記ヒト対象から採集した血液試料において、第ＶＩＩＩ因子活性の第１レベルを決定すること、
グルココルチコイドステロイド治療の前記初回クールが完了した後に前記ヒト対象から採集した血液試料において、第ＶＩＩＩ因子活性の第２レベルを決定すること、
第ＶＩＩＩ因子活性の前記第２レベルを第ＶＩＩＩ因子活性の前記第１レベルと比較すること、及び
漸減用量の前記グルココルチコイドステロイドを投与することであって、
第ＶＩＩＩ因子活性の前記第２レベルが第ＶＩＩＩ因子活性の前記第１レベル以上である場合、３週間以内の期間にわたって第１漸減用量の前記グルココルチコイドステロイドが投与され、
第ＶＩＩＩ因子活性の前記第２レベルが第ＶＩＩＩ因子活性の前記第１レベル未満である場合、３週間を超える期間にわたって第２漸減用量の前記グルココルチコイドステロイドが投与される、
前記投与すること
を含む方法。
【請求項１０】
第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を血友病Ａと診断されたヒト対象に投与する前に前記ヒト対象から採集した血液試料において、肝臓酵素活性の第１レベルを決定すること、
第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ粒子を前記ヒトに投与した後、かつグルココルチコイドステロイド治療の初回クールが完了した後に、前記ヒト対象から採集した血液試料において、肝臓酵素活性の第２レベルを決定すること、
肝臓酵素活性の前記第２レベルを肝臓酵素活性の前記第１レベルと比較すること、及び
漸減用量の前記グルココルチコイドステロイドを投与することであって、
肝臓酵素活性の前記第２レベルが肝臓酵素活性の前記第１レベル以下である場合、３週間以内の期間にわたって第１漸減用量の前記グルココルチコイドステロイドが投与され、
肝臓酵素活性の前記第２レベルが第ＶＩＩＩ因子活性の前記第１レベルよりも高い場合、３週間を超える期間にわたって第２漸減用量の前記グルココルチコイドステロイドが投与される、
前記投与すること
を含む方法。
【請求項１１】
前記第１漸減用量の前記グルココルチコイドステロイドを投与することが、
グルココルチコイドステロイド治療の前記初回クールの完了直後の連続する５日間にわたって、１日あたり２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること、
２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与した前記５日間の直後の連続する３日間にわたって、１日あたり１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること、
１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与した前記３日間の直後の連続する３日間にわたって、１日あたり１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること、及び
１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与した前記３日間の直後の連続する３日間にわたって、１日あたり５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること
を含む、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２漸減用量の前記グルココルチコイドステロイドを投与することが、
グルココルチコイドステロイド治療の前記初回クールの完了直後の連続する７日間にわたって、１日あたり３０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること、
３０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与した前記７日間の直後の連続する７日間にわたって、１日あたり２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること、
２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与した前記７日間の直後の連続する５日間にわたって、１日あたり１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること、
１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与した前記５日間の直後の連続する５日間にわたって、１日あたり１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること、及び
１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与した前記５日間の直後の連続する５日間にわたって、１日あたり５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを前記ヒト対象に投与すること
を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を使用する血友病Ａの第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法の有効性をモニタリングする方法であって、
前記ＡＡＶ粒子を前記ヒト対象に投与した後に前記ヒト対象から採集した血液試料の中に、第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体が存在するか否かを判定すること、及び
前記ヒト対象の血液における第ＶＩＩＩ因子インヒビターの存在を検出した時点で、血友病Ａの治療のための代替薬剤を前記ヒト対象に投与すること
を含む、前記方法。
【請求項１４】
前記代替薬剤が、化学修飾されたヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記代替薬剤がブタ第ＶＩＩＩ因子タンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記代替薬剤が、第ＩＩ因子、第ＩＸ因子及び第Ｘ因子を含む第ＶＩＩＩ因子バイパス療法剤である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラムあたり２×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することであって、第１の時間点において、前記ＡＡＶ粒子が、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を含むポリヌクレオチドを含む、前記投与すること、及び
ｂ）後の時間点において、前記患者の血流における配列番号１またはその断片のレベルを測定することであって、前記後の時間点が７日以降である、前記測定すること
を含む方法。
【請求項１８】
ａ）血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラムあたり６×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することであって、第１の時間点において、前記ＡＡＶ粒子が、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を含むポリヌクレオチドを含む、前記投与すること、及び
ｂ）後の時間点において、前記患者の血流における配列番号１またはその断片のレベルを測定することであって、前記後の時間点が７日以降である、前記測定すること
を含む方法。
【請求項１９】
ａ）血友病Ａ患者にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することであって、第１の時間点において、前記ＡＡＶ粒子が、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、前記投与すること、及び
ｂ）後の時間点において、前記患者の血流における前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその断片のレベルを測定することであって、前記後の時間点が７日以降である、前記測定すること
を含む方法。
【請求項２０】
前記後の時間点が７日である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記後の時間点が１４日である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記後の時間点が２１日である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ａ）血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラムあたり２×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することであって、第１の時間点において、前記ＡＡＶ粒子が、カプシドタンパク質と、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を含むポリヌクレオチドとを含む、前記投与すること、及び
ｂ）後の時間点において、前記患者の血流における前記カプシドタンパク質のレベルを測定することであって、前記後の時間点が７日以降である、前記測定すること
を含む方法。
【請求項２４】
ａ）血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラムあたり６×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することであって、第１の時間点において、前記ＡＡＶ粒子が、カプシドタンパク質と、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を含むポリヌクレオチドとを含む、前記投与すること、及び
ｂ）後の時間点において、前記患者の血流における前記カプシドタンパク質のレベルを測定することであって、前記後の時間点が７日以降である、前記測定すること
を含む方法。
【請求項２５】
ａ）血友病Ａ患者にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することであって、第１の時間点において、前記ＡＡＶ粒子が、カプシドタンパク質と、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、前記投与すること、及び
ｂ）後の時間点において、前記患者の血流における前記カプシドタンパク質のレベルを測定することであって、前記後の時間点が７日以降である、前記測定すること
を含む方法。
【請求項２６】
前記後の時間点が７日である、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記後の時間点が１４日である、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記後の時間点が２１日である、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ａ）血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラムあたり２×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することであって、第１の時間点において、前記ＡＡＶ粒子が、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を含むポリヌクレオチドを含む、前記投与すること、及び
ｂ）後の時間点において、前記患者の血流における抗第ＶＩＩＩ因子抗体のレベルを測定することであって、前記後の時間点が７日以降である、前記測定すること
を含む方法。
【請求項３０】
ａ）血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラムあたり６×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することであって、第１の時間点において、前記ＡＡＶ粒子が、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を含むポリヌクレオチドを含む、前記投与すること、及び
ｂ）後の時間点において、前記患者の血流における抗第ＶＩＩＩ因子抗体のレベルを測定することであって、前記後の時間点が７日以降である、前記測定すること
を含む方法。
【請求項３１】
ａ）血友病Ａ患者にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することであって、第１の時間点において、前記ＡＡＶ粒子が、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、前記投与すること、及び
ｂ）後の時間点において、前記患者の血流における抗第ＶＩＩＩ因子抗体のレベルを測定することであって、前記後の時間点が７日以降である、前記測定すること
を含む方法。
【請求項３２】
前記後の時間点が７日である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記後の時間点が１４日である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記後の時間点が２１日である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
ａ）血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラムあたり２×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することであって、第１の時間点において、前記ＡＡＶ粒子が、カプシドタンパク質と、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を含むポリヌクレオチドとを含む、前記投与すること、及び
ｂ）後の時間点において、前記患者の血流における抗カプシドタンパク質抗体のレベルを測定することであって、前記後の時間点が７日以降である、前記測定すること
を含む方法。
【請求項３６】
ａ）血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラムあたり６×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することであって、第１の時間点において、前記ＡＡＶ粒子が、カプシドタンパク質と、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を含むポリヌクレオチドとを含む、前記投与すること、及び
ｂ）後の時間点において、前記患者の血流における抗カプシドタンパク質抗体のレベルを測定することであって、前記後の時間点が７日以降である、前記測定すること
を含む方法。
【請求項３７】
ａ）血友病Ａ患者にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することであって、第１の時間点において、前記ＡＡＶ粒子が、カプシドタンパク質と、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、前記投与すること、及び
ｂ）後の時間点において、前記患者の血流における抗カプシドタンパク質抗体のレベルを測定することであって、前記後の時間点が７日以降である、前記測定すること
を含む方法。
【請求項３８】
ｃ）前記患者に前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の前記用量を投与する前に、前記患者の血流における抗カプシドタンパク質抗体のベースラインレベルを測定すること、及び
ｄ）任意で、前記後の時間点での前記患者の血流における抗カプシドタンパク質抗体の前記測定されたレベルを、前記患者の血流における抗カプシドタンパク質抗体の前記ベースラインレベルと比較すること
をさらに含む、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記後の時間点が７日である、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記後の時間点が１４日である、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記後の時間点が２１日である、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／６９８，６８０号に基づく優先権を主張し、２０１９年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８６７，１７１号に基づく優先権を主張するものであり、これらの両方は、参照によりその全体が援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出された配列表を含んでおり、参照によりその全体が援用される。上記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年７月１５日に作成されたものであるが、名前が００８０７３＿５２０２＿ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズが８５，０００バイトである。
【背景技術】
【０００３】
開示の背景
血液凝固は、凝固カスケードと呼ばれる相互依存的生化学反応の複雑かつ動的な生物学的経路によって進行する。凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）はカスケードの肝要な構成要素である。第ＶＩＩＩ因子は、出血部位へ動員され、活性型第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）及び第Ｘ因子（ＦＸ）とのＸａｓｅ複合体を形成する。Ｘａｓｅ複合体はＦＸを活性化させ、これが今度はプロトロンビンをトロンビンに活性化させ、次にこれが凝固カスケードの他の構成要素を活性化させて安定な血餅を生成する（Ｓａｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，９：１８５−１９２（１９９９）（非特許文献１）、Ｌｅｎｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９２：３９８３−３９９６（１９９８）（非特許文献２）に総説されている）。
【０００４】
血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子活性の欠乏を特徴とする先天性Ｘ染色体連鎖性出血性障害である。弱められた第ＶＩＩＩ因子活性は凝固カスケードにおける正のフィードバックループを阻害する。これは不完全な凝固を引き起こすが、それは、持続時間が増えた出血エピソード、大きなあざ、自然発生する口腔及び鼻出血、関節強直及び慢性疼痛、ならびに重症例で起こり得る内出血及び貧血として顕在化する（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃ．Ｒｅｖ．Ａｌｌｅｒｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７：１１４−１２４（２００９）（非特許文献３））。
【０００５】
慣例的には血友病Ａを第ＶＩＩＩ因子補充療法によって治療するが、これは、血友病Ａを有する個体に第ＶＩＩＩ因子タンパク質（例えば、血漿由来の、または組換えによって製造された第ＶＩＩＩ因子）を投与することからなる。第ＶＩＩＩ因子は、急性出血エピソードに応じて出血エピソードを予防するもしくはその頻度を低減するために、及び／または手術中の出血を周術期に管理するために、予防的に投与される。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子補充療法にはいくつかの望ましくない特徴がある。
【０００６】
第一に、第ＶＩＩＩ因子補充療法は血友病Ａを治療または管理するために使用されるが、根底にある第ＶＩＩＩ因子欠乏症を治癒させない。このため、血友病Ａを有する個体は第ＶＩＩＩ因子補充療法を一生必要とする。継続的治療は高額であり、個体が厳密なコンプライアンスを維持することを必要とする。というのも、予防的用量がほんの数回欠けただけで、重度の血友病Ａを有する個体に重篤な転帰をもたらし得るからである。
【０００７】
第二に、第ＶＩＩＩ因子はインビボでの半減期が比較的短いため、従来の予防的第ＶＩＩＩ因子補充療法は投与を２日ごとまたは３日ごとに必要とする。これは、個体にとってコンプライアンスを一生維持する上での負担になる。第三世代「長時間作用性」第ＶＩＩＩ因子薬は投与の頻度を低減し得るものの、これらの薬による予防的ＦＶＩＩＩ因子補充療法は依然として毎月、毎週またはより頻繁な投与を永久に必要とする。例えば、ＥＬＯＣＴＡＴＥ（商標）［抗血友病因子（組換え）、Ｆｃ融合タンパク質］による予防的処置は３〜５日ごとの投与を必要とする（ＥＬＯＣＴＡＴＥ（商標）の処方情報（Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ），Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  Ｉｎｃ．，（２０１５）（非特許文献４））。しかも、化学修飾された生物学（例えばペグ化ポリペプチド）の長期的影響は未だ完全には理解されていない。
【０００８】
第三に、第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けている全個体の１５〜３０％は抗第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体を形成して療法を非効率的なものにする。インヒビター抗体を形成する個体における血友病を治療するために、第ＶＩＩＩ因子バイパス療法（例えば、血漿由来の、または組換えによって製造されたプロトロンビン複合体濃縮物の投与）を用いることができる。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子バイパス療法は第ＶＩＩＩ因子補充療法よりも効果が小さく（Ｍａｎｎｕｃｃｉ  Ｐ．Ｍ．，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．，１（７）：１３４９−５５（２００３）（非特許文献５））、心血管合併症のリスクの増大との関連があり得る（Ｌｕｕ  ａｎｄ  Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１０  Ｓｕｐｐｌ．２：１０−１６（２００４）（非特許文献６））。
【０００９】
体細胞遺伝子療法は血友病Ａの治療に非常に有望である。というのも、それは第ＶＩＩＩ因子活性の１回限りの用量を個体に提供するのではなく、根底にある（例えばミスセンスまたはナンセンス突然変異に起因する）機能的第ＶＩＩＩ因子活性の低発現を治すことになるからである。この作用機序の差異ゆえに、第ＶＩＩＩ因子補充療法と比較して第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法ベクターの１回限りの投与は個体に第ＶＩＩＩ因子を数年にわたって提供し得、治療費を低減し得、患者コンプライアンスを継続する必要をなくし得る。
【００１０】
弱められた第ＩＸ因子活性を特徴とする関連する血液凝固症状である血友病Ｂを有する個体を治療するために凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）遺伝子療法が効果的に用いられたことがある（Ｍａｎｎｏ  Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，１２（３）：３４２−４７（２００６）（非特許文献７））。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法はいくつかの特有の難題を提示する。例えば、完全長野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（２３５１アミノ酸、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ００４５１）は完全長野生型第ＩＸ因子ポリペプチド（４６１アミノ酸、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７４０）よりも５倍長い。このため、野生型第ＶＩＩＩ因子のコード配列は７０５３塩基対であり、これでは大きすぎて従来のＡＡＶ遺伝子療法ベクターの中にパッケージングすることができない。さらに、報告された組換えによる第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン欠失変異体（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）の発現は乏しかった。このため、いくつかのグループがＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ構築物のコドン使用の改変を試みたことはあるが、大した成果は得られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓａｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，９：１８５−１９２（１９９９）
【非特許文献２】Ｌｅｎｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９２：３９８３−３９９６（１９９８）
【非特許文献３】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃ．Ｒｅｖ．Ａｌｌｅｒｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７：１１４−１２４（２００９）
【非特許文献４】ＥＬＯＣＴＡＴＥ（商標）の処方情報（Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ），Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  Ｉｎｃ．，（２０１５）
【非特許文献５】Ｍａｎｎｕｃｃｉ  Ｐ．Ｍ．，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．，１（７）：１３４９−５５（２００３）
【非特許文献６】Ｌｕｕ  ａｎｄ  Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１０  Ｓｕｐｐｌ．２：１０−１６（２００４）
【非特許文献７】Ｍａｎｎｏ  Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，１２（３）：３４２−４７（２００６）
【発明の概要】
【００１２】
開示の概要
したがって、コード配列がより効率的に遺伝子療法ベクターによってパッケージング及び送達される第ＶＩＩＩ因子変異体が必要とされている。また、第ＶＩＩＩ因子をより効率的に発現させる合成のコドン改変型核酸も必要とされている。そのような第ＶＩＩＩ因子変異体、及びコドン改変型核酸は、第ＶＩＩＩ因子欠乏症（例えば血友病Ａ）の治療の改善を可能にする。上記欠乏症、及び第ＶＩＩＩ因子欠乏症（例えば血友病Ａ）の治療に関連する他の問題は、本開示のコドン改変型第ＶＩＩＩ因子変異体によって軽減または排除される。
【００１３】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、第ＶＩＩＩ因子重鎖（例えば、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ）及び軽鎖（例えば、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ）の本開示のコドン改変型配列との高い配列同一性を有する第ＶＩＩＩ因子変異体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、これらの核酸はさらに、天然第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインを置き換えるリンカー配列（例えば、フューリン切断部位を含むリンカー配列）をコードする配列を、第ＶＩＩＩ因子重軽鎖をコードする配列の間に含む。
【００１４】
一態様では、本開示は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、軽鎖、重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端に連結しているポリペプチドリンカーを含む。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）との少なくとも９５％の同一性を有する第１ヌクレオチド配列にコードされる。ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）との少なくとも９５％の同一性を有する第２ヌクレオチド配列にコードされる。ポリペプチドリンカーはフューリン切断部位を含む。
【００１５】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＢＤＬＯ０４（配列番号５）との少なくとも９５％の同一性を有する第３ヌクレオチド配列にコードされる。
【００１６】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１ヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３））との少なくとも９６％の同一性を有し、ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２ヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４））との少なくとも９６％の同一性を有する。
【００１７】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１ヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３））との少なくとも９７％の同一性を有し、ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２ヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４））との少なくとも９７％の同一性を有する。
【００１８】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１ヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３））との少なくとも９８％の同一性を有し、ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２ヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４））との少なくとも９８％の同一性を有する。
【００１９】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１ヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３））との少なくとも９９％の同一性を有し、ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２ヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４））との少なくとも９９％の同一性を有する。
【００２０】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１ヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３））との少なくとも９９．５％の同一性を有し、ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２ヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４））との少なくとも９９．５％の同一性を有する。
【００２１】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１ヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３））との少なくとも９９．９％の同一性を有し、ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２ヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４））との少なくとも９９．９％の同一性を有する。
【００２２】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１ヌクレオチド配列はＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）であり、ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２ヌクレオチド配列はＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）である。
【００２３】
一態様において本開示は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡとの少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、当該ポリヌクレオチドを提供する。
【００２４】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１））との少なくとも９６％の同一性を有する。
【００２５】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１））との少なくとも９７％の同一性を有する。
【００２６】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１））との少なくとも９８％の同一性を有する。
【００２７】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１））との少なくとも９９％の同一性を有する。
【００２８】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１））との少なくとも９９．５％の同一性を有する。
【００２９】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１））との少なくとも９９．９％の同一性を有する。
【００３０】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）である。
【００３１】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。
【００３２】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。
【００３３】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。
【００３４】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。
【００３５】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。
【００３６】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。
【００３７】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。
【００３８】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。
【００３９】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡからなる群から選択される配列との少なくとも９５％の同一性を有する。
【００４０】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡからなる群から選択される配列との少なくとも９６％の同一性を有する。
【００４１】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡからなる群から選択される配列との少なくとも９７％の同一性を有する。
【００４２】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡからなる群から選択される配列との少なくとも９８％の同一性を有する。
【００４３】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡからなる群から選択される配列との少なくとも９９％の同一性を有する。
【００４４】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡからなる群から選択される配列との少なくとも９９．５％の同一性を有する。
【００４５】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡからなる群から選択される配列との少なくとも９９．５％の同一性を有する。
【００４６】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡからなる群から選択される。
【００４７】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能可能に繋げられたプロモーターエレメントも含む。
【００４８】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能可能に繋げられたエンハンサーエレメントも含む。
【００４９】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能可能に繋げられたポリアデニル化エレメントも含む。
【００５０】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に繋げられたイントロンも含む。
【００５１】
上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、イントロンは、プロモーターエレメントと、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始部位（例えば第１コードＡＴＧ）との間に位置する。
【００５２】
別の態様において本開示は、上記ポリヌクレオチドを含む哺乳動物遺伝子療法ベクターを提供する。
【００５３】
上記哺乳動物遺伝子療法ベクターの一実施形態では、哺乳動物遺伝子療法ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【００５４】
上記哺乳動物遺伝子療法ベクターの一実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ−８ベクターである。
【００５５】
別の態様において本開示は、血友病Ａを治療する方法であって、それを必要とする患者に上記哺乳動物遺伝子療法ベクターを投与することを含む、当該方法を提供する。
【００５６】
別の態様において本開示は、血友病Ａを治療するための上記哺乳動物遺伝子療法ベクターを提供する。
【００５７】
別の態様において本開示は、血友病Ａを治療するための医薬の製造のための、上記哺乳動物遺伝子療法ベクターの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】野生型及びＲｅＦａｃｔｏ型ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質構築物の模式図を示す。
【図２Ａ】いくつかの実施形態に係る第ＶＩＩＩ因子変異体をコードするＣＳ０４コドン改変型ヌクレオチド配列（配列番号１）（完全長コード配列である「ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ」）を示す。
【図２Ｂ】いくつかの実施形態に係る第ＶＩＩＩ因子変異体をコードするＣＳ０４コドン改変型ヌクレオチド配列（配列番号１）（完全長コード配列である「ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ」）を示す。
【図３】いくつかの実施形態に係るＣＳ０４コドン改変型ヌクレオチド配列にコードされる第ＶＩＩＩ因子変異体アミノ酸配列（配列番号２）（完全長アミノ酸配列である「ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ」）を示す。
【図４】いくつかの実施形態に係る第ＶＩＩＩ因子変異体の重鎖をコードする、ＣＳ０４コドン改変型ヌクレオチド配列（配列番号３）の一部（「ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ」）を示す。
【図５】いくつかの実施形態に係る第ＶＩＩＩ因子変異体の軽鎖をコードする、ＣＳ０４コドン改変型ヌクレオチド配列（配列番号４）の一部（「ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ」）を示す。
【図６】いくつかの実施形態に係るＢドメイン置換リンカーの例示的なコード配列（配列番号５）を示す。ＢＤＬＯ０４（配列番号５）は、Ｂドメイン置換リンカーをコードする、ＣＳ０４コドン改変型ヌクレオチド配列の固有な一部である。
【図７Ａ】いくつかの実施形態に係るＣＳ０４コドン改変型ヌクレオチド配列を含有するＡＡＶベクター配列（配列番号８）（「ＣＳ０４−ＡＶ−ＮＡ」）を示す。
【図７Ｂ】いくつかの実施形態に係るＣＳ０４コドン改変型ヌクレオチド配列を含有するＡＡＶベクター配列（配列番号８）（「ＣＳ０４−ＡＶ−ＮＡ」）を示す。
【図７Ｃ】いくつかの実施形態に係るＣＳ０４コドン改変型ヌクレオチド配列を含有するＡＡＶベクター配列（配列番号８）（「ＣＳ０４−ＡＶ−ＮＡ」）を示す。
【図８Ａ】いくつかの実施形態に係る第ＶＩＩＩ因子変異体をコードするＣＳ０８コドン改変型ヌクレオチド配列（配列番号７）（「ＣＳ０８−ＦＬ−ＮＡ」）を示す。
【図８Ｂ】いくつかの実施形態に係る第ＶＩＩＩ因子変異体をコードするＣＳ０８コドン改変型ヌクレオチド配列（配列番号７）（「ＣＳ０８−ＦＬ−ＮＡ」）を示す。
【図９Ａ】いくつかの実施形態に係る第ＶＩＩＩ因子変異体をコードするＣＳ１０コドン改変型ヌクレオチド配列（配列番号８）（「ＣＳ１０−ＦＬ−ＮＡ」）を示す。
【図９Ｂ】いくつかの実施形態に係る第ＶＩＩＩ因子変異体をコードするＣＳ１０コドン改変型ヌクレオチド配列（配列番号８）（「ＣＳ１０−ＦＬ−ＮＡ」）を示す。
【図１０Ａ】いくつかの実施形態に係る第ＶＩＩＩ因子変異体をコードするＣＳ１１コドン改変型ヌクレオチド配列（配列番号９）（「ＣＳ１１−ＦＬ−ＮＡ」）を示す。
【図１０Ｂ】いくつかの実施形態に係る第ＶＩＩＩ因子変異体をコードするＣＳ１１コドン改変型ヌクレオチド配列（配列番号９）（「ＣＳ１１−ＦＬ−ＮＡ」）を示す。
【図１１Ａ】いくつかの実施形態に係るＣＳ４０野生型ＲｅＦａｃｔｏコード配列（配列番号１０）（「ＣＳ４０−ＦＬ−ＮＡ」）を示す。
【図１１Ｂ】いくつかの実施形態に係るＣＳ４０野生型ＲｅＦａｃｔｏコード配列（配列番号１０）（「ＣＳ４０−ＦＬ−ＮＡ」）を示す。
【図１２Ａ】いくつかの実施形態に係る第ＶＩＩＩ因子変異体をコードするＣＨ２５コドン改変型ヌクレオチド配列（配列番号１１）（「ＣＨ２５−ＦＬ−ＮＡ」）を示す。
【図１２Ｂ】いくつかの実施形態に係る第ＶＩＩＩ因子変異体をコードするＣＨ２５コドン改変型ヌクレオチド配列（配列番号１１）（「ＣＨ２５−ＦＬ−ＮＡ」）を示す。
【図１３】いくつかの実施形態に係る野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号１２）（「ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ」）を示す。
【図１４】ベクター骨格ｐＣｈ−ＢＢ０１にＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ制限部位を介して合成Ｒｅｆａｃｔｏ型ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ  ＤＮＡ配列を挿入することによってｐＣＳ４０、ｐＣＳ０４、ｐＣＳ０８、ｐＣＳ１０、ｐＣＳ１１及びｐＣｈ２５構築物をクローニングするためのスキームを示す。
【図１５】アガロースゲル電気泳動によって分析したＡＡＶベクターゲノム作製物の完全性を示す。レーン１、ＤＮＡマーカー；レーン２、ｖＣＳ４０；レーン４、ｖＣＳ０４。ＡＡＶベクターは全て同じサイズのゲノムを有し、移動しておよそ５ｋｂの所（矢印、右側）にある。左側の目盛りはＤＮＡ断片のサイズをキロベース（ｋｂ）で表す。
【図１６】ＡＡＶベクター作製物のＰＡＧＥ及び銀染色によるタンパク質分析を示す。レーン１、タンパク質マーカー（Ｍ）；レーン２、ｖＣＳ４０；及びレーン４、ｖＣＳ０４。構築物は全て、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３からなる同じＡＡＶ８カプシドを有する（右側矢印）。左側の目盛りはタンパク質マーカーのサイズをキロダルトン（ｋＤａ）で表す。
【図１７】実施例３に記載のＣＳ０４第ＶＩＩＩ因子コドン最適化構築物を含有する（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法ベクターの全身投与後のＦＶＩＩＩ活性を示す。ｃｐ、ベクターカプシド粒子；ＦＶＩＩＩ、第ＶＩＩＩ因子；ＬＬＯＱ、定量の下限。グラフの左から右へと１４、２８、４２及び５６日の時間点を示す。
【図１８】実施例３に記載のＣＳ０４第ＶＩＩＩ因子コドン最適化構築物を含有する（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法ベクターの全身投与後の尾端出血アッセイにおける低減された血液損失を示す。ｃｐ、ベクターカプシド粒子。
【図１９Ａ】全身投与後のＣＳ０４第ＶＩＩＩ因子コドン最適化構築物ＤＮＡを含有する（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法ベクターの生体内分布を示す。１９０２＝肝臓、１９０４＝リンパ節、１９０６＝骨格筋、１９０８＝心臓、１９１０＝腎臓、１９１２＝脾臓、１９１４＝肺、１９１６＝精巣、１９１８＝脳。
【図１９Ｂ】全身投与後のＣＳ０４第ＶＩＩＩ因子コドン最適化構築物ＤＮＡを含有する（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法ベクターの生体内分布を示す。１９０２＝肝臓、１９０４＝リンパ節、１９０６＝骨格筋、１９０８＝心臓、１９１０＝腎臓、１９１２＝脾臓、１９１４＝肺、１９１６＝精巣、１９１８＝脳。
【図１９Ｃ】全身投与後のＣＳ０４第ＶＩＩＩ因子コドン最適化構築物ＤＮＡを含有する（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法ベクターの生体内分布を示す。１９０２＝肝臓、１９０４＝リンパ節、１９０６＝骨格筋、１９０８＝心臓、１９１０＝腎臓、１９１２＝脾臓、１９１４＝肺、１９１６＝精巣、１９１８＝脳。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
開示の詳細な説明
Ｉ．序論
ＡＡＶに基づく遺伝子療法は血友病の治療において大いに期待されている。血友病Ｂでは、最初の臨床データは、約１０％のＦＩＸレベルが少なくとも数名の患者において１年超にわたって維持され得るという点で有望である。しかしながら、血友病Ａでは、ＡＡＶベクターで５〜１０％の治療的発現レベルを達成することは様々な理由から難題であり続けている。第一に、従来のＡＡＶベースのベクターには第ＶＩＩＩ因子コード配列は大きすぎる。第二に、操作されてＢドメインが欠失している、または切り詰められている第ＶＩＩＩ因子構築物は、コドン最適化されている場合でさえ、インビボでの発現が乏しいという欠点を有する。第三に、Ｂドメインが欠失している、または切り詰められているこれらの第ＶＩＩＩ因子変異体構築物はインビボでの半減期が短く、発現の乏しさの影響を増悪させる。第四に、ＦＶＩＩＩは、発現した場合でさえ、他の凝固因子、例えば第ＩＸ因子と同様に細胞から効率的に分泌されない。したがって、ＦＶＩＩＩ遺伝子療法を血友病Ａ患者のための実用可能な治療選択肢とするためにはＦＶＩＩＩの発現を改善する方策が必要である。
【００６０】
本開示は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法に関連するこれらの及び他の課題を解決する配列をコードするコドン改変型第ＶＩＩＩ因子変異体の発見に関する。例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞における著しく改善された発現をもたらし、充填相互作用の安定化による改善されたビリオンパッケージングを呈する。いくつかの実施態様において、これらの利点は、コドン改変型ＣＳ０４構築物との高い配列同一性を有する（例えば、ＣＳ０４−ＨＣ重鎖コード配列との高い配列同一性、及びＣＳ０４−ＬＣ軽鎖コード配列との高い配列同一性を有する）第ＶＩＩＩ因子の重軽鎖のためのコード配列を使用することによって実現される。
【００６１】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドにコードされる第ＶＩＩＩ因子分子は、野生型Ｂドメインを切り詰める、欠失させるまたは置き換えることによって短くされている。このため、当該ポリヌクレオチドは、野生型第ＶＩＩＩ因子などのより大きなポリペプチドを非効率的に発現させるものである従来の遺伝子療法ベクターによって第ＶＩＩＩ因子を発現させるのにより適している。
【００６２】
好都合なことに、ＣＳ０４コドン改変型第ＶＩＩＩ因子変異体コード配列はインビボでのＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子構築物の優れた発現をもたらすことが本明細書に示される。例えば、実施例２及び表４では、第ＶＩＩＩ因子ノックアウトマウスにおけるＣＳ０４（配列番号１）コード配列を有するＡＡＶベースの遺伝子療法ベクターの静脈内投与が、野生型ポリヌクレオチド配列（配列番号１０）にコードされる対応するＣＳ４０構築物と比較して第ＶＩＩＩ因子発現の７４倍の増加をもたらすことが実証される（表４）。
【００６３】
さらに、ＣＳ０４コドン改変型第ＶＩＩＩ因子変異体コード配列が優れたビリオンパッケージング及びウイルス産生をもたらすことも本明細書に示される。例えば、実施例１では、同量の細胞ペレットから単離した場合、ＣＳ０４構築物を含有するＡＡＶベクター構築物が、野生型ポリヌクレオチド配列にコードされる対応するＣＳ４０構築物と比較して５〜７倍高いウイルス収率をもたらすことが実証される。
【００６４】
ＩＩ．定義
本明細書中で使用する場合、以下の用語は、特に断らない限りそれらに属するとみなされる意味を有する。
【００６５】
本明細書中で使用する場合、「第ＶＩＩＩ因子」及び「ＦＶＩＩＩ」という用語は交換可能に使用され、第ＶＩＩＩ因子活性を有する任意のタンパク質（例えば、しばしばＦＶＩＩＩａと呼称される活性型ＦＶＩＩＩ）、または第ＶＩＩＩ因子活性、特に第ＩＸａ因子補因子活性を有するタンパク質のタンパク質前駆体（例えば、プロタンパク質またはプレプロタンパク質）を指す。例示的実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重軽鎖との高い（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の）配列同一性を有する配列を有するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのサイズを減らすべく第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメインが欠失している、切り詰められている、またはリンカーポリペプチドで置き換えられている。例示的実施形態では、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡのアミノ酸２０〜１４５７が第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを構成する。
【００６６】
野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの非限定的な例としては、ヒトプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５２４８５、ＣＡＡ２５６１９、ＡＡＡ５８４６６、ＡＡＡ５２４８４、ＡＡＡ５２４２０、ＡＡＶ８５９６４、ＢＡＦ８２６３６、ＢＡＧ３６４５２、ＣＡＩ４１６６０、ＣＡＩ４１６６６、ＣＡＩ４１６７２、ＣＡＩ４３２４１、ＣＡＯ０３４０４、ＥＡＷ７２６４５、ＡＡＨ２２５１３、ＡＡＨ６４３８０、ＡＡＨ９８３８９、ＡＡＩ１１９６８、ＡＡＩ１１９７０またはＡＡＢ６１２６１）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子、及びその天然の変異体；ブタプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｆ１ＲＺ３６またはＫ７ＧＳＺ５）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子、及びその天然の変異体；マウスプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３７３８５、ＣＡＭ１５５８１、ＣＡＭ２６４９２、またはＥＤＬ２９２２９）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子、及びその天然の変異体；ラットプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＱ２１５８０）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子、及びその天然の変異体；ラットプレプロ第ＶＩＩＩ因子；ならびに他の哺乳動物第ＶＩＩＩ因子相同体（例えば、サル、類人猿、ハムスター、モルモットなど）が挙げられる。
【００６７】
本明細書中で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、第ＩＸ因子補因子活性を有する天然の変異体及び人工構築物が含まれる。本開示の中で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子は、いくらかの基礎的第ＩＸ因子補因子活性（例えば、対応する野生型活性の少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％またはそれ以上）を保持している任意の天然の変異体、代替配列、アイソフォームまたは突然変異タンパク質を包含する。ヒト集団にみられる（ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ（配列番号１２）に対する）第ＶＩＩＩ因子アミノ酸変異体の例としては、限定されないが、
2021530524.tif 000003
2021530524.tif 000004
が挙げられる。第ＶＩＩＩ因子タンパク質には、翻訳後修飾を含有するポリペプチドも含まれる。
【００６８】
通常、第ＶＩＩＩ因子をコードするポリヌクレオチドは、翻訳後プロセシングを受けて活性型第ＶＩＩＩ因子タンパク質（例えばＦＶＩＩＩａ）を形成する不活性な一本鎖ポリペプチド（例えばプレプロタンパク質）をコードする。例えば、図１を参照して、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子プレプロタンパク質は、まず切断されて、コードされるシグナルペプチド（図示せず）を遊離させて（「ヒト野生型ＦＶＩＩＩとして示される）第１一本鎖プロタンパク質を形成する。プロタンパク質はその後、ＢドメインとＡ３ドメインとの間で切断されて、第ＶＩＩＩ因子重鎖（例えばＡ１及びＡ２ドメイン）及びＢドメインを含む第１ポリペプチド、ならびに（例えば、Ａ３、Ｃ１及びＣ３ドメインを含む）第ＶＩＩＩ因子軽鎖を含む第２ポリペプチドを形成する。第１ポリペプチドは、Ｂドメインを除去するように、なおかつ成熟第ＶＩＩＩａタンパク質中で第ＶＩＩＩ因子軽鎖と会合したままとなるＡ１ドメインとＡ２ドメインとを分離するように、さらに切断される。第ＶＩＩＩ因子成熟プロセスの総説については、参照によりその内容全体があらゆる目的のために本明細書に援用される、Ｇｒａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．，６（６）：４８８−５０１（２００５）を参照されたい。
【００６９】
しかしながら、いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは一本鎖第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである。一本鎖第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、天然の切断部位を除去するように、及び任意で、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインの除去、切詰め、または置換えをするように操作される。このため、それらは、（任意選択のシグナル及び／またはリーダーペプチドの切断以外の）切断による成熟をせず、一本鎖として活性である。一本鎖第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの非限定的な例は、参照によりその開示全体があらゆる目的のために援用される、Ｚｏｌｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ，１３４（１）：１２５−３１（２０１４））、及びＤｏｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，３１２（１）：４９−５５（１９９５））に記載されている。
【００７０】
本明細書中で使用する場合、「第ＶＩＩＩ因子重鎖」または単に「重鎖」という用語は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ１及びＡ２ドメインの凝集体を指す。例示的実施形態では、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸２０〜７５９が第ＶＩＩＩ因子重鎖を構成する。
【００７１】
本明細書中で使用する場合、「第ＶＩＩＩ因子軽鎖」または単に「軽鎖」という用語は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ３、Ｃ１及びＣ２ドメインの凝集体を指す。例示的実施形態では、アミノ酸７７４〜１４５７  ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）が第ＶＩＩＩ因子軽鎖を構成する。いくつかの実施形態では、インビボで成熟する間に遊離するものである酸性ａ３ペプチドは第ＶＩＩＩ因子軽鎖から排除される。
【００７２】
通常、第ＶＩＩＩ因子重軽鎖は、例えば任意選択のＢドメインまたはＢドメイン置換リンカーと一緒に、１本のポリペプチド鎖として発現する。しかしながら、いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子重鎖及び第ＶＩＩＩ因子軽鎖は別個のポリペプチド鎖として発現し（例えば共発現し）、再構成されて第ＶＩＩＩ因子タンパク質を（例えばインビボまたはインビトロで）形成する。
【００７３】
本明細書中で使用する場合、「Ｂドメイン置換リンカー」及び「第ＶＩＩＩ因子リンカー」という用語は交換可能に使用され、野生型第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインの切詰め形態（例えば、ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ（配列番号１２）のアミノ酸７６０〜１６６７）、または第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメインを置き換えるように操作されたペプチドを指す。本明細書中で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子リンカーは、いくつかの実施形態に係る第ＶＩＩＩ因子変異体ポリペプチドにおいて第ＶＩＩＩ因子重鎖のＣ末端と第ＶＩＩＩ因子軽鎖のＮ末端との間に位置する。Ｂドメイン置換リンカーの非限定的な例は、参照によりその開示全体があらゆる目的のために援用される、米国特許第４，８６８，１１２号、第５，１１２，９５０号、第５，１７１，８４４号、第５，５４３，５０２号、第５，５９５，８８６号、第５，６１０，２７８号、第５，７８９，２０３号、第５，９７２，８８５号、第６，０４８，７２０号、第６，０６０，４４７号、第６，１１４，１４８号、第６，２２８，６２０号、第６，３１６，２２６号、第６，３４６，５１３号、第６，４５８，５６３号、第６，９２４，３６５号、第７，０４１，６３５号及び第７，９４３，３７４号；米国特許出願公開第２０１３／０２４９６０号、第２０１５／００７１８８３号及び第２０１５／０１５８９３０号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０６４２７７号及び第ＷＯ２０１４／１２７２１５号に開示されている。
【００７４】
本明細書中で特に断らない限り、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸の付番は、図１３中に配列番号１２として示される完全長野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子配列（ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ）において対応するアミノ酸を指す。したがって、本明細書に開示される第ＶＩＩＩ因子変異体タンパク質におけるアミノ酸置換に言及する場合、列挙されたアミノ酸番号は、完全長野生型第ＶＩＩＩ因子配列中の類似する（例えば構造的または機能的に等価である）及び／または相同である（例えば一次アミノ酸配列において進化的に保存されている）アミノ酸を指す。例えば、Ｔ２１０５Ｎアミノ酸置換は、完全長野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子配列（ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ、配列番号１２）の位置２１０５におけるＴからＮへの置換、及びＣＳ０４にコードされる第ＶＩＩＩ因子変異体タンパク質（ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ、配列番号２）の位置１２１１におけるＴからＮへの置換を意味する。
【００７５】
本明細書に記載する場合、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸付番体系は、第ＶＩＩＩ因子シグナルペプチド（例えば完全長野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子配列のアミノ酸１〜１９）が含まれているか否かによって決まる。シグナルペプチドが含まれる場合、付番は「シグナルペプチド包含」または「ＳＰＩ」と呼称される。シグナルペプチドが含まれない場合、付番は「シグナルペプチド除外」または「ＳＰＥ」と呼称される。例えば、Ｆ３２８Ｓは、ＳＰＥ付番でのＦ３０９Ｓと同じアミノ酸についてのＳＰＩ付番である。特に示されていない限り、全てのアミノ酸付番は、図１３中に配列番号１２として示される完全長野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子配列（ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ）において対応するアミノ酸を指す。
【００７６】
本明細書中に記載する場合、コドン改変型ポリヌクレオチドは（例えば遺伝子療法ベクターの一部として投与された場合）、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物（例えば、野生型ヒトコドンを使用して同じ第ＶＩＩＩ因子構築物をコードするポリヌクレオチド）によってもたらされる第ＶＩＩＩ因子発現のレベルと比較してインビボでの遺伝子導入第ＶＩＩＩ因子の発現の増強をもたらす。本明細書中で使用する場合、「発現の増強」という用語は、第ＶＩＩＩ因子をコードするコドン改変型ポリヌクレオチドを投与された動物の血液における遺伝子導入第ＶＩＩＩ因子活性のレベルが、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物を投与された動物の血液における遺伝子導入第ＶＩＩＩ因子活性のレベルに比べて上昇していることを意味する。活性レベルは、当技術分野で知られている任意の第ＶＩＩＩ因子活性を用いて測定され得る。第ＶＩＩＩ因子活性を決定するための例示的なアッセイはＴｅｃｈｎｏｃｈｒｏｍｅ  ＦＶＩＩＩアッセイ（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、発現の増強は、コドン改変型第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血液における遺伝子導入第ＶＩＩＩ因子活性が、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血液における遺伝子導入第ＶＩＩＩ因子活性のレベルに比べて少なくとも２５％大きいことを意味する。いくつかの実施形態では、発現の増強は、コドン改変型第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血液における遺伝子導入第ＶＩＩＩ因子活性が、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血液における遺伝子導入第ＶＩＩＩ因子活性のレベルに比べて少なくとも５０％大きい、少なくとも７５％大きい、少なくとも１００％大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも５倍大きい、少なくとも６倍大きい、少なくとも７倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも９倍大きい、少なくとも１０倍大きい、少なくとも１５倍大きい、少なくとも２０倍大きい、少なくとも２５倍大きい、少なくとも３０倍大きい、少なくとも４０倍大きい、少なくとも５０倍大きい、少なくとも６０倍大きい、少なくとも７０倍大きい、少なくとも８０倍大きい、少なくとも９０倍大きい、少なくとも１００倍大きい、少なくとも１２５倍大きい、少なくとも１５０倍大きい、少なくとも１７５倍大きい、少なくとも２００倍大きい、少なくとも２２５倍大きい、または少なくとも２５０倍大きいことを意味する。
【００７８】
本明細書に記載する場合、コドン改変型ポリヌクレオチドは、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物（例えば、野生型ヒトコドンを使用して同じ第ＶＩＩＩ因子構築物をコードするポリヌクレオチド）によってもたらされるベクター産生のレベルと比較してベクター産生の増強をもたらす。本明細書中で使用する場合、「ウイルス産生の増強」という用語は、第ＶＩＩＩ因子をコードするコドン改変型ポリヌクレオチドが播種された細胞培養物におけるベクター収率（例えば培養物１リットルあたりの力価）が、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物が播種された細胞培養物におけるベクター収率と比べて上昇していることを意味する。ベクター収率は、当技術分野で知られている任意のベクター力価アッセイを用いて測定され得る。（例えばＡＡＶベクターの）ベクター収率を決定するための例示的なアッセイは、ＡＡＶ２末端逆位反復配列を標的とするｑＰＣＲである（Ａｕｍｈａｍｍｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｐａｒｔ  Ｂ  ２３：１８−２８（２０１２））。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ウイルス産生の増強は、コドン改変型ベクター収率が、同じタイプの培養物における天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物の収率に比べて少なくとも２５％高いことを意味する。いくつかの実施形態では、ベクター産生の増強は、コドン改変型ベクター収率が、同じタイプの培養物での天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物の収率に比べて少なくとも５０％大きい、少なくとも７５％大きい、少なくとも１００％大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも５倍大きい、少なくとも６倍大きい、少なくとも７倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも９倍大きい、少なくとも１０倍大きい、少なくとも１５倍大きい、または少なくとも２０倍大きいことを意味する。
【００８０】
本明細書中で使用する場合、「血友病」という用語は、減退した血液凝固または凝血を大まかな特徴とする疾患状態の群を指す。血友病は、Ａ型、Ｂ型もしくはＣ型血友病、または３つの疾患型全ての複合形態を指し得る。Ａ型血友病（血友病Ａ）は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性の減退または喪失によって引き起こされ、血友病サブタイプの中で最も有名である。Ｂ型血友病（血友病Ｂ）は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）凝固機能の喪失または減退によって生じる。Ｃ型血友病（血友病Ｃ）は、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）凝固活性の喪失または減退の結果である。血友病Ａ及びＢはＸ染色体連鎖性疾患であるが、血友病Ｃは常染色体に関するものである。血友病の従来の治療は、凝固因子、例えばＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、例えばＢｅｂｕｌｉｎ（登録商標）−ＶＨ、及びＦＸＩ、ならびにＦＥＩＢＡ−ＶＨ、デスモプレシン、及び血漿点滴液の予防的投与及び要求に応じた投与の両方を含む。
【００８１】
本明細書中で使用する場合、「ＦＶＩＩＩ遺伝子療法」という用語は、第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸を患者に提供して血友病に関連する１つ以上の症候（例えば臨床因子）の再発を和らげる、減らす、または防ぐ任意の治療手法を含む。当該用語は、血友病を有する個体の健康状態を維持または改善するために、第ＶＩＩＩ因子の任意の改変形態（例えば第ＶＩＩＩ因子変異体）を含めた第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸を含む任意の化合物、薬物、手順または投薬計画を施すことを包含する。当業者であれば、例えば本開示に従って得た結果に基づいて、ＦＶＩＩＩ療法のクールまたはＦＶＩＩＩ治療剤の用量が変更され得ることを理解するであろう。
【００８２】
本明細書中で使用する場合、「バイパス療法」という用語は、非第ＶＩＩＩ因子止血薬剤、化合物または凝固因子を患者に提供して血友病に関連する１つ以上の症候（例えば臨床因子）の再発を和らげる、減らす、または防ぐ任意の治療手法を含む。非第ＶＩＩＩ因子化合物及び凝固因子としては、限定されないが、第ＶＩＩＩ因子抗体迂回活性複合体（ＦＥＩＢＡ）、組換え活性型第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）、プロトロンビン複合体濃縮物、及び活性型プロトロンビン複合体濃縮物が挙げられる。これらの非第ＶＩＩＩ因子化合物及び凝固因子は、組換えまたは血漿由来のものであり得る。当業者であれば、バイパス療法のクールまたはバイパス療法の用量を、例えば本開示に従って得た結果に基づいて変更できることを理解するであろう。
【００８３】
本明細書中で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸及び従来の血友病Ａ治療剤の投与を含む「併用療法」は、第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸と、第ＶＩＩＩ因子分子及び／または非第ＶＩＩＩ因子止血剤（例えばバイパス療法剤）とを両方とも患者に提供して血友病に関連する１つ以上の症候（例えば臨床因子）の再発を和らげる、減らす、または防ぐ任意の治療手法を含む。当該用語は、血友病を有する個体の健康状態を維持または改善するために有用であり本明細書に記載の治療剤のいずれかを含むものである第ＶＩＩＩ因子の任意の改変形態を含めた第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸を含む任意の化合物、薬物、手順または投薬計画を施すことを包含する。
【００８４】
「治療的有効量または用量」または「治療的に十分な量または用量」または「有効または十分な量または用量」という用語は、その投与のねらいとする治療効果を生む用量を指す。例えば、血友病を治療するのに役立つ薬物の治療的有効量は、血友病に関連する１つ以上の症候を防ぐまたは和らげることができる量であり得る。厳密な用量は、治療の目的によって決まるであろうし、当業者によって既知の技術を用いて確かめられるであろう（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）、Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）、Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい）。
【００８５】
本明細書中で使用する場合、「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ分子の部分（例えばコード領域）を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子には、ポリペプチド鎖の産生に関与するコード領域のすぐ前の、後の、及び／または間に介在する領域（例えば、調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、またはイントロン）が配置されている。
【００８６】
本明細書中で使用する場合、「調節エレメント」という用語は、細胞におけるコード配列の発現をもたらすヌクレオチド配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、終結因子、ポリアデニル化配列、イントロンなどを指す。
【００８７】
本明細書中で使用する場合、「プロモーターエレメント」という用語は、コード配列の発現の制御を支援するヌクレオチド配列を指す。通常、プロモーターエレメントは、遺伝子の翻訳開始部位の５’側に位置している。しかしながら、特定の実施形態では、プロモーターエレメントがイントロン配列内、またはコード配列の３’側に位置していてもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターに有用なプロモーターは、対象となるタンパク質の天然の遺伝子から得られる（例えば、第ＶＩＩＩ因子プロモーター）。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターに有用なプロモーターは、対象となる生物の特定の細胞または組織における発現に対して特異的である（例えば肝臓特異的プロモーター）。さらに他の実施形態では、十分に特性評価された複数のプロモーターエレメントのうちの１つを本明細書に記載の遺伝子療法ベクターに使用する。十分に特性評価されたプロモーターエレメントの非限定的な例としては、ＣＭＶ早期プロモーター、β−アクチンプロモーター、及びメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、対象となるタンパク質の実質的に定常的な発現を促すものである恒常的プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、特定の刺激（例えば、特定の治療または薬剤への曝露）に応答して対象となるタンパク質の発現を促すものである誘導性プロモーターである。ＡＡＶ媒介遺伝子療法のプロモーターを設計することの総説については、参照によりその内容全体があらゆる目的のために明示的に援用される、Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２２：１１４３−５３（２０１１））を参照されたい。
【００８８】
本明細書中で使用する場合、「ベクター」という用語は、（例えば第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法構築物をコードする）核酸を宿主細胞に移入させるために使用される任意のビヒクルを指す。いくつかの実施形態では、ベクターは、ビヒクルを対象となる核酸と一緒に複製するように機能するレプリコンを含む。遺伝子療法に有用なベクターの非限定的な例としては、インビボで自律的複製単位として機能するプラスミド、ファージ、コスミド、人工染色体、及びウイルスが挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、対象となる核酸（例えば、第ＶＩＩＩ因子変異体をコードするコドン改変型ポリヌクレオチド）を導入するためのウイルスビヒクルである。遺伝子療法に有用な、改変された真核生物ウイルスは当技術分野で多く知られている。例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はヒト遺伝子療法における使用に特によく適している。というのも、ヒトは当該ウイルスの天然の宿主であり、天然のウイルスが何らかの疾患の原因になることは知られておらず、ウイルスは弱い免疫応答を誘発するからである。
【００８９】
本明細書中で使用する場合、「ＣｐＧ島」という用語は、統計学的にＣｐＧジヌクレオチドの密度が高くなっているポリヌクレオチド内の領域を指す。本明細書中で使用する場合、ポリヌクレオチド（例えばコドン改変型第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の領域は、２００塩基対を上回る枠にわたって（ｉ）領域のＧＣ含有量が５０％超でありかつ（ｉｉ）関係式：
2021530524.tif 000005
で定義される予測ＣｐＧジヌクレオチドに対する実測ＣｐＧジヌクレオチドの比率が少なくとも０．６であるときに、ＣｐＧ島である。ＣｐＧ島を同定する方法に関するさらなる情報については、参照によりその内容全体があらゆる目的のために援用される、Ｇａｒｄｉｎｅｒ−Ｇａｒｄｅｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，１９６（２）：２６１−８２（１９８７）を参照されたい。
【００９０】
本明細書中で使用する場合、「核酸」という用語は、一本鎖形態か二本鎖形態かのどちらかであるデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそのポリマー、及びその相補体を指す。当該用語は、合成のもの、天然に存在するもの、及び天然に存在しないものであり、基準核酸と同様の結合特性を有しており、基準ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、既知ヌクレオチド類縁体または修飾骨格残基もしくは結合を含有する核酸を包含する。そのような類縁体の例としては、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、メチルホスホナート、不斉メチルホスホナート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
【００９１】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類縁体及びアミノ酸模倣体を含めた天然に存在しないアミノ酸を指す。天然に存在するアミノ酸としては、遺伝子コードにコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ｙ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリンが挙げられる。天然に存在するアミノ酸には例えばＤ−及びＬ−アミノ酸が含まれ得る。本明細書中で使用されるアミノ酸には、非天然アミノ酸も含まれ得る。アミノ酸類縁体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合した任意の炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシドまたはメチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類縁体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有しながらも天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を指す。本明細書においてアミノ酸はその一般的に知られている３文字記号か、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって勧告される１文字記号かのどちらかで呼称され得る。ヌクレオチドは同様に、その一般に受け入れられている１文字コードで呼称され得る。
【００９２】
アミノ酸配列に関して、コードされる配列の単一のアミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変更、追加または削除する、核酸またはペプチド配列に対する個々の置換、欠失または付加は、改変によってアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換された「保存的に改変された変異体」である、ということを当業者は認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸をもたらす保存的置換の表は当技術分野でよく知られている。そのような保存的に改変された変異体は、本開示の多型変異体、種間相同体及び対立遺伝子に加わるものであり、それらを排除しないものである。
【００９３】
機能的に類似するアミノ酸をもたらす保存的アミノ酸置換は当技術分野でよく知られている。特定のアミノ酸の機能性、例えば、触媒的、構造的または立体的に重要なアミノ酸に応じて、種々の部類のアミノ酸は互いに対して保存的置換とみなされ得る。表１は、アミノ酸の電荷及び極性、アミノ酸の疎水性、アミノ酸の表面露出／構造的性質、ならびにアミノ酸の二次構造傾向に基づいて保存的置換とみなされるアミノ酸の部類を示す。
【００９４】
（表１）タンパク質中の残基の機能性に基づく保存的アミノ酸置換の部類
2021530524.tif 000006
【００９５】
２つ以上の核酸またはペプチド配列に関して「同一」、または「同一性」パーセントという用語は、例えば下記の初期設定パラメータでＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、または手作業でのアラインメント及び目視検査によって測定した場合に、同じである、または同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの指定の百分率（つまり、比較枠または指定領域にわたって一致を最大にすべく比較し整列させたときに指定の領域にわたって約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性）を有する、２つ以上の配列または部分配列を意味する。
【００９６】
当技術分野では知られていることであるが、タンパク質（または以下に記述される核酸）が既知配列との配列同一性または類似性を有するか否かを識別するために複数の異なるプログラムが使用され得る。配列同一性及び／または類似性は、当技術分野で知られている標準的技術、例えば、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ  ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズムを用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）の配列同一性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージの中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２：３８７−３９５（１９８４）に記載されるＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラムの好ましくは初期設定を用いるコンピュータ化実施によって、または検査によって、決定される。好ましくは、同一性パーセントは、不一致ペナルティを１とし、ギャップペナルティを１とし、ギャップサイズペナルティを０．３３とし、結合ペナルティを３０とするパラメータに基づいてＦａｓｔＤＢによって計算され、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ１２７−１４９（１９８８），Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃは参照によりその全てが援用される。
【００９７】
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、漸進的ペアワイズアラインメントを用いて関連する配列の群から複数の配列アラインメントを作成する。それはまた、アラインメントを作成するために使用されるクラスタリングの関係性を示す樹形図を描き得る。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ  ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）の漸進的アラインメント法の単純化を用いるが、当該方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆Ｓｈａｒｐ  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９）に記載されるものに類似しており、参照により両方が援用される。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、３．００の初期設定ギャップ重み、０．１０の初期設定ギャップ長さ重み、及び重み付けされた末端ギャップを含む。
【００９８】
別の有用なアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，（１９９０）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）、及びＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５７８７（１９９３）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、参照により両方が援用される。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ］から得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用するものであり、そのほとんどは初期設定値に設定される。調節可能なパラメータは以下の値で設定される：重なり距離＝１、重なり率＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ  Ｓ、及びＨＳＰ  Ｓ２パラメータは動的な値であり、特定配列の組成、及び関心対象の配列の検索が行われる特定データベースの組成に応じてプログラム自体によって確立されるが、感度を向上させるために値が調節されることがある。
【００９９】
さらなる有用なアルゴリズムは、参照により援用されるＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２によって報告されたギャップ付きＢＬＡＳＴである。ギャップ付きＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコア；９に設定される閾値Ｔパラメータ；ギャップなしの拡張を誘発するためのｔｗｏ−ｈｉｔ法；ｋの電荷ギャップ長さ  １０＋ｋのコスト；１６に設定されるＸｕ、及びデータベース検索段階では４０に設定されアルゴリズムの出力段階では６７に設定されるＸｇを用いる。ギャップ付きアルゴリズムは約２２ビットに対応するスコアによって誘発される。
【０１００】
アミノ酸配列同一性％値は、整列させた領域において一致する同一残基の数を「長い方の」配列の残基の総数で除することによって決定される。「長い方の」配列は、整列させた領域において最も多くの実際の残基を有している配列である（アラインメントスコアを最大にするようにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２によって導入されたギャップを無視する）。同様に、同定されたポリペプチドのコード配列に関して「核酸配列同一性パーセント（％）」は、細胞周期タンパク質のコード配列の中のヌクレオチド残基と同一な候補配列中のヌクレオチド残基の百分率と定義される。望ましい方法は、重なり距離及び重なり率をそれぞれ１及び０．１２５に設定して、初期設定パラメータに設定したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。
【０１０１】
アラインメントは、整列させる配列にギャップを導入することを含み得る。加えて、図２の配列（配列番号１）にコードされるタンパク質に比べてより多いまたはより少ないアミノ酸を含有する配列について、配列同一性の百分率が一実施形態ではアミノ酸またはヌクレオチドの総数に関する同一アミノ酸またはヌクレオチドの数に基づいて決定されることになることは理解される。したがって、例えば図２中に示されているもの（配列番号１）よりも短い配列の配列同一性は、一実施形態では以下に記述するように短い方の配列の中のヌクレオチドの数を用いて決定されることになる。同一性パーセントの計算では、挿入、欠失、置換などの配列変化の様々な現れに対して相対的重みを割り当てない。
【０１０２】
一実施形態では、同一性のみをプラス（＋１）に採点し、ギャップを含めたあらゆる形態の配列変化に「０」の値を割り当てるが、これによって、配列類似性計算における下記の重み付けされた倍率またはパラメータの必要性が省かれる。配列同一性パーセントは、例えば、整列させた領域において一致する同一残基の数を「短い方の」配列の残基の総数で除して１００を乗ずることによって計算され得る。「長い方の」配列は、整列させた領域において最も多くの実際の残基を有している配列である。
【０１０３】
「対立遺伝子変異体」という用語は、特定遺伝子座にある遺伝子の多型形態、ならびに当該遺伝子のｍＲＮＡ転写産物に由来するｃＤＮＡ、及びそれらにコードされるポリペプチドを指す。「望ましい哺乳動物コドン」という用語は、以下に列挙するものから選択される、哺乳動物細胞に発現するタンパク質に最も頻繁に使用されるアミノ酸をコードするコドンのセットの中からのコドンのサブセットを指す：
2021530524.tif 000007
【０１０４】
本明細書中で使用する場合、コドン改変型という用語は、ポリペプチドをコードする天然ポリヌクレオチドの少なくとも１つのコドンがポリヌクレオチド配列の特性を改善するように変更された、ポリペプチド（例えば第ＶＩＩＩ因子変異体タンパク質）をコードするポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、改善された特性は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの転写の増進、ｍＲＮＡの安定性の向上（例えば、ｍＲＮＡ半減期の改善）、ポリペプチドの翻訳の増進、及び／またはベクター内へのポリヌクレオチドのパッケージングの増進を促す。改善された特性を獲得するために用いられ得る改変の非限定的な例としては、特定のアミノ酸についてのコドンの利用法及び／または分布の変更、全体的及び／または局所的ＧＣ含有量の調整、ＡＴに富む配列の除去、反復配列エレメントの除去、全体的及び／または局所的ＣｐＧジヌクレオチド含有量の調整、不可解な調節エレメント（例えばＴＡＴＡボックス及びＣＣＡＡＴボックスエレメント）の除去、イントロン／エクソンスプライス部位の除去、調節配列の改良（例えばコザック共通配列の導入）、及び転写されたｍＲＮＡにおける二次構造の形成が可能である配列エレメント（例えばステム−ループ）の除去が挙げられる。
【０１０５】
本明細書中に述べられているように、本明細書における開示の構成要素を指す様々な命名法が存在する。「ＣＳ番号」（例えば「ＣＳ０４」）は、変異体を含めたＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチド、及び／またはコードされるポリペプチドを指す。例えば、ＣＳ０４−ＦＬは、完全長コドン改変型ＣＳ０４ポリヌクレオチド配列またはＣＳ０４ポリヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列（本明細書では時として、アミノ酸配列については「ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ」、核酸配列については「ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ」と呼称される）を指す。同様に、「ＣＳ０４−ＬＣ」は、ＦＶＩＩＩポリペプチドの軽鎖をコードするコドン改変型核酸配列（「ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ」）か、ＣＳ０４ポリヌクレオチド配列にコードされるＦＶＩＩＩ軽鎖のアミノ酸配列（同様に本明細書では時として「ＣＳ０４−ＬＣ−ＡＡ」と呼称される）かのどちらかを指す。同様に、ＣＳ０４−ＨＣ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＡＡ、及びＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡはＦＶＩＩＩ重鎖についての同じことである。当業者によって理解されるであろうことであるが、コドン改変型であるにすぎないＣＳ０４などの構築物の場合（例えばそれらはＲｅｆａｃｔｏと比較して追加のアミノ酸置換を含有しない）、アミノ酸配列は、コドン最適化による改変がなされていないアミノ酸配列と同一であろう。このように、本開示の配列構築物は、限定されないが、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＬＣ−ＡＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＡＡ、及びＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡを含む。
【０１０６】
ＩＩＩ．コドン改変型第ＶＩＩＩ因子変異体
いくつかの実施形態では、本開示は、第ＶＩＩＩ因子変異体をコードするコドン改変型ポリヌクレオチドを提供する。これらのコドン改変型ポリヌクレオチドは、ＡＡＶベースの遺伝子療法構築物にして投与された場合、第ＶＩＩＩ因子の著しく増強された発現をもたらす。コドン改変型ポリヌクレオチドはさらに、従来のコドン最適化構築物に比べて改善されたＡＡＶビリオンパッケージングも示す。実施例２及び表４において実証されるように、本出願人らは、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子重軽鎖と、インビボでの活性型ＦＶＩＩＩａタンパク質の成熟を促進するためのフューリン切断部位を含有する短い１４アミノ酸のＢドメイン置換リンカー（「ＳＱ」リンカー）とを有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチド（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）の発見によってこれらの利点をもたらした。
【０１０７】
一実施形態では、本明細書に提供されるコドン改変型ポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子重鎖及び第ＶＩＩＩ因子軽鎖をコードするＣＳ０４（配列番号１）の中の配列との高い配列同一性を少なくとも有するヌクレオチド配列を有する。当技術分野で知られているように、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインはインビボでの活性に重要でない。このため、いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるコドン改変型ポリヌクレオチドは第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインが全く存在しない。いくつかの実施形態では、天然の第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインが、フューリン切断部位を含有する短いアミノ酸リンカー、例えばＣＳ０４（配列番号２）構築物のアミノ酸７６０〜７７３からなる「ＳＱ」リンカーで置き換えられている。「ＳＱ」リンカーは、ＢＤＬＯ０４（−ＡＡはアミノ酸配列、−ＮＡはヌクレオチド配列）とも呼称される。
【０１０８】
一実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドにコードされる第ＶＩＩＩ因子重軽鎖はそれぞれヒト第ＶＩＩＩ因子重軽鎖である。他の実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドにコードされる第ＶＩＩＩ因子重軽鎖は別の哺乳動物からの重軽鎖配列（例えばブタ第ＶＩＩＩ因子）である。さらに他の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子重軽鎖はキメラ重軽鎖（例えばヒト及び第２哺乳動物配列の組合せ）である。さらに他の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子重軽鎖は、別の哺乳動物からの重軽鎖のヒト化形態、例えば、得られたペプチドのヒトへの投与時の免疫原性を低減すべく別の哺乳動物からの重軽鎖配列に選定位置でのヒト残基による置換を施したものである。
【０１０９】
ヒト遺伝子のＧＣ含有量は２５％未満から９０％超まで実に様々である。しかしながら大抵は、ＧＣ含有量が高いヒト遺伝子ほど高レベルで発現する。例えば、Ｋｕｄｌａ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．，４（６）：８０（２００６））は、遺伝子のＧＣ含有量を増加させると、主に転写の増進及び定常状態でのｍＲＮＡ転写産物レベルの上昇によって、コードされるポリペプチドの発現が増強されることを示している。大抵、コドン最適化遺伝子構築物のＧＣ含有量は６０％以上であることが望まれる。しかしながら、天然ＡＡＶゲノムはＧＣ含有量が５６％あたりである。
【０１１０】
それゆえに、いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるコドン改変型ポリヌクレオチドは、天然ＡＡＶビリオンのＧＣ含有量により近いＣＧ含有量（例えば５６％あたりのＧＣ）を有し、これは、哺乳動物細胞における発現のために従来のコドン最適化がなされたポリヌクレオチドの望ましいＣＧ含有量（例えば６０％以上のＧＣ）よりも低い。実施例１に概説されるように、約５６％のＧＣ含有量を有するものであるＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）は、より高いＧＣ含有量を有する同様にコドン改変されたコード配列と比較してビリオンパッケージングが改善されている。
【０１１１】
このように、いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は６０％未満である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５９％未満である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５８％未満である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５７％未満である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５６％以下である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５４〜５９％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５５〜５９％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５６〜５９％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５４〜５８％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５５〜５８％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５６〜５８％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５４〜５７％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５５〜５７％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５６〜５７％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５４〜５６％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５５〜５６％である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５６±０．５％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５６±０．４％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５６±０．３％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５６±０．２％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５６±０．１％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体ＧＣ含有量は５６％である。
【０１１４】
Ａ．第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン置換リンカー
いくつかの実施形態では、さらに、ＦＶＩＩＩの重鎖と軽鎖との間の結合（例えば野生型第ＶＩＩＩ因子中のＢドメイン）を改変する。ＡＡＶパッケージング容量のサイズ制約のため、Ｂドメインを欠失させた、切り詰めた、及びまたはリンカーで置換した変異体がＦＶＩＩＩ遺伝子療法構築物の有効性を改善せねばならない。最も一般的に使用されるＢドメイン置換リンカーはＳＱ  ＦＶＩＩＩのものであり、これは、リンカー配列としてＢドメインのたったの１４アミノ酸しか保持していない。ブタＶＩＩＩの別の変異体（米国特許第６，４５８，５６３号に記載の「ＯＢＩ−１」）はＣＨＯ細胞において良好に発現し、わずかにより長い２４アミノ酸のリンカーを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコドン改変型ポリヌクレオチドにコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物は、ＳＱ型Ｂドメインリンカー配列を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のコドン改変型ポリヌクレオチドにコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物は、ＯＢＩ−１型Ｂドメインリンカー配列を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ、配列番号１２）のアミノ酸７６０〜７６２／１６５７〜１６６７を含むＳＱ型Ｂドメインリンカー
2021530524.tif 000008
を含む（Ｓａｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：９３（２００１））。いくつかの実施形態では、ＳＱ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ＳＱ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して２つのアミノ酸置換を有する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ、配列番号１２）のアミノ酸７６０／１５８２〜１６６７を含むＧｒｅｅｎｇｅｎｅ型Ｂドメインリンカーを含む（Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１７：１９９９（２００１））。いくつかの実施形態では、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して２つのアミノ酸置換を有する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ、配列番号１２）のアミノ酸７６０〜７６９／１６５７〜１６６７を含む拡張されたＳＱ型Ｂドメインリンカーを含む（Ｔｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１６：３４９（２０１０））。いくつかの実施形態では、拡張されたＳＱ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、拡張されたＳＱ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して２つのアミノ酸置換を有する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型ブタ第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインからのアミノ酸
2021530524.tif 000009
を含むブタＯＢＩ−１型Ｂドメインリンカーを含む（Ｔｏｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：５１７（２０１０））。いくつかの実施形態では、ブタＯＢＩ−１型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ブタＯＢＩ−１型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して２つのアミノ酸置換を有する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ、配列番号１２）のアミノ酸７６０〜７７２／１６５５〜１６６７を含むヒトＯＢＩ−１型Ｂドメインリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＯＢＩ−１型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ヒトＯＢＩ−１型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して２つのアミノ酸置換を有する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型ブタ第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインからのアミノ酸
2021530524.tif 000010
を含むＯ８型Ｂドメインリンカーを含む（Ｔｏｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：５１７（２０１０））。いくつかの実施形態では、ブタＯＢＩ−１型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ブタＯＢＩ−１型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して２つのアミノ酸置換を有する。
【０１２１】
Ｂ．切断可能リンカーを有する第ＶＩＩＩ因子変異体をコードするコドン改変型ポリヌクレオチド
ＣＳ０４コドン改変型ポリヌクレオチド
一実施形態では、本明細書に提供されるコドン改変型ポリヌクレオチドは、インビボで切断されることが可能なリンカーを有する第ＶＩＩＩ因子変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子軽鎖、第ＶＩＩＩ因子重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端に連結しているポリペプチドリンカーを含む。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、第ＶＩＩＩ因子重鎖をコードするＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）の一部であるＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）との高い配列同一性を有する第１ヌクレオチド配列にコードされる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、第ＶＩＩＩ因子軽鎖をコードするＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）の一部であるＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）との高い配列同一性を有する第２ヌクレオチド配列にコードされる。ポリペプチドリンカーは、（例えば前駆体ポリペプチドのインビボでの発現または投与の後に）インビボでの成熟を可能にするものであるフューリン切断部位を含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９９．９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）と同一である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子構築物のポリペプチドリンカーは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸７６０〜７７３に対応する１４アミノ酸のリンカーをコードするものであるＢＤＬＯ０４（配列番号５）との高い配列同一性を有する第３ヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、第３ヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号５）との少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３ヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号５）との少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３ヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号５）との少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３ヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号５）との少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３ヌクレオチド配列はＢＤＬＯ０４（配列番号５）と同一である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）と同一である。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドにコードされる第ＶＩＩＩ因子変異体は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列はＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）と同一である。
【０１２６】
Ｃ．第ＶＩＩＩ因子発現ベクター
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコドン改変型ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込む。発現ベクターの非限定的な例としては、ウイルスベクター（例えば遺伝子療法に適するベクター）、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミド、ファージミド、人工染色体などが挙げられる。
【０１２７】
ウイルスベクターの非限定的な例としては、レトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクチニアウイルス；ならびにポリオウイルスが挙げられる。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコドン改変型ポリヌクレオチドを遺伝子療法ベクターに組み込む。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターはレトロウイルス、特に複製能欠乏型レトロウイルスである。複製能欠乏型レトロウイルスを生産するためのプロトコールは当技術分野で知られている。総説については、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）、及びＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９１）を参照されたい。
【０１２９】
一実施形態では、遺伝子療法ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースの遺伝子療法ベクターである。ＡＡＶシステムは以前に記載がなされたことがあり、当該技術分野で全般的によく知られている（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ  ａｎｄ  Ｖｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０−１７（１９９４）、Ｃｏｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９（１３）：６０９４−９８（１９９２）、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎ，１３（２−３）：１４１−６４（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７−１２９（１９９２）、及びＡｓｏｋａｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０（４）：６９９−７０８（２０１２）、参照によりそれらの各々の全体があらゆる目的のために本明細書に援用される）。ｒＡＡＶベクターの生成及び用途に関する詳細は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に記載されており、参照によりそれらの各々の全体があらゆる目的のために本明細書に援用される。詳しい実施形態において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ−８ベクターである。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコドン改変型ポリヌクレオチドをレトロウイルス発現ベクターに組み込む。これらのシステムは以前に記載がなされたことがあり、当技術分野で全般的によく知られている（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１５３−１５９，１９８３、Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ．，Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，ｐｐ．４９４−５１３，１９８８、Ｔｅｍｉｎ，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９−１８８，１９８６）。具体的な実施形態において、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２（５２５９）：２６３−２６７，１９９６、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１５（９）：８７１−８７５，１９９７、Ｂｌｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７１（９）：６６４１−６６４９，１９９７、米国特許第６，０１３，５１６号及び第５，９９４，１３６を参照されたい）。
【０１３１】
真核生物及び原核生物発現ベクターを含めた細胞培養物におけるコドン改変型ポリペプチドからの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現のために多種多様なベクターが使用され得る。特定の実施形態では、細胞培養物における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現に使用するためにプラスミドベクターを企図する。通常、宿主細胞に適合する種に由来するレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターを、これらの宿主に関連して使用する。ベクターは、複製部位、及び形質転換細胞における表現型選択を提供することができる標示配列を保有し得る。プラスミドは、１つ以上の制御配列、例えばプロモーターに機能可能に繋げられた、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドを含むことになる。
【０１３２】
原核生物発現のためのベクターの非限定的な例としては、プラスミド、例えば、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤなどが挙げられ、原核生物発現ベクターのために使用されるプロモーターとしては、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤなどが挙げられる。真核生物発現のためのベクターの例としては、（ｉ）ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１などのプロモーターを使用して酵母で発現させるためのｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴなどのベクター、（ｉｉ）ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈなどのプロモーターを使用して昆虫細胞で発現させるためのｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣなどのベクター、ならびに（ｉｉｉ）ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ及びβ−アクチンなどのプロモーターを使用して哺乳動物細胞で発現させるための、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶなどのベクター、及びワクチニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどのウイルスシステムに由来するベクターが挙げられる。
【０１３３】
Ｄ．投薬
本発明は、血友病Ａと診断されたヒト患者（「血友病Ａ患者」または「患者」）への本発明のコドン最適化構築物の投与を提供する。総じて、本明細書に概説されるように投与は、本発明のコドン最適化構築物を含有するＡＡＶ粒子を使用して行われる。さらに、以下により詳しく記載されるように本発明の構築物の投与は、プレドニゾロンまたはプレドニゾンも投与することによって増補され得る。
【０１３４】
体重１キログラムあたり２×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子
一態様において本開示は、血友病Ａ患者に、ヒト患者の体重１キログラムあたり２×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を（例えば末梢静脈内輸注によって）静脈内輸注することを含む、血友病Ａを治療する方法であって、ＡＡＶ粒子が、配列番号１（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）との高い配列同一性を有し第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドを含む、当該方法を提供する。
【０１３５】
一実施形態では、ヒト患者の体重１キログラムあたり２×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量でヒト患者に投与される、配列番号１（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）との高い配列同一性を有するコドン改変型ポリヌクレオチドは、インビボで切断されることが可能なリンカーを有する第ＶＩＩＩ因子変異体ポリペプチドをコードする。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子軽鎖、第ＶＩＩＩ因子重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端に連結しているポリペプチドリンカーを含む。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、第ＶＩＩＩ因子重鎖をコードするＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）の一部であるＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）との高い配列同一性を有する第１ヌクレオチド配列にコードされる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、第ＶＩＩＩ因子軽鎖をコードするＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）の一部であるＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）との高い配列同一性を有する第２ヌクレオチド配列にコードされる。ポリペプチドリンカーは、（例えば前駆体ポリペプチドのインビボでの発現または投与の後に）インビボでの成熟を可能にするものであるフューリン切断部位を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９９．９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）と同一である。これらの実施形態では、これらのヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列はＣＳ０４−ＨＣ−ＡＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＡＡと同一である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子構築物のポリペプチドリンカーは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸７６０〜７７３に対応する１４アミノ酸のリンカーをコードするものであるＢＤＬＯ０４（配列番号５）との高い配列同一性を有する第３ヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、第３ヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号５）との少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３ヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号５）との少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３ヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号５）との少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３ヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号５）との少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３ヌクレオチド配列はＢＤＬＯ０４（配列番号５）と同一である。これらの実施形態では、これらのヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列はＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸７６０〜７７３と同一である。いくつかの実施形態では、ヒト患者の体重１キログラムあたり２×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量でヒト患者に投与されるコドン改変型ポリヌクレオチド）は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）と同一である。これらの実施形態では、これらのヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列はＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡと同一である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドにコードされる第ＶＩＩＩ因子変異体は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列はＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）と同一である。
【０１３９】
かくして、一実施形態において本開示は、血友病Ａ患者に、ヒト患者の体重１キログラムあたり２×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を静脈内輸注することを含む、血友病Ａを治療する方法であって、ＡＡＶ粒子が、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を有するポリヌクレオチドを含む、当該方法を提供する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を単回用量で（例えば患者の腕の静脈への）静脈内輸注によって投与する。いくつかの実施形態では、単回用量の一部を投与し、投与に対する副作用の兆候について患者を短期間（例えば３０分間）にわたってモニタリングし、その後、（例えば副作用の兆候が現れない場合に）単回用量の残りの部分を患者に投与する。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を投与されるヒト患者は重度の血友病Ａを有する。例えば、いくつかの実施形態では、患者は、第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けていないとき、彼らの血流における第ＶＩＩＩ因子活性のレベルが、基準血液試料、例えば正常な第ＶＩＩＩ因子活性を有する血液試料（例えば、血友病Ａでないと判定された対象からの血液試料）に認められる第ＶＩＩＩ因子活性、または血友病Ａでないと判定される複数の対象の血液試料に認められる平均第ＶＩＩＩ因子活性の量の２％未満である。いくつかの実施形態では、対象は、第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けていないとき、彼らの血流における第ＶＩＩＩ因子活性のレベルが、基準血液試料に認められる第ＶＩＩＩ因子活性の量の２％未満である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を投与されるヒト患者は、ＦＶＩＩＩに対するインヒビター（例えば第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体）、重度の血友病Ａ以外の止血障害、慢性肝機能不全及び／または重度の腎機能障害を有していない。
【０１４３】
かくして、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ヒト患者の体重１キログラムあたり２×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量の投与に関して患者の適格性確認を行うステップを含み、ＡＡＶ粒子は、配列番号１（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）との高い配列同一性を有する、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドを含む。方法は、患者が第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けていないときに患者の血流における第ＶＩＩＩ因子活性のレベルを決定すること、及び患者の血流における第ＶＩＩＩ因子活性のレベルが基準試料における第ＶＩＩＩ因子のレベルの約２％未満または約１％未満である場合にＡＡＶ粒子の投与に関して患者の適格性確認を行うことを含む。いくつかの実施形態では、方法は、患者がＦＶＩＩＩに対するインヒビター（例えば第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体）、重度の血友病Ａ以外の止血障害、慢性肝機能不全及び重度の腎機能障害のうちの１つ以上を有するか否かを判定すること、ならびに列挙される症状のいずれかを患者が有している場合に彼らを不適格とみなすことを含む。
【０１４４】
体重１キログラムあたり６×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子
一態様において本開示は、血友病Ａ患者に、ヒト患者の体重１キログラムあたり６×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を（例えば末梢静脈内輸注によって）静脈内輸注することを含む、血友病Ａを治療する方法であって、ＡＡＶ粒子が、配列番号１（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）との高い配列同一性を有し第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドを含む、当該方法を提供する。
【０１４５】
一実施形態では、ヒト患者の体重１キログラムあたり６×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量でヒト患者に投与される、配列番号１（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）との高い配列同一性を有するコドン改変型ポリヌクレオチドは、インビボで切断されることが可能なリンカーを有する第ＶＩＩＩ因子変異体ポリペプチドをコードする。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子軽鎖、第ＶＩＩＩ因子重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端に連結しているポリペプチドリンカーを含む。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、第ＶＩＩＩ因子重鎖をコードするＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）の一部であるＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）との高い配列同一性を有する第１ヌクレオチド配列にコードされる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、第ＶＩＩＩ因子軽鎖をコードするＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）の一部であるＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）との高い配列同一性を有する第２ヌクレオチド配列にコードされる。ポリペプチドリンカーは、（例えば前駆体ポリペプチドのインビボでの発現または投与の後に）インビボでの成熟を可能にするものであるフューリン切断部位を含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）との少なくとも９９．９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ヌクレオチド配列はそれぞれＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び配列番号４）と同一である。これらの実施形態では、これらのヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列はＣＳ０４−ＨＣ−ＡＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＡＡと同一である。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子構築物のポリペプチドリンカーは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸７６０〜７７３に対応する１４アミノ酸のリンカーをコードするものであるＢＤＬＯ０４（配列番号５）との高い配列同一性を有する第３ヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、第３ヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号５）との少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３ヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号５）との少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３ヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号５）との少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３ヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号５）との少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３ヌクレオチド配列はＢＤＬＯ０４（配列番号５）と同一である。これらの実施形態では、これらのヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列はＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸７６０〜７７３と同一である。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ヒト患者の体重１キログラムあたり６×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量でヒト患者に投与されるコドン改変型ポリヌクレオチド）は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）との少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）と同一である。これらの実施形態では、これらのヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列はＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡと同一である。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドにコードされる第ＶＩＩＩ因子変異体は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）との少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列はＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）と同一である。
【０１５０】
かくして、一実施形態では、本開示は、血友病Ａ患者に、ヒト患者の体重１キログラムあたり６×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を静脈内輸注することを含む、血友病Ａを治療する方法であって、ＡＡＶ粒子が、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を有するポリヌクレオチドを含む、当該方法を提供する。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を単回用量で（例えば患者の腕の静脈への）静脈内輸注によって投与する。いくつかの実施形態では、単回用量の一部を投与し、投与に対する副作用の兆候について患者を短期間（例えば３０分間）にわたってモニタリングし、その後、（例えば副作用の兆候が現れない場合に）単回用量の残りの部分を患者に投与する。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を投与されるヒト患者は重度の血友病Ａを有する。例えば、いくつかの実施形態では、患者は、第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けていないとき、彼らの血流における第ＶＩＩＩ因子活性のレベルが、基準血液試料、例えば正常な第ＶＩＩＩ因子活性を有する血液試料（例えば、血友病Ａでないと判定された対象からの血液試料）に認められる第ＶＩＩＩ因子活性、または血友病Ａでないと判定される複数の対象の血液試料に認められる平均第ＶＩＩＩ因子活性の量の２％未満である。いくつかの実施形態では、対象は、第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けていないとき、彼らの血流における第ＶＩＩＩ因子活性のレベルが、基準血液試料に認められる第ＶＩＩＩ因子活性の量の２％未満である。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を投与されるヒト患者は、ＦＶＩＩＩに対するインヒビター（例えば第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体）、重度の血友病Ａ以外の止血障害、慢性肝機能不全及び／または重度の腎機能障害を有していない。
【０１５４】
かくして、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ヒト患者の体重１キログラムあたり６×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量の投与に関して患者の適格性確認を行うステップを含み、ＡＡＶ粒子は、配列番号１（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）との高い配列同一性を有する、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドを含む。方法は、患者が第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けていないときに患者の血流における第ＶＩＩＩ因子活性のレベルを決定すること、及び患者の血流における第ＶＩＩＩ因子活性のレベルが基準試料における第ＶＩＩＩ因子のレベルの約２％未満または約１％未満である場合にＡＡＶ粒子の投与に関して患者の適格性確認を行うことを含む。いくつかの実施形態では、方法は、患者がＦＶＩＩＩに対するインヒビター（例えば第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体）、重度の血友病Ａ以外の止血障害、慢性肝機能不全及び重度の腎機能障害のうちの１つ以上を有するか否かを判定すること、ならびに列挙される症状のいずれかを患者が有している場合に彼らを不適格とみなすことを含む。
【０１５５】
プレドニゾロンまたはプレドニゾンとの共投与
いくつかの実施形態では、いずれかの用量でＡＡＶ粒子を投与することによって血友病Ａを治療する上記方法は、例えば対象のサイトカイン及び／またはケモカインの産生を減らすことによって例えば炎症反応のレベルを低減するためにプレドニゾロンまたはプレドニゾンのクールをヒト患者に投与することも含む。遺伝子療法と共にプレドニゾロンまたはプレドニゾンを共投与する方法の例は、例えば国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０６９９４２号に記載されており、参照によりその内容全体があらゆる目的のために本明細書に援用される。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、プレドニゾロンまたはプレドニゾンは、配列番号１（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）との配列同一性が高く第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与する前にヒト患者に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、患者にＡＡＶ粒子を投与する約１週間前または約１もしくは２日前にプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を投与する約１週間前または約１もしくは２日前からプレドニゾロンまたはプレドニゾンのクールを施し始めて、ＡＡＶ粒子の投与後も継続する。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、配列番号１（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）との配列同一性が高く第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与する時にプレドニゾロンまたはプレドニゾンをヒト対象に共投与する。例えば、いくつかの実施形態では、同じ日、例えばＡＡＶ粒子の投与の直前または直後に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を投与するのと同じ日にプレドニゾロンまたはプレドニゾンのクールを施して、ＡＡＶ粒子の投与後も継続する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、配列番号１（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）との配列同一性が高く第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与した後にプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与する。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を患者に投与してから約１または２日後にプレドニゾロンまたはプレドニゾンを最初に投与する。
【０１５９】
プレドニゾロンまたはプレドニゾンが（静脈内投与されることもできるが）経口投与される低分子薬であり、そのためこの文脈において「共投与」は単一の液剤が両方の薬物を含有することを必要としない、ということに留意すべきである。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、少なくとも２週間の期間にわたって例えば毎日または２日ごとにプレドニゾロンまたはプレドニゾンのクールを患者に施す。いくつかの実施形態では、少なくとも３週間の期間にわたってプレドニゾロンまたはプレドニゾンのクールを施す。いくつかの実施形態では、プレドニゾロンまたはプレドニゾンの用量はクール中に減少する。例えば、一実施形態では、クールを１日あたり約６０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンの投与から開始し、クールの進行とともに減らしてゆく。
【０１６１】
一実施形態では、クールは、クールの第１週の間、１日あたり約６０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをヒト患者に投与すること、クールの第２週の間、１日あたり約４０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与すること、及びＡＡＶ粒子の輸注の直後の第３週の間、１日あたり約３０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与することを含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、クールは、第３週の後にプレドニゾロンまたはプレドニゾンをさらに漸減投与すること、例えば、プレドニゾロンまたはプレドニゾンの漸減用量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、プレドニゾロンまたはプレドニゾンの漸減用量は、１日あたり約２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾン、１日あたり約１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾン、１日あたり約１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾン、及び１日あたり約５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンの用量（例えば各濃度で１回分以上の用量）を連続投与することを含む。
【０１６３】
一実施形態では、プレドニゾロンまたはプレドニゾンの漸減用量は、プレドニゾロンまたはプレドニゾンの初回クールの完了後（例えば完了直後）の連続する５日間にわたって１日あたり約２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与すること、２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与した５日間の後（例えば直後）の連続する３日間にわたって１日あたり約１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与すること、１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与した３日間の後（例えば直後）の連続する３日間にわたって１日あたり約１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与すること、及び１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与した３日間の後（例えば直後）の連続する３日間にわたって１日あたり約５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与することを含む。
【０１６４】
一実施形態では、プレドニゾロンまたはプレドニゾンの漸減用量は、プレドニゾロンまたはプレドニゾンの初回クールの完了直後の連続する７日間にわたって１日あたり約３０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与すること、３０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与した７日間の直後の連続する７日間にわたって１日あたり約２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与すること、２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをヒト対象に投与した７日間の直後の連続する５日間にわたって１日あたり約１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与すること、１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与した５日間の直後の連続する５日間にわたって１日あたり約１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与すること、及び１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与した５日間の直後の連続する５日間にわたって１日あたり約５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与することを含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、患者に投与するプレドニゾロンまたはプレドニゾンの漸減用量の長さは、プレドニゾロンまたはプレドニゾンの初回クールの最後に患者がなおも（例えば、第ＶＩＩＩ因子レベル、例えば第ＶＩＩＩ因子力価もしくは第ＶＩＩＩ因子活性の低下、または肝臓酵素の増加によって示される）肝臓炎症の兆候を呈しているか否かに基づいて決定される。
【０１６６】
例えば、一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を患者に投与した後、患者がグルココルチコイドステロイド治療の初回クールを受けている間に、患者の血流（例えば患者から採集した血液試料）における第ＶＩＩＩ因子の第１レベル（例えば力価または活性）を決定する。グルココルチコイドステロイド治療の初回クールが完了した後、患者の血流における第ＶＩＩＩ因子の第２レベル（例えば力価または活性）を決定する。その後、第ＶＩＩＩ因子の第２レベルを第ＶＩＩＩ因子の第１レベルと比較する。第ＶＩＩＩ因子の第２レベルが低下していない場合（例えば、第ＶＩＩＩ因子の第２レベルが、第ＶＩＩＩ因子の第１レベル以上である、または第ＶＩＩＩ因子の第１レベル未満の閾値量以上である場合）、３週間以内の期間にわたって第１漸減用量のグルココルチコイドステロイドを患者に投与する。第ＶＩＩＩ因子の第２レベルが低下している場合（例えば、第ＶＩＩＩ因子の第２レベルが、第ＶＩＩＩ因子の第１レベル未満である、または第ＶＩＩＩ因子の第１レベル未満の閾値量未満である場合）、３週間を超える期間にわたって第２漸減用量のグルココルチコイドステロイドを患者に投与する。
【０１６７】
同様に、いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の患者への投与の前（例えば、または少し後）に、患者の血流における肝臓酵素の第１レベル（例えば肝臓酵素の力価または活性）を決定する。グルココルチコイドステロイド治療の初回クールが完了した後、患者の血流における肝臓酵素の第２レベル（例えば肝臓酵素の力価または活性）を決定する。その後、肝臓酵素の第２レベルを肝臓酵素の第１レベルと比較する。肝臓酵素の第２レベルが上昇していない場合（例えば、肝臓酵素の第２レベルが、肝臓酵素の第１レベル以下である、または肝臓酵素の第１レベルを上回る閾値量以下である場合）、３週間以内の期間にわたって第１漸減用量のグルココルチコイドステロイドを患者に投与する。肝臓酵素の第２レベルが上昇している場合（例えば、肝臓酵素の第２レベルが、肝臓酵素の第１レベルよりも高い、または肝臓酵素の第１レベルを上回る閾値量よりも高い場合）、３週間を超える期間にわたって第２漸減用量のグルココルチコイドステロイドを患者に投与する。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、プレドニゾロンまたはプレドニゾンの第１漸減用量は、プレドニゾロンまたはプレドニゾンの初回クールの完了後（例えば完了直後）の連続する５日間にわたって１日あたり約２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与すること、２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与した５日間の後（例えば直後）の連続する３日間にわたって１日あたり約１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与すること、１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをヒト対象に投与した３日間の後（例えば直後）の連続する３日間にわたって１日あたり約１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与すること、及び１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与した３日間の後（例えば直後）の連続する３日間にわたって１日あたり約５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与することを含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、プレドニゾロンまたはプレドニゾンの第２漸減用量は、プレドニゾロンまたはプレドニゾンの初回クールの完了直後の連続する７日間にわたって１日あたり約３０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与すること、３０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与した７日間の直後の連続する７日間にわたって１日あたり約２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与すること、２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与した７日間の直後の連続する５日間にわたって１日あたり約１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与すること、１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与した５日間の直後の連続する５日間にわたって１日あたり約１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与すること、及び１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与した５日間の直後の連続する５日間にわたって１日あたり約５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に投与することを含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子の投与に続いて患者における免疫応答の徴候を検出した後に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンのクールを施す。いくつかの実施形態では、患者における肝臓炎症の徴候を検出した後にプレドニゾロンまたはプレドニゾンのクールを施す。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子の投与後に肝臓炎症があるかについて患者をモニタリングし、肝臓炎症を検出した時点でプレドニゾロンまたはプレドニゾンのクールを患者に施す。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、患者の血流における第ＶＩＩＩ因子発現または第ＶＩＩＩ因子活性の急激または大幅な低下は対象における肝臓炎症を示唆している。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子活性の早期ピークに続く小幅及び／または緩徐な低下が観察され得、その後、プレドニゾロンまたはプレドニゾンのクールを施す必要がない幾分より低いレベルで第ＶＩＩＩ因子タンパク質が作られ得る、という可能性がある。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子の投与に続いて患者血流における第ＶＩＩＩ因子の量（例えば第ＶＩＩＩ因子力価または第ＶＩＩＩ因子活性レベル）をモニタリングし、第ＶＩＩＩ因子の量の急激または大幅な低下（例えば、ＡＡＶ粒子の投与後の患者血流におけるレベルと比較した場合に第ＶＩＩＩ因子力価または第ＶＩＩＩ因子活性レベルの閾値を超える低下）が検出される場合に対象にプレドニゾロンまたはプレドニゾンのクールを施す。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、患者における肝臓酵素のレベルの上昇は対象における肝臓炎症を示唆している。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子の投与に続いて患者における肝臓酵素のレベルをモニタリングし、肝臓酵素のレベルの上昇（例えばＡＡＶ粒子の投与前またはＡＡＶ粒子の投与の少し後での患者における肝臓酵素のベースラインレベルと比較した場合に、肝臓酵素の量の閾値を超える上昇）が検出される場合に対象患者（ｓｕｂｊｅｐａｔｉｅｎｔｃｔ）にプレドニゾロンまたはプレドニゾンのクールを施す。
【０１７３】
投与後のモニタリング
いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号１（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）との配列同一性が高いポリヌクレオチドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の投与後に副作用及び／または治療有効性について患者をモニタリングする方法が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）（例えば第ＶＩＩＩ因子レベル（例えば力価または活性）の急激もしくは大幅な低下及び／または肝臓酵素（例えば力価または活性）の増加による）肝臓炎症の徴候、（ｂ）患者の血流における第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の増加、（ｃ）患者の血流におけるカプシドタンパク質の増加、（ｄ）患者の血流における抗カプシドタンパク質抗体の増加、ならびに（ｅ）患者の血流における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片の増加のうちの１つ以上について患者をモニタリングする。いくつかの実施形態では、治療の１つ以上の副作用及び／または無効性が検出された時点で対象をさらに治療する。
【０１７４】
例えば、一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を使用して血友病Ａの第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法の有効性をモニタリングする方法が提供される。方法は、ＡＡＶ粒子を患者に投与した後に第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体が患者の血流中（例えば患者から採集した血液試料の中）に存在しているか否かを判定することを含む。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体が患者の血流中に検出される場合（例えば、ＡＡＶ粒子の投与前の患者におけるレベルと比較して第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体のレベルの上昇が検出される場合）、方法は、血友病Ａの治療のための代替薬剤を患者に投与することを含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、血友病Ａの治療のための代替薬剤は、第ＶＩＩＩ因子の代替形態（例えば、検出された第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の標的となる多くのエピトープの１つを含まないかまたはそれが隠されているもの）である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子の代替形態は、化学修飾された第ＶＩＩＩ因子タンパク質（例えば、化学修飾されたヒトまたはブタ第ＶＩＩＩ因子タンパク質）である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子の代替形態は、非ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質に由来する第ＶＩＩＩ因子タンパク質、例えば、ブタ第ＶＩＩＩ因子タンパク質である。いくつかの実施形態では、血友病Ａを治療するための代替薬剤は、第ＶＩＩＩ因子バイパス療法、例えば、第ＩＩ因子、第ＩＸ因子及び第Ｘ因子を含む治療剤である。例えば、いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子バイパス療法は、第ＶＩＩＩ因子インヒビターバイパス活性（ＦＥＩＢＡ）複合体、組換え活性型第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）、プロトロンビン複合体濃縮物、または活性型プロトロンビン複合体濃縮である。
【０１７６】
一実施形態では、ＡＡＶ粒子の投与後の患者の血流における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片のレベルをモニタリングする方法が提供される。一実施形態では、方法は、患者の体重１キログラムあたりのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を血友病Ａ患者に投与することを含み、第１の時間点において、ＡＡＶ粒子は、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。方法は、後の時間点において、患者の血流における第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその断片のレベルを測定することも含み、後の時間点は７日以降である。一実施形態では、方法は、血友病Ａ患者に、患者の体重１キログラムあたり２×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することを含み、第１の時間点において、ＡＡＶ粒子は、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を有するポリヌクレオチドを含む。方法は、後の時間点において、患者の血流における配列番号１の核酸またはその断片のレベルを測定することも含み、後の時間点は７日以降である。一実施形態では、方法は、血友病Ａ患者に、患者の体重１キログラムあたり６×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することを含み、第１の時間点において、ＡＡＶ粒子は、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を有するポリヌクレオチドを含む。方法は、後の時間点において、患者の血流における配列番号１の核酸またはその断片のレベルを測定することも含み、後の時間点は７日以降である。方法のいくつかの実施形態では、後の時間点は少なくとも１４日以降または少なくとも２１日以降である。いくつかの実施形態では、後の時間点はＡＡＶ粒子の投与の７日後、１４日後または２１日後である。
【０１７７】
一実施形態では、ＡＡＶ粒子の投与後の患者の血流におけるカプシドタンパク質のレベルをモニタリングする方法が提供される。一実施形態では、方法は、血友病Ａ患者に上記患者の体重１キログラムあたり２×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することを含み、第１の時間点において、ＡＡＶ粒子は、カプシドタンパク質と、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を含むポリヌクレオチドとを含む。方法は、後の時間点において、上記患者の血流におけるカプシドタンパク質のレベルを測定することも含み、後の時間点は７日以降である。一実施形態では、方法は、血友病Ａ患者に、患者の体重１キログラムあたり６×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することを含み、第１の時間点において、ＡＡＶ粒子は、カプシドタンパク質と、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を含むポリヌクレオチドとを含む。方法は、後の時間点において、上記患者の血流におけるカプシドタンパク質のレベルを測定することも含み、後の時間点は７日以降である。一実施形態では、方法は、血友病Ａ患者に上記患者の体重１キログラムあたりのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することを含み、第１の時間点において、ＡＡＶ粒子は、カプシドタンパク質と、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む。方法は、後の時間点において、上記患者の血流におけるカプシドタンパク質のレベルを測定することも含み、後の時間点は７日以降である。方法のいくつかの実施形態では、後の時間点は少なくとも１４日以降または少なくとも２１日以降である。いくつかの実施形態では、後の時間点はＡＡＶ粒子の投与の７日後、１４日後または２１日後である。
【０１７８】
一実施形態では、ＡＡＶ粒子の投与後に患者の血流における第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体のレベルをモニタリングする方法が提供される。一実施形態では、方法は、血友病Ａ患者に、患者の体重１キログラムあたり２×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することを含み、第１の時間点において、ＡＡＶ粒子は、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を含むポリヌクレオチドを含む。方法は、後の時間点において、患者の血流における抗第ＶＩＩＩ因子抗体のレベルを測定することも含み、後の時間点は７日以降である。一実施形態では、方法は、血友病Ａ患者に、患者の体重１キログラムあたり６×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することを含み、第１の時間点において、ＡＡＶ粒子は、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を含むポリヌクレオチドを含む。方法は、後の時間点において、ｔｅｈ患者の血流における抗第ＶＩＩＩ因子抗体のレベルを測定することも含み、上記後の時間点は７日以降である。一実施形態では、方法は、血友病Ａ患者にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することを含み、第１の時間点において、ＡＡＶ粒子は、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。方法は、後の時間点において、ｔｅｈ患者の血流における抗第ＶＩＩＩ因子抗体のレベルを測定することも含み、上記後の時間点は７日以降である。方法のいくつかの実施形態では、後の時間点は少なくとも１４日以降または少なくとも２１日以降である。いくつかの実施形態では、後の時間点はＡＡＶ粒子の投与の７日後、１４日後または２１日後である。
【０１７９】
一実施形態では、ＡＡＶ粒子の投与後に対象の血流における抗カプシドタンパク質抗体のレベルをモニタリングする方法が提供される。一実施形態では、方法は、血友病Ａ患者に上記患者の体重１キログラムあたり２×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することを含み、第１の時間点において、ＡＡＶ粒子は、カプシドタンパク質と、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を含むポリヌクレオチドとを含む。方法は、後の時間点において、患者の血流における抗カプシドタンパク質抗体のレベルを測定することも含み、後の時間点は７日以降である。一実施形態では、方法は、血友病Ａ患者に、患者の体重１キログラムあたり６×１０１２個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することを含み、第１の時間点において、ＡＡＶ粒子は、カプシドタンパク質と、配列番号１の核酸配列（ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ）を含むポリヌクレオチドとを含む。方法は、後の時間点において、上記患者の血流における抗カプシドタンパク質抗体のレベルを測定することも含み、後の時間点は７日以降である。一実施形態では、方法は、血友病Ａ患者に、患者の体重１キログラムあたりのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の用量を投与することを含み、第１の時間点において、ＡＡＶ粒子は、カプシドタンパク質と、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む。方法は、後の時間点において、上記患者の血流における抗カプシドタンパク質抗体のレベルを測定することも含み、後の時間点は７日以降である。方法のいくつかの実施形態では、後の時間点は少なくとも１４日以降または少なくとも２１日以降である。いくつかの実施形態では、後の時間点はＡＡＶ粒子の投与の７日後、１４日後または２１日後である。
【実施例】
【０１８０】
ＩＶ．実施例
実施例１−コドン改変型第ＶＩＩＩ因子変異体発現配列の構築
血友病Ａの遺伝子療法に効果的な第ＶＩＩＩ因子コード配列を作り出すには２つの障壁を乗り越えねばならなかった。第一に、従来の遺伝子療法送達ベクター（例えばＡＡＶビリオン）のゲノムサイズの制限ゆえに、コードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをかなり短くせねばならなかった。第二に、（ｉ）送達ベクター内でのパッケージング相互作用を安定化させるように、（ｉｉ）ｍＲＮＡ中間段階を安定化させるように、及び（ｉｉｉ）ｍＲＮＡの転写／翻訳の堅牢性を改善するようにコード配列を改変せねばならなかった。
【０１８１】
第一の目的を達成するために、本出願人らは、本明細書中で「ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−ＳＱ」と呼称されるＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子変異体構築物から出発した。この構築物ではＢドメインが、「ＳＱ」配列と呼称される１４アミノ酸の配列で置き換えられている。組換えＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−ＳＱはＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）の商標名で販売されており、血友病Ａの管理に有効であることが示されている。しかしながら、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−ＳＱの天然のコード配列は、第ＶＩＩＩ因子重軽鎖のヒト野生型核酸配列を含むものであるが、遺伝子療法ベクターにおける発現が効果的でない。
【０１８２】
天然ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−ＳＱの発現の乏しさに対処するために、Ｆａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，６：ｅ１７５９６（２０１１））に記載されているコドン最適化アルゴリズムをＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ，１１７：７９８（２０１１））及びＭｃＩｎｔｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ，１２１，３３３５−３３４４（２０１３））に記載されているように改変したものをＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−ＳＱ配列に適用して、第１中間コード配列ＣＳ０４ａを作出した。しかしながら、本出願人らは、改変アルゴリズムを使用して作出されたＣＳ０４ａ配列が配列のさらなる改変によって改良され得ることを認識した。結果的に本出願人らは、ＣｐＧ島、ならびにＡＴに富む範囲及びＧＣに富む範囲の局所過剰出現を避けつつ、ＣｐＧジヌクレオチドを再導入し、アルギニンのためのＣＧＣコドンを再導入し、ロイシン及びセリンコドン分布を変化させ、高度に保存されたコドン対を再導入し、不可解なＴＡＴＡボックス、ＣＣＡＡＴボックス及びスプライス部位エレメントを除去した。
【０１８３】
第一に、改変アルゴリズムは、ＣｐＧジヌクレオチドを含有するコドン（例えばアルギニンコドン）を非ＣｐＧジヌクレオチドコドンで体系的に置き換え、隣接コドンによって作り出されるＣｐＧジヌクレオチドを排除／回避する。ＣｐＧジヌクレオチドのこの厳密な回避は通常、ＤＮＡワクチンの筋肉内注射後にＴＬＲによって誘導される免疫性を防止するために行われる。しかしながら、そうすることによってコドン最適化の可能性が制限される。例えば、改変アルゴリズムは、ＣＧＸのアルギニンコドンの全セットの使用を排除する。これは、ヒト細胞における発現のための遺伝子をコードする際に特に妨害となる。というのも、高度に発現するヒト遺伝子においてＣＧＣは最も頻繁に使用されるアルギニンコドンであるからである。加えて、隣接コドンによってＣｐＧが作り出されるのを回避することは、最適化の可能性をさらに制限する（例えば、一緒に使用され得るコドン対の数を制限する）。
【０１８４】
ＴＬＲによって誘導される免疫性が、肝臓特異的なＡＡＶベースの遺伝子療法に関連する問題になるとは予想されないので、ＣｐＧを含むコドン、及びＣｐＧを作り出す隣接コドンを中間コード配列ＣＳ０４ａの中、好ましくは第ＶＩＩＩ因子軽鎖をコードする配列の中（例えば、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−ＳＱコード配列の３’末端）に再導入した。これによって、望ましいヒトコドン、特にアルギニンのためのものをより頻繁に使用することが可能になった。但し、ＣｐＧ部位の頻度が高いコード配列の領域であるＣｐＧ島が作り出されるのを回避するように注意を払った。このことは、転写開始部位の下流にあるＣｐＧドメインが高レベルの遺伝子発現を促進すると示唆するＫｒｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４２（６）：３５５１−６４（２０１４））の教示内容とは逆である。
【０１８５】
第二に、改変アルゴリズムは専ら特定のコドン、例えばロイシンにはＣＴＧ、バリンにはＧＴＧ、及びグルタミンにはＣＡＧを適用する。しかしながら、このことは、例えばＨａａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６（３）：３１５−２４（１９９６））において提唱されているような均衡の取れたコドン使用の原理に反する。改変アルゴリズムによる望ましいコドンの過剰使用に対応すべく、コドン改変に適用される他の法則（例えばＣｐＧ頻度及びＧＣ含有量）によって許容される場合に代替ロイシンコドンを再導入した。
【０１８６】
第三に、改変アルゴリズムは、特定の基準（例えばＣＧジヌクレオチドの存在）が満たされる場合にコドン対を、それらが天然においてどのくらい保存されているかを考慮せずに置き換える。進化によって保存されてきた可能性がある有益な特性に対応すべく、アルゴリズムによって置き換えられた最も保存されているコドン対、及び例えばＴａｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ９：４６３（２００８））に記載されているような最も保存されている望ましいコドン対を、解析し、コドン改変に適用される他の法則（例えばＣｐＧ頻度及びＧＣ含有量）によって許容される場合に調整した。
【０１８７】
第四に、中間コード配列に使用されるセリンコドンも再操作した。具体的には、全体的にヒトコドン利用（Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．、上記）とより良好に一致するようにＡＧＣ、ＴＣＣ及びＴＣＴセリンコドンをより高い頻度で改変コード配列に導入した。
【０１８８】
第五に、ＴＡＴＡボックス、ＣＣＡＡＴボックスエレメント、及びイントロン／エクソンスプライス部位を選別して改変コード配列から除去した。コード配列を改変する際、ＡＴに富む範囲またはＧＣに富む範囲の局所過剰出現を回避するように注意を払った。
【０１８９】
最後に、コード配列内でのコドン利用を最適化する以外にも、中間コード配列ＣＳ０４ａをさらに改良していく際に、基礎をなすＡＡＶビリオンの構造要件を考慮した。ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶビリオンの核酸部分）を一本鎖ＤＮＡ分子としてそれらのカプシド内にパッケージングした（総説についてはＤａｙａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．，２１（４）：５８３−９３（２００８）を参照されたい）。したがって、ベクターのＧＣ含有量は、ゲノムのパッケージング、ゆえに製造中のベクター収率に影響を与える可能性がある。多くのアルゴリズムと同様に、ここで使用する改変アルゴリズムは、少なくとも６０％のＧＣ含有量を有する最適化された遺伝子配列を作り出す（Ｆａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，６（３）：ｅｌ７５９６（２０１１）（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，（６）３（２０１１）の中の正誤表）を参照のこと）。しかしながら、ＡＡＶ８カプシドタンパク質は、より低い約５６％のＧＣ含有量を有するヌクレオチド配列にコードされる。このため、天然ＡＡＶ８カプシドタンパク質コード配列をより良く模倣するために中間コード配列ＣＳ０４ａのＧＣ含有量を５６％に減らした。
【０１９０】
得られたＣＳ０４コード配列は、図２に示されるが、５６％の全体ＧＣ含有量を有する。配列のＣｐＧジヌクレオチド含有量は中程度である。しかしながら、ＣｐＧジヌクレオチドは主にコード配列の下流部分、例えば、第ＶＩＩＩ因子軽鎖をコードする部分にある。ＣＳ０４配列は、野生型第ＶＩＩＩ因子中の対応するコード配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１４１１３）とのヌクレオチド配列同一性が７９．７７％である。
【０１９１】
比較目的のために、いくつかの他のコドン最適化ＲｅＦａｃｔｏ構築物を作製した。ＣＳ０８ＲｅＦａｃｔｏ構築物は、参照によりその内容全体があらゆる目的のために本明細書に明示的に援用される、Ｒａｄｃｌｉｆｆ  Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１５：２８９−９７（２００８）に記載のとおりにコドン最適化された。ＣＳ１０コドン最適化ＲｅＦａｃｔｏ構築物はＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ＣＳ１１コドン最適化ＲｅＦａｃｔｏ構築物はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）から入手した。ＣＨ２５コドン最適化ＲｅＦａｃｔｏ構築物はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ’ｓ  ＧｅｎｅＡｒｔ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ＣＳ４０ＲｅＦａｃｔｏ構築物は野生型第ＶＩＩＩ因子コード配列からなる。各ＲｅＦａｃｔｏコード配列の間で共有される配列同一性を以下の表２に示す。
【０１９２】
（表２）コドン改変型第ＶＩＩＩ因子構築物の同一性パーセントの一覧
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【０１９３】
各構築物のプラスミドは、種々の合成ＤＮＡ断片を同じベクター骨格プラスミド（ｐＣｈ−ＢＢ０１）にクローニングすることによって構築された。隣接ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ酵素制限部位を有するＲｅｆａｃｔｏ型ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ断片のＤＮＡ合成は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって行われた。ベクター骨格は、肝臓特異的マウストランスサイレチン遺伝子に由来するプロモーター／エンハンサー配列を包含する２つの隣接ＡＡＶ２由来末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、それぞれのＲｅｆａｃｔｏ型ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの挿入のためのＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ酵素制限部位、ならびに合成ポリＡ部位を含有する。作製されたベクター骨格とインサートとをＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ部位を介してライゲートした後、得られたプラスミドをミリグラム規模に増幅した。構築物のＲｅｆａｃｔｏ型ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ配列の確認を直接的配列決定（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって行った。クローニングによって、ｐＣＳ４０、ｐＣＳ０４、ｐＣＳ０８、ｐＣＳ１０、ｐＣＳ１１及びｐＣｈ２５と名付けた７つの異なるプラスミド構築物を得た（図１４）。構築物は同じベクター骨格を有し、同じＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質（Ｒｅｆａｃｔｏ型ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）をコードするが、それらのＦＶＩＩＩコード配列が異なっている。
【０１９４】
ＡＡＶ８ベースのベクターは、参照によりその内容全体があらゆる目的のために本明細書に援用される、Ｇｒｉｅｇｅｒ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．（Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ＨＥＫ２９３  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｈａｒｖｅｓｔ  ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉａ  ｆｏｒ  ＧＭＰ  ＦＩＸ  ａｎｄ  ＦＬＴ１  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．，Ｏｃｔ  ６．（２０１５）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１５．１８７．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］）に記載されているような３つのプラスミドトランスフェクション方法によって作製された。対応するＦＶＩＩＩベクタープラスミド、（アデノウイルスヘルパー遺伝子を保有する）ヘルパープラスミドｐＸＸ６−８０、及び（ｒｅｐ２及びｃａｐ８遺伝子をもたらす）パッケージングプラスミドｐＧＳＫ２／８を使用するプラスミドトランスフェクションのためにＨＥＫ２９３懸濁液細胞を使用した。ＡＡＶ８構築物を単離するために、Ｇｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５、上記）に記載されているようにイオジキサノール勾配を用いて１リットルの培養物の細胞ペレットを処理した。手順の結果として、ｖＣＳ０４、ｖＣＳ０８、ｖＣＳ１０、ｖＣＳ１１及びｖＣＨ２５と呼ぶベクター作製物が得られた。ＡＡＶ２末端逆位反復配列を標的とする普遍的ｑＰＣＲ手順を用いてベクターをｑＰＣＲで定量した（Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＰａｒｔＢ  ２３：１８−２８（２０１２））。ＡＡＶ２末端逆位反復配列を保有する対照ベクタープラスミドを標準曲線の作成に役立てた。得られたｖＣＳ０４構築物を図７Ａ〜Ｃに配列番号８として示す。
【０１９５】
ベクターゲノムの完全性をＡＡＶアガロースゲル電気泳動で分析した。電気泳動は、Ｆａｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３：１−７（２０１２）に記載されているように実施した。手短に述べると、ＡＡＶベクター作製物を７５℃で１０分間、０．５％のＳＤＳの存在下でインキュベートし、その後室温に冷ました。およそ１．５Ｅ１０ベクターゲノム（ｖｇ）を１％の１ｘＴＡＥアガロースゲルの各レーンに添加し、７Ｖ／ｃｍゲル長で６０分間電気泳動を行った。その後、ゲルを２ｘのＧｅｌＲｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍ  カタログ＃４１００３）溶液で染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭＭＰ（Ｂｉｏｒａｄ）によって撮像した。図１５に示す結果は、ｖＣＳ０４及びｖＣＳ４０ウイルスベクターが、５ｋｂ範囲内の明確なバンドで示される、同じサイズのゲノムを有することを実証している（図１５、レーン２〜４）。およそ５．２ｋｂのベクターサイズにもかかわらず、ゲノムは均一なバンドであり、（４．７ｋｂのＡＡＶ野生型ゲノムに対して）いくぶん超過したサイズのゲノムの正確なパッケージングを裏付けていた。他の全てのｖＣＳベクター作製物は同じゲノムサイズを示す（データ示さず）。
【０１９６】
カプシドタンパク質の予期されたパターンを確認するために、ベクターｖＣＳ０４及びｖＣＳ４０についてＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びこれに続く銀染色を実施した（図１６）。図に示すように、下流の精製手順によって、予期したＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３のタンパク質パターンを呈する、高度に精製された材料が得られた（図１６、レーン２〜４）。他の全てのウイルス作製物について、同じパターンがみられた（図示せず）。ＡＡＶ作製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ手順を標準的な手順に従って行った。各レーンは１Ｅ１０ｖｇのそれぞれのウイルス構築物を含有し、これを４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ゲルで製造業者の指示に従って分離した。銀染色をＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔＴＭキット（Ｎｏｖｅｘ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で製造業者の指示に従って実施した。
【０１９７】
驚くべきことに、ｖＣＳ４０野生型コード構築物及び他のコドン最適化構築物と比較してＡＡＶベクターｖＣＳ０４は、ＡＡＶウイルス産生のより高い収率によって測定されるより高いビリオンパッケージングを有していた。表３に示すように、ｖＣＳ０４ベクターは、実質的にｖＣＳ４０よりも良好に複製され、ＡＡＶ力価で表される収率が５〜７倍向上した。
【０１９８】
（表３）細胞ペレットから精製したＡＡＶベクター構築物ｖＣＳ０４及びｖＣＤ４０を使用して得られた、細胞培養物１リットルあたりの収率
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【０１９９】
実施例２−コドン改変型第ＶＩＩＩ因子変異体発現配列のインビボ発現
コドン改変型第ＶＩＩＩ因子変異体配列の生物学的力価を試験するために、第ＶＩＩＩ因子を欠くマウスに実施例１に記載のＲｅＦａｃｔｏ型ＦＶＩＩＩ構築物を投与した。手短に述べると、Ｃ５７Ｂｌ／６  ＦＶＩＩＩノックアウト（ｋｏ）マウスにおいて（群１つあたり６〜８匹として）マウスの体重１キログラムあたり４Ｅ１２ベクターゲノム（ｖｇ）の尾静脈注射によってアッセイを実施した。注射の１４日後に眼窩後方穿刺によって血液を採取し、標準的手順を用いて血漿を調製し凍結させた。１４日目の発現レベルを選択した。というのも、この時には、後の時間にこのマウスモデルの数匹の動物にみられるものであるインヒビター抗体の影響が、最小限に抑えられているからである。製造業者（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）が提案するようにわずかにだけ改変したＴｅｃｈｎｏｃｈｒｏｍｅ  ＦＶＩＩＩアッセイの実施によって、マウス血漿におけるＦＶＩＩＩ活性を決定した。アッセイのために血漿試料を大まかに希釈し、トロンビン、活性型第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、リン脂質、第Ｘ因子及びカルシウムを含有するアッセイ試薬と混合した。トロンビンによるＦＶＩＩＩ活性化後にＦＩＸａ、リン脂質及びカルシウムとの複合体が形成される。この複合体は、ＦＸを活性型ＦＸ（ＦＸａ）に活性化し、それが今度は発色基質からパラニトロアニリド（ｐＮＡ）を切り出す。ｐＮＡ形成の動態は４０５ｎｍで測定される。速度は試料のＦＶＩＩＩ濃度に正比例する。ＦＶＩＩＩ濃度を標準曲線から読み取り、結果はＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ミリリットル表示で与えられる。
【０２００】
結果は、以下の表４に示されるが、市販のアルゴリズムを使用して設計されたコドン改変型配列（ＣＳ１０、ＣＳ１１及びＣＨ２５）は、野生型ＢＤＤ−第ＶＩＩＩ因子構築物（ＣＳ４０）と比較してＢＤＤ−第ＶＩＩＩ因子の中程度の増加（３〜４倍）をもたらしたにすぎないことを実証している。同様に、Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．に記載されているとおりに作製されたコドン改変型ＢＤＤ−第ＶＩＩＩ因子構築物（ＣＳ０８）は、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ発現の３〜４倍の増強をもたらしたにすぎなかった。この結果は、Ｒａｄｃｌｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．に報告されている結果と一致する。驚くべきことに、ＣＳ０４構築物は、インビボでの生物学的力価アッセイにおいて、よりはるかに高いＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ発現をもたらした（例えば７４倍の増強）。
【０２０１】
（表４）種々のＡＡＶベクター構築物によって誘導されたＦＶＩＩＩノックアウトマウスの血漿におけるＦＶＩＩＩの発現
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【０２０２】
実施例３−マウスにおけるヒトＦＶＩＩＩ遺伝子療法ベクターの非臨床有効性及び毒性学評価
血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の欠如または欠損によって引き起こされる遺伝性出血性障害であり、血漿由来または組換えの因子濃縮物で治療される。これらの濃縮物は、出血事象を管理及び予防するのに十分なＦＶＩＩＩレベルを維持すべく定期的に輸注される必要がある。タンパク質補充療法の難題を考慮に入れると、遺伝子療法は、血友病Ａの患者に代替治療手法を提供する可能性がある。機能性Ｆ８遺伝子コピーを標的肝細胞に導入して内因性ＦＶＩＩＩ発現を誘導することによって、凝固因子の頻繁な輸注がもはや不要になる可能性がある。
【０２０３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースの遺伝子療法は、血友病Ａの患者に臨床的利益をもたらす可能性を有する。肝臓特異的トランスサイレチンプロモーターの制御下でヒトコドン最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤＦＶＩＩＩ）導入遺伝子を送達すべく、ＣＳ０４第ＶＩＩＩ因子コドン最適化構築物を含有する組換え（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法ベクターを設計した。この構築物を使用して、Ｆ８ノックアウト（ｋｏ）マウスにおけるＦＶＩＩＩ活性の用量−応答関係性を調べ、単回静脈内投与後の毒性を評価した。
【０２０４】
手短に述べると、処置の有効性を試験するために、群１つあたり１２匹の雄のＦＶＩＩＩノックアウトマウスに、３．０×１０１１、１．２×１０１２または３．０×１０１２個のベクターカプシド粒子（ｃｐ）／ｋｇの、または１０ｍＬ／ｋｇの緩衝液の単回静脈内用量を投与した。８週間にわたって１週間おきに眼窩後方血液試料を採取し、発色アッセイを用いてＦＶＩＩＩについて分析した。最後の生存時採血から得られた血漿試料もＦＶＩＩＩ結合及び中和抗体の分析に使用した。観察期間の最後に、尾端出血アッセイを用いて止血対照を評価した。
【０２０５】
試験の最後に、結合及び中和抗体について陽性であった（３．０×１０１２ｃｐ／ｋｇのベクターで処置した）４匹の動物を除く全ての試料は、抗ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ結合抗体について陰性であった。これらの動物はＦＶＩＩＩ活性レベル及び尾端出血アッセイでの血液損失の統計解析から除外した。１．２×１０１２または３．０×１０１２ｃｐ／ｋｇのベクターの投与によって、調査期間にわたって算出された平均血漿ＦＶＩＩＩ活性が用量依存的にそれぞれ０．６及び１．９ＩＵ／ｍＬに上昇したが、３．０×１０１１ｃｐ／ｋｇのベクターで処置したマウスはＦＶＩＩＩ活性が定量下限（ＬＬＯＱ）未満であった（図１７）。
【０２０６】
６３日目に尾端出血アッセイにおいて有効性を評価した。６０分にわたる血液損失をｍｇ／ｇ体重で図１８に示す。緩衝液または３．０×１０１１ｃｐ／ｋｇの遺伝子療法ベクターで処置した動物は、類似する血液損失（それぞれ６．１ｍｇ／ｇ及び７．５ｍｇ／ｇ）を示し、検出可能なＦＶＩＩＩ活性の非存在と一致していた。より高い用量の遺伝子療法ベクターは、血液損失を用量依存的に有意に減少させた（１．２×１０１２：０．６ｍｇ／ｇ、３．０×１０１２：０．４ｍｇ／ｇ、ヨンクヒール・タプストラ検定：片側Ｐ値＜０．００１）。
【０２０７】
構築物の毒性学を試験するために、雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝２０／群）に１×１０１３、３×１０１３または５×１０１３ｃｐ／ｋｇのベクターまたは製剤化用緩衝液の単回ボーラス用量を静脈内注射した（表５）。毒性の評価は、臨床兆候、体重、食餌摂取、眼科学、ならびに臨床的及び解剖学的病理に基づくものであった。各コホートからの５匹の動物に対して完全剖検を実施し、巨視的知見、臓器重量、及び顕微鏡検査の結果を記録した。各コホートからのさらなる５匹の動物から、定量的ポリメラーゼ連鎖反応による生体内分布評価のために組織を採取した。投薬前及び剖検時に血液を採集した。ＦＶＩＩＩ活性、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ抗原、結合抗ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ抗体、中和抗ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ抗体、及び結合抗ＡＡＶ８抗体を分析した。
【０２０８】
（表５）毒性研究の設計
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【０２０９】
５×１０１３ｃｐ／ｋｇまでの遺伝子療法ベクターの単回静脈内ボーラス投与は、十分に忍容されたことが見出された。試験中に死は起こらず、臨床兆候も投薬後所見もベクターの投与に関係していると考えられなかった。好ましくない眼科知見は認められなかった。体重にも食餌摂取にも影響を認められなかった。臨床化学にも、血液学にも、尿検査パラメータにも変化は認められなかった。そして、毒性学的に関係のある巨視的または顕微鏡的知見は、遺伝子療法ベクターの投与に関するものではなかった。
【０２１０】
ＦＶＩＩＩ活性及びＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ抗原評価は多様性に富む傾向にあり、これはヒトＢＤＤ−ＦＶＩＩＩに対する中和抗体の生成の結果であることが最もあり得た。しかしながら、全てのベクター群の個々の動物は３日目及び３週目及び１８週目に一般的なベースラインレベルよりも高い活性を有していた（データ示さず）。採取した組織試料においてベクターＤＮＡは主に肝臓で検出された。肝臓及び他の組織への生体内分布は用量に関係し、大抵は最も早い時間点において最も高く、時間の経過とともに低下した。脳及び精巣におけるベクターＤＮＡの存在は時間の経過とともに有意に低下し、多くの動物において１８週目までにアッセイのＬＬＯＱ未満となった（図１９）。
【０２１１】
まとめると、結果は、コドン最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩ遺伝子療法が１．２×１０１２ｃｐ／ｋｇ以上の用量でＦＶＩＩＩノックアウトマウスに投与される場合に有効であることを示している。副作用が観察されないレベルは、毒性研究で試験した最高用量である５．０×１０１３ｃｐ／ｋｇであると考えられた。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、マウスに投与する用量を、参照によりその内容全体があらゆる目的のために援用される、“Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ−Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｄｏｓｅ  ｉｎ  Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ），Ｊｕｌｙ  ２００５，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙに提供されている指針に従って、ヒト投薬量に換算することができる。
【０２１３】
本明細書に記載の実施例及び実施形態が例示目的ものであるにすぎず、それに鑑みて様々な改変または変更が当業者に示唆されるであろうし本出願の趣旨及び範囲ならびに別記の特許請求の範囲の中に含まれることになるということは理解される。本明細書中で援用される全ての刊行物、特許及び特許出願は参照によりそれらの全体があらゆる目的のために援用される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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