(57)【要約】ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアント融合タンパク質が提供される。ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドも提供される。ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又は単離ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び核酸構築物、これを発現する宿主細胞並びにその使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＩＲＰαアミノ酸配列及び４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質であって、
前記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１００〜１１９アミノ酸長であり、及び／又は
前記４−１ＢＢＬアミノ酸配列は：
（ａ）配列番号２２、２３、２７、及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長であるか；配列番号７４及び７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する１７０〜１９７アミノ酸長であり、ただし配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＧ１９８−Ｅ２０５を含まないか；配列番号７２と少なくとも８０％の同一性を有する１７０〜１８２アミノ酸長であり、ただし配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＡ１−Ｅ２３を含まないか；又は配列番号７０と少なくとも８０％の同一性を有する１８４アミノ酸長であり、及び／又は
（ｂ）４−１ＢＢＬアミノ酸配列の３回の反復を含み、
前記融合タンパク質は、
（ｉ）ＣＤ４７及び４−１ＢＢに結合すること、
（ｉｉ）前記４−１ＢＢを発現する細胞において前記４−１ＢＢシグナル伝達経路を活性化すること、
（ｉｉｉ）前記４−１ＢＢを発現する免疫細胞を共刺激すること、及び／又は
（ｉｖ）前記ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の非存在下と比較して、食細胞による前記ＣＤ４７を発現する病的細胞に対する食作用を増強すること、
の少なくとも１つが可能である、
ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項２】
ＳＩＲＰαアミノ酸配列及び４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質であって、
前記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１００〜１１９アミノ酸長であり、及び／又は
前記４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長であり、並びに
前記融合タンパク質は、
（ｉ）ＣＤ４７及び４−１ＢＢに結合すること、
（ｉｉ）前記４−１ＢＢを発現する細胞において前記４−１ＢＢシグナル伝達経路を活性化すること、
（ｉｉｉ）前記４−１ＢＢを発現する免疫細胞を共刺激すること、及び／又は
（ｉｖ）前記ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の非存在下と比較して、食細胞による前記ＣＤ４７を発現する病的細胞に対する食作用を増強すること、
の少なくとも１つが可能である、
ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項３】
ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、
前記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１００〜１１９アミノ酸長であり、前記ポリペプチドはＣＤ４７に結合可能である、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項４】
前記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は少なくとも１１５アミノ酸長である、請求項１若しくは請求項２に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又は請求項３に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
前記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は１１６アミノ酸長である、請求項１〜請求項３及び請求項４のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又は単離ポリペプチド。
【請求項６】
前記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２に対応するＬ４、Ａ２７、Ｅ４７、及びＶ９２からなる群から選択されるアミノ酸残基での変異を含む、請求項３及び請求項４〜請求項５のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又は単離ポリペプチド。
【請求項７】
前記変異は、配列番号２に対応するＬ４Ｉ、Ａ２７Ｉ、Ｅ４７Ｖ、及びＶ９２Ｉからなる群から選択される、請求項６に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又は単離ポリペプチド。
【請求項８】
前記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２に対応するアミノ酸残基Ｋ１１７−Ｙ３４３のいずれも含まない、請求項１〜請求項３及び請求項４〜請求項７のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又は単離ポリペプチド。
【請求項９】
前記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４又は２６を含む、請求項１〜請求項３、請求項４、及び請求項８のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又は単離ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４又は２６からなる、請求項１〜請求項３、請求項４、請求項５、及び請求項８のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又は単離ポリペプチド。
【請求項１１】
前記４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３に対応するアミノ酸残基Ａ１−Ｖ６及びＡ１−Ｇ１４のいずれも含まない、請求項１、請求項２、及び請求項４〜請求項１０のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項１２】
前記４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、又は２８を含む、請求項１、請求項２、請求項４〜請求項１０、及び請求項１１のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項１３】
前記４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、又は２８からなる、請求項１、請求項２、請求項４〜請求項１０、及び請求項１１のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項１４】
（ｉ）前記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２又は２５に記載の通りであり、前記４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、又は２８に記載の通りであるか、又は
（ｉｉ）前記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４又は２６に記載の通りであり、前記４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３、２２、２３、２７、又は２８に記載の通りである、
請求項１及び請求項２のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項１５】
（ｉ）前記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は配列番号２に記載の通りであり、前記４−１ＢＢＬアミノ酸配列は配列番号２２又は２３に記載の通りであるか、又は
（ｉｉ）前記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は配列番号２４に記載の通りであり、前記４−１ＢＢＬアミノ酸配列は配列番号２２に記載の通りである、
請求項１及び請求項２のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項１６】
前記ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、前記ＳＩＲＰαと前記４−１ＢＢＬとの間にリンカーを含む、請求項１、請求項２、及び請求項４〜請求項１５のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項１７】
前記４−１ＢＢＬアミノ酸配列の３回の反復のそれぞれの間にリンカーを含む、請求項１及び請求項４〜請求項１５のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項１８】
前記リンカーは単一アミノ酸リンカーである、請求項１６及び請求項１７のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項１９】
前記リンカーはグリシンである、請求項１８に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項２０】
可溶性である、請求項１〜請求項１９のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又は単離ポリペプチド。
【請求項２１】
前記融合タンパク質の産生収量は、同じ産生条件下での配列番号５の産生収量よりも１．５倍以上多く、
前記産生条件は、哺乳動物細胞での発現、並びに３２〜３７℃及び５〜１０％ＣＯ２で５〜１３日間の培養を含む、請求項１、請求項２、及び請求項４〜請求項２０のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項２２】
前記ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、１５、１６、１８〜２１、及び４５〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１、請求項２、及び請求項１６〜請求項２１のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項２３】
前記ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、及び１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１及び請求項１６〜請求項２１のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項２４】
前記ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、１５、１６、１８〜２１、及び４５〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１及び請求項１６〜請求項２１のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項２５】
前記ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、及び１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１及び請求項１６〜請求項２１のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項２６】
前記ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、１５、１６、１８〜２１、及び４５〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１及び請求項１６〜請求項２１のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項２７】
前記ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、及び１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１及び請求項１６〜請求項２１のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項２８】
請求項１〜請求項２７のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２８に記載のポリヌクレオチドと、
宿主細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を指示するための調節エレメントと、
を含む核酸構築物。
【請求項３０】
請求項１〜請求項２７のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質若しくはポリペプチド又は請求項２８及び請求項２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物を含む宿主細胞。
【請求項３１】
請求項２８及び請求項２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は核酸構築物を宿主細胞において発現させることを含む、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又はポリペプチドを製造する方法。
【請求項３２】
前記融合タンパク質又は前記ポリペプチドを単離することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜請求項２７のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質若しくは単離ポリペプチド、請求項２８及び請求項２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物、又は請求項３０に記載の宿主細胞を、処置を必要とする対象に投与することを含む、免疫細胞の活性化から恩恵を受け得る疾患を処置する方法。
【請求項３４】
前記対象に、前記疾患を処置するための治療薬を投与することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
免疫細胞の活性化から恩恵を受け得る疾患の処置に使用するための、請求項１〜請求項２７のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質若しくは単離ポリペプチド、請求項２８及び請求項２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物、又は請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
前記疾患を処置するための治療薬をさらに含む、請求項３５に記載の使用のための組成物。
【請求項３７】
免疫細胞の活性化から恩恵を受け得る疾患を処置するための治療薬、及び請求項１〜請求項２７のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質若しくは単離ポリペプチド、請求項２８及び請求項２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物、又は請求項３０に記載の宿主細胞を包装する包装材料を含む製品。
【請求項３８】
前記疾患の細胞がＣＤ４７を発現する、請求項３３及び請求項３４のいずれか一項に記載の方法、請求項３５及び請求項３６のいずれか一項に記載の使用のための組成物、又は請求項３７に記載の製品。
【請求項３９】
前記疾患が過剰増殖性疾患を含む、請求項３３〜請求項３８のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、又は製品。
【請求項４０】
前記過剰増殖性疾患ががんを含む、請求項３９に記載の方法、使用のための組成物、又は製品。
【請求項４１】
前記疾患が、免疫抑制、薬物誘発性免疫抑制、又は感染症に関連する疾患を含む、請求項３３〜請求項３８のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、又は製品。
【請求項４２】
請求項１〜請求項２７のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質若しくは単離ポリペプチド、請求項２８及び請求項２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物、又は請求項３０に記載の宿主細胞の存在下において、インビトロで免疫細胞を活性化することを含む、免疫細胞を活性化する方法。
【請求項４３】
前記活性化が、ＣＤ４７又は外因性ＣＤ４７を発現する細胞の存在下である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記活性化が抗がん剤の存在下である、請求項４２及び請求項４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記疾患を処置するための前記治療薬又は前記抗がん剤が抗体を含む、請求項３４、請求項３６、請求項３７〜請求項４１、及び請求項４４のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、又は製品。
【請求項４６】
前記抗体は、リツキシマブ、セツキシマブ、及びアレムツズマブからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法、使用のための組成物、又は製品。
【請求項４７】
前記疾患を処置するための前記治療薬又は前記抗がん剤は、ＩＭｉＤ（例えば、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド）を含む、請求項３４、請求項３６、請求項３７〜請求項４１、及び請求項４４のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、又は製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は２０１８年７月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／６９６，３６２号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表の記載
本出願の提出と同時に提出された、２０１９年７月１１日に作成された１９２，５１２バイトを含む「７７７９４  ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」というタイトルのＡＳＣＩＩファイルは、参照により本明細書に援用される。
【０００３】
本発明は、いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアント融合タンパク質及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
シグナル変換タンパク質（Ｓｉｇｎａｌ−Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＣＰ）としても知られるデュアルシグナル伝達タンパク質（Ｄｕａｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＤＳＰ）は、Ｉ型膜タンパク質の細胞外部分（細胞外アミノ末端）をＩＩ型膜タンパク質の細胞外部分（細胞外カルボキシル末端）に連結し、２つの活性端を有する融合タンパク質を形成する二機能性融合タンパク質として現在当技術分野で公知である（例えば、米国特許番号第７，５６９，６６３号及び第８，０３９，４３７号を参照）。
【０００５】
ＳＩＲＰα（シグナル調節タンパク質α）は、免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面受容体である。ＳＩＲＰαは主に、マクロファージや樹状細胞（ＤＣ）などの食細胞系の免疫細胞の表面に発現される。ＣＤ４７はＳＩＲＰαのリガンドである。ＣＤ４７は免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面分子である。ＣＤ４７は、食細胞に発現するＳＩＲＰαのライゲーションを通じて食作用の阻害剤として機能する。ＣＤ４７は、正常組織の大部分で広く発現される。このように、ＣＤ４７の喪失は、老化又は損傷した細胞の恒常性食作用につながるため、ＣＤ４７は貪食を回避するシグナル（ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ  ｓｉｇｎａｌ）及び自己のマーカーとして機能する。ＣＤ４７は複数のヒト腫瘍タイプで発現されることが判明している。腫瘍は、ＣＤ４７を含む抗食作用シグナルの発現を通じてマクロファージの食作用を回避する。ＣＤ４７は正常細胞では低レベルで遍在的に発現されるが、複数の腫瘍では正常細胞の対応物と比較して高レベルのＣＤ４７が発現され、ＣＤ４７の過剰発現により、腫瘍は食作用の回避を通じて自然免疫系の監視から逃れることが可能となっている。
【０００６】
４−１ＢＢＬは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであり、強力な活性化誘導Ｔ細胞共刺激分子である４−１ＢＢ受容体（ＣＤ１３７）の活性化リガンドである。４−１ＢＢＬは自然にホモ三量体を形成するが、４−１ＢＢを介したシグナル伝達には、４−１ＢＢＬの有意なオリゴマー化（多量体化）が必要である。４−１ＢＢＬは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、マクロファージなど、様々な抗原提示細胞（ＡＰＣ）に存在する。４−１ＢＢ受容体は休止Ｔ細胞又はＴ細胞株では検出されない（＜３％）が、Ｔ細胞が活性化されると４−１ＢＢは安定してアップレギュレートされる。４−１ＢＢの活性化は、生存遺伝子をアップレギュレートし、細胞分裂を促進し、サイトカイン産生を誘導し、Ｔ細胞の活性化誘導細胞死を防ぐ。
【０００７】
さらなる背景技術には以下が含まれる。
【０００８】
Ｗｅｉｓｋｏｐｆ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１３）；  ３４１（６１４１）：８８−９１
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１７０２７４２２号
国際特許出願公開番号ＷＯ２００１０８６００３号
国際特許出願公開番号ＷＯ２００１０７５０６７号
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１７１９４６４１号
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４１８０２８８号
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１７０５９１６８号
国際特許出願公開番号ＷＯ２００１／０４９３１８号
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１６／１３９６６８号
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４／１０６８３９号
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／０４２４８０号
米国特許出願第２０１５０１８３８８１号
米国特許出願第ＵＳ２００７０１１０７４６号
米国特許出願第ＵＳ２００７００３６７８３号
米国特許第ＵＳ９５６２０８７号
【発明の概要】
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列及び４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質が提供され、
ここで、上記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１００〜１１９アミノ酸長であり、及び／又は
上記４−１ＢＢＬアミノ酸配列は：
（ａ）配列番号２２、２３、２７、及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長であるか；配列番号７４及び７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する１７０〜１９７アミノ酸長であり、ただし配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＧ１９８−Ｅ２０５を含まないか；配列番号７２と少なくとも８０％の同一性を有する１７０〜１８２アミノ酸長であり、ただし配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＡ１−Ｅ２３を含まないか；又は配列番号７０と少なくとも８０％の同一性を有する１８４アミノ酸長であり、及び／又は
（ｂ）４−１ＢＢＬアミノ酸配列の３回の反復を含み、
上記融合タンパク質は、
（ｉ）ＣＤ４７及び４−１ＢＢに結合すること、
（ｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する細胞において上記４−１ＢＢシグナル伝達経路を活性化すること、
（ｉｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する免疫細胞を共刺激すること、及び／又は
（ｉｖ）上記ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の非存在下と比較して、食細胞による上記ＣＤ４７を発現する病的細胞に対する食作用を増強すること、
の少なくとも１つが可能である。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列及び４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質が提供され、
ここで、上記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１００〜１１９アミノ酸長であり、及び／又は
上記４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長であり、
上記融合タンパク質は、
（ｉ）ＣＤ４７及び４−１ＢＢに結合すること、
（ｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する細胞において上記４−１ＢＢシグナル伝達経路を活性化すること、
（ｉｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する免疫細胞を共刺激すること、及び／又は
（ｉｖ）上記ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の非存在下と比較して、食細胞による上記ＣＤ４７を発現する病的細胞に対する食作用を増強すること、
の少なくとも１つが可能である。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドが提供され、
ここで、上記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１００〜１１９アミノ酸長であり、上記ポリペプチドはＣＤ４７に結合可能である。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドが提供され、
ここで、上記４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長であり、
上記ポリペプチドは、
（ｉ）４−１ＢＢを結合すること、
（ｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する細胞において上記４−１ＢＢシグナル伝達経路を活性化すること、及び／又は
（ｉｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する免疫細胞を共刺激すること、
の少なくとも１つが可能である。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は少なくとも１１５アミノ酸長である。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は１１６アミノ酸長である。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２に対応するＬ４、Ａ２７、Ｅ４７、及びＶ９２からなる群から選択されるアミノ酸残基での変異を含む。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、変異は、配列番号２に対応するＬ４Ｉ、Ａ２７Ｉ、Ｅ４７Ｖ、及びＶ９２Ｉからなる群から選択される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２に対応するアミノ酸残基Ｋ１１７〜Ｙ３４３のいずれも含まない。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４又は２６を含む。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４又は２６からなる。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２及び２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３に対応するアミノ酸残基Ａ１〜Ｖ６及びＡ１〜Ｇ１４のいずれも含まない。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、又は２８を含む。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、又は２８からなる。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、
【００２５】
（ｉ）ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２又は２５に記載の通りであり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、又は２８に記載の通りであるか、又は
【００２６】
（ｉｉ）ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４又は２６に記載の通りであり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３、２２、２３、２７、又は２８に記載の通りである。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、
【００２８】
（ｉ）ＳＩＲＰαアミノ酸配列は配列番号２に記載の通りであり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は配列番号２２又は２３に記載の通りであるか、又は
【００２９】
（ｉｉ）ＳＩＲＰαアミノ酸配列は配列番号２４に記載の通りであり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は配列番号２２に記載の通りである。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７２、７４、又は７６を含む。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７２、７４、又は７６からなる。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７０を含む。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７０からなる。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、ＳＩＲＰαと４−１ＢＢＬとの間にリンカーを含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、４−１ＢＢＬアミノ酸配列の３回の反復のそれぞれの間にリンカーを含む。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、リンカーは１〜６アミノ酸長を有する。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、リンカーは単一アミノ酸リンカーである。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、リンカーはグリシンである。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、リンカーは、抗体のＦｃドメイン又はその断片でない。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、リンカーは、抗体のＦｃドメイン又はその断片である。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、少なくともホモ三量体の形態である。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくともホモ三量体は、ＳＥＣ−ＭＡＬＳによって測定される分子量で１００ｋＤ以上である。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又は単離ポリペプチドは可溶性である。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、融合タンパク質の産生収量は、同じ産生条件下での配列番号５の産生収量よりも１．５倍以上多く、
上記産生条件は、哺乳動物細胞での発現、並びに３２〜３７℃及び５〜１０％ＣＯ２で５〜１３日間の培養を含む。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、１５、１６、１８〜２１、及び４５〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、及び１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、１５、１６、１８〜２１、及び４５〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、及び１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、１５、１６、１８〜２１、及び４５〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、及び１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、上記ポリヌクレオチドと、宿主細胞における上記ポリヌクレオチドの発現を指示するための調節エレメントと、を含む核酸構築物が提供される。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリヌクレオチドは、配列番号５５〜６６及び６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリヌクレオチドは、配列番号５５、５６、及び５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、上記ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質若しくはポリペプチド又は上記ポリヌクレオチド若しくは核酸構築物を含む宿主細胞が提供される。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、上記ポリヌクレオチド又は上記核酸構築物を宿主細胞において発現させることを含む、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又はポリペプチドを製造する方法が提供される。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法は、上記融合タンパク質又は上記ポリペプチドを単離することを含む。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、免疫細胞の活性化から恩恵を受け得る疾患を処置する方法が提供され、上記方法は、上記のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質若しくは単離ポリペプチド、ポリヌクレオチド若しくは核酸構築物、又は宿主細胞を、処置を必要とする対象に投与することを含む。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法は、上記対象に、上記疾患を処置するための治療薬を投与することをさらに含む。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、免疫細胞の活性化から恩恵を受け得る疾患の処置に使用するための、上記のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質若しくは単離ポリペプチド、ポリヌクレオチド若しくは核酸構築物、又は宿主細胞が提供される。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記組成物は、上記疾患を処置するための治療薬をさらに含む。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、免疫細胞の活性化から恩恵を受け得る疾患を処置するための治療薬、及び上記のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質若しくは単離ポリペプチド、ポリヌクレオチド若しくは核酸構築物、又は宿主細胞を包装する包装材料を含む製品が提供される。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記疾患の細胞がＣＤ４７を発現する。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記疾患は過剰増殖性疾患を含む。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記過剰増殖性疾患は、硬化症、線維症、特発性肺線維症、乾癬、全身性硬化症／強皮症、原発性胆汁性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、肝線維症、放射線誘発性肺線維症の予防、骨髄線維症、又は後腹膜線維症を含む。
【００６６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記過剰増殖性疾患はがんを含む。
【００６７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記がんは、リンパ腫、白血病、及び癌腫からなる群から選択される。
【００６８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記疾患は、免疫抑制又は薬物誘発性免疫抑制に関連する疾患を含む。
【００６９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記疾患には、ＨＩＶ、はしか、インフルエンザ、ＬＣＣＭ、ＲＳＶ、ヒトライノウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶ、又はパルボウイルスが含まれる。
【００７０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記疾患は感染症を含む。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、免疫細胞を活性化する方法が提供され、上記方法は、上記のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質若しくは単離ポリペプチド、ポリヌクレオチド若しくは核酸構築物、又は宿主細胞の存在下において、インビトロで免疫細胞を活性化することを含む。
【００７２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記活性化は、ＣＤ４７又は外因性ＣＤ４７を発現する細胞の存在下である。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＣＤ４７を発現する細胞は病的細胞を含む。
【００７４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記病的細胞はがん細胞を含む。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記活性化は抗がん剤の存在下である。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記疾患を処置するための上記治療薬又は上記抗がん剤が抗体を含む。
【００７７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体は、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、イブリツモマブ（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ビバツズマブメルタンシン（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブロンツベトマブ（Ｂｌｏｎｔｕｖｅｔｍａｂ）、ブレンツキシマブベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、シクスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、ベズロトクスマブ（Ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ）、セルトリズマブペゴル（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）、シタツズマブボガトックス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ  ｂｏｇａｔｏｘ）、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、ジヌツキシマブ（Ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エルツマクソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ジレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、及びイピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）からなる群から選択される。
【００７８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体は、リツキシマブ、セツキシマブ、及びアレムツズマブからなる群から選択される。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、疾患を処置するための上記治療薬又は上記抗がん剤は、ＩＭｉＤ（例えば、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド）を含む。
【００８０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法は、活性化の後に、処置を必要とする対象に免疫細胞を養子移入することを含む。
【００８１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記免疫細胞はＴ細胞を含む。
【００８２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記免疫細胞は食細胞を含む。
【００８３】
特段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施形態の実施又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料を以下に説明する。矛盾する場合は、定義を含む本特許明細書が優先される。また、材料、方法、及び例は例示にすぎず、必ずしも限定することを意図するものではない。
【００８４】
本発明のいくつかの実施形態は、添付の図面を参照して、例としてのみ本明細書に記載されている。詳細に図面を具体的に参照すると、示されている詳細は、例として、本発明の実施形態の例示的な議論の目的のためであることが強調される。これに関して、図面を伴う説明は、本発明の実施形態がどのように実施され得るかを当業者に明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を含む、本明細書で「ＤＳＰ１０７」（配列番号５）と称されるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の概略図を示した図である。シグナルペプチド（下線付き、配列番号４）、ＳＩＲＰαドメイン（赤、配列番号２）、グリシンリンカー（黒）、４−１ＢＢＬドメイン（青、配列番号３）、及びＣ末端Ｈｉｓタグ（黒太字）を示す。
【００８６】
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｃは、ＤＳＰ１０７（配列番号５）の予測された３Ｄ構造を示した図である。図２Ａは概略３Ｄモデルを示した図である。ＳＩＲＰαは灰色のリボンで示され、ＣＤ４７（ＳＩＲＰα受容体）は緑色のリボンで示され、４−１ＢＢＬは青色のリボンで示され、４−１ＢＢＬの２つの追加コピー（三量体を形成）は水色で示されている。
【図２Ｂ】図２Ａ〜図２Ｃは、ＤＳＰ１０７（配列番号５）の予測された３Ｄ構造を示した図である。図２Ｂは、概略的な完全な原子３Ｄモデルを示した図である。
【図２Ｃ】図２Ａ〜図２Ｃは、ＤＳＰ１０７（配列番号５）の予測された３Ｄ構造を示した図である。図２Ｃは概略３Ｄモデルを示した図である。Ｘ線解像ドメインはその表面で表され、疎水性スケール（青（最も親水性）〜茶色（疎水性））で色付けされている。４−１ＢＢＬは、より高いレベルの露出した疎水性領域を示している。
【００８７】
【図３】図３は、ＤＳＰ１０７で識別されたドメイン及びセグメント（配列番号５）の概略図を示した図である。Ｉｇ様Ｖ型ドメインは水色で強調表示され、Ｉｇ様Ｃ１タイプ１ドメインは黄色で強調表示され、Ｉｇ様Ｃ１タイプ２ドメインは緑色で強調表示され、Ｘ線で解像された部分は灰色で強調表示され、隣接／非構造化領域は赤いボックスで印されている。
【００８８】
【図４】図４は、本明細書で「ＤＳＰ１０７＿ｖａｒ１」（配列番号１１）と称されるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアント融合タンパク質の予測される３Ｄ構造を示した図である。上のパネルは、表面表現で３Ｄ構造を示し、疎水性スケールで色分けされている。親水性は青色及び疎水性表面は茶色。下のパネルは、Ｎ末端（青）からＣ末端（赤）までの配列位置によって色分けされたリボン表現で３Ｄ構造を示している。
【００８９】
【図５】図５は、本明細書で「ＤＳＰ１０７＿ｖａｒ２」（配列番号１３）と称されるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアント融合タンパク質の予測される３Ｄ構造を示した図である。上のパネルは、表面表現で３Ｄ構造を示し、疎水性スケールで色分けされている：親水性は青色、疎水性表面は茶色。下のパネルは、Ｎ末端（青）からＣ末端（赤）までの配列位置によって色分けされたリボン表現で３Ｄ構造を示している。
【００９０】
【図６】図６は、本明細書で「ＤＳＰ１０７＿ｖａｒ３．１」（配列番号１５）と称されるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアント融合タンパク質の予測される３Ｄ構造を示した図である。上のパネルは、表面表現で３Ｄ構造を示し、疎水性スケールで色分けされている：親水性は青色、疎水性表面は茶色。下のパネルは、Ｎ末端（青）からＣ末端（赤）までの配列位置によって色分けされたリボン表現で３Ｄ構造を示している。
【００９１】
【図７Ａ】図７Ａは、産生したＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示した図である。Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＮＨ）として示した；配列番号４４）、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＣＨ）として示した；配列番号１］、及びＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７バリアント［（ＣＨ）−Ｖ１、（ＣＨ）−Ｖ２、及び（ＣＨ）−Ｖ３．１として示した（それぞれ配列番号１２、１４、及び１７）］（２μｇ／ウェル）を、還元（図７Ａ）及び非還元（図７Ｂ）条件下で４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ゲル上でのタンパク質の移動は、ｅ−Ｓｔａｉｎ  ｐｅｄを使用した染色によって可視化した。分子サイズのタンパク質マーカーも同じゲルで分離し、サイズを示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、産生したＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示した図である。Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＮＨ）として示した；配列番号４４）、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＣＨ）として示した；配列番号１］、及びＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７バリアント［（ＣＨ）−Ｖ１、（ＣＨ）−Ｖ２、及び（ＣＨ）−Ｖ３．１として印した（それぞれ配列番号１２、１４、及び１７）］（２μｇ／ウェル）を、還元（図７Ａ）及び非還元（図７Ｂ）条件下で４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ゲル上でのタンパク質の移動は、ｅ−Ｓｔａｉｎ  ｐｅｄを使用した染色によって可視化した。分子サイズのタンパク質マーカーも同じゲルで分離し、サイズを示している。
【００９２】
【図８Ａ】図８Ａは、産生したＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のウエスタンブロット分析を示した図である。Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＮＨ）として示した；配列番号４４］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＣＨ）として示した；配列番号１］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１［（ＣＨ）−Ｖ１として示した；配列番号１２］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２［（ＣＨ）−Ｖ２）として示した；配列番号１４］、及びＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１［（ＣＨ）−Ｖ３．１として示した；配列番号１７］（５００ｎｇ／ウェル）を、非還元（図８Ａ）及び還元（図８Ｂ）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、抗４−１ＢＢＬ抗体を用いた免疫ブロットを行った。Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２［（ＣＨ）−Ｖ２）として示した；配列番号１４］（５０ｎｇ／ウェル）もまた、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、抗ＳＩＲＰα抗体を用いた免疫ブロットを行った（図８Ｃ）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、産生したＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のウエスタンブロット分析を示した図である。Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＮＨ）として示した；配列番号４４］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＣＨ）として示した；配列番号１］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１［（ＣＨ）−Ｖ１として示した；配列番号１２］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２［（ＣＨ）−Ｖ２）として示した；配列番号１４］、及びＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１［（ＣＨ）−Ｖ３．１として示した；配列番号１７］（５００ｎｇ／ウェル）を、非還元（図８Ａ）及び還元（図８Ｂ）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、抗４−１ＢＢＬ抗体を用いた免疫ブロットを行った。Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２［（ＣＨ）−Ｖ２）として印した、配列番号１４］（５０ｎｇ／ウェル）もまた、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、抗ＳＩＲＰα抗体を用いた免疫ブロットを行った（図８Ｃ）。
【図８Ｃ】図８Ｃは、産生したＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のウエスタンブロット分析を示した図である。Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＮＨ）として示した；配列番号４４］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＣＨ）として示した；配列番号１］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１［（ＣＨ）−Ｖ１として示した；配列番号１２］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２［（ＣＨ）−Ｖ２）として示した；配列番号１４］、及びＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１［（ＣＨ）−Ｖ３．１として示した；配列番号１７］（５００ｎｇ／ウェル）を、非還元（図８Ａ）及び還元（図８Ｂ）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、抗４−１ＢＢＬ抗体を用いた免疫ブロットを行った。Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２［（ＣＨ）−Ｖ２）として印した、配列番号１４］（５０ｎｇ／ウェル）もまた、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、抗ＳＩＲＰα抗体を用いた免疫ブロットを行った（図８Ｃ）。
【００９３】
【図９】図９は、サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定されたのと同様の用量反応様式での、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＮＨ）として示した；配列番号４４］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１［（ＣＨ）−Ｖ１として示した；配列番号１２］、及びＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２［（ＣＨ）−Ｖ２として示した；配列番号１４］のＳＩＲＰα及び４−１ＢＢＬへの結合（結合のための抗４−１ＢＢＬ抗体及び検出のためのＳＩＲＰα−ビオチン化抗体を使用）を示すグラフを示した図である。
【００９４】
【図１０】図１０は、フローサイトメトリー分析によって決定されたＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＣＨ）として示した；配列番号１］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１［ｍａｒｋｅｄ  ａｓ（ＣＨ）−Ｖ１）として示した；配列番号１２］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２［（ＣＨ）−Ｖ２として示した；配列番号１４］、及びＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１［（ＣＨ）−Ｖ３．１として示した；配列番号１７］のＳＩＲＰα部分の結合を示す棒グラフを示した図である。ＧＭＦＩ値を示す。
【００９５】
【図１１】図１１は、産生したＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質がＴ細胞増殖を促進することを実証するグラフを示した図である。示されているように、ＰＢＭＣを、ＩＬ−２有り又はＩＬ−２無しで、抗ＣＤ３の存在下で０．０１μｇ／ｍＬのＮ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＮＨ）として示した；配列番号４４］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１［（ＣＨ）−Ｖ１として示した；配列番号１２］、又はＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２［（ＣＨ）−Ｖ２として示した；配列番号１７］と共にインキュベートした。増殖は、コンフルエンシー測定によって示された時点で測定した。
【００９６】
【図１２】図１２は、示された時点での非刺激細胞（ｎａ）と比較して、準最適濃度の抗ＣＤ３及び／又はＩＬ−２の存在下での刺激後のヒトＰＢＭＣにおける４−１ＢＢ発現を示す棒グラフを示した図である。ＧＭＦＩ値を示す。
【００９７】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質が、ＳＩＲＰαと４−１ＢＢＬとのブロック相互作用を生じたことを示した図である。図１３Ａはアッセイデザインを示した図である：組換えヒトＣＤ４７をＥＬＩＳＡプレートに結合させた。ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又は陽性対照抗ＣＤ４７抗体をプレートに加えた。洗浄後、ビオチン化組換えヒトＳＩＲＰαを添加し、続いてストレプトアビジンＨＲＰ及びＴＭＢ基質を添加した。ＳＩＲＰαとＣＤ４７との相互作用は、４５０ｎｍでの吸光度によって測定した。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質が、ＳＩＲＰαと４−１ＢＢＬとのブロック相互作用を生じたことを示した図である。図１３Ｂは、ブロッキング抗体陽性対照と比較した、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＮＨ）として示した；配列番号４４］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＣＨ）として示した；配列番号１］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１［（ＣＨ）−Ｖ１として示した；配列番号１２］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２［（ＣＨ）−Ｖ２として示した；配列番号１４］、及びＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１［（ＣＨ）−Ｖ３．１として示した；配列番号１７］によるＳＩＲＰα相互作用の阻害を示すグラフを示した図である。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質が、ＳＩＲＰαと４−１ＢＢＬとのブロック相互作用を生じたことを示した図である。図１３Ｃは、限られた範囲内の濃度で計算したＥＣ５０値を示すグラフを示した図である。
【００９８】
【図１４Ａ】図１４Ａは、産生したＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質が、ヒトがん細胞の多形核（ＰＭＮ）媒介性食作用を増強することを示す棒グラフを示した図である。Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＣＨ）として示した；配列番号１］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１［（ＣＨ）−Ｖ１として示した；配列番号１２］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２［（ＣＨ）−Ｖ２として示した；配列番号１４］、又はＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１［（ＣＨ）−Ｖ３．１として示した；配列番号１７］を、示されているように、単独で又はリツキシマブ（ＲＴＸ）若しくはセツキシマブ（ＣＴＸ）と組み合わせて、ＰＭＮ及びＲａｍｏｓ又はＤＬＤ１がん細胞と２時間（図１４Ａ）又は１８時間（図１４Ｂ）インキュベートした後の食作用（％）を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、産生したＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質が、ヒトがん細胞の多形核（ＰＭＮ）媒介性食作用を増強することを示す棒グラフを示した図である。Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＣＨ）として示した；配列番号１］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１［（ＣＨ）−Ｖ１として示した；配列番号１２］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２［（ＣＨ）−Ｖ２として示した；配列番号１４］、又はＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１［（ＣＨ）−Ｖ３．１として示した；配列番号１７］を、示されているように、単独で又はリツキシマブ（ＲＴＸ）若しくはセツキシマブ（ＣＴＸ）と組み合わせて、ＰＭＮ及びＲａｍｏｓ又はＤＬＤ１がん細胞と２時間（図１４Ａ）又は１８時間（図１４Ｂ）インキュベートした後の食作用（％）を示す。
【００９９】
【図１５】図１５は、産生したＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質が、ヒトリンパ腫細胞のマクロファージ媒介性食作用を増強することを実証する棒グラフを示した図である。Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７［（ＣＨ）として示した；配列番号１］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１［（ＣＨ）−Ｖ１として示した；配列番号１２］、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２［（ＣＨ）−Ｖ２として示した；配列番号１４］、又はＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１［（ＣＨ）−Ｖ３．１として示した；配列番号１７］を、示されているように、単独で又はリツキシマブ（ＲＴＸ）と組み合わせて、マクロファージ並びにＳＵＤＨＬ５、ＳＵＤＨＬ４、及びＯＣＩ−ＬＹ３がん細胞と２時間インキュベートした後の食作用（％）を示す。
【０１００】
【図１６】図１６は、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２［（ＣＨ）−Ｖ２として示した；配列番号１４］が、用量依存的に、２時間のインキュベート後のＳＵＤＨＬ４がん細胞のマクロファージ媒介食作用を増強することを示すグラフを示した図である。
【０１０１】
【図１７】図１７は、両面ＥＬＩＳＡによって測定した、流加培養から１１日目に採取されたミニプールの試料中のＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）濃度を示す棒グラフを示した図である。
【０１０２】
【図１８】図１８は、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示した図である。流加培養から１１日目に採取したミニプールの試料（５μＬ）及び精製ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（５ｍｇ）を、還元条件で４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、クマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色を行った。
【０１０３】
【図１９Ａ】図１９Ａは、フローサイトメトリー分析によって決定されるように、ＣＨＯ−Ｋ１過剰発現（ＯＸ）ヒトＣＤ４７細胞（図１９Ａ）及びＳＵＤＨＬ４細胞（図１９Ｂ）でのＣＤ４７の膜発現、並びにＣＨＯ−Ｋ１細胞での発現なし（図１９Ａ）を示すヒストグラムを示した図である。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、フローサイトメトリー分析によって決定されるように、ＣＨＯ−Ｋ１過剰発現（ＯＸ）ヒトＣＤ４７細胞（図１９Ａ）及びＳＵＤＨＬ４細胞（図１９Ｂ）でのＣＤ４７の膜発現、並びにＣＨＯ−Ｋ１細胞での発現なし（図１９Ａ）を示すヒストグラムを示した図である。
【０１０４】
【図２０】図２０は、フローサイトメトリー分析によって決定されるように、ＨＴ１０８０細胞ＯＸ  ４−１ＢＢでの４−１ＢＢ及びＣＤ４７の膜発現、並びにＨＴ１０８０親（ＷＴ）細胞での４−１ＢＢの発現なしを示すヒストグラムを示した図である。
【０１０５】
【図２１Ａ】図２１Ａは、フローサイトメトリー分析によって決定されるように、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）のＳＩＲＰα部分の、ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＤ４７細胞（図２１Ａ）及びＳＵＤＨＬ４細胞（図２１Ｂ）への結合、並びにＣＨＯ−Ｋ１親細胞への結合なしを示すグラフを示した図である。陽性に染色された細胞の割合（％）又はＧＭＦＩ値を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、フローサイトメトリー分析によって決定されるように、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）のＳＩＲＰα部分の、ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＤ４７細胞（図２１Ａ）及びＳＵＤＨＬ４細胞（図２１Ｂ）への結合、並びにＣＨＯ−Ｋ１親細胞への結合なしを示すグラフを示した図である。陽性に染色された細胞の割合（％）又はＧＭＦＩ値を示す。
【０１０６】
【図２２】図２２Ａは、フローサイトメトリー分析によって決定されるように、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の両アームの４−１ＢＢ過剰発現ＨＴ１０８０細胞への結合（図２２Ａ〜図２２Ｂ、図２２Ｅ〜図２２Ｆ）、又はＨＴ１０８０ＷＴ細胞上のＣＤ４７へのＳＩＲＰαアームの結合（図２２Ｃ及び図２２Ｄ）を示した図である。示されている場合、抗ＣＤ４７抗体及び／又は抗４−１ＢＢ抗体の添加を使用して、特異的結合を測定した。陽性に染色された細胞の割合（％）及びＧＭＦＩ値を示す。図２２Ｂは、フローサイトメトリー分析によって決定されるように、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の両アームの４−１ＢＢを過剰発現するＨＴ１０８０細胞への結合（図２２Ａ〜図２２Ｂ、図２２Ｅ〜図２２Ｆ）、又はＨＴ１０８０ＷＴ細胞上のＣＤ４７へのＳＩＲＰαアームの結合（図２２Ｃ及び図２２Ｄ）を示した図である。示されている場合、抗ＣＤ４７抗体及び／又は抗４−１ＢＢ抗体の添加を使用して、特異的結合を測定した。陽性に染色された細胞の割合（％）及びＧＭＦＩ値を示す。図２２Ｃは、フローサイトメトリー分析によって決定されるように、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の両アームの４−１ＢＢを過剰発現するＨＴ１０８０細胞への結合（図２２Ａ〜図２２Ｂ、図２２Ｅ〜図２２Ｆ）、又はＨＴ１０８０ＷＴ細胞上のＣＤ４７へのＳＩＲＰαアームの結合（図２２Ｃ及び図２２Ｄ）を示した図である。示されている場合、抗ＣＤ４７抗体及び／又は抗４−１ＢＢ抗体の添加を使用して、特異的結合を測定した。陽性に染色された細胞の割合（％）及びＧＭＦＩ値を示す。図２２Ｄは、フローサイトメトリー分析によって決定されるように、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の両アームの４−１ＢＢを過剰発現するＨＴ１０８０細胞への結合（図２２Ａ〜図２２Ｂ、図２２Ｅ〜図２２Ｆ）、又はＨＴ１０８０ＷＴ細胞上のＣＤ４７へのＳＩＲＰαアームの結合（図２２Ｃ及び図２２Ｄ）を示した図である。示されている場合、抗ＣＤ４７抗体及び／又は抗４−１ＢＢ抗体の添加を使用して、特異的結合を測定した。陽性に染色された細胞の割合（％）及びＧＭＦＩ値を示す。図２２Ｅは、フローサイトメトリー分析によって決定されるように、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の両アームの４−１ＢＢを過剰発現するＨＴ１０８０細胞への結合（図２２Ａ〜図２２Ｂ、図２２Ｅ〜図２２Ｆ）、又はＨＴ１０８０ＷＴ細胞上のＣＤ４７へのＳＩＲＰαアームの結合（図２２Ｃ及び図２２Ｄ）を示した図である。示されている場合、抗ＣＤ４７抗体及び／又は抗４−１ＢＢ抗体の添加を使用して、特異的結合を測定した。陽性に染色された細胞の割合（％）及びＧＭＦＩ値を示す。図２２Ｆは、フローサイトメトリー分析によって決定されるように、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の両アームの４−１ＢＢを過剰発現するＨＴ１０８０細胞への結合（図２２Ａ〜図２２Ｂ、図２２Ｅ〜図２２Ｆ）、又はＨＴ１０８０ＷＴ細胞上のＣＤ４７へのＳＩＲＰαアームの結合（図２２Ｃ及び図２２Ｄ）を示した図である。示されている場合、抗ＣＤ４７抗体及び／又は抗４−１ＢＢ抗体の添加を使用して、特異的結合を測定した。陽性に染色された細胞の割合（％）及びＧＭＦＩ値を示す。
【０１０７】
【図２３Ａ】図２３Ａ及び図２３Ｂは、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）のＣＨＯ  Ｋ１−ＣＤ４７及びＨＴ１０８０−４−１ＢＢ細胞への同時結合を示した図である。ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）をＣＦＳＥ標識ＨＴ１０８０  ４−１ＢＢＯＸ細胞及びＣｙｔｏＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ標識ＣＨＯ−Ｋ１ＣＤ４７  ＯＸ細胞とインキュベートし、ダブレット形成をフローサイトメトリーで測定した。図２３Ａは、培地対照と比較した、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）との標識細胞のインキュベーション後のＣＦＳＥ対ＣｙｔｏＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄの代表的なフローサイトメトリープロットを示した図である。
【図２３Ｂ】図２３Ａ及び図２３Ｂは、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）のＣＨＯ  Ｋ１−ＣＤ４７及びＨＴ１０８０−４−１ＢＢ細胞への同時結合を示した図である。ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）をＣＦＳＥ標識ＨＴ１０８０  ４−１ＢＢＯＸ細胞及びＣｙｔｏＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ標識ＣＨＯ−Ｋ１ＣＤ４７  ＯＸ細胞とインキュベートし、ダブレット形成をフローサイトメトリーで測定した。図２３Ｂは、３つの独立した実験からのダブレット形成の平均結果を示すグラフを示した図である。
【０１０８】
【図２４】図２４は、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）のＣＨＯ  Ｋ１−ＣＤ４７及びＨＴ１０８０−４−１ＢＢ細胞への同時結合を示した図である。ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）を、抗４−１ＢＢ抗体又は抗ＣＤ４７抗体の有り又は無しでＣＦＳＥ標識ＨＴ１０８０  ４−１ＢＢＯＸ細胞及びＣｙｔｏＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ標識ＣＨＯ−Ｋ１ＣＤ４７  ＯＸ細胞とインキュベートし、ダブレット形成をフローサイトメトリーで測定した。中程度の効果を差し引いた後の２つの独立した実験からのダブレット形成の平均結果を示す。
【０１０９】
【図２５Ａ】図２５Ａは、単一培養アッセイにおいてＨＴ１０１８−４−１ＢＢ細胞からのＩＬ８分泌によって決定されるように、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）による４−１ＢＢの活性化が実証されることを示した図である。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、単一培養アッセイにおいてＨＴ１０１８−４−１ＢＢ細胞からのＩＬ８分泌によって決定されるように、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）による４−１ＢＢの活性化が実証されることを示した図である。
【０１１０】
【図２６】図２６は、共培養アッセイにおいてＨＴ１０１８−４−１ＢＢ細胞からのＩＬ８分泌によって決定されるように、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）による４−１ＢＢの活性化を示した図である。
【０１１１】
【図２７】図２７は、活性化マーカーＣＤ２５及び４−１ＢＢの発現によって決定されるように、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）が、用量依存的にＴ細胞活性化を誘導することを示す棒グラフを示した図である。３人のドナーからのＰＢＭＣを、プレート結合抗ＣＤ３の存在下で、示された濃度のＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）と共にインキュベートした。ＣＤ２５又は４−１ＢＢの発現は、フローサイトメトリーによる４８時間のインキュベート後に測定した。
【０１１２】
【図２８】図２８は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）によって測定した、ＰＢＭＣ増殖に対するＤＳＰ１０７−Ｖ２（配列番号１３）の効果を実証する代表的な画像を示した図である。
【０１１３】
【図２９】図２９は、フローサイトメトリーによって測定されるように、３人のヒトドナーから得られたＣＰＤ染色されたＴ細胞の増殖に対するＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の効果を示す棒グラフを示した図である。
【０１１４】
【図３０Ａ】図３０Ａは、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）によって測定されるように、ＳＮＵ３８７（図２６Ａ）、ＳＮＵ４２３（図２６Ｂ）、及びＯｖｃａｒ８（図２６Ｃ）がん細胞のＴ細胞媒介性死滅に対するＤＳＰ１０７−Ｖ２（配列番号１３）の効果が実証されることを示した図である。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）によって測定されるように、ＳＮＵ３８７（図２６Ａ）、ＳＮＵ４２３（図２６Ｂ）、及びＯｖｃａｒ８（図２６Ｃ）がん細胞のＴ細胞媒介性死滅に対するＤＳＰ１０７−Ｖ２（配列番号１３）の効果が実証されることを示した図である。
【図３０Ｃ】図３０Ｃは、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）によって測定されるように、ＳＮＵ３８７（図２６Ａ）、ＳＮＵ４２３（図２６Ｂ）、及びＯｖｃａｒ８（図２６Ｃ）がん細胞のＴ細胞媒介性死滅に対するＤＳＰ１０７−Ｖ２（配列番号１３）の効果が実証されることを示した図である。
【０１１５】
【図３１Ａ】図３１Ａは、フローサイトメトリーによって測定されるように、ＭＳＴＯ（図３１Ａ）及びＨ２０５２（図３１Ｂ）中皮腫細胞のＴ細胞媒介性死滅に対するＤＳＰ１０７−Ｖ２（配列番号１３）の効果が実証されることを示した図である。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、フローサイトメトリーによって測定されるように、ＭＳＴＯ（図３１Ａ）及びＨ２０５２（図３１Ｂ）中皮腫細胞のＴ細胞媒介性死滅に対するＤＳＰ１０７−Ｖ２（配列番号１３）の効果が実証されることを示した図である。
【０１１６】
【図３２Ａ】図３２Ａは、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）が、異なるリンパ腫細胞株（図３２Ｂ〜図３２Ｄ）及びＤＬＤ−１結腸がん細胞株（図３２Ｅ）のＭ１−マクロファージ媒介性食作用を増強することを示す代表的な画像（図３２Ａ）及びグラフ（図３２Ｂ〜Ｅ）を示した図である。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）が、異なるリンパ腫細胞株（図３２Ｂ〜図３２Ｄ）及びＤＬＤ−１結腸がん細胞株（図３２Ｅ）のＭ１−マクロファージ媒介性食作用を増強することを示す代表的な画像（図３２Ａ）及びグラフ（図３２Ｂ〜Ｅ）を示した図である。
【図３２Ｃ】図３２Ｃは、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）が、異なるリンパ腫細胞株（図３２Ｂ〜図３２Ｄ）及びＤＬＤ−１結腸がん細胞株（図３２Ｅ）のＭ１−マクロファージ媒介性食作用を増強することを示す代表的な画像（図３２Ａ）及びグラフ（図３２Ｂ〜Ｅ）を示した図である。
【図３２Ｄ】図３２Ｄは、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）が、異なるリンパ腫細胞株（図３２Ｂ〜図３２Ｄ）及びＤＬＤ−１結腸がん細胞株（図３２Ｅ）のＭ１−マクロファージ媒介性食作用を増強することを示す代表的な画像（図３２Ａ）及びグラフ（図３２Ｂ〜Ｅ）を示した図である。
【図３２Ｅ】図３２Ｅは、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）が、異なるリンパ腫細胞株（図３２Ｂ〜図３２Ｄ）及びＤＬＤ−１結腸がん細胞株（図３２Ｅ）のＭ１−マクロファージ媒介性食作用を増強することを示す代表的な画像（図３２Ａ）及びグラフ（図３２Ｂ〜Ｅ）を示した図である。
【０１１７】
【図３３Ａ】図３３Ａは、可溶性ＳＩＲＰａ、可溶性４−１ＢＢＬ、又はその両方の組み合わせ（図３３Ｄ〜図３３Ｆ）と比較した、単剤療法及びリツキシマブとの併用療法（図３３Ａ〜図３３Ｄ）としての異なるリンパ腫細胞株の顆粒球媒介性食作用に対するＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の効果を示した図である。単剤療法及びトラスツズマブとの併用療法におけるＤＳＰ１０７＿Ｖ２による顆粒球によるＤＬＤ１結腸がん細胞株の食作用（図３３Ｇ〜図３３Ｈ）。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、可溶性ＳＩＲＰａ、可溶性４−１ＢＢＬ、又はその両方の組み合わせ（図３３Ｄ〜図３３Ｆ）と比較した、単剤療法及びリツキシマブとの併用療法（図３３Ａ〜図３３Ｄ）としての異なるリンパ腫細胞株の顆粒球媒介性食作用に対するＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の効果を示した図である。単剤療法及びトラスツズマブとの併用療法におけるＤＳＰ１０７＿Ｖ２による顆粒球によるＤＬＤ１結腸がん細胞株の食作用（図３３Ｇ〜図３３Ｈ）。
【図３３Ｃ】図３３Ｃは、可溶性ＳＩＲＰａ、可溶性４−１ＢＢＬ、又はその両方の組み合わせ（図３３Ｄ〜図３３Ｆ）と比較した、単剤療法及びリツキシマブとの併用療法（図３３Ａ〜図３３Ｄ）としての異なるリンパ腫細胞株の顆粒球媒介性食作用に対するＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の効果を示した図である。単剤療法及びトラスツズマブとの併用療法におけるＤＳＰ１０７＿Ｖ２による顆粒球によるＤＬＤ１結腸がん細胞株の食作用（図３３Ｇ〜図３３Ｈ）。
【図３３Ｄ】図３３Ｄは、可溶性ＳＩＲＰａ、可溶性４−１ＢＢＬ、又はその両方の組み合わせ（図３３Ｄ〜図３３Ｆ）と比較した、単剤療法及びリツキシマブとの併用療法（図３３Ａ〜図３３Ｄ）としての異なるリンパ腫細胞株の顆粒球媒介性食作用に対するＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の効果を示した図である。単剤療法及びトラスツズマブとの併用療法におけるＤＳＰ１０７＿Ｖ２による顆粒球によるＤＬＤ１結腸がん細胞株の食作用（図３３Ｇ〜図３３Ｈ）。
【図３３Ｅ】図３３Ｅは、可溶性ＳＩＲＰａ、可溶性４−１ＢＢＬ、又はその両方の組み合わせ（図３３Ｄ〜図３３Ｆ）と比較した、単剤療法及びリツキシマブとの併用療法（図３３Ａ〜図３３Ｄ）としての異なるリンパ腫細胞株の顆粒球媒介性食作用に対するＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の効果を示した図である。単剤療法及びトラスツズマブとの併用療法におけるＤＳＰ１０７＿Ｖ２による顆粒球によるＤＬＤ１結腸がん細胞株の食作用（図３３Ｇ〜図３３Ｈ）。
【図３３Ｆ】図３３Ｆは、可溶性ＳＩＲＰａ、可溶性４−１ＢＢＬ、又はその両方の組み合わせ（図３３Ｄ〜図３３Ｆ）と比較した、単剤療法及びリツキシマブとの併用療法（図３３Ａ〜図３３Ｄ）としての異なるリンパ腫細胞株の顆粒球媒介性食作用に対するＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の効果を示した図である。単剤療法及びトラスツズマブとの併用療法におけるＤＳＰ１０７＿Ｖ２による顆粒球によるＤＬＤ１結腸がん細胞株の食作用（図３３Ｇ〜図３３Ｈ）。
【図３３Ｇ】図３３Ｇは、可溶性ＳＩＲＰａ、可溶性４−１ＢＢＬ、又はその両方の組み合わせ（図３３Ｄ〜図３３Ｆ）と比較した、単剤療法及びリツキシマブとの併用療法（図３３Ａ〜図３３Ｄ）としての異なるリンパ腫細胞株の顆粒球媒介性食作用に対するＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の効果を示した図である。単剤療法及びトラスツズマブとの併用療法におけるＤＳＰ１０７＿Ｖ２による顆粒球によるＤＬＤ１結腸がん細胞株の食作用（図３３Ｇ〜図３３Ｈ）。
【図３３Ｈ】図３３Ｈは、可溶性ＳＩＲＰａ、可溶性４−１ＢＢＬ、又はその両方の組み合わせ（図３３Ｄ〜図３３Ｆ）と比較した、単剤療法及びリツキシマブとの併用療法（図３３Ａ〜図３３Ｄ）としての異なるリンパ腫細胞株の顆粒球媒介性食作用に対するＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の効果を示した図である。単剤療法及びトラスツズマブとの併用療法におけるＤＳＰ１０７＿Ｖ２による顆粒球によるＤＬＤ１結腸がん細胞株の食作用（図３３Ｇ〜図３３Ｈ）。
【０１１８】
【図３４】図３４は、ＭＣ３８（マウス）及びＤＬＤ１（ヒト）結腸がん細胞株へのＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の結合を表した図である。
【０１１９】
【図３５Ａ】図３５Ａは、ｈ４−１ＢＢノックインマウスにおけるｈＣＤ４７  ＭＣ３８腫瘍の増殖（図３４Ａ）及び生存（図３５Ｂ）に対するＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）及び抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体のインビボ効果を示した図である。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、ｈ４−１ＢＢノックインマウスにおけるｈＣＤ４７  ＭＣ３８腫瘍の増殖（図３４Ａ）及び生存（図３５Ｂ）に対するＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）及び抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体のインビボ効果を示した図である。
【０１２０】
【図３６Ａ】図３６Ａ及び図３６Ｂは、ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＳＵＤＨＬ６  ＤＬＢＣＬ腫瘍に対するＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）のインビボ効果を示した図である。図３６Ａは、２２日目にマウスを犠牲にした後に測定した平均腫瘍重量を示した図である。
【図３６Ｂ】図３６Ａ及び図３６Ｂは、ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＳＵＤＨＬ６  ＤＬＢＣＬ腫瘍に対するＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）のインビボ効果を示した図である。図３６Ｂは、２０日目にマウスを犠牲にする前に測定した平均腫瘍体積を示した図である。
【０１２１】
【図３７Ａ】図３７Ａは、結合カウンターパート（ＣＤ４７及び４−１ＢＢ）の存在下での、ＳＩＲＰα（配列番号２）及び４−１ＢＢＬアミノ酸配列の３回の反復（配列番号７８）を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアント融合物の予測される３Ｄ構造を示した図である。図３７Ａは概略３Ｄモデルであり、図３７Ｂは完全な原子３Ｄモデルである。ＳＩＲＰαは、濃い灰色のリボン表示（右上）で表される。４−１ＢＢＬは、濃い灰色のリボン（左側）で表される。スペーサー／リンカーセグメントは、ＳＩＲＰαと４−１ＢＢＬの構造要素との間の灰色及び白のリボンで表される。ＣＤ４７は灰色のリボン（右上）で表され、３つの４−１ＢＢ受容体は４−１ＢＢＬ（左側）と複合体を形成した灰色のリボンで表される。
【図３７Ｂ】図３７Ｂは、結合カウンターパート（ＣＤ４７及び４−１ＢＢ）の存在下での、ＳＩＲＰα（配列番号２）及び４−１ＢＢＬアミノ酸配列の３回の反復（配列番号７８）を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアント融合物の予測される３Ｄ構造を示した図である。図３７Ａは概略３Ｄモデルであり、図３７Ｂは完全な原子３Ｄモデルである。ＳＩＲＰαは、濃い灰色のリボン表示（右上）で表される。４−１ＢＢＬは、濃い灰色のリボン（左側）で表される。スペーサー／リンカーセグメントは、ＳＩＲＰαと４−１ＢＢＬの構造要素との間の灰色及び白のリボンで表される。ＣＤ４７は灰色のリボン（右上）で表され、３つの４−１ＢＢ受容体は４−１ＢＢＬ（左側）と複合体を形成した灰色のリボンで表される。
【０１２２】
【図３８】図３８は、ＤＳＰ１０７−Ｖ２（配列番号１３）のＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析を示した図である。タンパク質（１５０μｇ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にロードし、移動相として１０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰＯ４）（ｐＨ８．０）＋１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を使用して０．８ｍＬ／分の流速で実施した。検出は、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ社）＋ＭｉｎｉＤａｗｎ  ＴＲＥＯＳ＋ＯＰＴＩＬＡＢ  Ｔ−ｒｅＸ（ＷＹＡＴＴ社）を使用して、ＵＶ、ＭＡＬＳ、及びＲＩによって実施した。
【発明を実施するための形態】
【０１２３】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアント融合タンパク質及びその使用方法に関する。
【０１２４】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるか、又は実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であるか、又は様々な方法で実施又は実行され得る。
【０１２５】
シグナル変換タンパク質（ＳＣＰ）としても知られるデュアルシグナル伝達タンパク質（ＤＳＰ）は、Ｉ型膜タンパク質の細胞外部分（細胞外アミノ末端）をＩＩ型膜タンパク質の細胞外部分（細胞外カルボキシル末端）に連結し、２つの活性端を有する融合タンパク質を形成する二機能性融合タンパク質として現在当技術分野で公知である。
【０１２６】
構造機能ツールを使用して、本発明者らは、改善された産生特性（例えば、より高い収率）を有するＳＩＲＰαバリアント及び／又は４−１ＢＢＬバリアントを含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質を生成することに成功した。これらは、概して、（共刺激を介して）免疫細胞を活性化するために、そして特に免疫細胞を活性化することから恩恵を受け得る疾患（例えば、がん）を処置するために有利に使用され得る。
【０１２７】
理論に拘束されることなく、以下は、例としてのがんの処置における本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の作用様式として本発明者らによって示唆される。
【０１２８】
腫瘍細胞の表面及び腫瘍の微小環境におけるＣＤ４７の発現が比較的高いため、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合体のＳＩＲＰα部分は、分子を腫瘍及び転移部位に標的化し、腫瘍の微小環境内でＣＤ４７への融合タンパク質の結合を起こす。
【０１２９】
融合タンパク質を腫瘍細胞又は／及び腫瘍微小環境に標的化すると、腫瘍微小環境におけるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ濃度の増加及びそれに続く腫瘍部位での融合タンパク質の４−１ＢＢＬ部分のオリゴマー化が促進され、それにより腫瘍部位のＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、特に腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ−Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＴＩＬ）、並びに他の免疫細胞の活性化を促進する４−１ＢＢ共刺激シグナルを伝達し、がん細胞を死滅させる。
【０１３０】
４−１ＢＢＬ−４−１ＢＢ共刺激シグナルに加えて、腫瘍部位のＣＤ４７への融合タンパク質のＳＩＲＰα部分の結合は、マクロファージ及び樹状細胞で発現する内因性ＳＩＲＰαと競合し、それによりこれらの細胞の阻害を取り除き、腫瘍細胞の食作用と腫瘍微小環境における樹状細胞及びＴ細胞の活性化にさらに貢献する。
【０１３１】
ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の上記の活性は、腫瘍微小環境内のＴＩＬ、樹状細胞、及びマクロファージの活性化に相乗効果をもたらすと予想され、その２つの異なる部分を組み合わせて使用する場合と同様に、各部分の個別の効果と比較して、より特異的で強力な効果であると予想される。
【０１３２】
よって、本発明の一態様によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列及び４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質が提供され、
ここで、上記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１００〜１１９アミノ酸長であり、及び／又は
上記４−１ＢＢＬアミノ酸配列は：
（ａ）配列番号２２、２３、２７、及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長であるか；配列番号７４及び７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する１７０〜１９７アミノ酸長であり、ただし配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＧ１９８−Ｅ２０５を含まないか；配列番号７２と少なくとも８０％の同一性を有する１７０〜１８２アミノ酸長であり、ただし配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＡ１−Ｅ２３を含まないか；又は配列番号７０と少なくとも８０％の同一性を有する１８４アミノ酸長であり、及び／又は
（ｂ）４−１ＢＢＬアミノ酸配列の３回の反復を含み、
上記融合タンパク質は、以下の少なくとも１つが可能である：
（ｉ）ＣＤ４７及び４−１ＢＢに結合すること、
（ｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する細胞において上記４−１ＢＢシグナル伝達経路を活性化すること、
（ｉｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する免疫細胞を共刺激すること、及び／又は
（ｉｖ）上記ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の非存在下と比較して、食細胞による上記ＣＤ４７を発現する病的細胞に対する食作用を増強すること。
【０１３３】
本発明の代替的又は更なる態様によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列及び４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質が提供され、
ここで、上記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１００〜１１９アミノ酸長であり、及び／又は
上記４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長であり、並びに
上記融合タンパク質は、以下の少なくとも１つが可能である：
（ｉ）ＣＤ４７及び４−１ＢＢに結合すること、
（ｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する細胞において上記４−１ＢＢシグナル伝達経路を活性化すること、
（ｉｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する免疫細胞を共刺激すること、及び／又は
（ｉｖ）上記ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の非存在下と比較して、食細胞による上記ＣＤ４７を発現する病的細胞に対する食作用を増強すること。
【０１３４】
本発明の代替的又は更なる態様によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドが提供され、
ここで、上記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１００〜１１９アミノ酸長であり、上記ポリペプチドはＣＤ４７に結合可能である。
【０１３５】
本発明の代替又は更なる態様によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドが提供され、
ここで、上記４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長であるか；配列番号７４及び７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する１７０〜１９７アミノ酸長であり、ただし配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＧ１９８−Ｅ２０５を含まないか；又は配列番号７２と少なくとも８０％の同一性を有する１７０〜１８２アミノ酸長であり、ただし配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＡ１−Ｅ２３を含まず、
所望により上記４−１ＢＢＬアミノ酸配列の３回の反復を含み、
上記ポリペプチドは、
（ｉ）４−１ＢＢを結合すること、
（ｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する細胞において上記４−１ＢＢシグナル伝達経路を活性化すること、及び／又は
（ｉｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する免疫細胞を共刺激すること、
の少なくとも１つが可能である。
【０１３６】
本発明の代替又は更なる態様によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドが提供され、
ここで、上記４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長であり、
上記ポリペプチドは、
（ｉ）４−１ＢＢを結合すること、
（ｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する細胞において上記４−１ＢＢシグナル伝達経路を活性化すること、及び／又は
（ｉｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する免疫細胞を共刺激すること、
の少なくとも１つが可能である。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「ＳＩＲＰα（Ｓｉｇｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｌｐｈａ、ＣＤ１７２ａとしても知られる）」という用語は、ＳＩＲＰＡ遺伝子（遺伝子ＩＤ：１４０８８５）のポリペプチド又は機能的ホモログ、例えば、その機能的断片を指す。ある具体的な実施形態によれば、「ＳＩＲＰα」という用語は、ＳＩＲＰαポリペプチドの機能的ホモログを指す。ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαはヒトＳＩＲＰαである。特定の一実施形態によれば、ＳＩＲＰαタンパク質は、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１０３５１１１、ＮＰ＿００１０３５１１２、ＮＰ＿００１３１７６５７、又はＮＰ＿５４２９７０に提示されるようなヒトタンパク質を指す。
【０１３８】
本明細書で使用する場合、ＳＩＲＰαに関連する場合の「機能的ホモログ」又は「機能的断片」という句は、完全長ＳＩＲＰαの活性、例えばＣＤ４７結合を維持するポリペプチドの一部を指す。
【０１３９】
特定の一実施形態によれば、ＣＤ４７タンパク質は、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１７６８又はＮＰ＿９４２０８８に提示されるようなヒトタンパク質を指す。
【０１４０】
結合を試験するためのアッセイは当技術分野で周知であり、フローサイトメトリー、ＢｉａＣｏｒｅ（ビアコア）、生体層干渉法（Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、ＢＬＩ）Ｂｌｉｔｚ（登録商標）アッセイ、ＨＰＬＣが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４１】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαは、ＳＰＲによって測定した場合、０．１〜１００μＭ、０．１〜１０μＭ、１〜１０μＭ、０．１〜５μＭ、又は１〜２μＭのＫｄでＣＤ４７に結合し、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４２】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαは、上記ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン又はその機能的断片を含む。
【０１４３】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２９を含む。
【０１４４】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２９からなる。
【０１４５】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα核酸配列は、配列番号３０を含む。
【０１４６】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα核酸配列は、配列番号３０からなる。
【０１４７】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２を含む。
【０１４８】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２からなる。
【０１４９】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα核酸配列は、配列番号３１又は６７を含む。
【０１５０】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα核酸配列は、配列番号３１又は６７からなる。
【０１５１】
また、「ＳＩＲＰα」という用語は、所望の活性（すなわち、ＣＤ４７の結合）を示す機能的ホモログ（天然に存在するか、又は合成／組換えにより産生される）を包含する。そのようなホモログは、例えば、ポリペプチド配列番号２又は２９と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一又は相同であり得るか；又は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（以下でさらに説明する）と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であり得る。
【０１５２】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα機能的ホモログは、ポリペプチド配列番号２又は２９と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一又は相同であるか；又は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（以下でさらに説明する）と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「同一性」又は「配列同一性」とは、全体的な同一性、すなわち、本明細書に開示されるアミノ酸又は核酸配列の一部ではなく、本明細書に開示されるアミノ酸又は核酸配列全体にわたる同一性を指す。
【０１５４】
配列の同一性又は相同性は、Ｂｌａｓｔ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、及びＭＵＳＣＬＥなどの任意のタンパク質又は核酸配列アラインメントアルゴリズムを使用して決定することが可能である。ホモログはまた、以下でさらに説明されるように、アミノ酸置換を含む、オルソログ、欠失、挿入、又は置換バリアントを指す場合もある。
【０１５５】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαポリペプチドは、保存的及び非保存的アミノ酸置換（本明細書では突然変異とも称される）を含み得る。そのような置換は当技術分野で公知であり、例えば、その内容が全体として参照により本明細書に援用されるＷｅｉｓｋｏｐｆ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１３）；  ３４１（６１４１）：８８−９１に開示されている。
【０１５６】
タンパク質について配列同一性の割合（％）を使用する場合、同一ではない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換によって異なることが多く、アミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、したがって、分子の機能特性を変化させないと認識される。配列が保存的置換で異なる場合、パーセント配列同一性（％）は、置換の保存的性質を補正するために上方に調整され得る。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると見なされる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。通常、これには、完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとして保存的置換をスコアリングすることが含まれ、それによってパーセント配列同一性（％）が増加する。したがって、たとえば、同一のアミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換に０のスコアが与えられる場合、保存的置換には０から１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアは、例えば、ヘニコフＳ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｓ）及びヘニコフＪＧ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＪＧ）のアルゴリズムに従って計算される［Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １９９２，  ８９（２２）：  １０９１５−９］。
【０１５７】
ある具体的な実施形態によれば、１又は複数のアミノ酸変異は、配列番号２に記載のＳＩＲＰαアミノ酸配列に対応するＬ４、Ｖ６、Ａ２１、Ａ２７、Ｉ３１、Ｅ４７、Ｋ５３、Ｅ５４、Ｈ５６、Ｖ６３、Ｌ６６、Ｋ６８、Ｖ９２、及びＦ９６から選択されるアミノ酸残基に位置する。
【０１５８】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２に記載のＳＩＲＰαアミノ酸配列に対応するＬ４、Ａ２７、Ｅ４７、及びＶ９２からなる群から選択されるアミノ酸残基に変異を含む。
【０１５９】
ある具体的な実施形態によれば、１又は複数のアミノ酸変異は、配列番号２に記載のＳＩＲＰαアミノ酸配列に対応するＬ４Ｖ又はＬ４Ｉ、Ｖ６Ｉ又はＶ６Ｌ、Ａ２１Ｖ、Ａ２７Ｉ又はＡ２７Ｌ、Ｉ３１Ｆ又はＩ３１Ｔ、Ｅ４７Ｖ又はＥ４７Ｌ、Ｋ５３Ｒ、Ｅ５４Ｑ、Ｈ５６Ｐ又はＨ５６Ｒ、Ｖ６３Ｉ、Ｌ６６Ｔ又はＬ６６Ｇ、Ｋ６８Ｒ、Ｖ９２Ｉ、及びＦ９４Ｌ又はＦ９４Ｖからなる群から選択される。
【０１６０】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２に記載のＳＩＲＰαアミノ酸配列に対応するＬ４Ｉ、Ａ２７Ｉ、Ｅ４７Ｖ、及びＶ９２Ｉからなる群から選択される変異を含む。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、「配列番号２に記載のＳＩＲＰαアミノ酸配列に対応する」又は「配列番号２に対応する」という句は、対応するアミノ酸残基を、任意の他のＳＩＲＰαアミノ酸配列に対して含ませることを意図している。
【０１６２】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２５を含む。
【０１６３】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２５からなる。
【０１６４】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα核酸配列は、配列番号３５を含む。
【０１６５】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα核酸配列は、配列番号３５からなる。
【０１６６】
保存的アミノ酸置換及び非保存的アミノ酸置換についての更なる説明を以下にさらに記載する。
【０１６７】
本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰαは、ポリペプチド配列番号２４又は２６と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一又は相同であるか；又は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（以下でさらに説明する）と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である。
【０１６８】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び／又は２６と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０１６９】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び／又は２６と、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し、ここで、それぞれの選択肢は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１７０】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０１７１】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２６と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０１７２】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２に対応するアミノ酸セグメントＫ１１７−Ｙ３４３を含まない。
【０１７３】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２に対応するアミノ酸セグメントＫ１１７−Ｙ３４３のいずれも含まない。
【０１７４】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号３２又はその任意の断片を含まない。
【０１７５】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号３２を含まない。
【０１７６】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列のＣ末端は、配列番号８で終わる。
【０１７７】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４又は２６を含む。
【０１７８】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４を含む。
【０１７９】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２６を含む。
【０１８０】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４又は２６からなる。
【０１８１】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４からなる。
【０１８２】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２６からなる。
【０１８３】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα核酸配列は、配列番号３３及び／又は３４に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１８４】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα核酸配列は、配列番号３３及び／又は３４と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０１８５】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα核酸配列は、配列番号３３及び／又は３４と、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０１８６】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα核酸配列は、配列番号３３と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０１８７】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα核酸配列は、配列番号３４と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０１８８】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα核酸配列は、配列番号３３又は３４を含む。
【０１８９】
ある具体的な実施形態によれば、上記核酸配列は、配列番号３３を含む。
【０１９０】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα核酸配列は、配列番号３４を含む。
【０１９１】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα核酸配列は、配列番号３３又は３４からなる。
【０１９２】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα核酸配列は、配列番号３３からなる。
【０１９３】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα核酸配列は、配列番号３４からなる。
【０１９４】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、１００〜５００アミノ酸、１５０〜４５０アミノ酸、２００〜４００アミノ酸、２５０〜４００アミノ酸、３００〜４００アミノ酸、３２０〜４２０アミノ酸、３４０〜３５０アミノ酸を含み、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１９５】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、３００〜４００アミノ酸長である。
【０１９６】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、３４０〜４５０アミノ酸長である。
【０１９７】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、３４３アミノ酸長である。
【０１９８】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、１００〜２００アミノ酸、１００〜１５０アミノ酸、１００〜１２５アミノ酸、１００〜１２０アミノ酸、１００〜１１９アミノ酸を含み、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１９９】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、１００〜１１９アミノ酸長である。
【０２００】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、１０５〜１１９アミノ酸、１１０〜１１９アミノ酸、１１５〜１１９アミノ酸、１０５〜１１８アミノ酸、１１０〜１１８アミノ酸、１１５〜１１８アミノ酸、１０５〜１１７アミノ酸、１１０〜１１７アミノ酸、１１５〜１１７アミノ酸であり、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２０１】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、少なくとも１１５アミノ酸長である。
【０２０２】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列は、１１５〜１１９アミノ酸長である。
【０２０３】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列は、１１６アミノ酸長である。
【０２０４】
本明細書で使用される場合、「４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ及びＴＮＦＳＦ９としても知られる）」という用語は、ＴＮＦＳＦ９遺伝子（遺伝子ＩＤ：８７４４）のポリペプチド又は機能的ホモログ、例えばその機能的断片を指す。ある具体的な実施形態によれば、「４−１ＢＢＬ」という用語は、４−１ＢＢＬポリペプチドの機能的ホモログを指す。ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬはヒト４−１ＢＢＬである。特定の一実施形態によれば、４−１ＢＢＬタンパク質は、下記のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００３８０２に提示されるようなヒトタンパク質を指す。
【０２０５】
本明細書で使用する場合、４−１ＢＢＬに関連する場合の「機能的ホモログ」又は「機能的断片」という句は、完全長４−１ＢＢＬの活性、例えば（ｉ）４−１ＢＢを結合すること、（ｉｉ）４−１ＢＢシグナル伝達経路を活性化すること、（ｉｉｉ）４−１ＢＢを発現する免疫細胞を活性化すること、（ｉｖ）ホモ三量体を形成すること、を維持するポリペプチドの一部を指す。
【０２０６】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬに関連する場合の機能的ホモログは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉ）＋（ｉｉ）、（ｉ）＋（ｉｉｉ）、（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）が可能である。
【０２０７】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬに関連する場合の機能的ホモログは、（ｉ）＋（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）が可能である。
【０２０８】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬに関連する場合の機能的ホモログは、（ｉｖ）、（ｉ）＋（ｉｖ）、（ｉｉ）＋（ｉｖ）、（ｉｉｉ）＋（ｉｖ）、（ｉ）＋（ｉｉ）＋（ｉｖ）、（ｉ）＋（ｉｉｉ）＋（ｉｖ）、（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）＋（ｉｖ）が可能である。
【０２０９】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬに関連する場合の機能的同族体は、（ｉ）＋（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）＋（ｉｖ）が可能である。
【０２１０】
特定の一実施形態によれば、４−１ＢＢタンパク質は、下記のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１５５２に提示されるようなヒトタンパク質を指す。
【０２１１】
結合を試験するためのアッセイは当技術分野で公知であり、本明細書の上記でさらに説明されている。
【０２１２】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬは、ＳＰＲによって決定されるように、約０．１〜１０００ｎＭ、０．１〜１００ｎＭ、１〜１００ｎＭ、又は５５．２ｎＭのＫｄで４−１ＢＢに結合し、ここで、それぞれの選択肢は特許請求される発明の別個の実施形態を表す。
【０２１３】
三量体化を試験するためのアッセイは当技術分野で周知であり、ＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ  ２Ｄゲル、ゲル濾過、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ、分析用超遠心分離（ＡＵＣ）質量分析（ＭＳ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１４】
本明細書で使用される場合、「活性化する（こと）」又は「活性化」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、食細胞）を刺激することによって、細胞増殖、成熟、サイトカイン産生、食作用及び／又は調節機能若しくはエフェクター機能の誘導細胞増殖を起こすプロセスを指す。
【０２１５】
ある具体的な実施形態によれば、活性化は、共刺激を含む。
【０２１６】
本明細書で使用される場合、「共刺激する（こと）」又は「共刺激」という用語は、二次抗原非依存性刺激シグナル（例えば、４−１ＢＢシグナル）を伝達して、免疫細胞の活性化を起こすことを指す。
【０２１７】
ある具体的な実施形態によれば、活性化することは、阻害性シグナル（例えば、ＣＤ４７シグナル）を抑制することによって、免疫細胞の活性化を起こすことを含む。
【０２１８】
刺激性又は抑制性シグナルのシグナル伝達を決定する方法は当技術分野で周知であり、下記の実施例セクションにも開示されており、例えば、ＢｉａＣｏｒｅ、ＨＰＬＣ、又はフローサイトメトリーを用いる結合アッセイ、キナーゼ活性アッセイなどの酵素活性アッセイ、並びに、例えば、ＰＣＲ、ウエスタンブロット、免疫沈降、及び免疫組織化学を用いるシグナル伝達カスケードに関与する分子の発現が挙げられるが、これらに限定されない。追加的又は代替的に、シグナルの伝達（共刺激性又は抑制性）の測定は、免疫細胞の活性化又は機能を評価することによって実施することが可能である。免疫細胞の活性化又は機能を評価する方法は、当技術分野で周知であり、ＣＦＳＥ染色、ＭＴＳ、アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）、ＢＲＤＵ、チミジン取り込みなどの増殖アッセイ、ＣＦＳＥ染色などの細胞毒性アッセイ、クロム放出、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ、細胞内サイトカイン染色、ＥＬＩＳＰＯＴ、及びＥＬＩＳＡなどのサイトカイン分泌アッセイ、フローサイトメトリーを用いるＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１、及びＣＤ６２Ｌなどの活性化マーカーの発現が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１９】
ある具体的な実施形態によれば、シグナル伝達活性又は活性化の測定は、下記でさらに説明するように、インビトロ又はエクスビボで、例えば、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において行われる。
【０２２０】
同じ培養条件の場合、シグナル伝達活性又は免疫細胞の活性化若しくは機能は、通常、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、又はそれをコードする宿主細胞と接触していないが、溶媒対照（対照とも称される）と接触している同じ種の細胞におけるシグナル伝達、活性化又は機能と比較して表される。
【０２２１】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬは、上記４−１ＢＢＬの細胞外ドメイン又はその機能的断片を含む。
【０２２２】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３６を含む。
【０２２３】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３６からなる。
【０２２４】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号３７を含む。
【０２２５】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号３７からなる。
【０２２６】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３を含む。
【０２２７】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３からなる。
【０２２８】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号３８を含む。
【０２２９】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号３８からなる。
【０２３０】
また、「４−１ＢＢＬ」という用語は、所望の活性（上記で定義されるように）を示す機能的ホモログ（天然に存在するか、又は合成／組換えにより産生される）を包含する。そのようなホモログは、例えば、ポリペプチド配列番号３又は３６と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一又は相同であり得るか；又は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（以下でさらに説明する）と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であり得る。
【０２３１】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ機能的ホモログは、ポリペプチド配列番号３又は３６と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一又は相同であるか；又は上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（以下でさらに説明する）と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である。
【０２３２】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬポリペプチドは、本明細書の上記及び下記にさらに記載されるように、保存的アミノ酸置換を含み得る。
【０２３３】
本発明のいくつかの実施形態の４−１ＢＢＬは、ポリペプチド配列番号２２、２３、２７、又は２８と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一又は相同であるか；又は上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（以下でさらに説明する）と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である。
【０２３４】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２３５】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７及び／又は２８と、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２３６】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２及び／又は２３と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０２３７】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０２３８】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２３と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０２３９】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２７と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０２４０】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２８と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０２４１】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＡ１−Ｖ６を含まない。
【０２４２】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＡ１−Ｇ１４を含まない。
【０２４３】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＡ１−Ｖ６及びＡ１−Ｇ１４のいずれも含まない。
【０２４４】
本明細書で使用される場合、「配列番号３に対応する」という句は、対応するアミノ酸残基を、任意の他の４−１ＢＢＬアミノ酸配列に対して含ませることを意図する。
【０２４５】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号６若しくは７又はその任意の断片を含まない。
【０２４６】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号６又は７を含まない。
【０２４７】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、又は２８を含む。
【０２４８】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２又は２３を含む。
【０２４９】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２を含む。
【０２５０】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２３を含む。
【０２５１】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬαアミノ酸配列は、配列番号２７を含む。
【０２５２】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２８を含む。
【０２５３】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、又は２８からなる。
【０２５４】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２又は２３からなる。
【０２５５】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２からなる。
【０２５６】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２３からなる。
【０２５７】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬαアミノ酸配列は、配列番号２７からなる。
【０２５８】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２８からなる。
【０２５９】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７４及び７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性を有し、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２６０】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７４及び７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％の同一性を有し、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２６１】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７４及び７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２６２】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７４及び／又は７６と、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２６３】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７４及び７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性を有し、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２６４】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７４及び／又は７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２６５】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＧ１９８−Ｅ２０５を含まない。
【０２６６】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３に対応するアミノ酸残基Ｇ１９８−Ｅ２０５のいずれも含まない。
【０２６７】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号９７又はその任意の断片を含まない。
【０２６８】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号９７を含まない。
【０２６９】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７４又は７６を含む。
【０２７０】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７４又は７６からなる。
【０２７１】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７２と少なくとも８０％の同一性を有する。
【０２７２】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７２と少なくとも８５％の同一性を有する。
【０２７３】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７２と少なくとも９０％の同一性を有する。
【０２７４】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７２と、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０２７５】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７２と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０２７６】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７２と、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０２７７】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＡ１−Ｅ２３を含まない。
【０２７８】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３に対応するアミノ酸残基Ａ１−Ｅ２３のいずれも含まない。
【０２７９】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号９８又はその任意の断片を含まない。
【０２８０】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号９８を含まない。
【０２８１】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７２を含む。
【０２８２】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７２からなる。
【０２８３】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７０と少なくとも８０％の同一性を有する。
【０２８４】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７０と少なくとも８５％の同一性を有する。
【０２８５】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７０と少なくとも９０％の同一性を有する。
【０２８６】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７０と、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０２８７】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７０と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０２８８】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７０と、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０２８９】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７０を含む。
【０２９０】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７０からなる。
【０２９１】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号３９、４０、４１、及び／又は４２と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２９２】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号３９、４０、４１、及び／又は４２と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０２９３】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号３９、４０、４１、及び／又は４２と、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０２９４】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号３９及び／又は４０と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０２９５】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号３９、４０、４１、又は４２を含む。
【０２９６】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号３９又は４０を含む。
【０２９７】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号３９を含む。
【０２９８】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号４０を含む。
【０２９９】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号４１を含む。
【０３００】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号４２を含む。
【０３０１】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号３９、４０、４１、又は４２からなる。
【０３０２】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号３９又は４０からなる。
【０３０３】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号３９からなる。
【０３０４】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号４０からなる。
【０３０５】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬα核酸配列は、配列番号４１からなる。
【０３０６】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号４２からなる。
【０３０７】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７５及び／又は７７と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３０８】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７５及び／又は７７と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０３０９】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７５及び／又は７７と、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０３１０】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７５又は７７を含む。
【０３１１】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７５又は７７からなる。
【０３１２】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７３と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０３１３】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７３と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０３１４】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７３と、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０３１５】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７３を含む。
【０３１６】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７３からなる。
【０３１７】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７１と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０３１８】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７１と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０３１９】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７１と、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０３２０】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７１を含む。
【０３２１】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７１からなる。
【０３２２】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、１００〜３００アミノ酸、１５０〜２５０アミノ酸、１００〜２５０アミノ酸、１５０〜２２０アミノ酸、１８０〜２２０アミノ酸、１８０〜２１０アミノ酸、１８５〜２０５アミノ酸、１９０〜２１０アミノ酸を含み、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３２３】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬのアミノ酸配列は、１９０〜２１０アミノ酸長である。
【０３２４】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、２０４アミノ酸長である。
【０３２５】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬのアミノ酸配列は、１８５〜２０２アミノ酸長である。
【０３２６】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬのアミノ酸配列は、１８５〜２００アミノ酸長である。
【０３２７】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬのアミノ酸配列は、１８５〜１９９アミノ酸長である。
【０３２８】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬのアミノ酸配列は、１７０〜１９７アミノ酸長である。
【０３２９】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬのアミノ酸配列は、１７０〜１８２アミノ酸長である。
【０３３０】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、１８４アミノ酸長である。
【０３３１】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、１８５、１９１、１９７、又は１９９アミノ酸長であり、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３３２】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、１８４アミノ酸長である。
【０３３３】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、１８３アミノ酸長である。
【０３３４】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、１８２アミノ酸長である。
【０３３５】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、１７６アミノ酸長である。
【０３３６】
ある具体的な実施形態によれば、本明細書に開示されるＳＩＲＰα−１ＢＢＬ融合タンパク質又は４−１ＢＢＬポリペプチドに含まれる４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、４−１ＢＢＬアミノ酸配列の３回の反復を含む。
【０３３７】
ある具体的な実施形態によれば、３回の反復のそれぞれは、（ｉ）４−１ＢＢを結合すること、（ｉｉ）４−１ＢＢシグナル伝達経路を活性化すること、（ｉｉｉ）４−１ＢＢを発現する免疫細胞を活性化すること、（ｉｖ）ホモ三量体を形成すること、の少なくとも１つが可能である。
【０３３８】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、上記４−１ＢＢＬアミノ酸配列の３回の反復のそれぞれの間にリンカーを含まない。
【０３３９】
別のある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、４−１ＢＢＬアミノ酸配列の３回の反復のそれぞれの間にリンカーを含む。当技術分野で公知の任意のリンカーを、本発明のある具体的な実施形態とともに使用してもよい。使用され得るリンカーの非限定的な例は、以下に詳細に記載されている。
【０３４０】
特定の一実施形態によれば、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）×２＋ＧＧＧＧ（配列番号８２）リンカーである。
【０３４１】
ある具体的な実施形態によれば、反復される配列は、本明細書で定義される４−１ＢＢＬのいずれかであり得る。
【０３４２】
ある具体的な実施形態によれば、３回の反復は同一の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を有する。
【０３４３】
別のある具体的な実施形態によれば、３回の反復は別個である、すなわち、異なる４−１ＢＢＬアミノ酸配列を有する。
【０３４４】
別のある具体的な実施形態によれば、３回の反復のうちの２つは、同一の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を有する。
【０３４５】
ある具体的な実施形態によれば、反復の少なくとも１つは、本明細書に開示される４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む。
【０３４６】
ある具体的な実施形態によれば、反復の少なくとも１つは、本明細書に開示される４−１ＢＢＬアミノ酸配列からなる。
【０３４７】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２３を含むアミノ酸配列の３回の反復を含む。
【０３４８】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２３からなるアミノ酸配列の３回の反復を含む。
【０３４９】
こうして、ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７８と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３５０】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３５１】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７８と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３５２】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７８と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３５３】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７８と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３５４】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７８を含む。
【０３５５】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号７８からなる。
【０３５６】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７９と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０３５７】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７９と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０３５８】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７９と、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０３５９】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７９を含む。
【０３６０】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬ核酸配列は、配列番号７９からなる。
【０３６１】
「ＤＳＰ」及び「融合タンパク質」、「キメラタンパク質」又は「キメラ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、自然界での単一のアミノ酸配列においては一緒に見出されない２以上の部分を有するアミノ酸配列を指す。
【０３６２】
本発明のいくつかの実施形態の融合タンパク質は、ＳＩＲＰαアミノ酸配列及び４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む（本明細書では「ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質」と称される）。
【０３６３】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαは４−１ＢＢＬのＮ末端にある。
【０３６４】
別のある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαは４−１ＢＢＬのＣ末端にある。
【０３６５】
本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−１ＢＢＬ融合タンパク質は、本明細書で定義される任意のＳＩＲＰα、及び、（例えば、本願明細書で開示されているような）以下の任意の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含み得る：
【０３６６】
（ａ）配列番号２２、２３、２７、及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長であるか；配列番号７４及び７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する１７０〜１９７アミノ酸長であり、ただし配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＧ１９８−Ｅ２０５を含まないか；配列番号７２と少なくとも８０％の同一性を有する１７０〜１８２アミノ酸長であり、ただし配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＡ１−Ｅ２３を含まないか；又は配列番号７０と少なくとも８０％の同一性を有する１８４アミノ酸長であり、及び／又は
【０３６７】
（ｂ）４−１ＢＢＬアミノ酸配列の３回の反復を含む（ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す）。本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、本明細書で定義される任意のＳＩＲＰα；及び（例えば、本明細書に開示されるような）配列番号２２、２３、２７、及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長である任意の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含み得、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３６８】
本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、（例えば、本明細書で開示されるような）１００〜１１９アミノ酸長であり、配列番号２４及び／又は２６と少なくとも９５％の同一性を有する任意のＳＩＲＰα；及び本明細書で定義されるような任意の４−１ＢＢＬを含み得る、（ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３６９】
本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−１ＢＢＬ融合タンパク質は、（例えば、本明細書で開示されるような）１００〜１１９アミノ酸長であり、配列番号２４及び／又は２６と少なくとも９５％の同一性を有する任意のＳＩＲＰα；及び（例えば、本明細書に開示されるような）以下の任意の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含み得る：
（ａ）配列番号２２、２３、２７、及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長であるか；配列番号７４及び７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する１７０〜１９７アミノ酸長であり、ただし配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＧ１９８−Ｅ２０５を含まないか；配列番号７２と少なくとも８０％の同一性を有する１７０〜１８２アミノ酸長であり、ただし配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＡ１−Ｅ２３を含まないか；又は配列番号７０と少なくとも８０％の同一性を有する１８４アミノ酸長であり、及び／又は
（ｂ）４−１ＢＢＬアミノ酸配列の３回の反復を含み、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３７０】
本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、（例えば、本明細書で開示されるような）１００〜１１９アミノ酸長であり、ただし配列番号２４及び／又は２６と少なくとも９５％の同一性を有する任意のＳＩＲＰα；及び（例えば、本明細書に開示されるような）配列番号２２、２３、２７、及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長である任意の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含み得、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３７１】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２、２４〜２６、及び／又は２９と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し、
４−１ＢＢＬアミノ酸配列は：
（ａ）配列番号２２、２３、２７、及び／又は２８と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長であるか；配列番号７４及び７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する１７０〜１９７アミノ酸長であり、ただし配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＧ１９８−Ｅ２０５を含まないか；配列番号７２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する１７０〜１８２アミノ酸長であり、ただし配列番号３に対応するアミノ酸セグメントＡ１−Ｅ２３を含まないか；又は配列番号７０と少なくとも８０％の同一性を有する１８４アミノ酸長であり、及び／又は
（ｂ）４−１ＢＢＬアミノ酸配列の３回の反復を含み、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３７２】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２、２４〜２６、又は２９を含み、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は：
（ａ）配列番号２２、２３、２７、及び２８を含む１８５〜２０２アミノ酸長であるか；配列番号７４及び７６を含む１７０〜１９７アミノ酸長であるか；配列番号７２を含む１７０〜１８２アミノ酸長であるか；又は配列番号７０を含む１８４アミノ酸長であり、及び／又は
（ｂ）４−１ＢＢＬアミノ酸配列の３回の反復を含み、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３７３】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２、２４〜２６、又は２９に記載の通りであり；４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、２８、７４、７６、７２、又は７０に記載の通りであり、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３７４】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２、２４〜２６、及び／又は２９と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し；４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、及び／又は２８と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長であり、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３７５】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２、２４〜２６、又は２９を含み；４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、又は２８を含む１８５〜２０２アミノ酸長であり、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３７６】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２、２４〜２６、又は２９に記載の通りであり；４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、又は２８に記載の通りであり、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３７７】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２又は２５と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し；４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、及び／又は２８と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長である。
【０３７８】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２又は２５を含み、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、又は２８を含む１８５〜２０２アミノ酸長である。
【０３７９】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２又は２５に記載の通りであり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、又は２８に記載の通りである。
【０３８０】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２又は２３と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長である。
【０３８１】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は配列番号２を含み、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２又は２３を含む１８５〜２０２アミノ酸長である。
【０３８２】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２に記載の通りであり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２又は２３に記載の通りである。
【０３８３】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び／又は２６と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する１００〜１１９アミノ酸長であり；４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３、２２、２３、２７、２８、及び／又は３６と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３８４】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び／又は２６を含む１００〜１１９アミノ酸長であり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３、２２、２３、２７、２８、及び／又は３６を含み、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３８５】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び／又は２６に記載の通りであり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３、２２、２３、２７、２８、及び／又は３６に記載の通りである。
【０３８６】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４又は２６と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する１００〜１１９アミノ酸長であり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３、２２、２３、２７、２８、又は２８と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【０３８７】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び／又は２６を含む１００〜１１９アミノ酸長であり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３、２２、２３、２７、又は２８を含む。
【０３８８】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４又は２６に記載の通りであり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号３、２２、２３、２７、又は２８に記載の通りである。
【０３８９】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び／又は２６と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する１００〜１１９アミノ酸長であり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、及び／又は２８と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長であり、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３９０】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び／又は２６を含む１００〜１１９アミノ酸長であり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、及び／又は２８を含む１８５〜２０２アミノ酸長であり、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０３９１】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４及び／又は２６に記載の通りであり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、２７、及び／又は２８に記載の通りである。
【０３９２】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する１００〜１１９アミノ酸長であり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長である。
【０３９３】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は配列番号２４を含む１００〜１１９アミノ酸長であり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２を含む１８５〜２０２アミノ酸長である。
【０３９４】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２４に記載の通りであり、４−１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号２２に記載の通りである。
【０３９５】
本発明のある具体的な実施形態で使用可能なＳＩＲＰαアミノ酸配列と４−１ＢＢＬアミノ酸配列との特定の組み合わせの非限定的な例は、本明細書の不可欠な部分として機能する、下記の実施例セクションの表４に示されている。
【０３９６】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド又は４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドは、可溶性である（すなわち、合成又は天然に存在する表面に固定化されていない）。
【０３９７】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド又は４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドは、合成又は天然に存在する表面に固定化されている。
【０３９８】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、可溶性である（すなわち、合成又は天然に存在する表面に固定化されていない）。
【０３９９】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、合成又は天然に存在する表面に固定化されている。
【０４００】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、少なくともホモ三量体の形態である。
【０４０１】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、以上５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上は、少なくともホモ三量体の形態であり、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４０２】
ある具体的な実施形態によれば、上記少なくともホモ三量体はホモ三量体を含む。
【０４０３】
ある具体的な実施形態によれば、上記少なくともホモ三量体はホモ四量体を含む。
【０４０４】
ある具体的な実施形態によれば、上記少なくともホモ三量体はホモ五量体を含む。
【０４０５】
ある具体的な実施形態によれば、上記少なくともホモ三量体はホモ六量体を含む。
【０４０６】
三量体化を測定する方法は当技術分野で周知であり、ＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ  、２Ｄゲル、ゲル濾過、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ、分析用超遠心分離（ＡＵＣ）質量分析（ＭＳ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０４０７】
ある具体的な実施形態によれば、上記少なくともホモ三量体は、ＳＥＣ−ＭＡＬＳによって測定される分子量が、１００ｋＤ以上、１４０ｋＤ以上、１６０ｋＤ以上、１８０ｋＤ以上、２００ｋＤ以上、２２０ｋＤ以上、２４０ｋＤ以上、２５０ｋＤ以上である。
【０４０８】
ある具体的な実施形態によれば、上記少なくともホモ三量体は、ＳＥＣ−ＭＡＬＳによって測定される分子量が１００ｋＤ以上である。
【０４０９】
ある具体的な実施形態によれば、上記少なくともホモ三量体は、ＳＥＣ−ＭＡＬＳによって測定される分子量が２４０ｋＤ以上である。
【０４１０】
ある具体的な実施形態によれば、上記少なくともホモ三量体は、ＳＥＣ−ＭＡＬＳによって測定される分子量が約２５０〜２７０ｋＤである。
【０４１１】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬは、ＳＩＲＰαと４−１ＢＢＬとの間にリンカーを含まない。
【０４１２】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、上記ＳＩＲＰαと上記４−１ＢＢＬとの間にリンカーを含む。
【０４１３】
当技術分野で公知の任意のリンカーを、本発明のある具体的な実施形態で使用してもよい。
【０４１４】
ある具体的な実施形態によれば、リンカーは、天然に存在するマルチドメインタンパク質に由来する場合もあれば、例えば、その全内容が参照により本明細書に援用されるＣｈｉｃｈｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ２２（２）：  １５３−１６７及びＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，（２０１３），  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ６５（１０）：  １３５７−１３６９に説明されているように経験的リンカーである場合もある。いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー設計データベースや、その全内容が参照により本明細書に援用されるＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３），  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ６５（１０）：  １３５７−１３６９及びＣｒａｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １３（５）：３０９−３１２に記載されているようなコンピュータープログラムを使用して設計されてもよい。
【０４１５】
ある具体的な実施形態によれば、リンカーは、ＰＥＧなどの合成リンカーである。
【０４１６】
ある具体的な実施形態によれば、リンカーは、抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ）のＦｃドメイン若しくはヒンジ領域又はその断片である。
【０４１７】
ある具体的な実施形態によれば、リンカーは、抗体のＦｃドメイン若しくはヒンジ領域又はその断片ではない。
【０４１８】
ある具体的な実施形態によれば、リンカーは、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメイン又はヒンジ領域である。
【０４１９】
ある具体的な実施形態によれば、Ｆｃドメインリンカーは、配列番号９５を含む。
【０４２０】
ある具体的な実施形態によれば、リンカーは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン又はヒンジ領域である。
【０４２１】
ある具体的な実施形態によれば、Ｆｃドメインリンカーは、配列番号９６を含む。
【０４２２】
ある具体的な実施形態によれば、Ｆｃドメイン又はヒンジ領域リンカーは、保存的及び非保存的アミノ酸置換（本明細書では突然変異とも称される）を含んでもよい。そのような置換は当技術分野で公知である。ある具体的な実施形態によれば、リンカーは機能的であってもよい。例えば、限定されるものではないが、リンカーは、フォールディング及び／又は安定性の改善、発現の向上、薬物動態の改善、及び／又はＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の生物活性の改善を行うように機能し得る。別の例では、リンカーは、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質を特定の細胞型又は位置に標的化するように機能し得る。
【０４２３】
ある具体的な実施形態によれば、リンカーはポリペプチドである。
【０４２４】
ポリペプチドリンカーの非限定的な例としては、ＬＥ、ＧＧＧＧＳ（配列番号８５）の配列を有するリンカー、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝１〜４）（配列番号８４）の配列を有するリンカー、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号８３）の配列を有するリンカー、（ＧＧＧＧＳ）×２（配列番号８６）の配列を有するリンカー、（ＧＧＧＧＳ）×２＋ＧＧＧＧ（配列番号８２）の配列を有するリンカー、（Ｇｌｙ）８、（Ｇｌｙ）６、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１〜３）（配列番号８７）の配列を有するリンカー、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５）（配列番号８８）の配列を有するリンカー、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号８９）の配列を有するリンカー、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ（配列番号９０）の配列を有するリンカー、ＰＡＰＡＰ（配列番号９１）の配列を有するリンカー、Ｋ  ＥＳＧＳＶＳＳ  ＥＱ  ＬＡＱ  ＦＲＳ  ＬＤ（配列番号９２）の配列を有するリンカー、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号９３）の配列を有するリンカー、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号９４）の配列を有するリンカー、及び（ＸＰ）ｎ（ここでＸは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、又はＧｌｕなどの任意のアミノ酸を指定する）の配列を有するリンカーが挙げられる。
【０４２５】
ある具体的な実施形態によれば、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号８５）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝１〜４）（配列番号８４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号８３）、（ＧＧＧＧＳ）×２（配列番号８６）、及び（ＧＧＧＧＳ）×２＋ＧＧＧＧ（配列番号８２）からなる群から選択される。
【０４２６】
ある具体的な実施形態によれば、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝１〜４）（配列番号８４）リンカーである。
【０４２７】
ある具体的な実施形態によれば、リンカーは、ＧＧＧＧＳ×２（配列番号８６）リンカーである。
【０４２８】
ある具体的な実施形態によれば、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号８３）リンカーである。
【０４２９】
ある具体的な実施形態によれば、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）×２＋ＧＧＧＧ（配列番号８２）リンカーである。
【０４３０】
いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬは、１〜６アミノ酸長のリンカーを含む。
【０４３１】
ある具体的な実施形態によれば、リンカーは、実質的にグリシン及び／又はセリン残基（例えば、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、又は１００％のグリシン及びセリン）を含む。
【０４３２】
ある具体的な実施形態によれば、リンカーは、単一アミノ酸リンカーである。
【０４３３】
本発明のいくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαと４−１ＢＢＬとを連結するアミノ酸はグリシンであり、本明細書ではＳＩＲＰα−Ｇ−４−１ＢＢＬ融合タンパク質とも称される。
【０４３４】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、１５、１６、１８〜２１、及び４５〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４３５】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、１５、１６、１８〜２１、及び４５〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４３６】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、１５、１６、及び１８〜２１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０４３７】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、１５、１６、及び１８〜２１からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０４３８】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、及び１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０４３９】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０４４０】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１３と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０４４１】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１６と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０４４２】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、及び１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０４４３】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、１５、１６、１８〜２１、及び４５〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４４４】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、１５、１６、及び１８〜２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０４４５】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、及び１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０４４６】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１を含む。
【０４４７】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１３を含む。
【０４４８】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１６を含む。
【０４４９】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、１５、１６、１８〜２１、及び４５〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４５０】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、１５、１６、及び１８〜２１からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
【０４５１】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１、１３、及び１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
【０４５２】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１からなる。
【０４５３】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１３からなる。
【０４５４】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１６からなる。
【０４５５】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、２００〜９００アミノ酸長、２００〜８００アミノ酸長、２００〜７００アミノ酸長、２５０〜６５０アミノ酸長、２５０〜６００アミノ酸長、又は２５０〜５５０アミノ酸長であり、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４５６】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、２７０〜７５０アミノ酸長である。
【０４５７】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、２９０〜７５０アミノ酸長である。
【０４５８】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、２９０〜５５０アミノ酸長である。
【０４５９】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、２９７〜５４３アミノ酸長である。
【０４６０】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、２９６〜５４２アミノ酸長である。
【０４６１】
本発明のある具体的な実施形態で使用可能な具体的なＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の非限定的な例は、本明細書の不可欠な部分として機能する、以下の実施例セクションの表４に示される。
【０４６２】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の産生収量は、同じ産生条件下での、配列番号２に記載のＳＩＲＰαアミノ酸配列及び配列番号３に記載の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の産生収量よりも、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上高く、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４６３】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の産生収量は、同じ産生条件下での、配列番号２に記載のＳＩＲＰαアミノ酸配列及び配列番号３に記載の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の産生収量よりも、１．５倍以上高い。
【０４６４】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の産生収量は、同じ産生条件下での、配列番号２に記載のＳＩＲＰαアミノ酸配列及び配列番号３に記載の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の産生収量よりも、２倍以上高い。
【０４６５】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の産生収量は、同じ産生条件下での、配列番号５の産生収量よりも、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上高く、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４６６】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の産生収量は、同じ産生条件下での、配列番号５の産生収量よりも１．５倍以上高い。
【０４６７】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の産生収量は、同じ産生条件下での、配列番号５の産生収量よりも２倍以上高い。
【０４６８】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドの産生収量は、同じ産生条件下での、配列番号２の産生収量よりも、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上高く、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４６９】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドの産生収量は、同じ産生条件下での、配列番号３の産生収量よりも、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上高く、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４７０】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の凝集体の量は、同じ産生条件下での、配列番号２に記載のＳＩＲＰαアミノ酸配列及び配列番号３に記載の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の凝集体の量よりも、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上少なく、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４７１】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の凝集体の量は、同じ産生条件下での、配列番号５の凝集体の量よりも、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上少なく、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４７２】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の凝集体の量は、同じ産生条件下での、配列番号５の凝集体の量よりも２０％以上少なく、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４７３】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の凝集体の量は、同じ産生条件下での、配列番号５の凝集体の量よりも５０％以上少なく、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４７４】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の活性は、例えば同じ産生条件下での、配列番号２に記載のＳＩＲＰαアミノ酸配列及び配列番号３に記載の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の活性よりも、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上高く、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４７５】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の活性は、例えば同じ産生条件下での、配列番号５の活性よりも、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上高く、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４７６】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドの活性は、例えば同じ産生条件下での、配列番号２の活性よりも、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上高く、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４７７】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドの活性は、例えば同じ産生条件下での、配列番号３の活性よりも、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上高く、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４７８】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の安定性は、同じ産生条件下での、配列番号２に記載のＳＩＲＰαアミノ酸配列及び配列番号３に記載の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の安定性よりも、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上高く、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４７９】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の安定性は、同じ産生条件下での、配列番号５の安定性よりも、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上高く、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４８０】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドの安定性は、同じ産生条件下での、配列番号２の安定性よりも、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上高く、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４８１】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドの安定性は、同じ産生条件下での、配列番号３の安定性よりも、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上高く、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４８２】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の安全性は、同じ産生条件下での、配列番号２に記載のＳＩＲＰαアミノ酸配列及び配列番号３に記載の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の安全性よりも、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上高く、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４８３】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の安全性は、同じ産生条件下での、配列番号５の安全性よりも、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上高く、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４８４】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドの安全性は、同じ産生条件下での、配列番号２の安全性よりも、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上高く、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０４８５】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドの安全性は、同じ産生条件下での、配列番号３の安全性よりも、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上高く、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
ある具体的な実施形態によれば、産生条件は、哺乳動物細胞での発現、及び３２〜３７℃、５〜１０％ＣＯ２で５〜１３日間の培養を含む。
【０４８６】
本発明のある具体的な実施形態で使用可能な産生条件の非限定的な例は、下記の実施例のセクションに開示されている。
【０４８７】
こうして、例えば、Ｎ末端に人工シグナルペプチド（例えば、配列番号４）及びＣ末端にＨｉｓタグと終止コドンとを含む、融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、又は４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドをコードする発現ベクターは、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞又はＥｘｐｉＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞で発現される。次に、形質導入細胞を、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞又はＥｘｐｉＣＨＯ細胞の製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ社）の指示に従って、細胞特異的培地で３２〜３７℃、５〜１０％ＣＯ２で培養し、少なくとも培養５日後に、タンパク質を上清から収集して精製する。
【０４８８】
ある具体的な実施形態によれば、培養は、バッチ、分割バッチ（ｓｐｌｉｔ−ｂａｔｃｈ）、流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）、又は灌流様式で行われる。
【０４８９】
ある具体的な実施形態によれば、培養は流加培養条件下で行われる。
【０４９０】
ある具体的な実施形態によれば、培養は３７℃で行われる。
【０４９１】
ある具体的な実施形態によれば、培養を３７℃で行い３２℃へ移行する。この温度移行により、定常期に達する前に細胞の代謝を遅くすることができる。
【０４９２】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドは、ＣＤ４７に結合することが可能である。
【０４９３】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドは、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドの非存在下での場合と比較して、食細胞によるＣＤ４７を発現する病的細胞の食作用を増強することが可能である。
【０４９４】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドは、配列番号２と比較して、本明細書に開示されるように増強された活性を有する。
【０４９５】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドは、以下の少なくとも１つが可能である：
（ｉ）４−１ＢＢを結合すること、
（ｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する細胞において上記４−１ＢＢシグナル伝達経路を活性化すること、及び／又は
（ｉｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する免疫細胞を共刺激すること。
【０４９６】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドは、配列番号３と比較して、本明細書に開示されるように増強された活性を有する。
【０４９７】
ある具体的な実施形態によれば、４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉ）＋（ｉｉ）、（ｉ）＋（ｉｉｉ）、（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）、及び（ｉ）＋（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）が可能である。
【０４９８】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、以下の少なくとも１つが可能である：
（ｉ）ＣＤ４７及び４−１ＢＢに結合すること、
（ｉｉ）４−１ＢＢを発現する免疫細胞（例えばＴ細胞）において４−１ＢＢシグナル伝達経路を活性化すること、
（ｉｉｉ）上記４−１ＢＢを発現する免疫細胞（例えばＴ細胞）を活性化すること、及び／又は
（ｉｖ）ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の非存在下と比較して、食細胞によるＣＤ４７を発現する病的細胞に対する食作用を増強すること。
【０４９９】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、配列番号２に記載のＳＩＲＰαアミノ酸配列と配列番号３に記載の４−１ＢＢＬアミノ酸配列とを含む融合タンパク質と比較して、本明細書に開示されるように増強された活性を有する。
【０５００】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、配列番号５と比較して、本明細書に開示されるように増強された活性を有する。
【０５０１】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｉ）＋（ｉｉ）、（ｉ）＋（ｉｉｉ）、（ｉ）＋（ｉｖ）、（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）、（ｉｉ）＋（ｉｖ）、（ｉ）＋（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）、（ｉ）＋（ｉｉ）＋（ｉｖ）、（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）＋（ｉｖ）が可能である。
【０５０２】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、（ｉ）＋（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）＋（ｉｖ）が可能である。
【０５０３】
結合、４−１ＢＢシグナル伝達経路の活性化、免疫細胞の活性化を測定する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書の上記及び下記並びに以下の実施例のセクションでさらに説明する。
【０５０４】
ある具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又はＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドは、食細胞によるＣＤ４７を発現する病的細胞の食作用を増強する。
【０５０５】
食作用を分析する方法は当技術分野で周知であり、以下の実施例セクションの実験４にも開示されている。例えば、死滅アッセイ、フローサイトメトリー、及び／又は顕微鏡評価（生細胞イメージング、蛍光顕微鏡共焦点顕微鏡、電子顕微鏡）が挙げられる。
【０５０６】
ある具体的な実施形態によれば、例えばフローサイトメトリー又は顕微鏡評価によって決定される、食作用の増強は、本発明のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又はＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド若しくは核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞が存在しない場合と比較して、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、５倍以上、１０倍以上、又は２０倍以上である。
【０５０７】
ある具体的な実施形態によれば、例えばフローサイトメトリー又は顕微鏡評価によって決定される、生存率の増加は、本発明のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又はＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド若しくは核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞が存在しない場合と比較して、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％、又は１００％以上である。
【０５０８】
本発明のいくつかの実施形態の組成物（例えば、融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド若しくは核酸、又はそれを発現する宿主細胞）は免疫細胞を活性化することが可能であるため、それらは、インビトロ、エクスビボ、及び／又はインビボで免疫細胞を活性化する方法で使用され得る。
【０５０９】
よって、本発明の一態様によれば、免疫細胞を活性化する方法が提供され、上記方法は、本明細書に開示されるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド及び／又は４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞の存在下において、インビトロ又はエクスビボで免疫細胞を活性化することを含む。
【０５１０】
本発明の別の態様によれば、Ｔ細胞を活性化する方法が提供され、上記方法は、本明細書に開示されるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質及びＣＤ４７を発現する細胞の存在下において、インビトロ又はエクスビボでＴ細胞を活性化することを含む。
【０５１１】
本発明の別の態様によれば、食細胞を活性化する方法が提供され、上記方法は、本明細書に開示されるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質及び／又はＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、並びにＣＤ４７を発現する細胞の存在下において、インビトロ又はエクスビボで食細胞を活性化することを含む。
【０５１２】
ある具体的な実施形態によれば、活性化は、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞の存在下で行われる。
【０５１３】
ある具体的な実施形態によれば、活性化は、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞の存在下で行われる。
【０５１４】
ある具体的な実施形態によれば、活性化は、４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞の存在下で行われる。
【０５１５】
ある具体的な実施形態によれば、活性化は、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞；及び、４−１ＢＢＬアミノ酸配列、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞の存在下で行われる。
【０５１６】
ある具体的な実施形態によれば、免疫細胞は４−１ＢＢを発現する。
【０５１７】
ある具体的な実施形態によれば、免疫細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。
【０５１８】
本明細書で使用される場合、「末梢単核血球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）」という用語は、単一の核を有する血球を指し、リンパ球、単球、及び樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ、ＤＣ）を含む。
【０５１９】
ある具体的な実施形態によれば、ＰＢＭＣは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞からなる群から選択される。
【０５２０】
ある具体的な実施形態によれば、ＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞を含む。
【０５２１】
ＰＢＭＣを取得する方法（対象から全血を採取し、抗凝固剤（例えば、ヘパリン又はクエン酸塩）を含む容器に収集するなど）、並びにアフェレーシス（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ）は当技術分野で周知である。続いて、ある具体的な実施形態によれば、少なくとも１つのタイプのＰＢＭＣが末梢血から精製される。全血からＰＢＭＣを精製するための当業者に公知のいくつかの方法及び試薬が存在し、白血球アフェレーシス、沈降、密度勾配遠心分離（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標））、遠心水簸、分画、例えば赤血球などの化学溶解（例えば、ＡＣＫによる）、細胞表面マーカーを使用した特定の細胞型の選択（例えば、ＦＡＣＳソーター、又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＣｅｌｌＰｒｏ社、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社、若しくはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社から市販されている磁気細胞分離技術を使用）、及び特定の抗体による根絶（例えば、死滅）などの方法による又は陰性選択に基づくアフィニティーベースの精製（例えば、磁気細胞分離技術、ＦＡＣＳソーター及び／又はキャプチャＥＬＩＳＡ標識を使用）による、特定の細胞型の枯渇などが挙げられる。そのような方法は、例えば、ＴＨＥ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ｔｏ  ４，（Ｄ．Ｎ．  Ｗｅｉｒ編）及びＦＬＯＷ  ＣＹＴＯＭＥＴＲＹ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬ  ＳＯＲＴＩＮＧ（Ａ．  Ｒａｄｂｒｕｃｈ，  ｅｄｉｔｏｒ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  ２０００）に記載されている。
【０５２２】
ある具体的な実施形態によれば、免疫細胞は腫瘍浸潤リンパ球を含む。
【０５２３】
本明細書で使用される場合、「腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＴＩＬ）」という用語は、血流から外れて腫瘍に移動した単核白血球を指す。
【０５２４】
ある具体的な実施形態によれば、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球からなる群から選択される。
【０５２５】
ＴＩＬを取得する方法は、例えば、生検又は剖検により対象から腫瘍試料を取得し、その単一細胞懸濁液を調製するなど、当技術分野で周知である。単一細胞懸濁液は、任意の適切な方法で得ることができ、例えば、機械的に（例えば、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、カリフォルニア州オーバーン）を使用して腫瘍を分解する）又は酵素的に（例えば、コラゲナーゼ又はＤＮａｓｅ）得ることができる。続いて、少なくとも１つのタイプのＴＩＬを細胞懸濁液から精製することができる。所望のタイプのＴＩＬを精製するための当業者に公知のいくつかの方法及び試薬が存在し、細胞表面マーカーを使用した特定の細胞型の選択（例えば、ＦＡＣＳソーター、又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＣｅｌｌＰｒｏ社、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社、若しくはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社から市販されている磁気細胞分離技術を使用）、及び特定の抗体による根絶（例えば、死滅）などの方法による又は陰性選択に基づくアフィニティーベースの精製（例えば、磁気細胞分離技術、ＦＡＣＳソーター及び／又はキャプチャＥＬＩＳＡ標識を使用）による、特定の細胞型の枯渇などが挙げられる。そのような方法は、例えば、ＴＨＥ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ｔｏ  ４，（Ｄ．Ｎ．  Ｗｅｉｒ編）及びＦＬＯＷ  ＣＹＴＯＭＥＴＲＹ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬ  ＳＯＲＴＩＮＧ（Ａ．  Ｒａｄｂｒｕｃｈ，  ｅｄｉｔｏｒ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  ２０００）に記載されている。
【０５２６】
ある具体的な実施形態によれば、免疫細胞は食細胞を含む。
【０５２７】
本明細書で使用される場合、「食細胞」という用語は、食作用が可能な細胞であり、プロフェッショナル食細胞及びノンプロフェッショナル食細胞の両方を含む。食作用を分析する方法は当技術分野で周知であり、本明細書の上記及び下記にさらに開示されている。ある具体的な実施形態によれば、食細胞は、単球、樹状細胞（ＤＣ）、及び顆粒球からなる群から選択される。
【０５２８】
ある具体的な実施形態によれば、食細胞は顆粒球を含む。
【０５２９】
ある具体的な実施形態によれば、食細胞は単球を含む。
【０５３０】
ある具体的な実施形態によれば、免疫細胞は単球を含む。
【０５３１】
ある具体的な実施形態によれば、「単球」という用語は、循環血液中の単球（circulating monocytes）及び組織に存在するマクロファージ（単核食細胞とも称される）の両方を指す。
【０５３２】
ある具体的な実施形態によれば、単球はマクロファージを含む。通常、マクロファージの細胞表面表現型としては、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６４、Ｆ４／８０（マウス）／ＥＭＲ１（ヒト）、リゾチームＭ、ＭＡＣ−１／ＭＡＣ−３、及びＣＤ６８が含まれる。
【０５３３】
ある具体的な実施形態によれば、単球は循環血液中の単球を含む。通常、循環血液中の単球の細胞表面表現型としては、ＣＤ１４及びＣＤ１６（例えば、ＣＤ１４＋＋  ＣＤ１６−、ＣＤ１４＋  ＣＤ１６＋＋、ＣＤ１４＋＋  ＣＤ１６＋）が含まれる。
【０５３４】
ある具体的な実施形態によれば、免疫細胞はＤＣを含む。
【０５３５】
本明細書で使用される場合、「樹状細胞（ＤＣ）」という用語は、リンパ組織又は非リンパ組織に見られる形態学的に類似した細胞型の多様な集団の任意のメンバーを指す。ＤＣはプロフェッショナル抗原提示細胞のクラスであり、ＨＬＡ拘束性Ｔ細胞を感作する高い能力を有する。ＤＣとしては、例えば、形質細胞様樹状細胞、骨髄性樹状細胞（未成熟及び成熟樹状細胞を含む）、ランゲルハンス細胞、指状嵌入細胞、濾胞樹状細胞が含まれる。樹状細胞は、機能によって、又は表現型によって、特に細胞表面の表現型によって認識され得る。これらの細胞は、細胞表面にベール様の突起を有する独特の形態、中〜高レベルの表面ＨＬＡクラスＩＩ発現、及びＴ細胞、特にナイーブＴ細胞に抗原を提示する能力を特徴とする（Ｓｔｅｉｎｍａｎ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９１；  ９：２７１−１９６を参照）。通常、ＤＣの細胞表面表現型としては、ＣＤｌａ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８６＋、又はＨＬＡ−ＤＲが含まれる。ＤＣという用語には、未成熟ＤＣ及び成熟ＤＣの両方が包含される。
【０５３６】
ある具体的な実施形態によれば、免疫細胞は顆粒球を含む。
【０５３７】
本明細書で使用される場合、「顆粒球」という用語は、細胞質に顆粒が存在することを特徴とする多形核白血球を指す。
【０５３８】
ある具体的な実施形態によれば、顆粒球は好中球を含む。
【０５３９】
ある具体的な実施形態によれば、顆粒球は肥満細胞を含む。
【０５４０】
ある具体的な実施形態によれば、免疫細胞はＴ細胞を含む。
【０５４１】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ３＋、かつＣＤ４＋又はＣＤ８＋表現型のいずれかを有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）＋の分化したリンパ球を指す。Ｔ細胞はエフェクターＴ細胞又は制御性Ｔ細胞のいずれかである。
【０５４２】
本明細書で使用される場合、「エフェクターＴ細胞」という用語は、例えばサイトカインを産生することにより他の免疫細胞を活性化若しくは指示する、又は細胞傷害活性を有するＴ細胞を指し、例えば、ＣＤ４＋、Ｔｈ１／Ｔｈ２、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球である。
【０５４３】
本明細書で使用される場合、「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」という用語は、エフェクターＴ細胞を含む他のＴ細胞、及び自然免疫系細胞の活性化を負に調節するＴ細胞を指す。Ｔｒｅｇ細胞は、エフェクターＴ細胞応答の持続的な抑制を特徴とする。特定の一実施形態によれば、ＴｒｅｇはＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞である。
【０５４４】
ある具体的な実施形態によれば、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【０５４５】
別のある具体的な実施形態によれば、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０５４６】
ある具体的な実施形態によれば、Ｔ細胞はメモリーＴ細胞である。メモリーＴ細胞の非限定的な例としては、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７−表現型を有するエフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋表現型を有するセントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７−表現型を有するエフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ３＋／ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋表現型を有するセントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞が挙げられる。
【０５４７】
ある具体的な実施形態によれば、Ｔ細胞は、目的の発現産物をコードする核酸配列で形質導入された改変Ｔ細胞を含む。
【０５４８】
ある具体的な実施形態によれば、目的の発現産物は、Ｔ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）である。
【０５４９】
本明細書で使用される場合、「ＴＣＲをコードする核酸配列で形質導入される」又は「ＴＣＲをコードする核酸配列で形質導入する」という句は、ＭＨＣの観点においての提示された目的の抗原に対しての特異性（specificity against a desired antigen presented in the context of MHC）を有するＴ細胞からの可変α鎖及びβ鎖のクローニングを指す。ＴＣＲで形質導入する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２０１２；  ２０１２：４０４０８１；  Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｉｖｉｅｒｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１５  Ｍａｒ；２２（２）：８５−９４）及びＬａｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００２）  ９，  ６１３−６２３に開示されている。
【０５５０】
本明細書で使用される場合、「ＣＡＲをコードする核酸配列で形質導入される」又は「ＣＡＲをコードする核酸配列で形質導入する」という句は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列のクローニングを指し、ＣＡＲは、抗原認識部分及びＴ細胞活性化部分を含む。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞シグナル伝達又はＴ細胞活性化ドメインに連結された抗体の抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含む人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はハイブリッドポリペプチドである。ＣＡＲで形質導入する方法は当技術分野で公知であり、Ｄａｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０１２  Ｄｅｃ  １；１（９）：１５７７−１５８３、Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｉｖｉｅｒｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１５  Ｍａｒ；２２（２）：８５−９４）、Ｍａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２０１４  Ａｐｒ  ２４；１２３（１７）：２６２５−３５、Ｐｏｒｔｅｒ  ＤＬ  Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２０１１，  ３６５（８）：７２５−７３３、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＨＪ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１６；１３（６）：３７０−３８３、及びＧｌｏｂｅｒｓｏｎ−Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１４；２２（５）：１０２９−１０３８に開示されている。
【０５５１】
ある具体的な実施形態によれば、免疫細胞はＢ細胞を含む。
【０５５２】
本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞」という用語は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）＋、ＣＤ１９＋、及び／又はＢ２２０＋表現型を有するリンパ球を指す。Ｂ細胞は、特定の抗原に結合し、体液性応答を誘発する能力を特徴とする。
【０５５３】
ある具体的な実施形態によれば、免疫細胞はＮＫ細胞を含む。
【０５５４】
本明細書で使用される場合、「ＮＫ細胞」という用語は、ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋及び／又はＣＤ５７＋ＴＣＲ−表現型を有する分化したリンパ球を指す。ＮＫは、特定の細胞溶解酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ  ／  ＨＬＡ抗原を発現できない細胞に結合して殺傷する能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞又は他の疾患細胞を殺傷する能力、及び免疫応答を刺激又は阻害するサイトカインと称されるタンパク質分子を放出する能力を特徴とする。
【０５５５】
ある具体的な実施形態によれば、免疫細胞はＮＫＴ細胞を含む。
【０５５６】
本明細書で使用される「ＮＫＴ細胞」という用語は、半不変のαβＴ細胞受容体を発現するが、ＮＫ１．１などのＮＫ細胞に典型的に関連する様々な分子マーカーも発現するＴ細胞の特殊な集団を指す。ＮＫＴ細胞としては、ＮＫ１．１＋及びＮＫ１．１−、並びにＣＤ４＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋、及びＣＤ８−細胞が挙げられる。ＮＫＴ細胞のＴＣＲは、ＭＨＣＩ様分子ＣＤ１ｄによって提示される糖脂質抗原を認識するという点で固有である。ＮＫＴ細胞は、炎症又は免疫寛容のいずれかを促進するサイトカインを産生する能力があるため、保護効果又は有害効果のいずれかを持つ可能性がある。
【０５５７】
ある具体的な実施形態によれば、免疫細胞は健康な対象から得られる。
【０５５８】
ある具体的な実施形態によれば、免疫細胞は、病状（例えば、がん）を有している対象から得る。
【０５５９】
ある具体的な実施形態によれば、活性化は、ＣＤ４７を発現する細胞又は外因性ＣＤ４７の存在下で行われる。
【０５６０】
ある具体的な実施形態によれば、活性化は外因性ＣＤ４７の存在下で行われる。
【０５６１】
ある具体的な実施形態によれば、外因性ＣＤ４７は可溶性である。
【０５６２】
別のある具体的な実施形態によれば、外因性ＣＤ４７は固体支持体に固定化される。
【０５６３】
ある具体的な実施形態によれば、活性化は、ＣＤ４７を発現する細胞の存在下で行われる。
【０５６４】
ある具体的な実施形態によれば、ＣＤ４７を発現する細胞は、病的（疾患）細胞を含む。
【０５６５】
ある具体的な実施形態によれば、ＣＤ４７を発現する細胞は、がん細胞を含む。
【０５６６】
ある具体的な実施形態によれば、活性化は、細胞増殖、成熟、サイトカイン産生、食作用、及び／又は免疫細胞の制御機能又はエフェクター機能の誘導を起こす一次活性化シグナル［例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）／ペプチド複合体とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のライゲーション］を少なくとも伝達可能な刺激剤の存在下で行われる。ある具体的な実施形態によれば、刺激因子は、二次共刺激シグナルを伝達することも可能である。
【０５６７】
刺激剤の量及び刺激剤と免疫細胞との比率を決定する方法は、充分に当業者の能力の範囲内であり、したがって、本明細書では特定しない。
【０５６８】
刺激剤は、抗原依存性又は非依存性（すなわち、ポリクローナル）の方法で免疫細胞を活性化し得る。
【０５６９】
ある具体的な実施形態によれば、刺激剤は、抗原非特異的刺激因子を含む。
【０５７０】
非特異的刺激因子は当業者に公知である。よって、非限定的な例として、免疫細胞がＴ細胞を含む場合、抗原非特異的刺激因子は、Ｔ細胞表面構造に結合して、Ｔ細胞のポリクローナル刺激を誘導可能な薬剤であり得、非限定的な例として、抗ＣＤ２８抗体などの共刺激タンパク質と組み合わせた抗ＣＤ３抗体などが挙げられる。他の非限定的な例としては、抗ＣＤ２、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ１３４、ノッチリガンド（例えばＤｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  １／４（ＤＬＬ１／４）やＪａｇｇｅｄｌ／２）が挙げられ、これらは単独で又は抗ＣＤ３と様々に組み合わせられる。Ｔ細胞のポリクローナル刺激を誘発し得る他の薬剤には、マイトジェン、ＰＨＡ、ＰＭＡ−イオノマイシン、ＣＥＢ、及びＣｙｔｏＳｔｉｍ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）が含まれるが、これらに限定されない。ある具体的な実施形態によれば、抗原非特異的刺激因子は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を含む。ある具体的な実施形態によれば、Ｔ細胞刺激因子は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社から入手したＣＤ３ＣＤ２８  ＭＡＣＳｉＢｅａｄｓなどの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８コーティングビーズを含む。
【０５７１】
ある具体的な実施形態によれば、刺激剤は、抗原特異的刺激因子を含む。
【０５７２】
抗原特異的Ｔ細胞刺激因子の非限定的な例としては、抗原負荷抗原提示細胞［ＡＰＣ、例えば、樹状細胞］及びペプチド負荷組換えＭＨＣが挙げられる。したがって、例えば、Ｔ細胞刺激因子は、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）が事前に負荷された、又は所望の抗原をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた樹状細胞であり得る。
【０５７３】
ある具体的な実施形態によれば、抗原はがん抗原である。
【０５７４】
本明細書で使用される場合、「がん抗原」という用語は、非がん性細胞と比較して、がん性細胞で過剰発現されるか又はがん細胞のみで発現される抗原を指す。がん抗原は、公知のがん抗原、又はがん細胞で発生する新しい特異的抗原（すなわち、新抗原）であり得る。
【０５７５】
公知のがん抗原の非限定的な例としては、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−ＡＳ、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−ＡＳ、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａｌｌ、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＢＡＧＥ−１、ＲＡＧＥ−１、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃｌ／ＣＴ７、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＮＹ−ＥＳ０−１、ＬＡＧＥ−１、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１、及びＸＡＧＥ、メラノサイト分化抗原、ｐ５３、ｒａｓ、ＣＥＡ、ＭＵＣＩ、ＰＭＳＡ、ＰＳＡ、チロシナーゼ、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＲＴ−Ｉ、ｇｐｌＯＯ、ｇｐ７５、αアクチニン−４、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ−８、βカテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ−ｌ、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａｌｌ、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡ０２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ−２及び３、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ−Ｋ−ｍｅｌ、ＮＡ−８８、ＳＰ１７、及びＴＲＰ２−Ｉｎｔ２（ＭＡＲＴ−Ｉ）、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バール・ウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐｌＳＯｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈｌ、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、α−フェトプロテイン、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３（ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、Ｃ０−０２９、ＦＧＦ−５、０２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼１７０Ｋ、ＮＹＣＯ−Ｉ、ＲＣＡＳＩ、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、チロシナーゼ関連タンパク質、ＴＲＰ−１、又はＴＲＰ−２が挙げられる。
【０５７６】
発現され得る他の腫瘍抗原は当技術分野で周知である（例えば、ＷＯ００／２０５８１；Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（２０００）  Ｅｄｓ  Ｓｔｅｒｎ，  Ｂｅｖｅｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｏｌｌ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅを参照）。これらの腫瘍抗原の配列は、公開データベースから容易に入手できるが、ＷＯ１９９２／０２０３５６（Ａ１）、ＷＯ１９９４／００５３０４（Ａ１）、ＷＯ１９９４／０２３０３１（Ａ１）、ＷＯ１９９５／０２０９７４（Ａ１）、ＷＯ１９９５／０２３８７４（Ａ１）、及びＷＯ１９９６／０２６２１４（Ａ１）にも記載されている。
【０５７７】
代替的に又は追加的に、腫瘍抗原は、例えば生検によって、対象から得られたがん細胞を使用して同定されてもよい。
【０５７８】
したがって、ある具体的な実施形態によれば、刺激剤はがん細胞を含む。
【０５７９】
ある具体的な実施形態によれば、活性化は抗がん剤の存在下で行われる。
【０５８０】
ある具体的な実施形態によれば、免疫細胞は活性化後に精製される。
【０５８１】
したがって、本発明はまた、本発明の方法によって取得可能な単離された免疫細胞も意図している。
【０５８２】
ある具体的な実施形態によれば、本発明によって使用及び／又は得られる免疫細胞は、任意の段階で、新たに単離され、将来使用ための長期間（例えば、数ヶ月、数年）、例えば液体窒素温度で、凍結保存（すなわち、凍結）されて保存され得、細胞株であり得る。
【０５８３】
凍結保存の方法は、当業者に公知であり、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２００７０５４１６０号及びＷＯ２００１０３９５９４号並びに米国特許出願第ＵＳ２０１２０１４９１０８に開示されている。
【０５８４】
ある具体的な実施形態によれば、本発明によって得られた細胞は、細胞バンク又は保管庫若しくは貯蔵施設に貯蔵されていてもよい。
【０５８５】
結果として、本教示はさらに、本発明の単離免疫細胞の使用及び方法を、免疫細胞を活性化することから恩恵を受け得る疾患（例えば、過剰増殖性疾患や免疫抑制と感染症に関連する病気）に対する養子免疫細胞療法の供給源として使用することを提案するが、これらに限定されない。
【０５８６】
したがって、ある具体的な実施形態によれば、本発明の方法は、活性化に続いて、必要とする対象に免疫細胞を養子移入することを含む。
【０５８７】
ある具体的な実施形態によれば、本発明の方法によって得られる、養子細胞療法で使用するための免疫細胞が提供される。
【０５８８】
本発明のある具体的な実施形態に従って使用される細胞は、自家又は非自家であり得、それらは同系又は非同系であり得、対象に対して同種又は異種であり得、ここで、それぞれの選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【０５８９】
本教示はまた、免疫細胞の活性化から恩恵を受け得る疾患を処置する方法において、本発明の組成物（例えば、融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド若しくは核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞）を使用することを意図している。
【０５９０】
よって、本発明の別の態様によれば、処置を必要とする対象に、本明細書に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、及び／又は４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド若しくは核酸構築物、又はそれをコードする宿主細胞を投与することを含む、免疫細胞の活性化から恩恵を受け得る疾患を処置するための方法が提供される。
【０５９１】
本発明の別の態様によれば、免疫細胞の活性化から恩恵を受け得る疾患の処置に使用するための、本明細書に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、及び／又は４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド若しくは核酸構築物、又はそれをコードする宿主細胞が提供される。
【０５９２】
ある具体的な実施形態によれば、処置すること又は処置は、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞を用いて行われる。
【０５９３】
ある具体的な実施形態によれば、処置すること又は処置は、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞を用いて行われる。
【０５９４】
ある具体的な実施形態によれば、処置すること又は処置は、４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞を用いて行われる。
【０５９５】
ある具体的な実施形態によれば、処置すること又は処置は、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞、及び４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞を用いて行われる。
【０５９６】
本明細書において「処置する（treating）」又は「処置（treatment）」という用語は、病状（疾患、障害又は医学的状態）の発症を阻害、予防又は停止し、且つ／又は病状又は病状の兆候を減退、寛解、又は後戻りさせることを意味する。当業者は、種々の方法及びアッセイを使用して病状の発現を評価することができ、同様に、種々の方法及びアッセイを使用して、病状の減退、寛解又は後戻りを評価しうることを理解するであろう。
【０５９７】
本明細書において「対象」という用語は、哺乳動物、例えば、任意の年齢及び任意の性別のヒトを含む。ある具体的な実施形態によれば、「対象」という用語は、病状（疾患、障害又は医学的状態）に罹患している対象をいう。ある具体的な実施形態によれば、この用語は、病状を発症するおそれのある個体（individuals）を包含する。
【０５９８】
ある具体的な実施形態によれば、対象は、CD47を発現している細胞に関連する疾患に罹患している。
【０５９９】
ある具体的な実施形態によれば、対象の罹患細胞はCD47を発現する。
【０６００】
本明細書において「免疫細胞の活性化から恩恵を受け得る疾患」とのフレーズは、対象の免疫応答活性が、少なくとも疾患の症状を改善する又は症状の発症を遅延させるのには十分であり得るが、何らかの理由で、その際の対象の免疫応答の活性が最適には及ばない疾患をいう。
【０６０１】
免疫細胞の活性化から恩恵を受け得る疾患の非限定的な例には、過剰増殖性疾患、免疫抑制に関連する疾患、薬物療法（例えば、ｍＴＯＲ阻害剤、カルシニューリン阻害剤、ステロイド）によって引き起こされる免疫抑制、及び感染症が含まれる。
【０６０２】
ある具体的な実施形態によれば、前記疾患は、過剰増殖性疾患を含む。
【０６０３】
ある具体的な実施形態によれば、前記過剰増殖性疾患は、硬化症、線維症、特発性肺線維症、乾癬、全身性硬化症／強皮症、原発性胆汁性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、肝線維症、放射線誘発性肺線維症の予防、骨髄線維症、又は後腹膜線維症を含む。
【０６０４】
別のある具体的な実施形態によれば、前記過剰増殖性疾患はがんを含む。
【０６０５】
よって、本発明の別の態様によれば、本明細書に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド及び／又は４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含む、がんを処置する方法が提供される。
【０６０６】
本明細書で使用される場合、がんという用語は、悪性がん及び前悪性がんの両方を包含する。
【０６０７】
前がん性又は良性の形態のがんに関して、任意で前悪性のがんの悪性形態への進行を停止させるために、前記組成物及び方法を適用してもよい。
【０６０８】
本発明のいくつかの実施形態の方法によって処置することができるがんは、任意の固形又は非固形のがん及び／又はがん転移であり得る。
【０６０９】
ある具体的な実施形態によれば、前記がんは悪性がんを含む。
【０６１０】
がんの例には、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。かかるがんのより具体的な例には：扁平上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺扁平上皮がんを含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん（消化器がんを含む）、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞がん（ヘパトーマ）、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん又は腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝がん、様々な種類の頭頸部がん、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；バーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ）リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ｄｉｆｆｕｓｅｄ  ｌａｒｇｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＤＬＢＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；中等度濾胞性ＮＨＬ；中等度びまん性ＮＨＬ；高度免疫芽球性ＮＨＬ；高度リンパ芽球性ＮＨＬ；高度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤性ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）；  Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病（ＣＭＬ）；及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、並びに母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、及びＭｅｉｇｓ症候群が含まれる。好ましくは、前記がんは、乳がん、結腸直腸がん、直腸がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、軟部肉腫、カポジ肉腫、カルチノイドがん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、中皮腫、及び多発性骨髄腫からなる群より選択される。本発明の処置に適したがん性状態には、転移性がんが含まれる。
【０６１１】
ある具体的な実施形態によれば、前記がんは前悪性がんを含む。
【０６１２】
前悪性がん（又は前がん）は充分に特徴付けられており、当技術分野で公知である（例えば、Ｂｅｒｍａｎ  ＪＪ．  ａｎｄ  Ｈｅｎｓｏｎ  ＤＥ．，  ２００３．  Ｃｌａｓｓｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｅｃａｎｃｅｒｓ：  ａ  ｍｅｔａｄａｔａ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  ＢＭＣ  Ｍｅｄ  Ｉｎｆｏｒｍ  Ｄｅｃｉｓ  Ｍａｋ．  ３：８を参照）。本発明の方法による処置に適した前悪性がんのクラスには、後天性の小さな又は顕微鏡的な前悪性がん、核異型を伴う後天性の大きな病変、がんに進行する遺伝性過形成症候群で発生する前駆病変、及び後天性びまん性過形成及びびまん性化生が含まれる。小さな又は顕微鏡的な前悪性がんの例には、ＨＧＳＩＬ（子宮頸部の高度扁平上皮内病変）、ＡＩＮ（肛門上皮内新生物）、声帯の異形成、（結腸の）異常な陰窩、ＰＩＮ（前立腺上皮内新生物）が含まれる。核異型を伴う後天性の大きな病変の例には、尿細管腺腫、ＡＩＬＤ（異常蛋白血症を伴う血管免疫芽球性リンパ節症）、非定型髄膜腫、胃ポリープ、大局面型類乾癬、骨髄異形成、乳頭状移行上皮内がん、過剰な芽球を伴う難治性貧血、及びシュナイダー乳頭腫が含まれる。がんに進行する遺伝性過形成症候群で発生する前駆病変の例には、非定型ほくろ症候群、Ｃ細胞腺腫症、及びＭＥＡが含まれる。後天性びまん性過形成及びびまん性化生の例には、ＡＩＤＳ、非定型リンパ過形成、骨パジェット病、移植後リンパ増殖性疾患、及び潰瘍性大腸炎が含まれる。
【０６１３】
ある具体的な実施形態によれば、前記がんは、白血病、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、ｐｒｅ−Ｂ急性リンパ芽球性白血病（ｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬ）、平滑筋肉腫、卵巣がん、乳がん、結腸がん、膀胱がん、膠芽腫、肝細胞がん、前立腺がん、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、黒色腫、頭頸部がん、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、膵臓管腺がん、又は脳腫瘍である。
【０６１４】
いくつかの実施形態によれば、前記がんは、急性骨髄性白血病、膀胱がん、乳がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、上皮性卵巣がん、上皮性腫瘍、卵管がん、濾胞性リンパ腫、多形性膠芽腫、肝細胞がん、頭頸部がん、白血病、リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、前立腺がん、又は腎細胞がんである。
【０６１５】
ある具体的な実施形態によれば、前記がんはリンパ腫、白血病及び癌腫からなる群より選択される。
【０６１６】
ある具体的な実施形態によれば、前記がんはリンパ腫、白血病、大腸がん、膵臓がん、卵巣がん、肺がん及び扁平上皮がんからなる群より選択される。
【０６１７】
ある具体的な実施形態によれば、前記がんは大腸がんである。
【０６１８】
ある具体的な実施形態によれば、前記がんは卵巣がんである。
【０６１９】
ある具体的な実施形態によれば、前記がんは肺がんである。
【０６２０】
ある具体的な実施形態によれば、前記がんは頭部がんである。
【０６２１】
ある具体的な実施形態によれば、前記がんは白血病である。
【０６２２】
ある具体的な実施形態によれば、前記白血病は、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球血症性白血病（leukocythemic leukemia）、好塩基球性白血病、芽球性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胚性細胞性白血病、好酸球性白血病、（）ｒｏｓｓ’白血病、有毛細胞白血病、血芽球性白血病（hemoblastic Leukemia）、血球芽細胞性白血病（hemocyteblastic leukemia）、組織球性白血病、幹細胞白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ性（リンパ行性）白血病、リンパ性白血病、リンパ肉腫細胞白血病、マスト細胞白血病、巨核球性白血病、微小骨髄芽球性白血病（micromyeloblastic leukemia）、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄性顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ型白血病、形質細胞白血病（plasma cell leukemia）、形質細胞性白血病（plasmacytic leukemia）、前骨髄球性白血病、ーＲｉｅｄｅｒ細胞白血病、シリング型白血病、幹細胞白血病、亜白血性白血病、及び未分化細胞白血病からなる群より選択される。
【０６２３】
ある具体的な実施形態によれば、前記白血病は、前骨髄性白血病、急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血病である。
【０６２４】
ある具体的な実施形態によれば、前記がんはリンパ腫である。
【０６２５】
ある具体的な実施形態によれば、前記リンパ腫はＢ細胞リンパ腫である。
【０６２６】
ある具体的な実施形態によれば、前記リンパ腫はＴ細胞リンパ腫である
【０６２７】
別のある具体的な実施形態によれば、前記リンパ腫はホジキンリンパ腫である。
【０６２８】
ある具体的な実施形態によれば、前記リンパ腫は非ホジキンリンパ腫である。
【０６２９】
ある具体的な実施形態によれば、前記非ホジキンリンパ腫は、アグレッシブＮＨＬ、形質転換ＮＨＬ、低悪性度（インドレント）ＮＨＬ、再発性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、低悪性度ＮＨＬ、濾胞性リンパ腫、大細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、ＮＫ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性リンパ腫、及び菌状息肉腫／セザリー症候群を含む皮膚Ｔ細胞がんからなる群より選択される。
【０６３０】
ある具体的な実施形態によれば、前記がんは、多発性骨髄腫である。
【０６３１】
少なくともいくつかの実施形態によれば、前記多発性骨髄腫は：κ型の軽鎖及び／又はλ型の軽鎖を産生する多発性骨髄腫がん；原発性形質細胞白血病（ＰＣＬ）などのアグレッシブ多発性骨髄腫；ＭＧＵＳ（意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症）、多発性骨髄腫に進行する可能性があるワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ、リンパ形質細胞性リンパ腫としても知られる）などの良性形質細胞障害；くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、インドレント多発性骨髄腫、多発性骨髄腫に進行する可能性のある前悪性の多発性骨髄腫；原発性アミロイドーシスからなる群より選択される。
【０６３２】
ある具体的な実施形態によれば、前記がんは、腫瘍微小環境に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を有する腫瘍、及び／又は腫瘍微小環境にＣＤ４７が比較的高発現している腫瘍の存在によって定義される。
【０６３３】
ある具体的な実施形態によれば、前記がんの細胞は、ＣＤ４７を発現する。
【０６３４】
ある具体的な実施形態によれば、前記疾患は、免疫抑制に関連する疾患、又は薬物療法（ｍＴＯＲ阻害剤、カルシニューリン阻害剤、ステロイドなど）によって引き起こされる又は免疫抑制を含む。
【０６３５】
本発明のある具体的な実施形態によれば、前記疾患には、ＨＩＶ、はしか、インフルエンザ、ＬＣＣＭ、ＲＳＶ、ヒトライノウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶ、及びパルボウイルスが含まれる。
【０６３６】
ある具体的な実施形態によれば、前記疾患は感染を含む。
【０６３７】
本明細書で使用される場合、「感染」又は「感染症」という用語は、病原体によって誘発される疾患を指す。病原体の具体例には、ウイルス性病原体、細菌性病原体、例えば、細胞内マイコバクテリア病原体（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなど）、細胞内細菌性病原体（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなど）、又は細胞内原生動物病原体（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａなど）などが含まれる。
【０６３８】
本発明の教示に従って処置可能な感染症を引き起こすウイルス性病原体の具体的な種類には、レトロウイルス、サーコウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、イリドウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、ピコルナウイルス、カリシウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アレナウイルス、及びフィロウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【０６３９】
本発明の教示に従って処置され得るウイルス感染の具体的な例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に誘発される後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、インフルエンザ、ライノウイルス感染症、ウイルス性髄膜炎、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）感染症、Ａ型、Ｂ型又はＣ型肝炎ウイルス感染症、はしか、パピローマウイルス感染／疣贅、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染、単純ヘルペスウイルス感染症、黄熱病、エボラウイルス感染症、狂犬病などが含まれるが、これらに限定されない。
【０６４０】
ある具体的な実施形態によれば、本明細書に開示される組成物（例えば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含むポリペプチド、４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド又は核酸構築物、及び／又はそれを発現する宿主細胞）を、当技術分野で周知の鎮痛薬、化学療法剤、放射線療法剤、細胞毒性療法（コンディショニング）、ホルモン療法、抗体、及び他の処置レジメン（例えば、外科手術）を含むがこれらに限定されない他の確立された又は実験的な処置レジメンと組み合わせて対象に投与して、免疫細胞の活性化から恩恵を受け得る疾患（例えば、がん）を処置することができる。
【０６４１】
ある具体的な実施形態によれば、本明細書に開示される組成物（例えば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含むポリペプチド、４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド又は核酸構築物、及び／又はそれを発現する宿主細胞）を、骨髄細胞、造血幹細胞、ＰＢＭＣ、臍帯血幹細胞、及び／又は人工多能性幹細胞の移植などが挙げられるがこれに限定されない養子細胞移植と組み合わせて対象に投与することができる。
【０６４２】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の組成物と組み合わせて投与される治療剤は、抗がん剤を含む。
【０６４３】
よって、本発明の別の態様によれば、抗がん剤と、本明細書に開示されるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド及び／若しくは４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞と、を必要とする対象に投与することを含む、がんを処置する方法が提供される。
【０６４４】
本発明のある具体的な実施形態で使用することができる抗がん剤には、以下の抗がん剤が含まれるが、これらに限定されない：アシビシン（Ａｃｉｖｉｃｉｎ）；アクラルビシン（Ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）；アコダゾール塩酸塩（Ａｃｏｄａｚｏｌｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；アクロニン（Ａｃｒｏｎｉｎｅ）；アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）；アドゼレシン（Ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）；アルデスロイキン（Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）；アルトレタミン（Ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）；アムボマイシン（Ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）；アメタントロン酢酸塩（Ａｍｅｔａｎｔｒｏｎｅ  Ａｃｅｔａｔｅ）；アミノグルテチミド（Ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）；アムサクリン（Ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；アナストロゾール（Ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）；アントラマイシン（Ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）；アスパラギナーゼ（Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）；アスペルリン（Ａｓｐｅｒｌｉｎ）；アザシチジン（Ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）；アゼテパ（Ａｚｅｔｅｐａ）；アゾトマイシン（Ａｚｏｔｏｍｙｃｉｎ）；バチマスタット（Ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）；ベンゾデパ（Ｂｅｎｚｏｄｅｐａ）；ビカルタミド（Ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）；ビサントレン塩酸塩（Ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ビスナフィドジメシル酸塩（Ｂｉｓｎａｆｉｄｅ  Ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ）；ビゼレシン（Ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）；ブレオマイシン硫酸塩（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ）；ブレキナルナトリウム塩（Ｂｒｅｑｕｉｎａｒ  Ｓｏｄｉｕｍ）；ブロピリミン（Ｂｒｏｐｉｒｉｍｉｎｅ）；ブサルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）；カクチノマイシン（Ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）；カルステロン（Ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）；カラセミド（Ｃａｒａｃｅｍｉｄｅ）；カルベチマー（Ｃａｒｂｅｔｉｍｅｒ）；カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）；カルムスチン（Ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）；カルビシン塩酸塩（Ｃａｒｕｂｉｃｉｎ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；カルゼレシン（Ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）；セデフィンゴル（Ｃｅｄｅｆｉｎｇｏｌ）；クロラムブシル（Ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）；シロレマイシン（Ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）；シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）；クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）；クリスナトールメシル酸塩（Ｃｒｉｓｎａｔｏｌ  Ｍｅｓｙｌａｔｅ）；シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）；シタラビン（Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）；ダカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）；ダクチノマイシン（Ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）；ダウノルビシン塩酸塩（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；デシタビン（Ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；デキソルマプラチン（Ｄｅｘｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；デザグアニン（Ｄｅｚａｇｕａｎｉｎｅ）；デザグアニンメシル酸塩（Ｄｅｚａｇｕａｎｉｎｅ  Ｍｅｓｙｌａｔｅ）；ジアジクオン（Ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）；ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）；ドキソルビシン塩酸塩（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ドロロキシフェン（Ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）；ドロロキシフェンクエン酸��（Ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ  Ｃｉｔｒａｔｅ）；ドロモスタノロンプロピオン酸塩（Ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ  Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）；ズアゾマイシン（Ｄｕａｚｏｍｙｃｉｎ）；エダトレキセート（Ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）；エフロニチン塩酸塩（Ｅｆｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；エラサミトルチン（Ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）；エンロプラチン（Ｅｎｌｏｐｌａｔｉｎ）；エンプロメート（Ｅｎｐｒｏｍａｔｅ）；エピプロピジン（Ｅｐｉｐｒｏｐｉｄｉｎｅ）；エピルビシン塩酸塩（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；エルブロゾール（Ｅｒｂｕｌｏｚｏｌｅ）；エソルビシン塩酸塩（Ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；エストラムスチン（Ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）；エストラムスチンリン酸ナトリウム（Ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｓｏｄｉｕｍ）；エタニダゾール（Ｅｔａｎｉｄａｚｏｌｅ）；エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）；エトポシドリン酸塩（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；エトプリン（Ｅｔｏｐｒｉｎｅ）；ファドロゾール塩酸塩（Ｆａｄｒｏｚｏｌｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ファザラビン（Ｆａｚａｒａｂｉｎｅ）；フェンレチニド（Ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ）；フロクスウリジン（Ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；フルダラビンリン酸塩（Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；フルオロウラシル（Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）；フルロシタビン（Ｆｌｕｒｏｃｉｔａｂｉｎｅ）；フォスキドン（Ｆｏｓｑｕｉｄｏｎｅ）；フォストリエシンナトリウム塩（Ｆｏｓｔｒｉｅｃｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ）；ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）；ゲムシタビン塩酸塩（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）；イダルビシン塩酸塩（Ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；イホスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；イルモフォシン（Ｉｌｍｏｆｏｓｉｎｅ）；インターフェロンα−２ａ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｌｆａ−２ａ）；インターフェロンα−２ｂ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｌｆａ−２ｂ）；インターフェロンα−ｎ１（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｌｆａ−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｌｆａ−ｎ３）；インターフェロンβ−Ｉａ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｂｅｔａ−Ｉａ）；インターフェロンγ−Ｉｂ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｇａｍｍａ−Ｉｂ）；イプロプラチン（Ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎ）；イリノテカン塩酸塩（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ランレオチド酢酸塩（Ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ  Ａｃｅｔａｔｅ）；レトロゾール（Ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）；ロイプロリド酢酸塩（Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ  Ａｃｅｔａｔｅ）；リアロゾール塩酸塩（Ｌｉａｒｏｚｏｌｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ロメトレキソールナトリウム塩（Ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ  Ｓｏｄｉｕｍ）；ロムスチン（Ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）；ロソキサントロン塩酸塩（Ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；マソプロコル（Ｍａｓｏｐｒｏｃｏｌ）；メイタンシン（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）；メクロレタミン塩酸塩（Ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；メゲストロール酢酸塩（Ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ  Ａｃｅｔａｔｅ）；メレンゲストロール酢酸塩（Ｍｅｌｅｎｇｅｓｔｒｏｌ  Ａｃｅｔａｔｅ）；メルファラン（Ｍｅｌｐｈａｌａｎ）；メノガリル（Ｍｅｎｏｇａｒｉｌ）；メルカプトプリン（Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）；メトトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）；メトトレキセートナトリウム塩（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  Ｓｏｄｉｕｍ）；メトプリン（Ｍｅｔｏｐｒｉｎｅ）；メツレデパ（Ｍｅｔｕｒｅｄｅｐａ）；ミチンドミド（Ｍｉｔｉｎｄｏｍｉｄｅ）；ミトカルシン（Ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎ）；ミトクロミン（Ｍｉｔｏｃｒｏｍｉｎ）；ミトギリン（Ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）；ミトマルシン（Ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）；ミトマイシン（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）；ミトスペル（Ｍｉｔｏｓｐｅｒ）；ミトタン（Ｍｉｔｏｔａｎｅ）；ミトキサントロン塩酸塩（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；マイコフェノール酸（Ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ）；ノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）；ノガラマイシン（Ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）；オルマプラチン（Ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；オキシスラン（Ｏｘｉｓｕｒａｎ）；パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）；ペグアスパラガーゼ（Ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ）；ペリオマイシン（Ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ）；ペンタムスチン（Ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ）；ペプロマイシン硫酸塩（Ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ）；ペルホスファミド（Ｐｅｒｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；ピポブロマン（Ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ピポスルファン（Ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ）；ピロキサントロン塩酸塩（Ｐｉｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；プリカマイシン（Ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）；プロメスタン（Ｐｌｏｍｅｓｔａｎｅ）；ポリフィマーナトリウム塩（Ｐｏｒｆｉｍｅｒ  Ｓｏｄｉｕｍ）；ポルフィロマイシン（Ｐｏｒｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）；プレドニムスチン（Ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）；プロカルバジン塩酸塩（Ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）；ピューロマイシン塩酸塩（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ピラゾフリン（Ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）；リボプリン（Ｒｉｂｏｐｒｉｎｅ）；ログレチミド（Ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ）；サフィンゴール（Ｓａｆｉｎｇｏｌ）；サフィンゴール塩酸塩（Ｓａｆｉｎｇｏｌ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；セムスチン（Ｓｅｍｕｓｔｉｎｅ）；シムトラゼン（Ｓｉｍｔｒａｚｅｎｅ）；スパルフォセートナトリウム塩（Ｓｐａｒｆｏｓａｔｅ  Ｓｏｄｉｕｍ）；スパルソマイシン（Ｓｐａｒｓｏｍｙｃｉｎ）；スピロゲルマニウム塩酸塩（Ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；スピロムスチン（Ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）；スピロプラチン（Ｓｐｉｒｏｐｌａｔｉｎ）；ストレプトニグリン（Ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）；ストレプトゾシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）；スロフェヌル（Ｓｕｌｏｆｅｎｕｒ）；タリソマイシン（Ｔａｌｉｓｏｍｙｃｉｎ）；タキソール（Ｔａｘｏｌ）；テコガランナトリウム塩（Ｔｅｃｏ��ａｌａｎ  Ｓｏｄｉｕｍ）；テガフール（Ｔｅｇａｆｕｒ）；テロキサントロン塩酸塩（Ｔｅｌｏｘａｎｔｒｏｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；テモポルフィン（Ｔｅｍｏｐｏｒｆｉｎ）；テニポシド（Ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）；テロキシロン（Ｔｅｒｏｘｉｒｏｎｅ）；テストラクトン（Ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）；チアミプリン（Ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）；チオグアニン（Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）；チオテパ（Ｔｈｉｏｔｅｐａ）；チアゾフリン（Ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）；チラパザミン（Ｔｉｒａｐａｚａｍｉｎｅ）；トポテカン塩酸塩（Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；トレミフェンクエン酸塩（Ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ  Ｃｉｔｒａｔｅ）；トレストロン酢酸塩（Ｔｒｅｓｔｏｌｏｎｅ  Ａｃｅｔａｔｅ）；トリシリビンリン酸塩（Ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；トリメトレキセート（Ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）；トリメトレキセートグルクロン酸塩（Ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ  Ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）；トリプトレリン（Ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）；ツブロゾール塩酸塩（Ｔｕｂｕｌｏｚｏｌｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ウラシルマスタード（Ｕｒａｃｉｌ  Ｍｕｓｔａｒｄ）；ウレデパ（Ｕｒｅｄｅｐａ）；バプレオチド（Ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅ）；ベルテポルフィン（Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）；ビンブラスチン硫酸塩（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ）；ビンクリスチン硫酸塩（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ）；ビンデシン（Ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）；ビンデシン硫酸塩（Ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ）；ビネピジン硫酸塩（Ｖｉｎｅｐｉｄｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ）；ビングリシネート硫酸塩（Ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ）；ビンロイロシン硫酸塩（Ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ）；ビノレルビン酒石酸塩（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ  Ｔａｒｔｒａｔｅ）；ビンロシジン硫酸塩（Ｖｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ）；ビンゾリジン硫酸塩（Ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ）；ボロゾール（Ｖｏｒｏｚｏｌｅ）；ゼニプラチン（Ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ）；ジノスタチン（Ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）；ゾルビシン塩酸塩（Ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）。追加の抗新生物薬には、Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎの“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
ｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ“，  Ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９０，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｉｎｃ．（Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）の第５２章「Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ」（Ｐａｕｌ  Ｃａｌａｂｒｅｓｉ  ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ  Ａ．  Ｃｈａｂｎｅｒ）及びその序文（１２０２−１２６３）に開示されるものが含まれる。
【０６４５】
ある具体的な実施形態によれば、前記抗がん剤は、抗体を含む。
【０６４６】
ある具体的な実施形態によれば、前記抗体は、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、イブリツモマブ（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ビバツズマブメルタンシン（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブブロンツベトマブ（Ｂｌｏｎｔｕｖｅｔｍａｂ）、ブレンツキシマブベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、シクスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、ベズロトクスマブ（Ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ）、セルトリズマブペゴル（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）、シタツズマブボガトックス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ  ｂｏｇａｔｏｘ）、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、ジヌツキシマブ（Ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エルツマクソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ジレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、及びイピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）からなる群より選択される。
【０６４７】
ある具体的な実施形態によれば、抗体は、リツキシマブ及びセツキシマブからなる群より選択される。
【０６４８】
ある具体的な実施形態によれば、前記治療剤又は前記抗がん剤は、免疫調節薬（ＩＭｉＤ；例えば、サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミド）を含む。
【０６４９】
ある具体的な実施形態によれば、ＩＭｉＤは、サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミドからなる群より選択される。
【０６５０】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の組成物と組み合わせて投与される治療剤は、抗感染剤（例えば、抗生物質及び抗ウイルス剤）を含む。
【０６５１】
ある具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の組成物と組み合わせて投与される治療剤は、免疫抑制剤（例えば、ＧＣＳＦ及び他の骨髄刺激剤、ステロイド）を含む。
【０６５２】
ある具体的な実施形態によれば、併用療法には相加効果がある。
【０６５３】
ある具体的な実施形態によれば、併用療法には相乗効果がある。
【０６５４】
本発明の別の態様によれば、免疫細胞の活性化から恩恵を受け得る疾患を処置するための治療剤と、本明細書に開示されるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド及び／若しくは４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞と、を包装する包装材料を含む製品が提供される。ある具体的な実施形態によれば、前記製品は、免疫細胞の活性化から恩恵を受け得る疾患の処置のために特定される。
【０６５５】
ある具体的な実施形態によれば、前記疾患を処置するための治療剤と、本明細書に開示されるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド及び／若しくは４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞と、は別々の容器に包装される。
【０６５６】
ある具体的な実施形態によれば、前記疾患を処置するための治療剤、並びに本明細書に開示されるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド及び／若しくは４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞は、合剤として包装される。
【０６５７】
ある具体的な実施形態によれば、前記製品は、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞を含む。
【０６５８】
ある具体的な実施形態によれば、前記製品は、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞を含む。
【０６５９】
ある具体的な実施形態によれば、前記製品は、４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞を含む。
【０６６０】
ある具体的な実施形態によれば、前記製品は、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞、及び４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞を含む。
【０６６１】
よって、本発明の別の態様によれば、本明細書に開示されるＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞と、本明細書に開示される４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞と、を包装する包装材料を含む製品が提供される。
【０６６２】
ある具体的な実施形態によれば、本明細書に開示されるＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞；及び本明細書に開示される４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞は、別々の容器に包装される。
【０６６３】
ある具体的な実施形態によれば、本明細書に開示されるＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞；及び本明細書に開示される４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、又はそれを発現する宿主細胞は、合剤として包装される。
【０６６４】
ある具体的な実施形態によれば、前記ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド及び／又は前記４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドは、異種の治療部分（heterologous therapeutic moiety）に付着しているか、又は異種の治療部分を含む。前記治療部分（therapeutic moiety）は、小分子化学化合物及びポリペプチドなどの任意の分子であり得る。
【０６６５】
本発明のある具体的な実施形態で使用され得る治療部分の非限定的な例には、細胞毒性部分、毒性部分、サイトカイン部分、免疫調節部分、ポリペプチド、抗体、薬物、化学物質、及び／又は放射性同位体が含まれる。
【０６６６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記治療部分は、本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、前記治療部分をコードする核酸配列と翻訳的に融合すること（translationally fusing）によって結合される。
【０６６７】
追加的又は代替的に、前記治療部分は、当業者に公知の任意の結合方法を使用して、本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドに化学的に結合（カップリング）され得る。例えば、ペプチドは、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナートとも称される）（ＳＤＰＤ）（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｐ−３４１５；例えば、Ｃｕｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９８５，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１２：  ２０７−２２４を参照）、グルタルアルデヒド結合手順（例えば、Ｇ．Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  １９９６，  “Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ，  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏを参照）、又はカルボジイミド結合手順［例えば、Ｊ．  Ｍａｒｃｈ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎ’ｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｐｐ．  ３４９−５０  ＆  ３７２−７４（３ｄ  ｅｄ．），  １９８５、Ｂ．  Ｎｅｉｓｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９７８，  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．，  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  １７：５２２、Ａ．  Ｈａｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９７８，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ４４７５、Ｅ．Ｐ．  Ｂｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８６，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ５０：２３９４及びＬ．Ｊ．  Ｍａｔｈｉａｓ  １９７９，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ５６１を参照］を使用して、目的の薬剤に結合させてもよい。
【０６６８】
治療部分は、例えば、ペプチド結合（機能部分がポリペプチドである場合）を介する、又はリンカーペプチド若しくは有機ポリマーなどの他の化学部分などの、介在するリンカー要素への共有結合を介するなど、直接的又は間接的な任意の適切な化学結合を使用するなどの、当技術分野で広く実施されている標準的な化学合成技術［例えば、ｈｙｐｅｒｔｅｘｔｔｒａｎｓｆｅｒｐｒｏｔｏｃｏｌ：／／ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ（ｄｏｔ）  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ｄｏｔ）  ｏｒｇ／ｐｏｒｔａｌ／Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を参照］を使用して本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドに付着させることができる。キメラペプチドは、ペプチドのカルボキシ（Ｃ）又はアミノ（Ｎ）末端における結合を介して、又は直鎖、分岐状、若しくは環状の側鎖、内部炭素若しくは窒素原子などの内部化学基への結合を介して、連結され得る。
【０６６９】
本明細書で使用される場合、本明細書で互換的に使用される「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、天然ペプチド（分解産物、合成的に合成されたペプチド、又は組換えペプチドのいずれか）及びペプチド模倣物（通常、合成的に合成されたペプチド）、並びに例えば、ペプチドを体内でより安定させる、又は細胞により浸透可能にする修飾（modifications）を有し得るペプチド類似体であるペプトイド及びセミペプトイドを包含する。かかる修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾、骨格修飾、及び残基修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣化合物を調製するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、本明細書に完全に記載されているかのように参照により援用される、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｃ．Ａ．  Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，  Ｆ．  Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に明記されている。この点に関するさらなる詳細は、以下に提供される。
【０６７０】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化アミド結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、スルフィニルメチレン結合（−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは、任意のアルキル（例えば、メチル）、アミン結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、スルフィド結合（−ＣＨ２−Ｓ−）、エチレン結合（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、フッ素化オレフィン二重結合（−ＣＦ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）であり、Ｒは「通常の」側鎖であって、炭素原子上に天然に存在する）によって置換され得る。
【０６７１】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿ったいずれの結合でも生じる場合があり、いくつかの（２〜３）結合で同時に生じる場合もある。
【０６７２】
天然芳香族アミノ酸であるトリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びフェニルアラニン（Ｐｈｅ）は、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、ナフチルアラニン、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）の環メチル化誘導体、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）又はＯ−メチル−チロシン（Ｔｙｒ）のハロゲン化誘導体などの非天然芳香族アミノ酸で置換され得る。
【０６７３】
本発明のいくつかの実施形態のペプチドはまた、１又は複数の修飾アミノ酸又は１又は複数の非アミノ酸モノマー（例えば、脂肪酸、複合炭水化物など）を含み得る。
【０６７４】
「アミノ酸（単数）」又は「アミノ酸（複数）」という用語は、２０の天然アミノ酸；インビボにおいてしばしば翻訳後修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン、及びホスホスレオニンなど）；並びに他の異常アミノ酸（例えば２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシン、及びオルニチンなどを含むがこれらに限定されない）が含まれるを含むと理解される。さらに、「アミノ酸」という用語は、Ｄ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の両方を含む。
【０６７５】
以下の表１及び表２は、本発明のいくつかの実施形態で使用され得る天然アミノ酸（表１）、及び非従来型又は修飾アミノ酸（例えば、合成アミノ酸、表２）を列挙している。
【０６７６】
【表１】
2021529547.tif 000002
【０６７７】
【表２−１】
2021529547.tif 000003
【０６７８】
【表２−２】
2021529547.tif 000004
【０６７９】
【表２−３】
2021529547.tif 000005
【０６８０】
【表２−４】
2021529547.tif 000006
【０６８１】
本発明のいくつかの実施形態のペプチドは、好ましくは直鎖状形態で利用されるが、環状化がペプチド特性を著しく妨害しない場合、ペプチドの環状形態も利用できることが理解されるであろう。
【０６８２】
本発明のペプチドは、ペプチドが可溶性形態であることを必要とする治療において好適に利用されるため、本発明のいくつかの実施形態のペプチドは、ヒドロキシル含有側鎖によりペプチド溶解度を増加可能なセリン及びスレオニンを含むがこれらに限定されない、１又は複数の非天然又は天然の極性アミノ酸を含むことが好ましい。
【０６８３】
本発明のペプチドのアミノ酸は、保存的又は非保存的に置換され得る。
【０６８４】
本明細書で使用される「保存的置換」という用語は、ペプチドの天然配列に存在するアミノ酸を、同様の立体特性を有する天然又は非天然アミノ又はペプチド模倣物で置換することを指す。置換される天然アミノ酸の側鎖が極性又は疎水性のいずれかである場合、保存的置換は、（置換されたアミノ酸の側鎖と同じ立体特性を有することに加えて）極性若しくは疎水性である、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、又はペプチド模倣部分で行う必要がある。
【０６８５】
天然アミノ酸は通常、その特性に従ってグループ化されるので、天然アミノ酸による保存的置換は、本発明によれば、立体的に類似した非荷電アミノ酸による荷電アミノ酸の置換も保存的置換と見なされるという事実を念頭に置きつつ、容易に決定することができる。
【０６８６】
非天然アミノ酸による保存的置換を生成するために、当技術分野で周知のアミノ酸類似体（合成アミノ酸）を使用することも可能である。天然アミノ酸のペプチド模倣物は、当業者に公知の文献に充分に文書化されている。
【０６８７】
保存的置換に影響を与える場合、置換アミノ酸は、元のアミノ酸と同じ又は類似の官能基を側鎖に持つ必要がある。
【０６８８】
機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントである可能性が高いかに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：  １３０６  １３１０にも記載されている。かかる保存的に改変されたバリアントは、多型バリアント、種間ホモログ、及び対立遺伝子に追加されるものであり、これらを除外するものではない。典型的な保存的置換には、以下が含まれるが、これらに限定されない：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。アミノ酸は、側鎖に関連する特性に基づいて置換することができる。例えば、セリン（Ｓ）やスレオニン（Ｔ）など、極性側鎖を有するアミノ酸は置換可能であり；アルギニン（Ｒ）やヒスチジン（Ｈ）など、側鎖の電荷に基づいてアミノ酸を置換可能であり；バリン（Ｖ）やロイシン（Ｌ）など、疎水性側鎖を持つアミノ酸は置換可能である。示されているように、変化は通常、タンパク質の折り畳み又は活性に有意な影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換などのマイナーな性質のものである。
【０６８９】
本明細書で使用される「非保存的置換」という句は、親配列に存在するアミノ酸を、異なる電気化学的及び／又は立体的特性を有する別の天然又は非天然アミノ酸で置換することを指す。したがって、置換アミノ酸の側鎖は、置換される天然アミノ酸の側鎖よりも著しく大きく（又は小さく）、かつ／又は置換されるアミノ酸とは著しく異なる電子特性を有する官能基を有していてもよい。このタイプの非保存的置換の例には、アラニンをフェニルアラニン又はシコヘキシルメチルグリシンに置換すること、グリシンをイソロイシンに置換すること、又はアスパラギン酸を−ＮＨ−ＣＨ［（−ＣＨ２）５−ＣＯＯＨ］−ＣＯ−に置換することを含む。本発明の範囲に含まれるこれらの非保存的置換は、依然として抗菌特性を有するペプチドを構成するものである。
【０６９０】
本発明のペプチドのＮ末端及びＣ末端は、官能基によって保護され得る。適切な官能基は、その教示が参照により本明細書に援用されるＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，  “Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ“，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ５  ａｎｄ  ７，  １９９１に記載されている。好ましい保護基は、例えば、化合物の親水性を低下させ、親油性を増加させることによって、保護基に付着した化合物の細胞への輸送を促進するものである。
【０６９１】
ある具体的な実施形態によれば、１又は複数のアミノ酸は、例えば、官能基の付加によって修飾され得る（概念的には「化学的に修飾された」と見なされる）。例えば、天然配列に現れる側鎖アミノ酸残基が所望により修飾され得、あるいは以下に記載されるように、タンパク質の他の部分が、側鎖アミノ酸残基に加えて、又は、側鎖アミノ酸残基の代わりに、所望により修飾され得る。かかる修飾は所望により、化学合成プロセスの後に、例えば化学的に修飾されたアミノ酸を加えることによって、分子の合成中に実施することができる。ただし、アミノ酸が分子内にすでに存在する場合の化学修飾（「ｉｎ  ｓｉｔｕ」修飾）も可能である。ペプチド又はタンパク質への修飾は、例えば、遺伝子合成によって、（例えば、ＰＣＲに基づく）部位特異的突然変異誘発若しくは（例えば、ＥＭＳによる）ランダム突然変異誘発によって、エキソヌクレアーゼデリーションによって、化学修飾によって、又は異種ドメイン若しくは結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の融合によって、導入することができる。
【０６９２】
本明細書で使用される場合、「化学修飾」という用語は、ペプチドに言及する場合、そのアミノ酸残基の少なくとも１つが、プロセシング若しくは他の翻訳後修飾などの自然のプロセスによって、又は当技術分野で周知の化学修飾手法によって修飾されているペプチドを指す。修飾の非限定的な例示的タイプには、カルボキシメチル化；アセチル化；アシル化；リン酸化；グリコシル化；アミド化；ＡＤＰ−リボシル化；脂肪アシル化；ファルネシル基、イソファルネシル基、炭水化物基、脂肪酸基、及び結合のためのリンカーの添加；官能基付与（functionalization）；ＧＰＩアンカー形成；脂質又は脂質誘導体の共有結合；メチル化；ミリストイル化；ペグ化（pegylation）；プレニル化；リン酸化；ユビキチン化；並びに同様のプロセス及び公知の保護基／ブロッキング基が含まれる。所望により、エーテル結合を使用して、セリン又はスレオニンのヒドロキシルを糖のヒドロキシルに結合してもよい。所望により、アミド結合を使用して、グルタミン酸又はアスパラギン酸のカルボキシル基を糖のアミノ基に結合してもよい（Ｇａｒｇ  ａｎｄ  Ｊｅａｎｌｏｚ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．  ４３，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）、Ｋｕｎｚ，  Ａｎｇ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌｉｓｈ  ２６：２９４−３０８（１９８７））。また所望により、アセタール及びケタール結合がアミノ酸と炭水化物との間に形成されてもよい。所望により、脂肪酸アシル誘導体を、例えば、遊離アミノ基（例えば、リジン）のアシル化によって作製してもよい（Ｔｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｒｉｖｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌ，  ｅｄｓ．，  ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌ．，  Ｌｅｉｄｅｎ，  １０７８−１０７９（１９９０））。
【０６９３】
ある具体的な実施形態によれば、本明細書に完全に記載されているかのように参照により本明細書に援用されるＰＣＴ出願であるＷＯ２００６／０５０２６２号に記載されるように、修飾には、ペプチドへのシクロアルカン部分の付加が含まれる。これらの部分は、生体分子で使用するために設計されており、タンパク質に様々な特性を付与するために所望により使用され得る。
【０６９４】
さらに、所望により、ペプチド上の任意の部位を修飾してもよい。例えば、タンパク質上のグリコシル化部分のペグ化は、本明細書に完全に記載されているかのように参照により本明細書に援用されるＰＣＴ出願であるＷＯ２００６／０５０２４７号に記載されているように、所望により実施することができる。所望により、１又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基をＯ結合型及び／又はＮ結合型グリコシル化に付加してもよい。ＰＥＧ基は、所望により分岐状又は直鎖状であり得る。所望により、任意の種類の水溶性ポリマーを、グリコシルリンカーを介してタンパク質のグリコシル化部位に結合させてもよい。
【０６９５】
「ペグ化タンパク質（PEGylated protein）」とは、タンパク質のアミノ酸残基に共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を有する、生物学的活性を有するタンパク質又はその断片を意味する。
【０６９６】
「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」とは、カップリング剤と、又はカップリング部分若しくは活性化部分（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジルジン、オキシラン、又は好ましくはマレイミド部分）による誘導体化と併用した又は併用しない、ポリアルキレングリコール化合物又はその誘導体を意味する。マレイミドモノメトキシＰＥＧなどの化合物は、本発明の例示的な又は活性化されたＰＥＧ化合物である。ポリプロピレングリコールなどの他のポリアルキレングリコール化合物を本発明で使用してもよい。他の適切なポリアルキレングリコール化合物には、以下の種類の荷電性又は中性ポリマーが含まれるが、これらに限定されない：デキストラン、コロミン酸又は他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸のポリマー、及びビオチン誘導体。
【０６９７】
ある具体的な実施形態によれば、ペプチドは、変更されたグリコシル化パターンを持つように修飾される（すなわち、元の又は天然のグリコシル化パターンから変更される）。本明細書で使用される場合、「変更された（altered）」とは、１又は複数の炭水化物部分が欠失されていること、及び／又は元のタンパク質に少なくとも１つのグリコシル化部位が付加されていることを意味する。
【０６９８】
タンパク質のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型又はＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合の認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。Ｏ結合型グリコシル化とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの糖の１つがヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに結合することを指しているが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用され得る。
【０６９９】
ペプチドへのグリコシル化部位の付加は、ペプチドのアミノ酸配列を変更して、上記のトリペプチド配列の１又は複数を含むようにすることによって、簡便に達成される（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。変更は、元のペプチドの配列内の１又は複数のセリン又はスレオニン残基の追加又は置換によって行ってもよい（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。ペプチドのアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルで変化を導入することによっても変更され得る。
【０７００】
ペプチド上の炭水化物部分の数を増やす別の手段は、ペプチドのアミノ酸残基へのグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによるものである。使用するカップリング様式によっては、糖が（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、又はヒドロキシプロリンなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンの芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に結合する場合がある。これらの方法は、例えば、ＷＯ８７／０５３３０及びＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２２：  ２５９−３０６（１９８１）に記載されている。
【０７０１】
ペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的に、酵素的に、又はＤＮＡレベルでの変化の導入によって、達成され得る。化学的脱グリコシル化には、ペプチドをトリフルオロメタンスルホン酸又は同等の化合物に曝露する必要がある。この処理により、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんど又は全ての糖が切断され、アミノ酸配列は未変化のまま残る。
【０７０２】
化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  ２５９：  ５２  （１９８７）及びＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １１８：  １３１  （１９８１）に記載されている。ペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １３８：  ３５０（１９８７）に記載されているように、様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼを使用することによって達成され得る。
【０７０３】
ある具体的な実施形態によれば、前記ペプチドは検出可能なタグを含む。本明細書で使用される場合、一実施形態では、「検出可能なタグ」という用語は、当技術分野で公知の技術を使用して当業者が検出できる任意の部分を指す。検出可能なタグはペプチド配列であり得る。所望により、検出可能なタグは、化学薬品によって、又はタンパク質分解などの酵素的手段によって、除去され得る。本発明のいくつかの実施形態の検出可能なタグは、ペプチドの精製に使用され得る。例えば、「検出可能なタグ」という用語には、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）タグ；マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ；ポリ（Ｈｉｓ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｖ５タグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ＨＡタグなどのエピトープタグ；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、及びシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）などの蛍光タグ；並びにこれらのタグの派生物、又は当技術分野で公知の任意のタグが含まれる。「検出可能なタグ」という用語には「検出可能なマーカー」という用語も含まれる。
【０７０４】
ある具体的な実施形態によれば、前記ペプチドは、そのＮ末端に付着した検出可能なタグ（例えば、ポリ（Ｈｉｓ）タグ）を含む。
【０７０５】
ある具体的な実施形態によれば、前記ペプチドは、そのＣ末端に付着した検出可能なタグ（例えば、ポリ（Ｈｉｓ）タグ）を含む。
【０７０６】
ある具体的な実施形態によれば、前記ペプチドのＮ末端は検出可能なタグ（例えば、ポリ（Ｈｉｓ）タグ）を含まない。
【０７０７】
ある具体的な実施形態によれば、前記ペプチドのＣ末端は検出可能なタグ（例えば、ポリ（Ｈｉｓ）タグ）を含まない。
【０７０８】
ある具体的な実施形態によれば、前記ペプチドは切断可能部分（cleavable moiety）に融合している。したがって、例えば、回収を容易にするために、発現されるコード配列は、本発明のいくつかの実施形態のペプチド及び融合した切断可能部分をコードするように設計されてもよい。一実施形態では、前記ペプチドは、例えば、切断可能部分に特異的なカラムへの固定化によるアフィニティークロマトグラフィーによって容易に単離されるように設計されている。一実施形態では、切断部位は、前記ペプチドと切断可能部分との間に設計され、ペプチドは、この部位で融合タンパク質を特異的に切断する適切な酵素又は薬剤で処理することにより、クロマトグラフィーカラムから放出され得る［例えば、Ｂｏｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １９：６５−７０（１９８８）；及びＧａｒｄｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５：１５８５４−１５８５９（１９９０）を参照］。ある具体的な実施形態によれば、前記ペプチドは単離ペプチドである。
【０７０９】
本発明のいくつかの実施形態のペプチドは、固相及び組換え技術などであるがこれらに限定されない、ペプチド合成の当業者に公知の任意の技術によって、合成及び精製され得る。
【０７１０】
固相ペプチド合成については、多くの技術の要約が、Ｊ．  Ｍ．  Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｄ．  Ｙｏｕｎｇ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），  １９６３、及びＪ．  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，  Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ｖｏｌ．  ２，  ｐ．  ４６，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  １９７３に記載されている。従来の溶液合成については、Ｇ．  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｌｕｐｋｅ，  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ｖｏｌ．  １，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  １９６５を参照のこと。
【０７１１】
概して、これらの方法は、成長するペプチド鎖に１又は複数のアミノ酸又は適切に保護されたアミノ酸を連続的に付加することを含む。通常、最初のアミノ酸のアミノ基又はカルボキシル基のいずれかが、適切な保護基によって保護されている。次に、この保護又は誘導体化されたアミノ酸は、不活性固体支持体に結合するか、アミド結合を形成するのに適した条件下で、適切に保護された相補的（アミノ又はカルボキシル）基を有する配列中の次のアミノ酸を加えることによって、溶液中で利用されうる。この新しく追加されたアミノ酸残基から保護基が除去された後、次のアミノ酸（適切に保護されている）が追加され、以下同様に続く。全ての所望のアミノ酸が適切な配列で連結された後、残りの保護基（及び任意の固体支持体）が順次又は同時に除去されて、最終的なペプチド化合物が得られる。この一般的な手順を簡単に変更することにより、例えば、保護されたトリペプチドを適切に保護されたジペプチドと（キラル中心をラセミ化しない条件下で）カップリングすることにより、脱保護後、ペンタペプチドなどを形成するなど、成長する鎖に一度に複数のアミノ酸を加えることが可能である。ペプチド合成のさらなる説明は米国特許第６，４７２，５０５号に開示されている。
【０７１２】
本発明のいくつかの実施形態のペプチド化合物を調製する好ましい方法は、固相ペプチド合成を含む。
【０７１３】
大規模ペプチド合成についてはＡｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２０００；５５（３）：２２７−５０に記載されている。
【０７１４】
ある具体的な実施形態によれば、前記ペプチドは、インビトロ発現系を使用して合成される。かかるインビトロ合成法は当技術分野で周知であり、前記発現系の構成要素は市販されている。
【０７１５】
ある具体的な実施形態によれば、前記ペプチドは組換えＤＮＡ技術によって生成される。「組換え」ペプチド又はタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生されたペプチド又はタンパク質を指す。すなわち、望ましいペプチド又はタンパク質をコードする外因性ＤＮＡ構築物によって形質転換された細胞から産生される。
【０７１６】
したがって、本発明の別の態様によれば、上記の融合タンパク質のいずれかをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドが提供される。
【０７１７】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号５５〜６６又は６８に記載される核酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相同であり、ここで各ポシビリティー（possibility）は本発明の別個の実施形態を表す。
【０７１８】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号５５〜６６又は６８に記載される核酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相同である。
【０７１９】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号５５〜６６及び６８からなる群より選択される核酸配列を含み、ここで各ポシビリティーは本発明の別個の実施形態を表す。
【０７２０】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号５５〜６６及び６８からなる群より選択される核酸配列からなり、ここで各ポシビリティーは本発明の別個の実施形態を表す。
【０７２１】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号５５〜６１及び６８からなる群より選択される核酸配列を含む。
【０７２２】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号５５〜６１及び６８からなる群より選択される核酸配列からなる。
【０７２３】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号５５、５６及び５８からなる群より選択される核酸配列を含む。
【０７２４】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号５５、５６及び５８からなる群より選択される核酸配列からなる。
【０７２５】
本発明の別の態様によれば、配列番号２４及び／又は配列番号２６と少なくとも９５％の同一性を有する１００〜１１９アミノ酸長の上記のＳＩＲＰαアミノ酸配列のいずれか、又は配列番号２２、配列番号２３、配列番号２７及び配列番号２８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する１８５〜２０２アミノ酸長である前記４−１ＢＢＬアミノ酸配列のいずれか、をコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドが提供される。
【０７２６】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３３又は３４に記載される核酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相同であり、ここで各ポシビリティー（possibility）は本発明の別個の実施形態を表す。
【０７２７】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３３又は３４に記載される核酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相同である。
【０７２８】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３３又は３４の核酸配列を含む。
【０７２９】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３３又は３４の核酸配列からなる。
【０７３０】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３９、４０、４１、４２、７３、７５、７７又は７９に記載される核酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相同であり、各ここで各ポシビリティーは本発明の別個の実施形態を表す。
【０７３１】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３９、４０、４１又は４２に記載される核酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相同であり、各ここで各ポシビリティーは本発明の別個の実施形態を表す。
【０７３２】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３９、４０、４１、４２、７３、７５、７７又は７９に記載される核酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相同である。
【０７３３】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３９、４０、４１又は４２に記載される核酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相同である。
【０７３４】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３９、４０、４１、４２、７３、７５、７７又は７９を含む。
【０７３５】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３９、４０、４１又は４２を含む。
【０７３６】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３９、４０、４１、４２、７３、７５、７７又は７９からなる。
【０７３７】
ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３９、４０、４１又は４２からなる。
【０７３８】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、単離され、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列及び／又は複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記のものの組み合わせ）の形態で提供される一本鎖又は二本鎖の核酸配列を指す。
【０７３９】
哺乳動物細胞において外因性ポリペプチドを発現させるために、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞の発現に適した核酸構築物に連結することが好ましい。かかる核酸構築物は、構成的又は誘導的な方法で細胞内の前記ポリヌクレオチド配列の転写を指示するためのプロモーター配列を含む。
【０７４０】
よって、ある具体的な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチド及び宿主細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を指示するための調節エレメントを含む核酸構築物が提供される。
【０７４１】
ある具体的な実施形態によれば、前記調節エレメントは異種の調節エレメントである。
【０７４２】
本発明のいくつかの実施形態における核酸構築物（本明細書では「発現ベクター」とも称される）は、このベクターを原核生物、真核生物、又は好ましくは両方における複製及び組み込みに適したもの（例えば、シャトルベクター）にする追加の配列を含む。さらに、典型的なクローニングベクターはまた、転写及び翻訳開始配列、転写及び翻訳ターミネーター、並びにポリアデニル化シグナルを含み得る。例として、かかる構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起源、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含むであろう。
【０７４３】
本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物は、典型的には、それが配置される宿主細胞からペプチドを分泌するためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳動物シグナル配列又は本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドバリアントのシグナル配列である。
【０７４４】
真核生物のプロモーターには通常、ＴＡＴＡボックス及び上流のプロモーター要素の２種類の認識配列が含まれている。転写開始部位の２５〜３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼにＲＮＡ合成を開始するように指示することに関与していると考えられている。他の上流プロモーター要素は、転写が開始される速度を決定する。
【０７４５】
好ましくは、本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物によって利用されるプロモーターは、形質転換された特定の細胞集団において活性を有する。細胞型特異的及び／又は組織特異的プロモーターの例には、肝臓特異的なアルブミンなどのプロモーター［Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １：２６８−２７７］やリンパ球特異的プロモーター［Ｃａｌａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４３：２３５−２７５］などのプロモーター、特にＴ細胞受容体のプロモーター［Ｗｉｎｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ８：７２９−７３３］及び免疫グロブリン［Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｃｅｌｌ  ３３７２９−７４０］、ニューロフィラメントプロモーターなどのニューロン特異的プロモーター［Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７］、膵臓特異的プロモーター［Ｅｄｌｕｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６］、又はミルクホエイプロモーターなどの乳腺特異的プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開第２６４，１６６号）が含まれる。
【０７４６】
エンハンサー要素は、連結された同種又は異種のプロモーターから最大１，０００倍の転写を刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流又は上流に配置されると活性を示す。ウイルスに由来する多くのエンハンサー要素は、宿主範囲が広く、様々な組織で活性を示す。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは多くの細胞型に適している。本発明のいくつかの実施形態に適した他のエンハンサー／プロモーターの組み合わせには、ポリオーマウイルス、ヒト又はマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス白血病ウイルス、マウス又はラウスの肉腫ウイルス及びＨＩＶなどの様々なレトロウイルスからの長末端反復に由来するものが含まれる。参照により本明細書に援用されるＥｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  １９８３を参照のこと。
【０７４７】
発現ベクターの構築において、前記プロモーターは好ましくは、異種転写開始部位からの距離が、前記プロモーターの天然の設定における転写開始部位からの距離とほぼ同じとなる位置に、配される。しかしながら、当技術分野で公知のように、この距離が多少変動しても、プロモーター機能を失うことなく適応できる。
【０７４８】
ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ、ＳＩＲＰα、又は４−１ＢＢＬのｍＲＮＡ翻訳の効率を高めるために、ポリアデニル化配列を発現ベクターに加えることもできる。正確で効率的なポリアデニル化には、ポリアデニル化部位の下流に位置するＧＵリッチ又はＵリッチな配列、及び１１〜３０ヌクレオチド上流に位置する６ヌクレオチドの高度に保存された配列ＡＡＵＡＡＡ、の２つの異なる配列要素が必要である。本発明のいくつかの実施形態に適した終結シグナル及びポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０に由来するものが含まれる。
【０７４９】
既述の要素に加えて、本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは、典型的には、クローニングされた核酸の発現レベルを増加させること又は組換えＤＮＡを担持する細胞の同定を容易にすることを目的とする、他の特殊な要素を含み得る。例えば、多くの動物ウイルスには、許容細胞型でウイルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列が含まれている。これらのウイルスレプリコンを保有するプラスミドは、プラスミド上に保持されている遺伝子又は宿主細胞のゲノムに存在する遺伝子により適切な因子が提供されている限り、エピソーマルに複製される（replicated episomally）。
【０７５０】
ベクターは真核生物のレプリコンを含む場合と含まない場合がある。真核生物のレプリコンが存在する場合、ベクターは適切な選択マーカーを使用して真核生物の細胞で増幅可能である。ベクターが真核生物のレプリコンを含まない場合、エピソーマル増幅は不可能である。代わりに、組換えＤＮＡは改変細胞のゲノムに組み込まれ、ここでプロモーターが目的の核酸の発現を指示する。
【０７５１】
本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは、例えば、内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ、ＩＲＥＳ）やプロモーターキメラポリペプチドのゲノム組み込みのための配列など、単一のｍＲＮＡからのいくつかのタンパク質の翻訳などを可能にする、追加のポリヌクレオチド配列をさらに含み得る。
【０７５２】
発現ベクターに含まれる個々の要素は、様々な構成で配置することができることが理解されよう。例えば、エンハンサー要素、プロモーターなど、及びＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬをコードするポリヌクレオチド配列、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むポリペプチドでさえ、「同方向の連結（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）」構成に配置とすることが可能であり、逆相補鎖（inverted complement）として、又は相補的構成で逆平行鎖として存在し得る。このような多様な構成は、発現ベクターの非コード要素で発生する可能性が高いが、発現ベクター内のコード配列の代替構成も想定されている。
【０７５３】
哺乳類の発現ベクターの例には、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、及びｐＮＭＴ８１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から入手可能）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、及びｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社から入手可能）、ｐＴＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から入手可能）、及びそれらの派生物が含まれるが、これらに限定されない。
【０７５４】
レトロウイルスなどの真核生物ウイルスからの調節エレメントを含む発現ベクターも使用され得る。ＳＶ４０ベクターにはｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２が含まれる。パピローマウイルスに由来するベクターにはｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタイン・バール・ウイルスに由来するベクターにはｐＨＥＢＯ及びｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ；ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋；ｐＭＡＭｎｅｏ−５；バキュロウイルスｐＤＳＶＥ；及び、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳がんウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核細胞での発現に有効であることが示された他のプロモーターの指示の下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。
【０７５５】
上記のように、ウイルスは、多くの場合、宿主の防御機構を回避するために進化してきた、非常に特殊な感染性病原体である。通常、ウイルスは特定の細胞型に感染して増殖する。ウイルスベクターの標的化特異性は、その元来の特異性を利用して、所定の細胞型を特異的に標的化し、それにより感染細胞に組換え遺伝子を導入する。したがって、本発明のいくつかの実施形態によって使用されるベクターの種類は、形質転換される細胞型に依存するであろう。形質転換される細胞型に従って適切なベクターを選択する能力は、当業者の能力の範囲内であり、したがって、選択の考慮事項の一般的な説明は本明細書では提供されない。例えば、Ｌｉａｎｇ  ＣＹ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４  （Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．  １４９：  ５１−６０）に記載されるように、骨髄細胞はヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）を使用して標的化でき、腎臓細胞はバキュロウイルスであるＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ、ＡｃＭＮＰＶ）に存在する異種プロモーターを使用して標的化できる。
【０７５６】
組換えウイルスベクターは、水平感染や標的特異性などの利点を提供することから、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ、ＳＩＲＰα、又は４−１ＢＢＬのインビボ発現に有用である。水平感染は、例えばレトロウイルスのライフサイクルに固有のものであり、単一の感染細胞が発芽して隣接細胞に感染する多くの子孫ビリオンを生成するプロセスである。その結果、そのほとんどが最初は元のウイルス粒子に感染していなかった広い領域が急速に感染する。これは、感染性病原体が娘の子孫を通してのみ広がる垂直型の感染とは対照的である。水平方向に広がることができないウイルスベクターも生成されうる。この特性は、特定の遺伝子を局所的な数の標的細胞にのみ導入することが望ましい目的である場合に有用である。
【０７５７】
本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターを細胞に導入するために、様々な方法を使用することができる。かかる方法は、概してＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９，  １９９２、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍｄ．（１９８９）、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５），  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，  Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）、及びＧｉｌｂｏａ  ｅｔ  ａｌ．［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：  ５０４−５１２，  １９８６］に記載されており、例えば、安定的又は一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、及び組換えウイルスベクターによる感染が含まれる。また、陽性−陰性選択方法については、米国特許第５，４６４，７６４号及び第５，４８７，９９２号を参照のこと。
【０７５８】
ウイルス感染による核酸の導入は、ウイルスの感染性により高いトランスフェクション効率が得られるため、リポフェクションやエレクトロポレーションなどの他の方法に比べていくつかの利点がある。
【０７５９】
現在好ましいインビボ核酸導入技術には、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルス又は非ウイルス構築物及び脂質ベースの系によるトランスフェクションが含まれる。脂質を介した遺伝子の伝達に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌである［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，  １４（１）：  ５４−６５（１９９６）］。遺伝子治療で使用するための最も好ましい構築物は、ウイルスであり、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、又はレトロウイルスである。レトロウイルス構築物などのウイルス構築物は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー又は遺伝子座定義要素、又は選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出、若しくはメッセンジャー翻訳後修飾などの他の手段によって遺伝子発現を制御する他の要素を含む。このようなベクター構築物には、パッケージングシグナル、長末端反復（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ、ＬＴＲ）又はその一部、及びウイルス構築物に既に存在しない限り、使用するウイルスに適したプラス鎖及びマイナス鎖プライマー結合部位も含まれる。さらに、かかる構築物は、典型的には、それが配置されている宿主細胞からのペプチドの分泌のためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳動物シグナル配列又は本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドバリアントのシグナル配列である。所望により、構築物はまた、ポリアデニル化を指示するシグナル、並びに１又は複数の制限部位及び翻訳終結配列を含み得る。例として、かかる構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起源、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含むであろう。カチオン性脂質、ポリリジン、デンドリマーなど、他の非ウイルス性であるベクターを使用してもよい。
【０７６０】
前述のように、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含む以外に、本発明のいくつかの実施形態の発現構築物は、発現ペプチドの安定性、産生、精製、収量、又は毒性を増強するように設計された配列も含み得る。例えば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬタンパク質又は本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドと異種タンパク質とを含む、融合タンパク質又は切断可能な融合タンパク質の発現を設計することができる。かかる融合タンパク質は、例えば異種タンパク質に特異的なカラムへの固定化によるアフィニティークロマトグラフィーによって融合タンパク質が容易に単離され得るようにデザインすることができる。ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬタンパク質又は本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドと異種タンパク質との間で切断部位が設計される場合、前記ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬタンパク質又はポリペプチドは、切断部位を破壊する適切な酵素又は薬剤で処理することにより、クロマトグラフィーカラムから放出され得る［例えば、Ｂｏｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １９：６５−７０；及びＧａｒｄｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５：１５８５４−１５８５９を参照］。
【０７６１】
本発明はまた、本明細書に記載の組成物を含む細胞を企図する。
【０７６２】
したがって、ある具体的な実施形態によれば、本明細書に開示されるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含むポリペプチド及び／又は４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、又はそれをコードする核酸構築物を含む、宿主細胞が提供される。
【０７６３】
上記のように、本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドを発現するための宿主発現系としては、様々な原核生物又は真核生物の細胞を使用しうる。これらには、コード配列を含む、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染した、又はコード配列を含むＴｉプラスミドなどの組換えプラスミド発現ベクターで形質転換された植物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現系を使用して、本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドを発現させてもよい。
【０７６４】
細菌性構築物（bacterial constructs）の例には、大腸菌発現ベクターのｐＥＴシリーズが含まれる（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８５：６０−８９）。
【０７６５】
本発明の教示と共に使用され得る真核細胞の例には、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、藻類細胞、又は植物細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０７６６】
酵母では、米国特許出願第５，９３２，４４７号に開示されているように、構成的又は誘導性のプロモーターを含む多くのベクターを使用することができる。あるいは、酵母染色体への外来ＤＮＡ配列の組み込みを促進するベクターを使用してもよい。
【０７６７】
植物発現ベクターが使用される場合、コード配列の発現は、いくつかのプロモーターによって駆動され得る。例えば、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡ及び１９ＳＲＮＡプロモーターなどのウイルスプロモーター［Ｂｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１−５１４］又はＴＭＶへのコートタンパク質プロモーター［Ｔａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：３０７−３１１］が使用され得る。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットなどの植物プロモーター［Ｃｏｒｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３：１６７１−１６８０、及びＢｒｏｇｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３］又はヒートショックプロモーター、例えば、大豆ｈｓｐ１７．５−Ｅ又はｈｓｐ１７．３−Ｂ［Ｇｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ６：５５９−５６５］が使用され得る。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及び当業者に周知の他の技術を使用して植物細胞に導入され得る。例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，  １９８８，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ，  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，  ｐｐ  ４２１−４６３を参照。
【０７６８】
当技術分野で周知の昆虫及び哺乳動物宿主細胞系などの他の発現系もまた、本発明のいくつかの実施形態によって使用され得る。
【０７６９】
ある具体的な実施形態によれば、前記細胞は哺乳動物細胞である。
【０７７０】
ある具体的な実施形態によれば、前記細胞はヒト細胞である。
【０７７１】
ある具体的な実施形態によれば、前記細胞は細胞株（cell line）である。
【０７７２】
別のある具体的な実施形態によれば、前記細胞は初代培養細胞（primary cell）である。
【０７７３】
細胞は、血液、筋肉、神経、脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、胸腺、食道、胃、腸、腎臓、精巣、卵巣、髪、皮膚、骨、乳房、子宮、膀胱、脊髄、又は様々な種類の体液を含むがこれらに限定されない適切な組織に由来し得る。前記細胞は、胚、胎児、及び成体の段階を含む任意の発達段階、並びに発達起源、すなわち、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉起源に由来し得る。
【０７７４】
哺乳動物細胞の非限定的な例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ヒト胎児腎臓細胞株（ＨＥＫ２９３、又は浮遊培養における増殖のためにサブクローン化されたＨＥＫ２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，  ３６：５９  １９７７）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ２３：２４３−２５１  １９８０）、サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ３８３：４４−６８  １９８２）、ＭＲＣ  ５細胞、ＦＳ４細胞、並びにヒト肝細胞がん細胞株（Ｈｅｐ  Ｇ２）、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｋ５６２、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が含まれる。
【０７７５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ１０８０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＢＨＫ、Ｎａｍａｌｗａ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ細胞、及びＶｅｒｏ細胞からなる群より選択される。
【０７７６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、及び２９３（例えば、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）細胞を含む。
【０７７７】
本発明の別の態様によれば、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むポリペプチドを産生する方法であって、本明細書に記載のポリヌクレオチド又は核酸構築物を宿主細胞で発現させることを含む、前記方法が提供される。
【０７７８】
ある具体的な実施形態によれば、前記方法は、融合タンパク質又はポリペプチドを単離することを含む。
【０７７９】
ある具体的な実施形態によれば、前記組換えポリペプチドの回収は、適切な培養期間の後に行われる。「組換えポリペプチドを回収する」という句は、ポリペプチドを含む発酵培地全体を回収することを指し、分離又は精製の追加のステップを意味しなくてもよい。しかしながら、本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、金属アフィニティークロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、及び示差可溶化（differential solubilization）などであるがこれらに限定されない、様々な標準タンパク質精製技術を使用して精製されてもよい。
【０７８０】
ある具体的な実施形態によれば、合成及び精製に続いて、ペプチドの治療効果をインビボ又はインビトロのいずれかでアッセイすることができる。かかる方法は当技術分野で公知であり、例えば、細胞生存率、トランスジェニックマウスの生存、及び活性化マーカーの発現が含まれる。
【０７８１】
本発明のいくつかの実施形態の組成物（例えば、本明細書に開示されるＳＲＩＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含むポリペプチド、４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、それをコードする核酸構築物、及び／又は細胞）は、それ自体で、又は適切な担体若しくは添加剤と混合される医薬組成物で投与され得る。
【０７８２】
したがって、本発明は、いくつかの実施形態において、治療有効量の本明細書に開示される組成物を含む医薬組成物を特徴とする。
【０７８３】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、生理学的に適切な担体及び添加剤などの他の化学成分を用いた、本明細書に記載の１又は複数の活性成分の調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０７８４】
本明細書において、「有効成分」という用語は、生物学的効果の原因となる組成物（例えば、本明細書に記載のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰαアミノ酸配列を含むポリペプチド、４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、及び／又は細胞）を指す。
【０７８５】
本明細書において、「添加剤（excipient）」という用語は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。添加剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖及び各種デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、及びポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。
【０７８６】
以下、互換的に使用され得る「生理学的に許容される担体」及び「医薬的に許容される担体」という句は、生物に重大な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性及び特性を無効にしない担体又は希釈剤を指す。これらの句にはアジュバントが含まれる。
【０７８７】
本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体」には、生理学的に適合性のある全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、並びに吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、前記担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適している。投与経路に応じて、本明細書に記載の活性化合物、すなわち、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、及び／又は細胞は、１又は複数の医薬的に許容される塩を含み得る。「医薬的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒物学的効果を与えない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，  Ｓ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ６６：  １−１９を参照のこと）。かかる塩の例には、酸付加塩及び塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リンなどの非毒性無機酸に由来するもの、並びに脂肪族モノカルボン酸及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属、並びにＮ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性有機アミンに由来するものが含まれる。
【０７８８】
本発明の少なくともいくつかの実施形態による医薬組成物はまた、医薬的に許容される抗酸化剤を含み得る。医薬的に許容される抗酸化剤の例は、以下を含む：（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；及び（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤。本発明の少なくともいくつかの実施形態による医薬組成物はまた、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）及び可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ２０（ポリソルベート−２０）、ＴＷＥＥＮ８０（ポリソルベート−８０））、防腐剤（例えば、チメルソル、ベンジルアルコール）、及び増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含み得る。
【０７８９】
本発明の少なくともいくつかの実施形態による医薬組成物に使用され得る適切な水性及び非水性の担体の例には、水、様々な緩衝液含有量（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ、及びイオン強度の緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。
【０７９０】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持、及び界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）の使用によって維持することができる。
【０７９１】
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントを含み得る。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順によって、並びに様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって確実にされ得る。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることも望ましい場合がある。さらに、注射可能な剤形の長期吸収（prolonged absorption）は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を含めることによってもたらされ得る。
【０７９２】
医薬的に許容される担体には、無菌の注射可能な溶液又は分散液の即時調製のための、無菌の水溶液又は分散液及び無菌の粉末が含まれる。医薬的に活性な物質のためのかかる媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で公知である。従来の媒体又は剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の少なくともいくつかの実施形態による医薬組成物におけるそれらの使用が企図される。補足的な活性化合物もまた、前記組成物に組み込まれうる。
【０７９３】
治療用組成物は、通常、製造及び保管の条件下で無菌かつ安定でなければならない。前記組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に適した他の秩序立った構成（ordered structure）として処方されうる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合に必要な粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムを前記組成物に含めることが好ましいであろう。注射可能な前記組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアレート塩及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらされ得る。無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて、上記に列挙された成分の１つ又は組み合わせを含む適切な溶媒に必要な量の活性化合物を組み込み、続いて滅菌精密濾過することによって調製され得る。通常、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒及び上記に列挙されたものから必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）であり、これにより、有効成分に加えて、予め滅菌濾過された溶液から任意の追加の望ましい成分の粉末が得られる。
【０７９４】
無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて、上記に列挙された成分の１つ又は組み合わせを含む適切な溶媒に必要な量の活性化合物を組み込み、続いて滅菌精密濾過することによって調製され得る。通常、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒及び上記に列挙されたものから必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）であり、これにより、有効成分に加えて、予め滅菌濾過された溶液から任意の追加の望ましい成分の粉末が得られる。
【０７９５】
担体材料と組み合わせて単一の剤形を生成することができる有効成分の量は、処置される対象、及び個別の投与様式に応じて変化するであろう。担体材料と組み合わせて単一の剤形を生成することができる有効成分の量は、通常、治療効果を生成する組成物の量である。概して、１００％のうち、この量は、医薬的に許容される担体と組み合わせた、約０．０１％〜約９９％の有効成分、好ましくは約０．１％〜約７０％の有効成分、最も好ましくは約１％〜約３０％の有効成分の範囲内である。
【０７９６】
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整される。例えば、単一のボーラスが投与されてよく、いくつかの分割された用量が経時的に投与されてもよく、又は用量が、治療状況の緊急性によって示されるように比例して減少又は増加されてもよい。投与の容易さ及び投与量の均一性のために、投与単位形態で非経口組成物を処方することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位形態（dosage unit form）は、処置される対象への単一投与量として適した物理的個別単位（physically discrete units）を指す。各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の少なくともいくつかの実施形態による投与単位形態の規格は、（ａ）活性化合物の固有の特徴及び達成されるべき個別の治療効果、及び（ｂ）個人の感受性の処置のためにかかる活性化合物を配合する当技術分野に固有の制限によって決定され、それらに直接依存する。
【０７９７】
薬物の製剤及び投与のための技術は、参照により本明細書に援用される「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ）（最新版）に記載されている。
【０７９８】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、当技術分野で周知のプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、磨り潰し（levigate)、乳化、カプセル化、捕捉、又は凍結乾燥プロセスによって製造され得る。
【０７９９】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の様々な方法の１又は複数を使用して、１又は複数の投与経路を介して投与され得る。当業者によって理解されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて変化するであろう。本発明の少なくともいくつかの実施形態による治療剤の好ましい投与経路には、例えば、血管内送達（例えば、注射又は注入）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、経口、経腸、直腸、肺（例えば、吸入）、鼻、局所（経皮、頬側、及び舌下を含む）、膀胱内、硝子体内、腹腔内、膣、脳への送達（例えば、脳室内、脳内、及び対流により増強される拡散（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ））、中枢神経系（ＣＮＳ）送達（例えば、くも膜下腔内、脊髄周囲、及び脊髄内）、非経口（皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）、及び皮内を含む）、経皮（受動的に又はイオントフォレーシス若しくはエレクトロポレーションを使用）、経粘膜（例えば、舌下投与、鼻、膣、直腸、又は舌下）投与、インプラントによる投与、又は他の非経口投与経路(例えば注射又は注入による）；又は当技術分野で公知の他の送達経路及び／又は投与形態が含まれる。本明細書で使用される「非経口投与」という句は、通常は注射による、経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、被膜内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下（ｓｕｂｃａｐｓｕｌａｒ）、くも膜下、脊髄内、硬膜外、及び胸骨内注射及び注入、又は生体侵食性インサートを使用することを含むがこれらに限定されず、各投与経路に適した剤形で処方することができる。ある具体的な実施形態では、本発明の少なくともいくつかの実施形態によるタンパク質、治療剤、又は医薬組成物は、腹腔内又は静脈内に投与され得る。
【０８００】
ある具体的な実施形態によれば、本明細書に開示される組成物は、非経口注射によって水溶液中で投与される。前記製剤は、懸濁液又は乳濁液の形態であってもよい。通常、非経口注射用の医薬組成物は、有効量の本明細書に記載の組成物を含み、所望により、医薬的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、及び／又は担体を含む。かかる組成物は、所望により、希釈剤；滅菌水；様々な緩衝液含有量（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ、及びイオン強度の緩衝生理食塩水；並びに、洗浄剤界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）や可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ２０（ポリソルベート−２０）、ＴＷＥＥＮ８０（ポリソルベート−８０））、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性酸化防止剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤）、防腐剤（例えば、チメルソル、ベンジルアルコール）、及び増量物質（例えば、乳糖、マンニトール）などの添加剤のうち１又は複数を含む。非水性溶媒又はビヒクルの例は、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油、及びコーン油などの植物油、ゼラチン、並びにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。前記製剤はフリーズドライ（凍結乾燥）又は真空乾燥されていてよく、使用直前に及び再溶解／再懸濁され得る。前記製剤は、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって、滅菌剤を前記組成物に組み込むことによって、前記組成物を照射することによって、又は前記組成物を加熱することによって、滅菌することができる。
【０８０１】
本明細書に開示される様々な組成物（例えば、ポリペプチド）は、局所的に適用され得る。局所投与は、ほとんどのペプチド製剤ではうまく機能しないが、肺、鼻、経口（舌下、頬側）、膣、又は直腸粘膜に適用した場合に特に効果的でありうる。
【０８０２】
本発明の組成物は、空気力学的直径が約５ミクロン未満のエアロゾル又は噴霧乾燥粒子のいずれかとして送達される場合、吸入しながら肺に送達され、肺上皮内層を横切って血流に移動することが可能である。ネブライザー、定量吸入器、及び粉末吸入器を含むがこれらに限定されない、治療用製品の肺送達用に設計された広範囲の機械的デバイスを使用可能であり、これらは全て当業者に周知である。市販のデバイスのいくつかの具体例は、ＵｌｔｒａＶｅｎｔネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ミズーリ州セントルイス）、Ａｃｏｒｎ  ＩＩネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、コロラド州イングルウッド）、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器（Ｇｌａｘｏ社、ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク）、及びＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．社、マサチューセッツ州ベッドフォード）である。Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社、Ａｌｋｅｒｍｅｓ社、及びＭａｎｎｋｉｎｄ社は全て、承認済であるか又は臨床試験の段階にある吸入可能なインスリン粉末製剤を有しており、本明細書に記載の製剤に技術を適用できる可能性がある。
【０８０３】
粘膜に投与するための製剤は、通常、噴霧乾燥された薬物粒子であり、これは、錠剤、ゲル、カプセル、懸濁液、又は乳濁液に組み込まれ得る。標準的な医薬品添加剤は、任意の製剤業者（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒ）からも入手可能である。経口製剤は、チューインガム、ゲルストリップ、錠剤、又はトローチ（ｌｏｚｅｎｇｅ）の形態であり得る。
【０８０４】
経皮製剤を調製することもできる。これらは通常、軟膏、ローション、スプレー、又はパッチであり、これらはすべて標準的な技術を使用して調製できる。経皮製剤には、浸透促進剤を含める必要がある。本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に有毒とならずに、個別の患者、組成物、及び投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分の量を得るように変更可能である。選択される投与量レベルは、様々な薬物動態学的要因に依存し、それらには、採用される本発明の個々の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用されている個別の化合物の排泄速度、処置期間、採用される個々の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び／又は材料、処置を受けている患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態、既往歴、並びに医療分野で周知の同様の要因が含まれる。
【０８０５】
ある具体的な実施形態によれば、本明細書に開示される組成物は、治療有効量で対象に投与される。本明細書で使用される場合、「有効量」又は「治療有効量」という用語は、処置される障害の１又は複数の症状を処置、阻害、又は軽減するのに十分な、又はその他の方法で所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を提供するのに十分な用量を意味する。正確な投与量は、対象によって決定される変数（例えば、年齢、免疫系の健康など）、疾患、及び実施される処置などの様々な要因によって異なる。本明細書に開示されるポリペプチド組成物、それをコードするポリヌクレオチド及び核酸構築物、並びに本明細書に記載される細胞の場合、さらなる研究が行われるにつれて、様々な患者の様々な状態の処置のための適切な投与量レベルに関する情報が明らかになり、当業者は、被処置者の治療状況、年齢、及び全身の健康状態を考慮して、適切な投与量を確認することができるであろう。選択される投与量は、所望の処置効果、投与経路、及び所望の処置の期間によって決定される。ポリペプチド組成物の場合、一般に、一日０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルが哺乳動物に投与され、より普通には０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇである。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、又は１０ｍｇ／ｋｇ体重、あるいは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的な処置レジメンは、週５回、週４回、週３回、週２回、週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月に１回、３か月に１回、又は３〜６か月に１回の投与を伴う。一般的に、静脈内注射又は注入の場合、投与量は少なくなりうる。投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整される。例えば、単一のボーラスが投与されてよく、いくつかの分割された用量が経時的に投与されてもよく、又は用量が、治療状況の緊急性によって示されるように比例して減少又は増加されてもよい。投与の容易さ及び投与量の均一性のために、投与単位形態で非経口組成物を処方することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位形態（dosage unit form）は、処置される対象への単一投与量として適した物理的個別単位（physically discrete units）を指す。各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の少なくともいくつかの実施形態による投与単位形態の規格は、（ａ）活性化合物の固有の特徴及び達成されるべき個別の治療効果、及び（ｂ）個人の感受性の処置のためにかかる活性化合物を配合する当技術分野に固有の制限によって決定され、それらに直接依存する。
【０８０６】
場合により、前記ポリペプチド製剤は、任意の適切な投与タイミングレジメンに従って、０．０００１〜１００ｍｇ／患者の体重（ｋｇ）／日の間の量、好ましくは０．００１〜２０．０ｍｇ／ｋｇ／日の間の量で投与され得る。本発明の少なくともいくつかの実施形態による治療組成物は、例えば、１日３回、１日２回、１日１回、週３回、週２回、週１回、又は２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間若しくは８週間ごとに１回、投与され得る。さらに、前記組成物は、短期間又は長期間（例えば、１週間、１ヶ月、１年、５年）にわたって投与され得る。
【０８０７】
あるいは、本明細書に開示される組成物は、徐放性製剤として投与することができ、その場合、必要とされる投与の頻度はより少ない。投与量と頻度は、患者における治療剤の半減期によって異なる。一般に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、次にヒト化抗体、キメラ抗体、及び非ヒト抗体が続く。融合タンパク質の半減期は大きく異なり得る。投与量及び投与頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかによって異なり得る。予防的用途では、比較的低用量が長期間にわたって比較的低頻度の間隔で（relatively infrequent intervals）投与される。一部の患者は生涯処置を受け続ける。治療用途では、疾患の進行が低減又は終了するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い投与量が必要とされる場合がある。その後、患者に予防的投与レジメンで投与してもよい。
【０８０８】
ある具体的な実施形態において、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、又は細胞組成物は、例えば、処置される部位に直接注射することによって、局所的に投与される。典型的には、注射は、全身投与によって達成され得る濃度よりも高い、組成物の局所濃度の増加を引き起こす。処置される部位からのポリペプチドの受動拡散を低減することによって、ポリペプチド組成物の局所濃度の増加を作り出すのを助けるために、前記ポリペプチド組成物は、上記のようにマトリックスと組み合わせることができる。
【０８０９】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の医療デバイスと共に投与してもよい。例えば、所望による実施形態では、本発明のいくつかの実施形態による医薬組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号、又は第４，５９６，５５６号に開示されるデバイスなどの針皮下注射デバイスを用いて投与され得る。本発明において有用な周知のインプラント及びモジュールの例には、米国特許第４，４８７，６０３号に開示される制御された速度で薬剤を分配するための埋め込み型マイクロ注入ポンプ、米国特許第４，４８６，１９４号に開示される皮膚を通して薬剤を投与するための治療デバイス、米国特許第４，４４７，２３３号に開示される正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプ、米国特許第４，４４７，２２４号に開示される連続薬物送達のための可変流量埋め込み型注入装置、米国特許第４，４３９，１９６号に開示されるマルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧ドラッグデリバリーシステム、及び米国特許第４，４７５，１９６号に開示される浸透圧ドラッグデリバリーシステムが含まれる。これらの特許は、参照により本明細書に援用される。他の多くのこのようなインプラント、送達システム、及びモジュールは、当業者に公知である。
【０８１０】
前記活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤など、急速放出に抗して化合物を保護する担体を用いて調製してもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用しうる。かかる製剤を調製するための多くの方法は、特許とされているか、又は一般に当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  ｅｄ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７８を参照のこと。制御放出ポリマーデバイスは、ポリマーデバイス（ロッド、シリンダー、フィルム、ディスク）又は注射（微粒子）を移植し続いて全身に長期放出を行うために作製されうる。マトリックスは、ペプチドが固体ポリマーマトリックス又はマイクロカプセル内に分散され、コアがポリマーシェルとは異なる材料であり、ペプチドが、元来液体でも固体でもよいコアに分散又は懸濁されている、ミクロスフェアなどの微粒子の形態であってもよい。本明細書で特に定義されていない限り、微粒子、ミクロスフェア、及びマイクロカプセルは互換的に使用される。あるいは、ポリマーは、数ナノメートル〜４センチメートルの範囲内の薄いスラブ又はフィルムとして成型されてもよく、粉砕又は他の標準的な技術によって生成される粉末であってもよく、あるいはヒドロゲルなどのゲルであってもよい。
【０８１１】
非生分解性又は生分解性マトリックスのいずれかを、本明細書に開示される活性剤の送達に使用することができるが、生分解性マトリックスが好ましい。これらは天然又は合成ポリマーであり得るが、分解及び放出プロファイルのより良い特徴付けのために合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、放出が望まれる期間に基づいて選択される。線形放出が最も有用な場合もあれば、パルス放出又は「バルク放出」がより効果的な結果を提供する場合もある。ポリマーは、ヒドロゲルの形態（典型的には、最大約９０重量％の水を吸収している）であってもよく、場合により、多価イオン又は多価ポリマーで架橋されていてもよい。
【０８１２】
マトリックスは、溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出、及び当業者に公知の他の方法によって形成され得る。生体侵食性ミクロスフェアは、例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｒ，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ５：１３−２２（１９８７）；  Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ６：２７５−２８３（１９８７）；及びＭａｔｈｉｏｗｉｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｐｐｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ＳｃＬ，  ３５：７５５−７７４（１９８８）によって記載されているように、薬物送達のためのミクロスフェアを作製するために開発された方法のいずれかを使用して調製することができる。
【０８１３】
前記デバイスは、移植又は注射の領域を処置するための局所放出（通常、全身の処置のための投与量よりもはるかに少ない投与量を送達する）又は全身送達用に製剤化され得る。これらは、皮下、筋肉、脂肪に移植又は注射されるか、嚥下されてもよい。ある具体的な実施形態において、本発明の少なくともいくつかの実施形態による治療化合物が（必要に応じて）ＢＢＢを通過することを確実にするために、それらは、例えば、リポソーム中に製剤化され得る。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、第５，３７４，５４８号、及び第５，３９９，３３１号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞又は器官に選択的に輸送されて、標的化された薬物送達を増強する、１又は複数の部分を含み得る（例えば、Ｖ．  Ｖ．  Ｒａｎａｄｅ（１９８９）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２９：６８５を参照のこと）。例示的な標的化部分として、葉酸又はビオチン（例えば、米国特許第５，４１６，０１６号〜Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．を参照のこと）、マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １５３：１０３８）、抗体（Ｐ．  Ｇ．  Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３５７：１４０；  Ｍ．  Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ３９：１８０）、サーファクタントプロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ａｍ．  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２３３：１３４）、ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：９０９０）が挙げられる。Ｋ．  Ｋｅｉｎａｎｅｎ；  Ｍ．  Ｌ．  Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３４６：１２３；  Ｊ．  Ｊ．  Ｋｉｌｌｉｏｎ；  Ｉ．  Ｊ．  Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）  Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３についても参照のこと。
【０８１４】
本発明のいくつかの実施形態の組成物は、必要に応じて、有効成分を含む１又は複数の単位剤形を含み得る、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）に承認されたキットなどのパック又はディスペンサーデバイスで提示され得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属又はプラスチックの箔を含み得る。パック又はディスペンサーデバイスには、投与のためのインストラクション（instructions for administration）が添付され得る。パック又はディスペンサーは、医薬品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の容器に関連付けられた通知によって適応される場合もあり、この通知は、人若しくは動物投与用組成物の形態の機関による承認を反映している。このような通知は、例えば、処方薬についてアメリカ食品医薬品局によって承認されたラベル、又は承認された添付文書に関するものである場合がある。適合性のある医薬担体中に製剤化された本発明の調製物を含む組成物もまた、上記でさらに詳述されたように、調製され、適切な容器に入れられ、そして適応とされた状態の処置のためにラベルを付され得る。
【０８１５】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、±１０％を指す。
【０８１６】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語及びそれらの複合は、「含むがそれに限定されない」ことを意味する。
【０８１７】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、「含み且つ限定される」ことを意味する。
【０８１８】
「本質的に〜からなる」という用語は、追加の成分、工程、及び／又は部分が請求の範囲の組成物、方法、又は構造の基本的及び新規の特性を実質的に（ｍａｔｅｒｉａｌｌｙ）変更しない場合に限り、組成物、方法、又は構造が追加の成分、工程、及び／又は部分を含み得ることを意味する。
【０８１９】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び定冠詞「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の参照を含む。例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」又は「少なくとも１つの化合物（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」という用語は、複数の化合物（それらの混合物を含む）を含み得る。
【０８２０】
本出願を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、全ての可能な部分的範囲を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の説明は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分的範囲並びにその範囲内の個々の数字（１、２、３、４、５、及び６など）を具体的に開示していると見なす必要がある。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０８２１】
本明細書で数値範囲が示されるときは常に、示された範囲内の引用された数字（分数又は整数）を含むことを意味する。第１の表示番号及び第２の表示番号の「間の範囲（に及んでいる）／範囲（に及ぶ）」という句、及び第１の表示番号「から」第２の表示番号「までの範囲（に及んでいる）／範囲（に及ぶ）」という句は、本明細書では互換的に使用され、１番目に示された数字及び２番目に示された数字並びにそれらの間の全ての分数と整数を含むことを意味する。
【０８２２】
本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、所与の課題（タスク）を達成するための方法、手段、技術、及び手順を指し、化学、薬理学、生物学、生化学、及び医学の専門家に公知であるか、それらの専門家により公知の方法、手段、技術、及び手順から容易に開発される方法、手段、技術、及び手順を含むがこれらに限定されない。
【０８２３】
特定の配列表を参照する場合、かかる参照は、例えば、配列決定エラー、クローニングエラー、又は塩基置換、塩基欠失、若しくは塩基付加をもたらすその他の変化がもたらすマイナーな配列変異を含むものとして、その相補的配列に実質的に対応する配列も包含すると理解されるべきである。但し、かかる変化の頻度は５０ヌクレオチドに１未満、あるいは１００ヌクレオチドに１未満、あるいは２００ヌクレオチドに１未満、あるいは５００ヌクレオチドに１未満、あるいは１０００ヌクレオチドに１未満、あるいは５，０００ヌクレオチドに１未満、あるいは１０，０００ヌクレオチドに１未満である。
【実施例】
【０８２４】
ここで、以下の実施例を参照する。これらの実施例は、上記の説明と共に、本発明のいくつかの実施形態を非限定的な方法で示している。
【０８２５】
一般に、本明細書で使用される命名法及び本発明で利用される実験室手順は、分子、生化学、微生物学的及び組換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（１９８９）；  Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｒ．Ｍ．、ｅｄ．“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ“  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ（１９９４）；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ“、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；  Ｐｅｒｂａｌ、“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ“、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；  Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ“、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ） “Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ“、Ｖｏｌｓ．１−４、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；例えば米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、及び同第５，２７２，０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ、Ｊ．  Ｅ．、ｅｄ．  “Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ“、Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ（１９９４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  −  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”（１９９４）、Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ； “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ“  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．  Ｅ．、ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）、“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ  （１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （ｅｄｓ）、“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ“、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能なイムノアッセイは特許及び科学文献に広範囲に記載されており、例えば  米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号、及び同第５，２８１，５２１号などを参照；Ｇａｉｔ、Ｍ．  Ｊ．、ｅｄ． “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（１９８４）；Ｈａｍｅｓ、Ｂ．  Ｄ．、ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．、ｅｄｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”（１９８５）；Ｈａｍｅｓ、Ｂ．  Ｄ．、ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．、ｅｄｓ．“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”（１９８４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｒ．Ｉ．、ｅｄ．“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ“ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ、Ｂ．、“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）及び“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ“  Ｖｏｌ．  １−３１７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ“、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  （１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ“  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照のこと。これらは全て、本明細書に完全に記載されているかのように参照として援用される。他の一般的な参考文献は、本明細書全体を通して提供される。その中の手順は、当該技術分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれる全ての情報は、本明細書中に参照として援用される。
【０８２６】
実施例１
ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアントの選択
以下のパラメーターを最適化するために、本明細書で「ＤＳＰ１０７」と称される、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端Ｈｉｓタグ（配列番号４３、図１）を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の構造分析を行った。
【０８２７】
・  折り畳み…標的への結合を可能にする適切な折り畳み。潜在的なジスルフィドスクランブリングを最小限に抑える。
【０８２８】
・  完全性…露出したタンパク質分解部位がない。
【０８２９】
・  多量体化…２つのドメインの潜在的な多量体化を調査する。具体的には、Ｃ末端ドメイン形成の三量体化を最適化する。
【０８３０】
・  哺乳類の発現系における高発現。
【０８３１】
・  低い免疫原性。
【０８３２】
具体的には、ＳＩＲＰαドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ７８３２４  ＥＭドメインの３１番目〜３７３番目のアミノ酸に対応、配列番号２）の場合：
【０８３３】
１．  包括的ＳＩＲＰαモデル（SIRPα comprehensive model）は、ＰＤＢ構造（２ＪＪＳ、２ＪＪＴ、２ＵＶ３、２ＷＮＧ、４ＣＭＭ、４ＫＪＹ、６ＢＩＴ）に基づいて生成された。ＳＩＲＰαのＣ末端部分がこれらのＰＤＢ構造（ＶＡＬ３３８から開始、すなわちＶＳＡＨＰＫＥＱＧＳＮＴＡＡＥＮＴＧＳＮＥＲＮＩＹ、配列番号９）では欠落しているため、モデリング及びホモロジーモデリングの手法を適用して、妥当と思われる予測モデルを作成した。
【０８３４】
２．  構造解析…構造解析は、目的のプロファイルに影響を与える可能性のある融合タンパク質内の潜在的な要素を強調するために実施した。これらの分析には以下が含まれる。
・Ｄｅｌｐｈｉ及びＣＨＡＲＭＭに基づくアルゴリズムを使用する静電ポテンシャル表面計算を用いての、タンパク質凝集及び非天然オリゴマー化を引き起こす可能性のある疎水性セグメントの識別。
・公開されているＸ線構造に基づく融合タンパク質のホモロジーモデリング。
・高解像度構造が決定されていない領域の構造予測（構造予測サーバー：Ｒｏｂｅｔｔａ、ＴＡＳＳＥＲ、ＰＥＰ−ＦＯＬＤ３を使用）。
・タンパク質分解部位予測のための、ＰＲＯＳＰＥＲサーバーによる融合タンパク質（又は示唆されるバリアント）の配列上の潜在的な切断部位の予測。
【０８３５】
３．  ＳＩＲＰα発現ドメインと４−１ＢＢＬとのＤＳＰ１０７ドッキング（結合）を評価するために、潜在的に生じうる誤った折りたたみ形態（potential misfolded forms）の大まかなモデルを生成した。
【０８３６】
４−１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ４１２７３  ＥＭドメインの５０番目〜２５４番目のアミノ酸に対応、配列番号３）の場合：
【０８３７】
１．  ４−１ＢＢ−Ｌ細胞外（ＥＣ）ドメインモデルは、ＰＤＢ構造：２Ｘ２９に基づいて生成された。４−１ＢＢＬのＮ末端部分が欠落しており、Ｘ線で解像されなかった（not resolved）ため、このセグメント（ＡＣＰＷＡＶＳＧＡＲＡＳＰＧＳＡＡＳＰＲＬＲＥＧＰＥＬＳＰＤ、配列番号１０）が、疎水性残基を溶媒に曝露し、その構造を予測しようとする試みでは非構造化領域が示されたものと思われる。これにより、融合ＤＳＰ１０７の安定性が低下し、４−１ＢＢＬを介した三量体化の適切な配向が妨げられる可能性がある。
【０８３８】
２．  前記融合タンパク質を、そのタンパク質分解部位について、ＰＲＯＳＰＥＲサーバーを使用して分析した。
【０８３９】
３．  溶媒に向かって外側を向いている４−１ＢＢＬ分解ドメイン内のループが検出された。これは、プロセシングを受ける領域でありうることを意味する。
【０８４０】
図２Ａ〜図３及び表３に、生成された３Ｄモデル、識別されたドメイン及びセグメント、並びにＤＳＰ１０７融合タンパク質の分析で検出された予測タンパク質分解部位を示す。
【０８４１】
まとめると、構造分析は次のことを示した。
【０８４２】
１．  ４−１ＢＢＬドメインのＮ末端セグメント（ＡＣＰＷＡＶＳＧＡＲＡＳＰＧ、配列番号６／ＡＣＰＷＡＶ、配列番号７）を除去すると、ＤＳＰ１０７の可動性及び疎水性が低下すると予想される。
【０８４３】
２．  Ｉｇ様Ｃ１ｔｙｐｅ１及びＩｇ様Ｃ１ｔｙｐｅ２を除去すると、ＣＤ４７相互作用ドメインを活性に保ちながら、タンパク質のサイズが小さくなる。したがって、ＳＩＲＰαのＣ末端は、４−１ＢＢＬに連結したＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳ（配列番号８）で終わる必要がある。
【０８４４】
３．  ４−１ＢＢＬドメインのＮ末端セグメント（ＡＣＰＷＡＶＳＧＡＲＡＳＰＧ、配列番号６／ＡＣＰＷＡＶ、配列番号７）には遊離Ｃｙｓ残基があり、誤ったジスルフィド結合により適切な折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）／再編成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を妨げる場合がある。
【０８４５】
４．  ＳＩＲＰαのＮ末端にある６−Ｈｉｓタグは、ＳＩＲＰαの最初の３つのグルタミン酸と相互作用し、この領域のマスキングをもたらすと予測される。
【０８４６】
５．  隣接／非構造化領域には切断部位がほとんどないようである。
【０８４７】
【表３】
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【０８４８】
４−１ＢＢＬ又はその任意のバリアントに融合され得る、配列番号２４又は配列番号２６のアミノ酸配列を有するＳＩＲＰαバリアントをいくつか、構造分析に基づいて設計した。
【０８４９】
また、ＳＩＲＰα又はその任意のバリアントに融合され得る、配列番号２２、２３、２７、２８、７０、７２、７４、又は７６のアミノ酸配列を有する４−１ＢＢＬバリアントをいくつか、構造分析に基づいて設計した。
【０８５０】
さらに、４−１ＢＢＬ部分の活性を誘導するための融合タンパク質の三量体化の必要性を回避するために、ＳＩＲＰα又はその任意のバリアントに融合され得る４−１ＢＢＬアミノ酸配列の３回の反復を含む４−１ＢＢＬバリアントを設計した。かかる４−１ＢＢＬバリアントの例示的な配列は配列番号７８のアミノ酸配列を有し、これは配列番号２３の反復を３つ含み、該反復間に（ＧＧＧＧＳ）×２＋ＧＧＧＧ（配列番号８２）リンカーを有する。
【０８５１】
かかる反復３つを有する４−１ＢＢＬアミノ酸配列を含むＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合体の例として、予測３Ｄモデルが、ホモロジーモデリング並びにそれに続く側鎖及びループ精製を使用して生成された。これらのモデル分析で、リガンドへの結合の可能性があること及び異なるドメイン間の干渉がないことが予測された（図３７Ａ及び図３７Ｂ）。
【０８５２】
続いて、いくつかのＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアントを設計した。それらの選択の根拠及びそれらの３Ｄモデルを含む配列を、以下の表４並びに図４〜図６及び図３７に示す。
【０８５３】
【表４−１】
2021529547.tif 000008
【０８５４】
【表４−２】
2021529547.tif 000009
【０８５５】
【表４−３】
2021529547.tif 000010
【０８５６】
【表４−４】
2021529547.tif 000011
【０８５７】
【表４−５】
2021529547.tif 000012
【０８５８】
【表４−６】
2021529547.tif 000013
【０８５９】
【表４−７】
2021529547.tif 000014
【０８６０】
【表４−８】
2021529547.tif 000015
【０８６１】
実施例２
ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアントの製造
比較機能分析及び産生評価のために、いくつかのヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ付きＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質が産生された。
【０８６２】
Ｃ末端Ｈｉｓタグ（配列番号１）を含み本明細書で「ＤＳＰ１０７」と称されるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質、並びにそれぞれＣ末端Ｈｉｓタグを含み本明細書で「ＤＳＰ１０７＿Ｖ１」、「ＤＳＰ１０７＿Ｖ２」、及び「ＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１」と称される３つのＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアント（それぞれ配列番号１２、１４、及び１７）の産生は、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞で行った。
【０８６３】
Ｎ末端Ｈｉｓタグを含む「ＤＳＰ１０７」（配列番号４４）の産生は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で行った。
【０８６４】
細胞を、完全融合タンパク質及び３つのバリアントのコード配列でクローン化したｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターによってトランスフェクトした。前記配列は、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列、Ｎ末端に人工シグナルペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ、配列番号４）、Ｎ末端又はＣ末端に６×Ｈｉｓタグ、及びＣ末端（配列番号５１〜５４及び６９）に終止コドンを添加して、ＥｃｏＲＩ制限酵素及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を使用してベクターにクローン化した。前記タンパク質を細胞培養物の上清から回収して、ＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＦＦ  Ｃｒｕｄｅカラムによるワンステップ精製により精製した。
【０８６５】
これらの産生条件下で、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号１）の収量は、培養物１リットルあたり約６７ｍｇであった。比較すると、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１（配列番号１２）及びＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１４）の収量は、培養液１リットルあたり約１５０ｍｇであり、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１（配列番号１７）の収量は、培養液１リットルあたり約２１２ｍｇであった。収量は、最終産物のＢＣＡタンパク質測定によって決定した。
【０８６６】
続いて、Ｈｉｓタグ付きタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、精製された三量体の画分を回収した。１０ｍｇのＨｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１及びＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１２及び１４）を、移動相としてＰＢＳを含むＳｕｐｅｒｄｅ×２００カラム（６０＋１００×１．６ｃｍ）に１ｍＬ／分の流速でロードした。タンパク質三量体に対応する主要なピークを回収した。
【０８６７】
本明細書で「ＤＳＰ１０７＿Ｖ１」及び「ＤＳＰ１０７＿Ｖ２」と称されるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の２つのバリアント（それぞれ配列番号１１及び１３）の産生は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞及びＣＨＯ−Ｓ細胞（ＤＳＰ１０７−Ｖ２のみ）で行われた。
【０８６８】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＤＳＰ１０７＿Ｖ１及びＤＳＰ１０７＿Ｖ２バリアントのコード配列でクローン化されたｐＧｅｎＨＴ１．０発現ベクターによってトランスフェクトした。コザック配列及びＮ末端に人工シグナルペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ、配列番号４）を添加して、配列をベクターにクローン化した。ＣＨＯ−Ｓ細胞は、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２バリアントのコード配列でクローン化されたｐＭＡＸＸ１発現ベクターによってトランスフェクトした。前記配列は、５’非翻訳ＤＮＡ配列、コザック配列、及びリツキシマブ重鎖のシグナルペプチド（ＭＧＷＳＬＩＬＬＦＬＶＡＶＡＴＲＶＬＳ、配列番号９９）を添加してベクターにクローン化した。トランスフェクトされた細胞をミニプールとして選択し、ＤＳＰ１０７バリアントの発現をバッチ培養又は流加培養のいずれかで評価した。タンパク質は細胞培養の上清から回収し、ＥＬＩＳＡ（図１７）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１８）によって評価した。
【０８６９】
ＣＨＯ−Ｋ１由来の選択されたミニプールの５日間のバッチ培養の収量は、ＤＳＰ１０７＿Ｖ１で最大７５ｍｇ／Ｌ、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２で最大３２７ｍｇ／Ｌであった。ＣＨＯ−Ｓ由来の選択されたミニプールの１１日間流加培養の収量は、最大１２００ｍｇ／Ｌであった。
【０８７０】
実施例３
ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアントのオリゴマー状態の決定
【０８７１】
材料…実施例２に記載されるように製造した、Ｎ末端Ｈｉｓタグを含むＤＳＰ１０７（配列番号４４）、並びにＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号１）、ＤＳＰ１０７＿Ｖ１（配列番号１２）、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１４）及びＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１（配列番号１７）。Ｓｐｅｃｔｒａ  ＢＲタンパク質分子量マーカー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号２６６３４）、４〜２０％ポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ社、カタログ番号５５６−８０９４）、ｅ−Ｓｔａｉｎ  ｐｅｄ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、カタログ番号Ｌ０２０１１）、Ｌａｅｍｍｌｉローディングバッファー（ＢｉｏＲａｄ社、カタログ番号１６１−０７４７）。
【０８７２】
方法…
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析…各試料のタンパク質２μｇをβ−メルカプトエタノールを含む又は含まないローディングバッファーと混合し（それぞれ還元又は非還元条件）、９５℃で５分間加熱し、４〜２０％勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ゲル上でのタンパク質の移動は、ｅ−Ｓｔａｉｎ  ｐｅｄを使用した染色と、製造元の指示に従ってｅ−Ｓｔａｉｎシステム（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を使用した洗浄とによって視覚化した。
【０８７３】
質量分析（ＭＳ）…各タンパク質試料５μｇを、還元せずにヨードアセトアミド（ＩＡＡ）によりシステイン（Ｃｙｓ）を修飾した後、又は還元的ジメチル化還元及びヨードアセトアミド（ＩＡＡ）によるシステイン（Ｃｙｓ）修飾の後に、トリプシン処理した。試料を、ＨＦＸ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ社）を使用して分析し、ヒトのＵｎｉＰｒｏｔデータベース及びデコイデータベース（誤検出率（ＦＤＲ）を決定するため）に対してＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェアバージョン１．４を使用して、また具体的配列に対してＳｅｑｕｅｓｔ検索エンジンを使用して、識別した。さらに、ＭａｓｓＭａｔｒｉｘソフトウェア及びＳｔａｒｖｏＸソフトウェアを使用してＳ−Ｓ結合を検出した。
【０８７４】
ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析…タンパク質をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にロードし、移動相として１０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰＯ４）（ｐＨ８．０）＋１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を使用して０．８ｍＬ／分の流速でランを実施した。検出は、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ社）＋ＭｉｎｉＤａｗｎ  ＴＲＥＯＳ＋ＯＰＴＩＬＡＢ  Ｔ−ｒｅＸ（ＷＹＡＴＴ社）を使用して、ＵＶ、ＭＡＬＳ、及びＲＩによって実施した。
【０８７５】
結果…産生されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７及びＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号４４及び配列番号１）、並びにＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１及びＤＳＰ１０７＿Ｖ２が、還元条件で７０ｋＤａの分子量マーカーよりもわずかに移動が遅いことが示された（図７Ａ）。予想通り、同様の条件で、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７−Ｖ３．１（配列番号１７）は、他のバリアントとは移動が異なり、４０ｋＤａマーカーと同様の位置に現れた。非還元条件下では、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７及びＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号４４及び配列番号１）は、主に高分子量タンパク質（〜２１０ｋＤａ）として現れた（図７Ｂ）。これらのタンパク質のごく一部、並びにＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１及びＤＳＰ１０７＿Ｖ２は、還元条件での移動と同様（すなわち、約７５ｋＤａ）に移動した。これは、ＤＳＰ１０７融合タンパク質がＳ−Ｓ結合多量体を含むことを示唆しうる。Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７−Ｖ３．１は、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７−Ｖ１及びＤＳＰ１０７−Ｖ２のように、還元条件下と非還元条件下とで同様に移動した。これは、ＤＳＰ１０７タンパク質中にあると予測されるＳ−Ｓ結合が、３つ全てのバリアントの配列から除去された遊離システイン残基（Ｃｙｓ３４６）によって媒介されていることを示唆している。
【０８７６】
Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７及びＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７の還元体対非還元体についての質量分析（ＭＳ）分析により、Ｃｙｓ３４６が部分的にＳ−Ｓ結合していたことが示された。この知見は、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７及びＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号４４及び配列番号１）の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析における二量体の存在と相関していた。一方、Ｃｙｓ３４６はＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ＿Ｖ１、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２及びＤＳＰ１０７−Ｖ３．１から除去されていたため、該３つのバリアントの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では高次のオリゴマーは検出されなかった。
【０８７７】
産生されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬタンパク質のＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析で、３つ全てのＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアント（配列番号１２、１４、及び１７）及びタグなしＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）が三量体を形成することが示された。計算された総タンパク質の質量は、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１（配列番号１２）で約２５８ｋＤａ、Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１４）で約２６９ｋＤａ、Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１（配列番号：１７）で１０７ｋＤａ、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）で約２１０±２０ｋＤａ（図３８）であった。
【０８７８】
実施例４
ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアントは両方のドメインを含む
【０８７９】
材料…実施例２に記載されるように製造したＮ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号４４）、並びにＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号１）、ＤＳＰ１０７＿Ｖ１（配列番号１２）、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１４）、及びＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１（配列番号１７）。ウエスタンブロット分析では、Ｓｐｅｃｔｒａ  ＢＲタンパク質マーカー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号２６６３４）、Ｌａｅｍｍｅｌｉローディングバッファー（ＢｉｏＲａｄ社、カタログ番号１６１−０７４７）、４〜２０％ポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ社、カタログ番号５５６−８０９４）、抗４−１ＢＢＬ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社、５３６９−１００）、抗ＳＩＲＰαビオチン化（番号ＬＳ−Ｃ３７０３３７、ＬｓＢｉｏ社）、二次ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ複合体（Ｒ＆Ｄ社、カタログ番号１７０−６５１５）、ストレプトアビジンタンパク質、ＨＲＰ（番号２１１２６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社、カタログ番号３２１３２）。サンドイッチＥＬＩＳＡでは、抗４−１ＢＢＬ抗体（一致したペアからの捕捉抗体、Ａｂｎｏｖａ社、番号Ｈ００００８７４４−ＡＰ４１）、抗ＳＩＲＰαビオチン化抗体（ＬｓＢｉｏ社、番号ＬＳ−Ｃ３７０３３７）、ストレプトアビジンタンパク質、ＨＲＰ（番号２１１２６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＴＭＢ基質（１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、番号３４０２８）。
【０８８０】
方法…
ウエスタンブロット分析…タンパク質（レーンあたり５００ｎｇ又は５０ｎｇ）を還元条件又は非還元条件（それぞれ、β−メルカプトエタノールを含み、９５℃で５分間煮沸したローディングバッファー、又はβ−メルカプトエタノールを含まないサンプルバッファーで加熱なし）で処理し、４〜２０％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。タンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、一次抗体である抗４−１ＢＢＬ（１：１００００）又はビオチン化抗ＳＩＲＰα（１：１０００）と共に一晩インキュベートした後、ＨＲＰ標識二次抗体（１：１００００）又はストレプトアビジン−ＨＲＰ基質（１：２００００）のそれぞれと１時間インキュベートした。電気化学発光（ECL development）後にシグナルを検出した。
【０８８１】
サンドイッチＥＬＩＳＡ…プレートを抗４−１ＢＢＬ抗体（ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍＬ）でコーティングし、ブロッキング溶液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ）でブロックする。産生されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質をブロッキング溶液で段階希釈し、コーティングしたプレートに加えて２時間インキュベートした後、製造業者の推奨に従って、検出用抗ＳＩＲＰα−ビオチン化抗体（１：１００）と共にインキュベートし、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を用いて検出した。プレートは、プレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣ）を使用し、６２０ｎｍをリファレンス波長として、４５０ｎｍで分析した。
【０８８２】
結果…非還元又は還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのＮ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号４４）、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号１）、及び３つのＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７バリアント（ＤＳＰ１０７＿Ｖ１、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２、ＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１）（配列番号１２、１４、及び１７）の分離とそれに続く抗４−１ＢＢＬ抗体（図８Ａ〜図８Ｂ）又は抗ＳＩＲＰα抗体（図８Ｃ）を用いた免疫ブロットでは、分子のＮ末端側及び分子のＣ末端側の両方が存在することが実証された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（上記実施例３）に従って、ウエスタンブロット分析では、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７、並びにＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７、ＤＳＰ１０７＿Ｖ１、及びＤＳＰ１０７＿Ｖ２タンパク質が、還元条件で、予想されるＤＳＰ１０７モノマーサイズに対応する約７５ｋＤａのサイズとして移動したことが示された。非還元条件下では、高分子量である追加のバンドも、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７及びＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７融合タンパク質において抗４−１ＢＢＬ抗体で検出され、これはＳ−Ｓ結合多量体の形成を示唆する。
【０８８３】
続いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を設計して、４−１ＢＢＬドメインに結合する捕捉抗体及びＳＩＲＰαドメインに結合する検出抗体を使用して、産生されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質を検出した。図９に示すように、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７、並びにＣ末端ＨＩｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１及びＤＳＰ１０７＿Ｖ２を、両面ＥＬＩＳＡを使用して同様の用量反応様式で検出及び定量化した。試験した融合タンパク質の全てがＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインを含むことが示された。
【０８８４】
実施例５
ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアントはＣＤ４７及び４−１ＢＢに結合する
ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬタンパク質のＳＩＲＰα部分のＣＤ４７への結合分析
【０８８５】
ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬのＳＩＲＰαドメインのヒトＣＤ４７への結合を、ＣＤ４７を過剰発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞株又はＣＤ４７を内生的に発現しているＳＵＤＨＬ４ヒトＢ細胞リンパ腫細胞株を使用して評価した。ＣＨＯ−Ｋ１  ＷＴ（野生型）細胞を陰性対照とした。ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬの４−１ＢＢＬドメインのヒト４−１ＢＢへの結合は、４−１ＢＢを過剰発現しているヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０を使用して評価した（Ｗｙｚｇｏｌ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００９  １８３：１８５１−６１）。野生型ＨＴ１０８０細胞株を陰性対照とした。細胞を異なる濃度の産生されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質と共にインキュベートした後二次抗４−１ＢＢＬ抗体で免疫染色してＣＤ４７への結合を検出した。あるいは、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２をビオチン化して、分子の総結合能を測定した。特異的結合は、抗ＣＤ４７ブロッキング抗体、抗４−１ＢＢブロッキング抗体、又は両抗体の組み合わせを使用して評価した。結合はフローサイトメトリーによって分析した（ＦＡＣＳ）。
【０８８６】
材料…実施例２に記載されるように作製したＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号１）、ＤＳＰ１０７＿Ｖ１（配列番号１２）、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１４）及びＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１（配列番号１７）、並びにＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）。
【０８８７】
ＣＨＯ−Ｋ１−ＷＴ及びＣＨＯ−Ｋ１−ＣＤ４７細胞株（Ｂｏｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ、２０１７、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７（２）：  ｅ１３８６３６１）、ＳＵＤＨＬ４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２９５７）、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２１）、４−１ＢＢ過剰発現ＨＴ１０８０細胞（Ｗｙｚｇｏｌ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００９  １８３：１８５１−６１）、Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号５６２２４７）、ヒトＦｃブロッカーＴｒｕｅ  ｓｔａｉｎ  ＦＣＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４２２３０２）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号Ａ３９２５９）、及び以下の抗体：抗４−１ＢＢＬ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号３１１５０６）、抗ＣＤ４７（ＫＡＨＲ  Ｍｅｄｉｃａｌの指示書によるＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製「Ｉｎｈｉｂｒｉｘ−ｌｉｋｅ」；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号３２３１２４）、抗４−１ＢＢ（ＢＤ社、カタログ番号５５２５３２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号３０９８１０）、アイソタイプＩｇＧ１、ｋ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４００１１２）、ＡＰＣストレプトアビジン（ＳＡ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４０５２０７）、ＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社、カタログ番号Ｃ３４５５４）、ＣｙｔｏＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ（ＩｎｃｕＣｙｔｅ、カタログ番号４７０６）。
【０８８８】
方法…膜におけるＣＤ４７又は４−１ＢＢの発現は、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗ＣＤ４７抗体及び抗４−１ＢＢ抗体、並びに対応するアイソタイプ対照をそれぞれ使用したフローサイトメトリーによって評価した。ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬのＣＤ４７への結合を測定するために、細胞をヒトＦｃブロッカーで事前にインキュベートした後、様々な濃度の産生ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬタンパク質（０．０１〜５０μｇ／ｍＬ、０．１５６〜８０μｇ／ｍＬ、又は０．０５〜２５μｇ／ｍＬ）と氷上で３０分又は１時間インキュベートし、その後抗４−１ＢＢＬ抗体で免疫染色し、固定し、フローサイトメトリーで分析した。ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬの４−１ＢＢへの結合を測定するために、製造業者のプロトコルに従って、ＥＺ−ＬｉｎｋＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎキットを使用してＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬをビオチン化した。続いて、細胞を洗浄し、抗ＣＤ４７ブロッキング抗体と共に３７℃で１時間インキュベートして、ＳＩＲＰαアームのＣＤ４７への結合を防止するか、ブロッキングなしで結合を行って、（２つのリガンドによる）分子を細胞に完全に結合させた。インキュベート後、ビオチン化ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬを細胞に添加し（段階希釈：０．０５〜５０μｇ／ｍＬ、０．２３８〜２３８ｎＭ）、４℃で２０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞を洗浄し、検出抗体ＡＰＣ−ストレプトアビジン（ＳＡ）で染色し、４℃で３０分間インキュベートし、洗浄してフローサイトメトリーで分析した。ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＤ４７細胞は製造業者の指示に従ってＣＦＳＥで染色し、ＨＴ１０８０細胞及び過剰発現細胞はＣｙｔｏＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄで染色した。２つの染色された細胞株を１：１の比率で混合した（細胞株あたり３００００細胞）。いくつかの実験では、ブロッキング抗体（αＣＤ４７、α４１ＢＢ−１０μｇ／ｍＬ）を添加し、４℃で３０分間インキュベートした。５μｇ／ｍＬのＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）を添加し、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。２つの色素のフローサイトメトリーを使用して細胞を分析した。
【０８８９】
結果…膜におけるＣＤ４７の高発現は、ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＤ４７過剰発現細胞、ＳＵＤＨＬ４細胞、及びＨＴ１０１８細胞では観察されたが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞では観察されなかった（図１９Ａ〜図１９Ｂ及び図２０）。ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＤ４７上及びＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）上のＣＤ４７に結合した、全ての被験融合タンパク質は、ＳＵＤＨＬ４細胞に結合し、用量依存的に４−１ＢＢを過剰発現するＨＴ１０８０細胞上の４−１ＢＢ及びＣＤ４７に結合した（図１０、図２１Ａ〜図２１Ｄ、及び図２２）。前記結果は、ビオチン化ＤＳＰ１０７＿Ｖ２のＨＴ１０８０  ４−１ＢＢ  ＯＸ細胞への総結合が、ＨＴ１０８０親細胞への結合と比べて高かったことを示している（図２２）。さらに、ＨＴ１０８０（ＷＴ）細胞への結合は、特異的ブロッキング抗体によるＣＤ４７遮断後に完全に無効となり、ＨＴ１０８０  ４−１ＢＢ  ＯＸ細胞への結合の減少はごく部分的であった。同様に、抗４−１ＢＢ抗体によって誘導されたＨＴ１０８０  ４−１ＢＢ  ＯＸ細胞へのブロッキングもごく部分的であった。両抗体を使用して、ＣＤ４７と４−１ＢＢの両方の対応物を二重遮断（ｄｕａｌ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）すると、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２結合の完全な抑止が達成された（図２２）。タンパク質はＣＨＯ−Ｋ１−ＷＴ細胞には結合しなかった（図２１Ａ及び図２１Ｂ）。アイソタイプ対照は最高濃度のタンパク質とインキュベートしてもバックグラウンド染色を示さなかった。
【０８９０】
続いて、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）のＣＦＳＥ標識ＨＴ１０８０  ４−１ＢＢＯＸ細胞及びＣｙｔｏＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ標識ＣＨＯ−Ｋ１ＣＤ４７ＯＸ細胞への同時結合を評価した。インキュベート後、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２とＣＤ４７及び４−１ＢＢ  ＯＸ細胞の両方との共染色複合体のダブレット（Ｄｏｕｂｌｅｔ）形成が観察され（図２３Ａ）、免疫原性シナプスを介した隣接細胞の近似が示唆された。ＤＳＰ１０７＿Ｖ２を培地対照と比較した３つの独立した実験の平均結果から、ダブレットが約１０％から３０％超へと大幅に増加することが示された（図２３Ｂ及び図２４）。重要なことに、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２によるダブレットの形成は、抗ＣＤ４７又は抗４−１ＢＢブロッキング抗体との共培養時に強く阻害された。この知見は、ＣＤ４７及び４−１ＢＢの両方に同時に結合するＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬの作用機序と一致している。
【０８９１】
ヒト、マウス、及びカニクイザルのＣＤ４７及び４−１ＢＢ対応物への、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬの結合
【０８９２】
産生されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のＣＤ４７及び４−１ＢＢへの結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって測定した。
【０８９３】
材料…実施例２に記載されるように製造したＮ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号４４）、並びにＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１（配列番号１２）、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１４）、及びＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）。
【０８９４】
Ｓｅｒｉｅｓ  ＳセンサーチップＣＭ５（ＧＥ社、カタログ番号ＢＲ１００５３０）、ヒト抗体捕捉キット（ＧＥ社、カタログ番号ＢＲ１００８３９）、ヒトＰＤＬ１−ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ社、カタログ番号１５６−Ｂ７−１００）、ヒトＣＤ４７−ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ社、カタログ番号４６７０−ＣＤ−０５０）、マウスＣＤ４７−ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号１８６６−ＣＤ−０５０）、カニクイザルＣＤ４７−ｈＦｃ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＣＤ７−Ｃ５２５２）、ヒト４−１ＢＢ−ｈＦｃ（ＬｓＢｉｏ社、カタログ番号ＬＳ−Ｇ４０４１−１００）、マウス４−１ＢＢ−ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ社、カタログ番号９３７−４Ｂ−０５０）、カニクイザル４−１ＢＢ−ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ社、カタログ番号９３２４−４Ｂ−１００）。
【０８９５】
方法…ＳＰＲアッセイは、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００バイオセンサー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して実施した。ヒト抗体捕捉キットの２５μｇ／ｍＬ抗ヒトＩｇＧ（抗Ｆｃ）抗体を、製造業者が推奨する標準のアミンカップリングプロトコルを使用して、チップの４つのフローチャネル全て（Ｆｃ１〜Ｆｃ４）にカップリング（coupled to）させた。ＣＤ４７及び４−１ＢＢのチップへの結合は、ＨＢＳ−ＥＰ＋ランニングバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で行った。ヒトＰＤＬ１（陰性対照）を参照チャネルＦｃ１にロードし（１回目の実験では１０μｇ／ｍＬ、２回目の実験では５μｇ／ｍＬ、２０μＬ／分で１０秒間）、チャネルＦｃ２〜Ｆｃ４には、ヒト、マウス、及びカニクイザルＣＤ４７−ｈＦｃタンパク質をロードした（１回目の実験では１０μｇ／ｍＬ、２回目の実験では５μｇ／ｍＬ、２０μＬ／分で５秒間）。チップの自動再生に続いて、チップはチャネルＦｃ１にヒトＰＤＬ１−ｈＦｃを、チャネルＦｃ２〜Ｆｃ４にヒト、マウス、及びカニクイザル４−１ＢＢ−ｈＦｃタンパク質を再ロードした（１回目の実験でそれぞれ１０、５、及び７．５μｇ／ｍＬ、２回目の実験でそれぞれ５、２．５、及び３．７５μｇ／ｍＬ、２０μＬ／分で５秒間）。チップは全ての対応物で完全にチャージした（リガンドの平均固定化量は１５０ＲＵであった）。続いて、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号４４）、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１（配列番号１２）及びＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１４）を４つのチャネル全てを通過させた。このプロセスは、５０μＬ／分の流速で様々な濃度のＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質（５００〜０．１、２ｎＭ、連続１：２希釈）を使用して反復して繰り返した（会合時間：１２０秒、解離時間：ＣＤ４７タンパク質の場合は３００秒、４−１ＢＢタンパク質の場合は６００秒）。各サイクルの最後に３Ｍ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）溶液を注入し（２０μＬ／分で４５秒）、捕捉された分子を除去して活性表面を再生した。結合パラメーターは、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ．３．０．２（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）の動力学的結合（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ）（１：１）モデルを使用して評価した。
【０８９６】
結果…動態解析では、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７並びに２つのＣ末端Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアントＤＳＰ１０７＿Ｖ１及びＤＳＰ１０７＿Ｖ２が、ヒトＣＤ４７及びカニクイザルＣＤ４７と同様の高い親和性を持ち、マウスＣＤ４７との親和性が低いことが示された（以下の表５Ａ）。ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の動態解析では、ヒトＣＤ４７及びカニクイザルＣＤ４７に対して類似した高い親和性が示され、マウスＣＤ４７に対しては親和性が示されなかった（表５Ｂ〜表５Ｃ）。試験した４つのＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は全て、ヒト４−１ＢＢ及びカニクイザル４−１ＢＢと同様の高い親和性を示し、マウス４−１ＢＢには結合しない。被験ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質はいずれも、ヒトＰＤＬ１陰性対照には結合しなかった。
【０８９７】
【表５Ａ】
2021529547.tif 000016
【０８９８】
【表５Ｂ】
2021529547.tif 000017
【０８９９】
【表５Ｃ】
2021529547.tif 000018
【０９００】
実施例６
ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアントによる４−１ＢＢの活性化
【０９０１】
産生されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質による４−１ＢＢ受容体の活性化効果は、４−１ＢＢ受容体を過剰発現しているＨＴ１０８０細胞を使用して試験する。具体的には、ＨＴ１０８０−４−１ＢＢ細胞株は４−１ＢＢを過剰発現しており、４−１ＢＢＬの結合時にＩＬ８を分泌することが知られている（Ｗｙｚｇｏｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８３（３）：１８５１−６１）。したがって、これらの細胞の表面にある４−１ＢＢ受容体への４−１ＢＢＬの結合は、シグナル伝達経路の活性化とそれに続くＩＬ８の分泌をもたらすと予想される。この目的のために、細胞を異なる濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬの存在下でインキュベートし、培地へのＩＬ８分泌をＥＬＩＳＡで測定する。
【０９０２】
材料…上記実施例２に記載されるように製造したＮ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号４４）、並びにＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号１）、ＤＳＰ１０７＿Ｖ１（配列番号１２、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１４）、及びＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１（配列番号１７）、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）。
【０９０３】
ＨＴ１０８０−４−１ＢＢ細胞（Ｗｙｚｇｏｌ、ｅｔ  ａｌ、２００９、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、組換えヒトＨｉｓタグ付きＣＤ４７タンパク質（ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社、カタログ番号ＣＤ７−Ｈ５２２７）、組換えヒトＨｉｓタグ付き４−１ＢＢＬタンパク質（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、カタログ番号８４６０ＬＦ）、ＩＬ８  ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｄ８０００Ｃ、Ｒ＆Ｄ社）、ＤＭＥＭ（カタログ番号０１−０５５−１Ａ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）、ＦＢＳ（カタログ番号１０２７０１０６、Ｒｈｅｎｉｕｍ社）、ＡＩＭ  Ｖ（無血清培地）（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、抗ＣＤ４７抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号１６−０４７９−８５、クローンＢ６Ｈ１２）。
【０９０４】
方法…単一培養アッセイ：平底の９６ウェルプレートを５μｇ／ｍＬの組換えヒトＨｉｓタグ付きＣＤ４７タンパク質でコーティングした。洗浄工程の後、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質を添加し（０〜５μｇ／ｍＬ）、３７℃で１時間インキュベートした。野生型（ＷＴ）ＨＴ１０８０細胞又はＨＴ１０１８−４−１ＢＢ細胞をウェルに添加し（１０，０００細胞／ウェル）、無血清培地で３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベート後、上清中のＩＬ８濃度を、製造業者のプロトコルに従ってＩＬ８ＥＬＩＳＡキットによって測定した。プレートは、プレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣ）を使用し、５４０ｎｍをリファレンス波長として、４５０ｎｍで分析した。ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬの効果は、その個々の可溶性成分、ヒトＳＩＲＰα、ヒト４−１ＢＢＬ、又は両方の組み合わせの効果とも比較した。結合特異性を測定するために、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質を添加する１時間前に抗ＣＤ４７ブロッキング抗体競合物質を培養物に添加して、ＳＩＲＰαアームを介した結合をブロックした。
【０９０５】
共培養アッセイ：ＣＨＯ−Ｋ１（ＷＴ）又はＣＨＯ−Ｋ１−ＣＤ４７細胞を平底９６ウェルプレート（１０，０００細胞／ウェル）に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、上清を廃棄し、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質を添加し（０〜１０μｇ／ｍＬ）、３７℃で１時間インキュベートした後、洗浄工程を行った。次に、ＨＴ１０８０（ＷＴ）又はＨＴ１０８０−４−１ＢＢ細胞を添加し（１０，０００細胞／ウェル）、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベート後、上清中のＩＬ８濃度は、製造業者のプロトコルに従ってＩＬ８ＥＬＩＳＡキットによって測定した。プレートは、プレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣ）を使用し、５４０ｎｍをリファレンス波長として、４５０ｎｍで分析した。
【０９０６】
結果…単一培養アッセイでは、ＤＳＰ１０７−Ｖ２（配列番号１３）はプレート結合ＣＤ４７の存在下でＨＴ１０８０−４−１ＢＢ細胞からのＩＬ−８分泌を誘導した一方で、ＣＤ４７の非存在下では、活性化効果が有意に低いことが明らかであった（図２５Ａ、ｐ＜０．００３、約３倍減少）。プレート結合ＤＳＰ１０７＿Ｖ２及び可溶性ＤＳＰ１０７＿Ｖ２の両方とも、活性は、抗ＣＤ４７抗体によって完全に無効となった。可溶性ＤＳＰ１０７＿Ｖ２のブロックは、ＨＴ１０８０細胞で発現する内因性ＣＤ４７への低結合の抑制に起因する可能性がある。
【０９０７】
さらに、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２は、可溶性４−１ＢＢＬ又は可溶性ＳＩＲＰαと４−１ＢＢＬとの組み合わせよりも効果的に４−１ＢＢシグナル伝達を活性化（約３倍増加）した（図２５Ｂ）。予想通り、可溶性ＳＩＲＰαは４−１ＢＢ受容体との相互作用がないため効果がなかった。
【０９０８】
さらに、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２で処理した後のＨＴ１０８０−４−１ＢＢ細胞からのＩＬ−８分泌は、ＣＨＯ−Ｋ１（ＷＴ）細胞と比較して、ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＤ４７細胞の存在下で有意に増強された（ｐ＜０．００３２）（約３．５倍）。ＩＬ−８分泌は抗ＣＤ４７抗体によって完全にブロックされ、４−１ＢＢ受容体を介して４−１ＢＢＬアームによる共刺激シグナルを伝達するために交差提示が必要であることをさらに示唆している（図２６）。
【０９０９】
実施例７
ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアントによるＴ細胞の活性化
【０９１０】
Ｔ細胞の活性化には２つのシグナル：抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）／ペプチド複合体とのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のライゲーション、及びＴ細胞上の共刺激受容体とＡＰＣ上の対応するリガンドとの架橋が必要である。４−１ＢＢはＴ細胞共刺激受容体であり、４−１ＢＢＬにライゲーションすると、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の増殖、生存、分化、及びサイトカイン発現を促進する。
【０９１１】
以下を含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞の活性化を測定するための多くの方法が、当技術分野で公知である。
【０９１２】
Ｔ細胞の表面における活性化マーカーの発現（例えば：ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１など）。活性化マーカーの発現は、細胞を特異的抗体で染色し、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によって試験する。
【０９１３】
炎症性サイトカインの分泌（例えば：ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＮＦγなど）。炎症性サイトカインの分泌はＥＬＩＳＡによって試験する。
【０９１４】
増殖。ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）でＴ細胞を前染色し、ＦＡＣＳによって測定されるＣＦＳＥ希釈によって細胞のデビエーション（deviation of cells）を測定することによって測定される（増殖）。
【０９１５】
標的細胞の殺滅。例えば、Ｃａｌｃｉｎｅ（カルセイン）−ＡＭ試薬を使用してがん細胞を前標識し、発光プレートリーダーを使用して培地へのカルセイン放出を測定することによって測定されるがん細胞（である標的細胞の殺滅）。
【０９１６】
この目的のために、産生されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質がヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖に及ぼす影響を、以下のように評価した。
【０９１７】
材料…上記実施例２に記載されるように製造したＮ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号４４）、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１（配列番号１２）及びＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１４）。
【０９１８】
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（カタログ番号１７−１４４０−０３、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ＲＰＭＩ  １６４０（カタログ番号０１−１００−１Ａ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）、ＦＢＳ（カタログ番号１２６５７−０２９、Ｇｉｂｃｏ社）、Ｌ−グルタミン（カタログ番号２５０３０−０２４、Ｇｉｂｃｏ社）、ペニシリンストレプトマイシン（Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ）（カタログ番号１５１４０−１２２、Ｇｉｂｃｏ社）、ＬＥＡＦ  精製抗ヒトＣＤ３（カタログ番号ＢＬＧ−３１７３１５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、組換えヒトＩＬ−２（カタログ番号５８９１０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗４−１ＢＢ抗体（カタログ番号ＢＬＧ−１０６１０９）、抗ＩｇＧ抗体（カタログ番号ＢＬＧ−４０２０１２）。
【０９１９】
方法…ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ法を使用して健康なドナー末梢血から分離した（Ｇｒｉｅｎｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１６、Ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖ  Ｂｉｏｂａｎｋ．  １４（５）：４１０−４１５）。続いて、最適未満濃度の抗ＣＤ３（３０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍＬ）、又は抗ＣＤ３＋ＩＬ−２の存在下で、細胞を、異なる濃度の様々なＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬタンパク質を添加して７日間培養した。ＰＢＭＣの増殖を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３  Ｌｉｖｅ−Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍによって、製造業者のプロトコルに従って測定した。実験の０日目及び３日目に、細胞の４−１ＢＢ表面発現をフローサイトメトリーによって試験した。
【０９２０】
結果…ＰＢＭＣを、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１、及びＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２と共にインキュベートすると、ＩＬ−２の添加の有無に関わらず、細胞コンフルエンシーが増加した。これは抗ＣＤ３抗体で刺激された細胞の増殖率が高いことを示す（図１１）。試験したＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の全てについて、０．０１μｇ／ｍＬの濃度で最適な誘導が得られた。こうして、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１、及びＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２の結合により４−１ＢＢＬ／４−１ＢＢを媒介したＴ細胞増殖を共刺激及び誘導することが可能になった。これらの結果は、ＩＬ−２の有無に関わらず抗ＣＤ３で刺激した後には４−１ＢＢ発現が誘導されたことと相関している（図１２）。
【０９２１】
以下の設定では、ヒトＰＢＭＣ及びＴ細胞の増殖に対するＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の効果を以下のように評価した。
【０９２２】
材料…上記実施例２に記載されるように製造したＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）。
【０９２３】
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（カタログ番号１７−１４４０−０３、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ＲＰＭＩ  １６４０（カタログ番号０１−１００−１Ａ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）、ＦＢＳ（カタログ番号１２６５７−０２９、Ｇｉｂｃｏ社）、Ｌ−グルタミン（カタログ番号２５０３０−０２４、Ｇｉｂｃｏ社）、ペニシリンスレプトマイシン（Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ）（カタログ番号１５１４０−１２２、Ｇｉｂｃｏ社）、組換えヒトＩＬ−２（カタログ番号５８９１０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ダイナビーズ、ＥａｓｙＳｅｐ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、細胞増殖色素（ＣＰＤ、ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号６５−０８４２−８５）、Ｈｉｓタグ付きＣＤ４７組換えタンパク質（ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社、カタログ番号ＣＤ７−Ｈ５２２７）。
【０９２４】
方法…ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ法を使用して健康なドナー末梢血から分離した（Ｇｒｉｅｎｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１６、Ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖ  Ｂｉｏｂａｎｋ．  １４（５）：４１０−４１５）。続いて、ＩｎｃｕＣｙｔｅ分析のために、９６ウェルの平底プレートをポリ−Ｌ−オルニチン（０．０１％、５０μＬ、３７℃で１時間インキュベート）でコーティングして、ＰＢＭＣ細胞を接着させた。ｒｈＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍＬ）及びＤＳＰ１０７＿Ｖ２（０．３３μｇ／ｍＬ）の存在下でＰＢＭＣを播種した（５０，０００個／ウェル）。プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ機器で３７℃で５日間インキュベートした。フェーズスクリーニング画像は３時間ごとに撮影し、細胞密度はＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を使用して分析した。フローサイトメトリー分析では、陰性選択磁気ビーズ（ＥａｓｙＳｅｐ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）によってＰＢＭＣからＴ細胞を分離し、製造業者の指示に従って細胞増殖色素（ＣＰＤ）で染色した。染色されたＴ細胞は、９６ウェルプレートで、又はプレートにＨｉｓタグ付きＣＤ４７組換えタンパク質（２μｇ／ｍＬ、３７℃で３時間）をプレコーティングした後に、最適未満濃度のヒト抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズＴ細胞活性化因子（Ｔ細胞あたり１：１０ビーズ）及びＤＳＰ１０７＿Ｖ２（０．３〜３μｇ／ｍＬ）の存在下で３日間又は５日間培養した。続いて、ＣＤ３＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーでＣＰＤレベルを分析した。
【０９２５】
結果…ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）は、ＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウェアによって捕捉された位相画像分析によって測定されたように、ＩＬ−２によって誘発された新鮮単離ヒトＰＢＭＣの増殖を増強した。具体的には、細胞密度は、ＩＬ−２のみで処理されたＰＢＭＣと比較して、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍＬ）及び１．６ｎＭ（０．３３μｇ／ｍＬ）ＤＳＰ１０７＿Ｖ２とのＰＢＭＣの５日間のインキュベート後に劇的に増加した。代表的な画像を図２８に示す。同様に、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）は、フローサイトメトリーで測定されたように、プレートに結合したＣＤ４７の存在下で、最適未満濃度の抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズによって誘導されるＣＰＤ染色Ｔ細胞の増殖を大幅に（１６％〜３５％、ｐ＜０．００２５）増強した（図２９）。
【０９２６】
産生されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質がＴ細胞活性化マーカーの発現に及ぼす効果を以下のように評価した。
【０９２７】
材料…上記実施例２に記載されるように製造したＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）。
【０９２８】
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（カタログ番号１７−１４４０−０３、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ＲＰＭＩ  １６４０（カタログ番号０１−１００−１Ａ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）、ＦＢＳ（カタログ番号１２６５７−０２９、Ｇｉｂｃｏ社）、Ｌ−グルタミン（カタログ番号２５０３０−０２４、Ｇｉｂｃｏ社）、ペニシリンストレプトマイシン（Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ）（カタログ番号１５１４０−１２２、Ｇｉｂｃｏ社）、ＬＥＡＦ  精製抗ヒトＣＤ３（カタログ番号ＢＬＧ−３１７３１５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、抗４−１ＢＢ抗体（カタログ番号ＢＬＧ−１０６１０９）、ＰＥ抗ＣＤ２５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号３０２６０６）、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号３１７３１０）。
【０９２９】
方法…製造業者の指示に従って、標準的なフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）勾配法を使用して、健康なドナーの末梢血からヒトＰＢＭＣを分離した。９６ウェルプレートは、抗ヒトＣＤ３抗体（０．５μｇ／ｍＬ）で、３７℃で３時間インキュベートすることによりプレコートした。３人のドナーからのＰＢＭＣを、異なる濃度のＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３、０〜５μｇ／ｍＬ）を含む抗ＣＤ３プレコートプレート（１００，０００細胞／ウェル）で３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。インキュベート後、ゲーティングされたＣＤ３＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーで分析し、活性化マーカーＣＤ２５及び４−１ＢＢの発現を調べた。
【０９３０】
結果…ＣＤ２５及び４−１ＢＢ活性化マーカーのＴ細胞上における発現が抗ＣＤ３により誘導され、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）によって、３人の試験ドナー全てにおいて用量依存的に有意に増強された（図２７、４−１ＢＢ発現の場合は０．００１２＜ｐ＜０．０４１、ＣＤ２５発現の場合は０．００３９＜ｐ＜０．０４７）。
【０９３１】
産生されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質がＴ細胞を媒介した標的がん細胞の殺滅に及ぼす効果を、以下のように評価した。
【０９３２】
材料及び方法…ＩｎｃｕＣｙｔｅ分析では、４つのＡＴＣＣがん細胞株であるＳＮＵ４２３、ＳＮＵ３８７、ＳＮＵ４２３肝細胞がん（ＨＣＣ）、及びＯｖｃａｒ８卵巣がん細胞株に、細胞の形質導入に適したＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（試薬）（ＥＦ１α、ピューロマイシン、３ＴＵ／細胞）を、非摂動性核限定赤色蛍光標識を用いて形質導入した。安定した細胞株を確立するために、ピューロマイシン選択（２μｇ／ｍＬ）を適用した。がん細胞株の表面における核赤色蛍光及びＣＤ４７発現は、アッセイの前にフローサイトメトリーによって検証した（データは示さず）。Ｔ細胞を、陰性選択磁気ビーズを使用して、２人の健康なドナーの末梢血試料から分離した。単離したＴ細胞を、５：１のエフェクター対腫瘍比（Ｅ：Ｔ）で異なるがん細胞株と共培養し、最適未満濃度の抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（細胞あたり１：１０ビーズ）及び上記実施例２に記載されるように製造したＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）（０．１１、０．３３、及び１μｇ／ｍＬ）で活性化した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ緑色蛍光カスパーゼ３／７基質試薬を共培養に添加して、アポトーシス細胞を標識した。細胞をＩｎｃｕＣｙｔｅ機器で５日間インキュベートした。フェイズ、緑色及び赤色蛍光画像を１．５時間ごとに記録し、重なり合う緑色及び赤色蛍光（「黄色」）シグナルをアポトーシスがん細胞シグナルとして定量化した。
アポトーシスＣＦＳＥ標識腫瘍細胞のフローサイトメトリー分析のために、ＰＢＭＣを健康なドナーの末梢血から分離し、抗ＣＤ３及びＩＬ−２を使用して１１日間増殖させた。中皮腫がん細胞株ＭＳＴＯ及びＨ２０５２（ＡＴＣＣ）を、プロトコルに従ってＣＦＳＥで染色した。増殖したＰＢＭＣ及び染色されたがん細胞を、上記実施例２に記載されるように製造した０．１μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍＬのＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の存在下で、いくつかのＥ：Ｔ比で共培養した。トリプシンによる剥離後、生存ＣＦＳＥ標識がん細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【０９３３】
結果…ＤＳＰ１０７＿Ｖ２は、Ｔ細胞によって媒介される、肝細胞がん、卵巣がん、及び中皮腫のがん細胞株の殺滅を促進した（図３０Ａ〜図３０Ｄ及び図３１Ａ〜図３１Ｂ）。
【０９３４】
具体的には、ＩｎｃｕＣｙｔｅ分析では、最適未満濃度の抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズで活性化された、Ｔ細胞の存在下における肝細胞がん細胞株及び卵巣がん細胞株の共培養が、がん細胞の殺滅がもたらされることが示された。ＤＳＰ１０７＿Ｖ２の追加により、Ｔ細胞を媒介したＳＮＵ３８７、ＳＮＵ４２３、及びＯｖｃａｒ８細胞の殺滅がそれぞれ４９％、２７％、及び２３％増強された（図３０Ａ〜図３０Ｃ）。これらのがん細胞株をＤＳＰ１０７＿Ｖ２とのみ（図３０Ａ〜図３０Ｃ）インキュベートした後では殺滅は観察されず、Ｔ細胞の非存在下におけるがん細胞株に対する直接的な細胞毒性効果は裏付けられなかった。
【０９３５】
フローサイトメトリー分析では、ＣＦＳＥ標識中皮腫がん細胞株をＴ細胞と様々なＥ：Ｔ比で共培養すると、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２の存在下で増強されるがん細胞の殺滅がもたらされることが示された（図３１Ａ〜図３１Ｂ：ＤＳＰ１０７＿Ｖ２の非存在下での死滅がない場合と比較して、最大５２％の細胞死がＤＳＰ１０７＿Ｖ２によってＥ：Ｔ比１：１〜１：５で誘導された）。肝細胞がん細胞株及び卵巣がん細胞株と同様に、Ｔ細胞の非存在下においては、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２と共にインキュベートした後にＣＦＳＥ標識中皮腫がん細胞株の殺滅は観察されなかった。
【０９３６】
実施例８
ＣＤ４７結合の遮断に対するＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアントの効果
【０９３７】
ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬのＳＩＲＰα部分は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）で発現する内因性ＳＩＲＰαと腫瘍細胞で発現するＣＤ４７との相互作用をブロックすることにより、貪食回避シグナル（ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ  ｓｉｇｎａｌ）をブロックするように設計されている。
【０９３８】
この目的のために、生成されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質の、この相互作用に対するブロッカーとしての効果を評価した。
【０９３９】
材料…実施例２に記載されるように製造したＮ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号４４）、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号１）、ＤＳＰ１０７＿Ｖ１（配列番号１２、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１４）、及びＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１（配列番号１７）、並びにＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）。
【０９４０】
組換えヒトＣＤ４７（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＤ７−Ｈ５２２７）、抗ｈＣＤ４７中和抗体（Ｎｏｖｕｓ社、ＡＦ４６７０）、ビオチン化ＳＩＲＰα（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＤＡ−Ｈ８２Ｆ２）。
【０９４１】
方法…ＥＬＩＳＡプレートを組換えヒトＣＤ４７で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、産生されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質又は陽性対照抗ＣＤ４７抗体を、異なる濃度で１時間インキュベートした。続いて、ビオチン化ＳＩＲＰαを追加し、１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従ってストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質でブロットした（図１３Ａ）。プレートを、プレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣ）を使用し、６２０ｎｍをリファレンス波長として、４５０ｎｍで分析した。
【０９４２】
結果…全ての被験ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、陽性対照ブロッキング抗体と同様に、ＳＩＲＰαとＣＤ４７との相互作用を効率的にブロックした（図１３Ｂ）。ＥＣ５０値は０．０７５〜０．２３８μｇ／ｍＬの範囲内であった（図１３Ｃ）。
【０９４３】
実施例９
マクロファージ及び多形核細胞に対するＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアントの効果
【０９４４】
上述のように、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のＳＩＲＰα部分は、腫瘍細胞上のＣＤ４７と内因性ＳＩＲＰαとの相互作用を競合及び遮断することにより、マクロファージ及び顆粒球などのＡＰＣで発現する内因性ＳＩＲＰαに対してＣＤ４７発現腫瘍細胞によって誘導される貪食回避シグナル（「ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ」シグナル）をブロックするように設計されている。この貪食回避シグナル（「ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ」シグナル）のブロックが、腫瘍細胞の食作用を誘発する。
【０９４５】
この目的のために、産生されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質がヒトマクロファージ又は多形核細胞（ＰＭＮ）による腫瘍細胞の食作用に及ぼす影響を、フローサイトメトリーに基づくアッセイ又は蛍光顕微鏡を使用して評価した。
【０９４６】
材料…実施例２に記載されるように製造したＮ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号１）、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１（配列番号１２）、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１４）、及びＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１（配列番号１７）、並びにＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）。
【０９４７】
ヒトがん細胞株であるＲａｍｏｓ（リンパ腫）、ＤＬＤ−１（結腸がん）、Ｄａｕｄｉ、ＳＵＤＨＬ５、ＳＵＤＨＬ４、Ｕ２９３２、ＳＵＤＨＬ２、ＳＵＤＨＬ６、ＳＵＤＨＬ１０、ＤＵＤＨＬ４、及びＯＣＩ−ＬＹ３（リンパ腫）。
【０９４８】
方法…多形核細胞（ＰＭＮ）及びＰＢＭＣは、健康なボランティアの血液試料から、密度勾配遠心分離とそれに続く赤血球の塩化アンモニウム溶解によって分離された。
【０９４９】
ＰＭＮアッセイでは、Ｒａｍｏｓ及びＤＬＤ−１がん細胞をＶｙｂｒａｎｔ  ＤｉＤで標識し、ターゲットに対するエフェクターの比率（effector-to-target ratio）が１：１になるように単離ＰＭＮと混合した。混合培養物を、産生されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のみで、又はさらに治療用抗体リツキシマブ（ＲＴＸ、抗ＣＤ２０）若しくはセツキシマブ（ＣＴＸ、抗ＥＧＦＲ）と組み合わせて、２時間処理するか、産生されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のみで１８時間処理した。続いて、ＰＭＮによるがん細胞の食作用をフローサイトメトリーによって分析した。
【０９５０】
マクロファージアッセイでは、ＣＤ１４磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を使用したＭＡＣＳソーティングにより、単離ＰＢＭＣから単球をさらに濃縮した。単球は、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地＋１０％ＦＣＳ中で７日間でマクロファージ（Ｍ０）に分化させた。１型マクロファージ（Ｍ１）を生成するために、Ｍ０細胞をＬＰＳ及びＩＦＮ−γでさらに２４時間プライミングした。あるいは、２型マクロファージ（Ｍ２）を生成するために、Ｍ０細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４とともに２４時間インキュベートした。ＳＵＤＨＬ５、ＳＵＤＨＬ４、ＯＣＩ−ＬＹ３、ＳＵＤＨＬ２、ＳＵＤＨＬ６、ＳＵＤＨＬ１０、ＳＣ−１、Ｒａｍｏｓ、及びＤａｕｄｉがん細胞は、Ｖ４５０細胞質色素で標識し、ターゲットに対するエフェクターの比率が１：１又は１：５でインビトロ分化Ｉ型マクロファージ（Ｍ１）と混合した。混合培養物を、産生されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質のみで、又はさらにＲＴＸ、トラスツズマブ若しくはＣＴＸと組み合わせて、２〜２．５時間処理した。インキュベート後、貪食されなかった腫瘍細胞を洗い流し、マクロファージを抗ＣＤ１１ｂ  ＡＦ５９４抗体で染色した。マクロファージによるがん細胞の食作用を蛍光顕微鏡で分析した。他の実験では、食作用は次のようにＩｎｃｕＣｙｔｅによって評価した。製造業者のプロトコルに従って、様々なリンパ腫細胞株の腫瘍細胞をＣＦＳＥで前染色し、マクロファージをＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＣｙｔｏＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ細胞質色素で前染色した。染色された腫瘍細胞及びマクロファージを、腫瘍細胞に対するマクロファージの比率（macrophage to tumor cell ratio）が１：５で共培養し、赤色及び緑色の位相画像をＩｎｃｕｃｙｔｅによって撮影した。食作用を、全マクロファージ（赤色のシグナル）のうち、腫瘍細胞の貪食に陽性のマクロファージ（「黄色」のシグナル）の割合として定量化した。
【０９５１】
結果…試験したＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は全て、治療用抗体であるリツキシマブ（ＲＴＸ）又はセツキシマブ（ＣＴＸ）と組み合わせて２時間培養した後、ＰＭＮを媒介したＲａｍｏｓ及びＤＬＤ１がん細胞の食作用を増強した（図１４Ａ）。Ｒａｍｏｓ及びＤＬＤ１がん細胞のＰＭＮを媒介した食作用は、１８時間のインキュベート後にさらに増強されることが実証された（図１４Ｂ）。
【０９５２】
また、試験したＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は全て、２時間のインキュベート後にマクロファージを媒介したＳＵＤＨＬ４、ＳＵＤＨＬ５、及びＯｃｉ−Ｌｙ３リンパ腫細胞株の食作用を増強した。これはリツキシマブ（ＲＴＸ）と組み合わせるとさらに増強された（図１５）。また、Ｃ末端のＨｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１４）は、２時間のインキュベート後、マクロファージを媒介したＳＵＤＨＬ４の食作用を、用量依存的に増強した（図１６）。
【０９５３】
さらに、Ｍ１マクロファージによる腫瘍細胞のリツキシマブ誘発性食作用は、２．５μｇ／ｍＬのＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）とのインキュベート後に増強された（図３２Ａ）。ＤＳＰ１０７＿Ｖ２は、各マクロファージに貪食されるＲａｍｏｓ細胞の数も増加させた（図３２Ｂ）。
【０９５４】
次に、リンパ腫細胞株の幅広いパネルを、Ｉｎｃｕｃｙｔｅイメージングシステムを使用して試験した。Ｍ１マクロファージをがん細胞及び単剤としての２．１μｇ／ｍＬのＤＳＰ１０７＿Ｖ２とインキュベートした後、Ｍ１マクロファージを介したがん細胞株の食作用が観察された（図３２Ｃ）。ＤＳＰ１０７＿Ｖ２をリツキシマブと組み合わせて使用した場合、単剤としてのリツキシマブによって誘発された効果と比較して、相加的な食作用効果も観察された（図３２Ｄ）。
【０９５５】
興味深いことに、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）がＭ０及びＭ２マクロファージによって誘発する食作用は、単剤としてもリツキシマブとの組み合わせとしても両方で増強されたが、Ｍ１マクロファージで観察されたものよりも程度は小さかった（データは示さず）。
ＤＬＤ−１結腸がん細胞を用いた同様の実験では、培地対照と比較して、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２単剤処理（２．１μｇ／ｍＬ）でマクロファージによって有意に多くのＤＬＤ−１細胞が貪食された（図３２Ｅ）。さらに、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２とトラスツズマブ（抗Ｈｅｒ２抗体）の併用療法では、単剤としてのトラスツズマブ処置と比較して、腫瘍細胞の食作用の増大が明確に示された（図３２Ｅ）。
【０９５６】
実施例１０
顆粒球細胞に対するＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアントの効果
【０９５７】
材料及び方法…標準的な手順を使用して、健康なドナーの末梢血から白血球を単離した。腫瘍細胞は、製造業者のプロトコルに従って、ＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）又はＶｙｂｒａｎｔ  ＤｉＤ  Ｃｅｌｌ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）で前染色した。単離した白血球及び染色した腫瘍細胞は、１：１の白血球対腫瘍細胞比で混合し、治療用抗体リツキシマブ（１μｇ／ｍＬ）を併用するか又はしないで、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の存在下でインキュベートした。続いて、顆粒球による腫瘍細胞の取り込みをフローサイトメトリーで評価し、Ｖｙｂｒａｎｔ  ＤｉＤ陽性の顆粒球集団を定量化した。がん細胞株の貪食を評価するために、ＤＬＤ−１結腸がん細胞をＣＦＳＥで染色し、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号：１３）、トラスツズマブ（抗ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）抗体、０．１μｇ／ｍＬ）、又はＤＳＰ１０７＿Ｖ２とトラスツズマブとの組み合わせの存在下でマクロファージ：腫瘍細胞比１：５で２時間マクロファージと共培養した。インキュベート後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を使用して細胞をプレートから剥離し、ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ抗体を使用してマクロファージを染色し、試料をＦＡＣＳで分析した。顆粒球による腫瘍細胞の取り込みに対するＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）の効果も、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα又は可溶性４−１ＢＢＬ、あるいは両方の組み合わせと比較した。
【０９５８】
結果…顆粒球を媒介した腫瘍細胞の食作用に対しての、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２の効果及び可溶性Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰαと可溶性４−１ＢＢＬとの組み合わせの効果を、複数のリンパ腫細胞株でさらに評価した。ＤＳＰ１０７＿Ｖ２又はその可溶性成分の組み合わせとのインキュベート後の食作用を単剤として試験し、培地と比較した。腫瘍細胞の食作用は、リツキシマブを単剤として、又はＤＳＰ１０７＿Ｖ２又はその可溶性成分の組み合わせとの併用として、試験した。２．１μｇ／ｍＬのＤＳＰ１０７＿Ｖ２と２．５時間インキュベートした後、顆粒球を媒介したリンパ腫細胞の食作用は、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２によっては刺激されたが、可溶性ＳＩＲＰαと可溶性４−１ＢＢＬとの組み合わせによっては刺激されなかった（図３３Ｂ）。リツキシマブはまた、顆粒球を媒介した腫瘍細胞の食作用を強力に単剤刺激した。この効果は、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２との組み合わせで強化されたが、可溶性ＳＩＲＰαと可溶性４−１ＢＢＬとの混合物との組み合わせでは強化されなかった（図３３Ｂ〜図３３Ｆ）。
【０９５９】
実施例１１
ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアントのインビボ抗腫瘍効果  
【０９６０】
がんの処置における産生されたＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬの有効性を試験するために、４つの異なるインビボマウスモデルを使用する。
【０９６１】
１．  ヒト腫瘍細胞を接種したヌードＳＣＩＤマウス。このモデルでは、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質はマウス及びヒトの（腫瘍細胞で発現される）ＣＤ４７と相互作用し、マウスマクロファージ活性に対する融合タンパク質の効果を試験する。
【０９６２】
２．  ヒト幹細胞及びヒト腫瘍細胞を接種したＮＳＧマウス。このモデルでは、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質はマウス及びヒトの（腫瘍及び免疫細胞で発現される）ＣＤ４７並びにヒトＴ細胞上の４−１ＢＢと相互作用する。マウス及びヒトのマクロファージ並びにヒトのＴ細胞に対しての融合タンパク質の効果を試験する。
【０９６３】
３．  ＭＣ３８マウス結腸がん若しくは他のがん細胞株又はヒトＣＤ４７を過剰発現するがん細胞株を接種した、Ｃ５７ＢＬ／６−ヒト４−１ＢＢノックインマウス。このモデルでは、マウス４−１ＢＢ細胞外ドメインがヒト４−１ＢＢの細胞外ドメインに置き換えられている。よって、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は、マウスＴ細胞に発現するヒト４−１ＢＢと相互作用し得る。前記融合タンパク質は、腫瘍細胞上のマウスＣＤ４７及びヒトＣＤ４７と相互作用する。マウスのマクロファージ並びにマウスのＴ細胞に対しての、融合タンパク質の効果を試験する。
【０９６４】
４．  マウスＣＤ４７を発現する同系マウス腫瘍モデル。これらのモデルでは、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質は腫瘍細胞上のマウスＣＤ４７と相互作用する。マウスのマクロファージに対する融合タンパク質の効果を試験する。
【０９６５】
方法…
４つのモデル全てにおいて、マウスに腫瘍細胞を静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、皮下（ＳＣ）、又は同所的に（orthotopically）接種する。腫瘍が触知可能（〜８０ｍｍ３）になったら、マウスをＩＶ、ＩＰ、ＳＣ、又は同所的に、異なる用量及び異なるレジメンにてＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬ融合タンパク質（例えば、上記実施例１に記載されるように製造したＮ末端Ｈｉｓタグ付き（配列番号４４）、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７（配列番号１）、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ１（配列番号１２）、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１４）、及びＣ末端Ｈｉｓタグ付きＤＳＰ１０７＿Ｖ３．１（配列番号１７））で処置する。
【０９６６】
体重及び臨床徴候についてマウスを追跡する。腫瘍は週に数回ノギスで測定し、腫瘍体積は下記式に従って計算する：Ｖ＝長さ×幅２／２。マウスの体重は定期的に測定する。腫瘍の増殖及び生存を、実験全体を通してモニタリングする。
【０９６７】
腫瘍内の免疫細胞の浸潤は、腫瘍を切除するかリンパ節を排出させ、消化し、特異的抗体染色とフローサイトメトリー分析を使用して免疫表現型を決定することによって試験する。追加的又は代替的に、免疫細胞の浸潤又は腫瘍の壊死グレードは、腫瘍を切除し、パラフィン包埋し、特異的抗体で免疫組織化学染色するために切片化することによって決定する。
【０９６８】
犠牲にする際に、マウスの臓器を採取し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色及び免疫組織化学染色（ＩＨＣ）染色のためにパラフィンブロックに包埋する。
【０９６９】
血液試料は、ＰＫ分析、血漿中のサイトカイン測定、循環中の血球亜集団のＦＡＣＳプロファイリング、血液学検査、血清化学検査、抗薬物抗体（ＡＤＡ）分析、及び中和抗体分析（ＮＡＢ）の試験のために、一般的な手順に従って、様々な時点でマウスから採取する。
【０９７０】
実施例１２
マウスモデルでヒト４−１ＢＢノックインマウスモデルを使用したＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアントのインビボ抗腫瘍効果
【０９７１】
マウスにおけるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアント融合タンパク質の効果を試験するために、ヒト４−１ＢＢ（ｈ４−１ＢＢ）ノックインマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）を利用した。ヒトＣＤ４７発現ＭＣ３８（ｈＣＤ４７  ＭＣ３８）細胞を腫瘍モデルとして選択した。注目すべきことに、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＳＩＲＰαはヒトＣＤ４７と相互作用しないことが示されており［Ｙａｍａｕｃｈｉ、Ｔ．、ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）  Ｂｌｏｏｄ、１２１（８）：  ｐ．  １３１６−２５］、よってこのモデルでは、天然食細胞によるｈＣＤ４７ＭＣ３８細胞の食作用は生じなかった。さらに、フローサイトメトリー分析を使用して、ＤＳＰ１０７のマウスＷＴ  ＭＣ３８結腸がん細胞への結合を、ＤＳＰ１０７のヒトＤＬＤ１結腸がん細胞への結合と比較した（図３４）。ＤＳＰ１０７のマウスＭＣ３８への低結合に基づいて、インビボ有効性研究にｈＣＤ４７ＭＣ３８細胞を選択した。その結果、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアント融合タンパク質のＳＩＲＰαアームは、ヒトＣＤ４７を発現する腫瘍細胞を標的とすることが期待されたが、このモデルでは腫瘍細胞の食作用の促進に影響を与えなかった。
【０９７２】
材料及び方法…８〜９週齢の雌ｈ４−１ＢＢノックインＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に、１×１０６ｈＣＤ４７  ＭＣ３８細胞（Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を皮下接種した。腫瘍が６０〜１００ｍｍ３のサイズに達した時点で処置を開始した。ランダムな割り当てに続いて、一群あたり６匹の動物に、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３、２５０μｇ／注射、１２．５ｍｇ／ｋｇ）（０日目、１日目、２日目、３日目、及び４日目に１日１回投与）、抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体（クローン１０Ｆ．９Ｇ２、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ社、６０μｇ／注射）（隔週で３週間腹腔内（ＩＰ）投与）、又はＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）と抗マウスＰＤ−Ｌ１Ａｂとの組み合わせのいずれかを腹腔内（ＩＰ）注射した。対照マウスには、２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注射した。ＤＳＰ１０７＿Ｖ２は、マウス抗ヒト抗体の発生の可能性を回避するために、実験の最初の週にのみ投与した。ノギスを使用して腫瘍体積を週に３回測定し、個々の体積を下記式で計算した。Ｖ＝（［幅］２×長さ）／２。腫瘍が３０００ｍｍ３の体積に達した時点で、マウスを個別に犠牲にした。
【０９７３】
結果…抗ＰＤ−Ｌ１又はＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）を単剤として処置すると、腫瘍増殖が抑制された（それぞれ、５０．４％及び２９．５％、図３５Ａ）。ＰＤ−Ｌ１又はＤＳＰ１０７＿Ｖ２を組み合わせると、腫瘍増殖阻害（Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、ＴＧＩ）の割合がさらに向上した（ビヒクルで処理した対照と比較して８３％、ｐ＝０．０２）。さらに、メンタルコックス（Ｍｅｎｔａｌ−Ｃｏｘ）分析に基づくと、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２と抗ＰＤ−Ｌ１との併用処置では、ビヒクル処置の対照マウスと比較して統計的に有意な生存率の改善がもたらされた（ｐ＝０．０１、図３５Ｂ）。
【０９７４】
実施例１３
ＮＳＧマウスモデルを使用した、ＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアントのインビボ抗ＤＬＢＣＬ効果
【０９７５】
ヒト免疫系とのコンテクストにおけるインビボでのヒトＤＬＢＣＬ腫瘍の処置におけるＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアント融合タンパク質の効果を、ＳＵＤＨＬ６ヒトＤＬＢＣＬ細胞及びヒトＰＢＭＣを接種したＮＳＧマウスを使用して評価した。これらのマウスは、単剤としてのＳＩＲＰα−４−１ＢＢＬバリアント融合タンパク質でさらに処置した。腫瘍増殖についてマウスを追跡した。
【０９７６】
材料及び方法…１４週齢の雌のＮＳＧマウスに、０日目に１×１０６個のＳＵＤＨＬ６細胞を皮下接種した。７日目に、マウスを以下の２群にランダムに分類した。
１．  マウス５匹−ＰＢＭＣ
２．  マウス６匹−ＰＢＭＣ＋ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）
【０９７７】
製造業者の指示に従って、標準的なフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）勾配法を使用して、健康なドナーの末梢血からヒトＰＢＭＣを分離した。７日目にマウスに、単離ＰＢＭＣをマウスあたり１×１０６細胞、静脈内接種した。同じドナーからの凍結ＰＢＭＣを、１３日目にマウスに再注射した（マウスあたり１×１０６細胞）。７日目から２週間隔日で、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２群のマウスを、ＤＳＰ１０７＿Ｖ２（配列番号１３）をマウスあたり２５０μｇ腹腔内投与する処置に供した。臨床的兆候がないかマウスを追跡した。マイクロノギスで腫瘍を測定した。腫瘍体積は下記式で計算した。長さ×長さ×幅／２。２２日目にマウスを犠牲にし、腫瘍を取り出して重量を測定した。
【０９７８】
結果…ＰＢＭＣ及びＤＳＰ１０７＿Ｖ２による処置は、２０日目までにＰＢＭＣのみを注射した対照群と比較して腫瘍増殖を約３．７倍抑制した（図３６Ａ）。ＰＢＭＣ＋ＤＳＰ１０７＿Ｖ２による処置は、２２日目にマウスを犠牲にした後に測定された腫瘍重量を有意に減少させた（図３６Ｂ）。重要なことに、どの処置もマウスの体重に影響を与えず、マウスの健康に大きな副作用がないことを示唆している（データは示さず）。
【０９７９】
【表６】
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【０９８０】
本発明は、そのある具体的な実施形態と併せて説明されてきたが、多くの代替、修正、及び変形が当業者には明らかであることは自明である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神及び広い範囲に含まれるかかるすべての代替、修正、及び変形を包含することが意図されている。
【０９８１】
本明細書に記載されている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照によりその全体が本明細書に援用される。さらに、本出願における参考文献の引用又は識別は、かかる参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。セクション見出しが使用されている範囲において、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。
【０９８２】
さらに、本出願の優先権書類は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３３Ｅ】
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【図３３Ｆ】
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【図３３Ｇ】
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【図３３Ｈ】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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