(57)【要約】本開示は軟骨の欠損を修復するための組成物及び方法を提供する。
2021505344.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、
極低温凍結した細胞バンクの試料から増殖させた培養同種細胞と
吸収性コラーゲン膜とを含み、
前記細胞はｃｍ２当たり少なくとも２５０，０００個の細胞の密度で前記膜の上に播種される、前記組成物。
【請求項２】
同種軟骨マトリックスを製造する方法であって、
極低温凍結した細胞バンクの試料を解凍する工程と、
前記試料の前記細胞を培養する工程と、
前記試料を特徴付ける工程と、
吸収性コラーゲン膜を調製する工程と、
前記培養物を前記膜に播種する工程と、
前記膜をパッケージ化する工程とを含む、前記方法。
【請求項３】
治療法で使用するための組成物であって、前記組成物が
極低温凍結した細胞バンクの試料から増殖させた培養同種細胞と
吸収性コラーゲン膜とを含み、
前記細胞はｃｍ２当たり少なくとも２５０，０００個の細胞の密度で前記膜の上に播種される、前記組成物。
【請求項４】
軟骨及び／または骨軟骨の欠損を治療する方法で使用するための組成物であって、前記組成物が、
極低温凍結した細胞バンクの試料から増殖させた培養同種細胞と
吸収性コラーゲン膜とを含み、
前記細胞がｃｍ２当たり少なくとも２５０，０００個の細胞の密度で前記膜の上に播種される、前記組成物。
【請求項５】
マトリックスの製造方法で使用するための細胞バンクであって、
前記マトリックスが
極低温凍結した細胞バンクの試料から増殖させた培養同種細胞と
吸収性コラーゲン膜とを含み、
前記細胞がｃｍ２当たり少なくとも２５０，０００個の細胞の密度で前記膜の上に播種される、前記細胞バンク。
【請求項６】
軟骨欠損及び／または骨軟骨欠損を治療する方法で使用するための組成物であって、
前記方法が培養同種細胞を含む組成物を移植することを含む、前記組成物。
【請求項７】
前記極低温凍結した細胞バンクの試料を約３７℃の水浴、ヒートブロック、または細胞用のドライバスにて解凍する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項８】
前記試料がＤＭＥＭを含む培地で培養される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項９】
前記試料が、生存率、ウイルスの存在、無菌性、エンドトキシン、マイコプラズマ、老化、独自性、アグリカン、及び核学について特徴付けられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項１０】
前記細胞が前記膜上にて単層である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項１１】
前記細胞が脱分化する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項１２】
前記吸収性コラーゲン膜がＩ型及びＩＩＩ型のコラーゲンを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項１３】
前記吸収性コラーゲン膜がブタのコラーゲンを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項１４】
前記ブタのコラーゲンがブタの腹膜に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト対象にて軟骨及び／または骨軟骨の欠損を治療する方法であって、
前記方法が、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に移植することを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記組成物が脱分化した細胞を含む、請求項１５に記載の方法または組成物。
【請求項１７】
前記ヒト対象が成人または若年である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記軟骨欠損及び／または骨軟骨欠損が関節接合部にある、請求項１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記関節接合部が、膝、股関節、足首、肘、手首、または肩である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が前記欠損を覆って及び／またはその中に移植される、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が、あるサイズ及び／または形状にトリミングされて、前記軟骨及び／または骨軟骨の欠損の上を覆う、及び／またはそれに適合する、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が、同種ヒト軟骨を含む少なくとも１つの面が前記軟骨及び／または骨軟骨の欠損に接触する状態で移植される、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物の複数の層が前記欠損を覆って及び／またはその中に移植される、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が軟骨細胞を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年１２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／５９６，００９号の利益及びそれに対する優先権を主張するものであり、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
軟骨及び骨軟骨の病変、例えば、膝の関節軟骨の耐荷重領域における局所性病変は、変形性関節症のリスクを大きく高める。病変のこのタイプは、例えば、外傷、スポーツへの参加、解離性骨軟骨炎などから頻繁に発生する。軟骨病変の自然治癒のための能力は、軟骨組織への限定された血液供給にある程度起因して微小である。
【０００３】
特定の現在の治療介入戦略には通常、関節鏡を介して物理的に除去し、洗浄することによって、関節から破損したまたは外れた軟骨を取り除くことが関与する。そのような治療は通常、一時的に負傷の症状を緩和するが、それらは、病変の起源、または欠損を治療することはなく、そして、特に軟骨の進行性の劣化を防ぐことはない。
【０００４】
現在の代替治療的介入戦略には、変形性関節症の重症例を治療するのに使用されることがある人工膝関節置換術が含まれる。しかし、人工補綴物は、限られた寿命を有するので、すべての年齢の患者に最適ではない。また、変形性関節症の軟骨劣化の真の治療は、健康な軟骨による欠損軟骨の交換を必要とし、自家軟骨細胞移植戦略は、このような交換を達成するために記載されている（Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄ．Ｒｅｄ．ＲＥＳ。（１９９９）３６７Ｓ：Ｓ１４７−Ｓ１５５）。そのような手順では、軟骨細胞は、患者から採取され、軟骨細胞の数を増やすために細胞培養で増殖させ、次いで、患者の損傷部位に移植して戻す。
さらに最近の研究は、マトリックス誘導自家軟骨細胞移植（ＭＡＣＩ）として知られるプロセスにおいてマトリックス上に増殖させた自家細胞を播種することによって自家移植を改善している。（Ｂａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ：Ｈｅｎｄｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，４９−５６（２００３））
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄ．Ｒｅｄ．ＲＥＳ。（１９９９）３６７Ｓ：Ｓ１４７−Ｓ１５５
【非特許文献２】Ｂａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ：Ｈｅｎｄｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，４９−５６（２００３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、マトリックス誘導の軟骨細胞移植技術への重要な改善を提供する。例えば、とりわけ、本開示は、自家ではなく同種の軟骨細胞のマトリックス誘導の移植の実現可能性及び／または有効性を実証する。提供される技術の利点には、例えば、提供された同種軟骨細胞の組成物を用いて対象を治療するために単一の侵襲性手順のみが必要とされることが挙げられる。最少限に侵襲性の介入を用いて軟骨の病変及び欠損の治療を可能にするＭＡＣＩ移植でさえも、依然として、少なくとも２つの介入、１つは、自己細胞を採取するための、もう１つは、移植を施行するための介入を必要とする。従って、提供される技術は、ＭＡＣＩ技術に対してさえさらなる改善を表し、具体化する
【０００７】
いくつかの実施形態では、本開示は、極低温凍結細胞バンク試料から増殖させた培養同種細胞と吸収性コラーゲン膜とを含む組成物を提供し、細胞はｃｍ２当たり少なくとも２５０，０００個の細胞の密度で膜上に播種される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本開示は、同種軟骨マトリックスの製造方法を提供し、該方法は、極低温凍結細胞バンク試料を解凍する工程と、試料の細胞を培養する工程と、試料を特徴付ける工程と、吸収性コラーゲン膜を調製する工程と、膜に培養物を播種する工程と、膜を包装する工程とを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本開示は、治療法で使用するための組成物を提供し、該組成物は極低温凍結細胞バンク試料から増殖させた培養同種細胞と吸収性コラーゲン膜とを含み、細胞はｃｍ２当たり少なくとも２５０，０００個の細胞の密度で膜上に播種される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本開示は、軟骨及び骨軟骨の欠損を治療する方法で使用するための組成物を提供し、該組成物は極低温凍結細胞バンク試料から増殖させた培養同種細胞と吸収性コラーゲン膜と含み、細胞はｃｍ２当たり少なくとも２５０，０００個の細胞の密度で膜上に播種される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本開示は、マトリックスを製造する方法で使用するための細胞バンクを提供し、該マトリックスは極低温凍結細胞バンク試料から増殖させた培養同種細胞と吸収性コラーゲン膜とを含み、細胞はｃｍ２当たり少なくとも２５０，０００個の細胞の密度で膜上に播種される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本開示は、軟骨及び／または骨軟骨の欠損を治療する方法に使用するための組成物を提供し、該方法は培養同種細胞を含む組成物を移植することを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、極低温細胞バンク試料を約３７℃の水浴、ヒートブロック、または細胞用のドライバスにて解凍する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、試料をＤＭＥＭを含む培地で培養する。いくつかの実施形態では、試料をＤＭＥＭ、ＨＥＰＥＳ、ウシ胎児血清及びゲンタマイシンを含む培地で培養する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、試料は生存率、ウイルスの存在、無菌性、エンドトキシン、マイコプラズマ、老化、独自性、アグリカン、及び核学について特徴付けられる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、細胞は膜上にて単層である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、細胞は脱分化する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、吸収性コラーゲン膜はＩ型及びＩＩＩ型のコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、吸収性コラーゲン膜はブタのコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、ブタのコラーゲンはブタの腹膜に由来する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒト対象における軟骨及び／また骨軟骨の欠損を治療する方法を提供し、該方法は本開示により提供される組成物を対象に移植することを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、組成物は、脱分化した細胞を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ヒト対象は、成人または若年である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、軟骨及び／または骨軟骨の欠損は、関節接合部にある。いくつかの実施形態では、関節接合部は、膝、股関節、足首、肘、手首、または肩である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、組成物は欠損を覆って及び／または欠損の中に移植される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、組成物は、あるサイズ及び／または形状にトリミングされて、軟骨及び／または骨軟骨の欠損の上を覆い、及び／またはそれに適合する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、組成物は、同種ヒト軟骨細胞を含む少なくとも１つの表面が軟骨及び／または骨軟骨の欠損に接触する状態で移植される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、多層の組成物が欠損を覆って及び／または欠損の中に移植される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、細胞は軟骨細胞を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本開示は、ｃｍ２当たり少なくとも２５０，０００個の細胞の密度での培養同種ヒト軟骨細胞を含む細胞バンクを提供し、培養軟骨細胞は極低温で凍結され、品質管理アッセイによって特徴付けられる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、細胞バンクはヒト死体の軟骨細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞バンクは初代培養物を含む。いくつかの実施形態では、細胞バンクは二次培養物を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、品質管理アッセイはアガロースアッセイ、６ウェルプレートアッセイ、及び細胞ペレットアッセイの１以上を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞バンクを調製する方法を提供し、該方法は、ヒト由来の組織試料を得る工程と、汚染について組織試料を検査する工程と、組織試料を秤量する工程と、組織試料を細かく刻む工程と、組織試料を消化する工程と、生存率を決定するために組織試料中の細胞を計数する工程と、細胞を培養する工程と、及び／または貯蔵のために細胞を極低温凍結する工程とを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、方法は、ヒトの死体から軟骨を取り出すことを含む組織試料を得る工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、死後約２４時間〜約７日以内にヒトの死体から軟骨を取り出すことを含む組織試料を得る工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、死後約２４時間以内にヒトの死体から軟骨を取り出すことを含む組織試料を得る工程を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、組織試料は滑膜、骨、線維組織、脂肪組織について、及び／または汚染について検査される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、組織試料は、約１ｇ〜約９ｇの重さである。いくつかの実施形態では、組織試料は約９ｇである。いくつかの実施形態では、組織試料は、約２００ｍｇ〜約４００ｍｇの重さの小片に分割される。いくつかの実施形態では、組織試料は、約２００ｍｇ〜約３００ｍｇの重さの小片に分割される。いくつかの実施形態では、組織試料は、約２８０ｍｇ〜約３００ｍｇの重さの小片に分割される。いくつかの実施形態では、組織試料は、約３００ｍｇの重さの小片に分割される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、組織をプロテアーゼで消化する。いくつかの実施形態では、組織をコラゲナーゼで消化する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、組織試料は、約０．５ｍｍ２〜約３ｍｍ２の小片に細かく切り刻まれる。いくつかの実施形態では、組織試料は、約０．５ｍｍ２〜約２ｍｍ２の小片に細かく切り刻まれる。いくつかの実施形態では、組織試料は、約０．５ｍｍ２〜約１ｍｍ２の小片に細かく切り刻まれる。いくつかの実施形態では、組織試料は、約０．５ｍｍ２の小片に細かく切り刻まれる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、細胞を血球計で計数する。いくつかの実施形態では、組織試料は約５０％〜約１００％の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、組織試料は約７０％〜約１００％の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、組織試料は約７０％の生細胞を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ＤＭＥＭを含む培地で細胞を培養する。いくつかの実施形態では、ＤＭＥＭ、ＨＥＰＥＳ、ウシ胎児血清及びゲンタマイシンを含む培地で試料を培養する。いくつかの実施形態では、細胞を約３７℃で培養する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、細胞は−８０℃で約２〜２４時間、極低温凍結される。いくつかの実施形態では、細胞を極低温凍結し、液体窒素にて保存する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本開示は細胞バンクの試料を特徴付ける方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、極低温凍結した初代細胞バンク試料を解凍し、初代試料に由来する二次試料を培養し、二次試料に由来する三次試料を培養し、及び／または細胞生存率、マイコプラズマ、エンドトキシン、無菌性、老化、独自性、及びアグリカン値を決定するために試料をアッセイする工程を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、試料は、アガロースアッセイを用いてアッセイされる。いくつかの実施形態では、アガロースアッセイは２回以上の分裂についてコロニーを形成する細胞の比率を検査する。いくつかの実施形態では、アガロースアッセイの合格判定基準は、細胞の少なくとも６．８％が少なくとも２回の分裂についてコロニーを形成することを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、試料は、６ウェルプレートアッセイを用いてアッセイされる。いくつかの実施形態では、６ウェルプレートアッセイは、ウェル当たりの細胞の平均数を検査する。いくつかの実施形態では、６ウェルアッセイの合格判定基準は、０．８８×１０５以上であるウェル当たりの細胞の平均を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、試料は、ペレット培養アッセイを用いてアッセイされる。いくつかの実施形態では、ペレット培養アッセイは細胞培養増殖に続いて軟骨を生成する細胞の能力を検査する。いくつかの実施形態では、ペレット培養アッセイの合格判定基準は、−４．７３Ｃｔ以上のｄｇａを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、マイコプラズマのアッセイのための合格判定基準は、検出可能なレベルがないことを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、無菌性のアッセイのための合格判定基準は、増殖の検出がないことを含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、細胞生存率の合格判定基準は、少なくとも７０％の生細胞を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、老化についての合格判定基準は、培養物が５継代未満で老化しないこと、または培養物が不死ではないことを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、独自性についての合格判定基準は、軟骨細胞の存在の同定を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本開示は細胞バンクの試料を培養する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、極低温凍結した細胞バンクの試料を解凍し、フラスコに培養培地を添加し、生存率を決定するために細胞を計数し、細胞培養培地中で細胞を増殖させ、細胞培養物で培地交換を行い、及び／またトリプシンで細胞培養物を処理する工程を含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、極低温凍結した細胞バンクの試料を約３７℃の水浴、ヒートブロック、または細胞用のドライバスにて解凍する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ＤＭＥＭを含む培地で試料を培養する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、細胞を血球計で計数する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、少なくとも１〜４日ごとに培地交換を行う。
【００５４】
いくつかの実施形態では、細胞培養物を０．０５％トリプシン溶液で処理する。いくつかの実施形態では、細胞がフラスコから剥離するまで細胞培養物をトリプシン溶液で処理する。
【００５５】
本明細書に記載されている本教示は、添付図面と共に読まれるとき、種々の例示的実施形態の以下の説明からさらに完全に理解されるであろう。なお、以下で説明する図面は単に説明目的のためであり、いかなる意味においても本教示の範囲を限定するように意図されるものではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】自家軟骨細胞及び同種軟骨細胞の双方を用いた軟骨再生を示す例示的な一連の写真を示す。
【図２】自家軟骨細胞及び同種軟骨細胞の双方を用いた軟骨再生を示す例示的な一連の組織試料を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
定義
本明細書で使用されるとき、値に関連して使用されるような用語「約」は、文脈において参照値に類似する値を指す。一般に、文脈に精通している当業者は、その文脈における「約」によって包含される関連する差異の度合いを十分に理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、用語「約」は、参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下の範囲内にある値の範囲を包含してもよい。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、用語「成人」は１７歳以上のヒトを指す。いくつかの実施形態では、ヒト成人は約９０ポンド〜約２５０ポンドの範囲内の体重を有する。
【００５９】
本明細書で使用されるとき「関連付けられた」という用語は、一方の存在、レベル及び／または形態が他方のそれと相関する場合の２つの事象または実体を指す。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド、遺伝子署名、代謝産物、微生物、等）は、その存在、レベル及び／または形態が、（例えば、関連する集団にわたって）疾患、障害、または状態の発生及び／または易罹患性と相関するならば、特定の疾患、障害、または状態に関連すると見なされる。いくつかの実施形態では、２以上の実体は、それらが直接的または間接的に相互作用するならば、互いに物理的に「関連する」ので、それらは互いに物理的に近接する、及び／または近接したままである。いくつかの実施形態では、互いに物理的に関連付けられている２以上の実体が互いに共有結合され、いくつかの実施形態では、互いに物理的に関連付けられている２以上の実体が共有結合で互いに結合されないが、例えば、水素結合、ファン・デル・ワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気、及びそれらの組み合わせによって、非共有結合性に結合される。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、「生体適合性」という用語は、例えば、生体組織と生体内で接触して置かれたときにそのような組織に重大な害を及ぼさない物質を指す。特定の実施形態では、物質は、それらが細胞に対して毒性でなければ「生体適合性」である。特定の実施形態では、物質は、試験管内での細胞へのその添加が２０％以下の細胞死を生じるならば、及び／または生体内でのそれらの投与が重大な炎症または他のそのような有害効果を誘導しなければ、「生体適合性」である
【００６１】
本明細書で使用されるとき、用語「軟骨細胞」または「軟骨の細胞」は、ＩＩ型コラーゲン、アグリカン、コンドロイチン硫酸及び／またはケラチン硫酸を含むが、これらに限定されない軟骨細胞に特徴的である生化学的マーカーを発現することができる細胞を指す。いくつかの実施形態では、軟骨細胞または軟骨の細胞は、試験管内での丸い形態を含むが、これらに限定されない平滑筋細胞に特徴的である形態学的マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、軟骨細胞または軟骨の細胞は、試験管内でＩＩ型コラーゲンを分泌することができる。いくつかの実施形態では、軟骨細胞または軟骨の細胞は、試験管内でアグリカンを分泌することができる。いくつかの実施形態では、軟骨細胞または軟骨の細胞は、試験管内で軟骨の血行動態特性を伴う組織またはマトリックスを生成することができる。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、用語「密度」は、体積の単位面積当たりの物質、例えば、細胞または他の物体の平均数を指す。いくつかの実施形態では、密度は、細胞密度、すなわち、表面積の単位当たりの細胞の数である。いくつかの実施形態では、平均密度は、播種した細胞の数をそれらが増殖する表面の肉眼的表面積で割ることによって近似される。いくつかの実施形態では、表面は二次元である。いくつかの実施形態では、表面は三次元である。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、用語「接種すること」は、それによって表面、例えば、細胞培養に好適な容器の表面に細胞を接触させるプロセスまたは工程を指す。いくつかの実施形態では、細胞培養表面（例えば、フラスコ、皿）上に接種された細胞は、ある期間付着する。いくつかの実施形態では、細胞培養表面上に接種されるとすぐに、細胞は増殖する。いくつかの実施形態では、細胞培養表面上に接種された細胞（例えば、軟骨細胞）は脱分化してもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養表面上に接種された細胞（例えば、軟骨細胞前駆体、間葉幹細胞）は、所望の細胞型、例えば、軟骨細胞に分化してもよい。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、用語「試験管内で」は、多細胞生物内ではなく、人工環境において、例えば、試験管または反応容器にて、細胞培養、等にて起こる事象を指す。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、用語「生体内で」は、ヒト及び非ヒト動物のような多細胞生物内で起こる事象を指す。細胞系システムの文脈では、その用語は生きている細胞内（例えば、試験管内でのシステムとは対照的に）で起こる事象を指すのに使用されてもよい。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、用語「培地」は、培養中の細胞の増殖または維持を支える成分を指す。いくつかの実施形態では、これは、従来の液体細胞培養培地及び追加の因子を含んでもよい。いくつかの実施形態では、追加の因子には、例えば、血清、抗生物質、増殖因子、薬剤、緩衝液、ｐＨ指示薬、等が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、培地は、細胞（例えば、軟骨細胞及び／または軟骨細胞前駆体）を組織試料（例えば、軟骨試料）から単離するプロセスで使用されてもよい。いくつかの実施形態では、組織は、機械的に粉砕され（例えば、みじん切りされる、細かく刻まれる、ブレンドされる）、次いで培地と混ぜ合わせる。いくつかの実施形態では、培地は、組織を消化し、細胞を遊離するために酵素（例えば、コラゲナーゼ、プロテアーゼ）を含む。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、用語「馴化培地」は、細胞と接触して、培地の組成が、例えば、１以上の代謝産物、栄養素、または因子の取り込みまたは放出によって改変されるのを可能にしている培地を指す。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、用語「患者」は、提供される組成物が、例えば、実験用、診断用、予防用、化粧品、及び／または治療の目的で投与される、または投与されてもよい任意の生物を指す。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及び／またはヒトのような哺乳動物）が挙げられる。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。いくつかの実施形態では、患者は１以上の障害または状態を患っている、またはそれに罹り易い。いくつかの実施形態では、患者は障害または状態の１以上の症状を示す。いくつかの実施形態では、患者は、１以上の障害または状態と診断されている。いくつかの実施形態では、患者は、疾患、障害、または状態を診断する及び／または治療するために特定の治療法を受けている、または受けたことがある。
【００６９】
本明細書で使用されるとき「播種」という用語は、それによって細胞がある期間支持マトリックス（例えば、コラーゲン膜）に接触し、付着する（接着剤の有無にかかわらず）プロセスまたは工程を指す。播種した細胞は支持マトリックス上で分裂してもよく、及び／または分化してもよい。いくつかの細胞は、対象に移植されるのに先立って、支持マトリックス上に播種される。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、用語「対象」は、生物、通常、哺乳動物（例えば、いくつかの実施形態では、出生前のヒト形態を含むヒト）を指す。いくつかの実施形態では、対象は関連する疾患、障害または状態を患っている。いくつかの実施形態では、対象は疾患、障害または状態に罹り易い。いくつかの実施形態では、対象は疾患、障害または状態の１以上の症状または特徴を示す。いくつかの実施形態では、対象は疾患、障害または状態のどんな症状または特徴も示さない。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態への易罹患性またはそのリスクに特有の１以上の特徴を持つだれかである。いくつかの実施形態では、対象は患者である。いくつかの実施形態では、対象は、診断及び／または治療が施される及び／または施されている個体である。いくつかの実施形態では、対象は生体試料、組織及び／または物質のドナーである。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、「実質的に」という用語は、対象とする特徴または特性の全体またはほぼ全体の程度または度合いを示す定性状態を指す。生物学分野の当業者は、生物学的な現象及び化学的な現象が稀に、仮にあるとしても、完了に向かう及び／または完全性に進行する、または絶対的な結果を達成するもしくは回避することを理解するであろう。従って「実質的に」という用語は、多くの生物学的現象及び化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために本明細書で使用される。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、用語「エンドトキシンを実質的に含まない」は、生物製剤についてＦＤＡによって許可されているものに満たない組成物の用量あたりのエンドトキシンのレベル（すなわち、平均７０ｋｇのヒトにとって総用量当たり３５０ＥＵである、時間あたり５ＥＵ／ｋｇ体重の総エンドトキシン）を指す。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、用語「マイコプラズマ汚染及び／または微生物汚染を実質的に含まない」は、当業者に知られている汚染の一般に認められた検査で陰性の読み取りを指す。例えば、マイコプラズマ汚染は、ブロス培地にて製品試料を継代培養し、適当な陽性及び陰性の対照と共に３７℃にて１、３、７及び１４日目に寒天プレート上に培養物を分配することによって判定される。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ汚染はリアルタイムＰＣＲ法を使用して判定される。製品試料の外観を、１００×にて顕微鏡で陽性及び陰性の対照のそれと比較する。加えて、マイコプラズマ汚染の存在は、３及び５日間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ結合蛍光色素を用いた落射蛍光顕微鏡により６００×で調べる指標細胞培養物の接種によって検出されてもよい。組成物は、寒天培地及び／またはブロス培地の手順と指標細胞培養の手順がマイコプラズマ汚染の証拠を示さなければ、満足であると見なされる。いくつかの実施形態では、微生物汚染のレベルを評価するために利用されてもよいアッセイは、米国薬局方（ＵＳＰ）直接導入法であってもよく、またはそれを含んでもよい。これには、トリプシン大豆ブロス培地及び流体チオグリコレート培地を含有するチューブに試料を接種することが関与する。チューブは、インキュベートの指定された期間（例えば、１４日）の間に濁った外観（濁度）について定期的に観察される。いずれかの培地の任意の日での濁った外観は汚染を示し、透明な外観（増殖なし）は組成物が汚染物質を実質的に含まないと見なされてもよいことを示す。いくつかの実施形態では、微生物汚染の検出のためのＵＳＰ法に代わる認可済みの方法、例えば、異なる培地製剤を使用するＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ検査が使用されている。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、用語「表面積」は、例えば、正方形の面積、ｃｍ２、または基板の肉眼的表面積を指す。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、用語「治療」（また、「治療する」または「治療すること」）は、特定の疾患、障害及び／または状態の１以上の症状、特徴及び／または原因を部分的にまたは完全に緩和する、改善する、和らげる、抑制する、その発症を遅延させる、その重症度を軽減する及び／またはその発生を減らす治療法の施行を指す。いくつかの実施形態では、そのような治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態の徴候を示さない対象、及び／または疾患、障害、及び／または状態の初期徴候のみを示す対象の治療であってよい。代わりにまたはさらに、そのような治療は、関連する疾患、障害及び／または状態の１以上の確立された徴候を示す対象の治療であってもよい。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害及び／または状態を患っていると診断されている対象の治療であってもよい。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害及び／または状態の発症リスクの増加と統計学的に相関している１以上の感受性因子を有することが知られている対象の治療であってもよい。
【００７６】
本開示は、軟骨細胞、特にヒト由来のものを含む特定の組成物、ならびにそのような組成物の種々の関連する方法（例えば、使用方法及び／または製造方法）及び／または関連する技術を提供する。特に、本開示は、同種ヒト軟骨細胞を含む組成物を提供し、組成物は、例えば、軟骨病変及び／または骨軟骨病変（例えば、膝関節軟骨の耐荷重領域における局所性病変）の治療に有用であってもよい。すなわち、本開示は、第１のヒト対象とは異なる第２のヒト対象において損傷を治療するのに使用するための第１のヒト対象に由来するヒト軟骨細胞を含む組成物を提供する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本開示によれば、第１のヒト対象から採取したヒト軟骨細胞を生体外で（例えば、試験管内で）で培養し、吸収性支持マトリックス（例えば、コラーゲン膜）上に播種し、それは第２のヒト対象に移植されてもよい。
【００７８】
とりわけ、本開示は、特定の特性（例えば、細胞収量、細胞浮遊液の密度、生存率、無菌性等）を示す調製物を含む、同種ヒト軟骨細胞の培養調製物（例えば、浮遊液）を製造するための技術、及び／または、そのような培養調製物を調製する、保存する、輸送する及び／または利用する技術を提供する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本開示は、培養した同種ヒト軟骨細胞が、特定のパラメータ（例えば、膜完全性、細胞生存率、細胞の独自性、無菌性）に従って吸収性支持マトリックス上に播種される組成物を製造するための技術、及び／またはそのような組成物を調製する（例えば、播種を実施する）、保存する、輸送する及び／または利用する技術を提供する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本開示は、臨床的に有意な軟骨及び／または骨軟骨の病変、欠損、負傷及び／または外傷の治療を可能にする及び／または達成する技術を提供する。いくつかの実施形態では、治療は、組織の修復及び／または再生を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、軟骨細胞を含む組成物は病変、欠損、負傷及び／または外傷の部位またはその近傍にて、例えば、関節面にてまたはその近傍にて対象に移植される。本開示の組成物を用いて治療されてもよい関節面には、例えば、膝、足首、手首、股関節、肘または肩の関節面が挙げられる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞バンクの組成物、方法及び使用を提供する。いくつかの実施形態では、細胞バンクは、生体外で（例えば、試験管内で）培養されている第１のヒト対象から採取され、極低温凍結されたヒト軟骨細胞から作り出される。
【００８３】
組成物
本開示の組成物は、培養で増殖されて支持マトリックス上に播種されたヒト軟骨細胞を含む。
【００８４】
細胞の調製
本開示は、本明細書に記載されているような有用な組成物の調製のために同種ヒト軟骨細胞を利用する。通常、同種ヒト軟骨細胞は、提供される組成物が移植されるであろう対象とは異なる対象である第１の対象の組織から単離される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、同種ヒト軟骨細胞は、ヒトから採取した組織から得られる。いくつかの実施形態では、同種ヒト軟骨細胞は、成人ヒトから採取した組織から得られる。代わりにまたはさらに、いくつかの実施形態では、同種ヒト軟骨細胞は、死体から採取した組織から得られる。いくつかの実施形態では、同種ヒト軟骨細胞は、細胞バンクから得られる。
【００８６】
軟骨細胞及び軟骨細胞前駆体を含むソース細胞調製物が単離されてもよいように、採取した組織は通常、１以上の処理工程に供される。
【００８７】
そのようなソース細胞調製物は、本開示に係る使用のために培養同種ヒト軟骨細胞の調製物を調製するのに利用される。当業者は、ヒト軟骨細胞が通常、例えば、ＨＡＰＬＮ１のような特定の検出可能なマーカーを発現することを認識している。例えば、培養ヒト軟骨細胞上に発現される特定のマーカーを記載し、その教示がその関連で参照により本明細書に組み込まれているＵＳ８，０２９，９９２を参照のこと。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本開示に従って有用なヒト軟骨細胞の調製物は、調製物内の細胞による１以上の関連マーカーの発現レベルを特徴とする。例えば、いくつかの実施形態では、１以上の軟骨細胞マーカーは、調製物にて特定の閾値を上回るレベルで存在する。代わりにまたはさらに、いくつかの実施形態では、非軟骨細胞の細胞型の１以上のマーカー（例えば、１以上の線維芽細胞及び／または滑膜細胞のマーカー）は、調製物にて特定の閾値を下回るレベルで存在する（例えば、ＭＦＡＰ５）。当業者は、マーカーのレベルを決定するための技法（例えば、既知の技術に係るＲＮＡ及び／またはタンパク質の検出）に精通しているであろう。
【００８９】
いくつかの実施形態では、軟骨細胞によって過剰発現される遺伝子（例えば、ＨＡＰＬＮ１）についてのＲＮＡの発現レベルは培養細胞にて測定される。いくつかの実施形態では、滑膜細胞によって過剰発現される遺伝子（例えば、ＭＦＡＰ５）についてのＲＮＡ発現が培養細胞にて測定される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの発現レベルは、滑膜細胞マーカー（ＭＦＡＰ５）の発現に対比した軟骨細胞マーカー（例えば、ＨＡＰＬＮ１）の発現の比として提示される。いくつかの実施形態では、培養された軟骨細胞は、対数スケールで約−２、約−１、約０、約＋１、約＋２、約＋３、約＋４、約＋５、約＋６、約＋７、約＋８、約＋９、約＋１０以上の相対ＲＮＡ発現レベル（ＨＡＰＬＮ１対ＭＦＡＰ５）を実証する。いくつかの実施形態では、培養された軟骨細胞は約−２〜約＋１０、約−１〜約＋９、約１〜約１０、約＋３〜約＋８、約＋５〜約＋７またはその中の範囲に及ぶ相対的なＲＮＡ発現レベルを実証する。いくつかの実施形態では、培養された滑膜細胞は、対数スケールで約−２未満の相対的なＲＮＡ発現レベルを実証する。いくつかの実施形態では、培養された滑膜細胞は、対数スケールで約−２未満から−１０に及ぶ相対的なＲＮＡ発現レベルを実証する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ソース細胞調製物から調製される軟骨細胞は、少なくとも２５０，０００個の細胞／ｃｍ２で支持マトリックスに播種するのに十分な密度にて培養物中に存在する。いくつかの実施形態では、培養で増殖させた軟骨細胞は単層培養中に存在する場合に脱分化する。いくつかの実施形態では、脱分化した軟骨細胞は線維芽細胞の表現型を示す。いくつかの実施形態では、脱分化した軟骨細胞はＥＣＭをコードする遺伝子、例えば、ＡＣＡＮ及び／またはＣＯＬ２Ａ１の発現を下方調節する。いくつかの実施形態では、脱分化した軟骨細胞は、より少ない量のＥＣＭ、例えば、コラーゲン（例えば、ＩＩ型コラーゲン）及び／またはアグリカン（軟骨特異的なプロテオグリカンコアタンパク質、またはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン１としても知られる）を作る及び／または分泌する。理論に束縛されることを望まないが、脱分化は、三次元軟骨マトリックスからの軟骨細胞の取り出し後に発生し、単層培養における細胞の増殖の間、観察される。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている軟骨細胞調製物は支持マトリックスに播種するのに十分な数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、軟骨細胞調製物は、２回目の継代に続いて少なくとも約３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６個以上の細胞を含む。いくつかの実施形態では、軟骨細胞調製物は２回目の継代の後、少なくとも約３×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている軟骨細胞調製物は、最終継代にて少なくとも約１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７個以上の細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている軟骨細胞調製物は、最終継代にて少なくとも１×１０７個の細胞を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、軟骨細胞の培養物は約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％以上集密的である。いくつかの実施形態では、軟骨細胞の培養物は約１００％集密的である。いくつかの実施形態では、軟骨細胞の培養物は約５０％〜９０％集密的である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、軟骨細胞は少なくとも２５０，０００個の細胞／ｃｍ２、３００，０００個の細胞／ｃｍ２、４００，０００個の細胞／ｃｍ２、５００，０００個の細胞／ｃｍ２、６００，０００個の細胞／ｃｍ２、７００，０００個の細胞／ｃｍ２、８００，０００個の細胞／ｃｍ２、９００，０００個の細胞／ｃｍ２、１，０００，０００個の細胞／ｃｍ２以上の密度で支持マトリックス上に播種される。
【００９４】
とりわけ、本開示は、かなりの比率の細胞が生存可能である細胞調製物を提供し、そのような高い生存率の細胞調製物は特定の病変または欠損の成功的治療を著しく向上させることができ、そのために必要とされ得る。いくつかの実施形態では、調製物中に存在する細胞の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％以上が生存可能である。いくつかの実施形態では、調製物中の軟骨細胞の少なくとも９０％が生存可能である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される本開示の組成物は、ソース細胞調製物の調製の間及び軟骨細胞の増殖の間に使用される成分（例えば、ウシ胎児血清アルブミン、ウシ胎児血清及び／またはウマ血清）を実質的に含まない。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ未満のウシ胎児血清アルブミンを含む。いくつかの実施形態では、細胞調製物は、マイコプラズマ、エンドトキシン及び／または微生物（例えば、好気性微生物（複数可）、嫌気性微生物（複数可）及び／または真菌）の汚染を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、細胞調製物は、マイコプラズマ、エンドトキシン、及び／または微生物の汚染について検査で陰性と出る。
【００９６】
支持マトリックス
本開示に従って使用するための支持マトリックスは、ヒト同種軟骨細胞が付着する材料でできている。いくつかの実施形態では、支持マトリックスは、細胞接着を促す及び／または可能にする接着剤を含む、及び／またはそれでコーティングされる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、支持マトリックスは細胞増殖を支える。
【００９８】
いくつかの実施形態では、支持マトリックスは生体吸収性である。いくつかのそのような実施形態では、生体吸収性マトリックスは、数時間、数日、数週間または数ヶ月の期間にわたって分解してもよい。例えば、生体吸収性マトリックスは、少なくとも２４時間以内、少なくとも７日間以内、少なくとも３０日間以内または少なくとも６ヶ月以内に分解してもよい。いくつかの実施形態では、支持マトリックスは、身体の特定の領域、例えば、治療を必要とする領域（例えば、関節接合部）への隣接する細胞及び組織の侵入を阻害する止血障壁として作用してもよい。
【００９９】
いくつかの実施形態では、支持マトリックスはゲル、固体、または半固体である。いくつかの実施形態では、支持マトリックスは不浸透性、浸透性、または半浸透性（例えば、孔を含む）である。いくつかの実施形態では、支持マトリックスは、合成材料、天然材料、またはそれらの組み合わせで構成される。
【０１００】
いくつかの実施形態では、支持マトリックスは、膜、マイクロビーズ、フリース、糸、ゲル、またはそれらの組み合わせを含む構造を有していてもよい。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、支持マトリックスは細胞によって生成される生体物質であってもよく、またはそれを含んでもよい。いくつかのそのような実施形態では、生体物質は培養中の細胞によって生成される。あるいは、いくつかのそのような実施形態では、生体物質は、組織中の細胞（例えば、生体内で）によって生成される。いくつかの実施形態では、そのような生体物質は、本明細書に記載されているような治療を受ける対象に対して同種である細胞によって生成される。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、支持マトリックスはコラーゲンであってもよく、またはそれを含んでもよい。例えば、支持マトリックスはＩ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、またはそれらの組み合わせ（例えば、Ｉ型コラーゲンとＩＩ型コラーゲンの組み合わせを含んでもよく、またはＩ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンの組み合わせを含んでもよい）であってもよく、またはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、支持マトリックスは、第１の面でのＩ型コラーゲン及び第２の面でのＩＩＩ型コラーゲンから主として構成される。いくつかの実施形態では、Ｉ型コラーゲンを含む支持マトリックスの第１の面は平滑面である。いくつかの実施形態では、ＩＩＩ型コラーゲンを含む支持マトリックスの第２の面は粗面である。いくつかの実施形態では、支持マトリックスの粗面は、細胞の播種に好適である。いくつかの実施形態では、支持マトリックスの平滑面は、関節面と接触するのに好適である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本開示に従って使用するための支持マトリックスにおける一部またはすべてのコラーゲンは架橋されてもよく、いくつかの実施形態では、それは架橋されなくてもよい。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本開示に従って利用されるコラーゲンはブタのような動物に由来する。いくつかの実施形態では、コラーゲンはブタの腹膜に由来する。
【０１０５】
本明細書に記載されるようないくつかの実施形態では、支持マトリックスはＩ型とＩＩＩ型のブタコラーゲンの組み合わせを含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているような支持マトリックスに播種される及び／またはそこで培養される細胞（例えば、軟骨細胞）は、支持マトリックスと相互作用する、及び／またはそれに取り込まれる１以上の細胞外マトリックスタンパク質（例えば、コラーゲン）を作り出してもよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、支持マトリックスは、タンパク質、ポリペプチド、ヒアルロン酸）及び／またはポリマー（例えば、エラスチン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン）も含んでもよい。いくつかの実施形態では、支持マトリックスは細胞を含まない。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、支持マトリックスは、特定の軟骨または骨軟骨の欠損、病変または損傷の治療のための適切な表面積、サイズ、形状及び／または寸法を有する。いくつかの実施形態では、支持マトリックスは、特定の軟骨または骨軟骨の欠損への投与のために（例えば、折り曲げ、切断、トリミング、等によって）成形され易い形態（例えば、シート形態）で提供される。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、支持マトリックスの表面積は少なくとも約５ｃｍ２、１０ｃｍ２、１２ｃｍ２、１３ｃｍ２、１３．５ｃｍ２、１４ｃｍ２、１４．５ｃｍ２、１５ｃｍ２、１５．５ｃｍ２、１６ｃｍ２、１７ｃｍ２、１８ｃｍ２、１９．５ｃｍ２、２０ｃｍ２、２０．５ｃｍ２、２１．５ｃｍ２、２２ｃｍ２、２５ｃｍ２、３０ｃｍ２以上である。支持マトリックスの寸法は、軟骨及び／または骨軟骨の欠損を治療するのに好適な所望の表面積を達成するのに必要な任意の寸法であってもよい。例えば、２０ｃｍ２の支持マトリックスの寸法は、約２ｃｍ×１０ｃｍ、２．５ｃｍ×８ｃｍ、３ｃｍ×６．７ｃｍまたは４ｃｍ×５ｃｍであってもよい。いくつかの実施形態では、支持マトリックス（例えば、コラーゲン膜）の表面積は約３ｃｍ×５ｃｍの寸法を持つ約１４．５ｃｍ２であってもよい。いくつかの実施形態では、支持マトリックス（例えば、コラーゲン膜）の表面積は約４×５ｃｍ２の寸法を持つ約２０ｃｍ２であってもよい。
【０１１０】
細胞を播種した支持マトリックス
とりわけ、本開示は、支持マトリックス（例えば、コラーゲン膜）上に播種される培養ヒト軟骨細胞を含む組成物を提供する。
【０１１１】
通常、ある期間（例えば、３日間〜５週間）培養されている細胞は、支持マトリックス上に、またはその中に存在する。いくつかの実施形態では、支持マトリックス上に播種された細胞は付着性である。いくつかの実施形態では、細胞は、その後の細胞培養工程の間にマトリックスから洗い流されない、輸送される間にマトリックスから離れない、及び／またはマトリックスを移植する外科的処置の間にマトリックスから離れない程度に支持マトリックスに付着する。
【０１１２】
とりわけ、本開示は、かなりの比率の細胞が生存可能である細胞を播種した支持マトリックスを提供し、細胞を播種したマトリックスに存在するそのような高い生存率の細胞は特定の病変または欠損の成功的治療を著しく向上させることができ、そのために必要とされてもよい。いくつかの実施形態では、細胞を播種したマトリックスに存在する細胞の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％以上が生存可能である。いくつかの実施形態では、細胞を播種したマトリックスに存在する軟骨細胞の少なくとも９０％が生存可能である。
【０１１３】
細胞を播種した支持マトリックス上に播種された細胞は、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、２週間、３週間以上生存可能である。いくつかの実施形態では、支持マトリックス上に播種された細胞は分裂する。いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは約４℃〜約３７℃で保存される。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは少なくとも２５０，０００個の細胞／ｃｍ２、３００，０００個の細胞／ｃｍ２、４００，０００個の細胞／ｃｍ２、５００，０００個の細胞／ｃｍ２、６００，０００個の細胞／ｃｍ２、７００，０００個の細胞／ｃｍ２、８００，０００個の細胞／ｃｍ２、９００，０００個の細胞／ｃｍ２、１，０００，０００個の細胞／ｃｍ２以上を含む。いくつかの実施形態では、２５０，０００個の細胞／ｃｍ２、３００，０００個の細胞／ｃｍ２、４００，０００個の細胞／ｃｍ２、５００，０００個の細胞／ｃｍ２、６００，０００個の細胞／ｃｍ２、７００，０００個の細胞／ｃｍ２、８００，０００個の細胞／ｃｍ２、９００，０００個の細胞／ｃｍ２、１，０００，０００個の細胞／ｃｍ２を超える細胞を含む細胞を播種した支持マトリックスは対象への移植に好適である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは少なくとも５×１０６、７．５×１０６、１．０×１０７、１．５×１０７、２．０×１０７、２．５×１０７、３．０×１０７個以上の細胞を含む。いくつかの実施形態では、２０ｃｍ２のブタＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンの膜は、約１．０×１０７個の軟骨細胞〜約２．０×１０７個の軟骨細胞を含む。いくつかの実施形態では、１４．５ｃｍ２のブタＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンの膜は、約７．５×１０６個の軟骨細胞〜約１．５×１０７個の軟骨細胞を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは培地（例えば、ＤＭＥＭ）及び栄養補助剤（例えば、ウシ胎児血清、抗生物質）も含んでもよい。いくつかの実施形態では、培地は約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％のウシ胎児血清を含む。いくつかの実施形態では、培地は８．９％＋／−０．２％のウシ胎児血清及びゲンタマイシンで補完される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは少なくとも約５ｃｍ２、１０ｃｍ２、１２ｃｍ２、１３ｃｍ２、１３．５ｃｍ２、１４ｃｍ２、１４．５ｃｍ２、１５ｃｍ２、１５．５ｃｍ２、１６ｃｍ２、１７ｃｍ２、１８ｃｍ２、１９．５ｃｍ２、２０ｃｍ２、２０．５ｃｍ２、２１．５ｃｍ２、２２ｃｍ２、２５ｃｍ２、３０ｃｍ２の表面積を有する。いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは、約２０ｃｍ２（例えば、４ｃｍ×５ｃｍ）の表面積を有する。いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは、約１４．５ｃｍ２（例えば、３ｃｍ×５ｃｍ）の表面積を有する。いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは、トリミングされ、成形され、切断され、形作られ、または形成され、治療を必要とする欠損、病変及び／または負傷の形状に対応する。いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは不規則な形状のものである。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは、軟骨細胞の増殖の間のソース細胞調製物の調製の間に使用される成分（例えば、ウシ胎児血清アルブミン、ウシ胎児血清及び／またはウマ血清）を実質的に含まない。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞を播種した支持マトリックスは、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ未満のウシ胎児血清アルブミンを含む。いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは、マイコプラズマ、エンドトキシン、及び／または微生物（例えば、好気性微生物（複数可）、嫌気性微生物（複数可）及び／または真菌）の汚染を実質的に含まない。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本開示に従って調製される細胞を播種した支持マトリックス組成物は生体適合性の接着剤または糊を含む。いくつかの実施形態では、細胞の少なくとも一部は生体適合性の接着剤または糊でコーティングされる。いくつかの実施形態では、生体適合性の接着剤または糊は支持マトリックス上の細胞を覆って層を形成する。いくつかの実施形態では、生体適合性の接着剤または糊は支持マトリックス上の細胞の下で層を形成する。いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは生体適合性の接着剤または糊と細胞との多重層を含む。いくつかの実施形態では、生体適合性の接着剤または糊は支持マトリックス内に含侵される。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本開示は、支持マトリックスの表面または端部にて細胞と糊及び／または接着剤との１以上の交互層の混合物で一緒に組み合わせられる細胞と糊及び／または接着剤とを提供する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物に使用される生体適合性の接着剤または糊には、有機フィブリン接着剤（例えば、ＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａから入手可能なフィブリン系接着剤）または自己血を使用した手術中に調製されるフィブリン接着剤が挙げられる。
【０１２２】
調製方法
いくつかの実施形態では、同種ヒト軟骨細胞はヒトから採取した組織から得られる。いくつかの実施形態では、同種ヒト軟骨細胞は成人ヒトから採取した組織から得られる。いくつかの実施形態では、ソース組織試料は生きているヒト対象から得られてもよい。代わりにまたはさらに、いくつかの実施形態では、同種ヒト軟骨細胞は死体から採取した組織から得られる。試料がヒトの死体から得られる場合、試料は死亡の２４時間以内に、または代わりに死後１週間までに採取されてもよい。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、組成物の細胞は、軟骨細胞または軟骨細胞前駆体を含むソース組織試料の生検、摘出、切除及び／または切開によってヒト対象から得てもよい。いくつかの実施形態では、骨は、生細胞の可能性または数を増やすので組織試料に含まれる。いくつかの実施形態では、ヒト対象は成人である。いくつかの実施形態では、成人はおよそ１８〜３０歳、１８〜４０歳、１８〜５０歳、１８〜５５歳、または１８〜６０歳である。いくつかの実施形態では、試料は２０〜３０歳程度の成人から得られる。いくつかの実施形態では、ヒト対象は若年である。いくつかの実施形態では、ヒト対象はおよそ１歳〜１７歳である。いくつかの実施形態では、ヒト対象はおよそ１２歳〜３９歳である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は少なくとも１０歳である。本開示は、軟骨細胞または軟骨細胞前駆体を含むソース組織試料が、治療を必要とする対象（複数可）以外のヒト対象から得られることを企図する（例えば、細胞は同種である）。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、組織試料は物理的な整合性を確保するために検査に供される。いくつかの実施形態では、検査は目視による。いくつかの実施形態では、組織試料は、それを含んで輸送する培地の種類を決定するために検査される。いくつかの実施形態では、組織試料は組織が凍結培地に含まれた状態で受理されたかどうかを決定するために検査される。いくつかの実施形態では、組織試料は異物が存在するかどうかを決定するために検査される。いくつかの実施形態では、組織試料は、輸送培地が失効しているかどうかを決定するために検査される。いくつかの実施形態では、損傷した軟骨が分離される。いくつかの実施形態では、異常な軟骨が分離される。いくつかの実施形態では、損傷した軟骨が拒絶される。いくつかの実施形態では、異常な軟骨が拒絶される。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、組織試料は滑膜について検査される。いくつかの実施形態では、組織試料は骨について検査される。いくつかの実施形態では、組織試料は望ましくない組織について検査される。いくつかの実施形態では、組織試料は剛性の欠如がある領域について検査される。いくつかの実施形態では、組織試料は剛性を欠く１以上の領域を検出するために各面を突くことによって検査される。いくつかの実施形態では、組織試料は膜組織について検査される。いくつかの実施形態では、組織試料は線維組織について検査される。いくつかの実施形態では、組織試料は脂肪組織について検査される。いくつかの実施形態では、骨、滑膜、薄い組織、浮遊組織、または変わった色のうちの１以上の存在は、組織試料が組織処理後にわずかな軟骨細胞を生じ得ることを示すことができる。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ソース細胞調製物はヒト対象に由来する組織試料の採取の後、約６時間、１２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間または４週間以内に組織試料から調製される。いくつかの実施形態では、組織試料は処理に供される。いくつかの実施形態では、軟骨細胞は組織試料から単離される。いくつかの実施形態では、組織試料は輸送培地にて輸送される。いくつかの実施形態では、組織試料は、調達の後７日間まで輸送培地にて保存されることが可能である。いくつかの実施形態では、輸送培地は組織試料から静かに捨てられる。いくつかの実施形態では、輸送培地は組織試料から吸引して除かれる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、組織試料が単離されるとすぐに、どんな骨及び滑膜も、存在するならば、トリミングで除かれる。いくつかの実施形態では、トリミングした後、組織試料の目標最終重量は９ｇ以下である。いくつかの実施形態では、トリミングされて約１ｇ〜約９ｇの重さである組織試料が処理される。いくつかの実施形態では、トリミングされて約９ｇの重さである組織試料が処理される。いくつかの実施形態では、トリミングされて１ｇ未満の重さである組織試料は処理されない。いくつかの実施形態では、トリミングされて９ｇを超える重さである組織試料は処理されない。いくつかの実施形態では、トリミングされて組織試料はおよそ３００ｍｇの試料に分割される。いくつかの実施形態では、組織試料は約２００ｍｇ〜約４００ｍｇの重さの試料に分割される。いくつかの実施形態では、組織試料は約２５０ｍｇ〜約３２０ｍｇの重さの試料に分割される。いくつかの実施形態では、組織試料は約２８０ｍｇ〜約３００ｍｇの重さの試料に分割される。いくつかの実施形態では、組織試料は約３００ｍｇの重さである。いくつかの実施形態では、組織試料は約２８０ｍｇ未満の重さではない。いくつかの実施形態では、各組織試料は別々に処理される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、組織試料は、細胞を遊離するために機械的粉砕に供される。いくつかの実施形態では、酵素処理に先立って、消化を助けるために組織を細かく刻む。いくつかの実施形態では、組織を約２ｍｍ２〜約３ｍｍ２の小片に細かく刻む。いくつかの実施形態では、組織を約１ｍｍ２〜約２ｍｍ２の小片に細かく刻む。いくつかの実施形態では、組織を約０．５ｍｍ２〜約１ｍｍ２の小片に細かく刻む。いくつかの実施形態では、組織を約０．５ｍｍ２の小片に細かく刻む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、組織試料は酵素処理に供される。いくつかの実施形態では、組織試料は酵素（複数可）を含有する細胞増殖培地にて洗浄され、インキュベートされて細胞を損傷することなく、細胞の周囲の組織を消化する。いくつかの実施形態では、組織は非特異的なプロテアーゼ及びコラゲナーゼの組み合わせを用いて消化される。いくつかの実施形態では、軟骨細胞を含む組織は非特異的なプロテアーゼを含む細胞増殖培地を用いて消化されてもよい。いくつかの実施形態では、組織は３７℃で約３０分間〜約９０分間、約３０分間〜約２時間、約６０分間〜約９０分間または約６０分間〜約２時間消化される。いくつかの実施形態では、軟骨試料は非特異的なプロテアーゼにて６０〜９０分間消化される。非特異的なプロテアーゼによる処理に続いて、いくつかの実施形態では、組織はさらに、細胞増殖培地にてコラゲナーゼによって消化される。いくつかの実施形態では、組織は３７℃で約８時間〜約１６時間、約８時間〜約２４時間、約８時間〜約３２時間、約１６時間〜約２４時間、または約１６時間〜約３２時間消化される。いくつかの実施形態では、軟骨試料はコラゲナーゼで約１６〜２４時間消化される。いくつかの実施形態では、組織は５％ＣＯ２の雰囲気で消化される。いくつかの実施形態では、組織は密閉容器にて消化される。いくつかの実施形態では、細胞増殖培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、約２０％（＋／−１％）の照射されたウシ胎児血清（ｉｒＦＢＳ）、及び任意で抗生物質（例えば、４０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン）、抗真菌剤、及び系列の細胞分化を誘導するための因子（複数可）を含む（以下「細胞増殖培地」）。いくつかの実施形態では、細胞増殖培地は、アスコルビン酸及びまたは形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）を含む。いくつかの実施形態では、細胞増殖培地はＨＥＰＥＳを含む。いくつかの実施形態では、細胞増殖培地はグルタマックスを含む。いくつかの実施形態では、細胞増殖培地は高グルコースを含む。いくつかの実施形態では、細胞増殖培地はＬ−グルタミンを含む。いくつかの実施形態では、細胞増殖培地はＤＭＥＭ、ＨＥＰＥＳ、ウシ胎児血清及びゲンタマイシンを含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、消化の工程に続いて、細胞を遠心分離によって単離する。いくつかの実施形態では、上清を細胞ペレットから静かに捨てる。いくつかの実施形態では、上清を細胞ペレットから吸引して除く。いくつかの実施形態では、遠心分離には増殖培地による細胞の洗浄が続く。いくつかの実施形態では、細胞ペレットは増殖培地に再浮遊される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、単離された細胞を計数し、生存率について評価する。いくつかの実施形態では、細胞を血球計で計数する。いくつかの実施形態では、生細胞を計数する。いくつかの実施形態では、非生細胞を計数する。いくつかの実施形態では、ｍＬ当たりの生細胞が算出される。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、単離に続いて、細胞を３７℃で５％ＣＯ２の雰囲気にて約３日間〜約６週間細胞増殖培地において培養する。培養期間は、最初に得られた細胞の数に応じて変化してもよい。様々な種類の細胞は増殖の様々な速度を有するので、培養時間は様々な細胞の種類で変化してもよい。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、組織培養における細胞の増殖及び／または分化を支援する培地が利用される。当業者は、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α−改変最小必須培地（α−ＭＥＭ）、及びロズウェルパーク記念研究所培地１６４０（ＲＰＭＩ培地１６４０）等を含む潜在的に有用な種々の培地を認識するであろう。いくつかの実施形態では、約２０％までのウシ胎児血清（ＦＢＳ）または１％〜２０％のウマ血清が培地に添加されて軟骨細胞の増殖を支援する。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、定義された培地が使用されてもよく、いくつかのそのような実施形態では、１以上の成長因子、サイトカイン、ホルモン、及びＦＢＳが、細胞の成長、増殖及び／または分化を可能にする及び／または促すのに適当な濃度で提供される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、２％〜１０％のＣＯ２含量及び１％〜２２％の酸素含量にて３１℃〜３７℃の温度で細胞を増殖させ、及び／または維持する。いくつかの実施形態では、細胞は６週間までこれらの条件下で維持されてもよい。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、細胞は、２回の継代、３回の継代、４回の継代、５回の継代、６回の継代、７回の継代、８つの通路、９回の継代、１０回以上の継代まで培養で維持される。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、軟骨細胞は単層細胞培養において脱分化し、線維芽細胞の表現型を示し、Ｃｏｌ２及びアグリカンを下方調節する。理論に束縛されることを望まないが、脱分化は、三次元の軟骨マトリックスからの軟骨細胞の取り出し後に発生し、単層培養における細胞の増殖及び増大の間、観察される。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載されているように、細胞播種密度を達成するのに十分な密度まで培養される。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、細胞は、組織培養表面から細胞を遊離させるのに十分な時間、酵素（例えば、トリプシン）と接触させる。いくつかの実施形態では、遊離された細胞は、細胞の浮遊液として提供される。いくつかの実施形態では、細胞の浮遊液を支持マトリックスの１以上の所定部分（例えば、一方の面は、面の一部と）と接触させるので、細胞の実質的な一部または実質的にすべての細胞は支持マトリックスの１以上の面に接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、支持マトリックスの片面のみにて、または片面の端部にて保持される。いくつかの実施形態では、支持マトリックスとの接触の際、細胞は付着する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、支持マトリックス（例えば、吸収性コラーゲン膜）は容器にて提供される。いくつかの実施形態では、支持マトリックスは容器の底面上に配置されるまたは置かれる。いくつかの実施形態では、容器はアンカーを含む。いくつかの実施形態では、支持マトリックスは、容器の底面上に配置されまたは置かれ、アンカーはそのような支持マトリックスの上に配置される。当業者は、支持マトリックスの上に配置されたアンカーが支持マトリックスの外側端部（例えば、周縁部）のみに接触してもよいことを認識するであろう。いくつかの実施形態では、支持マトリックスの上に配置されたアンカーは、そのようなアンカーの側壁と支持マトリックスの上面によって囲まれた面積または体積を定義する。いくつかの実施形態では、アンカーの側壁と支持マトリックスの上面によって囲まれた面積または体積はそのような面積または体積の範囲内での細胞（例えば、軟骨細胞）を限定する。いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスはアンカーを含む容器内に固定される。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、支持マトリックスの表面上の及び／またはその近傍の細胞のそのような制御された播種は、細胞が自由に移動し、及び／または移植の部位に存在できるようにし得、及び／または移植の部位での強化された細胞増殖及び／または組織の再生につながり得る。
【０１４２】
現在開示されているように、均一な播種が好ましい。理論に束縛されることを望まないが、播種した細胞の数は、細胞を播種した支持マトリックスを用いて治療される患者にて生成される最終組織の量を限定しないと考えられている。しかしながら、最適な播種は、移植後の患者における細胞及びまたは組織の生成の速度を高めてもよい。いくつかの実施形態では、最適な播種量は培養条件に左右される。いくつかの実施形態では、均一な播種は播種された細胞間の隙間または空間の欠如を特徴とする。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、軟骨細胞は少なくとも２５０，０００個の細胞／ｃｍ２、３００，０００個の細胞／ｃｍ２、４００，０００個の細胞／ｃｍ２、５００，０００個の細胞／ｃｍ２、６００，０００個の細胞／ｃｍ２、７００，０００個の細胞／ｃｍ２、８００，０００個の細胞／ｃｍ２、９００，０００個の細胞／ｃｍ２、１，０００，０００個の細胞／ｃｍ２以上の密度で支持マトリックス（例えば、ブタのＩ型及びＩＩＩ型のコラーゲン）上に播種される。いくつかの実施形態では、支持マトリックス上に播種された細胞は分裂してもよいし、及び／または分化してもよい。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、合計少なくとも５×１０６、７．５×１０６、１．０×１０７、１．５×１０７、２．０×１０７、２．５×１０７、３．０×１０７個以上の軟骨細胞が支持マトリックス（例えば、Ｉ型及びＩＩＩ型のコラーゲン）上に播種される。いくつかの実施形態では、合計約１．０×１０７個の軟骨細胞〜約２．０×１０７個の軟骨細胞が２０ｃｍ２のブタのＩ型及びＩＩＩ型のコラーゲン膜上に播種される。いくつかの実施形態では、合計約７．５×１０６個の軟骨細胞〜約１．５×１０７個の軟骨細胞が１４．５ｃｍ２のブタのＩ型及びＩＩＩ型のコラーゲン膜上に播種される。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスを細胞増殖、支持マトリックスへの付着、生存率及び／または分化に有利な培地に接触させる。いくつかの実施形態では、培地はＤＭＥＭを含む。いくつかの実施形態では、培地は物質、例えば、ウシ胎児血清、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）で補完される。いくつかの実施形態では、培地は約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％のウシ胎児血清で補完される。いくつかの実施形態では、培地は８．９％＋／−０．２％のウシ胎児血清で補完される。いくつかの実施形態では、同種軟骨細胞を播種したブタコラーゲンＩ型及びＩＩＩ型を含む膜を、８．９％＋／−０．２％のＦＢＳ及び４５μｇ／ｍＬのゲンタマイシンで補完されたＤＭＥＭと接触させる。いくつかの実施形態では、支持マトリックス上に播種した細胞を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８日以上、上述したように培地と接触させる。いくつかの実施形態では、支持マトリックス上に播種した軟骨細胞を約２〜４日間、上述したように培地と接触させる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、品質評価工程は、細胞を播種した支持マトリックス、またはその一部で実施される。いくつかの実施形態では、品質評価工程は、膜の完全性、粒子状物質の存在または非存在、細胞生存率、細胞密度、細胞の独自性及びまたは無菌性の評価または測定を含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、すすぎを含む工程によって、栄養補助剤を含有する培地を支持マトリックス上に播種した軟骨細胞から取り除く。いくつかの実施形態では、すすぎ工程は一連のすすぎ工程である。いくつかの実施形態では、細胞を播種したマトリックスを培地、例えば、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭを用いてすすぐ。いくつかの実施形態では、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭも保存培地や輸送培地として好適である。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、生体適合性の接着剤または糊は支持マトリックスに細胞を接触させるのに利用される。いくつかの実施形態では、細胞は支持マトリックスとの接触の前に、その最中に及びまたはその後で生体適合性の接着剤または糊と混合される。いくつかの実施形態では、生体適合性の接着剤または糊は、支持マトリックス上の細胞を覆って、支持マトリックス上の細胞の下で積層されてもよいし、または支持マトリックス内に含浸されてもよい。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本開示は、混合物にて一緒に組み合わせられる細胞と糊を組み合わせることと、支持マトリックスの表面または端部にて細胞と糊の１以上の交互層を形成することとを提供する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物に使用される生体適合性の接着剤または糊には、有機フィブリン糊（例えば、ＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａから入手可能なフィブリン系接着剤）または自己血を使用した手術中に調製されるフィブリン糊が挙げられる。
【０１５１】
細胞バンクの調製の方法及び使用
本発明は、培養細胞及び／または後で使用するための細胞を播種した支持マトリックスの貯蔵及びバンキングを企図する。企図されるのはまた、保存された細胞の使用方法である。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、単一のヒト対象から得られるソース組織試料は、複数の他のヒト対象を治療するのに十分な数の軟骨細胞及び／または軟骨細胞前駆体を提供する。いくつかの実施形態では、十分なソース組織が単一の対象から得られて約１００、約２００、約５００、約１０００、約１５００または約２０００人の対象を治療するのに十分な軟骨細胞を提供してもよい。
【０１５３】
通常、ソース組織試料は軟骨細胞または軟骨細胞前駆体を含む組織から得られる。例えば、軟骨細胞及び軟骨細胞前駆体は、軟骨（例えば、硝子軟骨、線維軟骨または弾性軟骨）または骨髄から単離されてもよい。いくつかの実施形態では、好適な軟骨は関節面に（例えば、膝関節）または半月板に位置してもよい。いくつかの実施形態では、適切な軟骨は、大腿顆、特に、切痕の外上領域または外側領域に位置してもよい。いくつかの実施形態では、関節面から得られるソース組織試料から単離される軟骨細胞は本明細書に記載されている組成物の調製に好適である。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ソース組織（例えば、ソース軟骨）は、レシピエント対象における病変部位に対応するソース対象の部位から得られる。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、培養細胞及び／または細胞を播種した支持マトリックスは、約０℃、約４℃、約６℃、約８℃、約１０℃、約１２℃、約１４℃、約１６℃、約１８℃、約２０℃、約２２℃、約２４℃、約２６℃、約２８℃、約３０℃、約３２℃、約３４℃、約３６℃、約３７℃以上で保存される。いくつかの実施形態では、培養細胞及び／または細胞を播種した支持マトリックスは０℃未満で保存される。いくつかの実施形態では、培養細胞及び／または細胞を播種した支持マトリックスは、約−５℃〜約５℃、約５℃〜約１０℃、約１０℃〜約１５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約４０℃で保存される。いくつかの実施形態では、培養細胞及び／または細胞を播種した支持マトリックスは、約−５℃〜約３７℃、及びその中の範囲で保存される。理論に束縛されることを望まないが、保存は、軟骨細胞の機能特性に影響を与えることなく、それを長期間保存することを有利に可能にする。いくつかの実施形態では、軟骨細胞の調製物及び／または軟骨細胞を播種したコラーゲン膜は、例えば、生体内での移植に先立って本明細書に記載されている条件下で保存されてもよい。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている細胞調製物及び／または細胞を播種した支持マトリックスは、少なくとも２４時間、少なくとも２日間、少なくとも５日間、少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間以上保存される。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、細胞は、初代細胞バンクとして（例えば最初の培養工程に続いて）保存される。いくつかの実施形態では、初代細胞における細胞は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０年間保存される。いくつかの実施形態では、細胞は二次細胞バンク、または作業細胞バンクとして保存される。二次細胞バンクまたは作業細胞バンクは初代細胞バンクに由来する細胞から構成されてもよい。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、細胞は凍結保存に先立ってトリプシンで処理される。いくつかの実施形態では、細胞は約５０％〜約１００％の集密レベルにてトリプシンで処理される。いくつかの実施形態では、細胞は約５０％〜約９０％の集密レベルにてトリプシンで処理される。いくつかの実施形態では、細胞は約７０％での集密レベルにてトリプシンで処理される。あるいは、いくつかの実施形態では、細胞は、初代培養物が増殖の最大日数の１６日に達した場合、及び二次培養物が増殖の最大日数の１０日に達した場合にトリプシンで処理される。いくつかの実施形態では、細胞は０．０５％トリプシン及びＥＤＴＡで処理される。いくつかの実施形態では、トリプシンで処理した後、血球計を用いて生存率について細胞を分析する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、細胞は、約１×１０６個の細胞／ｍＬ〜約５×１０６個の細胞／ｍＬの細胞密度で凍結される。いくつかの実施形態では、２０％ＤＭＳＯはバイアル中の細胞の体積に等しい体積で凍結保存バイアルに添加される。いくつかの実施形態では、２０％のＤＭＳＯは凍結保存バイアルに一滴ずつ添加される。いくつかの実施形態では、細胞は約−７０℃〜約−６０℃の温度で凍結される。いくつかの実施形態では、細胞は約−８０℃の温度で凍結される。いくつかの実施形態では、細胞は液体窒素蒸気（ＬＮ２）で長期間保存される。いくつかの実施形態では、凍結保存バイアルを約−８０℃で約２時間〜約２４時間凍結した後、ＬＮ２に移す。いくつかの実施形態では、細胞は約１日〜約７年間、長期的に保存される。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、生理食塩水溶液（例えば、血漿と等張の溶液）は軟骨細胞を保存するために使用される。いくつかの実施形態では、細胞または細胞を播種した支持マトリックスは、塩化物塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び／または塩化マグネシウム）と乳酸塩（例えば、乳酸ナトリウム）を含む溶液中で保存されてもよい。いくつかの実施形態では、等張の生理食塩水溶液は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、及び乳酸ナトリウムを含んでもよい。いくつかの実施形態では、等張の生理食塩水溶液は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び乳酸ナトリウムを含んでいてもよく、それは「乳酸リンゲル液」と同等である。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、保存される細胞は品質管理のために分析される。いくつかの実施形態では、解凍された細胞バンクの細胞は品質管理のために分析される。いくつかの実施形態では、初代細胞が品質管理のために分析される。いくつかの実施形態では、二次細胞が品質管理のために分析される。いくつかの実施形態では、三次細胞が品質管理のために分析される。いくつかの実施形態では、細胞はマイコプラズマについて分析される。いくつかの実施形態では、細胞はエンドトキシンについて分析される。いくつかの実施形態では、細胞は無菌性について分析される。いくつかの実施形態では、細胞はウイルスについて分析される。いくつかの実施形態では、細胞はレトロウイルスについて分析される。いくつかの実施形態では、細胞は核学について分析される。いくつかの実施形態では、細胞は細胞株（例えば軟骨細胞）の同定について分析される。いくつかの実施形態では、細胞は生存率について分析される。いくつかの実施形態では、細胞は老化について分析される。いくつかの実施形態では、細胞は集密性について分析される。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、極低温凍結した細胞を解凍する。いくつかの実施形態では、極低温凍結した細胞を培養接種のために解凍する。いくつかの実施形態では、細胞は約３５．５℃〜約３８．５℃で解凍される。いくつかの実施形態では、細胞は約３７℃で解凍される。いくつかの実施形態では、細胞はヒートブロックにて解凍される。いくつかの実施形態では、細胞はデジタルドライバスユニットにて解凍される。いくつかの実施形態では、細胞は水浴にて解凍される。いくつかの実施形態では、解凍された細胞を新しい試験管に移す。いくつかの実施形態では、凍結保存バイアルを培地で洗浄する。いくつかの実施形態では、洗浄液は解凍した細胞に一滴ずつ添加される。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、解凍された細胞は生存率について測定される。いくつかの実施形態では、生存率は血球計で測定される。いくつかの実施形態では、存在する細胞の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％以上は生存能力がある。いくつかの実施形態では、調製物中の細胞の少なくとも９０％は生存能力がある。いくつかの実施形態では、調製物中の細胞の少なくとも７０％は生存能力がある。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、解凍後の回収率が算出される。いくつかの実施形態では、回収率は少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％以上である。いくつかの実施形態では、細胞の少なくとも５０％が解凍後に回収される。
【０１６５】
治療方法
いくつかの実施形態では、本開示は、対象における軟骨の欠損、病変及び／または負傷を治療する／修復するために支持マトリックス（例えば、コラーゲン膜）上にて播種し、増殖させた軟骨細胞の使用を企図する。代わりにまたはさらに、いくつかの実施形態では、本開示は対象にて軟骨を再生するための本明細書に開示されている組成物の使用を企図する。いくつかの実施形態では、軟骨の欠損、病変及び／または負傷は、対象の関節接合部（例えば、膝、足首、肘、肩、股関節、または手首）に位置する。いくつかの実施形態では、対象の内側大腿顆、外側大腿顆または滑車の欠損は本開示の組成物を用いて治療される。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、治療される対象は、成人ヒトである。いくつかの実施形態では、治療される対象は、１０〜１７歳のヒトであり、いくつかのそのような実施形態では、対象は開放成長板を有さない。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスが欠損、病変及び／または損傷の部位に移植される場合、マトリックスは治療される面に向いて（例えば、接触して）細胞と共に配置される。いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは病変、欠損及び／または負傷の部位の中に及び／またはそれを覆って移植される。いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは、軟骨または骨軟骨の欠損への投与のために（例えば、折り曲げ、切断、トリミング、等によって）成形し易い形態（例えば、シート形態）で提供される。いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは、対象の軟骨または骨軟骨の欠損に独自に適合するまたは付着する形態に成形される。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは、欠損、病変及び／または損傷に移植された後、覆っているマトリックスは、例えば、生体適合性の接着剤または縫合糸を使用して固定される。いくつかの実施形態では、覆っているマトリックスは、周囲組織からの治療される領域への望ましくない細胞及び／または生体因子（例えば、線維芽細胞、マクロファージ）の浸潤を防止するために領域を覆うのに役立つ。いくつかの実施形態では、覆っているマトリックスは、本明細書に記載されている任意の支持マトリックスを含む、及び／またはヒアルロン酸、フィブリン及び／またはポリ乳酸を含んでもよい。いくつかの実施形態では、覆っているマトリックスは無細胞であり、且つ吸収性である。いくつかの実施形態では、覆っているマトリックスは半浸透性である。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、覆っているマトリックスを固定するのに使用される生体適合性の接着剤または糊には、有機フィブリン糊または封止剤（例えば、ＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａから入手可能なフィブリン系接着剤）または自己血を使用した手術中に調製されるフィブリン糊が挙げられる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、生体適合性の接着剤または糊は、細胞を播種した支持マトリックスを欠損を覆うように配置またはその中へ配置するのに先立って欠損に塗布される。いくつかの実施形態では、生体適合性の接着剤または糊は、欠損を覆うように配置またはその中へ配置するのに先立って、細胞を播種した支持マトリックスに塗布される。いくつかの実施形態では、生体適合性の接着剤または糊は、移植片の周囲に塗布される。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは、接着剤または糊の有無にかかわらず、移植の部位に注入される。いくつかの実施形態では、細胞を播種した支持マトリックスは、低侵襲性処置を介して移植される。いくつかの実施形態では、低侵襲性処置は、関節切開術、ミニ関節切開術、関節形成術及び関節鏡検査から成る。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、細胞を播種した１以上の支持マトリックスは欠損、病変及び／または負傷を含む領域を治療するために移植される。いくつかの実施形態では、細胞を播種した１、２、３、４、５以上の支持マトリックスが欠損、病変及び／または負傷を含む領域に移植される。いくつかの実施形態では、細胞を播種した１を超える支持マトリックスが欠損、病変及び／または負傷の中でまたはそれを覆って積層される。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、単一マトリックスが、複数の欠損を治療するために利用される。いくつかの実施形態では、複数の欠損は異なるマトリックスでそれぞれ治療される。いくつかの実施形態では、１以上の欠損は複数の個々のマトリックスで治療される。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物による治療に続いて、治療された領域（例えば、関節接合部）をスクリーニング法（例えば、磁気共鳴画像法）を用いて評価する。いくつかの実施形態では、治療された領域は、欠損、病変及び／または負傷の充填、修復及び／または治癒について評価される。
【０１７５】
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。加えて、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似のまたは同等の方法及び材料が本開示の実践または試験において使用され得るけれども、好適な方法及び材料が本明細書に記載されている。
【０１７６】
本開示は以下の実施例によってさらに説明される。実施例は単に例示の目的のために提供される。それらはいかなる方法でも本開示の範囲または内容を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１７７】
実施例１：ＭＡＣＩ処置と組み合わせた自家及び同種の軟骨細胞ソースを比較する膝軟骨修復前臨床フィージビリティ試験。
すべての手順はＡＳＴＭ  Ｆ２４５１−０５（２０１０）１を規範とするＩＡＣＵＣの承認後に実施された。合計１８匹の骨格的に成熟したニュージーランドホワイト系ウサギを使用して、同種軟骨細胞ソースに対比させて自家軟骨細胞ソースを比較した。追加の８匹のウサギは対照に使用した（欠損のみとコラーゲン膜のみで、群当たり４匹のウサギ）。
【０１７８】
自家対同種試験については、ウサギを以下のコホート：１〜６：自家群、７〜１２：同種群のためのドナー（非生存、軟骨の採取のみ）、１３〜１８：同種群に分けた。
【０１７９】
ウサギから膝軟骨を採取した。採取した軟骨組織は、０．９％ＮａＣｌ中で１０ｍＬのファルコンチューブに入れ、軟骨組織の消化及び細胞単離のためにＶｅｒｉｃｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に輸送した。細胞を播種したコラーゲン膜は、約３週間後移植のための準備ができていた。各シートはｃｍ２当たりおよそ５００，０００〜１，０００，０００個の細胞を含有した。
【０１８０】
ＮＺＷＲ１〜６は、膝（滑車溝）上に自家ＭＡＣＩの移植を受けた一方で、ＮＺＷＲ１３〜１８は同種軟骨細胞ソースを使用してＭＡＣＩの移植を受けた。各ウサギについて、２つの直径３ｍｍの軟骨欠損を滑車溝内に作り出したが、一方は溝の上面にあり、第２の欠損は顆間切痕より上にある溝の下面にあった。３ｍｍの生検皮膚パンチを使用してＭＡＣＩ膜を切り出し、欠損を覆って置き、フィブリンゲル封止剤（Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ）を用いて固定した。膝蓋骨は慎重に滑車溝に移し、３−０ナイロンを用いて膝カプセルを閉じ、及び３−０ビクリルを使用して真皮組織を閉じた。手術した後、ウサギをケージに戻し、餌と水を自由に摂取させて、制御された温度、湿度、概日周期の環境にて飼育した。すべてのウサギを１２週で安楽死させた。膝を採取し、組織学的分析のために処理した。新軟骨形成を評価するために脱パラフィン化スライド上にてヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）、トルイジンブルー、及びＩＩ型コラーゲンの染色を行った。
【０１８１】
すべてのＮＺＷＲは１２週時点に到達した。結果を図１に要約する。対照群（欠損のみの群）及び膜のみの群では軟骨再生は肉眼的にまたは組織学的に可視化されなかった。コラーゲン膜の残渣のみが依然としてコラーゲン膜のみの群に存在した。自家コホートでは、肉眼的検査は硝子質様の軟骨組織によって覆われた欠損を明らかにした。滑液は透明であり、通常の量で存在した。組織学的に、軟骨組織は豊富なトルイジンブルー染色を特徴としていた。ＩＩ型コラーゲン染色はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の染色パターンと一致した。
【０１８２】
１２週で、新軟骨組織は部分的に周囲のネイティブ軟骨組織と統合した。骨軟骨組織内に炎症性浸潤の徴候はなかった。同種群では、肉眼的に欠損が硝子質様の軟骨組織で覆われていた。感染症または炎症の徴候はなく、滑液は透明で、正常な量で存在した。組織学的に、欠損はトルイジンブルー染色を介して豊富なＧＡＧ沈着を示す軟骨組織で満たされた。コラーゲン染色は同じ染色パターンに従った。自家群と同様に、新軟骨は部分的に周囲の軟骨と一体化した。重要なことに、血管新生または免疫細胞の浸潤を含む、明らかな免疫応答は隣接する組織において明らかにならなかった。
【０１８３】
実施例２：細胞バンクの試料の調製。
この実施例は、細胞を将来の対象で使用するための細胞バンクでの長期保存のために細胞を培養し、凍結することを実証する。
【０１８４】
処理する前に、すべての組織試料を明瞭さと正確さについて目視で検査する。
【０１８５】
組織を輸送培地で受け取るならば、培地を吸引して除き、捨てる。組織を袋で受け取るならば、無菌のハサミを使用して袋の上部の角を切断する。輸送培地を吸引し、その後バッグを切り開き、引き離して平坦で、無菌の領域を作り出す。組織を、滅菌ペトリ皿に移し、Ｌ−グルタミンとのＨａｍ’ｓＦ−１２の混合物（例えば、Ｆ−１２溶液）ですすぐ。
【０１８６】
組織を秤量し、各面を突くことによって滑膜、骨、または他の望ましくない組織を目視で検査し、剛性を欠く、線維質と思われる、または脂肪と思われる任意の領域を検出する。組織は、軟骨のみが残るようにすべての骨と滑膜をトリミングする。次いで組織を再び秤量する。トリミングした重量が９ｇより大きければ、最終重量が９ｇ以下になるまで、過剰な組織を除去する。９ｇより大きなまたは１ｇ未満の組織は処理されるべきではない。
【０１８７】
組織試料の重量を３００ｍｇで割って、処理するために何本の遠心管を必要とするかを決定する。各遠心管にて、５ｍＬのＦ−１２溶液と５ｍＬの２×のプロテアーゼを各遠心管に添加することによって１×非特異的プロテアーゼ溶液を添加する。組織を２８０ｍｇ〜３００ｍｇの重さの小片に分割し、各小片を滅菌ペトリ皿に入れる。０．５ｍＬのＦ−１２溶液を組織の各小片に加え、小片が乾燥してしまわないことを保証する。プロテアーゼ消化のための準備ができるとＦ−１２溶液を吸引して除く。
【０１８８】
各遠心管からの０．５ｍＬの１×プロテアーゼ／Ｆ−１２溶液を各ペトリ皿に加える。小片のすべてが約０．５ｍｍ２よりも小さくなるまで組織を細かく切り刻む。１×プロテアーゼ／Ｆ−１２溶液を含む遠心管に切り刻んだ組織を移す。反応物を３７℃±１．５℃で７５分±１５分間インキュベートする。
【０１８９】
インキュベート後、１×プロテアーゼ／Ｆ−１２溶液を取り除く。組織片を１０ｍＬのＦ−１２溶液ですすぐ。Ｌ−グルタミン、高グルコース、及びＨＥＰＥＳ（例えばＥＸＸＸＸ溶液）及び１ｍＬの１％コラゲナーゼを伴った９ｍｌのＤＭＥＭを各遠心管に添加し、反応物を３７℃±１．５℃で２０時間±４時間インキュベートする。
【０１９０】
ＨＥＰＥＳ、グルタマックス、２０％の照射したウシ胎児血清、４０μＬ／ｍＬのゲンタマイシンを伴った１０ｍＬのＤＭＥＭ（例えばＥＧ２ＭＸ溶液）を各遠心管に添加する。各遠心管からの浮遊液をプールし、２１０ＲＣＦで５分間遠心分離する。上清を吸引除去し、ペレットを５ｍＬのＥＧ２ＭＸ溶液に再浮遊させる。
【０１９１】
血球計を用いて生存率について細胞を計数する。顕微鏡を用いて、中間正方形と各角の正方形を計数する。生細胞及び非生細胞を計数し、生細胞／ｍＬの数を算出する。５×１０５個の細胞／フラスコの密度にてＥＧ２ＭＸ溶液３５ｍＬに播種するのに調製する必要がある細胞の数を決定する。細胞は５％ＣＯ２のインキュベーターにて３７℃±１．５℃で増殖させる。
【０１９２】
初代細胞は培養の開始後３〜５日に培地交換を行い、その後１〜４日の間隔で培地交換を行う。馴化培地を各フラスコから廃棄物容器に注ぎ、４０ｍＬのＥＧ２ＭＸを各フラスコに添加する。
【０１９３】
二次細胞は培養の開始後１〜４日に培地交換を行い、その後１〜４日の間隔で培地交換を行う。
【０１９４】
凍結保存する前に、品質管理のために馴化培地を分析する。無菌性について分析するために試料を採取する。
【０１９５】
実施例３：細胞バンクに保存するための細胞培養物の凍結保存。
この実施例は細胞バンクに保存のための同種細胞培養物の凍結保存を実証する。
【０１９６】
いったん細胞が７０％±２０％の集密になると、または培養物が、初代培養については増殖の最大日数の１６日もしくは二次培養については最大日数の１０日に達していると、保存に先立って細胞をトリプシンで処理する。
【０１９７】
馴化培地をフラスコから取り除き、次いで各フラスコをＥＤＴＡですすぐ。
【０１９８】
０．０５％トリプシンとＥＤＴＡ溶液をフラスコに添加し、３７℃±１．５℃にて細胞が剥離するまで、且つ８分を超えずにインキュベートする。ＥＧ２ＭＸ溶液１０ｍＬを加えてトリプシンを失活させる。
【０１９９】
浮遊液を２１０ＲＣＦで５分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを３ｍＬのＥＧ２ＭＸに再浮遊させる。
【０２００】
血球計を用いて生存率について細胞を計数する。顕微鏡を用いて、中間正方形と各角の正方形を計数する。生細胞及び非生細胞を計数し、生細胞／ｍＬの数を算出する。１０×１０６個の細胞の浮遊液を調製するのに必要とされる体積を決定し、その体積のＥＧ２ＭＸを試験管に加える。浮遊液は今や５×１０６個の細胞である。
【０２０１】
浮遊液の体積と同じ体積の２０％ＤＭＳＯを各試験管に加える。次いで、この浮遊液１ｍＬを凍結保存バイアルに加える。浮遊液を−８０℃±１０℃で少なくとも２時間、及び２４時間まで凍結する。
【０２０２】
最初の凍結後、凍結保存バイアルを液体窒素（ＬＮ２）を含む極低温保管デュワーに移す。
【０２０３】
実施例４：細胞バンクの使用。
この実施例は、特徴付けアッセイにおける使用のための及び製品のための細胞バンクの試料の解凍を実証する。
【０２０４】
凍結保存バイアルを３７℃±１．５℃で約５分間に設定されたヒートブロックに入れる。
【０２０５】
解凍したらすぐに、内容物を新しい試験管に移す。凍結保存バイアルをＥＧ２ＭＸ溶液ですすぎ、新しい試験管に移す。ＥＧ２ＭＸで体積を１０ｍＬに増やす。
【０２０６】
血球計を用いて生存率について細胞を計数する。顕微鏡を用いて、中間正方形と各角の正方形を計数する。生細胞及び非生細胞を計数し、生細胞／ｍＬの数を算出する。解凍後に回収された細胞の比率を算出する。回収率は少なくとも５０％であるべきである。
【０２０７】
細胞培養を開始するために、フラスコにてＥＧ２ＭＸ溶液３５ｍＬに５ｍＬの細胞浮遊液を接種する。細胞は５％ＣＯ２のインキュベーターにて３７℃±１．５℃で増殖させる。
【０２０８】
実施例５：細胞バンクの特徴付け。
この実施例は、製品のための使用に先立って、初代（マスター）細胞バンク試料の品質を特徴付ける及び／または決定するのに使用されるアッセイを実証する。
【０２０９】
細胞の初代凍結保存バイアルまたはマスター凍結保存バイアルを解凍後、血球計を用いて生存率について細胞を計数する。顕微鏡を用いて、中間正方形と各角の正方形を計数する。生細胞及び非生細胞を計数し、生細胞／ｍＬの数を算出する。１×１０５個の細胞／ｍＬを達成するのに必要とされる細胞浮遊液の体積を算出する。この体積は二次培養物に由来するアガロース、ペレット培養、６ウェルプレート、独自性／アグリカン及び老化のアッセイに使用される。
【０２１０】
二次細胞培養のために５×１０５個及び１×１０５個の初代細胞のフラスコを調製し、５％ＣＯ２のインキュベーターにて３７℃±１．５℃で増殖させる。培地交換は培養開始後１〜４日に行う。実施例３に記載されているように細胞をトリプシンで処理する。トリプシン処理した細胞を、アガロース、ペレット培養、６ウェルプレートの品質管理アッセイに使用する。
【０２１１】
生存率について二次細胞を再度計数し、ＥＧ２ＭＸを伴うフラスコに細胞浮遊液を接種し、８．０×１０５個の細胞／フラスコを得て、三次細胞培養物を作り出す。細胞は５％ＣＯ２のインキュベーターにて３７℃±１．５℃で増殖させる。三次培養物を用いて、独自性（例えば、軟骨細胞の存在）とアグリカンの存在について細胞バンクの試料を特徴付ける。アガロース試験及び６ウェルプレート試験のための１×１０６個の細胞／試験管を達成するために必要とされる二次培養浮遊液の体積を算出する。三次培養は培養開始後１〜４日に培地交換を行い、その後１〜４日の間隔で培地交換を行う。
【０２１２】
独自性試験とアグリカン試験については、細胞を膜上に負荷する。膜上に負荷するのに先立って、三次培養物を実施例３に記載されているようにトリプシンで処理する。フラスコをプールし、ストレイナーを介して浮遊液をすすぐ。血球計を用いて生存率について細胞を計数する。膜負荷には２５ｍＬ中２０．００×１０６個の細胞が必要とされる。細胞を２１０ＲＣＦで５分間遠心分離し、上清を取り除く。
【０２１３】
粗面を上にして膜をペトリ皿に入れ、ＨＥＰＥＳ、高グルコース、グルタマックス、４５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、及び８．９％±０．２％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（例えば、ＥＧ１ＭＸ溶液）で湿らす。細胞ペレットを５ｍＬのＥＧ１ＭＸに再浮遊させ、体積を２５ｍＬの最終体積にする。膜を３７℃±１．５℃での５％ＣＯ２のインキュベーターに入れる。負荷の２〜４日後、膜をパッケージ化し、ＨＥＰＥＳを含み、フェノールレッドを含まない１５ｍＬのＤＭＥＭ（例えばＥＸＸＩＭ）ですすぐ。
【０２１４】
老化試験のために１×１０５個の初代細胞のフラスコを調製し、５％ＣＯ２のインキュベーターにて３７℃±１．５℃で増殖させる。実施例３に記載されているように細胞を７日ごとにトリプシンで処理しなければならない。培養開始後１〜４日ごとに培地交換が発生する。
【０２１５】
血球計を用いて生存率について細胞を計数する。顕微鏡を用いて、中間正方形と各角の正方形を計数する。生細胞及び非生細胞を計数し、生細胞／ｍＬの数を算出する。１×１０５個の細胞／ｍＬを達成するのに必要とされる細胞浮遊液の体積を算出する。ＥＧ２ＭＸ溶液を含むフラスコに１ｍＬの細胞を接種し、３７℃±１．５℃での５％ＣＯ２のインキュベーターにて増殖させ、各フラスコ、各継代について集団倍加を算出する。ＰＤＬ＝［ＬＯＧ（細胞収率）−ＬＯＧ（接種した細胞）］／ＬＯＧ（２）。集団倍加の数が２週間連続して１未満である場合、老化に達する。
【０２１６】
細胞バンクの試料が、検出可能なマイコプラズマを有する、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、他のウイルスの汚染について陽性である、または正常なヒト核型を有さない場合、試料は廃棄されるであろう。
【０２１７】
【表１−１】
2021505344.tif 000003
【表１−２】
2021505344.tif 000004
【０２１８】
例示的な実施形態
実施形態１．
ｃｍ２当たり少なくとも２５０，０００個の細胞の密度での培養同種ヒト軟骨細胞を含む膜であって、前記培養軟骨細胞は極低温で凍結した細胞バンクの試料に由来し、前記培養軟骨細胞は品質管理アッセイによって特徴付けられる、前記膜。
【０２１９】
実施形態２．
前記細胞バンクがヒト死体の軟骨細胞を含む、実施形態１の組成物。
【０２２０】
実施形態３．
前記細胞バンクが初代培養物を含む、実施形態１の組成物。
【０２２１】
実施形態４．
前記細胞バンクが二次培養物を含む、実施形態１の組成物。
【０２２２】
実施形態５．
前記品質管理アッセイがアガロースアッセイ、６ウェルプレートアッセイ、及び細胞ペレットアッセイの１以上を含む、実施形態１の組成物。
【０２２３】
実施形態６．
細胞バンクを調製する方法であって、前記方法が、ヒト由来の組織試料を得る工程と、汚染について前記組織試料を検査する工程と、前記組織試料を秤量する工程と、前記組織試料を細かく刻む工程と、前記組織試料を消化する工程と、生存率を決定するために前記組織試料中の細胞を計数する工程と、前記細胞を培養する工程と、及び／または保管のために前記細胞を極低温凍結する工程とを含む、前記方法。
【０２２４】
実施形態７．
組織試料を得る前記工程がヒトの死体から軟骨を取り出すことを含む、実施形態６の方法。
【０２２５】
実施形態８．
組織試料を得る前記工程が、死後約２４時間以内〜約７日以内にヒトの死体から軟骨を取り出すことを含む、実施形態６の方法。
【０２２６】
実施形態９．
組織試料を得る前記工程が、死後約２４時間以内にヒトの死体から軟骨を取り出すことを含む、実施形態６の方法。
【０２２７】
実施形態１０．
前記組織試料が滑膜、骨、線維組織、脂肪組織、及び汚染について検査される、実施形態６の方法。
【０２２８】
実施形態１１．
前記組織試料が約１ｇ〜約９ｇの重さである、実施形態６の方法。
【０２２９】
実施形態１２．
前記組織試料が約９ｇの重さである、実施形態６の方法。
【０２３０】
実施形態１３．
前記組織試料が約２００ｍｇ〜約４００ｍｇの重さの小片に分割される、実施形態６の方法。
【０２３１】
実施形態１４．
前記組織試料が約２００ｍｇ〜約３００ｍｇの重さの小片に分割される、実施形態６の方法。
【０２３２】
実施形態１５．
前記組織試料が約２８０ｍｇ〜約３００ｍｇの重さの小片に分割される、実施形態６の方法。
【０２３３】
実施形態１６．
前記組織試料が約３００ｍｇの重さの小片に分割される、実施形態６の方法。
【０２３４】
実施形態１７．
前記組織がプロテアーゼで消化される、実施形態６の方法。
【０２３５】
実施形態１８．
前記組織がコラゲナーゼで消化される、実施形態６の方法。
【０２３６】
実施形態１９．
前記組織試料が約０．５ｍｍ２〜約３ｍｍ２の小片に刻まれる、実施形態６の方法。
【０２３７】
実施形態２０．
前記組織試料が約０．５ｍｍ２〜約２ｍｍ２の小片に刻まれる、実施形態６の方法。
【０２３８】
実施形態２１．
前記組織試料が約０．５ｍｍ２〜約１ｍｍ２の小片に刻まれる、実施形態６の方法。
【０２３９】
実施形態２２．
前記組織試料が約０．５ｍｍ２の小片に刻まれる、実施形態６の方法。
【０２４０】
実施形態２３．
前記細胞を血球計で計数する、実施形態６の方法。
【０２４１】
実施形態２４．
前記組織試料が約５０％〜約１００％の生細胞を含む、実施形態６の方法。
【０２４２】
実施形態２５．
前記組織試料が約７０％〜約１００％の生細胞を含む、実施形態６の方法。
【０２４３】
実施形態２６．
前記組織試料が約７０％の生細胞を含む、実施形態６の方法。
【０２４４】
実施形態２７．
前記細胞がＤＭＥＭを含む培地で培養される、実施形態６の方法。
【０２４５】
実施形態２８．
前記細胞が約３７℃で培養される、実施形態６の方法。
【０２４６】
実施形態２９．
前記細胞が約−８０℃で約２〜２４時間極低温凍結される、実施形態６の方法。
【０２４７】
実施形態３０．
前記細胞が極低温凍結され、液体窒素にて保存される、実施形態６の方法。
【０２４８】
実施形態３１．
細胞バンクの試料を特徴付ける方法であって、前記方法が、極低温凍結した初代細胞バンク試料を解凍する工程と、前記初代試料に由来する二次試料を培養する工程と、前記二次試料に由来する三次試料を培養する工程と、細胞生存率、マイコプラズマ、エンドトキシン、無菌性、老化、独自性、及びアグリカンの値を決定するために前記試料をアッセイする工程とを含む、前記方法。
【０２４９】
実施形態３２．
前記試料がアガロースアッセイを用いてアッセイされる、実施形態３１に記載の細胞バンクの試料を特徴付ける方法。
【０２５０】
実施形態３３．
前記アガロースアッセイが２回以上の分裂についてコロニーを形成する細胞の比率を調べる、実施形態３２に記載の細胞バンクの試料を特徴付ける方法。
【０２５１】
実施形態３４．
前記アガロースアッセイの合格判定基準は、細胞の少なくとも６．８％が少なくとも２回の分裂についてコロニーを形成することを含む、実施形態３１に記載の細胞バンクの試料を特徴付ける方法。
【０２５２】
実施形態３５．
前記試料が６ウェルプレートアッセイを用いてアッセイされる、実施形態３１に記載の細胞バンクの試料を特徴付ける方法。
【０２５３】
実施形態３６．
前記６ウェルプレートアッセイがウェル当たりの細胞の平均数を調べる、実施形態３５に記載の細胞バンクの試料を特徴付ける方法。
【０２５４】
実施形態３７．
前記６ウェルアッセイの合格判定基準が０．８８×１０５以上であるウェル当たりの細胞の平均を含む、実施形態３６に記載の細胞バンクの試料を特徴付ける方法。
【０２５５】
実施形態３８．
前記試料がペレット培養アッセイを用いてアッセイされる、実施形態３１に記載の細胞バンクの試料を特徴付ける方法。
【０２５６】
実施形態３９．
前記ペレット培養アッセイが細胞培養増殖に続いて軟骨を生成する細胞の能力を調べる、実施形態３１の細胞バンクの試料を特徴付ける方法。
【０２５７】
実施形態４０．
前記ペレット培養アッセイの合格判定基準が−４．７３Ｃｔ以上のｄｇａを含む、実施形態３９に記載の細胞バンクの試料を特徴付ける方法。
【０２５８】
実施形態４１．
マイコプラズマの前記アッセイについての合格判定基準が検出可能なレベルがないことを含む、実施形態３１の細胞バンクの試料を特徴付ける方法。
【０２５９】
実施形態４２．
無菌性の前記アッセイについての合格判定基準は、増殖の検出がないことを含む、実施形態３１の細胞バンクの試料を特徴付ける方法。
【０２６０】
実施形態４３．
細胞生存率についての合格判定基準は細胞の少なくとも７０％が生きていることを含む、実施形態３１の細胞バンクの試料を特徴付ける方法。
【０２６１】
実施形態４４．
老化についての合格判定基準は、培養物が５継代未満で老化しないこと、または培養物が不死ではないことを含む、実施形態３１の細胞バンクの試料を特徴付ける方法。
【０２６２】
実施形態４５．
独自性についての合格判定基準が軟骨細胞の存在の同定を含む、実施形態３１の細胞バンクの試料を特徴付ける方法。
【０２６３】
実施形態４６．
細胞バンクの試料を培養する方法であって、前記方法が、極低温凍結した細胞バンクの試料を解凍する工程と、フラスコに培養培地を加える工程と、生存率を決定するために細胞を計数する工程と、細胞培養物の培地で細胞を増殖させる工程と、細胞培養物で培地交換を行う工程と、トリプシンで細胞培養物を処理する工程とを含む、前記方法。
【０２６４】
実施形態４７．
前記極低温凍結した細胞バンクの試料を約３７℃の水浴、ヒートブロック、または細胞用のドライバスにて解凍する、実施形態４６の細胞バンクの試料を培養する方法。
【０２６５】
実施形態４８．
前記試料がＤＭＥＭを含む培地で培養される、実施形態４６の方法。
【０２６６】
実施形態４９．
前記細胞を血球計で計数する、実施形態４６の方法。
【０２６７】
実施形態５０．
前記細胞培養物は少なくとも１〜４日ごとに培地交換を行う、実施形態４６の方法。
【０２６８】
実施形態５１．
前記細胞培養物を０．０５％トリプシン溶液で処理する、実施形態４６の方法。
【０２６９】
実施形態５２．
前記細胞が前記フラスコから剥離するまで前記細胞培養物をトリプシン溶液で処理する、実施形態４６の方法。
【０２７０】
均等物
本開示をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、添付のクレームの範囲によって定義される本発明の範囲を説明するように意図されるのであって、限定するようには意図されないことが理解されるべきである。他の態様、利点、及び改変は、以下のクレームの範囲内にある。
【図１】
2021505344.tif 000005
【図２】
2021505344.tif 000006
【国際調査報告】
2021505344.tif 000007
2021505344.tif 000008