(57)【要約】本開示は、とりわけ、精子機能を改善する方法及び関連する受精方法を、活性化又は増強された精子の調製液と共に提供する。本開示によって提供される方法は、一部の実施形態において、エネルギー枯渇と、その後の異なるエネルギー源の段階的再導入とを伴う。本開示は、本発明によって提供される方法を実施するのに好適な製品を更に提供する。本発明は、一部の実施形態では、ＩＶＦ又はＩＵＩのために精子を分離し、且つ精子を処理及び調製するためのキットを提供する。また、精子を調製するのに有用な栄養素不含試薬も提供される。
2021529554.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受精を増進させる方法であって、
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、前記哺乳類精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすること、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記増強された哺乳類精子に有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供すること、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）から得られた前記哺乳類精子に、受精を増進させる条件下において、卵子への到達手段を提供すること
を含み、前記有効量は、改善された精子機能を誘導するのに十分な量である、方法。
【請求項２】
曲線速度、頭部振幅、オートファジー、精子受精能獲得、超活性化精子の割合、中間運動能精子の割合並びに超活性化精子及び中間運動能精子の割合から選択される１つ以上の精子機能は、前記増強された哺乳類精子が前記第１のエネルギー源及び前記第２のエネルギー源の一方のみを提供されるか、又は前記第１のエネルギー源及び前記第２のエネルギー源を同時に提供される方法と比べて改善される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のエネルギー源は、解糖系エネルギー源であり、及び前記第２のエネルギー源は、糖新生基質であるか、又は前記第１のエネルギー源は、前記糖新生基質であり、及び前記第２のエネルギー源は、前記解糖系エネルギー源であり、更に、ステップ（ａ）の前記哺乳類精子は、ヒト精子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
体外で実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）からの前記哺乳類精子の腟内又は子宮内授精（ＩＵＩ）での人工授精により、雌対象の生殖路において体内で実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）の前記第２のエネルギー源を提供することは、有効量の前記第１のエネルギー源を提供された前記増強された哺乳類精子の子宮内授精（ＩＵＩ）により、雌対象の生殖路において体内で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のエネルギー源は、ピルビン酸である糖新生基質であり、及び前記第２のエネルギー源は、解糖系エネルギー源である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）からの前記哺乳類精子を前記卵子と共にインキュベートするか、又はステップ（ｂ）からの前記哺乳類精子を前記卵子の細胞質に注入して、前記卵子の体外受精を増進させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
受精を増進させることは、胚であって、好適な対照精子によって発生された胚と比べて向上した生存能及び／又は改善された着床を呈する胚の発生を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
受精を増進させることは、少なくとも２細胞期発育段階、胚盤胞期発育段階又は子孫まで発育する胚の発生を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）の前記哺乳類精子は、精子減少症の対象又は低受精能の対象からのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）の前記哺乳類精子は、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ又はマウス精子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）の前記哺乳類精子は、ヒト精子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）の前記哺乳類精子は、非低温又は低温貯蔵から回収された精子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）の前記哺乳類精子は、２回分以上の射精液のプールとして提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ａ）の前記哺乳類精子は、ステップ（ａ）前に密度勾配遠心法、スイムアップ法又はマイクロフルイディクスによって精液から濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
２００〜２８０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）は、少なくとも前記第１のエネルギー源又は前記第２のエネルギー源と組み合わせて、解糖系の上流又は下流の１つ以上の成分を前記哺乳類精子に提供することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のエネルギー源は、（ｉ）グルコース、又は（ｉｉ）ピルビン酸から選択され、及び前記第２のエネルギー源は、（ｉ）グルコース、又は（ｉｉ）ピルビン酸から選択され、前記第１及び第２のエネルギー源は、異なる、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）のエネルギー枯渇条件下での前記インキュベーションは、少なくとも１０分にわたるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
向上した精子機能を誘導する方法であって、
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、増強された哺乳類精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記増強された哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）糖新生基質から選択される第１のエネルギー源を提供すること、及び
（ｃ）その後、ステップ（ｂ）からの前記哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）前記解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）前記糖新生基質から選択される第２のエネルギー源を提供することであって、提供される前記第２のエネルギー源は、ステップ（ｂ）で選択されない、提供すること
を含み、前記有効量は、向上した精子機能を誘導するのに十分な量である、方法。
【請求項２２】
前記向上した精子機能は、好適な対照精子と比べて向上しており、前記好適な対照精子は、未処理の哺乳類精子、有効量の前記解糖系エネルギー源又は前記糖新生基質を独立に提供されている、ステップ（ａ）の前記増強された哺乳類精子、有効量の前記解糖系エネルギー源及び前記糖新生基質を同時に提供されている、ステップ（ａ）の前記増強された哺乳類精子又は標準受精能獲得培地（Ｃ−ＨＴＦ）で処理された精子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
体外で実施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）からの前記哺乳類精子の腟内又は子宮内授精（ＩＵＩ）での人工授精により、雌対象の生殖路において体内で実施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記向上した精子機能は、コンピュータ支援精液分析（ＣＡＳＡ）によって測定される運動能の向上を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記運動能の向上は、前記哺乳類精子の曲線速度の向上、超活性化精子の割合の向上、中間運動能精子の割合の向上又はこれらの組み合わせを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記向上した精子機能は、精子−透明帯結合検査によって測定される精子受精能獲得の向上を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記向上した精子機能は、精子侵入検査によって測定される、卵子を受精させる前記哺乳類精子の能力の向上を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記向上した精子機能は、好適な対照精子で発生された胚と比べて向上した生存能、改善された着床、少なくとも２細胞期発育段階、胚盤胞期発育段階又は子孫まで発育する向上した能力を有する胚の発生を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記哺乳類精子は、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ又はマウス精子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳類精子は、ヒト精子である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記解糖系エネルギー源は、グルコースであり、及び前記糖新生基質は、ピルビン酸である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２１に記載の方法によって調製される、向上した精子機能を有する前記哺乳類精子を含む精子調製液。
【請求項３４】
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、増強された哺乳類精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、及び
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記増強された哺乳類精子に有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供すること
のプロセスによって調製される、向上した割合の超活性化精子を含む精子調製液であって、前記有効量は、１つ以上の精子機能の向上を誘導するのに十分な量であり、向上した割合の超活性化精子を含む前記精子調製液は、
未処理の哺乳類精子、有効量の前記第１のエネルギー源又は前記第２のエネルギー源を独立に提供されている、ステップ（ａ）の前記増強された哺乳類精子、有効量の前記第１のエネルギー源及び前記第２のエネルギー源を同時に提供されている、ステップ（ａ）の前記増強された哺乳類精子又は標準受精能獲得培地（Ｃ−ＨＴＦ）で処理された哺乳類精子
から選択される好適な対照精子と比べて１つ以上の精子機能の向上を含む、精子調製液。
【請求項３５】
向上した精子機能を誘導する方法であって、
（ａ）緩衝剤を含み、且つ約６〜７のｐＨ及び約３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する保存培地に哺乳類精子を提供すること、
（ｂ）前記哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、前記哺乳類精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすること、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）からの前記増強された哺乳類精子に有効量の（ｉ）解糖系エネルギー源、及び／又は（ｉｉ）糖新生基質を提供すること
を含み、それにより好適な対照精子と比較して向上した精子機能を誘導する、方法。
【請求項３６】
受精を増進させる方法であって、
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、前記精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすることであって、前記インキュベーション前に、前記哺乳類精子は、緩衝剤を含み、且つ弱酸性ｐＨ及び約３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する保存培地に貯蔵される、インキュベートすること、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記増強された精子に有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供すること、
（ｃ）ステップ（ａ）の前記増強された哺乳類精子に有効量の前記第１のエネルギー源又は前記第２のエネルギー源を独立に提供するか、又は有効量の前記第１のエネルギー源及び前記第２のエネルギー源を同時に提供することによって得られるものを上回るレベルまで精子機能の１つ以上を向上させること、及び
（ｄ）向上した機能を有する前記哺乳類精子に、受精を増進させる条件下において、卵子への到達手段を提供すること
を含む方法。
【請求項３７】
ａ）緩衝化精子増強用エネルギー枯渇組成物を含む第１の組成物を含む第１の容器、及び
ｂ）哺乳類精子に好適な少なくとも第１のエネルギー源を含む第２の組成物を含む第２の容器
を含むキットであって、
前記哺乳類精子を前記第１の組成物中で好適な時間にわたってインキュベートすると、増強された哺乳類精子を生じさせ、
前記増強された哺乳類精子に有効量の少なくとも前記第１のエネルギー源を提供すると、好適な対照と比べて、前記増強された哺乳類精子の機能を向上させる、キット。
【請求項３８】
少なくとも５％の超活性化精子を含む超活性化精子調製液であって、任意選択で、超活性化に基づいて事前に選別されておらず、任意選択で、前記超活性化精子及び／又は中間精子は、好適な対照と比べて、細胞内ＲＮＡ濃度（マイクロＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡ濃度など）の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０％又はそれを超える（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍又はそれを超える）低下を有する、超活性化精子調製液。
【請求項３９】
ａ．正常精子の雄、低受精能の雄又は精子減少症の雄、例えば低受精能（精子減少症を含む）の雄などの雄対象の精液から精子を濃縮すること、
ｂ．前記精子を、エネルギー枯渇下において、前記精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすること、
ｃ．前記増強された精子に、有効量の解糖系エネルギー源又は有効量の糖新生基質から選択されるが、但し有効量の解糖系エネルギー源及び糖新生基質の両方ではない、第１のエネルギー源を提供すること
によって調製される精子調製液。
【請求項４０】
緩衝剤を含み、且つ弱酸性ｐＨ及び約３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば約３００〜３８０、３２０〜３７０、３３０〜３７０、３４０〜３６０、例えば約３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０又は３８０、例えば約３５０の重量オスモル濃度を有する精子保存培地であって、有意な量の卵黄を含まないか、又は一部の実施形態では一切の卵黄を含まない精子保存培地。
【請求項４１】
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇下において、増強された哺乳類精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、及び
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記増強された哺乳類精子に有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供すること
によって調製される精子調製液であって、ステップ（ｂ）の前記精子は、好適な対照精子と異なるエピジェネティックプロファイルを含む、精子調製液。
【請求項４２】
改善された適応度を有する子孫を作製する方法であって、
（ａ）精子試料を、エネルギー枯渇下において、増強された精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、
（ｂ）前記増強された精子に有効量の第１のエネルギー源を提供すること、及び
（ｃ）その後、ステップ（ｂ）からの前記精子に有効量の第２のエネルギー源を提供すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの前記精子を卵子に受精させて、胚を発生させること、及び
（ｅ）雌対象において前記胚を成長させて、前記改善された適応度を有する子孫を作製すること
を含み、前記改善された適応度は、病態を発症する低下したリスクを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２０１８年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７７３，４４８号明細書、２０１８年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７７３，４５３号明細書、２０１８年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７７３，４６２号明細書、２０１８年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７７３，４７１号明細書、２０１８年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７７３，４３３号明細書、２０１８年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７７３，４４０号明細書、２０１９年１０月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／９１４，８０３号明細書、２０１９年２月２１日に出願された米国特許出願公開第１６／２８２，２０４号明細書、２０１９年２月２１日に出願された米国特許出願公開第１６／２８２，２１７号明細書及び２０１９年２月２１日に出願された米国特許出願公開第１６／２８２，２２４号明細書の利益を主張するものであり、これらの出願の各々は、全体として参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
妊娠困難なカップルの約５０％は、男性因子が原因である。生殖補助の重要な側面は、雄性配偶子（精子）の機能を最大限引き出して、受精が最大となることを促進することである。従って、精子機能を向上させるための、例えばそれにより生殖補助を促進する培地、組成物及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、とりわけ、精子機能を向上させるための、例えばそれにより生殖補助を促進する培地、組成物及び方法を提供する。
【０００４】
本明細書では、受精を増進させる方法であって、（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、哺乳類精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすること、（ｂ）ステップ（ａ）からの増強された哺乳類精子に有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供すること、及び（ｃ）ステップ（ｂ）から得られた哺乳類精子に、受精を増進させる条件下において、卵子への到達手段を提供することを含み、有効量は、改善された精子機能を誘導するのに十分な量である、方法が提供される。
【０００５】
本明細書では、向上した精子機能を誘導する方法であって、（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、増強された哺乳類精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、（ｂ）ステップ（ａ）からの増強された哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）糖新生基質から選択される第１のエネルギー源を提供すること、及び（ｃ）その後、ステップ（ｂ）からの哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）糖新生基質から選択される第２のエネルギー源を提供することであって、提供される第２のエネルギー源がステップ（ｂ）で選択されないことを含み、有効量は、向上した精子機能を誘導するのに十分な量である、方法が提供される。
【０００６】
本明細書では、（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、増強された哺乳類精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、及び（ｂ）ステップ（ａ）からの増強された哺乳類精子に有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供することのプロセスによって調製される、向上した割合の超活性化精子を含む精子調製液であって、有効量は、１つ以上の精子機能の向上を誘導するのに十分な量であり、向上した割合の超活性化精子を含む精子調製液は、未処理の哺乳類精子、有効量の第１のエネルギー源又は第２のエネルギー源を独立に提供されている、ステップ（ａ）の増強された哺乳類精子、有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を同時に提供されている、ステップ（ａ）の増強された哺乳類精子又はＣ−ＨＴＦなどの標準受精能獲得培地で処理された哺乳類精子から選択される好適な対照精子と比べて１つ以上の精子機能の向上を含む、精子調製液が提供される。
【０００７】
本明細書では、向上した精子機能を誘導する方法であって、（ａ）緩衝剤を含む、且つ約６〜７のｐＨ及び約３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する保存培地に哺乳類精子を提供すること、（ｂ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、哺乳類精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすること、及び（ｃ）ステップ（ｂ）からの増強された哺乳類精子に有効量の（ｉ）解糖系エネルギー源、及び／又は（ｉｉ）糖新生基質を提供することを含み、それにより好適な対照精子と比較した向上した精子機能を誘導する、方法が提供される。
【０００８】
本明細書では、受精を増進させる方法であって、（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすることであって、インキュベーション前に、哺乳類精子は、緩衝剤を含み、且つ弱酸性ｐＨ及び約３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する保存培地に貯蔵される、インキュベートすること、（ｂ）ステップ（ａ）からの増強された精子に有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供すること、（ｃ）ステップ（ａ）の増強された哺乳類精子に有効量の第１のエネルギー源又は第２のエネルギー源を独立に提供するか、又は有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を同時に提供することによって得られるものを上回るレベルまで精子機能の１つ以上を向上させること、及び（ｄ）向上した精子機能を有する哺乳類精子に、受精を増進させる条件下において、卵子への到達手段を提供することを含む方法が提供される。
【０００９】
本明細書では、ａ）緩衝化精子増強用エネルギー枯渇組成物を含む第１の組成物を含む第１の容器、及びｂ）哺乳類精子に好適な少なくとも第１のエネルギー源を含む第２の組成物を含む第２の容器を含むキットであって、哺乳類精子を第１の組成物中で好適な時間にわたってインキュベートすると、増強された哺乳類精子を生じさせ、増強された哺乳類精子に有効量の少なくとも第１のエネルギー源を提供すると、好適な対照と比べて、増強された哺乳類精子の機能を向上させる、キットが提供される。
【００１０】
本明細書では、少なくとも５％の超活性化精子を含む超活性化精子調製液であって、任意選択で、超活性化に基づいて事前に選別されておらず、任意選択で、超活性化精子及び／又は中間精子は、好適な対照と比べて、細胞内ＲＮＡ濃度（マイクロＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡなど）の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０％又はそれを超える（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍又はそれを超える）低下を有する、超活性化精子調製液が提供される。
【００１１】
本明細書では、ａ．正常精子の雄、低受精能の雄又は精子減少症の雄、例えば低受精能（精子減少症を含む）の雄などの雄対象の精液から精子を濃縮すること、ｂ．精子を、エネルギー枯渇下において、精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすること、ｃ．増強された精子に、有効量の解糖系エネルギー源又は有効量の糖新生基質から選択されるが、但し有効量の解糖系エネルギー源及び糖新生基質の両方ではない、第１のエネルギー源を提供することによって調製される精子調製液が提供される。
【００１２】
本明細書では、緩衝剤を含み、且つ弱酸性ｐＨ及び約３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば約３００〜３８０、３２０〜３７０、３３０〜３７０、３４０〜３６０、例えば約３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０又は３８０、例えば約３５０の重量オスモル濃度を有する精子保存培地であって、有意な量の卵黄を含まないか、又は一部の実施形態では一切の卵黄を含まない精子保存培地が提供される。
【００１３】
本明細書では、（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇下において、増強された哺乳類精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、及び（ｂ）ステップ（ａ）からの増強された哺乳類精子に有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供することによって調製される精子調製液であって、ステップ（ｂ）の精子は、好適な対照精子と異なるエピジェネティックプロファイルを含む、精子調製液が提供される。
【００１４】
本明細書では、改善された適応度を有する子孫を作製する方法であって、（ａ）精子試料を、エネルギー枯渇下において、増強された精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、（ｂ）増強された精子に有効量の第１のエネルギー源を提供すること、及び（ｃ）その後、ステップ（ｂ）からの精子に有効量の第２のエネルギー源を提供すること、（ｄ）ステップ（ｃ）からの精子を卵子に受精させて、胚を発生させること、及び（ｅ）雌対象において胚を成長させて、改善された適応度を有する子孫を作製することを含み、改善された適応度は、病態を発症する低下したリスクを含む、方法が提供される。
【００１５】
本明細書に記載される様々な方法、培地、調製液及びキットは、組み合わせて使用することができる。例えば、本発明により提供される精子保存培地で保存される精子調製液は、一部の実施形態では、本発明により提供される様々な方法（例えば、精子機能を亢進させる、受精を増進させる、改善された適応度を有する子孫を作製する等）であって、一部の実施形態では、本発明により提供される様々なキットを使用して実施することができ、従って特定の実施形態では、本発明により提供される精子調製液が作製されることになる方法及び／又は生殖補助方法を含めた受精方法など、本発明により提供される更なる方法において使用することができる。
【００１６】
本明細書に記載される方法、培地、精子調製液及びキットの特徴には、以下に挙げる実施形態の態様の１つ以上が含まれ、これらの実施形態は、組み合わせ及び挿入することができるものであり、具体的に提供されない限り、組み合わせ又は修飾を受け入れない狭義の具体的な実施形態と見なされてはならない。本開示の例は、以下に挙げる実施形態に容易に適合させることのできる非限定的な例示を提供する。
【００１７】
１．受精を増進させる方法であって、
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、哺乳類精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすること、
（ｂ）ステップ（ａ）からの増強された哺乳類精子に有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供すること、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）から得られた哺乳類精子に、受精を増進させる条件下において、卵子への到達手段を提供すること
を含み、有効量は、改善された精子機能を誘導するのに十分な量である、方法。
【００１８】
２．曲線速度、頭部振幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ｏｆ  ｌａｔｅｒａｌ  ｈｅａｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、オートファジー、精子受精能獲得、超活性化精子の割合、中間運動能精子の割合並びに超活性化精子及び中間運動能精子の割合から選択される１つ以上の精子機能は、増強された哺乳類精子が第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源の一方のみを提供されるか、又は第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を同時に提供される方法と比べて改善される、実施形態１の方法。
【００１９】
３．第１のエネルギー源は、解糖系エネルギー源であり、及び第２のエネルギー源は、糖新生基質であるか、又は第１のエネルギー源は、糖新生基質であり、及び第２のエネルギー源は、解糖系エネルギー源であり、更に、ステップ（ａ）の哺乳類精子は、ヒト精子である、実施形態１の方法。
【００２０】
４．体外で実施される、実施形態３の方法。
【００２１】
５．ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）からの哺乳類精子の腟内又は子宮内授精（ＩＵＩ）での人工授精により、雌対象の生殖路において体内で実施される、実施形態３の方法。
【００２２】
６．ステップ（ｂ）の第２のエネルギー源を提供することは、有効量の第１のエネルギー源を提供された増強された哺乳類精子の子宮内授精（ＩＵＩ）により、雌対象の生殖路において体内で実施される、実施形態１の方法。
【００２３】
７．第１のエネルギー源は、ピルビン酸である糖新生基質であり、及び第２のエネルギー源は、解糖系エネルギー源である、実施形態６の方法。
【００２４】
８．ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）からの哺乳類精子を卵子と共にインキュベートするか、又はステップ（ｂ）からの哺乳類精子を卵子の細胞質に注入して、卵子の体外受精を増進させることを含む、実施形態４の方法。
【００２５】
９．受精を増進させることは、胚であって、好適な対照精子によって発生された胚と比べて向上した生存能及び／又は改善された着床を呈する胚の発生を含む、実施形態１の方法。
【００２６】
１０．受精を増進させることは、少なくとも２細胞期発育段階、胚盤胞期発育段階又は子孫まで発育する胚の発生を含む、実施形態１の方法。
【００２７】
１１．ステップ（ａ）の哺乳類精子は、精子減少症の対象又は低受精能の対象からのものである、実施形態１の方法。
【００２８】
１２．ステップ（ａ）の哺乳類精子は、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ又はマウス精子である、実施形態１の方法。
【００２９】
１３．ステップ（ａ）の哺乳類精子は、ヒト精子である、実施形態１２の方法。
【００３０】
１４．ステップ（ａ）の哺乳類精子は、非低温又は低温貯蔵から回収された精子である、実施形態１の方法。
【００３１】
１５．ステップ（ａ）の哺乳類精子は、２回分以上の射精液のプールとして提供される、実施形態１の方法。
【００３２】
１６．ステップ（ａ）の哺乳類精子は、ステップ（ａ）前に密度勾配遠心法、スイムアップ法又はマイクロフルイディクスによって精液から濃縮される、実施形態１の方法。
【００３３】
１７．２００〜２８０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度で実施される、実施形態１の方法。
【００３４】
１８．ステップ（ｂ）は、少なくとも第１のエネルギー源又は第２のエネルギー源と組み合わせて、解糖系の上流又は下流の１つ以上の成分を哺乳類精子に提供することを更に含む、実施形態１の方法。
【００３５】
１９．第１のエネルギー源は、（ｉ）グルコース、又は（ｉｉ）ピルビン酸から選択され、及び第２のエネルギー源は、（ｉ）グルコース、又は（ｉｉ）ピルビン酸から選択され、第１及び第２のエネルギー源は、異なる、実施形態３の方法。
【００３６】
２０．ステップ（ａ）のエネルギー枯渇条件下でのインキュベーションは、少なくとも１０分にわたるものである、実施形態１の方法。
【００３７】
２１．向上した精子機能を誘導する方法であって、
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、増強された哺乳類精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、
（ｂ）ステップ（ａ）からの増強された哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）糖新生基質から選択される第１のエネルギー源を提供すること、及び
（ｃ）その後、ステップ（ｂ）からの哺乳類精子に、（ｉ）有効量の、解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）糖新生基質から選択される第２のエネルギー源を提供することであって、提供される第２のエネルギー源は、ステップ（ｂ）で選択されない、提供すること
を含み、有効量は、向上した精子機能を誘導するのに十分な量である、方法。
【００３８】
２２．向上した精子機能は、好適な対照精子と比べて向上しており、好適な対照精子は、未処理の哺乳類精子、有効量の解糖系エネルギー源又は糖新生基質を独立に提供されている、ステップ（ａ）の増強された哺乳類精子、有効量の解糖系エネルギー源及び糖新生基質を同時に提供されている、ステップ（ａ）の増強された哺乳類精子又は標準受精能獲得培地（Ｃ−ＨＴＦ）で処理された精子である、実施形態２１の方法。
【００３９】
２３．体外で実施される、実施形態２１の方法。
【００４０】
２４．ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）からの哺乳類精子の腟内又は子宮内授精（ＩＵＩ）での人工授精により、雌対象の生殖路において体内で実施される、実施形態２１の方法。
【００４１】
２５．向上した精子機能は、コンピュータ支援精液分析（ＣＡＳＡ）によって測定される運動能の向上を含む、実施形態２１の方法。
【００４２】
２６．運動能の向上は、哺乳類精子の曲線速度の向上、超活性化精子の割合の向上、中間運動能精子の割合の向上又はこれらの組み合わせを含む、実施形態２５の方法。
【００４３】
２７．向上した精子機能は、精子−透明帯結合検査によって測定される精子受精能獲得の向上を含む、実施形態２１の方法。
【００４４】
２８．向上した精子機能は、精子侵入検査によって測定される、卵子を受精させる哺乳類精子の能力の向上を含む、実施形態２１の方法。
【００４５】
２９．向上した精子機能は、好適な対照精子で発生された胚と比べて向上した生存能、改善された着床、少なくとも２細胞期発育段階、胚盤胞期発育段階又は子孫まで発育する向上した能力を有する胚の発生を含む、実施形態２１の方法。
【００４６】
３０．哺乳類精子は、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ又はマウス精子である、実施形態２１の方法。
【００４７】
３１．哺乳類精子は、ヒト精子である、実施形態３０の方法。
【００４８】
３２．解糖系エネルギー源は、グルコースであり、及び糖新生基質は、ピルビン酸である、実施形態３１の方法。
【００４９】
３３．実施形態２１の方法によって調製される、向上した精子機能を有する哺乳類精子を含む精子調製液。
【００５０】
３４．（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、増強された哺乳類精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、及び
（ｂ）ステップ（ａ）からの増強された哺乳類精子に有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供すること
のプロセスによって調製される、向上した割合の超活性化精子を含む精子調製液であって、有効量は、１つ以上の精子機能の向上を誘導するのに十分な量であり、向上した割合の超活性化精子を含む精子調製液は、
未処理の哺乳類精子、有効量の第１のエネルギー源又は第２のエネルギー源を独立に提供されている、ステップ（ａ）の増強された哺乳類精子、有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を同時に提供されている、ステップ（ａ）の増強された哺乳類精子又は標準受精能獲得培地（Ｃ−ＨＴＦ）で処理された哺乳類精子
から選択される好適な対照精子と比べて１つ以上の精子機能の向上を含む、精子調製液。
【００５１】
３５．第１のエネルギー源は、解糖系エネルギー源であり、及び第２のエネルギー源は、糖新生基質であるか、又は第１のエネルギー源は、糖新生基質であり、及び第２のエネルギー源は、解糖系エネルギー源である、実施形態３４の精子調製液。
【００５２】
３６．ステップ（ａ）の哺乳類精子は、２回分以上の射精液のプールとして提供される、実施形態３４の精子調製液。
【００５３】
３７．ステップ（ａ）の哺乳類精子は、低受精能の雄又は精子減少症の雄からのものである、実施形態３４の精子調製液。
【００５４】
３８．ステップ（ａ）の哺乳類精子は、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ又はマウス精子である、実施形態３４の精子調製液。
【００５５】
３９．ステップ（ａ）の哺乳類精子は、ヒト精子である、実施形態３８の精子調製液。
【００５６】
４０．減少した細胞内ＲＮＡを更に含む、実施形態３４の精子調製液。
【００５７】
４１．向上した精子機能を誘導する方法であって、
（ａ）緩衝剤を含み、且つ約６〜７のｐＨ及び約３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する保存培地に哺乳類精子を提供すること、
（ｂ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、哺乳類精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすること、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）からの増強された哺乳類精子に有効量の（ｉ）解糖系エネルギー源、及び／又は（ｉｉ）糖新生基質を提供すること
を含み、それにより好適な対照精子と比較して向上した精子機能を誘導する、方法。
【００５８】
４２．解糖系エネルギー源と糖新生基質とは、同時に提供される、実施形態４１の方法。
【００５９】
４３．解糖系エネルギー源と糖新生基質とは、順次提供される、実施形態４１の方法。
【００６０】
４４．向上した精子機能は、曲線速度、頭部振幅、オートファジー、精子受精能獲得、超活性化精子の割合、中間運動能精子の割合又はこれらの組み合わせの向上を含む、実施形態４１の方法。
【００６１】
４５．向上した精子機能は、超活性化精子及び中間運動能精子の割合の向上である、実施形態４１の方法。
【００６２】
４６．ステップ（ａ）の哺乳類精子は、２回分以上の射精液のプールとして提供される、実施形態４１の方法。
【００６３】
４７．保存培地は、卵黄を含まない、実施形態４１の方法。
【００６４】
４８．保存培地は、抗生物質を更に含む、実施形態４１の方法。
【００６５】
４９．保存培地は、血清アルブミンを更に含む、実施形態４１の方法。
【００６６】
５０．緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ又はこれらの組み合わせである、実施形態４１の方法。
【００６７】
５１．保存培地は、約６．６〜６．９のｐＨ及び約３３０〜３７０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する、実施形態４１の方法。
【００６８】
５２．保存培地は、グルコース、フルクトース、マンノース及びスクロースからなる群から選択される１つ以上の炭素源を更に含む、実施形態４１の方法。
【００６９】
５３．保存培地中の哺乳類精子は、ステップ（ａ）前に非低温条件下で貯蔵される、実施形態４１の方法。
【００７０】
５４．受精を増進させる方法であって、
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすることであって、インキュベーション前に、哺乳類精子は、緩衝剤を含み、且つ弱酸性ｐＨ及び約３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する保存培地に貯蔵される、インキュベートすること、
（ｂ）ステップ（ａ）からの増強された精子に有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供すること、
（ｃ）ステップ（ａ）の増強された哺乳類精子に有効量の第１のエネルギー源又は第２のエネルギー源を独立に提供するか、又は有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を同時に提供することによって得られるものを上回るレベルまで精子機能の１つ以上を向上させること、及び
（ｄ）向上した精子機能を有する哺乳類精子に、受精を増進させる条件下において、卵子への到達手段を提供すること
を含む方法。
【００７１】
５５．ステップ（ａ）の哺乳類精子は、２回分以上の射精液のプールとして提供される、実施形態５４の方法。
【００７２】
５６．１つ以上の精子機能は、曲線速度、頭部振幅、オートファジー、精子受精能獲得、超活性化精子の割合、中間運動能精子の割合並びに超活性化精子及び中間運動能精子の割合から選択される、実施形態５４の方法。
【００７３】
５７．体外で実施される、実施形態５４の方法。
【００７４】
５８．ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）からの、向上した精子機能を有する哺乳類精子の子宮内授精（ＩＵＩ）により、雌対象の生殖路において体内で実施される、実施形態５４の方法。
【００７５】
５９．ステップ（ｂ）の第２のエネルギー源を提供することは、ステップ（ｂ）からの、有効量の第１のエネルギー源を提供された増強された哺乳類精子の子宮内授精（ＩＵＩ）により、雌対象の生殖路において体内で実施される、実施形態５４の方法。
【００７６】
６０．ステップ（ｄ）は、向上した精子機能を有する哺乳類精子を卵子と共にインキュベートするか、又は向上した精子機能を有する哺乳類精子を卵子の細胞質に注入して、卵子の体外受精を増進させることを含む、実施形態５７の方法。
【００７７】
６１．ａ）緩衝化精子増強用エネルギー枯渇組成物を含む第１の組成物を含む第１の容器、及び
ｂ）哺乳類精子に好適な少なくとも第１のエネルギー源を含む第２の組成物を含む第２の容器
を含むキットであって、
哺乳類精子を第１の組成物中で好適な時間にわたってインキュベートすると、増強された哺乳類精子を生じさせ、
増強された哺乳類精子に有効量の少なくとも第１のエネルギー源を提供すると、好適な対照と比べて、増強された哺乳類精子の機能を向上させる、キット。
【００７８】
６２．緩衝化精子増強用エネルギー枯渇組成物を含む第１の組成物は、栄養素不含合成ヒト卵管液である、実施形態６１のキット。
【００７９】
６３．増強された哺乳類精子の機能は、曲線速度、頭部振幅、オートファジー、精子受精能獲得、超活性化精子の割合、中間運動能精子の割合、超活性化精子及び中間運動能精子の割合又はこれらの組み合わせである、実施形態６１〜６２のいずれか１つのキット。
【００８０】
６４．緩衝化精子増強用エネルギー枯渇組成物は、約０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３ｍＭ未満又はそれより低いグルコース濃度を含む、実施形態６１〜６３のいずれか１つのキット。
【００８１】
６５．緩衝化精子増強用エネルギー枯渇組成物は、約０．１５、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００５、０．００３、０．００２ｍＭ未満又はそれより低いピルビン酸濃度を含む、実施形態６１〜６４のいずれか１つのキット。
【００８２】
６６．好適な時間は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、４５、５０、５５、６０、９０、１２０、１５０又は１８０分である、実施形態６１〜６５のいずれか１つのキット。
【００８３】
６７．緩衝化精子増強用エネルギー枯渇組成物は、約２００〜２８０ｍＯｓｍ、例えば約２２０〜２６０、２２５〜２５５、２３０〜２５０ｍＯｓｍの範囲の容量オスモル濃度を含む、実施形態６１〜６６のいずれか１つのキット。
【００８４】
６８．増強された哺乳類精子に有効量の少なくとも第１のエネルギー源を提供することは、少なくとも約２７０、２７５、２８０、２８５、２９０又は２９５ｍＯｓｍの容量オスモル濃度におけるものである、実施形態６１〜６７のいずれか１つのキット。
【００８５】
６９．第１の組成物は、７．５〜１２．５ｍＭなど、例えば約５〜２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、９０〜１００ｍＭなど、例えば約８０〜１２０ｍＭの塩化ナトリウム、４〜７ｍＭ  ｍＭなど、例えば約３〜８ｍＭの塩化カリウム、１．５〜２．５ｍＭなど、例えば約１〜５ｍＭの塩化カルシウム、０．３〜０．４ｍＭなど、例えば約０．１〜０．５ｍＭのリン酸カリウム、０．１６〜０．３５ｍＭなど、例えば０．１〜０．５ｍＭの硫酸マグネシウム、１５〜３０ｍＭなど、例えば約１０〜５０ｍＭの重炭酸ナトリウムの１つ以上を含む、実施形態６１〜６８のいずれか１つのキット。
【００８６】
７０．第１の組成物は、例えば、約０．０００１％、０．０００２％、０．０００３％、０．０００４％、０．０００５％、０．０００６％、０．０００７％、０．０００８％、０．０００９％又は０．００１％のフェノールレッドを更に含む、実施形態６１〜６９のいずれか１つのキット。
【００８７】
７１．第１の組成物及び／又は第２の組成物は、例えば、約１〜２０μｇ／ｍｌ、２〜１８μｇ／ｍｌ、４〜１６μｇ／ｍｌ、６〜１４μｇ／ｍｌ又は８〜１２μｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシンなどの抗生物質を更に含む、実施形態６１〜７０のいずれか１つのキット。
【００８８】
７２．第１のエネルギー源は、解糖系エネルギー源又は糖新生基質である、実施形態６１〜７１のいずれか１つのキット。
【００８９】
７３．少なくとも第１のエネルギー源を含む第２の組成物が入った第２の容器は、緩衝化精子増強用エネルギー枯渇組成物を更に含む、実施形態６１〜７２のいずれか１つのキット。
【００９０】
７４．第１の組成物、第２の組成物又は第１の組成物と第２の組成物との両方は、例えば、滅菌ろ過によって事前に滅菌されている滅菌水溶液などの水溶液である、実施形態６１〜７３のいずれか１つのキット。
【００９１】
７５．第１の組成物及び／又は第２の組成物は、凍結乾燥組成物である、実施形態６１〜７３のいずれか１つのキット。
【００９２】
７６．哺乳類精子に好適な少なくとも第２のエネルギー源を含む第３の組成物を含む第３の容器を更に含み、増強された哺乳類精子に有効量の第２のエネルギー源を提供すると、精子の機能を向上させ、有効量の第２のエネルギー源は、第１のエネルギー源の有効量と同時に又は逐次的に提供される、実施形態６１〜７５のいずれか１つのキット。
【００９３】
７７．第３の組成物は、例えば、滅菌ろ過によって事前に滅菌されている滅菌水溶液などの水溶液である、実施形態７６のキット。
【００９４】
７８．第３の組成物は、凍結乾燥組成物である、実施形態７６のキット。
【００９５】
７９．哺乳類精子に好適な少なくとも第２のエネルギー源を含む第３の組成物を含む第３の容器は、緩衝化精子増強用エネルギー枯渇組成物を更に含む、実施形態７６〜７８のいずれか１つのキット。
【００９６】
８０．第３の組成物は、例えば、約１〜２０μｇ／ｍｌ、２〜１８μｇ／ｍｌ、４〜１６μｇ／ｍｌ、６〜１４μｇ／ｍｌ又は８〜１２μｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシンなどの抗生物質を更に含む、実施形態７６〜７９のいずれか１つのキット。
【００９７】
８１．第２のエネルギー源は、解糖系エネルギー源又は糖新生基質であり、第２のエネルギー源は、第１のエネルギー源として選択されないものである、実施形態７６〜８０の１つのキット。
【００９８】
８２．解糖系エネルギー源は、例えば、約１００ｍＭ〜１Ｍ、２００〜９００ｍＭ、３００〜８００ｍＭ、４００〜６００ｍＭ又は５００ｍＭ、例えば少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍＭ又は１Ｍの濃度のグルコースである、実施形態７２〜８１のいずれか１つのキット。
【００９９】
８３．糖新生基質は、例えば、約１０〜５０ｍＭ、１５〜４５ｍＭ、２０〜４０ｍＭ又は２５〜３５ｍＭ、例えば少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ｍＭの濃度のピルビン酸である、実施形態７２〜８２のいずれか１つのキット。
【０１００】
８４．第１のエネルギー源又は任意選択で第２のエネルギー源は、有効量のグルコースであり、グルコースの有効量は、希釈剤への導入時に約０．６ｍＭ〜１０．０ｍＭ、例えば約１．０〜７．０ｍＭ、２．５〜７．０ｍＭ、３．５〜６．５ｍＭ又は約５ｍＭ、例えば少なくとも約１、２、３又は４ｍＭである、実施形態７１〜８３のいずれか１つのキット。
【０１０１】
８５．第１のエネルギー源又は任意選択で第２のエネルギー源は、有効量のピルビン酸であり、ピルビン酸の有効量は、希釈剤への導入時に約０．１５〜０．６６ｍＭ、例えば約０．２０〜０．５０ｍＭ、０．２５〜０．４０ｍＭ又は約０．３０ｍＭである、実施形態７１〜８３のいずれか１つのキット。
【０１０２】
８６．第１のエネルギー源は、任意選択で、ピルビン酸ナトリウムの形態のピルビン酸である、実施形態７１〜８５のいずれか１つのキット。
【０１０３】
８７．第２のエネルギー源は、グルコースである、実施形態７６〜８６のいずれか１つのキット。
【０１０４】
８８．第１の組成物は、例えば、約１〜１０ｍｇ／ｍｌ、２〜８ｍｇ／ｍｌ又は３〜７ｍｇ／ｍｌの濃度のヒト血清アルブミンを含む、実施形態７１〜８７のいずれか１つのキット。
【０１０５】
８９．ヒト血清アルブミンを含む更なる容器を含む、実施形態７１〜８８のいずれか１つのキット。
【０１０６】
９０．第１及び／又は第２の組成物は、例えば、約９７．８ｍＭの濃度のＮａＣｌ、例えば約４．７ｍＭの濃度のＫＣｌ、例えば約２ｍＭの濃度のＣａＣｌ２、例えば約０．３７ｍＭの濃度のＫＨ２ＰＯ４、例えば約０．２ｍＭの濃度のＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、例えば約４ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＳＡ、例えば約１０μｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシン、例えば約１０ｍＭの濃度のＨＥＰＥＳ及び例えば約０．０００６％の濃度のフェノールレッドから本質的になる、実施形態７１〜８９のいずれか１つのキット。
【０１０７】
９１．第３の組成物は、例えば、約９７．８ｍＭの濃度のＮａＣｌ、例えば約４．７ｍＭの濃度のＫＣｌ、例えば約２ｍＭの濃度のＣａＣｌ２、例えば約０．３７ｍＭの濃度のＫＨ２ＰＯ４、例えば約０．２ｍＭの濃度のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、例えば約４ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＳＡ、例えば約１０μｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシン、例えば約１０ｍＭの濃度のＨＥＰＥＳ及び例えば約０．０００６％の濃度のフェノールレッドから本質的になる、実施形態７６〜９０のいずれか１つのキット。
【０１０８】
９２．マイクロ流体デバイス、密度勾配溶液、精子単離マトリックス（シラン化シリカなど、任意選択で栄養素不含合成ヒト卵管液に懸濁される）又はこれらの組み合わせから選択される精子の選択手段を更に含む、実施形態７１〜９１のいずれか１つのキット。
【０１０９】
９３．飢餓−レスキュー法／飢餓−再栄養法など、本明細書に記載されるとおりの方法の実施に関する説明書などの使用説明書を更に含む、実施形態７１〜９２のいずれか１つのキット。
【０１１０】
９４．哺乳類ドナーからの哺乳類精子の試料を採取するための採取容器を更に含む、実施形態７１〜９３のいずれか１つのキット。
【０１１１】
９５．第１の容器及び／又は第２の容器は、ボトル、バイアル、シリンジ又は試験管である、実施形態７１〜９４のいずれか１つのキット。
【０１１２】
９６．第３の容器は、ボトル、バイアル、シリンジ又は試験管である、実施形態７６〜９５のいずれか１つのキット。
【０１１３】
９７．第１の容器及び／又は第２の容器は、多目的容器である、実施形態７１〜９６のいずれか１つのキット。
【０１１４】
９８．第３の容器は、多目的容器である、実施形態７６〜９７のいずれか１つのキット。
【０１１５】
９９．精子機能を向上させる方法であって、
ｉ）精子を、エネルギー枯渇下において、精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすること、
ｉｉ）増強された精子に、解糖系エネルギー源又は糖新生基質から選択されるが、但し有効量の解糖系エネルギー源及び有効量の糖新生基質の両方ではない、有効量の第１のエネルギー源を提供すること、及び
ｉｉｉ）その後、有効量の糖新生基質及び解糖系エネルギー源の両方を提供するように、精子に有効量の第２のエネルギー源を提供すること
を含み、それにより精子機能を向上させる、方法。
【０１１６】
１００．エネルギー枯渇は、例えば、約０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３ｍＭ未満のグルコース又はそれより低い、約０．０２又は０．０１ｍＭ未満など、例えば約０．０１ｍＭ未満の低グルコース濃度を含む、実施形態９９の方法。
【０１１７】
１０１．エネルギー枯渇は、例えば、約０．１５、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００５、０．００３、０．００２ｍＭ未満又はそれより低い低ピルビン酸濃度を含む、実施形態９９又は実施形態１００の方法。
【０１１８】
１０２．エネルギー枯渇は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０分、例えば少なくとも約３０、４０、４５、５０、５５、６０、９０、１２０、１５０若しくは１８０分又は１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５若しくは１０時間にわたるものである、実施形態９９〜１０１のいずれか１つの方法。
【０１１９】
１０３．精子の増強後に有効量の第１のエネルギー源を提供することと、有効量の第２のエネルギー源を提供することとの間の時間は、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０分、例えば少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０分、例えば少なくとも約５〜１５分である、実施形態９９〜１０２のいずれか１つの方法。
【０１２０】
１０４．糖新生基質は、例えば、約０．１５〜０．６６ｍＭ、例えば約０．２５〜０．４０ｍＭ又は約０．３０ｍＭなど、約０．２０〜０．５０ｍＭの濃度のピルビン酸である、実施形態９９〜１０３のいずれか１つの方法。
【０１２１】
１０５．解糖系エネルギー源は、例えば、約０．６ｍＭ〜１０．０ｍＭ、１．０〜７．０ｍＭ、２．５〜７．０ｍＭ、３．５〜６．５ｍＭ又は５ｍＭ、例えば少なくとも約１、２、３又は４ｍＭの濃度のグルコースである、実施形態９９〜１０４のいずれか１つの方法。
【０１２２】
１０６．第１のエネルギー源は、グルコースなどの解糖系エネルギー源である、実施形態９９〜１０５のいずれか１つの方法。
【０１２３】
１０７．第２のエネルギー源は、グルコースなどの解糖系エネルギー源である、実施形態９９〜１０５のいずれか１つの方法。
【０１２４】
１０８．第１のエネルギー源は、ピルビン酸などの糖新生基質である、実施形態９９〜１０５のいずれか１つの方法。
【０１２５】
１０９．第２のエネルギー源は、ピルビン酸などの糖新生基質である、実施形態９９〜１０５のいずれか１つの方法。
【０１２６】
１１０．精子は、哺乳類精子（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ又は霊長類精子、例えばヒト精子）である、実施形態９９〜１０９のいずれか１つの方法。
【０１２７】
１１１．エネルギー枯渇中、約２００〜２８０ｍＯｓｍ、例えば約２２０〜２６０、２２５〜２５５、２３０〜２５０ｍＯｓｍの範囲の容量オスモル濃度で実施され、任意選択で、有効量の第１及び／又は第２のエネルギー源を添加すると、容量オスモル濃度は、少なくとも約２７０、２７５、２８０、２８５、２９０又は２９５ｍＯｓｍに増加する、実施形態９９〜１１０のいずれか１つの方法。
【０１２８】
１１２．例えば、ＣＡＳＡ又はＤＮＡ断片化（例えば、ＴＵＮＥＬによる）、脂質過酸化、活性酸素種若しくはこれらの組み合わせを測定することによる、精子の運動能又は品質の１つ以上の定量的評価を更に含む、実施形態９９〜１１１のいずれか１つの方法。
【０１２９】
１１３．治療前に、精子は、低温貯蔵から回収される、前出の実施形態のいずれか１つの方法。
【０１３０】
１１４．治療前に、精子は、非低温貯蔵から回収される、実施形態９９〜１１２のいずれか１つの方法。
【０１３１】
１１５．精子は、２回分以上の射精液（例えば、２、３、４、５、６回分又はそれを超える射精液）からプールされる、実施形態９９〜１１４のいずれか１つの方法。
【０１３２】
１１６．精子は、例えば、１ミリリットル当たりの精子が約１５００万個未満の精子数である低受精能の雄又は精子減少症の雄から入手される、実施形態９９〜１１５のいずれか１つの方法。
【０１３３】
１１７．エネルギー枯渇前に、精子は、例えば、密度勾配遠心法、スイムアップ法又はマイクロフルイディクスによって精液から濃縮される（又は単離される）、実施形態９９〜１１６のいずれか１つの方法。
【０１３４】
１１８．精子を雌生殖路に提供することを更に含み、任意選択で、有効量の第２のエネルギー源は、雌生殖路に提供される、実施形態９９〜１１７のいずれか１つの方法。
【０１３５】
１１９．体外で実施される、実施形態９９〜１１８のいずれか１つの方法。
【０１３６】
１２０．向上した機能を有する精子を、受精を増進させる条件下で卵子と接触させることを更に含む、実施形態１１９の方法。
【０１３７】
１２１．実施形態９９〜１１７のいずれか１つの方法によって調製された精子に、卵子を受精させるのに十分な時間にわたり、卵子への到達手段（例えば、ＩＣＳＩによることを含む）を提供することを含む、受精方法。
【０１３８】
１２２．好適な対照と比べて、超活性化精子及び／又は中間運動能精子の少なくとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは１００％の増加又はそれより大きい、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍の増加などであるか又はそれより大きい、約１．２倍を含む増加がある、実施形態９９〜１２１のいずれか１つの方法。
【０１３９】
１２３．少なくとも第１のエネルギー源又は第２のエネルギー源と組み合わせて、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ＋、クエン酸、ＡＭＰ又はＡＤＰなどの解糖系の上流又は下流の１つ以上の成分を精子に提供するステップを更に含む、実施形態９９〜１２２のいずれか１つの方法。
【０１４０】
１２４．少なくとも５％の超活性化精子を含む超活性化精子調製液であって、任意選択で、超活性化に基づいて事前に選別されておらず、任意選択で、超活性化精子及び／又は中間精子は、好適な対照と比べて、細胞内ＲＮＡ濃度（マイクロＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡなど）の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０％又はそれを超える（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍又はそれを超える）低下を有する、精子調製液。
【０１４１】
１２５．ａ．正常精子の雄、低受精能の雄又は精子減少症の雄、例えば低受精能（精子減少症を含む）の雄などの雄対象の精液から精子を濃縮すること、
ｂ．精子を、エネルギー枯渇下において、精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすること、
ｃ．増強された精子に、有効量の解糖系エネルギー源又は有効量の糖新生基質から選択されるが、但し有効量の解糖系エネルギー源及び糖新生基質の両方ではない、第１のエネルギー源を提供すること
によって調製される精子調製液。
【０１４２】
１２６．実施形態１２５の調製液に、卵子を受精させるのに十分な時間にわたり、有効量の糖新生基質及び解糖系エネルギー源の両方を提供するように、第２のエネルギー源の有効量及び卵子への到達手段を提供することを含む、受精方法。
【０１４３】
１２７．体外で実施される、実施形態１２６の方法。
【０１４４】
１２８．雌の生殖路（腟又は子宮）において体内で実施される、実施形態１２６の方法。
【０１４５】
１２９．精子は、精子減少症の対象又は低受精能の（例えば、精子運動能が低い）対象からのものである、実施形態１２５の調製液。
【０１４６】
１３０．実施形態９９〜１２０のいずれか１つの方法によって調製される、実施形態１２５の調製液。
【０１４７】
１３１．ｉ）精子との接触時にエネルギー枯渇を誘導する精子増強溶液、
ｉｉ）有効量の解糖系エネルギー源又は有効量の糖新生基質から選択されるが、但し有効量の解糖系エネルギー源及び糖新生基質の両方ではない、第１のエネルギー源を提供する溶液、及び
ｉｉｉ）有効量の第２のエネルギー源を提供する溶液
を含む製品。
【０１４８】
１３２．精子単離マトリックスを更に含む、実施形態１３１の製品。
【０１４９】
１３３．精子単離マトリックスは、シラン化シリカであり、任意選択で、シラン化シリカは、いかなる解糖系エネルギー源又は糖新生基質も実質的に含まない培地中にある、実施形態１３２の製品。
【０１５０】
１３４．緩衝剤を含み、且つ弱酸性ｐＨ及び約３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば約３００〜３８０、３２０〜３７０、３３０〜３７０、３４０〜３６０、例えば約３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０又は３８０、例えば約３５０の重量オスモル濃度を有する精子保存培地であって、有意な量の卵黄を含まないか、又は一部の実施形態では一切の卵黄を含まない精子保存培地。
【０１５１】
１３５．炭素源を更に含み、任意選択で、炭素源は、グルコース、フルクトース、マンノース、スクロース又はこれらの組み合わせから選択される、実施形態１３４の精子保存培地。
【０１５２】
１３６．炭素源は、グルコースである、実施形態１３５の精子保存培地。
【０１５３】
１３７．グルコースは、約０．１〜０．４Ｍの濃度、約０．２〜０．４Ｍなど、例えば約０．３０〜０．３６Ｍ又は約０．３３Ｍの濃度で存在する、実施形態１３６の精子保存培地。
【０１５４】
１３８．緩衝剤は、両性イオン緩衝剤であり、緩衝剤濃度は、約１〜１００ｍＭ、例えば１〜５０ｍＭ、１〜４０ｍＭ、１〜３０ｍＭ、１〜２０ｍＭ、５〜１５ｍＭ、例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ｍＭ、例えば約１０ｍＭである、実施形態１３４〜１３７のいずれか１つの精子保存培地。
【０１５５】
１３９．緩衝剤は、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）又はこれらの組み合わせである、実施形態１３８の精子保存培地。
【０１５６】
１４０．抗生物質を更に含む、実施形態１３４〜１３９のいずれか１つの精子保存培地。
【０１５７】
１４１．抗生物質は、アミノグリコシドである、実施形態１４０の精子保存培地。
【０１５８】
１４２．抗生物質は、ゲンタマイシンである、実施形態１４０又は１４１の精子保存培地。
【０１５９】
１４３．ゲンタマイシンは、約５〜２０μｇ／ｍｌ、例えば約１０μｇ／ｍｌの濃度で存在する、実施形態１４２の精子保存培地。
【０１６０】
１４４．血清アルブミンを更に含む、実施形態１３１〜１４３のいずれか１つの精子保存培地。
【０１６１】
１４５．血清アルブミンは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はこれらの組み合わせであり、より詳細には、血清アルブミンは、約１．５〜４．５％（Ｗ／Ｖ）、例えば約２〜４％、２．５〜３．５％又は３％の濃度で存在する、実施形態１４４の精子保存培地。
【０１６２】
１４６．約３４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する、実施形態１３４〜１４５のいずれか１つの精子保存培地。
【０１６３】
１４７．約６〜７、例えば６．６〜６．９のｐＨを有する、実施形態１３４〜１４６のいずれか１つの精子保存培地。
【０１６４】
１４８．ステロール、抗酸化剤又は抗炎症剤の１つ以上を更に含む、実施形態１３４〜１４７のいずれか１つの精子保存培地。
【０１６５】
１４９．両性イオン緩衝剤及び約６．６〜６．９のｐＨ、約０．２５〜０．３６Ｍの濃度のグルコース、約３２０〜３８０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を含む精子保存培地であって、有意な量の卵黄を含まないか、又は一部の実施形態では一切の卵黄を含まない精子保存培地。
【０１６６】
１５０．抗生物質を更に含み、任意選択で、抗生物質は、ゲンタマイシンである、実施形態１４９の精子保存培地。
【０１６７】
１５１．ｐＨは、約６．８であり、グルコース濃度は、約０．３３０ｍＭであり、重量オスモル濃度は、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、及び血清アルブミンは、ＢＳＡ及び／又はＨＳＡであり、任意選択で、ＢＳＡ及び／又はＨＳＡは、約２〜４％（Ｗ／Ｖ）の濃度で存在する、実施形態１４９又は実施形態１５０の精子保存培地。
【０１６８】
１５２．緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ又はこれらの組み合わせである、実施形態１５１の精子保存培地。
【０１６９】
１５３．滅菌製剤として任意選択で密閉滅菌容器に提供される、実施形態１４９〜１５２のいずれか１つの精子保存培地。
【０１７０】
１５４．凍結乾燥される、実施形態１５３の精子保存。
【０１７１】
１５５．液体製剤である、実施形態１５３の精子保存培地。
【０１７２】
１５６．保存培地中に約４℃で最長４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日間又はそれを超えて貯蔵された精子は、受精能獲得培地への移し替え時に好適な対照精子と比べて少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０％又はそれを超える運動精子を維持する、実施形態１４９〜１５５のいずれか１つの精子保存培地。
【０１７３】
１５７．保存培地中に約４℃で７日間にわたって貯蔵された精子は、受精能獲得培地への移し替え時に好適な対照精子と比べて少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０％又はそれを超える運動精子を有する、実施形態１４９〜１５６のいずれか１つの精子保存培地。
【０１７４】
１５８．保存培地中に約４℃で４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日間又はそれを超えて貯蔵された精子は、受精能獲得培地への移し替え時に好適な対照精子と比べて少なくとも約７５％の運動精子を有する、実施形態１４９〜１５７のいずれか１つの精子保存培地。
【０１７５】
１５９．保存培地中に約４℃で７日間にわたって貯蔵された精子は、受精能獲得培地への移し替え時、保存培地中にある貯蔵前の対照精子と比べて１、２、５、１０、１５又は２０％以下だけ低下した運動精子率である、実施形態１４９〜１５８のいずれか１つの精子保存培地。
【０１７６】
１６０．培地中に貯蔵した精子は、
低温貯蔵した細胞と比べて少なくとも３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５％又はそれを超えるＴＵＮＥＬ染色の減少、
低温貯蔵した細胞と比べて少なくとも３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５％又はそれを超える脂質過酸化の減少、
低温貯蔵した細胞と比べて少なくとも３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５％又はそれを超える活性酸素種の減少、又は
１つ、２つ又は３つ全てを含めた前述の組み合わせ
の１つ以上を呈する、実施形態１５６〜１５９のいずれか１つの精子保存培地。
【０１７７】
１６１．約６．７〜６．９のｐＨを有し、両性イオン緩衝剤、約０．２５〜０．３５Ｍの濃度のグルコース、抗生物質、約３４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度、約２〜４％（Ｗ／Ｖ）の濃度のＢＳＡ又はＨＳＡから本質的になる滅菌液体精子保存培地であって、この保存培地中に４℃で最長１２日間にわたって貯蔵された精子は、受精能獲得培地への移し替え時に好適な対照精子と比べて少なくとも６０％の運動精子を維持し、任意選択で、この培地は、卵黄を含有しない、滅菌液体精子保存培地。
【０１７８】
１６２．前出の実施形態のいずれか１つの精子保存培地を含む組成物であって、生存精子を更に含み、任意選択で、精子は、精液から（例えば、密度勾配遠心法、スイムアップ法、ろ過又はマイクロフルイディクスによって）濃縮される、組成物。
【０１７９】
１６３．精子は、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、ネコ、イヌ又はヒトなどの霊長類精子など、哺乳類精子である、実施形態１６２の組成物。
【０１８０】
１６４．哺乳類精子は、精子数の減少した、例えば１ミリリットル当たり約１５００万個未満の精子を有する対象からのものである、実施形態１６３の組成物。
【０１８１】
１６５．約４℃で最長４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日間又はそれを超えて貯蔵したとき、受精能獲得培地への移し替え時に好適な対照精子と比べて少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０％又はそれを超える精子は、運動能を有する、実施形態１６２〜１６４のいずれか１つの組成物。
【０１８２】
１６６．（ｉ）精子、例えばヒト精子、及び
（ｉｉ）緩衝剤
を含む組成物であって、５〜７（例えば、６〜７又は６．６〜６．９）のｐＨ及び約３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、約３００〜３８０、３２０〜３７０、３３０〜３７０、３４０〜３６０、例えば約３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０又は３８０、例えば約３５０）の重量オスモル濃度を有し、培地は、任意選択で、有意な量の卵黄を含まないか、又は一部の実施形態では一切の卵黄を含まない、組成物。
【０１８３】
１６７．組成物の非精子部分は、実施形態１３４〜１６１のいずれか１つの精子保存培地である、実施形態１６６の組成物。
【０１８４】
１６８．ヒト精子と液体精子保存培地とを含む組成物であって、液体精子保存培地は、約６．７〜６．９のｐＨを有し、両性イオン緩衝剤、約０．２５〜０．３５Ｍの濃度のグルコース、約３４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度、抗生物質、約２〜４％（Ｗ／Ｖ）の濃度のＢＳＡ又はＨＳＡから本質的になり、４℃で最長１２日間にわたって貯蔵したとき、受精能獲得培地への移し替え時に好適な対照精子と比べて少なくとも６０％の精子は、運動能を有し、任意選択で、培地は、卵黄を含有しない、組成物。
【０１８５】
１６９．精子は、２回分以上の射精液（例えば、２、３、４、５、６回分又はそれを超える射精液）からプールされる、実施形態１３４〜１６８のいずれか１つの組成物。
【０１８６】
１７０．精子を、実施形態１３４〜１６１のいずれか１つの培地と接触させることを含む、精子を保存する方法。
【０１８７】
１７１．実施形態１６２〜１６９のいずれか１つの組成物を雌レシピエントの生殖器官（例えば、腟又は子宮）に導入することを含む受精方法であって、任意選択で、雌レシピエントの生殖器官への導入前に、精子は、組成物から単離されて受精能獲得培地に置かれる、方法。
【０１８８】
１７２．実施形態１６２〜１６９のいずれか１つの組成物を卵子に接触させること（例えば、ＩＳＣＩによるなど、注入によることを含む）を含む受精方法であって、任意選択で、卵子に接触させる前に、精子は、組成物から単離されて受精能獲得培地に置かれる、方法。
【０１８９】
１７３．（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇下において、増強された哺乳類精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、及び
（ｂ）ステップ（ａ）からの増強された哺乳類精子に有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供すること
によって調製される精子調製液であって、ステップ（ｂ）の精子は、好適な対照精子と異なるエピジェネティックプロファイルを含む、精子調製液。
【０１９０】
１７４．好適な対照精子は、未処理の哺乳類精子、有効量の第１のエネルギー源又は第２のエネルギー源を独立に提供されている、ステップ（ａ）の増強された哺乳類精子、有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を同時に提供されている、ステップ（ａ）の増強された哺乳類精子又は標準受精能獲得培地（Ｃ−ＨＴＦ）で処理された精子である、実施形態１７３の精子調製液。
【０１９１】
１７５．異なるエピジェネティックプロファイルは、ＤＮＡメチル化、ＤＮＡアセチル化、ＲＮＡメチル化、タンパク質（例えば、ヒストン）メチル化、タンパク質（例えば、ヒストン）アセチル化又はこれらの組み合わせの変化したレベルを含む、実施形態１７３〜１７４のいずれか１つの精子調製液。
【０１９２】
１７６．ステップ（ｂ）の精子は、好適な対照精子と比べて減少したＲＮＡレベルを更に含む、実施形態１７３〜１７５のいずれか１つの精子調製液。
【０１９３】
１７７．減少したＲＮＡレベルは、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）の減少を含む、実施形態１７６の精子調製液。
【０１９４】
１７８．非コードＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである、実施形態１７７の精子調製液。
【０１９５】
１７９．改善された適応度を有する子孫を作製する方法であって、
（ａ）精子試料を、エネルギー枯渇下において、増強された精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、
（ｂ）増強された精子に有効量の第１のエネルギー源を提供すること、及び
（ｃ）その後、ステップ（ｂ）からの精子に有効量の第２のエネルギー源を提供すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの精子を卵子に受精させて、胚を発生させること、及び
（ｅ）雌対象において胚を成長させて、改善された適応度を有する子孫を作製すること
を含み、改善された適応度は、病態を発症する低下したリスクを含む、方法。
【０１９６】
１８０．改善された適応度を有する子孫は、病態を発症しない、実施形態１７９の方法。
【０１９７】
１８１．ステップ（ｃ）の精子は、好適な対照精子と異なるエピジェネティックプロファイルを含む、実施形態１７９〜１８０のいずれか１つの方法。
【０１９８】
１８２．ステップ（ｃ）の精子は、好適な対照精子と比べて減少した細胞内ＲＮＡレベルを含む、実施形態１７９〜１８１のいずれか１つの方法。
【０１９９】
１８３．病態は、肥満又は肥満関連障害（例えば、２型糖尿病、心血管疾患、呼吸器疾患、不妊症又は癌）である、実施形態１７９〜１８２のいずれか１つの方法。
【０２００】
１８４．第１のエネルギー源は、解糖系エネルギー源であり、及び第２のエネルギー源は、糖新生基質である、実施形態１７９〜１８３のいずれか１つの方法。
【０２０１】
１８５．第１のエネルギー源は、糖新生基質であり、及び第２のエネルギー源は、解糖系エネルギー源である、実施形態１７９〜１８３のいずれか１つの方法。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】対照及び飢餓（グルコース、ピルビン酸及び乳酸不含）条件における超活性及び中間運動能精子の割合の棒グラフである。
【図２】対照及び飢餓（グルコース、ピルビン酸及び乳酸不含）条件における、グルコース及びピルビン酸の両方（飢餓／レスキュー同時）、グルコースのみ（飢餓／グルコースレスキュー）、ピルビン酸のみ（飢餓／ピルビン酸のみ）、１時間グルコース＋１５分ピルビン酸（飢餓／グルコースレスキュー＋１５分ピルビン酸）又は１時間ピルビン酸＋１５分グルコース（飢餓／ピルビン酸レスキュー＋１５分グルコース）の添加後の超活性及び中間運動能精子の割合の棒グラフである。
【図３】本発明により提供される方法の特定の例示的実施形態と組み合わせた密度勾配法による精子単離の説明図である。
【図４】本発明により提供される方法の特定の例示的実施形態と組み合わせたスイムアップ法による精子単離の説明図である。
【図５Ａ】７人の異なるドナーにおける中間運動能精子の割合±ＳＥＭの棒グラフである。Ｎ＝２０、＊：ｔ検定によって決定したとき、対照に対してｐ＜０．０５。精液試料は、健常ボランティアから入手した。
【図５Ｂ】７人の異なるドナーにおける超活性運動能精子の割合±ＳＥＭの棒グラフである。Ｎ＝２０、＊：ｔ検定によって決定したとき、対照に対してｐ＜０．０５。精液試料は、健常ボランティアから入手した。
【図６Ａ】中間運動能精子の割合±ＳＥＭの棒グラフである。Ｎ＝５、＊：ｔ検定によって決定したとき、対照に対してｐ＜０．０５。精液試料は、不妊症の治療を求める男性から入手した。
【図６Ｂ】超活性運動能精子の割合±ＳＥＭの棒グラフである。Ｎ＝５、＊：ｔ検定によって決定したとき、対照に対してｐ＜０．０５。精液試料は、不妊症の治療を求める男性から入手した。
【図７】ＩＶＦ及びＩＵＩの一般的な実施技法を説明する。ＩＶＦの精子処理（左）は、概して、密度勾配遠心法（ここに図示されている）などの分離ステップと、続く洗浄ステップとからなる。代替的な分離手段としてスイムアップ法（図示せず）が用いられることもある。ＩＵＩの精子処理（右）は、洗浄ステップのみで済むが、クリニックによっては、密度勾配遠心法（図示されている）又はスイムアップ法（図示せず）のいずれかによる初期分離ステップを含めることを好む。
【図８】本発明の例示的キットを用いたＩＶＦのための精子処理の概要を提供する。１つの例示的なＩＶＦ適用では、栄養素不含密度勾配遠心のためのキットを栄養素不含洗浄、インキュベーション及び逐次的栄養素添加のためのキットと共に利用することができる。これにより、栄養素不含分離、洗浄及びインキュベーションと、続くグルコース及びピルビン酸の段階的再添加とで精子調製液を調製することが可能となる。最終的なグルコースインキュベーション後、試料を遠心し、卵母細胞とのコインキュベーション前に適切な容量の受精培地（これは、例えば、クリニックの好みの受精培地であり得る）に再懸濁する。
【図９】本発明の例示的キットを用いたＩＵＩのための精子処理の概要を提供する。１つの例示的なＩＵＩ適用では、栄養素不含密度勾配遠心のためのキットを栄養素不含洗浄、インキュベーション及び単一栄養素添加のためのキットと共に利用することができる。これにより、栄養素不含分離、洗浄及びインキュベーションと、続くピルビン酸の段階的再添加とで精子調製液を調製することが可能となる。ＩＵＩについては、子宮内にグルコースが存在するため、授精前にグルコースが再導入されない。
【図１０】飢餓−レスキュープロトコルの効果を示す。初めに、ヒト精子をグルコース及びピルビン酸の非存在下でインキュベートする飢餓−レスキュープロトコルを一般的な精子調製液と比較した。グルコース及びピルビン酸を再導入した後間もなく（Ｃ）、より高い割合の精子が中間及び超活性化運動能表現型を呈した（差し込み図に各々の代表的な軌跡を示す）。Ｎ＝２０（７個体からの試料）。＊ｐ＝０．００８４。
【図１１】得られた２細胞期胚及び胚盤胞期胚の数を示す。Ｎ＝４（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス：低受精能マウス系統）、＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＝０．１７。これらの胚を雌に移植するとまた、３倍を超える生児出生率の増加が生じた。
【図１２】ＩＶＦ用キット及びＩＵＩ用キットの一構成品である、スイムアップ法プロトコル精子分離のための栄養素不含ｓＨＴＦ（ここでは「ｓＨＴＦ培地」又は「ｓＨＴＦ洗浄緩衝液」として図示される）を使用した精子処理の概要を提供する。一般的な実施技法に倣い、ピペットで慎重にｓＨＴＦ培地の下に精液の層を作り、インキュベートすることにより、精液を泳ぎ出て上方に向かう運動精子を上層の培地に入らせる。インキュベーション後、運動精子を含有する上部のｓＨＴＦ培地をＩＶＦ用キット又はＩＵＩ用キットの洗浄ステップに慎重に移し替えると、精子調製が完了となる。
【図１３Ａ】４℃で貯蔵した後に回収された運動精子の割合の折れ線グラフである。ｘ軸に指示される時間にわたって供試保存培地又はＥＦＭのいずれかに貯蔵した精子を回収し、受精能獲得後の運動能を測定した。データは、時間０における（試料処理直後に取得された）総運動精子に対する割合として示す。
【図１３Ｂ】４℃で貯蔵した後に回収された運動精子割合の折れ線グラフである。ｘ軸に指示される時間にわたって４℃で供試保存培地又は冷蔵培地に貯蔵した精子を回収し、受精能獲得後の運動能を測定した。データは、時間０における（試料処理直後に取得された）総運動精子に対する割合として示す。
【図１４Ａ】供試培地（保存培地）に４℃で７日間貯蔵した後又は凍結保存後のＴＵＮＥＬ染色によって決定したときのＤＮＡ断片化を有する精子の割合の棒グラフである。
【図１４Ｂ】凍結保存（ＣＲＹＯ）と比較した、供試培地（保存培地）に４℃で７日間貯蔵した後に回収された運動精子割合の散布図である。精子を回収し、受精能獲得後の運動能について評価した。データは、時間０における総運動精子に対する割合として示され、各データ点が個々の測定値を表す。
【発明を実施するための形態】
【０２０３】
妊娠困難なカップルの約５０％は、男性因子が原因である。低精子数は、広く認められている男性不妊症の要因である。世界保健機関は、低精子数（精子減少症）を１ミリリットル当たり１５００万個未満の精子として定義している（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｕｐｄａｔｅ，１６（３），２３１−２４５，２００９）。男性不妊症又は低受精能の他の原因としては、低運動能又は形態異常が挙げられる。生殖補助の重要な側面は、雄性配偶子（精子）の機能を最大限引き出して、受精が最大となることを促進することである。受精前、精子は、卵子を受精させることが可能となるための一連の変化、精子受精能獲得と呼ばれる過程を経なければならない。体外受精能獲得培地は、３つの成分（アルブミン、カルシウム及び重炭酸）を含み、精子受精能獲得を惹起する。精子は、最初にほぼ対称的な鞭毛運動で直進的に泳ぐ。種に応じた様々な時間が経った後、この直線的な精子運動は、「超活性化」として知られる定位置でのらせん運動に取って代わる。精子を活性化させる方法が存在するが、そうした方法は、最大限の精子活性化を実現することができず、従って不妊症における男性因子の影響に十分に対処するものではない。従って、精子機能を向上させるための、例えばそれにより生殖補助を促進する培地、組成物及び方法が必要とされている。
【０２０４】
本開示は、とりわけ、精子の保存方法、精子機能を向上させる方法、受精を増進させる方法、かかる方法を実施するためのキット、精子調製液及び製品を提供する。本発明は、少なくとも一部には、飢餓期間後に異なるエネルギー源を段階的に再導入すると優れた精子活性化が実現するという本出願人の驚くべき発見に基づく。
【０２０５】
定義
本開示の理解を促すため、以下に多くの用語及び語句を定義する。
【０２０６】
用語「向上した」、「向上させる」、「向上している」若しくは「亢進させる」又は「増進させる」は、全て本明細書において概して向上を意味して用いられる。誤解を避けるために言えば、用語「向上した」、「向上させる」又は「亢進させる」は、好適な対照と比較したときの少なくとも５％、例えば少なくとも１０％の向上、例えば好適な対照と比較したときの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の向上、又は１００％以下の向上、又は１０〜１００％の任意の向上、又は好適な対照と比較したときの少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍の向上、又は２倍〜１０倍、又はそれを超えるものの間の任意の向上を意味する。向上は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又はそれを超えるものであり得、好ましくは所与の疾患（例えば、精子機能異常又は精子減少症に起因する男性不妊症）を有しない哺乳類雄対象からの正常な精子の範囲内として認められているレベルになることである。
【０２０７】
用語「減少させる」、「低減する」、「低減」、「低下させる」若しくは「低下」又は「阻害する」は、全て本明細書において概して減少を意味して用いられる。例えば、「減少させる」、「低減する」、「低減」又は「阻害する」は、好適な対照と比較したときの少なくとも５％、例えば１０％の減少、例えば好適な対照と比較したときの少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の減少、又は１００％以下の減少（例えば、好適な対照と比較したとき存在しないレベル又は検出不能レベル）、又は１０〜１００％にある任意の減少を意味する。減少は、例えば、所与の疾患を有しないある個体についての正常範囲と比べて少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又はそれを超え得る。
【０２０８】
本明細書で使用されるとき、用語「有効量」は、哺乳類精子の検出可能な機能（例えば、精子運動能、曲線速度、頭部振幅、オートファジー、精子受精能獲得、超活性化精子の割合、中間運動能精子の割合並びに超活性化精子及び中間運動能精子の割合、卵子を受精させる能力並びに胚の発生）に変化を生じさせるのに十分な第１のエネルギー源又は第２のエネルギー源の１つ又は複数の活性成分の総量を意味する。単独で投与される個々のエネルギー源に適用されるとき、この用語は、そのエネルギー源単独について参照する。組み合わせに適用されるとき、この用語は、組み合わせて投与されるか、順次投与されるか、又は同時に投与されるかに関わらず、効果を生じる第１のエネルギー源と第２のエネルギー源との組み合わせの量を指す。
【０２０９】
用語「有効量」は、その意味の範囲内において、所望の効果を提供するのに十分な量のエネルギー源（例えば、糖新生基質又は解糖系エネルギー源）を含む。本開示に関係するとき、所望の効果とは、１つ以上の精子機能の向上又は受精の向上であり得る。必要とされる厳密な量は、治療下の哺乳類精子種、例えば精子が低受精能の哺乳類対象から入手される場合に哺乳類精子の入手元の雄対象の年齢及び全般的状態などの要因に応じて変わることになる。従って、厳密な「有効量」を規定することはできない。しかしながら、どのような場合でも、適切な「有効量」は、当業者がルーチンに過ぎない実験を用いて決定し得る。
【０２１０】
用語「精子（ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏｏｎ）」は、雄哺乳類からの生存生殖細胞を指す。用語「精子（ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ）」は、複数の生存雄性生殖細胞を指す。文脈上特に要求されない限り、複数形及び単数形は、同義的である。用語「精子（ｓｐｅｒｍ）」が略語として使用され、これは、少なくとも１つの精子を指す。
【０２１１】
本明細書で使用されるとき、用語「卵子を受精させる能力」は、精子（例えば、哺乳類精子）が未受精卵（卵細胞）に侵入してそれらの遺伝子材料の組み合わせを生じさせ、その結果、接合体を形成する能力を指す。本開示に関係するとき、卵子を「受精させる能力」とは、体外及び／又は体内で受精させる能力であり得る。一部の実施形態において、体外で受精させる能力は、自然妊娠、腟内授精、子宮内授精又は卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）による受精を含む。
【０２１２】
用語「胚」は、本明細書では、二倍体全能性細胞、例えば受精卵を形成するための哺乳類精子による未受精卵の受精時に形成される接合体と、続いて細胞分裂を起こして２細胞期以降まで発育する胚（例えば、４細胞期、１６細胞期、３２細胞期、胚盤胞期（分化した栄養外胚葉及び内部細胞塊を伴う）又は子孫への発育）との両方を指して使用される。
【０２１３】
本明細書で使用されるとき、用語「発育する能力」は、胚が成長又は発育する能力又は潜在的可能性を指す。これらの用語は、胚が少なくとも２細胞期発育段階、胚盤胞期発育段階に達し、子宮内に着床して、完全な子孫に発育するか、又は生きて生まれる能力又は潜在的可能性を指し得る。用語「子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）」は、本明細書で使用されるとき親の子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）を指し、ここで、子孫は、出生前の胎児又は新生児である。
【０２１４】
用語「胚盤胞」は、受精５又は６日後の胚を指し、胚全体の由来である内部細胞塊と、栄養外胚葉と呼ばれる外側細胞層と、内部細胞塊を収容する体液によって満たされた胞胚腔とを有する。栄養外胚葉は、胎盤の前駆体である。胚盤胞は、透明帯に取り囲まれており、透明帯は、続いて、胚盤胞が「孵化」するときに脱落する。糖タンパク質の外被で構成される透明帯は、発育段階の１細胞期から胚盤胞期まで卵母細胞を取り囲む。胚が付着し、着床する前に、透明帯は、タンパク質分解を含めた幾つもの機構によって胚から脱落する。透明帯は、最初に２つ以上の精子が卵母細胞に侵入することを防ぐ役割を果たし、次に後に胚が子宮に到着する前に早まって接着することを防ぐ役割を果たす。
【０２１５】
本明細書で使用されるとき、用語「濃縮された」は、濃縮のない最終産物又は調製液中でその種が天然に存在するレベルと比べて目標種の濃度が実質的に高くなるように目標種が部分的に精製されている組成物又は画分又は調製液を指す。
【０２１６】
用語「生殖補助技術」、又は「ＡＲＴ」、又は「補助受精」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、人工的な又は部分的に人工的な手段によって妊娠を実現するために用いられる方法を指す。生殖補助技術には、限定はされないが、古典的体外受精（ＩＶＦ）、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、子宮内授精（ＩＵＩ）及び頸管内授精が含まれる。
【０２１７】
用語「子宮内授精」又は「ＩＵＩ」は、子宮中への精子（ｓｐｅｒｍ）又は精子（ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ）の直接的な子宮内注入を指す。
【０２１８】
用語「体外受精」又は「ＩＶＦ」は、インビトロで生体の外部で卵母細胞を精子によって受精させる方法を指す。ＩＶＦは、不妊症において体内での妊娠が成功しなかった場合の主要な治療法である。
【０２１９】
用語「卵細胞質内精子注入法」又は「ＩＣＳＩ」は、単一の精子を卵子の細胞質に直接注入する体外受精手技を指す。この手技は、最も一般的には、男性不妊症因子を克服するために用いられているが、卵母細胞が精子の侵入を受け難い場合にも及びときに体外受精方法として用いられることもある。
【０２２０】
全体を通して開示される幾つかの数値は、例えば、「Ｘは、少なくとも又は少なくとも約１００又は２００［又は任意の数値］である」と表現される。この数値は、その数字自体及び以下の全てを含む：
ｉ．Ｘは、少なくとも１００であり、
ｉｉ．Ｘは、少なくとも２００であり、
ｉｉｉ．Ｘは、少なくとも約１００であり、及び
ｉｖ．Ｘは、少なくとも約２００である。
【０２２１】
全体を通して開示される数値により、これらの異なる組み合わせの全てが企図される。開示される数値の全ては、それが治療剤の投与を指すか、又は日数、月数、年数、重量、投薬量等を指すかに関わらず、特にそうでない旨が具体的に指示されない限りこのように解釈されるべきである。
【０２２２】
全体を通して開示される範囲は、例えば、「Ｘは、１〜２若しくは２〜３［若しくは任意の数値範囲］日目又は約その日数目に投与される」と表現されることもある。この範囲は、その数字自体（例えば、範囲の端点）及び以下の全てを含む：
ｉ．Ｘは、１日目〜２日目に投与され、
ｉｉ．Ｘは、２日目〜３日目に投与され、
ｉｉｉ．Ｘは、約１日目〜２日目に投与され、
ｉｖ．Ｘは、約２日目〜３日目に投与され、
ｖ．Ｘは、１日目〜約２日目に投与され、
ｖｉ．Ｘは、２日目〜約３日目に投与され、
ｖｉｉ．Ｘは、約１日目〜約２日目に投与され、及び
ｖｉｉｉ．Ｘは、約２日目〜約３日目に投与される。
【０２２３】
全体を通して開示される範囲により、これらの異なる組み合わせの全てが企図される。開示される範囲の全ては、それが治療剤の投与を指すか、又は日数、月数、年数、重量、投薬量等を指すかに関わらず、特にそうでない旨が具体的に指示されない限りこのように解釈されるべきである。
【０２２４】
精子機能
一部の実施形態において、本明細書では、精子機能を向上させる方法が提供される。本方法は、哺乳類精子を、エネルギー枯渇下において、哺乳類精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすること、増強された哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）糖新生基質から選択される第１のエネルギー源を提供すること、及びその後、ステップ（ｂ）からの哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）糖新生基質から選択される第２のエネルギー源を提供することであって、提供されるエネルギー源は、第１のエネルギー源として選択されないものである、提供することを含み、それにより好適な対照精子と比較して向上した精子機能を誘導する。一部の実施形態において、本方法は、体外で実施される。一部の実施形態において、第２のエネルギー源の提供は、体内で、例えば事前にエネルギー枯渇下でインキュベートされ、且つ第１のエネルギー源が提供されている精子の頸管内又は子宮内授精によって実施される。向上した精子機能としては、集団中でＣＡＳＡｎｏｖａにより評価したとき、超活性化及び／又は中間運動能を呈する精子の割合など、向上した運動能（Ｇｏｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．９７：６９８−７０８；ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｌｒｅ／ｉｏｘ１２０を参照されたい）、向上したオートファジー、向上した受精能獲得及び向上した受精率、例えば少なくとも２細胞期までの発育、胚盤胞発育又は生児出生の１つ以上が挙げられる。従って、一部の実施形態において、精子機能は、精子運動能、曲線速度、頭部振幅、オートファジー、精子受精能獲得、超活性化精子の割合、中間運動能精子の割合並びに超活性化精子及び中間運動能精子の割合、卵子を受精させる能力、胚の発生であり得る。一部の実施形態において、向上した機能を有する精子によって発生された胚は、生存能の向上、着床の向上、発育が少なくとも２細胞期発育段階、胚盤胞期発育段階、子孫  −  即ち生児出生まで至る能力の向上又は改善された適応度（例えば、病態の発症リスクの低下を含む改善された適応度）の子孫から選択される１つ以上の特性を含む。
【０２２５】
一部の実施形態において、第１及び第２のエネルギー源は、順次提供される（例えば、第１のエネルギー源を提供し、続いて第２のエネルギー源を提供する）。一部の実施形態において、第１及び第２のエネルギー源は、同時に提供される。本明細書で企図されるとおりの１つ以上の精子機能の向上は、好適な対照精子と比べた１つ以上の精子機能の向上に相当する。一部の実施形態において、１つ以上の精子機能は、少なくとも又は少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％若しくは１００％、２００％、３００％又はそれを超えて向上し得る。一部の実施形態において、１つ以上の精子機能は、１０％〜２００％、２５％〜１５０％、５０％〜１００％又は７０％〜９０％向上し得る。
【０２２６】
本明細書では、精子機能を向上させる方法及び好適な対照精子と比べて向上した機能を含む精子の調製が提供される。本開示に関係するとき、精子の「活性」及び／又は「機能」は、例えば、精子運動能、精子向性（即ち精子が特定の刺激に向かって動こうとするか又はそれから遠ざかろうとする性質）及び卵子を受精させる能力など、生理学的過程を包含する。用語「活性」及び／又は「機能」には、受精及び／又は卵子（又はその膜／層）との相互作用前、その最中に起こる過程（かかる過程としては、例えば、精子受精能獲得及び先体活性を挙げることができる）及び／又は卵子の受精後の過程、例えば胚の形成も更に含まれ得る。一部の実施形態において、胚は、生存の向上（長期化）、着床の改善及び／又は２細胞期、胚盤胞期まで、又は子孫まで発育して生児出生をもたらす能力を呈する。
【０２２７】
精子機能の向上を測定する例示的方法は、運動能、粘液貫通性、卵母細胞受精又は続く胚発育などにより評価され得る。精子機能を決定する方法は、当技術分野において周知であり、例えばＳＳ．Ｖａｓａｎ  Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｕｒｏｌ．２０１１  Ｊａｎ−Ｍａｒ；２７（１）：４１−４８を参照されたい。
【０２２８】
精子運動能
精子運動能について、当業者は、用語「運動能」が一般的な運動に関するのみならず、例えば精子細胞の運動速度及び／又はいずれか所与の集団中における動いている精子細胞の比率の任意の増加又は減少など、運動能の他の側面にも適用され得ることを理解するであろう。そのため、本明細書に開示される方法は、精子運動能を向上させるためのみならず、精子細胞の運動速度及び／又はいずれか所与の精子集団中における動いている細胞の比率（割合）を向上させるためにも用いられ得る。
【０２２９】
精子の運動能は、総運動精子率又は運動能のある精子の速度として表される。これらの測定は、種々の検査法により行われ得るが、好都合には２つの方法の一方で検査される。位相差顕微鏡を使用して、精子が血球計算板又は顕微鏡スライドに置かれているときに主観的目視測定が行われるか、又はコンピュータ支援精液分析器が使用されるかのいずれかである。位相差顕微鏡下では、運動精子数及び総精子数のカウントが行われ、速度は、速い、中程度又は遅いとして評価される。精子運動能を評価する２つ目の方法は、コンピュータ支援精液分析器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｔｈｏｒｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）を使用することによるものであり、試料中にある個々の精子細胞の運動能特性が客観的に決定される。簡潔に言えば、その分析器のために設計されたスライド又はチャンバに精子試料が置かれる。分析器が個々の精子細胞を追跡し、精子の運動能及び速度を決定する。データは、運動率として表され、経路速度及び軌跡速度についての測定値も入手される。
【０２３０】
従って、用語「運動能」は、運動精子の割合を包含し、これは、Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｕｐｄａｔｅ，Ｖｏｌ  １６，Ｎｏ  ３  ｐｐ  ２３１−２４５，２０１０に考察されるとおり、速度又は方向性に関わらず、世界保健機関（ＷＨＯ）による「運動能なし」に指定されるカテゴリを除く全ての運動能カテゴリに当てはまると評価された総精子数の割合であり得る。手動カウントにより、精子細胞を、定性的主観的選択基準を用いて４つのカテゴリに分類する（不動、局所運動性、非直線運動性及び直線運動性）。
【０２３１】
用語「運動能」は、運動精子の割合、即ち集団中においてコンピュータ支援精子分析に基づいて直進運動能、超活性化運動能及び／又は中間運動能を呈すると評価された総精子数の割合を包含する（例えば、ＣＡＳＡｎｏｖａにより評価したとき；Ｇｏｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１７，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．９７：６９８−７０８を参照されたい）。
【０２３２】
本明細書に開示される方法は、直進運動能のある精子の割合、即ち本来非直進性の精子、即ち動きがあっても、前方への進行をなさない精子と比べて、頭部の回転が、９０度未満のある点から別の点への直線的な動きを呈する精子の割合を増加させることができる。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、中間運動能精子の割合を増加させることができる。中間運動能精子は、直進性の活発な運動能に類似しているが、しかし、経路からの変動がより大きく、首振り運動など、約９０度の精子頭部の回転を呈する運動によって特徴付けられる。一部の実施形態において、向上した運動能は、超活性化精子としても知られる活性化された超活性精子の割合の向上を含む。超活性化精子運動能は、振幅の大きい非対称な鞭打ちパターンの鞭毛を有する精子によって特徴付けられる。超活性化運動能は、多くが十分に定義付けられた前進経路のない一見ランダムな変動及び９０度より大きい精子頭部の回転を伴う活発な運動によって特徴付けられる。超活性化精子運動能は、より活発であり、直進運動能より短時間である。生物学的には、超活性化精子運動能は、成熟卵の受精に先立ち精子が卵子の外被を通り抜けることが可能となるのに重要である。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、所与の精子集団中における超活性化精子及び中間運動能精子の割合を向上させることができる。
【０２３３】
精子運動能パラメータの他の標準化された尺度も使用され得ることが理解されなければならない。他の精子運動能尺度としては、「速度」及び「直線性」が挙げられ、これらは、自動精液分析器を用いて評価することができる。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、平均経路速度（ＶＡＰ）、直線速度（ＶＳＬ）、曲線速度（ＶＣＬ）、頭部振幅（ＡＬＨ）及び頭部振動数（ＢＣＦ）又は当業者に公知の他のパラメータを含めた精子の運動パラメータの向上を含め、精子機能を向上させることができる。曲線速度（ＶＣＬ）は、所与の時間にわたる精子頭部の重心の移動速度の尺度である。平均経路速度（ＶＡＰ）は、精子の平均経路に沿った速度である。直線速度（ＶＳＬ）は、細胞の直線速度又は直進速度である。直進性（ＬＩＮ）は、ＶＣＬに対するＶＳＬの比であり、パーセンテージとして表される。精子頭部の頭部振幅（ＡＬＨ）は、細胞の進路軸又は平均経路に対するその横方向へのずれの振幅から計算される。ＣＡＳＡによる精子運動能の測定方法は、当技術分野において周知であり、例えば国際公開第２０１２０６１５７８Ａ２号パンフレットを参照されたい。精子運動能の向上とは、本明細書で企図されるとき、好適な対照精子と比べた精子の運動能の向上に相当する。
【０２３４】
一部の実施形態において、運動能が向上した精子が提供され、これは、精子をエネルギー枯渇条件でインキュベートして精子を増強すること、その後、増強された精子に第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を提供することを含む方法の産物である。一部の実施形態において、第１及び第２のエネルギー源は、同時に提供される。一部の実施形態において、第１及び第２のエネルギー源は、順次提供される。一部の実施形態において、精子運動能の向上は、好適な対照精子と比べて約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９％超であり得る。一部の実施形態において、精子運動能の向上は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％であり得る。一部の実施形態において、精子運動能の向上は、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも１０，０００倍であり得る。一部の実施形態において、精子運動能は、１０％〜２００％、２５％〜１５０％、５０％〜１００％又は７０％〜９０％向上し得る。一部の実施形態において、向上した精子機能又は向上した精子運動能は、超活性化精子の割合の向上であり得る。一部の実施形態において、向上した精子機能又は精子運動能の向上は、中間運動能精子の割合の向上であり得る。一部の実施形態において、向上した精子機能又は向上した精子運動能は、直進運動能精子の割合の向上であり得る。一部の実施形態において、向上した精子機能又は向上した精子運動能は、超活性化精子及び中間運動能精子の割合の向上であり得る。一部の実施形態において、超活性化精子、直進運動能精子、中間運動能精子又はこれらの組み合わせのレベルは、超活性化精子、直進運動能精子、中間運動能精子又はこれらの組み合わせが調製液中の全精子の少なくとも約５％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０．０％、１０．５％、１１．０％、１１．５％、１２．０％、１２．５％、１３．０％、１３．５％、１４．０％、１４．５％、１５．０％、１５．５％、１６．０％、１６．５％、１７．０％、１７．５％、１８．０％、１８．５％、１９．０％、１９．５％、２０．０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％又はそれを超えるものを占めるように向上する。精子運動能の向上は、向上した精子機能を指し示している。
【０２３５】
精子受精能獲得
一部の実施形態において、向上した精子機能は、精子受精能獲得の向上を含む。「精子受精能獲得」とは、先体の開口分泌並びに未受精卵の透明帯への結合及びそれを通した侵入を行う能力を有する精子を指す。受精能獲得の完了は、精子が透明帯に結合し、リガンド誘導性の先体反応を起こす能力に現れる。精子受精能獲得の判定方法は、当技術分野において公知であり、例えば、現在利用されている最も一般的な精子−透明帯結合試験は、半透明帯検査（又はＨＺＡ）及び競合的インタクト透明帯結合検査である。半透明帯検査は、精子が受精能獲得を起こして卵母細胞に結合する能力を測定する。卵母細胞の無細胞性外被である透明帯に囲まれた死細胞の卵母細胞と共に精子をインキュベートする。受精能を獲得した精子は、透明帯に結合し、精子結合数を顕微鏡下でカウントする。この数は、試料中における正常に受精能を獲得した精子の数及び精子試料の受精能と相関する。例えば、Ｃｒｏｓｓ  ＮＬ  ｅｔ  ａｌ．Ｇａｍｅｔｅ  Ｒｅｓ．１９８６；１５：２１３−２６を参照されたい。
【０２３６】
一部の実施形態において、受精能獲得が向上した精子が提供され、これは、精子をエネルギー枯渇条件でインキュベートして精子を増強すること、その後、増強された精子に第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を同時に又は順次提供することを含む方法の産物である。一部の実施形態において、精子受精能獲得の向上は、好適な対照精子と比べて約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９％超であり得る。一部の実施形態において、精子受精能獲得の向上は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％であり得る。一部の実施形態において、精子受精能獲得の向上は、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも１０，０００倍であり得る。一部の実施形態において、精子受精能獲得は、１０％〜２００％、２５％〜１５０％、５０％〜１００％又は７０％〜９０％向上し得る。一部の実施形態において、精子受精能獲得レベルは、受精能を獲得した精子が調製液中の全精子の少なくとも約５％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０．０％、１０．５％、１１．０％、１１．５％、１２．０％、１２．５％、１３．０％、１３．５％、１４．０％、１４．５％、１５．０％、１５．５％、１６．０％、１６．５％、１７．０％、１７．５％、１８．０％、１８．５％、１９．０％、１９．５％、２０．０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％又はそれを超えるものを占め得るように向上する。精子受精能獲得の向上は、向上した精子機能を指し示している。
【０２３７】
受精能力
一部の実施形態において、精子機能は、精子が卵子を受精させる能力を含む。精子の受精能力は、例えば、精子侵入検査により決定することができる。精子侵入検査（ＳＰＡ）は、ゴールデンハムスター卵子を利用し、この卵子は、その透明帯を除去すると、卵子侵入に対するあらゆる種特異性が失われる点で珍しい。この試験を行うことにより、精子が卵母細胞に侵入する能力が決定される（Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｒｔ．Ｓｔｅｒ．３２：６６４，１９７９）。簡潔に言えば、市販の透明帯のないハムスター卵母細胞を使用することができる（Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓ．）。いかなる種の精子についても、この検査法には、ハムスター卵母細胞が好適である。精子をハムスター卵母細胞と３時間インキュベートする。インキュベーション後、卵母細胞をアセトラクモイド又は均等な染色剤で染色し、各卵母細胞に侵入する精子の数を顕微鏡下でカウントする。精子受精能力の別のパラメータは、頸管粘液に侵入する能力である。この侵入試験は、均等なインビトロ又はインビボのいずれでも行うことができる。簡潔に言えば、インビトロでは、頸管粘液（Ｔｒｕ−Ｔｒａｘ、Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓ．）、典型的にはウシ頸管粘液が入った市販のキットを調製する。精子を走路の一端に置き、所与の時間後に精子が粘液中に侵入した距離を決定する。代わりに、精子の粘液侵入は、雌の体内で測定され得る。ある実施形態において、受精能力が向上した精子が提供され、これは、精子をエネルギー枯渇条件でインキュベートして精子を増強すること、その後、増強された精子に第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を同時に又は順次提供することを含む方法の産物である。一部の実施形態において、受精能力の向上は、好適な対照精子と比べて約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９％超であり得る。一部の実施形態において、受精能力の向上は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％であり得る。一部の実施形態において、受精能力の向上は、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも１０，０００倍であり得る。一部の実施形態において、受精能力は、１０％〜２００％、２５％〜１５０％、５０％〜１００％又は７０％〜９０％向上し得る。一部の実施形態において、受精能力レベルは、卵子を受精させることが可能な精子の数が調製液中の全精子の少なくとも約５％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０．０％、１０．５％、１１．０％、１１．５％、１２．０％、１２．５％、１３．０％、１３．５％、１４．０％、１４．５％、１５．０％、１５．５％、１６．０％、１６．５％、１７．０％、１７．５％、１８．０％、１８．５％、１９．０％、１９．５％、２０．０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％又はそれを超えるものとなるように向���する。受精能力の向上は、向上した精子機能及び向上した受精を指し示している。
【０２３８】
胚の発生
一部の実施形態において、精子機能は、胚の発生を含む。一部の実施形態では、本明細書の方法により調製される、向上した機能を有する精子に卵子への到達手段を提供することにより、受精を増進させ、ここで、受精を増進させることは、胚の発生を含み得る。一部の実施形態では、本明細書の方法により調製される、向上した機能を有する精子に体外で卵子への到達手段を提供し、従って、胚は、体外で発生する。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法により調製される、向上した機能を有する精子に、精子のＩＵＩによって体内で卵子への到達手段を提供し、従って、胚は、体内で発生する。一部の実施形態では、エネルギー欠損条件下でインキュベートされ、且つ第１のエネルギー源を提供された精子を雌対象の生殖路において授精させ、そのため、第２のエネルギー源を提供し、且つ卵子への到達手段を提供して胚を発生させることは、体内で行われることになる。一部の実施形態において、胚を体外で発生させる場合、胚は、後の使用のために凍結保存され得るか、又は更に体外培養されて胚の発育を可能にし得る。一部の実施形態において、胚は、凍結保存前及び／又は雌対象への注入前に少なくとも２細胞期まで発育させる。一部の実施形態において、胚は、更なる処理前に体外で２細胞期より後の発育段階まで発育させる。一部の実施形態において、胚は、更なる処理（例えば、凍結保存又は完全な子孫に発育させるための雌対象への注入）前に体外で胚盤胞期まで発育させる。生殖補助技術（ＡＲＴ）手技による間の胚の体外インキュベーション及び培養には、様々な好適な培地を利用可能であり、その種類及び組成は、当業者に周知である。好ましくは、培養培地は、少なくとも水、塩、栄養素、必須アミノ酸、ビタミン及びホルモンを含有し、１つ以上の成長因子も含み得る。種々の好適な培養培地、例えばアール培地、ＨａｍのＦ１０培地及びヒト卵管液（ＨＴＦ）培地が市販されている。本開示は、当技術分野において公知の方法による「フィーダー細胞」層上での胚の体外共培養も企図する。共培養に適切な「フィーダー細胞」としては、例えば、ウシ卵管細胞又はヒト卵管上皮細胞を挙げることができる。
【０２３９】
当業者は、本明細書に開示される方法により調製される、向上した機能を有する精子がもたらす利点が受精の向上に限られないことを理解するであろう。むしろ、本発明の方法及び調製液は、胚が生殖補助技術（ＡＲＴ）によって体外で作り出されるか、又は動物の生殖路において作り出されるかに関わらず、受精を増進させる治療としても等しく適用可能である。本発明の方法は、生殖補助による妊娠又は他の生殖補助なしの妊娠における受精、胚生存能、胚着床及び妊娠率の改善に適用可能である。本開示の実施形態は、雄動物の精子の受精能力を向上させる方法も提供する。
【０２４０】
本明細書に関連して、用語「生存能が向上した胚」及び「生存能が長期化した胚」とは、好適な対照精子によって発生した１つ又は複数の胚の生存可能性と比較した、本明細書に開示される方法及び調製の哺乳類精子、例えば１つ以上の向上した精子機能を有する哺乳類精子によって発生した１つ又は複数の胚の生存可能性の向上又は亢進を意味する。一部の実施形態において、胚は、生殖補助技術、例えばＩＶＦ又はＩＣＳＩにより発生する。一部の実施形態において、胚は、人工授精により、雌哺乳類対象の生殖路において体内で発生する。
【０２４１】
本開示の目的上、胚生存能は、幾つもの指標に反映され得る。例えば、向上した胚生存能は、受精後の胚着床率の向上、着床前及び着床後胚致死率の低下、臨床妊娠率の向上又は出生率の向上をもたらし得る。従って、本開示は、胚のアポトーシス又は発育遅延を防止する方法及び動物における妊娠率を向上させる方法にも関する。胚生存能とは、体外又は体内での胚の生存能を指し得る。
【０２４２】
一部の実施形態において、生存能が向上した胚を発生させる能力を有する精子が提供され、これは、精子をエネルギー枯渇条件でインキュベートして精子を増強すること、その後、増強された精子に第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を同時に又は順次提供することを含む方法の産物である。一部の実施形態では、向上した機能を有する精子に卵子への到達手段を提供することにより、受精を増進させる。一部の実施形態において、受精を増進させることは、生存能が向上した１つ又は複数の胚の発生を含む。一部の実施形態において、本明細書の方法により調製された精子によって卵子への到達時に発生する胚の生存能の向上は、好適な対照精子によって発生する胚と比べて約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９％超であり得る。一部の実施形態において、胚生存能の向上は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％であり得る。一部の実施形態において、胚生存能の向上は、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも１０，０００倍であり得る。一部の実施形態において、胚生存能は、１０％〜２００％、２５％〜１５０％、５０％〜１００％又は７０％〜９０％向上し得る。一部の実施形態において、生存能が向上した胚を発生させることのできる精子のレベルは、調製液中にある全精子の少なくとも約５％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０．０％、１０．５％、１１．０％、１１．５％、１２．０％、１２．５％、１３．０％、１３．５％、１４．０％、１４．５％、１５．０％、１５．５％、１６．０％、１６．５％、１７．０％、１７．５％、１８．０％、１８．５％、１９．０％、１９．５％、２０．０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％又はそれを超える。生存能が向上した胚の発生は、向上した精子機能及び／又は向上した受精を指し示している。
【０２４３】
典型的には、胚の卵割段階は、培養の最初の３日間で起こる。体外発生させた胚は、胚移植により雌対象に移植される。「胚移植」は、１つ以上の胚及び／又は胚盤胞を子宮内又はファロピウス管内に置く手技である。従来のＩＶＦ法では、胚は、各胚が４細胞期になる受精２日後、又は胚が８細胞期になる受精３日後、又は胚が胚盤胞期になる受精５日後に子宮腔に移植される。培養５〜７日目に達したときの胚盤胞期の胚を使用することが望ましいであろうと認識されている。本開示によれば、一連の胚／胚盤胞発育に沿った任意の時点で胚移植が可能である。顕微鏡法の使用によるなどの目視観察を通して、胞胚腔が明らかに見てとれ、胚の容積の５０％超を占めるようになったとき、胚盤胞又は胚は、子宮に移植できる状態にあると見なされる。体内環境であれば、この段階は、通常、受精後４〜５日で、胚がファロピウス管を通り抜けて子宮に到達して間もなく実現され得る。胚の発育段階は、顕微鏡法（例えば、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ  ２０００−Ｓ顕微鏡）を使用した胚の目視観察により決定することができ、胚は、子宮への移植前に特定の決まった物理的又は形態学的特徴を同時に呈することになる。胚盤胞の成熟状態は、Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８の分類に基づいて範囲ＩＩ  ＡＢ〜ＶＩ  ＡＡと決定されることになる。
【０２４４】
本明細書に開示される方法によれば、２細胞期発育段階、胚盤胞期発育段階まで発達する率又は子孫に発育する率及び生児出生率が向上した胚が発生する。一部の実施形態において、正常な発育段階（例えば、２細胞期、胚盤胞期、子孫への発育及び生児出生）を経て発育する能力を有する胚を発生させることのできる精子が提供され、これは、精子をエネルギー枯渇条件でインキュベートして精子を増強すること、その後、増強された精子に第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を同時に又は順次提供することを含む方法の産物である。一部の実施形態では、向上した機能を有する精子に卵子への到達手段を提供することにより、受精を増進させる。一部の実施形態において、受精を増進させることは、正常な発育段階（例えば、２細胞期、胚盤胞期、子孫への発育及び生児出生）を経て発育する能力が向上した胚の発生を含む。一部の実施形態において、方法により調製された精子によって発生する、正常な発育段階を経て発達する胚の比率の向上は、好適な対照精子によって発生する胚と比べて約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９％超であり得る。一部の実施形態において、正常な発育段階を経て発達する胚の比率の向上は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％であり得る。一部の実施形態において、正常な発育段階を経て発達する胚の比率の向上は、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも１０，０００倍であり得る。一部の実施形態において、正常な発育段階を経て発達する胚の比率は、１０％〜２００％、２５％〜１５０％、５０％〜１００％又は７０％〜９０％向上し得る。一部の実施形態において、正常な発育段階を経て発達する能力を有する胚を発生させることのできる精子のレベルは、調製液中にある全精子の少なくとも約５％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０．０％、１０．５％、１１．０％、１１．５％、１２．０％、１２．５％、１３．０％、１３．５％、１４．０％、１４．５％、１５．０％、１５．５％、１６．０％、１６．５％、１７．０％、１７．５％、１８．０％、１８．５％、１９．０％、１９．５％、２０．０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％又はそれを超える。１つ以上の正常な発育段階を経て発達する能力を有する胚の発生は、向上した精子機能及び／又は向上した受精を指し示している。
【０２４５】
体内では、胚は、子宮の壁に付着又は着床し、胎盤を作り出し、妊娠期間中に分娩時まで胎児子孫に発育する。１つ以上の胚が子宮内膜に着床したかどうか、即ち手技によって妊娠開始に成功したかどうかを決定するための検査は、移植から２週間後、例えばｂ−ｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）に関する血液検査及び当技術分野において一般に公知の他の技法を用いて実施される。Ｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第４，３１５，９０８号明細書は、ラジオイムノアッセイによる尿中ｈＣＧの検出方法を説明している。Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第８，１６３，５０８号明細書は、試料中における初期妊娠関連アイソフォームのｈＣＧの量を決定することによるｈＣＧ法による対象の妊娠予測方法及びキットを提供する。かかる診断法及び他の方法は、本開示の範囲内で有用である。
【０２４６】
一部の実施形態において、着床率が改善した又は妊娠率が改善した胚を発生させる能力を有する精子が提供され、これは、精子をエネルギー枯渇条件でインキュベートして精子を増強すること、その後、増強された精子に第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を同時に又は順次提供することを含む方法の産物である。一部の実施形態では、向上した機能を有する精子に卵子への到達手段を提供することにより、受精を増進させる。一部の実施形態において、受精を増進させることは、着床率が改善した又は妊娠率が改善した胚の発生を含む。一部の実施形態において、本明細書の方法により調製された精子によって発生する胚の着床率又は胚の着床時の妊娠率の向上は、好適な対照精子によって発生する胚と比べて約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９％超であり得る。一部の実施形態において、胚着床率又は妊娠率の向上は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％であり得る。一部の実施形態において、胚着床率又は妊娠率の向上は、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも１０，０００倍であり得る。一部の実施形態において、胚着床率又は妊娠率は、１０％〜２００％、２５％〜１５０％、５０％〜１００％又は７０％〜９０％向上し得る。一部の実施形態において、着床率が向上した又は妊娠率が改善した胚を発生させることのできる精子のレベルは、調製液中にある全精子の少なくとも約５％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０．０％、１０．５％、１１．０％、１１．５％、１２．０％、１２．５％、１３．０％、１３．５％、１４．０％、１４．５％、１５．０％、１５．５％、１６．０％、１６．５％、１７．０％、１７．５％、１８．０％、１８．５％、１９．０％、１９．５％、２０．０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％又はそれを超える。着床が改善した（即ち着床率が向上した）又は着床時の妊娠率が向上した胚の発生は、向上した精子機能及び／又は向上した受精を指し示している。
【０２４７】
オートファジー
一部の実施形態において、向上した精子機能は、オートファジーの向上を含む。オートファジーの向上を決定する方法は、当技術分野において公知である。例えば、オートファジーの向上は、オートファジーマーカータンパク質の１つ以上の向上によって決定することができる。マーカータンパク質の向上の検出は、イムノブロッティングなどの従来方法によって行うことができる。オートファジーマーカータンパク質の非限定的な例としては、Ａｔｇ  ５、Ａｔｇ  １６、ｐ６２、ＬＣ３−ＩＩ、ＡＭＰＫ、ｍ−ＴＯＲ及びベクリン１が挙げられる。ＬＣ３−ＩＩは、オートファジーの研究に広く使用されており、哺乳類のオートファゴソームマーカーと考えられている。ＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉ比をオートファジー向上の決定因子として用いることができる。１つ以上のオートファジーマーカータンパク質（例えば、Ａｔｇ  ５、Ａｔｇ  １６、ｐ６２及びＬＣ３−ＩＩ、ＡＭＰＫ、ｍ−ＴＯＲ及びベクリン１）のレベルの向上及び／又はＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉ比の向上は、精子機能の向上を指し示すものであり得る。一部の実施形態において、オートファジーの向上は、細胞ＲＮＡレベル（マイクロＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡなど）の低下によって指示され得る。
【０２４８】
一部の実施形態において、オートファジーが向上した精子が提供され、これは、精子をエネルギー枯渇条件でインキュベートして精子を増強すること、その後、増強された精子に第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を同時に又は順次提供することを含む方法の産物である。一部の実施形態において、オートファジーの向上は、好適な対照精子と比べて約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９％超であり得る。一部の実施形態において、精子オートファジーの向上は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％であり得る。一部の実施形態において、精子オートファジーの向上は、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも１０，０００倍であり得る。一部の実施形態において、精子オートファジーは、１０％〜２００％、２５％〜１５０％、５０％〜１００％又は７０％〜９０％向上し得る。一部の実施形態において、精子オートファジーレベルは、オートファジーが向上した精子が調製液中の全精子の少なくとも約５％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０．０％、１０．５％、１１．０％、１１．５％、１２．０％、１２．５％、１３．０％、１３．５％、１４．０％、１４．５％、１５．０％、１５．５％、１６．０％、１６．５％、１７．０％、１７．５％、１８．０％、１８．５％、１９．０％、１９．５％、２０．０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％又はそれを超えるものを占め得るように向上する。精子オートファジーの向上は、向上した精子機能を指し示している。
【０２４９】
飢餓
「エネルギー枯渇」は、枯渇によるか、低減（有効量を下回るまで）によるか、或いはかかるエネルギー源の除去又は酵素機構若しくは取込み輸送機構の阻害によるかに関わらず、細胞のエネルギー産生量を抑制又は制限することを意味する。一部の実施形態において、エネルギー枯渇では、解糖、糖新生、クレブス回路又は酸化的リン酸化の１つ以上が阻害され、詳細な実施形態では、エネルギー枯渇には、解糖系エネルギー枯渇が含まれる。例示的な解糖系エネルギー枯渇条件には、精子の培地中にあるグルコース（他の実施形態としては、マンノース、フルクトース、デキストロース、スクロース及びグルコースとの組み合わせを含めたこれらの組み合わせを挙げることができる）などの解糖され易い糖を実質的に全て除去すること、又は解糖され易い糖の濃度を低減すること、又は解糖、糖新生若しくは解糖され易い糖の取込み輸送体の阻害薬を使用することが含まれる。精子の主要なエネルギー源は、グルコースであるため、好ましい実施形態において、エネルギー枯渇は、グルコースエネルギー枯渇（飢餓を含む）であり、これは、糖新生基質（例えば、ピルビン酸又は一部の実施形態では乳酸（これは、乳酸デヒドロゲナーゼによってピルビン酸に変換され得る）を含む）及びクレブス回路基質（アセチルＣｏＡ、クエン酸、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸及びオキサロ酢酸）の枯渇（飢餓を含む）を更に伴う。
【０２５０】
一部の実施形態において、エネルギー枯渇は、例えば、約０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３ｍＭ未満のグルコース又はそれより低い、約０．０２又は０．０１ｍＭ未満など、例えば約０．０１ｍＭ未満の低グルコース濃度を含む。一部の実施形態において、エネルギー枯渇とは、実質的にグルコース不含の条件を意味する。本発明は、有効量の第１及び第２のエネルギー源の段階的提供を伴う方法を提供し、当業者は、本発明の範囲内に包含される一部の実施形態では無効量の解糖系エネルギー源がエネルギー枯渇であり、例えばかかる実施形態では前述の低グルコース濃度をエネルギー枯渇として用い得ることを理解するであろう。
【０２５１】
一部の実施形態において、エネルギー枯渇は、例えば、約０．１５、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００５、０．００３、０．００２ｍＭ未満又はそれより低い低ピルビン酸濃度を含む。一部の実施形態において、エネルギー枯渇とは、実質的にピルビン酸不含の条件を意味する。上記に指摘し、且つ解糖系エネルギー源についてグルコースで例示したとおり、当業者は、本発明の範囲内に包含される一部の実施形態では無効量の糖新生基質がエネルギー枯渇であり、例えばかかる実施形態では前述の低ピルビン酸濃度をエネルギー枯渇として用い得ることも理解するであろう。
【０２５２】
一部の詳細な実施形態において、エネルギー枯渇は、低グルコース濃度及び低ピルビン酸濃度などの実質的に炭素源を含まない条件、例えば実質的にグルコース不含且つ実質的にピルビン酸不含の条件を含む。
【０２５３】
一部の実施形態において、エネルギー枯渇は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０分、例えば少なくとも約３０、４０、４５、５０、５５、６０、９０、１２０、１５０又は１８０分又は１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５又は１０時間にわたる。
【０２５４】
本発明に従うエネルギー枯渇は、精子を増強する。精子を「増強する」又は「増強すること」とは、好適な誘導時、例えばエネルギー枯渇を取り除くか又は元に戻して、例えば精子を受精能獲得条件又は段階的エネルギー再導入でインキュベーションしたとき、超活性化精子、中間精子又は直進運動能精子の比率の向上（又は２つ（超活性化と中間など）若しくは３つ全ての組み合わせの比率の向上）及び／又は曲線速度の向上の１つ以上など、精子が運動能を急速に回復するように精子を条件付けることを意味する。
【０２５５】
段階的エネルギー再導入
精子の増強に十分なエネルギー枯渇後、増強された精子に有効量の第１のエネルギー源、次に有効量の第２のエネルギー源が提供される。一部の実施形態において、精子の増強後に有効量の第１のエネルギー源を提供することと、有効量の第２のエネルギー源を提供することとの間の時間は、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０分、例えば少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０分、例えば少なくとも約５〜１５分である。一部の実施形態において、精子の増強後に有効量の第１のエネルギー源を提供することと、有効量の第２のエネルギー源を提供することとの間の時間は、より長く、例えば少なくとも２、３、４若しくは５時間などであるか又はそれを超える。
【０２５６】
一部の実施形態において、糖新生基質は、例えば、約０．１５〜０．６６ｍＭ、例えば約０．２０〜０．５０ｍＭ、例えば約０．２５〜０．４０ｍＭなど、又は約０．３０ｍＭの濃度のピルビン酸である。前述の濃度は、例えば、本発明により提供される方法において第１又は第２のいずれかのエネルギー源として提供されるときの糖新生基質の例示的有効量である。当業者は、本発明の教示に従い、精子機能を向上させるその能力に基づいて糖新生基質の他の有効量を認識するであろう。一部の実施形態では、第１のエネルギー源がピルビン酸などの糖新生基質である。一部の実施形態では、第２のエネルギー源がピルビン酸などの糖新生基質である。
【０２５７】
一部の実施形態において、解糖系エネルギー源は、例えば、約０．６ｍＭ〜１０．０ｍＭ、１．０〜７．０ｍＭ、２．５〜７．０ｍＭ、３．５〜６．５ｍＭ又は５ｍＭ、例えば少なくとも約１、２、３又は４ｍＭの濃度のグルコースである。前述の濃度は、例えば、本発明により提供される方法において第１又は第２のいずれかのエネルギー源として提供されるときの解糖系エネルギー源の例示的有効量である。当業者は、本発明の教示に従い、精子機能を向上させるその能力に基づいて解糖系エネルギー源の他の有効量を認識するであろう。一部の実施形態では、第１のエネルギー源がグルコースなどの解糖系エネルギー源である。一部の実施形態では、第２のエネルギー源がグルコースなどの解糖系エネルギー源である。一部の実施形態では、第１のエネルギー源がグルコースなどの解糖系エネルギー源である一方、第２のエネルギー源がピルビン酸などの糖新生基質である。
【０２５８】
本発明により提供される方法の一部の実施形態において調節される追加的な条件は、容量オスモル濃度（ｍＯｓｍ）又は重量オスモル濃度（ｍＯｓｍ／ｋｇ）である。一部の実施形態において、本方法は、エネルギー枯渇中、約２００〜２８０ｍＯｓｍ（ｍＯｓｍ／ｋｇ）、例えば約２２０〜２６０、２２５〜２５５、２３０〜２５０ｍＯｓｍ（ｍＯｓｍ／ｋｇ）の範囲の容量オスモル濃度（又は重量オスモル濃度）で実施され、任意選択で、第１又は第２のエネルギー源を添加すると、容量オスモル濃度（又は重量オスモル濃度）は、少なくとも約２７０、２７５、２８０、２８５、２９０又は２９５ｍＯｓｍ（ｍＯｓｍ／ｋｇ）に増加する。
【０２５９】
本開示の方法における使用に好適な糖新生基質としては、限定はされないが、ピルビン酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、グリセロール、アセチルＣｏＡ、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、オキサロ酢酸又は糖新生基質の生理学的に許容可能な誘導体、塩、エステル、ポリマー若しくはα−ケト類似体が挙げられる。任意の糖新生アミノ酸又はその生理学的に許容可能な誘導体、塩、エステル、若しくはポリマー、若しくはα−ケト類似体も糖新生基質として好適である。糖新生アミノ酸の非限定的な例としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、シスチン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、メチオニン、プロリン、セリン、スレオニン及びバリンが挙げられる。ピルビン酸の薬学的に許容可能な塩の非限定的な例は、ピルビン酸リチウム、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸カリウム、ピルビン酸マグネシウム、ピルビン酸カルシウム及びピルビン酸亜鉛である。一部の実施形態において、ピルビン酸は、ピルビン酸ナトリウムである。乳酸の塩の非限定的な例としては、乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸マグネシウム、乳酸カルシウム、乳酸亜鉛及び乳酸マンガンが挙げられる。本明細書に開示される方法の糖新生基質は、上記に挙げた糖新生基質のいずれか１つであり得る。
【０２６０】
本開示の方法における使用に好適な解糖系エネルギー源としては、限定はされないが、解糖の炭素源が挙げられる。本明細書に開示される方法において有用な解糖系エネルギー源の非限定的な例としては、単糖類（フルクトース、グルコース、ガラクトース及びマンノースなど）及び二糖類（スクロース、ラクトース、マルトース及びトレハロース）並びに多糖類、ガラクトース、オリゴ糖類、そのポリマーが挙げられる。
【０２６１】
本発明により提供される方法の一部の実施形態において、精子に追加的な成分が提供される。例えば、少なくとも第１のエネルギー源又は第２のエネルギー源と組み合わせて、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ＋、クエン酸、ＡＭＰ、ＡＤＰ又はこれらの組み合わせなど、解糖系の上流及び下流の他の成分が添加される。
【０２６２】
本発明により提供される方法の一部の実施形態は、精子の評価を含む。例えば、一部の実施形態において、本方法は、例えば、ＣＡＳＡによる精子運動能の１つ以上の定量的評価及び／又はＤＮＡ断片化（例えば、ＴＵＮＥＬによる）、脂質過酸化、活性酸素種又はこれらの組み合わせなど、精子品質を測定することを含む。
【０２６３】
本発明により提供される方法は、向上した精子機能を実現する。一部の実施形態では、好適な対照精子と比べたものである。一部の実施形態において、好適な対照は、飢餓ステップのない標準受精能獲得培地（Ｃ−ＨＴＦ）中の精子である一方、一部の実施形態において、好適な対照は、３時間の飢餓後の  −  例えば、飢餓及びエネルギー源の再導入を段階的に分けない有効量のエネルギー源の再導入後の  −  標準受精能獲得培地（Ｃ−ＨＴＦ）中の精子である。
【０２６４】
哺乳類精子
本明細書に開示される方法は、精子の１つ以上の機能を向上させることを含む。本開示は、受精を増進させることにも関する。向上した機能を有する精子の調製液も提供される。本明細書で使用されるとき、精子は、脊椎動物、好ましくは哺乳類からのものであり得る。従って、本開示の精子は、哺乳類精子であり得る。
【０２６５】
哺乳類としては、限定なしに、ヒト、霊長類、げっ歯類、野生の又は家畜化された動物であって、野生化動物、農業動物、競技用動物及びペットを含むものが挙げられる。げっ歯類としては、例えば、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターが挙げられる。家畜動物及び狩猟動物としては、例えば、雌ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、スイギュウ、ネコ科動物種、例えばイエネコ及びイヌ科動物種、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、鳥類種、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ及び魚類、例えばマス、ナマズ及びサケが挙げられる。哺乳類精子は、偶蹄目の有蹄類（例えば、ブタ、ペッカリー、カバ、ラクダ、ラマ、マメジカ（ネズミジカ）、シカ、キリン、プロングホーン、レイヨウ、ヤギ亜科のレイヨウに類する動物（ｇｏａｔ−ａｎｔｅｌｏｐｅ）（これには、ヒツジ、ヤギなどが含まれる）又はウシ）又は奇蹄目の有蹄類（例えば、ウマ、バク及びサイ）などの有蹄類、非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、カニクイザル、クモザル及びマカク、例えばアカゲザル）、イヌ科（Ｃａｎｉｄａｅ）（例えば、イヌ）又はネコを含めた非ヒト哺乳類からのものであり得る。哺乳類精子は、ローラシア獣上目（Ｌａｕｒａｓｉａｔｈｅｒｉａ）のメンバーからのものであり得る。ローラシア獣上目（Ｌａｕｒａｓｉａｔｈｅｒｉａ）としては、Ｗａｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｏｗａｒｄｓ  Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｏｒｄｉｎａｌ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｍａｍｍａｌｓ”．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４８（１）：１−５（１９９９）に記載されるとおりの一群の哺乳類を挙げることができる。ローラシア獣上目（Ｌａｕｒａｓｉａｔｈｅｒｉａ）のメンバーとしては、真無盲腸目（Ｅｕｌｉｐｏｔｙｐｈｌａ）（ハリネズミ、トガリネズミ及びモグラ）、奇蹄目（Ｐｅｒｉｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）（サイ、ウマ及びバク）、食肉目（Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）（肉食動物）、鯨偶蹄目（Ｃｅｔａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）（偶蹄類及びクジラ類）、翼手目（Ｃｈｉｒｏｐｔｅｒａ）（コウモリ）及び鱗甲目（Ｐｈｏｌｉｄｏｔａ）（センザンコウ）を挙げることができる。ローラシア獣上目（Ｌａｕｒａｓｉａｔｈｅｒｉａ）のメンバーは、有蹄類、例えば奇蹄目の有蹄類又は偶蹄目の有蹄類であり得る。有蹄類は、ブタであり得る。哺乳類精子は、ネコ又はイヌなど、食肉目（Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）のメンバーからのものであり得る。一部の実施形態において、哺乳類精子は、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ又はマウス精子である。一部の実施形態において、哺乳類精子は、ヒト精子である。
【０２６６】
一部の実施形態において、哺乳類精子は、健常雄哺乳類からのものである。一部の実施形態において、哺乳類精子は、精子機能不全、例えば低精子数、精子運動能の低下及び精子の形態異常を患っている雄からのものである。一部の実施形態において、哺乳類精子は、低受精能の雄又は精子減少症の雄からのものであり得る。哺乳類精子は、例えば、精子減少症、奇形精子症、精子無力症又は乏精子・精子無力・奇形精子症を患っている雄からのものであり得る。精子減少症とは、２０００万／ｍｌ未満の精子濃度によって特徴付けられる病態を指す。精子無力症とは、精子運動能の低下によって特徴付けられる病態を指す。奇形精子症とは、形態異常のある精子の存在によって特徴付けられる病態を指す。乏精子・精子無力・奇形精子症とは、乏精子症（精子数が少ない）、精子無力症（精子の運動不良）及び奇形精子症（異常な精子形状）を含む病態を指す。一部の実施形態において、精子は、例えば、精子数が１ミリリットル当たり約２０００万、１９００万、１８００万、１８００万、１６００万、１５００万、１４００万、１３００万、１２００万、１１００万、１０００万、９００万、８００万、７００万、６００万、５００万、４００万、３００万、２００万個を下回る精子、例えば１ミリリットル当たり１５００万個未満の精子である低受精能のヒト男性又は精子減少症のヒト男性から入手される。
【０２６７】
一部の実施形態において、エネルギー枯渇に先立ち精子が精液から濃縮される（又は単離される）。密度勾配遠心法、スイムアップ法、マイクロフルイディクス又はこれらの組み合わせを含め、本発明に従って任意の精子濃縮又は単離方法を用いることができる。
【０２６８】
本発明により提供される方法では、新鮮な精子又は保存ストックからの精子のいずれも使用され得る。例えば、一部の実施形態において、精子は、治療前に低温貯蔵から回収される。一部の実施形態において、精子は、治療前に非低温貯蔵から回収される。一部の実施形態において、精子は、治療前に保存培地に提供される。一部の実施形態において、保存培地中の精子は、エネルギー枯渇条件下でのインキュベーション前に低温条件に貯蔵される。一部の条件では、保存培地中の精子は、エネルギー枯渇条件下でのインキュベーション前に非低温条件に貯蔵される。
【０２６９】
一部の実施形態において、保存培地は、弱酸性ｐＨを含み、且つ約３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば約３００〜３８０、３２０〜３７０、３３０〜３７０、３４０〜３６０、例えば約３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０又は３８０、例えば約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する緩衝溶液である。一部の実施形態において、本発明により提供される保存培地の重量オスモル濃度は、約３２０〜３４０ｍＯｓｍ／ｋｇである。「弱酸性」ｐＨとは、７未満５超を意味する。一部の実施形態において、弱酸性ｐＨは、約６〜７、例えば約６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．７、６．８、６．９であるか又はそれより高く、且つ７．０より低い（６．９９など）、例えば約６．５〜６．９９、例えば約６．７〜６．９など、例えば約６．８である。一部の実施形態において、保存培地は、約６．７〜６．９のｐＨを有し、両性イオン緩衝剤、約０．２５〜０．３５Ｍの濃度のグルコース、抗生物質、約３４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度、約２〜４％（Ｗ／Ｖ）の濃度のＢＳＡ又はＨＳＡを含む（又はそれから本質的になる）緩衝溶液であり、ここで、この保存培地中に４℃で最長１２日間にわたって貯蔵された精子は、受精能獲得培地への移し替え時に好適な対照精子と比べて少なくとも６０％の運動精子を維持し、任意選択で、培地は、卵黄を含有しない。
【０２７０】
本発明により提供される方法では、１回の射精液の分割量又は射精液全量を含め、様々な分量の精子を使用することができる。一部の実施形態において、精子は、２回分以上の射精液（例えば、２、３、４、５、６回分又はそれを超える射精液）からプールされる。
【０２７１】
保存培地
一態様において、本発明は、精子保存培地を提供する。本発明により提供されるこれらの保存培地は、有利には、本発明により提供される方法（例えば、向上した精子機能を誘導する、受精を増進させる、改善された適応度を有する子孫を作製する等）であって、一部の実施形態では、本発明により提供される様々なキットを使用して実施することができ、従って特定の実施形態では、本発明により提供される精子調製液が作製されることになる方法及び／又は生殖補助方法を含めた受精方法など、本発明により提供される更なる方法における使用に取り入れることができる。本発明により提供されるこれらの保存培地は、有利には、本発明により提供されるキットに取り入れることができ、これらのキットは、一部の実施形態では、本発明により提供される様々な方法であって、従って特定の実施形態では、本発明により提供される精子調製液が作製されることになる方法の実施に有用であり、且つ／又は向上した精子機能を誘導する、受精を増進させる、改善された適応度を有する子孫を作製するなどの本発明により提供される更なる方法、生殖補助方法を含めた受精方法において有用であり得る。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法の実施に先立ち保存培地から精子が回収される。一部の実施形態において、保存培地からの精子の回収は、例えば、本明細書に開示されるとおりのキット又はその構成品を使用した精子試料の濃縮、洗浄又は希釈を含む。一部の実施形態において、本開示の精子又は精子調製液は、本明細書に記載される方法であって、例えば本明細書に開示されるキットを使用して実施される方法の実施後、保存培地に貯蔵することができる。
【０２７２】
本発明により提供される保存培地は、弱酸性ｐＨを含み、且つ約３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば約３００〜３８０、３２０〜３７０、３３０〜３７０、３４０〜３６０、例えば約３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０又は３８０、例えば約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する緩衝溶液を含む。特定の他の実施形態において、本発明により提供される保存培地の重量オスモル濃度は、約３２０〜３４０ｍＯｓｍ／ｋｇである。「弱酸性」ｐＨとは、７未満５超を意味する。一部の実施形態において、弱酸性ｐＨは、約６〜７、例えば約６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．７、６．８、６．９であるか又はそれより高く、且つ７．０より低い（６．９９など）、例えば約６．５〜６．９９、例えば約６．７〜６．９など、例えば約６．８である。これらの保存培地は、以下に記載する実施形態を含め、「本発明により提供される１つ又は複数の保存培地」又は「本発明により提供される１つ又は複数の精子保存培地」などと称される。
【０２７３】
「精子保存」は、例えば、精子の受精能獲得を誘導することが公知の条件で運動能を回復する能力によって評価したとき、時間が経っても精子の生存能及び機能を維持することを指す。本発明により提供される保存培地及び本発明により提供される前記保存培地に精子を保存することを含む方法は、有利には、かかる精子機能を保存すること、精子の損傷及び分解を抑えること又はこれらの組み合わせの１つ以上を行い得る。特定の実施形態において、Ｍｏｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．２０１８（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｃｅｌｌ．２０１８．０００７２）に開示されるものなど、当技術分野において公知の技法を用いて受精能獲得が誘導され、測定される  −  簡潔に言えば、受精能獲得は、５ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン及び２５ｍＭ重炭酸ナトリウムを補足した変法ヒト卵管液（ｍＨＴＦ）培地（ＨＥＰＥＳ  ２１ｍＭ、ＮａＣｌ  ９７．８ｍＭ、ＫＣｌ  ４．７ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．３７ｍＭ、ＭｇＳＯ４  ０．２ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２ｍＭ、グルコース２．７８ｍＭ、ピルビン酸０．３３ｍＭ、乳酸２１．４ｍＭ）において３７℃及び５％ＣＯ２で４時間実施される。一部の実施形態において、精子保存は、静止状態を急速に（例えば、４℃で貯蔵してから約１、２、３、４、８、１２、１６、２０又は２４時間以内、一部の実施形態では、４℃で貯蔵してから約２４時間以内に誘導することを伴い、その間、受精能獲得条件（前掲）で運動精子を急速に（例えば、約１、２、３若しくは４時間以内又はそれ未満、一部の実施形態では約３０、４０、５０又は６０分以内に）回復する能力、例えば保存前の運動精子数の、即ち対照と比べて６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％又はそれを超える、例えば９６、９７、９８、９９％を回復する能力が保持されている。従って、一部の実施形態において、静止状態の急速誘導後、本発明により提供される保存培地は、５ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン及び２５ｍＭ重炭酸ナトリウムを補足した変法ヒト卵管液（ｍＨＴＦ）培地において３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートしたとき、精子濃縮後、静止前に取った対照試料と比べて高い割合（例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％又はそれを超える）の運動精子数を提供する。
【０２７４】
特定の実施形態において、本発明により提供される保存培地は、卵黄、添加電解質（緩衝剤、炭素源、任意選択で血清アルブミン又は任意選択で抗生物質に帰されるもの以外）、グリセロール、レシチン又はデキストロースの１つ以上（即ち１、２、３、４つ又は５つ全て）を（完全に又はかなりの量）欠いている。他の実施形態において、保存培地は、グリセロールなどの凍結保護物質を含み得る。特定の実施形態において、本発明により提供される精子保存培地は、オスモライト（カルシウムなどのイオン成分を含む）、脂質、粘度調整剤、ステロール、抗酸化剤（トレハロースなど）、抗炎症剤（例えば、ドキシサイクリン）及び前述の組み合わせを更に含む追加的な成分も含み得る。
【０２７５】
一部の実施形態において、本発明により提供される精子保存培地は、グルコース、フルクトース、マンノース、スクロース又はこれらの組み合わせ（例えば、１、２、３つ又は４つ全て）などの炭素源を含む。一部の実施形態において、炭素源は、グルコースを含む。特定の実施形態において、グルコースが主要な（５０％超の）又は実質的に唯一の炭素源である。特定の実施形態において、本発明により提供される保存培地中において、グルコースは、約０．１〜０．７Ｍ、例えば約０．２〜０．５Ｍなど、例えば約０．２５〜０．３６、０．２５〜０．３５、０．３０〜０．３６若しくは０．３〜０．３３Ｍ又は約０．２０、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３０、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７Ｍの濃度で存在する。一部の実施形態において、本発明により提供される保存培地中では、グルコースなどの炭素源が主要な（例えば、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８％又はそれを超えるものなど、５０％超の）オスモライトであるが、しかし、主要なオスモライトの濃度は、本発明に従う重量オスモル濃度、例えば３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇが維持されるように容易に調整することができる。
【０２７６】
本発明により提供される精子保存は、弱酸性条件の調節を促進するための緩衝剤を含む。一部の実施形態において、緩衝剤は、重炭酸緩衝剤でない。特定の実施形態において、緩衝剤は、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）又はこれらの組み合わせなど、両性イオン緩衝剤である。１つ又は複数の緩衝剤成分の濃度は、様々であり得、例えば約１〜１００ｍＭ、例えば１〜５０ｍＭ、１〜４０ｍＭ、１〜３０ｍＭ、１〜２０ｍＭ、５〜１５ｍＭ、例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ｍＭ、例えば約１０ｍＭであり得る。特定の詳細な実施形態において、緩衝剤は、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）又はこれらの組み合わせである。一部の実施形態において、緩衝剤は、ＨＥＰＥＳである。他の実施形態において、それは、ＭＯＰＳである。なおも他の実施形態において、緩衝剤は、ＨＥＰＥＳとＭＯＰＳとの混合物である。かかる実施形態において、ＨＥＰＥＳ及びＭＯＰＳは、１０：９０、２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０又は９０：１０の比率において、例えば１０ｍＭの緩衝剤中、ＨＥＰＥＳ及びＭＯＰＳの各々が５ｍＭで存在するＨＥＰＥＳとＭＯＰＳとの５０：５０混合物で使用される。
【０２７７】
本発明により提供される精子保存培地は、一部の実施形態において、抗生物質を含む。種々の抗生物質が本発明での使用に好適である１つの例示的なクラスは、ゲンタマイシンなどのアミノグリコシドである。これらの詳細な実施形態において、ゲンタマイシンは、本発明により提供される保存培地中に約５〜２０μｇ／ｍｌ、例えば約１０μｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
【０２７８】
本発明により提供される保存培地の追加的な成分は、一部の実施形態において、血清アルブミンである。本発明に従って複数の血清アルブミン源が有用であるが、一部の実施形態では、血清アルブミンは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はこれらの組み合わせである。血清アルブミンが存在するとき、特定の実施形態において、血清アルブミン（例えば、ＢＳＡ、ＨＳＡ又は組み合わせ）は、約１．５〜４．５％（Ｗ／Ｖ）、例えば約２〜４％、約２．５〜３．５％又は約３％の濃度で存在する。
【０２７９】
特定の実施形態において、本発明により提供される精子保存培地は、両性イオン緩衝剤（上述のとおり）並びに約６．６〜６．９のｐＨ、約０．２５〜０．３６Ｍの濃度のグルコース及び約３２０〜３８０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を含み、ここで、詳細な実施形態では、培地は、卵黄を含まない。本明細書の教示に従えば、これらの実施形態は、ゲンタマイシンなどの抗生物質も更に含み得る。一部の実施形態において、保存培地は、ｐＨが約６．８であり（例えば、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ又はこれらの組み合わせを使用する）、グルコース濃度が約０．３３０ｍＭであり、重量オスモル濃度が約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、ここで、血清アルブミンは、ＢＳＡ又はＨＳＡであり、任意選択で、ＢＳＡ又はＨＳＡは、約２〜４％（Ｗ／Ｖ）の濃度で存在する。
【０２８０】
上述のとおり、理論によって拘束されるものではないが、本発明により提供される精子保存培地は、有利には、精子損傷を最小限に抑えつつ、高レベルの精子機能を保つ。本発明により提供される精子保存培地の特定の実施形態において、保存培地中に約４℃で最長４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日間又はそれを超えて貯蔵された精子は、受精能獲得条件でインキュベートした後、保存及び冷蔵前に試料中に存在する総運動精子数など、好適な対照と比べて少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０％又はそれを超える運動精子を維持する。例えば、特定の実施形態において、本発明により提供される保存培地中に約４℃で７日間貯蔵された精子は、受精能獲得培地への移し替え時に好適な対照精子と比べて少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０％又はそれを超える運動精子を有する。一部の実施形態において、本発明により提供される保存培地中に約４℃で４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日間又はそれを超えて貯蔵された精子は、受精能獲得培地への移し替え時に好適な対照精子と比べて少なくとも約７５％の運動精子を有する。一部の実施形態において、本発明により提供される保存培地中に約４℃で７日間貯蔵された精子は、保存培地中での貯蔵前の運動精子率と比べて１％、２、５％、１０％、１５％又は２０％以上低い運動精子率を有する。
【０２８１】
精子機能の保持に加えて、特定の実施形態では、対照冷蔵又は凍結保存試料と比べた本発明により提供される保存培地中に貯蔵された精子の品質は、７日間のインキュベーション後、例えばＴＵＮＥＬ染色の減少、脂質過酸化の減少及び活性酸素種の減少又はこれらの組み合わせにより明らかである。例えば、一部の実施形態において、本発明により提供される保存培地中に貯蔵された精子は、例えば、本発明により提供される培地又は凍結保存培地（ゲンタマイシン及び１２％グリセロール含有ＴＹＢ）のいずれかにおける７日間の貯蔵及び解凍／回復後、低温貯蔵した細胞と比べて少なくとも：３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５％又はそれを超えるＴＵＮＥＬ染色の減少を呈する。特定の実施形態において、ＴＵＮＥＬ染色は、Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．２０１４  Ｍａｙ；２９（５）：９０４−１７の方法を用いて実施される。Ｇｏｒｃｚｙｃａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  １（６）：６３９−４８（１９９２）による追加的なアッセイを用い得る。特定の実施形態において、本発明により提供される保存培地中に貯蔵された精子は、例えば、本発明により提供される培地又は凍結保存培地（ゲンタマイシン及び１２％グリセロール含有ＴＹＢ）のいずれかにおける７日間の貯蔵及び解凍／回復後、ＢＯＤＩＰＹ  Ｃ１１を使用したフローサイトメトリーにより測定したとき、低温貯蔵した細胞と比べて少なくとも：３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５％又はそれを超える脂質過酸化の減少を呈する。特定の実施形態において、脂質過酸化は、Ｎａｇｕｉｂ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６５（２）：２９０−８（１９９８）又はＰａｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５３（３）：２７８−８２（１９９９）の方法によって判定される。特定の実施形態において、本発明により提供される保存培地中に貯蔵された精子は、例えば、本発明により提供される培地又は凍結保存培地（ゲンタマイシン及び１２％グリセロール含有ＴＹＢ）のいずれかにおける７日間の貯蔵及び解凍／回復後、低温貯蔵した細胞と比べて少なくとも：３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５％又はそれを超える活性酸素種の減少を呈する。
【０２８２】
特定の実施形態において、本発明により提供される任意の培地が滅菌製剤として提供される。かかる滅菌製剤は、密閉滅菌容器内にあり得る。特定の実施形態において、滅菌製剤は、液体製剤である。他の実施形態において、培地は、凍結乾燥される。当業者が理解するであろうとおり、凍結乾燥製剤は、実質的に水を含まないが、例えば滅菌蒸留水による再構成時にその製剤が本発明により提供される培地、特に本発明に従うｐＨ、重量オスモル濃度及び他の成分濃度のものとなるように製剤化される。
【０２８３】
従って、特定の例示的実施形態において、本発明は、約６．７〜６．９のｐＨを有し、両性イオン緩衝剤、約０．２５〜０．３５Ｍの濃度のグルコース、約３４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度、抗生物質、約２〜４％（Ｗ／Ｖ）の濃度のＢＳＡ又はＨＳＡを含む（又はそれから本質的になる）滅菌液である精子保存培地を提供し、ここで、この保存培地中に４℃で最長１４日間貯蔵された精子は、受精能獲得条件への移し替え時、好適な対照、時間０における運動精子数と比べて少なくとも６０％の運動精子を維持する。ここで、詳細な実施形態に例示されているが、本発明により提供されるかかる詳細な保存培地の成分は、特定の実施形態において本発明により提供されるかかる保存培地が卵黄を含まず、且つ任意選択で上掲の指摘される他の成分を欠き得る（又は含み得る）ことを含め、上記の例示のとおり様々であり得る。
【０２８４】
本発明の関連する態様は、一部の実施形態では生存精子を含む追加的な成分と共に、本発明により提供される保存培地を含む組成物である。一部の実施形態において、精子は、精液から濃縮される（又は単離される）。種々の精子濃縮又は単離手段は、遠心（密度勾配遠心法など）、スイムアップ法、ろ過、マイクロフルイディクス又はこれらの組み合わせによることを含めて可能である。特定の実施形態において、生存精子は、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、ネコ、イヌ又は霊長類精子など、哺乳類精子である。特定の実施形態において、精子は、ヒトからのものである。一部の実施形態において、ヒト対象は、精子数の減少を呈し、例えば精子減少症であり、例えば精子数が１ミリリットル当たり約２０００万、１９００万、１８００万、１８００万、１６００万、１５００万、１４００万、１３００万、１２００万、１１００万、１０００万、９００万、８００万、７００万、６００万、５００万、４００万、３００万、２００万個を下回る精子、例えば１ミリリットル当たり１５００万個未満の精子である。一部の実施形態において、精子は、２回分以上の射精液、例えば２、３、４、５、６回分又はそれを超える射精液からのものである。
【０２８５】
従って、本発明により提供される保存培地に従えば、特定の例示的実施形態において、本発明は、一部の実施形態では生存精子を含む追加的な成分と共に液体精子保存培地を含む組成物を提供し、この液体精子保存培地は、約６．７〜６．９のｐＨを有し、両性イオン緩衝剤、約０．２５〜０．３５Ｍの濃度のグルコース、約３４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度、抗生物質、約２〜４％（Ｗ／Ｖ）の濃度のＢＳＡ又はＨＳＡから本質的になり、ここで、４℃で最長１２日間貯蔵したとき、受精能獲得培地への移し替え時に好適な対照精子と比べて少なくとも６０％の精子が運動性を有する。ここで、詳細な実施形態に例示されているが、一部の実施形態では生存精子を含む追加的な成分と共に液体精子保存培地を含む組成物の成分は、本発明により提供される保存培地について例示されるとおり様々であり得る。従って、特定の実施形態において、精子保存培地を含む組成物は、卵黄を含有せず、任意選択で上掲の保存培地について指摘した他の成分を欠き得る（又は含み得る）。
【０２８６】
本明細書に提供される保存培地及び保存培地を含む組成物を所与として、本発明は、精子の保存方法の関連する態様も提供する。かかる方法は、高濃度化又は単離された精子を含め、精子を、本発明により提供される保存培地に接触させることを伴う。上述のとおり、精子減少症のヒト男性からの精子などのヒト精子を含め、種々の精子を使用することができる。精子は、複数回分の射精液からプールされ得る。特定の実施形態において、精子の保存方法は、保存培地と精子とを含む組成物を例えば約４℃である期間、例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日間又はそれを超えて貯蔵することであって、その間、特定の実施形態では、受精能獲得時に好適な対照と比べて少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０％又はそれを超える運動精子が保たれている、貯蔵することを伴う。
【０２８７】
一部の実施形態において、精子を卵子と接触させる前、例えば体外で接触させるか、又は精子を雌レシピエントの生殖器官に導入することによって体内で接触させる前に、本発明により提供される保存培地から精子を単離することができる。一部の実施形態において、保存培地からの精子の単離後、精子は、受精能獲得培地に置くことができる。
【０２８８】
精子試料の入手方法
生存精子の様々な採取方法が公知である。かかる方法としては、例えば、滅菌容器内への自慰、手袋をはめた手による方法、人工腟の使用及び電気射精が挙げられる。動物の精液は、人工腟を使用するか、電気射精装置によるか、又は動物の膨大部を手でマッサージすることにより採取することができる。また、外科手技を用いた精巣若しくは精巣上体の穿刺又は精巣若しくは精巣上体を摘出して周囲媒質中の精子を採取するなど、種々の方法論を用いて、精巣内精子及び精巣上体頭部、体部又は尾部から得られる精子を含め、雄生殖路の任意の部分から直接採取することもできる。精子は、好ましくは、採取されるか、又は生理的温度（典型的には約３５℃〜約３９℃）からの急激な温度変化を避けるために断熱容器に速やかに移し替えられる。射精液には、典型的には、種及び詳細な動物に応じて１ミリリットル当たり約５億〜１５０億個の精子が含まれる。この数字は、低受精能の雄又は精子機能不全を患っている雄から入手した場合に低くなり得る。
【０２８９】
精子は、供給源動物（例えば、哺乳類）から新鮮に採取された試料であり得るか、又は事前に解凍若しくは凍結保存された試料であり得る。採取時点において又はそれに続いて、採取された精子は、ＴＣＡ、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳなど、精子と適合性のある幾つもの様々な緩衝剤のいずれか又は米国特許出願公開第２００５／０００３４７２号明細書（その内容は、本明細書によって参照により本明細書に援用される）に開示される他の緩衝剤のいずれかと組み合わされ得る。例えば、１ミリリットル当たり約５億〜約１００億個の精子細胞が典型的に含まれるウシ精液試料は、供給源哺乳類から緩衝剤が入ったベッセルに直接採取して、精子懸濁液を形成し得る。精子懸濁液には、精子の生存を維持するため様々な他の添加剤も含まれ得る。例示的添加剤としては、タンパク質源、抗生物質、成長因子及び細胞内及び／又は細胞外での酸化／還元反応を調節する組成物が挙げられる。これらの添加剤の各々の例は、例えば、米国特許出願公開第２００７００９２８６０Ａ１号明細書及び同第２００５０２４４８０５Ａ１号明細書（これらの各々の内容は、本明細書によって参照により本明細書に援用される）の開示に実証されるとおり、当技術分野において周知である。代わりに、精液試料は、空の容器に採取して、次に続いて採取から数分〜数時間以内に緩衝剤と接触させて精子懸濁液を形成し得る。一部の実施形態において、精子細胞は、エネルギー枯渇下でのインキュベーションのために、エネルギー枯渇培地（例えば、グルコース、ピルビン酸及び乳酸を欠くＨＴＦ培地）が入った容器に直接採取することができる。一部の実施形態において、精子細胞は、空の容器に採取して、続いてエネルギー枯渇条件下でインキュベートすることができる。
【０２９０】
一部の実施形態において、精子採取は、本明細書に開示される方法を行う前に精子細胞を洗浄することを含む。概して、洗浄は、希釈用洗浄培地中で精液又は解凍精子試料を遠心することを伴い、これにより精子に富んだペレットの採取が可能となる。精子洗浄工程後又は代わりに、試料からの運動精子の特別な単離手順を行うことができる。
【０２９１】
一部の実施形態において、精子は、本明細書に開示される方法における使用前に精液から単離される。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法により調製した精子から、向上した機能を有する精子を更に濃縮することができる（例えば、運動能が向上した精子の濃縮）。概して、精子は、運動精子を泳がせて、死滅精子、非運動精子及び残屑から引き離すことによるか（精子スイムアップ法）、精子を密度勾配中で遠心することによるか、又は死滅精子及び残屑を結合するカラムに精子を通すことにより単離又は濃縮される。精液からの精子の単離（又は濃縮）は、洗浄及びスピン法、沈降法、直接的スイムアップ法、ペレット及びスイムアップ法及び浮遊密度勾配法から選択される方法により実施される。これらの方法は、当技術分野において周知である。これらは、従来、生殖補助技術に用いられており、“Ａ  ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｔｈｅ  Ｂｏｕｒｎ  Ｈａｌｌ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｅｄｉｔｏｒ：Ｐｅｔｅｒ  Ｒ．Ｂｒｉｎｓｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｐａｒｔｈｅｎｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ”（１９９９）に詳細に記載されている。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法により調製される精子は、沈降法、直接的スイムアップ法、ペレット及びスイムアップ法及び浮遊密度勾配法などの単離手順によって運動精子を更に濃縮することができる。
【０２９２】
直接的スイムアップ法とは、運動精子の自己選択を含意し、本質的には、培地のアリコートを精液試料又は本明細書に開示される精子調製液の上に重ねること及びそれを室温で一定期間静置させておくことを含む。運動精子細胞は、上層（培地）に遊走することになり、そこから回収することができる。この方法は、１回又は複数回の遠心ステップも含み得る。「スイムアップ法」により選択された精子の利点は、試料中に存在する運動能のある細胞が単離及び濃縮されること及び形態学的に正常な精子の比率が向上することである。
【０２９３】
この方法は、試料中の運動能のある細胞の量に応じて変更し、且つ更なる単離／分離技法と組み合わされ得る。例えば、スイムアップ手順は、試験管内で１ｍｌの下層の精液液体上に１ｍｌのアルブミン含有培地の層を重ねることにより実施され得る。３７℃で空気中又は５％ＣＯ２において１時間インキュベートした後、運動能特性がより良好な精子が遊走した上相の培地を収集する。この技法は、遠心ステップ、例えばパーコール勾配遠心を含み得るか又はそれと組み合わされ得る。典型的な適用では、精子を含有する溶液を勾配材料、好ましくは０．０５％ペクチンと混合した３０〜９０％のパーコールの上に重ね、次に遠心にかけることにより、向上した機能に関して濃縮された精子が収集される。分離、単離又は濃縮された精子は、次に、本明細書に開示される方法において使用されるか、又は例えば更に処理することになるまで凍結保存され得る。本明細書の方法により調製される精子調製液の場合、それは、濃縮ステップ後にＩＶＦ、ＩＣＳＩ又は人工授精に使用することができるか、又は例えば後の使用のために凍結保存され得る。従って、これらの単離又は濃縮方法のいずれについても、試料は、精液、部分的に精製された精子、精製された精子又は本明細書の方法により調製される、向上した機能を有する精子であり得る。一部の実施形態において、運動能のある細胞の割合は、直接的スイムアップ法、ペレット及びスイムアップ法及び浮遊密度勾配法などの単離方法を用いた精子の単離又は濃縮後、未処理の精液試料又は濃縮されていない精子調製液と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％又は約１００％向上する。
【０２９４】
一部の実施形態において、単離、濃縮及び洗浄後、精子ペレットは、保存培地、培養のためのＨＴＦ培地、エネルギー枯渇条件のための培地（例えば、グルコース、乳酸及びピルビン酸を欠くＨＴＦ）を含め、更なる処理に好適な培地に再懸濁することができる。本明細書に開示される方法により調製される、向上した機能を有する精子に関するとき、精子調製液は、保存培地、培養のためのＨＴＦ培地、授精用、本明細書に記載されるとおりの受精可能性検査用、体外受精用、凍結用、子宮内授精用、子宮頸管キャップ授精用などの培地に再懸濁することができる。精子が培地に加えられ得るか、又は培地が精子に加えられ得る。培地は、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳなどの両性イオン緩衝剤又は重炭酸ナトリウムなどの他の緩衝剤を含有し得る平衡塩類溶液であり得る。一般に、精子の希釈用培地又は精子、卵母細胞、胚若しくは胚性幹細胞の培養用培地は、Ｍ１９９、合成卵管液、ＰＢＳ、ＢＯ、Ｔｅｓｔ−卵黄、タイロード液、ＨＢＳＳ、ＨａｍのＦ１０、ＨＴＦ、ＭｅｎｅｚｏのＢ２、ＭｅｎｅｚｏのＢ３、ＨａｍのＦ１２、ＤＭＥＭ、ＴＡＬＰ、アール緩衝塩、ＣＺＢ、ＫＳＯＭ、ＢＷＷ培地及びｅｍＣａｒｅ培地（ＰＥＴＳ、Ｃａｎｔｏｎ，Ｔｅｘ．）などの平衡塩類溶液である。一部の実施形態において、精子培養培地にＴＡＬＰ又はＨＴＦが使用され、胚培養培地にＣＺＢが使用される。本開示の精子又は胚は、凍結保護物質を含む低温培地に保存することができる。
【０２９５】
一部の実施形態において、エネルギー枯渇条件でのインキュベーションに先立ち精子が保存培地に提供又は採取される。一部の実施形態において、保存培地は、弱酸性ｐＨを含み、且つ約３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば約３００〜３８０、３２０〜３７０、３３０〜３７０、３４０〜３６０、例えば約３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０又は３８０、例えば約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する緩衝溶液である。一部の実施形態において、本発明により提供される保存培地の重量オスモル濃度は、約３２０〜３４０ｍＯｓｍ／ｋｇである。「弱酸性」ｐＨとは、７未満５超を意味する。一部の実施形態において、弱酸性ｐＨは、約６〜７、例えば約６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．７、６．８、６．９であるか又はそれより高く、且つ７．０より低い（６．９９など）、例えば約６．５〜６．９９、例えば約６．７〜６．９など、例えば約６．８である。一部の実施形態において、保存培地は、約６．７〜６．９のｐＨを有し、両性イオン緩衝剤、約０．２５〜０．３５Ｍの濃度のグルコース、抗生物質、約３４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度、約２〜４％（Ｗ／Ｖ）の濃度のＢＳＡ又はＨＳＡを含む（又はそれから本質的になる）緩衝溶液であり、ここで、この保存培地中に４℃で最長１２日間にわたって貯蔵された精子は、受精能獲得培地への移し替え時に好適な対照精子と比べて少なくとも６０％の運動精子を維持し、任意選択で、培地は、卵黄を含有しない。一部の実施形態において、精子は、エネルギー枯渇条件でのインキュベーションに先立ち保存培地に約２時間、約３時間、約４時間、約２４時間、約１０日間、約１ヵ月間、約６ヵ月間、約１０ヵ月間、約１年間又はそれを超えて貯蔵される。一部の実施形態において、保存培地中の精子は、洗浄され、遠心でペレットにされ、エネルギー枯渇培地に再懸濁される。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法により調製される、向上した機能を有する精子は、上記に記載される保存培地に更に貯蔵される。
【０２９６】
好適な対照精子
好適な対照精子は、対照条件下、即ちヒト卵管液（「ＨＴＦ」）培地又は変法ＨＴＦ培地などの対照緩衝剤中において、エネルギー枯渇条件でない中でインキュベートされた精子であり得る。ＨＴＦは、重炭酸ナトリウム緩衝系を含み、インキュベーション中に二酸化炭素雰囲気を必要とする用途に利用し得る。変法ＨＴＦは、重炭酸ナトリウムとＨＥＰＥＳ（［４−２（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸］）との組み合わせ緩衝剤を含む。ＨＴＦ培地又は変法ＨＴＦ培地の好適な例としては、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されているものが挙げられる。一部の実施形態において、エネルギー枯渇条件でインキュベートすることは、グルコース、乳酸及びピルビン酸が除かれているＨＴＦ培地をインキュベートすることであり得る。精子は、精子の運動能（又は他の特性）の測定可能な変化をもたらすのに十分な期間にわたってインキュベートされ得、この方法の具体的な実施形態において、インキュベーションは、１分〜２４時間、１５分〜３時間、３０分〜１．５時間、約１時間又はその任意の部分的範囲若しくは部分的値である。一部の実施形態において、好適な対照精子は、エネルギー枯渇条件でインキュベートされ、続いて第１のエネルギー源（例えば、糖新生基質又は解糖系基質から選択される）又は第２のエネルギー源（例えば、糖新生基質又は解糖系基質から選択されるが、第１のエネルギー源と同じでない）によって独立に処理される精子である。一部の実施形態において、好適な対照精子は、エネルギー枯渇条件でインキュベートされ、続いて糖新生基質又は解糖系基質によって独立に処理される精子である。一部の実施形態において、好適な対照は、エネルギー枯渇条件でインキュベートされ、続いて第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源によって同時に処理される精子である。一部の実施形態において、好適な対照精子は、エネルギー枯渇条件でインキュベートされ、続いて糖新生基質及び解糖系基質によって同時に処理される精子である。一部の実施形態において、好適な対照精子は、未処理の精子である。好適な対照精子は、少なくとも１つの精子又は精子の集団、例えば精子調製液又は精子懸濁液であり得ることが理解される。好適な対照は、対照条件下、即ち対照緩衝剤中でインキュベートされた精子であり得る。対照条件は、例えば、標準的な受精能獲得条件下で精子をインキュベートすることを含み得る。「標準的な受精能獲得条件」は、本明細書で使用されるとき、標準的な受精能獲得培地で精子をインキュベートすることを指す。
【０２９７】
精子調製液
一部の実施形態において、本発明は、活性化された精子（例えば、飢餓状態に置いた後、続いて有効量の第１及び第２のエネルギー源の両方を導入した、超活性化精子及び中間精子が濃縮されている精子）、部分的に活性化された精子（飢餓状態に置き、有効量の第１のエネルギー源のみと接触させた精子）又は増強された精子の調製液など、精子調製液を提供する。これらは、まとめて、「本発明により提供される精子調製液」又は「本発明により提供される調製液」である。一部の実施形態において、本発明は、少なくとも５％の超活性化精子、例えば少なくとも約５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０％又はそれを超えるもの、例えば約５〜２０、８．５〜２０、１０〜２０又は１２．５〜２０％の超活性化精子を含む超活性化精子調製液を提供する。一部の実施形態において、この調製液は、少なくとも約５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２５、２６、２８又は３０％、例えば約２０．５〜約３０％、約２２．５〜約３０％の中間運動能精子も含有する。従って、一部の実施形態において、超活性化精子と中間運動能精子との合計割合は、少なくとも１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、２４．０、２４．５、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０％又はそれを超えるもの、例えば約１０〜５０、３０．５〜５０、３２．５〜５０である。当業者が理解するであろうとおり、精子は、超活性化（及び／又は中間）表現型に基づいて分離され得るが、一部の実施形態では、前述の割合は、活性化されていない調製液に基づいて、次に超活性化に基づいて選別される（しかしながら、一部の実施形態では、精子調製液は、例えば、ある種の不規則な精子を含めた他の精液成分から精子を分離又は他に濃縮するために前処理されていることができる）。一部の実施形態において、調製液中の超活性化（又は中間運動能若しくは超活性化及び中間運動能）精子は、好適な対照と比べて、細胞内ＲＮＡ濃度（マイクロＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡなど）が１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０％又はそれを超えて（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍又はそれを超えて）低下している。一部の実施形態において、本発明により提供される調製液中の精子は、（バルク平均メトリック又はカテゴリ内での割合のいずれかによって評価したとき）精子頭部形態の変化、尾部運動（例えば、振幅）の増加又はこれらの組み合わせによって特徴付けられる。
【０２９８】
一部の実施形態において、本開示は、好適な対照精子と異なるエピジェネティックプロファイルを含む精子調製液を提供する。
【０２９９】
「エピジェネティックプロファイル」とは、ヌクレオチド配列の変化を伴わないＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質修飾（例えば、メチル化又はアセチル化）として定義される。修飾の非限定的な例としては、メチル化、及び／又はアセチル化、及び／又は非コードＲＮＡの結合、及び／又はヒストン修飾が挙げられる。非コードＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、エンドｓｉＲＮＡ）結合は、スプライシングされたイントロン又はエクソンＲＮＡの遺伝子シグナル伝達及びＲＮＡｉ様実体を含めた一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ実体の生成を包含する。「エピジェネティックプロファイル」には、タンパク質修飾、例えばタンパク質メチル化、タンパク質アセチル化が含まれ得、例えばアセチル化、メチル化及び他の変化などのヒストン修飾が含まれ得る。
【０３００】
一部の実施形態において、本明細書に開示される方法によって処理された精子は、好適な対照（例えば、好適な対照精子）と比べて異なる又は変化したエピジェネティックプロファイルを呈する。本明細書で使用されるとき、用語「異なるエピジェネティックプロファイル」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質に対する１つ以上の修飾のパターンの変化を指す。一部の実施形態において、パターンの変化は、好適な対照精子のものと比べて精子のＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質上の特定の部位に修飾（例えば、メチル化又はアセチル化）が存在することを含む。一部の実施形態において、パターンの変化は、好適な対照精子のものと比べて精子のＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質上の特定の部位に修飾（例えば、メチル化又はアセチル化）が存在しないことを含む。一部の実施形態において、パターンの変化は、１つ以上の修飾の変化したレベルを含む。一部の実施形態において、パターンの変化は、１つ以上の修飾のレベルの増加を含む。一部の実施形態において、パターンの変化は、１つ以上の修飾のレベルの低下を含む。例えば、１つ以上の修飾の変化したレベルは、メチル化レベル、アセチル化レベルなどの増加又は低下を含み得る。一部の実施形態において、異なるエピジェネティックプロファイルは、変化したＤＮＡメチル化及び／又はＤＮＡアセチル化レベルを含む。一部の実施形態において、異なるエピジェネティックプロファイルは、特定のＤＮＡ部位にメチル化が存在すること及び／又は存在しないことを含む。一部の実施形態において、異なるエピジェネティックプロファイルは、特定のＤＮＡ部位にアセチル化が存在すること及び／又は存在しないことを含む。エピジェネティック変化を測定する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｋ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  Ｎｕｒｓ．２０１３  Ｏｃｔ；１５（４）：３７３−３８１及びＤｅＡｎｇｅｌｉｓ  Ｔ．Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８  Ｆｅｂ；３８（２）：１７９−１８３（これらは、全体として参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【０３０１】
一部の実施形態において、精子試料における対照精子と比べて異なるエピジェネティックプロファイルは、生理的条件、形質、表現型又は状態に関連する。例えば、異なるエピジェネティックプロファイルは、肥満（又は癌若しくは糖尿病などの肥満関連障害）などの病態が存在しないこと、又は産乳量の向上などの望ましい形質が存在すること、又は受精能の低下などの望ましくない形質が存在しないことに関連し得る。従って、本明細書に開示される方法によって処理された精子は、雄又は雌のいずれであれ、親と比べて改善された適応度を有する子孫の産生に有用であり得る。
【０３０２】
一部の実施形態において、本発明は、本発明により提供される方法のいずれか１つにより調製される精子調製液を提供する。
【０３０３】
一部の実施形態において、本発明は、正常精子の雄、低受精能の雄又は精子減少症の雄、例えば低受精能（精子減少症を含む）の雄などの雄対象の精液から精子を濃縮すること、精子を、エネルギー枯渇下において、精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすること及び有効量の解糖系エネルギー源又は有効量の糖新生基質から選択されるが、但し有効量の解糖系エネルギー源及び糖新生基質の両方ではない、第１のエネルギー源を精子に提供することによって調製される精子調製液を提供する。
【０３０４】
本発明により提供される調製液のいずれについても、精子は、任意の雄対象、例えば哺乳類など、及び一部の実施形態ではヒトからのものであり得る。一部の実施形態において、ヒトは、正常精子の男性であるか、又は他の実施形態において、雄は、精子減少症又は低受精能（例えば、低精子運動能）の対象である。
【０３０５】
一部の実施形態において、本明細書に記載される精子調製液は、本発明により提供される精子保存培地で保存することができる。一部の実施形態において、本明細書に提供される精子調製液は、本発明により提供される様々な方法（例えば、精子機能を亢進させる、受精を増進させる等）であって、一部の実施形態では、本発明により提供される様々なキットを使用して実施することができ、従って特定の実施形態では、本発明により提供される精子調製液が作製されることになる方法により、且つ／又は生殖補助方法を含めた受精方法など、本発明により提供される更なる方法において調製することができる。
【０３０６】
受精の増進
本明細書に開示される方法により調製される、向上した機能を有する精子の調製液は、受精を増進させるのに有用であり得る。従って、本開示は、受精を増進させる方法にも関する。本方法は、エネルギー枯渇条件下で精子をインキュベートして精子を増強すること、増強された精子に第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供して１つ以上の精子機能を向上させること及び向上した機能を有する精子に、受精を増進させる条件下において、卵子への到達手段を提供することを含む。向上した機能を有する精子の調製液は、ヒトにおけるＩＶＦ、ＩＣＳＩ、人工授精（例えば、子宮内授精）、並びにヒト疾患（不妊症、精子機能不全）の動物モデルの生物医学研究産業、並びに育種及び農産業において適用することができる。本明細書に開示される方法により調製される、向上した機能を有する精子は、精子と同じ種の未受精卵子への到達手段を提供されることにより体外受精、ＩＣＳＩを増進することができるか、又は例えば精子と同じ種の雌対象の子宮内授精を含めた人工授精に使用することができる。
【０３０７】
体内受精
本明細書に開示される方法により調製される、向上した機能を有する精子は、向上した機能を有する精子に、例えば精子と同じ種の雌対象の生殖路にある卵子への到達手段を提供することにより、体内での受精を増進させるのに有用であり得る。体内受精は、精子の人工授精、例えば頸管内授精又は子宮内授精によって行うことができる。標準的な人工授精及び子宮内授精並びに他の方法は、当業者に周知である。一部の実施形態では、向上した機能を有する精子に、前記精子の子宮内授精によって雌対象の生殖路にある卵子への到達手段を提供することにより、卵子の受精が増進される。他の実施形態では、精子に、エネルギー枯渇条件下でインキュベートされ、且つ体外で第１のエネルギー源が提供された哺乳類精子の子宮内授精によって体内で卵子への到達手段及び第２のエネルギー源が提供され得る。注入される精子は、好適な液体中に保持されたまま使用され得る。この目的で使用される液体は、通常、人工授精のための培地として使用される液体であり得る。
【０３０８】
体外受精
本明細書に開示される本方法及び精子調製液は、生殖補助技術による受精、例えばＡＲＴ、詳細にはＩＶＦ後の胚生存能を増進させるのに有用である。本開示を適用可能な他の好適なＡＲＴ技法としては、限定はされないが、配偶子卵管内移植（ＧＩＦＴ）、接合子卵管内移植（ＺＩＦＴ）、胚盤胞移植（ＢＴ）、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、配偶子、胚及び細胞凍結保存、胚生検のための胚の体外調製並びに核移植による胚の形成及びトランスジェニック株及び遺伝子修飾株の作製を含めた他の形態の胚顕微操作が挙げられる。これは、胚性幹細胞株の作製にも適用可能である。
【０３０９】
一部の実施形態において、本明細書に開示される方法により調製される、向上した機能を有する精子は、例えば、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）を含めた顕微注入法及び当業者に周知の他の方法によるなど、卵子の体外受精に使用することができる。典型的には、ＩＶＦでは、受精後に細胞を胚盤胞期まで成長させて、次に移植する。本明細書に開示される方法により、生存がより長く、且つ２細胞期、胚盤胞期に発育する能力が向上した胚の形成が向上する。従って、本明細書に開示される精子調製液は、例えば、ＩＣＳＩを含めた体外受精手技において有用であり得る。
【０３１０】
本開示の方法は、本明細書の方法により調製された精子に卵子への到達手段を提供して体外受精を増進することを包含する。精子に体外での卵子への到達手段を提供することは、適切な培地中で行われ得る。この目的で使用される培地は、通常体外受精のための培地として使用される培地、例えばＨＴＦ培地であり得る。到達手段を提供するための温度条件は、体外受精に用いられる一般的な温度であり得、例えば哺乳類の平均体温又はそれに近い温度であり得る。到達手段を提供する時間は、一般的に体外受精に必要な任意の時間であり得るが、特に限定はされず、好ましくは６〜２４時間である。体外受精率は、１つ以上の精子を成熟卵母細胞と約２４時間インキュベートすることにより決定し得る。次に、卵母細胞を１％アセトオルセイン染色剤で染色して受精率を決定するか、又は培養下に置いておくことにより分割させて、形成された胚の数をカウントする。卵母細胞は、５０μｇ黄体形成ホルモン／ｍｌ含有Ｍ１９９培地において体外で成熟させることができる（Ｂｒａｃｋｅｔｔ  ａｎｄ  Ｚｕｅｌｋｅ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ３９：４３，１９９３）。
【０３１１】
受精用途
本明細書に開示されるこれらの方法及び精子調製液は、概して、ヒト、ウシ、イヌ、ウマ、ブタ、ヒツジ、鳥類、げっ歯類などを含め、多くの種に適用可能である。本方法は、受精が所望される場合に常に有用であるが、受精機能不全を呈する動物及びヒトにおいて受胎可能性を向上させるための特別な用途がある。かかる機能不全には、低精子数、精子運動能の低下及び精子の形態異常が含まれる。従って、本明細書に開示される方法は、不妊症クリニックにおいて、その体外受精又は子宮内授精における使用に先立ち、向上した機能を有する精子を調製するのに有用であり得る。本明細書に記載される方法は、外来種及び／又は絶滅危惧種における人工授精、ＩＶＦ又はＩＣＳＩの改善に使用することができる。このように本方法は、動物園において飼育下で管理されている動物の受精を増進させるための、且つ世界で絶滅の危機に瀕している動物の繁殖の改善を目的とする保護計画での用途が見出され得る。例えば、本開示の方法及び精子調製液は、畜産業における農業的価値のある種についての、且つ保護を目的として繁殖される種における受精率及び妊娠率を改善するために使用することができる。
【０３１２】
加えて、本発明の方法及び組成物は、例えば、商業的育種における人工授精手技に有用である。本方法は、飼い慣らされた動物、特に家畜類からの精子並びに野生動物（例えば、絶滅危惧種）からの精子で行うことができる。例えば、本明細書に開示されるとおり、本開示の方法及び組成物の実施形態は、ウシの繁殖に適用が見出される。本方法及び調製液は、家畜類に特定の遺伝的に決定された形質を導入することにより１つ以上の好ましい特性又は形質を有する子孫、例えば特定の性別の子孫、産乳量が亢進した子孫、高品質肉産生のための子孫に向けて成績に影響を与えることが望ましい畜産産業における人工授精に有用であり得る。本明細書に記載される方法を使用することにより、妊娠率が改善することになる。哺乳類精子は、高頻度で凍結及び解凍によって損傷を受け、受精能が低下する結果となる。本明細書に開示される方法により調製される精子は、生存精子の性能を改善することにより、授精への使用時に性周期当たりの妊娠率の上昇を増進し得るため、受胎を確実にするのに必要なサイクル数が削減され、従って全体的な人工授精費用が削減され得る。
【０３１３】
極めて望ましい形質を有する動物からの精液であれば、それをより多くの雌の授精に使用し得、なぜなら、任意の１匹の雌において受胎を確実にするために必要なサイクル数が少なくて済むためである。かかる適用について、精液は、所望の特性を有する雄から入手される。得られる子孫の性別成績に影響を与えるために、精子調製液は、Ｘ染色体及びＹ染色体担持細胞に選別され、且つ／又は本明細書に開示される１つ以上の向上した精子機能を有する精子に関して濃縮され得る。精子は、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，１３５，７５９号明細書）に記載されるとおりの一般的に用いられる方法により、フローサイトメーター／セルソーターを使用してＸ染色体及びＹ染色体担持精子濃縮集団に選別され得る。本明細書に開示される方法により調製される精子は、一定のＸ染色体担持又はＹ染色体担持精子細胞率を含む集団となるように選別することができる。例えば、これらの集団の１つにおける精子は、少なくとも約６５％のＸ染色体担持又はＹ染色体担持精子細胞、少なくとも約７０％のＸ染色体担持又はＹ染色体担持精子細胞、少なくとも約７５％のＸ染色体担持又はＹ染色体担持精子細胞、少なくとも約８０％のＸ染色体担持又はＹ染色体担持精子細胞、少なくとも約８５％のＸ染色体担持又はＹ染色体担持精子細胞、少なくとも約９０％のＸ染色体担持又はＹ染色体担持精子細胞又は更に少なくとも約９５％のＸ染色体担持又はＹ染色体担持精子細胞を含み得る。一部の実施形態において、選別は、本明細書に開示されるとおりの向上した機能を有する精子の調製前に行うことができる。一部の実施形態において、選別は、向上した機能を有する精子に、ＩＶＦ、ＩＣＳＩ又はＡＩの場合のような受精のための卵子への到達手段を提供する前に行うことができる。
【０３１４】
本発明により提供される方法及び調製液は、ＩＣＳＩ（卵細胞質内精子注入法）によるものを含め、ＩＶＦなどの補助受精において使用することができる。一部の実施形態において、本発明により提供される方法のいずれも、精子を雌生殖路に提供するステップを含むことができ、任意選択で、雌生殖路は、有効量の第２のエネルギー源を提供される。一部の実施形態において、本発明により提供される（向上した精子機能を有する）精子調製液に、卵子を受精させるのに十分な時間にわたり、卵子への到達手段を提供することができ、この卵子は、体外にあり得るか（例えば、ＩＣＳＩを含めたＩＶＦ）、又は一部の実施形態では雌生殖路内にあり得る。かかる方法は、一部の実施形態では、続く雌保卵者における受精卵の着床を伴う。
【０３１５】
一部の実施形態において、本発明は、有効量の第２のエネルギー源と接触させていない本発明により提供される調製液に、卵子を受精させるのに十分な時間にわたり、有効量の糖新生基質及び解糖系エネルギー源の両方を提供するように、第２のエネルギー源の有効量及び卵子への到達手段を提供することを含む受精方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、体外で実施される。他の実施形態において、本方法は、雌の生殖路（腟又は子宮）において体内で実施される。
【０３１６】
一部の実施形態において、本発明は、異なるエピジェネティックプロファイルを有する精子の調製液を提供することを含む受精方法を提供する。一部の実施形態において、精子試料における対照精子と比べて異なるエピジェネティックプロファイルは、生理的条件、形質、表現型又は状態に関連する。例えば、異なるエピジェネティックプロファイルは、肥満などの病態（又は癌若しくは糖尿病などの肥満関連障害）が存在しないこと、又は産乳量の増加などの望ましい形質が存在すること、又は受精能の低下などの望ましくない形質が存在しないことに関連し得る。従って、本明細書に開示される方法によって処理された精子は、雄親対象と比べて改善された適応度を有する子孫の作製に有用であり得る。一態様において、本明細書では、雄親対象と比べて改善された適応度を有する子孫を作製する方法であって、本明細書に開示される方法により雄親からの精子試料を処理すること、及び処理した精子を卵子に受精させて、胚を発生させること、及び雌対象において胚を成長させて、改善された適応度を有する子孫を作製することを含む方法が提供される。用語「改善された適応度を有する子孫」は、生理的条件、形質、表現型又は状態について親対象と比べて望ましい変化又は改善を呈する子孫を指す。例えば、望ましい変化には、肥満などの病態（又は癌、心血管疾患、不妊症などの肥満関連障害）が存在しないことが含まれ得る。例えば、改善には、産乳量の増加などの望ましい形質が存在することが含まれ得る。
【０３１７】
製品
一部の実施形態において、本発明は、例えば、本発明により提供される方法のいずれかの実施又は本発明により提供される調製液のいずれかの調製に好適な製品及びキットも提供する。例えば、一部の実施形態において、本発明は、精子との接触時にエネルギー枯渇を誘導する精子増強溶液、有効量の解糖系エネルギー源又は有効量の糖新生基質から選択されるが、但し有効量の解糖系エネルギー源及び糖新生基質の両方ではない、第１のエネルギー源を提供する第１の溶液及び有効量の第２のエネルギー源を提供する第２の溶液を含む製品を提供する。一部の実施形態において、本製品は、一部の実施形態では、精子単離マトリックスなど、精子を単離又は濃縮する手段を更に含む。一部の実施形態において、精子単離マトリックスは、シラン化シリカであり、任意選択で、シラン化シリカは、いかなる解糖系エネルギー源又は糖新生基質も実質的に含まない培地中にある。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に開示される方法の実行に関する説明書を含む。本キットは、洗浄用培地、保存培地、培養培地（例えば、ＨＴＦ）、希釈剤なども含み得る。本キットには、必要に応じてアジュバント、試薬及び緩衝剤が更に含まれ得る。
【０３１８】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるキットの全ての成分及び試薬は、少なくともその成分についての米国薬局方（ＵＳＰ）モノグラフグレード純度に適合する。一部の成分についてＵＳＰモノグラフが利用可能でないこともあり、従って、特定の実施形態では、その成分の好適な医薬品グレード参照標準純度が用いられる。一部の実施形態において、キットの成分の純度は、約９５％の純度である。成分及び試薬は、より詳細には、少なくとも約９５％、より詳細には少なくとも約９８％、より詳細には少なくとも約９９％の純度を有する。一部の実施形態において、キットの成分及び試薬は、実質的に無菌であるか、実質的にパイロジェンフリーであるか、又は実質的に無菌且つ実質的にパイロジェンフリーである。
【０３１９】
一部の実施形態において、キットの試薬中に含まれる成分は、実質的に純粋である。本明細書で使用されるとき、実質的に純粋とは、任意の適切な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動又はＨＰＬＣにより決定したときに容易に検出可能な不純物を含まないように見えるだけの十分な均一性があることを意味する。用語「実質的に純粋」は、少なくとも６０重量％（乾燥重量）が目的成分（例えば、グルコース又はピルビン酸）である配合物を意味する。詳細な実施形態において、配合物は、少なくとも７５重量％、より詳細には少なくとも９０重量％、更により詳細には少なくとも９９重量％が目的成分である。配合物が２つ以上の目的成分を含む場合、「実質的に純粋な」配合物とは、全ての目的成分の総重量（乾燥重量）が総乾燥重量の少なくとも６０％である配合物を意味する。同様に、２つ以上の目的成分を含有するかかる配合物について、２つ以上の目的成分の総重量は、配合物の総乾燥重量の少なくとも７５％、より詳細には少なくとも９０％、更により詳細には少なくとも９９％である。一部の実施形態において、本開示は、例えば、本発明により提供される方法のいずれかの実施又は本発明により提供される調製液のいずれかの調製に好適な製品及びキットも提供する。
【０３２０】
例えば、一部の実施形態において、本開示は、精子との接触時にエネルギー枯渇を誘導して増強された哺乳類精子を生じさせる精子増強用エネルギー枯渇組成物を含む第１の容器を含むキットを提供する。
【０３２１】
一部の実施形態において、精子増強用エネルギー枯渇組成物は、例えば、約０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３ｍＭ未満のグルコース又はそれより低い、例えば約０．０２又は０．０１ｍＭ未満、例えば約０．０１ｍＭ未満の低グルコース濃度を含む。一部の実施形態において、精子増強用エネルギー枯渇組成物は、実質的にグルコース不含である。一部の実施形態において、精子増強用エネルギー枯渇組成物は、例えば、約０．１５、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００５、０．００３、０．００２ｍＭ未満又はそれより低い低ピルビン酸濃度を含む。一部の実施形態において、精子増強用エネルギー枯渇組成物は、実質的にピルビン酸不含である。
【０３２２】
一部の実施形態において、精子増強用エネルギー枯渇組成物は、低グルコース濃度及び低ピルビン酸濃度など、実質的に炭素源を含まず、例えば実質的にグルコース不含且つ実質的にピルビン酸不含である。一部の実施形態において、精子増強用エネルギー枯渇組成物は、緩衝剤を含む。一部の実施形態において、緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ又はこれらの組み合わせである。一部の実施形態において、精子増強用エネルギー枯渇組成物は、約１ｍＭ〜５０ｍＭ、２〜４０ｍＭ、３〜３０ｍＭ、５〜２０ｍＭ、７〜１５ｍＭ又は７．５〜１２．５ｍＭの濃度のＨＥＰＥＳを含む。一部の実施形態において、ＨＥＰＥＳは、約１、２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ｍＭの濃度である。一部の実施形態において、ＨＥＰＥＳは、少なくとも約１、２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ｍＭの濃度である。一部の実施形態において、ＨＥＰＥＳは、１０ｍＭの濃度である。
【０３２３】
一部の実施形態において、精子増強用エネルギー枯渇組成物は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、ウシ胎仔血清又はウシ血清アルブミンを更に含む。一部の実施形態において、精子増強用エネルギー枯渇組成物は、例えば、約１〜１０ｍｇ／ｍｌ、２〜８ｍｇ／ｍｌ又は３〜７ｍｇ／ｍｌの濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。一部の実施形態において、ＨＳＡは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ｍｇ／ｍｌの濃度である。一部の実施形態において、ＨＳＡは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ｍｇ／ｍｌの濃度である。一部の実施形態において、ＨＳＡは、４ｍｇ／ｍｌの濃度である。一部の実施形態において、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンは、濃縮ストック溶液など、別個の溶液中に提供され、本発明により提供されるキット中の組成物の１つ以上に希釈される。
【０３２４】
一部の実施形態において、精子増強用エネルギー枯渇組成物は、抗生物質を更に含む。一部の実施形態において、抗生物質は、精子増強用エネルギー枯渇組成物中に約１〜２０μｇ／ｍｌ、２〜１８μｇ／ｍｌ、４〜１６μｇ／ｍｌ、６〜１４μｇ／ｍｌ又は８〜１２μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一部の実施形態において、抗生物質は、約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０μｇ／ｍｌの濃度である。一部の実施形態において、抗生物質は、少なくとも約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０μｇ／ｍｌの濃度である。一部の実施形態において、抗生物質は、１０μｇ／ｍｌの濃度である。一部の実施形態において、抗生物質は、ゲンタマイシン又はペニシリンである。
【０３２５】
一部の実施形態において、精子増強用エネルギー枯渇組成物は、１つ以上の塩、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３を更に含む。
【０３２６】
一部の実施形態において、ＮａＣｌは、約５０〜１５０ｍＭ、６０〜１４０ｍＭ、７０〜１３０ｍＭ、８０〜１２０ｍＭ又は９０〜１００ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＮａＣｌは、約５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９７．１、９７．２、９７．３、９７．４、９７．５、９７．６、９７．８、９７．９、９８、９８．５、９９、９９．５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＮａＣｌは、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９７．１、９７．２、９７．３、９７．４、９７．５、９７．６、９７．８、９７．９、９８、９８．５、９９、９９．５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＮａＣｌは、９７．８ｍＭの濃度で存在する。
【０３２７】
一部の実施形態において、ＫＣｌは、約１〜１０ｍＭ、１．５〜９．５ｍＭ、２〜９ｍＭ、２．５〜８．５ｍＭ、３〜８ｍＭ、３．５〜７．５ｍＭ、４〜７ｍＭ、４．５〜６．５ｍＭ、４．５〜６ｍＭ又は４．５〜５ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＫＣｌは、約１、２、３、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．５、６、７、８、９又は１０ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＫＣｌは、少なくとも約１、２、３、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．５、６、７、８、９又は１０ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＫＣｌは、４．７ｍＭの濃度で存在する。
【０３２８】
一部の実施形態において、ＣａＣｌ２は、約１〜５ｍＭ、１．１〜４．５ｍＭ、１．２〜４ｍＭ、１．３〜３．５ｍＭ、１．４〜３ｍＭ又は１．５〜２．５ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＣａＣｌ２は、約１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．５、４、４．５又は５ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＣａＣｌ２は、少なくとも約１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．５、４、４．５又は５の濃度で存在する。一部の実施形態において、ＣａＣｌ２は、２ｍＭの濃度で存在する。
【０３２９】
一部の実施形態において、ＫＨ２ＰＯ４は、約０．１〜０．６ｍＭ、０．１５〜０．５５ｍＭ、０．２〜０．５ｍＭ、０．２５〜０．４５ｍＭ又は０．３〜０．４ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＫＨ２ＰＯ４は、約０．１、０．１５、０．２、０．２２、０．２５、０．２６、０．３、０．３２、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４、０．４５、０．５又は０．６ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＫＨ２ＰＯ４は、少なくとも約０．１、０．１５、０．２、０．２２、０．２５、０．２６、０．３、０．３２、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４、０．４５、０．５又は０．６ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＫＨ２ＰＯ４は、０．３７ｍＭの濃度で存在する。
【０３３０】
一部の実施形態において、ＮａＨＣＯ３は、約１０〜５０ｍＭ、１２〜４５ｍＭ又は１５〜３０ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＮａＨＣＯ３は、約１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５、４０、４５又は５０ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＮａＨＣＯ３は、少なくとも約１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５、４０、４５又は５０ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＮａＨＣＯ３は、２０ｍＭの濃度で存在する。
【０３３１】
一部の実施形態において、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏは、約０．１〜０．５ｍＭ、０．１２〜０．４５ｍＭ、０．１４〜０．４ｍＭ、０．１６〜０．３５又は０．１８〜０．３ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏは、約０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．２２、０．２４、０．２６、０．２８、０．３、０．３５、０．４、０．４５又は０．５ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏは、少なくとも約０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．２２、０．２４、０．２６、０．２８、０．３、０．３５、０．４、０．４５又は０．５ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏは、０．２ｍＭの濃度で存在する。
【０３３２】
一部の実施形態において、精子増強用エネルギー枯渇組成物は、例えば、約０．０００１〜０．００１％、０．０００２〜０．００９％、０．０００３〜０．０００８％、０．０００４〜０．０００７％又は０．０００５〜０．０００６５％の濃度のｐＨ指示薬、例えばフェノールレッドを含む。一部の実施形態において、フェノールレッドは、約０．０００１％、０．０００２％、０．０００３％、０．０００４％、０．０００５％、０．０００６％、０．０００７％、０．０００８％、０．０００９％又は０．００１％の濃度で存在する。一部の実施形態において、フェノールレッドは、少なくとも約０．０００１％、０．０００２％、０．０００３％、０．０００４％、０．０００５％、０．０００６％、０．０００７％、０．０００８％、０．０００９％又は０．００１％の濃度で存在する。一部の実施形態において、フェノールレッドは、０．０００６％の濃度で存在する。
【０３３３】
一部の実施形態において、精子増強用エネルギー枯渇組成物は、弱酸性ｐＨを含み、且つ約２００〜２８０ｍＯｓｍ（ｍＯｓｍ／ｋｇ）、例えば約２２０〜２６０、２２５〜２５５、２３０〜２５０ｍＯｓｍ（ｍＯｓｍ／ｋｇ）の重量オスモル濃度を有する緩衝溶液であり、任意選択で、第１又は第２のエネルギー源を加えると、容量オスモル濃度（又は重量オスモル濃度）は、少なくとも約２７０、２７５、２８０、２８５、２９０又は２９５ｍＯｓｍ（ｍＯｓｍ／ｋｇ）に増加する。「弱酸性」ｐＨとは、７未満５超を意味する。一部の実施形態において、弱酸性ｐＨは、約６〜７、例えば約６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．７、６．８、６．９であるか又はそれより高く、且つ７．０より低い（６．９９など）、例えば約６．５〜６．９９、例えば約６．７〜６．９など、例えば約６．８である。
【０３３４】
一部の実施形態において、精子増強用エネルギー枯渇組成物は、栄養素不含合成ヒト卵管液である。一部の実施形態において、栄養素不含合成ヒト卵管液は、例えば、９７．８ｍＭの濃度のＮａＣｌ、例えば４．７ｍＭの濃度のＫＣｌ、例えば２ｍＭの濃度のＣａＣｌ２、例えば０．３７ｍＭの濃度のＫＨ２ＰＯ４、例えば０．２ｍＭの濃度のＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、例えば４ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＳＡ、例えば１０μｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシン、例えば１０ｍＭの濃度のＨＥＰＥＳ及び例えば０．０００６％の濃度のフェノールレッドを含む。一部の実施形態において、栄養素不含合成ヒト卵管液は、例えば、９７．８ｍＭの濃度のＮａＣｌ、例えば４．７ｍＭの濃度のＫＣｌ、例えば２ｍＭの濃度のＣａＣｌ２、例えば０．３７ｍＭの濃度のＫＨ２ＰＯ４、例えば０．２ｍＭの濃度のＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、例えば４ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＳＡ、例えば１０μｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシン、例えば１０ｍＭの濃度のＨＥＰＥＳ及び例えば０．０００６％の濃度のフェノールレッドから本質的になる。一部の実施形態において、栄養素不含合成ヒト卵管液は、例えば、９７．８ｍＭの濃度のＮａＣｌ、例えば４．７ｍＭの濃度のＫＣｌ、例えば２ｍＭの濃度のＣａＣｌ２、例えば０．３７ｍＭの濃度のＫＨ２ＰＯ４、例えば０．２ｍＭの濃度のＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、例えば４ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＳＡ、例えば１０μｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシン、例えば１０ｍＭの濃度のＨＥＰＥＳ及び例えば０．０００６％の濃度のフェノールレッドからなる。一部の実施形態において、栄養素不含合成ヒト卵管液は、低グルコース濃度、低乳酸濃度及び低ピルビン酸濃度など、実質的に炭素源を含まず、例えば実質的にグルコース不含、実質的に乳酸不含且つ実質的にピルビン酸不含である。
【０３３５】
一部の実施形態において、本キットは、解糖系エネルギー源又は糖新生基質から選択されるが、但し解糖系エネルギー源及び糖新生基質の両方ではない、第１のエネルギー源を含む第２の組成物を含む第２の容器を更に含む。一部の実施形態において、本キットは、解糖系エネルギー源又は糖新生基質から選択される第２のエネルギー源を含む第３の組成物を含む第３の容器を更に含み、選択される第２のエネルギー源は、第１のエネルギー源として選択されないものである。
【０３３６】
一部の実施形態において、解糖系エネルギー源は、グルコースである。一部の実施形態において、糖新生基質は、ピルビン酸である。一部の実施形態において、本キットは、第１のエネルギー源を含む第１の溶液のみを含む。一部の実施形態において、第１のエネルギー源は、糖新生基質（例えば、ピルビン酸）である。一部の実施形態において、第１のエネルギー源は、解糖系エネルギー源（例えば、グルコース）である。一部の実施形態において、本キットは、第１の溶液と第２の溶液との両方を含み、ここで、例えば、第１のエネルギー源がグルコースであり、及び第２のエネルギー源がピルビン酸である。一部の実施形態において、本キットは、第１の溶液と第２の溶液との両方を含み、ここで、例えば、第１のエネルギー源がピルビン酸であり、及び第２のエネルギー源がグルコースである。一部の実施形態において、解糖系エネルギー源は、例えば、約１００ｍＭ〜１Ｍ、２００〜９００ｍＭ、３００〜８００ｍＭ、４００〜６００ｍＭ又は５００ｍＭ、例えば少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍＭ又は１Ｍの濃度のグルコースである。一部の実施形態において、糖新生基質は、例えば、約１０〜５０ｍＭ、１５〜４５ｍＭ、２０〜４０ｍＭ又は２５〜３５ｍＭの濃度のピルビン酸である。一部の実施形態において、ピルビン酸は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ｍＭ、例えば約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０ｍＭの濃度である。一部の実施形態において、ピルビン酸は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍＭの濃度である。
【０３３７】
一部の実施形態において、本キットは、マイクロ流体デバイス、密度勾配溶液又は精子単離マトリックスなど、精子を濃縮又は単離する手段を更に含む。一部の実施形態において、精子単離マトリックスは、シラン化シリカであり、任意選択で、シラン化シリカは、いかなる解糖系エネルギー源又は糖新生基質も実質的に含まない培地中にある。一部の実施形態において、精子増強用エネルギー枯渇組成物は、シラン化シリカを含む。一部の実施形態において、シラン化シリカは、適切な希釈剤、例えば栄養素不含合成ヒト卵管液に懸濁される。
【０３３８】
一部の実施形態において、本キットは、本明細書に開示される方法の実行に関する説明書を含む。本キットは、洗浄用培地、保存培地、培養培地（例えば、ＨＴＦ）、希釈剤なども含み得る。本キットには、必要に応じてアジュバント、試薬及び緩衝剤が更に含まれ得る。必要に応じて、他の添加剤（例えば、アミノ酸（例えば、グルタミン酸）又はフリーラジカル捕捉剤）が存在し得る。更に、ホルモン又は他のタンパク質が加えられ得る。かかるホルモン及びタンパク質としては、黄体形成ホルモン、エストロゲン、プロゲステロン、卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、成長因子、卵胞液及びオビダクチン、アルブミン及びアミノ酸が挙げられる。典型的には、グリセロールは、３％〜１５％で添加され、当技術分野において公知の方法により他の好適な濃度を容易に決定し得る。他の薬剤は、典型的には約０．１％〜５％の範囲の濃度で添加される。脱脂乳、ゼラチン、カゼイン又はオビダクチンなどのタンパク質も添加され得る。
【０３３９】
本発明に従う他のキットには、例えば、１つ以上の（１つ、２つ又は３つ全ての）試薬中に抗生物質を含まなくてもよいもの（又はゲンタマイシン以外の抗生物質を提供する）及び／又はフェノールレッドを含んでも又は含まなくてもよいものが含まれる。全体として本開示によって記載されるパラメータに従って成分を置き換えるキットが本発明の一部であることは、容易に理解されるであろう。実質的に同様のキットが具体的に想定され、ここで、「実質的に同様」のキットは、成分の１つ以上（即ち１、２、３、４、５、６、７、８つ又は該当する場合には９つの成分）が、これらの詳細な実施形態に記載されるモル濃度と最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５％異なるものを包含する。液体溶液（例えば、精製水を含むもの、例えばＨＣｌ及び／又はＮａＯＨによるｐＨの調整を伴う）及び凍結乾燥組成物の両方がこれらの詳細な例示に包含される。
【０３４０】
本キットは、バイアル、チューブなどの１つ以上の容器を受け入れるように区切られている運搬手段、包装又は容器も含むことができ、１つ又は複数の容器の各々は、本明細書に記載される方法で使用されることになる精子増強組成物、第１のエネルギー源を含む第２の組成物及び第２のエネルギー源を含む第３の組成物など、別個の要素の１つを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ及び試験管が挙げられる。こうした容器は、ガラス又はプラスチックなど、種々の材料で形成され得る。本明細書に提供される製品は、包装材料を含む。医薬品包装材料の例としては、限定はされないが、ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル及び本明細書に開示される方法における使用に好適な任意の包装材料が挙げられる。キットは、典型的には、内容物を掲載したラベル及び／又は使用説明書並びに使用説明書に伴う添付文書を含む。説明書一式も含まれ得る。
【０３４１】
本明細書に開示されるキットは、限定はされないが、ＩＶＦ及びＩＵＩのための精子の処理を含め、種々の適用に有用であり得る。本開示のキットは、本明細書に開示される方法の実施に有用である。本明細書では、精子増強用エネルギー枯渇組成物、例えば栄養素不含合成ＨＴＦを含むキットが開示される。一部の実施形態において、本開示のキットは、栄養素不含合成ＨＴＦに希釈されたシラン被覆シリカを含む。かかるキットは、例えば、密度勾配法又はスイムアップ法により精子を精子試料と分離する処理に有用であり得る。本開示のキットは、精子増強用エネルギー枯渇組成物（例えば、栄養素不含合成ＨＴＦを含む）と、第１のエネルギー源（例えば、グルコース）を含む第２の組成物とを含む。かかるキットの１つの例示的な使用は、ＩＵＩのための精子の調製である。密度勾配法又はスイムアップ法により分離された精子は、精子増強用エネルギー枯渇組成物、例えば栄養素不含合成ＨＴＦを使用して洗浄するか又は希釈することができる。精子増強用エネルギー枯渇組成物と共に好適な時間にわたってインキュベートした精子に有効量の第１のエネルギー源（例えば、糖新生基質又は解糖系エネルギー源）を提供してＩＵＩのための精子を調製することができる。一部の実施形態では、精子増強用エネルギー枯渇組成物と共に好適な時間にわたってインキュベートした精子に有効量の第１のエネルギー源、例えばピルビン酸又はその塩などの糖新生基質を提供してＩＵＩのための精子を調製することができる。他の実施形態では、第１のエネルギー源を含む第２の組成物に加えて、本明細書に開示されるキットは、第２のエネルギー源を含む第３の組成物を含む第３の容器を含む第３の容器を含むことができる。一部の実施形態において、第１のエネルギー源は、糖新生基質（例えば、ピルビン酸）であり、及び第２のエネルギー源は、解糖系エネルギー源（例えば、グルコース）である。他の実施形態において、第１のエネルギー源は、解糖系エネルギー源（例えば、グルコース）であり、及び第２のエネルギー源は、糖新生基質（例えば、ピルビン酸）である。かかるキットは、例えば、ＩＶＦに有用であり得る。精子増強用エネルギー枯渇組成物（例えば、栄養素不含合成ＨＴＦを含む）と共に好適な時間にわたってインキュベートした精子に更に有効量の第１のエネルギー源を提供し、逐次的に又は同時に有効量の第２のエネルギー源を提供して、ＩＶＦのための精子を調製することができる。
【０３４２】
キットの成分は、解糖系エネルギー源（例えば、グルコース）又は糖新生基質（例えば、ピルビン酸）を含有しない栄養素不含合成ＨＴＦ中での精子の初期インキュベーションを提供し、次に後に解糖系エネルギー源又は糖新生基質が同時に又は逐次的に添加されることにより、精子機能が改善されることになる。糖新生基質とは、糖新生過程に用いられる非炭水化物炭素源を意味する。糖新生基質は、糖新生経路の基質としての役割を果たし、更に糖新生を促進する役割を果たす。本開示のキットにおける使用に好適な糖新生基質としては、限定はされないが、ピルビン酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、グリセロール、アセチルＣｏＡ、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、オキサロ酢酸又は糖新生基質の生理学的に許容可能な誘導体、塩、エステル、ポリマー若しくはα−ケト類似体が挙げられる。任意の糖新生アミノ酸又はその生理学的に許容可能な誘導体、塩、エステル、若しくはポリマー、若しくはα−ケト類似体も糖新生基質として好適である。糖新生アミノ酸の非限定的な例としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、シスチン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、メチオニン、プロリン、セリン、スレオニン及びバリンが挙げられる。ピルビン酸の薬学的に許容可能な塩の非限定的な例は、ピルビン酸リチウム、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸カリウム、ピルビン酸マグネシウム、ピルビン酸カルシウム及びピルビン酸亜鉛である。一部の実施形態において、ピルビン酸は、ピルビン酸ナトリウムである。乳酸の塩の非限定的な例としては、乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸マグネシウム、乳酸カルシウム、乳酸亜鉛及び乳酸マンガンが挙げられる。キットのピルビン酸成分は、上記に挙げた任意の他の糖新生基質に置き換えることができる。
【０３４３】
解糖系エネルギー源には、解糖の炭素源が含まれる。解糖系エネルギー源の非限定的な例としては、単糖類（フルクトース、グルコース、ガラクトース及びマンノースなど）及び二糖類（スクロース、ラクトース、マルトース及びトレハロース）並びに多糖類、ガラクトース、オリゴ糖類、そのポリマーが挙げられる。キットのグルコース成分は、上記に挙げた任意の他の解糖系エネルギー源に置き換えることができる。
【０３４４】
一部の実施形態において、本キットは、追加的な成分を含み、例えば少なくとも第１のエネルギー源又は第２のエネルギー源と組み合わせて、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ＋、クエン酸、ＡＭＰ、ＡＤＰ又はこれらの組み合わせなど、解糖系の上流及び下流の他の成分が添加される。
【０３４５】
生理学的に許容可能とは、精子、卵母細胞又は胚にとって無毒であり、加えて体外及び体内でのハンドリング及び操作時にその機能及び生存を改善するものを意味すると理解される。
【０３４６】
本キットの精子増強用エネルギー枯渇組成物の非限定的な使用としては、例えば、スイムアップ法を用いた精子の単離への使用、希釈剤としての使用、例えば密度勾配のためのシラン被覆シリカの希釈への使用及び精子の洗浄への使用が挙げられる。精子試料は、例えば、精子増強用エネルギー枯渇組成物での分離又は洗浄により処理することができ、次に不妊症検査及び精子毒性検査を含めた種々の診断又は研究プロトコルにおいて使用することができる。不妊症検査の例としては、精子運動能、生存精子率、精子数、膜機能、侵入率及び体外受精率の検査が挙げられる。詳細な精子細胞型及び詳細な診断又は研究適のために好適である、当技術分野で利用可能なプロトコルが用いられ得る。一部の実施形態において、精子を精子増強用エネルギー枯渇組成物と共にインキュベートすると、精子が増強される。一部の実施形態において、増強された精子に有効量の第１のエネルギー源を提供すると、精子機能が向上し、ＩＵＩのための精子が調製される。一部の実施形態において、増強された精子に有効量の第１のエネルギー源を提供し、同時に又は逐次的に有効量の第２のエネルギー源を提供すると、精子機能が向上し、ＩＶＦのための精子が調製される。
【０３４７】
一部の実施形態において、本キットの組成物及び溶液は、プレフィルドチューブに所定の容積で提供される。この製品は、特定の適用向けのディスペンサー内の溶液中にも提供され得る。一実施形態では、遠心管が提供される。本キットは、冷蔵下又は室温下で貯蔵され得る。
【０３４８】
一部の実施形態において、本明細書に記載されるキットは、本発明により提供される保存培地を含む。本発明により提供されるキットは、本発明の方法（例えば、向上した精子機能を誘導する、受精を増進させる、改善された適応度を有する子孫を作製する等）であって、一部の実施形態では、本発明により提供される様々なキットを使用して実施することができ、従って特定の実施形態では、本発明により提供される精子調製液が作製されることになる方法の実施に有用であり、且つ／又は生殖補助方法を含めた受精方法など、本発明により提供される更なる方法において有用である。一部の実施形態において、本明細書に提供されるキットは、本開示の精子調製液の作成に有用である。
【実施例】
【０３４９】
以下の具体的な例を用いて本開示を更に詳細に説明する。以下の例は、例示を目的として提供され、いかなる方法によっても本発明を限定するように意図するものではない。当業者は、本発明にかかる代替的実施形態をもたらすために変更又は修正することのできる種々の決定的でないパラメータを容易に認識するであろう。本明細書に挙げる全ての特許、特許出願及び刊行物は、全体として参照により本明細書に援用される。
【０３５０】
実施例１：材料及び方法
培地
ヒト精子受精能獲得のための培地は、５％ＣＯ２で平衡化した、９７．８ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．３７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、２５．１ｍＭ  ＮａＨＣＯ３−、０．３３ｍＭピルビン酸Ｎａ、２．７８ｍＭグルコース、乳酸２１．４ｍＭ及び５ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン及びフェノールレッド０．０００６％を含有するｐＨ７．４のヒト卵管液（完全ＨＴＦ又はＣ−ＨＴＦ）培地であった。精子飢餓処理については、上記のＨＴＦ培地からグルコース、乳酸及びピルビン酸を除いた（Ｆ−ＨＴＦ、供試培地）。
【０３５１】
精液試料
精液試料は、健常男性又は不妊症の治療を求める男性から滅菌容器内への自慰によって入手した。射精液は本実験の処理に先立ち最長２時間にわたって液状化した。液状化後、射精液の容積をＦ−ＨＴＦ（供試）条件又はＣ−ＨＴＦ（対照条件）の処理のために等分した。精液試料を密度勾配遠心法又は直接的スイムアップ法のいずれかにより処理して生存精子細胞を収集した。
【０３５２】
精子処理
密度勾配遠心法
液状化後、各射精液の全容積を２つの異なる勾配条件に等分した。供試試料は、リン酸緩衝生理食塩水中４５〜９０％パーコール（Ｓｉｇｍａ、Ｐ−１６４４））勾配を用いて調製した。対照試料は、ヒト卵管液中のＩｓｏｌａｔｅ勾配（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ；９９２６４）を用いて調製した。両方の試料とも５００×ｇで２０分間遠心した。遠心後、上清を除去し、ペレットを１０ｍｌ培地で洗浄した。供試試料は、Ｆ−ＨＴＦで洗浄し、対照試料は、Ｃ−ＨＴＦで洗浄した。
【０３５３】
精子スイムアップ法
液状化後、先述のとおり各射精液の全容積を供試試料と対照試料とに分割した。供試試料を２．５ｍｌのＦ−ＨＴＦと穏やかに層状にした。対照試料は、Ｃ−ＨＴＦ培地と層状にした。チューブを４５°の角度に慎重に傾け、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。上清を慎重に収集してＦ−ＨＴＦで洗浄し、対照試料は、Ｃ−ＨＴＦで洗浄した。
【０３５４】
精子運動能の分析
供試精子及び対照精子の精子懸濁液（６μｌ）を１つの事前に温めたチャンバースライド（深さ、２０μｍ）（Ｌｅｊａスライド、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードし、３７℃で顕微鏡ステージに置いた。ＣＥＲＯＳ  ＩＩコンピュータ支援精液分析（ＣＡＳＡ）システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｔｈｏｒｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用して精子運動能を調べた。以下の設定を用いて１秒間の軌道を捕捉した：毎秒６０フレーム、６０フレーム取得、最低コントラスト＝８０、最小サイズ＝３ピクセル、デフォルト細胞サイズ＝６ピクセル、デフォルト細胞強度＝１６０、遅い細胞を運動能があるものとしてカウントする、低ＶＡＰカットオフ＝１０μｍ／ｓ、低ＶＳＬカットオフ＝０μｍ／ｓ、最小強度ゲート＝０．１８、最大強度ゲート＝１．２１、最小サイズゲート＝０．５６ピクセル、最大サイズゲート＝２．６３ピクセル、最小延長ゲート＝０ピクセル及び最大延長ゲート＝９９ピクセル。ＣＡＳＡｎｏｖａパラメータを用いて生データを選別し、分析した（Ｇｏｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８、前掲）。各実験において、最低でも５００個の精子に対応する少なくとも２０個の顕微鏡視野を分析した。
【０３５５】
実施例２：実験結果
本例は、栄養素枯渇後にエネルギー源を順次再導入すると精子の超活性化が向上することを示す。
【０３５６】
図１に示されるとおり、グルコース、ピルビン酸及び乳酸不含培地で精子を３時間インキュベートしたところ、運動能が低下した。異なるエネルギー基質で精子運動能のレスキューを試験した。精子を３時間飢餓状態に置き、完全ＨＴＦでレスキューしたとき、対照処理と比較して精子超活性化及び中間運動能が上昇した（図２）。対照的に、グルコース（５ｍＭ）又はピルビン酸（０．３３ｍＭ）単独で処理した精子は、対照と比較して精子超活性化が改善しなかった（図２）。ピルビン酸単独の再導入は、飢餓状態からの精子運動能に何ら影響を与えなかったが、しかしながら、グルコース単独の再導入は、運動能を対照レベルまで回復させたことから（図２）、グルコースが精子超活性化に必要な主要なエネルギー源であることが示唆される。意外にも、グルコース処理した精子にピルビン酸を添加したとき又はピルビン酸処理した精子にグルコースを添加したとき、それが対照条件又はピルビン酸及びグルコースの両方を同時に精子に再導入したときと比べて超活性化運動能の有意な上昇を引き起こした。
【０３５７】
実施例３：活性化の亢進
Ｃ−ＨＴＦの容量オスモル濃度は、約２９０ｍＯｓｍであり、ここで、Ｆ−ＨＴＦは、約２４３ｍＯｓｍである。低張条件が精子にストレスを与え、従って元に戻したときに精子運動能及び機能の上昇が引き起こされることを明らかにするため、トレハロース、デキストラン又は他の長鎖糖など、精子によって効率的に代謝されない炭素源の存在下において、低張性、等張性又は高張性の異なる条件で精子をインキュベートし、低張条件でのインキュベーション時及び等張条件に戻した後の運動能に与える影響をＣＡＳＡ分析によって観察する。これには、増強段階中にカルシウム、ナトリウム及びカリウムなどの様々なイオンの濃度を調整すること、Ｃ−ＨＴＦに戻した後の運動能を判定することが含まれる。加えて、増強段階及びレスキュー段階の両方中にカルシウム、ナトリウム及びカリウムなどのイオンの濃度が増加又は低下する影響について、自然妊娠中に女性生殖路で起こるイオン周期を模倣するためのイオンの段階的添加と同じく試験する。運動能に加えて、カルシウムイオン流束を評価する。これらの操作は、単独でも又は記載されるグルコース及びピルビン酸の操作と併せても、超活性又は中間運動能を実現する精子の割合を亢進させる。
【０３５８】
ヒト精子は、これらの処理の飢餓段階で運動能の低下を呈するが、精子が完全に動きを停止することはなく、細胞がグリコーゲンなどの内部エネルギー源を利用しているか、又は脂質、タンパク質若しくはＲＮＡなどの細胞成分を分解していることが示唆される。飢餓段階に曝露された精子について、全脂質含量、ＲＮＡ含量及びタンパク質含量を評価する。精子運動能状態に関連する細胞内変化を明らかにするため、飢餓段階後、第１のエネルギー源の添加後及び第２のエネルギー源の添加後にプロテオミクス、メタボロミクス及びリピドミクス分析を実施する。実施例２に示すとおり対照条件で処理した精子及び試験条件で処理した精子中の全ＲＮＡ（ｍＲＮＡ又はマイクロＲＮＡなどの低分子非コードＲＮＡなど、ある種の細画分を含む）を測定する。この分析の結果は、精子によってＲＮＡがエネルギー源として用いられていることを示すものとなる。
【０３５９】
栄養素枯渇及び再導入は、精子適応度及び／又は子孫の健康及び適応度を改善する方式で精子のＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質のメチル化及びアセチル化パターンも変化させ得る。ＤＮＡメチル化分析は、バルク細胞又は単一細胞のいずれかの精子からのＤＮＡのバイサルファイトシーケンシングによって実施することができる。栄養枯渇後及び各栄養素再導入後の精子ＤＮＡメチル化の変化を評価することになる。
【０３６０】
解糖の上流炭素源（グルコース、マンノース、フルクトース、デキストロース又はスクロースなど）及び下流代謝産物（ピルビン酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸など）を段階的に導入すると、ＡＭＰからＡＴＰへの変換速度が変化し、そのため、同時の添加と比較して精子運動能及び機能が改善される。飢餓後、第１のエネルギー源の導入後及び第２のエネルギー源の導入後に精子中のＡＴＰ及びＡＭＰレベルを測定する。飢餓後に栄養素を段階的に導入すると、ＡＭＰからＡＴＰへの変換が向上する。
【０３６１】
実施例４
本例は、エネルギー源を段階的に再導入すると精子が活性化することの追加的なエビデンスを提供する。
【０３６２】
不妊治療クリニックから、不妊症の治療を求める男性の精子試料を入手した。これらの試料には、正常な受精能の精子及び低受精能の精子が含まれた。精子の質を改善するため、試料を実施例１に記載されるとおり密度勾配遠心法によって調製した。液状化後、各射精液の全容積を等分し、２つの異なる密度勾配条件に供した。供試試料は、最終的なｐＨが７．４である、栄養素を欠いているリン酸緩衝生理食塩水溶液中に希釈した４５〜９０％パーコール（Ｓｉｇｍａ、Ｐ−１６４４）勾配を用いて調製した（Ｆ−ＰＥＲＣＯＬＬ）。対照試料は、最終的なｐＨが７．４である、（乳酸、グルコース及びピルビン酸）などの栄養素を含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液中に希釈した４５〜９０％パーコール勾配を用いて調製した（Ｃ−ＰＥＲＣＯＬＬ）。両方の試料とも５００×ｇで２０分間遠心した。遠心後、上清を除去し、ペレットを１０ｍｌ培地で洗浄した。供試試料は、Ｆ−ＨＴＦで洗浄し、対照試料は、Ｃ−ＨＴＦで洗浄した。
【０３６３】
試料を実施例１に記載されるとおりＣ−ＨＴＦ培地で処理するか、又は栄養素不含培地中の密度勾配によって分離し、Ｆ−ＨＴＦで洗浄した。Ｆ−ＨＴＦによる精子、Ａ）Ｆ−ＨＴＦ中で１時間のインキュベーション、続いてグルコース（５ｍＭ）、ピルビン酸（０．３３ｍＭ）及び乳酸を添加して１時間１５分のインキュベーション、Ｂ）Ｆ−ＨＴＦ中で１時間のインキュベーション、１時間のピルビン酸添加、次に１５分間のグルコース添加、又はＣ）Ｆ−ＨＴＦ中で１時間のインキュベーション、１時間のグルコース添加、次に１５分間のピルビン酸添加。試料を実施例１に概説するとおりＣＡＳＡによって分析した。結果は、図５Ａ及び図５Ｂ並びに図６Ａ及び図６Ｂに示す。各試験条件により、対照と比べて中間及び超活性運動能を有する精子の数が増加し、処理Ｂ及びＣで最も高い活性化レベルが観察された。
【０３６４】
飢餓状態を高速化するため、精子を栄養素不含培地中での密度勾配により分離し、１０ｍｌ  Ｆ−ＨＴＦで洗浄した。図３に描かれるとおり、Ｆ−ＨＴＦ中で１時間インキュベートした後、図１で見られたとおりの運動能の低下と同様の運動能の低下があった精子をピルビン酸（０．３３ｍＭ）又はグルコース（５ｍＭ）のいずれかで１時間プライミングし、次に（Ｂ）グルコース（５ｍＭ）又は（Ｃ）ピルビン酸（０．３３ｍＭ）のいずれかで１５分間レスキューした。図２に示される結果と同様に、この高速／飢餓プロトコルも、図５に示される精子運動能パラメータを有意に改善した。
【０３６５】
実施例５
本例は、ＩＵＩを受けるヒト対象の受精能を改善するための本発明の特定の実施形態により処理した精子の使用について記載する。
【０３６６】
対象は、反復性の妊娠損失歴のない成人女性（例えば、１８〜３５歳）であり、過去にＩＵＩを試みたことがあっても又はなくてもよい。対象を標準的な医療（例えば、クロミッド製剤、適応があればＨｃｇ誘発注射を伴う）で治療し、Ｃ−ＨＴＦ又はＦ−ＨＴＦのいずれかで精液を希釈及び遠心し、細胞をＣ−ＨＴＦ又はＦ−ＨＴＦのいずれかに収集及び再懸濁することにより調製した精子のＩＵＩを受けるように無作為に割り付ける。代わりに、精子は、密度勾配遠心法と、Ｃ−ＨＴＦ又はＦ−ＨＴＦによる細胞の洗浄及び再懸濁とによって収集することができる。精子は、Ｆ−ＨＴＦで（例えば、１時間）処理し、次にピルビン酸又はグルコースのいずれかを添加し、精子を（例えば、１時間）インキュベートし、次にその精子を、女性を授精させるために使用する。精子は、Ｃ−ＨＴＦで（例えば、２時間）処理し、次にその精子を、女性を授精させるために使用する。定期的フォローアップで妊娠をモニタする。グルコース（例えば、５ｍＭ）又はピルビン酸（例えば、０．３３ｍＭ）の非存在下でインキュベートし、続いてグルコース又はピルビン酸を段階的に添加した精子を受け取った女性は、改善した受精能、例えば向上した妊娠率、胎児心拍数（例えば、７週時点での）、妊娠の継続（例えば、１０週時点での）及び／又は生児出生率のパラメータを呈するものと予想される。
【０３６７】
実施例６
本例は、ＩＶＦを受けるヒト対象の受精能を改善するための本発明の特定の実施形態により処理した精子の使用について記載する。
【０３６８】
対象は、反復性の妊娠損失歴のない成人女性（例えば、１８〜３７歳）であり、過去にＩＶＦを試みたことがあっても又はなくてもよい。対象を標準的な医療（例えば、排卵抑制と、続く排卵刺激、適応があればヒト絨毛性ゴナドトロピン誘発注射とを伴う）で治療した後、採卵する。採卵時、対象の卵子は、対照条件又は治療条件を用いて処理した精子による授精に無作為に割り付ける。対照群では、精子を密度勾配遠心法によって収集し、精子洗浄培地、Ｃ−ＨＴＦ又は受精培地のいずれかに再懸濁する。市販の受精培地の非限定的な例としては、Ｇｌｏｂａｌ  Ｔｏｔａｌ  ｆｏｒ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ（Ｏｒｉｇｉｏ）、Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（登録商標）−ＮＸ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｉｒｖｉｎｅ）、Ｓｙｄｎｅｙ  ＩＶＦ受精培地（Ｃｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｐｅｒｍ  Ｗａｓｈ（Ｉｒｖｉｎｅ）が挙げられる。治療群では、精子を密度勾配遠心法によって収集し、精子を増強させるのに十分なインキュベーション時間（例えば、１時間）にわたってＦ−ＨＴＦで洗浄及び再懸濁する。このインキュベーション後、ピルビン酸（０．３３ｍＭ）又はグルコース（５ｍＭ）のいずれかを添加し、精子を（例えば、１時間）インキュベートする。このインキュベーション後、グルコース（５ｍＭ）又はピルビン酸（０．３３ｍＭ）のいずれか（最初のステップで添加しなかった方）を添加し、精子を（例えば、少なくとも１５分間）インキュベートする。治療群及び対照群のいずれでも、精子は、卵子と体外でインキュベートし、受精率及び胚の発育をモニタすることになる。胚（例えば、５日目における）を女性に移植することになり、血液検査によって（例えば、２週間後に）妊娠を判定することになる。定期的フォローアップで妊娠をモニタする。グルコース及びピルビン酸の非存在下でインキュベートした後、続いてグルコース及びピルビン酸を段階的に添加した精子で発生された胚は、改善した受精能パラメータ、例えば向上した受精率、胚盤胞発育を呈するものと予想される。グルコース及びピルビン酸の非存在下でインキュベートした後、続いてグルコース及びピルビン酸を段階的に添加した精子で発生された胚を受け取った女性は、向上した妊娠率、胎児心拍数（例えば、７週時点での）、妊娠継続（例えば、１０週時点での）及び／又は生児出生率を呈するものと予想される。
【０３６９】
実施例７  キット
本明細書に開示されるキットは、栄養素不含ｓＨＴＦ中の２つの栄養素を順序付けることによってＩＵＩ又はＩＶＦのための精子を調製するものであり、結果として中間及び超活性運動能を呈する精子の比率が向上する。キットの成分は、グルコース又はピルビン酸を含有しない栄養素不含合成ＨＴＦ中での精子の初期インキュベーションを提供し、次に後にグルコース及びピルビン酸が逐次的に添加される。この飢餓−再栄養方法により、標準的な精子調製液と比較してより高い比率の中間精子及び超活性化精子が生じる（図１０）。
【０３７０】
低受精能系統のマウスの精巣上体から単離した精子を、グルコース又はピルビン酸を含有しない栄養素不含合成ＨＴＦ中でインキュベートし、次に後にグルコース及びピルビン酸を逐次的に提供すると、超活性運動能を呈する精子の比率が向上し、続いて受精率、胚盤胞への発育及び生児出生率が向上した（図１１）。マウス精子又はヒト精子においてこの栄養素の順序付けの結果としての異常な運動能表現型は、認められず、マウスにおいて胚発育又は子の異常も認められなかった。結果及び精子運動能と受精との既知の関連性に基づき、本明細書に開示されるキットの使用により、ＩＶＦ及びＩＵＩを受けているカップルについて妊娠及び生児出生の確率を向上させることができる。
【０３７１】
本明細書に記載されるキットは、ＩＶＦ及びＩＵＩのための精子の処理及び調製に有用である。本キットは、別個のキットとして管理され得るか又は組み合わされ得る。例えば、密度勾配分離用キットは、ＩＶＦ用キット又はＩＵＩ用キットと分けられ得るか、又は密度勾配分離用キットは、ＩＶＦ又はＩＵＩ用キットと組み合わされ得る。かかる組み合わされたキットの実施形態において、ＩＶＦ用キットは、別個のキットからの成分、即ち密度勾配分離のための成分及びＩＶＦのための成分を含み得る。密度勾配のためのキットは、密度勾配法によって射精液から精子を分離するプロセスで使用される。ＩＶＦ用キットは、栄養素不含ｓＨＴＦからなる。この試薬は、ＩＶＦにおける受精ステップのための精子を調製するための精子の洗浄に有用であり、精子分離において、（１）スイムアップ法による運動生存精子の単離、又は（２）密度勾配分離用キットの試薬の希釈のいずれかに使用することができる。密度勾配分離用キットは、栄養素不含ｓＨＴＦ中のシラン被覆シリカを含む。
【０３７２】
ＩＵＩ用キットは、栄養素不含ｓＨＴＦを含む。この成分は、精子の洗浄、ＩＵＩ手技のための精子の保持に用いることができ、ＩＶＦと同じく、精子分離において、（１）スイムアップ法による運動生存精子の単離、又は（２）キットの密度勾配成分の希釈のいずれかに使用することができる。キットの密度勾配試薬は、栄養素不含ｓＨＴＦ中のシラン被覆シリカであり得る。キットの例示的組成を以下の表１〜表５に提供する。これらの表は、個々の試薬の例示的成分及びその濃度を提供する。
【０３７３】
【表１】
2021529554.tif 000003
【０３７４】
【表２】
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【０３７５】
【表３】
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【０３７６】
【表４】
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【０３７７】
【表５】
2021529554.tif 000007
【０３７８】
キットの成分は、解糖系エネルギー源（例えば、グルコース）又は糖新生基質（例えば、ピルビン酸）を含有しない栄養素不含合成ＨＴＦ中での精子の初期インキュベーションを提供し、次に後に解糖系エネルギー源又は糖新生基質が同時に又は逐次的に添加されることにより、精子機能が改善されることになる。糖新生基質とは、糖新生過程に用いられる非炭水化物炭素源を意味する。糖新生基質は、糖新生経路の基質としての役割を果たし、更に糖新生を促進する役割を果たす。本開示のキットにおける使用に好適な糖新生基質としては、限定はされないが、ピルビン酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、グリセロール、アセチルＣｏＡ、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、オキサロ酢酸又は糖新生基質の生理学的に許容可能な誘導体、塩、エステル、ポリマー若しくはα−ケト類似体が挙げられる。任意の糖新生アミノ酸又はその生理学的に許容可能な誘導体、塩、エステル、若しくはポリマー、若しくはα−ケト類似体も糖新生基質として好適である。糖新生アミノ酸の非限定的な例としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、シスチン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、メチオニン、プロリン、セリン、スレオニン及びバリンが挙げられる。ピルビン酸の薬学的に許容可能な塩の非限定的な例は、ピルビン酸リチウム、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸カリウム、ピルビン酸マグネシウム、ピルビン酸カルシウム及びピルビン酸亜鉛である。一部の実施形態において、ピルビン酸は、ピルビン酸ナトリウムである。乳酸の塩の非限定的な例としては、乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸マグネシウム、乳酸カルシウム、乳酸亜鉛及び乳酸マンガンが挙げられる。キットのピルビン酸成分は、上記に挙げた任意の他の糖新生基質に置き換えることができる。
【０３７９】
解糖系エネルギー源には、解糖の炭素源が含まれる。解糖系エネルギー源の非限定的な例としては、単糖類（フルクトース、グルコース、ガラクトース及びマンノースなど）及び二糖類（スクロース、ラクトース、マルトース及びトレハロース）並びに多糖類、ガラクトース、オリゴ糖類、そのポリマーが挙げられる。キットのグルコース成分は、上記に挙げた任意の他の解糖系エネルギー源に置き換えることができる。
【０３８０】
一部の実施形態において、本キットは、追加的な成分を含み、例えば少なくとも第１のエネルギー源又は第２のエネルギー源と組み合わせて、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ＋、クエン酸、ＡＭＰ、ＡＤＰ又はこれらの組み合わせなど、解糖系の上流及び下流の他の成分が添加される。
【０３８１】
生理学的に許容可能とは、精子、卵母細胞又は胚にとって無毒であり、加えて体外及び体内でのハンドリング及び操作時にその機能及び生存を改善するものを意味すると理解される。
【０３８２】
実施例８  密度勾配用キット
密度勾配用キットは、密度勾配遠心法を用いて運動精子を射精液と分離するのに有用である。これは、密度勾配試薬、即ち栄養素不含ｓＨＴＦ中のシラン化シリカの懸濁液で構成される。密度勾配分離用キットは、２つ以上の濃度のシラン化シリカを含み、これは、例えば、特にＩＶＦクリニックの技師の中での使用者の好みに基づいて提供される。加えて、ＩＶＦ用キット及びＩＵＩ用キットの栄養素不含ｓＨＴＦ成分は密度勾配試薬の希釈に使用することができるため、使用者は、シラン化シリカの濃度をカスタマイズ可能である。
【０３８３】
密度勾配用キットは、使用説明書も含み、これは、現行の密度勾配による臨床業務を映し出すものとなり得る。一般には、精液試料を密度勾配の表面に加え、遠心する。チューブの底にあるペレットからピペットで運動精子を収集する。従って、試料は、随時洗浄できる状態になる。
【０３８４】
密度勾配試薬は、後に精子洗浄中にＩＶＦ用キット又はＩＵＩ用キットから添加されることになる栄養素を欠いている。
【０３８５】
密度勾配用キットは、ＩＶＦ用キット及びＩＵＩ用キットの使用者に好都合となるように、栄養素を含まず設計される。栄養素不含密度勾配がなかったならば、技師は、ＩＶＦ用キット及びＩＵＩ用キットを用いて提供される栄養素の段階的導入のための精子を調製するのに精子をより多くの回数にわたって洗浄しなければならず、より多くの時間及びリソースが費やされることになる。密度勾配試薬は、約７．４のｐＨを有する。
【０３８６】
実施例９  ＩＶＦ用キット
ＩＶＦ用キットは、精子の洗浄、スイムアップ法による運動生存精子の単離及び密度勾配試薬の希釈に有用である。本キットは、ＩＶＦにおける受精ステップのための精子を調製する。ＩＶＦ用キットには、３つの試薬：栄養素不含ｓＨＴＦ並びにピルビン酸及びグルコースの濃縮溶液が入っている（表１〜表５）。本キットは、使用説明書も含む。使用説明書は、洗浄ステップの実行に関する説明書を含み、またピルビン酸及びグルコースの時限式逐次添加に関する説明書も含む。本キットの一般的な使用を以下に説明する。
【０３８７】
精子分離：スイムアップ法
多くのクリニックでは、分離方法としてスイムアップ法よりも密度勾配遠心法が好まれている。しかしながら、使用者の好みに対応するため、栄養素不含ｓＨＴＦ試薬がスイムアップ法による運動生存精子の単離に使用され得る（図１２）。初めに、少量の栄養素不含ｓＨＴＦの下に精液試料の層を重ねる。次に、精子が栄養素不含ｓＨＴＦ中に泳ぎ上がるのに十分な時間を与える。最後に、上部の栄養素不含ｓＨＴＦ層を収集し、遠心する。
【０３８８】
精子分離：密度勾配試薬の希釈
密度勾配試薬の希釈に使用する場合、栄養素不含ｓＨＴＦを密度勾配試薬に添加して所望の濃度を実現する。密度勾配培地中におけるシラン化シリカの好ましい濃度は、クリニック毎に異なり得る。このＩＶＦ用キットによれば、使用者は、その必要性に合わせて密度勾配試薬濃度をカスタマイズすることが可能である。
【０３８９】
精子の洗浄
精子分離後、ペレット化した精子を栄養素不含ｓＨＴＦで１回洗浄し、短時間インキュベートする。キットの説明書に詳述されるとおり、グルコースを添加し、精子をインキュベートする。次に、キットの説明書に詳述されるとおり、ピルビン酸を添加し、精子をインキュベートした後、最後に１回遠心する。試料は、卵母細胞とのコインキュベーションのため受精培地に再懸濁できる状態となる。
【０３９０】
ＩＶＦ用キットは、ＩＶＦにおける受精ステップのための精子を調製する。ＩＶＦ用キットは、栄養素の段階的導入を可能にする３つの試薬  −  栄養素不含ｓＨＴＦ、グルコース含有試薬及びピルビン酸含有試薬  −  を含む。グルコース及びピルビン酸は、事前に混合されるのでなく、むしろ逐次的に添加するものとして存在する。表２及び表５に、グルコースを含有する試薬の例示的組成を提供する。表２及び表４に、ピルビン酸を含有する試薬の例示的組成を提供する。
【０３９１】
実施例１０  ＩＵＩ用キット
ＩＵＩ用キットは、精子の洗浄、スイムアップ法による運動生存精子の単離、密度勾配試薬の希釈及びＩＵＩ手技のための精子の保持に使用される。ＩＵＩ用キットは、グルコースを含まないが、他の点ではＩＶＦ用キットと同じである。ＩＶＦ及びＩＵＩキットの使用説明書も概して同じであり、主な違いは、ＩＵＩ用キットの説明書がグルコースの添加ステップを含まない点である。説明書は、子宮内授精のための調製液の準備ができたところで終わる。グルコースは、ＩＶＦ用キットの栄養素不含ｓＨＴＦ−グルコース−ピルビン酸混合物中の最終グルコース濃度以上の濃度で子宮内に存在する。従って、調製された試料中の精子は、子宮内注入時に超活性化を誘導するのに十分なグルコースに曝露される。
【０３９２】
ＩＵＩ用キットは、２つの試薬  −  栄養素不含ｓＨＴＦ及びピルビン酸含有試薬  −  を含み、体外でのピルビン酸（別個の試薬として含まれる）及び天然でのグルコース（子宮内曝露を通して）の段階的導入を可能にする。ＩＵＩ用キットでは、グルコース及びピルビン酸は、最初に培地に存在しない。初期栄養素不含インキュベーション後にピルビン酸が添加される。グルコースは、エキソビボで添加されず、精子の子宮内授精時に提供される。これには、ピルビン酸への曝露によって引き起こされる精子超活性化が子宮内注入のタイミングと同期するという付加的な利益がある。表２及び表５に、グルコースを含有する試薬の例示的組成を提供する。表２及び表４に、ピルビン酸を含有する試薬の例示的組成を提供する。
【０３９３】
実施例１１  −  使用上の指示
密度勾配用キット
密度勾配用キットは、密度勾配遠心法を用いて運動精子を射精液と分離するのに有用である。これは、ＩＶＦ用キット又はＩＵＩ用キットと併せた使用が指示される。
【０３９４】
ＩＶＦ用キット
ＩＶＦ用キットは、精子の洗浄、スイムアップ法による運動生存精子の単離及び密度勾配分離用キット中の密度勾配試薬の希釈に有用である。
【０３９５】
本キットは、ＩＶＦにおける受精ステップのための精子を調製する。ＩＶＦ用キットを使用した精子の調製前に密度勾配遠心法を実施して精子を精液と分離するとき、密度勾配用キットを使用することができる。
【０３９６】
ＩＵＩ用キット
ＩＵＩ用キットは、精子の洗浄、スイムアップ法による運動生存精子の単離、密度勾配用キット中の密度勾配試薬の希釈及びＩＵＩ手技のための精子の保持に有用である。ＩＵＩ用キットを使用した精子の調製前に密度勾配遠心法を実施して精子を精液と分離するとき、密度勾配分離用キットを使用することができる。
【０３９７】
実施例１２  −  子孫の代謝適応度の改善
肥満については、２型糖尿病、心血管疾患、呼吸器疾患、関節炎及び癌を含めた多くのヒト疾患とのその関連性を理由として世界的に公衆衛生上の懸念が高まりつつある。ほとんどの肥満症例は、遺伝的素因と相まって、エネルギー摂取量とエネルギー消費量との釣り合いがとれないことによって生じる。古典的なリスク遺伝子の遺伝的継承に加えて、エピジェネティクスメッセージが精子に取り込まれ得る。本例は、本発明により提供される方法に供された精子が子孫の代謝適応度に及ぼす効果について明らかにする。
【０３９８】
食事性肥満モデルを使用して、肥満マウスからの精子の飢餓／レスキュー処理が受精能及び子孫体重に与える影響を試験する。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに通常の固形飼料又は高脂肪食を与える。精子を採取し、対照条件下において（Ｃ−ＨＴＦ、対照）又は実施例２に記載される飢餓／レスキュー手順後（Ｆ−ＨＴＦ、グルコース及びピルビン酸の段階的再導入を伴う、供試）、受精能を獲得させる。運動能、全ＲＮＡ（並びにマイクロＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡ）含量並びにＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質メチル化に関して対照条件と試験条件との間で精子を分析する。ＲＮＡｓｅｑを実施して、マイクロＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡなどのＲＮＡの変化を判定する。バイサルファイトシーケンシングを実施して、ＤＮＡメチル化の変化を判定する。対照条件及び試験条件からの精子を使用して体外受精を実施し、受精卵数、胚盤胞形成及び生児出生を判定する。最後に、各実験条件からの２細胞期胚に対してＲＮＡ  ｓｅｑ及びＤＮＡメチル化に関するバイサルファイトシーケンシングを実施する。加えて、各条件からの子孫の体重を１２ヵ月間モニタし、且つ定期的血液化学分析を行う。試験条件に供した精子は、対照と比較してＲＮＡレベル（マイクロＲＮＡを含む）の減少及び／又はＤＮＡメチル化の変化を示し、対応する子は、対照と比べて肥満の減少を示す。
【０３９９】
肥満又は過体重の男性から入手された精子に関して、栄養枯渇及び再導入がＲＮＡ含量並びにＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質のメチル化及びアセチル化に及ぼす効果を評価することになる。精子を単離し、対照条件又は飢餓／レスキュー手順（Ｆ−ＨＴＦ、グルコース及びピルビン酸の段階的再導入を伴う、供試）に曝露する。飢餓段階及び各栄養素の再導入後のＲＮＡ含量、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質メチル化及びアセチル化の変化に関して試料を分析することになる。
【０４００】
実施例１３  例示的保存培地
試料及び方法
精液試料及び精子調製液
本研究のために、あるコホートの任意抽出ドナーが精液試料を供給した。試料は、滅菌容器内への自慰によって産生され、射精から１時間以内に研究室に届けられた。密度勾配遠心法（Ｉｓｏｌａｔｅ、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により精液試料の分画を実現した。Ｔａｒｃｈａｌａ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．，５３ｒｄ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ；Ｐ−１１６，１９９８を参照されたい。３００×ｇで２０分間遠心した後、精漿画分及び低密度層を取り除き、生存能、運動能及び正常形態の割合が高い精子を主に含有する高密度画分を適切な貯蔵培地で２回洗浄した。
【０４０１】
精子の貯蔵
Ｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ．２０１１  Ｓｅｐ；８５（３）：５３６−４７）により記載されるとおり電解質不含培地（ＥＦＭ）を調製した。供試保存培地又は供試培地は、ｐＨが６．８に調整された滅菌細胞培養品質水中、０．３３Ｍグルコース、３％ウシ血清アルブミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンからなった。冷蔵培地（ＲＭ）は、ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｇ１２７２）含有ＴＹＢ（ＴＥＳトリス及び卵黄緩衝液）からなった。洗浄した精子試料を０．５〜１．０ｍＬの培地（ＥＦＭ、ＲＭ又は供試保存培地）に再懸濁し、冷却インキュベーター（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に４℃で貯蔵した。凍結保存については、試料を凍結用培地（グリセロール及びゲンタマイシン含有ＴＹＢ）（ＦＭ、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９０１２８）と共に混合し（１：１試料培地比）、４℃でゆっくりと（０．５℃／分）冷却し、次に製造者の推奨に従って液体窒素の気相中に凍結及び貯蔵した。
【０４０２】
コンピュータ支援精子運動能分析（ＣＡＳＡ）
Ｇｏｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ．２０１７  Ｎｏｖ  １；９７（５）：６９８−７０８）によって推奨されるプロトコルに従い、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＴｈｏｒｎｅからのＣＥＲＯＳ  ＩＩシステムで精液及び貯蔵精子試料のコンピュータ支援精子運動能分析（ＣＡＳＡ）を入手した。停止精子及び運動精子の相対的分布並びに曲線速度（ＶＣＬ）を少なくとも５００個の精子で決定した。精子は、ＣＡＳＡ前に、受精能獲得を誘導することが公知の条件、５ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミン、２５ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ７．３の変法ヒト卵管液（ｍＨＴＦ）において４時間回復させた。使い捨て２０μｍチャンバースライド（Ｌｅｊａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＳＣ  ２０−０１−０２−Ｂ）に６μｌの精子懸濁液をロードし、ＣＡＳＡのための映像を取得した（１秒、毎秒６０フレーム）。
【０４０３】
末端デオキシヌクレオチド転移酵素ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）
３×１０６細胞に対して、Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．２０１４  Ｍａｙ；２９（５）：９０４−１７）によって推奨されるプロトコルに従い、ＡＰＯ−ＤＩＲＥＣＴキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５６３８１）を使用してＤＮＡ断片化を測定した。ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で遊離３’−ＯＨ基の存在を測定した。
【０４０４】
脂質過酸化アッセイ
１×１０６細胞に対して、脂質過酸化センサＢＯＤＩＰＹ  Ｃ１１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄ３８６１）を使用して精子の過酸化損傷を評価した。ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターで陽性対照（８０ｕＭ硫酸第一鉄とインキュベートした試料）及び陰性対照（色素なし）と比べた蛍光発光ピークのシフトを測定した。
【０４０５】
データ処理
フローサイトメトリー生データは、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）で処理した。ＣＡＳＡ及びフローサイトメトリーデータは、統計的分析のためにＰｒｉｓｍ  ８（ＧｒａｐｈＰａｄ）にインポートした。
【０４０６】
結果
電解質不含培地（ＥＦＭ）、冷蔵培地（ＲＭ）又は供試保存培地に４℃で短期間貯蔵したときの複数のｎ人のドナーからのヒト精子の運動能を、ＣＡＳＡを用いて評価した。供試保存培地に７日間貯蔵した後、当初の精子運動能の最高８０％が保たれ、これは、ＥＦＭでの貯蔵（図１３Ａ、供試培地では７５％であるのに対して、ＥＦＭでは３５％）及びＲＭでの貯蔵（図１３Ｂ、供試培地では８０％であるのに対して、ＥＦＭでは６０％）と比べて大幅な改善に相当した。供試保存培地に１４日間貯蔵した後、当初の精子運動能の最高５０％が保たれた。
【０４０７】
供試保存培地での短期貯蔵は、精子ＤＮＡ損傷の防止の点で凍結保存と比べて遜色がない。新鮮なヒト精子試料を供試培地に４℃で７日間貯蔵するか、又はＩｒｖｉｎｅ凍結用培地に希釈して液体窒素中に凍結した。７日後、供試培地に保存した精子及び凍結保存精子の運動能パラメータ（ＣＡＳＡにより評価した）に有意な差はなかった（図１４Ａ）。しかしながら、ＴＵＮＥＬ分析によれば、供試培地に保存した精子では、凍結保存して解凍した精子と比べてＤＮＡ断片化が有意に低かったことが明らかになり（図１４Ｂ）、短期貯蔵に関して４℃における供試培地（供試保存培地）での貯蔵は凍結保存よりも精子にとって有害性が低いことが示唆される。
【０４０８】
「約」、「少なくとも」、「未満」及び「超」など、本願において一部のパラメータを表現する全ての数値境界について、その表現は、記載される値によって境界される任意の範囲も必然的に包含することが理解されなければならない。従って、例えば、表現「少なくとも１、２、３、４又は５」は、とりわけ、範囲１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、２〜３、２〜４、２〜５、３〜４、３〜５及び４〜５なども表現する。
【０４０９】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、各個別の刊行物、特許又は特許出願が参照によって援用されることが具体的且つ個別に示されたのと同程度に、あらゆる目的のために全体として参照により本明細書に援用される。例えば、本明細書で言及される全ての刊行物及び特許は、本明細書に説明される方法、キット及び組成物に関連して使用される可能性のある、それらの刊行物に説明されているキット、組成物及び方法論を説明及び開示する目的で全体として参照により本明細書に援用される。本明細書で考察される文献は、本願の出願日より前のそれらの開示のみ提供される。本明細書のいかなる事項も、先行発明であることを理由として又は任意の他の理由で本明細書に記載される本発明者らがかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されてはならない。参照によって援用される文献と本開示との間に何らかの矛盾がある場合、本開示が優先するものとする。
【０４１０】
本願において使用される見出しは、便宜上に過ぎず、本願の解釈に影響を及ぼすことはない。見出しは、決して本発明を限定するために用いられてはならない。例えば、精子機能という見出しの下に説明される方法は、その方法を精子運動能という見出しの下に説明されるとおりに実施することができないか、又は保存培地という見出しの下に開示される試薬で実施することができないというように限定されてはならない。むしろ、様々な見出しの下に開示及び説明される方法及び試薬が全面的に置き替え可能であり、当業者であれば、本明細書における本発明の説明の任意の一部分から開示を選択して、本明細書における本発明の説明の任意の他の一部分と組み合わせることが可能であり得るように任意の組み合わせで実施し得ることが意図される。
【０４１１】
本発明により提供される態様（例えば、培地、組成物、調製液及び方法）の各々の好ましい特徴は、本発明の他のあらゆる態様に適宜修正して適用可能であり、限定なしに、従属請求項によって例示され、また実際に行った実施例を含め、本発明の詳細な実施形態及び態様の個別の特徴（例えば、数値の範囲を含めた要素及び例示的実施形態）の組み合わせ及び並べ替えも包含する。例えば、実際に行った実施例に例示される詳細な実験パラメータは、本発明から逸脱することなく、特許請求される本発明における使用に断片的に適合させることができる。例えば、開示される材料について、それらの化合物の様々な個別の及びまとめた組み合わせ及び並べ替えの各々の具体的な言及は、明示的に開示されないこともあるが、本明細書では各々が具体的に企図され、記載される。従って、要素Ａ、Ｂ及びＣのクラスが開示されると共に、要素Ｄ、Ｅ及びＦのクラス及び要素Ａ−Ｄの組み合わせ例も開示される場合、従って各々が個別に記載されない場合でも、各々が個別に及びまとめて企図される。従って、この例では、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ及びＣ−Ｆの各々が具体的に企図され、Ａ、Ｂ及びＣ；Ｄ、Ｅ及びＦ；並びに例示的組み合わせＡ−Ｄの開示から開示されると見なされるべきである。同様に、これらの任意の部分集合又は組み合わせも具体的に企図され、開示される。従って、例えばＡ−Ｅ、Ｂ−Ｆ及びＣ−Ｅのサブ群が具体的に企図され、Ａ、Ｂ及びＣ；Ｄ、Ｅ及びＦ；並びに例示的組み合わせＡ−Ｄの開示から開示されると見なされるべきである。この概念は、物質の組成物の要素並びにその組成物を作製又は使用する方法のステップを含め、本願の全ての態様に適用される。
【０４１２】
本明細書の教示に従い、当業者が認識するとおりの本発明の前述の態様は、それらが先行技術に鑑みて新規且つ非自明である範囲において任意の組み合わせ又は並べ替えで特許請求することができる  −  従って、ある要素が当業者に公知の１つ以上の参考文献に記載される範囲において、それらは、とりわけ特徴又は特徴の組み合わせの否定的な但し書き又はディスクレーマーにより、特許請求される本発明から除外され得る。
【図１】
2021529554.tif 000008
【図２】
2021529554.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年4月16日(2021.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
向上した精子機能を誘導するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、増強された哺乳類精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記増強された哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）糖新生基質から選択される第１のエネルギー源を提供すること、及び
（ｃ）その後、ステップ（ｂ）からの前記哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）前記解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）前記糖新生基質から選択される第２のエネルギー源を提供することであって、提供される前記第２のエネルギー源は、ステップ（ｂ）で選択されない、提供すること
を含み、前記有効量は、向上した精子機能を誘導するのに十分な量である、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２】
前記向上した精子機能は、標準受精能獲得培地（完全ヒト卵管液）で処理された精子と比べて向上している、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項３】
前記向上した精子機能は、コンピュータ支援精液分析（ＣＡＳＡ）によって測定される運動能の向上を含む、請求項１または２に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項４】
前記運動能の向上は、前記哺乳類精子の曲線速度の向上、超活性化精子の割合の向上、中間運動能精子の割合の向上又はこれらの組み合わせを含む、請求項３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項５】
前記哺乳類精子は、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ又はマウス精子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項６】
前記哺乳類精子は、ヒト精子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項７】
前記解糖系エネルギー源は、グルコースであり、及び前記糖新生基質は、ピルビン酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項８】
前記ピルビン酸の濃度は、０．１５ｍＭ〜０．６６ｍＭであり、前記グルコースの濃度は、０．６ｍＭ〜１０ｍＭである、請求項７に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項９】
前記精子を増強した後、有効量の第１のエネルギー源を提供してから有効量の第２のエネルギー源を提供するまでの時間は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０分である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１０】
前記第１のエネルギー源は、糖新生基質である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１１】
前記第１のエネルギー源は、ピルビン酸である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１２】
前記第２のエネルギー源は、解糖系エネルギー源である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１３】
前記第２のエネルギー源は、グルコースである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）の前記哺乳類精子は：
（ｉ）精子減少症の対象または低受精能の対象に由来する、
（ｉｉ）非低温貯蔵または低温貯蔵から回収された精子である；且つ／又は、
（ｉｉｉ）２回分以上の射精液のプールとして提供される、
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）の前記哺乳類精子は、密度勾配遠心法、スイムアップ法、マイクロフルイディクス、又はこれらの組み合わせにより、ステップ（ａ）の前に精液から濃縮されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１６】
２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜２８０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度で実施される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）のエネルギ枯渇条件下での前記インキュベートは、少なくとも３０、４０、４５、５０、５５、６０、９０、１２０、１５０、又は１８０分にわたる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）は、実質的にグルコース不含、且つ実質的にピルビン酸不含である精子増強用エネルギー枯渇組成物中で、前記哺乳類精子をインキュベートすることを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１９】
前記精子増強用エネルギー枯渇組成物は、ＨＥＰＥＳを含む、請求項１８に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２０】
ＨＥＰＥＳは、３〜３０ｍＭの濃度である、請求項１９に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２１】
前記精子増強用エネルギー枯渇組成物は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及びＮａＨＣＯ３から選択される１つ以上の塩を更に含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２２】
ＮａＣｌは、５０〜１５０ｍＭの濃度で存在し；ＫＣｌは、１〜１０ｍＭの濃度で存在し；ＣａＣｌ２は、１〜５ｍＭの濃度で存在し；ＫＨ２ＰＯ４は、０．１〜０．６ｍＭの濃度で存在し；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏは、０．１〜０．５ｍＭの濃度で存在し；ＮａＨＣＯ３は１５〜３０ｍＭの濃度で存在する、請求項２１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２３】
ステップ（ｂ）から得られた前記哺乳類精子に、受精を増進させる条件下において、卵子への到達手段を提供することを更に含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法によって調製される、向上した精子機能を有するヒト精子を含む調製液。
【請求項２５】
５％〜２０％、８．５％〜２０％、１０％〜２０％、又は１２．５％〜２０％の超活性化精子を含む、請求項２３に記載の調製液。
【請求項２６】
向上した精子機能を誘導するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、増強された哺乳類精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすることを含み、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記増強された哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）糖新生基質から選択される第１のエネルギー源を提供すること、及び
（ｃ）その後、ステップ（ｂ）からの前記哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）前記解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）前記糖新生基質から選択される第２のエネルギー源を提供することであって、提供される前記第２のエネルギー源は、ステップ（ｂ）で選択されず、前記有効量は、向上した精子機能を誘導するのに十分な量である、提供すること
と組み合わせて実施されることを特徴とし、
ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、この順番で実施される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２７】
向上した精子機能を誘導するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
（ｂ）増強された哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）糖新生基質から選択される第１のエネルギー源を提供することを含み、
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、前記増強された哺乳類精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）からの前記増強された哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）前記解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）前記糖新生基質から選択される第２のエネルギー源を提供することであって、提供される前記第２のエネルギー源は、ステップ（ｂ）で選択されず、前記有効量は、向上した精子機能を誘導するのに十分な量である、提供すること
と組み合わせて実施されることを特徴とし、
ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、その順番で実施される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２８】
向上した精子機能を誘導するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
（ｃ）増強された哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）糖新生基質から選択される第２のエネルギー源を提供することであって、前記有効量は、向上した精子機能を誘導するのに十分な量である、提供することを含み、
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、前記増強された哺乳類精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、及び
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記増強された哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）糖新生基質から選択される第１のエネルギー源を提供することであって、ステップ（ｂ）の前記増強された哺乳類精子を生じさせ、前記増強された提供される前記第２のエネルギー源は、ステップ（ｂ）で選択されない、提供すること
と組み合わせて実施されることを特徴とし、
ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、この順番で実施される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１２】
本明細書の教示に従い、当業者が認識するとおりの本発明の前述の態様は、それらが先行技術に鑑みて新規且つ非自明である範囲において任意の組み合わせ又は並べ替えで特許請求することができる  −  従って、ある要素が当業者に公知の１つ以上の参考文献に記載される範囲において、それらは、とりわけ特徴又は特徴の組み合わせの否定的な但し書き又はディスクレーマーにより、特許請求される本発明から除外され得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
受精を増進させる方法であって、
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、前記哺乳類精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすること、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記増強された哺乳類精子に有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供すること、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）から得られた前記哺乳類精子に、受精を増進させる条件下において、卵子への到達手段を提供すること
を含み、前記有効量は、改善された精子機能を誘導するのに十分な量である、方法。
（項目２）
曲線速度、頭部振幅、オートファジー、精子受精能獲得、超活性化精子の割合、中間運動能精子の割合並びに超活性化精子及び中間運動能精子の割合から選択される１つ以上の精子機能は、前記増強された哺乳類精子が前記第１のエネルギー源及び前記第２のエネルギー源の一方のみを提供されるか、又は前記第１のエネルギー源及び前記第２のエネルギー源を同時に提供される方法と比べて改善される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１のエネルギー源は、解糖系エネルギー源であり、及び前記第２のエネルギー源は、糖新生基質であるか、又は前記第１のエネルギー源は、前記糖新生基質であり、及び前記第２のエネルギー源は、前記解糖系エネルギー源であり、更に、ステップ（ａ）の前記哺乳類精子は、ヒト精子である、項目１に記載の方法。
（項目４）
体外で実施される、項目３に記載の方法。
（項目５）
ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）からの前記哺乳類精子の腟内又は子宮内授精（ＩＵＩ）での人工授精により、雌対象の生殖路において体内で実施される、項目３に記載の方法。
（項目６）
ステップ（ｂ）の前記第２のエネルギー源を提供することは、有効量の前記第１のエネルギー源を提供された前記増強された哺乳類精子の子宮内授精（ＩＵＩ）により、雌対象の生殖路において体内で実施される、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記第１のエネルギー源は、ピルビン酸である糖新生基質であり、及び前記第２のエネルギー源は、解糖系エネルギー源である、項目６に記載の方法。
（項目８）
ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）からの前記哺乳類精子を前記卵子と共にインキュベートするか、又はステップ（ｂ）からの前記哺乳類精子を前記卵子の細胞質に注入して、前記卵子の体外受精を増進させることを含む、項目４に記載の方法。
（項目９）
受精を増進させることは、胚であって、好適な対照精子によって発生された胚と比べて向上した生存能及び／又は改善された着床を呈する胚の発生を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
受精を増進させることは、少なくとも２細胞期発育段階、胚盤胞期発育段階又は子孫まで発育する胚の発生を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
ステップ（ａ）の前記哺乳類精子は、精子減少症の対象又は低受精能の対象からのものである、項目１に記載の方法。
（項目１２）
ステップ（ａ）の前記哺乳類精子は、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ又はマウス精子である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
ステップ（ａ）の前記哺乳類精子は、ヒト精子である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
ステップ（ａ）の前記哺乳類精子は、非低温又は低温貯蔵から回収された精子である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
ステップ（ａ）の前記哺乳類精子は、２回分以上の射精液のプールとして提供される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
ステップ（ａ）の前記哺乳類精子は、ステップ（ａ）前に密度勾配遠心法、スイムアップ法又はマイクロフルイディクスによって精液から濃縮される、項目１に記載の方法。
（項目１７）
２００〜２８０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度で実施される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
ステップ（ｂ）は、少なくとも前記第１のエネルギー源又は前記第２のエネルギー源と組み合わせて、解糖系の上流又は下流の１つ以上の成分を前記哺乳類精子に提供することを更に含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記第１のエネルギー源は、（ｉ）グルコース、又は（ｉｉ）ピルビン酸から選択され、及び前記第２のエネルギー源は、（ｉ）グルコース、又は（ｉｉ）ピルビン酸から選択され、前記第１及び第２のエネルギー源は、異なる、項目３に記載の方法。
（項目２０）
ステップ（ａ）のエネルギー枯渇条件下での前記インキュベーションは、少なくとも１０分にわたるものである、項目１に記載の方法。
（項目２１）
向上した精子機能を誘導する方法であって、
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、増強された哺乳類精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記増強された哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）糖新生基質から選択される第１のエネルギー源を提供すること、及び
（ｃ）その後、ステップ（ｂ）からの前記哺乳類精子に、有効量の、（ｉ）前記解糖系エネルギー源、又は（ｉｉ）前記糖新生基質から選択される第２のエネルギー源を提供することであって、提供される前記第２のエネルギー源は、ステップ（ｂ）で選択されない、提供すること
を含み、前記有効量は、向上した精子機能を誘導するのに十分な量である、方法。
（項目２２）
前記向上した精子機能は、好適な対照精子と比べて向上しており、前記好適な対照精子は、未処理の哺乳類精子、有効量の前記解糖系エネルギー源又は前記糖新生基質を独立に提供されている、ステップ（ａ）の前記増強された哺乳類精子、有効量の前記解糖系エネルギー源及び前記糖新生基質を同時に提供されている、ステップ（ａ）の前記増強された哺乳類精子又は標準受精能獲得培地（Ｃ−ＨＴＦ）で処理された精子である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
体外で実施される、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）からの前記哺乳類精子の腟内又は子宮内授精（ＩＵＩ）での人工授精により、雌対象の生殖路において体内で実施される、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記向上した精子機能は、コンピュータ支援精液分析（ＣＡＳＡ）によって測定される運動能の向上を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
前記運動能の向上は、前記哺乳類精子の曲線速度の向上、超活性化精子の割合の向上、中間運動能精子の割合の向上又はこれらの組み合わせを含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記向上した精子機能は、精子−透明帯結合検査によって測定される精子受精能獲得の向上を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２８）
前記向上した精子機能は、精子侵入検査によって測定される、卵子を受精させる前記哺乳類精子の能力の向上を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２９）
前記向上した精子機能は、好適な対照精子で発生された胚と比べて向上した生存能、改善された着床、少なくとも２細胞期発育段階、胚盤胞期発育段階又は子孫まで発育する向上した能力を有する胚の発生を含む、項目２１に記載の方法。
（項目３０）
前記哺乳類精子は、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ又はマウス精子である、項目２１に記載の方法。
（項目３１）
前記哺乳類精子は、ヒト精子である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記解糖系エネルギー源は、グルコースであり、及び前記糖新生基質は、ピルビン酸である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
項目２１に記載の方法によって調製される、向上した精子機能を有する前記哺乳類精子を含む精子調製液。
（項目３４）
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、増強された哺乳類精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、及び
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記増強された哺乳類精子に有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供すること
のプロセスによって調製される、向上した割合の超活性化精子を含む精子調製液であって、前記有効量は、１つ以上の精子機能の向上を誘導するのに十分な量であり、向上した割合の超活性化精子を含む前記精子調製液は、
未処理の哺乳類精子、有効量の前記第１のエネルギー源又は前記第２のエネルギー源を独立に提供されている、ステップ（ａ）の前記増強された哺乳類精子、有効量の前記第１のエネルギー源及び前記第２のエネルギー源を同時に提供されている、ステップ（ａ）の前記増強された哺乳類精子又は標準受精能獲得培地（Ｃ−ＨＴＦ）で処理された哺乳類精子
から選択される好適な対照精子と比べて１つ以上の精子機能の向上を含む、精子調製液。
（項目３５）
向上した精子機能を誘導する方法であって、
（ａ）緩衝剤を含み、且つ約６〜７のｐＨ及び約３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する保存培地に哺乳類精子を提供すること、
（ｂ）前記哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、前記哺乳類精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすること、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）からの前記増強された哺乳類精子に有効量の（ｉ）解糖系エネルギー源、及び／又は（ｉｉ）糖新生基質を提供すること
を含み、それにより好適な対照精子と比較して向上した精子機能を誘導する、方法。
（項目３６）
受精を増進させる方法であって、
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇条件下において、前記精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすることであって、前記インキュベーション前に、前記哺乳類精子は、緩衝剤を含み、且つ弱酸性ｐＨ及び約３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する保存培地に貯蔵される、インキュベートすること、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記増強された精子に有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供すること、
（ｃ）ステップ（ａ）の前記増強された哺乳類精子に有効量の前記第１のエネルギー源又は前記第２のエネルギー源を独立に提供するか、又は有効量の前記第１のエネルギー源及び前記第２のエネルギー源を同時に提供することによって得られるものを上回るレベルまで精子機能の１つ以上を向上させること、及び
（ｄ）向上した機能を有する前記哺乳類精子に、受精を増進させる条件下において、卵子への到達手段を提供すること
を含む方法。
（項目３７）
ａ）緩衝化精子増強用エネルギー枯渇組成物を含む第１の組成物を含む第１の容器、及び
ｂ）哺乳類精子に好適な少なくとも第１のエネルギー源を含む第２の組成物を含む第２の容器
を含むキットであって、
前記哺乳類精子を前記第１の組成物中で好適な時間にわたってインキュベートすると、増強された哺乳類精子を生じさせ、
前記増強された哺乳類精子に有効量の少なくとも前記第１のエネルギー源を提供すると、好適な対照と比べて、前記増強された哺乳類精子の機能を向上させる、キット。
（項目３８）
少なくとも５％の超活性化精子を含む超活性化精子調製液であって、任意選択で、超活性化に基づいて事前に選別されておらず、任意選択で、前記超活性化精子及び／又は中間精子は、好適な対照と比べて、細胞内ＲＮＡ濃度（マイクロＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡ濃度など）の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０％又はそれを超える（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍又はそれを超える）低下を有する、超活性化精子調製液。
（項目３９）
ａ．正常精子の雄、低受精能の雄又は精子減少症の雄、例えば低受精能（精子減少症を含む）の雄などの雄対象の精液から精子を濃縮すること、
ｂ．前記精子を、エネルギー枯渇下において、前記精子を増強するのに好適な時間にわたってインキュベートすること、
ｃ．前記増強された精子に、有効量の解糖系エネルギー源又は有効量の糖新生基質から選択されるが、但し有効量の解糖系エネルギー源及び糖新生基質の両方ではない、第１のエネルギー源を提供すること
によって調製される精子調製液。
（項目４０）
緩衝剤を含み、且つ弱酸性ｐＨ及び約３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば約３００〜３８０、３２０〜３７０、３３０〜３７０、３４０〜３６０、例えば約３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０又は３８０、例えば約３５０の重量オスモル濃度を有する精子保存培地であって、有意な量の卵黄を含まないか、又は一部の実施形態では一切の卵黄を含まない精子保存培地。
（項目４１）
（ａ）哺乳類精子を、エネルギー枯渇下において、増強された哺乳類精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、及び
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記増強された哺乳類精子に有効量の第１のエネルギー源及び第２のエネルギー源を順次提供すること
によって調製される精子調製液であって、ステップ（ｂ）の前記精子は、好適な対照精子と異なるエピジェネティックプロファイルを含む、精子調製液。
（項目４２）
改善された適応度を有する子孫を作製する方法であって、
（ａ）精子試料を、エネルギー枯渇下において、増強された精子を生じさせるのに好適な時間にわたってインキュベートすること、
（ｂ）前記増強された精子に有効量の第１のエネルギー源を提供すること、及び
（ｃ）その後、ステップ（ｂ）からの前記精子に有効量の第２のエネルギー源を提供すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの前記精子を卵子に受精させて、胚を発生させること、及び
（ｅ）雌対象において前記胚を成長させて、前記改善された適応度を有する子孫を作製すること
を含み、前記改善された適応度は、病態を発症する低下したリスクを含む、方法。
【国際調査報告】
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