(57)【要約】  本開示は、ウイルス粒子を安定な状態で維持するための製剤を提供する。特定の実施形態において、製剤は、少なくとも1種の塩基性アミノ酸及びバッファー溶液を含有し、該ウイルス粒子は1mLあたり約1×1011〜約5×1013個のDNase耐性ウイルス粒子の濃度で存在する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1種の塩基性アミノ酸及びバッファー溶液を含有する、ウイルス粒子を安定な形態で維持するための製剤であって、該ウイルス粒子が1mLあたり約1×1011〜約5×1013個のDNase耐性ウイルス粒子（DRP/mL）の濃度で存在する、上記製剤。
【請求項２】
塩基性アミノ酸が、アルギニン、ヒスチジン及びリジンからなる群から選択される、請求項１記載の製剤。
【請求項３】
アルギニンが約2mM〜約10mMの量で製剤中に存在する、請求項２記載の製剤。
【請求項４】
アルギニンが約5mMの量で製剤中に存在する、請求項３記載の製剤。
【請求項５】
ヒスチジンが約2mM〜約10mMの量で製剤中に存在する、請求項２記載の製剤。
【請求項６】
ヒスチジンが約5mMの量で製剤中に存在する、請求項５記載の製剤。
【請求項７】
リジンが約2mM〜約10mMの量で製剤中に存在する、請求項２記載の製剤。
【請求項８】
リジンが約5mMの量で製剤中に存在する、請求項７記載の製剤。
【請求項９】
非イオン性界面活性剤を更に含有する、請求項１記載の製剤。
【請求項１０】
非イオン性界面活性剤がtween-20である、請求項１記載の製剤。
【請求項１１】
tween-20が約0.005％〜約0.025％（v/v）の量で製剤中に存在する、請求項１０記載の製剤。
【請求項１２】
tween-20が約0.014％（v/v）の量で製剤中に存在する、請求項１１記載の製剤。
【請求項１３】
バッファー溶液がリン酸緩衝生理食塩水（PBS）である、請求項１記載の製剤。
【請求項１４】
ウイルス粒子が1mLあたり約5×1012〜約5×1013個のDNase耐性ウイルス粒子（DRP/mL）の濃度で存在する、請求項１記載の製剤。
【請求項１５】
製剤のpHが約7.0〜約7.5である、請求項１記載の製剤。
【請求項１６】
製剤のpHが約7.5である、請求項１５記載の製剤。
【請求項１７】
ウイルス粒子がアデノ随伴ウイルス（AAV）である、請求項１記載の製剤。
【請求項１８】
ウイルス粒子が組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）である、請求項１７記載の製剤。
【請求項１９】
製剤が-80℃での保存後に安定である、請求項１記載の製剤。
【請求項２０】
製剤が45℃への加熱後に安定である、請求項１記載の製剤。
【請求項２１】
製剤が高強度の振とう後に安定である、請求項１記載の製剤。
【請求項２２】
製剤が治療薬の送達のために使用される、請求項１記載の製剤。
【請求項２３】
治療薬が遺伝子治療ベクターである、請求項２２記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2017年12月5日に出願された米国特許仮出願第62/594,833号に基づく優先権を主張するものであり、該出願の内容は全て参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
本開示は、ウイルス粒子を安定な状態で維持するための製剤を提供する。特定の実施形態において、製剤は、少なくとも1種の塩基性アミノ酸及びバッファー溶液を含有し、該ウイルス粒子は1mLあたり約1×1011〜約5×1013個のDNase耐性ウイルス粒子の濃度で存在する。
【背景技術】
【０００２】
パルボウイルス科のアデノ随伴ウイルス（AAV）は、ヒト及び他の一部の霊長類の種に感染する4.7kbの複製欠損非エンベロープ型動物ウイルスである。AAVのいくつかの特徴、例えばAAVはヒト疾患を引き起こすことが知られておらず、軽度の免疫応答を誘導すること、及びAAVベクターは宿主細胞ゲノム中に組み込まれることなく分裂細胞及び静止細胞の双方に感染することができることにより、このウイルスは遺伝子治療による治療タンパク質の送達のための魅力的なビヒクルとなっている。AAVは、眼、筋肉、肺、及び脳を含む多くの組織において高効率の遺伝子送達及び持続的な導入遺伝子発現のための能力を付与する。AAVはヒトの臨床試験において有望であることが示されている。
【０００３】
しかしながら、最適なベクターの安全性、安定性及び有効性を達成するためのベクター製剤の開発における課題が残っている。AAVベクターは、凝集、タンパク分解及び酸化による、並びにベクターの精製及び保存のために使用される生成物接触物質への非特異的結合による活性の消失を受けやすい可能性がある。AAVの凝集は精製中の収量の低下をもたらし、in vivo投与後のベクターの形質導入効率、生体分布及び免疫原性に対して有害な影響を有し得る。
【０００４】
本開示は、これらの課題を克服し、ウイルス粒子のために最適化された新規な製剤を提供する。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、多数のDNA耐性粒子(DRP)/mL（例えば約1×1011〜約5×1013 DRP/mL）を収容することができ、多くの厳しい条件に曝された後に安定性を維持するウイルス粒子、特にAAV粒子のために最適化される製剤の驚くべき知見に基づく。DRP/mLはカプシド濃度の測定値であり、カプシド濃度はAAV粒子の凝集を促進することが知られている。本発明は、AAV凝集の問題を克服する。
【０００６】
従って、第1の一態様において、本開示は、少なくとも1種の塩基性アミノ酸及びバッファー溶液を含有する、ウイルス粒子を安定な形態で維持するための製剤を提供し、ここで、ウイルス粒子は1mLあたり約1×1011〜約5×1013個のDNase耐性ウイルス粒子（DRP/mL）の濃度で存在する。一実施形態において、塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン及びリジンからなる群より選択される。一実施形態において、アルギニンは、約2mM〜約10mMの量で製剤中に存在する。更なる実施形態において、アルギニンは、約5mMの量で製剤中に存在する。一実施形態において、ヒスチジンは、約2mM〜約10mMの量で製剤中に存在する。更なる実施形態において、ヒスチジンは、約5mMの量で製剤中に存在する。一実施形態において、リジンは、約2mM〜約10mMの量で製剤中に存在する。更なる実施形態において、リジンは、約5mMの量で製剤中に存在する。一実施形態において、製剤は更に非イオン性界面活性剤を含有する。更なる実施形態において、非イオン性界面活性剤はtween-20である。別の更なる実施形態において、tween 20は約0.005％〜約0.025％（v/v）の量で製剤中に存在する。更に別の更なる実施形態において、tween 20は約0.014％（v/v）の量で製剤中に存在する。一実施形態において、バッファー溶液はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）である。一実施形態において、ウイルス粒子は1mLあたり約5×1012〜約5×1013個のDNase耐性ウイルス粒子の濃度で存在する。一実施形態において、製剤のpHは約7.0〜約7.5である。更なる実施形態において、製剤のpHは約7.5である。一実施形態において、ウイルス粒子はアデノ随伴ウイルス（AAV）である。更なる実施形態において、ウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）である。一実施形態において、製剤は−80℃での保存後に安定である。一実施形態において、製剤は45℃までの加熱後に安定である。一実施形態において、製剤は高強度の振とう後に安定である。一実施形態において、製剤は治療薬の送達のために使用される。更なる実施形態において、治療薬は遺伝子治療ベクターである。
本開示の他の実施形態は以下に提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本開示は、ウイルス粒子のために、特にAAVウイルス粒子のために最適化された新規製剤を提供する。
【０００８】
定義
本開示がより容易に理解され得るために、特定の用語を最初に定義する。更に、あるパラメーターの値又は値の範囲が記載されている場合は、記載された値の間に介在する値及び範囲も本開示の一部であることが意図されていることに留意すべきである。文脈から他の意味であることが明らかでない場合、本明細書で提供された全ての数値は、用語「約」によって修正され得る。
【０００９】
冠詞「a」、「an」及び「the」は、本明細書において、そうでないことが他に明確に示されていない限り、文法上の対象物の1つ又は2つ以上（すなわち少なくとも1つ）をいうために使用される。例として、「要素（an element）」は、1つの要素又は2つ以上の要素を意味する。
【００１０】
用語「を含む（including）」は、本明細書において、「を含むがこれに限定されない」との語句を意味するために使用され、これと互換的に使用される。
【００１１】
用語「又は（or）」は、本明細書において、文脈が明らかに他であることを示さない限り、用語「及び／又は（and/or）」を意味するために使用され、これと互換的に使用される。
【００１２】
用語「等の（such as）」は、本明細書において、「限定されないが〜等の」との語句を意味するために使用され、これと互換的に使用される。
【００１３】
本明細書中の可変物（variable）の定義における化学基のリストの記載には、任意の単一の基、又は挙げられた基の組合せとしてのその可変物の定義が含まれる。本明細書中の可変物又は態様の実施形態の記載には、任意の単一の実施形態、又は任意の他の実施形態若しくはその一部との組み合わせとしてのその実施形態が含まれる。本明細書中に提供される任意の組成物又は方法は、本明細書中に提供される1以上の他の組成物及び方法のいずれかと組み合わせることができる。
【００１４】
本明細書に記載する範囲は、その範囲内の値の全ての省略であると理解される。例えば、1〜50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、又は50からなる群からの任意の数、数の組合せ、又は部分的範囲を含むことが理解される。
【００１５】
用語「約」は、当業者によって決定されるような特定の値についての許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これはその値がどのように測定若しくは決定されるか、すなわち測定システムの限界に部分的に依存するであろう。例えば、「約」は、当分野の慣行に従って、1又は1を超える標準偏差内であることを意味し得る。あるいはまた、「約」は、所定の値の20％まで、好ましくは10％まで、より好ましくは5％まで、更により好ましくは1％までの範囲を意味し得る。あるいはまた、特に生物学的システム若しくはプロセスに関して、この用語は、ある値の一桁以内（within an order of magnitude）、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内を意味し得る。本明細書及び請求の範囲に特定の値が記載されている場合、そうでないことが記載されていない限り、用語「約」はその特定の値について許容される誤差範囲内を意味すると推定されるべきである。
【００１６】
本明細書において使用する用語「アデノ随伴ウイルス」（AAV）としては、限定するものではないがAAV 1型、AAV 2型、AAV 3型（3A型及び3B型を含む）、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、及びヒツジAAV、及び現在知られている、若しくは今後発見される他の任意のAAVが含まれる。例えば、BERNARD N. FIELDS等、VIROLOGY、第2巻、第69章（第4版、Lippincott-Raven Publishers）を参照されたい。様々なAAV及び自律型パルボウイルスのゲノム配列、並びにITR、Repタンパク質、及びカプシドサブユニットの配列は当分野において知られている。そのような配列は、文献又はGENBANKデータベース等のパブリックデータベース中に見出すことができる。例えば、GenBankアクセッション番号NC 002077、NC 001401、NC 001729、NC 001863、NC 001829、NC 001862、NC 000883、NC 001701、NC 001510、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC 001358、NC 001540、AF513851、AF513852、AY530579、AY631965、AY631966を参照されたい。これらの開示はその全体が本明細書に組み込まれる。また、例えばSrivistava等、(1983) J. Virol. 45:555；Chiorini等、(1998) J. Virol. 71:6823；Chiorini等、(1999) J. Virol. 73:1309；Bantel-Schaal等、(1999) J. Virol. 73:939；Xiao等、(1999) J. Virol. 73:3994；Muramatsu等、(1996) Virology 221:208；Shade等、(1986) J. Virol. 58:921；Gao等、(2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854；国際公開WO 00/28061号、WO 99/61601号、WO 98/11244号；米国特許第6,156,303号も参照されたい。これらの開示はその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１７】
本明細書において使用する用語「ウイルス粒子」は、ウイルス、ウイルス粒子及びウイルスベクターをいうことを意味する。これらの用語は同義語であり、互換可能である。この用語には、野生型ウイルス、死滅ウイルス、弱毒化生ウイルス、不活化ウイルス、及び組換えウイルスが含まれる。この用語は更に、ウイルスベクター等のウイルスベースの産物、ウイルス様粒子（VLP）等のウイルス粒子、又はヌクレオカプシドを含む。特定の実施形態において、ウイルス粒子は、パルボウイルス科由来である。他の実施形態において、ウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス（AAV）である。
【００１８】
本明細書において使用する「AAVウイルス粒子」又は「AAVベクター粒子」又は「AAVウイルス」は、少なくとも1つのAAVカプシドタンパク質（典型的には野生型AAVの全てのカプシドタンパク質による）及びカプセル化された（encapsidated）ポリヌクレオチドrAAVベクターから構成されるウイルス粒子をいう。粒子が異種のポリヌクレオチド（すなわち哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子等の野生型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、これは典型的には「rAAVウイルス」又は「rAAVベクター」と呼ばれる。
【００１９】
本明細書において使用する略語「rAAV」は、組換えAAVベクター（又は「rAAVベクター」）とも呼ばれる組換えアデノ随伴ウイルスをいう。本明細書において使用する「rAAVベクター」は、AAV由来ではないポリヌクレオチド配列（すなわちAAVに対して異種であるポリヌクレオチド）、典型的には細胞の遺伝的形質転換のための目的の配列を含むAAVベクターをいう。一般的に、異種ポリヌクレオチドには、少なくとも1つの、一般には2つのAAV逆位末端反復配列（ITR）が隣接している。用語「rAAVベクター」には、rAAVベクター粒子及びrAAVベクタープラスミドの双方が包含される。
【００２０】
本明細書において使用する用語「ベクター」、「ウイルスベクター」、「送達ベクター」（及び類似の用語）は、一般的には核酸送達ビヒクルとして機能し、ビリオン内にパッケージングされたウイルス核酸（すなわちべクターゲノム）を含むウイルス粒子をいう。
【００２１】
他に定義されない限り、本明細書において使用する全ての技術的及び科学的用語は、本開示が属する分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似若しくは等価な任意の方法及び材料を本開示の実施又は試験において使用することができるが、以下に好ましい方法及び材料を記載する。
【００２２】
以下に、本開示の好ましい実施形態について、詳細に記載する。好ましい実施形態との関連において本開示を記載するが、本開示をこれらの好ましい実施形態に限定することが意図されるものではないことが理解されよう。反対に、添付の特許請求の範囲で規定される本開示の精神及び範囲内に含まれるように代替物、改変物、及び等価物を包含することが意図される。
【００２３】
Ｉ．製剤
本開示は、ウイルス粒子のための最適化された製剤を特徴とする。特定の態様において、本開示は、ウイルス粒子を安定な形態で維持するための、塩基性アミノ酸及びバッファー溶液を含有する製剤であって、ウイルス粒子が1mLあたり約1×1011〜約5×1013個のDNase耐性ウイルス粒子（DRP/mL）の濃度で存在する製剤を特徴とする。
【００２４】
好ましい一実施形態に従えば、本開示の製剤は、アルギニン、ヒスチジン及びリジンからなる群において選択される少なくとも1種のアミノ酸を含有する。
【００２５】
一実施形態において、塩基性アミノ酸はアルギニンである。製剤は、任意の好適な量のアルギニンを含有し得る。一実施形態において、アルギニンは、約2mM〜約10mMの量、例えば約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10mMの量で製剤中に存在する。一実施形態において、アルギニンは、約5mMの量で製剤中に存在する。
【００２６】
一実施形態において、塩基性アミノ酸はヒスチジンである。製剤は、任意の好適な量のヒスチジンを含有し得る。一実施形態において、ヒスチジンは、約2mM〜約10mMの量、例えば約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10mMの量で製剤中に存在する。一実施形態において、ヒスチジンは、約5mMの量で製剤中に存在する。
【００２７】
一実施形態において、塩基性アミノ酸はリジンである。製剤は、任意の好適な量のリジンを含有し得る。一実施形態において、リジンは、約2mM〜約10mMの量、例えば約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10mMの量で製剤中に存在する。一実施形態において、リジンは、約5mMの量で製剤中に存在する。
【００２８】
製剤は、更に非イオン性界面活性剤を含有し得る。非イオン性界面活性剤は、任意の好適な非イオン性界面活性剤であり得る。非イオン性界面活性剤としては、例えばNP-40、Brij洗剤、CHAP洗剤等の両性イオン性洗剤、オクチルフェノキシポリエトキシ-エタノール（Triton X-100）、C12E8、オクチル-β-D-グルコピラノシド、Pluronic F68等のプルロニック界面活性剤、及びポリソルベート20（tween 20）が挙げられる。
【００２９】
非イオン性界面活性剤は、任意の好適な量で製剤中に存在し得る。一実施形態において、製剤は、約0.005％〜約0.025％（v/v）の量で非イオン性界面活性剤を含有する。別の実施形態において、組成物は、約0.010〜0.020％（v/v）の濃度で非イオン性界面活性剤を含有する。別の実施形態において、組成物は、約0.010〜0.015％（v/v）の濃度で非イオン性界面活性剤を含有する。別の実施形態において、組成物は、約0.010、0.011、0.012、0.013、0.014、0.015、0.016、0.017、0.018、0.019、0.020％（v/v）の濃度で非イオン性界面活性剤を含有する。一実施形態において、組成物は、約0.014％（v/v）の濃度で非イオン性界面活性剤を含有する。
【００３０】
好ましい非イオン性界面活性剤はポリソルベート20（tween 20）である。一実施形態において、組成物は、約0.005％〜約0.025％（v/v）の量でtween 20を含有する。別の実施形態において、組成物は、約0.010〜0.020％（v/v）の濃度でtween 20を含有する。別の実施形態において、組成物は、約0.010〜0.015％（v/v）の濃度でtween 20を含有する。別の実施形態において、組成物は、約0.010、0.011、0.012、0.013、0.014、0.015、0.016、0.017、0.018、0.019、0.020％（v/v）の濃度でtween 20を含有する。一実施形態において、組成物は、約0.014％（v/v）の濃度でtween 20を含有する。
【００３１】
本開示の製剤は、バッファー溶液を含有する。一実施形態において、バッファー溶液はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）である。製剤は、他の成分を含有し得る。そのような他の成分としては、例えば緩衝剤、塩、希釈剤、pH調整剤等が挙げられる。
【００３２】
本開示の製剤は、好ましくは液体製剤である。別の実施形態において、製剤は、フリーズドライ（freeze-dried）調製物、凍結乾燥（lyophilized）調製物、又は他の形態であり得る。液体製剤に関して、特定の実施形態において、液体製剤は医薬製剤である。フリーズドライ又は凍結乾燥調製物は、典型的には、製薬上許容される担体等の液体を使用して再構成させることによって液体形態に変換される。製薬上許容される担体は、例えば緩衝剤及び塩を含有する液体担体（すなわちPBS）であり得る。好適な緩衝剤及び塩、並びに他のタイプの製薬上許容される担体の例は、当分野において周知である。
【００３３】
pH
製剤のために好適なpHは、ウイルス粒子が保存期間にわたって望ましい状態（すなわち生存性、感染力価等）に維持される任意のpHである。例えば、製剤のpHは、望ましくは約6〜9、6〜8.5、6.5〜8.5、7〜8.5、7.5〜8.5、6〜8、6.5〜8、7〜8、7.5〜8、又は7〜7.5である。好ましい実施形態において、製剤は約7.5のpHを有する。
【００３４】
安定性
本開示の製剤は安定であり、品質、効力、又は純度において許容できない変化なしに保存することができる。
【００３５】
製剤は、好ましくはウイルス粒子を、望ましい時間（例えば約24時間、約48時間、約3日間、約7日間(すなわち約1週間)、約2週間、約1ヶ月、約3ヶ月、約6ヶ月、約1年、又は約2年）にわたって、望ましい温度（例えば約-80℃、約-4℃、約0℃、約5℃、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、又は約50℃）で、組成物中のウイルス粒子の安定性、感染性、及び／又は活性が有意に若しくは実質的に劣化しないか、又は有意な程度（例えば少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、又は少なくとも約95％）に保持されるように維持（例えば保存）する。一実施形態において、製剤は-80℃での保存後に安定である。
【００３６】
一実施形態において、製剤は45℃までの加熱後に安定である。
一実施形態において、製剤は高強度での振とう後に安定である。
ウイルス粒子の安定性の保持（例えば維持）が特に好ましい。ウイルス粒子の安定性、効力（活性）及び純度は、任意の好適な技術によって決定することができる。そのような技術の多くが当分野において公知である。
【００３７】
ウイルス粒子の「安定性」は、ウイルスベクター粒子が構造的統合性を長期に維持する能力をいう。ウイルス粒子の安定性を決定するための好適な技術としては、例えば分光光度法による濁度分析、PCRによるベクター濃度の決定、細胞ベースアッセイによるベクター感染性の決定、及びタンパク質ゲル電気泳動による純度の決定が挙げられる。
【００３８】
ウイルス粒子の「効力」又は「活性」は、哺乳動物細胞に感染して導入遺伝子を発現させる能力をいう。効力を決定する方法としては、PCRの読み出しを含む細胞ベースの感染性アッセイ（TCDI50）及び分光光度的読み出しを含むイムノアッセイ（ELISA）が挙げられるであろう。
【００３９】
ウイルス粒子の「純度」は、不純物、例えば分解産物、同時に精製されたタンパク質、又は他のプロセスに関連する生成物の不存在下で存在するウイルス粒子成分の実証（demonstration）をいう。純度を実証する方法としては、タンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロッティング、キャピラリー電気泳動、質量分析、及びゲルろ過クロマトグラフィーが挙げられる。
【００４０】
II.ウイルス粒子
本明細書に記載する通り、本開示は、ウイルス粒子のための新規かつ進歩性を有する製剤を提供する。
特定の実施形態において、ウイルス粒子は約1×1011 DRP/mLの濃度で製剤中に存在する。特定の実施形態において、ウイルス粒子は約5×1011 DRP/mL以上の濃度で製剤中に存在する。特定の実施形態において、ウイルス粒子は約1×1012 DRP/mL以上の濃度で製剤中に存在する。特定の実施形態において、ウイルス粒子は約5×1012 DRP/mL以上の濃度で製剤中に存在する。特定の実施形態において、ウイルス粒子は約1×1013 DRP/mL以上の濃度で製剤中に存在する。特定の実施形態において、ウイルス粒子は約5×1013 DRP/mL以上の濃度で製剤中に存在する。特定の実施形態において、ウイルス粒子は約1×1011〜約5×1013 DRP/mLの濃度で製剤中に存在する。
【００４１】
ウイルス粒子は、望ましくは非毒性であり、非免疫原性であり、製造が容易で、かつDNAを保護し標的細胞中に送達する上で有効なものである。特定の一実施形態において、ウイルス粒子はアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である。30種を超える天然のAAV血清型が入手可能である。多くのAAVカプシドの天然変異型が存在しており、眼細胞に対して特に適した性質を有するAAVの同定及び使用が可能である。AAVウイルスは伝統的な分子生物学的技術によって操作することができ、核酸配列の細胞特異的送達のため、免疫原性を最小化するため、安定性及び粒子寿命を調整するため、効率的な分解のため、核への正確な送達のため等にこれらの粒子を最適化することを可能とする。
【００４２】
AAVの使用は、これが比較的非毒性であり、効率的な遺伝子導入をもたらし、かつ特殊な目的のために容易に最適化し得るため、DNAの一般的な送達方法である。ヒト又は非ヒト霊長類（NHP）から単離され、十分に性状解析されたAAVの血清型の中で、ヒト血清型2は、遺伝子導入ベクターとして開発された最初のAAVである。これは、様々な標的組織及び動物モデルでの効率的な遺伝子導入実験のために広く使用されてきた。AAV2に基づくベクターの一部のヒト疾患モデルへの実験的適用の臨床試験が進行中であり、これには嚢胞性線維症及び血友病B等の疾患が含まれる。他のAAV血清型としては、限定するものではないが、AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8及びAAV9が挙げられる。様々なAAV血清型の議論については、例えば参照により本明細書中に組み込まれるWO 2005/033321号を参照されたい。
【００４３】
ベクターへのアセンブリのための望ましいAAV断片としては、vp1、vp2、vp3及び超可変領域を含むcapタンパク質、rep78、rep68、rep52、及びrep40を含むrepタンパク質、及びこれらのタンパク質をコードする配列が挙げられる。これらの断片は、様々なベクターシステム及び宿主細胞において容易に利用することができる。このような断片は単独で、他のAAV血清型配列若しくは断片と組み合わせて、又は他のAAV若しくは非AAVウイルス配列由来のエレメントと組み合わせて使用することができる。本明細書において使用する場合、人工的AAV血清型としては、限定することなく、非天然のカプシドタンパク質を有するAAVが挙げられる。そのような人工的カプシドは、選択されたAAV配列（例えばvp1カプシドタンパク質の断片）を、選択された異なるAAV血清型、同じAAV血清型の不連続部分、非AAVウイルス供給源、又は非ウイルス供給源から得ることができる異種配列と組み合わせて用いて、任意の好適な技術によって作製することができる。人工的AAV血清型は、限定することなく、シュードタイプAAV、キメラAAVカプシド、組換えAAVカプシド、又は「ヒト化」AAVカプシドであり得る。1種のAAVのカプシドが異種カプシドタンパク質と置き換えられているシュードタイプベクターが、本開示において有用である。
【００４４】
一実施形態において、本明細書に記載される製剤において有用なウイルス粒子（すなわちベクター）は、選択されたAAV血清型カプシドタンパク質又はその断片をコードする配列を少なくとも含む。別の実施形態において、有用なウイルス粒子、すなわちベクターは、選択されたAAV血清型repタンパク質又はその断片をコードする配列を少なくとも含む。場合によって、そのようなベクターは、AAV cap及びrepタンパク質の双方を含み得る。AAV rep及びcapの双方が提供されるベクターでは、AAV rep及びAAV cap配列が双方ともに1種の血清型、例えば全てがAAV2起源であり得る。あるいはまた、rep配列が、cap配列を提供するものとは異なるAAV血清型由来であるベクターを使用し得る。一実施形態において、rep及びcap配列は、別個の起源（例えば別個のベクター、又は宿主細胞及びベクター）から発現される。別の実施形態において、これらのrep配列は、異なるAAV血清型のcap配列にインフレームで融合してキメラAAVベクターを形成する。
【００４５】
本開示の特定の好ましい実施形態において、ベクターは組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）である。
【００４６】
本開示の製剤は、in vitro、in vivo、又はex vivoで宿主細胞に投与することができる。その点において、宿主細胞は、哺乳動物（例えばヒト）中にあり、又は、例えば、臓器（例えば心臓）の一部であることができ、又は哺乳動物中（例えば哺乳動物中の腫瘍）に存在するものであり得る。製剤は、任意の好適な方法によって宿主細胞と接触し得る。製剤は様々な経路で投与され得る。体腔中への投与若しくは点滴によって、エアゾールの吸入若しくは吹送によって、又は筋肉間、筋肉内、静脈内、腹腔内、眼内、経鼓膜（transtympanical）、経皮、鼻内、若しくは皮下投与を含む非経口的導入によって、又は他の手段によって、局所又は全身送達が達成され得る。組成物は、ヒト患者体内の特定の組織、臓器、腺、又は他の部分（例えば腫瘍、脚等の手足、肺、脳、眼、又は耳）に送達され得る。
【００４７】
特定の実施形態において、本開示は、製剤が治療薬の送達のために使用されることを提供する。一実施形態において、治療薬は遺伝子治療ベクターである。
【００４８】
本開示の多くの実施形態を記載してきた。しかしながら、当業者であれば、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、本開示の様々な変更及び改変を行い、様々な使用及び条件に適合させることができる。従って、以下の実施例は、特許請求される発明の範囲を説明することを意図するものであるが、これを限定するものではない。
【実施例】
【００４９】
［実施例１  分解試験］
本試験の目的は、AAV粒子のための異なる製剤を比較し、多数のDNA耐性粒子（DPR）/mLを収容し、厳しい条件に曝された後に安定性を維持することができる製剤を最適化することである。
【００５０】
試験設計
表１に示す以下の実験的製剤を、以下の条件：(1)凍結／融解、(2)加熱（45℃）及び(3)撹拌、下で試験した。
【００５１】
【表１】
2021505610.tif 000002
【００５２】
濁度試験
凍結／融解条件
【表２】
2021505610.tif 000003
【００５３】
表２に記載したサンプルを48ウェルの平底プレートに三連でロードする。光学密度の読み取りは振とうせずに室温で波長600 nmで測定する（OD600）。作業濃度は全て同じ濃度となるように調整した。これにより、3種の製剤（Form 1、Form 2、Form 3）及び対照間でデータセットの比較が可能となる。次いで、プレートを-80℃で凍結し、フリーザー中に一晩置く。次いで翌朝プレートをフリーザーから取り出し、試験前に室温で融解させる。サンプルを室温まで完全に戻した後、OD600の読み取り値を再度取得する。
【００５４】
加熱条件
【表３】
2021505610.tif 000004
【００５５】
表３に記載したサンプルを、48ウェルの平底プレートに三連でロードする。作業濃度は全て同じ濃度となるように調整した。これにより、3種の製剤（Form 1、Form 2、Form 3）及び対照間でのデータセットの比較が可能となる。プレートを、予め45℃に加熱したプレートリーダーSpectraMax i3xに挿入する。プレートをプレートリーダー中で45℃で30分間、振とうせずに維持する。次に、振とうせずにOD600の読み取り値を45℃で取得する。
【００５６】
振とう条件
【表４】
2021505610.tif 000005
【００５７】
表４に記載したサンプルを、48ウェルの平底プレートに三連でロードする。作業濃度は全て同じ濃度となるように調整した。これにより、3種の製剤（Form 1、Form 2、Form 3）及び対照間でのデータセットの比較が可能となる。プレートを、プレートリーダーSpectraMax i3xに挿入する。OD600で吸光度を測定する前に振とうを軌道／線形の高強度で5分間に設定する。振とう直後に室温でのOD600の読み取り値を取得する。
【００５８】
SDS-PAGE銀染色
実験計画
3種の条件（凍結／融解、加熱(45℃)及び振とう）を、各条件に付いて4つのサンプル（製剤1(Form 1)、製剤2(Form 2)、製剤3(Form 3)及び対照）で試験する。全ての製剤及び対照を、3.0×109 DRP/ウェルで試験する。
【００５９】
サンプル調製
銀染色手順に従って、サンプルは2.5×1011 DRP/ml以上の濃度、12μl/ウェルで添加する必要がある。
【００６０】
実験手順
濁度試験からの試験したサンプルを、速やかに銀染色に供する。簡単に記載すると、ウイルスサンプルを、色素及び変性剤を含有するバッファーと混合する。変性させた試験品を、陽性対照及び分子量ラダーと共にタンパク質電気泳動ゲルのウェル中にロードする。ゲルをサイズによるタンパク質の分離のために電気泳動に供する。次いでゲルを固定し、染色し、イメージングのために現像する。標準作業手順。
【００６１】
SV40-qPCR
簡単に記載すると、ウイルスサンプル及び陽性対照をDNAse及びプロテイナーゼ処理、続いて酵素賦活化ステップに供する。試験品を、ウイルスゲノム中のSV40配列に特異的なプライマー及び蛍光プローブを含むバッファーと混合する。PCRを使用してウイルスDNAを増幅して検出し、DNA標準曲線に対して試験品を定量化する。
【００６２】
TCID50
濁度試験及びSDS-PAGE試験からの3つの条件下での3種の製剤の結果を評価し、対照（1×BSST）と比較する。最良の安定性を示す1種又は2種の製剤をTCID50試験のために予定し、選択した条件（凍結／融解、加熱又は振とう）で処理した後にその感染性を評価する。
【００６３】
等価物
当業者は、慣用的な実験を使用して、本明細書に記載された具体的な実施形態及び方法に対する多くの等価物を認識し、これを確かめることができるであろう。そのような等価物は、以下の請求請求の範囲に包含されることが意図される。
【００６４】
参照による組込み
本出願において参照された各文献、特許及び特許出願は、各文献が個々に組み込まれることが記載されているように参照により本明細書に組み込まれる。
【国際調査報告】
2021505610.tif 000006