(57)【要約】本開示は、単一細胞分析、例えば限定されないが、Ｓｅｑ−ｗｅｌｌにおいて使用されるハードウェアおよび酵素反応の両方の改善を記載し、細胞当たりの転写産物の収量の有意な増加、携帯性および使用容易性の改善、前記アッセイのスケーラビリティの増加、ならびに転写産物情報とピコウェルアレイで行われた他の測定との関連付けを可能にする。本開示は、単一細胞分析において使用するための改善された製品および方法を提供する。これらの改善された製品および方法は、ウェルベースアッセイおよび／またはビーズベースアッセイ、例えばＳｅｑ−ｗｅｌｌアッセイにおいて有用であるが、それに限定されない。
2021505157.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インプット核酸からの５’および３’末端上にユニバーサルプライマーサイトを含有する核酸のライブラリーを生産するための方法であって、
（ａ）インプット核酸を、各キャプチャーオリゴヌクレオチドが５’ユニバーサルプライマーサイトと、インプット核酸中のヌクレオチド配列に相補的な３’標的結合部位と、必要に応じて、前記５’ユニバーサルプライマーサイトと前記３’標的結合部位との間に必要に応じて存在するバーコードとを含有するキャプチャーオリゴヌクレオチドのプールと接触させること、
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼを添加し、それにより、インプット核酸にハイブリダイズしたキャプチャーオリゴヌクレオチドを伸長させて、それぞれが前記５’ユニバーサルプライマーサイトと、インプット核酸に相補的な配列とを含む第１鎖核酸を形成すること、
（ｃ）前記第１鎖核酸を、それぞれが５’ユニバーサルプライマーサイトと、前記第１鎖核酸中のヌクレオチド配列に相補的な３’標的結合部位とを含む第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドのプールと接触させること、ならびに
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを添加し、それにより、前記第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させて、前記インプット核酸に存在するヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ユニバーサルプライマーサイトを含む第２鎖核酸を形成すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが、ポリ（ｄＴ）配列を含む標的結合配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
キャプチャーオリゴヌクレオチドの前記プール中の前記標的結合配列が、ポリ（ｄＴ）配列、または前記インプット核酸中の特定の配列をターゲティングする配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
キャプチャーオリゴヌクレオチドの前記プール中の前記標的結合配列が、前記インプット核酸中の特定の配列をターゲティングする配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが、表面、必要に応じてビーズの表面に付着している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記インプット核酸が、インプット核酸の複合混合物として提供される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記インプット核酸がＲＮＡを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記インプット核酸が一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）とＲＮＡとの混合物を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記インプット核酸が、（ａ）ウイルスもしくは細菌に由来するか、（ｂ）酵母もしくは昆虫もしくは哺乳動物細胞に由来するか、（ｃ）単離された核であるか、または（ｄ）エキソソームである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記インプット核酸が、酵母または昆虫または哺乳動物ＲＮＡおよび細菌またはウイルスＤＮＡを含む感染細胞に由来する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記インプット核酸が単一細胞に由来する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記インプット核酸が２〜１０００個の細胞に由来する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドの前記プール中の前記標的結合配列が、ランダムヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドの前記プール中の前記標的結合配列が、セミランダムヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドの前記プール中の前記標的結合配列が、ランダム配列と、前記第１鎖核酸中の特定の配列に相補的な配列とを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドの前記プール中の前記標的結合配列が、前記第１鎖核酸中の配列に相補的な配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドの前記プールが、前記第１鎖核酸中の配列に相補的な標的結合配列を含むが前記ユニバーサルプライマーサイトを欠くデコイオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドが、表面、必要に応じてビーズの表面に付着している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）において、クラウディング試薬を添加する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｂ）において、クラウディング試薬を添加する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｄ）において、クラウディング試薬を添加する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが、ユニークな分子同定のためのランダムヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
単一細胞から複数の同一に５’および３’標識されたｃＤＮＡ分子を生産するための方法であって、
（ａ）単一細胞ＲＮＡライブラリーから第１鎖ｃＤＮＡライブラリーを合成すること、ここで、前記ライブラリーからの第１鎖ｃＤＮＡ分子がそれぞれ、同一の５’ユニバーサルプライマーサイトと、必要に応じて同一のバーコードとを含む；
（ｂ）５’ユニバーサルプライマーサイトを有する第１鎖ｃＤＮＡ分子を、標的結合配列の上流に５’ユニバーサルプライマーサイトを有するオリゴヌクレオチドと接触させること；ならびに
（ｃ）前記オリゴヌクレオチドを伸長させて、５’ユニバーサルプライマーサイトおよび３’ユニバーサルプライマーサイトで同一に標識された複数の第２鎖ｃＤＮＡ分子を生産すること
を含む、方法。
【請求項２４】
前記５’ユニバーサルプライマーサイトと、ランダム、セミランダムおよび／または標的化キャプチャー配列とを含むキャプチャーオリゴヌクレオチドへの単一ＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションにより、前記第１鎖ｃＤＮＡライブラリーを合成する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記５’ユニバーサルプライマーサイトと、ポリ（ｄＴ）キャプチャー配列とを含むキャプチャーオリゴヌクレオチドへの単一ＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションにより、前記第１鎖ｃＤＮＡライブラリーを合成する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドがビーズに付着している、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
複数の同一のキャプチャーオリゴヌクレオチドが前記ビーズに付着している、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが、５’ユニバーサルプライマー配列、バーコードおよび３’キャプチャー配列を含む、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
単一細胞由来のＲＮＡライブラリーを取得または提供することをさらに含む、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｂ）が、第１鎖ｃＤＮＡ分子を、５’ユニバーサルプライマーサイトを欠くデコイオリゴヌクレオチドと接触させることをさらに含む、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
複数の核酸分子を生産するための方法であって、
（ａ）複数の親核酸から、それぞれが前記複数の親核酸に相補的な第１鎖核酸を合成すること、ここで、第１鎖核酸がそれぞれ、同一の５’ユニバーサルプライマーサイトを含み；
（ｂ）５’ユニバーサルプライマーサイトを有する第１鎖核酸を、標的結合配列の上流に５’ユニバーサルプライマーサイトを含む第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドと接触させること；ならびに
（ｃ）前記第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させて、５’ユニバーサルプライマーサイトおよび３’ユニバーサルプライマーサイトで同一に標識された複数の第２鎖核酸を生産すること
を含む、方法。
【請求項３２】
親核酸を、ランダム、セミランダムまたは標的化配列を有するキャプチャーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることにより、各前記第１鎖核酸を合成する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドがビーズに付着している、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
複数の同一のキャプチャーオリゴヌクレオチドがビーズに付着している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが、５’ユニバーサルプライマー配列、バーコード配列および３’キャプチャー配列を含む、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
単一細胞またはウイルスから前記複数の親核酸を取得することをさらに含む、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記単一細胞が病原体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記標的結合配列が、ランダム配列、セミランダム配列および／または非ランダム／標的化配列を含む、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
第１鎖ｃＤＮＡ分子または前記第１鎖核酸がそれぞれ、同一のバーコードを含む、請求項２３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１鎖ｃＤＮＡ分子または前記第１鎖核酸がビーズに付着している、請求項２３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
工程（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）において、クラウディング試薬を添加することをさらに含む、請求項２３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記５’ユニバーサルプライマーサイトと、キャプチャー配列と、必要に応じてそれらの間のバーコード配列とを含む前記キャプチャーオリゴヌクレオチドを提供すること；
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドを、単一細胞由来の複数のＲＮＡ分子と接触させること；
前記複数のＲＮＡ分子がそれらの各キャプチャー配列にアニーリングすることを可能にすること；および
ＤＮＡポリメラーゼを添加し、それにより、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドを伸長させて、前記第１鎖ｃＤＮＡ分子を生成すること、ここで、前記第１鎖ｃＤＮＡ分子が前記複数のＲＮＡ分子に相補的である、
を含む第１鎖ｃＤＮＡ分子の生成をさらに含む、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記５’ユニバーサルプライマーサイトと、キャプチャー配列と、必要に応じてそれらの間のバーコード配列とを含む前記キャプチャーオリゴヌクレオチドを提供すること；
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドを、単一細胞またはウイルス由来の複数の親核酸と接触させること；
前記複数の親核酸が前記キャプチャー配列にアニーリングすることを可能にすること；および
ＤＮＡポリメラーゼを添加し、それにより、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドを伸長させて、前記第１鎖核酸を生成すること、ここで、前記第１鎖核酸がそれぞれ親核酸に相補的である、
を含む第１鎖核酸の生成をさらに含む、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
テンプレートスイッチング反応の収量を増加させる方法であって、クラウディング試薬をテンプレートスイッチング反応に添加することを含む、方法。
【請求項４５】
ピコウェルアレイへの膜のシーリングを増強する方法であって、前記ピコウェルアレイおよび膜をクラウディング試薬と接触させることを含む、方法。
【請求項４６】
ピコウェルアレイがＳｅｑ−ｗｅｌｌアッセイで使用される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ピコウェルアレイであって、
各ピコウェルが、１つまたはそれを超える核酸バーコードを含む機能化表面を含む複数のピコウェルを含む、ピコウェルアレイ。
【請求項４８】
各核酸バーコードが、前記アレイ中のすべての他の核酸バーコードと比べて、または前記アレイ中の一部の他の核酸バーコードと比べてユニークである、請求項４７に記載のピコウェルアレイ。
【請求項４９】
前記複数のピコウェルがそれぞれ、核酸バーコードのユニークな組み合わせを含む、請求項４７に記載のピコウェルアレイ。
【請求項５０】
１つまたはそれを超える核酸バーコードが、複数のピコウェル間で共有される、請求項４７に記載のピコウェルアレイ。
【請求項５１】
前記アレイ中の各核酸バーコードの位置が既知である、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載のピコウェルアレイ。
【請求項５２】
ユニークな刺激が、ユニークな核酸バーコードを有する各ピコウェルに適用される、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載のピコウェルアレイ。
【請求項５３】
前記機能化表面が、前記ピコウェルの底内面である、請求項４７〜５２のいずれか一項に記載のピコウェルアレイ。
【請求項５４】
前記ピコウェルアレイの底内面がＤＮＡマイクロアレイを含む、請求項４７〜５３のいずれか一項に記載のピコウェルアレイ。
【請求項５５】
複数のピコウェルがそれぞれ、スペクトル符号化ビーズを含む、請求項４７〜５４のいずれか一項に記載のピコウェルアレイ。
【請求項５６】
複数のピコウェルがそれぞれ、複数のスペクトル符号化ビーズを含む、請求項４７〜５５のいずれか一項に記載のピコウェルアレイ。
【請求項５７】
前記スペクトル符号化ビーズが、前記ピコウェルの機能化表面に付着している、請求項５５または５６に記載のピコウェルアレイ。
【請求項５８】
ピコウェルアレイであって、
それぞれが、ユニークな空間バーコードを有する１つまたはそれを超える核酸分子を含む機能化表面を含む複数のピコウェルを含み、各ユニークな空間バーコードが、ピコウェルの１つまたはクラスタにユニークであり、必要に応じて、前記ピコウェルアレイ中の各空間バーコードの位置が既知である、ピコウェルアレイ。
【請求項５９】
前記機能化表面が前記ピコウェルの内底面に存在する、請求項５８に記載のピコウェルアレイ。
【請求項６０】
前記ピコウェルアレイの底部がＤＮＡマイクロアレイを含む、請求項５９に記載のピコウェルアレイ。
【請求項６１】
前記機能化表面がスペクトル符号化ビーズを含む、請求項５９に記載のピコウェルアレイ。
【請求項６２】
ピコウェルアレイ中の転写産物を空間的に位置決定するための方法であって、
（ａ）ピコウェルアレイを提供すること、ここで：
（ｉ）１つまたはそれを超えるピコウェルが、ユニークな空間バーコードを有する核酸分子をそれぞれが含む１つまたはそれを超える機能化表面を含み；
（ｉｉ）１つまたはそれを超えるピコウェルが、空間バーコードのユニークな組み合わせを含み；
（ｉｉｉ）各ピコウェルに配置された空間バーコードのアイデンティティが既知であり；および
（ｉｖ）１つまたはそれを超えるピコウェルが、バーコード化転写産物キャプチャービーズをロードされている、
（ｂ）前記ピコウェルアレイを、各細胞が１つまたはそれを超える転写産物を含有する細胞の集団と接触させること；
（ｃ）前記細胞を溶解させ、前記同じウェルに存在する前記ビーズ上の細胞由来のＲＮＡをキャプチャーすること；
（ｄ）前記ビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、前記キャプチャーした転写産物からｃＤＮＡを生成すること；
（ｅ）転写産物キャプチャービーズに結合した空間バーコードのプライマー伸長により、ビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子を生成すること；
（ｆ）前記ｃＤＮＡおよびビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子をシークエンシングすること；
（ｇ）各ビーズバーコードに関連するすべての前記空間バーコードを決定すること；
（ｈ）ビーズバーコードに関連する空間バーコードの組み合わせを、空間バーコードの同じ組み合わせを有する既知のピコウェルとマッチングすることにより、各ビーズバーコードの起源のウェルを決定すること；ならびに
（ｉ）前記ｃＤＮＡ中の前記ビーズバーコードを、そのビーズバーコードの供給源として同定されたピコウェルとマッチングすることにより、前記ピコウェルアレイ上の前記転写産物を位置決定すること
を含む、方法。
【請求項６３】
前記機能化表面が、前記ピコウェルの底内面を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ピコウェルアレイの底部がＤＮＡマイクロアレイを含む、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記機能化表面がスペクトル符号化ビーズを含む、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
ガラススライドに結合した薄組織切片として細胞の前記集団を前記アレイに送達する、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
ピコウェルアレイを使用して、刺激のセットに対する転写応答を決定するための方法であって、
（ａ）ピコウェルアレイを提供すること、ここで、ピコウェルの大部分がそれぞれ、（１）ユニークな空間バーコードを有する核酸分子と、（２）ユニークな刺激とを含む１つまたはそれを超える機能化表面を含む；
（ｂ）前記ピコウェルアレイを、１つまたはそれを超える転写産物を含有する細胞の集団と接触させること；
（ｃ）前記機能化表面から前記刺激を放出させること；
（ｄ）前記細胞を培養して、前記放出刺激に対する転写応答を可能にすること；
（ｅ）バーコード化転写産物キャプチャービーズをウェルの大部分にロードすること；
（ｆ）前記細胞を溶解させ、前記細胞と同じウェルに存在する前記ビーズ上の細胞由来のＲＮＡをキャプチャーすること；
（ｇ）前記ビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、前記キャプチャーしたＲＮＡからｃＤＮＡを生成すること；
（ｈ）転写産物キャプチャービーズに結合した空間バーコードのプライマー伸長により、ビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子を生成すること；
（ｉ）前記ｃＤＮＡおよびビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子をシークエンシングすること；
（ｊ）各ビーズバーコードに関連する空間バーコードの組み合わせを決定すること；ならびに
（ｋ）空間バーコードの組み合わせをウェルに存在する刺激の組み合わせに変換することにより、所定のビーズバーコードに関連するｃＤＮＡの供給源であった細胞の刺激曝露を決定すること
を含む、方法。
【請求項６８】
前記機能化表面が前記ピコウェルの底部を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ピコウェルアレイの前記底部がＤＮＡマイクロアレイを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記機能化表面がスペクトル符号化ビーズを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
ピコウェルアレイ上の転写産物を空間的に位置決定するための方法であって、
ピコウェルアレイを提供すること、ここで、
（ｉ）各ピコウェルが、ユニークな空間バーコードを有する１つまたはそれを超える核酸分子を含む機能化表面を含み；
（ｉｉ）各ユニークな空間バーコードが、ピコウェルの１つまたはクラスタにユニークであり；
（ｉｉｉ）前記ピコウェルアレイ上の各ユニークな空間バーコードの位置が既知であり；
（ｉｖ）各ピコウェルが、バーコード化転写産物キャプチャービーズをロードされている、
前記ピコウェルアレイを、１つまたはそれを超える転写産物を含有する細胞の集団と接触させること；
前記ビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、前記転写産物からｃＤＮＡを生成すること；
転写産物キャプチャービーズに結合した空間バーコードのプライマー伸長により、ビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子を同時生成すること；ならびに
前記ｃＤＮＡ中の前記ビーズバーコードをビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子とマッチングすることにより、前記ピコウェルアレイ上の前記転写産物を位置決定すること
を含む、方法。
【請求項７２】
機能化表面が前記ピコウェルの底部を含む、請求項７１に記載のピコウェルアレイ。
【請求項７３】
前記ピコウェルアレイの前記底部がマイクロアレイを含む、請求項７２に記載のピコウェルアレイ。
【請求項７４】
前記機能化表面がスペクトル符号化ビーズを含む、請求項７１に記載のピコウェルアレイ。
【請求項７５】
各ピコウェルが刺激をさらに含む、請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
組織切片中の転写産物を空間的に位置決定するための方法であって、
ピコウェルアレイを提供すること、ここで、
（ｉ）各ピコウェルが、ユニークな空間バーコードを有する１つまたはそれを超える核酸分子を含む機能化表面を含み；
（ｉｉ）各ユニークな空間バーコードが、ピコウェルの１つまたはクラスタにユニークであり；
（ｉｉｉ）前記ピコウェルアレイ上の各ユニークな空間バーコードの位置が既知であり；
（ｉｖ）各ピコウェルが、バーコード化転写産物キャプチャービーズをロードされている、
前記ピコウェルアレイを、ガラススライドに結合した薄組織切片と接触させること；
前記ビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、前記転写産物からｃＤＮＡを生成すること；
転写産物キャプチャービーズに結合した空間バーコードのプライマー伸長により、ビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子を生成すること；ならびに
前記ｃＤＮＡ中の前記ビーズバーコードをビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子とマッチングすることにより、前記ピコウェルアレイ上の前記転写産物を位置決定すること
を含む、方法。
【請求項７７】
機能化表面が前記ピコウェルの底部を含む、請求項７６に記載のピコウェルアレイ。
【請求項７８】
前記ピコウェルアレイの前記底部がマイクロアレイを含む、請求項７７に記載のピコウェルアレイ。
【請求項７９】
前記機能化表面がスペクトルビーズを含む、請求項７６に記載のピコウェルアレイ。
【請求項８０】
各ピコウェルが刺激をさらに含む、請求項７６〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
膜をピコウェルアレイに適用するためのメンブレンアプリケーターであって、
半多孔質膜；および
剛性支持体
を含み、
前記膜が、可逆的化学により前記剛性支持体に付着している、メンブレンアプリケーター。
【請求項８２】
前記可逆的化学が親水性薄膜である、請求項８１に記載のメンブレンアプリケーター。
【請求項８３】
前記親水性薄膜が塩橋または親水性ポリマーである、請求項８２に記載のメンブレンアプリケーター。
【請求項８４】
前記剛性支持体がガラスまたはアクリルプラスチックである、請求項８１〜８３のいずれか一項に記載のメンブレンアプリケーター。
【請求項８５】
前記ピコウェルアレイがＳｅｑ−ｗｅｌｌアレイである、請求項８１〜８４のいずれか一項に記載のメンブレンアプリケーター。
【請求項８６】
複数のピコウェルを含むアレイに半多孔質膜をシーリングするための方法であって、
ピコウェルアレイを剛性支持体上の半多孔質膜と接触させること；および
加熱面を前記剛性支持体に適用すること、ここで、前記半多孔質膜は、前記剛性支持体と前記アレイとの間に挟まれている、
それにより、前記膜を前記ピコウェルアレイにシーリングすることを含む、方法。
【請求項８７】
前記加熱面を前記膜に１０分間未満適用する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記加熱面が３５℃〜５０℃である、請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項８９】
デバイスであって、１つまたはそれを超えるピコウェルアレイを剛性支持体上の半多孔質膜と接触させ、加熱面を前記剛性支持体に適用し、それにより、前記半多孔質膜を前記ピコウェルにシーリングするように構成された、デバイス。
【請求項９０】
剛性支持体と、所望の温度に加熱されることができる表面とを含む、請求項８９に記載のデバイス。
【請求項９１】
刺激を細胞に送達するための方法であって、
（ａ）ピコウェルアレイを提供すること、ここで、各ピコウェルが、刺激に付着した１つまたはそれを超えるビーズと、前記刺激にユニークに関連するユニークな刺激バーコードを含む核酸とを含む；
（ｂ）前記ピコウェルアレイを、１つまたはそれを超える転写産物を含有する細胞の集団と接触させること；
（ｃ）細胞を前記刺激と共に培養すること；
（ｄ）バーコード化転写産物キャプチャービーズを各ウェルにロードすること；
（ｅ）前記ビーズから、前記ユニークな刺激バーコードを含む前記核酸を放出させること；
（ｆ）前記ビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、前記転写産物から前記ｃＤＮＡを生成すること；
（ｇ）転写産物キャプチャービーズに結合した空間バーコードのプライマー伸長により、ビーズバーコード：刺激バーコードハイブリッド分子を生成すること；ならびに
（ｈ）前記ｃＤＮＡ中の前記ビーズバーコードをビーズバーコード：刺激バーコードハイブリッド分子とマッチングすることにより、各ｃＤＮＡの起源の前記細胞の刺激を同定すること
を含む、方法。
【請求項９２】
前記ビーズから前記刺激を放出させることをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ビーズバーコード：刺激バーコードハイブリッド分子をシークエンシングすることをさらに含む、請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項９４】
膜をピコウェルアレイに固定するためのクランプであって、
三ネジ設計
を含み、
アレイホルダーおよびトップピースを包含する矩形であり、下側においてのみ前記アレイホルダーと接触し、それにより、前記アレイに対して上向きの力を引き起こす、クランプ。
【請求項９５】
前記クランプがプラスチックである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
バーコード化ビーズとして使用するための多孔質樹脂を磁化するための方法であって、
前記樹脂を収縮させ、それにより、前記樹脂の細孔を拡大すること；
前記樹脂を磁性ナノ粒子と接触させること；および
前記樹脂を膨張させること
を含む、方法。
【請求項９７】
前記樹脂を、温度を低下させることにより収縮させ、温度を上昇させることにより膨張させる、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
溶媒の組成を変化させることにより、前記樹脂を収縮および膨張させる、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
ピコウェルアレイであって、
複数のピコウェル
を含み、各ピコウェルが、
（１）膜付着および単一細胞転写産物キャプチャーを可能にするように表面機能化されており；ならびに
（２）前記ピコウェルの１つまたはそれを超える内壁に沈殿および／または固定化した単一細胞の内容物を含む、ピコウェルアレイ。
【請求項１００】
バーコード化転写産物キャプチャービーズが複数のピコウェルにロードされている、請求項９９に記載のピコウェルアレイ。
【請求項１０１】
単一細胞分析のために細胞を貯蔵する方法であって、
（ａ）ピコウェルアレイを提供すること、ここで、ピコウェルの大部分が、バーコード化転写産物キャプチャービーズをロードされており、
（ｂ）前記アレイの表面を単一細胞懸濁液と接触させること、
（ｃ）重力により細胞がピコウェルにロードすることを可能にすること、
（ｄ）前記アレイを固定液に浸漬すること、および
（ｅ）前記アレイを１日間またはそれを超えて貯蔵すること
を含む、方法。
【請求項１０２】
前記ピコウェルアレイが、転写産物キャプチャーのために膜の付着を可能にするように機能化されている、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
固定後に前記アレイを乾燥させる、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
ウェルアレイであって、
０．１〜１００ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度および／または５０ｎｍ〜３ミクロンの孔径を有する第１の多孔質膜；ならびに
第１の複数のスルーホールを有するドライフィルムフォトレジストを含む第１のボトムレスマイクロウェルアレイ
を含み、
前記第１の多孔質膜が、前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの底面において前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイと接触し；
前記アレイの各ウェルが、前記第１の複数のスルーホールの１つと、前記第１の多孔質膜を含む底面とを含む、ウェルアレイ。
【請求項１０５】
ドライフィルムフォトレジストであって、１５〜１００ミクロンの範囲の最大横寸法を有し、０．１〜１００ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度および／または５０ｎｍ〜３ミクロンの孔径を有する多孔質底部を有するウェルアレイを含む、ドライフィルムフォトレジスト。
【請求項１０６】
マイクロ流体デバイスであって、（ａ）１〜５００ミクロンの範囲の最大横寸法を有する第２のボトムレスマイクロウェルアレイと、（ｂ）第１の多孔質膜とに結合した、１〜５００ミクロンの範囲の最大横寸法を有する第１のボトムレスマイクロウェルアレイを含むマイクロ流体デバイス。
【請求項１０７】
複数のスルーホールを含むフリースタンディングフォトレジストフィルムを作製する方法であって、
第１のドライフィルムフォトレジストをフォトマスクとアライメントすること；
前記フォトマスクを介して、前記第１のドライフィルムフォトレジストの少なくとも一部を紫外線（ＵＶ）光に曝露して、前記第１のドライフィルムフォトレジストに複数の第１スルーホールを形成し、それにより、複数のスルーホールを含む第１のフリースタンディングフォトレジストフィルムを生産すること
を含む、方法。
【請求項１０８】
（ｉ）請求項１０４に記載のウェルアレイ；
（ｉｉ）請求項１０５に記載のドライフィルムフォトレジスト；または
（ｉｉｉ）請求項１０６に記載のマイクロ流体デバイス
を介して、複数の細胞および／または複数のビーズを含む第１の流体を流し、
それにより、細胞ロードおよび／またはビーズロードマイクロウェルアレイを形成すること
を含む、方法。
【請求項１０９】
１５〜１００ミクロンの平均ウェル直径を有し、８０〜１０００ナノメートルの平均孔径を有する第１の多孔質膜に結合した第１のボトムレスマイクロウェルアレイを含むマイクロ流体デバイスを提供すること；
前記マイクロ流体デバイスを介して、複数のビーズを含む第１の流体を流すこと；
前記第１の多孔質膜に結合した第１のボトムレスマイクロウェルアレイを、１〜１０ミクロンの平均ウェル直径を有する第２のボトムレスマイクロウェルアレイに結合した８０〜１０００ナノメートルの平均孔径を有する第２の多孔質膜に結合させること；および
前記マイクロ流体デバイスを介して、複数の細胞を含む第２の流体を流すこと
を含み、
前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイのウェルの８０％が単一のビーズにより占有されている、方法。
【請求項１１０】
１〜１０ミクロンの平均ウェル直径を有し、（ａ）１５〜１００ミクロンの平均ウェル直径を有する第２のボトムレスマイクロウェルアレイと、（ｂ）８０〜１０００ナノメートルの平均孔径を有する多孔質膜とに結合した第１のボトムレスマイクロウェルアレイを含むマイクロ流体デバイスを提供すること；
前記マイクロ流体デバイスを介して、複数の細胞を含む第１の流体を流すこと；および
前記マイクロ流体デバイスを、ビーズを含む第２の流体に曝露すること
を含む、方法。
【請求項１１１】
生物学的サンプルを処理するためのキットであって、
その中に形成された複数のレセプタクルを有する表面を含むベースプレートであって、各レセプタクルが、マイクロウェルアレイを収容するサイズおよび形状であるベースプレート；
前記ベースプレートの表面に付着して、１つまたはそれを超える膜が前記複数のレセプタクルをカバーするようにアセンブリを形成するように構成された１つまたはそれを超える膜；ならびに
ハイブリダイゼーションプレートと前記ベースプレートとの間に配置された前記１つまたはそれを超える膜を有する前記アセンブリに付着されるように構成されたハイブリダイゼーションプレートであって、ハイブリダイゼーションプレートの内面と前記１つまたはそれを超える膜との間に形成された別個のボリュームを有するハイブリダイゼーションプレート
を含み、各ボリュームが、前記複数のレセプタクルの別個の１つに流体連結している、キット。
【請求項１１２】
複数の凹部を含むコレクションプレートをさらに含み、前記コレクションプレートが、前記ベースプレートおよび関連マイクロウェルアレイを収容するように構築されており、前記コレクションプレートにより前記ベースプレートおよび関連マイクロウェルアレイが収容されると、各凹部が、単一のマイクロウェルアレイに流体連結する、請求項１１１に記載のキット。
【請求項１１３】
前記コレクションプレートの複数の凹部をシーリングするサイズおよび形状のカバーをさらに含む、請求項１１１または１１２に記載のキット。
【請求項１１４】
ハイブリダイゼーションバッファーをさらに含む、請求項１１１〜１１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１５】
溶解バッファーをさらに含む、請求項１１１〜１１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１６】
前記複数のレセプタクルがそれぞれ底面を含む、請求項１１１〜１１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１７】
前記複数のレセプタクルが、前記ベースプレートに形成されたスルーホールを含む、請求項１１１〜１１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１８】
前記ハイブリダイゼーションプレートが複数の開口部を含み、前記複数の開口部の１つがそれぞれ、前記ボリュームの別個の１つと流体連通するように配置されている、請求項１１１〜１１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１９】
前記キットを使用して生物学的サンプルを処理するための取扱説明書をさらに含む、請求項１１１〜１１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２０】
マイクロウェルデバイスであって、
（ａ）上面と、底面と、前記上面から前記底面への複数のスルーホールとを含むフォトレジストフィルムであって、各ホールが、前記上面上の上開口部と、前記底面上の底開口部とを有するフォトレジストフィルム、および
（ｂ）前記フォトレジストフィルムの前記底面と接触した多孔質底部膜であって、１０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）の水の初期フラックス速度により測定した場合に、少なくとも０．１ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度を有する多孔質底部膜
を含む、マイクロウェルデバイス。
【請求項１２１】
前記多孔質底部膜が、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０または９０ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度を有する乾燥膜である、請求項１２０に記載のデバイス。
【請求項１２２】
無基板二層ラミネートであって、
（ａ）フォトレジストフィルムであって、
（ｉ）上面と、底面と、（ｉｉ）強化部および未強化部とを含み、
溶解剤と接触すると、
前記未強化部が溶解して、前記上面から前記底面への複数のスルーホールを形成し、各ホールが、前記上面上の上開口部と、前記底面上の底開口部とを有し、前記上面、前記底面または両面の少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％または７５％が前記スルーホールによりカバーされ、
前記強化部が前記溶解剤に対して実質的に耐性であるフォトレジストフィルム；ならびに
（ｂ）フォトマスクであって、
前記フォトマスクの最大特徴距離が２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８、０．７、０．６または０．５ｍｍ以下であり、
前記フォトレジストフィルムの上面と接触し、その少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または全体をカバーするフォトマスク
を含む、無基板二層ラミネート。
【請求項１２３】
複数のスルーホールを含むフリースタンディングフォトレジストフィルムを製造する方法であって、
（ａ）フォトマスクでフォトレジストフィルムをラミネートすること、ここで、前記フォトマスクが、複数の特徴と、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８、０．７、０．６または０．５ｍｍ以下の最大特徴距離とを有し、
前記フォトマスクが、フォトレジストフィルムの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または全体をカバーし、
（ｂ）前記フォトマスクを介して、前記フォトレジストフィルムを光源に、前記フォトレジストの強化部を作るために十分な時間にわたって曝露すること、
（ｃ）前記フォトレジストフィルムを現像すること、および
（ｄ）前記フォトマスクから前記フォトレジストフィルムを分離し、それにより、前記複数のスルーホールを含む前記フリースタンディングフォトレジストフィルムを製造すること
を含む、方法。
【請求項１２４】
前記フォトレジストの前記強化部が、表面積で前記フォトレジストの多くとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％または７５％である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記フォトレジストフィルムを同時に現像および分離する、請求項１２３または１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記フォトレジストを曝露する前または後に、前記フォトレジストフィルムから剥離ライナーを除去することをさらに含む、請求項１２３〜１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
細胞ローディングの方法であって、
（ａ）（ｉ）上面と、底面と、前記上面から前記底面への複数のスルーホールとを含むボトムレスマイクロウェルアレイであって、各ホールが、前記上面上の上開口部と、前記底面上の底開口部とを有するボトムレスマイクロウェルアレイと、（ｉｉ）前記マイクロウェルアレイの前記底面と接触した多孔質底部膜であって、１０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）の水の初期フラックス速度により測定した場合に、少なくとも０．１ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度を有する多孔質底部膜とを含むマイクロアレイデバイスを介して、複数の細胞を含む流体サンプルを流すこと、
（ｂ）前記複数のスルーホールの少なくとも１つの前記上開口部から前記底開口部に圧力勾配を適用し、それにより、単一細胞を前記少なくとも１つのスルーホールにロードすること、
（ｃ）前記圧力勾配を適用することにより、前記細胞を前記少なくとも１つのスルーホールの底部に保持すること、
（ｄ）前記細胞を保持している間に、前記マイクロウェルアレイを反転させること、
（ｅ）前記反転マイクロウェルアレイを逆転させ、それにより、細胞を前記マイクロアレイの前記スルーホールにロードすること
を含む、方法。
【請求項１２８】
前記保持細胞により、前記少なくとも１つのスルーホール内の圧力勾配が、第２の細胞のローディングを誘導するために不十分なレベルに減少される、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記マイクロウェルアレイを反転させる際に、前記細胞または前記マイクロウェルアレイを洗浄することをさらに含む、請求項１２７または１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
単離された細胞を培養または貯蔵する方法であって、
（ａ）（ｉ）上面と、底面と、前記上面から前記底面への複数のスルーホールとを含むボトムレスマイクロウェルアレイであって、各ホールが、前記上面上の上開口部と、前記底面上の底開口部とを有するボトムレスマイクロウェルアレイと、（ｉｉ）前記マイクロウェルアレイの前記底面と接触した多孔質底部膜であって、１０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）の水の初期フラックス速度により測定した場合に、少なくとも０．１ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度を有する多孔質底部膜とを含むマイクロアレイデバイスを介して、複数の細胞を含む流体サンプルを流すこと、
（ｂ）重力により、または圧力勾配の適用により、前記複数の細胞の少なくとも１つの細胞を前記スルーホールにロードすること、
（ｃ）前記マイクロウェルアレイの前記上面の上に多孔質上部膜を適用し、それにより、前記細胞を前記スルーホールに保持すること、および
（ｄ）前記複数のスルーホールの少なくとも一部が、前記上部、前記底部または両開口部を介して培地と流体接続されるように、前記マイクロウェルアレイを前記培地に浸漬すること
を含む、方法。
【請求項１３１】
複数のビーズが前記マイクロウェルアレイにプレロードされている、請求項１２７〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
複数のビーズを含む流体サンプルを流すことをさらに含む、請求項１２７〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
組織切片を分析する方法であって、
（ａ）前記組織切片を、マイクロアレイデバイスであって、（ｉ）上面と、底面と、前記上面から前記底面への複数のスルーホールとを含むボトムレスマイクロウェルアレイであって、各ホールが、前記上面上の上開口部と、前記底面上の底開口部とを有し、
前記複数のスルーホールの少なくとも一部がバーコード化転写産物キャプチャービーズおよび機能表面を含むボトムレスマイクロウェルアレイと、（ｉｉ）前記マイクロウェルアレイの前記底面と接触した多孔質底部膜とを含むマイクロアレイデバイスと接触させること、ならびに
（ｂ）前記ビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、前記転写産物からｃＤＮＡ配列を生成し、それにより、前記組織切片を分析すること
を含む、方法。
【請求項１３４】
単一細胞分析キットであって、
（ａ）上面と、底面と、前記上面から前記底面への複数のスルーホールとを含むフォトレジストフィルムであって、各ホールが、前記上面上の上開口部と、前記底面上の底開口部とを有するフォトレジストフィルムをそれぞれが含む１つまたはそれを超えるマイクロアレイ、および
（ｂ）１０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）の水の初期フラックス速度により測定した場合に、少なくとも０．１ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度を有する少なくとも１つの多孔質乾燥膜
を含む、単一細胞分析キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて、２０１７年１２月７日に出願され、「ＳＩＮＧＬＥ  ＣＥＬＬ  ＡＮＡＬＹＳＥＳ，」という表題の米国仮出願第６２／５９５，８９５号（これは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｓｅｑ−ｗｅｌｌとも称されるウェルベース生物学的分析プラットフォームは、ミクロン寸法の１０，０００〜１，０００，０００個またはそれを超えるウェルと、バーコード化転写産物キャプチャービーズをプレロードされたピコリットルボリュームとを含有するデバイスを使用して、数千の単一細胞からのバーコード化単一細胞シークエンシングライブラリーの作成を容易にする。細胞は、アレイの上面に単に付与され、数分以内に重力によりウェルに落下する。この簡便なローディングスキームは、Ｓｅｑ−ｗｅｌｌが、デバイスの表面に適用された細胞のほぼ１００％をキャプチャーすることを可能にする。Ｓｅｑ−ｗｅｌｌによる単一細胞トランスクリプトームのロバストなキャプチャーの鍵は、（公開されている国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１７／１３７９１号に開示されているように）細胞ローディング後のアレイ表面への半透膜の付着であり、キャプチャーのために生物学的高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質）を保持しながら、細胞溶解およびＲＮＡハイブリダイゼーションのためにウェル内のバッファー交換を可能にする。低いインプット要件ならびにビーズおよび細胞の効率的なキャプチャーにより、Ｓｅｑ−ｗｅｌｌプラットフォームは、多数の研究および臨床状況において広く適用されている。前記プラットフォームは、細胞およびｍＲＮＡキャプチャービーズの閉じ込め後の個々にバーコード化された単一細胞シークエンシングライブラリーの生成に最適化されている（Ｍａｃｏｓｋｏら、２０１５）と同時に、それは、複数レベルのデータ取得が可能である。前記プラットフォームは、同じアレイで実施される他のアッセイおよび測定と適合する。細胞表面タンパク質のレベル（Ｏｇｕｎｎｉｙｉ，Ａ．Ｏ．，Ｂ．Ａ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｔ．Ｊ．Ｐｏｌｉｔａｎｏ，Ｎ．Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ，Ｅ．Ｌａｎｄａｉｓ，Ｐ．Ｐｏｉｇｎａｒｄ，Ｂ．Ｄ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｄ．Ｓ．Ｋｗｏｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｌｏｖｅ，“Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｖａｃｃｉｎｅ，３２（２４），２８６６−２８７３）、分泌タンパク質（例えば、米国特許第７，７７６，５５３号；米国特許第８，８３５，１８７号；米国特許第８，７７２，０４９号；米国特許第８，８６５，４７９号；日本国特許第５７１８２２号公報；欧州特許出願公開第２２９７３３３号；米国特許出願公開第２０１２／００１５８２４号を参照のこと）、細胞の細胞溶解挙動（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１４９５９２号を参照のこと）、動的運動性（例えば、Ｙａｏ，Ｘら、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｒａｒｅ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｒａｉｔｓ．Ｉｎｔｅｇｒ  Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ），ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ３ｉｂ４０２６４ａ（２０１４）を参照のこと）および遺伝子発現（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０１１１９８１号を参照のこと）は、制限容量技術を使用して評価され得る。しかしながら、バーコード化ビーズローディングプロセスのランダム性質は、シークエンシングスペースのビーズバーコードをその起源ウェルに遡って関連付けることを妨害するので、これらのさらなる測定は、各細胞の完全なトランスクリプトームに関連付けられていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第７，７７６，５５３号明細書
【特許文献２】米国特許第８，８３５，１８７号明細書
【特許文献３】米国特許第８，７７２，０４９号明細書
【特許文献４】米国特許第８，８６５，４７９号明細書
【特許文献５】日本国特許第５７１８２２号明細書
【特許文献６】欧州特許出願公開第２２９７３３３号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１２／００１５８２４号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１２／０１４９５９２号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１１／０１１１９８１号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｏｇｕｎｎｉｙｉ，Ａ．Ｏ．，Ｂ．Ａ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｔ．Ｊ．Ｐｏｌｉｔａｎｏ，Ｎ．Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ，Ｅ．Ｌａｎｄａｉｓ，Ｐ．Ｐｏｉｇｎａｒｄ，Ｂ．Ｄ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｄ．Ｓ．Ｋｗｏｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｌｏｖｅ，Ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｖａｃｃｉｎｅ，３２（２４），２８６６−２８７３
【非特許文献２】Ｙａｏ，Ｘら、Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ），ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ３ｉｂ４０２６４ａ（２０１４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
したがって、本開示は、単一細胞分析において使用するための改善された製品および方法を提供する。これらの改善された製品および方法は、ウェルベースアッセイおよび／またはビーズベースアッセイ、例えばＳｅｑ−ｗｅｌｌアッセイにおいて有用であるが、それに限定されない。それらは、例えば、キャプチャーされる単一細胞転写産物の割合を増加させ、それにより、このような単一細胞のより完全な「トランスクリプトーム」を達成し、および／またはウェルアレイ内のあるウェルから別のものへの物質のクロスコンタミネーションの可能性を減少させることにより、このようなアッセイのロバスト性を改善する。それらはまた、各トランスクリプトームの起源ウェルを空間的に位置決定する手段を提供することにより、ウェルベースアッセイの使用を拡大するために役立つ。この後者の改善は、トランスクリプトームデータを、転写産物キャプチャーの前に細胞に対して実施された他の測定または操作に関連付けることを可能にする。例えば、異なる条件または異なる薬剤をウェルアレイ中の各ウェル（またはウェルの一部）に適用する方法が提供され、このような操作の効果が決定され得る。次いで、この細胞応答はまた、これらのウェル中の単一細胞のトランスクリプトームの分析に関連付けられ得る。別の例として、エンドユーザーは、１つまたはそれを超えるマーカー、例えば細胞表面マーカーの発現に基づいて細胞を調べて、このようなマーカー発現を細胞の転写プロファイルと再び関連付け得る。さらに別の例では、それは、例えば細胞増殖または遊走活性について、単一細胞を機能的に分析し、次いで、このような機能的属性を特定の遺伝子発現パターンに関連付けることを可能にする。アレイ中のウェルおよびしたがってアレイ中の細胞を空間的にバーコード化する能力は、トランスクリプトミクス、プロテオミクスおよびこのような細胞の機能分析の組み合わせを可能にする。それらはまた、ドライフィルムフォトレジストで作られたアレイを提供することにより、ウェルベースアレイの使用を拡大するために役立ち、非常にスケーラブルな方法で製造されたアレイであって、超ポアソンでロードされ得るアレイをもたらす。
【０００６】
したがって、一態様において、本開示は、インプット核酸からの５’および３’末端上にユニバーサルプライマーサイトを含有する核酸のライブラリーを生産するための方法を提供し、この方法は、（ａ）インプット核酸を、各キャプチャーオリゴヌクレオチドが５’ユニバーサルプライマーサイトと、インプット核酸中のヌクレオチド配列に相補的な３’標的結合部位（キャプチャー部位とも言及される）と、必要に応じて、前記５’ユニバーサルプライマーサイトと前記３’標的結合部位との間に必要に応じて存在するバーコードとを含有するキャプチャーオリゴヌクレオチドのプールと接触させること、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼを添加し、第１鎖核酸をその相補的な核酸から変性させ、それにより、インプット核酸にハイブリダイズしたキャプチャーオリゴヌクレオチドを伸長させて、それぞれが前記５’ユニバーサルプライマーサイトと、インプット核酸に相補的な配列とを含む第１鎖核酸を形成すること、（ｃ）前記第１鎖核酸を、それぞれが５’ユニバーサルプライマーサイトと、前記第１鎖核酸中のヌクレオチド配列に相補的な３’標的結合部位とを含む第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドのプールと接触させること、ならびに（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを添加し、それにより、前記第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させて、前記インプット核酸に存在するヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ユニバーサルプライマーサイトを含む第２鎖核酸を形成することを含む。
いくつかの実施形態では、キャプチャーオリゴヌクレオチドは、ポリ（ｄＴ）配列を含む標的結合配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプチャーオリゴヌクレオチドは、ポリ（ｄＴ）配列を含む標的結合配列、および／またはインプット核酸中の特定の配列をターゲティングする配列を含む標的結合配列を含む。いくつかの実施形態では、キャプチャーオリゴヌクレオチドは、インプット核酸中の特定の配列をターゲティングする配列を含む標的結合配列を含む。
いくつかの実施形態では、キャプチャーオリゴヌクレオチドは、表面、必要に応じてビーズの表面に付着される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、インプット核酸は、インプット核酸の複合混合物として提供される。いくつかの実施形態では、インプット核酸は、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、インプット核酸は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）とＲＮＡとの混合物を含む。いくつかの実施形態では、インプット核酸は、（ａ）ウイルスもしくは細菌に由来するか、または（ｂ）真核細胞、例えば酵母もしくは昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、インプット核酸は、哺乳動物または酵母または昆虫ＲＮＡおよび細菌またはウイルスＤＮＡを含む感染細胞に由来する。いくつかの実施形態では、インプット核酸は、単一細胞に由来する。いくつかの実施形態では、インプット核酸は、２〜１０００個の細胞に由来する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドの前記プール中の前記標的結合配列が、ランダムヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドの前記プール中の前記標的結合配列が、セミランダムヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドの前記プール中の前記標的結合配列が、ランダム配列と、前記第１鎖核酸中の特定の配列に相補的な配列とを含む。いくつかの実施形態では、第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドの前記プール中の前記標的結合配列が、前記第１鎖核酸中の配列に相補的な配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドの前記プールが、前記第１鎖核酸中の配列に相補的な標的結合配列を含むが前記ユニバーサルプライマーサイトを欠くデコイオリゴヌクレオチドをさらに含み、特異的な核酸の枯渇を媒介する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、前記第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドが、表面、必要に応じてビーズの表面に付着している。
【００１１】
いくつかの実施形態では、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）において、クラウディング試薬を添加する。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、クラウディング試薬を添加する。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）において、クラウディング試薬を添加する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが、ユニークな分子同定のためのランダムヌクレオチド配列をさらに含む。
【００１３】
本開示の別の態様は、単一細胞から複数の同一に５’および３’標識されたｃＤＮＡ分子を生産するための方法を提供し、この方法は、（ａ）単一細胞ＲＮＡライブラリーから第１鎖ｃＤＮＡライブラリーを合成すること、ここで、前記ライブラリーからの第１鎖ｃＤＮＡ分子がそれぞれ、同一の５’ユニバーサルプライマーサイトと、必要に応じて同一のバーコードとを含む；（ｂ）５’ユニバーサルプライマーサイトを有する第１鎖ｃＤＮＡ分子を、標的結合配列の上流に５’ユニバーサルプライマーサイトを有するオリゴヌクレオチドと接触させること；ならびに（ｃ）前記オリゴヌクレオチドを伸長させて、５’ユニバーサルプライマーサイトおよび３’ユニバーサルプライマーサイトで同一に標識された複数の第２鎖ｃＤＮＡ分子を生産することを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、前記５’ユニバーサルプライマーサイトと、ランダム、セミランダムおよび／または標的化キャプチャー配列とを含むキャプチャーオリゴヌクレオチドへの単一ＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションにより、前記第１鎖ｃＤＮＡライブラリーを合成する。いくつかの実施形態では、前記５’ユニバーサルプライマーサイトと、ポリ（ｄＴ）キャプチャー配列とを含むキャプチャーオリゴヌクレオチドへの単一ＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションにより、前記第１鎖ｃＤＮＡライブラリーを合成する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドがビーズに付着している。いくつかの実施形態では、複数の同一のキャプチャーオリゴヌクレオチドが前記ビーズに付着している。
【００１６】
いくつかの実施形態では、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが、５’ユニバーサルプライマー配列、バーコードおよび３’キャプチャー配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、方法は、単一細胞由来のＲＮＡライブラリーを取得または提供することをさらに含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）が、第１鎖ｃＤＮＡ分子を、５’ユニバーサルプライマーサイトを欠くデコイオリゴヌクレオチドと接触させることをさらに含む。
【００１９】
本開示の別の態様は、複数の核酸分子を生産するための方法を提供し、この方法は、（ａ）複数の親核酸から、それぞれが前記複数の親核酸に相補的な第１鎖核酸を合成すること、ここで、第１鎖核酸がそれぞれ、同一の５’ユニバーサルプライマーサイトを含み；
（ｂ）５’ユニバーサルプライマーサイトを有する第１鎖核酸を、標的結合配列の上流に５’ユニバーサルプライマーサイトを含む第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドと接触させること；ならびに（ｃ）前記第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させて、５’ユニバーサルプライマーサイトおよび３’ユニバーサルプライマーサイトで同一に標識された複数の第２鎖核酸を生産することを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、親核酸を、ランダム、セミランダムまたは標的化配列を有するキャプチャーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることにより、各前記第１鎖核酸を合成する。いくつかの実施形態では、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドがビーズに付着している。
【００２１】
いくつかの実施形態では、複数の同一のキャプチャーオリゴヌクレオチドがビーズに付着している。
【００２２】
いくつかの実施形態では、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドが、５’ユニバーサルプライマー配列、バーコード配列および３’キャプチャー配列を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、方法は、単一細胞またはウイルスから前記複数の親核酸を取得することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記単一細胞が病原体である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、前記標的結合配列が、ランダム配列、セミランダム配列および／または非ランダム／標的化配列を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、第１鎖ｃＤＮＡ分子または前記第１鎖核酸がそれぞれ、同一のバーコードを含む。いくつかの実施形態では、前記第１鎖ｃＤＮＡ分子または前記第１鎖核酸がビーズに付着している。
【００２６】
いくつかの実施形態では、方法は、工程（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）において、クラウディング試薬を添加することをさらに含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、方法は、前記５’ユニバーサルプライマーサイトと、キャプチャー配列と、必要に応じてそれらの間のバーコード配列とを含む前記キャプチャーオリゴヌクレオチドを提供すること；前記キャプチャーオリゴヌクレオチドを、単一細胞由来の複数のＲＮＡ分子と接触させること；前記複数のＲＮＡ分子がそれらの各キャプチャー配列にアニーリングすることを可能にすること；およびＤＮＡポリメラーゼを添加し、それにより、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドを伸長させて、前記第１鎖ｃＤＮＡ分子を生成すること、ここで、前記第１鎖ｃＤＮＡ分子が前記複数のＲＮＡ分子に相補的である、を含む第１鎖ｃＤＮＡ分子の生成をさらに含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、方法は、前記５’ユニバーサルプライマーサイトと、キャプチャー配列と、必要に応じてそれらの間のバーコード配列とを含む前記キャプチャーオリゴヌクレオチドを提供すること；前記キャプチャーオリゴヌクレオチドを、単一細胞またはウイルス由来の複数の親核酸と接触させること；前記複数の親核酸が前記キャプチャー配列にアニーリングすることを可能にすること；およびＤＮＡポリメラーゼを添加し、それにより、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドを伸長させて、前記第１鎖核酸を生成すること、ここで、前記第１鎖核酸がそれぞれ親核酸に相補的である、を含む第１鎖核酸の生成をさらに含む。
【００２９】
本開示の別の態様は、テンプレートスイッチング反応の収量を増加させる方法であって、クラウディング試薬をテンプレートスイッチング反応に添加することを含む、方法を提供する。
【００３０】
本開示の別の態様は、ピコウェルアレイへの膜のシーリングを増強する方法であって、前記ピコウェルアレイおよび膜をクラウディング試薬と接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ピコウェルアレイがＳｅｑ−ｗｅｌｌアッセイで使用される。
【００３１】
本開示の別の態様は、各ピコウェルが、１つまたはそれを超える核酸バーコードを含む機能化表面を含む複数のピコウェルを含む、ピコウェルアレイを提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、各核酸バーコードが、前記アレイ中のすべての他の核酸バーコードと比べて、または前記アレイ中の一部の他の核酸バーコードと比べてユニークである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、１つまたはそれを超える核酸バーコードが、複数のピコウェル間で共有される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、前記アレイ中の各核酸バーコードの位置が既知である。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ユニークな刺激が、ユニークな核酸バーコードを有する各ピコウェルに適用される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、前記機能化表面が、前記ピコウェルの底内面である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、前記ピコウェルアレイの底内面がＤＮＡマイクロアレイを含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、複数のピコウェルがそれぞれ、スペクトル符号化ビーズを含む。いくつかの実施形態では、複数のピコウェルがそれぞれ、複数のスペクトル符号化ビーズを含む。いくつかの実施形態では、前記スペクトル符号化ビーズが、前記ピコウェルの機能化表面に付着している。
【００３９】
本開示の別の態様は、それぞれが、ユニークな空間バーコードを有する１つまたはそれを超える核酸分子を含む機能化表面を含む複数のピコウェルを含み、各ユニークな空間バーコードが、ピコウェルの１つまたはクラスタにユニークであり、必要に応じて、前記ピコウェルアレイ中の各空間バーコードの位置が既知である、ピコウェルアレイを提供する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、前記機能化表面が前記ピコウェルの内底面に存在する。いくつかの実施形態では、前記ピコウェルアレイの内底面がＤＮＡマイクロアレイを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、前記機能化表面がスペクトル符号化ビーズを含む。
【００４２】
本開示の別の態様は、ピコウェルアレイ中の転写産物を空間的に位置決定するための方法を提供し、この方法は、（ａ）ピコウェルアレイを提供すること、ここで：（ｉ）１つまたはそれを超えるピコウェルが、ユニークな空間バーコードを有する核酸分子をそれぞれが含む１つまたはそれを超える機能化表面を含み；（ｉｉ）１つまたはそれを超えるピコウェルが、空間バーコードのユニークな組み合わせを含み；（ｉｉｉ）各ピコウェルに配置された空間バーコードのアイデンティティが既知であり；および（ｉｖ）１つまたはそれを超えるピコウェルが、バーコード化転写産物キャプチャービーズをロードされている、（ｂ）前記ピコウェルアレイを、各細胞が１つまたはそれを超える転写産物を含有する細胞の集団と接触させること；（ｃ）前記細胞を溶解させ、前記同じウェルに存在する前記ビーズ上の細胞由来のＲＮＡをキャプチャーすること；（ｄ）前記ビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、前記キャプチャーした転写産物からｃＤＮＡを生成すること；（ｅ）転写産物キャプチャービーズに結合した空間バーコードのプライマー伸長により、ビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子を生成すること；（ｆ）前記ｃＤＮＡおよびビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子をシークエンシングすること；（ｇ）各ビーズバーコードに関連するすべての前記空間バーコードを決定すること；（ｈ）ビーズバーコードに関連する空間バーコードの組み合わせを、空間バーコードの同じ組み合わせを有する既知のピコウェルとマッチングすることにより、各ビーズバーコードの起源のウェルを決定すること；ならびに（ｉ）前記ｃＤＮＡ中の前記ビーズバーコードを、そのビーズバーコードの供給源として同定されたピコウェルとマッチングすることにより、前記ピコウェルアレイ上の前記転写産物を位置決定することを含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、前記機能化表面が、前記ピコウェルの底内面を含む。いくつかの実施形態では、前記ピコウェルアレイの底内面がＤＮＡマイクロアレイを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、前記機能化表面がスペクトル符号化ビーズを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ガラススライドに結合した薄組織切片として細胞の前記集団を前記アレイに送達する。
【００４６】
本開示の別の態様は、ピコウェルアレイを使用して、刺激のセットに対する転写応答を決定するための方法を提供し、この方法は、（ａ）ピコウェルアレイを提供すること、ここで、ピコウェルの大部分がそれぞれ、（１）ユニークな空間バーコードを有する核酸分子と、（２）ユニークな刺激とを含む１つまたはそれを超える機能化表面を含む；（ｂ）前記ピコウェルアレイを、１つまたはそれを超える転写産物を含有する細胞の集団と接触させること；（ｃ）前記機能化表面から前記刺激を放出させること；（ｄ）前記細胞を培養して、前記放出刺激に対する転写応答を可能にすること；（ｅ）バーコード化転写産物キャプチャービーズをウェルの大部分にロードすること；（ｆ）前記細胞を溶解させ、前記細胞と同じウェルに存在する前記ビーズ上の細胞由来のＲＮＡをキャプチャーすること；（ｇ）前記ビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、前記キャプチャーしたＲＮＡからｃＤＮＡを生成すること；（ｈ）転写産物キャプチャービーズに結合した空間バーコードのプライマー伸長により、ビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子を生成すること；（ｉ）前記ｃＤＮＡおよびビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子をシークエンシングすること；（ｊ）各ビーズバーコードに関連する空間バーコードの組み合わせを決定すること；ならびに（ｋ）空間バーコードの組み合わせをウェルに存在する刺激の組み合わせに変換することにより、所定のビーズバーコードに関連するｃＤＮＡの供給源であった細胞の刺激曝露を決定することを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、前記機能化表面が前記ピコウェルの底部を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、前記ピコウェルアレイの前記底部がＤＮＡマイクロアレイを含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、前記機能化表面がスペクトル符号化ビーズを含む。
【００５０】
本開示の別の態様は、ピコウェルアレイ上の転写産物を空間的に位置決定するための方法を提供し、この方法は、（ａ）ピコウェルアレイを提供すること、ここで、（ｉ）各ピコウェルが、ユニークな空間バーコードを有する１つまたはそれを超える核酸分子を含む機能化表面を含み；（ｉｉ）各ユニークな空間バーコードが、ピコウェルの１つまたはクラスタにユニークであり；（ｉｉｉ）前記ピコウェルアレイ上の各ユニークな空間バーコードの位置が既知であり；（ｉｖ）各ピコウェルが、バーコード化転写産物キャプチャービーズをロードされている、（ｂ）前記ピコウェルアレイを、１つまたはそれを超える転写産物を含有する細胞の集団と接触させること；（ｃ）前記ビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、前記転写産物からｃＤＮＡを生成すること；（ｄ）転写産物キャプチャービーズに結合した空間バーコードのプライマー伸長により、ビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子を同時生成すること；ならびに（ｅ）前記ｃＤＮＡ中の前記ビーズバーコードをビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子とマッチングすることにより、前記ピコウェルアレイ上の前記転写産物を位置決定すること
を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、機能化表面が前記ピコウェルの底部を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、前記ピコウェルアレイの前記底部がマイクロアレイを含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、前記機能化表面がスペクトル符号化ビーズを含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、各ピコウェルが刺激をさらに含む。
【００５５】
本開示の別の態様は、組織切片中の転写産物を空間的に位置決定するための方法を提供し、この方法は、（ａ）ピコウェルアレイを提供すること、ここで、（ｉ）各ピコウェルが、ユニークな空間バーコードを有する１つまたはそれを超える核酸分子を含む機能化表面を含み；（ｉｉ）各ユニークな空間バーコードが、ピコウェルの１つまたはクラスタにユニークであり；（ｉｉｉ）前記ピコウェルアレイ上の各ユニークな空間バーコードの位置が既知であり；（ｉｖ）各ピコウェルが、バーコード化転写産物キャプチャービーズをロードされている、（ｂ）前記ピコウェルアレイを、ガラススライドに結合した薄組織切片と接触させること；（ｃ）前記ビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、前記転写産物からｃＤＮＡを生成すること；（ｄ）転写産物キャプチャービーズに結合した空間バーコードのプライマー伸長により、ビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子を生成すること；ならびに（ｅ）前記ｃＤＮＡ中の前記ビーズバーコードをビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子とマッチングすることにより、前記ピコウェルアレイ上の前記転写産物を位置決定することを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、機能化表面が前記ピコウェルの底部を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、前記ピコウェルアレイの前記底部がマイクロアレイを含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、前記機能化表面がスペクトルビーズを含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、各ピコウェルが刺激をさらに含む。
【００６０】
本開示の別の態様は、膜をピコウェルアレイに適用するためのメンブレンアプリケーターであって、半多孔質膜；および剛性支持体を含み、前記膜が、可逆的化学により前記剛性支持体に付着している、メンブレンアプリケーターを提供する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、前記可逆的化学が親水性薄膜である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、前記親水性薄膜が塩橋または親水性ポリマーである。
【００６３】
いくつかの実施形態では、前記剛性支持体がガラスまたはアクリルプラスチックである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、前記ピコウェルアレイがＳｅｑ−ｗｅｌｌアレイである。
【００６５】
本開示の別の態様は、複数のピコウェルを含むアレイに半多孔質膜をシーリングするための方法を提供し、この方法は、（ａ）ピコウェルアレイを剛性支持体上の半多孔質膜と接触させること；および（ｂ）加熱面を前記剛性支持体に適用すること、ここで、前記半多孔質膜は、前記剛性支持体と前記アレイとの間に挟まれている、それにより、前記膜を前記ピコウェルアレイにシーリングすることを含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、前記加熱面を前記膜に１０分間未満適用する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、前記加熱面が３５℃〜５０℃である。
【００６８】
本開示の別の態様は、１つまたはそれを超えるピコウェルアレイを剛性支持体上の半多孔質膜と接触させ、加熱面を前記剛性支持体に適用し、それにより、前記半多孔質膜を前記ピコウェルにシーリングするように構成された、デバイスを提供する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、剛性支持体と、所望の温度に加熱されることができる表面とを含む。
【００７０】
本開示の別の態様は、刺激を細胞に送達するための方法を提供し、この方法は、（ａ）ピコウェルアレイを提供すること、ここで、各ピコウェルが、刺激に付着した１つまたはそれを超えるビーズと、前記刺激にユニークに関連するユニークな刺激バーコードを含む核酸とを含む；（ｂ）前記ピコウェルアレイを、１つまたはそれを超える転写産物を含有する細胞の集団と接触させること；（ｃ）細胞を前記刺激と共に培養すること；（ｄ）バーコード化転写産物キャプチャービーズを各ウェルにロードすること；（ｅ）前記ビーズから、前記ユニークな刺激バーコードを含む前記核酸を放出させること；（ｆ）前記ビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、前記転写産物から前記ｃＤＮＡを生成すること；（ｇ）転写産物キャプチャービーズに結合した空間バーコードのプライマー伸長により、ビーズバーコード：刺激バーコードハイブリッド分子を生成すること；ならびに（ｈ）前記ｃＤＮＡ中の前記ビーズバーコードをビーズバーコード：刺激バーコードハイブリッド分子とマッチングすることにより、各ｃＤＮＡの起源の前記細胞の刺激を同定することを含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、方法は、前記ビーズから前記刺激を放出させることをさらに含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、方法は、前記ビーズバーコード：刺激バーコードハイブリッド分子をシークエンシングすることをさらに含む。
【００７３】
本開示の別の態様は、膜をピコウェルアレイに固定するためのクランプであって、三ネジ設計を含み、アレイホルダーおよびトップピースを包含する矩形であり、下側においてのみ前記アレイホルダーと接触し、それにより、前記アレイに対して上向きの力を引き起こす、クランプを提供する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、前記クランプがプラスチックである。
【００７５】
本開示の別の態様は、バーコード化ビーズとして使用するための多孔質樹脂を磁化するための方法を提供し、この方法は、（ａ）前記樹脂を収縮させ、それにより、前記樹脂の細孔を拡大すること；（ｂ）前記樹脂を磁性ナノ粒子と接触させること；および（ｃ）前記樹脂を膨張させることを含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、前記樹脂を、温度を低下させることにより収縮させ、温度を上昇させることにより膨張させる。いくつかの実施形態では、溶媒の組成を変化させることにより、前記樹脂を収縮および膨張させる。
【００７７】
本開示の別の態様は、複数のピコウェルを含み、各ピコウェルが、（１）膜付着および単一細胞転写産物キャプチャーを可能にするように表面機能化されており；ならびに（２）前記ピコウェルの１つまたはそれを超える内壁に沈殿および／または固定化した単一細胞の内容物を含む、ピコウェルアレイを提供する。
【００７８】
本開示の別の態様は、単一細胞分析のために細胞を貯蔵する方法を提供し、この方法は、（ａ）ピコウェルアレイを提供すること、ここで、ピコウェルの大部分が、バーコード化転写産物キャプチャービーズをロードされており、（ｂ）前記アレイの表面を単一細胞懸濁液と接触させること、（ｃ）重力により細胞がピコウェルにロードすることを可能にすること、（ｄ）前記アレイを固定液に浸漬すること、および（ｅ）前記アレイを１日間またはそれを超えて貯蔵することを含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、前記ピコウェルアレイが、転写産物キャプチャーのために膜の付着を可能にするように機能化されている。
【００８０】
いくつかの実施形態では、固定後に前記アレイを乾燥させる。
【００８１】
本開示の別の態様は、０．１〜１００ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度および／または５０ｎｍ〜３ミクロンの孔径を有する第１の多孔質膜；ならびに第１の複数のスルーホールを有するドライフィルムフォトレジストを含む第１のボトムレスマイクロウェルアレイ
を含み、前記第１の多孔質膜が、前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの底面において前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイと接触し；前記アレイの各ウェルが、前記第１の複数のスルーホールの１つと、前記第１の多孔質膜を含む底面とを含む、ウェルアレイを提供する。
【００８２】
本開示の別の態様は、１５〜１００ミクロンの範囲の最大横寸法を有し、０．１〜１００ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度および／または５０ｎｍ〜３ミクロンの孔径を有する多孔質底部を有する第１のウェルアレイを含む、ドライフィルムフォトレジストを提供する。
【００８３】
本開示の別の態様は、（ａ）１〜５００ミクロンの範囲の最大横寸法を有する第２のボトムレスマイクロウェルアレイと、（ｂ）第１の多孔質膜とに結合した、１〜５００ミクロンの範囲の最大横寸法を有する第１のボトムレスマイクロウェルアレイを含むマイクロ流体デバイスを提供する。
【００８４】
本開示の別の態様は、複数のスルーホールを含むフリースタンディングフォトレジストフィルムを作製する方法を提供し、この方法は、第１のドライフィルムフォトレジストをフォトマスクとアライメントすること；前記フォトマスクを介して、前記第１のドライフィルムフォトレジストの少なくとも一部を紫外線（ＵＶ）光に曝露して、前記第１のドライフィルムフォトレジストに複数の第１スルーホールを形成し、それにより、複数のスルーホールを含む第１のフリースタンディングフォトレジストフィルムを生産することを含む。
【００８５】
本開示の別の態様は、本明細書に記載のウェルアレイ、ドライフィルムフォトレジスト、またはマイクロ流体デバイスのいずれかを介して、複数の細胞および／または複数のビーズを含む第１の流体を流し、それにより、細胞ロードおよび／またはビーズロードマイクロウェルアレイを形成することを含む、方法を提供する。
【００８６】
本開示の別の態様は、１５〜１００ミクロンの平均ウェル直径を有し、８０〜１０００ナノメートルの平均孔径を有する第１の多孔質膜に結合した第１のボトムレスマイクロウェルアレイを含むマイクロ流体デバイスを提供すること；前記マイクロ流体デバイスを介して、複数のビーズを含む第１の流体を流すこと；前記第１の多孔質膜に結合した第１のボトムレスマイクロウェルアレイを、１〜１０ミクロンの平均ウェル直径を有する第２のボトムレスマイクロウェルアレイに結合した８０〜１０００ナノメートルの平均孔径を有する第２の多孔質膜に結合させること；および前記マイクロ流体デバイスを介して、複数の細胞を含む第２の流体を流すことを含み、前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイのウェルの８０％が単一のビーズにより占有されている、方法を提供する。
【００８７】
本開示の別の態様は、１〜１０ミクロンの平均ウェル直径を有し、（ａ）１５〜１００ミクロンの平均ウェル直径を有する第２のボトムレスマイクロウェルアレイと、（ｂ）８０〜１０００ナノメートルの平均孔径を有する多孔質膜とに結合した第１のボトムレスマイクロウェルアレイを含むマイクロ流体デバイスを提供すること；前記マイクロ流体デバイスを介して、複数の細胞を含む第１の流体を流すこと；および前記マイクロ流体デバイスを、ビーズを含む第２の流体に曝露することを含む、方法を提供する。
【００８８】
本開示の別の態様は、生物学的サンプルを処理するための、ベースプレート、１つまたはそれを超える膜およびハイブリダイゼーションプレートを含むキットを提供する。ベースプレートは、その中に形成された複数のレセプタクルを有する表面を含んでもよく、各レセプタクルは、マイクロウェルアレイを収容するサイズおよび形状である。１つまたはそれを超える膜は、前記ベースプレートの表面に付着して、１つまたはそれを超える膜が前記複数のレセプタクルをカバーするようにアセンブリを形成するように構成され得る。ハイブリダイゼーションプレートは、ハイブリダイゼーションプレートと前記ベースプレートとの間に配置された前記１つまたはそれを超える膜を有する前記アセンブリに付着されるように構成され得る。別個のボリュームが、ハイブリダイゼーションプレートの内面と前記１つまたはそれを超える膜との間に形成され得、各ボリュームは、前記複数のレセプタクルの別個の１つに流体連結している。
【００８９】
本開示の別の態様は、（ａ）上面と、底面と、前記上面から前記底面への複数のスルーホールとを含むフォトレジストフィルムであって、各ホールが、前記上面上の上開口部と、前記底面上の底開口部とを有するフォトレジストフィルム、および（ｂ）前記フォトレジストフィルムの前記底面と接触した多孔質底部膜であって、１０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）の水の初期フラックス速度により測定した場合に、少なくとも０．１ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度を有する多孔質底部膜を含む、マイクロウェルデバイスを提供する。
【００９０】
本開示の別の態様は、（ａ）フォトレジストフィルムであって、（ｉ）上面と、底面と、（ｉｉ）強化部および未強化部とを含み、溶解剤と接触すると、前記未強化部が溶解して、前記上面から前記底面への複数のスルーホールを形成し、各ホールが、前記上面上の上開口部と、前記底面上の底開口部とを有し、前記上面、前記底面または両面の少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％または７５％が前記スルーホールによりカバーされ、前記強化部が前記溶解剤に対して実質的に耐性であるフォトレジストフィルム；ならびに（ｂ）フォトマスクであって、前記フォトマスクの最大特徴距離が２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８、０．７、０．６または０．５ｍｍ以下であり、前記フォトレジストフィルムの上面と接触し、その少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または全体をカバーするフォトマスクを含む、無基板二層ラミネートを提供する。
【００９１】
本開示の別の態様は、複数のスルーホールを含むフリースタンディングフォトレジストフィルムを製造する方法であって、（ａ）フォトマスクでフォトレジストフィルムをラミネートすること、ここで、前記フォトマスクが、複数の特徴と、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８、０．７、０．６または０．５ｍｍ以下の最大特徴距離とを有し、前記フォトマスクが、フォトレジストフィルムの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または全体をカバーし、（ｂ）前記フォトマスクを介して、前記フォトレジストフィルムを光源に、前記フォトレジストの強化部を作るために十分な時間にわたって曝露すること、（ｃ）前記フォトレジストフィルムを現像すること、および
（ｄ）前記フォトマスクから前記フォトレジストフィルムを分離し、それにより、前記複数のスルーホールを含む前記フリースタンディングフォトレジストフィルムを製造することを含む、方法を提供する。
【００９２】
本開示の別の態様は、細胞ローディングの方法であって、（ａ）（ｉ）上面と、底面と、前記上面から前記底面への複数のスルーホールとを含むボトムレスマイクロウェルアレイであって、各ホールが、前記上面上の上開口部と、前記底面上の底開口部とを有するボトムレスマイクロウェルアレイと、（ｉｉ）前記マイクロウェルアレイの前記底面と接触した多孔質底部膜であって、１０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）の水の初期フラックス速度により測定した場合に、少なくとも０．１ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度を有する多孔質底部膜とを含むマイクロアレイデバイスを介して、複数の細胞を含む流体サンプルを流すこと、（ｂ）前記複数のスルーホールの少なくとも１つの前記上開口部から前記底開口部に圧力勾配を適用し、それにより、単一細胞を前記少なくとも１つのスルーホールにロードすること、（ｃ）前記圧力勾配を適用することにより、前記細胞を前記少なくとも１つのスルーホールの底部に保持すること、（ｄ）前記細胞を保持している間に、前記マイクロウェルアレイを反転させること、（ｅ）前記反転マイクロウェルアレイを逆転させ、それにより、細胞を前記マイクロアレイの前記スルーホールにロードすることを含む方法を提供する。
【００９３】
本開示の別の態様は、単離された細胞を培養または貯蔵する方法であって、（ａ）（ｉ）上面と、底面と、前記上面から前記底面への複数のスルーホールとを含むボトムレスマイクロウェルアレイであって、各ホールが、前記上面上の上開口部と、前記底面上の底開口部とを有するボトムレスマイクロウェルアレイと、（ｉｉ）前記マイクロウェルアレイの前記底面と接触した多孔質底部膜であって、１０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）の水の初期フラックス速度により測定した場合に、少なくとも０．１ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度を有する多孔質底部膜とを含むマイクロアレイデバイスを介して、複数の細胞を含む流体サンプルを流すこと、（ｂ）重力により、または圧力勾配の適用により、前記複数の細胞の少なくとも１つの細胞を前記スルーホールにロードすること、（ｃ）前記マイクロウェルアレイの前記上面の上に多孔質上部膜を適用し、それにより、前記細胞を前記スルーホールに保持すること、および（ｄ）前記複数のスルーホールの少なくとも一部が、前記上部、前記底部または両開口部を介して培地と流体接続されるように、前記マイクロウェルアレイを前記培地に浸漬することを含む、方法を提供する。
【００９４】
本開示の別の態様は、組織切片を分析する方法であって、（ａ）前記組織切片を、マイクロアレイデバイスであって、（ｉ）上面と、底面と、前記上面から前記底面への複数のスルーホールとを含むボトムレスマイクロウェルアレイであって、各ホールが、前記上面上の上開口部と、前記底面上の底開口部とを有し、前記複数のスルーホールの少なくとも一部がバーコード化転写産物キャプチャービーズおよび機能表面を含むボトムレスマイクロウェルアレイと、（ｉｉ）前記マイクロウェルアレイの前記底面と接触した多孔質底部膜とを含むマイクロアレイデバイスと接触させること、ならびに（ｂ）前記ビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、前記転写産物からｃＤＮＡ配列を生成し、それにより、前記組織切片を分析することを含む、方法を提供する。
【００９５】
本開示の別の態様は、単一細胞分析キットであって、（ａ）上面と、底面と、前記上面から前記底面への複数のスルーホールとを含むフォトレジストフィルムであって、各ホールが、前記上面上の上開口部と、前記底面上の底開口部とを有するフォトレジストフィルムをそれぞれが含む１つまたはそれを超えるマイクロアレイ、および（ｂ）１０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）の水の初期フラックス速度により測定した場合に、少なくとも０．１ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度を有する少なくとも１つの多孔質乾燥膜を含む、単一細胞分析キットを提供する。
【００９６】
本開示のこれらのおよび他の態様および実施形態は、本明細書により詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】クラウディング試薬は、全トランスクリプトーム増幅産物収量を増加させる。異なる濃度の様々なポリ（エチレングリコール）サイズが、ハイブリダイゼーションバッファーおよび洗浄バッファーの両方に含まれていた。ＡＡＴＩフラグメントアナライザーを使用して、等数のバーコード化ビーズからの全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）産物収量を定量した。ＷＴＡは、最初にＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、次いでｃＤＮＡを増幅することにより、全トランスクリプトームの増幅を含む。ＡＡＴＩフラグメントアナライザーは、核酸濃度およびサイズ分布に関する詳細な情報を提供する。
【００９８】
【図２】第２鎖ｃＤＮＡタギングによる転写産物キャプチャーの改善。図２Ａ  ５’プライマータグを適用するための標準的なテンプレートスイッチング方法。図２Ｂ  新たな第２鎖ｃＤＮＡタギング方法。図２Ｃ  第２鎖ｃＤＮＡタギング（紫色；横線）またはテンプレートスイッチング（金色；縦線）を使用して、異なる細胞タイプから取得したユニークな転写産物および遺伝子の数のバイオリン図。
【００９９】
【図３】スペクトルバーコード化粒子。グリオキシル官能基化アガロースビーズを、５つの異なる蛍光標識ストレプトアビジン分子のコンビナトリアルな組み合わせで官能基化し、３１個のユニークなスペクトルバーコードを作製した。５つのスペクトルチャネルで標準的な落射蛍光顕微鏡法を使用して、ビーズをイメージングした。図３Ａ  スペクトルデータの二次元ｔ−ＳＮＥ削減の散布図。図３Ｂ  ５つのカラースペクトルバーコードを使用して正確に求められたビーズのパーセンテージ。
【０１００】
【図４】空間バーコードを含むオリゴヌクレオチドの実施形態の概略図。ｄＡ１７を短いまたは長いポリ（ｄＡ）配列で置き換え得る。ｍＲＮＡ転写産物をキャプチャーするように設計された場合、キャプチャービーズ上に存在するものなどのキャプチャーオリゴヌクレオチドは、ポリ（ｄＡ）配列に代えてポリ（ｄＴ）配列を含み得る。あるいは、それらは、キャプチャーすべき核酸（標的核酸としても公知）中の配列に相補的な別のキャプチャー配列を含み得る。
【０１０１】
【図５】ピコウェルアレイのＤＮＡマイクロアレイ媒介空間バーコード化。図５Ａ  二本鎖マイクロアレイ特徴の生成を示す概略図。図５Ｂ  トップダウンバーコード化アレイの概略図。図５Ｃ  ボトムアップバーコード化アレイの概略図。図５Ｄ  標識ＤＮＡマイクロアレイでシーリングしたピコウェルアレイの画像。
【０１０２】
【図６−１】ピコウェルアレイ中の個々のウェルへの化合物の送達。図６Ａ  インクジェットプリントを使用してピコウェルアレイに送達した材料の画像。図６Ｂ  粒子送達を使用した化合物の送達の概略図。図６Ｃ  デスチオビオチン−ストレプトアビジンおよびジチオール結合ビオチン：ストレプトアビジン結合を使用した、２つの化合物（ＦＩＴＣ標識オリゴおよびＡＦ５５５標識抗体）の制御非同期送達。
【図６−２】ピコウェルアレイ中の個々のウェルへの化合物の送達。図６Ａ  インクジェットプリントを使用してピコウェルアレイに送達した材料の画像。図６Ｂ  粒子送達を使用した化合物の送達の概略図。図６Ｃ  デスチオビオチン−ストレプトアビジンおよびジチオール結合ビオチン：ストレプトアビジン結合を使用した、２つの化合物（ＦＩＴＣ標識オリゴおよびＡＦ５５５標識抗体）の制御非同期送達。
【０１０３】
【図７】メンブレンアプリケーター。メンブレンアプリケーターの層の概略図。上から下へ：ＰＣ膜、ＰＶＡまたは塩、アクリルまたはガラス。
【０１０４】
【図８】プラスチッククランプの概略図。図８Ａ  組み合わせた３つの部材。図８Ｂ  内部空洞を有しないトップピース。図８Ｃ  ３つのネジ穴を有する矩形クランプ。図８Ｄ  アレイホルダーの底部。
【０１０５】
【図９】生細胞、またはアレイへのロード後に８０％メタノールで固定した細胞から取得した単一細胞ＲＮＡｓｅｑライブラリーのメトリック。図９Ａ．生細胞またはメタノール固定細胞由来の単一細胞の遺伝子発現シグネチャのヒートマップ。図９Ｂ  生細胞または固定細胞由来のライブラリーの細胞当たりの遺伝子。図９Ｃ  生細胞または固定細胞由来のライブラリーからの細胞当たりの転写産物。図９Ｄ  生細胞または固定細胞由来のライブラリーからの細胞当たりの％ミトコンドリア遺伝子。図９Ｅ  生細胞または固定細胞由来のライブラリーからの細胞当たりのシークエンシングリード。
【０１０６】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｅは、本明細書に記載される層状デバイスの概略図である。図１０Ａは、特定の非限定的な実施形態による、ウェルアレイ１００の断面概略図である。図１０Ｂは、特定の非限定的な実施形態による、ウェルアレイ１０００の断面概略図である。図１０Ｃは、特定の非限定的な実施形態による、ウェルアレイ８００の断面概略図である。図１０Ｄは、特定の非限定的な実施形態による、層状デバイス２００の断面概略図である。図１０Ｅは、特定の非限定的な実施形態による、層状デバイス３００（例えば、マイクロ流体デバイス）の断面概略図である。
【図１０Ｂ】同上。
【図１０Ｃ】同上。
【図１０Ｄ】同上。
【図１０Ｅ】同上。
【０１０７】
【図１１−１】図１１Ａおよび１１Ｂは、スルーホールを有するドライフィルムフォトレジストの画像である。図１１Ａは、直径５０ミクロンのスルーホールを有するドライフィルムフォトレジストである。図１１Ｂは、直径５ミクロンのスルーホールを有するドライフィルムフォトレジストである。
【図１１−２】図１１Ａおよび１１Ｂは、スルーホールを有するドライフィルムフォトレジストの画像である。図１１Ａは、直径５０ミクロンのスルーホールを有するドライフィルムフォトレジストである。図１１Ｂは、直径５ミクロンのスルーホールを有するドライフィルムフォトレジストである。
【０１０８】
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｄは、本明細書に記載される層状デバイスの断面概略図である。図１２Ａは、特定の非限定的な実施形態による、層状デバイス４００（例えば、マイクロ流体デバイス）の断面概略図である。図１２Ｂは、特定の非限定的な実施形態による、層状デバイス５００（例えば、マイクロ流体デバイス）の断面概略図である。図１２Ｃは、特定の非限定的な実施形態による、層状デバイス６００（例えば、マイクロ流体デバイス）の断面概略図である。図１２Ｄは、特定の非限定的な実施形態による、層状デバイス７００（例えば、マイクロ流体デバイス）の断面概略図である。
【図１２Ｂ】同上。
【図１２Ｃ】同上。
【図１２Ｄ】同上。
【０１０９】
【図１３−１】図１３Ａおよび図１３Ｂは、細胞ロードアレイの画像である。図１３Ａは、ドライフィルムフォトレジストから作製した細胞ロードアレイである。図１３Ｂは、ドライフィルムフォトレジストから作製し、ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  ｒｅｄで染色した細胞ロードアレイである。
【図１３−２】図１３Ａおよび図１３Ｂは、細胞ロードアレイの画像である。図１３Ａは、ドライフィルムフォトレジストから作製した細胞ロードアレイである。図１３Ｂは、ドライフィルムフォトレジストから作製し、ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  ｒｅｄで染色した細胞ロードアレイである。
【０１１０】
【図１４】図１４は、複数のマイクロウェルアレイを処理するために使用したキットの一実施形態の概略斜視図である。
【０１１１】
【図１５】図１５は、マイクロウェルアレイを支持するためのベースプレートの一実施形態の概略斜視図である。
【０１１２】
【図１６】図１６は、マイクロウェルアレイを支持するためのベースプレートの別の実施形態の概略斜視図である。
【０１１３】
【図１７】図１７は、メンブレンプレートの一実施形態の概略斜視図である。
【０１１４】
【図１８】図１８は、ハイブリダイゼーションプレートの一実施形態の概略斜視図である。
【０１１５】
【図１９】図１９は、ハイブリダイゼーションプレートの別の実施形態の概略斜視図である。
【０１１６】
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂは、本明細書に記載されるハイブリダイゼーションチャンバーの概略斜視図である。図２０Ａは、マイクロウェルアレイとの結合前のハイブリダイゼーションチャンバーの一実施形態の概略斜視図である。図２０Ｂは、サンプル収集中にマイクロウェルアレイに結合した図２０Ａのハイブリダイゼーションチャンバーの実施形態の概略斜視図である。
【０１１７】
【図２１】図２１は、ハイブリダイゼーションチャンバーの別の実施形態の概略斜視図である。
【０１１８】
【図２２】図２２は、サンプルを処理するためのワークフローの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１９】
発明の詳細な説明
本開示は、ピコウェルベースシステムおよび液滴ベースシステムを含むウェルベースまたは他の制限容量システムに関するハードウェアおよびアプリケーションの両方の改善を記載する。
【０１２０】
ピコウェルおよびピコウェルアレイは、多数の単一細胞または他の核酸源、例えば単一のウイルス、単一の核などの大規模並列分析を容易にする。しかしながら、これらのウェルの非常に小さなボリュームおよびそれらの対応するアレイの高密度は、このようなウェル試薬、核酸源、例えば細胞および／または細胞内容物、例えばｍＲＮＡ転写産物への送達および／またはそれらからの回収のための標準的な流体処理技術の使用を不可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるアレイ、例えば、ドライフィルムフォトレジストを含むアレイは、ピコウェルアレイ（これは、各ウェルに含まれるボリュームを指し、むしろウェルの直径および深さを特徴とする）と称されないと理解されよう。
【０１２１】
本開示は、部分的には、アレイ、例えばピコウェルおよび高密度ピコウェルアレイに関する改善を提供する。これらの改善としては、限定されないが、単一細胞からの核酸キャプチャーの改善、携帯性および使用容易性の改善、任意の所定のアッセイのスケーラビリティの増加、転写産物またはトランスクリプトーム情報とウェルで行われた他の測定または介入との関連付け、ならびにドライフィルムフォトレジストで作られたアレイの改善が挙げられ、これらは、以下でさらに詳細に記載されるように、製造および超ポアソンローディングにおけるスケーラビリティの増加を提供する。様々なこれらの改善はまた、非ウェルベースシステム、例えば液滴ベースシステムに適用され得ると理解されよう。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、ピコウェルは、約０．０１ピコリットル〜約１０００ピコリットルまたは約０．１ピコリットル〜１０００ピコリットル未満または約０．０１ピコリットル〜約５００ピコリットルの範囲のボリュームを含む１ピコリットル未満〜約１０，０００ピコリットルの範囲のボリュームを含むピコリットル範囲のボリュームを有するウェルを指す。範囲は、約１ピコリットル〜約１０００ピコリットルまたは約３ピコリットル〜約１０００ピコリットルまたは約３ピコリットル〜約５００ピコリットルまたは約３ピコリットル〜約１２５ピコリットルまたは約０．０５ピコリットル〜約１０００ピコリットルまたは約０．１ピコリットル〜約５００ピコリットルまたは約０．１ピコリットル〜約１２５ピコリットルであり得る。これらのウェルは、典型的には、ミクロンの範囲の寸法（例えば、ｘおよびｙまたは直径ならびに高さ寸法を有する。例えば、ウェルは、約４５ミクロン（ｘ）×約４５ミクロン（ｙ）×約６０ミクロン（ｈ）の寸法を有し得、長方形ボリュームを有し得るか、またはそれらは、約５０ミクロン（ｘ）×約５０ミクロン（ｙ）×約５０（ｈ）ミクロンの寸法を有し得、立方体ボリュームを有し得る。ウェルは、矩形または円形または楕円形である（トップダウン視点からの）断面積を有し得るが、これらのいずれにも限定されない。したがって、「マイクロウェル」または「ウェル」という用語が本開示で使用される程度に、このような用語は、ピコリットルまたはサブピコリットル（例えば、１フェムトリットル〜１０，０００ピコリットル）ボリュームを有するウェルを指すと理解すべきである。
【０１２３】
ピコウェルアレイは、約１０３〜約１０７個のウェル、約３×１０３〜約１０７個のウェル、約５×１０３〜約１０７個のウェル、約１０４〜約１０７個のウェル、約１０４または約５×１０４または約８×１０４〜約１０５または約５×１０５または約１×１０６または約５×１０６または約１×１０７個のウェルを含み得るので、「高密度」アレイと称される。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ウェルおよびウェルアレイは、Ｓｅｑ−ｗｅｌｌを実施するように機能化される。Ｓｅｑ−ｗｅｌｌアレイは、公開されている国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１７／１３７９１号（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。Ｓｅｑ−ｗｅｌｌでは、８０，０００個を超えるピコリットルウェルのアレイが、バーコード化転写産物キャプチャービーズと一緒に単一細胞を単離するために使用される。小分子および溶解バッファーの通過を可能にしながら、ｍＲＮＡなどの高分子の漏出およびしたがってクロスコンタミネーションを最小化するために、半多孔質膜を使用して、ウェルをシーリングする。これは、シーリングウェル内における細胞溶解、およびその結果としてＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーの生成を可能にする。これは、最初に、ウェルに存在するバーコード化ビーズ上の溶解細胞により放出されたｍＲＮＡ分子をキャプチャーすることにより達成される。キャプチャー後、ビーズ（およびしたがってウェル）のユニークなバーコードは、各単一細胞からｃＤＮＡライブラリーを作るプロセスにおいて、キャプチャーされたｍＲＮＡ転写産物からの逆転写を使用して合成された（したがって前記転写産物に相補的な）第１鎖ｃＤＮＡに組み込まれる。したがって、ビーズバーコードは、同じ単一細胞由来のすべてのキャプチャーされた転写産物を同一にマーキング（または標識）する。次いで、バーコード化ｃＤＮＡライブラリーは、その単一細胞起源に関してマーキングされた各ｃＤＮＡと組み合わせられ得、全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）および次いでシークエンシングを受け得る。いくつかの実施形態では、単一細胞トランスクリプトームは、同じビーズバーコードですべての転写産物を凝集させることにより、インシリコで回収される。
【０１２５】
ライブラリーは、例えば、約１００、１，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００または１，０００，０００個またはそれを超える細胞を含む複数の細胞由来の転写産物を含み得る。したがって、いくつかの場合におけるウェルアレイは、これらの細胞の並行分析を実施するために、これらの同じ数の細胞を収容するために十分な大きさである。
【０１２６】
本開示を考慮して、当業者は、様々な方法論を用いて、単一細胞により占有されるアレイ中のウェルの割合を増加させ、同時に、２つまたはそれを超える細胞により占有されるアレイ中のウェルの割合を減少させ得ると理解されよう。これを達成する１つの方法は、ウェルの大部分が細胞を有しないかまたは単一細胞を有するように、細胞懸濁液を希釈する（および同時にアレイに適用される絶対細胞数を減少させる）ことである。いくつかの場合では、ウェルの約５〜１５％は単一細胞により占有され、ウェルの１〜２％またはそれ未満は２つまたはそれを超える細胞により占有される。残りのウェルは、いかなる細胞によっても占有されない。同じアプローチは、限定されないが、ウイルス、核、エキソソーム、血小板などを含む、本開示の方法および製品を使用して分析され得る他の核酸源について採用され得ると認識されよう。
【０１２７】
本開示により提供される様々な改善は、以下により詳細に議論される。
【０１２８】
核酸（例えば、転写産物）回収を増加させるための方法
本開示のいくつかの態様は、単一細胞からキャプチャーされるユニークな転写産物の数を増加させることにより、単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーの質を改善することに関する。より高い細胞転写産物収量は、サンプル内のユニークな細胞集団を同定するための統計的検出力の増加を提供する。例えば、単一ウェルまたは液滴中の単一細胞または小さな細胞群からの転写産物キャプチャー収量を改善する方法が本明細書で提供される。これらの方法は、転写産物キャプチャー効率およびクラウディング試薬の使用を増加させる改善された第２鎖ｃＤＮＡタギング方法論を伴う。とりわけ、これらは、ウェルベースアッセイ、例えばＳｅｑ−ｗｅｌｌアッセイおよび液滴ベースシステムのパフォーマンスの改善に関連する。本開示は、いずれかまたは両方の方法が連続してまたは同時に使用され得ることを企図する。
【０１２９】
核酸（例えば、転写産物）キャプチャー効率を増加させるための第２鎖核酸（例えば、ｃＤＮＡ）のタギング／標識
ユニバーサルプライマー配列で核酸、例えば限定されないが、第２鎖ｃＤＮＡ分子を効率的にタギングする（例えば、核酸で標識するかまたは核酸にコンジュゲートする）ための改善された方法が本明細書で提供される。これらの方法は、単一の供給源、例えば単一細胞、単一の核、単一のウイルスなどに由来する核酸を同一に５’および３’標識するために使用され得る。核酸を同一に５’および３’標識するとは、同一のヌクレオチド配列を単一の供給源由来の複数の核酸の５’末端上に組み込むこと、および同一のヌクレオチド配列を単一の供給源由来の複数の核酸の３’末端上に組み込むことを意味する。しかしながら、５’および３’末端のヌクレオチド配列は同じものである必要はなく、ほとんどの場合において同じものではない。５’および３’ヌクレオチド配列が同じものではなくてもよい（典型的には、同じものではない）場合であっても、同一に５’および３’標識された核酸は、同じ５’ヌクレオチド配列および同じ３’ヌクレオチド配列を共有する。核酸を同一に５’および３’標識する利点は、このような核酸が比較的同様の効率で増幅および／またはシークエンシングされ得ることである。
【０１３０】
核酸間で共有される５’および３’ヌクレオチド配列は、５’および３’ユニバーサルプライマー配列（またはユニバーサルプライマーサイト。これらの用語は、本明細書では互換的に使用される）を最小限に含む。複数の核酸中の共通または共有の５’および３’ＵＰＳは、このような核酸が一緒にプールされる場合を含め、このような核酸の比較的非優先的な増幅および／またはシークエンシングを容易にする。このような核酸は、単一細胞などの単一の供給源に由来し得るか、またはそれらは、複数の細胞などの複数の異なる供給源に由来し得る。
【０１３１】
核酸間で共有される５’および／または３’ヌクレオチド配列は、バーコードを含み得る。バーコードは、特定の供給源からの核酸を標識および同定するために、ならびにこのような核酸を１つまたはそれを超える他の供給源由来の他の核酸と区別するために使用されるユニークな配列を指す。この文脈におけるバーコードは、それらの核酸の性質により、核酸バーコードと称され得る。本明細書で提供されるいくつかの場合では、バーコードは、単一細胞由来の核酸を標識し、同定し、１つまたはそれを超える他の細胞由来のものと区別するために使用される。このようなバーコードは、細胞特異的バーコードと称され得る。バーコードはまた、核酸を標識および同定して、同様に操作された細胞の集団と区別するために使用され得る。いくつかの場合では、２つまたはそれを超えるバーコードが使用され得、あるバーコードは細胞供給源を同定し、別のバーコードは操作を同定する。バーコードは、核酸の５’末端および／または３’末端に組み込まれ得る。例えば、バーコードは、ｃＤＮＡが合成されるプライマー配列にバーコードを含めることにより、第１鎖ｃＤＮＡ合成反応中に組み込まれ得る。次いで、バーコードは、第２鎖ｃＤＮＡおよびさらに子孫に組み込まれ得る。バーコードは既知の配列であり得る。バーコードはランダムであり得る。
【０１３２】
核酸間で共有される５’および／または３’ヌクレオチド配列は、キャプチャー部位またはドメイン（または標的結合部位。これらの用語は互換的に使用される）を含み得る。キャプチャードメインは、標的核酸中の配列に相補的なヌクレオチド配列（およびしたがって標的結合配列と称され得る）またはその相補配列を含む。このドメインは、標的核酸とハイブリダイズ（およびしたがってそれをキャプチャー）するように作用し、その後、第１鎖および第２鎖の核酸が生成され得る。キャプチャードメインは、ランダム、セミランダムまたは特異的（または標的化）配列を有し得る。特異的（または標的化）配列の例は、ｍＲＮＡ転写産物のポリ（ｄＡ）配列とハイブリダイズするポリ（ｄＴ）配列である。特異的（または標的化）配列の他の例は、転写産物、特定の転写産物または特定の核酸クラスにおける公知の保存されたヌクレオチド配列に相補的な配列である。キャプチャードメインが第１鎖または第２鎖核酸に存在するかに応じて、キャプチャー配列は、標的核酸中の対応する配列に相補的であるかまたはそれと同一であると理解されよう。
【０１３３】
図２Ｂは、ｍＲＮＡキャプチャーならびに第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成の文脈における標的核酸の５’および３’標識の一実施形態を示す。最初に、ｍＲＮＡは、ビーズに結合したキャプチャーオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによりキャプチャーされる。キャプチャーオリゴヌクレオチドは、ＵＰＳおよびキャプチャードメインを最小限に含み、バーコード配列を必要に応じて含み得る。例として、キャプチャーオリゴヌクレオチド配列は、ビーズ５’−ＵＰＳ−バーコード−キャプチャードメイン−３’からのものであり得る。標的核酸はｍＲＮＡ転写産物であるので、ｍＲＮＡのポリ（ｄＡ）テールにハイブリダイズするために、キャプチャードメインはポリ（ｄＴ）配列を有し得る。標的ｍＲＮＡ転写産物は、キャプチャードメインを介してキャプチャーオリゴヌクレオチドに結合し、次いで、逆転写のプロセスを通じて、キャプチャーオリゴヌクレオチドから第１鎖ｃＤＮＡが合成される。このようにして、第１鎖ｃＤＮＡは、５’ＵＰＳ、バーコード、キャプチャードメイン、およびｍＲＮＡ標的の相補配列を含む。
【０１３４】
次いで、第２鎖ｃＤＮＡ合成は、第１鎖ｃＤＮＡを、それぞれが５’ＵＰＳおよびキャプチャードメインを有する１つまたはそれを超える他のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることにより行われる。これらのオリゴヌクレオチドは、「第２鎖プライミングオリゴヌクレオチド」と称され得る。図２Ｂでは、それらは、ＵＰＳタグ付きランダマーと称される。キャプチャードメインは、ランダム、セミランダムまたは特異的（標的化）配列を含み得る。このオリゴヌクレオチドの例は、配列ＮＮＮＧＧＮＮＮＢを有するものとして図２Ｂに示されている。ＧＧモチーフは、自己ハイブリダイゼーションおよびポリ（ｄＴ）／ユニバーサルプライマーへの結合を防止する。図に示されているオリゴヌクレオチドは、そのキャプチャー配列がランダムであり、ｍＲＮＡ転写産物にランダムに結合するように設計されていることを意図して、ランダマーと称される。ＤＮＡポリメラーゼの添加により、オリゴヌクレオチドは、次の隣接オリゴヌクレオチドまたは第１鎖のｃＤＮＡの末端に到達するまで伸長される。それは、最も興味深い第１鎖ｃＤＮＡの末端に最も近接して位置する第２鎖核酸であり、それらは、５’および３’ＵＰＳの両方と、必要に応じて５および／または３’バーコード（これは、ランダム配列バーコードならびに／または必要に応じて５’および／もしくは３’キャプチャー配列であり得る）とを組み込むであろう。
【０１３５】
さらに、標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ転写産物）がビーズ上にキャプチャーされたら、手順の残りの工程は、ウェル（または液滴）中またはウェル外で実施され得ると理解すべきである。特に、第２鎖合成工程は、典型的には、複数のウェルまたは複数の液滴からの内容物のプール後に溶液中で実施される。細胞特異的転写産物は、共有結合的に付着した第１鎖核酸（例えば、第１鎖ｃＤＮＡ）を介してビーズに既に共有結合的に付着しているので、ウェルまたは液滴などの制限容量の外でこの工程を行うことが可能である。第２鎖合成は、例えば、ピコウェルアレイからのすべてのウェルを含む複数のウェルまたは液滴からのビーズを使用して、単一の反応ボリュームで実施され得る。
【０１３６】
前記方法を使用して、複数の細胞からｍＲＮＡ転写産物をキャプチャーする場合、生成される第２鎖ｃＤＮＡの一部は、同じ５’ＵＰＳおよび同じ３’ＵＰＳを有するであろう。したがって、これらの「同一に」標識された一本鎖核酸は、同じプライマーを使用して増幅され得、および／または同じプライマーを使用してシークエンシングされ得る。
【０１３７】
したがって、いくつかの場合では、前記方法は、ユニバーサルプライマー配列で第２鎖ｃＤＮＡをタギング（または標識）して、全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）を可能にする。利用可能なＲＮＡの量が限定的であるので、単一または少数の細胞から生成されたｃＤＮＡライブラリーは、シークエンシング前にＰＣＲ増幅されなければならない。ＰＣＲ増幅は、増幅すべき配列に隣接する公知のプライマー結合部位を必要とする。ＷＴＡの場合、典型的には、ユニバーサルプライマーサイトがｃＤＮＡの両側に付加される。上記のように、ユニバーサルプライマーサイトは、標的ＲＮＡを、キャプチャー配列、例えばポリ（ｄＴ）配列の５’側にユニバーサルプライマー配列を含有するオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、次いで、逆転写を実施して、その５’末端にユニバーサルプライマー配列を有する第１鎖ｃＤＮＡを得ることにより、第１鎖ｃＤＮＡの５’末端に容易に付加される。
【０１３８】
しかしながら、ｃＤＮＡの他の末端へのユニバーサルプライマー配列の付加は、これまでは困難であった。本明細書では、本発明者らは、この第２のユニバーサルプライマーサイトを効率的に付加するための方法論を提供する。
【０１３９】
現在の最先端技術は、テンプレートスイッチング逆転写反応、第１ｃＤＮＡ鎖のポリ（ｄＡ）テーリング、または二本鎖ｃＤＮＡへのライゲーションを利用して、第２のユニバーサルサイトを付加するが、テンプレートスイッチング（図２Ａ）が最も一般的な手順である。テンプレートスイッチングは、いくつかの逆転写酵素のｄＣテーリング活性を利用して、逆転写反応中に第１鎖ｃＤＮＡの末端にユニバーサルポリ（ｄＣ）部位を生成し、これは、ポリ（ｄＧ）トラクトの５’側にユニバーサルプライマーサイトを含有するテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドにより結合される。次いで、逆転写酵素は、ｃＤＮＡのポリ（ｄＣ）テールから伸長し、ユニバーサルプライマーサイトを第１鎖ｃＤＮＡの３’末端に付加する。簡便であるが、テンプレートスイッチングは非効率的であり、ＲＮＡ全体の逆転写を必要とし、より短いＲＮＡ分子が好ましい。
【０１４０】
第２のユニバーサルプライマーサイトを第１鎖ｃＤＮＡの３’末端に付加する代わりに、本発明者らは、第２鎖合成中に第２のプライマーサイトを付加する方法を考案した。これは、少なくとも上記のように、および図２Ｂに示されているように達成され得る。その５’末端にユニバーサルプライムサイトを含有する第１鎖ｃＤＮＡから開始して、第２鎖は、標的結合（またはキャプチャー）配列の５’側にユニバーサルプライマー配列を含有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズおよび伸長させることにより合成される。標的結合配列は、ランダムプライマー配列であり得るか、またはそれは、標的化プライマー配列であり得る。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは、５’−３’および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を欠くもの、例えばクレノウｅｘｏ−、ＢｓｕラージフラグメントまたはＢｓｔラージフラグメントを使用して伸長される。図２Ｃは、標準的なテンプレートスイッチングアプローチおよび本開示の第２鎖合成アプローチを使用した、様々な細胞タイプに関する細胞当たりの転写産物収量の比較を示す。示されているように、第２鎖合成アプローチは、テンプレートスイッチング反応と比較して、細胞当たりの転写産物収量を５〜１０倍増加させる（図２Ｃ）。例えば、図２Ｃに示されているように、ＵＭＩの数（例えば、個々の転写産物の数）および同定された遺伝子の数は両方とも、テンプレートスイッチング反応と比べて大幅に増加した。
【０１４１】
ＳｅｑＷｅｌｌの場合のように第１鎖合成がビーズ結合オリゴヌクレオチドによりプライミングされる場合に、第２鎖核酸、例えばＤＮＡまたはｃＤＮＡに両プライマーサイトを有することのさらなる利益は、第２鎖がバーコード化ビーズ表面に共有結合的に連結されず、限定されないが、増幅（例えば、ＰＣＲ）などのその後の操作の前に、ビーズ表面からのタグ付き第２鎖核酸、例えばＤＮＡまたはｃＤＮＡのより容易な分離が可能になることである。ビーズからの非共有結合的に付着した第２鎖の分離は、限定されないが、簡便な塩基媒介ＤＮＡ変性を含む任意の手段により達成され得る。これは、ＷＴＡ増幅のための単一のＰＣＲ反応の使用と、サンプルバンキングのためのバーコード化ビーズの保持とを可能にする。
【０１４２】
従来技術の方法では、ビーズ表面の非効率なプライミング、および過度に高い濃度で存在する場合にはビーズによるＰＣＲ反応の「中毒」のために、ＷＴＡ反応を約４０個の反応／アレイに分割して、第２鎖核酸、例えばｃＤＮＡの効率的な増幅を確保しなければならなかった。加えて、ＰＣＲサイクルの後、典型的には、ビーズは廃棄された。ＷＴＡ増幅はライブラリー調製の半額であるので、第２鎖タギングは、ライブラリー調製のコストも有意に削減するはずである。
【０１４３】
上記のように、本開示の第２鎖ＤＮＡ合成方法はまた、指向性ライブラリーを生成するために使用され得る。第１鎖ｃＤＮＡ分子の所望のセットに特異的な標的結合配列（キャプチャー配列）を有する第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドのプールは、目的の転写産物を含有するシークエンシングライブラリーを生成するために使用され得る。あるいは、ｃＤＮＡ分子のセットに特異的な標的結合配列（キャプチャー配列）を含有するがユニバーサルプライマー配列を欠くオリゴヌクレオチドは、ユニバーサルプライマー配列および標的結合配列（キャプチャー配列）の両方を含有するプローブと併せて使用される場合、ライブラリーから標的ｃＤＮＡ分子を枯渇させるために使用され得る。最後に、同じ標的結合配列（キャプチャー配列）を含有し、ユニバーサルプライマー配列を欠くまたは含む２つのオリゴヌクレオチドの混合物は、２つのオリゴヌクレオチドの比に基づいて、高発現されるｃＤＮＡ分子の濃度を定量的に正規化するために使用され得、例えば、ユニバーサルプライマーサイトを含むオリゴヌクレオチドと、前記サイトを欠くオリゴヌクレオチドとの比が１：３である場合、所定のｃＤＮＡの４コピーのうちの１コピーのみがユニバーサルプライマー配列でタギングされ、増幅されるであろう。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「ユニバーサルプライマーサイト」は、プライマー結合の目的のために核酸分子に導入された外因性プライマー結合部位である。ユニバーサルプライマーサイトの例としては、ｐ５およびｎｅｘｔｅｒａが挙げられる。「ユニバーサルプライマーサイト」および「ユニバーサルプライマー配列」という用語は互換的に使用されると理解すべきである。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、５’ユニバーサルプライマーサイトは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長、例えば１０〜３０または１５〜２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、３’ユニバーサルプライマーサイトは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長、例えば１０〜３０または１５〜２５ヌクレオチド長である。５’および３’末端のユニバーサルプライマーサイトは同じものであり得るか、またはそれらは異なるものであり得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、標的結合部位（または標的結合配列またはキャプチャー部位、配列もしくはドメイン。これらの用語は互換的に使用される）はランダマーであり、例えば、特定の核酸、例えばｃＤＮＡ分子中の配列に相補的ではない（例えば、図２ＢのＵＰＳタグ付きランダマーを参照のこと）。いくつかの実施形態では、標的結合部位の配列はセミランダムである。いくつかの実施形態では、標的結合部位の配列は、特定の核酸、例えばｃＤＮＡ分子中の配列に相補的であり、所望の核酸、例えばｃＤＮＡ分子の標的化タギングを可能にする。いくつかの実施形態では、標的結合配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド長、例えば５〜１５または７〜１２ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、異なる標的結合部位を有する複数のオリゴヌクレオチドは、所望のｃＤＮＡ分子の標的化ライブラリーを作製するために使用される。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、５’ユニバーサルプライマーサイトを有する第１鎖核酸、例えばｃＤＮＡを、標的結合配列の上流にユニバーサルプライマーサイトを含むオリゴヌクレオチドと接触させることは、５’ユニバーサルプライマーサイトを有する第１鎖核酸、例えばｃＤＮＡを、標的結合部位において標的結合配列の上流にユニバーサルプライマーサイトを含むオリゴヌクレオチドとアニーリングさせる（またはハイブリダイズさせる）ことを含む（例えば、図２Ｂを参照のこと）。いくつかの実施形態では、標的結合部位は、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃または６５℃で、５’ユニバーサルプライマーサイトを有する第１鎖核酸、例えばｃＤＮＡにアニーリングされる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、５’ユニバーサルプライマーサイトを有する第１鎖核酸、例えばｃＤＮＡは、ユニバーサルプライマーサイトの５’側のビーズに付着される。従来の共有結合的連結方法論は、キャプチャーオリゴヌクレオチドおよびしたがって最終的には第１鎖核酸をビーズに付着させるために使用され得る。例えば限定されないが、ビオチン−ストレプトアビジンなどの親和性結合ペアを含む、十分な強度の任意の共有結合的または非共有結合的付着手段が使用され得る。いくつかの実施形態では、ビーズは、転写産物キャプチャービーズである。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「キャプチャービーズ」は、その表面に付着したキャプチャーオリゴヌクレオチドを有するビーズを含み、そしてこれが、標的転写産物などの標的核酸にアニーリングするためのキャプチャードメイン、部位または配列を含む。標的核酸が転写産物である場合、ビーズは、「転写産物キャプチャービーズ」と称され得る。いくつかの実施形態では、転写産物キャプチャービーズは、ｍＲＮＡ転写産物のポリ（ｄＡ）テールにアニーリングするためのポリ（ｄＴ）キャプチャー配列を有する。上記のように、いくつかの実施形態では、キャプチャーオリゴヌクレオチドは、バーコードをさらに含む。バーコードは、単一細胞のすべてのキャプチャーされた転写産物を含む、単一細胞由来のすべてのキャプチャーされた核酸を標識するために使用され得る。これは、転写産物キャプチャービーズおよび単一細胞が同じウェルに入れられ、細胞が溶解されると達成され得る。バーコードは、単一細胞（または単一のウェル）由来の核酸を標識するために使用され得るか、またはそれは、複数の細胞（または複数のウェル）由来の核酸を標識するために使用され得る。この後者の実施形態では、バーコードは、細胞（またはウェル）に対して行われる特定の操作を表すために使用され得る。
【０１５０】
キャプチャービーズのサイズは、典型的には、使用されるウェルまたは液滴のサイズにより決定されるであろう。いくつかの実施形態では、ビーズのサイズは、１つのビーズのみが単回でウェルまたは液滴を占有し得るように選択されるであろう。あるいは、ウェルまたは液滴の寸法は、１つのビーズのみが単回でウェルまたは液滴を占有し得るように選択され得る。いくつかの実施形態では、キャプチャービーズは、１μｍ、５μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１５０μｍまたは２００μｍの直径である。いくつかの実施形態では、転写産物キャプチャービーズは、１０μｍ〜５０μｍの直径である。いくつかの実施形態では、ビーズは、約３５ミクロンの直径である。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、「バーコード」は、識別子として使用されるヌクレオチド配列を指す。いくつかの場合では、それは、条件（例えば、ウェルおよびしたがって細胞が供される条件）、アレイ上の物理的位置または単一の核酸源、例えば単一細胞を同定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、バーコードは、核酸または核酸のセット（例えば、転写産物または転写産物のセット）が同じ細胞由来のものであるとして同定する。いくつかの実施形態では、バーコードは、核酸または核酸のセット（例えば、転写産物または転写産物のセット）が、特定の空間的位置に、または必要に応じてその位置における特定の処置もしくは操作に関連するものであるとして同定する。例えば、いくつかの実施形態では、バーコードは、核酸または核酸のセット（例えば、転写産物または転写産物のセット）が特定の刺激への曝露に関連するものであるとして同定する。いくつかの実施形態では、バーコードは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド、例えば１０〜３０ヌクレオチド長である。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、キャプチャー配列は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５または３０ヌクレオチドを含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、キャプチャーオリゴヌクレオチドは、約１０、２０、３０、４０または５０ヌクレオチドを含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡは、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃または６５℃で、そのキャプチャー配列にアニーリングする。キャプチャーオリゴヌクレオチドを標的核酸に、および／または第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドを第１鎖核酸にアニーリングさせる（ハイブリダイズさせる）ための条件は、特定のヌクレオチド配列に依存し得るが、それにもかかわらず、当業者により決定され得る。本開示の方法は、このようなオリゴヌクレオチドが、ビーズに付着したキャプチャーオリゴヌクレオチドまたは第２鎖プライミングオリゴヌクレオチドであるかにかかわらず、標的核酸および第１鎖核酸がそれらの各相補的オリゴヌクレオチドに比較的等しくハイブリダイズされることを提供する。
【０１５５】
前述の方法は、単一細胞由来のＲＮＡ転写産物をキャプチャーするために使用され得るので、限定されないが、Ｓｅｑ−ｗｅｌｌ、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ、ＩｎＤｒｏｐおよび１０ＸＧｅｎｏｍｉｃｓなどの技術に適用可能であると理解すべきである。しかしながら、これらの方法はより広い適用可能性を有し、このような核酸がキャプチャーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ得、第２鎖核酸が形成される第１鎖核酸を生成するために使用され得る限り、核酸源由来の他の核酸をキャプチャーするために使用され得る。
【０１５６】
核酸源は、目的の核酸を含む供給源である。これらとしては、細胞、ウイルス、核、エキソソーム、体液およびそれらの沈殿物などが挙げられる。本明細書で提供される方法では、事実上任意の核酸源が使用され得る。
【０１５７】
本発明の文脈では、「オリゴヌクレオチド」は、多連結ヌクレオチド（すなわち、ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））またはプリン（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである交換可能な有機塩基に連結された糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を指す。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えばＤ型ＤＮＡおよびＬ型ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにそれらの様々な改変を含む。修飾としては、塩基修飾、糖修飾および骨格修飾が挙げられる。これらの非限定的な例は以下に示されている。
【０１５８】
本発明において使用され得るＤＮＡ変異体の非限定的な例は、Ｌ−ＤＮＡ（文献で公知のＤＮＡの骨格エナンチオマー）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ｂｉｓＰＮＡクランプ、偽相補的ＰＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）または上記の共核酸、例えばＤＮＡ−ＬＮＡ共核酸である。本発明の製品および方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、均一または不均一の性質であり得ると理解すべきである。一例として、それらは、完全にＤＮＡの性質であり得るか、またはそれらは、ＤＮＡおよび非ＤＮＡ（例えば、ＬＮＡ）モノマーもしくは配列から構成され得る。したがって、核酸エレメントの任意の組み合わせが使用され得る。オリゴヌクレオチド修飾は、オリゴヌクレオチドを特定の条件下でより安定性および／またはより低分解性にし得る。例えば、いくつかの場合では、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性である。
【０１５９】
オリゴヌクレオチドは、均一な骨格（例えば、完全にホスホジエステルまたは完全にホスホロチオエート）または不均一な（またはキメラ）骨格を有し得る。ホスホロチオエート骨格修飾は、オリゴヌクレオチドを特定の条件下で（ネイティブなホスホジエステル骨格の核酸と比較して）よりヌクレアーゼ低感受性およびしたがってより安定性にする。より多くの安定性をオリゴヌクレオチドに提供し得る他の結合としては、限定されないが、ホスホロジチオエート結合、メチルホスホネート結合、メチルホスホロチオエート結合、ボラノホスホネート結合、ペプチド結合、アルキル結合、デホスホ型結合などが挙げられる。したがって、いくつかの場合では、オリゴヌクレオチドは、天然に存在しない骨格を有する。
【０１６０】
オリゴヌクレオチドはインビトロで合成され得る。自動化核酸合成を含む核酸を合成するための方法も当技術分野で公知である。ホスホロチオエート結合を含む骨格などの修飾骨格を有するオリゴヌクレオチド（キメラ修飾骨格を含むものを含む）は、ホスホルアミデートまたはＨホスホネート化学のいずれかを用いた自動化技術を使用して合成され得る（Ｆ．Ｅ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９９１およびＭ．Ｄ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２１，７１９（１９８０））。アリールおよびアルキルホスホン酸結合は、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されているように作製され得；例えば、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許出願第０９２，５７４号に記載されている（荷電酸素部分がアルキル化された）アルキルホスホトリエステル結合は、市販の試薬を使用した自動化固相合成により調製され得る。他のＤＮＡ骨格修飾および置換を行うための方法が記載されている。Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅら、（１９９０）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １：１６５；Ｃｒｏｏｋｅ  ＳＴら、（１９９６）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３６：１０７−１２９；およびＨｕｎｚｉｋｅｒ  Ｊら、（１９９５）Ｍｏｄ  Ｓｙｎｔｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７：３３１−４１７。
【０１６１】
加えてまたはあるいは、オリゴヌクレオチドは、それらの糖に修飾を含み得る。例えば、β−リボース単位またはβ−Ｄ−２’−デオキシリボース単位は、修飾糖単位で置き換えられ得、修飾糖単位は、例えば、β−Ｄ−リボース、α−Ｄ−２’−デオキシリボース、Ｌ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−２’−デオキシリボース、アラビノース、２’−Ｆ−アラビノース、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−リボースから選択され、好ましくは、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−リボースは、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−（Ｃ２Ｃ６）アルケニル−リボース、２’−［Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］−リボース、２’−ＮＨ２−２’−デオキシリボース、β−Ｄキシロ−フラノース、αアラビノフラノース、２，４ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ヘキソ−ピラノースならびに（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  Ｊ（１９９２）Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １１４：８３２０に記載されている）炭素環式および／または（例えば、Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅら、（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：７２２３に記載されている）開鎖糖類似体および／または（例えば、Ｔａｒｋｏｖ  Ｍら、（１９９３）Ｈｅｌｖ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ７６：４８１に記載されている）ビシクロ糖類似体である。
【０１６２】
オリゴヌクレオチドは、それらの塩基に修飾を含み得る。修飾塩基としては、修飾シトシン（例えば、５−置換シトシン（例えば、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−クロロ−シトシン、５−ブロモ−シトシン、５−ヨード−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、５−ジフルオロメチル−シトシンおよび非置換または置換５−アルキニル−シトシン）、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン（例えば、Ｎ４−エチル−シトシン）、５−アザ−シトシン、２−メルカプト−シトシン、イソシトシン、シュード−イソシトシン、縮合環系を有するシトシン類似体（例えば、Ｎ，Ｎ’−プロピレンシトシンまたはフェノキサジン）およびウラシルおよびその誘導体（例えば、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ブロモビニル−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−ヒドロキシ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル）、修飾グアニン、例えば７デアザグアニン、７デアザ７置換グアニン（例えば、７デアザ７（Ｃ２Ｃ６）アルキニルグアニン）、７デアザ８置換グアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２−置換グアニン（例えば、Ｎ２−メチル−グアニン）、５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６ジアミノプリン、２アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン（例えば、Ｎ６−メチル−アデニン、８−オキソ−アデニン）、８置換グアニン（例えば、８ヒドロキシグアニンおよび８ブロモグアニン）および６チオグアニンが挙げられる。核酸は、ユニバーサル塩基（例えば、３−ニトロピロール、Ｐ−塩基、４−メチル−インドール、５−ニトロ−インドールおよびＫ−塩基）および／または芳香環系（例えば、フルオロベンゼン、ジフルオロベンゼン、ベンズイミダゾールまたはジクロロ−ベンズイミダゾール、１−メチル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−カルボン酸アミド）を含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る特定の塩基対は、Ｙａｎｇら、ＮＡＲ，２００６，３４（２１）：６０９５−６１０１により報告されているｄＺおよびｄＰ非標準核酸塩基対である。ピリミジン類似体であるｄＺは、６−アミノ−５−ニトロ−３−（１’−β−Ｄ−２’−デオキシリボフラノシル）−２（１Ｈ）−ピリドンであり、プリン類似体であるそのワトソン・クリック補体ｄＰは、２−アミノ−８−（１’−β−Ｄ−１’−デオキシリボフラノシル）−イミダゾ［１，２−ａ］−１，３，５−トリアジン−４（８Ｈ）−オンである。
【０１６３】
本明細書に記載される「プローブ」および「プライマー」は、オリゴヌクレオチドを含む。それらは、全体的または部分的に核酸であり得る。それらは、天然に存在するヌクレオチドおよび／または天然に存在しないヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドに配列特異的にハイブリダイズすることができ、および／またはいくつかの場合では標識にコンジュゲートされることができる限り、それらは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ類似体、ＲＮＡ類似体、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびそれらの組み合わせであり得るかまたはそれらを含み得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマーは、アデニン、チミン、グアニンおよびシトシンを含む。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマーは、チミンに代えてウラシルを含む。
【０１６５】
プローブまたはプライマーは、標的と少なくともワトソン・クリック結合を形成し得る。他の場合では、プローブまたはプライマー、例えばプローブは、標的とフーグスティーン結合を形成し、それにより、三重鎖を形成し得る。フーグスティーン結合により結合するプローブまたはプライマーは、核酸の主溝に入り、そこに位置する塩基とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマーは、標的とワトソン・クリックおよびフーグスティーン結合の両方を形成し得る。例えば、ＢｉｓＰＮＡプローブは、核酸とワトソン・クリックおよびフーグスティーン結合の両方をすることができる。
【０１６６】
プローブまたはプライマーは、限定されないが、８〜１００ヌクレオチド、８〜７５ヌクレオチド、８〜５０ヌクレオチド、８〜３０ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、および本明細書に明示的に記載されるかのようにそれらの間のあらゆる整数を含む任意の長さであり得る。
【０１６７】
プローブまたはプライマーは、好ましくは一本鎖であるが、それらはそのように限定されない。例えば、プローブまたはプライマーがｂｉｓＰＮＡである場合、それは、標的と二次構造を採用し、三重ヘリックスコンフォメーションをもたらし得、ｂｉｓＰＮＡのある領域は、識別子配列の骨格とフーグスティーン結合を形成し、ｂｉｓＰＮＡの別の領域は、標的の塩基とワトソン・クリック結合を形成する。
【０１６８】
ハイブリダイゼーションを介した標的へのプローブまたはプライマーの結合は、ハイブリダイゼーション条件に基づいて操作され得る。例えば、塩濃度および温度はモジュレートされ得る。当業者は、所望の特異性のための最適条件を決定することができるであろう。いくつかの実施形態では、完全に相補的なプローブまたはプライマーのみが標的に結合するように、ハイブリダイゼーション条件はストリンジェントである。他の実施形態では、ストリンジェント未満の条件が使用される。
【０１６９】
核酸ハイブリダイゼーションの文脈で使用される場合、配列依存的結合は、核酸中のヌクレオチドの特定の線形配置の認識およびそれへの結合を意味する。プローブおよびプライマーの場合、線形配置は、プローブおよびプライマー中の対応する相補的ヌクレオチドにそれぞれ結合する隣接ヌクレオチドを含む。
【０１７０】
本明細書に記載されるプローブおよびプライマーは、典型的には、ストリンジェントな条件下でそれらの標的核酸にハイブリダイズする。本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな条件」という用語は、当技術分野でよく知られたパラメータを指す。核酸ハイブリダイゼーションのパラメータは、このような方法を集めた参考文献、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｅｄｓ．，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０１２またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに見られ得る。より具体的には、本明細書で使用される場合、ストリンジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーションバッファー（３．５×ＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、６５℃のハイブリダイゼーションを指す。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７であり；ＳＤＳは、ドデシル硫酸ナトリウムであり；ＥＤＴＡは、エチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写された膜を、例えば、２×ＳＳＣで室温で洗浄し、次いで、０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで最大６８℃の温度で洗浄する。
【０１７１】
同様の程度のストリンジェンシーをもたらす使用され得る他の条件、試薬などがある。当業者はこのような条件を熟知するので、それらは本明細書に示されていない。しかしながら、当業者は、本発明の核酸へのプローブおよび／またはプライマーの特異的かつ選択的なハイブリダイゼーションを可能にするように（例えば、より低いストリンジェンシー条件を使用することにより）条件を操作することができると理解されよう。
【０１７２】
核酸（例えば、転写産物）キャプチャー効率を増加させるクラウディング試薬
核酸キャプチャー効率を増加させる（すなわち、単一の核酸源当たりの、例えば細胞当たりの核酸キャプチャーの数を増加させる）ための別のアプローチは、クラウディング試薬の使用を伴う。
【０１７３】
クラウディング試薬は、本明細書に記載される機能の１つまたはそれよりも多くを有する任意の化合物（例えば、生物学的または合成ポリマー）である。それは、下記のように、核酸キャプチャー効率を増加させる様々な方法で機能し得る。クラウディング試薬は、膜とアレイとの間の電荷相互作用に干渉しない両性イオン剤または中性荷電剤であり得る。クラウディング試薬の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、１０００Ｄａまたはそれを超える分子量を有する。クラウディング試薬の他の例としては、限定されないが、デキスタン、フィコール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびスクロースが挙げられる。
【０１７４】
したがって、本明細書に記載されるプロセスの複数の工程においてクラウディング試薬を含めることにより、細胞当たりの核酸（例えば、転写産物）キャプチャー率を増加させる方法が本明細書で提供される。クラウディング試薬は、例えば、キャプチャービーズへの核酸（例えば、ｍＲＮＡ）結合中に、アレイからの除去前または後の核酸結合ビーズの洗浄中に、オープンウェルまたはバルクにかかわらず第１鎖核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を生成するための結合核酸（例えば、ＲＮＡ）の逆転写、およびビーズ上の第２鎖核酸（例えば、ｃＤＮＡ）の合成に使用され得る。
【０１７５】
クラウディング試薬が転写産物収量を増加させる機構は、試薬が使用される際に応じて変動する。
【０１７６】
いくつかの工程では、クラウディング試薬は、溶液中の有意な割合の溶媒分子に関連するかまたはそれに影響を及ぼし、それにより、溶液中の溶質の濃度を有効に増加させる。いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、クラウディング試薬は、溶質の周囲の溶媒を無秩序化し、それにより、エントロピーを増加させる可能性があり、これが、この用語が当技術分野で理解されているように分子クラウディングをもたらす。
【０１７７】
メンブレンシーリングウェルにおけるＲＮＡハイブリダイゼーション中に、クラウディング剤は、サイズ排除により半多孔質膜を透過し得ず、それにより、ウェル（例えば、ピコウェル）にシーリングされた溶液のより低い浸透圧のために、膜に対して内向きの力が確立される。この内向きの力は、膜によるウェルのより良好なシーリングをもたらし、それにより、ウェル内容物の喪失が減少し、クロスコンタミネーションが減少する。ビーズの洗浄および逆転写中に、クラウディング試薬は、ビーズ結合ＲＮＡの解離速度定数を減少させ、それにより、ｃＤＮＡに逆転写される分子の数を増加させる。最後に、第２鎖ｃＤＮＡ合成反応においてクラウディング試薬を含めることにより、第２鎖プライミングオリゴヌクレオチド（例えば、図２Ｂのランダマー）のハイブリダイゼーション率が増加し、第２鎖ｃＤＮＡの量が大きく増加する。
【０１７８】
様々なＰＥＧタイプを使用した転写産物キャプチャー収量は、クラウディング剤の非存在下でキャプチャーされた転写産物の数と比べて、図１に示されている。ＰＥＧなどのクラウディング試薬の添加は、全トランスクリプトーム増幅産物の約５０％の増加および細胞当たりのより高い転写産物キャプチャーをもたらし得る。
【０１７９】
クラウディング試薬の性質にかかわらず、前記方法は、核酸（例えば、転写産物）収量を、このようなクラウディング試薬の非存在下におけるキャプチャーと比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％増加させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、クラウディング剤の使用は、キャプチャー収量を、このようなクラウディング試薬の非存在下におけるキャプチャーと比べて少なくとも２５％または少なくとも５０％増加させ得る。
【０１８０】
クラウディング試薬は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％または３０％の濃度で、反応混合物において使用され得る。いくつかの実施形態では、クラウディング試薬は、１％〜１５％または５％〜１０％の濃度で、反応混合物において使用される。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、クラウディング試薬は、他の成分とは別個に、または他の成分、例えば限定されないが、反応バッファー、洗浄バッファーもしくは溶液と一緒に反応に添加され得る。例として、クラウディング試薬は、例えば、細胞溶解後にＳｅｑ−ｗｅｌｌアレイ表面に適用されるハイブリダイゼーションバッファーと共に（またはその中に）、および／またはＳｅｑ−ｗｅｌｌアレイからのビーズの除去中に使用される洗浄バッファーと一緒に（またはその中に）添加され得る。
【０１８２】
ウェルアレイを空間的にバーコード化するための方法
細胞機能を単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑに関連付ける能力は、薬物、他の細胞または代謝産物を含む摂動に対する単一細胞応答が関与する多くの用途を可能にするであろう。Ｓｅｑ−ｗｅｌｌアレイの大規模並列性は、一次臨床サンプルを使用した多くの化合物の複数回投与スクリーニングもしくは化合物のコンビナトリアルスクリーニング、またはまれな機能的表現型の同定を可能にするために十分な複製物を提供し、これらは、精密医療の分野で非常に強力であり得る。しかしながら、ウェルアレイへのバーコード化ビーズのランダムなローディング（これは、シークエンシングデータで検出された所定のバーコード配列を、アレイ上の特定のウェルまたは刺激条件に遡って追跡することを不可能にする）により、以前は、Ｓｅｑ−ｗｅｌｌを通じて取得された単一細胞トランスクリプトーム情報に単一細胞機能活性を関連付けることができなかった。本開示の方法は、既知のユニークなＤＮＡ空間バーコードまたはバーコードのユニークな組み合わせを各ウェルに送達することにより、この制限を克服する。空間バーコードを利用して、各転写産物の起源のウェルを配置し、転写産物データを他のアッセイまたはアレイで実施された処理の結果と関連付けることを可能にする。空間バーコード化ウェルアレイはまた、ガラススライドに付着した薄組織切片から転写産物を取得し、それにより、元の組織構造内の各転写産物の２Ｄ位置を保持するために使用され得る。空間バーコード送達方法をさらに利用して、ユニークなマッチ刺激と共にユニークな空間バーコードを共送達して、アレイ上における多剤コンビナトリアルスクリーニングを可能にした。
【０１８３】
アレイを空間的にバーコード化する複数の方法がある。例えば、インクジェットプリンターまたはアレイデバイスを使用して、既知のバーコード配列をＳｅｑ−ｗｅｌｌアレイ上の既知の位置に直接送達することが可能である。別の例として、既知の配列および位置の核酸を有する核酸マイクロアレイ、例えばＤＮＡマイクロアレイは、既知の配列を個々のピコウェルに送達するために使用され得る。さらに他の実施形態では、空間バーコード化は、蛍光バーコード化ビーズなどのスペクトル関連ビーズの使用を伴い得る。
一態様では、ウェルアレイが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、各
【０１８４】
ウェルは、ユニークな空間バーコードを有する１つまたはそれを超える核酸分子を含む機能化表面を含む。いくつかの実施形態では、各ユニークな空間バーコードは、ウェルの１つまたはクラスタにユニークである。いくつかの実施形態では、各ウェルは、空間バーコードのユニークな組み合わせを含有する。いくつかの実施形態では、各ユニークな空間バーコードは、ユニークな刺激と共に共送達される。いくつかの実施形態では、ウェルアレイ上の各空間バーコードの位置は既知である。
【０１８５】
別の態様では、前記ウェルアレイ上の転写産物を空間的に位置決定するための方法であって、前記ウェルアレイを、１つまたはそれを超える転写産物を含有する細胞の集団と接触させること；ユニークなビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、標準的なバーコード化キャプチャービーズ上の前記転写産物からｃＤＮＡを生成すること；前記ウェル表面から前記ユニークな空間バーコードを同時に放出させ、前記バーコード化キャプチャービーズへの前記空間バーコードの結合を可能にすること；逆転写反応中に、ハイブリダイズした空間バーコード配列を介してビーズキャプチャープローブを伸長させることにより、前記空間バーコードとビーズバーコードとの融合物を生成すること；ならびに前記ｃＤＮＡ分子に存在する前記ビーズバーコードを、シークエンシングデータのビーズバーコード−空間バーコード融合物配列とマッチングすることにより、前記ウェルアレイ上の転写産物を位置決定することを含む方法が本明細書で提供される。
【０１８６】
ｃＤＮＡまたは第１鎖ｃＤＮＡという用語は、ｍＲＮＡに相補的であるヌクレオチド配列およびｍＲＮＡに相補的ではないヌクレオチド配列を含む核酸分子を意図すると理解すべきである。これらの後者の配列の例としては、５’ＵＰＳ、バーコードヌクレオチド配列などが挙げられる。したがって、簡潔にするために、いくつかの核酸は、本明細書ではｃＤＮＡまたは第１鎖ｃＤＮＡと称されるが、このような核酸は、ｃＤＮＡ配列ならびにｃＤＮＡ配列の５’および／または３’側の隣接配列を含むことに留意すべきである。
【０１８７】
別の態様では、ユニークな空間バーコードおよびマッチ刺激と結合した機能化表面を含有するウェルアレイ上の細胞における刺激のセットまたは刺激の組み合わせに対する転写応答を決定するための方法であって、前記ウェルアレイを、１つまたはそれを超える転写産物を含有する細胞の集団と接触させること；機能化表面から刺激を放出させること；各ウェルに存在する刺激に対する転写応答を可能にするために十分に長く、ウェル中の細胞を培養すること；ユニークなビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、標準的なバーコード化キャプチャービーズ上の前記転写産物からｃＤＮＡを生成すること；前記ウェル表面から前記ユニークな空間バーコードを同時に放出させ、前記バーコード化キャプチャービーズへの前記空間バーコードの結合を可能にすること；逆転写反応中に、ハイブリダイズした空間バーコード配列を介してビーズキャプチャープローブを伸長させることにより、前記空間バーコードとビーズバーコードとの融合物を生成すること；ならびに前記ｃＤＮＡ分子に存在する前記ビーズバーコードを、シークエンシングデータのビーズバーコード−空間バーコード融合物配列（これは、ウェルに存在する刺激または刺激の組み合わせを規定する）とマッチングすることにより、前記転写応答を特定の刺激に関連付けることを含む方法が本明細書で提供される。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、機能化表面はウェルの壁である。いくつかの実施形態では、機能化表面はウェルの底壁である。いくつかの実施形態では、ウェルアレイの各ウェルは、１、２、３、４または５つの機能化表面を含む。いくつかの実施形態では、機能化表面は、ウェルに挿入された物体である。いくつかの実施形態では、機能化表面はビーズである。いくつかの実施形態では、機能化表面はスペクトルビーズである。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ウェルアレイは、ユニークな空間バーコードのマイクロアレイ上に構築される。いくつかの実施形態では、ウェルアレイは、ユニークな空間バーコードをプリントされた表面上に構築される。いくつかの実施形態では、ユニークな空間バーコードは、ウェルアレイのウェルに移される。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、各ユニークな空間バーコードは、ウェルの１つまたはクラスタにユニークである。いくつかの実施形態では、各ユニークな空間バーコードは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のウェルにユニークである。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、機能化表面はストレプトアビジンで機能化され、ユニークな空間バーコードはビオチン標識される。いくつかの実施形態では、機能化表面は、アクリル基で機能化される。いくつかの実施形態では、機能化表面は、グリオキシル、チオール、アミン、カルボキシル、スクシンイミドエステル、エポキシドおよび／またはチオシアネートで機能化される。結合が可逆的または切断可能である限り、実質的に任意の共有結合的または非共有結合的化学が、バーコードを表面、例えばウェル表面またはビーズに付着させるために使用され得る。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、前記方法は、機能化表面から、ユニークな空間バーコードを有する核酸分子を放出させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、ユニークな空間バーコードを有する核酸分子は、細胞溶解バッファーなどの還元剤により、機能化表面から放出される。例えば、いくつかの実施形態では、ユニークな空間バーコードを有する核酸分子を、ジスルフィドリンカーを介してビオチンで標識し、機能化表面をストレプトアビジン機能化してジスルフィド架橋を作り、これを還元剤により、例えば細胞溶解バッファーで切断して、機能化表面から、ユニークな空間バーコードを有する核酸分子を放出させ得る。いくつかの実施形態では、ユニークな空間バーコードを有する核酸分子は、感光性結合の切断により、機能化表面から放出される。いくつかの実施形態では、ユニークな空間バーコードを有する核酸分子は、酵素的に切断可能な結合の切断により、機能化表面から放出される。いくつかの実施形態では、空間バーコードを、表面に共有結合的に連結した相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、温度、カオトロープまたは塩基を介してＤＮＡ変性を誘導することにより放出させる。
【０１９３】
本明細書で使用される場合、「スペクトル符号化ビーズ」は、光学的シグネチャを有するビーズである。いくつかの実施形態では、スペクトルビーズは、１つまたはそれを超える色素で標識される。いくつかの実施形態では、スペクトルビーズは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２８、１９または２０個のフルオロフォアで標識される。いくつかの実施形態では、スペクトルビーズは、１つまたはそれを超える色素および１つまたはそれを超えるフルオロフォアで標識される。いくつかの実施形態では、スペクトルビーズは、質量標識で標識される。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、スペクトル符号化ビーズは、約３〜約１０ミクロンの直径である。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、スペクトル符号化ビーズは、ポリスチレンまたはアガロースビーズであり得る。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、スペクトル符号化ビーズは、ストレプトアビジンで表面機能化され、したがって、ユニークな空間バーコードを有するビオチン化核酸分子に結合され得る。ストレプトアビジンはビーズ表面に複合化され得、および／またはオリゴヌクレオチドは、ジチオールリンカーを介してビオチンと複合化され得る。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、ウェル当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のスペクトル符号化ビーズがある。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のスペクトル符号化ビーズの位置は、落射蛍光顕微鏡法により視覚化される。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、ユニークな空間バーコードは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドであり、例えば１０〜３０ヌクレオチド長である。
【０２００】
いくつかの実施形態では、ユニークな空間バーコードを含む核酸は、ユニバーサルプライマーサイトをさらに含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマーサイトは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長、例えば１０〜３０または１５〜２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ユニークな空間バーコードを含む核酸は、転写産物キャプチャービーズに付着した核酸上のキャプチャー配列に相補的な配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、転写産物キャプチャービーズに付着した核酸上のキャプチャー配列に相補的な配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、転写産物キャプチャービーズに付着した核酸上のキャプチャー配列に相補的な配列は、ポリ（ｄＡ）トラクトである。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、前記方法は、ウェルアレイを、１つまたはそれを超える転写産物を含有する細胞の集団と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃または４５℃で、ウェルアレイと接触される。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、細胞は細菌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はマウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は霊長類細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は非哺乳動物細胞であり、原核細胞または他の真核細胞であり得る。細胞（または核酸源）は、天然に存在するものであり得るか、またはそれは、天然に存在しないものであり得る。天然に存在しない核酸の例は、合成的に生産された細胞である。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、前記方法は、ウェルアレイのウェルを半透膜でシーリングすることを含む。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、前記方法は、細胞を溶解させることを含む。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、前記方法は、ビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、１つまたはそれを超える転写産物からｃＤＮＡを生成することを含む。逆転写酵素を使用してｍＲＮＡ転写産物からｃＤＮＡを生成するための方法は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、転写産物は、バーコード化ビーズ上のキャプチャー配列に結合し；同時に、空間バーコードはウェル表面から放出され、キャプチャービーズ上のキャプチャー配列にも結合し；ビーズは除去され、結合空間バーコードおよび転写産物は両方とも、逆転写反応でキャプチャーオリゴヌクレオチドを伸長させ、転写産物配列または空間バーコード配列に融合したビーズバーコードを有する第１鎖ｃＤＮＡを形成することにより複製される。いくつかの実施形態では、第２鎖ｃＤＮＡは、本明細書に記載される方法を使用して合成される。
【０２０６】
したがって、いくつかの実施形態では、各ウェルは、異なるが関連する２つの第２鎖核酸を生じさせ、一方は標的核酸配列を有し、他方は空間バーコード配列を有するが、両方とも、最終的に両第２鎖核酸を関連付けるために使用され得るビーズバーコード配列を有する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、転写産物は、ｃＤＮＡ中のビーズバーコードをビーズバーコード−空間バーコード融合物とマッチングすることによりウェルアレイ上で位置決定される。いくつかの実施形態では、機能化表面に関連するユニークな空間バーコードの位置は既知である。いくつかの実施形態では、機能化表面はスペクトルビーズであり、ユニークな空間バーコードの位置は、ウェルアレイ上のスペクトルビーズを視覚化することにより把握される。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、スペクトルビーズは刺激をさらに含む。いくつかの実施形態では、刺激は薬物である。いくつかの実施形態では、刺激は、デスチオビオチン−ストレプトアビジン結合により、スペクトルビーズに付着される。いくつかの実施形態では、薬物は、スペクトルビーズに付着した感光性ミセルに含められる。いくつかの実施形態では、刺激は、感光性共有結合により、スペクトルビーズに付着される。
【０２０９】
本明細書に記載される方法の１つの例示的な実行形態は、スペクトル符号化ビーズを使用して、ウェルアレイ上の転写産物を空間的に位置決定することを含む（図３ＡおよびＢ）。ビーズは、ＬｕｍｉｎｅｘまたはＢＤなどの企業により商業的に提供される限られた数の色素の異なる量子のコンビナトリアルな組み合わせ、最大１６個の異なるフルオロフォアのコンビナトリアルな組み合わせ、またはその両方により、スペクトル的に標識されて、多数の潜在的な空間バーコードが得られ得る。ユニークなスペクトル符号化バーコード化ビーズはそれぞれ、切断可能な結合を介して、ユニークな空間バーコードに結合される。ジスルフィド結合は、標準的な細胞溶解バッファー中の還元剤により切断されるので、１つの好ましい方法は、ストレプトアビジン機能化ビーズと、ジスルフィド架橋を介して付着したビオチン分子を有するオリゴヌクレオチドとを使用することである。感光性または酵素的に切断可能な結合を含む他の化学が使用され得る。バーコード化オリゴヌクレオチドは、３つの部分、すなわちユニバーサルプライマーサイトと、バーコード配列と、転写産物キャプチャービーズ上のポリ（ｄＴ）配列への結合を媒介するポリ（ｄＡ）トラクトとからなる（図４）。バーコード化ビーズは、ウェル当たり複数のビーズをもたらす密度でアレイにロードされる。トランスクリプトームがビーズのローディング中に変化するか、またはビーズの存在が他のアッセイを妨げるかの懸念に応じて、バーコード化ビーズローディングは、他の細胞アッセイの前または後に実施され得る。すべての細胞機能アッセイが完了し、バーコード化ビーズがロードされた後、アレイはイメージングされて、空間バーコード化ビーズのどの組み合わせが各ウェルに存在していたかが定義される。最後に、標準的なＤＮＡ−バーコード化転写産物キャプチャービーズはアレイにロードされ、Ｓｅｑ−ｗｅｌｌは、記載されているように実施される。いくつかの実施形態では、バーコード化転写産物キャプチャービーズは、それらが自己蛍光性であり、存在する場合に、転写産物キャプチャービーズの化学の変化を介して、空間バーコード化ビーズの画像取得を妨害する場合には最後にロードして、これらのビーズが全体に存在することを可能にし得る。多孔質膜でウェルが依然としてシーリングされている間に、ユニークな空間ビーズバーコードは、光、酵素、または好ましくは細胞溶解バッファーに存在する還元剤を使用して、空間バーコード化ビーズから放出されなければならない。放出後、空間バーコードの一部は、転写産物キャプチャービーズと結合する。結合オリゴは、標準的な逆転写反応中に伸長されて、ユニークな空間ビーズバーコードと、転写産物キャプチャービーズに含まれる転写産物キャプチャーバーコードとの間の融合をもたらす。これらの融合事象は、ユニークな空間ビーズバーコードオリゴヌクレオチドおよび転写産物キャプチャービーズ上のプライマーサイトを使用して増幅され、標準的な化学を使用してシークエンシングされ得る（実施例２および３）。任意の転写産物キャプチャーバーコードに関連するユニークな空間バーコードオリゴヌクレオチドの組み合わせは、各ウェルに存在するスペクトルビーズの組み合わせとマッチングされて、シークエンシングデータを特定のウェルに関連付け得る。スペクトルビーズを介した空間バーコード化は、ビーズ／ウェルのユニークな組み合わせを得るために多数（数百）の異なるスペクトルビーズ（これは、作製し、落射蛍光顕微鏡法を使用して正確に区別することが困難であり得る）と、ウェル当たり比較的多数のビーズ（例えば、４〜５つ）とを必要とするという制限を有するので、正確な画像処理がさらに複雑になり、ウェルに存在するすべてのビーズからの空間スペクトルビーズバーコードがシークエンシングスペースでキャプチャーされることを必要とする。これらの制限は、より低密度（数千のウェル）のウェルアレイの場合には、それを最も有用なものにするが、それは、任意のＳｅｑ−ｗｅｌｌアレイに容易に適用され得る安価な選択肢である。
【０２１０】
本明細書に記載される方法の第２の例示的な実行形態は、ＤＮＡマイクロアレイを使用して転写産物をウェルアレイ上に空間的に配置して、既知のオリゴヌクレオチドを各ウェルに送達することを含む（図５Ａ〜Ｄ）。いくつかの実施形態では、このアプローチは、各ＤＮＡマイクロアレイ特徴がユニークな空間バーコード配列を有する上記（図４）ユニークな空間バーコードオリゴヌクレオチドの逆補体のＤＮＡマイクロアレイを作製することを伴う。いくつかの実施形態では、好ましくは、特に最大１００万個のユニークなバーコード配列を含有するより高密度のマイクロアレイの場合には、商業的なインサイチューＤＮＡ合成により達成される。任意の位置合わせでウェルアレイに対してシーリングされた場合に、あらゆるウェルがマイクロアレイ特徴の少なくとも一部の領域へのアクセスを有し、マイクロアレイ特徴が２つのウェルに及び得ないように、ＤＮＡマイクロアレイ特徴のサイズおよび間隔は設計される。ユニバーサルプライマーサイトに相補的な蛍光標識オリゴヌクレオチドはマイクロアレイにハイブリダイズされ、次いで、標準的なＤＮＡポリメラーゼを使用して酵素的に伸長され、ユニークな空間バーコードを含有する二本鎖マイクロアレイ特徴が得られる。いくつかの実施形態では、空間バーコード配列は、それが、切断可能な結合、例えば光、還元剤または酵素により切断可能な結合を介してアレイ表面に付着される場合、アレイ上で直接合成される。次いで、空間バーコードを有するマイクロアレイは、トップダウン（図５Ａ、実施例２）または好ましくはボトムアップ（図５Ｃ、実施例３）プロセスを介して、バーコードをウェルアレイに送達するために使用され得る。
【０２１１】
トップダウン送達スキーム（実施例２）では、マイクロアレイ上の第２鎖をプライミングするために使用されるオリゴヌクレオチドはまた、光、還元剤または酵素により切断可能な結合を含有するビオチンリンカーを有する。細胞アッセイが実施される前に、標準的なＳｅｑ−ｗｅｌｌマイクロアレイのウェル内面は、好ましくはカルボジイミド化学または当技術分野で公知の他の共有結合化学を介して、ストレプトアビジン分子で機能化され得る。次いで、標準的な二本鎖マイクロアレイを使用して、ウェルアレイをシーリングし得る（図５Ａ）。蛍光顕微鏡法は、ＤＮＡマイクロアレイ特徴およびウェルグリッドのアライメントを決定するために使用され得る（図５Ｂ）。次いで、シーリングされたアレイを加熱して、二本鎖マイクロアレイ特徴を変性させ得る。放出されたオリゴの一部は、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介して、ウェル表面にキャプチャーされる。ここで、ウェルアレイは、空間的にバーコード化されたといわれ、細胞機能アッセイに使用され得る。アッセイの完了後、バーコード化転写産物キャプチャービーズはロードされ、Ｓｅｑ−ｗｅｌｌは通常どおり実施され得る。溶解中に、還元剤は、オリゴヌクレオチド−ビオチン結合を切断して、転写産物キャプチャービーズ上へのキャプチャーのために空間バーコードを放出させる。逆転写中に、ユニークな空間バーコードは、転写産物キャプチャーバーコードに再び融合され、上記のように増幅およびシークエンシングされる。空間バーコードのマイクロアレイ送達は、ウェル当たり単一のバーコードのみが転写産物キャプチャービーズおよびシークエンシングスペースに成功裏にキャプチャーされることを必要とするので一般に好ましく、技術的な負担が少なくなる。また、空間バーコードおよびウェルアレイの位置合わせの規定は、かなり簡単な画像処理工程である。トップダウン送達アプローチの利益としては、標準的なＳｅｑ−ｗｅｌｌピコウェルアレイを使用することができることが挙げられる。
【０２１２】
ボトムアップ送達スキーム（図５Ｃ、実施例３）では、ウェルアレイはＤＮＡマイクロアレイの上部に合成され、各ウェルの底部がＤＮＡマイクロアレイ表面になる。これは、ＤＮＡマイクロアレイ表面を、ウェルアレイを合成するために使用される材料と関連付けるために使用され得る官能基でＤＮＡマイクロアレイを機能化することにより達成され、好ましい実行形態はアクリル基であり、アクリル樹脂の３Ｄステレオリソグラフィー架橋と組み合わせて、ＤＮＡマイクロアレイの上部でアレイを共有結合的に連結させて構築する。ＤＮＡマイクロアレイ機能化は、好ましくは、最終的なヌクレオチド環脱保護前に、アクリダイトなどのアクリル含有ホスホラミダイトでインサイチュー合成ＤＮＡマイクロアレイを処理することにより達成される。標準的なオリゴヌクレオチド脱保護および第２鎖合成の完了後、ＤＮＡウェルアレイ上でウェルアレイを合成する。あるいは、アクリル官能基はまた、アクリルシランの蒸着により、ＤＮＡマイクロアレイに付加され得るか、またはＤＮＡマイクロアレイは、アクリル基で事前機能化されたガラススライド上で最初に合成され得る。完了したら、蛍光顕微鏡を再び使用して、ＤＮＡマイクロアレイとウェルグリッドとの間の位置合わせを決定する。次いで、記載されている化学を使用して、合成ウェルアレイを機能化して、標準的なＳｅｑ−ｗｅｌｌプロトコールと適合させる。次いで、アレイは、トップダウン方法に記載されているように、細胞アッセイおよび転写産物キャプチャーに使用される。ユニークな空間バーコードは、変性細胞溶解バッファーにより放出され得る。バーコードはウェルアレイ合成に統合されるため、よりスケーラブルであるので、ボトムアップアプローチは、トップダウン方法よりも好ましい。また、ウェルが半多孔質膜により完全にシーリングされるまで、バーコードは放出されないので、ウェル間のユニークな空間バーコードの漏出の可能性が低い。これらのバーコード化アレイはまた、二本鎖バーコードの再生成後に再利用可能である。
【０２１３】
本明細書に記載される方法の第３の例示的な実行形態は、空間バーコードおよびユニークなマッチ刺激を共ロードした機能化表面の使用を介して、転写応答を個々の刺激のセットまたは刺激の組み合わせに関連付けることを含む（図６）。共機能化表面は、ストレプトアビジンなどの架橋化学でウェルアレイの内壁を機能化し、次いで、改変インクジェットプリンターを使用して、マッチ空間バーコードと一緒にアレイの異なるセグメントに異なる分子をプリントすることにより作成され得（図６Ａ）、これらは両方とも、ウェル表面に結合した官能基に連結するように機能化されている。あるいは、ビーズは、ユニークなマッチ刺激および空間バーコードと共ロードされ、アレイにランダムにロードされる（図６Ｂ）。いずれのアプローチにおいても、薬物は、細胞に無害な条件で誘導可能な薬物放出を可能にする機構を介して、機能化表面に安定して会合される。１つのアプローチは、デスチオビオチン−ストレプトアビジン結合を介した表面への薬物の連結であり、これは、標準的な細胞培地に存在するビオチンにより放出される（図６Ｃ）。薬物放出後、細胞を培養して、各薬物に対する転写応答を可能にする。適切なインキュベーション後、転写産物は、共送達空間バーコードと同様に上記のようにバーコード化ビーズにキャプチャーされる。所定の刺激に対する単一細胞転写応答は、その特定の刺激に特異的な空間バーコードに融合したビーズバーコードを同定することにより決定される。
【０２１４】
限定されないが、Ｓｅｑ−ｗｅｌｌなどのウェルベースアッセイおよび分析を実施するための改善されたハードウェア
メンブレンアプリケーター
別の態様では、半多孔質膜をウェルアレイに適用するためのメンブレンアプリケーターが本明細書で提供される。Ｓｅｑ−ｗｅｌｌは、最適な転写産物キャプチャーを達成するために、アレイ表面への半多孔質膜の付着を必要とする。初期プロトコールでは、プラズマ活性化ポリカーボネート膜は、第１のガラススライドで適切な位置にアレイに対して膜を保持し、次いで、膜の背面に対して第２のガラススライドを動かして、膜とアレイとの間から液体を除去するという機械的に困難な方法を介して、ピコウェルアレイに付着された。この工程は、前記技術のスケーラビリティ、携帯性および使用容易性にいくつかの課題をもたらす。プラズマ活性化は膜付着に必須であるが、特別な装置（すなわち、プラズマオーブン）を必要とし、前記技術の幅広い採用のために膜の集中的な活性化を必要とする。しかしながら、プラズマ処理膜は非常に薄いので、乾燥および水和状態の両方において、十分な訓練なしで輸送して膜付着を再生可能に実施することは非常に困難である。最後に、各膜は個々に処理され、アッセイのスケーラビリティが制限される。
【０２１５】
驚くべきことにこれらの課題を克服するメンブレンアプリケーターが本明細書で提示される。一般的な形態のアプリケーターは、可逆的化学、例えば親水性薄膜を介して、ガラスまたは好ましくはアクリルプラスチックの剛性裏材に付着した膜からなる（図７）。最も単純な形態では、薄膜は塩橋であるが、理想的には、より厚い膜の達成を可能にする親水性ポリマーからなる。活性化膜は乾燥状態で剛性裏材に接着されて長期間安定し、標準的な顕微鏡スライドコンテナで膜を輸送することが可能になるので、前記アプリケーターは輸送問題を解決する。透明なアクリル支持体およびより厚いポリマー薄膜の使用を介して、個々の膜のスケーラブルな生産が可能になる。これらの材料を使用して、大きなバルクアプリケーターが構築され得る。アクリル裏材は、バルクアプリケーターを数百の個々のアプリケーターにレーザー切断することを可能にする。レーザー切断中に、アクリル裏材への膜の融合を防止するためには、より厚い薄膜が必要であり、適用中の膜の剥離が可能になる。最後に、アプリケーター全体を単一の乾燥片としてアレイの上部に配置し得るので、アプリケーターは、アレイへの膜の付着を劇的に簡素化する。クランピングおよびインキュベーションの後、アプリケーター：アレイサンドイッチを溶液に浸漬する。親水性薄膜は水を吸収し、アプリケーターから膜が放出されて、アレイに付着した膜が残る。したがって、アプリケーターは、エンドユーザーが薄膜を扱って、誤りがちな標準的な膜付着手順を実施する必要性をなくす。
【０２１６】
一実施形態では、膜；および剛性支持体を含むメンブレンアプリケーターであって、前記膜が、可逆的化学により前記剛性支持体に付着しているメンブレンアプリケーターが本明細書で提供される。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、剛性支持体はガラスを含む。いくつかの実施形態では、剛性支持体はアクリルプラスチックを含む。いくつかの実施形態では、剛性支持体は、ポリカーボネートまたはポリスチレンを含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、剛性支持体は、約１〜約２ｍｍの厚さである。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、膜は半多孔質膜である。いくつかの実施形態では、膜はプラズマ活性化である。いくつかの実施形態では、膜はポリカーボネートである。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、膜は、可逆的化学により剛性支持体に付着される。いくつかの実施形態では、可逆的化学は親水性薄膜である。いくつかの実施形態では、親水性薄膜は塩橋である。いくつかの実施形態では、親水性薄膜は、親水性ポリマー、例えばポリアクリルアミド、ポリ（ビニルアルコール）、アガロースまたはアルギン酸塩である。いくつかの実施形態では、可逆的化学は、還元剤により切断され得るビオチン−ストレプトアビジン相互作用により作られるジスルフィド架橋である。いくつかの実施形態では、可逆的化学は感光性結合である。いくつかの実施形態では、可逆的化学は、酵素的に切断可能な結合である。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、メンブレンアプリケーターは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ｍｍの幅である。いくつかの実施形態では、メンブレンアプリケーターは、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９または８０ｍｍの長さである。他の実施形態では、メンブレンアプリケーターは、例えば、１〜５フィート×１〜５フィート（例えば、２フィート×２フィートまたは２フィート×３フィート）を含むかなり大きなものであり得る。これらのより大きなアプリケーターの使用は、複数のアレイを同時にシーリングすることを可能にする。
【０２２２】
アレイクランプ
膜とウェルアレイとの間に完全なシーリングを誘導するために、長時間にわたって高温で、典型的には３０分間にわたって３７℃で、剛性裏材を有するアレイに対して膜を押し付けなければならない。伝統的なプロトコールは、市販の４５０ドルの鋼ハイブリダイゼーションクランプを利用する。クランプの高いコストは、同時に処理し得るサンプルの数を制限し、新たなラボにおける技術採用の摩擦点になる。
【０２２３】
新たなラボにおける迅速な技術採用を促進するために、より柔軟で安価なプラスチック材料で構築された場合に機能する再設計手動クランプが本明細書で提供される（図８Ａ〜Ｄ）。プラスチックで機能するクランプを設計するための３つの重要点があった。１．アレイの長軸に沿って圧力を適用する必要があること。中央の１本のネジを使用した場合、トップピースが曲がって、アレイの末端のシーリングが不十分になった。三ネジ設計は、長軸に沿って下向きの力を提供するために最適であることが見出された。２．アレイの真下に上向きの力を適用すること。これは、アレイホルダーおよびトップピースを完全に取り囲み、アレイの下のアレイホルダーにのみ接触した矩形クランプを作って、アレイの下に上向きの力を引き起こすことにより達成した。３．アレイ表面を離れる流体経路を可能にすること。本明細書で提示されるデザインは、１５ドル未満で射出成形され得るので、クランプは、膜およびアレイと一緒に新たなラボに送られ得る使い捨て商品となる。安価なコストはまた、多数のクランプを利用可能になることを可能にして、ヘビーユーザーラボまたはコアのスループットを増加させる。
【０２２４】
加熱プレスによるスケーラブルなアレイクランプ
別の態様では、加熱プレスを使用してウェルをアレイにシーリングするための方法が本明細書で提供される。各アレイの手動クランプは依然として、ヘビーユーザーラボの場合には、アッセイのスループットのボトルネックに相当する。プレスは、アレイが配置される弾性底面からなる。標準的な手順を使用して膜をアレイ上に予め配置し得るか、またはより好ましくはメンブレンアプリケーターをアレイの上部に配置する。前述のように、プレスの上面を規定の温度、典型的には３７℃に加熱する。次いで、プレスを規定の圧力で規定の時間閉じて、膜付着を媒介する。加熱プレス法は、ヘビーユーザーラボのためのいくつかの利点を有する。現在のプレス寸法は、同時に５０個のアレイへの膜付着を可能にする。オーブンと比較して改善されたプレスの熱伝達は、３０分間ではなく５分間の膜付着を可能にする。最後に、単一の膜を使用して、５０個のアレイすべてをシーリングし得るので、作製することが必要な個々の膜が少なくなることにより、前記技術のスケーリングが容易になり、転写産物キャプチャー後、一度に１つではなくすべてのアレイからの膜の同時除去を可能にすることによっても、ユーザーを支援する。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、膜をウェルアレイにシーリングするための方法は、ウェルアレイを膜と接触させること；および加熱面を、ウェルアレイに接触した膜に適用することを含む。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、膜は、剛性支持体、例えば、本明細書に記載される剛性支持体を含み、膜はウェルに面し、剛性支持体は加熱表面に面する。いくつかの実施形態では、膜は、本明細書に記載されるメンブレンアプリケーターを含む。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、加熱面は、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃または５５℃に加熱される。いくつかの実施形態では、加熱面は、３５℃〜５０℃に加熱される。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、加熱面は、膜に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５分間適用される。いくつかの実施形態では、加熱面は、膜に１０分間未満適用される。いくつかの実施形態では、加熱面は、膜に５分間適用される。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、加熱プレスは熱プレスを含む。いくつかの実施形態では、加熱プレスはＴシャツプレスを含む。いくつかの実施形態では、加熱プレスはアイロンを含む。
【０２３０】
多孔質プラスチック粒子またはビーズを磁化する方法
磁性粒子は、溶液からの粒子の分離を劇的に簡素化して自動化を可能にするので、粒子を利用するほとんどの生物学的アッセイのための最適な樹脂となっている。磁性キャプチャービーズ、例えば磁性バーコード化転写産物キャプチャービーズは、Ｓｅｑ−ｗｅｌｌ中に、転写産物キャプチャー後に実施される酵素反応の多くを効率化するが、磁性ビーズはこれまで使用されていない。Ｓｅｑ−ｗｅｌｌにおいて使用される転写産物キャプチャービーズには、大きなサイズ（例えば、約３５ミクロン）、非常に均一なサイズ分布、大孔隙（＞１００ｎｍの細孔）および高密度表面機能を含むアッセイに必須の複数の規格を有する。これらの規格を満たす市販の樹脂はほとんどなく、磁性のものはない。スクラッチからの磁性樹脂の作成を回避するために、市販の多孔質樹脂を磁化するための簡易方法が考案された。前記方法は、溶媒または温度のいずれかを利用して、樹脂を作製するために使用されるポリマーの収縮を引き起こし、好ましくは、−２０℃で４Ｍ  ＮａＣｌ、１０％ＰＥＧ８０００の水溶液である。樹脂の収縮は、樹脂内の細孔がより大きくなることを誘導する。収縮状態では、通常状態の細孔よりもわずかに大きい、好ましくは５０〜１００ｎｍのサイズの磁性粒子は樹脂と混合される。粒子が収縮状態の樹脂の細孔に浸透した後、樹脂を標準的な溶媒条件および標準的な温度に戻す。細孔が通常に戻ると、磁性粒子は細孔構造内に永久に閉じ込められ、磁性樹脂が得られる。
【０２３１】
単一細胞ＲＮＡの安定貯蔵のための方法
現在、標準的なバルク凍結プロセス後の細胞回収率は低いので、単一細胞ＲＮＡｓｅｑ分析のわずかな細胞サンプルは、取得日にサンプルをバーコード化ｃＤＮＡに処理することを必要とする。それは、サンプル取得部位またはその近くで適切な機器が利用可能であることを必要とし、あらゆるサンプルをｃＤＮＡ段階に処理すること（これは、大規模な臨床試験では極めてコストおよび時間がかかり得る）を必要とするので、これは重大な技術制限である。この制限を克服するために、本発明者らは、数千の細胞の単一細胞ＲＮＡ貯蔵ビヒクルとして機能するピコウェルアレイ、例えばＳｅｑ−Ｗｅｌｌアレイを利用する方法を開発した。細胞を、バーコード化キャプチャービーズをプレロードされた機能化ピコアレイに数分でロードする。次いで、アレイをアルコール固定液（例えば、メタノール）に浸漬して、各細胞の内容物を沈殿させ、それにより、細胞溶解、内容物沈殿中におよび最終的には貯蔵中にこのような内容物をウェルに保持する。本発明者らは、アレイにロードすると、アルコール（例えば、メタノール）による細胞の固定が、細胞からの転写産物回収に対して最小効果を有することを実証した（図９Ａ〜Ｅ）。次いで、アレイを、例えば約−８０℃または約−２０℃を含む０℃未満の温度で長期貯蔵に置き得る。貯蔵アレイから単一細胞トランスクリプトームを回収するために、半多孔質膜をアルコール固定液中のアレイに付着させる。次いで、Ｓｅｑ−Ｗｅｌｌプロトコール、またはピコウェルもしくはピコウェルアレイを伴う任意の他のプロトコールを実施する。ロバストな変性溶解バッファーは沈殿材料を再溶解させて、単一細胞レゾリューションでＲＮＡをキャプチャーすることを可能にする。
【０２３２】
層状デバイス
スルーホールを有する層状デバイス（例えば、マイクロ流体デバイス、例えばドライフィルムフォトレジストを含むウェルアレイ）および／または各ウェルが１つの細胞および／またはビーズを収容し得るように構成された複数のウェルを有するウェルアレイ（例えば、マイクロウェルアレイ）ならびに関連方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、このようなデバイスは、必要に応じて多孔質膜であるベース層を含む。いくつかの実施形態では、スルーホールおよび／またはウェルアレイを有するドライフィルムフォトレジストは、スルーホールおよび／またはウェルアレイを有する第２（例えば、第２または最上層）のドライフィルムフォトレジストをさらに含む。ウェルアレイ／ボトムレスマイクロウェルアレイは、有利には、固体支持体を使用せずにドライフィルムフォトレジストから製造され、当技術分野におけるアレイおよび製造方法を超えるいくつかの利点を提供する。
【０２３３】
（例えば、液体の通過を許容しない固体ウェル底部を含む）他のタイプのウェルアレイは、アレイへの細胞および／またはビーズのポアソンローディングのみを可能にし、本開示の層状デバイス（例えば、層状デバイスの多孔質膜を介して、細胞および／またはビーズを含む液体が流れることを可能にする多孔質膜を含むウェル底部を含む層状デバイス）を使用して達成され得るよりも有意に低いスループットをもたらし得る。
【０２３４】
層状デバイス（例えば、ウェルアレイ、例えばマイクロウェルアレイ）を作製するための他の方法は、スケーラビリティおよび／または再現性に関して制限され得る。本明細書に記載されるものとは別のデバイス製造方法では、フォトレジストを固体支持体表面上にスピンコーティングし得る。これらの方法の後、フォトレジストのスルーホールのアレイを曝露および現像し、次いで、機械的方法により（例えば、カミソリ刃を使用して支持体からフォトレジストフィルムを削り取ることにより）、支持体からフォトレジストフィルムを放出させ得る。このような機械的方法は、（例えば、長さ０．１ｍ×幅０．１ｍを超える）大面積のフォトレジストフィルムに容易に適用され得ず、容易に再現可能であり得ない。固体表面からフォトレジストを剥離する別の代替方法は、リフトオフ層と称される溶解可能な固体支持体上にフォトレジストをスピンコーティングすることを伴い得る。しかしながら、この方法は、相当な複雑性を製造プロセスに追加し得る。デバイスを作製する他の代替方法は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を使用してマイクロウェルアレイを作製することを含むが、これらの方法は、（例えば、長さ０．１ｍ×幅０．１ｍを超える）大面積のＰＤＭＳに適用困難であり得、容易に再現可能であり得ない。
【０２３５】
有利には、本明細書に開示される層状デバイスを作製する方法は、現像液への曝露中にドライフィルムフォトレジストから自然に剥離し得るフォトマスク以外に、ドライフィルムフォトレジストのためのいかなる固体支持体も用いずに、ドライフィルムフォトレジストを用いて行われ得る。本明細書に開示される層状デバイスを作製する方法は、（例えば、長さ０．１ｍ×幅０．１ｍを超える）大面積のフォトレジストフィルムにより容易に適用され得、代替方法よりも容易に再現可能であり得る。例えば、本明細書に開示される方法は、大きな人的資源を用いずに、より短い時間で再現可能に数千または数万で作製する（例えば、少数の技術者で、１日当たり少なくとも１０，０００個のアレイを作製することを含む）ために使用され得る。
【０２３６】
フォトマスク以外に、ドライフィルムフォトレジストのための固体支持体を必要とせずに、ドライフィルムフォトレジストを含むフリースタンディング構造（例えば、ボトムレスウェルアレイ）を作製する方法は、ウェルアレイのロバストな、簡易なおよび再現可能な製造を超える重大な有用性を有する。
【０２３７】
本明細書に記載されるものの代替デバイスでは、ボトムレスウェルアレイは、ウェルの底面を形成するキトサン層により支持され得る。キトサン層を有するこれらの代替アレイは、典型的には、ハイスループットで細胞および／もしくはビーズをロードする目的のために、ならびに／または細胞および／もしくはビーズをウェルアレイに超ポアソンでロードする目的のために十分に迅速にそれを介して液体が移動することを防止または妨害するように低い孔径および／またはフラックスを有する。本明細書に開示されるウェルアレイは、これらのキトサン層状アレイよりも有意に高いフラックスおよび／または有意に高い孔径を有し得るので、ハイスループットで細胞および／もしくはビーズをロードすること、ならびに／またはウェルアレイに超ポアソンでロードすることを容易にし得る。
デバイス
【０２３８】
いくつかの実施形態では、層状デバイス（例えば、マイクロ流体デバイス、例えば、ドライフィルムフォトレジストを含むウェルアレイ）が提供される。いくつかの実施形態では、層状デバイスは複数の層を含む。層状デバイス中の層は、例えば、１つもしくはそれを超える多孔質膜、１つもしくはそれを超えるボトムレスウェルアレイおよび／または１つもしくはそれを超える限外濾過膜を含み得る。
【０２３９】
本明細書で使用される場合、「ボトムレスマイクロウェルアレイ」は、複数のスルーホールを有する平面基板を含む。いくつかの実施形態では、ボトムレスマイクロウェルアレイは、約１０３個またはそれを超えるスルーホール、例えば１０３〜約１０７個のスルーホール、約３×１０３〜約１０７個のスルーホール、約５×１０３〜約１０７個のスルーホール、約１０４〜約１０７個のスルーホール、約１０４または約５×１０４または約８×１０４〜約１０５または約５×１０５または約１×１０６または約５×１０６または約１×１０７個のスルーホールを含む。いくつかの実施形態では、ボトムレスマイクロウェルアレイは、底部において多孔質膜に結合していない場合には、マイクロウェルアレイの状態である。
【０２４０】
ウェル
いくつかの実施形態では、層状デバイスは、複数のスルーホールまたはウェル（例えば、ボトムレスウェルアレイ、例えばボトムレスマイクロウェルアレイ）を含むフリースタンディングフォトレジストフィルムを含む。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、層状デバイスはウェルアレイを含む。いくつかの実施形態では、ウェルアレイの各ウェルは、（例えば、ドライフィルムフォトレジストに）複数のスルーホールの１つと、（例えば、多孔質膜を含む例えばベース層を含む）底面とを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるウェルアレイ中のウェルは、単一細胞および／またはビーズをキャプチャーするように構成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるウェルアレイ中のウェルは、六角形パターンで配置される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるウェルアレイ中のウェルは、矩形または長方形グリッドパターンで配置される。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、「マイクロウェル」または「ウェル」または「スルーホール」という用語は互換的に使用され、１０００ミクロン未満またはそれに等しい（例えば、１ミクロン〜１０００ミクロンまたはそれに等しい）最大横寸法または直径、例えば均一な直径を有するウェルを指す。
【０２４３】
ウェルは任意の形状であり得、少なくとも側面と、必要に応じて底面とを有する。いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールは、円筒形、（例えば、矩形断面を有する）長方形プリズム、角錐形または円錐形の形状を有する。
【０２４４】
本明細書で使用される場合、層（例えば、フォトマスク、ボトムレスウェルアレイ）中の特徴（例えば、ウェル）の「最大横寸法」という用語は、その上および／またはその中に特徴が配置される層（例えば、ボトムレスウェルアレイ）の平面に対して平行な平面（例えば、任意の平面、特定の平面）中の同じ特徴（例えば、ウェル）の２つの端部（例えば、２つの対側端部、２つの対角端部）間の最大距離を指す。例えば、円形断面を有するウェルの場合、ウェルアレイの平面に対して平行な平面中の最大横寸法は、平面中の円形断面の直径である。別の例として、長方形断面（例えば、矩形断面）を有するウェルの場合、ウェルアレイの平面に対して平行な平面中の最大横寸法は、平面中の長方形断面の対角の長さである。本明細書で使用される場合、物品（例えば、細胞、ビーズ）の「最大横寸法」という用語は、同じ物品（例えば、細胞、ビーズ）のいずれか２つの端部間の最大距離を指す。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールは、円筒形、（例えば、矩形断面を有する）長方形プリズム、角錐形または円錐形の形状を有する。
【０２４６】
本明細書に記載されるウェルアレイ中のウェル、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールは、適切な最大および／または最小横寸法を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるウェルアレイ中のウェル、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールは、少なくとも５ミクロン、少なくとも７ミクロン、少なくとも１０ミクロン、少なくとも２０ミクロン、少なくとも４５ミクロン、少なくとも５０ミクロンまたは少なくとも１００ミクロンの最大および／または最小横寸法を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるウェルアレイ中のウェル、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールは、多くとも５００ミクロン、多くとも４００ミクロン、多くとも３００ミクロンまたは多くとも２００ミクロンの最大および／または最小横寸法を有する。上記範囲の組み合わせも可能である（例えば、５ミクロン〜５００ミクロン、７ミクロン〜４００ミクロン、５ミクロン〜５０ミクロンの範囲）。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるウェルアレイ中のウェル、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールは、５ミクロン〜５００ミクロン（例えば、４５ミクロン、７ミクロン、１０ミクロン）の範囲の最大および／または最小横寸法を有する。
【０２４７】
本明細書で使用される場合、量的特徴（例えば、最大横寸法）が、より小さな値およびより大きな値を伴う場合の「範囲」として記載される場合、これは、より小さな値とより大きな値との間の値、またはより小さな値もしくはより大きな値に等しい値を有する量的特徴を指す。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールは、均一な深さを有する。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールは、多くともいくつかのビーズおよび／または細胞（例えば、単一のビーズおよび／または単一細胞）が、ウェルおよび／またはスルーホールの内側にフィットするような深さを有する。いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールは、ボトムレスウェルアレイおよび／またはドライフィルムフォトレジストの厚さのものに等しい深さを有する。いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールは、少なくとも５ミクロン、少なくとも１０ミクロン、少なくとも２０ミクロンまたは少なくとも３０ミクロンの深さを有する。いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールは、多くとも５００ミクロン、多くとも２００ミクロンまたは多くとも１００ミクロンの深さを有する。上記範囲の組み合わせも可能である（例えば、５ミクロン〜５００ミクロン、１０ミクロン〜２００ミクロン、３０ミクロン〜１００ミクロンの範囲）。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールは、５ミクロン〜５００ミクロン（例えば、３０ミクロン〜１００ミクロン）の範囲の深さを有する。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールは、均一な最大横寸法を有する。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、多くともいくつかのビーズおよび／または細胞（例えば、単一のビーズおよび／または単一細胞）が、ウェルおよび／またはスルーホールの内側にフィットするような最大横寸法を有する。いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、少なくとも１ミクロン、少なくとも１０ミクロンまたは少なくとも１５ミクロンの最大横寸法（例えば、均一な直径）を有する。いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、多くとも５００ミクロン、多くとも３００ミクロン、多くとも２００ミクロン、多くとも１００ミクロンまたは多くとも１０ミクロンの最大横寸法（例えば、均一な直径）を有する。上記範囲の組み合わせも可能である（例えば、１ミクロン〜５００ミクロン、１０ミクロン〜３００ミクロン、１５ミクロン〜１００ミクロンの範囲）。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、１ミクロン〜５００ミクロン（例えば、１５ミクロン〜１００ミクロン、１ミクロン〜１０ミクロン）の範囲の最大横寸法（例えば、均一な直径）を有する。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、多くともいくつかのビーズおよび／または細胞（例えば、単一のビーズおよび／または単一細胞）が、ウェルおよび／またはスルーホールの内側にフィットするような、細胞および／またはウェルの最大横寸法に対する最大横寸法を有する。いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、細胞および／またはビーズの最大横寸法の少なくとも１倍、少なくとも２倍または少なくとも３倍の最大横寸法を有する。いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、細胞および／またはビーズの最大横寸法の多くとも６倍、少なくとも５倍または多くとも４倍の最大横寸法を有する。上記範囲の組み合わせも可能である（例えば、１〜６倍、２〜５倍、３〜４倍の範囲）。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、細胞および／またはビーズの最大横寸法の１〜６倍の範囲の最大横寸法を有する。いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、細胞の最大横寸法の１〜６倍の範囲の最大横寸法を有する。いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／またはドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、ビーズの最大横寸法の１〜６倍の範囲の最大横寸法を有する。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は円筒形である。いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は円筒形であり、均一な直径を有する。いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は円筒形であり、少なくとも１ミクロン、少なくとも１０ミクロンまたは少なくとも１５ミクロンの直径を有する。いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は円筒形であり、多くとも５００ミクロン、多くとも３００ミクロン、多くとも２００ミクロン、多くとも１００ミクロンまたは多くとも１０ミクロンの直径を有する。上記範囲の組み合わせも可能である（例えば、１ミクロン〜５００ミクロン、１０ミクロン〜３００ミクロン、１５ミクロン〜１００ミクロンの範囲）。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は円筒形であり、１ミクロン〜５００ミクロン（例えば、１５ミクロン〜１００ミクロンまたは１ミクロン〜１０ミクロン）の範囲の直径を有する。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、ウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、長方形プリズムの形状（例えば、矩形断面を有する矩形プリズム）である。いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、長方形プリズムの形状（例えば、矩形断面を有する矩形プリズム）であり、均一な最大横寸法を有する。いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、長方形プリズムの形状（例えば、矩形断面を有する矩形プリズム）であり、１ミクロン〜５００ミクロン（例えば、１５ミクロン〜１００ミクロンまたは１ミクロン〜１０ミクロン）の範囲の最大横寸法（例えば、長方形または矩形断面の対角；例えば、均一な最大横寸法）を有する。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、角錐形（角錐の形状；例えば、長方錐、方錐、三角錐など）である。いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）アレイ中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は角錐形であり、均一な最大横寸法を有する。いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）アレイ中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は角錐形であり、層またはアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）の上面において３５ミクロン〜１００ミクロン（例えば、４５ミクロン〜８０ミクロン、４０ミクロン〜５０ミクロン）の範囲の最大横寸法（例えば、最大断面の対角；例えば、均一な最大横寸法）を有し、層またはアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）の底面において０．５ミクロン〜１０ミクロン（例えば、０．５ミクロン〜３ミクロン、１ミクロン〜５ミクロン）の範囲の最大横寸法を有する。他の範囲も可能である。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は円錐形である。いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）アレイ中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は円錐形であり、均一な直径を有する。いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）アレイ中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は円錐形であり、層またはアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）の上面において３５ミクロン〜１００ミクロン（例えば、４５ミクロン〜８０ミクロン、４０ミクロン〜５０ミクロン）の範囲の直径（例えば、均一な直径）を有し、層またはアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）の底面において０．５ミクロン〜１０ミクロン（例えば、０．５ミクロン〜３ミクロン、１ミクロン〜５ミクロン）の直径を有する。他の範囲も可能である。
【０２５７】
本明細書で使用される場合、量（例えば、距離、厚さ、寸法（例えば、最大横寸法））に関する「均一」という特徴用語は、表示値またはその量の平均の多かれ少なかれ１０％を超えない（例えば、表示値またはその量の平均の多かれ少なかれ５％を超えない、多かれ少なかれ１％を超えない、多かれ少なかれ０．１％を超えない）その量の変動を指す。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、各ウェルまたはスルーホール間の適切な分離を提供しながら、ウェルまたはスルーホール当たり単一の細胞および／またはビーズを使用して、大量の細胞および／またはビーズを分析するために必要なデバイス面積を低減または最小化するために十分に低いピッチを有する。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストの層中のスルーホールのピッチは、各ウェルまたはスルーホール間の適切な分離を提供しながら、ドライフィルムフォトレジストに結合したフォトマスクが現像液中で除去され得るように十分に低い。
【０２５９】
本明細書で使用される場合、層中の特徴（例えば、ウェルアレイ中のウェル、フォトマスク上の特徴）間の「ピッチ」という用語は、その上および／またはその中に特徴が配置される層（例えば、ボトムレスウェルアレイ）の平面に対して平行な平面（例えば、任意の平面、特定の平面）中の層中の特徴間の中心間距離を指す。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、ウェルアレイ中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、２ｍｍの最大ピッチを有する。いくつかの実施形態では、ウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、少なくとも１ミクロン、少なくとも１０ミクロン、少なくとも２０ミクロンまたは少なくとも５０ミクロンのピッチを有する。いくつかの実施形態では、ウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、多くとも２ｍｍ、多くとも１ｍｍ、多くとも５００ミクロンまたは多くとも２００ミクロンのピッチを有する。上記範囲の組み合わせも可能である（例えば、１ミクロン〜２ｍｍ、１０ミクロン〜１ｍｍ、２０ミクロン〜５００ミクロンの範囲）。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態では、ウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）中のウェルの少なくとも一部（例えば、全部）、および／または層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）中のスルーホールの少なくとも一部（例えば、全部）は、２０ミクロン〜２００ミクロン（例えば、１０ミクロン〜２００ミクロン）の範囲のピッチを有する。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストの層中のスルーホールは、フォトマスクに面する表面上において、ドライフィルムフォトレジストに結合したフォトマスクが現像液中で除去され得るように十分に大きな面積率のドライフィルムフォトレジストを占有する。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストの上面（例えば、フォトマスクに接触した表面）におけるウェルの総横面積は、ドライフィルムフォトレジストの総横面積の少なくとも１０％である。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストの上面におけるウェルの総横面積は、ドライフィルムフォトレジストの総横面積の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％である。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストの上面におけるウェルの総横面積は、ドライフィルムフォトレジストの総横面積の多くとも９９．９％、多くとも９９％、多くとも９０％、多くとも８０％、多くとも７０％または多くとも６０％である。上記範囲の組み合わせも可能である（例えば、１０％〜９９．９％、２０％〜９０％、３０％〜８０％の範囲）。他の範囲も可能である。
【０２６２】
本明細書で使用される場合、層中の（例えば、ウェルの）特徴の集合体の「総横面積」という用語は、その上および／またはその中に特徴が配置される層（例えば、ボトムレスウェルアレイ）の平面に対して平行な平面（例えば、任意の平面、特定の平面）中の特徴（例えば、ウェル）のすべての累積断面積を指す。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、ウェルは、ドライフィルムフォトレジストの上面（例えば、フォトマスクに接触した表面）の表面積の少なくとも約１０％に相当する。いくつかの実施形態では、ウェルは、ドライフィルムフォトレジストの上面の表面積の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％に相当する。いくつかの実施形態では、ウェルは、ドライフィルムフォトレジストの上面の表面積の多くとも９９．９％、多くとも９９％、多くとも９０％、多くとも８０％、多くとも７０％または多くとも６０％に相当する。上記範囲の組み合わせも可能である（例えば、１０％〜９９．９％、２０％〜９０％、３０％〜８０％の範囲）。他の範囲も可能である。
【０２６４】
第１のボトムレスマイクロウェルアレイ
いくつかの実施形態では、層状デバイス（例えば、マイクロ流体デバイス、例えば、ドライフィルムフォトレジストを含むウェルアレイ）は、例えば、複数のスルーホールまたはウェルを含むドライフィルムフォトレジスト（例えば、ボトムレスウェルアレイ、ボトムレスマイクロウェルアレイ）を含む。
【０２６５】
本明細書で使用される場合、「フォトレジスト」という用語は当業者に公知であり、材料の表面上におよび／または材料を介してパターンを形成する方法において使用される特定の電磁放射（例えば、紫外線（ＵＶ）光）に対して感受性の材料を指す。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストはネガティブフォトレジストである。「ネガティブフォトレジスト」という用語は当業者に公知であり、特定の電磁放射（例えば、ＵＶ光）に曝露された部分が架橋される一方、非曝露部分が依然として現像液中で可溶性であり、現像中に除去され得るフォトレジストを指す。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストは、エポキシド基を含むネガティブフォトレジスト材料を含む。エポキシド基は、三員環を有する環状エーテルであって、三員環中の２つの炭素と結合した様々な置換基のいずれかを必要に応じて含む環状エーテルを指す。いくつかの実施形態では、ネガティブフォトレジストは、特定の電磁放射（例えば、ＵＶ光）への曝露中に酸を形成し、この酸は、ネガティブフォトレジスト材料の重合を誘導する。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストは、８つのエポキシド基を含む一般的なフォトレジストであるＳＵ−８フォトレジストを含み、ＳＵ−８中のエポキシド基の化学構造は、
【化１】
2021505157.tif 000003
である。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストは、市販のドライフィルムフォトレジスト（例えば、ネガティブドライフィルムフォトレジスト）を含む。エポキシドフォトレジスト化学が例として言及されるが、他のフォトレジスト化学も可能であると理解すべきである。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジスト（例えば、複数のスルーホールを含む；例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）は、多孔質膜の上にある（例えば、それに隣接して配置されている、接触している、直接接触している、接着している、結合している）。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストは、多孔質膜に直接接触している。特定の実施形態では、ドライフィルムフォトレジスト（例えば、複数のスルーホールを含む、例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）は多孔質膜に結合している。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストは、（例えば、熱ラミネーションにより）多孔質膜に結合している。
【０２６７】
本明細書で使用される場合、２つの物品（例えば、２つの層、例えばボトムレスアレイおよびベース層）に関する「接触」という用語は、接して利用可能な２つの物品の任意の部分を互いに物理的に接させることを意味する。例えば、２つの物品（例えば、層）の層状構成では、第１の物品の上面は、第２の物品の底面と接触し得る。
【０２６８】
本明細書で使用される場合、「結合した」という用語は、（例えば、接着剤による、ラミネーションによる、例えば熱ラミネーションによる）別の層へのある層の付着状態を指す。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、第１のボトムレスマイクロウェルアレイは、第１の多孔質膜を含む。いくつかの実施形態では、第１の多孔質膜は、ハイスループットで多孔質膜を介した液体の流れを供給するために十分に大きな孔径（例えば、平均孔径）であって、しかし、細胞および／またはビーズが多孔質膜を通過することを防止するために十分に小さな孔径（例えば、平均孔径）を有する。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、少なくとも１ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも３００ｎｍまたは少なくとも５００ｎｍの孔径（例えば、平均孔径）を有する。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、多くとも３ミクロン、多くとも２ミクロンまたは少なくとも１ミクロンの孔径（例えば、平均孔径）を有する。上記範囲の組み合わせも可能である（例えば、５ｎｍ〜３ミクロン、１ｎｍ〜１ミクロン、８０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲）。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、５０ｎｍ〜３ミクロンの範囲の孔径（例えば、平均孔径）を有する。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、１ｎｍ〜１０００ｎｍ（例えば、８０ｎｍ〜２００ｎｍ）の範囲の平均孔径（例えば、直径）を有する。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、多孔質膜は、細胞および／またはビーズが多孔質膜を通過し得ないように、細胞および／またはビーズの最大横寸法の十分に小さな倍数の孔径（例えば、平均孔径）を有する。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、細胞および／またはビーズの最大横寸法の少なくとも０．００１倍、少なくとも０．０１倍または少なくとも０．１倍の平均孔径を有する。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、細胞および／またはビーズの最大横寸法の多くとも０．２５倍、多くとも０．２倍または多くとも０．１５倍の平均孔径を有する。上記範囲の組み合わせも可能である（例えば、０．００１倍〜０．２５倍、０．０１倍〜０．２倍、０．１倍〜０．１５倍の範囲）。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、細胞および／またはビーズの最大横寸法の０．００１〜０．２５倍（例えば、０．００１〜０．１倍）の範囲の平均孔径を有する。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、細胞の最大横寸法の０．００１〜０．１倍の範囲の平均孔径を有する。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、ビーズの最大横寸法の０．００１〜０．１倍の範囲の平均孔径を有する。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、多孔質膜は、ハイスループットで多孔質膜を介した液体の流れを供給するために十分に高いフラックス速度を有する。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、少なくとも０．１ｍＬ／分／ｃｍ２、少なくとも０．５ｍＬ／分／ｃｍ２または少なくとも１ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度を有する。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、多くとも１００ｍＬ／分／ｃｍ２、多くとも１０ｍＬ／分／ｃｍ２または多くとも５ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度を有する。上記範囲の組み合わせも可能である（例えば、０．１ｍＬ／分／ｃｍ２〜１００ｍＬ／分／ｃｍ２、０．５ｍＬ／分／ｃｍ２〜１０ｍＬ／分／ｃｍ２、１ｍＬ／分／ｃｍ２〜５ｍＬ／分／ｃｍ２の範囲）。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、０．１ｍＬ／分／ｃｍ２〜１００ｍＬ／分／ｃｍ２の範囲のフラックス速度を有する。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、多孔質膜は、細胞およびビーズが通過しないが、膜を介した液体のフラックスを所望の値未満に減少させるほど高くないような機械的完全性を提供するために十分な厚さのものである。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、少なくとも５ミクロン、少なくとも１０ミクロンまたは少なくとも２０ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、多くとも５００ミクロン、多くとも２００ミクロンまたは多くとも１００ミクロンの厚さを有する。上記範囲の組み合わせも可能である（例えば、５ミクロン〜５００ミクロン、１０ミクロン〜２００ミクロン、２０ミクロン〜１００ミクロンの範囲）。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、５ミクロン〜５００ミクロンの範囲の厚さを有する。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、１０ミクロンの厚さを有する。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、多孔質膜は、例えば、第２の層の底面において、複数のスルーホールを含むドライフィルムフォトレジスト、例えばボトムレスマイクロウェルアレイの下にある（例えば、それに隣接して配置されている、接触している、直接接触している、接着している、結合している）。
【０２７４】
本明細書で使用される場合、「隣接」という用語は、互いに近くに配置されており、互いに接触してもよいしまたは接触しなくてもよい（例えば、間に介在層を有し得る）２つの物品（例えば、２つの層、例えばボトムレスアレイおよびベース層）を指す。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストは、複数のスルーホールを有する。いくつかの実施形態では、複数のスルーホールを含むドライフィルムフォトレジストは、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）を形成する。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストは均一な厚さを有する。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストは、多くともいくつかのビーズおよび／または細胞（例えば、単一のビーズおよび／または単一細胞）が、ドライフィルムフォトレジストのウェルおよび／またはスルーホールの内側にフィットするような厚さを有する。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストは、少なくとも５ミクロン、少なくとも１０ミクロンまたは少なくとも２０ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストは、多くとも５００ミクロン、多くとも２００ミクロンまたは多くとも１００ミクロンの厚さを有する。上記範囲の組み合わせも可能である（例えば、５ミクロン〜５００ミクロン、１０ミクロン〜２００ミクロン、２０ミクロン〜１００ミクロンの範囲）。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストは、５ミクロン〜５００ミクロンの範囲の厚さを有する。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストは、５ミクロン〜１００ミクロンの範囲の厚さを有する。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストは、５０ミクロンの厚さを有する。
【０２７８】
上部膜
いくつかの実施形態では、層状デバイス（例えば、マイクロ流体デバイス、例えば、ドライフィルムフォトレジストを含むウェルアレイ）は、第２の多孔質膜をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の多孔質膜は、層状デバイスのウェルをシーリングするためのものである。本明細書で使用される場合、「限外濾過膜」という用語は、高分子量分子（例えば、ＤＮＡ）の通過を排除するために十分に小さな孔径（例えば、平均孔径）を有する半透膜を指す。いくつかの実施形態では、限外濾過膜は、１０６Ｄａ未満またはそれに等しい（例えば、１０３〜１０６Ｄａまたはそれに等しい、１０３〜３＊１０５Ｄａまたはそれに等しい）分子量カットオフを有する。「分子量カットオフ」という用語は当業者に公知であり、分子の少なくとも９０％の膜の通過を防止する分子の最低分子量を指す。いくつかの実施形態では、限外濾過膜は、ポリマー（例えば、ポリスルホン、ポリプロピレン、酢酸セルロース、ポリ乳酸）および／またはセラミックを含む。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、第２の多孔質膜（例えば、限外濾過膜）は、細胞および少なくともいくつかの細胞内容物（例えば、高分子量分子、例えばＤＮＡ）の通過を排除するために十分に小さな平均孔径（例えば、直径）を有する。いくつかの実施形態では、第２の多孔質膜は、本明細書に記載される範囲（例えば、１ｎｍ〜２００ｎｍの範囲）の平均孔径を有する。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、第２の多孔質膜は、層状デバイスの他の構成要素（例えば、層）に対して層状デバイス中に位置する。例えば、いくつかの実施形態では、第２の多孔質膜は、層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）の上にあり、例えば、層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）の上面において層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト）と接触している。いくつかの実施形態では、第２の多孔質膜は、第２の層の上または下にある。例えば、いくつかの実施形態では、第２の多孔質膜は、第２の層（例えば、ドライフィルムフォトレジスト、ボトムレスマイクロウェルアレイ）の上面または底面と接触している。いくつかの実施形態では、第２の多孔質膜は、第２のボトムレスマイクロウェルアレイの上にある。いくつかの実施形態では、第２の多孔質膜は、第２のボトムレスマイクロウェルアレイと直接接触している。
【０２８１】
第２のボトムレスマイクロウェルアレイ
いくつかの実施形態では、層状デバイス（例えば、マイクロ流体デバイス、例えば、ドライフィルムフォトレジストを含むウェルアレイ）は、例えば、複数のスルーホールを含む第２のドライフィルムフォトレジスト（例えば、ボトムレスウェルアレイ、ボトムレスマイクロウェルアレイ）を含む。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、第２のドライフィルムフォトレジスト（例えば、第２のボトムレスマイクロウェルアレイ）は、第１のドライフィルムフォトレジスト（例えば、第１のボトムレスマイクロウェルアレイ）の上にある（例えば、それに隣接している、接触している、結合している）。いくつかの実施形態では、第２のドライフィルムフォトレジスト（例えば、第２のボトムレスマイクロウェルアレイ）は、第１のドライフィルムフォトレジスト（例えば、第１のボトムレスマイクロウェルアレイ）と直接接触している。いくつかの実施形態では、第２のドライフィルムフォトレジスト（例えば、第２のボトムレスマイクロウェルアレイ）は、第３の多孔質膜に結合している。いくつかの実施形態では、第２のボトムレスマイクロウェルアレイは、第２のドライフィルムフォトレジストを含む。いくつかの実施形態では、第２のドライフィルムフォトレジストは、第１のドライフィルムフォトレジストの上にあり（例えば、多孔質膜が間にあるか、またはより多くの層が間にあるか、または直接隣接および／もしくは接触している）、第２の複数のスルーホールを有する。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、層状デバイスは、互いに重なった層状構成で（例えば、互いに接触または結合している；例えば、多孔質膜が間にある）スルーホール（例えば、ボトムレスウェルアレイ、例えばボトムレスマイクロウェルアレイ）を含む少なくとも２つのドライフィルムフォトレジストを含む。いくつかの実施形態では、第１のボトムレスウェルアレイのスルーホール（例えば、ウェル）の少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％はそれぞれ、第１のボトムレスウェルアレイの各単一のスルーホール（例えば、ウェル）と流体連通している。いくつかの実施形態では、第１のボトムレスウェルアレイのスルーホール（例えば、ウェル）の多くとも１００％、多くとも９５％または多くとも８５％はそれぞれ、第１のボトムレスウェルアレイの各単一のスルーホール（例えば、ウェル）と流体連通している。上記範囲の組み合わせも可能である（例えば、７０％〜１００％、８０％〜９５％、８０％〜８５％の範囲）。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態では、第１のボトムレスウェルアレイのスルーホール（例えば、ウェル）の少なくとも９０％はそれぞれ、第１のボトムレスウェルアレイの各単一のスルーホール（例えば、ウェル）と流体連通している。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、第１のボトムレスウェルアレイ中のスルーホールの最大横寸法は、第２のボトムレスウェルアレイ中のスルーホールの最大横寸法よりも小さい。いくつかの実施形態では、第１のボトムレスウェルアレイ中のスルーホールの最大横寸法は１〜１０ミクロンであり、第２のボトムレスウェルアレイ中のスルーホールの最大横寸法は１５〜１００ミクロンである。いくつかの実施形態では、第１のボトムレスウェルアレイ中のスルーホールの最大横寸法は、第２のボトムレスウェルアレイ中のスルーホールの最大横寸法よりも大きい。いくつかの実施形態では、第１のボトムレスウェルアレイ中のスルーホールの最大横寸法は１５〜１００ミクロンであり、第２のボトムレスウェルアレイ中のスルーホールの最大横寸法は１〜１０ミクロンである。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、層状デバイス（例えば、マイクロ流体デバイス、例えば、ドライフィルムフォトレジストを含むウェルアレイ）は、第３の多孔質膜を含む。いくつかの実施形態では、第３の多孔質膜は、第２のドライフィルムフォトレジスト（例えば、スルーホールを含む；例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）の下にあり、および／または第１のドライフィルムフォトレジスト（例えば、スルーホールを含む；例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）の上にある。いくつかの実施形態では、第３の多孔質膜は、第１および／または第２のドライフィルムフォトレジスト（例えば、スルーホールを含む；例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）と直接接触している。いくつかの実施形態では、第３の多孔質膜は、第１のドライフィルムフォトレジスト（例えば、スルーホールを含む；例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）と、第２のドライフィルムフォトレジスト（例えば、スルーホールを含む；例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）との間にある。いくつかの実施形態では、第３の多孔質膜は、本明細書に記載される第１の多孔質膜の特性のいずれかを有する。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、層状デバイスのウェルは、本明細書に記載されるように、ビーズおよび／または細胞をさらに含む。
【０２８７】
層状デバイス（例えば、マイクロ流体デバイス、例えば、ドライフィルムフォトレジストを含むウェルアレイ）のいくつかの非限定的な実施形態がさらに詳細に記載される。しかしながら、本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態のみに限定されないと理解すべきである。その代わりに、本開示はそのように限定されないので、様々な開示される構成要素、物品、特徴および方法は、任意の適切な組み合わせで配置され得る。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、層状デバイスは、それぞれ円形または長方形断面を有する円筒形または長方形プリズム（例えば、矩形プリズム）の形状である複数のスルーホールを含むドライフィルムフォトレジストに付着したベース層（例えば、多孔質膜）を含む。この構成は図１０Ａおよび１０Ｄに示されている。
【０２８９】
図１０Ａは、特定の非限定的な実施形態による、ウェルアレイ１００の断面概略図である。示されているウェルアレイ１００は、第１の層１０２（例えば、多孔質膜）を含む。いくつかの実施形態では、第１の層１０２は多孔質膜であり、０．１ｍＬ／分／ｃｍ２〜１００ｍＬ／分／ｃｍ２の範囲のフラックス速度および／または５０ｎｍ〜３ミクロンの範囲の孔径を有する。示されているウェルアレイ１００はまた、第１の複数のスルーホール１０３を有する第１のドライフィルムフォトレジスト１０５を含む第１のボトムレスウェルアレイ１０４（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）を含む。第１の層１０２は、第１のボトムレスウェルアレイ１０４の底面１０６において、第１のボトムレスウェルアレイ１０４と接触している（例えば、それに隣接し配置されている、直接接触している、接着している、結合している）。アレイ１００の各ウェルは、第１の複数のスルーホール１０３の１つと、第１の層１０２を含む底面１０１とを含む。３つのウェルが示されており、ウェルは、ドライフィルムフォトレジストの平面に対して垂直な壁を有するとして示されているが、アレイは、一次元もしくは二次元で任意の適切な数のウェル（例えば、１、１０、１００、１０００個またはそれを超えるウェル）を含み得、ならびに／または任意の適切な形状（例えば、円筒形、長方形プリズム、矩形プリズム、円錐形または角錐形の形状）および／もしくはサイズ（例えば、最大横寸法）のウェルを含み得ると理解すべきである；例えば、図１０Ｃを参照のこと。他の範囲も可能である。アレイ１００は、例えば、アレイ１００を介して流れ方向１３１に、細胞および／またはビーズを含む液体を流すことにより、細胞および／またはビーズの超ポアソンローディングに使用され得る。
【０２９０】
図１０Ｄは、特定の非限定的な実施形態による、層状デバイス２００の断面概略図である。示されている層状デバイス２００は、ウェルアレイ２０４を含むドライフィルムフォトレジスト２０５を含む。いくつかの実施形態では、ウェルアレイ２０４中のウェルは、１５ミクロン〜１００ミクロンの範囲の最大横寸法２０９を有する。アレイ２０４中のウェルは、底部２０１（例えば、多孔質底部）を有する。底部２０１（例えば、多孔質底部）は、層２０２（例えば、多孔質膜）を含む。いくつかの実施形態では、底部２０１（例えば、多孔質底部）および／または層２０２（例えば、多孔質膜）は多孔質であり、０．１ｍＬ／分／ｃｍ２〜１００ｍＬ／分／ｃｍ２の範囲のフラックス速度および／または５０ｎｍ〜３ミクロンの範囲の孔径を有する。アレイは、一次元もしくは二次元で任意の適切な数のウェル（例えば、１、１０、１００、１０００個またはそれを超えるウェル）を含み得、ならびに／または任意の適切な形状（例えば、円筒形、長方形プリズム、矩形プリズム、円錐形または角錐形の形状）および／もしくはサイズ（例えば、最大横寸法）のウェルを含み得ると理解すべきである。他の範囲も可能である。アレイ２００は、例えば、アレイ２００を介して流れ方向２３１に、細胞および／またはビーズを含む液体を流すことにより、細胞および／またはビーズの超ポアソンローディングに使用され得る。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、層状デバイスは、それぞれ円形または長方形断面を有する円筒形または長方形プリズム（例えば、矩形プリズム）の形状である複数のスルーホールを含むドライフィルムフォトレジストを含み、このドライフィルムフォトレジストは、ベース層（例えば、多孔質膜）の底面に付着しており、第２層（例えば、限外濾過膜）の上面に付着している。この構成は図１０Ｂに示されている。
【０２９２】
図１０Ｂは、特定の非限定的な実施形態による、ウェルアレイ１０００の断面概略図である。示されているアレイ１０００は、アレイ１００の特徴を含み、第１のドライフィルムフォトレジスト１０５の上面１０７において、第１のドライフィルムフォトレジスト１０５と接触した第２の層１０８（例えば、多孔質膜）をさらに含む。第２の層１０８（例えば、多孔質膜）は、第１の層１０２のものと同じ平均孔径または異なる平均孔径を有し得る。第２の多孔質膜１０８は、例えば、流れ方向１３１に真空を適用することにより、アレイ１０００上に配置され得る。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、層状デバイスは、円錐形または角錐形の形状である、複数のスルーホールを含むドライフィルムフォトレジストに付着したベース層（例えば、多孔質膜）を含む。これは図１０Ｃに示されている。
【０２９４】
図１０Ｃは、特定の非限定的な実施形態による、ウェルアレイ８００の断面概略図である。示されているウェルアレイ８００は、第１の層８０２（例えば、多孔質膜）を含む。いくつかの実施形態では、第１の層８０２（例えば、多孔質膜）は、０．１ｍＬ／分／ｃｍ２〜１００ｍＬ／分／ｃｍ２の範囲のフラックス速度および／または５０ｎｍ〜３ミクロンの範囲の孔径を有する。示されているウェルアレイ８００はまた、第１の複数のスルーホール８０３を有する第１のドライフィルムフォトレジスト８０５を含む第１のボトムレスウェルアレイ８０４を含む。第１の層８０２（例えば、多孔質膜）は、第１のボトムレスウェルアレイ８０４の底面８０６において、第１のボトムレスウェルアレイ８０４と接触している（例えば、それに隣接し配置されている、直接接触している、接着している）。アレイ８００の各ウェルは、第１の複数のスルーホール８０３の１つと、第１の層８０２（例えば、多孔質膜）を含む表底面８０１とを含む。２つのウェルが示されているが、アレイは、一次元もしくは二次元で任意の適切な数のウェル（例えば、１、１０、１００、１０００個またはそれを超えるウェル）を含み得ると理解すべきである。示されているウェルは、各ウェルが、ドライフィルムフォトレジスト８０５の上面８０７において最大断面寸法８０９と、ドライフィルムフォトレジスト８０５の底面８０６において最小断面寸法８１３とを有するように、（例えば、円錐形の形状または角錐形の形状により）先細断面を有する。いくつかの実施形態では、ウェルは、ドライフィルムフォトレジスト８０５の上面８０７において、３５ミクロン〜１００ミクロンの範囲の最大断面寸法８０９を有する。いくつかの実施形態では、ウェルは、ドライフィルムフォトレジスト８０５の底面８０６において、０．５ミクロン〜３ミクロンの範囲の最小断面寸法８１３を有する。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジスト８０５は、３０ミクロン〜１００ミクロンまたはそれに等しい厚さ８１５を有する。他の範囲も可能である。アレイ８００は、例えば、アレイ８００を介して流れ方向８３１に、細胞および／またはビーズを含む液体を流すことにより、細胞および／またはビーズの超ポアソンローディングに使用され得る。いくつかの実施形態では、アレイ８００は、例えば、アレイ８００を介して流れ方向８３１に、細胞を含む液体を流し、次いで、ビーズを含む液体にアレイ８００を曝露する（例えば、ビーズをアレイに定着させ、アレイ８００を介して流れ方向８３１に、ビーズを含む液体を流す）ことにより、第１に（本明細書に記載される）細胞および次いで第２に（本明細書に記載される）ビーズの超ポアソンローディングに使用される。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、層状デバイスは、それぞれ円形または長方形断面を有する円筒形または長方形プリズム（例えば、矩形プリズム）の形状である複数のスルーホールを含む第１のドライフィルムフォトレジストを含み、この第１のドライフィルムフォトレジストは、ベース層（例えば、多孔質膜）の底面に付着しており、第２のドライフィルムフォトレジストの上面に付着しており、第２のドライフィルムフォトレジストは、それぞれ円形または長方形断面を有する円筒形または長方形プリズム（例えば、矩形プリズム）の形状である複数のスルーホールを含み、第１のドライフィルムフォトレジスト中の１つ以下のスルーホールは、第２のドライフィルムフォトレジスト中の１つ以下のスルーホールとオーバーラップし、第１のドライフィルムフォトレジスト中の７０％〜１００％またはそれに等しい（例えば、７０％〜８５％またはそれに等しい）スルーホールは、第２のドライフィルムフォトレジスト中の各スルーホールとオーバーラップする。これは図１０Ｅに示されている。
【０２９６】
図１０Ｅは、特定の非限定的な実施形態による、層状デバイス３００（例えば、マイクロ流体デバイス）の断面概略図である。示されている層状デバイス３００は、第１の複数のスルーホール３０３を含む第１のボトムレスウェルアレイ３０４を含む。いくつかの実施形態では、第１の複数のスルーホール３０３は、１ミクロン〜５００ミクロンの範囲の最大横寸法（例えば、３０９）を有する。第１のボトムレスウェルアレイ３０４は、第２の複数のスルーホール３１３を含む第２のボトムレスウェルアレイ３１４と接触している（例えば、結合している）。いくつかの実施形態では、第２の複数のスルーホール３１３は、１ミクロン〜５００ミクロンの範囲の最大横寸法（例えば、３１１）を有する。第１のボトムレスウェルアレイ３０４はまた、第１の層３０２（例えば、多孔質膜）と接触している（例えば、結合している）。アレイは、一次元もしくは二次元で任意の適切な数のウェル（例えば、１、１０、１００、１０００個またはそれを超えるウェル）を含み得、ならびに／または任意の適切な形状（例えば、円筒形、長方形プリズム、矩形プリズム、円錐形または角錐形の形状）および／もしくはサイズ（例えば、最大横寸法）のウェルを含み得ると理解すべきである。他の範囲も可能である。アレイ３００は、例えば、アレイ３００を介して流れ方向３３１に、細胞および／またはビーズを含む液体を流すことにより、細胞および／またはビーズの超ポアソンローディングに使用され得る。いくつかの実施形態では、アレイ３００は、図１０Ｃのアレイ８００のものと同様の方法を使用して、例えば、アレイ３００を介して流れ方向３３１に、細胞を含む液体を流し、次いで、ビーズを含む液体にアレイ３００を曝露する（例えば、ビーズをアレイに定着させ、アレイ３００を介して流れ方向３３１に、ビーズを含む液体を流す）ことにより、第１に（本明細書に記載される）細胞および次いで第２に（本明細書に記載される）ビーズの超ポアソンローディングに使用される。いくつかの実施形態では、層状デバイスは、ボトムレスウェルアレイ３０４とボトムレスウェルアレイ３１４との間の多孔質膜、および／またはボトムレスウェルアレイ３１４の上部にある多孔質膜をさらに含む。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、層状デバイスは、それぞれ円形または長方形断面を有する円筒形または長方形プリズム（例えば、矩形プリズム）の形状である複数のスルーホールを含む第１のドライフィルムフォトレジストを含み、この第１のドライフィルムフォトレジストは、ベース層（例えば、多孔質膜）の底面に付着しており、多孔質膜の上面に付着しており、この多孔質膜の上面は、第２のドライフィルムフォトレジストに付着しており、第２のドライフィルムフォトレジストは、それぞれ円形または長方形断面を有する円筒形または長方形プリズム（例えば、矩形プリズム）の形状である複数のスルーホールを含み、第１のドライフィルムフォトレジスト中の１つ以下のスルーホールは、第２のドライフィルムフォトレジスト中の１つ以下のスルーホールとオーバーラップし、第１のドライフィルムフォトレジスト中の７０％〜１００％またはそれに等しい（例えば、７０％〜８５％またはそれに等しい）スルーホールは、第２のドライフィルムフォトレジスト中の各スルーホールとオーバーラップし、第１のドライフィルムフォトレジスト中のスルーホールの少なくとも７０％（例えば、少なくとも８０％、８０％〜８５％の範囲）はそれぞれ、単一のビーズにより占有されている。
【０２９８】
本明細書で使用される場合、「第１」および「第２」の特徴および／または層（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ、複数のスルーホール）という特徴用語は、層状デバイス内の異なる特徴および／または層を指し、その特徴および／または層の位置に関して限定することを意味しないと認識すべきである。さらに、いくつかの実施形態では、図に示されているものに加えて、さらなる特徴および／または層（例えば、「第３」、「第４」、「第５」、「第６」または「第７」の特徴）が存在し得る。いくつかの実施形態では、図に示されているすべての特徴および／または層が存在する必要はないと認識すべきである。
【０２９９】
本明細書で使用される場合、「上」および「下」という記述語は、層状構成を指し、方向特異的ではないが、アレイが保持される角度に応じて上または下であり得る。「上」または「下」は層状化を意味するが、必ずしも直接接触を意味しない；１つまたはそれを超える介在層があり得る。
【０３００】
製造方法
本明細書に記載されるフリースタンディングフォトレジストフィルム、例えば層状デバイス（例えば、マイクロ流体デバイス、例えば、ドライフィルムフォトレジストを含むウェルアレイ）を作製する方法が提供される。
【０３０１】
本明細書で使用される場合、「フリースタンディングフォトレジストフィルム」は、スルーホールを含む本明細書に記載される任意のドライフィルムフォトレジストを含み、スルーホールは、ドライフィルムフォトレジストをフォトマスク以外の固体支持体に付着させずに、ドライフィルムフォトレジストをＵＶ光に曝露することにより生成される。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、方法は、ドライフィルムフォトレジストをフォトマスクとアライメントすることを含む。
【０３０３】
本明細書で使用される場合、２つの層（例えば、フォトレジストおよびフォトマスク）の「アライメント」という用語は、２つの各層の平面が互いに平行になるように、層状構成で２つの層を配置することを意味する。いくつかの実施形態では、２つのアライメント層は、空間および／または２つの層間の１つまたはそれを超える介在層を有する。いくつかの実施形態では、２つのアライメント層は互いに接触している。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストは、デバイス製造中に、基板により支持されない。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、前記方法は、必要に応じて基礎支持体を用いずに、ドライフィルムフォトレジストの表面をフォトマスクに直接ラミネートすることを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、ドライフィルムフォトレジストの表面から剥離ライナー（例えば、ポリオレフィン剥離ライナー）を除去することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、ラミネーションの直前に剥離ライナーを除去することを含む。いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストの表面をフォトマスクに直接ラミネートすることは、ドライフィルムフォトレジストの表面をフォトマスクの表面と接触させること；ならびにドライフィルムフォトレジストおよびフォトマスクを摂氏６０度〜摂氏８０度の範囲の温度（例えば、摂氏６０度〜７０度またはそれに等しい、摂氏６５度）に、ドライフィルムフォトレジストの表面をフォトマスクの表面に結合させるために十分な期間にわたって曝露することを伴う。他の温度範囲も可能である。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、ドライフィルムフォトレジストの表面をフォトマスクに直接ラミネートすることは、０．１ｍ／分〜０．５ｍ／分（例えば、０．２ｍ／分〜０．４ｍ／分；０．３０４８ｍ／分＝１ｆｔ／分）の範囲の速度で、ドライフィルムフォトレジストをフォトマスクに直接熱ラミネートすることを伴う。他の曝露速度範囲も可能である。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、前記方法は、フォトマスクを介して、ドライフィルムフォトレジストの少なくとも１つの部分を紫外線（ＵＶ）光に、１分間〜１０分間（例えば、２分間〜８分間、２分間〜３分間、２．５分間）の範囲の時間にわたって曝露することを含む。他の期間も可能である。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、フォトマスクを介して、ドライフィルムフォトレジストの少なくとも１つの部分をＵＶ光に曝露することは、ドライフィルムフォトレジストに形成されたボトムレスウェルアレイのウェル（例えば、マイクロウェル）が円錐形の形状になるように、ドライフィルムフォトレジストの表面に対して垂直方向から０度〜４５度の範囲の角度でＵＶ光を向けることを含む。いくつかのこのような実施形態では、フォトマスクを介して、ドライフィルムフォトレジストの少なくとも１つの部分をＵＶ光に曝露することは、フォトマスクおよびドライフィルムフォトレジストの平面に対して垂直な軸上で曝露中にフォトマスクおよびドライフィルムフォトレジストをスピンすることを含む。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、フォトマスクを介して、ドライフィルムフォトレジストの少なくとも１つの部分をＵＶ光に曝露することは、ディフューザーをフォトマスクの直前の光路（例えば、ＵＶ光路）に置き（ここで、光路は、フォトマスクのドライフィルムフォトレジストとは反対側を起点とする）、それにより、ドライフィルムフォトレジストに形成されたボトムレスウェルアレイのウェル（例えば、マイクロウェル）が円錐形の形状になるように、ドライフィルムフォトレジストの表面に対して垂直方向から０度〜４５度の範囲の角度でＵＶ光を向けることを含む。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、円錐形の形状であるボトムレスウェルアレイ中のウェル（例えば、マイクロウェル）は、反応性イオンエッチングまたはＵＶ裏面曝露フォトリソグラフィー技術により、ドライフィルムフォトレジストに形成される。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、フォトマスクに付着したドライフィルムフォトレジストを電磁放射（例えば、光）に曝露した後（例えば、電磁放射に曝露したフォトレジストの領域を架橋した後）、前記方法は、フォトマスクを介して、ドライフィルムフォトレジストおよび／またはフォトマスク（例えば、フォトマスクがドライフィルムフォトレジストに付着している場合）を摂氏８０度〜摂氏１００度の範囲の温度（例えば、摂氏８５度〜摂氏９５度、摂氏９５度）に、ＵＶ光に曝露したドライフィルムフォトレジストの少なくとも１つの部分を架橋するために十分な期間にわたって曝露することをさらに含む。他の温度範囲も可能である。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、前記方法は、ドライフィルムフォトレジストおよび／またはフォトマスク（例えば、フォトマスクがドライフィルムフォトレジストに付着している場合）を摂氏８０度〜摂氏１００度の範囲の温度（例えば、摂氏８５度〜摂氏９５度、摂氏９５度）に、１分間〜３０分間の範囲の時間（例えば、５分間〜２５分間、１０分間〜２０分間、１５分間）にわたって曝露することを含む。他の温度および期間範囲も可能である。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、方法は、ドライフィルムフォトレジストおよび／またはフォトマスク（例えば、フォトマスクがドライフィルムフォトレジストに付着している場合）を摂氏１０度〜摂氏３０度の範囲の温度（例えば、摂氏１５度〜摂氏２５度、摂氏２０度）に、（例えば、少なくとも１つの架橋部分を含む）ドライフィルムフォトレジストおよびフォトマスクを前記温度に冷却するために十分な期間にわたって曝露することを含む。他の温度範囲も可能である。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、方法は、（例えば、少なくとも１つの架橋部分を含む）ドライフィルムフォトレジストおよび／またはフォトマスク（例えば、フォトマスクがドライフィルムフォトレジストに付着している場合）を摂氏１０度〜摂氏３０度の範囲の温度（例えば、摂氏１５度〜摂氏２５度、摂氏２０度）に、３０分間〜９０分間の範囲の時間（例えば、４０分間〜７０分間、５０分間〜７０分間、６０分間）にわたって曝露することを含む。他の温度および期間範囲も可能である。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、方法は、ドライフィルムフォトレジストおよび／またはフォトマスクを現像液に曝露することをさらに含む。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、方法は、ドライフィルムフォトレジストおよび／またはフォトマスクを現像液に、ドライフィルムフォトレジストからドライフィルムフォトレジストの非架橋部分を除去するために十分な期間にわたって曝露することを含む。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、方法は、ドライフィルムフォトレジストおよび／またはフォトマスクを現像液に、１分間〜３０分間の範囲（例えば、１０分間〜３０分間、２０分間）の時間にわたって曝露することを含む。他の期間範囲も可能である。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、現像液は現像溶媒を含む。現像液としては、限定されないが、シクロヘキサノール、シクロヘキサノン、プロピレングリコールおよびメチルエーテルアセテートが挙げられる。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、方法は、現像液中でフォトマスクから第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストをデラミネートすることを含む。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、方法は、現像ドライフィルムフォトレジストを洗浄することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、現像ドライフィルムフォトレジストをイソプロパノールで洗浄することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、現像ドライフィルムフォトレジストをイソプロパノールで、第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストから残存現像液を除去するために十分な期間にわたって洗浄することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、現像ドライフィルムフォトレジストをイソプロパノールで、１分間〜１０分間（例えば、２分間〜８分間、３分間〜７分間、５分間）の範囲の時間にわたって洗浄することを含む。他の期間範囲も可能である。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、方法は、現像ドライフィルムフォトレジストを空気乾燥することを含む。
【０３２２】
フォトマスク
いくつかの実施形態では、フォトマスクはポリマーを含む。いくつかの実施形態では、フォトマスクはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）を含む。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、フォトマスクは、現像液への曝露中に、ドライフィルムフォトレジストがフォトマスクから剥離するように設計される。いくつかのこのような実施形態では、フォトマスクは、現像中にドライフィルムフォトレジストがフォトマスクから剥離するような（例えば、特徴の最大ピッチにより表される）特徴密度を有する。対照的に、例えば、フォトマスクが特徴を有しない場合（例えば、その全表面積が、曝露される電磁放射の波長または波長範囲に対して透過性である場合）、フォトレジストは依然として、現像液中でフォトマスクに結合しており、除去困難であり得る。いくつかの実施形態では、フォトマスク中の特徴の最大ピッチを減少させることにより、フォトマスクとドライフィルムフォトレジストの架橋部分との間の相互作用の表面積は減少する。本明細書で使用される場合、「ピッチ」という用語は、例えば、実体のアレイについて、実体（例えば、特徴、ウェル）間の中心間距離を指す。理論に縛られるものではないが、フォトレジストとフォトマスクとの間の結合が、現像液により容易に破壊されるような、フォトマスク中の特徴のより低いピッチは、アクセス可能な領域間の距離が短くなって、現像液が、表面領域全体にわたってフォトレジスト／フォトマスクインターフェースにアクセスすることができることをもたらすと考えられる。いくつかの実施形態では、フォトマスクの特徴は、任意の２つの隣接特徴間で２ｍｍの最大ピッチを有する。いくつかの実施形態では、フォトマスクのパターン化領域は、フォトレジストフィルムの領域よりも大きい。理論に縛られるものではないが、いくつかの実施形態では、２ｍｍの最大ピッチと、フォトマスクの領域の少なくとも１０％をカバーする特徴と、フォトマスクのパターン化領域がフォトレジストフィルムの領域よりも大きいこととの組み合わせは、現像液中のフォトレジストからのフォトマスクの完全な剥離を容易にすると考えられる。対照的に、標準的なアプローチは、フォトマスクのパターン化領域をフォトレジストの中心に置くことを伴い、パターンの端部周囲の領域はパターン化されていない。この標準的なアプローチを本明細書に記載される方法と組み合わせた場合、フォトレジストの端部は、現像液中でフォトマスクから剥離し得ず、フィルムを損傷させずにフォトマスクから剥離することが困難であり得る。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、フォトマスクは、任意の２つの隣接特徴間で２ｍｍの最大ピッチを有する特徴（例えば、これは、ドライフィルムフォトレジストを含むボトムレスウェルアレイ中のウェルの壁を形成するスルーホールであり、本明細書ではフォトマスクの「ウェル」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、フォトマスクは、フォトマスクの表面に沿って任意の方向に２ｍｍまたはそれ未満ごとに特徴を含む。いくつかの実施形態では、フォトマスクは、少なくとも１ミクロン、少なくとも１０ミクロン、少なくとも２０ミクロンまたは少なくとも５０ミクロンのピッチを有する特徴を有する。いくつかの実施形態では、フォトマスクは、多くとも２ｍｍ、多くとも１ｍｍ、多くとも５００ミクロンまたは多くとも２００ミクロンのピッチを有する特徴を有する。上記範囲の組み合わせも可能である（例えば、１ミクロン〜２ｍｍ、１０ミクロン〜１ｍｍ、２０ミクロン〜５００ミクロンの範囲）。他の範囲も可能である。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、フォトマスク上の特徴（例えば、「ウェル」）は、フォトマスクの面積の少なくとも１０％およびフォトマスクの面積の多くとも９９．９％（例えば、５０％）を占有する。いくつかの実施形態では、フォトマスク上の「ウェル」は、フォトマスクの面積の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％を占有する。いくつかの実施形態では、フォトマスク上の「ウェル」は、フォトマスクの面積の多くとも９９．９％、多くとも９９％、多くとも９０％、多くとも８０％、多くとも７０％または多くとも６０％を占有する。上記範囲の組み合わせも可能である（例えば、１０％〜９９．９％、２０％〜９０％、３０％〜８０％の範囲）。他の範囲も可能である。
【０３２６】
本明細書で使用される場合、フォトマスクの「特徴」という用語は、例えば、フォトマスクを使用したフォトリソグラフィーにより形成されたドライフィルムフォトレジスト中のウェルの横位置に対応するフォトマスクの遮蔽部分（例えば、電磁照射の波長範囲の光、またはフォトマスクおよび／もしくはドライフィルムフォトレジストが曝露される光に対して不透過性の部分）を指す。
【０３２７】
層状デバイス
いくつかの実施形態では、前記方法は、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）をベース層と接触させて、ウェルアレイを形成することをさらに含む。
【０３２８】
いくつかの実施形態では、ベース層は、プラスチックシート、アクリルプラスチックシート、ＤＮＡマイクロアレイ、シリコーンエラストマーシート、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）または多孔質膜（例えば、第１の多孔質膜、例えば本明細書に記載される第１の多孔質膜）またはそれらの組み合わせを含む。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、方法は、（例えば、接着剤により、熱ラミネーションにより）ベース層をボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）の底面に結合させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ベース層をボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）の底面に熱ラミネートすることを含む（例えば、ベース層が多孔質膜を含む実施形態）。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、方法は、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）およびベース層を収納部に封入することを含む。いくつかの実施形態では、収納部はポリスチレンを含む。収納部の他の材料も可能である。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、前記方法は、ビーズをウェルアレイまたはボトムレスマイクロウェルアレイにロードすることをさらに含む。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、方法は、ボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）またはウェルアレイを、その上面において、本明細書に記載される第２の多孔質膜と接触させることを含む。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、前記方法は、第２の多孔質膜を、その曝露面において、第２のボトムレスマイクロウェルアレイと接触させる（例えば、配置する、結合させる、熱ラミネートする）ことをさらに含む。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、方法は、第１のボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）を、その上面において、第２のボトムレスマイクロウェルアレイと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、第２のボトムレスマイクロウェルアレイは、本明細書に記載される方法により生産される。
【０３３５】
いくつかの実施形態では、方法は、第１のボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）を第２のボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）とランダムにアライメントすることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、第１のボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）を第２のボトムレスウェルアレイ（例えば、ボトムレスマイクロウェルアレイ）と熱ラミネートすることを含む。
【０３３６】
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載される方法によりフォトマスクを使用して、（本明細書に記載される）ドライフィルムフォトレジストに（本明細書に記載される）複数のスルーホールを形成して（本明細書に記載される）第１のボトムレスウェルアレイを形成すること、および第１のボトムレスウェルアレイをベース層（例えば、多孔質膜）と接触（例えば、付着、結合）させてウェルアレイを形成することを伴う。いくつかの実施形態では、前記方法は、ビーズをウェルアレイにロードすることをさらに伴う。いくつかの実施形態では、前記方法は、第１のボトムレスウェルアレイの上面を多孔質膜と接触させることをさらに伴う。いくつかの実施形態では、前記方法は、多孔質膜の上面を第２のボトムレスウェルアレイと接触させることをさらに伴う。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載される方法によりフォトマスクを使用して、（本明細書に記載される）ドライフィルムフォトレジストに（本明細書に記載される）複数のスルーホールを形成して（本明細書に記載される）第１のボトムレスウェルアレイを形成すること、および第１のボトムレスウェルアレイをベース層（例えば、多孔質膜）と接触（例えば、付着、結合）させてウェルアレイを形成することを伴う。いくつかの実施形態では、前記方法は、第１のボトムレスウェルアレイの１つ以下のウェルが第２のボトムレスウェルアレイの１つ以下のウェルとオーバーラップし、第１のボトムレスウェルアレイのウェルの少なくとも７０％が第２のボトムレスウェルアレイの各ウェルとオーバーラップするように、第１のボトムレスウェルアレイの上面を第２のボトムレスウェルアレイと接触させることをさらに伴う。
【０３３８】
層状デバイスの使用
有利には、本明細書に記載される層状デバイス（例えば、マイクロ流体デバイス、例えば、ドライフィルムフォトレジストを含むウェルアレイ）は、限定されないが、本明細書に記載されるものを含む様々なタイプの単一細胞分析に使用され得る。例えば、本明細書に記載される層状デバイス（例えば、マイクロ流体デバイス、例えば、ドライフィルムフォトレジストを含むウェルアレイ）のいずれかを介して、複数の細胞および／または複数のビーズを含む第１の流体を流して、細胞ロードおよび／またはビーズロードマイクロウェルアレイを形成し得る。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、デバイスを介して第１の流体を流し、第１の流体はビーズを含む。いくつかの実施形態では、デバイスを介して第１の流体を流し、第１の流体は細胞を含む。いくつかの実施形態では、デバイスを介して第１の流体を流し、第１の流体はビーズおよび細胞を含む。いくつかの実施形態では、デバイスを介して第２の流体を流し、第２の流体はビーズを含む。いくつかの実施形態では、デバイスを介して第２の流体を流し、第２の流体は細胞を含む。
【０３４０】
超ポアソンローディング
単一細胞分析のための伝統的なアレイの欠点は、細胞および／またはビーズがポアソン分布でアレイにロードされることである。本明細書で使用される場合、「ポアソン分布」は、これらの事象が既知の平均速度で発生し、互いに独立する場合に、一定の時間または空間で発生するいくつかの事象の確率を表す離散確率分布である。ポアソン分布の式は以下のとおりである：ｆ（ｋ；λ）＝（ｅ−λλｋ／ｋ！）（式中、ｋは、事象の発生数であり、λは、所定間隔中の予想発生数の正の実数である）。いくつかの実施形態では、ラテラルデバイスがポアソン分布で細胞ロードされる場合、（例えば、第１および／もしくは第２のボトムレスマイクロウェルアレイまたは第１および／もしくは第２のウェルアレイ）のウェルの少なくとも１％は、１つを超える細胞を有するであろう。いくつかの実施形態では、ラテラルデバイスがポアソン分布で細胞ロードされる場合、ウェルの１％〜４０％、例えば１〜１０％または１％〜２％、例えば１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％は、１つを超える細胞を有するであろう。いくつかの実施形態では、ラテラルデバイスがポアソン分布でビーズロードされる場合、ウェルの少なくとも１％は、１つを超えるビーズを有するであろう。いくつかの実施形態では、ラテラルデバイスがポアソン分布でビーズロードされる場合、ウェルの１％〜４０％、例えば１〜１０％または１％〜２％、例えば１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％は、１つを超えるビーズを有するであろう。いくつかの実施形態では、ラテラルデバイスがポアソン分布で細胞ロードされる場合、ウェルの少なくとも１０％は、細胞を有しないであろう。いくつかの実施形態では、ラテラルデバイスがポアソン分布で細胞ロードされる場合、ウェルの１０％〜４０％、例えば１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％は、細胞を有しないであろう。いくつかの実施形態では、ラテラルデバイスがポアソン分布でビーズロードされる場合、ウェルの少なくとも１０％は、ビーズを有しないであろう。いくつかの実施形態では、ラテラルデバイスがポアソン分布でビーズロードされる場合、ウェルの１０％〜４０％、例えば１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％は、ビーズを有しないであろう。
【０３４１】
したがって、ラテラルデバイスがポアソン分布で細胞ロード（またはビーズロード）される場合、すべてのウェルが単一細胞（または単一のビーズ）を含有するわけではないので、すべてのウェルが使用可能であり得るかまたは有用な「単一細胞」（または「単一のビーズ」）情報を提供し得るわけではないことが明らかであろう。したがって、ロードをポアソン分布で行う場合、アレイ中のウェルのほとんどは使用不可能であることも明らかである。これは、細胞および／またはビーズの重大な浪費につながり、これらのいずれかまたは両方は希少および／または高価であり得る。本明細書で提供されるアレイおよびそれらの使用方法（超ポアソン分布を含む）は、ポアソンベース分析のこの短所に対するロバストな解決策を提供する。
【０３４２】
したがって、対照的に、本明細書で提供される層状デバイスでは、いくつかの実施形態では、層の１つまたはそれよりも多くは、超ポアソン分布でロードされた細胞および／またはビーズである。本明細書で使用される場合、「超ポアソン分布」は、これらの事象が既知の平均速度で発生し、互いに独立する場合に、一定の時間または空間で平均速度で発生するいくつかの事象の確率が、ポアソン分布におけるよりも大きいことを意味する。例えば、アレイがビーズをロードされており、平均ローディングがウェル当たり１つのビーズである場合、ポアソンロードアレイは、同じ数のビーズをロードされた超ポアソンロードアレイよりも、１つのビーズを有するウェルが少なく、０または２つまたはそれを超えるビーズを有するウェルが多いであろう。いくつかの実施形態では、ラテラルデバイスが超ポアソン分布で細胞ロードされる場合、ウェルの５％超（またはそれを超える）は、同じ数の細胞をポアソン分布で細胞ロードされたラテラルデバイスよりも、１つの細胞を有する。いくつかの実施形態では、ラテラルデバイスが超ポアソン分布で細胞ロードされる場合、（例えば、第１および／もしくは第２のボトムレスマイクロウェルアレイまたは第１および／もしくは第２のウェルアレイの）ウェルの１〜２０％超、例えば１％、５％、１０％、１５％または２０％超は、同じ数の細胞をポアソン分布で細胞ロードされたラテラルデバイスよりも、１つの細胞を有する。換言すれば、超ポアソンローディングは、ポアソンローディングと比較して多くの数の数の使用可能なウェル（例えば、単一細胞および／または単一のビーズを有するもの）をもたらす。同様に、いくつかの実施形態では、ラテラルデバイスが超ポアソン分布でビーズロードされる場合、ウェルの５％超（またはそれを超える）は、同じ数のビーズをポアソン分布でビーズロードされたラテラルデバイスよりも、１つのビーズを有する。いくつかの実施形態では、ラテラルデバイスが超ポアソン分布でビーズロードされる場合、ウェルの１〜２０％超、例えば１％、５％、１０％、１５％または２０％超は、同じ数のビーズをポアソン分布で細胞ロードされたラテラルデバイスよりも、１つのビーズを有する。いくつかの実施形態では、ラテラルデバイスへのビーズの超ポアソンローディングは、１つのビーズのみがウェルにフィットするようなビーズの直径の１〜１．５倍の範囲の最大横寸法を有するウェルを含むようにラテラルデバイスを形成することにより達成される。
【０３４３】
ロードビーズおよび／または細胞の超ポアソン分布は、層状デバイスを介して流体を流すことから生じる。実際、デバイスが多孔質底部を有する実施形態では、デバイスを介して流体を（例えば、ウェルの上部から底部に）流すことができる。デバイスを介して液体を流すことは、デバイスの底部に向かって細胞および／またはビーズがウェルに流れることを引き起こす。いくつかの実施形態では、細胞および／またはビーズは、それがウェルの底部に流れたらウェルをブロックして、流速の減少を引き起こすであろう。これは、ウェルが、１つを超える細胞／またはビーズをロードされる可能性を減少させるであろう。例えば、これは図１２Ｄで例証されており、アレイ７１４の第１の層は、細胞７２２がアレイに入って多孔質膜７０２をブロックするサイズのウェルを有し、それにより、流れが減少していないウェルと比べて、他の細胞がウェルに入る可能性が減少するように、ウェルを介した流れを減少させる。
【０３４４】
いくつかの実施形態では、（例えば、第１および／もしくは第２のボトムレスマイクロウェルアレイまたは第１および／もしくは第２のウェルアレイの）ウェルの２５％もしくはそれよりも多く、３０％もしくはそれよりも多く、４０％もしくはそれよりも多く、５０％もしくはそれよりも多く、６０％もしくはそれよりも多く、７０％もしくはそれよりも多く、８０％もしくはそれよりも多くまたは９０％もしくはそれよりも多くは、単一細胞をロードされる。いくつかの実施形態では、ウェルの約２５％もしくはそれよりも多く、約３０％もしくはそれよりも多く、約４０％もしくはそれよりも多く、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９９％は、単一細胞をロードされる。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、（例えば、第１および／もしくは第２のボトムレスマイクロウェルアレイまたは第１および／もしくは第２のウェルアレイの）ウェルの２５％もしくはそれよりも多く、３０％もしくはそれよりも多く、４０％もしくはそれよりも多く、５０％もしくはそれよりも多く、６０％もしくはそれよりも多く、７０％もしくはそれよりも多く、８０％もしくはそれよりも多くまたは９０％もしくはそれよりも多くは、単一ビーズをロードされる。いくつかの実施形態では、ウェルの約２５％もしくはそれよりも多く、約３０％もしくはそれよりも多く、約４０％もしくはそれよりも多く、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９９％は、単一ビーズをロードされる。
【０３４６】
いくつかの実施形態では、（例えば、第１および／もしくは第２のボトムレスマイクロウェルアレイまたは第１および／もしくは第２のウェルアレイの）ウェルの２５％もしくはそれよりも多く、３０％もしくはそれよりも多く、４０％もしくはそれよりも多く、５０％もしくはそれよりも多く、６０％もしくはそれよりも多く、７０％もしくはそれよりも多く、８０％もしくはそれよりも多くまたは９０％もしくはそれよりも多くは、単一ビーズおよび単一細胞をロードされる。いくつかの実施形態では、ウェルの約２５％もしくはそれよりも多く、約３０％もしくはそれよりも多く、約４０％もしくはそれよりも多く、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９９％は、単一ビーズおよび単一細胞をロードされる。
【０３４７】
様々な方法でウェルを介して、細胞および／またはビーズを含有する流体を流し得る。例えば限定されないが、アレイの流れ方向に真空を適用するか、またはアレイを介して流れ方向に圧力を液体に適用することにより、例えば、アレイを遠心分離することにより、アレイを介して細胞を流し得る。
【０３４８】
いくつかの実施形態では、アレイを介して、細胞および／またはビーズを、３０分間もしくはそれ未満、２５分間もしくはそれ未満、２０分間もしくはそれ未満、１５分間もしくはそれ未満または１０分間もしくはそれ未満にわたって流す。いくつかの実施形態では、アレイを介して、細胞および／またはビーズを、１〜１０分間、例えば約１〜５分間または１〜５分間にわたって流す。
【０３４９】
いくつかの実施形態では、アレイを介して、細胞および／またはビーズを、２０℃〜４０℃、例えば２５℃〜３５℃、例えば約３０℃で流す。
【０３５０】
いくつかの実施形態では、流速は、０．０１〜１００ｍＬ／分、例えば０．０５〜５０ｍＬ／分、例えば０．１〜１０ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、流速は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍＬ／分である。
【０３５１】
ビーズおよび／または細胞ロードデバイスの構成
いくつかの実施形態では、ビーズ／および／または細胞層状デバイス（例えば、マイクロ流体デバイス、例えば、ドライフィルムフォトレジストを含むウェルアレイ）は、本明細書に記載される任意のデバイスである。例示的なビーズおよび／または細胞ロードデバイスは、図１２Ａ〜１２Ｃに示されている。
【０３５２】
図１２Ａは、多孔質膜に接触した第１のボトムレスマイクロウェルアレイを有する層状デバイス（例えば、マイクロ流体デバイス、例えば、ドライフィルムフォトレジストを含むウェルアレイ）を表し、アレイの各ウェルはビーズを含む。図１２Ａは、特定の非限定的な実施形態による、層状デバイス４００（例えば、マイクロ流体デバイス）の断面概略図である。示されている層状デバイス４００は、基板４０２と接触した（例えば、熱ラミネーションにより結合した）ボトムレスウェルアレイ４０４を含む。基板４０２は、非限定的な例として、ガラス、プラスチック、エラストマー（例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ））および／または多孔質膜を含み得る。基板４０２は、非限定的な例として、良好な光学的透明度を有する、例えば、タンパク質アッセイおよび／または組織トランスクリプトミクスに有用なガラスまたはプラスチックを含み得る。いくつかの実施形態では、層状デバイス４００は、製造されるアレイ当たり１米ドル（ＵＳＤ）未満のコストである。いくつかの実施形態では、ボトムレスウェルアレイ４０４は、本明細書に記載される方法（例えば、フォトリソグラフィープロセス）により、長さ０．３０４８ｍ×幅０．９１４４ｍのスケールで作製され、より小さなマイクロウェルアレイを形成するようにダイシングされる。マイクロウェルアレイ４０４中のウェル（本明細書に記載されるウェルであり得る）はそれぞれ、ビーズ４２０（本明細書に記載されるビーズであり得る）を含む。いくつかの実施形態では、マイクロウェルアレイ４０４のウェルの少なくとも７０％はビーズを含む。デバイスは、ビーズを含んでもよいしまたは含まなくてもよい。アレイは、一次元もしくは二次元で任意の適切な数のウェル（例えば、１、１０、１００、１０００個またはそれを超えるウェル）を含み得、ならびに／または任意の適切な形状（例えば、円筒形、長方形プリズム、矩形プリズム、円錐形または角錐形の形状）および／もしくはサイズ（例えば、最大横寸法）のウェルを含み得ると理解すべきである。他の範囲も可能である。
【０３５３】
図１２Ｂは、各ウェルがビーズおよび細胞を含むことを除いて同様の単層デバイスを示す。図１２Ｂは、特定の非限定的な実施形態による、層状デバイス５００（例えば、マイクロ流体デバイス）の断面概略図である。示されている層状デバイス５００は、多孔質膜５０２（本明細書に記載される多孔質膜であり得る）と接触した（例えば、熱ラミネーションにより結合した）ボトムレスウェルアレイ５０４を含む。マイクロウェルアレイ５０４中のウェル（本明細書に記載されるウェルであり得る）はそれぞれ、ビーズ５２０（本明細書に記載されるビーズであり得る）を含む。いくつかの実施形態では、多孔質膜５０２は、２００ｎｍ〜３ミクロン（例えば、２００ｎｍ〜４００ｎｍ）またはそれに等しいサイズ範囲の孔を有する。いくつかの実施形態では、マイクロウェルアレイ５０４のウェルの少なくとも７０％はビーズを含む。マイクロウェルアレイ５０４中のいくつかのウェル（本明細書に記載されるウェルであり得る）は、細胞５２２（本明細書に記載される細胞であり得る）を含む。いくつかの実施形態では、マイクロウェルアレイ５０４中のウェルの少なくとも７０％は細胞を含む。デバイスは、ビーズおよび／または細胞を含んでもよいしまたは含まなくてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロウェルアレイ５０４を介して流れ方向５３１に、細胞および／またはビーズを含む液体を流すことにより（例えば、マイクロウェルアレイを介して真空を引き出すことにより）、細胞および／またはビーズをロードした。いくつかの実施形態では、例えば、流れ方向５３１に真空を引き出すことにより、限外濾過膜５０８をマイクロウェルアレイ５０４の上面５０７と接触（例えば、付着、結合）させる。この層状デバイス５００を完全自動液体ハンドラーと接続して、細胞および／またはビーズをロードし得る。アレイは、一次元もしくは二次元で任意の適切な数のウェル（例えば、１、１０、１００、１０００個またはそれを超えるウェル）を含み得、ならびに／または任意の適切な形状（例えば、円筒形、長方形プリズム、矩形プリズム、円錐形または角錐形の形状）および／もしくはサイズ（例えば、最大横寸法）のウェルを含み得ると理解すべきである。他の範囲も可能である。
【０３５４】
図１２Ｃの構成では、デバイスは、ボトムレスマイクロウェルアレイの二重層（例えば、第１のボトムレスマイクロウェルアレイおよび第２のボトムレスマイクロウェルアレイ）を有し、底部層上のビーズ（例えば、１５〜１００ミクロンの直径）にフィットするように構成されたウェルと、上部層上の細胞（例えば、１〜１０ミクロンの直径）にフィットするように構成されたウェルとを有する第１のボトムレスマイクロウェルアレイの底部に結合した多孔質膜をさらに含む。図１２Ｃは、特定の非限定的な実施形態による、層状デバイス６００（例えば、マイクロ流体デバイス）の断面概略図である。示されている層状デバイス６００は、第１の多孔質膜６０２（本明細書に記載される多孔質膜であり得る）および第２の多孔質膜６１２（本明細書に記載される多孔質膜であり得る）と接触した（例えば、熱ラミネーションにより結合した）ボトムレスウェルアレイ６０４を含む。マイクロウェルアレイ６０４中のウェル（本明細書に記載されるウェルであり得る）はそれぞれ、ビーズ６２０（本明細書に記載されるビーズであり得る）を含む。いくつかの実施形態では、第１の多孔質膜６０２および／または第２の多孔質膜６１２は、２００ｎｍ〜３ミクロン（例えば、２００ｎｍ〜４００ｎｍ）のサイズ範囲の孔を有する。いくつかの実施形態では、マイクロウェルアレイ６０４中のウェルの少なくとも７０％はビーズを含む。第２の多孔質膜６１２は、マイクロウェルアレイ６１４と接触している。マイクロウェルアレイ６１４中のウェル（本明細書に記載されるウェルであり得る）はそれぞれ、細胞６２２（本明細書に記載される細胞であり得る）を含む。デバイスは、細胞を含んでもよいしまたは含まなくてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロウェルアレイ６０４中のウェルの少なくとも７０％は細胞を含む。示されているマイクロウェルアレイ６１４中の各ウェルは、マイクロウェルアレイ６０４中の対応するウェルとオーバーラップする。いくつかの実施形態では、マイクロウェルアレイ６１４中の７０％〜８５％またはそれに等しいウェルは、（例えば、２つのマイクロウェルアレイのランダムアライメントにより）マイクロウェルアレイ６０４中の対応するウェルとオーバーラップする。いくつかの実施形態では、マイクロウェルアレイ６０４および６１４中のウェルの最大横寸法およびピッチは、マイクロウェルアレイ６０４中の多くとも１つのウェルが、マイクロウェルアレイ６１４中の対応するウェルとオーバーラップし得るようなものである。いくつかの実施形態では、マイクロウェルアレイ６０４のウェルは、２０ミクロン〜５００ミクロンの範囲（例えば、５０ミクロン）の最大横寸法を有し、マイクロウェルアレイ６１４のウェルは、１ミクロン〜１０ミクロンの範囲（例えば、５ミクロン）の最大横寸法を有する。いくつかの実施形態では、層状デバイス６００を介して流れ方向６３１に、細胞および／またはビーズを含む液体を流すことにより（例えば、マイクロウェルアレイを介して真空を引き出すことにより）、細胞および／またはビーズをロードした。いくつかの実施形態では、ビーズを含む液体にデバイス６００を曝露することにより（例えば、ビーズをデバイスに定着させることにより）、例えば、多孔質膜６０２およびマイクロウェルアレイ６０４を含むが、示されている他の構成要素を含まない層状デバイス６００の一部を介して流れ方向６３１に、ビーズを含む液体を流すことにより（例えば、マイクロウェルアレイ６０４を介して真空を引き出すことにより、アレイを遠心分離することにより）、ビーズをロードした。次いで、いくつかの実施形態では、層状デバイス６００に示されているように、第２の多孔質膜６１２およびマイクロウェルアレイ６１４を配置した（例えば、一緒に結合させた）。いくつかの実施形態では、流れ方向６３１に細胞を含む液体を流すことにより（例えば、層状デバイス６００を介して真空を引き出すことにより）、細胞をロードした。理論に縛られるものではないが、細胞をウェルにロードしたら、それはウェルの基部を詰まらせて、ウェルを介したフラックスを排除し、それにより、第２の細胞のロードを妨害すると考えられる。いくつかの実施形態では、例えば、流れ方向６３１に真空を引き出すことにより、限外濾過膜６０８を層状デバイス６００の上面６０７と接触（例えば、付着、結合）させる。この層状デバイス６００を完全自動液体ハンドラーと接続して、細胞および／またはビーズをロードし得る。アレイは、一次元もしくは二次元で任意の適切な数のウェル（例えば、１、１０、１００、１０００個またはそれを超えるウェル）を含み得、ならびに／または任意の適切な形状（例えば、円筒形、長方形プリズム、矩形プリズム、円錐形または角錐形の形状）および／もしくはサイズ（例えば、最大横寸法）のウェルを含み得ると理解すべきである。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態では、細胞を溶解させ、溶解後、各細胞の内容物は、マイクロウェルアレイ６１４中のウェルから、おそらくビーズを含有するマイクロウェルアレイ６０４中の対応する隣接ウェルに拡散する（例えば、マイクロウェルアレイ６０４中のウェルの７０％またはそれよりも多くは、ビーズを含有する）。
【０３５５】
このようなアレイを製造するために、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して、デバイスを介して、複数のビーズを含む第１の流体を流すことにより、底面において第１の多孔質膜に結合した第１のボトムレスマイクロウェルアレイにビーズをロードする。次いで、本明細書に記載される方法を使用して、ビーズロードした第１のボトムレスマイクロウェルアレイに第２のボトムレスマイクロウェルアレイをシーリングし、次いで、本明細書に記載される方法を使用して、デバイスを介して、複数の細胞を含む第２の流体を流すことにより、第２のボトムレスマイクロウェルアレイに細胞をロードする。
【０３５６】
図１２Ｄの構成では、デバイスは、ボトムレスマイクロウェルアレイの二重層（例えば、第１のボトムレスマイクロウェルアレイおよび第２のボトムレスマイクロウェルアレイ）を有し、底部層上の細胞（例えば、１〜１０ミクロンの直径）にフィットするように構成されたウェルと、上部層上の細胞（例えば、１５〜１００ミクロンの直径）にフィットするように構成されたウェルとを有する第１のボトムレスマイクロウェルアレイの底部に結合した多孔質膜をさらに含む。図１２Ｄは、特定の非限定的な実施形態による、層状デバイス７００（例えば、マイクロ流体デバイス）の断面概略図である。示されている層状デバイス７００は、第１の多孔質膜７０２（本明細書に記載される多孔質膜であり得る）および第２のボトムレスウェルアレイ７０４と接触した（例えば、熱ラミネーションにより、例えば結合した）第１のボトムレスウェルアレイ７１４を含む。いくつかの実施形態では、第１の多孔質膜７０２は、２００ｎｍ〜３ミクロン（例えば、２００ｎｍ〜４００ｎｍ）またはそれに等しいサイズ範囲の孔を有する。いくつかの実施形態では、第２のボトムレスウェルアレイ７０４は、限外濾過膜７０８と接触している（例えば、熱ラミネーションにより、例えば結合している）。マイクロウェルアレイ７１４中のウェル（本明細書に記載されるウェルであり得る）はそれぞれ、細胞７２２（本明細書に記載される細胞であり得る）を含む。マイクロウェルアレイ７０４中のウェル（本明細書に記載されるウェルであり得る）はそれぞれ、ビーズ７２０（本明細書に記載されるビーズであり得る）を含む。層状デバイス７００は、ビーズおよび／または細胞を含んでもよいしまたは含まなくてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロウェルアレイ７１４中のウェルの少なくとも７０％は細胞を含む。いくつかの実施形態では、マイクロウェルアレイ７０４中のウェルの少なくとも７０％はビーズを含む。示されているマイクロウェルアレイ７１４中の各ウェルは、マイクロウェルアレイ７０４中の対応するウェルとオーバーラップする。いくつかの実施形態では、マイクロウェルアレイ７１４中の７０％〜８５％またはそれに等しいウェルは、（例えば、２つのマイクロウェルアレイのランダムアライメントにより）マイクロウェルアレイ７０４中の対応するウェルとオーバーラップする。いくつかの実施形態では、マイクロウェルアレイ７０４および７１４中のウェルの最大横寸法およびピッチは、マイクロウェルアレイ７０４中の多くとも１つのウェルが、マイクロウェルアレイ７１４中の対応するウェルとオーバーラップし得るようなものである。いくつかの実施形態では、層状デバイス７００を介して流れ方向７３１に、細胞および／またはビーズを含む液体を流すことにより（例えば、マイクロウェルアレイを介して真空を引き出すことにより）、細胞および／またはビーズをロードした。いくつかの実施形態では、流れ方向７３１に、細胞を含む液体を流すことにより（例えば、層状デバイス７００を介して真空を引き出すことにより）、細胞をロードした。理論に縛られるものではないが、細胞をウェルにロードしたら、いくつかの実施形態では、それはウェルの基部を詰まらせて、ウェルを介したフラックスを排除し、それにより、第２の細胞のロードを妨害すると考えられる。次いで、いくつかの実施形態では、ビーズを含む液体にデバイス７００を曝露することにより（例えば、ビーズをデバイスに定着させることにより）、例えば、層状デバイス７００を介して流れ方向７３１に、ビーズを含む液体を流すことにより（例えば、層状デバイス７００を介して真空を引き出すことにより）、ビーズをロードした。いくつかの実施形態では、例えば、流れ方向７３１に真空を引き出すことにより、限外濾過膜７０８を層状デバイス７００の上面と接触（例えば、付着、結合）させる。この層状デバイス７００を完全自動液体ハンドラーと接続して、細胞および／またはビーズをロードし得る。アレイは、一次元もしくは二次元で任意の適切な数のウェル（例えば、１、１０、１００、１０００個またはそれを超えるウェル）を含み得、ならびに／または任意の適切な形状（例えば、円筒形、長方形プリズム、矩形プリズム、円錐形または角錐形の形状）および／もしくはサイズ（例えば、最大横寸法）のウェルを含み得ると理解すべきである。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態では、細胞を溶解させ、溶解後、各細胞の内容物は、マイクロウェルアレイ７１４中のウェルから、おそらくビーズを含有するマイクロウェルアレイ７０４中の対応する隣接ウェルに拡散する（例えば、マイクロウェルアレイ７０４中のウェルの７０％またはそれよりも多くは、ビーズを含有する）。
【０３５７】
単一細胞の特性評価
本明細書に記載される細胞ロードおよび／またはビーズロード層状デバイス（例えば、マイクロ流体デバイス、例えば、ドライフィルムフォトレジストを含むウェルアレイ）は、様々なタイプの生化学単一細胞分析に使用され得る。例えば、ラテラルデバイスは、ウェル中で実施される細胞溶解などのハイスループット生化学分析、および続いてＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＤＮＡ−ｓｅｑ、質量分析、ＡＴＡＣ−ｓｅｑ、バイサルファイトシークエンシング、免疫ＰＣＲ、インサイチューシークエンシング、ローリングサークル増幅、インサイチューハイブリダイゼーション、近接伸長アッセイ、免疫蛍光、ＥＬＩＳＡ、逆ＥＬＩＳＡ、複数置換反応、ＤＮａｓｅ感受性、ｃｈｉｐ−ｓｅｑ、または（例えば、国際特許出願第ＰＣＴ  ＵＳ１７／１３７１９号または国際公開第２０１８／１３２６３５号（これらの全内容はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような）単一細胞分析のための従来のアレイと共に使用するための当技術分野で公知の方法を使用した任意の他のゲノムアッセイの１つまたはそれよりも多くに使用され得る。
【０３５８】
いくつかの実施形態では、細胞は細菌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はマウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は霊長類細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は非哺乳動物細胞であり、原核細胞または他の真核細胞であり得る。細胞（または核酸源）は、天然に存在するものであり得るか、またはそれは、天然に存在しないものであり得る。天然に存在しない核酸の例は、合成的に生産された細胞である。
【０３５９】
いくつかの実施形態では、層状デバイスに細胞および／またはビーズをロードした後、多孔質膜、例えば本明細書に記載される限外濾過膜でそれを上面でシーリングする。本明細書に記載される方法を使用して、例えば、加熱プレスもしくはＰＣＲ機を用いて、または膜を層状デバイスの上部と接触させ、固体表面、例えばガラススライドを膜の上部に置き、層状デバイスをスライドにクランピングすることにより、膜をシーリングする。いくつかの実施形態では、層状デバイスをスライドに、３０分間またはそれを超えて、例えば３０分間〜２時間、例えば約１時間にわたってクランピングする。
【０３６０】
いくつかの実施形態では、溶解バッファーを層状デバイスの上部に適用することにより、ラテラルデバイス内の細胞を溶解させる。例示的な溶解バッファーは当技術分野で公知であり、塩酸グアニジンが挙げられる。ラテラルデバイス内で細胞は溶解され、溶解バッファーを洗い流し得る間に、膜は、ラテラルデバイス内の細胞の内容物を保持する。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、前記方法は、溶解細胞のタンパク質および／または核酸を分析することをさらに含む。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、次いで、各細胞の単一細胞トランスクリプトームを単離する。これは、最初に、ウェルに存在するバーコード化ビーズ上の溶解細胞により放出されたｍＲＮＡ分子をキャプチャーすることにより達成される。キャプチャー後、ビーズ（およびしたがってウェル）のユニークなバーコードは、各単一細胞からｃＤＮＡライブラリーを作るプロセスにおいて、キャプチャーされたｍＲＮＡ転写産物からの逆転写を使用して合成された（したがって前記転写産物に相補的な）第１鎖ｃＤＮＡに組み込まれる。したがって、ビーズバーコードは、同じ単一細胞由来のすべてのキャプチャーされた転写産物を同一にマーキング（または標識）する。次いで、バーコード化ｃＤＮＡライブラリーは、その単一細胞起源に関してマーキングされた各ｃＤＮＡと組み合わせられ得、全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）および次いでシークエンシングを受け得る。
【０３６３】
例示的な実施形態
スケーラブルな製造方法およびフィルムの作製方法を使用して作製され得るフリースタンディングフォトレジストフィルムが本明細書で提供される。伝統的に、フォトレジストフィルムは、フォトレジストの液体コーティングが基板上にコーティングされ得るように支持をフォトレジストに提供する基板上で製造される。伝統的な方法を使用してフリースタンディングフォトレジストフィルムを製造するためには、フォトレジストフィルムを基板と分離するかまたはそれから「リフトオフ」するが、これは、煩雑なプロセスを必要とし、スケーラブルではない。本明細書で提供される方法は、これらの制限を克服した。
【０３６４】
フリースタンディングフォトレジストフィルムを製造する方法が本明細書で提供される。前記方法は、フォトレジストフィルムをフォトマスクでラミネートすること、フォトマスクを介してフォトレジストフィルムを曝露してフォトレジストの一部を強化すること、フォトレジストの未強化部を除去すること（現像工程）、およびフォトマスクからフォトレジストフィルムを分離することなどのいくつかの工程を含み得る。フォトレジストフィルムは、ネガティブまたはポジティブフォトレジストフィルムであり得、フォトレジストのタイプに応じて、適切な光源、例えば電子ビーム、紫外線（ＵＶ）または他の短波長光源が強化に使用され得る。本明細書に記載されるフォトマスクは、限定されないが、反復特徴、非反復特徴、固体特徴、陰影特徴、アレイ（例えば、円、矩形、長方形、楕円形、三角形および五角形のアレイ）、文字および図を含む複数の特徴を含み得る。本明細書で使用される場合、「特徴距離」という用語は、（ｉ）特徴の端部間の距離および（ｉｉ）特徴の端部とフォトマスクの端部との間の距離の両方を指す。
【０３６５】
したがって、本明細書に記載されるフォトマスクのいくつかは、５、４、３、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２または０．１ｍｍ以下の最大特徴距離を有し、本明細書に記載されるフォトマスクのいくつかは、３、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．１または０．０１ｍｍ以上の最大特徴距離を有する。いくつかの場合では、フォトマスクの最大特徴距離は、約２、１．５または１ｍｍである。曝露プロセス中に、フォトマスクは、フォトレジストフィルムの表面またはフォトレジストフィルムの曝露面の最小パーセンテージをカバーし得る。例えば、フォトマスクは、表面の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％をカバーし得る。別の例では、フォトマスクは、表面全体またはフォトレジストフィルムの曝露面全体をカバーし得る。さらに、フォトマスクのいくつかは、フォトレジストフィルムの表面の最大パーセンテージが光源に曝露される（すなわち、ネガティブフォトレジストの場合、フォトレジストの表面の最大パーセンテージが強化される）という特徴カバレッジを有し得る。例えば、フォトレジストの強化部は、表面積でフォトレジストの多くとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％または７５％であり得る。
【０３６６】
フォトレジストフィルムおよびフォトマスクのラミネートを、事前選択光源からの１つまたはそれを超えるタイプの放射線または光に、フィルムを強化するために十分な時間にわたって曝露し、それにより、強化部およびいくつかの未強化部を有するフォトレジストフィルムを形成し得る。ネガティブフォトレジストフィルムの場合、強化は、重合または架橋してそれぞれ重合部または架橋部を作ることを伴い得る。強化部は溶解剤に対して実質的に耐性であるので、現像プロセス中に除去されない。現像工程中に、フォトレジストを現像し、例えば、それを溶解剤に溶解させることにより、未強化部を除去する。製造方法は、フォトマスクからフォトレジストフィルムを分離する分離工程を含み得る。分離は、現像工程と同時にまたはその後に発生し得、それは、自然にまたは操作により発生し得る。いくつかの実施形態では、フォトレジストが現像されている際に、分離は自然に発生する。当業者は、ポジティブフォトレジストフィルムの場合、曝露部が可溶性になり得、現像工程中に除去され得ることを理解することに留意すべきである。前記方法は、フォトレジストから剥離ライナーを除去することをさらに含み得る。剥離ライナーは、ラミネーション後、例えば、曝露工程または現像工程の前または後に除去され得る。
【０３６７】
一態様では、フォトレジストフィルムおよびフォトマスクを含む無基板二層ラミネートが本明細書で提供され、このラミネートから、フリースタンディングフォトレジストフィルムが生産され得る。曝露後、フォトレジストフィルムは、強化部および未強化部を含み得、強化部は、現像プロセスにおいて使用される溶解剤に対して実質的に耐性である。溶解剤と接触すると、未強化部は溶解して、複数のスルーホールなどのパターンを形成する。スルーホールは、表面積でフォトレジストの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％または９０％を占有し得る。
【０３６８】
フォトレジストフィルムは、上面および底面を含み得、それは、強化（例えば、架橋）部および未強化（例えば、非架橋）部とを含み得る。フォトレジストフィルムのいくつかでは、未強化（例えば、非架橋）部を溶解剤（または現像剤）で除去して、上面から底面まで複数のスルーホールを形成し得、各ホールは、上面上の上開口部と、底面上の底開口部とを有する。一般に、現像段階中に、現像剤により、フォトレジストの未強化部を除去して、フォトレジスト上にパターン、例えば六角形にパッキングされた複数のスルーホールを作り得る。
【０３６９】
フォトレジストフィルムのいくつかは、少なくともまたは多くとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００ミクロンの厚さを有し得る。複数のスルーホールは、上開口部の平均直径および底開口部の平均直径を有し得る；２つの平均直径は、同じものまたは異なるものであり得る。フォトレジストフィルムのいくつかは、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、２００または５００ミクロンの上開口部、底開口部または両開口部の平均直径を有する。フォトレジストフィルムのいくつかは、多くとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、２００または５００ミクロンの上開口部、底開口部または両開口部の平均直径を有する。上開口部の幾何形状および底開口部の幾何形状は、矩形、円、長方形、三角形、五角形、六角形、七角形、八角形または他の幾何形状から選択され得る。加えて、フォトレジストフィルムの複数のスルーホールは、円筒、立方体、直方体、円錐、三角錐、四角錐または三角柱の形状を有し得る。さらに、フォトレジストのスルーホールの壁は、機能的壁面、例えば国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１７／１３７９１号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものを含み得る。いくつかの用途では、スルーホールのサイズおよび形状は、スルーホール当たり１つの細胞または１つのビーズを保持するように構成される。
【０３７０】
本明細書に記載される方法により作製されたフォトレジストフィルムは、様々な用途に使用され得る。例えば、ピコウェル、マイクロウェルまたはボトムレスマイクロウェルアレイはフリースタンディングフォトレジストフィルムを含み得るか、またはフリースタンディングフォトレジストフィルムである。一態様では、マイクロウェルデバイスは、フォトレジストフィルムおよび多孔質底部膜を含み得る。多孔質底部膜は、フォトレジストフィルムの底面と接触し得る。マイクロウェルデバイスはまた、必要に応じて互いに結合した２つのフォトレジストフィルム（第１のフォトレジストフィルムおよび第２のフォトレジストフィルム）を平行に含み得、第２のフォトレジストフィルムの底面は、第１のフォトレジストフィルムの上面に面している。２つのフォトレジストフィルムのスルーホールのサイズは、同じものまたは異なるものであり得る；例えば、第１のフィルムのスルーホールは、第２のフィルムのスルーホールよりも大きいまたは小さいものであり得、それらは、同じまたは異なる形状および幾何形状を有し得る。デバイスのいくつかは、第１および第２のフォトレジストフィルム間に多孔質膜を含み得；デバイスのいくつかは、第２のフォトレジストフィルムの上面に固体または多孔質のいずれかの膜を含み得る。
【０３７１】
記載される多孔質膜は、所望の膜フラックスを有し得る。例えば、多孔質膜は、１０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）の水の初期フラックス速度により測定した場合に、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度を有し得、この水は、事前に濾過されていてもよいしまたは濾過されてなくてもよい。別の例では、多孔質膜は、１０ｐｓｉの水の初期フラックス速度により測定した場合に、多くとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または２００ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度を有し得る。多孔質膜は、ドライフィルム膜またはヒドロゲル系膜であり得る。
【０３７２】
多孔質膜は、目的の物体、例えば細胞、ビーズ、ゲノム、核酸、ウイルス、核、タンパク質、ペプチドまたは他の生体高分子を保持するように構成され得る。細胞は、細菌、植物または動物、例えば哺乳動物細胞であり得る。細胞は、血液細胞、例えば白血球（例えば、単球、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球およびマクロファージ）、赤血球（エリスロサイト）または血小板であり得る。血液細胞分析に適用可能ないくつかの方法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１３４４３号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。細胞はまた、健常細胞または非健常細胞（例えば、感染細胞または腫瘍細胞）であり得る。したがって、用途に応じて、多孔質膜は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００または１０００ｎｍの平均孔径を有し得る。多孔質膜はまた、多くとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１０００または５０００ｎｍの平均孔径を有し得る。
【０３７３】
マイクロウェルデバイスは、フォトレジストフィルムの上面と接触した組織切片をさらに収容し得る。マイクロウェルデバイスはまた、スルーホール中にビーズ（例えば、スルーホール当たり１つまたはそれを超えるビーズがプレロードされるかまたは細胞の後にロードされる）および／または細胞を含み得る。
【０３７４】
一態様では、フォトレジストフィルムを含むボトムレスマイクロウェルアレイが本明細書で提供される。マイクロウェルアレイは、上面と、底面と、上面から底面への複数のスルーホールとを含み得、各ホールは、上面上の上開口部と、底面上の底開口部とを有する。アレイがフォトレジストフィルムを含むかにかかわらず、ボトムレスマイクロウェルアレイを使用する方法が本明細書でさらに提供される。
【０３７５】
一態様では、細胞ローディングの方法が本明細書で提供される。前記方法は、ボトムレスマイクロウェルアレイと、マイクロウェルアレイの底面と接触した多孔質底部膜とを含むマイクロアレイデバイスを介して、複数の細胞を含む流体サンプルを流すことを含み得る。細胞ローディングの方法は、重力により、または複数のスルーホールの少なくとも１つの上開口部から底開口部に圧力勾配を適用して、単一細胞を少なくとも１つのスルーホールにロードすることにより、細胞をロードすることを含み得る。圧力勾配は、真空の適用または流体流れの強制を含む任意の手段により生成され得る。前記方法は、圧力勾配を適用することにより、細胞を少なくとも１つのスルーホールの底部に保持することを含み得る。細胞をスルーホールの底部に保持すると、スルーホール内の圧力勾配は、例えば、ホール当たり単一の細胞のみがロードされるように、第２の細胞のローディングを誘導するために不十分なレベルに減少され得る。前記方法は、例えば、流体流れにより非ロード細胞が除去され得、ロード細胞が保持され得るように、細胞を保持している間に、マイクロウェルアレイを反転させることをさらに含み得る。前記方法はまた、マイクロウェルアレイを反転させる際に、細胞またはマイクロウェルアレイを洗浄することをさらに含み得る。加えて、前記方法は、反転マイクロウェルアレイを逆転させることをさらに含み得、逆転後、圧力勾配を必要に応じて除去し得る。細胞ローディングの方法を使用して、複数のスルーホールの少なくとも一部に、スルーホール当たり単一細胞をロードし得る。
【０３７６】
一態様では、単離された細胞を培養または保存する方法が本明細書で提供される。前記方法は、マイクロアレイデバイスを介して、複数の細胞を含む流体サンプルを流すことを含み得る。前記方法はまた、重力により、または圧力勾配の適用により、複数の細胞の少なくとも１つの細胞をスルーホールにロードすることを含み得る。前記方法は、マイクロウェルアレイを介して培地を流すこと、および／または複数のスルーホールの少なくとも一部が、上部、底部または両開口部を介して培地と流体接続されるように、マイクロウェルアレイを培地に浸漬することをさらに含み得る。培地は、バッファー、細胞培養培地または固定液であり得る。いくつかの用途では、多孔質上部膜は、マイクロウェルアレイの上面の上に適用され得る。シークエンシングなどの特定の用途では、前記方法は、マイクロウェルアレイを介して、複数のビーズを含む流体サンプルを流すことを含み得る。前記方法は、マイクロアレイをある温度で１日、１週間、１カ月間、６カ月間または１年間を超えて貯蔵することをさらに含み得、温度は周囲温度であり得るか、または４０℃、３０℃、２０℃、１０℃、０℃、−１０℃、−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃もしくは−８０℃未満もしくはそれを超える任意の温度であり得る。
【０３７７】
一態様では、組織切片を分析する、例えば、組織切片中の転写産物を空間的に位置決定する方法が本明細書で提供される。前記方法は、組織切片を、マイクロアレイデバイスであって、ボトムレスマイクロウェルアレイ（例えば、フォトレジストフィルム）と、マイクロウェルアレイの底面と接触した多孔質底部膜とを含むマイクロアレイデバイスと接触させることを含み得る。複数のスルーホールの一部は、１つもしくはそれを超えるバーコード化転写産物キャプチャービーズ、および／またはマイクロアレイ上の既知の位置を有するユニークな空間バーコードを含む１つもしくはそれを超える機能表面を含み得る。前記方法は、組織がマイクロウェルアレイに付着する前または後のいずれかに、スルーホールを水和することを含み得る。いくつかのデバイスでは、より良好な水和は、組織切片が付着する前にスルーホールを水和することにより達成され得る。前記方法は、転写産物からｃＤＮＡ配列を生成すること、および／または転写産物キャプチャービーズに結合した空間バーコードのプライマー伸長により、ビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子を生成することをさらに含み得る。前記方法は、ｃＤＮＡ中のビーズバーコードをビーズバーコード：空間バーコードハイブリッド分子とマッチングして、マイクロアレイ上の転写産物を位置決定することをさらに含み得る。
【０３７８】
当業者は、デバイスを使用およびアセンブルする様々な方法を認識することに留意すべきである；デバイスを完全にアセンブルする前または後に、サンプル（例えば、細胞または組織）をデバイスに付着させ得るかまたはそれにロードし得る。上記プロセスの代替の１つとして、組織切片分析を例にとると、組織をボトムレスマイクロウェルアレイの上面に付着させ、続いて、ビーズの有無にかかわらず水和し、次いで、多孔質膜をマイクロウェルアレイの底面に適用し得る。ビーズをプレロードしない場合、底部多孔質膜が付着する前に、それらをロードできる。同様の原理は、細胞およびビーズなどの他のサンプルに適用される。デバイスが、２つもしくはそれを超えるフォトレジストフィルムまたは２つもしくはそれを超える多孔質膜を含む場合、デバイスおよびサンプルをアセンブルする順序もまた、サンプルのタイプおよび用途に応じ変動し得る；すべてが本開示により包含される。
【０３７９】
一態様では、単一細胞分析キットは、それぞれがフォトレジストフィルムおよび少なくとも１つの多孔質膜を含む１つまたはそれを超えるマイクロアレイを含み得る。キットは、限定されないが、第２の多孔質膜、メンブレンアプリケーター、マイクロアレイホルダー、メンブレンフレーム、ハイブリダイゼーションチャンバープレート、バッファー、細胞培養培地、固定液、ビーズ、マニュアルクランプ、クラウディング剤、ＤＮＡポリメラーゼ、サーモサイクラーアダプターまたはそれらの任意の組み合わせを含むさらなる構成要素を含み得る。キットのいくつかでは、ビーズは、マイクロアレイの１つまたはそれよりも多くにプレロードされる（例えば、スルーホール当たり１つのビーズ）。
【０３８０】
キット
いくつかの場合では、分析のためのサンプルの調製に関連する手動処理および操作の量を減少させることが望ましい場合がある。これは、サンプルの処理に関連する時間を減少させるだけではなく、サンプルの処理コストを削減するために役立ち得る。例えば、サンプルの処理のための構成要素を含むキットは、バルク処理のための複数のマイクロウェルアレイをロードするために実践者に提供され得る。任意の数の異なる方法およびキットがこのような用途に使用され得るが、キットの可能な実施形態（ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｅｍｏｂｉｄｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｋｉｔｓ）およびそれらの使用は以下にさらに詳述される。
【０３８１】
図１４は、生物学的サンプルを処理するためのキットの一実施形態を示す。キットは、ベースプレート７００、１つもしくはそれを超える膜を含み得るメンブレンプレート７０２、ハイブリダイゼーションプレート７０４、カバー７０６、コレクションプレート７０８、ハイブリダイゼーションバッファー７１０、溶解バッファー７１２、それらの組み合わせ、および／または任意の他の適切な構成要素もしくは解決手段の１つまたはそれよりも多くを含み得る。いくつかの実施形態では、キットはまた、キットを使用して生物学的サンプルを処理するための取扱説明書を含み得る。
【０３８２】
図１５および１６は、ベースプレート７００の２つの可能な実施形態を示す。ベースプレートは、ベースプレートの表面、例えば上面に形成された複数のレセプタクルを含み得る。各レセプタクルは、その中にマイクロウェルアレイを収容するサイズおよび形状であり得る。例えば、図１５に示されているように、各レセプタクルが、個々のマイクロウェルアレイが配置され得る底面を含むように、レセプタクルは、ベースプレートの上面に形成された陥凹７１４であり得る。いくつかの場合では、陥凹は、マイクロウェルアレイがレセプタクル内に完全に収容されるように十分に深いものであり得る。このような実施形態は、個々のウェルがアレイ全体に広がらない閉鎖底部を有するマイクロウェルアレイで有用であり得る。別の実施形態では、ベースプレートは、複数のスルーホール７１６および周囲リップ７１８の形態でレセプタクルを含み得る。個々のスルーホールおよびリップは、その中にマイクロウェルアレイを収容および支持するサイズおよび形状であり得る。このような実施形態では、ベースプレートに配置されたマイクロウェルアレイの底面は、スルーホールの底開口部を介して環境に曝露され得る。このような実施形態は、前述のように、マイクロウェルアレイがアレイに完全に広がるマイクロウェルを含む用途において有用であり得る。しかしながら、これらの別個のベースプレートが、アレイに完全に広がるマイクロウェルを有するおよび／または有しない異なるタイプのマイクロウェルアレイと共に使用される実施形態も企図されるが、本開示はそのように限定されない。
【０３８３】
図１７は、ベースプレートに形成された複数のレセプタクルをカバーするように、ベースプレートの表面に付着するように構成された１つまたはそれを超える膜７２２を含むメンブレンプレートの１つの可能な実施形態を示す。いくつかの場合では、これは、ベースプレートに付着し得る単一のメンブレンシートに単に対応し得る。しかしながら、いくつかの場合では、支持を１つまたはそれを超える膜に提供すること、および／または複数のレセプタクルの相互分離を支援することが望ましい場合がある。例えば、メンブレンプレートは、１つまたはそれを超える膜が配置および付着された複数のリブ７２０ａまたは他の構造を有するフレーム７２０を含み得る。さらに、図に示されているように、リブまたは他の構造は、レセプタクルを含むベースプレートの表面上に配置された場合に、それらが、ベースプレートの個々のレセプタクルの周辺を取り囲むようにレイアウトされる。ベースプレートに適切に結合している場合、メンブレンプレートは、１つまたはそれを超える膜の分離部分を介してレセプタクル中のアレイに出入りする流体連通を可能にしながら、メンブレンプレートそれ自体を介した個々のレセプタクル間の流れを妨害し得る。
【０３８４】
図１８および１９は、ハイブリダイゼーションプレート７０４の２つの可能な実施形態を示す。両実施形態では、ハイブリダイゼーションプレートは、その中に形成された開口部７２４を有するプレート７０４ａを含む。ハイブリダイゼーションプレートが上記ベースプレートと共にアセンブルされると、個々の開口部が別個のレセプタクルと流体連通するように、開口部は、プレート全体に分布し得る。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションプレートは、プレートの外周を取り囲み、それから垂直方向に延びるリップ７０４ｂを含み得る。リップは、以下にさらに記載されるように、ハイブリダイゼーションプレートがそれとアセンブルされると、ベースプレートの対応する周囲を取り囲むサイズおよび形状であり得る。図１８の実施形態では、ハイブリダイゼーションプレートは、レセプタクルが形成されたベースプレートの表面に対して配置することを目的とするプレートの内面上に配置された接着剤ガスケットの形態で接着剤７２６を含み得る。接着剤ガスケットは、それがメンブレンプレートのフレームの一部および／または別の適切な構造と係合して、ハイブリダイゼーションプレートの内面と１つまたはそれを超える膜との間に、各ボリュームがベースプレートの別個のレセプタクルおよびその中に含まれるアレイと流体連通するような別個の分離ボリュームを形成するのに役立つように構築され得る。これらの別個の各ボリュームはまた、ハイブリダイゼーションプレートに形成された開口部の少なくとも１つと流体連結されて、マイクロウェルアレイの処理のために個々のレセプタクルへの流体の導入が可能になる。図１９は、ベースプレートに形成された凹部と係合し得る機械的締まりばめ、例えばタブ７２８を使用して、ハイブリダイゼーションプレートをベースプレートに付着させたハイブリダイゼーションプレートの別の実施形態を示す。このような実施形態では、適切な対応するリップ、ガスケット、ならびに／またはハイブリダイゼーションプレートおよび／もしくはメンブレンプレートのいずれかに存在する任意の他の適切な構造により、個々のボリュームを形成して、別個のレセプタクルおよびアレイに関連する上記分離ボリュームを形成し得るが、本開示はそのように限定されない。
【０３８５】
ハイブリダイゼーションプレート、およびハイブリダイゼーションプレートをベースプレートに付着させるための方法の特定の実施形態を上記で議論したが、本開示は、これらの特定の構築物および方法に限定されないと理解すべきである。例えば限定されないが、ネジ部品、クランプ、接着剤、機械的締まりばめ、または任意の他の適切な技術を含む適切な方法を使用して、ハイブリダイゼーションプレートをベースプレートに付着させ得るが、本開示はこの方法で限定されない。
【０３８６】
図２０Ａおよび２０Ｂは、サンプル収集のためのデバイスおよび方法の一実施形態を示す。示されている実施形態では、ハイブリダイゼーションチャンバー８００は、複数のマイクロウェルが形成されたマイクロウェルアレイ８００の上面に結合している。任意の適切な方法および／または材料を使用して、ハイブリダイゼーションチャンバーをアレイに結合させ得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションチャンバーを疎水性接着剤でアレイ上に結合させることが有益であり得る。示されているハイブリダイゼーションチャンバーはアレイを完全に取り囲まないので、アレイは、マイクロウェルアレイが、アレイに部分的に広がるにすぎないように閉鎖底面を含み得る。ハイブリダイゼーションチャンバーは、ハイブリダイゼーションチャンバーの内面８０２ａとアレイとの間に内部ボリュームを形成する内面を含み得る。ハイブリダイゼーションチャンバーの外面から内面に広がる開口部８０４を介して、ピペット８０６または他の適切な流体分配デバイスにより、流体を導入し得る。したがって、示されているアセンブリを使用して、サンプルを注入し、最初に処理し得る。
【０３８７】
図２１は、ハイブリダイゼーションチャンバー８０８の別の実施形態を示す。この特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションチャンバーは、第１の本体部８１０および第２の本体部８１２を含む。第１および第２の本体部は、リビングヒンジと、本体部に付着および／またはオーバーモールドした別個に形成されたヒンジとの両方を含む任意の適切な構造であり得るヒンジ８１４により接続される。示されているタブおよびスロット構成などの適切なコネクタ８２２を使用して、互いに対して閉鎖構成で第１および第２の本体部を選択的に保持し得る。第１および第２の本体部は、それらが互いに対して配置された閉鎖構成である場合、第１および第２の本体部間にチャンバー８１６を形成するように適切に構成された内面を含み得る。チャンバーは、複数のマイクロウェルを含むアレイを収容するサイズおよび形状であり得る。いくつかの場合では、マイクロウェルは、アレイに完全に広がり得る。チャンバーはまた、閉鎖された場合、チャンバーをシーリングするためのチャンバーの周囲を取り囲むガスケット８２０を含み得る。加えて、上記実施形態と同様に、初期サンプル処理のために液体をチャンバーに導入してそれから除去するために、開口部８１８は、第１および／または第２の本体部のいずれかに形成され得る。
【０３８８】
使用される特定のハイブリダイゼーションチャンバーにかかわらず、アレイをハイブリダイゼーションチャンバーに適切に配置および／または結合させたら、所望のバッファーまたは他の溶液を所望の期間にわたって導入することにより、アレイを水和させ得る。次いで、チャンバー開口部を介して、適切に緩衝された細胞をハイブリダイゼーションチャンバーに導入する導入前に、ハイブリダイゼーションチャンバーを吸引し得る。細胞は、アレイのマイクロウェルの大部分または実質的に全部がその中に細胞を収容することを確保するために適切な期間にわたって、ハイブリダイゼーションチャンバー中に残り得る。次いで、ハイブリダイゼーションチャンバーを再び吸引し得、緩衝固定液をハイブリダイゼーションチャンバーに導入し得る。次いで、特定の用途に応じて、アレイ内に保持された生物学的サンプル（すなわち、細胞）のその後の使用および処理のために、ハイブリダイゼーションチャンバーを回転乾燥させ、ならびに／またはステッカー、プラグもしくは他のシールをハイブリダイゼーションチャンバーの開口部中および／もしくはその上に配置し得る。
【０３８９】
多くのサンプルを収集した後、一度に複数のアレイを処理することが望ましい場合がある。このようなプロセスは、前述のキットを使用して図２２に示されている。最初に、アレイを支持するように構築および配置されたベースプレート７００に形成された対応する複数のレセプタクルに、複数のマイクロウェルアレイ８００をロードし得る。メンブレンプレートの１つまたはそれを超える膜が、アレイが収容されるレセプタクルを含むベースプレートの表面上に配置されるように、ベースプレートおよびアレイの第１のアセンブリ７００ａを用いて、別個のメンブレンプレート７０２をアセンブルし得る。アセンブル状態では、メンブレンプレートの１つまたはそれを超える膜は、複数のレセプタクルおよびその中に配置されたアレイをカバーし得る。前述のように、メンブレンプレートを介したレセプタクル間の流体連通を回避するために、メンブレンプレートは、レセプタクルを互いに分離するための適切な構造を含み得る。アセンブルした後、メンブレンプレートをベースプレート上にシーリングして、第２のアセンブリ７００ｂを形成し得る。いくつかの実施形態では、熱プレスを使用して、メンブレンプレートをベースプレート上にシーリングし得る。しかしながら、他のシーリング方法を使用する実施形態も企図される。例えば、この場合、前述のように、ベースプレートに形成されたスルーホールにより形成されたレセプタクルを含むベースプレートは、メンブレンプレートをベースプレートに付着およびシーリングするための真空シーリングの使用を容易にし得る。しかしながら、任意の適切な付着および／またはシーリング方法を使用し得るが、本開示はそのように限定されない。
【０３９０】
図２２にも示されているように、続いて、ベースプレートにシーリングされたメンブレンプレートを含む得られた第２のアセンブリ７００ｂをハイブリダイゼーションプレート７０４とアセンブルし得る。具体的には、ハイブリダイゼーションプレート内面とベースプレートとの間に配置されたメンブレンプレートを有する第２のアセンブリ上に配置されるように、ハイブリダイゼーションプレートの内面を配置し得る。前述のように、ハイブリダイゼーションプレートは、メンブレンプレートの１つまたはそれを超える膜と、ハイブリダイゼーションプレート内面の対応する領域との間に別個の分離ボリュームを形成するように構築され得る。別個の分離ボリュームはそれぞれ、ベースプレートの別個の個々のレセプタクルおよびその中に配置されたアレイと流体連通し得る。任意の適切な方法を使用して、ハイブリダイゼーションプレートを第２のアセンブリに付着させて、第３のアセンブリ７００ｃを形成し得る。
【０３９１】
第３のアセンブリ７００ｃが形成されたら、第３のアセンブリに含まれるアレイのマイクロウェルに含まれる生物学的サンプルの任意の適切な処理を行い得る。具体的には、ハイブリダイゼーションプレートに形成された開口部を介して、様々な反応物、バッファー、溶媒および／または任意の他の所望の材料を個々のボリュームおよび関連レセプタクルに投入し得る。これは、手動でおよび／または自動システムを使用して行われ得るが、本開示はそのように限定されない。例えば、細胞溶解、ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＲＴ、ｅｘｏおよびＳ３反応はすべて、アレイを含有する個別の分離レセプタクルに所望の材料を注入することにより容易に実施し得る。次いで、材料をシステムから吸引し得るが、膜は、アレイ中に保持された生物学的材料が処理中にシステムを離れることを防止する。次いで、処理が完了するまで、次の処理工程を同様に実施し得る。
【０３９２】
アレイのマイクロウェル中の生物学的材料のすべての処理が完了したら、ハイブリダイゼーションプレートおよびメンブレンプレートをアセンブリから除去し得る。アレイ８００、およびいくつかの実施形態では対応するベースプレート７００を関連コレクションプレート７０８上に配置し得る。前述のように、各アレイおよびベースプレートの関連レセプタクルが、コレクションプレートの単一の凹部と流体連通するように、コレクションプレートは、個々のアレイおよびベースプレートを支持するように構築および配置された複数の凹部を含み得る。したがって、アレイ、ベースプレートおよびコレクションプレートのアセンブリを遠心分離して、アレイの複数のマイクロウェルに含まれる生物学的材料をコレクションプレートの凹部にスピンアウトし得る。いくつかの実施形態では、マイクロウェルに含まれる生物材料は、マイクロビーズと結合した細胞断片、例えばＤＮＡおよび／またはＲＮＡ断片であり得るが、異なる生物学的材料を収集する実施形態も企図される。所望の用途に応じて、その後の使用および／または処理のためにコレクションプレートの複数の凹部をシーリングするサイズおよび形状の適切なカバーでコレクションプレートをシーリングし得る。あるいは、収集した生物学的材料を凹部から単に収集し、任意の所望の様式で使用し得る。
【実施例】
【０３９３】
実施例１−Ｓｅｑ−ｗｅｌｌ第２鎖合成プロトコール
０．１Ｍ  ＮａＯＨ
ＴＥ−１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０
ＴＥ−０．５％ＳＤＳ
ＴＥ−０．０１％Ｔｗｅｅｎ
ＲＴ反応−ＴＳＯなし
４０ｕＬの５×Ｍａｘｉｍａバッファー
８０ｕＬの３０％ＰＥＧ８０００
２０ｕＬのｄＮＴＰ
５ｕＬのＲＮａｓｅ阻害剤
１０ｕＬのＭａｘｉｍａ  ＲＴ（Ｔｈｅｒｍｏ）
４５ｕＬの水
第２鎖合成反応
４０ｕＬの５×Ｍａｘｉｍａバッファー
８０ｕＬの３０％ＰＥＧ８０００
２０ｕＬのｄＮＴＰ
２ｕＬのｄＮ−ＳＭＲＴオリゴ（１ｍＭ）
５ｕＬのクレノウＥｘｏ−（ＮＥＢ）
５３ｕＬの水
ｄＮ−ＳＭＲＴオリゴ−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＧＡＮＮＮＧＧＮＮＮＢ（配列番号１）
【０３９４】
標準的なＳｅｑ−ｗｅｌｌプロトコールのＥｘｏ処理後のＴＥ−Ｔｗｅｅｎの２回目の洗浄後に開始する
１）２回目のＴＥ−Ｔｗｅｅｎ洗浄の吸引後、ビーズを５００ｕＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨに再懸濁する
２）チューブを室温で５分間回転させる。
３）上清をスピンして吸引する
４）ＴＥ−Ｔｗｅｅｎで１回洗浄する
５）ＴＥで１回洗浄する
６）ビーズを２００ｕＬの第２鎖合成反応液に再懸濁する。
７）３７℃で１時間回転させる
８）ビーズをＴＥ−Ｔｗｅｅｎで２回洗浄する
９）ＴＥで１回洗浄する
１０）ビーズを２００ｕＬの水に再懸濁する
１１）ビーズをカウントする
１２）標準的なＷＴＡプロトコールに進む。
【０３９５】
実施例２−バーコードマイクロアレイでピコウェルアレイをシーリングする空間バーコード化プロトコール
試薬
空間バーコードマイクロアレイの伸長
インサイチューハイブリダイズマイクロアレイ−８０ｋ特徴
各特徴は、５’−ｄＴ１７−ＳｐａｔｉａｌＢＣ１０−ＣＡＡＣＴＣＴＧＣＧＴＴＧＡＴＡＣＣＡＣＴＧ−３’（配列番号２）である
ハイブリダイゼーションバッファー−６×ＳＳＣ、１０％ホルムアミド、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、．０１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ
クレノウｅｘｏ−Ｒｘｎ−１×バッファー２、３０ｕＭ  ｄＮＴＰ、０．２Ｕ／ｕＬクレノウＥｘｏ−
オプション：伸長産物を視覚化するために６ｕＭ  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−５−ｄＣＴＰ
２０×ＳＳＣバッファー
プライマー
ＳｐａｔＢＣオリゴ／５６−ＦＡＭ／／ｉＡｍＭＣ６Ｔ／ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＴＧ（ＨＰＬＣ精製）（配列番号３）
０．１Ｍ重炭酸ナトリウムバッファーｐＨ８．５
ＮＨＳ−Ｓ−Ｓ−ビオチン
Ｓｅｑ−ｗｅｌｌアレイのコンジュゲーション
標準的なキトサン／アスパラギン酸Ｓｅｑ−ｗｅｌｌナノウェルアレイ
ＥＤＣ（（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド）−（Ｔｈｅｒｍｏ  ２２９８０）
ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）−（Ｔｈｅｒｍｏ）
ＢｕｐＨ  ＭＥＳ生理食塩水バッファーｐＨ４．７（Ｔｈｅｒｍｏ  ２８３９０Ｂ）
ＰＢＳ
ストレプトアビジン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）
６０×２５リフタースリップ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）
空間バーコードの増幅／シークエンシング
Ａｍｐｕｒｅビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ）
クレノウＥｘｏ−（ＮＥＢ）
Ｋａｐａ  ＨｉＦｉ  ２×マスターミックス（Ｋａｐａ）
プライマー
Ｐ５−ＴＳＯ＿ハイブリッド−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＣＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ＊Ａ＊Ｃ（配列番号４）
ＳＢ＿Ｎｅｘｔｅｒａ＿プライマー１−ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ＊Ｔ＊Ｇ（配列番号５）
Ｎｅｘｔｅｒａ  Ｎ７ｘｘ−（Ｎ７０１）−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＣＧＣＣＴＴＡＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ（配列番号６）
リード１カスタムＳｅｑＢ−ＧＣＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣ（配列番号７）
機器
６０℃オーブン
ハイブリダイゼーションクランプ（Ａｇｉｌｅｎｔ）
【０３９６】
プロトコール
切断可能なビオチンとのオリゴのコンジュゲート
１．オリゴを０．１Ｍ重炭酸ナトリウムバッファーｐＨ８．５に再懸濁して２００μＭの濃度にする
２．９０ｕＬのオリゴ溶液当たり、１．５ｍＬチューブ中で２５０ｕｇのＮＨＳ−Ｓ−Ｓ−ビオチンを測定する。
３．ＮＨＳ−ビオチンを１０ｕＬのＤＭＳＯに再懸濁する
４．オリゴ溶液をビオチン架橋剤に迅速に添加する。
５．暗所で６時間超〜一晩インキュベートする。最初の２時間は、３０分ごとに軽くボルテックスする。
６．オリゴコンジュゲートしながら、３００ｕＬのＰＢＳで２回洗浄し、各洗浄の間に１０００×ｇで１分間遠心分離することにより、脱塩カラムを調製する。
７．インキュベーション後、１００ｕＬ／カラムで反応液を脱塩カラムに通すことにより、未反応のビオチンを除去する
【０３９７】
空間バーコードマイクロアレイの伸長
典型的には、スライドウォッシャーで実施する
１．２×ＳＳＣで２分間洗浄する
２．２００ｕＬのハイブリダイゼーションバッファーを注入する
３．１０分間ハイブリダイズさせる
４．２×ＳＳＣで洗浄する
５．２００ｕＬのハイブリダイゼーションバッファー＋１００ｎＭ  ＳＰＡＴＢＣオリゴを注入する
６．７０℃で３分間インキュベートする
７．２５℃で１時間インキュベートする
８．２×ＳＳＣで洗浄する
９．０．２×ＳＳＣで洗浄する
１０．２００ｕＬの１×バッファー２を注入する
１１．２００ｕＬのクレノウ反応液を注入する
１２．２５℃で３０分間インキュベートする
１３．２×ＳＳＣで洗浄する
１４．０．２×ＳＳＣで洗浄する
１５．ＰＢＳ中に最大５日間貯蔵する（おそらくはかなり長く−乾燥させない）
抗ＦＩＴＣ抗体とのＳｅｑ−ｗｅｌｌアレイのコンジュゲーション
１６．チップボックス中、５０ｍＬの水でアレイを洗浄する
１７．４ウェルディッシュ中、５ｍＬの１×ＭＥＳバッファーでアレイを洗浄する
１８．４ウェルディッシュ中、アレイを、５ｍＬのＭＥＳバッファー中１０ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＣ、１ｍｇ／ｍＬ  ＮＨＳに浸漬する
１９．室温で３０分間インキュベートする
２０．チップボックス中、５０ｍＬの水でアレイを２回洗浄する
２１．チップボックス中、１×ＰＢＳで迅速に１回洗浄する
２２．２００ｕＬのＰＢＳ中５０ｕｇ／ｍＬストレプトアビジンをアレイ上部に添加する
１３）オプション：コンジュゲートタンパク質層を可視化するために５ｕｇ／ｍＬ  ＰＥ−ストレプトアビジン
２３．リフタースリップをアレイ上に置く
２４．４℃で１５時間超インキュベートする
２５．ＰＢＳで２回洗浄する
【０３９８】
空間バーコードの移送
２６．０．１×ＰＢＳでＳｅｑ−ｗｅｌｌアレイおよび伸長空間バーコードマイクロアレイを洗浄する
２７．Ｓｅｑ−ｗｅｌｌアレイをハイブリダイゼーションクランプに置く
２８．アレイの側面を下にしてマイクロアレイを上に置き、気泡が下にいかないようにする。
２９．クランプを締めることにより、アレイをシーリングする
３０．３７℃で３０分間インキュベートして、シーリングを改善する
３１．クランプを除去する
３２．透過光およびＦＩＴＣ蛍光チャネルのアレイサンドイッチをイメージングして、空間アレイとＳｅｑ−ｗｅｌｌアレイとの関係を記録する
３３．イメージング中に、沸騰水浴を調製する
３４．イメージング後、サンドイッチをクランプに戻す
３５．クランプを沸騰水浴に３分間移す
３６．クランプを室温に１時間移す
３７．クランプを開く
３８．顕微鏡下でアレイを検査する−ＦＩＴＣシグナルがウェルボリューム全体に広がるはずである
３９．その場合、アレイを５０ｍＬのＰＢＳに入れ、サンドイッチを開く
４０．チップボックス中、ＰＢＳで迅速に２回洗浄する
４１．アレイを空間的にバーコード化する
細胞のロード
機能的アッセイ／イメージサイトメトリーの実施
ＲＴ工程まで標準的なＳｅｑ−ｗｅｌｌキャプチャー反応の実施
空間バーコードの増幅およびシークエンシング
１４）
４２．Ｓｅｑ−ｗｅｌｌプロトコールにしたがってＲＴおよびＥｘｏＩ工程を実施する。
４３．８サイクル増幅する以外は同じＰＣＲミックスを使用して、ＷＴＡ反応を実施する（多数のバーコードがキャプチャーされている場合にのみ必要）。
【０３９９】
ｃＤＮＡライブラリーの精製
４４．ビーズを室温にし（３０分間）、時折、５〜１０秒間ボルテックスする。
４５．１サンプルのためのＰＣＲ反応物を１．５ｍＬチューブにプールする（例えば、１サンプル（すなわち、１アレイ）について７回のＰＣＲ反応をランする場合、その後の処理のためにそれらをまとめる）
４６．０．６×ボリュームのＡｍｐｕｒｅＸＰビーズをプールＰＣＲ産物に添加する
４７．５分間インキュベートする
４８．チューブをマグネットスタンドに置く。マグネットでビーズを凝集させる（約１〜２分間）
４９．上清を除去し、クリーンチューブに入れる
５０．ビーズを有するチューブに４００ｕＬの８０％エタノールを添加する
５１．除去した上清に１．４×ボリュームのＡｍｐｕｒｅビーズを添加する
オプション：ビーズを節約するために、上清の一部のみを精製し得る
５２．５分間インキュベートする
５３．マグネットの上に置く。マグネットでビーズを凝集させる（約１〜２分間）
５４．上清を除去する
５５．４００ｕＬの８０％エタノールを上清チューブに添加する
５６．マグネット上のすべてのチューブの位置を４回回転させて、チューブ内でビーズを動かす
５７．洗浄液を除去する
５８．工程７〜１０を繰り返す
５９．２回目の洗浄液を除去した後、チューブの上部を閉じ、遠心機に入れる。
６０．最大速度で１０秒間スピンする
６１．チューブをマグネットラックに戻す
６２．２０ｕＬピペットを用いて、残った液体を除去する
６３．開いて５分間インキュベートして、ペレットを乾燥させる（これを超過してはならず、ビーズをウェルに再懸濁しない）
６４．マグネットラックからチューブを除去する
６５．１５ｕＬのＨ２Ｏを各チューブに添加する
６６．ビーズを水に完全に再懸濁する
６７．マグネットラックに戻す
６８．上清を新たなＰＣＲチューブに移し、ビーズを有するチューブを廃棄する。
６９．２５ｕＬのＫａｐａ  ＨｉＦｉおよび４ｕＭ  Ｓｅｑ−ｗｅｌｌ  ＷＴＡプライマーを添加する。
７０．さらに８サイクルでＷＴＡ産物の増幅を終了する。
【０４００】
空間バーコードの増幅
７１．上清画分を１：１０、１：１００および１：１０００、１：１０，０００希釈する
７２．以下のＰＣＲミックスの４つの反応液を作製する
２５ｕＬの２×Ｋａｐａ  ＨｉＦｉミックス
１ｕＬの４０ｕＭ  Ｐ５−ＴＳＯ＿ハイブリッド
１ｕＬの４０ｕＭ  ＳＢ＿Ｎｅｘｔｅｒａ＿プライマー１
１ｕＬの希釈上清画分
２２ｕＬの水
７３．以下のプログラムで各希釈物を増幅する
ＰＣＲプログラム
１５）９５℃で３分間
１６）以下を１５サイクル：
１７）９８℃で２０秒間
１８）６７℃で２０秒間
１９）７２℃で３０分間
２０）次いで：
２１）４℃でフォーエバー
７４．第２のＰＣＲミックスの４つの反応液を作製する：
２２）２５ｕＬの２×Ｋａｐａ  ＨｉＦｉミックス
２３）１ｕＬの４０ｕＭ  Ｐ５−ＴＳＯ＿ハイブリッド
２４）１ｕＬの４０ｕＭ  ＳＢ＿Ｎｅｘｔｅｒａ  Ｎ７ｘｘ
２５）１ｕＬのＰＣＲ反応１
２６）２２ｕＬの水
７５．
以下のプログラムで各希釈物を増幅する
ＰＣＲプログラム
２７）９５℃で３分間
２８）以下を１２サイクル：
２９）９８℃で２０秒間
３０）６７℃で２０秒間
３１）７２℃で３０分間
３２）次いで：
３３）４℃でフォーエバー
７６．上記のように、２×Ａｍｐｕｒｅビーズで反応物を精製する
７７．ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒにより分析する
７８．過度に増幅されていないライブラリー（２〜２０ｎＭ）を選択する
ａ．ライブラリーは、クリーンな約２３０〜２４０ｂｐピークであるはずである
７９．以下のように、ＭｉＳｅｑでシークエンシングする
リード１−２０ｂｐ−プライマー−リード１カスタムＳｅｑＢ
インデックス１−８ｂｐ−Ｎｅｘｔｅｒａスタンダード
リード２−４０ｂｐ−プライマー−Ｎｅｘｔｅｒａスタンダード
【０４０１】
実施例３−バーコードオリゴマイクロアレイ上に合成されたピコウェルアレイを使用した空間バーコード化プロトコール
試薬
空間バーコードマイクロアレイ機能化
インサイチューハイブリダイズマイクロアレイ−８０ｋ特徴、非脱保護
各特徴は、５’−ｄＴ１７−ＳｐａｔｉａｌＢＣ１０−ＣＡＡＣＴＣＴＧＣＧＴＴＧＡＴＡＣＣＡＣＴＧ−３’（配列番号２）である
アクリダイトホスホラミダイト（無水アセトニトリル中０．１Ｍ）
ジクロロメタン（ＤＣＭ）中３％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）
０．３Ｍ  ＢＴＴ
ＴＨＦ／ピリジン／水中０．１Ｍヨウ素
最終脱保護溶液−エタノールアミン：エタノール１：１溶液
空間バーコードマイクロアレイの伸長
ハイブリダイゼーションバッファー−６×ＳＳＣ、１０％ホルムアミド、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、．０１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ
クレノウｅｘｏ−Ｒｘｎ−１×バッファー２、３０ｕＭ  ｄＮＴＰ、０．２Ｕ／ｕＬクレノウＥｘｏ−
オプション：伸長産物を視覚化するために６ｕＭ  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−５−ｄＣＴＰ
２０×ＳＳＣバッファー
プライマー
ＳｐａｔＢＣオリゴ／５６−ＦＡＭ／ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＴＧ（配列番号３）（ＨＰＬＣ精製）
ピコウェルアレイ表面機能化
０．１Ｍ酢酸ｐＨ６．０中０．２％キトサン
ＰＢＳ中１％ＢＳＡ
空間バーコードの増幅／シークエンシング
Ａｍｐｕｒｅビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ）
クレノウＥｘｏ−（ＮＥＢ）
Ｋａｐａ  ＨｉＦｉ  ２×マスターミックス（Ｋａｐａ）
プライマー
Ｐ５−ＴＳＯ＿ハイブリッド−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＣＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ＊Ａ＊Ｃ（配列番号４）
ＳＢ＿Ｎｅｘｔｅｒａ＿プライマー１−ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ＊Ｔ＊Ｇ（配列番号５）
Ｎｅｘｔｅｒａ  Ｎ７ｘｘ−（Ｎ７０１）−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＣＧＣＣＴＴＡＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ（配列番号６）
リード１カスタムＳｅｑＢ−ＧＣＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣ（配列番号７）
機器
６０℃オーブン
ハイブリダイゼーションクランプ（Ａｇｉｌｅｎｔ）
【０４０２】
プロトコール
空間バーコードマイクロアレイアクリル機能化
１．５００μＬのＴＣＡ溶液でアレイを２分間処理することにより、オリゴ上に保護基を依然として含有する空間バーコードマイクロアレイからＤＭＴを除去する
２．無水ＤＣＭで洗浄する
３．無水バイアル中で、２５０ｕＬのＢＴＴ活性化試薬および２５０ｕＬのアクリダイト溶液を混合する
４．マイクロアレイ上面に添加する
５．１０分間インキュベートする
６．５ｍＬのアセトニトリルで２回洗浄する
７．アレイを４ｍＬのヨウ素溶液に２分間浸漬する
８．アセトニトリルで２回洗浄する
９．エタノールで２回洗浄する
１０．アレイを５ｍＬの最終脱保護溶液に６５℃で２５分間浸漬する。
１１．エタノールで３回洗浄する
１２．アセトンで１回洗浄する
１３．スピンドライする
【０４０３】
空間バーコードマイクロアレイの伸長
典型的には、スライドウォッシャーで実施する
１４．２×ＳＳＣで２分間洗浄する
１５．２００ｕＬのハイブリダイゼーションバッファーを注入する
１６．１０分間ハイブリダイズさせる
１７．２×ＳＳＣで洗浄する
１８．２００ｕＬのハイブリダイゼーションバッファー＋１００ｎＭ  ＳＰＡＴＢＣオリゴを注入する
１９．７０℃で３分間インキュベートする
２０．２５℃で１時間インキュベートする
２１．２×ＳＳＣで洗浄する
２２．０．２×ＳＳＣで洗浄する
２３．２００ｕＬの１×バッファー２を注入する
２４．２００ｕＬのクレノウ反応液を注入する
２５．２５℃で３０分間インキュベートする
２６．２×ＳＳＣで洗浄する
２７．０．２×ＳＳＣで洗浄する
２８．ＰＢＳ中に最大５日間貯蔵する（おそらくはかなり長く−乾燥させない）
アクリル含有樹脂を使用してマイクロアレイ表面上でピコウェルアレイを合成するための３Ｄステレオリソグラフィーの使用
ピコウェルアレイ表面の機能化
２９．アレイをキトサン溶液に２時間浸漬する
３０．水で４回洗浄する
３１．ＢＳＡ溶液に浸漬する
３２．真空チャンバーに入れて、ピコウェルを水和させる
３３．真空チャンバー中で、ロッキングを一晩インキュベートする
３４．使用直前までＰＢＳに入れる
３５．細胞をロードする直前に、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ（または同等の培地）に移す
細胞のロード
機能的アッセイ／イメージサイトメトリーの実施
ＲＴ工程まで標準的なＳｅｑ−ｗｅｌｌキャプチャー反応の実施
溶解バッファーは、二本鎖バーコードの変性を引き起こす。放出されたオリゴは、バーコード化キャプチャービーズに結合する。
【０４０４】
空間バーコードの増幅およびシークエンシング
３４）
３６．Ｓｅｑ−ｗｅｌｌプロトコールにしたがってＲＴおよびＥｘｏＩ工程を実施する。
３７．８サイクル増幅する以外は同じＰＣＲミックスを使用して、ＷＴＡ反応を実施する（多数のバーコードがキャプチャーされている場合にのみ必要）。
【０４０５】
ｃＤＮＡライブラリーの精製
３８．ビーズを室温にし（３０分間）、時折、５〜１０秒間ボルテックスする。
３９．１サンプルのためのＰＣＲ反応物を１．５ｍＬチューブにプールする（例えば、１サンプル（すなわち、１アレイ）について７回のＰＣＲ反応をランする場合、その後の処理のためにそれらをまとめる）
４０．０．６×ボリュームのＡｍｐｕｒｅＸＰビーズをプールＰＣＲ産物に添加する
４１．５分間インキュベートする
４２．チューブをマグネットスタンドに置く。マグネットでビーズを凝集させる（約１〜２分間）
４３．上清を除去し、クリーンチューブに入れる
４４．ビーズを有するチューブに４００ｕＬの８０％エタノールを添加する
４５．除去した上清に１．４×ボリュームのＡｍｐｕｒｅビーズを添加する
オプション：ビーズを節約するために、上清の一部のみを精製し得る
４６．５分間インキュベートする
４７．マグネットの上に置く。マグネットでビーズを凝集させる（約１〜２分間）
４８．上清を除去する
４９．４００ｕＬの８０％エタノールを上清チューブに添加する
５０．マグネット上のすべてのチューブの位置を４回回転させて、チューブ内でビーズを動かす
５１．洗浄液を除去する
５２．工程７〜１０を繰り返す
５３．２回目の洗浄液を除去した後、チューブの上部を閉じ、遠心機に入れる。
５４．最大速度で１０秒間スピンする
５５．チューブをマグネットラックに戻す
５６．２０ｕＬピペットを用いて、残った液体を除去する
５７．開いて５分間インキュベートして、ペレットを乾燥させる（これを超過してはならず、ビーズをウェルに再懸濁しない）
５８．マグネットラックからチューブを除去する
５９．１５ｕＬのＨ２Ｏを各チューブに添加する
６０．ビーズを水に完全に再懸濁する
６１．マグネットラックに戻す
６２．上清を新たなＰＣＲチューブに移し、ビーズを有するチューブを廃棄する。
６３．２５ｕＬのＫａｐａ  ＨｉＦｉおよび４ｕＭ  Ｓｅｑ−ｗｅｌｌ  ＷＴＡプライマーを添加する。
６４．さらに８サイクルでＷＴＡ産物の増幅を終了する。
【０４０６】
空間バーコードの増幅
６５．上清画分を１：１０、１：１００および１：１０００、１：１０，０００希釈する
６６．以下のＰＣＲミックスの４つの反応液を作製する
２５ｕＬの２×Ｋａｐａ  ＨｉＦｉミックス
１ｕＬの４０ｕＭ  Ｐ５−ＴＳＯ＿ハイブリッド
１ｕＬの４０ｕＭ  ＳＢ＿Ｎｅｘｔｅｒａ＿プライマー１
１ｕＬの希釈上清画分
２２ｕＬの水
６７．以下のプログラムで各希釈物を増幅する
ＰＣＲプログラム
３５）９５℃で３分間
３６）以下を１５サイクル：
３７）９８℃で２０秒間
３８）６７℃で２０秒間
３９）７２℃で３０分間
４０）次いで：
４１）４℃でフォーエバー
６８．第２のＰＣＲミックスの４つの反応液を作製する：
４２）２５ｕＬの２×Ｋａｐａ  ＨｉＦｉミックス
４３）１ｕＬの４０ｕＭ  Ｐ５−ＴＳＯ＿ハイブリッド
４４）１ｕＬの４０ｕＭ  ＳＢ＿Ｎｅｘｔｅｒａ  Ｎ７ｘｘ
４５）１ｕＬのＰＣＲ反応１
４６）２２ｕＬの水
６９．
以下のプログラムで各希釈物を増幅する
ＰＣＲプログラム
４７）９５℃で３分間
４８）以下を１２サイクル：
４９）９８℃で２０秒間
５０）６７℃で２０秒間
５１）７２℃で３０分間
５２）次いで：
５３）４℃でフォーエバー
７０．上記のように、２×Ａｍｐｕｒｅビーズで反応物を精製する
７１．ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒにより分析する
７２．過度に増幅されていないライブラリー（２〜２０ｎＭ）を選択する
ａ．ライブラリーは、クリーンな約２３０〜２４０ｂｐピークであるはずである
７３．以下のように、ＭｉＳｅｑでシークエンシングする
リード１−２０ｂｐ−プライマー−リード１カスタムＳｅｑＢ
インデックス１−８ｂｐ−Ｎｅｘｔｅｒａスタンダード
リード２−４０ｂｐ−プライマー−Ｎｅｘｔｅｒａスタンダード
【０４０７】
実施例４−ドライフィルムフォトレジストラミネートを使用して、ミクロンサイズの特徴を有するテンプレート化多孔質膜を作製するためのスケーラブルな方法
現在、マイクロ流体デバイスのスケーラブルな製造は達成困難である。ほとんどの研究グレードのデバイスは、シリコンウェーハまたはフォトレジストにエッチングされたマイクロ流体構成要素を、モールド中、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）ポリマーでレプリカ成形することにより製造される。ＰＤＭＳは、それをマイクロ流体デバイスに適切なものにするいくつかの特性（弾性、光学的透明度および使用容易性を含む）を有する。しかしながら、材料の長い硬化時間、短いポットライフおよび粘度により、ＰＤＭＳデバイスの製造のスケーリングは非常に困難である。典型的には、マイクロ流体デバイスの大規模製造では、熱可塑性プラスチックのマイクロインジェクション成形またはガラス中における流体構成要素の直接的なエッチングを含む他のシステムが選ばれる。しかしながら、これらの技術は広く利用可能ではなく、生産され得る幾何形状の制限を有する。さらに、それらは、薄いデバイスを維持しながら、エラストマーデバイスまたはスルーホールを有するデバイスを生産し得ない。本明細書で提供される新たなアプローチは、マイクロ流体特徴のスケーラブルな生産のために開発されたものであり、低コストで大規模に標準的なエラストマーデバイスを作製するために利用され得、単一細胞分析のためのフィルタプレートを含む新たなデバイス（例えば、アレイ）形態を作製するために使用され得る。
【０４０８】
本明細書に記載されるアプローチは、フォトリソグラフィープロセスを使用したメンブレンロールトゥプレート製造プロセスを使用して、フォトレジスト中で最終マイクロ流体特徴を直接製造するために、ドライフィルムフォトレジストを利用する。研究または大規模な伝統的なマイクロ流体デバイス製造では、液体フォトレジストを基板、典型的にはシリコンウェーハ上にスピンコーティングする。次いで、フォトリソグラフィーマスクおよびＵＶ曝露を使用して、フォトレジスト中に特徴を作製する。フォトマスクは、孔幾何形状および間隔を規定する。次いで、現像されたフォトレジスト中の特徴を、（マイクロインジェクション成形のためにＰＤＭＳまたはニッケルを使用して）複製するか、またはマスクとして使用して、特徴を基礎基板にエッチングする（ガラスマイクロフルイディクス）。本明細書に記載されるプロセスでは、液体フォトレジストのスピンコーティングに代えて、事前製造されたドライフィルムフォトレジストを使用し、このようなドライフィルムをバルクで（１００ｍまたはそれを超えるロールで）購入し得る。基礎基板を用いずに、ドライフィルムをフォトマスクに直接ラミネートし、ＵＶ光に曝露し、現像し、フィルム中にマイクロ流体特徴を生成する。ドライフィルムの低コストおよびスケールにより、フォトレジスト中の特徴を最終流体特徴として使用し得る。前記方法は、マイクロ特徴の高価で技術的に困難な複製を必要としない。追加のＵＶ光源を用いた加熱メンブレンロールトゥプレートプロセスでこのプロセスを行って、標準的な工業用膜プロセスを使用して、数千個のデバイスの材料を毎日製造することを可能にし得る。
【０４０９】
別の主な利点は、フォトレジストであるフィルム全体の性質により、マイクロ流体特徴がフィルム中のスルーホールになるので、得られる製品が、光により設計された高度設計多孔質ボトムレスマイクロウェルアレイになることである。スルーホールは、小規模であっても、マイクロ流体製造プロセスを使用して作ることが非常に困難である。本明細書に記載されるプロセスは、重大な努力を伴わずにスルーホールを製造する。別の利点は、複数のフォトレジストフィルムを別個に曝露し、互いに重ねてラミネートして、複雑な３Ｄ幾何形状を生成し得ることである。最後に、フィルムは、例えば、約５〜５００ミクロンを含む様々な厚さで事前に作製されるので、伝統的なスピンコーティングで問題であった特徴の厚さを制御することが極めて容易になる。
【０４１０】
設計されたボトムレスマイクロウェルアレイを使用して、様々な形態の単一細胞分析デバイスを生成した。一例では、ボトムレスマイクロウェルアレイを標準的なアクリルプラスチックシートに結合させ、レーザー切断して、マイクロインジェクション成形と同様のコストおよび規模でハードプラスチックデバイスを作製し得るが、事前作業およびコストははるかに少ない。また、このアプローチを拡大して、マイクロ流体特徴の底部に生物学的機能を組み込み得る。例えば、スルーホールを有するドライフィルムフォトレジストをＤＮＡマイクロアレイに結合させて、本明細書に開示される空間バーコード化技術のために既知のＤＮＡ配列を各ナノウェルに配置したデバイスを作製した。別の例では、ボトムレスマイクロウェルアレイをエラストマーシリコーンシートに結合させて、マイクロ流体特徴の壁がフォトレジストであるが、上部および底部が弾性であるエラストマーデバイスを作製し、それにより、ＰＤＭＳの利点を取り戻しながら、スケーラビリティおよび低コストを維持し得る。
【０４１１】
さらに別の例では、設計されたボトムレスマイクロウェルアレイを、はるかに小さな小さな孔（例えば、８０〜２００ｎｍ）を有する市販の膜に結合させて、マイクロ流体特徴を介したフラックスを可能にするフィルタを作ることにより、デバイスを作る。例として、２００ｎｍの細孔膜に結合したフォトレジスト中に配列した４５ミクロンウェルを有する２４ウェルフィルタプレートを作製した。これは、真空を介して細胞をウェルにロードし、細胞ローディング後に、吸引により半多孔質膜を上面に付着させることが可能になった。これは、ゲノム研究を含むナノウェルアレイの有用性を劇的に増加させた。
【０４１２】
例示的な構成は、図１０Ａおよび１０Ｂに示されている。図１１Ａおよび１１Ｂは、それぞれ５０ミクロンおよび５ミクロンの孔径（直径）を有する例示的なアレイを示す。図１３Ａおよび１３Ｂは、例示的なロードアレイを示す。２つの設計されたフォトレジストを市販の膜に結合させることにより、二重層アレイを作製した。例示的な二重層構成は図１０Ｃおよび１０Ｄに示されており、ロード構成は図１２Ａおよび１２Ｂに示されている。設計されたアレイは、７ミクロンおよび４５ミクロンのウェルサイズを有しており、１つの７ミクロンホールのみが任意の所定の４５ミクロンホールとオーバーラップし得るように、ウェルの間隔を設計した。吸引により、この設計されたアレイに細胞をロードすると、単一細胞のみが小さなホールにフィットし得、続いて、より大きな４５ミクロンウェル構造への吸引力を遮断し、それにより、１０ミクロンウェルとオーバーラップした各４５ミクロンウェルへの単一細胞の指向性細胞ローディングが可能になる。
【０４１３】
指向性細胞ローディングは、単一細胞ゲノミクスにおける大きな進歩であり、典型的には、ウェルまたは液滴のポアソンローディングによる単一細胞レゾリューションを達成するが、残念ながら、これは、単一細胞が１０個のウェルまたは液滴のうちの約１個のみにロードされ、試薬およびデバイスの表面積の９０％を浪費することを意味する。指向性細胞ローディングは、同じコストでデバイス中で分析され得る細胞の数を１桁増加させる能力を有する。
【０４１４】
さらなる実施形態
本開示のさらなる非限定的な実施形態は以下のとおりである：
１．ウェルアレイであって、
０．１〜１００ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度および／または５０ｎｍ〜３ミクロンの孔径を有する第１の多孔質膜；ならびに
第１の複数のスルーホールを有するドライフィルムフォトレジストを含む第１のボトムレスマイクロウェルアレイ
を含み、
前記第１の多孔質膜が、前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの底面において前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイと接触し；
前記アレイの各ウェルが、前記第１の複数のスルーホールの１つと、前記第１の多孔質膜を含む底面とを含む、ウェルアレイ。
【０４１５】
２．前記アレイが、前記第１のドライフィルムフォトレジストの上面において前記第１のドライフィルムフォトレジストと接触した第２の多孔質膜をさらに含む、実施形態１のウェルアレイ。
【０４１６】
３．前記第２の多孔質膜が限外濾過膜である、実施形態２に記載のウェルアレイ。
【０４１７】
４．前記限外濾過膜が１ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の平均孔径を有する、実施形態３に記載のウェルアレイ。
【０４１８】
５．前記第１のドライフィルムフォトレジストが前記第１の多孔質膜に結合している、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４１９】
６．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、２０ミクロン〜２００ミクロンの範囲のピッチを有する、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４２０】
７．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、５ミクロン〜５００ミクロンの範囲の均一な深さを有する、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４２１】
８．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが円筒形であり、１ミクロン〜５００ミクロン（例えば、１５〜１００ミクロンまたは１〜１０ミクロン）の範囲の均一な直径を有する、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４２２】
９．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが立方体であり、１ミクロン〜５００ミクロン（例えば、１５〜１００ミクロンまたは１〜１０ミクロン）の範囲の均一な最大横長を有する、実施形態１〜７のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４２３】
１０．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが円錐形であり、前記上面において３５ミクロン〜１００ミクロンの範囲の均一な直径を有し、前記底面において０．５ミクロン〜３ミクロンの範囲の均一な直径を有する、実施形態１〜７のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４２４】
１１．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、３０ミクロン〜１００ミクロンの範囲の均一な深さを有する、実施形態１０に記載のウェルアレイ。
【０４２５】
１２．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、細胞および／またはビーズの最大横寸法の１〜６倍の範囲の最大横寸法を有する、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４２６】
１３．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、細胞の最大横寸法の１〜６倍の範囲の最大横寸法を有する、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４２７】
１４．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、ビーズの最大横寸法の１〜６倍の範囲の最大横寸法を有する、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４２８】
１５．前記第１のドライフィルムフォトレジストが前記第１の多孔質膜に直接接触している、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４２９】
１５．前記第１のドライフィルムフォトレジストの前記上面における前記ウェルの総横面積が、前記第１のドライフィルムフォトレジストの総横面積の少なくとも１０％である、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４３０】
１６．前記アレイが第２のボトムレスマイクロウェルアレイをさらに含む、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４３１】
１７．前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイが、第２の複数のスルーホールを有する前記第１のドライフィルムフォトレジスト上に第２のドライフィルムフォトレジストを含む、実施形態１６に記載のウェルアレイ。
【０４３２】
１８．前記アレイが、前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイ上に第２の多孔質膜をさらに含む、実施形態１６または１７に記載のウェルアレイ。
【０４３３】
１９．前記第２の多孔質膜が前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイに直接接触している、実施形態１８に記載のウェルアレイ。
【０４３４】
２０．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、１ミクロン〜１０ミクロンの範囲の均一な直径を有する、実施形態１６〜１９のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４３５】
２１．前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、１５ミクロン〜１００ミクロンの範囲の均一な直径を有する、実施形態１６〜２０のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４３６】
２２．前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイが前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイに直接接触している、実施形態１６〜２１のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４３７】
２３．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、１５ミクロン〜１００ミクロンの範囲の均一な直径を有する、実施形態１６〜１９のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４３８】
２４．前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、１ミクロン〜１０ミクロンの範囲の均一な直径を有する、実施形態１６〜１９または２３のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４３９】
２５．前記アレイが、前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイと前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイとの間に第３の多孔質膜をさらに含む、実施形態１６〜２４のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４４０】
２６．前記第３の多孔質膜が、前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイおよび／または前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイに直接接触している、実施形態２５に記載のウェルアレイ。
【０４４１】
２７．前記第２のドライフィルムフォトレジストの前記上面における前記ウェルの総横面積が、前記第２のドライフィルムフォトレジストの総横面積の少なくとも１０％である、実施形態１６〜２６のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４４２】
２９．前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストの前記ウェルが２ｍｍの最大ピッチを有する、実施形態１６〜２７のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４４３】
３０．前記アレイが１つまたはそれを超える細胞をさらに含む、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４４４】
３１．前記アレイが１つまたはそれを超えるビーズをさらに含む、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ。
【０４４５】
３２．ドライフィルムフォトレジストであって、１５〜１００ミクロンの範囲の最大横寸法を有し、０．１〜１００ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度および／または５０ｎｍ〜３ミクロンの孔径を有する多孔質底部を有する第１のウェルアレイを含む、ドライフィルムフォトレジスト。
【０４４６】
３３．前記多孔質底部が第１の多孔質膜を含む、実施形態３２のドライフィルムフォトレジスト。
【０４４７】
３４．前記ドライフィルムフォトレジストが、前記第１のドライフィルムフォトレジストの上面に接触した第２の多孔質膜をさらに含む、実施形態３２または３３のドライフィルムフォトレジスト。
【０４４８】
３５．前記ドライフィルムフォトレジストが前記第１の多孔質膜に結合している、実施形態３２〜３４のいずれかに記載のドライフィルムフォトレジスト。
【０４４９】
３６．前記ドライフィルムフォトレジストが、２０ミクロン〜２００ミクロンの範囲のピッチを有する、実施形態３２〜３５のいずれかに記載のドライフィルムフォトレジスト。
【０４５０】
３７．前記ドライフィルムフォトレジストの前記ウェルが２ｍｍの最大ピッチを有する、実施形態３２〜３６のいずれかに記載のドライフィルムフォトレジスト。
【０４５１】
３８．前記ウェルが、５ミクロン〜５００ミクロンの範囲の均一な深さを有する、実施形態３２〜３７のいずれかに記載のドライフィルムフォトレジスト。
【０４５２】
３９．前記ウェルが円筒形であり、１ミクロン〜５００ミクロン（例えば、１５〜１００ミクロンまたは１〜１０ミクロン）の範囲の均一な直径を有する、実施形態３２〜３８のいずれかに記載のドライフィルムフォトレジスト。
【０４５３】
４０．前記ウェルが立方体であり、１ミクロン〜５００ミクロン（例えば、１５〜１００ミクロンまたは１〜１０ミクロン）の範囲の最大横長を有する、実施形態３２〜３８のいずれかに記載のドライフィルムフォトレジスト。
【０４５４】
４１．前記ウェルが円錐形であり、前記上面において３５ミクロン〜１００ミクロンの範囲の均一な直径を有し、前記底面において０．５ミクロン〜３ミクロンの範囲の均一な直径を有する、実施形態３２〜３８のいずれかに記載のドライフィルムフォトレジスト。
【０４５５】
４２．前記ウェルが３０ミクロン〜１００ミクロンの均一な深さを有する、実施形態４１のドライフィルムフォトレジスト。
【０４５６】
４３．前記ドライフィルムフォトレジストの前記上面における前記ウェルの総横面積が、前記ドライフィルムフォトレジストの総横面積の少なくとも１０％である、実施形態３２〜４２のいずれかに記載のドライフィルムフォトレジスト。
【０４５７】
４４．マイクロ流体デバイスであって、（ａ）１〜５００ミクロンの範囲の最大横寸法を有する第２のボトムレスマイクロウェルアレイと、（ｂ）第１の多孔質膜とに結合した、１〜５００ミクロンの範囲の最大横寸法を有する第１のボトムレスマイクロウェルアレイを含むマイクロ流体デバイス。
【０４５８】
４５．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが１〜１０ミクロンの範囲の最大横寸法を有し、前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが１５〜１００ミクロンの範囲の最大横寸法を有する、実施形態４４のマイクロ流体デバイス。
【０４５９】
４６．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、２０ミクロン〜２００ミクロンの範囲のピッチを有する、実施形態４５に記載のマイクロ流体デバイス。
【０４６０】
４７．前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、１０ミクロン〜２００ミクロンの範囲のピッチを有する、実施形態４５または４６に記載のマイクロ流体デバイス。
【０４６１】
４８．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが１５〜１００ミクロンの範囲の最大横寸法を有し、前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが１〜１０ミクロンの範囲の最大横寸法を有する、実施形態４４に記載のマイクロ流体デバイス。
【０４６２】
４９．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、１０ミクロン〜２００ミクロンの範囲のピッチを有する、実施形態４８に記載のマイクロ流体デバイス。
【０４６３】
５０．前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、２０ミクロン〜２００ミクロンの範囲のピッチを有する、実施形態４８または４９に記載のマイクロ流体デバイス。
【０４６４】
５１．前記第１および第２のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが２ｍｍの最大ピッチを有する、実施形態４４〜５０のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【０４６５】
５２．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記上面における前記ウェルの総横面積が、前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの総横面積の少なくとも１０％である、実施形態４４〜５１のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【０４６６】
５３．前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイの前記上面における前記ウェルの総横面積が、前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイの総横面積の少なくとも１０％である、実施形態４４〜５２のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【０４６７】
５４．前記ウェルが円筒形である、実施形態４４〜５３のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【０４６８】
５５．前記ウェルが立方体である、実施形態４４〜５３のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【０４６９】
５６．前記アレイの前記ウェルが円錐形である、実施形態４４〜５３のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【０４７０】
５７．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルの少なくとも９０％がそれぞれ、前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイの単一ウェルと流体連通している、実施形態４４〜５６のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【０４７１】
５８．前記第１および／または第２のボトムレスマイクロウェルアレイがドライフィルムフォトレジストを含む、実施形態４４〜５７のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【０４７２】
５９．前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイの前記上面と接触した第２の多孔質膜をさらに含む、実施形態４４〜５８のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【０４７３】
６０．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイが前記第１の多孔質膜に結合している、実施形態４４〜５９のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【０４７４】
６１．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、５ミクロン〜５００ミクロンの範囲の均一な深さを有する、実施形態４４〜６０のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【０４７５】
６２．前記第１および第２のボトムレスマイクロウェルアレイの間にある第３の多孔質膜をさらに含む、実施形態４４〜６１のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【０４７６】
６３．前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイが第３の多孔質膜に結合している、実施形態６２に記載のマイクロ流体デバイス。
【０４７７】
６４．ウェルが、単一細胞および／またはビーズをキャプチャーするように構成されている、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ、ドライフィルムフォトレジストまたはマイクロ流体デバイス。
【０４７８】
６５．前記ウェルが六角形パターンで配置されている、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ、ドライフィルムフォトレジストまたはマイクロ流体デバイス。
【０４７９】
６６．前記第１の多孔質膜が、１ｎｍ〜１０００ｎｍ（例えば、８０ｎｍ〜２００ｎｍ）の範囲の平均孔径を有する、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ、ドライフィルムフォトレジストまたはマイクロ流体デバイス。
【０４８０】
６７．前記第１多孔質膜が、細胞および／またはビーズの最大横寸法の０．００１〜０．２５倍の範囲の平均孔径を有する、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ、ドライフィルムフォトレジストまたはマイクロ流体デバイス。
【０４８１】
６８．前記第１の多孔質膜が、細胞の最大横寸法の０．００１〜０．１倍の範囲の平均孔径を有する、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ、ドライフィルムフォトレジストまたはマイクロ流体デバイス。
【０４８２】
６９．前記第１の多孔質膜が、ビーズの最大横寸法の０．００１〜０．１倍の範囲の平均孔径を有する、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ、ドライフィルムフォトレジストまたはマイクロ流体デバイス。
【０４８３】
７０．前記第２の多孔質膜が限外濾過膜である、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ、ドライフィルムフォトレジストまたはマイクロ流体デバイス。
【０４８４】
７１．前記限外濾過膜が、１ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の平均孔径を有する、実施形態７０に記載のウェルアレイ、ドライフィルムフォトレジストまたはマイクロ流体デバイス。
【０４８５】
７２．前記第３の多孔質膜が、１ｎｍ〜１０００ｎｍ（例えば、８０ｎｍ〜２００ｎｍ）の範囲の平均孔径を有する、前述の実施形態のいずれかに記載のウェルアレイ、ドライフィルムフォトレジストまたはマイクロ流体デバイス。
【０４８６】
７３．複数のスルーホールを含むフリースタンディングフォトレジストフィルムを作製する方法であって、
第１のドライフィルムフォトレジストをフォトマスクとアライメントすること；
前記フォトマスクを介して、前記第１のドライフィルムフォトレジストの少なくとも一部を紫外線（ＵＶ）光に曝露して、前記第１のドライフィルムフォトレジストに複数の第１スルーホールを形成し、それにより、複数のスルーホールを含む第１のフリースタンディングフォトレジストフィルムを生産すること
を含む、方法。
【０４８７】
７３ａ．複数のスルーホールを含む前記第１のフリースタンディングフォトレジストフィルムが第１のボトムレスマイクロウェルアレイを含む、実施形態７３に記載の方法。
【０４８８】
７３ａ．前記ボトムレスマイクロウェルをベース層と接触させて、ウェルアレイを形成することをさらに含み、前記第１のドライフィルムフォトレジストが基板により支持されない、実施形態７３または７３ａに記載の方法。
【０４８９】
７４．前記ベース層が第１の多孔質膜を含む、実施形態７３〜７３ｂのいずれかに記載の方法。
【０４９０】
７５．ビーズを前記ウェルアレイにロードすることをさらに含む、実施形態７４に記載の方法。
【０４９１】
７６．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイまたは前記ウェルアレイを、その上面において第２の多孔質膜と接触させることをさらに含む、実施形態７３〜７５のいずれかに記載の方法。
【０４９２】
７７．前記第２の多孔質膜を、その曝露面において前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイと接触させる（例えば、結合させる、熱ラミネートする）ことをさらに含む、実施形態７６に記載の方法。
【０４９３】
７８．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイを、その上面において第２のボトムレスマイクロウェルアレイと接触させることをさらに含む、実施形態７３〜７５のいずれかに記載の方法。
【０４９４】
７９．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイを、前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイを有するボトムレスマイクロウェルアレイで熱ラミネートすることをさらに含む、実施形態７８に記載の方法。
【０４９５】
８０．第２のドライフィルムフォトレジストを第２のフォトマスクとアライメントすること；前記第２のフォトマスクを介して前記第２のドライフィルムフォトレジストの少なくとも一部をＵＶ光に曝露して、前記第２のドライフィルムフォトレジストに複数の第２のスルーホールを形成し、それにより、第２のボトムレスマイクロウェルアレイを生産することにより、前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイを生産する、実施形態７３〜７９のいずれかに記載の方法。
【０４９６】
８１．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイを前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイとランダムアライメントすることをさらに含む、実施形態８０に記載の方法。
【０４９７】
８２．前記フォトマスクを介して前記第１のドライフィルムフォトレジストの少なくとも一部をＵＶ光に曝露することが、前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの第１のマイクロウェルが円錐形の形状になるように、前記第１のドライフィルムフォトレジストの表面に対して垂直方向から０度〜４５度の範囲の角度で前記ＵＶ光を向けることを含む、実施形態８０または８１に記載の方法。
【０４９８】
８３．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、２０ミクロン〜２００ミクロンの範囲のピッチを有する、実施形態７３ａ〜８２のいずれかに記載の方法。
【０４９９】
８４．前記第１および／または第２のボトムレスマイクロウェルアレイが、５ミクロン〜５００ミクロンの範囲の厚さを有する、実施形態７３ａ〜８３のいずれかに記載の方法。
【０５００】
８５．前記ウェルが、５ミクロン〜５００ミクロン（例えば、４５ミクロン、７ミクロン、１０ミクロン）の範囲の最大および／または最小横寸法を有する、実施形態７３ａ〜８４のいずれかに記載の方法。
【０５０１】
８６．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが１〜１０ミクロンの範囲の最大横寸法を有し、前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが１５〜１００ミクロンの範囲の最大横寸法を有する、実施形態７３ａ〜８５のいずれかに記載の方法。
【０５０２】
８７．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、２０ミクロン〜２００ミクロンの範囲のピッチを有する、実施形態８６に記載の方法。
【０５０３】
８８．前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、１０ミクロン〜２００ミクロンの範囲のピッチを有する、実施形態８６または８７に記載の方法。
【０５０４】
８９．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが１５〜１００ミクロンの範囲の最大横寸法を有し、前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが１〜１０ミクロンの範囲の最大横寸法を有する、実施形態７３ａ〜８８のいずれかに記載の方法。
【０５０５】
９０．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、１０ミクロン〜２００ミクロンの範囲のピッチを有する、実施形態８９に記載の方法。
【０５０６】
９１．前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルが、２０ミクロン〜２００ミクロンの範囲のピッチを有する、実施形態８９または９０に記載の方法。
【０５０７】
９２．前記フォトマスクがポリマーを含む、実施形態７３〜９１のいずれかに記載の方法。
【０５０８】
９３．前記フォトマスクがポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）を含む、実施形態９２に記載の方法。
【０５０９】
９４．前記フォトマスクが、任意の２つの隣接ウェルの間に、２ｍｍの最大ピッチを有するウェルを含む、実施形態７３〜９３のいずれかに記載の方法。
【０５１０】
９５．前記フォトマスクが、前記フォトマスクの表面に沿って任意の方向に２ｍｍまたはそれ未満の特徴を含む、実施形態７３〜９４のいずれかに記載の方法。
【０５１１】
９６．前記フォトマスク上の前記特徴が、前記フォトマスクの面積の少なくとも１０％および前記フォトマスクの面積の多くとも９９．９％（例えば、５０％）を占有する、実施形態９５に記載の方法。
【０５１２】
９７．前記ベース層がプラスチックシートを含む、実施形態７３ｂ〜９６のいずれかに記載の方法。
【０５１３】
９８．前記プラスチックシートがアクリルプラスチックシートを含む、実施形態９７に記載の方法。
【０５１４】
９７．前記ベース層がＤＮＡマイクロアレイを含む、実施形態７３ｂ〜９６のいずれかに記載の方法。
【０５１５】
１００．前記ベース層がシリコーンエラストマーシートを含む、実施形態７３ｂ〜９６のいずれかに記載の方法。
【０５１６】
１０１．前記シリコーンエラストマーシートがポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む、実施形態１００に記載の方法。
【０５１７】
１０２．前記ベース層が多孔質膜を含む、実施形態７ｂ３〜９６のいずれかに記載の方法。
【０５１８】
１０３．前記多孔質膜が、０．１〜１００ｍＬ／分／ｃｍ２のフラックス速度および／または５０ｎｍ〜３ミクロンの孔径を有する、実施形態１０２に記載の方法。
【０５１９】
１０４．必要に応じて基礎支持体を用いずに、前記第１のドライフィルムフォトレジストの表面を前記フォトマスクに直接的にラミネートすることをさらに含む、実施形態７３〜１０３のいずれかに記載の方法。
【０５２０】
１０５．前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストの表面から剥離ライナー（例えば、ポリオレフィン剥離ライナー）を除去することをさらに含む、実施形態１０４に記載の方法。
【０５２１】
１０６．ラミネーションの直前に前記剥離ライナーを除去することをさらに含む、実施形態１０５に記載の方法。
【０５２２】
１０７．前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストの前記表面を前記第１および／または第２のフォトマスクに直接ラミネートすることが、前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストの前記表面を前記第１および／または第２のフォトマスクの表面と接触させること；ならびに
前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストの前記表面を前記第１および／または第２のフォトマスクの前記表面に結合させるために十分な期間にわたって、前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストならびに前記第１および／または第２のフォトマスクを摂氏６０度〜摂氏８０度の範囲の温度（例えば、摂氏６５度）に曝露すること
を伴う、実施形態１０４〜１０６のいずれかに記載の方法。
【０５２３】
１０８．前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストの前記表面を前記第１および／または第２のフォトマスクに直接ラミネートすることが、前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストを、０．１ｍ／分〜０．５ｍ／分の範囲の速度（例えば、０．３０４８ｍ／分＝１ｆｔ／分）で前記第１および／または第２のフォトマスクに直接的に熱ラミネートすることを伴う、実施形態１０４〜１０７のいずれかに記載の方法。
【０５２４】
１０９．前記第１および／または第２のフォトマスクを介して、前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストの少なくとも一部を紫外線（ＵＶ）光に、１分間〜１０分間の範囲の期間（例えば、２．５分間）にわたって曝露する、実施形態７３〜１０８のいずれかに記載の方法。
【０５２５】
１１０．前記第１および／または第２のフォトマスクを介して、前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストならびに前記第１および／または第２のフォトマスクを摂氏８０度〜摂氏１００度の範囲の温度（例えば、摂氏９５度）に、ＵＶ光に曝露された前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストの少なくとも一部を架橋するために十分な期間にわたって曝露することをさらに含む、実施形態７３〜１０９のいずれかに記載の方法。
【０５２６】
１１１．前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストならびに前記第１および／または第２のフォトマスクを摂氏８０度〜摂氏１００度の範囲の温度（例えば、摂氏９５度）に、１分間〜３０分間の範囲の時間（例えば、１５分間）にわたって曝露することをさらに含む、実施形態７３〜１１０のいずれかに記載の方法。
【０５２７】
１１２．前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストならびに前記第１および／または第２のフォトマスクを摂氏１５度〜摂氏２５度の範囲の温度（例えば、摂氏２０度）に、前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストならびに前記第１および／または第２のフォトマスクを前記温度に冷却するために十分な期間にわたって曝露することをさらに含む、実施形態７３〜１１１のいずれかに記載の方法。
【０５２８】
１１３．前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストならびに前記第１および／または第２のフォトマスクを摂氏１５度〜摂氏２５度（例えば、摂氏２０度）の範囲の温度に、３０分間〜９０分間の範囲の時間（例えば、６０分間）にわたって曝露する、実施形態１１２に記載の方法。
【０５２９】
１１４．前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストならびに前記第１および／または第２のフォトマスクを現像液に、前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストから前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストの非架橋部分を除去するために十分な期間にわたって曝露することをさらに含む、実施形態７３〜１１３のいずれかに記載の方法。
【０５３０】
１１５．前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストならびに前記第１および／または第２のフォトマスクを現像液に、１０分間〜３０分間の範囲の時間（例えば、２０分間）にわたって曝露する、実施形態１１４に記載の方法。
【０５３１】
１１６．前記現像液が現像溶媒（例えば、シクロヘキサノール、シクロヘキサノン）を含む、実施形態１１４または１１５に記載の方法。
【０５３２】
１１７．前記現像液中で前記フォトマスクから前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストをデラミネートすることをさらに含む、実施形態７３〜１１６のいずれかに記載の方法。
【０５３３】
１１８．前記現像した第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストを洗浄することをさらに含む、実施形態７３〜１１８のいずれかに記載の方法。
【０５３４】
１１９．前記現像した第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストをイソプロパノールで、前記第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストから残存現像液を除去するために十分な期間にわたって洗浄する、実施形態１１９に記載の方法。
【０５３５】
１２０．前記現像した第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストをイソプロパノールで、１分間〜１０分間の範囲の時間（例えば、５分間）にわたって洗浄することを含む、実施形態１１８または１１９に記載の方法。
【０５３６】
１２１．前記現像した第１および／または第２のドライフィルムフォトレジストを空気乾燥することをさらに含む、実施形態７３〜１２０のいずれかに記載の方法。
【０５３７】
１２２．前記ベース層を、複数のスルーホールを含む前記第１のフリースタンディングフォトレジストフィルム（例えば、前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイ）の前記底面に（例えば、接着剤により、熱ラミネーションにより）結合させることをさらに含む、実施形態７３〜１２１のいずれかに記載の方法。
【０５３８】
１２３．（例えば、前記ベース層が多孔質膜を含む実施形態では）前記ベース層を前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記底面にラミネートする、実施形態１２２に記載の方法。
【０５３９】
１２４．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイおよび前記ベース層を収納部に入れることをさらに含む、実施形態７３ｂ〜１２３のいずれかに記載の方法。
【０５４０】
１２５．前記収納部がポリスチレンを含む、実施形態１２４に記載の方法。
【０５４１】
１２６．
（ｉ）実施形態１〜３１または６４〜７２のいずれか一項に記載のウェルのアレイ；
（ｉｉ）実施形態３２〜４３または６４〜７２のいずれか一項に記載のドライフィルムフォトレジスト；または
（ｉｉｉ）実施形態４４〜７２のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス
を介して、複数の細胞および／または複数のビーズを含む第１の流体を流し、
それにより、細胞ロードおよび／またはビーズロードマイクロウェルアレイを形成することを含む、方法。
【０５４２】
１２６ａ．前記細胞ロードアレイが超ポアソンでロードされている、実施形態１２６に記載の方法。
【０５４３】
１２７．前記ビーズロードアレイが超ポアソンでロードされている、実施形態１２６または１２６ａに記載の方法。
【０５４４】
１２８．前記第１の液体を流すことが、前記アレイを介して０．１〜１０ｍＬ／分の流速で液体を流すことを含む、実施形態１２６〜１２７のいずれかに記載の方法。
【０５４５】
１２９．前記アレイを介して室温で前記第１の液体を流す、実施形態１２６〜１２８のいずれかに記載の方法。
【０５４６】
１３０．前記アレイを介して前記第１の液体を１〜５分間にわたって流す、実施形態１２６〜１２９のいずれかに記載の方法。
【０５４７】
１３１．前記第１の液体を流すことが、前記アレイを介して流れ方向に真空を適用することを含む、実施形態１２６〜１３０のいずれかに記載の方法。
【０５４８】
１３２．前記第１の液体を流すことが、前記アレイを介して流れ方向に圧力を前記液体に適用することを含む、実施形態１２６〜１３１のいずれかに記載の方法。
【０５４９】
１３３．前記第１の液体を流すことが、前記アレイを遠心分離することを含む、実施形態１２６〜１３２のいずれかに記載の方法。
【０５５０】
１３４．ウェルの８５％が単一細胞で占有される、実施形態１２６〜１３３のいずれかに記載の方法。
【０５５１】
１３５．前記第１の流体中の細胞の濃度が不明である、実施形態１２６〜１３４のいずれかに記載の方法。
【０５５２】
１３６．前記第１の流体中の細胞の濃度が、ポアソン分布に必要とされるであろう濃度を超える、実施形態１２６〜１３５のいずれかに記載の方法。
【０５５３】
１３７．前記第１の流体中の細胞の濃度が、ウェルの７５％超が細胞により占有されることをもたらす、実施形態１２６〜１３６のいずれかに記載の方法。
【０５５４】
１３８．前記ウェルの９５％が単一ビーズをロードされる、実施形態１２６〜１３７のいずれかに記載の方法。
【０５５５】
１３９．前記アレイを限外濾過膜でシーリングすることをさらに含む、実施形態１２６〜１３８のいずれかに記載の方法。
【０５５６】
１４０．前記アレイを１つまたはそれを超える溶解バッファーと接触させて前記細胞を溶解させること、および前記溶解細胞から放出されたタンパク質および／または核酸を分析することをさらに含む、実施形態１２６〜１３９のいずれかに記載の方法。
【０５５７】
１４１．前記ビーズがバーコード化転写産物キャプチャービーズであり、各ウェル中の前記溶解細胞由来のＲＮＡを、同じウェルに存在するビーズ上にキャプチャーする、実施形態１４０に記載の方法。
【０５５８】
１４２．前記ビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、前記キャプチャーしたＲＮＡからｃＤＮＡを生成することをさらに含む、実施形態１４１に記載の方法。
【０５５９】
１４３．前記第１の流体が１つまたはそれを超えるビーズを含み、（ｉ）実施形態１〜３１または６４〜７２のいずれか一項に記載のウェルアレイ、または（ｉｉ）実施形態３２〜４３または６４〜７２のいずれか一項に記載のドライフィルムフォトレジストを介して流され、前記アレイを、複数のスルーホールを有する第２のドライフィルムフォトレジスト（例えば、第２のボトムレスマイクロウェルアレイ）と接触させることをさらに含む、実施形態１２５〜１３８のいずれかに記載の方法。
【０５６０】
１４４．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイまたは前記ドライフィルムフォトレジストの前記ウェルの少なくとも９０％が、前記第２のドライフィルムフォトレジストの単一のスルーホールと流体連通している、実施形態１４３に記載の方法。
【０５６１】
１４５．前記ウェルアレイまたはドライフィルムフォトレジストを介して、１つまたはそれを超える細胞を含む第２の流体を流すことをさらに含む、実施形態１４３または１４４に記載の方法。
【０５６２】
１４６．前記第２の液体を流すことが、前記アレイを介して流れ方向に真空を適用することを含む、実施形態１４５に記載の方法。
【０５６３】
１４７．前記第２の液体を流すことが、前記アレイを介して流れ方向に圧力を前記液体に適用することを含む、実施形態１４５に記載の方法。
【０５６４】
１４８．前記第２の液体を流すことが、前記アレイを遠心分離することを含む、実施形態１４５に記載の方法。
【０５６５】
１４９．前記アレイを限外濾過膜でシーリングすることをさらに含む、実施形態１４４〜１４８のいずれかに記載の方法。
【０５６６】
１５０．前記アレイを１つまたはそれを超える溶解バッファーと接触させて前記細胞を溶解させること、および前記溶解細胞から放出されたタンパク質および／または核酸を分析することをさらに含む、実施形態１４４〜１４９のいずれかに記載の方法。
【０５６７】
１５１．前記ビーズがバーコード化転写産物キャプチャービーズであり、各ウェル中の前記溶解細胞由来のＲＮＡを、同じウェルに存在するビーズ上にキャプチャーする、実施形態１４４〜１５０のいずれかに記載の方法。
【０５６８】
１５２．前記ビーズバーコードの配列がｃＤＮＡに組み込まれるように、前記キャプチャーした転写産物からｃＤＮＡを生成することをさらに含む、実施形態１５１に記載の方法。
１５３．１５〜１００ミクロンの平均ウェル直径を有し、８０〜１０００ナノメートルの平均孔径を有する第１の多孔質膜に結合した第１のボトムレスマイクロウェルアレイを含むマイクロ流体デバイスを提供すること；
前記マイクロ流体デバイスを介して、複数のビーズを含む第１の流体を流すこと；
前記第１の多孔質膜に結合した第１のボトムレスマイクロウェルアレイを、１〜１０ミクロンの平均ウェル直径を有する第２のボトムレスマイクロウェルアレイに結合した８０〜１０００ナノメートルの平均孔径を有する第２の多孔質膜に結合させること；および
前記マイクロ流体デバイスを介して、複数の細胞を含む第２の流体を流すこと
を含み、
前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイのウェルの８０％が単一のビーズにより占有されている、方法。
【０５６９】
１５４．１〜１０ミクロンの平均ウェル直径を有し、（ａ）１５〜１００ミクロンの平均ウェル直径を有する第２のボトムレスマイクロウェルアレイと、（ｂ）８０〜１０００ナノメートルの平均孔径を有する多孔質膜とに結合した第１のボトムレスマイクロウェルアレイを含むマイクロ流体デバイスを提供すること；
前記マイクロ流体デバイスを介して、複数の細胞を含む第１の流体を流すこと；および
前記マイクロ流体デバイスを、ビーズを含む第２の流体に曝露すること
を含み、
前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルの８０％が、単一細胞で占有される、方法。
【０５７０】
１５５．前記第１のボトムレスマイクロウェルアレイの前記ウェルの少なくとも９０％が、前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイの単一のウェルと接触している、実施形態１５３または１５４に記載の方法。
【０５７１】
１５６．前記第１および／または第２のボトムレスマイクロウェルアレイがドライフィルムフォトレジストを含む、実施形態１５３〜１５５のいずれかに記載の方法。
【０５７２】
１５７．前記第２のボトムレスマイクロウェルアレイ中のウェルの８５％が、単一細胞および／またはビーズで占有される、実施形態１５３〜１５６のいずれかに記載の方法。
【０５７３】
１５８．前記第１の流体中の前記複数の細胞の濃度が不明である、実施形態１５３〜１５７のいずれかに記載の方法。
【０５７４】
１５９．前記第１の流体中の前記複数の細胞の濃度が、ポアソン分布に必要とされるであろう濃度を超える、実施形態１５３〜１５８のいずれかに記載の方法。
均等物
【０５７５】
いくつかの本発明の実施形態を本明細書に記載および説明したが、当業者は、機能を実行し、および／もしくは結果および／もしくは本明細書に記載される利点の１つもしくはそれよりも多くを得るための様々な他の手段および／もしくは構造を容易に想到し、ならびにこのような変形および／または改変はそれぞれ、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載されるすべてのパラメータ、寸法、材料および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料および／または構成が、本発明の教示が使用される特定の１つまたは複数の用途に依存することを容易に認識するであろう。当業者は、ルーチンな実験のみを使用して本明細書に記載される特定の本発明の実施形態の多くの均等物を認識するか、またはそれらを確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、ほんの一例として提示されており、本発明の実施形態は、具体的に記載および特許請求されている以外の方法で実施され得ると理解すべきである。本開示の本発明の実施形態は、本明細書に記載される個々の各特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法を対象とする。加えて、２つまたはそれを超えるこのような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が相互に矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
【０５７６】
本明細書で定義および使用される定義はすべて、辞書定義、参照により組み込まれる文献の定義、および／または規定の用語の通常の意味を支配すると理解すべきである。
【０５７７】
本明細書に開示される参考文献、特許および特許出願はすべて、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれ、いくつかの場合では、文献全体を包含し得る。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」および「ａｎ」という不定冠詞は、文脈上特に明確な指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解すべきである。
【０５７８】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「および／または」という語句は、そのように接続されたエレメント（すなわち、いくつかの場合では接続的に存在し、他の場合では選言的に存在するエレメント）の「いずれかまたは両方」を意味すると理解すべきである。「および／または」を用いて列挙されている複数のエレメントは、同じように（すなわち、そのように接続されたエレメントの「１つまたはそれよりも多く」）と解釈されるべきである。具体的に特定されたエレメントとの関連または非関連にかかわらず、「および／または」という節により具体的に特定されたエレメント以外の他のエレメントが必要に応じて存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などの非制限的な文言と併せて使用される場合、一実施形態ではＡのみ（Ｂ以外のエレメントを必要に応じて含む）；別の実施形態ではＢのみ（Ａ以外のエレメントを必要に応じて含む）；さらに別の実施形態ではＡおよびＢの両方（他のエレメントを必要に応じて含む）；などを指し得る。
【０５７９】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義される「および／または」と同じ意味を有すると理解すべきである。例えば、リストの項目を分類する場合、「または」または「および／または」は、包括的である（すなわち、多くのまたはリストのエレメントの少なくとも１つを含むだけではなく、１つを超えるエレメントと、必要に応じて、列挙されていないさらなる項目とも含む）と解釈されるべきである。反対の明確な指示がある用語、例えば「の１つのみ」もしくは「のちょうど１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合には「からなる」のみが、多くのまたはリストのエレメントのちょうど１つのエレメントを含むことを指すであろう。一般に、本明細書で使用される場合、「または」という用語は、「いずれか」、「の１つ」、「の１つのみ」または「のちょうど１つ」などの排他的な用語が先行する場合、排他的な代替物（すなわち、「両方ではなく一方または他方」）を示すとしてのみ解釈されるものとする。特許請求の範囲で使用される場合、「から本質的になる」は、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０５８０】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、リストの１つまたはそれを超えるエレメントに関する「少なくとも１つ」という語句は、エレメントリストのエレメントのいずれか１つまたはそれよりも多くから選択される少なくとも１つのエレメントを意味し、エレメントリスト内で具体的に列挙されているそれぞれのおよびあらゆるエレメントの少なくとも１つを必ずしも含まず、エレメントリストのエレメントのいかなる組み合わせも排除しないと理解すべきである。この定義はまた、具体的に特定されているエレメントとの関連または非関連にかかわらず、「少なくとも１つの」という語句が指すエレメントリスト内で具体的に特定されているエレメント以外のエレメントが必要に応じて存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または同等に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、Ｂが存在せずに少なくとも１つ（１つを超えるを必要に応じて含む）のＡ（およびＢ以外のエレメントを必要に応じて含む）；別の実施形態では、Ａが存在せずに少なくとも１つ（１つを超えるを必要に応じて含む）のＢ（およびＡ以外のエレメントを必要に応じて含む）；さらに別の実施形態では、少なくとも１つ（１つを超えるを必要に応じて含む）のＡおよび少なくとも１つ（１つを超えるを必要に応じて含む）のＢ（および他のエレメントを必要に応じて含む）；などを指し得る。
【０５８１】
特に反対の明確な指示がない限り、１つを超える工程または動作を含む本明細書で特許請求される方法ではいずれも、方法の工程または動作の順序は、方法の工程または動作が記載されている順序に必ずしも限定されないとも理解すべきである。
【０５８２】
特許請求の範囲では、および上記本明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する」、「有する」、「含有する」、「伴う」、「保持する」、「から構成される」などの移行句はすべて、非限定的である（すなわち、限定的ではなく含むを意味する）と理解すべきである。Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ２１１１．０３に記載されているように、「からなる」および「から本質的になる」とういう移行句のみが、それぞれ限定的または半限定的な移行句であるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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