(57)【要約】  本発明は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードするコード配列を含み、コード配列の一部分が野生型ではない、ポリヌクレオチドに関する。本発明は、更に、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えゲノムを含むウイルス粒子、ポリヌクレオチド又はウイルス粒子を含む組成物、並びにポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の方法及び使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって：
（ｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードするコード配列を含み；
（ｉｉ）コード配列の一部分が、コドンが最適化されており；
（ｉｉｉ）コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、長さが少なくとも１１００のヌクレオチドであり；
（ｉｖ）コドンが最適化されている一部分においては、コドンの少なくとも６０％が、ＴＴＣ、ＣＴＧ、ＡＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＣ、ＡＧＣ、ＣＣＣ、ＡＣＣ、ＧＣＣ、ＴＡＣ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＧＡＣ、ＴＧＣ、ＡＧＧ、ＧＧＣ及びＧＡＧからなる群から選択され；
（ｖ）コドンが最適化されている一部分が、配列番号９の対応する一部分と比較して減少した数のＣｐＧを含み；
（ｖｉ）ポリヌクレオチドが：
（ａ）Ａ１ＡＴプロモーター又はＡ１ＡＴプロモーターの断片；及び／又は
（ｂ）ＨＣＲエンハンサー又はＨＣＲエンハンサーの断片
を含む転写調節エレメントを更に含み；並びに
（ｖｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、野生型第ＩＸ因子における３８４位に対応する位置でロイシンをコードするコドンを含む、
ポリヌクレオチド。
【請求項２】
コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、ヒト肝臓における発現のためにコドンが最適化されている、前記請求項のポリヌクレオチド。
【請求項３】
（ｉ）参照野生型第ＩＸ因子ヌクレオチド配列と比較して、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドが、ヒト肝細胞において、より高レベルで発現し；並びに／或いは
（ｉｉ）コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、長さが少なくとも８００の、少なくとも９００の、少なくとも１１００の、１５００未満の、１３００未満の、１２００未満の、８００〜１５００の、９００〜１３００の、１１００〜１２００の、又は約１１９１のヌクレオチドであり；並びに／或いは
（ｉｉｉ）コドンが最適化されている、コード配列の一部分が：
ａ）エキソン３又は少なくとも１０の、少なくとも１５の、少なくとも２０の、２５未満の、１０〜２５の、１５〜２５の、若しくは２０〜２５のヌクレオチドの、エキソン３の一部分；
ｂ）エキソン４又は少なくとも８０の、少なくとも９０の、少なくとも１００の、１１４未満の、８０〜１１４の、９０〜１１４の、若しくは１００〜１１４のヌクレオチドの、エキソン４の一部分；
ｃ）エキソン５又は少なくとも９０の、少なくとも１００の、少なくとも１１０の、１２９未満の、９０〜１２９の、１００〜１２９の、若しくは１１０〜１２９のヌクレオチドの、エキソン５の一部分；
ｄ）エキソン６又は少なくとも１５０の、少なくとも１８０の、少なくとも２００の、２０３未満の、１５０〜２０３の、１８０〜２０３の、若しくは２００〜２０３のヌクレオチドの、エキソン６の一部分；
ｅ）エキソン７又は少なくとも７０の、少なくとも８０の、少なくとも９０の、少なくとも１００の、１１５未満の、７０〜１１５の、８０〜１１５の、９０〜１１５の、若しくは１００〜１１５のヌクレオチドの、エキソン７の一部分；及び／又は
ｆ）エキソン８又は少なくとも４００の、少なくとも４５０の、少なくとも５００の、５４８未満の、４００〜５４８の、４５０〜５４８の、若しくは５００〜５４８のヌクレオチドの、エキソン８の一部分
のうちの１、２、３、４、５若しくはすべてを含み；並びに／或いは
（ｉｖ）コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、少なくとも２０のヌクレオチドの、エキソン３の一部分、少なくとも１００のヌクレオチドの、エキソン４の一部分、少なくとも１１０のヌクレオチドの、エキソン５の一部分、少なくとも１８０のヌクレオチドの、エキソン６の一部分、少なくとも１００のヌクレオチドの、エキソン７の一部分、及び少なくとも５００のヌクレオチドの、エキソン８の一部分を含み；並びに／或いは
（ｖ）コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、及びエキソン８を含み；並びに／或いは
（ｖｉ）コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、エキソン２の一部を含み、エキソン２の一部分が、長さが１６０未満の、１５０未満の、１００未満の、７５未満の、６０未満の、少なくとも２０の、少なくとも３０の、少なくとも４０の、少なくとも５０の、２０〜１６０の、３０〜１５０の、３０〜１００の、４０〜７５の、若しくは約５６のヌクレオチドであり；並びに／或いは
（ｖｉｉ）コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、長さが３０〜１００のヌクレオチドであるエキソン２の一部分を含む、
前記請求項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
【請求項４】
（ｉ）コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、４０未満の、２０未満の、１８未満の、１０未満の、５未満の、若しくは１未満のＣｐＧを含み、及び／又は
（ｉｉ）コドンが最適化されている、コード配列の一部分がＣｐＧを含まない、
前記請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
（ｉ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも４、若しくは少なくとも５が、ＴＴＣと置換されている；
ｂ）フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＴＴＣである；
ｃ）フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＴＴＣであり、残りがＴＴＴである；及び／又は
ｄ）フェニルアラニンをコードするコドンが、次のコドンがＧで始まる場合を除いて、ＴＴＣである；並びに／或いは
（ｉｉ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、ロイシンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、若しくは少なくとも１６が、ＣＴＧと置換されている；
ｂ）ロイシンをコードするコドンの少なくとも９０％、若しくは少なくとも９４％がＣＴＧである；及び／又は
ｃ）ロイシンをコードするコドンの少なくとも９０％、若しくは少なくとも９４％がＣＴＧであり、残りがＣＴＣである；並びに／或いは
（ｉｉｉ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、イソロイシンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１１、若しくは少なくとも１２が、ＡＴＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まるコドンＡＴＣの少なくとも１がＡＴＴと置換されている；
ｃ）イソロイシンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも７０％、若しくは少なくとも７５％がＡＴＣである；
ｄ）イソロイシンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも７０％、若しくは少なくとも７５％がＡＴＣであり、残りがＡＴＴである；及び／又は
ｅ）イソロイシンをコードするコドンが、次のコドンがＧで始まる場合を除いて、ＡＴＣである；並びに／或いは
（ｉｖ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、バリンをコードするコドンの少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、若しくは少なくとも２５が、ＧＴＧと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、バリンをコードするコドンの少なくとも１がＧＴＣと置換されている；
ｃ）バリンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＧＴＧである；及び／又は
ｄ）バリンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＧＴＧであり、残りがＧＴＣである；並びに／或いは 
（ｖ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、セリンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１２、若しくは少なくとも１３が、ＡＧＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、セリンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、若しくは少なくとも４が、ＴＣＴと置換されている；
ｃ）セリンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＡＧＣである；及び／又は
ｄ）セリンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＡＧＣであり、残りがＴＣＴ若しくはＴＣＣである；並びに／或いは
（ｖｉ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、プロリンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、若しくは少なくとも５が、ＣＣＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、プロリンをコードするコドンの少なくとも１が、ＣＣＴと置換されている；
ｃ）プロリンをコードするコドンの少なくとも５０％、少なくとも５５％、若しくは少なくとも６０％がＣＣＣである；
ｄ）プロリンをコードするコドンの５０％、少なくとも５５％、若しくは少なくとも６０％がＣＣＣであり、残りがＣＣＡ若しくはＣＣＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、プロリンをコードするコドンがＣＣＣである；並びに／或いは
（ｖｉｉ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、スレオニンをコードするコドンの少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、若しくは少なくとも１０が、ＡＣＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、スレオニンをコードするコドンの少なくとも１若しくは少なくとも２が、ＡＣＴと置換されている； 
ｃ）スレオニンをコードするコドンの少なくとも４５％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも５５％がＡＣＣである；
ｄ）スレオニンをコードするコドンの少なくとも４５％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも５５％がＡＣＣであり、残りがＡＣＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、スレオニンをコードするコドンがＡＣＣである；並びに／或いは
（ｖｉｉｉ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アラニンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、若しくは少なくとも４が、ＧＣＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、アラニンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、若しくは少なくとも３が、ＧＣＴと置換されている；
ｃ）アラニンをコードするコドンの少なくとも３５％、少なくとも４０％、若しくは少なくとも４３％がＧＣＣである；
ｄ）アラニンをコードするコドンの少なくとも３５％、少なくとも４０％、若しくは少なくとも４５％がＧＣＣであり、残りがＧＣＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、アラニンをコードするコドンがＧＣＣである；並びに／或いは
（ｉｘ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、チロシンをコードするコドンの少なくとも１若しくは少なくとも２が、ＴＡＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まるコドンＴＡＣの少なくとも１が、ＴＡＴと置換されている；
ｃ）チロシンをコードするコドンの少なくとも４０％、少なくとも４５％、若しくは少なくとも４８％がＴＡＣである；
ｄ）チロシンをコードするコドンの少なくとも４０％、少なくとも４５％、若しくは少なくとも４８％がＴＡＣであり、残りがＴＡＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、チロシンをコードするコドンがＴＡＣである；並びに／或いは
（ｘ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも１が、ＣＡＣと置換されている；
ｂ）ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも５０％、少なくとも６０％、若しくは少なくとも６５％がＣＡＣである；
ｃ）ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも５０％、少なくとも６０％、若しくは少なくとも６５％がＣＡＣであり、残りがＣＡＴである；及び／又は
ｄ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、ヒスチジンをコードするコドンがＣＡＣである；並びに／或いは
（ｘｉ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グルタミンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも４、若しくは少なくとも５が、ＣＡＧと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、コドンＣＡＧの少なくとも１が、ＣＡＡと置換されている；
ｃ）グルタミンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも８５％、若しくは少なくとも９０％がＣＡＧである；及び／又は
ｄ）グルタミンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも８５％、若しくは少なくとも９０％がＣＡＧであり、残りがＣＡＡである；並びに／或いは
（ｘｉｉ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アスパラギンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも４、若しくは少なくとも５が、ＡＡＣと置換されている；
ｂ）アスパラギンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＡＡＣである；
ｃ）アスパラギンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＡＡＣであり、残りがＡＡＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、アスパラギンをコードするコドンがＡＡＣである；並びに／或いは
（ｘｉｉｉ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、リシンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも７、少なくとも８、若しくは少なくとも９が、ＡＡＧと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、コドンＡＡＧの少なくとも１が、ＡＡＡと置換されている；
ｃ）リシンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＡＡＧである；及び／又は
ｄ）リシンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＡＡＧであり、残りがＡＡＡである；並びに／或いは
（ｘｉｖ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、若しくは少なくとも４が、ＧＡＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、コドンＧＡＣの少なくとも１が、ＧＡＴと置換されている；
ｃ）アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも４５％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも６０％がＧＡＣである；
ｄ）アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも４５％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも６０％がＧＡＣであり、残りがＧＡＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、アスパラギン酸をコードするコドンがＧＡＣである；並びに／或いは
（ｘｖ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、若しくは少なくとも２６が、ＧＡＧと置換されている；
ｂ）グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＧＡＧである；及び／又は
ｃ）グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＧＡＧであり、残りがＧＡＡである；並びに／或いは
（ｘｖｉ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、システインをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、若しくは少なくとも８が、ＴＧＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、コドンＴＧＣの少なくとも１が、ＴＧＴと置換されている；
ｃ）システインをコードするコドンの少なくとも４０％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも５５％がＴＧＣである；
ｄ）システインをコードするコドンの少なくとも４０％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも５５％がＴＧＣであり、残りがＴＧＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、システインをコードするコドンがＴＧＣである；並びに／或いは
（ｘｖｉｉ）トリプトファンをコードするコドンがＴＧＧである；並びに／或いは
（ｘｖｉｉｉ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アルギニンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、若しくは少なくとも１１が、ＡＧＧと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アルギニンをコードするコドンの少なくとも１が、ＡＧＡと置換されている；
ｃ）アルギニンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも７０％、若しくは少なくとも７５％がＡＧＧである；及び／又は
ｄ）アルギニンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも７０％、若しくは少なくとも７５％がＡＧＧであり、残りがＡＧＡである；並びに／或いは
（ｘｉｘ）ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グリシンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１２、若しくは少なくとも１３が、ＧＧＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、グリシンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、若しくは少なくとも８が、ＧＧＧと置換されている；
ｃ）グリシンをコードするコドンの少なくとも５０％、少なくとも５５％、若しくは少なくとも６０％がＧＧＣである；
ｄ）グリシンをコードするコドンの少なくとも５０％、少なくとも５５％、若しくは少なくとも６０％がＧＧＣであり、残りがＧＧＧである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、グリシンをコードするコドンがＧＧＣである、
前記請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、プロリン、スレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファン、アルギニン、及びグリシン、をコードするコドンを含み、且つコドンが最適されている一部分において：
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも５が、ＴＴＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、ロイシンをコードするコドンの少なくとも１６が、ＣＴＧと置換されている；
ｃ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、イソロイシンをコードするコドンの少なくとも１２が、ＡＴＣと置換されている；
ｄ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、バリンをコードするコドンの少なくとも２５が、ＧＴＧと置換されている；
ｅ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、セリンをコードするコドンの少なくとも１３が、ＡＧＣと置換されている；
ｆ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、プロリンをコードするコドンの少なくとも５が、ＣＣＣと置換されている；
ｇ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、スレオニンをコードするコドンの少なくとも１０が、ＡＣＣと置換されている；
ｈ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アラニンをコードするコドンの少なくとも４が、ＧＣＣと置換されている；
ｉ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、チロシンをコードするコドンの少なくとも２が、ＴＡＣと置換されている；
ｊ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも１が、ＣＡＣと置換されている；
ｋ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グルタミンをコードするコドンの少なくとも５が、ＣＡＧと置換されている；
ｌ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アスパラギンをコードするコドンの少なくとも５が、ＡＡＣと置換されている；
ｍ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、リシンをコードするコドンの少なくとも９が、ＡＡＧと置換されている；
ｎ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも４が、ＧＡＣと置換されている；
ｏ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも２６が、ＧＡＧと置換されている；
ｐ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、システインをコードするコドンの少なくとも８が、ＴＧＣと置換されている；
ｑ）トリプトファンをコードするコドンがＴＧＧである；
ｒ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アルギニンをコードするコドンの少なくとも１１が、ＡＧＧと置換されている；及び
ｓ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グリシンをコードするコドンの少なくとも１３が、ＧＧＣと置換されている、
前記請求項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
【請求項７】
コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、プロリン、スレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファン、アルギニン、及びグリシンをコードするコドンを含み、且つコドンが最適化されている一部分において：
ａ）フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも７０％がＴＴＣであり；
ｂ）ロイシンをコードするコドンの少なくとも９４％がＣＴＧであり；
ｃ）イソロイシンをコードするコドンの少なくとも７５％がＡＴＣであり；
ｄ）バリンをコードするコドンの少なくとも９５％がＧＴＧであり；
ｅ）セリンをコードするコドンの少なくとも７０％がＡＧＣであり；
ｆ）プロリンをコードするコドンの少なくとも６０％がＣＣＣであり；
ｇ）スレオニンをコードするコドンの少なくとも５５％がＡＣＣであり；
ｈ）アラニンをコードするコドンの少なくとも４３％がＧＣＣであり；
ｉ）チロシンをコードするコドンの少なくとも４８％がＴＡＣであり；
ｊ）ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも６５％がＣＡＣであり；
ｋ）グルタミンをコードするコドンの少なくとも９０％がＣＡＧであり；
ｌ）アスパラギンをコードするコドンの少なくとも７０％がＡＡＣであり；
ｍ）リシンをコードするコドンの少なくとも９５％がＡＡＧであり；
ｎ）アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも６０％がＧＡＣであり；
ｏ）グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも９５％がＧＡＧであり；
ｐ）システインをコードするコドンの少なくとも５５％がＴＧＣであり；
ｑ）トリプトファンをコードするコドンがＴＧＧであり；
ｒ）アルギニンをコードするコドンの少なくとも７５％がＡＧＧであり；及び
ｓ）グリシンをコードするコドンの少なくとも６０％がＧＧＣである、
前記請求項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
【請求項８】
コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、プロリン、スレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファン、アルギニン、及びグリシン、をコードするコドンを含み、且つコドンが最適化されている一部分において：
ａ）フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも７０％がＴＴＣであり、残りがＴＴＴであり；
ｂ）ロイシンをコードするコドンの少なくとも９４％がＣＴＧであり、残りがＣＴＣであり；
ｃ）イソロイシンをコードするコドンの少なくとも７５％がＡＴＣであり、残りがＡＴＴであり；
ｄ）バリンをコードするコドンの少なくとも９５％がＧＴＧであり；
ｅ）セリンをコードするコドンの少なくとも７０％がＡＧＣであり；
ｆ）プロリンをコードするコドンの少なくとも６０％がＣＣＣであり、残りがＣＣＡ又はＣＣＴであり；
ｇ）スレオニンをコードするコドンの少なくとも５５％がＡＣＣであり、残りがＡＣＴであり；
ｈ）アラニンをコードするコドンの少なくとも４３％がＧＣＣであり、残りがＧＣＴであり；
ｉ）チロシンをコードするコドンの少なくとも４８％がＴＡＣであり、残りがＴＡＴであり；
ｊ）ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも６５％がＣＡＣであり、残りがＣＡＴであり；
ｋ）グルタミンをコードするコドンの少なくとも９０％がＣＡＧであり、残りがＣＡＡであり；
ｌ）アスパラギンをコードするコドンの少なくとも７０％がＡＡＣであり、残りがＡＡＴであり；
ｍ）リシンをコードするコドンの少なくとも９５％がＡＡＧであり、残りがＡＡＡであり；
ｎ）アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも６０％がＧＡＣであり、残りがＧＡＴであり；
ｏ）グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも９５％がＧＡＧであり、残りがＧＡＡであり；
ｐ）システインをコードするコドンの少なくとも５５％がＴＧＣであり、残りがＴＧＴであり；
ｑ）トリプトファンをコードするコドンがＴＧＧであり；
ｒ）アルギニンをコードするコドンの少なくとも７５％がＡＧＧであり、残りがＡＧＡであり；及び
ｓ）グリシンをコードするコドンの少なくとも６０％がＧＧＣであり、残りがＧＧＧである、
前記請求項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
【請求項９】
参照野生型第ＩＸ因子配列が配列番号９又は配列番号１９である、請求項４〜８のいずれか１項のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
転写調節エレメントが肝臓特異的プロモーターを含む、前記請求項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
Ａ１ＡＴプロモーターの断片が： 
（ｉ）長さが少なくとも１００の、少なくとも１２０の、少なくとも１５０の、少なくとも１８０の、２５５未満の、１００〜２５５の、１５０〜２２５の、１５０〜３００の、若しくは１８０〜２５５のヌクレオチドである；及び／又は
（ｉｉ）長さが１５０〜３００のヌクレオチドである、
前記請求項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ＨＣＲエンハンサーの断片が： 
（ｉ）長さが少なくとも８０の、少なくとも９０の、少なくとも１００の、１９２未満の、８０〜１９２の、９０〜１９２の、１００〜２５０の、若しくは１１７〜１９２のヌクレオチドの断片である；及び／又は
（ｉｉ）長さが１００〜２５０のヌクレオチドである、
前記請求項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
（ｉ）転写調節エレメントが、配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、若しくは１００％同一である；及び／又は
（ｉｉ）転写調節エレメントが、配列番号６の配列を有する、
前記請求項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
（ｉ）ポリヌクレオチドが、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、若しくは１００％同一であるエンハンサーを含む；及び／又は
（ｉｉ）ポリヌクレオチドが、配列番号１３と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、若しくは１００％同一であるエンハンサーを含む；及び／又は
（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドが、配列番号１３のエンハンサーを含む；及び／又は
（ｉｖ）ポリヌクレオチドが、配列番号１４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、若しくは１００％同一であるプロモーターを含む；及び／又は
（ｖ）ポリヌクレオチドが、配列番号１４と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、若しくは１００％同一であるプロモーターを含む；及び／又は
（ｖｉ）ポリヌクレオチドが、配列番号１４のプロモーターを含む、
前記請求項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
野生型第ＩＸ因子における３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがＣＴＸであって、Ｘが任意のヌクレオチドであり、場合によりＸがＣ又はＧである、前記請求項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含み、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードするコード配列を含み、コード配列の一部分が野生型ではない、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記請求項のいずれか１項のポリヌクレオチドを含む組換えゲノムを含む、ウイルス粒子。
【請求項１８】
（ｉ）ＡＡＶ、アデノウイルス、若しくはレンチウイルスのウイルス粒子である；並びに／又は
（ｉｉ）ＡＡＶウイルス粒子である；並びに／又は
（ｉｉｉ）組換えゲノムが：
ａ）ＡＡＶ２  ＩＴＲ；
ｂ）ポリＡ配列；
ｃ）複製起点；及び／若しくは
ｄ）２の分離可能なＩＴＲ
を更に含む；並びに／又は
（ｉｖ）組換えゲノムが一本鎖である、
請求項１７のウイルス粒子。
【請求項１９】
Ｈｕｈ７細胞への形質導入において、ウイルス粒子が、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含むウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子の活性よりも高い第ＩＸ因子活性を有する第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現する、請求項１７又は請求項１８のウイルス粒子。
【請求項２０】
第ＩＸ因子断片が、長さが少なくとも２００の、少なくとも２５０の、少なくとも３００の、２００〜４１５の、２５０〜４１５の、又は３００〜４１５のアミノ酸である、前記請求項のいずれか１項のポリヌクレオチド又はウイルス粒子。
【請求項２１】
前記請求項のいずれか１項のポリヌクレオチド又はウイルス粒子と、医薬的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
【請求項２２】
治療方法における使用のための、前記請求項のいずれか１項のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物。
【請求項２３】
治療方法が、有効量の請求項１〜２１のいずれか１項のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、請求項２２の、使用のためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物。
【請求項２４】
（ｉ）治療方法が血友病を治療する方法である；及び／若しくは
（ｉｉ）治療方法が血友病Ｂを治療する方法である；及び／若しくは
（ｉｉｉ）患者が第ＩＸ因子に対する抗体又は阻害剤を有する；
請求項２２又は請求項２３の、使用のためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子、又は組成物。
【請求項２５】
血友病Ｂを有する患者において、少なくとも２０％の、安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成することであって、場合により、請求項１〜２１のいずれか１項のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成することにおける使用のための、請求項１〜２１のいずれか１項のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物。
【請求項２６】
患者において、少なくとも２０％の、安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、血友病Ｂの治療における使用のための、請求項１〜２１のいずれか１項のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物。
【請求項２７】
（ａ）第ＩＸ因子の活性レベルが、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、又は組成物の投与から少なくとも１０週間、少なくとも１５週間、少なくとも２０週間、少なくとも３０週間、少なくとも４０週間、又は少なくとも５０週間後に安定している；
（ｂ）患者が、（ｉ）配列番号４又は５の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）配列番号６の転写調節エレメント、を含むウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子の活性よりも低い活性を有する第ＩＸ因子による治療が無効である患者である；
（ｃ）患者が、（ｉ）配列番号４又は５の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）配列番号６の転写調節配列、を含むヌクレオチド配列によってコードされる第ＩＸ因子ポリペプチドよりも低いレベルで発現する第ＩＸ因子ポリペプチドによる治療が無効である患者である；
（ｄ）ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物が、血友病Ｂを有する患者における、少なくとも２０％の、安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で投与される；
（ｅ）ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物が、少なくとも４．５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇの用量、又は５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ未満の用量、又は４．５ｘ１０１１〜１ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇの用量、又は４．５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ〜４．９ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、場合により、用量が、ｑＰＣＲを用いてベクターゲノムの数を定量化することによって決定され、場合により、ｑＰＣＲが、プロモーター領域へ結合するプライマーを用い、場合により、プロモーター領域が、導入遺伝子カセットのプロモーター領域である；
（ｆ）投与されるポリヌクレオチド又はウイルス粒子が、哺乳動物細胞から産生され、及び／又は哺乳動物ウイルスベクター産生細胞の使用から生じ、昆虫ウイルスベクター産生細胞（例えば、バキュロウイルス系）で産生されるベクターとは異なる特徴を有する；
（ｇ）安定している第ＩＸ因子活性レベルが、少なくとも２５％又は少なくとも３０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルであり、場合により、安定している第ＩＸ因子活性レベルが、少なくとも３５％の安定している第ＩＸ因子活性レベルであり、場合により、安定している第ＩＸ因子活性レベルが、少なくとも又は約４０％のものである；
（ｈ）第ＩＸ因子活性レベルが、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後、少なくとも５０週間又は約５２週間の時点で、少なくとも２０％であり、場合により、第ＩＸ因子活性レベルが、その時点の直前の少なくとも４０週間の連続期間の間、少なくとも２０％で持続する；
（ｉ）第ＩＸ因子活性レベルが、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後、少なくとも５０週間又は約５２週間の時点で、少なくとも２５％であり、場合により、第ＩＸ因子活性レベルが、その時点の直前の少なくとも４０週間の連続期間の間、少なくとも２５％で持続する；
（ｊ）第ＩＸ因子活性が、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後、少なくとも５０週間又は約５２週間の時点で、少なくとも又は約４０％であり、場合により、第ＩＸ因子活性レベルが、その時点の直前の少なくとも４０週間の連続期間の間、少なくとも４０％で持続する；
（ｋ）第ＩＸ因子活性が、凝固アッセイを用いて、患者からの血液サンプル中の第ＩＸ因子活性を決定して測定され、場合により、凝固アッセイが、ＳｙｎｔｈＡＳｉｌＴＭキットを用いる；
（ｌ）第ＩＸ因子活性が、患者から血液サンプルを採取し、凝固アッセイを用いて血液サンプル中の第ＩＸ因子活性を決定することによって測定され、場合により、凝固アッセイが、ＳｙｎｔｈＡＳｉｌＴＭキットを用いる；
（ｍ）凝固アッセイが一段階凝固アッセイであり、場合により、一段階凝固アッセイがＳｙｎｔｈＡＳｉｌＴＭキットを用いる；並びに／或いは
（ｎ）使用が、ステロイドの共投与を含み、場合により、ステロイドがプレドニゾロンである；
請求項２５又は２６の、使用のためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子、又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、第ＩＸ因子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むウイルス粒子、及び該ポリヌクレオチドを利用する治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｘ連鎖性の、致死的な出血性疾患である血友病Ｂは、３０，０００人に１人の男性に発症する。現在の治療には、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）タンパク質の頻繁な静脈内注射（週に２〜３回）が関係する。この治療は出血を止めるのに非常に効果的であるが、治癒的ではなく、非常に高価であり（１５０，０００ポンド／患者／年）、従って、世界中大多数の血友病Ｂ患者は負担できない。血友病Ｂのための遺伝子治療は、第ＩＸ因子遺伝子の機能的コピーを、罹患した患者に移入した後、第ＩＸ因子の持続的な内因的産生による治癒の可能性を提供する。
【０００３】
本出願は、第ＩＸ因子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを投与することを含む、血友病Ｂを治療するための遺伝子治療アプローチに関する。かかる遺伝子治療アプローチは、第ＩＸ因子の頻繁な静脈内注射の必要性を回避する。しかしながら、効果的な遺伝子治療ベクター、即ち、高レベルの第ＩＸ因子発現及び高活性である第ＩＸ因子の発現を可能にするものを提供することは困難である。
【発明の概要】
【０００４】
発明の要旨
本出願は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに対する様々な改変が、発現した第ＩＸ因子ポリペプチドの発現レベル及び活性を向上させるのに役立ち得ることを実証する。例えば、本出願は、以下：
・コドンが最適化されている配列を用いること；
・コドンが最適化されていない、第ＩＸ因子ポリペプチドの一部分を維持すること；
・イントロン又はイントロンの断片を含めること；
・イントロン又はイントロンの断片に隣接する、コドンが最適化されていない配列を提供すること；
・機能獲得型変異を用いること；
・特異的プロモーターを用いること；及び／又は
・ヌクレオチドを含むＡＡＶゲノムを一本鎖の形態で維持すること
が血友病Ｂの治療のための第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの効力を向上し得ることを実証する。
【０００５】
これらの改変は、高度に発現し、高度に活性のある第ＩＸ因子ポリペプチド又はその断片をコードする第ＩＸ因子配列を提供する。実施例において示されるように、本発明のポリヌクレオチドは、他の第ＩＸ因子をコードするポリヌクレオチド、例えば、国際公開第ＷＯ１６／０７５４７３号に開示されるものよりも高レベルで、全体的な第ＩＸ因子活性を発現させ、提供する。
【０００６】
従って、本発明の第１の態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードするコード配列を含み、コード配列の一部分が野生型ではない、ポリヌクレオチドが提供される。
【０００７】
本発明の第２の態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードするコード配列を含み、コード配列が：（ｉ）配列番号１と、少なくとも９５％、少なくとも９８少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である配列；及び（ｉｉ）配列番号１５と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一ある配列を含む、ポリヌクレオチドが提供される。
【０００８】
本発明の第３の態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードし、配列番号５と、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％の同一性を有する、ポリヌクレオチドが提供される。
【０００９】
本発明の第４の態様においては、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えゲノムを含むウイルス粒子が提供される。
【００１０】
本発明の第５の態様においては、本発明のポリヌクレオチド又はウイルス粒子及び医薬的に許容される賦形剤を含む組成物が提供される。
【００１１】
本発明の第６の態様においては、有効量の本発明のポリヌクレオチド又はウイルス粒子を患者に投与することを含む治療方法が提供される。
【００１２】
本発明の第７の態様においては、治療方法における使用のための薬剤の製造における、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。
【００１３】
第８の態様においては、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現し、それによって疾患を治療することにおける使用のためのものである。
【００１４】
第９の態様においては、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることによって、疾患を治療することにおける使用のためのものである。
【００１５】
第１０の態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させる方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、方法が提供される。
【００１６】
第１１の態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることによって疾患を治療する方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、方法が提供される。
【００１７】
第１２の態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させ、それによって疾患を治療することにおける、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。
【００１８】
第１３の態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることにより、疾患を治療することにおける本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。
【００１９】
第１４の態様においては、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させ、それによって疾患を治療することにおける使用のためのものである。
【００２０】
第１５の態様においては、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドより少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることによって、疾患を治療することにおける使用のためのものである。
【００２１】
第１６の態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させる方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、方法が提供される。
【００２２】
第１７の態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることによって疾患を治療する方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、方法が提供される。
【００２３】
第１８の態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させ、それによって疾患を治療することにおける、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。
【００２４】
第１９の態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることにより、疾患を治療することにおける、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。
【００２５】
第２０の態様においては、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含むウイルス粒子並びに／又は配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含むウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子の活性よりも高い第ＩＸ因子活性を有する第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現させることによる疾患の治療における使用のためのものである。
【００２６】
第２１の態様においては、有効量の本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含むウイルス粒子並びに／又は配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含むウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子の活性よりも高い第ＩＸ因子活性を有する第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現させることによって疾患を治療する方法が提供される。
【００２７】
第２２の態様においては、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含むウイルス粒子並びに／又は配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含むウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子の活性よりも高い第ＩＸ因子活性を有する第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現させることによる疾患の治療おける、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。
【００２８】
第２３の態様においては、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子、又は組成物は、血友病Ｂを有する患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成することにおける使用のためのものである。
【００２９】
第２４の態様においては、有効量の本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、血友病Ｂを有する患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成する方法が提供される。
【００３０】
第２５の態様においては、血友病Ｂを有する患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルの達成することにおける、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。
【００３１】
第２６の態様においては、患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、血友病Ｂの治療に使用するための、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物が提供される。
【００３２】
本発明の第２７の態様においては、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を、患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で、患者に投与することを含む、血友病Ｂを治療する方法が提供される。
【００３３】
第２８の態様においては、患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を、患者に投与することを含む、血友病Ｂの治療における、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１−ＦＩＸ導入遺伝子カセットｓｓＬＰ１．ＦＩＸｃｏ、ｓｓＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦ（ＨＴＦＧ）及びｓｓＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦ（ＨＴＡＧ）の模式図。ＩＴＲ＝逆方向末端反復配列；ＨＬＰ２及びＬＰ１は、それぞれ配列番号６及び７の転写調節エレメントである；Ｅ＝エキソン；Ｔ１＝短縮型イントロン１Ａ；ＷＴ＝野生型；ＣＯ＝コドンが最適化されている；ＡＣＮＰ＝本発明の、コドンが最適化されている配列。
【図２】図２−ＡＡＶ２／Ｍｕｔ  ＣベクターによるＨＵＨ７形質導入の結果―実験１；（Ａ）は、上清中のＦＩＸ抗原のレベルを示す；（Ｂ）は、細胞溶解物中に存在するベクターゲノム数を用いる正規化後のＦＩＸ抗原のレベルを示す；エラーバーは、ｎ＝２の平均±標準偏差を表す。１ｅ３＝１ｘ１０３；５ｅ３＝５ｘ１０３；１ｅ４＝１ｘ１０４；ＭＯＩ＝感染多重度。
【図３】図３−ＡＡＶ２／Ｍｕｔ  ＣベクターによるＨＵＨ７形質導入の結果−実験２、上清中のＦＩＸ抗原のレベルを示す。エラーバーは、ｎ＝３の平均±標準偏差を表す。１ｅ３＝１ｘ１０３；５ｅ３＝５ｘ１０３；１ｅ４＝１ｘ１０４、ＭＯＩ＝感染多重度。
【図４】図４−ＡＡＶ２／Ｍｕｔ  ＣベクターによるＨＵＨ７形質導入の結果―実験２；Ａ）は、上清中のＦＩＸ抗原のレベルを示す；（Ｂ）は、細胞溶解物に存在するベクターゲノム数を用いる正規化後のＦＩＸ抗原のレベルを示す。エラーバーは、ｎ＝３の平均±標準偏差を表す。１ｅ３＝１ｘ１０３；５ｅ３＝５ｘ１０３；１ｅ４＝１ｘ１０４；ＭＯＩ＝感染多重度。
【図５】図５−ＭＯＩ  ５ｘ１０３でのＨＵＨ７細胞のＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ形質導入についての組合せデータ（実験１及び２から）。エラーバーは、ｎ＝１２の平均±標準偏差を表す。Ｐ＝０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｔ検定による）。５ｅ３＝５ｘ１０３；ＭＯＩ＝感染多重度。
【図６】図６−ＡＡＶ２／Ｍｕｔ  ＣベクターによるＨＵＨ７形質導入（実験１）後の、ＭＯＩ  １ｘ１０３、５ｘ１０３、及び１ｘ１０４についてのＦＩＸの活性を示す。エラーバーは、ｎ＝２のデュプリケートウェルの平均±標準偏差を表す。１ｅ３＝１ｘ１０３；５ｅ３＝５ｘ１０３；１ｅ４＝１ｘ１０４；ＭＯＩ＝感染多重度。
【図７】図７−ＡＡＶ２／Ｍｕｔ  ＣベクターによるＨＵＨ７形質導入（実験２）後のＦＩＸの活性を示す。エラーバーは、ｎ＝３の平均±標準偏差を表す。１ｅ３＝１ｘ１０３；５ｅ３＝５ｘ１０３；１ｅ４＝１ｘ１０４；ＭＯＩ＝感染多重度。
【図８】図８−ＡＡＶ２／Ｍｕｔ  ＣベクターによるＨＵＨ７形質導入（実験３）後のＦＩＸの活性を示す。エラーバーは、ｎ＝３の平均±標準偏差を表す。１ｅ３＝１ｘ１０３；５ｅ３＝５ｘ１０３；１ｅ４＝１ｘ１０４；ＭＯＩ＝感染多重度。
【図９】図９−ＡＡＶ２／Ｍｕｔ  ＣベクターによるＨＵＨ７形質導入後に示された、ＭＯＩ  ５ｘ１０３についてのＦＩＸの活性を示す組合せデータ（実験１及び２から；図６及び７）。エラーバーは、ｎ＝１２の平均±標準偏差を表す。５ｅ３＝５ｘ１０３；ＭＯＩ＝感染多重度。統計的有意性はＳｔｕｄｅｎｔ  Ｔ検定（ｐ＝０．０１９５）を用いて決定された。
【図１０】図１０−ＡＡＶ２／８．ＬＰ１．ＦＩＸｃｏ及びＡＡＶ２／８．ＨＬＰ２．ＨＴＦＧの投与（実験３）後の、マウス血漿中のヒトＦＩＸの正規化レベル。ＦＩＸ：抗原レベルはベクターコピー／細胞に対して正規化された。エラーバーは、ｎ＝４のマウスの平均±標準偏差を表す。Ｐ値＜０．０５（Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｔ検定）
【図１１】図１１−Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、代替のＦＩＸコドン最適化の比較（実験４）。ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＦＧ、ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＡＧ又はｓｃＬＰ１．ＦＩＸｃｏ（対照）を含有するＡＡＶ２／８ベクターをマウスに注射した。ＦＩＸ抗原（Ａ）のレベルを、注射の３週間後に評価した（ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＡＧ−ｓｃ．ＬＰ１．ＦＩＸｃｏ間はＰ＝０．０００７、ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＡＧ−ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＦＧ間はｐ＝０．０１９８）。抗原レベルを、ベクターゲノム（Ｂ）に対して正規化した（ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＡＧ−ｓｃ．ＬＰ１．ＦＩＸｃｏ間はｐ＝０．０００９、ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＡＧ−ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＦＧ間はｐ＝０．００３９）。ｎ＝４のマウス。Ｐ値は、一元配置分散分析を用いて決定した（多重比較）。
【図１２】図１２−Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、代替のＦＩＸコドン最適化の比較（実験４）。ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＦＧ、ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＡＧ又はｓｃＬＰ１．ＦＩＸｃｏ（対照）を含有するＡＡＶ２／８ベクターをマウスに注射した。ＦＩＸ活性のレベルは、注射の３週間後に評価した。ｎ＝４のマウス。ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＡＧ−ｓｃＬＰ１．ＦＩＸｃｏ間はＰ＝０．０００８、ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＡＧ−ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＦＧ間はｐ＝０．０１；ｐ値は、一元配置分散分析を用いて決定した（多重比較）。
【図１３】図１３−第ＩＸ因子構造の模式図。模式図の上の数字は、シグナルペプチド及びプロペプチドの領域（配列番号９によってコードされる）を含む完全な第ＩＸ因子ポリペプチド中のアミノ酸位置を表す。模式図の下の数字は、成熟した第ＩＸ因子（配列番号１９中のコード配列の一部分に対応する）の対応のアミノ酸位置を表す。
【図１４−１】図１４−配列表。
【図１４−２】図１４−配列表。
【図１４−３】図１４−配列表。
【図１４−４】図１４−配列表。
【図１４−５】図１４−配列表。
【図１４−６】図１４−配列表。
【図１４−７】図１４−配列表。
【図１４−８】図１４−配列表。
【図１５】図１５−ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＡＧを含有するＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃベクターを受容した２名の血友病Ｂ患者における平均第ＩＸ因子活性。２名の血友病患者に、ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＡＧを含有する４．５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃベクターを投与した。第ＩＸ因子の活性レベルは、投与後０〜５５週間の間定期的に評価した。ＳｙｎｔｈＡＳｉｌＴＭ  ｋｉｔを用いて１段階凝固アッセイで評価したところ、患者は５２週間で４０．５＋／−４．５％の安定している平均第ＩＸ因子活性レベルを達成した。ベクター投与（注入）後６〜１２週目に、予防的プレドニゾロンも患者に投与した。「ＦＩＸ：Ｃ（％）」は、ＦＩＸ活性レベルを示す；左のｙ軸を参照。「ＡＬＴ（ＩＵ／Ｌ）」はアラニンアミノトランスフェラーゼレベルを示す；右のｙ軸を参照。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
一般的な定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３６】
一般に、用語「含む」は、含むが、これに限定されないという意味であることが意図される。例えば、語句「第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドが第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を有するが、ポリヌクレオチドが更なるヌクレオチドを含有し得ることを意味すると解釈されるべきである。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態においては、単語「含む」は、語句「からなる」と置換される。用語「からなる」は、限定的であることが意図される。例えば、語句「第ＩＸ因子ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドが第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を有し、更なるヌクレオチドを有さないことを意味すると理解されるべきである。
【００３８】
用語、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書では交換可能に用いられ、アミノ酸の、任意の長さのポリマー鎖を指すことが意図される。
【００３９】
本発明の目的のために、２の配列（２のポリヌクレオチド配列又は２のポリペプチド配列等）の同一性のパーセントを特定するために、配列は、最適な比較の目的のためにアラインされる（例、第２の配列との最適なアラインメントのために、ギャップが、第１の配列に導入され得る）。次いで、ヌクレオチドの位置でヌクレオチド残基が比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチド残基で占められている場合、その位置でヌクレオチドは同一である。２の配列間の同一性のパーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数（即ち、％同一性＝同一の位置の数／参照配列内の位置の総数ｘ１００）である。
【００４０】
典型的には、配列比較は参照配列の長さの全てにわたって行われる。例えば、ユーザーが、ある特定の（「試験」）配列が配列番号５と９５％同一であるか否かを決定したい場合、配列番号５が参照配列になる。例えば、配列が配列番号５（参照配列の例）と少なくとも８０％同一であるか否かを評価するためには、当業者は、アラインメントを配列番号５の長さの全てにわたって行い、試験配列中のどれだけの位置が配列番号５のものと同一であったかを特定する。少なくとも８０％の位置が同一である場合、試験配列は、配列番号５と少なくとも８０％同一である。該配列が配列番号５より短い場合、ギャップ又は抜けている位置は、同一でない位置であると見なされるべきである。
【００４１】
当業者は、２の配列間の相同性又は同一性を決定するために利用可能な異なるコンピュータプログラムを認識している。例えば、配列の比較及び２の配列間の同一性のパーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成し得る。一実施形態においては、２のアミノ酸配列又は核酸配列間の同一性のパーセントは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  ＧＣＧ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／で入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）アルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、並びにギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、又は４、長さの重み１、２、３、４、５、又は６を用いて決定される。
【００４２】
本発明の目的のために、用語「断片」は、配列の連続部分を指す。例えば、配列番号５の、５０ヌクレオチドの断片は、配列番号の５の、連続する５０ヌクレオチドを指す。
【００４３】
ポリヌクレオチド
一態様においては、本発明は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードするコード配列を含み、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列の一部分が野生型ではない、ポリヌクレオチドを提供する。
【００４４】
ポリヌクレオチドは、以下の特徴のうちの１以上を更に含み得る。ポリヌクレオチドは、コドンが最適化されていない一部分を含み得る。ポリヌクレオチドは、イントロン又はイントロンの断片を含み得る。ポリヌクレオチドは、野生型第ＩＸ因子のコドン３８４に対応するコドンにおける変異を含み得る。
【００４５】
用語、「ポリヌクレオチド」は、任意の長さの、ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はそれらの類似体のポリマー形態を指す。例えば、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（デオキシリボヌクレオチド）又はＲＮＡ（リボヌクレオチド）を含み得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡからなり得る。ポリヌクレオチドはｍＲＮＡであり得る。ポリヌクレオチドはＲＮＡ又はＤＮＡを含み得るので、Ｔ（チミン）ヌクレオチドへのすべての言及はＵ（ウラシル）と置換され得る。
【００４６】
第ＩＸ因子ヌクレオチド配列
ポリヌクレオチドは、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含む。第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードするコード配列を含む。
【００４７】
「コード配列」は、ポリヌクレオチドをコードする配列であり、イントロン等の非コード領域を除外する。コード配列は、非コードヌクレオチド（例、イントロン）によって中断され得るが、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのみがコード配列の一部であると見なされるべきである。例えば、第ＩＸ因子タンパク質をコードするコード配列は、そのコード配列から発現する第ＩＸ因子タンパク質の一部を形成するアミノ酸をコードする任意のコドンを、それらのコドンが配列中で連続しているか、又は１以上の非コードヌクレオチドによって分離されているか否かに関係なく含む。言い換えれば、非コードヌクレオチドのストレッチによって中断されたコードヌクレオチドのストレッチを含有するポリヌクレオチドは、直に並置された（即ち、非コードストレッチを差し引いた）非連続コードストレッチからなる「コード配列」を含むと見なされる。しかしながら、本明細書においては、終止コドンは、全長のコード配列の一部であると見なされる。
【００４８】
用語「コードする配列」は、コードされるポリペプチドをコードするコドンを含むヌクレオチド配列を指す。例えば、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードするヌクレオチド配列は、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片のアミノ酸配列をコードするコドンを含む。好適なヌクレオチド配列が、配列番号５中に提供される。
【００４９】
以下の表は、各アミノ酸をコードするコドンを示す。
【００５０】
【表１】
2021533799.tif 000002
【００５１】
対応するＲＮＡコドンは、上記の表におけるＴの代わりにＵを含有する。
【００５２】
本発明の一態様は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードし、配列番号５と、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％の同一性を有する、ポリヌクレオチドを提供する。場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列はコード配列を含み、コード配列の一部分はコドンが最適化されている。
【００５３】
一般に、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号５の少なくとも１２００の、少なくとも１３５０の、又は少なくとも１６５０のヌクレオチドの断片と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であり得る。第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号５の少なくとも１２００の、少なくとも１３５０の、又は少なくとも１６５０のヌクレオチドの連続断片と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であり得る。第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号５と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一あり得る。例えば、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号５と少なくとも９８％同一であり得る。
【００５４】
第ＩＸ因子タンパク質又はその断片
ポリヌクレオチドは、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードするコード配列を含む第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含む。
【００５５】
野生型第ＩＸ因子は、凝固カスケードの一部を形成するセリンプロテアーゼである。第ＩＸ因子の欠如又は変異は、血液凝固の低下及び血友病Ｂの疾患をもたらし得る。典型的な野生型第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号９（時に第ＩＸ因子Ｍａｌｍｏ  Ｂと称される）又は配列番号１９によってコードされる。代替の野生型第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号９によってコードされるものとコドン１９４において異なり、例えば、コドン１９４は、アラニンの代わりにスレオニン（「Ｍａｌｍｏ  Ａ」）をコードし得る。
【００５６】
第ＩＸ因子（例、配列番号１６の第ＩＸ因子）は、最初は、図１３に示すような、疎水性シグナルペプチド（配列番号１６のアミノ酸１〜２８）、プロペプチド領域（配列番号１６のアミノ酸２９〜４６）及び成熟ポリペプチド領域を含む、前駆体の「未成熟」型として発現する。第ＩＸ因子の成熟（ザイモゲン）型は、疎水性シグナルペプチド及びプロペプチド領域を欠いている。用語、「成熟第ＩＸ因子」は、配列番号８等の、疎水性シグナルペプチドやプロペプチド領域を含まない第ＩＸ因子ポリペプチドを指す。
【００５７】
凝固の間、一本鎖ザイモゲン型は第ＸＩａ因子又は第ＶＩＩａ因子によって切断され、２本の鎖がジスルフィド架橋によって連結された、活性のある二本鎖形態（第ＩＸａ因子）が生成される。活性化された形態は、第Ｘ因子中のアルギニン−イソロイシン結合の加水分解を触媒して、第Ｘａ因子を形成できる。野生型第ＩＸ因子はトロンビンによって阻害される。野生型の第ＩＸ因子タンパク質には、４のタンパク質ドメイン、Ｇｌａドメイン、ＥＧＦドメインの２のタンデムコピー、及び触媒的切断を担うＣ末端トリプシン様ペプチダーゼドメインがある。
【００５８】
用語、「第ＩＸ因子タンパク質」は、第ＩＸ因子の一本鎖ザイモゲン型、活性化された二本鎖形態及びその変異体を指し、成熟第ＩＸ因子ポリペプチド又はプロペプチド領域及び／又はシグナルペプチド領域を含む第ＩＸ因子ポリペプチドを指し得る。
【００５９】
好ましくは、第ＩＸ因子断片は、長さが少なくとも２００の、少なくとも２５０の、少なくとも３００の、２００〜４６１の、２５０〜４６１の、又は３００〜４６１のアミノ酸である。一実施形態においては、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片は：
ａ）配列番号８と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である；又は
ｂ）長さが少なくとも２００の、少なくとも２５０の、少なくとも３００の、２００〜４１５の、２５０〜４１５の、又は３００〜４１５のアミノ酸の配列番号８の断片と、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である
配列を含む。
【００６０】
一実施形態においては、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片は、配列番号１６と、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である；又は、長さが、少なくとも２００の、少なくとも２５０の、少なくとも３００の、２００〜４６１の、２５０〜４６１の、又は３００〜４６１のアミノ酸である配列番号１６の断片と、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である。一実施形態においては、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片は、配列番号１６と、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である；又は、長さが少なくとも３００の、又は３００〜４６１のアミノ酸の配列番号１６の断片と、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である。第ＩＸ因子タンパク質又はその断片は、配列番号１６又は配列番号８の配列を有し得る。
【００６１】
好ましくは、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片は機能的である。機能的な第ＩＸ因子タンパク質又は断片は、第Ｘ因子中のアルギニン−イソロイシン結合の加水分解を行って第Ｘａ因子を形成するものである。
【００６２】
第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされる第ＩＸ因子タンパク質又は断片が機能的であるか否かを決定することは、当業者の能力の範囲内である。当業者は、単に、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を発現させ、発現したタンパク質が、活性があるか否かを試験することを要するのみである。例えば、当業者は、作動可能なプロモーターに連結された第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含む本発明のウイルス粒子を調製し、ウイルス粒子で、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片の発現に好適な条件下で、細胞に形質導入することができ得る。発現した第ＩＸ因子タンパク質又はその断片の活性は、実施例３に記載の活性アッセイ等の発色アッセイを用いて分析され得る。
【００６３】
例えば、好適な発色アッセイは以下の通りである。第ＩＸ因子は、トロンビン、リン脂質、カルシウム、トロンビン活性化第ＶＩＩＩ因子及び第ＸＩａ因子と混合される。これらの条件下で、第ＸＩａ因子は第ＩＸ因子を活性化して第ＩＸａ因子を形成し、第ＩＸａ因子の活性は発色基質（ＳＸａ−１１）の切断を触媒してｐＮＡを生成できる。生成されたｐＮＡのレベルは、４０５ｎｍでの吸光度を決定することにより測定でき、これは、サンプル中の第ＩＸ因子の活性に比例する。
【００６４】
活性は、実施例４に記載のアッセイ等の標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、サンプル中の第ＩＸ因子の濃度を測定し、活性を第ＩＸ因子濃度で除することにより、サンプル中の第ＩＸ因子の異なる濃度を補償するように正規化され得る。例えば、第ＩＸ因子に結合する抗体がプレートに結合させられ得る。未知の濃度の第ＩＸ因子を含むサンプルが、プレート上を通過させられ得る。第ＩＸ因子に結合する二次検出抗体をプレートに適用し、任意の余剰物を洗浄除去する。残っている（即ち、洗浄除去されない）検出抗体が、第ＩＸ因子に結合する。検出抗体は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素に連結され得る。プレート上の第ＩＸ因子に結合する検出抗体のレベルは、検出抗体の量を測定することによって測定され得る。例えば、検出抗体がセイヨウワサビペルオキシダーゼに連結されている場合、セイヨウワサビペルオキシダーゼは、ＴＭＢ（３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン）等の基質からの青色反応生成物の生成を触媒し得、青色生成物のレベルは、４５０ｎｍでの吸収によって検出され得る。青色生成物のレベルは、洗浄ステップ後に残った検出抗体の量に比例する。これは、サンプル中の第ＩＸ因子の量に比例する。
【００６５】
場合により、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片は、配列番号９、配列番号１９、又は配列番号１２によってコードされる第ＩＸ因子ポリペプチドの活性よりも高い活性を有する。場合により、活性は、第ＩＸ因子に特異的な発色基質、即ち、第ＩＸａ因子によって改変されて発色シグナルを提供し得る基質を用いて測定される。好適な発色基質はＳＸａ−１１である。
【００６６】
一実施形態においては、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片は、野生型第ＩＸ因子における３８４位に対応する位置に変異を含む。例えば、野生型第ＩＸ因子の３８４位（シグナルペプチドの開始からの番号付け、即ち、配列番号１６のアミノ酸３８４に対応する位置）はアルギニン残基（Ｒ３８４）であるが、これは異なる残基により置換され得る。一実施形態においては、Ｒ３８４は、小分子疎水性アミノ酸と置換される。例えば、小分子疎水性アミノ酸は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、又はグリシンであり得る。好ましくは、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片は、配列番号１６に示されるように、野生型第ＩＸ因子における３８４位に対応する位置にロイシンを含む。
【００６７】
野生型配列の３８４位に対応する位置での変異は、機能獲得（ＧｏＦ）型変異を引き起こし、機能亢進的な第ＩＸ因子をもたらし得る。３８４位に変異を含有する第ＩＸ因子タンパク質を発現させることの利点は、タンパク質量の比較的小規模の増加が、全体的なタンパク質活性のより大規模な増加をもたらすことである。
【００６８】
ある特定のポリペプチドが３８４位に対応する位置に変異を有するか否かを決定することは、当業者の能力の範囲内である。当業者は、単に、ポリペプチド配列の配列を野生型（前駆体、未成熟）第ＩＸ因子ポリペプチドのものとアラインさせ、後者の３８４番目の残基とアラインする前者の残基がアルギニンであるか否かを決定することを要するのみである。そうでない場合、ポリペプチドは、野生型第ＩＸ因子における３８４位に対応する位置に変異を有する。アラインメントは、上記のＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズム等の任意の好適なアルゴリズムを用いて行われ得る。
【００６９】
コード配列の一部分は野生型ではない
コード配列の一部分は野生型ではない場合がある。野生型第ＩＸ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９により表され、配列番号９のものとは異なる一部分を含むコード配列は、野生型ではない部分を含む（但し、かかる一部分は、やはり野生型と見なされる他の第ＩＸ因子コード配列、例えば、前述のＭａｌｍｏ  Ａ変異体、とも異なる）。
【００７０】
一実施形態においては、野生型ではないコード配列の一部分は、コドンが最適化されている。コード配列が、コドンが最適化されている一部分を含むか否かを特定するために、コード配列を配列番号９とアラインできる。配列のいずれかの部分が配列番号９と同一でない場合、ユーザーは、それらが、コドンが最適化されているか否か、即ち、それらが優先コドン、即ち、ＴＴＣ、ＣＴＧ、ＡＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＣ、ＡＧＣ、ＣＣＣ、ＡＣＣ、ＧＣＣ、ＴＡＣ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＧＡＣ、ＴＧＣ、ＡＧＧ、ＧＧＣ、及びＧＡＧのうちの１と置換されている少なくとも１のコドンを含むか否かを決定しなければならない。野生型ではない該一部分が、優先コドンと置換されている少なくとも１のコドンを含む場合、それは、コドンが最適化されている。好ましくは、コード配列の、連続する一部分は、コドンが最適化されている。しかしながら、いくつかの実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、コード配列の２、３、４又は５領域にわたって分割され得る。場合により、コドンが最適化されていない、コード配列の一部分が、コード配列の３未満の又は２未満の領域に分割される。ヌクレオチド配列は、コドンを、特定の器官又は特定の生物において優先される（即ち、コドンバイアスを反映している）他のコドン（いわゆる優先コドン）と置換することによって、コドンが最適化され得る。かかるコドン最適化は、特定の器官又は特定の生物におけるヌクレオチド配列の発現を向上させる。例えば、ヌクレオチド配列が、ヒト肝臓に対してコドンが最適化される場合、ヌクレオチド配列は、ヒト肝臓において優先されるコドンの数を増加させるように改変される。当業者は、配列のコドンを最適化することは、いくつかの位置には「優先コドン」がすでに存在し得るので、すべてのコドンを変更することを伴わない場合があることを理解する。
【００７１】
かかるコドン最適化は、他の要因の影響を受け得る。例えば、ＣｐＧの存在は発現に対し悪影響を有するため、それらを特定の位置で用いることにより、配列にＣｐＧが導入される場合、ユーザーは優先コドンを用いないことを決定し得る。これはなおコドンの最適化と見なされる。一実施形態においては、Ｃヌクレオチドで終わる優先コドンは、配列中の次のコドンがＧで始まる、コドンが最適化されている、コード配列の一部分に含められない。例えば、コドンＣＴＣはロイシンをコードする。ＣＴＣは、配列中、次のコドンがＧで始まる（コドンＧＴＴ等）ロイシンをコードするためには用いてはならない。
【００７２】
本出願は、特定のコドンが、ヒト肝臓における発現のために優先されており、高い割合の、それら優先コドンを維持しながら、コード配列のＣｐＧ含量を減少させることにより、コード配列の発現が向上することを開示する。優先コドンは、ＴＴＣ、ＣＴＧ、ＡＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＣ、ＡＧＣ、ＣＣＣ、ＡＣＣ、ＧＣＣ、ＴＡＣ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＧＡＣ、ＴＧＣ、ＡＧＧ、ＧＧＣ、及びＧＡＧである。
【００７３】
一実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、肝臓、場合によりヒト肝臓における発現のために、コドンが最適化されている。肝臓における発現のためにコドンが最適化されている、コード配列の一部分は、より高い割合の、優先コドンＴＴＣ、ＣＴＧ、ＡＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＣ、ＡＧＣ、ＣＣＣ、ＡＣＣ、ＧＣＣ、ＴＡＣ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＧＡＣ、ＴＧＣ、ＡＧＧ、ＧＧＣ、及びＧＡＧ等の、肝臓において優先されるコドンを含み得る。
【００７４】
一実施形態においては、以下のコドン：ＴＴＣ、ＣＴＧ、ＡＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＣ、ＡＧＣ、ＣＣＣ、ＡＣＣ、ＧＣＣ、ＴＡＣ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＧＡＣ、ＴＧＣ、ＡＧＧ、ＧＧＣ、及びＧＡＧ、は、野生型ではないか、又はコドンが最適化されている、コード配列の一部分においてトータルで過多である。「トータルで過多である」とは、コドンが最適化されているか、又は野生型ではない、コード配列の一部分における優先コドンの総数が、野生型第ＩＸ因子ヌクレオチド配列（配列番号９又は配列番号１９のもの等）の対応する部分における優先コドンの総数よりも多いことを意味する。
【００７５】
好ましい実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、野生型第ＩＸ因子ヌクレオチド配列の対応する部分（配列番号９のもの等）と比較して、以下のコドン：ＴＴＣ、ＣＴＧ、ＡＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＣ、ＡＧＣ、ＣＣＣ、ＡＣＣ、ＧＣＣ、ＴＡＣ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＧＡＣ、ＴＧＣ、ＡＧＧ、ＧＧＣ、及びＧＡＧ、の頻度が高い。場合により、以下のコドン：ＴＴＣ、ＣＴＧ、ＡＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＣ、ＡＧＣ、ＣＣＣ、ＡＣＣ、ＧＣＣ、ＴＡＣ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＧＡＣ、ＴＧＣ、ＡＧＧ、ＧＧＣ、及びＧＡＧ、は、それらの存在がＣｐＧをもたらす場合を除いて、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、トータルで過多である。場合により、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７３％の、ＴＴＣ、ＣＴＧ、ＡＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＣ、ＡＧＣ、ＣＣＣ、ＡＣＣ、ＧＣＣ、ＴＡＣ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＧＡＣ、ＴＧＣ、ＡＧＧ、ＧＧＣ、及びＧＡＧから成る群から選択されるコドンを含む。
【００７６】
以下の表において、本発明のポリヌクレオチドの、コドンが最適化されている一部分（ＨＬＰ２．Ｔ１−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦ）におけるコドン使用頻度が、野生型第ＩＸ因子ヌクレオチド配列（配列番号９）の対応するストレッチにおけるコドン使用頻度と比較される。
【００７７】
【表２−１】
2021533799.tif 000003
【００７８】
【表２−２】
2021533799.tif 000004
【００７９】
この領域における、配列番号９中の優先コドンの総数は１２０である（配列の３０％）。一方、ＨＴＡＧの、コドンが最適化されている一部分における、優先コドンの総数は２９３（コドンの７３％）である。
【００８０】
ポリヌクレオチドのある特定の部分が優先コドンを含むか否かを決定することは簡単である。ヌクレオチド配列の一部分において用いられる各コドンの頻度を決定するためには、当業者は、単に、コドン使用頻度を調べる、容易に利用可能な１のアルゴリズムにその一部分の配列を入力して結果を検討することを要するのみである。ユーザーは、代替的に、単にそれらを数えることができる。
【００８１】
配列番号９の対応する領域と比較して、ＨＴＡＧの、コドンが最適化されている一部分において、置換されているコドンを以下の表中に示す。
【００８２】
【表３−１】
2021533799.tif 000005
【００８３】
【表３−２】
2021533799.tif 000006
【００８４】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、フェニルアラニンをコードするのコドンの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも４、若しくは少なくとも５が、ＴＴＣと置換されている；
ｂ）フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＴＴＣである；
ｃ）フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＴＴＣであり、残りがＴＴＴである；及び／又は
ｄ）フェニルアラニンをコードするコドンが、次のコドンがＧで始まる場合を除いて、ＴＴＣである。
【００８５】
例えば、少なくとも１のコドンＡが、少なくとも１のコドンＢと置換されていると言うとき、これは、配列番号９等の野生型配列と比較して、少なくとも１の位置における、コドンＡのコドンＢとの置換を指す。かかる置換が行われたか否かを決定するためには、単に、試験配列を野生型の第ＩＸ因子配列にアラインし、どのコドンが異なるかを確認することを要するのみである。野生型第ＩＸ因子のコドンＡに対応する、試験配列中の少なくとも１のコドンが試験配列中のコドンＢである場合、コドンＡの少なくとも１がコドンＢに置き換えられている。例えば、最初のコドンが、試験配列中ではＴＴＴであり、野生型第ＩＸ因子配列中ではＴＴＣである場合、試験配列は、ＴＴＣがＴＴＴで置換された、少なくとも１のコドンを含む。
【００８６】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、ロイシンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、若しくは少なくとも１６が、ＣＴＧと置換されている；
ｂ）ロイシンをコードするコドンの少なくとも９０％、若しくは少なくとも９４％がＣＴＧである；及び／又は
ｃ）ロイシンをコードするコドンの少なくとも９０％、若しくは少なくとも９４％がＣＴＧであり、残りがＣＴＣである。
【００８７】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、イソロイシンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１１、若しくは少なくとも１２が、ＡＴＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まるコドンＡＴＣの少なくとも１がＡＴＴと置換されている；
ｃ）イソロイシンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも７０％、若しくは少なくとも７５％がＡＴＣである；
ｄ）イソロイシンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも７０％、若しくは少なくとも７５％がＡＴＣであり、残りがＡＴＴである；及び／又は
ｅ）イソロイシンをコードするコドンが、次のコドンがＧで始まる場合を除いて、ＡＴＣである。
【００８８】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、バリンをコードするコドンの少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、若しくは少なくとも２５が、ＧＴＧと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、バリンをコードするコドンの少なくとも１がＧＴＣと置換されている；
ｃ）バリンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＧＴＧである；及び／又は
ｄ）バリンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＧＴＧであり、残りがＧＴＣである。
【００８９】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、セリンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１２、若しくは少なくとも１３が、ＡＧＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、セリンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、若しくは少なくとも４が、ＴＣＴと置換されている；
ｃ）セリンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＡＧＣである；及び／又は
ｄ）セリンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＡＧＣであり、残りがＴＣＴ若しくはＴＣＣである。
【００９０】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、プロリンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、若しくは少なくとも５が、ＣＣＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、プロリンをコードするコドンの少なくとも１が、ＣＣＴと置換されている；
ｃ）プロリンをコードするコドンの少なくとも５０％、少なくとも５５％、若しくは少なくとも６０％がＣＣＣである；
ｄ）プロリンをコードするコドンの５０％、少なくとも５５％、若しくは少なくとも６０％がＣＣＣであり、残りがＣＣＡ若しくはＣＣＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、プロリンをコードするコドンがＣＣＣである。
【００９１】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、スレオニンをコードするコドンの少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、若しくは少なくとも１０が、ＡＣＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、スレオニンをコードするコドンの少なくとも１若しくは少なくとも２が、ＡＣＴと置換されている； 
ｃ）スレオニンをコードするコドンの少なくとも４５％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも５５％がＡＣＣである；
ｄ）スレオニンをコードするコドンの少なくとも４５％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも５５％がＡＣＣであり、残りがＡＣＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、スレオニンをコードするコドンがＡＣＣである。
【００９２】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アラニンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、若しくは少なくとも４が、ＧＣＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、アラニンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、若しくは少なくとも３が、ＧＣＴと置換されている；
ｃ）アラニンをコードするコドンの少なくとも３５％、少なくとも４０％、若しくは少なくとも４３％がＧＣＣである；
ｄ）アラニンをコードするコドンの少なくとも３５％、少なくとも４０％、若しくは少なくとも４５％がＧＣＣであり、残りがＧＣＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、アラニンをコードするコドンがＧＣＣである。
【００９３】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、チロシンをコードするコドンの少なくとも１若しくは少なくとも２が、ＴＡＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まるコドンＴＡＣの少なくとも１が、ＴＡＴと置換されている；
ｃ）チロシンをコードするコドンの少なくとも４０％、少なくとも４５％、若しくは少なくとも４８％がＴＡＣである；
ｄ）チロシンをコードするコドンの少なくとも４０％、少なくとも４５％、若しくは少なくとも４８％がＴＡＣであり、残りがＴＡＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、チロシンをコードするコドンがＴＡＣである。
【００９４】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも１が、ＣＡＣと置換されている；
ｂ）ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも５０％、少なくとも６０％、若しくは少なくとも６５％がＣＡＣである；
ｃ）ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも５０％、少なくとも６０％、若しくは少なくとも６５％がＣＡＣであり、残りがＣＡＴである；及び／又は
ｄ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、ヒスチジンをコードするコドンがＣＡＣである。
【００９５】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グルタミンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも４、若しくは少なくとも５が、ＣＡＧと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、コドンＣＡＧの少なくとも１が、ＣＡＡと置換されている；
ｃ）グルタミンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも８５％、若しくは少なくとも９０％がＣＡＧである；及び／又は
ｄ）グルタミンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも８５％、若しくは少なくとも９０％がＣＡＧであり、残りがＣＡＡである。
【００９６】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アスパラギンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも４、若しくは少なくとも５が、ＡＡＣと置換されている；
ｂ）アスパラギンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＡＡＣである；
ｃ）アスパラギンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＡＡＣであり、残りがＡＡＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、アスパラギンをコードするコドンがＡＡＣである。
【００９７】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、リシンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも７、少なくとも８、若しくは少なくとも９が、ＡＡＧと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、コドンＡＡＧの少なくとも１が、ＡＡＡと置換されている；
ｃ）リシンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＡＡＧである；及び／又は
ｄ）リシンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＡＡＧであり、残りがＡＡＡである。
【００９８】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、若しくは少なくとも４が、ＧＡＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、コドンＧＡＣの少なくとも１が、ＧＡＴと置換されている；
ｃ）アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも４５％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも６０％がＧＡＣである；
ｄ）アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも４５％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも６０％がＧＡＣであり、残りがＧＡＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、アスパラギン酸をコードするコドンがＧＡＣである。
【００９９】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、若しくは少なくとも２６が、ＧＡＧと置換されている；
ｂ）グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＧＡＧである；及び／又は
ｃ）グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＧＡＧであり、残りがＧＡＡである。
【０１００】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、システインをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、若しくは少なくとも８が、ＴＧＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、コドンＴＧＣの少なくとも１が、ＴＧＴと置換されている；
ｃ）システインをコードするコドンの少なくとも４０％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも５５％がＴＧＣである；
ｄ）システインをコードするコドンの少なくとも４０％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも５５％がＴＧＣであり、残りがＴＧＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、システインをコードするコドンがＴＧＣである。
【０１０１】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
トリプトファンをコードするコドンがＴＧＧである。
【０１０２】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アルギニンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、若しくは少なくとも１１が、ＡＧＧと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アルギニンをコードするコドンの少なくとも１が、ＡＧＡと置換されている；
ｃ）アルギニンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも７０％、若しくは少なくとも７５％がＡＧＧである；及び／又は
ｄ）アルギニンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも７０％、若しくは少なくとも７５％がＡＧＧであり、残りがＡＧＡである。
【０１０３】
一態様においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グリシンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１２、若しくは少なくとも１３が、ＧＧＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、グリシンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、若しくは少なくとも８が、ＧＧＧと置換されている；
ｃ）グリシンをコードするコドンの少なくとも５０％、少なくとも５５％、若しくは少なくとも６０％がＧＧＣである；
ｄ）グリシンをコードするコドンの少なくとも５０％、少なくとも５５％、若しくは少なくとも６０％がＧＧＣであり、残りがＧＧＧである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、グリシンをコードするコドンがＧＧＣである。
【０１０４】
一実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、プロリン、スレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファン、アルギニン、及びグリシン、をコードするコドンを含む。
【０１０５】
一実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、プロリン、スレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファン、アルギニン、及びグリシン、をコードするコドンを含み、且つコドンが最適されている一部分において：
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも５が、ＴＴＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、ロイシンをコードするコドンの少なくとも１６が、ＣＴＧと置換されている；
ｃ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、イソロイシンをコードするコドンの少なくとも１２が、ＡＴＣと置換されている；
ｄ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、バリンをコードするコドンの少なくとも２５が、ＧＴＧと置換されている；
ｅ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、セリンをコードするコドンの少なくとも１３が、ＡＧＣと置換されている；
ｆ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、プロリンをコードするコドンの少なくとも５が、ＣＣＣと置換されている；
ｇ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、スレオニンをコードするコドンの少なくとも１０が、ＡＣＣと置換されている；
ｈ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アラニンをコードするコドンの少なくとも４が、ＧＣＣと置換されている；
ｉ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、チロシンをコードするコドンの少なくとも２が、ＴＡＣと置換されている；
ｊ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも１が、ＣＡＣと置換されている；
ｋ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グルタミンをコードするコドンの少なくとも５が、ＣＡＧと置換されている；
ｌ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アスパラギンをコードするコドンの少なくとも５が、ＡＡＣと置換されている；
ｍ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、リシンをコードするコドンの少なくとも９が、ＡＡＧと置換されている；
ｎ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも４が、ＧＡＣと置換されている；
ｏ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも２６が、ＧＡＧと置換されている；
ｐ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、システインをコードするコドンの少なくとも８が、ＴＧＣと置換されている；
ｑ）トリプトファンをコードするコドンがＴＧＧである；
ｒ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アルギニンをコードするコドンの少なくとも１１が、ＡＧＧと置換されている；及び
ｓ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グリシンをコードするコドンの少なくとも１３が、ＧＧＣと置換されている。
【０１０６】
一実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、プロリン、スレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファン、アルギニン、及びグリシンをコードするコドンを含み、且つコドンが最適化されている一部分において：
ａ）フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも７０％がＴＴＣであり；
ｂ）ロイシンをコードするコドンの少なくとも９４％がＣＴＧであり；
ｃ）イソロイシンをコードするコドンの少なくとも７５％がＡＴＣであり；
ｄ）バリンをコードするコドンの少なくとも９５％がＧＴＧであり；
ｅ）セリンをコードするコドンの少なくとも７０％がＡＧＣであり；
ｆ）プロリンをコードするコドンの少なくとも６０％がＣＣＣであり；
ｇ）スレオニンをコードするコドンの少なくとも５５％がＡＣＣであり；
ｈ）アラニンをコードするコドンの少なくとも４３％がＧＣＣであり；
ｉ）チロシンをコードするコドンの少なくとも４８％がＴＡＣであり；
ｊ）ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも６５％がＣＡＣであり；
ｋ）グルタミンをコードするコドンの少なくとも９０％がＣＡＧであり；
ｌ）アスパラギンをコードするコドンの少なくとも７０％がＡＡＣであり；
ｍ）リシンをコードするコドンの少なくとも９５％がＡＡＧであり；
ｎ）アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも６０％がＧＡＣであり；
ｏ）グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも９５％がＧＡＧであり；
ｐ）システインをコードするコドンの少なくとも５５％がＴＧＣであり；
ｑ）トリプトファンをコードするコドンがＴＧＧであり；
ｒ）アルギニンをコードするコドンの少なくとも７５％がＡＧＧであり；及び
ｓ）グリシンをコードするコドンの少なくとも６０％がＧＧＣである。
【０１０７】
一実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、プロリン、スレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファン、アルギニン、及びグリシン、をコードするコドンを含み、且つコドンが最適化されている一部分において：
ａ）フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも７０％がＴＴＣであり、残りがＴＴＴであり；
ｂ）ロイシンをコードするコドンの少なくとも９４％がＣＴＧであり、残りがＣＴＣであり；
ｃ）イソロイシンをコードするコドンの少なくとも７５％がＡＴＣであり、残りがＡＴＴであり；
ｄ）バリンをコードするコドンの少なくとも９５％がＧＴＧであり；
ｅ）セリンをコードするコドンの少なくとも７０％がＡＧＣであり；
ｆ）プロリンをコードするコドンの少なくとも６０％がＣＣＣであり、残りがＣＣＡ又はＣＣＴであり；
ｇ）スレオニンをコードするコドンの少なくとも５５％がＡＣＣであり、残りがＡＣＴであり；
ｈ）アラニンをコードするコドンの少なくとも４３％がＧＣＣであり、残りがＧＣＴであり；
ｉ）チロシンをコードするコドンの少なくとも４８％がＴＡＣであり、残りがＴＡＴであり；
ｊ）ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも６５％がＣＡＣであり、残りがＣＡＴであり；
ｋ）グルタミンをコードするコドンの少なくとも９０％がＣＡＧであり、残りがＣＡＡであり；
ｌ）アスパラギンをコードするコドンの少なくとも７０％がＡＡＣであり、残りがＡＡＴであり；
ｍ）リシンをコードするコドンの少なくとも９５％がＡＡＧであり、残りがＡＡＡであり；
ｎ）アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも６０％がＧＡＣであり、残りがＧＡＴであり；
ｏ）グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも９５％がＧＡＧであり、残りがＧＡＡであり；
ｐ）システインをコードするコドンの少なくとも５５％がＴＧＣであり、残りがＴＧＴであり；
ｑ）トリプトファンをコードするコドンがＴＧＧであり；
ｒ）アルギニンをコードするコドンの少なくとも７５％がＡＧＧであり、残りがＡＧＡであり；及び
ｓ）グリシンをコードするコドンの少なくとも６０％がＧＧＣであり、残りがＧＧＧである。
【０１０８】
参照野生型第ＩＸ因子配列は、配列番号９又は配列番号１９であり得る。
【０１０９】
コドンが最適化されている一部分は、第ＩＸ因子タンパク質の一部又は全体をコードする配列に対応し得る。例えば、第ＩＸ因子タンパク質は、完全長のコード配列（配列番号８又は配列番号１６をコードする配列等）又はその変異体であり得、且つコード配列全体が、コドンが最適化され得る。従って、本明細書における「コード配列の一部分がコドンが最適化されている」への言及は、「コード配列の少なくとも一部分がコドンが最適化されている」ことを意味すると理解されるべきである。しかしながら、いくつかの実施形態においては、コード配列の一部分は、コドンが最適化されておらず、例えば、コード配列の一部分は、肝臓における発現のためにコドンが最適化されていない。いくつかの実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、長さが少なくとも８００の、少なくとも９００の、少なくとも１１００の、１５００未満の、１３００未満の、１２００未満の、８００〜１５００の、９００〜１３００の、１１００〜１２００の、又は約１１９１のヌクレオチドである。
【０１１０】
一実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、エキソン３又はエキソン３の一部分の少なくとも１０の、少なくとも１５の、少なくとも２０の、２５未満の、１０〜２５の、１５〜２５の、又は２０〜２５のヌクレオチドを含む。更なる実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、エキソン４又はエキソン４の一部分の少なくとも８０の、少なくとも９０の、少なくとも１００の、１１４未満の、８０〜１１４の、９０〜１１４の、又は１００〜１１４のヌクレオチドを含む。更なる実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、エキソン５又はエキソン５の一部分の少なくとも９０の、少なくとも１００の、少なくとも１１０の、１２９未満の、９０〜１２９の、１００〜１２９の、又は１１０〜１２９のヌクレオチドを含む。更なる実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、エキソン６又はエキソン６の一部分の少なくとも１５０の、少なくとも１８０の、少なくとも２００の、２０３未満の、１５０〜２０３の、１８０〜２０３の、又は２００〜２０３のヌクレオチドを含む。更なる実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、エキソン７又はエキソン７の一部分の少なくとも７０の、少なくとも８０の、少なくとも９０の、少なくとも１００の、１１５未満の、７０〜１１５の、８０〜１１５の、９０〜１１５の、又は１００〜１１５のヌクレオチドを含む。更なる実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、エキソン８又はエキソン８の一部分の少なくとも４００の、少なくとも４５０の、少なくとも５００の、５４８未満の、４００〜５４８の、４５０〜５４８の、又は５００〜５４８のヌクレオチドを含む。
【０１１１】
エキソン３は、野生型第ＩＸ因子（配列番号９の第ＩＸ因子等）のヌクレオチド２５３〜２７７、又は非野生型第ＩＸ因子ヌクレオチド配列における対応する配列を含む。エキソン４は、野生型第ＩＸ因子（配列番号９の第ＩＸ因子等）のヌクレオチド２７８〜３９１、又は非野生型第ＩＸ因子ヌクレオチド配列における対応する配列を含む。エキソン５は、野生型第ＩＸ因子（配列番号９の第ＩＸ因子等）のヌクレオチド３９２〜５２０、又は非野生型第ＩＸ因子ヌクレオチド配列における対応する配列を含む。エキソン６は、野生型第ＩＸ因子（配列番号９の第ＩＸ因子等）のヌクレオチド５２１〜７２３、又は非野生型第ＩＸ因子ヌクレオチド配列における対応する配列を含む。エキソン７は、野生型第ＩＸ因子（配列番号９の第ＩＸ因子等）のヌクレオチド７２４〜８３８、又は非野生型第ＩＸ因子ヌクレオチド配列における対応する配列を含む。エキソン８は、野生型第ＩＸ因子（配列番号９の第ＩＸ因子等）のヌクレオチド８３９〜１３８６、又は非野生型第ＩＸ因子ヌクレオチド配列における対応する配列を含む。
【０１１２】
好ましくは、エキソン３の一部分の少なくとも２０のヌクレオチド、エキソン４の一部分の少なくとも１００のヌクレオチド、エキソン５の一部分の少なくとも１１０のヌクレオチド、エキソン６の一部分の少なくとも１８０のヌクレオチド、エキソン７の一部分の少なくとも１００のヌクレオチド、及びエキソン８の一部分の少なくとも５００のヌクレオチドがコドンが最適化されている。コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、及びエキソン８を含み得る。一実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、エキソン８を含む。
【０１１３】
一実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、エキソン２の一部分を含み、エキソン２の一部分は、長さが、１６０未満の、１５０未満の、１００未満の、７５未満の、６０未満の、少なくとも２０の、少なくとも３０の、少なくとも４０の、少なくとも５０の、２０〜１６０の、３０〜１５０の、３０〜１００の、４０〜７５の、又は約５６のヌクレオチドである。エキソン２は、野生型第ＩＸ因子（配列番号９の第ＩＸ因子等）のヌクレオチド８９〜２５２、又は非野生型第ＩＸ因子ヌクレオチド配列における対応する配列を含む。好ましい実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、長さが３０〜１００のヌクレオチドであるエキソン２の一部分を含む。
【０１１４】
第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードする配列の一部分が、例えば、野生型第ＩＸ因子のエキソン８に対応するか否かを決定することは、当業者の能力の範囲内である。当業者は、単に、上記のＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈのもの等の好適なアラインメントアルゴリズムを用いて、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードする配列とエキソン８との配列アラインメントを行い、少なくとも一部のヌクレオチド配列が、配列番号９の、エキソン８（上記のように、配列番号９のエキソン８は、配列番号９のヌクレオチド８３９〜１３８６からなる）に対する、９０％超、９５％超、又は９８％超の同一性を有するか否かを決定することを要するのみである。
【０１１５】
上記のように、部分的又は全体的にコドンが最適化されているコード配列を含むポリヌクレオチド配列を提供することにより、コードされたポリペプチドが高レベルで発現することが確実になり得る。一実施形態においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、ヒト肝細胞において、参照野生型第ＩＸ因子配列と比較してより高レベルで発現する。参照野生型第ＩＸ因子配列は配列番号９であり得る。一実施形態においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、ヒト肝細胞において、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含むヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと比較して、より高レベルで発現する。一実施形態においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、ヒト肝細胞において、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含むヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと比較して、より高レベルで発現する。
【０１１６】
一実施形態においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、ヒト肝細胞において、配列番号１２又は配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７又は配列番号６の転写調節エレメントを含むヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２．５、又は少なくとも３倍高レベルで発現する。場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、ヒト肝細胞において、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含むヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも、少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２．５、又は少なくとも３倍高レベルで発現する。場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、ヒト肝細胞において、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含むヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２．５、又は少なくとも３倍高レベルで発現する。
【０１１７】
一態様においては、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現し、それによって疾患を治療することにおける使用のためのものである。一態様においては、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることによって、疾患を治療することにおける使用のためのものである。一態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させる方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、方法が提供される。一態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることによって疾患を治療する方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、方法が提供される。一態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させ、それによって疾患を治療することにおける、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。一態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることにより、疾患を治療することにおける本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。一実施形態においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを発現することは、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む。
【０１１８】
一態様においては、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させ、それによって疾患を治療することにおける使用のためのものである。一態様においては、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドより少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることによって、疾患を治療することにおける使用のためのものである。一態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させる方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、方法が提供される。一態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることによって疾患を治療する方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、方法が提供される。一態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させ、それによって疾患を治療することにおける、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。一態様においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることにより、疾患を治療することにおける、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。一実施形態においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを発現させることは、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む。場合により、疾患は血友病、例えば血友病Ｂである。
【０１１９】
当業者は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むウイルス粒子で宿主細胞に、及び参照配列を含むベクターで一部の細胞に、形質導入することにより、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、参照配列と比較してより高レベルで発現するか否かを決定し得る。細胞は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされる第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現するのに好適な条件下で培養され得、発現した第ＩＸ因子タンパク質のレベルが比較され得る。発現した第ＩＸ因子タンパク質のレベルは、「第ＩＸ因子タンパク質又はその断片」と題されたセクションに記載されているようなＥＬＩＳＡを用いて評価され得る。好適な宿主細胞としては、Ｈｕｈ７細胞等の培養ヒト肝細胞が挙げられる。
【０１２０】
上記のように、ＣｐＧ（即ち、ＣＧジヌクレオチド）の存在は、発現効率を低下させ得る。これは、ＣｐＧがメチル化され得、それらのメチル化が遺伝子サイレンシングをもたらし、それによって発現を低下させ得るからである。このため、コドンが最適化されているコード配列の一部分が、参照野生型第ＩＸ因子配列の対応する一部分と比較して、減少した数のＣｐＧを含むことが好ましい。好ましい実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、４０未満の、２０未満の、１０未満の、５未満の、又は１未満のＣｐＧを含む。好ましくは、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、ＣｐＧを含まない、即ち、ＣＧジヌクレオチドを含有しない（０のＣＧジヌクレオチドを含有する）。
【０１２１】
一実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、配列番号１の少なくとも８００の、少なくとも９００の、少なくとも１１００の、１１９１未満の、１１００未満の、１０００未満の、８００〜１１９１の、９００〜１１９１の、又は約１１９１のヌクレオチドの断片と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である。一実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、配列番号１と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である。一実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、配列番号１の９００〜１１９１のヌクレオチドの断片と少なくとも９５％同一である。一実施形態においては、コドンが最適化されている、コード配列の一部分は、配列番号１と少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一である。
【０１２２】
本発明は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードするコード配列を含み、コード配列が、配列番号１と、少なくとも９５％、少なくとも９８少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である配列、及び配列番号１５と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一ある配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。場合により、配列番号１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．８％同一である配列が、コドンが最適化されている。
【０１２３】
コドンが最適化されていないコード配列の一部分
一実施形態においては、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、コドンが最適化されていない一部分を含む。コドンが最適化されていない一部分は、連続する一部分であり得る。コドンが最適化されていない一部分は、イントロン又はイントロンの断片等のコード配列の他の部分と有益に相互作用し得るので、コドンが最適化されていない一部分を含めることは、コード配列の発現を向上し得る。例えば、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、イントロン又はイントロンの断片を含み得、かかる場合においては、野生型第ＩＸ因子配列を有するイントロン又はイントロンの断片に隣接することは、正しいスプライシングを確実にするのに役立ち得る。
【０１２４】
コドンが最適化されていない一部分は、野生型配列と比較して、より多くの数の優先コドンを含むように改変されていない。例えば、コドンが最適化されていない一部分は、野生型配列と同様の数の優先コドンを含み得る。コドンが最適化されていない一部分が含む、コドンＴＴＣ、ＣＴＧ、ＡＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＣ、ＡＧＣ、ＣＣＣ、ＡＣＣ、ＧＣＣ、ＴＡＣ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＧＡＣ、ＴＧＣ、ＡＧＧ、ＧＧＣ、及びＧＡＧは５０％未満であり得る。場合により、コドンが最適化されていない一部分が含む、ＴＴＣ、ＣＴＧ、ＡＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＣ、ＡＧＣ、ＣＣＣ、ＡＣＣ、ＧＣＣ、ＴＡＣ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＧＡＣ、ＴＧＣ、ＡＧＧ、ＧＧＣ、及びＧＡＧからなる群から選択されるコドンは、５０％未満、４５％未満、又は４０％未満である。
【０１２５】
場合により、コドンが最適化されていない一部分は、コドンが、ヒト肝細胞での発現のために最適化されていない。一実施形態においては、コドンが最適化されていない一部分は、配列番号９の対応する一部分と実質的に同数の優先コドンを含む。例えば、コドンが最適化されていない一部分は、対応する、配列番号９の一部分として、優先コドン数の少なくとも９０％を含み得る。
【０１２６】
場合により、コドンが最適化されていない一部分は、長さが少なくとも１００の、少なくとも１５０の、少なくとも１７０の、少なくとも１９０の、２５０未満の、２２５未満の、２００未満の、又は約１９５のヌクレオチドである。
【０１２７】
以下でより詳細に検討されるように、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、イントロン又はイントロンの断片を含み得る。かかる場合、イントロン又はイントロンの断片には、コドンが最適化されていない一部分が隣接し得る。即ち、コドンが最適化されていない一部分の一部は、イントロン又はイントロンの断片の３’末端に隣接し得、コドンが最適化されていない一部分の一部は、イントロン又はイントロンの断片の５’末端に隣接し得る。イントロン又はイントロンの断片は、エキソン１とエキソン２との間にあり得る。かかる場合においては、コドンが最適化されていない一部分であって、該部分がエキソン１の一部分及びエキソン２の一部分を含む、一部分を含めることが好都合である。
【０１２８】
場合により、コドンが最適化されていない一部分は、エキソン１又はエキソン１の少なくとも６０の、少なくとも７０の、少なくとも８０の、６０〜８８の、７０〜８８の、又は８０〜８８の連続ヌクレオチドの一部分を含む。エキソン１は、野生型第ＩＸ因子（配列番号９の第ＩＸ因子等）のヌクレオチド１〜８８、又は非野生型第ＩＸ因子ヌクレオチド配列における対応する配列を含む。エキソン１の一部は、シグナルペプチド領域及びプロペプチド領域をコードし得る。場合により、コドンが最適化されていない一部分は、シグナルペプチド及び／又はプロペプチド領域を含むか、又は含まない。エキソン１は、５’末端に、２９のヌクレオチドの更なる非コードストレッチも含み得る。第ＩＸ因子ヌクレオチド配列がイントロン又はイントロンの断片を含む場合、コドンが最適化されていない一部分は、イントロン又はイントロンの断片に隣接する、エキソン１の一部分を含むことが好ましい。例えば、イントロン又はイントロンの断片がエキソン１とエキソン２との間にある場合、コドンが最適化されていない部分は、配列番号９のヌクレオチド８０〜８８、７０〜８８、６０〜８８、４０〜８８、又は２０〜８８に対応する、エキソン１の一部分を含むことが好ましい。
【０１２９】
場合により、コドンが最適化されていない一部分は、エキソン２の、少なくとも５０の、少なくとも７５の、少なくとも８０の、少なくとも９０の、少なくとも１００の、１４０未満の、１２０未満の、５０〜１４０の、７５〜１２０の又は約１０７のヌクレオチドの一部分を含む。例えば、イントロン又はイントロンの断片がエキソン１とエキソン２との間にある場合、コドンが最適化されていない一部分は、配列番号９のヌクレオチド８９〜１００、８９〜１２０、８９〜１４０、８９〜１６０、８９〜１８０、又は８９〜１９６に対応する、エキソン２の一部分を含むことが好ましい。
【０１３０】
コドンが最適化されていない一部分は、ＣｐＧを含み得る。（，）例えば、コドンが最適化されていない一部分は、配列番号９の対応する部分と同じ数のＣｐＧを含み得る。コドンが最適化されていない一部分は、１００のヌクレオチドあたり少なくとも１の、少なくとも１．５の、又は少なくとも２のＣｐＧを含み得る。コドンが最適化されていない一部分は、少なくとも１の、少なくとも２の、少なくとも３の、１〜５の、２〜５の、又は約５のＣｐＧを含み得る。
【０１３１】
コドンが最適化されていない一部分は、配列番号１５又は配列番号２の、少なくとも１００の、少なくとも１５０の、少なくとも１７５の、１９５未満の、１９０未満の、又は１８０未満の断片と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であり得る。コドンが最適化されていない一部分は、配列番号１５又は配列番号２と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であり得る。例えば、コドンが最適化されていない一部分は、配列番号１５又は配列番号２と少なくとも９８％同一であり得る。
【０１３２】
コドンが最適化されていない一部分は、野生型であり得る。配列番号９は、野生型第ＩＸ因子ヌクレオチドのコード配列の一例である。従って、コドンが最適化されていない一部分は、配列番号９の対応する一部分と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であり得る。
【０１３３】
第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、イントロン又はイントロンの断片を含み得る
第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、コード配列を中断するイントロン又はイントロンの断片を含み得る。イントロンは、発現の過程の間に切除されるヌクレオチドの配列であり、コード配列の一部を形成しない。
【０１３４】
ゲノムの野生型第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、第ＩＸ因子コード配列を中断するイントロンを含む。イントロンの存在は、野生型第ＩＸ因子の高レベルの発現を維持するのに役立ち得る。従って、本発明の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列中に、イントロン、又は少なくともイントロンの断片を含めることが好都合であり得る。例えば、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、野生型第ＩＸ因子におけるイントロン１に対応するイントロン又はイントロンの断片を含み得る。好適には、イントロンは、配列番号３等の、野生型第ＩＸ因子のイントロン１Ａの断片である。イントロン１の配列を短縮することにより、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列の発現が増加することが見出されている。イントロン１Ａを形成するためのイントロン１の短縮は、イントロン中のリプレッサーエレメントを削除し得ると考えられている。イントロン１配列の短縮は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列がより短くなる結果にもなり、これによって、遺伝子治療の実施形態において、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列の、ウイルス送達システムへのより効率的なパッケージングが可能になる。
【０１３５】
イントロンの断片は、５００未満の、４００未満の、３５０未満の、３００未満の、少なくとも１００の、少なくとも２００の、少なくとも２５０の、少なくとも２９０の、１００〜５００の、２００〜４００の、２５０〜３５０の、又は約２９９のヌクレオチドであり得る。イントロンの断片は、配列番号３の少なくとも１００の、少なくとも２００の、少なくとも２５０の、又は少なくとも２９０のヌクレオチドの断片と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であり得る。イントロン又はイントロンの断片は、配列番号３と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であり得る。例えば、イントロン又はイントロンの断片は、配列番号３と、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一であり得る。
【０１３６】
好ましくは、イントロン又はイントロンの断片は、コドンが最適化されていない一部分を中断させる。即ち、イントロンは、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列において、コドンが最適化されていない一部分に対して５’であり、コドンが最適化されていない一部分に対して３’である。イントロンのすぐ３’及び５’、又はイントロンの３’及び５’セクションに近いヌクレオチドが、コドンが最適化されていない場合、イントロンには、コドンが最適化されていない配列が「隣接」する。「イントロンに近い」は、イントロンの１ヌクレオチド以内、２ヌクレオチド以内、３ヌクレオチド以内、４ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、６ヌクレオチド以内、７ヌクレオチド以内、８ヌクレオチド以内、８ヌクレオチド以内、又は１０ヌクレオチド以内を指す。上記のように、イントロン又はイントロンの断片を、コドンが最適化されていないヌクレオチド配列と隣接させることは、正しいスプライシングを確実にするのに役立ち得る。場合により、イントロン又はイントロンの断片には、コドンが最適化されていない少なくとも６０の、少なくとも７０の、少なくとも８０の、少なくとも９０の、又は少なくとも１００のヌクレオチドが隣接する。例えば、イントロンのすぐ３’にある４０のヌクレオチドとイントロンのすぐ５’にある２０のヌクレオチドが、コドンが最適化されていない場合、又はイントロンのすぐ３’にある３０のヌクレオチド及びイントロンのすぐ５’にある３０のヌクレオチドが、コドンが最適化されていない場合、イントロンには、コドンが最適化されていない６０のヌクレオチドが隣接する。場合により、イントロン又はイントロンの断片には、５’末端（例、イントロンのすぐ５’）で、コドンが最適化されていない１１０〜１２０のヌクレオチド、及び３’末端（例、イントロンのすぐ３’）でコドンが最適化されていない１００〜１１０のヌクレオチドが隣接する。
【０１３７】
イントロン又はイントロンの断片は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列のエキソン１及びエキソン２に対応するコード配列部分の間に位置し得る。イントロン又はイントロンの断片が野生型第ＩＸ因子におけるイントロン１の断片に対応する場合、イントロン又はイントロンの断片は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列のエキソン１及びエキソン２に対応するコード配列部分の間にあることが好ましい。
【０１３８】
ポリヌクレオチドは、転写調節エレメントを更に含み得る
ポリヌクレオチドは、転写調節エレメントを含み得る。
【０１３９】
一実施形態においては、転写調節エレメントは、配列番号６と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である。一実施形態においては、ポリヌクレオチドは、配列番号６と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である転写調節エレメントを含む。場合により、ポリヌクレオチドは、配列番号６の転写調節エレメントを含む。
【０１４０】
ＨＬＰ２、ＨＬＰ１、ＬＰ１、ＨＣＲ−ｈＡＡＴ、ＡｐｏＥ−ｈＡＡＴ、及びＬＳＰ等の適切な転写調節エレメント（すべて肝臓特異的転写調節エレメントである）が用いられ得る。これらの転写調節エレメントは、以下：ＨＬＰ１：ＭｃＩｎｔｏｓｈ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１３  Ａｐｒ  ２５，１２１（１７）：３３３５−４４；ＬＰ１：Ｎａｔｈｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００６  Ａｐｒｉｌ  １，１０７（７）：２６５３-２６６１；ＨＣＲ−ｈＡＡＴ：Ｍｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０００；１：５２２−５３２；ＡｐｏＥ−ｈＡＡＴ：Ｏｋｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７，６３７−６４５（１９９６）；及びＬＳＰ：Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９９  Ｍａｒｃｈ  ３０，９６（７）：３９０６-３９１０の参考文献でより詳細に説明されている。ＨＬＰ２転写調節エレメントは、配列番号６の配列を有する。
【０１４１】
転写調節エレメントは、ＨＬＰ２、ＨＬＰ１、ＬＰ１、ＨＣＲ−ｈＡＡＴ、ＡｐｏＥ−ｈＡＡＴ、及びＬＳＰからのプロモーターエレメント及び／又はエンハンサーエレメント等のプロモーター及び／又はエンハンサーを含み得る。これらの転写調節エレメントのそれぞれは、プロモーター、エンハンサー、及び場合により他のヌクレオチドを含む。
【０１４２】
一実施形態においては、転写調節エレメントは、ヒトアポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）肝遺伝子座制御領域（ＨＣＲ；Ｍｉａｏ  ｅｔ  ａｌ（２０００），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １（６）：５２２）、又はその断片であるエンハンサーを含む。一実施形態においては、転写調節エレメントは、長さが少なくとも８０の、少なくとも９０の、少なくとも１００の、１９２未満の、８０〜１９２の、９０〜１９２の、１００〜２５０の又は１１７〜１９２のヌクレオチドの断片である、ＨＣＲエンハンサーの断片を含む。場合により、ＨＣＲエンハンサーの断片は、長さが１００〜２５０のヌクレオチドである。
【０１４３】
好適なＨＣＲエンハンサーエレメント断片は、配列番号１３に記載されている。場合により、転写調節エレメントは、長さが少なくとも８０の、少なくとも９０の、少なくとも１００の、１９２未満の、８０〜１９２の、９０〜１９２の、１００〜２５０の、又は１１７〜１９２のヌクレオチドであるエンハンサーを含み、エンハンサーは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一の配列番号１３であるポリヌクレオチド配列を含む。場合により、転写調節エレメントは、長さが１１７〜１９２のヌクレオチドであるエンハンサーを含み、エンハンサーは、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一の配列番号１３であるポリヌクレオチド配列を含む。
【０１４４】
場合により、転写調節エレメントは、配列番号の１３の少なくとも９０の、少なくとも１００の、又は少なくとも１１０のヌクレオチドの断片と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％又は１００％同一であるエンハンサーを含む。場合により、ポリヌクレオチドは、配列番号１３と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であるエンハンサーを含む。場合により、ポリヌクレオチドは、配列番号１３と、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であるエンハンサーを含む。場合により、ポリヌクレオチドは、配列番号１３のエンハンサーを含む。
【０１４５】
一実施形態においては、転写調節エレメントは、ヒトアルファ−１抗トリプシンプロモーター（Ａ１ＡＴ；Ｍｉａｏ  ｅｔ  ａｌ  （２０００），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １（６）：５２２）であるプロモーター、又はその断片を含む。場合により、長さが少なくとも１００の、少なくとも１２０の、少なくとも１５０の、少なくとも１８０の、２５５未満の、１００〜２５５の、１５０〜２２５の、１５０〜３００の、又は１８０〜２５５のヌクレオチドであるＡ１ＡＴプロモーターの断片。場合により、Ａ１ＡＴプロモーターの断片は、長さが１５０〜３００のヌクレオチドである。
【０１４６】
好適なＡ１ＡＴプロモーター断片は、配列番号１４に記載されている。場合により、転写調節エレメントは、長さが少なくとも１００の、少なくとも１２０の、少なくとも１５０の、少なくとも１８０の、２５５未満の、１００〜２５５の、１５０〜３００の、又は１８０〜２５５のヌクレオチドであるプロモーターを含み、プロモーターは、配列番号１４と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。場合により、転写調節エレメントは、長さが１８０〜２５５のヌクレオチドであるプロモーターを含み、プロモーターは、配列番号１４と、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。場合により、ポリヌクレオチドは、配列番号１４の少なくとも１００の、少なくとも１２０の、又は少なくとも１５０のヌクレオチドの断片と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であるプロモーターを含む。場合により、ポリヌクレオチドは、配列番号１４と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であるプロモーターを含む。場合により、ポリヌクレオチドは、配列番号１４と、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であるプロモーターを含む。場合により、ポリヌクレオチドは、配列番号１４のプロモーターを含む。
【０１４７】
ポリヌクレオチドが肝臓における発現を目的としている場合、プロモーターは肝臓特異的プロモーターであり得る。場合により、プロモーターはヒト肝臓特異的プロモーターである。
【０１４８】
「肝臓特異的プロモーター」は、一般的に他の細胞と比較して肝細胞においてより高レベルの発現を提供するプロモーターである。例えば、当業者は、肝細胞（Ｈｕｈ７細胞等）におけるポリヌクレオチドの発現を、他の組織からの細胞におけるポリヌクレオチドの発現と比較することによって、プロモーターが肝臓特異的プロモーターであるか否かを決定できる。他の組織からの細胞と比較して、肝細胞における発現レベルが高い場合、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。
【０１４９】
機能獲得型変異
第ＩＸ因子タンパク質又はその断片は、機能獲得型変異を含み得る。機能獲得型変異は、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片の活性を増大させる変異である。例えば、機能獲得型変異は、野生型第ＩＸ因子（配列番号９又は配列番号１９によってコードされる第ＩＸ因子等）より少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、若しくは少なくとも８倍又はそれ以上の活性を有する第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をもたらし得る。
【０１５０】
第ＩＸ因子タンパク質又はその断片は、野生型第ＩＸ因子における３８４位に対応する位置（配列番号９のコドン３８４又は配列番号９によってコードされる未成熟ポリペプチドのアミノ酸３８４に対応する）に変異を含み得る。野生型第ＩＸ因子における３８４位に対応する位置での変異は、機能獲得型変異であり得る。例えば、アルギニン３８４のロイシンとの置換は、活性の大幅な増加をもたらし得る。
【０１５１】
第ＩＸ因子タンパク質が第ＩＸ因子における３８４位に対応する位置に変異を含むか否かは、上記のＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈのもの等の適切なアルゴリズムを用い、第ＩＸ因子タンパク質を配列番号１６とアラインさせ、アミノ酸３８４（配列番号１６におけるロイシン）にアラインするアミノ酸がアルギニン残基であるか否かを決定することによって決定できる。配列番号１６のアミノ酸３８４にアラインするアミノ酸がアルギニン残基ではない場合、第ＩＸ因子タンパク質は野生型第ＩＸ因子における３８４位に対応する位置に変異を有する。
【０１５２】
変異が機能獲得型変異であるか否かは、変異を含む第ＩＸ因子タンパク質の活性を、推定される機能獲得型変異を除いて同一である参照第ＩＸ因子タンパク質の活性と比較することによって決定できる。これら２のタンパク質の相対的な活性は、「第ＩＸ因子タンパク質又はその断片」という見出しの下で説明されているような発色アッセイを用いて決定できる。変異を含む第ＩＸ因子タンパク質の活性が参照タンパク質の活性よりも高い場合、その変異は機能獲得型変異である。
【０１５３】
従って、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、第ＩＸ因子における３８４位に対応する位置で、変異をコードするコドンを含み得る。例えば、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置で、小分子疎水性アミノ酸であるアミノ酸をコードするコドンを含み得る。小分子疎水性アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、又はバリンであり得る。例えば、小分子疎水性アミノ酸は、アラニン又はロイシンであり得る。好ましくは、小分子疎水性アミノ酸はロイシンである。
【０１５４】
野生型第ＩＸ因子における３８４位に対応する位置で変異をコードするコドンは、ＣＴＸ等のロイシンをコードするコドンであり得、ここで、Ｘは任意のヌクレオチドである。好ましくは、ＸはＣ又はＧである。野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンは、配列番号４における等のＣＴＣであり得る。代替の実施形態においては、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンは、配列番号１１又は配列番号２６における等のＴＴＧ又はＣＴＧである。例えば、本明細書における配列番号１への言及は、配列番号２６又は１１の対応する部分への言及によって置換され得る。言い換えれば、配列番号１は、ヌクレオチド９５７（Ｃ）でＧと置換され得るか、又はヌクレオチド９５５（Ｃ）及び９５７（Ｃ）で、Ｔ及びＧとそれぞれ置換され得る。
【０１５５】
ポリヌクレオチドは、配列番号５の少なくとも１２００の、少なくとも１３５０の、又は少なくとも１６５０のヌクレオチドの断片と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％又は１００％同一である第ＩＸ因子配列を含み得る。例えば、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号５と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であり得る。
【０１５６】
好適には、
（ｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である配列を含み；且つ
（ｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンはロイシンをコードする。
【０１５７】
好適には、
（ｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であるコード配列を含み；
（ｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンはロイシンをコードし；且つ
（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号１３と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であるエンハンサーエレメントを含む。
【０１５８】
好適には、
（ｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であるコード配列を含み；
（ｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンはロイシンをコードし；且つ
（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号１４と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であるプロモーターエレメントを含む。
【０１５９】
好適には、
（ｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である配列を含み；
（ｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンはロイシンをコードし；且つ
（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号６と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である転写調節エレメントを含む。
【０１６０】
好適には、
（ｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である配列を含み；
（ｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号２と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である配列を含み；且つ
（ｉｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンはロイシンをコードする。
【０１６１】
好適には、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、イントロン又はイントロンの断片を含み、イントロンの断片は、配列番号３と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である。
【０１６２】
ポリヌクレオチドを含むウイルス粒子
本発明は更に、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えゲノムを含むウイルス粒子を提供する。本発明の目的のために、用語「ウイルス粒子」は、ビリオンの全部又は一部を指す。例えば、ウイルス粒子は組換えゲノムを含み、更にキャプシドを含み得る。ウイルス粒子は、遺伝子治療ベクターであり得る。本明細書中、用語「ウイルス粒子」及び「ベクター」は交換可能に使用される。本出願の目的のために、「遺伝子治療」ベクターは、遺伝子治療で用いられ得るウイルス粒子、即ち、投与後の宿主細胞において、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列等の導入遺伝子を発現するために必要なすべての機能的要素を含むウイルス粒子である。
【０１６３】
好適なウイルス粒子としては、パルボウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、又は単純ヘルペスウイルスが挙げられる。パルボウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり得る。ウイルス粒子は、好ましくは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターである。より好ましくは、ウイルス粒子はＡＡＶウイルス粒子である。用語、ＡＡＶ及びｒＡＡＶは、本明細書中、交換可能に用いられる。
【０１６４】
すべての既知のＡＡＶ血清型のゲノム構成は非常に似ている。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５，０００ヌクレオチド未満の線状の一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）は、非構造的な複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質についての特有のコードヌクレオチド配列に隣接する。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、−２、及び−３）がキャプシドを形成する。末端１４５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ字型ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二重鎖が形成され得るように構成されている。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製の起点として機能し、細胞のＤＮＡポリメラーゼ複合体のためのプライマーとして機能する。哺乳動物細胞における野生型（ｗｔ）ＡＡＶ感染に続いて、Ｒｅｐ遺伝子（即ち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードする）は、それぞれＰ５プロモーター及びＰ１９プロモーターから発現し、両方のＲｅｐタンパク質はウイルスゲノムの複製における機能を有する。Ｒｅｐ  ＯＲＦにおけるスプライシングイベントにより、実際には４のＲｅｐタンパク質（即ち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）の発現がもたらされる。しかし、哺乳動物細胞においては、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードする、スプライシングされていないｍＲＮＡが、ＡＡＶベクターの産生に十分であることが示されている。また、昆虫細胞においては、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質が、ＡＡＶベクターの産生に十分である。
【０１６５】
本発明の組換えウイルスゲノムは、ＩＴＲを含み得る。本発明のＡＡＶベクターは１のＩＴＲのみで機能することが可能である。従って、ウイルスゲノムは少なくとも１のＩＴＲを含むが、より典型的には２のＩＴＲを含む（一般的に、ウイルスゲノムのいずれの端にも１、つまり５’末端に１、及び３’末端に１）。ポリヌクレオチドと１以上のＩＴＲとの間に介在配列があり得る。本発明のポリヌクレオチドは、正規の２のＩＴＲの間に位置するか、又は２のＤ領域で改変されたＩＴＲのいずれかの側に位置するウイルス粒子に組み込まれ得る。
【０１６６】
本発明において、ＡＡＶベクターの産生のために使用され得るＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来し得る。一般的に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで有意な相同性のゲノム配列を有し、同一の一式の遺伝的機能を提供し、実質的に物理的及び機能的に同等のビリオンを生成し、実質的に同一のメカニズムによって複製及び集合する。さまざまなＡＡＶ血清型のゲノム配列及びゲノム類似性の概要については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９７；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ，１９８３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９９；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９８；及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ，２０００を参照。本発明においては、ＡＡＶ血清型１、２、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２が用いられ得る。ＡＡＶ血清型由来の配列は、遺伝子治療ベクターの作製に用いられる場合に変異又は操作され得る。
【０１６７】
場合により、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４及び／又はＡＡＶ６に由来するＩＴＲ配列を含む。好ましくは、ＩＴＲ配列はＡＡＶ２  ＩＴＲ配列である。本明細書において、用語、ＡＡＶｘ／ｙは、ＡＡＶｘからのいくつかの成分（ここで、ｘは、ＡＡＶ血清型番号）及びＡＡＶｙからのいくつかの成分（ここで、ｙは、同一か又は異なる血清型の番号）を含むウイルス粒子を指す。例えば、ＡＡＶ２／８ベクターは、ＩＴＲを含む、ＡＡＶ２株に由来するウイルスゲノムの一部分、及びＡＡＶ８株に由来するキャプシドを含み得る。
【０１６８】
一実施形態においては、ウイルス粒子は、キャプシドを含むＡＡＶウイルス粒子である。ＡＡＶキャプシドは、一般的には、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３の３のタンパク質から形成される。ＶＰ１のアミノ酸配列はＶＰ２の配列を含む。ＶＰ２の一部を形成しないＶＰ１の一部分は、ＶＰ１ｕｎｉｑｕｅ又はＶＰ１Ｕと称される。ＶＰ２のアミノ酸配列はＶＰ３の配列を含む。ＶＰ３の一部を形成しないＶＰ２の一部分は、ＶＰ２ｕｎｉｑｕｅ又はＶＰ２Ｕと称される。好ましくは、キャプシドは、ＡＡＶ５キャプシド又はＭｕｔ  Ｃキャプシドである。Ｍｕｔ  Ｃキャプシドは、配列番号１０に対して少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％の同一性又は１００％の同一性を有し得る。ＡＡＶキャプシドは、配列番号１７に対して少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、９９．５％の、少なくとも９９．８％、又は１００％の同一性を有し得る。代替の実施形態においては、キャプシドは、配列番号１７のＶＰ２Ｕ及び／又はＶＰ３並びに配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４又は配列番号２５に対して少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％の同一性を有するＶＰ１Ｕを有する。
【０１６９】
本発明のウイルス粒子は、ウイルスＩＴＲ及びウイルスキャプシドが、異なるＡＡＶ血清型等の異なるパルボウイルスに由来する「ハイブリッド」粒子であり得る。好ましくは、ウイルスＩＴＲ及びキャプシドは、ＡＡＶの異なる血清型に由来し、その場合、かかるウイルス粒子は、トランスキャプシド化又は偽型化として知られる。同様に、パルボウイルスは、「キメラ」キャプシド（例、異なるパルボウイルス、好ましくは異なるＡＡＶ血清型由来の配列を含有する）又は「標的化」キャプシド（例、指向性）を有し得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態においては、組換えＡＡＶゲノムは、機能的末端分離部位（ＴＲＳ）を含む完全なＩＴＲを含む。かかるＡＡＶゲノムは、１又は２の分離可能なＩＴＲ、つまり、部位特異的なニッキングが発生して、ＤＮＡポリメラーゼがＩＴＲを巻き戻し、複製するための基質として機能できる遊離の３’ヒドロキシル基を作製できる機能的ＴＲＳを含有するＩＴＲを含有し得る。好ましくは、組換えゲノムは一本鎖である（即ち、それは一本鎖形態でウイルス粒子にパッケージングされる）。場合により、組換えゲノムは、自己相補的構成でパッケージングされず、即ち、ゲノムは、ウイルス粒子内でアニーリングする実質的な自己相補的部分を有する、単一の、共有結合的に連結されたポリヌクレオチド鎖を含まない。代替的に、組換えゲノムは「単量体二重鎖」形態でパッケージングされ得る。「単量体二重鎖」は、ＷＯ２０１１／１２２９５０に記載されている。ゲノムは、ウイルス粒子内でアニーリングする２の実質的に相補的であるが、非共有結合的に連結されたポリヌクレオチドとしてパッケージングされ得る。
【０１７１】
ウイルス粒子は、ポリＡ配列を更に含み得る。ポリＡ配列は、機能的な第ＩＸ因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流に位置し得る。ポリＡ配列は、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ｂＧＨｐＡ）であり得る。ポリＡ配列は、長さが２５０〜２７０のヌクレオチドであり得る。
【０１７２】
本発明のウイルス粒子は、場合により、宿主細胞において高度に発現する。例えば、Ｈｕｈ７細胞における形質導入において、ウイルス粒子は、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含むウイルス粒子並びに／又は配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含むウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子タンパク質の活性よりも高い第ＩＸ因子活性を有する第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現する。
【０１７３】
場合により、ウイルス粒子は、Ｈｕｈ７細胞の集団への形質導入後、同等のＨｕｈ７細胞の集団に形質導入された、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む同等のウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子の活性よりも高い第ＩＸ因子活性を有する第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現する。場合により、ウイルス粒子は、Ｈｕｈ７細胞の集団への形質導入後、同等のＨｕｈ７細胞の集団に形質導入された、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む同等のウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子の活性よりも高い第ＩＸ因子活性を有する第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現する。
【０１７４】
一態様においては、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含むウイルス粒子並びに／又は配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含むウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子の活性よりも高い第ＩＸ因子活性を有する第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現させることによる疾患の治療における使用のためのものである。一態様においては、有効量の本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含むウイルス粒子並びに／又は配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含むウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子の活性よりも高い第ＩＸ因子活性を有する第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現させることによって疾患を治療する方法が提供される。一態様においては、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含むウイルス粒子並びに／又は配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含むウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子の活性よりも高い第ＩＸ因子活性を有する第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現させることによる疾患の治療おける、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。場合により、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含むウイルス粒子並びに／又は配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含むウイルス粒子は、同等のウイルス粒子である。場合により、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現させることは、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む。場合により、疾患は血友病、例えば血友病Ｂである。
【０１７５】
かかる実施形態においては、用語「同等のウイルス粒子」は、該同等のウイルス粒子が、異なる第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び異なる転写調節エレメント（配列番号１２及び配列番号７又は配列番号１８及び配列番号６）を含むことを除けば、本発明のＡＡＶウイルス粒子と同じウイルス粒子を指す。場合により、活性は、上記の発色アッセイ等の発色アッセイを用いて評価される。ただし、この場合、活性は第ＩＸ因子濃度に対して正規化されていないため、活性は第ＩＸ因子タンパク質の発現レベル及び固有の活性の関数である。
【０１７６】
組成物、方法及び使用
本発明の更なる態様において、本発明のポリヌクレオチド又はベクター／ウイルス粒子及び医薬的に許容される賦形剤を含む組成物が提供される。
【０１７７】
医薬的に許容される賦形剤は、担体、希釈剤及び／又は他の医薬品（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｇｅｎｔ）、医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）又は補助剤等を含み得る。場合により、医薬的に許容される賦形剤は、生理食塩水を含む。場合により、医薬的に許容される賦形剤は、ヒト血清アルブミンを含む。
【０１７８】
本発明は更に、治療方法における使用のための本発明のポリヌクレオチド、ベクター／ウイルス粒子又は組成物を提供する。場合により、治療方法は、有効量の本発明のポリヌクレオチド又はベクター／ウイルス粒子を患者に投与することを含む。
【０１７９】
本発明は更に、有効量の本発明のポリヌクレオチド又はベクター／ウイルス粒子を患者に投与することを含む治療方法を提供する。
【０１８０】
本発明は更に、治療方法における使用のための薬剤の製造における、本発明のポリヌクレオチド、ベクター／ウイルス粒子又は組成物の使用を提供する。
【０１８１】
場合により、治療方法は、有効量の本発明のポリヌクレオチド又はベクター／ウイルス粒子を患者に投与することを含む。
【０１８２】
場合により、治療方法は遺伝子治療である。「遺伝子治療」は、それが投与される宿主において導入遺伝子（第ＩＸ因子ヌクレオチド配列等）を発現できる本発明のベクター／ウイルス粒子を投与することを含む。
【０１８３】
場合により、治療方法は、血友病（例えば、血友病Ａ若しくはＢ）又はフォン・ヴィレブランド病等の凝固障害を治療する方法である。好ましくは、凝固障害は、出血の増加及び／又は凝固の減少を特徴とする。場合により、治療方法は、血友病、例えば血友病Ｂを治療する方法である。いくつかの実施形態においては、患者は血友病Ｂに罹患している患者である。場合により、患者は第ＩＸ因子に対する抗体又は阻害剤を有する。場合により、ポリヌクレオチド及び／又はベクター／ウイルス粒子は静脈内投与される。場合により、ポリヌクレオチド及び／又はベクター／ウイルス粒子は、患者に一回のみ投与（即ち、単回投与）するためのものである。
【０１８４】
上記の方法で血友病Ｂを「治療」する場合、これは血友病の１以上の症状が改善されることを意味する。血友病の症状が完全に改善されて患者に存在しなくなるという意味ではないが、一部の方法ではそうなる場合がある。治療方法は、血友病Ｂの症状の１以上の、治療前よりも低い重症度をもたらし得る。場合により、治療方法は、投与前の状況と比較して、患者の血液中の循環する第ＩＸ因子の量／濃度、及び／又はある特定の量の患者の血液内で検出可能な第ＩＸ因子活性の全体的なレベル、及び／又は患者の血液中の第ＩＸ因子の比活性（第ＩＸ因子タンパク質の量あたりの活性）の増加をもたらす。
【０１８５】
「治療有効量」は、投与量で、及び必要な期間の間に（機能的第ＩＸ因子産生を、血友病Ｂの症状を改善するのに十分なレベルでもたらすために）被験体における機能的第ＩＸ因子のレベルを上げる等の所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。
【０１８６】
場合により、ベクター／ウイルス粒子は、患者の体重１ｋｇあたり１ｘ１０１１未満の、１ｘ１０１２未満の、５ｘ１０１２未満の、２ｘ１０１２未満の、１．５ｘ１０１２未満の、３ｘ１０１２未満の、１ｘ１０１３未満の、２ｘ１０１３未満の、又は３ｘ１０１３未満のベクターゲノムの用量で投与される。場合により、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、又は組成物は、患者の体重１ｋｇあたり、少なくとも４．５ｘ１０１１の、又は４．５ｘ１０１１〜１ｘ１０１２のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与される。場合により、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ未満の用量で投与される。場合により、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、４．５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ〜５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇの、又は４．５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ〜４．９ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。場合により、投与されるポリヌクレオチド又はウイルス粒子は、哺乳動物細胞から産生され、及び／又は哺乳動物ウイルスベクター産生細胞の使用に起因し、昆虫ウイルスベクター産生細胞（例、バキュロウイルス系）で産生されるベクターとは異なる特徴を有する。
【０１８７】
場合により、ベクターゲノムの数に関して定量化された所定用量のベクター／ウイルス粒子の投与は、ベクターゲノムを力価測定するためのｑＰＣＲを用いて達成される。原則として、ｑＰＣＲプライマーは、野生型ゲノムには共通していない組換えベクターゲノムの任意の部分に結合するように設計され得るが、ＩＴＲに非常に近いプライマーテンプレート配列を用いると、ベクターゲノム力価測定の過大評価がもたらされ得るため、そうしないことが推奨される。場合により、ベクターゲノムは、プロモーター領域、例えば、導入遺伝子カセット（時に導入遺伝子発現カセットとしても知られる）のプロモーター領域に対するプライマーを利用する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって定量化される。
【０１８８】
ｑＰＣＲを行う方法は、当業者に公知である。リアルタイムＰＣＲサイクラー及びＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等のＤＮＡ結合色素を用いて、新生二本鎖アンプリコンの増幅がリアルタイムで検出され得る。次いで、既知量のｑＰＣＲテンプレート遺伝物質（例、プロモーター領域）を段階的に希釈して検量線を作成し、検量線からサンプルベクターゲノム力価が内挿される。
【０１８９】
場合により、投与されるベクター／ウイルス粒子の用量は、被験体が、第ＩＸ因子を、非血友病の健康な被験者の第ＩＸ因子活性の１０％〜９０％、２０％〜８０％、３０％〜７０％、２５％〜５０％、２０〜１５０％、３０％〜１４０％、４０％〜１３０％、５０％〜１２０％、６０％〜１１０％又は７０％〜１００％の活性で発現するように選択される。場合により、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、血友病Ｂを有する患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で投与される。場合により、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、血友病Ｂを有する患者において少なくとも２５％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で投与される。場合により、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、血友病Ｂを有する患者において少なくとも３０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で投与される。場合により、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、血友病Ｂを有する患者において少なくとも３５％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で投与される。場合により、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、血友病Ｂを有する患者において少なくとも又は約４０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で投与される。
【０１９０】
一態様においては、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子、又は組成物は、血友病Ｂを有する患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成することにおける使用のためのものである。一態様においては、有効量の本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、血友病Ｂを有する患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成する方法が提供される。更なる態様においては、血友病Ｂを有する患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成することにおける、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。更なる態様においては、血友病Ｂを有する患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、血友病Ｂの治療における使用のための、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物が提供される。更なる態様においては、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を、血友病Ｂを有する患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で、患者に投与することを含む、血友病Ｂを治療する方法が提供される。更なる態様においては、血友病Ｂを有する患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を、患者に投与することを含む、血友病Ｂの治療における、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。場合により、血友病Ｂを治療するか、又は安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成することは、本発明のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む。場合により、少なくとも２０％、少なくとも３０％又は少なくとも４０％の安定している第ＩＸ因子活性レベル等の安定な第ＩＸ因子活性レベルを達成するために、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物は、５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ未満の又は４．５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ〜４．９ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。場合により、投与されるポリヌクレオチド又はウイルス粒子は、哺乳動物細胞から産生され、及び／又は哺乳動物ウイルスベクター産生細胞の使用に起因し、昆虫ウイルスベクター産生細胞（例、バキュロウイルス系）で産生されるベクターとは異なる特徴を有する。
【０１９１】
少なくともＸ％（例、少なくとも２０％）の第ＩＸ因子活性レベルは、正常の第ＩＸ因子レベル範囲の少なくともＸ％（例、２０％）である第ＩＸ因子活性レベルを指す。当業者は、国際基準を参照することによって、日常の臨床診療において決定される、正常第ＩＸ因子活性レベルの％への言及によって何が意味されるかを容易に理解する。プールされた正常な（健康な）ヒト血漿の第ＩＸ因子濃度は約５μｇ／ｍｌである。
【０１９２】
用語「安定している第ＩＸ因子活性レベル」は、少なくとも５週間の連続期間の間に特定のレベル以上で持続する第ＩＸ因子活性レベルを指す。いくつかの実施形態においては、第ＩＸ因子活性レベルは、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、又は少なくとも５０週間の連続期間の間、特定のレベル以上で持続する。例えば、活性レベルが少なくとも５週間の連続期間の間に少なくとも２０％で持続する場合、患者は少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを有する。かかる例においては、第ＩＸ因子活性レベルは、少なくとも５週間後も少なくとも２０％であり続ける場合があり、従って、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、又は少なくとも４０、又は少なくとも５０週間の累積連続期間の間に少なくとも２０％で持続し得る。場合により、第ＩＸ因子活性レベルが少なくとも２０週間の連続期間の間に特定のレベル以上で持続する場合、患者は安定している第ＩＸ因子活性レベルを有する。場合により、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物が投与された患者は、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、又は少なくとも３５％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを有し得る。場合により、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、又は組成物が投与された患者は、少なくとも又は約４０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを有し得る。
【０１９３】
場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与から少なくとも１０週間、少なくとも１５週間、少なくとも２０週間、少なくとも３０週間、少なくとも４０週間、又は少なくとも５０週間後に安定している。例えば、患者がポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を投与される時から、少なくとも１０週間後に、患者が少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを有する場合、投与から最初の少なくとも１０週間を経て、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０又は少なくとも４０、又は少なくとも５０週間の連続期間の間に少なくとも２０％で持続する、少なくとも２０％の第ＩＸ因子活性レベルが存在する。場合により、患者は、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与から少なくとも１０週間後に安定している第ＩＸ因子活性レベルを有し、第ＩＸ因子活性レベルは、少なくとも２０週間又は少なくとも４０週間（投与から最初の少なくとも１０週間を経て）の連続期間の間に特定のレベル以上で（ａｔ  ａｔ）持続する。場合により、投与から少なくとも１０週間、少なくとも１５週間、少なくとも２０週間、少なくとも３０週間、又は少なくとも４０週間後の安定している第ＩＸ因子活性レベルは、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％又は少なくとも３５％であり得る。場合により、投与から少なくとも１０週間、少なくとも１５週間、少なくとも２０週間、少なくとも３０週間、又は少なくとも４０週間後の安定している第ＩＸ因子活性レベルは、少なくとも又は約４０％であり得る。いくつかの実施形態においては、患者は、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与から少なくとも１０週間後、少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを有し、第ＩＸ因子活性レベルは、少なくとも（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ａｔ  ｌｅａｓｔ）２０週間又は少なくとも４０週間（投与から最初の少なくとも１０週間を経て）の連続期間の間に少なくとも２０％で持続する。いくつかの実施形態においては、患者は、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与から少なくとも１０週間後に少なくとも４０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを有し、第ＩＸ因子活性レベルは、少なくとも２０週間又は少なくとも４０週間（投与から最初の少なくとも１０週間を経て）の連続期間の間に少なくとも４０％で持続する。
【０１９４】
場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０又は少なくとも５０週間の時点で特定のレベル（例、２０％、２５％、３０％、３５％、又は４０％）以上である。例えば、第ＩＸ因子の活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１又は５２週間の時点で、特定のレベル（例、２０％、２５％、３０％、３５％、又は４０％）以上である。場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後約１０週間の時点で少なくとも２０％である。場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後約１０週間の時点で少なくとも２５％である。場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後約１０週間の時点で少なくとも４０％である。場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後約２０週間の時点で少なくとも２０％である。場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後約２０週間の時点で少なくとも２５％である。場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後約２０週間の時点で少なくとも又は約４０％である。場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後約５２週間の時点で少なくとも２０％である。場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後約５２週間の時点で少なくとも２５％である。場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後約５２週間の時点で少なくとも又は約４０％である。
【０１９５】
第ＩＸ因子活性レベルが、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０又は少なくとも５０週間の時点で特定のレベル（例、２０％、２５％、３０％、３５％、又は４０％）以上である場合、第ＩＸ因子活性レベルも安定している場合がある。第ＩＸ因子活性レベルも安定している、かかる実施形態においては、少なくとも５週間（又は少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０又は少なくとも４０、又は少なくとも５０週間）の連続期間が、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、又は少なくとも５０週間の時点の直前を先行し、含み、又は直後に続き得る。場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後約１０週間の時点で少なくとも２０％であり、第ＩＸ因子活性レベルは、該時点の直後の少なくとも４０週間の連続期間の間、少なくとも２０％で持続する。場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後約１０週間の時点で少なくとも２５％であり、第ＩＸ因子活性レベルは、該時点の直後の少なくとも４０週間の連続期間の間少なくとも２５％で持続する。場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後約１０週間の時点で少なくとも４０％であり、第ＩＸ因子活性レベルは、該時点の直後の少なくとも４０週間の連続期間の間、少なくとも４０％で持続する。場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後約５２週間の時点で少なくとも２０％であり、第ＩＸ因子活性レベルは、該時点の直前の少なくとも４０週間の連続期間の間、少なくとも２０％で持続する。場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後約５２週間の時点で少なくとも２５％であり、第ＩＸ因子活性レベルは、該時点の直前の少なくとも４０週間の連続期間の間、少なくとも２５％で持続する。場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後約５２週間の時点で少なくとも４０％であり、第ＩＸ因子活性レベルは、該時点の直前の少なくとも４０週間の連続期間の間、少なくとも４０％で持続する。
【０１９６】
ヒト患者等の患者においては、第ＩＸ因子活性は、患者から血液サンプルを採取することによって、又は患者から採取されている血液サンプルに対してアッセイを行うことによって測定され得る。
【０１９７】
場合により、第ＩＸ因子活性レベルは、凝固アッセイを用いて測定され得る。場合により、凝固アッセイは一段階凝固アッセイである。場合により、一段階凝固アッセイ等の凝固アッセイは、ＳｙｎｔｈＡＳｉｌＴＭ  ｋｉｔを使用する。一例においては、好適な凝固アッセイ（一段階凝固アッセイ）は以下の通りである。
【０１９８】
第ＩＸ因子は凝固カスケードの一部であるため、活性が増加した第ＩＸ因子ポリペプチドは、活性がより低い第ＩＸ因子ポリペプチドよりも迅速に血液凝固を触媒する。第ＩＸ因子ポリペプチドは血小板が僅かな血漿と混合され、３７℃でインキュベートされる。次いで、リン脂質と、ＳｙｎｔｈＡＳｉｌＴＭ  ＡＰＴＴ（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ  Ｔｉｍｅ）試薬等の接触活性化経路活性化因子が加えられる。次いでカルシウムが加えられ、ユーザーが、凝固が起こるのにかかる時間を測定する。血餅の形成は、分光光度法又は磁気スチールボール法を用いて評価され得る。例えば、血餅形成は、混合物の、閾値を超える（ｅｘｃｅｅｄｓ）光学密度と共に、又は混合物がセンサーによって検出される磁気ボールの動きを変えるのに十分に凝固した時に、起こったと見なされ得る。
【０１９９】
場合により、第ＩＸ因子活性はＳｙｎｔｈＡＳｉｌＴＭ  ｏｎｅ  ｓｔａｇｅ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いて測定され、血液サンプル中の第ＩＸ因子活性が決定される。
【０２００】
場合により、患者は、（ｉ）配列番号４又は５の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）配列番号６の転写調節エレメントを含むウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子の活性よりも低い活性を有する第ＩＸ因子による治療に抵抗性の患者である。場合により、患者は、（ｉ）配列番号４又は５の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）配列番号６の転写調節エレメントを含むヌクレオチド配列によってコードされる第ＩＸ因子よりも低いレベルで発現する第ＩＸ因子ポリペプチドによる治療に抵抗性の患者である患者である。実施例において証明されるように、（ｉ）配列番号４又は５の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）配列番号６の転写調節配列を含むウイルス粒子は、第ＩＸ因子ポリペプチドをより高レベルで発現し、前記ポリペプチドは、他の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列から発現するポリペプチドと比較してより高い活性を有する。従って、（ｉ）配列番号４又は５の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）配列番号６の転写調節配列を含むウイルス粒子は、高レベルの第ＩＸ因子、低用量のウイルス粒子を必要とする患者、又は代替の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列、を含むウイルス粒子から第ＩＸ因子を発現するのに問題がある患者、例えば、肝臓の一部を失ったために、肝細胞から高レベルの第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を発現することができにくい患者、の治療に用いられ得る。
【０２０１】
場合により、方法又は使用は、ステロイドの予防的共投与を含み、即ち、好適な用量のステロイドが患者に投与される。共投与は、同時であり得る、即ち、患者は、ある用量の本発明のポリヌクレオチド、ベクター、又は組成物を投与されるのと同時に、該用量のステロイドを投与される。代替的に、ステロイドは、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、又は組成物が患者に投与される前又は後に投与され得る。場合により、ステロイドは、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、又は組成物の患者への投与後、６〜１２週間で投与される。
【０２０２】
場合により、ステロイドは、プレドニゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン及びデキサメタゾンからなる群から選択される。場合により、ステロイドはプレドニゾロンである。
【０２０３】
配列表
【０２０４】
【表４】
2021533799.tif 000007
【実施例】
【０２０５】
実施例
以下の実施例においては、ＦＩＸ導入遺伝子カセットｓｓＬＰ１．ＦＩＸｃｏ（本明細書中、ＦＩＸｃｏ）、ｓｓＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦ（本明細書中、ＨＴＦＧ）、及びｓｓＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦ（本明細書中、ＨＴＡＧ）を搭載する組換えＡＡＶにより実験を行った。ｓｓＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦは、コードされたＦＩＸポリペプチドの３８４位で、アルギニン（Ｒ）の代わりにロイシン（Ｌ）をコードするように改変された、国際公開第ＷＯ２０１６／０７５４７３号に開示されたｓｓＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ構築物の一型である。これらのカセットを図１に示す。ｓｓＬＰ１．ＦＩＸｃｏには、完全にコドンが最適化されているＦＩＸコード配列（配列番号１２）が含まれ、５’の前にＳＶ４０イントロンがあり、発現はＬＰ１プロモーター（配列番号７）によってドライブされる。ｓｓＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦ及びｓｓＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦは、ＦＩＸコード配列の５’側にある、より短いＨＬＰ２転写調節エレメント（配列番号６）を有する構造を共有している。それは、短縮型のネイティブイントロン１Ａにより中断され、その中ではエキソン１及び一部のエキソン２のヌクレオチド配列が野生型（コドンが最適化されていない）であり、残りのコード配列が、コドンが最適化されている（ＨＴＦＧについて配列番号１８及びＨＴＡＧについて配列番号５）。コドンが最適化されている一部分のヌクレオチド配列が、それぞれの２の構築物間で異なっているものである。ｓｓＬＰ１．ＦＩＸｃｏによってコードされる野生型ＦＩＸタンパク質とは異なり、ｓｓＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦ及びｓｓＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦは、ＦＩＸポリペプチドの３８４位における、アルギニン（Ｒ）からロイシン（Ｌ）への置換を有する超活性ＦＩＸをコードする。
【０２０６】
実施例１−方法
ＡＡＶベクターの生成及び定量
１．ＡＡＶベクターストックは、ベクターゲノムプラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミド、並びにＡＡＶ  Ｒｅｐ及びＣａｐ（ＡＡＶ８又はＡＡＶＭｕｔ  Ｃ）機能を含有するパッケージングプラスミドから成るプラスミドの組合せによる、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞の標準的なトリプルプラスミドトランスフェクションによって調製した。組換えＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２ベースのゲノム、及び血清型８由来のキャプシド、又は２の血清型由来の部分を含む合成キャプシド（「Ｍｕｔ  Ｃ」；配列番号１０）を含有するので、「疑型」と称される。
２．ベクターを、イオジキサノールによる密度勾配遠心分離によって精製した。
３．ベクターゲノムを、プロモーター領域に対するプライマーによるｑＰＣＲによって力価測定した。
【０２０７】
インビトロでの形質導入及びＦＩＸ発現の検出
１．ＨＵＨ７細胞を、１２ウェルプレートにウェルあたり５ｘ１０５細胞で播種した。
２．次いで、細胞をマイトマイシンＣで１時間刺激した後、ＦＩＸをコードする導入遺伝子カセットを搭載したＡＡＶ粒子で形質導入した。
３．形質導入の５日後、上清を収集し、市販のＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｓｔａｇｏ  Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ  ＩＸ：Ａｇ  ｋｉｔ  Ｒｅｆ＃００９４３）を用いてＦＩＸのレベルを分析した。Ｑｕａｄｒａｔｅｃｈから市販されている発色キット（Ｂｉｏｐｈｅｎ  ＦＩＸ（６）  ｋｉｔ  Ｒｅｆ  ＃２２１８０６）を用いて、ＦＩＸの活性を分析した。
４．Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ｒｅｆ＃  ６９５０６）を用い、製造者の指示に従って、ベクターゲノムＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲで定量した。
【０２０８】
インビボでのＦＩＸの検出
１．成体のＣ５７ＢＬ／６マウスに、５ｘ１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）の、ＦＩＸをコードする導入遺伝子カセットを有するＡＡＶ粒子を、尾静脈から注射した（群あたりｎ＝４）。
２．注射の２週間後、マウスに麻酔し、心臓穿刺により採血し、クエン酸ナトリウム（１／１０希釈）に加え、３０００ｘｇ、４℃で、１５分間遠心分離して血漿を収集し、分析のために−８０℃で凍結した。
３．肝臓を採取し、液体窒素で急速凍結した後、ベクターゲノム分析用のＤＮＡ抽出（Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ，Ｒｅｆ＃  ６９５０６）のために−８０℃で保存した。
４．マウス血漿中に存在するＦＩＸのレベルは、ＦＩＸ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｓｔａｇｏ  Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ  ＩＸ：Ａｇ  ｋｉｔ  ＲＥＦ  ００９４３）を用いて決定した。Ｑｕａｄｒａｔｅｃｈから市販されている発色キット（Ｂｉｏｐｈｅｎ  ＦＩＸ（６）  ｋｉｔ  Ｒｅｆ  ＃２２１８０６）を用いて、ヒトＦＩＸの活性を測定した。
【０２０９】
実施例２-ＥＬＩＳＡを用いるインビトロでのＦＩＸ導入遺伝子発現の分析
ＨＵＨ７（ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）細胞を、標準的な細胞培養条件で培養した。導入ＦＩＸ遺伝子を、ＨＵＨ７細胞をマイトマイシンＣで１時間処理し、続いて偽型化ｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃにより形質導入することによって発現させた。ＡＡＶ粒子を、ＨＥＫ２９３細胞の、ＡＡＶヘルパープラスミド及びＡＡＶパッケージングプラスミドに加えて、組換えベクターゲノムプラスミドによるトランスフェクション並びに更なる４８時間の培養によってはじめに生成した。ｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃベクターを、ＨＥＫ２９３細胞から、密度勾配遠心分離及びイオジキサノールによって精製した。ベクターゲノムを、導入遺伝子発現カセットのプロモーター領域に対するプライマーを利用するｑＰＣＲによって力価測定した。ＦＩＸ発現カセットを比較して、形質導入の５日後にＦＩＸレベルを測定することにより、それらの、導入ＦＩＸ遺伝子をインビトロで発現する相対的能力を決定した。評価されるベクターは、ｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ．ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦ及びｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ．ＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦであった。培養上清中のＦＩＸレベルは、市販のＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｓｔａｇｏ  Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ  ＩＸ：Ａｇ  ｋｉｔＲｅｆ  ＃００９４３）の使用により分析した。２の別個の実験（図２Ｂ及び４Ｂを参照）においては、ＦＩＸ発現レベル―ＨＵＨ７培養細胞の上清を利用したＥＬＩＳＡアッセイから導出した―は、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ  （Ｒｅｆ  ＃６９５０６）を用いてＨＵＨ７細胞ＤＮＡを採取した後、細胞あたりのベクターゲノムのコピーに対して正規化した。
【０２１０】
１ｘ１０３ベクターゲノム（ｖｇ）のＭＯＩでのｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ．ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦ及びｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ．ＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦによる形質導入の５日後、ＦＩＸレベルは、ｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ．ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦにより形質導入したＨＵＨ７細胞中よりもｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ．ＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦにより形質導入されたＨＵＨ７細胞中で高かった（ｎ＝２；図２Ａ、３及び４Ａ）。同様に、ＭＯＩが増加した（５ｘ１０３及び１ｘ１０４）ＨＵＨ７細胞において同一のＦＩＸ発現アッセイを行った場合、ＦＩＸレベルは、ｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ．ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦにより形質導入した細胞中よりも、ｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ．ＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦにより形質導入した細胞中で高かった。（ｎ＝２；図２Ａ、３、及び４Ａ）。ＦＩＸ発現レベルが細胞あたりのウイルスベクターゲノムコピーに対して正規化された場合、試験した３のＭＯＩ（１ｘ１０３、５ｘ１０３、及び１ｘ１０４）のそれぞれで、ＦＩＸレベルは、ｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ．ＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦにより形質導入されたＨＵＨ７細胞中で、ｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ．ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦに対して一貫して高かった。（ｎ＝２；図２Ｂ及び４Ｂ）。図２、３、及び４の実験からの５ｘ１０３の形質導入データを組み合わせると、ｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ．ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦと比較して、ｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ．ＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦからの有意に優れた発現が示される（図５）。
【０２１１】
実施例３-インビトロでのＦＩＸ導入遺伝子活性の分析
ＦＩＸ活性を、ＨＵＨ７細胞上清を回収し、ＢＩＯＰＨＥＮ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｋｉｔ（Ｑｕａｄｒａｔｅｃｈ＃２２１８０６、＃２２２１０１、＃２２３２０１）を用いることにより評価した。部分的にコドンが最適化されているＦＩＸ導入遺伝子（ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦ及びＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦ）を、ＨＵＨ７細胞の（１ｘ１０３、５ｘ１０３及び１ｘ１０４のＭＯＩでの）ｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ形質導入後、インビトロで比較して、相対的なＦＩＸ活性を決定した。形質導入の５日後にＨＵＨ７細胞から上清を単離し、ＢＩＯＰＨＥＮ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｋｉｔを用いてＦＩＸ活性を決定した。ＭＯＩにかかわらず、ｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ．ＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦにより形質導入された細胞に由来する上清において、より高い平均ＦＩＸ活性が観察された（図６〜８）。図６及び７の実験からの５ｘ１０３の形質導入データを組み合わせると、ｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ．ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦと比較して、ｓｓＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃ．ＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦからの有意に優れた発現が示される（図９）。
【０２１２】
実施例４-ＥＬＩＳＡを用いるインビボでのＦＩＸ導入遺伝子発現の分析
ＦＩＸ導入遺伝子を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて、５ｘ１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）の偽型ｓｓＡＡＶ２／８ベクターを尾静脈注射により形質導入した後、発現させた。ＡＡＶ粒子を、ＡＡＶヘルパープラスミド及びパッケージングプラスミドに加えて、組換えベクターゲノムプラスミドでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションし、更に４８時間培養することによってはじめに生成した。ｓｓＡＡＶ２／８ベクターは、密度勾配遠心分離とイオジキサノールによってＨＥＫ２９３細胞から精製した。ベクターゲノムを、導入遺伝子発現カセットのプロモーター領域に対するプライマーを利用するｑＰＣＲによって力価測定した。ＦＩＸ発現カセットＬＰ１．ＦＩＸｃｏ、ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦ及びＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦを比較して、それらの、ＦＩＸ導入遺伝子を発現する相対的能力を決定した。
【０２１３】
ｓｓＡＡＶ２／８．ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦ及びｓｓＡＡＶ２／８．ＬＰ１．ＦＩＸｃｏを含む最初の実験においては、投与後２週間の血液を麻酔したマウスから心臓穿刺により採取した。続いて、クエン酸ナトリウム（１／１０希釈）の添加及び３０００ｘｇ、４℃、１５分間の遠心分離により血漿を単離した。ＦＩＸの循環レベルは、ＦＩＸ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｓｔａｇｏ  Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ  ＩＸ：ｋｉｔ  Ｒｅｆ  ＃００９４３）を用いて決定された。
【０２１４】
ＦＩＸ発現レベルを、マウス肝臓の採取後の、細胞あたりのベクターゲノムコピーに対して正規化した。正規化したＦＩＸ発現レベルは、ｓｓＡＡＶ２／８．ＬＰ１．ＦＩＸｃｏと比較して、ｓｓＡＡＶ２／８．ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦによる形質導入後に有意に高い（ｐ＜０．０５）と決定した（ｎ＝４のマウス；図１０）。
【０２１５】
更なる実験では、部分的にコドンが最適化されているＦＩＸ導入遺伝子（ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦ及びＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦ）をインビボで比較して、ｓｓＡＡＶ２／８によるＣ５７Ｂｌ／６マウス形質導入後の相対的なＦＩＸ発現を決定した。同時に、ＦＩＸ発現を、ｓｃＡＡＶ２／８．ＬＰ１．ＦＩＸｃｏベクターによるＣ５７Ｂｌ／６マウスの形質導入後に決定した。投与の３週間後に、マウスから血漿を単離し、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＦＩＸ抗原レベルを決定した。平均ＦＩＸ発現レベルは、ｓｃＡＡＶ２／８．ＬＰ１．ＦＩＸｃｏにより形質導入したマウスで最低であった一方、ｓｓＡＡＶ２／８．ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦにより形質導入したマウスでレベルがより高かった（ｎ＝４のマウス；図１１Ａ）。ｓｓＡＡＶ２／８．ＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦにより形質導入したマウスは、ｓｓＡＡＶ２／８．ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦにより形質導入したマウスよりも有意に高いＦＩＸ発現を示した（ｎ＝４のマウス；図１１Ａ）。ＦＩＸ発現レベルを細胞あたりのウイルスベクターゲノムコピーに対して正規化した場合、ＦＩＸ発現の傾向が維持された。よって、ｓｓＡＡＶ２／８．ＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦは、ｓｓＡＡＶ２／８．ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦ及びｓｃＡＡＶ２／８．ＬＰ１．ＦＩＸｃｏの両方よりも有意に多くのＦＩＸを生成する（ｎ＝４；図１１Ｂ）。更に、ｓｓＡＡＶ２／８．ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦは、ｓｃＡＡＶ２／８．ＬＰ１．ＦＩＸｃｏよりも高いＦＩＸ発現を示した（ｎ＝４のマウス；図１１Ｂ）。
【０２１６】
実施例５-インビボでのＦＩＸ導入遺伝子活性の分析
ＢＩＯＰＨＥＮ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｋｉｔ（Ｑｕａｄｒａｔｅｃｈ＃２２１８０６、＃２２２１０１、＃２２３２０１）は、手動の発色法を用いて、ヒトクエン酸血漿又は第ＩＸ因子濃縮物中の第ＩＸ因子活性を測定するための発色アッセイである。
【０２１７】
アッセイにおいて、一定の濃度且つ過剰に供給される最初の第ＸＩａ因子は、トロンビン、リン脂質及びカルシウムの存在下で、試験サンプルに存在するＦＩＸをＦＩＸａに活性化し、これは、アッセイにおいて、やはり一定の濃度且つ過剰に供給される、トロンビン活性化第ＶＩＩＩ：Ｃ因子、リン脂質（ＰＬＰ）及びカルシウムと、アッセイ系に存在する第Ｘ因子を第Ｘａ因子に活性化する酵素複合体を形成する。この活性は、律速因子である第ＩＸ因子の量に直接関係している。生成された第Ｘａ因子は、次いで、第Ｘａ因子発色基質（ＳＸａ−１１）に対するその比活性によって正確に測定される。第Ｘａ因子は基質を切断し、ｐＮＡを切り離す。生成されるｐＮＡの量は、第ＩＸａ因子の活性に正比例する。最後に、アッセイしたサンプル中の第ＩＸ因子の量と、４０５ｎｍでの発色によって決定された、切り離されたｐＮＡの量によって測定された、生成された第Ｘａ因子活性との間には直接的関係がある。
【０２１８】
部分的にコドンが最適化されているＦＩＸ導入遺伝子（ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦ及びＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦ）をインビボで比較して、ｓｓＡＡＶ２／８によるＣ５７Ｂｌ／６マウス形質導入後の相対的なＦＩＸ活性を決定した。同時に、ｓｃＡＡＶ２／８．ＬＰ１．ＦＩＸｃｏによるＣ５７Ｂｌ／６マウスの形質導入後に、ＦＩＸ活性を決定した。血漿を投与の３週間後にマウスから単離し、ＦＩＸ活性をＢＩＯＰＨＥＮ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  キットを用いて決定した。平均ＦＩＸ活性は、ｓｃＡＡＶ２／８．ＬＰ１．ＦＩＸｃｏで形質導入されたマウスで最も低かった一方、ｓｓＡＡＶ２／８．ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦで形質導入されたマウスでより高かった（ｎ＝４のマウス；図１２）。ｓｓＡＡＶ２／８．ＨＬＰ２．ＴＩ−ＡＣＮＰ−ＦＩＸ−ＧｏＦにより形質導入したマウスは、ｓｓＡＡＶ２／８．ＨＬＰ２．ＴＩ−ｃｏｄｏｐ−ＦＩＸ−ＧｏＦにより形質導入したマウスよりも有意に高いＦＩＸ活性を示した（ｎ＝４のマウス；図１２）。
【０２１９】
実施例６
２名の血友病Ｂ患者を、ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＡＧを含有する４．５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃベクターで治療した。両患者は、スクリーニングにおいて内因性ＦＩＸ活性が１％未満の重度の血友病Ｂを患っていることが知られていた。患者１はベースラインで予防を受けており、研究の最初の４日間はそれを継続した。ｓｓＨＬＰ２．ＨＴＡＧを含有するＡＡＶ２／Ｍｕｔ  Ｃベクターの単回注入を受けて４週間以内に、両患者が３０％超のＦＩＸ活性レベルを達成した。ＳｙｎｔｈＡＳｉｌＴＭキットを用いて１段階凝固アッセイで評価した場合、患者は５２週間で４０．５＋／−４．５％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成した。予防的ステロイド（プレドニゾロン）は６週間から１２週間の間に投与された。
【０２２０】
どちらの患者も、自発的又は長期の出血イベントを経験していない。患者１は、治療後１０週目に右指切断のために外傷性出血があった。重要なことに、患者はいかなる外因性凝固因子も必要とせず、イベントは同日に解消した。イベント時における患者のＦＩＸ活性は３８％と測定された。
【０２２１】
本明細書中に記載の発明は、以下の態様にも関する。
１．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含み、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードするコード配列を含み、コード配列の一部分が野生型ではない、ポリヌクレオチド。
２．野生型ではないコード配列の一部分が、コドンが最適化されている、態様１のポリヌクレオチド。
３．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードするコード配列を含み、コード配列が：
（ｉ）配列番号１と、少なくとも９５％、少なくとも９８少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である配列；及び
（ｉｉ）配列番号１５と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一ある配列
を含む、ポリヌクレオチド。
４．配列番号１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．８％同一である配列が、コドンが最適化されている、態様３のポリヌクレオチド。
５．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、第ＩＸ因子タンパク質又はその断片をコードし、配列番号５と、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％の同一性を有する、ポリヌクレオチド。
６．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列がコード配列を含み、コード配列の一部分はコドンが最適化されている、態様５のポリヌクレオチド。
７．ポリヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡを含む、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
８．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、連続する一部分である、態様２、４、６、７又は８のいずれか１のポリヌクレオチド。
９．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、ヒト肝臓における発現のためにコドンが最適化されている、態様２、４、６、７又は８のいずれか１のポリヌクレオチド。
１０．参照野生型第ＩＸ因子ヌクレオチド配列と比較して、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドが、ヒト肝細胞において、より高レベルで発現する、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
１１．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、長さが少なくとも８００の、少なくとも９００の、少なくとも１１００の、１５００未満の、１３００未満の、１２００未満の、８００〜１５００の、９００〜１３００の、１１００〜１２００の、又は約１１９１のヌクレオチドである態様２、４、６又は７のいずれか１のポリヌクレオチド。
１２．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が：
ａ）エキソン３又は少なくとも１０の、少なくとも１５の、少なくとも２０の、２５未満の、１０〜２５の、１５〜２５の、若しくは２０〜２５のヌクレオチドの、エキソン３の一部分；
ｂ）エキソン４又は少なくとも８０の、少なくとも９０の、少なくとも１００の、１１４未満の、８０〜１１４の、９０〜１１４の、若しくは１００〜１１４のヌクレオチドの、エキソン４の一部分；
ｃ）エキソン５又は少なくとも９０の、少なくとも１００の、少なくとも１１０の、１２９未満の、９０〜１２９の、１００〜１２９の、若しくは１１０〜１２９のヌクレオチドの、エキソン５の一部分
ｄ）エキソン６又は少なくとも１５０の、少なくとも１８０の、少なくとも２００の、２０３未満の、１５０〜２０３の、１８０〜２０３の、若しくは２００〜２０３のヌクレオチドの、エキソン６の一部分；
ｅ）エキソン７又は少なくとも７０の、少なくとも８０の、少なくとも９０の、少なくとも１００の、１１５未満の、７０〜１１５の、８０〜１１５の、９０〜１１５の、若しくは１００〜１１５のヌクレオチドの、エキソン７の一部分；及び／又は
ｆ）エキソン８又は少なくとも４００の、少なくとも４５０の、少なくとも５００の、５４８未満の、４００〜５４８の、４５０〜５４８の、若しくは５００〜５４８のヌクレオチドの、エキソン８の一部分
のうちの１、２、３、４、５若しくはすべてを含む、態様２、４又は６〜１１のいずれか１のポリヌクレオチド。
１３．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）及びｆ）を含む、態様１２のポリヌクレオチド。
１４．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、少なくとも２０のヌクレオチドの、エキソン３の一部分、少なくとも１００のヌクレオチドの、エキソン４の一部分、少なくとも１１０のヌクレオチドの、エキソン５の一部分、少なくとも１８０のヌクレオチドの、エキソン６の一部分、少なくとも１００のヌクレオチドの、エキソン７の一部分、及び少なくとも５００のヌクレオチドの、エキソン８の一部分を含む、態様１２又は態様１３のポリヌクレオチド。
１５．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、及びエキソン８を含む、態様１２〜１４のいずれか１のポリヌクレオチド。
１６．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、エキソン２の一部を含み、エキソン２の一部分が、長さが１６０未満の、１５０未満の、１００未満の、７５未満の、６０未満の、少なくとも２０の、少なくとも３０の、少なくとも４０の、少なくとも５０の、２０〜１６０の、３０〜１５０の、３０〜１００の、４０〜７５の、若しくは約５６のヌクレオチドである、態様２、４又は６〜１５のいずれか１のポリヌクレオチド。
１７．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、長さが３０〜１００のヌクレオチドであるエキソン２の一部分を含む、態様２、４又は６〜１６のいずれか１のポリヌクレオチド。
１８．コドンが最適化されているコード配列の一部分が、参照野生型第ＩＸ因子配列の対応する一部分と比較して、減少した数のＣｐＧを含む、態様２、４又は６〜１７のいずれか１のポリヌクレオチド。
１９．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、４０未満の、２０未満の、１８未満の、１０未満の、５未満の、若しくは１未満のＣｐＧを含む、態様１８のポリヌクレオチド。
２０．コドンが最適化されている、コード配列の一部分がＣｐＧを含まない、
態様１８又は１９のポリヌクレオチド。
２１．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７３％のコドンが、
ａ）  ＴＴＣ；
ｂ）  ＣＴＧ；
ｃ）  ＡＴＣ；
ｄ）  ＧＴＧ；
ｅ）  ＧＴＣ；
ｆ）  ＡＧＣ；
ｇ）  ＣＣＣ；
ｈ）  ＡＣＣ；
ｉ）  ＧＣＣ；
ｊ）  ＴＡＣ；
ｋ）  ＣＡＣ；
ｌ）  ＣＡＧ；
ｍ）  ＡＡＣ；
ｎ）  ＡＡＡ；
ｏ）  ＡＡＧ；
ｐ）  ＧＡＣ；
ｑ）  ＴＧＣ；
ｒ）  ＡＧＧ；
ｓ）  ＧＧＣ；及び
ｔ）  ＧＡＧ
から成る群から選択される、態様２、４又は６〜２０のいずれか１のポリヌクレオチド。
２２．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも４、若しくは少なくとも５が、ＴＴＣと置換されている；
ｂ）フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＴＴＣである；
ｃ）フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＴＴＣであり、残りがＴＴＴである；及び／又は
ｄ）フェニルアラニンをコードするコドンが、次のコドンがＧで始まる場合を除いて、ＴＴＣである、態様２、４又は６〜２１のいずれか１のポリヌクレオチド。
２３．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、ロイシンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、若しくは少なくとも１６が、ＣＴＧと置換されている；
ｂ）ロイシンをコードするコドンの少なくとも９０％、若しくは少なくとも９４％がＣＴＧである；及び／又は
ｃ）ロイシンをコードするコドンの少なくとも９０％、若しくは少なくとも９４％がＣＴＧであり、残りがＣＴＣである、態様２、４又は６〜２２のいずれか１のポリヌクレオチド。
２４．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、イソロイシンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１１、若しくは少なくとも１２が、ＡＴＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まるコドンＡＴＣの少なくとも１がＡＴＴと置換されている；
ｃ）イソロイシンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも７０％、若しくは少なくとも７５％がＡＴＣである；
ｄ）イソロイシンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも７０％、若しくは少なくとも７５％がＡＴＣであり、残りがＡＴＴである；及び／又は
ｅ）イソロイシンをコードするコドンが、次のコドンがＧで始まる場合を除いて、ＡＴＣである、態様２、４又は６〜２３のいずれか１のポリヌクレオチド。
２５．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、バリンをコードするコドンの少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、若しくは少なくとも２５が、ＧＴＧと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、バリンをコードするコドンの少なくとも１がＧＴＣと置換されている；
ｃ）バリンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＧＴＧである；及び／又は
ｄ）バリンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＧＴＧであり、残りがＧＴＣである、態様２、４又は６〜２４のいずれか１のポリヌクレオチド。
２６．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、セリンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１２、若しくは少なくとも１３が、ＡＧＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、セリンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、若しくは少なくとも４が、ＴＣＴと置換されている；
ｃ）セリンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＡＧＣである；及び／又は
ｄ）セリンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＡＧＣであり、残りがＴＣＴ若しくはＴＣＣである、態様２、４又は６〜２５のいずれか１のポリヌクレオチド。
２７．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、プロリンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、若しくは少なくとも５が、ＣＣＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、プロリンをコードするコドンの少なくとも１が、ＣＣＴと置換されている；
ｃ）プロリンをコードするコドンの少なくとも５０％、少なくとも５５％、若しくは少なくとも６０％がＣＣＣである；
ｄ）プロリンをコードするコドンの５０％、少なくとも５５％、若しくは少なくとも６０％がＣＣＣであり、残りがＣＣＡ若しくはＣＣＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、プロリンをコードするコドンがＣＣＣである、態様２、４又は６〜２６のいずれか１のポリヌクレオチド。
２８．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、スレオニンをコードするコドンの少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、若しくは少なくとも１０が、ＡＣＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、スレオニンをコードするコドンの少なくとも１若しくは少なくとも２が、ＡＣＴと置換されている； 
ｃ）スレオニンをコードするコドンの少なくとも４５％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも５５％がＡＣＣである；
ｄ）スレオニンをコードするコドンの少なくとも４５％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも５５％がＡＣＣであり、残りがＡＣＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、スレオニンをコードするコドンがＡＣＣである、態様２、４又は６〜２７のいずれか１のポリヌクレオチド。
２９．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アラニンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、若しくは少なくとも４が、ＧＣＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、アラニンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、若しくは少なくとも３が、ＧＣＴと置換されている；
ｃ）アラニンをコードするコドンの少なくとも３５％、少なくとも４０％、若しくは少なくとも４３％がＧＣＣである；
ｄ）アラニンをコードするコドンの少なくとも３５％、少なくとも４０％、若しくは少なくとも４５％がＧＣＣであり、残りがＧＣＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、アラニンをコードするコドンがＧＣＣである、態様２、４又は６〜２８のいずれか１のポリヌクレオチド。
３０．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、チロシンをコードするコドンの少なくとも１若しくは少なくとも２が、ＴＡＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まるコドンＴＡＣの少なくとも１が、ＴＡＴと置換されている；
ｃ）チロシンをコードするコドンの少なくとも４０％、少なくとも４５％、若しくは少なくとも４８％がＴＡＣである；
ｄ）チロシンをコードするコドンの少なくとも４０％、少なくとも４５％、若しくは少なくとも４８％がＴＡＣであり、残りがＴＡＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、チロシンをコードするコドンがＴＡＣである、態様２、４又は６〜２９のいずれか１のポリヌクレオチド。
３１．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも１が、ＣＡＣと置換されている；
ｂ）ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも５０％、少なくとも６０％、若しくは少なくとも６５％がＣＡＣである；
ｃ）ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも５０％、少なくとも６０％、若しくは少なくとも６５％がＣＡＣであり、残りがＣＡＴである；及び／又は
ｄ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、ヒスチジンをコードするコドンがＣＡＣである、態様２、４又は６〜３０のいずれか１のポリヌクレオチド。
３２．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グルタミンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも４、若しくは少なくとも５が、ＣＡＧと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、コドンＣＡＧの少なくとも１が、ＣＡＡと置換されている；
ｃ）グルタミンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも８５％、若しくは少なくとも９０％がＣＡＧである；及び／又は
ｄ）グルタミンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも８５％、若しくは少なくとも９０％がＣＡＧであり、残りがＣＡＡである、態様２、４又は６〜３１のいずれか１のポリヌクレオチド。
３３．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アスパラギンをコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも４、若しくは少なくとも５が、ＡＡＣと置換されている；
ｂ）アスパラギンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＡＡＣである；
ｃ）アスパラギンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも６５％、若しくは少なくとも７０％がＡＡＣであり、残りがＡＡＴである；及び／又は
ｄ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、アスパラギンをコードするコドンがＡＡＣである、態様２、４又は６〜３２のいずれか１のポリヌクレオチド。
３４．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、リシンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも７、少なくとも８、若しくは少なくとも９が、ＡＡＧと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、コドンＡＡＧの少なくとも１が、ＡＡＡと置換されている；
ｃ）リシンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＡＡＧである；及び／又は
ｄ）リシンをコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＡＡＧであり、残りがＡＡＡである、態様２、４又は６〜３３のいずれか１のポリヌクレオチド。
３５．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、若しくは少なくとも４が、ＧＡＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、コドンＧＡＣの少なくとも１が、ＧＡＴと置換されている；
ｃ）アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも４５％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも６０％がＧＡＣである；
ｄ）アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも４５％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも６０％がＧＡＣであり、残りがＧＡＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、アスパラギン酸をコードするコドンがＧＡＣである、態様２、４又は６〜３４のいずれか１のポリヌクレオチド。
３６．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、若しくは少なくとも２６が、ＧＡＧと置換されている；
ｂ）グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＧＡＧである；及び／又は
ｃ）グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％がＧＡＧであり、残りがＧＡＡである、態様２、４又は６〜３５のいずれか１のポリヌクレオチド。
３７．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、システインをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、若しくは少なくとも８が、ＴＧＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、コドンＴＧＣの少なくとも１が、ＴＧＴと置換されている；
ｃ）システインをコードするコドンの少なくとも４０％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも５５％がＴＧＣである；
ｄ）システインをコードするコドンの少なくとも４０％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも５５％がＴＧＣであり、残りがＴＧＴである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、システインをコードするコドンがＴＧＣである、態様２、４又は６〜３６のいずれか１のポリヌクレオチド。
３８．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
トリプトファンをコードするコドンがＴＧＧである、態様２、４又は６〜３７のいずれか１のポリヌクレオチド。
３９．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アルギニンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、若しくは少なくとも１１が、ＡＧＧと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アルギニンをコードするコドンの少なくとも１が、ＡＧＡと置換されている；
ｃ）アルギニンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも７０％、若しくは少なくとも７５％がＡＧＧである；及び／又は
ｄ）アルギニンをコードするコドンの少なくとも６０％、少なくとも７０％、若しくは少なくとも７５％がＡＧＧであり、残りがＡＧＡである、態様２、４又は６〜３８のいずれか１のポリヌクレオチド。
４０．コドンが最適化されている、コード配列の一部分において、
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グリシンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１２、若しくは少なくとも１３が、ＧＧＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、次のコドンがＧで始まる、グリシンをコードするコドンの少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、若しくは少なくとも８が、ＧＧＧと置換されている；
ｃ）グリシンをコードするコドンの少なくとも５０％、少なくとも５５％、若しくは少なくとも６０％がＧＧＣである；
ｄ）グリシンをコードするコドンの少なくとも５０％、少なくとも５５％、若しくは少なくとも６０％がＧＧＣであり、残りがＧＧＧである；及び／又は
ｅ）次のコドンがＧで始まる場合を除いて、グリシンをコードするコドンがＧＧＣである、態様２、４又は６〜３９のいずれか１のポリヌクレオチド。
４１．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、プロリン、スレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファン、アルギニン、及びグリシン、をコードするコドンを含む、態様２、４又は６〜４０のいずれか１のポリヌクレオチド。
４２．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、プロリン、スレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファン、アルギニン、及びグリシン、をコードするコドンを含み、且つコドンが最適されている一部分において：
ａ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも５が、ＴＴＣと置換されている；
ｂ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、ロイシンをコードするコドンの少なくとも１６が、ＣＴＧと置換されている；
ｃ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、イソロイシンをコードするコドンの少なくとも１２が、ＡＴＣと置換されている；
ｄ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、バリンをコードするコドンの少なくとも２５が、ＧＴＧと置換されている；
ｅ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、セリンをコードするコドンの少なくとも１３が、ＡＧＣと置換されている；
ｆ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、プロリンをコードするコドンの少なくとも５が、ＣＣＣと置換されている；
ｇ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、スレオニンをコードするコドンの少なくとも１０が、ＡＣＣと置換されている；
ｈ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アラニンをコードするコドンの少なくとも４が、ＧＣＣと置換されている；
ｉ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、チロシンをコードするコドンの少なくとも２が、ＴＡＣと置換されている；
ｊ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも１が、ＣＡＣと置換されている；
ｋ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グルタミンをコードするコドンの少なくとも５が、ＣＡＧと置換されている；
ｌ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アスパラギンをコードするコドンの少なくとも５が、ＡＡＣと置換されている；
ｍ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、リシンをコードするコドンの少なくとも９が、ＡＡＧと置換されている；
ｎ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも４が、ＧＡＣと置換されている；
ｏ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも２６が、ＧＡＧと置換されている；
ｐ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、システインをコードするコドンの少なくとも８が、ＴＧＣと置換されている；
ｑ）トリプトファンをコードするコドンがＴＧＧである；
ｒ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、アルギニンをコードするコドンの少なくとも１１が、ＡＧＧと置換されている；及び
ｓ）参照野生型第ＩＸ因子配列と比較して、グリシンをコードするコドンの少なくとも１３が、ＧＧＣと置換されている、
態様２、４又は６〜４１のいずれか１のポリヌクレオチド。
４３．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、プロリン、スレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファン、アルギニン、及びグリシンをコードするコドンを含み、且つコドンが最適化されている一部分において：
ａ）フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも７０％がＴＴＣであり；
ｂ）ロイシンをコードするコドンの少なくとも９４％がＣＴＧであり；
ｃ）イソロイシンをコードするコドンの少なくとも７５％がＡＴＣであり；
ｄ）バリンをコードするコドンの少なくとも９５％がＧＴＧであり；
ｅ）セリンをコードするコドンの少なくとも７０％がＡＧＣであり；
ｆ）プロリンをコードするコドンの少なくとも６０％がＣＣＣであり；
ｇ）スレオニンをコードするコドンの少なくとも５５％がＡＣＣであり；
ｈ）アラニンをコードするコドンの少なくとも４３％がＧＣＣであり；
ｉ）チロシンをコードするコドンの少なくとも４８％がＴＡＣであり；
ｊ）ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも６５％がＣＡＣであり；
ｋ）グルタミンをコードするコドンの少なくとも９０％がＣＡＧであり；
ｌ）アスパラギンをコードするコドンの少なくとも７０％がＡＡＣであり；
ｍ）リシンをコードするコドンの少なくとも９５％がＡＡＧであり；
ｎ）アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも６０％がＧＡＣであり；
ｏ）グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも９５％がＧＡＧであり；
ｐ）システインをコードするコドンの少なくとも５５％がＴＧＣであり；
ｑ）トリプトファンをコードするコドンがＴＧＧであり；
ｒ）アルギニンをコードするコドンの少なくとも７５％がＡＧＧであり；及び
ｓ）グリシンをコードするコドンの少なくとも６０％がＧＧＣである、
態様２、４又は６〜４２のいずれか１のポリヌクレオチド。
４４．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、プロリン、スレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファン、アルギニン、及びグリシン、をコードするコドンを含み、且つコドンが最適化されている一部分において：
ａ）フェニルアラニンをコードするコドンの少なくとも７０％がＴＴＣであり、残りがＴＴＴであり；
ｂ）ロイシンをコードするコドンの少なくとも９４％がＣＴＧであり、残りがＣＴＣであり；
ｃ）イソロイシンをコードするコドンの少なくとも７５％がＡＴＣであり、残りがＡＴＴであり；
ｄ）バリンをコードするコドンの少なくとも９５％がＧＴＧであり；
ｅ）セリンをコードするコドンの少なくとも７０％がＡＧＣであり；
ｆ）プロリンをコードするコドンの少なくとも６０％がＣＣＣであり、残りがＣＣＡ又はＣＣＴであり；
ｇ）スレオニンをコードするコドンの少なくとも５５％がＡＣＣであり、残りがＡＣＴであり；
ｈ）アラニンをコードするコドンの少なくとも４３％がＧＣＣであり、残りがＧＣＴであり；
ｉ）チロシンをコードするコドンの少なくとも４８％がＴＡＣであり、残りがＴＡＴであり；
ｊ）ヒスチジンをコードするコドンの少なくとも６５％がＣＡＣであり、残りがＣＡＴであり；
ｋ）グルタミンをコードするコドンの少なくとも９０％がＣＡＧであり、残りがＣＡＡであり；
ｌ）アスパラギンをコードするコドンの少なくとも７０％がＡＡＣであり、残りがＡＡＴであり；
ｍ）リシンをコードするコドンの少なくとも９５％がＡＡＧであり、残りがＡＡＡであり；
ｎ）アスパラギン酸をコードするコドンの少なくとも６０％がＧＡＣであり、残りがＧＡＴであり；
ｏ）グルタミン酸をコードするコドンの少なくとも９５％がＧＡＧであり、残りがＧＡＡであり；
ｐ）システインをコードするコドンの少なくとも５５％がＴＧＣであり、残りがＴＧＴであり；
ｑ）トリプトファンをコードするコドンがＴＧＧであり；
ｒ）アルギニンをコードするコドンの少なくとも７５％がＡＧＧであり、残りがＡＧＡであり；及び
ｓ）グリシンをコードするコドンの少なくとも６０％がＧＧＣであり、残りがＧＧＧである、
態様２、４又は６〜４３のいずれか１のポリヌクレオチド。
４５．参照野生型第ＩＸ因子配列が配列番号９又は配列番号１９である、態様１０〜４４のいずれか１のポリヌクレオチド。
４６．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、配列番号１の少なくとも８００の、少なくとも９００の、少なくとも１１００の、１１９１未満の、１１００未満の、１０００未満の、８００〜１１９１の、９００〜１１９１の、又は約１１９１のヌクレオチドの断片と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である、態様２、４又は６〜４５のいずれか１のポリヌクレオチド。
４７．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、配列番号１と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である、態様４６のポリヌクレオチド。
４８．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、配列番号１の９００〜１１９１のヌクレオチドの断片と少なくとも９５％同一である、態様４６又は４７のポリヌクレオチド。
４９．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が、配列番号１と少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一である、態様４６〜４７のいずれか１のポリヌクレオチド。
５０．コード配列が、コドンが最適化されていない一部分を含む、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
５１．コドンが最適化されていない一部分が、少なくとも１００の、少なくとも１５０の、少なくとも１７０の、少なくとも１９０の、２５０未満の、２２５未満の、２００未満の、又は約１９５のヌクレオチドである、態様５０のポリヌクレオチド。
５２．コドンが最適化されていない一部分が、エキソン１又はエキソン１の少なくとも６０の、少なくとも７０の、少なくとも８０の、６０〜８８の、７０〜８８の、又は８０〜８８のヌクレオチドの一部分を含む、態様５０又は５１のポリヌクレオチド。
５３．コドンが最適化されていない一部分が、エキソン２の、少なくとも５０の、少なくとも７５の、少なくとも８０の、少なくとも９０の、少なくとも１００の、１４０未満の、１２０未満の、５０〜１４０の、７５〜１２０の又は約１０７のヌクレオチドの一部分を含む、態様５０〜５２のいずれか１のポリヌクレオチド。
５４．コドンが最適化されていない一部分が、ＣｐＧを含む、態様５０〜５３のいずれか１のポリヌクレオチド。
５５．コドンが最適化されていない一部分が、１００のヌクレオチドあたり少なくとも１の、又は少なくとも２のＣｐＧを含む、態様５４のポリヌクレオチド。
５６．コドンが最適化されている、コード配列の一部分が
ａ）  ＴＴＣ；
ｂ）  ＣＴＧ；
ｃ）  ＡＴＣ；
ｄ）  ＧＴＧ；
ｅ）  ＧＴＣ；
ｆ）  ＡＧＣ；
ｇ）  ＣＣＣ；
ｈ）  ＡＣＣ；
ｉ）  ＧＣＣ；
ｊ）  ＴＡＣ；
ｋ）  ＣＡＣ；
ｌ）  ＣＡＧ；
ｍ）  ＡＡＣ；
ｎ）  ＡＡＡ；
ｏ）  ＡＡＧ；
ｐ）  ＧＡＣ；
ｑ）  ＴＧＣ；
ｒ）  ＡＧＧ；
ｓ）  ＧＧＣ；及び
ｔ）  ＧＡＧ
から成る群から選択されるコドンを、５０％未満、４５％未満、４０％未満、又は３５％未満含む、態様５０〜５５のいずれか１のポリヌクレオチド。
５７．コドンが最適化されていない一部分が、配列番号１５の少なくとも１００の、少なくとも１５０の、少なくとも１７５の、１９５未満の、１９０未満の、又は１８０未満のヌクレオチドの断片と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である、態様５０〜５６のいずれか１のポリヌクレオチド。
５８．コドンが最適化されていない一部分が、配列番号１５と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である、態様５７のポリヌクレオチド。
５９．コドンが最適化されていない一部分が、野生型である、態様５０〜５８のいずれか１のポリヌクレオチド。
６０．コドンが最適化されていない一部分が、配列番号１５と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である、態様５０〜５９のいずれか１のポリヌクレオチド。
６１．ポリヌクレオチドが、コード配列を中断する、イントロン又はイントロンの断片更に含む、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
６２．イントロン又はイントロンの断片が、野生型第ＩＸ因子の一部分である、態様６１のポリヌクレオチド。
６３．イントロンの断片が、５００未満の、４００未満の、３５０未満の、３００未満の、少なくとも１００の、少なくとも２００の、少なくとも２５０の、少なくとも２９０の、１００〜５００の、２００〜４００の、２５０〜３５０の、又は約２９９のヌクレオチドである、態様６１又は６２のポリヌクレオチド。
６４．イントロンの断片が、配列番号３の少なくとも１００の、少なくとも２００の、少なくとも２５０の、又は少なくとも２９０のヌクレオチドの断片と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である、態様６１〜６３のいずれか１のポリヌクレオチド。
６５．イントロン又はイントロンの断片が、配列番号３と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である、態様６１〜６４のいずれか１のポリヌクレオチド。
６６．イントロン又はイントロンの断片が、配列番号３と、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一である、態様６５のポリヌクレオチド。
６７．イントロン又はイントロンの断片が、コドンが最適化されていない一部分を中断させる、態様６１〜６６のいずれか１のポリヌクレオチド。
６８．イントロン又はイントロンの断片には、コドンが最適化されていない少なくとも６０の、少なくとも７０の、少なくとも８０の、少なくとも９０の、又は少なくとも１００のヌクレオチドが隣接する、態様６７のポリヌクレオチド。
６９．イントロン又はイントロンの断片には、５’末端で、コドンが最適化されていない１１０〜１２０のヌクレオチド、及び３’末端で、コドンが最適化されていない１００〜１１０のヌクレオチドが隣接する、態様６８のポリヌクレオチド。
７０．イントロン又はイントロンの断片が、エキソン１及びエキソン２の間に配置される、態様６１〜６９のいずれか１のポリヌクレオチド。
７１．イントロン又はイントロンの断片が、ネイティブイントロン（イントロン１Ａ）である、態様６１〜７０のいずれか１のポリヌクレオチド。
７２．ポリヌクレオチドが、転写調節エレメントを更に含む、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
７３．転写調節エレメントが肝臓特異的プロモーターを含む、態様７２のポリヌクレオチド。
７４．転写調節エレメントがＡ１ＡＴプロモーター又はＡ１ＡＴプロモーターの断片を含む、態様７２又は態様７３のポリヌクレオチド。
７５．Ａ１ＡＴプロモーターの断片が、長さが少なくとも１００の、少なくとも１２０の、少なくとも１５０の、少なくとも１８０の、２５５未満の、１００〜２５５の、１５０〜２２５の、１５０〜３００の、若しくは１８０〜２５５のヌクレオチドである、態様７４のポリヌクレオチド。
７６．Ａ１ＡＴプロモーターの断片が、長さが１５０〜３００のヌクレオチドである、態様７５のポリヌクレオチド。
７７．転写調節エレメントがエンハンサーを含む、態様７２〜７６のいずれか１のポリヌクレオチド。
７８．エンハンサーがＨＣＲエンハンサー又はＨＣＲエンハンサーの断片である、態様７７のポリヌクレオチド。
７９．ＨＣＲエンハンサーの断片が、長さが少なくとも８０の、少なくとも９０の、少なくとも１００の、１９２未満の、８０〜１９２の、９０〜１９２の、１００〜２５０の、若しくは１１７〜１９２のヌクレオチドの断片である、態様７８のポリヌクレオチド。
８０．ＨＣＲエンハンサーの断片が、長さが１００〜２５０のヌクレオチドである、態様７９のポリヌクレオチド。
８１．転写調節エレメントが、配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、若しくは１００％同一である、態様７２〜８０のいずれか１のポリヌクレオチド。
８２．転写調節エレメントが、配列番号６の配列を有する、態様８１のポリヌクレオチド。
８３．ポリヌクレオチドが、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、若しくは１００％同一であるエンハンサーを含む、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
８４．ポリヌクレオチドが、配列番号１３と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、若しくは１００％同一であるエンハンサーを含む、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
８５．ポリヌクレオチドが、配列番号１３のエンハンサーを含む、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
８６．ポリヌクレオチドが、配列番号１４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、若しくは１００％同一であるプロモーターを含む、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
８７．ポリヌクレオチドが、配列番号１４と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、若しくは１００％同一であるプロモーターを含む、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
８８．ポリヌクレオチドが、配列番号１４のプロモーターを含む、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
８９．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、野生型第ＩＸ因子のコドン３８４に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンが、アラニン又はロイシンをコードする、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
９０．野生型第ＩＸ因子における３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがＣＴＸであって、Ｘが任意のヌクレオチドである、態様８９のポリヌクレオチド。
９１．ポリヌクレオチドが、配列番号５の少なくとも１２００の、少なくとも１３５０の、又は少なくとも１６５０のヌクレオチドの断片と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％又は１００％同一である第ＩＸ因子配列を含む、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
９２．ポリヌクレオチドが、配列番号５と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含む、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
９３．
（ｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である配列を含み；且つ
（ｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンはロイシンをコードする、
前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
９４．
（ｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であるコード配列を含み；
（ｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンはロイシンをコードし；且つ
（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドが、配列番号１４と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であるプロモーターエレメント及び／又は配列番号１３と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一であるプロモーターエレメントを含む、
前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
９５．
（ｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である配列を含み；
（ｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンはロイシンをコードし；且つ
（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドが、配列番号６と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である転写調節エレメントを含む、
前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
９６．
（ｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である配列を含み；
（ｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号２と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である配列を含み；且つ
（ｉｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンはロイシンをコードする、
前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
９７．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、イントロン又はイントロンの断片を含み、イントロンの断片は、配列番号３と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である、態様９５又は９６のいずれか１のポリヌクレオチド。
９８．
（ｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、コード配列及びコドンが最適化されていない、コード配列の一部分を含み；且つ
（ｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、野生型第ＩＸ因子の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンはロイシンをコードする、
前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
９９．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドが、ヒト肝細胞において、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含むヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと比較して、より高レベルで発現する、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
１００．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドが、ヒト肝細胞において、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含むヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと比較して、より高レベルで発現する、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
１０１．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドが、ヒト肝細胞において、配列番号１２又は配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７又は配列番号６の転写調節エレメントを含むヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２、又は少なくとも３倍高レベルで発現する、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド。
１０２．前記態様のいずれか１のポリヌクレオチドを含む組換えゲノムを含む、ウイルス粒子。
１０３．ＡＡＶ、アデノウイルス、若しくはレンチウイルスのウイルス粒子である、態様１０２のウイルス粒子。
１０４．ＡＡＶウイルス粒子である、態様１０３のウイルス粒子。
１０５． 組換えゲノムが：
ａ）ＡＡＶ２  ＩＴＲ；
ｂ）ポリＡ配列；
ｃ）複製起点；及び／若しくは
ｄ）２の分離可能なＩＴＲ
を更に含む、
態様１０２〜１０４のいずれか１のウイルス粒子。
１０６．組換えゲノムが一本鎖である、及び／又は２の分離可能なＩＴＲを含む、態様１０５のウイルス粒子。
１０７．ウイルス粒子が：
（ｉ）配列番号１０に対して少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％の同一性又は１００％の同一性を有するキャプシド； 
（ｉｉ）配列番号１７に対して少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、９９．５％の、少なくとも９９．８％、又は１００％の同一性を有するキャプシド；
（ｉｉｉ）ＡＡＶＭｕｔＣ；及び
（ｉｖ）ＡＡＶ５
から成る群から選択されるキャプシドを含む、態様１０２〜１０６のいずれか１のウイルス粒子。
１０８．Ｈｕｈ７細胞への形質導入において、ウイルス粒子が、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメント並びに／又は配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含むウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子の活性よりも高い第ＩＸ因子活性を有する第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現する、態様１０２〜１０７のいずれか１のウイルス粒子。
１０９．活性が第Ｘａ因子に特異的な発色基質を用いて測定される、態様１０８のウイルス粒子。
１１０．第ＩＸ因子タンパク質断片が、長さが少なくとも２００の、少なくとも２５０の、少なくとも３００の、２００〜４１５の、２５０〜４１５の、又は３００〜４１５のアミノ酸である、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド又はウイルス粒子。
１１１．第ＩＸ因子タンパク質又はその断片が：
ａ）配列番号８と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である；又は
ｂ）長さが少なくとも２００の、少なくとも２５０の、少なくとも３００の、２００〜４１５の、２５０〜４１５の、又は３００〜４１５のアミノ酸の配列番号８の断片と、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、又は１００％同一である、
前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド又はウイルス粒子。
１１２．前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド又はウイルス粒子と、医薬的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
１１３．治療方法における使用のための、前記態様のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物。
１１４．治療方法が、有効量の態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、組成物又はウイルス粒子を患者に投与することを含む、態様１１３の、使用のためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物。
１１５．有効量の態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、治療方法。
１１６．治療方法における使用のための医薬の製造における、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用。
１１７．治療方法が、有効量の態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、組成物又はウイルス粒子を患者に投与することを含む、態様１１６の使用。
１１８．治療方法が、血友病を治療する方法である、態様１１３〜１１７のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子、組成物、使用又は方法。
１１９．血友病が血友病Ｂである、態様１１８のポリヌクレオチド、ウイルス粒子、組成物、使用又は方法。
１２０．患者が、第ＩＸ因子に対する抗体又は阻害剤を有する、態様１１９のポリヌクレオチド、ウイルス粒子、組成物、使用又は方法。
１２１．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現し、それによって疾患を治療することにおける使用のための、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物。
１２２．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることによって、疾患を治療することにおける使用のための、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物。
１２３．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させる方法であって、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、方法。
１２４．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることによって疾患を治療する方法であって、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、方法。
１２５．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させ、それによって疾患を治療することにおける、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用。
１２６．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることにより、疾患を治療することにおける態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用。
１２７．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドより少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させ、それによって疾患を治療することにおける使用のための、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物。
１２８．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドより少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることにより、疾患を治療することにおける使用のための、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物。
１２９．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させる方法であって、患者に対する態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を含む、方法。
１３０．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることによって疾患を治療する方法であって、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、方法。
１３１．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させ、それによって疾患を治療することにおける、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用。
１３２．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含む、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも少なくとも２倍、又は少なくとも３倍高レベルで発現させることにより、疾患を治療することにおける、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用。
１３３．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを発現させることが、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、態様１２１〜１２２、１２５〜１２８、若しくは１３１〜１３２のいずれか１の、使用のためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、又は使用。
１３４．配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含むウイルス粒子並びに／又は配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含むウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子の活性よりも高い第ＩＸ因子活性を有する第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現させることによる疾患の治療における使用のための、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物。
１３５．有効量の態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含むウイルス粒子並びに／又は配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含むウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子の活性よりも高い第ＩＸ因子活性を有する第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現させることによって疾患を治療する方法。
１３６．配列番号１２の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号７の転写調節エレメントを含むウイルス粒子並びに／又は配列番号１８の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び配列番号６の転写調節エレメントを含むウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子の活性よりも高い第ＩＸ因子活性を有する第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現させることによる疾患の治療おける、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用。
１３７．第ＩＸ因子タンパク質又はその断片を発現させることが、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、態様１３４若しくは１３６のいずれか１の、使用のためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、又は使用。
１３８．疾患が血友病である、態様１２１〜１２２、１２４〜１２８、１３０〜１３７のいずれか１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１３９．疾患が血友病ｂである、態様１３８の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１４０．血友病Ｂを有する患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成することにおける使用のための、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子、又は組成物。
１４１．有効量の態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、血友病Ｂを有する患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成する方法。
１４２．血友病Ｂを有する患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成することにおける、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。
１４３．患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、血友病Ｂの治療における使用のための、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物。
１４４．態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を、患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で、患者に投与することを含む、血友病Ｂを治療する方法。
１４５．患者において少なくとも２０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を、患者に投与することを含む、血友病Ｂの治療における、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用。
１４６．血友病Ｂを治療するか、又は安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成することが、態様１〜１１２のいずれか１のポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、態様１４０、１４２、１４３、若しくは１４５の、使用のためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、又は使用。
１４７．第ＩＸ因子の活性レベルが、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、又は組成物の投与から少なくとも１０週間、少なくとも１５週間、少なくとも２０週間、少なくとも３０週間、少なくとも４０週間、又は少なくとも５０週間後に安定している、態様１４１、１４４、１４６〜１４８のいずれか１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１４８．患者が、（ｉ）配列番号４又は５の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）配列番号６の転写調節エレメント、を含むウイルス粒子から発現する第ＩＸ因子の活性よりも低い活性を有する第ＩＸ因子による治療が無効である患者である、態様１２３、１２４、１２９、１３０、１３３、１３５、１３７〜１４７のいずれか１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１４９．患者が、（ｉ）配列番号４又は５の第ＩＸ因子ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）配列番号６の転写調節配列、を含むヌクレオチド配列によってコードされる第ＩＸ因子ポリペプチドよりも低いレベルで発現する第ＩＸ因子ポリペプチドによる治療が無効である患者である、態様１２３、１２４、１２９、１３０、１３３、１３５、１３７〜１４８のいずれか１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１５０．ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物が、血友病Ｂを有する患者における、少なくとも２０％の、安定している第ＩＸ因子活性レベルを達成するのに有効な用量で投与される、態様１２１〜１４９のいずれか１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１５１．ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物が、少なくとも４．５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇの用量、又は５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ未満の用量、又は４．５ｘ１０１１〜１ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇの用量、又は４．５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ〜４．９ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、態様１２１〜１５０のいずれか１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１５２．用量が、ｑＰＣＲを用いてベクターゲノムの数を定量化することによって決定され、場合により、ｑＰＣＲが、プロモーター領域へ結合するプライマーを用い、場合により、プロモーター領域が、導入遺伝子カセットのプロモーター領域である、態様１５１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１５３．投与されるポリヌクレオチド又はウイルス粒子が、哺乳動物細胞から産生され、及び／又は哺乳動物ウイルスベクター産生細胞の使用から生じ、昆虫ウイルスベクター産生細胞（例えば、バキュロウイルス系）で産生されるベクターとは異なる特徴を有する、態様１２１〜１５２のいずれか１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１５４．安定している第ＩＸ因子活性レベルが、少なくとも２５％又は少なくとも３０％の安定している第ＩＸ因子活性レベルである、態様１４０〜１５３のいずれか１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１５５．安定している第ＩＸ因子活性レベルが、少なくとも３５％の安定している第ＩＸ因子活性レベルである、態様１４０〜１５４のいずれか１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１５６．安定している第ＩＸ因子活性レベルが、少なくとも又は約４０％のものである、態様１４０〜１５５のいずれか１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１５７．第ＩＸ因子活性レベルが、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後、少なくとも５０週間又は約５２週間の時点で、少なくとも２０％である、態様１４０〜１５６のいずれか１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１５８．第ＩＸ因子活性レベルが、その時点の直前の少なくとも４０週間の連続期間の間、少なくとも２０％で持続する、態様１５７の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１５９．第ＩＸ因子活性レベルが、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後、少なくとも５０週間又は約５２週間の時点で、少なくとも２５％である、態様１４０〜１５６のいずれか１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１６０．第ＩＸ因子活性レベルが、その時点の直前の少なくとも４０週間の連続期間の間、少なくとも２５％で持続する、態様１５９の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１６１．第ＩＸ因子活性が、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の投与後、少なくとも５０週間又は約５２週間の時点で、少なくとも又は約４０％である、態様１４０〜１５６のいずれか１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１６２．第ＩＸ因子活性レベルが、その時点の直前の少なくとも４０週間の連続期間の間、少なくとも４０％で持続する、態様１６１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１６３．第ＩＸ因子活性が、凝固アッセイを用いて、患者からの血液サンプル中の第ＩＸ因子活性を決定して測定され、場合により、凝固アッセイが、ＳｙｎｔｈＡＳｉｌＴＭキットを用いる、態様１４０〜１６２のいずれか１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１６４．第ＩＸ因子活性が、患者から血液サンプルを採取し、凝固アッセイを用いて血液サンプル中の第ＩＸ因子活性を決定することによって測定され、場合により、凝固アッセイが、ＳｙｎｔｈＡＳｉｌＴＭキットを用いる、態様１４０〜１６２のいずれか１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１６５．凝固アッセイが一段階凝固アッセイであり、場合により、一段階凝固アッセイがＳｙｎｔｈＡＳｉｌＴＭキットを用いる、態様１６３又は１６４の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１６６．方法又は使用が、ステロイドの共投与を含む、態様１４０〜１６２のいずれか１の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
１６７．ステロイドがプレドニゾロンである、態様１６６の、使用ためのポリヌクレオチド、ウイルス粒子若しくは組成物、方法、又は使用。
【図１】
2021533799.tif 000008
【図２】
2021533799.tif 000009
【図３】
2021533799.tif 000010
【図４】
2021533799.tif 000011
【図５】
2021533799.tif 000012
【図６】
2021533799.tif 000013
【図７】
2021533799.tif 000014
【図８】
2021533799.tif 000015
【図９】
2021533799.tif 000016
【図１０】
2021533799.tif 000017
【図１１】
2021533799.tif 000018
【図１２】
2021533799.tif 000019
【図１３】
2021533799.tif 000020
【図１４−１】
2021533799.tif 000021
【図１４−２】
2021533799.tif 000022
【図１４−３】
2021533799.tif 000023
【図１４−４】
2021533799.tif 000024
【図１４−５】
2021533799.tif 000025
【図１４−６】
2021533799.tif 000026
【図１４−７】
2021533799.tif 000027
【図１４−８】
2021533799.tif 000028
【図１５】
2021533799.tif 000029
【配列表】
2021533799000001.app
【国際調査報告】
2021533799.tif 000030
2021533799.tif 000031
2021533799.tif 000032