(57)【要約】  ガイドポリヌクレオチドと共に、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインおよび核酸塩基編集ドメインを含む、塩基エディターを使用する組成物および方法が提供される。標的ヌクレオチド配列の核酸塩基を編集するための塩基エディターシステムも提供される。
2021523738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）と関連する単一ヌクレオチド多型（SNP）を含むSERPINA1ポリヌクレオチドを編集する方法であって、SERPINA1ポリヌクレオチドを、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドと複合体化した塩基エディターと接触させることを含み、塩基エディターが、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含み、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターをターゲティングして、A1ADと関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、方法。
【請求項２】
接触が、細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、またはヒト細胞中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、in vivoまたはex vivoにある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
A1ADと関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変が、アルファ−１アンチトリプシン（A1AT）ポリペプチド中のリシンをグルタミン酸に変化させる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
A1ADと関連するSNPが、アミノ酸342位にリシンを有するA1ATポリペプチドの発現をもたらす、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
塩基エディターによる修正が、342位のリシンをグルタミン酸で置き換える、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変されたStreptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）、またはそのバリアントである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変されたプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有する改変されたSpCas9を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
改変されたSpCas9が、核酸配列5'-AGC-3'に対する特異性を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
改変されたSpCas9が、アミノ酸置換D1332A、ならびにD1135M、S1137Q、G1218K、E1219F、D1332A、R1335E、およびT1337Rのうちの１つ以上、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変されたプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有するSpCas9のバリアントを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
改変されたSpCas9が、核酸配列5'-NGC-3'に対する特異性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
改変されたSpCas9が、アミノ酸置換D1135M、S1137Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E、およびT1337R、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、ヌクレアーゼ不活性バリアントまたはニッカーゼバリアントである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ニッカーゼバリアントが、アミノ酸置換D10Aまたはそれに対応するアミノ酸置換を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
アデノシンデアミナーゼドメインが、デオキシリボ核酸（DNA）中のアデノシンを脱アミノ化することができる、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
アデノシンデアミナーゼが、天然には存在しない改変されたアデノシンデアミナーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アデノシンデアミナーゼが、TadAデアミナーゼである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
TadAデアミナーゼが、TadA*7.10である、請求項１８に記載の方法。 
【請求項２０】
１つまたは複数のガイドRNAが、CRISPR RNA（crRNA）およびトランスコード小RNA（tracrRNA）を含み、crRNAが、A1ADと関連するSNPを含むSERPINA1核酸配列と相補的な核酸配列を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
塩基エディターが、A1ADと関連するSNPを含むSERPINA1核酸配列と相補的な核酸配列を含む単一ガイドRNA（sgRNA）と複合体化している、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
細胞、またはその前駆細胞に、
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディター、塩基エディターをコードするポリヌクレオチドと；
塩基エディターをターゲティングしてA1ADと関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドと
を導入することによって生産される、細胞。
【請求項２３】
産生される細胞が肝細胞である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
細胞またはその前駆細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、または肝細胞である、請求項２２または２３に記載の細胞。
【請求項２５】
肝細胞が、A1ATポリペプチドを発現する、請求項２３または２４に記載の細胞。
【請求項２６】
細胞が、A1ADを有する対象から得られるものである、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８】
A1ADと関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変が、A1ATポリペプチド中のリシンをグルタミン酸に変化させる、請求項２２から２７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２９】
A1ADと関連するSNPが、アミノ酸342位にリシンを有するA1ATポリペプチドの発現をもたらす、請求項２２から２８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０】
A1ADと関連するSNPが、グルタミン酸をリシンで置換する、請求項２２から２９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１】
細胞が、A1ADと関連するSNPのA・TからG・Cへの改変のために選択される、請求項２２から３０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３２】
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変されたStreptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）、またはそのバリアントである、請求項２２から３１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３３】
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変されたプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有する改変されたSpCas9を含む、請求項２２から３２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３４】
改変されたSpCas9が、核酸配列5'-AGC-3'に対する特異性を有する、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３５】
改変されたSpCas9が、アミノ酸置換D1332A、ならびにD1135M、S1137Q、G1218K、E1219F、D1332A、R1335E、およびT1337Rのうちの１つ以上、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、請求項３３または３４に記載の細胞。
【請求項３６】
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変されたプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有するSpCas9のバリアントを含む、請求項２２から３５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３７】
SpCas9のバリアントが、核酸配列5'-NGC-3'に対する特異性を有する、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
改変されたSpCas9が、アミノ酸置換D1135M、S1137Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E、およびT1337R、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、請求項３６または３７に記載の細胞。
【請求項３９】
プログラム可能なポリヌクレオチド結合ドメインが、ヌクレアーゼ不活性バリアントまたはニッカーゼバリアントである、請求項２２から３８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４０】
ニッカーゼバリアントが、アミノ酸置換D10Aまたはそれに対応するアミノ酸置換を含む、請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
アデノシンデアミナーゼドメインが、デオキシリボ核酸（DNA）中のアデノシンを脱アミノ化することができる、請求項２２から４０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４２】
アデノシンデアミナーゼが、天然には存在しない改変されたアデノシンデアミナーゼである、請求項３１に記載の細胞。
【請求項４３】
アデノシンデアミナーゼが、TadAデアミナーゼである、請求項４１または４２に記載の細胞。
【請求項４４】
TadAデアミナーゼが、TadA*7.10である、請求項４３に記載の細胞。
【請求項４５】
１つまたは複数のガイドRNAが、CRISPR RNA（crRNA）およびトランスコード小RNA（tracrRNA）を含み、crRNAが、A1ADと関連するSNPを含むSERPINA1核酸配列と相補的な核酸配列を含む、請求２２から４４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４６】
塩基エディターと、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドとが、細胞中で複合体を形成する、請求項２２から４５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４７】
塩基エディターが、A1ADと関連するSNPを含むSERPINA1核酸配列と相補的な核酸配列を含む単一ガイドRNA（sgRNA）と複合体化している、請求項４６に記載の細胞。
【請求項４８】
それを必要とする対象においてA1ADを治療する方法であって、対象に、請求項２２から４７のいずれか一項に記載の細胞を投与することを含む、方法。
【請求項４９】
細胞が、対象にとって自家性、同種異系、または異種である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
請求項２２から４７のいずれか一項に記載の細胞から増殖または拡張された、単離細胞または細胞集団。
【請求項５１】
対象におけるA1ADを治療する方法であって、それを必要とする対象に、
ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディター、またはそれをコードするポリヌクレオチドと；
塩基エディターをターゲティングしてA1ADと関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドと
を投与することを含む、方法。
【請求項５２】
対象が、哺乳動物またはヒトである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
塩基エディター、またはそれをコードするポリヌクレオチドと、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドとを、対象の細胞に送達することを含む、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
細胞が、肝細胞である、請求項５１から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
細胞が、肝細胞の前駆細胞である、請求項５１から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
細胞が、変異を含むA1ATポリペプチドを発現する、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
A1ADと関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変が、A1ATポリペプチドにおいてグルタミン酸をリシンに変化させる、請求項５１から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
A1ADと関連するSNPが、アミノ酸342位にリシンを有するA1ATポリペプチドの発現をもたらす、請求項５１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
A1ADと関連するSNPが、グルタミン酸をリシンで置換する、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変されたStreptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）、またはそのバリアントを含む、請求項５１から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインが、改変されたプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有する改変されたSpCas9を含む、請求項５１から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
改変されたSpCas9が、核酸配列5'-AGC-3'に対する特異性を有する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
改変されたSpCas9が、アミノ酸置換D1332AならびにD1135M、S1137Q、G1218K、E1219F、D1332A、R1335E、およびT1337Rのうちの１つ以上、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６４】
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変されたプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有する改変されたSpCas9を含む、請求項５１から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
改変されたSpCas9が、核酸配列5'-NGC-3'に対する特異性を有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
改変されたSpCas9が、アミノ酸置換D1135M、S1137Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E、およびT1337R、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、ヌクレアーゼ不活性バリアントまたはニッカーゼバリアントである、請求項５１から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
ニッカーゼバリアントが、アミノ酸置換D10Aまたはそれに対応するアミノ酸置換を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
アデノシンデアミナーゼドメインが、デオキシリボ核酸（DNA）中のアデノシンを脱アミノ化することができる、請求項５１から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
アデノシンデアミナーゼが、天然には存在しない改変されたアデノシンデアミナーゼである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
アデノシンデアミナーゼが、TadAデアミナーゼである、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
TadAデアミナーゼが、TadA*7.10である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドが、CRISPR RNA（crRNA）およびトランスコード小RNA（tracrRNA）を含み、crRNAが、A1ADと関連するSNPを含むSERPINA1核酸配列と相補的な核酸配列を含む、請求項５１から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
塩基エディターが、A1ADと関連するSNPを含むSERPINA1核酸配列と相補的な核酸配列を含む単一ガイドRNA（sgRNA）と複合体化している、請求項５１から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
肝細胞、またはその前駆細胞を生産する方法であって、
（a）A1ADと関連するSNPを含む人工多能性幹細胞または肝前駆細胞中に、
ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディター、またはそれをコードするポリヌクレオチドと；
塩基エディターをターゲティングしてA1ADと関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドと
を導入すること、および
（b）人工多能性幹細胞または肝前駆細胞を、肝細胞に分化させること
を含む、方法。
【請求項７６】
人工多能性幹細胞を、肝細胞またはその前駆細胞に分化させることを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ステップ（a）の人工多能性幹細胞が、E342K変異を含む、請求項７５または７６に記載の方法。
【請求項７８】
肝前駆細胞が、A1ADを有する対象から得られるものである、請求項７５から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
肝細胞または肝前駆細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、請求項７５から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
A1ADと関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変が、A1ATポリペプチドにおいてリシンをグルタミン酸に変化させる、請求項７５から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
A1ADと関連するSNPが、アミノ酸342位にリシンを有するA1ATポリペプチドの発現をもたらす、請求項７５から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
A1ADと関連するSNPが、グルタミン酸をリシンで置換する、請求項７５から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
細胞が、A1ADと関連するSNPのA・TからG・Cへの改変のために選択される、請求項７５から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変されたStreptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）、またはそのバリアントを含む、請求項７５から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変されたプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有する改変されたSpCas9を含む、請求項７５から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
改変されたSpCas9が、核酸配列5'-AGC-3'に対する特異性を有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
改変されたSpCas9が、アミノ酸置換D1332AならびにD1135M、S1137Q、G1218K、E1219F、D1332A、R1335E、およびT1337Rのうちの１つ以上、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、請求項８４から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変されたプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有する改変されたSpCas9を含む、請求項７５から８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
改変されたSpCas9が、核酸配列5'-NGC-3'に対する特異性を有する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
改変されたSpCas9が、アミノ酸置換D1135M、S1137Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E、およびT1337R、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、請求項８８または８９に記載の方法。
【請求項９１】
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、ヌクレアーゼ不活性バリアントまたはニッカーゼバリアントである、請求項７５から９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
ニッカーゼバリアントが、アミノ酸置換D10Aまたはそれに対応するアミノ酸置換を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
アデノシンデアミナーゼドメインが、デオキシリボ核酸（DNA）中のアデノシンを脱アミノ化することができる、請求項７５から９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
アデノシンデアミナーゼが、天然には存在しない改変されたアデノシンデアミナーゼである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
アデノシンデアミナーゼが、TadAデアミナーゼである、請求項９３または９４に記載の方法。
【請求項９６】
TadAデアミナーゼが、TadA*7.10である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドが、CRISPR RNA（crRNA）およびトランスコード小RNA（tracrRNA）を含み、crRNAが、A1ADと関連するSNPを含むSERPINA1核酸配列と相補的な核酸配列を含む、請求項７５から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
塩基エディターと、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドとが、細胞中で複合体を形成する、請求項７５から９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
塩基エディターが、A1ADと関連するSNPを含むSERPINA1核酸配列と相補的な核酸配列を含む単一ガイドRNA（sgRNA）と複合体化している、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
(i) MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFmqPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAkfLQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPrAFKYFDTTIaRKeYrSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDEGADKRTADGSEFESPKKKRK；
および
（ii）アデノシンデアミナーゼドメイン
を含む、塩基エディター。
【請求項１０１】
5’- GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC UUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’;
5’-ACCAUCGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’;
5’-CCAUCGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’;
5’-CAUCGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’;
5’-AUCGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’;
5’-UCGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’; および
5’-CGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’
からなる群から選択される核酸配列を含む、ガイドRNA。
【請求項１０２】
請求項１００に記載の塩基エディターと、請求項１０１に記載のガイドRNAとを含む、タンパク質核酸複合体。
【請求項１０３】
遺伝子中の病原性単一ヌクレオチド多型（SNP）を修正するための塩基エディターシステムであって、塩基エディターシステムが、
（a）（i）ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメイン、および
（ii）病原性SNPまたはその相補的核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメイン
を含む塩基エディターと、
（b）少なくともその一部が前記遺伝子またはその逆相補鎖中に位置する標的ポリヌクレオチド配列へと塩基エディターをターゲティングするガイドポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインに付随する、ガイドポリヌクレオチドと
を含み、
病原性SNPまたはその相補的核酸塩基の脱アミノ化が、病原性SNPからその野生型アリルへの転換をもたらし、それによって、表3Aまたは表3Bに記載される病原性変異を修正する、
塩基エディターシステム。
【請求項１０４】
遺伝子中の病原性単一ヌクレオチド多型（SNP）を修正するための方法であって、
少なくともその一部が前記遺伝子またはその逆相補鎖中に位置する標的ヌクレオチド配列を、
（i）少なくともその一部が前記遺伝子またはその逆相補鎖中に位置する標的ポリヌクレオチド配列へと塩基エディターをターゲティングするガイドポリヌクレオチドを伴う、ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメイン、および
（ii）病原性SNPまたはその相補的核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメイン
を含む前記塩基エディターと接触させることと、
標的ヌクレオチド配列への塩基エディターのターゲティングの際に病原性SNPまたはその相補的核酸塩基を脱アミノ化することによって、病原性SNPを編集することと
を含み、
病原性SNPまたはその相補的核酸塩基の脱アミノ化が、病原性SNPからその野生型アリルへの転換をもたらし、それによって病原性変異を修正する、
方法。
【請求項１０５】
遺伝子中の病原性単一ヌクレオチド多型（SNP）を修正するための方法であって、
少なくともその一部が前記遺伝子またはその逆相補鎖中に位置する標的ヌクレオチド配列を、
（i）少なくともその一部が前記遺伝子またはその逆相補鎖中に位置する標的ポリヌクレオチド配列へと塩基エディターをターゲティングするガイドポリヌクレオチドを伴う、ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメイン、および
（ii）病原性SNPまたはその相補的核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメイン
を含む前記塩基エディターと接触させることと、
標的ヌクレオチド配列への塩基エディターのターゲティングの際に病原性SNPまたはその相補的核酸塩基を脱アミノ化することによって病原性SNPを編集することと
を含み、
病原性SNPまたはその相補的核酸塩基の脱アミノ化が、病原性SNPから野生型アリルへの転換をもたらし、それによって、表3Aまたは表3Bに記載される病原性変異を修正する、
方法。
【請求項１０６】
遺伝子中の病原性単一ヌクレオチド多型（SNP）を修正することによって対象における遺伝的障害を治療する方法であって、
それを必要とする対象に、
（i）ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメイン、および
（ii）病原性SNPまたはその相補的核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメイン
を含む塩基エディター、またはそれをコードするポリヌクレオチドを投与することと、
少なくともその一部が前記遺伝子またはその逆相補鎖中に位置する標的ヌクレオチド配列へと塩基エディターをターゲティングするガイドポリヌクレオチドを対象に投与することと、
標的ヌクレオチド配列への塩基エディターのターゲティングの際に病原性SNPまたはその相補的核酸塩基を脱アミノ化することによって病原性SNPを編集することと
を含み、
病原性SNPまたはその相補的核酸塩基の脱アミノ化が、病原性SNPからその野生型アリルへの転換をもたらし、それによって、表3Aまたは表3Bに記載される病原性変異を修正し、遺伝的障害を治療する、
方法。
【請求項１０７】
細胞、組織、または器官の遺伝子中の病原性単一ヌクレオチド多型（SNP）を修正することによって、それを必要とする対象における遺伝的障害を治療するための細胞、組織、または器官を生産する方法であって、
細胞、組織、または器官を、
（i）ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメイン、および
（ii）病原性SNPまたはその相補的核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメイン
を含む塩基エディターと接触させることと、
細胞、組織、または器官を、少なくともその一部が前記遺伝子またはその逆相補鎖中に位置する標的ヌクレオチド配列へと塩基エディターをターゲティングするガイドポリヌクレオチドと接触させることと、
標的ヌクレオチド配列への塩基エディターのターゲティングの際に病原性SNPまたはその相補的核酸塩基を脱アミノ化することによって病原性SNPを編集することと
を含み、
病原性SNPまたはその相補的核酸塩基の脱アミノ化が、病原性SNPからその野生型アリルへの転換をもたらし、それによって、表3Aまたは表3Bに記載される病原性変異を修正し、遺伝的障害を治療するための細胞、組織、または器官を生産する、
方法。
【請求項１０８】
細胞、組織、または器官を対象に投与することをさらに含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
細胞、組織、または器官が、対象にとって自家性、同種異系、または異種である、請求項１０７または１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
さらなる核酸塩基の編集のための第2のガイドポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１０３から１０９のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１１１】
さらなる核酸塩基が、前記遺伝子中に位置しない、請求項１１０に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１１２】
さらなる核酸塩基が、前記遺伝子中に位置する、請求項１１０に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１１３】
さらなる核酸塩基が、タンパク質コード領域中に位置する、請求項１０９から１１１のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１１４】
さらなる核酸塩基が、タンパク質非コード領域中に位置する、請求項１０９から１１１のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１１５】
タンパク質非コード領域が、遺伝子調節エレメントである、請求項１１３に記載の塩基エディターシステムまたは方法。 
【請求項１１６】
デアミナーゼドメインが、シチジンデアミナーゼドメインまたはアデノシンデアミナーゼドメインである、請求項１０３から１１５のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１１７】
デアミナーゼドメインが、シチジンデアミナーゼドメインである、請求項１１６に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１１８】
デアミナーゼドメインが、アデノシンデアミナーゼドメインである、請求項１１６に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１１９】
アデノシンデアミナーゼドメインが、デオキシリボ核酸（DNA）中のアデニンを脱アミノ化することができる、請求項１１８に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１２０】
ガイドポリヌクレオチドが、リボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA）を含む、請求項１０３から１１９のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１２１】
ガイドポリヌクレオチドが、CRISPR RNA（crRNA）配列、トランス活性化CRISPR RNA（tracrRNA）配列、またはその組合せを含む、請求項１０３から１２０のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１２２】
第2のガイドポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１０３から１２１のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１２３】
第2のガイドポリヌクレオチドが、リボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA）を含む、請求項１２２に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１２４】
第2のガイドポリヌクレオチドが、CRISPR RNA（crRNA）配列、トランス活性化CRISPR RNA（tracrRNA）配列、またはその組合せを含む、請求項１２２に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１２５】
第2のガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターを第2の標的ヌクレオチド配列へとターゲティングする、請求項１２２から１２４のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１２６】
ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインが、Cas9ドメイン、Cpf1ドメイン、CasXドメイン、CasYドメイン、Cas12b/C2c1ドメイン、またはCas12c/C2c3ドメインを含む、請求項１０３から１２５のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１２７】
ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインが、ヌクレアーゼ不活である、請求項１０３から１２６のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１２８】
ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインが、ニッカーゼである、請求項１０３から１２６のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１２９】
ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインが、Cas9ドメインを含む、請求項１２６に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１３０】
Cas9ドメインが、ヌクレアーゼ不活Cas9（dCas9）、Cas9ニッカーゼ（nCas9）、またはヌクレアーゼ活性Cas9を含む、請求項１２９に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１３１】
Cas9ドメインが、Cas9ニッカーゼを含む、請求項１３０に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１３２】
ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインが、操作または改変されたポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインである、請求項１０３から１３１のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１３３】
第2の塩基エディターをさらに含む、請求項１０３から１３２のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１３４】
第2の塩基エディターが、前記塩基エディターとは異なるデアミナーゼドメインを含む、請求項１３３に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
【請求項１３５】
編集が、20%未満のインデル形成、15%未満のインデル形成、10%未満のインデル形成、5%未満のインデル形成、4%未満のインデル形成、3%未満のインデル形成、2%未満のインデル形成、1%未満のインデル形成、0.5%未満のインデル形成、または0.1%未満のインデル形成をもたらす、請求項１０４から１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
編集が、転座をもたらさない、請求項１０４から１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
1a型糖原病（GSD1a）と関連する単一ヌクレオチド多型（SNP）を含むG6PCポリヌクレオチドを編集する方法であって、G6PCポリヌクレオチドを、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドと複合体化した塩基エディターと接触させることを含み、塩基エディターが、ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含み、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターをターゲティングして、GSD1aと関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、方法。
【請求項１３８】
1a型糖原病（GSD1a）と関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変が、G6PCポリペプチドにおいてグルタミン（Q）を非グルタミン（X）アミノ酸に変化させるか、またはアルギニン（R）を非アルギニン（X）に変化させる、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
GSD1aと関連するSNPが、347位に非グルタミン（X）アミノ酸または83位に非アルギニン（X）アミノ酸を有するG6PCポリペプチドの発現をもたらす、請求項１３７または１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
塩基エディターによる修正が、347位のグルタミンを非グルタミンアミノ酸（X）で置き換えるか、または83位のアルギニンを非アルギニンアミノ酸（X）で置き換える、請求項１３７から１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインが、改変されたStreptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）、またはそのバリアントである、請求項１３７から１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインが、改変されたプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有する改変されたSpCas9を含む、請求項１３７から１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
改変されたSpCas9が、核酸配列5'-NGA-3'または5'-NGG-3'に対する特異性を有する、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
アデノシンデアミナーゼがABE7.10である、請求項１３７から１４３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
細胞、またはその前駆細胞に、
ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含む、塩基エディター、塩基エディターをコードするポリヌクレオチドと；
塩基エディターをターゲティングして1a型糖原病（GSD1a）と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドと
を導入することによって産生される、細胞。
【請求項１４６】
細胞が、肝細胞、肝前駆細胞、またはiPSc由来肝細胞である、請求項１４５に記載の細胞。
【請求項１４７】
細胞が、GSD1aを有する対象から得られるものである、請求項１４５または１４６に記載の細胞。
【請求項１４８】
細胞がQ347X変異を有する、請求項１４５から１４７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４９】
GSD1aと関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変が、G6PCポリペプチドにおいてグルタミンを非グルタミン（X）アミノ酸に変化させるか、またはアルギニンを非アルギニン（X）アミノ酸に変化させる、請求項１４５から１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５０】
GSD1aと関連するSNPが、347位に非グルタミン（X）アミノ酸または83位に非アルギニン（X）アミノ酸を有するG6PCポリペプチドの発現をもたらす、請求項１４５から１４９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５１】
それを必要とする対象において1a型糖原病（GSD1a）またはフォン・ギールケ病を治療する方法であって、対象に、請求項１４５から１５０のいずれか一項に記載の細胞を投与することを含む、方法。
【請求項１５２】
肝細胞、またはその前駆細胞を生産する方法であって、
（a）GSD1aと関連するSNPを含む人工多能性幹細胞または肝前駆細胞中に、
ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディター、またはそれをコードするポリヌクレオチドと；
塩基エディターをターゲティングしてGSD1aと関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドと
を導入すること、および
（b）人工多能性幹細胞または肝前駆細胞を、肝細胞に分化させること
を含む、方法。
【請求項１５３】
人工多能性幹細胞を、肝細胞またはその前駆細胞に分化させることを含む、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
ステップ（a）の人工多能性幹細胞が、Q347X変異を含む、請求項１５２または１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
肝前駆細胞が、GSD1aを有する対象から得られるものである、請求項１５２から１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
肝細胞または肝前駆細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、請求項１５２から１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
GSD1aと関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変が、G6PCポリペプチドにおいてグルタミンを非グルタミン（X）アミノ酸に変化させるか、またはアルギニンを非アルギニン（X）アミノ酸に変化させる、請求項１５２から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５８】
GSD1aと関連するSNPが、347位に非グルタミン（X）アミノ酸または83位に非アルギニン（X）アミノ酸を有するG6PCポリペプチドの発現をもたらす、請求項１５２から１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５９】
GSD1aと関連するSNPが、グルタミンを非グルタミン（X）アミノ酸で置換する、またはアルギニンを非アルギニン（X）アミノ酸で置換する、請求項１５２から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
細胞が、GSD1aと関連するSNPのA・TからG・Cへの改変のために選択される、請求項１５２から１５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
1型ムコ多糖症（MPS1）と関連する単一ヌクレオチド多型（SNP）を含むIDUAポリヌクレオチドを編集する方法であって、IDUAポリヌクレオチドを、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドと複合体化した塩基エディターと接触させることを含み、塩基エディターが、ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含み、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターをターゲティングしてMPS1と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、方法。
【請求項１６２】
ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインが、改変されたStreptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）、またはそのバリアントである、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインが、改変されたプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有する改変されたSpCas9を含む、請求項１６０または１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
改変されたSpCas9が、核酸配列5'-NGG-3'に対する特異性を有する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
アデノシンデアミナーゼがABE7.10である、請求項１６１から１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
ガイドポリヌクレオチドが、ヒト核酸配列ACTCTaGGCAGAGGTCTCAAAGGを含む、請求項１６１から１６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６７】
ガイドポリヌクレオチドが、マウス核酸配列GCTCTaGGCCGAAGTGTCGCAGGを含む、請求項１６１から１６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
細胞、またはその前駆細胞に、
ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含む、塩基エディター、それをコードするポリヌクレオチドと；
塩基エディターをターゲティングして1型ムコ多糖症（MPS1）と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチド
を導入することによって産生される、
細胞。
【請求項１６９】
細胞が、幹細胞、幹細胞前駆細胞、または人工多能性幹細胞（iPSC）である、請求項１６８に記載の細胞。
【請求項１７０】
細胞が、MPS1を有する対象に由来するものである、請求項１６８または１６９に記載の細胞。
【請求項１７１】
それを必要とする対象においてMPS1を治療する方法であって、対象に、請求項１６８から１７０のいずれか一項に記載の細胞を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／６７０，５８８号、２０１８年１２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／７８０，８３８号、および２０１９年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／８１７，９８６号の優先権および利益を主張し、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
多くの公知の遺伝的疾患に関して、疾患の根本原因を研究する、またはそれに対処するためには、遺伝子の確率的破壊よりもむしろ、標的遺伝子座における点変異の修正が必要である。clustered regularly interspaced short palindromic repeat（CRISPR）系を利用する現在のゲノム編集技術は、遺伝子修正に対する第１のステップとして、標的遺伝子座に二本鎖ＤＮＡ切断を導入する。二本鎖ＤＮＡ切断に応答して、細胞ＤＮＡ修復プロセスは、大抵、非相同末端結合によってＤＮＡ切断部位に無作為の挿入または欠失（インデル）をもたらす。多くの遺伝的疾患は点変異から生じるが、点変異修正に対する現在の手法は、不十分であり、典型的には、ｄｓＲＮＡ切断に対する細胞応答の結果生じる標的遺伝子座での多数の無作為の挿入および欠失（インデル）を誘導する。したがって、より効率的であり、確率的挿入もしくは欠失（インデル）または転座などの望ましくない生成物がはるかに少ない、改良された形態のゲノム編集が必要である。
【０００３】
アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）は、アルファ−１アンチトリプシン（A1AT）タンパク質をコードするSERPINA1遺伝子中の病原性変異が、疾患を有する個体におけるタンパク質産生の減少をもたらす遺伝的疾患である。A1ATは、好中球エラスターゼの特に良好な阻害剤であり、エラスチン分解から肺などの組織および臓器を保護する。結果として、A1ADを有する患者の肺中のエラスチンは、好中球エラスターゼによってより容易に分解され、時間と共に、肺の弾性の喪失は慢性閉塞性肺疾患（COPD）に発達する。健康な個体では、A1ATは、肝臓内の肝細胞によって産生され全身循環中に分泌され、そこでタンパク質がプロテアーゼ阻害剤として機能する。
【０００４】
最も一般的な病原性A1ATバリアントは、SERPINA1遺伝子におけるグアニンからアデニン（Ｇ→Ａ）への変異であり、A1ATタンパク質のアミノ酸342でのグルタミン酸からリシンへの置換をもたらす。この置換は、タンパク質のミスフォールディングおよび肝細胞内での重合化を引き起こし、最終的には、毒性凝集体が肝臓傷害および肝硬変をもたらし得る。肝臓毒性は、潜在的には遺伝子ノックアウト（CRISPR/ZFN/TALEN）または遺伝子ノックダウン（siRNA）によって対処され得るが、これらの手法はいずれも、肺病理には対処できない。肺病理はタンパク質補充療法を用いて対処され得るが、この療法は、肝臓毒性に対処できない。遺伝子療法も、A1AT遺伝子欠損に対処するには不十分である。A1ADを有する患者の肝臓は既に内因性A1AT凝集によって引き起こされる重篤な疾患負荷の下にあるため、肝臓中のA1ATを増加させる遺伝子療法は逆効果であろう。したがって、A1ADに伴う肺病理と肝臓毒性との両方に対処する、該疾患を有する患者を治療する方法が必要である。
【０００５】
参照による組み込み
本明細書に記載されているすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれるように示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。別段の表示がない限り、本明細書に記載されている刊行物、特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書に記載されるように、プログラム可能な核酸塩基エディターを使用して疾患または障害と関連するタンパク質中の病原性アミノ酸の正確な修正のための組成物および方法が提供される。特定の態様では、記載される組成物および方法は、アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）の治療にとって有用である。ある実施形態では、A1ADを治療するための記載される組成物および方法は、アデノシン（A）塩基エディター（ABE-（NGCバリアント））を利用して、内因性SERPINA1遺伝子中の有害な、単一ヌクレオチド多型（SNP）を正確に修正する。ある実施形態では、組成物および方法は、コードされるアルファ−１アンチトリプシン（A1AT）タンパク質の活性および機能に影響する有害な変異、E342Kを修正する。この修正は同時に、肝臓に対する病原性タンパク質負荷を除去し、機能的タンパク質を肺に回復させる。
【０００７】
一態様では、アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）と関連する単一ヌクレオチド多型（SNP）を含有するSERPINA1ポリヌクレオチドを編集する方法であって、SERPINA1ポリヌクレオチドを、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドと複合体化した塩基エディターと接触させることを含み、塩基エディターがポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含有し、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドが塩基エディターをターゲティング（標的指向化）して、A1ADと関連するSERPINA1遺伝子中のSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、方法が提供される。一実施形態では、方法は、細胞、例えば、真核細胞、哺乳動物細胞、またはヒト細胞を接触させることを含む。別の実施形態では、細胞は、in vivoまたはex vivoにある。
【０００８】
別の態様では、本発明は、細胞、またはその前駆細胞中に、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含有する、塩基エディター、塩基エディターをコードするポリヌクレオチド；ならびに塩基エディターをターゲティングして、A1ADと関連する遺伝子、例えば、SERPINA1遺伝子中のSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドを導入することによって産生される細胞を特徴とする。一実施形態では、産生される細胞は、肝細胞である。別の実施形態では、細胞またはその前駆細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、または肝細胞である。別の実施形態では、肝細胞は、A1ATポリペプチドを発現する。別の実施形態では、細胞は、A1ADを有する対象に由来する。さらに別の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。
【０００９】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象に、上で詳述された態様および実施形態に記載された細胞を投与することを含む、対象におけるA1ADを治療する方法を特徴とする。一実施形態では、細胞は、自家性（autologous）のものであるか、または対象にとって同種異系（allogeneic）もしくは異種（xenogeneic）である。
【００１０】
別の態様では、本発明は、単離された細胞または上で詳述された態様のいずれかの細胞から増殖もしくは拡張された細胞集団を特徴とする。
【００１１】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象に、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含有する、塩基エディター、または塩基エディターをコードするポリヌクレオチド；ならびに塩基エディターをターゲティングして、A1ADと関連する遺伝子、例えば、SERPINA1遺伝子中のSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドを投与することを含む、対象におけるA1ADを治療する方法を特徴とする。一実施形態では、対象は、哺乳動物またはヒトである。別の実施形態では、方法は、塩基エディター、または塩基エディターをコードするポリヌクレオチド、および１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドを、対象の細胞に送達することを含む。さらに別の実施形態では、細胞は肝細胞である。別の実施形態では、細胞は、肝細胞の前駆細胞である。さらに別の実施形態では、肝細胞は、変異を含有するA1ATポリペプチドを発現する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、肝細胞またはその前駆細胞を生産する方法であって、（a）A1ADと関連する遺伝子、例えば、SERPINA1遺伝子においてSNPを含有する人工多能性幹細胞または肝細胞前駆細胞中に、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含有する塩基エディター、または塩基エディターをコードするポリヌクレオチドと；塩基エディターをターゲティングして、A1ADと関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドとを導入すること、および（b）人工多能性幹細胞または肝細胞前駆細胞を肝細胞に分化させることを含む、方法を特徴とする。一実施形態では、方法は、人工多能性幹細胞を、肝細胞またはその前駆細胞に分化させることを含む。別の実施形態では、人工多能性幹細胞は、E342K変異を含有する。別の実施形態では、肝細胞前駆細胞は、A1ADを有する対象から得られるものである。さらに別の実施形態では、肝細胞または肝細胞前駆細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。
【００１３】
別の態様では、記載される組成物および方法において使用される塩基エディター（BE）は、アミノ酸配列：（i）：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFmqPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAkfLQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPrAFKYFDTTIaRKeYrSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDEGADKRTADGSEFESPKKKRK；および（ii）アデノシンデアミナーゼドメインを含むポリペプチドを含む。
【００１４】
別の態様では、本発明は、以下のもの：
5’- GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC UUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’;
5’-ACCAUCGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’;
5’-CCAUCGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’;
5’-CAUCGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’;
5’-AUCGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’;
5’-UCGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’; および
5’-CGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’からの核酸配列を含有するガイドRNA（gRNA）を特徴とする。
【００１５】
別の態様では、本発明は、塩基エディターと、本明細書で詳述された前記態様または実施形態のいずれかのガイドRNAとを含有するタンパク質核酸複合体を特徴とする。
【００１６】
上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、A1ADと関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変は、A1ATポリペプチド中のリシンをグルタミン酸に変化させる。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、A1ADと関連するSNPは、アミノ酸342位にリシンを有するA1ATポリペプチドの発現をもたらす。別の実施形態では、塩基エディター修正は、A1ADと関連するA1ATポリペプチドの342位のリシンを、グルタミン酸で置き換える。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインは、改変されたStreptococcus pyogenesのCas9（SpCas9）、またはそのバリアントである。
【００１７】
上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインは、改変されたプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有する改変されたSpCas9を含有する。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、改変されたSpCas9は、核酸配列5'-AGC-3'に対する特異性を有する。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、改変されたSpCas9は、アミノ酸置換D1332AならびにD1135M、S1136Q、G1218K、E1219F、D1332A、R1335E、およびT1337Rのうちの１つもしくは複数、またはその対応するアミノ酸置換を含む。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインは、改変されたプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有するSpCas9のバリアントを含有する。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、SpCas9のバリアントは、核酸配列5'-NGC-3'に対する特異性を有する。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、改変されたSpCas9は、アミノ酸置換D1135M、S1136Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E、およびT1337R、またはその対応するアミノ酸置換を含有する。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインは、ヌクレアーゼ不活性またはニッカーゼバリアントである。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、ニッカーゼバリアントは、アミノ酸置換D10Aまたはその対応するアミノ酸置換を含有する。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、アデノシンデアミナーゼドメインは、デオキシリボ核酸（DNA）中のアデノシンを脱アミノ化することができる。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、天然には存在しない改変されたアデノシンデアミナーゼである。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、TadAデアミナーゼ（例えば、TadA*7.10）である。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、１つまたは複数のガイドRNAは、CRISPR RNA（crRNA）とトランスコード小RNA（tracrRNA）とを含有し、crRNAは、A1ADと関連するSNPを含有するSERPINA1核酸配列と相補的な核酸配列を含有する。上記態様の様々な実施形態では、塩基エディターは、A1ADと関連するSNPを含有するSERPINA1核酸配列と相補的な核酸配列を含有する単一ガイドRNA（sgRNA）と複合体化している。
【００１８】
さらに別の態様では、遺伝子中の病原性単一ヌクレオチド多型（SNP）を修正するための塩基エディターシステムであって、塩基エディターシステムが、（a）（i）ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメイン、および（ii）病原性SNPまたはその相補的核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインを含む、塩基エディターと、（b）少なくともその一部が前記遺伝子またはその逆相補鎖中に位置する標的ポリヌクレオチド配列へと塩基エディターをターゲティングする、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインと連結されたガイドポリヌクレオチドとを含み、病原性SNPまたはその相補的核酸塩基の脱アミノ化が、病原性SNPの、その野生型アリルへの転換をもたらし、それによって、本明細書の表3Aおよび3Bに列挙されるものなどの病原性変異を修正する、塩基エディターシステムが本明細書で提供される。
【００１９】
別の態様では、遺伝子中の病原性単一ヌクレオチド多型（SNP）を修正するための方法であって、その少なくとも一部が前記遺伝子またはその逆相補鎖中に位置する標的ヌクレオチド配列を、（i）少なくとも一部が前記遺伝子またはその逆相補鎖中に位置する標的ポリヌクレオチド配列へと塩基エディターをターゲティングするガイドポリヌクレオチドを伴うポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインと、（ii）病原性SNPまたはその相補的核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインとを含む塩基エディターと接触させることと、塩基エディターが標的ヌクレオチド配列にターゲティングされる際に病原性SNPまたはその相補的核酸塩基を脱アミノ化することによって、病原性SNPを編集することとを含み、病原性SNPまたはその相補的核酸塩基の脱アミノ化が、病原性SNPからその野生型アリルへの転換をもたらし、それによって、本明細書の表3Aまたは表3Bに列挙されるものなどの病原性変異を修正する、方法が本明細書で提供される。
【００２０】
別の態様では、遺伝子中の病原性単一ヌクレオチド多型（SNP）を修正することによって対象における遺伝的障害を治療する方法であって、（i）ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメイン、および（ii）病原性SNPまたはその相補的核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインを含む塩基エディター、または塩基エディターをコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することと、少なくとも一部が前記遺伝子またはその逆相補鎖中に位置する標的ヌクレオチド配列へと塩基エディターをターゲティングするガイドポリヌクレオチドを、対象に投与することと、標的ヌクレオチド配列への塩基エディターのターゲティングの際に病原性SNPまたはその相補的核酸塩基を脱アミノ化することによって病原性SNPを編集することとを含み、病原性SNPまたはその相補的核酸塩基の脱アミノ化が、病原性SNPからその野生型アリルへの転換をもたらし、それによって、表3Aまたは表3Bに列挙されるものなどの病原性変異を修正し、遺伝的障害を治療する、方法が本明細書で提供される。
【００２１】
細胞、組織、または器官の遺伝子中の病原性単一ヌクレオチド多型（SNP）を修正することによって、それを必要とする対象における遺伝的障害を治療するための細胞、組織、または器官を生産する方法であって、細胞、組織、または器官を、（i）ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメイン、および（ii）病原性SNPまたはその相補的核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインを含む塩基エディターと接触させることと、細胞、組織、または器官を、少なくとも一部が前記遺伝子またはその逆相補鎖中に位置する標的ヌクレオチド配列に塩基エディターをターゲティングするガイドポリヌクレオチドと接触させることと、標的ヌクレオチド配列への塩基エディターのターゲティングの際に病原性SNPまたはその相補的核酸塩基を脱アミノ化することによって病原性SNPを編集することとを含み、病原性SNPまたはその相補的核酸塩基の脱アミノ化が、病原性SNPからその野生型アリルへの転換をもたらし、それによって、表3Aまたは表3Bに列挙されるものなどの病原性変異を修正し遺伝的障害を治療するための、細胞、組織、または器官を生産する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、細胞、組織、または器官を対象に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、細胞、組織、または器官は、対象にとって自家性である。一部の実施形態では、細胞、組織、または器官は、対象にとって同種異系である。一部の実施形態では、細胞、組織、または器官は、対象にとって異種である。
【００２２】
一部の実施形態では、病原性SNPは、スタルガルト病と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、ABCA4遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、A1038V、L541P、G1961E、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、弾性線維性仮性黄色腫と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、ABCC6遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R1141*を含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、中鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、ACADM遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、K329Eを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、重症複合免疫不全と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、ADA遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、G216R、Q3*、またはその組合せを含む。
【００２３】
一部の実施形態では、病原性SNPは、原発性低シュウ酸尿症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、AGXT遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、G170Rを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、常染色体劣性遺伝性高コレステロール血症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、ARH遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、Q136*を含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、異染性白質ジストロフィーと関連する；必要に応じて、病原性SNPは、ARSA遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、P426L、c.459+1G>A、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、マロトー・ラミー症候群（MSPVI）と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、ARSB遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、Y210Cを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、I型シトルリン血症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、ASS遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、G390Rを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、ダリエ病と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、ATP2A2遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、N767Sを含む。
【００２４】
一部の実施形態では、病原性SNPは、古典的ホモシスチン尿症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、CBS遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、G307S、T191M、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、嚢胞性線維症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、CFTR遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、G551D、W1282*、R553*、R117H、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、先天性脈絡膜欠如と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、CHM遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R293*、R270*、A117A、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、神経セロイドリポフスチン症（NCL）と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、CLN2遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R208*を含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、常染色体優性難聴と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、COCH遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、G88Eを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼII欠損症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、CPT2遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、S113Lを含む。
【００２５】
一部の実施形態では、病原性SNPは、シスチン症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、CTNS遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、W138*を含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、常染色体劣性難聴と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、CX30遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、T5Mを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、常染色体劣性難聴と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、DFNB59遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R183Wを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、孤立性無ガンマグロブリン血症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、E47遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、E555Kを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、先天性第XI因子欠乏症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、F11遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、E117*、F283L、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、先天性第V因子欠乏症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、F5遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R506Q、R534Q、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、先天性第VII因子欠乏症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、F7遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、A294V、C310F、R304Q、Q100R、またはその組合せを含む。
【００２６】
一部の実施形態では、病原性SNPは、血友病Aと関連する；必要に応じて、病原性SNPは、F8遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R2169H、R1985Q、R2178C、R550C、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、血友病Bと関連する；必要に応じて、病原性SNPは、F9遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、T342M、R294Q、R43Q、R191H、G106S、A279T、R75*、R294*、R379Q、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、1型チロシン血症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、FAH遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、P261Lを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、常染色体優性遺伝性低リン酸血症性くる病と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、FGF23遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R176Qを含む。
【００２７】
一部の実施形態では、病原性SNPは、フォン・ギールケ病と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、G6PC遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、Q347*を含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、地中海G6PD欠損症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、G6PD遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、S188Dを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、モルキオ症候群と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、GALNS遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R386Cを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、古典的ガラクトース血症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、GALT遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、Q188Rを含む。
【００２８】
一部の実施形態では、病原性SNPは、ゴーシェ病と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、GBA遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、N370S、L444P、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、グルタリル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症と関連する；必要に応じて、病原性SNPはGCDH遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R138G、M263V、R402W、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、グリシン脳症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、GLDC遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、A389V、G771R、T269M、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、錐体桿体ジストロフィーと関連する；必要に応じて、病原性SNPは、GUCY2D遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R838Cを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、スライ症候群（MPSVII）と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、GUSB遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、L175Fを含む。
【００２９】
一部の実施形態では、病原性SNPは、鎌状赤血球病と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、HBB遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、E26K；E7K；c.−１38C>T；IVS2、654C>T；またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、間欠性ポルフィリン症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、HMBS遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R173Wを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、レッシュ・ナイハン症候群と関連する；必要に応じて、病原性SNPはHPRT1遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R51*、R170*、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、ハンター症候群と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、IDS遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R88C、G374G、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、ハーラー症候群（MPS1）と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、IDUA遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、Q70*を含む。
【００３０】
一部の実施形態では、病原性SNPは、網膜色素変性症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、IMPDH1遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、D226Nを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、アンデルセン・タウィル症候群と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、KCNJ2遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R218Wを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、メースマン角膜上皮変性症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、KRT12遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、L132Pを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、パーキンソン病と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、LRRK2遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、G2109Sを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、レット症候群と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、MECP2遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R106W、R133C、R306C、R168*、R255*、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、サンフィリポ症候群B（MPSIIIB）と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、NAGLU遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R297*、Y140C、またはその組合せを含む。
【００３１】
一部の実施形態では、病原性SNPは、CADASIL症候群と関連する；必要に応じて、病原性SNPはNOTCH3遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R90C、R141C、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、青錐体全色覚異常と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、OPN1LW遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、C203Rを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、フェニルケトン尿症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、PAH遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R408W、I65T、R261Q、IVS10−１1G>A、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、1F型アッシャー症候群と関連する；必要に応じて、病原性SNPはPCDH15遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R245*を含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、網膜色素変性症と関連する；必要に応じて、病原性SNPはPDE6A遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、V685M、D670G、またはその組合せを含む。
【００３２】
一部の実施形態では、病原性SNPは、ペンドレッド症候群と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、PDS遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、L236P；c.1001+1G>A；IVS8、+1G>A、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、異型ポルフィリン症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、PPOX遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R59Wを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、神経セロイドリポフスチン症1と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、PPT1遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R151*を含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）と関連する；必要に応じて、病原性SNPはPRNP遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、M129V、P102L、D178N、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、網膜色素変性症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、PRPF3遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、T494Mを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、網膜色素変性症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、PRPF8遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、H2309Rを含む。
【００３３】
一部の実施形態では、病原性SNPは、遺伝性慢性膵炎と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、PRSS1遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R122Hを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、網膜色素変性症と関連する；必要に応じて、病原性SNPはRHO遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、P347L、D190N、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、網膜色素変性症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、RP1遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R667*を含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、レーバー先天性黒内障2と関連する；必要に応じて、病原性SNPはRPE65遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R44*；IVS1、G-A、+5；またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、ブラックファン・ダイアモンド貧血と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、RPS19遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R62Qを含む。
【００３４】
一部の実施形態では、病原性SNPはX連鎖性網膜分離症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは（RS1）遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R102W、R141C、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、A1ADと関連する；必要に応じて、病原性SNPは、SERPINA1遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、E342K、R48C（R79C）、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、サンフィリポ症候群A（MPSIIIA）と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、SGSH遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、R74Cを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、A型ナイマン・ピック病と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、SMPD1遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、L302Pを含む。
【００３５】
一部の実施形態では、病原性SNPは、常染色体優性パーキンソン病と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、SNCA遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、A53Tを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、家族性筋萎縮性側索硬化症（ALS）と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、スーパーオキシドジスムターゼ1（SOD1）遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、A4V、H46R、G37R、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、常染色体優性難聴と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、TECTA遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、Y1870Cを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、常染色体劣性難聴と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、TMC1遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、Y182Cを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、ATTRアミロイドーシスと関連する；必要に応じて、病原性SNPは、TTR遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、V50M/V30Mを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、網膜色素変性症/1C型アッシャー症候群と関連する；必要に応じて、病原性SNPはUSH1C遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、V72Vを含む。
【００３６】
一部の実施形態では、病原性SNPは、網膜色素変性症と関連する；必要に応じて、病原性SNPは、USH2a遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、C759Fを含む。一部の実施形態では、病原性SNPは、筋細管ミオパシーと関連する；必要に応じて、病原性SNPは、MTM1遺伝子中にある；必要に応じて、病原性変異は、c.1261-10A>Gを含む。
【００３７】
一部の実施形態では、本明細書で提供される塩基エディターシステムまたは方法はいずれも、さらなる核酸塩基の編集のための第2のガイドポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。一部の実施形態では、さらなる核酸塩基は、前記遺伝子中に位置しない。一部の実施形態では、さらなる核酸塩基は、前記遺伝子中に位置する。一部の実施形態では、さらなる核酸塩基は、タンパク質コード領域中に位置する。一部の実施形態では、さらなる核酸塩基は、タンパク質非コード領域中に位置する。一部の実施形態では、タンパク質非コード領域は、遺伝子調節エレメントである。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、シチジンデアミナーゼドメインまたはアデノシンデアミナーゼドメインである。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、シチジンデアミナーゼドメインである。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、アデノシンデアミナーゼドメインである。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼドメインは、デオキシリボ核酸（DNA）中のアデノシンを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、リボ核酸（RNA）、またはデオキシリボ核酸（DNA）を含む。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、CRISPR RNA（crRNA）配列、トランス活性化CRISPR RNA（tracrRNA）配列、またはその組合せを含む。
【００３８】
一部の実施形態では、本明細書で提供される塩基エディターシステムまたは方法はいずれも、第2のガイドポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。一部の実施形態では、第2のガイドポリヌクレオチドは、リボ核酸（RNA）、またはデオキシリボ核酸（DNA）を含む。一部の実施形態では、第2のガイドポリヌクレオチドは、CRISPR RNA（crRNA）配列、トランス活性化CRISPR RNA（tracrRNA）配列、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、第2のガイドポリヌクレオチドは、塩基エディターを第2の標的ヌクレオチド配列にターゲティングする。
【００３９】
一部の実施形態では、本明細書で提供される塩基エディターシステムまたは方法のいずれかにおいて、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインは、Cas9ドメイン、Cpf1ドメイン、CasXドメイン、CasYドメイン、Cas12b/C2ｃ１ドメインまたはCas12c/C2ｃ３ドメインを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインは、ヌクレアーゼ不活（dead）である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインは、ニッカーゼである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインは、Cas9ドメインを含む。一部の実施形態では、Cas9ドメインは、ヌクレアーゼ不活Cas9（dCas9）、Cas9ニッカーゼ（nCas9）、またはヌクレアーゼ活性Cas9を含む。一部の実施形態では、Cas9ドメインは、Cas9ニッカーゼを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインは、操作または改変されたポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインである。
【００４０】
一部の実施形態では、本明細書で提供される塩基エディターシステムまたは方法はいずれも、第2の塩基エディターをさらに含んでもよい。一部の実施形態では、第2の塩基エディターは、前記塩基エディターとは異なるデアミナーゼドメインを含む。
【００４１】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかにおいて、編集は、20%未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、編集は、15%未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、編集は、10%未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、編集は、5%未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、編集は、4%未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、編集は、3%未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、編集は、2%未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、編集は、1%未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、編集は、0.5%未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、編集は、0.1%未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、編集は、転座をもたらさない。
【００４２】
一態様では、本発明は、1a型糖原病（GSD1a）と関連する単一ヌクレオチド多型（SNP）を含むG6PCポリヌクレオチドを編集する方法であって、G6PCポリヌクレオチドを、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドと複合体化した塩基エディターと接触させることを含み、塩基エディターが、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含み、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターをターゲティングして、GSD1aと関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、方法を提供する。一実施形態では、1a型糖原病（GSD1a）と関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変は、グルタミン（Q）を非グルタミン（X）アミノ酸に変化させる。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、1a型糖原病（GSD1a）と関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変は、G6PCポリペプチド中でアルギニン（R）を非アルギニン（X）に変化させる。
【００４３】
上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、GSD1aと関連するSNPは、347位に非グルタミン（X）アミノ酸または83位に非アルギニン（X）アミノ酸を有するG6PCポリペプチドの発現をもたらす。一実施形態では、塩基エディター修正は、347位のグルタミンを、非グルタミンアミノ酸（X）と置き換える。一実施形態では、塩基エディター修正は、83位のアルギニンを、非アルギニンアミノ酸（X）と置き換える。
【００４４】
上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインは、改変されたStreptococcus pyogenesのCas9（SpCas9）、またはそのバリアントである。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインは、改変されたプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有する改変されたSpCas9を含む。一実施形態では、改変されたSpCas9は、核酸配列5'-NGA-3'または5'-NGG-3'に対する特異性を有する。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ABE7.10である。
【００４５】
一態様では、細胞は、細胞、またはその前駆細胞中に、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディター、塩基エディターをコードするポリヌクレオチド；ならびに塩基エディターをターゲティングして1a型糖原病（GSD1a）と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドを導入することによって生産される。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、細胞は、肝細胞、肝細胞前駆細胞、またはiPSC由来肝細胞である。
【００４６】
上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、細胞は、GSD1aを有する対象に由来する。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、細胞は、Q347X変異を担持する。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、GSD1aと関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変は、グルタミンを非グルタミン（X）アミノ酸に変化させる。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、GSD1aと関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変は、G6PCポリペプチド中のアルギニンを非アルギニン（X）アミノ酸に変化させる。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、GSD1aと関連するSNPは、347位に非グルタミン（X）アミノ酸または83位に非アルギニン（X）アミノ酸を有するG6PCポリペプチドの発現をもたらす。
【００４７】
一態様では、本発明は、それを必要とする対象における1a型糖原病（GSD1a）またはフォン・ギールケ病を治療する方法であって、上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態の細胞を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、肝細胞、またはその前駆細胞を生産する方法であって、（a）GSD1aと関連するSNPを含む人工多能性幹細胞または肝細胞前駆細胞中に、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディター、または塩基エディターをコードするポリヌクレオチド；ならびに塩基エディターをターゲティングしてGSD1aと関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドを導入することと、（b）人工多能性幹細胞または肝細胞前駆細胞を肝細胞に分化させることとを含む、方法を提供する。さらなる態様では、方法は、人工多能性幹細胞を、肝細胞またはその前駆細胞に分化させることを含む。様々な実施形態では、ステップ（a）の人工多能性幹細胞は、Q347X変異を含む。
【００４９】
上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、肝細胞前駆細胞は、GSD1aを有する対象から得られる。様々な実施形態では、肝細胞または肝細胞前駆細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、GSD1aと関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変は、G6PCポリペプチド中のグルタミンを非グルタミン（X）アミノ酸に変化させるか、またはアルギニンを非アルギニン（X）アミノ酸に変化させる。様々な実施形態では、GSD1aと関連するSNPは、347位に非グルタミン（X）アミノ酸を有するG6PCポリペプチドの発現をもたらす。様々な実施形態では、GSD1aと関連するSNPは、83位に非アルギニン（X）アミノ酸を有するG6PCポリペプチドの発現をもたらす。様々な実施形態では、GSD1aと関連するSNPは、グルタミンを、非グルタミン（X）アミノ酸で置換する。様々な実施形態では、GSD1aと関連するSNPは、アルギニンを、非アルギニン（X）アミノ酸で置換する。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、細胞は、GSD1aと関連するSNPのA・TからG・Cへの改変のために選択される。
【００５０】
一態様では、本発明は、1型糖原病（MPS1）と関連する単一ヌクレオチド多型（SNP）を含むIDUAポリヌクレオチドを編集する方法であって、IDUAポリヌクレオチドを、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドと複合体化した塩基エディターと接触させることを含み、塩基エディターが、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含み、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターをターゲティングしてMPS1と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、方法を提供する。一実施形態では、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインは、改変されたStreptococcus pyogenesのCas9（SpCas9）、またはそのバリアントである。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインは、改変されたプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有する改変されたSpCas9を含む。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、改変されたSpCas9は、核酸配列5'-NGG-3'に対する特異性を有する。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ABE7.10である。様々な実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ヒト核酸配列ACTCTaGGCAGAGGTCTCAA AGGを含む。様々な実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、マウス核酸配列GCTCTaGGCCGAAGTGTCGC AGGを含む。
【００５１】
一態様では、細胞は、細胞、またはその前駆細胞中に、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディター、塩基エディターをコードするポリヌクレオチド；ならびに塩基エディターをターゲティングして1型糖原病（MPS1）と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドを導入することによって生産される。様々な実施形態では、細胞は、幹細胞、幹細胞前駆細胞、または人工多能性幹細胞（iPSC）である。上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、細胞は、MPS1を有する対象に由来する。
【００５２】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるMPS1を治療する方法であって、対象に、上記態様または本明細書で詳述される本発明の任意の他の態様に記載の細胞を投与することを含む、方法を提供する。
【００５３】
本開示の特徴は、特に、添付の特許請求の範囲と共に記載される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理を利用する、例示的実施形態を記載する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】健康な対象と、アンチトリプシン欠損症（A1AD）を有する患者とを比較する模式図である。健康な対象では、アルファ−１アンチトリプシン（A1AT）は、プロテアーゼ損傷から肺を保護し、肝臓はアルファ−１アンチトリプシンを血中に放出する。A1ADを有する患者では、正常に機能するA1ATタンパク質の欠乏は、肺組織損傷をもたらす。さらに、肝細胞中での異常なA1ATの蓄積が肝硬変をもたらす。
【００５５】
【図２】異なる遺伝子型（正常（MM）；アルファ−１アンチトリプシン欠損症のヘテロ接合性キャリア（MZ、SZ）；およびホモ接合性欠損（SS、ZZ））に関する血清アルファ−１アンチトリプシン（A1AT）レベルの典型的な範囲を示す。血清アルファ−１アンチトリプシン（AAT）濃度は、左の「ｙ」軸にμMで表され、これが文献中で一般的である。右の「ｙ」軸は、臨床検査室によって、および異なる測定技術（比濁法または放射状免疫拡散法）によって一般に報告されるように、mg/dL単位への血清AAT濃度の近似転換を示す。
【００５６】
【図３】塩基編集標的配列、およびA1ATタンパク質をコードするSERPINA1遺伝子中の病原性変異の精密修正に関するグラフを提示する。図3Aは、A1ATをコードするSERPINA1遺伝子中の変異に関する精密修正塩基編集戦略を示す。A7（「標的A」）を編集して、野生型（WT）表現型を回復させることができる。一部の事例では、「A」核酸塩基A5/A7を編集して、アミノ酸D341GをA1ATタンパク質中に導入することができる。一部の事例では、A7/A8を編集して、アミノ酸E342GをA1ATタンパク質中に導入することができる。図3Bは、SERPINA1遺伝子内の標的A核酸塩基の位置を示す核酸配列およびコードされるアミノ酸、ならびに、野生型（WT）またはE342K、D341G、もしくはE342Gを含有するA1ATバリアントを発現するHEK293T細胞から分泌されるA1ATのレベル（ng/ml）を示すグラフを提供する。図3Cは、野生型（WT）A1ATタンパク質におけるエラスターゼ活性と、E342KまたはD341Gを含有するA1ATバリアントにおけるそれとを示すグラフである。
【００５７】
【図４】TadA tRNAデアミナーゼから出発してDNAデオキシアデノシンデアミナーゼを進化させるための戦略を示す模式図である。dCas9に融合されたecTadA（TadA*）遺伝子変異体のプラスミドライブラリーと、抗生物質耐性遺伝子を修復するために標的化されたA・TからG・Cへの変異を必要とする選択プラスミドとを担持する大腸菌（E.coli）のライブラリーが示される。生存するTadA*バリアントからの変異を、ヒト細胞中での塩基編集のためにABEアーキテクチャに輸入した。
【００５８】
【図５】SERPINA1遺伝子内の標的「A」核酸塩基の位置を示す核酸配列およびコードされるアミノ酸、ならびにガイドRNA長の関数としてのSERPINA1遺伝子中の位置A5またはA7での編集率を示すグラフを提供する。
【００５９】
【図６】Cas9のPAM相互作用（PI）ドメイン内の変異について富化するために生成されたSpCas9変異体のライブラリーを示す。このライブラリーを、PAM特異性が改変されたSpCas9についてスクリーニングすることができる。
【００６０】
【図７】NGGおよびNGA PAM認識配列を使用して標的部位（強調表示）でA>Gに転換する塩基エディターを使用する、Q347X変異の修正のための戦略を示す模式図である。精密修正は、TAG>CAG（終止コドン>グルタミン）転換をもたらす。
【００６１】
【図８】GSD1a iPSC由来肝細胞に関する成熟サイクルに基づくトランスフェクションスケジュールを提供する。図8Aは、播種、トランスフェクション、および細胞収獲のための代表的な時点を示すトランスフェクションスケジュールの時系列を提供する。図8Bは、5日目および7日目での成熟中のGSD1a iPSC由来肝細胞の画像を示す。
【００６２】
【図９】G6PC Q347XのGSD1aへの塩基編集精密修正を示すデータを提供する。図9Aは、G6PC遺伝子内のオンターゲットおよびバイスタンダー（bystander）「A」核酸塩基の位置を示す核酸配列と、対応するNGGおよびNGA PAM配列、ならびに、NGA PAMまたはNGG PAMを使用したABE-オンターゲット、ABE-バイスタンダー、インデル、およびヌクレアーゼ-インデルについての、HEK293T細胞中でのG6PC Q347Xの塩基編集効率のパーセンテージを示すグラフを提供する。図9Bは、NGA PAMまたはNGG PAMのいずれかを使用したABE-オンターゲット、ABE-バイスタンダー、インデル、およびヌクレアーゼ-インデルについての、患者のiPSC由来肝細胞中のG6PC Q347Xの塩基編集効率を示すグラフを提供する。実線は、実験の平均を示す。
【００６３】
【図１０】G6PC遺伝子内のオンターゲットおよびバイスタンダー「A」核酸塩基の位置を示す核酸配列と、対応するGGA PAM配列、ならびに、mRNAバリアントを使用したABE-オンターゲット、ABE-バイスタンダー、およびインデルについての、患者のiPSC由来肝細胞中のG6PC Q347XのA>G塩基編集のパーセントを示すグラフを提供する。
【００６４】
【図１１】ABE7.10塩基エディターを使用した、マウスおよびヒトIDUA遺伝子中での塩基編集効率のパーセントを示すグラフを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
本明細書の説明および実施例は、本開示の実施形態を詳細に例証する。本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態に限定されず、そのため、変化してもよいことが理解されるべきである。当業者であれば、本開示のいくつかの変形および改変が存在し、それらがその範囲内に包含されることを認識できるであろう。
【００６６】
全ての用語は、それらが当業者によって理解されるように理解されるべきであることが意図される。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
【００６７】
本明細書に開示される一部の実施形態の実施は、別途指摘しない限り、当業界の技術の範囲内にある、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、遺伝学および組換えDNAの従来の技術を用いる。例えば、Sambrook and Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (2012); the series Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al.eds.); the series Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.), PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, および Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6th Edition (R.I. Freshney, ed. (2010))を参照されたい。
【００６８】
本明細書で使用されるセクションの見出しは、整理の目的のためのみであり、記載される主題を限定すると解釈されるべきではない。
【００６９】
本開示の様々な特徴を、単一の実施形態の文脈において記載することができるが、それらの特徴を、別々に、または任意の好適な組合せで提供することもできる。逆に、本開示を、明確さのために別々の実施形態の文脈で本明細書に記載することができるが、本開示を単一の実施形態において実行することもできる。
定義
【００７０】
以下の定義は、本技術分野のものを補足するものであり、本出願に向けられるものであり、任意の関連する、または関連しない事例、例えば、任意の同時所有される特許または特許出願に帰属されるべきではない。本明細書に記載のものと類似するか、または等価である任意の方法および材料を、本開示の試験のための実施において使用することができるが、好ましい方法および材料を本明細書で説明する。したがって、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態だけを説明するためのものであり、限定を意図するものではない。
【００７１】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に、本発明において使用される多くの用語の一般的な定義を提供する: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); および Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。
【００７２】
本出願において、単数形の使用は、特に断りのない限り、複数形を含む。本明細書で使用されるように、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されなければならない。本出願において、「又は」の使用は、別段の記載がない限り、「及び/又は」を意味する。さらに、用語「含む(including)」、ならびに「含む(include)」、「含む(includes)」、および「含まれる(included)」などの他の形態の使用は、非限定的である。
【００７３】
本明細書及びクレームにおいて使用される場合、用語「含む(comprising)」(および「含む(comprise)」および「含む(comprises)」などのそのあらゆる形態)、「有する(having)」(「有する(have)」および「有する(has)」などのそのあらゆる形態)、「含む(including)」(「含む(include)」および「含む(includes)」などのそのあらゆる形態)又は「含む(containing)」(「含む(contains)」および「含む(contain)」などのそのあらゆる形態)は、包括的又は開放的であり、追加の、記載されていない要素又は方法工程を排除しない。本明細書で議論される任意の実施形態は、本開示の任意の方法または組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であると考えられる。さらに、本開示の組成物を用いて、本開示の方法を達成することができる。
【００７４】
用語「約(about)」または「およそ(approximately)」は、当業者によって決定されるように、特定の値について許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野における実務によれば、1以内または1を超える標準偏差内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、所定の値の最大20%、最大10%、最大5%、または最大1%の範囲を意味し得る。別法として、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、同じ桁以内、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内の値を意味することができる。特定の値が出願及び特許請求の範囲に記載されている場合、別段の記載がない限り、その特定の値について許容可能な誤差範囲内にあることを意味する「約」という用語が推定されるべきである。
【００７５】
明細書における「いくつかの実施形態」、「ある実施形態」、「一実施形態」、または「他の実施形態」という言及は、その実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が、本開示の少なくともいくつかの実施形態に含まれるが、必ずしもすべての実施形態に含まれるとは限らないことを意味する。
【００７６】
「アデノシンデアミナーゼ」とは、アデニンまたはアデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒することができるポリペプチドまたはその断片を意味する。ある態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、アデノシンからイノシン、またはデオキシアデノシンからデオキシイノシンへの加水分解的脱アミノ化を触媒するアデノシンデアミナーゼである。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸(DNA) 中のアデニンまたはアデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒する。本明細書中で提供されるアデノシンデアミナーゼ(例えば、遺伝子操作されたアデノシンデアミナーゼ、進化させたアデノシンデアミナーゼ)は、細菌などの任意の生物由来であり得る。
【００７７】
「薬剤（agent）」とは、任意の小分子化合物、抗体、核酸分子、またはポリペプチド、またはそれらの断片を意味する。
【００７８】
「改善する(ameliorate)」とは、疾患の発生または進行を減少させる、抑制する、減衰させる、減少させる、停止させる、または安定させることを意味する。
【００７９】
「改変」とは、本明細書に記載されるような標準技術の公知の方法によって検出されるような、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の変化（増加または減少）を意味する。本明細書で使用される場合、改変は、発現レベルの10%の変化、好ましくは25%の変化、より好ましくは40%の変化、最も好ましくは50%以上の発現レベルの変化を含む。
【００８０】
「アナログ」とは、同一ではないが、類似の機能的または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチドアナログは、対応する天然ポリペプチドの生物学的活性を保持しながら、天然ポリペプチドと比較してそのアナログの機能を増強させる特定の生化学的修飾を有する。そのような生化学的修飾は、例えばリガンド結合を変化させることなく、アナログのプロテアーゼ抵抗性、膜透過性、または半減期を増加させることができる。アナログは、非天然アミノ酸を含み得る。
【００８１】
「投与すること」は、本明細書に記載される1以上の組成物を患者または対象に提供することとして本明細書で言及される。例として、限定するものではないが、組成物の投与、例えば注射は、静脈内(i.v.) 注射、皮下 (s.c.) 注射、皮内 (i.d.) 注射、腹腔内(i.p.) 注射又は筋肉内(i.m.) 注射によって行われ得る。1つ以上のそのような経路を用いることができる。非経口投与は、例えば、ボーラス注射によって、または経時的に徐々に灌流することによって行うことができる。あるいは、または同時に、投与は経口経路によることができる。
【００８２】
「アルファ−１アンチトリプシン（A1AT）タンパク質」は、UniProt受託番号P01009のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。特定の実施形態では、A1ATタンパク質は、以下の参照配列と比較して１つまたは複数の改変を含む。１つの特定の実施形態では、A1ADと関連するA1ATタンパク質は、E342K変異を含む。例示的A1ATアミノ酸配列（>sp|P01009|A1AT_HUMAN Alpha-1-antitrypsin OS=Homo sapiens OX=9606 GN=SERPINA1PE=1 SV=3）が以下に提供される：
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLAEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFS
LYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGF
QELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQ
INDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTV
KVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFL
ENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKA
VLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK.
【００８３】
「塩基エディター (BE)」または「核酸塩基エディター(NBE)」とは、ポリヌクレオチドに結合し、核酸塩基改変活性を有する薬剤を意味する。様々な実施形態において、塩基エディターは、核酸塩基改変ポリペプチド(例えばデアミナーゼ)と、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインとを、ガイドポリヌクレオチド(例えばガイドRNA)と共に含む。様々な態様において、この薬剤は、塩基編集活性を有するタンパク質ドメイン、すなわち、核酸分子(例えばDNA)内の塩基(例えばA、T、C、G、U)を改変することができるドメインを含む生体分子複合体である。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なDNA結合ドメインは、デアミナーゼドメインに融合または連結される。一実施形態において、薬剤は、塩基編集活性を有するドメインを含む融合タンパク質である。別の態様において、塩基編集活性を有するタンパク質ドメインは、ガイドRNAに連結される(例えば、ガイドRNA上のRNA結合モチーフおよびデアミナーゼに融合されたRNA結合ドメインを介して)。ある態様において、塩基編集活性を有するドメインは、核酸分子内の塩基を脱アミノ化することができる。ある態様において、塩基エディターは、DNA分子内の塩基を脱アミノ化することができる。ある態様において、塩基エディターは、DNA内のシトシン(C) またはアデノシン(A) を脱アミノ化することができる。ある態様において、塩基エディターは、シチジン塩基エディター(CBE) である。一部の実施形態では、塩基編集はアデノシン塩基エディター(ABE) である。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadAから進化される。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なDNA結合ドメインは、CRISPR関連(例えばCasまたはCpf1)酵素である。ある態様において、塩基エディターは、デアミナーゼドメインに融合された、触媒的には死んだCas9 (dCas9) である。ある態様において、塩基エディターは、デアミナーゼドメインに融合されたCas9ニッカーゼ(nCas9) である。ある態様において、塩基エディターは、塩基除去修復 (BER) の阻害因子に融合される。ある態様において、塩基除去修復の阻害因子は、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害因子(UGI) である。ある態様において、塩基除去修復の阻害因子は、イノシン塩基除去修復阻害因子である。塩基エディターの詳細は、国際PCT出願番号PCT/2017/045381(国際公開第2018/027078号)およびPCT/US 2016/058344(国際公開第2017/070632号)に記載されており、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage”Nature  551, 464-471 (2017); Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017), および Rees, H.A., et al., “Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.”  Nat Rev Genet. 2018 Dec;19(12):770-788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1も参照のこと (その内容全体を参照により本明細書に組み込む) 。
【００８４】
例として、本明細書に記載される塩基編集の組成物、システム、および方法において使用されるシチジン塩基エディターCBEは、下記に提供される核酸配列（8877塩基対）を有する（Addgene, Watertown, MA.; Komor AC, et al., 2017, Sci Adv., 30;3(8):eaao4774. doi: 10.1126/sciadv.aao4774）。BE4核酸配列に対して少なくとも95%またはそれより高い同一性を有するポリヌクレオチド配列も企図される。
1 atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg
61 cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg
121 ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact
181 cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa
241 atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta
301 ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctggttt agtgaaccgt cagatccgct
361 agagatccgc ggccgctaat acgactcact atagggagag ccgccaccat gagctcagag
421 actggcccag tggctgtgga ccccacattg agacggcgga tcgagcccca tgagtttgag
481 gtattcttcg atccgagaga gctccgcaag gagacctgcc tgctttacga aattaattgg
541 gggggccggc actccatttg gcgacataca tcacagaaca ctaacaagca cgtcgaagtc
601 aacttcatcg agaagttcac gacagaaaga tatttctgtc cgaacacaag gtgcagcatt
661 acctggtttc tcagctggag cccatgcggc gaatgtagta gggccatcac tgaattcctg
721 tcaaggtatc cccacgtcac tctgtttatt tacatcgcaa ggctgtacca ccacgctgac
781 ccccgcaatc gacaaggcct gcgggatttg atctcttcag gtgtgactat ccaaattatg
841 actgagcagg agtcaggata ctgctggaga aactttgtga attatagccc gagtaatgaa
901 gcccactggc ctaggtatcc ccatctgtgg gtacgactgt acgttcttga actgtactgc
961 atcatactgg gcctgcctcc ttgtctcaac attctgagaa ggaagcagcc acagctgaca
1021 ttctttacca tcgctcttca gtcttgtcat taccagcgac tgcccccaca cattctctgg
1081 gccaccgggt tgaaatctgg tggttcttct ggtggttcta gcggcagcga gactcccggg
1141 acctcagagt ccgccacacc cgaaagttct ggtggttctt ctggtggttc tgataaaaag
1201 tattctattg gtttagccat cggcactaat tccgttggat gggctgtcat aaccgatgaa
1261 tacaaagtac cttcaaagaa atttaaggtg ttggggaaca cagaccgtca ttcgattaaa
1321 aagaatctta tcggtgccct cctattcgat agtggcgaaa cggcagaggc gactcgcctg
1381 aaacgaaccg ctcggagaag gtatacacgt cgcaagaacc gaatatgtta cttacaagaa
1441 atttttagca atgagatggc caaagttgac gattctttct ttcaccgttt ggaagagtcc
1501 ttccttgtcg aagaggacaa gaaacatgaa cggcacccca tctttggaaa catagtagat
1561 gaggtggcat atcatgaaaa gtacccaacg atttatcacc tcagaaaaaa gctagttgac
1621 tcaactgata aagcggacct gaggttaatc tacttggctc ttgcccatat gataaagttc
1681 cgtgggcact ttctcattga gggtgatcta aatccggaca actcggatgt cgacaaactg
1741 ttcatccagt tagtacaaac ctataatcag ttgtttgaag agaaccctat aaatgcaagt
1801 ggcgtggatg cgaaggctat tcttagcgcc cgcctctcta aatcccgacg gctagaaaac
1861 ctgatcgcac aattacccgg agagaagaaa aatgggttgt tcggtaacct tatagcgctc
1921 tcactaggcc tgacaccaaa ttttaagtcg aacttcgact tagctgaaga tgccaaattg
1981 cagcttagta aggacacgta cgatgacgat ctcgacaatc tactggcaca aattggagat
2041 cagtatgcgg acttattttt ggctgccaaa aaccttagcg atgcaatcct cctatctgac
2101 atactgagag ttaatactga gattaccaag gcgccgttat ccgcttcaat gatcaaaagg
2161 tacgatgaac atcaccaaga cttgacactt ctcaaggccc tagtccgtca gcaactgcct
2221 gagaaatata aggaaatatt ctttgatcag tcgaaaaacg ggtacgcagg ttatattgac
2281 ggcggagcga gtcaagagga attctacaag tttatcaaac ccatattaga gaagatggat
2341 gggacggaag agttgcttgt aaaactcaat cgcgaagatc tactgcgaaa gcagcggact
2401 ttcgacaacg gtagcattcc acatcaaatc cacttaggcg aattgcatgc tatacttaga
2461 aggcaggagg atttttatcc gttcctcaaa gacaatcgtg aaaagattga gaaaatccta
2521 acctttcgca taccttacta tgtgggaccc ctggcccgag ggaactctcg gttcgcatgg
2581 atgacaagaa agtccgaaga aacgattact ccatggaatt ttgaggaagt tgtcgataaa
2641 ggtgcgtcag ctcaatcgtt catcgagagg atgaccaact ttgacaagaa tttaccgaac
2701 gaaaaagtat tgcctaagca cagtttactt tacgagtatt tcacagtgta caatgaactc
2761 acgaaagtta agtatgtcac tgagggcatg cgtaaacccg cctttctaag cggagaacag
2821 aagaaagcaa tagtagatct gttattcaag accaaccgca aagtgacagt taagcaattg
2881 aaagaggact actttaagaa aattgaatgc ttcgattctg tcgagatctc cggggtagaa
2941 gatcgattta atgcgtcact tggtacgtat catgacctcc taaagataat taaagataag
3001 gacttcctgg ataacgaaga gaatgaagat atcttagaag atatagtgtt gactcttacc
3061 ctctttgaag atcgggaaat gattgaggaa agactaaaaa catacgctca cctgttcgac
3121 gataaggtta tgaaacagtt aaagaggcgt cgctatacgg gctggggacg attgtcgcgg
3181 aaacttatca acgggataag agacaagcaa agtggtaaaa ctattctcga ttttctaaag
3241 agcgacggct tcgccaatag gaactttatg cagctgatcc atgatgactc tttaaccttc
3301 aaagaggata tacaaaaggc acaggtttcc ggacaagggg actcattgca cgaacatatt
3361 gcgaatcttg ctggttcgcc agccatcaaa aagggcatac tccagacagt caaagtagtg
3421 gatgagctag ttaaggtcat gggacgtcac aaaccggaaa acattgtaat cgagatggca
3481 cgcgaaaatc aaacgactca gaaggggcaa aaaaacagtc gagagcggat gaagagaata
3541 gaagagggta ttaaagaact gggcagccag atcttaaagg agcatcctgt ggaaaatacc
3601 caattgcaga acgagaaact ttacctctat tacctacaaa atggaaggga catgtatgtt
3661 gatcaggaac tggacataaa ccgtttatct gattacgacg tcgatcacat tgtaccccaa
3721 tcctttttga aggacgattc aatcgacaat aaagtgctta cacgctcgga taagaaccga
3781 gggaaaagtg acaatgttcc aagcgaggaa gtcgtaaaga aaatgaagaa ctattggcgg
3841 cagctcctaa atgcgaaact gataacgcaa agaaagttcg ataacttaac taaagctgag
3901 aggggtggct tgtctgaact tgacaaggcc ggatttatta aacgtcagct cgtggaaacc
3961 cgccaaatca caaagcatgt tgcacagata ctagattccc gaatgaatac gaaatacgac
4021 gagaacgata agctgattcg ggaagtcaaa gtaatcactt taaagtcaaa attggtgtcg
4081 gacttcagaa aggattttca attctataaa gttagggaga taaataacta ccaccatgcg
4141 cacgacgctt atcttaatgc cgtcgtaggg accgcactca ttaagaaata cccgaagcta
4201 gaaagtgagt ttgtgtatgg tgattacaaa gtttatgacg tccgtaagat gatcgcgaaa
4261 agcgaacagg agataggcaa ggctacagcc aaatacttct tttattctaa cattatgaat
4321 ttctttaaga cggaaatcac tctggcaaac ggagagatac gcaaacgacc tttaattgaa
4381 accaatgggg agacaggtga aatcgtatgg gataagggcc gggacttcgc gacggtgaga
4441 aaagttttgt ccatgcccca agtcaacata gtaaagaaaa ctgaggtgca gaccggaggg
4501 ttttcaaagg aatcgattct tccaaaaagg aatagtgata agctcatcgc tcgtaaaaag
4561 gactgggacc cgaaaaagta cggtggcttc gatagcccta cagttgccta ttctgtccta
4621 gtagtggcaa aagttgagaa gggaaaatcc aagaaactga agtcagtcaa agaattattg
4681 gggataacga ttatggagcg ctcgtctttt gaaaagaacc ccatcgactt ccttgaggcg
4741 aaaggttaca aggaagtaaa aaaggatctc ataattaaac taccaaagta tagtctgttt
4801 gagttagaaa atggccgaaa acggatgttg gctagcgccg gagagcttca aaaggggaac
4861 gaactcgcac taccgtctaa atacgtgaat ttcctgtatt tagcgtccca ttacgagaag
4921 ttgaaaggtt cacctgaaga taacgaacag aagcaacttt ttgttgagca gcacaaacat
4981 tatctcgacg aaatcataga gcaaatttcg gaattcagta agagagtcat cctagctgat
5041 gccaatctgg acaaagtatt aagcgcatac aacaagcaca gggataaacc catacgtgag
5101 caggcggaaa atattatcca tttgtttact cttaccaacc tcggcgctcc agccgcattc
5161 aagtattttg acacaacgat agatcgcaaa cgatacactt ctaccaagga ggtgctagac
5221 gcgacactga ttcaccaatc catcacggga ttatatgaaa ctcggataga tttgtcacag
5281 cttgggggtg actctggtgg ttctggagga tctggtggtt ctactaatct gtcagatatt
5341 attgaaaagg agaccggtaa gcaactggtt atccaggaat ccatcctcat gctcccagag
5401 gaggtggaag aagtcattgg gaacaagccg gaaagcgata tactcgtgca caccgcctac
5461 gacgagagca ccgacgagaa tgtcatgctt ctgactagcg acgcccctga atacaagcct
5521 tgggctctgg tcatacagga tagcaacggt gagaacaaga ttaagatgct ctctggtggt
5581 tctggaggat ctggtggttc tactaatctg tcagatatta ttgaaaagga gaccggtaag
5641 caactggtta tccaggaatc catcctcatg ctcccagagg aggtggaaga agtcattggg
5701 aacaagccgg aaagcgatat actcgtgcac accgcctacg acgagagcac cgacgagaat
5761 gtcatgcttc tgactagcga cgcccctgaa tacaagcctt gggctctggt catacaggat
5821 agcaacggtg agaacaagat taagatgctc tctggtggtt ctcccaagaa gaagaggaaa
5881 gtctaaccgg tcatcatcac catcaccatt gagtttaaac ccgctgatca gcctcgactg
5941 tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg
6001 aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga
6061 gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg
6121 aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa
6181 ccagctgggg ctcgataccg tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca tggtcatagc
6241 tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca
6301 taaagtgtaa agcctagggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct
6361 cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac
6421 gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc
6481 tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt
6541 tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg
6601 ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg
6661 agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat
6721 accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta
6781 ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct
6841 gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc
6901 ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa
6961 gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg
7021 taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag
7081 tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt
7141 gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta
7201 cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc
7261 agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca
7321 cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa
7381 cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat
7441 ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct
7501 taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt
7561 tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat
7621 ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta
7681 atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg
7741 gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt
7801 tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg
7861 cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg
7921 taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc
7981 ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa
8041 ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac
8101 cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt
8161 ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg
8221 gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa
8281 gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata
8341 aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc gacggatcgg
8401 gagatcgatc tcccgatccc ctagggtcga ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat
8461 agttaagcca gtatctgctc cctgcttgtg tgttggaggt cgctgagtag tgcgcgagca
8521 aaatttaagc tacaacaagg caaggcttga ccgacaattg catgaagaat ctgcttaggg
8581 ttaggcgttt tgcgctgctt cgcgatgtac gggccagata tacgcgttga cattgattat
8641 tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt
8701 tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc
8761 cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac
8821 gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatc
【００８５】
ある実施形態では、BE4核酸配列は、以下のもののうちの１つから選択される。
【００８６】
オリジナルのBE4
ATGagctcagagactggcccagtggctgtggaccccacattgagacggcggatcgagccccatgagtttgaggtattcttcgatccgagagagctccgcaaggagacctgcctgctttacgaaattaattgggggggccggcactccatttggcgacatacatcacagaacactaacaagcacgtcgaagtcaacttcatcgagaagttcacgacagaaagatatttctgtccgaacacaaggtgcagcattacctggtttctcagctggagcccatgcggcgaatgtagtagggccatcactgaattcctgtcaaggtatccccacgtcactctgtttatttacatcgcaaggctgtaccaccacgctgacccccgcaatcgacaaggcctgcgggatttgatctcttcaggtgtgactatccaaattatgactgagcaggagtcaggatactgctggagaaactttgtgaattatagcccgagtaatgaagcccactggcctaggtatccccatctgtgggtacgactgtacgttcttgaactgtactgcatcatactgggcctgcctccttgtctcaacattctgagaaggaagcagccacagctgacattctttaccatcgctcttcagtcttgtcattaccagcgactgcccccacacattctctgggccaccgggttgaaatctggtggttcttctggtggttctagcggcagcgagactcccgggacctcagagtccgccacacccgaaagttctggtggttcttctggtggttctgataaaaagtattctattggtttagccatcggcactaattccgttggatgggctgtcataaccgatgaatacaaagtaccttcaaagaaatttaaggtgttggggaacacagaccgtcattcgattaaaaagaatcttatcggtgccctcctattcgatagtggcgaaacggcagaggcgactcgcctgaaacgaaccgctcggagaaggtatacacgtcgcaagaaccgaatatgttacttacaagaaatttttagcaatgagatggccaaagttgacgattctttctttcaccgtttggaagagtccttccttgtcgaagaggacaagaaacatgaacggcaccccatctttggaaacatagtagatgaggtggcatatcatgaaaagtacccaacgatttatcacctcagaaaaaagctagttgactcaactgataaagcggacctgaggttaatctacttggctcttgcccatatgataaagttccgtgggcactttctcattgagggtgatctaaatccggacaactcggatgtcgacaaactgttcatccagttagtacaaacctataatcagttgtttgaagagaaccctataaatgcaagtggcgtggatgcgaaggctattcttagcgcccgcctctctaaatcccgacggctagaaaacctgatcgcacaattacccggagagaagaaaaatgggttgttcggtaaccttatagcgctctcactaggcctgacaccaaattttaagtcgaacttcgacttagctgaagatgccaaattgcagcttagtaaggacacgtacgatgacgatctcgacaatctactggcacaaattggagatcagtatgcggacttatttttggctgccaaaaaccttagcgatgcaatcctcctatctgacatactgagagttaatactgagattaccaaggcgccgttatccgcttcaatgatcaaaaggtacgatgaacatcaccaagacttgacacttctcaaggccctagtccgtcagcaactgcctgagaaatataaggaaatattctttgatcagtcgaaaaacgggtacgcaggttatattgacggcggagcgagtcaagaggaattctacaagtttatcaaacccatattagagaagatggatgggacggaagagttgcttgtaaaactcaatcgcgaagatctactgcgaaagcagcggactttcgacaacggtagcattccacatcaaatccacttaggcgaattgcatgctatacttagaaggcaggaggatttttatccgttcctcaaagacaatcgtgaaaagattgagaaaatcctaacctttcgcataccttactatgtgggacccctggcccgagggaactctcggttcgcatggatgacaagaaagtccgaagaaacgattactccatggaattttgaggaagttgtcgataaaggtgcgtcagctcaatcgttcatcgagaggatgaccaactttgacaagaatttaccgaacgaaaaagtattgcctaagcacagtttactttacgagtatttcacagtgtacaatgaactcacgaaagttaagtatgtcactgagggcatgcgtaaacccgcctttctaagcggagaacagaagaaagcaatagtagatctgttattcaagaccaaccgcaaagtgacagttaagcaattgaaagaggactactttaagaaaattgaatgcttcgattctgtcgagatctccggggtagaagatcgatttaatgcgtcacttggtacgtatcatgacctcctaaagataattaaagataaggacttcctggataacgaagagaatgaagatatcttagaagatatagtgttgactcttaccctctttgaagatcgggaaatgattgaggaaagactaaaaacatacgctcacctgttcgacgataaggttatgaaacagttaaagaggcgtcgctatacgggctggggacgattgtcgcggaaacttatcaacgggataagagacaagcaaagtggtaaaactattctcgattttctaaagagcgacggcttcgccaataggaactttatgcagctgatccatgatgactctttaaccttcaaagaggatatacaaaaggcacaggtttccggacaaggggactcattgcacgaacatattgcgaatcttgctggttcgccagccatcaaaaagggcatactccagacagtcaaagtagtggatgagctagttaaggtcatgggacgtcacaaaccggaaaacattgtaatcgagatggcacgcgaaaatcaaacgactcagaaggggcaaaaaaacagtcgagagcggatgaagagaatagaagagggtattaaagaactgggcagccagatcttaaaggagcatcctgtggaaaatacccaattgcagaacgagaaactttacctctattacctacaaaatggaagggacatgtatgttgatcaggaactggacataaaccgtttatctgattacgacgtcgatcacattgtaccccaatcctttttgaaggacgattcaatcgacaataaagtgcttacacgctcggataagaaccgagggaaaagtgacaatgttccaagcgaggaagtcgtaaagaaaatgaagaactattggcggcagctcctaaatgcgaaactgataacgcaaagaaagttcgataacttaactaaagctgagaggggtggcttgtctgaacttgacaaggccggatttattaaacgtcagctcgtggaaacccgccaaatcacaaagcatgttgcacagatactagattcccgaatgaatacgaaatacgacgagaacgataagctgattcgggaagtcaaagtaatcactttaaagtcaaaattggtgtcggacttcagaaaggattttcaattctataaagttagggagataaataactaccaccatgcgcacgacgcttatcttaatgccgtcgtagggaccgcactcattaagaaatacccgaagctagaaagtgagtttgtgtatggtgattacaaagtttatgacgtccgtaagatgatcgcgaaaagcgaacaggagataggcaaggctacagccaaatacttcttttattctaacattatgaatttctttaagacggaaatcactctggcaaacggagagatacgcaaacgacctttaattgaaaccaatggggagacaggtgaaatcgtatgggataagggccgggacttcgcgacggtgagaaaagttttgtccatgccccaagtcaacatagtaaagaaaactgaggtgcagaccggagggttttcaaaggaatcgattcttccaaaaaggaatagtgataagctcatcgctcgtaaaaaggactgggacccgaaaaagtacggtggcttcgatagccctacagttgcctattctgtcctagtagtggcaaaagttgagaagggaaaatccaagaaactgaagtcagtcaaagaattattggggataacgattatggagcgctcgtcttttgaaaagaaccccatcgacttccttgaggcgaaaggttacaaggaagtaaaaaaggatctcataattaaactaccaaagtatagtctgtttgagttagaaaatggccgaaaacggatgttggctagcgccggagagcttcaaaaggggaacgaactcgcactaccgtctaaatacgtgaatttcctgtatttagcgtcccattacgagaagttgaaaggttcacctgaagataacgaacagaagcaactttttgttgagcagcacaaacattatctcgacgaaatcatagagcaaatttcggaattcagtaagagagtcatcctagctgatgccaatctggacaaagtattaagcgcatacaacaagcacagggataaacccatacgtgagcaggcggaaaatattatccatttgtttactcttaccaacctcggcgctccagccgcattcaagtattttgacacaacgatagatcgcaaacgatacacttctaccaaggaggtgctagacgcgacactgattcaccaatccatcacgggattatatgaaactcggatagatttgtcacagcttgggggtgactctggtggttctggaggatctggtggttctactaatctgtcagatattattgaaaaggagaccggtaagcaactggttatccaggaatccatcctcatgctcccagaggaggtggaagaagtcattgggaacaagccggaaagcgatatactcgtgcacaccgcctacgacgagagcaccgacgagaatgtcatgcttctgactagcgacgcccctgaatacaagccttgggctctggtcatacaggatagcaacggtgagaacaagattaagatgctctctggtggttctggaggatctggtggttctactaatctgtcagatattattgaaaaggagaccggtaagcaactggttatccaggaatccatcctcatgctcccagaggaggtggaagaagtcattgggaacaagccggaaagcgatatactcgtgcacaccgcctacgacgagagcaccgacgagaatgtcatgcttctgactagcgacgcccctgaatacaagccttgggctctggtcatacaggatagcaacggtgagaacaagattaagatgctctctggtggttctAAAAGGACGGCGGACGGATCAGAGTTCGAGAGTCCGAAAAAAAAACGAAAGGTCGAAtaa
【００８７】
BE4コドン最適化１
ATGTCATCCGAAACCGGGCCAGTGGCCGTAGACCCAACACTCAGGAGGCGGATAGAACCCCATGAGTTTGAAGTGTTCTTCGACCCCAGAGAGCTGCGCAAAGAGACTTGCCTCCTGTATGAAATAAATTGGGGGGGTCGCCATTCAATTTGGAGGCACACTAGCCAGAATACTAACAAACACGTGGAGGTAAATTTTATCGAGAAGTTTACCACCGAAAGATACTTTTGCCCCAATACACGGTGTTCAATTACCTGGTTTCTGTCATGGAGTCCATGTGGAGAATGTAGTAGAGCGATAACTGAGTTCCTGTCTCGATATCCTCACGTCACGTTGTTTATATACATCGCTCGGCTTTATCACCATGCGGACCCGCGGAACAGGCAAGGTCTTCGGGACCTCATATCCTCTGGGGTGACCATCCAGATAATGACGGAGCAAGAGAGCGGATACTGCTGGCGAAACTTTGTTAACTACAGCCCAAGCAATGAGGCACACTGGCCTAGATATCCGCATCTCTGGGTTCGACTGTATGTCCTTGAACTGTACTGCATAATTCTGGGACTTCCGCCATGCTTGAACATTCTGCGGCGGAAACAACCACAGCTGACCTTTTTCACGATTGCTCTCCAAAGTTGTCACTACCAGCGATTGCCACCCCACATCTTGTGGGCTACTGGACTCAAGTCTGGAGGAAGTTCAGGCGGAAGCAGCGGGTCTGAAACGCCCGGAACCTCAGAGAGCGCAACGCCCGAAAGCTCTGGAGGGTCAAGTGGTGGTAGTGATAAGAAATACTCCATCGGCCTCGCCATCGGTACGAATTCTGTCGGTTGGGCCGTTATCACCGATGAGTACAAGGTCCCTTCTAAGAAATTCAAGGTTTTGGGCAATACAGACCGCCATTCTATAAAAAAAAACCTGATCGGCGCCCTTTTGTTTGACAGTGGTGAGACTGCTGAAGCGACTCGCCTGAAGCGAACTGCCAGGAGGCGGTATACGAGGCGAAAAAACCGAATTTGTTACCTCCAGGAGATTTTCTCAAATGAAATGGCCAAGGTAGATGATAGTTTTTTTCACCGCTTGGAAGAAAGTTTTCTCGTTGAGGAGGACAAAAAGCACGAGAGGCACCCAATCTTTGGCAACATAGTCGATGAGGTCGCATACCATGAGAAATATCCTACGATCTATCATCTCCGCAAGAAGCTGGTCGATAGCACGGATAAAGCTGACCTCCGGCTGATCTACCTTGCTCTTGCTCACATGATTAAATTCAGGGGCCATTTCCTGATAGAAGGAGACCTCAATCCCGACAATTCTGATGTCGACAAACTGTTTATTCAGCTCGTTCAGACCTATAATCAACTCTTTGAGGAGAACCCCATCAATGCTTCAGGGGTGGACGCAAAGGCCATTTTGTCCGCGCGCTTGAGTAAATCACGACGCCTCGAGAATTTGATAGCTCAACTGCCGGGTGAGAAGAAAAACGGGTTGTTTGGGAATCTCATAGCGTTGAGTTTGGGACTTACGCCAAACTTTAAGTCTAACTTTGATTTGGCCGAAGATGCCAAATTGCAGCTGTCCAAAGATACCTATGATGACGACTTGGATAACCTTCTTGCGCAGATTGGTGACCAATACGCGGATCTGTTTCTTGCCGCAAAAAATCTGTCCGACGCCATACTCTTGTCCGATATACTGCGCGTCAATACTGAGATAACTAAGGCTCCCCTCAGCGCGTCCATGATTAAAAGATACGATGAGCACCACCAAGATCTCACTCTGTTGAAAGCCCTGGTTCGCCAGCAGCTTCCAGAGAAGTATAAGGAGATATTTTTCGACCAATCTAAAAACGGCTATGCGGGTTACATTGACGGTGGCGCCTCTCAAGAAGAATTCTACAAGTTTATAAAGCCGATACTTGAGAAAATGGACGGTACAGAGGAATTGTTGGTTAAGCTCAATCGCGAGGACTTGTTGAGAAAGCAGCGCACATTTGACAATGGTAGTATTCCACACCAGATTCATCTGGGCGAGTTGCATGCCATTCTTAGAAGACAAGAAGATTTTTATCCGTTTCTGAAAGATAACAGAGAAAAGATTGAAAAGATACTTACCTTTCGCATACCGTATTATGTAGGTCCCCTGGCTAGAGGGAACAGTCGCTTCGCTTGGATGACTCGAAAATCAGAAGAAACAATAACCCCCTGGAATTTTGAAGAAGTGGTAGATAAAGGTGCGAGTGCCCAATCTTTTATTGAGCGGATGACAAATTTTGACAAGAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCCAAGCATTCCCTTTTGTATGAATACTTTACAGTATATAATGAACTGACTAAAGTGAAGTACGTTACCGAGGGGATGCGAAAGCCAGCTTTTCTCAGTGGCGAGCAGAAAAAAGCAATAGTTGACCTGCTGTTCAAGACGAATAGGAAGGTTACCGTCAAACAGCTCAAAGAAGATTACTTTAAAAAGATCGAATGTTTTGATTCAGTTGAGATAAGCGGAGTAGAGGATAGATTTAACGCAAGTCTTGGAACTTATCATGACCTTTTGAAGATCATCAAGGATAAAGATTTTTTGGACAACGAGGAGAATGAAGATATCCTGGAAGATATAGTACTTACCTTGACGCTTTTTGAAGATCGAGAGATGATCGAGGAGCGACTTAAGACGTACGCACATCTCTTTGACGATAAGGTTATGAAACAATTGAAACGCCGGCGGTATACTGGCTGGGGCAGGCTTTCTCGAAAGCTGATTAATGGTATCCGCGATAAGCAGTCTGGAAAGACAATCCTTGACTTTCTGAAAAGTGATGGATTTGCAAATAGAAACTTTATGCAGCTTATACATGATGACTCTTTGACGTTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTATCCGGCCAAGGGGATAGCCTCCATGAACACATAGCCAACCTGGCCGGCTCACCAGCTATTAAAAAGGGAATATTGCAAACCGTTAAGGTTGTTGACGAACTCGTTAAGGTTATGGGCCGACACAAACCAGAGAATATCGTGATTGAGATGGCTAGGGAGAATCAGACCACTCAAAAAGGTCAGAAAAATTCTCGCGAAAGGATGAAGCGAATTGAAGAGGGAATCAAAGAACTTGGCTCTCAAATTTTGAAAGAGCACCCGGTAGAAAACACTCAGCTGCAGAATGAAAAGCTGTATCTGTATTATCTGCAGAATGGTCGAGATATGTACGTTGATCAGGAGCTGGATATCAATAGGCTCAGTGACTACGATGTCGACCACATCGTTCCTCAATCTTTCCTGAAAGATGACTCTATCGACAACAAAGTGTTGACGCGATCAGATAAGAACCGGGGAAAATCCGACAATGTACCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAGATGAAAAACTATTGGAGACAATTGCTGAACGCCAAGCTCATAACACAACGCAAGTTCGATAACTTGACGAAAGCCGAAAGAGGTGGGTTGTCAGAATTGGACAAAGCTGGCTTTATTAAGCGCCAATTGGTGGAGACCCGGCAGATTACGAAACACGTAGCACAAATTTTGGATTCACGAATGAATACCAAATACGACGAAAACGACAAATTGATACGCGAGGTGAAAGTGATTACGCTTAAGAGTAAGTTGGTTTCCGATTTCAGGAAGGATTTTCAGTTTTACAAAGTAAGAGAAATAAACAACTACCACCACGCCCATGATGCTTACCTCAACGCGGTAGTTGGCACAGCTCTTATCAAAAAATATCCAAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTTTACGGTGACTATAAAGTATACGACGTTCGGAAGATGATAGCCAAATCAGAGCAGGAAATTGGGAAGGCAACCGCAAAATACTTCTTCTATTCAAACATCATGAACTTCTTTAAGACGGAGATTACGCTCGCGAACGGCGAAATACGCAAGAGGCCCCTCATAGAGACTAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTATGGGACAAAGGACGGGACTTTGCGACCGTTAGAAAAGTACTTTCAATGCCACAAGTGAATATTGTTAAAAAGACAGAAGTACAAACAGGGGGGTTCAGTAAGGAATCCATTTTGCCCAAGCGGAACAGTGATAAATTGATAGCAAGGAAAAAAGATTGGGACCCTAAGAAGTACGGTGGTTTCGACTCTCCTACCGTTGCATATTCAGTCCTTGTAGTTGCGAAAGTGGAAAAGGGGAAAAGTAAGAAGCTTAAGAGTGTTAAAGAGCTTCTGGGCATAACCATAATGGAACGGTCTAGCTTCGAGAAAAATCCAATTGACTTTCTCGAGGCTAAAGGTTACAAGGAGGTAAAAAAGGACCTGATAATTAAACTCCCAAAGTACAGTCTCTTCGAGTTGGAGAATGGGAGGAAGAGAATGTTGGCATCTGCAGGGGAGCTCCAAAAGGGGAACGAGCTGGCTCTGCCTTCAAAATACGTGAACTTTCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAACTCAAGGGTTCTCCTGAGGATAACGAGCAGAAACAGCTGTTTGTAGAGCAGCACAAGCATTACCTGGACGAGATAATTGAGCAAATTAGTGAGTTCTCAAAAAGAGTAATCCTTGCAGACGCGAATCTGGATAAAGTTCTTTCCGCCTATAATAAGCACCGGGACAAGCCTATACGAGAACAAGCCGAGAACATCATTCACCTCTTTACCCTTACTAATCTGGGCGCGCCGGCCGCCTTCAAATACTTCGACACCACGATAGACAGGAAAAGGTATACGAGTACCAAAGAAGTACTTGACGCCACTCTCATCCACCAGTCTATAACAGGGTTGTACGAAACGAGGATAGATTTGTCCCAGCTCGGCGGCGACTCAGGAGGGTCAGGCGGCTCCGGTGGATCAACGAATCTTTCCGACATAATCGAGAAAGAAACCGGCAAACAGTTGGTGATCCAAGAATCAATCCTGATGCTGCCTGAAGAAGTAGAAGAGGTGATTGGCAACAAACCTGAGTCTGACATTCTTGTCCACACCGCGTATGACGAGAGCACGGACGAGAACGTTATGCTTCTCACTAGCGACGCCCCTGAGTATAAACCATGGGCGCTGGTCATCCAAGATTCCAATGGGGAAAACAAGATTAAGATGCTTAGTGGTGGGTCTGGAGGGAGCGGTGGGTCCACGAACCTCAGCGACATTATTGAAAAAGAGACTGGTAAACAACTTGTAATACAAGAGTCTATTCTGATGTTGCCTGAAGAGGTGGAGGAGGTGATTGGGAACAAACCGGAGTCTGATATACTTGTTCATACCGCCTATGACGAATCTACTGATGAGAATGTGATGCTTTTaACGTCAGACGCTCCCGAGTACAAACCCTGGGCTCTGGTGATTCAGGACAGCAATGGTGAGAATAAGATTAAAATGTTGAGTGGGGGCTCAAAGCGCACGGCTGACGGTAGCGAATTTGAGAGCCCCAAAAAAAAACGAAAGGTCGAAtaa
【００８８】
BE4コドン最適化２
ATGAGCAGCGAGACAGGCCCTGTGGCTGTGGATCCTACACTGCGGAGAAGAATCGAGCCCCACGAGTTCGAGGTGTTCTTCGACCCCAGAGAGCTGCGGAAAGAGACATGCCTGCTGTACGAGATCAACTGGGGCGGCAGACACTCTATCTGGCGGCACACAAGCCAGAACACCAACAAGCACGTGGAAGTGAACTTTATCGAGAAGTTTACGACCGAGCGGTACTTCTGCCCCAACACCAGATGCAGCATCACCTGGTTTCTGAGCTGGTCCCCTTGCGGCGAGTGCAGCAGAGCCATCACCGAGTTTCTGTCCAGATATCCCCACGTGACCCTGTTCATCTATATCGCCCGGCTGTACCACCACGCCGATCCTAGAAATAGACAGGGACTGCGCGACCTGATCAGCAGCGGAGTGACCATCCAGATCATGACCGAGCAAGAGAGCGGCTACTGCTGGCGGAACTTCGTGAACTACAGCCCCAGCAACGAAGCCCACTGGCCTAGATATCCTCACCTGTGGGTCCGACTGTACGTGCTGGAACTGTACTGCATCATCCTGGGCCTGCCTCCATGCCTGAACATCCTGAGAAGAAAGCAGCCTCAGCTGACCTTCTTCACAATCGCCCTGCAGAGCTGCCACTACCAGAGACTGCCTCCACACATCCTGTGGGCCACCGGACTTAAGAGCGGAGGATCTAGCGGCGGCTCTAGCGGATCTGAGACACCTGGCACAAGCGAGTCTGCCACACCTGAGAGTAGCGGCGGATCTTCTGGCGGCTCCGACAAGAAGTACTCTATCGGACTGGCCATCGGCACCAACTCTGTTGGATGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAATCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACTCTGGCGAAACAGCCGAAGCCACCAGACTGAAGAGAACCGCCAGGCGGAGATACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGATGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGAGACTGATCTACCTGGCTCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTTCTGATCGAGGGCGATCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCTCTGGCGTGGACGCCAAGGCTATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGAAGGCTGGAAAACCTGATCGCCCAGCTGCCTGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGACTGACCCCTAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGATCAGTACGCCGACTTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGATATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACAAAGGCCCCTCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGATCTGACCCTGCTGAAGGCCCTCGTTAGACAGCAGCTGCCAGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGATCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGATGGCGGAGCCAGCCAAGAGGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAATGGCTCTATCCCTCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGAGACAAGAGGACTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCAGGATCCCCTACTACGTGGGACCACTGGCCAGAGGCAATAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACACCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCTCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCTAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACTCCCTGCTGTATGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTTCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATTGTGGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAAATCAGCGGCGTGGAAGATCGGTTCAATGCCAGCCTGGGCACATACCACGACCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAGAACGAGGACATTCTCGAGGACATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACATACGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAACTGAAGCGGAGGCGGTACACAGGCTGGGGCAGACTGTCTCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGATAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAAGGCGATTCTCTGCACGAGCACATTGCCAACCTGGCCGGATCTCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTTGTGAAAGTGATGGGCAGACACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACACAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGACGGGATATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAACCGGCTGAGCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCCCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGATAACAAGGTCCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGATAACGTGCCCTCCGAAGAGGTGGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGCGGAAGTTCGATAACCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTTGATAAGGCCGGCTTCATTAAGCGGCAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACCAAACACGTGGCACAGATTCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTCATCACCCTGAAGTCTAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTCTACAAAGTGCGGGAAATCAACAACTACCATCACGCCCACGACGCCTACCTGAATGCCGTTGTTGGAACAGCCCTGATCAAGAAGTATCCCAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAACAAGAGATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTTTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACAGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAAAGACCCCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCAGAGATTTTGCCACAGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAGAAAACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCTAAGCGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGATAGCCCTACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAAAAGCTCAAGAGCGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTTGAGAAGAACCCGATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTCAAGAAGGACCTCATCATCAAGCTCCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAAAATGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCTCAGCAGGCGAACTGCAGAAAGGCAATGAACTGGCCCTGCCTAGCAAATACGTCAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAATGAGCAAAAGCAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAACCTGGATAAGGTGCTGTCTGCCTATAACAAGCACCGGGACAAGCCTATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAACCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACACTGATCCACCAGTCTATCACCGGCCTGTACGAAACCCGGATCGACCTGTCTCAGCTCGGCGGCGATTCTGGTGGTTCTGGCGGAAGTGGCGGATCCACCAATCTGAGCGACATCATCGAAAAAGAGACAGGCAAGCAGCTCGTGATCCAAGAATCCATCCTGATGCTGCCTGAAGAGGTTGAGGAAGTGATCGGCAACAAGCCTGAGTCCGACATCCTGGTGCACACCGCCTACGATGAGAGCACCGATGAGAACGTCATGCTGCTGACAAGCGACGCCCCTGAGTACAAGCCTTGGGCTCTCGTGATTCAGGACAGCAATGGGGAGAACAAGATCAAGATGCTGAGCGGAGGTAGCGGAGGCAGTGGCGGAAGCACAAACCTGTCTGATATCATTGAAAAAGAAACCGGGAAGCAACTGGTCATTCAAGAGTCCATTCTCATGCTCCCGGAAGAAGTCGAGGAAGTCATTGGAAACAAACCCGAGAGCGATATTCTGGTCCACACAGCCTATGACGAGTCTACAGACGAAAACGTGATGCTCCTGACCTCTGACGCTCCCGAGTATAAGCCCTGGGCACTTGTTATCCAGGACTCTAACGGGGAAAACAAAATCAAAATGTTGTCCGGCGGCAGCAAGCGGACAGCCGATGGATCTGAGTTCGAGAGCCCCAAGAAGAAACGGAAGGTgGAGtaa
【００８９】
「塩基編集活性」とは、ポリヌクレオチド内の塩基を化学的に改変するように作用することを意味する。一実施形態では、第1の塩基が第2の塩基に変換される。一実施形態では、塩基編集活性は、例えば標的C・GをT・Aに変換する、シチジンデアミナーゼ活性である。別の実施形態では、塩基編集活性は、例えばA・TをG・Cに変換する、アデノシンまたはアデニンデアミナーゼ活性である。
【００９０】
用語「塩基エディターシステム」は、標的ヌクレオチド配列の核酸塩基を編集するための系を指す。様々な実施形態において、塩基エディター(BE) システムは、(1)ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインと、前記核酸塩基を脱アミノ化するためのデアミナーゼドメイン、および(2) ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインに伴うガイドポリヌクレオチド(例えばガイドRNA)を含む。いくつかの実施形態において、塩基エディターシステムは、(1)ポリヌクレオチドプログラミング可能なDNA結合ドメインと、前記核酸塩基を脱アミノ化するためのデアミナーゼドメインとを含む塩基エディター(BE) 、および(2) ポリヌクレオチドプログラミング可能なDNA結合ドメインに伴うガイドRNAを含む。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラミング可能なDNA結合ドメインである。いくつかの実施形態では、塩基編集はシチジン塩基エディター(CBE) である。ある態様において、塩基エディターは、アデニンまたはアデノシン塩基エディター(ABE) である。
【００９１】
「保存的アミノ酸置換」または「保存的変異」という用語は、あるアミノ酸が共通の特性を有する別のアミノ酸に置き換わることを指す。個々のアミノ酸間の共通の性質を定義するための機能的な方法は、相同的な生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化された頻度を分析することである(Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979))。このような分析によれば、グループ内のアミノ酸が互いに優先的に交換され、それゆえに全体的なタンパク質構造に対するそれらの影響において互いに最も類似しているところアミノ酸のグループを定義することができる(上記Schulz, G. E. and Schirmer, R. H.)。保存変異の非限定的な例としては、例えば正電荷を維持することができるアミノ酸アルギニンからリジンおよびその逆；負電荷を維持することができるアスパラギン酸からグルタミン酸およびその逆；遊離の-OHが維持されるトレオニンからセリン；および遊離NH2を維持できるアスパラギンからグルタミンのようなアミノ酸置換が挙げられる。
【００９２】
本明細書中で交換可能に使用される用語「コード配列」または「タンパク質コード配列」とは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのセグメントをいう。この領域または配列は、5’末端に近い方が開始コドンで境界され、3’末端に近い方が停止コドンで境界される。コード配列はオープンリーディングフレームとも呼ばれる。
【００９３】
「シチジンデアミナーゼ」とは、アミノ基をカルボニル基に変換する脱アミノ化反応を触媒することができるポリペプチドまたはその断片を意味する。1つの実施形態において、シチジンデアミナーゼは、シトシンをウラシルに、または5-メチルシトシンをチミンに変換する。Petromyzon marinus由来のPmCDA1（Petromyzon marinus cytosine deaminase 1、「PmCDA1」）、哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、サル等）由来のAID（活性化誘導シチジンデアミナーゼ; AICDA）、およびAPOBECは、例示的シチジンデアミナーゼである。
【００９４】
本明細書中で使用する場合、用語「デアミナーゼ」または「デアミナーゼドメイン」とは、脱アミノ化反応を触媒するタンパク質または酵素を指す。ある態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、それぞれウリジンまたはデオキシウリジンへのシチジンまたはデオキシシチジンの加水分解的脱アミノ化を触媒するシチジンデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインはシトシンデアミナーゼであり、ウラシルへのシトシンの加水分解的脱アミノ化を触媒する。ある態様において、デアミナーゼは、ヒポキサンチンへのアデニンの加水分解的脱アミノ化を触媒するアデノシンデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、アデノシンまたはアデニン(A) からイノシン(I) への加水分解的脱アミノ化を触媒するアデノシンデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、アデノシンデアミナーゼであり、それぞれイノシンまたはデオキシイノシンへのアデノシンまたはデオキシアデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒する。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸(DNA) 中のアデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒する。本明細書中で提供されるアデノシンデアミナーゼ(例えば、遺伝子操作されたアデノシンデアミナーゼ、進化されたアデノシンデアミナーゼ)は、細菌などの任意の生物由来であり得る。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、E. coli、S. aureus、S. typhi、S. putrefaciens、H. influenzae、またはC. crescentusなどの細菌に由来する。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadAデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、例えばヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスなどの生物由来の天然デアミナーゼのバリアントである。ある態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、非天然のものである。例えば、いくつかの実施形態において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然のデアミナーゼに対して少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.1%、少なくとも99.2%、少なくとも99.3%、少なくとも99.4%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%、または少なくとも99.9%の同一性を有する。例えば、デアミナーゼドメインは、国際PCT出願番号PCT/2017/045381(国際公開第2018/027078号)およびPCT/US 2016/058344(国際公開第2017/070632号)に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage”Nature  551, 464-471 (2017); Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017), and Rees, H.A., et al., “Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.”  Nat Rev Genet. 2018 Dec;19(12):770-788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1も参照（その内容全体を参照により本明細書に組み込む）。
【００９５】
「検出可能な標識」とは、目的の分子に連結されたときに、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段を介してそれを検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識には、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素(例えばELISAで一般的に使用されるもの)、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが含まれる。
【００９６】
「疾患」とは、細胞、組織、または器官の正常な機能を損傷する、またはそれに干渉する任意の条件または障害を意味する。疾患の例としては、網膜色素変性症、アッシャー症候群、鎌状赤血球病、ベータサラセミア、アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）、肝性ポルフィリン症、中鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ（MCAD）欠損症、リソソーム酸リパーゼ（LAL）欠損症、フェニルケトン尿症、ヘモクロマトーシス、フォン・ギールケ病、ポンペ病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、嚢胞性線維症、または慢性疼痛が挙げられる。特定の実施形態では、疾患は、A1ADである。
【００９７】
「有効量」は、未処置の患者または疾患を有しない個体、すなわち、健康な個体と比較して、疾患の症状を改善するのに必要とされる、薬剤または活性化合物、例えば、本明細書に記載の塩基エディターの量を意味する。疾患の治療処置のために本発明を実施するのに使用される活性化合物の有効量は、投与の様式、対象の年齢、体重、および一般的健康状態に応じて変化する。最終的には、主治医または獣医師が、適切な量および用量レジメンを決定するであろう。そのような量は、「有効」量と呼ばれる。一実施形態では、有効量は、細胞（例えば、in vitroまたはin vivoの細胞）に目的の遺伝子の改変を導入するのに十分な本発明の塩基エディターの量である。一実施形態では、有効量は、治療効果を達成する（例えば、網膜色素変性症、アッシャー症候群、鎌状赤血球病、ベータサラセミア、アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）、肝性ポルフィリン症、中鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ（MCAD）欠損症、リソソーム酸リパーゼ（LAL）欠損症、フェニルケトン尿症、ヘモクロマトーシス、フォン・ギールケ病、ポンペ病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、嚢胞性線維症、もしくは慢性疼痛、またはその症状もしくは状態を低減または制御する）のに必要とされる塩基エディターの量である。そのような治療効果は対象の細胞、組織、または器官の全てにおけるMecp2を改変するために十分である必要はなく、対象中に存在する細胞、組織、または器官の約1%、5%、10%、25%、50%、75%、またはそれ以上で細胞中の病原性遺伝子を改変させればよい。一実施形態では、有効量は、疾患（例えば、網膜色素変性症、アッシャー症候群、鎌状赤血球病、ベータサラセミア、アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）、肝性ポルフィリン症、中鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ（MCAD）欠損症、リソソーム酸リパーゼ（LAL）欠損症、フェニルケトン尿症、ヘモクロマトーシス、フォン・ギールケ病、ポンペ病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、嚢胞性線維症、または慢性疼痛）の１つまたは複数の症状を改善するのに十分なものである。
【００９８】
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を含む。断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000のヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。
【００９９】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸塩基間の水素結合を意味し、ワトソン-クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であり得る。たとえば、アデニンとチミンは相補的な核酸塩基で、水素結合を形成して対を形成する。
【０１００】
用語「塩基修復の阻害因子」、「塩基修復阻害因子」、「IBR」または他の文法的等価物は、核酸修復酵素、例えば塩基除去修復酵素の活性を阻害することができるタンパク質を指す。ある態様において、IBRは、イノシン塩基除去修復の阻害因子である。塩基修復の阻害因子の例としては、APE1、Endo III、Endo IV、Endo V、Endo VIII、Fpg、hOGGl、hNEILl、T7 Endol、T4 PDG、UDG、hSMUGLおよびhAAGの阻害因子が挙げられる。ある実施形態では、塩基修復阻害因子は、Endo VまたはhAAGの阻害因子である。ある実施形態では、IBRは、Endo VまたはhAAGの阻害因子である。ある実施形態では、IBRは、触媒的に不活性なEndoVまたは触媒的に不活性なhAAGである。ある実施形態では、塩基修復阻害因子は、触媒的に不活性なEndoVまたは触媒的に不活性なhAAGである。ある実施形態では、塩基修復阻害因子は、ウラシルグリコシラーゼ阻害因子(UGI) である。UGIとは、ウラシル-DNAグリコシラーゼの塩基除去修復酵素を阻害することができるタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、UGIドメインは、野生型UGIまたはその断片を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるUGIタンパク質は、UGIの断片、および、UGIまたはUGI断片に相同的なタンパク質を含む。ある態様において、塩基修復阻害因子は、イノシン塩基除去修復の阻害因子である。いくつかの態様において、塩基修復阻害因子は、「触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼ」または「死んだイノシン特異的ヌクレアーゼ」である。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、触媒的に不活性なイノシングリコシラーゼ（例えば、アルキルアデニングリコシラーゼ(AAG)）は、イノシンに結合することができるが、脱塩基部位を作ることもイノシンを除去することもできず、それによって、新たに形成されるイノシン部分をDNA損傷/修復機構から立体的にブロックする。いくつかの実施形態において、触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼは、核酸中のイノシンに結合することができるが、核酸を切断しない。代表的な、触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼの非限定的例としては、（例えばヒト由来の）触媒的に不活性なアルキルアデノシングリコシラーゼ(AAGヌクレアーゼ)、および（例えばE.coli由来の）触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼV (EndoVヌクレアーゼ)が挙げられる。いくつかの実施形態において、触媒的に不活性なAAGヌクレアーゼは、E125Q突然変異または別のAAGヌクレアーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０１０１】
用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」とは、その天然状態で見出される場合に通常それに付随する成分が、様々な程度まで除去されている物質を指す。「単離」は、元の入手源又は周囲環境からの分離の程度を示す。「精製」は、単離よりも高い分離度を示す。「精製された」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は、不純物がタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を与えたり他の有害な結果を引き起こさないように、他の物質が十分に除去されている。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えDNA技術によって産生された場合には細胞物質、ウイルス物質または培地を実質的に含まない場合、あるいは化学的に合成された場合には化学的前駆体その他の化学物質を実質的に含まない場合には、精製されている。純度および均一性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを用いて決定される。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じることを意味し得る。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化を受けることができるタンパク質については、異なる修飾は、別々に精製することができる異なる単離されたタンパク質を生じ得る。
【０１０２】
「単離ポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然ゲノムにおいて当該遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸(例えばDNA)を意味する。したがって、この用語は、例えば、ベクターに組み込まれた；自律的に複製するプラスミドやウイルスに組み込まれた；原核生物や真核生物のゲノムDNAに組み込まれた；または他の配列とは独立した別の分子(例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されたcDNAまたはゲノムもしくはcDNA断片)として存在する組換えDNAを含む。さらに、この用語は、DNA分子から転写されるRNA分子、ならびに、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。
【０１０３】
「単離ポリペプチド」とは、天然状態で付随する成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが天然状態で会合しているタンパク質および天然有機分子から重量で少なくとも60%フリーである場合に、単離されている。好ましくは、調製物は、重量で少なくとも75%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも99%が本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然源からの抽出、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現；または化学的にタンパク質を合成することにより得ることができる。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定することができる。
【０１０４】
本明細書において使用される用語「リンカー」は、二つの分子もしくは部分（例えばタンパク質複合体もしくはリボ核複合体の二つの成分、または融合タンパク質の二つのドメイン、例えば、ポリヌクレオチドプログラミング可能DNA結合ドメイン(例dCas9)とデアミナーゼドメイン(例えばアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ)）を連結する共有結合リンカー(例えば共有結合)、非共有結合リンカー、化学基、または分子を指すことができる。リンカーは、塩基エディターシステムの異なるコンポーネントまたはコンポーネントの異なる部分を繋げることができる。例えば、いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリヌクレオチドプログラミング可能ヌクレオチド結合ドメインのガイドポリヌクレオチド結合ドメインおよびデアミナーゼの触媒ドメインを繋げることができる。ある態様において、リンカーは、CRISPRポリペプチドおよびデアミナーゼを結合することができる。ある態様において、リンカーは、Cas9およびデアミナーゼを繋げることができる。ある態様において、リンカーは、dCas9およびデアミナーゼを繋げることができる。ある態様において、リンカーは、nCas9およびデアミナーゼを繋げることができる。ある態様において、リンカーは、ガイドポリヌクレオチドおよびデアミナーゼを繋げることができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、塩基エディター系の脱アミノ化成分およびポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合成分を繋げることができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、塩基エディターシステムの脱アミノ化成分のRNA結合部分と、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合成分とを繋げることができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、塩基エディタ系の脱アミノ化成分のRNA結合部分と、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合成分のRNA結合部分とを結合することができる。リンカーは、2つの基、分子、または他の部分の間に配置され、またはそれらによって挟まれ、共有結合または非共有結合相互作用を介してそれぞれに連結され、かくして2つを連結することができる。ある態様において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学的部分であり得る。ある態様において、リンカーはポリヌクレオチドであり得る。ある態様において、リンカーはDNAリンカーであり得る。ある態様において、リンカーはRNAリンカーであり得る。ある態様において、リンカーは、リガンドに結合することができるアプタマーを含むことができる。ある態様において、リガンドは、炭水化物、ペプチド、タンパク質、または核酸であり得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、リボスイッチに由来するアプタマーを含むことができる。アプタマーが由来するリボスイッチは、テオフィリンリボスイッチ、チアミンピロリン酸(TPP) リボスイッチ、アデノシンコバラミン(AdoCbl) リボスイッチ、S-アデノシルメチオニン(SAM) リボスイッチ、SAHリボスイッチ、フラビンモノヌクレオチド(FMN) リボスイッチ、テトラヒドロ葉酸リボスイッチ、リジンリボスイッチ、グリシンリボスイッチ、プリンリボスイッチ、GlmSリボスイッチ、またはプレクエオシン1 (PreQ1) リボスイッチから選択され得る。ある態様において、リン��ーは、ポリペプチドまたはポリペプチドリガンドなどのタンパク質ドメインに結合したアプタマーを含み得る。ある態様において、ポリペプチドリガンドは、K相同(KH) ドメイン、MS2コートタンパク質ドメイン、PP7コートタンパク質ドメイン、SfMu Comコートタンパク質ドメイン、無菌のαモチーフ、テロメラーゼKu結合モチーフおよびKuタンパク質、テロメラーゼSm7結合モチーフおよびSm7タンパク質、またはRNA認識モチーフであり得る。ある態様において、ポリペプチドリガンドは、塩基エディター系成分の一部であり得る。例えば、核酸塩基編集成分は、デアミナーゼドメインおよびRNA認識モチーフを含み得る。
【０１０５】
ある態様において、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸(例えばペプチドまたはタンパク質)であり得る。ある態様において、リンカーは、長さが約5〜100アミノ酸、例えば、長さが約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20-30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90または90〜100アミノ酸であり得る。ある態様において、リンカーは、長さが約100〜150、150〜200、200〜250、250〜300、300〜350、350〜400、400〜450、または450〜500アミノ酸であり得る。より長いまたはより短いリンカーも考えられる。
【０１０６】
ある態様において、リンカーは、Cas9ヌクレアーゼドメインを含むRNAプログラム可能ヌクレアーゼのgRNA結合ドメインと、核酸編集タンパク質(例えば、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼ)の触媒ドメインとを繋げる。ある態様において、リンカーは、dCas9および核酸編集タンパク質を繋げる。例えば、リンカーは、2つの基、分子、または他の部分の間に配置されるか、または2つの基、分子、または他の部分によって隣接され、共有結合を介してそれぞれに連結され、したがって2つを連結する。ある態様において、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸(例えば、ペプチドまたはタンパク質)である。ある態様において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。ある態様において、リンカーは、長さが5〜200アミノ酸、例えば、長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、35、45、50、55、60、60、65、70、70、75、80、85、90、90、95、100、101、102、103、104、105、110、120、130、140、150、160、175、180、190、または200アミノ酸である。より長いまたはより短いリンカーも考えられる。ある態様において、リンカーは、XTENリンカーとも呼ばれ得るアミノ酸配列SGSETPGTSESATPESを含む。ある態様において、リンカーは、アミノ酸配列SGGSを含む。ある態様において、リンカーは、(SGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS) n, (G)n, (EAAAK)n, (GGS)n, SGSETPGTSESATPES, または (XP)nモチーフ、またはこれらの任意の組合せを含み、ここで、nは独立して1〜30の整数であり、Xは任意のアミノ酸である。いくつかの実施態様において、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15である。ある態様において、リンカーは、複数のプロリン残基を含み、長さが5〜21、5〜14、5〜9、5〜7アミノ酸であり、例えば、PAPAP, PAPAPA, PAPAPAP, PAPAPAPA, P(AP)4, P(AP)7, P(AP)10である。このようなプロリンに富むリンカーはまた、「リジッド（rigid）」リンカーとも呼ばれる。
【０１０７】
ある態様において、塩基エディターのドメインは、SGGSSGSETPGTSESATPESSGGS, SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS, またはGGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGSのアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合される。ある態様において、塩基エディターのドメインは、XTENリンカーとも呼ばれ得るアミノ酸配列SGSETPGTSESATPESを含むリンカーを介して融合される。ある態様において、リンカーは、長さが24アミノ酸である。ある態様において、リンカーは、アミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESを含む。ある態様において、リンカーは、40アミノ酸長である。ある態様において、リンカーは、アミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTESATPESSGGSSGGSSGSSGGSを含む。ある態様において、リンカーは、64アミノ酸長である。ある態様において、リンカーは、アミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSを含む。ある態様において、リンカーは、長さが92アミノ酸である。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSを含む。
【０１０８】
本明細書中で使用される場合、用語「変異」とは、配列内、例えば核酸もしくはアミノ酸配列内の残基が、別の残基により置換されること、または配列内の1以上の残基の欠失もしくは挿入をいう。変異は、本明細書中において典型的には、元の残基を同定し、次いで配列内の残基の位置を同定し、そして新たに置換された残基を同定することによって、記載される。本明細書中に提供されるアミノ酸置換(変異) を作製するための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012) )によって提供されている。いくつかの態様において、本開示の塩基エディターは、有意な数の非意図的な変異、例えば非意図的な点突然変異を生成することなく、核酸(例えば対象のゲノム内の核酸)において「意図された変異」例えば点突然変異を効率的に生成することができる。いくつかの実施形態において、意図された変異は、その意図された変異を生じさせるように特に設計された、ガイドポリヌクレオチド(例えばgRNA)に結合した特定の塩基エディター(例えばシチジン塩基エディターまたはアデノシン塩基エディター)によって生じる変異である。
【０１０９】
一般に、配列(例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列)においてなされるか又は同定される変異は、参照(または野生型)配列、すなわち、その変異を含まない配列に関連して番号付けされる。当業者は、参照配列に対するアミノ酸および核酸配列における突然変異の位置を決定する方法を容易に理解するであろう。
【０１１０】
「非保存的変異」という用語は、異なるグループの間のアミノ酸置換に関し、例えば、トリプトファンからリジン、またはセリンからフェニルアラニンなどである。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能性バリアントの生物学的活性を妨害または阻害しないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性が野生型タンパク質と比較して増加するように、機能的バリアントの生物学的活性を増強することができる。
【０１１１】
「核局在化配列」、「核局在化シグナル」または「NLS」という用語は、タンパク質の細胞核への移入を促進するアミノ酸配列を意味する。核局在化配列は当該技術分野において公知であり、例えば、2000年11月23日に出願され2001年5月31日にWO/2001/038547として公開された国際PCT出願PCT/EP 2000/011690のPlank et al.に記載されており、その内容は、例示的な核局在化配列の開示について参照により本明細書に組み入れられる。他の実施形態では、NLSは、例えばKoblan et al., Nature Biotech. 2018 doi:10.1038/nbt.4172によって記載された、最適化されたNLSである。ある態様において、NLSは、アミノ酸配列KRTADGSEFESPKKKRKV, KRPAATKKAGQAKKKK, KKTELQTTNAENKTKKL, KRGINDRNFWRGENGRKTR, RKSGKIAAIVVKRPRK, PKKKRKV,または MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCを含む。
【０１１２】
用語「核酸塩基」、「窒素塩基」、または「塩基」は、本明細書中で互換的に使用され、ヌクレオシドを形成する窒素含有生物学的化合物を指し、ヌクレオシドはヌクレオチドの成分である。塩基対を形成し、互いに積み重なる核酸塩基の能力は、直接、リボ核酸(RNA) およびデオキシリボ核酸(DNA) のような長鎖らせん構造をもたらす。アデニン(A) 、シトシン(C) 、グアニン(G) 、チミン(T) 、ウラシル(U) の5種類の核酸塩基は、一次塩基または標準塩基と呼ばれる。アデニンとグアニンはプリンに由来し、シトシン、ウラシル、チミンはピリミジンに由来する。DNAとRNAは修飾された他の(非一次) 塩基を含むこともある。非限定的な例示的修飾核酸塩基としては、ヒポキサンチン、キサンチン、7-メチルグアニン、5,6-ジヒドロウラシル、5-メチルシトシン(m5C) 、および5-ヒドロメチルシトシンが挙げられる。ヒポキサンチンとキサンチンは変異原の存在によって生成され得、どちらも脱アミノ化(アミン基のカルボニル基への置換)によって生成される。ヒポキサンチンはアデニンから修飾され得る。キサンチンはグアニンから修飾され得る。ウラシルはシトシンの脱アミノ化によって生じ得る。「ヌクレオシド」は核酸塩基と五炭糖(リボースまたはデオキシリボース)からなる。ヌクレオシドの例としては、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、5-メチルウリジン(m5U) 、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、およびデオキシシチジンが挙げられる。修飾核酸塩基を有するヌクレオシドとしては、イノシン(I) 、キサントシン(X) 、7-メチルグアノシン(m7G) 、ジヒドロウリジン(D) 、5-メチルシチジン(m5C) 、プソイドウリジン(Ψ) 等が挙げられる。ヌクレオチドは、核酸塩基、五炭糖(リボースまたはデオキシリボース)、および少なくとも一つのリン酸基からなる。
【０１１３】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」および「核酸分子」とは、核酸塩基および酸性部分を含む化合物、例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーをいう。典型的には、ポリマー核酸、例えば3つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子は、隣接するヌクレオチドがホスホジエステル結合を介して互いに連結されている直鎖分子である。ある態様において、「核酸」は、個々の核酸残基(例えばヌクレオチドおよび/またはヌクレオシド)を指す。ある態様において、「核酸」は、三つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖をいう。本明細書中で使用される、用語「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、および「ポリ核酸」は、ヌクレオチドのポリマー(例えば少なくとも3つのヌクレオチドの鎖)を指すために交換可能に使用され得る。ある態様において、「核酸」は、RNAならびに一本鎖および/または二本鎖DNAを包含する。核酸は、例えば、ゲノム、転写物、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、snRNA、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体、または他の天然に存在する核酸分子との関連において、天然に存在し得る。他方、核酸分子は、例えば非天然に存在する分子、組換えDNAもしくはRNA、人工染色体、操作されたゲノム、もしくはその断片、または合成DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、または非天然に存在するヌクレオチドもしくはヌクレオシドを含む、非天然に存在する分子であり得る。さらに、用語「核酸」、「DNA」、「RNA」、および/または類似の用語は、核酸アナログ、例えばホスホジエステル骨格以外を有するアナログを含む。核酸は、天然源から精製される、組換え発現系を用いて産生され必要に応じて精製される、化学的に合成される、等が可能である。化学的に合成された分子の場合、核酸は、適切な場合には、例えば、化学的に修飾された塩基または糖、および骨格修飾を有するアナログなどのヌクレオシドアナログを含み得る。核酸配列は、特に示されない限り、5’〜3’方向に示される。ある態様において、核酸は、天然ヌクレオシド(例えばアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン)；ヌクレオシド類似体(例えば2-アミノアデノシン、2-チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、3-メチルアデノシン、5-メチルシチジン、2-アミノアデノシン、C5-ブロモウリジン、C5-フルオロウリジン、C5-ヨードウリジン、C5-プロピニル-ウリジン、C5-プロピニル-シチジン、C5-メチルシチジン、2-アミノアデノシン、7-デアザアデノシン、7-デアザグアノシン、8-オキソアデノシン、8-オキソグアニン、O6-メチルグアニン、および2-チオシチジン)；化学修飾塩基；生物学的に修飾された塩基(例えばメチル化塩基)；挿入塩基；修飾糖(例えば2’-フルオロリボース、リボース、2’-デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース)；および/または修飾リン酸基(例えばホスホロチオエートおよび5’-N-ホスホロアミダイト結合)であるか、またはそれらを含む。
【０１１４】
「核酸プログラム可能DNA結合タンパク質」または「napDNAbp」という用語は、「ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメイン」と交換可能に使用され、napDNAbpを特定の核酸配列にガイドする、ガイド核酸などの核酸(例えばDNAまたはRNA)に付随するタンパク質を意味する。例えば、Cas9タンパク質は、ガイドRNAに相補的な特定のDNA配列にCas9タンパク質をガイドするガイドRNAと結合することができる。ある態様において、napDNAbpは、Cas9ドメイン、例えばヌクレアーゼ活性Cas9、Cas9ニッカーゼ(nCas9) 、またはヌクレアーゼ不活性Cas9 (dCas9) である。核酸プログラム可能なDNA結合タンパク質の例としては、Cas9 (例:dCas9およびnCas9)、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、およびCas12iが挙げられるが、これらに限定されない。他の核酸プログラム可能なDNA結合タンパク質もまた、本開示の範囲内であるが、それらは本開示に具体的に記載されていないこともあり得る。例えば、Makarova et al. “Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?” CRISPR J. 2018 Oct;1:325-336. doi: 10.1089/crispr.2018.0033; Yan et al., “Functionally diverse type V CRISPR-Cas systems” Science. 2019 Jan 4;363(6422):88-91. doi: 10.1126/science.aav7271に記載されているとおりであり、それぞれの内容全体を参照により本明細書に組み込む。
【０１１５】
「核酸塩基編集ドメイン」または「核酸塩基編集タンパク質」という用語は、本明細書において使用される場合、シトシン(もしくはシチジン)からウラシル(もしくはウリジン)またはチミン(もしくはチミジン)への、およびアデニン(もしくはアデノシン)からヒポキサンチン(もしくはイノシン)への脱アミノ化、ならびに非鋳型ヌクレオチド付加および挿入のような、RNAまたはDNAにおける核酸塩基修飾を触媒することができるタンパク質または酵素を指す。ある態様において、核酸塩基編集ドメインは、デアミナーゼドメイン(例えば、シチジンデアミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、アデニンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼ)である。ある態様において、核酸塩基編集ドメインは、天然に存在する核酸塩基編集ドメインであり得る。いくつかの実施形態において、核酸塩基編集ドメインは、天然に存在する核酸塩基編集ドメインから操作または進化された核酸塩基編集ドメインであり得る。核酸塩基編集ドメインは、細菌、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスなどの任意の生物由来であり得る。例えば、核酸塩基編集タンパク質は、国際PCT出願番号PCT/2017/045381(国際公開第2018/027078号)およびPCT/US 2016/058344(国際公開第2017/070632号)に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage”Nature  551, 464-471 (2017); およびKomor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)も参照（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「薬剤を取得する」におけるような「取得する」は、その薬剤を合成すること、購入すること、または他の方法で獲得することを含む。
【０１１７】
本明細書で使用される「患者」または「対象」は、疾患または障害と診断されている、それらを生じるリスクがある、またはそれらを有するかもしくは生ずる疑いがある哺乳動物対象または個体を指す。ある態様において、用語「患者」は、疾患または障害を生ずる可能性が平均より高い哺乳動物対象を指す。例示的な患者は、ヒト、ヒト以外の霊長類、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ラクダ、ラマ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット)および本明細書に開示される治療から利益を得ることができる他の哺乳動物であり得る。例示的なヒト患者は、男性および/または女性であり得る。
【０１１８】
本明細書において、「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」は、疾患または障害（例えばアルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）であるがこれに限定されない）と診断されたまたはそれを有すると疑われる患者として言及される。
【０１１９】
「病原性変異」、「病原性バリアント」、「疾患原因変異」、「疾患原因バリアント」、「有害変異」または「素因となる変異」という用語は、特定の疾患または障害に対する固体の感受性または素因を増大させる遺伝子変化または突然変異を指す。ある態様において、病原性変異は、遺伝子によってコードされるタンパク質中の少なくとも1つの野生型アミノ酸が少なくとも1つの病原性アミノ酸によって置換されたものを含む。
【０１２０】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、およびそれらの文法的等価物は、本明細書において交換可能に使用され、ペプチド(アミド) 結合によって互いに連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、任意のサイズ、構造または機能のタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、少なくとも3アミノ酸長である。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々のタンパク質または一群のタンパク質を指すことができる。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中の1以上のアミノ酸は、例えば炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、結合のためのリンカー、官能化、または他の修飾などの化学的実体の添加によって、修飾され得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドはまた、単一分子であってもよく、または多分子複合体であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するタンパク質またはペプチドの単なる断片であり得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するもの、組換え体、もしくは合成のもの、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。本明細書中で使用される場合、用語「融合タンパク質」とは、少なくとも二つの異なるタンパク質由来のタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをいう。1つのタンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端(N末端) 部分またはカルボキシ末端(C末端) タンパク質に位置することができ、かくして、それぞれ、アミノ末端融合タンパク質またはカルボキシ末端融合タンパク質を形成する。タンパク質は、異なるドメイン、例えば、核酸結合ドメイン(例えば、標的部位へのタンパク質の結合を誘導するCas9のgRNA結合ドメイン)および核酸切断ドメイン、あるいは核酸編集タンパク質の触媒ドメインを含み得る。ある態様において、タンパク質は、タンパク質性部分、例えば、核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列、および有機化合物、例えば、核酸切断剤として作用し得る化合物を含む。ある態様において、タンパク質は、核酸(例えば、RNAまたはDNA) と複合体化されているか、または核酸と会合している。本明細書で提供される任意のタンパク質は、当技術分野で公知の任意の方法によって生産することができる。例えば、本明細書で提供されるタンパク質は、組換えタンパク質発現および精製を介して生産することができ、これは、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質に特に適している。組換えタンパク質の発現および精製のための方法はよく知られており、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))によって記載されているものを含み、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２１】
本明細書に開示されるポリペプチドおよびタンパク質(機能的部分およびその機能的バリアントを含む)は、一つ以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含むことができる。そのような合成アミノ酸は当該分野で公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α-アミノn-デカン酸、ホモセリン、S-アセチルアミノメチル-システイン、trans-3-およびtrans-4-ヒドロキシプロリン、4-アミノフェニルアラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-クロロフェニルアラニン、4-カルボキシフェニルアラニン、β-フェニルセリンβ-ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α-ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン-2-カルボン酸、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、N'-ベンジル-N'-メチルリジン、N',N'-ジベンジル-リジン、6-ヒドロキシリジン、オルニチン、α-アミノシクロペンタンカルボン酸、アミノシクロヘキサンカルボン酸、アミノシクロヘキサンカルボン酸、α-アミノシクロヘプタンカルボン酸、α-(2-アミノ-2-ノルボルナン)-カルボン酸、α,γ-ジアミノ酪酸、α,β-ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびα-tert-ブチルグリシンが挙げられる。ポリペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチド構築物の1つ以上のアミノ酸の翻訳後修飾と結合することができる。翻訳後修飾の非限定的な例としては、リン酸化、アセチル化およびホルミル化を含むアシル化、グリコシル化(N-リンクおよびO-リンクを含む)、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化およびエチル化を含むアルキル化、ユビキチン化、ピロリドンカルボン酸の添加、ジスルフィド架橋の形成、硫酸化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化、グリピエーション、リポイル化およびヨード化が挙げられる。
【０１２２】
用語「ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメイン」とは、ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインを特定の核酸配列にガイドするガイドポリヌクレオチド(例えばガイドRNA)のような核酸(DNAやRNAなど)に付随するタンパク質をいう。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインである。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラム可能なRNA結合ドメインである。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、Cas9タンパク質である。Cas9タンパク質は、ガイドRNAに相補的な特定のDNA配列にCas9タンパク質をガイドするガイドRNAと結合することができる。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、Cas9ドメイン、例えばヌクレアーゼ活性Cas9、Cas9ニッカーゼ(nCas9) 、またはヌクレアーゼ不活性Cas9 (dCas9) である。核酸プログラム可能DNA結合タンパク質の非限定的な例は、Cas9 (例:dCas9およびnCas9)、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、およびCas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、およびCas12iを含む。Cas酵素の非限定的な例としては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5d、Cas5t、Cas5h、Cas5a、Cas6、Cas7、Cas8、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9(Csn1またはCsx12とも呼ばれる)、Cas10、Cas10d、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Csy1、Csy2、Csy3、Csy4、Cse1、Csc1、Csc1、Csm2、Csm3、Csm3、Csm4、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csx11、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Csd1、Csd2、Cst1、Cst2、Csh1、Csh2、Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5、タイプII Casエフェクタータンパク質、タイプV Casエフェクタータンパク質、タイプVI Casエフェクタータンパク質、CARF、DinG、それらのホモログ、またはそれらの修飾もしくは改変バージョンが挙げられる。他の核酸プログラム可能なDNA結合タンパク質もまた、本開示の範囲内であるが、本開示に具体的に記載されていないこともあり得る。
【０１２３】
タンパク質または核酸に関連して本明細書中で使用される用語「組み換え体」とは、自然界には存在しないが、人間の工学の産物であるタンパク質または核酸を指す。例えば、いくつかの実施形態において、組換えタンパク質または核酸分子は、任意の天然に存在する配列と比較して、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、または少なくとも7つの変異を含むアミノ酸またはヌクレオチド配列を含む。
【０１２４】
「減少する」とは、少なくとも10%、25%、50%、75%、または100%の負の変化を意味する。
【０１２５】
「参照」は、標準又は対照条件を意味する。1つの実施形態において、参照は野生型または健常な細胞である。
【０１２６】
「参照配列」は、配列比較の基礎として使用される定義済み配列である。参照配列は、特定の配列のサブセット又は全体であり得る；例えば、完全長のcDNAもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なcDNAまたは遺伝子配列。ポリペプチドについては、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約16アミノ酸、好ましくは少なくとも約20アミノ酸、より好ましくは少なくとも約25アミノ酸、さらにより好ましくは約35アミノ酸、約50アミノ酸、または約100アミノ酸である。核酸については、参照核酸配列の長さは、一般に、少なくとも約50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約75ヌクレオチド、さらにより好ましくは約100ヌクレオチドまたは約300ヌクレオチドまたはそれらの周辺もしくはそれらの間の任意の整数である。
【０１２７】
用語「RNAプログラム可能なヌクレアーゼ」および「RNA誘導ヌクレアーゼ」は、切断の標的ではない一つ以上のRNAをとともに使用される(例えば、それに結合または付随する)。ある態様において、RNAプログラム可能ヌクレアーゼは、RNAと複合体である場合、ヌクレアーゼ:RNA複合体と称され得る。典型的には、結合したRNAはガイドRNA (gRNA) と呼ばれる。gRNAは2つ以上のRNAの複合体として存在することもあれば、1つのRNA分子として存在することもある。単一のRNA分子として存在するgRNAは、単一ガイドRNA (sgRNA) と呼ばれることがあるが、「gRNA」は、単一の分子として、または二以上の分子の複合体として存在するガイドRNAのいずれかを指すために互換的に使用される。典型的には、単一のRNA種として存在するgRNAは、二つのドメイン: (1) 標的核酸と相同性を共有する(例えば、標的へのCas9複合体の結合を誘導する)ドメイン；および (2) Cas9タンパク質に結合するドメインを含む。ある態様において、ドメイン (2) は、tracrRNAとして知られる配列に対応し、ステム-ループ構造を含む。例えば、いくつかの実施形態において、ドメイン (2) は、Jinek et al., Science 337:816-821(2012)に提供されるtracrRNAと同一または相同であり、その全内容を参照により本明細書に援用する。gRNA (例えばドメイン2を含むもの)の他の例は、2013年9月6日に出願された「Switchable Cas9 Nucleases and Uses Thereof」という名称の米国仮特許出願第61/874,682号および2013年9月6日に出願された「Delivery System for Functional Nucleases」という名称の米国仮特許出願第61/874,746号に見出され得る。いくつかの実施形態において、gRNAは、二つ以上のドメイン (1) および (2)を含み、「伸長された（extended）gRNA」と称され得る。例えば、伸長されたgRNAは、本明細書に記載されるように、例えば二つ以上のCas9タンパク質と結合し、二つ以上の異なる領域で標的核酸と結合する。gRNAは、ヌクレアーゼ/RNA複合体の前記標的部位への結合を媒介し、ヌクレアーゼ:RNA複合体の配列特異性を提供する、標的部位を相補するヌクレオチド配列を含む。ある態様において、RNAプログラム可能ヌクレアーゼは、(CRISPR関連システム) Cas9エンドヌクレアーゼ、例えば、Streptococcus pyogenes由来のCas9 (Csnl) である（例えば、"Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)参照）。
【０１２８】
用語「単一ヌクレオチド多型 (SNP)」は、ゲノム中の特定の位置で起こる単一ヌクレオチドの変異であり、ここで、各変異は集団内で認識できるある程度(例>1%)まで存在する。たとえば、ヒトゲノムの特定の塩基位置では、ほとんどの個体でCヌクレオチドが出現しうるが、少数の個体ではその位置がAで占められている。これは、この特定の位置にSNPがあることを意味し、CまたはAという2つのヌクレオチドの可能なバリエーションがこの位置のアリルであると言われる。SNPは疾患に対する感受性の差の根底にある。病気の重症度や治療に対する体の反応も、遺伝的バリエーションの表れである。SNPは、遺伝子のコード領域、遺伝子の非コード領域、または遺伝子間領域(遺伝子と遺伝子の間の領域)に存在しうる。ある態様において、コード配列内のSNPは、遺伝子コードの縮重のために、産生されるタンパク質のアミノ酸配列を必ずしも変化させない。コード領域のSNPには、同義SNPと非同義SNPの2種類がある。同義SNPはタンパク質配列に影響しないが、非同義SNPはタンパク質のアミノ酸配列を変化させる。非同義SNPにはミスセンスとナンセンスの2種類がある。タンパク質をコードする領域にないSNPは、遺伝子のスプライシング、転写因子の結合、メッセンジャーRNAの分解、または非コードRNAの配列に影響を与えることがある。この種のSNPによって影響を受ける遺伝子発現はeSNP (発現SNP)と呼ばれ、遺伝子の上流または下流にあり得る。一塩基バリアント (SNV) は、頻度に制限のない一塩基のバリエーションであり、体細胞で生じ得る。体細胞一塩基バリエーション(例えば癌により引き起こされるもの)は一塩基改変とも呼ばれ得る。
【０１２９】
「SERPINA1ポリヌクレオチド」とは、A1ATタンパク質またはその断片をコードする核酸分子を意味する。例示的SERPINA1ポリヌクレオチドの配列は、NCBI Accession NO. NM_000295で入手可能であり、下記に提供される：
2021523738.tif 000003
2021523738.tif 000004
2021523738.tif 000005
PAM配列は斜体と二重下線で示されており、アデノシン塩基編集後の正しい配列が示されている。
【０１３０】
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドおよび/または核酸分子を認識および結合するが、試料（例えば生物学的試料）中の他の分子を実質的に認識および結合しない核酸分子、ポリペプチド、もしくはそれらの複合体（例えば、核酸プログラム可能なDNA結合ドメインおよびガイド核酸）、化合物、または分子を意味する。
【０１３１】
本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と100%同一である必要はないが、典型的には実質的同一性を示す。内因性配列に対して「実質的同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一つの鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と100%同一である必要はないが、典型的には実質的同一性を示す。内因性配列に対して「実質的同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一つの鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、種々のストリンジェンシー条件下で相補的ポリヌクレオチド配列(例えば、本明細書に記載の遺伝子)の間、またはその一部の間に二本鎖分子を形成する対をなすことを意味する。(例えばWahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507参照)。
【０１３２】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約750 mM未満 NaClおよび75 mMクエン酸三ナトリウム、好ましくは約500 mM未満 NaClおよび50 mMクエン酸三ナトリウム、より好ましくは約250 mM未満 NaClおよび25 mMクエン酸三ナトリウムである。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で得ることができ、一方、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35%ホルムアミド、より好ましくは少なくとも約50%ホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含むであろう。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤 (例えば、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) ) の濃度、および担体DNAの含入または排除などの様々な追加のパラメーターは、当業者によく知られている。必要に応じてこれら様々な条件を組み合わせることによって、様々なレベルのストリンジェンシーが達成される。ある好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、30℃で、750 mM NaCl、75 mMクエン酸三ナトリウムおよび1% SDS中で起こる。さらに好ましい一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、37℃で、500 mM NaCl、50 mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS、35%ホルムアミドおよび100μg/ml変性サケ精子DNA (ssDNA) 中で起こる。最も好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、42℃において、250 mM NaCl、25 mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS、50%ホルムアミドおよび200μg/ml ssDNA中で起こる。これらの条件の有用なバリエーションは、当業者には容易に明らかになるであろう。
【０１３３】
ほとんどの用途では、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もまた、ストリンジェンシーが異なる。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって定義することができる。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させるか、または温度を上昇させることによって増加させることができる。例えば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約30 mM未満 NaClおよび3 mMクエン酸三ナトリウムであり、最も好ましくは約15 mM未満 NaClおよび1.5 mMクエン酸三ナトリウムであり得る。洗浄工程のためのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、さらにより好ましくは少なくとも約68℃の温度を含む。好ましい実施形態において、洗浄工程は、25℃で、30 mM NaCl、3 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中で行われる。より好ましい実施形態において、洗浄工程は、42℃で、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中で行われる。より好ましい実施形態において、洗浄工程は、68℃で、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中で行われる。これらの条件のさらなるバリエーションは、当業者には容易に明らかになるであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者によくしられており、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); および Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記述されている。
【０１３４】
「実質的に同一である」とは、参照アミノ酸配列(例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか1つ)または核酸配列(例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか1つ)に対して少なくとも50%の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、そのような配列は、比較のために使用される配列とアミノ酸レベルまたは核酸において少なくとも60%、より好ましくは80%または85%、より好ましくは90%、95%または99%までもの同一性を有する。
【０１３５】
配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェア(例えば、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705のSequence Analysis Software Package、BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム)を用いて測定される。そのようなソフトウェアは、種々の置換、欠失、および/または他の改変に相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列をマッチさせる。保存的置換は、典型的には、以下の群内の置換を含む:グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；フェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチにおいて、BLASTプログラムを使用することができ、e -3とe -100の間の確率スコアが密接に関連した配列を示す。COBALTは、たとえば次のパラメータとともに使用される：
a) アラインメントパラメータ：Gap penalties-11,-1 and End-Gap penalties-5,-1,
b) CDDパラメータ：Use RPS BLAST on; Blast E-value 0.003; Find Conserved columns and Recompute on
c) クエリー・クラスタリング・パラメータ：Use query clusters on; Word Size 4; Max cluster distance 0.8; Alphabet Regular。
EMBOSS Needleは、たとえば次のパラメータで使用される。
a) Matrix: BLOSUM62;
b) GAP OPEN: 10;
c) GAP EXTEND: 0.5;
d) OUTPUT FORMAT: pair;
e) END GAP PENALTY: false;
f) END GAP OPEN: 10; and
g) END GAP EXTEND: 0.5.
【０１３６】
「対象」とは、限定されるものではないが、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジまたはネコなどのヒトまたは非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物を意味する。
【０１３７】
用語「標的部位」とは、核酸分子内の配列であって、核酸塩基エディターによって改変される配列をいう。一実施形態において、標的部位は、デアミナーゼまたはそれを含む融合タンパク質(例えば、シチジンまたはアデニンデアミナーゼ)によって脱アミノ化される。
【０１３８】
RNAプログラム可能なヌクレアーゼ(例:Cas9)は、DNA切断部位を標的とするためにRNA:DNAハイブリダイゼーションを使用するので、これらのタンパク質は、原理的に、ガイドRNAによって指定されるあらゆる配列を標的とすることができる。部位特異的切断のためにCas9のようなRNAプログラム可能なヌクレアーゼを使用する方法(例えばゲノムを改変するために)は、当該技術分野において公知である(例えば、Cong, L. et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013); Mali, P. et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013); Hwang, W.Y. et al., Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013); Jinek, M. et al., RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013); Dicarlo, J.E. et al., Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013); Jiang, W. et al., RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)を参照。これらの各々の全内容は参照により本明細書に組み入れられる)。
【０１３９】
本明細書中で使用される、用語「治療する(treat)」、「治療する(treating)」、「治療(treatment)」 などは、障害および/またはそれに関連する症状を軽減もしくは改善すること、または所望の薬理学的および/または生理学的効果を得ることを指す。障害または状態を治療することは、関連する障害、状態または症状を完全に除去することを必要としないことが理解されるであろう（完全な除去が除外されるわけでもない）。いくつかの態様において、効果は、治療的であり、すなわち、限定されるものではないが、効果は、疾患および/または疾患に起因する有害症状を部分的または完全に低減、減少、除去、軽減、緩和、強度低下、または治癒する。ある態様において、効果は予防的であり、すなわち効果は、疾患、または状態の発生または再発を保護または予防する。この目的のために、本開示の方法は、本明細書に記載されるような治療的に有効な量の組成物を投与することを含む。
【０１４０】
「ウラシルグリコシラーゼ阻害因子」とは、ウラシル除去修復系を阻害する因子を意味する。1つの実施形態において、該因子は、宿主ウラシル-DNAグリコシラーゼに結合してDNAからのウラシル残基の除去を妨げるタンパク質またはその断片である。
【０１４１】
本明細書で提供される範囲は、範囲内のすべての値についての省略形であると理解される。例えば、1〜50の範囲は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, または 50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、またはサブ範囲を含むと理解される。
【０１４２】
本明細書における変数の任意の定義における化学基のリストの記載は、リストされた基の任意の単一の基または組合せとしてのその変数の定義を含む。本明細書における変数または態様に関する実施形態の説明は、任意の単一の実施形態としての、または任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせられた、その実施形態を含む。
【０１４３】
本明細書に提供される任意の組成物または方法は、本明細書に提供される他の任意の組成物および方法の1つ以上と組み合わせることができる。
【０１４４】
DNA編集は、遺伝子レベルで病原性変異を補正することにより疾患状態を修飾する実行可能な手段として出現してきた。最近まで、全てのDNA編集プラットホームは、特定のゲノム部位でDNA二本鎖切断 (DSB) を誘導することにより機能し、内因性DNA修復経路に依存して半確率的な態様で産物結果が決定され、遺伝的産物の複雑な集団を生じていた。相同性誘導修復 (HDR) 経路を介すれば、ユーザーにより定義される正確な修復結果を達成できるが、多くの課題が、治療に関連する細胞型でのHDRを用いた高効率修復を妨げている。実際的にはこの経路は、競合する、誤りを起こしやすい非相同末端結合経路と比較して効率が悪い。さらに、HDRは細胞周期のG1期とS期に厳密に限定されており、有糸分裂後の細胞におけるDSBの正確な修復を妨げる。その結果、これらの集団において高い効率で、ユーザー定義のプログラム可能な態様でゲノム配列を改変することは困難または不可能であることと判明してきた。
【０１４５】
［核酸塩基エディター］
ポリヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列を編集、修飾または改変するための塩基エディターまたは核酸塩基エディターが本明細書に開示される。本明細書に記載されるのは、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインおよび核酸塩基編集ドメインを含む核酸塩基エディターまたは塩基エディターである。ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、結合されたガイドポリヌクレオチド(例えばgRNA)と一緒である場合に、（結合されたガイド核酸の塩基と標的ポリヌクレオチド配列の塩基との間の相補的塩基対形成を介して）標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合することができ、それによって、編集されることが所望される標的核酸配列に塩基エディターを局在化させることができる。或る実施態様では、標的ポリヌクレオチド配列は一本鎖DNAまたは二本鎖DNAを含む。或る実施態様では、標的ポリヌクレオチド配列はRNAを含む。或る実施態様では、標的ポリヌクレオチド配列はDNA-RNAハイブリッドを含む。
【０１４６】
［ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメイン］
用語「ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメイン」とは、ガイドポリヌクレオチド(例えばガイドRNA)のような核酸(例えばDNAまたはRNA)と会合するタンパク質であって、その核酸がポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインを特定の核酸配列にガイドするところのものをいう。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインである。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラム可能なRNA結合ドメインである。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、Cas9タンパク質である。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、Cpf1タンパク質である。
【０１４７】
ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインはまた、RNAに結合する核酸プログラム可能タンパク質を含むことができることを理解されたい。例えば、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインをRNAにガイドする核酸と結合され得る。他の核酸プログラム可能DNA結合タンパク質もまた、本開示の範囲内にあるが、それらは本開示には特に列記されていない。
【０１４８】
塩基エディターのポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインは、それ自体が1つ以上のドメインを含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、1つ以上のヌクレアーゼドメインを含むことができる。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインのヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼを含むことができる。本明細書において、用語「エキソヌクレアーゼ」は、核酸(例えばRNAまたはDNA)を遊離末端から消化することができるタンパク質またはポリペプチドを指し、用語「エンドヌクレアーゼ」は、核酸(例えばDNAまたはRNA)の内部領域を触媒(例えば劈開)することができるタンパク質またはポリペプチドを指す。ある態様において、エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸の一本鎖を切断することができる。ある態様において、エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸分子の両方の鎖を切断することができる。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインは、デオキシリボヌクレアーゼであり得る。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインは、リボヌクレアーゼであり得る。
【０１４９】
ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインのヌクレアーゼドメインは、標的ポリヌクレオチドの0本、1本または2本の鎖を切断することができる。ある場合には、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、ニッカーゼドメインを含むことができる。本明細書において、用語「ニッカーゼ」は、二本鎖核酸分子(例えばDNA)中の二本鎖の一方の鎖のみを切断することができるヌクレアーゼドメインを含むポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインを指す。ある態様において、ニッカーゼは、活性なポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインに一つ以上の突然変異を導入することによって、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインの完全に触媒活性な(例えば天然の)形態から誘導することができる。例えば、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインがCas9に由来するニッカーゼドメインを含む場合、Cas9に由来するニッカーゼドメインは、D10A突然変異および位置840におけるヒスチジンを含むことができる。そのような場合、残基H 840は触媒活性を保持し、それによって核酸二本鎖の一本鎖を切断することができる。別の例において、Cas9由来ニッカーゼドメインは、H840A突然変異を含むことができ、一方、位置10におけるアミノ酸残基は、Dのままである。いくつかの実施形態において、ニッカーゼは、ニッカーゼ活性に必要ではないヌクレアーゼドメインの全部または一部を除去することによって、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインの完全に触媒活性な(例えば天然の)形態から誘導することができる。例えば、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインがCas9に由来するニッカーゼドメインを含む場合、Cas9に由来するニッカーゼドメインは、RuvCドメインまたはHNHドメインの全部または一部の欠失を含むことができる。
【０１５０】
例示的な、触媒的に活性であるCas9のアミノ酸配列は以下の通りである：
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.
【０１５１】
したがって、ニッカーゼドメインを含むポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディターは、特定のポリヌクレオチド標的配列(例えば結合したガイド核酸の相補的配列によって決定される)において一本鎖DNA切断 (ニック) を生成することができる。ある態様において、ニッカーゼドメイン(例えばCas9由来のニッカーゼドメイン)を含む塩基エディターによって切断される核酸二本鎖標的ポリヌクレオチド配列の鎖は、塩基エディターによって編集されない鎖である(すなわち、塩基エディタによって切断される鎖は、編集される塩基を含む鎖とは反対の鎖である)。他の態様において、ニッカーゼドメイン(例えばCas9由来のニッカーゼドメイン)を含む塩基エディターは、編集のために標的とされるDNA分子の鎖を切断することができる。このような場合、非標的鎖は切断されない。
【０１５２】
触媒的に死んだ(すなわち標的ポリヌクレオチド配列を切断することができない)ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディターも本明細書中に提供される。本明細書において、用語「触媒的に死んだ」および「死んだヌクレアーゼ」は、核酸の鎖を切断することができない結果となる一つ以上の突然変異および/または欠失を有するポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインを指すために交換可能に使用される。いくつかの実施形態において、触媒的に死んだポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメイン塩基エディターは、1つ以上のヌクレアーゼドメインにおける特定の点突然変異の結果としてヌクレアーゼ活性を欠くことができる。例えば、Cas9ドメインを含む塩基エディターの場合、Cas9は、D10A突然変異およびH840A突然変異の両方を含むことができる。このような変異は両方のヌクレアーゼドメインを不活性化し、その結果ヌクレアーゼ活性を失う。他の実施形態において、触媒的に死んだポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、触媒ドメイン(例えばRuvC1および/またはHNHドメイン)の全部又は一部の一つ以上の欠失を含むことができる。さらなる態様において、触媒的に死んだポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインは、点突然変異(例えばD10AまたはH840A)ならびにヌクレアーゼドメインの全部または一部の欠失を含む。
【０１５３】
また、本明細書では、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインの以前に機能していたバージョンから、触媒的に死んだポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインを生成することができる突然変異も企図される。例えば、触媒的に死んだCas9 (「dCas9」) の場合、D10AおよびH840A以外の突然変異を有してヌクレアーゼ不活性化Cas9をもたらすバリアントが提供される。このような突然変異は、例えば、D10およびH840における他のアミノ酸置換、またはCas9のヌクレアーゼドメイン内の他の置換(例えば、HNHヌクレアーゼサブドメインおよび/またはRuvC1サブドメインにおける置換)を含む。さらなる適切なヌクレアーゼ不活性dCas9ドメインは、本開示および当該分野における知識に基づいて当業者に明らかとなり得、本開示の範囲内である。このようなさらなる例示的な適切なヌクレアーゼ不活性Cas9ドメインには、限定されるものではないが、D10A/H840A、D10A/D839A/H840A、およびD10A/D839A/H840A/N863A突然変異体ドメインが含まれる(例えば、Prashant et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838を参照されたい (その全内容は参照により本明細書に組み込まれる))。
【０１５４】
塩基エディターに組み込むことができるポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインの非限定的な例としては、CRISPRタンパク質由来ドメイン、制限ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、TALヌクレアーゼ (TALEN) 、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN) が挙げられる。いくつかの場合において、塩基エディターは、核酸のCRISPR (すなわちClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)媒介修飾の際に、結合ガイド核酸を介して核酸配列に結合することができる天然もしくは修飾されたタンパク質またはその一部を含むポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインを含む。そのようなタンパク質は、本明細書において「CRISPRタンパク質」と呼ばれる。従って、本明細書に開示されているのは、CRISPRタンパク質の全部または一部を含むポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディター（すなわち、CRISPRタンパク質の全部または一部をドメインとして含む塩基エディター（それは塩基エディターの「CRISPRタンパク質由来ドメイン」とも呼ばれる））である。塩基エディターに組み込まれたCRISPRタンパク質由来ドメインは、野生型または天然型のCRISPRタンパク質と比較して改変され得る。例えば、以下に記載するように、CRISPRタンパク質由来ドメインは、野生型または天然型のCRISPRタンパク質と比較して、1以上の突然変異、挿入、欠失、再配列および/または組換えを含み得る。
【０１５５】
CRISPRは、可動遺伝要素(ウイルス、転移因子、接合プラスミド)に対する防御を提供する適応免疫系である。CRISPRクラスターは、スペーサー、先行する可動要素に相補的な配列、および標的侵入核酸を含む。CRISPRクラスターは転写され、CRISPR RNA (crRNA) にプロセシングされる。II型CRISPRシステムでは、pre‐crRNAの正しいプロセシングはトランスコード小RNA (tracrRNA)、内因性リボヌクレアーゼ3 (rnc) 、およびCas9タンパク質を必要とする。tracrRNAはリボヌクレアーゼ3によるpre-crRNAのプロセシングのガイドとなる。続いて、Cas9/crRNA/tracrRNAが、スペーサーに相補的な線状または環状のdsDNA標的をエンドヌクレアーゼで切断する。crRNAに相補的でない標的鎖は、最初にエンドヌクレアーゼ的に切断され、次にエキソヌクレアーゼ的に3’-5’にトリムされる。自然界では、DNA結合と切断にはタンパク質と両方のRNAが必要である。しかしながら、crRNAおよびtracrRNAの両方の側面を単一のRNA種に組み込むように、単一ガイドRNA (「sgRNA」、あるいは単に「gRNA」)を作製することができる。例えばJinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を参照されたい（その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）。Cas9は、CRISPR反復配列中の短いモチーフ(PAMまたはプロトスペーサー隣接モチーフ)を認識して、「自己」と「非自己」を区別することを助ける。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、組み換え操作された（engineered）Casタンパク質を利用することができる。ガイドRNA (gRNA) は、Cas結合に必要な足場配列と、修飾されるゲノム標的を規定するユーザー定義の約20塩基スペーサーとからなる短い合成RNAである。したがって当業者は、ゲノム標的を変えることができ、Casタンパク質の特異性は、gRNA標的化配列がゲノムの他の部分と比較してゲノム標的に対していかに特異的であるかによって部分的に決定される。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、gRNAスキャフォールド配列は以下の通りである：GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたCRISPRタンパク質由来ドメインは、結合ガイド核酸と組み合わせられた場合に標的ポリヌクレオチドに結合することができるエンドヌクレアーゼ(例えばデオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼ)である。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたCRISPRタンパク質由来ドメインは、結合ガイド核酸と組み合わせられた場合に標的ポリヌクレオチドに結合することができるニッカーゼである。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたCRISPRタンパク質由来ドメインは、結合ガイド核酸と組み合わせられた場合に標的ポリヌクレオチドに結合することができる触媒的に死んだドメインである。或る実施態様では、塩基エディターのCRISPRタンパク質由来ドメインに結合する標的ポリヌクレオチドはDNAであり、或る実施態様では、塩基エディターのCRISPRタンパク質由来ドメインに結合する標的ポリヌクレオチドはRNAである。
【０１５９】
本明細書中で用いることができるCAsタンパク質は、クラス1およびクラス2を含む。Casタンパク質の非限定的な例としては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5d、Cas5t、Cas5h、Cas5a、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csn1またはCsx12とも呼ばれる)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Csy4、Cse1、Cse2、Cse3、Cse4、Cse5、Csn1、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Cssx16、Cx16、Cx、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Csd1、Csd2、Cst1、Cst2、Csh1、Csh2、Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5、Cas12a/Cpf1、Cas12b/C2c1、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、およびCas12i、CARF、DinG、それらのホモログ、またはそれらの改変体が挙げられる。未改変のCRISPR酵素は、Cas9のように、2つの機能性エンドヌクレアーゼ領域、RuvCおよびHNHを有するDNA切断活性を有することができる。CRISPR酵素は、標的配列内および/または標的配列の相補鎖内などの標的配列において、一方または両方の鎖の切断を誘導することができる。例えば、CRISPR酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500塩基対またはそれ以上にある一方または両方の鎖の切断を誘導することができる。
【０１６０】
標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠失するように、対応する野生型酵素に対して変異されたCRISPR酵素をコードするベクターを用いることができる。Cas9は、野生型の例示的なCas9ポリペプチド(例えばS. pyogenesからのCas9)と少なくとも、または少なくともおよそ、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性および/または配列相同性を有するポリペプチドを指すことができる。Cas9は、野生型の例示的なCas9ポリペプチド(例えばS.pyogenesからのもの)に対して、最大で、または最大でおよそ、約50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性および/または配列相同性を有するポリペプチドを指すことができる。Cas9は、野生型、または欠失、挿入、置換、バリアント、突然変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組合せなどのアミノ酸変化を含み得るCas9タンパク質の改変型を指すことができる。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、塩基エディターのCRISPRタンパク質由来ドメインは、Corynebacterium ulcerans (NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1); Corynebacterium diphtheria (NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1); Spiroplasma syrphidicola (NCBI Ref: NC_021284.1); Prevotella intermedia (NCBI Ref: NC_017861.1); Spiroplasma taiwanense (NCBI Ref: NC_021846.1); Streptococcus iniae (NCBI Ref: NC_021314.1); Belliella baltica (NCBI Ref: NC_018010.1); Psychroflexus torquis (NCBI Ref: NC_018721.1); Streptococcus thermophilus (NCBI Ref: YP_820832.1); Listeria innocua (NCBI Ref: NP_472073.1); Campylobacter jejuni (NCBI Ref: YP_002344900.1); Neisseria meningitidis (NCBI Ref: YP_002342100.1), Streptococcus pyogenes, または Staphylococcus aureusからのCas9の全部または一部を含み得る。
【０１６２】
［核酸塩基エディターのCas9ドメイン］
用語「Cas9」または「Cas9ドメイン」とは、Cas9タンパク質またはその断片(例えばCas9の活性、不活性、または部分的に活性なDNA切断ドメイン、および/またはCas9のgRNA結合ドメインを含むタンパク質)を含むRNA誘導型ヌクレアーゼを表す。Cas9ヌクレアーゼは、casnlヌクレアーゼまたはCRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）関連ヌクレアーゼとも呼ばれる。例示的なCas9は、アミノ酸配列が以下に提供されるStreptococcus pyogenes Cas9（spCas9）である：
2021523738.tif 000006
（一本下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
【０１６３】
Cas9ヌクレアーゼの配列および構造は、当業者によく知られている(例えば“Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes.”  Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); “CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.” Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); および “A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.”  Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)参照。その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。)。Cas9オーソログは、限定されるものではないが、S.pyogenesおよびS.thermophilusを含む種々の種において記述されてきた。さらなる適切なCas9ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて当業者に明らかとなり、そのようなCas9ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski, Rhun, and Charpentier, “The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems” (2013) RNA Biology 10:5, 726-737に開示されている生物および遺伝子座由来のCas9配列を含む。その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６４】
ある態様では、核酸プログラム可能なDNA結合タンパク質（napDNAbp）はCas9ドメインである。非限定的、例示的なCas9ドメインは本明細書に提供されている。Cas9ドメインはヌクレアーゼ活性Cas9ドメイン、ヌクレアーゼ不活性Cas9ドメイン、またはCas9ニッカーゼであり得る。いくつかの実施形態では、Cas9ドメインはヌクレアーゼ活性ドメインである。例えば、Cas9ドメインは二本鎖核酸の両方の鎖（例えば二本鎖DNA分子の両方の鎖）を切断するCas9ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、Cas9ドメインは本明細書に提供アミノ酸配列のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、Cas9ドメインは、本明細書に提供アミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれかと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれかと比較して、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、または少なくとも1200の同一の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０１６５】
ある態様において、Cas9の断片を含むタンパク質が提供される。例えば、いくつかの実施形態において、タンパク質は、以下の2つのCas9ドメインのうちの1つを含む：(1) Cas9のgRNA結合ドメイン;(2) Cas9のDNA切断ドメイン。ある態様において、Cas9またはその断片を含むタンパク質は、「Cas9バリアント」と称される。Cas9バリアントは、Cas9またはその断片と相同性を共有する。例えば、Cas9バリアントは、野生型Cas9と少なくとも約70%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、少なくとも約96%同一、少なくとも約97%同一、少なくとも約98%同一、少なくとも約99%同一、少なくとも約99.5%同一、または少なくとも約99.9%同一である。いくつかの実施形態において、Cas9変異体は、野生型Cas9と比較して、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50またはそれ以上のアミノ酸変化を有し得る。いくつかの実施形態において、Cas9バリアントは、Cas9の断片 (例えばgRNA結合ドメインまたはDNA切断ドメイン)を含み、その断片は、野生型Cas9の対応する断片と少なくとも約70%同一であり、少なくとも約80%同一であり、少なくとも約90%同一であり、少なくとも約95%同一であり、少なくとも約96%同一であり、少なくとも約97%同一であり、少なくとも約98%同一であり、少なくとも約99%同一であり、少なくとも約99.5%同一であり、または少なくとも約99.9%同一である。ある態様において、断片は、対応する野生型Cas9のアミノ酸長の少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%である。ある態様において、断片は、長さが少なくとも100アミノ酸である。ある態様において、断片は、少なくとも100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, または少なくとも 1300アミノ酸の長さである。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるCas9融合タンパク質は、Cas9タンパク質の全長アミノ酸配列、例えば、本明細書に提供されるCas9配列の1つを含む。しかしながら、他の実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質は、全長Cas9配列を含まず、その1つ以上の断片のみを含む。好適なCas9ドメインおよびCas9断片の例示的アミノ酸配列が本明細書に提供され、Cas9ドメインおよび断片のさらなる好適な配列は、当業者には明らかであろう。
【０１６７】
Cas9タンパク質は、そのガイドRNAに相補的な特定のDNA配列にCas9タンパク質をガイドする、ガイドRNAと結合することができる。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、Cas9ドメイン、例えばヌクレアーゼ活性Cas9、Cas9ニッカーゼ (nCas9) 、またはヌクレアーゼ不活性Cas9 (dCas9) である。核酸プログラム可能なDNA結合タンパク質の例としては、Cas9 (例えばdCas9 および nCas9)、CasX、CasY、Cpf1、Cas12b/C2C1、およびCas12c/C2C3が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、野生型Cas9はStreptococcus pyogenesからのCas9に対応する（NCBI Reference Sequence: NC_017053.1、ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は以下の通りである）。
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGATTATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGGCAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGCAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAATCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTAGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAGAAATGGCTTGTTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGATTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATAGTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAGCGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAGGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGCGCCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGGGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGATATTCAAAAAGCACAGGTGTCTGGACAAGGCCATAGTTTACATGAACAGATTGCTAACTTAGCTGGCAGTCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAATTGTTGATGAACTGGTCAAAGTAATGGGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTACAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCATTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTACTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA 
2021523738.tif 000007
（一本下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
【０１６９】
いくつかの実施形態では、野生型Cas9は以下のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列に対応するかまたはそれを含む：
ATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGACATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATCACATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACGGATCCCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTCGAGCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCTGCAGGA 
2021523738.tif 000008
（一本下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
【０１７０】
いくつかの実施形態では、野生型Cas9は、StreptococcuspyogenesからのCas9に対応する（NCBI Reference Sequence: NC_002737.2（ヌクレオチド配列は下記）；およびUniprot Reference Sequence: Q99ZW2（アミノ酸配列は下記）：
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA 
2021523738.tif 000009
（一本下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
【０１７１】
いくつかの実施形態では、Cas9は、Corynebacterium ulcerans (NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1); Corynebacterium diphtheria (NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1); Spiroplasma syrphidicola (NCBI Ref: NC_021284.1); Prevotella intermedia (NCBI Ref: NC_017861.1); Spiroplasma taiwanense (NCBI Ref:  NC_021846.1); Streptococcus iniae(NCBI Ref: NC_021314.1); Belliella baltica (NCBI Ref: NC_018010.1); Psychroflexus torquisI (NCBI Ref: NC_018721.1); Streptococcus thermophilus (NCBI Ref: YP_820832.1), Listeria innocua (NCBI Ref: NP_472073.1), Campylobacter jejuni (NCBI Ref: YP_002344900.1) もしくは Neisseria meningitidis (NCBI Ref: YP_002342100.1) からのCas9、または他の任意の生物体からのCas9を表す。
【０１７２】
追加的なCas9タンパク質(例えば、ヌクレアーゼ不活Cas9 (dCas9) 、Cas9ニッカーゼ (nCas9) 、またはヌクレアーゼ活性Cas9)は、そのバリアントおよびホモログを含めて、本開示の範囲内にあることを理解されたい。例示的なCas9タンパク質は、限定されるものではないが、以下に提供されるものを含む。ある態様において、Cas9タンパク質は、ヌクレアーゼ不活Cas9 (dCas9) である。ある態様において、Cas9タンパク質は、Cas9ニッカーゼ(nCas9) である。いくつかの実施形態において、Cas9タンパク質はヌクレアーゼ活性Cas9である。
【０１７３】
ある態様において、Cas9ドメインは、ヌクレアーゼ不活性Cas9ドメイン(dCas9) である。例えば、dCas9ドメインは、二本鎖核酸分子のいずれの鎖も切断することなく、二本鎖核酸分子に結合し得る(例えば、gRNA分子を介して)。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ不活性dCas9ドメインは、本明細書中に記載されたアミノ酸配列のD10X突然変異およびH840X突然変異、または本明細書中に提供されたアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、Xは任意のアミノ酸変化である。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ不活性dCas9ドメインは、本明細書に記載のアミノ酸配列のD10A突然変異およびH840A突然変異、または本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。一例として、ヌクレアーゼ不活性Cas9ドメインは、クローニングベクターpPlatTET-gRNA 2 (アクセス番号BAV54124)に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１７４】
例示的な、触媒的に不活なCas9 (dCas9)のアミノ酸配列は以下の通りである。
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD  
（例えば、Qi et al., “Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.” Cell. 2013; 152(5):1173-83参照。その内容全体は参照により本明細書に組み入れられる。）
【０１７５】
ある態様において、Cas9ヌクレアーゼは、不活性な(例えば不活化された) DNA切断ドメインを有し、すなわち、Cas9は、「nCas9」タンパク質（「nickase」Cas9の意）と呼ばれるニッカーゼである。ヌクレアーゼ不活性化Cas9タンパク質は、互換的に「dCas9」タンパク質（nuclease-“dead” Cas9の意）または触媒的に不活なCas9とも称され得る。不活性なDNA切断ドメインを有するCas9タンパク質(又はその断片)を生成する方法は公知である(例えばJinek et al, Science. 337:816-821(2012); Qi et al., “Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression” (2013) Cell. 28; 152(5): 1173-83参照(各内容は参照により本明細書に組み込まれる))。例えば、Cas9のDNA切断ドメインは、HNHヌクレアーゼサブドメインとRuvC1サブドメインという2つのサブドメインを含むことが知られている。HNHサブドメインはgRNAに相補的な鎖を切断し、RuvC1サブドメインは非相補的な鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異はCas9のヌクレアーゼ活性を抑制し得る。例えば、突然変異D10AおよびH840Aは、S. pyogenes Cas9 のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell.
【０１７６】
いくつかの実施形態において、dCas9ドメインは、本明細書に提供されるdCas9ドメインのいずれかに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれかと比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれ以上の突然変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれかと比較して、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、または少なくとも1200の同一の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０１７７】
ある態様において、dCas9は、Cas9ヌクレアーゼ活性を不活性化する1以上の突然変異を有するCas9アミノ酸配列に対応するか、またはその一部もしくは全体を含む。例えば、いくつかの実施形態において、dCas9ドメインは、D10AおよびH840A突然変異または別のCas9における対応する突然変異を含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、dCas9は、以下のdCas9 (D10AおよびH840A)のアミノ酸配列を含む：
2021523738.tif 000010
（単一下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、Cas9ドメインはD10A突然変異を含み、一方、上記で提供したアミノ酸配列における位置840における残基、または本明細書で提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する位置における残基は、ヒスチジンのままである。
【０１８０】
他の実施形態において、例えばヌクレアーゼ不活性化Cas9 (dCas9) をもたらす、D10AおよびH840A以外の突然変異を有するdCas9バリアントが提供される。このような突然変異は、例えば、D10およびH840における他のアミノ酸置換、またはCas9のヌクレアーゼドメイン内の他の置換(例えば、HNHヌクレアーゼサブドメインおよび/またはRuvC1サブドメインにおける置換)を含む。ある態様において、dCas9のバリアントまたはホモログであって、少なくとも約70%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、少なくとも約98%同一、少なくとも約99%同一、少なくとも約99.5%同一、または少なくとも約99.9%の同一性を有するものが提供される。ある態様において、約5アミノ酸、約10アミノ酸、約15アミノ酸、約20アミノ酸、約25アミノ酸、約30アミノ酸、約40アミノ酸、約50アミノ酸、約75アミノ酸、約100アミノ酸またはそれ以上だけ短いまたは長いアミノ酸配列を有するdCas9のバリアントが提供される。
【０１８１】
ある態様において、Cas9ドメインは、Cas9ニッカーゼである。Cas9ニッカーゼは、二本鎖核酸分子(例えば二本鎖DNA分子)の一方の鎖のみを切断することができるCas9タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、Cas9ニッカーゼは、二本鎖核酸分子の標的鎖を切断し、これは、Cas9ニッカーゼが、Cas9に結合しているgRNA（例えばsgRNA）と塩基対を形成している（相補的である）鎖を切断することを意味する。ある態様において、Cas9ニッカーゼは、D10A突然変異を含み、位置840にヒスチジンを有する。いくつかの実施形態において、Cas9ニッカーゼは、二本鎖核酸分子の非標的、非塩基編集鎖を切断し、これは、Cas9ニッカーゼが、Cas9に結合しているgRNA（例えばsgRNA）と塩基対を形成していない鎖を切断することを意味する。ある態様において、Cas9ニッカーゼは、H840A突然変異を含み位置10にアスパラギン酸残基を有するか、または対応する突然変異。いくつかの実施形態において、Cas9ニッカーゼは、本明細書に提供されるCas9ニッカーゼのいずれかと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。さらなる適切なCas9ニッカーゼは、本開示および当該分野における知識に基づいて当業者に明らかであり、本開示の範囲内である。
【０１８２】
例示的な、触媒的Cas9ニッカーゼ（nCas9）のアミノ酸配列は以下の通りである。
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD  
【０１８３】
ある態様において、Cas9は、単細胞原核微生物のドメインおよび界を構成する古細菌(例えばナノアーキア)由来のCas9を指す。ある態様において、プログラム可能なヌクレオチド結合タンパク質は、例えば、Burstein et al., "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes." Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21に記載されているCasXまたはCasYタンパク質であり得、その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる。ゲノム分解メタゲノミクスを用いて、生命の古細菌ドメインにおいて最初に報告されたCas9を含め、多くのCRISPR‐Cas系が同定された。この分岐Cas9タンパク質は、ほとんど研究されていないナノアーキアにおいて、活性CRISPR‐Cas系の一部として発見された。細菌では、それまで知られていなかった二つの系、CRISPR-CasXとCRISPR-CasYが発見され、それらは、これまでに発見された中でも最もコンパクトな系に入る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される塩基エディターシステムにおいて、Cas9は、CasXまたはCasXのバリアントによって置き換えられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される塩基エディターシステムにおいて、Cas9は、CasYまたはCasYのバリアントによって置き換えられる。核酸プログラム可能DNA結合タンパク質(napDNAbp) として他のRNA誘導DNA結合タンパク質も使用され得、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかの核酸プログラム可能DNA結合タンパク質(napDNAbp) は、CasXまたはCasYタンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、napDNAbpはCasXタンパク質である。いくつかの実施形態において、napDNAbpはCasYタンパク質である。いくつかの実施形態において、napDNAbpは、天然に存在するCasXまたはCasYタンパク質に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、プログラム可能なヌクレオチド結合タンパク質は、天然に存在するCasXまたはCasYタンパク質である。いくつかの実施形態において、プログラム可能なヌクレオチド結合タンパク質は、本明細書に記載されるいずれかのCasXまたはCasYタンパク質に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の細菌種由来のCasXおよびCasYもまた、本開示に従って使用され得ることを理解されたい。
【０１８５】
例示的CasX ((uniprot.org/uniprot/F0NN87; uniprot.org/uniprot/F0NH53) tr|F0NN87|F0NN87_SULIHCRISPR-associatedCasx protein OS = Sulfolobus islandicus (strain HVE10/4) GN = SiH_0402 PE=4 SV=1)のアミノ酸配列は以下の通りである。
MEVPLYNIFGDNYIIQVATEAENSTIYNNKVEIDDEELRNVLNLAYKIAKNNEDAAAERRGKAKKKKGEEGETTTSNIILPLSGNDKNPWTETLKCYNFPTTVALSEVFKNFSQVKECEEVSAPSFVKPEFYEFGRSPGMVERTRRVKLEVEPHYLIIAAAGWVLTRLGKAKVSEGDYVGVNVFTPTRGILYSLIQNVNGIVPGIKPETAFGLWIARKVVSSVTNPNVSVVRIYTISDAVGQNPTTINGGFSIDLTKLLEKRYLLSERLEAIARNALSISSNMRERYIVLANYIYEYLTG SKRLEDLLYFANRDLIMNLNSDDGKVRDLKLISAYVNGELIRGEG.
【０１８６】
例示的CasX (>tr|F0NH53|F0NH53_SULIR CRISPR associated protein, Casx OS = Sulfolobus islandicus (strain REY15A) GN=SiRe_0771 PE=4 SV=1) のアミノ酸配列は以下の通りである。
MEVPLYNIFGDNYIIQVATEAENSTIYNNKVEIDDEELRNVLNLAYKIAKNNEDAAAERRGKAKKKKGEEGETTTSNIILPLSGNDKNPWTETLKCYNFPTTVALSEVFKNFSQVKECEEVSAPSFVKPEFYKFGRSPGMVERTRRVKLEVEPHYLIMAAAGWVLTRLGKAKVSEGDYVGVNVFTPTRGILYSLIQNVNGIVPGIKPETAFGLWIARKVVSSVTNPNVSVVSIYTISDAVGQNPTTINGGFSIDLTKLLEKRDLLSERLEAIARNALSISSNMRERYIVLANYIYEYLTGSKRLEDLLYFANRDLIMNLNSDDGKVRDLKLISAYVNGELIRGEG.
【０１８７】
Deltaproteobacteria CasX 
MEKRINKIRKKLSADNATKPVSRSGPMKTLLVRVMTDDLKKRLEKRRKKPEVMPQVISNNAANNLRMLLDDYTKMKEAILQVYWQEFKDDHVGLMCKFAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPVKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDfAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPVVERRENEVDWWNTINEVKKLIDAKRDMGRVFWSGVTAEKRNTILEGYNYLPNENDHKKREGSLENPKKPAKRQFGDLLLYLEKKYAGDWGKVFDEAWERIDKKIAGLTSHIEREEARNAEDAQSKAVLTDWLRAKASFVLERLKEMDEKEFYACEIQLQKWYGDLRGNPFAVEAENRVVDISGFSIGSDGHSIQYRNLLAWKYLENGKREFYLLMNYGKKGRIRFTDGTDIKKSGKWQGLLYGGGKAKVIDLTFDPDDEQLIILPLAFGTRQGREFIWNDLLSLETGLIKLANGRVIEKTIYNKKIGRDEPALFVALTFERREVVDPSNIKPVNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLPEFKDSSGGPTDILRIGEGYKEKQRAIQAAKEVEQRRAGGYSRKFASKSRNLADDMVRNSARDLFYHAVTHDAVLVFANLSRGFGRQGKRTFMTERQYTKMEDWLTAKLAYEGLTSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITYADMDVMLVRLKKTSDGWATTLNNKELKAEYQITYYNRYKRQTVEKELSAELDRLSEESGNNDISKWTKGRRDEALFLLKKRFSHRPVQEQFVCLDCGHEVHAAEQAALNIARSWLFLNSNSTEFKSYKSGKQPFVGAWQAFYKRRLKEVWKPNA
【０１８８】
例示的CasY ((ncbi.nlm.nih.gov/protein/APG80656.1) >APG80656.1 CRISPR-associated protein CasY [uncultured Parcubacteria group bacterium]) のアミノ酸配列は以下の通りである。
MSKRHPRISGVKGYRLHAQRLEYTGKSGAMRTIKYPLYSSPSGGRTVPREIVSAINDDYVGLYGLSNFDDLYNAEKRNEEKVYSVLDFWYDCVQYGAVFSYTAPGLLKNVAEVRGGSYELTKTLKGSHLYDELQIDKVIKFLNKKEISRANGSLDKLKKDIIDCFKAEYRERHKDQCNKLADDIKNAKKDAGASLGERQKKLFRDFFGISEQSENDKPSFTNPLNLTCCLLPFDTVNNNRNRGEVLFNKLKEYAQKLDKNEGSLEMWEYIGIGNSGTAFSNFLGEGFLGRLRENKITELKKAMMDITDAWRGQEQEEELEKRLRILAALTIKLREPKFDNHWGGYRSDINGKLSSWLQNYINQTVKIKEDLKGHKKDLKKAKEMINRFGESDTKEEAVVSSLLESIEKIVPDDSADDEKPDIPAIAIYRRFLSDGRLTLNRFVQREDVQEALIKERLEAEKKKKPKKRKKKSDAEDEKETIDFKELFPHLAKPLKLVPNFYGDSKRELYKKYKNAAIYTDALWKAVEKIYKSAFSSSLKNSFFDTDFDKDFFIKRLQKIFSVYRRFNTDKWKPIVKNSFAPYCDIVSLAENEVLYKPKQSRSRKSAAIDKNRVRLPSTENIAKAGIALARELSVAGFDWKDLLKKEEHEEYIDLIELHKTALALLLAVTETQLDISALDFVENGTVKDFMKTRDGNLVLEGRFLEMFSQSIVFSELRGLAGLMSRKEFITRSAIQTMNGKQAELLYIPHEFQSAKITTPKEMSRAFLDLAPAEFATSLEPESLSEKSLLKLKQMRYYPHYFGYELTRTGQGIDGGVAENALRLEKSPVKKREIKCKQYKTLGRGQNKIVLYVRSSYYQTQFLEWFLHRPKNVQTDVAVSGSFLIDEKKVKTRWNYDALTVALEPVSGSERVFVSQPFTIFPEKSAEEEGQRYLGIDIGEYGIAYTALEITGDSAKILDQNFISDPQLKTLREEVKGLKLDQRRGTFAMPSTKIARIRESLVHSLRNRIHHLALKHKAKIVYELEVSRFEEGKQKIKKVYATLKKADVYSEIDADKNLQTTVWGKLAVASEISASYTSQFCGACKKLWRAEMQVDETITTQELIGTVRVIKGGTLIDAIKDFMRPPIFDENDTPFPKYRDFCDKHHISKKMRGNSCLFICPFCRANADADIQASQTIALLRYVKEEKKVEDYFERFRKLKNIKVLGQMKKI.
【０１８９】
ある態様において、核酸プログラム可能DNA結合タンパク質(napDNAbp) は、微生物CRISPR-Cas系の単一のエフェクターである。微生物CRISPR-Cas系の単一エフェクターは、Cas9、Cpf1、Cas12b/C2c1、およびCas12c/C2c3を含むが、これらに限定されない。典型的には、微生物CRISPR-Cas系はクラス1およびクラス2系に分けられる。クラス1の系は多サブユニットエフェクター複合体をもち、クラス2の系は単一のタンパク質エフェクターをもつ。たとえば、Cas9とCpf1はクラス2エフェクタである。Cas9およびCpf1に加えて、三つの異なるクラス2 CRISPR-Casシステム(Cas12b/C2c1およびCas12c/C2c3)がShmakov et al., “Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems”, Mol. Cell, 2015 Nov. 5; 60(3): 385-397によって記載されている(その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる) 。2つの系、Cas12b/C2c1とCas12c/C2c3のエフェクターはCpf1に関連するRuvC様エンドヌクレアーゼ領域を含む。第3の系は、2つの予測されるHEPN RNaseドメインをもつエフェクターを含む。Cas12b/C2c1によるCRISPR RNAの産生とは異なり、成熟CRISPR RNAの産生がtracrRNA非依存性である。Cas12b/C2c1はDNA切断にCRISPRRNAとtracrRNAの両方に依存する。
【０１９０】
Alicyclobaccillus acidoterrastris Cas12b/C2c1 (AacC2c1) の結晶構造が、キメラ単一分子ガイドRNA (sgRNA) との複合体として報告されている。例えば、Liu et al., “C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism”, Mol. Cell, 2017 Jan. 19; 65(2):310-322参照 (その内容全体を参照により本明細書に組み込む) 。また、三元複合体として標的DNAに結合したAlicyclobacillus acidoterrestris C2c1においても結晶構造が報告されている。例えば、Yang et al., “PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease”, Cell, 2016 Dec. 15; 167(7):1814-1828参照（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。標的DNA鎖および非標的DNA鎖の両方と共に、AacC2c1の触媒的にコンピテントな立体配座は、1つのRuvC触媒ポケット内に独立して捕捉され、Cas12b/C2c1媒介切断は標的DNAのスタガード7ヌクレオチドの切断を生じる。Cas 12b/C2c1三元複合体と以前に同定されたCas9およびCpf1対応物の間の構造比較は、CRISPR‐Cas9システムにより使用される機構の多様性を示す。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかの核酸プログラム可能DNA結合タンパク質(napDNAbp) は、Cas12b/C2c1またはCas12c/C2c3タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、napDNAbpはCas12b/C2c1タンパク質である。いくつかの実施形態において、napDNAbpはCas12c/C2c3タンパク質である。いくつかの実施形態において、napDNAbpは、天然に存在するCas12b/C2c1またはCas12c/C2c3タンパク質に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、napDNAbpは、天然に存在するCas12b/C2c1またはCas12c/C2c3タンパク質である。いくつかの実施形態において、napDNAbpは、本明細書に提供されるnapDNAbp配列のいずれかに対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の細菌種由来のCas12b/C2c1またはCas12c/C2c3も本開示に従って使用することができることを理解されたい。
【０１９２】
Cas12b/C2c1 ((uniprot.org/uniprot/T0D7A2#2) sp|T0D7A2|C2C1_ALIAG CRISPR-associated endonuclease C2c1 OS = Alicyclobacillus acido-terrestris (strain ATCC 49025 / DSM 3922/ CIP 106132 / NCIMB 13137/GD3B) GN=c2c1 PE=1 SV=1) のアミノ酸配列は以下の通りである。
MAVKSIKVKLRLDDMPEIRAGLWKLHKEVNAGVRYYTEWLSLLRQENLYRRSPNGDGEQECDKTAEECKAELLERLRARQVENGHRGPAGSDDELLQLARQLYELLVPQAIGAKGDAQQIARKFLSPLADKDAVGGLGIAKAGNKPRWVRMREAGEPGWEEEKEKAETRKSADRTADVLRALADFGLKPLMRVYTDSEMSSVEWKPLRKGQAVRTWDRDMFQQAIERMMSWESWNQRVGQEYAKLVEQKNRFEQKNFVGQEHLVHLVNQLQQDMKEASPGLESKEQTAHYVTGRALRGSDKVFEKWGKLAPDAPFDLYDAEIKNVQRRNTRRFGSHDLFAKLAEPEYQALWREDASFLTRYAVYNSILRKLNHAKMFATFTLPDATAHPIWTRFDKLGGNLHQYTFLFNEFGERRHAIRFHKLLKVENGVAREVDDVTVPISMSEQLDNLLPRDPNEPIALYFRDYGAEQHFTGEFGGAKIQCRRDQLAHMHRRRGARDVYLNVSVRVQSQSEARGERRPPYAAVFRLVGDNHRAFVHFDKLSDYLAEHPDDGKLGSEGLLSGLRVMSVDLGLRTSASISVFRVARKDELKPNSKGRVPFFFPIKGNDNLVAVHERSQLLKLPGETESKDLRAIREERQRTLRQLRTQLAYLRLLVRCGSEDVGRRERSWAKLIEQPVDAANHMTPDWREAFENELQKLKSLHGICSDKEWMDAVYESVRRVWRHMGKQVRDWRKDVRSGERPKIRGYAKDVVGGNSIEQIEYLERQYKFLKSWSFFGKVSGQVIRAEKGSRFAITLREHIDHAKEDRLKKLADRIIMEALGYVYALDERGKGKWVAKYPPCQLILLEELSEYQFNNDRPPSENNQLMQWSHRGVFQELINQAQVHDLLVGTMYAAFSSRFDARTGAPGIRCRRVPARCTQEHNPEPFPWWLNKFVVEHTLDACPLRADDLIPTGEGEIFVSPFSAEEGDFHQIHADLNAAQNLQQRLWSDFDISQIRLRCDWGEVDGELVLIPRLTGKRTADSYSNKVFYTNTGVTYYERERGKKRRKVFAQEKLSEEEAELLVEADEAREKSVVLMRDPSGIINRGNWTRQKEFWSMV NQRIEGYLVKQIRSRVPLQDSACENTGDI.
【０１９３】
BhCas12b (Bacillus hisashii) NCBI Reference Sequence: WP_095142515 
MAPKKKRKVGIHGVPAAATRSFILKIEPNEEVKKGLWKTHEVLNHGIAYYMNILKLIRQEAIYEHHEQDPKNPKKVSKAEIQAELWDFVLKMQKCNSFTHEVDKDEVFNILRELYEELVPSSVEKKGEANQLSNKFLYPLVDPNSQSGKGTASSGRKPRWYNLKIAGDPSWEEEKKKWEEDKKKDPLAKILGKLAEYGLIPLFIPYTDSNEPIVKEIKWMEKSRNQSVRRLDKDMFIQALERFLSWESWNLKVKEEYEKVEKEYKTLEERIKEDIQALKALEQYEKERQEQLLRDTLNTNEYRLSKRGLRGWREIIQKWLKMDENEPSEKYLEVFKDYQRKHPREAGDYSVYEFLSKKENHFIWRNHPEYPYLYATFCEIDKKKKDAKQQATFTLADPINHPLWVRFEERSGSNLNKYRILTEQLHTEKLKKKLTVQLDRLIYPTESGGWEEKGKVDIVLLPSRQFYNQIFLDIEEKGKHAFTYKDESIKFPLKGTLGGARVQFDRDHLRRYPHKVESGNVGRIYFNMTVNIEPTESPVSKSLKIHRDDFPKVVNFKPKELTEWIKDSKGKKLKSGIESLEIGLRVMSIDLGQRQAAAASIFEVVDQKPDIEGKLFFPIKGTELYAVHRASFNIKLPGETLVKSREVLRKAREDNLKLMNQKLNFLRNVLHFQQFEDITEREKRVTKWISRQENSDVPLVYQDELIQIRELMYKPYKDWVAFLKQLHKRLEVEIGKEVKHWRKSLSDGRKGLYGISLKNIDEIDRTRKFLLRWSLRPTEPGEVRRLEPGQRFAIDQLNHLNALKEDRLKKMANTIIMHALGYCYDVRKKKWQAKNPACQIILFEDLSNYNPYEERSRFENSKLMKWSRREIPRQVALQGEIYGLQVGEVGAQFSSRFHAKTGSPGIRCSVVTKEKLQDNRFFKNLQREGRLTLDKIAVLKEGDLYPDKGGEKFISLSKDRKCVTTHADINAAQNLQKRFWTRTHGFYKVYCKAYQVDGQTVYIPESKDQKQKIIEEFGEGYFILKDGVYEWVNAGKLKIKKGSSKQSSSELVDSDILKDSFDLASELKGEKLMLYRDPSGNVFPSDKWMAAGVFFGKLERILISKLTNQYSISTIEDDSSKQSMKRPAATKKAGQAKKKK
【０１９４】
いくつかの実施形態において、Cas12bはBvCas12Bであり、これはBhBvCas12Bのバリアントであり、BhBvCas12Bに対して以下の変化を含む：S893R、K846R、およびE837G。
BvCas12b (Bacillus sp. V3-13) NCBI Reference Sequence: WP_101661451.1 
MAIRSIKLKMKTNSGTDSIYLRKALWRTHQLINEGIAYYMNLLTLYRQEAIGDKTKEAYQAELINIIRNQQRNNGSSEEHGSDQEILALLRQLYELIIPSSIGESGDANQLGNKFLYPLVDPNSQSGKGTSNAGRKPRWKRLKEEGNPDWELEKKKDEERKAKDPTVKIFDNLNKYGLLPLFPLFTNIQKDIEWLPLGKRQSVRKWDKDMFIQAIERLLSWESWNRRVADEYKQLKEKTESYYKEHLTGGEEWIEKIRKFEKERNMELEKNAFAPNDGYFITSRQIRGWDRVYEKWSKLPESASPEELWKVVAEQQNKMSEGFGDPKVFSFLANRENRDIWRGHSERIYHIAAYNGLQKKLSRTKEQATFTLPDAIEHPLWIRYESPGGTNLNLFKLEEKQKKNYYVTLSKIIWPSEEKWIEKENIEIPLAPSIQFNRQIKLKQHVKGKQEISFSDYSSRISLDGVLGGSRIQFNRKYIKNHKELLGEGDIGPVFFNLVVDVAPLQETRNGRLQSPIGKALKVISSDFSKVIDYKPKELMDWMNTGSASNSFGVASLLEGMRVMSIDMGQRTSASVSIFEVVKELPKDQEQKLFYSINDTELFAIHKRSFLLNLPGEVVTKNNKQQRQERRKKRQFVRSQIRMLANVLRLETKKTPDERKKAIHKLMEIVQSYDSWTASQKEVWEKELNLLTNMAAFNDEIWKESLVELHHRIEPYVGQIVSKWRKGLSEGRKNLAGISMWNIDELEDTRRLLISWSKRSRTPGEANRIETDEPFGSSLLQHIQNVKDDRLKQMANLIIMTALGFKYDKEEKDRYKRWKETYPACQIILFENLNRYLFNLDRSRRENSRLMKWAHRSIPRTVSMQGEMFGLQVGDVRSEYSSRFHAKTGAPGIRCHALTEEDLKAGSNTLKRLIEDGFINESELAYLKKGDIIPSQGGELFVTLSKRYKKDSDNNELTVIHADINAAQNLQKRFWQQNSEVYRVPCQLARMGEDKLYIPKSQTETIKKYFGKGSFVKNNTEQEVYKWEKSEKMKIKTDTTFDLQDLDGFEDISKTIELAQEQQKKYLTMFRDPSGYFFNNETWRPQKEYWSIVNNIIKSCLKKKILSNKVEL
【０１９５】
Cas9ヌクレアーゼはRuvCとHNHという二つの機能性エンドヌクレアーゼ領域をもっている。Cas9は標的DNAに結合すると二番目のコンホメーション変化を起こし、これがヌクレアーゼドメインを位置付け、標的DNAの反対側の鎖を切断させる。Cas9を介したDNA切断の最終結果は、標的DNA内の二本鎖切断 (DSB) である(PAM配列の約3〜4ヌクレオチド上流)。生じたDSBは、次の二つの一般的修復経路のうちの一つにより修復される: (1) 効率的だが誤りがちな非相同末端結合 (NHEJ) 経路；または (2) 効率は低いが忠実度の高い相同性誘導修復 (HDR) 経路。
【０１９６】
非相同末端結合 (NHEJ) および/または相同性指向修復 (HDR) の「効率」は、任意の簡便な方法によって計算することができる。例えば、ある場合には、効率は、成功したHDRのパーセンテージで表すことができる。例えば、検査用ヌクレアーゼ分析を用いて切断産物を生成し、基質に対する産物の比を用いてパーセンテージを計算することができる。たとえば、HDRが成功した結果として新たに組み込まれた制限配列を含むDNAを直接切断する測量用ヌクレアーゼ酵素を使用することができる。切断される基質が多いほどHDRの割合が高かった(HDRの効率がより高かった)ことを示す。例示的な例として、HDRの割合 (パーセンテージ) は、以下の式を用いて計算することができる[(切断産物)/(基質+切断産物)] （例えば、 (b+c) / (a+b+c) ここで、「a」はDNA基質のバンド強度であり、「b」および「c」は切断生成物である。)。
【０１９７】
場合によっては、効率はNHEJの成功率で表すことができる。例えば、T7エンドヌクレアーゼIアッセイを用いて切断産物を生成し、基質に対する産物の比を用いてNHEJのパーセンテージを計算することができる。T7エンドヌクレアーゼIは、野生型および突然変異体DNA鎖(NHEJは最初の切断部位に小さなランダムな挿入や欠失 (インデル) を生じる)のハイブリダイゼーションから生じるミスマッチのヘテロ二本鎖DNAを切断する。切断が多いほどNHEJの割合が高いこと(NHEJの効率が高いこと)を示す。例示的な例として、NHEJの割合 (パーセンテージ) は、式(1-(1-(b+c)/(a+b+c))1/2) ×100を用いて計算することができ、ここで、「a」はDNA基質のバンド強度であり、「b」および「c」は切断生成物である（Ran et. al., Cell. 2013 Sep. 12; 154(6):1380-9; and Ran et al., Nat Protoc. 2013 Nov.; 8(11): 2281-2308）。
【０１９８】
NHEJ修復経路は最も活性な修復機構であり、DSB部位での小ヌクレオチド挿入または欠失 (インデル) を頻繁に引き起こす。NHEJ媒介DSB修復のランダム性は、Cas9およびgRNAまたはガイドポリヌクレオチドを発現する細胞集団が多様な突然変異のアレイをもたらし得るので、重要な実際的意味を有する。ほとんどの場合、NHEJは標的DNAに小さなインデルを生じさせ、その結果、標的遺伝子のオープンリーディングフレーム (ORF) 内に未熟な終止コドンをもたらすアミノ酸欠失、挿入、またはフレームシフト突然変異が生じる。理想的な最終結果は、標的遺伝子内の機能喪失型変異である。
【０１９９】
NHEJ媒介DSB修復はしばしば遺伝子のオープンリーディングフレームを破壊するが、相同性指向修復 (HDR) は単一ヌクレオチド変化からフルオロフォアまたはタグの付加のような大きな挿入までの範囲の特異的ヌクレオチド変化を生成するために使用できる。
【０２００】
HDRを遺伝子編集に利用するために、所望の配列を含むDNA修復テンプレートを、gRNAおよびCas9またはCas9ニッカーゼと共に目的の細胞型に送達することができる。修復テンプレートは、所望の編集ならびにその標的のすぐ上流および下流(左右相同アームと呼ばれる)にさらなる相同配列を含むことができる。各相同アームの長さは導入される変化の大きさに依存し得、より大きな挿入はより長い相同アームを必要とする。修復鋳型は、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、または二本鎖DNAプラスミドであり得る。HDRの効率は、Cas9、gRNAおよび外因性修復テンプレートを発現する細胞においても、一般的に低い(10%未満の修正アリル)。HDRは細胞周期のS期とG2期の間に起こるので、細胞を同調させることによってHDRの効率を高めることができる。NHEJに関与する遺伝子を化学的または遺伝的に阻害することもHDR頻度を増加させ得る。
【０２０１】
いくつかの実施態様において、Cas9は、修飾Cas9である。所与のgRNA標的配列は、ゲノム全体にわたり、部分的な相同性が存在するさらなる部位を有し得る。これらの部位はオフターゲットと呼ばれ、gRNAを設計する際に考慮する必要があるが、gRNAの設計を最適化することに加えて、Cas9を修飾することによってCRISPRの特異性を高めることもできる。Cas9は2つのヌクレアーゼドメイン、RuvCおよびHNHの組合せ活性を介して二本鎖切断 (DSB) を生成する。SpCas9のD10A変異体であるCas9ニッカーゼは1つのヌクレアーゼドメインを保持し、DSBではなくDNAニックを生成する。特異的遺伝子編集のためのHDR媒介遺伝子編集にニッカーゼを組み合わせることもできる。
【０２０２】
ある場合には、Cas9はバリアントCas9タンパク質である。バリアントCas9ポリペプチドは、野生型Cas9タンパク質のアミノ酸配列と比較して、一アミノ酸単位で異なる(例えば、欠失、挿入、置換、融合を有する)アミノ酸配列を有する。いくつかの例において、バリアントCas9ポリペプチドは、Cas9ポリペプチドのヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸変化(例えば欠失、挿入、または置換)を有する。例えば、いくつかの例において、バリアントCas9ポリペプチドは、対応する野生型Cas9タンパク質のヌクレアーゼ活性の50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、または1%未満を有する。ある場合には、バリアントCas9タンパク質は実質的なヌクレアーゼ活性をもたない。対象Cas9タンパク質が、実質的なヌクレアーゼ活性を有さないバリアントCas9タンパク質である場合、それは「dCas9」と称され得る。
【０２０３】
ある場合には、バリアントCas9タンパク質はヌクレアーゼ活性を低下させる。例えば、バリアントCas9タンパク質は、野生型Cas9タンパク質（例えば野生型Cas9タンパク質）のエンドヌクレアーゼ活性の約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満、約1%未満、または約0.1%未満を示す。
【０２０４】
ある場合には、バリアントCas9タンパク質は、ガイド標的配列の相補鎖を切断することができるが、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断する能力が低下している。例えば、バリアントCas9タンパク質は、RuvCドメインの機能を低下させる突然変異(アミノ酸置換)を有することができる。非限定的な例として、いくつかの実施形態において、バリアントCas9タンパク質は、D10A (アミノ酸位置10におけるアスパラギン酸からアラニン)を有し、したがって、二本鎖ガイド標的配列の相補鎖を切断することができるが、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断する能力が低下している(したがって、このバリアントCas9タンパク質が二本鎖標的核酸を切断するとき、二本鎖切断 (DSB) の代わりに一本鎖切断 (SSB) を生じる) (例えばJinek et al., Science. 2012 Aug. 17; 337(6096):816-21参照)。
【０２０５】
ある場合には、バリアントCas9タンパク質は、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断することができるが、ガイド標的配列の相補鎖を切断する能力が低下している。例えば、バリアントCas9タンパク質は、HNHドメインの機能を低下させる変異(アミノ酸置換)を有することができる(RuvC/HNH/RuvCドメインモチーフ)。非限定的な例として、いくつかの実施形態において、バリアントCas9タンパク質は、H840A (アミノ酸位置840におけるヒスチジンからアラニン)突然変異を有し、したがって、ガイド標的配列の非相補的ストランドを切断することができるが、ガイド標的配列の相補的ストランドを切断する能力が低下している(したがって、このバリアントCas9タンパク質が二本鎖ガイド標的配列を切断すると、DSBの代わりにSSBが生じる)。このようなCas9タンパク質は、ガイド標的配列(例えば一本鎖ガイド標的配列)を切断する能力が低下しているが、ガイド標的配列(例えば一本鎖ガイド標的配列)に結合する能力を保持している。
【０２０６】
ある場合には、バリアントCas9タンパク質は、二本鎖標的DNAの相補鎖および非相補鎖の両方を切断する能力が低下している。非限定的な例として、ある場合には、バリアントCas9タンパク質は、D10AおよびH840A突然変異の両方を有し、その結果、ポリペプチドは、二本鎖標的DNAの相補鎖および非相補鎖の両方を切断する能力が低下している。このようなCas9タンパク質は、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力が低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力は保持している。
【０２０７】
別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、W476AおよびW1126A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力が低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力は保持している。
【０２０８】
別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1127A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNAを切断する能力が低下している。そのようなCas9タンパク質は、標的DNAを切断する能力を低下しているが(例えば一本鎖標的DNA)、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力を保持している。
【０２０９】
別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、H840A、W476A、およびW1126A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力が低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力は保持している。別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、H840A、D10A、W476A、およびW1126A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNAを切断する能力が低下している。このようなCas9タンパク質は、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力が低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力は保持している。いくつかの実施形態において、バリアントCas9は、Cas9 HNHドメインの位置840における触媒的His残基が回復されている(A840H)。
【０２１０】
別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、H840A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1127A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力を低下させるが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力を保持する。別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、D10A、H840A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1127A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNAを切断する能力が低下している。そのようなCas9タンパク質は、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力を低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力を保持している。バリアントCas9タンパク質がW476AおよびW1126A変異を有する場合、またはバリアントCas9タンパク質がP475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1127A変異を有する場合、バリアントCas9タンパク質はPAM配列に効率的に結合しない。したがって、このような場合には、このようなバリアントCas9タンパク質を結合の方法に用いると、この方法はPAM配列を必要としない。換言すれば、ある場合には、このようなバリアントCas9タンパク質を結合の方法に用いる場合、この方法はガイドRNAを含み得るが、この方法は、PAM配列の非存在下で行うことができる(したがって、結合の特異性はガイドRNAの標的セグメントによってもたらされる)。上記の効果を達成するために、他の残基を変異させ得る(すなわち一方または他方のヌクレアーゼ部分を不活性化する)。非限定的な例として、残基D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、および/またはA987を変更(すなわち置換)することができる。また、アラニン置換以外の変異も好適である。
【０２１１】
ある態様において、低下した触媒活性を有するバリアントCas9タンパク質(例えばCas9タンパク質がD10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、および/またはA987突然変異、例えばD10A、G12A、G17A、E762A、H840A、N854A、N863A、H982A、H983A、A984A、および/またはD986Aを有する場合)は、それがガイドRNAと相互作用する能力を保持する限り、部位特異的様式で標的DNAに結合することができる(ガイドRNAによって標的DNA配列に誘導されるからである)。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、バリアントCas9は、spCas9、spCas9-VRQR、spCas9-VRER、xCas9 (sp)、saCas9, saCas9-KKH、spCas9-MQKSER、spCas9-LRKIQK、またはspCas9-LRVSQLであり得る。
【０２１３】
S. pyogenes Cas9の代替としては、哺乳動物細胞において切断活性を示すCpf1ファミリー由来のRNA誘導エンドヌクレアーゼが挙げられ得る。PrevotellaおよびFrancisella 1由来のCRISPR (CRISPR/Cpf1) は、CRISPR/Cas9システムに類似したDNA編集技術である。Cpf1はクラスII CRISPR/Cas系のRNA誘導エンドヌクレアーゼである。この獲得免疫機構はPrevotellaやFrancisella細菌に見られる。Cpf1遺伝子はCRISPR遺伝子座に関連しており、ウイルスDNAを見出して切断するためにガイドRNAを用いるエンドヌクレアーゼをコードしている。Cpf1はCas9より小さく単純なエンドヌクレアーゼであるため、CRISPR/Cas9系の制限のいくつかを克服する。Cas9ヌクレアーゼとは異なり、Cpf1を介したDNA切断の結果は、短い3'突出を伴う二本鎖切断である。Cpf1の互い違いの切断パターンは、伝統的な制限酵素クローニングに類似した、方向性のある遺伝子導入の可能性を開くことができ、これは遺伝子編集の効率を高め得る。上述したCas9のバリアントおよびオーソログと同様に、Cpf1は、CRISPRが標的とすることができる部位の数を、SpCas9が好むNGG PAM部位を欠くATに富む領域またはATに富むゲノムに拡大することもできる。Cpf1遺伝子座はα/β混合ドメイン、RuvC‐Iとそれに続くらせん領域、RuvC‐IIおよびジンクフィンガー様ドメインを含む。Cpf1タンパク質は、Cas9のRuvCドメインに類似したRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを有する。さらに、Cpf1はHNHエンドヌクレアーゼ領域をもたず、Cpf1のN末端はCas9のαヘリックス認識ローブをもたない。Cpf1 CRISPR‐Casドメイン構成は、Cpf1が機能的にユニークであり、クラス2、タイプV CRISPRシステムとして分類されることを示した。Cpf1遺伝子座は、II型系よりもI型およびIII型に類似したCas1、Cas2およびCas4タンパク質をコードしていた。機能的Cpf1はトランス活性化CRISPR RNA (tracrRNA) を必要としない;したがって、CRISPR (crRNA) だけを要する。Cpf1はCas9より小さいだけでなく、より小さいsgRNA分子(Cas9の約半分の数のヌクレオチド)を有するので、これはゲノム編集に有益である。Cas9が標的とするGリッチPAMとは対照的に、Cpf1-crRNA複合体は、モチーフ5'-YTN-3'に隣接するプロトスペーサーの同定によって標的DNAまたはRNAを切断する。PAMの同定後、Cpf1は、4または5ヌクレオチドの突出を有するスティッキーエンド様のDNA二本鎖切断を導入する。
【０２１４】
本開示のいくつかの態様は、核酸プログラム可能なDNA結合タンパク質として作用するドメインを含む融合タンパク質を提供し、これは、例えば塩基エディターのようなタンパク質を特定の核酸（例えばDNAまたはRNA）配列へと誘導するために使用され得る。特定の実施形態において、融合タンパク質は、核酸プログラム可能なDNA結合タンパク質ドメインおよびデアミナーゼドメインを含む。DNA結合タンパク質としては、非限定的に、Cas9 (例えばdCas9およびnCas9)、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、およびCas12iが挙げられる。Cas9とは異なるPAM特異性を有するプログラム可能なポリヌクレオチド結合タンパク質の一例は、Prevotella および Francisella1からのClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeatsである。Cas9と同様に、Cpf1はクラス2のCRISPRエフェクターである。Cpf1はCas9とは異なる特徴で頑強なDNA干渉を媒介することが示されている。Cpf1は、tracrRNAを欠く単一RNA誘導エンドヌクレアーゼであり、Tに富むプロトスペーサ隣接モチーフ(TTN、TTTN、またはYTN)を利用する。さらに、Cpf1はDNAを互い違いの二本鎖切断で切断する。16のCpf1ファミリータンパク質のうち、AcidaminococcusとLachnospiraceaeからの二つの酵素がヒト細胞において効率的なゲノム編集活性を有することが示されている。Cpf1タンパク質は当技術分野で知られており、例えば以前にYamano et al., “Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA.” Cell (165) 2016, p. 949-962により記述されており、その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１５】
また、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能なポリヌクレオチド結合タンパク質ドメインとして使用され得るヌクレアーゼ不活性Cpf1 (dCpf1) バリアントも、本発明の組成物および方法において有用である。Cpf1タンパク質は、Cas9のRuvCドメインに類似したRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを有するが、HNHエンドヌクレアーゼドメインを有さず、Cpf1のN末端はCas9のα-ヘリックス認識ローブを有さない。Zetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015 (参照により本明細書に組み込まれる)は、Cpf1のRuvC様ドメインが両方のDNA鎖の切断を担い、RuvC様ドメインの不活性化はCpf1ヌクレアーゼ活性を不活化することを示した。例えば、Francisella novicida Cpf1におけるD917A、E1006A、またはD1255Aに対応する突然変異は、Cpf1ヌクレアーゼ活性を不活化する。いくつかの実施形態において、本開示のdCpf1は、D917A、E1006A、D1255A、D917A/E1006A、D917A/D1255A、E1006A/D1255A、またはD917A/E1006A/D1255Aに対応する突然変異を含む。Cpf1のRuvCドメインを不活性化する任意の突然変異、例えば、置換変異、欠失、または挿入が、本開示に従って使用され得ることを理解されたい。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかの核酸プログラム可能ヌクレオチド結合タンパク質は、Cpf1タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、Cpf1タンパク質は、Cpf1ニッカーゼ (nCpf1) である。ある態様において、Cpf1タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性Cpf1 (dCpf1) である。いくつかの実施形態において、Cpf1、nCpf1、またはdCpf1は、本明細書に開示されたCpf1配列に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、dCpf1は、本明細書に開示されたCpf1配列に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、D917A、E1006A、D1255A、D917A/E1006A、D917A/D1255A、E1006A/D1255A、またはD917A/E1006A/D1255Aに対応する突然変異を含む。他の細菌種からのCpf1もまた、本開示に従って使用され得ることを理解されたい。
【０２１７】
野生型Francisella novicida Cpf1のアミノ酸配列は以下の通りである。D917、E1006、およびD1255は太字で下線を付している。
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN.
【０２１８】
Francisella novicida Cpf1 D917Aのアミノ酸配列は以下の通りである。（A917, E1006, および D1255は太字で下線を付している。）
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIARGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN.
【０２１９】
Francisella novicida Cpf1 E1006Aのアミノ酸配列は以下の通りである。（D917, A1006, および D1255には太字で下線を付している。）
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFADLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN. 
【０２２０】
Francisella novicida Cpf1 D1255Aのアミノ酸配列は以下の通りである。（D917, E1006, およびA1255変異位置には太字で下線を付している。）
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDAAANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN  
【０２２１】
Francisella novicida Cpf1 D917A/E1006Aのアミノ酸配列は以下の通りである。（A917, A1006, および D1255には太字で下線を付している。）
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIARGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFADLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN.
【０２２２】
Francisella novicida Cpf1 D917A/D1255Aのアミノ酸配列は以下の通りである。（A917, E1006, および A1255には太字で下線を付している。）
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIARGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDAAANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN.
【０２２３】
Francisella novicida Cpf1 E1006A/D1255Aのアミノ酸配列は以下の通りである。（D917, A1006, および A1255には太字で下線を付している。）
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFADLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDAAANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN.
【０２２４】
Francisella novicida Cpf1 D917A/E1006A/D1255Aのアミノ酸配列は以下の通りである。（A917、A1006、およびA1255には太字で下線を付している。）
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIARGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFADLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDAAANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN.
【０２２５】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質中に存在するCas9ドメインの1つは、PAM配列を必要としないガイドヌクレオチド配列プログラム可能DNA結合タンパク質ドメインで置換され得る。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、CasドメインはStaphylococcus aureusからのCas（SaCas9）ドメインである。いくつかの実施形態において、SaCas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性SaCas9、ヌクレアーゼ不活性SaCas9（SaCas9d）、またはSaCas9ニッカーゼ（SaCas9n）である。いくつかの実施形態において、SaCas9ドメインは、N579A変異を含み、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、SaCas9ドメイン、SaCas9dドメイン、またはSaCas9nドメインは、非標準PAMを有する核酸配列に結合することができ、いくつかの実施形態において、SaCas9ドメイン、SaCas9dドメイン、またはSaCas9nドメインは、NNGRRTまたはNNGRRT PAM配列を有する核酸配列に結合することができる。いくつかの実施形態において、SaCas9ドメインは、E781X、N967X、およびR1014X突然変異の1以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SaCas9ドメインは、E781K、N967K、およびR1014H突然変異のうちの1つ以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける1つ以上の対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SaCas9ドメインは、E781K、N967K、またはR1014H突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。
【０２２８】
例示的SaCas9のアミノ酸配列は以下の通りである。
KRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG。この配列において、太字で下線を付している残基N579は（例えばA579に）変異されてSaCas9ニッカーゼを生じ得る。
【０２２９】
例示的SaCas9nのアミノ酸配列は以下の通りである。
KRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG.  
【０２３０】
この配列において、N579から変異されてSaCas9ニッカーゼを生じ得る残基A579には太字で下線を付している。
【０２３１】
例示的SaKKH Cas9のアミノ酸配列は以下の通りである。
KRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG.
【０２３２】
上記残基N579は、N579から変異されてSaCas9ニッカーゼを生じ得るものであり、太字で下線を付している。上記残基K781、K967、およびH1014は、E781、N967、およびR1014から変異されてSaKKH Cas9を生じ得るものであり、斜体で下線を付している。
【０２３３】
［高忠実度Cas9ドメイン］
本開示のいくつかの態様は、高忠実度Cas9ドメインを提供する。いくつかの実施形態において、高忠実度Cas9ドメインは、対応する野生型Cas9ドメインと比較して、Cas9ドメインとDNAの糖-リン酸骨格との間の静電相互作用を減少させる1つ以上の突然変異を含む人工Cas9ドメインである。DNAの糖-リン酸骨格との静電相互作用を減少させた高忠実度Cas9ドメインは、より少ないオフターゲット効果を有し得る。ある態様において、Cas9ドメイン(例えば、野生型Cas9ドメイン)は、Cas9ドメインとDNAの糖-リン酸骨格との間の結合を低減させる一つ以上の突然変異を含む。ある態様において、Cas9ドメインは、Cas9ドメインとDNAの糖-リン酸骨格との間の結合を少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも3%、少なくとも4%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、または少なくとも70%だけ低減させる一つ以上の突然変異を含む。
【０２３４】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCas9融合タンパク質のいずれかは、N497X、R661X、Q695X、および/またはQ926X突然変異の1以上、または本明細書で提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCas9融合タンパク質のいずれかは、N497A、R661A、Q695A、および/またはQ926A突然変異の1以上、または本明細書で提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、D10A突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。高い忠実度を有するCas9ドメインは当技術分野で公知であり、当業者には明らかであろう。例えば、高い忠実度を有するCas9ドメインは、Kleinstiver, B.P., et al. “High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.” Nature 529, 490-495 (2016); および Slaymaker, I.M., et al. “Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.”Science 351, 84-88 (2015)に記述されており、それぞれの全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２３５】
ある態様において、改変されたCas9は、高忠実度Cas9酵素である。いくつかの実施形態において、高忠実度Cas9酵素は、SpCas9(K855A)、eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1、または高精度Cas9バリアント(HypaCas9)である。修飾Cas9eSpCas9(1.1)は、HNH/RuvCグルーブと非標的DNA鎖との間の相互作用を弱めるアラニン置換を含み、オフターゲット部位での鎖分離と切断を防止する。同様に、SpCas9-HF1は、DNAリン酸骨格とのCas9の相互作用を破壊するアラニン置換を介して、オフターゲット編集を低下させる。HypaCas9は、Cas9の校正と標的識別を増加させる突然変異をREC3ドメインに含む(SpCas9 N692A/M694A/Q695A/H698A)。3つの高忠実度酵素はすべて、野生型Cas9よりもオフターゲット編集が少ない。
【０２３６】
以下に、高忠実度Cas9の一例を示す。Cas9に対する高忠実度Cas9ドメイン突然変異を太字および下線で示す。
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTAFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGALSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMALIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRAITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
【０２３７】
［ガイドポリヌクレオチド］
本明細書中で使用される、用語「ガイドポリヌクレオチド」とは、標的配列に特異的であり得かつポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインタンパク質(例えばCas9またはCpf1)と複合体を形成し得るポリヌクレオチドをいう。一実施形態では、ガイドポリヌクレオチドはガイドRNAである。本明細書において使用される用語「ガイドRNA (gRNA)」およびその文法的等価物は、標的DNAに対して特異的であり得かつCasタンパク質と複合体を形成し得るRNAを表し得る。RNA/Cas複合体は、Casタンパク質を標的DNAに「ガイド」するのを補助することができる。Cas9/crRNA/tracrRNAは、スペーサーに相補的な線状または環状dsDNA標的をエンドヌクレアーゼ的に切断する。crRNAに相補的でない標的鎖が最初にエンドヌクレアーゼで切断され、次いでエキソヌクレアーゼ的に3’-5’方向にトリムされる。自然界では、DNA結合と切断にはタンパク質と両方のRNAが通常必要とされる。しかしながら、crRNAおよびtracrRNAの両方の側面を単一のRNA種に組み込むように、単一ガイドRNA (「sgRNA」、または単に「gRNA」)を作製することができる。例えば、Jinek M. et al., Science 337:816-821(2012)を参照されたい（その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）。Cas9は、CRISPR反復配列中の短いモチーフ(PAMまたはプロトスペーサー隣接モチーフ)を認識して、自己と非自己を区別するのを助ける。Cas9ヌクレアーゼの配列および構造は、当業者によく知られている（例えば“Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.”  Ferretti, J.J. et al., Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); “CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.”  Deltcheva E. et al., Nature 471:602-607(2011); および “Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.”Jinek M.et al, Science 337:816-821(2012)参照。その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）。Cas9オーソログは、限定されるものではないが、S. pyogenes および S. thermophilusを含む様々な種において記述されている。さらなる適切なCas9ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて当業者に明らかとなり得、そのようなCas9ヌクレアーゼおよび配列には、Chylinski, Rhun, and Charpentier, “The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems”(2013) RNA Biology 10:5, 726-737に開示されている生物および遺伝子座からのCas9配列が含まれる（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。ある態様において、Cas9ヌクレアーゼは、不活性(例えば不活化) DNA切断ドメインを有し、すなわち、Cas9はニッカーゼである。
【０２３８】
ある態様において、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも一つの単一ガイドRNA (「sgRNA」または「gRNA」)である。ある態様において、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも一つのtracrRNAであり、ある態様において、ガイドポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメイン(例:Cas9またはCpf1)を標的ヌクレオチド配列に導くためにPAM配列を必要としない。
【０２３９】
本願明細書に開示される塩基エディターのポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメイン(例えばCRISPR由来ドメイン)は、ガイドポリヌクレオチドと会合することによって標的ポリヌクレオチド配列を認識することができる。ガイドポリヌクレオチド(例えばgRNA)は、典型的には一本鎖であり、ポリヌクレオチドの標的配列に部位特異的に結合(すなわち相補的塩基対形成を介して)するようにプログラムすることができ、それによって、ガイド核酸を伴った塩基エディターを標的配列に導く。ガイドポリヌクレオチドはDNAであり得る。ガイドポリヌクレオチドはRNAであり得る。場合によっては、ガイドポリヌクレオチドは天然ヌクレオチド(例えばアデノシン)を含む。場合によっては、ガイドポリヌクレオチドは、非天然(または不自然)ヌクレオチド(例えばペプチド核酸またはヌクレオチドアナログ)を含む。ある場合には、ガイド核酸配列の標的化領域は、長さが少なくとも15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドであり得る。ガイド核酸の標的化領域は、長さが10〜30ヌクレオチドの間、または長さが15〜25ヌクレオチドの間、または長さが15〜20ヌクレオチドの間であり得る。
【０２４０】
いくつかの実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、例えば相補的塩基対形成を介して互いに相互作用できる、二つ以上の個別のポリヌクレオチドを含む(例えば二重ガイドポリヌクレオチド)。例えば、ガイドポリヌクレオチドは、CRISPR RNA (crRNA) およびトランス活性化CRISPR RNA (tracrRNA) を含むことができる。例えば、ガイドポリヌクレオチドは、1以上のトランス活性化CRISPR RNA (tracrRNA) を含むことができる。
【０２４１】
II型CRISPRシステムにおいて、CRISPRタンパク質(例Cas9)による核酸の標的化は、典型的には、標的配列を認識する配列を含む第一のRNA分子(crRNA) と、ガイドRNA-CRISPRタンパク質複合体を安定化させる足場領域を形成する反復配列を含む第二のRNA分子(trRNA) との間の相補的塩基対形成を必要とする。このような二重ガイドRNAシステムは、本明細書に開示された塩基エディターを標的ポリヌクレオチド配列に導くためのガイドポリヌクレオチドとして利用され得る。
【０２４２】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される塩基エディターは、単一ガイドポリヌクレオチド(例えばgRNA)を利用する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される塩基エディターは、デュアル（二重）ガイドポリヌクレオチド(例えばデュアルgRNA)を利用する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される塩基エディターは、一つ以上のガイドポリヌクレオチド(例えば複数のgRNA)を利用する。いくつかの実施形態において、単一ガイドポリヌクレオチドが、本明細書に記載される異なる塩基エディターのために利用される。例えば、単一ガイドポリヌクレオチドを、シチジン塩基エディターおよびアデノシン塩基エディターのために利用することができる。
【０２４３】
他の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、核酸のポリヌクレオチド標的化部分および核酸の足場部分の両方を単一分子(すなわち単一分子ガイド核酸)中に含むことができる。例えば、単一分子ガイドポリヌクレオチドは、単一ガイドRNA (sgRNAまたはgRNA)であり得る。本明細書において、「ガイドポリヌクレオチド配列」という用語は、塩基エディターと相互作用し標的ポリヌクレオチド配列に塩基エディターを導くことができる任意の単一、二重または複数分子核酸を企図する。
【０２４４】
典型的には、ガイドポリヌクレオチド(例えばcrRNA/trRNA複合体またはgRNA)は、標的ポリヌクレオチド配列を認識しそれに結合することができる配列を含む「ポリヌクレオチド標的セグメント」と、塩基エディターのポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメイン成分内でガイドポリヌクレオチドを安定化させる「タンパク質結合セグメント」とを含む。或る実施態様では、ガイドポリヌクレオチドのポリヌクレオチド標的セグメントは、DNAポリヌクレオチドを認識してそれに結合し、それによりDNA中の塩基の編集を促進する。他の実施態様では、ガイドポリヌクレオチドのポリヌクレオチド標的セグメントは、RNAポリヌクレオチドを認識しそれに結合し、それによりRNA中の塩基の編集を促進する。ここで、「セグメント」とは、分子の一部分または領域、例えばガイドポリヌクレオチド中の連続したヌクレオチドのストレッチをいう。また、セグメントは、複合体の領域/セクションも表し得、従ってセグメントは2つ以上の分子の領域を含むことができる。例えば、ガイドポリヌクレオチドが複数の核酸分子を含む場合、タンパク質結合セグメントは、例えば相補性の領域に沿ってハイブリダイズした複数の別個の分子の全てまたは一部を含むことができる。ある態様において、二つの別個の分子を含むDNA標的化RNAのタンパク質結合セグメントは、(i) 長さが100塩基対である第一のRNA分子の塩基対40〜75；および(ii) 長さが50塩基対である第二のRNA分子の10〜25塩基対を含み得る。「セグメント」の定義は、特定の文脈において特に定義されない限り、全塩基対のうちの特定の数に限定されず、所与のRNA分子からの塩基対の特定の数に限定されず、複合体内の別個の分子の特定の数に限定されず、任意の全長のRNA分子の領域を含み得、他の分子に対する相補性を有する領域を含み得る。
【０２４５】
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、2つ以上のRNA、例えばCRISPR RNA (crRNA) およびトランス活性化crRNA (tracrRNA) を含むことができる。ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、時に、crRNAおよびtracrRNAの一部分(例えば機能的部分) の融合によって形成される単一鎖RNA、あるいは単一ガイドRNA (sgRNA) を含み得る。ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、crRNAおよびtracrRNAを含む二重RNAであってもよい。さらに、crRNAは標的DNAとハイブリダイズし得る。
【０２４６】
上述のように、ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、発現産物であり得る。例えば、ガイドRNAをコードするDNAは、ガイドRNAをコードする配列を含むベクターであり得る。ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、単離されたガイドRNA、またはガイドRNAをコードする配列およびプロモーターを含むプラスミドDNAを細胞にトランスフェクトすることによって、細胞に導入することができる。ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、ウイルス媒介遺伝子送達の使用など、他の方法で細胞に導入することもできる。
【０２４７】
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドを単離することができる。例えば、ガイドRNAは、単離されたRNAの形態で細胞または生物にトランスフェクトされ得る。ガイドRNAは、当技術分野で公知の任意のインビトロ転写系を用いたインビトロ転写によって調製することができる。ガイドRNAは、ガイドRNAをコードする配列を含むプラスミドの形態ではなく、単離されたRNAの形態で細胞に移入され得る。
【０２４８】
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、以下の3つの領域を含み得る：染色体配列中の標的部位に相補的であり得る5’末端における第1の領域、ステムループ構造を形成し得る第2の内部領域、および一本鎖であり得る第3の3’領域。各ガイドRNAが融合タンパク質を特異的な標的部位にガイドするように、各ガイドRNAの第1の領域を異ならせることもできる。さらに、各ガイドRNAの第2および第3の領域は、すべてのガイドRNAにおいて同一であり得る。
【０２４９】
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドの第1の領域は、そのガイドRNAの第1の領域が標的部位と塩基対を形成できるように、染色体配列の標的部位における配列に相補的であり得る。場合によっては、ガイドRNAの第一の領域は、約10ヌクレオチド〜25ヌクレオチド(すなわち、10ヌクレオチドからヌクレオチドまで;または約10ヌクレオチドから約25ヌクレオチドまで;または10ヌクレオチドから約25ヌクレオチドまで;または約10ヌクレオチドから25ヌクレオチドまで)またはそれ以上を含むことができる。例えば、ガイドRNAの第一の領域と染色体配列中の標的部位との間の塩基対形成の領域は、長さが約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25またはそれ以上のヌクレオチドであり得るか、またはおよそその長さであり得る。ときに、ガイドRNAの第一の領域は、長さが19、20、もしくは21ヌクレオチド、または約19、20、もしくは21ヌクレオチドであり得る。
【０２５０】
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、二次構造を形成する第2の領域を含むこともできる。例えば、ガイドRNAによって形成される二次構造は、ステム（またはヘアピン）およびループを含むことができる。ループとステムの長さはさまざまであり得る。例えば、ループの長さは（約）3から10ヌクレオチドの範囲であり得、ステムの長さは（約）6から20塩基対の範囲であり得る。ステムは、1から10または約10ヌクレオチドの一つ以上のバルジを含むことができる。第二の領域の全長は、約16から60ヌクレオチド長の範囲であり得る。例えば、ループは長さが（約）4ヌクレオチドであり得、ステムは（約）12塩基対であり得る。
【０２５１】
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、本質的に一本鎖状態であり得る3'末端の第3の領域も含むこともできる。たとえば、第3の領域は、対象とする細胞のいずれの染色体配列とも相補的でないこともあれば、ガイドRNAの残りの部分と相補的でないこともある。さらに第3の領域の長さはさまざまであり得る。第3の領域は、長さが約4ヌクレオチド以上であり得る。例えば、第3の領域の長さは、（約）5から60ヌクレオチド長の範囲であり得る。
【０２５２】
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、遺伝子標的の任意のエクソンまたはイントロンを標的とすることができる。場合によっては、ガイドは遺伝子のエキソン1または2を標的にすることができる;他の場合には、ガイドは遺伝子のエキソン3または4を標的にすることができる。組成物は、全てが同じエクソンを標的とする複数のガイドRNA、または場合によっては、異なるエクソンを標的とする複数のガイドRNAを含むことができる。遺伝子のエキソンとイントロンが標的とされ得る。
【０２５３】
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、（約）20ヌクレオチドの核酸配列を標的とし得る。標的核酸は、（約）20ヌクレオチド未満であり得る。標的核酸は、長さが少なくとも（約）5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、または1〜100ヌクレオチドの間の任意の長さであり得る。標的核酸は、長さが多くとも約5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50ヌクレオチド、または1〜100ヌクレオチドの間の任意の長さであり得る。標的核酸配列は、PAMの最初のヌクレオチドの5’直近の（約）20塩基であり得る。ガイドRNAは、核酸配列を標的化し得る。標的核酸は、少なくとも（約）1〜10、1〜20、1〜30、1〜40、1〜50、1〜60、1〜70、1〜80、1〜90、または1〜100ヌクレオチドであり得る。
【０２５４】
ガイドポリヌクレオチド、例えば、ガイドRNAは、別の核酸、例えば、細胞のゲノム中の標的核酸またはプロトスペーサーにハイブリダイズし得る核酸を指すことができる。ガイドポリヌクレオチドはRNAであり得る。ガイドポリヌクレオチドはDNAであり得る。ガイドポリヌクレオチドは、核酸の配列に部位特異的に結合するようにプログラムまたは設計することができる。ガイドポリヌクレオチドは、一ポリヌクレオチド鎖を含み得、単一ガイドポリヌクレオチドと呼ばれ得る。ガイドポリヌクレオチドは、2つのポリヌクレオチド鎖を含み得、二重ガイドポリヌクレオチドと呼ばれ得る。ガイドRNAはRNA分子として細胞や胚に導入され得る。例えば、RNA分子は、インビトロで転写され得、および/または化学的に合成され得る。RNAは、合成DNA分子、例えばgBlocks（登録商標）遺伝子断片から転写され得る。ガイドRNAはRNA分子として細胞や胚に導入され得る。ガイドRNAはまた、非RNA核酸分子、例えばDNA分子の形態で細胞または胚に導入され得る。例えば、ガイドRNAをコードするDNAが、対象の細胞または胚におけるガイドRNAの発現のためにプロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。RNAコード配列は、RNAポリメラーゼIII (Pol III)によって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結され得る。ガイドRNAを発現するために使用することができるプラスミドベクターは、px330ベクターおよびpx333ベクターを含むが、これらに限定されない。場合によっては、プラスミドベクター(例えばpx333ベクター)は、少なくとも二つのガイドRNAをコードするDNA配列を含むことができる。
【０２５５】
ガイドポリヌクレオチド（例えばガイドRNA）およびターゲティング配列を選択、設計および検証するための方法は、本明細書中に記載され、当業者に知られている。例えば、核酸塩基エディター系におけるデアミナーゼドメイン(例えばAIDドメイン)の潜在的基質混合性（promiscuity）の影響を最小限にするために、意図せず脱アミノ化の標的となり得る残基(例えば、標的核酸遺伝子座内のssDNA上に潜在的に位置し得るオフターゲットC残基)の数を最小限にすることができる。さらに、ソフトウェアツールを使用して、標的核酸配列に対応するgRNAを最適化することができ、例えば、ゲノム全体の総オフターゲット活性を最小限化することができる。例えば、S. pyogenes Cas9を用いた標的化ドメイン選択肢の各可能性について、(例えばNAGまたはNGGなどの選択されたPAMに先行する)ある数(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10)までのミスマッチ塩基対を含むすべてのオフターゲット配列をゲノムにわたって同定することができる。標的部位に相補的なgRNAの第一の領域を同定することができ、すべての第一の領域(例:crRNA)をその総予測オフターゲットスコアに従ってランク付けすることができ;上位にランクされた標的化ドメインは、最大のオンターゲット活性と最小のオフターゲット活性を持つ可能性が高いものを表す。候補標的化gRNAは、当技術分野で公知の方法および/または本明細書に記載の方法を用いて機能的に評価することができる。
【０２５６】
非限定的な例として、Cas9と共に使用するためのガイドRNAのcrRNAにおける標的DNAハイブリダイズ配列は、DNA配列探索アルゴリズムを用いて同定することができる。gRNA設計は、Bae S., Park J., & Kim J.-S. Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics 30, 1473-1475 (2014)に記載されているような公開ツールcas-offinderに基づくカスタムgRNA設計ソフトウェアを用いて実施することができる。このソフトウェアは、ガイドのゲノム全体的オフターゲット傾向を計算した後にガイドにスコアを付ける。通常、完全マッチから7個のミスマッチまでの範囲の一致が、17から24までの長さの範囲のガイドについて考慮される。いったんオフターゲットサイトが計算的に決定されると、各ガイドについて集約スコアが計算され、ウェブインターフェースを使用した表形式の出力に要約される。PAM配列に隣接する潜在的な標的部位を同定することに加えて、ソフトウェアは、選択された標的部位から1、2、3または3超のヌクレオチドだけ異なるすべてのPAM隣接配列も同定する。標的核酸配列、例えば標的遺伝子についてのゲノムDNA配列を得て、反復エレメントを、公に入手可能なツール、例えば、RepeatMaskerプログラムを用いてスクリーニングすることができる。RepeatMaskerは、入力されたDNA配列から、反復エレメントや低複雑性領域を探し出す。所与のクエリー配列に存在する反復の詳細な注釈が出力となる。
【０２５７】
同定後、ガイドRNA（例えばcrRNA）の第１の領域が、標的部位へのそれらの距離、それらの直交性（orthogonality）、および関連するPAM配列との密接な一致のための5’ヌクレオチドの存在(例えば、関連するPAM (例えば、化膿レンサ球菌についてのNGG PAM、黄色ブドウ球菌についてのNNGRRTまたはNNGRRV PAM) を含むヒトゲノムにおける密接な一致の同定に基づく5’G)に基づいて、階層にランク付けされ得る。本明細書において使用される場合、直交性とは、標的配列に対して最小数のミスマッチを含む、ヒトゲノムにおける配列の数を表す。「高レベルの直交性」または「良好な直交性」は、例えば、意図された標的以外にヒトゲノムにおいて同一の配列を有さず、標的配列において一または二のミスマッチを含有する配列も有さない20マー標的化ドメインを指し得る。良好な直交性を有する標的化ドメインは、オフターゲットDNA切断を最小化するように選択され得る。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、塩基編集活性を検出すること、および候補ガイドポリヌクレオチドを試験することのためにレポーターシステムが使用され得る。いくつかの態様において、レポーターシステムは、塩基編集活性がレポーター遺伝子の発現をもたらす、レポーター遺伝子ベースのアッセイを含むことができる。例えば、レポーターシステムは、不活性化開始コドン、例えば、鋳型鎖上の3'-TAC-5'から3'-CAC-5'への突然変異を含むレポーター遺伝子を含み得る。標的Cの脱アミノ化に成功すると、対応するmRNAは5'-GUG-3'ではなく5'-AUG-3'として転写され、レポーター遺伝子の翻訳を可能にする。適切なレポーター遺伝子は、当業者には明らかであろう。レポーター遺伝子の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質(GFP) 、赤色蛍光タンパク質(RFP) 、ルシフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP) 、または、発現が検出可能であり当業者には明らかである他の任意の遺伝子をコードする遺伝子が挙げられる。レポーター系を用いて、多くの異なるgRNAを試験することができ、例えば、標的DNA配列に関してどの残基を、それぞれの対応デアミナーゼが標的とするかを決定することができる。非鋳型鎖を標的とするsgRNAも、特定の塩基編集タンパク質（例えばCas9デアミナーゼ融合タンパク質）のオフターゲット効果を評価するために試験することができる。いくつかの実施形態において、そのようなgRNAは、変異開始コドンがgRNAと塩基対を形成しないように設計することができる。ガイドポリヌクレオチドは、標準リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド(例えば、プソイドウリジン)、リボヌクレオチド異性体、および/またはリボヌクレオチド類似体を含むことができる。いくつかの実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも1つの検出可能な標識を含むことができる。検出可能な標識は、フルオロフォア(例えば、FAM、TMR、Cy3、Cy5、テキサスレッド、オレゴングリーン、Alexa Fluor、Haloタグ、または適切な蛍光色素)、検出タグ(例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン等)、量子ドット、または金粒子であり得る。
【０２５９】
ガイドポリヌクレオチドは、化学的に合成され得るか、酵素的に合成され得るか、またはそれらの組み合わせであり得る。例えば、ガイドRNAは、標準的なホスホロアミダイトベースの固相合成法を用いて合成することができる。あるいは、ガイドRNAをコードするDNAを、ファージRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーター制御配列に作動可能に連結することによって、ガイドRNAをインビトロで合成することができる。適切なファージプロモーター配列の例は、T7、T3、SP6プロモーター配列、またはそれらのバリアントを含む。ガイドRNAが二つの別々の分子(例えば、crRNAとtracrRNA)を含む実施形態において、crRNAは化学的に合成することができ、tracrRNAは酵素的に合成することができる。
【０２６０】
ある態様において、塩基エディター系は、複数のガイドポリヌクレオチド、例えばgRNAを含み得る。例えば、gRNAは、塩基エディター系に含まれる一つ以上の標的遺伝子座(例えば少なくとも1 gRNA、少なくとも2 gRNA、少なくとも5 gRNA、少なくとも10 gRNA、少なくとも20 gRNA、少なくとも30 gRNA、少なくとも50 gRNA)を標的とすることができる。前記複数のgRNA配列はタンデムに配置され得、好ましくは直接反復によって分離される。
【０２６１】
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドをコードするDNA配列がベクターの一部であってもよい。さらに、ベクターは、追加の発現制御配列(例えばエンハンサー配列、Kozak配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など)、選択可能なマーカー配列(例えばGFPまたはピューロマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子)、複製起点などを含むことができる。ガイドRNAをコードするDNA分子は線状であってもよい。ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドをコードするDNA分子も環状であってもよい。
【０２６２】
いくつかの態様において、塩基エディター系の1つ以上の構成要素は、DNA配列によってコードされ得る。このようなDNA配列は、発現系（例えば細胞）に一緒に、または別々に導入することができる。例えば、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインおよびガイドRNAをコードするDNA配列を細胞に導入することができ、各DNA配列は別個の分子の一部であることができ(例えばポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインのコード配列を含む1つのベクターおよびガイドRNAコード配列を含む第2のベクター)、または両方が同じ分子の一部であることができる(例えばポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメイン及びガイドRNAの両方のためのコード(および調節)配列を含む一つのベクター)。
【０２６３】
ガイドポリヌクレオチドは、新しいまたは増強された特徴を有する核酸を提供するための1以上の改変を含むことができる。ガイドポリヌクレオチドは、核酸親和性タグを含むことができる。ガイドポリヌクレオチドは、合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド誘導体、および/または修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【０２６４】
場合によっては、gRNAまたはガイドポリヌクレオチドは修飾（改変）を含むことができる。修飾は、gRNAまたはガイドポリヌクレオチドの任意の位置に施され得る。単一のgRNAまたはガイドポリヌクレオチドに対して複数の修飾を行うことができる。gRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、修飾後に品質管理を受けることができる。場合によっては、品質管理は、PAGE、HPLC、MS、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０２６５】
gRNAまたはガイドポリヌクレオチドの修飾は、置換、挿入、欠失、化学的修飾、物理的修飾、安定化、精製、またはそれらの任意の組合せであり得る。
【０２６６】
gRNAまたはガイドポリヌクレオチドはまた、5’アデニル酸、5’グアノシン三リン酸キャップ、5’N 7-メチルグアノシン三リン酸キャップ、5’三リン酸キャップ、3’リン酸、3’チオリン酸、5’リン酸、5’チオリン酸、Cis-Synチミジン二量体、三量体、C12スペーサー、C3スペーサー、C6スペーサー、dスペーサー、PCスペーサー、rスペーサー、スペーサー18、スペーサー9、3’-3’修飾、5’-5’修飾、塩基脱落、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンBB、ビオチンTEG、コレステロールTEG、デスチオビオチンTEG、DNP TEG、DNP-X、DOTA、dT-ビオチン、二重ビオチン、ソラレン、ソラレンC2、ソラレンC6、TINA、3’DABCYL、ブラックホールクエンチャー1、ブラックホールクエンチャー2、DABCYL SE、dT-DABCYL、IRDye QC-1、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、2’-デオキシリボヌクレオシド類似体プリン、2’-デオキシリボヌクレオシド類似体ピリミジン、リボヌクレオシド類似体、2’-O-メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾類似体、ウォブル/ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、2’-フルオロRNA、2’-O-メチルRNA、メチルホスホネート、ホスホジエステルDNA、ホスホジエステルRNA、ホスホチオエステルDNA、ホスホロチオネートRNA、UNA、プソイドリジン-5’-トリホスフェート、5’-メチルシジン-5’-トリホスフェート、またはそれらの任意の組合せでも修飾され得る。
【０２６７】
場合によっては、修飾は永続的である。その他の場合、修飾は一時的である。場合によっては、gRNAまたはガイドポリヌクレオチドに対して複数の修飾が行われる。gRNAまたはガイドポリヌクレオチドの修飾は、それらのコンホメーション、極性、疎水性、化学反応性、塩基対形成相互作用、またはそれらの組み合わせなどの、ヌクレオチドの物理化学的特性を変化させることができる。
【０２６８】
修飾はホスホロチオエート置換でもあり得る。ある場合には、天然のホスホジエステル結合は細胞のヌクレアーゼによって急速に分解されやすく、ホスホロチオエート(PS) 結合置換体を用いたヌクレオチド間結合の修飾は、細胞分解による加水分解に対してより安定である。修飾は、gRNAまたはガイドポリヌクレオチドの安定性を増大させることができる。修飾は生物学的活性を増強させることもできる。ある場合には、ホスホロチオエート強化RNA gRNAは、RNアーゼA、RNアーゼT1、子牛血清ヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを阻害することができる。これらの特性は、in vivoまたはin vitroでヌクレアーゼへの暴露がある可能性が高いアプリケーションにおいて、PS-RNA gRNAの使用を可能にする。例えば、ホスホロチオエート(PS) 結合をgRNAの5'末端または''末端における最後の3〜5ヌクレオチドの間に導入することができ、それはエキソヌクレアーゼ分解を阻害し得る。ある場合には、ホスホロチオエート結合をgRNA全体に加えてエンドヌクレアーゼによる攻撃を減らすことができる。
【０２６９】
［プロトスペーサ隣接モチーフ］
「プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM)」またはPAM様モチーフは、CRISPR細菌適応免疫系においてCas9ヌクレアーゼによって標的化されるDNA配列の直後の2〜6塩基対DNA配列を指す。いくつかの実施形態では、PAMは5’PAM (すなわちプロトスペーサの5’末端の上流に位置する)であり得る。他の実施形態では、PAMは3’PAM (すなわちプロトスペーサの5’末端の下流に位置する)であり得る。
【０２７０】
プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM)またはPAM様モチーフは、CRISPR細菌適応免疫系においてCas9ヌクレアーゼによって標的化されるDNA配列の直後の2〜6塩基対DNA配列を指す。いくつかの実施形態では、PAMは5’PAM (すなわちプロトスペーサの5’末端の上流に位置する)であり得る。他の実施形態では、PAMは3’PAM (すなわちプロトスペーサの5’末端の下流に位置する)であり得る。PAM配列は標的結合に必須であるが、正確な配列はCasタンパク質の種類に依存する。
【０２７１】
本明細書で提供される塩基エディターは、標準的または非標準的プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM) 配列を含むヌクレオチド配列に結合することができるCRISPRタンパク質由来ドメインを含むことができる。PAM部位は、標的ポリヌクレオチド配列に近接するヌクレオチド配列である。本開示のいくつかの側面は、異なるPAM特異性を有するCRISPRタンパク質の全部または一部を含む塩基エディターを提供する。例えば、S. pyogenes由来のCas9 (spCas9) などのCas9タンパク質は、典型的に、特定の核酸領域に結合するために標準的なNGG PAM配列を必要とし、ここで「NGG」中の「N」はアデニン(A) 、チミン(T) 、グアニン(G) 、またはシトシン(C) であり、Gはグアニンである。PAMはCRISPRタンパク質特異的であり得、異なるCRISPRタンパク質由来ドメインを含む異なる塩基エディター間で異なり得る。PAMは標的配列の5’または3’にあり得る。PAMは、標的配列の上流または下流にあり得る。PAMは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。多くの場合、PAMは2〜6ヌクレオチドの長さである。
【０２７２】
ある態様において、Cas9ドメインは、Streptococcus pyogenes由来のCas9ドメインである (SpCas9)。ある態様において、SpCas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性SpCas9、ヌクレアーゼ不活性SpCas9 (SpCas9d) 、またはSpCas9ニッカーゼ(SpCas9n) である。いくつかの実施形態において、SpCas9は、D9X突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXはD以外のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SpCas9は、D9A突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。ある態様において、SpCas9ドメイン、SpCas9dドメインまたはSpCas9nドメインは、非標準PAMを有する核酸配列に結合することができる。ある態様において、SpCas9ドメイン、SpCas9dドメインまたはSpCas9nドメインは、NGG、NGAまたはNGCG PAM配列を有する核酸配列に結合することができる。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135X、R1335X、およびT1336X突然変異の1つ以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135E、R1335Q、およびT1336R突然変異の1つ以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135E、R1335Q、およびT1336R突然変異、または本明細書に提供されるアミノ配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135X、R1335X、およびT1336X突然変異のうちの1つ以上、または本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135V、R1335Q、およびT1336R突然変異の1以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135V、R1335Q、およびT1337R突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9SpCas9ドメインは、D1135X、G1217X、R1335X、およびT1336X突然変異の1以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135V、G1217R、R1335Q、およびT1336R突然変異の1つ以上、または本明細書に提供されるアミノ配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135V、G1217R、R1335Q、およびT1336R突然変異、または本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。
【０２７３】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかのCas9ドメインは、本明細書に記載されるCas9ポリペプチドに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかのCas9ドメインは、本明細書に記載される任意のCas9ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかのCas9ドメインは、本明細書に記載される任意のCas9ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。
【０２７４】
例示的PAM結合SpCas9のアミノ酸配列は以下の通りである。
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD. 
【０２７５】
例示的PAM結合SpCas9のアミノ酸配列は以下の通りである。
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.
例示的PAM結合SpEQR Cas9のアミノ酸配列は以下の通りである。
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFESPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKQYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.  この配列において、D1135、R1335、およびT1337から変異されてSpEQR Cas9を生じることができる残基E1135、Q1335、およびR1337は、太字で下線を付している。
【０２７６】
例示的PAM結合SpVQR Cas9のアミノ酸配列は以下の通りである。
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKQYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.   この配列において、D1135, R1335, および T1336から変異されてSpVQR Cas9を生じることができる残基V1135, Q1335, および R1336は、太字で下線を付している。
【０２７７】
例示的PAM-結合SpVRER Cas9のアミノ酸配列は以下の通りである。
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASARELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKEYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.
【０２７８】
ある態様において、Cas9ドメインは、組換えCas9ドメインである。ある態様において、組換えCas9ドメインは、SpyMacCas9ドメインである。いくつかの実施形態において、SpyMacCas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性SpyMacCas9、ヌクレアーゼ不活性SpyMacCas9 (SpyMacCas9d) 、またはSpyMacCas9ニッカーゼ(SpyMacCas9n) である。いくつかの実施形態において、SaCas9ドメイン、SaCas9dドメイン、またはSaCas9nドメインは、非標準PAMを有する核酸配列に結合することができる。いくつかの実施形態において、SpyMacCas9ドメイン、SpCas9dドメイン、またはSpCas9nドメインは、NAA PAM配列を有する核酸配列に結合することができる。
【０２７９】
例示的SpyMacCas9
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDDYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFGSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLADSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQIYNQLFEENPINASRVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKRNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNSEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGAYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDRGMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGHSLHEQIANLAGSPAIKKGILQTVKIVDELVKVMGHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFIKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEIQTVGQNGGLFDDNPKSPLEVTPSKLVPLKKELNPKKYGGYQKPTTAYPVLLITDTKQLIPISVMNKKQFEQNPVKFLRDRGYQQVGKNDFIKLPKYTLVDIGDGIKRLWASSKEIHKGNQLVVSKKSQILLYHAHHLDSDLSNDYLQNHNQQFDVLFNEIISFSKKCKLGKEHIQKIENVYSNKKNSASIEELAESFIKLLGFTQLGATSPFNFLGVKLNQKQYKGKKDYILPCTEGTLIRQSITGLYETRVDLSKIGED.
【０２８０】
ある場合には、バリアントCas9タンパク質はH840A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、D1218Aの突然変異を有し、その結果、標的DNAまたはRNAを切断する能力が低下している。このようなCas9タンパク質は、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力は低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力は保持している。別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、D10A、H840A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1218A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNA(例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力が低下している。そのようなCas9タンパク質は、標的DNA(例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力を低下しているが、標的DNA(例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力を保持している。バリアントCas9タンパク質がW476AおよびW1126A変異を有する場合、またはバリアントCas9タンパク質がP475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1218A変異を有する場合、バリアントCas9タンパク質はPAM配列に効率的に結合しない。したがって、このような場合には、このようなバリアントCas9タンパク質を結合の方法に用いると、この方法はPAM配列を必要としない。換言すれば、ある場合には、このようなバリアントCas9タンパク質を結合の方法に用いる場合、この方法はガイドRNAを含み得るが、この方法は、PAM配列の非存在下で行うことができる(したがって、結合の特異性はガイドRNAの標的セグメントによってもたらされる)。上記の効果を達成するために、他の残基が変異され得る(すなわち一方または他方のヌクレアーゼ部分を不活性化する)。非限定的な例として、残基D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、および/またはA987を変更(すなわち置換)することができる。また、アラニン置換以外の変異も好適である。
【０２８１】
ある態様において、塩基エディターのCRISPRタンパク質由来ドメインは、標準的PAM配列 (NGG) を有するCas9タンパク質の全部または一部を含み得る。他の実施形態では、塩基エディターのCas9由来ドメインは、非標準的PAM配列を用いることができる。そのような配列は本技術分野で記述されており当業者には明らかであろう。例えば、非標準的PAM配列に結合するCas9ドメインは、Kleinstiver, B. P., et al., “Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities” Nature, 523, 481-485 (2015); およびKleinstiver, B. P., et al., “Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition” Nature Biotechnology, 33, 1293-1298 (2015)に記述されており、それぞれの全内容を参照によりここに組み込む。
【０２８２】
いくつかの例において、本明細書に開示される塩基エディターのCRISPRタンパク質由来ドメインによって認識されるPAMは、塩基エディターをコードするインサート(例えばAAVインサート)とは別個のオリゴヌクレオチド上で細胞に提供され得る。そのような場合、別個のオリゴヌクレオチド上にPAMを提供することは、さもなくば標的配列と同じポリヌクレオチド上に隣接するPAMが存在しないために切断することができない標的配列の切断を可能にする。
【０２８３】
一実施形態において、S. pyogenes Cas9 (SpCas9) を、ゲノム工学のためのCRISPRエンドヌクレアーゼとして使用することができる。ただし、他のものも使用され得る。場合によっては、異なるエンドヌクレアーゼを用いて特定のゲノム標的を標的化することができる。場合によっては、非NGG PAM配列を有する合成SpCas9由来バリアントを使用することができる。さらに、様々な種からの他のCas9オルソログが同定されており、これらの 「非SpCas9」は、本開示でも有用になり得る種々のPAM配列に結合し得る。例えば、比較的大きなサイズのSpCas9 (約4 kbのコード配列)は、細胞内で効率的に発現することができないSpCas9 cDNAプラスミドをもたらすこともあり得る。逆に、Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) のコード配列は、SpCas9よりも約1キロ塩基短いので、細胞内で効率的に発現させ得る。SpCas9と同様に、SaCas9エンドヌクレアーゼは、in vitroの哺乳類細胞およびin vivoのマウスにおいて標的遺伝子を修飾する能力がある。ある場合には、Casタンパク質は異なるPAM配列を標的とすることができる。いくつかの場合において、標的遺伝子は、Cas9 PAM、例えば、5’-NGGに隣接し得る。他の場合には、他のCas9オーソログは異なるPAM要件を有し得る。例えば、S. thermophilus のもののようなPAM（CRISPR1の場合は5’-NNAGAA、CRISPR3の場合は5’-NGGNG）およびNeisseria meningiditis のもの（5’-NNNNGATT）のような他のPAMも標的遺伝子に隣接して見出され得る。
【０２８４】
いくつかの実施形態において、S. pyogenes系について、標的遺伝子配列は、5’-NGG PAMの前(すなわち、その5’側)にあり得、20 ntガイドRNA配列が、反対側の鎖と塩基対を形成して、PAMに隣接するCas9切断を媒介することができる。ある場合には、隣接切断は、PAMの（約）3塩基対上流であり得る。ある場合には、隣接切断は、PAMの（約）10塩基対上流であり得る。ある場合には、隣接切断は、PAMの（約）0〜20塩基対上流であり得る。例えば、隣接切断は、PAM上流の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30塩基対の隣であり得る。隣接切断はPAMの1〜30塩基対下流でもあり得る。
【０２８５】
［核局在化配列 (NLS) を含む融合タンパク質］
いくつかの態様において、本明細書で提供される融合タンパク質は、一つ以上 (例:2, 3, 4, 5) の核ターゲティング配列、例えば、核局在化配列 (NLS) をさらに含む。一実施形態では、二部（bipartite）NLSが使用される。いくつかの態様において、NLSは、NLSを含むタンパク質の細胞核中への輸入(例えば核輸送によるもの)を促進するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される融合タンパク質のいずれかは、核局在化配列 (NLS) をさらに含む。いくつかの実施形態において、NLSは融合タンパク質のN末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSは融合タンパク質のC末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSはCas9ドメインのN末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSはnCas9ドメインまたはdCas9ドメインのC末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSはデアミナーゼのN末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSはデアミナーゼのC末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSは、1つ以上のリンカーを介して融合タンパク質に融合される。ある態様において、NLSは、リンカーなしで融合タンパク質に融合される。いくつかの実施形態において、NLSは、本明細書において提供または参照されるNLS配列のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。さらなる核局在化配列は当技術分野で公知であり、当業者には明らかであろう。例えば、NLS配列は、Plank et al., PCT/EP2000/011690に記載されており、その内容は、例示的な核局在化配列の開示について参照により本明細書に組み込まれる。ある態様において、NLSは、アミノ酸配列PKKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV, KRTADGSEFESPKKKRKV, KRPAATKKAGQAKKKK, KKTELQTTNAENKTKKL, KRGINDRNFWRGENGRKTR, RKSGKIAAIVVKRPRKPKKKRKV, またはMDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCを含む。いくつかの実施形態において、NLSはリンカー中に存在するか、またはNLSはリンカー、例えば本明細書に記載されるリンカーによって隣接される。いくつかの実施形態において、N末端またはC末端NLSは、二部NLSである。二部NLSは、比較的短いスペーサー配列によって分離される二つの塩基性アミノ酸クラスターを含む(それゆえにbipartite、2部分と呼ばれ、一部（monopartite）NLSは異なる)。ヌクレオプラスミンのNLSであるKR[PAATKKAGQA]KKKKは遍在的な二部シグナルのプロトタイプであり、塩基性アミノ酸の二つのクラスターが約10アミノ酸のスペーサーによって隔てられたものである。例示的な二部NLSの配列は、PKKKRKVEGADKRTADGSEFES PKKKRKVである。
【０２８６】
いくつかの態様において、本発明の融合タンパク質は、リンカー配列を含まない。ある態様において、1以上のドメインまたはタンパク質の間にリンカー配列が存在する。
【０２８７】
本開示の融合タンパク質は、1つ以上のさらなる特徴を含み得ることが理解されるべきである。例えば、いくつかの態様において、融合タンパク質は、阻害因子、細胞質局在化配列、核輸出配列などの輸出配列、または他の局在化配列、ならびに融合タンパク質の可溶化、精製、または検出に有用な配列タグを含むことができる。本明細書において提供される適切なタンパク質タグには、限定されるものではないが、ビオチンカルボキシラーゼキャリアータグ (BCCP) タグ、myc-タグ、カルモジュリンタグ、FLAG-タグ、ヘマグルチニン (HA) -タグ、ポリヒスチジンタグ（ヒスチジンタグまたはHis-タグとも呼ばれる）、マルトース結合タンパク質 (MBP) -タグ、nus-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST) -タグ、緑色蛍光タンパク質 (GFP) -タグ、チオレドキシンタグ、S-タグ、ソフタグ(例えばSoftag1、Softag3)、ストレプトタグ、ビオチンリガーゼタグ、FLAsHタグ、V5タグ、およびSBP-タグが含まれる。さらなる適切な配列は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、1つ以上のHisタグを含む。
【０２８８】
1以上の核局在化配列 (NLS) を含むCRISPR酵素をコードするベクターを使用することができる。例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個のNLSを使用することができる。CRISPR酵素は、アミノ末端またはその近傍のNLS、カルボキシ末端またはその近傍の約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上のNLS、またはこれらの任意の組み合わせ(例えばアミノ末端における1以上のNLSおよびカルボキシ末端における1以上のNLS)を含むことができる。複数のNLSが存在する場合、各NLSは他から独立して選択することができ、したがって1つのNLSが1つ以上のコピーで存在することができ、および/または1つ以上のコピーで存在する1つ以上の他のNLSと組み合わせて存在することができる。
【０２８９】
該方法において使用されるCRISPR酵素は、約6個のNLSを含むことができる。NLSに最も近いアミノ酸がN-またはC-末端からポリペプチド鎖に沿って約50アミノ酸内（例えば1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、または50アミノ酸内）にあるとき、そのNLSはN-またはC-末端の近傍にあると考えられる。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、NLSは、アミノ酸配列PKKKRKVEGADKRTADGSEFES PKKKRKV, KRTADGSEFESPKKKRKV, KRPAATKKAGQAKKKK, KKTELQTTNAENKTKKL, KRGINDRNFWRGENGRKTR, RKSGKIAAIVVKRPRKPKKKRKV, またはMDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCを含む。
【０２９１】
いくつかの実施形態において、NLSはリンカー中に存在するか、またはNLSはリンカー、例えば本明細書に記載されるリンカーによって隣接される。いくつかの実施形態において、N末端またはC末端のNLSは、二部NLSである。二部NLSは、比較的短いスペーサー配列によって分離される二つの塩基性アミノ酸クラスターを含む(それゆえにbipartite、2部分と呼ばれ、一部（monopartite）NLSは異なる)。ヌクレオプラスミンのNLSであるKR[PAATKKAGQA]KKKKは遍在的な二部シグナルのプロトタイプであり、塩基性アミノ酸の二つのクラスターが約10アミノ酸のスペーサーによって隔てられたものである。例示的な二部NLSの配列は、PKKKRKVEGADKRTADGSEFES PKKKRKVである。
【０２９２】
ある実施形態では、本発明の融合タンパク質はリンカー配列を含まない。ある実施形態では、１つ以上のドメインまたはタンパク質の間にリンカー配列が存在する。
【０２９３】
PAM配列は、当該技術分野で公知の任意のPAM配列であり得る。適切なPAM配列には、以下が含まれるが、これらに限定されない：NGG, NGA, NGC, NGN, NGT, NGCG, NGAG, NGAN, NGNG, NGCN, NGCG, NGTN, NNGRRT, NNNRRT, NNGRR(N), TTTV, TYCV, TYCV, TATV, NNNNGATT, NNAGAAW, または NAAAAC。Yはピリミジンであり、Nは任意のヌクレオチド塩基であり、WはAまたはTである。
【０２９４】
［核酸塩基編集ドメイン］
ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインおよび核酸塩基編集ドメイン(例えばデアミナーゼドメイン)を含む融合タンパク質を含む塩基エディターを本明細書に記載する。塩基エディターは、標的配列を認識することができるガイドポリヌクレオチドと相互作用することによって、標的ポリヌクレオチド配列中の1以上の塩基を編集するようにプログラムすることができる。標的配列がいったん認識されると、編集が行われるポリヌクレオチド上に塩基エディターが固定され、次いで、塩基エディターのデアミナーゼドメイン成分が標的塩基を編集することができる。
【０２９５】
ある態様において、核酸塩基編集ドメインは、デアミナーゼドメインである。場合によっては、デアミナーゼドメインは、シトシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼであり得る。いくつかの実施形態では、「シトシンデアミナーゼ」および「シチジンデアミナーゼ」という用語は、交換可能に使用され得る。場合によっては、デアミナーゼドメインは、アデニンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼであり得る。いくつかの実施形態では、「アデニンデアミナーゼ」および「アデノシンデアミナーゼ」という用語は、交換可能に使用され得る。核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際PCT出願番号PCT/2017/045381 (WO2018/027078) およびPCT/US2016/058344 (WO2017/070632) に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage”Nature  551, 464-471 (2017); および Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)も参照（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２９６】
［CからTへの編集］
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される塩基エディターは、ポリヌクレオチドの標的シチジン (C) 塩基を脱アミノ化してチミンの塩基対形成特性を有するウリジン (U) を生成することができる、シチジンデアミナーゼを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、例えば、ポリヌクレオチドが二本鎖(例えばDNA)である場合、ウリジン塩基は次いで、チミジン塩基で置換されて(例えば細胞修復機構により)、C:GからT:Aへの転移を生じさせることができる。他の実施形態において、塩基エディターによる核酸中のCからUへの脱アミノ化は、UからTへの置換を伴うことができない。
【０２９７】
ポリヌクレオチド中の標的Cを脱アミノ化してUを生じさせることは、本明細書に記載の塩基エディターによって実行することができるタイプの塩基編集の非限定的な例である。別の例において、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、シトシン (C) 塩基からグアニン (G) 塩基への変換を媒介することができる。例えば、塩基エディターのシチジンデアミナーゼドメインによるシチジンの脱アミノ化によって生成されたポリヌクレオチドのUは、塩基除去修復機構(例えばウラシルDNAグリコシラーゼ (UDG) ドメインによるもの)によってポリヌクレオチドから切り出され、脱塩基部位を生成することができる。次に、脱塩基部位の反対側の核酸塩基が、Cのような別の塩基で置換され得(例えば塩基修復機構により)、例えばこれは損傷乗り越えポリメラーゼによって行われる。脱塩基部位の反対側の核酸塩基がCで置換されるのが典型的であるが、他の置換(例えばA、G、T)も起こりうる。
【０２９８】
従って、いくつかの実施形態において、本明細書に記載される塩基エディターは、ポリヌクレオチド中の標的Cを脱アミノ化してUにすることができる脱アミノ化ドメイン(例えばシチジンデアミナーゼドメイン)を含む。さらに、以下に記載するように、塩基エディターは、脱アミノ化から生じるUの、ある態様においてはTまたはGへの、変換を促進させるさらなるドメインを含むことができる。例えば、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、さらにウラシルグリコシラーゼ阻害因子 (UGI) ドメインを含み、TによるUの置換を媒介し、CからTへの塩基編集事象を完了することができる。損傷乗り越えポリメラーゼは脱塩基部位の反対側でCの取り込みを促進することができるので(すなわち脱塩基部位でのGの取り込みをもたらし、CからGへの塩基編集事象を完了する)、別の例では塩基エディターは損傷乗り越えポリメラーゼを組み込んで、CからGへの塩基編集の効率を改善させることができる。
【０２９９】
ドメインとしてシチジンデアミナーゼを含む塩基エディターは、DNA、RNAおよびDNA-RNAハイブリッドを含む任意のポリヌクレオチドにおいて標的Cを脱アミノ化することができる。典型的には、シチジンデアミナーゼは、ポリヌクレオチドの一本鎖部分の文脈に配置されるC核酸塩基を触媒する。ある態様において、標的Cを含むポリヌクレオチド全体が一本鎖であり得る。例えば、塩基エディターに組み込まれたシチジンデアミナーゼは、一本鎖RNAポリヌクレオチド中の標的Cを脱アミノ化することができる。他の実施形態において、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、二本鎖ポリヌクレオチドに作用することができるが、標的Cは、脱アミノ化反応の時点で一本鎖状態になるポリヌクレオチドの一部に位置し得る。例えば、NAGPBドメインがCas9ドメインを含む実施形態において、いくつかのヌクレオチドは、Cas9-gRNA-標的DNA複合体の形成の際に対合しないままにしておくことができ、その結果、Cas9「Rループ複合体」が形成される。これらの不対ヌクレオチドは、一本鎖特異的ヌクレオチドデアミナーゼ酵素(例えばシチジンデアミナーゼ)の基質として作用し得る一本鎖DNAのバブルを形成することができる。
【０３００】
ある態様において、塩基エディターのシチジンデアミナーゼは、アポリポタンパク質B mRNA編集複合体 (APOBEC) ファミリーデアミナーゼの全部または一部を含むことができる。APOBECは進化的に保存されたシチジンデアミナーゼファミリーである。このファミリーのメンバーはCからUへの編集酵素である。APOBEC様タンパク質のN末端ドメインは触媒ドメインであり、C末端ドメインは偽触媒ドメインである。より具体的には、触媒ドメインは亜鉛依存性のシチジンデアミナーゼドメインであり、シチジンの脱アミノ化にとって重要である。APOBECファミリーメンバーには、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D(今では「APOBEC3E」はこれを指す)、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4、および活性化誘導 (シチジン) デアミナーゼが含まれる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC1デアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC2デアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3デアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3Aデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3Bデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3Cデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3Dデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3Eデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3Fデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3Gデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3Hデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC4デアミナーゼの全部または一部を含む。ある態様において、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ (AID) の全部または一部を含む。ある態様において、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ1 (CDA1) の全部または一部を含む。塩基エディターは、任意の適切な生物(例えばヒトまたはラット)からのデアミナーゼを含むことができることを理解されるべきである。ある態様において、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウス由来である。ある態様において、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ラットに由来する(例えばラットAPOBEC1)。ある態様において、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ヒトAPOBEC1である。ある態様において、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、PmCDA1である。
【０３０１】
PmCDA1のアミノ酸配列および核酸配列を下記に示す。
>tr|A5H718|A5H718_PETMA Cytosine deaminase OS=Petromyzon marinus OX=7757 PE=2 SV=1 アミノ酸配列:
MTDAEYVRIHEKLDIYTFKKQFFNNKKSVSHRCYVLFELKRRGERRACFWGYAVNKPQSG
TERGIHAEIFSIRKVEEYLRDNPGQFTINWYSSWSPCADCAEKILEWYNQELRGNGHTLK
IWACKLYYEKNARNQIGLWNLRDNGVGLNVMVSEHYQCCRKIFIQSSHNQLNENRWLEKT
LKRAEKRRSELSIMIQVKILHTTKSPAV
核酸配列:  >EF094822.1 Petromyzon marinus isolate PmCDA.21 cytosine deaminase mRNA, complete cds:
TGACACGACACAGCCGTGTATATGAGGAAGGGTAGCTGGATGGGGGGGGGGGGAATACGTTCAGAGAGGA
CATTAGCGAGCGTCTTGTTGGTGGCCTTGAGTCTAGACACCTGCAGACATGACCGACGCTGAGTACGTGA
GAATCCATGAGAAGTTGGACATCTACACGTTTAAGAAACAGTTTTTCAACAACAAAAAATCCGTGTCGCA
TAGATGCTACGTTCTCTTTGAATTAAAACGACGGGGTGAACGTAGAGCGTGTTTTTGGGGCTATGCTGTG
AATAAACCACAGAGCGGGACAGAACGTGGAATTCACGCCGAAATCTTTAGCATTAGAAAAGTCGAAGAAT
ACCTGCGCGACAACCCCGGACAATTCACGATAAATTGGTACTCATCCTGGAGTCCTTGTGCAGATTGCGC
TGAAAAGATCTTAGAATGGTATAACCAGGAGCTGCGGGGGAACGGCCACACTTTGAAAATCTGGGCTTGC
AAACTCTATTACGAGAAAAATGCGAGGAATCAAATTGGGCTGTGGAACCTCAGAGATAACGGGGTTGGGT
TGAATGTAATGGTAAGTGAACACTACCAATGTTGCAGGAAAATATTCATCCAATCGTCGCACAATCAATT
GAATGAGAATAGATGGCTTGAGAAGACTTTGAAGCGAGCTGAAAAACGACGGAGCGAGTTGTCCATTATG
ATTCAGGTAAAAATACTCCACACCACTAAGAGTCCTGCTGTTTAAGAGGCTATGCGGATGGTTTTC 
ヒト活性化誘導シチジンデアミナーゼ (AID)のコード配列(CDS)のアミノ酸配列および核酸配列を下記に示す：
>tr|Q6QJ80|Q6QJ80_HUMAN Activation-induced cytidine deaminase OS=Homo sapiens OX=9606 GN=AICDA PE=2 SV=1 アミノ酸配列:
MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCYVVKRRDSATSFSLDFGYLRNKNGCHVELL
FLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPNLSLRIFTARLYFCEDRK
AEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKAPV
ヒト活性化誘導シチジンデアミナーゼ (AID)のコード配列(CDS)のアミノ酸配列および核酸配列を下記に示す：
>tr|Q6QJ80|Q6QJ80_HUMAN Activation-induced cytidine deaminase OS=Homo sapiens OX=9606 GN=AICDA PE=2 SV=1 アミノ酸配列:
MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCYVVKRRDSATSFSLDFGYLRNKNGCHVELL
FLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPNLSLRIFTARLYFCEDRK
AEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKAPV
核酸配列:  >NG_011588.1:5001-15681 Homo sapiens activation induced cytidine deaminase (AICDA), RefSeqGene (LRG_17) on chromosome 12:
AGAGAACCATCATTAATTGAAGTGAGATTTTTCTGGCCTGAGACTTGCAGGGAGGCAAGAAGACACTCTG
GACACCACTATGGACAGGTAAAGAGGCAGTCTTCTCGTGGGTGATTGCACTGGCCTTCCTCTCAGAGCAA
ATCTGAGTAATGAGACTGGTAGCTATCCCTTTCTCTCATGTAACTGTCTGACTGATAAGATCAGCTTGAT
CAATATGCATATATATTTTTTGATCTGTCTCCTTTTCTTCTATTCAGATCTTATACGCTGTCAGCCCAAT
TCTTTCTGTTTCAGACTTCTCTTGATTTCCCTCTTTTTCATGTGGCAAAAGAAGTAGTGCGTACAATGTA
CTGATTCGTCCTGAGATTTGTACCATGGTTGAAACTAATTTATGGTAATAATATTAACATAGCAAATCTT
TAGAGACTCAAATCATGAAAAGGTAATAGCAGTACTGTACTAAAAACGGTAGTGCTAATTTTCGTAATAA
TTTTGTAAATATTCAACAGTAAAACAACTTGAAGACACACTTTCCTAGGGAGGCGTTACTGAAATAATTT
AGCTATAGTAAGAAAATTTGTAATTTTAGAAATGCCAAGCATTCTAAATTAATTGCTTGAAAGTCACTAT
GATTGTGTCCATTATAAGGAGACAAATTCATTCAAGCAAGTTATTTAATGTTAAAGGCCCAATTGTTAGG
CAGTTAATGGCACTTTTACTATTAACTAATCTTTCCATTTGTTCAGACGTAGCTTAACTTACCTCTTAGG
TGTGAATTTGGTTAAGGTCCTCATAATGTCTTTATGTGCAGTTTTTGATAGGTTATTGTCATAGAACTTA
TTCTATTCCTACATTTATGATTACTATGGATGTATGAGAATAACACCTAATCCTTATACTTTACCTCAAT
TTAACTCCTTTATAAAGAACTTACATTACAGAATAAAGATTTTTTAAAAATATATTTTTTTGTAGAGACA
GGGTCTTAGCCCAGCCGAGGCTGGTCTCTAAGTCCTGGCCCAAGCGATCCTCCTGCCTGGGCCTCCTAAA
GTGCTGGAATTATAGACATGAGCCATCACATCCAATATACAGAATAAAGATTTTTAATGGAGGATTTAAT
GTTCTTCAGAAAATTTTCTTGAGGTCAGACAATGTCAAATGTCTCCTCAGTTTACACTGAGATTTTGAAA
ACAAGTCTGAGCTATAGGTCCTTGTGAAGGGTCCATTGGAAATACTTGTTCAAAGTAAAATGGAAAGCAA
AGGTAAAATCAGCAGTTGAAATTCAGAGAAAGACAGAAAAGGAGAAAAGATGAAATTCAACAGGACAGAA
GGGAAATATATTATCATTAAGGAGGACAGTATCTGTAGAGCTCATTAGTGATGGCAAAATGACTTGGTCA
GGATTATTTTTAACCCGCTTGTTTCTGGTTTGCACGGCTGGGGATGCAGCTAGGGTTCTGCCTCAGGGAG
CACAGCTGTCCAGAGCAGCTGTCAGCCTGCAAGCCTGAAACACTCCCTCGGTAAAGTCCTTCCTACTCAG
GACAGAAATGACGAGAACAGGGAGCTGGAAACAGGCCCCTAACCAGAGAAGGGAAGTAATGGATCAACAA
AGTTAACTAGCAGGTCAGGATCACGCAATTCATTTCACTCTGACTGGTAACATGTGACAGAAACAGTGTA
GGCTTATTGTATTTTCATGTAGAGTAGGACCCAAAAATCCACCCAAAGTCCTTTATCTATGCCACATCCT
TCTTATCTATACTTCCAGGACACTTTTTCTTCCTTATGATAAGGCTCTCTCTCTCTCCACACACACACAC
ACACACACACACACACACACACACACACACACAAACACACACCCCGCCAACCAAGGTGCATGTAAAAAGA
TGTAGATTCCTCTGCCTTTCTCATCTACACAGCCCAGGAGGGTAAGTTAATATAAGAGGGATTTATTGGT
AAGAGATGATGCTTAATCTGTTTAACACTGGGCCTCAAAGAGAGAATTTCTTTTCTTCTGTACTTATTAA
GCACCTATTATGTGTTGAGCTTATATATACAAAGGGTTATTATATGCTAATATAGTAATAGTAATGGTGG
TTGGTACTATGGTAATTACCATAAAAATTATTATCCTTTTAAAATAAAGCTAATTATTATTGGATCTTTT
TTAGTATTCATTTTATGTTTTTTATGTTTTTGATTTTTTAAAAGACAATCTCACCCTGTTACCCAGGCTG
GAGTGCAGTGGTGCAATCATAGCTTTCTGCAGTCTTGAACTCCTGGGCTCAAGCAATCCTCCTGCCTTGG
CCTCCCAAAGTGTTGGGATACAGTCATGAGCCACTGCATCTGGCCTAGGATCCATTTAGATTAAAATATG
CATTTTAAATTTTAAAATAATATGGCTAATTTTTACCTTATGTAATGTGTATACTGGCAATAAATCTAGT
TTGCTGCCTAAAGTTTAAAGTGCTTTCCAGTAAGCTTCATGTACGTGAGGGGAGACATTTAAAGTGAAAC
AGACAGCCAGGTGTGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTCTGGGAGGCTGAGGTGGGTGGATCGCTT
GAGCCCTGGAGTTCAAGACCAGCCTGAGCAACATGGCAAAACGCTGTTTCTATAACAAAAATTAGCCGGG
CATGGTGGCATGTGCCTGTGGTCCCAGCTACTAGGGGGCTGAGGCAGGAGAATCGTTGGAGCCCAGGAGG
TCAAGGCTGCACTGAGCAGTGCTTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGTGACAGGACCAGACCTTGCCTCA
AAAAAATAAGAAGAAAAATTAAAAATAAATGGAAACAACTACAAAGAGCTGTTGTCCTAGATGAGCTACT
TAGTTAGGCTGATATTTTGGTATTTAACTTTTAAAGTCAGGGTCTGTCACCTGCACTACATTATTAAAAT
ATCAATTCTCAATGTATATCCACACAAAGACTGGTACGTGAATGTTCATAGTACCTTTATTCACAAAACC
CCAAAGTAGAGACTATCCAAATATCCATCAACAAGTGAACAAATAAACAAAATGTGCTATATCCATGCAA
TGGAATACCACCCTGCAGTACAAAGAAGCTACTTGGGGATGAATCCCAAAGTCATGACGCTAAATGAAAG
AGTCAGACATGAAGGAGGAGATAATGTATGCCATACGAAATTCTAGAAAATGAAAGTAACTTATAGTTAC
AGAAAGCAAATCAGGGCAGGCATAGAGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGAGAGGCCACGTGGGAA
GATTGCTAGAACTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGGCAACACAGTGAAACTCCATTCTCCACAAAAATGG
GAAAAAAAGAAAGCAAATCAGTGGTTGTCCTGTGGGGAGGGGAAGGACTGCAAAGAGGGAAGAAGCTCTG
GTGGGGTGAGGGTGGTGATTCAGGTTCTGTATCCTGACTGTGGTAGCAGTTTGGGGTGTTTACATCCAAA
AATATTCGTAGAATTATGCATCTTAAATGGGTGGAGTTTACTGTATGTAAATTATACCTCAATGTAAGAA
AAAATAATGTGTAAGAAAACTTTCAATTCTCTTGCCAGCAAACGTTATTCAAATTCCTGAGCCCTTTACT
TCGCAAATTCTCTGCACTTCTGCCCCGTACCATTAGGTGACAGCACTAGCTCCACAAATTGGATAAATGC
ATTTCTGGAAAAGACTAGGGACAAAATCCAGGCATCACTTGTGCTTTCATATCAACCATGCTGTACAGCT
TGTGTTGCTGTCTGCAGCTGCAATGGGGACTCTTGATTTCTTTAAGGAAACTTGGGTTACCAGAGTATTT
CCACAAATGCTATTCAAATTAGTGCTTATGATATGCAAGACACTGTGCTAGGAGCCAGAAAACAAAGAGG
AGGAGAAATCAGTCATTATGTGGGAACAACATAGCAAGATATTTAGATCATTTTGACTAGTTAAAAAAGC
AGCAGAGTACAAAATCACACATGCAATCAGTATAATCCAAATCATGTAAATATGTGCCTGTAGAAAGACT
AGAGGAATAAACACAAGAATCTTAACAGTCATTGTCATTAGACACTAAGTCTAATTATTATTATTAGACA
CTATGATATTTGAGATTTAAAAAATCTTTAATATTTTAAAATTTAGAGCTCTTCTATTTTTCCATAGTAT
TCAAGTTTGACAATGATCAAGTATTACTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTTT
TGGTCTTGTTGCCCATGCTGGAGTGGAATGGCATGACCATAGCTCACTGCAACCTCCACCTCCTGGGTTC
AAGCAAAGCTGTCGCCTCAGCCTCCCGGGTAGATGGGATTACAGGCGCCCACCACCACACTCGGCTAATG
TTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCAAACTCCTGACCTCAGAGG
ATCCACCTGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGATGTAGGCCACTGCGCCCGGCCAAGTATTGC
TCTTATACATTAAAAAACAGGTGTGAGCCACTGCGCCCAGCCAGGTATTGCTCTTATACATTAAAAAATA
GGCCGGTGCAGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAAGCCAAGGCGGGCAGAACACCCGAGGT
CAGGAGTCCAAGGCCAGCCTGGCCAAGATGGTGAAACCCCGTCTCTATTAAAAATACAAACATTACCTGG
GCATGATGGTGGGCGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGGATCCGCGGAGCCTGGCA
GATCTGCCTGAGCCTGGGAGGTTGAGGCTACAGTAAGCCAAGATCATGCCAGTATACTTCAGCCTGGGCG
ACAAAGTGAGACCGTAACAAAAAAAAAAAAATTTAAAAAAAGAAATTTAGATCAAGATCCAACTGTAAAA
AGTGGCCTAAACACCACATTAAAGAGTTTGGAGTTTATTCTGCAGGCAGAAGAGAACCATCAGGGGGTCT
TCAGCATGGGAATGGCATGGTGCACCTGGTTTTTGTGAGATCATGGTGGTGACAGTGTGGGGAATGTTAT
TTTGGAGGGACTGGAGGCAGACAGACCGGTTAAAAGGCCAGCACAACAGATAAGGAGGAAGAAGATGAGG
GCTTGGACCGAAGCAGAGAAGAGCAAACAGGGAAGGTACAAATTCAAGAAATATTGGGGGGTTTGAATCA
ACACATTTAGATGATTAATTAAATATGAGGACTGAGGAATAAGAAATGAGTCAAGGATGGTTCCAGGCTG
CTAGGCTGCTTACCTGAGGTGGCAAAGTCGGGAGGAGTGGCAGTTTAGGACAGGGGGCAGTTGAGGAATA
TTGTTTTGATCATTTTGAGTTTGAGGTACAAGTTGGACACTTAGGTAAAGACTGGAGGGGAAATCTGAAT
ATACAATTATGGGACTGAGGAACAAGTTTATTTTATTTTTTGTTTCGTTTTCTTGTTGAAGAACAAATTT
AATTGTAATCCCAAGTCATCAGCATCTAGAAGACAGTGGCAGGAGGTGACTGTCTTGTGGGTAAGGGTTT
GGGGTCCTTGATGAGTATCTCTCAATTGGCCTTAAATATAAGCAGGAAAAGGAGTTTATGATGGATTCCA
GGCTCAGCAGGGCTCAGGAGGGCTCAGGCAGCCAGCAGAGGAAGTCAGAGCATCTTCTTTGGTTTAGCCC
AAGTAATGACTTCCTTAAAAAGCTGAAGGAAAATCCAGAGTGACCAGATTATAAACTGTACTCTTGCATT
TTCTCTCCCTCCTCTCACCCACAGCCTCTTGATGAACCGGAGGAAGTTTCTTTACCAATTCAAAAATGTC
CGCTGGGCTAAGGGTCGGCGTGAGACCTACCTGTGCTACGTAGTGAAGAGGCGTGACAGTGCTACATCCT
TTTCACTGGACTTTGGTTATCTTCGCAATAAGGTATCAATTAAAGTCGGCTTTGCAAGCAGTTTAATGGT
CAACTGTGAGTGCTTTTAGAGCCACCTGCTGATGGTATTACTTCCATCCTTTTTTGGCATTTGTGTCTCT
ATCACATTCCTCAAATCCTTTTTTTTATTTCTTTTTCCATGTCCATGCACCCATATTAGACATGGCCCAA
AATATGTGATTTAATTCCTCCCCAGTAATGCTGGGCACCCTAATACCACTCCTTCCTTCAGTGCCAAGAA
CAACTGCTCCCAAACTGTTTACCAGCTTTCCTCAGCATCTGAATTGCCTTTGAGATTAATTAAGCTAAAA
GCATTTTTATATGGGAGAATATTATCAGCTTGTCCAAGCAAAAATTTTAAATGTGAAAAACAAATTGTGT
CTTAAGCATTTTTGAAAATTAAGGAAGAAGAATTTGGGAAAAAATTAACGGTGGCTCAATTCTGTCTTCC
AAATGATTTCTTTTCCCTCCTACTCACATGGGTCGTAGGCCAGTGAATACATTCAACATGGTGATCCCCA
GAAAACTCAGAGAAGCCTCGGCTGATGATTAATTAAATTGATCTTTCGGCTACCCGAGAGAATTACATTT
CCAAGAGACTTCTTCACCAAAATCCAGATGGGTTTACATAAACTTCTGCCCACGGGTATCTCCTCTCTCC
TAACACGCTGTGACGTCTGGGCTTGGTGGAATCTCAGGGAAGCATCCGTGGGGTGGAAGGTCATCGTCTG
GCTCGTTGTTTGATGGTTATATTACCATGCAATTTTCTTTGCCTACATTTGTATTGAATACATCCCAATC
TCCTTCCTATTCGGTGACATGACACATTCTATTTCAGAAGGCTTTGATTTTATCAAGCACTTTCATTTAC
TTCTCATGGCAGTGCCTATTACTTCTCTTACAATACCCATCTGTCTGCTTTACCAAAATCTATTTCCCCT
TTTCAGATCCTCCCAAATGGTCCTCATAAACTGTCCTGCCTCCACCTAGTGGTCCAGGTATATTTCCACA
ATGTTACATCAACAGGCACTTCTAGCCATTTTCCTTCTCAAAAGGTGCAAAAAGCAACTTCATAAACACA
AATTAAATCTTCGGTGAGGTAGTGTGATGCTGCTTCCTCCCAACTCAGCGCACTTCGTCTTCCTCATTCC
ACAAAAACCCATAGCCTTCCTTCACTCTGCAGGACTAGTGCTGCCAAGGGTTCAGCTCTACCTACTGGTG
TGCTCTTTTGAGCAAGTTGCTTAGCCTCTCTGTAACACAAGGACAATAGCTGCAAGCATCCCCAAAGATC
ATTGCAGGAGACAATGACTAAGGCTACCAGAGCCGCAATAAAAGTCAGTGAATTTTAGCGTGGTCCTCTC
TGTCTCTCCAGAACGGCTGCCACGTGGAATTGCTCTTCCTCCGCTACATCTCGGACTGGGACCTAGACCC
TGGCCGCTGCTACCGCGTCACCTGGTTCACCTCCTGGAGCCCCTGCTACGACTGTGCCCGACATGTGGCC
GACTTTCTGCGAGGGAACCCCAACCTCAGTCTGAGGATCTTCACCGCGCGCCTCTACTTCTGTGAGGACC
GCAAGGCTGAGCCCGAGGGGCTGCGGCGGCTGCACCGCGCCGGGGTGCAAATAGCCATCATGACCTTCAA
AGGTGCGAAAGGGCCTTCCGCGCAGGCGCAGTGCAGCAGCCCGCATTCGGGATTGCGATGCGGAATGAAT
GAGTTAGTGGGGAAGCTCGAGGGGAAGAAGTGGGCGGGGATTCTGGTTCACCTCTGGAGCCGAAATTAAA
GATTAGAAGCAGAGAAAAGAGTGAATGGCTCAGAGACAAGGCCCCGAGGAAATGAGAAAATGGGGCCAGG
GTTGCTTCTTTCCCCTCGATTTGGAACCTGAACTGTCTTCTACCCCCATATCCCCGCCTTTTTTTCCTTT
TTTTTTTTTTGAAGATTATTTTTACTGCTGGAATACTTTTGTAGAAAACCACGAAAGAACTTTCAAAGCC
TGGGAAGGGCTGCATGAAAATTCAGTTCGTCTCTCCAGACAGCTTCGGCGCATCCTTTTGGTAAGGGGCT
TCCTCGCTTTTTAAATTTTCTTTCTTTCTCTACAGTCTTTTTTGGAGTTTCGTATATTTCTTATATTTTC
TTATTGTTCAATCACTCTCAGTTTTCATCTGATGAAAACTTTATTTCTCCTCCACATCAGCTTTTTCTTC
TGCTGTTTCACCATTCAGAGCCCTCTGCTAAGGTTCCTTTTCCCTCCCTTTTCTTTCTTTTGTTGTTTCA
CATCTTTAAATTTCTGTCTCTCCCCAGGGTTGCGTTTCCTTCCTGGTCAGAATTCTTTTCTCCTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACAAACAAACAAAAAACCCAAAAAAACTCTTTCCCAATTTACTTTCTT
CCAACATGTTACAAAGCCATCCACTCAGTTTAGAAGACTCTCCGGCCCCACCGACCCCCAACCTCGTTTT
GAAGCCATTCACTCAATTTGCTTCTCTCTTTCTCTACAGCCCCTGTATGAGGTTGATGACTTACGAGACG
CATTTCGTACTTTGGGACTTTGATAGCAACTTCCAGGAATGTCACACACGATGAAATATCTCTGCTGAAG
ACAGTGGATAAAAAACAGTCCTTCAAGTCTTCTCTGTTTTTATTCTTCAACTCTCACTTTCTTAGAGTTT
ACAGAAAAAATATTTATATACGACTCTTTAAAAAGATCTATGTCTTGAAAATAGAGAAGGAACACAGGTC
TGGCCAGGGACGTGCTGCAATTGGTGCAGTTTTGAATGCAACATTGTCCCCTACTGGGAATAACAGAACT
GCAGGACCTGGGAGCATCCTAAAGTGTCAACGTTTTTCTATGACTTTTAGGTAGGATGAGAGCAGAAGGT
AGATCCTAAAAAGCATGGTGAGAGGATCAAATGTTTTTATATCAACATCCTTTATTATTTGATTCATTTG
AGTTAACAGTGGTGTTAGTGATAGATTTTTCTATTCTTTTCCCTTGACGTTTACTTTCAAGTAACACAAA
CTCTTCCATCAGGCCATGATCTATAGGACCTCCTAATGAGAGTATCTGGGTGATTGTGACCCCAAACCAT
CTCTCCAAAGCATTAATATCCAATCATGCGCTGTATGTTTTAATCAGCAGAAGCATGTTTTTATGTTTGT
ACAAAAGAAGATTGTTATGGGTGGGGATGGAGGTATAGACCATGCATGGTCACCTTCAAGCTACTTTAAT
AAAGGATCTTAAAATGGGCAGGAGGACTGTGAACAAGACACCCTAATAATGGGTTGATGTCTGAAGTAGC
AAATCTTCTGGAAACGCAAACTCTTTTAAGGAAGTCCCTAATTTAGAAACACCCACAAACTTCACATATC
ATAATTAGCAAACAATTGGAAGGAAGTTGCTTGAATGTTGGGGAGAGGAAAATCTATTGGCTCTCGTGGG
TCTCTTCATCTCAGAAATGCCAATCAGGTCAAGGTTTGCTACATTTTGTATGTGTGTGATGCTTCTCCCA
AAGGTATATTAACTATATAAGAGAGTTGTGACAAAACAGAATGATAAAGCTGCGAACCGTGGCACACGCT
CATAGTTCTAGCTGCTTGGGAGGTTGAGGAGGGAGGATGGCTTGAACACAGGTGTTCAAGGCCAGCCTGG
GCAACATAACAAGATCCTGTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAGAGAGGGCCGGGCGTGGTG
GCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGCCGGGCGGATCACCTGTGGTCAGGAGTTTGAGA
CCAGCCTGGCCAACATGGCAAAACCCCGTCTGTACTCAAAATGCAAAAATTAGCCAGGCGTGGTAGCAGG
CACCTGTAATCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCCAGGAGGTGGAGGTTGCA
GTAAGCTGAGATCGTGCCGTTGCACTCCAGCCTGGGCGACAAGAGCAAGACTCTGTCTCAGAAAAAAAAA
AAAAAAAGAGAGAGAGAGAGAAAGAGAACAATATTTGGGAGAGAAGGATGGGGAAGCATTGCAAGGAAAT
TGTGCTTTATCCAACAAAATGTAAGGAGCCAATAAGGGATCCCTATTTGTCTCTTTTGGTGTCTATTTGT
CCCTAACAACTGTCTTTGACAGTGAGAAAAATATTCAGAATAACCATATCCCTGTGCCGTTATTACCTAG
CAACCCTTGCAATGAAGATGAGCAGATCCACAGGAAAACTTGAATGCACAACTGTCTTATTTTAATCTTA
TTGTACATAAGTTTGTAAAAGAGTTAAAAATTGTTACTTCATGTATTCATTTATATTTTATATTATTTTG
CGTCTAATGATTTTTTATTAACATGATTTCCTTTTCTGATATATTGAAATGGAGTCTCAAAGCTTCATAA
ATTTATAACTTTAGAAATGATTCTAATAACAACGTATGTAATTGTAACATTGCAGTAATGGTGCTACGAA
GCCATTTCTCTTGATTTTTAGTAAACTTTTATGACAGCAAATTTGCTTCTGGCTCACTTTCAATCAGTTA
AATAAATGATAAATAATTTTGGAAGCTGTGAAGATAAAATACCAAATAAAATAATATAAAAGTGATTTAT
ATGAAGTTAAAATAAAAAATCAGTATGATGGAATAAACTTG
【０３０２】
本開示の態様に従ってCas9に融合され得る他の例示的デアミナーゼが、以下に提供される。いくつかの実施形態において、それぞれの配列の活性ドメイン、例えば、局在化シグナル(核局在化配列、核外搬出シグナル、細胞質局在化シグナル)を伴わないドメインが使用され得ることが理解されるべきである。
【０３０３】
Human AID:
2021523738.tif 000011
(下線:  核局在化配列; 二重下線:  核外搬出シグナル)
【０３０４】
Mouse AID: 
2021523738.tif 000012
(下線:  核局在化配列; 二重下線:  核外搬出シグナル)
【０３０５】
Dog AID: 
2021523738.tif 000013
(下線:  核局在化配列; 二重下線:  核外搬出シグナル)
【０３０６】
Bovine AID: 
2021523738.tif 000014
(下線:  核局在化配列; 二重下線:  核外搬出シグナル)
【０３０７】
Rat AID 
2021523738.tif 000015
(下線:  核局在化配列; 二重下線:  核外搬出シグナル)
【０３０８】
Mouse APOBEC-3
2021523738.tif 000016
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０３０９】
Rat APOBEC-3:
2021523738.tif 000017
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０３１０】
Rhesus macaque APOBEC-3G: 
2021523738.tif 000018
（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）
【０３１１】
Chimpanzee APOBEC-3G: 
2021523738.tif 000019
（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）
【０３１２】
Green monkey APOBEC-3G: 
2021523738.tif 000020
（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）
【０３１３】
Human APOBEC-3G: 
2021523738.tif 000021
（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）
【０３１４】
Human APOBEC-3F: 
2021523738.tif 000022
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０３１５】
Human APOBEC-3B: 
2021523738.tif 000023
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０３１６】
Rat APOBEC-3B: 
MQPQGLGPNAGMGPVCLGCSHRRPYSPIRNPLKKLYQQTFYFHFKNVRYAWGRKNNFLCYEVNGMDCALPVPLRQGVFRKQGHIHAELCFIYWFHDKVLRVLSPMEEFKVTWYMSWSPCSKCAEQVARFLAAHRNLSLAIFSSRLYYYLRNPNYQQKLCRLIQEGVHVAAMDLPEFKKCWNKFVDNDGQPFRPWMRLRINFSFYDCKLQEIFSRMNLLREDVFYLQFNNSHRVKPVQNRYYRRKSYLCYQLERANGQEPLKGYLLYKKGEQHVEILFLEKMRSMELSQVRITCYLTWSPCPNCARQLAAFKKDHPDLILRIYTSRLYFWRKKFQKGLCTLWRSGIHVDVMDLPQFADCWTNFVNPQRPFRPWNELEKNSWRIQRRLRRIKESWGL 
【０３１７】
Bovine APOBEC-3B: 
DGWEVAFRSGTVLKAGVLGVSMTEGWAGSGHPGQGACVWTPGTRNTMNLLREVLFKQQFGNQPRVPAPYYRRKTYLCYQLKQRNDLTLDRGCFRNKKQRHAERFIDKINSLDLNPSQSYKIICYITWSPCPNCANELVNFITRNNHLKLEIFASRLYFHWIKSFKMGLQDLQNAGISVAVMTHTEFEDCWEQFVDNQSRPFQPWDKLEQYSASIRRRLQRILTAPI
【０３１８】
Chimpanzee APOBEC-3B: 
MNPQIRNPMEWMYQRTFYYNFENEPILYGRSYTWLCYEVKIRRGHSNLLWDTGVFRGQMYSQPEHHAEMCFLSWFCGNQLSAYKCFQITWFVSWTPCPDCVAKLAKFLAEHPNVTLTISAARLYYYWERDYRRALCRLSQAGARVKIMDDEEFAYCWENFVYNEGQPFMPWYKFDDNYAFLHRTLKEIIRHLMDPDTFTFNFNNDPLVLRRHQTYLCYEVERLDNGTWVLMDQHMGFLCNEAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGQVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFEYCWDTFVYRQGCPFQPWDGLEEHSQALSGRLRAILQVRASSLCMVPHRPPPPPQSPGPCLPLCSEPPLGSLLPTGRPAPSLPFLLTASFSFPPPASLPPLPSLSLSPGHLPVPSFHSLTSCSIQPPCSSRIRETEGWASVSKEGRDLG 
【０３１９】
Human APOBEC-3C:
2021523738.tif 000024
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０３２０】
Gorilla APOBEC-3C 
2021523738.tif 000025
【０３２１】
Human APOBEC-3A: 
2021523738.tif 000026
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０３２２】
Rhesus macaque APOBEC-3A: 
2021523738.tif 000027
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０３２３】
Bovine APOBEC-3A: 
2021523738.tif 000028
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０３２４】
Human APOBEC-3H: 
2021523738.tif 000029
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０３２５】
Rhesus macaque APOBEC-3H: 
MALLTAKTFSLQFNNKRRVNKPYYPRKALLCYQLTPQNGSTPTRGHLKNKKKDHAEIRFINKIKSMGLDETQCYQVTCYLTWSPCPSCAGELVDFIKAHRHLNLRIFASRLYYHWRPNYQEGLLLLCGSQVPVEVMGLPEFTDCWENFVDHKEPPSFNPSEKLEELDKNSQAIKRRLERIKSRSVDVLENGLRSLQLGPVTPSSSIRNSR 
【０３２６】
Human APOBEC-3D: 
2021523738.tif 000030
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０３２７】
Human APOBEC-1: 
MTSEKGPSTGDPTLRRRIEPWEFDVFYDPRELRKEACLLYEIKWGMSRKIWRSSGKNTTNHVEVNFIKKFTSERDFHPSMSCSITWFLSWSPCWECSQAIREFLSRHPGVTLVIYVARLFWHMDQQNRQGLRDLVNSGVTIQIMRASEYYHCWRNFVNYPPGDEAHWPQYPPLWMMLYALELHCIILSLPPCLKISRRWQNHLTFFRLHLQNCHYQTIPPHILLATGLIHPSVAWR
【０３２８】
Mouse APOBEC-1: 
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSVWRHTSQNTSNHVEVNFLEKFTTERYFRPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRHPYVTLFIYIARLYHHTDQRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQEYCYCWRNFVNYPPSNEAYWPRYPHLWVKLYVLELYCIILGLPPCLKILRRKQPQLTFFTITLQTCHYQRIPPHLLWATGLK
【０３２９】
Rat APOBEC-1: 
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLK 
【０３３０】
Human APOBEC-2: 
MAQKEEAAVATEAASQNGEDLENLDDPEKLKELIELPPFEIVTGERLPANFFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEAQGKGGQVQASRGYLEDEHAAAHAEEAFFNTILPAFDPALRYNVTWYVSSSPCAACADRIIKTLSKTKNLRLLILVGRLFMWEEPEIQAALKKLKEAGCKLRIMKPQDFEYVWQNFVEQEEGESKAFQPWEDIQENFLYYEEKLADILK 
【０３３１】
Mouse APOBEC-2: 
MAQKEEAAEAAAPASQNGDDLENLEDPEKLKELIDLPPFEIVTGVRLPVNFFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEVQSKGGQAQATQGYLEDEHAGAHAEEAFFNTILPAFDPALKYNVTWYVSSSPCAACADRILKTLSKTKNLRLLILVSRLFMWEEPEVQAALKKLKEAGCKLRIMKPQDFEYIWQNFVEQEEGESKAFEPWEDIQENFLYYEEKLADILK
【０３３２】
Rat APOBEC-2: 
MAQKEEAAEAAAPASQNGDDLENLEDPEKLKELIDLPPFEIVTGVRLPVNFFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEAQSKGGQVQATQGYLEDEHAGAHAEEAFFNTILPAFDPALKYNVTWYVSSSPCAACADRILKTLSKTKNLRLLILVSRLFMWEEPEVQAALKKLKEAGCKLRIMKPQDFEYLWQNFVEQEEGESKAFEPWEDIQENFLYYEEKLADILK
【０３３３】
Bovine APOBEC-2: 
MAQKEEAAAAAEPASQNGEEVENLEDPEKLKELIELPPFEIVTGERLPAHYFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEAQSKGGQVQASRGYLEDEHATNHAEEAFFNSIMPTFDPALRYMVTWYVSSSPCAACADRIVKTLNKTKNLRLLILVGRLFMWEEPEIQAALRKLKEAGCRLRIMKPQDFEYIWQNFVEQEEGESKAFEPWEDIQENFLYYEEKLADILK 
【０３３４】
Petromyzon marinus CDA1 (pmCDAl): 
MTDAEYVRIHEKLDIYTFKKQFFNNKKSVSHRCYVLFELKRRGERRACFWGYAVNK PQSGTERGIHAEIFSIRKVEEYLRDNPGQFTINWYSSWSPCADCAEKILEWYNQELRG NGHTLKIWACKLYYEKNARNQIGLWNLRDNGVGLNVMVSEHYQCCRKIFIQSSHNQ LNENRWLEKTLKRAEKRRSELSFMIQVKILHTTKSPAV  
【０３３５】
Human APOBEC3G D316R D317R 
MKPHFRNTVERMYRDTFSYNFYNRPILSRRNTVWLCYEVKTKGPSRPPLDAKIFRGQ VYSELKYHPEMRFFHWFSKWRKLHRDQEYEVTWYISWSPCTKCTRDMATFLAEDP KVTLTIFVARLYYFWDPDYQEALRSLCQKRDGPRATMKFNYDEFQHCWSKFVYSQ RELFEPWNNLPKYYILLHFMLGEILRHSMDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVER MHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTC FTSWSPCFSCAQEMAKFISKKHVSLCIFTARIYRRQGRCQEGLRTLAEAGAKISF T YSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQNQEN
【０３３６】
Human APOBEC3G chain A:
MDPPTFTFNFNNEPWWGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHG FLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCI FTARIYDDQGRCQEGLRTLAEAGAKISFTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLD EHSQDLSGRLRAILQ  
【０３３７】
Human APOBEC3G chain A D120R D121R:
MDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHG FLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCI FTARIYRRQGRCQEGLRTLAEAGAKISFMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDE HSQDLSGRLRAILQ  
【０３３８】
本開示のいくつかの態様は、例えばデアミナーゼドメインに点突然変異を生じさせることによって、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかのデアミナーゼドメイン触媒活性を調節することが、融合タンパク質(例えば塩基エディター)のプロセス特性に影響を及ぼすという認識に基づく。例えば、塩基編集融合タンパク質内のデアミナーゼドメインの触媒活性を減少させるが除去はしない突然変異は、デアミナーゼドメインが標的残基に隣接する残基の脱アミノ化を触媒する可能性を低くし、それによって脱アミノ化のウィンドウを狭めることができる。脱アミノ化のウィンドウを狭める能力は、特定の標的残基に隣接する残基の望まれない脱アミノ化を防ぐことができ、それは、オフターゲット効果を減少させるか、または防ぐことができる。
【０３３９】
例えば、いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のH121X、H122X、R126X、R126X、R118X、W90X、W90X、およびR132Xからなる群より選択される1以上の突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1以上の対応する突然変異を含むことができ、ここでXは任意のアミノ酸である。ある態様において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のH121R、H122R、R126A、R126E、R118A、W90A、W90Y、およびR132Eからなる群より選択される1以上の突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1以上の対応する突然変異を含むことができる。
【０３４０】
ある態様において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのD316X、D317X、R320X、R320X、R313X、W285X、W285X、R326Xからなる群より選択される1以上の突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1以上の対応する突然変異を含むことができ、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかは、hAPOBEC3GのD316R、D317R、R320A、R320E、R313A、W285A、W285Y、R326Eからなる群から選択される1以上の突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。
【０３４１】
ある態様において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のH121RおよびH122R突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のR126A突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のR126E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のR118A突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のW90A突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のW90Y突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のR132E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のW90YおよびR126E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のR126EおよびR132E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のW90YおよびR132E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のW90Y、R126E、およびR132E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。
【０３４２】
いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのD316RおよびD317R突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかは、hAPOBEC3GのR320A突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのR320E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのR313A突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのW285A突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのW285Y突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのR326E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのW285YおよびR320E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのR320EおよびR326E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのW285YおよびR326E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのW285Y、R320E、およびR326E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。
【０３４３】
限定されるものではないが、SaBE3、SaKKH-BE3、VQR-BE3、EQR-BE3、VRER-BE3、YE1-BE3、EE-BE3、YE2-BE3、およびYE-BEE3を含む、多数の改変シチジンデアミナーゼが市販されており、これらはAddgeneから入手可能である(プラスミド85169、85170、85171、85172、85173、85174、85175、85176、85177)。いくつかの実施形態では、塩基エディターに組み入れられるデアミナーゼはAPOBEC1デアミナーゼの全部または一部を含む。
【０３４４】
CからTへの核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際PCT出願番号PCT/US2016/058344 (WO2017/070632) およびKomor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016) に記載されており、これらの全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０３４５】
［AからGへの編集］
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼを含むデアミナーゼドメインを含むことができる。塩基エディターのこのようなアデノシンデアミナーゼドメインは、Aを脱アミノ化して、Gの塩基対形成特性を示すイノシン (I) を形成することによって、アデニン (A) 核酸塩基からグアニン (G) 核酸塩基への編集することを促進することができる。アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸 (DNA) 中のデオキシアデノシン残基のアデニンを脱アミノ化すること(すなわちアミン基を除去すること)ができる。
【０３４６】
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される核酸塩基エディターは、1つ以上のタンパク質ドメインを融合させ、それによって融合タンパク質を生成することによって作製することができる。ある態様において、本明細書において提供される融合タンパク質は、融合タンパク質の塩基編集活性(例えば効率、選択性、特異性)を改善する一つ以上の特徴を含む。例えば、本明細書中に提供される融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が低下したCas9ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、本明細書中で提供される融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有さないCas9ドメイン (dCas9) 、または、Cas9ニッカーゼ (nCas9) と呼ばれる、二本鎖DNA分子の一鎖を切断するCas9ドメインを有することができる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、触媒残基(例えばH840)の存在が、標的Aと反対のTを含有する非編集（例えば非脱アミノ化）鎖を切断するCas9の活性を維持する。Cas9の触媒残基の突然変異(例えばD10からA10)は、標的A残基を含有する編集鎖の切断を妨げる。このようなCas9バリエーションは、gRNAによって規定される標的配列に基づく特定の位置で単一鎖DNA切断 (ニック) を生じさせることができ、非編集鎖の修復を導き、最終的には編集鎖においてTからCへの変化をもたらす。ある態様において、AからGへの塩基エディターは、イノシン塩基除去修復の阻害因子、例えば、ウラシルグリコシラーゼ阻害因子 (UGI) ドメインまたは触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼをさらに含む。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、UGIドメインまたは触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼは、脱アミノ化されたアデノシン残基(例えばイノシン)の塩基除去修復を阻害または防止することができ、これが、塩基エディターの活性または効率を改善させることができる。
【０３４７】
アデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターは、DNA、RNAおよびDNA-RNAハイブリッドを含む任意のポリヌクレオチドに作用することができる。特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターは、RNAを含むポリヌクレオチドの標的Aを脱アミノ化することができる。例えば、塩基エディターは、RNAポリヌクレオチドおよび/またはDNA-RNAハイブリッドポリヌクレオチドの標的Aを脱アミノ化することができるアデノシンデアミナーゼドメインを含むことができる。一実施形態によると、塩基エディターに組み込まれたアデノシンデアミナーゼは、RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR、例えばADAR1またはADAR2)の全部または一部を含む。別の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたアデノシンデアミナーゼは、tRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAT)の全部または一部を含む。アデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターはまた、DNAポリヌクレオチドのA核酸塩基を脱アミノ化する能力も有し得る。一実施形態では、塩基エディターのアデノシンデアミナーゼドメインは、1以上の突然変異を含むADATの全部または一部を含み、これがDNA中の標的AをADATが脱アミノ化することを可能にする。例えば、塩基エディターは、D108N、A106V、D147Y、E155V、L84F、H123Y、I157F、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異の1以上を含む大腸菌由来のADAT (EcTadA)の全部または一部を含むことができる。
【０３４８】
アデノシンデアミナーゼは、任意の適切な生物（例えばE. coli）に由来することができる。ある態様において、アデニンデアミナーゼは、天然に存在するアデノシンデアミナーゼが本明細書に提供される突然変異のいずれかに対応する一つ以上の突然変異を含むものである(例えば、ecTadAにおける突然変異)。任意の相同タンパク質中の対応する残基は、例えば、配列アラインメントおよび相同残基の決定によって同定することができる。本明細書中に記載された突然変異のいずれか(例えば、ecTadAで同定された突然変異のいずれか)に対応する、任意の天然アデノシンデアミナーゼ(例えば、ecTadAに対して相同性を有するもの)における突然変異を、それに応じて生成することができる。
【０３４９】
［TadA］
特定の実施形態では、TadAは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるPCT/US2017/045381(国際公開第2018/027078号)に記載されているTadAのいずれかである。
【０３５０】
1つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、TadA7.10に連結された野生型TadAがCas9ニッカーゼに連結されたものを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、単一のTadA7.10ドメイン(例えば、モノマーとして提供される)を含む。他の実施形態では、ABE7.10エディターは、TadA7.10およびTadA(wt) を含み、これらはヘテロ二量体を形成することができる。関連する配列は以下のとおりである。
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTD
これは「TadA参照配列」または野生型TadA（TadA(wt)）と呼ばれる。
TadA7.10:
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
【０３５１】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかに記載のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼは、一つ以上の突然変異(例えば、本明細書に提供される突然変異のいずれか)を含み得ることが理解されるべきである。本開示は、特定のパーセント同一性を有するデアミナーゼドメインが加えて本明細書に記載される突然変異のいずれかまたはその組合せを含むものを提供する。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、参照配列または本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、当該技術分野において既知であるかまたは本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれかと比較して、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、少なくとも110個、少なくとも120個、少なくとも130個、少なくとも140個、少なくとも150個、少なくとも160個、または少なくとも170個の同一の連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０３５２】
いくつかの実施形態において、TadAデアミナーゼは、全長E.coli TadAデアミナーゼである。例えば、特定の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、以下のアミノ酸配列を含む:
MRRAFITGVFFLSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEI KAQKKAQSSTD。
【０３５３】
しかしながら、本出願において有用な追加のアデノシンデアミナーゼは当業者には明らかであり、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。例えば、アデノシンデアミナーゼは、tRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAT)のホモログであり得る。限定されるものではないが、例示的なAD AT相同体のアミノ酸配列は、以下を含む:
【０３５４】
Staphylococcus aureus TadA: 
MGSHMTNDIYFMTLAIEEAKKAAQLGEVPIGAIITKDDEVIARAHNLRETLQQPTAHAEHIAIERAAKVLGSWRLEGCTLYVTLEPCVMCAGTIVMSRIPRVVYGADDPKGGCSGS LMNLLQQSNFNHRAIVDKGVLKEACSTLLTTFFKNLRANKKSTN  
【０３５５】
Bacillus subtilis TadA: 
MTQDELYMKEAIKEAKKAEEKGEVPIGAVLVINGEIIARAHNLRETEQRSIAHAEML VIDEACKALGTWRLEGATLYVTLEPCPMCAGAVVLSRVEKVVFGAFDPKGGC S GTLMNLLQEERFNHQAEVVSGVLEEECGGMLSAFFRELRKKKKAARKNLSE  
【０３５６】
Salmonella typhimurium (S. typhimurium) TadA: 
MPPAFITGVTSLSDVELDHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNHRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVLQNYRLLDTTLYVTLEPCVMCAGAMVHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLIDVLHHPGMNHRVEIIEGVLRDECATLLSDFFRMRRQEIK ALKKADRAEGAGPAV  
【０３５７】
Shewanella putrefaciens (S. putrefaciens) TadA: 
MDEYWMQVAMQMAEKAEAAGEVPVGAVLVKDGQQIATGYNLSISQHDPT AHAEILCLRSAGKKLENYRLLDATLYITLEPCAMCAGAMVHSRIARVVYGARDEKTGAAGTVVNLLQHPAFNHQVEVTSGVLAEACSAQLSRFFKRRRDEKKALKLAQRAQQGIE 
【０３５８】
Haemophilus influenzae F3031 (H. influenzae) TadA: 
MDAAKVRSEFDEKMMRYALELADKAEALGEIPVGAVLVDDARNIIGEGWNLSIVQSDPTΑΗAEIIALRNGAKNIQNYRLLNSTLYVTLEPCTMCAGAILHSRIKRLVFG ASDYKTGAIGSRFHFFDDYKMNHTLEITSGVLAEECSQKLSTFFQKRREEKKIEKALLKSLSDK  
【０３５９】
Caulobacter crescentus (C. crescentus) TadA: 
MRTDESEDQDHRMMRLALDAARAAAEAGETPVGAVILDPSTGEVIATAGNGPIAAHDPTAHAEIAAMRAAAAKLGNYRLTDLTLVVTLEPCAMCAGAISHARIGRVVFGADD PKGGAVVHGPKFFAQPTCHWRPEVTGGVLADESADLLRGFFRARRKAKI  
【０３６０】
Geobacter sulfurreducens (G. sulfurreducens) TadA: 
MSSLKKTPIRDDAYWMGKAIREAAKAAARDEVPIGAVIVRDGAVIGRGHNLREGSNDPSAHAEMIAIRQAARRSANWRLTGATLYVTLEPCLMCMGAIILARLERVVFGCYDPKGGAAGSLYDLSADPRLNHQVRLSPGVCQEECGTMLSDFFRDLRRRKKAKATPALF IDERKVPPEP 
【０３６１】
E. Coli TadA (ecTadA)の一実施形態は以下の通りである。
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
【０３６２】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、原核生物由来である。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、細菌由来である。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、Escherichia coli、Staphylococcus aureus、Salmonella typhi、Shewanella putrefaciens、Haemophilus influenzae、Caulobacter crescentus、またはBacillus subtilisに由来する。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌由来である。
【０３６３】
1つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、TadA7.10に連結された野生型TadAがCas9ニッカーゼに連結されたものを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、単一のTadA7.10ドメイン(例えば、モノマーとして提供される)を含む。他の実施形態では、ABE7.10エディターは、TadA7.10およびTadA(wt) を含み、これらはヘテロ二量体を形成することができる。
【０３６４】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかに記載のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼは、一つ以上の突然変異(例えば、本明細書に提供される突然変異のいずれか)を含み得ることが理解されるべきである。本開示は、特定のパーセント同一性を有するデアミナーゼドメインが加えて本明細書に記載される突然変異のいずれかまたはその組合せを含むものを提供する。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、参照配列または本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、当該技術分野において既知であるかまたは本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれかと比較して、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、少なくとも110個、少なくとも120個、少なくとも130個、少なくとも140個、少なくとも150個、少なくとも160個、または少なくとも170個の同一の連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０３６５】
本明細書に提供される変異（例えば、TadA参照配列に基づく）のいずれも、TadA（ecTadA）、S.aureusTadA（saTadA）、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えば、細菌アデノシンデアミナーゼ）などの他のアデノシンデアミナーゼに導入することができることが理解されるべきである。さらなるデアミナーゼを同様に整列させて、本明細書に提供されるように変異させることができる相同なアミノ酸残基を同定することができることが、当業者には明らかであろう。かくして、TadA参照配列中で同定される任意の変異を、相同なアミノ酸残基を有する他のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ecTada）中で作成することができる。また、本明細書で提供される変異のいずれも、TadA参照配列または別のアデノシンデアミナーゼ中で個別に、または任意の組合せで作成することができることも理解されるべきである。
【０３６６】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてD108X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ(例えばecTadA)における対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、D108G、D108N、D108V、D108A、またはD108Y突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０３６７】
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列中にA106X変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ecTadA）中に対応する変異を含み、ここで、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列中にA106V変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、野生型TadAもしくはecTadA）中に対応する変異を含む。
【０３６８】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてE155X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてE155D、E155G、またはE155V突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０３６９】
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列中にD147X変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ecTadA）中に対応する変異を含み、ここで、Xの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは参照配列中にD147Y変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ecTadA）中に対応する変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてA106X、E155X、またはD147X、突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、E155D、E155G、またはE155V突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、D147Yを含む。
【０３７０】
例えば、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるD108N、A106V、E155V、および/またはD147Y突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み得る。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列における以下の突然変異群(突然変異の群は「；」によって分離されている)、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む：D108NおよびA106V；D108NおよびE155V；D108NおよびD147Y；A106VおよびE155V；A106VおよびD147Y；E155VおよびD147Y；D108N, A106V,およびE55V；D108N, A106V,およびD147Y；D108N, E55V,およびD147Y；A106V, E55V,およびD 147Y；およびD108N, A106V, E55V,およびD147Y。ただし、ここで提供される対応する突然変異の任意の組合せを、アデノシンデアミナーゼ(例えばecTadA)において作製することができることを理解されたい。
【０３７１】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、T17X、L18X、W23X、L34X、W45X、R51X、A56X、E59X、E85X、M94X、I95X、V102X、F104X、A106X、R107X、D108X、K110X、M118X、N127X、A138X、F149X、M151X、R153X、Q154X、I156X、および/またはK157X突然変異のうちの1以上、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1以上の対応する突然変異を含み、ここで、Xの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、T17S、L18E、W23L、L34S、W45L、R51H、A56E、またはA56S、E59G、E85K、またはE85G、M94L、1951、V102A、F104L、A106V、R107C、またはR107H、またはR107P、D108G、またはD108N、またはD108A、D108Y、K110I、M118K、N127S、A138V、F149Y、M151V、R153C、Q154L、I156D、および/またはK157R突然変異のうちの1つ以上、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1つ以上の対応する突然変異を含む。
【０３７２】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、D108X、および/またはN127X突然変異のうちの1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1つ以上の対応する突然変異を含み、Xは任意のアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、D108N、および/またはN127S突然変異のうちの1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1つ以上の対応する突然変異を含む。
【０３７３】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、R26X、M61X、L68X、M70X、A106X、D108X、A109X、N127X、D147X、R152X、Q154X、E155X、K161X、Q163X、および/またはT166X突然変異の1以上、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1以上の対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、R26W、M61I、L68Q、M70V、A106T、D108N、A109T、N127S、D147Y、R152C、Q154HもしくはQ154R、E155GもしくはE155VもしくはE155D、K161Q、Q163H、および/もしくはT166P突然変異の1つ以上、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1つ以上の対応する突然変異を含む。
【０３７４】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、D108X、N127X、D147X、R152X、およびQ154Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、M61X、M70X、D108X、N127X、Q154X、E155X、およびQ163Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてH8X、D108X、N127X、E155X、およびT166Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。
【０３７５】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、H8X、A106X、D108X、別のアデノシンデアミナーゼにおける突然変異（複数可）からなる群から選択される1、2、3、4、5、または6個の突然変異を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、H8X、R126X、L68X、D108X、N127X、D147X、およびE155Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異（複数可）を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてH8X、D108X、A109X、N127X、およびE155Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。
【０３７６】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてH8Y、D108N、N127S、D147Y、R152C、およびQ154Hからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてH8Y、M61I、M70V、D108N、N127S、Q154R、E155GおよびQ163Hからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたは8つの突然変異、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においててH8Y、D108N、N127S、E155V、およびT166Pからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてH8Y、A106T、D108N、N127S、E155D、およびK161Qからなる群から選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの突然変異、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてH8Y、R126W、L68Q、D108N、N127S、D147Y、およびE155Vからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つの突然変異、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてH8Y、D108N、A109T、N127S、およびE155Gからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含む。
【０３７７】
本明細書に提供される突然変異のいずれか、および任意のさらなる突然変異(例えばecTadAアミノ酸配列に基づくもの)は、任意の他のアデノシンデアミナーゼに導入することができる。本明細書に提供される突然変異のいずれも、TadA参照配列または別のアデノシンデアミナーゼにおいて、個々に、または任意の組合せで作製することができる。
【０３７８】
AからGへの核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際PCT出願第PCT/2017/045381号(国際公開第2018/027078号)およびGaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature, 551, 464-471 (2017)に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３７９】
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ecTadA）中に１つまたは複数の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列中にD108N、D108G、もしくはD108V変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ecTadA）中に対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列中にA106VおよびD108N変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ecTadA）中に対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列中にR107CおよびD108N変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ecTadA）中に対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列中にH8Y、D108N、N127S、D147Y、およびQ154H変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ecTadA）中に対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列中にH8Y、R24W、D108N、N127S、D147Y、およびE155V変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ecTadA）中に対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列中にD108N、D147Y、およびE155V変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ecTadA）中に対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列中にH8Y、D108N、およびN127S変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ecTadA）中に対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列中にA106V、D108N、D147YおよびE155V変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ecTadA）中に対応する変異を含む。
【０３８０】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、tadA参照配列に対してS2X、H8X、I49X、L84X、H123X、N127X、I156Xおよび/またはK160X突然変異の1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含み、Xの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対してS2A、H8Y、I49F、L84F、H123Y、N127S、I156Fおよび/またはK160S突然変異のうちの1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1つ以上の対応する突然変異を含む。
【０３８１】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、L84X突然変異アデノシンデアミナーゼを含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するL84F突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０３８２】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に関連するH123X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するH123Y突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０３８３】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に関連するI157X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に関連するI157F突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０３８４】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対して、L84X、A106X、D108X、H123X、D147X、E155X、およびI156Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または7つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、tadA参照配列に対してS2X、I49X、A106X、D108X、D147X、およびE155Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対してH8X、A106X、D108X、N127X、およびK160Xからなる群より選択される1、2、3、4、または5個の突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。
【０３８５】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対して、L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、およびI156Fからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または7つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対して、S2A、I49F、A106V、D108N、D147Y、およびE155Vからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの突然変異を含む。
【０３８６】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対してH8Y、A106T、D108N、N127S、およびK160Sからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異もしくは突然変異を含む。
【０３８７】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対してE 25 X、R 26 X、R 107 X、A 142 X、および/またはA 143 X突然変異のうちの1以上、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1以上の対応する突然変異を含み、Xの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA基準配列に関連するE25M, E25D, E25A, E25R, E25V, E25S, E25Y, R26G, R26N, R26Q, R26C, R26L, R26K, R107P, R07K, R107A, R107N, R107W, R107H, R107S, A142N, A142D, A142G, A143D, A143G, A143E, A143L, A143W, A143M, A143S, A143Q および/またはA143R突然変異のうちの1以上、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1以上の対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対応する本明細書に記載の突然変異のうちの1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異のうちの1つ以上を含む。
【０３８８】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に関連するE25X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対してE25M、E25D、E25A、E25R、E25V、E25S、またはE25Y突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０３８９】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に関連するR26X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対してR26G、R26N、R26Q、R26C、R26L、またはR26K突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０３９０】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するR107X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対してR107P、R07K、R107A、R107N、R107W、R107H、またはR107S突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０３９１】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するA142X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するA142N、A142D、A142G突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０３９２】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対してA143X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するA143D、A143G、A143E、A143L、A143W、A143M、A143S、A143Qおよび/またはA143Rの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０３９３】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するH36X、N37X、P48X、I49X、R51X、M70X、N72X、D77X、E134X、S146X、Q154X、K157X、および/またはK161X突然変異の1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1つ以上の対応する突然変異を含み、ここでXの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に関連するH36L、N37T、N37S、P48T、P48L、I49V、R51H、R51L、M70L、N72S、D77G、E134G、S146R、S146C、Q154H、K157N、および/またはK161T突然変異の1以上、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1以上の対応する突然変異を含む。
【０３９４】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するH36X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するH36L突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０３９５】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するN37X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するN37TまたはN37S突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０３９６】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するP48X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するP48TまたはP48L突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０３９７】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するR51X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するR51HまたはR51L突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０３９８】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するS146X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するS146RまたはS146C突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０３９９】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するK157X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するK157N突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０４００】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するP48X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するP48S、P48T、またはP48A突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０４０１】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するA142X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するA142N突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０４０２】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するW23X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するW23RまたはW23L突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０４０３】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するR152X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対するR152PまたはR52H突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
【０４０４】
一実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、突然変異H36L、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157Nを含むことができる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、tadA基準配列に関連する突然変異の以下の組合せを含み、ここで、組合せの各突然変異は「_」によって分離され、突然変異の各組合せは括弧内にある：
(A106V_D108N), 
(R107C_D108N), 
(H8Y_D108N_N127S_D147Y_Q154H), 
(H8Y_R24W_D108N_N127S_D147Y_E155V), 
(D108N_D147Y_E155V), 
(H8Y_D108N_N127S), 
(H8Y_D108N_N127S_D147Y_Q154H), 
(A106V_D108N_D147Y_E155V),
(D108Q_D147Y_E155V),
(D108M_D147Y_E155V), 
(D108L_D147Y_E155V), 
(D108K_D147Y_E155V), 
(D108I_D147Y_E155V),
(D108F_D147Y_E155V), 
(A106V_D108N_D147Y), 
(A106V_D108M_D147Y_E155V),
(E59A_A106V_D108N_D147Y_E155V), 
(E59A cat dead_A106V_D108N_D147Y_E155V), 
(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156Y), 
(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(D103A_D104N), 
(G22P_D103A_D104N), 
(G22P_D103A_D104N_S138 A), 
(D103A_D104N_S138A),
(R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),
(E25G_R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V
_I156F), (E25D_R26G_L84F_A106V_R107K_D108N_H123Y_A142N_A143G_D147Y_E155V_
I156F), 
(R26Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F), 
(E25M_R26G_L84F_A106V_R107P_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V
_I156F), 
(R26C_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F), (L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_A143L_D147Y_E155V_I156F), 
(R26G_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F), 
(E25A_R26G_L84F_A106V_R107N_D108N_H123Y_A142N_A143E_D147Y_E155V
_I156F), 
(R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),
(A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V), 
(R26G_A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V), 
(E25D_R26G_A106V_R107K_D108N_A142N_A143G_D147Y_E155V), 
(R26G_A106V_D108N_R107H_A142N_A143D_D147Y_E155V), 
(E25D_R26G_A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V), 
(A106V_R107K_D108N_A142N_D147Y_E155V), 
(A106V_D108N_A142N_A143G_D147Y_E155V), 
(A106V_D108N_A142N_A143L_D147Y_E155V), 
(H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N),
(N37T_P48T_M70L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_I49V_E155V_I156F),
(N37S_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K161T), 
(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_Q154H_E155V_I156F), 
(N72S_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F), 
(H36L_P48L_L84F_A106V_D108N_H123Y_E134G_D147Y_E155V_I156F), 
(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K157N), (H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F), 
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F_K161T), 
(N37S_R51H_D77G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K157N), 
(D24G_Q71R_L84F_H96L_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K160E),
(H36L_G67V_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146T_D147Y_E155V_I156F), 
(Q71L_L84F_A106V_D108N_H123Y_L137M_A143E_D147Y_E155V_I156F), 
(E25G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_Q159L), 
(L84F_A91T_F104I_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(N72D_L84F_A106V_D108N_H123Y_G125A_D147Y_E155V_I156F), 
(P48S_L84F_S97C_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(W23G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(D24G_P48L_Q71R_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_Q159L),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F), 
(H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F
_K157N), (N37S_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F_K161T),
(L84F_A106V_D108N_D147Y_E155V_I156F), 
(R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K161T),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K161T), 
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K160E_K161T),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K160E), 
(R74Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(R74A_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(R74Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(L84F_R98Q_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(L84F_A106V_D108N_H123Y_R129Q_D147Y_E155V_I156F), 
(P48S_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F), 
(P48S_A142N),
(P48T_I49V_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F_L157N),
(P48T_I49V_A142N), 
(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N), 
(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_A142N_D147Y_E155V_I156F (H36L_P48T_I49V_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N), 
(H36L_P48T_I49V_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_ I156F _K157N), 
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N), 
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N), 
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_A142N_D147Y_E155V_I156F _K157N), 
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N), 
(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N), 
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F _K161T), 
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152H_E155V_I156F _K157N), 
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F _K157N), 
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V _I156F _K157N), 
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_E155V
_I156F _K157N), 
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_R152P _E155V_I156F_K157N), 
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F _K161T), 
(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V _I156F _K157N), 
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_R152P_E155V
_I156F _K157N).
【０４０５】
特定の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、融合タンパク質の塩基編集活性を改善する1つ以上の特徴を含む。例えば、本明細書に提供される融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が低下したCas9ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有さないCas9ドメイン (dCas9) 、またはCas9ニッカーゼ (nCas9) と呼ばれる、二本鎖DNA分子の1鎖を切断するCas9ドメインを有し得る。
【０４０６】
［シチジンデアミナーゼ］
1つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、シチジンデアミナーゼを含む。ある態様において、本明細書において提供されるシチジンデアミナーゼは、シトシンまたは5-メチルシトシンを脱アミノ化してウラシルまたはチミンにすることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるシトシンデアミナーゼは、DNA中のシトシンを脱アミノ化することができる。シチジンデアミナーゼは、任意の適切な生物に由来することができる。いくつかの実施形態において、シチジンデアミナーゼは、天然に存在するシチジンデアミナーゼが本明細書に提供される突然変異のいずれかに対応する1つ以上の突然変異を含むところのものである。当業者は、例えば、配列アラインメントおよび相同的残基の決定によって、任意の相同的タンパク質中の対応する残基を同定することができる。従って、当業者は、本明細書に記載された突然変異のいずれかに対応する突然変異を、任意の天然に存在するシチジンデアミナーゼにおいて生じさせることができる。ある態様において、シチジンデアミナーゼは、原核生物由来である。ある態様において、シチジンデアミナーゼは、細菌由来である。ある態様において、シチジンデアミナーゼは、哺乳動物(例えば、ヒト)由来である。
【０４０７】
いくつかの実施形態において、シチジンデアミナーゼは、本明細書に記載されるシチジンデアミナーゼアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。本明細書において提供されるシチジンデアミナーゼは、一つ以上の突然変異(例えば、本明細書に提供される突然変異のいずれか)を含み得ることを理解されたい。本開示は、特定のパーセント同一性を有する任意のデアミナーゼドメインに、本明細書に記載される突然変異またはその組合せのいずれかが加えられたものを提供する。いくつかの実施形態において、シチジンデアミナーゼは、参照配列または本明細書に提供されるいずれかのシチジンデアミナーゼと比較して、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50個またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、シチジンデアミナーゼは、当技術分野において既知であるかまたは本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれかと比較して、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、または少なくとも170個の同一の連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０４０８】
本発明の融合タンパク質は、核酸編集ドメインを含む。ある態様において、核酸編集ドメインは、CからUへの塩基変化を触媒することができる。ある態様において、核酸編集ドメインは、デアミナーゼドメインである。ある態様において、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、アポリポタンパク質B mRNA編集複合体 (APOBEC) ファミリーデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEClデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC 2デアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3デアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Aデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Bデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Cデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Dデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Eデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Fデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Gデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Hデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC4デアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ (AID) である。ある態様において、デアミナーゼは、脊椎動物デアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、無脊椎動物デアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、ヒトデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、ラットデアミナーゼ、例えば、rAPOBEClである。ある態様において、デアミナーゼは、Petromyzon marinusシチジンデアミナーゼ1 (pmCDAl) である。ある態様において、デアミナーゼは、ヒトAPOBEC3Gである。ある態様において、デアミナーゼは、ヒトAPOBEC3Gの断片である。ある態様において、デアミナーゼは、D316R D317R突然変異を含むヒトAPOBEC3Gバリアントである。ある態様において、デアミナーゼは、ヒトAPOBEC3Gの断片であり、D316R D317R突然変異に対応する突然変異を含む。ある態様において、核酸編集ドメインは、本明細書に記載される任意のデアミナーゼのデアミナーゼドメインに対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%) 、または少なくとも99.5%の同一性である。
【０４０９】
［排他性が低減されたCas9ドメイン］
典型的には、S. pyogenes由来のCas9 (spCas9) などのCas9タンパク質は、特定の核酸領域に結合するために標準的なNGG PAM配列を必要とし、ここで「NGG」の「N」はアデノシン (A) 、チミジン (T) またはシトシン (C) であり、Gはグアノシンである。これは、ゲノム内の所望の塩基を編集する能力を制限し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基編集融合タンパク質は、正確な位置、例えばPAMの上流にある標的塩基を含む領域に配置することが必要になり得る。例えばKomor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016)参照（これらの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。従って、いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかは、標準的（例えばNGG）PAM配列を含まないヌクレオチド配列に結合することができるCas9ドメインを含み得る。非標準的PAM配列に結合するCas9ドメインは本技術分野において記述されており当業者には明らかであろう。例えば、非標準PAM配列に結合するCas9ドメインは、Kleinstiver, B. P., et al., “Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities” Nature 523, 481-485 (2015); および Kleinstiver, B. P., et al., “Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition” Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015); Nishimasu, H., et al., “Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space” Science. 2018 Sep 21;361(6408):1259-1262, Chatterjee, P., et al., Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog” Sci Adv. 2018 Oct 24;4(10):eaau0766. doi: 10.1126/sciadv.aau0766に記述されており、それぞれの全内容を参照によりここに組み込む。下記表１に、いくつかのPAMバリアントを示す。PAMバリアントのいくつかの非限定的な例が下記表１に記載されている。
表１．Cas9タンパク質および対応するPAM配列
【表１】
2021523738.tif 000031
【０４１０】
［ガイドRNAを伴うCas9複合体］
本開示のいくつかの態様は、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれか、およびガイドRNA (例えばSERPINA1を標的とするガイド)を含む複合体を提供する。ある態様において、ガイド核酸(例えばガイドRNA)は、15〜100ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的である少なくとも10個の連続するヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドRNAは、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、ガイドRNAは、標的配列に相補的な15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40個の連続したヌクレオチドの配列を含む。ある態様において、標的配列はDNA配列である。ある態様において、標的配列は、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物または動物のゲノムにおける配列である。ある態様において、標的配列は、ヒトのゲノムにおける配列である。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、標準PAM配列 (NGG) にすぐ隣接している。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、非標準PAM配列(例えば、表１に列挙されている配列又は5’-NAA-3’)にすぐ隣接している。ある態様において、ガイド核酸(例えばガイドRNA)は、目的の遺伝子（例えばSERPINA1）における配列に相補的である。
【０４１１】
本開示のいくつかの態様は、本明細書に提供される融合タンパク質または複合体を使用する方法を提供する。例えば、本開示のいくつかの局面は、DNA分子を、本明細書中に提供される融合タンパク質のいずれか、および少なくとも一つのガイドRNAと接触させることを含む方法を提供し、ここで、ガイドRNAは、約15〜100ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的である少なくとも10個の連続したヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、AGC、GAG、TTT、GTG、またはCAA配列にすぐ隣接している。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、NGA、NGCG、NGN、NNGRRT、NNNRRT、NGCG、NGCN、NGTN、NGTN、NGTN、または5’ (TTTV) 配列にすぐ隣接している。
【０４１２】
それぞれの配列における特定の位置または残基の番号付けは、使用される特定のタンパク質および番号付けスキームに依存することが理解されるであろう。たとえば、成熟タンパク質の前駆体と成熟タンパク質そのものとでは番号付けが異なることがあり、種ごとの配列の違いが番号付けに影響することがある。当業者は、当業者に周知の方法、例えば、配列アラインメントおよび相同的残基の決定によって、任意の相同的タンパク質およびそれぞれのコード核酸中のそれぞれの残基を同定することができる。
【０４１３】
本明細書に開示された融合タンパク質のいずれかを標的部位、例えば、編集される突然変異を含む部位にターゲティングするためには、融合タンパク質をガイドRNAと共に共発現させることが典型的に必要であることは当業者には明らかであろう。本明細書の他の箇所でより詳細に説明されるように、ガイドRNAは、典型的には、Cas9結合を可能にするtracrRNAフレームワークと、Cas9:核酸編集酵素/ドメイン融合タンパク質に配列特異性を付与するガイド配列とを含む。あるいは、ガイドRNAおよびtracrRNAは、2つの核酸分子として別々に提供され得る。いくつかの態様において、ガイドRNAは、ガイド配列が標的配列に相補的な配列を含むという構造を含む。ガイド配列は典型的には20ヌクレオチド長である。Cas9:核酸編集酵素/ドメイン融合タンパク質を特定のゲノム標的部位にターゲティングするための適切なガイドRNAの配列は、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。そのような適切なガイドRNA配列は、典型的には、編集される標的ヌクレオチドの50ヌクレオチド以内の上流または下流内の核酸配列に相補的なガイド配列を含む。提供された融合タンパク質のいずれかを特定の標的配列に標的化するのに適したいくつかの例示的なガイドRNA配列が本明細書に提供される。
【０４１４】
［追加的ドメイン］
本明細書に記載される塩基エディターは、ポリヌクレオチドの核酸塩基の編集、修飾、または改変を促進させるのを助ける任意のドメインを含むことができる。ある態様において、塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメイン(例えばCas9)、核酸塩基編集ドメイン(例えばデアミナーゼドメイン)、および一つ以上のさらなるドメインを含む。場合によっては、追加のドメインは、塩基エディターの酵素的または触媒的機能、塩基エディターの結合機能を促進することができ、または所望の塩基編集結果に干渉し得る細胞機構(例えば酵素)の阻害因子であり得る。ある態様において、塩基エディターは、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、デアミナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、転写アクチベーター、または転写リプレッサードメインを含むことができる。
【０４１５】
ある態様において、塩基エディターは、ウラシルグリコシラーゼ阻害因子 (UGI) ドメインを含むことができる。UGIドメインは、例えば、Cの脱アミノ化によって形成されるUがC核酸塩基に再変換されることを阻害することによって、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターの効率を改善することができる。ある場合には、U:Gヘテロ二本鎖DNAの存在に対する細胞DNA修復応答が、細胞における核酸塩基編集効率の低下の原因となりうる。ある場合には、ウラシルDNAグリコシラーゼ (UDG)が、細胞内のDNAからのUの除去を触媒し得、それが塩基除去修復 (BER) を開始し得、大部分がU:G対からC:G対への復帰をもたらす。このような場合、一本鎖に結合する、編集された塩基をブロックする、UGIを阻害する、BERを阻害する、編集された塩基を保護する、および/または編集されていない鎖の修復を促進する、1以上のドメインを含む塩基エディターにおいてBERは阻害され得る。したがって、本開示は、UGIドメインを含む塩基編集融合タンパク質を企図する。
【０４１６】
ある態様において、塩基エディターは、二本鎖切断 (DSB) 結合タンパク質の全部または一部をドメインとして含む。例えば、DSB結合タンパク質は、バクテリオファージMuのGamタンパク質を含み得、これはDSBの末端に結合してそれらを分解から保護することができる。Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)を参照されたい（その全内容が参照により本明細書に組み入れられる）。
【０４１７】
ある態様において、塩基エディターは、核酸ポリメラーゼ (NAP) の全てまたは一部をドメインとして含むことができる。例えば、塩基エディターは、真核生物NAPの全部または一部を含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれるNAPまたはその一部は、DNAポリメラーゼである。ある態様において、塩基エディターに組み込まれるNAPまたはその一部は、損傷乗り越えポリメラーゼ活性を有する。場合によっては、塩基エディターに組み込まれるNAPまたはその一部は損傷乗り越えDNAポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれるNAPまたはその一部は、Rev7、Rev1複合体、ポリメラーゼイオタ、ポリメラーゼカッパ、またはポリメラーゼイタである。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれるNAPまたはその一部は、真核生物ポリメラーゼα、β、γ、δ、ε、γ、η、iota、κ、λ、mu、またはnu成分である。ある態様において、塩基エディターに組み込まれるNAPまたはその一部は、核酸ポリメラーゼ(例えば損傷乗り越えDNAポリメラーゼ)に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。
【０４１８】
［塩基エディターシステム］
本明細書で提供される塩基エディターシステムは、 (a) 対象のポリヌクレオチド(例えば、二本鎖DNAまたはRNA、一本鎖DNAまたはRNA)の標的ヌクレオチド配列を、核酸塩基エディタ(例えば、アデノシン塩基エディターまたはシチジン塩基エディター)およびガイドポリ核酸(例えばgRNA)を含む塩基エディターシステムと接触させる工程であって、標的ヌクレオチド配列は標的核酸塩基対を含む、工程と；(b) 標的領域の鎖分離を誘導する工程と；(c) 標的領域の一本鎖における標的核酸塩基対の第1の核酸塩基を第2の核酸塩基に変換する工程と；(d) 標的領域の鎖を2本以上は切断することなく、第1の核酸塩基に相補的な第3の核酸塩基が、第2の核酸塩基に相補的な第4の核酸塩基に置換される工程とを含む。一部の実施形態では、ステップ (b) は省略されることを理解されたい。ある態様において、標的核酸塩基対は、1以上の遺伝子における複数の核酸塩基対である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基エディターシステムは、1以上の遺伝子における複数の核酸塩基対の多重編集を可能にする。ある態様において、複数の核酸塩基対は、同一遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態において、複数の核酸塩基対は、1またはそれより多い遺伝子に位置し、ここで、少なくとも1つの遺伝子は、異なる遺伝子座に位置する。
【０４１９】
いくつかの実施形態において、切断された一本鎖(ニック鎖)は、ガイド核酸にハイブリダイズされる。いくつかの実施態様において、切断された一本鎖は、第一の核酸塩基を含む鎖と反対である。一部の実施形態では、塩基エディターはCas9ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第1の塩基はアデニンであり、第2の塩基はG、C、AまたはTではない。いくつかの実施形態において、第2の塩基はイノシンである。
【０４２０】
本明細書に提供される塩基編集システムは、触媒的に欠陥のあるStreptococcus pyogenes Cas9と、シチジンデアミナーゼと、塩基除去修復の阻害因子とを含む融合タンパク質を用いて、二本鎖DNA切断を生じることなく、ドナーDNA鋳型を必要とせず、かつ過剰な確率的挿入および欠失を誘導することなく、DNAにおけるプログラム可能な一塩基(C→TまたはA→G)変化を誘導する、ゲノム編集の新規なアプローチを提供する。
【０４２１】
本明細書では、塩基エディター系を用いて核酸塩基を編集するためのシステム、組成物、および方法を提供する。いくつかの実施形態において、塩基エディターシステムは、 (1) 核酸塩基を編集するための、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインおよび核酸塩基編集ドメイン(例えばデアミナーゼドメイン)を含む塩基エディター (BE) と、(2) ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインに付随するガイドポリヌクレオチド(例えばガイドRNA)とを含む。ある態様において、塩基エディターシステムは、シトシン塩基エディター (CBE) を含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターシステムは、アデノシン塩基エディター (ABE) を含む。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインである。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラム可能なRNA結合ドメインである。ある態様において、核酸塩基編集ドメインは、デアミナーゼドメインである。場合によっては、デアミナーゼドメインは、シトシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼであり得る。いくつかの実施形態では「シトシンデアミナーゼ」および「シチジンデアミナーゼ」という用語は交換可能に使用され得る。場合によっては、デアミナーゼドメインは、アデニンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼであり得る。いくつかの実施形態では「アデニンデアミナーゼ」および「アデノシンデアミナーゼ」という用語は交換可能に使用され得る。核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際PCT出願番号PCT/2017/045381 (WO2018/027078) およびPCT/US2016/058344 (WO2017/070632) に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature  551, 464-471 (2017); および Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)も参照のこと（その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【０４２２】
一部の実施形態では、核酸塩基エディターシステムは、複数の塩基編集コンポーネントを含むことができる。例えば、核酸塩基エディターシステムは、複数のデアミナーゼを含むことができる。ある態様において、ヌクレアーゼ塩基編集システムは、1以上のシチジンデアミナーゼおよび/または1以上のアデノシンデアミナーゼを含み得る。いくつかの実施形態において、単一のガイドポリヌクレオチドを利用して、異なるデアミナーゼを標的核酸配列にターゲティングすることができる。ある態様において、一対のガイドポリヌクレオチドが、異なるデアミナーゼを標的核酸配列にターゲティングするために利用され得る。
【０４２３】
塩基エディター系の核酸塩基成分およびポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合成分は、互いに共有結合的または非共有結合的により結合され得る。例えば、いくつかの実施形態において、デアミナーゼドメインが、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインによって標的ヌクレオチド配列にターゲティングされ得る。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインに融合または連結され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインと非共有結合的に相互作用または結合することによって、デアミナーゼドメインを標的ヌクレオチド配列にターゲティングすることができる。例えば、いくつかの実施形態において、核酸塩基編集成分、例えばデアミナーゼ成分は、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインの一部をなすさらなる異種部分またはドメインと相互作用し、会合し、または複合体を形成することができる、さらなる異種部分またはドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリペプチドと結合し、相互作用し、会合し、または複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドと結合し、相互作用し、会合し、または複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合することができる。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであってもよい。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、K相同 (KH) ドメイン、MS2コートタンパク質ドメイン、PP7コートタンパク質ドメイン、SfMu Comコートタンパク質ドメイン、ステリルαモチーフ、テロメラーゼKu結合モチーフおよびKuタンパク質、テロメラーゼSm7結合モチーフおよびSm7タンパク質、またはRNA認識モチーフであり得る。
【０４２４】
塩基編集システムは、ガイドポリヌクレオチド成分をさらに含むことができる。塩基編集システムの構成要素は、共有結合、非共有結合的相互作用、またはそれらの結合および相互作用の任意の組合せを介して互いに結合され得ることが理解されるべきである。ある態様において、デアミナーゼドメインは、ガイドポリヌクレオチドによって標的ヌクレオチド配列にターゲティングされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、塩基エディター系の核酸塩基編集成分、例えばデアミナーゼ成分は、ガイドポリヌクレオチドの一部またはセグメント(例えばポリヌクレオチドモチーフ) と相互作用し、結合し、または複合体を形成し得るさらなる異種部分またはドメイン(例えばRNAまたはDNA結合タンパク質のようなポリヌクレオチド結合ドメイン)を含み得る。いくつかの実施形態において、追加の異種部分またはドメイン(例えばRNAまたはDNA結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン)は、デアミナーゼドメインに融合または連結され得る。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリペプチドと結合し、相互作用し、会合し、またはポリペプチドと複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドと結合し、相互作用し、会合し、またはポリヌクレオチドと複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合することができる。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであってもよい。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、K相同 (KH) ドメイン、MS2コートタンパク質ドメイン、PP7コートタンパク質ドメイン、SfMu Comコートタンパク質ドメイン、無菌アルファモチーフ、テロメラーゼKu結合モチーフおよびKuタンパク質、テロメラーゼSm7結合モチーフおよびSm7タンパク質、またはRNA認識モチーフであり得る。
【０４２５】
ある態様において、塩基編集システムは、塩基除去修復 (BER) コンポーネントの阻害因子をさらに含むことができる。塩基編集システムの構成要素は、共有結合、非共有結合的相互作用、またはそれらの結合および相互作用の任意の組み合わせを介して互いに結合され得ることが理解されるべきである。BER成分の阻害因子は、塩基除去修復阻害因子を含み得る。ある態様において、塩基除去修復の阻害因子は、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害因子 (UGI) であり得る。ある態様において、塩基除去修復の阻害因子は、イノシン塩基除去修復阻害因子であり得る。ある態様において、塩基除去修復の阻害因子は、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインにより標的ヌクレオチド配列にターゲティングされ得る。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、塩基除去修復の阻害因子に融合または連結され得る。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインおよび塩基除去修復の阻害因子に融合または連結され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、塩基除去修復の阻害因子と非共有結合的に相互作用するか、または塩基除去修復の阻害因子と会合することによって、塩基除去修復の阻害因子を標的ヌクレオチド配列へとターゲティングすることができる。例えば、いくつかの実施形態において、塩基除去修復成分の阻害因子は、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインの一部であるさらなる異種部分またはドメインと相互作用、会合、または複合体形成し得るさらなる異種部分またはドメインを含み得る。ある態様において、塩基除去修復の阻害因子は、ガイドポリヌクレオチドにより標的ヌクレオチド配列にターゲティングされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、塩基除去修復の阻害因子は、ガイドポリヌクレオチドの一部またはセグメント(例えば、ポリヌクレオチドモチーフ)と相互作用、会合、または複合体形成し得るさらなる異種部分またはドメイン(例えば、RNAまたはDNA結合タンパク質のようなポリヌクレオチド結合ドメイン)を含み得る。いくつかの実施形態において、ガイドポリヌクレオチドのさらなる異種部分またはドメイン(例えば、RNAまたはDNA結合タンパク質のようなポリヌクレオチド結合ドメイン)は、塩基除去修復の阻害因子に融合または連結され得る。
【０４２６】
いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドと結合、相互作用、会合、または複合体形成することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合することができる。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであってもよい。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、K相同 (KH) ドメイン、MS2コートタンパク質ドメイン、PP7コートタンパク質ドメイン、SfMu Comコートタンパク質ドメイン、無菌アルファモチーフ、テロメラーゼKu結合モチーフおよびKuタンパク質、テロメラーゼSm7結合モチーフおよびSm7タンパク質、またはRNA認識モチーフであり得る。
【０４２７】
ある態様において、塩基エディターは、編集された鎖の塩基除去修復を阻害する。いくつかの実施形態において、塩基エディターは、編集されていない鎖を保護または結合する。一部の実施形態では、塩基エディターはUGI活性を含む。ある態様において、塩基エディターは、触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターはニッカーゼ活性を含む。ある態様において、塩基対の意図された編集は、PAM部位の上流にある。ある態様において、塩基対の意図された編集は、PAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド上流にある。いくつかの実施形態において、塩基対の意図された編集は、PAM部位の下流にある。ある態様において、意図される編集された塩基対は、PAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド下流にある。
【０４２８】
いくつかの実施形態では、本方法は、標準(例えばNGG) PAMサイトを必要としない。いくつかの実施態様において、核酸塩基エディターは、リンカー又はスペーサーを含む。ある態様において、リンカーまたはスペーサーは、長さが1〜25アミノ酸である。ある態様において、リンカーまたはスペーサーは、長さが5〜20アミノ酸である。ある態様において、リンカーまたはスペーサーは、長さが10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸である。
【０４２９】
一部の実施形態では、標的領域は標的ウィンドウを含み、標的ウィンドウは標的核酸塩基対を含む。ある態様において、標的ウィンドウは、1〜10ヌクレオチドを含む。ある態様において、標的ウィンドウは、長さが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、塩基対の意図された編集は、標的ウィンドウ内にある。いくつかの実施態様において、標的ウィンドウは、塩基対の意図された編集を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかを用いて実施される。いくつかの実施態様において、標的ウィンドウは、脱アミノ化ウィンドウである。
【０４３０】
いくつかの実施形態では、塩基エディターはシチジン塩基エディター (CBE) である。いくつかの実施形態において、非限定的な例示的CBEは、BE1 (APOBEC1-XTEN-dCas9) 、BE2 (APOBEC1-XTEN-dCas9-UGI) 、BE3 (APOBEC1-XTEN-dCas9(A840H)-UGI) 、BE3-Gam、saBE3、saBE4-Gam、BE4、BE4-Gam、saBE4、またはsaB4E-Gamである。BE4はAPOBEC1‐Cas9n(D10A)リンカーを32アミノ酸まで、Cas9n‐UGIリンカーを9アミノ酸まで拡張し、単一塩基エディター構築物のC末端に別の9アミノ酸リンカーと共にUGIの第二コピーを付加する。塩基性エディタsaBE3およびsaBE4では、S. pyogene Cas9n(D10A) をより小さいS. aureus Cas9n(D10A) で置き換えた。BE3-Gam、saBE3-Gam、BE4-Gam、およびsaBE4-Gamは、174残基のGamタンパク質が、16アミノ酸のXTENリンカーを介してBE3、saBE3、BE4、およびsaBE4のN末端に融合されたものを有する。
【０４３１】
一部の実施形態では、塩基エディターはアデノシン塩基エディター (ABE) である。ある態様において、アデノシン塩基エディターは、DNA中のアデニンを脱アミノ化することができる。ある態様において、ABEは、BE3のAPOBEC1成分を、天然または操作された大腸菌TadA、ヒトADAR2、マウスADA、またはヒトADAT2で置換することによって生成される。いくつかの実施形態において、ABEは、進化されたTadAバリアントを含む。いくつかの実施態様では、ABEはABE 1.2 (TadA*-XTEN-nCas9-NLS) である。ある態様において、TadA*はA106VおよびD108N突然変異を含む。
【０４３２】
ある態様において、ABEは第二世代ABEである。ある態様において、ABEはABE 2.1であり、これは、TadA* (TadA*2.1) において追加の突然変異D147YおよびE155Vを含むものである。いくつかの実施形態において、ABEはABE 2.2であり、これはABE 2.1が触媒的に不活性化されたバージョンのヒトアルキルアデニンDNAグリコシラーゼ(E125Q変異を伴うAAG)に融合されたものである。いくつかの実施形態において、ABEはABE 2.3であり、こではABE 2.1が触媒的に不活性化された大腸菌Endo V (D35A変異で不活化される)に融合されたものである。いくつかの態様において、ABEはABE 2.6であり、これはABE 2.1におけるリンカーの二倍の長さ(32アミノ酸、(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2)のリンカーを有する。いくつかの実施態様において、ABEはABE 2.7であり、これはABE 2.1が追加の野生型TadAモノマーと連結されたものである。いくつかの実施態様では、ABEはABE 2.8であり、これはABE 2.1が追加のTadA*2.1モノマーでつながれたものである。いくつかの実施形態において、ABEはABE 2.9であり、これは進化されたTadA (TadA*2.1) とABE 2.1のN末端との直接融合体である。いくつかの実施形態において、ABEはABE 2.10であり、これは野生型TadAとABE 2.1のN末端との直接融合体である。いくつかの実施形態において、ABEはABE 2.11であり、これは、TadA*モノマーのN末端において不活性化E59A突然変異を有するABE 2.9である。いくつかの実施形態において、ABEはABE 2.12であり、これは、内部TadA*モノマーにおいて不活性化E59A突然変異を有するABE 2.9である。
【０４３３】
ある態様において、ABEは、第三世代ABEである。ある態様において、ABEはABE 3.1であり、これは、三つのさらなるTadA突然変異(L84F、H123Y、およびI157F)を伴うABE 2.3である。
【０４３４】
いくつかの実施形態において、ABEは第四世代ABEである。いくつかの実施形態において、ABEはABE4.3であり、これはさらなるTadA突然変異A142N (TadA*4.3) を伴うABE 3.1である。
【０４３５】
いくつかの実施形態において、ABEは第五世代ABEである。いくつかの実施形態において、ABEはABE 5.1であり、これは生存クローンからの突然変異のコンセンサスセット(H36L、R51L、S146C、およびK157N) をABE 3.1に輸入することによって生成される。いくつかの実施形態において、ABEはABE 5.3であり、これは内部の進化されたTadA*に融合された野生型大腸菌TadAを含むヘテロ二量体構築物を有する。ある態様において、ABEは、以下の表2に示されるように、ABE 5.2、ABE 5.4、ABE 5.5、ABE 5.6、ABE 5.7、ABE 5.8、ABE 5.9、ABE 5.10、ABE 5.11、ABE 5.12、ABE 5.13、またはABE 5.14である。一部の実施形態では、ABEは第6世代ABEである。一部の実施形態では、ABEは、以下の表2に示されるように、ABE 6.1、ABE 6.2、ABE 6.3、ABE 6.4、ABE 6.5、またはABE 6.6である。いくつかの実施形態において、ABEは、第七世代ABEである。いくつかの実施形態において、ABEは、以下の表2に示されるように、ABE7.1、ABE7.2、ABE7.3、ABE7.4、ABE7.5、ABE7.6、ABE7.7、ABE7.8、ABE7.9、またはABE7.10である。
表２：ABEの遺伝子型
【表２】
2021523738.tif 000032
2021523738.tif 000033
2021523738.tif 000034
【０４３６】
ある態様において、塩基エディターは、核酸塩基編集ドメイン(例えばデアミナーゼドメインの全部または一部) に融合されたポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメイン(例えばCas9由来ドメイン)を含む融合タンパク質である。ある態様において、塩基エディターは、ウラシルグリコシラーゼ阻害因子 (UGI) の全部または一部を含むドメインをさらに含む。ある態様において、塩基エディターは、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)などの、ウラシル結合タンパク質(UBP)の全部または一部を含むドメインを含む。ある態様において、塩基エディターは、核酸ポリメラーゼの全てまたは一部を含むドメインを含む。ある態様において、塩基エディターに組み込まれる核酸ポリメラーゼまたはその一部は、損傷乗り越えDNAポリメラーゼである。
【０４３７】
いくつかの実施形態では、塩基エディターのドメインは、複数のドメインを含むことができる。例えば、Cas9に由来するポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディターは、野生型または天然のCas9のRECローブおよびNUCローブに対応するRECローブおよびNUCローブを含むことができる。別の例では、塩基エディターは、RuvCIドメイン、BHドメイン、REC1ドメイン、REC2ドメイン、RuvCIIドメイン、L1ドメイン、HNHドメイン、L2ドメイン、RuvCIIIドメイン、WEDドメイン、TOPOドメインまたはCTDドメインのうちの1つ以上を含むことができる。ある態様において、塩基エディターの一つ以上のドメインは、そのドメインを含むポリペプチドの野生型バージョンに対する突然変異(例えば置換、挿入、削除)を含む。例えば、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインのHNHドメインは、H840A置換を含むことができる。別の例では、ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインのRuvCIドメインは、D10A置換を含むことができる。
【０４３８】
本明細書に開示される塩基エディターの異なるドメイン(例えば隣接ドメイン)は、一つ以上のリンカードメイン(例えばXTENリンカードメイン)を使用して、または使用せずに、互いに接続することができる。場合によっては、リンカードメインは、二つの分子もしくは部分（例えば、第一のドメイン(例えばCas9由来ドメイン)および第二のドメイン(例えばシチジンデアミナーゼドメインまたはアデノシンデアミナーゼドメイン)のような融合タンパク質の二つのドメイン）をつなげる結合(例えば共有結合)、化学基、または分子であり得る。ある態様において、リンカーは、共有結合(例えば炭素-炭素結合、ジスルフィド結合、炭素-ヘテロ原子結合など。)である。ある態様において、リンカーは、アミド結合における炭素窒素結合である。特定の実施形態では、リンカーは、環状もしくは非環状、置換もしくは非置換、分枝もしくは非分枝の脂肪族もしくはヘテロ脂肪族リンカーである。ある態様において、リンカーは、ポリマー(例えばポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど)である。特定の実施態様では、リンカーは、アミノアルカン酸のモノマー、ダイマー又はポリマーを含む。ある態様において、リンカーは、アミノアルカン酸(例えばグリシン、エタン酸、アラニン、β-アラニン、3-アミノプロパン酸、4-アミノブタン酸、5-ペンタン酸等)を含む。いくつかの実施態様において、リンカーは、アミノヘキサン酸 (Ahx) のモノマー、ダイマー又はポリマーを含む。ある態様において、リンカーは炭素環部分(例えばシクロペンタン、シクロヘキサン)に基づく。他の態様において、リンカーはポリエチレングリコール部分 (PEG) を含む。ある態様において、リンカーは、アリールまたはヘテロアリール部分を含む。ある態様において、リンカーは、フェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核剤(例えばチオール、アミノ)の結合を促進させる官能化部分を含むことができる。リンカーの一部として任意の求電子剤を使用することができる。例示的な求電子剤としては、活性化エステル、活性化アミド、マイケル受容体、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアナートが挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、リンカーは、Cas9ヌクレアーゼドメインを含むRNAプログラム可能ヌクレアーゼのgRNA結合ドメインと、核酸編集タンパク質の触媒ドメインとを結合する。ある態様において、リンカーは、dCas9と第二のドメイン(例、シチジンデアミナーゼ、UGI等)とを連結する。
【０４３９】
典型的には、リンカーは、2つの基、分子、または他の部分の間に配置されるか、または2つの基、分子、または他の部分によって隣接され、共有結合を介してそれぞれに連結され、したがって2つを連結する。ある態様において、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸(例えばペプチドまたはタンパク質)である。ある態様において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。ある態様において、リンカーは、長さが2〜100アミノ酸であり、例えば、長さが2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30〜35、35〜40、40〜45、45〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜150〜200アミノ酸である。ある態様において、リンカーは、長さが約3〜約104 (例えば5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100)アミノ酸である。より長いまたはより短いリンカーも考えられる。ある態様において、リンカードメインは、XTENリンカーとも呼ばれ得るアミノ酸配列SGSETPGTSESATPESを含む。融合タンパク質ドメインを連結するための任意の方法を用いて (例えば、(SGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n、および(G)nの形態の非常に柔軟なリンカーから、(EAAAK)n、 (GGS)n、SGSETPGTSESATPESの形態のより剛性の高いリンカーまで(例えばGuilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82参照。その全内容は参照によりここに組み込まれる)、もしくは (XP)nモチーフ、またはこれらの任意の組合せ)、核酸塩基エディターの活性のための最適な長さを達成することができ、ここでnは独立に1〜30の整数であり、Xは任意のアミノ酸である。いくつかの実施態様において、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15である。ある態様において、リンカーは、(GGS)nモチーフを含み、ここで、nは、1、3、または7である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のCas9ドメインは、アミノ酸配列SGSETPGTSESATPESを含むリンカーを介して融合される。いくつかの実施形態において、リンカーは、複数のプロリン残基を含み長さが5〜21、5〜14、5〜9、5〜7アミノ酸であり、例えば、PAPAP、PAPAPA、PAPAPAP、PAPAPAPA、P(AP)4、P(AP)7、P(AP)10である(例えば、Tan J, Zhang F, Karcher D, Bock R. Engineering of high-precision base editors for site-specific single nucleotide replacement. Nat Commun. 2019 Jan 25;10(1):439を参照；その全内容は参照によりここに組み込まれる)。このようなプロリンに富むリンカーはまた、「硬質」リンカーとも呼ばれる。
【０４４０】
本明細書に開示される塩基エディターのドメインは、任意の順序で配置することができる。例えばポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインおよびデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質を含む塩基エディターの非限定的な例は、以下のように配置され得る。
NH2-[核酸塩基編集ドメイン]-リンカー1-[例えば Cas9 由来ドメイン]-COOH;
NH2-[例えば シチジンデアミナーゼ]-リンカー1-[例えば Cas9 由来ドメイン]-COOH;
NH2-[例えば シチジンデアミナーゼ]-リンカー1-[例えば Cas9 由来ドメイン]-リンカー2-[UGI]-COOH;
NH2-[例えば APOBEC]-リンカー1-[例えば Cas9 由来ドメイン]-COOH;
NH2-[例えば シチジンデアミナーゼ]-リンカー1-[例えば Cas9 由来ドメイン]-COOH;
NH2-[例えば APOBEC]-リンカー1-[例えば Cas9 由来ドメイン]-COOH; 
NH2-[例えば APOBEC]-リンカー1-[例えば Cas9 由来ドメイン]-リンカー2-[UGI]-COOH
NH2-[例えば アデノシンデアミナーゼ]-[例えば Cas9 由来ドメイン]-COOH; 
NH2-[例えば Cas9 由来ドメイン]-[例えば アデノシンデアミナーゼ]-COOH;
NH2-[例えば アデノシンデアミナーゼ]-[例えば Cas9 由来ドメイン]-[イノシンBER阻害因子]-COOH;
NH2-[例えば アデノシンデアミナーゼ]-[ イノシンBER阻害因子]-[例えば Cas9 由来ドメイン]-COOH;
NH2-[イノシンBER阻害因子]-[例えば アデノシンデアミナーゼ]-[例えば Cas9 由来ドメイン]-COOH;
NH2-[例えば Cas9 由来ドメイン]-[例えば アデノシンデアミナーゼ]-[ イノシンBER阻害因子]-COOH;
NH2-[例えば Cas9 由来ドメイン]-[ イノシンBER阻害因子]-[例えば アデノシンデアミナーゼ]-COOH; または
NH2-[イノシンBER阻害因子]-[例えば Cas9 由来ドメイン]-[例えば アデノシンデアミナーゼ]-COOH
【０４４１】
さらに、場合によっては、Gamタンパク質を塩基エディターのN末端に融合させることができる。場合によっては、Gamタンパク質を塩基エディタのC末端に融合させることができる。バクテリオファージMuのGamタンパク質は二本鎖切断(DSB) の末端に結合し、それらを分解から保護することができる。いくつかの実施形態において、Gamを使用してDSBの遊離末端を結合することにより、塩基編集のプロセス中のインデル形成を低減することができる。いくつかの実施形態において、174残基のGamタンパク質は、塩基エディターのN末端に融合される。Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)を参照されたい。場合によっては、1つまたは複数の突然変異が、野生型ドメインと比較して、塩基編集ドメインの長さを変化させることができる。例えば、少なくとも1つのドメインにおける少なくとも1つのアミノ酸の欠失は、塩基エディターの長さを短くすることができる。別の例では、1つまたは複数の突然変異は、野生型ドメインに対するドメインの長さを変化させない。例えば、いずれかのドメインにおける置換（複数可）は塩基エディターの長さを変えない。全てのドメインの長さが野生型ドメインと同じであるこのような塩基エディターの非限定的な例は、以下を含むことができる:
NH2-[APOBEC1]-リンカー1-[Cas9(D10A)]-リンカー2-[UGI]-COOH;
NH2-[CDA1]-リンカー1-[Cas9(D10A)]-リンカー2-[UGI]-COOH;
NH2-[AID]-リンカー1-[Cas9(D10A)]-リンカー2-[UGI]-COOH;
NH2-[APOBEC1]-リンカー1-[Cas9(D10A)]-リンカー2-[SSB]-COOH;
NH2-[UGI]-リンカー1-[ABOBEC1]-リンカー2-[Cas9(D10A)]-COOH;
NH2-[APOBEC1]-リンカー1-[Cas9(D10A)]-リンカー2-[UGI]-リンカー3-[UGI]-COOH;
NH2-[Cas9(D10A)]-リンカー1-[CDA1]-リンカー2-[UGI]-COOH;
NH2-[Gam]-リンカー1-[APOBEC1]-リンカー2-[Cas9(D10A)]-リンカー3-[UGI]-COOH;
NH2-[Gam]-リンカー1-[APOBEC1]-リンカー2-[Cas9(D10A)]-リンカー3-[UGI]-リンカー4-[UGI]-COOH;
NH2-[APOBEC1]-リンカー1-[dCas9(D10A, H840A)]-リンカー2-[UGI]-COOH; または
NH2-[APOBEC1]-リンカー1-[dCas9(D10A, H840A)]-COOH
【０４４２】
いくつかの実施形態において、本明細書中で提供される塩基編集融合タンパク質は、正確な位置、例えば、標的塩基が規定された領域(例えば「脱アミノ化ウィンドウ」)内に配置されるような位置に配置される必要がある。場合によっては、標的は4塩基領域内にあり得る。場合によっては、そのような規定された標的領域は、PAMの約15塩基上流にあり得る。Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature  551, 464-471 (2017); and Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017) 参照；その全内容が参照により本明細書に組み入れられる。
【０４４３】
定義された標的領域は、脱アミノ化ウィンドウであり得る。脱アミノ化ウィンドウは、塩基エディターが標的ヌクレオチドに作用して脱アミノ化する、規定された領域であり得る。いくつかの実施態様において、脱アミノ化ウィンドウは、2、3、4、5、6、7、8、9又は10塩基領域内にある。いくつかの実施態様において、脱アミノ化ウィンドウは、PAMの5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25塩基上流にある。
【０４４４】
本開示の塩基エディターは、標的ポリヌクレオチド配列の編集を促進させる任意のドメイン、特徴またはアミノ酸配列を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、塩基エディターは、核局在化配列 (NLS) を含む。いくつかの実施形態において、塩基エディターのNLSは、デアミナーゼドメインとポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインとの間に位置する。いくつかの実施形態において、塩基エディターのNLSは、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインに対してC末端に位置する。
【０４４５】
本明細書に開示される塩基エディターに存在し得る他の例示的特徴は、細胞質局在化配列、核輸出配列などの輸出配列、または他の局在化配列などの局在化配列、ならびに融合タンパク質の可溶化、精製、または検出に有用な配列タグである。本明細書において提供される適切なタンパク質タグには、限定されるものではないが、ビオチンカルボキシラーゼキャリアータグ (BCCP) タグ、myc-タグ、カルモジュリンタグ、FLAG-タグ、ヘマグルチニン (HA) -タグ、ヒスチジンタグまたはHis-タグとも呼ばれるポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質 (MBP) -タグ、nus-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST) -タグ、緑色蛍光タンパク質 (GFP) -タグ、チオレドキシンタグ、S-タグ、ソフタグ(例ソフタグ1、ソフタグ3)、ストレプトタグ、ビオチンリガーゼタグ、FLASHタグ、V5タグ、およびSBP-タグが含まれる。さらなる適切な配列は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、1つ以上のHisタグを含む。
【０４４６】
融合タンパク質に含まれ得るタンパク質ドメインの非限定的な例としては、デアミナーゼドメイン(例えばシチジンデアミナーゼおよび/またはアデノシンデアミナーゼ)、ウラシルグリコシラーゼ阻害因子 (UGI) ドメイン、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および/または以下の活性の一つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる:メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、RNA切断活性、および核酸結合活性。追加のドメインは、異種の機能的ドメインであり得る。そのような異種機能ドメインは、DNAメチル化、DNA損傷、DNA修復、標的DNAと結合した標的ポリペプチド(例えばヒストン、DNA結合タンパク質など)の修飾などの機能活性を付与し、例えばヒストンメチル化、ヒストンアセチル化、ヒストンユビキチン化などをもたらすことができる。
【０４４７】
付与される他の機能には、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、リモデリング活性、プロテアーゼ活性、酸化還元酵素活性、トランスフェラーゼ活性、ヒドロラーゼ活性、イソメラーゼ活性、シンターゼ活性、シンテターゼ活性、および脱ミリストイル化活性、またはこれらの任意の組合せが含まれる。
【０４４８】
エピトープタグの非限定的な例は、ヒスチジン (His) タグ、V5タグ、FLAGタグ、インフルエンザヘマグルチニン (HA) タグ、Mycタグ、VSV-Gタグ、およびチオレドキシン (Trx) タグを含む。レポーター遺伝子の例としては、グルタチオン-5-トランスフェラーゼ (GST) 、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ (CAT) 、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質 (GFP) 、HcRed、DsRed、シアン蛍光タンパク質 (CFP) 、黄色蛍光タンパク質 (YFP) 、および青色蛍光タンパク質 (BFP) を含む自己蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。さらなるタンパク質配列には、DNA分子に結合するかまたは他の細胞分子に結合するアミノ酸配列が含まれ得、これらには、マルトース結合タンパク質 (MBP) 、Sタグ、Lex A DNA結合ドメイン (DBD) 融合体、GAL4 DNA結合ドメイン融合体、および単純ヘルペスウイルス (HSV) BP16タンパク質融合体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４９】
［塩基エディターの効率性］
CRISPR-Cas9ヌクレアーゼは、標的ゲノム編集を媒介するために広く使用されている。ほとんどのゲノム編集応用において、Cas9はガイドポリヌクレオチド(例えば単一ガイドRNA (sgRNA))と複合体を形成し、sgRNA配列により指定される標的部位で二本鎖DNA切断 (DSB) を誘導する。細胞は主に非相同末端結合 (NHEJ) 修復経路を介してこのDSBに応答し、遺伝子を破壊するフレームシフト変異を生じる確率的挿入または欠失 (インデル) を生じる。DSBに隣接する配列と高度の相同性を有するドナーDNA鋳型の存在下で、相同性指向性修復 (HDR) として知られる代替経路を介して遺伝子補正が達成され得る。残念ながら、ほとんどの非侵襲的条件下では、HDRは非効率であり、細胞状態および細胞型に依存し、より高いインデルの頻度によって支配される。ヒトの疾患に関連する既知の遺伝的変異の大部分は点突然変異であるため、より効率的かつクリーンに正確な点突然変異を作製できる方法が必要である。本明細書に提供される塩基編集システムは、二本鎖DNA切断を生じることなく、ドナーDNA鋳型を必要とせず、かつ過剰な確率的挿入および欠失を誘導することなく、ゲノム編集を編集するための新しい方法を提供する。
【０４５０】
本明細書に提供される塩基エディターは、著しい割合のインデルを生成することなく、特定のヌクレオチド塩基を改変することができる。「インデル（indel）」という用語は、本明細書において使用される場合、核酸内のヌクレオチド塩基の挿入または欠失を指す。このような挿入または欠失は、遺伝子のコード領域内でフレームシフト突然変異を引き起こす可能性がある。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列において多数の挿入または欠失(すなわちインデル)を生じることなく、核酸内の特定のヌクレオチドを効率的に改変(例えば変異または脱アミノ化)する塩基エディターを生成することが望ましい。特定の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターのいずれも、インデルに対して意図された改変(例えば点突然変異または脱アミノ化)のより大きな割合を生成することができる。
【０４５１】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される塩基エディター系のいずれも、標的ポリヌクレオチド配列において、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、19%未満、18%未満、17%未満、16%未満、15%未満、14%未満、13%未満、12%未満、11%未満、10%未満、9%未満、8%未満、7%未満、6%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、1%未満、0.9%未満、0.8%未満、未満、0.7%未満、0.6%未満、0.5%未満、0.4%未満、0.3%未満、0.2%未満、0.1%未満、0.09%未満、0.08%未満、0.07%未満、未満、0.06%未満、0.05%未満、0.04%未満、0.03%未満、0.02%未満、または0.01%未満のインデル形成をもたらす。
【０４５２】
本開示のいくつかの態様は、本明細書に提供される塩基エディターが、有意な数の非意図的な突然変異（例えば非意図的な点突然変異など）を生成することなく、核酸(例えば対象のゲノム内の核酸)において、意図する突然変異（例えば点突然変異など）を効率的に生成することができるという認識に基づく。
【０４５３】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基エディターは、少なくとも0.01%の意図された突然変異(すなわち少なくとも0.01%の編集効率)を生じることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基エディターは、少なくとも0.01%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%の意図された突然変異を生成することができる。
【０４５４】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基エディターは、1:1より大きい、意図された点突然変異対インデルの比を生成することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基エディターは、少なくとも1.5:1、少なくとも2:1、少なくとも2.5:1、少なくとも3:1、少なくとも3.5:1、少なくとも4:1、少なくとも4.5:1、少なくとも5:1、少なくとも5.5:1、少なくとも6:1、少なくとも6.5:1、少なくとも7:1、少なくとも7.5:1、少なくとも8:1、少なくとも8.5:1、少なくとも9:1、少なくとも10:1、少なくとも11:1、少なくとも12:1、少なくとも13:1、少なくとも14:1、少なくとも15:1、少なくとも20:1、少なくとも25:1、少なくとも30:1、少なくとも40:1、少なくとも50:1、少なくとも100:1、少なくとも200:1、少なくとも300:1、少なくとも400:1、少なくとも500:1、少なくとも600:1、少なくとも700:1、少なくとも800:1、少なくとも900:1、もしくは少なくとも1000:1、またはそれ以上の、意図される点突然変異対インデルの比を生じることができる。
【０４５５】
意図された突然変異およびインデルの数は、例えば、国際PCT出願番号PCT/2017/045381 (WO2030/027078) およびPCT/US2016/058344 (WO2017/070632)；Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage”Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature  551, 464-471 (2017); および Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity,” Science Advances 3:eaao4774 (2017)（その全内容は参照によりここに組み込まれる）に記載されているもののような、任意の適切な方法を用いて決定することができる。
【０４５６】
いくつかの実施形態において、インデル頻度を計算するために、インデルが生じ得るウィンドウの両側に隣接する二つの10 bp配列に対する正確なマッチについて配列決定リードがスキャンされる。完全マッチが見つからない場合、そのリードは解析から除外される。このインデルウィンドウの長さが参照配列と完全にマッチする場合、リードはインデルを含まないものとして分類される。インデルウィンドウが参照配列よりも2塩基以上長いかまたは短い場合、配列決定リードは、それぞれ挿入または欠失として分類される。いくつかの態様において、本明細書において提供される塩基エディターは、核酸の領域におけるインデルの形成を制限することができる。ある態様において、その領域は、塩基エディターによって標的化されるヌクレオチドのところにあるか、または塩基エディターによって標的化されるヌクレオチドの2、3、4、5、6、7、8、9または10ヌクレオチド以内の領域である。
【０４５７】
標的ヌクレオチド領域で形成されるインデルの数は、核酸(例えば細胞のゲノム内の核酸)が塩基エディターに曝される時間の量に依存し得る。いくつかの実施形態において、インデルの数または割合は、標的ヌクレオチド配列(例えば細胞のゲノム内の核酸)を塩基エディターに曝してから少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも6時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも36時間、少なくとも48時間、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも7日、少なくとも10日、または少なくとも14日後に決定される。本明細書に記載される塩基エディターの特徴は、本明細書に提供される融合タンパク質、または融合タンパク質を使用する方法のいずれにも適用され得ることが理解されるべきである。
【０４５８】
［多重編集］
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基エディターシステムは、1以上の遺伝子における複数の核酸塩基対の多重編集を可能にする。ある態様において、複数の核酸塩基対は、同一遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態において、複数の核酸塩基対は、1つまたはそれより多い遺伝子に位置し、ここで、少なくとも1つの遺伝子は、異なる遺伝子座に位置する。ある態様において、多重編集は、1以上のガイドポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、多重編集は、1つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。いくつかの実施形態において、多重編集は、単一のガイドポリヌクレオチドを有する1つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。いくつかの実施形態において、多重編集は、複数のガイドポリヌクレオチドを有する1つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。いくつかの実施形態において、多重編集は、単一の塩基エディター系を有する1以上のガイドポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、多重編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにPAM配列を必要としない少なくとも1つのガイドポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、多重編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにPAM配列を必要とする少なくとも1つのガイドポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、多重編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにPAM配列を必要としない少なくとも1つのガイドポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにPAM配列を必要とする少なくとも1つのガイドポリヌクレオチドとの混合物を含むことができる。本明細書に記載される塩基エディターのいずれかを使用する多重編集の特徴は、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかを使用する方法の任意の組み合わせに適用され得ることを理解されたい。また、本明細書に記載される塩基エディターのいずれかを使用する多重編集は、複数の核酸塩基対の順次的編集を含むことができることを理解されたい。
【０４５９】
本明細書で提供される方法は、 (a) 対象のポリヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列(例えば二本鎖DNA配列)を、核酸塩基エディター(例えばアデノシン塩基エディターまたはシチジン塩基エディター)およびガイドポリヌクレオチド酸(例えばgRNA)を含む塩基エディターシステムと接触させる工程であって、ここで、標的ヌクレオチド配列は標的核酸塩基対を含む、工程と；(b) 標的領域の鎖分離を誘導する工程と；(c) 標的領域の一本鎖における標的核酸塩基対の第一の核酸塩基を第二の核酸塩基に編集する工程と；(d) 標的領域の鎖を1本より多くは切断せず、第1の核酸塩基に相補的な第3の核酸塩基が第2の核酸塩基に相補的な第4の核酸塩基に置換される工程とを含む。
【０４６０】
いくつかの実施形態において、複数の核酸塩基対は、1つ以上の遺伝子に存在する。ある態様において、複数の核酸塩基対は、同じ遺伝子内にある。いくつかの実施形態において、1つ以上の遺伝子における少なくとも1つの遺伝子は、異なる遺伝子座に位置する。
【０４６１】
ある態様において、編集は、少なくとも1つのタンパク質コード領域における複数の核酸塩基対の編集である。いくつかの実施形態において、編集は、少なくとも1つのタンパク質非コード領域における複数の核酸塩基対の編集である。ある態様において、編集は、少なくとも1つのタンパク質コード領域および少なくとも1つのタンパク質非コード領域における複数の核酸塩基対の編集である。
【０４６２】
いくつかの態様において、編集は、1以上のガイドポリヌクレオチドを伴う。いくつかの実施形態では、塩基エディターシステムは、1つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、塩基エディターシステムは、単一のガイドポリヌクレオチドとともに1つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターシステムは、複数のガイドポリヌクレオチドとともに1つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。いくつかの実施形態において、編集は、単一の塩基エディター系を有する1以上のガイドポリヌクレオチドを伴う。いくつかの実施形態において、編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにPAM配列を必要としない少なくとも1つのガイドポリヌクレオチドを伴う。いくつかの実施形態において、編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにPAM配列を必要とする少なくとも1つのガイドポリヌクレオチドを伴う。いくつかの実施形態において、編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにPAM配列を必要としない少なくとも1つのガイドポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにPAM配列を必要とする少なくとも1つのガイドポリヌクレオチドとの混合物を伴う。本明細書に記載される塩基エディターのいずれかを使用する多重編集の特徴は、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかを使用する方法の任意の組み合わせに適用され得ることを理解されたい。また、編集は、複数の核酸塩基対の順次的編集を含むことができることを理解されたい。
【０４６３】
［塩基エディターを使用する方法］
疾患関連遺伝子およびアリルにおける点突然変異の補正は、治療および基礎研究への応用を有する遺伝子補正のための新しい戦略を切り開く。
【０４６４】
本開示は、本明細書に提供される塩基エディターシステムによって補正することができる点突然変異に関連するまたはその点突然変異によって引き起こされる疾患と診断された対象の治療方法を提供する。例えば、いくつかの態様において、疾患、例えば遺伝子突然変異によって引き起こされる疾患を有する対象に、疾患関連遺伝子における点突然変異を補正する核酸塩基エディター(例えばアデノシンデアミナーゼ塩基エディターまたはシチジンデアミナーゼ塩基エディター)の有効量を投与する工程を含む方法が提供される。
【０４６５】
一部の実施形態では、疾患は、増殖性疾患である。一部の実施形態では、疾患は、遺伝的疾患である。一部の実施形態では、疾患は、新生物疾患である。一部の実施形態では、疾患は、代謝性疾患である。一部の実施形態では、疾患は、リソソーム蓄積症である。例示的な好適な疾患および障害としては、限定されるものではないが、網膜色素変性症（例えば、adRP-PRPF3、adRP-RHO）、1F型アッシャー症候群、鎌状赤血球病、アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）、肝性ポルフィリン症、MCAD欠損症、LAL欠損症、フェニルケトン尿症（PKU）、ヘモクロマトーシス、フォン・ギールケ病（GSD1a）、ポンペ病（GSDII）、ゴーシェ病、ハーラー症候群（MPS1）、嚢胞性線維症、ホモシスチン尿症（HCU）または慢性疼痛が挙げられる。点変異を修正するか、または脱活性化変異を疾患関連遺伝子中に導入することによって治療することができる他の疾患は、当業者には公知であり、本開示はこの点において限定されない。さらなる疾患または障害、例えば、デアミナーゼ媒介性遺伝子編集によって修正することができる点変異と関連するか、またはそれによって引き起こされる疾患または障害の治療のための方法が提供される。そのような疾患は、本明細書に記載され、本明細書で提供される戦略および融合タンパク質を用いて治療することができるさらなる好適な疾患は、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。
【０４６６】
ある特定の態様では、点変異（例えば、A1ATタンパク質をコードするSERPINA1遺伝子中の）と関連するか、またはそれによって引き起こされ、デアミナーゼ媒介性遺伝子編集によって修正することができるA1ADの治療のための方法が提供される。
【０４６７】
それぞれの配列（例えば、それぞれ疾患関連遺伝子またはそのコードタンパク質のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列）における特定の位置または残基の番号付けは、使用される特定のタンパク質および番号付けスキームに依存することが理解されるであろう。たとえば、成熟タンパク質の前駆体と成熟タンパク質そのものとでは番号付けが異なることがあり、種ごとの配列の違いが番号付けに影響することがある。当業者は、当業者に周知の方法、例えば、配列アラインメントおよび相同的残基の決定によって、任意の相同的タンパク質およびそれぞれのコード核酸中のそれぞれの残基を同定することができる。
【０４６８】
本明細書では、疾患または障害に関連する標的ヌクレオチド配列中の核酸塩基を編集するために、塩基エディターまたは塩基エディターシステムを使用する方法が提供される。いくつかの実施形態において、塩基エディター(例えばアデノシンデアミナーゼおよびCas9ドメインを含むもの)の活性は、点突然変異の補正をもたらす。ある態様において、標的DNA配列は、疾患または障害と関連するG→A点突然変異を含み、ここで、突然変異体A塩基の脱アミノ化は、疾患または障害と関連しない配列をもたらす。ある態様において、標的DNA配列は、疾患または障害と関連するT→C点突然変異を含み、ここで、突然変異体C塩基の脱アミノ化は、疾患または障害と関連しない配列をもたらす。
【０４６９】
いくつかの実施形態において、標的DNA配列はタンパク質をコードし、点突然変異はコドン中にあり、野生型コドンと比較して突然変異コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの実施形態において、突然変異体Aの脱アミノ化は、突然変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの実施形態において、突然変異体Aの脱アミノ化は、野生型アミノ酸をコードするコドンをもたらす。いくつかの実施形態において、突然変異体Cの脱アミノ化は、突然変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの実施形態において、突然変異体Cの脱アミノ化は、野生型アミノ酸をコードするコドンをもたらす。ある態様において、対象は、疾患もしくは障害を有するか、または疾患もしくは障害と診断されている。
【０４７０】
ある態様において、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼは、DNAのデオキシアデノシン残基のアデニンを脱アミノ化することができる。開示の他の態様は、アデノシンデアミナーゼ(例えば、本明細書に記載のDNA中のデオキシアデノシンを脱アミノ化するアデノシンデアミナーゼ)および特定のヌクレオチド配列に結合することができるドメイン(例えばCas9やCpf1タンパク質)を含む融合タンパク質を提供する。例えば、アデノシンは、典型的にはシトシン残基と塩基対を形成するイノシン残基に変換されることができる。このような融合タンパク質は、特に核酸配列の標的化編集に有用である。そのような融合タンパク質は、インビトロでのDNAの標的化された編集のために、例えば、突然変異体の細胞または動物の生成のために；標的化された突然変異の導入のために、例えば、ex vivoの細胞における遺伝的欠陥の補正のために、例えば、対象から得られその後同じまたは別の対象に再導入される細胞において；およびin vivoでの標的突然変異の導入のために使用することができ、例えば、GからAへ、またはTからCへの突然変異による疾患関連遺伝子における遺伝子欠陥の補正または不活性化突然変異の導入は、本明細書に提供される核酸塩基エディターを用いて処理することができる。本開示は、デアミナーゼおよび核酸塩基エディターを利用するデアミナーゼ、融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞、組成物、方法、キット、システム等を提供する。
【０４７１】
［SERPINA1遺伝子におけるヌクレオチドを標的とするための核酸塩基エディターの使用］
SERPINA1遺伝子におけるヌクレオチドを標的とする核酸塩基エディターの適性は、本明細書に記載されるように評価される。一実施形態では、関心対象の単一細胞を、レポーター(例えばGFP)をコードする少量のベクターとともに、本明細書に記載される核酸塩基エディターをコードする核酸分子（複数可）を用いてトランスフェクト、形質導入、またはその他の方法で改変する。これらの細胞は、例えば293T、K562、またはU20Sなどの不死化ヒト細胞株であり得る。あるいは、初代ヒト細胞を使用してもよい。細胞は、対象または個体から、例えば組織生検、外科手術、血液、血漿、血清、または他の生物学的流体などから得ることもできる。そのような細胞は、最終的な細胞標的に関連したものであり得る。
【０４７２】
送達は、以下にさらに記載されるように、ウイルスベクターを用いて実施され得る。一実施形態において、トランスフェクションは、脂質トランスフェクション(LipofectamineやFugeneなど)を用いて、またはエレクトロポレーションによって実施することができる。トランスフェクション後、GFPの発現を蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーのいずれかによって測定して、一貫した高レベルのトランスフェクションを確認することができる。最も高い活性を与えるエディターの組み合わせを決定するために、これらの予備的なトランスフェクションは異なる複数の核酸塩基エディターを含むことができる。
【０４７３】
核酸塩基エディターの活性は、本明細書に記載のように、すなわち標的遺伝子を配列決定して標的配列の変化を検出することによって評価される。サンガー配列決定のためには、精製されたPCRアンプリコンをプラスミド骨格中にクローン化し、形質転換し、ミニプレップし、単一のプライマーで配列決定する。配列決定はまた、次世代配列決定技術を用いて実施されてもよい。次世代配列決定を使用する場合、アンプリコンは、意図された切断部位が非対称に配置された300〜500 bpであり得る。PCRに続いて、次世代配列決定のアダプターおよびバーコード(たとえば、Illumina multiplexアダプターとインデックス)をアンプリコンの末端に付加し得る（例えば高スループット配列決定(例えばIllumina MiSeq上でのもの)で使用するために）。
【０４７４】
最初の試験で最大レベルの標的特異的改変を誘導する融合タンパク質を、さらなる評価のために選択し得る。
【０４７５】
特定の実施形態では、核酸塩基エディターを用いて、目的のポリヌクレオチドを標的化する。一実施形態では、本発明の核酸塩基エディターは、核酸配列（例えばAIAD関連突然変異を有するSERPINA1ポリヌクレオチドを標的化するために使用されるガイドRNAと共に細胞（例えば肝細胞）に送達され、それによって標的遺伝子すなわちSERPINA1を改変する。
【０４７６】
ある実施形態では、核酸塩基エディターは、ガイドRNAによりターゲティングされて目的遺伝子の配列に１つ以上の編集を導入する。ある実施形態では、SERPINA1 または SERPINC1遺伝子に導入される１つ以上の改変は、表3A および 3Bに示されているものである。
【０４７７】
［意図する変異の生成］
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法の目的は、遺伝子編集を介して機能不全遺伝子の機能を回復させることである。いくつかの実施形態において、機能不全遺伝子の機能は、意図された突然変異を導入することによって回復される。本明細書において提供される核酸塩基編集タンパク質は、例えばヒト細胞培養物中の疾患関連突然変異を補正することによって、インビトロでの遺伝子編集に基づくヒト治療のために検証され得る。本明細書において提供される核酸塩基編集タンパク質、例えば、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメイン(例:Cas9)および核酸塩基編集ドメイン(例えば、アデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメイン)を含む融合タンパク質は、任意のAからGまたはCからTへの単一点突然変異を補正するために使用することができることが当業者によって理解されよう。最初のケースでは、変異体AからIへの脱アミノ化が変異を修正し、後者のケースでは、変異体Tと塩基対を形成しているAの脱アミノ化とそれに続く一回の複製が変異を修正する。
【０４７８】
いくつかの態様において、本開示は、有意な数の非意図的な突然変異（例えば非意図的な点突然変異）を生成することなく、核酸(例えば対象のゲノム内の核酸)において、意図する突然変異（例えば点突然変異）を効率的に生成することができる塩基エディターを提供する。いくつかの実施形態において、意図された突然変異は、意図された突然変異を生じさせるように特に設計されたガイドポリヌクレオチド(例えばgRNA)に結合した特定の塩基エディター(例えばシチジン塩基エディターまたはアデノシン塩基エディター)によって生じる突然変異である。ある態様において、意図される突然変異は、疾患または障害に関連する突然変異である。ある態様において、意図される突然変異は、疾患または障害に関連するアデニン (A) からグアニン (G) への点突然変異である。ある態様において、意図される突然変異は、疾患または障害に関連するシトシン (C) からチミン (T) への点突然変異である。いくつかの実施形態において、意図される突然変異は、遺伝子のコード領域または非コード領域内のアデニン (A) からグアニン (G) への点突然変異である。ある態様において、意図される突然変異は、遺伝子のコード領域または非コード領域内のシトシン (C) からチミン (T) への点突然変異である。いくつかの実施形態において、意図される突然変異は、停止コドン、例えば遺伝子のコード領域内の未成熟停止コドンを生成する点突然変異である。いくつかの実施形態において、意図される突然変異は、停止コドンを除去する突然変異である。
【０４７９】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかは、意図される突然変異対意図されない突然変異の比（例えば、意図される点突然変異：意図されない点突然変異）を1:1よりも大きくすることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかは、意図される突然変異対意図されない突然変異の比（例えば意図される点突然変異：意図されない点突然変異）を、少なくとも1.5:1、少なくとも2:1、少なくとも2.5:1、少なくとも3:1、少なくとも3.5:1、少なくとも4:1、少なくとも4.5:1、少なくとも5:1、少なくとも5.5:1、少なくとも6:1、少なくとも6.5:1、少なくとも7:1、少なくとも7.5:1、少なくとも8:1、少なくとも10:1、少なくとも12:1、少なくとも15:1、少なくとも20:1、少なくとも25:1、少なくとも30:1、少なくとも40:1、少なくとも50:1、少なくとも100:1、少なくとも150:1、少なくとも200:1、少なくとも250:1、少なくとも500:1、または少なくとも1000:1以上とすることができる。
【０４８０】
塩基エディター効率の詳細は、国際PCT出願番号PCT/2017/045381 (WO2030/027078) およびPCT/US2016/058344 (WO2017/070632) に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature  551, 464-471 (2017); および Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)も参照（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４８１】
あつ実施形態では、１つ以上の遺伝子における複数の核酸塩基対の編集が、少なくとも１つの意図される変異の形成をもたらす。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの意図される変異の形成は、疾患を引き起こす変異の正確な補正をもたらす。本明細書に記載される塩基エディターの多重編集の特徴は、本明細書に提供される塩基エディターを使用する方法の任意の組み合わせに適用され得ることが理解されるべきである。
【０４８２】
［病原性変異の正確な補正］
いくつかの実施形態では、意図される変異は、疾患または病理に関連する遺伝子における病原性変異または疾患原因変異の正確な補正である。病原性変異は、病原性一塩基多型（SNP）であり得、またはSNPにより引き起こされるものでああり得る。例えば、病原性変異は、遺伝子によってコードされるタンパク質におけるアミノ酸変化であり得る。別の例では、病原性変異は、遺伝子における病原性SNPであり得る。正確な補正は、病原性変異をその野生型状態に回復させ得る。いくつかの実施形態では、病原性変異は、疾患または障害に関連するG→A点変異であり、ここで、AからGへの塩基エディター（ABE）を用いた変異体A塩基の脱アミノ化が、疾患または障害に関連しない配列をもたらす。いくつかの実施形態では、病原性変異は、C→T点変異である。C→T点変異は、例えば、AからGへの塩基エディター（ABE）を反対の鎖にターゲティングして、病原性T核酸塩基の相補体Aを編集することによって補正することができる。いくつかの実施形態では、病原性変異は、疾患または障害に関連するT→C点変異であり、CからTへの塩基エディター（BEまたはCBE）を用いた変異体C塩基の脱アミノ化が、疾患または障害に関連しない配列をもたらす。いくつかの実施形態では、病原性変異は、疾患または障害に関連するA→G点変異である。A→G点変異は、例えば、CBEを反対の鎖にターゲティングして、病原性G核酸塩基の相補体Cを編集することによって補正することができる。病原性変異または疾患原因変異の非限定的な例は、その病原性変異を野生型状態へと編集することによって変異を補正するために使用できる塩基エディターと共に、本明細書の表3Aおよび3Bに記載されている。示された塩基エディターは、病原性SNPへと、またはその相補体へとターゲティングされ得る。突然変異および他の配列バリエーションを記述する命名法の詳細は、den Dunnen, J.T. and Antonarakis, S.E., “Mutation Nomenclature Extensions and Suggestions to Describe Complex Mutations: A Discussion.” Human Mutation 15:712 (2000)に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
表３Ａ：SERPINA1またはSERPINC1遺伝子における病原性変異の正確な補正
【表３Ａ】
2021523738.tif 000035
表３Ｂ：疾患関連遺伝子における病原性変異の正確な補正
【表３Ｂ】
2021523738.tif 000036
2021523738.tif 000037
2021523738.tif 000038
2021523738.tif 000039
2021523738.tif 000040
2021523738.tif 000041
*は停止コドンである。
【０４８３】
一部の実施形態では、疾患または障害は、アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）である。一部の実施形態では、病原性変異は、A1ATタンパク質をコードするSERPINA1遺伝子中にある。一部の実施形態では、SERPINA1にコードされるA1ATタンパク質の変異は、E342K（PiZアリル）である（図3A）。一部の実施形態では、SERPINA1アリルの7位の核酸塩基「A」を、「G」に編集して、PiZアリルを野生型アリルに回復させる（図3Bおよび図3c）。
【０４８４】
［送達システム］
本明細書に開示される塩基エディターを、ウイルスベクター中に含まれる核酸上にコードさせることができる。ウイルスベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（AAV）を含んでもよい。ウイルスベクターを、用途に基づいて選択することができる。例えば、AAVは、その軽度の免疫原性に起因してin vivoでの遺伝子送達のために一般的に使用される。アデノウイルスは、それらが誘導する強い免疫原性応答のため、ワクチンとして一般的に使用される。ウイルスベクターのパッケージング能力は、ベクター中にパッケージングすることができる塩基エディターのサイズを制限し得る。例えば、AAVのパッケージング能力は、2つの134塩基の逆方向末端反復（ITR）を含む約4.5kbである。
【０４８５】
AAVはパルボウイルスファミリーに属する小さな一本鎖DNA依存性ウイルスである。4.7 kbの野生型(wt) AAVゲノムは、それぞれ四つの複製タンパク質および三つのキャプシドタンパク質をコードする二つの遺伝子からなり、両側に145 bpの逆方向末端反復配列(ITR) がある。ビリオンは三つのキャプシドタンパク質Vp1、Vp2およびVp3から成り、これらは同じオープンリーディングフレームから1:1:10比で産生されるが、異なるスプライシング(Vp1) および選択的翻訳開始部位(Vp2とVp3のそれぞれ)から産生される。Vp3はビリオン中に最も豊富に存在するサブユニットであり、ウイルスの指向性を規定する細胞表面での受容体認識に関与する。ウイルス感染性において機能するホスホリパーゼドメインがVp1のユニークなN末端に同定されている。
【０４８６】
組換えAAV (rAAV) は、wt AAVと同様に、ベクター導入遺伝子カセットを挟むシス作用性145 bp ITRを利用し、外来DNAのパッケージングのために最大4.5 kbを提供する。感染後、rAAVは本発明の融合タンパク質を発現することができ、環状の頭・尾コンカテマーの状態のエピソームとして存在することにより、宿主ゲノムに組み込まれることなく存続することができる。このシステムを用いたrAAVの成功例は数多くあるが、in vitroおよびin vivoでは、パッケージング能力が限られているため、遺伝子のコード配列の長さがwt AAVゲノムの長さ以上である場合にAAV媒介遺伝子送達の使用が制限されている。
【０４８７】
AAVベクターの小さいパッケージング能力は、このサイズを超える多数の遺伝子の送達および/または大きな生理学的調節エレメントの使用を困難にする。これらの課題は、例えば、送達されるタンパク質を2つ以上の断片に分割することによって対処することができ、ここで、N末端断片を分割インテイン-Nに融合し、C末端断片を分割インテイン-Cに融合する。そしてこれらの断片を2つ以上のAAVベクターにパッケージングする。本明細書中で使用される場合、「インテイン」とは、隣接するN末端エクステインおよびC末端エクステイン(例えば、連結されるべき断片)をライゲートする自己スプライシングタンパク質イントロン(例えばペプチド)を指す。異種タンパク質断片を連結するための特定のインテインの使用は、例えば、Wood et al., J. Biol. Chem. 289(21); 14512-9 (2014)に記載されている。例えば、インテインIntNおよびIntCは、別々のタンパク質断片に融合された場合、互いを認識して、自身をスプライスして排出し、それと同時に、融合している上記タンパク質断片の隣接するN-およびC-末端エクステインをライゲートして、それによってそれによって2つのタンパク質断片から完全長タンパク質を再構成する。他の適切なインテインは当業者に明らかであろう。
【０４８８】
本発明の融合タンパク質の断片は、長さを変えることができる。ある態様において、タンパク質断片は、長さが2アミノ酸〜約1000アミノ酸の範囲である。ある態様において、タンパク質断片は、長さが約5アミノ酸〜約500アミノ酸の範囲である。ある態様において、タンパク質断片は、長さが約20アミノ酸〜約200アミノ酸の範囲である。ある態様において、タンパク質断片は、長さが約10アミノ酸〜約100アミノ酸の範囲である。他の長さの適切なタンパク質断片は、当業者には明らかであろう。
【０４８９】
ある態様において、ヌクレアーゼ(例えばCas9)の一部または断片は、インテインに融合される。ヌクレアーゼは、インテインのN末端またはC末端に融合され得る。ある態様において、融合タンパク質の一部または断片は、インテインに融合され、AAVキャプシドタンパク質に融合される。インテイン、ヌクレアーゼおよびキャプシドタンパク質は、任意の配置(例えば、ヌクレアーゼ-インテイン-キャプシド、インテイン-ヌクレアーゼ-キャプシド、キャプシド-インテイン-ヌクレアーゼなど)で一緒に融合され得る。いくつかの実施形態において、インテインのN末端は融合タンパク質のC末端に融合され、インテインのC末端はAAVキャプシドタンパク質のN末端に融合される。
【０４９０】
一実施形態では、大きな導入遺伝子発現カセットを二つの別々の半分(5’および3’末端、またはヘッドおよびテール)に分割することによって二重AAVベクターが生成され、カセットの各半分が単一のAAVベクター(5 kb未満)内にパッケージングされる。次いで、両方の二重AAVベクターによる同一細胞の同時感染に続いて、(1) 5’および3’ゲノム（二重AAV重複ベクター）間の相同組換え(HR)；(2) ITRを介した5′及び3′ゲノム(二重AAVトランススプライシングベクター)の尾・頭コンカテマー化；または(3) それら二つのメカニズムの組み合わせ(二重AAVハイブリッドベクター)により、完全長トランスジーン発現カセットの再構築が達成される。in vivoでの二重AAVベクターの使用は完全長タンパク質の発現をもたらす。二重AAVベクタープラットフォームの使用は、>4.7 kbの大きさの導入遺伝子のための効率的で実行可能な遺伝子導入戦略を表す。
【０４９１】
塩基エディターを設計するための、開示される戦略は、ウイルスベクターにパッケージングされることができる塩基エディターを生成するために有用となり得る。塩基エディターの送達のためのRNAまたはDNAウイルスベースのシステムの使用は、培養中または宿主中の特定の細胞にウイルスをターゲティングし、ウイルスの積荷を核または宿主細胞ゲノムに輸送する、高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、培養中の細胞、患者に直接投与することができ(in vivo)、またはそれらを用いて細胞をin vitroで処理し得、改変された細胞を任意で患者に投与することができる(ex vivo)。従来のウイルスベースのシステムは、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴及び単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子導入法では、宿主ゲノムへの組み込みが可能であり、しばしば挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において高い形質導入効率が観察されている。
【０４９２】
レトロウイルスの指向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することによって変化させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることができ、典型的には高いウイルス力価を産生するレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子導入系の選択は標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、6〜10 kbまでの外来配列のパッケージング能力を有するシス作用性の長い末端反復から構成される。最小シス作用性LTRは、ベクターの複製およびパッケージングのために十分であり、次いでそれを用いて治療遺伝子が標的細胞に組み込まれ、永続的な導入遺伝子発現が提供される。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス(MuLV) 、テナガザル白血病ウイルス (GaLV) 、サル免疫不全ウイルス(SIV) 、ヒト免疫不全ウイルス(HIV) 、およびそれらの組み合わせに基づくものが含まれる(例えばBuchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700参照)。
【０４９３】
レトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターは、標的細胞への効率的な組み込みのために所定の長さより小さいポリヌクレオチド配列を必要とし得る。例えば、9 kbを超える長さのレトロウイルスベクターは、より小さいサイズのものと比較して低いウイルス力価をもたらし得る。いくつかの態様において、本開示の塩基エディターは、レトロウイルスベクターを介して効率的なパッケージングおよび標的細胞への送達を可能にするのに十分なサイズである。場合によっては、塩基エディターは、ガイド核酸および/またはターゲティング可能なヌクレアーゼ系の他の成分と共に発現された場合でも、効率的なパッキングおよび送達を可能にするサイズである。
【０４９４】
一過性発現が好ましい用途では、アデノウイルスベースのシステムを使用することができる。アデノウイルスベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターでは、高い力価および発現レベルが得られている。このベクターは比較的簡単な系で大量に生成できる。アデノ随伴ウイルス(「AAV」) ベクターは、標的核酸で細胞を形質導入するために使用することもでき、例えば、核酸およびペプチドのインビトロでの産生において、ならびにインビボおよびエクスビボでの遺伝子治療手順のために使用され得る（例えば、West et al., Virology 160:38-47 (1987); U.S. Patent No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)）。組換えAAVベクターの構築は、米国特許第5,173,414号；Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); およびSamulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)を含む多くの刊行物に記載されている。
【０４９５】
従って、本明細書に記載される塩基エディターは、ウイルスベクターを用いて送達され得る。塩基エディターシステムの1つ以上のコンポーネントは、1つ以上のウイルスベクター上にコードされ得る。例えば、塩基エディターおよびガイド核酸が、単一のウイルスベクター上にコードされ得る。他の場合には、塩基エディターおよびガイド核酸は、異なるウイルスベクター上にコードされる。いずれの場合にも、塩基エディターおよびガイド核酸は、各々、プロモーターおよびターミネーターに作動可能に連結され得る。
【０４９６】
ウイルスベクター上にコードされる成分の組み合わせは、選択されたウイルスベクターのカーゴサイズ制約によって決定され得る。
【０４９７】
［塩基エディターの非ウイルス性送達］
塩基エディターのための非ウイルス性送達アプローチも利用可能である。非ウイルス核酸ベクターの1つの重要なカテゴリーは、有機または無機であり得るナノ粒子である。ナノ粒子は当技術分野でよく知られており、任意の適切なナノ粒子設計を用いて、ゲノム編集システム構成要素またはそのような構成要素をコードする核酸を送達することができる。例えば、有機(例えば、脂質および/またはポリマー)ナノ粒子は、本開示の特定の実施形態における送達ビヒクルとしての使用に好適であり得る。ナノ粒子製剤、および/または遺伝子導入において使用するための例示的な脂質を、表４に示す(下記)。
【表４】
2021523738.tif 000042
2021523738.tif 000043
表５は、遺伝子導入および/またはナノ粒子製剤における使用のための例示的ポリマーを列挙する。
【表５】
2021523738.tif 000044
表６は、本明細書で記述される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのための送達法を要約する。
【表６】
2021523738.tif 000045
【０４９８】
別の局面において、例えばCas9またはそのバリアントなどの核酸結合タンパク質および目的のゲノム核酸配列を標的とするgRNAのような、ゲノム編集システム構成要素またはそのような構成要素をコードする核酸の送達は、リボ核タンパク質(RNP) を細胞に送達することによって達成され得る。RNPは、標的化gRNAと複合体を形成した核酸結合タンパク質、例えば、Cas9を含む。RNPは、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、またはカチオン性脂質媒介方法、例えば、Zuris, J.A. et al., 2015, Nat. Biotechnology, 33(1):73-80によって報告されているもののような、公知の方法を用いて細胞に送達することができる。RNPは、CRISPR塩基編集システムにおける使用のために有利であり、特に一次細胞のようなトランスフェクトが困難な細胞のために有利である。さらに、RNPは、細胞におけるタンパク質発現で起こり得る困難を軽減することもでき、特に、CRISPRプラスミドにおいて使用され得るCMVまたはEF1Aなどの真核生物プロモーターがよく発現されない場合にはそうである。有利なことに、RNPの使用は、細胞への外来DNAの送達を必要としない。さらに、核酸結合タンパク質およびgRNA複合体を含むRNPは、経時的に分解されるので、RNPの使用は、オフターゲット効果を制限する可能性を有する。プラスミドベースの技術の場合と同様の方法で、RNPは、結合タンパク質(例えばCas9バリアント)を送達するために、そして相同性依存修復（HDR）を導くために使用され得る。
【０４９９】
核酸分子発現をコードする塩基エディターを駆動するために使用されるプロモーターは、AAV ITRを含み得る。これは、ベクター中のスペースを占領してしまい得るさらなるプロモーター要素の必要性を排除するために有利であり得る。解放された追加のスペースは、ガイド核酸または選択マーカーなどの追加のエレメントの発現を駆動するために使用することができる。ITR活性は比較的弱いので、これは選択したヌクレアーゼの過剰発現による潜在的毒性を低減するために使用できる。
【０５００】
任意の適切なプロモーターを使用して、塩基エディターおよび、適当な場合には、ガイド核酸の発現を誘導することができる。遍在性発現のために使用することができるプロモーターとしては、CMV、CAG、CBh、PGK、SV40、フェリチン重鎖または軽鎖などが挙げられる。脳または他のCNS細胞での発現については、適切なプロモーターとしては、全てのニューロンについてのシナプシンI、興奮性ニューロンについてのCaMKIIα、GABA作動性ニューロンについてのGAD67もしくはGAD65またはVGATなどが挙げられ得る。肝細胞での発現については、適切なプロモーターとしては、アルブミンプロモーターが挙げられる。肺細胞の発現については、適切なプロモーターはSP-Bを含むことができ、内皮細胞については、適切なプロモーターはICAMを含むことができ、造血細胞については、適切なプロモーターはIFNβまたはCD45を含むことができる。骨芽細胞用。適当なプロモーターにはOG-2が含まれる。
【０５０１】
いくつかの場合において、本開示の塩基エディターは、同じ核酸分子内で別々のプロモーターが塩基エディターおよび適合性ガイド核酸の発現を駆動することを可能にするのに十分な小ささである。例えば、ベクターまたはウイルスベクターは、塩基エディターをコードする核酸に作動可能に連結された第1のプロモーター、およびガイド核酸に作動可能に連結された第2のプロモーターを含むことができる。
【０５０２】
ガイド核酸の発現を駆動するために使用されるプロモーターには、U6またはH1などのPol IIIプロモーター、ならびにgRNAアデノ随伴ウイルス(AAV) を発現するためのPol IIプロモーターとイントロンのカセットの使用が含まれ得る。
【０５０３】
一以上のガイド核酸を伴うまたは伴わない本明細書に記載される塩基エディターは、アデノ随伴ウイルス(AAV) 、レンチウイルス、アデノウイルス、または他のプラスミドもしくはウイルスベクター型を用いて、特に、例えば、米国特許第8,454,972号(アデノウイルスの製剤、用量)、米国特許第8,404,658号(AAVの製剤、用量)および米国特許第5,846,946号(DNAプラスミドの製剤、用量)からの製剤および用量、ならびにレンチウイルス、AAVおよびアデノウイルスが関わる臨床試験およびそれに関する出版物からの製剤および用量を用いて送達することができる。例えば、AAVについては、投与経路、製剤化および用量は、米国特許第8,454,972号およびAAVが関わる臨床試験におけるようにすることができる。アデノウイルスについては、投与経路、製剤化および用量は、米国特許第8,404,658号およびアデノウイルスが関わる臨床試験におけるようにすることができる。プラスミド送達については、投与経路、処方および用量は、米国特許第5,846,946号およびプラスミドが関わる臨床試験におけるようにすることができる。投与量は平均的な70 kgの個体(例えば成人男性)に基づいて算出するか、またはそれに外挿することができ、患者、被験者、体重および動物種の異なる哺乳動物について調整することができる。投与の頻度は、年齢、性別、全般的な健康状態、患者又は対象の他の状態及び対処される特定の状態又は症状を含む通常の要因に依存して、医学又は獣医学の実施者(例えば医師、獣医師)の技量の範囲内である。ウイルスベクターを対象組織に注射することができる。細胞型特異的塩基編集のために、塩基エディターおよび任意のガイド核酸の発現を、細胞型特異的プロモーターによって駆動し得る。
【０５０４】
in vivo送達に関して、AAVは他のウイルスベクターよりも有利であり得る。場合によっては、AAVは低い毒性を可能にするが、これは、免疫応答を活性化させ得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法に起因し得る。ある場合には、AAVは宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入突然変異を引き起こす確率の低さを可能にする。
【０５０５】
AAVのパッケージング限界は4.5または4.75 Kbである。このことは、開示された塩基エディター並びにプロモーター及び転写ターミネーターは、単一のウイルスベクター中にフィットし得ることを意味する。4.5 Kbまたは4.75 Kbを超える構築物は、ウイルス産生を有意に減少させ得る。例えば、SpCas9は非常に大きく、遺伝子自体が4.1 Kbを超え、AAVに詰め込むことが困難であるため、本開示の実施形態は、従来の塩基エディターよりも短い長さの開示された塩基エディターを利用することを含む。いくつかの例では、塩基エディターは4 kb未満である。開示される塩基エディターは、4.5 kb、4.4 kb、4.3 kb、4.2 kb、4.1 kb、4 kb、3.9 kb、3.8 kb、3.7 kb、3.6 kb、3.5 kb、3.4 kb、3.3 kb、3.2 kb、3.1 kb、3 kb、2.9 kb、2.8 kb、2.7 kb、2.6 kb、2.5 kb、2 kb、または1.5 kb未満であり得る。いくつかの場合において、開示された塩基エディターは、長さが4.5 kb以下である。
【０５０６】
AAVは、AAV1、AAV2、AAV5、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。標的とする細胞に関してAAVのタイプを選択することができる；例えば、AAV血清型1、2、5またはハイブリッドキャプシドAAV1、AAV2、AAV5またはそれらの任意の組合せを選択して、脳または神経細胞を標的化することができる；また、心臓組織を標的とするAAV4を選択することができる。AAV8は肝臓への送達に有用である。これらの細胞に関する特定のAAV血清型の表は、Grimm, D. et al, J. Virol. 82: 5887-5911 (2008)に見出され得る。
【０５０７】
レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、有糸分裂細胞と有糸分裂後細胞の両方に感染してその遺伝子を発現する能力をもつ。最も一般的に知られているレンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス(HIV) であり、これは広範囲の細胞型を標的とするために他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用する。
【０５０８】
レンチウイルスは以下のように調製できる。pCasES 10 (これはレンチウイルス伝達プラスミド骨格を含む)をクローニングした後、低継代(p=5)のHEK293FTを、T-75フラスコ中に播種し、抗生物質なしで、10%ウシ胎児血清を含むDMEM中でトランスフェクションの前日に50%コンフルエンスにした。20時間後、培地をOptiMEM (無血清) 培地に変え、トランスフェクションを4時間後に行った。10μgのレンチウイルストランスファープラスミド(pCasES 10) および以下のパッケージングプラスミド：5μgのpMD2.G (VSV-g偽型)および7.5μgのpsPAX2 (gag/pol/rev/tat) で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションは4 mLのOptiMEM中でカチオン性脂質送達剤(50μlのリポフェクタミン2000および100μlのプラス試薬)を用いて行うことができる。6時間後、培地を10%ウシ胎児血清を含む抗生物質不含DMEMに変更する。これらの方法は細胞培養中に血清を用いるが、無血清法が好ましい。
【０５０９】
レンチウイルスは以下のように精製できる。ウイルス上清を48時間後に回収する。上清をまずデブリから除去し、0.45μm低タンパク質結合(PVDF) フィルターを通して濾過する。次いで、これらを24,000 rpmで2時間超遠心機で遠心する。ウイルスペレットを50μlのDMEM中に4℃で一晩再懸濁する。次いでそれらを等分し、直ちに-80℃で凍結する。
【０５１０】
別の実施形態では、ウマ伝染性貧血ウイルス (EIAV) に基づく最小の非霊長類レンチウイルスベクターも考えられる。別の実施形態では、血管静止タンパク質エンドスタチンおよびアンジオスタチンを発現するウマ感染性貧血ウイルスに基づくレンチウイルス遺伝子治療ベクター、RetinoStat RTMを、網膜下注射を介して送達することが考えられる。別の実施形態では、自己不活化レンチウイルスベクターの使用が考えられる。
【０５１１】
この系の任意のRNA、例えば、ガイドRNAまたは塩基エディターをコードするmRNAは、RNAの形態で送達することができる。塩基エディターをコードするmRNAは、インビトロ転写を用いて生成することができる。例えば、ヌクレアーゼmRNAは、以下の要素を含むPCRカセットを用いて合成することができる：T7プロモーター、任意でコザック配列(GCCACC) 、ヌクレアーゼ配列、およびβグロビン-ポリAテールからの3’UTRのような3’UTR。このカセットは、T7ポリメラーゼによる転写のために用いることができる。ガイドポリヌクレオチド(例えばgRNA)もまた、インビトロ転写を用いて、T7プロモーター、次いで配列「GG」、およびガイドポリヌクレオチド配列を含有するカセットから転写され得る。
【０５１２】
発現を増強し、可能性のある毒性を低減するために、塩基エディターコード配列および/またはガイド核酸は、例えば擬似Uまたは5-メチル-Cを用いて、1以上の修飾ヌクレオシドを含むように修飾され得る。
【０５１３】
本開示はいくつかの態様において、細胞または生物を改変する方法を含む。細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。細胞は哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞は、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、齧歯類またはマウス細胞であり得る。本開示の塩基エディター、組成物および方法によって細胞に導入される改変は、細胞および細胞の子孫が、抗体、澱粉、アルコールまたは他の所望の細胞アウトプットなどの生物学的産物の生産を改善するために改変されるようなものであり得る。本開示の方法によって細胞に導入される改変は、細胞およびその子孫が、産生される生物学的産物を変化させる改変を含むようなものであり得る。
【０５１４】
システムは、1つまたは複数の異なるベクターを含むことができる。一態様では、塩基エディターは、所望の細胞型、好ましくは真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞またはヒト細胞の発現のためにコドン最適化される。
【０５１５】
一般に、コドン最適化とは、目的の宿主細胞における発現を増強するために、天然配列の少なくとも一つのコドン(例えば約1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、20個、25個、50個以上のコドン)を、天然アミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置換することによって、核酸配列を改変するプロセスをいう。様々な種は特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定の偏りを示す。コドンバイアス(生物間のコドン利用の違い)は、メッセンジャーRNA (mRNA) の翻訳効率としばしば相関し、それは特に、翻訳されるコドンの性質および特定のトランスファーRNA (tRNA) 分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞内の選択されたtRNAの優位性は、一般にペプチド合成で最も頻繁に使われるコドンを反映している。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせて調整することができる。コドン使用表は、例えば、「コドン使用データベース」www.kazusa.orjp/codon/ (2002年7月9日に訪問した)で容易に入手可能であり、これらの表は、多くの方法で適合させることができる。Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)参照。例えばGene Forge (Aptagen; Jacobus, Pa.)のような、特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能である。ある態様において、操作されたヌクレアーゼをコードする配列中の一つ以上のコドン(例えば1、2、3、4、5、10、15、20、25、50以上、または全てのコドン)は、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
【０５１６】
パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染し得るウイルス粒子を形成するために使用される。そのような細胞は、アデノウイルスをパッケージングする293細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするpsi.2細胞またはPA317細胞を含む。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージする細胞株を作製することによって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組み込みに必要な最小のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるべきポリヌクレオチドのための発現カセットによって置き換えられる。欠けているウイルス機能は、典型的にはパッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば、遺伝子治療に使用されるAAVベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組み込みに必要なAAVゲノムからのITR配列のみを有する。ウイルスDNAは、他のAAV遺伝子、すなわちrepおよびcapをコードするがITR配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞株においてパッケージングされ得る。細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスによっても感染され得る。ヘルパーウイルスは、AAVベクターの複製およびヘルパープラスミドからのAAV遺伝子の発現を促進することができる。ある場合には、ヘルパープラスミドは、ITR配列の欠如のために、有意な量ではパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えばAAVよりもアデノウイルスの方が感受性である熱処理によって減少させることができる。
【０５１７】
［医薬組成物］
本開示の他の態様は、本明細書に記載される塩基エディター、融合タンパク質、または融合タンパク質-ガイドポリヌクレオチド複合体のいずれかを含む医薬組成物に関する。用語「医薬組成物」は、本明細書中で使用される場合、薬学的使用のために処方される組成物を指す。いくつかの態様において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。ある態様において、医薬組成物は、さらなる剤(例えば特異的送達、半減期の延長のためのもの、または他の治療化合物)を含む。
【０５１８】
ここで使用されるところの用語「薬学的に許容される担体」は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤(例えば潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたはステアリン酸亜鉛、あるいはステアリン酸)、または溶媒カプセル化材料などの、身体のある部位(例えば送達部位)から別の部位(例えば器官、組織または身体の一部)への化合物の運搬または輸送に関与する薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを意味する。薬学的に許容される担体は、製剤の他の成分と適合し、対象の組織に有害でないという意味で許容される(例えば生理的適合性、無菌性、生理的pH等)。
【０５１９】
薬学的に許容される担体として役立つことができる物質のいくつかの非限定的な例は、以下を含む: (1) ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖;(2) コーンスターチ、ジャガイモでん粉等のでん粉;(3) セルロース及びその誘導体(カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、酢酸セルロース等);(4) トラガント末;(5) モルト;(6)ゼラチン;(7) ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の潤滑剤;(8) ココアバター、坐剤用ワックス等の添加剤;(9) 落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、大豆油等の油;(10) プロピレングリコール等のグリコール;(11) ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール(PEG); (12) エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど;(13) 寒天;(14) 水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム等の緩衝剤;(15) アルギン酸;(16) パイロジェンフリー水;(17) 生理食塩液;(18) リンガー液;(19)エチルアルコール;(20) pH緩衝液;(21) ポリエステル、ポリカーボネート及び／又はポリ無水物;(22) ポリペプチドおよびアミノ酸のような増量剤(23) エタノールのような血清アルコール;及び(23) 製剤に使用される他の非毒性適合性物質。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、風味料、香料、保存剤および抗酸化剤も製剤中に存在させることができる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」、「ベヒクル」などの用語は、本明細書では交換可能に使用される。
【０５２０】
医薬組成物は、約5.0〜約8.0の範囲などの生理学的pHを反映する所定のレベルに製剤のpHを維持するために、一つ以上のpH緩衝化合物を含むことができる。水性液体製剤で使用されるpH緩衝化合物は、アミノ酸またはヒスチジンなどのアミノ酸の混合物、またはヒスチジンおよびグリシンなどのアミノ酸の混合物であり得る。あるいは、pH緩衝化合物は、製剤のpHを所定のレベル、例えば約5.0〜約8.0の範囲に維持し、カルシウムイオンをキレートしない剤であることが好ましい。このようなpH緩衝化合物の典型的な例としては、イミダゾールおよび酢酸イオンが挙げられるが、これらに限定されない。pH緩衝化合物は、製剤のpHを所定のレベルに維持するのに適した任意の量で存在し得る。
【０５２１】
医薬組成物はまた、一つ以上の浸透圧調節剤、すなわち、処方物の浸透圧特性(例えば、等張性、オスモラリティ、および／または浸透圧)をレシピエント個体の血流および血液細胞にとって許容可能なレベルに調節する化合物を含有することができる。浸透圧調節剤は、カルシウムイオンをキレートしない薬剤であり得る。浸透圧調節剤は、製剤の浸透圧特性を調節する当業者に公知または入手可能な任意の化合物であり得る。当業者は、本発明の処方における使用のための所定の浸透圧調節剤の適合性を経験的に決定することができる。適切なタイプの浸透圧調節剤の例示的な例としては、塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウムのような塩；スクロース、デキストロース、マンニトールなどの糖;グリシンなどのアミノ酸;これらの薬剤および/または薬剤タイプの1つ以上の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。浸透圧調節剤は、製剤の浸透圧特性を調節するのに十分な任意の濃度で存在し得る。
【０５２２】
いくつかの態様において、医薬組成物は、対象への送達のために、例えば遺伝子編集のために製剤化される。本明細書に記載の医薬組成物を投与する適切な経路は、限定されるものではないが、局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内、蝸牛内、経鼓膜、器官内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、および脳室内投与を含む。
【０５２３】
いくつかの態様において、本明細書に記載される医薬組成物は、患部(例えば腫瘍部位)に局所的に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、注射、カテーテル、坐剤、またはインプラントによって、対象に投与され、インプラントは、多孔質、非多孔質、またはゼラチン質材料であり、例えば、シアラスティック膜、または繊維などの膜を含む。
【０５２４】
他の態様において、本明細書に記載される医薬組成物は、制御放出システムにおいて送達される。一実施形態では、ポンプを使用することができる(例えばLanger, 1990, Science 249: 1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574参照)。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。(例えばMedical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. See also Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et ah, 1989, J. Neurosurg. 71: 105.)。他の制御放出システムは、例えば、上記Langerに記載されている。
【０５２５】
いくつかの態様において、医薬組成物は、対象、例えばヒトへの静脈内または皮下投与に適合された組成物として、ルーチンの手順に従って製剤化される。いくつかの態様において、注射による投与のための医薬組成物は、可溶化剤としての無菌等張使用の溶液および注射部位の痛みを緩和するためのリグノカインなどの局所麻酔薬である。一般に、成分は、単位投与形態、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェットのような密閉容器内の乾燥凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、別々にまたは一緒に供給される。薬剤が注入によって投与される場合には、無菌の医薬グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルを用いてそれを分注することができる。医薬組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０５２６】
全身投与のための医薬組成物は、液体、例えば滅菌生理食塩水、乳酸化リンゲル液またはハンク液であり得る。さらに、医薬組成物は、固体形態であって、使用の直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態もまた考えられる。医薬組成物は、非経口投与にも適した、リポソームまたは微結晶などの脂質粒子または小胞内に含有することができる。粒子は、組成物がその中に含まれる限り、単ラメラまたは複数ラメラのような任意の適切な構造であり得る。化合物は、融合性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、低量(5-10モル%)のカチオン性脂質を含み、ポリエチレングリコール(PEG) コーティングにより安定化された、「安定化プラスミド脂質粒子」(SPLP)中に捕捉され得る(Zhang Y. P. et ah, Gene Ther. 1999, 6: 1438-47)。このような粒子および小胞には、N-[l-(2,3-ジオレオイルキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル-アモニウムメチル硫酸塩、あるいは「DOTAP」のような正電荷脂質が特に好ましい。このような脂質粒子の調製はよく知られている。例えば、米国特許第4,880,635；4,906,477；4,911,928；4,917,951；4,920,016;および4,921,757号参照（その各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０５２７】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、単位用量として投与または包装することができる。「単位用量」という用語は、本開示の医薬組成物に関して使用される場合、対象のための単一用量として適した物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要な希釈剤（例えば担体、またはビヒクル）と合わせて所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含有する。
【０５２８】
さらに、この医薬組成物は、 (a) 凍結乾燥形態の本発明の化合物を含有する容器、および(b) 本発明の凍結乾燥化合物の再構成または希釈のために使用される、薬学的に許容される希釈剤(例えば無菌のもの) を含有する第2の容器を含む薬学的キットとして提供することができる。必要に応じて、そのような容器には、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された様式の通知であって、人に投与するための製造、使用又は販売の機関による承認を反映するものとすることができる。
【０５２９】
別の態様では、上記の疾患の治療にとって有用な材料を含有する製品が含まれる。一部の実施形態では、製品は、容器およびラベルを含む。好適な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器を、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成させることができる。一部の実施形態では、容器は、本明細書に記載の疾患を治療するのに有効である組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい。例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい。組成物中の活性薬剤は、本発明の化合物である。一部の実施形態では、容器上のラベルまたは容器と会合したラベルは、組成物が選択された疾患を治療するために使用されることを示す。製品は、リン酸緩衝塩水、リンゲル溶液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝剤を含む第2の容器をさらに含んでもよい。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、使用説明書を含むパッケージインサートなどの、商業的観点およびユーザー観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【０５３０】
いくつかの態様において、本明細書に記載される融合タンパク質、gRNA、および/または複合体のいずれかは、医薬組成物の一部として提供される。いくつかの態様において、医薬組成物は、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかを含む。いくつかの態様において、医薬組成物は、本明細書に提供される複合体のいずれかを含む。いくつかの態様において、医薬組成物は、gRNAおよびカチオン性脂質と複合体を形成するRNA-ガイドヌクレアーゼ(例えばCas9)を含むリボ核タンパク質複合体を含む。ある態様において、医薬組成物は、gRNA、核酸プログラム可能DNA結合タンパク質、カチオン性脂質、および薬学的に許容される賦形剤を含む。医薬組成物は、場合により、1つ以上の追加の治療活性物質を含むことができる。
【０５３１】
［A1ADを治療する方法］
A1ADおよび／またはそれを引き起こすSERPINA1における遺伝子変異を治療する方法も提供され、本方法は、対象(例えばヒト等の哺乳動物)に、本明細書に記載の塩基エディター系(例えば、塩基エディターとgRNA)をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。ある態様において、塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質である。対象の細胞は、SERPINA1遺伝子中の変異を含む核酸配列のA・TからG・Cへの変化(細胞がアデノシンデアミナーゼドメインで形質導入される場合)またはC・GからU・Aへの変化(細胞がシチジンデアミナーゼドメインで形質導入される場合)をもたらすために、塩基エディターおよびそれをターゲティングする一つ以上のガイドポリヌクレオチドとともに形質導入される。
【０５３２】
本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の組成物の有効量を対象(そのような治療を必要としていると特定された対象、又は疾患のリスクがありそのような治療を必要としていると疑われる対象を含む)に投与することを含む。このような治療を必要とする対象を同定することは、対象または医療専門家の判断にあり得、主観的(例えば所見)または客観的(例えば、検査または診断方法によって測定可能)であり得る。
【０５３３】
治療方法は、一般的に、例えば、それを必要とする対象(例えば、ヒト患者)のSERPINA1遺伝子を標的とする塩基エディターおよびgRNAをコードするベクターを含む医薬組成物の治療有効量の投与を含む。このような治療は、A1ADを患っている、それを有している、それに罹患しやすい、またはその罹患のリスクがある対象、特にヒト対象に適切に投与される。本明細書中の組成物はまた、A1ADが関与し得る任意の他の障害の治療にも使用され得る。
【０５３４】
一実施形態では、治療の進行を監視する方法が提供される。本方法は、A1ADに関連する疾患またはその症状に罹患しているかまたは罹患しやすい対象において、診断マーカー（マーカー）(例えば、A1ADに関連するSNP) または診断測定(例えば、スクリーニング、アッセイ) のレベルを決定する工程を含み、ここでその対象は、疾患またはその症状を治療するのに十分な本明細書中の組成物の治療量を投与された対象である。この方法で測定されたマーカーのレベルを、健康な正常対照または他の罹患患者のいずれかにおけるマーカーの既知のレベルと比較して、対象の疾患状態を確立することができる。好ましい態様において、第1のレベルの決定よりも後の時点で、対象におけるマーカーの第2のレベルが決定され、疾患の経過または治療の有効性をモニターするためにこの2つのレベルが比較される。特定の好ましい実施形態では、対象における治療前のマーカーのレベルが、本発明による治療を開始する前に決定される。このマーカーの治療前レベルを治療開始後の対象のマーカーレベルと比較して、治療の有効性を判定することができる。
【０５３５】
ある態様において、本明細書に提供される組成物は、対象内で標的化されたゲノム改変をもたらすために、対象、例えばヒト対象に投与される。ある態様において、細胞が対象から取得され、本明細書に提供される医薬組成物と接触される。いくつかの態様において、対象から取り出されてex vivoで医薬組成物と接触された細胞は、場合により、所望のゲノム改変が細胞において実行または検出された後に、対象に再導入される。ヌクレアーゼを含む医薬組成物を送達する方法は既知であり、例えば、米国特許第6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; and 7,163,824号に記載されており、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に提供される医薬組成物の説明は、主に、ヒトへの投与に適した医薬組成物に向けられているが、そのような組成物は、一般に、あらゆる種類の動物または生物への投与、例えば、獣医学的使用に適していることが、当業者によって理解されるであろう。
【０５３６】
種々の動物への投与に適した組成物を与えるための、ヒトへの投与に適した医薬組成物の改変は十分に理解されており、通常の熟練した獣医薬理学者は、もし必要だとしても単に通常の実験で、そのような改変を設計および/または実施することができる。薬学的組成物の投与が意図される対象には、限定されるものではないが、ヒトおよび/または他の霊長類;哺乳動物、家畜、ペット、およびウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および/またはラットなどの商業的に関連のある哺乳動物;ニワトリ、カモ、ガチョウ及び/又は七面鳥のような商業的に関連のある鳥類が含まれる。
【０５３７】
本明細書に記載される薬学的組成物の製剤は、薬学の分野において公知の、または今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、このような調製方法は、活性成分を賦形剤および/または1つ以上の他の補助成分と会合させ、次いで、必要および/または所望であれば、製品を所望の単回または複数回投与単位に成形および/または包装する工程を含む。薬学的製剤はさらに、薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、それは、本明細書で使用される場合、所望の特定の剤形に適した、溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、潤滑剤などのいずれかおよび全てを含む。Remington’s The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、薬学的組成物を製剤化する際に使用される種々の賦形剤およびその調製のための公知の技術を開示する。ヌクレアーゼを含む医薬組成物を製造するためのさらなる適切な方法、試薬、賦形剤および溶媒については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるPCT出願PCT/US2010/055131(2010年11月2日出願、公開番号WO2011/053982 A8)も参照のこと。
【０５３８】
あらゆる従来の賦形剤媒体は、望ましくない生物学的効果を生じさせること、または他のかたちで医薬組成物の何らかの他の成分と有害な様式で相互作用することなどによって、物質またはその誘導体と不適合である場合を除き、その使用が本開示の範囲内にあると考えられる。
【０５３９】
上記の組成物は、有効量で投与することができる。有効量は、投与方法、治療される特定の状態、および所望の結果に依存する。それはまた、状態のステージ、対象の年齢および身体的状態、もしあれば併用療法の性質、および医師によく知られた同様の因子に依存し得る。治療用途のためには、それは医学的に望ましい結果を達成するのに十分な量である。
【０５４０】
一部の実施形態では、本開示による組成物を、限定されるものではないが、以下のうちの１つまたは複数：自己免疫障害（例えば、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ）；炎症性障害（例えば、関節炎、骨盤内炎症性疾患）；感染症（例えば、ウイルス感染症（例えば、HIV、HCV、RSV）、細菌感染症、真菌感染症、敗血症）；神経障害（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病；自閉症；デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、血栓症、凝固障害、黄斑変性などの血管新生障害）；増殖性障害（例えば、がん、良性新生物）；呼吸器障害（例えば、慢性閉塞性肺疾患）；消化器障害（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍）；骨格筋障害（例えば、線維筋痛症、関節炎）；内分泌、代謝、および栄養障害（例えば、糖尿病、骨粗鬆症）；泌尿器系障害（例えば、腎疾患）；精神障害（例えば、抑鬱、統合失調症）；皮膚障害（例えば、創傷、湿疹）；血液およびリンパ管障害（例えば、貧血、血友病）などの様々な疾患、障害、および/または状態のいずれかの治療のために使用することができる。
【０５４１】
［キット］
本開示の様々な態様は、塩基エディターシステムを含むキットを提供する。一実施形態では、キットは、核酸塩基エディター融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む。この融合タンパク質は、デアミナーゼ(例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデニンデアミナーゼ)および核酸プログラム可能DNA結合タンパク質(napDNAbp) を含む。ある態様において、キットは、対象核酸分子、例えばA1AD関連変異を標的とすることができる、少なくとも一つのガイドRNAを含む。いくつかの実施形態において、キットは、少なくとも1つのガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む。
【０５４２】
いくつかの実施形態において、キットは、それを使用して一つ以上のA1AD関連変異を編集するための使用説明書を提供する。説明書は、一般に、核酸分子を編集するためのキットの使用に関する情報を含む。他の実施形態では、説明書は、以下のうちの少なくとも1つを含む：注意事項；警告；臨床試験；および/または参考資料。使用説明書は、容器（もしあれば）に直接印刷するか、容器に貼付するラベルとして印刷するか、または容器内にもしくは容器と共に提供される独立したシート、パンフレット、カードまたはフォルダーとして印刷され得る。さらなる実施形態では、キットは、適切な動作パラメータのためのラベルまたは別個のインサート(添付文書)の形態で説明書を含むことができる。さらに別の実施形態では、キットは、検出、較正、または正規化のための標準として使用される、適切なポジティブおよびネガティブコントロールまたは対照サンプルを有する1つ以上の容器を含むことができる。キットは、(滅菌) リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第2の容器をさらに含むことができる。さらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用説明書付きの添付文書を含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の物質を含むことができる。
【０５４３】
特定の実施形態では、キットは、アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）を有する対象の治療のために有用である。
【０５４４】
塩基エディターシステムの方法および組成物ならびに使用を包含する、以下の番号付けされた追加の実施形態が本明細書で企図される：
1.  それを必要とする対象においてアルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）を治療する方法であって、対象に、
ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインまたはそれをコードする核酸、および
アデノシンデアミナーゼドメインまたはそれをコードする核酸
を含む塩基エディターシステムを投与することを含み、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、対象中の細胞のSERPINA1ポリヌクレオチド中の単一ヌクレオチド多型（SNP）のA・TからG・Cへの改変をもたらすことによって、A1ADを治療することができ；
前記SNPはA1ADの原因である、
方法。
2.  それを必要とする対象においてアルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）を治療する方法であって、
（a）細胞中に、
ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインまたはそれをコードする核酸、および
アデノシンデアミナーゼドメインまたはそれをコードする核酸
を含む塩基エディターシステムを導入することと、
（b）細胞を対象に投与することと
を含み、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、細胞中のSERPINA1ポリヌクレオチド中の単一ヌクレオチド多型（SNP）のA・TからG・Cへの改変をもたらすことによって、A1ADを治療することができ；
前記SNPはA1ADの原因である、
方法。
3.  細胞が、肝細胞またはその前駆細胞である、実施形態2に記載の方法。
4.  細胞が、対象にとって自家性、同種異系、または異種である、実施形態2または3に記載の方法。
5.  SERPINA1ポリヌクレオチド中の、アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）の原因となる単一ヌクレオチド多型（SNP）を修正する方法であって、SERPINA1ポリヌクレオチドを、
ガイドポリヌクレオチド；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメイン、および
アデノシンデアミナーゼドメイン
を含む塩基エディターシステムと接触させることを含み、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、SERPINA1ポリヌクレオチド中のSNPのA・TからG・Cへの改変を行うことによって、SNPを修正する、方法。
6.  アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）の治療のための改変された細胞を生産する方法であって、細胞中に、
ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインまたはそれをコードする核酸、および
アデノシンデアミナーゼドメインまたはそれをコードする核酸
を含む塩基エディターシステムを導入することを含み、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、細胞中のSERPINA1ポリヌクレオチドにおける、A1ADの原因となる単一ヌクレオチド多型（SNP）のA・TからG・Cへの改変をもたらすことができる、方法。
7.  導入が、in vivoである、実施形態6に記載の方法。
8.  導入が、ex vivoである、実施形態6に記載の方法。
9.  細胞が、肝細胞またはその前駆細胞である、実施形態6から8のいずれか１つに記載の方法。
10.  細胞が、A1ADを有する対象から得られるものである、実施形態6から9のいずれか１つに記載の方法。
11.  SERPINA1ポリヌクレオチドが、SNPによりもたらされる342位におけるリシンを含むA1ATタンパク質をコードする、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
12.  A・TからG・Cへの改変が、リシンを野生型アミノ酸で置換する、実施形態11に記載の方法。
13.  それを必要とする対象においてアルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）を治療する方法であって、対象に、
ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインまたはそれをコードする核酸、および
アデノシンデアミナーゼドメインまたはそれをコードする核酸
を含む塩基エディターシステムを投与することを含み、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、対象における細胞のSERPINA1ポリヌクレオチド中の、A1ADの原因となる単一ヌクレオチド多型（SNP）のA・TからG・Cへの改変をもたらすことができ、
SERPINA1ポリヌクレオチドが、SNPによりもたらされる342位におけるリシンを含むA1ATタンパク質をコードし、
A・TからG・Cへの改変が、リシンを野生型アミノ酸で置換し、それによってA1ADを治療する、方法。
14.  それを必要とする対象においてアルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）を治療する方法であって、
（a）細胞を、
ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインまたはそれをコードする核酸、および
アデノシンデアミナーゼドメインまたはそれをコードする核酸
を含む塩基エディターシステムと接触させることと、
（b）細胞を対象に投与することと
を含み、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、細胞におけるSERPINA1ポリヌクレオチド中の、A1ADの原因となる単一ヌクレオチド多型（SNP）のA・TからG・Cへの改変をもたらすことができ、
SERPINA1ポリヌクレオチドが、SNPによりもたらされる342位におけるリシンを含むA1ATタンパク質をコードし、
A・TからG・Cへの改変が、リシンを野生型アミノ酸で置換し、それによってA1ADを治療する、方法。
15.  細胞が、肝細胞またはその前駆細胞である、実施形態14に記載の方法。
16.  細胞が、対象にとって自家性、同種異系、または異種である、実施形態14または15に記載の方法。
17.  SERPINA1ポリヌクレオチド中の、アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）の原因となる単一ヌクレオチド多型（SNP）を修正する方法であって、SERPINA1ポリヌクレオチドを、
ガイドポリヌクレオチド；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメイン、および
アデノシンデアミナーゼドメイン
を含む塩基エディターシステムと接触させることを含み、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、SNPのA・TからG・Cへの改変をもたらすことができ、
SERPINA1ポリヌクレオチドが、SNPによりもたらされる342位におけるリシンを含むA1ATタンパク質をコードし、
A・TからG・Cへの改変が、リシンを野生型アミノ酸で置換し、それによってSNPを修正する、方法。
18.  A1ADの治療のための改変された細胞を生産する方法であって、細胞中に、
ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインまたはそれをコードする核酸、および
アデノシンデアミナーゼドメインまたはそれをコードする核酸
を含む塩基エディターシステムを導入することを含み、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、細胞におけるSERPINA1ポリヌクレオチド中の、A1ADの原因となる単一ヌクレオチド多型（SNP）のA・TからG・Cへの改変をもたらすことができ、
SERPINA1ポリヌクレオチドが、SNPによりもたらされる342位におけるリシンを含むA1ATタンパク質をコードし、
A・TからG・Cへの改変が、リシンを野生型アミノ酸で置換する、方法。
19.  導入が、ex vivoである、実施形態18に記載の方法。
20.  導入が、ex vivoである、実施形態18に記載の方法。
21.  細胞が、肝細胞またはその前駆細胞である、実施形態18から20のいずれか１つに記載の方法。
22.  細胞が、A1ADを有する対象から得られるものである、実施形態18から21のいずれか１つに記載の方法。
23.  野生型アミノ酸が、グルタミン酸である、実施形態12から22のいずれか１つに記載の方法。
24.  ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインはCas9ドメインである、前記実施形態のいずれか１つの方法。
25.  Cas9ドメインはヌクレアーゼ不活性Cas9ドメインである、実施形態24の方法。
26.  Cas9ドメインはCas9ニッカーゼドメインである、実施形態24の方法。
27.  Cas9ドメインはSpCas9ドメインを含む、実施形態24〜26のいずれか１つの方法。
28.  SpCas9ドメインは、D10Aおよび／またはH840Aアミノ酸置換、またはそれに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態27の方法。
29.  SpCas9ドメインは、NGG PAMに対する特異性を有する、実施形態27または28の方法。
30.  SpCas9ドメインは、NGA PAM、NGT PAM、またはNGC PAMに対する特異性を有する、実施形態27〜29のいずれか１つの方法。
31.  SpCas9ドメインは、アミノ酸置換L1111R, D1135V, G1218R, E1219F, A1322R, R1335V, T1337R、ならびにL1111, D1135L, S1136R, G1218S, E1219V, D1332A, R1335Q, T1337I, T1337V, T1337F, および T1337Mのうちの１つ以上、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態27〜30のいずれか１つの方法。
32.  SpCas9ドメインは、アミノ酸置換L1111R, D1135V, G1218R, E1219F, A1322R, R1335V, T1337R、ならびにL1111, D1135L, S1136R, G1218S, E1219V, D1332A, D1332S, D1332T, D1332V, D1332L, D1332K, D1332R, R1335Q, T1337I, T1337V, T1337F, T1337S, T1337N, T1337K, T1337R, T1337H, T1337Q, および T1337Mのうちの１つ以上、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態27〜31のいずれか１つの方法。
33.  SpCas9ドメインは、アミノ酸置換D1135L, S1136R, G1218S, E1219V, A1322R, R1335Q, T1337, および A1322R、ならびにL1111, D1135L, S1136R, G1218S, E1219V, D1332A, D1332S, D1332T, D1332V, D1332L, D1332K, D1332R, R1335Q, T1337I, T1337V, T1337F, T1337S, T1337N, T1337K, T1337R, T1337H, T1337Q, および T1337Mのうちの１つ以上、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態27〜32のいずれか１つの方法。
34.  SpCas9ドメインは、アミノ酸置換D1135M, S1136Q, G1218K, E1219F, A1322R, D1332A, R1335E, および T1337R、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態27〜33のいずれか１つの方法。
35.  SpCas9ドメインは、NG PAM、NNG PAM、GAA PAM、GAT PAM、またはCAA PAMに対する特異性を有する、実施形態27〜34のいずれか１つの方法。
36.  SpCas9ドメインは、アミノ酸置換480K, E543K, および E1219V、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態35の方法。
37.  Cas9ドメインはSaCas9ドメインを含む、実施形態27〜29のいずれか１つの方法。
38.  SaCas9ドメインはNNNRRT PAMに対する特異性を有する、実施形態27の方法。
39.  SaCas9ドメインはNNGRRT PAMに対する特異性を有する、実施形態38の方法。
40.  SaCas9ドメインは、アミノ酸置換N579A、またはそれに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態37〜39のいずれか１つの方法。
41.  SaCas9ドメインは、アミノ酸置換E782K, N968K, およびR1015H、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態37〜40のいずれか１つの方法。
42.  Cas9ドメインはSt1Cas9ドメインを含む、実施形態27〜29のいずれか１つの方法。
43.  St1Cas9ドメインはNNACCA PAMに対する特異性を有する、実施形態40の方法。
44.  アデノシンデアミナーゼドメインは、天然には存在しない改変されたアデノシンデアミナーゼドメインである、前記実施形態のいずれか１つの方法。
45.  アデノシンデアミナーゼドメインはTadAドメインを含む、実施形態44の方法。
46. TadAドメインはTadA 7.10のアミノ酸配列を含む、実施形態45の方法。
47.  塩基エディターシステムはジンクフィンガードメインをさらに含む、前記実施形態のいずれか１つの方法。
48. ジンクフィンガードメインは、認識ヘリックス配列RNEHLEV、QSTTLKR、およびRTEHLAR、または認識ヘリックス配列RGEHLRQ、QSGTLKR、およびRNDKLVPを含む、実施形態47の方法。
49.  ジンクフィンガードメインは、zf1raまたはzf1rbである、実施形態47または48の方法。
50. 塩基エディターシステムは核局在化シグナル（NLS）をさらに含む、前記実施形態のいずれか１つの方法。
51. 塩基エディターシステムは１つ以上のリンカーをさらに含む、前記実施形態のいずれか１つの方法。
52.  ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメイン、アデノシンデアミナーゼドメイン、ジンクフィンガードメイン、およびNLSのうちの２つ以上が、リンカーを介して接続されている、実施形態51の方法。
53.  リンカーはペプチドリンカーであり、それによって塩基編集融合タンパク質を形成している、実施形態52の方法。
54.  ペプチドリンカーは、SGGSSGSETPGTSESATPESSGGS, SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS, GGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGS, SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES, SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGS, SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS, PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATS, (SGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n, (G)n, (EAAAK)n, (GGS)n, SGSETPGTSESATPES, および (XP)nからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態53の方法。
55. 塩基編集融合タンパク質は、
MPKKKRKVSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESDLVLGLAIGIGSVGVGILNKVTGEIIHKNSRIFPAAQAENNLVRRTNRQGRRLARRKKHRRVRLNRLFEESGLITDFTKISINLNPYQLRVKGLTDELSNEELFIALKNMVKHRGISYLDDASDDGNSSVGDYAQIVKENSKQLETKTPGQIQLERYQTYGQLRGDFTVEKDGKKHRLINVFPTSAYRSEALRILQTQQEFNPQITDEFINRYLEILTGKRKYYHGPGNEKSRTDYGRYRTSGETLDNIFGILIGKCTFYPDEFRAAKASYTAQEFNLLNDLNNLTVPTETKKLSKEQKNQIINYVKNEKAMGPAKLFKYIAKLLSCDVADIKGYRIDKSGKAEIHTFEAYRKMKTLETLDIEQMDRETLDKLAYVLTLNTEREGIQEALEHEFADGSFSQKQVDELVQFRKANSSIFGKGWHNFSVKLMMELIPELYETSEEQMTILTRLGKQKTTSSSNKTKYIDEKLLTEEIYNPVVAKSVRQAIKIVNAAIKEYGDFDNIVIEMARETNEDDEKKAIQKIQKANKDEKDAAMLKAANQYNGKAELPHSVFHGHKQLATKIRLWHQQGERCLYTGKTISIHDLINNSNQFEVDHILPLSITFDDSLANKVLVYATANQEKGQRTPYQALDSMDDAWSFRELKAFVRESKTLSNKKKEYLLTEEDISKFDVRKKFIERNLVDTLYASRVVLNALQEHFRAHKIDTKVSVVRGQFTSQLRRHWGIEKTRDTYHHHAVDALIIAASSQLNLWKKQKNTLVSYSEDQLLDIETGELISDDEYKESVFKAPYQHFVDTLKSKEFEDSILFSYQVDSKFNRKISDATIYATRQAKVGKDKADETYVLGKIKDIYTQDGYDAFMKIYKKDKSKFLMYRHDPQTFEKVIEPILENYPNKQINDKGKEVPCNPFLKYKEEHGYIRKYSKKGNGPEIKSLKYYDSKLGNHIDITPKDSNNKVVLQSVSPWRADVYFNKTTGKYEILGLKYADLQFDKGTGTYKISQEKYNDIKKKEGVDSDSEFKFTLYKNDLLLVKDTETKEQQLFRFLSRTMPKQKHYVELKPYDKQKFEGGEALIKVLGNVANSGQCKKGLGKSNISIYKVRTDVLGNQHIIKNEGDKPKLDFPKKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV, MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKGEGADKRTADGSEFESPKKKRKV、
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKGEGADKRTADGSEFESPKKKRKVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHSRPGERPFQCRICMRNFSRNEHLEVHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSQSTTLKRHLRTHTGEKPFQCRICMRNFSRTEHLARHLKTHLRGSSAQ、または
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKGEGADKRTADGSEFESPKKKRKVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHSRPGERPFQCRICMRNFSRGEHLRQHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSQSGTLKRHLRTHTGEKPFQCRICMRNFSRNDKLVPHLKTHLRGSSAQ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態53または54の方法。
56.  ガイドポリヌクレオチドは、２つの別個のポリヌクレオチドを含み、２つの別個のポリヌクレオチドは２つのDNA、２つのRNA、またはDNAとRNAである、前記実施形態のいずれか１つの方法。
57.  ガイドポリヌクレオチドが、crRNAおよびtracrRNAを含み、crRNAが、SERPINA1ポリヌクレオチド中の標的配列と相補的な核酸配列を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
58.  標的配列が、GACAAGAAAGGGACTGAAGC、ATCGACAAGAAAGGGACTGA、およびACACACCGGTTGGTGGCCTCからなる群から選択される配列、またはその相補体を含む、実施形態57に記載の方法。
59.  塩基エディターシステムが、単一ガイドRNA（sgRNA）を含む、実施形態57または58に記載の方法。
60.  sgRNAが、ACTCTaGGCAGAGGTCTCAAAGGおよびGCTCTaGGCCGAAGTGTCGCAGGからなる群から選択される配列を含む、実施形態59に記載の方法。
61.  塩基エディターシステムが、ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメイン、およびデアミナーゼドメインのうちの１つまたは複数を含むベクターを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
62.  ベクターが、アデノウイルスベクター、AAVベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターである、実施形態61に記載の方法。
63.  ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインまたはそれをコードする核酸、および
アデノシンデアミナーゼドメインまたはそれをコードする核酸
を含む塩基エディターシステムを含む、改変された細胞であって、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、細胞におけるSERPINA1ポリヌクレオチド中の、アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）の原因となる単一ヌクレオチド多型（SNP）のA・TからG・Cへの改変をもたらすことができる、
改変された細胞。
64.  ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインまたはそれをコードする核酸、および
アデノシンデアミナーゼドメインまたはそれをコードする核酸
を含む塩基エディターシステムを含む、改変された細胞であって、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、細胞におけるSERPINA1ポリヌクレオチド中の、アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）の原因となる単一ヌクレオチド多型（SNP）のA・TからG・Cへの改変をもたらすことができ、
SERPINA1ポリヌクレオチドが、SNPによりもたらされる324位におけるリシンを含むA1ATタンパク質をコードし、
A・TからG・Cへの改変が、リシンを野生型アミノ酸で置換する、
改変された細胞。
65.  SERPINA1ポリヌクレオチドが、SNPによりもたらされる342位におけるリシンを含むA1ATタンパク質をコードする、実施形態63に記載の改変された細胞。
66.  A・TからG・Cへの改変が、リシンを野生型アミノ酸で置換する、実施形態65に記載の改変された細胞。
67.  肝細胞またはその前駆細胞である、実施形態63から66のいずれか１つに記載の改変された細胞。
68.  A1ADを有する対象から得られるものである、実施形態67に記載の改変された細胞。
69.  野生型アミノ酸が、グルタミン酸である、実施形態66から68のいずれか１つに記載の改変された細胞。
70. ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインはCas9ドメインである、実施形態63〜66のいずれか１つの改変された細胞。
71. Cas9ドメインはヌクレアーゼ不活性Cas9ドメインである、実施形態70の改変された細胞。
72. Cas9ドメインはCas9ニッカーゼドメインである、実施形態71の改変された細胞。
73. Cas9ドメインはSpCas9ドメインを含む、実施形態70〜72のいずれか１つの改変された細胞。
74. SpCas9ドメインは、D10Aおよび／またはH840Aアミノ酸置換、またはそれに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態73の改変された細胞。
75. SpCas9ドメインは、NGG PAMに対する特異性を有する、実施形態73または74の改変された細胞。
76. SpCas9ドメインは、NGA PAM、NGT PAM、またはNGC PAMに対する特異性を有する、実施形態73〜75のいずれか１つの改変された細胞。
77. SpCas9ドメインは、アミノ酸置換L1111R, D1135V, G1218R, E1219F, A1322R, R1335V, T1337R、ならびにL1111, D1135L, S1136R, G1218S, E1219V, D1332A, R1335Q, T1337I, T1337V, T1337F, および T1337Mのうちの１つ以上、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態73〜76のいずれか１つの改変された細胞。
78. SpCas9ドメインは、アミノ酸置換L1111R, D1135V, G1218R, E1219F, A1322R, R1335V, T1337R、ならびにL1111, D1135L, S1136R, G1218S, E1219V, D1332A, D1332S, D1332T, D1332V, D1332L, D1332K, D1332R, R1335Q, T1337I, T1337V, T1337F, T1337S, T1337N, T1337K, T1337R, T1337H, T1337Q, および T1337Mのうちの１つ以上、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態73〜76のいずれか１つの改変された細胞。
79. SpCas9ドメインは、アミノ酸置換D1135L, S1136R, G1218S, E1219V, A1322R, R1335Q, T1337, および A1322R、ならびにL1111, D1135L, S1136R, G1218S, E1219V, D1332A, D1332S, D1332T, D1332V, D1332L, D1332K, D1332R, R1335Q, T1337I, T1337V, T1337F, T1337S, T1337N, T1337K, T1337R, T1337H, T1337Q, および T1337Mのうちの１つ以上、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態73〜76のいずれか１つの改変された細胞。
80. SpCas9ドメインは、アミノ酸置換D1135M, S1136Q, G1218K, E1219F, A1322R, D1332A, R1335E, および T1337R、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態73〜76のいずれか１つの改変された細胞。
81. SpCas9ドメインは、NG PAM、NNG PAM、GAA PAM、GAT PAM、またはCAA PAMに対する特異性を有する、実施形態73〜75のいずれか１つの改変された細胞。
82. SpCas9ドメインは、アミノ酸置換480K, E543K, および E1219V、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態81の改変された細胞。
83.  Cas9ドメインはSaCas9ドメインを含む、実施形態70〜72のいずれか１つの改変された細胞。
84. SaCas9ドメインはNNNRRT PAMに対する特異性を有する、実施形態83の改変された細胞。
85. SaCas9ドメインはNNGRRT PAMに対する特異性を有する、実施形態84の改変された細胞。
86.  SaCas9ドメインは、アミノ酸置換N579A、またはそれに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態83〜85のいずれか１つの改変された細胞。
87. SaCas9ドメインは、アミノ酸置換E782K, N968K, およびR1015H、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態83〜86のいずれか１つの改変された細胞。
88. Cas9ドメインはSt1Cas9ドメインを含む、実施形態70〜72のいずれか１つの改変された細胞。
89. St1Cas9ドメインはNNACCA PAMに対する特異性を有する、実施形態88の改変された細胞。
90. アデノシンデアミナーゼドメインは、天然には存在しない改変されたアデノシンデアミナーゼドメインである、前記実施形態のいずれか１つの改変された細胞。
91. アデノシンデアミナーゼドメインはTadAドメインを含む、実施形態90の改変された細胞。
92. TadAドメインはTadA 7.10のアミノ酸配列を含む、実施形態91の改変された細胞。
93. 塩基エディターシステムはジンクフィンガードメインをさらに含む、実施形態63〜92のいずれか１つの改変された細胞。
94. ジンクフィンガードメインは、認識ヘリックス配列RNEHLEV、QSTTLKR、およびRTEHLAR、または認識ヘリックス配列RGEHLRQ、QSGTLKR、およびRNDKLVPを含む、実施形態93の改変された細胞。
95. ジンクフィンガードメインは、zf1raまたはzf1rbである、実施形態93または94の改変された細胞。
96. 塩基エディターシステムは核局在化シグナル（NLS）をさらに含む、前記実施形態のいずれか１つの改変された細胞。
97. 塩基エディターシステムは１つ以上のリンカーをさらに含む、実施形態63〜96のいずれか１つの改変された細胞。
98. ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメイン、アデノシンデアミナーゼドメイン、ジンクフィンガードメイン、およびNLSのうちの２つ以上が、リンカーを介して接続されている、実施形態97の改変された細胞。
99.  リンカーはペプチドリンカーであり、それによって塩基編集融合タンパク質を形成している、実施形態98の改変された細胞。
100. ペプチドリンカーは、SGGSSGSETPGTSESATPESSGGS, SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS, GGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGS, SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES, SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGS, SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS, PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATS, (SGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n, (G)n, (EAAAK)n, (GGS)n, SGSETPGTSESATPES, および (XP)nからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態99の改変された細胞。
101.   塩基編集融合タンパク質は、
MPKKKRKVSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESDLVLGLAIGIGSVGVGILNKVTGEIIHKNSRIFPAAQAENNLVRRTNRQGRRLARRKKHRRVRLNRLFEESGLITDFTKISINLNPYQLRVKGLTDELSNEELFIALKNMVKHRGISYLDDASDDGNSSVGDYAQIVKENSKQLETKTPGQIQLERYQTYGQLRGDFTVEKDGKKHRLINVFPTSAYRSEALRILQTQQEFNPQITDEFINRYLEILTGKRKYYHGPGNEKSRTDYGRYRTSGETLDNIFGILIGKCTFYPDEFRAAKASYTAQEFNLLNDLNNLTVPTETKKLSKEQKNQIINYVKNEKAMGPAKLFKYIAKLLSCDVADIKGYRIDKSGKAEIHTFEAYRKMKTLETLDIEQMDRETLDKLAYVLTLNTEREGIQEALEHEFADGSFSQKQVDELVQFRKANSSIFGKGWHNFSVKLMMELIPELYETSEEQMTILTRLGKQKTTSSSNKTKYIDEKLLTEEIYNPVVAKSVRQAIKIVNAAIKEYGDFDNIVIEMARETNEDDEKKAIQKIQKANKDEKDAAMLKAANQYNGKAELPHSVFHGHKQLATKIRLWHQQGERCLYTGKTISIHDLINNSNQFEVDHILPLSITFDDSLANKVLVYATANQEKGQRTPYQALDSMDDAWSFRELKAFVRESKTLSNKKKEYLLTEEDISKFDVRKKFIERNLVDTLYASRVVLNALQEHFRAHKIDTKVSVVRGQFTSQLRRHWGIEKTRDTYHHHAVDALIIAASSQLNLWKKQKNTLVSYSEDQLLDIETGELISDDEYKESVFKAPYQHFVDTLKSKEFEDSILFSYQVDSKFNRKISDATIYATRQAKVGKDKADETYVLGKIKDIYTQDGYDAFMKIYKKDKSKFLMYRHDPQTFEKVIEPILENYPNKQINDKGKEVPCNPFLKYKEEHGYIRKYSKKGNGPEIKSLKYYDSKLGNHIDITPKDSNNKVVLQSVSPWRADVYFNKTTGKYEILGLKYADLQFDKGTGTYKISQEKYNDIKKKEGVDSDSEFKFTLYKNDLLLVKDTETKEQQLFRFLSRTMPKQKHYVELKPYDKQKFEGGEALIKVLGNVANSGQCKKGLGKSNISIYKVRTDVLGNQHIIKNEGDKPKLDFPKKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV, MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKGEGADKRTADGSEFESPKKKRKV、
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKGEGADKRTADGSEFESPKKKRKVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHSRPGERPFQCRICMRNFSRNEHLEVHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSQSTTLKRHLRTHTGEKPFQCRICMRNFSRTEHLARHLKTHLRGSSAQ、または
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKGEGADKRTADGSEFESPKKKRKVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHSRPGERPFQCRICMRNFSRGEHLRQHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSQSGTLKRHLRTHTGEKPFQCRICMRNFSRNDKLVPHLKTHLRGSSAQ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態99または100の改変された細胞。
102. ガイドポリヌクレオチドは、２つの別個のポリヌクレオチドを含み、２つの別個のポリヌクレオチドは２つのDNA、２つのRNA、またはDNAとRNAである、実施形態63〜101のいずれか１つの改変された細胞。
103.  ガイドポリヌクレオチドが、crRNAおよびtracrRNAを含み、crRNAが、SERPINA1ポリヌクレオチド中の標的配列と相補的な核酸配列を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の改変された細胞。
104.  標的配列が、GACAAGAAAGGGACTGAAGC、ATCGACAAGAAAGGGACTGA、およびACACACCGGTTGGTGGCCTCからなる群から選択される配列、またはその相補体を含む、実施形態103に記載の改変された細胞。
105.  塩基エディターシステムが、単一ガイドRNA（sgRNA）を含む、実施形態102または103に記載の改変された細胞。
106.  sgRNAが、ACTCTaGGCAGAGGTCTCAAAGGおよびGCTCTaGGCCGAAGTGTCGCAGGからなる群から選択される配列を含む、実施形態105に記載の改変された細胞。
107.  塩基エディターシステムが、ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメイン、およびデアミナーゼドメインのうちの１つまたは複数を含むベクターを含む、実施形態63から106のいずれか１つに記載の改変された細胞。
108.  ベクターが、アデノウイルスベクター、AAVベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターである、実施形態107に記載の改変された細胞。
109.  ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインまたはそれをコードする核酸、および
アデノシンデアミナーゼドメインまたはそれをコードする核酸
を含む塩基エディターシステムであって、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、SERPINA1ポリヌクレオチド中の、アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）の原因となる単一ヌクレオチド多型（SNP）のA・TからG・Cへの改変をもたらすことができる、
塩基エディターシステム。
110.  ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインまたはそれをコードする核酸、および
アデノシンデアミナーゼドメインまたはそれをコードする核酸
を含む塩基エディターシステムであって、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、SERPINA1ポリヌクレオチド中の、アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）の原因となる単一ヌクレオチド多型（SNP）のA・TからG・Cへの改変をもたらすことができ、
SERPINA1ポリヌクレオチドが、SNPによりもたらされる324位におけるリシンを含むA1ATタンパク質をコードし、
A・TからG・Cへの改変が、リシンを野生型アミノ酸で置換する、
塩基エディターシステム。
111.  SERPINA1ポリヌクレオチドが、SNPによりもたらされる342位におけるリシンを含むA1ATタンパク質をコードする、実施形態109に記載の塩基エディターシステム。
112.  A・TからG・Cへの改変が、リシンを野生型アミノ酸で置換する、実施形態111に記載の塩基エディターシステム。
113.  野生型アミノ酸が、グルタミン酸である、実施形態110または112に記載の塩基エディターシステム。
114. ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインはCas9ドメインである、実施形態109〜113のいずれか１つの塩基エディターシステム。
115. Cas9ドメインはヌクレアーゼ不活性Cas9ドメインである、実施形態114の塩基エディターシステム。
116. Cas9ドメインはCas9ニッカーゼドメインである、実施形態114の塩基エディターシステム。
117. Cas9ドメインはSpCas9ドメインを含む、実施形態114〜116のいずれか１つの塩基エディターシステム。
118. SpCas9ドメインは、D10Aおよび／またはH840Aアミノ酸置換、またはそれに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態117の塩基エディターシステム。
119. SpCas9ドメインは、NGG PAMに対する特異性を有する、実施形態117または118の塩基エディターシステム。
120. SpCas9ドメインは、NGA PAM、NGT PAM、またはNGC PAMに対する特異性を有する、実施形態117〜119のいずれか１つの塩基エディターシステム。
121. SpCas9ドメインは、アミノ酸置換L1111R, D1135V, G1218R, E1219F, A1322R, R1335V, T1337R、ならびにL1111, D1135L, S1136R, G1218S, E1219V, D1332A, R1335Q, T1337I, T1337V, T1337F, および T1337Mのうちの１つ以上、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態117〜119のいずれか１つの塩基エディターシステム。
122. SpCas9ドメインは、アミノ酸置換L1111R, D1135V, G1218R, E1219F, A1322R, R1335V, T1337R、ならびにL1111, D1135L, S1136R, G1218S, E1219V, D1332A, D1332S, D1332T, D1332V, D1332L, D1332K, D1332R, R1335Q, T1337I, T1337V, T1337F, T1337S, T1337N, T1337K, T1337R, T1337H, T1337Q, および T1337Mのうちの１つ以上、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態117〜119のいずれか１つの塩基エディターシステム。
123. SpCas9ドメインは、アミノ酸置換D1135L, S1136R, G1218S, E1219V, A1322R, R1335Q, T1337, および A1322R、ならびにL1111, D1135L, S1136R, G1218S, E1219V, D1332A, D1332S, D1332T, D1332V, D1332L, D1332K, D1332R, R1335Q, T1337I, T1337V, T1337F, T1337S, T1337N, T1337K, T1337R, T1337H, T1337Q, および T1337Mのうちの１つ以上、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態117〜119のいずれか１つの塩基エディターシステム。
124. SpCas9ドメインは、アミノ酸置換D1135M, S1136Q, G1218K, E1219F, A1322R, D1332A, R1335E, および T1337R、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態117〜119のいずれか１つの塩基エディターシステム。
125. SpCas9ドメインは、NG PAM、NNG PAM、GAA PAM、GAT PAM、またはCAA PAMに対する特異性を有する、実施形態125の塩基エディターシステム。
126. SpCas9ドメインは、アミノ酸置換480K, E543K, および E1219V、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態125の塩基エディターシステム。
127. Cas9ドメインはSaCas9ドメインを含む、実施形態114〜116のいずれか１つの塩基エディターシステム。
128. SaCas9ドメインはNNNRRT PAMに対する特異性を有する、実施形態127の塩基エディターシステム。
129. SaCas9ドメインはNNGRRT PAMに対する特異性を有する、実施形態128の塩基エディターシステム。
130. SaCas9ドメインは、アミノ酸置換N579A、またはそれに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態127〜129のいずれか１つの塩基エディターシステム。
131. SaCas9ドメインは、アミノ酸置換E782K, N968K, およびR1015H、またはそれらに対応するアミノ酸置換を含む、実施形態127〜130のいずれか１つの塩基エディターシステム。
132. Cas9ドメインはSt1Cas9ドメインを含む、実施形態117〜119のいずれか１つの塩基エディターシステム。
133. St1Cas9ドメインはNNACCA PAMに対する特異性を有する、実施形態132の塩基エディターシステム。
134. アデノシンデアミナーゼドメインは、天然には存在しない改変されたアデノシンデアミナーゼドメインである、前記実施形態のいずれか１つの塩基エディターシステム。
135. アデノシンデアミナーゼドメインはTadAドメインを含む、実施形態90の塩基エディターシステム。
136. TadAドメインはTadA 7.10のアミノ酸配列を含む、実施形態91の塩基エディターシステム。
137. 塩基エディターシステムはジンクフィンガードメインをさらに含む、実施形態109〜136のいずれか１つの塩基エディターシステム。
138. ジンクフィンガードメインは、認識ヘリックス配列RNEHLEV、QSTTLKR、およびRTEHLAR、または認識ヘリックス配列RGEHLRQ、QSGTLKR、およびRNDKLVPを含む、実施形態137の塩基エディターシステム。
139. ジンクフィンガードメインは、zf1raまたはzf1rbである、実施形態136または137の塩基エディターシステム。
140. 塩基エディターシステムは核局在化シグナル（NLS）をさらに含む、前記実施形態のいずれか１つの塩基エディターシステム。
141. 塩基エディターシステムは１つ以上のリンカーをさらに含む、実施形態109〜140のいずれか１つの塩基エディターシステム。
142. ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメイン、アデノシンデアミナーゼドメイン、ジンクフィンガードメイン、およびNLSのうちの２つ以上が、リンカーを介して接続されている、実施形態141の塩基エディターシステム。
143. リンカーはペプチドリンカーであり、それによって塩基編集融合タンパク質を形成している、実施形態142の塩基エディターシステム。
144.  ペプチドリンカーが、SGGSSGSETPGTSESATPESSGGS, SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS, GGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGS, SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES, SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGS, SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS, PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATS, (SGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n, (G)n, (EAAAK)n, (GGS)n, SGSETPGTSESATPES, および (XP)nからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態143の塩基エディターシステム。
145. 塩基編集融合タンパク質が、
MPKKKRKVSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESDLVLGLAIGIGSVGVGILNKVTGEIIHKNSRIFPAAQAENNLVRRTNRQGRRLARRKKHRRVRLNRLFEESGLITDFTKISINLNPYQLRVKGLTDELSNEELFIALKNMVKHRGISYLDDASDDGNSSVGDYAQIVKENSKQLETKTPGQIQLERYQTYGQLRGDFTVEKDGKKHRLINVFPTSAYRSEALRILQTQQEFNPQITDEFINRYLEILTGKRKYYHGPGNEKSRTDYGRYRTSGETLDNIFGILIGKCTFYPDEFRAAKASYTAQEFNLLNDLNNLTVPTETKKLSKEQKNQIINYVKNEKAMGPAKLFKYIAKLLSCDVADIKGYRIDKSGKAEIHTFEAYRKMKTLETLDIEQMDRETLDKLAYVLTLNTEREGIQEALEHEFADGSFSQKQVDELVQFRKANSSIFGKGWHNFSVKLMMELIPELYETSEEQMTILTRLGKQKTTSSSNKTKYIDEKLLTEEIYNPVVAKSVRQAIKIVNAAIKEYGDFDNIVIEMARETNEDDEKKAIQKIQKANKDEKDAAMLKAANQYNGKAELPHSVFHGHKQLATKIRLWHQQGERCLYTGKTISIHDLINNSNQFEVDHILPLSITFDDSLANKVLVYATANQEKGQRTPYQALDSMDDAWSFRELKAFVRESKTLSNKKKEYLLTEEDISKFDVRKKFIERNLVDTLYASRVVLNALQEHFRAHKIDTKVSVVRGQFTSQLRRHWGIEKTRDTYHHHAVDALIIAASSQLNLWKKQKNTLVSYSEDQLLDIETGELISDDEYKESVFKAPYQHFVDTLKSKEFEDSILFSYQVDSKFNRKISDATIYATRQAKVGKDKADETYVLGKIKDIYTQDGYDAFMKIYKKDKSKFLMYRHDPQTFEKVIEPILENYPNKQINDKGKEVPCNPFLKYKEEHGYIRKYSKKGNGPEIKSLKYYDSKLGNHIDITPKDSNNKVVLQSVSPWRADVYFNKTTGKYEILGLKYADLQFDKGTGTYKISQEKYNDIKKKEGVDSDSEFKFTLYKNDLLLVKDTETKEQQLFRFLSRTMPKQKHYVELKPYDKQKFEGGEALIKVLGNVANSGQCKKGLGKSNISIYKVRTDVLGNQHIIKNEGDKPKLDFPKKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV, MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKGEGADKRTADGSEFESPKKKRKV、
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKGEGADKRTADGSEFESPKKKRKVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHSRPGERPFQCRICMRNFSRNEHLEVHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSQSTTLKRHLRTHTGEKPFQCRICMRNFSRTEHLARHLKTHLRGSSAQ、または 
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKGEGADKRTADGSEFESPKKKRKVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHSRPGERPFQCRICMRNFSRGEHLRQHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSQSGTLKRHLRTHTGEKPFQCRICMRNFSRNDKLVPHLKTHLRGSSAQ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態143または144の塩基エディターシステム。
146.  ガイドポリヌクレオチドが、２つの別個のポリヌクレオチドを含み、２つの別個のポリヌクレオチドは、２つのDNA、２つのRNA、またはDNAとRNAである、前記実施形態のいずれか１つの塩基エディターシステム。
147.  ガイドポリヌクレオチドが、crRNAおよびtracrRNAを含み、crRNAは、SERPINA1ポリヌクレオチド中の標的配列と相補的な核酸配列を含む、実施形態109から146のいずれか１つに記載の塩基エディターシステム。
148.  標的配列が、GACAAGAAAGGGACUGAAGC、AUCGACAAGAAAGGGACUGA、およびACACACCGGUUGGUGGCCUCからなる群から選択される配列、またはその相補体を含む、実施形態147に記載の塩基エディターシステム。
149.  単一ガイドRNA（sgRNA）を含む、実施形態147または148に記載の塩基エディターシステム。
150.  sgRNAが、ACTCTaGGCAGAGGTCTCAAAGGおよびGCTCTaGGCCGAAGTGTCGCAGGからなる群から選択される配列を含む、実施形態149に記載の塩基エディターシステム。
151.  ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメイン、およびデアミナーゼドメインのうちの１つまたは複数を含むベクターを含む、実施形態109から150のいずれか１つに記載の塩基エディターシステム。
152.  ベクターが、アデノウイルスベクター、AAVベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターである、実施形態151に記載の塩基エディターシステム。
153.  それを必要とする対象において疾患を治療する方法であって、対象に、
ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインまたはそれをコードする核酸、および
アデノシンデアミナーゼドメインまたはそれをコードする核酸
を含む塩基エディターシステムを投与することを含み、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、対象における細胞の標的ポリヌクレオチド中の、病原性単一ヌクレオチド多型（SNP）の脱アミノ化をもたらすことができ、
病原性SNPが、表3Aまたは表3B中の病原性アミノ酸変異の原因となり、病原性SNPの脱アミノ化が、病原性SNPからその野生型アリルへの転換をもたらすことによって、疾患を治療する、
方法。
154.  それを必要とする対象において疾患を治療する方法であって、
（a）細胞中に、
ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインまたはそれをコードする核酸、および
アデノシンデアミナーゼドメインまたはそれをコードする核酸
を含む塩基エディターシステムを導入することと、
（b）細胞を対象に投与することと
を含み、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、対象における細胞の標的ポリヌクレオチド中の、病原性単一ヌクレオチド多型（SNP）の脱アミノ化をもたらすことができ、
病原性SNPが、表3Aまたは表3B中の病原性アミノ酸変異の原因となり、病原性SNPの脱アミノ化が、病原性SNPからその野生型アリルへの転換をもたらすことによって、疾患を治療する、
方法。
155.  標的ポリヌクレオチド中の、疾患の原因となるSNPを修正する方法であって、標的ポリヌクレオチドを、
ガイドポリヌクレオチド；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメイン、および
デアミナーゼドメイン
を含む塩基エディターシステムと接触させることを含み、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、対象における細胞の標的ポリヌクレオチド中の病原性単一ヌクレオチド多型（SNP）の脱アミノ化をもたらすことができ、
病原性SNPが、表3Aまたは表3B中の病原性アミノ酸変異の原因となり、病原性SNPの脱アミノ化が、病原性SNPからその野生型アリルへの転換をもたらすことによって、標的ポリヌクレオチド中の病原性SNPを修正する、
方法。
156.  疾患の治療のための改変された細胞を生産する方法であって、細胞中に、
ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインまたはそれをコードする核酸、および
アデノシンデアミナーゼドメインまたはそれをコードする核酸
を含む塩基エディターシステムを導入することを含み、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、対象における細胞の標的ポリヌクレオチド中の病原性単一ヌクレオチド多型（SNP）の脱アミノ化をもたらすことができ、
病原性SNPが、表3Aまたは表3B中の病原性アミノ酸変異の原因となり、SNPの脱アミノ化が、病原性SNPからその野生型アリルへの転換をもたらすことによって、標的ポリヌクレオチド中の病原性SNPを修正する、
方法。
157.  導入が、in vivoまたはex vivoである、実施形態156に記載の方法。
158.  細胞が、疾患を有する対象から得られるものである、実施形態156または157に記載の方法。
159.  疾患が、スタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、中鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症、重症複合免疫不全、原発性低シュウ酸尿症、常染色体劣性遺伝性高コレステロール血症、異染性白質ジストロフィー、マロトー・ラミー症候群（MSPVI）、I型シトルリン血症、ダリエ病、古典的ホモシスチン尿症、嚢胞性線維症、先天性脈絡膜欠如、神経セロイドリポフスチン症、常染色体優性難聴、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼII欠損症、シスチン症、常染色体劣性難聴、孤立性無ガンマグロブリン血症、先天性第XI因子欠乏症、先天性第V因子欠乏症、先天性第VII因子欠乏症、血友病A、血友病B、1型チロシン血症、常染色体優性遺伝性低リン酸血症性くる病、フォン・ギールケ病、地中海G6PD欠損症、モルキオ症候群（MPSIVA）、古典的ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルタリル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症、グリシン脳症、錐体桿体ジストロフィー、スライ症候群（MPSVII）、鎌状赤血球病、間欠性ポルフィリン症、レッシュ・ナイハン症候群、ハンター症候群、ハーラー症候群（MSPII）、網膜色素変性症、アンデルセン・タウィル症候群、メースマン角膜上皮変性症、パーキンソン病、サンフィリポ症候群B（MPSIIIB）、CADASIL症候群、青錐体全色覚異常、フェニルケトン尿症、ペンドレッド症候群、異型ポルフィリン症、神経セロイドリポフスチン症1、クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）、遺伝性慢性膵炎、レーバー先天性黒内障2、ブラックファン・ダイアモンド貧血、サンフィリポ症候群A（MPSIIIA）、A型ナイマン・ピック病、ATTRアミロイドーシス、網膜色素変性症/1C型アッシャー症候群、および筋細管ミオパシーからなる群から選択される、実施形態156から158のいずれか１つに記載の方法。
160.  標的ポリヌクレオチドが、表3Aまたは表3B中の遺伝子を含む、実施形態156から159のいずれか１つに記載の方法。
161.病原性アミノ酸変異が、表3Aまたは表3B中の病原性変異を含む、実施形態156から160のいずれか１つに記載の方法。
162.  ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、Cas9ドメインである、実施形態156から161のいずれか１つに記載の方法。
163.  Cas9ドメインが、ヌクレアーゼ不活性Cas9ドメインまたはCas9ニッカーゼドメインである、実施形態162に記載の方法。
164.  Cas9ドメインが、SpCas9ドメインを含む、実施形態162または163に記載の方法。
165.  SpCas9ドメインが、D10Aおよび/もしくはH840Aアミノ酸置換またはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態164に記載の方法。
166.  SpCas9ドメインが、NGN PAMに対する特異性を有する、実施形態164または165に記載の方法。
167.  Cas9ドメインが、アミノ酸置換D1135M、S1136Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E、およびT1337R、またはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態164から166のいずれか１つに記載の方法。
168.  SpCas9ドメインが、NG PAM、NNG PAM、GAA PAM、GAT PAM、またはCAA PAMに対する特異性を有する、実施形態164または165に記載の方法。
169.  SpCas9ドメインが、アミノ酸置換E480K、E543K、およびE1219Vまたはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態168に記載の方法。
170.  Cas9ドメインが、SaCas9を含む、実施形態162または163に記載の方法。
171.  SaCas9ドメインが、NNNRRT PAMに対する特異性を有する、実施形態170に記載の方法。
172.  SaCas9ドメインが、アミノ酸置換N579Aまたはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態170または171に記載の方法。
173.  SaCas9ドメインが、アミノ酸置換E782K、N968K、およびR1015H、またはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態170から172のいずれか１つに記載の方法。
174.  Cas9ドメインが、St1Cas9ドメインを含む、実施形態162または163に記載の方法。
175.  St1Cas9ドメインが、NNACCA PAMに対する特異性を有する、実施形態174に記載の方法。
176.  デアミナーゼドメインが、シチジンデアミナーゼドメインを含む、実施形態156から175のいずれか１つに記載の方法。
177.  シチジンデアミナーゼドメインが、APOBEC1ドメインを含む、実施形態176に記載の方法。
178.  デアミナーゼドメインが、アデノシンデアミナーゼドメインを含む、実施形態156から175のいずれか１つに記載の方法。
179.  アデノシンデアミナーゼドメインが、TadA7.10ドメインを含む、実施形態178に記載の方法。
180.  塩基エディターシステムが、UGIドメインをさらに含む、実施形態156から179のいずれか１つに記載の方法。
181.  塩基エディターシステムが、ジンクフィンガードメインをさらに含む、実施形態156から180のいずれか１つに記載の方法。
182.  塩基エディターシステムが、１つまたは複数のリンカーをさらに含む、実施形態156から181のいずれか１つに記載の方法。
183.  ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメイン、デアミナーゼドメイン、UGIドメインおよびジンクフィンガードメインのうちの2つ以上が、リンカーによって接続される、実施形態182に記載の方法。
184.  リンカーが、ペプチドリンカーであり、それによって、塩基編集融合タンパク質を形成する、実施形態183に記載の方法。
185.  塩基編集融合タンパク質が、BE4のアミノ酸配列を含む、実施形態184に記載の方法。
186.  塩基編集融合タンパク質が、
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFmqPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAkfLQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPrAFKYFDTTIaRKeYrSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDEGADKRTADGSEFESPKKKRKV
のアミノ酸配列を含む、実施形態184に記載の方法。
187.  脱アミノ化が、10%未満のインデル形成をもたらす、実施形態156から186のいずれか１つに記載の方法。
188.  ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸；
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインまたはそれをコードする核酸、および
デアミナーゼドメインまたはそれをコードする核酸
を含む塩基エディターシステムであって、
ガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターシステムをターゲティングして、標的ポリヌクレオチド中の病原性単一ヌクレオチド多型（SNP）の脱アミノ化を行うことができ、
病原性SNPが、表3Aまたは表3B中の病原性アミノ酸変異の原因となり、病原性SNPの脱アミノ化が、病原性SNPからその野生型アリルへの転換をもたらし、標的ポリヌクレオチドが、表3Aまたは表3B中の標的化配列を含む、
塩基エディターシステム。
【実施例】
【０５４５】
以下の実施例は、説明目的のためだけに提供され、本明細書に提供される特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
【０５４６】
（実施例1）
塩基エディター中のPAMバリアントの検証
新規CRISPR系およびPAMバリアントにより、塩基エディターは標的SNPで精密修正を行うことができる。いくつかの新規PAMバリアントを評価および検証した。PAM評価および塩基エディターの詳細は、例えば、国際出願PCT/2017/045381 （WO2018/027078）およびPCT/US2016/058344 （WO2017/070632）に記載されており、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature  551, 464-471 (2017); および Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)（それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
【０５４７】
（実施例2）
アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）を修正するための遺伝子編集
アルファ−１アンチトリプシン（A1AまたはA1AT）は、第14染色体上のSERPINA1遺伝子によってコードされるプロテアーゼ阻害因子である。この糖タンパク質は、主に肝臓で合成され、血中に分泌され、その血清濃度は、健康な成人では1.5〜3.0g/L（20〜52μmol/L）である。A1ATは、肺間質および肺胞上皮被覆液（alveolar lining fluid）に拡散し、そこでそれは好中球エラスターゼを不活化することによって、プロテアーゼ媒介性損傷から肺組織を保護する。アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）は、常染色体共優性様式で遺伝する。
【０５４８】
SERPINA1遺伝子の100種を超える遺伝子バリアントが記載されているが、全てが疾患と関連しているわけではない。これらのバリアントのアルファベットによる命名は、ゲル電気泳動上でのその移動速度に基づいている。最も一般的なバリアントは、M（中程度の移動度）アリルであり、2つの最も頻度が高い欠損アリルは、PiSおよびPiZ（後者が最も遅い移動速度を有する）である。測定可能な血清タンパク質を産生しないいくつかの変異が記載されている；これらのものは、「ヌル」アリルと呼ばれる。最も一般的な遺伝子型は、正常な血清レベルのアルファ−１アンチトリプシンを産生するMMである。重篤な欠損症を有する多くの人々は、Zアリルについてホモ接合性（ZZ）である。Zタンパク質は、肝細胞の小胞体中でのその産生中に、ミスフォールディングし、重合する；これらの異常なポリマーは、肝臓中で捕捉され、アルファ−１アンチトリプシンの血清レベルを大きく低下させる。アルファ−１アンチトリプシン欠損症を有する患者に見られる肝疾患は、肝細胞中での異常なアルファ−１アンチトリプシンタンパク質の蓄積ならびに自食作用、小胞体ストレス応答およびアポトーシスを含む、その後の細胞応答によって引き起こされる。図2は、アルファ−１アンチトリプシンの最も一般的な遺伝子型（MM、MZ、SS、SZおよびZZ）と、それぞれの血清レベルを示す。アルファ−１アンチトリプシンの循環レベルの低下は、肺における好中球エラスターゼ活性の増大をもたらす；プロテアーゼと抗プロテアーゼ活性とのこの不均衡は、この状態と関連する肺疾患をもたらす（図1）。
【０５４９】
アルファ−１アンチトリプシン欠損症（A1AD）は、白人において最も一般的であり、それは肺および肝臓に最も頻繁に影響する。肺では、最も一般的な兆候は、肺底において最も顕著である早発型（30代および40代の患者）汎細葉性肺気腫である。しかしながら、びまん性または上葉性気腫が起こり得、気管支拡張症も起こり得る。最も頻繁に記載される症状としては、呼吸困難、喘鳴および咳が挙げられる。罹患した個体の肺機能試験は、COPDと一致する所見を示す；しかしながら、気管支拡張剤に対する応答性が観察され、喘息として誤診されることがある。
【０５５０】
ZZ遺伝子型によって引き起こされる肝疾患は、様々な形で現れる。罹患した幼児は、新生児期に胆汁鬱滞性黄疸を呈することがあり、無胆汁便（薄い色または土色）および肝腫大を伴うこともある。血中の抱合型ビリルビン、トランスアミナーゼおよびガンマ-グルタミルトランスフェラーゼレベルが上昇する。年長児および成人における肝疾患は、トランスアミナーゼ上昇の偶発的所見または静脈瘤出血もしくは腹水を含む確立された肝硬変の兆候を呈し得る。アルファ−１アンチトリプシン欠損症はまた、患者に、肝細胞癌に罹りやすくさせる。ホモ接合性ZZ遺伝子型は肝疾患の発症にとって必要であるが、ヘテロ接合性Z変異は、C型肝炎感染および嚢胞性線維症肝疾患などにおいてより重篤な肝疾患のリスクをもたらすことによって、他の疾患についての遺伝学的修飾因子として作用し得る。
【０５５１】
A1ADの2つの最も一般的な臨床的バリアントは、E264V（PiS）およびE342K（PiZ）アリルである。半数を超えるA1AD患者が、少なくとも1コピーのE342K変異を担持する。相同性誘導型修復（HDR）によるヌクレアーゼゲノム編集は非効率的であり、豊富なインデルが、循環レベルを低下させ、肺症状を悪化させるであろう。肝臓に対するAAVによる遺伝子療法は、さらなるミスフォールディングされたタンパク質のため肝臓病理を悪化させる。野生型A1ATと、E342K A1ATをノックダウンするsiRNAとの両方をコードするAAVは、両方の病理に対処するのに有望である。
【０５５２】
図3Aは、SERPINA1遺伝子中の変異についての精密修正塩基編集戦略を示す。配列（A7）中の7位の「A」核酸塩基、「標的A」を編集して、野生型を回復させることができる。図3Bは、DNAエディター（E342K、D341G、E342G）によって生成される変異型アリルの関数としての、A1ATタンパク質分泌の特性評価を示す。HEK293Kに、A1ATバリアントをコードするベクターをトランスフェクトし、A1AT含量についてELISAによって上清を評価した。このアッセイは、WT A1ATと比較した、E342Kを含有するA1ATの分泌の減少を特徴付けた。その結果、PAMの選択肢が、SERPINA1配列の5位および/または7位の「A」（A5および/またはA7）の編集をもたらすと予想される、AGCTであることが示された。A1ATの機能は、A7編集が野生型タンパク質をもたらす場合；A5およびA7編集が342位のグルタミン酸（E）およびD341Gをもたらす場合；ならびにA7およびA8がWTおよびE342Gに転換される場合に回復することがわかった。組換え変異体A1ATの評価された表現型（活性/機能）は、細胞からのタンパク質の分泌と、好中球エラスターゼの阻害との両方を含んでいた。A1ATバリアントの機能的活性は、図3Cに示される（エラスターゼの阻害）。興味深いことに、D341G変異は、有意なエラスターゼ活性を有していたが、これはA5およびA7編集に関する回復的結果を確認するものである。図4は、ポリペプチドバリアント（例えば、アデノシンデアミナーゼバリアント）を生成するための戦略を示す。
【０５５３】
（実施例3）
HEK298T細胞中での塩基編集
異なる遺伝子中の様々なSNPの塩基編集効率を、HEK298T細胞中で試験した（表7）。プラスミドトランスフェクションのために、HEK293T細胞に、HEK293細胞のために最適化された高効率、低毒性DNAトランスフェクション試薬であるMirus TransIT293を用い、250ngのgRNAプラスミドおよび750ngの塩基エディタープラスミドを使用して3μl：1μgの比で一過的にトランスフェクトした。mRNAトランスフェクションのために、HEK293T細胞に、2つの20msパルスを用い1150VでNeon Systemを使用して3μgの全RNAをエレクトロポレーションした。プラスミドトランスフェクションについては4日後およびRNAエレクトロポレーションについては2日後、ゲノムDNAを、0.05%SDS、25μg/mlプロテイナーゼK、10mM Tris pH8.0を含有する単純溶解緩衝液を用いて細胞から抽出した後、85℃で熱不活化した。ゲノム部位をPCR増幅し、MiSeq上で配列決定した。それぞれの位置での塩基頻度について、およびインデルパーセントについて、記載されたように結果を分析した。例えば、インデル算出の詳細は、国際出願PCT/2017/045381 （WO2018/027078） およびPCT/US2016/058344 （WO2017/070632）に記載されており、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature  551, 464-471 (2017); および Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)（それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
表７．SNP補正の肝臓標的化編集
【表７】
2021523738.tif 000046
【０５５４】
（実施例4）
変異シャッフリングにより生成されたNGC-PAM ABEの改善
E342Kを含有するA1ATバリアントを発現するPiZ ORFが組み込まれたレンチウイルスカセットを含有する、HEK293T細胞（HEK293T-E342K）に、Lipo2000を使用して、ABEバリアントを発現するプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション後、A1ATにおける塩基編集を特性評価した。この手法により、以下のアミノ酸配列：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFmqPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAkfLQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPrAFKYFDTTIaRKeYrSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDEGADKRTADGSEFESPKKKRKV
を有するVar-3を含む、いくつかの改善されたABEが同定された。
【０５５５】
HEK293T-E342Kを、2.5μgのVar-3 ABE mRNAおよび1000ngのgRNA 191 20nt長を使用してNeonエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。
【０５５６】
spCas9塩基エディターのためのsgRNAとして提供されるgRNA骨格は、以下の通りである：
5’- GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC UUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’
【０５５７】
本発明の方法において有用なgRNAは、以下のもの：
5’-ACCAUCGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’;
5’-CCAUCGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’;
5’-CAUCGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’;
5’-AUCGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’;
5’-UCGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’; および
5’-CGACAAGAAAGGGACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’
を含む。
【０５５８】
mRNAおよびsgRNAを用いた編集は、主にA5およびA7でリンクしなかった。Var-3 ABEは他のABEバリアントよりも性能が非常に優れており、35%を超える総有益修正をもたらした（A7のみ=WT）+（A5+A7=WT+D341G-分泌の変化なし）。
【０５５９】
（実施例5）
HEK293T細胞中でのE342Kの修正のためのgRNA長の最適化
ABE Var-3のためのSynthego gRNAおよびmRNAを、Neon Systemを使用して2回反復でHEK293T-E342K中にトランスフェクトした。18および19ヌクレオチドの標的相補長を有するgRNAは、A5位と比較して、望ましいA7位でより良好な編集比をもたらした（図5）。このパターンは、トランケートされたgRNAがRループの接近可能領域を短縮し、かくして、gRNAの末端に近い位置の編集を低下させるメカニズムと一致している。
【０５６０】
18および19ヌクレオチドのgRNAおよびABE Var-3を、人工多能性幹細胞由来E342肝細胞およびPiZZマウスモデルにおいてE342K変異を修正するその能力について試験する。PAM結合特異性が改変されたSpCas9変異体を、NGC PAM進化を使用して生成した（図6A、6B）。これらのSpCas9変異体を、Cas9のPAM相互作用（PI）ドメイン内の変異について富化するために選択した。ライブラリーを、PAM特異性が改変されたSpCas9についてスクリーニングする。
【０５６１】
（実施例6）
1a型糖原病（フォン・ギールケ病）を修正するための遺伝子編集
1型糖原病（GSD1またはフォン・ギールケ病としても知られる）は、組織中でのグリコーゲンの蓄積と共に、グリコーゲン分解および糖新生の欠損をもたらす遺伝性障害であり、重度の低血糖および乳酸アシドーシスを引き起こし、CNS損傷を伴うこともある。米国の新生児100,000人のうち約1人がGSD1を伴って生まれている。
【０５６２】
異なる遺伝子変異によって引き起こされる、2つの型のGSD1、1a型（GSD1a）および1b型（GSD1b）が存在する。GSD1aは、グルコース-6-ホスファターゼ（G6PC）中の変異によって引き起こされ、GSD1を有する患者の約80%に影響する。白人患者の約25%が、劣性変異Q347*を担持する。現在の治療レジメンは、食事間の規則的または連続的なコーンスターチ供給を含む（アミラーゼがデンプンを直接グルコースに転換する）。
【０５６３】
Q347X変異の修正のための塩基編集戦略
G6PCの発現を回復させ、グルコース代謝を正常化するためのQ347*の直接修正が存在する。塩基エディターは、標的部位において効率的にA>G転換をすることによってQ347Xの修正のために使用することができる。代表的な標的部位（強調表示）を、図7に示す。この部位での精密修正は、以下の転換：TAG>CAG（終止コドン>グルタミン）をもたらす。塩基エディターは、NGG PAM認識配列またはNGA PAM認識配列のいずれかを利用し得る。組織および送達戦略は、肝臓脂質ナノ粒子（LNP）送達を含んでもよい。
【０５６４】
Q347X変異を有するiPSC由来肝細胞のin vitroでのトランスフェクション
iPSC由来肝細胞（Definigen, Lot 00419 F 002）中でin vitroトランスフェクション法を使用して、塩基編集を試験した。GSD1a iPSc由来肝細胞は、複合ヘテロ接合性であり（Q347X/G222R）、Q347X変異を有する。GSD1a細胞を播種し、成熟させた。
【０５６５】
図8Aおよび図8Bに示されるように、トランスフェクションスケジュールを、GSD1a iPSc由来肝細胞の既知の成熟サイクルに基づいて選択した。図8Aは、播種、トランスフェクション、および細胞収獲のための代表的な時点を示すトランスフェクションスケジュールの時系列を提供する。図8Bは、5日目および7日目でのGSD1a iPSC由来肝細胞の成熟の代表的な画像を示す。成熟後（例えば、12日目）、GSD1a細胞に、塩基エディターABE7.10 VRQR/gRNA 272をトランスフェクトした。トランスフェクションの48〜72h後（例えば、14日目）、GSD1aがトランスフェクトされた細胞を、gDNAのために収獲した。
【０５６６】
GSD1aに関するG6PC Q347Xの代表的な塩基編集精密修正を、図9Aおよび図9Bに示す。図9Aでは、ABE-オンターゲット、ABE-バイスタンダー、インデル、およびヌクレアーゼ-インデルに関するHEK293T細胞中でのG6PC Q347Xの塩基編集効率を、NGA PAMまたはNGG PAM配列のいずれかを使用して検査した。NGG PAMを使用するG6PCの標的/挿入配列を、以下に示す：
ggacct agg cga ggc agt ag ggg
【０５６７】
上記標的/挿入配列は、バイスタンダー（左の下線で示される）およびオンターゲット（右の下線で示される）に対応する2つの「a」核酸塩基を含有する。
【０５６８】
NGA PAMを使用するG6PCの標的/挿入配列を、以下に示す：
gacct agg cga ggc agt ag gga
【０５６９】
上記標的/挿入配列は、バイスタンダー（左の下線で示される）およびオンターゲット（右の下線で示される）に対応する2つの「a」核酸塩基を含有する。
【０５７０】
NGA PAM gRNA 272は、HEK293T細胞中でQ347Xの40%を超える精密修正をもたらし、インデルは低くバイスタンダーV384Aは検出されなかった。かくして、高い塩基編集効率が、HEK293細胞を使用して達成された。
【０５７１】
図9Bでは、ABE-オンターゲット、ABE-バイスタンダー、インデル、およびヌクレアーゼ-インデルに関する患者のiPSC由来肝細胞中でのG6PC Q347Xの塩基編集効率を、NGA PAMまたはNGG PAM配列のいずれかを使用して検査した。患者のiPSC由来肝細胞中でのG6PC Q347Xの同様の編集が、NGA（ｎ=4）とNGG（n=2）との両方について観察され、インデル、バイスタンダーV384Aは無視できる程度であった。図9Bに示されるように、ヘテロ接合性患者iPS由来Q347X肝細胞中での精密修正は、約8%〜15%のA>Gの転換効率をもたらした。HEK293細胞よりも低いが、Q347X iPSc肝細胞中での塩基編集は、バイスタンダーと比較してより明確な結果をもたらした。
【０５７２】
患者iPSc由来肝細胞における、ABEバリアントに関するAからGへの転換効率
G6PC Q347X患者iPSc由来肝細胞中で、ABEバリアントについてAからGへの転換効率を試験した。mRNAバリアントを生成し（TriLink pBxt464、MSP464、MSP465、MSP471）、培養の12日目にGSD1a患者iPSc由来肝細胞中にトランスフェクトした。14日目に、細胞をgDNA単離のために収獲し、PAS染色を行った。
【０５７３】
GGA PAMを使用するG6PCの標的/挿入配列を、以下に示す：
gacctaggcgaggcagtagg
【０５７４】
上記標的/挿入配列は、バイスタンダー（左の下線で示される）およびオンターゲット（右の下線で示される）に対応する2つの「a」核酸塩基を含有する。
【０５７５】
Q347Xの塩基編集修正効率のパーセントは、mRNAバリアント間で類似しており、ヘテロ接合性配列に関するAからGへの転換効率は約10%であった（図10）。
【０５７６】
（実施例7）
1型ムコ多糖症（ハーラー症候群）を修正するための遺伝子編集
1型ムコ多糖症（MPS1またはハーラー症候群としても知られる）は、新生児200,000人のうち約1人に生じる稀な常染色体劣性リソソーム蓄積症である。MPS1は、骨格異常、認知機能障害、心疾患、呼吸器問題、肥大した肝臓および脾臓、ならびに平均余命の減少を特徴とする。MPS1は、アルファ-L-イズロニダーゼ遺伝子（IDUA）の変異によって引き起こされ、リソソーム中でのグリコサミノグリカンの分解にとって必須であるアルファ-L-イズロニダーゼの欠損をもたらす。
【０５７７】
NCBI参照配列番号NP_032351.1の下で見出される、代表的なマウスアルファ-L-イズロニダーゼ（IDUA）タンパク質のアミノ酸配列を、以下に提供する：
1 MRPPRPSSAM LTFFAAFLAA PLALAESPYL VRVDAARPLR PLLPFWRSTG FCPPLPHDQA
61 DQYDLSWDQQ LNLAYIGAVP HSGIEQVRIH WLLDLITARK SPGQGLMYNF THLDAFLDLL
121 MENQLLPGFE LMGSPSGYFT DFDDKQQVFE WKDLVSLLAR RYIGRYGLTH VSKWNFETWN
181 EPDHHDFDNV SMTTQGFLNY YDACSEGLRI ASPTLKLGGP GDSFHPLPRS PMCWSLLGHC
241 ANGTNFFTGE VGVRLDYISL HKKGAGSSIA ILEQEMAVVE QVQQLFPEFK DTPIYNDEAD
301 PLVGWSLPQP WRADVTYAAL VVKVIAQHQN LLFANSSSSM RYVLLSNDNA FLSYHPYPFS
361 QRTLTARFQV NNTHPPHVQL LRKPVLTVMG LMALLDGEQL WAEVSKAGAV LDSNHTVGVL
421 ASTHHPEGSA AAWSTTVLIY TSDDTHAHPN HSIPVTLRLR GVPPGLDLVY IVLYLDNQLS
481 SPYSAWQHMG QPVFPSAEQF RRMRMVEDPV AEAPRPFPAR GRLTLHRKLP VPSLLLVHVC
541 TRPLKPPGQV SRLRALPLTH GQLILVWSDE RVGSKCLWTY EIQFSQKGEE YAPINRRPST
601 FNLFVFSPDT AVVSGSYRVR ALDYWARPGP FSDPVTYLDV PAS
【０５７８】
NCBI参照配列番号NM_008325.4の下で見出される、代表的なマウスアルファ-L-イズロニダーゼ（IDUA）核酸配列を、以下に提供する：
1 ctctgtgccc acccactgcc aagagggaca ggtctcaaag gtcagggcag tgtcccggga
61 aggagggcat cggctcctgg gagcggcctt aggacgcggg gtggactctc accatcgcac
121 aggaagccag ccagtcccca gatgaagtcc gagcagaggt ggcagaagag cacctacagg
181 cctccagcga gaccgagaca gccgcaagaa taatggccgc tctgagacac ccaagcactg
241 ctaatgttgg ttccattttt ggagcgcctg ggacgcagcg gaactcgcca gcacggggcg
301 gcgcgtgact gggttccttt ttgtcccggc ctggcgagag gtcacgtggg gcgttacgca
361 gaggcggaac actgcgaccg ccgcctaaaa agcttgctgt ttaggggcac ctggatatcc
421 caaccatgcg acccccgcgt ccctcctcag ctatgctgac gttttttgct gcgttcttgg
481 ccgcgccctt ggcgctggct gagtcaccgt acctggtgcg tgtggacgca gcccgcccgc
541 tgaggcctct gttgcccttc tggaggagca ccggcttctg ccccccactg cctcacgacc
601 aggctgacca gtacgacctt agttgggacc agcaactgaa ccttgcctac ataggtgccg
661 tacctcacag tggcattgag caggtccgga tacactggct gctggatctc atcacagcca
721 ggaagtcacc tgggcaggga cttatgtaca acttcaccca cttggatgca ttcttggacc
781 ttctcatgga gaaccagctt ctccctggat ttgagctcat gggcagtcct tctgggtact
841 tcacggactt tgatgacaag cagcaggtgt ttgaatggaa ggacctggtt tctctcttgg
901 ccaggagata cattggtagg tatgggctga cacacgtttc caagtggaac tttgagactt
961 ggaatgaacc agaccaccat gactttgaca acgtgtccat gaccacacaa ggcttcctga
1021 attactatga tgcctgctct gaggggctgc gcattgccag ccccactttg aagttgggtg
1081 gtcctgggga ttccttccac cccctgccaa ggtcaccaat gtgctggagc ctcctgggtc
1141 actgtgccaa tggaaccaac ttcttcactg gcgaggtggg cgtgcgtctg gattacatct
1201 ccctgcacaa gaagggtgca ggtagctcca tcgccatcct ggagcaggag atggcagttg
1261 tggagcaggt ccagcagctc ttccctgagt tcaaggatac ccctatttac aatgacgagg
1321 cagaccctct ggtgggctgg tccctgccac aaccttggag agctgatgtg acttatgcgg
1381 ccctggtggt gaaggtcatt gcacagcacc agaacctgct gtttgccaac agcagttcct
1441 ccatgcgcta tgtgctcctc agcaatgaca atgccttcct gagctaccac ccgtaccctt
1501 tctcccagcg cacacttact gctcgattcc aggtcaacaa tactcaccca ccccacgtgc
1561 agttgctgcg aaagccagta ctcacagtca tggggctcat ggccctgttg gatggagaac
1621 aactctgggc agaggtctca aaggctgggg ctgtgttgga cagcaatcat acagtgggtg
1681 tcctggccag cacccatcac cctgaaggct ccgcagcggc ctggagtacc acagtcctca
1741 tctacactag tgatgacacc cacgcacacc ccaaccacag tatccctgtg actcttcgcc
1801 tgcgtggggt acctcctggc ttggatcttg tctacatagt actctactta gacaatcaac
1861 tcagcagccc ctacagtgcg tggcagcaca tgggccagcc agtcttcccc tctgcagagc
1921 agttccgacg tatgcgcatg gtggaggacc ccgtggctga ggcaccacgc ccctttcctg
1981 ctaggggccg cctgacccta caccggaagc ttccggtgcc atcactcctg ctggtgcatg
2041 tatgcacacg ccccttgaag ccacctgggc aggtcagccg gctccgtgca ctgcccctga
2101 cacatggaca gctgattttg gtctggtcag atgagcgtgt gggctccaag tgcctgtgga
2161 catatgagat ccagttttcc cagaaaggtg aagagtatgc cccaatcaac aggaggccgt
2221 ctacttttaa cctctttgtg ttcagcccag acacagctgt ggtctctggc tcctaccgag
2281 ttcgagcatt ggattactgg gcccggccag gccccttctc cgaccctgtg acttacctgg
2341 atgtccctgc ctcatgagag ccactggctc ctagtgactt gtgaatctgt gctgactggt
2401 gaatggagtc aaccagtatg agctagactg ccattagcta ggcagctgac tgtcagcttc
2461 tattgttctt cccctatttc cctttaaagt gtctttctct acctcagact tagggtcagt
2521 ctttgtggct aagcacttta taggcccagt tggagtgacc tttgcccacc ttcctcccca
2581 tgcccagctg ttcaaaaagt ttaaatgtgg gactggaaag atggctcagt agataaagtg
2641 cttgctgtgc aggcccaggg acttgtgttc agatatctag cactcatgta taggctgggc
2701 atggcaatat atgcctattg tcctagtgtt ggtggaaggg acagagacag gccagggttc
2761 cctggccttc cagtctacct gaaactgcaa gctccaggtt cagtaagaaa ccctgtttta
2821 gaaaaatcaa gtagagtgct tggtacacac acacacacac acacacagag
2881 tctaaattta gtttcttgag cttctgtaat atcaaaaatg aagttatgta cttctgaaat
2941 acaatactgc acagagtaag catcttcatt ccaacaggaa aaagaaatga cagggaagga
3001 tttaagtgaa acaagaccaa agcatagcaa gacaaacgtt aaatcctgca gctccattct
3061 cagcatcggg gcccatgatc ctgtgatgtg ctggacagtc tgtgtctgtg gtgttgccat
3121 ttccagccgc catgaccttt ctcctaggct ggtgtcttgg gcttcctatt gattcgataa
3181 accgcgatga atgagcagaa gcatctgggt agggaagcgt tgacttcact tgtattccta
3241 cattacagtc tatcatcgaa ggcagtcagg caggcacctg gaggcaggaa gtcatggaga
3301 ggccatggag gggtgctgct tactcagact atgatcttac acatcccggg atcaccagcc
3361 aaagggtggg cccccaccca caacggtctg gaccctccca catcaatcac tagtttaaga
3421 aaacaggctt atctataggt caatcttgtt ggggcatttt tctcaattga ggttccttct
3481 tcccaaatga ctctagcttg taataaactg aaataaagcc accccaatct tgccacacat
3541 tacctggcct cccaagtctt cctttgaaat ctgggtggaa gccaacataa ccctgtcact
3601 gtaactctga tattctacct tctaagccag catcctgtgg atcacagcct actatcagct
3661 tgagtggtag ttgaggactc ctgggtcatc catggctaca ataagcatga agtgcctgag
3721 gcttagtccc atgcatttgt ggagaatatt atgatgatga tatctagtag aggggggagg
3781 ctgttcacct caaagggaac aggaagtaga gtggggatag aattaagcta aatacttctt
3841 cactgacccg ctttgtttaa ctcagccctg catcctaaag tttctagaat ctccccaaac
3901 agacctatta cctggaaact acctttaagg tgtaagcctg ggctgatctt aataggctga
3961 tgttcctacc ttggttctgg ccacgggaag aaccctctct cctttagtac aaacccctgg
4021 tgtgccccac cagagagcct gttggacaca cgtgtcctta attcattctg cacatttttc
4081 ttctctccat cagcacacag aagttcagca tacagaggtt tgtgctgaaa tgtaggcgta
4141 ctcccaagct ctccccagag tactatcacc tactgtccag gaaatgagtc tgagtgcagt
4201 gctcatatac actgcatggc tacatccaaa gtcagagttc ctctgccctc atgcctcttg
4261 aagtgaacga aatgtgatga ccttctgcag ggtgtttttt agtcctctgt ggaccctagg
4321 ctggccttgg catcttggct cacctgtccc agagttacta ctattaagat tacaggtgtg
4381 taccaccatg cctgccaatt acctctcact ttaaataaaa tatgacattt
【０５７９】
NCBI参照配列番号NP_000194.2の下で見出される、代表的なヒトアルファ-L-イズロニダーゼ（IDUA）タンパク質のアミノ酸配列を、以下に提供する：
1 MRPLRPRAAL LALLASLLAA PPVAPAEAPH LVHVDAARAL WPLRRFWRST GFCPPLPHSQ
61 ADQYVLSWDQ QLNLAYVGAV PHRGIKQVRT HWLLELVTTR GSTGRGLSYN FTHLDGYLDL
121 LRENQLLPGF ELMGSASGHF TDFEDKQQVF EWKDLVSSLA RRYIGRYGLA HVSKWNFETW
181 NEPDHHDFDN VSMTMQGFLN YYDACSEGLR AASPALRLGG PGDSFHTPPR SPLSWGLLRH
241 CHDGTNFFTG EAGVRLDYIS LHRKGARSSI SILEQEKVVA QQIRQLFPKF ADTPIYNDEA
301 DPLVGWSLPQ PWRADVTYAA MVVKVIAQHQ NLLLANTTSA FPYALLSNDN AFLSYHPHPF
361 AQRTLTARFQ VNNTRPPHVQ LLRKPVLTAM GLLALLDEEQ LWAEVSQAGT VLDSNHTVGV
421 LASAHRPQGP ADAWRAAVLI YASDDTRAHP NRSVAVTLRL RGVPPGPGLV YVTRYLDNGL
481 CSPDGEWRRL GRPVFPTAEQ FRRMRAAEDP VAAAPRPLPA GGRLTLRPAL RLPSLLLVHV
541 CARPEKPPGQ VTRLRALPLT QGQLVLVWSD EHVGSKCLWT YEIQFSQDGK AYTPVSRKPS
601 TFNLFVFSPD TGAVSGSYRV RALDYWARPG PFSDPVPYLE VPVPRGPPSP GNP
【０５８０】
NCBI参照配列番号NM_000203の下で見出される、代表的なヒトアルファ-L-イズロニダーゼ（IDUA）核酸配列を、以下に提供する：
1 agtgcagccc gaagccccgc agtccccgag cacgcgtggc catgcgtccc ctgcgccccc
61 gcgccgcgct gctggcgctc ctggcctcgc tcctggccgc gcccccggtg gccccggccg
121 aggccccgca cctggtgcat gtggacgcgg cccgcgcgct gtggcccctg cggcgcttct
181 ggaggagcac aggcttctgc cccccgctgc cacacagcca ggctgaccag tacgtcctca
241 gctgggacca gcagctcaac ctcgcctatg tgggcgccgt ccctcaccgc ggcatcaagc
301 aggtccggac ccactggctg ctggagcttg tcaccaccag ggggtccact ggacggggcc
361 tgagctacaa cttcacccac ctggacgggt acctggacct tctcagggag aaccagctcc
421 tcccagggtt tgagctgatg ggcagcgcct cgggccactt cactgacttt gaggacaagc
481 agcaggtgtt tgagtggaag gacttggtct ccagcctggc caggagatac atcggtaggt
541 acggactggc gcatgtttcc aagtggaact tcgagacgtg gaatgagcca gaccaccacg
601 actttgacaa cgtctccatg accatgcaag gcttcctgaa ctactacgat gcctgctcgg
661 agggtctgcg cgccgccagc cccgccctgc ggctgggagg ccccggcgac tccttccaca
721 ccccaccgcg atccccgctg agctggggcc tcctgcgcca ctgccacgac ggtaccaact
781 tcttcactgg ggaggcgggc gtgcggctgg actacatctc cctccacagg aagggtgcgc
841 gcagctccat ctccatcctg gagcaggaga aggtcgtcgc gcagcagatc cggcagctct
901 tccccaagtt cgcggacacc cccatttaca acgacgaggc ggacccgctg gtgggctggt
961 ccctgccaca gccgtggagg gcggacgtga cctacgcggc catggtggtg aaggtcatcg
1021 cgcagcatca gaacctgcta ctggccaaca ccacctccgc cttcccctac gcgctcctga
1081 gcaacgacaa tgccttcctg agctaccacc cgcacccctt cgcgcagcgc acgctcaccg
1141 cgcgcttcca ggtcaacaac acccgcccgc cgcacgtgca gctgttgcgc aagccggtgc
1201 tcacggccat ggggctgctg gcgctgctgg atgaggagca gctctgggcc gaagtgtcgc
1261 aggccgggac cgtcctggac agcaaccaca cggtgggcgt cctggccagc gcccaccgcc
1321 cccagggccc ggccgacgcc tggcgcgccg cggtgctgat ctacgcgagc gacgacaccc
1381 gcgcccaccc caaccgcagc gtcgcggtga ccctgcggct gcgcggggtg ccccccggcc
1441 cgggcctggt ctacgtcacg cgctacctgg acaacgggct ctgcagcccc gacggcgagt
1501 ggcggcgcct gggccggccc gtcttcccca cggcagagca gttccggcgc atgcgcgcgg
1561 ctgaggaccc ggtggccgcg gcgccccgcc ccttacccgc cggcggccgc ctgaccctgc
1621 gccccgcgct gcggctgccg tcgcttttgc tggtgcacgt gtgtgcgcgc cccgagaagc
1681 cgcccgggca ggtcacgcgg ctccgcgccc tgcccctgac ccaagggcag ctggttctgg
1741 tctggtcgga tgaacacgtg ggctccaagt gcctgtggac atacgagatc cagttctctc
1801 aggacggtaa ggcgtacacc ccggtcagca ggaagccatc gaccttcaac ctctttgtgt
1861 tcagcccaga cacaggtgct gtctctggct cctaccgagt tcgagccctg gactactggg
1921 cccgaccagg ccccttctcg gaccctgtgc cgtacctgga ggtccctgtg ccaagagggc
1981 ccccatcccc gggcaatcca tgagcctgtg ctgagcccca gtgggttgca cctccaccgg
2041 cagtcagcga gctggggctg cactgtgccc atgctgccct cccatcaccc cctttgcaat
2101 atatttttat attttattat tttcttttat atcttggtac caacgccccc tttaaagcgg
2161 ctttgcacag gtca
【０５８１】
塩基編集を、マウスおよびヒトのIDUA標的配列を用いて、HEK293T細胞株中で試験した（図11）。マウスIDUAの標的/挿入配列は、以下に示され、上に示されたマウスIDUA遺伝子配列の核酸1612〜1824に対応する。
atggagaaca actctaggca gaggtctcaa aggctggggc tgtgttggac agcaatcata cagtgggtgt cctggccagc acccatcacc ctgaaggctc cgcagcggcc tggagtacca cagtcctcat ctacactagt gatgacaccc acgcacaccc caaccacagt atccctgtga ctcttcgcct gcgtggggta cctcctggct tgg
【０５８２】
上のマウス標的/挿入配列は、「a」核酸塩基（太字および下線付きで示される）を含有するが、マウスIDUA遺伝子配列は、IDUA配列の1627位において「g」核酸塩基を含有する。
【０５８３】
ヒトIDUAポリヌクレオチド配列中の標的/挿入配列は、以下に示され、上に示されたヒトIDUA遺伝子配列の核酸1231〜1324に対応する。
atgaggagca gctctaggcc gaagtgtcgc aggccgggac cgtcctggac agcaaccaca cggtgggcgt cctggccagc gcccaccgcc ccca
【０５８４】
上のヒト標的/挿入配列は、「a」核酸塩基（太字および下線付きで示される）を含有するが、ヒトIDUA遺伝子配列は、IDUA配列の1246位に「g」核酸塩基を含有する。
【０５８５】
プラスミドトランスフェクションのために、48ウェルプレートのウェルあたり30,000個の細胞で、HEK293T細胞に、250ngのgRNAプラスミドおよび750ngの塩基エディタープラスミドをトランスフェクトした。NGG PAM配列を有する塩基エディターSpCas9-ABE7.10を使用した。マウスgRNA配列は、以下に示され、「a」核酸塩基（太字および下線付きで示される）を含有する：
gctctaggccgaagtgtcgc agg
【０５８６】
ヒトgRNA配列は、以下に示され、「a」核酸塩基（太字および下線付きで示される）を含有する：
actctaggcagaggtctcaa agg
【０５８７】
（実施例8）
材料および方法
本明細書に記載の実施例に提供される結果は、以下の材料および方法を使用して得られたものである。
【０５８８】
［クローニング］
使用した標的ポリヌクレオチドおよびgRNAおよびプライマーのDNA配列は、本明細書に記載される。gRNAについては、以下の足場配列が提示される：GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU。この足場を、本明細書の表に示されるPAM、例えば、NGG、NGA、NGC、NGT PAMのために使用した；gRNAは、本明細書に提供されるか、または当業者の知識に基づいて決定され、当業者には理解されるような、疾患関連遺伝子（例えば、表3Aおよび表3B）のための足場配列およびスペーサー配列（標的配列）を包含する（例えば、Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature 551, 464-471 (2017); Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017), および Rees, H.A., et al., “Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.” Nat Rev Genet. 2018 Dec;19(12):770-788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1)を参照されたい。
【０５８９】
PCRはVeraSeq ULtra DNAポリメラーゼ(Enzymatics) またはQ5 Hot Start High-Fidelity DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を用いて行った。USERクローニング(New England Biolabs)を用いて塩基エディター (BE) プラスミドを構築した。デアミナーゼ遺伝子はgBlocks Gene Fragments (Integrated DNA Technologies)として合成された。用いたCas9遺伝子は下記に示す。Cas9遺伝子は以前に報告されたプラスミドから得られた。デアミナーゼと融合遺伝子をpCMV (哺乳類コドン最適化)またはpET28b (大腸菌コドン最適化)の骨格にクローニングした。sgRNA発現プラスミドは、部位特異的変異誘発を用いて構築した。
【０５９０】
簡単に説明すると、上述のプライマーは、製造業者の指示に従ってT4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を用いて5’リン酸化した。次に、リン酸化プライマー、およびテンプレートとしての、目的の遺伝子をコードするプラスミドと共に、Q5 Hot Start High-Fidelity Polymerase (New England Biolabs)を用いて、製造業者の指示に従ってPCRを実施した。PCR産物をDpnI (20 U、New England Biolabs)と共に37℃で1時間インキュベートし、QIAprepスピンカラム (Qiagen) で精製し、製造業者の指示に従ってQuickLigase (New England Biolabs)を用いてライゲーションした。DNAベクター増幅はMach1コンピテント細胞(ThermoFisher Scientific)を用いて行った。
【０５９１】
［ssDNAに対するインビトロのデアミナーゼアッセイ］
すべてのssDNA基質の配列を下記に示す。Cy3標識基質はすべてIntegrated DNA Technologies (IDT) から入手した。デアミナーゼは、1μgのプラスミドを使用して、製造業者の指示に従ってTNT T7 Quick Coupled Transcription/Translation Kit (Promega) を使用してin vitroで発現させた。タンパク質発現に続いて、5μlの溶解物を、CutSmart緩衝液(New England Biolabs) (50 mM酢酸カリウム、29 mMトリス酢酸、10 mM酢酸マグネシウム、100μg ml-1 BSA、pH 7.9)中で35μlのssDNA (1.8μM)およびUSER酵素(1ユニット)と組み合わせ、37℃で2時間インキュベートした。切断されたU含有基質を、10% TBE‐尿素ゲル (Bio-Rad) 上で完全長未改変基質から分離した。
【０５９２】
［His6−rAPOBEC1−リンカー−dCas9融合体の発現および精製］
大腸菌BL21 STAR (DE 3) コンピテント細胞(ThermoFisher Scientific)を、pET28b-His6-rAPOBEC1-リンカー-dCas9をコードするプラスミドで形質転換した。得られた発現株を、カナマイシン100μg ml-1を含むLuria-Bertani (LB) ブロス中で37℃で一晩増殖させた。細胞を同じ増殖培地に1:100希釈し、OD600=〜0.6になるまで37℃で増殖させた。培養物を4℃で2時間冷却し、イソプロピル-β-d-1-チオガラクトピラノシド (IPTG) を0.5 mMで添加してタンパク質発現を誘導した。約16時間後、4,000 gで遠心分離して細胞を集め、溶解緩衝液(50 mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris) -HCl (pH 7.5)、1M NaCl、20%グリセロール、10 mMトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP、Soltec Ventures))に再懸濁した。細胞を超音波処理(20秒パルス・オン、20秒パルス・オフ、合計8分間、6 W出力)によって溶解し、25,000 gで15分間遠心分離した後に溶解物上清を単離した。溶解物をHis-Purニッケル-ニトリロ酢酸 (ニッケル-NTA) 樹脂(ThermoFisher Scientific)と共に4℃で1時間インキュベートし、His標識融合タンパク質を捕捉した。樹脂をカラムに移し、溶解緩衝液40 mlで洗浄した。Hisタグ融合タンパク質を、285 mMイミダゾールを補充した溶解緩衝液中で溶出し、限外濾過(100 kDa分子量カットオフのAmicon-Millipore)によって全容量1 mlに濃縮した。タンパク質を、50 mMトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン (Tris) -HCl (pH 7.0)、0.1 M NaCl、20%グリセロール、10 mM TCEPを含む低塩精製緩衝液中で20mlに希釈し、SPセファロースFast Flow樹脂(GE  Life Sciences)上にロードした。樹脂をこの低塩緩衝液40 mlで洗浄し、50 mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン (Tris) -HCl (pH 7.0)、0.5 M NaCl、20%グリセロール、10 mM TCEPを含む活性緩衝液5 mlでタンパク質を溶出した。溶出したタンパク質をSDS-PAGEで定量した。
【０５９３】
［sgRNAのin vitro転写］
T7プロモーターに続いて20-bp sgRNA標的配列を含む直鎖DNA断片を、製造業者の指示に従ってTranscriptAid T 7 High Yield Transcription Kit (ThermoFisher Scientific)を用いて、in vitroで転写した。製造業者の指示に従ってMEGAclear キット(ThermoFisher Scientific)を用いてsgRNA産物を精製し、UV吸収により定量した。
【０５９４】
［Cy3共役dsDNA基質の調製］
典型的には、無標識配列鎖（例えば80 ntの無標識鎖）を、PAGE精製オリゴヌクレオチドとしてIDT社にオーダーした。各80 nt基質の3’末端に相補的である25-nt Cy3標識プライマーは、HPLC精製オリゴヌクレオチドとしてIDTにオーダーした。Cy3標識dsDNA基質を生成するために、80 nt鎖(5μlの100μM溶液)を、Cy3標識プライマー(5μlの100μM溶液)とNEBuffer 2 (38.25μlの50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、1 mM DTT、pH 7.9溶液、New England Biolabs)中でdNTP (0.75μlの100 mM溶液)と組み合わせ、95℃で5分間加熱し、その後45℃まで0.1℃/秒の速度で徐々に冷却した。このアニーリング期間の後、Klenow exo-(5U、New England Biolabs)を加え、反応物を37℃で1時間インキュベートした。溶液を緩衝液PB (250μl、Qiagen)およびイソプロパノール(50μl)で希釈し、QIAprepスピンカラム(Qiagen) で精製し、50μlのTris緩衝液で溶出した。dsDNAに対するデアミナーゼアッセイ。精製した融合タンパク質(活性緩衝液中1.9μMを20μl)を1当量の適切なsgRNAと組み合わせ、周囲温度で5分間インキュベートした。Cy3標識dsDNA基質を125 nMの最終濃度で添加し、得られた溶液を37℃で2時間インキュベートした。緩衝液PB (100μl、Qiagen)およびイソプロパノール(25μl)の添加により融合物からdsDNAを分離し、EconoSpinマイクロスピンカラム(Epoch Life Science)で精製し、20μlのCutSmart緩衝液(New England Biolabs)で溶出した。精製された編集dsDNAにUSER酵素(1 U、New England Biolabs)を添加し、37℃で1時間インキュベートした。5μlの反応溶液を15μlのDMSOベースのローディング緩衝液(5 mM Tris、0.5 mM EDTA、12.5%グリセロール、0.02%ブロモフェノールブルー、0.02%キシレンシアン、80% DMSO)と組み合わせることによって、Cy3標識鎖をその相補鎖から完全に変性させた。全長C含有基質を、10% TBE-尿素ゲル(Bio-Rad) 上で、切断されたU含有編集基質から分離し、GE Amersham Typhoonイメージャー上で画像化した。
【０５９５】
［ハイスループットシークエンシングのためのin vitro編集dsDNAの調製］
オリゴヌクレオチドはIDT社から入手した。相補的配列をTris緩衝液中で組み合わせ(5μlの100μM溶液)、95℃に5分間加熱し、続いて45℃まで0.1℃/秒の速度で徐々に冷却することによってアニールし、60 bpのdsDNA基質を生成した。精製融合タンパク質(活性緩衝液中1.9μMを20μl)を1当量の適切なsgRNAと組み合わせ、周囲温度で5分間インキュベートした。60マーdsDNA基質を125 nMの最終濃度で添加し、得られた溶液を37℃で2時間インキュベートした。緩衝液PB (100μl、Qiagen)およびイソプロパノール(25μl)の添加により融合物からdsDNAを分離し、EconoSpinマイクロスピンカラム(Epoch Life Science)で精製し、20μlのTris緩衝液で溶出した。得られた編集されたDNA (1μlをテンプレートとして使用した)を、製造業者の指示に従ってハイスループット配列決定プライマー対およびVeraSeq Ultra (Enzymatics) を用いて13サイクルの増幅を伴うPCRによって増幅した。RapidTips (Diffinity Genomics)を用いてPCR反応生成物を精製し、精製したDNAを、シークエンシングアダプターを含むプライマーを用いてPCRにより増幅し、精製し、先に記載したようにMiSeqハイスループットDNAシークエンサー(Illumina) 上で配列決定した。
【０５９６】
［細胞培養］
HEK293T (ATCC CRL-3216)およびU2OS (ATCC HTB-96)を、10% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS) を補充したダルベッコの改変イーグル培地プラスGlutaMax (ThermoFisher) 中で、37℃、5% CO2で維持した。HCC1954細胞(ATCC CRL-2338)を、上記のように補充したRPMI-1640培地(ThermoFisher Scientific)中で維持した。目的遺伝子（例えばSERPINA1、G6PC、IDUA等）を含有する不死化細胞(Taconic Biosciences)を、10% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS) および200μg ml-1ゲネチシン(ThermoFisher Scientific)を補足したダルベッコの改変イーグル培地プラスGlutaMax (ThermoFisher Scientific)中で培養した。
【０５９７】
［トランスフェクション］
HEK293Tを、48ウェルのコラーゲン被覆BioCoatプレート(Corning) 上に播種し、約85%コンフルエントの状態でトランスフェクトした。簡単に述べれば、750 ngのBEおよび250 ngのsgRNA発現プラスミドを、1.5μlのリポフェクタミン2000 (ThermoFisher Scientific)/ウェルを用いて、製造業者のプロトコルに従ってトランスフェクトした。HEK293T細胞を、メーカーの指示に従って、適切なAmaxa Nucleofector IIプログラムを用いてトランスフェクトした(HEK 293T細胞のためのプログラムQ-001を用いるVキット)。
【０５９８】
［ゲノムDNA試料のハイスループットDNA配列決定］
トランスフェクトした細胞を3日後に収穫し、Agencourt DNAdvance Genomic DNA Isolation Kit (Beckman Coulter)を製造業者の指示に従って用いてゲノムDNAを単離した。対象のオン・ターゲットおよびオフ・ターゲットゲノム領域を、隣接するハイスループット配列決定プライマー対を用いたPCRによって増幅した。PCR増幅は、5 ngのゲノムDNAをテンプレートとして使用し、Phusion高忠実度DNAポリメラーゼ(ThermoFisher) を用いて、製造業者の指示に従って実施した。反応が直線的増幅範囲内で停止することを確実にするために、各プライマー対について別々にサイクル数を決定した。RapidTips (Diffinity Genomics)を用いてPCR産物を精製した。精製DNAを、配列決定アダプターを含むプライマーを用いたPCRにより増幅した。生成物をゲル精製し、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (ThermoFisher) およびKAPA Library Quantification Kit-Illumina (KAPA Biosystems)を用いて定量した。サンプルは、前述のようにIllumina MiSeq上で配列決定された(Pattanayak, Nature Biotechnol. 31, 839-843 (2013))。
【０５９９】
［データ分析］
配列決定リード（read）は、MiSeq Reporter (Illumina) を使用して自動的に脱マルチプレックス化され、個々のFASTQファイルを、カスタムMatlabを使用して分析した。各リードは、Smith-Watermanアルゴリズムを使用して、適切な参照配列にペアワイズでアラインメントされた。Qスコアが31未満の塩基コールはNに置き換え、ヌクレオチド頻度の計算から除外した。この処理により、予測されるMiSeq塩基呼び出しエラー率は約1,000分の1になる。リードと参照配列がギャップを含まないアラインメント配列は、アラインメントテーブルに保存し、そこから各遺伝子座について塩基頻度を表にすることができた。インデル頻度は、前述の基準(Zuris, et al., Nature Biotechnol. 33, 73-80 (2015)) を用いて、カスタムのMatlabスクリプトで定量した。配列決定リードをスキャンして、インデル（indel）が生じる可能性のあるウィンドウの両側に隣接する二つの10 bp配列との正確なマッチを探した。完全なマッチが見つからなかった場合、そのリードは分析から除外した。このインデルウィンドウの長さが参照配列と正確に一致した場合、そのリードはインデルを含まないものとして分類された。インデルウィンドウが参照配列よりも2塩基以上長いかまたは短い場合、その配列決定リードは、それぞれ挿入または欠失として分類された。
【０６００】
［配列］
以下の表8は、記載される実施形態において利用される野生型およびバリアント（E342K）SERPINA1によりコードされるアミノ酸配列ならびに野生型およびバリアント（E342K）SERPINA1ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ORF）核酸配列の代表的な一覧を提示する。
表８．例示的配列
【表８】
2021523738.tif 000047
2021523738.tif 000048
【図１】
2021523738.tif 000049
【図２】
2021523738.tif 000050
【図３】
2021523738.tif 000051
【図４】
2021523738.tif 000052
【図５】
2021523738.tif 000053
【図６Ａ】
2021523738.tif 000054
【図６Ｂ】
2021523738.tif 000055
【図７】
2021523738.tif 000056
【図８】
2021523738.tif 000057
【図９】
2021523738.tif 000058
【図１０】
2021523738.tif 000059
【図１１】
2021523738.tif 000060
【配列表】
2021523738000001.app
【国際調査報告】
2021523738.tif 000061
2021523738.tif 000062
2021523738.tif 000063
2021523738.tif 000064
2021523738.tif 000065
2021523738.tif 000066