(57)【要約】  ２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症及び甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群又はパーキンソン病の患者を処置する物質及び方法であって、患者にエクスビボ培養活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の治療上有効な量を投与することを含む物質及び方法。エクスビボ培養活性化細胞は、サイトカインの存在下で活性化及び培養され、且つ患者に対して自家性又は同種であり得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症及び甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の調節不全又はパーキンソン病の患者を処置する方法であって、
２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症及び甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群又はパーキンソン病の患者にエクスビボ培養活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の治療上有効な量を投与すること
を含み、前記エクスビボ培養活性化細胞は、前記患者に対して自家性であり、且つサイトカインの存在下で活性化及び培養される、方法。
【請求項２】
前記サイトカインは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２型糖尿病の患者を処置することを含み、前記ＰＢＭＣの前記投与は、前記患者の糖化ヘモグロビンレベルを、前記投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記２型糖尿病の患者を処置することを含み、前記ＰＢＭＣの前記投与は、前記患者のトリグリセリドレベルを、前記投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記患者の血液から前記ＰＢＭＣを単離することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＢＭＣの増殖アッセイに基づいて、前記細胞の培養で使用するためのＩＬ−２の濃度及びＧＭ−ＣＳＦの濃度を決定することを更に含み、前記ＰＢＭＣは、ＩＬ−２の前記決定された濃度及び前記ＧＭ−ＣＳＦの前記決定された濃度で培養される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記培養活性化細胞は、血清を含有する培地で培養されるか、又は無血清条件下で培養される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＢＭＣの投与を繰り返すことを更に含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記２型糖尿病の患者を処置し、且つ前記ＰＢＭＣの前記投与前又は後に前記患者の血糖値を検査することを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記２型糖尿病の患者を処置することを含み、且つ前記ＰＢＭＣの投与前に前記患者を評価して、前記患者が２型糖尿病を有することを決定することを更に含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記２型糖尿病の患者を処置することを含み、且つ前記ＰＢＭＣの投与前にベースラインの血糖値及び／又は糖化ヘモグロビンレベルを確立することを更に含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記２型糖尿病の患者を処置することを含み、且つ前記ＰＢＭＣの投与前又は後に前記患者の糖化ヘモグロビンレベルを測定することを更に含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＢＭＣの投与後に前記患者のトリグリセリドレベル及び／又はコレステロールレベルを測定することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記糖化ヘモグロビンレベルは、前記ＰＢＭＣの前記投与後に処置前レベルに対して低下し、及び前記方法は、前記糖化ヘモグロビンレベルのその後の上昇後に前記ＰＢＭＣの投与を繰り返すことを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＢＭＣの用量は、１×１０５個〜２×１０８個の細胞の範囲である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
１〜２６週間の範囲の期間にわたってＰＢＭＣの前記用量の２〜２０回を投与することを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＢＭＣは、カルシウムイオノフォアの存在下で培養される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群、パーキンソン病、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の調節不全又はこれらの組み合わせの処置での使用のためのエクスビボ培養活性化血液細胞。
【請求項１９】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であって、サイトカインの存在下でＰＢＭＣを培養して前記ＰＢＭＣを活性化することを含むプロセスによって調製される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項１８に記載の血液細胞。
【請求項２０】
自家性である、請求項１８又は１９に記載の血液細胞。
【請求項２１】
前記使用は、２型糖尿病の処置を含む、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の血液細胞。
【請求項２２】
前記エクスビボ培養活性化血液細胞の投与は、糖化ヘモグロビンレベルを、前記投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、請求項２１に記載の血液細胞。
【請求項２３】
前記エクスビボ培養活性化血液細胞の投与は、トリグリセリドレベルを、前記投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、請求項２１又は２２に記載の血液細胞。
【請求項２４】
前記サイトカインは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の血液細胞。
【請求項２５】
前記ＰＢＭＣは、カルシウムイオノフォアの存在下で培養される、請求項１９から２４のいずれか一項に記載の血液細胞。
【請求項２６】
高トリグリセリド血症及び／又は高コレステロール血症を含む付随の医学的状態での更なる使用のための、請求項１９から２５のいずれか一項に記載の血液細胞。
【請求項２７】
２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群、パーキンソン病、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の調節不全又はこれらの組み合わせを処置するための薬物の製造のためのエクスビボ培養活性化血液細胞の使用であって、前記エクスビボ培養血液細胞は、サイトカインの存在下で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養して前記ＰＢＭＣを活性化することを含むプロセスによって調製される、使用。
【請求項２８】
前記薬物は、２型糖尿病を処置するためのものである、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記サイトカインは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２７又は２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記プロセスは、前記患者の血液から前記ＰＢＭＣを単離することを含む、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
前記プロセスは、前記ＰＢＭＣの増殖アッセイに基づいて、前記ＰＢＭＣの前記培養のためのＩＬ−２の濃度及びＧＭ−ＣＳＦの濃度を決定することを含む、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
前記培養活性化細胞は、血清を含有する培地で培養されるか、又は無血清条件下で培養される、請求項２７から３１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
前記細胞は、カルシウムイオノフォアの存在下で培養される、請求項２７から３２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３４】
前記薬物は、２型糖尿病を処置するためのものであり、前記２型糖尿病の前記処置は、糖化ヘモグロビンレベルのベースラインに対する低下を提供する、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
前記薬物は、２型糖尿病を処置するためのものであり、前記２型糖尿病の前記処置は、前記患者のトリグリセリドレベルのベースラインに対する低下を提供する、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３６】
高トリグリセリド血症及び／又は高コレステロール血症を含む付随の医学的状態での使用のためである更なる使用を伴う、請求項２７から３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
前記薬物は、ＴＳＨレベルの調節不全のためのものであり、前記処置は、前記処置後に正常なＴＳＨレベルへの回復を提供するか、又は前記患者のＴＳＨレベルは、ＴＳＨのベースラインレベルに対して正常に近いレベルに回復される、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３８】
前記薬物は、メタボリックシンドローム及び／又は肥満の処置のためのものであり、前記処置は、メタボリックシンドローム及び／又は肥満の症状を、前記処置前に確立されたベースラインに対して低減させる、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３９】
前記薬物は、不妊症の処置のためのものであり、前記投与前に確立されたベースラインに対して、前記処置は、前記患者の精子の健康の程度を改善し、及び／又はＴＳＨレベルは、上昇される、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４０】
前記薬物は、高血圧の処置のためのものであり、前記処置は、前記患者の血圧を、前記投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４１】
前記薬物は、甲状腺機能亢進症又は甲状腺機能低下症の処置のためのものであり、前記処置は、必要に応じて、ＴＳＨレベルを、前記投与前に確立されたベースラインに対して低下又は上昇させる、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４２】
前記薬物は、高脂血症のためのものである、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４３】
前記薬物は、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の処置のためのものである、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４４】
前記薬物は、副腎機能低下症の処置のためのものであり、前記処置は、前記患者のステロイドホルモンのレベルを、前記投与前に確立されたベースラインに対して上昇させる、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４５】
前記薬物は、多嚢胞性卵巣症候群の処置のためのものであり、前記処置は、前記患者のＬＨ対ＦＳＨの比率を、前記投与前に確立されたベースラインに対して改善する、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４６】
前記薬物は、パーキンソン病の処置のためのものであり、前記処置は、前記患者の症状を、前記投与前に確立されたベースラインに対して改善する、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「ＣＥＬＬ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＦＯＲ  ＰＡＴＩＥＮＴＳ」という名称の２０１８年３月２９日に出願された同時係属中の実用新案出願米国特許出願公開第１５／９４０，５５３号明細書に対する優先権を主張し、この出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本技術分野は、２型糖尿病及び他の状態の細胞治療処置に関し、且つ糖尿病及び他の状態を処置するためのエクスビボ培養細胞の投与を含む。
【背景技術】
【０００３】
２型糖尿病は、急速に世界規模での主要な健康問題になりつつある。この疾患の根本的な原因は、複雑であるため、効果的な予防は、成功しておらず、疾患に関連する薬物処置も成功が限定されている［１〜４］。糖尿病患者は、糖尿病ではない者と比較して循環器疾患を発症して死亡するリスクが２倍高く、且つ一般集団と比べて腎臓透析を必要とする割合がはるかに高い［５〜７］。グルコース及び脂質の恒常性の悪化によって動脈硬化が引き起こされると考えられ、この動脈硬化により、最終的に糖尿病と関連する重度の合併症の大部分が引き起こされる［８、９］。従って、２型糖尿病と関連する死亡率及び罹患率を減少させるために、グルコー及び脂質の恒常性を維持し得る新規の治療が不可欠である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の一実施形態は、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群、パーキンソン病又はこれらの組み合わせの患者を処置する方法であって、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群、パーキンソン病又はこれらの組み合わせの患者にエクスビボ培養活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の治療上有効な量を投与することを含む方法である。エクスビボ培養活性化細胞は、患者に対して自家性であり得、且つサイトカインの存在下で活性化及び培養される。
【０００５】
本発明の一実施形態は、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群、パーキンソン病又はこれらの組み合わせの処置のためのエクスビボ培養活性化血液細胞であって、サイトカインの存在下で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養してＰＢＭＣを活性化することを含むプロセスによって調製されるエクスビボ培養活性化血液細胞である。
【０００６】
本発明の一実施形態は、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群、パーキンソン病又はこれらの組み合わせを処置するための薬物の製造のためのエクスビボ培養活性化血液細胞の使用であって、エクスビボ培養血液細胞は、サイトカインの存在下で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養してＰＢＭＣを活性化することを含むプロセスによって調製される、使用である。
【０００７】
上記の実施形態の全ては、サイトカインが、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びこれらの組み合わせからなる群から選択される場合を含み得る。培養では、カルシウムイオノフォア及び／又は血清が使用され得る。本発明の方法に従うＰＢＭＣの投与は、患者の糖化ヘモグロビンレベルを低減させる。この低減は、投与前に確立されたベースラインに対して測定され得る。ＰＢＭＣの投与は、特に、患者の年齢及び性別を考慮した、患者に対する正常な範囲を処置前のトリグリセリドレベルが超えている患者において、患者のトリグリセリドレベルを低減させる。この低減は、細胞の投与前に確立されたベースラインに対して測定され得る。
【０００８】
上記の実施形態の全ては、患者からＰＢＭＣを単離することを含む、ＰＢＭＣを培養することを含み得、この単離は、血液サンプルの使用によって最も容易に達成される。ＰＢＭＣは、自家性又は同種であり得。培養することは、ＰＢＭＣの増殖アッセイに基づいて、細胞の培養で使用するためのサイトカイン（例えば、ＩＬ−２及びＧＭ−ＣＳＦ）の濃度を決定することを含み得、ＰＢＭＣは、サイトカインの決定された濃度で培養される。細胞は、血清を含有する培地で培養され得るか、又は無血清条件下で培養され得る。
【０００９】
ＰＢＭＣの投与に関する実施形態は、用量のセット間の間隔によって任意選択的に離れている１つ又は複数の期間にわたり、この用量のセットでＰＢＭＣの投与を繰り返すことを含み得る。例えば、２〜１００日の範囲の期間にわたって２〜２０回の用量で投与される用量のセットであり、当業者は、明記されている境界間の全ての範囲及び値（例えば、２、４、８、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２５、３０、３１、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００日及び２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０回の用量）が企図されていることを容易に理解するであろう。この期間内の各用量は、１日又は複数日（例えば、１〜７、１、２、３、４、５、６又は７日）離れ得る。この用量のセット間の間隔は、例えば、１〜２６週間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、２０、２３、２６週間）であり得るか、又は１、２、３、４、５若しくは６ヶ月であり得る。この処置は、患者の試験により適応がある場合、繰り返され得、処置間でより長い時間が経過し得る。実施例を参照すると、一例は、用量間で１日離れている、１５日である期間で投与する８回の用量のセット及びその後の２ヶ月の間隔で離れた用量の第２のセットである。１日目の用量と３日目の用量との間で約４８時間が経過しており、且つこれらの用量が１日離れていると言われていることに留意されたい。ＰＢＭＣの用量は、例えば、１×１０５〜２×１０８個の細胞の範囲であり得、当業者は、明記されている境界間の全ての範囲及び値（１０５、１０６、１０７、１０８及び２×１０８）が企図されていることを容易に理解するであろう。本処置の方法は、ＰＢＭＳの投与後、処置前のレベルに対して糖化ヘモグロビンレベルが低下する第１の処置を提供することを含み、且つ糖化ヘモグロビンレベルのその後の上昇後の培養活性化ＰＢＭＣの投与を含む更なる処置を提供することを更に含み得る。
【００１０】
上記の実施形態は、下記の１つ又は複数を含み得る：培養活性化ＰＢＭＣの投与前又は後に患者の血糖値を検査すること、ＰＢＭＣの投与前に患者を評価して、患者が２型糖尿病を有することを決定すること、ＰＢＭＣの投与前に血糖値及び／又は糖化ヘモグロビンレベルのベースラインを確立すること、ＰＢＭＣの投与前又は後に患者の糖化ヘモグロビンレベルを測定すること並びにＰＢＭＣの投与後に患者のトリグリセリドレベル及び／又はコレステロールレベルを測定すること。患者は、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群及びパーキンソン病の１つ又は複数の存在に関して評価され得、及び示された疾患に適したベースラインが選択及び確立され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】実施例１で説明される治療前の患者のベースライン特性を示す表１である。
【図１Ｂ】図１Ａの表１の続きである。
【図２】糖化ヘモグロビンレベルのベースライン及び変化と、治療前後の糖化ヘモグロビンの実際の平均値の統計とを示すデータのプロットである。
【図３】治療前後の平均トリグリセリドのベースライン及び変化を示すデータのプロットである。
【図４】治療前（４Ａ、４Ｃ、４Ｅ、４Ｇ）及び治療後（４Ｂ、４Ｄ、４Ｆ、４Ｈ）に採取した高脂血症の患者の血漿を示す写真であり、４Ｂ、４Ｄ、４Ｆ、４Ｈは、それぞれ４Ａ、４Ｃ、４Ｅ、４Ｇの患者の血漿サンプルに由来する。
【図５】差次的に発現される遺伝子（ＤＥＧ）についてのＧＯ濃縮分析の概要を示すデータのプロットである。
【図６】下垂体ホルモンの遺伝子及び選択された遺伝子に関するｑＰＣＲ分析の結果である。
【図７】治療前後の患者のＴＳＨレベルを表すデータのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書では、２型糖尿病の患者の処置に有効なエクスビボ細胞培養技術が開示されている。糖尿病が効果的に処置されたメカニズムを示す、動物から収集したデータが提示されている。このメカニズムは、視床下部又は下垂体の調節不全を伴う更なる疾患を処置するのにより広範に適用可能である。甲状腺機能低下症、不妊症、変形性関節症、多嚢胞性卵巣症候群及びパーキンソン病の患者の処置の成功等、そのような疾患の処置の例を更に提示する。処置される疾患として、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群、パーキンソン病又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００１３】
脳内では、代謝恒常性において多くの解剖学的領域が役割を果たすことが認識されている［１４］が、末梢からのシグナルを検知して統合し、エネルギー恒常性を維持するために適切な変化をもたらすうえで特に視床下部が重要である。多くの末梢因子（例えば、レプチン、グルコース、インスリン、甲状腺ホルモン、アミノ酸及び線維芽細胞増殖因子）は、エネルギー恒常性を維持するために視床下部に影響を及ぼし得ることが示される［１５］。それにもかかわらず、２型糖尿病等の代謝性疾患の処置に臨床的に利用可能である、視床下部のメカニズムを標的とする治療は、成功していないと思われる。
【００１４】
視床下部−下垂体軸は、全ての脊椎動物での神経内分泌活動に関与している。内分泌系は、遠位の標的臓器に向けて運ばれるために循環系にホルモンを直接分泌する、生物の腺の集合体である。主な内分泌腺として、松果体、下垂体、膵臓、卵巣、精巣、甲状腺、副甲状腺、視床下部、消化管及び副腎が挙げられる。視床下部及び下垂体は、高度に統合されている。視床下部の機能障害又は視床下部での不均衡は、下垂体の反応性及び正常な機能に影響を及ぼすであろう。視床下部の調節不全により、ホルモン又は他の因子（例えば、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、ベータ−エンドルフィン及びメラノサイト刺激ホルモン）の欠乏をもたらす、下垂体への不十分なシグナル伝達又はシグナル伝達の阻害が引き起こされる場合がある。
【００１５】
プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）は、下垂体及び／又は視床下部の調節不全の影響を受ける可能性がある重要な前駆体ポリペプチドである。ＰＯＭＣは、下垂体で合成され、疼痛及びエネルギー恒常性、メラノサイト刺激並びに免疫調節における役割を有するペプチドを生じる。これらとして、副腎皮質刺激ホルモン及びγ−リポトロピンペプチドに含まれるいくつかの異なるメラノトロピン、リポトロピン及びエンドルフィンが挙げられる。ＰＯＭＣは、プロオピオメラノコルチンのＮ末端ペプチド（ＮＰＰ又はプロ−γ−ＭＳＨ）、α−メラノトロピン（α−メラノサイト刺激ホルモン又はα−ＭＳＨ）、β−メラノトロピン（β−ＭＳＨ）、γ−メラノトロピン（γ−ＭＳＨ）、δ−メラノサイト刺激ホルモン、コルチコトロピン（副腎皮質刺激ホルモン、（ＡＣＴＨ））、コルチコトロピン様中間ペプチド（ＣＬＩＰ）、β−リポトロピン（β−ＬＰＨ）、ガンマリポトロピン（γーＬＰＨ）、β−エンドルフィン及び［Ｍｅｔ］エンケファリンが挙げられるペプチドの供給源である。
【００１６】
多くの機能障害（例えば、体温調節、成長、体重、ナトリウムと水とのバランス、乳汁分泌、感情及び睡眠サイクルの混乱）が視床下部及び／又は下垂体の疾患の結果として現れる。これらの混乱に対処することにより処置され得る疾患として、下記が挙げられる：２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症及び甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群及びパーキンソン病の処置。
【００１７】
本明細書で説明されている動物モデルデータは、末梢血白血球又は白血球等のエクスビボ活性化ＰＢＭＣが下垂体を刺激して複数のホルモンのＲＮＡの量を増加させ得る（５種のホルモンが下垂体により排他的に作られることを含む）ことを示す。ＰＯＭＣは、約３倍に増加しており、代謝及び複数の生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことが知られている。白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）及び／又は白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）等のエクスビボ活性化ＰＢＭＣと下垂体との間の効果は、これまで知られていなかった。視床下部及び下垂体の機能障害を処置するために、視床下部及び／又は下垂体の刺激及び／又は調節をもたらす本明細書のプロセスは、これまで知られておらず、且つ脳（特に視床下部及び下垂体）に対する活性化ＰＢＭＣの効果は、これまで知られていなかった。
【００１８】
本明細書で開示されているのは、細胞治療方法、糖尿病の処置での使用のための細胞の製造プロセス及び実施例１で説明している第Ｉ相臨床ヒト試験でのこの細胞の使用の結果である。少量の自家末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をインビトロで培養し、患者に注入して戻した。各患者に４週間以内に細胞を８回注入し、治療後６ヶ月にわたり毎月追跡調査した。主な転帰測定値は、糖化ヘモグロビンレベルの変化であり、他の転帰測定値として、治療前のベースラインに対する総コレステロール及びトリグリセリドのレベルの変化、目のかすみ、排尿及び喉の渇きの増加という糖尿病の症状が挙げられた。この研究では、２型糖尿病の２５例の患者が登録されたが、一部は、高トリグリセリド血症及び高コレステロール血症等の個々の医学的状態又は併発する医学的状態の組み合わせを呈した。この免疫療法は、大きい有害事象がなく、安全であり且つ良好な耐容性を示した。糖化ヘモグロビン及びトリグリセリドのレベルが有意に低下し、且つ糖尿病の症状が改善された（目のかすみ、排尿及び喉の渇きの増加の問題の改善を含む）。
【００１９】
この臨床試験の結果は、再生不良性貧血（ＡＡ）の処置に関して説明されているような、ＰＢＭＣにより実施される免疫療法のメカニズムの再考を促すものであった。特定の理論に拘束されないが、インビトロ活性化細胞は、中枢神経系（特に視床下部−下垂体軸）に直接的又は間接的に影響を及ぼし得、エネルギー恒常性の維持に有利であると考えられる。
【００２０】
実施例２で説明しているように、比較ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ分析）を実施して、本免疫療法に反応した正常ラットの下垂体でのトランスクリプトームの変化を調べた。視床下部と物理的につながっている重要な神経内分泌器官であり、且つ周囲の組織を汚染することなく容易に切除され得ることから、下垂体を選択した。配列品質、ヌクレオチド組成の偏り、ＰＣＲの偏り及びＧＣの偏り、配列決定飽和、マッピングされた読み取り値の分布、カバー度の不均一性、鎖の特異性並びに転写レベルでのＲＮＡの完全性をチェックし、これらの結果は、配列データに明らかに検出可能な偏りがないことを示唆した。アラインメント統計は、データが高品質であり且つ均一であることを示し、コントロール群と、免疫療法で処置された群との間で差次的発現試験を行うのに十分な配列決定深度を提供した。
【００２１】
ＲＮＡ−ｓｅｑにより、本免疫療法に反応した２９１種の異なる発現遺伝子（ＤＥＧ）が同定された。ＧＯ及びＫＥＧＧ濃縮経路分析により、これらのＤＥＧは、代謝に大きくマッピングされた。下垂体の６種のホルモン遺伝子及び重要な生物学的役割を果たす数種の選択されたＤＥＧに関しても定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析を実施して検証し、ＲＮＡ−ｓｅｑ結果と比較した。この免疫療法により、ほとんどの下垂体ホルモン（特にプロオピオメラノコルチン）及び選択されたＤＥＧのより高い遺伝子発現が誘発された。この結果は、免疫系が中枢神経系に効果的に影響を及ぼしてエネルギー恒常性の維持に役立つという、本発明が拘束されない動作理論を示し、これは、実施例１及び３〜７で更に実証されている。
【００２２】
実施例３で説明しているように、処置は、甲状腺機能低下症に有効であった。視床下部−下垂体−甲状腺軸は、甲状腺ホルモンレベルを正常範囲内に維持することに関与している。下垂体前葉によるＴＳＨの産生は、視床下部から放出される甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）により順に刺激される。チロキシンは、負のフィードバックを介してＴＳＨレベル及びＴＨＲレベルを低下させる。処置により視床下部−下垂体軸の調節が回復したことから、本活性化細胞は、甲状腺機能亢進症の処置にも有用である。実施例４は、不妊症の患者の処置を説明する。視床下部−下垂体の調節不全は、不妊症の既知の原因であり、ＴＳＨレベルの測定は、概して不妊症問題の評価の一部である。全体として、ＴＳＨの調節不全は、本活性化細胞により処置可能である（例えば、ＴＳＨレベルの増加若しくは減少及び／又はＴＳＨレベルの正常範囲内への回復）ことが分かる。
【００２３】
実施例５で報告しているように、３例の患者をエクスビボ培養活性化ＰＢＭＣ（自家又は同種）により変形性関節症に関して処置した。視床下部−下垂体軸は、副腎を介した疼痛の身体的管理（特にコルチゾールレベル）に関与している。全ての患者は、処置前後に標準的な試験により測定した場合、疼痛の減少を報告した。従って、本明細書で報告されている細胞及び方法は、変形性関節症又は骨粗鬆症を患う患者に有用である。
【００２４】
実施例６で報告しているように、患者をエクスビボ培養活性化ＰＢＭＣにより多嚢胞性卵巣症候群に関して処置した。この症候群は、内分泌機能の調節不全を特徴とし、視床下部−下垂体軸の調節不全が示される。この治療により、黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の比率が低下しており、これは、改善を示す。本明細書の細胞及び方法は、多嚢胞性卵巣症候群の処置に有用であり、且つＬＨ対ＦＳＨの比率を改善し得、この改善は、比率が処置前のレベルに対して正常に近いレベルまで移動し得ることを意味する。
【００２５】
実施例７で報告しているように、患者をエクスビボ培養活性化ＰＢＭＣによりパーキンソン病に関して処置した。パーキンソン病は、概して、この疾患の症状の多くの一因となる視床下部機能の不均衡をもたらす。従って、視床下部機能の調節の改善は、この疾患の処置に有用である。この患者の処置により、客観的な試験で測定した場合に器用さが改善され、患者は、他の機能の改善も報告した。本明細書で報告されている方法及び細胞による処置は、パーキンソン病の患者の処置に有効である。
【００２６】
全ての実施例により支持されているように、副腎機能低下症、メタボリックシンドローム、肥満、高脂血症及び高血圧を、下垂体−視床下部軸の調節を回復させることにより、本明細書の活性化エクスビボ培養細胞及び方法で処置し得る。副腎機能低下症は、視床下部−下垂体軸の調節不全につながる可能性があり、典型的にはステロイドホルモン（例えば、コルチゾール及び／又はアルドステロン）の産生低下に関与する。メタボリックシンドロームは、腹部肥満、高血圧、高血糖、高血清トリグリセリド及び低密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルの少なくとも３つを有することを特徴とする。視床下部の調節不全は、肥満の既知の原因の１つであり、エネルギー調節及び恒常性は、肥満に関与している。視床下部の隆起領域は、血圧調節に関与することが知られている。視床下部−下垂体軸は、これらの状態に関与している。本明細書で説明されているのは、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群、パーキンソン病又はこれらの組み合わせを処置するための、培養活性血液細胞を使用する物質及び方法である。培養という用語は、当技術分野において慣習であるような細胞を培養するプロセスを指す。培養は、所望の効果を生じさせるために細胞の細胞機構を活性化させる細胞の条件をもたらすことに関連する。そのため、細胞を活性化させるために、特定の因子と共に細胞をインキュベートすることは、細胞の数を増加させるためにエクスビボで細胞を拡大させることと同様に培養プロセスである。これに対して、例えば凍結又は単離又は特定の種類による、細胞を保存するか又は処理するプロセスは、単に細胞の貯蔵又は選別である。
【００２７】
用語「治療上有効な量」とは、処置する疾患を示す症状又はベースライン因子の統計的に有意な改善をもたらすのに十分な活性化血液細胞の量である。２型糖尿病に関連する血液中の因子のレベルとして糖化ヘモグロビンが挙げられる。糖化ヘモグロビンレベルは、短期的な効果とは対照的に数週間又は数ヶ月にわたって起こる効果を反映することから、判断するのに有利である。高トリグリセリド血症を有する糖尿病患者では、血漿中トリグリセリドレベルが適切である。実施例１は、糖化ヘモグロビンの処置前ベースラインレベルの約９．１から約７．１への低下（約２０％の低下）を説明する。更に、この糖化ヘモグロビンレベルは、約２ヶ月後に安定していた。平均トリグリセリドレベルは、約３．１から約２．１に低下した（約３０％の低下）。実施例で示すように、パラメータの改善は、統計的に有意であった。
【００２８】
実施形態は、２型糖尿病患者における糖化ヘモグロビン及び／又は血漿中トリグリセリドのレベルを処置前の患者におけるベースラインに対して１〜５０％の量で低下させるためのエクスビボ培養活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の使用を含み、当業者は、明記されている境界間の全ての範囲及び値が企図されていることを容易に理解し、例えば、下記のいずれかは、上限又は下限として利用可能である：５、７、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０％。実施形態は、糖化ヘモグロビン及び／又は血漿中トリグリセリドのレベルを低下させて、第１の期間後に第２の期間に関する新規のレベルを確立することを含み、例えば、５〜５０％の低下は、それらの間の全ての範囲及び値を含む。更に、処置後の第２の期間中に確立された新規のレベルに対するベースラインは、下記の処置等の他の処置のために確立され得る：メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群、パーキンソン病又はこれらの組み合わせ。第１の期間及び第２の期間は、１〜１２ヶ月（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ヶ月）であるように独立して選択され得る。当業者は、患者の因子のベースラインレベルの確立に慣れている。医療におけるベースラインとは、研究の開始時に見出される情報であるか、又は後のデータとの比較に使用される他の初期の既知の値である。ベースラインの概念は、データに対して絶対的な意味ではなく、相対的な意味を確立するために医療の一般的な方法で使用される。
【００２９】
特定の実施形態は、血液細胞（特に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ））の培養を対象とする。ＰＢＭＣの単離は、Ｂｏｙｕｍにより開発された後に様々な技術を使用して１９６０年代から実行されており、Ｂｏｙｕｍ，Ａ．（１９６４）Ｎａｔｕｒｅ，２０４，７９３−７９４及びＢｏｙｕｍ，Ａ．（１９６７）Ｓｃａｎ，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｓｕｐｐｌを参照されたい。ＰＢＭＣを使用する一部の実施形態は、１種のみの細胞型を単離する必要がないことから有利である。そのため、本質的に１種のみの細胞型を捕捉するための複雑な手順を回避し得る。特定の実施形態は、少なくとも２〜２０種の血液細胞型の血液培養を対象としており、当業者は、この明示的な範囲内の全ての値が企図及び説明されていることを認識するであろう。白血球及び／又は単球は、培養ＰＢＭＣを使用する処置で特に有用であり、且つＰＢＭＣから単離され得るか、又はＰＢＭＣは、白血球及び／又は単球の濃縮画分を得るために更に精製され得る。ＰＢＭＣを培養して投与することを含む実施形態は、白血球及び／又は単球を培養して投与することによって実施され得る。
【００３０】
エクスビボ培養により血液細胞を活性化するプロトコルは、患者から血液サンプル（例えば、１０〜１００ｍｌ）を得ることと、この血液サンプルからＰＢＭＣを分離することと、分離されたＰＢＭＣを培養することとを含む。血液細胞は、遠心分離等のプロトコルにより血清から分離され得る。次いで、分離された血液細胞は、サイトカイン（細胞刺激因子を含むため）及びカルシウムイオノフォアの１つ又は複数を含む細胞培養培地中において滅菌条件下で培養される。
【００３１】
血液細胞の活性化に有用なサイトカインとして、インターロイキン−２（ＩＬ−２）及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられる。ＩＬ−２は、刺激されたＴリンパ球により放出されるホルモン様物質である。ＩＬ−２は、抗原とは無関係に他のＴリンパ球の活性化及び分化を引き起こす。ＩＬ−２は、免疫系において特定の疾患に対処する血液細胞の増殖を刺激し、Ｔｈｌ  ＣＤ４細胞により分泌されてＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激する。ＩＬ−２は、ＣＤ４細胞自体の増殖及び成熟も増加させる。ＧＭ−ＣＳＦは、内部ジスルフィド結合を有する２３ｋＤの酸性糖タンパク質である。ＧＭ−ＣＳＦは、造血環境中及び炎症の末梢部位に存在する間葉細胞により、多くの炎症性メディエータに反応して産生される。ＧＭ−ＣＳＦは、骨髄細胞由来の好中性顆粒球、マクロファージ及び混合型顆粒球−マクロファージコロニーの産生を刺激し、胎児肝臓前駆細胞由来の好酸球コロニーの形成を刺激し得る。サイトカイン、及びＩＬ−２、及びＧＭ−ＣＳＦの細胞培養濃度は、ＰＢＭＣを活性化させる濃度を決定するのに適切なアッセイにより確立され得る。例えば、ある範囲の濃度を試験し、細胞増殖アッセイを使用して、いずれの濃度が細胞の増殖を最も引き起こすかを決定し得る。次いで、この濃度を、ＰＢＭＣを活性化させるためのＰＢＭＣの培養で使用し得る。
【００３２】
ＩＬ−２の有用な濃度は、１００〜２０００の国際単位／ｍｌ（ＩＵ／ｍｌ）であると観察しており、典型的には５００〜１０００であり、ＩＬ−２の企図されるエンドポイント及び範囲として１００、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１５００、１８００及び２０００ＩＵ／ｍｌが挙げられる。ＧＭ−ＣＳＦの有用な濃度は、０．０２〜０．２μｇ／ｍｌであると観察しており、典型的には０．０８〜０．１５μｇ／ｍｌであり、ＧＭ−ＣＳＦの企図されるエンドポイント及び範囲として０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８及び０．２μｇ／ｍｌが挙げられる。
【００３３】
カルシウムイオノフォアは、既知である。これは、最適な結果を得るためにＩＬ−２及びＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて使用するのに有用であるが、必須ではない。イオノフォアは、脂質二重層を横断し得、且つ脂質可溶性であり得る、カルシウム又は他の陽イオンに特異的な試薬（例えば、ポリペプトレート）である。イオノフォアには、下記の２つのクラスが存在する：キャリア及びチャネル形成剤。バリノマイシンのようなキャリアは、特定のイオンの周りにかごのような構造を形成し、二重層の疎水性領域を介して自由に拡散する。グラミシジンのようなチャネル形成剤は、二重層を介して連続的な水性細孔を形成し、イオンがこの細孔を通ることを可能にする。上記に加えて、本プロトコルに適したイオノフォアとして、Ａ２３１８７（カルシマイシン）、イオノマイシン、ゲルダナマイシン、モネンシン（Ｎａ塩）、ナイスタチン、ポリミキシン−Ｂ硫酸塩及びラパマイシンが挙げられ得る。Ａ２３１８７等のキャリアは、ｐＨ勾配に反応してカルシウム陽イオンを蓄積すると考えられる。Ａ２３１８７は、解離性カルボン酸基を有し、膜を介してプロトンの他の陽イオンへの電気的に中性の交換を触媒する（Ｈｙｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＡ  ３８９，３４−４６（１９８５）：Ｋｏｌｂｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｙｎｅｓ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３６，３６９−３９１（１９８１）；Ｈｕｎｔ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２，９２１−９２８（１９８２））。Ａ２３１８７の２つの分子は、カルボキシレート陰イオンとして存在し、そのため、輸送される二価の陽イオンを放出した後、膜を介してプロトン又は均等物を戻すために利用可能である。存在する場合、カルシウムイオノフォアは、約１〜１０，０００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得、当業者は、明記されている境界間の全ての範囲及び値（例えば、１、１００、５００、１０００、２０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、１００００、１〜１０００ｎｇ／ｍｌ又は１０〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲を含む）が企図されていることを容易に理解するであろう。代わりに、イオノフォアは、有効濃度で存在し得る。イオノフォアの有効濃度は、本プロトコルにより血液細胞が活性化されるが、過剰に活性化されない任意の濃度である。
【００３４】
エクスビボでの活性化に有用な適切な培養培地は、血液細胞に必須栄養素を提供する。この培地は、一般に、例えば無機塩、アミノ酸、ビタミン及び他の化合物を、全て血液細胞により直接的に利用され得る形態で含む。実例として、限定されないが、好適な一培地は、ＲＰＭＩ  １６４０である。しかしながら、培養中に血液細胞を支持するであろう他の培地（例えば、無血清培地ＡＩＭ−Ｖ）も適切であり得る。培地は、体積で細胞培養培地の約０．１〜５０％のレベルで哺乳類の血清（例えば、ウシ胎仔血清）が補充され得、当業者は、明記されている境界間の全ての範囲及び値（体積で細胞培地のパーセントとして０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０）が企図されていることを容易に理解するであろう。ＲＰＭＩ  １６４０等の細胞培養培地は、公知であり、当業者は、適切な培養培地を容易に選択し得る。
【００３５】
細胞の培養期間は、同様に、例えば細胞増殖により判断した場合、細胞を活性化させるのに適した時間であり得る。分離された血液細胞の培養時間は、例えば、約１時間超であり得るか、又は約１０〜２００時間であり得、当業者は、明記されている境界間の全ての範囲及び値（例えば、１、２、５、１０、２４、４８、７２、１００、１２０、１４０、１５０、１７５及び２００時間）が企図されていることを容易に理解するであろう。培養物の温度は、例えば、３０〜４２℃の範囲の温度で適切に制御され得、当業者は、明記されている境界間の全ての範囲及び値（例えば、３０、３２、３４、３７、３８、３９、４０、４２℃）が企図されていることを容易に理解するであろう。
【００３６】
培養した後、活性化血液細胞を洗浄し得る（例えば、滅菌生理食塩水で２回）。次いで、この活性化血液細胞の治療上有効な量を患者に投与する。この活性化血液細胞の投与の許容される１つの方法は、静脈内である。
【００３７】
本活性化細胞を１回で投与し得るか、又は活性化細胞の複数回の投与を使用し得る。例えば、実施例１の場合、４週間の期間で８回の投与を実施した。血液サンプルを最初の処置前、その間又はその後に繰り返し患者から採取し得、その結果、追加の活性化血液細胞を更なる投与のために得ることができる。この細胞を各投与前に採取して培養し得るか、又は培養細胞の群の全体又は一部を将来の投与のために保存し得る。処置（例えば、活性化血液細胞のある用量の投与）に必要な総時間は、利用可能な活性化血液細胞の量及び患者の反応に依存し得る。
【００３８】
活性化化合物（例えば、１種若しくは複数のサイトカイン及び／又は１種若しくは複数のイオノフォア）を、適切な細胞培養培地又はその一部と混合して分配し得る。代替実施形態では、１種又は複数の活性化化合物を出荷のために細胞培養培地又はその一部と一緒にパッケージし得る。同様に、活性化化合物の所望の組み合わせ（例えば、１種又は複数のサイトカイン及び１種又は複数のイオノフォア）を混合又は別個のコンパートメント中のいずれかで出荷のために一緒にパッケージし得る。これらの実施形態のいずれかでは、培地及び／又は活性化化合物を、任意の残余の培地成分及び／又は活性化化合物と組み合わせて、細胞を活性化させる条件下で細胞を培養するための所望の培地を形成し得る。同様に、これらの実施形態のいずれかでは、一緒にパッケージされる組成物は、例えば、活性化特性を有する細胞培養培地を完成させるための説明書及び／又は細胞培養を実施するための説明書を含み得る。
【００３９】
細胞培養を、患者を処置している施設で実施し得るか、又は細胞を活性化させるための細胞培養を遠隔地で実施し得る。いずれの場合にも、活性化細胞を細胞培養物からの収穫の短期間後に投与して、細胞が生存し続けることを確実にし得る。代わりに、この細胞を、この細胞を生存可能な状態で維持する条件下で貯蔵し得る。例えば、この細胞を抗凍結剤と共に液体窒素温度で貯蔵し得る。この細胞を、患者への投与に適したときに例えば既知の手順を使用して調製し得る。例えば、この細胞を患者に投与するために緩衝化生理食塩水に懸濁させ得る。この細胞の送達に例えば他の既知のキャリアを使用し得る。実施例１で報告している試験は、自家ヒト細胞を使用した。ＡＡの処置にＰＢＭＣを使用する類似の方法も、同種ＰＢＭＣにより問題なく実施した。従って、自家細胞の代わりに同種細胞を使用し得る。
【実施例】
【００４０】
実施例１：エクスビボ活性化ＰＢＭＣによる患者の処置
１．患者
この研究では、２型糖尿病と既に診断されている合計２５例の患者が登録されて完了した。これらには、１９例の男性と６例の女性とが含まれており、病歴の中央値は、９年（範囲：１〜２１年）であり、年齢の中央値は、５９歳（範囲：２７〜７９歳）であった。糖化ヘモグロビンの平均ベースラインは、９．０７±１．９７％（範囲：６．５〜１３．３％）であった。これらの２５例の患者のうち、１０例は、＞１．７０ｍｍｏｌ／Ｌ（平均：３．１２±１．２４ｍｍｏｌ／Ｌ；範囲：１．７０〜４．８６ｍｍｏｌ／Ｌ）のトリグリセリドレベルを最初に示し、１３例は、≧５．２０ｍｍｏｌ／Ｌ（平均：６．３５±０．５２ｍｍｏｌ／Ｌ；範囲：５．７０〜７．４７ｍｍｏｌ／Ｌ）の総コレステロールレベルを示し、１８例は、目のかすみ（１２例；４８％）、頻繁なトイレ（１０例；４０％、一晩当たり２回以上のトイレと定義される）及び抑えられない喉の渇き（１６例；６４％）という１種又は複数の糖尿病関連の症状を示した。２５例の患者のうち、１６例（６４％）に血糖降下剤（例えば、インスリン、グリクラジド、メトホルミン及びアカルボース）の１種又は組み合わせを最初に投与した。全ての薬物の投与量を、この研究全体を通して例外なく少なくとも５０％以上削減した。高脂血症を最初に示した患者には、治療前、その間又はその後にいかなる脂質降下剤も投与しなかった。
【００４１】
治療前の患者の特徴を図１の表１にまとめる。２５例の患者のうち、１１例（４４％）は、大卒であった。これらの患者には、生活様式、食習慣又は運動に関する特別なアドバイスをしなかったが、アルコールの使用を避けるように強く勧めた。いずれの患者も、いかなる専門的な食事計画又は運動計画も実行しておらず、この研究前、その間及びその後に同様の生活様式を維持した。
【００４２】
２．安全性及び投与
各患者から静脈血５０ミリリットを採取し、実験室でＰＢＭＣを単離し、培養し、次いで回収した後、同一の患者に静脈内投与した。全ての患者に４週間の期間内で合計８回注入した。全体的に見て、処置は、良好な耐容性を示しており、最も一般的な副作用は、頭痛（２２例；８８％）、疲労（２０例；８０％）、３７℃〜３８．５℃の発熱（１６例；６４％）、悪寒（１６例；６４％）並びに嘔吐及び下痢（２例；８％）であり、これらは、注入に関連した一時的なものがほとんどであり、ほとんどは、無投薬で及び細胞注入後２４時間以内に消散した。副作用に起因してこの研究を脱落した患者はいなかった。
【００４３】
３．主な転帰
この研究では、治療前のベースラインでの平均糖化ヘモグロビンは、９．０７±１．９７％であり、治療後の平均減少は、６ヶ月にわたり毎月評価してそれぞれ１．３９±１．０５％、１．８６±１．４４、１．９１±１．４３、１．８７±１．５４、１．９９±１．５０及び１．９２±１．４７％であった（ｐ＜０．００１）。治療前後での糖化ヘモグロビンレベルの変化と、糖化ヘモグロビンの実際の平均値の統計とを図２及び表２に示す。
【００４４】
【表１】
2021519823.tif 000003
【００４５】
４．トリグリセリド及び総コレステロール
高トリグリセリド血症を最初に有した１０例の患者では、治療前の血漿中トリグリセリドの平均ベースラインは、３．１２±１．２４ｍｍｏｌ／Ｌであった。治療後の平均減少は、６ヶ月にわたり毎月評価してそれぞれ０．７９±１．０３ｍｍｏｌ／Ｌ、１．１７±１．０６ｍｍｏｌ／Ｌ、１．００±１．００ｍｍｏｌ／Ｌ、１．１３±０．８９、０．９７±０．９９及び０．５６±２．５３ｍｍｏｌ／Ｌであった。図２は、治療前後の平均トリグリセリドレベルの実際の平均値の変化及び統計を示す。図３及び表３に示すように、治療後の総コレステロールレベルには、ベースラインからの有意な変化がなかった。
【００４６】
【表２】
2021519823.tif 000004
【００４７】
５．糖尿病の症状及びいくつかの身体所見
目のかすみを最初に報告した１２例の患者のうち、１０例（８３％）は、治療後に有意な改善を報告した。頻繁なトイレ（一晩当たり平均２．４±０．５２回のトイレ）を最初に報告した１０例の患者のうち、８例（８０％）は、一晩当たり少なくとも１回のトイレの減少を報告し、抑えられない喉の渇きを最初に報告した１６例の患者のうち、１２例（７５％）は、治療中及び後に改善を報告したが、程度及び持続期間は、様々であり、ほとんどが血糖値の低下と並行していた。２５例の患者のうち、２０例（８０％）は、治療中及び後、食欲、睡眠及びエネルギーレベルの有意な改善を報告した。全ての患者で皮膚の色素沈着のわずかな減少を観察した。
【００４８】
６．血漿外観の変化
この研究中、高脂血症を最初に報告した患者から新たに単離した血漿は、脂肪質であり且つ濁っているように見え、血糖値及びトリグリセリドレベルの低下とほぼ同時に、同一の患者由来の血漿は、程度が有意に低いように見えることを観察した。血漿の透明度及び濁りの変化を目視検査で容易に区別し、高脂血症を最初に報告した１０例全ての患者で観察した。図４Ａ〜４Ｈは、高脂血症の４例の患者の血漿外観でのこの変化を示し、患者からの静脈血５０ミリリットルをＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離により血漿（チューブの上部）、白血球（界面）及び赤血球（チューブの下部）に分離した。初回用量の細胞処理中に単離した血漿を撮影し（処置前の写真）、次いで最後の細胞注入の細胞注入中に単離した血漿を撮影した（処置後の写真）。
【００４９】
７．材料及び方法
この試験を中国の２つの病院で実施し、且つこの試験は、外来診療で実施する単一アーム試験であった。この研究は、各病院の治験審査委員会で承認され、全ての患者が書面によるインフォームドコンセントを提出した。
【００５０】
８．患者
この試験への参加資格を得るために、患者は、下記の基準の全てを満たすことが必要であった：２５歳以上の年齢；血糖降下剤の使用、医師の報告書又は血糖値により検証されている自己申告の２型糖尿病；及び６．５％以上の糖化ヘモグロビンレベル。下記の因子のいずれかを有する患者を除外した：悪性腫瘍の病歴、活動的な感染、ヒト免疫不全ウイルス感染に関する血清陽性、過去３ヶ月での心筋梗塞若しくは不安定狭心症の病歴又は現在妊娠中若しくは授乳中。
【００５１】
９．治療用細胞の調製及び処置
患者からの静脈血５０ミリリットルからＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。次いで、ＰＢＭＣ（４×１０６個／ｍＬ）をインターロイキン（ＩＬ）−２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び２００ｎｇ／ｍＬでのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）の存在下で２日にわたり滅菌条件下において、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−１６４０培地（ＲＰＭＩ−１６４０）で培養した。この細胞培養で使用するＩＬ−２及びＧＭ−ＣＳＦの濃度を細胞増殖アッセイにより個別に予め決定して、最大刺激活性を決定した。付着している細胞をプラスチックから削り取り、付着していない細胞と一緒に回収した。次いで、これらの細胞を生理食塩水で２回洗浄した後、患者に静脈内投与で戻した。４週間の期間内に各患者に合計８回注入した。
【００５２】
１０．転帰及び評価
主な転帰は、処置の完了後６ヶ月にわたり毎月モニタリングした糖化ヘモグロビンのベースラインからの変化を含んだ。他の事前に指定した転帰は、高トリグリセリド血症及び高コレステロール血症を最初に有した患者での総コレステロール及びトリグリセリドレベルのベースラインからの変化を含んだ。目のかすみ、夜間での頻繁なトイレ及び抑えられない喉の渇きという糖尿病に関連する症状も、事前に指定した転帰としてモニタリングした。
【００５３】
全てのベースラインを最初の細胞注入の１週間前に評価し、全ての転帰を最後の細胞注入後６ヶ月にわたり毎月評価した。
【００５４】
実施例２：ＲＮＡ−ｓｅｑ分析
１．差次的に発現される遺伝子（ＤＥＧ）及びその後の分析
免疫療法の結果、ｐ値≦０．０５で２９１種の遺伝子が差次的に発現されていることを確認した。これらのうち、１４１種の遺伝子が上方制御されており、１５０種の遺伝子が下方制御されていた。これらのＤＥＧを生物学的に理解するために、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔオンラインサービス（http://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/）により提供されるＷｅｂＧｅｔａｌｔ  ２０１７ツールキットを使用して機能分析及び経路分析を行った。
【００５５】
２９１種のＤＥＧのうち、１８８種のユニークな遺伝子は、Ｅｎｓｅｍｂｌの参照ゲノムデータベースのユニークな遺伝子に一義的にマッピングされたが、１０３種の遺伝子は、複数の遺伝子にマッピングされたか又はいずれの遺伝子にもマッピングされ得なかった。この参照ゲノムデータベースには、４７９８９種の遺伝子が含まれており、２６６４種の遺伝子は、濃縮分析の参照として使用される選択された機能カテゴリにアノテートされている。遺伝子オントロジー（ＧＯ）、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ（ＫＥＧＧ）分析は、マッピングにより同定した１８８種のユニークな遺伝子に基づいた。
【００５６】
２．ＧＯ濃縮分析
１８８種のユニークなＤＥＧのうち、１２９種は、選択された機能カテゴリに対してアノテートされており、また濃縮分析に使用される参照遺伝子リストにも入っていた。生物学的プロセスカテゴリでは、これらのＤＥＧは、ほとんどが下記に関連していた：生体調節（８８種の遺伝子）、代謝プロセス（７６種の遺伝子）、刺激への反応（７１種の遺伝子）、多細胞生物プロセス（５５種の遺伝子）、局在化（５１種の遺伝子）、細胞コミュニケーション（５０種の遺伝子）、発生プロセス（４４種の遺伝子）、細胞成分の組織化（３５種）、細胞増殖（１８種の遺伝子）、多生物プロセス（１７種の遺伝子）、生殖（９種の遺伝子）及び成長（３種の遺伝子）。７６種の遺伝子は、生体調節に次いで２番目に多いカテゴリである代謝プロセスに密接に関連していた。
【００５７】
細胞成分カテゴリの上位は、膜（７９種の遺伝子）、核（３７種の遺伝子）、小胞（３６種の遺伝子）、細胞内膜系（３２種の遺伝子）、高分子複合体（２６種の遺伝子）、細胞外空間（２５種の遺伝子）及び膜で囲まれた内腔（１６種の遺伝子）であった。
【００５８】
分子機能カテゴリでは、タンパク質結合（５６種の遺伝子）、イオン結合（４１種の遺伝子）、ヒドロラーゼ活性（２１種の遺伝子）、核酸結合（２０種の遺伝子）及びトランスポーター活性（１７種の遺伝子）が最も多かった。２１種の遺伝子が生物学的プロセス分析の結果と一致してヒドロラーゼ活性に関連していたことは、注目に値する。
【００５９】
このＧＯ濃縮分析の概要を図５Ａ〜５Ｃに示す。
【００６０】
３．ＫＥＧＧ経路濃縮分析
参照ゲノムデータベースのユニークな遺伝子に一義的にマッピングされた１８８種のＤＥＧに基づいて、ＫＥＧＧ経路濃縮分析も実行した。これらの１８８種の遺伝子のうち、８３種の遺伝子は、選択された機能カテゴリにアノテートされており、且つこの濃縮分析に使用される参照リストにも入っていた。これらの８３種のＤＥＧからの上位１０種の濃縮カテゴリは、胃酸分泌、アディポサイトカインシグナル伝達経路、脂肪の消化吸収、唾液分泌、ＡＢＣトランスポーター、造血細胞系列、グルカゴンシグナル伝達経路、ヒスチジン代謝、光伝達及びレニン分泌であった。ＧＯ分析と同様に、１０種の濃縮カテゴリの５種は、エネルギー代謝に直接関連していた。これらの濃縮カテゴリ及びこれらのカテゴリで同定された遺伝子を表４にまとめる。これらの遺伝子及び遺伝子記号は、当業者に既知である。
【００６１】
【表３】
2021519823.tif 000005
【００６２】
【表４】
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【００６３】
【表５】
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【００６４】
４．ｑＰＣＲ
ＲＮＡ−Ｓｅｑ結果を検証するために、下垂体のホルモン（即ち甲状腺刺激ホルモン（ｔｓｈβ−３）、卵胞刺激ホルモン（ｆｓｈβ−２）、黄体形成ホルモン（ｌｈβ−１）、プロオピオメラノコルチン（ｐｏｍｃ−１）、成長ホルモン（ｇｈ１−２）及びプロラクチン（ｐｒｌ−３））をコードする６種の遺伝子のサブユニットをｑＰＣＲ分析に選択した。同様に、アンジオテンシノーゲン（ａｇｔ−２）、脳由来神経栄養因子（ｂｄｎｆ−１）、ガストリン（ｇａｓｔ−１）及びレジスチン（ｒｅｔｎ−２）のＤＥＧもｑＰＣＲ分析に選択し、なぜなら、これらは、他の研究者により広く研究されており、且つそれらの重要な生物学的機能を説明する文献が豊富だからである。これらのＤＥＧも複数のカテゴリで富むことをこの研究のＧＯ分析及びＫＥＧＧ分析により確認した。
【００６５】
ｑＰＣＲ分析は、ｐｒｌが緩やかに０．８１倍減少し、ｔｓｈβ、ｆｓｈβ、ｌｈβ及びｇｈ１が緩やかに１．２６〜１．５０倍増加し、ｐｏｍｃが有意に３．１倍増加することを示した。Ｐｏｍｃは、ＲＮＡ−ｓｅｑ分析において、差次的に発現される遺伝子であることも確認した。アンジオテンシノーゲン（Ａｇｔ）の発現に関するｑＰＣＲ分析及びＲＮＡ−ｓｅｑ分析の結果は、互いに一致しておらず、ｑＰＣＲで緩やかな増加が示されたが、ＲＮＡ−ｓｅｑで有意な減少が示されたのに対して、ｂｄｎｆ、ｇａｓｔ及びｒｅｔｎのｑＰＣＲ分析は、コントロールと比較して様々な程度で発現の増加を示した。下垂体の６種のホルモン及び選択された遺伝子のｑＰＣＲ分析の結果を図６に示す。
【００６６】
ｑＰＣＲ及びＲＮＡ−ｓｅｑの結果に基づいて、本免疫療法は、正常なラットの下垂体中のトランスクリプトームの有意な変化を誘発し、この変化は、２型糖尿病患者及び他の患者に関して本明細書で報告されている有利な結果に寄与すると結論付けた。
【００６７】
５．サンプルの調製、ＲＮＡ−ｓｅｑ及びｑＲＴ−ＰＣＲ
雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）は、到着時に１６０〜１７０ｇであった。ラットをコントロール群及び処置群（それぞれ１０匹のラット）に分類した。治療用細胞をラット１匹当たり１×１０６個の細胞の用量で静脈内注射（尾部注射）し、且つ２日間隔で合計４回の注射を実施したのに対して、コントロールラットには生理食塩水を注射した。
【００６８】
動物を頚椎脱臼により屠殺し、下垂体を氷上で迅速に摘出した。組織を液体窒素でスナップ凍結させ、処理するまで−８０℃で貯蔵した。ＲＮＥＡＳＹ  ＭＩＮＩ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ−Ｓｅｑ及びｑＰＣＲ前にＤＮａｓｅＩ処理を実施し、ゲノムＤＮＡのキャリーオーバーがないことを確実にした。ＤＮａｓｅＩで消化したＲＮＡを、標準プロトコルに従ってフェノール：クロロホルムを使用して精製した。ＲＮＡをＢＩＯＡＮＡＬＹＺＥＲ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で濃度及び純度に関してチェックした。製造業者の指示に従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、逆転写を実行した。ＲＮＡ配列決定をＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨＩＳＥＱ  Ｘ  ＴＥＮ  Ｐｌａｔｆｏｒｍで行った。ｑＰＣＲに関して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＯＬＩＧＯＰＥＲＦＥＣＴ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒによりプライマーを設計し、各遺伝子のために３対のプライマーを設計してリアルＰＣＲの実行により最適化した。各遺伝子配列に適したプライマーを、標準的な技術を使用して作製した。ｑＰＣＲを、ＣＦＡ９０  ＴＯＵＣＨ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ  Ｃｈｉｎａ）を使用して実行した。
【００６９】
６．差次的に発現される遺伝子（ＤＥＧ）の分析
全ての読み取りを、デフォルトオプションでＴＯＰＨＡＴ（バージョン２．０．６）を使用してラッタス・ノベルギクス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ゲノム（Ｅｎｓｅｍｂｌゲノムデータベース、Ｒｎｏｒ＿６．０）全体にアラインさせた。ＣＵＦＦＬＩＮＫＳ（バージョン２．０．２）を使用して、マッピングされた１００万個のフラグメント当たりのエクソン１キロベース当たりのフラグメント（ＦＰＫＭ）値を推定し、ＦＰＫＭが３以上である遺伝子を発現していると見なした。２つの群のラットのサンプルから生カウントを抽出し、ＣＵＦＦＤＩＦＦパッケージを用いて、ｐ値≦０．０５において差次的に発現される遺伝子を見出した。
【００７０】
７．経路濃縮分析及び疾患関連分析
本免疫療法と統計的に有意に関連する遺伝子セットを生物学的に理解するために、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔオンラインサービス（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ．ｅｄｕ／ｗｅｂｇｅｓｔａｌｔ／）により提供されるＷＥＢＧＥＴＡＬＴツールキットを使用して経路濃縮分析を実行した。有意な遺伝子セットの遺伝子に関して、下記の２種の経路濃縮分析を行った：ＧＯ分析及びＫＥＧＧ分析。ＧＯ分析により、遺伝子の機能アノテーションに基づいて、いずれのＧＯタームが遺伝子セットにおいて過剰に表されているかが見出され得る。ＫＥＧＧ分析により、ＫＥＧＧデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／ｐａｔｈｗａｙ．ｈｔｍｌ）に対して遺伝子セット中の遺伝子で濃縮された経路を発見し得る。経路濃縮分析を実施する場合、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔのパラメータのデフォルト値を採用した。
【００７１】
８．統計分析
ＲＮＡ−ｓｅｑを除く全ての統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェア（ｖ７．０；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した。２つの群間の差異の分析を、対応のあるｔ検定により評価した。データを平均±平均の標準誤差で表し、全てのｐ値は、両側であり、ｐ＜０．０５は、統計的有意性を示した。
【００７２】
実施例３：甲状腺機能低下症
５４歳の女性患者は、細胞治療による処置の５年前に甲状腺機能低下症と診断された。この細胞治療前に、患者は、変形性関節症、乾燥肌及び心拍数低下に起因する重度の疲労感、便秘及び背痛を訴えた。患者は、過去５年にわたり薬物を服用していたという事実にもかかわらず、これらの症状は、持続しており且つ一層悪化していた。実施例１で説明されている細胞注入液を調製し、患者に１６回の用量で投与して、結果として甲状腺機能低下症に関連する症状の全てが消失することを観察した。用量の最初のセットに関して、１日目に採血し、３、５、７、９、１１、１３、１５及び１７日目に細胞の用量を投与することにより、１５日にわたり８回の用量を投与した。２ヶ月後、用量の第２のセットを投与し、１日目に採血し、２日後に開始して１日おきに８回の用量を投与して、１５日にわたり８回の用量を投与した。細胞治療の１週間前の臨床検査により、非常に低いレベルのＴＳＨが示された。患者に細胞注入液を合計１６回投与した後、この治療後２週間で全ての症状が完全に消失した。この細胞治療の完了の２週間後の臨床検査により、ＴＳＨが正常範囲内で有意に増加し、抗甲状腺グロブリン抗体も有意に改善されることが示された。この細胞治療の前後の臨床検査の結果を下記の表５に示す。患者は、この細胞治療後に薬物を服用する必要がなく、疾患の再発も経験しておらず、臨床検査により、ホルモン及びチロキシンが正常なレベル内のままであることが示される。
【００７３】
【表６】
2021519823.tif 000008
【００７４】
実施例４：不妊症
不妊症の１例の女性患者及び４例の男性患者を細胞治療で処置し、各患者に細胞注入液を合計８回投与した。１日目に採血し、細胞を培養し、３日目に開始して１日おきに細胞の８回の用量を投与して、１５日にわたり８回の用量を投与した。この治療前の精子分析により、下記の表に示すように４例の男性患者間での精子機能障害の程度は、様々であることが示され、女性患者は、生殖にとって比較的高齢な４６歳であった。４例中の３例の男性患者のパートナーは、この細胞治療後３ヶ月以内に妊娠し、その後、３例の健康な乳児を出産したのに対して、女性患者は、治療後２ヶ月で妊娠したが、妊娠３ヶ月後に流産した。これらの女性のＴＳＨ分泌は、下記の図に示す治療前と比較してこの細胞治療後に有意に増加することが留意された。別の男性患者は、妊娠に失敗した。注目すべきことに、４例の男性患者全員は、この治療に起因して性欲が有意に増加することを報告した。
【００７５】
【表７】
2021519823.tif 000009
【００７６】
実施理５：変形性関節症
変形性関節症と診断された３例の女性患者は、細胞治療前に両膝の重度の関節痛の病歴を有した。各患者に細胞注入液を合計８回投与した。１日目に採血し、細胞を培養し、３日目に開始して１日おきに細胞の８回の用量を投与して、１５日にわたり８回の用量を投与した。各細胞注入液は、末梢血５０ｍＬ由来のエクスビボ培養活性化細胞を含んだ。患者１及び３を自家細胞のみで処置し、患者２を自家細胞及び同種細胞の両方で交互に処置した。Ｖｉｓｕａｌ  Ａｎａｌｏｇｕｅ  Ｓｃａｌｅ（ＶＡＳ）法を使用して疼痛の程度を測定し、この細胞治療の完了の１週間前及び２週間後に測定を実行して、この細胞治療の効果を判定した。下記の表７に示すように、この細胞治療により、これらの３名の患者において膝の疼痛が有意に軽減されることが分かった。
【００７７】
【表８】
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【００７８】
実施例６：多嚢胞性卵巣症候群
３１歳の患者は、１０年にわたり多嚢胞性卵巣症候群と診断されていた。患者は、月経周期がまれに長く、治療前の最後の２つの期間は、９０日間隔であった。超音波検査により、両側の卵巣に複数の嚢胞があることが示された。ホルモン検査により、黄体形成（ＬＨ）ホルモン及び卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の比率は、３．７７であることが示された。患者に処置の合計２５回の細胞注入液（用量）を投与した。患者に４週間以内に細胞注入液を１０回投与した。最後の注入の８週間後、患者に１日おきに７回の用量の第２のセットを投与した。第２の処置の５週間後、患者に１日おきに８回の用量の最後のセットを投与した。この患者は、この細胞治療に対する反応が遅いことを観察したが、これは、この細胞治療に反応した悪寒及び発熱という副作用の通常の発生と比べてはるかに遅いことで示されるように、遅い視床下部に起因する可能性がある。視床下部は、体温を制御しており、患者は、この細胞治療が有効な場合、この細胞治療に反応して一時的な悪寒及び発熱を通常発症するはずである。この場合、視床下部を刺激するために、より多くの細胞注入を、時間をかけて行った。この治療後第１の期間は、前の治療から６０日後に到来する。この治療後のＬＨ及びＦＳＨの比率は、１．１８まで低下しており、これは、改善を示す。治療前後のホルモン検査の結果を下記の表８に示す。
【００７９】
【表９】
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【００８０】
実施例７：パーキンソン病
新たに６３歳の女性患者がパーキンソン病と診断された。患者の主な症状は、動作の緩慢さ、硬直及び姿勢の不安定さであった。患者に２日間隔で８回の細胞注入液の処置を施した。この細胞治療の前後に患者の両手を使用して簡単なＰｕｒｄｕｅ  Ｐｅｇ  Ｂｏａｒｄ  Ｄｅｘｔｅｒｉｔｙ  Ｔｅｓｔを実施した。板には、２５個の穴が開いており、患者が全ての穴にペグを入れるのに必要な時間を記録した。同様の年齢の障害がない健常者もコントロールとして同一の課題を実施した。この試験の結果を下記の表に示す。患者は、緩慢な動作、硬直及び姿勢の不安定さという症状の顕著な改善も報告した。
【００８１】
【表１０】
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【００８２】
更なる開示及び考察
実施例１のこの臨床試験により、本ＰＢＭＣ治療が２型糖尿病の患者の高血糖及び高トリグリセリド血症のコントロールに役立つことを示す結果が得られた。この結果は、免疫療法処置により、血糖値及びトリグリセリドレベルが同時に下がり得るが、総コレステロールレベルが下がらないことを示した。一部の患者では、総コレステロールレベルに加えて、低密度リポタンパク質コレステロール及び高密度リポタンパク質コレステロールも測定したが、この治療の結果としての有意な変化を観察しなかった。血糖値及びトリグリセリドレベルは、より代謝的に相互に関連しており、コレステロールから独立した同様の代謝経路を利用していると思われた。活性化培養ＰＢＭＣが２型糖尿病の患者の高い血漿粘度を有意に低下させるというこの研究の観察は、予想外のものであり且つ注目すべきものであった。本治療によるトリグリセリドの減少の観察は、高い血漿粘度の一因となっている他の脂質も有意に減少したという観測を十分に説明できないことがあり得る。注目すべきことに、治療前に目のかすみを報告していた１０例の患者の９例は、本治療に起因して少なくとも一時的に改善した。
【００８３】
この研究の結果は、本明細書で採用した治療方法が２型糖尿病の処置に有効であることと、例えば処置により得られる改善が減少した場合、必要に応じて処置を繰り返すことにより疾患の症状を継続的に寛解させ得ることとを示した。
【００８４】
この研究全体を通して、２型糖尿病と、経口抗高血糖薬による処置とは、インビトロでのＰＢＭＣにおける免疫細胞活性化及びその後のインビトロでの免疫反応に影響を及ぼす２つの因子であった。ＰＢＭＣでの健康な免疫細胞は、刺激に積極的に反応し、その後、細胞培養で大きい細胞集合体を形成するはずである。同様に、ＰＢＭＣでの活性化免疫細胞の注入は、レシピエントにおいてある程度の症候性反応を誘発するはずである。しかしながら、この研究では、比較的重度の糖尿病の患者又は抗高血糖薬を服用していた患者では、細胞集合体の形成又は注入に関連する症状をほとんど観察しなかった。これらの患者は、疾患の改善に伴い、悪寒及び発熱等の症候性副作用を徐々に発症したが、患者の約２０％は、この研究全体を通して、治療により誘発されるいかなる副作用も全く示さず、これは、この治療が、これらの患者で効果が十分でなかった可能性があることを示す。
【００８５】
細胞培養方法を、いくつかのエクスビボ活性化免疫細胞が骨髄に移動し、必要な成長因子及び細胞接触を造血幹細胞に提供して、その成長及び分化を可能にし得るという当時の仮説に基づいて、米国特許第７，３３２，１５８号明細書で説明されているようなＡＡの処置のために開発された細胞培養のプロセスから適応させた。本明細書での結果は、２型糖尿病では、本明細書の活性化細胞が視床下部−下垂体軸等のヒトの脳中の指令中枢に影響を及ぼす可能性があり、活性化ＰＢＭＣが、末梢の免疫系と脳との間において、これまで未確認であったが、積極的な橋渡しの役割を果たし得ることを示唆した。視床下部−下垂体軸の調節不全に関与している状態の更なる患者の処置の成功により、この理解は、更に裏付けられる。
【００８６】
この理論を検証するために、正常ラットの下垂体を、実施例２で詳細に説明したように、本培養ＰＢＭＣ治療法に応じて調べた。下垂体を選択し、なぜなら、視床下部−下垂体軸は、基礎代謝率の制御を通したエネルギー消費等の神経内分泌恒常性の調節に不可欠であるからである。更に、下垂体は、幅広い神経内分泌活動に必須の６種のホルモンを産生する。全体として、ＡＡの処置と比較して２型糖尿病の処置に有用であり、処置毎により多くの細胞を投与するのに有用であり、且つより低い血糖値及び糖化ヘモグロビンレベルにより測定可能な反応の好ましいレベルを得るために、より長期にわたる患者への細胞の更なる投与で患者を処置するのに有用であった。
【００８７】
ＲＮＡ−ｓｅｑ分析では、このラットの下垂体でのトランスクリプトームの有意な変化を観察し、この活性化細胞による治療の結果として２９１種のＤＥＧを同定した。これらのＤＥＧのＧＯ分析及びＫＥＧＧ分析の結果、驚くべき程度まで代謝に大きくアノテートされることが分かった。脳へのこの免疫療法の効果の正確な分子メカニズムは、今後更に研究する必要がある。
【００８８】
ｂｄｎｆ、ｇａｓｔ及びｒｅｔｎのＤＥＧに関するｑＰＣＲの結果及びＲＮＡ−ｓｅｑの結果は、十分に一致したが、ａｇｔの結果は、一致しなかった。ｂｄｎｆは、ニューロトロフィンであり、中枢神経系内で多くの活性を有すると報告されており、且つ急性冠症候群及び２型糖尿病等の全身状態又は末梢状態に影響を及ぼすことが報告されている［１７］。ｂｄｎｆは、食物摂取の調節及び体重コントロールでの重要なタンパク質の１つであり、且つグルコースレベルの調節に大きく関係する［１８］。ｇａｓｔの遺伝子によりコードされるガストリンは、胃酸の分泌及び消化管粘膜の成長に重要なペプチドホルモンであり［１９］、ガストリン欠損マウスは、鉄欠乏に反応して造血が妨害されていることが報告されている［２０］。このデータは、造血において中枢神経系が果たす役割の理解を更に深め得る。エネルギー恒常性で果たすｒｅｔｎの役割が議論されており、レジスチンを注射したマウスで観察したインスリン抵抗性により、レジスチンと呼ばれた。肥満と２型糖尿病との間のレジスチンリンク理論を裏付ける証拠の量は、膨大である［２１］が、それにもかかわらず、これに反する証拠を提示する研究の数が増え続けていることから、この理論は、科学会では完全には受け入れられていない［２２］。本明細書での発見は、レジスチンは、少なくとも脳中で発現された場合にエネルギー恒常性の維持に役立つであろうという議論を裏付ける。
【００８９】
ｐｏｍｃは、食物摂取に関与する視床下部で重要な役割を果たすと多くの人が考えていることから特に興味深い遺伝子であった。本治療方法は、この免疫療法の結果として、下垂体におけるｐｏｍｃの発現を有意に増加させた（これをｑＰＣＲ及びＲＮＡ−ｓｅｑの両方で検出した）。ラットの視床下部においても、この治療に反応してｐｏｍｃの発現が増加したと考えるのが妥当であろう。更に、この研究の糖尿病患者での、この治療により誘発される皮膚の軽微な色素沈着異常、睡眠の改善、発熱及び悪寒の観察も視床下部及びｐｏｍｃの関与を示した。この研究のこれらの発見は、エネルギー恒常性に関する視床下部中心理論を裏付けた。
【００９０】
実施例１の結果は、本治療方法が２型糖尿病の患者において高血糖、高トリグリセリド血症及び糖尿病の症状のコントロールに役立つことを示す。実施例２で報告したラットにおけるＲＮＡ−ｓｅｑ分析及びｑＰＣＲ分析の結果は、本ＰＢＭＣ治療が中枢神経系を有意に刺激し得、且つ恒常性全体の維持に役立ち得、特にエネルギー恒常性の維持に役立ち得ることを示す。
【００９１】
甲状腺機能低下症の処置が実施例３で説明されている。甲状腺機能低下症の症状を呈する患者にエクスビボ培養活性化ＰＢＭＣを投与した。処置前に得たベースラインは、約０．０４ＩＵという甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の低いレベルを示した。処置後、患者の症状が減少し、ＴＳＨ及び他のホルモン並びにチロキシンに関する検査は、正常レベル内であった。この処置により、ＴＳＨ及び他の関連するバイオマーカーに対する恒常性が回復した。同様に、この方法を使用して、恒常性の欠如に同様に関連する甲状腺機能亢進症を処置し得る。
【００９２】
不妊症の処置が実施例４で説明されている。生殖能力の欠如を呈する男性患者及び女性患者にエクスビボ培養活性化ＰＢＭＣを投与した。５例の患者の４例は、処置後に問題なく妊娠した。女性患者でＴＳＨレベルを測定し、処置後に上昇することを観察した（図７）。ＴＳＨ測定値は、報告していないが、男性患者でのＴＳＨレベルも恒常性まで回復したと考えられる。
【００９３】
３例の変形性関節症患者を実施例５で説明したように処置した。２例の患者を自家性の活性化ＰＢＭＣで処置し、１例の患者を同種細胞で処置した。ＰＢＭＣの８回の注入後、全ての患者で症状が緩和されており、膝関節痛のＶｉｓｕａｌ  Ａｎａｌｏｇｕｅ  Ｓｃａｌｅ（ＶＡＳ）法による測定値は、平均８．３から平均２．６への有意な改善を示した。多嚢胞性卵巣症候群が長期にわたる患者は、処置前の黄体形成（ＬＨ）ホルモン及び卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の比率が３．７７であり、２超のレベルは、多嚢胞性卵巣症候群を示す。実施例６で報告したように、本治療後のＬＨ及びＦＳＨの比率は、１．１８まで３分の１に減少し、これは、改善を示す。
【００９４】
パーキンソン病の６３歳の女性患者は、動作の緩慢さ、硬直及び姿勢の不安定さという症状を有した。患者に自家性の活性化ＰＢＭＣによる処置を施した。処置後、Ｐｕｒｄｕｅ  Ｐｅｇ  Ｂｏａｒｄ  Ｄｅｘｔｅｒｉｔｙ  Ｔｅｓｔによる患者の平均スコアは、８４から７３に低下した。コントロールは、この試験で平均４５を得点した。患者は、動作の緩慢さ、硬直及び姿勢の不安定さという症状の顕著な改善も報告した。
【００９５】
更なる開示
本発明の様々な実施形態を下記に記載する。１．２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群、パーキンソン病又はこれらの組み合わせの患者を処置する方法であって、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群又はパーキンソン病の患者にエクスビボ培養活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の治療上有効な量を投与することを含み、エクスビボ培養活性化細胞は、患者に対して自家性又は同種であり、且つサイトカインの存在下で活性化及び培養される、方法。２．サイトカインは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、１に記載の方法。３．患者は、２型糖尿病を有し、及びＰＢＭＣの投与は、患者の糖化ヘモグロビンレベルを、投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、１又は２に記載の方法。４．患者は、２型糖尿病を有し、及びＰＢＭＣの投与は、患者のトリグリセリドレベルを、投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、１〜３のいずれか１つに記載の方法。５．患者は、２型糖尿病を有し、及び方法は、ＰＢＭＣの投与前又は後に患者の血糖値を検査することを更に含む、１〜４のいずれか１つに記載の方法。６．患者は、２型糖尿病を有し、及び方法は、ＰＢＭＣの投与前に患者を評価して、患者が２型糖尿病を有することを決定することを更に含む、１〜５のいずれか１つに記載の方法。７．患者は、２型糖尿病を有し、及び方法は、ＰＢＭＣの投与前に血糖値及び／又は糖化ヘモグロビンレベルのベースラインを確立することを更に含む、１〜６のいずれか１つに記載の方法。８．患者は、２型糖尿病を有し、及び方法は、ＰＢＭＣの投与前又は後に患者の糖化ヘモグロビンレベルを測定することを更に含む、１〜７のいずれか１つに記載の方法。９．患者は、２型糖尿病を有し、及び方法は、ＰＢＭＣの投与後に患者のトリグリセリドレベル及び／又はコレステロールレベルを測定することを更に含む、１〜８のいずれか１つに記載の方法。１０．患者は、２型糖尿病を有し、及び糖化ヘモグロビンレベルは、ＰＢＭＣの投与後に処置前のレベルに対して低下し、及び方法は、糖化ヘモグロビンレベルのその後の増加後にＰＢＭＣの投与を繰り返すことを更に含む、１〜９のいずれか１つに記載の方法。１１．患者のＴＳＨレベルは、処置後に正常レベルに回復されるか、又は患者のＴＳＨレベルは、ＴＳＨのベースラインレベルに対して正常に近いレベルに回復される、１又は２に記載の方法。１２．患者は、メタボリックシンドローム及び／又は肥満を有し、及びＰＢＭＣの投与は、メタボリックシンドローム及び／又は肥満の症状を、投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、１又は２に記載の方法。１３．患者は、不妊症を有し、及び投与前に確立されたベースラインに対して、ＰＢＭＣの投与は、患者の精子の健康の程度を改善し、及び／又はＴＳＨレベルは、上昇される、１又は２に記載の方法。１４．患者は、高血圧を有し、及びＰＢＭＣの投与は、患者の血圧を、投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、１又は２に記載の方法。１５．患者は、甲状腺機能亢進症又は甲状腺機能低下症を有し、及びＰＢＭＣの投与は、必要に応じて、ＴＳＨレベルを、投与前に確立されたベースラインに対して低下又は上昇させる、１又は２に記載の方法。１６．患者は、高脂血症を有し、及びＰＢＭＣの投与は、脂質レベル（コレステロール、及び／又は低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、及び／又はトリグリセリド）を、投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、１又は２に記載の方法。１７．患者は、代謝性骨粗鬆症及び／又は変形性関節症を有し、及びＰＢＭＣの投与は、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の症状（疼痛、動作の困難さ又はその他）を、投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、１又は２に記載の方法。１８．患者は、副腎機能低下症を有し、及びＰＢＭＣの投与は、患者のステロイドホルモン（例えば、コルチゾール、アルドステロン）のレベルを、投与前に確立されたベースラインに対して上昇させる、１又は２に記載の方法。１９．患者は、多嚢胞性卵巣症候群を有し、及びＰＢＭＣの投与は、患者のＬＨ対ＦＳＨの比率を、投与前に確立されたベースラインに対して改善する、１又は２に記載の方法。１９．患者は、パーキンソン病を有し、及びＰＢＭＣの投与は、患者の症状（例えば、器用さ、緩慢な動作、硬直、姿勢の不安定さ）を、投与前に確立されたベースラインに対して改善する、１又２に記載の方法。２０．患者の血液からＰＢＭＣを単離することを含む、１〜１９のいずれか１つに記載の方法。２１．ＰＢＭＣの増殖アッセイに基づいて、細胞の培養で使用するためのＩＬ−２の濃度及びＧＭ−ＣＳＦの濃度を決定することを更に含み、ＰＢＭＣは、ＩＬ−２の決定された濃度及びＧＭ−ＣＳＦの決定された濃度で培養される、１〜２０のいずれか１つに記載の方法。２２．培養活性化細胞は、血清を含有する培地で培養されるか、又は無血清条件下で培養される、１〜２１のいずれか１つに記載の方法。２３．ＰＢＭＣの投与を繰り返すことを更に含む、１〜２２のいずれか１つに記載の方法。２４．ＰＢＭＣの用量は、１×１０５〜２×１０８個の細胞の範囲である、１〜２１のいずれか１つに記載の方法。２５．１〜２６週間の範囲の期間にわたってＰＢＭＣの用量の２〜２０回を投与することを更に含む、１〜２４のいずれか１つに記載の方法。２６．ＰＢＭＣは、カルシウムイオノフォアの存在下で培養される、１〜２５のいずれか１つに記載の方法。２７．１〜２４のいずれか１つの使用のために製造されるエクスビボ培養細胞。２８．２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群、パーキンソン病の処置での使用のための、２７に記載のエクスビボ培養細胞。２９．高トリグリセリド血症及び／又は高コレステロール血症を含む付随の医学的状態の処置での使用のための、２８に記載の細胞。
【００９６】
更なる実施形態は、下記のとおりである。２１．２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群、パーキンソン病又はこれらの組み合わせの処置での使用のためのエクスビボ培養活性化血液細胞であって、サイトカインの存在下で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養してＰＢＭＣを活性化することを含むプロセスによって調製され、ＰＢＭＣは、処置される患者に関して自家性である、エクスビボ培養活性化血液細胞。代替として、ＰＢＭＣは、処置される患者に対して同種である。２２．サイトカインは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、２１に記載の使用のための血液細胞。２３．プロセスは、患者の血液からＰＢＭＣを単離することを含む、２１又は２２に記載の使用のための血液細胞。２４．プロセスは、ＰＢＭＣの増殖アッセイに基づいて、ＰＢＭＣの培養のためのＩＬ−２の濃度及びＧＭ−ＣＳＦの濃度を決定することを含む、２１〜２３のいずれか１つに記載の使用のための血液細胞。２５．培養活性化細胞は、血清を含有する培地で培養されるか、又は無血清条件下で培養される、２１〜２４のいずれか１つに記載の使用のための血液細胞。２６．細胞は、カルシウムイオノフォアの存在下で培養される、２１〜２５のいずれか１つに記載の使用のための血液細胞。２７．２型糖尿病の処置は、糖化ヘモグロビンレベルのベースラインに対する低下を提供する、２１〜２６のいずれか１つに記載の使用のための血液細胞。２８．２型糖尿病の処置は、患者のトリグリセリドレベルのベースラインに対する低下を提供する、２１〜２７のいずれか１つに記載の使用のための血液細胞。２９．高トリグリセリド血症及び／又は高コレステロール血症を含む付随の医学的状態での更なる使用のための、２１〜２７のいずれか１つに記載の使用のための血液細胞。３０．患者のＴＳＨレベルは、処置後に正常なレベルに回復されるか、又は患者のＴＳＨレベルは、ＴＳＨのベースラインレベルに対して正常に近いレベルに回復される、２１〜２６のいずれか１つに記載の使用のための血液細胞。３１．メタボリックシンドローム及び／又は肥満の処置は、メタボリックシンドローム及び／又は肥満の症状を、投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、２１〜２６のいずれか１つに記載の血液細胞。３１．投与前に確立されたベースラインに対して、不妊症の処置は、患者の精子の健康の程度を改善し、及び／又はＴＳＨレベルは、上昇される、２１〜２６のいずれか１つに記載の使用のための血液細胞。３２．高血圧の処置は、患者の血圧を、投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、２１〜２６のいずれか１つに記載の使用のための血液細胞。３３．甲状腺機能亢進症又は甲状腺機能低下症の処置は、必要に応じて、ＴＳＨレベルを、投与前に確立されたベースラインに対して低下又は上昇させる、２１〜２６のいずれか１つに記載の使用のための血経細胞。３４．高脂血症の処置は、脂質レベル（コレステロール、及び／又は低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、及び／又はトリグリセリド）を、投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、２１〜２６のいずれか１つに記載の使用のために血液細胞。３５．骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の処置は、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の症状（疼痛、動作の困難さ又はその他）を、投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、２１〜２６のいずれか１つに記載の使用のための血液細胞。３６．副腎機能低下症の処置は、患者のステロイドホルモン（例えば、コルチゾール、アルドステロン）のレベルを、投与前に確立されたベースラインに対して上昇させる、２１〜２６のいずれか１つに記載の使用のための血液細胞。３７．多嚢胞性卵巣症候群の処置は、患者のＬＨ対ＦＳＨの比率を、投与前に確立されたベースラインに対して改善する、２１〜２６のいずれか１つに記載の使用のための血液細胞。３８．パーキンソン病の処置は、患者の症状（例えば、器用さ、緩慢な動作、硬直、姿勢の不安定さ）を、投与前に確立されたベースラインに対して改善する、２１〜２６のいずれか１つに記載の使用のための血液細胞。３９．２１〜３３のいずれか１つに記載の血液細胞を製造する方法であって、１〜２７のいずれか１つを含む方法。
【００９７】
更なる実施形態は、下記である。４０．２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、不妊症、高血圧、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、骨粗鬆症、変形性関節症、副腎機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群、パーキンソン病又はこれらの組み合わせを処置するための薬物の製造のためのエクスビボ培養活性化血液細胞の使用であって、エクスビボ培養血液細胞は、サイトカインの存在下で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養してＰＢＭＣを活性化することを含むプロセスによって調製される、使用。４１．サイトカインは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、４０に記載の使用。４２．プロセスは、患者の血液からＰＢＭＣを単離することを含む、４０又は４１に記載の使用。４３．プロセスは、ＰＢＭＣの増殖アッセイに基づいて、ＰＢＭＣの培養のためのＩＬ−２の濃度及びＧＭ−ＣＳＦの濃度を決定することを含む、４０〜４２のいずれか１つに記載の使用。４４．培養活性化細胞は、血清を含む培地で培養されるか、又は無血清条件下で培養される、４０〜４３のいずれか１つに記載の使用。４５．細胞は、カルシウムイオノフォアの存在下で培養される、４０〜４４のいずれか１つに記載の使用。４６．２型糖尿病の処置は、糖化ヘモグロビンレベルのベースラインに対する低下を提供する、４０〜４５のいずれか１つに記載の使用。４７．２型糖尿病の処置は、患者のトリグリセリドレベルのベースラインに対する低下を提供する、４０〜４６のいずれか１つに記載の使用。４８．高トリグリセリド血症及び／又は高コレステロール血症を含む付随の医学的状態での更なる使用を伴う、４０〜４７のいずれか１つに記載の使用。４９．ＴＳＨレベルの調節不全に関する患者の処置は、処置後に正常なＴＳＨレベルへの回復を提供するか、又は患者のＴＳＨレベルは、ＴＳＨのベースラインレベルに対して正常に近いレベルに回復される、４０〜４５のいずれか１つに記載の使用。５０．メタボリックシンドローム及び／又は肥満の処置は、メタボリックシンドローム及び／又は肥満の症状を、投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、４０〜４５のいずれか１つに記載の使用。５１．投与前に確立されたベースラインに対して、不妊症の処置は、患者の精子の健康の程度を改善し、及び／又はＴＳＨレベルは、上昇される、４０〜４５のいずれか１つに記載の使用。５２．高血圧の処置は、患者の血圧を、投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、４０〜４５のいずれか１つに記載の使用。５３．甲状腺機能亢進症又は甲状腺機能低下症の処置は、必要に応じて、ＴＳＨレベルを、投与前に確立されたベースラインに対して低下又は上昇させる、４０〜４５のいずれか１つに記載の使用。５４．高脂血症の処置は、脂質レベル（コレステロール、及び／又は低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、及び／又はトリグリセリド）を、投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、４０〜４５のいずれか１つに記載の使用。５５．骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の処置は、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の症状（疼痛、動作の困難さ又はその他）を、投与前に確立されたベースラインに対して低減させる、４０〜４５のいずれか１つに記載の使用。５６．副腎機能低下症の処置は、患者のステロイドホルモン（例えば、コルチゾール、アルドステロン）のレベルを、投与前に確立されたベースラインに対して上昇させる、４０〜４５のいずれか１つに記載の使用。５７．多嚢胞性卵巣症候群の処置は、患者のＬＨ対ＦＳＨの比率を、投与前に確立されたベースラインに対して改善する、４０〜４５のいずれか１つに記載の使用。５８．パーキンソン病の処置は、患者の症状（例えば、器用さ、緩慢な動作、硬直、姿勢の不安定さ）を、投与前に確立されたベースラインに対して改善する、４０〜４５のいずれか１つに記載の使用。５９．４０〜５９のいずれか１つに記載の血液細胞を製造する方法であって、１〜２７のいずれか１つを含む方法。
【００９８】
本明細書に記載されている全ての特許出願、特許及び刊行物は、参照により本明細書に組み込まれ、矛盾する場合には本明細書が優先する。
【００９９】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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