(57)【要約】  本発明は、生命維持技術において異種哺乳動物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植される霊長類の生存を延長する方法及び生命維持技術において異種哺乳動物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植されている霊長類の生存を延長する方法において使用するための組成物に関する。本発明はまた、心臓、腎臓、肺又は肝臓が、それぞれ、移植された異種哺乳動物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓によって機能的に置換されている生存している霊長類を対象とする。最後に、本発明は、遺伝子改変された哺乳動物及び異種臓器移植片のドナー生物並びにそれを製造する方法を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レシピエント生物のそれぞれ心臓、腎臓、肺又は肝臓を機能的に置換するように異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するためのmTOR阻害剤を含む組成物であって、
レシピエント生物が、投薬レジメンに従って降圧処置を受け、
ドナー生物が、哺乳動物であり、レシピエント生物が、霊長類であり、好ましくは、ドナー生物が、イノシシ科に属する、組成物。
【請求項２】
ドナー生物が、イノシシ種に属する、請求項1に記載の使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
【請求項３】
心臓、腎臓、肺又は肝臓の過成長を防止する方法において使用するための、請求項1又は2に記載の使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
【請求項４】
機能的置換が、同所性置換である、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
【請求項５】
レシピエント生物がオナガザル科に属する、好ましくは、レシピエント生物が、ヒヒ属に属する、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
【請求項６】
レシピエント生物がヒトである、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
【請求項７】
遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
a)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のホモ接合性ノックアウト、
b)ヒトCD46遺伝子の挿入、及び
c)ヒトトロンボモジュリン遺伝子の挿入
を有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
【請求項８】
mTOR阻害剤が、以下のリスト:ダクトリシブ(BEZ235、NVP-BEZ235)、ラパマイシン(シロリムス)、エベロリムス(RAD001)、AZD8055、テムシロリムス(CCI-779、NSC683864)、SF2523、3BDO、PI-103、KU-0063794 I、トルキニブ(PP242)、リダフォロリムス(デフォロリムス、MK-8669)、サパニセルチブ (INK128、MLN0128)、ボクスタリシブ(SAR245409、XL765)類似体、トリン1、オミパリシブ(GSK2126458、GSK458)、OSI-027、PF-04691502、アピトリシブ(GDC-0980、RG7422)、GSK1059615、ゲダトリシブ(PF-05212384、PKI-587)、WYE-354、ビスツセルチブ(AZD2014)、トリン2、WYE-125132(WYE-132)、BGT226(NVP-BGT226)、パロミド529(P529)、PP121、WYE-687、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、ゾタロリムス(ABT-578)、CZ415、MHY1485、ボクスタリシブ(XL765、SAR245409)、クリソファン酸及びCC-223、LY3023414から選択される、好ましくは、mTOR阻害剤が、テムシロリムスである、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
【請求項９】
レシピエント生物が、投薬レジメンに従って免疫抑制維持療法を受け、投薬レジメンが、移植後の1種又は複数の免疫抑制剤の投与を含み、投薬レジメンが、移植後1日以内に行われたグルココルチコイドの第1の投与を含み、投薬レジメンに従ってレシピエント生物に投与されるグルココルチコイドの投与量(mg/kg/日)が、移植後5日以内に5分の1以下、好ましくは、10分の1以下に減少している、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
【請求項１０】
移植前に異種ドナー生物由来の心臓、腎臓、肺又は肝臓が、非虚血性保存によって、好ましくは、非虚血性心臓、腎臓、肺又は肝臓灌流によって保存されていた、請求項1から9のいずれか一項に記載の使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
【請求項１１】
遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された心臓である、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
【請求項１２】
遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された腎臓である、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
【請求項１３】
遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された肺である、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
【請求項１４】
遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された肝臓である、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
【請求項１５】
レシピエント生物のそれぞれ心臓、腎臓、肺又は肝臓を機能的に置換するように異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するための1種又は複数の降圧剤を含む組成物であって、
レシピエント生物が、投薬レジメンに従ってmTOR阻害剤を投与され、
ドナー生物が、哺乳動物であり、レシピエント生物が、霊長類であり、好ましくは、ドナー生物が、イノシシ科に属する、組成物。
【請求項１６】
ドナー生物が、イノシシ種に属する、請求項15に記載の使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
【請求項１７】
心臓、腎臓、肺又は肝臓の過成長を防止する方法において使用するための、請求項15又は16に記載の使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
【請求項１８】
機能的置換が、同所性置換である、請求項15から17のいずれか一項に記載の使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
【請求項１９】
レシピエント生物がオナガザル科に属する、好ましくは、レシピエント生物が、ヒヒ属に属する、請求項15から18のいずれか一項に記載の使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
【請求項２０】
レシピエント生物がヒトである、請求項15から18のいずれか一項に記載の使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
【請求項２１】
遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
a)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のホモ接合性ノックアウト、
b)ヒトCD46遺伝子の挿入、及び
c)ヒトトロンボモジュリン遺伝子の挿入
を有する、請求項15から20のいずれか一項に記載の使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
【請求項２２】
降圧剤が、以下のリスト:利尿薬、カルシウムチャネルブロッカー、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、アンジオテンシンII受容体アンタゴニスト、アドレナリン受容体アンタゴニスト、血管拡張剤、レニン阻害剤、アルドステロン受容体アンタゴニスト、アルファ-2アドレナリン受容体アゴニスト及びエンドセリン受容体ブロッカーから選択される1種又は複数の薬剤である、好ましくは、降圧剤が、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤及びアドレナリン受容体アンタゴニストから選択され、より好ましくは、降圧剤が、エナラプリル及び/又はメトプロロール酒石酸塩であり、最も好ましくは、降圧剤が、エナラプリル及びメトプロロール酒石酸塩である、請求項15から21のいずれか一項に記載の使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
【請求項２３】
レシピエント生物が、投薬レジメンに従って免疫抑制維持療法を受け、投薬レジメンが、移植後の1種又は複数の免疫抑制剤の投与を含み、投薬レジメンが、移植後1日以内に行われたグルココルチコイドの第1の投与を含み、投薬レジメンに従ってレシピエント生物に投与されるグルココルチコイドの投与量(mg/kg/日)が、移植後5日以内に5分の1以下、好ましくは、10分の1以下に減少している、請求項15から22のいずれか一項に記載の使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
【請求項２４】
移植前に異種ドナー生物由来の心臓、腎臓、肺又は肝臓が、非虚血性保存によって、好ましくは、非虚血性心臓、腎臓、肺又は肝臓灌流によって保存されていた、請求項15から23のいずれか一項に記載の使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
【請求項２５】
遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された心臓である、請求項15から24のいずれか一項に記載の使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
【請求項２６】
遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された腎臓である、請求項15から24のいずれか一項に記載の使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
【請求項２７】
遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された肺である、請求項15から24のいずれか一項に記載の使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
【請求項２８】
遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された肝臓である、請求項15から24のいずれか一項に記載の使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
【請求項２９】
心臓、腎臓、肺又は肝臓が、それぞれ、異種哺乳動物由来の移植された遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓によって機能的に置換されている非ヒトの生存している霊長類であって、前記生存している霊長類の心臓、腎臓、肺又は肝臓が、40日前よりも更に前に、好ましくは、60日前よりも更に前に、最も好ましくは、90日前よりも更に前に移植されており、異種哺乳動物が、イノシシ科に属する、非ヒトの生存している霊長類。
【請求項３０】
異種哺乳動物が、イノシシ種に属する請求項29に記載の非ヒトの生存している霊長類。
【請求項３１】
機能的置換が、同所性置換である、請求項29又は30に記載の非ヒトの生存している霊長類。
【請求項３２】
異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植されるレシピエント生物の生存を延長する方法であって、
(vi)投薬レジメンに従ってレシピエント生物に1種又は複数の降圧剤を投与する工程であって、投薬レジメンが、移植後の1種又は複数の降圧剤の投与を含む、工程と、
(vii)投薬レジメンに従ってレシピエント生物にmTOR阻害剤を投与する工程であって、投薬レジメンが、移植後のmTOR阻害剤の投与を含む、工程と
を含み、
ドナー生物が、哺乳動物であり、好ましくは、ドナー生物が、イノシシ科に属し、
レシピエント生物が、霊長類である、方法。
【請求項３３】
(ii)ドナー生物から心臓、腎臓、肺又は肝臓を外科的に摘出する工程及び移植まで非虚血性保存によって外科的に摘出された心臓、腎臓、肺又は肝臓をそれぞれ保存する工程と
(iii)レシピエント生物のそれぞれ心臓、腎臓、肺又は肝臓を機能的に置換するように、ドナー生物の外科的に摘出された、保存された心臓、腎臓、肺又は肝臓を、レシピエント生物に移植する工程と、
(iv)投薬レジメンに従って免疫抑制維持療法をレシピエント生物に投与する工程であって、投薬レジメンが、移植後の1種又は複数の免疫抑制剤の投与を含み、投薬レジメンが、移植の1日後のグルココルチコイドの第1の投与を含む、工程と、
(viii)工程(iv)の投薬レジメンに従ってレシピエント生物に投与されるグルココルチコイドの投与量(mg/kg/日)を、移植後5日以内に5分の1以下、好ましくは、10分の1以下に減少させる工程と
を含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
(i)投薬レジメンに従って免疫抑制維持療法をレシピエント生物に投与する工程であって、投薬レジメンが、移植前の1種又は複数の免疫抑制剤の投与を含む、工程と、
(v)投薬レジメンに従って抗炎症療法をレシピエント生物に投与する工程であって、投薬レジメンが、移植後の1種又は複数の抗炎症剤の投与を含む、工程と
を更に含む、請求項32又は33に記載の方法。
【請求項３５】
レシピエント生物が、オナガザル科に属する、好ましくは、レシピエント生物が、ヒヒ属に属する請求項32から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
レシピエント生物が、ヒトである、請求項32から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
工程(vi)の投薬レジメンが、以下のリスト:利尿薬、カルシウムチャネルブロッカー、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、アンジオテンシンII受容体アンタゴニスト、アドレナリン受容体アンタゴニスト、血管拡張剤、レニン阻害剤、アルドステロン受容体アンタゴニスト、アルファ-2アドレナリン受容体アゴニスト及びエンドセリン受容体ブロッカーから選択される1種又は複数の降圧剤を投与する工程を含み、好ましくは、投薬レジメンが、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤及びアドレナリン受容体アンタゴニストから選択される1種又は複数の降圧剤を投与する工程を含み、より好ましくは、投薬レジメンが、エナラプリル及び/又はメトプロロール酒石酸塩を投与する工程を含み、最も好ましくは、投薬レジメンが、エナラプリル及びメトプロロール酒石酸塩を投与する工程を含む、請求項32から36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
工程(vii)の投薬レジメンが、以下のリスト:ダクトリシブ(BEZ235、NVP-BEZ235)、ラパマイシン(シロリムス)、エベロリムス(RAD001)、AZD8055、テムシロリムス(CCI-779、NSC 683864)、SF2523、3BDO、PI-103、KU-0063794 I、トルキニブ(PP242)、リダフォロリムス(デフォロリムス、MK-8669)、サパニセルチブ(INK 128、MLN0128)、ボクスタリシブ(SAR245409、XL765)類似体、トリン1、オミパリシブ(GSK2126458、GSK458)、OSI-027、PF-04691502、アピトリシブ(GDC-0980、RG7422)、GSK1059615、ゲダトリシブ(PF-05212384、PKI-587)、WYE-354、ビスツセルチブ(AZD2014)、トリン2、WYE-125132(WYE-132)、BGT226(NVP-BGT226)、パロミド529(P529)、PP121、WYE-687、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、ゾタロリムス(ABT-578)、CZ415、MHY1485、ボクスタリシブ(XL765、SAR245409)、クリソファン酸及びCC-223、LY3023414から選択されるmTOR阻害剤を投与する工程を含み、好ましくは、投薬レジメンが、テムシロリムスを投与する工程を含む、請求項32から37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された心臓である、請求項32から38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された腎臓である、請求項32から38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された肺である、請求項32から38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された肝臓である、請求項32から38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
以下の遺伝子改変:
a)ヒト補体調節タンパク質をコードする配列の挿入、及び
b)ヒトトロンボモジュリンをコードする配列の挿入
を有する遺伝子改変された哺乳動物であって、
ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座に挿入され、少なくともヒト補体調節タンパク質をコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の内因性プロモーターの制御下で発現され、
遺伝子改変された哺乳動物が非ヒトである、
遺伝子改変された哺乳動物。
【請求項４４】
アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を欠く、請求項43に記載の遺伝子改変された哺乳動物。
【請求項４５】
ヒト補体調節タンパク質をコードする配列が、ヒトD46をコードする配列である、請求項43又は44に記載の遺伝子改変された哺乳動物。
【請求項４６】
c)CMAH遺伝子のホモ接合性ノックアウト、及び
d)B4GALNT2遺伝子のホモ接合性ノックアウト
を更に有する、請求項43から45のいずれか一項に記載の遺伝子改変された哺乳動物。
【請求項４７】
1つ又は複数の追加の遺伝子改変を有する、請求項43から46のいずれか一項に記載の遺伝子改変された哺乳動物。
【請求項４８】
1つ又は複数の追加の遺伝子改変が、挿入であり、1つ又は複数の挿入が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座におけるものである、請求項47に記載の遺伝子改変された哺乳動物。
【請求項４９】
イノシシ種に属する、請求項43から48のいずれか一項に記載の遺伝子改変された哺乳動物。
【請求項５０】
ブタ内因性レトロウイルスC(PERV-C)を有さない請求項43から49のいずれか一項に記載の遺伝子改変された哺乳動物。
【請求項５１】
異種臓器移植片のドナー生物として働くのに適している、請求項43から50のいずれか一項に記載の遺伝子改変された哺乳動物。
【請求項５２】
遺伝子改変された哺乳動物を作製する方法であって、
(a)ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列を、哺乳動物ゲノムのアルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座に挿入して、遺伝子改変されたゲノムを提供する工程と、
(b)遺伝子改変されたゲノムを細胞に導入する工程と、
(c)遺伝子改変されたゲノムを含む細胞が、遺伝子改変された哺乳動物に成熟するのを可能にする工程と
を含み、
遺伝子改変された哺乳動物が、非ヒトである、方法。
【請求項５３】
ヒト補体調節タンパク質をコードする配列が、ヒトCD46をコードする配列である、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座中に挿入される単一発現ベクター上に位置する、請求項52又は53に記載の方法。
【請求項５５】
遺伝子改変された哺乳動物が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を欠くように、ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座に挿入される、請求項52から54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
少なくともヒト補体調節タンパク質をコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の内因性プロモーターの制御下で発現されるように、ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座に挿入される、請求項52から55のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
工程(b)の前に哺乳動物ゲノムのCMAH及びB4GALNT2遺伝子をノックアウトする工程を更に含む、請求項52から56のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
工程(b)の前に1つ又は複数の追加の遺伝子改変を哺乳動物ゲノム中に導入する工程を更に含む、請求項52から57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
1つ又は複数の追加の遺伝子改変が、遺伝子挿入であり、ヒト補体調節タンパク質をコードする配列、ヒトトロンボモジュリンをコードする配列及び1つ又は複数の追加の挿入が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座中に挿入される単一発現ベクター上に位置する、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
遺伝子改変が、CRISPR/Cas9を使用して導入される、請求項52から59のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
哺乳動物が、イノシシ種に属する、請求項52から59のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
哺乳動物が、ブタ内因性レトロウイルスC (PERV-C)を有さない、請求項52から61のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
遺伝子改変された哺乳動物が、異種臓器移植片のドナー生物として働くのに適している、請求項52から62のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
請求項52から63のいずれか一項に記載の方法によって得られる遺伝子改変された哺乳動物。
【請求項６５】
以下の遺伝子改変:
a)成長ホルモン受容体遺伝子のホモ接合性ノックアウト
を有し、
非ヒト哺乳動物である、異種臓器移植片のドナー生物。
【請求項６６】
以下の遺伝子改変:
b)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のホモ接合性ノックアウト、
c)ヒトCD46をコードする配列の挿入、及び
d)ヒトトロンボモジュリンをコードする配列の挿入
を更に有する、請求項65に記載のドナー生物。
【請求項６７】
以下の遺伝子改変:
b)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、CMAH遺伝子及びB4GALNT2遺伝子のホモ接合性ノックアウト、及び
c)ヒトCD46をコードする配列、ヒトCD55をコードする配列、ヒトCD59をコードする配列、ヘムオキシゲナーゼ1をコードする配列及びA20をコードする配列の挿入
を更に有する、請求項65に記載のドナー生物。
【請求項６８】
以下の遺伝子改変:
d)LEA29Y又はPD-L1をコードする配列の挿入
を更に含む、請求項67に記載のドナー生物。
【請求項６９】
イノシシ種に属する、請求項65から68のいずれか一項に記載のドナー生物。
【請求項７０】
ブタ内因性レトロウイルスC(PERV-C)を有さない、請求項65から69のいずれか一項に記載のドナー生物。 
【請求項７１】
異種臓器移植片のドナー生物を作製する方法であって、
(i)ドナー生物をIGF1を用いて処置することによってドナー生物のサイズを調整する工程
を含み、
ドナー生物が、以下の遺伝子改変:
a)成長ホルモン受容体遺伝子のホモ接合性ノックアウト
を有し、
ドナー生物が、非ヒト哺乳動物である、方法。
【請求項７２】
b)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のホモ接合性ノックアウト、
c)ヒトCD46をコードする配列の挿入、及び
d)ヒトトロンボモジュリンをコードする配列の挿入
を更に有する、請求項71に記載の方法。
【請求項７３】
ドナー生物が、以下の遺伝子改変:
b)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、CMAH遺伝子及びB4GALNT2遺伝子のホモ接合性ノックアウト、及び
c)ヒトCD46をコードする配列、ヒトCD55をコードする配列、ヒトCD59をコードする配列、ヘムオキシゲナーゼ1をコードする配列及びA20をコードする配列の挿入
を更に有する、請求項71に記載の方法。
【請求項７４】
ドナー生物が、以下の遺伝子改変:
d)LEA29Y又はPD-L1をコードする配列の挿入
を更に有する、請求項73に記載の方法。
【請求項７５】
ドナー生物が、イノシシ種に属する、請求項71から74のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
ドナー生物が、ブタ内因性レトロウイルスC(PERV-C)を有さない、請求項71から75のいずれかの方法。
【請求項７７】
請求項71から76のいずれか一項に記載の方法に従って得られる、異種臓器移植片のドナー生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生命維持技術において異種哺乳動物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植される霊長類の生存を延長する方法及び生命維持技術において異種哺乳動物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植されている霊長類の生存を延長する方法において使用するための組成物に関する。本発明はまた、心臓、腎臓、肺又は肝臓が、移植された異種哺乳動物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓によって機能的に置換されている生存している霊長類を対象とする。最後に、本発明は、遺伝子改変された哺乳動物及び異種臓器移植片のドナー生物並びにそれを製造する方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
同種異系臓器提供の代替案が必要である。遺伝子改変されたブタ心臓を診療へと導入するために、ある特定の高レベルの実験的前提条件が過去に設定されているが、過去25年間誰も満たすことができなかった。本発明者らは、本明細書において、生命維持性異種心臓移植のための方法及び組成物を記載する。これらの方法及び組成物はまた、生命維持性異種腎臓、肺及び肝臓移植に適用可能である。
【０００３】
心臓置換は、依然として、末期患者において選択される処置である。しかし、臓器に対する需要は、その供給をはるかに上回る(参考文献1、2、3を参照のこと)。機械的補助デバイスは、移植への橋渡しにおいて又は最終様式において代替選択肢となる(参考文献4を参照のこと)が、出血、血栓症又はドライブライン感染のような重度の方法関連事象が、その長期成功を制限する。拍動するが、作動しない、遺伝子改変された(gm)ブタからヒヒへの異所性腹部心臓移植片モデル(非生命維持性)における298日(最長945日)の最近の生存期間中央値は、安全な免疫抑制(IS;参考文献5を参照のこと)を適用しながらの不調和な臓器が長期にわたり免疫学的に許容される可能性を証明する。しかし、臨床使用の前に、ISHLT諮問委員会のガイドラインは、少なくとも3分の2の連続実験において生命維持性(好ましくは、同所性であるが、胸腔内異所性技術においても)位置における最短3カ月の良好な移植片機能を要求しており(参考文献6を参照のこと)、そうした結果は過去25年間達成されていない(参考文献7を参照のこと)。実際、同所性異種手順は、非ヒト霊長類では可能ではないとさえ考えられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Mohiuddin, Reichartら、2015
【非特許文献２】https://imagej.nih.gov/ij/
【非特許文献３】https://de.mathworks.com/products/matlab.html
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、以下に記載される実施形態を提供することによって、上記の必要性を満たし、当技術分野における上記の問題を解決する。
【０００６】
本発明者らは、ブタ等の異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓が、レシピエント霊長類に移植される場合に、移植された心臓が過成長し、これがレシピエント霊長類の死亡を最終的に引き起こすことを見出した。驚くべきことに、本発明者らは、レシピエント霊長類の生存は、新規移植方法を適用することによって、及び/又はレシピエントにmTOR阻害剤/降圧剤組成物を投与することによって有意に延長され得ることを見出した。具体的には、本発明者らは、驚くべきことに、とりわけ、以下の手段がレシピエントの生存を改善することを見出した:
・移植まで非虚血性保存によってドナー生物から得た心臓を保存すること。
・移植後にレシピエントに1種又は複数の降圧剤を投与すること。ブタ等の哺乳動物は、+/-80mmHgの収縮期血圧を有し、ヒヒ等の霊長類は、+/-120mmHgを有する。本発明者らは、降圧処置が、そうでなければ心筋肥大(過成長)を引き起こす、霊長類のより高い血圧値を低下させることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、1種又は複数の降圧剤の投与が、レシピエント生物におけるドナー心臓の過成長を防ぐことを見出した。
・移植後にレシピエントへのmTOR阻害剤を投与すること。本発明者らは、驚くべきことに、mTOR阻害剤は、免疫抑制剤であるだけではなく、ブタ等の哺乳動物において成長ホルモンの強力な阻害剤でもあるということを見出した。したがって、mTOR阻害剤の投与はまた、レシピエント生物におけるドナー心臓の過成長も防ぐ。
・移植後早期に免疫抑制維持療法の一部としてレシピエントに投与されるグルココルチコイドの投与量を減少させること。本発明者らは、驚くべきことに、グルココルチコイドの早期離脱もまた、レシピエント生物におけるドナー心臓の過成長も防ぐことを見出した。
【０００７】
移植後のレシピエントにおけるドナー臓器過成長という現象はまた、腎臓及び肺移植後にも観察されている(参考文献15を参照のこと)。このような移植のレシピエントは、それぞれの終末期疾患を患っているであろう。したがって、本発明において記載される方法(特に、移植後にレシピエントに1種又は複数の降圧剤を投与すること、移植後にレシピエントにmTOR阻害剤を投与すること及び移植後早期に免疫抑制維持療法の一部としてレシピエントに投与されるグルココルチコイドの投与量を減少させること)は、腎臓移植、肺移植及び肝臓移植を含む任意の異種臓器移植にとって有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明は、以下の項目において記載される好ましい実施形態を提供することによって、異種哺乳動物から心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植される霊長類の生存を延長する方法及び異種哺乳動物から心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植されている霊長類の生存を延長する方法において使用するための組成物を提供する。本発明はまた、以下の項目において記載される好ましい実施形態を提供することによって、心臓、腎臓、肺又は肝臓が、それぞれ、移植された異種哺乳動物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓によって機能的に置き換えられる生存している霊長類も提供する:
1.異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植されるレシピエント生物の生存を延長する方法であって、
(i)投薬レジメンに従ってレシピエント生物に免疫抑制誘導療法を投与する工程であって、投薬レジメンが、移植前の1種又は複数の免疫抑制剤の投与を含む、工程、
(ii)ドナー生物から心臓、腎臓、肺又は肝臓を外科的に摘出する工程及び移植まで非虚血性保存によって外科的に摘出された心臓、腎臓、肺又は肝臓をそれぞれ保存する工程、
(iii)レシピエント生物のそれぞれ心臓、腎臓、肺又は肝臓を機能的に置換するように、ドナー生物の外科的に摘出された、保存された心臓、腎臓、肺又は肝臓を、レシピエント生物に移植する工程、
(iv)投薬レジメンに従って免疫抑制維持療法をレシピエント生物に投与する工程であって、投薬レジメンが、移植後の1種又は複数の免疫抑制剤の投与を含み、投薬レジメンが、移植後1日以内のグルココルチコイドの第1の投与を含む、工程、
(v)投薬レジメンに従って抗炎症療法をレシピエント生物に投与する工程であって、投薬レジメンが、移植後の1種又は複数の抗炎症剤の投与を含む、工程、
(vi)投薬レジメンに従って1種又は複数の降圧剤をレシピエント生物に投与する工程であって、投薬レジメンが、移植後の1種又は複数の降圧剤の投与を含む、工程、
(vii)投薬レジメンに従ってmTOR阻害剤をレシピエント生物に投与する工程であって、投薬レジメンが、移植後のmTOR阻害剤の投与を含む、工程、
(viii)工程(iv)の投薬レジメンに従ってレシピエント生物に投与されるグルココルチコイドの投与量(mg/kg/日)を、移植後5日以内に5分の1以下、好ましくは、10分の1以下に減少させる工程
のうちすべて又はサブセットを含み:
ドナー生物は、哺乳動物であり、
レシピエント生物は、霊長類である、
方法。
【０００９】
項目1に従う上記の方法は、工程(vi)及び(vii)のみを含む場合もあるが、好ましくは、工程(ii)、(iii)、(iv)、(vi)、(vii)及び(viii)を含み、最も好ましくは、工程(i)〜(viii)のすべてを含む。
【００１０】
2.方法が、心臓、腎臓、肺又は肝臓過成長を防ぐためである、項目1の方法。
3.工程(iii)の機能的置換が、同所性置換である、項目1又は2の方法。
4.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
a)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のホモ接合性ノックアウト、
b)ヒトCD46遺伝子の挿入、及び
c)ヒトトロンボモジュリン遺伝子の挿入
を有する、項目1から3のいずれかの方法:
5.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
a)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、CMAH遺伝子及びB4GALNT2遺伝子のホモ接合性ノックアウト、及び
b)ヒトCD46遺伝子、ヒトCD55遺伝子、ヒトCD59遺伝子、ヘムオキシゲナーゼ1遺伝子及びA20遺伝子の挿入
を有する、項目1〜3のいずれかの方法。
6.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
c)LEA遺伝子又はPDL-1遺伝子の挿入
を更に有する、項目5の方法。
7.LEA遺伝子が、配列番号1に示されるようなLEA29Yである、項目6の方法。
8.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
d)ヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼをコードする配列の挿入
を更に有する、項目4〜7のいずれかの方法。
9.ドナー生物が、イノシシ(Suidae)科に属し、好ましくは、ドナー生物が、イノシシ(Sus)属に属し、より好ましくは、ドナー生物が、イノシシ(S.scrofa)種に属し、最も好ましくは、ドナー生物が、ブタ(S.s.domesticus)亜種に属する、項目1〜8のいずれかの方法。
10.ドナー生物が、イノシシ種に属する、項目1〜9のいずれかの方法。
11.ドナー生物が、ジャーマンランドレース(German Landrace)/ラージホワイト(Large White)交雑遺伝的バックグラウンドのブタ、デュロック(Duroc)ブタ、シュヴェービッシュ-ヘリッシュ(Schwabisch-Hallische)ブタ、ブラックミニブタ又はオークランド・アイランド(Auckland Island)ブタである、好ましくは、ドナー生物が、ジャーマンランドレース(German Landrace)/ラージホワイト(Large White)交雑遺伝的バックグラウンドのブタである、項目1〜10のいずれかの方法。
12.レシピエント生物が、オナガザル(Cercopithecidae)科に属する、好ましくは、レシピエント生物が、ヒヒ(Papio)属に属する、より好ましくは、レシピエント生物が、アヌビスヒヒ(Papio Anubis)又はマントヒヒ(Papio Hamadryas)種に属する、最も好ましくは、レシピエント生物が、アヌビスヒヒ種に属する、項目1〜11のいずれかの方法。
13.レシピエント生物が、ヒト(Homonidae)科に属する、好ましくは、レシピエント生物が、ヒト(Homo)属に属する、より好ましくは、レシピエント生物が、ヒトである、項目1〜11のいずれかの方法。
14.レシピエント生物の生存が、移植後40日よりも後まで、移植後50日よりも後まで、移植後60日よりも後まで、移植後70日よりも後まで、移植後80日よりも後まで、又は移植後90日よりも後まで延長される、好ましくは、レシピエント生物の生存が、移植後50日よりも後まで、より好ましくは、移植後70日よりも後まで、最も好ましくは、移植後90日よりも後まで延長される、項目1〜13のいずれかの方法。
15.工程(i)の免疫抑制誘導療法の投薬レジメンが、以下のリスト:抗CD20抗体、抗胸腺細胞グロブリン(ATG)及び抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fabから選択される1種又は複数の免疫抑制剤を投与する工程を含む、好ましくは、投薬レジメンが、上記の免疫抑制剤のすべてを投与する工程を含む、項目1〜14のいずれかの方法。
16.工程(ii)の非虚血性保存が、非虚血性心臓、腎臓、肺又は肝臓灌流である、項目1〜15のいずれかの方法。
17.工程(iv)の免疫抑制維持療法の投薬レジメンが、グルココルチコイドの第1の投与の当日の9mg/kg/日〜11mg/kg/日の投与量でのグルココルチコイドの投与を含む、項目1〜16のいずれかの方法。
18.工程(iv)の免疫抑制維持療法の投薬レジメンが、グルココルチコイドと、以下のリスト:抗CD20抗体、抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fab及びミコフェノール酸モフェチル(MMF)から選択される1種又は複数の免疫抑制剤とを投与する工程を含む、好ましくは、投薬レジメンが、上記の免疫抑制剤のすべてを投与する工程を含む、項目1〜17のいずれかの方法。
19.工程(v)の抗炎症療法の投薬レジメンが、以下のリスト:IL-6-受容体抗体、TNFα阻害剤及びIL-1-受容体アンタゴニストから選択される1種又は複数の抗炎症剤を投与する工程を含む、好ましくは、投薬レジメンが、上記の抗炎症剤のすべてを投与する工程を含む、項目1〜18のいずれかの方法。
20.工程(iv)の投薬レジメンに従うレシピエント生物に投与されるグルココルチコイドの投与量(mg/kg/日)が、工程(viii)において、移植後10日以内に10分の1以下、好ましくは、20分の1以下に減少する、項目1〜19のいずれかの方法。
21.工程(vi)の投薬レジメンが、以下のリスト:利尿薬、カルシウムチャネルブロッカー、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、アンジオテンシンII受容体アンタゴニスト、アドレナリン受容体アンタゴニスト、血管拡張剤、レニン阻害剤、アルドステロン受容体アンタゴニスト、アルファ-2アドレナリン受容体アゴニスト及びエンドセリン受容体ブロッカーから選択される1種又は複数の降圧剤を投与する工程を含む、好ましくは、投薬レジメンが、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤及びアドレナリン受容体アンタゴニストから選択される1種又は複数の降圧剤を投与する工程を含む、より好ましくは、投薬レジメンが、エナラプリル及び/又はメトプロロール酒石酸塩を投与する工程を含む、最も好ましくは、投薬レジメンが、エナラプリル及びメトプロロール酒石酸塩を投与する工程を含む、項目1〜20のいずれかの方法。
22.工程(vi)の投薬レジメンが、移植後2日以内の1種又は複数の降圧剤の第1の投与を含む、項目1〜21のいずれかの方法。
23.工程(vi)の降圧剤が、レシピエント生物の平均動脈圧が70〜90mmHgの範囲内で、好ましくは、75〜85mmHgの範囲内で維持されるように投与される、項目1〜22のいずれかの方法。
24.工程(vii)の投薬レジメンが、以下のリスト:ダクトリシブ(BEZ235、NVP-BEZ235)、ラパマイシン(シロリムス)、エベロリムス(RAD001)、AZD8055、テムシロリムス(CCI-779、NSC683864)、SF2523、3BDO、PI-103、KU-0063794 I、トルキニブ(torkinib)(PP242)、リダフォロリムス(デフォロリムス、MK-8669)、サパニセルチブ(sapanisertib)(INK128、MLN0128)、ボクスタリシブ(voxtalisib)(SAR245409、XL765)類似体、トリン(torin)1、オミパリシブ(omipalisib)(GSK2126458、GSK458)、OSI-027、PF-04691502、アピトリシブ(GDC-0980、RG7422)、GSK1059615、ゲダトリシブ(PF-05212384、PKI-587)、WYE-354、ビスツセルチブ(vistusertib)(AZD2014)、トリン(torin)2、WYE-125132(WYE-132)、BGT226(NVP-BGT226)、パロミド(palomid)529(P529)、PP121、WYE-687、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、ゾタロリムス(ABT-578)、CZ415、MHY1485、ボクスタリシブ(voxtalisib)(XL765、SAR245409)、クリソファン酸及びCC-223、LY3023414から選択されるmTOR阻害剤を投与する工程を含む、好ましくは、投薬レジメンが、テムシロリムスを投与する工程を含む、項目1〜23のいずれかの方法。
25.工程(vii)の投薬レジメンが、移植後10日以内の、好ましくは、移植後2日から9日の間の、より好ましくは、移植後4日から7日の間のmTOR阻害剤の第1の投与を含む、項目1〜25のいずれかの方法。
26.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された心臓である、項目1〜25のいずれかの方法。
27.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された腎臓である、項目1〜25のいずれかの方法。
28.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された肺である、項目1〜25のいずれかの方法。
29.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された肝臓である、項目1〜25のいずれかの方法。
30.心臓、腎臓、肺又は肝臓が、それぞれ、異種哺乳動物由来の移植された遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓によって機能的に置換されている生存している霊長類であって、項目1〜29のいずれかに従う方法によって得ることができる(又は得られる)、生存している霊長類。
31.心臓、腎臓、肺又は肝臓が、それぞれ、異種哺乳動物由来の移植された遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓によって機能的に置換されている生存している霊長類であって、前記の生存している霊長類の心臓、腎臓、肺又は肝臓が、40日前よりも更に前に、50日前よりも更に前に、60日前よりも更に前に、70日前よりも更に前に、80日前よりも更に前に、又は90日前よりも更に前に、好ましくは、50日前よりも更に前に、より好ましくは、70日前よりも更に前に、最も好ましくは、90日前よりも更に前に移植されている、生存している霊長類。
32.非ヒトの生存している霊長類である、項目31に従う生存している霊長類。
33.オナガザル科に属する、好ましくは、ヒヒ属に属する、より好ましくは、アヌビスヒヒ又はマントヒヒ種に属する、最も好ましくは、アヌビスヒヒ種に属する、項目31又は32に従う生存している霊長類。
34.異種哺乳動物が、イノシシ科に属する、好ましくは、異種哺乳動物が、イノシシ属に属する、より好ましくは、異種哺乳動物が、イノシシ種に属する、最も好ましくは、異種哺乳動物が、ブタ亜種に属する、項目31〜33のいずれかに従う生存している霊長類。
35.異種哺乳動物が、イノシシ種に属する、項目31〜34のいずれかに従う生存している霊長類。
36.異種哺乳動物が、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタ、デュロックブタ、シュヴェービッシュ-ヘリッシュブタ、ブラックミニブタ又はオークランド・アイランドブタである、好ましくは、異種哺乳動物が、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタである、項目31〜35のいずれかに従う生存している霊長類。
37.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
a)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のホモ接合性ノックアウト、
b)ヒトCD46遺伝子の挿入、及び
c)ヒトトロンボモジュリン遺伝子の挿入
を有する、項目31〜36のいずれかに従う生存している霊長類。
38.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
a)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、CMAH遺伝子及びB4GALNT2遺伝子のホモ接合性ノックアウト、及び
b)ヒトCD46遺伝子、ヒトCD55遺伝子、ヒトCD59遺伝子、ヘムオキシゲナーゼ1遺伝子及びA20遺伝子の挿入
を有する、項目31〜36のいずれかに従う生存している霊長類。
39.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
c)LEA遺伝子又はPDL-1遺伝子の挿入
を更に有する、項目38に従う生存している霊長類。
40.LEA遺伝子が、配列番号1に示されるようなLEA29Yである、項目39に従う生存している霊長類。
41.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
d)ヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼをコードする配列の挿入
を更に有する、項目37〜40のいずれかに従う生存している霊長類。
42.心臓が、移植された遺伝子改変された心臓によって機能的に置換されている、項目31〜41のいずれかに従う生存している霊長類。
43.腎臓が、移植された遺伝子改変された腎臓によって機能的に置換されている、項目31〜41のいずれかに従う生存している霊長類。
44.肺が、移植された遺伝子改変された肺によって機能的に置換されている、項目31〜41のいずれかに従う生存している霊長類。
45.肝臓が、移植された遺伝子改変された肝臓によって機能的に置換されている、項目31〜41のいずれかに従う生存している霊長類。
46.前記生存している霊長類の移植された心臓が、移植の時点での同一心臓の左室容積の150%以下、好ましくは、移植の時点での同一心臓の左室容積の140%以下、より好ましくは、移植の時点での同一心臓の左室容積の130%以下、更により好ましくは、移植の時点での同一心臓の左室容積の120%以下、最も好ましくは、移植の時点での同一心臓の左室容積の110%以下である左室容積を有する、項目42に従う生存している霊長類。
47.150から300g/lの間の、好ましくは、170から250g/lの間の、より好ましくは、180から230g/lの間の血小板数を有する、項目31〜46のいずれかに従う生存している霊長類。
48.1.2mg/dl以下の、好ましくは、1.0mg/dl以下の、より好ましくは、0.8mg/dl以下の、最も好ましくは、0.6mg/dl以下のビリルビンレベルを有する項目31〜47のいずれかに従う生存している霊長類。
49.0.3ng/ml以下の、好ましくは、0.2ng/ml以下の、より好ましくは、0.1ng/ml以下の、最も好ましくは、0.014ng/ml以下のトロポニンT(hs)レベルを有する、項目31〜48のいずれかに従う生存している霊長類。
50.1500U/l以下の、好ましくは、1000U/l以下の、より好ましくは、700U/l以下の、最も好ましくは、500U/l以下のLDHレベルを有する、項目31〜49のいずれかに従う生存している霊長類。
51.異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するためのmTOR阻害剤を含む組成物であって、ドナー生物が、哺乳動物であり、レシピエント生物が、霊長類である、組成物。
52.心臓、腎臓、肺又は肝臓過成長を防ぐ方法において使用するためのものである、項目51に従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
53.それぞれ、レシピエント生物の心臓、腎臓、肺又は肝臓を機能的に置換するように、レシピエント生物が、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植されている、項目51又は52に従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
54.機能的置換が、同所性置換である、項目53に従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
55.ドナー生物が、イノシシ科に属する、好ましくは、ドナー生物が、イノシシ属に属する、より好ましくは、ドナー生物が、イノシシ種に属する、最も好ましくは、ナー生物が、ブタ亜種に属する、項目51〜54のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
56.ドナー生物が、イノシシ種に属する、項目51〜55にいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
57.ドナー生物が、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタ、デュロックブタ、シュヴェービッシュ-ヘリッシュブタ、ブラックミニブタ又はオークランド・アイランドブタである、好ましくは、ドナー生物が、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタである、項目51〜56のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
58.レシピエント生物が、オナガザル科に属する、好ましくは、レシピエント生物が、ヒヒ属に属する、より好ましくは、レシピエント生物が、アヌビスヒヒ又はマントヒヒ種に属する、最も好ましくは、レシピエント生物が、アヌビスヒヒ種に属する、項目51〜57のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
59.レシピエント生物が、ヒト科に属する、好ましくは、レシピエント生物が、ヒト属に属する、より好ましくは、レシピエント生物が、ヒトである、項目51〜57のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
60.レシピエント生物の生存が、移植後40日よりも後まで、移植後50日よりも後まで、移植後60日よりも後まで、移植後70日よりも後まで、移植後80日よりも後まで、又は移植後90日よりも後まで延長される、好ましくは、レシピエント生物の生存が、移植後50日よりも後まで、より好ましくは、移植後70日よりも後まで、最も好ましくは、移植後90日よりも後まで延長される、項目51〜59のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
61.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
a)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のホモ接合性ノックアウト、
b)ヒトCD46遺伝子の挿入、及び
c)ヒトトロンボモジュリン遺伝子の挿入
を有する、項目51〜60のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
62.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
a)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、CMAH遺伝子及びB4GALNT2遺伝子のホモ接合性ノックアウト、及び
b)ヒトCD46遺伝子、ヒトCD55遺伝子、ヒトCD59遺伝子、ヘムオキシゲナーゼ1遺伝子及びA20遺伝子の挿入
を有する、項目51〜60のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
63.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
c)LEA遺伝子又はPDL-1遺伝子の挿入
を更に有する、項目62に従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
64.LEA遺伝子が、配列番号1に示されるようなLEA29Yである、項目63に従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
65.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
d)ヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼをコードする配列の挿入
を更に有する、項目61〜64のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
66. mTOR阻害剤が、以下のリスト:ダクトリシブ(BEZ235、NVP-BEZ235)、ラパマイシン(シロリムス)、エベロリムス(RAD001)、AZD8055、テムシロリムス(CCI-779、NSC683864)、SF2523、3BDO、PI-103、KU-0063794 I、トルキニブ(PP242)、リダフォロリムス(デフォロリムス、MK-8669)、サパニセルチブ(INK128、MLN0128)、ボクスタリシブ(SAR245409、XL765)類似体、トリン1、オミパリシブ(GSK2126458、GSK458)、OSI-027、PF-04691502、アピトリシブ(GDC-0980、RG7422)、GSK1059615、ゲダトリシブ(PF-05212384、PKI-587)、WYE-354、ビスツセルチブ(AZD2014)、トリン2、WYE-125132(WYE-132)、BGT226(NVP-BGT226)、パロミド529(P529)、PP121、WYE-687、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、ゾタロリムス(ABT-578)、CZ415、MHY1485、ボクスタリシブ(XL765、SAR245409)、クリソファン酸及びCC-223、LY3023414から選択される、好ましくは、mTOR阻害剤が、テムシロリムスである、項目51〜65のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
67.移植後10日以内の、好ましくは、移植後2日から9日の間の、より好ましくは、移植後4日から7日の間の組成物の第1の投与を含む投薬レジメンに従って投与される、項目51〜66のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
68.第1の投与及びその後毎日の投与を含む投薬レジメンに従って投与される、項目51〜67のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
69.レシピエント生物が、投薬レジメンに従って免疫抑制誘導療法を受けており、投薬レジメンが、移植前の1種又は複数の免疫抑制剤の投与を含んでいた、項目51〜68のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
70.免疫抑制誘導療法の投薬レジメンが、以下のリスト:抗CD20抗体、抗胸腺細胞グロブリン(ATG)及び抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fabから選択される1種又は複数の免疫抑制剤を投与する工程を含んでいた、好ましくは、投薬レジメンが、上記の免疫抑制剤のすべてを投与する工程を含んでいた、項目69に従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
71.レシピエント生物が、投薬レジメンに従って免疫抑制誘導療法を受け、投薬レジメンが、移植後の1種又は複数の免疫抑制剤の投与を含み、投薬レジメンが、移植後1日以内に行われたグルココルチコイドの第1の投与を含む、項目51〜70のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
72.免疫抑制維持療法の投薬レジメンが、グルココルチコイドの第1の投与の当日の9mg/kg/日〜11mg/kg/日の投与量でのグルココルチコイドの投与を含む、項目71に従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
73.免疫抑制維持療法の投薬レジメンが、グルココルチコイドと、以下のリスト:抗CD20抗体、抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fab及びミコフェノール酸モフェチル(MMF)から選択される1種又は複数の免疫抑制剤とを投与する工程を含む、好ましくは、投薬レジメンが、グルココルチコイド、抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fab及びミコフェノール酸モフェチル(MMF)を投与する工程を含む、最も好ましくは、投薬レジメンが、グルココルチコイド、抗CD20抗体、抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fab及びミコフェノール酸モフェチル(MMF)を投与する工程を含む、項目71又は72に従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
74.投薬レジメンに従ってレシピエント生物に投与されるグルココルチコイドの投与量(mg/kg/日)が、移植後5日以内に5分の1以下、好ましくは、10分の1以下に減少している、項目71〜73のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
75.レシピエント生物が、投薬レジメンに従って抗炎症療法を受ける、項目51〜74のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
76.抗炎症療法の投薬レジメンが、以下のリスト:IL-6-受容体抗体、TNFα阻害剤及びIL-1-受容体アンタゴニストから選択される1種又は複数の抗炎症剤を投与する工程を含む、好ましくは、投薬レジメンが、上記の抗炎症剤のすべてを投与する工程を含む、項目75に従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
77.レシピエント生物が、投薬レジメンに従って降圧処置を受ける、項目51〜76のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
78.降圧処置の投薬レジメンが、以下のリスト:利尿薬、カルシウムチャネルブロッカー、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、アンジオテンシンII受容体アンタゴニスト、アドレナリン受容体アンタゴニスト、血管拡張剤、レニン阻害剤、アルドステロン受容体アンタゴニスト、アルファ-2アドレナリン受容体アゴニスト及びエンドセリン受容体ブロッカーから選択される1種又は複数の降圧剤を投与する工程を含む、好ましくは、投薬レジメンが、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤及びアドレナリン受容体アンタゴニストから選択される1種又は複数の降圧剤を投与する工程を含む、より好ましくは、投薬レジメンが、エナラプリル及び/又はメトプロロール酒石酸塩を投与する工程を含む、最も好ましくは、投薬レジメンが、エナラプリル及びメトプロロール酒石酸塩を投与する工程を含む、項目77に従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
79.降圧処置の投薬レジメンが、移植後2日以内に行われた1種又は複数の降圧剤の第1の投与を含む、項目77又は78に従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
80.降圧剤が、レシピエント生物の平均動脈圧が70〜90mmHgの範囲内で、好ましくは、75〜85mmHgの範囲内で維持されるように投与される、項目77〜79のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
81.移植前に異種ドナー生物由来の心臓、腎臓、肺又は肝臓が、非虚血性保存によって保存されていた、項目51〜80のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
82.非虚血性保存が、非虚血性心臓、腎臓、肺又は肝臓灌流である、項目81に従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
83.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された心臓である、項目51〜82に従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
84.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された腎臓である、項目51〜82のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
85.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された肺である、項目51〜82のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
86.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された肝臓である、項目51〜82のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
87.異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するための1種又は複数の降圧剤を含む組成物であって、ドナー生物が、哺乳動物であり、レシピエント生物が、霊長類である、組成物。
88.心臓、腎臓、肺又は肝臓過成長を防ぐ方法において使用するためのものである、項目87に従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
89.それぞれ、レシピエント生物の心臓、腎臓、肺又は肝臓を機能的に置換するように、レシピエント生物が、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植されている、項目87又は88に従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
90.機能的置換が、同所性置換である、項目89に従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
91.ドナー生物が、イノシシ科に属する、好ましくは、ドナー生物が、イノシシ属に属する、より好ましくは、ドナー生物が、イノシシ種に属する、最も好ましくは、ドナー生物が、ブタ亜種に属する、項目87〜90のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
92.ドナー生物が、イノシシ種に属する、項目87〜91のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
93.ドナー生物が、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタ、デュロックブタ、シュヴェービッシュ-ヘリッシュブタ、ブラックミニブタ又はオークランド・アイランドブタである、好ましくは、ドナー生物が、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタである、項目87〜92のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
94.レシピエント生物が、オナガザル科に属する、好ましくは、レシピエント生物が、ヒヒ属に属する、より好ましくは、レシピエント生物が、アヌビスヒヒ又はマントヒヒ種に属する、最も好ましくは、レシピエント生物が、アヌビスヒヒ種に属する、項目87〜93のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
95.レシピエント生物が、ヒト科に属する、好ましくは、レシピエント生物が、ヒト属に属する、より好ましくは、レシピエント生物が、ヒトである、項目87〜93のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
96.レシピエント生物の生存が、移植後40日よりも後まで、移植後50日よりも後まで、移植後60日よりも後まで、移植後70日よりも後まで、移植後80日よりも後まで、又は移植後90日よりも後まで延長される、好ましくは、レシピエント生物の生存が、移植後50日よりも後まで、より好ましくは、移植後70日よりも後まで、最も好ましくは、移植後90日よりも後まで延長される、項目87〜95のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
97.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
a)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のホモ接合性ノックアウト、
b)ヒトCD46遺伝子の挿入、及び
c)ヒトトロンボモジュリン遺伝子の挿入
を有する、項目87〜96のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
98.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
a)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、CMAH遺伝子及びB4GALNT2遺伝子のホモ接合性ノックアウト、及び
b)ヒトCD46遺伝子、ヒトCD55遺伝子、ヒトCD59遺伝子、ヘムオキシゲナーゼ1遺伝子及びA20遺伝子の挿入
を有する、項目87〜96のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
99.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
c)LEA遺伝子又はPDL-1遺伝子の挿入
を更に有する、項目98に従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
100.LEA遺伝子が、配列番号1に示されるようなLEA29Yである、項目99に従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
101.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、以下の遺伝子改変:
d)ヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼをコードする配列の挿入
を更に有する、項目97〜100のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
102.降圧剤が、以下のリスト:利尿薬、カルシウムチャネルブロッカー、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、アンジオテンシンII受容体アンタゴニスト、アドレナリン受容体アンタゴニスト、血管拡張剤、レニン阻害剤、アルドステロン受容体アンタゴニスト、アルファ-2アドレナリン受容体アゴニスト及びエンドセリン受容体ブロッカーから選択される1種又は複数の薬剤である、好ましくは、降圧剤が、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤及びアドレナリン受容体アンタゴニストから選択される、より好ましくは、降圧剤が、エナラプリル及び/又はメトプロロール酒石酸塩である、最も好ましくは、降圧剤が、エナラプリル及びメトプロロール酒石酸塩である、項目87〜101のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
103.移植後2日以内の組成物の第1の投与を含む投薬レジメンに従って投与される、項目87〜102のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
104.レシピエント生物の平均動脈圧が70〜90mmHgの範囲内で、好ましくは、75〜85mmHgの範囲内で維持されるように投与される、項目87〜103のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
105.レシピエント生物が、投薬レジメンに従って免疫抑制誘導療法を受けており、投薬レジメンが、移植前の1種又は複数の免疫抑制剤の投与を含んでいた、項目87〜104のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
106.免疫抑制誘導療法の投薬レジメンが、以下のリスト:抗CD20抗体、抗胸腺細胞グロブリン(ATG)及び抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fabから選択される1種又は複数の免疫抑制剤を投与する工程を含んでいた、好ましくは、投薬レジメンが、上記の免疫抑制剤のすべてを投与する工程を含んでいた、項目105に従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
107.レシピエント生物が、投薬レジメンに従って免疫抑制誘導療法を受け、投薬レジメンが、移植後の1種又は複数の免疫抑制剤の投与を含み、投薬レジメンが、移植後1日以内に行われたグルココルチコイドの第1の投与を含む、項目87〜106のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
108.免疫抑制維持療法の投薬レジメンが、グルココルチコイドの第1の投与の当日の9mg/kg/日〜11mg/kg/日の投与量でのグルココルチコイドの投与を含む、項目107に従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
109.免疫抑制維持療法の投薬レジメンが、グルココルチコイドと、以下のリスト:抗CD20抗体、抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fab及びミコフェノール酸モフェチル(MMF)から選択される1種又は複数の免疫抑制剤とを投与する工程を含む、好ましくは、投薬レジメンが、グルココルチコイド、抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fab及びミコフェノール酸モフェチル(MMF)を投与する工程を含む、最も好ましくは、投薬レジメンが、グルココルチコイド、抗CD20抗体、抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fab及びミコフェノール酸モフェチル(MMF)を投与する工程を含む、項目107又は108に従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
110.投薬レジメンに従ってレシピエント生物に投与されるグルココルチコイドの投与量(mg/kg/日)が、移植後5日以内に5分の1以下、好ましくは、10分の1以下に減少している、項目107〜109のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
111.レシピエント生物が、投薬レジメンに従って抗炎症療法を受ける、項目87〜110のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
112.抗炎症療法の投薬レジメンが、以下のリスト:IL-6-受容体抗体、TNFα阻害剤及びIL-1-受容体アンタゴニストから選択される1種又は複数の抗炎症剤を投与する工程を含み、好ましくは、投薬レジメンが、上記の抗炎症剤のすべてを投与する工程を含む、項目111に従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
113.レシピエント生物が、投薬レジメンに従ってmTOR阻害剤が投与される、項目87〜112のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
114. mTOR阻害剤が、以下のリスト:ダクトリシブ(BEZ235、NVP-BEZ235)、ラパマイシン(シロリムス)、エベロリムス(RAD001)、AZD8055、テムシロリムス(CCI-779、NSC683864)、SF2523、3BDO、PI-103、KU-0063794 I、トルキニブ(PP242)、リダフォロリムス(デフォロリムス、MK-8669)、サパニセルチブ(INK128、MLN0128)、ボクスタリシブ(SAR245409、XL765)類似体、トリン1、オミパリシブ(GSK2126458、GSK458)、OSI-027、PF-04691502、アピトリシブ(GDC-0980、RG7422)、GSK1059615、ゲダトリシブ(PF-05212384、PKI-587)、WYE-354、ビスツセルチブ(AZD2014)、トリン2、WYE-125132(WYE-132)、BGT226(NVP-BGT226)、パロミド529(P529)、PP121、WYE-687、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、ゾタロリムス(ABT-578)、CZ415、MHY1485、ボクスタリシブ(XL765、SAR245409)、クリソファン酸及びCC-223、LY3023414から選択される、好ましくは、mTOR阻害剤が、テムシロリムスである、項目113に従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
115.投薬レジメンが、移植後10日以内に、好ましくは、移植後2日から9日の間に、より好ましくは、移植後4日から7日の間に行われたmTOR阻害剤の第1の投与を含む、項目113又は114に従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
116.mTOR阻害剤が、第1の投与及びその後毎日の投与を含む投薬レジメンに従って投与される、項目113〜115のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
117.移植前に異種ドナー生物由来の心臓、腎臓、肺又は肝臓が、非虚血性保存によって保存されていた、項目87〜116のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
118.非虚血性保存が、非虚血性心臓、腎臓、肺又は肝臓灌流である、項目117に従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
119.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された心臓である、項目87〜118のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
120.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された腎臓である、項目87〜118のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
121.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された肺である、項目87〜118のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
122.遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が、遺伝子改変された肝臓である、項目87〜118のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
【００１１】
項目30〜50における生存している霊長類の特徴及び/又は項目51〜122の組成物の特徴もまた、項目1〜29の方法又は方法のレシピエントに当てはまり得るということが認められよう。
【００１２】
上記のように、本発明者らは、驚くべきことに、遺伝子改変された心臓が移植されるレシピエント生物の生存を延長する方法が実施される、及び/又は本発明に従って組成物が投与される場合に、心臓レシピエントの生存が有意に延長されることを見出した。更に、本発明に従って方法が実施される、及び/又は組成物が投与される場合に、移植された心臓は、レシピエントにおいて過成長しない、心臓関連巨視的(例えば、心室壁及び心室腔の外観における)、顕微鏡的(例えば、心臓の免疫組織学的解析における)、機能的(例えば、心エコー検査における)又は生化学的(例えば、血液値における)異常は、全く観察されない、又はわずかしか観察されない(図1及び図6、特に、以下の図6の簡単な説明を参照のこと)。
【００１３】
レシピエント生物の生存を延長する上記の方法では、前記レシピエント生物は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植される。同様に、上記の生存している霊長類は、異種哺乳動物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植されており、上記のmTOR阻害剤/降圧剤を含む組成物は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するためのものである。したがって、本発明はまた、一実施形態では、このような遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓の異種ドナー生物として働き得る、遺伝子改変された哺乳動物を提供する。この遺伝子改変された哺乳動物は、ヒト補体調節タンパク質をコードする配列の挿入部分並びにヒトトロンボモジュリンをコードする配列の挿入部分を有する。これらの配列の両方とも、内因性N-アセチルラクトサミニドアルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座(以下では、GGTA1遺伝子座又はアルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座とも呼ばれる)中に挿入され、その結果、GGTA1遺伝子座は、中断され、GGTA1はもはや発現されない。ヒト補体調節タンパク質をコードする配列は、その発現が、内因性GGTA1プロモーターの制御下にあるように挿入される。この設計は、とりわけ、以下の利点を提供する:ヒト補体調節タンパク質をコードする配列並びにヒトトロンボモジュリンをコードする配列を、単一遺伝子座(すなわち、GGTA1遺伝子座)に導入することは、遺伝子改変された哺乳動物の育種の際のこれらの遺伝子の分離を妨げる。更に、GGTA1遺伝子座は、セーフハーバーからの十分な転写を可能にする転写活性部位であるとわかっている。したがって、本発明は、遺伝子改変された哺乳動物及び以下の項目において記載される好ましい実施形態を提供することによってそれを製造する方法を提供する。
【００１４】
123.以下の遺伝子改変:
a)ヒト補体調節タンパク質をコードする配列の挿入、及び
b)ヒトトロンボモジュリンをコードする配列の挿入
を有する遺伝子改変された哺乳動物であって、
ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座に挿入され、少なくともヒト補体調節タンパク質をコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の内因性プロモーターの制御下で発現され
遺伝子改変された哺乳動物が、非ヒトである、遺伝子改変された哺乳動物。
124.ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列の両方が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の内因性プロモーターの制御下で発現される、項目123の遺伝子改変された哺乳動物。
125.ヒト補体調節タンパク質をコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の内因性プロモーターの制御下で発現され、ヒトトロンボモジュリンをコードする配列が、外因性プロモーターの制御下で発現される、項目123の遺伝子改変された哺乳動物。
126.ヒトトロンボモジュリンをコードする配列の発現を制御する外因性プロモーターが、遍在的に活性なプロモーターである、項目125の遺伝子改変された哺乳動物。
127.遺伝子改変された哺乳動物が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を欠く、項目123〜126のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物。
128.ヒト補体調節タンパク質をコードする配列が、ヒトCD46、ヒトCD55又はヒトCD59をコードする配列である、項目123〜127のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物。
129.ヒト補体調節タンパク質をコードする配列が、ヒトCD46をコードする配列である、項目123〜128のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物。
130.遺伝子改変された哺乳動物が、以下の遺伝子改変:
c)CMAH遺伝子のホモ接合性ノックアウト、及び
d) B4GALNT2遺伝子のホモ接合性ノックアウト
を更に有する、項目123〜129のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物。
131.遺伝子改変された哺乳動物が、以下の遺伝子改変:
e)ヒト補体調節タンパク質をコードする配列とヒトトロンボモジュリンをコードする配列の間の選択マーカー遺伝子配列の挿入
を更に有する、項目123〜130のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物。
132.選択マーカー遺伝子配列が、loxP部位と隣接している、項目131の遺伝子改変された哺乳動物。
133.遺伝子改変された哺乳動物が、以下の遺伝子改変:
f)ヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼをコードする配列の挿入
を更に有する、項目123〜132のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物。
134.遺伝子改変された哺乳動物が、1つ又は複数の追加の遺伝子改変を有する、項目123〜133のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物。
135.1つ又は複数の追加の遺伝子改変が、挿入である、項目134の遺伝子改変された哺乳動物。
136.1つ又は複数の挿入が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座である、項目133又は135の遺伝子改変された哺乳動物。
137.遺伝子改変された哺乳動物が、イノシシ科に属する、好ましくは、遺伝子改変された哺乳動物が、イノシシ属に属する、より好ましくは、遺伝子改変された哺乳動物が、イノシシ種に属する、最も好ましくは、遺伝子改変された哺乳動物が、ブタ亜種に属する、項目123〜136のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物。
138.遺伝子改変された哺乳動物が、イノシシ種に属する、項目123〜137のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物。
139.遺伝子改変された哺乳動物が、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタ、デュロックブタ、シュヴェービッシュ-ヘリッシュブタ、ブラックミニブタ又はオークランド・アイランドブタである、好ましくは、ドナー哺乳動物が、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタである、項目123〜138のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物。
140.遺伝子改変された哺乳動物が、ブタ内因性レトロウイルスC(PERV-C)を有さない、項目123〜139のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物。
141.遺伝子改変された哺乳動物が、異種臓器移植片のドナー生物として働くのに適している、項目123〜140のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物。
142.項目123〜141のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物に由来する臓器。
143.項目123〜141のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物に由来する心臓。
144.項目123〜141のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物に由来する腎臓。
145.項目123〜141のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物に由来する肺。
146.項目123〜141のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物に由来する肝臓。
147.項目123〜141のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物に由来する細胞。
148.異種ドナー生物が、項目123〜141のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物である、項目1〜29のいずれかの方法。
149.異種ドナー哺乳動物が、項目123〜141のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物である、項目30〜50のいずれかに従う生存している霊長類。
150.異種ドナー生物が、項目123〜141のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物である、項目51〜86のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
151.異種ドナー生物が、項目123〜141のいずれかの遺伝子改変された哺乳動物である、項目87〜122のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
152.遺伝子改変された哺乳動物を作製する方法であって、
(a)ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列を、哺乳動物ゲノムのアルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座に挿入して、遺伝子改変されたゲノムを提供する工程と、
(b)遺伝子改変されたゲノムを細胞に導入する工程と、
(c)遺伝子改変されたゲノムを含む細胞が、遺伝子改変された哺乳動物に成熟するのを可能にする工程と
を含み、
遺伝子改変された哺乳動物が、非ヒトである、方法。
153.ゲノムが、体細胞ゲノムであり、遺伝子改変されたゲノムが、体細胞核移植によって細胞中に導入される、項目152の方法。
154.ヒト補体調節タンパク質をコードする配列が、ヒトCD46、ヒトCD55又はヒトCD59をコードする配列である、項目152又は153の方法。
155.ヒト補体調節タンパク質をコードする配列が、ヒトCD46をコードする配列である、項目152〜154のいずれかの方法。
156.ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座中に挿入される単一発現ベクター上に位置する、項目152〜155のいずれかの方法。
157.アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座中に挿入される発現ベクターが、ヒト補体調節タンパク質をコードする配列とヒトトロンボモジュリンをコードする配列の間に選択マーカー遺伝子配列を更に含む、項目156の方法。
158.選択マーカー遺伝子配列が、loxP部位と隣接している、項目157の方法。
159.ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座に挿入され、その結果、遺伝子改変された哺乳動物が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を欠く、項目152〜158のいずれかの方法。
160.ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座に挿入され、その結果、少なくともヒト補体調節タンパク質をコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の内因性プロモーターの制御下で発現される、項目152〜159のいずれかの方法。
161.ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座に挿入され、その結果、ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列の両方が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の内因性プロモーターの制御下で発現される、項目152〜160のいずれかの方法。
162.ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座に挿入され、その結果、ヒト補体調節タンパク質をコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の内因性プロモーターの制御下で発現され、ヒトトロンボモジュリンをコードする配列が、外因性プロモーターの制御下で発現される、項目152〜160のいずれかの方法。
163.外因性プロモーターが、遍在的に活性なプロモーターである、項目162の方法。
164.工程(b)の前に哺乳動物ゲノムのCMAH及びB4GALNT2遺伝子をノックアウトする工程を更に含む、項目152〜163のいずれかの方法。
165.工程(b)の前にヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼをコードする配列を、哺乳動物ゲノム中に挿入する工程を更に含む、項目152〜164のいずれかの方法。
166.ヒト補体調節タンパク質をコードする配列、ヒトトロンボモジュリンをコードする配列及びヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼをコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座中に挿入される単一発現ベクター上に位置する、項目165の方法。
167.工程(b)の前に1つ又は複数の追加の遺伝子改変を哺乳動物ゲノム中に導入する工程を更に含む、項目152〜166のいずれかの方法。
168.1つ又は複数の追加の遺伝子改変が、遺伝子挿入である、項目167の方法。
169.ヒト補体調節タンパク質をコードする配列、ヒトトロンボモジュリンをコードする配列及び1つ又は複数の追加の挿入が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座中に挿入される単一発現ベクター上に位置する、項目168の方法。
170.遺伝子改変が、CRISPR/Cas9、ZFN又はTALENを使用して導入される、項目152〜169のいずれかの方法。
171.遺伝子改変が、CRISPR/Cas9を使用して導入される、項目152〜170のいずれかの方法。
172.哺乳動物が、イノシシ科に属する、好ましくは、哺乳動物が、イノシシ属に属する、より好ましくは、哺乳動物が、イノシシ種に属する、最も好ましくは、哺乳動物が、ブタ亜種に属する項目152〜171のいずれかの方法。
173.哺乳動物が、イノシシ種に属する、項目152〜172のいずれかの方法。
174.哺乳動物が、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタ、デュロックブタ、シュヴェービッシュ-ヘリッシュブタ、ブラックミニブタ又はオークランド・アイランドブタである、好ましくは、哺乳動物が、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタである、項目152〜173のいずれかの方法。
175.哺乳動物が、ブタ内因性レトロウイルスC (PERV-C)を有さない項目152〜174のいずれかの方法。
176.遺伝子改変された哺乳動物が、異種臓器移植片のドナー生物として働くのに適している、項目152〜175のいずれかの方法。
177.項目152〜176のいずれかの方法によって得ることができる(又は得られる)遺伝子改変された哺乳動物。
178.異種ドナー生物が、項目177に従う遺伝子改変された哺乳動物である、項目1〜29のいずれかの方法。
179.異種哺乳動物が、項目177に従う遺伝子改変された哺乳動物である、項目30〜50のいずれかに従う生存している霊長類。
180.異種ドナー生物が、項目177に従う遺伝子改変された哺乳動物である、項目51〜86のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
181.異種ドナー生物が、項目177に従う遺伝子改変された哺乳動物である、項目87〜122のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
【００１５】
レシピエント生物における臓器過成長は、異種ドナー生物由来の(例えば、ブタ由来の)遺伝子改変された臓器が、レシピエント生物に(例えば、ヒヒに)移植される場合の大きな問題である。本発明に従って、臓器過成長は、処置の組合せ:(i)レシピエントの(例えば、ヒヒの)血圧を低下させて、ドナーの(例えば、ブタの)より低いレベルに対応すること、(ii)初期段階でコルチゾンを漸減すること及び/又は(iii)シロリムスプロドラッグであるテムシロリムスを使用して心筋肥大を緩和すること(実施例1〜4を参照のこと)によって相殺される。しかし、本発明者らは、ブタの(及び従ってその臓器の)成長は、成長ホルモン受容体(GHR)遺伝子をノックアウトすることによって遺伝的に相殺できることも見出した。本発明者らは、GHR-KO(GHR-ノックアウト)ブタの体重が、対照と比較して60%低減されること及びほとんどの臓器の重量が比例的に低減されることを見出した(実施例7を参照のこと)。更に、GHR-KOブタは、血清インスリン様成長因子1(IGF1)レベルを著しく低減した。際立ったことに、GHR-KOブタを、IGF1を用いて処置することによって、その成長を促進することが可能となろう(ラロン症候群を有する患者について参考文献88、108、109及び110に示される)。したがって、GHR-KOブタをIGF1を用いて処置することによって、ブタ及びその臓器の大きさを随意に調整できる。
【００１６】
上記を考慮して、本発明者らは、霊長類への異種移植のドナー生物として使用され得るGT-KO/hCD46/hTMブタにおいてGHR遺伝子をノックアウトした(実施例7を参照のこと)。したがって、本発明は、異種移植の適したドナーであるGHR-KO哺乳動物(例えば、ブタ)を提供し、その大きさ/臓器の大きさは、それらをIGF1を用いて処置することによって調整され得る。本発明に従う異種移植においてこのようなドナー哺乳動物を使用することは、本発明の上記の薬物処置と協調して、臓器過成長を相殺し得る。したがって、ドナーとしてGHR-KO哺乳動物を使用すると、mTOR阻害剤を用いるレシピエントの長期処置を避けることができる。最後に、ドナー臓器の大きさをレシピエントの要求に応じて調整可能であることは、比較的小さいドナー臓器を必要とする比較的小さい大きさのレシピエントにとって特に有用であり得る。
【００１７】
更に、本発明は、以下の項目に記載される好ましい実施形態を提供することによって、異種臓器移植片のドナー生物及びそれを製造する方法を提供する:
【００１８】
182.以下の遺伝子改変:
a)成長ホルモン受容体遺伝子のホモ接合性ノックアウト
を有し、
非ヒト哺乳動物である、異種臓器移植片のドナー生物。
183.以下の遺伝子改変:
b)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のホモ接合性ノックアウト、
c)ヒトCD46をコードする配列の挿入、及び
d)ヒトトロンボモジュリンをコードする配列の挿入
を更に有する、項目182のドナー生物。
184.以下の遺伝子改変:
b)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、CMAH遺伝子及びB4GALNT2遺伝子のホモ接合性ノックアウト、及び
c)ヒトCD46をコードする配列、ヒトCD55をコードする配列、ヒトCD59をコードする配列、ヘムオキシゲナーゼ1をコードする配列及びA20をコードする配列の挿入
を更に有する項目182のドナー生物。
185.ヘムオキシゲナーゼ1をコードする配列が、ヒトヘムオキシゲナーゼ1をコードし、A20をコードする配列が、ヒトA20をコードする、項目184のドナー生物。
186.以下の遺伝子改変:
d)LEA29Y又はPD-L1をコードする配列の挿入
を更に有する項目184又は185のドナー生物。
187.LEA29Yをコードする配列が、配列番号1に示される配列である、項目186のドナー生物。
188.PD-L1をコードする配列が、ヒトPD-L1をコードする、項目186のドナー生物。
189.以下の遺伝子改変:
e)ヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼをコードする配列の挿入
を更に有する項目182〜188のいずれかのドナー生物。
190.イノシシ科に属する、好ましくは、イノシシ属に属する、より好ましくは、イノシシ種に属する、最も好ましくは、ブタ亜種に属する項目182〜189のいずれかのドナー生物。
191.イノシシ種に属する、項目182〜190のいずれかのドナー生物。
192.ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタ、デュロックブタ、シュヴェービッシュ-ヘリッシュブタ、ブラックミニブタ又はオークランド・アイランドブタである、好ましくは、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタである、項目182〜191のいずれかのドナー生物。
193.ブタ内因性レトロウイルスC(PERV-C)を有さない、項目182〜192のいずれかのドナー生物。
194.項目123〜141のいずれかの遺伝子改変された生物である、項目182〜193のいずれかのドナー生物。
195.異種ドナー生物が、項目182〜194のいずれかに従うドナー生物である、項目1〜29のいずれかの方法。
196.異種哺乳動物が、項目182〜194のいずれかに従うドナー生物である、項目30〜50のいずれかに従う生存している霊長類。
197.異種ドナー生物が、項目182〜194のいずれかに従うドナー生物である、項目51〜86のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
198.異種ドナー生物が、項目182〜194のいずれかに従うドナー生物である、項目87〜122のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
199.異種臓器移植片のドナー生物を作製する方法であって、
(i)ドナー生物をIGF1を用いて処置することによってドナー生物のサイズを調整する工程
を含み、
ドナー生物が、以下の遺伝子改変:
a)成長ホルモン受容体遺伝子のホモ接合性ノックアウト
を有し
ドナー生物が、非ヒト哺乳動物である、方法。
200.IGF1を用いる処置が、ドナー生物の誕生後に開始される項目199の方法。
201.ドナー生物が、以下の遺伝子改変:
b)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のホモ接合性ノックアウト、
c)ヒトCD46をコードする配列の挿入、及び
d)ヒトトロンボモジュリンをコードする配列の挿入
を更に有する、項目199又は200の方法。
202.ドナー生物が、以下の遺伝子改変:
b)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、CMAH遺伝子及びB4GALNT2遺伝子のホモ接合性ノックアウト、及び
c)ヒトCD46をコードする配列、ヒトCD55をコードする配列、ヒトCD59をコードする配列、ヘムオキシゲナーゼ1をコードする配列及びA20をコードする配列の挿入
を更に有する、項目199又は200の方法。
203.ヘムオキシゲナーゼ1をコードする配列が、ヒトヘムオキシゲナーゼ1をコードし、A20をコードする配列が、ヒトA20をコードする、項目202の方法。
204.ドナー生物が、以下の遺伝子改変:
d)LEA29Y又はPD-L1をコードする配列の挿入
を更に有する、項目202又は203の方法。
205.LEA29Yをコードする配列が、配列番号1に示される配列である、項目204の方法。
206.PD-L1をコードする配列が、ヒトPD-L1をコードする、項目204の方法。
207.ドナー生物が、以下の遺伝子改変:
e)ヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼをコードする配列の挿入
を更に有する、項目199〜206のいずれかの方法。
208.ドナー生物が、イノシシ科に属する、好ましくは、ドナー生物が、イノシシ属に属する、より好ましくは、ドナー生物が、イノシシ種に属する、最も好ましくは、ドナー生物が、ブタ亜種に属する、項目199〜207のいずれかの方法。
209.ドナー生物が、イノシシ種に属する、項目199〜208のいずれかの方法。
210.ドナー生物が、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタ、デュロックブタ、シュヴェービッシュ-ヘリッシュブタ、ブラックミニブタ又はオークランド・アイランドブタである、好ましくは、ドナー生物が、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタである、項目199〜209のいずれかの方法。
211.ドナー生物が、ブタ内因性レトロウイルスC(PERV-C)を有さない、項目199〜210のいずれかの方法。
212.ドナー生物が、項目123〜141のいずれかに従う遺伝子改変された生物である、項目199〜210のいずれかの方法。
213.項目199〜212のいずれかの方法に従って得ることができる(又は得られる)異種臓器移植片のドナー生物。
214.異種ドナー生物が、項目213に従うドナー生物である、項目1〜29のいずれかの方法。
215.異種哺乳動物が、項目213に従うドナー生物である、項目30〜50のいずれかに従う生存している霊長類。
216.異種ドナー生物が、項目213に従うドナー生物である、項目51〜86のいずれかに従う使用のためのmTOR阻害剤を含む組成物。
217.異種ドナー生物が、項目213に従うドナー生物である、項目87〜122のいずれかに従う使用のための1種又は複数の降圧剤を含む組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】実施例2において報告した結果の例証。A、3つの実験群(I、薄い灰色のドット;II、濃い灰色の破線;III、黒色の線)の高感受性心筋トロポニンTレベル。群I(晶質性心筋保護)及び群II(非虚血性心臓潅流)の動物と対照的に、群III(非虚血性心臓潅流及び心臓肥大に対する処置)の動物は、実験全体を通して低レベルのトロポニンTを有し、正常な移植片の機能と肝臓の機能を示した。
【図１Ｂ】実施例2において報告した結果の例証。B、3つの実験群(I、薄い灰色のドット;II、濃い灰色の破線;III、黒色の線)のビリルビンレベル。群I(晶質性心筋保護)及び群II(非虚血性心臓潅流)の動物と対照的に、群III(非虚血性心臓潅流及び心臓肥大に対する処置)の動物は、実験全体を通して低レベルのビリルビンを有し、正常な移植片の機能と肝臓の機能を示した。
【図１Ｃ】実施例2において報告した結果の例証。C、群I、II及びIIIの同所性異種移植後の生存についてのカプランマイヤー曲線;最も長い実験は、90日の研究のエンドポイントに到達した後に、随意に終了させた;対数順位検定、p=0.0236。
【図１Ｄ】実施例2において報告した結果の例証。D、心エコー検査によって推定されるドナーの心臓のLV質量の増加。群IIの実験64のLV質量は、40日後に4倍になったが、一方、67(群III)のLV質量は、90日後も変化しないままであった。対照の心臓(実験64のドナーの同胞、Co)は、33日後に3倍になった。
【図１Ｅ】実施例2において報告した結果の例証。E、POD 30における説明後の実験57(群I)のブタドナーの心臓(左)及び比較のための動物自体の心臓(右)の画像。実験の終わりには、移植片は初期質量の230%に達し;ドナーの心臓とレシピエントの心臓は、移植の日にはほぼ同じサイズを有した。
【図１Ｆ】実施例2において報告した結果の例証。F、ホルマリン中での保存及び組織サンプリング後の、Eと同じ心臓。僧帽弁のおよそ1cm下を横方向に切断する;移植片のLVは広範囲に肥大し、LVの腔は消失した。
【図１Ｇ】実施例2において報告した結果の例証。G、POD 90における説明後の実験67(群III)のブタドナーの心臓(左)及び動物自体の心臓(右)の画像。僧帽弁のおよそ1cm下を横方向に切断する。LV壁の厚みは、実験の終わりに少しだけ増加し、LVの腔は消失しなかった。
【図１Ｈ】実施例2において報告した結果の例証。H、POD 40における実験64のブタドナーのLV心筋(左)及びレシピエントの肝臓(右)のHE染色。心筋:過好酸球増加症、リンパ球、好中球及びマクロファージの中程度の間質内浸潤、小血管の突発性血栓症による多源性の細胞壊死;肝臓:多源性の小葉中心細胞の空胞形成及び壊死、多源性の病巣内出血。
【図１Ｉ】実施例2において報告した結果の例証。I、POD 90における実験67のブタドナーのLV心筋及びレシピエントの肝臓のHE染色。心筋:リンパ球の非常に突発的な浸潤、多源性の軽症間質内浮腫;肝臓:肝細胞の小さな空胞変性(脂質型)。
【図１Ｊ】実施例2において報告した結果の例証。J、筋細胞のサイズ(WGA染色、スケールバー=50μm)を偽手術されたブタの心臓(対照、左)、実験64(群II、中央)及び実験67(群III、右)の代表的な心筋切片において示した。
【図１Ｋ】実施例2において報告した結果の例証。K、偽手術された心臓(Co)と比較して、実験67ではそうではないが、実験64では、筋細胞の横断面積が増加した(データを平均±SDとして表し;p値は表示された通りである、Holm-Sidakの多重比較検定による一元ANOVA)。
【図１Ｌ】実施例2において報告した結果の例証。L、対照(Co)と比較して、テムシロリムスによる処置後に、実験67においていずれも下方調節された、リン酸化されたmTORとPCNAのウエスタンブロット(心筋)。Co、対照;HE、ヘマトキシリンエオジン;LV、左心室;mTOR、ラパマイシンの機構的標的;POD、術後日数;PCNA、増殖細胞核抗原;WGA、コムギ胚芽凝集素。
【図２Ａ】心筋組織における免疫蛍光染色。3つの異なる群:実験番号57(群I、上の行)、実験番号64(群II、真中の行)及び実験番号67(群III、下の行)の例示的な染色。IgM沈着(A、緑色で示され、群I、群IIではかすかに緑色、群IIIでは非存在);核は常にDAPI(青色)で染色され、スケールバーは常に25μmを表す。
【図２Ｂ】心筋組織における免疫蛍光染色。3つの異なる群:実験番号57(群I、上の行)、実験番号64(群II、真中の行)及び実験番号67(群III、下の行)の例示的な染色。IgG沈着(B、すべての群において非存在);核は常にDAPI(青色)で染色され、スケールバーは常に25μmを表す。
【図２Ｃ】心筋組織における免疫蛍光染色。3つの異なる群:実験番号57(群I、上の行)、実験番号64(群II、真中の行)及び実験番号67(群III、下の行)の例示的な染色。核は常にDAPI(青色)で染色され、スケールバーは常に25μmを表す。群I、群IIのブタの心筋組織では、C3b/c(赤色)、C4b/c(緑色)(C)のわずかな沈着。群IIIではこのような知見は得られなかった。
【図２Ｄ】心筋組織における免疫蛍光染色。3つの異なる群:実験番号57(群I、上の行)、実験番号64(群II、真中の行)及び実験番号67(群III、下の行)の例示的な染色。核は常にDAPI(青色)で染色され、スケールバーは常に25μmを表す。群I、群IIのブタの心筋組織では、フィブリン(緑色、D)のわずかな沈着。群IIIではこのような知見は得られなかった。
【図２Ｅ】心筋組織における免疫蛍光染色の定量的測定。ImageJを使用して蛍光強度(それぞれn=5)を測定し、GraphPad Prismを使用して対応する値をプロットした。3つの群が示される:群I(番号57);群II(番号60、番号63、番号64)、及び群III(番号66、番号67)。E、IgM。バーは、平均±標準偏差である。
【図２Ｆ】心筋組織における免疫蛍光染色の定量的測定。ImageJを使用して蛍光強度(それぞれn=5)を測定し、GraphPad Prismを使用して対応する値をプロットした。3つの群が示される:群I(番号57);群II(番号60、番号63、番号64)、及び群III(番号66、番号67)。F、IgG。バーは、平均±標準偏差である。
【図２Ｇ】心筋組織における免疫蛍光染色の定量的測定。ImageJを使用して蛍光強度(それぞれn=5)を測定し、GraphPad Prismを使用して対応する値をプロットした。3つの群が示される:群I(番号57);群II(番号60、番号63、番号64)、及び群III(番号66、番号67)。G、C3b/c。C3b/c値を健康なブタの心臓において測定した対照(Co)の値と比較する;バーは、平均±標準偏差である。
【図２Ｈ】心筋組織における免疫蛍光染色の定量的測定。ImageJを使用して蛍光強度(それぞれn=5)を測定し、GraphPad Prismを使用して対応する値をプロットした。3つの群が示される:群I(番号57);群II(番号60、番号63、番号64)、及び群III(番号66、番号67)。H、C4b/c。C4b/c値を健康なブタの心臓において測定した対照(Co)の値と比較する;バーは、平均±標準偏差である。
【図２Ｉ】心筋組織における免疫蛍光染色の定量的測定。ImageJを使用して蛍光強度(それぞれn=5)を測定し、GraphPad Prismを使用して対応する値をプロットした。3つの群が示される:群I(番号57);群II(番号60、番号63、番号64)、及び群III(番号66、番号67)。I、フィブリン;バーは、平均±標準偏差である。
【図２Ｊ】非Gal抗体のレベル。J、ヒヒの血漿中の非Gal IgMの抗体レベル及び非Gal IgGの抗体レベル;GT-KO/hCD46/hTM PAECに対する抗体の結合;細胞を熱失活させたヒヒの血漿中でインキュベートし、IgGとIgMについて染色し、蛍光標識細胞分取(FACS)によって分析した。値は、蛍光強度の中央値(MFI)として表す。ヒヒの番号46は、陽性対照(灰色)としての役割を果たすその(異所的に胸腔内に移植した)ドナーの心臓の体液性拒絶を経験した;POD=術後の日数;Gal、α1,3-ガラクトシル。
【図２Ｋ】非Gal抗体のレベル。K、ヒヒの血漿中の非Gal IgMの抗体レベル及び非Gal IgGの抗体レベル;GT-KO/hCD46/hTM PAECに対する抗体の結合;細胞を熱失活させたヒヒの血漿中でインキュベートし、IgGとIgMについて染色し、蛍光標識細胞分取(FACS)によって分析した。値は、蛍光強度の中央値(MFI)として表す。ヒヒの番号46は、陽性対照(灰色)としての役割を果たすその(異所的に胸腔内に移植した)ドナーの心臓の体液性拒絶を経験した;POD=術後の日数;Gal、α1,3-ガラクトシル。
【図３】経肺熱希釈法及び術後のカテコラミン補充によって測定した血行動態データ。麻酔の誘導後(CPB前)且つ心肺バイパス術終了の60分後(CPB後)に血行動態の測定値を得た。群I(薄い灰色)のドナーの心臓は晶質性心筋保護を受け、群II(濃い灰色)及び群III(黒色)のドナーの心臓は連続的な高張性による冷却潅流で保存し;データを、中央値のバーを伴う散布図として表し、対応のあるt検定と対応のないt検定により有意差を分析した。A、CPB前後のSVI及びB、CPB前後のCI。両パラメーターは、群Iにおいて低下し、群II及び群IIIと比較した場合、CPB後の群Iの心臓でより低かった。C、CPB終了の60分後のカテコラミンの投薬量及びD、術後の昇圧及び変力作用療法の補充の持続期間。群Iは、群II及び群IIIと比較した場合、より多くのノルアドレナリン(NOR)及びエピネフリン(EPI)を必要とした。群Iの動物は、より長時間エピネフリンによる変力作用療法の補充を必要とした。CI、心指数;CPB、心肺バイパス術;EPI、エピネフリン;SVI、1回拍出係数;NOR;ノルアドレナリン。
【図４】経胸壁心エコー検査に由来する、心臓拡張期(左)及び心臓収縮期(右)の間のLVのサイズについての画像。A、実験64(群II、生存40日):LV質量は、POD 38において303%増加し、心臓拡張機能及び心臓収縮機能は心筋肥大によって大いに損なわれ、心室内の腔が減少した。LV FSは、POD 1とPOD 38において32%と14%であった。動物は心不全の兆候を有した。これらの知見は、群I及び群IIの他の実験と類似した。B、実験67(群III、生存90日):実験64と対照的に、LV質量は、POD 82において22%しか増加せず、心臓拡張機能及び心臓収縮機能は保存された。LV FSは、POD 1とPOD 82において27%と34%であった。動物は心不全の兆候を有さなかった。C、ブタ5157(対照、実験64のドナーの同胞):LV質量は、POD 33において187%増加したが、心臓拡張機能及び心臓収縮機能は保存された。LV FSは、POD 1とPOD 33において32%と41%であった。移植した同胞の心臓(実験64)と比較して、LVのサイズはほとんど成長せず、心筋肥大も心不全も示さなかった。FS、短縮率;LV、左心室;POD、術後の日数
【図５】それぞれ、LV質量(黒色のドット)、血小板数(濃い灰色の線)とLDH値(薄い灰色の破線)の間の相関。A、レシピエント64(群II)においてPOD 20辺りで、LV質量はより激しく増加したが、血小板は下降し、LDHは増加した。B、これらの知見を、LV質量が安定なままであったレシピエント67(群III)と対比した。LV、左心室;POD、術後の日数。
【図６】異種心臓移植後のブタ移植片の経胸壁心エコー検査による中乳頭の短軸像(ビデオスチール)。A、移植した臓器の過剰成長の例、実験64(群II、POD 30):LVの筋肉壁は肥厚し、心機能は低下した;LVの腔はかなり消失した;壁運動は消失した;末期的な心不全の兆候があり;それに引き続いて末期的な肝不全の兆候があった。これらの知見は、群I及び群IIの他の実験と類似した。B、実験67(群III、POD 57):実験64と対照的に、LVの筋肉壁は変化しないままであり、LVとRVの機能は十分に保存された;LVの腔のサイズは正常であった;ほぼ正常なポンプ機能もあり;心不全又は肝不全の兆候はなかった。RV、右心室;LV、左心室
【図７】免疫抑制の誘導及び維持療法の例示的な投与レジメン並びにmTOR阻害剤投与の例示的な投与レジメンのフローチャート。タイムラインのそれぞれにあるマークは投与を表す。メチルプレドニゾロンのタイムラインのマークの下の数は、それぞれの投薬量(mg/kg/日)を表す。HTX、心臓移植;ATG、抗胸腺グロブリン;i.v.、静脈内。
【図８】抗炎症療法の例示的な投与レジメンのフローチャート。HTX、心臓移植;i.v.、静脈内;s.c.、皮下。タイムラインのそれぞれにあるマークは投与を表す。
【図９】降圧剤による処置の例示的な投与レジメンのフローチャート。HTX、心臓移植;i.v.、静脈内。タイムラインのそれぞれにあるマークは投与を表す。
【図１０Ａ】例示的な異種心臓移植技法。A、同所性心臓移植。レシピエントの心臓を心房レベルで除去し;上行大動脈と肺動脈を切除する。次いで、それに応じてドナーの臓器を接続する。
【図１０Ｂ】例示的な異種心臓移植技法。B、胸腔内異所性心臓移植。右の胸部において、ドナーの臓器をレシピエントの心臓右に配置する。端と端を吻合するため、2つの共通の心房が存在する。上行大動脈、肺動脈のレベルで(後者は、移植挿入物を必要とする)、血液量が2つの端から端への接続を介して両方の心臓によって駆出される。両臓器は同調的に作動しない。心拍出量の両臓器の負担は、それぞれの前負荷に依存し、同様に、2つの心臓の拍動周期の部分に関連する。
【図１０Ｃ】例示的な異種心臓移植技法。C、異所性腹部移植。冠動脈のみが潅流され(腹部大動脈を介して)、冠静脈血は右心房、次いで右心室に入る。これは、肺動脈を介して下大静脈へと駆出される。心臓は拍動しているが、作動していない。図面は、Mohiuddin, Reichartら、2015から改作した。
【図１１Ａ】同所性異種移植後の生存率、実験室パラメーター、剖検及び組織学。A、群I(薄い灰色のドット;n=5頭の動物)、群II(濃い灰色の破線:n=4頭の動物)及び群III(黒色の線;n=5頭の動物)の生存率のカプランマイヤー曲線。両側対数順位検定、P=0.0007。
【図１１Ｂ】同所性異種移植後の生存率、実験室パラメーター、剖検及び組織学。B、心筋トロポニンT(B)の血清中濃度。
【図１１Ｃ】同所性異種移植後の生存率、実験室パラメーター、剖検及び組織学。C、ビリルビン(C)の血清中濃度。
【図１１Ｄ】同所性異種移植後の生存率、実験室パラメーター、剖検及び組織学。D、動物9(群II)、動物11及び動物13(いずれも群III)からの異種移植した心臓の左心室(LV)質量;テムシロリムスの中断(矢印)後に増加した移植片の成長に留意されたい。
【図１１Ｅ】同所性異種移植後の生存率、実験室パラメーター、剖検及び組織学。E、心筋細胞の断面積の定量的分析。データは平均±s.d.であり、P値を、Holm-Sidak多重比較検定に関する一元配置分散分析(ANOVA)(それぞれ5〜8回の測定値を有するn=3の生物学的に独立した試料)で表示する。
【図１１Ｆ】同所性異種移植後の生存率、実験室パラメーター、剖検及び組織学。F、動物11及び動物12の移植された心臓からの心筋のウエスタンブロット分析により、年齢の適合した対照試料と比較してmTORのリン酸化(p-mTOR)の低減が示された。n=2、群III;n=2、対照。
【図１２Ａ】心筋組織における抗体、補体及びフィブリンの定量的評価並びに非ガラクトース-α1,3-ガラクトース異種反応性抗体の血清中レベル。A、蛍光強度の定量的評価(n=実験当たり5〜10回の測定値を有する9個の生物学的に独立した試料;代表的な画像については図2A〜図2Dを参照のこと)。IgM(A)について、生の総輝度値を示す。群I(動物3);群II(動物6、動物8、動物9);群III(動物11〜動物14)。データは、平均±s.d.である。
【図１２Ｂ】心筋組織における抗体、補体及びフィブリンの定量的評価並びに非ガラクトース-α1,3-ガラクトース異種反応性抗体の血清中レベル。B、蛍光強度の定量的評価(n=実験当たり5〜10回の測定値を有する9個の生物学的に独立した試料; 代表的な画像については図2A〜図2Dを参照のこと)。IgG(B)について、生の総輝度値を示す。群I(動物3);群II(動物6、動物8、動物9);群III(動物11〜動物14)。データは、平均±s.d.である。
【図１２Ｃ】心筋組織における抗体、補体及びフィブリンの定量的評価並びに非ガラクトース-α1,3-ガラクトース異種反応性抗体の血清中レベル。C、蛍光強度の定量的評価(n=実験当たり5〜10回の測定値を有する9個の生物学的に独立した試料; 代表的な画像については図2A〜図2Dを参照のこと)。C3b/c (C)について、生の総輝度値を示す。群I(動物3);群II(動物6、動物8、動物9);群III(動物11〜動物14)。C3b/c値を健康なブタの心臓において測定した対照のC3b/c値と比較する。データは、平均±s.d.である。
【図１２Ｄ】心筋組織における抗体、補体及びフィブリンの定量的評価並びに非ガラクトース-α1,3-ガラクトース異種反応性抗体の血清中レベル。D、蛍光強度の定量的評価(n=実験当たり5〜10回の測定値を有する9個の生物学的に独立した試料; 代表的な画像については図2A〜図2Dを参照のこと)。C4b/c (D)について、生の総輝度値を示す。群I(動物3);群II(動物6、動物8、動物9);群III(動物11〜動物14)。C4b/c値を健康なブタの心臓において測定した対照のC4b/c値と比較する。データは、平均±s.d.である。
【図１２Ｅ】心筋組織における抗体、補体及びフィブリンの定量的評価並びに非ガラクトース-α1,3-ガラクトース異種反応性抗体の血清中レベル。E、蛍光強度の定量的評価(n=実験当たり5〜10回の測定値を有する9個の生物学的に独立した試料; 代表的な画像については図2A〜図2Dを参照のこと)。フィブリン(E)について、生の総輝度値を示す。群I(動物3);群II(動物6、動物8、動物9);群III(動物11〜動物14)。データは、平均±s.d.である。
【図１２Ｆ】心筋組織における抗体、補体及びフィブリンの定量的評価並びに非ガラクトース-α1,3-ガラクトース異種反応性抗体の血清中レベル。F、ヒヒの血漿における非ガラクトース-α1,3-ガラクトース異種反応性IgM抗体のレベル;ヒトCD46及びトロンボモジュリンを発現するα-ガラクトシルトランスフェラーゼ-ノックアウトブタ大動脈内皮細胞に対する抗体結合を蛍光標識細胞分取によって分析した。値は、平均蛍光強度として表す。動物6、動物9及び動物10は、抗CD40L PAS化Fabを受け、他の動物は、抗CD40モノクローナル抗体で処置した。異所的に胸腔内に移植したブタの心臓を拒絶したヒヒ由来の血漿が陽性対照としての役割を果たした。
【図１２Ｇ】心筋組織における抗体、補体及びフィブリンの定量的評価並びに非ガラクトース-α1,3-ガラクトース異種反応性抗体の血清中レベル。G、ヒヒの血漿における非ガラクトース-α1,3-ガラクトース異種反応性IgG抗体のレベル;ヒトCD46及びトロンボモジュリンを発現するα-ガラクトシルトランスフェラーゼ-ノックアウトブタ大動脈内皮細胞に対する抗体結合を蛍光標識細胞分取によって分析した。値は、平均蛍光強度として表す。動物6、動物9及び動物10は、抗CD40L PAS化Fabを受け、他の動物は、抗CD40モノクローナル抗体で処置した。異所的に胸腔内に移植したブタの心臓を拒絶したヒヒ由来の血漿が陽性対照としての役割を果たした。
【図１３Ａ】経肺熱希釈法及び術後のカテコラミン補充によって測定した血行動態データ。麻酔の誘導後(前)且つCPB終了の60分後(後)に測定値を得た。群I(薄い灰色)のドナーの心臓は晶質性心筋保護を受け、群II(濃い灰色)及び群III(黒色)のドナーの心臓は連続的な高張性による冷却潅流で保存した;データを、ドットとして示される個体に関して平均±s.d.の散布図として表す;n=14頭の動物、対応のある両側t検定と対応のないt検定、P値は表示された通りである。A、1回拍出係数。両方のパラメーターは群Iにおいて低下し、群II及び群IIIにおけるよりもCPB後の群Iにおいてより低かった
【図１３Ｂ】経肺熱希釈法及び術後のカテコラミン補充によって測定した血行動態データ。麻酔の誘導後(前)且つCPB終了の60分後(後)に測定値を得た。群I(薄い灰色)のドナーの心臓は晶質性心筋保護を受け、群II(濃い灰色)及び群III(黒色)のドナーの心臓は連続的な高張性による冷却潅流で保存した;データを、ドットとして示される個体に関して平均±s.d.の散布図として表す;n=14頭の動物、対応のある両側t検定と対応のないt検定、P値は表示された通りである。B、CPB前後の心係数。両方のパラメーターは群Iにおいて低下し、群II及び群IIIにおけるよりもCPB後の群Iにおいてより低かった。
【図１３Ｃ】経肺熱希釈法及び術後のカテコラミン補充によって測定した血行動態データ。麻酔の誘導後(前)且つCPB終了の60分後(後)に測定値を得た。群I(薄い灰色)のドナーの心臓は晶質性心筋保護を受け、群II(濃い灰色)及び群III(黒色)のドナーの心臓は連続的な高張性による冷却潅流で保存した;データを、ドットとして示される個体に関して平均±s.d.の散布図として表す;n=14頭の動物、対応のある両側t検定と対応のないt検定、P値は表示された通りである。C、CPB終了の60分後のカテコラミンの投薬量。群Iの動物は、群II及び群IIIの動物よりも多くのノルアドレナリン及びアドレナリンを必要とした。
【図１３Ｄ】経肺熱希釈法及び術後のカテコラミン補充によって測定した血行動態データ。麻酔の誘導後(前)且つCPB終了の60分後(後)に測定値を得た。群I(薄い灰色)のドナーの心臓は晶質性心筋保護を受け、群II(濃い灰色)及び群III(黒色)のドナーの心臓は連続的な高張性による冷却潅流で保存した;データを、ドットとして示される個体に関して平均±s.d.の散布図として表す;n=14頭の動物、対応のある両側t検定と対応のないt検定、P値は表示された通りである。D、術後の昇圧及び変力作用療法の補充の持続期間。群Iの動物は、より長時間アドレナリンによる変力作用療法の補充を必要とした。
【図１４】追加の実験室パラメーター。A、B、群I(図の黒/白バージョンにおける薄い灰色のドット;図のカラーバージョンにおける黒色の線)、群II(図の黒/白バージョンにおける濃い灰色の破線;図のカラーバージョンにおける赤色の線)及び群III(図の黒/白バージョンにおける黒色の線;図のカラーバージョンにおける赤紫色の線)の動物における乳酸デヒドロゲナーゼの血清中濃度(A)及び血小板数(B)。群I及び群IIにおいて、実験の終わりに、血小板数は減少し、一方、LDHは増加した。群IIIの動物は、これらの変化を示さなかった。
【図１５Ａ】死後の心筋標本の免疫組織化学。A、ヒト膜補因子タンパク質(hCD46)(A)の発現は、すべてのドナーの臓器において一貫していた(1〜14)。スケールバー、50μm。n=14頭のGTKO/hCD46/hTMブタ;n=1頭の野生型のブタ(対照)。すべての動物に由来する生物学的な試料を示す。
【図１５Ｂ】死後の心筋標本の免疫組織化学。B、ヒトトロンボモジュリン(hTM)(B)の発現は、すべてのドナーの臓器において一貫していた(1〜14)。スケールバー、50μm。n=14頭のGTKO/hCD46/hTMブタ;n=1頭の野生型のブタ(対照)。すべての動物に由来する生物学的な試料を示す。
【図１６】Revivicorによって与えられるGGTA1-KO/hCD46トランスジェニックブタのhCD46導入遺伝子の遺伝子座のナノポアシーケンシングによって、マウスのMHCプロモーターに駆動される発現カセットにおけるヒトFUT1コード配列の少なくとも2つの組み込み体の存在が明らかとなる。2つの組み込み体(右側に1及び2で標識した)は、隣接するhCD46導入遺伝子の複製の方向によって明確に識別することができる。
【図１７】5頭の2年齢、雌、野性型のブタ由来の異なる組織におけるGGTA1、CMAH及びB4GALNT2の転写物存在量の平均。RNAシーケンシングによって発現のプロファイリングを実施した。TPM(百万当たりの転写物数(Transcripts Per Million);参考文献106を参照のこと)は、試料内の異なる遺伝子の発現レベルを比較するのに有用な転写物の存在量の計量である。TPMは、百万リード毎に正規化することによって貴殿のライブラリーの深さを考慮し、また、各データ点を塩基数での転写物の長さで除して、遺伝子長を制御する。
【図１８】ドナーのブタの遺伝子操作に関する戦略。GGTA1、CMAH及びB4GALNT2遺伝子をCRISPR/Cas9によって不活性化することになる。次いで、プロモーターを有さないhCD46ミニ遺伝子、loxPが導入された選択可能なマーカー遺伝子(SMG)を含むカセット、及びhTM発現カセットをGGTA1遺伝子座へと挿入し、その結果、hCD46の発現がGGTA1調節配列によって駆動される。1つ又はいくつかの追加の導入遺伝子を含有する操作されたBACとのCre媒介性カセットの交換によって、追加の導入遺伝子を挿入することができる。
【図１９】CRISPR/Cas技術を使用するGHR欠損ブタモデルの生成。GHRエクソン3の部分的DNA配列。sgRNA結合部位を配列の下に実線で示し、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を配列の下に破線で示す。1bp(創始者番号2529)又は7bp(創始者番号2533)の挿入(配列の下の二重線)によってリーディングフレームのシフトがもたらされた。WT=野生型。
【図２０】CRISPR/Cas技術を使用するGHR欠損ブタモデルの生成。GHR-KOブタにおいて機能的GHR(対照において暗色に染色)の非存在を実証するリガンド免疫組織化学。色素原:DAB;対比染色:Mayerのヘマラム;バー=10μm。
【図２１】対照のブタと比較したGHR-KOの血清中のIGF1、IGFBP及びGHの濃度。A、血清中IGF1値の平均及び標準偏差(GHR-KO:n=42;対照:n=69)。B、GHR-KO(n=10)及び対照のブタ(n=12)由来の血清中のIGFBP3及びIGFBP2の定量。図は、中央値、25及び75パーセンタイル(箱)、並びに極値(ひげ)を示す。C、GH曲線下面積(AUC;6頭の雌のGHR-KO及び5頭の雌/1頭の雄の対照のブタについて、平均及び標準偏差)。AU=任意単位。*p<0.05;***p<0.001。
【図２２】対照のブタと比較した体重増加及びGHR-KOの成長。A、6カ月齢のGHR-KOブタ(前)及び対照の同腹子。B、体重増加。12頭のGHR-KOブタと25頭の対照のブタにおいてパラメーターを決定した。パネルBは、群*年齢について推定される最小二乗平均(LSM)とLSMの標準誤差とを示す。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;ns=有意差なし。
【図２３Ａ】対照のブタと比較してGHR-KOブタにおいて反比例する臓器の成長。GHR欠損は、臓器のサイズの比例した低下と反比例した低下をもたらした。A、対照のブタ(左)とGHR-KOブタ(右)に由来する代表的な臓器。
【図２３Ｂ】対照のブタと比較してGHR-KOブタにおいて反比例する臓器の成長。GHR欠損は、臓器のサイズの比例した低下と反比例した低下をもたらした。B、臓器の絶対質量及び臓器の質量対体重比(臓器の相対質量)におけるGHR-KOブタと対照のブタとの間の相対的差異。9頭のGHR-KOブタと25頭の対照のブタにおいてこれらのパラメーターを決定し、最小二乗平均(LSM)とLSMの標準誤差とを2つの群について推定した。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。
【図２４Ａ】A、対照のブタと比較した6カ月齢のGHR-KOの体組成。DXA分析により、GHR-KOブタにおいて有意に高い総体脂肪量が明らかになった(GHR-KO:n=12;対照:n=25;***p<0.001)。パネルAは、2つの群について推定した最小二乗平均(LSM)とLSMの標準誤差を示す。
【図２４Ｂ】B、GHR-KOブタと対照のブタにおけるグルコースの週齢に依存する変化。B、GHR-KOブタにおける一過性の若年性低血糖症。群及び週齢分類当たり少なくとも6頭の動物を調査した。パネルBは、群*週齢について推定した最小二乗平均(LSM)とLSMの標準誤差を示す。*P<0.05;**p<0.01。
【図２４Ｃ】C、GHR-KOブタと対照のブタにおける脂質恒常性パラメーターの週齢に依存する変化。血清中の(C)トリグリセリド濃度は、週齢が適合する対照におけるよりも若いGHR-KOブタにおいて有意に低下したが、年齢について正規化した。群及び週齢分類当たり少なくとも6頭の動物を調査した。パネルCは、群*週齢について推定した最小二乗平均(LSM)とLSMの標準誤差を示す。*P<0.05;**p<0.01。
【図２４Ｄ】D、GHR-KOブタと対照のブタにおける脂質恒常性パラメーターの週齢に依存する変化。血清中の(D)コレステロール濃度は、週齢が適合する対照におけるよりも若いGHR-KOブタにおいて有意に低下したが、年齢について正規化した。群及び週齢分類当たり少なくとも6頭の動物を調査した。パネルDは、群*週齢について推定した最小二乗平均(LSM)とLSMの標準誤差を示す。*P<0.05;**p<0.01。
【図２５】GHR欠損のGGTA1-KO、hCD46/hTBMトランスジェニックブタの生成。初代細胞をGGTA1-KO、hCD46/hTBMトランスジェニックブタから単離し、Cas9発現プラスミド及びブタGHRエクソン3に特異的なガイドRNAを転写するプラスミドを同時にトランスフェクトした。二対立遺伝子のGHR突然変異細胞クローンを体細胞核移入に使用し、クローニングした胚を発情周期が同時に起こるレシピエントの若い雌ブタに移し、その結果GHR欠損のGGTA1-KO、hCD46/hTBMトランスジェニックブタが誕生した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に別段の定義がない限り、本発明で使用される用語は、当業者に公知のそれらの共通の意味に従って理解されなければならない。
【００２１】
本発明において、「含む(comprise)」及び「からなる(consist of)」という用語は、当技術分野で公知の意味を有する。本発明で使用される場合、「含む(comprise(s)」という用語は、任意選択で、各出現の際、「からなる(consist(s) of)」によって置き換えられ得る。
【００２２】
本明細書で引用されたすべての刊行物、特許及び特許出願は、すべての目的のためにその全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２３】
定義
「異種の」という用語は、当技術分野で公知の一般的な意味に従って使用される。したがって、本発明において使用される場合、「異種のドナー」とは、レシピエント生物とは異なる種のメンバーであるドナーである。「異種移植」とは、移植組織がレシピエント生物の種とは異なる種に由来する移植である。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「過成長」という用語は、一般に、特に、外因性因子のために(例えば、空間制限による圧迫)、又は内因性因子のために(例えば、不十分な微小血管循環による低酸素)臓器又は組織機能にとって有害である、臓器又は組織質量又は容積の何らかの増大を指す。したがって、心臓、腎臓又は肝臓が、レシピエント生物のそれぞれの臓器の生理学的範囲内の質量で移植される場合には、本発明の一実施形態では、「過成長」という用語は、臓器の質量が増大して生理学的質量よりも50%高い質量に到達したことを意味する。肺が、レシピエント生物の肺の生理学的範囲内の容量で移植される場合には、一実施形態では、「過成長」という用語は、肺の容量が増大して生理学的容量よりも50%大きい容量に到達したことを意味する。本明細書において使用される場合、生理学的範囲内の質量又は容量とは、それぞれ、それぞれのレシピエント生物のそれぞれの臓器の生理学的質量又は容量から+/-20%よりも、好ましくは、+/-10%よりも逸脱しない質量又は容量を意味する。臓器の生理学的質量又は容量は、共通一般知識に基づいて、任意の所与のレシピエントについて当業者によって決定され得る。臓器の例示的生理学的質量及び容量は、参考文献116及び117に示されている。好ましい実施形態では、本明細書において使用される場合、「過成長」という用語は、移植された臓器(例えば、心臓)が、移植後およそ1カ月以内に容量及び質量が3倍〜4倍になることを意味する。
【００２５】
「遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓」という用語は、本明細書において使用される場合、その細胞が人工的に改変されたゲノムを有する心臓/腎臓/肺/肝臓を指す。制限されるものではないが、このような人工改変は、例えば、外因性核酸の人工挿入及び/又は内因性核酸の欠失であり得る。当業者ならば、このような遺伝子改変を導入して、遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を得るための種々の方法に気付くであろう。例えば、突然変異を、動物の生殖系列中に人工的に導入でき、その結果、このような遺伝子改変された動物のすべての細胞がそのゲノム中にそれぞれの突然変異を有する。このような遺伝子改変された動物の心臓/腎臓/肺/肝臓は、本発明に従う遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓であろう。
【００２６】
「免疫抑制誘導療法」という用語は、本明細書において使用される場合、レシピエント生物に、前記レシピエント生物が移植組織を移植される前に投与される任意の免疫抑制療法を指す。したがって、本発明では、「免疫抑制誘導療法」という用語は、心臓/腎臓/肺/肝臓移植の前にレシピエント生物に投与される免疫抑制療法を指す。
【００２７】
「免疫抑制維持療法」という用語は、本明細書において使用される場合、レシピエント生物に、前記レシピエント生物が、移植組織を移植された後に投与される任意の免疫抑制療法を指す。したがって、本発明では、「免疫抑制維持療法」という用語は、心臓/腎臓/肺/肝臓移植後にレシピエント生物に投与される免疫抑制療法を指す。
【００２８】
「非虚血性保存」という用語は、本明細書において使用される場合、臓器のex vivo保存を指し、前記保存の間、前記臓器の細胞が十分な酸素供給、栄養分及びホルモンを受けることが確実にされる。例えば、本発明の一実施形態では、外科的に摘出された心臓/腎臓/肺/肝臓の「非虚血性保存」は、「非虚血性心臓/腎臓/肺/肝臓灌流」によって実施される。本明細書において使用される場合、「非虚血性心臓/腎臓/肺/肝臓灌流」という用語は、ex vivo心臓/腎臓/肺/肝臓保存を指し、前記心臓/腎臓/肺/肝臓の細胞の十分な酸素供給及びエネルギー、ホルモン需要を確実にするために、栄養分及びホルモンを補給した酸素運搬血液又は酸素運搬血液様流体が、前記心臓/腎臓/肺/肝臓の血管を通して送られる。
【００２９】
移植された心臓/腎臓/肺/肝臓によって心臓/腎臓/肺/肝臓を「機能的に置換すること」という用語は、本明細書において使用される場合、好ましくは、同所性置換を指すが、異所性支持体を、移植された心臓の場合には、胸腔内異所性支持体を指す場合もある。置換が同所性置換である場合には、置換は、移植された心臓/腎臓/肺/肝臓が、レシピエント自身の心臓/腎臓/肺/肝臓の機能を引き継ぐ置換である。このような機能的置換は、レシピエント生物の心臓/腎臓/肺/肝臓が移植に先立って除去されること及びドナー心臓/腎臓/肺/肝臓が、レシピエント生物において同所性(すなわち、天然の)位置に配置されることを必要とする。移植された心臓の場合には、置換が、胸腔内異所性支持体である場合には、置換は、例えば、ヒト状況において罹患しているレシピエントの心臓を支持する(参考文献24、図10Bを参照のこと)。異所性胸腔内置換では、レシピエント自身の心臓は、定位置のままであり、ドナー心臓は、血行動態的に並行に、右側に接続される、言い換えれば、ドナー臓器はレシピエントの心臓(例えば、臨床状態では、末期の病気である)を支持する(ちょうど記載したように)。当業者には明らかであろうが、移植された心臓の機能パラメーター(例えば、心拍数、心拍出量、駆出率、一回拍出量等)は、レシピエント自身の心臓の機能パラメーターと同一でない場合がある。それにもかかわらず、移植された心臓は、その機能パラメーターがレシピエントの生存を可能にする範囲内である場合には、レシピエントの心臓を機能的に置換すると考えられる。
【００３０】
「抗炎症療法」という用語は、本明細書において使用される場合、当技術分野で公知であり、抗炎症剤の投与を指す。当業者には公知であろうが、薬剤の抗炎症特性は、コンピュータで、in vitro及び/又はin vivoで評価され得る。例えば、薬剤は、前記薬剤が、異種タンパク質によって媒介される炎症性シグナルを低減若しくは阻害する、又は低減若しくは阻害すると予測される場合に、及び/又は前記薬剤が対象において炎症を低減若しくは阻害する場合に、抗炎症特性を有する(従って、抗炎症剤である)と考えられる。
【００３１】
本発明において定義されるような心臓/腎臓/肺/肝臓移植の時点は、移植された心臓/腎臓/肺/肝臓が、レシピエント生物の心臓/腎臓/肺/肝臓を機能的に置換し始める時点である。例えば、グルココルチコイドが「移植後1日以内」に投与される場合には、このようなグルココルチコイドの投与は、移植された心臓/腎臓/肺/肝臓が、レシピエント生物の心臓/腎臓/肺/肝臓を機能的に置換し始めるや否や開始し、翌日の最後に終了する期間内に生じる。したがって、移植が朝に実施される場合には、「移植後1日以内」という期間は、翌日の最後に、すなわち、24時間より多くの後に終了する。同様に、例えば、「移植後2日から9日の間」又は「移植後2から9日の間」又は「移植後2〜9日」という期間は、移植後2日目の始まりに開始し、移植後9日目の最後に終了する。投与が、例えば、「移植後5日」で生じるといわれる場合には、これは、移植後5日目での投与を指す。
【００３２】
「投与量(mg/kg/日)」という用語は、本明細書において使用される場合、1日あたりの対象の体重1キログラム(kg)あたりの対象に投与されるミリグラム(mg)での物質の投与量を指す。このような投与量は、単回投与で、若しくは1日にわたって分布する数回の投与で投与され得る、又は連続投与によって投与され得る。特定の係数分の1に投与量(mg/kg/日)を減少させる場合には、減少させた投与量は、前記係数によって第1の投与の投与量を除することによって算出される。例えば、グルココルチコイドが10mg/kg/日の初期投与量の免疫抑制維持療法の一部として投与される場合には、投与量を2mg/kg/日に減少させることは、5分の1への減少に相当する。
【００３３】
「平均動脈圧」という用語は、当技術分野で公知のその一般的な意味に従って使用され、単一心周期の間の対象の動脈における平均血圧を指す。当業者ならば、平均動脈圧を決定するための多数の方法を認識するであろう。
【００３４】
「内因性プロモーター」という用語は、本明細書において使用される場合、それぞれの哺乳動物のゲノム中に天然に存在するプロモーターを指す。対照的に、「外因性プロモーター」という用語は、本明細書において使用される場合、それぞれの哺乳動物のゲノム中に天然に存在しないプロモーターを指す。
【００３５】
「遍在的に活性なプロモーター」という用語は、本明細書において使用される場合、複数の組織及び細胞種において遺伝子の発現を駆動するプロモーターを指す。言い換えれば、遺伝子の発現が、遍在的に活性なプロモーターによって制御される場合には、発現は、組織特異的ではない。
【００３６】
「心臓/腎臓/肺/肝臓」という用語は、本明細書において使用される場合、心臓、腎臓、肺及び肝臓からなる群から選択される1つ又は複数の臓器を意味する。好ましい実施形態では、「心臓/腎臓/肺/肝臓」という用語は、本明細書において使用される場合、心臓、腎臓、肺又は肝臓を意味する。
【００３７】
実施形態
心臓/腎臓/肺/肝臓移植後の霊長類の生存を延長する方法
本発明は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓が移植されるレシピエント生物の生存を延長する方法に関する。とりわけ、本発明に従う方法の以下の態様の各々は、レシピエント生物の生存の延長に寄与する:(1)移植前にレシピエントに免疫抑制誘導療法を投与する工程。(2)移植まで非虚血性保存によって、ドナー生物から外科的に摘出された心臓/腎臓/肺/肝臓を保存する工程。(3) レシピエント生物に免疫抑制維持療法を投与する工程であって、移植後1日以内のグルココルチコイドの第1の投与を含み、前記グルココルチコイドの投与量(mg/kg/日)が、移植後5日以内に5分の1以下に減少する。(4)移植後レシピエント生物へ1種又は複数の降圧剤を投与する工程。(5)移植後レシピエント生物へmTOR阻害剤を投与する工程。上記の態様(単独又は組み合わせて)は、異種ドナー生物由来の心臓/腎臓/肺/肝臓が移植されているレシピエント生物の生存を、異種ドナー生物由来の心臓/腎臓/肺/肝臓が移植されているが、本発明に従って処置されていないレシピエント生物の生存と比較して延長する。本発明の一実施形態では、本発明の方法は、レシピエント生物の生存を、移植後40日よりも後まで、移植後50日よりも後まで、移植後60日よりも後まで、移植後70日よりも後まで、移植後80日よりも後まで、又は移植後90日よりも後まで延長する。好ましくは、本発明の方法は、レシピエント生物の生存を、移植後50日よりも後まで、より好ましくは、移植後70日よりも後まで、最も好ましくは、移植後90日よりも後まで延長する。
【００３８】
本発明では、レシピエント生物は、霊長類である、好ましくは、レシピエント生物は、オナガザル科に属する、より好ましくは、レシピエント生物は、ヒヒ属に属する、更により好ましくは、レシピエント生物は、アヌビスヒヒ又はマントヒヒ種に属する、最も好ましくは、レシピエント生物は、アヌビスヒヒ種に属する。ヒヒは、ヒトにおける心臓/腎臓/肺/肝臓移植のモデル生物として働き得る。したがって、本発明の別の実施形態では、レシピエント生物は、ヒト科に属する、好ましくは、レシピエント生物は、ヒト属に属する、より好ましくは、レシピエント生物は、ヒトである。本発明の代替実施形態では、レシピエント生物は、オナガザル科に、好ましくは、マカク(Macaca)属に、最も好ましくは、アカゲザル(M. mulatta)種に属する。
【００３９】
本発明では、ドナー生物は、哺乳動物である、好ましくは、ドナー生物は、イノシシ科に属する、より好ましくは、ドナー生物は、イノシシ属に属する、更により好ましくは、ドナー生物は、イノシシ種に属する、最も好ましくは、ドナー生物は、ブタ亜種に属する。好ましくは、ドナー生物は、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタ、デュロックブタ、シュヴェービッシュ-ヘリッシュブタ、ブラックミニブタ又はオークランド・アイランドブタ(2、3種の感染性微生物しか有さない、参考文献26を参照のこと)である、より好ましくは、ドナー生物は、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタである。この実施形態のすべてのその他の態様に従って、ドナー生物は、若齢である。
【００４０】
本発明に従って心臓、腎臓又は肝臓が移植される場合には、ドナー生物が、移植されるべき臓器の質量が、レシピエント生物のそれぞれの臓器の生理学的範囲内であるように選択されることが好ましい。生理学的範囲内の質量とは、本明細書において使用される場合、臓器の質量が、それぞれのレシピエント生物の臓器の生理学的質量から+/-20%よりも、好ましくは、+/-10%よりも逸脱しないことを意味する。本発明に従って肺が移植される場合には、ドナー生物が、肺の容量が、レシピエント生物の肺の生理学的範囲であるように選択されることが好ましい。生理学的範囲内の容量とは、本明細書において使用される場合、肺の容量が、それぞれのレシピエント生物の肺の生理学的容量から+/-20%よりも、好ましくは、+/-10%よりも逸脱しないことを意味する。任意の所与のレシピエントについて、臓器の生理学的質量又は容量は、共通一般知識に基づいて当業者によって決定され得る。臓器の例示的生理学的質量及び容量は、参考文献116及び117に示されている。当業者には明らかであろうが、生物の体重は、その臓器の質量及び容量の指標として働き得る。したがって、本発明の別の実施形態では、ドナー生物の体重は、レシピエント生物の体重から+/-20%よりも、好ましくは、+/-10%よりも逸脱しない。
【００４１】
本発明に従って心臓/腎臓/肺/肝臓は、レシピエント生物による移植拒絶を避けるために遺伝子改変される。当業者ならば、本発明に従うそれぞれのドナー生物及びそれぞれのレシピエント生物に応じて適した遺伝子改変を認識するであろう。一実施形態では、本発明の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓は、以下の遺伝子改変:(1)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のホモ接合性ノックアウト、(2)ヒトCD46遺伝子の挿入及び(3)ヒトトロンボモジュリン遺伝子の挿入を有する。ドナー生物が、イノシシ科に属し、レシピエント生物が、ヒヒ属に属する場合には、遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓は、任意選択で、上記の遺伝子改変(1)、すなわち、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のホモ接合性ノックアウトのみを有する場合がある。ドナー生物が、イノシシ科に属し、レシピエント生物が、ヒトである場合には、遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓は、好ましくは、上記の遺伝子改変(1)〜(3)のすべてを有する。別の実施形態では、本発明の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓は、以下の遺伝子改変:(1)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、CMAH遺伝子及びB4GALNT2遺伝子のホモ接合性ノックアウト、(2)ヒトCD46遺伝子、ヒトCD55遺伝子、ヒトCD59遺伝子、ヘムオキシゲナーゼ1遺伝子及びA20遺伝子の挿入及び任意選択で、(3)LEA遺伝子又はPDL-1(PD-L1、PDL1、CD274)遺伝子の挿入を有する。この実施形態の遺伝子改変の詳細は、参考文献23(その全文が本明細書に組み込まれる)に見出すことができる。この実施形態では、ヘムオキシゲナーゼ1遺伝子、A20遺伝子、LEA遺伝子及びPDL-1遺伝子は、任意の生物に由来し得るが、好ましくは、それらは、それぞれ、ヒトヘムオキシゲナーゼ1遺伝子、ヒトA20遺伝子、ヒトLEA遺伝子及びヒトPDL-1遺伝子である。上記の実施形態では、ヒトCD46遺伝子(huCD46)を挿入する場合には、好ましくは、以下のゲノム遺伝子座/コーディング領域から産生された任意の転写物に従う転写物が発現される:GRCH38p7、NC_000001、領域207752038〜207795516。より好ましくは、ヒトCD46遺伝子を挿入する場合には、導入遺伝子発現カセットから以下の転写物のうち少なくとも1つが発現される:NM_002389、NM_172359、NM_172351、NM_153826、NM_172352、NM_172353、NM_172350及びNM_172361。上記の実施形態では、ヒトトロンボモジュリン遺伝子(huTHBD、huTBM)を挿入する場合には、好ましくは、以下のゲノム遺伝子座/コーディング領域から産生される任意の転写物に従う転写物が発現される:GRCH38p7、NC_000020、領域23045633〜23049664。より好ましくは、ヒトトロンボモジュリン遺伝子を挿入する場合には、以下の転写物は、導入遺伝子発現カセットから発現される:NM_000361。上記の実施形態では、ヒトCD55遺伝子(huCD55)を挿入する場合には、好ましくは、以下のゲノム遺伝子座/コーディング領域から産生される任意の転写物に従う転写物が発現される:GRCH38p7、NC_000001、領域207321472〜207360966。より好ましくは、ヒトCD55遺伝子を挿入する場合には、以下の転写物のうち少なくとも1つが、導入遺伝子発現カセットから発現される:NM_001114752、NM_001300903、NM_001300904、NM_000574及びNM_001300902。上記の実施形態では、ヒトCD59遺伝子(huCD59)を挿入する場合には、好ましくは、以下のゲノム遺伝子座/コーディング領域から産生される任意の転写物に従う転写物が発現される:GRCH38p7、NC_000011、領域33703010〜33736479。より好ましくは、ヒトCD59遺伝子を挿入する場合には、以下の転写物のうち少なくとも1つが、導入遺伝子発現カセットから発現される:NM_000611、NM_203331、NM_203329、NM_203330、NM001127227、NM_001127226、NM_001127225及びNM_001127223。上記の実施形態では、ヒトヘムオキシゲナーゼ1遺伝子(huHMOX1、huHO1)を挿入する場合には、好ましくは、以下のゲノム遺伝子座/コーディング領域から産生される任意の転写物に従う転写物が発現される:GRCH38p7、NC_000022、領域35381067〜35394214。より好ましくは、ヒトヘムオキシゲナーゼ1遺伝子を挿入する場合には、以下の転写物が、導入遺伝子発現カセットから発現される:NM_002133。上記の実施形態では、ヒトA20遺伝子(huA20、huTNFAIP3)を挿入する場合には、好ましくは、以下のゲノム遺伝子座/コーディング領域から産生される任意の転写物に従う転写物が発現される:GRCH38p7、NC_000006.12、領域137866317〜137883314。より好ましくは、ヒトA20遺伝子を挿入する場合には、以下の転写物のうち少なくとも1つが、導入遺伝子発現カセットから発現される:NM_001270508、NM_001270507、NM_006290。当業者には明らかであろうが、「LEA遺伝子」という用語は、本明細書において使用される場合、CD80/CD86に対する高親和性のために最適化されている人工CTLA4-Igタンパク質の合成配列コーディングを指す。上記の実施形態では、ヒトLEA遺伝子(すなわち、配列)を挿入する場合には、好ましくは、以下のコドン最適化バリアントLEA29Yが、例えば、導入遺伝子発現カセットから発現される。
atgggggtactgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagcatggcgatgcacgtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaatatactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacgagggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (配列番号1)
【００４２】
上記の実施形態では、ヒトPDL-1遺伝子(huPD-L1、huPDL1、huCD274)を挿入する場合には、好ましくは、以下のゲノム遺伝子座/コーディング領域から産生される任意の転写物に従う転写物が発現される:GRCH38p7、NC_000009、領域5450503〜5470567。より好ましくは、ヒトPDL-1遺伝子を挿入する場合には、以下の転写物のうち少なくとも1つが、導入遺伝子発現カセットから発現される:NM_014143、NM_001267706、NM_00134029。
【００４３】
当業者には明らかとなり、上記から直接続くように、本発明に従って「遺伝子の挿入」に言及する場合には、好ましい実施形態では、遺伝子全体が挿入されるわけではない。この実施形態では、発現されるべきそれぞれの遺伝子の転写物を可能にする任意の配列(例えば、発現カセット中)が挿入され得る。
【００４４】
上記の実施形態のいずれかと組み合わせることができる別の実施形態では、本発明の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓は、ヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼをコードする配列の挿入を更に有する。好ましくは、ヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼは、以下の遺伝子から発現されるタンパク質である:公式記号:FUT1;公式完全名称:フコシルトランスフェラーゼ1(H血液型);主供給源:HGNC:HGNC:4012;関連参照:Ensembl:ENSG00000174951、MIM:211100。
【００４５】
本発明では、遺伝子/配列の挿入に言及する場合には、この挿入は、ヘテロ接合性挿入であっても、ホモ接合性挿入であってもよい。当業者には明らかであろうが、ヘテロ接合性挿入を用いた場合に発現レベルが十分に高くない場合には、ホモ接合性挿入が好ましい。
【００４６】
好ましくは、本発明に従う遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓は、遺伝子改変されたドナー生物から、すなわち、その生殖系列中にそれぞれの遺伝子改変を有するドナー生物から得られる。このような遺伝子改変されたドナー生物(例えば、ブタ)を得る方法は、当業者に公知である(すべてその全文が本明細書に組み込まれる、参考文献92、103、104及び105を参照のこと)。従来技術の代替として、遺伝子改変されたブタはまた、改善された挿入遺伝子座を提供し得るCRISPR/CAS9等の新規技術を使用して得ることもできる。
【００４７】
本発明に従う免疫抑制誘導療法、免疫抑制維持療法、抗炎症療法、降圧剤及びmTOR阻害剤が、投薬レジメンに従って投与される。各投薬レジメンは、1種のみの医薬上活性な薬剤の投与又はいくつかの医薬上活性な薬剤の投与を含み得る。投薬レジメンが、いくつかの医薬上活性な薬剤の投与を含む場合には、前記薬剤を投与の前に単一組成物に混合してもよい、又は別個に投与してもよい。別個に投与する場合には、前記医薬上活性な薬剤を実質的に同時に(例えば、同時に又は逐次)投与してもよく、又はそれらを異なる時間で投与してもよい。更に、投薬レジメンが、1種のみの医薬上活性な薬剤の投与を含むか又はいくつかの医薬上活性な薬剤の投与を含むかに関わらず、各投薬レジメンは、各医薬上活性な薬剤の単回投与又は各医薬上活性な薬剤の数回の投与を含み得る。投薬レジメンが、いくつかの医薬上活性な薬剤の投与を含む場合及びいくつかの医薬上活性な薬剤が数回投与される場合は、異なる医薬上活性な薬剤の投与の間の時間間隔は、異なり得る。例えば、投薬レジメンが、医薬上活性な薬剤A及び医薬上活性な薬剤Bの数回の投与を含む場合には、医薬上活性な薬剤Aは、毎日(又は1日又は数日の固定間隔後)投与されてもよく、医薬上活性な薬剤Bは、1日おきに投与されてもよい。本発明に従う投薬レジメン内の医薬上活性な薬剤の任意の第1の投与は、「第1の投与」と呼ばれる。もちろん、このような「第1の投与」は、本発明に従う投薬レジメンが開始されたよりも前に、対象が同じ医薬上活性な薬剤を投与されていることを排除しない。
【００４８】
当業者には明らかであろうが、本発明が移植後所与の日に生じる医薬上活性な薬剤の単回投与に言及する場合には、このような単回投与を数回の投与に、これらの数回の投与が同日に生じる限り、分けることができる。もちろん、用量がこのような単回投与のために与えられ、単回投与が、同日に生じる数回の投与に分けられる場合には、数回の投与の用量は合計で、本発明において指示される単回投与の用量になる必要がある。当業者には明らかであろうが、投与はまた、医薬上活性な薬剤が終日を通して連続投与される連続投与であってもよい。用量がこのような連続投与のために与えられる場合には、用量は、終日を通して投与される累積用量を表す。連続投与が、継続した日に生じる場合には、医薬上活性な薬剤は、数日間連続投与される。
【００４９】
本発明に従う免疫抑制誘導療法は、投薬レジメンに従ってレシピエント生物に投与される。前記投薬レジメンは、移植前の1種又は複数の免疫抑制剤の投与を含む。免疫抑制誘導療法の投薬レジメンに従って投与され得る例示的免疫抑制剤は、抗CD20抗体、抗胸腺細胞グロブリン及び抗CD40抗体/抗CD40LPAS化(PASylated)Fab(断片抗原結合性)を含む。
【００５０】
本発明の一実施形態では、免疫抑制誘導療法の投薬レジメンは、抗CD20抗体の投与を含む。好ましい実施形態では、前記抗CD20抗体は、Roche Pharma AG(ドイツ、グレンツァッハ-ヴィレン)から市販されている抗CD20抗体マブセラである。免疫抑制誘導療法の投薬レジメンは、抗CD20抗体の単回又は数回の投与を含み得る。好ましい実施形態では、投薬レジメンは、抗CD20抗体の単回投与を含む。より好ましくは、抗CD20抗体の前記単回投与は、心臓/腎臓/肺/肝臓移植の5日から9日前の間に生じる、最も好ましくは、前記単回投与は、心臓/腎臓/肺/肝臓移植の7日前に生じる。抗CD20抗体投与の好ましい用量は、体重1kgあたり19mgである。この実施形態のすべての他の態様によれば、抗CD20抗体投与の好ましい経路は、静脈内(i.v.)短時間注入である。
【００５１】
本発明の別の実施形態では、免疫抑制誘導療法の投薬レジメンは、抗胸腺細胞グロブリン(ATG)の投与を含む。好ましい実施形態では、前記抗胸腺細胞グロブリンは、Sanofi-Aventis Germany GmbH(ドイツ、フランクフルト)から市販されている抗胸腺細胞グロブリンサイモグロブリン(Thymoglobuline)である。免疫抑制誘導療法の投薬レジメンは、抗胸腺細胞グロブリンの単回又は数回の投与を含み得る。好ましい実施形態では、投薬レジメンは、抗胸腺細胞グロブリンの数回の投与を含み、更により好ましい実施形態では、投薬レジメンは、抗胸腺細胞グロブリンの2回の投与を含む。好ましくは、抗胸腺細胞グロブリンの前記2回の投与は、心臓/腎臓/肺/肝臓移植前3日以内に生じ、最も好ましくは、それらは、それぞれ心臓/腎臓/肺/肝臓移植の1日及び2日前に生じる。抗胸腺細胞グロブリン投与の好ましい用量は、体重1kgあたり50mgである。別の実施形態では、抗胸腺細胞グロブリン投与の好ましい用量は、体重1kgあたり5mgである。この実施形態のすべての他の態様によれば、抗胸腺細胞グロブリン投与の好ましい経路は、静脈内(i.v.)短時間注入である。
【００５２】
本発明の別の実施形態では、免疫抑制誘導療法の投薬レジメンは、抗CD40抗体又は抗CD40LPAS化(PASylated)Fabの投与を含む。好ましい実施形態では、前記抗CD40抗体は、NIH Nonhuman Primate Reagent Resource, Mass Biologicals、米国、マサチューセッツ州、ボストン;Keith Reimannの厚意から入手可能であるマウス/アカゲザルキメラIgG4クローン2C10R4である。別の好ましい実施形態では、前記抗CD40LPAS化Fabは、Binder & Skerra(参考文献9を参照のこと)に記載されるような、Wacker-Chemie (ドイツ、ブルクハウゼン)によって製造され、XL-protein GmbH(ドイツ、フライジング)によって精製されるヒト化抗CD40LPAS化Fabである。免疫抑制誘導療法の投薬レジメンは、抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fabの単回又は数回の投与を含み得る。好ましい実施形態では、投薬レジメンは、抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fabの単回投与を含む。より好ましくは、抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fabの前記単回投与は、心臓/腎臓/肺/肝臓移植前2日以内に生じる、最も好ましくは、前記単回投与は、心臓/腎臓/肺/肝臓移植前1日以内に生じる。投与の好ましい用量は、体重1kgあたり50mgの抗CD40抗体又は体重1kgあたり20mgの抗CD40LPAS化Fabである。この実施形態のすべての他の態様によれば、抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fab投与の好ましい経路は、静脈内(i.v.)短時間注入である。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態では、免疫抑制誘導療法の投薬レジメンは、抗CD20抗体、抗胸腺細胞グロブリン及び抗CD40抗体/抗CD40LPAS化(PASylated)Fabの投与を含む。この好ましい実施形態では、好ましい抗CD20抗体、好ましい抗胸腺細胞グロブリン及び好ましい抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fabは、上記のそれぞれの実施形態について記載されたものと同一である。更に、この好ましい実施形態ではまた、投与の好ましい頻度、好ましい時点、好ましい用量及び好ましい経路も、上記のそれぞれの実施形態について記載されたものと同一である。本発明に従う免疫抑制誘導療法の特に好ましい投薬レジメンは、図7に表わされている。
【００５４】
本発明に従うドナー生物からの外科的心臓/腎臓/肺/肝臓摘出は、当業者に公知な通りに実施される。その後、外科的に摘出された心臓/腎臓/肺/肝臓は、移植まで非虚血性保存によって保存される。非虚血性保存の期間は、好ましくは、24時間より短い、より好ましくは、15時間より短い、更により好ましくは、10時間より短い、更により好ましくは、5時間より短い、最も好ましくは、4時間よりも短い。好ましくは、前記非虚血性保存は、例えば、参考文献10(その全文が本明細書に組み込まれる)においてSteenらによって非虚血性心臓灌流について記載されるような非虚血性心臓/腎臓/肺/肝臓灌流である。このような非虚血性心臓灌流のために、圧力及び流量制御ローラーポンプ、O2/CO2交換体、白血球フィルター、動脈フィルター及び冷却器-加熱器ユニットからなるポータブル体外(extracorporal)心臓保存システムにおいて、8℃の温度で3.5Lのホルモン及び赤血球を含む酸素化アルブミンを含有する高張性心筋保護(cardioplegic)栄養溶液を使用できる。大動脈をクロスクランプした後、心臓を、600mlの保存媒体を用いて灌流し、次いで、切除し、心臓保存システム中に移動させることができる。大きな挿管を上行大動脈中に導入でき、僧帽弁を一時的に無力化して左室拡張を防ぐことができ、上大静脈は閉塞される場合があるが、下大静脈、肺動脈及び肺静脈は、灌流液の自由な出口のために開放されたままにされる場合がある。心臓を冷却した灌流媒体で満たされたリザーバー中に沈めることができ、順行性冠動脈灌流をすでに配置された大動脈挿管を介して開始できる。灌流圧は、正確に20mmHgで調節されたままであり得る。移植の間、心臓は20分毎に2分間、間欠的に灌流されることがある。
【００５５】
本発明に従うレシピエント生物への心臓/腎臓/肺/肝臓移植はまた、当業者に公知な通りに実施される。好ましくは、レシピエント生物は、例えば、参考文献11(その全文が本明細書に組み込まれる)に記載されるような、ケタミン塩酸塩、ミダゾラム、プロトフォール、フェンタニル、セボフルラン及び/又はメタミゾールを投与することを含み得る、麻酔おび鎮痛処置を受ける。好ましい実施形態では、心臓移植は、その全文が本明細書に組み込まれる参考文献8に記載されるようなShumway及びLowerの技術を適用して実施される。
【００５６】
本発明の方法では、ドナー生物の外科的に摘出された保存された心臓/腎臓/肺/肝臓は、レシピエント生物の心臓/腎臓/肺/肝臓を機能的に置換するようにレシピエント生物中に移植される。このような機能的置換は、好ましくは、同所性置換であるが、異所性支持体、移植された心臓の場合には、胸腔内異所性支持体である場合もある。同所性心臓置換は、実施例1に記載されるように実施され得る。胸腔内異所性心臓移植はまた、生命維持を助け、代替法となろう。手短には、胸腔内異所性心臓移植は、レシピエントの心臓を定位置に、移植された異種臓器が失敗した場合にバックアップとして残し、これは、少なくとも臨床パイロット研究の極めて最初に適用され得る(再移植が可能であろう)重要な戦略である。胸腔内異所性異種心臓移植は、C.N. Barnardによって開発された方法(参考文献24、25を参照のこと)に基づく技術(図10B)を使用して実施され得る。この手順は、心臓-肺機械の支持を必要とする。ドナー心臓(例えば、ブタ心臓)は、レシピエント(例えば、ヒヒ)心臓の右側に配置され、それによって、右肺の部分を圧迫する。移植は、左及び右心房の吻合で始まる。次いで、両大動脈が、端側様式で組み合わされる。最後に、両肺動脈が、間置移植組織(図10Bを参照のこと)の助けを借りて接続される。収縮するが駆出しない腹部に移植された心臓とは対照的に(図10C、免疫学的モデルを参照のこと)、胸腔内に配置された移植片は、血液を駆出する。術後心エコーは、大動脈及び僧帽弁の収縮及び弛緩運動を証明し、大動脈収縮期圧曲線は、ドナーECGと相関する。胸腔内異所性手順後、ドナー及びレシピエント心臓は両方とも(臨床状況では、機能を損なっている場合もある)そのそれぞれの心周期(その前負荷)に従って心拍出量に寄与する。胸腔内異所性異種心臓移植は、参考文献25に記載されるように実施される。もちろん、参考文献25に記載されるような胸腔内異所性異種心臓移植は、好ましくは、本発明に従う非虚血性心臓保存と、本発明に従う免疫抑制誘導及び維持療法を投与することと、本発明に従う免疫抑制維持療法の一部として投与されるグルココルチコイドの投与量を減少させることと、本発明に従う抗炎症療法を投与することと、本発明に従う1種又は複数の降圧剤を投与することと及び/又は本発明に従うmTOR阻害
剤を投与することと組み合わされる。
【００５７】
本発明に従う免疫抑制維持療法は、投薬レジメンに従ってレシピエント生物に投与される。前記投薬レジメンは、移植後の1種又は複数の免疫抑制剤の投与を含み、投薬レジメンは、移植の1日後の、好ましくは、移植の当日のグルココルチコイドの第1の投与を含む。グルココルチコイドに加えて、免疫抑制維持療法の投薬レジメンに従って投与され得る例示的免疫抑制剤として、抗CD20抗体、ミコフェノール酸モフェチル及び抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fabが挙げられる。
【００５８】
本発明に従う免疫抑制維持療法の投薬レジメンは、任意選択で、グルココルチコイドの投与を含む。グルココルチコイドの第1の投与は、移植後1日以内、好ましくは、移植の当日に生じる。免疫抑制維持療法の投薬レジメンは、グルココルチコイドの数回の投与、好ましくは、第1の投与後毎日の1回の投与を含む。第1の投与の当日のグルココルチコイドの好ましい投与量は、5mg/kg/日〜15mg/kg/日、好ましくは、7mg/kg/日〜13mg/kg/日、より好ましくは、9mg/kg/日〜11mg/kg/日、最も好ましくは、10mg/kg/日である。免疫抑制維持療法の投薬レジメンは、レシピエント生物に投与されるグルココルチコイドの投与量(mg/kg/日)を、移植後5日以内に5分の1以下、好ましくは、10分の1以下に減少させる工程を含む。例えば、第1の投与の当日のグルココルチコイドの投与量が、10mg/kg/日である場合には、移植後5日目の最大投与量は、2mg/kg/日、好ましくは、1mg/kg/日である。好ましい実施形態では、免疫抑制維持療法の投薬レジメンは、種々の態様で、レシピエント生物に投与されるグルココルチコイド投与量(mg/kg/日)を、移植後10日以内に10分の1以下、好ましくは、20分の1以下に少させる工程を含む。別の好ましい実施形態では、免疫抑制維持療法の投薬レジメンは、レシピエント生物に投与されるグルココルチコイドの投与量(mg/kg/日)を、移植後20日以内に50分の1以下、好ましくは、100分の1以下に減少させる工程を含む。原則上、グルココルチコイド効力を有する任意の副腎皮質ステロイドが、本発明において使用され得る。しかし、好ましい実施形態では、グルココルチコイドは、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン又はトリアムシノロンである、好ましくは、グルココルチコイドは、プレドニゾロン又はメチルプレドニゾロンである、最も好ましくは、グルココルチコイドは、メチルプレドニゾロンである。メチルプレドニゾロンは、例えば、Sanofi-Aventis Germany GmbH(ドイツ、フランクフルト)からUrbasone可溶性として市販されている。この実施形態のすべての他の態様によれば、グルココルチコイドの好ましい投与経路は、静脈内(i.v.)ボーラス注射である。
【００５９】
本発明の一実施形態では、免疫抑制維持療法の投薬レジメンは、抗CD20抗体の投与を含む。抗CD20抗体が、先行する免疫抑制誘導療法の一部としてすでに投与されていた場合には、免疫抑制維持療法の一部として投与される抗CD20抗体 は、好ましくは、免疫抑制誘導療法の一部として投与されている同一の抗CD20抗体である。好ましい実施形態では、免疫抑制誘導療法及び免疫抑制維持療法の抗CD20抗体は、Roche Pharma AG(グレンツァッハ-ヴィレン、ドイツ)から市販されている抗CD20抗体マブセラである。免疫抑制維持療法の投薬レジメンは、抗CD20抗体の単回又は数回の投与を含み得る。好ましい実施形態では、投薬レジメンは、抗CD20抗体の数回の投与を含む。より好ましくは、投薬レジメンは、抗CD20抗体の2〜4回の投与を含む、最も好ましくは、投薬レジメンは、抗CD20抗体の3回の投与を含む。一実施形態では、免疫抑制維持療法の投薬レジメンは、移植後1日以内の抗CD20抗体の投与を含む、好ましくは、免疫抑制維持療法の投薬レジメンは、移植の当日での抗CD20抗体の投与を含む。別の実施形態では、投薬レジメンが、抗CD20抗体の2回以上の投与を含む場合には、投薬レジメンは、移植後1日以内の抗CD20抗体の投与及び移植後6日から8日の間の抗CD20抗体の投与、好ましくは、移植の当日での抗CD20抗体の投与及び移植の7日後の抗CD20抗体の投与を含む。別の実施形態では、投薬レジメンが、抗CD20抗体の3回以上の投与を含む場合には、投薬レジメンは、移植後1日以内の抗CD20抗体の投与、移植後6日から8日の間の抗CD20抗体の投与及び移植後13日〜15日の間の抗CD20抗体の投与、好ましくは、移植の当日での抗CD20抗体の投与、移植の7日後の抗CD20抗体の投与及び移植の14日後の抗CD20抗体の投与を含む。抗CD20抗体投与の好ましい用量は、体重1kgあたり19mgである。この実施形態のすべての他の態様によれば、抗CD20抗体投与の好ましい経路は、静脈内(i.v.)短時間注入である。
【００６０】
本発明の別の実施形態では、免疫抑制維持療法の投薬レジメンは、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)の投与を含む。好ましい実施形態では、免疫抑制維持療法のミコフェノール酸モフェチルは、Roche(スイス、バーゼル)から市販されているミコフェノール酸モフェチルCellCeptである。免疫抑制維持療法の投薬レジメンは、好ましくは、ミコフェノール酸モフェチルの数回の投与を含み、1回の投与は、移植後1日以内に、好ましくは、移植の当日に生じる。好ましい実施形態では、免疫抑制維持療法の投薬レジメンは、移植後各日のミコフェノール酸モフェチルの1回の投与を含む。ミコフェノール酸モフェチル投与の好ましい用量は、体重1kgあたり40mgである。更により好ましくは、用量は、2〜3μg/mlのトラフレベルに調整される。この実施形態のすべての他の態様によれば、ミコフェノール酸モフェチル投与の好ましい経路は、連続静脈内 (i.v.)注入である。好ましい実施形態では、ミコフェノール酸モフェチルが免疫抑制維持療法の投薬レジメンに従って投与される場合には、ミコフェノール酸モフェチルは、移植時にすでに治療薬レベルに到達するために移植前にすでに更に投与される。例えば、ミコフェノール酸モフェチルは、移植前に1回又は数回投与され得る。好ましくは、ミコフェノール酸モフェチルは、移植前に数回投与される、更により好ましくは、ミコフェノール酸モフェチルは、移植前に2回投与される。好ましくは、ミコフェノール酸モフェチルの前記2回の投与は、移植前3日以内に生じる、最も好ましくは、それらは、それぞれ、心臓/腎臓/肺/肝臓移植の1及び2日前に生じる。好ましいミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸モフェチル投与の好ましい用量及び好ましい投与経路は、免疫抑制維持療法の投薬レジメンに従ってミコフェノール酸モフェチル投与について上記のとおりである。
【００６１】
本発明の別の実施形態では、免疫抑制維持療法の投薬レジメンは、抗CD40抗体又は抗CD40LPAS化(PASylated)Fabの投与を含む。抗CD40抗体又は抗CD40LPAS化Fabが、先行する免疫抑制誘導療法の一部としてすでに投与されている場合には、免疫抑制維持療法の一部として投与される抗CD40抗体又は抗CD40LPAS化Fabは、好ましくは、免疫抑制誘導療法の一部として投与されている同一の抗CD40抗体又は抗CD40LPAS化Fabである。好ましい実施形態では、前記抗CD40抗体は、NIH Nonhuman Primate Reagent Resource, Mass Biologicals、米国、マサチューセッツ州、ボストン;Keith Reimannの厚意から入手可能であるマウス/アカゲザルキメラIgG4クローン2C10R4である。別の好ましい実施形態では、前記抗CD40LPAS化Fabは、Binder & Skerra(参考文献9を参照のこと)に記載されるような、Wacker-Chemie (ドイツ、ブルクハウゼン)によって製造され、XL-protein GmbH(ドイツ、フライジング)によって精製されるヒト化抗CD40LPAS化Fabである。免疫抑制維持の投薬レジメンは、好ましくは、抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fabの数回の投与を含み、1回の投与は、移植後1日以内に、好ましくは、移植の当日に生じる。好ましい実施形態では、免疫抑制維持療法の投薬レジメンは、移植後1日以内の1回の投与、移植後8日以内の4回の投与、移植後15日以内の6回の投与、移植後20日以内の7回の投与及び6〜8日毎のその後の投与を含む。投与の好ましい用量は、体重1kgあたり50mgの抗CD40抗体又は体重1kgあたり20mgの抗CD40LPAS化Fabである。この実施形態のすべての他の態様によれば、抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fab投与の好ましい経路は、静脈内(i.v.)短時間注入である。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態では 、免疫抑制維持療法の投薬レジメンは、グルココルチコイド、抗CD20抗体、ミコフェノール酸モフェチル及び抗CD40抗体/抗CD40LPAS化(PASylated)Fabの投与を含む。この好ましい実施形態では、好ましいグルココルチコイド、好ましい抗CD20抗体、好ましいミコフェノール酸モフェチル及び好ましい抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fabは、上記のそれぞれの実施形態について記載されるものと同一である。更に、この好ましい実施形態ではまた、投与の好ましい頻度、好ましい時点、好ましい用量(又は投与量)及び好ましい経路は、上記のそれぞれの実施形態について記載されるものと同一である。本発明に従う免疫抑制維持療法の特に好ましい投薬レジメンは、図7に表わされている。
【００６３】
本発明に従う抗炎症療法は、投薬レジメンに従ってレシピエント生物に投与される。前記投薬レジメンは、移植後の1種又は複数の抗炎症剤の投与を含む。抗炎症療法の投薬レジメンに従って投与され得る例示的抗炎症剤として、IL-1受容体アンタゴニスト、TNF-α(=TNFa=TNFα)阻害剤及びIL-6受容体抗体が挙げられる。本発明では、抗炎症処置は、胸腔/心膜液貯留のような通常の非特異的異種炎症反応を相殺するはずである。
【００６４】
本発明の一実施形態では、抗炎症療法の投薬レジメンは、IL-1受容体アンタゴニストの投与を含む。好ましい実施形態では、前記IL-1受容体アンタゴニストは、Swedish Orphan Biovitrum GmbH (ドイツ、マルティンスリート)から市販されているIL-1受容体アンタゴニストKineretである。好ましい実施形態では、抗炎症療法の投薬レジメンは、IL-1受容体アンタゴニストの数回の投与を含み、1回の投与は、移植後1日以内に、好ましくは、移植の当日に生じる。より好ましい実施形態では、抗炎症療法の投薬レジメンは、IL-1受容体アンタゴニストの数回の投与を含み、1回の投与は、移植後1日以内に、好ましくは、移植の当日に生じ、1回の投与は、その後の各日に生じる。IL-1受容体アンタゴニスト投与の好ましい用量は、体重1kgあたり1.3mgである。この実施形態のすべての他の態様によれば、IL-1受容体アンタゴニスト投与の好ましい経路は、皮下(s.c.)又は静脈内(i.v.)ボーラス注射である。
【００６５】
本発明の別の実施形態では、抗炎症療法の投薬レジメンは、TNF-α阻害剤の投与を含む。好ましい実施形態では、前記TNF-α阻害剤は、Pfizer Pharma GmbH(ドイツ、ベルリン)から市販されているTNF-α阻害剤エンブレルである。好ましい実施形態では、抗炎症療法の投薬レジメンは、TNF-α阻害剤の数回の投与を含み、1回の投与は、移植後1日以内に、好ましくは、移植の当日に生じる。より好ましい実施形態では、抗炎症療法の投薬レジメンは、TNF-α阻害剤の数回の投与を含み、1回の投与は、移植後1日以内に生じ、1回の投与は、その後、6〜8日毎に生じる、好ましくは、1回の投与は、移植の当日に生じ、1回の投与は、その後7日毎に生じる。TNF-α阻害剤投与の好ましい用量は、体重1kgあたり0.7mgである。この実施形態のすべての他の態様によれば、TNF-α阻害剤投与の好ましい経路は、皮下(s.c.)ボーラス注射である。
【００６６】
本発明の別の実施形態では、抗炎症療法の投薬レジメンは、IL-6受容体抗体の投与を含む。好ましい実施形態では、前記IL-6受容体抗体は、Roche Pharma AG(グレンツァッハ-ヴィレン、ドイツ)から市販されているIL-6受容体抗体RoActemraである。抗炎症療法の投薬レジメンは、IL-6受容体抗体の単回又は数回の投与を含み得る。好ましい実施形態では、抗炎症療法の投薬レジメンは、IL-6受容体抗体の数回の投与を含み、1回の投与は、移植後1日以内に、好ましくは、移植の当日に生じる。より好ましい実施形態では、抗炎症療法の投薬レジメンは、IL-6受容体抗体の数回の投与を含み、1回の投与は、移植後1日以内に生じ、1回の投与は、その後20〜40日毎に生じ、好ましくは、1回の投与は、移植の当日に生じ、1回の投与は、その後25〜35日毎に生じる。IL-6受容体抗体投与の好ましい用量は、体重1kgあたり8mgである。この実施形態のすべての他の態様によれば、IL-6受容体抗体投与の好ましい経路は、静脈内(i.v.)短時間注入である。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態では 、抗炎症療法の投薬レジメンは、投与IL-1受容体アンタゴニスト、TNF-α阻害剤及びIL-6受容体抗体を含む。この好ましい実施形態では、好ましいIL-1受容体アンタゴニスト、好ましいTNF-α阻害剤及び好ましいIL-6受容体抗体は、上記のそれぞれの実施形態について記載されるものと同一である。更に、この好ましい実施形態ではまた、投与の好ましい頻度、好ましい時点、好ましい用量及び好ましい経路は、上記のそれぞれの実施形態について記載されるものと同一である。本発明に従う抗炎症療法の特に好ましい投薬レジメンは、図8に表わされている。
【００６８】
本発明に従う1種又は複数の降圧剤は、投薬レジメンに従ってレシピエント生物に投与される。前記投薬レジメンは、移植後の1種又は複数の降圧剤の投与を含む。抗炎症療法の投薬レジメンに従って投与され得る例示的降圧剤として、利尿薬、例えば、ループ利尿薬フロセミド及びエタクリン酸、チアジド/チアジド様利尿薬ヒドロクロロチアジド及びインダパミド及びカリウム保持性利尿薬トリアムテレン及びアミロライド;カルシウムチャネルブロッカー、例えば、ジヒドロピリジンアムロジピン及びニフェジピン及び非ジヒドロピリジンベラパミル及びジルチアゼム;アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、例えば、エナラプリル及びラミプリル;アンジオテンシンII受容体アンタゴニスト、例えば、バルサルタン及びカンデサルタン;アドレナリン受容体アンタゴニスト、例えば、ベータブロッカービソプロロール及びメトプロロール、アルファブロッカードキサゾシン及びフェノキシベンザミン並びに混合アルファ/ベータブロッカーカルベジロール及びラベタロール;血管拡張剤、例えば、ナトリウムニトロプルシド及びヒドラジン;レニン阻害剤、例えば、アリスキレン;アルドステロン受容体アンタゴニスト、例えば、スピロノラクトン及びエプレレノン;アルファ-2アドレナリン受容体アゴニスト、例えば、クロニジン及びメチルドパ;並びにエンドセリン受容体ブロッカー、例えば、ボセンタンが挙げられる。好ましい実施形態では、投薬レジメンは、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤及びアドレナリン受容体アンタゴニストから選択される1種又は複数の降圧剤の投与を含む。好ましくは、1種又は複数の降圧剤の用量は、レシピエント生物の平均動脈圧が70〜90mmHgの範囲内、好ましくは、75〜85mmHgの範囲内で維持されるように調整される。更により好ましくは、用量は、レシピエント生物の平均動脈圧が70〜90mmHgの範囲内、好ましくは、75〜85mmHgの範囲内で維持されるように、また心拍数が80〜120bpmの範囲内、好ましくは、90〜110bpmの範囲内で維持されるように調整される。
【００６９】
本発明の一実施形態では、1種又は複数の降圧剤を投与する投薬レジメンは、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤の投与を含む。好ましい実施形態では、前記アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤は、エナラプリルである。エナラプリルは、例えば、Hexal AG(ドイツ、ホルツキルヒェン)からEnahexalとして市販されている。好ましい実施形態では、1種又は複数の降圧剤を投与する投薬レジメンは、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤の数回の投与を含み、1回の投与は、移植後2日以内に、好ましくは、移植後1日以内に生じる。より好ましい実施形態では、1種又は複数の降圧剤を投与する投薬レジメンは、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤の数回の投与を含み、1回の投与は、移植後2日以内に、好ましくは、移植後1日以内に生じ、1回の投与は、その後各日で生じる。この実施形態のすべての他の態様によれば、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤投与の好ましい経路は、静脈内(i.v.)投与である。
【００７０】
本発明の別の実施形態では、1種又は複数の降圧剤を投与する投薬レジメンは、アドレナリン受容体アンタゴニストの投与を含む。好ましい実施形態では、前記アドレナリン受容体アンタゴニストは、メトプロロール酒石酸塩である。メトプロロール酒石酸塩は、例えば、AstraZeneca GmbH(ドイツ、ヴェーデル)からBeloc i.v.として市販されている。好ましい実施形態では、1種又は複数の降圧剤を投与する投薬レジメンは、アドレナリン受容体アンタゴニストの数回の投与を含み、1回の投与は、移植後2日以内に、好ましくは、移植後1日以内に生じる。より好ましい実施形態では、1種又は複数の降圧剤を投与する投薬レジメンは、アドレナリン受容体アンタゴニストの数回の投与を含み、1回の投与は、移植後2日以内に、好ましくは、移植後1日以内に生じ、1回の投与は、その後各日で生じる。この実施形態のすべての他の態様によれば、アドレナリン受容体アンタゴニスト投与の好ましい経路は、静脈内(i.v.)投与である。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態では、1種又は複数の降圧剤を投与する投薬レジメンは、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤及びアドレナリン受容体アンタゴニストの投与を含む。この好ましい実施形態では、好ましいアンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤及び好ましいアドレナリン受容体アンタゴニストは、上記のそれぞれの実施形態について記載されるものと同一である。更に、この好ましい実施形態ではまた、投与の好ましい頻度、好ましい時点及び好ましい経路は、上記のそれぞれの実施形態について記載されるものと同一である。本発明に従う1種又は複数の降圧剤を投与する特に好ましい投薬レジメンは、図9に表わされている。本発明に従う降圧剤は、血圧をドナー(例えば、ブタ)生物の(低い)レベルへ低下させるためにレシピエント生物に投与される。
【００７２】
本発明に従うmTOR阻害剤は、投薬レジメンに従ってレシピエント生物に投与される。前記投薬レジメンは、移植後のmTOR阻害剤の投与を含む。mTOR阻害剤を投与する投薬レジメンに従って投与され得る例示的mTOR阻害剤として、ダクトリシブ(BEZ235、NVP-BEZ235)、ラパマイシン(シロリムス)、エベロリムス(RAD001)、AZD8055、テムシロリムス(CCI-779、NSC 683864)、SF2523、3BDO、PI-103、KU-0063794 I、トルキニブ(PP242)、リダフォロリムス(デフォロリムス、MK-8669)、サパニセルチブ(INK128、MLN0128)、ボクスタリシブ(SAR245409、XL765)類似体、トリン1、オミパリシブ(GSK2126458、GSK458)、OSI-027、PF-04691502、アピトリシブ(GDC-0980、RG7422)、GSK1059615、ゲダトリシブ(PF-05212384、PKI-587)、WYE-354、ビスツセルチブ(AZD2014)、トリン2、WYE-125132(WYE-132)、BGT226(NVP-BGT226)、パロミド529(P529)、PP121、WYE-687、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、ゾタロリムス(ABT-578)、CZ415、MHY1485、ボクスタリシブ(XL765、SAR245409)、クリソファン酸及びCC-223、LY3023414が挙げられる。好ましい実施形態では、投薬レジメンは、mTOR阻害剤テムシロリムスの投与を含む。テムシロリムスは、例えば、Pfizer Pharma GmbH(ドイツ、ベルリン)からトーリセルとして静脈内適用のために入手可能である。テムシロリムスは、抗CD40抗体/抗CD40LPAS化Fabと同様に長時間作用性であり得る。これは、非ヒト霊長類実験における取り扱い利点である。本発明に従うmTOR阻害剤は、移植された心臓/腎臓/肺/肝臓の過成長を阻害するために成長ホルモンを阻害するためにレシピエント生物に投与される。
【００７３】
好ましい実施形態では、mTOR阻害剤を投与する投薬レジメンは、mTOR阻害剤の数回の投与を含み、第1の投与は、移植後10日以内に、好ましくは、移植後2日から9日の間に、より好ましくは、移植後4日から7日の間に生じる。より好ましい実施形態では、mTOR阻害剤を投与する投薬レジメンは、mTOR阻害剤の数回の投与を含み、第1の投与は、移植後10日以内に、好ましくは、移植後2日から9日の間に、より好ましくは、移植後4日から7日の間に生じ、1回の投与は、その後各日で生じる。当業者には明らかであろうが、mTOR阻害剤の第1の投与の時点は、レシピエントの全身状態(例えば、心膜液/胸腔貯留があるか否か)に応じて変わる。好ましくは、mTOR阻害剤投与の用量は、5〜10ng/mlのラパマイシンのトラフレベルに調整される。この実施形態のすべての他の態様によれば、mTOR阻害剤投与の好ましい経路は、静脈内(i.v.)短時間注入である。本発明に従うmTOR阻害剤を投与する特に好ましい投薬レジメンは、図7に表わされている。
【００７４】
本発明の一実施形態では、異種ドナー生物に由来する遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物は、投薬レジメンに従う相加的療法を受ける。前記投薬レジメンは、1種又は複数の医薬上活性な薬剤の投与を含む。相加的療法の投薬レジメンに従って投与され得る例示的医薬上活性な薬剤として、アセチルサリチル酸、未分画ヘパリン、C1エステラーゼ阻害剤、ガンシクロビル、セフロキシム及びエポエチンベータが挙げられる。
【００７５】
本発明の一実施形態では、相加的療法の投薬レジメンは、アセチルサリチル酸の投与を含む。好ましい実施形態では、前記アセチルサリチル酸は、Bayer Vital GmbH(ドイツ、レーバークーゼン)から市販されているアセチルサリチル酸アスピリンである。相加的療法の投薬レジメンは、好ましくは、アセチルサリチル酸の数回の投与を含む。好ましい実施形態では、投薬レジメンは、移植後各日のアセチルサリチル酸投与を含む。アセチルサリチル酸投与の好ましい用量は、体重1kgあたり2mgである。この実施形態のすべての他の態様によれば、アセチルサリチル酸投与の好ましい経路は、静脈内(i.v.)ボーラス注射である。本発明では、アセチルサリチル酸は、抗凝血剤として使用される。
【００７６】
本発明の別の実施形態では、相加的療法の投薬レジメンは、未分画ヘパリンの投与を含む。好ましい実施形態では、前記未分画ヘパリンは、ratiopharm GmbH (ドイツ、ウルム)から市販されている未分画ヘパリンHeparin-Natrium-25000-ratiopharmである。相加的療法の投薬レジメンは、好ましくは、未分画ヘパリンの数回の投与を含み、未分画ヘパリンの第1の投与は、移植後4日〜6日に、好ましくは、移植後5日に生じる。より好ましい実施形態では、相加的療法の投薬レジメンは、未分画ヘパリンの数回の投与を含み、未分画ヘパリンの第1の投与は、移植後4日〜6日で、好ましくは、移植後5日に生じ、1回の投与は、その後各日で生じる。未分画ヘパリン投与の好ましい用量は、1日あたり体重1kgあたり480〜960Uである。この実施形態のすべての他の態様によれば、未分画ヘパリン投与の好ましい経路は、連続静脈内(i.v.)注入である。したがって、未分画ヘパリンは、好ましくは、1日につき24時間の間、1時間あたり体重1kgあたり20〜40Uで連続投与される。本発明では、未分画ヘパリンは、抗凝血剤として使用される。
【００７７】
本発明の別の実施形態では、相加的療法の投薬レジメンは、C1エステラーゼ阻害剤の投与を含む。好ましい実施形態では、前記C1エステラーゼ阻害剤は、CSL Behring GmbH(ドイツ、ハッタースハイム)から市販されているC1エステラーゼ阻害剤Berinertである。相加的療法の投薬レジメンは、好ましくは、C1エステラーゼ阻害剤の数回の投与を含み、第1の投与は、移植後1日以内に、好ましくは、移植の当日に生じる。より好ましい実施形態では、相加的療法の投薬レジメンは、C1エステラーゼ阻害剤の数回の投与を含み、第1の投与は、移植後1日以内に生じ、別の投与は、移植後6日から8日の間に生じ、別の投与は、移植後13日〜15日の間に生じる。最も好ましい実施形態では、相加的療法の投薬レジメンは、C1エステラーゼ阻害剤の数回の投与を含み、第1の投与は、移植の当日に生じ、別の投与は、移植の7日後に生じ、別の投与は、移植の14日後に生じる。C1エステラーゼ阻害剤投与の好ましい用量は、体重1kgあたり17.5Uである。この実施形態のすべての他の態様によれば、C1エステラーゼ阻害剤投与の好ましい経路は、静脈内(i.v.)短時間注入である。本発明では、C1エステラーゼ阻害剤は、補体阻害剤として使用される。
【００７８】
本発明の別の実施形態では、相加的療法の投薬レジメンは、ガンシクロビルの投与を含む。好ましい実施形態では、前記ガンシクロビルは、Roche Pharma AG(グレンツァッハ-ヴィレン、ドイツ)から市販されているガンシクロビルCymeveneである。相加的療法の投薬レジメンは、好ましくは、ガンシクロビルの数回の投与を含む。好ましい実施形態では、投薬レジメンは、移植後各日でのガンシクロビル投与を含む。ガンシクロビル投与の好ましい用量は、体重1kgあたり5mgである。この実施形態のすべての他の態様によれば、ガンシクロビル投与の好ましい経路は、連続静脈内(i.v.)注入である。本発明では、ガンシクロビルは、霊長類シクロメガロウイルス(cyclomegalovirus)感染を遮断するために使用される。
【００７９】
本発明の別の実施形態では、相加的療法の投薬レジメンは、セフロキシムの投与を含む。好ましい実施形態では、前記セフロキシムは、Hikma Pharma GmbH(ドイツ、マルティンスリート)から市販されているCefuroxim Hikmaである。相加的療法の投薬レジメンは、好ましくは、セフロキシムの数回の投与を含む。好ましい実施形態では、投薬レジメンは、移植後1日以内の、好ましくは、移植の当日でのセフロキシム投与を含む。より好ましい実施形態では、投薬レジメンは、移植の当日でのセフロキシム投与及び移植後5日まで(5日を含む)のその後各日でのセフロキシム投与を含む。セフロキシム投与の好ましい用量は、体重1kgあたり50mgである。この実施形態のすべての他の態様によれば、セフロキシム投与の好ましい経路は、連続静脈内(i.v.)注入である。本発明では、セフロキシム(セファロスポリン)が、手術の際に罹患し得る細菌感染に対する広範な抗生物質予防として使用される。
【００８０】
本発明の別の実施形態では、相加的療法の投薬レジメンは、エポエチンベータの投与を含む。好ましい実施形態では、前記エポエチンベータは、Roche Pharma AG(グレンツァッハ-ヴィレン、ドイツ)から市販されているエポエチンベータNeoRecormon 5000IUである。相加的療法の投薬レジメンは、エポエチンベータの単回投与又は数回の投与を含み得る。好ましい実施形態では、投薬レジメンは、移植前6日から8日のエポエチンベータ投与及び移植前1日から移植後1日の間のエポエチンベータ投与を含む。より好ましい実施形態では、投薬レジメンは、移植前7日のエポエチンベータ投与及び移植の当日でのエポエチンベータ投与を含む。エポエチンベータ投与の好ましい用量は、2000Uである。この実施形態のすべての他の態様によれば、エポエチンベータ投与の好ましい経路は、皮下(s.c.)又は静脈内(i.v.)ボーラス注射である。本発明では、エリスロポエチンが、ホルモン刺激性ヘモグロブリン製品として使用される(すなわち、失血を相殺し得る)。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態では、相加的療法の投薬レジメンは、アセチルサリチル酸、未分画ヘパリン、C1エステラーゼ阻害剤、ガンシクロビル、セフロキシム及びエポエチンベータの投与を含む。この好ましい実施形態では、好ましいアセチルサリチル酸、好ましい未分画ヘパリン、好ましいC1エステラーゼ阻害剤、好ましいガンシクロビル、好ましいセフロキシム及び好ましいエポエチンベータは、上記のそれぞれの実施形態について記載されるものと同一である。更に、この好ましい実施形態ではまた、投与の好ましい頻度、好ましい時点、好ましい用量及び好ましい経路は、上記のそれぞれの実施形態について記載されるものと同一である。
【００８２】
移植された心臓/腎臓/肺/肝臓を有する霊長類
本発明はまた、心臓/腎臓/肺/肝臓が、異種哺乳動物由来の移植された遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓によって機能的に置換されており、上記のように心臓/腎臓/肺/肝臓移植後の霊長類の生存を延長する方法によって得ることができる、生存している霊長類(例えば、非ヒトの生存している霊長類)に関する。
【００８３】
更に、本発明は、心臓/腎臓/肺/肝臓が、異種哺乳動物由来の移植された遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓によって機能的に置換されており、前記生存している霊長類の心臓/腎臓/肺/肝臓が、40日前よりも更に前に、50日前よりも更に前に、60日前よりも更に前に、70日前よりも更に前に、80日前よりも更に前に、又は90日前よりも更に前に、好ましくは、50日前よりも更に前に、より好ましくは、70日前よりも更に前に、最も好ましくは、90日前よりも更に前に移植されている、生存している霊長類に関する。
【００８４】
一実施形態では、生存している霊長類は、オナガザル科に、好ましくは、ヒヒ属に、より好ましくは、アヌビスヒヒ又はマントヒヒ種に、最も好ましくは、アヌビスヒヒ種に属する。代替実施形態では、生存している霊長類は、オナガザル科、好ましくは、マカク属に、最も好ましくは、アカゲザル種に属する。
【００８５】
別の実施形態では、異種哺乳動物は、イノシシ科に、より好ましくは、イノシシ属に、更により好ましくは、イノシシ種に、最も好ましくは、ブタ亜種に属する。好ましくは、異種哺乳動物は、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタ、デュロックブタ、シュヴェービッシュ-ヘリッシュブタ、ブラックミニブタ又はオークランド・アイランドブタである、より好ましくは、異種哺乳動物は、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタである。この実施形態のすべての他の態様によれば、異種哺乳動物は、移植の時点で若齢であった。
【００８６】
本発明に従う心臓/腎臓/肺/肝臓は、生存している霊長類による移植拒絶を避けるために遺伝子改変される。当業者ならば、本発明に従うそれぞれのドナー生物及びそれぞれの生存している霊長類に応じて適した遺伝子改変を認識するであろう。一実施形態では、生存している霊長類の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓は、以下の遺伝子改変:(1)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のホモ接合性ノックアウト、(2)ヒトCD46遺伝子の挿入及び(3)ヒトトロンボモジュリン遺伝子の挿入を有する。ドナー生物が、イノシシ科に属し、生存している霊長類が、ヒヒ属に属する場合には、遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓は、任意選択で、上記の遺伝子改変(1)、すなわち、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のホモ接合性ノックアウトのみを有する場合がある。別の実施形態では、生存している霊長類の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓は、以下の遺伝子改変:(1)アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、CMAH遺伝子及びB4GALNT2遺伝子のホモ接合性ノックアウト、(2)ヒトCD46遺伝子、ヒトCD55遺伝子、ヒトCD59遺伝子、ヘムオキシゲナーゼ1遺伝子及びA20遺伝子の挿入、及び任意選択で(3)LEA遺伝子又はPDL-1(PD-L1、PDL1、CD274)遺伝子の挿入を有する。この実施形態の遺伝子改変の詳細は、参考文献23(その全文が本明細書に組み込まれる)に見出すことができる。この実施形態では、ヘムオキシゲナーゼ1遺伝子、A20遺伝子、LEA遺伝子及びPDL-1遺伝子は、任意の生物に由来し得るが、好ましくは、それらは、それぞれ、ヒトヘムオキシゲナーゼ1遺伝子、ヒトA20遺伝子、ヒトLEA遺伝子及びヒトPDL-1遺伝子である。上記の実施形態では、ヒトCD46遺伝子(huCD46)を挿入する場合には、好ましくは、以下のゲノム遺伝子座/コーディング領域から産生される任意の転写物に従う転写物が発現される:GRCH38p7、NC_000001、領域207752038〜207795516。より好ましくは、ヒトCD46遺伝子を挿入する場合には、以下の転写物のうち少なくとも1つが、導入遺伝子発現カセットから発現される:NM_002389、NM_172359、NM_172351、NM_153826、NM_172352、NM_172353、NM_172350及びNM_172361。上記の実施形態では、ヒトトロンボモジュリン遺伝子(huTHBD、huTBM)を挿入する場合には、 好ましくは、以下のゲノム遺伝子座/コーディング領域から産生される任意の転写物に従う転写物が発現される:GRCH38p7、NC_000020、領域23045633〜23049664。より好ましくは、ヒトトロンボモジュリン遺伝子を挿入する場合には、以下の転写物が、導入遺伝子発現カセットから発現される:NM_000361。上記の実施形態では、ヒトCD55遺伝子(huCD55)を挿入する場合には、好ましくは、以下のゲノム遺伝子座/コーディング領域から産生される任意の転写物に従う転写物が発現される:GRCH38p7、NC_000001、領域207321472〜207360966。より好ましくは、ヒトCD55遺伝子を挿入する場合には、以下の転写物のうち少なくとも1つが、導入遺伝子発現カセットから発現される:NM_001114752、NM_001300903、NM_001300904、NM_000574及びNM_001300902。上記の実施形態では、ヒトCD59遺伝子(huCD59)を挿入する場合には、好ましくは、以下のゲノム遺伝子座/コーディング領域から産生される任意の転写物に従う転写物が発現される:GRCH38p7、NC_000011、領域33703010〜33736479。より好ましくは、ヒトCD59遺伝子を挿入する場合には、以下の転写物のうち少なくとも1つが、導��遺伝子発現カセットから発現される:NM_000611、NM_203331、NM_203329、NM_203330、NM001127227、NM_001127226、NM_001127225及びNM_001127223。上記の実施形態では、ヒトヘムオキシゲナーゼ1遺伝子(huHMOX1、huHO1)を挿入する場合には、以下のゲノム遺伝子座/コーディング領域から産生される任意の転写物に従う転写物が発現される:GRCH38p7、NC_000022、領域35381067〜35394214。より好ましくは、ヒトヘムオキシゲナーゼ1遺伝子を挿入する場合には、 以下の転写物が、導入遺伝子発現カセットから発現される:NM_002133。上記の実施形態では、ヒトA20(huA20、huTNFAIP3)遺伝子を挿入する場合には、好ましくは、以下のゲノム遺伝子座/コーディング領域から産生される任意の転写物に従う転写物が発現される:GRCH38p7、NC_000006.12、領域137866317〜137883314。より好ましくは、ヒトA20遺伝子を挿入する場合には、以下の転写物のうち少なくとも1つが、導入遺伝子発現カセットから発現される:NM_001270508、NM_001270507、NM_006290。当業者には明らかであろうが、「LEA遺伝子」とい用語は、本明細書において使用される場合、CD80/CD86に対する高親和性のために最適化されている人工CTLA4-Igタンパク質の合成配列コーディングを指す。上記の実施形態では、ヒトLEA遺伝子を挿入する場合には、好ましくは、以下のコドン最適化バリアントLEA29Yが、例えば、導入遺伝子発現カセットから発現される。
atgggggtactgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagcatggcgatgcacgtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaatatactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacgagggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(配列番号1)
【００８７】
上記の実施形態では、ヒトPDL-1遺伝子(huPD-L1、huPDL1、huCD274)を挿入する場合には、好ましくは、以下のゲノム遺伝子座/コーディング領域から産生される任意の転写物に従う転写物が発現される:GRCH38p7、NC_000009、領域5450503〜5470567。より好ましくは、ヒトPDL-1遺伝子を挿入する場合には、以下の転写物のうち少なくとも1つが、導入遺伝子発現カセットから発現される:NM_014143、NM_001267706、NM_00134029。
【００８８】
当業者には明らかとなり、上記から直接続くように、本発明に従って「遺伝子の挿入」に言及する場合には、好ましい実施形態では、遺伝子全体が挿入されるわけではない。この実施形態では、発現されるべきそれぞれの遺伝子の転写物を可能にする任意の配列(例えば、発現カセット中)が挿入され得る。
【００８９】
上記の実施形態のいずれかと組み合わせることができる別の実施形態では、本発明の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓は、ヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼをコードする配列の挿入を更に有する。好ましくは、ヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼは、以下の遺伝子から発現されるタンパク質である:公式記号:FUT1;公式完全名称:フコシルトランスフェラーゼ1(H血液型);主供給源:HGNC:HGNC:4012;関連参照:Ensembl:ENSG00000174951、MIM:211100。
【００９０】
本発明では、遺伝子/配列の挿入に言及する場合には、この挿入は、ヘテロ接合性挿入であっても、ホモ接合性挿入であってもよい。当業者には明らかであろうが、ヘテロ接合性挿入を用いた場合に発現レベルが十分に高くない場合には、ホモ接合性挿入が好ましい。
【００９１】
好ましくは、本発明に従う遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓は、遺伝子改変されたドナー生物から、すなわち、その生殖系列中にそれぞれの遺伝子改変を有するドナー生物から得られる。このような遺伝子改変されたドナー生物(例えば、ブタ)を得る方法は、当業者に公知である。従来技術の代替として、遺伝子改変されたブタはまた、改善された挿入遺伝子座を提供し得るCRISPR/CAS9等の新規技術を使用して得ることもできる。
【００９２】
移植された心臓を有する霊長類の一実施形態では、本発明に従う生存している霊長類の移植された心臓は、移植の時点での同一心臓の左室容積の150%以下である左室容積を有する。好ましくは、前記生存している霊長類の移植された心臓は、移植の時点での同一心臓の左室容積の140%以下、より好ましくは、移植の時点での同一心臓の左室容積の130%以下、更により好ましくは、移植の時点での同一心臓の左室容積の120%以下、最も好ましくは、移植の時点での同一心臓の左室容積の110%以下である左室容積を有する。この実施形態では、左心室(LV)容積、LV容積は増大し、短縮率(FS)は以下のとおりに定量化される。経胸壁心エコーが、例えば、HP Sonos 7500(HP Inc.、米国、カリフォルニア州、パロアルト)を使用して一定間隔で鎮痛鎮静で行われ、乳頭中央部の短軸像が記録される。拡張末期及び収縮末期に、LV径(LVEDD、LVESD)、拡張期及び収縮期 心室間(IVSd、IVSs)、後壁厚(PWd、PWs)が測定され、3つの測定値の平均がさらなる算出及び可視化に使用される(Excel and PowerPoint、Microsoft、米国、ワシントン州、レドモンド)。LV容積は、以下の式1を使用して算出され、相対LV容積増大及びLV FSは、以下の式2及び3を使用して算出される(参考文献11、12を参照のこと)。
(式1)LV容積(g)=0.8*(1.04([LVEDD+IVSd+PWd]3-[LVEDD]3))+0.6
(式2)LV容積増大(%)=([LV容積end/LV容積start]-1)*100
(式3)FS(%)=([LVEDD-LVESD]/LVEDD)*100
【００９３】
IVSd、拡張期心室内中隔厚;IVSs、収縮期心室内中隔厚;LVEDD、左心室拡張末期径;LVESD、左心室収縮末期径;PWd、拡張期後壁厚;PWs、収縮期後壁厚。
【００９４】
一実施形態では、本発明に従う移植された心臓/腎臓/肺/肝臓を有する生存している霊長類は、150から300g/lの間、好ましくは、170から250g/lの間、より好ましくは、180から230g/lの間の血小板数を有する。血小板数を調べる方法は、当技術分野で公知である。
【００９５】
別の実施形態では、本発明に従う生存している霊長類は、1.2mg/dl以下、好ましくは、1.0mg/dl以下、より好ましくは、0.8mg/dl以下、最も好ましくは、0.6mg/dl以下のビリルビンレベルを有する。ビリルビンレベルを調べる方法は、当技術分野で公知である。
【００９６】
別の実施形態では、本発明に従う生存している霊長類は、0.3ng/ml以下、好ましくは、0.2ng/ml以下、より好ましくは、0.1ng/ml以下、最も好ましくは、0.014ng/ml以下のトロポニンT(hs)レベルを有する。トロポニンT(hs)レベルを調べる方法は、当技術分野で公知である。
【００９７】
別の実施形態では、本発明に従う生存している霊長類は、1500U/l以下、好ましくは、1000U/l以下、より好ましくは、700U/l以下、最も好ましくは、500U/l以下のLDHレベルを有する。LDHレベルを調べる方法は、当技術分野で公知である。
【００９８】
心臓/腎臓/肺/肝臓移植後の霊長類の生存を延長する方法において使用するためのmTOR阻害剤組成物
更に、本発明は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するためのmTOR阻害剤を含む組成物であって、ドナー生物は、哺乳動物であり、レシピエント生物は、霊長類である組成物に関する。好ましくは、前記レシピエント生物は、レシピエント生物の心臓/腎臓/肺/肝臓を機能的に置換するように、遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されている。
【００９９】
mTOR阻害剤を含む組成物が使用される方法は、上記のレシピエント生物の生存を延長する方法と似ているので、上記のレシピエント生物の生存を延長する方法のそれぞれの実施形態はまた、レシピエント生物の生存を延長する方法において使用するためのmTOR阻害剤を含む組成物の実施形態でもある、逆もまた同様。特に、ドナー生物、レシピエント生物及び遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓は、レシピエント生物の生存を延長する方法のそれぞれの実施形態について上記で記載されるとおりである。別の好ましい実施形態では、mTOR阻害剤が使用される方法は、レシピエント生物の生存を、移植後40日よりも後まで、移植後50日よりも後まで、移植後60日よりも後まで、移植後70日よりも後まで、移植後80日よりも後まで、又は移植後90日よりも後まで延長する。好ましくは、mTOR阻害剤が使用される方法は、レシピエント生物の生存を、移植後50日よりも後まで、より好ましくは、移植後70日よりも後まで、最も好ましくは、移植後90日よりも後まで延長する。
【０１００】
一実施形態では、本発明に従うmTOR阻害剤を含む組成物は、ダクトリシブ(BEZ235、NVP-BEZ235)、ラパマイシン(シロリムス)、エベロリムス(RAD001)、AZD8055、テムシロリムス(CCI-779、NSC 683864)、SF2523、3BDO、PI-103、KU-0063794 I、トルキニブ(PP242)、リダフォロリムス(デフォロリムス、MK-8669)、サパニセルチブ(INK128、MLN0128)、ボクスタリシブ(SAR245409、XL765)類似体、トリン1、オミパリシブ(GSK2126458、GSK458)、OSI-027、PF-04691502、アピトリシブ(GDC-0980、RG7422)、GSK1059615、ゲダトリシブ(PF-05212384、PKI-587)、WYE-354、ビスツセルチブ(AZD2014)、トリン2、WYE-125132(WYE-132)、BGT226(NVP-BGT226)、パロミド529(P529)、PP121、WYE-687、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、ゾタロリムス(ABT-578)、CZ415、MHY1485、ボクスタリシブ(XL765、SAR245409)、クリソファン酸及びCC-223、LY3023414から選択されるmTOR阻害剤を含む。好ましい実施形態では、mTOR阻害剤は、テムシロリムスである。テムシロリムスは、例えば、Pfizer Pharma GmbH(ドイツ、ベルリン)からトーリセルとして市販されている。当業者には明らかであろうが、本発明に従うmTOR阻害剤を含む組成物は、医薬上許容される担体及び/又は賦形剤を更に含み得る。
【０１０１】
好ましくは、本発明に従うmTOR阻害剤を含む組成物は、投薬レジメンに従ってレシピエント生物に投与される。より好ましくは、前記投薬レジメンは、移植後の組成物の投与を含む。
【０１０２】
好ましい実施形態では、本発明に従うmTOR阻害剤を含む組成物を投与する投薬レジメンは、組成物の数回の投与を含み、第1の投与は、移植後10日以内に、好ましくは、移植後2日から9日の間に、より好ましくは、移植後4日から7日の間に生じる。より好ましい実施形態では、mTOR阻害剤を含む組成物を投与する投薬レジメンは、組成物の数回の投与を含み、第1の投与は、移植後10日以内に、好ましくは、移植後2日から9日の間に、より好ましくは、移植後4日から7日の間に生じ、1回の投与は、その後各日で生じる。当業者には明らかであろうが、mTOR阻害剤の第1の投与の時点は、レシピエントの全身状態(例えば、心膜液/胸腔貯留があるか否か)に応じて変わる。好ましくは、mTOR阻害剤を含む組成物投与の用量は、5〜10ng/mlのラパマイシンのトラフレベルに調整される。この実施形態のすべての他の態様によれば、好ましい経路は、静脈内(i.v.)短時間注入である。本発明に従うmTOR阻害剤を含む組成物を投与する特に好ましい投薬レジメンは、図7に表わされている。
【０１０３】
本発明の一実施形態では、本発明に従うレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するためのmTOR阻害剤を含む組成物は、投薬レジメンに従って免疫抑制誘導療法を受けたレシピエント生物に、及び/又は免疫抑制維持療法、抗炎症療法、降圧剤及び/又は追加の療法をそれぞれの投薬レジメンに従って受けているレシピエント生物に投与される。本発明者らが、移植後に1種又は複数の降圧剤をレシピエントに投与すること、移植後にmTOR阻害剤をレシピエントに投与すること及び免疫抑制維持療法の一部としてレシピエントに投与されるグルココルチコイドの投与量を減少することが、移植後早期にレシピエント生物におけるドナー心臓の過成長を防ぐことを見出したことを考慮して、本発明に従うレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するためのmTOR阻害剤を含む組成物は、好ましくは、免疫抑制維持療法及び降圧剤をそれぞれの投薬レジメンに従って受けているレシピエント生物に投与される。上記の処置及びその(好ましい)実施形態のいずれかのそれぞれの投薬レジメンは、レシピエント生物の生存を延長する方法について上記で記載されたとおりである。当業者には明らかであろうが、レシピエント生物が、上記の処置のうち1つをそれぞれの投薬レジメンに従って受けている場合には、前記投薬レジメン中に含まれる第1の投与は、既に生じている。好ましくは、レシピエント生物が、免疫抑制維持療法を投薬レジメンに従って受けている場合及び前記投薬レジメンが、グルココルチコイドの投与量(mg/kg/日)をある特定の期間特定の係数分の1に減少させることを含む場合には、このような減少はすでに生じている。
【０１０４】
本発明の別の実施形態では、レシピエント生物の生存を延長する方法において使用するためのmTOR阻害剤を含む組成物は、移植前に異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓が、例えば、レシピエント生物の生存を延長する方法について上記で記載されるように、非虚血性保存によって、好ましくは、非虚血性心臓/腎臓/肺/肝臓灌流によって保存されていたレシピエント生物に投与される。
【０１０５】
心臓/腎臓/肺/肝臓移植後の霊長類の生存を延長する方法において使用するための降圧剤組成物
更に、本発明は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するための1種又は複数の降圧剤を含む組成物であって、ドナー生物が、哺乳動物であり、レシピエント生物が、霊長類である組成物に関する。好ましくは、前記レシピエント生物は、レシピエント生物の心臓/腎臓/肺/肝臓を機能的に置換するように、遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されている。
【０１０６】
1種又は複数の降圧剤を含む組成物が使用される方法は、上記のレシピエント生物の生存を延長する方法と似ているので、上記のレシピエント生物の生存を延長する方法のそれぞれの実施形態はまた、レシピエント生物の生存を延長する方法において使用するための1種又は複数の降圧剤を含む組成物の実施形態でもある。特に、ドナー生物、レシピエント生物及び遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓は、レシピエント生物の生存を延長する方法のそれぞれの実施形態について上記で記載されるとおりである。別の好ましい実施形態では、1種又は複数の降圧剤が使用される方法は、レシピエント生物の生存を、移植後40日よりも後まで、移植後50日よりも後まで、移植後60日よりも後まで、移植後70日よりも後まで、移植後80日よりも後まで、又は移植後90日よりも後まで延長する。好ましくは、1種又は複数の降圧剤が使用される方法は、レシピエント生物の生存を、移植後50日よりも後まで、より好ましくは、移植後70日よりも後まで、最も好ましくは、移植後90日よりも後まで延長する。
【０１０７】
一実施形態では、本発明に従う1種又は複数の降圧剤を含む組成物は、利尿薬、例えば、ループ利尿薬フロセミド及びエタクリン酸、チアジド/チアジド様利尿薬ヒドロクロロチアジド及びインダパミド及びカリウム保持性利尿薬トリアムテレン及びアミロライド;カルシウムチャネルブロッカー、例えば、ジヒドロピリジンアムロジピン及びニフェジピン及び非ジヒドロピリジンベラパミル及びジルチアゼム;アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、例えば、エナラプリル及びラミプリル;アンジオテンシンII受容体アンタゴニスト、例えば、バルサルタン及びカンデサルタン;アドレナリン受容体アンタゴニスト、例えば、ベータブロッカービソプロロール及びメトプロロール、アルファブロッカードキサゾシン及びフェノキシベンザミン並びに混合アルファ/ベータブロッカーカルベジロール及びラベタロール;血管拡張剤、例えば、ナトリウムニトロプルシド及びヒドラジン;レニン阻害剤、例えば、アリスキレン;アルドステロン受容体アンタゴニスト、例えば、スピロノラクトン及びエプレレノン;アルファ-2アドレナリン受容体アゴニスト、例えば、クロニジン及びメチルドパ;並びにエンドセリン受容体ブロッカー、例えば、ボセンタンから選択される1種又は複数の降圧剤を含む。好ましい実施形態では、1種又は複数の降圧剤を含む組成物は、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤及びアドレナリン受容体アンタゴニストから選択される1種又は複数の降圧剤を含む。
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従う1種又は複数の降圧剤を含む組成物は、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、好ましくは、エナラプリルを含む。エナラプリルは、例えば、Hexal AG(ドイツ、ホルツキルヒェン)からEnahexalとして市販されている。本発明の別の好ましい実施形態では 、本発明に従う1種又は複数の降圧剤を含む組成物は、アドレナリン受容体アンタゴニスト、好ましくは、メトプロロール酒石酸塩を含む。メトプロロール酒石酸塩は、例えば、AstraZeneca GmbH(ドイツ、ヴェーデル)からBeloc i.v.として市販されている。別の好ましい実施形態では、本発明に従う1種又は複数の降圧剤を含む組成物は、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、好ましくは、エナラプリル及びアドレナリン受容体アンタゴニスト、好ましくは、メトプロロール酒石酸塩を含む。
【０１０９】
当業者には明らかであろうが、本発明に従う1種又は複数の降圧剤を含む組成物は、医薬上許容される担体及び/又は賦形剤を更に含み得る。
【０１１０】
好ましくは、本発明に従う1種又は複数の降圧剤を含む組成物は、投薬レジメンに従ってレシピエント生物に投与される。より好ましくは、前記投薬レジメンは、移植後の組成物の投与を含む。
【０１１１】
好ましい実施形態では、1種又は複数の降圧剤を含む組成物を投与する投薬レジメンは、組成物の数回の投与を含み、1回の投与は、移植後2日以内に、好ましくは、移植後1日以内に生じる。より好ましい実施形態では、1種又は複数の降圧剤を含む組成物を投与する投薬レジメンは、組成物の数回の投与を含み、1回の投与は、移植後2日以内に、好ましくは、移植後1日以内に生じ、1回の投与は、その後各日で生じる。この実施形態のすべての他の態様によれば、1種又は複数の降圧剤を含む組成物を投与する好ましい経路は、静脈内(i.v.)投与である。
【０１１２】
好ましくは、1種又は複数の降圧剤を含む組成物の用量は、レシピエント生物の平均動脈圧が、70〜90mmHgの範囲内で、好ましくは、75〜85mmHgの範囲内で維持されるように調整される。更により好ましくは、用量は、レシピエント生物の平均動脈圧が、70〜90mmHgの範囲内で、好ましくは、75〜85mmHgの範囲内で維持されるように、及び心拍数が、80〜120bpmの範囲内、好ましくは、90〜110bpmの範囲内で維持されるように調整される。本発明に従う1種又は複数の降圧剤を含む組成物を投与する特に好ましい投薬レジメンは、図9に表わされている。
【０１１３】
本発明の一実施形態では、レシピエント生物の生存を延長する方法において使用するための1種又は複数の降圧剤を含む組成物は、投薬レジメンに従って免疫抑制誘導療法を受けたレシピエント生物に、及び/又は免疫抑制維持療法、抗炎症療法、mTOR阻害剤及び/又は及び/又は追加の療法をそれぞれの投薬レジメンに従って受けているレシピエント生物に投与される。本発明者らが、移植後に1種又は複数の降圧剤をレシピエントに投与すること、移植後にmTOR阻害剤をレシピエントに投与すること及び免疫抑制維持療法の一部としてレシピエントに投与されるグルココルチコイドの投与量を減少することが、移植後早期にレシピエント生物におけるドナー心臓の過成長を防ぐことを見出したことを考慮して、本発明に従うレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するための1種又は複数の降圧剤を含む組成物は、好ましくは、免疫抑制維持療法及びmTOR阻害剤をそれぞれの投薬レジメンに従って受けているレシピエント生物に投与される。上記の処置及びその(好ましい)実施形態のいずれかのそれぞれの投薬レジメンは、レシピエント生物の生存を延長する方法について上記で記載されたとおりである。当業者には明らかであろうが、レシピエント生物が、上記の処置のうち1つをそれぞれの投薬レジメンに従って受けている場合には、前記投薬レジメン中に含まれる第1の投与は、既に生じている。好ましくは、レシピエント生物が、免疫抑制維持療法を投薬レジメンに従って受けている場合及び前記投薬レジメンが、グルココルチコイドの投与量(mg/kg/日)をある特定の期間特定の係数分の1に減少させることを含む場合には、このような減少はすでに生じている。
【０１１４】
本発明の別の実施形態では、レシピエント生物の生存を延長する方法において使用するための1種又は複数の降圧剤を含む組成物は、移植前に異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓が、例えば、レシピエント生物の生存を延長する方法について上記で記載されるように、非虚血性保存によって、好ましくは、非虚血性心臓/腎臓/肺/肝臓灌流によって保存されていたレシピエント生物に投与される。
【０１１５】
心臓/腎臓/肺/肝臓の不全を予防又は処置する方法、このような方法によって得られる霊長類及びこのような方法において使用するための組成物
本発明はまた、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されるレシピエント生物において心臓/腎臓/肺/肝臓の不全を予防又は処置する方法であって、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓が移植されるレシピエント生物の生存を延長する方法について上記で記載された工程及び好ましい実施形態のすべてを含む方法に関する。
【０１１６】
本発明はまた、心臓/腎臓/肺/肝臓が、異種哺乳動物由来の移植された遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓によって機能的に置換される生存している霊長類であって、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓が移植されるレシピエント生物において心臓/腎臓/肺/肝臓の不全を予防又は処置する上記の方法によって得られる霊長類に関する。前記生存している霊長類及びその好ましい実施形態は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されるレシピエント生物の生存を延長する方法によって得られる生存している霊長類について上記で記載されたとおりである。
【０１１７】
本発明はまた、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物において心臓/腎臓/肺/肝臓の不全を予防又は処置する方法において使用するためのmTOR阻害剤を含む組成物であって、ドナー生物が、哺乳動物であり、レシピエント生物が、霊長類である、組成物に関する。前記mTOR阻害剤を含む組成物及びその好ましい実施形態は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するためのmTOR阻害剤を含む組成物について上記で記載されたとおりである。
【０１１８】
本発明はまた、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物において心臓/腎臓/肺/肝臓の不全を予防又は処置する方法において使用するための1種又は複数の降圧剤を含む組成物であって、ドナー生物が、哺乳動物であり、レシピエント生物が、霊長類である、組成物に関する。前記1種又は複数の降圧剤を含む組成物及びその好ましい実施形態は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するための1種又は複数の降圧剤を含む組成物について上記で記載されたとおりである。
【０１１９】
異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されるレシピエント生物を処置する方法、このような方法によって得られる霊長類及びこのような方法において使用するための組成物
本発明はまた、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されるレシピエント生物を処置する方法であって、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されるレシピエント生物の生存を延長する方法の上記の工程及び好ましい実施形態のすべてを含む方法に関する。
【０１２０】
本発明はまた、心臓/腎臓/肺/肝臓が、移植された異種哺乳動物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓によって機能的に置換されている生存している霊長類であって、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物を処置する上記の方法によって得られる、生存している霊長類に関する。前記生存している霊長類及びその好ましい実施形態は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法によって得られる生存している霊長類について上記で記載されるとおりである。
【０１２１】
本発明はまた、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物を処置する方法において使用するためのmTOR阻害剤を含む組成物であって、ドナー生物が、哺乳動物であり、レシピエント生物が、霊長類である、組成物に関する。前記mTOR阻害剤を含む組成物及びその好ましい実施形態は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するためのmTOR阻害剤を含む組成物について上記で記載されるとおりである。
【０１２２】
本発明はまた、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物を処置する方法において使用するための1種又は複数の降圧剤を含む組成物であって、ドナー生物が、哺乳動物であり、レシピエント生物が、霊長類である、組成物に関する。前記1種又は複数の降圧剤を含む組成物及びその好ましい実施形態は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するための1種又は複数の降圧剤を含む組成物について上記で記載されるとおりである。
【０１２３】
異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物において心臓/腎臓/肺/肝臓の過成長を予防する方法、このような方法によって得られる霊長類及びこのような方法において使用するための組成物
レシピエント生物における移植された心臓/腎臓/肺/肝臓の過成長は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓が、レシピエント生物中に移植される場合の主要な問題である。過成長とは、特に、外因性因子のために(例えば、空間制限による圧迫)、又は内因性因子のために(例えば、不十分な微小血管循環による低酸素)臓器又は組織機能にとって有害である、臓器又は組織質量又は容積の何らかの増大を指す。一実施形態では、心臓過成長とは、移植された心臓が移植後およそ1カ月以内に容積及び質量が3倍〜4倍になることを意味する。周囲の解剖学的構造、レシピエントの胸部が、この拡大を最終的に制限する。結果として、心臓機能が著しく制限され、血流が制限され、閉塞され、滞留し、うっ血する。肝臓は、心臓の下の(後ろの)血行動態的に第1の臓器であるので、肝臓機能が最初に損なわれる。レシピエントは、心臓及び肝臓機能障害に屈する。過成長の理由は、哺乳動物の心臓(例えば、ブタ心臓)が、ドナーにおいて迅速に(つまり、移植の時点で、およそ20kgであり得る、迅速に成長する身体に比例して)成長することである。ボストンハーバードグループは、腎臓及び肺移植後にもこの現象を見出し、それは「内因性成長」と呼ばれた(心臓は、その身体発達の時点において迅速に成長しなければならず、たとえ霊長類の身体に移植されるとしても、成長を止めない;参考文献15を参照のこと)。
【０１２４】
本発明者らは、特に、移植後に1種又は複数の降圧剤をレシピエントに投与すること、移植後にmTOR阻害剤をレシピエントに投与すること及び免疫抑制維持療法の一部としてレシピエントに投与されるグルココルチコイドの投与量を迅速に減少させることが、レシピエント生物におけるドナー心臓の過成長を移植後早期に防ぐことを見出した(例えば、図5及び6を参照のこと)。したがって、本発明はまた、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物において心臓/腎臓/肺/肝臓の過成長を防ぐ方法であって、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓が移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法の上記の工程及び好ましい実施形態のすべてを含む方法に関する。
【０１２５】
本発明はまた、心臓/腎臓/肺/肝臓が、移植された異種哺乳動物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓によって機能的に置換されている生存している霊長類であって、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物における心臓/腎臓/肺/肝臓の過成長を防ぐ上記の方法によって得られる、生存している霊長類に関する。前記生存している霊長類及びその好ましい実施形態は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法によって得られる生存している霊長類について上記で記載されるとおりである。
【０１２６】
本発明はまた、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物において心臓/腎臓/肺/肝臓の過成長を防ぐ方法において使用するためのmTOR阻害剤を含む組成物であって、ドナー生物が、哺乳動物であり、レシピエント生物が霊長類である、組成物に関する。前記mTOR阻害剤を含む組成物及びその好ましい実施形態は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するためのmTOR阻害剤を含む組成物について上記で記載されるとおりである。
【０１２７】
本発明はまた、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物において、心臓/腎臓/肺/肝臓の過成長を防ぐ方法において使用するための1種又は複数の降圧剤を含む組成物であって、ドナー生物が、哺乳動物であり、レシピエント生物が、霊長類である、組成物に関する。前記1種又は複数の降圧剤を含む組成物及びその好ましい実施形態は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓を移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するための1種又は複数の降圧剤を含む組成物について上記で記載されるとおりである。
【０１２８】
他の臓器の異種移植への本発明の適用性
上記のように、ボストンハーバードグループは、腎臓及び肺移植後にもレシピエントにおけるドナー臓器過成長の現象を見出した(参考文献15を参照のこと)。このような移植のレシピエントは、それぞれの終末期疾患を患うであろう。したがって、本発明に記載される方法(特に、レシピエントに移植後に1種又は複数の降圧剤を投与すること、移植後にレシピエントにmTOR阻害剤を投与すること及び移植後早期に免疫抑制維持療法の一部としてレシピエントに投与されるグルココルチコイドの投与量を減少させること)は、腎臓移植、肺移植及び肝臓移植を含めた任意の異種臓器移植にとって有用である。例えば、本技術はまた、前臨床腎臓、肺(肝臓も)移植後にアカゲザルにおいても働かなければならない(参考文献15を参照のこと)。
【０１２９】
遺伝子改変された哺乳動物及びそれを製造する方法
家畜種の遺伝子工学及びゲノム編集における大きな前進によって、その使用は生物医学的適用に伸ばされ、最も注目すべきは、以下である:トランスレーショナル医療のための目的に合わせた大きな動物モデル;異種移植のためのブタ細胞、組織及び臓器;並びにトランスジェニック大型動物における医薬用タンパク質の製造。基礎研究から得た新規発見から臨床適用への橋渡しは、長く、しばしば非効率的な、費用のかかるプロセスである。適当な動物モデルは、橋渡し研究の成功にとって重大である。げっ歯類モデルは広く使用されているが、ヒト疾患に正確に相当するものではないことが多い。したがって、ヒト解剖学及び生理学の面をより密接に模倣するさらなる動物モデルが必要である。数種の遺伝子操作されたブタモデルが作製されており、そのうちの多数が、既存のげっ歯類モデルよりも密接にヒト疾患機序及び表現型を表す。更に、ブタは、異種移植の最も有望なドナー種である。異種-臓器の免疫拒絶を防ぎ、生理学的不適合性を克服するために、及びブタ内因性レトロウイルス(PERV)等の潜在的リスク因子を排除するために、複数の遺伝子改変が必要であるので、ゲノム編集は、この分野における高速の進歩である。最後になったが、医薬用タンパク質の製造のためのバイオリアクターとしての大型動物種の遺伝子工学は、依然として興味深い選択肢であるが、2、3種のこのような製品しか、市販されていない。要約すると、遺伝子操作された大型動物は、生体臨床医学においてますます重要な役割を果たすようになっている。適用のすべての領域について、遺伝子操作されたブタの価値のために、一貫した、信頼できる導入遺伝子発現が重要である。本発明は、一貫した、信頼できる導入遺伝子発現を有する遺伝子改変された哺乳動物を提供する。
【０１３０】
本明細書において記載されるレシピエント生物の生存を延長する方法において、前記レシピエント生物は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植される。同様に、上記の生存している霊長類は、異種哺乳動物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が移植されており、mTOR阻害剤/降圧剤を含む上記の組成物は、異種ドナー生物由来の遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓が移植されているレシピエント生物の生存を延長する方法において使用するためのものである。本明細書において提供される一貫した、信頼できる導入遺伝子発現を有する遺伝子改変された哺乳動物は、一実施形態では、このような遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓の異種ドナー生物として働き得る。
【０１３１】
ゲノム中にランダムに挿入された導入遺伝子の発現は、隣接するクロマチンの状況に大きく左右される。これらのいわゆる位置効果は、異なるトランスジェニック系列間で可変導入遺伝子発現をもたらし、1つの系列内でも一貫しない発現をもたらすことが多い。ランダム導入遺伝子挿入のこれらの不利点を避ける戦略として、オープン構造を有し、安定な導入遺伝子発現を確実にする、いわゆる「セーフハーバー」遺伝子座への発現カセットの標的化配置がある。最も顕著な例として、ブタにおいても発見され、使用されている、マウスにおけるRosa26遺伝子座がある(参考文献27を参照のこと)。本発明は、信頼できる導入遺伝子発現にとって有利なセーフハーバーとしてGGTA1遺伝子座を提供する。これは、とりわけ、以下の利点を提供する:
i)GGTA1は、複数の組織及び細胞種において、最も重要なことに、内皮細胞において高度に発現される:ブタ内皮野生型細胞では、CMAHの転写レベルは、B4GALNT2のものと同様であるが、GGTA1の転写レベルは、およそ5倍高い(実施例6も参照のこと)、
ii)GGTA1は、GGTA1を欠くヒト及び旧世界サル並びにGGTA1ノックアウトブタの複数の系列によって実証されるように、正常発達にとって不必要である、
iii)標的化ヌクレアーゼを使用するGGTA1の突然変異は、卵母細胞への注入後でさえ高度に効率的である(参考文献28を参照のこと)、
iv異種移植のドナーブタを作製するために、ともかくGGTA1を不活性化して、ブタから霊長類への異種移植組織の超急性拒絶を避けることが好ましい。
v)GGTA1遺伝子座への異種保護的導入遺伝子の標的化組込みは、育種の際のその分離を防ぐ。
【０１３２】
上記を考慮して、本発明は、導入遺伝子が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子(GGTA1)遺伝子座に挿入されており、導入遺伝子のうち少なくとも1つが、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の内因性プロモーターの制御下で発現される、遺伝子改変された哺乳動物を提供する。
【０１３３】
異種移植組織の免疫拒絶を防ぎ、生理学的不適合性を克服し、動物由来感染症病原体を伝染させるリスクを低減するために、40種を超える種々の遺伝子改変が、ブタに導入されている(参考文献29に概説されている)。独立した組込み部位の分離を避けながら実用的な動物育種を可能にするために複数の導入遺伝子を組み合わせるという課題は、「コンビニアリング」及び遺伝子スタッキング、すなわち、単一ゲノム遺伝子座での複数の発現カセットのランダム又は標的化配置によって克服できる(参考文献23、30を参照のこと)。したがって、本発明は、いくつかの導入遺伝子が、同一遺伝子座、すなわち、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子(GGTA1)遺伝子座に挿入されている遺伝子改変された哺乳動物を提供する。
【０１３４】
GGTA1遺伝子座での導入遺伝子の挿入は、GGTA1遺伝子を破壊し、従って、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を消失させる。本発明に従って移植された遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓においてGGTA1の破壊は、異種移植組織の超急性拒絶を避けるのに役立つので好ましい。ブタから霊長類への異種移植組織の超急性拒絶は、特異的異種抗原との事前形成された抗体の結合によって引き起こされる。補体系のその後の活性化は、異種移植片上のレギュレーターとレシピエントのエフェクター分子間の種不適合性のために制御できない(参考文献31に概説されている)。主要な異種抗原は、N-アセチルラクトサミニドアルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ(GGTA1)によって合成されるガラクトース-α1,3-ガラクトース(αGal)である。この酵素は、ヒト及び旧世界サルでは欠損しており、αGalは、結果として存在しない。腸管における細菌αGalエピトープとの免疫学的接触は、ヒト及び旧世界サルに若年期において抗αGal抗体を作製させる。
【０１３５】
GGTA1遺伝子座中に挿入される導入遺伝子は、ヒト補体調節タンパク質導入遺伝子(すなわち、ヒト補体調節タンパク質をコードする配列)及びヒトトロンボモジュリン導入遺伝子(すなわち、ヒトトロンボモジュリンをコードする配列)である。トランスジェニックドナー哺乳動物(例えば、ブタ)におけるヒト補体調節タンパク質の発現は、哺乳動物(例えば、ブタ)から霊長類への異種移植組織の超急性拒絶を克服するために望ましい。ヒト補体調節タンパク質は、補体活性化を減弱し、哺乳動物(例えば、ブタ)から霊長類への異種移植組織の生存を有意に延長する(参考文献29に概説されている)。本発明に従う例示的ヒト補体調節タンパク質として、CD46(膜補因子タンパク質;MCP)、CD55(補体崩壊促進因子、DAF)及びCD59(反応性溶解の膜阻害剤、MIRL)がある。本発明に従う特に好ましいヒト補体調節タンパク質は、CD46である。しかし、本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物はまた、GGTA1遺伝子座中に挿入されたCD46、CD55及びCD59のうちすべても有し得る。
【０１３６】
血液凝固の調節不全及び止血の乱れは、前臨床哺乳動物(例えば、ブタ)から非ヒト霊長類への異種移植における頻繁な合併症である(参考文献32に概説されている)。症状は、血小板減少及び出血を伴う急性の命を脅かす消費性凝固障害から、異種移植片の喪失につながる血栓性微小血管障害に及ぶ。提案される原因として、炎症、血管損傷、自然、体液性及び細胞性免疫応答、特に、血液凝固の哺乳動物(例えば、ブタ)及び霊長類レギュレーター間の分子不適合性が挙げられる(参考文献33を参照のこと)。ヒトトロンボモジュリン(hTM)は、ドナー哺乳動物(例えば、ブタ)の遺伝子工学によって補給され得る重要な内皮抗凝固性/抗血栓性タンパク質である。ブタTMは、ヒトトロンビンと結合するが、ヒトプロテインCの活性化の不十分な補助因子である(参考文献34を参照のこと)。この問題を克服するために、種々のプロモーター:CMV(参考文献35を参照のこと)、CAGGS(参考文献36を参照のこと)、ヒトICAM(参考文献5を参照のこと)及びブタTHBD(参考文献37を参照のこと)下でヒトTMを発現するトランスジェニック哺乳動物(例えば、ブタ)の系列を作製できる。GGTA1ノックアウト、後者のhTM発現ベクターを有するhCD46トランスジェニックブタ心臓は、適当な免疫抑制(抗胸腺細胞グロブリン及び抗CD20抗体を用いる誘導、ミコフェノール酸モフェチル及び集中的に投薬される抗CD40(2C10R4)抗体を用いる維持)を有するヒヒにおいて異所性腹部移植後に900日より多く生存した(参考文献5を参照のこと)。
【０１３７】
本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物は、追加の遺伝子改変を有し得る。一実施形態では、本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物は、CMAH及びB4GALNT2遺伝子のホモ接合性ノックアウトを更に有する。シチジン一リン酸-N-アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ(CMAH)は、N-アセチルノイラミン酸(Neu5Gc、Flanganutziu-Deicher抗原とも呼ばれる)を合成し、ブタβ-1,4-N-アセチル-ガラクトサミニルトランスフェラーゼ2(B4GALNT2)は、Sd(a)様グリカンを生成する。両方とも他の顕著な異種抗原である(参考文献38に概説されている)。GGTA1/CMAH/B4GALNT2欠損ブタから得た細胞は、GGTA1及びCMAHのみを欠いている細胞と比較した、ヒトIgM及びIgG結合の低減の結果を示す。
【０１３８】
別の実施形態では、本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物は、ヘムオキシゲナーゼ1(好ましくは、ヒトヘムオキシゲナーゼ1)をコードする配列及びA20(好ましくは、ヒトA20)をコードする配列の挿入を更に有する。好ましくは、これらの挿入もまた、GGTA1遺伝子座におけるものである。
【０１３９】
別の実施形態では、本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物は、LEA29Y又はPD-L1(好ましくは、ヒトPD-L1)をコードする配列の挿入を更に有する。好ましくは、これらの挿入もまた、GGTA1遺伝子座におけるものである。別の実施形態では、本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物は、ヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼをコードする配列の挿入を更に有する。好ましくは、この挿入もまた、GGTA1遺伝子座におけるものである。
【０１４０】
本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物では、ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座に挿入され、その結果、少なくともヒト補体調節タンパク質をコードする配列が、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の内因性プロモーターの制御下で発現される。上記のように、GGTA1は、複数の組織及び細胞種において、最も重要なことに、内皮細胞において高度に発現される。したがって、ヒト補体調節タンパク質をコードする配列を、それが、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の内因性プロモーターの制御下で発現されるようにGGTA1遺伝子座に挿入することは、ヒト補体調節タンパク質が高度に発現されることを確実にする。
【０１４１】
本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物の別の実施形態では、ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列の両方が、それらが、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の内因性プロモーターの制御下で発現されるように挿入され、その結果、両遺伝子は、複数の組織及び細胞種において高度に発現される。複数の組織及び細胞種におけるヒト補体調節タンパク質及びヒトトロンボモジュリンの発現は、本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物が、種々の臓器、すなわち、遺伝子改変された心臓、腎臓、肺又は肝臓の各々の異種ドナー生物として働き得ることを確実にする。
【０１４２】
本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物の代替実施形態では、ヒト補体調節タンパク質をコードする配列は、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の内因性プロモーターの制御下で発現され、ヒトトロンボモジュリンをコードする配列は、ブタTHBDプロモーター又は外因性プロモーターの制御下で発現される。例えば、外因性プロモーターは、CMVプロモーター、CAGGSプロモーター又はヒトICAMプロモーターであり得る。好ましくは、このような外因性プロモーターは、遍在的に活性なプロモーター、すなわち、複数の組織及び細胞種において発現されるプロモーターである。やはり、複数の組織及び細胞種におけるヒトトロンボモジュリンをコードする配列の発現は、本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物が、種々の臓器の異種ドナー生物として働き得ることを確実にする。
【０１４３】
本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物の別の実施形態では、遺伝子改変された哺乳動物は、ヒト補体調節タンパク質をコードする配列とヒトトロンボモジュリンをコードする配列の間の選択マーカー遺伝子配列の挿入を更に有する。好ましくは、この選択マーカー遺伝子配列は、loxP部位と隣接している。これは、遺伝子改変された哺乳動物に由来する細胞が、単離され、追加の発現ベクターの標的化組込みのために使用され得ることを確実にする。追加の発現ベクターは、1種又は数種の追加の導入遺伝子を含有する遺伝子操作された細菌人工染色体(BAC)とのCre媒介性カセット交換によって挿入され得る(図18を参照のこと)。
【０１４４】
本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物の別の実施形態では、遺伝子改変された哺乳動物は、イノシシ科に、好ましくは、イノシシ属に、より好ましくは、イノシシ種に、最も好ましくは、ブタ亜種に属する。本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物の好ましい実施形態では、遺伝子改変された哺乳動物は、イノシシ種に属する。
【０１４５】
本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物の別の実施形態では、遺伝子改変された哺乳動物は、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタ、デュロックブタ、シュヴェービッシュ-ヘリッシュ(シュヴァーベン-ホール(Swabian-Hall))ブタ、ブラックミニブタ又はオークランド・アイランドブタである、好ましくは、遺伝子改変された哺乳動物は、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタである。
【０１４６】
本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物の別の実施形態では、遺伝子改変された哺乳動物(例えば、ブタ)は、ブタ内因性レトロウイルスC(PERV-C)を有さない。ブタ内因性レトロウイルス(PERV)は、それらがブタゲノム中に組み込まれているので容易に排除できず、従って、最も難治性のリスクの供給源となる(参考文献39に概説されている)。PERV-A及びPERV-Bは、いくつかのヒト腫瘍細胞に、及びより少ない程度でヒト一次細胞に感染できる。PERV-Cは、ブタ細胞のみに感染するが、PERV-Aを有する組換え体は、ヒト細胞に感染でき、高い複製速度を特徴とする。PERV-Cは、すべてのブタに存在するわけではないので、PERV-Cを有さない動物を同定し、可能性あるドナーとして選択することが可能である。これは、特に、本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物(例えば、ブタ)が、霊長類中に移植されるべき臓器の異種ドナー生物として働く場合に好ましい。
【０１４７】
本発明はまた、霊長類中に移植される臓器の異種ドナー生物として働き得る遺伝子改変された哺乳動物を作製する方法を提供する。この方法は、哺乳動物ゲノムのアルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座にヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列を挿入して、遺伝子改変されたゲノムを提供すること、遺伝子改変されたゲノムを細胞中に導入すること、遺伝子改変されたゲノムを含む細胞が、遺伝子改変された哺乳動物に成熟するのを可能にすることを含む。好ましくは、ゲノムは、体細胞ゲノムであり、遺伝子改変されたゲノムは、体細胞核移植によって細胞中に導入される(このような遺伝子改変された哺乳動物を得る方法に関する詳細については、例えば、その全文が本明細書に組み込まれる参考文献92を参照のこと)。
【０１４８】
本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物を作製する方法の一実施形態では、ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列は、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座中に挿入される単一発現ベクター上に位置している。好ましくは、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座中に挿入される発現ベクターは、ヒト補体調節タンパク質をコードする配列とヒトトロンボモジュリンをコードする配列の間に選択マーカー遺伝子配列を更に含む。当業者には公知となろうが、このマーカー 遺伝子配列は、遺伝子改変されたゲノムを含む細胞の選択を可能にする。
【０１４９】
本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物を作製する方法の別の実施形態では、方法は、ヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼをコードする配列を挿入すること及び/又は1つ若しくは複数の追加の遺伝子改変を哺乳動物ゲノム中に導入することを更に含む。これらの遺伝子改変が挿入である場合には、配列がGGTA1遺伝子座に挿入されることが好ましい。更により好ましくは、挿入されるべき配列は、本発明に従うアルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座中に挿入される、ヒト補体調節タンパク質をコードする配列及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列と一緒に、単一発現ベクター上に位置する。
【０１５０】
本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物を作製する方法の好ましい実施形態では、遺伝子改変は、CRISPR/Cas9を使用して導入される。CRISPR/Cas9は、ゲノム内の遺伝子の標的化挿入及び/又は欠失を可能にする。或いは、遺伝子改変は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)又は転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を使用して導入され得る。これらの技術の使用は、その全文が本明細書に組み込まれる参考文献107に記載されている。
【０１５１】
本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物について上記で記載される実施形態はまた、変更すべきところは変更して、本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物を作製する方法に当てはまる。特に、本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物を作製する方法の好ましい実施形態では、哺乳動物は、イノシシ種に属する。
【０１５２】
本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物について、及び本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物を作製する方法について両方とも、遺伝子改変された哺乳動物中に挿入される上記の配列に関する詳細は、本発明に従う心臓/腎臓/肺/肝臓移植後の霊長類の生存を延長する方法に関する節において、また本発明に従う移植された心臓/腎臓/肺/肝臓を有する霊長類に関する節において見出される。特に、好ましくは、それらの節において記載される遺伝子を挿入する場合に発現される転写物はまた、好ましくは、対応する配列を本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物中に挿入する場合に発現される転写物である。
【０１５３】
本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物の一実施形態では、遺伝子改変された哺乳動物は、1つ又は複数の追加の遺伝子改変を有する。同様に、本発明に従う遺伝子改変された哺乳動物を作製する方法の一実施形態では、方法は、1つ又は複数の追加の遺伝子改変を導入することを更に含む。遺伝子改変された哺乳動物が、異種移植のための遺伝子改変された臓器の異種ドナー生物として働くと思われる場合、これらの1つ又は複数の追加の遺伝子改変は、好ましくは、(1)哺乳動物(例えば、ブタ)から霊長類への異種移植組織の超急性及び急性血管性拒絶を克服するための遺伝子改変、(2)哺乳動物(例えば、ブタ)から霊長類への異種移植組織の細胞性拒絶を克服するための遺伝子改変、(3)血液凝固の調節不全及び炎症を克服するための遺伝子改変並びに/又は(4)動物由来感染症のリスクを低下させるための遺伝子改変から選択される。好ましい実施形態では、これらの遺伝子改変が、遺伝子挿入に相当する場合には、これらは、GGTA1遺伝子座にある。本発明に従う可能性がある遺伝子改変の上記のグループは、特に、ブタから霊長類への異種移植に関して以下に記載されている。これらの遺伝子改変のうちいずれも、本発明に従う1つ又は複数の追加の遺伝子改変であり得る:
【０１５４】
(1)ブタから霊長類への異種移植組織の超急性及び急性血管性拒絶を克服するための遺伝子改変。
ブタから霊長類への異種移植組織の超急性拒絶は、特異的異種抗原との事前形成された抗体の結合によって引き起こされる。補体系のその後の活性化は、異種移植片上のレギュレーターとレシピエントのエフェクター分子間の種不適合性のために制御できない(参考文献31に概説されている)。主要な異種抗原は、N-アセチルラクトサミニドアルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ(GGTA1)によって合成されるガラクトース-α1,3-ガラクトース(αGal)である。この酵素は、ヒト及び旧世界サルでは欠損しており、αGalは、結果として存在しない。腸管における細菌αGalエピトープとの免疫学的接触は、ヒト及び旧世界サルに若年期において抗αGal抗体を作製させる。その他の顕著な異種抗原として、シチジン 一リン酸-N-アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ(CMAH)によって合成されるN-アセチルノイラミン酸(Neu5Gc、Flanganutziu-Deicher抗原とも呼ばれる)及びブタβ-1,4-N-アセチル-ガラクトサミニルトランスフェラーゼ2(B4GALNT2)によって生成されるSd(a)様グリカンがある(参考文献38に概説されている)。ブタから霊長類への異種移植組織の超急性拒絶を克服するための第1の工程は、ヒト補体調節タンパク質、例えば、CD46(膜補因子タンパク質;MCP)、CD55(補体崩壊促進因子、DAF)、CD59(反応性溶解の膜阻害剤、MIRL)を単独で、又は組合せて発現するトランスジェニックドナーブタの作製であった。CD46トランスジェニックブタは、参考文献113において特性決定されている。これらのトランスジェニックドナーブタは、補体活性化を減弱し、ブタから霊長類への異種移植組織の生存を有意に延長する(参考文献29に概説されている)。血管形成されたブタから霊長類への異種移植組織の長期生存にむけての主要な工程は、ブタGGTA1遺伝子の不活性化であった。GGTA1(及び結果としてαGal)欠損ブタの最初の公開後(参考文献40を参照のこと)、最初に標的遺伝子組換えによって(参考文献41に概説される)、後に遺伝子編集によって(例えば、参考文献42)、複数のGGTA1ノックアウトブタ系列が作製された。Neu5Gc異種抗原を除去するために、CMAHを欠くブタが作製されており(参考文献43を参照のこと)、GGTA1欠損と組み合わされている(参考文献44〜46を参照のこと)。Sd(a)様異種抗原を排除するために、ブタB4GALNT2遺伝子も不活性化された(参考文献47を参照のこと)。著者らは、GGTA1/CMAH/B4GALNT2欠損ブタから得た細胞は、GGTA1及びCMAHのみを欠く細胞と比較して、ヒトIgM及びIgG結合の低減を示すことを示した。
【０１５５】
(2)ブタから霊長類への異種移植組織の細胞性拒絶を克服するための遺伝子改変
細胞性免疫系の自然及び適応構成成分は両方とも、異種移植片拒絶に寄与する(参考文献48に概説されている)。組織及び実質臓器異種移植組織の免疫細胞浸潤は、好中球で始まり、マクロファージ及びT細胞がそれに続く(参考文献49に概説されている)。更に、ナチュラルキラー(NK)細胞が、異種移植片において内皮細胞活性化を誘導することもあり(参考文献50を参照のこと)、ブタ細胞を直接的に、及び抗体依存性細胞傷害によって溶解することもある(参考文献51に概説される)。
【０１５６】
非ヒト霊長類におけるブタ膵島等の細胞性異種移植組織は、CD4+T細胞によって主に拒絶される。それらの活性化は、霊長類T細胞受容体の、ブタ細胞のSLAクラス1及びクラス2分子との直接結合によって、又は処理された異種抗原を用いてMHCを発現するレシピエントの抗原提示細胞(APC)によって間接的に誘導され得る(参考文献49に概説されている)。このT細胞受容体媒介性シグナルに加えて、T細胞活性化は、その性質に応じて、効果的な免疫応答を誘導し得る、増幅し得る、又は阻害性免疫寛容誘発機能を示し得る共刺激シグナルによって調節される。異種移植に関連して、最良に研究されたT細胞共刺激シグナル伝達複合体として、CD80/CD86-CD28及びCD40-CD154があり、CD28及びCD154(=CD40L)は、T細胞に位置しており、CD80/CD86及びCD40は、APCに位置している。CD80/CD86-CD28又は共刺激経路は、同種異系及び異種組織移植組織の著しく改善された長期アウトカムを有するCTLA4-lg(アバタセプト(登録商標))又はLEA29Y(ベラタセプト(登録商標))を用いる全身処置によって遮断され得る(参考文献52に概説されている)。これらの分子はまた、遺伝子改変されたドナーブタにおいて発現させることができ、T細胞活性化を移植組織部位で局所的に、従って、レシピエントの全身免疫抑制を、結果として、感染のリスクを避けながら阻害するという可能性を開いた(参考文献53において論評されている)。免疫不全糖尿病マウスに移植されたLEA29Y発現性トランスジェニックブタ新生仔膵島細胞クラスター(NICC)は、野生型NICCと対照的に血糖値を正常化し、レシピエントマウスをヒト免疫細胞を用いて再構成した後に拒絶されなかった(参考文献54を参照のこと)。レシピエントとして長期「ヒト化」免疫系を有する糖尿病マウスを使用するその後の研究は、LEA29Yを発現する異種移植されたブタ膵島が数カ月生存し、レシピエントの血糖値を正規化したのに対し、野生型膵島は、このモデルにおいて生着しなかったことを示した(参考文献55を参照のこと)。
【０１５７】
ヒトTNF関連アポトーシス誘導性リガンド(TRAIL)(参考文献56、57を参照のこと)、ヒトFASリガンド(FASL)(参考文献58を参照のこと)及びHLA-E/ベータ2-ミクログロブリンを発現するトランスジェニックブタも、細胞性拒絶を防ぐために作製されている。HLA-E/ベータ2-ミクログロブリンブタ由来の細胞は、NK細胞でのCD94/NKG2A発現のレベルに応じて、ヒトNK細胞媒介性細胞傷害性から効率的に保護された(参考文献51を参照のこと)。マクロファージ活性を制御するために、ブタ細胞でヒトCD47を発現させて、(ヒト)単球/マクロファージ上の「私を食べないで(don't eat me)シグナル」受容体SIRPαを活性化し、食作用活性を抑制した(参考文献29に概説されている)。
【０１５８】
(3)血液凝固の調節不全及び炎症を克服するための遺伝子改変
血液凝固の調節不全及び止血の乱れは、前臨床ブタから非ヒト霊長類異種移植における頻繁な合併症である(参考文献32に概説されている)。症状は、血小板減少及び出血を伴う急性の命を脅かす消費性凝固障害から、異種移植片の喪失につながる血栓性微小血管障害に及ぶ。提案される原因として、炎症、血管損傷、自然、体液性及び細胞性免疫応答、特に、血液凝固のブタ及び霊長類レギュレーター間の分子不適合性が挙げられる(参考文献33を参照のこと)。
【０１５９】
ドナーブタの遺伝子工学によって改変されている/補充されている重要な内皮抗凝固性/抗血栓性タンパク質として、ヒトトロンボモジュリン(hTM)、内皮プロテインC受容体(EPCR)、組織因子経路阻害剤(TFPI)及びエクトヌクレオチド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1(ENTPD1別名CD39)が挙げられる(参考文献33に概説されている)。
【０１６０】
ブタTMは、ヒトトロンビンに結合するが、ヒトプロテインCの活性化にとって不十分な補助因子である(参考文献34を参照のこと)。この問題を克服するために、ヒトTMを種々のプロモーター:CMV(参考文献35を参照のこと)、CAGGS(参考文献36を参照のこと)、ヒトICAM(参考文献5を参照のこと)及びブタTHBD(参考文献37を参照のこと)下で発現するトランスジェニックブタの系列が作製されている。GGTA1ノックアウト、後者のhTM 発現ベクターを有するhCD46トランスジェニックブタ心臓は、適当な免疫抑制(抗胸腺細胞グロブリン及び抗CD20抗体を用いる誘導、ミコフェノール酸モフェチル及び集中的に投薬される抗CD40(2C10R4)抗体を用いる維持)を有するヒヒにおいて異所性腹部移植後に900日より多く生存した(参考文献5を参照のこと)。
【０１６１】
EPCRはプロテインCに結合し、それをTHBD/トロンビン複合体に活性化のために提示し、活性化プロテインCの生成を増強する(参考文献59を参照のこと)。ブタ大動脈内皮細胞におけるヒトEPCRの発現は、ヒトTHBDとほぼ同程度に効率的にヒト血小板凝集を低減した(参考文献60を参照のこと)。著者らは、ヒトEPCRのトランスジェニック発現は、ブタTHBDの効果を増強し得るが、ヒトTHBDと同時発現される場合にはより大きな効果を有するであろうと結論づけた。ブタTFPIは、ヒトTF/第VIIa因子の、ヒトTFPIよりもあまり効率的ではない阻害剤である(参考文献33に概説されている)。最近の研究によって、Kunitzドメイン1がブタTFPIとヒト組織因子(TF)間の種不適合性にとって重要であること及び凝固は、ヒトTFPIがトランスフェクトされたブタ骨髄間葉系細胞によって阻害され得ることが実証された(参考文献61を参照のこと)。この不適合性を克服するためにヒトTFPIを発現するトランスジェニックブタが作製されている(参考文献62、63を参照のこと)。
【０１６２】
CD39は、ATP及びADPをAMPに迅速に加水分解する。AMPは、エクト-5'-ヌクレオチダーゼ(CD73)によってアデノシン、抗血栓性及び心血管保護媒介物質に加水分解される。マウスH-2Kbプロモーターの制御下でヒトCD39を発現するトランスジェニックブタは、心筋虚血/再灌流傷害後の梗塞サイズの低減を示した(参考文献64を参照のこと)。その後、遺伝子が複数改変されたブタ(ヒトCD39の発現を含む)の腎臓(参照される65、66を参照のこと)及び膵島(参考文献67を参照のこと)を、非ヒト霊長類における異種移植実験において試験した。しかし、他の遺伝子改変の中でヒトCD39の特異的効果を区別できなかった。
【０１６３】
凝固促進性TFの発現の低減は、siRNA媒介性ノックダウンによって達成されている(参考文献68を参照のこと)。ブタ肝臓の灌流の間のヒト血小板の異常な食作用は、ブタアシアロ糖タンパク質受容体(ASGR)を枯渇させることによって部分的に克服できた(参考文献69を参照のこと)。異種移植における血液凝固障害を標的とする改変に加えて、抗アポトーシス性及び抗炎症性タンパク質、例えば、ヒト腫瘍壊死因子アルファ誘導性タンパク質3(A20)(参考文献70を参照のこと)及びヒトヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)(参考文献71を参照のこと)を発現するトランスジェニックブタが製造されている。
【０１６４】
(4)動物由来感染症のリスクを低下させるための遺伝子改変
ブタ細胞、組織又は臓器の異種移植は、ブタ微生物をヒトレシピエントに伝染させ、動物由来感染症を誘導するリスクを有する(参考文献72、73を参照のこと)。稀に、同種移植がヒト免疫不全及び狂犬病ウイルス等の病原微生物の伝染と関連する。しかし、異種移植片は、高度療法用医薬品(ATMP)として厳密に規制されており、最高レベルの安全性必要条件の対象であり、したがって、将来では、同種移植組織よりも実際に安全であり得る(参考文献74を参照のこと)。広範な細菌、ウイルス、寄生生物及び真菌が理論上のリスクとなるが、種々のブタコロニーの包括的な調査によって、ブタにおいて見られる微生物の実際の数は限られていることがわかっている、例えば(参考文献26、75を参照のこと)。個々のブタにおける微生物の全体像は、まだ入手できず、使用される試験方法に応じて大きく異なるが、多数の新規病原菌が同定される可能性は低い。1つの理由は、ヒトとブタの数千年の共存であり、第2のものとしてほとんどのブタドナーがSPF又はSPFに近い条件下で生産され、第3の種からの感染症を防いでいることがある。それにもかかわらず、推定動物由来病原菌微生物のスクリーニング及び無菌試験は、必須である。
【０１６５】
ブタ内因性レトロウイルス(PERV)は、それらがブタゲノム中に組み込まれているので容易に排除できず、従って、最も難治性のリスクの供給源となる(参考文献39に概説されている)。PERV-A及びPERV-Bは、いくつかのヒト腫瘍細胞に、及びより少ない程度でヒト一次細胞に感染できる。PERV-Cは、ブタ細胞のみに感染するが、PERV-Aを有する組換え体は、ヒト細胞に感染でき、高い複製速度を特徴とする。PERV-Cは、すべてのブタに存在するわけではないので、PERV-Cを有さない動物を同定し、可能性あるドナーとして選択することが可能である。これまでのところ、200人を超える患者を用いたブタ膵島の第1の臨床治験を含めて多数の研究にもかかわらず、PERVのin vivo伝染は実証されていない。非ヒト霊長類に移植されたブタ細胞及び臓器の多数の前臨床治験においても、PERV伝染は実証されていない(参考文献39に概説されている)。しかし、ほとんどすべての臨床異種移植治験において、免疫抑制は適用されず、少数の細胞のみが移植された。動物異種移植及びPERV感染実験は、十分に機能的なPERV受容体を有さないレシピエント種、例えば、非ヒト霊長類又はラットを含む。したがって、in vivoでのPERV感染性に関するデータは、完全であると考えてはならない。
【０１６６】
PERV伝染を防ぐための戦略として、(i)PERV-A及び-Bを低発現するPERV-Cを有さない(参考文献23を参照のこと)動物の選択、(ii)中和抗体に基づくワクチン(概説については、参考文献76を参照のこと)及び(iii)PERV特異的siRNAによるPERV発現の長期間低減(例えば、参考文献77、78)が挙げられる。論文によって、CRISPR/Cas9システムを使用する不死ブタ腎臓細胞株(PK15)における最大62種のプロウイルスの同時不活性化が報告された(参考文献79を参照のこと)。このアプローチは、一次ブタ細胞を用いた場合再現できず、健常なPERVを有さない動物を生成した(参考文献80を参照のこと、参考文献81、82において論評されている)。
【０１６７】
異種臓器移植片のためのドナー生物及びそれを製造する方法
レシピエント生物における臓器過成長は、異種ドナー生物由来の(例えば、ブタ由来の)遺伝子改変された臓器が、レシピエント生物に(例えば、ヒヒに)移植される場合の大きな問題である。本発明によれば、臓器過成長は、処置の組合せ:(i)レシピエントの(例えば、ヒヒの)血圧を低下させて、ドナーの(例えば、ブタの)より低いレベルに対応すること、(ii)初期段階でコルチゾンを漸減すること及び/又は(iii)シロリムスプロドラッグであるテムシロリムスを使用して心筋肥大を緩和すること(実施例1〜4を参照のこと)によって相殺される。しかし、本発明者らは、ブタの(及び従ってその臓器の)成長は、成長ホルモン受容体(GHR)遺伝子をノックアウトすることによって遺伝的に相殺できるということを見出した(実施例7を参照のこと)。本発明者らは、GHR-KO(GHR-ノックアウト)ブタの体重が、対照と比較して60%低減されること及びほとんどの臓器の重量が比例的に低減されることを見出した。更に、GHR-KOブタは、血清インスリン様成長因子1(IGF1)レベルを著しく低減した。際立ったことに、GHR-KOブタを、IGF1を用いて処置することによって、その成長を促進することが可能となろう(ラロン症候群を有する患者について参考文献88、108、109及び110に示される)。したがって、GHR-KOブタをIGF1を用いて処置することによって、ブタ及びその臓器の大きさを随意に調整できる。
【０１６８】
上記を考慮して、本発明者らは、霊長類への異種移植のドナー生物として使用され得るGT-KO/hCD46/hTMブタにおいてGHR遺伝子をノックアウトした(実施例7を参照のこと)。したがって、本発明は、異種移植の適したドナーであるGHR-KO哺乳動物(例えば、ブタ)を提供し、その大きさ/臓器の大きさは、それらをIGF1を用いて処置することによって調整され得る。本発明に従う異種移植においてこのようなドナー哺乳動物を使用することは、本発明の上記の薬物処置と協調して、臓器過成長を相殺し得る。したがって、ドナーとしてGHR-KO哺乳動物を使用すると、mTOR阻害剤を用いるレシピエントの長期処置を避けることができる。最後に、ドナー臓器の大きさをレシピエントの要求に応じて調整可能であることは、比較的小さいドナー臓器を必要とする比較的小さい大きさのレシピエントにとって特に有用であり得る。
【０１６９】
したがって、本発明は、異種臓器移植片のドナー生物であって、成長ホルモン受容体遺伝子のホモ接合性ノックアウトを有し、哺乳動物である、ドナー生物を提供する。このようなドナー生物は、実施例7に記載されるとおりに得ることができる。
【０１７０】
本発明に従う異種臓器移植片のドナー生物の一実施形態では、ドナー生物は、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のホモ接合性ノックアウト、ヒトCD46をコードする配列の挿入及びヒトトロンボモジュリンをコードする配列の挿入を更に有する。代替実施形態では、ドナー生物は、アルファ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAH及びB4GALNT2遺伝子のホモ接合性ノックアウト及びヒトCD46をコードする配列、ヒトCD55をコードする配列、ヒトCD59をコードする配列、ヘムオキシゲナーゼ1(好ましくは、ヒトヘムオキシゲナーゼ1) をコードする配列及びA20(好ましくは、ヒトA20)をコードする配列の挿入を更に有する。後者の実施形態では、ドナー生物は、LEA29Y又はPD-L1、好ましくは、ヒトPD-L1をコードする配列の挿入を更に有し得る。本発明に従う異種臓器移植片のドナー生物に挿入され得る上記の配列に関する詳細は、本発明に従う心臓/腎臓/肺/肝臓移植後の霊長類の生存を延長する方法に関する節において、本発明に従う移植された心臓/腎臓/肺/肝臓を有する霊長類に関する節において見出される。特に、好ましくは、それらの節において記載される遺伝子を挿入する場合に発現される転写物はまた、好ましくは、対応する配列を本発明に従う異種臓器移植片のドナー生物中に挿入する場合に発現される転写物である。
【０１７１】
本発明に従う異種臓器移植片のドナー生物の別の実施形態では、ドナー生物は、1つ又は複数の追加の遺伝子改変を有し得る。これらの1つ又は複数の追加の遺伝子改変に関する詳細は、上記の「遺伝子改変された哺乳動物及びそれを製造する方法」の節において見出される。これらの1つ又は複数の追加の遺伝子改変のうち1つは、ヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼをコードする配列の挿入であり得る。好ましくは、ヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼは、以下の遺伝子から発現されるタンパク質である: 公式記号:FUT1;公式完全名称:フコシルトランスフェラーゼ1(H血液型);主供給源:HGNC:HGNC:4012;関連参照:Ensembl:ENSG00000174951、MIM:211100。
【０１７２】
本発明に従う異種臓器移植片のドナー生物の別の実施形態では、ドナー生物は、イノシシ科に、より好ましくは、シシ属に、更により好ましくは、イノシシ種に、最も好ましくは、ブタ亜種に属する。好ましい実施形態では、ドナー生物は、イノシシ種に属する。更なる実施形態では、ドナー生物は、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタ、デュロックブタ、シュヴァーベン-ホール(シュヴェービッシュ-ヘリッシュ)ブタ、ブラックミニブタ又はオークランド・アイランドブタ、好ましくは、ジャーマンランドレース/ラージホワイト交雑遺伝的バックグラウンドのブタである。
【０１７３】
上記のように、本発明に従う異種臓器移植片のドナー生物もまた、本発明に従う遺伝子改変された生物であり得る。
【０１７４】
本発明はまた、異種臓器移植片のドナー生物を作製する方法であって、ドナー生物をIGF1を用いて処置することによってドナー生物のサイズを調整する工程を含み、ドナー生物が、成長ホルモン受容体遺伝子のホモ接合性ノックアウトを有し、ドナー生物が、非ヒト哺乳動物である、好ましくは、IGF1を用いる処置が、ドナー生物の誕生後に開始される方法を提供する。ヒトには、rhIGF-1 0.04mg/kg1日2回SCの出発用量が推奨される。用量は、許容されるように、0.12mg/kg1日2回の維持量に到達するまで一定増分で約2〜3カ月まで増大されなければならない。0.12mg/kg/日未満の用量を用いる長期間処置は、最適未満の成長応答につながり得る。本発明に従う非ヒトドナー哺乳動物には、同様の投薬レジメンが適当であり得る。
【０１７５】
本発明に従う異種臓器移植片のための生物について記載される実施形態はまた、変更すべきところは変更して、本発明に従う異種臓器移植片のドナー生物を作製する方法に当てはまる。
【０１７６】
当業者には明らかであろうが、本発明のすべての実施形態について、タンパク質をコードする配列の挿入が言及される場合には、このような配列は、好ましくは、例えば、調節配列を更に含む発現カセットの一部として配列を挿入することによってタンパク質が発現されるように挿入される。本発明に従うこのような配列の挿入は、導入遺伝子の挿入と呼ばれることもある。
【０１７７】
当業者には明らかであろうが、本発明に従うドナー臓器又はドナー生物における遺伝子又は配列の挿入が言及される場合には、これらの遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質が、それぞれのレシピエント生物と適合していることは保証されなければならない。したがって、本発明のすべての他の実施形態と組み合わせることができる一実施形態では、挿入される遺伝子又は配列は、レシピエント生物と同じ種に由来し得る。挿入される遺伝子又は配列の、レシピエント生物のそれぞれの遺伝子との高い配列相同性は、次いで、適合性を保証する。本発明によれば、ドナー生物は哺乳動物であり、レシピエント生物は霊長類である。ヒト遺伝子又は配列が挿入されたドナー臓器は、非ヒト霊長類レシピエントとでさえ適合すると考えられるので(実施例1〜4を参照のこと)、一実施形態では、本発明に従う挿入される遺伝子又は配列は、それぞれ、ヒト遺伝子又はヒト配列である。この実施形態ではまた、レシピエント生物は、ヒトであり得る。
【０１７８】
以下では、本発明を実施例によって例示するが、それに制限するものではない。
【実施例】
【０１７９】
(実施例1)
材料及び方法
以下の材料及び方法を本発明の次の実験において使用した。
【０１８０】
動物
交雑遺伝子バックグラウンドを有する7頭の若いブタ(ジャーマンランドレース(German Landrace)とラージホワイト(Large White)、血液型O)が心臓の異種移植のためのドナーとしての役割を果たした。すべての臓器は、アルファ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウト(GT-KO)に対してホモ接合型であり、hCD46/トロンボモジュリン(hTM)に対してトランスジェニックであった(Revivicor社、Blacksburg、VA、USA及びInstitute for Molecular Animal Breeding and Biotechnology, Gene Center, Faculty of Veterinary Medicine, Ludwig-Maximilians-University、Munich、Germany)。hCD46/hTM発現の局在化と安定性とを死後に免疫組織化学によって検証した(図15)。ドナーの心臓の機能と心臓弁障害がないことを心エコー検査によって移植の7日前に評価した。7頭の雄の飼育下繁殖ヒヒ(アヌビスヒヒ(Papio Anubis)、血液型B及び血液型AB)をレシピエントとして使用した。
【０１８１】
この研究は、オーバーバイエルンの地方自治体と政府によって承認された。すべての動物を、実験動物の管理と使用に関する指針(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)(米国の国立衛生研究所及び国内法(US National Institutes of Health and National Law))に従って処置した。
【０１８２】
麻酔及び鎮痛剤
ヒヒのプレメディケーションは、塩酸ケタミン6〜10mg/kg(Ketavet(登録商標)100mg/mL;Pfizer Deutschland GmbH社、Berlin、Germany)及び0.3〜0.5mg/kgのミダゾラム(Midazolam-ratiopharm(登録商標);ratiopharm GmbH社、Ulm、Germany)の筋肉内注射からなった。全身麻酔は、2.0〜2.5mg/kgのプロポフォール(Propofol(登録商標)-Lipuro 2%;B. Braun Melsungen AG社、Melsungen、Germany)及び0.05mgのフェンタニル(Fentanyl-Janssen 0.5mg; Janssen-Cilag GmbH社、Neuss、Germany)の静脈内ボーラス注射により誘導し、プロポフォール(0.16±0.06mg/kg/分)又はセボフルラン(1〜2体積%の呼気終末圧;セボラン、AbbVie Germany GmbH & Co. KG社、Wiesbaden、Germany)及び他所で記載されているように(参考文献11を参照のこと)、フェンタニル(5〜10μg/kg,、45分毎に繰り返す)のボーラス投与により維持した。術後には、フェンタニル、塩酸ケタミン及びメタミゾール(Novaminsulfon-ratiopharm(登録商標)1g/2mL;ratiopharm GmbH,社、Ulm、Germanyの連続的注入)を適用し、鎮痛を確保した。
【０１８３】
ドナーの外移植及び心臓の保存
胸骨正中切開及びヘパリン処置(500IU/kg)の後、小さな挿管を上行大動脈中に挿入し、次いで、挿管の遠位をクロスクランプした。群Iでは、心臓を4℃にて単回用量の20ml/kgの晶質性心筋保護溶液で心筋保護した:実験番号56、実験番号58及び実験番号59はCustodiol HTK溶液(Dr. F. Kohler Chemie GmbH社、Bernsheim、Germany)を受け、実験番号55及び実験番号57はBelzer's UW溶液(Preservation Solutions Inc.社、Elkhorn、WI、USA)を受けた。右心耳と左心耳を減圧するために開いた。次いで、心臓を切除し、心筋保護溶液中に沈めて氷上で保存した。
【０１８４】
群II及び群IIIでは、圧力及び流量を制御したローラーポンプ、O2/CO2交換機、白血球フィルター、動脈フィルター及び冷却器-加熱器ユニットからなるポータブルの体外心臓保存システムにおいて、8℃の温度で、ホルモンと赤血球とを含む酸素化アルブミンを含有する高張性の心筋保護栄養溶液3.5Lを使用して、Steenら(参考文献10を参照のこと)に記載されているように、心臓を保存した。
【０１８５】
大動脈をクロスクランプした後に、心臓を600mlの保存媒体で潅流し、次いで、切除して、心臓保存システム中に移動させた。大きな挿管を上行大動脈中に導入し、左室拡張を防止するために僧帽弁を一時的に無力化した;上大静脈を塞いだが、下大静脈、肺動脈及び肺静脈は潅流液を自由に排出させるために開いたままにした。冷却した潅流媒体で満たしたリザーバー中に心臓を沈め、順行性冠動脈潅流を既に配置した大動脈挿管を介して開始した。潅流圧力は、正確に20mmHgに調節したままにした。移植中、20分毎に2分間、断続的に心臓を灌流した。
【０１８６】
移植技法
レシピエントの胸部を正中線で開いた。未分画ヘパリン(500IU/kg; Heparin-Natrium-25000-ratiopharm、ratiopharm GmbH社、Ulm、Germany)を与え、大静脈と上行大動脈の両方を使用して人工心肺を接続した。心肺バイパス術を開始し、レシピエントを冷却した(群Iでは30℃、群II及び群IIIでは34℃)。上行大動脈をクロスクランプした後、レシピエントの心臓を心房レベルで切除し、両方の大きな血管を切断した。ShumwayとLowerの技法(参考文献8を参照のこと)を適用して、ブタのドナーの心臓を移植した。
【０１８７】
5番目の肋骨と6番目の肋骨との間の鎖骨中線の右側の皮下ポーチ中に、ワイヤレス遠隔測定送信機(Data Sciences International社、St. Paul、MN、USA)を移植した。圧力プローブを左心室の大動脈及び心突中に挿入し、AN ECGリードを右心室壁に配置した。
【０１８８】
免疫抑制レジメン、抗炎症療法及び添加剤療法
免疫抑制は、補体阻害のためのコブラ毒因子の代わりにC1エステラーゼ阻害剤を用いる、Mohiuddinのレジメン(参考文献5を参照のこと;以下に示したように変更点がある)に基づいた。抗CD20抗体(マブセラ;Roche Pharma AG社、Grenzach-Wyhlen、Germany)、ATG (サイモグロブリン、Sanofi-Aventis Germany GmbH社、Frankfurt、Germany)、及び抗CD40抗体(マウス/アカゲザルのキメラIgG4クローン2C10R4、NIH Nonhuman Primate Reagent Resource、Mass Biologicals社、Boston、MA、USA; Keith Reimannの好意による)又はヒト化抗CD40L pas化Fab(製造:Wacker-Chemie社、Burghausen、Germany;精製:XL-protein GmbH社、Freising、Germany;Arne Skerraの好意による、参考文献9を参照のこと)のいずれかからなる誘導。免疫抑制の維持は、MMF(CellCept、Roche社、Basle、Switzerland;トラフレベル2〜3μg/ml)、抗CD40抗体又は抗CD40L pas化Fabのいずれか、メチルプレドニゾロン(Urbasone可溶性、Sanofi-Aventis Germany GmbH社、Frankfurt、Germany)からなった。抗炎症療法は、Il-6-受容体抗体(RoActemra、Roche Pharma AG社、Grenzach-Wyhlen、Germany)、TNFa阻害剤(エンブレル、Pfizer Pharma GmbH社、Berlin、Germany)及びIl-1-受容体アンタゴニスト(Kineret、Swedish Orphan Biovitrum GmbH社、Martinsried、Germany)を含んだ。添加剤療法:アセチルサリチル酸(アスピリン、Bayer Vital GmbH社、Leverkusen、Germany)、未分画ヘパリン(Heparin-Natrium-25000-ratiopharm、ratiopharm GmbH社、Ulm、Germany)、C1エステラーゼ阻害剤(Berinert、CSL Behring GmbH社、Hattersheim、Germany)、ガンシクロビル(Cymevene、Roche Pharma AG社、Grenzach-Wyhlen、Germany)、セフロキシム(Cefuroxim Hikma、Hikma Pharma GmbH社、Martinsried、Germany)及びエポエチンベータ(NeoRecormon 5000IU、Roche Pharma AG社、Grenzach-Wyhlen、Germany)。
【０１８９】
10mg/kg/日から出発し、群I及び群IIでは、メチルプレドニゾロンを10日毎に1mg/kg漸減し、群IIIでは、メチルプレドニゾロンを19日以内に0.1mg/kgまで漸減した。群IIIではまた、免疫抑制維持のためにテムシロリムス(Torisel、Pfizer Pharma GmbH社、Berlin、Germany)を添加し、5〜10ng/mlのラパマイシンのトラフレベルを目標として、毎日、i.v.短期間注入として投与した。群IIIはまた、平均動脈圧80mmHg及び心拍数100bpmを目標として、エナラプリル(Enahexal、Hexal AG社、Holzkirchen、Germany)及び酒石酸メトプロロール(Beloc i.v.、AstraZeneca GmbH社、Wedel、Germany)を用いる連続的なi.v.への降圧剤による薬物治療を受けた。
【０１９０】
血行動態の測定
全身麻酔の誘導後、中心静脈カテーテル(Arrow International社、Reading、PA、USA)を左頸動脈中に、動脈カテーテル(Thermodilution Pulsiocath;Pulsion Medical Systems社、Munich、Germany)を右大腿動脈中に挿入した。心拍出量及び1回排出係数を経肺熱希釈法によって評価し、式0.083*kg.0.639を使用して、レシピエントの体表面積にインデックス付けした。麻酔の誘導後且つ定常状態でのCPBの終了の60分後に測定値を得て、PiCCOWinソフトウェア(Pulsion Medical Systems社、Munich、Germany)を用いて記録した。すべてのデータをExcel(Microsoft社、Redmond、Washington、USA)を用いて処理し、GraphPad Prism 7.0(GraphPad Software Inc.社、San Diego、California、USA)を用いて分析した。
【０１９１】
LV質量、LV質量の増加及びFSの定量
HP Sonos 7500(HP Inc.社、Palo Alto、CA、USA)を使用して、通常の間隔で、経胸壁心エコー検査を鎮痛鎮静において行い;中乳頭の短軸像を記録した。拡張終期及び収縮終期に、LVの直径(LVEDD、LVESD)、心室拡張及び心室収縮(IVSd、IVSs)、後壁厚(PWd、PWs)を測定した;3回の測定値の平均をさらなる計算及び可視化のために使用した(Excel及びPowerPoint、Microsoft社、Redmond、Washington、USA)。
【０１９２】
式(1)を使用してLV質量を計算し、式(2)及び式(3)を使用して相対的なLV質量の増加及びLV FSを計算した(参考文献11、参考文献12を参照のこと)。
(1) LV質量g)=0.8*(1.04([LVEDD+IVSd+PWd]3-[LVEDD]3))+0.6
(2) LV質量の増加(%)=([LV質量終了時/LV質量開始時]-1)*100
(3) FS(%)=([LVEDD-LVESD]/LVEDD)*100
【０１９３】
剖検及び組織学
the Institute of Veterinary Pathology、及びthe Institute of Pathology(いずれもLMU Munich)において、剖検及び組織学を実施した。標本をホルマリン中で固定し、パラフィン及びプラスチック中に包埋し、切片化し、ヘマトキシリンエオジン(HE)で染色した。
【０１９４】
組織化学分析
標準的な組織学の技法を使用して、凍結切片(8μm)を作成した。筋細胞のサイズを断面積として定量した。左心室の8μmの厚さの心臓切片をAlexafluor647をコンジュゲートしたコムギ胚芽凝集素(Life Technologies社)及び核色素DAPI(Life Technologies社)で染色した。Leica TCS SP8共焦点顕微鏡を使用して、10x及び63xの対物レンズを用いて画像を得た;ImageJソフトウェアを適用して、1つの切片における心筋細胞(1つの切片当たり200〜300個の細胞及び1つの心臓当たり5〜7つの切片)の平均断面積を決定した。
【０１９５】
免疫蛍光染色
心筋組織の生検試料をTissue-Tek(Sakura Finetek社、Zoeterwoude、The Netherlands)中に包埋し、-80℃で凍結保存した。免疫蛍光染色では、5μmの厚さの凍結切片を切断し、30〜60分間空気乾燥させ、さらなる分析まで-20℃で保存した。凍結切片を氷冷したアセトンで固定し、水和させ、一段階直接免疫蛍光技法又は二段階間接免疫蛍光技法のいずれかを使用して染色した。以下の抗体を使用した:ウサギ抗ヒトC3b/c(Dako社、Glostrup、Denmark)、ウサギ抗ヒトC4b/c-FITC(Dako社)、ヤギ抗ブタIgM(AbD Serotec社、Hercules CA、USA)、ヤギ抗ブタIgG-FITC(Southern Biotech社、Birmingham、USA)。二次抗体は、ロバ抗ヤギIgG-Alexa 488(Thermo Fischer Scientific社、MA、USA)、ヒツジ抗ウサギCy3(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、USA)であった。4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI;Boehringer, Roche Diagnostics社、Indianapolis、IN、USA)を使用して核染色を実施した。蛍光顕微鏡(DM14000B;Leica社、Wetzlar、Germany)を使用してスライドを分析した。未処理のTIFF(タグ付き画像ファイル形式(tagged image file format))画像に関して、Image Jソフトウェア、バージョン1.50i(https://imagej.nih.gov/ij/)を使用して、蛍光強度の定量を実施した。正確な定量と蛍光強度の比較を可能にするために、同じ条件下ですべての写真を得た。
【０１９６】
抗非Gal抗体レベルの評価
Azimzadehら(参考文献14を参照のこと)によって公開されたコンセンサスプロトコールに従い、フローサイトメトリーによって、抗非GalヒヒIgM抗体及び抗非GalヒヒIgG抗体の血漿中レベルを測定した。簡潔には、GT-KO/hCD46/hTMブタ大動脈内皮細胞(PAEC)を回収し、染色緩衝液(PBS+1%BSA)中に1ml当たり2×106個の細胞で懸濁させた。血漿試料を56℃で30分間熱失活させ、染色緩衝液中に1/20で希釈した。PAECを希釈したヒヒの血漿と共に4℃で45分間インキュベートした。次いで、細胞を冷却した染色緩衝液で洗浄し、ヤギ抗ヒトIgM-RPE(Southern Biotech社)又はヤギ抗ヒトIgG-FITC(Thermo Fischer社)と共に4℃で30分間インキュベートした。次いで、細胞を冷却した染色緩衝液で洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に再懸濁させ、FACS LSRIIに取得し、FITCチャネルにおいて平均蛍光強度(MFI)を検出するために、FlowJo分析ソフトウェアを使用して分析した。次いで、Prism 7(Graphpad software, Inc.社)を使用してデータをプロットした。FITC、フルオレセインイソチオシアネート;RPE、リブロースホスフェートエピメラーゼ。
【０１９７】
ウエスタンブロット分析
タンパク質抽出のために、心臓の試料をLaemmli抽出緩衝液中でホモジナイズし、ビシンコニン酸(BCA、Merck社、Darmstadt、Germany)タンパク質アッセイによってタンパク質含量を推定した。20μgの総タンパク質を10%のSDS-PAGEで分離し、電気ブロッティングによってフッ化ポリビニリデン(PDVF)膜(Millipore社、Billerica、USA)に移した。膜を0.1%のTween-20(Merck社)を含むTris緩衝生理食塩水溶液(TBS-T)中で洗浄し、5%w/vの無脂肪乳粉末(Roth社、Karlsruhe、Germany)中で、室温にて1時間ブロッキングした。次いで、膜をTBS-T中で再度洗浄し、適切な一次抗体の5%w/vBSA(Roth社)中で、4℃にて一晩インキュベートした。以下の抗体を使用した:ウサギ抗ヒトpmTOR(番号5536;Cell Signaling社、Frankfurt、Germany)及びマウス抗ヒトPCNA(番号2586;Cell Signalling社)。洗浄後、5%w/vの無脂肪乳粉末中で、セイヨウワサビペルオキシダーゼで標識した二次抗体と共に、室温で1時間インキュベートした。結合した抗体を増強化学ルミネセンス検出試薬(ECL Advance Western Blotting Detection Kit、GE Healthcare社、Munich、Germany)及び適切なx線フィルム(GE Healthcare社)を使用して検出した。検出後、膜を剥ぎ取り(溶出緩衝液:2%のSDS、62.5mMのTris/HCl、pH6.7及び100mMのβ-メルカプトエタノールで70℃にて30分間)、適切な二次抗体と共にインキュベートした。SDS-PAGE、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動。
【０１９８】
統計分析
生存データとして、カプランマイヤー曲線をプロットし、Mantel-Cox対数順位検定を使用して、群間の有意差を決定した。血行動態データとして、示したように、対応のないスチューデントt検定と対応のあるスチューデントt検定を使用して統計的有意差を決定した;データは、群の中央値としてのバーと共に単一の測定値として表した。組織化学分析では、Holm-Sidakの多重比較による一元ANOVAを使用して、統計的有意差を決定した;データは、平均±s.d.で表した。P<0.05を有意とみなした。s.d.、標準偏差。
【０１９９】
(実施例2)
結果
gm(GTKO/hCD46/hTM)ブタからヒヒへの心臓移植実験を臨床的に承認された「Shumway」の同所性技法(参考文献8を参照のこと)を適用して行った。この研究のすべてのレシピエントは、多かれ少なかれMohiuddin(参考文献5を参照のこと)によって記載されたISを受けた:誘導療法は、抗CD20、抗胸腺細胞-グロブリン(ATG)及び抗CD40又は本発明者ら自身の抗CD40L pas化Fab(参考文献9を参照のこと)を含んだ。維持療法は、抗CD40又は抗CD40L pas化Fab、MMF及び漸減させたメチルプレドニゾロン(MP)からなった(Table 1(表1);添加剤による医学的処置も示されている;コブラ毒因子を置き換えたC1エステラーゼ阻害剤)。
【０２００】
【表１】
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【０２０１】
11の実験を3つの群に分割した(Table 2(表2)を参照のこと);群I(n=5)は、2種類の臨床的に承認された晶質液によりドナーの臓器を保存した(4℃のCustodial HTK、Belzer's UWはそれぞれ1回与えた;次いで、ブタの心臓(血液型0)を溶液で満たしたプラスチックバッグ中に保持し、バッグを角氷中に保持した;静的保存);群II(n=4)及び群III(n=2)では、切除した心臓を上行大動脈に固定した挿管を介して、圧力を制御したローラーポンプを用いて8℃で直ちに潅流した。ドナーの臓器に残った脱酸素化血液をリザーバーに採取し、次いで、人工肺に通した(非虚血性保存)。左心房と右心房との吻合の間に、肺動脈縫合線の潅流を断続的に継続した;両方の大動脈の断端が接続した場合にのみ潅流を停止した。
【０２０２】
【表２】
2021519819.tif 000003
【０２０３】
11頭の飼育下繁殖ヒヒ(アヌビスヒヒ、血液型B及び血液型AB)がレシピエントとしての役割を果たした。レシピエントの術後処置は他に記載されている(参考文献11を参照のこと)。
【０２０４】
群Iの結果(晶質液による静的な冷却保存)は以下の通りであった:虚血時間は可能な限り短く保ったが(123±7分)、生存は3回、すなわち1日、3日及び28日に一度であった。後者の場合には(Belzer's UW溶液による心臓の保存)、心エコー検査によって、末期的な肝不全(Table 3(表3)、図1B、図1H)と合わせて、拡張ポンプ機能の制限(LVの心筋の肥厚、LVの腔の減少及びそれによる拡張充満;図6A;図3;図1E、図1F)が明らかとなった;対比して、4頭の短期間の生き残りは、心肺バイパス術(CPB)を中止した後に、常に、重篤な収縮の左心不全にあり、高用量の静脈内カテコラミンを必要とした(図3、図1A〜図1C)。しかし、4頭すべてをCPBから引き離し、それらのうちの3頭を抜管した。
【０２０５】
【表３】
2021519819.tif 000004
【０２０６】
以下の群II及び群IIIでは、実施例1に記載したように臓器の潅流(非虚血心保存;潅流時間はそれぞれ196±44、224±45分)を開始した。次に、2つの群のすべてのヒヒをCPBから容易に引き離し、少量のカテコラミンを与えた(図3)。しかし、群IIの3頭の長期間の生き残りはすべて(18日、27日及び40日。4日間の実験は技術的な失敗であった)、末期的な肝疾患と合わせて拡張ポンプ不全に屈し、これらは、群Iの1つの28日間の生き残りに関して記載したのと類似する知見であった(図6A;Table 3(表3);図1A、図1B、図1H)。
【０２０７】
各実験の終了直前の、群IIの動物の最も重要な生化学的血清測定のデータをTable 3(表3)に示す:ビリルビンは上昇し、ASTのような肝臓の酵素も上昇した;プロトロンビン比及びコリンエステラーゼは低下した;トロポニンTは正常範囲を超えていた。(図1A、図1Bは、実験を終了させなければならないその直前に、トロポニンとビリルビンのレベルの急激な上昇を示す)。乳酸デヒドロゲナーゼレベルは上昇し、血小板数は低かった。検死の際に、ドナーの心臓は、移植時の質量と比較した場合、増大しており、群I及び群IIの過成長は平均259%であった。実際のところ、移植物は周囲の縦隔構造によって圧迫されていたようであった。左心室壁と右心室壁の直径は拡大しており、左心室腔は微小であった(図4A;参考文献12、参考文献13を参照のこと)。注目に値するのは図4Cであり、これは、同時に安楽死させた移植64のドナーの同胞の心臓のサイズを示し、その心臓の外径はほぼ同じであった。
【０２０８】
群IIの移植物の心筋組織学により細胞の肥大が明らかになった(図1E、図1F、図1J、図1K)。中心静脈の周囲には多量の肝細胞壊死が存在した(図1H)。
【０２０９】
対比すると、これらのすべてのまさに記載された病理学的所見は群IIIのレシピエントには存在せず、これらは、降圧剤による処置(ブタは、ヒヒと比較した場合、より低い収縮圧を有し、平均して80mmHg対120mmHgである)、初期のグルココルチコイド離脱及び追加のテムシロリムスによる薬物治療を有した。注目に値するのは、検死の際の心筋の外観であった:90日の終わりに、心エコー検査は正常であった(図6B)。検死では、心室壁はほぼ正常であり、腔のサイズは損なわれなかった;ドナーの心臓とレシピエントの肝臓の組織学的所見も正常であった(Table 3(表3);図1G、図1I、図1J、図1K、図1L;図4B)。
【０２１０】
図2は、長期の生き残りのすべてについての免疫学的応答についてまとめる。群IIの移植片は、体液性拒絶反応の全体的兆候を示さず、わずかな変化は、むしろ、心機能について記載された終了前の制限の原因であり得る;群IIIでは、病理学的な免疫組織化学的所見はなかった。両群では、非Gal抗体の血漿中の測定値(参考文献14を参照のこと)は既に存在している低いレベルを上回る増加を呈さなかった。
【０２１１】
上記の実験に加えて、群IIIのヒヒについて記載したように、且つ実施例1の材料及び方法に従って、別のヒヒに心臓を移植した。このヒヒは90日間生存し、術後の所見及び測定値は、上記実験番号67と同じであった。
【０２１２】
(実施例3)
結論
まとめると、ここで提示した実験を行うことにより、終了時に(群III)、生命を維持する(同所性の)異種心臓移植は、(前)臨床標準を適用することが可能であり、部分的には、ISHLTガイドライン(参考文献6を参照のこと)の要求を満たしていることを証明する。
【０２１３】
以下が成功に寄与した:
・  有効な細胞拒絶及び最も重要な体液性拒絶を除外するMohiuddin's basic IS(参考文献5を参照のこと)の採用;群IIにおいて見られる血栓性微小血管症の明らかな兆候(血小板の減少、LDHの増加)は、むしろ、臓器の法外な成長及び不適切な血管新生によって明らかにその供給に適合しなかった細胞肥大についてのエネルギー需要の増加(他の臓器について以前に記載されているように(参考文献15を参照のこと)、図5)によって説明され得る。しかし、いくつかの重要な変更がなされた:抗CD40L pas化Fabは、抗CD40と同程度に有効であると思われた(図2)。抗炎症療法を加えた。グルココルチコイドをより急速に漸減させ、テムシロリムスを添加し、最終的に降圧剤による処置を与えた。
・  非虚血性ブタ心臓保存の導入(参考文献10を参照のこと)。群II及び群IIIと対比して、群Iのドナーの臓器は、臨床同種手順に対して使用されるように、静的心筋保存を有した。静的心筋保存に関しては、手術直後の経過における心拍出量は低く(図3A)、多量のカテコラミンを必要とした(図3B)。得られた非常に早期の死亡率は、40〜60%の範囲について記載する(参考文献7を参照のこと)、過去25年にわたる文献における所見と一致している。この現象は、「周術期心臓異種移植片機能障害」と称されており(参考文献16を参照のこと)、心臓手術の初期から知られている心臓拒絶(cardiac stunning)と明らかに類似しており;この現象は超急性拒絶とは似ていない。
【０２１４】
群II及び群IIIにおける非虚血性保存技法は、更に臨床的に許容される結果を達成した:7頭すべてのレシピエントが、ベースラインと比較した場合、心拍出量が変化しないままであったため、CPBから容易に分離された。
【０２１５】
異種間の腎移植及び肺移植後に移植片の過成長を制限することについても報告されている(参考文献15を参照のこと)。著者は、この現象が、外部からの刺激(レシピエントの様々な成長ホルモンによる)によるよりもむしろ、内因子(ブタの臓器の「過成長」が所定のものであることを意味する)によるものであると説明した。この記述は、実験64のエンドポイントまで、移植されていない同胞の心臓とほぼ同程度にサイズが増加した本発明の観察に支持される(図4C)。
【０２１６】
・  過成長は、最初に、より低いブタのレベルに適合させるためにヒヒの血圧を下げることによって、対抗することに成功した。薬物は、若齢期の肥大型心筋症の原因となることが記載されているため、グルココルチコイドは早期に漸減された(参考文献17を参照のこと)。最後に、シロリムス化合物は、2種類のmTORキナーゼを阻害することによって、すべての細胞成長の複雑なネットワークを制御することが知られている(参考文献18を参照のこと)。心筋肥大が減弱され、拡張ポンプ機能が改善され(参考文献19、参考文献20を参照のこと);稀な遺伝的過成長症候群は、ヒトにおいて処置される(参考文献21を参照のこと)という臨床的証拠がある。本発明者らの場合には、テムシロリムスが選択され、心筋肥大が緩和され、LVの腔の閉塞が除外された。
【０２１７】
まとめると、本発明は、同所性の異種心臓移植が、困難なgmブタからヒヒへのモデルで実行可能であることを初めて示す。ISHLTガイドライン(参考文献6を参照のこと)の要求の全範囲を実現することも可能であると思われる。安全性の問題(参考文献22を参照のこと)も対処され得る。
【０２１８】
(実施例4)
拡大研究プロトコール
群IIIに関する研究プロトコールを6カ月の移植片生存を目的として拡大した(参考文献115を参照のこと)。統合した結果を以下のTable 4(表4)、及び図11〜図15において示す。Table 4(表4)で表す結果は、上記実施例2において記載した実験の結果を含み、Table 3(表3)の実験番号57、実験番号60、実験番号63、実験番号64、実験番号66及び実験番号67は、それぞれ、Table 4(表4)の実験3、実験6、実験8、実験9、実験10及び実験11に対応する。Table 4(表4)の実験12は、上記実施例2の最後のパラグラフにおいて言及された追加の実験に対応し、Table 4(表4)の実験13及び実験14は、群IIIに対する研究プロトコールが6カ月の移植片生存を目的として拡大される追加の実験である。図11〜図15に表したデータは、Table 4(表4)に示されているすべての実験の結果に基づく。
【０２１９】
【表４】
2021519819.tif 000005
【０２２０】
拡大研究の結果の統合によって実施例2の結果が確認された:まとめると、219±30分の心臓潅流時間の後、群IIIの5頭の動物すべてがCPBから容易に分離され、群IIに匹敵した(図13)。群IIIのレシピエントはいずれもPCXDを示さず;4週間後にすべてが良好な心臓機能を有する定常状態に達した。1頭のレシピエント(実験10)が、胸管の閉塞によって引き起こされる難治性の胸水を発症し、したがって、51日後に安楽死させた。2頭のレシピエント(実験11及び実験12)は、研究プロトコールに従って、安楽死までの3カ月間、良好な健康状態で生存した(図11A)。これらの3頭のレシピエントにおいて、心エコー検査によって、左心室質量の増加がないことが明らかになり(図11D);移植片の機能は拡張機能不全の兆候もなく正常なままであった(図4B)。心機能及び肝機能並びにLDHレベル及び血小板数という生化学パラメーターは、正常な組織学(図1I)と一致して、実験(Table 4(表4)、図11B、図11C、及び図14A、図14B)全体を通して正常であるか又はわずかに変更された。左心室心筋の組織学によって、肥大の兆候は示されず(図1J及び図11E)、心筋のウエスタンブロット分析によって、移植されていない年齢の適合する対照の心臓よりも、mTORのリン酸化レベルが低いことが明らかになった(図11F)。群IIと同様に、群IIIでは体液性移植片拒絶の兆候はなかった(図12及び図2A〜図2D)。
【０２２１】
群IIIの最後の2頭のレシピエント(実験13及び実験14)は、良好な全身状態で195日間及び182日間生存可能であり、血小板数又は血清中のLDHのレベル及びビリルビンのレベルに大きな変化はなかった(図11A、図11C及び図14A、図14B)。静脈内へのテムシロリムス処置は、175日目と161日目に中断した。この点まで、収縮心機能及び拡張心機能は正常であった。その後、心臓移植片の成長増加が両レシピエントにおいて観察され(図11D)、同所性異種心臓異種移植モデルにおけるmTOR阻害の重要性が強調された。群IIにおいて観察された変化に類似して、より小さいレシピエント13は、トロポニンTの血清中レベルの上昇及びうっ血性肝障害(血清中ALTレベル及びASTレベルが上昇し、プロトロンビン比及びコリンエステラーゼが減少する)の開始を伴う拡張機能障害の兆候を発症し;血小板数は、正常範囲内のままであった(Table 4(表4)、図11B、図11C及び図14A、図14B)。組織学によって、肝臓うっ血が確認され、免疫細胞の浸潤又は血栓性微小血管症の兆候を有さない多源性の心筋壊死が明らかになった。より大きなレシピエント14は、動物13と同時に安楽死させなければならなかったが、心臓の過成長の結果は最小限であった。
【０２２２】
上記の結果によって、実施例2の結果及び実施例3に記載の結論が確認される。少なくとも3カ月間、非ヒト霊長類において生命を維持するブタの心臓の生存が一貫して達成され、これは、the International Society for Heart and Lung Transplantationのアドバイザリー報告書によって示唆されている異種移植臨床試験の開始に関する前臨床有効性の要件に合致する(参考文献6を参照のこと)。2つの工程が成功に寄与した。第1に、非虚血性ブタ心臓保存は、異種移植した心臓の生存に重要であることを見出した。晶質液による虚血性静的心筋保存を受けた(臨床同種手順に対して使用されるように)群Iから異種移植した心臓は、5つの事例のうちの4つにおいてPCXDを示し、より多量のカテコラミンを必要とした。この現象は、心臓手術の初期から知られている事象である「心臓拒絶」と明らかに類似しており、これは超急性拒絶反応を表すものではない。対照的に、群II及び群III(潅流による非虚血性ブタ心臓保存)(参考文献10を参照のこと)では、9頭のレシピエントすべてが、ベースラインと比較して、それらの心拍出量が変化しないままであったため、CPBから容易に分離された。これらの群で達成された短期間の結果は、臨床標準によってさえも優れていた。第2の工程は、有害な異種移植片の過成長の防止であった。以前のブタからヒヒへの腎臓及び肺の移植実験は、移植片の成長が、成長ホルモン等のレシピエント由来の刺激によるよりも、内因子により依存することを示唆してきた(参考文献15を参照のこと)。本発明者らの群IIのレシピエントにおける強力な心臓肥大は、より複雑な状況を示す。とりわけ、この群において移植した心臓は、同じタイムスパンの同胞の移植していない心臓より62%多く質量が増加した(図4C)。群IIIでは、心臓の過成長は、以下の処置の組合せによって対抗することに成功した:(i)より低いブタのレベルに適合させるためにヒヒの血圧を低下させること;(ii)初期の段階でコルチゾンを漸減すること(コルチゾンは、ヒトの若齢期の肥大型心筋症の原因となり得る)(参考文献83を参照のこと);及び(iii) シロリムスプロドラッグであるテムシロリムスを使用して心筋肥大を緩和すること。シロリムス化合物は、両方のmTORキナーゼを阻害することによって細胞成長の複雑なネットワークを制御することが知られている(参考文献84を参照のこと)。シロリムスによる処置が、心筋肥大を減弱させ、拡張ポンプ機能を改善することができ(参考文献19、参考文献20を参照のこと)、また、ヒトにおける稀な遺伝的過成長症候群を軽快する(参考文献21を参照のこと)という臨床的証拠がある。移植片におけるヒトトロンボモジュリン発現の効果に加えて(参考文献5、参考文献37を参照のこと)、テムシロリムス処置は、更に、コラーゲンに誘導される血小板凝集を低減することによって、及び剪断応力条件下で形成される血小板凝集物を不安定化させることによって、血小板の微小血管症病変の形成を防止することができる(参考文献85を参照のこと)。まとめると、この研究は、最も関連のある前臨床モデルにおいて、一貫して長期間生命を維持する同所性異種心臓移植が実行可能であり、異種心臓移植の臨床解釈を容易にすることを実証する。
【０２２３】
統合した材料及び方法(実施例2〜実施例4のすべてに関する)
動物
2015年2月から2018年8月の間に実験を行った。交雑遺伝子バックグラウンドを有する14頭の若いブタ(ジャーマンランドレースとラージホワイト、血液型O)が心臓の異種移植のためのドナーとしての役割を果たした。すべての臓器は、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウト(GTKO)に対してホモ接合型であり、ヒトCD46(hCD46)及びヒトトロンボモジュリン(hTM)に対してヘテロ接合型のトランスジェニックであった(参考文献37を参照のこと)(Revivicor社及びInstitute of Molecular Animal Breeding and Biotechnology)。hCD46及びhTM発現の局在化と安定性とを死後に免疫組織化学によって検証した(図15)。ドナーの心臓の機能と心臓弁障害がないことを心エコー検査によって移植の7日前に評価した。14頭の雄の飼育下繁殖ヒヒ(アヌビスヒヒ、血液型B及び血液型AB)をレシピエント(German Primate Centre)として使用した。
【０２２４】
この研究は、オーバーバイエルンの地方自治体と政府によって承認された。すべての動物を、実験動物の管理と使用に関する指針(米国の国立衛生研究所及びドイツ国内法)に従って処置した。
【０２２５】
麻酔及び鎮痛剤
ヒヒを、塩酸ケタミン6〜8mg/kg(Ketavet 100mg/ml;Pfizer社)及び0.3〜0.5mg/kgのミダゾラム(midazolam-ratiopharm;Ratiopharm社)の筋肉内注射によってプレメディケーションを行った。全身麻酔は、2.0〜2.5mg/kgのプロポフォール(propofol-lipuro 2%;B. Braun Melsungen社)及び0.05mgのフェンタニル(fentanyl-janssen 0.5mg;Janssen-Cilag社)の静脈内ボーラス注射により誘導し、プロポフォール(0.16±0.06mg/kg/分)又はセボフルラン(1〜2体積%の呼気終末圧;セボラン、AbbVie社)及び他所で記載されているように(参考文献11を参照のこと)フェンタニル(6〜8μg/kg、45分毎に繰り返す)のボーラス投与により維持した。術後には、フェンタニル、塩酸ケタミン及びメタミゾール(novam-insulfon-ratiopharm 2mlに対して1g;Ratiopharm社)の連続的注入を適用し、鎮痛を確保した。
【０２２６】
ドナーの心臓の外移植及び保存
ブタを、塩酸ケタミン10〜20mg/kg、アザペロン10mg/kg(stresnil 40mg/ml;Lilly Deutschland社)及び硫酸アトロピン(atropin-sulfat B. Braun 0.5mg;B. Braun Melsungen社)の筋肉内注射によってプレメディケーションを行った。全身麻酔は、20mgのプロポフォール及び0.05mgのフェンタニルの静脈内ボーラス注射により誘導し、プロポフォール(0.12mg/kg/分)及びフェンタニル(2.5μg/kg、30分毎に繰り返す)のボーラス投与により維持した。
【０２２７】
胸骨正中切開及びヘパリン処置(500IU/kg)の後、小さな挿管を上行大動脈中に挿入し、次いで、挿管の遠位をクロスクランプした。群Iでは、心臓を4℃にて単回用量の20ml/kgの晶質性心筋保護溶液で潅流し:custodiol HTK溶液(Dr. Franz Kohler Chemie社)を動物2、動物4及び動物5の心臓に対して使用し、Belzer's UW溶液(Preservation Solutions社)を動物1及び動物3の心臓に対して使用した。右心耳と左心耳を減圧するために開いた。次いで、心臓を切除し、心筋保護溶液中に沈めて氷上で保存した。
【０２２８】
群II及び群IIIでは、圧力及び流量を制御したローラーポンプ、O2/CO2交換機、白血球フィルター、動脈フィルター及び冷却器/加熱器ユニットからなるポータブルの体外心臓保存システムにおいて、8℃の温度で、ホルモンと赤血球とを含む酸素化アルブミンを含有する高張性の心筋保護栄養溶液3.5lを使用して、以前に記載されているように(参考文献10を参照のこと)、心臓を保存した。
【０２２９】
大動脈をクロスクランプした後に、心臓を600mlの保存媒体で潅流し、切除して、心臓保存システム中に移動させた。大きな挿管を上行大動脈中に導入し、左室拡張を防止するために僧帽弁を一時的に無力化した;上大静脈を結紮したが;下大静脈、肺動脈及び肺静脈は潅流液を自由に排出させるために開いたままにした。冷却した潅流媒体で満たしたリザーバー中に心臓を沈め、順行性冠動脈潅流を既に配置した大動脈挿管を介して開始した。潅流圧力は、正確に20mmHgに調節した。移植中、15分毎に2分間、断続的に心臓を潅流した。
【０２３０】
移植技法
レシピエントの胸部を正中線で開いた。未分画ヘパリン(500IU/kg;heparin-natrium-25000-ratiopharm、Ratiopharm社)を与え、大静脈と上行大動脈の両方を使用して人工心肺を接続した。CPBを開始し、レシピエントを群Iでは30℃、群II及び群IIIでは34℃に冷却した。上行大動脈をクロスクランプした後、レシピエントの心臓を心房レベルで切除し、両方の大きな血管を切断した。ShumwayとLowerの技法(参考文献8を参照のこと)を使用して、ブタのドナーの心臓を移植した。
【０２３１】
5番目の肋骨と6番目の肋骨との間の鎖骨中線の右側の皮下ポーチ中に、ワイヤレス遠隔測定送信機(Data Sciences International社)を移植した。圧力プローブを左心室の上行大動脈及び心突中に挿入し、心電図のリードを右心室壁に配置した。
【０２３２】
免疫抑制レジメン、抗炎症療法及び添加剤療法
免疫抑制は、補体阻害のためのコブラ毒因子の代わりにC1エステラーゼ阻害剤を用いる、以前に公開されたレジメン(参考文献5を参照のこと)に基づいた(Table 5(表5))。抗CD20抗体(マブセラ;Roche Pharma社)、ATG(サイモグロブリン、Sanofi-Aventis社)、及び抗CD40モノクローナル抗体(マウス/アカゲザルのキメラIgG4クローン2C10R4、NIH Non-human Primate Reagent Resource、Mass Biologicals社;K. Reimannの好意による;動物1〜動物3、動物5、動物7、動物8、動物11〜動物14)又はヒト化抗CD40L Pas化Fab(XL-Protein社及びWacker-Chemie社;動物4、動物6、動物9、動物10)のいずれかからなる誘導。免疫抑制の維持は、ミコフェノール酸モフェチル(CellCept、Roche社;トラフレベル2〜3μg/ml)、抗CD40モノクローナル抗体(動物1〜動物3、動物5、動物7、動物8、動物11〜動物14)又は抗CD40L Pas化Fab(動物4、動物6、動物9、動物10)のいずれか、及びメチルプレドニゾロン(Urbasone可溶性、Sanofi-Aventis社)からなった。抗炎症療法は、IL-6-受容体アンタゴニスト(RoActemra、Roche社)、TNF阻害剤(エンブレル、Pfizer社)及びIL-1-受容体アンタゴニスト(Kineret、Swedish Orphan Biovitrum社)を含んだ。添加剤療法は、アセチルサリチル酸(アスピリン、Bayer Vital社)、未分画ヘパリン(heparin-natrium-25000-ratiopharm、Ratiopharm社)、C1エステラーゼ阻害剤(berinert、CSL Behring社)、ガンシクロビル(cymevene、Roche社)、セフロキシム(cefuroxim Hikma社)及びエポエチンベータ(neorecormon 5000IU、Roche P社)。
【０２３３】
1日当たり10mg/kgから出発し、群I及び群IIでは、メチルプレドニゾロンを10日毎に1mg/kgゆっくり低減し、群IIIでは、メチルプレドニゾロンを19日以内に0.1mg/kgまで漸減した。群IIIではまた、免疫抑制維持のためにテムシロリムス(torisel、Pfizer社)を添加し、5〜10ng/mlのラパマイシンのトラフレベルを目標として、毎日、静脈内短期間注入として投与した。群IIIはまた、平均動脈圧80mmHg及び心拍数100b.p.m.を目標として、エナラプリル(Enahexal、Hexal AG社、Holzkirchen、Germany)及び酒石酸メトプロロール(Beloc、AstraZeneca社)を用いる連続的な静脈内への降圧剤による薬物治療を受けた。
【０２３４】
血行動態の測定
全身麻酔の誘導後、中心静脈カテーテル(Arrow International社)を左頸動脈中に、動脈カテーテル(Thermodilution Pulsiocath;Pulsion Medical Systems社)を右大腿動脈中に挿入した。心拍出量及び1回排出係数を経肺熱希釈法によって評価し、式0.083×B0.639(ここで、Bは体重をkgで示す)を使用して、レシピエントの体表面積にインデックス付けした。麻酔の誘導後且つ定常状態でのCPBの終了の60分後に測定値を得て、PiCCOWinソフトウェア(Pulsion Medical Systems社)を用いて記録した。すべてのデータをExcel(Microsoft社)を用いて処理し、GraphPad Prism 7.0(GraphPad Software社)を用いて分析した。
【０２３５】
左心室質量、左心室質量の増加及び短縮率の定量
HP Sonos 7500(HP社)及びSiemens Acuson X300(Siemens社)を使用して、通常の間隔で、経胸壁心エコー検査による試験を鎮痛鎮静の下で行い;中乳頭の短軸像を記録した。左心室拡張終期直径(LVEDD)及び左心室収縮終期直径(LVESD)、拡張終期の心室中隔厚(IVSd)及び拡張終期の後壁厚(PWd)を測定した;3回の測定値の平均をさらなる計算及び可視化のために使用した(Excel及びPowerPoint、Microsoft社)。
【０２３６】
式(1)を使用して左心室質量を計算し、式(2)及び式(3)を使用して相対的な左心室質量の増加及び左心室(LV)短縮率(FS)を計算した(参考文献13、参考文献12を参照のこと)。
LV質量(g)=0.8(1.04((LVEDD+IVSd+PWd)3-LVEDD))+0.6 (1)
LV質量の増加(%)=((LV質量終了時/LV質量開始時)-1)×100 (2)
FS(%)=((LVEDD-LVESD)/LVEDD)×100 (3)
【０２３７】
剖検及び組織学
the Institute of Veterinary Pathology及びthe Institute of Pathologyにおいて、剖検及び組織学を実施した。標本をホルマリン中で固定し、パラフィン及びプラスチック中に包埋し、切片化し、ヘマトキシリン及びエオジンで染色した。
【０２３８】
組織化学分析
標準的な組織学の技法を使用して、凍結切片(8μm)を作成した。心筋細胞のサイズを断面積として定量した。左心室の8μmの厚さの心臓切片をAlexa Fluor 647をコンジュゲートしたコムギ胚芽凝集素(Life Technologies社)及び核色素4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、Life Technologies社)で染色した。Leica TCS SP8共焦点顕微鏡を使用して、63xの対物レンズを用いて画像を得た;SMASHソフトウェア(MATLAB（登録商標）、https://de.mathworks.com/products/matlab.html)を使用して、1つの切片における心筋細胞(1つの切片当たり200〜300個の細胞及び1つの心臓当たり5〜8つの切片)の平均断面積を決定した。
【０２３９】
免疫蛍光染色
心筋組織の生検試料をTissue-Tek(Sakura Finetek社)中に包埋し、-80℃で凍結保存した。免疫蛍光染色では、5μmの凍結切片を切断し、30〜60分間空気乾燥させ、さらなる分析まで-20℃で保存した。凍結切片を氷冷したアセトンで固定し、水和させ、一段階直接免疫蛍光技法又は二段階間接免疫蛍光技法のいずれかを使用して染色した。以下の抗体を使用した:ウサギ抗ヒトC3b/c(Dako社)、ウサギ抗ヒトC4b/c-FITC(Dako社)、ヤギ抗ブタIgM(AbD Serotec社)、ヤギ抗ヒトIgG-FITC(Sigma-Aldrich社)及びウサギ抗ヒトフィブリノーゲン-FITC(DAKO社)。二次抗体は、ロバ抗ヤギIgG-Alexa Fluor 488(Thermo Fischer Scientific社)、ヒツジ抗ウサギCy3(Sigma-Aldrich社)であった。DAPI(Boehringer, Roche Diagnostics社)を使用して核染色を実施した。蛍光顕微鏡(DM14000B;Leica社)を使用してスライドを分析した。マーカー当たり5個〜10個の免疫蛍光写真をランダムにとり、未処理のTIFF画像に関して、Image Jソフトウェア、バージョン1.50i(https://imagej.nih.gov/ij/)を使用して、蛍光強度を定量した。正確な定量と蛍光強度の比較を可能にするために、同じ条件下ですべての写真を得た。
【０２４０】
非ガラクトース-α1,3-ガラクトース抗体レベルの評価
以前に公開されたコンセンサスプロトコール(参考文献14を参照のこと)に従い、フローサイトメトリーによって、非ガラクトース-α1,3-ガラクトースヒヒIgM抗体及び非ガラクトース-α1,3-ガラクトースヒヒIgG抗体の血漿中レベルを測定した。簡潔には、GTKO/hCD46/hTMブタ大動脈内皮細胞を採取し、染色緩衝液(1%BSAを含有するPBS)中に1ml当たり2×106個の細胞で懸濁させた。血漿試料を56℃で30分間熱失活させ、染色緩衝液中に1:20で希釈した。ブタの大動脈内皮細胞を希釈したヒヒの血漿と共に4℃で45分間インキュベートした。次いで、細胞を冷却した染色緩衝液で洗浄し、ヤギ抗ヒトIgM-RPE(Southern Biotech社)又はヤギ抗ヒトIgG-FITC(Thermo Fischer社)と共に4℃で30分間インキュベートした。冷却した染色緩衝液で再度洗浄した後、PBS中に細胞を再懸濁させ、蛍光をFACS LSRII(BD Biosciences社)に取得し、FITCチャネルにおいて又はRPEチャネルにおいて平均蛍光強度(MFI)を検出するために、FlowJo分析ソフトウェアを使用して、データを分析した。次いで、Prism 7(GraphPad Software社)を使用してデータをプロットした。
【０２４１】
ウエスタンブロット分析
タンパク質抽出のために、心臓の試料をLaemmli試料緩衝液中でホモジナイズし、ビシンコニン酸(BCA、Merck社)タンパク質アッセイを使用して、タンパク質含量を推定した。次いで、20μgの総タンパク質を10%のSDS-PAGEで分離し、電気ブロッティングによって、PDVF膜(Millipore社)に移した。膜を0.1%のTween-20(Merck社)を含むTris緩衝生理食塩水溶液(TBS-T)中で洗浄し、5%w/vの無脂肪乳粉末(Roth社)中で、室温にて1時間ブロッキングした。次いで、膜をTBS-T中で再度洗浄し、適切な一次抗体の5%w/vBSA(Roth社)中で、4℃にて一晩インキュベートした。以下の抗体を使用した:ウサギ抗ヒトpmTOR(5536;Cell Signaling社)、ウサギ抗ヒトmTOR(2983;Cell Signaling社)及びウサギ抗ヒトGAPDH(2118;Cell Signaling社)。洗浄後、5%w/vの無脂肪乳粉末中で、セイヨウワサビペルオキシダーゼで標識した二次抗体(ヤギ抗ウサギIgG;7074;Cell Signaling社)と共に、室温で1時間インキュベートした。結合した抗体を増強化学ルミネセンス検出試薬(ECL Advance Western Blotting Detection Kit、GE Healthcare社)及び適切なX線フィルム(GE Healthcare社)を使用して検出した。検出後、膜を剥ぎ取り(2%のSDS、62.5mMのTris-HCl、pH6.7、100mMのβ-メルカプトエタノール)、70℃にて30分間、適切な二次抗体と共にインキュベートした。
【０２４２】
免疫組織化学染色
心筋組織を4%のホルマリンで一晩固定させ、パラフィン包埋し、及び3μmの切片を切断及び乾燥させた。それぞれ、hCD46に関しては、沸騰水浴中のTarget Retrieval溶液(S1699、DAKO社)中で20分間、hTMに関しては、スチーマー中のクエン酸緩衝液、pH6.0中で45分間、熱に誘導される抗原賦活化を実施した。以下の一次抗体を使用して免疫組織化学を実施した:マウス抗ヒトCD46モノクローナル抗体(HM2103、Hycult Biotech社)及びマウス抗ヒトトロンボモジュリンモノクローナル抗体(sc-13164、Santa Cruz社)。二次抗体は、ビオチン化AffiniPureヤギ抗マウスIgG(115-065-146、Jackson ImmunoResearch社)であった。免疫反応性は、3,3-ジアミノベンジジン四塩酸塩二水和物(DAB)(茶色)を使用して可視化した。核の対比染色は、ヘマラム(青色)を用いて行った。
【０２４３】
統計分析
生存データとして、カプランマイヤー曲線をプロットし、Mantel-Cox対数順位検定を使用して、群間の有意差を決定した。血行動態データとして、示したように、対応のない両側スチューデントt検定と対応のある両側スチューデントt検定を使用して統計的有意差を決定した;データは、群の平均±s.d.としてのバーと共に単一の測定値として表した。組織化学分析では、Holm-Sidakの多重比較による一元ANOVAを使用して、統計的有意差を決定した;データは、平均±s.d.である。P<0.05を有意とみなした。統計的方法を使用せずに、標本サイズを予め決定した。この実験はランダム化されず、調査者は、実験及び結果の評価の間の割当てに対して盲検化されなかった。
【０２４４】
免疫抑制レジメン、対応する用量及びタイミング間隔を含む抗炎症療法及び添加剤療法についての概要の統合
【０２４５】
【表５】
2021519819.tif 000006
【０２４６】
(実施例5)
遺伝子改変されたブタにおけるヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の特定
上述のように、実施例1〜実施例4において使用したドナーのブタは、アルファ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウト(GT-KO)に対してホモ接合型であり、hCD46/トロンボモジュリン(hTM)に対してトランスジェニックであった(Revivicor社、Blacksburg、VA、USA及びInstitute for Molecular Animal Breeding and Biotechnology, Gene Center, Faculty of Veterinary Medicine, Ludwig-Maximilians-University、Munich、Germany)。トランスジェニックブタのゲノムのナノポアシーケンシングの際に、このゲノムが、複数のhCD46ミニ遺伝子の複製のアレイ内に、追加の導入遺伝子の、すなわち、ヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の2つの複製を含有することを予期せず見出した(図16)。本発明の異種ドナー生物の遺伝子改変された心臓/腎臓/肺/肝臓におけるヒトα1,2-フコシルトランスフェラーゼの発現は、霊長類への移植後の異種拒絶反応を回避することに寄与し得る(参考文献112も参照のこと)。
【０２４７】
(実施例6)
異種心臓移植のために遺伝子改変したブタの生産
心臓移植は、末期的な心不全を有する患者にとって、依然として好ましい処置であるが、提供されるヒトの臓器に対する需要は、供給をはるかに超えており、代替案が早急に必要とされる。三重に改変されたドナーの心臓(GTKO/hCD46/hTM)を有するヒヒでは、異所性腹部(参考文献5を参照のこと)及び生命を維持する同所性心臓異種移植(実施例1〜実施例4を参照のこと)において注目すべき進歩があった。GTKO/hCD46のバックグラウンドは、Revivicor Inc社、Blacksburg、VAによって供給され;ブタのTHBD遺伝子プロモーターによって制御されたhTM導入遺伝子が加えられた(参考文献37を参照のこと)。しかし、この遺伝的バックグラウンドは、PERV-Cを含まない訳ではなく、hCD46導入遺伝子の遺伝子座の構造は明らかになっておらず、且つhTM導入遺伝子は、異なる組込み部位にあり、飼育による動物の繁殖を複雑化している。したがって、GTKO/hCD46/hTMブタは、PERV-Cを有さないバックグラウンドにおいてデノボで確立されることになり、更に、CMAH及びB4GALNT2遺伝子は、ノックアウトされることになる。
【０２４８】
デノボでGTKO/hCD46/hTMブタを確立するために、以下の戦略が追求される:ランダムにゲノム中に挿入された導入遺伝子の発現は、隣接するクロマチンの状況に大きく依存する。これらのいわゆる位置効果は、異なる遺伝子系列間に可変的な導入遺伝子の発現及び多くの場合1つの系列内でも一貫しない発現をもたらす。ランダム導入遺伝子挿入についてのこれらの不利益を回避する戦略は、オープン構造を有し、且つ安定した導入遺伝子の発現を確保するいわゆる「セーフハーバー」遺伝子座への発現カセットの標的化配置である。
【０２４９】
よって、最初に、有利なセーフハーバーが特定された。ブタの野性型内皮細胞では、CMAHの転写レベルはB4GALNT2のレベルと類似しており、一方、GGTA1の転写レベルはおよそ5倍高いことを見出した。更に、ブタの心臓では、GGTA1の発現は、CMAH又はB4GALNT2の発現よりも20〜30倍高いことを見出した(図17)。また、ブタの肝臓及び脂肪組織では、GGTA1の発現は、CMAH又はB4GALNT2の発現よりも高いことを見出した(図17)。よって、GGTA1は、複数の組織及び細胞型において、最も重要なことには、内皮細胞において高度に発現されることを見出し、これを導入遺伝子を配置するための有利なセーフハーバーとみなした。このセーフハーバーへのいくつかの異種保護導入遺伝子の標的化された組込みによって、飼育中のそれらの分離も防止される。
【０２５０】
したがって、デノボでGTKO/hCD46/hTMブタを確立するために、GGTA1、CMAH、及びB4GALNT2遺伝子は、PERV-Cを有さない子ブタの雄性細胞及び雌性細胞においてCRISPR/Cas技術を使用して、不活性化されることになる。hCD46ミニ遺伝子を内在性ブタGGTA1プロモーター、続いて、loxP部位に隣接する選択可能なマーカー遺伝子及びブタのTHBDプロモーターを有するhTM発現カセットの制御下に置くことになる。雄及び雌の初代腎細胞は、遺伝子改変のこの基本セットを用いて確立されることになり、子ブタを核移入によって生産し、飼育によって繁殖させることになる。1つ以上の追加の発現カセットを有するようにリコンビニアリングによって操作されたバクテリア人工染色体(BAC)ベクターによるCreに駆動されるカセット交換によって、この遺伝子座にさらなる改変を付加することができる(図18)。所望の遺伝子改変の存在は、PCRによって評価されることになる。単一細胞クローンに関する発現についての研究は、RT-PCR及び免疫蛍光分析によってなされることになる。
【０２５１】
(実施例7)
異種移植のために臓器のサイズを調整するためのブタにおける成長ホルモン受容体(GHR)遺伝子のノックアウト
レシピエント生物における臓器の過成長は、異種のドナー生物(例えば、ブタ)から遺伝子改変された臓器をレシピエント生物(例えば、ヒヒ)へと移植する際の主要な問題である。異種移植されたブタの臓器の成長の制御は、前臨床のブタからヒヒへの移植実験において重要であるだけでなく、臨床移植研究に関しても重要であるため、遺伝子によるアプローチは、一工程でブタのサイズを低減すると考えられた。このことにより、mTOR阻害剤による、例えば、ラパマイシンによるレシピエントの長期間の処置が回避される。
【０２５２】
ヒトにおける成長ホルモン受容体(GHR)遺伝子の機能喪失変異は、ラロン症候群の原因であり、この症候群は、成長遅滞及び肥満によって特徴付けられるが、がん及び糖尿病の発生率を低下させ、且つ寿命を増加させる(参考文献89を参照のこと)。よって、最初に、野生型ブタのバックグラウンドに関するGHRノックアウトの効果について試験した(参考文献86を参照のこと)。CRISPR/Cas9システムを設計し、ブタの接合体中に注射し、GHR遺伝子のエクソン3を変異させた。GHRのエクソン3に1bp又は7bpの挿入を含む(リーディングフレームのシフトをもたらす;図19)2つのヘテロ接合型の創始者の雌ブタ(GHR+/-)を野生型の雄ブタ(ジャーマンランドレース)と交配させてヘテロ接合型のF1ブタを得て、これを交雑させてGHR-/-(KO)ブタを生産した。GHR-KOブタはGHRを欠いており(図20)、血清中のインスリン様成長因子1(IGF1)のレベルが著しく低下し(図21A)、IGF-結合タンパク質3(IGFBP3)の活性が低下したが、IGFBP2レベルは上昇した(図21B)。血清中GH濃度は、対照のブタと比較して有意に上昇した(図21C)。GHR-KOブタは、正常な出生体重を有した。成長遅滞は、5週齢で有意となった。6カ月齢では、GHR-KOブタの体重は、対照と比較して60%まで低下した(図22A、図22B)。GHR-KOブタのほとんどの臓器質量は、体重と比例して低下した(図23A、図23B)。しかし、肝臓、腎臓、及び心臓の質量は反比例して低下し、一方、相対的な脳の質量はほぼ倍加した(図23A、図23B)。GHR-KOブタは、体重に対して著しく増加したパーセンテージの総体脂肪を有し(図24A)、血清中トリグリセリドレベル及びコレステロールレベルの低下と共に(図24C、図24D)、一過性の若年性低血糖症を示した(図24B)。成体の絶食したブタの肝臓におけるインスリン受容体に関するシグナル伝達の分析によって、IRS1及びPI3Kのリン酸化の増加が明らかになった。GHRの喪失に一致して、STAT5のリン酸化は有意に低下した(参考文献86を参照のこと)。
【０２５３】
GHR-/-雄ブタとGHR-/-雌ブタとの交配によって、6頭の健康なGHR-/-子豚の同腹子が得られ、これらは、ヘテロ接合型の親からのGHR-/-の子(1331±298g)よりも小さい(p<0.001)出生体重(808±103g)を有した。前者は、約16週齢で後者の有する体重に追いつくように管理した(8.2±1.6kg対7.3±1.9kg;p=0.36)。
【０２５４】
GHR欠損は、野生型ブタのバックグラウンドに有害な作用を有さないため、心臓異種移植に成功したGGTA1-KO、hCD46/hTBMトランスジェニックのバックグラウンドにもGHR-KO変異を導入した(図25)。最初の子ブタが産まれ、野生型バックグラウンドに関するGHR-KOブタで観察されたのと同じ程度の成長遅滞を示した。具体的には、9カ月齢の2頭のGHR-KO、GGTA1-KO、hCD46/hTBMトランスジェニックブタの体重は、70.3kg及び73.4kgであった。野生型ブタは、3カ月早くこの体重を有する。循環血液中のIGF1レベルは、GHR-KOのみのブタの33.8±1.5ng/mL(平均±SD)及び野性型対照の215.5±141.2ng/mLと比較して23.5±0.7ng/mLであった。
【０２５５】
上記の内容は、以下の理由により、臨床異種移植にとって重要な意義を有し得る。
i)農場のブタの臓器は多くの患者に対して大きすぎる;
ii)より適切な臓器のサイズを有するミニブタは、高負荷のブタ内在性レトロウイルス(PERV)を有する(参考文献87を参照のこと);
iii)GHR-KOブタ及びその臓器のサイズは、レシピエントの需要に対して組換えインスリン様成長因子1(IGF1)(参考文献88で検討された)を用いて処置することによって調整され得る;及び
iv)GHR欠損は、最終的に異種移植片の寿命を増加させる、細胞及び組織のストレス耐性に関して有益であることが示された(参考文献89を参照のこと)。
【０２５６】
上記態様iii)に関して、GHR-KOブタ及びその臓器のサイズがレシピエント生物の需要に対して調整される場合、有益なサイズ効果は、GHR欠損臓器がIGF1インタクトの異種レシピエント中に移植される場合にも無効にならないことが指摘される。これは、GHR欠損のドナーのブタを加齢が進んでも(その成長曲線の最も傾きが急な段階を超えて)使用することができるためである。更に、局所的に生じたIGF1は、肝臓由来の循環血液中のIGF1よりも臓器成長にとってより重要である(参考文献114を参照のこと)。よって、本発明に従い、GHR欠損臓器のサイズは、ドナーのブタをIGF1で処置することによってレシピエントの需要に対して調整することができる。
【０２５７】
材料及び方法
CRISPR/Casを使用する野性型バックグラウンドのGHR変異ブタの生産
この研究におけるすべての動物に関する手順は、責任のある動物福祉局によって承認されており(Regierung von Oberbayern;認可55.2-1-54-2532-70-12)、科学目的のために使用される動物保護に関するthe German Animal Welfare Act and Directive 2010/63/EUに従って実施された。
【０２５８】
エクソン3配列5'-TTCATGCCACTGGACAGATG-3'(配列番号8)に特異的な単一ガイドRNA(sgRNA)を使用するCRISPR/Cas関連GHR遺伝子破壊のために、対応するオリゴヌクレオチドを前記のようにpEX-A-U6-gRNAベクター中にクローニングした(参考文献90を参照のこと)。Ambion Maxiscript SP6キット(Thermo Fisher Scientific社)を使用して、Cas9 mRNAとsgRNAをインビトロで転写させた。
【０２５９】
ブタの接合体(ジャーマンランドレースバックグラウンド)を前記のようにインビトロで生産し(参考文献91を参照のこと)、Cas9 mRNA(50ng/μL)とsgRNA(100ng/μL)をインビトロでの受精において、8.5〜9.5時間後に、その細胞質中に注射した。4mLのAltrenogest(Regumate(登録商標);MSD Animal Health社)を15日間経口投与し、続いて、それぞれ更に24時間及び104時間後に、750IUのECG(Intergonan(登録商標);MSD Animal Health社)及び750IUのHCG(Ovogest(登録商標);MSD Animal Health社)を筋肉内注射することによって、レシピエントの雌子ブタの発情周期を同調させた。腹腔鏡下で、一方の卵管中に胚移入を実施した(参考文献92、参考文献93を参照のこと)。21日目に最初に、4〜6週後に再度、超音波検査によって妊娠を確認した。
【０２６０】
Wizard DNA Extraction Kit(Promega社)を使用して、子ブタの尾の先からゲノムDNAを単離した。プライマーGHR_Fw 5'-acc gct ctg aag ctg tga cc-3'(配列番号9)及びGHR_Rv 5'-cac cct cag ata ctc tca tgc-3'(配列番号10)を使用して得た、GHRエクソン3 PCR産物をシーケンシングすることによってGHR変異を検出した。検出した変異に基づいて、XcmI制限断片長多型アッセイを確立し、野性型GHRに関する203bp及び441bpの断片と変異したGHR配列に関する644bpの単一断片とを得た。
【０２６１】
異なるフレームシフト変異を有する2頭の雌の創始者動物を野生型雄ブタと交配して、ヘテロ接合型のF1の子を生産した。同じ創始者のヘテロ接合型の子を交雑させて、それぞれのGHR変異を有するホモ接合型の動物(GHR-KO)を得た。
【０２６２】
GGTA1-KO、hCD46/hTBMトランスジェニックバックグラウンドにおけるGHR変異ブタの生産
この研究におけるすべての動物に関する手順は、責任のある動物福祉局によって承認されており(Regierung von Oberbayern;認可55.2-1-54-2532-70-12)、科学目的のために使用される動物保護に関するthe German Animal Welfare Act and Directive 2010/63/EUに従って実施された。
【０２６３】
雌のGGTA1-KO、hCD46/hTBMトランスジェニックブタから初代細胞を単離した。Cas9発現プラスミド(CMV-Cas9;参考文献111を参照のこと)及びブタのGHRエクソン3に特異的なttcatgccactggacaGAtgGGG(配列番号11)gRNA(下線を付したPAM)を転写するプラスミドを使用して、細胞に同時にトランスフェクトした。単一細胞のクローンを生産した;ブタのGHR遺伝子からのPCR産物をプライマー対5'-gcacacttcagatgctacctaa(配列番号12)及び5'-cacatgctcaccctcagatac(配列番号13)を用いて増幅させた;PCR産物のサンガーシーケンシングを実施し、プライマー5'-accgctctgaagctgtgacc(配列番号14)及び5'-caggagaccagagaccttatct(配列番号15)を使用して双方向サンガーシーケンシングによってフレームシフト変異について分析した。二対立遺伝子の配置の有害突然変異(ctggacagatggggt(配列番号16)/ctggacagatggggt(配列番号16)→ctgTCC-Atggggt(配列番号17)/ctggacag---gggt(配列番号18))を有する細胞クローンを体細胞核移入に使用した。
【０２６４】
4mLのAltrenogest(Regumate(登録商標);MSD Animal Health社)を15日間経口投与し、続いて、それぞれ更に24時間及び104時間後に、750IUのECG(Intergonan(登録商標);MSD Animal Health社)及び750IUのHCG(Ovogest(登録商標);MSD Animal Health社)を筋肉内注射することによって、レシピエントの雌子ブタの発情周期を同調させた。腹腔鏡下で、一方の卵管中に胚移入を実施した(参考文献92、参考文献93を参照のこと)。21日目に最初に、4〜6週後に再度、超音波検査によって妊娠を確認した。
【０２６５】
Wizard DNA Extraction Kit(Promega社)を使用して、子ブタの尾の先からゲノムDNAを単離した。プライマーGHR_Fw 5'-acc gct ctg aag ctg tga cc-3'(配列番号9)及びGHR_Rv 5'-cac cct cag ata ctc tca tgc-3'(配列番号10)を使用して得た、GHRエクソン3のPCR産物をシーケンシングすることによって、GHR変異を検出した。検出した変異に基づいて、XcmI制限断片長多型アッセイを確立し、野性型GHRに関する203bp及び441bpの断片と変異したGHR配列に関する644bpの単一断片とを得た。
【０２６６】
4頭の雌のGTKO.hCD46.hTBM.GHRKOが産まれ、サンガーシーケンシングによって、それぞれの変異の配置を有することが確認された。4頭の子ブタのうちの2頭は、生後1日目に死亡し、他の2頭のブタは、臨床的問題なく成体まで育った。
【０２６７】
ブタGHRのリガンド免疫染色(野生型バックグラウンドのみ)
GHR-KOブタ及び対照のブタの肝臓及び腎臓組織を4%のホルムアルデヒド中に一晩固定し、通常通りパラフィンに包埋した。パラフィン切片を脱ろうし、内在性ペルオキシダーゼ及びビオチンをTris緩衝生理食塩水(TBS)中の1%のH2O2で15分間、それぞれ、アビジン/ビオチンブロッキングキット(番号SP-2001;Vector Laboratories社)を使用することによってブロッキングした。0.5%の魚ゼラチンで30分間ブロッキングした後、スライドを0.2%の魚ゼラチン溶液中0.5μg/mLの組換えラットGH(番号16343667、ImmunoTools社)中で、4℃にて一晩インキュベートした。次いで、これらをTBS中で5分間3回洗浄し、ヤギ抗ラットGHポリクローナル抗体溶液中(希釈比1:2,400、番号AF1566、R&D Systems社)で、室温にて6時間インキュベートした。TBS中3回の洗浄工程(それぞれ10分)の後、スライドをビオチン化ウサギ抗ヤギIgG溶液中(希釈比1:100、番号BA-5000、Vector Laboratories社)で、室温にて1時間インキュベートし、TBS中で10分間3回洗浄し、最後に、セイヨウワサビペルオキシダーゼで標識したアビジンビオチン複合体を用いて30分間インキュベートした(番号PK-6100、VECTASTAIN Elite ABC-Peroxidaseキット、Vector Laboratories社)。免疫反応性は、3,3-ジアミノベンジジン四塩酸塩二水和物(DAB)(茶色)を使用して可視化した。核の対比染色は、Mayerのヘマラム(青色)を用いて実施した。リガンド免疫組織化学アッセイのための特異性対照として、ラットGH並びにラットGH及び一次抗体を除外した。
【０２６８】
採血
頸動脈からの採血の前に、動物を一晩(16時間)絶食させた。室温で30分間凝固させた後、6℃で20分間遠心分離(1200×g)することによって血清を分離し、分析まで-80℃で保存した。GH分泌プロファイルを分析するために必要とされる反復血液サンプリングのために、中心静脈カテーテル(Argon Careflow(商標);Merit Medical社)を外耳静脈を通して外科的に挿入した。午前11時に開始して、30分毎に9時間血液試料を採取し、上記のように血清採取物を処理した。試験の間、動物に定期的に給餌し、水に自由にアクセスさせた。
【０２６９】
臨床化学、ホルモンアッセイ、IGFBPリガンドブロット分析(野生型バックグラウンドのみ)
血清中の臨床化学パラメーターは、それぞれ、Roche Diagnostics社又はBeckman-Coulter社からの試薬を適合させたCobas 311システム(Hitachi社)又はAU480自動分析器(Beckman-Coulter社)を使用して決定した。血清中のGH濃度をブタGHと交差反応するラット/マウスGH(EZRMGH-45K;Merck社)に関してELISAによって測定した。GH曲線下面積を計算するために、このアッセイの定量下限値より低い値(<0.07ng/mL)を任意に0.07ng/mLに設定した。過剰なIGF2を含むIGF1結合部位を酸性化及びブロッキングすることによって、IGFBPからIGF1を解離させた後、RIAによって、血清中のIGF1レベルを決定した(参考文献94を参照のこと)。定量のために組換えヒトIGFBP3(41/38kDa)、IGFBP2(32kDa)、IGFBP5(29kDa)及びIGFBP4(24kDa)の連続希釈液を使用して、血清試料のIGFBPリガンドブロット分析を以前に記載されたように実施した(参考文献95を参照のこと)。以前に記載されたように(参考文献96を参照のこと)、種特異的RIA(Merck Millipore社)を使用して血漿中インスリンを決定した。Precision Xceed(登録商標)血糖値測定器及びPrecision XtraPlus(登録商標)試験ストリップ(Abbott)を使用して、血糖値を直接決定した(参考文献97を参照のこと)。ブタの試料について検証した複数種レプチンラジオイムノアッセイ(カタログ番号XL-85K;EMD Millipore Corporation社)を使用して、血清中レプチンレベルを測定した。
【０２７０】
成長パラメーター及び体組成
GHR-KOブタ及び対照のブタの体重及び体長(動物をまっすぐにして鼻の先から尾の付け根の間の距離)を1週間間隔で決定した。体長を体重の立方根で除すことによって相対的体長を計算し、同一寸法を保持した。すべての動物を同じ週齢で正確に秤量/測定することができなかったため、生のデータを定義した週齢/時点に対する直線補間によって調整した。
【０２７１】
6カ月齢のGHR-KOブタ及び対照のブタにおいて、以前に記載されたように(参考文献99を参照のこと)、二重エネルギーX線吸収測定法(DXA;Lunar iDXA、GE Healthcare社)を使用して、総体脂肪のパーセンテージを決定した。更に、最後の肋骨を覆っている背脂の面積で除した背最長筋の面積として、筋肉対脂肪比を可視化及び決定するために、磁気共鳴画像法(MRI;Magnetom Open、Siemens社)(参考文献100を参照のこと)を実施した。
【０２７２】
剖検(野生型バックグラウンドのみ)
GHR-KOブタ及び対照のブタをT61(登録商標)(Intervet社)を静脈内注入することによる麻酔下で6カ月齢で安楽死させ、直ちに剖検に供した。臓器を切除し、最近接のmgまで秤量した。以前に記載されたように(参考文献101を参照のこと)組織試料を採取し、通常通り、中性緩衝ホルマリン溶液(4%)中で24時間固定するか又はドライアイス上で直ちに凍結させて分子プロファイリングの間-80℃で保存した。ホルマリン固定した組織標本をパラフィン包埋した。筋肉切片をヘマトキシリン及びエオジン(H&E)で染色した。
【０２７３】
シグナル伝達カスケードのイムノブロット分析(野生型バックグラウンドのみ)
肝臓におけるGHR関連シグナル伝達分子の濃度及びリン酸化状態を以前に記載されたように(参考文献102を参照のこと)ウエスタンブロット分析によって評価した。簡潔には、Laemmli抽出緩衝液中で肝臓組織試料をホモジナイズし、ビシンコニン酸タンパク質アッセイによってタンパク質含量を決定した。総タンパク質のうちの40マイクログラムをSDS-PAGEで分離し、電気ブロッティングによってPVDF膜(Millipore社)に移した。0.1%のTween-20を含むTBS中で膜を洗浄し、5%w/vの無脂肪乳粉末(Roth社)中で1時間ブロッキングした。次いで、膜を再度洗浄し、5%w/vBSA(Roth社)溶液中で適切な一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。使用した抗体及び濃度を補遺Table 1(表1)において列挙する。洗浄後、膜を5%w/vの無脂肪乳粉末溶液中で二次抗体(ロバ抗ウサギ;1:2000;GE Healthcare社)と共に1時間インキュベートした。結合した抗体をECL Advance Western Blotting Detection Kit(GE Healthcare社)及び同じ供給者からの適切なフィルムを使用して検出した。ImageQuantソフトウェアパッケージ(GE Healthcare社)を使用して、バンド強度を定量した。
【０２７４】
統計分析(野生型バックグラウンドのみ)
体重及び体長又は相対的体長に関する縦断的データをそれぞれ、ブタ系列(番号2529;番号2533)、群(GHR-KO;対照)、性別、年齢、及び相互作用群*年齢の効果を考慮して、PROC MIXED(SAS 8.2)を使用して分析した。最小二乗平均(LSM)とLSMの標準誤差(SE)とを群*年齢に関して計算し、スチューデントt検定を使用して比較した。グルコース恒常性及び血清中脂質濃度に関するデータを、群、性別、年齢及び相互作用群*年齢の効果を考慮して、PROC GLM(SAS 8.2)を使用して分析した。LSM及びSEを群*年齢に関して計算し、スチューデントt検定を使用して比較した。体組成、臓器質量及び臨床化学データを、群及び性別の効果を考慮して、PROC GLMを使用して分析した。LSM及びSEを群に関して計算し、スチューデントt検定を使用して比較した。IGFBPリガンドブロット及びウエスタンイムノブロットデータを、Mann-Whitney U検定を使用して、GHR-KOブタ及び対照のブタの間の有意差について評価した。
【産業上の利用可能性】
【０２７５】
本発明の方法、プロセス及び生産物は商業的に有用である。例えば、本発明に従う組成物は、異種動物由来の心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植した霊長類の生存を延長するために販売することができる。本発明に従って、生きた霊長類を使用して、異種の心臓、腎臓、肺又は肝臓を移植した霊長類の生存を更に延長するために新規組成物及び/又は処置レジメンを見出すことができる。異種の臓器移植に関するドナー生物を使用して、異種移植のための臓器を得ることができる。よって、本発明は産業上利用可能である。
【０２７６】
[参考文献]
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2021519819.tif 000008
2021519819.tif 000009
2021519819.tif 000010
2021519819.tif 000011
2021519819.tif 000012
2021519819.tif 000013
【図１Ａ】
2021519819.tif 000014
【図１Ｂ】
2021519819.tif 000015
【図１Ｃ】
2021519819.tif 000016
【図１Ｄ】
2021519819.tif 000017
【図１Ｅ】
2021519819.tif 000018
【図１Ｆ】
2021519819.tif 000019
【図１Ｇ】
2021519819.tif 000020
【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
2021519819.tif 000024
【図１Ｌ】
2021519819.tif 000025
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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