(57)【要約】  本発明は、デキストラン、ポロキサマーまたはこれらの混合物を含む関節疾患または結合組織疾患の治療用組成物またはデキストラン、ポロキサマーまたはこれらの混合物を含む軟骨再生用組成物に関するものである。本発明の組成物は、緩衝効果、コーティング効果または抗炎症効果によって、関節または結合組織の損傷部に長く留まって衝撃を緩和し、損傷部特異的に損傷部を覆ったり、癒着した部位の炎症を軽減させることができるので、関節疾患、結合組織疾患の治療または軟骨再生に有効に使用することができる。
2021505680.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物を有効成分として含む、関節疾患または結合組織疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記デキストランは、５００〜１０，０００Ｄａの 平均分子量を有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポロキサマーは、１００〜２０，０００Ｄａの 平均分子量を有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記デキストランは、デキストラン１で組成物に単一の有効成分として含まれ、デキストラン１の濃度は、２〜４０（ｗ／ｖ）％であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記デキストランは、デキストラン５で組成物に単一の有効成分として含まれ、デキストラン５の濃度は、２〜３０（ｗ／ｖ）％であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ポロキサマーは、組成物に単一の有効成分として含まれ、ポロキサマーの濃度は、１〜１５（ｗ／ｖ）％であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記混合物は、デキストラン５およびポロキサマーの混合物であり、前記デキストラン５の濃度は、２〜４０（ｗ／ｖ）％、前記ポロキサマーの濃度は、１〜２０（ｗ／ｖ）％であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記混合物は、デキストラン５およびデキストラン１の混合物であり、前記デキストラン５の濃度は、２〜４０（ｗ／ｖ）％、前記デキストラン１の濃度は、２．５〜４０（ｗ／ｖ）％であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記混合物は、デキストラン１およびポロキサマーの混合物であり、前記デキストラン１の濃度は、２．５〜４０（ｗ／ｖ）％、前記ポロキサマーの濃度は、１〜５（ｗ／ｖ）％であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記混合物は、デキストラン１およびポロキサマーの混合物であり、前記デキストラン１の濃度は、４５〜５５（ｗ／ｖ）％、前記ポロキサマーの濃度は、１〜２（ｗ／ｖ）％であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物内のデキストラン：ポロキサマーの濃度（ｗ／ｖ）％の比率は、１：０．０１〜１：４０であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物内のデキストラン１およびデキストラン５の濃度（ｗ／ｖ）％の比率は、１：０．０１〜１：２０であることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ポロキサマーは、ポロキサマー１０１、ポロキサマー１０５、ポロキサマー１０５ベンゾエート、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１２２、ポロキサマー１２３、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８２ジベンゾエート、ポロキサマー１８３、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８５、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２１２、ポロキサマー２１５、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３１、ポロキサマー２３４、ポロキサマー２３５、ポロキサマー２３７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８２、ポロキサマー２８４、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０１、ポロキサマー４０２、ポロキサマー４０３およびポロキサマー４０７からなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記結合組織疾患は、炎症性骨関節疾患、炎症性皮膚炎、炎症性眼疾患、炎症性筋肉炎、炎症性消化管疾患、軟骨疾患、血管炎、および捻挫からなる群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物を有効成分として含む、軟骨再生用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デキストラン、ポロキサマー、またはこれらの混合物を含む、関節疾患または結合組織疾患の治療用組成物、軟骨再生用組成物または炎症性疾患の治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節は、骨と骨が連結する部位であって、骨と骨の間がスムーズに運動できるよう軟骨、関節包、滑膜、靭帯、腱、筋肉などからなり、動きによって発生する衝撃を吸収する役割をする。関節炎は、様々な原因によって関節に炎症などを伴った機能異常が生じたことを意味する。結合組織（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ）は、動物において組織の間を結合して器官を形成する組織であり、例えば、軟骨、椎間円板、腱、靭帯、骨、皮膚、脂肪組織、血管、腸管組織などが挙げられる。
【０００３】
関節炎の治療に用いられる薬は、炎症の軽減、疾病進行の遅延、尿酸などの代謝産物の濃度の減少といった主な作用機序を根拠に大別することができるが、多くの関節炎の治療薬が炎症を軽減させる作用をする。炎症は、痛み、膨脹、熱感、発赤、こわばりなどを引き起こす病的過程であり、炎症を迅速に緩和させる薬には、アスピリンをはじめとする非ステロイド性抗炎症剤とコルチゾンをはじめとするステロイド性抗炎症剤がある。しかし、これらの消炎剤及び抗炎症剤などは、疾患を治療するというよりは、痛みを和らげることが主な作用であり、薬物を長期間服用したときには、さまざまな合併症が多く発生する。特に、ステロイド性抗炎症剤は、疾患の原因を治療することとは関係なく、強力で、一時的な抗炎症作用を通じてただ単に痛みを一時的に軽減させ、関節の過剰な使用を招く素地があり、これは関節を破壊させ、障害を悪化させる要因となるので、使用には注意を要する。
【０００４】
したがって、関節炎などの関節損傷に用いられる従来の治療法は、その有効性において限定的であり、明白な中毒性副作用を伴い、長期間持続して用いることができず、その有効性が制限されるので、従来の治療法が持つ欠点を克服した新たな新規治療法ないしは治療剤が切実に求められているのが実情である。
【０００５】
一方、デキストランは、多糖類の一種で、Ｄ−グルコースの重合体を指すものであって、でんぷんやグリコーゲンと類似する構造を有し、Ｄ−グルコースがα−１，６結合で直鎖状につながり、ところどころにα−１，４またはα−１，３結合で枝別れしている。一般に用いられている高分子量のデキストランは、体内でアレルギー反応をよく引き起こすとして知られている。デキストランは、血漿増量剤、血液凝固剤（癒着防止剤）、架橋デキストラン（ｃｒｏｓｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎ）を用いたフィラー等に使用されてきたが、関節疾患や結合組織疾患の治療剤として使用されたとの報告はされたところがない。ポロキサマーは、非イオン性界面活性剤を指し、界面活性剤の他に乳化剤、安定化剤、溶解補助剤などとしても用いられるとして知られている。
【０００６】
現在、関節疾患または結合組織疾患に対する従来の治療法が持つ限界、すなわち、限定的とされる有効性、明白な中毒性副作用、持続性の不在により、新規な治療法又は治療薬が必要とされ、特に体内に投与する場合、アレルギー反応を起こさないデキストランまたはポロキサマーは、特に低分子量のデキストランまたはポロキサマーを用いた、関節疾患または結合組織疾患の治療に関する研究は、知られたところがないのが実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明者等は、関節または結合組織の治療のための研究を行った結果、デキストラン、ポロキサマーまたはこれらの混合物が、アレルギー反応を起こさず、関節および結合組織の損傷部に対する緩衝効果、保持効果または抗炎症効果により、関節および結合組織を保護する効果があることを確認した。これにより、本発明を完成した。
【０００８】
本発明の目的は、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物を含む、関節疾患または結合組織疾患の治療用薬学的組成物、軟骨再生用組成物または炎症性疾患の治療用薬学的組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物を含む、関節疾患または結合組織疾患の治療用薬学的組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）１、デキストラン５およびポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８からなる群から選択された２種の混合物を含む、関節疾患または結合組織疾患の予防、または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１１】
また、本発明は、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物を有効成分として含む、炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。  
【００１２】
また、本発明は、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物を有効成分として含む、軟骨再生用組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）１、デキストラン５およびポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８からなる群から選択された２種の混合物を含む、軟骨再生用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の組成物は、緩衝効果、コーティング効果または抗炎症効果により、関節または結合組織の損傷部に長く留まることにより衝撃を和らげ、損傷部特異的に損傷部を包んだり、癒着した部位の炎症を軽減することができるので、関節疾患、結合組織疾患の治療または軟骨の再生に有効に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】正常軟骨細胞に対するデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物の処理２４時間後、軟骨細胞の細胞増殖能を確認した結果を示す図である（＊／＊＊／＊＊＊は、それぞれ陰性対照群（ｎｃ）対比ｐ＜０．０５／ｐ＜０．０１／ｐ＜０．００１の有意度を表す）。
【図２】正常軟骨細胞に対するデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物の処理４８時間後、軟骨細胞の細胞増殖能を確認した結果を示す図である（＊／＊＊／＊＊＊は、それぞれ陰性対照群（ｎｃ）対比ｐ＜０．０５／ｐ＜０．０１／ｐ＜０．００１の有意度を表す）。
【図３】ｒｈＩＬ−１α処理による骨関節炎ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの軟骨細胞に対するデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物の処理２４時間後、軟骨細胞の細胞増殖能を確認した結果を示す図である（＊／＊＊／＊＊＊は、それぞれ炎症誘発陽性対照群（ｐｃ）対比ｐ＜０．０５／ｐ＜０．０１／ｐ＜０．００１の有意度を表す）。
【図４】ｒｈＩＬ−１α処理による変形性関節症ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの軟骨細胞に対するデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物の処理４８時間後、軟骨細胞の細胞増殖能を確認した結果を示す図である（＊／＊＊／＊＊＊は、それぞれ炎症誘発陽性対照群（ｐｃ）対比ｐ＜０．０５／ｐ＜０．０１／ｐ＜０．００１の有意度を表す）。
【図５】ｒｈＩＬ−１α処理による変形性関節症ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの軟骨細胞に対するデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物の処理によるＩＬ−１０／ＩＬ−６遺伝子発現比を確認した結果を示す図である（＊／＊＊／＊＊＊は、それぞれ炎症誘発陽性対照群（ｐｃ）対比ｐ＜０．０５／ｐ＜０．０１／ｐ＜０．００１の有意度を表す）。
【図６】ｒｈＩＬ−１α処理による変形性関節症ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの軟骨細胞に対するデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物処理によるＭＭＰ−３遺伝子発現量を確認した結果を示す図である（＊／＊＊／＊＊＊は、それぞれ炎症誘発陽性対照群（ｐｃ）対比ｐ＜０．０５／ｐ＜０．０１／ｐ＜０．００１の有意度を表す）。
【図７】ｒｈＩＬ−１α処理による変形性関節症ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの軟骨細胞に対するデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物処理によるＭＭＰ−１３遺伝子発現量を確認した結果を示す図である（＊／＊＊／＊＊＊は、それぞれ炎症誘発陽性対照群（ｐｃ）対比ｐ＜０．０５／ｐ＜０．０１／ｐ＜０．００１の有意度を表す）。
【図８】ｒｈＩＬ−１α処理による変形性関節症ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの軟骨細胞に対するデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物の処理によるＩＩ型コラーゲン生成量を確認した結果を示す図である（＊／＊＊／＊＊＊は、それぞれ炎症誘発陽性対照群（ｐｃ）対比ｐ＜０．０５／ｐ＜０．０１／ｐ＜０．００１の有意度を表す）。
【図９】ｒｈＩＬ−１α処理による変形性関節症ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの軟骨細胞に対するデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物の処理によるアグリカン生成量を確認した結果を示す図である（＊／＊＊／＊＊＊は、それぞれ炎症誘発陽性対照群（ｐｃ）対比ｐ＜０．０５／ｐ＜０．０１／ｐ＜０．００１の有意度を表す）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物を含む、関節疾患または結合組織疾患の治療用薬学組成物を提供する。また、本発明は、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物をこれを必要とする個体に投与する段階；を含む、関節疾患または結合組織疾患の予防、または治療方法を提供する。
【００１７】
本発明において、「デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）」は、多糖類の一種であるＤ−グルコースの重合体を意味する。デキストランは、でんぷんやグリコーゲンと類似する構造を有しており、Ｄ−グルコースがα−１，６結合に直鎖状につながり、ところどころにα−１，４またはα−１，３結合が枝分かれしている。デキストランは、血漿増量剤、血液凝固剤として用いることができ、目的に応じてデキストランの分子量を異にして用いることができる。本発明において、前記デキストランは、５００〜１０，０００Ｄａの平均分子量を有することができ、好ましくは５００〜８，０００Ｄａ、より好ましくは１，０００〜５，０００Ｄａの平均分子量であってもよい。デキストランは、分子量に応じて平均分子量が１，０００Ｄａの場合には「デキストラン１」、５，０００Ｄａの場合には「デキストラン５」、平均分子量が１０，０００Ｄａの場合には「デキストラン１０」などと命名して使用する。 
【００１８】
一般に、８，０００Ｄａ以上のデキストランは、人体に投与され、アレルギー反応を起こす危険性が大きいとして知られている。特に、前記アレルギー反応により抗原−抗体の免疫反応が原因となって発生する急激な全身的な反応であるアナフィラキシー（ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ）が発生することがあるが、これは非常に危険といえる。しかし、本発明に係る低分子量のデキストラン、好ましくは１，０００Ｄａ〜５，０００Ｄａデキストランを用いると、アレルギー反応を最小限に抑えることができる長所があり、公知の物質（例えば、ヒアルロン酸）に比べて体内で分解される速度が遅いので、関節疾患または結合組織疾患の治療効果が長く持続する長所がある。
【００１９】
また、本発明に係る低分子量のデキストランは、８，０００Ｄａ以上のデキストランに比べてアレルギー反応がないばかりでなく、作用発現時間（ｏｎｓｅｔ）が速く、広範囲に分布するように広がることができる特徴がある。
本発明は、好ましい例として、デキストラン１、デキストラン５を用いた実施例を提供する。これらはデキストラン１とデキストラン５の組み合わせで用いることができ、ポロキサマー１８８との組み合わせでも用いることができる。
【００２０】
本発明において、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）１、デキストラン５およびポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８からなる群から選択された２種は、１：１の体積比で混合されたものであってもよい。
【００２１】
本発明において、前記デキストランの濃度は、溶媒１００ｃｃ中、質量（ｇ）濃度（ｗ／ｖ）の百分率で表し、例えば、デキストラン１は、単一有効成分として組成物に含まれる場合には、２〜４０（ｗ／ｖ）％濃度で含まれることができ、デキストラン５は、単一有効成分として組成物に含まれる場合には、デキストラン５は２〜３０（ｗ／ｖ）％濃度で含まれることができる。
【００２２】
また、デキストランがデキストラン１または５の混合物、デキストランとポロキサマーとの混合物で組成物に含まれる場合、デキストランの濃度は、混合対象に応じて異なりうる。例えば、デキストラン５およびデキストラン１の混合物が組成物に含まれる場合には、前記デキストラン５の濃度は、２〜４０（ｗ／ｖ）％、前記デキストラン１の濃度は、２．５〜４０（ｗ／ｖ）％、またはデキストラン５の濃度は、４〜４０（ｗ／ｖ）％、デキストラン１の濃度は、５〜４０（ｗ／ｖ）％であってもよい。
【００２３】
デキストランが組成物に高濃度に存在する場合、多糖類の水分を含有する特性上、粘度が過度に増加して性状を作りにくいという欠点があるので、デキストランは、一般に５％以下の濃度で用いられてきた。しかし、本発明の組成物内に、デキストランは分子量に応じて少なくとも２〜最大４０（ｗ／ｖ）％濃度で含まれるので、関節疾患または結合組織疾患の治療効果が最大化されることができる。このようなデキストランの溶解度を高めたり、安定化させるために、本発明の組成物は、追加で添加物をさらに含むことができ、前記添加物は、糖アルコール類、単糖類、またはＣａＣｌ２を含む２価陽イオンを含むことができる。
【００２４】
本発明において、「ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）」は、疎水性のプロピレンオキサイドを中心に両端に親水性のエチレンオキサイドが結合された非イオン性のトリブロック共重合体であって、温度感度の特徴を有しており、濃度と温度に応じてゾル（Ｓｏｌ）とゲル（Ｇｅｌ）の変換が可能であり、ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンの割合に応じてポロキサマーの性質が変わる。ポロキサマーは、界面活性剤の他に乳化剤、安定化剤、溶解補助剤などとしても用いられる。
【００２５】
本発明において、前記ポロキサマーは、１００〜２０，０００Ｄａの平均分子量を有することができる。
【００２６】
前記ポロキサマーは、ポロキサマー１０１、ポロキサマー１０５、ポロキサマー１０５ベンゾエート、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１２２、ポロキサマー１２３、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８２ジベンゾエート、ポロキサマー１８３、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８５、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２１２、ポロキサマー２１５、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３１、ポロキサマー２３４、ポロキサマー２３５、ポロキサマー２３７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８２、ポロキサマー２８４、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０１、ポロキサマー４０２、ポロキサマー４０３およびポロキサマー４０７からなる群から選択することができ、好ましくはポロキサマー１８８を含むが、これに制限されるものではない。
【００２７】
本発明において、前記ポロキサマーの濃度は、溶媒１００ｃｃ中の質量（ｇ）濃度（ｗ／ｖ）の百分率であって、１〜５０（ｗ／ｖ）％濃度、２〜３０（ｗ／ｖ）％濃度で組成物に含まれることを特徴とすることができ、例えば、ポロキサマー１８８は、組成物内の単独有効成分として含まれる場合、１〜１５（ｗ／ｖ）％、または１〜１０（ｗ／ｖ）％濃度で組成物に含まれることができる。
【００２８】
このようなポロキサマーの溶解度を高めたり、安定化させたりするために、本発明の組成物は、追加で糖アルコール類、単糖類、２価陽イオンと同様の添加物をさらに含むことができ、別途の添加物なしに滅菌水または生理食塩水を組成物に含むこともできる。
【００２９】
本発明において、前記薬学的組成物は、デキストランおよびポロキサマーの混合物を含むことができる。特に、ポロキサマー１８８をデキストランと混合して用いた場合、デキストラン１またはデキストラン５と混合して用いることができ、例えば、デキストラン５と混合する場合、前記デキストラン５の濃度は、２〜４０（ｗ／ｖ）％、前記ポロキサマー１８８の濃度は、１〜２０（ｗ／ｖ）％であってもよく、またはデキストラン５の濃度が４〜４０（ｗ／ｖ）％、ポロキサマー１８８の濃度が２〜１０（ｗ／ｖ）％であってもよい。
【００３０】
また、例えば、デキストラン１と混合する場合、前記デキストラン１の濃度は、２．５〜４０（ｗ／ｖ）％、前記ポロキサマーの濃度は、１〜５（ｗ／ｖ）％であってもよい、またはデキストラン１の濃度が４５〜５５（ｗ／ｖ）％、ポロキサマー１８８の濃度が１〜２（ｗ／ｖ）％であってもよい。
【００３１】
ポロキサマー１８８は、高濃度、例えば、２５（ｗ／ｖ）％を超過して組成物内に含まれる場合、毒性を示すことができ、デキストランと混合する場合、濃度を適切に調節して用いることができる。
【００３２】
一実施例として、本発明の薬学的組成物内のデキストラン：ポロキサマーは、例えば、（ｗ／ｖ）％の割合として、５：０．０５、５：０．５、５：５、５：１０、５：２０、５：３０、５：４０、５：５０、５：１００、５：１５０、５：２００、１０：０．１、１０：１、１０：１０、１０：２０、１０：３０、１０：４０、１０：５０、１０：１００、１０：１５０、１０：３００、１０：４００、５０：０．５、５０：１、５０：５、５０：１０、５０：２０、５０：３０、５０：４０、５０：５０含むことができ、例を挙げれば、１：０．０１〜１：４０、例示的な組み合わせとしてポロキサマー１８８  １（ｗ／ｖ）％とデキストラン１  ４０（ｗ／ｖ）％とを混合した場合、１：４０、ポロキサマー１８８  ２０（ｗ／ｖ）％とデキストラン５  ２（ｗ／ｖ）％とを混合した場合、１：０．１の比を反映し、１：０．１〜１：４０含むことができる。ここで、前記デキストランの平均分子量は１，０００Ｄａまたは５，０００Ｄａであることができ、前記ポロキサマーの平均分子量は８，５００Ｄａであるポロキサマー１８８を含むことができる。また、本発明の一実施例として、デキストラン１、デキストラン５およびポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８からなる群から選択された２種の混合物を含む場合、それぞれの成分は、１：１の体積比で混合して組成物に含まれることができる。
【００３３】
また、本発明の一実施例として、本発明の薬学的組成物は、デキストラン１およびデキストラン５の混合物を含み、薬学的組成物内のデキストラン１：デキストラン５は、例えば、（ｗ／ｖ）％の割合として、５：０．０５、５：０．５、５：５、５：１０、５：２０、５：３０、５：４０、５：５０、５：１００、１０：０．１、１０：１、１０：１０、１０：２０、１０：３０、１０：４０、１０：５０、１０：１００、１０：１５０、１０：２００、５０：０．５、５０：１、５０：５、５０：１０、５０：２０、５０：３０、５０：４０、５０：５０、５０：１０００含むことができ、例に挙げれば、１：０．０１〜１：２０、例示的な組み合わせとして、デキストラン１  ２．５（ｗ／ｖ）％とデキストラン５  ４０（ｗ／ｖ）％とを混合した場合、１：１６、デキストラン１  ４０（ｗ／ｖ）％とデキストラン５  ２（ｗ／ｖ）％とを混合した場合、１：０．０５の比を反映し、１：０．０５〜１：１６含むことができる。
【００３４】
本発明の組成物がデキストランおよびポロキサマーの混合物を含む場合、ポロキサマーの疎水性成分がデキストランまたは併用薬物の溶解度を増進させることができ、ポロキサマーの親水性成分であるＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）は、細胞膜を保持して癒着を防止し、組織を保持することができる。ただし、ポロキサマーは、体液により希釈され易く、体液に吸収され易い欠点があるので、デキストランとの混合を介して、体内の安定性を増加させることができる。したがって、デキストランおよびポロキサマーの混合物の場合、デキストラン単独またはポロキサマー単独を含む場合に比べて粘性が長持ちし、損傷した関節または結合組織部位を包むことができ、組織の病理学的な癒着を防いで摩擦力による炎症所見が減少することにより、栄養物質の供給が円滑になり、組織の再生が促される効果がある。前記効果は、デキストランおよびポロキサマー混合物の緩衝効果（ｃｕｓｈｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ）、コーティング効果（ｃｏａｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）、または抗炎症効果（ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ）によって誘導され得る。
【００３５】
本発明において、「緩衝効果（ｃｕｓｈｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ）」とは、投与された部位、例えば、関節での摩擦を減らすことによって、加わる衝撃を緩衝するクッションのような役割をする効果を意味し、「コーティングの効果（ｃｏａｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）」とは、硬くなった部位、例えば、関節内の損傷した軟骨組織を迅速に覆ってコーティングすることにより、膝関節を楽に動かせるようにする効果を意味する。これらの効果により、破損した関節部位の炎症反応が軽減される。
【００３６】
したがって、緩衝効果とコーティング効果または抗炎症効果を誘導する本発明の組成物は、再生または損傷した組織を改善するのに適しているので、関節疾患または結合組織疾患の治療に効果的に用いることができる。本発明の組成物の前記のような効果は、現在、関節疾患の治療のために用いられている幹細胞治療剤と同様の効果であり、高度な技術力およびコストが要求される幹細胞治療剤と比較して競争力を有することができる。
【００３７】
一方、本発明のデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物を含む、関節疾患または結合組織疾患の予防または治療用薬学的組成物には、本発明が目的とする関節疾患または結合組織疾患の予防または治療効果を促進させるために、幹細胞をさらに含むことができる。本発明に含まれることができる幹細胞は、胚性幹細胞または成体幹細胞を含み、前記成体幹細胞は、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）、ヒト組織由来間葉系幹細胞、多分化能幹細胞または羊膜上皮細胞であることができる。前記幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪（または脂肪組織細胞）、筋肉、神経、皮膚、羊膜および胎盤（または胎盤組織の細胞）、尿などに由来する幹細胞であることができるが、これに限定されるものでない。前記幹細胞は、幹細胞またはその濃縮液、幹細胞培養液またはこれの濃縮液、幹細胞培養分泌物またはこれの濃縮液、または、これらの配合物であることができる。前記組成物内のデキストランまたはポロキサマーは、幹細胞を関節または結合組織の破損した病変部に特異的に運搬する役割をすることができ、また、幹細胞が運ばれた病変部に定着して損傷した組織の再生を誘導することを上昇させる効果がある。
【００３８】
本発明において、「予防」とは、組成物の投与により、関節疾患または結合組織疾患を抑制したり、発症を遅延させたりするすべての行為をいう。
【００３９】
本発明において、「治療」とは、組成物の投与により、関節疾患または結合組織疾患の症状が好転したり、有益に変更したりするすべての行為をいう。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される添加剤をさらに含むことができ、薬学分野において通常の方法にしたがって患者の身体内投与に適した単位投与型の製剤で製剤化することができる。また、前記製剤は、薬剤学的に許容される担体または媒体、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、または結合剤などと組み合わせて、薬学的に認められている単位容量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００４０】
前記薬学的組成物は、溶液状態または粉末状態であってもよく、前記薬学的組成物が粉末状態の場合、投与直前に溶媒に溶解して用いることができるが、これに限定されるものではなく、薬物の製造時に発生し得る数々の状況を考慮して最適な方法で製造することができる。 
【００４１】
前記薬学的組成物の投与形態は、特に限定されないが、経口投与、注射、輸液による投与等の一般的な投与経路を経ることができる。
【００４２】
経口投与の場合には、前記組成を有する組成物として、または、医薬上許容される担体、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）と一緒に錠剤、丸薬、カプセル、ゲル、シロップなどの製剤として用いてもよい。ただし、精製や散剤などの固形剤では、吸収に時間がかかることが多いので、液剤などによる経口投与が好ましい。その場合には、適当な添加物、例えば、塩化ナトリウムなどの塩類、緩衝剤、キレート剤などと一緒に水溶液として投与するのが好ましい。
【００４３】
また、関節疾患または結合組織を標的とする特異抗体により被覆されたリポソームのような標的薬物輸送システムを介して薬物を投与することができる。リポソームは、病気のある組織に選択的に取り込むことができる。
【００４４】
本発明の薬学的組成物が局所投与用の製剤で投与される場合、適切な緩衝剤、等張化剤などを添加して滅菌蒸留水に溶解したものを用いて、個体の関節腔、結合組織、静脈内、皮下、皮内、関節内、または筋肉などに直接注入するか、肌に塗布するか、或いはパッチ（ｐａｔｃｈ）形態であってもよい。
【００４５】
前記個体は、ヒト、犬、猫、豚、馬、牛、羊、ラット、およびサルを含む哺乳動物から選択されるいずれか一つ、好ましくはヒトであってもよい。
【００４６】
本発明において、用語「関節内」とは、本発明の薬学的組成物への関節経皮注射をいう。
【００４７】
本発明において、用語「局所投与」とは、炎症のある関節内にまたはその付近の経皮注射をいう。したがって、局所投与の注射は、表皮、真皮、筋肉または任意の深部器官に関連するものである。
【００４８】
局所投与の主な利点は、損傷した領域に対する鎮痛効果を選択的に制限するというものである。さらに、局所投与は、全身への放出がほとんどない、または、全くない、高い局所濃度レベルを可能にする。
【００４９】
前記薬学的組成物は、安定化剤、潤滑剤、緩衝剤、等張性調整剤、麻酔剤または抗菌剤などをさらに含むことができる。
【００５０】
また、前記薬学的組成物は、当分野において広く用いられる抗炎症剤をさらに含むことができる。該抗炎症剤は、非ステロイド性、ステロイド性またはこれらの配合物であることができる。非ステロイド性抗炎症剤の非限定的な例は、オキシカム、例えば、ピロキシカム、イソキシカム、テノキシカム、スドキシカム； サリチルレート、例えば、アスピリン、ジサルシド、ベノリレート、トリセート、サファプリン、ソルプリン、ジフルニサル、およびフェンドサル；酢酸誘導体、例えば、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、イソキセパク、フロフェナク、チオピナク、ジドメタシン、アセマタシン、フェンチアザク、ゾメピラック、クリンダナク、オキセピナク、フェルビナク、およびケトロラク；フェナム酸、例えば、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、ニフルム酸、およびトルフェナム酸；プロピオン酸誘導体、例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ベノキサプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン、およびチオプロフェン；ピラゾール、例えば、フェニルブタゾン、オキシフェノブタゾン、フェプラゾン、アザプロパゾン、およびトリメタゾンを含む。これらの非ステロイド性抗炎症剤の抽出物もまた用いることができる。
【００５１】
前記ステロイド性抗炎症剤の非限定的な例には、コルチコステロイド、例えば、ハイドロコルチゾン、ヒドロキシ−トリアムシノロン、アルファ−メチルデキサメタゾン、デキサメタゾン− ホスフェート、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、クロベタゾールバレレート、デソニド、デソキシメサゾン、デソキシコルチコステロンアセテート、デキサメタゾン、ジクロリソン、ジ酢酸ジフロラソン、ジフルコルトロンバレレート、フルアドレノロン、フルクロロロンアセトニド、フルドロコルチゾン、フルメタゾンピバレート、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、フルプレドニデン（フルプレドニリデン）アセテート、フルランドレノロン、ハルシノニド、ハイドロコルチゾンアセテート、酪酸ハイドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、ジ酢酸ジフルオロソン、フルラドレノロン、フルドロコルチゾン、ジ酢酸ジフルロソン、フルラドレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ベタメタゾン、およびそのエステルのバランス(balance)、クロロプレドニゾン、酢酸クロロプレドニゾン、クロコルテロン、クレシノロン、ジクロリゾン、ジフルプレドネート、フルロロニド、フルニソリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレニソロン、ハイドロコルチゾンバレレート、ハイドロコルチゾンシクロペンチルプロピオネート、ハイドロコルタメート、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ベクロメタゾンジプロピオネート、トリアムシノロンおよびその抽出物が含まれる。
【００５２】
本発明の薬学的組成物は、薬剤学的に有効な量で投与することができる。用語「薬剤学的に有効な量」とは、疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、疾患の重症度、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する感度、投与時間、投与経路および排出割合、治療期間、用いられた本発明の組成物と配合または同時に用いられる薬剤を含む要素、並びにその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定することができる。デキストラン、ポロキサマー、またはこれらの混合物の容量は、広い範囲で変わり、それぞれの特別な場合の個々のニーズに応じて決定される。
【００５３】
本発明の薬学的組成物は、関節疾患または結合組織疾患の治療のための公知の薬剤と併用して投与することができ、前記治療剤と一緒に同時または順次投与することができる。
【００５４】
本発明の薬学的組成物は、１回または数回に分けて好ましい投与間隔、例えば、１週間間隔で投与することができる。
【００５５】
本発明によると、デキストラン、ポロキサマー、またはこれらの混合物を含む薬学的組成物は、関節疾患または結合組織疾患を患う個体から長期間持続する痛みの軽減を誘導する。本発明に係る薬学的組成物を用いる場合、主要薬物による副作用を避けられ、過度な侵襲的な技術を使うことなく、且つ、急性のみならず、慢性関節疾患または結合組織疾患の治療および／または予防を可能にする。
【００５６】
本発明において、「結合組織（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ）」とは、 動物の組織に広く分布し、細胞、臓器、器官などを結合、保護、充電する役割をする組織を指し、線維性結合組織、膠質組織、細網組織に分類されるが、線維性結合組織がその大部分を占めている。例えば、本発明の結合組織は、軟骨、椎間円板、腱、靭帯、骨、皮膚、血管、腸管組織などを制限なしに含むことができる。
【００５７】
本発明において、「関節疾患」または「結合組織疾患」が発生する原因として、外傷性、感染性、炎症性、退行性に大きく分類することができる。本発明に係る組成物または治療剤は、関節に損傷をもたらすあらゆる原因による関節疾患および結合組織疾患に用いられることができるが、本発明の組成物が効果的に用いられると予想される関節疾患は、骨関節炎、好ましくは反復的な摩擦力とそれによって発生する退行性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、外傷性関節炎、関節リウマチ、膝蓋大腿症疼痛候群、慢性炎症または関節症を含む。また、本発明の組成物が効果的に用いられると予想される結合組織疾患は、軟骨、椎間円板、腱、靭帯、骨、皮膚、血管、腸管組織などが物理的な損傷や反復的な摩擦による退行性変化によりコラーゲンまたは水分の損失が生じた場合の結合組織疾患を含む。特に、本発明の組成物は、抗炎症効果およびコラーゲン合成を促進し、アグリカンの生成量を増加させる効果に優れているので、このような効果に基づいて結合組織疾患のうち、特に炎症に関連する結合組織疾患、好ましくは炎症性骨関節疾患、炎症性皮膚炎、炎症性眼疾患、炎症性筋肉炎、炎症性消化管疾患、軟骨疾患、血管炎、および捻挫からなる群から選択された１種以上の結合組織疾患の予防または治療に効果的に用いることができる。
【００５８】
本発明において、細胞毒性は示されず、且つ、抗炎症効果が効果的に示され、軟骨基質を破壊するタンパク質ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３遺伝子発現を抑制し、軟骨の保護作用としてＩＩ型コラーゲンの合成を促進し、アグリカンの生成量を増加させる効果を達成することができる好ましい例を次のように提供することができる。
【００５９】
本発明において、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）１、デキストラン５およびポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８からなる群から選択された２種は、１：１の体積比で混合されるものであってもよい。
【００６０】
また、本発明は、デキストラン１、デキストラン５およびポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８からなる群から選択された２種の混合物を含む、関節疾患または結合組織疾患の予防、または治療用薬学的組成物に関するものである。
【００６１】
前記デキストランは、デキストラン１で組成物に単一有効成分として含まれ、デキストラン１の濃度は、２〜４０（ｗ／ｖ）％であることができる。
【００６２】
前記デキストランは、デキストラン５で組成物に単一有効成分として含まれ、デキストラン５の濃度は、２〜３０（ｗ／ｖ）％であることができる。
【００６３】
また、前記ポロキサマーは、組成物に単一有効成分として含まれ、ポロキサマーの濃度は、１〜１５（ｗ／ｖ）％であることができる。
【００６４】
本発明の一例では、前記混合物は、デキストラン５およびポロキサマーの混合物であり、前記デキストラン５の濃度は、２〜４０（ｗ／ｖ）％、前記ポロキサマーの濃度は、１〜２０（ｗ／ｖ）％であることができる。
【００６５】
また、前記混合物は、デキストラン５およびデキストラン１の混合物であり、前記デキストラン５の濃度は、２〜４０（ｗ／ｖ）％、前記デキストラン１の濃度は２．５ 〜４０（ｗ／ｖ）％であることができる。
【００６６】
また、前記混合物は、デキストラン１およびポロキサマーの混合物であり、前記デキストラン１の濃度は、２．５〜４０（ｗ／ｖ）％、前記ポロキサマーの濃度は、１〜５（ｗ／ｖ）％であることができる。
【００６７】
また、前記混合物は、デキストラン１およびポロキサマーの混合物であり、前記デキストラン１の濃度は、４５〜５５（ｗ／ｖ）％、前記ポロキサマーの濃度は、１〜２（ｗ／ｖ）％であることができる。
【００６８】
また、本発明の一例は、抗炎症作用に基づく抗炎症組成物、炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物、これを用いた炎症性疾患の予防または治療方法に関するものである。
【００６９】
これにより、本発明は、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物を有効成分として含む、炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００７０】
また、本発明は、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物を、これを必要とする個体に投与する段階； を含む、炎症性疾患の予防または治療方法を提供する。
【００７１】
これにより、本発明は、具体的にデキストラン１、デキストラン５およびポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８からなる群から選択された１種以上を含む、炎症性疾患の予防、治療用薬学的組成物、炎症性疾患の予防、または治療方法を提供する。
【００７２】
本発明において、炎症性疾患とは、炎症性皮膚疾患、炎症性眼疾患、炎症性骨関節疾患、炎症性筋疾患または炎症性胃腸疾患であることができるが、これに限定されるものではない。
【００７３】
前記デキストラン１、デキストラン５およびポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８からなる群から選択された２種の混合物を投与する場合、それぞれの成分の抗炎症効果と比較して顕著に優れた効果を示すことができる。具体的にはデキストラン１、デキストラン５およびポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８の投与時、デキストラン１  ２および４０（ｗ／ｖ）％、デキストラン５  ２および４０（ｗ／ｖ）％、ポロキサマー１８８  １〜１０（ｗ／ｖ）％の全範囲で抗炎症効果に優れていることを示すことができ、例えば、好ましい実施例では、デキストラン１  ５（ｗ／ｖ）％およびポロキサマー１８８  ２（ｗ／ｖ）〜１０（ｗ／ｖ）％、デキストラン１  ５（ｗ／ｖ）％およびデキストラン５  ４〜４０（ｗ／ｖ）％、デキストラン１  ５０（ｗ／ｖ）％およびポロキサマー１８８  ２〜１０（ｗ／ｖ）％、デキストラン１  ５０（ｗ／ｖ）％およびデキストラン５  ４〜４０（ｗ／ｖ）％、ポロキサマー１８８  ２（ｗ／ｖ）％およびデキストラン１  ５〜５０（ｗ／ｖ）％、ポロキサマー１８８  ２（ｗ／ｖ）％およびデキストラン５  ４〜４０（ｗ／ｖ）％、ポロキサマー１８８  １０（ｗ／ｖ）％およびデキストラン１  ５〜５０（ｗ／ｖ）％、ポロキサマー１８８  １０（ｗ／ｖ）％およびデキストラン５  ４〜４０（ｗ／ｖ）％、デキストラン５  ４（ｗ／ｖ）％およびデキストラン１  ５〜５０（ｗ／ｖ）％、デキストラン５  ４０（ｗ／ｖ）％およびデキストラン１  ５〜５０（ｗ／ｖ）％、ないし４０（ｗ／ｖ）％、デキストラン５  ４０（ｗ／ｖ）％およびポロキサマー１８８ ２〜１０（ｗ／ｖ）％で組み合わせて抗炎症、炎症性疾患の治療用途で用いることができる。
【００７４】
したがって、本発明の混合物は、デキストラン１およびポロキサマー１８８の混合物であり、前記デキストラン１の濃度は、２〜４０（ｗ／ｖ）％、前記ポロキサマー１８８の濃度は、１〜１０（ｗ／ｖ）％であることを特徴とすることができる。
【００７５】
また、本発明の混合物は、デキストラン１およびデキストラン５の混合物であり、前記デキストラン１の濃度は、２〜４０（ｗ／ｖ）％、およびデキストラン５の濃度は、２〜４０（ｗ／ｖ）％であることを特徴とすることができる。
【００７６】
また、本発明の混合物は、デキストラン５およびポロキサマー１８８の混合物であり、前記デキストラン５の濃度は、２〜４０（ｗ／ｖ）％、前記ポロキサマー１８８の濃度は、１〜１０（ｗ／ｖ）％であることを特徴とすることができる。
【００７７】
本発明のもう一つの一例は、軟骨基質の再生効果に基づいた軟骨再生用組成物、これを用いた軟骨再生方法に関するものである。
【００７８】
これにより、本発明は、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物を有効成分として含む、軟骨再生用組成物を提供する。
【００７９】
また、本発明は、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはこれらの混合物を、軟骨再生を必要とする個体に投与する段階；を含む、軟骨再生方法を提供する。
【００８０】
本発明において、具体的にデキストラン１、デキストラン５およびポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８からなる群から選択された１種以上を含む、軟骨再生用組成物または軟骨再生方法を提供し、これらをコラーゲン生成量の増加およびアグリカンの生成量の増加を誘導し、ＭＭＰ−３またはＭＭＰ−１３の発現量を減少させることができる。 
【００８１】
前記デキストラン１、デキストラン５およびポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８からなる群から選択された１種を投与する場合、デキストラン１は、２〜４０（ｗ／ｖ）％、ポロキサマー１８８は、１〜１５（ｗ／ｖ）％、デキストラン５は、２〜３０（ｗ／ｖ）％で含まれることができる。 
【００８２】
また、デキストラン１、デキストラン５およびポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８からなる群から選択された２種以上の混合物を投与した場合、具体的な実施例で、デキストラン１  ５（ｗ／ｖ）％およびポロキサマー１８８  ２（ｗ／ｖ）％、デキストラン１  ５（ｗ／ｖ）％およびデキストラン５  ４〜４０（ｗ／ｖ）％、デキストラン１  ５０（ｗ／ｖ）％およびポロキサマー１８８  ２（ｗ／ｖ）％、デキストラン５  ４〜４０％（ｗ／ｖ）％およびポロキサマー１８８  ２〜１０（ｗ／ｖ）％で組み合わせることができ、このように組み合わせた場合、コラーゲンまたはアグリカンの生成量を増加させ、ＭＭＰ−３またはＭＭＰ−１３の発現を抑制し、優れた軟骨再生効果を達成することができる。
【００８３】
したがって、本発明の混合物は、デキストラン１およびポロキサマー１８８の混合物であり、前記デキストラン１の濃度は、５〜４０（ｗ／ｖ）％、前記ポロキサマー１８８の濃度は、２（ｗ／ｖ）％であることを特徴とすることができる。
【００８４】
また、本発明の混合物は、デキストラン１およびデキストラン５の混合物であり、前記デキストラン１の濃度は、５（ｗ／ｖ）％、前記デキストラン５の濃度は、４〜４０（ｗ／ｖ）％であることを特徴とすることができる。
【００８５】
また、本発明の混合物は、デキストラン５およびポロキサマー１８８の混合物であり、前記デキストラン５の濃度は、４〜４０（ｗ／ｖ）％、前記ポロキサマー１８８の濃度は、２〜１０（ｗ／ｖ）％であることを特徴とすることができる。
【００８６】
また、抗炎症および軟骨再生効果の両方を同時に達成することができ、関節疾患または結合組織疾患の予防または治療に最も適した実施例は、これに限定されるものではないが、デキストラン１、デキストラン５およびポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８を単独で含む場合、デキストラン１  ２．５（ｗ／ｖ）％、デキストラン５  ２〜３０（ｗ／ｖ）％、ポロキサマー１８８  １〜１５（ｗ／ｖ）％であることができ、デキストラン１、デキストラン５およびポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８からなる群から選択された２種以上の混合物を用いる場合、デキストラン１  ５（ｗ／ｖ）％およびテキストラン５  ４〜４０（ｗ／ｖ）％、デキストラン５  ４〜４０（ｗ／ｖ）％および好ましくは２〜１０（ｗ／ｖ）％、ポロキサマー１８８  ２（ｗ／ｖ）％およびデキストラン１  ５〜４０（ｗ／ｖ）％で組み合わせて用いることができる。
【００８７】
本明細書において特に定義されていない用語は、本発明が属する技術分野で通常用いられることを意味するものである。
【００８８】
［発明を実施するための形態］
材料および方法
本願発明では、デキストラン１（Ｄｅｘｔｒａｎ  １（ＥＰ  ｇｒａｄｅ、Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）、デキストラン５（Ｄｅｘｔｒａｎ  ５、ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｑｕａｌｉｔｙ、Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）、ポロキサマー１８８（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８、ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｇｒａｄｅ、シグマ−アルドリッチ）を用いて実験を行った。また、関節炎誘導のためにｒｈＩＬ−１α（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１α、Ｌｏｔ  Ｎｏ．  ２００−０１Ａ）をＰＥＰＲＯＴＥＣＨで購入して使用し、陽性対照物質としてインドメタシン（Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ、シグマ−アルドリッチ、Ｌｏｔ  Ｎｏ．  ５３−８６−１）、ヒアルロン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ  ２５  ｍｇ／２．５  ｍＬ、Ａｒａｇａｎ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  （ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ）、Dongkwang Pharm.、専門医薬品）を用いた。
【００８９】
実施例１．デキストラン、ポロキサマーまたはこれらの混合物の製造および実験の準備
１．１  細胞の分離培養
３週齢の雄ＳＤラットの後肢関節を滅菌状態で分離した後、関節を構成する軟骨組織だけを集めて単一細胞化して、一次、ラット軟骨細胞（Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）を分離して使用した。初代培養した細胞が安定すると試験に用い、安定した軟骨細胞を特定するためにＲＮＡ分離後、軟骨細胞標識因子であるＩＩ型コラーゲンやＳＯＸ９遺伝子の発現程度をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて確認した上で試験に使用した。
【００９０】
１．２  細胞の培養方法
前記１．１から分離された細胞は、温度３７℃、湿度９５％、ＣＯ２５％に設定された培養器で培養し、培養室の温度および湿度は、８時間単位で確認した。培地としては、１０％牛胎児血清、２  ｍＬ  Ｌ−グルタミン、５０  Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンが補充されたＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地を用いた。培養期間の間、細胞数が９０％以上増殖したとき、Ｄｅｔａｃｈｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．２５（ｗ／ｖ）％Ｔｒｙｐｓｉｎ、０．５３  ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３  ｍＬ））で細胞を分離し、１２５  Ｘ  ｇ、１０分間遠心分離して細胞を分離し、以下の実験にて用いた。
【００９１】
１．３  試験群の構成および製造
試験群は、ｒｈＩＬ−１α５  ｎｇ／ｍＬで骨関節炎を誘発させたモデルに、正常対照群（ＮＣ）、炎症誘発対照群（ＰＣ）、試験物質（単一物または混合物）濃度別に処理するもので構成しており、陽性対照群であるインドメタシン（ＩＭ）またはヒアルロン酸ナトリウム（ＨＮ）処理群は、単一濃度で構成した。試験群は、下記表１に示した。
【００９２】
【表１】
2021505680.tif 000003
【００９３】
Ｄ＝デキストラン１、Ｔ＝デキストラン５、Ｐ＝ポロキサマー１８８、ＮＣ＝正常群、ＰＣ＝炎症誘発物質（ｒｈＩＬ−１α）投与群、ＨＮ＝ヒアルロン酸ナトリウム、ＩＭ＝インドメタシン、Ｄ＋Ｐ＝デキストラン１とポロキサマー１８８との混合物、Ｄ＋Ｔ＝デキストラン１とデキストラン５との混合物、Ｐ＋Ｔ＝ポロキサマー１８８とデキストラン５との混合物
【００９４】
本発明にて用いられた成分の濃度は、次のような表記方法に基づいて表記した：Ｄ１０＝デキストラン１の１０（ｗ／ｖ）％溶液、Ｐ１０＝ポロキサマー１８８の１０（ｗ／ｖ）％溶液、Ｔ１０＝デキストラン５の１０（ｗ／ｖ）％溶液。
【００９５】
本発明にて用いられた試験物質は、次のような方法を使って調製した：細胞培養液に溶ける最大濃度を反映し、デキストラン１（Ｄ）は、１〜５０（ｗ／ｖ）％、デキストラン５（Ｔ）は、１〜４０（ｗ／ｖ）％、ポロキサマー１８８（Ｐ）は、１〜３５（ｗ／ｖ）％の範囲内で単一物を調製した。混合物を調製する場合には、二種類の単一物をそれぞれ１：１（ｖ：ｖ）体積比で混合して調製した。
【００９６】
細胞培養のために調製した培地であるｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉａ（１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、２  ｍＬ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５０  Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ、５０  ｕｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎなどが全部含まれたＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地））に、デキストラン１、５およびポロキサマー１８８をそれぞれ投与濃度（ｗ／ｖ）に適するように完全に溶解させた。試験物質をｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉａに完全に溶解させて均質化するために涼しい温度で、特にポロキサマー１８８の場合には、冷たい温度で、滅菌スパチュラ、スティック、ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂａｒなどでゆっくり攪拌したり、泡が生じない程に短く数回振とうしたりして、浮遊物のない、完全に透明になるまで溶解させた。試験物質が完全に溶解した後は、０．２２  μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒでろ過した後、密封して冷蔵保管した。
さらなる具体的な単一物の調製は、以下のような方法で行った。
【００９７】
デキストラン１の５％単一物（「Ｄ５」）の製造
デキストラン１の５％の試験溶液を調製する場合、デキストラン１を５ｇ分取して、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉａに完全に溶解させ、１００  ｍＬに総量を合わせ、Ｄ５（ｗ／ｖ）％の試験溶液を調製した。このように０．０５  ｇ／ｍＬの濃度で溶解した試験物質を０．２２  μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒを用いて濾過し、冷蔵保管した後、使用した。
【００９８】
デキストラン１の５％とポロキサマー１８８の１０％との混合物（「Ｄ５＋Ｐ１０」）の製造
Ｄ５とＰ１０をそれぞれ調製し、０．２２  μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒで濾過し、冷蔵保管した後、それぞれの容量を１：１（ｖ：ｖ）の割合で混合して低速で泡が出ないように振とうした後、使用した。
【００９９】
比較例：インドメタシン処理群（ＩＭ）の製造
インドメタシン５  ｍＭの濃度でＤＭＳＯに完全に溶解させた後、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉａで希釈し、０．２２  μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒでろ過した後、細胞に処理される際、最終濃度が５  μＭとなるように調整した。
【０１００】
比較例：ヒアルロン酸ナトリウム処理群（ＨＮ）の製造 
ヒアルロン酸ナトリウムは、 Ａｒａｇａｎ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  （ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ）（ヒアルロン酸ナトリウム２５  ｍｇ／２．５  ｍＬ、使い捨て滅菌注射器に入った薬剤形態）にｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉａを吸入し、ヒアルロン酸ナトリウム２５  ｍｇ／３  ｍＬ（＝ヒアルロン酸ナトリウム８．３３  ｍｇ／ｍＬ）で希釈した後、即時使用した。
【０１０１】
１．４  投与方法の設定
ラットから分離した初代培養軟骨細胞の場合、ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｔｉｍｅが約２４時間であるから増殖および安定化が適正なときに試験物質を処理した。４８  ｗｅｌｌまたは２４  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに軟骨細胞を培養した後、各試験物質を１回投与するが、関節炎を誘導するためのｒｈＩＬ−１α処理１時間前に、各試験物質の濃度別に総培養液容量の２０％（ｖ／ｖ）になるように試験溶液を投与した。ｒｈＩＬ−１α処理２４時間後、培養液を採取して分析実験を進めた。ただし、軟骨細胞に対する試験物質の毒性または増殖能を確認する際には、ｒｈＩＬ−１αを処理せずに試験物質のみを処理した。
【０１０２】
１．５  統計学的分析
すべての実験結果は、正常対照群（ＮＣ）または炎症誘発陽性対照群（ＰＣ）とｓｔｕｄｅｎｔ  Ｔ−ｔｅｓｔでｐ＜０．０５レベルで比較分析し、有意性を示した。
【０１０３】
実施例２．細胞毒性に関する分析
試験物質の処理により軟骨細胞の増殖能が変化するか否かを確認し、細胞毒性に関する分析を行った。細胞増殖能の評価は、ｒｈＩＬ−１αを処理していない未処理軟骨細胞と、ｒｈＩＬ−１αを処理して炎症を誘発した軟骨細胞において全部行い、それぞれの試験物質を、ラット軟骨細胞に処理してから２４時間および４８時間培養した後に、ＭＴＴ分析（Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ  Ｂｌｕｅ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｌｕｅ；Ｓｉｇｍａ、Ｍ５６５５）を進めた。炎症誘発物質であるｒｈＩＬ−１αで誘導した関節炎ｉｎ−ｖｉｔｒｏモデルにおける試験物質の細胞増殖能の評価では、ｒｈＩＬ−１α処理１時間前に、各々の試験物質をラット軟骨細胞に処理し、２４時間および４８時間培養した後、ＭＴＴ分析（Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ  Ｂｌｕｅ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｌｕｅ；Ｓｉｇｍａ、Ｍ５６５５）を進めており、その結果を図１〜図４に示した。
【０１０４】
図１に示すように、炎症を誘発していないラットの膝関節軟骨細胞において、デキストラン１、デキストラン５、ポロキサマー１８８またはこれらの混合物の細胞増殖率を２４時間観察した結果、ほとんどのデキストラン１、デキストラン５、ポロキサマー１８８およびこれらの混合物が、細胞に毒性を示さず、且つ、細胞の増殖を手助けすることが確認された。ただし、単一処理群のうち、ポロキサマー１８８処理群の場合には、ポロキサマー１８８  ２５（ｗ／ｖ）％（Ｐ２５）、３５（ｗ／ｖ）％（Ｐ３５）の濃度で２４時間培養時、一部細胞増殖能の減少が、対照薬物（市販薬）であるヒアルロン酸ナトリウム（ＨＮ）投与群よりも高く表れ、単一投与には適していないことを示した。また、これらの混合物からも２４時間培養時、一部細胞増殖能の減少が表れ、このことからポロキサマー１８８の場合、これを高濃度で処理した場合には、細胞毒性を誘発し得る可能性があることを確認した。また、混合物中では、Ｄ５０＋Ｐ３５、Ｐ５＋Ｔ４０、Ｐ２５＋Ｔ４０、Ｐ３５＋Ｔ４０ｍｐ実験群から細胞増殖能の減少が、対照薬物（市販薬）であるヒアルロン酸ナトリウム（ＨＮ）投与群よりも高く表れた。
【０１０５】
図２に示すように、炎症を誘発していないラットの膝関節軟骨細胞において、デキストラン、ポロキサマーまたはこれらの混合物の細胞増殖率を４８時間観察した結果からも２４時間培養と類似する結果を確認した。
【０１０６】
これらの結果を通じて、正常な膝関節軟骨細胞に対して処理する際、デキストラン１（Ｄ）を５０％まで濃度を増加させたり、デキストラン５（Ｔ）を４０％まで濃度を増加させても軟骨細胞の増殖が市販薬に比べ抑制されないのに対し、ポロキサマー１８８の場合、２５％以上の濃度では、軟骨細胞に毒性が示されうることを確認した。また、混合物からなる場合、ポロキサマー１８８単独と比較して、細胞増殖能が一部改善はされるが、毒性を誘発させないためには、ポロキサマー１８８は１０（ｗ／ｖ）％濃度以下に混合されるのが好ましいことが確認された。
【０１０７】
図３および図４において、ｒｈＩＬ−１α処理による骨関節炎ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおける実験群の処理に伴う細胞増殖率をそれぞれ２４時間、４８時間の間、観察した結果を示した。
【０１０８】
図３に示すように、骨関節炎モデルからもポロキサマー１８８は、濃度が高くなる場合、細胞増殖が抑制されることが分かり、デキストラン１およびデキストラン５は、濃度が高くなっても細胞増殖が抑制されないことが分かった。ポロキサマー１８８の場合、Ｐ１０単独処理群からは、細胞増殖の抑制が確認されたが、これをＤ５、Ｄ５０、Ｔ４、Ｔ４０などと混合して用いた場合には、細胞増殖効果が示されたところ、デキストランと混合処理する際には、ポロキサマー１８８の１％〜１０（ｗ／ｖ）％を用いることができることを確認した。
図４においても、２４時間培養と同様の結果を確認することができ、Ｐ１０処理群の細胞増殖能は、デキストラン１またはデキストラン５との混合によって増加するという事実を確認した。
【０１０９】
前記のような結果を総合してみると、デキストラン１およびデキストラン５は、正常および炎症誘発細胞において、ほとんど細胞毒性を誘発しないことが確認された。一方、ポロキサマー１８８は、濃度が高くなるにつれて、単一物質で処理した場合、正常な細胞および炎症誘発細胞において、いずれも細胞増殖能の抑制が誘発しうることを示したが、ポロキサマー１８８を１〜１０（ｗ／ｖ）％でデキストラン１またはデキストラン５と混合投与した場合には、細胞毒性なく用いることが可能であることを確認した。
【０１１０】
実施例３．ＩＬ−１０／ＩＬ−６発現比を通じた抗炎症効果の確認
デキストラン１、デキストラン５またはポロキサマー１８８の抗炎症効果を確認するための実験を行った。具体的にはデキストラン１は、２．５〜５０（ｗ／ｖ）％、デキストラン５は、２〜４０（ｗ／ｖ）％で、ポロキサマー１８８は、１〜２０（ｗ／ｖ）％で変化させ、単一投与または混合投与を行い、これによるＩＬ−１０／ＩＬ−６発現比を確認した。炎症誘発のために炎症誘発物質ｒｈＩＬ−１αを処理し、ｒｈＩＬ−１αと試験物質（単一物、これらの混合物）を一緒に処理する際、ＩＬ−１０／ＩＬ−６発現比を確認した。ＩＬ−１０／ＩＬ−６発現比が増加するほど抗炎症効果に優れていると判断することができる。
【０１１１】
実験に使用されたプライマーの構成は、下記表２に示し、対照群としては、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨを使用した。結果を表３ａ〜表３ｂ、および図５に示した。
【表２】
2021505680.tif 000004
【０１１２】
該プライマー、ＳｙＢｒ  ｇｒｅｅｎ（ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ、Ｔａｋａｒａ、ＲＲ４２０Ａ）そしてテンプレートを混合した上、Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ（ＣＦＸ  ９６  ｔｏｕｃｈ、Ｂｉｏ  ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用い、ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ法によるＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｃｔ値を検量線に適用して得られる定量結果（遺伝子発現量）は、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの定量結果で割った値で表示した。
【０１１３】
【表３ａ】
2021505680.tif 000005
【０１１４】
ＲｈＩＬ−１αを２４ｈ処理した軟骨細胞におけるデキストラン１（Ｄ）、デキストラン５（Ｔ）、ポロキサマー１８８（Ｐ）単一物のＩＬ−１０／ＩＬ−６遺伝子発現比
【０１１５】
【表３ｂ】
2021505680.tif 000006
【０１１６】
ＲｈＩＬ−１αを２４ｈ処理した軟骨細胞におけるデキストラン１（Ｄ）、デキストラン５（Ｔ）またはポロキサマー１８８（Ｐ）の混合物のＩＬ−１０／ＩＬ−６遺伝子発現比
【０１１７】
表３ａおよび図５に示すように、単一群処理実験であるデキストラン１（Ｄ）を単独で処理した群からは、５０（ｗ／ｖ）％の処理群を除いては、ＩＬ−１０／ＩＬ−６の発現比の増加が明確には確認されなかったが、ポロキサマー１８８（Ｐ）１〜２０（ｗ／ｖ）％処理群、デキストラン５（Ｔ）２〜２０（ｗ／ｖ）％群からは有意な増加効果が確認された。
表３ｂおよび図５に示すように、混合物処理実験であるデキストラン１（Ｄ）の混合物投与群の全部から有意なＩＬ−１０／ＩＬ−６発現比の増加効果が示され、ポロキサマー１８８（Ｐ）およびデキストラン５（Ｔ）との混合投与群からも全部有意な増加が示され、混合物における抗炎症効果が卓越であることを確認した。
【０１１８】
デキストラン１の５０（ｗ／ｖ）％投与群からは、たとえＩＬ−１０／ＩＬ−６発現比の増加が有意ではあったが、その増加量が頭角を表していないことを考慮すると、骨関節炎モデルにおけるＩＬ−１０／ＩＬ−６発現比の増加、すなわち、抗炎効果は、デキストラン１（Ｄ）の濃度を増加させるよりはポロキサマー１８８（Ｐ）またはデキストラン５（Ｔ）との混合で投与するのが好ましいことを示す。特に抗炎症効果は、デキストラン１（Ｄ）５および５０（ｗ／ｖ）％、デキストラン５（Ｔ）４および４０（ｗ／ｖ）％、ポロキサマー１８８（Ｐ）２および１０（ｗ／ｖ）％の単独投与群と比較してこれらの混合物投与群が、大部分のところ顕著に優れていることを示しているので、これを通じて、デキストラン１（Ｄ）、デキストラン５（Ｔ）、ポロキサマー１８８（Ｐ）の混合投与の優秀性を確認することができる。
【０１１９】
特に、デキストラン１（Ｄ）、デキストラン５（Ｔ）、ポロキサマー１８８（Ｐ）の混合投与は、デキストラン１（Ｄ）５および５０（ｗ／ｖ）％、デキストラン５（Ｔ）４および４０（ｗ／ｖ）％、ポロキサマー１８８（Ｐ）２および１０（ｗ／ｖ）％の全範囲で抗炎症効果に優れていることを示しているところ、これらの全ての組み合わせが抗炎症効果を示し、これにより、炎症性疾患の治療に効果的であることを確認した。
【０１２０】
実施例４．ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３遺伝子発現の変化を通じた軟骨基質再生効果の確認
【０１２１】
骨関節炎評価のための指標物質の遺伝子発現を介して骨関節炎の治療効果を確認するための実験を行った。ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３は、軟骨基質を破壊するタンパク質であるので、炎症刺激を通じて誘導しうる前記遺伝子発現量の増加が効果的に抑制されれば、軟骨保護の効果に優れていると評価することができる。
【０１２２】
デキストラン１は、２．５〜５０（ｗ／ｖ）％、デキストラン５は、２〜４０（ｗ／ｖ）％で、ポロキサマー１８８は、１〜２０（ｗ／ｖ）％で変化させ、単一投与または混合投与を行い、これに伴うＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３の発現の変化を確認した。具体的には、それぞれの試験物質をｒｈＩＬ−１α処理１時間前に、ラット軟骨細胞に処理した上、２４時間培養した。培養細胞の上澄み液を除去した後、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を用いて細胞を洗浄した。洗浄した細胞からＲＮＡを分離し、（ＧｅｎｅＡｌｌ  ｈｙｂｒｉｄ−Ｒ  ＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ；ＧｅｎｅＡｌｌ、３０３３５２２）、分離したＲＮＡをｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔａｋｅ３  Ｍｕｌｔｉ−Ｖｏｌｕｍｅ  ｐｌａｔｅ、  ＢｉｏＴｅＫ、  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、  ＶＴ、  ＵＳＡ）を用いて定量した後、各実験群別に同一の濃度で希釈した。同量で希釈されたＲＮＡをＰＣＲを用いてｃＤＮＡ合成し（ＲｅｖｅｒＴｒａ  ＡｃｅＲ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ、  Ｔｏｙｏｂｏ、  ＦＳＱ−３０１）、合成されたｃＤＮＡを用いて、Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲを介して９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅからＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３の遺伝子発現を確認した。
実験に使用されたプライマーの構成は、下記表４に示し、対照群としては、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを用いた。
【０１２３】
【表４】
2021505680.tif 000007
【０１２４】
該プライマー、ＳｙＢｒ  ｇｒｅｅｎ（ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ、  Ｔａｋａｒａ、  ＲＲ４２０Ａ）そしてテンプレートを混合した後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＣＦＸ  ９６  ｔｏｕｃｈ、  Ｂｉｏ  ｒａｄ、  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、  ＣＡ、  ＵＳＡ）を用いてｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ法によるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｃｔ値を検量線に適用して得られる定量結果（遺伝子発現量）は、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの定量結果で割った値で表示した。
【０１２５】
３．１  ＭＭＰ−３発現変化の確認
デキストラン１、デキストラン５、ポロキサマー１８８単一またはこれらの混合物の処理に伴うＭＭＰ−３発現結果を表５ａ〜表５ｂおよび図６に示した。
【０１２６】
【表５ａ】
2021505680.tif 000008
【０１２７】
ＲｈＩＬ−１αを２４ｈ処理した軟骨細胞において、デキストラン１（Ｄ）、デキストラン５（Ｔ）、ポロキサマー１８８（Ｐ）単一物のＭＭＰ−３遺伝子発現量
【０１２８】
【表５ｂ】
2021505680.tif 000009
【０１２９】
ＲｈＩＬ−１αを２４ｈ処理した軟骨細胞において、デキストラン１（Ｄ）、デキストラン５（Ｔ）またはポロキサマー１８８（Ｐ）の混合物のＭＭＰ−３遺伝子発現量
【０１３０】
前記表５ａおよび図６に示すように、デキストラン１（Ｄ）は、２．５〜４０（ｗ／ｖ）％で炎症誘発陽性対照群に比べて有意なＭＭＰ−３の減少効果が示され、デキストラン５（Ｔ）は、２〜２０（ｗ／ｖ）％で有意なＭＭＰ−３の減少効果が示された。一方、ポロキサマー１８８（Ｐ）は、実験したすべての群である１〜２０（ｗ／ｖ）％で減少効果が示された。
【０１３１】
表５ｂおよび図６に示すように混合物実験群においては、デキストラン１（Ｄ）５（ｗ／ｖ）％とポロキサマー１８８（Ｐ）２〜１０（ｗ／ｖ）％、デキストラン（Ｔ）４％および４０（ｗ／ｖ）％のすべての実験群から有意な効果を確認したが、デキストラン１（Ｄ）を５０（ｗ／ｖ）％まで高濃度で処理した群からは、Ｐ２との混合でのみ有意な減少効果が確認された。したがって、デキストラン１をデキストラン５またはポロキサマー１８８と混合した場合、濃度を５０（ｗ／ｖ）％未満に混合するのが好ましいことを確認した。ポロキサマー１８８は、単独処理および混合処理群からＭＭＰ−３の減少効果がほとんど有意に示されたが、実施例２にて確認したところにより、ポロキサマーの濃度は、１０（ｗ／ｖ）％以下であることが好ましく、これに該当するＰ２、Ｐ５、Ｐ１０は、デキストラン１およびデキストラン５との組み合わせでも有意なＭＭＰ−３の抑制効果を誘導することができることを確認した。
【０１３２】
３．２  ＭＭＰ−１３発現変化の確認
デキストラン１、デキストラン５、ポロキサマー１８８単一またはこれらの混合物の処理に伴うＭＭＰ−１３の発現結果を表６ａ〜表６ｂおよび図７に示した。
【０１３３】
【表６ａ】
2021505680.tif 000010
【０１３４】
ＲｈＩＬ−１αを２４ｈ処理した軟骨細胞において、デキストラン１（Ｄ）、デキストラン５（Ｔ）、ポロキサマー１８８（Ｐ）単一物のＭＭＰ−１３の遺伝子発現量
【０１３５】
【表６ｂ】
2021505680.tif 000011
【０１３６】
ＲｈＩＬ−１αを２４ｈ処理した軟骨細胞において、デキストラン１（Ｄ）、デキストラン５（Ｔ）またはポロキサマー１８８（Ｐ）の混合物のＭＭＰ−１３の遺伝子発現量
【０１３７】
前記表６ａ〜表６ｂ、図７から確認できるように、単一物実験群からデキストラン１（Ｄ）は、２．５〜２５（ｗ／ｖ）％で有意なＭＭＰ−１３遺伝子の増加抑制効果が示され、Ｄ４０である４０（ｗ／ｖ）％では有意ではなかったが、ＭＭＰ−１３遺伝子の増加が抑制され、Ｄ５０である５０（ｗ／ｖ）％では、むしろＭＭＰ−１３レベルが増加したことが示された。これらの特性は、デキストラン１（Ｄ）の混合物でも同様に表れた。したがって、デキストラン１（Ｄ）は、２．５〜４０（ｗ／ｖ）％が最も好ましい濃度範囲であることを確認し、これは、ＭＭＰ−３遺伝子発現量の結果とも一致する結果である。デキストラン５（Ｔ）は、単独投与時、２〜４０（ｗ／ｖ）％で有意なＭＭＰ−１３遺伝子の増加抑制効果が示され、デキストラン５（Ｔ）４および４０（ｗ／ｖ）％は、デキストラン１（Ｄ）５（ｗ／ｖ）％およびポロキサマー１８８（Ｐ）２および１０（ｗ／ｖ）％との混合でも有意なＭＭＰ−１３遺伝子の増加抑制効果が示された。
【０１３８】
ポロキサマー１８８の場合、単独実験群から５〜２０（ｗ／ｖ）％でＭＭＰ−１３遺伝子の増加抑制効果を示したが、デキストランとの混合物で投与した場合、２（ｗ／ｖ）％も同様に効果を示すことを確認した。実施例２における細胞毒性実験結果を考慮すると、ポロキサマー１８８（Ｐ）の濃度は、混合投与時、２〜１０（ｗ／ｖ）％であるのが好ましいことを確認した。これに該当するＰ２、Ｐ１０は、デキストラン１およびデキストラン５との組み合わせでもデキストラン１（Ｄ）５０（ｗ／ｖ）％の組み合わせを除いては、いずれも有意なＭＭＰ−１３遺伝子の増加抑制効果を誘導した。
【０１３９】
前記のような結果を通じ、Ｐ２、Ｐ５、Ｐ１０は、デキストラン１およびデキストラン５との組み合わせでも有意なＭＭＰ−１３の抑制効果を誘導することができることを確認した。
【０１４０】
実施例５．骨関節炎モデルにおけるＩＩ型コラーゲン（Ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ）およびアグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）の生成量増加の確認
【０１４１】
骨関節炎評価のための指標物質のうち、ＩＩ型コラーゲンとアグリカンタンパク質の生成量を確認するためにｒｈＩＬ−１αを処理する１時間前に、各々の試験物質を軟骨細胞に処理した後、２４時間培養した。ＩＩ型コラーゲンとアグリカンは、軟骨基質組成物であるので、これの生成量が増加すると、軟骨基質保護効果に優れていると判断することができる。
【０１４２】
ここで、細胞の上澄み液（培養液）を回収し、１３，０００  ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液だけを分析に用いた。遠心分離された細胞の上澄み液を用いて、Ａｇｇｒｅｃａｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒａｔ  Ａｇｇｒｅｃａｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、  Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、  ＭＢＳ２６１０７３）とｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ（Ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｅｃｉｅｓ、  Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、  ６０１８）製品のｍａｎｕａｌを参照した分析を進めた。正確な分析のために全波長帯ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ（ＥＰＯＣＨ  ２  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、ＢｉｏＴｅｋ、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＶＴ、ＵＳＡ）を用いて、それぞれ４５０ｎｍと４９０ｎｍでの吸光度を測定した後、検量線に基づいて、ＩＩ型コラーゲンとアグリカンの含有量（ｎｇ／ｍＬ）を定量した。
【０１４３】
５．１  ＩＩ型コラーゲン生成量の確認
デキストラン１（Ｄ）、デキストラン５（Ｔ）、ポロキサマー１８８（Ｐ）、単一またはこれらの混合物の処理に伴うＩＩ型コラーゲン生成量の結果を表７ａ〜表７ｂおよび図８に示す。
【０１４４】
【表７ａ】
2021505680.tif 000012
【０１４５】
ＲｈＩＬ−１αを２４ｈ処理した軟骨細胞において、デキストラン１（Ｄ）、デキストラン５（Ｔ）、ポロキサマー１８８（Ｐ）単一物のＴｙｐｅ  ＩＩ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ生成量
【０１４６】
【表７ｂ】
2021505680.tif 000013
【０１４７】
ＲｈＩＬ−１αを２４ｈ処理した軟骨細胞からデキストラン１（Ｄ）、デキストラン５（Ｔ）またはポロキサマー１８８（Ｐ）混合物のＴｙｐｅ  ＩＩ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ生成量。
【０１４８】
前記表７ａ〜表７ｂ、および図８に示すように、デキストラン１（Ｄ）５〜２５（ｗ／ｖ）％、デキストラン５（Ｔ）４〜４０（ｗ／ｖ）％の単独投与群から炎症誘発陽性対照群（ＰＣ）に比べてＩＩ型コラーゲン合成の増加が観察された。一方、デキストラン１（Ｄ）５０（ｗ／ｖ）％は、単独およびデキストラン５（Ｔ）、ポロキサマー１８８（Ｐ）との混合投与群全部から炎症誘発陽性対照群（ＰＣ）に比べてＩＩ型コラーゲン合成の増加を誘導し得ないことを示した。これは、実施例４にて確認したように、デキストラン１（Ｄ）５０（ｗ／ｖ）％、単独ではＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３の発現増加を抑制する効果を示さず、唯一ポロキサマー１８８（Ｐ）２〜１０（ｗ／ｖ）％との混合でのみＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３の発現の増加を抑制できることを考慮すると、デキストラン１（Ｄ）は、４０（ｗ／ｖ）％以下に単独または混合して用いることが好ましいことを示す結果である。特に、デキストラン１（Ｄ）５（ｗ／ｖ）％とデキストラン５（Ｔ）４〜４０（ｗ／ｖ）％と混合投与時に、炎症誘発陽性対照群（ＰＣ）に比べてＩＩ型コラーゲンの合成が有意に増加した。
ポロキサマー１８８（Ｐ）の場合、２（ｗ／ｖ）％の処理群を除いた１０（ｗ／ｖ）％、２０（ｗ／ｖ）％単独処理群全部からＩＩ型コラーゲン合成の増加効果が観察されず、濃度を増加させるほどＩＩ型コラーゲン合成は、より減少することを確認した。しかし、ポロキサマー１８８（Ｐ）２または１０（ｗ／ｖ）％をデキストラン１（Ｄ）５（ｗ／ｖ）％、またはデキストラン５（Ｔ）４０（ｗ／ｖ）％と混合して投与する場合には、ＩＩ型コラーゲン合成の増加効果が有意に示された。このような結果は、骨関節炎のＩＩ型コラーゲン合成において、デキストラン１（Ｄ）、デキストラン５（Ｔ）を単独で処理可能であるが、ポロキサマー１８８（Ｐ）は、２（ｗ／ｖ）％を除いては、単独処理には適しておらず、ポロキサマー１８８（Ｐ）とデキストラン１（Ｄ）またはデキストラン５（Ｔ）の混合投与がＩＩ型コラーゲン合成を効果的に誘導できることを示す。
【０１４９】
前の実施例３においては、単独投与と比較してポロキサマー１８８とデキストラン１またはデキストラン５の混合投与がＩＬ−１０／ＩＬ−６の遺伝子発現の割合を顕著に増加しうることを確認したので、このような結果を総合してみると、骨関節炎での炎症反応を緩和させるとともに、コラーゲン合成を促進させるためには、デキストラン１、デキストラン５またはポロキサマー１８８の混合物を投与することが好ましいことが確認された。
【０１５０】
５．２  アグリカン含有量の定量結果の確認
デキストラン１、デキストラン５、ポロキサマー１８８単一またはこれらの混合物の処理に伴うアグリカン生成量の結果を表８ａ〜表８ｂ、および図９に示した。
【０１５１】
【表８ａ】
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【０１５２】
【表８ｂ】
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【０１５３】
ＲｈＩＬ−１αを２４ｈ処理した軟骨細胞において、デキストラン１（Ｄ）、デキストラン５（Ｔ）またはポロキサマー１８８（Ｐ）混合物のアグリカン生成量
【０１５４】
前記表６ａおよび図９にて確認できるように、デキストラン１（Ｄ）５〜２５（ｗ／ｖ）％、デキストラン５（Ｔ）４（ｗ／ｖ）％、ポロキサマー１８８（Ｐ）２〜１０（ｗ／ｖ）％単独処理群からアグリカン生成量が炎症誘発陽性対照群（ＰＣ）と比較して有意に増加したことを確認した。一方、デキストラン１（Ｄ）５０（ｗ／ｖ）％、ポロキサマー１８８（Ｐ）２０（ｗ／ｖ）％、デキストラン５（Ｔ）２０〜４０（ｗ／ｖ）％の単独投与群は、アグリカン生成の増加を誘導し得なかったことを確認した。
【０１５５】
表８ｂおよび図９にて確認できるように、混合投与群中からはデキストラン１（Ｄ）５（ｗ／ｖ）％とポロキサマー１８８（Ｐ）２（ｗ／ｖ）％、またはデキストラン５（Ｔ）４〜４０（ｗ／ｖ）％の混合投与群からアグリカン生成量が炎症誘発陽性対照群（ＰＣ）と比較して有意に増加し、デキストラン１（Ｄ）５０（ｗ／ｖ）％とはポロキサマー１８８（Ｐ）２（ｗ／ｖ）％との混合投与群でのみアグリカン生成量が有意に増加した。デキストラン５（Ｔ）４〜４０（ｗ／ｖ）％とポロキサマー１８８（Ｐ）２〜１０（ｗ／ｖ）％間の混合投与群からも炎症誘発陽性対照群（ＰＣ）と比較してアグリカン生成量が有意に増加したことを確認した。特に、デキストラン１（Ｄ）５（ｗ／ｖ）％とポロキサマー１８８（Ｐ）２（ｗ／ｖ）％は、デキストラン５（Ｔ）４〜４０（ｗ／ｖ）％との混合投与時、単一投与に比べて有意にアグリカン生成量が増加したことを確認した。
【０１５６】
先に実施例５．１にて確認したＩＩ型コラーゲン合成の結果を共に考慮する場合、骨関節炎モデルにおいて、ＩＩ型コラーゲン合成を増加させ、アグリカン生成を増加させるためには、デキストラン１（Ｄ）５〜２５（ｗ／ｖ）％、デキストラン５（Ｔ）４（ｗ／ｖ）％、またはポロキサマー１８８（Ｐ）２（ｗ／ｖ）％を単独投与するか、デキストラン１（Ｄ）５（ｗ／ｖ）％をデキストラン５（Ｔ）４〜４０（ｗ／ｖ）％と混合投与するか、またはデキストラン１（Ｄ）５（ｗ／ｖ）％をポロキサマー１８８（Ｐ）２（ｗ／ｖ）％と混合投与する場合が好ましいことが確認された。また、デキストラン５（Ｔ）４〜４０（ｗ／ｖ）％は、デキストラン１（Ｄ）５（ｗ／ｖ）％との組合せで、特にデキストラン５  ４０（ｗ／ｖ）％の場合、ポロキサマー１８８（Ｐ）２〜１０（ｗ／ｖ）％との組み合わせにてＩＩ型コラーゲン合成とアグリカン生成を有意に増加させることができることを確認した。
【０１５７】
前記のような結果を総合すると、骨関節炎の治療において、デキストラン１、デキストラン５およびポロキサマー１８８を用いることができるが、これらの単独または全部の組み合わせが骨関節炎の治療に効果を示すものではなく、デキストラン１、デキストラン５およびポロキサマー１８８濃度の組み合わせに応じて毒性および効果が相違に示され得るので、これの適切な組み合わせを導き出すことが重要であることを確認することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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