(57)【要約】本開示は、以下：ａ）Ｒ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチド、またはＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸と、ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を含む核酸であって、ここで、この異種ヌクレオチド配列が、Ｒ２レトロトランスポゾン３’非翻訳領域（ＵＴＲ）及びＲ２レトロトランスポゾン５’ＵＴＲに隣接し、ここで、この異種ヌクレオチド配列が、少なくとも２００ヌクレオチドの長さを有する、核酸と、を含む遺伝子送達システムを提供する。本開示は、目的の１つ以上の遺伝子産物を真核細胞に送達する方法を提供し、この方法は、細胞を遺伝子送達媒体システムと接触させることを含む。【選択図】図１Ａ
2021530212.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、遺伝子送達媒体システム：
ａ）第１の核酸及び第２の核酸であって、
ｉ）該第１の核酸が、Ｒ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、及び
ｉｉ）該第２の核酸が、１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、ここで、該異種ヌクレオチド配列が、Ｒ２レトロトランスポゾン３’非翻訳領域（ＵＴＲ）及びＲ２レトロトランスポゾン５’ＵＴＲに隣接し、ここで、該異種ヌクレオチド配列が、少なくとも２００ヌクレオチドの長さを有する、
前記第１の核酸及び第２の核酸；または
ｂ）ポリペプチド及び核酸であって、
ｉ）該ポリペプチドがＲ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチドであり、及び
ｉｉ）該核酸が、１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、ここで、該異種ヌクレオチド配列が、Ｒ２レトロトランスポゾン３’ＵＴＲ及びＲ２レトロトランスポゾン５’ＵＴＲに隣接し、ここで、該異種ヌクレオチド配列が、少なくとも２００ヌクレオチドの長さを有する、
前記ポリペプチド及び核酸。
【請求項２】
前記Ｒ２ポリペプチドが、図７に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項３】
前記異種ヌクレオチド配列が、単一の異種遺伝子産物をコードする、請求項１または請求項２に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項４】
前記単一の異種遺伝子産物がポリペプチドである、請求項３に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項５】
前記単一の異種遺伝子産物がＲＮＡである、請求項３に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項６】
前記異種ヌクレオチド配列が、少なくとも第１の異種遺伝子産物及び第２の異種遺伝子産物をコードする、請求項１または請求項２に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項７】
前記第１の異種遺伝子産物がポリペプチドであり、前記第２の異種遺伝子産物がＲＮＡである、請求項６に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、キメラ抗原受容体である、請求項４に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項９】
前記第１の異種遺伝子産物が第１の異種ポリペプチドであり、前記第２の異種遺伝子産物が第２の異種ポリペプチドである、請求項６に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項１０】
前記異種ヌクレオチド配列が、５’から３’の順序で以下：
ｉ）前記第１の異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と；
ｉｉ）内部リボソーム侵入部位、または自己切断ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と；
ｉｉｉ）前記第２の異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と
を含む、請求項９に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項１１】
前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが一緒になってヘテロ二量体キメラ抗原受容体を形成する、請求項９に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項１２】
前記ポリペプチドがＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドであり、前記ＲＮＡがＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドに結合するガイドＲＮＡである、請求項７に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項１３】
前記Ｒ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、真核細胞中での発現のためにコドン最適化されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項１４】
１つ以上の異種遺伝子産物をコードする前記異種ヌクレオチド配列が、転写制御エレメントに機能的に連結されている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項１５】
前記転写制御エレメントが、調節可能なプロモーターである、請求項１４に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項１６】
前記転写制御エレメントが、構成的プロモーターである、請求項１４に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項１７】
前記異種ヌクレオチド配列が、少なくとも３キロバイトの長さを有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項１８】
前記異種ヌクレオチド配列が、約５ｋｂ〜約１０ｋｂの長さを有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項１９】
前記異種ヌクレオチド配列が、約１０ｋｂ〜約１５ｋｂの長さを有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の遺伝子送達媒体システム。
【請求項２０】
以下：
ａ１）Ｒ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸、及び
ｂ１）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を挿入するための挿入部位を含む第２の核酸であって、ここで、該挿入部位が、Ｒ２レトロトランスポゾン３’非翻訳領域（ＵＴＲ）及びＲ２レトロトランスポゾン５’ＵＴＲに隣接しており、ここで、該異種ヌクレオチド配列が、少なくとも２００ヌクレオチドの長さを有する、前記第２の核酸；または
ａ２）Ｒ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチド、及び
ｂ２）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を挿入するための挿入部位を含む核酸であって、該挿入部位が、Ｒ２レトロトランスポゾン３’ＵＴＲ及びＲ２レトロトランスポゾン５’ＵＴＲに隣接しており、該異種ヌクレオチド配列が、少なくとも２００ヌクレオチドの長さを有する、前記核酸
を備える、キット。
【請求項２１】
前記第１の核酸及び前記第２の核酸が別個の容器に入っている、請求項２０（ａ１及びｂ１）に記載のキット。
【請求項２２】
前記Ｒ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、真核細胞中での発現のためにコドン最適化されている、請求項２０（ａ１）に記載のキット。
【請求項２３】
前記第２の核酸が、前記挿入部位の５’側の転写制御エレメントをさらに含む、請求項２０（ｂ１）に記載のキット。
【請求項２４】
前記Ｒ２ポリペプチド及び前記核酸が別個の容器に入っている、請求項２０（ａ２及びｂ２）に記載のキット。
【請求項２５】
前記核酸が、前記挿入部位の５’側の転写制御エレメントをさらに含む、請求項２０（ｂ２）に記載のキット。
【請求項２６】
１つの以上の目的の遺伝子産物を真核細胞に送達する方法であって、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の遺伝子送達媒体システムと該細胞とを接触させることを含み、前記Ｒ２ポリペプチド、前記５’ＵＴＲ、及び前記３’ＵＴＲが、該真核細胞のゲノムの２８Ｓ領域への異種核酸の挿入を提供する、前記方法。
【請求項２７】
前記接触がインビトロである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記接触がインビボである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記接触がエクスビボである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記真核細胞が非ヒト動物細胞である、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記真核細胞がヒト細胞である、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記真核細胞が植物細胞である、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記真核細胞が無脊椎動物細胞である、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１８年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／６９７，８２９号の恩典を主張するものであり、この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
序説
遺伝子治療は、ヒトの疾患を治療する技術としてますます成功を収めている。遺伝子治療は、目的の遺伝子産物をコードするコード領域を含む核酸の送達を含み、この遺伝子産物は、特定の細胞における異常な挙動を修正するための機能の獲得または喪失を提供し得る。送達は概して、ウイルスを介した送達と、ウイルスを介さない送達という、２つの主なカテゴリに分類される。さらに、核酸の送達は、核酸の全部または一部の、宿主細胞ＤＮＡへの一過性の発現または不可逆的な組み込みのいずれかをもたらす。ウイルスを介した組み込み的アプローチは、分裂細胞において最も一般的に使用され、送達は、例えば、治療用ＤＮＡを細胞に運ぶように操作されたレンチウイルス及びレトロウイルスの使用により媒介される。このようなウイルスは、宿主細胞のゲノムへの安定した組み込みに効果的であるものの、いくつかの欠点がある。細胞のゲノム内のランダムな位置への組み込みにより、細胞の機能が破壊される場合があり、最終的には細胞自体の機構によって発現が抑制されることさえある。さらに、ウイルス法は、送達されるコード領域のサイズがレトロウイルス及びレンチウイルスについてそれぞれ６キロベース（ｋｂ）または８ｋｂを超える場合、目的の遺伝子産物をコードするコード領域をパッケージング及び送達する能力に深刻な問題を抱えている。多くの遺伝子治療は、パッケージング制限内のコード領域を含むが、遺伝子産物のコード領域の長さはすでに８ｋｂで最大制限に近づいており、より大きなｃＤＮＡ、調節エレメント、または複数の遺伝子の追加によって、インサートのサイズは現在のウイルス送達媒体が収容し得るよりも大きくなるであろう。
【０００３】
ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、及びＴｏｌ２などのクラスＩＩトランスポゾンは、より大きなペイロードを組み込み得る；ただし、このようなトランスポゾンには欠点がある。例えば、ＤＮＡトランスポゾンは、ゲノム内の特定だが共通の部位に組み込まれる場合があり（注目すべきことに、転位因子は一般にゲノムの４５％を構成する）、活発な転写が起こっている領域に組み込まれる傾向があるものもある。
【０００４】
より大きなコード領域の送達を提供する送達媒体が当該技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本開示は、以下：ａ）Ｒ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸と、ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を含む第２の核酸であって、ここで、この異種ヌクレオチド配列が、Ｒ２レトロトランスポゾン３’非翻訳領域（ＵＴＲ）及びＲ２レトロトランスポゾン５’ＵＴＲに隣接し、この異種ヌクレオチド配列の長さが最大約１５キロベースである、第２の核酸と、を含む遺伝子送達システムを提供する。本開示は、目的の１つ以上の遺伝子産物を真核細胞に送達する方法を提供し、この方法は、細胞を遺伝子送達媒体システムと接触させることを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】Ｒ２  ＵＴＲターゲティング配列に隣接する導入遺伝子をコードするデュアルベクター組み込みシステムの概略図。
【図１Ｂ】Ｒ２による組み込み機構の、提唱された機構。
【図２】本開示の遺伝子送達システムを使用して送達された遺伝子の２８Ｓ  ｒＤＮＡにおけるゲノム組み込み接合部の分析を示す。
【図３】本開示の遺伝子送達システムを使用して送達された遺伝子の２８Ｓ  ｒＤＮＡにおけるゲノム組み込み接合部の分析を示す。
【図４】細胞のトランスフェクション及び継代のためのプロトコルを示し、本開示の遺伝子送達システムをトランスフェクションした後の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を示すデータを提示する。
【図５】図５Ａ及びＢは、導入遺伝子の発現に対する最適化されたＲ２（「ＯＲ２」）の効果を示す。
【図６Ａ】本開示の遺伝子送達システムを細胞にトランスフェクトした後のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現を示し、ここで、この異種核酸は、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含んでいた。
【図６Ｂ】本開示の遺伝子送達システムを細胞にトランスフェクトした後のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現を示し、ここで、この異種核酸は、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含んでいた。
【図７】Ｒ２ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）のアミノ酸配列を示す。
【図８】５’ＵＴＲのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）を示す。
【図９】３’ＵＴＲのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）を示す。
【図１０】本開示の遺伝子送達システムをトランスフェクションした１４日後に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞のパーセントを示す。
【図１１】本開示の遺伝子送達システムをトランスフェクションした１４日後のハイグロマイシン耐性ＨＥＫ２９３コロニーの数を示す。
【図１２】本開示の遺伝子送達システムをトランスフェクションした１４日後のｃ−ｍｙｃ＋ＨＥＫ２９３細胞のパーセントを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
定義
本明細書で使用される場合、「異種」とは、天然の（例えば、天然に存在する）核酸またはタンパク質それぞれの中には見られないヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。
【０００８】
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖、もしくは多重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリン塩基及びピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。
【０００９】
「機能的に連結した」とは、近接した配置を指し、そのように説明される構成要素は、それらがその意図される様式で機能することを可能する関係にある。例えば、プロモーターは、当該プロモーターがその転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列と機能的に連結している。
【００１０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これは、遺伝的にコードされた、及び遺伝的にコードされていないアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾された、または誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。この用語は、融合タンパク質を含み、これには、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有するかまたは有さない異種及び同種リーダー配列との融合体；免疫学的にタグ付けされたタンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
本明細書で互換的に使用される「キメラ抗原受容体」及び「ＣＡＲ」という用語は、細胞外ドメイン（例えば、リガンド／抗原結合ドメイン）、膜貫通ドメイン及び１つ以上の細胞外シグナル伝達ドメインを一般的に含むがそれだけではない、免疫細胞の活性化を誘発または阻害し得る人工マルチモジュール分子を指す。「ＣＡＲ」という用語は、ＣＡＲ分子に特に限定されず、ＣＡＲバリアントも含む。ＣＡＲバリアントは、ＣＡＲの細胞外部分（例えば、リガンド結合部分）及び細胞内部分（例えば、細胞内シグナル伝達部分）が２つの別個の分子上に存在する、分割ＣＡＲを含む。ＣＡＲバリアントはまた、条件付きで活性化可能なＣＡＲであるオンスイッチＣＡＲを含み、例えば、分割ＣＡＲの２つの部分の条件付きヘテロ二量体化が薬理学的に制御される分割ＣＡＲを含む。ＣＡＲバリアントはまた、第一のＣＡＲの活性を増幅または阻害することができる第二のＣＡＲ結合ドメインを含む二重特異性ＣＡＲを含む。ＣＡＲバリアントはまた、例えば、二次ＣＡＲ結合ドメインの結合が一次ＣＡＲ活性化の阻害をもたらす二重特異性ＣＡＲシステムの構成要素として使用され得る阻害性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）を含む。ＣＡＲ分子及びその誘導体（すなわち、ＣＡＲバリアント）は、例えば、ＰＣＴ出願番号ＵＳ２０１４／０１６５２７；Ｆｅｄｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ（２０１３）；５（２１５）：２１５ｒａ１７２；Ｇｌｉｅｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２０１５）６：２１；Ｋａｋａｒｌａ  ＆  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ  ５２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ（２０１４）２０（２）：１５１−５；Ｒｉｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ（２０１４）２０（２）：１４１−４；Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ（２０１４）２０（２）：１２７−３３；Ｃｈｅａｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ（２０１４）２５７（１）：９１−１０６；Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ（２０１４）６５：３３３−４７；Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ（２０１３）３（４）：３８８−９８；Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１０）９５６３０４に記載されており；その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１２】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。いくつかの実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓＦｖは抗原結合のための所望の構造を形成し得る。ｓＦｖの概説については、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照のこと。
【００１３】
本明細書中で使用する場合、用語「ナノボディ」（Ｎｂ）とは、天然の重鎖抗体に由来する最小抗原結合断片または単一可変ドメイン（ＶＨＨ）を指し、これは当業者には公知である。これらはラクダに見られる重鎖のみ抗体に由来する（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。「ラクダ科」ファミリーでは、軽鎖ポリペプチドを欠損した免疫グロブリンが見出される。「ラクダ科」には、旧世界ラクダ科動物（ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）及びフタコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ））及び新世界ラクダ科動物（例えば、アルパカ（Ｌｌａｍａ  ｐａｃｃｏｓ）、リャマ（Ｌｌａｍａ  ｇｌａｍａ）、グアナコ（Ｌｌａｍａ  ｇｕａｎｉｃｏｅ）、及びビクーニャ（Ｌｌａｍａ  ｖｉｃｕｇｎａ））が含まれる。単一可変ドメイン重鎖抗体は、本明細書中ではナノボディまたはＶＨＨ抗体と呼ばれる。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「処置」、「処置すること」、「処置する」等の用語は、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという観点では予防的であってもよく、及び／または、疾患及び／もしくはその疾患に起因する副作用の部分的もしくは完全な治癒という観点では治療的であってもよい。本明細書で使用される場合、「処置」とは、哺乳動物、特に、ヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）その疾患にかかりやすいが、まだそれに罹患していると診断されていない対象における発病を予防すること、（ｂ）その疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること、及び（ｃ）その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患の退行を引き起こすことを含む。
【００１５】
本明細書で互換的に使用される「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、ネズミ（ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）、ウサギ目などを含むがこれらに限定されない哺乳動物を指す。いくつかの場合には、個体はヒトである。いくつかの場合には、個体は非ヒト霊長類である。いくつかの場合には、個体は齧歯類、例えばラットまたはマウスである。いくつかの場合には、個体はウサギ目、例えばウサギである。
【００１６】
本発明をさらに記載する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、言うまでもなく、異なり得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載するためのものに過ぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するものとしては意図されないことも理解されたい。
【００１７】
値の範囲が示される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値と下限値との間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、独立して、そのより小さい範囲内に含まれてもよく、また、表示範囲内の任意の具体的な除外限度に従って、本発明に包含される。表示範囲がそれらの限界値のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含される限界値のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に包含される。
【００１８】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と同様もしくは同等の任意の方法及び材料を、本発明の実践または試験においても使用してもよいが、好ましい方法及び材料がこれから記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、それらの刊行物が引用されるものに関連して方法及び／または材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が別途明らかに規定しない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「Ｒ２ポリペプチド（ａｎ  Ｒ２  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、複数のそのようなポリペプチドを含み、「異種遺伝子産物（ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ）」への言及は、１つ以上の異種遺伝子産物及び当業者に公知のそれらの同等物などへの言及を含む。特許請求の範囲はあらゆる任意の要素を除外するように作成され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関して、「単に」、「のみ」などのような排他的な用語法の使用、または「否定的な」制限の使用に対する先行記載となることが意図される。
【００２０】
明確化のために別個の実施形態の文脈において記載される、本発明の特定の特徴を、単一の実施形態において組み合わせて提供してもよいことが理解される。反対に、簡潔化のために単一の実施形態の文脈において記載される本発明の様々な特徴を、別個に、または任意の好適な副組み合わせで提供することもできる。本発明に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって特異的に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個々にかつ明示的に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態及びそれらの要素の全ての副組み合わせもまた、本発明によって特異的に包含され、ありとあらゆるそのような副組み合わせが個々にかつ明示的に本明細書に開示されたかのように本明細書に開示される。
【００２１】
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によるそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、別個に確認する必要がある場合がある。
【００２２】
詳細な説明
本開示は、以下：ａ）Ｒ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチド、またはＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸と、ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を含む核酸であって、ここで、この異種ヌクレオチド配列が、Ｒ２レトロトランスポゾン３’非翻訳領域（ＵＴＲ）及びＲ２レトロトランスポゾン５’ＵＴＲに隣接し、ここで、この異種ヌクレオチドが少なくとも２００ヌクレオチドの長さを有する、核酸と、を含む遺伝子送達システムを提供する。Ｒ２ポリペプチド、５’ＵＴＲ、及び３’ＵＴＲは、真核細胞のゲノムの２８Ｓ領域への異種核酸の挿入を提供する。本開示は、目的の１つ以上の遺伝子産物を真核細胞に送達する方法を提供し、この方法は、細胞を遺伝子送達媒体システムと接触させることを含む。
【００２３】
Ｒ２タンパク質は、２８Ｓ  ｒＤＮＡの多くの種間で保存されているＤＮＡ配列の５’及び３’部位を認識する。Ｒ２タンパク質は、Ｒ２コード配列の５’及び３’側に転写されたＲＮＡと相互作用して結合する。Ｒ２タンパク質が５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲのどちらに結合するかに基づいて、Ｒ２タンパク質は、標的部位の上流または下流の２８Ｓ  ＤＮＡと相互作用する。本組み込みモデルは、３’ＵＴＲ  ＲＮＡに結合したＲ２タンパク質が切断部位の上流に結合し、タンパク質のエンドヌクレアーゼドメインを介して３’末端にニックを入れるというものである。ここから、Ｒ２は標的プライミング逆転写（ＴＰＲＴ）のプロセスを開始し、Ｅｉｃｋｂｕｓｈ  ｅｔ  ａｌ．によって提案されたように２８Ｓ領域内のＤＮＡの３’鎖を合成する（図１）。Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｐｅｃｔｒ．３，ＭＤＮＡ３−００１１−２０１４（２０１５）。
【００２４】
一旦、それが完了すれば、下流の関連Ｒ２タンパク質またはネイティブ複製機構のいずれかが第２鎖合成を開始する。最終結果は、目的の導入遺伝子（「異種核酸」または「異種ヌクレオチド配列」）のネイティブ２８Ｓ  ｒＤＮＡ部位への組み込みである。
【００２５】
遺伝子送達システム
本開示は、以下：ａ）Ｒ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸と、ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を含む第２の核酸であって、ここで、この異種ヌクレオチド配列が、Ｒ２レトロトランスポゾン３’ＵＴＲ及びＲ２レトロトランスポゾン５’ＵＴＲに隣接し、この異種ヌクレオチド配列が、少なくとも２００ヌクレオチドの長さを有する、第２の核酸と、を含む遺伝子送達システムを提供する。この第１及び第２の核酸はＲＮＡであってもよい。この第１及び第２の核酸はＤＮＡであってもよい。
【００２６】
いくつかの場合には、第２の核酸は、５’から３’の順序で以下を含む：ｉ）Ｒ２  ５’ＵＴＲ、ｉｉ）プロモーター、ｉｉｉ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列、及びｉｖ）Ｒ２  ３’ＵＴＲ。いくつかの場合には、第２の核酸は、５’から３’の順序で以下を含む：ｉ）Ｒ２  ５’ＵＴＲ、ｉｉ）プロモーター、ｉｉｉ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列、ｉｖ）ポリアデニル化（ポリＡ）配列；及びｖ）Ｒ２  ３’ＵＴＲ。いくつかの場合には、例えば、プロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである場合、１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列は、Ｒ２  ５’ＵＴＲ及びＲ２  ３’ＵＴＲに対して反対の（逆の）方向にある。すなわち、１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列は、３’から５’の方向にある。いくつかの場合には、例えば、プロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターである場合、１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列は、Ｒ２  ５’ＵＴＲ及びＲ２  ３’ＵＴＲと同じ方向にある。すなわち、１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向にある。プロモーターは、１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列に機能的に連結されている。いくつかの場合には、プロモーターは、１つ以上の異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列に対して異種である。
【００２７】
本開示は、以下：ａ）Ｒ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチドと、ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を含む核酸であって、ここで、この異種ヌクレオチド配列が、Ｒ２レトロトランスポゾン３’ＵＴＲ及びＲ２レトロトランスポゾン５’ＵＴＲに隣接し、この異種ヌクレオチド配列が、少なくとも２００ヌクレオチドの長さを有する、核酸と、を含む遺伝子送達システムを提供する。
【００２８】
Ｒ２ポリペプチド
本開示の遺伝子送達システムの第１の核酸（この遺伝子送達システムは第１の核酸及び核酸を含む）によってコードされるＲ２ポリペプチド、または本開示の遺伝子送達システムに存在するＲ２ポリペプチド（この遺伝子送達システムはＲ２ポリペプチド及び核酸を含む）は、図７に示されるＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。Ｒ２ポリペプチドは、１１０５アミノ酸〜１１２５アミノ酸、例えば、約１１０５アミノ酸〜約１１１０アミノ酸、約１１１０アミノ酸〜約１１１５アミノ酸、約１１１５アミノ酸〜約１１２０アミノ酸、または約１１２０アミノ酸〜約１１２５アミノ酸の長さを有し得る。いくつかの場合には、Ｒ２ポリペプチドの長さは１１１４アミノ酸である。
【００２９】
５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ
適切な５’ＵＴＲは、Ｒ２レトロトランスポゾンの任意の５’ＵＴＲである。Ｒ２レトロトランスポゾン５’ＵＴＲのヌクレオチド配列は当技術分野で公知であり、そして、そのような５’ＵＴＲは、本開示の遺伝子送達システムに含まれ得る。
【００３０】
いくつかの場合には、適切な５’ＵＴＲは、図８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、適切な５’ＵＴＲの長さは約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１１００ｎｔ、例えば約１０００ｎｔ〜約１０２５ｎｔ、約１０２５ｎｔ〜約１０５０ｎｔ、約１０５０ｎｔ〜約１０７５ｎｔ、または約１０７５ｎｔ〜約１１００ｎｔである。いくつかの場合には、適切な５’ＵＴＲの長さは、約１０５０ｎｔ〜約１０６０ｎｔである。いくつかの場合には、適切な５’ＵＴＲの長さは、１０５６ｎｔである。
【００３１】
いくつかの場合には、適切な３’ＵＴＲは、図９に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、適切な３’ＵＴＲの長さは約４７５ｎｔ〜約５５０ｎｔ、例えば約４７５ｎｔ〜約５００ｎｔ、約５００ｎｔ〜約５２５ｎｔ、または約５２５ｎｔ〜約５５０ｎｔである。いくつかの場合には、適切な３’ＵＴＲの長さは、約５００ｎｔ〜約５１０ｎｔである。いくつかの場合には、適切な３’ＵＴＲの長さは、５０２ｎｔである。
【００３２】
異種ヌクレオチド配列
上記のように、本開示の遺伝子送達システムの第２の核酸は、１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列（本明細書では「異種核酸」とも呼ばれる）を含み、この異種ヌクレオチド配列は、少なくとも２００ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有する。例えば、いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約２００ｎｔ〜約３００ｎｔ、約３００ｎｔ〜約４００ｎｔ、約４００ｎｔ〜約５００ｎｔ、約５００ｎｔ〜約７５０ｎｔ、約７５０ｎｔ〜約１キロベース（ｋｂ）、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ〜約３ｋｂ、または約３ｋｂ〜約３．５ｋｂの長さを有する。別の例として、いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約３．５ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約４．５ｋｂ、約４．５ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約５．５ｋｂ、約５．５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約６．５ｋｂ、約６．５ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９からｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１１ｋｂ、約１１ｋｂ〜約１２ｋｂ、約１２ｋｂ〜約１３ｋｂ、約１３ｋｂ〜約１４ｋｂ、または約１４ｋｂ〜約１５ｋｂの長さを有する。いくつかの場合には、異種ヌクレオチド配列は、約２００ｎｔ〜約１ｋｂの長さを有する。いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約１ｋｂ〜約５ｋｂの長さを有する。いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約３．５ｋｂ〜約６ｋｂの長さを有する。いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約６ｋｂ〜約８ｋｂの長さを有する。いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約８ｋｂ〜約１５ｋｂの長さを有する。いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約９ｋｂ〜約１５ｋｂの長さを有する。いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約１０ｋｂ〜約１５ｋｂの長さを有する。
【００３３】
この異種遺伝子産物がポリペプチドである場合には、この異種ヌクレオチド配列は、５０アミノ酸を超える長さを有する単一の異種遺伝子産物をコードし得る。この異種遺伝子産物がポリペプチドである場合には、この異種ヌクレオチド配列は、２００アミノ酸を超える長さを有する単一の異種遺伝子産物をコードし得る。この異種遺伝子産物がポリペプチドである場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約５０アミノ酸（ａａ）〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約２００ａａ、約２００ａａ〜約３００ａａ、約３００ａａ〜約４００ａａ、約４００ａａ〜約５００ａａ、約５００ａａ〜約７５０ａａ、約７５０ａａ〜約１０００ａａ、約１０００ａａ〜約１５００ａａ、約１５００ａａ〜約２０００ａａ、約２０００ａａ〜約２５００ａａ、または約２５００ａａ〜約３０００ａａの長さを有する単一の異種遺伝子産物をコードし得る。この異種遺伝子産物がポリペプチドである場合には、この異種ヌクレオチド配列は、最大３０００アミノ酸の長さを有する単一の異種遺伝子産物をコードし得る。この異種遺伝子産物がポリペプチドである場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約３０００ａａ〜約５，０００ａａの長さを有する単一の異種遺伝子産物をコードし得る。この異種遺伝子産物が２つ以上のポリペプチドである場合、この異種ヌクレオチド配列は、最大３０００アミノ酸（ａａ）、最大４０００ａａ、または最大５０００ａａの合計長さを有する２つ以上の異種遺伝子産物をコードし得る。この異種遺伝子産物が２つ以上のポリペプチドである場合、この異種ヌクレオチド配列は、合計長が５０００ａａを超える２つ以上の異種遺伝子産物をコードし得る。この異種遺伝子産物が核酸である場合、この異種ヌクレオチド配列は、少なくとも２００ｎｔの長さ（例えば、約２００ｎｔ〜約５００ｎｔ、約５００ｎｔ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約１０ｋｂ、または約１０ｋｂ〜約１５ｋｂ）を有する単一の異種遺伝子産物をコードし得る。この異種遺伝子産物が２つ以上の核酸である場合、この異種ヌクレオチド配列は、少なくとも２００ｎｔの合計長さ（例えば、約２００ｎｔ〜約５００ｎｔ、約５００ｎｔ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約１０ｋｂ、または約１０ｋｂ〜約１５ｋｂ）を有する異種遺伝子産物をコードし得る。異種ヌクレオチド配列が、核酸である第１の遺伝子産物及びポリペプチドである第２の遺伝子産物をコードする場合、この異種ヌクレオチド配列は、例えば、遺伝子産物の長さの任意の組み合わせをコードし得、その結果、２つの遺伝子産物をコードするコード配列の合計長さは少なくとも２００ｎｔ（例えば、約２００ｎｔ〜約５００ｎｔ、約５００ｎｔ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約１０ｋｂ、または約１０ｋｂ〜約１５ｋｂ）である。
【００３４】
いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムの第２の核酸は、単一の異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムの第２の核酸は、単一の異種核酸をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムの第２の核酸は、以下：ａ）第１の異種ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と；ｂ）第２の異種ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムの第２の核酸は、以下：ａ）第１の異種ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と；ｂ）第２の異種ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列と、ｃ）第３の異種ポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムの第２の核酸は、以下：ａ）異種ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、ｂ）異種核酸をコードする第２のヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムの第２の核酸は、以下：ａ）異種ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、ｂ）異種核酸をコードする第２のヌクレオチド配列と、ｃ）第３の異種核酸をコードする第３のヌクレオチド配列と、を含む。
【００３５】
異種ヌクレオチド配列が２つ以上の遺伝子産物をコードする場合（例えば、この異種ヌクレオチド配列が、第１の異種遺伝子産物をコードする第１のヌクレオチド配列、及び第２の異種遺伝子産物をコードする第２のヌクレオチド配列を含む場合など）、いくつかの場合には、核酸リンカーは、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間（または遺伝子産物をコードする任意の２つのヌクレオチド配列との間）に提供される。核酸リンカーは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）であってもよい。核酸リンカーは、第１のヌクレオチド配列の３’末端を第２のヌクレオチド配列の５’末端に連結する自己切断２Ａペプチド（Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａなど）をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【００３６】
いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムの第２の核酸は、以下：ａ）第１の異種ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、ｂ）第２の異種ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列とを含み、ここで、この第１及び第２のヌクレオチド配列は、単一のプロモーターの制御下にある。いくつかの場合には、このプロモーターは第１のヌクレオチド配列の５’末端に機能的に連結されており、ＩＲＥＳ及び自己切断２Ａペプチド（Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａなど）をコードする核酸からなる群より選択される核酸リンカー（第１のヌクレオチド配列の３’末端を第２のヌクレオチド配列の５’末端に連結する）が存在し、ここで、この第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列は、プロモーターの制御下で単一のＲＮＡとして転写される。いくつかの場合には、プロモーターは第２のヌクレオチド配列の５’末端に機能的に連結されており、ＩＲＥＳ及び自己切断２Ａペプチド（Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａなど）をコードする核酸からなる群より選択される核酸リンカー（第２のヌクレオチド配列の３’末端を第１のヌクレオチド配列の５’末端に連結する）が存在し、この第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列は、プロモーターの制御下で単一のＲＮＡとして転写される。いくつかの場合には、このプロモーターは、誘導性である。
【００３７】
使用に適した自己切断ウイルス２Ａペプチドは、ウイルス２Ａペプチドを含み、ブタテッショウウイルス−１（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）及びウイルス性ブタテッショウウイルス−１（Ｐ２Ａ）ペプチドである。
2021530212.tif 000003
は、「タンパク質分解切断部位」または「リボソームスキップシグナル」（ＣＨＹＳＥＬ）のいずれかと見なし得る。例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６：ｅ１８５５６を参照のこと。コードされたポリペプチドが２つのポリペプチド鎖として生成される機構は、リンカーの自己切断、リボソームスキッピング、または翻訳シャントによるものであり得る。
【００３８】
一例として、いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムの第２の核酸は、以下：ａ）ヘテロ二量体の第１の鎖である第１の異種ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、ｂ）ヘテロ二量体の第２の鎖である第２の異種ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列と、を含み、ここで、この第１及び第２のヌクレオチド配列は、単一のプロモーターの制御下にある。いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムの第２の核酸は、以下：ａ）ヘテロ二量体の第１の鎖である第１の異種ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、ｂ）ＩＲＥＳ及び自己切断２Ａペプチドをコードする核酸からなる群より選択される核酸リンカーと、ｃ）ヘテロ二量体の第２の鎖である第２の異種ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列と、を含み、ここで、この第１及び第２のヌクレオチド配列は、単一のプロモーターの制御下にある。
【００３９】
いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、翻訳後に切断されて２つのポリペプチド鎖を生成する単一のポリペプチド鎖をコードする。例えば、いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、Ｎ末端からＣ末端の順に以下：ｉ）第１のポリペプチドと、ｉｉ）タンパク質分解的に切断可能なリンカーと、ｉｉｉ）第２のポリペプチドと、を含む単一のポリペプチド鎖をコードする。
【００４０】
タンパク質分解的に切断可能なリンカーとしては、アラニンカルボキシペプチダーゼ、ナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）アスタシン、細菌ロイシルアミノペプチダーゼ、癌凝固促進剤、カテプシンＢ、クロストリパイン、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンテロキナーゼ、ガストリシン、ゲラチナーゼ、Ｇｌｙ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、グリシルエンドペプチダーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ヒポデルミンＣ、ＩｇＡ特異的セリンエンドペプチダーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼ、ロイシルエンドペプチダーゼ、ｌｙｓＣ、リソソームプロＸカルボキシペプチダーゼ、リシルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、ミクソバクター（ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ）、ナルディリシン、膵臓エンドペプチダーゼＥ、ピコルナイン２Ａ、ピコルナイン３Ｃ、プロエンドペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、プロタンパク質転換酵素Ｉ、プロタンパク質転換酵素ＩＩ、ラッセルライシン、サッカロペプシン、セメノゲラーゼ、Ｔ−プラスミノーゲンアクチベーター、トロンビン、組織カリクレイン、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、トガビリン、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、Ｕ−プラスミノーゲンアクチベーター、Ｖ８、ベノムビンＡ、ベノムビンＡＢ、及びＸａａ−ｐｒｏアミノペプチダーゼからなる群より選択されるプロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ認識配列を含み得る。
【００４１】
例えば、タンパク質分解的に切断可能なリンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ切断部位、例えば、コラゲナーゼ−１、−２、及び−３（ＭＭＰ−１、−８、及び−１３）、ゲラチナーゼＡ及びＢ（ＭＭＰ−２及び−９）、ストロメリシン１、２、及び３（ＭＭＰ−３、−１０、及び−１１）、マトリライシン（ＭＭＰ−７）、及び膜メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＴ２−ＭＭＰ）から選択されるＭＭＰの切断部位を含み得る。例えば、ＭＭＰ−９の切断配列は、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ（ここで、Ｘは任意の残基を表す；Ｈｙ、疎水性残基；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、例えば、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、例えば、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）またはＰｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）である。プロテアーゼ切断部位の別の例は、プラスミノーゲン活性化因子切断部位、例えば、ｕＰＡまたは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）切断部位である。適切なプロテアーゼ切断部位の別の例は、プロラクチン切断部位である。ｕＰＡ及びｔＰＡの切断配列の特定の例としては、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含む配列が挙げられる。タンパク質分解的に切断可能なリンカーに含まれてもよいプロテアーゼ切断部位の別の例は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、例えば、プロテアーゼがグルタミンとセリンとの間で切断するＥＮＬＹＴＱＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）である。タンパク質分解的に切断可能なリンカーに含まれてもよいプロテアーゼ切断部位の別の例は、エンテロキナーゼ切断部位、例えば、ＤＤＤＤＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）であり、ここで、切断は、リジン残基の後に起こる。タンパク質分解的に切断可能なリンカーに含まれてもよいプロテアーゼ切断部位の別の例は、トロンビン切断部位、例えば、ＬＶＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）である。プロテアーゼ切断部位を含む追加の適切なリンカーとしては、以下のアミノ酸配列のうち１つ以上を含むリンカーが挙げられる：ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼによって切断されるＬＥＶＬＦＱＧＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）（ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合タンパク質；Ｗａｌｋｅｒ；ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６０１）；トロンビン切断部位、例えば、カテプシンＢによって切断される
2021530212.tif 000004
；エプスタインバーウイルスプロテアーゼによって切断される
2021530212.tif 000005
；ＭＭＰ−３（ストロメリシン）によって切断される
2021530212.tif 000006
；ＭＭＰ−７（マトリライシン）によって切断される
2021530212.tif 000007
；ＭＭＰ−９によって切断される
2021530212.tif 000008
；サーモリシン様ＭＭＰによって切断される
2021530212.tif 000009
；マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）によって切断される
2021530212.tif 000010
；カテプシンＬによって切断される
2021530212.tif 000011
；カテプシンＤによって切断される
2021530212.tif 000012
；マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ−１）によって切断される
2021530212.tif 000013
；ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターによって切断される
2021530212.tif 000014
；膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＴ−ＭＭＰ）によって切断される
2021530212.tif 000015
；ストロメリシン３（またはＭＭＰ−１１）、サーモリシン、線維芽細胞コラゲナーゼ及びストロメリシン−１によって切断される
2021530212.tif 000016
；マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（コラゲナーゼ−３）によって切断される
2021530212.tif 000017
；組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）によって切断される
2021530212.tif 000018
；ヒト前立腺特異抗原によって切断される
2021530212.tif 000019
；カリクレイン（ｈＫ３）によって切断される
2021530212.tif 000020
；好中球エラスターゼによって切断される
2021530212.tif 000021
；及びカルパイン（カルシウム活性化中性プロテアーゼ）によって切断される
2021530212.tif 000022
。
【００４２】
いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムの第２の核酸は、以下：ａ）第１の異種ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、ｂ）第２の異種ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列と、を含み、ここで、この第１及び第２のヌクレオチド配列は、２つの異なるプロモーターの制御下にある。例えば、いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムの第２の核酸は、以下：ａ）第１のプロモーターの制御下にある、第１の異種ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、ｂ）第２のプロモーターの制御下にある、第２の異種ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの場合には、第１のプロモーター及び第２のプロモーターは両方とも調節可能な（例えば、誘導可能な）プロモーターである。いくつかの場合には、第１のプロモーター及び第２のプロモーターは両方とも構成的プロモーターである。いくつかの場合には、第１のプロモーターは誘導性であり、第２のプロモーターは構成的である。いくつかの場合には、第１のプロモーターは構成的であり、第２のプロモーターは誘導性である。
【００４３】
転写制御エレメント
本開示の遺伝子送達システムの第２の核酸に存在する異種ヌクレオチド配列は、転写制御エレメント（複数可）に機能的に連結され得る。いくつかの場合には、この転写制御エレメントは誘導性である。いくつかの場合には、この転写制御エレメントは構成的である。いくつかの場合には、この転写制御エレメントは、プロモーターである。いくつかの場合には、このプロモーターは真核細胞において機能する。いくつかの場合には、このプロモーターは、細胞型特異的プロモーターである。いくつかの場合には、このプロモーターは、組織特異的プロモーターである。いくつかの場合には、このプロモーターは、構成的活性型である。いくつかの場合には、このプロモーターは、調節可能なプロモーターである。
【００４４】
プロモーターは、構成的活性型プロモーター（すなわち、構成的に活性／「ＯＮ」状態であるプロモーター）であってもよく、誘導性プロモーターであってもよく（すなわち、その活性／「ＯＮ」または不活性／「ＯＦＦ」状態が外部刺激、例えば、特定の温度、化合物、またはタンパク質の存在によって制御されるプロモーター）、空間的制約のあるプロモーター（すなわち、転写制御エレメント、エンハンサー等）（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）であってもよく、時間的制約のあるプロモーターであってもよい（すなわち、プロモーターは、胚発達の特定段階中、または生物学的過程の特定段階、例えば、マウスにおける毛包サイクル中に、「ＯＮ」状態または「ＯＦＦ」状態である）。
【００４５】
適切なプロモーター及びエンハンサーエレメントは当技術分野で公知である。真核細胞での発現の場合、適切なプロモーターとしては、限定するものではないが、軽鎖及び／または重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター及びエンハンサーエレメント；サイトメガロウイルス前初期プロモーター；単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター；初期及び後期ＳＶ４０プロモーター；レトロウイルスのロングターミナルリピートに存在するプロモーター；マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター；及び様々な当技術分野で公知の組織特異的プロモーターが挙げられる。
【００４６】
可逆的誘導性プロモーターを含む好適な可逆的プロモーターは、当該技術分野において公知である。そのような可逆的プロモーターは、多くの生物、例えば、真核生物及び原核生物から単離され得、それに由来し得る。第２の生物において使用するための第１の生物（例えば、第１の原核生物及び第２の真核生物、第１の真核生物及び第２の原核生物、等）に由来する可逆的プロモーターの修飾は、当該技術分野において周知である。そのような可逆的プロモーター、及び、そのような可逆的プロモーターに基づくだけでなく追加の制御タンパク質も含む系としては、限定するものではないが、アルコール調節型プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランスアクティベータータンパク質（ＡｌｃＲ）に応答性のプロモーター等）、テトラサイクリン調節型プロモーター（例えば、ＴｅｔＡｃｔｉｖａｔｏｒ、ＴｅｔＯＮ、ＴｅｔＯＦＦ等を含むプロモーター系）、ステロイド調節型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体プロモーター系、ヒトエストロゲン受容体プロモーター系、レチノイドプロモーター系、甲状腺プロモーター系、エクジソンプロモーター系、ミフェプリストンプロモーター系等）、金属調節型プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター系等）、病原体関連調節型プロモーター（例えば、サリチル酸調節型プロモーター、エチレン調節型プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節型プロモーター等）、温度調節型プロモーター（例えば、ヒートショック誘導性プロモーター（例えば、ＨＳＰ−７０、ＨＳＰ−９０、ダイズヒートショックプロモーター等）、光調節型プロモーター、合成誘導性プロモーター等が挙げられる。適切なプロモーターは、ＲＮＡ  ｐｏｌＩプロモーターであってもよい。適切なプロモーターは、ＲＮＡ  ｐｏｌＩＩプロモーターであってもよい。
【００４７】
使用に好適な誘導性プロモーターとしては、本明細書に記載されるか、または当業者に公知である、任意の誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、限定するものではないが、化学的／生化学的調節型及び物理的調節型プロモーター、例えば、アルコール調節型プロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター（例えば、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答性プロモーター、ならびにテトラサイクリンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、及びテトラサイクリントランスアクティベーター融合タンパク質（ｔＴＡ）を含む、他のテトラサイクリン応答性プロモーター系）、ステロイド調節型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、ガエクジソン受容体に基づくプロモーター、及びステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリー由来のプロモーター）、金属調節型プロモーター（例えば、酵母、マウス、及びヒト由来のメタロチオネイン（金属イオンに結合し、封鎖するタンパク質）に由来するプロモーター）、病因調節型プロモーター（例えば、サリチル酸、エチレン、またはベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）によって誘導される）、温度／熱誘導性プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）、及び光調節型プロモーター（例えば、植物細胞由来の光応答性プロモーター）が挙げられる。
【００４８】
いくつかの場合には、プロモーターはＣＤ８細胞特異的プロモーター、ＣＤ４細胞特異的プロモーター、好中球特異的プロモーター、またはＮＫ特異的プロモーターである。例えば、ＣＤ４遺伝子プロモーターを使用してもよい；例えば、Ｓａｌｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：  ７７３９；及びＭａｒｏｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１：３４１６を参照のこと。別の例として、ＣＤ８遺伝子プロモーターを使用してもよい。ＮＫ細胞特異的発現は、Ｎｃｒ１（ｐ４６）プロモーターを使用することで達成され得る。例えば、Ｅｃｋｅｌｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｂｌｏｏｄ  １１７：１５６５を参照のこと。
【００４９】
いくつかの場合には、このプロモーターは、心筋細胞特異的プロモーターである。いくつかの場合には、このプロモーターは、平滑筋細胞特異的プロモーターである。いくつかの場合には、このプロモーターは、ニューロン特異的プロモーターである。いくつかの場合には、このプロモーターは、脂肪細胞特異的プロモーターである。他の細胞型特異的プロモーターは当技術分野で公知であり、本明細書での使用に適している。
【００５０】
異種遺伝子産物
様々な異種遺伝子産物のいずれも、本開示の遺伝子送達システムの第２の核酸に存在する異種ヌクレオチド配列によってコードされ得る。この異種遺伝子産物は、単一の異種ポリペプチドであってもよい。この異種遺伝子産物は、単一の核酸であってもよい。この異種遺伝子産物は、２つ以上の異種ポリペプチドであってもよい。この異種遺伝子産物は、２つ以上の異種核酸であってもよい。この異種遺伝子産物は、以下：ｉ）異種ポリペプチド、及びｉｉ）異種核酸、であってもよい。
【００５１】
この異種遺伝子産物がポリペプチドである場合、適切なポリペプチドとしては、限定するものではないが、受容体、酵素、抗体、ホモ二量体ポリペプチド、ヘテロ二量体ポリペプチド、ポリペプチドホルモン、細胞外マトリックスタンパク質、プロテオグリカン、ヌクレアーゼ、ＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド、キメラポリペプチド、融合ポリペプチドなどが挙げられる。いくつかの場合には、この異種遺伝子産物はＣＡＲである。いくつかの場合には、この異種遺伝子産物はｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドである。いくつかの場合には、この異種遺伝子産物はｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチド及びＣＡＲである。
【００５２】
この異種遺伝子産物が核酸である場合、適切な核酸としては、限定するものではないが、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ；マイクロＲＮＡ；リボザイム；阻害性ＲＮＡ；標的核酸中のヌクレオチド配列に相補的である第１のセグメント、及びＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドに結合する第２のセグメントを含むガイドＲＮＡなど、が挙げられる。いくつかの場合において、この異種遺伝子産物は、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイム、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、スモールテンポラル（ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ）ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子ＲＮＡ誘導遺伝子活性化（ＲＮＡａ）、または低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）である。
【００５３】
キメラ抗原受容体
１つの非限定的な例として、異種ポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの場合には、ＣＡＲは単一ポリペプチド鎖ＣＡＲである。他の場合、ＣＡＲは２つのポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体ＣＡＲである。単一のポリペプチド鎖ＣＡＲは以下：ｉ）抗原結合ドメインと、ｉｉ）膜貫通ドメインと、ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含み得る。単一のポリペプチド鎖ＣＡＲは以下：ｉ）抗原結合ドメインと、ｉｉ）膜貫通ドメインと、ｉｉｉ）免疫調節ドメインと、ｉｖ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含み得る。
【００５４】
ＣＡＲの抗原結合部分は、抗体であっても、または抗体断片であってもよい。「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、例えば、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）；ダイアボディ；線状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；キメラ抗体；ヒト化抗体；一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）；単一ドメイン重鎖抗体；単一ドメイン軽鎖抗体；ナノボディ；二重特異性抗体；多重特異性抗体；抗体の抗原結合（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ）（本明細書では抗原結合（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）とも呼ばれる）部分と非抗体タンパク質とを含む融合タンパク質が挙げられる。いくつかの場合には、この抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。いくつかの場合には、この抗原結合ドメインはナノボディである。他の抗体ベースの抗原結合ドメイン（ｃＡｂ  ＶＨＨ（ラクダ抗体可変ドメイン）及びヒト化バージョン、ＩｇＮＡＲ  ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）及びヒト化バージョン、ｓｄＡｂ  ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）及び「ラクダ化」抗体可変ドメインが使用に適している。
【００５５】
ＣＡＲの抗原結合ドメインは、様々な抗原結合特異性を有し得る。いくつかの場合には、この抗原結合ドメインは、がん細胞によって発現される（合成される）抗原、すなわちがん細胞関連抗原に存在するエピトープに特異的である。がん細胞関連抗原とは、例えば、乳癌細胞、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫、肺癌細胞（例えば、小細胞肺癌細胞）、非ホジキンＢ細胞リンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫細胞、肺癌細胞（例えば、小細胞肺癌細胞）、メラノーマ細胞、慢性リンパ球性白血病細胞、急性リンパ球性白血病細胞、神経芽細胞腫細胞、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、結腸直腸癌細胞などに関連する抗原であり得る。がん細胞関連抗原はまた、非がん細胞によっても発現され得る。
【００５６】
ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合し得る抗原の非限定的な例としては、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ３０、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、ＣＡ１２５、ＭＵＣ−１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ４４表面接着分子、メソセリン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＧＤ２などが挙げられる。
【００５７】
適切な免疫調節ドメイン（「共刺激ドメイン」または「共刺激ポリペプチド」とも呼ばれる）としては、例えば、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ−４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、及びＨＶＥＭが挙げられる。
【００５８】
適切な細胞内シグナル伝達ドメインとしては、例えば、１つ以上の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むポリペプチドが挙げられる。ＩＴＡＭモチーフは、ＹＸ１Ｘ２Ｌ／Ｉであり、ここでＸ１及びＸ２は独立して任意のアミノ酸である。適切なＩＴＡＭモチーフ含有ポリペプチドの例としては限定するものではないが、以下が挙げられる：ＤＡＰ１２；ＦＣＥＲ１Ｇ（Ｆｃイプシロン受容体Ｉガンマ鎖）；ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３デルタ）；ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３イプシロン）；ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３ガンマ）；ＣＤ３Ｚ（ＣＤ３ゼータ）；及びＣＤ７９Ａ（抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖）。
【００５９】
いくつかの場合には、ＣＡＲは２つのポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体ＣＡＲである。例えば、米国特許第９，８２１，０１２号及び第９，５８７，０２０号を参照のこと。例えば、いくつかの場合には、ヘテロ二量体ＣＡＲは、以下：ａ）第１のポリペプチド鎖であって：ｉ）標的細胞上の抗原に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメイン、ｉｉ）膜貫通ドメイン；及びｉｉｉ）二量体化対の第１のメンバーを含む、第一のポリペプチド鎖と；ｂ）第２のポリペプチドであって：ｉ）膜貫通ドメイン；ｉｉ）二量体化対の第２のメンバー；及びｉｉｉ）ＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第２のポリペプチドと、を含み、この細胞内シグナル伝達ドメインがシグナル伝達活性を提供する。ヘテロ二量体ＣＡＲの第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第１及び第２のポリペプチドの両方は、共刺激ポリペプチドを含む。真核細胞の膜に存在する場合、ＣＡＲの第１のポリペプチドは抗原に結合し、ＣＡＲは小分子二量体の存在下で二量体化する。
【００６０】
いくつかの場合には、ヘテロ二量体ＣＡＲは、以下：ａ）第１のポリペプチドであって、Ｎ末端からＣ末端の順に：ｉ）抗原結合ドメイン（例えば、抗原結合一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）またはナノボディ）；ｉｉ）膜貫通ドメイン；及びｉｉｉ）二量体化対の第１のメンバーを含む、第１のポリペプチドと；ｂ）第２のポリペプチドであって、Ｎ末端からＣ末端の順に：ｉ）膜貫通ドメイン、ｉｉ）二量体化対の第２のメンバー、及びｉｉｉ）ＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第２のポリペプチドと、を含み、この細胞内シグナル伝達ドメインが、シグナル伝達活性を提供し、この第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第１と第２のポリペプチドの両方が、膜貫通ドメインと二量体化対のメンバーとの間に挿入される共刺激ポリペプチドを含む。いくつかの場合には、この共刺激ポリペプチドは４−１ＢＢポリペプチドである。いくつかの場合には、この共刺激ポリペプチドはＣＤ２８ポリペプチドである。いくつかの場合には、この共刺激ポリペプチドはＯＸ−４０ポリペプチドである。いくつかの場合には、この第１のポリペプチドは、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、ナノボディなど）と膜貫通ドメインとの間のヒンジ領域を含む。いくつかの場合には、ＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータ及びＺＡＰ７０からなる群より選択される。
【００６１】
適切な二量体化対としては、例えば、ａ）ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）とＦＫＢＰ；ｂ）ＦＫＢＰとカルシニューリン触媒サブユニットＡ（ＣｎＡ）；ｃ）ＦＫＢＰとシクロフィリン；ｄ）ＦＫＢＰとＦＫＢＰ−ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＢ）；ｅ）ジャイレースＢ（ＧｙｒＢ）とＧｙｒＢ；ｆ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）とＤＨＦＲ；ｇ）ＤｍｒＢとＤｍｒＢ；ｈ）ＰＹＬとＡＢＩ；ｉ）Ｃｒｙ２とＣＩＢ１；及びｊ）ＧＡＩとＧＩＤ１が挙げられる。
【００６２】
二量体結合対の第１のメンバー及び二量体結合対の第２のメンバーの二量体化を提供し得る適切な二量体化因子（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）（「二量体化剤」）としては、例えば：ａ  ）ＦＫＢＰ及びＦＫＢＰ（ラパマイシン）；ｂ）ＦＫＢＰ及びＣｎＡ（ラパマイシン）；ｃ）ＦＫＢＰ及びシクロフィリン（ラパマイシン）；ｄ）ＦＫＢＰ及びＦＲＧ（ラパマイシン）；ｅ）ＧｙｒＢ及びＧｙｒＢ（クメルマイシン）；ｆ）ＤＨＦＲ及びＤＨＦＲ（メトトレキサート）；ｇ）ＤｍｒＢ及びＤｍｒＢ（ＡＰ２０１８７）；ｈ）ＰＹＬ及びＡＢＩ（アブシジン酸）；ｉ）Ｃｒｙ２及びＣＩＢ１（青色光）；ならびに  ｊ）ＧＡＩ及びＧＩＤ１（ジベレリン）（ここで、二量体結合対に続く括弧内に二量体がある）が挙げられる。
【００６３】
ｓｙｎＮｏｔｃｈ
別の非限定的な例として、この異種ヌクレオチド配列は、ｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチド（本明細書では「キメラＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチド」とも呼ばれる）をコードし得る。適切なｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドは、例えば、米国特許第９，６７０，２８１号；Ｍｏｒｓｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ  １６４：７８０；及びＲｏｙｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ  １６７：４１９に記載されている。ｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドは、以下：ｉ）抗原結合ドメインと、ｉｉ）Ｎｏｔｃｈポリペプチドの一部と、ｉｉｉ）細胞内ドメイン（例えば、転写因子（例えば、転写活性化因子または転写抑制因子）、部位特異的ヌクレアーゼなど）と、を含む。ｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドは、天然に存在するＮｏｔｃｈリガンドであるＤｅｌｔａに結合しない。代わりに、ｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドは、ｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドに存在する抗原結合ドメインによって結合される抗原に結合する。抗原（例えば、がん細胞などの細胞上に存在する抗原）への抗原結合ドメインの結合は、ＮｏｔｃｈポリペプチドのＳ２タンパク質分解切断部位及び／またはＳ３タンパク質分解切断部位で切断を誘導し、それによって、細胞内ドメインを遊離する。
【００６４】
いくつかの場合には、ｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドは、以下：ｉ）抗原結合ドメインと、ｉｉ）Ｌｉｎ  １２−Ｎｏｔｃｈリピートを含むＮｏｔｃｈ調節領域、Ｓ２タンパク質分解切断部位を含むヘテロ二量体化ドメイン、及びＳ３タンパク質分解切断部位を含む膜貫通ドメインと、ｉｉｉ）ＤＮＡ結合ドメインを含む転写活性化因子を含む、Ｎｏｔｃｈ調節領域とは異種の細胞内ドメインと、を含み、ここで、抗原結合ドメインのトランスでの抗原への結合は、Ｓ２及びＳ３タンパク質分解切断部位で切断を誘導し、それによって細胞内ドメインを遊離する。
【００６５】
いくつかの場合には、ｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドは、以下：ｉ）抗原結合ドメインと、ｉｉ）Ｌｉｎ  １２−Ｎｏｔｃｈリピートを含むＮｏｔｃｈ調節領域、Ｓ２タンパク質分解切断部位、及びＳ３タンパク質分解切断部位を含む膜貫通ドメインと、ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ調節領域とは異種である転写活性化因子または転写抑制因子を含む細胞内ドメインと、を含み、ここで、細胞または他の固体支持体に存在する特異的結合対の第２のメンバーに対する、特定の結合対の第１のメンバーの結合は、Ｓ２及びＳ３タンパク質分解切断部位で切断を誘導し、それによって細胞内ドメインを遊離する。
【００６６】
ｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドの抗原結合部分は、抗体であってもまたは抗体断片であってもよい。「抗体断片」は、インタクトな抗体の部分、例えば、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）；ダイアボディ；線状抗体（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；キメラ抗体；ヒト化抗体；一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）；単一ドメイン重鎖抗体；単一ドメイン軽鎖抗体；ナノボディ；二重特異性抗体；多重特異性抗体；抗体の抗原結合（本明細書では抗原結合とも呼ばれる）部分と非抗体タンパク質とを含む融合タンパク質が挙げられる。いくつかの場合には、この抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。いくつかの場合には、この抗原結合ドメインはナノボディである。他の抗体ベースの抗原結合ドメイン（ｃＡｂ  ＶＨＨ（ラクダ抗体可変ドメイン）及びヒト化バージョン、ＩｇＮＡＲ  ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）及びヒト化バージョン、ｓｄＡｂ  ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）及び「ラクダ化」抗体可変ドメインが使用に適している。
【００６７】
ｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドの抗原結合ドメインは、様々な抗原結合特異性を有し得る。いくつかの場合には、抗原結合ドメインは、がん細胞によって発現される（合成される）抗原、すなわちがん細胞関連抗原に存在するエピトープに特異的である。がん細胞関連抗原とは、例えば、乳癌細胞、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫、肺癌細胞（例えば、小細胞肺癌細胞）、非ホジキンＢ細胞リンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫細胞、肺癌細胞（例えば、小細胞肺癌細胞）、メラノーマ細胞、慢性リンパ球性白血病細胞、急性リンパ球性白血病細胞、神経芽細胞腫細胞、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、結腸直腸癌細胞などに関連する抗原であり得る。がん細胞関連抗原はまた、非がん細胞によっても発現され得る。
【００６８】
ｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドの抗原結合ドメインが結合し得る抗原の非限定的な例としては、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ３０、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、ＣＡ１２５、ＭＵＣ−１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ４４表面接着分子、メソセリン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＭＡＧＥ−  Ａ１、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＧＤ２などが挙げられる。
【００６９】
いくつかの場合には、ｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドの抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。別の例として、いくつかの場合には、ｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドの抗原結合ドメインはナノボディである。
【００７０】
いくつかの場合には、ｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドに存在するＮｏｔｃｈポリペプチドは、以下の配列
2021530212.tif 000023
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、ｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドに存在するＮｏｔｃｈポリペプチドは、以下の配列
2021530212.tif 000024
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７１】
いくつかの場合には、細胞内ドメインは転写因子である。適切な転写因子としては、例えば、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＣＤＸ２、ＣＤＸ４、ＣＴＮＮＢ１、ＥＯＭＥＳ、ＪＵＮ、ＦＯＳ、ＨＮＦ４ａ、ＨＯＸＡ（例えば、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３）、ＨＯＸＢ（例えば、ＨＯＸＢ９）、ＨＯＸＣ（例えば、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３）ＨＯＸＤ（例えば、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１２、ＨＯＸＤ１３）、ＳＮＡＩ１−３、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＮＥＵＲＯＤ１−６（例えば、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＥＵＲＯＤ４、ＮＥＵＲＯＤ６）、ＰＤＸ１、ＰＵ．１、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、ＢＣＬ−６、ＳＯＸ９、ＳＴＡＴ１−６、ＴＢＥＴ、ＴＣＦ、ＴＥＡＤ１−４（例えば、ＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３、ＴＥＡＤ４）、ＴＡＦ６Ｌ、ＣＬＯＣＫ、ＣＲＥＢ、ＧＡＴＡ３、ＩＲＦ７、ＭｙｃＣ、ＮＦｋＢ、ＲＯＲｙｔ、ＲＵＮＸ１、ＳＲＦ、ＴＢＸ２１、ＮＦＡＴ、ＭＥＦ２Ｄ、及びＦｏｘＰ３が挙げられる。
【００７２】
いくつかの場合には、細胞内ドメインとは、１つ以上の免疫細胞において調節的役割を有する転写因子（すなわち、免疫細胞調節転写因子）である。適切な免疫細胞調節転写因子としては、例えば、２２１００１２Ｇ０２Ｒｉｋ、Ａｋａｐ８ｌ、Ａｐｐｌ２、Ａｒｉｄ４ｂ、Ａｒｉｄ５ｂ、Ａｓｈ１ｌ、Ａｔｆ７、Ａｔｍ、Ｃ４３００１４Ｋ１１Ｒｉｋ、Ｃｈｄ９、Ｄｍｔｆ１、Ｆｏｓ、Ｆｏｘｏ１、Ｆｏｘｐ１、Ｈｍｂｏｘ１、Ｋｄｍ５ｂ、Ｋｌｆ２、Ｍｇａ、Ｍｌｌ１、Ｍｌｌ３、Ｍｙｓｔ４、Ｐｃｇｆ６、Ｒｅｖ３ｌ、Ｓｃｍｌ４、Ｓｃｐ２、Ｓｍａｒｃａ２、Ｓｓｂｐ２、Ｓｕｈｗ４、Ｔｃｆ７、Ｔｆｄｐ２、Ｔｏｘ、Ｚｂｔｂ２０、Ｚｂｔｂ４４、Ｚｅｂ１、Ｚｆｍｌ、Ｚｆｐ１、Ｚｆｐ３１９、Ｚｆｐ３２９、Ｚｆｐ３５、Ｚｆｐ３８６、Ｚｆｐ４４５、Ｚｆｐ５１８、Ｚｆｐ６５２、Ｚｆｐ８２７、Ｚｈｘ２、Ｅｏｍｅｓ、Ａｒｎｔｌ、Ｂｂｘ、Ｈｂｐ１、Ｊｕｎ、Ｍｅｆ２ｄ、Ｍｔｅｒｆｄ１、Ｎｆａｔ５、Ｎｆｅ２ｌ２、Ｎｒ１ｄ２、Ｐｈｆ２１ａ、Ｔａｆ４ｂ、Ｔｒｆ、Ｚｂｔｂ２５、Ｚｆｐ３２６、Ｚｆｐ４５１、Ｚｆｐ５８、Ｚｆｐ６７２、Ｅｇｒ２、Ｉｋｚｆ２、Ｔａｆ１ｄ、Ｃｈｒａｃ１、Ｄｎａｊｂ６、Ａｐｌｐ２、Ｂａｔｆ、Ｂｈｌｈｅ４０、Ｆｏｓｂ、Ｈｉｓｔ１ｈ１ｃ、Ｈｏｐｘ、Ｉｆｉｈ１、Ｉｋｚｆ３、Ｌａｓｓ４、Ｌｉｎ５４、Ｍｘｄ１、Ｍｘｉ１、Ｐｒｄｍ１、Ｐｒｆ１、Ｒｏｒａ、Ｒｐａ２、Ｓａｐ３０、Ｓｔａｔ２、Ｓｔａｔ３、Ｔａｆ９ｂ、Ｔｂｘ２１、Ｔｒｐｓ１、Ｘｂｐ１、Ｚｅｂ２、Ａｔｆ３、Ｃｅｎｐｃ１、Ｌａｓｓ６、Ｒｂ１、Ｚｂｔｂ４１、Ｃｒｅｍ、Ｆｏｓｌ２、Ｇｔｆ２ｂ、Ｉｒｆ７、Ｍａｆｆ、Ｎｒ４ａ１、Ｎｒ４ａ２、Ｎｒ４ａ３、Ｏｂｆｃ２ａ、Ｒｂｌ２、Ｒｅｌ、Ｒｙｂｐ、Ｓｒａ１、Ｔｇｉｆ１、Ｔｎｆａｉｐ３、Ｕｈｒｆ２、Ｚｂｔｂ１、Ｃｃｄｃ１２４、Ｃｓｄａ、Ｅ２ｆ３、Ｅｐａｓ１、Ｈ１ｆ０、Ｈ２ａｆｚ、Ｈｉｆ１ａ、Ｉｋｚｆ５、Ｉｒｆ４、Ｎｓｂｐ１、Ｐｉｍ１、Ｒｆｃ２、Ｓｗａｐ７０、Ｔｆｂ１ｍ、２６１００３６Ｌ１１Ｒｉｋ、５１３３４００Ｇ０４Ｒｉｋ、Ａｐｉｔｄ１、Ｂｌｍ、Ｂｒｃａ１、Ｂｒｉｐ１、Ｃ１ｄ、Ｃ７９４０７、Ｃｅｎｐａ、Ｃｆｌ１、Ｃｌｓｐｎ、Ｄｄｘ１、Ｄｓｃｃ１、Ｅ２ｆ７、Ｅ２ｆ８、Ｅｒｃｃ６ｌ、Ｅｚｈ２、Ｆｅｎ１、Ｆｏｘｍ１、Ｇｅｎ１、Ｇｓｇ２、Ｈ２ａｆｘ、Ｈｄａｃ１、Ｈｄｇｆ、Ｈｅｌｌｓ、Ｈｉｓｔ１ｈ１ｅ、Ｈｉｓｔ３ｈ２ａ、Ｈｊｕｒｐ、Ｈｍｇｂ２、Ｈｍｇｂ３、Ｉｒｆ１、Ｉｒｆ８、Ｋｉｆ２２、Ｋｉｆ４、Ｌｉｇ１、Ｌｍｏ２、Ｌｎｐ、Ｍｂｄ４、Ｍｃｍ２、Ｍｃｍ３、Ｍｃｍ４、Ｍｃｍ５、Ｍｃｍ６、Ｍｃｍ７、Ｍｙｂｌ２、Ｎｅｉｌ３、Ｎｕｓａｐ１、Ｏｒｃ６ｌ、Ｐｏｌａ１、Ｐｏｌａ２、Ｐｏｌｅ、Ｐｏｌｅ２、Ｐｏｌｈ、Ｐｏｌｒ２ｆ、Ｐｏｌｒ２ｊ、Ｐｐｐ１ｒ８、Ｐｒｉｍ２、Ｐｓｍｃ３ｉｐ、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１ｃ、Ｒａｄ５４ｌ、Ｒｆｃ３、Ｒｆｃ４、Ｒｎｐｓ１、Ｒｐａ１、Ｓｍａｒｃｃ１、Ｓｐｉｃ、Ｓｓｒｐ１、Ｔａｆ９、Ｔｆｄｐ１、Ｔｍｐｏ、Ｔｏｐｂｐ１、Ｔｒｄｍｔ１、Ｕｈｒｆ１、Ｗｄｈｄ１、Ｗｈｓｃ１、Ｚｂｐ１、Ｚｂｔｂ３２、Ｚｆｐ３６７、Ｃａｒ１、Ｐｏｌｇ２、Ａｔｒ、Ｌｅｆ１、Ｍｙｃ、Ｎｕｃｂ２、Ｓａｔｂ１、Ｔａｆ１ａ、Ｉｆｔ５７、Ａｐｅｘ１、Ｃｈｄ７、Ｃｈｔｆ８、Ｃｔｎｎｂ１、Ｅｔｖ３、Ｉｒｆ９、Ｍｙｂ、Ｍｙｂｂｐ１ａ、Ｐｍｓ２、Ｐｒｅｂ、Ｓｐ１１０、Ｓｔａｔ１、Ｔｒｐ５３、Ｚｆｐ４１４、Ａｐｐ、Ｃｄｋ９、Ｄｄｂ１、Ｈｓｆ２、Ｌｂｒ、Ｐａ２ｇ４、Ｒｂｍｓ１、Ｒｆｃ１、Ｒｆｃ５、Ｔａｄａ２ｌ、Ｔｅｘ２６１、Ｘｒｃｃ６などが挙げられる。
【００７３】
ＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチド及びガイドＲＮＡ
別の非限定的な例として、この異種ヌクレオチド配列は、ＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドをコードし得る。別の非限定的な例として、この異種ヌクレオチド配列は、以下：ｉ）ＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、ｉｉ）ガイドＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列と、を含み得る。別の非限定的な例として、この異種ヌクレオチド配列は、以下：ｉ）ＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、ｉｉ）第１のガイドＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列と、ｉｉｉ）第２のガイドＲＮＡをコードする第３のヌクレオチド配列と、を含み得る。
【００７４】
適切なＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドとしては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼなどのクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）が挙げられる。適切なＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼなどのクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）である。いくつかの場合には、ＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドは、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。いくつかの場合には、適切なＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドは、クラス２  ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）である。いくつかの場合には、適切なＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドは、クラス２  Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、またはＣ２ｃ３タンパク質）である。いくつかの場合には、適切なＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドは、クラス２  ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質；「Ｃａｓ１３ａ」タンパク質とも呼ばれる）である。また、ＣａｓＸタンパク質も使用に適している。また、ＣａｓＹタンパク質も使用に適している。ヌクレアーゼ活性は低いが、ガイドＲＮＡと複合体を形成した場合に標的核酸結合活性を保持するＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドも使用に適している。ヌクレアーゼ活性を実質的に有さないが、ガイドＲＮＡと複合体を形成したときに標的核酸結合活性を保持するＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドも使用に適している。ニッカーゼ活性を示すＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドも使用に適している。ＲＮＡを切断するＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドも使用に適している。
【００７５】
様々なＣａｓ９タンパク質（及びＣａｓ９ドメイン構造）及びＣａｓ９ガイドＲＮＡの例（ならびに標的核酸に存在するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に関連する要件に関する情報）は、当技術分野において、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２  Ａｕｇ  １７；３３７（６０９６）：８１６−２１；Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｍａｙ；１０（５）：７２６−３７、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．２０１３；２０１３：２７０８０５、Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３  Ｓｅｐ  ２４；１１０（３９）：１５６４４−９；Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１３；２：ｅ００４７１、Ｐａｔｔａｎａｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｓｅｐ；３１（９）：８３９−４３、Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｆｅｂ  ２８；１５２（５）：１１７３−８３；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｍａｙ  ９；１５３（４）：９１０−８、Ａｕｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｏｃｔ  ３１、Ｃｈｅｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ  １；４１（２０）：ｅ１９、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｏｃｔ；２３（１０）：１１６３−７１、Ｃｈｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３  Ｎｏｖ；１９５（３）：１１７７−８０、ＤｉＣａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ａｐｒ；４１（７）：４３３６−４３、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｏｃｔ；１０（１０）：１０２８−３４、Ｅｂｉｎａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１３；３：２５１０、Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ．ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ  １；４１（２０）：ｅ１８７、Ｈｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ；２３（１１）：１３２２−５、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ  １；４１（２０）：ｅ１８８、Ｌａｒｓｏｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  Ｎｏｖ；８（１１）：２１８０−９６、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｏｃｔ；１０（１０）：９５７−６３、Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ．２０１３  Ｄｅｃ；５１（１２）：８３５−４３、Ｒａｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８、Ｒａｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｓｅｐ  １２；１５４（６）：１３８０−９、Ｕｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ．ａｌ．，Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１３  Ｄｅｃ  ９；３（１２）：２２３３−８、Ｗａｌｓｈ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３  Ｓｅｐ  ２４；１１０（３９）：１５５１４−５、Ｘｉｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ．２０１３  Ｏｃｔ  ９、Ｙａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｓｅｐ  １２；１５４（６）：１３７０−９、Ｂｒｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０１４  Ｏｃｔ  ２３；５６（２）：３３３−９；Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７  Ｍａｒ；１５（３）：１６９−１８２、ならびに米国特許及び特許出願第８，９０６，６１６号、第８，８９５，３０８号、第８，８８９，４１８号、第８，８８９，３５６号、第８，８７１，４４５号、第８，８６５，４０６号、第８，７９５，９６５号、第８，７７１，９４５号、第８，６９７，３５９号、第２０１４００６８７９７号、第２０１４０１７０７５３号、第２０１４０１７９００６号、第２０１４０１７９７７０号、第２０１４０１８６８４３号、第２０１４０１８６９１９号、第２０１４０１８６９５８号、第２０１４０１８９８９６号、第２０１４０２２７７８７号、第２０１４０２３４９７２号、第２０１４０２４２６６４号、第２０１４０２４２６９９号、第２０１４０２４２７００号、第２０１４０２４２７０２号、第２０１４０２４８７０２号、第２０１４０２５６０４６号、第２０１４０２７３０３７号、第２０１４０２７３２２６号、第２０１４０２７３２３０号、第２０１４０２７３２３１号、第２０１４０２７３２３２号、第２０１４０２７３２３３号、第２０１４０２７３２３４号、第２０１４０２７３２３５号、第２０１４０２８７９３８号、第２０１４０２９５５５６号、第２０１４０２９５５５７号、第２０１４０２９８５４７号、第２０１４０３０４８５３号、第２０１４０３０９４８７号、第２０１４０３１０８２８号、第２０１４０３１０８３０号、第２０１４０３１５９８５号、第２０１４０３３５０６３号、第２０１４０３３５６２０号、第２０１４０３４２４５６号、第２０１４０３４２４５７号、第２０１４０３４２４５８号、第２０１４０３４９４００号、第２０１４０３４９４０５号、第２０１４０３５６８６７号、第２０１４０３５６９５６号、第２０１４０３５６９５８号、第２０１４０３５６９５９号、第２０１４０３５７５２３号、第２０１４０３５７５３０号、第２０１４０３６４３３３号、及び第２０１４０３７７８６８号（これらの各々参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）で見出され得る。
【００７６】
いくつかの場合には、適切なＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドはバリアントＣａｓ９タンパク質である。バリアントＣａｓ９タンパク質は、対応する野生型Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸が異なる（例えば、欠失、挿入、置換、融合を有する）アミノ酸配列を有する。いくつかの場合には、このバリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を有する。例えば、いくつかの場合には、バリアントＣａｓ９タンパク質は、対応する野生型Ｃａｓ９タンパク質の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下のヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの場合には、バリアントＣａｓ９タンパク質は実質的なヌクレアーゼ活性を有さない。Ｃａｓ９タンパク質が実質的なヌクレアーゼ活性を有さないバリアントＣａｓ９タンパク質である場合、そのＣａｓ９タンパク質はヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質または「死んだ（ｄｅａｄ）」を意味するＣａｓ９の「ｄＣａｓ９」と呼ばれ得る。二本鎖標的核酸の一方の鎖を切断するが、もう一方は切断しないタンパク質（例えば、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、本明細書では「ニッカーゼ」（例えば、「ニッカーゼＣａｓ９」）と称される。
【００７７】
融合ＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドも使用に適しており、融合ＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドは以下：ａ）ＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドと、ｂ）異種融合パートナーとを含む。いくつかの場合には、この融合パートナーは、標的核酸（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）を修飾する酵素活性を有する。この融合パートナーによって提供され得る酵素活性の例としては、限定するものではないが、制限酵素（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ）によって提供されるものなどのヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＨｈａＩ  ＤＮＡ  ｍ５ｃ−メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）等）によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性；デメチラーゼ（例えば、Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１等）によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、デアミナーゼ（例えば、ラットＡＰＯＢＥＣ１などのシトシンデアミナーゼ酵素）によって提供されるものなどの脱アミン化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ及び／またはレゾルバーゼ（例えば、Ｇｉｎインベルターゼの超活性変異体、ＧｉｎＨ１０６ＹなどのＧｉｎインベルターゼ；ヒト免疫不全ウイルス１型インテグラーゼ（ＩＮ）；Ｔｎ３レゾルバーゼ等）によってもたらされるものなどのインテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、レコンビナーゼ（例えば、Ｇｉｎレコンビナーゼの触媒ドメイン）によって提供されるものなどのレコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性）が挙げられる。いくつかの場合には、融合パートナーはヌクレアーゼ、例えばＦｏｋＩヌクレアーゼである。いくつかの場合には、異種融合パートナーはデアミナーゼである。適切なデアミナーゼとしては、シチジンデアミナーゼ及びアデノシンデアミナーゼが挙げられる。
【００７８】
いくつかの場合には、ＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチド、または融合ＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。いくつかの場合には、ＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチド、または融合ＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドは、細胞透過性ペプチドを含む。いくつかの場合には、ＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチド、または融合ＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドは、エンドソーム不安定化（ｅｎｄｏｓｍｏｌｙｔｉｃ）ペプチドを含む。
【００７９】
いくつかの場合には、ガイドＲＮＡは、２つの別個の核酸分子：「アクチベーター」及び「ターゲッター（ｔａｒｇｅｔｅｒ）」を含み、本明細書では、「デュアルガイドＲＮＡ」、「二重分子ガイドＲＮＡ」、「２分子ガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」」と呼ばれる。いくつかの場合には、ガイドＲＮＡは１つの分子（例えば、一部のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の場合、対応するガイドＲＮＡは単一の分子であり、いくつかの場合には、アクチベーター及びターゲッターは、例えば、介在するヌクレオチドを介して互いに共有結合される）であり、ガイドＲＮＡは、「単一ガイドＲＮＡ」、「単一分子ガイドＲＮＡ」、「１分子ガイドＲＮＡ」、または単に「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる。
【００８０】
組成物
本開示は、本開示の遺伝子送達システムを含む組成物を提供する。
【００８１】
本開示の組成物は、以下：ａ）本開示の遺伝子送達システムと、ｂ）少なくとも１つの追加の成分と、を含み、ここで、適切な追加の成分としては、例えば、塩、緩衝液、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、脂質などが挙げられる。いくつかの場合には、本開示の組成物は、以下：ａ）本開示の遺伝子送達システムと、ｂ）脂質とを含む。いくつかの場合には、本開示の組成物は、以下：ａ）本開示の遺伝子送達システムと；ｂ）リポソーム、ヒドロゲル、微粒子、ナノ粒子、またはブロック共重合体ミセルと、を含む。
【００８２】
本開示の組成物は、以下：ａ）本開示の遺伝子送達システムと、ｂ）緩衝剤、界面活性剤、抗酸化剤、親水性ポリマー、デキストリン、キレート剤、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、静菌剤、湿潤剤、及び防腐剤のうちの１つ以上と、を含んでもよい。適切な緩衝液としては、限定するものではないが、（例えば、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン（ＢＩＳ−トリス）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’３−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳまたはＨＥＰＰＳ）、グリシルグリシン、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタン−スルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、重炭酸ナトリウム、３−（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−メチル−アミノ）−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸）ＴＡＰＳＯ、（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−グリシン（トリシン）、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）など）が挙げられる。適切な塩としては、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４等が挙げられる。
【００８３】
本開示の組成物は、以下：ａ）本開示の遺伝子送達システムと、ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，”２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，７ｔｈｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃを含む様々な刊行物に詳細に記載されている。
【００８４】
いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムは、粒子中であるか、または粒子と会合されている。「粒子」及び「ナノ粒子」という用語は、適切である場合、互換的に使用され得る。
【００８５】
本開示の遺伝子送達システムは、粒子、例えば、脂質またはリピドイド及び親水性ポリマー、例えば、カチオン性脂質及び親水性ポリマーを含む送達粒子内に存在するか、またはそれと会合されていてもよく、例えば、ここで、このカチオン性脂質は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）または１，２−ジテトラデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）を含むか、及び／またはこの親水性ポリマーはエチレングリコールまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むか；及び／またはこの粒子はコレステロールをさらに含む（例えば、配合物１からの粒子＝ＤＯＴＡＰ  １００、ＤＭＰＣ  ０、ＰＥＧ  ０、コレステロール０；配合物番号２＝ＤＯＴＡＰ  ９０、ＤＭＰＣ  ０、ＰＥＧ  １０、コレステロール０；配合物番号３＝ＤＯＴＡＰ  ９０、ＤＭＰＣ  ０、ＰＥＧ  ５、コレステロール５）。例えば、粒子は、多段階プロセスを使用して形成されてもよく、ここで本開示の遺伝子送達システムは、例えば、１：１のモル比で、例えば、室温で、例えば、３０分間にわたって、例えば、無菌のヌクレアーゼを含まない１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で一緒に混合され；別個に、配合物に適用できる場合、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＰＣ、ＰＥＧ、及びコレステロールを、アルコール、例えば、１００％のエタノールに溶解し；これら２つの溶液を一緒に混合して、本開示の遺伝子送達システムを含有する粒子を形成する。
【００８６】
本開示の遺伝子送達システムは、ナノ粒子の一部であり得る。例えば、リン脂質二層シェルによって封入されたポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアを有する生分解性コアシェル構造ナノ粒子を使用してもよい。いくつかの場合には、自己集合生体付着性ポリマーに基づく粒子／ナノ粒子が使用され、そのような粒子／ナノ粒子は、経口送達、静脈内送達、及び経鼻送達に適用され得る。
【００８７】
いくつかの場合には、本開示の組成物は、本開示の遺伝子送達システムと、ポリ（ベータ−アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）とを含む。米国特許公開第２０１３０３０２４０１号は、コンビナトリアル重合を使用して調製された、あるクラスのポリ（ベータ−アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）に関する。
【００８８】
いくつかの場合には、本開示の組成物は、本開示の遺伝子送達システムと、１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）とを含む。ＲＮＡなどの負に荷電されたポリマーは、ＬＮＰ中に低ｐＨ値（例えば、ｐＨ４）で負荷され得、ここで、イオン化脂質は、正電荷を示す。しかしながら、生理学的ｐＨ値において、ＬＮＰは、より長い循環時間に対応した低表面電荷を呈する。４種のイオン化カチオン脂質、すなわち１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−ケト−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）、及び１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）に焦点が当てられている。ＬＮＰの調製は、例えば、Ｒｏｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９：１２８６−２２００）に記載されている。カチオン性脂質１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシケト−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）、（３−ｏ−［２”−（メトキシポリエチレングリコール２０００）スクリノイル］−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリコール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）、及びＲ−３−［（オメガ．−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリストイルオキシルプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）を使用してもよい。核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、本開示の核酸等）は、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ、及びＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡを（カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧを４０：１０：４０：１０モル比で）含有して、ＬＮＰにカプセル化され得る。いくつかの場合には、０．２％のＳＰ−ＤｉＯＣ１８が使用される。
【００８９】
いくつかの場合には、本開示の組成物は、本開示の遺伝子送達システムと、球状核酸（ＳＮＡ（商標））構築物または他のナノ粒子（特に金ナノ粒子）とを含む。例えば、Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１  １３３：９２５４−９２５７，Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１  ７：３１５８−３１６２，Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１１  ５：６９６２−６９７０，Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２  １３４：１３７６−１３９１，Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１２  １２：３８６７−７１，Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２  １０９：１１９７５−８０，Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２  ７：６３５−６３８  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２  １３４：１６４８８−１６９１，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３  ４９５：Ｓ１４−Ｓ１６，Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３  １１０（１９）：  ７６２５−７６３０，Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）、及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，１０：１８６−１９２を参照されたい。
【００９０】
いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムは、ナノ粒子中に存在するか、またはナノ粒子と会合されている。一般に、「ナノ粒子」とは、１０００ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。いくつかの場合には、標的細胞に対する本開示の遺伝子送達システムの送達に使用するのに適したナノ粒子は、５００ｎｍ以下、例えば、２５ｎｍ〜３５ｎｍ、３５ｎｍ〜５０ｎｍ、５０ｎｍ〜７５ｎｍ、７５ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜１５０ｎｍ、１５０ｎｍ〜２００ｎｍ、２００ｎｍ〜３００ｎｍ、３００ｎｍ〜４００ｎｍ、または４００ｎｍ〜５００ｎｍの直径を有する。いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムの標的細胞への送達に使用するのに適したナノ粒子は、２５ｎｍ〜２００ｎｍの直径を有する。いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムの標的細胞への送達に使用するのに適したナノ粒子は、１００ｎｍ以下の直径を有する。いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムの標的細胞への送達に使用するのに適したナノ粒子は、３５ｎｍ〜６０ｎｍの直径を有する。
【００９１】
ナノ粒子は、様々な形態で、例えば、固体ナノ粒子（例えば、銀、金、鉄、チタンなどの金属）、非金属、脂質ベースの固体、ポリマー）、ナノ粒子の懸濁液、またはそれらの組み合わせとして提供され得る。金属、絶縁体、及び半導体ナノ粒子、ならびにハイブリッド構造（例えば、コアシェルナノ粒子）が調製され得る。半導体材料で作製されたナノ粒子はまた、それらが電子エネルギーレベルの量子化が起こるのに十分に小さい場合（典型的に、１０ｎｍ以下）、量子ドットと表記され得る。そのようなナノスケール粒子は、生物医学的適用において、薬物担体または造影剤として使用され、本開示において同様の目的に適応され得る。
【００９２】
半固体及び軟質ナノ粒子もまた、本開示の遺伝子送達システムを含む本開示の組成物に含めるのに適している。半固体性質のプロトタイプナノ粒子は、リポソームである。
【００９３】
いくつかの場合には、本開示の組成物は、本開示の遺伝子送達システムとリポソームとを含む。リポソームとは、内部水性区画を取り囲む単層または多層脂質二層、及び比較的不透過性の外側親油性リン脂質二層で構成される球形ベシクル構造である。リポソームは、いくつかの異なる種類の脂質から作製され得るが、リポソームを生成するためには、リン脂質が最も一般に使用される。リポソーム形成は、脂質膜が水溶液と混合されたときに自然に起こるが、それはまた、ホモジナイザー、超音波破砕機、または押出装置を使用することによる振盪の形態で力を加えることによって促進され得る。それらの構造及び特性を改変するために、いくつかの他の添加剤をリポソームに添加してもよい。例えば、リポソーム構造の安定化を助けるため、及びリポソーム内部カーゴの漏出を防止するために、コレステロールまたはスフィンゴミエリンのいずれかをリポソーム混合物に添加してもよい。リポソーム配合物は、主に、天然のリン脂質、ならびに１，２−ジステアロリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、及びモノシアロガングリオシドなどの脂質で構成され得る。
【００９４】
いくつかの場合には、本開示の組成物は、本開示の遺伝子送達システムと、安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）とを含む。ＳＮＡＬＰ配合物は、脂質３−Ｎ−［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリストイルオキシ−プロピルアミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、及びコレステロールを、２：４０：１０：４８のモル％比で含有し得る。ＳＮＡＬＰリポソームは、約８０〜１００ｎｍのサイズであり得る。ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．，ＵＳＡ）、３−Ｎ−［（ｗ−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリストイルオキシプロピルアミン、及びカチオン性１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパンを含み得る。ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、及び１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ；Ｎ−ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る。
【００９５】
アミノ脂質２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）などの他のカチオン性脂質を、本開示の組成物に含めて使用してもよい。以下の脂質組成物、アミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び（Ｒ）−２，３−ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ−脂質）をそれぞれ４０／１０／４０／１０モル比、及びおよそ０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ／総脂質比で有する予め形成されたベシクルが企図され得る。７０〜９０ｎｍの範囲の狭い粒径分布及び０．１１±０．０４（ｎ＝５６）の低い多分散指数を確実にするために、粒子は、遺伝子送達システムを付加する前に８０ｎｍ膜を通して最大３回押し出され得る。極めて強力なアミノ脂質１６を含有する粒子を使用してもよく、ここで、４つの脂質成分：１６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−脂質のモル比（５０／１０／３８．５／１．５）をさらに最適化して、インビボ活性を向上してもよい。
【００９６】
脂質を、本開示のシステムまたはその成分（複数可）またはそれをコードする核酸と配合して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成してもよい。好適な脂質としては、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ４、Ｃ１２−２００、及び共脂質ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロールが挙げられるが、これらに限定されず、ＰＥＧ−ＤＭＧを、自発的なベシクル形成手順を使用して、本開示のシステムまたはその成分と配合してもよい。成分モル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはＣ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ）であってもよい。
【００９７】
本開示の遺伝子送達システムは、米国出願公開第２０１３０２５２２８１号及び同第２０１３０２４５１０７号及び同第２０１３０２４４２７９号にさらに記載されるように、ＰＬＧＡ微小球にカプセル化され得る。
【００９８】
いくつかの場合には、本開示の組成物は、本開示の遺伝子送達システム及び超電荷（ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ）タンパク質を含む。超電荷タンパク質は、異常に高い正または負の正味理論的電荷を有する、操作されたかまたは天然型のタンパク質のクラスである。超負電荷タンパク質及び超正電荷タンパク質の両方とも、熱的または化学的に誘導される凝集に耐える能力を呈する。超正電荷タンパク質はまた、哺乳動物細胞を透過し得る。カーゴをこれらのタンパク質、例えば、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のタンパク質と会合させることで、インビトロ及びインビボの両方で、哺乳動物細胞へのこれらの高分子の機能的送達が可能になり得る。
【００９９】
本開示はまた、本開示の遺伝子送達システムを含む埋め込み可能なデバイスも提供する。埋め込み可能なデバイスは、例えば、本開示の遺伝子送達システムを含む組成物を含む、本開示の遺伝子送達システムを含む容器（例えば、リザーバー、マトリックスなど）を備えてもよい。好適な埋め込み可能なデバイスは、例えば、デバイス本体として使用されるマトリックスなどのポリマー基質、及びいくつかの場合には、金属または追加のポリマーなどの追加の足場材料、ならびに可視性及び撮像を向上させる材料を含んでもよい。埋め込み可能な送達デバイスは、局所的かつ長期間にわたって放出を提供するのに有利であり得、送達される核酸は、標的部位、例えば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、腫瘍を取り巻く血管系、病変組織等に直接放出される。
【０１００】
適切な埋め込み可能な送達デバイスには、腹腔などの空洞への送達、及び／または送達システムが固定されていないもしくは取り付けられていない任意の他のタイプの投与に使用するのに適したデバイス、例えば、任意選択でマトリックスであり得る、生体安定性及び／または分解性及び／または生体吸収性ポリマー基板を含むもの、が含まれる。いくつかの場合には、好適な埋め込み可能な薬物送達デバイスは、分解性ポリマーを含み、主な放出機序は、バルク浸食である。いくつかの場合には、好適な埋め込み可能な送達デバイスは、非分解性または分解の遅いポリマーを含み、主な放出機序は、バルク浸食ではなく拡散であり、それにより外側部分は膜として機能し、その内側部分は、リザーバーとして機能し、これは長期間（例えば、約１週間〜約数ヶ月間）にわたって事実上周囲に影響されない。異なる放出機序を有する異なるポリマーの組み合わせを、任意に使用してもよい。
【０１０１】
いくつかの場合には、埋め込み可能な送達系は、本質的に化学物質であれ、対象の体内の酵素及び他の因子からの攻撃に起因するものであれ、分解からヌクレオチド系治療剤（本開示の遺伝子送達システム）を遮断するように設計される。
【０１０２】
キット
本開示は、以下：ａ）Ｒ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸と、ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を挿入するための挿入部位を含む第２の核酸であって、ここで、この挿入部位が、Ｒ２レトロトランスポゾン３’非翻訳領域（ＵＴＲ）及びＲ２レトロトランスポゾン５’ＵＴＲに隣接しており、ここで、この異種ヌクレオチド配列が少なくとも２００ヌクレオチドの長さを有する、第２の核酸と、を備えるキットを提供する。したがって、第２の核酸は、任意の所望の異種遺伝子産物（複数可）をコードする異種ヌクレオチド配列の挿入を可能にする。いくつかの場合には、第１の核酸及び第２の核酸は別々の容器に入っている。いくつかの場合には、第２の核酸は、挿入部位の５’側の転写制御エレメントをさらに含む。転写制御エレメントは、異種ヌクレオチド配列が第２の核酸に挿入されたら、転写制御エレメントが異種ヌクレオチド配列に機能的に連結されるように、挿入部位に対して配置される。適切な転写制御エレメントは上記のとおりである。
【０１０３】
本開示は、以下：ａ）Ｒ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチドと、ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を挿入するための挿入部位を含む核酸であって、ここで、この挿入部位が、Ｒ２レトロトランスポゾン３’ＵＴＲ及びＲ２レトロトランスポゾン５’ＵＴＲに隣接し、ここで、この異種ヌクレオチド配列の長さが少なくとも２００ヌクレオチドである、核酸と、を含むキットを提供する。したがって、核酸は、任意の所望の異種遺伝子産物（複数可）をコードする異種ヌクレオチド配列の挿入を可能にする。いくつかの場合には、Ｒ２ポリペプチド及び核酸は別々の容器に入っている。いくつかの場合には、核酸は、挿入部位の５’側の転写制御エレメントをさらに含む。転写制御エレメントは、異種ヌクレオチド配列が核酸に挿入されたら、この転写制御エレメントが異種ヌクレオチド配列に機能的に連結されるように、挿入部位に対して配置される。適切な転写制御エレメントは上記のとおりである。
【０１０４】
上記のように、任意の所望の異種遺伝子産物（複数可）をコードする異種ヌクレオチド配列の挿入を可能にする核酸は、少なくとも２００ヌクレオチド（ｎｔ）の異種ヌクレオチド配列の挿入を提供する。例えば、いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約２００ｎｔ〜約３００ｎｔ、約３００ｎｔ〜約４００ｎｔ、約４００ｎｔ〜約５００ｎｔ、約５００ｎｔ〜約７５０ｎｔ、約７５０ｎｔ〜約１キロベース（ｋｂ）、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ〜約３ｋｂ、または約３ｋｂ〜約３．５ｋｂの長さを有する。別の例として、いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約３．５ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約４．５ｋｂ、約４．５ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約５．５ｋｂ、約５．５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約６．５ｋｂ、約６．５ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９からｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１１ｋｂ、約１１ｋｂ〜約１２ｋｂ、約１２ｋｂ〜約１３ｋｂ、約１３ｋｂ〜約１４ｋｂ、または約１４ｋｂ〜約１５ｋｂの長さを有する。いくつかの場合には、異種ヌクレオチド配列の長さは約２００ｎｔ〜約１ｋｂである。いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約１ｋｂ〜約５ｋｂの長さを有する。いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約３．５ｋｂ〜約６ｋｂの長さを有する。いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約６ｋｂ〜約８ｋｂの長さを有する。いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約８ｋｂ〜約１５ｋｂの長さを有する。いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約９ｋｂ〜約１５ｋｂの長さを有する。いくつかの場合には、この異種ヌクレオチド配列は、約１０ｋｂ〜約１５ｋｂの長さを有する。
【０１０５】
真核生物宿主細胞に遺伝子産物（複数可）を送達する方法
本開示は、目的の１つ以上の遺伝子産物を真核細胞に送達する方法を提供し、この方法は、細胞を本開示の遺伝子送達媒体システムと接触させることを含む。Ｒ２ポリペプチド、５’ＵＴＲ、及び３’ＵＴＲは、真核細胞のゲノムの２８Ｓ領域への異種ヌクレオチド配列の挿入を提供する。
【０１０６】
いくつかの場合には、真核細胞は、インビトロである。いくつかの場合には、真核細胞は、インビボである。いくつかの場合には、真核細胞は、エクスビボである。
【０１０７】
適切な真核細胞としては、例えば、ヒト細胞、非ヒト動物細胞、植物細胞、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、鳥類細胞、節足動物細胞、クモ形類細胞、昆虫細胞、爬虫類細胞、両生類細胞などが挙げられる。いくつかの場合には、真核細胞はヒト細胞である。いくつかの場合には、真核細胞は非ヒト動物細胞である。いくつかの場合には、真核細胞は、植物細胞である。いくつかの場合には、真核細胞は、無脊椎動物の細胞である。いくつかの場合には、細胞は、罹患細胞である。
【０１０８】
好適な細胞としては、幹細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞（例えば、卵母細胞、精子、卵原細胞、精原細胞等）、体細胞、例えば、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵細胞等が挙げられる。
【０１０９】
好適な細胞としては、ヒト胚性幹細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液肝細胞、筋芽細胞、成体肝細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、胚性幹細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外因性細胞、内因性細胞、幹細胞、造血幹細胞、骨髄由来の前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多能性前駆細胞、単能性前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種細胞、及び出生後幹細胞が挙げられる。適切な細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が挙げられる。
【０１１０】
いくつかの場合には、細胞は、免疫細胞、ニューロン、上皮細胞、及び内皮細胞、または幹細胞である。いくつかの場合には、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、またはマクロファージである。いくつかの場合には、免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの場合には、免疫細胞は、ヘルパーＴ細胞である。いくつかの場合には、免疫細胞は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。
【０１１１】
いくつかの場合には、細胞は、幹細胞である。幹細胞は、成体幹細胞を含む。成体幹細胞はまた、体幹細胞とも称される。
【０１１２】
成体幹細胞は、分化組織中に存在するが、自己更新の特性、及び複数の細胞型、通常は幹細胞が見出される組織に典型的な細胞型を生じる能力を保持する。体幹細胞の多くの例が当業者に公知であり、これには、筋幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、哺乳動物幹細胞、腸幹細胞、中胚葉性幹細胞、内皮幹細胞、嗅覚幹細胞、神経堤幹細胞等が挙げられる。
【０１１３】
関心対象の幹細胞としては、哺乳動物幹細胞が挙げられ、「哺乳動物」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、飼育動物及び家畜、ならびに動物園動物、実験動物、競技用動物、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ等を含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。いくつかの場合には、幹細胞は、ヒト幹細胞である。いくつかの場合には、幹細胞は、齧歯類（例えば、マウス、ラット）幹細胞である。いくつかの場合には、幹細胞は、非ヒト霊長類幹細胞である。
【０１１４】
幹細胞は、１つ以上の幹細胞マーカー、例えば、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＮＥＳＴＩＮ、ＳＯＸ１、ＰＡＸ６、ＫＬＦ４、ＳＯＸ９、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ７、ＬＧＲ５、ＣＡ９、ＦＸＹＤ２、ＣＤＨ６、ＣＬＤＮ１８、ＴＳＰＡＮ８、ＢＰＩＦＢ１、ＯＬＦＭ４、ＣＤＨ１７、及びＰＰＡＲＧＣ１Ａを発現し得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ＨＳＣは、骨髄、血液、臍帯血、胎児肝臓、及び卵黄嚢から単離され得る中胚葉由来の細胞である。ＨＳＣは、ＣＤ３４＋及びＣＤ３−として特徴付けられる。ＨＳＣは、赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球、及びリンパ球様造血細胞系統をインビボで再生し得る。インビトロで、ＨＳＣは、少なくともいくらかの自己更新細胞分裂を受けるように誘導され得、インビボで見られるものと同じ系統に分化するように誘導され得る。したがって、ＨＳＣは、赤血球細胞、巨核球、好中球、マクロファージ、及びリンパ球細胞のうちの１つ以上に分化するように誘導され得る。
【０１１６】
他の実施形態では、幹細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）である。神経幹細胞（ＮＳＣ）は、ニューロン及びグリア（オリゴデンドロサイト及び星状細胞を含む）に分化し得る。神経幹細胞は、多分裂の能力を有する多能性幹細胞であり、特定の条件下で、神経幹細胞である娘細胞、または神経芽細胞もしくは神経膠芽細胞であり得る神経前駆細胞、例えば、それぞれ１種以上のニューロン及びグリア細胞になるように方向付けられた細胞を産生し得る。ＮＳＣを得る方法は、当該技術分野において公知である。
【０１１７】
他の実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。本来、胚性中胚葉に由来し、成体骨髄から単離されるＭＳＣは、分化して、筋肉、骨、軟骨、脂肪、骨髄基質、及び腱を形成し得る。ＭＳＣを単離する方法は、当該技術分野において公知であり、任意の公知の方法を使用して、ＭＳＣを得てもよい。例えば、ヒトＭＳＣの単離について記載している米国特許第５，７３６，３９６号を参照されたい。
【０１１８】
細胞は、いくつかの場合には、植物細胞である。植物細胞は、単子葉植物の細胞であってもよい。細胞は、双子葉植物の細胞であってもよい。
【０１１９】
細胞は、いくつかの場合には、節足動物細胞である。例えば、細胞は、鋏角亜門（Ｃｈｅｌｉｃｅｒａｔａ）、多足類（Ｍｙｒｉａｐｏｄｉａ）、六脚類（Ｈｅｘｉｐｏｄｉａ）、クモ綱（Ａｒａｃｈｎｉｄａ）、昆虫綱（Ｉｎｓｅｃｔａ）、イシノミ目（Ａｒｃｈａｅｏｇｎａｔｈａ）、総尾目（Ｔｈｙｓａｎｕｒａ）、旧翅下綱（Ｐａｌａｅｏｐｔｅｒａ）、カゲロウ目（Ｅｐｈｅｍｅｒｏｐｔｅｒａ）、トンボ目（Ｏｄｏｎａｔａ）、不均翅亜目（Ａｎｉｓｏｐｔｅｒａ）、近翅亜目（Ｚｙｇｏｐｔｅｒａ）、新翅下綱（Ｎｅｏｐｔｅｒａ）、外翅上目（Ｅｘｏｐｔｅｒｙｇｏｔａ）、カワゲラ目（Ｐｌｅｃｏｐｔｅｒａ）、紡脚目（Ｅｍｂｉｏｐｔｅｒａ）、直翅目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）、ジュズヒゲムシ目（Ｚｏｒａｐｔｅｒａ）、革翅目（Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ）、網翅目（Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒａ）、ガロアムシ目（Ｎｏｔｏｐｔｅｒａ）、ガロアムシ科（Ｇｒｙｌｌｏｂｌａｔｔｉｄａｅ）、マントファスマ目（Ｍａｎｔｏｐｈａｓｍａｔｉｄａ）、ナナフシ目（Ｐｈａｓｍａｔｏｄｅａ）、ゴキブリ目（Ｂｌａｔｔａｒｉａ）、等翅目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）、カマキリ目（Ｍａｎｔｏｄｅａ）、準新翅上目（Ｐａｒａｐｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ）、チャタテムシ目（Ｐｓｏｃｏｐｔｅｒａ）、総翅目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）、シラミ目（Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａ）、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、内翅上目（Ｅｎｄｏｐｔｅｒｙｇｏｔａ）もしくは完全変態類（Ｈｏｌｏｍｅｔａｂｏｌａ）、膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、甲虫目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、撚翅目（Ｓｔｒｅｐｓｉｐｔｅｒａ）、ラクダムシ亜目（Ｒａｐｈｉｄｉｏｐｔｅｒａ）、広翅亜目（Ｍｅｇａｌｏｐｔｅｒａ）、脈翅目（Ｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ）、シリアゲムシ目（Ｍｅｃｏｐｔｅｒａ）、ノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、毛翅目（Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ）、または鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）の亜目、科、亜科、群、下位群、または種の細胞であってもよい。
【０１２０】
細胞は、いくつかの場合には、昆虫細胞である。例えば、いくつかの場合には、細胞は、蚊、バッタ、半翅類、ハエ、ノミ、ハナバチ、カリバチ、アリ、シラミ、蛾、または甲虫の細胞である。
【０１２１】
本開示の遺伝子送達システムは、その多くが当技術分野で公知である様々な方法のいずれかによって真核細胞に導入され得る。好適な方法としては、例えば、ウイルス感染、トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型トランスフェクション、リポソーム媒介型形質移入、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子を介した核酸送達等が挙げられる。
【０１２２】
核酸は、十分に開発された形質移入技法（例えば、Ａｎｇｅｌ及びＹａｎｉｋ（２０１０）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５（７）：ｅ１１７５６、ならびにＱｉａｇｅｎから市販されているＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、ＳｔｅｍｇｅｎｔのＳｔｅｍｆｅｃｔ（商標）ＲＮＡ形質移入キット、及びＭｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＬＣのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ｍＲＮＡ形質移入キットを参照）を使用して、真核細胞に提供され得る。また、Ｂｅｕｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ  １０５（５０）：１９８２１−１９８２６も参照されたい。
【０１２３】
いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムは、それを必要とする個体に投与される。本開示の遺伝子送達システムは、様々な投与経路のいずれかによって個体に投与され得る。従来の薬学的に許容される投与経路としては、腫瘍内、腫瘍周囲、筋肉内、気管内、頭蓋内、皮下、皮内、局所適用、静脈内、動脈内、直腸、経鼻、経口、及び他の経腸及び非経口投与経路が挙げられる。投与経路は、必要に応じて組み合わせてもよいし、または遺伝子送達システム及び／もしくは所望の効果に応じて調整してもよい。本開示の遺伝子送達システムは、単回投与で投与しても、または複数回投与で投与してもよい。
【０１２４】
いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムは静脈内投与される。いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムは筋肉内投与される。いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムは局所的に投与される。いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムは腫瘍内に投与される。いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムは腫瘍周囲に投与される。いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムは頭蓋内に投与される。いくつかの場合には、本開示の遺伝子送達システムは皮下投与される。
【０１２５】
いくつかの場合には、標的細胞または標的細胞の集団が、個体から取り出される（から得られる）。標的細胞または標的細胞の集団を、エクスビボで本開示の遺伝子送達システムと接触させて、遺伝子改変された標的細胞または遺伝子改変された標的細胞の集団を生成する。そして、この遺伝子改変された標的細胞または遺伝子改変された標的細胞の集団は、標的細胞または標的細胞の集団が得られた個体に投与される。したがって、いくつかの場合には、本開示の方法は、以下：ａ）エクスビボで標的細胞または標的細胞の集団を、本開示の遺伝子送達システムと接触させ、それにより、遺伝子改変された標的細胞または標的細胞の遺伝子改変された集団を生成すること（ここで、この標的細胞または標的細胞の集団は、治療を必要とする個体から得られた）と、ｂ）遺伝子改変された標的細胞または遺伝子改変された標的細胞の集団を個体に投与し、それにより個体を処置することと、を含む。いくつかの場合には、本開示の方法は、以下：ａ）個体から標的細胞または標的細胞の集団を取得することと、ｂ）エクスビボで標的細胞または標的細胞の集団を本開示の遺伝子送達システムと接触させ、それにより、遺伝子改変された標的細胞または標的細胞の遺伝子改変された集団を生成することと、ｃ）遺伝子改変された標的細胞または遺伝子改変された標的細胞の集団を個体に投与することと、を含む。１つの非限定的な例として、細胞はＴ細胞であってもよい。異種ポリペプチド（複数可）は、ＣＡＲ（例えば、単一ポリペプチド鎖ＣＡＲ；またはヘテロ二量体ＣＡＲ）であってもよい。別の例として、細胞は罹患細胞であってもよく、異種遺伝子産物は以下：ｉ）Ｃａｓ９ポリペプチドなどのＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチド、ｉｉ）ガイドＲＮＡであってもよい。
【０１２６】
本開示の非限定的な態様の例
上記に記載される本主題の実施形態を含む態様は、単独で、または１つ以上の他の態様もしくは実施形態との組み合わせで有益であり得る。上記の記載を制限することなく、１〜３３の番号が付けられた本開示のある特定の非限定的な態様が以下に提供される。本開示を読むと当業者には明らかであるように、個別に番号が付けられた態様の各々は、先行するかまたは後続の個別に番号が付けられた態様のうちのいずれかとともに使用されてもよいし、または組み合わされてもよい。これは、態様の全てのそのような組み合わせに対する裏付けを提供することが意図され、以下に明示的に提供される態様の組み合わせには限定されない。
【０１２７】
態様１．遺伝子送達媒体システムであって、以下：ａ）第１の核酸及び第２の核酸であって、ｉ）第１の核酸が、Ｒ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、及びｉｉ）第２の核酸が、１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、ここで、該異種ヌクレオチド配列が、Ｒ２レトロトランスポゾン３’非翻訳領域（ＵＴＲ）及びＲ２レトロトランスポゾン５’ＵＴＲに隣接し、ここで、該異種ヌクレオチド配列の長さが少なくとも２００ヌクレオチドである、前記第１の核酸及び第２の核酸；またはｂ）ポリペプチド及び核酸であって、ｉ）該ポリペプチドがＲ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチドであり、及びｉｉ）該核酸が、１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、ここで、該異種ヌクレオチド配列が、Ｒ２レトロトランスポゾン３’ＵＴＲ及びＲ２レトロトランスポゾン５’ＵＴＲに隣接し、ここで、該異種ヌクレオチド配列の長さが少なくとも２００ヌクレオチドである、前記ポリペプチド及び核酸、を含む、遺伝子送達媒体システム。
態様２．前記Ｒ２ポリペプチドが、図７に記載の前記アミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様３．前記異種ヌクレオチド配列が、単一の異種遺伝子産物をコードする、態様１または態様２に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様４．前記単一の異種遺伝子産物がポリペプチドである、態様３に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様５．前記単一の異種遺伝子産物がＲＮＡである、態様３に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様６．前記異種ヌクレオチド配列が、少なくとも第１の異種遺伝子産物及び第２の異種遺伝子産物をコードする、態様１または態様２に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様７．前記第１の異種遺伝子産物がポリペプチドであり、前記第２の異種遺伝子産物がＲＮＡである、態様６に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様８．前記ポリペプチドがキメラ抗原受容体である、態様４に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様９．前記第１の異種遺伝子産物が第１の異種ポリペプチドであり、前記第２の異種遺伝子産物が第２の異種ポリペプチドである、態様６に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様１０．前記異種ヌクレオチド配列が、５’から３’の順序で以下：ｉ）前記第１の異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、ｉｉ）内部リボソーム侵入部位、または自己切断ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、ｉｉｉ）前記第２の異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、を含む、態様９に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様１１．前記第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが一緒になってヘテロ二量体キメラ抗原受容体を形成する、態様９に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様１２．前記ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドであり、前記ＲＮＡが、ＲＮＡ誘導エフェクターポリペプチドに結合するガイドＲＮＡである、態様７に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様１３．Ｒ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が真核細胞での発現のためにコドン最適化されている、態様１〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様１４．１つ以上の異種遺伝子産物をコードする前記異種ヌクレオチド配列が、転写制御エレメントに機能的に連結されている、態様１〜１３のいずれか１項に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様１５．前記転写制御エレメントが調節可能なプロモーターである、態様１４に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様１６．前記転写制御エレメントが構成的プロモーターである、態様１４に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様１７．前記異種ヌクレオチド配列が少なくとも３ｋｂの長さを有する、態様１〜１６のいずれか１項に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様１８．前記異種ヌクレオチド配列が約５ｋｂ〜約１０ｋｂの長さを有する、態様１〜１６のいずれか１項に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様１９．前記異種ヌクレオチド配列が約１０ｋｂ〜約１５ｋｂの長さを有する、態様１〜１６のいずれか１項に記載の遺伝子送達媒体システム。
態様２０．以下：
ａ１）Ｒ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸、及び
ｂ１）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を挿入するための挿入部位を含む第２の核酸であって、ここで、該挿入部位が、Ｒ２レトロトランスポゾン３’非翻訳領域（ＵＴＲ）及びＲ２レトロトランスポゾン５’ＵＴＲに隣接しており、ここで、該異種ヌクレオチド配列が、少なくとも２００ヌクレオチドの長さを有する、前記第２の核酸；または
ａ２）Ｒ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチド、及び
ｂ２）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を挿入するための挿入部位を含む核酸であって、該挿入部位が、Ｒ２レトロトランスポゾン３’ＵＴＲ及びＲ２レトロトランスポゾン５’ＵＴＲに隣接しており、該異種ヌクレオチド配列が、少なくとも２００ヌクレオチドの長さを有する、前記核酸
を備える、キット。
態様２１．前記第１の核酸及び第２の核酸が別個の容器に入っている、態様２０（ａ１及びｂ１）に記載のキット。
態様２２．前記Ｒ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、真核細胞での発現のためにコドン最適化されている、態様２０（ａ１）に記載のキット。
態様２３．前記第２の核酸が、挿入部位の５’側の転写制御エレメントをさらに含む、態様２０（ｂ１）に記載のキット。
態様２４．前記Ｒ２ポリペプチド及び前記核酸が別個の容器に入っている、態様２０（ａ２及びｂ２）に記載のキット。
態様２５．前記核酸が、挿入部位の５’側の転写制御エレメントをさらに含む、態様２０（ｂ２）に記載のキット。
態様２６．目的の１つ以上の遺伝子産物を真核細胞に送達する方法であって、前記方法が、細胞を、態様１〜１９のいずれか１項に記載の遺伝子送達媒体システムと接触させることを含み、前記Ｒ２ポリペプチド、５’ＵＴＲ、及び３’ＵＴＲが、真核細胞のゲノムの２８Ｓ領域への異種核酸の挿入を提供する、前記方法。
態様２７．前記接触がインビトロである、態様２６に記載の方法。
態様２８．前記接触がインビボである、態様２６に記載の方法。
態様２９．前記接触がエクスビボである、態様２６に記載の方法。
態様３０．前記真核細胞が非ヒト動物細胞である、態様２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
態様３１．前記真核細胞がヒト細胞である、態様２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
態様３２．前記真核細胞が植物細胞である、態様２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
態様３３．前記真核細胞が無脊椎動物細胞である、態様２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【実施例】
【０１２８】
以下の実施例は、本発明の作成方法及び使用方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するために提示するものであり、本発明者らが考えるそれらの発明の範囲を限定することを意図するものでもなく、また、以下の実験が、実施した全てまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保する努力がなされているが、いくらかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧であるか、またはそれに近い。標準的な略語、例えば、ｂｐは塩基対（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｐｌはピコリットル（複数可）、ｓまたはｓｅｃは秒（複数可）、ｍｉｎは分（複数可）、ｈまたはｈｒは時間（複数可）、ａａはアミノ酸（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｂｐは塩基対（複数可）、ｎｔはヌクレオチド（複数可）、ｉ．ｍ．は筋肉内の（に）、ｉ．ｐ．は腹腔内の（に）、ｓ．ｃは皮下の（に）、等が使用され得る。
【０１２９】
実施例１
カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のＤＮＡを基にして、２つのＤＮＡプラスミドを生成した。１つのプラスミドは、タンパク質Ｒ２（ＯＲ２Ｂｍ）のコード配列の最適化されたバージョンを含んでおり、一方、第２のプラスミドは、いずれも完全ｒＤＮＡ転写物の転写を制御する単一のｒＤＮＡプロモーターの制御下で、３’から５’方向に配向された導入遺伝子、隣接する５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含んでいる。
【０１３０】
ＨＥＫ２９３細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞に両方のプラスミド構築物をＰＥＩトランスフェクトし、４８時間後、ゲノムＤＮＡを抽出し、組み込みの５’接合部から配列決定して、導入遺伝子が正しい部位に組み込まれたこと、及び全長の組み込みが行われたことの両方を確認した（図２）。導入遺伝子カセットをまた、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むように拡張し、次に、これを使用して、組み込み頻度を定量化し、滴定を実行して最も効果的な比率を決定した。ＵＴＲと導入遺伝子とを含むプラスミドのトランスフェクションにより、相同駆動組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ−ｄｒｉｖｅｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＨＤＲ）により１％の組み込み効率を得た。ＯＲ２プラスミドをコトランスフェクトすると、効率は全細胞集団の４％に増大した。
【０１３１】
図２：ゲノムＤＮＡは２８Ｓ  ｒＤＮＡの組み込み接合部をまたいで増幅され、ＣＭＶプロモーター下の５’及び３’ＵＴＲに隣接する導入遺伝子がＯＲ２Ｂｍあり（レーン１）及びなし（レーン３）で増幅されたときに、特異的なバンドが示された。ＲＮＡ  ｐｏｌ  Ｉプロモーターの制御下にある導入遺伝子カセット（レーン２）は、ＯＲ２Ｂｍの存在下でのみ特異的な組み込みバンドを示し、ＯＲ２Ｂｍが存在しない場合には示さなかった（レーン４）。
【０１３２】
図３は、細胞を、ＯＲ２なしで、ＵＴＲに隣接する導入遺伝子のみトランスフェクトした場合に、バンドが存在しないゲノムＤＮＡから完全長アンプリコンが増幅されたことを示している。
【０１３３】
細胞に、ＵＴＲに隣接する導入遺伝子、またはＵＴＲ及びＯＲ２に隣接する導入遺伝子のいずれかをトランスフェクトした。図４は、プロトコルを概略的に示している。３日後、細胞を１：１０の比率で継代し、一部を採取してフローサイトメトリーでスクリーニングした。６日後、細胞を１：１０の比率で再び継代し、１４日目にフローサイトメトリーで細胞をスクリーニングして、導入遺伝子（ＧＦＰ）の安定な発現を分析した。データを図４に示す。ＧＦＰ発現を２つのサンプル間で比較し、ＯＲ２が、３．４％のＧＦＰ陽性細胞の安定な集団の作成を媒介するのに役立つことが示されている。ＯＲ２をトランスフェクトした細胞は４倍多くのＧＦＰ発現を有した。＊はｐ＜０．００５を示す。
【０１３４】
細胞に、様々な量のＯＲ２及び導入遺伝子をトランスフェクトした。次いで、細胞を抗生物質選択（２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ）の下で２週間維持し、数回の洗浄後に生き残ったコロニーをカウントした。データを図５に提示している。図５に示されるように、ＯＲ２が、より高いレベルの持続的発現を媒介することが見出された。＊はｐ＜０．００５を示す。
【０１３５】
細胞にＣＡＲ−Ｔ受容体及びＯＲ２をトランスフェクトし、２週間かけて継代した。図６は、プロトコルを概略的に示している。その後、細胞を当該受容体に対する抗体で標識し、フローサイトメトリーでスクリーニングした。次に、ゲノムＤＮＡを抽出し、完全な転写産物を増幅して、組み込みをさらに確認した。データを図６に提示している。＊はｐ＜０．００５を示す。
【０１３６】
実施例２
２つの遺伝子送達構築物を調製する。第１の構築物は、Ｒ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターである。第２の構築物は、３’から５’方向に配向され、条件付きで活性なＣＡＲの２つのポリペプチド鎖をコードする異種ヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターである。異種ヌクレオチド配列は、Ｒ２  ５’ＵＴＲ及びＲ２  ３’ＵＴＲに隣接している。このＲ２ポリペプチドは、最適化されたＲ２（ＯＲ２）ポリペプチドである。条件付きで活性なＣＡＲの第１のポリペプチド鎖は、以下：ｉ）標的細胞（例えば、がん細胞）上の抗原に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインと、ｉｉ）膜貫通ドメインと、ｉｉｉ）二量体化対の第１のメンバーとを含む。条件付きで活性なＣＡＲの第２のポリペプチド鎖は、以下：ｉ）膜貫通ドメインと、ｉｉ）二量体化対の第２のメンバーと、ｉｉｉ）免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含み、ここで、この細胞内シグナル伝達ドメインはシグナル伝達活性を提供する。条件付きで活性なＣＡＲの第１のポリペプチド、条件付きで活性なＣＡＲの第２のポリペプチド、または条件付きで活性なＣＡＲの第１及び第２のポリペプチドの両方は、細胞内共刺激ポリペプチドを含む。
【０１３７】
２つの遺伝子送達構築物を、インビトロでＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）に導入し、それにより、Ｔ細胞を遺伝子改変する。この遺伝子改変されたＴ細胞は、個体、例えば、がんを有する個体に投与され、ここで、このがんは、条件付きで活性なＣＡＲによって認識される抗原を発現する細胞を含む。
【０１３８】
実施例３
２つの遺伝子送達構築物を調製する。第１の構築物は、Ｒ２レトロトランスポゾンＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターである。第２の構築物は、３’から５’方向に配向され、ＣＡＲ及びｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターである。この異種ヌクレオチド配列は、Ｒ２  ５’ＵＴＲ及びＲ２  ３’ＵＴＲに隣接している。このＲ２ポリペプチドは、最適化されたＲ２（ＯＲ２）ポリペプチドである。ＣＡＲは、ｓｙｎＮｏｔｃｈポリペプチドの細胞内シグナル伝達ドメインによって活性化されるプロモーターに機能的に連結されている。
【０１３９】
実施例４
ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞に、以下：ｉ）Ｒ２  ５’ＵＴＲ及びＲ２３’ＵＴＲに隣接し、ＵＴＲに対して３’から５’の方向に配向されているＧＦＰ発現構築物（ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列はサイトメガロウイルスプロモーターに機能的に連結されている）を含む２．５μｇのプラスミド、及びｉｉ）ＯＲ２をコードする発現カセットを含む５μｇのプラスミドまたはスタッファーＤＮＡ（ＯＲ２ポリペプチドをコードしない対照ＤＮＡ）を含む５μｇのプラスミドのいずれか、をトランスフェクトした。次に、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を１４日間増殖させて、組み込まれていないプラスミドを希釈及び分解した。１４日後、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞をフローサイトメトリーで定量し、ＧＦＰ導入遺伝子を組み込んだ細胞の安定した集団を決定した。
【０１４０】
その結果を図１０に示す。ＯＲ２及びＧＦＰ導入遺伝子を含む構築物をトランスフェクトした細胞のうち、平均して５．６％が、ＧＦＰを安定して発現した。対照的に、スタッファー及びＧＦＰ導入遺伝子をトランスフェクトした細胞の平均では、１．３％がＧＦＰを発現した。
【０１４１】
実施例５
ＨＥＫ２９３細胞に、以下：ｉ）Ｒ２  ５’ＵＴＲ及びＲ２  ３’ＵＴＲに隣接し、ＵＴＲに対して３’から５’の方向に配向された、ＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ（ＨｙｇＢ）耐性カセット（ヌクレオチド配列がＳＶ４０プロモーターに機能的に連結されたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む）を含む０．５μｇのプラスミド、及びｉｉ）ＯＲ２をコードする発現カセットを含む０．５μｇのプラスミドまたはスタッファーＤＮＡ（ＯＲ２ポリペプチドをコードしない対照ＤＮＡ）を含む０．５μｇのプラスミドのいずれか、をトランスフェクトした。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、２００μｇ／ｍのハイグロマイシンを含む培地で培養した。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞をハイグロマイシン含有培地で１４日間増殖させ、組み込まれていないプラスミドを希釈及び分解した。ＨＥＫ２９３細胞をメチレンブルーで染色し、次いで手作業でカウントしてコロニー数を定量化した。ここで、各々のコロニーは１つの組み込み事象を表している。
【０１４２】
その結果を図１１に示す。ＯＲ２及びＨｙｇＢ耐性カセットをトランスフェクトした細胞で、平均１７７の組み込み事象が発生した。スタッファー及びＨｙｇＢ耐性カセットをトランスフェクトした細胞では、平均３９．３３の組み込み事象が発生した。
【０１４３】
実施例６
ＨＥＫ２９３細胞に、以下：ｉ）Ｒ２非翻訳領域（Ｒ２  ５’ＵＴＲ及びＲ２  ３’ＵＴＲ）に隣接し、ＵＴＲに対して３’から５’の方向に配向された、ｃ−ｍｙｃタグを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（ＣＡＲ−ｃ−ｍｙｃ）をコードする発現構築物を含む２．５μｇのプラスミド（この発現構築物はＣＡＲ−ｃ−ｍｙｃをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このヌクレオチド配列は、ＥＦ１−ａｌｐｈａプロモーターに機能的に連結されている）、及びｉｉ）ＯＲ２の発現カセットを含むプラスミド５μｇまたはスタッファーＤＮＡ（ＯＲ２ポリペプチドをコードしない対照ＤＮＡ）を含むプラスミド５μｇのいずれか、をトランスフェクトした。次に、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を１４日間増殖させて、組み込まれていないプラスミドを希釈及び分解した。１４日後、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、ｃ−ｍｙｃタグの細胞表面発現を染色することによりフローサイトメトリーを介して定量化し、導入遺伝子を組み込んだ細胞の安定した集団を決定した。
【０１４４】
データを図１２に示す。ＯＲ２及びＣＡＲ−ｃ−ｍｙｃ導入遺伝子を含む構築物をトランスフェクトした細胞のうち、平均して１．８５％がｃ−ｍｙｃタグを安定して発現していた。対照的に、スタッファー及びＧＦＰ導入遺伝子をトランスフェクトした細胞のうち、平均して０．８７％がｃ−ｍｙｃタグを発現していた。
【０１４５】
本発明は、その特定の実施形態を参照して記載してきたが、本発明の真の主旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされてもよく、同等物に置き換えられてもよいことが、当業者には理解されるべきである。加えて、特定の状態、材料、組成物、プロセス、プロセスのステップ（複数可）を本発明の目的、主旨、及び範囲に適応させるために、多くの改変がなされてもよい。そのような改変は全て、本明細書に添付される特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図１Ａ】
2021530212.tif 000025
【図１Ｂ】
2021530212.tif 000026
【図２】
2021530212.tif 000027
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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