(57)【要約】  本発明は、ＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）のスパイクタンパク質又はそのタンパク質の一部を特異的に認識するモノクロナール抗体、又はその機能的断片であって、前記モノクロナール抗体、又はその機能的断片は、下記のポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか１つのポリペプチド配列を含むことを特徴とするモノクロナール抗体、又はその機能的断片：配列番号１で記載されるＣＤＲ１領域、配列番号２で記載されるＣＤＲ２領域及び配列番号３で記載されるＣＤＲ３領域を含む重鎖と、配列番号４で記載されるＣＤＲ１領域、配列番号５で記載されるＣＤＲ２領域及び配列番号６で記載されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖とで構成されるモノクロナール抗体及びその用途に関する。
2021533175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）のタンパク質又はそのタンパク質の一部を特異的に認識するモノクロナール抗体、又はその機能的断片であって、
前記モノクロナール抗体、又はその機能的断片は、下記のポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか１つのポリペプチド配列を含むことを特徴とする、モノクロナール抗体、又はその機能的断片：
配列番号１で記載されるＣＤＲ１領域、配列番号２で記載されるＣＤＲ２領域及び配列番号３で記載されるＣＤＲ３領域を含む重鎖と、配列番号４で記載されるＣＤＲ１領域、配列番号５で記載されるＣＤＲ２領域及び配列番号６で記載されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖とで構成されるモノクロナール抗体。
【請求項２】
前記機能的断片は、単一の側鎖抗体（ｓｃＦｖ）であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクロナール抗体、又はその機能的断片。
【請求項３】
前記機能的断片は、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクロナール抗体、又はその機能的断片。
【請求項４】
前記機能的断片は、請求項１に記載のＣＤＲ部位を含む軽鎖又は重鎖であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクロナール抗体、又はその機能的断片。
【請求項５】
前記機能的断片は、請求項１に記載のＣＤＲ部位を含む可変ドメイン（Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクロナール抗体、又はその機能的断片。
【請求項６】
前記モノクロナール抗体は、配列番号７で記載されるポリペプチド配列を含む重鎖、及び配列番号８で記載されるポリペプチド配列を含む軽鎖であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクロナール抗体。
【請求項７】
前記ＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）のタンパク質はスパイクタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクロナール抗体。
【請求項８】
前記スパイクタンパク質の一部は、配列番号１０に記載されたペプチド配列であることを特徴とする、請求項７に記載のモノクロナール抗体。
【請求項９】
配列番号１０に記載されるペプチド配列をエピトープとして認識する、モノクロナール抗体。
【請求項１０】
リポソーム内に同時にカプセル化されたＭＥＲＳコロナウイルス由来のエピトープペプチド及びＣｐＧ−ＤＮＡ複合体を動物に注射してＭＥＲＳコロナウイルスを認識するモノクロナール抗体を製造する方法。
【請求項１１】
前記ＭＥＲＳコロナウイルス由来のエピトープペプチドは、配列番号９で記載されるペプチド配列であることを特徴とする、請求項１０に記載のモノクロナール抗体を製造する方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の製造方法によって製造されるモノクロナール抗体。
【請求項１３】
請求項１に記載のモノクロナール抗体に標識物質を接合したコンジュゲートを含むＭＥＲＳコロナウイルス診断用組成物。
【請求項１４】
前記標識物質は、酵素、ルシフェラーゼ、磁性粒子、蛍光物質及び放射性同位元素からなる群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
１）サンプルと請求項１、９又は１２に記載のモノクロナール抗体とを接触させるステップと、
２）前記モノクロナール抗体を試料サンプルと接触させて形成された抗原−抗体複合体を検出するステップとを含む、
対象体のＭＥＲＳコロナウイルス感染の有無に関する情報提供方法。
【請求項１６】
１）請求項１、９又は１２に記載のモノクロナール抗体と、
２）容器とを含む、ＭＥＲＳコロナウイルス診断用キット。
【請求項１７】
１）請求項１３に記載の組成物と、
２）容器とを含む、ＭＥＲＳコロナウイルス診断用キット。
【請求項１８】
請求項１に記載のモノクロナール抗体を有効成分として含む、ＭＥＲＳコロナウイルス感染治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＥＲＳコロナウイルスのＳタンパク質に対するモノクロナール抗体及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＥＲＳコロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ、中東呼吸器症候群コロナウイルス）は、２０１２年にサウジアラビアで最初に発見された後、中東地域で集中的に発生したウイルスであって、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｖｉｒｉｄａｅ）群に属し、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス）と類似のウイルスとして知られている。
【０００３】
ＭＥＲＳ（中東呼吸器症候群）は、潜伏期が約１週間であり、発熱を伴う咳、呼吸困難、息切れ、痰などの呼吸器症状を主に起こし、その他にも、頭痛、悪寒、鼻水、筋肉痛だけでなく、食欲不振、吐き気、嘔吐、腹痛、下痢などの消化器症状も現れることがある。ただし、ＳＡＲＳとは異なり、急性腎不全を伴う。ＳＡＲＳよりも致死率が約６倍高いという調査結果が出るなど、さらに致命的な様相を見せている。年齢層に応じて、致死率は５０％を超える。現在まで中東呼吸器症候群ウイルスの治療のための抗ウイルス剤は開発されておらず、症状に対する治療を主としており、重症の場合、人工呼吸器や人工血液透析などを受けなければならない場合もある。
【０００４】
明確な感染源及び感染経路は確認されていないが、中東地域のラクダとの接触を通じて感染する可能性が高く、人と人との間の密接接触による伝播が可能であると報告されている。
【０００５】
ＭＥＲＳ−ＣｏＶは、コロナウイルスの中でもベータコロナウイルスの一種であって、遺伝子の長さは多様であるが、約３０ｋｂに該当し、１１個のＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）を有する。ＭＥＲＳ−ＣｏＶの構造タンパク質には、Ｓ（ｓｐｉｋｅ）、Ｅ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）、Ｍ（ｍｅｍｂｒａｎｅ）及びＮＰ（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）タンパク質が存在する。
【０００６】
ＭＥＲＳ−ＣｏＶの診断は、遺伝子診断と抗原−抗体診断に分類され、現在、ＷＨＯが推奨する標準診断法は、鼻水（ｎａｓａｌ  ｓｗａｐ）検体からのウイルス遺伝子特異的プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を用いたＰＣＲや遺伝子の塩基配列の分析によるものである。ＭＥＲＳ−ＣｏＶの抗体診断法は、ＮＰ抗原に対する抗体の診断ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、酵素免疫吸着法）法が実施されており、Ｅｕｒｏｉｍｍｕｎ社（ドイツ）で開発された抗体診断キットは、ラクダのＭＥＲＳＣｏＶを診断する用途に使用されている。しかし、未だにヒト抗原−抗体診断キットとして開発された製品はない。
【０００７】
韓国登録特許第１５９３６４１号には、‘中東呼吸器症候群コロナウイルスのヌクレオカプシドを認識する抗体及びその用途’が開示されており、韓国登録特許第０８３２８７０号には、‘ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシドタンパク質に対するモノクロナール抗体及びその用途’が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】大韓民国公開特許第１０−２０１６−０１４５８１３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記の必要性によって案出されたものであって、本発明の目的は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に対して特異的な新規なモノクロナール抗体を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に対して特異的なモノクロナール抗体の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的を達成するために、本発明は、ＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）のタンパク質又はそのタンパク質の一部を特異的に認識するモノクロナール抗体、又はその機能的断片であって、
【００１２】
前記モノクロナール抗体、又はその機能的断片は、下記のポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか１つのポリペプチド配列を含むことを特徴とするモノクロナール抗体、又はその機能的断片：
【００１３】
配列番号１で記載されるＣＤＲ１領域、配列番号２で記載されるＣＤＲ２領域及び配列番号３で記載されるＣＤＲ３領域を含む重鎖と、
【００１４】
配列番号４で記載されるＣＤＲ１領域、配列番号５で記載されるＣＤＲ２領域及び配列番号６で記載されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖とで構成されるモノクロナール抗体を提供する。
【００１５】
本発明の一実施例において、前記機能的断片は、単一の側鎖抗体（ｓｃＦｖ）、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、又は本発明のＣＤＲ部位を含む軽鎖又は重鎖であることが好ましく、前記機能的断片は、前記本発明のＣＤＲ部位を含む可変ドメイン（Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）であることが好ましいが、これに限定されない。
【００１６】
本発明の他の実施例において、前記モノクロナール抗体は、配列番号７で記載されるポリペプチド配列を含む重鎖、及び配列番号８で記載されるポリペプチド配列を含む軽鎖であることが好ましいが、これに限定されない。
【００１７】
本発明の更に他の実施例において、前記ＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）のタンパク質はＳタンパク質であることが好ましく、前記Ｓタンパク質の一部は、配列番号９で記載されるペプチド配列であることがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００１８】
また、本発明は、配列番号９で記載されるペプチド配列をエピトープとして認識するモノクロナール抗体を提供する。
【００１９】
また、本発明は、リポソーム内に同時にカプセル化されたＭＥＲＳコロナウイルス由来のエピトープペプチド及びＣｐＧ−ＤＮＡ複合体を動物に注射してＭＥＲＳコロナウイルスを認識するモノクロナール抗体を製造する方法を提供する。
【００２０】
また、本発明は、前記本発明の製造方法によって製造されるモノクロナール抗体を提供する。
【００２１】
また、本発明は、前記本発明のモノクロナール抗体に標識物質を接合したコンジュゲートを含むＭＥＲＳコロナウイルス診断用組成物を提供する。
【００２２】
本発明の一実施例において、前記標識物質は、酵素、ルシフェラーゼ、磁性粒子、蛍光物質及び放射性同位元素からなる群から選択されるいずれか１つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００２３】
また、本発明は、１）サンプルと本発明のモノクロナール抗体とを接触させるステップと、
２）前記モノクロナール抗体を試料サンプルと接触させて形成された抗原−抗体複合体を検出するステップとを含む、
【００２４】
対象体のＭＥＲＳコロナウイルス感染の有無に関する情報提供方法を提供する。
【００２５】
また、本発明は、前記本発明のモノクロナール抗体；及び容器を含むＭＥＲＳコロナウイルス診断用キットを提供する。
【００２６】
また、本発明は、前記本発明の組成物；及び容器を含むＭＥＲＳコロナウイルス診断用キットを提供する。
【００２７】
本発明は、前記モノクロナール抗体を試料サンプルと接触させて形成された抗原−抗体複合体を検出するステップを含むＭＥＲＳコロナウイルス検出方法を提供する。
【００２８】
本発明において、用語「抗原−抗体複合体」とは、試料中のＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳ抗原とこれを認識する本発明に係る単一クローン抗体又はその切片との結合物を意味し、このような抗原−抗体複合体は、比色法（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）、電気化学法（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ）、蛍光法（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）、発光法（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）、粒子計数法（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）、肉眼測定法（ｖｉｓｕａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）及び閃光計数法（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）からなる群から選択される任意の方法で検出することができる。しかし、必ずしもこれらに制限されるものではなく、様々な応用及び適用が可能である。
【００２９】
本発明では、抗原−抗体複合体を検出するためのものとして、様々な標識体を使用することができる。具体例としては、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子、及び放射性同位元素からなる群から選択することができる。しかし、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００３０】
検出標識体として使用される好ましい酵素としては、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、又はβ−ラクタマーゼがあり、好ましい蛍光物としては、フルオレセイン、Ｅｕ３＋、Ｅｕ３＋キレート又はクリプタートがあり、好ましいリガンドとしては、ビオチン誘導体があり、好ましい発光物としては、アクリジニウムエステル又はイソルミノール誘導体があり、好ましい微小粒子としては、コロイド金又は着色されたラテックスがあり、好ましい放射性同位元素としては、５７Ｃｏ、３Ｈ、１２５Ｉ又は１２５Ｉ−ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）試薬があるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
抗原−抗体複合体を検出する方法は、好ましくは、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて検出することができるが、これに限定されるものではない。酵素免疫吸着法は、固体支持体に付着した抗原を認識する抗体を用いる直接ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗原を認識する抗体の複合体において捕獲抗体を認識する標識された二次抗体を用いる間接ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体において抗原を認識する標識された別の抗体を用いる直接サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体において抗原を認識する別の抗体と反応させた後、この抗体を認識する標識された二次抗体を用いる間接サンドイッチＥＬＩＳＡなどの様々なＥＬＩＳＡ方法を含む。
【００３２】
前記モノクロナール抗体又はその切片は検出標識体を有することができ、検出標識体を有さない場合は、これらのモノクロナール抗体又はその切片を捕獲することができ、検出標識体を有する他の抗体を処理して確認することができる。
【００３３】
また、本発明は、前記モノクロナール抗体を含むＭＥＲＳコロナウイルス検出用キットを提供する。
【００３４】
本発明の検出用キットは、前記モノクロナール抗体、基質と反応して発色する標識体と縮合した抗体、及び発色基質を含む。本発明の検出用キットにおいて、前記モノクロナール抗体は基板に吸着された状態で提供され得る。前記基板としては、ＰＶＤＦ膜、プレート及びスライドを使用してもよいが、これらに限定されるものではない。標識体としてはＨＲＰ、発色基質としてはＴＭＢが好ましいが、これらに限定されるものではない。また、前記検出用キットは、分析方法に適する１種類又はそれ以上の他の構成成分を有する組成物、溶液又は装置をさらに含んで構成されてもよい。本発明の製造方法によって製造されるＭＥＲＳコロナウイルスのＳ抗原に特異的なモノクロナール抗体を用いてヒトからＭＥＲＳを診断するための検出用キットを提供する。検出用キットの最終検出方法としては、免疫クロマトグラフィー法、ラピッド診断法、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、又はウェスタンブロットが用いられてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
好ましくは、本発明の検出用キットに使用される検出方法は、免疫クロマトグラフィー法（ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及び酵素免疫吸着法であってもよい。
【００３６】
前記免疫クロマトグラフィー法を用いたＭＥＲＳコロナウイルス検出用キットは、試料を注入する試料注入部と；前記試料注入部から一定間隔離れた点に位置するＭＥＲＳコロナウイルスのＳタンパク質に特異的に結合できるモノクロナール抗体が結合した金縮合体を含む結合部と；前記結合部から一定間隔離れた位置にＭＥＲＳコロナウイルスのＳタンパク質に特異的に結合できるモノクロナール抗体が固定された検査線（ｔｅｓｔ  ｌｉｎｅ）と；抗マウスＩｇＧが固定された対照線（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｌｉｎｅ）が順次備えられることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
本発明の一実施例において、前記検出用キットは、ストリップ状のニトロセルロースメンブレンにガラス繊維（ｇｌａｓｓ  ｆｉｂｅｒ）、コットン（ｃｏｔｔｏｎ）又はセルロース材質のパッドを結合させて、試料を投入できる試料注入部が備えられ、前記試料注入部から一定間隔を維持しながら、コロイド金（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｇｏｌｄ）−ＭＥＲＳコロナウイルス抗体が縮合した複合体が乾燥された縮合パッド、前記ＭＥＲＳコロナウイルス抗体と同じ抗原を検出できる他の抗体が固定された検査線、及び前記縮合パッドに存在するモノクロナール抗体を検出できる二次抗体が固定された対照線が順次備えられた免疫ストリップであってもよい。
【００３８】
前記免疫クロマトグラフィー法の診断法は、前記ＭＥＲＳコロナウイルス検出用乾燥組成物を適用したキットを作製して使用するものであって、安定しているので長期間保管することが可能である。
【００３９】
前記ＭＥＲＳコロナウイルス検出用キットに、ＭＥＲＳコロナウイルスを含有すると疑われる試料を投入して、前記テストストリップの検査線及び対照線に赤紫色の線が現れる場合、ＭＥＲＳコロナウイルス感染を陽性と判定し、対照線のみに赤紫色の線が現れる場合、ＭＥＲＳコロナウイルス感染を陰性と判定することができる。
【００４０】
また、交差反応（ｃｒｏｓｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）検査において、他の呼吸器ウイルスを適用して検査結果が陰性と出ることを読み取り、検査が他の呼吸器ウイルスとどれくらい交差性がないかを確認することができる。
【００４１】
酵素免疫抗体法を用いたキットの場合、本発明のモノクロナール抗体がコーティングされたプレートの各ウェルにＭＥＲＳの疑いがある患者から採取した検体を反応させ、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）−縮合ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳ抗原特異モノクロナール抗体を添加した後、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）基質溶液を各ウェルに処理して、発色反応を吸光度で測定するように構成される。好ましくは、本発明の検出用キットは、ヒトのコロナウイルスからＭＥＲＳの鑑別診断のための特異的なモノクロナール抗体を用い、陽性対照群及び定量分析が可能なように組換えＳ抗原をさらに含むことができる。
【００４２】
本発明に係る前記診断用組成物は、本発明のモノクロナール抗体及び免疫学的分析に使用される試薬が含まれてもよい。免疫学的分析に使用される試薬としては、抗原−抗体結合を原理とする公知の全ての定量分析方法に使用される適切な担体、検出可能な信号を生成できる標識、溶解剤、洗浄剤が含まれる。前記定量分析方法の例としては、これに限定されないが、免疫ブロッティング、免疫沈降法、酵素免疫分析法、タンパク質チップ、ラピッドアッセイ及びマイクロアレイ方法などがある。
【００４３】
上記の適切な担体としては、これに限定されないが、可溶性担体、例えば、当分野において公知の生理学的に許容される緩衝液のいずれか１つ（例えば、ＰＢＳ）、又は不溶性担体、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組み合わせであってもよい。
【００４４】
検出可能な信号を生成できる標識としては、酵素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質などを使用することができる。酵素としては、過酸化酵素（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、インベルターゼなどを使用することができ、蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、フィコビリン（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｎ）タンパク質、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、フィコシアニン（ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）及びオルトフタルアルデヒド（ｏｒｔｈｏｐｈｔｈａｌｉｃ  ａｌｄｅｈｙｄｅ）などを使用することができる。発光物質としては、イソルミノール（ｉｓｏｌｕｍｉｎｏｌ）、ルシゲニン（ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ）などを使用することができ、放射性物質としては、１３１Ｉ、１４Ｃ、３Ｈなどを使用することができる。しかし、前記の例示されたもの以外に、免疫学的分析法に使用できるものであれば、いずれも使用可能である。
【００４５】
本発明の機能的抗体断片としては、軽鎖、重鎖、可変領域、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含有するペプチドなどが挙げられる。
【００４６】
Ｆａｂは、ＩｇＧをタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）で結合された分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００４７】
本発明のＦａｂは、本発明の抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得ることができる。又は、当該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、当該ベクターを原核生物又は真核生物に導入することによって発現させてＦａｂを製造することができる。
【００４８】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を介して結合されたものよりわずかに大きい分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００４９】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、本発明の抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。又は、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはＳ−Ｓ結合させて作製することができる。Ｆａｂ’は、前記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００５０】
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを１２残基以上の適当なペプチドリンカー（Ｐ）を使用して連結したＶＨ−Ｐ−ＶＬ又はＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドであって、抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００５１】
本発明のｓｃＦｖは、本発明の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを得て、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを作製し、当該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを原核生物又は真核生物に導入することによって発現させて製造することができる。
【００５２】
Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性が同一又は異なるｓｃＦｖが二量体を形成した抗体断片であり、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性、又は異なる抗原に対する二重特異的抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００５３】
本発明のＤｉａｂｏｄｙは、例えば、本発明の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを得て、３〜１５残基のポリペプチドリンカーを有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡを作製し、当該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを原核生物又は真核生物に導入することによってＤｉａｂｏｄｙを発現させて製造することができる。
【００５４】
また、ｌｉｎｋｅｒ  Ｐの長さが３〜１０であるときはｔｒｉｂｏｄｙが形成されて、ｔｒｉｂｏｄｙとして含むことができる。
【００５５】
ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１つのアミノ酸残基をシステイン残基で置換したポリペプチドを、当該システイン残基間のＳ−Ｓ結合を介して結合させたものをいう。システイン残基で置換されるアミノ酸残基は、Ｒｅｉｔｅｒなどによって記載された方法［参照：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］によって、抗体の立体構造の予測に基づいて選択することができる。
【００５６】
また、本発明は、前記本発明のモノクロナール抗体を有効成分として含むＭＥＲＳコロナウイルス感染治療用医薬組成物を提供する。
【００５７】
本発明の医薬組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に一般的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の医薬組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適切な薬学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、経口又は非経口で投与することができ、好ましくは非経口投与であり、非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる。
【００５９】
本発明の医薬組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方することができる。一方、本発明の医薬組成物の投与量は、好ましくは、１日当たり０．００１〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位用量形態で製造されるか、又は多用量容器内に入れて製造されてもよい。この場合、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、又はエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【００６１】
以下、本発明を説明する。
【００６２】
本発明者らは、代表的な大韓民国とサウジアラビアの菌株のＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質（Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−ＲＢＤ由来のＢ細胞エピトープ配列であるＳｐｉｋｅ−４９２及びＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）を選択した。そのＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質−ＲＢＤのＢ細胞エピトープペプチド配列であるＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）は、Ｌ５０６Ｆ置換体をコードする。ここで、本発明者らは、Ｂ細胞エピトープペプチドとＬｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）の複合体でマウスを免疫化して、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に対して特異的なモノクロナール抗体５０６−２Ｇ１０Ｇ５及び４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２を製造した。両モノクロナール抗体ともに、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に対する強くて特異的な結合を示したが、５０６−２Ｇ１０Ｇ５抗体は４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２と比較すると、Ｓｐｉｋｅ−４９２及びＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）ペプチドに対するさらに高い結合親和性を示した。さらに、間接免疫蛍光アッセイ及び共焦点アッセイから、Ｓタンパク質に対する２つの抗体の特異性を確認した。重要なことに、５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体の処理は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶに感染したプラークパーセントを、正常マウスＩｇＧ及び４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２の処理と比較すると効果的に減少させた。以上をまとめると、本発明のデータは、５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体をＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染に対する診断及び治療に対して適用可能であるということが分かる。
【発明の効果】
【００６３】
本発明を通じて分かるように、本発明の５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染に対する診断及び治療に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】Ｂ細胞エピトープ−特異的抗体の生産に対する図である。  （Ａ）ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質の図式的な図である。Ｓタンパク質は、Ｓ１及びＳ２サブユニットで構成され、ＲＢＤ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ；ＦＰ，ｆｕｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ；ＨＲ１及びＨＲ２，ｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔ  ｒｅｇｉｏｎ  １及び２；ＴＭ，ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ；ＣＰ，ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌで構成される。（Ｂ）Ｂ細胞エピトープは、エピトープの予測、表面接近性及び抗原性指数に基づくＩＥＤＢを使用して選択した。（Ｃ）血清を使用したＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２−又はＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）−特異的抗体の生産を示すＥＬＩＳＡ分析を示す。血清は、Ｂ細胞エピトープペプチド（Ｓｐｉｋｅ−４９２又はＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ））及びＬｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）の複合体で免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウスから分離した。
【図２】抗−Ｓｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）−特異的なモノクロナール抗体（５０６−２Ｇ１０Ｇ５）を生産するハイブリドーマクローンのスクリーニングを示す図である。  （Ａ、Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウス３匹を１０日間隔で４回、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に同時にカプセル化されたＭＢ−ＯＤＮ  ４５３１（Ｏ）及びＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）でｉ．ｐ．免疫化した。Ｓｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）ペプチドで免疫化されたマウスの脾臓細胞を使用した細胞融合実験の１次スクリーニング（ＨＡＴ  ｍｅｄｉｕｍ）のＥＬＩＳＡ結果を示す。  （Ｃ、Ｄ）ハイブリドーマクローンをＨＴ培地でリミッティング希釈法によるサブクローニングを伴うモノクロナール抗体の生産のために選択する。
【図３】抗−Ｓｐｉｋｅ−４９二重特異的モノクロナール抗体（４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２）を生産するハイブリドーマクローンのスクリーニングを示す図である。（Ａ、Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウス３匹を１０日間隔で４回、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に同時にカプセル化されたＭＢ−ＯＤＮ  ４５３１（Ｏ）及びＳｐｉｋｅ−４９２でｉ．ｐ．免疫化した。Ｓｐｉｋｅ−４９２ペプチドで免疫化されたマウスの脾臓細胞を使用した細胞融合実験の１次スクリーニング（ＨＡＴ  ｍｅｄｉｕｍ）のＥＬＩＳＡ結果を示す。（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）ハイブリドーマクローンをＨＴ培地でリミッティング希釈法によるサブクローニングを伴うモノクロナール抗体の生産のために選択する。
【図４】抗−ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）エピトープ−特異的なモノクロナール抗体の精製及び特性を示す図である。（Ａ）ｐｒｉｓｔｉｎｅ−ｐｒｉｍｅｄマウスに５０６−２Ｇ１０Ｇ５クローンを注射して腹水を得た後、５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｇａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィーを使用して精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。Ｒは、還元条件；ＮＲは、非還元条件である。（Ｂ）精製した５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体のイソタイプはＥＬＩＳＡで決定した。（Ｃ）ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）ペプチドに対する５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体の結合親和性は、ＥＬＩＳＡで決定し、ＥＣ５０値は、シグマプロット（Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ）プログラムで評価した。  （Ｄ−Ｇ）ＭＥＲＳ−ＣｏＶ−感染及び非感染のＶｅｒｏ細胞破砕液をＰＢＳ（−）又はＰＮＧａｓｅ  Ｆ（＋）で処理し、その破砕液を５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体で免疫ブロッティングした（Ｄ）。破砕液を抗−β−アクチン（ａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ）抗体を対照群としてウェスタンブロッティングした（Ｅ）。５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体を使用したウェスタンブロット分析は、５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体で破砕液の免疫沈降を伴って行った（Ｆ）。破砕液を対照群として抗−β−アクチン（ａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ）抗体でウェスタンブロッティングを行った（Ｇ）。（Ｈ、Ｉ）モノクロナール抗体の交差反応性を示す。９６ウェル免疫プレートをＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２（Ｇ）又はＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）（Ｈ）でコーティングし、４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２又は５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体で培養した。Ｓｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）ペプチドに対する４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２抗体の反応性、及び５０６−２Ｇ１０Ｇ５抗体のＳｐｉｋｅ−４９２ペプチドに対する反応性をＥＬＩＳＡ分析で決定した。
【図５】抗−ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２エピトープ−特異的なモノクロナール抗体の精製及び特性を示す図である。（Ａ）腹水から得た４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｇａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィーを使用して精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。Ｒは、還元条件；ＮＲは、非還元条件である。（Ｂ）精製した４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体のイソタイプはＥＬＩＳＡで決定した。（Ｃ）ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２ペプチドに対する４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体の結合親和性は、ＥＬＩＳＡで決定し、ＥＣ５０値は、シグマプロットプログラムで評価した。（Ｄ−Ｆ）ＭＥＲＳ−ＣｏＶ−感染及び非感染のＶｅｒｏ細胞破砕液をＰＢＳ（−）又はＰＮＧａｓｅ  Ｆ（＋）で処理し、その破砕液を４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体で免疫ブロッティングした（Ｄ）。４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体を使用したウェスタンブロット分析は、４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体で破砕液の免疫沈降を伴って行った（Ｅ）。破砕液を対照群として抗−β−アクチン抗体でウェスタンブロッティングを行った（Ｆ）。
【図６】ハイブリドーマ細胞クローン４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２から分離された重鎖及び軽鎖の可変ドメインのｃＤＮＡ配列を示す。  （Ａ）重鎖可変ドメインの配列である。  （Ｂ）軽鎖可変ドメインの配列である。  予測されたアミノ酸配列をｃＤＮＡ配列の下段に記載する。
【図７】ハイブリドーマ細胞クローン５０６−２Ｇ１０Ｇ５から分離された重鎖及び軽鎖の可変ドメインのｃＤＮＡ配列を示す。  （Ａ）重鎖可変ドメインの配列である。  （Ｂ）軽鎖可変ドメインの配列である。
【図８】Ｓｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）モノクロナール抗体でＭＥＲＳ−ＣｏＶ−感染した細胞の検出のための免疫蛍光アッセイ及び共焦点顕微鏡法を示す。（Ａ）間接免疫蛍光分析を示す。ＭＥＲＳ−ＣｏＶ−感染及び非感染のＶｅｒｏ細胞の混合物を５０６−２Ｇ１０Ｇ５抗体又は正常マウスＩｇＧで染色し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８−付着したヤギ抗マウス（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧ抗体（緑色）で培養した。核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８で染色（青色）した。イメージを蛍光顕微鏡で撮影した。（Ｂ）共焦点顕微鏡法を示す。Ｖｅｒｏ細胞をＭＥＲＳ−ＣｏＶで２日間感染させ、その細胞を５０６−２Ｇ１０Ｇ５抗体又は正常マウスＩｇＧで染色した後、Ａｌｅｘａ  ４８８−コンジュゲートヤギ抗マウス（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧ抗体（ｇｒｅｅｎ）で培養し、核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（ｂｌｕｅ）で染色した。スケールバー、１０μｍである。
【図９】４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体でＭＥＲＳ−ＣｏＶ−感染した細胞の検出のための免疫蛍光アッセイ及び共焦点顕微鏡法を示す。（Ａ）間接免疫蛍光分析を示す。ＭＥＲＳ−ＣｏＶ−感染及び非感染のＶｅｒｏ細胞の混合物を４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２抗体又は正常マウスＩｇＧで染色し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８−付着したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（緑色）で培養した。核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８で染色（青色）した。イメージを蛍光顕微鏡で撮影した。（Ｂ）共焦点顕微鏡法を示す。Ｖｅｒｏ細胞をＭＥＲＳ−ＣｏＶで２日間感染させ、その細胞を４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２抗体又は正常マウスＩｇＧで染色した後、Ａｌｅｘａ  ４８８−コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ｇｒｅｅｎ）で培養し、核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（ｂｌｕｅ）で染色した。スケールバー、１０μｍである。
【図１０】５０６−２Ｇ１０Ｇ５及び４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体によるＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の阻害を示す図である。ＭＥＲＳ−ＣｏＶを２倍継代希釈の正常マウスＩｇＧ、４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２又は５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体で３０分間、３７℃で予め培養した。ウイルス−抗体混合物をＶｅｒｏ細胞に添加し、１時間培養した。培養培地をＤＭＥＭ／Ｆ１２（０．６％  ｏｘｏｉｄアガーを含む）で代替した。プラークを感染４日後、クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）で染色した。（Ａ）プラーク減少分析を示す代表的な図である。（Ｂ）１００μｇ／ウェルから０μｇ／ウェルの正常マウスＩｇＧ又は４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２又は５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体で処理した後、ＭＥＲＳ−ＣｏＶに対するプラーク減少分析の定量化を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
以下、非限定的な実施例により本発明をさらに詳細に説明する。但し、以下の実施例は、本発明を例示するための意図で記載されたものであって、本発明の範囲は、以下の実施例によって制限されるものと解釈されるべきではない。
【００６６】
本発明のアフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）の腎臓細胞であるＶｅｒｏ細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入した。Ｖｅｒｏ細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で維持した。その細胞を３７℃、９５％ａｉｒ及び５％ＣＯ２で培養した。ＭＥＲＳ−ＣｏＶ／ＫＯＲ／ＫＮＩＨ／００２＿０５＿２０１５は大韓民国疾病管理本部から入手した（Ｐｅｒｍｉｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．１−００１−ＭＥＲ−ＩＳ−２０１５００１）。
【００６７】
実施例１：Ｂ細胞エピトープペプチドの製造
ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＭタンパク質−特異的抗体を生産するために、本発明者らは、Ｂ細胞エピトープをエピトープの予測、表面接近性及び抗原性指数に基づいてＭタンパク質を分析して選択した。ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＭタンパク質（ＭＥＲＳ−Ｍ１５８，１５８ＣＤＹＤＲＬＰＮＥＶＴＶＡＫＰＮＶＬＩＡＬＫＭＶＫ  １８２；配列番号９）に対するＢ細胞エピトープ配列を分析し、そのペプチドを自動化されたペプチド・シンセサイザー（Ｐｅｐｔｒｏｎ  ＩＩＩ−Ｒ２４，Ｐｅｐｔｒｏｎ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）で合成した。そのペプチドを逆相ＨＰＬＣ（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣ，Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で９０％以上の純度に精製した。
【００６８】
ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質のＢ細胞エピトープの選択、分析及び合成は、Ｐａｒｋ  ＢＫ，Ｌｅｅ  ＳＩ，Ｂａｅ  Ｊ−Ｙ  ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１０９８９−０１８−９７３１−８に記載されているように行った。ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に対するＢ細胞エピトープペプチド配列は、ＭＥＲＳ−ＣＶ菌株（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ／ＫＯＲ／ＫＮＩＨ／００２＿０５＿２０１５（ＧＩ：８２９０２１０４９））由来のＳｐｉｋｅ−４９２（４９２ＴＫＰＬＫＹＳＹＩＮＫＣＳＲＬＬＳＤＤＲＴＥＶＰＱ  ５１６；配列番号９）及びＭＥＲＳ−ＣＶ菌株（Ｓｐｉｋｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＧＩ：５１０７８５８０３））由来のＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）（４９２ＴＫＰＬＫＹＳＹＩＮＫＣＳＲＦＬＳＤＤＲＴＥＶＰＱ  ５１６；配列番号１０）を選択し、そのペプチドを自動化されたペプチド・シンセサイザー（Ｐｅｐｔｒｏｎ  ＩＩＩ−Ｒ２４，Ｐｅｐｔｒｏｎ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）で合成した。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）と命名）に同時にカプセル化されたＢ細胞エピトープペプチド及びＣｐＧ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ  ４５３１（Ｏ））複合体を製造した。
【００６９】
実施例２：マウスの免疫化
ＢＡＬＢ／ｃ（４週齢、雌、Ｈ−２ｂ）マウスをＮａｒａ−Ｂｉｏｔｅｃ（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）から購入した。マウスを特定の無菌の条件下で翰林大学校の動物実験室で維持し、動物実験は、翰林大学校翰林大学校の動物実験倫理委員会（Ｐｅｒｍｉｔ  ｎｕｍｂｅｒ，Ｈａｌｌｙｍ２０１６−５１）の承認を受けた。マウスに２００μｌのＳｐｉｋｅ−４９２ペプチド（５０μｇ）又はＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）ペプチド（５０μｇ）及びＬｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）複合体を、Ｇ．Ｗｕ，Ｄ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｎ．Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，８（２０１８），ｐｐ．７８−９１に記載されているように、１０日に３回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。
【００７０】
実施例３：マウスＡｎｔｉ−ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質のモノクロナール抗体の生産
標準ハイブリドーマ技術によって、ハイブリドーマ細胞をａｎｔｉ−Ｓｐｉｋｅ−４９二重特異的モノクロナール抗体（４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２）及びａｎｔｉ−Ｓｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）−特異的なモノクロナール抗体（５０６−２Ｇ１０Ｇ５）を生産するために選択した［Ｇ．Ｗｕ，Ｄ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｎ．Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，８（２０１８），ｐｐ．７８−９１；Ｗ．Ｍ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｍ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｄ．Ｓａｎｔｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ２（２００６），Ｕｎｉｔ２．５］．
【００７１】
１０日間隔で３回、ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｐ．でＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に同時にカプセル化されたＭＥＲＳ−Ｓｐｉｋｅ−４９２ペプチド（５０μｇ）（又はＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）ペプチド）及びＭＢ−ＯＤＮ  ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）を注射した。
【００７２】
免疫化されたマウスに由来した脾臓を、標準ハイブリドーマ技術によって融合に使用した。ＨＡＴ培地及びＨＴ培地でハイブリドーマクローンを標準リミッティング希釈プロトコルで選択して、クローン細胞群を得た。腹水を得るために、その選択されるハイブリドーマクローンをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に注射した。ａｎｔｉ−Ｓｐｉｋｅ−４９二重特異的モノクロナール抗体（４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２）及びａｎｔｉ−Ｓｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）−特異的なモノクロナール抗体（５０６−２Ｇ１０Ｇ５）を、タンパク質Ａ カラムカラムクロマトグラフィーで腹水液から精製した。
【００７３】
そのモノクロナール抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイピング（ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）キット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＳＡ）を使用した。
【００７４】
実施例４：ＥＬＩＳＡアッセイ
エピトープペプチド特異的抗体タイターを測定するために、５μｇ／ウェルのＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２又はＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）ペプチドを９６ウェル免疫プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にコーティングした後、４℃で一晩培養し、ＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０が補充されたＰＢＳ）で洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴでブロッキングした。
【００７５】
マウス血清を眼窩出血（ｏｒｂｉｔａｌ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ）で集めて１：３の比率で連続的に希釈し、各プレートのウェルに添加した後、常温で２時間培養した。ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）−付着したヤギ抗マウス（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）を２次抗体として１時間使用した。
【００７６】
ＰＢＳＴで洗浄した後、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｉｄｉｎｅ）ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）基質（ＫＰＬ，ＳｅｒａＣａｒｅ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を処理し、反応をＴＭＢ−ｓｔｏｐ溶液（ＫＰＬ）で停止した。吸光度をＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ２５０マイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して４５０ｎｍで測定した。モノクロナール抗体のアイソタイプの同定のために、ＨＲＰ−付着した抗マウス（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧ（各ｉｓｏｔｙｐｅ）抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）を使用した。交差−反応性を検出するために、９６ウェル免疫プレートをＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２又はＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）ペプチドで前記のようにコーティングした。
【００７７】
そのコーティングされたウェルを、２次抗体の培養の前に、４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体又は５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体で２時間培養した。
【００７８】
実施例５：ＥＬＩＳＡによる親和性定数の測定
Ａｎｔｉ−Ｓｐｉｋｅ−４９二重特異的モノクロナール抗体（４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２）及びａｎｔｉ−Ｓｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）−特異的なモノクロナール抗体（５０６−２Ｇ１０Ｇ５）の結合親和性を決定するために、５μｇ／ウェルのＳｐｉｋｅ−４９２及びＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）エピトープペプチドを９６ウェル免疫プレートにコーティングした後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴでブロッキングした。
【００７９】
そのモノクロナール抗体をＰＢＳＴで１：５継代希釈して各プレートに添加した後、常温で２時間培養した。ＰＢＳＴで洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が付着した抗ＩｇＧ抗体を各プレートに添加した。プレートで抗体の量を、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ，ＳｅｒａＣａｒｅ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）で現像した。
【００８０】
吸光度をＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ２５０マイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて４０５ｎｍで測定し、Ｄ．Ｉ．Ｋｉｓｉｅｌａ，Ｈ．Ａｖａｇｙａｎ，Ｄ．Ｆｒｉｅｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．，１１（２０１５），ｐｐ．ｅ１００４８５７に記載されているように、ＳｉｇｍａＰｌｏｔプログラムで計算して、ＥＣ５０値を決定した。
【００８１】
実施例６：ウェスタンブロッティング及び免疫沈降法
ＭＥＲＳ−ＣｏＶ−感染したＶｅｒｏ細胞を細胞破砕バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＦ、２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、プロテアーゼ阻害剤カクテル及び１０％ＮＰ−４０）で破砕した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にローディングした。その分離されたタンパク質をニトロセルロース（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）膜に移した後、３％ＢＳＡを含むＰＢＳＴでブロッキングした。その膜を、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２モノクロナール抗体又はＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）モノクロナール抗体で処理し、ＰＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰ付着したヤギ抗マウス（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧ抗体で処理した。
【００８２】
その膜をケミルミネッセンス（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）溶液で検出し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で図案化した。免疫沈降のために、ウイルス感染した−Ｖｅｒｏ細胞破砕液をＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２モノクロナール抗体又はＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）モノクロナール抗体を用いて４℃で一晩培養し、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質をプロテインＡビーズ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で１時間沈降させた。その免疫沈降したタンパク質をＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２モノクロナール抗体又はＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）モノクロナール抗体を使用してウェスタンブロッティングで分析した。
【００８３】
実施例７：脱グリコシル化アッセイ（Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）
細胞破砕液をＶｅｒｏ細胞及びＭＥＲＳ−ＣｏＶ−感染したＶｅｒｏ細胞から破砕バッファー（０．５％ＳＤＳ、１％β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を用いて取得し、その破砕液を１００℃で１０分間加熱した。その破砕液をペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ）Ｆ（Ｅｌｐｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）を用いて３７℃で２時間処理した後、１００℃で１０分間加熱した。処理後に、そのサンプルをＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２モノクロナール抗体又はＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）モノクロナール抗体でウェスタンブロットにより分析した。
【００８４】
免疫沈降法のために、そのＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理されたサンプルをＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２モノクロナール抗体又はＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）モノクロナール抗体を用いて４℃で一晩培養し、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２モノクロナール抗体又はＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）モノクロナール抗体でウェスタンブロッティングにより分析した。
【００８５】
実施例８：ａｎｔｉ−ＭＥＲＳ  ＣｏＶのＳタンパク質のモノクロナール抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインのクローニング
Ａｎｔｉ−Ｓｐｉｋｅ−４９２ペプチド−特異的なモノクロナール抗体（４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２）及びａｎｔｉ−Ｓｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）ペプチド−特異的なモノクロナール抗体（５０６−２Ｇ１０Ｇ５）を生産するハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）細胞（４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２クローン及び５０６−２Ｇ１０Ｇ５）を培養し、マウスモノクロナール抗体アイソタイピングキット（Ｄｉｐｓｔｉｃｋ  ｆｏｒｍａｔ，Ｂｉｂｃｏ  ＢＲＬ  ｏｒ  Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してアイソタイピングした。総ＲＮＡｓをハイブリドーマ細胞（４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２クローン及び５０６−２Ｇ１０Ｇ５）からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で抽出し、ｃＤＮＡｓを生成した。
【００８６】
Ａｎｔｉ−Ｓｐｉｋｅ−４９２ペプチド−特異的なモノクロナール抗体（４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２）の可変重鎖及び軽鎖ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）に対する配列をクローニングするために、そのｃＤＮＡｓを、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して下記のプライマーセットを用いて増幅した。重鎖プライマーのために、ＩＧＧ２Ａ（５’−ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＴＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡ−３’；配列番号１１）及び５’ＭＨ２（５’−ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＳＡＲ  ＧＴＮ  ＭＡＧ  ＣＴＧ  ＳＡＧ  ＳＡＧ  ＴＣＷ  ＧＧ−３’；配列番号１２）を使用した。
【００８７】
カッパ（ｋａｐｐａ）鎖プライマーのために、３’Ｋｃ（５’−ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＧＧＡ  ＴＡＣ  ＡＧＴ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＡＴＣ−３’；配列番号１３）、及び５’Ｍｋ（５’−ＧＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＹ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＭＴＳ  ＡＣＭ  ＣＡＲ  ＷＣＴ  ＭＣＡ−３’；配列番号１４）を使用した。
【００８８】
ａｎｔｉ−Ｓｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）ペプチド−特異的なモノクロナール抗体（５０６−２Ｇ１０Ｇ５）の可変重鎖及び軽鎖ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）に対する配列をクローニングするために、そのｃＤＮＡｓを、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して下記のプライマーセットを用いて増幅した。重鎖プライマーのために、ＩＧＧ１（５’−ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＡＴＡ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＧＣ−３’；配列番号１１）及び５’ＭＨ２（５’−ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＳＡＲ  ＧＴＮ  ＭＡＧ  ＣＴＧ  ＳＡＧ  ＳＡＧ  ＴＣＷ  ＧＧ−３’；配列番号１２）を使用した。
【００８９】
カッパ（ｋａｐｐａ）鎖プライマーのために、３’Ｋｃ（５’−ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＧＧＡ  ＴＡＣ  ＡＧＴ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＡＴＣ−３’；配列番号１３）、及び５’Ｍｋ（５’−ＧＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＹ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＭＴＳ  ＡＣＭ  ＣＡＲ  ＷＣＴ  ＭＣＡ−３’；配列番号１４）を使用した。
【００９０】
標準ＰＣＲ反応を２５サイクル行った。そのＰＣＲ産物を、直接ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲーションした。クローンされたマウスＩｇ挿入体をＤＮＡシークエンシングで分析した。
【００９１】
実施例９：間接免疫蛍光アッセイ及び共焦点イメージ
間接免疫蛍光アッセイ（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓａｙ：ＩＦＡ）を行うために、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染したＶｅｒｏ細胞及び−非感染のＶｅｒｏ細胞の混合物（ｒａｔｉｏ  １：３）をスライドガラス上にプレーティングした。その混合した細胞をアセトンで固定化し、蒸留水で洗浄し、正常マウス（ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧ、ＭＥＲＳ−Ｍ１５８ペプチド−特異的なモノクロナール抗体を用いて３７℃で培養した。２時間培養した後、そのスライドをＰＢＳ及びＤＷで洗浄した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８−付着したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で培養した。サンプルを取り付けた後、蛍光顕微鏡（ＩＸ７０，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して観察した。
【００９２】
共焦点イメージを観察するために、Ｖｅｒｏ細胞（５×１０４細胞）を１２ウェル培養プレート内のカバーガラス上にプレーティングし、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ（０．１ＭＯＩ）で２日間感染させた。その細胞を４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定化し、１％ＢＳＡ及び０．１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳで３０分間ブロッキングした。ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２モノクロナール抗体をプレートに添加し、２時間培養した後、Ａｌｅｘａ４８８付着したヤギ抗マウスＩｇＧで１時間培養した。核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。そのスライドをＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，ＤＥ）で観察した。
【００９３】
実施例１０：プラーク（Ｐｌａｑｕｅ）減少アッセイ
６×１０５  Ｖｅｒｏ細胞／ウェルを６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にプレーティングし、１２時間培養した。感染させる前に、ＭＥＲＳ−ＣｏＶを２倍に連続希釈された正常マウスＩｇＧ、４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体又は５０６−２Ｇ１０Ｇ５で３０分間、３７℃で予め培養した。ウイルス−抗体混合物をＶｅｒｏ細胞に５００μｌのＰＢＳで添加した。１時間培養した後、上澄液を除去し、３ｍｌの０．６％ｏｘｏｉｄアガーを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。各ウェルで形成されたプラークを、培養４日後、クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）で染色した。そのプラークをカウントし、パーセントを計算した。
【００９４】
前記実施例の結果は、下記の通りである。
【００９５】
Ｂ細胞エピトープの分析及びＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質のエピトープをターゲッティングする抗体の生産
Ｂ細胞エピトープの同定及び選択は、エピトープに基づく抗体の生産に考慮すべき重要な事項の一つであるので、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質の明白なＢ細胞エピトープのアミノ酸配列をエピトープの予測、表面接近性及び抗原性スケールに基づいてＩＥＤＢ（Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）を用いて予測した。Ｓタンパク質内のＲＢＤドメインは宿主への結合に関与するため、Ｓタンパク質内のＲＢＤドメイン内に４９２−５１６アミノ酸を有するＳｐｉｋｅ−４９２及びＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）ペプチド配列を選択して合成した（図１のＡ及びＢ）。Ｂ細胞エピトープとしての効率性を決定するために、各ペプチド及びＬｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）複合体を製造してＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫化した。抗体タイターをスクリーニングするために、ＥＬＩＳＡを、免疫化された抗体の血清から行った。両ペプチドともに、ペプチド−特異ＩｇＧｓの生産を誘導することができる（図１のＣ）。したがって、免疫原性エピトープが成功裏に考案され、生産された。
【００９６】
ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）又はＳｐｉｋｅ−４９２エピトープ−特異的なモノクロナール抗体の生産
ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質のエピトープ−特異的なモノクロナール抗体を生産するために、脾臓細胞を、リポソーム（ＤＯＰＥ；ＣＨＥＭＳ）内に同時にカプセル化されたＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）又はＳｐｉｋｅ−４９２エピトープペプチド及びＣｐＧ−ＤＮＡ複合体で免疫化されたマウスから集めた。そのマウスの脾臓細胞をＳＰ２／０と融合し、Ｓｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）エピトープペプチド−特異的抗体を生産する５０６−２Ｇ１０Ｇ５クローンをＨＡＴ及びＨＴ補充物として選択した（図２）。
【００９７】
そのマウスの脾臓細胞をＳＰ２／０と融合し、Ｓｐｉｋｅ−４９２エピトープペプチド−特異的抗体を生産する４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２クローンをＨＡＴ及びＨＴ補充物として選択した（図３）。
【００９８】
ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）又はＳｐｉｋｅ−４９２エピトープ−特異的なモノクロナール抗体の特性
多量のモノクロナール抗体を得るために、５０６−２Ｇ１０Ｇ５クローン又は４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２クローンを腹水の生産のためにマウスの腹腔内に注射し、腹水液を５０６−２Ｇ１０Ｇ５クローン又は４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２クローンで注射されたマウスから集めて精製した（図４のＡ及び図５のＡ）。次に、５０６−２Ｇ１０Ｇ５又は４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体のアイソタイプの分類をＥＬＩＳＡで行い、それぞれＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａであることが判明した（図４のＢ及び図５のＢ）。Ｓｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）又はＳｐｉｋｅ−４９２ペプチドをターゲッティングするモノクロナール抗体の結合親和性をＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）ペプチド又はＳｐｉｋｅ−４９２  ＥＬＩＳＡで決定し、５０６−２Ｇ１０Ｇ５及び４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体のＥＣ５０値は、それぞれ、１７８ｐＭ及び３．３ｎＭであった（図４のＣ及び図５のＣ）。
【００９９】
ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）又はＳｐｉｋｅ−４９２エピトープ−特異的なモノクロナール抗体によるＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質の検出
追加的にモノクロナール抗体の特性を調査するために、本発明者らは、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染及び非感染のＶｅｒｏ細胞でウェスタンブロット及び免疫沈降を行った。ウェスタンブロッティングの結果（図４のＤ、図５のＤ）は、両モノクロナール抗体ともに、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ−感染したＶｅｒｏ細胞でＳタンパク質に特異的なバンドを検出したが、非感染のＶｅｒｏ細胞ではバンドが観察されなかった。ＰＮＧａｓｅ（ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）Ｆで処理は、未処理されたサンプルと比較して、Ｓタンパク質バンドの分子量の減少を引き起こし（図４のＤ及び図５のＤ）、これは、両モノクロナール抗体がいずれも、それのグリコシル化及び非グリコシル化形態のＳタンパク質を認識できるということを示唆している。また、モノクロナール抗体が自然形態のＳタンパク質を認識できるかを評価するために、免疫沈降を行った。本発明者らは、両方の抗体を、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ−感染したＶｅｒｏ細胞破砕液由来の自然型のＳタンパク質で免疫沈降させた（図４のＦ及び図５のＥ）。各該当するエピトープで５０６−２Ｇ１０Ｇ５及び４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体の交差反応性を評価するために、ＥＬＩＳＡを行った。５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体は、Ｓｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）に対する４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体によって示したものと比較して、Ｓｐｉｋｅ−４９２ペプチドに対する著しい交差反応性を示した（図４のＨ及びＩ）。したがって、両方の抗体は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に対する特異的な結合を示した。
【０１００】
ａｎｔｉ−Ｓｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）ペプチド−特異的な、及びａｎｔｉ−Ｓｐｉｋｅ−４９２ペプチド−特異的なモノクロナール抗体の可変ドメインのクローニング
重鎖及び軽鎖可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）をコードするｃＤＮＡ配列を、Ｓｐｉｋｅ−４９２（Ｌ５０６Ｆ）ペプチド−特異的なモノクロナール抗体を生産するハイブリドーマ細胞（５０６−２Ｇ１０Ｇ５）から、通常の重鎖及び軽鎖プライマーを使用してクローニングした。ＤＮＡシークエンシングによって確認したその配列を図６に示した。
【０１０１】
重鎖及び軽鎖可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）をコードするｃＤＮＡ配列を、Ｓｐｉｋｅ−４９２ペプチド−特異的なモノクロナール抗体を生産するハイブリドーマ細胞（４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２）から、通常の重鎖及び軽鎖プライマーを使用してクローニングした。ＤＮＡシークエンシングによって確認したその配列を図７に示した。
【０１０２】
その配列を、タンパク質ＢＬＡＳＴプログラムを使用して、公知の配列とのホモロジーを分析した。
【０１０３】
５０６−２Ｇ１０Ｇ５及び４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２重鎖及び軽鎖の可変ドメインをコードするｃＤＮＡは、それぞれ報告されている免疫グロブリン可変重鎖及び軽鎖ドメインと約８０〜９５％及び９３〜９８％のホモロジーを示した。
【０１０４】
ＭＥＲＳ−ＣｏＶ−感染した細胞においてＳタンパク質に対する５０６−２Ｇ１０Ｇ５又は４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体の反応性
追加的にＩＦＡ（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓａｙ）で５０６−２Ｇ１０Ｇ５又は４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体の反応性の幅を分析した。蛍光顕微鏡法は、両方の抗体で培養されたウイルス感染した細胞において強い蛍光信号を示したが、正常マウスＩｇＧの場合には蛍光が観察されなかった（図８のＡ及び図９のＡ）。ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に対する両方の抗体の特異性を確認するために、共焦点顕微鏡法を行った。ＭＥＲＳ−ＣｏＶ−感染又は非感染のＶｅｒｏ細胞は、正常マウスＩｇＧ又は５０６−２Ｇ１０Ｇ５又は４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体で染色された。共焦点顕微鏡法のイメージは、５０６−２Ｇ１０Ｇ５又は４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体で染色されたＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染した細胞の原形質部位内で蛍光信号が明確に示された。正常マウスＩｇＧで培養された細胞では染色が観察されなかった（図８のＢ及び図９のＢ）。これらの結果は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ−感染した細胞でＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質の効果的な検出において両モノクロナール抗体の特異性を示している。
【０１０５】
５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体はＶｅｒｏ細胞のＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染を阻害する
追加的にプラーク減少アッセイにおいて、ＭＥＲＳ−ＣｏＶに対する両モノクロナール抗体の阻害活性を調査した。このアッセイにおいて、両モノクロナール抗体は、正常マウスＩｇＧと比較して、濃度依存的にプラークの形成を阻害した。しかし、５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体で処理した場合に、４９２−１Ｇ１０Ｅ４Ｅ２モノクロナール抗体と比較して、濃度依存的にプラークの形成のさらに高い阻害が観察された（図１０のＡ及びＢ）。したがって、このような結果は、５０６−２Ｇ１０Ｇ５モノクロナール抗体の効果がＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染に対する潜在的な治療的適用の可能性を示している。
【図１】
2021533175.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021533175.tif 000014
2021533175.tif 000015
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