(57)【要約】  本開示は、治療用核酸細胞（および画像化剤）を組織に送達するための材料および方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベータ細胞の質量を測定する方法であって、前記ベータ細胞を、前記ベータ細胞の前記質量を測定するのに有効な量の、画像化試薬に結合したアプタマーを含む構築物と接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記アプタマーがＭ１２−３７７３または１−７１７である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記画像化剤が、蛍光色素、ＰＥＴトレーサー、またはＭＲＩ造影剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アプタマーがキレート剤を介して画像化剤に結合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ベータ細胞の増殖を調節する方法であって、前記ベータ細胞を、前記ベータ細胞の増殖を調節するのに有効な量の、小さな活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）に結合したアプタマーを含む構築物と接触させることを含む、方法。
【請求項６】
組織移植片のアポトーシスの阻害を必要とする対象における前記組織移植片のアポトーシスを阻害するための方法であって、前記組織移植片を、前記組織移植片のアポトーシスを阻害するのに有効な量の、小さな活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）に結合したアプタマーを含む構築物と接触させることを含む、方法。
【請求項７】
前記アプタマーがＭ１２−３７７３または１−７１７である、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ベータ細胞のアポトーシスを阻害する、請求項５または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｓａＲＮＡがタンパク質ＸＩＡＰ（アポトーシス遺伝子ＩＤ３３１のＸ連鎖阻害剤）をアップレギュレートする、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組織移植片が、膵臓、心臓、肺、腎臓、胃、または皮膚から選択される器官に由来する、請求項６、７または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アプタマーが筋肉特異的アプタマーであり、問題点が心臓組織である、請求項６、７、９および１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ベータ細胞のＴ細胞媒介細胞毒性を阻害するのに有効な量の、ｓａＲＮＡに結合したアプタマーを含む構築物を用いて、前記ベータ細胞のＴ細胞媒介細胞毒性から前記ベータ細胞を保護するための方法。
【請求項１３】
前記アプタマーがＭ１２−３７７３または１−７１７である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｓａＲＮＡが免疫チェックポイントを増加させることができる、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｓａＲＮＡがタンパク質ＣＤ２７４（プログラムされたデスリガンド１、ＰＤＬ１、遺伝子ＩＤ２９１２６）をアップレギュレートする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
糖尿病の治療を必要とする対象における糖尿病を治療するための方法であって、ｓａＲＮＡに結合したアプタマーを含む構築物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１７】
配列番号２６４に記載のヌクレオチド配列を含むアプタマー。
【請求項１８】
配列番号２５９に記載のヌクレオチド配列を含むアプタマー。
【請求項１９】
ｓａＲＮＡに結合した請求項１７または請求項１８に記載のアプタマーを含む構築物。
【請求項２０】
前記ｓａＲＮＡがタンパク質ＸＩＡＰ（アポトーシス遺伝子ＩＤ３３１のＸ連鎖阻害剤）をアップレギュレートする、請求項１９に記載の構築物。
【請求項２１】
前記ｓａＲＮＡがタンパク質ＣＤ２７４（プログラムされたデスリガンド１、ＰＤＬ１、遺伝子ＩＤ２９１２６）をアップレギュレートする、請求項１９に記載の構築物。
【請求項２２】
小さな活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）に結合したアプタマーを含む構築物。
【請求項２３】
前記アプタマーが組織に特異的である、請求項２２に記載の構築物。
【請求項２４】
前記組織が器官に由来する、請求項２３に記載の構築物、
【請求項２５】
前記器官が膵臓、心臓、肺、腎臓、胃、皮膚または脳である、請求項２４に記載の構築物。
【請求項２６】
前記組織が膵島である、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項２７】
前記構築物が検出可能な標識をさらに含む、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項２８】
前記検出可能な標識が、蛍光色素、フッ素−１８、酸素−１５、ガリウム６８などのポジトロン放出断層撮影トレーサー、ガドリニウム、酸化鉄、鉄白金またはマンガンなどの磁気共鳴画像造影剤である、請求項２７に記載の構築物。
【請求項２９】
前記アプタマーがＭ１２−３７７３または１−７１７である、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項３０】
前記アプタマーがクラステリン（ＣＬＵ、遺伝子ＩＤ１１９１）に特異的である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項３１】
前記アプタマーが「膜貫通型ｅｍｐ２４ドメイン含有タンパク質６」（ＴＭＥＤ６、遺伝子ＩＤ１４６４５６）に特異的である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項３２】
前記組織が副腎組織または骨髄である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項３３】
前記アプタマーが１７３−２２７３、１０７−９０１またはｍ６−３２３９である、請求項３２に記載の構築物。
【請求項３４】
前記組織が乳房組織、肺組織またはリンパ節組織である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項３５】
前記アプタマーが１０７−９０１およびｍ６−３２３９である、請求項３４に記載の構築物。
【請求項３６】
前記組織が脳小脳である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項３７】
前記アプタマーが１７３−２２７３、１０７−９０１、ｍ１−２６２３またはｍ６−３２３９である、請求項１５に記載の構築物。
【請求項３８】
前記組織が、脳大脳皮質組織、下垂体組織、結腸組織、内皮組織、食道組織、心臓組織または腎臓組織である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項３９】
前記アプタマーが１０７−９０１、ｍ１−２６２３またはｍ６−３２３９である、請求項３８に記載の構築物。
【請求項４０】
前記組織が卵管組織である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項４１】
前記アプタマーがｍ６−３２３９である、請求項４０に記載の構築物。
【請求項４２】
前記組織が肝臓組織である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項４３】
前記アプタマーが１６６−２７９、１０７−９０１、ｍ１−２６２３またはｍ６−３２３９である、請求項４２に記載の構築物。
【請求項４４】
前記組織が卵巣組織である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項４５】
前記アプタマーが１０７−９０１である、請求項４４に記載の構築物。
【請求項４６】
前記組織が胎盤組織である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項４７】
前記アプタマーが１６６−２７０、１７３−２２７３、１０７−９０１、ｍ１−２６２３またはｍ６−３２３９である、請求項４６に記載の構築物。
【請求項４８】
前記組織が前立腺組織である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項４９】
前記アプタマーが１７３−２２７３または１０７−９０１である、請求項４８に記載の構築物。
【請求項５０】
前記組織が脊髄組織である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項５１】
前記アプタマーが１６６−２７９または１７３−２２７３である、請求項５０に記載の構築物。
【請求項５２】
前記組織が精巣組織である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項５３】
前記アプタマーが１６６−２７９、１７３−２２７３、１０７−９０１、ｍ１−２６２３、ｍ６−３２３９およびｍ１２−３７７３である、請求項５２に記載の構築物。
【請求項５４】
前記組織が胸腺組織である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項５５】
前記アプタマーが１７３−２２７３、１０７−９０１またはｍｆ−２６２３である、請求項５４に記載の構築物。
【請求項５６】
前記組織が甲状腺組織である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項５７】
前記アプタマーがｍ１−２６２３である、請求項５６に記載の構築物。
【請求項５８】
前記組織が尿管組織である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項５９】
前記アプタマーが１０７−９０１である、請求項５８に記載の構築物。
【請求項６０】
前記組織が頸部組織である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項６１】
前記アプタマーが１６６−２７９である、請求項６０に記載の構築物。
【請求項６２】
前記組織がランゲルハンス島または膵臓組織である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項６３】
前記アプタマーが１６６−２７９、１７３−２２７３、１０７−９０１、１−７１７、ｍ１−２６２３、ｍ６−３２３９またはｍ１２−３７７３である、請求項６２に記載の構築物。
【請求項６４】
組織に小さな活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）を送達する方法であって、前記組織に特異的である請求項２２〜６３のいずれか１項に記載の構築物と前記組織とを接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月８日に出願された米国仮出願第６２／６６８，４６３号の優先権の利益を主張し、該米国仮出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、治療用核酸細胞（および造影剤）を組織に送達するための材料および方法を提供する。
【０００３】
政府支援の声明
本発明は、米国国立糖尿病ならびに消化器系疾患および腎疾患研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＮＩＤＤＫ）によって授与された助成番号１ＵＣ４ＤＫ１１６２４１−０１の下で米国政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明におけるある特定の権利を有する。
【０００４】
電子的に提出された資料の参照による組込み
本出願は、本開示の別個の部分として、その全体が参照により組み込まれるコンピューター可読形式の配列表（ファイル名：５３０４８Ａ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：１１６，９９８バイト、２０１９年５月８日作成）を含む。
【背景技術】
【０００５】
糖尿病は、膵臓のベータ細胞によって産生されるホルモンであるインシュリンの不足によって引き起こされる、長期間にわたって高血糖値が存在する一群の代謝障害である。特に、１型糖尿病はベータ細胞の進行性の自己免疫破壊によって引き起こされるが、２型糖尿病では、体が必要とするのに十分な量のインシュリンが生成されない。２型糖尿病へのベータ細胞喪失の寄与が長年議論されてきたが、過去１０年間で、ベータ細胞の喪失が２型糖尿病の病態生理にも関与していることが明らかになった（Ｒｏｊａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２０１８，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ９６０１８０１，１９  ｐａｇｅｓ，２０１８；Ｄｏｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２００５  Ｄｅｃ；５４  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０８−１３）。これまでのこの知識にもかかわらず、インビボでベータ細胞（ベータ細胞質量）の数を直接測定するため、またはこれらの重要な細胞に特異的に治療薬を送達するための利用可能な方法はない。確かに、糖尿病の進行を決定する方法は、主に間接的な測定（すなわち、血中のグルコースまたはｃ−ペプチド濃度の決定）に依存しており、多くの細胞がインシュリンをほとんど生成しないか、または少数の細胞がこのホルモンを大量に生成するかを区別できない。したがって、これらの方法では、糖尿病患者の進行性ベータ細胞の喪失を測定することはできない。ベータ細胞に特異的な適切なマーカーがないことも、ベータ細胞の喪失を停止または逆転させるために、ベータ細胞に特異的に治療薬を送達することを不可能にしている。
【０００６】
ＲＮＡアプタマーは、受容体を介した内在化またはクラスリンを介したエンドサイトーシスによって治療用カーゴの細胞内蓄積を能動的に増強するため、多くのヒト疾患の治療におけるｓｉＲＮＡの効果的な送達媒体として浮上している（３５〜３９，４３〜７４）。目的の治療用ＲＮＡをβ細胞に送達するためのアプタマーの使用は、例えば、目的の遺伝子の一過性調節、免疫原性の欠如、および優れた安全性プロファイルなどのウイルスベクターの使用よりも有利である。現在まで、アデノウイルスベクターは主にインビトロで
初代膵島への遺伝子とｓｉＲＮＡの効率的な送達に使用されてきた（７９〜８４）。しかし、インビボでは、ウイルスベクターの使用における技術的困難に加えて、それらの固有の免疫原性および野生型ウイルスとの可能な組換えは、深刻な安全上の懸念を引き起こす。確かに、ウイルスベクターは、多臓器不全や死さえも含む可能性のある二次的合併症を伴う強力な免疫反応を誘発する可能性がある（８５）。レンチウイルスベクターの出現により、免疫原性の懸念の一部が緩和されたが、レンチウイルスは、無傷のヒト膵島の形質導入においてアデノウイルスほど効率的ではない（８６，８７）。しかし、現在のインビトロプロトコルは最適化されている（８８）。それにもかかわらず、ゲノムへのレンチウイルスの統合は、安全性の懸念、挿入型遺伝子変異のリスク、および野生型ウイルスとの組換えを依然として引き起こす。
【発明の概要】
【０００７】
一態様では、本開示は、１つ以上の薬剤を組織に送達する方法であって、組織を、薬剤に結合した組織に特異的なアプタマーを含む構築物と接触させることを含む、方法を提供する。ある実施形態では、組織は、膵臓、心臓、肺、腎臓、胃、皮膚、および脳からなる群から選択される器官に由来する。ある実施形態では、組織は膵島である。ある実施形態では、薬剤は治療用核酸である。ある実施形態では、治療用核酸は治療用ＲＮＡである。ある実施形態では、治療用ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡおよびｓａＲＮＡからなる群から選択される。ある実施形態では、薬剤は画像化剤である。例示的な画像化剤には、蛍光色素、フッ素−１８、酸素−１５、ガリウム６８などのポジトロン放出断層撮影トレーサー、ガドリニウム、酸化鉄、鉄白金およびマンガンなどの磁気共鳴画像造影剤が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の接触ステップは、インビボまたはインビトロで行うことができる。
【０００８】
別の態様では、本開示は、小さな活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）に結合したアプタマーを含む構築物を提供する。ある実施形態において、アプタマーは、ヒト膵島に特異的である。ある実施形態において、アプタマーは、Ｍ１２−３７７３および１−７１７からなる群から選択される。
【０００９】
ある実施形態において、アプタマーは、クラステリン（ＣＬＵ、遺伝子ＩＤ１１９１）に特異的である。ある実施形態において、アプタマーは、「膜貫通ｅｍｐ２４ドメイン含有タンパク質６」（ＴＭＥＤ６、遺伝子ＩＤ１４６４５６）に特異的である。
【００１０】
ある実施形態では、組織は副腎組織または骨髄であり、アプタマーは１７３−２２７３、１０７−９０１またはｍ６−３２３９である。ある実施形態では、組織は乳房組織、肺組織またはリンパ節組織であり、アプタマーは１０７−９０１およびｍ６−３２３９である。ある実施形態では、組織は脳小脳であり、アプタマーは１７３−２２７３、１０７−９０１、ｍ１−２６２３またはｍ６−３２３９である。ある実施形態では、組織は、脳大脳皮質組織、下垂体組織、結腸組織、内皮組織、食道組織、心臓組織または腎臓組織であり、アプタマーは、１０７−９０１、ｍ１−２６２３またはｍ６−３２３９である。ある実施形態では、組織は卵管組織であり、アプタマーはｍ６−３２３９である。ある実施形態では、組織は肝臓組織であり、アプタマーは１６６−２７９、１０７−９０１、ｍ１−２６２３またはｍ６−３２３９である。ある実施形態では、組織は卵巣組織であり、アプタマーは１０７−９０１である。ある実施形態では、組織は胎盤組織であり、アプタマーは、１６６−２７０、１７３−２２７３、１０７−９０１、ｍ１−２６２３、またはｍ６−３２３９である。ある実施形態では、組織は前立腺組織であり、アプタマーは１７３−２２７３または１０７−９０１である。ある実施形態では、組織は脊髄組織であり、アプタマーは１６６−２７９または１７３−２２７３である。ある実施形態では、組織は精巣組織であり、アプタマーは、１６６−２７９、１７３−２２７３、１０７−９０１、ｍ１−２６２３、ｍ６−３２３９、およびｍ１２−３７７３である。ある実施形態では、組織
は胸腺組織であり、アプタマーは１７３−２２７３、１０７−９０１またはｍｆ−２６２３である。ある実施形態では、組織は甲状腺組織であり、アプタマーはｍ１−２６２３である。ある実施形態では、組織は尿管組織であり、アプタマーは１０７−９０１である。ある実施形態では、組織は子宮頸部組織であり、アプタマーは１６６−２７９である。ある実施形態では、組織はランゲルハンス島または膵臓組織であり、アプタマーは１６６−２７９、１７３−２２７３、１０７−９０１、１−７１７、ｍ１−２６２３、ｍ６−３２３９またはｍ１２−３７７３である。
【００１１】
別の態様では、本開示は、１つ以上の薬剤を膵島に送達する方法であって、膵島を、薬剤に結合した膵島に特異的なアプタマーを含む構築物と接触させることを含む、方法を提供する。ある実施形態では、薬剤は治療用核酸である。ある実施形態では、治療用核酸は治療用ＲＮＡである。ある実施形態において、治療用ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡおよびｓａＲＮＡからなる群から選択される。ある実施形態では、薬剤は画像化剤である。例示的な画像化剤には、蛍光色素、フッ素−１８、酸素−１５、ガリウム６８などのポジトロン放出断層撮影トレーサー、ガドリニウム、酸化鉄、鉄白金およびマンガンなどの磁気共鳴画像造影剤が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の接触ステップは、インビボまたはインビトロで行うことができる。
【００１２】
ある実施形態において、アプタマーは、Ｍ１２−３７７３および１−７１７からなる群から選択される。ある実施形態において、アプタマーは、クラステリン（ＣＬＵ、遺伝子ＩＤ１１９１）に特異的である。ある実施形態において、アプタマーは、「膜貫通ｅｍｐ２４ドメイン含有タンパク質６」（ＴＭＥＤ６、遺伝子ＩＤ１４６４５６）に特異的である。
【００１３】
別の態様では、本開示は、ベータ細胞の質量を測定する方法であって、ベータ細胞を、ベータ細胞の質量を測定するのに有効な量の、画像化剤に結合したアプタマーを含む構築物と接触させることを含む、方法を提供する。ある実施形態において、アプタマーは、Ｍ１２−３７７３および１−７１７からなる群から選択される。ある実施形態では、画像化剤は蛍光色素である。ある実施形態では、画像化剤は、ＰＥＴトレーサーである。ある実施形態では、画像化剤は、ＭＲＩ造影剤である。ある実施形態では、画像化剤は、キレート剤を介してアプタマーに結合することができる。
【００１４】
別の態様では、本開示は、ベータ細胞の増殖を調節する方法であって、ベータ細胞を、ベータ細胞の増殖を調節するのに有効な量の、治療用核酸に結合したアプタマーを含む構築物と接触させることを含む、方法を提供する。ある実施形態において、アプタマーは、Ｍ１２−３７７３および１−７１７からなる群から選択される。ある実施形態では、治療用核酸は治療用ＲＮＡである。ある実施形態において、治療用ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡおよびｓａＲＮＡからなる群から選択される。本明細書に記載の接触ステップは、インビボまたはインビトロで行うことができる。
【００１５】
別の局面において、本開示は、ベータ細胞アポトーシスを阻害するための方法であって、ベータ細胞のアポトーシスを阻害するのに有効な量の、治療用核酸に結合したアプタマーを含む構築物とベータ細胞を接触させることを含む、方法を提供する。ある実施形態において、アプタマーは、Ｍ１２−３７７３および１−７１７からなる群から選択される。ある実施形態では、治療用核酸は治療用ＲＮＡである。ある実施形態において、治療用ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡおよびｓａＲＮＡからなる群から選択される。ある実施形態において、治療用ＲＮＡは、タンパク質ＸＩＡＰ（アポトーシス遺伝子ＩＤ３３１のＸ連鎖阻害剤）をアップレギュレートする。本明細書に記載の接触ステップは、インビボまたはインビトロで行うことができる。
【００１６】
別の局面において、本開示は、組織移植片のアポトーシスの阻害を必要とする対象における組織移植片アポトーシスを阻害するための方法であって、組織移植片のアポトーシスを阻害するのに有効な量の、治療用核酸に結合したアプタマーを含む構築物と組織移植片を接触させることを含む、方法を提供する。ある実施形態では、治療用核酸は治療用ＲＮＡである。ある実施形態において、治療用ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡおよびｓａＲＮＡからなる群から選択される。ある実施形態において、治療用ＲＮＡは、タンパク質ＸＩＡＰ（アポトーシス遺伝子ＩＤ３３１のＸ連鎖阻害剤）をアップレギュレートする。本明細書に記載の接触ステップは、インビボまたはインビトロで行うことができる。ある実施形態において、組織移植片は、膵臓、心臓、肺、腎臓、胃および皮膚からなる群から選択される器官に由来する。ある実施形態では、アプタマーは筋肉特異的アプタマーであり、組織は心臓組織である。
【００１７】
ある実施形態において、組織は、アプタマーの非存在下でタンパク質ＸＩＡＰをアップレギュレートする治療用ＲＮＡと接触させられる。例えば、別の局面において、本開示は、組織移植片アポトーシスの阻害を必要とする対象における組織移植片アポトーシスを阻害する方法であって、組織移植片を、組織移植片のアポトーシスを阻害するのに有効な量の、タンパク質ＸＩＡＰ（アポトーシス遺伝子ＩＤ３３１のＸ結合阻害剤）をアップレギュレートする治療用ＲＮＡと接触させることを含む、方法を提供する。本明細書に記載の接触ステップは、インビボまたはインビトロで行うことができる。ある実施形態において、組織移植片は、膵臓、心臓、肺、腎臓、胃および皮膚からなる群から選択される器官に由来する。
【００１８】
別の態様では、本開示は、ベータ細胞のＴ細胞媒介細胞毒性からベータ細胞を保護する方法であって、ベータ細胞を、ベータ細胞のＴ細胞媒介細胞毒性を阻害するのに有効な量の、治療用核酸に結合したアプタマーを含む構築物と接触させることを含む、方法を提供する。ある実施形態において、アプタマーは、Ｍ１２−３７７３および１−７１７からなる群から選択される。ある実施形態において、治療用核酸は、免疫チェックポイントを増加させることができる。ある実施形態では、治療用核酸は治療用ＲＮＡである。ある実施形態において、治療用ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡおよびｓａＲＮＡからなる群から選択される。ある実施形態において、治療用ＲＮＡは、タンパク質ＣＤ２７４（プログラムされたデスリガンド１、ＰＤＬ１、遺伝子ＩＤ２９１２６）をアップレギュレートする。本明細書に記載の接触ステップは、インビボまたはインビトロで行うことができる。
【００１９】
別の態様では、本開示は、糖尿病の治療を必要とする対象の糖尿病を治療する方法であって、対象の糖尿病を治療するのに有効な量の、小さな活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）に結合したアプタマーを含む構築物を対象に投与することを含む、方法を提供する。ある実施形態において、アプタマーは、Ｍ１２−３７７３および１−７１７からなる群から選択される。
【００２０】
別の態様では、ベータ細胞に特異的な１つまたは複数のアプタマーを組み合わせて使用して、治療薬または画像化剤の送達を増加させることができる。ある実施形態において、アプタマーは、Ｍ１２−３７７３および１−７１７からなる群から選択される。
【００２１】
配列番号２６４または２５９に記載のヌクレオチド配列を含むアプタマーも企図される。ある実施形態において、アプタマーは、ｓａＲＮＡに結合している。ある実施形態において、ｓａＲＮＡは、タンパク質ＸＩＡＰ（アポトーシス遺伝子ＩＤ３３１のＸ連鎖阻害剤）をアップレギュレートする。ある実施形態において、ｓａＲＮＡは、タンパク質ＣＤ２７４（プログラムされたデスリガンド１、ＰＤＬ１、遺伝子ＩＤ２９１２６）をアップレギュレートする。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ヒト膵島および腺房組織を用いてヒト膵島に特異的なアプタマーを単離するための教師なし戦略としてのＨＴクラスターＳＥＬＥＸを示すフローチャートである。
【図２】マウスとヒトの間で交差反応する膵島特異的アプタマーを分離するためのＨＴ−トグル−クラスターＳＥＬＥＸを示すフローチャートである。
【図３】マウスとヒトの間で交差反応する膵島特異的アプタマーを分離するためのＨＴ−トグル−クラスターＳＥＬＥＸら得られた画像を示す。
【図４】ヒトの腺房組織ではなくヒトの膵島を認識するモノクローナルアプタマーを同定するＨＴ−トグル−クラスターＳＥＬＥＸから得られた画像を示す。
【図５−１】図５Ａ及び図５Ｂは、アプタマー１−７１７（図５Ａ）およびＭ１２−３７７２（図５Ｂ）が、ヒト膵島に対して並外れた特異性を示すことを示す。
【図５−２】図５Ａ及び図５Ｂは、アプタマー１−７１７（図５Ａ）およびＭ１２−３７７２（図５Ｂ）が、ヒト膵島に対して並外れた特異性を示すことを示す。
【図５−３】図５Ｃは、様々な選択されたアプタマーによる様々な組織染色の結果を示す表である。
【図６】アプタマー１−７１７およびＭ１２−３７７２がマウス膵島およびその他のマウス組織を認識することを示す。
【図７】アプタマー１−７１７およびＭ１２−３７７３がヒトベータ細胞を優先的に認識することを示す。
【図８】クラステリンがアプタマーｍ１２−３７７３の標的となる可能性があることを示す。
【図９】ＴＭＥＤ６がアプタマー１−７１７の推定標的であることを示す。
【図１０】アプタマー１−７１７とｍ１２−３７７３の混合物が、個々のクローンよりもインビボでヒト膵島をよりよく認識することを示す。
【図１１】アプタマー１−７１７およびＭ１２−３７７３がインビボでのヒトベータ細胞量の測定を可能にすることを示す。図１１Ａは、実施例２で実施された実験の概略図である。図１１Ｂおよび１１Ｃは、ＥＦＰ領域の蛍光シグナルが移植された膵島の数に比例することを示し、これらのアプタマーを使用してインビボでβ細胞量を測定できることを示す。図１１Ｄは、同系（Ｂａｌｂ／ｃ）または同種（Ｃ５７Ｂｌ／６）膵島を、免疫応答性Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下（それぞれ右脇腹と左脇腹）にトを移植したことを示す。拒絶反応は、ＡＦ７５０結合アプタマーを静脈内注射し、５時間後にＩＶＩＳを実行することによって縦方向に監視された。データは、同種異系のＣ５７Ｂｌ６膵島移植片の拒絶反応が、左側腹部の信号の喪失によって見られるように、経時的に測定できることを示す。代わりに、同系の膵島移植片の信号（右）は、移植片の生存を示す時間の経過とともに維持される。
【図１２】膵島特異的アプタマーを介して治療用ＲＮＡを送達するためのアプタマーキメラの概略図である。
【図１３】膵島特異的アプタマーキメラが膵島特異的アプタマーを介した治療用ＲＮＡの送達を可能にすることを示す。
【図１４】ｐ５７ｋｉｐ２−ｓｉＲＮＡ島特異的アプタマーキメラがインビボでヒトベータ細胞の増殖を誘導することを示す。
【図１５】ヒト「Ｘ連鎖アポトーシス阻害因子」（Ｘｉａｐ、遺伝子ＩＤ３３１）に特異的な小さな活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）の同定を示す。
【図１６】Ｘｉａｐ−ｓａＲＮＡアプタマーキメラは、サイトカイン誘導アポトーシスからヒトベータ細胞を保護する。
【図１７】図１７Ａは、Ｘｉａｐ−ｓａＲＮＡ／膵島特異的アプタマーキメラがベータ細胞を一次機能不全から保護することを示す。図１７Ｂは、実施例５に記載された実験の概略図である。図１７Ｃは、ヒト膵島は、４８時間、２４時間にキメラが添加された培地で培養され、移植の日に、ストレプトゾトシン糖尿病ＮＯＧマウスの左腎臓被膜にマウスあたり６００ＩＥＱが移植された。データは、アプタマーキメラによるヒト膵島の前処理が膵島移植の有効性を大幅に改善し、マウスの約８０％が２日目までに正常血糖になることを示した。対照的に、膵島を移植された５０％ｏｄマウス（Ｐ＝０．０２；ｎキメラ処理＝１０；ｎ未処理＝８）のみが糖尿病を逆転させ、動態が遅れた。
【図１８】ヒト「ＰＤＬ１」（ＣＤ２７４、遺伝子ＩＤ２９１２６）に特異的な小さな活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）の同定。
【図１９】ＰＤＬ１−ｓａＲＮＡ／膵島特異的アプタマーキメラはヒトベータ細胞のＰＤＬ１をアップレギュレートする。
【図２０】ＰＤＬ１−ｓａＲＮＡ／アプタマーキメラはインビボでＰＤＬ１をアップレギュレートする。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
実施例に記載されているように、治療用ＲＮＡ／アプタマーキメラは、インビボでヒトβ細胞における遺伝子発現を調節して、それらの一過性増殖を誘導し、自己／同種免疫に対するそれらの耐性を改善するために生成された。特に、Ａ）β細胞増殖を誘導するｐ５７ｋｉｐ２に対するｓｉＲＮＡ、Ｂ）アポトーシスから膵島を保護するＸｉａｐ発現を促進するｓａＲＮＡ、およびＣ）保護するＰＤＬ１発現を促進するｓａＲＮＡ  Ｔ細胞の細胞毒性からのβ細胞を送達するための、膵島特異的アプタマーの使用を最適化および検証する。自己免疫Ｔ１Ｄの信頼できるヒト化マウスモデルがないため、我々のアプローチは、アプタマー治療の前にヒト膵島を移植したＮＳＧまたはヒト化ＮＳＧマウスの使用に基づいている。ヒト膵島の使用は、ｐ５７ｋｉｐ２生物学における種特異的な違い（１４）と、ヒト遺伝子に対するＰＤＬ１およびＸｉａｐｓａＲＮＡの特異性によって決定される。エクスビボおよび革新的なインビボ技術を使用して、β細胞増殖、アポトーシス、および免疫系との相互作用の画像化を通じて、インビボ治療に対する応答を定量化する。我々は、これらのアプタマーを、異なる遺伝子を同時に調節できるモノモーダルまたはマルチモーダルアプローチとして使用することを想定している。
【００２４】
このクラスの分子は免疫原性が低く、組織の奥深くまで浸透する能力が高く、同族の標的を高い親和性と特異性で認識する能力があるため、ＲＮＡアプタマーのインビボでの使用は特に魅力的である。アプタマーのフッ素化バックボーンにより、アプタマーはＲＮＡｓｅ分解に耐性があり、ＴＬＲシグナル伝達を誘発できなくなる（４１，４２）。ＲＮＡアプタマーは、多くのヒトの疾患の治療のために、特定の細胞サブセットまたは組織へのｓｉＲＮＡおよび他の薬物の効果的な送達媒体として出現した（６０，６２−７５）。実際、アプタマーとその細胞膜標的との間の相互作用を通じて、アプタマーは治療薬の細胞内蓄積を積極的に増強する（３７−３９，４３−６１）。一部のアプタマー薬はＦＤＡに承認されており、３０種以上が臨床試験で試験されている（１６〜２４）。インビボで投与される場合、特定の標的を見つけられないアプタマーは、腎臓を介して急速に排除される。組織または細胞で標的を見つけたものは、最大２週間検出可能である。それらのバイオアベイラビリティ、血漿半減期、および薬物動態特性は、合成中にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加するか、またはナノ粒子と結合させることにより、サイズを大きくすることで簡単に操作できる（６０，６２〜７４）。アプタマーは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓａＲＮＡに結合させて、特定の標的に望ましい治療効果をもたらすことができる。高い特異性と定義された機能を備えたアプタマーを直接操作する能力は、抗体や他の小分子に比べて明らかな利点である。
【実施例】
【００２５】
実施例１−ヒト膵島に特異的なモノクローナルＲＮＡアプタマーの単離。
監視されていないトグルＳＥＬＥＸは、マウス膵島に対するポリクローナルアプタマーライブラリーから始めて、膵島枯渇ヒト腺房細胞と４人の異なる死体ドナーからの厳選されたヒト膵島をそれぞれネガティブセレクターとポジティブセレクターとして使用して実行した。これにより、非特異的（腺房組織結合）ＲＮＡアプタマーの枯渇が可能になり、
マウスおよびヒトの膵島に特異的なアプタマーのライブラリーが充実した。
【００２６】
図１に示すように、ＨＴクラスターＳＥＬＥＸは、ヒト膵島と腺房組織を使用して、ヒト膵島に特異的なアプタマーを分離するための教師なし戦略として使用された。ランダムアプタマーライブラリーは、２つの定常領域に隣接する４０−ｎｔ可変領域を含むｃＤＮＡランダムライブラリー（ＴＣＴ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＴＣ  ＴＧ（Ｎ４０）ＣＣＧ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＣＣＴ  ＣＣＣ  ＴＡ（配列番号４１３）からＰＣＲおよびＤｕｒａｓｃｒｉｂｅ  Ｔ７ＲＮＡ転写によって生成された。このランダムライブラリーの５ｕｇ（約８．３ｘ１０１３アプタマー）は、死体ドナーからの膵島枯渇膵島（ネガティブセレクター）を使用して、腺房組織に結合するアプタマーが枯渇した。次に、結合していないアプタマーを、死体ドナーから厳選した膵島（ポジティブセレクターとしての１００〜３００ＩＥＱ）とともにインキュベートした。膵島をＰＢＳで洗浄し、膵島に結合したアプタマーをＲＮＡ抽出によって回収し、２’−フッ素−ｄＣＴＰ（２’−Ｆ−ｄＣＴＰ）および２’−フッ素−ｄＵＴＰ（２’−Ｆ−ｄＵＴＰ）、ＡＴＰ、およびＲＮＡｓｅ耐性が向上したＧＴＰを使用したＲＴ−ＰＣＲおよびＴ７−ＲＮＡポリメラーゼによって再増幅した。得られたＲＮＡアプタマーライブラリー（表１）は、膵島特異的アプタマーが豊富で、新しい選択サイクルに使用した。合計８回の選択サイクルが、４人の無関係な死体ドナーからの膵島と腺房組織を使用して実行された。各サイクルのライブラリーをＨＴシーケンスし、バイオインフォマティクス分析を行って頻度とクラスター分析を実行し、選択プロセス中に濃縮されたモノクローナルアプタマーとアプタマーファミリーを特定した。サイクル８からライブラリーに存在する最も頻繁なファミリーの中で最も頻繁なモノクローナルアプタマーを、経験的試験のために選択した。
【００２７】
【表１−１】
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【００２８】
【表１−２】
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【００２９】
【表１−３】
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【００３０】
【表１−４】
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【００３１】
【表１−５】
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【００３２】
【表１−６】
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【００３３】
【表１−７】
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【００３４】
【表１−８】
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【００３５】
【表１−９】
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【００３６】
【表１−１０】
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【００３７】
【表１−１１】
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【００３８】
【表１−１２】
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【００３９】
【表１−１３】
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【００４０】
【表１−１４】
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【００４１】
図２に示すように、ＨＴ−トグル−クラスターＳＥＬＥＸを使用して、マウスとヒトの間で交差反応する膵島特異的アプタマーを分離した。ＨＴクラスターＳＥＬＥＸの８サイクルは、ネガティブセレクターおよびポジティブセレクターとしてそれぞれマウス腺房組織およびマウス膵島を使用して、図１に記載されているように実行された（図２Ａ）。サイクル８から得られたポリクローナルアプタマーは、マウスからの腺房組織と膵島、または死体ドナーから分離された腺房組織と膵島のいずれかを使用して、選択の２つの追加サイクルに使用された（図２Ｂ）。得られたポリクローナルアプタマーライブラリーは、ＨＴシーケンシングおよびバイオインフォマティクス分析（図２Ｃ）を受けて、マウスまたはヒトの組織を使用して選択されたライブラリーに存在する各モノクローナルアプタマーの頻度を決定した。ヒトライブラリーに富むモノクローナルアプタマー（表３）（ヒト膵島に対する推定アプタマー、長方形の選択）が経験的試験のために選択された。表３は、ヒト膵島に対する推定アプタマーも示している。
【００４２】
【表２】
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【００４３】
【表３−１】
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【００４４】
【表３−２】
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【００４５】
【表３−３】
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【００４６】
【表３−４】
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【００４７】
【表３−５】
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【００４８】
【表３−６】
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【００４９】
【表３−７】
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【００５０】
次に、同定されたモノクローナルアプタマーのヒト膵島に対する特異性を、図１および図２に記載されている２つのハイスループットクラスターＳＥＬＥＸ戦略でテストした。簡単に言えば、バイオインフォマティクス分析によって同定された配列に対応するモノクローナルアプタマーは、重複するオリゴヌクレオチドをテンプレートとして使用して、ＰＣＲおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって生成された。得られたモノクローナルアプタマーはシアニン−３で標識され、死体ドナーからのヒト膵臓の切片の蛍光プローブとして使用された。クローン番号は、ＨＴ−トグルクラスターＳＥＬＥＸからのアプタマーの識別を示す接頭辞「ｍ」で報告される。データは、いくつかのアプタマー（ｍ１６６−２７９、ｍ５−３２２９、１０７−９０１、ｍ７−２５３７、ｍ９−３０７６、１−７１７、１７３−２２７３、ｍ１２−３７７２）が膵島に対して優れた特異性を示す一方で、他のラベルも示すことを示している腺房組織（１２−２６１７、１０９−２０３１、ｍ１−２６２３、ｍ２４−３２１９）、およびその他は染色を示さなかった（２０８−２５２９、１５５−１１１３、６４−２４３７）。
【００５１】
選択したモノクローナルアプタマーの特異性をさらに評価するために、図４の最高のパフォーマー（１６６−２７９、１７３−２２７３、１０７−９０１、１−７１７、ｍ１−２６２３、ｍ５−３２３９、およびｍ１２−３７７３）は、ＦＤＡ承認の組織マイクロアレイの染色に使用された。これらのアレイのそれぞれには、３０個のヒト組織（各組織は３人の異なるドナーから複製された）からのセクションが含まれ、通常は抗体スクリーニングに使用されるが、アプタマー評価にはまだ使用されていない。簡単に言えば、これらの組織マイクロアレイは、対照として無関係なアプタマーの選択されたｃｙ３標識ＲＮＡアプタマーで染色された。次に、各組織を免疫蛍光顕微鏡法によって分析した。ほとんどのアプタマーは、膵島だけでなく他の組織でも予想通りに結合を示すが（図５Ｃ）、アプタマー１−７１７（図５Ａ）およびアプタマーｍ１２−３７７３（図５Ｂ）は、膵島に対する並外れた特異性、および評価された他の組織（副腎、骨髄、乳房、脳、結腸、内皮、食道、ファロピウス管、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、胎盤、前立腺、皮膚、脊髄、脾臓、筋肉、胃、精巣、胸腺、甲状腺、尿管、子宮、および精巣）への結合はごくわずかであることを示す。
【００５２】
アプタマー１−７１７およびｍ１２−３７７２がヒト膵島だけでなくマウスの対応物も認識できるかどうかを評価するために、これら２つのＣｙ−３標識モノクローナルアプタマーによる染色を、それぞれ健康なマウスの１１組織を含む組織マイクロアレイで行った。これらの実験は、アプタマー１−７１７とアプタマーｍ１２−３７７３の両方がマウス膵島も認識できることを示している。図６を参照されたい。しかし、ヒト組織で観察されたものとは対照的に、両方のアプタマーは、膵臓組織だけでなく、脾臓、胃、および空腸も異なるレベルで認識することができる。これらのデータは、同族の標的の分布の違いが
２つの種の間に存在する可能性があることを示唆している。
【００５３】
膵島内のアプタマーの特異性をよりよく評価するために、共焦点顕微鏡法（図７Ａおよび図７Ｂ）とフローサイトメトリー（図７Ｃおよび図７Ｄ）の２つの異なる技術が採用された。共焦点顕微鏡検査では、ヒト膵臓の切片をｃｙ−３標識アプタマーＭ１２−３７７３（図７Ａ）またはｃｙ３標識アプタマー１−７１７（図７Ｂ）で染色した。切片をインシュリンとグルカゴンに対する抗体、およびＤＡＰＩで対比染色し、共焦点顕微鏡で評価した。データは、両方のアプタマーがアルファ細胞とベータ細胞の両方に結合していることを示すが、ベータ細胞ではシグナルが高くなっている。
【００５４】
フローサイトメトリーでは、ヒト膵島の単一細胞懸濁液をＣｙ３標識アプタマーＭ１２−３７７３（図７Ｃ）またはｃｙ３標識アプタマー１−７１７（図７Ｄ）で染色し、生体色素とインシュリンおよびグルカゴンに特異的な抗体で対比染色し、分析した。アプタマーシグナル（開いたヒストグラム）は、グルカゴン陽性細胞またはインシュリン陽性細胞（等高線）でそれぞれゲーティングした後、アルファ（上のヒストグラム）またはベータ細胞（右のヒストグラム）で定量化された。無関係なアプタマー（塗りつぶされたヒストグラム）をネガティブ対照として使用した。
【００５５】
クラスタリンは、アプタマーｍ１２−３７７３のターゲットとして可能性がある。３’ビオチン−アプタマーｍ１２−３７７３は、オリゴシンセサイザーで合成され、ヒト膵島からの単一細胞懸濁液を標識するために使用した。細胞を洗浄し、細胞質をｔｗｅｅｎ２０／ＢＳＡ溶液で溶解した。リガンドに結合したアプタマーは、磁気ビーズと磁気分離によって回収した。捕捉リガンドは、ＳＤＳで９５℃でアプタマービーズ複合体によって放出され、ＳＤＳページで実行した。バンドをカットし、質量分析とマスコットベースの分析を行った（図８Ａ）。クラスタリン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ１０９０９）（図９Ｂ）は、スコアが高い（２３６）タンパク質の１つであり、質量分析によって同定されたペプチドからカバーされた高い配列を持ち、ＳＤＳページから切り取ったバンドの１つと互換性のある分子量を有し、そしてより重要なことに、サイレンシングがベータ細胞に結合するアプタマーｍ１２−７３３７の能力であって、アプタマー１−７１７の能力ではない、を低下させた唯一のテストされたものであった（図８Ｃ）。
【００５６】
図９は、ＴＭＥＤ６がアプタマー１−７１７の推定標的であることを示している。図９Ａは、アプタマー１−７１７のターゲットを検出するための実験戦略を示している。アプタマー１−７１７の標的を特定するために、タンパク質アレイ（ＨｕＰｒｏｔ（商標）ｖ２．０、Ａｒｒａｙｉｔ）を使用した。これらのタンパク質アレイには、１９，０００を超えるヒト組換えタンパク質が含まれており、インフォマティクス分析により、抗体、ペプチド、またはタンパク質の同族タンパク質を特定できる。この技術は、アプタマーのリガンドの同定に適応されている。簡単に説明すると、事前にブロックされたアレイを、ブロッキングバッファー中でＲＴで３０分間、１−７１７またはｍ１２−３７７３と標識された１μｇのｃｙ３とハイブリダイズさせた。アレイを洗浄し、Ｇｅｎｅｐｉｘマイクロアレイリーダーで３回読み取り、アドホックで生成されたソフトウェアで分析した。このソフトウェアは、１）ｇｐｒファイルからデータを取得し、２）（遺伝子ＩＤ、対照、ブランク、ＮＤ）を使用して説明列を追加し、２）いくつかのポイントで変更された最適化された「ｐｌｏｔＡｒｒａｙ」関数を使用し（スクリプトは特定のタンパク質アレイに加えて、ＵＴＦファイル形式の問題）、３）ＭＡプロットの生成を再構築するマイクロアレイ画像を含む品質管理を実行し、４）データを正規化し、背景を減算し、および５）ｐ値分布のグラフ、火山プロット、およびｔ検定による有意な変調の分析を介して、アレイ間の微分式を分析する。この分析は、ＴＭＥＤ６（ＮＭ１４４６７６．１、タンパク質ＩＤ
Ｑ８ＷＷ６２）をアプタマー１−７１７の最も可能性の高いリガンドとして提案した。図９Ｂを参照。競合アッセイ（図９Ｃ）は、このターゲットの特異性を確認する。図９Ｃ
に示すように、競合アッセイにより、ＴＭＥＤ６に対するアプタマー１−７１７の特異性が確認される。簡単に説明すると、ヒト膵臓の連続切片を、異なる濃度の組換えＴＭＥＤ６タンパク質の存在下でＣｙ−３標識アプタマー１−７１７で染色した（すなわち、モル比アプタマー／組換えタンパク質範囲＝１／１−１／１０）。画像は蛍光顕微鏡によって取得され、アプタマー結合はセルプロファイラーによって定量化された。データは、組換えＴＭＥＤ６の添加が用量依存的にアプタマー１−７１７の結合を阻害することを示しており、ＴＭＥＤ６がこのアプタマーの標的であることを強く示唆している。
【００５７】
実施例２−同定されたアプタマーは、インビボで膵島特異的であった。
アプタマー１−７１７およびｍ１２−３７７３がインビボでヒト膵島を認識できるかどうかを評価するために、エピジダイマル脂肪パッドにヒト膵島を移植した免疫不全ＮＳＧマウスを使用した。さらに、アプタマー１−７１７およびアプタマーｍ１２−３７７３の新しい製剤を使用する。この製剤では、各モノクローナルアプタマーがビオチン化され、ストレプトアビジンと複合体を形成して、四量体ナノ粒子（以下、テトラプタマーと呼ぶ）を形成する。この製剤は、対応する単量体アプタマーよりも優れた薬物動態と親和性を持っている。
【００５８】
ビオチン／ストレプトアビジンＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ（ＡＦ７５０）標識アプタマー（アプタマー１−７１７またはアプタマーｍ１２−３７７３、または２つのアプタマーの等モル混合物）を免疫不全ＮＳＧマウス（上顎脂肪パッド（ＥＦＰ）にヒト膵島を移植）に静脈内注射した。）ｍ１２−３７７３および１−７１７がインビボでヒト膵島を認識できるかどうかを評価する。おそらく異なる膵島エピトープが各アプタマーによって標的化されたために、両方のアプタマーの混合物が使用された場合、累積的な相乗的シグナルがＥＦＰ領域で観察された（図１０Ａ）。４時間後、精巣上体脂肪パッド領域の蛍光シグナルを「インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）」で測定した。図１０Ｂのデータは、アプタマー１−７１７とアプタマーｍ１２−３７７３の両方がインビボで膵島を認識できることを示している。さらに、この実験は、２つのアプタマーの等モル混合物の使用が信号対バックグラウンド比を大幅に増加させることを明らかにしている。
【００５９】
アプタマーｍ１２−３７７３および１−７１７を使用してインビボでβ細胞の質量を測定できるかどうかを判断するために、免疫不全ＮＳＧマウスに、精巣上体脂肪パッドにさまざまな量（６２．５〜５００ＩＥＱの範囲）のヒト膵島を移植した。２１日後、アプタマー１−７１７とｍ１２−３７７３の等モル混合物のストレプトアビジンへの複合体形成によって生成されたＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ７５０テトラプタマーをマウスに静脈内注射した。４時間後、信号はＩＶＩＳによって定量化した。図１１Ａを参照。アプタマーｍ１２−３７７３および１−７１７は、ＥＦＰに移植されたマウス内因性膵島とヒト膵島の両方を認識した（図１１Ｂ）。重要なことに、ＥＦＰ領域の蛍光シグナルは、移植された膵島の数に比例し、これらのアプタマーを使用してインビボでβ細胞の質量を測定できることを示している（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。膵島からの信号は、注射後１０日間持続した（図示せず）。図１１Ｄに示すように、同種異系Ｃ５７Ｂｌ６膵島移植片の拒絶反応は、左側腹部の信号の喪失からわかるように、時間の経過とともに測定できる。代わりに、同系移植片の信号（図１１Ｄの右パネル）は、移植片の生存を示す時間の経過とともに維持される。
【００６０】
要約すると、選択されたアプタマーｍ１２−３７７３および１−７１７は、インビトロおよびインビボで良好な特異性でマウスおよびヒトβ細胞に結合するため、インビボでヒトβ細胞を標的とする治療に有用である可能性がある。
【００６１】
実施例３−アプタマーキメラは治療用ＲＮＡを膵島に送達することができる
図１２に示すように、膵島特異的ＲＮＡアプタマー１−７１７およびｍ１２−３７７３
は、３’末端をトリヌクレオチドリンカー領域（すなわちＧＧＧ）および望ましい治療用ＲＮＡのパッセンジャー鎖（パッセンジャーテール）で延長することにより、治療用ＲＮＡに容易に結合できる。次に、治療用ＲＮＡガイド鎖を７０℃で等モル量の２つのＲＮＡを混合し、混合物を室温でゆっくりと冷却することにより、修飾アプタマーに単純にアニーリングする。
【００６２】
アプタマーがβ細胞をトランスフェクトするための非ウイルス代替物になり得るかどうかを評価するために、非解離マウス膵島におけるアプタマー送達インシュリン（ＩＮＳ）１および２を介したノックダウンを目的とした原理実証実験を実施した。図１３Ａは実験手順の概略図である。膵島特異的アプタマーキメラは、図１２に示すように、アプタマー１−７１７またはアプタマーｍ１２−３７７３を、マウスインシュリン１／２（ＩＮＳ１／２）または細胞増殖阻害剤ヒトｐ５７ｋｉｐ２（ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ４９９１８、エイリアスＣＤＮ１ｃ）に特異的なｓｉＲＮＡと結合させることによって生成された。ＩＮＳ１／２−ｓｉＲＮＡ／アプタマーキメラは解離していないマウス膵島に加えられたが、ｐ５７ｋｉｐ２−ｓｉＲＮＡ／アプタマーキメラは死体ドナーからのヒト膵島に加えられた。スクランブルｓｉＲＮＡ／アプタマーキメラをネガティブ対照として使用した。７２時間後、ＩＮＳ１／２とｐ５７ｋｉｐ２の発現は、トランスフェクトされたマウス膵島とトランスフェクトされたヒト膵島でそれぞれｑＲＴ−ＰＣＲによって定量化された。図１３Ｂに示すように、アプタマーキメラは標的遺伝子の発現を有意にダウンレギュレートする。
【００６３】
図１４に示すように、ｐ５７ｋｉｐ２−ｓｉＲＮＡ島特異的アプタマーキメラはインビボでヒトベータ細胞の増殖を誘導する。図１４Ａは、実験手順を示す。ストレプトゾトシンで処理された免疫不全ＮＳＧマウスに、前房に最適以下の量（２５０ＩＥＱ）のヒト膵島を移植した。インシュリンペレットの皮下移植により、マウスを正常血糖に維持した。２１日後、膵島が血管新生されたとき、インシュリンペレットを除去して高血糖を発症させ、マウスにＢｒｄＵを７日間与えて細胞増殖を評価し、ｉ）スクランブル−ｓｉＲＮＡ／アプタマーキメラ、またはｉｉ）ｐ５７ｋｉｐ２−ｓｉＲＮＡ／アプタマーキメラで処理した。治療の９日後、マウスを人道的に安楽死させ、インシュリン、グルカゴン、およびＢｒＤＵ（白）に対する抗体で移植片切片を標識した後、ベータおよびアルファ細胞の増殖を免疫蛍光顕微鏡で評価した。図１４Ｂは、対照キメラまたはｐ５７ｋｉｐ２−ｓｉＲＮＡ／アプタマーキメラで処理されたマウスからの移植片の免疫蛍光写真を提供する。グルカゴンおよびインシュリン染色は疑似色として濃い灰色で示され、細胞増殖の尺度としてのＢｒｄＵ染色は疑似色として白で示されている。図１４Ｃは、増殖しているベータ細胞とアルファ細胞の定量化を示している。これらのデータを総合すると、ｐ５７ｋｉｐ２−ｓｉＲＮＡ／アプタマーキメラは、Ｔ１およびＴ２糖尿病を模倣する高血糖状態でインビボのヒトベータ細胞増殖を誘導できることが示されている。
【００６４】
β細胞におけるＰ５７ｋｉｐ２サイレンシングは、重要な治療上の意味を持っている。実際、ｐ５７Ｋｉｐ２の変異は、β細胞の劇的な非腫瘍性クローン増殖（１４）、インシュリンの過剰産生、および重度の制御不能な低血糖（８９，９０）を特徴とする臨床症候群である乳児期の限局性高インシュリン症（ＦＨＩ）に関連している。ＦＨＩの限局性病変は、ｐ５７ｋｉｐ２の喪失と相関する過剰なβ細胞増殖を特徴としている（９１，９２）。ｐ５７ｋｉｐ２サイレンシングの増殖促進活性は、ＦＨＩおよび癌では望ましくないが、一時的に定義されたサイレンシングは、Ｔ１Ｄにおける成人のβ細胞増殖を促進するのに役立つ可能性がある。実際、死亡した成人臓器提供者から得られたヒト膵島におけるアデノウイルスｓｈＲＮＡを介したｐ５７ｋｉｐ２のサイレンシングは、膵島が高血糖の免疫不全マウスに移植されると、β細胞複製を３倍以上増加させた（１４）。新たに複製された細胞は、インシュリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１１４の発現など、成熟β細胞の特性を保持していた。興味深いことに、正常血糖マウスではβ細胞の増殖は観察されなかっ
た。これは、高血糖が追加の増殖シグナルを提供する可能性があることを示している（９３）。これらの発見は、Ｔ１Ｄ患者の適切なβ細胞量を回復するため、および／または移植中に必要な膵島の数を減らすための新しい治療的介入の可能性を開いた。しかし、これまでのところ、これらの所見の翻訳可能性は、安定したｐ５７Ｋｉｐ２サイレンシングの結果としてのウイルスベクターの使用および新生物形成に関連する安全性の懸念によって妨げられていた。実際、ｐ５７Ｋｉｐ２はヒトの癌で頻繁にダウンレギュレートされ（９４）、その異所性発現が腫瘍性細胞の増殖を停止させるのに十分であるため、腫瘍抑制遺伝子として提案されている（９４）。しかし、アプタマー送達を介したｐ５７ｋｉｐ２の時間的に制御された調節は、時間的に制御された方法でβ細胞増殖を増加させるために糖尿病において重要である可能性がある。これは、安定したサイレンシングをもたらす可能性のある、制御不能な腫瘍性のようなβ細胞の増殖に関する安全性の懸念を回避しながら、時限投与中にβ細胞量を増加させるのに十分である可能性がある。
【００６５】
実施例４−ｓａＲＮＡ−アプタマーキメラを介したＸＩＡＰのアップレギュレーションは、β細胞のアポトーシスを阻害する。
アポトーシス細胞死は、あらゆる形態の糖尿病におけるインシュリン産生β細胞の喪失の特徴である（９９〜１０１）。白血球の浸潤と活性化、および膵島内の高血糖は、炎症性サイトカイン、ケモカイン、活性酸素種などのアポトーシストリガーの局所濃度を高くする（９９）。これらのアポトーシス経路のほとんどは、カスパーゼ（ＣＡＳＰ）３および７の活性化に収束し、遺伝子の再プログラミング、ホスファチジルセリンの反転、およびアポトーシス小体の形成をもたらす（１０２）。
【００６６】
β細胞のアポトーシスは、自己抗原提示と自己反応性Ｔ細胞の活性化を刺激することにより、自己免疫プロセスをさらに促進することができる（１０３）。同様に、膵島移植の設定では、一次機能不全、すなわち、移植後早期に発生する、移植された膵島塊の部分的ではあるが有意な、時には完全な喪失（１０４〜１０６）。β細胞のアポトーシスは、単離手順中に開始され、移植時に、低酸素症および高血糖症、ならびに凝固促進性および炎症性カスケードによって悪化する（１０７）。一次機能不全は、移植後の最初の４８時間に発生する機能性膵島の質量損失の５０％以上を占める（１０６）。
【００６７】
したがって、一時的なアポトーシスβ細胞死でさえも遮断することは、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）および膵島移植においてβ細胞量を維持するだけでなく、自己反応性Ｔ細胞活性化およびさらなる免疫損傷を低減するためにも非常に望ましい。
【００６８】
このタンパク質はアポトーシス阻害剤ファミリーの最も強力なメンバーであり、ＣＡＳＰ  ３、７、および９の活性化を防ぎ（１０８）、ｉｉ）ウイルスベクターを使用したＸｉａｐの過剰発現は、β細胞の生存率を改善し、サイトカインまたは低酸素誘導アポトーシスを防止し（１０９〜１１１）、ｉｉｉ）Ｘｉａｐを形質導入したヒト膵島は、糖尿病ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植すると正常血糖を延長した（１１）。ただし、Ｘｉａｐは多くの癌でアップレギュレートされているため、その安定した過剰発現は重要な安全上の懸念を引き起こす。したがって、膵島特異的アプタマーとともに送達されるｓａＲＮＡを介した制御されたＸｉａｐ活性化は、一次機能不全を減らし、β細胞の喪失およびＴ１Ｄにおける自己免疫プロセスを防ぐための有用な代替手段となり得る。
【００６９】
小さな活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）は、特定のプロモーター領域で作用を発揮し、ｍＲＮＡとタンパク質の発現を最大４週間アップレギュレートするオリゴヌクレオチドである（細胞複製、ｍＲＮＡ、タンパク質の代謝回転に応じて）（１１２〜１２２）。メカニズムを介したｓａＲＮＡを介した遺伝子のアップレギュレーションはまだ完全には理解されていないが、エピジェネティックな変化または抑制性ＲＮＡのダウンモジュレーションを伴うと考えられている（１２３〜１２５）。ｓａＲＮＡは、その特異性がＣＲＩＳＰ／Ｃ
ＡＳ９システムのｇＲＮＡに匹敵するため、ＤＮＡエレメントを挿入せずに安全で特異的かつ一時的な遺伝子活性化を提供するが、不可逆的なＤＮＡ修飾は誘導されない１２６。治療用ｓａＲＮＡは癌治療のために調査されているが、私たちの知る限り、Ｔ１Ｄでの研究は行われていない（１２７〜１３０）。
【００７０】
したがって、抗アポトーシス遺伝子ＸＩＡＰを特異的にアップレギュレートできるｓａＲＮＡを特定した。簡単に説明すると、最初に、前述のアルゴリズム（１１２，１３１）を使用してヒトＸＩＡＰプロモーターを調べた。非特異的配列を回避するためのゲノムブラスト分析を含むこの分析は、１５６を超える推定ｓａＲＮＡ標的領域を返した。最高スコアの９６個の推定ｓａＲＮＡを合成し、ヒト上皮細胞株Ａ５４９をトランスフェクトすることによってＸｉａｐをアップレギュレートする能力についてテストした。この細胞株は、トランスフェクションが容易で、ＰＤＬ１とＸｉａｐの基礎発現が低いために使用された。ｑＲＴ−ＰＣＲはトランスフェクションの９６時間後に実行され、結果はスクランブルｓａＲＮＡでトランスフェクトされた同じ細胞株で正規化された（図１５）。１２個のｓａＲＮＡ（表５に記載）は、スクランブルされたｓａＲＮＡよりも１０倍以上（範囲１０．４〜７４．８）Ｘｉａｐ発現をアップレギュレートすることがわかった。
【００７１】
【表４】
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【００７２】
アプタマーによって送達されたＸｉａｐ−ｓａＲＮＡがβ細胞をアポトーシスから保護できるかどうかを決定するために、死体ドナーから単離されたヒト膵島を使用して、インビトロでの原理実証実験を行った。Ｘｉａｐ−ｓａＲＮＡアプタマーキメラは、同定されたＸｉａｐ  ｓａＲＮＡ（−４４９、表２）をアプタマーｍ１２−３７７３またはアプタマー１−７１７のいずれかに結合させることにより、図１２に記載されているように生成された。図１６Ａは実験手順を示す。疥癬ドナーからの新たに単離された、解離されていないヒト膵島（２００ＩＥＱ）は、培養物にＸｉａｐ／ｓａＲＮＡアプタマーキメラ（５ｕｇ）を加えることによってＸｉａｐ−ｓａＲＮＡでトランスフェクトされた。スクランブルｓａＲＮＡ／アプタマーキメラをネガティブ対照として使用した。４８時間後、ウェルの半分に炎症性サイトカイン（ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＩＬ１ｂ）を投与して、ベータ細胞のアポトーシスを誘導した。ベータ細胞死は、インシュリンとグルカゴンの染色後のベータ／アルファ細胞比を測定することにより、サイトカインチャレンジの２４時間後にフローサイトメトリーによって評価した。図１６Ｂは、スクランブルされたｓａＲＮＡキメ
ラ（ＣＴＲＬキメラ）またはＸＩＡＰ−ｓａＲＮＡ／アプタマーキメラ（Ｘｉａｐキメラ）で処理され、後でサイトカイン（ＣＴＫ）でチャレンジされた、または未処理（ＣＴＫなし）のままにされた膵島の単一細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析を示す。図１６Ｃは、アプタマーｍ１２−３７７３またはアプタマー１−７１７のいずれかで生成されたキメラを使用した、異なる死体ドナーからの膵島を使用した５つの独立した実験からのスパゲッティプロットである。対応のあるＴ検定値が報告される。データは、Ｘｉａｐ−ｓａＲＮＡアプタマーキメラがベータ細胞をサイトカイン誘導アポトーシスから保護することを示す。
【００７３】
興味深いことに、サイトカインの非存在下での未処理の膵島は、ＣＴＲＬ−キメラの存在下（図１６Ｂ）およびキメラの非存在下（データは示さず）でα細胞（β／α細胞比＝０．８）でより高い割合を示し、β膵島の単離中、細胞の生存率はα細胞よりも影響を受ける可能性がある。サイトカインの添加により、β細胞の割合がさらに減少した（β／α細胞比約０．５）。特に、Ｘｉａｐ−ｓａＲＮＡ／キメラとのインキュベーションは、ＣＴＫによるβ細胞の減少（β／α細胞比約１．６）を防ぐだけでなく、膵島の単離に関連するβ細胞の喪失も防いだ。これらのデータは、ｓａＲＮＡキメラを使用してヒト膵島におけるＸｉａｐ発現を調節できることを示す。
【００７４】
実施例５−一次機能不全を防ぐためのＸｉａｐ−ｓａＲＮＡ／アプタマーキメラの使用
死体ドナーからのヒト膵島は、図１７Ａに詳述されているようにＸｉａｐ−ｓａＲＮＡアプタマーキメラまたは対照キメラでトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後、膵島は免疫不全ＮＳＧマウスの前眼房に移植された。膵島細胞のアポトーシスは、インビボアネキシンＶ（ＡＮＸＡ５）染色およびインビボ顕微鏡検査によって縦方向に評価された。データは、移植前のＸｉａｐ−ｓａＲＮＡ／アプタマーキメラによる治療がアポトーシス（ＡＮＸＡ５）を劇的に減少させ、したがって移植片の細胞喪失を減少させることを示している。
【００７５】
図１７Ｂに、移植片保存用のＸｉａｐ−ｓａＲＮＡ／アプタマーキメラの概略図を示す。図１７Ｃに示すように、ヒト膵島は、４８時間、２４時間にキメラが添加された培地で培養され、移植の日に、ストレプトゾトシン糖尿病ＮＯＧマウスの左腎臓被膜にマウスあたり６００ＩＥＱが移植された。データは、アプタマーキメラによるヒト膵島の前処理が膵島移植の有効性を大幅に改善し、マウスの約８０％が２日目までに正常血糖になることを示した。対照的に、膵島を移植された５０％ｏｄマウス（Ｐ＝０．０２；ｎキメラ処理＝１０；ｎ未処理＝８）のみが糖尿病を逆転させ、動態が遅れた。
【００７６】
実施例６−ＰＤＬ１−ｓａＲＮＡ／アプタマーキメラを介してヒト化マウスの同種免疫および自己免疫から膵島を保護する
組織特異的耐性の維持におけるＰＤＬ１発現の臨床的重要性は、癌におけるＰＤＬ１−ＰＤ１アンタゴニストの成功によって強調されている（１３５）。ＰＤＬ１によるＰＤ１の関与は、エフェクターＴ細胞の増殖と活性化をダウンレギュレートし、Ｔ細胞周期の停止とアポトーシスを誘導し、ＩＬ１０産生Ｔｒｅｇを促進する（１３６〜１３９）。興味深いことに、新たな副作用の抗ＰＤ１治療の１つはＴ１Ｄ１４０である。これは、ＰＤＬ１／ＰＤ１がβ細胞に対するＴ細胞の耐性を制御する上で重要な役割を果たしている可能性があることを示唆している。実際、ＮＯＤマウスでは、ＰＤＬ１遮断が雌マウスのＴ１Ｄを加速し、雄でそれを誘発する（１３）。逆に、同系移植された膵島におけるＰＤＬ１異所性発現は、ＮＯＤマウスをＴ１Ｄ再発から保護する（１２，１３）。インシュリンプロモーターの制御下でＰＤＬ１を発現するＮＯＤトランスジェニックマウスは、糖尿病の発生率の遅延、Ｔ１Ｄ発生率の低下、および全身性の膵島特異的Ｔ細胞アネルギーを示す（１４１）。ヒトでは、ＰＤＬ１多型はＴ１Ｄと関連する（ＯＲ＝１．４４）（１４２）。
【００７７】
ＰＤＬ１の発現がβ細胞に対するＴ細胞の反応性を制御する上で重要であるため、我々はＰＤＬ１に特異的なｓａＲＮＡを特定した（図１８）。簡単に説明すると、ＰＤＬ１の小さな活性化ＲＮＡの推定候補配列は、公的に利用可能なアルゴリズムを使用してＰＤＬ１プロモーターをスキャンすることによって特定された。この分析では、２００個を超える推定ターゲットｓａＲＮＡターゲット領域が返される。より高いスコアを持つ９５個の推定ｓａＲＮＡを合成し、ヒト上皮細胞株Ａ５４９をトランスフェクトすることによってＰＤＬ１をアップレギュレートする能力についてテストした。ｑＲＴ−ＰＣＲはトランスフェクションの９６時間後に実行され、結果はスクランブルｓａＲＮＡでトランスフェクトされた同じ細胞株で正規化された。１９個のｓａＲＮＡは、スクランブルされたｓａＲＮＡよりも３倍以上（範囲３．０１〜６３．２７）Ｘｉａｐ発現をアップレギュレートできることがわかった（表６）。
【００７８】
【表５】
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【００７９】
次に、本明細書に記載の膵島特異的アプタマーが、ＰＤＬ１−ｓａＲＮＡをヒト膵島に効果的に送達し、ＰＤＬ１発現をアップレギュレートできるかどうかを試験した。アプタマー−ＰＤＬ１−ｓａＲＮＡキメラは、図１２に示すように、アプタマー１−７１７をＰＤＬ１−ｓａＲＮＡ−６３６（表６）に結合させることによって生成された。図１９Ａに示すように、これらのＰＤＬ１−ｓａＲＮＡ／アプタマーキメラは、死体ドナーからの解離していないヒト膵島に添加された。４８時間後、膵島を解離させ、抗インシュリン、抗グルカゴン、および抗ＰＤＬ１抗体で標識し、フローサイトメトリーで分析した（図１９Ｂ）。ＰＤＬ１の発現は、インシュリン陽性ベータ細胞またはグルカゴン陽性アルファ細胞をゲーティングすることによって評価された。対照キメラによる治療はＰＤＬ１発現を変更しないが、ＰＤＬ１−ｓａＲＮＡ／アプタマーによる治療は、ベータ細胞上のこの重要な免疫調節タンパク質の発現を有意にアップレギュレートする（図１９Ｂ）。興味深い
ことに、アルファ細胞では変化は観察されず、このアプタマーのベータ細胞への優先的結合が間接的に確認された。これらの原理実証データは、アプタマーを効果的に使用して、機能的なＰＤＬ１−ｓａＲＮＡをインビトロでヒトβ細胞に送達できることを示している。
【００８０】
次に、インビボでＰＤＬ１をアップレギュレートするＰＤＬ１−ｓａＲＮＡ／アプタマーキメラの能力を評価した。図２０Ａに示すように、免疫不全のＮＳＧマウスは、死体ドナーからのヒト膵島とともに前眼房に移植された。３週間後、図１２および図１９に示すように生成されたＰＤＬ１−ｓａＲＮＡ（６３６）／１−７１７−アプタマーキメラでマウスを治療した。スクランブル−ｓａＲＮＡ／アプタマーキメラを対照として使用した（ＣＴＲＬキメラ）。治療の５日後、膵島（濃い灰色）でのＰＤＬ１発現（白）は、抗ＰＤＬ１抗体によるインビボ標識とインビボ顕微鏡検査によって定量化された（図２０Ｂ）。ベースライン時、またはＰＤＬ１−ｓａＲＮＡ／アプタマーキメラまたはスクランブル−ｓａＲＮＡ／アプタマーキメラ図２０Ｃ）による治療の５日後の移植された膵島におけるＰＤＬ１発現の要約。
【００８１】
これらの結果は、ｉ）インビボでヒト膵島細胞でＰＤＬ１を検出することが可能であり、ｉｉ）我々のアプタマーキメラがインビボでヒト膵島をトランスフェクトし、およびｉｉｉ）アプタマーキメラを介してインビボでヒト膵島でＰＤＬ１をアップレギュレートすることが可能である、ことを示した。
【００８２】
実施例７−アプタマーを介したＸｉａｐアップレギュレーションによるアポトーシスからのβ細胞保護を評価する
最初の一連の実験では、ＮＳＧマウスにＡＣＥにヒト膵島を移植する。移植の３週間後、マウスはＸｉａｐｓａＲＮＡ−アプタマーキメラまたは対照キメラで治療される。さまざまな時点で、ＩＬ１β、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮγの眼内注射によってヒト膵島移植片にチャレンジし、カスパーゼ３および７の活性化を介してβ細胞にアポトーシスを誘導する。カスパーゼ３および７の活性は、ＣＡＳＰ３／７  Ｇｒｅｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用した眼内イメージングシステムによってインビボで評価される。この細胞透過性試薬は、核酸結合色素に結合した４個のアミノ酸ペプチド（ＤＥＶＤ）で構成されている。活性化されると、カスパーゼ３および７はプローブを切断し、色素をＤＮＡに結合させ、ＡＣＥ２８の細胞レベルで検出できる明るい蛍光発生シグナルを放出する。さらに、抗アネキシンＶ抗体によるインビボ染色を使用して、インビボで膵島細胞のアポトーシスを直接測定する（図７）。
【００８３】
実験の２番目のセットは、抗膵島同種免疫に対するＸｉａｐ変調の効果を評価することを目的としている。簡単に説明すると、ＳＴＺ糖尿病ＮＳＧマウスには、ＡＣＥまたはＥＦＰに５００ＩＥＱのヒト膵島が移植される。３週間後、マウスはＸｉａｐキメラまたはスクランブル対照で治療される。Ａｉｍ２ｂで決定されたように治療が繰り返される。最初の治療の１週間後、マウスは、膵島に対するＨＬＡが一致しないＣＦＳＥ標識ヒトＴ細胞を受け取る。治療を行わないと、同種異系Ｔ細胞の養子移入により、移植片が失われ、３週間以内に高血糖に戻る。したがって、ｉ）血糖、ｉｉ）ヒトｃ−ペプチド血漿レベル、およびＡＣＥ群では、ｉｉｉ）Ｔ細胞浸潤の長期評価（７７，７８）で示したように、移植された膵島の容量分析を読み出しとして使用して、ヒト膵島同種移植片の生存に対するＸｉａｐキメラ治療の保護効果を評価する。
【００８４】
個体間のＸｉａｐキメラ効果のデータ再現性を確保するために、ＥｎｄｏＣ−ＢＨ３細胞で同定されたキメラは、６人の死体ドナーからの初代ヒト膵島を使用してさらに検証される。これにより、片側の対応のあるｔ検定で対照との１．２５ＳＤの差を検出するための８８％のパワーが提供される。アーティファクトを回避するために、３つの異なる読み
出し方法（ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット、および酵素アッセイ）を使用し、３つの異なる死体ドナーからのヒト膵島を使用して各実験に対して少なくとも３つの独立した繰り返しを実行する。移植研究では、群あたり合計９匹のマウス（各繰り返しで３匹）を使用して、９０％のパワー（ＡＮＯＶＡ、α＝０．０５）を確保し、対照に対する１．６ＳＤの差を検出する。
【００８５】
実施例８−ｐ５７ｋｉｐ２のインビボサイレンシングのために用量を最適化する
最初の一連の実験では、ＥＦＰに５００ＩＥＱのヒト膵島を移植したＮＳＧマウスを、ｐ５７ｋｉｐ２ｓｉＲＮＡまたはネガティブ対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（対照キメラ）と結合した膵島特異的アプタマーの異なる用量（６、２０、および６０ｐｍｏｌｅｓ／ｇ）でｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．で処置する。ポジティブ対照と同じｐ５７ｋｉｐ２ｓｈＲＮＡトランスフェクト膵島をコードするアデノウイルスを使用する（１４）。事前定義された時点（例えば、投与後１、２、３、４、および５日目）で、移植片が採取され、ｐ５７ｋｉｐ２の発現がｉ）レーザーで捕捉された膵島でのｑＲＴ−ＰＣＲ、およびｉｉ）定量的コンピューター支援免疫蛍光分析によって定量化される（９５）。どちらの手法も、糖尿病研究所（９６，９７）とＰＩｓ９５の研究所で最適化されている。用量依存的な毒性の可能性を評価するために、血清および関心のある臓器（脾臓、肝臓、リンパ節、肺、腎臓、および脳）が収集され、組織病理学的評価のためにマイアミ大学のマウス病理学研究所に送られる。
【００８６】
実験の２番目のセットでは、ＮＳＧマウスにＡＣＥに５００ＩＥＱのヒト膵島を移植する。３週間後、マウスを静脈内注射するか、または眼内注射（ｉ．ｏ）により、ｐ５７ｋｉｐ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＦ６４７スクランブルｓｉＲＮＡ（対照キメラ）をネガティブ対照としてロードしたアプタマーキメラを異なる用量（６、２０、６０ｐｍ／ｇ）で処置する。ＡＦ６４７ｓｉＲＮＡのインビボトランスフェクション効率は、注射の２、３、４、８、および２４時間後に我々の眼内画像化システムで評価される（２８）。選択された時点（例えば、治療後２、３、４、および７日）で、移植片が除去され、ＡＣＥから外植された膵島でのｑＲＴ−ＰＣＲによって、およびｉ）レーザーキャプチャー膵島でのｑＲＴ−ＰＣＲおよびｉｉ）定量的コンピューター支援免疫蛍光顕微鏡分析によって、ｐ５７ｋｉｐ２発現が定量化される（９５）。
【００８７】
実施例９−アプタマーキメラ投与の処置期間と頻度を最適化する
最適な投与量と投与経路が特定され、ｐ５７ｋｉｐ２サイレンシングの動態が評価されたら、実質的な変化（すなわち、≧１００％増加）を誘発するために必要なｐ５７ｋｉｐ２ｓｉＲＮＡ−アプタマーキメラの投与回数を決定する。ｐ５７ｋｉｐ２サイレンシングは高血糖マウスでのみβ細胞増殖を誘導することが示されたため（１４）、辺縁下のヒト膵島塊（２５０ＩＥＱ）がＮＳＧマウスのＥＦＰまたはＡＣＥに移植される。移植の２１日後、マウスはストレプトゾトシン（ＳＴＺ）治療により高血糖になる。ヒトβ細胞はかなり耐性があるため、ＳＴＺはマウス膵島を選択的に排除する（９８）。マウスが高血糖になると（通常、治療後５〜６日）、マウスは膵島特異的または対照アプタマーキメラの１、２、３、または４回の投与を受ける。アプタマー投与の頻度は、実施例５で確立された時間経過に基づいて決定される。ＢｒｄＵは、エクスビボでの増殖測定のために飲料水中で投与される。ＥＰＦ群のβ細胞量は、ＩＶＩＳによって縦方向（ベースライン、治療中、最後の治療から５日後および１０日後）に評価される（図２）。ＡＣＥ群では、膵島の質量は、膵島の体積のインビボイメージングと定量分析によって評価される（２８）。最後の処理から１０日後、移植片を採取し、免疫染色によって分析して、（ｉ）ＢｒｄＵおよびＫｉ７６染色によるβ細胞増殖、および（ｉｉ）α細胞とβ細胞の比率を決定する。
【００８８】
実施例１０−アプタマーを介したサイレンシングが、辺縁下の膵島塊を移植された糖尿病
マウスの正常血糖を回復できるかどうかを判断する
この実施例の目的は、アプタマーを介したｐ５７ｋｉｐ２サイレンシングが、最適以下の数のヒト膵島を移植された糖尿病マウスにおいて正常血糖を回復できるかどうかを試験することである。
【００８９】
最初の一連の実験では、インシュリン療法（持続的なインシュリン放出のためのｓ．ｃペレットインプラント）で維持されたＳＴＺ糖尿病ＮＳＧマウスに、ＡＣＥにさまざまな量のヒト膵島（５０、１５０、３５０ＩＥＱ）を移植する。３週間後、インシュリンペレットを除去し、マウスをｐ５７ｋｉｐ２ｓｉＲＮＡ−アプタマーキメラまたはスクランブル対照で局所的または全身的に治療する。この治療法を膵島トランスフェクションの今日のゴールドスタンダードと比較するために、マウスの２つの追加群を、対照としてｐ５７ｋｉｐ２ｓｈＲＮＡまたはＲＦＰをコードするアデノウイルスベクターで局所的に処置する。アデノウイルスをコードするＲＦＰを使用したパイロット実験は、ＡＣＥで実行され、膵島の少なくとも９０％を形質導入するために必要な最小用量を決定する。形質導入効率は、我々のインビボイメージングシステムを使用して定量化される（２８）。実験群（５０、１５０、および３５０ＩＥＱを受け取った）では、ＡＣＥ膵島移植片の生体内イメージングおよび体積分析に加えて、血糖値が治療効果の読み取り値として使用される。異なる群のさまざまな辺縁下の膵島の質量も、ヒトの膵島増殖に対する高血糖の促進の程度を明らかにする可能性がある。
【００９０】
実験の２番目のセットでは、ＳＴＺ糖尿病マウスを、同じ辺縁下のヒト膵島塊（５０、１５０、３５０ＩＥＱ）でＥＦＰに移植し、生着期間中インシュリンを維持する。３週間後、インシュリンペレットを除去し、マウスをｐ５７ｋｉｐ２ｓｉＲＮＡ−アプタマーキメラまたはスクランブル対照で治療する。読み取り値として、ＩＶＩＳによって血糖値とβ細胞量を縦方向に監視する。
【００９１】
両方の実験セットで、ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）は、正常血糖が回復したマウスで実行され、ストレス条件下での膵島機能をさらに評価する。
【００９２】
結果の再現性を確保するために、３人の異なる死体ドナーからのヒト膵島を使用して、各実験に対して少なくとも３回の独立した繰り返しが実行される。実験群ごとに合計９匹のマウス（各反復で３匹）を使用すると、９０％のパワー（一元配置分散分析、α＝０．０５）が得られ、１．６ＳＤの効果サイズを検出して制御できる。群あたり１２匹のマウスを使用して、読み取り値の予想される変動が大きくなることを説明する。読み出し固有のアーティファクトを最小限に抑えるために、同じ現象が少なくとも２つの独立した方法で測定される。
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９  Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｅｎｄｏ．２０１６．１７８（２０１６）。
１０  Ｍｅｈｒｏｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＥＴ  ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ＩＥＴ  ９，３８６−３９５，ｄｏｉ：１０．１０４９／ｉｅｔ−ｎｂｔ．２０１５．００１８（２０１５）。
１１  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ７，１６５５−１６６６，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ１０００７０ｊ（２０１０）。
１２  Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６４，５２９−５４０，ｄｏｉ：１０．２３３７／ｄｂ１３−１７３７（２０１５）。
１３  Ａｎｓａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８，６３−６９，ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２００２２１２５（２００３）。
１４  Ａｖｒａｈａｍｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２４，６７０−６７４，ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ６９５１９（２０１４）。
１５  Ｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ５，１２３−１３２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ１９５５（２００６）。
１６  Ａｌａｇｉａ，Ａ．＆Ｅｒｉｔｊａ，Ｒ．ｓｉＲＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡｉ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．Ｗｉｌｅｙ  ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ．ＲＮＡ，ｄｏｉ：１０．１００２／ｗｒｎａ．１３３７（２０１６）。
１７  Ａｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｉａ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｊａｐｏｎｉｃａ  １４７，３６２−３６７，ｄｏｉ：１０．１２５４／ｆｐｊ．１４７．３６２（２０１６）。
１８  Ｂａｎｄｅｌｌｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ２１，４７３１−４７３７（２０１５）。
１９  Ｃａｍｏｒａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５，１２６−１３７（２０１５）。
２０  Ｋａｎｗａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２，２５３９−２５５７（２０１５）。
２１  Ｌａｏ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  ｎａｎｏ  ９，２２３５−２２５４，（２０１５）。
２２  Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＢ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ４８，２３４−２３７（２０１５）。
２３  Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３５，２０８３−２０９１，（２０１５）。
２４  Ｙｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １７，３５８，（２０１６）。
２５  Ｖａｔｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８８，２１１３６−２１１４７，（２０１３）。
２６  Ｚｈｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ３５５，１８−２４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃａｎｌｅｔ．２０１４．０９．００４（２０１４）。
２７  Ｂｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６５，１３５０−１３６１，（２０１６）。
２８  Ａｂｄｕｌｒｅｄａ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８，１２８６３−１２８６８，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１１０５００２１０８（２０１１）。
２９  Ａｂｄｕｌｒｅｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ，ｅ５０４６６，（２０
１３）。
３０  Ｍｉｓｋａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２１１，４４１−４５６，（２０１４）。
３１  Ｈｕ，Ｐ．Ｐ．Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０７５３−０１６−０４３７−９（２０１６）。
３２  Ｐａｒａｓｈａｒ，Ａ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｒｅｓ  １０，Ｂｅ０１−０６，（２０１６）。
３３  Ｑｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ０００１８−０１６−２３４５−４（２０１６）。
３４  Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５２，１４１７−１４２０，（２０１６）。
３５  Ｔｈｉｅｌ，Ｗ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７，ｅ４３８３６，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４３８３６（２０１２）。
３６  Ｍａｇａｌｈａｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０，６１６−６２４，（２０１２）。
３７  Ｆａｒｏｋｈｚａｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４，７６６８−７６７２（２００４）。
３８  Ｃｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４，ｅ７３，（２００６）。
３９  ＭｃＮａｍａｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４，１００５−１０１５，（２００６）。
４０  Ｃａｒｏｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３２，１６１−１６４，（２０１６）。
４１  Ｕｌｒｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａ  ５９，２２０−２３１，（２００４）。
４２  Ｚｈｕ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）４８，１０４７２−１０４８０，（２０１２）。
４３  Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３，２３４，（２０１２）。４４  Ｂａｇａｌｋｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ４５，８１４９−８１５２（２００６）。
４５  Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  １０，８６２−８６８，（２００９）。
４６  Ｔａｇｈｄｉｓｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  １８，２７７−２８１，（２０１０）。
４７  Ｆａｒｏｋｈｚａｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ
Ｓ  Ａ  １０３，６３１５−６３２０，（２００６）。
４８  Ｄｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５，１７３５６−１７３６１，（２００８）。
４９  Ｇｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５，２５８６−２５９１，（２００８）。
５０  Ｃａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ４８，６４９４−６４９８，（２００９）。
５１  Ｋａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）４６，２４９−２５１，（２０１０）。
５２  Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ  ２，１２６８−１２７１，（２００７）。
５３  Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ８０，５６７−５７２，（２００８）。
５４  Ｊａｖｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １９，１３０９−
１３１２，（２００８）。
５５  Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）４６，３９２−３９４，（２０１０）。
５６  Ｇｕｏ，Ｐ．，Ｊ  Ｎａｎｏｓｃｉ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５，１９６４−１９８２（２００５）。
５７  Ｇｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １６，１０９７−１１０９，（２００５）。
５８  Ｗｕｌｌｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ８，５５４−５６５（２００８）。
５９  Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６，１４８１−１４８９，（２００８）。
６０  Ｄａｓｓｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２７，８３９−８４９，（２００９）。
６１  Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ９，１１４４−１１５７（２００９）。
６２  Ｐａｓｔｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６５，２２７−２３０，（２０１０）。
６３  Ｗｈｅｅｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２１，２４０１−２４１２，（２０１１）。
６４  Ｗｈｅｅｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２１，１３７８−１３８９，（２０１３）。
６５  Ｎｅｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３，６６ｒａ６６，（２０１１）。
６６  Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２１，１９２−２００，（２０１３）。
６７  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，（２０１５）。
６８  Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １２９７，１６９−１８５，（２０１５）。
６９  Ｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，１−８，（２０１５）。
７０  Ｇｉｌｂｏａ−Ｇｅｆｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １４，２２７９−２２９１，（２０１５）。
７１  Ｓｏｎｇ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４５２，１０４０−１０４５，（２０１４）。
７２  Ｌａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３５，２９０５−２９１４，（２０１４）。
７３  Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ３，ｅ２０９，（２０１４）。
７４  Ｈｅｒｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２４，２９７７−２９８７，（２０１４）。
７５  Ｂｒｕｎｏ，Ｊ．Ｇ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２０，６８６６−６８８７，（２０１５）。
７６  Ａｂｄｕｌｒｅｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ
Ｓ  Ａ，１０８，１２８６３−１２８６８，（２０１１）。
７７  Ｉｌｅｇｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ
Ａ，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３１３６９６１１０（２０１３）。
７８  Ａｌｍａｃａ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１４１４０５３１１１（２０１４）。
７９  Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９，２１２３４−２１２３８（１９９４）。
８０  Ｆｌｏｔｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０，５１５−５２０（２００１）。
８１  Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １９，９６８−９７５（２００２）。
８２  Ｌｏｉｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０，１５５１−１５５８，（２００３）。
８３  Ｂａｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３，２１９０−２１９４（２００４）。
８４  Ｈａｎａｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８，３１−３８，（２０１５）。
８５  Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ４，３４６−３５８，（２００３）。
８６  Ｂｏｔｔｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０，８７５−８８９，（２００３）。
８７  Ｇｉａｎｎｏｕｋａｋｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １２，５１２−５２８（２００５）。
８８  Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １５，４３６−４４６（２０１５）。
８９  Ｍｅｈｔａ，Ｎ．，Ｓｔｏｎｅ，Ｊ．＆Ｗｈｉｔｅｌａｗ，Ａ．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｉｓｍ  ｉｎ  ｉｎｆａｎｃｙ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ．Ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ８４，Ｆ２１８（２００１）。
９０  Ｍｅｎｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １０７，４７６−４７９（２００１）。
９１  ｄｅ  Ｌｏｎｌａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １００，８０２−８０７，（１９９７）。
９２  Ｋａｓｓｅｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０，２７６３−２７６９，（２００１）。
９３  ｄｉＩｏｒｉｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｎｃｒｅａｓ  ４０，１１４７−１１４９，（２０１１）。
９４  Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９，１２６９−１２８４，（２０１１）。
９５  Ｋａｓｓｅｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０，２７６３（２００１）。９６  Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １５０，１４９−１５９，（２０１７）。
９７  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５９，２４４８−２４５８，（２０１６）。
９８  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３，２４９１−２４９５，（２００２）。
９９  Ｍａｔｈｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１４，７９２−７９８，（２００１）。
１００  Ｂｕｔｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５０，２３２３−２３３１，（２００７）。
１０１  Ｍｅｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４８，２２２１−２２２８，（２００５）。
１０２  Ｈｕｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２００，１７７−２００，（２００４）。
１０３  Ｔｕｒｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９８，１５２７−１５３７，（２００３）。
１０４  Ｖｉｓｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ  ２２，８０８−
８０９（１９９０）。
１０５  Ｄｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ  ２９，２０６２−２０６３（１９９７）。
１０６  Ｈｕｇｈｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ６，２７４−２８４（２０１０）。
１０７  Ｂｅｌｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  ２６１，２１−２９，（２０１５）。
１０８  Ｌａｚａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ／ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８，４７５−４８４，（２０１２）。
１０９  Ｅｍａｍａｕｌｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ５，１２９７−１３０５，（２００５）。
１１０  Ｐｌｅｓｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４，２５３３−２５４０（２００５）。
１１１  Ｅｍａｍａｕｌｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４，２５４１−２５４８（２００５）。
１１２  Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３，１７３３７−１７３４２，（２００６）。
１１３  Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５，ｅ８８４８，（２０１０）。
１１４  Ｊａｎｏｗｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３，１６６−１７３，（２００７）。
１１５  Ｋｏｓａｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２２，３３５−３４３，（２０１２）。
１１６  Ｐａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５２７，１０２−１０８，（２０１３）。
１１７  Ｓａｋｕｒａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２１，１６４−１７０，（２０１４）。
１１８  Ｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ７３，１５９１−１６０１，（２０１３）。
１１９  Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  １３，７７２−７８１，（２０１４）。
１２０  Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０，１０１８２−１０１９１，（２０１０）。
１２１  Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４４３，８２１−８２８，（２０１２）。
１２２  Ｑｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｕｒｇｉｃａｌ
ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １０，１１，（２０１２）。
１２３  Ｍｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４，２２７４−２２８２，（２０１６）。
１２４  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １５，８４２−８４８，（２００８）。
１２５  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３５，７３０３−７３１２，（２００７）。
１２６  Ｇｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １１，１２２１−１２２５，（２０１４）。
１２７  Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｅｘｕａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８，２７７３−２７８０，（２０１１）。
１２８  Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ７，６９８−７０３，（２００８）。
１２９  Ｄｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｙｏｎｓｅｉ  Ｍｅｄ  Ｊ  ５５，３２４−３３０，（２０１４）。
１３０  Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４５，１３３８−１３４６，（２０１３）。
１３１  Ｃｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８，７７３６−７７４８，（２０１０）。
１３２  Ｂｅｎａｚｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ４，９１６−９２５，（２０１５）。
１３３  Ｗｅｉｒｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２１，３３９５−３３９７，（２０１１）。
１３４  Ｂｒｅｈｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２，ａ００７７５７，（２０１２）。
１３５  Ｈｕｇｈｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７，４６２−４７６，（２０１６）。
１３６  Ｐａｒｄｏｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ４２，５２３−５３８，（２０１５）。
１３７  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２３６，２１９−２４２，（２０１０）。
１３８  Ｋｅｉｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９，５０６４−５０７０（２００７）。
１３９  Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１，６９２９−６９３５（２００３）。
１４０  Ｈｕｇｈｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ３８，ｅ５５−５７，（２０１５）。
１４１  Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５７，１８６１−１８６９，（２００８）。
１４２  Ｐｉｚａｒｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ／ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ３０，７６１−７６６，（２０１４）。
１４３  Ｇｏｌｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １０３，３３５−３４２（１９９８）。
１４４  Ｍａｚｕｒｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ  １９，５３３−５４１（１９９９）。
１４５  Ｉｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １００，３１７５−３１８２（２００２）。
１４６  Ｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０６，１５６５−１５７３（２００５）。
１４７  Ｂｅｒｇｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３７３，３４２−３５１（２００８）。
１４８  Ｂｒａｉｎａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ  ８３，７３０５−７３２１（２００９）。
１４９  Ｂｒｅｈｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３５，８４−９８。１５０  Ｇｏｒａｎｔｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８４，７０８２−７０９１。
１５１  Ｇｏｒａｎｔｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９，２１２４−２１３２（２００５）。
１５２  Ｊｏｓｅｐｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８４，６６４５−６６５３。
１５３  Ｋｕｍａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３４，５７７−５８６（２００８）。１５４  Ｌｅｐｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７０，７９０−８０２，（２００９）。
１５５  Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８，８０３−８１１。
１５６  Ｎａｋａｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９，２０８７−２０９６（２
００５）。
１５７  Ｒａｊｅｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７１，５５１−５５９。
１５８  Ｓａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８  Ｓｕｐｐｌ  ２，Ｂ３２−３７。
１５９  Ｗａｔａｎａｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０９，２１２−２１８（２００７）。
１６０  Ａｋｋｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，ｅ２０１６９，（２０１１）。
１６１  Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ５７，３２６−３３４，（２０１３）。
１６２  Ｓｈｕｌｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４，６４７７−６４８９（２００５）。
１６３  Ｇｉａｎｎｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｂ  Ｃｌｉｎ  Ｃｙｔｏｍ  ７４，３４９−３５５（２００８）。
１６４  Ｓｈａｐｉｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４５，２２４−２３０，（２００２）。
１６５  Ｂｏｒｒｅｌｌｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１４，１７３６（２００９）。
１６６  Ｓｅｒａｆｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４，６３３７−６３４３，（２００４）。
１６７  Ｓｔｒｂｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５９，４０７−４１６，（２００８）。
１６８  Ａｒｍｉｔａｇｅ  Ｐ，Ｂ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｍａｔｔｈｅｗｓ  Ｊ  Ｎ．．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２００１）。
１６９  Ｂｒｏｗｎ  Ｈ，Ｐ．，Ｒ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｘｅｄ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．（Ｗｉｌｅｙ，１９９９）。
１７０  Ｈｏｓｍｅｒ  ＤＷ，Ｌ．Ｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｌｏｇｉｓｔｉｃ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｗｉｌｅｙ，２０００）。
１７１  Ｍａｃｈｉｎ  Ｄ，Ｃ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｐａｒｍａｒ  ＭＫＢ．．Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ，２００６）。
【図１】
2021523166.tif 000026
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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