(57)【要約】  本発明は、下痢症の予防および治療での使用のための多価赤痢菌／腸内原性大腸菌ワクチンに関する。赤痢菌−ＥＴＥＣワクチンは、先行のワクチンよりも広範囲のＥＴＥＣおよび赤痢菌分離株に対するカバー率の増加を提供し、ＣＳ１４抗原および血清型（フレクスナー赤痢菌７ａまたはフレクスナー赤痢菌１ｂ）を含む。【選択図】図１
2021519789.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下痢症の予防のためのワクチン組成物であって、
ａ．フレクスナー赤痢菌血清型７ａ、フレクスナー赤痢菌血清型１ｂ、およびフレクスナー赤痢菌血清型７ａとフレクスナー赤痢菌血清型１ｂの両方からなる群から選択される生弱毒化赤痢菌株；
ｂ．腸内原性大腸菌（ＥＴＥＣ）表面抗原ＣＳ１４
を含み、
前記ＥＴＥＣ  ＣＳ１４が、前記生弱毒化赤痢菌株の１つまたは両方において発現される、
ワクチン組成物。
【請求項２】
ｃ．ソンネ赤痢菌の生弱毒化株；
ｄ．フレクスナー赤痢菌血清型２ａの生弱毒化株；
ｅ．フレクスナー赤痢菌血清型３ａの生弱毒化株；および
ｆ．フレクスナー赤痢菌血清型６の生弱毒化株；
の１つまたは複数をさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
ｃ．ソンネ赤痢菌の生弱毒化株；
ｄ．フレクスナー赤痢菌血清型２ａの生弱毒化株；
ｅ．フレクスナー赤痢菌血清型３ａの生弱毒化株；および
ｆ．フレクスナー赤痢菌血清型６の生弱毒化株； 
をさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
志賀赤痢菌の弱毒化株をさらに含む、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
志賀赤痢菌の弱毒化株をさらに含む、請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
生弱毒化フレクスナー赤痢菌株の１つまたは複数が、１つまたは複数の腸内原性大腸菌（ＥＴＥＣ）抗原を発現するように操作される、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
生弱毒化フレクスナー赤痢菌株の１つまたは複数が、１つまたは複数の腸内原性大腸菌（ＥＴＥＣ）抗原を発現するように操作される、請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
ＥＴＥＣ抗原が、大腸菌表面抗原（ＣＳ）１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５、ＣＳ６、ＣＳ１４、定着因子抗原１（ＣＦＡ／１）、ｅｌｔＢ（ＬＴＢ）、先端アドヘシン、および志賀毒素Ｂ（ＳｔｘＢ）からなる群から選択される、請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
赤痢菌株が、ｇｕａＢＡおよびｓｅｎに変異を含有する、請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
ａ．ＥＴＥＣ抗原ＣＳ２およびＣＳ３を発現する、生弱毒化ソンネ赤痢菌、株ＣＶＤ１２３３Ｓ；
ｂ．ＥＴＥＣ抗原ＣＦＡ／１およびＬＴＢを発現する、生弱毒化フレクスナー赤痢菌血清型２ａ、株ＣＶＤ１２０８Ｓ；
ｃ．ＥＴＥＣ抗原ＣＳ１およびＣＳ５を発現する、生弱毒化フレクスナー赤痢菌血清型３ａ、株ＣＶＤ１２１３；
ｄ．ＥＴＥＣ抗原ＣＳ４およびＣＳ６を発現する、生弱毒化フレクスナー赤痢菌血清型６、株ＣＶＤ１２１５；
ｅ．ＥＴＥＣ抗原ＣＳ１４を発現する、生弱毒化フレクスナー赤痢菌血清型１ｂ、株ＣＶＤ１２２４；ならびに
ｆ．１つまたは複数のＥＴＥＣ先端アドヘシン抗原を発現する、生弱毒化フレクスナー赤痢菌血清型７ａ、株ＣＶＤ１２４２；
を含む、請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
ＥＴＥＣ抗原ＣＦＡ／１およびＬＴＢを発現する、生弱毒化志賀赤痢菌、株ＣＶＤ１２５４をさらに含む、請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
下痢症に対しそれを必要とする対象にワクチンを接種する方法であって、前記対象に請求項１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
下痢症に対しそれを必要とする対象にワクチンを接種する方法であって、前記対象に請求項３に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１７】
対象が、下痢症が風土病である地域に居住する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
対象が、下痢症が風土病である地域に居住する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
対象が、５歳未満の子供である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
対象が、５歳未満の子供である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月３日に出願された米国仮特許出願第６２／６５１，９７３号の利益を主張するものである。本出願の内容全体が参照によりあたかも本明細書に完全に記載されたかのように本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府資金援助
本発明は、国立衛生研究所により承認された助成金番号ＡＩ１０９７７６およびＡＩ１４２７２５の下で政府支援により行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、医薬分野、特に、赤痢菌血清型からの追加の抗原および毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）からの線毛定着抗原を含む、多成分の生弱毒化赤痢菌ワクチンに関する。この組成は、赤痢を含む下痢症に対して有用な、赤痢菌およびＥＴＥＣ病原体に対して増強されたより広範な防御を有するワクチンをもたらす。
【背景技術】
【０００４】
毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）からの線毛を含む定着因子は、定着および疾患を阻害する抗体を誘導するワクチン抗原に不可欠な抗原および標的である。ＥＴＥＣの分離株は、抗原的に異なる定着因子抗原を発現する。したがって、ＥＴＥＣに対して広範なカバー率を有するワクチンは、複数の定着因子抗原を含まなければならない。既に認識されている主要定着因子抗原としてはＣＦＡ／ＩおよびＣＳ１〜ＣＳ６が挙げられる。
【０００５】
毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）は、発展途上国の５歳未満の子供における下痢症、および軍人を含む、発展途上国を訪問する先進国からの人における旅行者下痢を引き起こす。ＥＴＥＣの臨床分離株は、コレラ毒素に類似した易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）、ならびに／またはヒトＳＴ（ＳＴｈ）およびブタＳＴ（ＳＴｐ）を含む１つもしくは複数の耐熱性エンテロトキシン（ＳＴ）を産生し得る。株は、ＬＴとＳＴの両方（ＬＴ／ＳＴ株）を産生し得るか、またはＳＴのみもしくはＬＴのみであり得る。ほとんどのＥＴＥＣは、絨毛先端細胞の吸収を低減し陰窩細胞による電解液および水の過剰分泌を惹起するエンテロトキシンを発現する前に、宿主病原体相互作用の必須部位である近位小腸腸細胞に病原体を付着させる定着因子（ＣＦ）をコードする。
【０００６】
赤痢菌およびＥＴＥＣは、特に低資源環境において、重要な世界的病原体として長い間認識されてきた。腸に関する世界的多施設研究（ＧＥＭＳ）からの最近のデータは、５歳未満の子供において中程度〜重度の下痢（ＭＳＤ）を引き起こす病原体上位４位中で赤痢菌およびＥＴＥＣを同定した。赤痢菌の世界的負荷は、年間症例数１６３００万例および死亡数７４，０００人超を含むと推定される。ＥＴＥＣの世界的負荷は、年間下痢症例数＞４００００万例と推定され、死亡数は推定１２０，０００人である。ごく最近、これらの病原体は、米国において考慮すべき疾患の原因として認識された。赤痢菌は、年間症例数約５００，０００例（薬物耐性２７，０００例）、入院数６，０００人および死亡数７０人をもたらす、米国において３番目に多い腸内細菌感染症である。赤痢菌は感染用量が非常に低いため、人から人に容易に伝播し、デイケアセンターの子供および保護施設の個人を含む衛生状態が低下した集団での感染を引き起こす。ＥＴＥＣは、軍人を含む旅行者において年間最大で１０００万の下痢のエピソードを引き起こすと推定されている。これらの病原体に対して広範な防御を提供するワクチンは、複数集団において有用な公衆衛生手段であろう。
【０００７】
ＣＦＡ／Ｉ、ＣＦＡ／ＩＩおよびＣＦＡ／ＩＶを含む、ヒトにおいて下痢性疾病または赤痢を引き起こす定着因子抗原（ＣＦＡ）の３つの主なファミリーは、ＥＴＥＣによりコードされる。ＣＦＡ／Ｉは、このファミリーの単一メンバーである。ＣＦＡ／ＩＩ株は、大腸菌表面（ＣＳ）抗原３（ＣＳ３）を単独でまたはＣＳ１もしくはＣＳ２と組み合わせてコードし、ＣＦＡ／ＩＶ株はＣＳ６を単独でまたはＣＳ４もしくはＣＳ５と組み合わせてのいずれかでコードする。ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ４およびＣＳ５は、直径約６〜７ｎｍの堅い線毛であり、ＣＳ３は、直径２〜３ｒｕｎ-inの薄い柔軟な線毛からなり、ＣＳ６の形態は特徴がない。
【０００８】
付随する抗毒素免疫ありまたはなしで、抗ＣＦ免疫を刺激するように設計されたＥＴＥＣワクチンが臨床開発中である。このワクチンは、精製線毛抗原または先端アドヘシン、不活化線毛状ＥＴＥＣ、ＣＦを発現する弱毒化ＥＴＥＣ、およびＥＴＥＣ  ＣＦをコードする赤痢菌などの細菌生ベクターを含む。ＣＦを結合しヒト小腸粘膜へのＥＴＥＣの付着を予防する腸分泌ＩｇＡ抗体の刺激は、ＥＴＥＣワクチンの成功に不可欠であると一般に考えられるが、腸粘膜に浸出する非経口ワクチン誘導血清ＩｇＧ抗体も、細菌性腸病原体により引き起こされるヒトにおける下痢を予防できるという主張もある。ほとんどのＥＴＥＣワクチンは、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ５およびＣＳ６抗原を含有し、いくつかのワクチンは、ＬＴトキソイドと共にＣＳ４も含む。
【０００９】
推定マイナーＣＦも存在し、これについて、ヒトの発症機序におけるその役割を支持するデータは、あまり説得力がないか、または不足しているが、上記ＣＦは、組織培養でヒト細胞への付着を媒介する。負荷されたボランティアにおいて下痢を惹起したＣＳ１７ＬＴのみの株は例外の可能性がある。マイナーＣＦ抗原ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、ＣＳ２０、ＣＳ２１およびＣＳ３０は、大きな注目を集めているが、ＣＳ８、ＣＳ１０、ＣＳ１１、ＣＳ１３、ＣＳ１５、ＣＳ１８およびＣＳ２３を含む他のマイナーＣＦ抗原も記載されている。ＧＥＭＳ研究において下痢と統計的に関連する唯一のマイナーＣＦは、ＣＳ１４であった（Ｖｉｄａｌ  ２０１９）。主要定着因子を含むワクチン中のＣＳ１４抗原の添加は、ワクチンのカバー率を拡大する。ＥＴＥＣにより引き起こされる下痢症は、発展途上国において依然として深刻な問題であり、したがって、ＥＴＥＣに対して広範なカバー率を有する改良ワクチンが、当技術分野において依然として必要とされている。
【００１０】
赤痢菌は、大腸菌に密接に関係する細菌属であり、霊長類において下痢症である細菌性赤痢を引き起こす。これは、世界中で下痢の主要原因の一つであり、アフリカおよび南アジアの子供において中程度〜重度の下痢を引き起こす病原体上位４位の１つである。赤痢菌種は、以下のように分類される：志賀赤痢菌（１５血清型）、フレクスナー赤痢菌（１５血清型）、ボイド赤痢菌（１９血清型）およびソンネ赤痢菌（１血清型）。
【００１１】
ソンネ赤痢菌およびフレクスナー赤痢菌は、先進環境および発展途上地域において疾患の最も重要な原因である（Ｌｉｖｉｏ、２０１４）。赤痢菌に対する防御免疫は、ＬＰＳ−Ｏ抗原に対してであり、血清型特異的である。ソンネ赤痢菌の唯一の血清型は、広範囲の防御ワクチンに含まれる必要があり、フレクスナー赤痢菌の複数の血清型は提示される必要がある。他の血清型（７ａを除く）で見出された型および群に特異的な抗原を発現する、フレクスナー赤痢菌２ａ、３ａおよび６のちょうど３個の血清型の混合物によるワクチン接種は、動物モデルにおいて異種フレクスナー赤痢菌血清型の負荷に対して少なくとも部分的な防御を提供することが実証された（Ｎｏｒｉｅｇａ、１９９９）。これらの４つの弱毒化株は、ｇｕａＢＡおよびｓｅｎ（およびフレクスナー赤痢菌２ａにおいてはｓｅｔ）の変異を含有するように操作され、動物モデルにおける相同チャレンジに対して安全で免疫原性および防御的であることが示された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
血清型分布の拡張された解析は、循環する赤痢菌分離株に対するカバー率の改善のための戦略を提供する。フレクスナー赤痢菌１ｂおよび７ａの弱毒化誘導体の添加により、直接的なカバー率を拡大することが、当技術分野において必要とされている。フレクスナー赤痢菌１ｂは、ＧＥＭＳでの全赤痢菌分離株の７．５％を占め、Ｉ型抗原を発現する。この重要な血清型の包含は、ワクチンの直接的なカバー率を拡大し、他の１型株に対するカバー率を増加させるために１型抗原を提供する。フレクスナー赤痢菌７ａ（正式名称１ｃ）は、全ＧＥＭＳ赤痢菌分離株全体の２％を占め、他の疫学研究において優勢な血清型として同定された。この血清型は、それが他の血清型で見出された型および群特異的抗原を含まない特有のＯ抗原構造を有し、したがって四価ワクチンによりカバーされると予想されないため、本発明のワクチンに含まれる。要約すれば、フレクスナー赤痢菌血清型１ｂおよび７の添加は、カバー率を増加させ、交差防御を提供する。
【００１３】
したがって、本発明は、ＣＳ１４抗原および血清型（フレクスナー赤痢菌７ａまたはフレクスナー赤痢菌１ｂ）を含む、広範囲のＥＴＥＣおよび赤痢菌分離株に対するカバー率が増加した赤痢菌−ＥＴＥＣワクチンを提供する。
【００１４】
具体的には、本発明は、下痢症および赤痢の予防および治療のためのワクチン組成物であって、
ａ．フレクスナー赤痢菌血清型７ａ、フレクスナー赤痢菌血清型１ｂ、およびフレクスナー赤痢菌血清型７ａとフレクスナー赤痢菌血清型１ｂの両方からなる群から選択される生弱毒化赤痢菌株；
ｂ．ＥＴＥＣＣＳ１４は生弱毒化赤痢菌株の１つまたは両方において発現される、腸内原性大腸菌（ＥＴＥＣ）表面抗原ＣＳ１４
を含む、ワクチン組成物に関する。
【００１５】
本発明の特定の実施形態は、
ｃ．ソンネ赤痢菌の生弱毒化株；
ｄ．フレクスナー赤痢菌血清型２ａの生弱毒化株；
ｅ．フレクスナー赤痢菌血清型３ａの生弱毒化株；および
ｆ．フレクスナー赤痢菌血清型６の生弱毒化株
の１つまたは複数をさらに含む、上記のワクチンに関する。
【００１６】
本発明の特定の実施形態は、
ｃ．ソンネ赤痢菌の生弱毒化株；
ｄ．フレクスナー赤痢菌血清型２ａの生弱毒化株；
ｅ．フレクスナー赤痢菌血清型３ａの生弱毒化株；
ｆ．フレクスナー赤痢菌血清型６の生弱毒化株；および
ｇ．任意選択で志賀赤痢菌の弱毒化株
をさらに含む、上記のワクチンに関する。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態は、生弱毒化フレクスナー赤痢菌株の１つまたは複数が、１つまたは複数の腸内原性大腸菌（ＥＴＥＣ）抗原を発現するように操作される、上記のワクチンを含む。ＥＴＥＣ抗原の例としては、大腸菌表面抗原（ＣＳ）１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５、ＣＳ６、ＣＳ１４、定着因子抗原１（ＣＦＡ／１）、ｅｌｔＡ２ｅｌｔＢ（ＬＴＢ）、先端アドヘシン、および志賀毒素Ｂ（ＳｔｘＢ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明の実施形態はまた、薬学的に許容される担体をさらに含む、上記のワクチン組成物を含む。
【００１９】
さらに、いくつかの実施形態は、赤痢菌株が、ｇｕａＢＡおよびｓｅｎでの変異を含有する、上記のワクチン組成物に関する。
【００２０】
本発明の一実施形態は、
ａ．ＥＴＥＣ抗原ＣＳ２およびＣＳ３を発現する、生弱毒化ソンネ赤痢菌、株ＣＶＤ１２３３Ｓ；
ｂ．ＥＴＥＣ抗原ＣＦＡ／１およびＬＡ２ＴＢを発現する、生弱毒化フレクスナー赤痢菌血清型２ａ、株ＣＶＤ１２０８Ｓ；
ｃ．ＥＴＥＣ抗原ＣＳ１およびＣＳ５を発現する、生弱毒化フレクスナー赤痢菌血清型３ａ、株ＣＶＤ１２１３；
ｄ．ＥＴＥＣ抗原ＣＳ４およびＣＳ６を発現する、生弱毒化フレクスナー赤痢菌血清型６、株ＣＶＤ１２１５；
ｅ．ＥＴＥＣ抗原ＣＳ１４を発現する、生弱毒化フレクスナー赤痢菌血清型１ｂ、株ＣＶＤ１２２４；
ｆ．１つまたは複数のＥＴＥＣ先端アドヘシン抗原を発現する、生弱毒化フレクスナー赤痢菌血清型７ａ、株ＣＶＤ１２４２；ならびに
ｇ．任意選択で、ＥＴＥＣ抗原ＣＦＡ／１およびＬＴＢを発現する、生弱毒化志賀赤痢菌、株ＣＶＤ１２５４；
を含む、本明細書に記載のワクチン組成物に関する。
【００２１】
他の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象に下痢症のワクチンを接種する方法であって、上記のワクチン組成物を、好ましくは、下痢症が風土病である地域に居住する対象、および／または５歳未満の子供である対象に投与することを含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＰＣＲによるｇｕａＢＡ遺伝子座の増幅を示すブロットであり、フレクスナー赤痢菌１ｂの２個の分離株での欠失を確認する。
【図２】プレートの写真であり、フレクスナー赤痢菌１ｂΔｇｕａＢＡワクチン株でのグアニン栄養要求性を確認する。
【図３】フレクスナー赤痢菌１ｂΔｇｕａＢＡワクチン株での細胞内複製欠損を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
１．定義
特に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術および科学用語は、当業者の一人より一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と類似のまたは同等の様々な方法および材料が、本発明の実施または試験において使用できるが、好適な方法および材料を以下に記載する。しかし、当業者は、用いられ、記載された方法および材料が例であり、本発明での使用に好適な唯一の材料および方法でない可能性があることを理解している。さらに、測定値には、ばらつきが内在し、相反する指示がない限り、本明細書で付与される任意の温度、重量、体積、時間間隔、ｐＨ、塩分、モル濃度または重量モル濃度、範囲、濃度および任意の他の測定値、量または数値表現は、およそであり、正確または決定的な数値でないことが意図される。
【００２４】
本明細書で使用する用語「約」は、列挙した値のプラスまたはマイナス２０％を意味し、したがって、例えば、「約０．１２５」は、０．１２５±０．０２５を意味し、「約１．０」は１．０±０．２を意味する。
【００２５】
本明細書で使用する用語「予防」は、疾患の文脈において、疾患の重症度の低減、疾患に罹患する確率の低下、ならびに疾患またはその兆候および症状の完全または部分的予防を含む。
【００２６】
本明細書で使用する用語「治療する」およびその同族語は、疾患の１つまたは複数の症状の緩和、軽減または改善；疾患の程度の減退；疾患の進行の遅延または緩慢化；計量的（統計的）な疾患の改善および緩和または安定化を含む、臨床結果を含む、有益または所望の結果を得るためのステップを行うことを指す。効果は、状態、疾患、もしくはこれらの症状の完全なもしくは部分的な予防という点で予防的であり得、かつ／あるいは状態もしくは疾患、および／または状態もしくは疾患に起因し得る有害作用の部分的もしくは完全な治癒という点で治療的であり得る。「治療」は、行われるステップを指す。これは、哺乳動物で、特に、ヒトでの状態または疾患の任意の治療を含み得、（ａ）状態または疾患の素因があり得るが、それを有すると未だ診断されていない対象において、状態、疾患またはこれらの症状が生じるのを予防すること；（ｂ）状態、疾患、またはこれらの症状を阻害する、例えば、その進行を阻止すること；および（ｃ）状態、疾患、またはこれらの症状を緩和、軽減または改善すること、例えば、状態、疾患、またはこれらの症状を退縮させることを含む。
【００２７】
本明細書で使用する用語「予防」およびその同族語は、疾患または状態を完全または部分的に予防するステップを含む、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのステップを行うことを指す。予防のためのワクチン接種は一般に、状態の部分的もしくは完全な阻害、または状態もしくは状態の進行の改善を含む、疾病の症状、重症度または持続期間の完全または部分的な予防、低減のための組成物の投与を指す。予防は、細菌感染（細菌力価）の減少、疾患または状態の症状を含む、疾患または状態に関連する細菌毒性に対する反応の低下、ならびに症状の重症度または持続期間の低減を含む。
【００２８】
本明細書で使用する用語「対象」は任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。実験動物はこの定義に含まれる。
【００２９】
本明細書で使用する用語「必要とする対象」は、下痢症（赤痢を含む）を患うか、または対象が下痢症に暴露され得る環境にある、ヒト患者を含む対象を指す。例えば、このような必要とする対象としては、下痢症が風土病である地域に居住する０歳（新生児）〜１０歳の人、またはデイケアセンターもしくは保護施設などの高リスク環境下で先進国に居住する人、または赤痢および／もしくはＥＴＥＣが風土病である発展途上地域に旅行する先進国に居住する人（軍人を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書で使用する用語「下痢」、「下痢症」または「赤痢」は、細菌感染により引き起こされる２４時間での３回以上の軟便または任意の回数の血液を含む軟便のエピソードを指す。
【００３１】
本明細書で使用する用語「治療有効量」は、対象に投与された場合、意図される治療効果を有する治療剤の量を指す。治療効果は、症状の低減を含む、疾患、障害、状態もしくはこれらの症状の改善、または疾患、障害、状態もしくは症状の発症もしくは再発の遅延を含む、意図される障害または状態を治療する効果である。完全な治療効果は、必ずしも１用量の投与により生じるわけではなく、一連の用量の投与後にのみ生じる場合もある。したがって、治療有効量は、１回または複数回の投与で投与され得る。ワクチンの文脈において、治療有効量は、発症の確率を低減するか、または疾患もしくは状態を現在患っていない対象において疾患もしくは状態の重症度を低減する量；または疾患もしくは状態に対する防御に関連する病因物質に対する免疫応答を引き起こす量である。疾患または状態を現在患っている対象に投与される場合、治療有効量は、疾患もしくは状態に対する防御に関連する病因物質に対する免疫応答を誘導し、対象の疾患または状態を改善する量である。
【００３２】
本明細書で使用する用語「ＣＦ」は定着因子を指し、最も一般的なものとしては、ＣＦＡ／Ｉが挙げられる。
【００３３】
本明細書で使用する用語「ＣＳ」は、ＥＴＥＣ由来の一群の抗原である大腸菌表面抗原を指す。
【００３４】
本明細書で使用する用語「ＣＦＡ」は、ＥＴＥＣ分離株において見出される定着因子抗原を指す。ＣＦＡ／Ｉ、ＣＦＡ／ＩＩおよびＣＦＡ／ＩＶは、特定の定着因子抗原Ｉ、ＩＩおよびＩＶを指す。
【００３５】
本明細書で使用する用語「ＳＴ」は、ＥＴＥＣなどの細菌株により産生される一群のペプチド毒素である耐熱性エンテロトキシンを指す。
【００３６】
本明細書で使用する用語「ＬＴ」は、大腸菌において見出される一群の毒素である（高温で不活化する）易熱性エンテロトキシンを指す。ＬＴＡ２Ｂは、ＬＴのＡ２サブユニット、さらにＢサブユニットからなる構築物である。
【００３７】
本明細書で使用する用語「ＥＴＥＣ」は、腸の内層を刺激する特別な毒素を産生し、毒素に過剰な液体を分泌させ、下痢を引き起こす、一群の大腸菌である毒素原性大腸菌を指す。
【００３８】
本明細書で使用する用語「ＥＴＥＣ先端アドヘシン抗原」は、ＥＴＥＣの先端アドヘシン由来の抗原を指す。アドヘシンは、発症機序におけるステップとして、病原体の付着を促進する一種の病原性因子である。
【００３９】
本明細書で使用する用語「ＳｔｘＢ」は、大腸菌毒素、志賀毒素Ｂサブユニットを指す。
【００４０】
２．概観
実地試験およびボランティアチャレンジ研究を含む数十年の文献は、病原体の抗原レパートリー全体を提示しかつ免疫学的に最も関連性のある経口経路を介して送達される、生弱毒化ワクチンの防御効果を支持する。治験は、赤痢菌がグアニンヌクレオチドをデノボ合成できないようにする、ｇｕａＢＡオペロンでの変異が、ボランティアにおいて安全でかつ免疫原性であるワクチン株をもたらすことを実証した。赤痢菌エンテロトキシンをコードするｓｅｔおよびｓｅｎ遺伝子でのさらなる変異は、ワクチン株ＣＶＤ１２０８Ｓの弱毒化を増加させ得る。さらなる赤痢菌成分株に対するこの弱毒化戦略が、広範な防御を付与する多価ワクチンを形成するために本明細書において用いられる。したがって、ＥＴＥＣ定着因子抗原、ならびに易熱性（ＬＴ）および耐熱性（ＳＴ）毒素に対して毒素中和抗体を誘導する抗原を発現する赤痢菌の６つの生弱毒化株からなる多価製剤が開発中である。
【００４１】
フレクスナー赤痢菌１ｂおよび７ａの弱毒化誘導体の添加により直接的なカバー率を拡大するために、循環する赤痢菌分離株に対するカバー率の改善のための戦略が本明細書において開発された。フレクスナー赤痢菌１ｂは、ＧＥＭＳの全赤痢菌分離株の７．５％を占め、Ｉ型抗原を発現する。この重要な血清型の包含は、ワクチンの直接的なカバー率を増加させる。フレクスナー赤痢菌７ａ（正式名称１ｃ）は、全ＧＥＭＳ赤痢菌分離株全体の２％を占め、他の疫学研究において優勢な血清型として同定された。この血清型は、それが他の血清型で見出された型および群特異的抗原を含まない特有のＯ抗原構造を有し、したがって任意の先行のワクチンによりカバーされると予想されないため、本発明のワクチンに含まれた。
【００４２】
フレクスナー赤痢菌１ｂの生弱毒化誘導体が開発された。フレクスナー赤痢菌のワクチン誘導体は、グアニンに対して栄養要求性であるｇｕａＢＡオペロンでの欠失を含有し、細胞内複製欠損であり、モルモットにおいて病原性が弱毒化され、モルモットでの免疫化後に免疫原性である（１００％免疫化された動物は単一の免疫化用量後に血清抗フレクスナー赤痢菌１ｂ  ＩｇＧの２〜７倍の増加を示した）。いくつかの実施形態において、ｓｅｔおよび／またはｓｅｎでの欠失が、安全性を強化するためにこの株に加えられ得る。
【００４３】
ＥＴＥＣは、タンパク質定着因子（ＣＦ）を用いてヒト小腸の内膜に付着し、その後、細菌性毒素が腸内分泌を刺激し、下痢を引き起こす。ＥＴＥＣ由来のＣＦは、定着および疾患を阻害する抗体を誘導するワクチン抗原に不可欠な抗原および標的である。ＥＴＥＣの分離株は、抗原的に異なる線毛型を発現する。したがって、ＥＴＥＣに対して広範なカバー率を有するワクチンは、複数の線毛型を含まなければならない。既に認識されている主要線毛抗原としてはＣＦＡ／ＩおよびＣＳ１〜ＣＳ６が挙げられる。推定マイナーＣＦも存在し、これについて、ヒトの発症機序におけるその役割を支持するデータは、あまり説得力がないか、または不足しているが、それらは、組織培養でのヒト細胞への付着を媒介する。ＧＥＭＳ研究において下痢と統計的に関連する唯一のマイナーＣＦは、ＣＳ１４であった（Ｖｉｄａｌ  ２０１９）。主要定着因子を含むワクチン中のＣＳ１４抗原の添加は、ワクチンのカバー率を拡大する。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＳ１４に対する抗体を誘導するためにマイナーＣＦ（ＣＳ１４）を含めることにより、高い割合のＥＴＥＣ分離株に対して広範な防御を有するワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、これは、ＣＳ１４を発現する生弱毒赤痢菌株（例えば、ＣＶＤ１２０８Ｓ）である。いくつかの実施形態において、ＣＶＤ１２０８Ｓ：：ＣＳ１４は、ＣＳ１４をコードするオペロンを赤痢菌株（例えば、ＣＶＤ１２０８Ｓ）の染色体に挿入することにより操作される。ＣＶＤ１２０８Ｓ：：ＣＳ１４でのモルモットの免疫化は、ＣＳ１４を認識する抗体を誘導した。いくつかの実施形態において、ワクチンは、粘膜ＳＩｇＡ赤痢菌抗ＯならびにＥＴＥＣ抗ＣＦおよび抗ＬＴ抗体を産生する。
【００４５】
４．本発明の実施形態
ＧＥＭＳ研究からの疫学データは、ＥＴＥＣ由来のこれまで認識不足であったマイナー線毛抗原ＣＳ１４が、中程度〜重度の下痢（ＭＳＤ）を有する子供由来の分離株で優勢であることを明らかにした。重要なことに、これは、ＭＳＤに有意に関連する唯一のマイナー線毛抗原であった。本発明のワクチンへのこの線毛抗原の包含は、ＥＴＥＣ分離株に対するカバー率を拡大する。
【００４６】
本発明の赤痢菌ワクチン戦略は、臨床分離株において見出される最も優勢な種および血清型を代表する赤痢菌の生弱毒化株の組み合わせを用いることを含む。ワクチンは、ソンネ赤痢菌（１血清型）ならびにフレクスナー赤痢菌２ａ、３ａおよび６を含む。これらの３個のフレクスナー赤痢菌血清型は、他の１６個のフレクスナー血清型で見出された型および群特異的抗原各々を発現すると同定された。動物データは、これらの血清型間の交差防御を支持する。ＧＥＭＳ研究において、最も優勢な血清型の間でさらに２個のフレクスナー赤痢菌血清型、７ａ（先に血清型１ｃｅとして言及）および１ｂが同定された。フレクスナー赤痢菌７ａは、他の血清型で見出された型および群特異的抗原を発現しない、特有のＯ抗原を有する。ワクチン中のフレクスナー赤痢菌７ａの生弱毒化誘導体の包含はまた、赤痢菌分離株に対する全体的なカバー率を拡大する。さらに、フレクスナー赤痢菌血清型１ｂもまた、この血清型がＧＥＭＳの赤痢菌分離株の７．５％で見出されたため、防御を拡大する。
【００４７】
ＥＴＥＣ線毛抗原ＣＳ１４をコードする遺伝子を、野生型ＥＴＥＣ株から発現プラスミド中にクローニングした。大腸菌についてＭｃＫｅｎｚｉｅおよびＣｒａｉｇにより開発されたＡｔｔＴｎ７方法論を用いて、ＣＳ１４をコードするオペロンを、赤痢菌ワクチン株ＣＶＤ１２０８Ｓの染色体の許容部位に挿入し、ＣＶＤ１２０８Ｓ：：ＣＳ１４を形成した。ＣＶＤ１２０８Ｓ：：ＣＳ１４でのモルモットの免疫化は、ＣＳ１４を認識する抗体を誘導した。代替的に、ＣＳ１４の線毛先端アドヘシンＣｓｕＤを、赤痢菌生ベクターの表面で発現させて、宿主細胞結合に関与するこのサブユニットに対する応答を誘導することができる。先端アドヘシンをコードする遺伝子ｃｓｕＤを、プラスミド上で構造的サブユニット遺伝子ｃｓｕＡ２とタンデムに操作した。プラスミドは、赤痢菌ワクチン株ＣＶＤ１２０８ＳにおけるＣＳ１４先端アドヘシンの発現を誘導した。ＣＶＤ１２０８Ｓ（ｐＣｓｕＡ２Ｄ）でのモルモットの免疫化は、ＣＳ１４を認識する抗体を誘導した。非経口送達される精製先端タンパク質が用いられ得る。
【００４８】
ＧＥＭＳ研究からの下痢に関連する赤痢菌の血清型分布の解析は、我々の多価赤痢菌ワクチンのカバー率を増加させる血清型としてフレクスナー赤痢菌１ｂおよび７ａを同定した。血清型１ｂの新しい生弱毒化フレクスナー赤痢菌株を、薬剤感受性を有するＧＥＭＳコレクションから選択された株（１０３４８９および２０４５８４）を用いて操作した。ｇｕａＢＡおよびｓｅｎ遺伝子への欠失は、ラムダｒｅｄ組換えを用いて導入された（図１）。２個の誘導体は、グアニンに対して栄養要求性であり（図２）、細胞内複製欠損であり（図３）、モルモットにおいて病原性が弱毒化され、モルモットでの免疫化後に免疫原性であること（表１）が示された。
【００４９】
【表１】
2021519789.tif 000003
【００５０】
血清型１ｂおよび７ａの新しい生弱毒化フレクスナー赤痢菌株は、薬剤感受性を有するＧＥＭＳコレクションから選択された株を用いて操作され得る。ｇｕａＢＡおよびｓｅｎ遺伝子に欠失を導入する。フレクスナー赤痢菌１ｂおよび７ａの包含は、混合ワクチンの直接的な赤痢菌カバー率を増加させる。ＣＳ１４をコードするオペロン全体を使用して、全長の線毛を発現できる。別の方法では、先端アドヘシン発現系に対して、先端サブユニットのみをコードする遺伝子ｃｓｕＤが用いられ得る。個々の株を凍結乾燥し、単一の組み合わせ製剤に組み合わせて小袋に入れ、経口送達前に緩衝液に再懸濁してもよい（ＣＶＤ１０３ＨｇＲ、Ｖａｘｃｈｏｒａ（商標）について）。選択された多価ワクチンの製剤全体の概要については以下の表２を参照のこと。
【００５１】
【表２】
2021519789.tif 000004
【００５２】
本発明の多価赤痢菌−ＥＴＥＣワクチンは、合計で少なくとも８個のＣＦ、さらにＬＴＡ２Ｂを発現する赤痢菌の６個の生弱毒化株（表２の上から６項目）、ならびにまた任意にＳｔｘＢを発現する生弱毒化志賀赤痢菌株も含む。表２は、本発明の実施形態に従いどのように赤痢菌ワクチン株とＥＴＥＣ抗原との組み合わせが分布され得るかの一例を示している。しかし、任意の生弱毒化赤痢菌株が、示されたＣＦの組み合わせのいずれかを発現するために用いられ得る。また、任意の生弱毒化赤痢菌ワクチンが、単一のＣＦを発現するために用いられ得る。
【００５３】
ＥＴＥＣワクチンのカバー率を拡大するための別の方式は、線毛先端アドヘシンタンパク質混合物の製剤化に基づく。線毛ＣＦは、その先端アドヘシンタンパク質のアミノ酸配列関連性に基づき分類でき、いくつかの重要なＥＴＥＣ  ＣＦは代替シャペロン経路により組み立てられたクラス５線毛に分類され得る。これらの線毛のストークを形成する主要な線毛サブユニットタンパク質は、実質的に互いに抗原的に異なるが、その先端アドヘシンタンパク質は、３つのサブクラスに高度に保存される。サブクラスの１つのアドヘシンに対する抗体は、他のメンバーによる付着を交差防御する。したがって、防御はまたこの戦略により拡大され得る。どの先端アドヘシンを多価ワクチンに含むか選択するには、包括的にＥＴＥＣ間でのＣＦの頻度を把握する必要がある。したがってＧＥＭＳデータは、このワクチン戦略の情報も提供する。ＥＴＥＣワクチンのカバー率を拡大する別の戦略は、ＥｔｐＡおよびＥａｔＡなどの非線毛表面抗原を含めることである。
【００５４】
ＧＥＭＳ  ＥＴＥＣ分離株の間で一連のＣＦを解析することは、ＥＴＥＣワクチンの開発および今後の展開を導く重要な情報を提供した。ＳＴのみおよびＬＴ／ＳＴ株は、重要なＥＴＥＣ病原体の原因と強く見なされているため、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１〜６およびＣＳ１４を含む線毛性ＥＴＥＣワクチンは、防御を増加させ得る。
【００５５】
ワクチン
本発明のワクチンは、これらの下痢症に関連する一群の抗原に対し必要とする対象を免疫化することにより、下痢症および赤痢を予防および改善するように設計される。本発明によるワクチンは、フレクスナー赤痢菌血清型７ａの生弱毒化株；フレクスナー赤痢菌血清型１ｂの生弱毒化株；および赤痢菌株の１つまたは複数において発現される毒素原性大腸菌表面抗原ＣＳ１４を含有する。好ましくは、ワクチンは、赤痢菌および大腸菌により引き起こされる下痢症に関与する重要な抗原に対して広範なカバー率を提供する、多価組成物である。
【００５６】
有利には、ワクチンは、その１つまたは複数が好ましくはＥＴＥＣ由来の抗原を発現する、５〜６個の赤痢菌株の混合物を組み合わせた、少なくとも五価または六価ワクチンである。例えば、ソンネ赤痢菌、フレクスナー赤痢菌株２ａ、フレクスナー赤痢菌株３ａ、フレクスナー赤痢菌株６、フレクスナー赤痢菌株１ｂおよびフレクスナー赤痢菌株７ａが一緒に混合される。ワクチンは最も好ましくは、少なくともフレクスナー赤痢菌株１ｂおよびフレクスナー赤痢菌株７ａを含有し、かつフレクスナー赤痢菌株２ａ、フレクスナー赤痢菌株３ａおよびフレクスナー赤痢菌株６も含有する。好ましくは、ワクチンは、下痢症に対する免疫に重要であることが示されている赤痢菌抗原および一般的な血清型に対して広範なカバー率を提供する。特定の実施形態によれば、本発明によるワクチンは、その１つまたは複数が、１つまたは複数のＥＴＥＣ抗原を発現する、２、３、４、または５個の赤痢菌種で製造され得る。別の実施形態において、ワクチンはまた、志賀赤痢菌の生弱毒化株を含有する。さらに、ワクチンは好ましくは、赤痢菌株の１つまたは複数により発現される毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）抗原を含有する。
【００５７】
赤痢菌株ＣＶＤ１２３３Ｓ、ＣＶＤ１２０８Ｓ、ＣＶＤ１２１３、ＣＶＤ１２１５、ＣＶＤ１２２４、ＣＶＤ１２４２およびＣＶＤ１２４５は、メリーランド大学ワクチン開発センターで製造および貯蔵される。表１および２を参照のこと。他の株は、当業者に利用可能であり得る。
【００５８】
ＥＴＥＣ抗原は、多価ワクチン中の赤痢菌株の１つもしくは複数において、またはそのすべてにおいて発現され得る。ワクチン組成物に有用なＥＴＥＣ抗原は、大腸菌表面（ＣＳ）１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５、ＣＳ６、ＣＳ１４、定着因子抗原１（ＣＦＡ／１）、ｅｌｔＢ（ＬＴＢ）、先端アドヘシンおよび志賀毒素Ｂ（ＳｔｘＢ）からなる群の１つまたは複数から選択される。これらの抗原のいずれか、または好ましくはすべてが、ワクチン組成物中の赤痢菌株の少なくとも１つにおいて発現される。詳細には、ＣＳ１４が、ワクチン中に存在し、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＤ５およびＣＤ６も存在する。表２は、便宜上、特定の赤痢菌株において発現される特定のＥＴＥＣ抗原を示しているが、当業者は、用いられる赤痢菌株のいずれかが、都合がよいように、ＥＴＥＣ抗原のいずれかを発現するように公知の方法に従って操作され得、したがって、示された抗原は、異なる株において発現され得ることを認識している。所望のＥＴＥＣ抗原を発現するように株を操作する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、ＷｕらＩｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７９（１２）：４９１２〜４９２２、２０１１  ＰＭＣ３２３２６４６中に見出され得る。
【００５９】
ワクチンは、赤痢菌の生弱毒化株であり、したがって好ましくは、依然として生存可能でありながら（生存しながら）、病原性がヒト宿主において低下するように改変されている。弱毒化は、当技術分野で公知であり当業者に利用可能な方法のいずれかにより行われ得る。このような方法は、ＷｕらＩｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７９（１２）：４９１２〜４９２２、２０１１  ＰＭＣ３２３２６４６およびＤｅｌａｉｎｅら、Ｐａｔｈｏｇ．Ｄｉｓ．７４（５）、２０１６  ＰＭＣ５９８５４７８に記載されている。さらに、本発明のワクチン組成物中の菌株は、病原性を低下させるために他の改変または変異を含有し得る。いくつかの実施形態において、赤痢菌の株は、ｇｕａＢＡならびにｓｅｎおよび／またはｓｅｔでの変異により弱毒化される。代替実施形態において、ワクチンが単一の株または死滅した株の混合物を含むように、赤痢菌株は、弱毒化ではなく不活化（死滅）されてよく、または弱毒化され、さらに不活化されてもよい。これはまた、当技術分野で利用可能な方法のいずれか、例えば、熱失活、ホルマリン処理などにより達成され得る。
【００６０】
本発明のワクチン組成物の特定の実施形態は、ＥＴＥＣ抗原ＣＳ２およびＣＳ３を発現する生弱毒化ソンネ赤痢菌、株ＣＶＤ１２２３Ｓ；ＥＴＥＣ抗原ＣＦＡ／１およびＬＴＢを発現する生弱毒化フレクスナー赤痢菌血清型２ａ、株ＣＶＤ１２０８Ｓ；ＥＴＥＣ抗原ＣＳ１およびＣＳ５を発現する生弱毒化フレクスナー赤痢菌血清型３ａ、株ＣＶＤ１２１３；ＥＴＥＣ抗原ＣＳ４およびＣＳ６を発現する生弱毒化フレクスナー赤痢菌血清型６、株ＣＶＤ１２１５；ＥＴＥＣ抗原ＣＳ１４を発現する生弱毒化フレクスナー赤痢菌血清型１ｂ、株ＣＶＤ１２２４；１つまたは複数のＥＴＥＣ先端アドヘシン抗原を発現する生弱毒化フレクスナー赤痢菌血清型７ａ、株ＣＶＤ１２４２；ならびに任意選択で、ＥＴＥＣ抗原ＣＦＡ／１およびＬＴＢを発現する生弱毒志賀赤痢菌、株ＣＶＤ１２５４を含む。
【００６１】
ワクチン組成物
本発明の特定の実施形態において、本明細書で考察されるワクチン組成物は、ワクチンおよび薬学的に許容される担体、ならびに任意選択で１つまたは複数の追加の活性剤を含有する医薬組成物として製剤化および投与される。好ましくは、医薬組成物は、治療有効量のワクチンを含む。薬学的に許容される担体は、毒性がなく、かつそれと共に製剤化される薬剤の薬理学的および免疫学的（ワクチン）活性を破壊しないまたは有意に低下させない、任意の好都合な化合物、または一群の化合物を指す。このような薬学的に許容される担体またはビヒクルは、当技術分野で考察されるものなど、当技術分野で公知の標準的な薬学的に許容される固体、液体または気体の担体のいずれかを包含する。
【００６２】
好適な担体は、医薬組成物に企図される投与経路に依存する。投与経路は、利便性、治療される対象の健康および状態、ならびに治療される状態の位置および段階により当業者により決定される。このような経路は、施術者が、患者、患者の全般的な状態および治療される特定の状態などを考察することにより、最も効果的または好都合であるとみなした任意の経路であり得る。本発明の生弱毒化ワクチンは好ましくは、経口経路により投与または送達される。あるいは、株は、ホルマリン、熱またはいくつかの他の薬剤を用いて不活化され得る。
【００６３】
いくつかの実施形態において、不活化多価赤痢菌−ＥＴＥＣワクチンは、経口経路または皮内、皮下、舌下、経鼻もしくは筋肉内経路により投与される。投与の他の経路としては、経口、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、皮下、皮内、腹腔内、筋肉内または局所注射；直腸または膣坐剤、外用剤、経鼻、頬側、経皮、舌下、吸入、経粘膜、創傷被覆などを含む局所または非経口が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、輸液または注入により行われ得、埋込物、埋込式ポンプもしくは外部ポンプまたは当技術分野で公知の任意のデバイスにより行われ得る。好ましくは、本発明のワクチンは、経口、筋肉内注射または経鼻投与により投与される。ワクチンの経口投与は、針およびシリンジまたは特別な装置が不要な非侵襲的投与であるため、有利な投与経路である。
【００６４】
したがって、医薬組成物が取り得る形態は、これらの投与経路のいずれかに好適なまたは好都合な任意の形態を含む。ワクチン組成物のこのような製品形態または剤形としては、希釈用の粉末または顆粒、予め充填されたシリンジ、注射液、注射用の懸濁液、経口溶液、経口懸濁液、経口エマルジョン、経鼻スプレー溶液、錠剤、カプセル、カプレット、ロゼンジ、糖衣錠、丸剤、顆粒、吸入用粉末、吸入薬、気体、直腸坐剤、膣坐剤、クリーム、ローション、油、軟膏、懸濁液、エマルジョン、脂質小胞などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、各剤形は、有効量のワクチンを含有する。
【００６５】
当技術分野で公知の任意の薬学的に許容される担体および／または賦形剤は、本発明での使用が企図される。担体としては、例えば、固体、液体または気体の形態で活性成分（複数可）を含有する溶媒、希釈剤、他の担体などを挙げることができる。固体形態の一般的な担体としては、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、コメデンプン）、セルロース（例えば、微結晶性セルロース、メチルセルロースなど）、糖（例えば、ラクトース、スクロース、グルコース、フルクトースなど）、粘土、鉱物（例えば、タルクなど）、ガム、ワックスなどが挙げられる。半液体形態の液体の一般的な担体としては、ゲル、脂質（例えば、脂質ビヒクルまたはナノ粒子）、油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、乳化剤、有機溶媒（例えば、エタノール）、水性溶媒（例えば、水、生理食塩水、電解質溶液、乳酸化生理食塩水）、懸濁化剤などが挙げられる。
【００６６】
賦形剤としてはまた、補助剤、香味剤、保存剤、着色剤、矯味剤、甘味剤、湿潤剤、充填剤、分散剤、固化防止剤、増量剤、ｐＨ調整剤および緩衝液、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムなど）、抗菌剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベンなど）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウムなど）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡなど）、滑剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）を挙げることができる。
【００６７】
化合物または化合物を含有する医薬組成物は、小袋、薬袋、ブリスターパック、箱、アンプル、バイアル、瓶、予め充填されたシリンジ、袋、スプレー装置、吸入器などの容器中で提供され得る。
【００６８】
徐放出組成物および持続放出性組成物も本発明の実施形態での使用が企図される。したがって、好適な担体は、活性成分の遅延放出、徐放または持続放出を達成することが公知の成分のいずれかを含み得る。
【００６９】
本発明のワクチンは、特定の実施形態において、凍結乾燥ワクチン粉末（６つの個々の凍結乾燥ワクチン株の乾燥混合物を表す）として製剤化され、ワクチンの１用量に相当する小袋で提供され、任意で緩衝剤粉末からなる小袋または他のパッケージと共に梱包される。場合によっては、ワクチンは、５用量または１０用量のパッケージで提供され得る。ワクチンの特定の製剤化において、用量は、任意で添付の小袋に含有される緩衝剤粉末と共に、小袋の内容物を水、例えば、約１００ｍＬの水に懸濁させることにより経口投与用に調製される。再構成された後、緩衝溶液中の得られたワクチン株の「カクテル」は経口送達される。任意で、ワクチンを含有する小袋は好適な緩衝液を含有し、したがって再構成は水単独で行われるか、または小袋が緩衝溶液中で再構成される。
【００７０】
ワクチンのこの実施形態は、旅行者ワクチンに、リスクを有する集団への配布に、および発展途上国における配布または軍人への配布に好適である。剤形の様々な実施形態としては、株の混合物を含有する個々の（単回使用）用量、および株の混合物を含有する個々の用量のマルチパックが挙げられるが、これらに限定されない。いずれかの実施形態では、任意で緩衝剤粉末または緩衝溶液からなる小袋が添付され得る。さらなる実施形態としては、５用量または１０用量の提示などの、個々の投与量の小袋からなる複数回用量パッケージが挙げられる。
【００７１】
用量およびレジメン
治療レジメンは、ワクチンの単回投与、または初回投与と１回もしくは複数回の「ブースター」投与の１コースを含む。好ましくは、投与は、医療関係者により決定される。対象への初回投与は、下痢症が風土病である場合、状態への暴露前に行われるが、暴露後に、または下痢の症状が生じた後行われる場合もある。ブースター投与は、必要な場合に行われる。例えば、赤痢が風土病である地域に入域する旅行者または軍人には、有利にはこの地域に入域する前に、２用量が１０日離して経口投与され得る。低中所得国（ＬＭＩＣ）の乳児は、生後１０週、１４週および９か月に各１用量を受けることが推奨される。子供は、学校入学時（５〜６歳）、青年期およびその後６５歳頃にブースター用量を投与され得る。ワクチンの１用量は、約１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）〜約５×１０１０ＣＦＵの乾燥弱毒化細菌を含有するか、または医療従事者により推奨される通りである。用量は、サイズ、暴露、全般的な健康、年齢または他の要因に応じて、約１０７ＣＦＵ〜約１０１１ＣＦＵ、好ましくは約１０８ＣＦＵ〜約５×１０１０ＣＦＵ、もしくは約５×１０８ＣＦＵ〜約１０１０ＣＦＵ、もしくは約１０８ＣＦＵ〜約１０９ＣＦＵ、または施術者により決定される好適な任意の用量で変動し得る。
【００７２】
対象
本発明によるワクチン組成物は、必要とする任意の対象、好ましくは、霊長類、例えば、ヒトに投与され得る。対象としては、新生児から１８歳までの任意の年齢の子供（好ましくは５歳未満の子供）、ならびに高齢者を含む任意の年齢の成人を含む、ヒト患者を挙げることができる。好ましくは、対象は、下痢症のワクチン接種を必要とする対象である。したがって、必要とするこのような対象としては、生後０か月または１か月未満〜１００歳を超える超高齢者の任意の人が挙げられる。本発明の実施形態によるワクチンの使用は、年少乳児および子供を含む混合集団におけるワクチンの投与である。しかし、疫学的に最も重要な赤痢菌血清型ならびに大腸菌（ＥＴＥＣ）の毒素および定着因子型に対して広域スペクトラムの粘膜ワクチンを必要とする、複数集団または任意の対象は、本ワクチンが投与され得る。ワクチンの投与の複数集団としては、好ましくは（１）これらの感染が高風土病である発展途上国を訪問する成人および子供の旅行者；（２）発展途上国における特定の高リスク集団の子供および成人；（３）発展途上国における５歳未満の子供；ならびに（４）自然なまたは故意によるアウトブレイクの制御のための集団の集団免疫化、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
要約すれば、ワクチン製品の実施形態は好ましくは、各々がＥＴＥＣからの防御抗原を発現する赤痢菌の６個の生弱毒化株を含む。このワクチンは、フレクスナー赤痢菌、ソンネ赤痢菌およびＥＴＥＣにより引き起こされる下痢および赤痢を予防することが意図される。志賀赤痢菌１の株が公衆衛生問題になる場合、志賀赤痢菌１を防御するための成分が、任意で加えられ得る。
【００７４】
５．実施例
記載される特定の工程、組成または方法論は変化し得るため、本発明はこれらに限定されない。説明で使用する用語は、特定のバージョンまたは実施形態のみを記載するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されない。本明細書に記載された方法および材料と類似のまたは同等の任意の方法および材料は、本発明の実施形態の実施または試験で使用できる。本明細書に言及されるすべての刊行物は、その全体が参照により組み込まれ、本明細書のいかなるものも本発明が、先行発明により、このような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【００７５】
実施例１．一般的方法
試験設計および集団
サハラ以南のアフリカのガンビア（Ｂａｓｓｅ）、マリ（Ｂａｍａｋｏ）、モザンビーク（Ｍａｎｈｉｃａ）およびケニヤ（Ｓｉａｙａ  Ｃｏｕｎｔｒｙ）、ならびに南アジアのインド（Ｋｏｌｋａｔａ）、バングラディッシュ（Ｍｉｒｚａｐｕｒ）およびパキスタン（Ｋａｒａｃｈｉ−Ｂｉｎ  Ｑａｓｉｍ  Ｔｏｗｎ）の５歳未満の子供の間で行われた３年間の症例対照研究であるＧＥＭＳの根拠、仮説、臨床的、疫学的および微生物学的方法を記載した。ＭＳＤは、過去７日以内に発症した下痢の急性エピソード（２４時間に３回以上の軟便）として定義され、７日以上の別のエピソードと分離され、脱水（眼窩陥凹、腹部の皮膚をつまんだ後の緩慢な反動または静脈内輸液投与）、赤痢、または下痢症の重症度の臨床的懸念に基づく入院のいずれかの徴候を伴った。
【００７６】
手順
症例および対照からの便または直腸スワブを、マッコンキーおよびキシロース／リジン／デオキシコール酸寒天に培養し、対象ごとに３つの大腸菌コロニーを、同定し、ＤＮＡ抽出のためにプールした。次いで、ＤＮＡを、ｅｌｔＢ（ＬＴＢサブユニット）およびｅｓｔ（ＳＴ）を増幅するプライマーを含有するマルチプレックスＰＣＲで試験した。ＥＴＥＣ株をチリ大学に輸送し、ＰＣＲにより確認してＬＴおよびＳＴ変異体（ＳＴｈおよびＳＴｐ）を検出した。確認されたＥＴＥＣ分離株を、主要ＣＦ（ＣＦＡ／Ｉ、ＣＦＡ／ＩＩ［ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３］、ＣＦＡ／ＩＶ［ＣＳ４、ＣＳ５、ＣＳ６］）および様々なマイナーＣＦ（ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１３、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１８、ＣＳ１９、ＣＳ２０、ＣＳ２１およびＣＳ３０）をコードする標的遺伝子を検出するプライマーを用いて、モノプレックスまたはマルチプレックスＰＣＲでさらに試験した（以下の表３）。
【００７７】
参考株を、特定のＣＦの陽性対照として利用した。粗細菌溶菌液を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で各ＥＴＥＣ分離株の５つのプールされたコロニーを１０分間煮沸して得、次いで、８０００×ｇで５分間遠心分離して細胞デブリから上清中のテンプレートＤＮＡを分離した。ＰＣＲを、１０ｍｍｏｌ／Ｌのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合物、３０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、１×反応緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ）、１ＵのＴａｑポリメラーゼ（ＧｏＴａｇ：Ｐｒｏｍｅｇａ（商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）および１μＬのテンプレートＤＮＡを含有する、２５μＬ反応液中の全細菌ＤＮＡを用いて行った。プライマーを、以下の表３に示す濃度で使用した。非特異的増幅を防止するために、「ホットスタート」技術を使用した。これは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添加する前に、反応混合物を９４℃に５分間余熱することを含む。試料を、各サイクルが９４℃で９０秒の変性、特定のプライマーアニーリング温度で３０秒、６８℃で６０秒の鎖伸長、および７２℃で５分の最終伸長を含む３５サイクルで増幅した。ＰＣＲ産物を、２．０％アガロースで電気泳動し、臭化エチジウムで染色し、アンプリコンを、増幅産物の予想サイズに基づき同定し、参考株のアンプリコンと比較した。
【００７８】
分離株を、特定の抗Ｏ−抗血清を用いて凝集させた。分離株のサブセットを、スウェーデンのヨーテボリ大学で試験して、モノクローナル抗体を用いてＣＦの表現型発現を評価した。
【００７９】
【表３】
2021519789.tif 000005
2021519789.tif 000006
2021519789.tif 000007
Ｃｆｓ：定着因子；Ｍｎ＝モノプレックスＰＣＲ；Ｍｔ＝マルチプレックスＰＣＲ
【００８０】
データ解析
解析は、単一のＥＴＥＣ毒素／ＣＦ遺伝子型パターンを有するＥＴＥＣ症例に限定された。ＥＴＥＣ  ＣＦの保有率を、ＥＴＥＣ毒素プロファイル、地域および領域による層別解析においてパーセンテージで示した。ＥＴＥＣ毒素とＣＦ遺伝子型とＭＳＤとの間の関連の強固性を、Ｆｉｒｔｈのペナルティ尤度方式を適用しながら、アウトカムが症例対照ステータス（ＭＳＤ）であり、独立変数（共変量）が子供のＥＴＥＣが特異的なＣＦＡを有するか否か（いいえまたははい）である条件付ロジスティック回帰モデルを用いて、調べた。一致オッズ比（ＯＲ）および対応する９５％信頼区間（ＣＩ）を、これらのモデルから得た。プールされた、地域特異性の解析を行った。地域全体のＯＲの異質性を、異質性のためのカイ二乗検定を用いて調べた。ｐ値≦０．０５を有意とみなした。データを、ＳＰＳＳバージョン２３（ＩＢＭ（商標）Ｉｎｃ．）およびＳＡＳ統計ソフトウェアバージョン９．４（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（商標）Ｉｎｃ．Ｃａｙ、ＮＣ、ＵＳＡ）を用いて解析した。
【００８１】
実施例２．ＭＳＤ症例および対照からのＥＴＥＣ中の主要ＣＦ
以下の表４は、ＣＦＡ／ＩおよびＣＳ１〜ＣＳ６を含む主要ＣＦ抗原を有するＥＴＥＣ株の割合を概説しており、データは国別、大陸別および毒素遺伝子型別で示されている。全体で、５４８個のＳＴのみおよびＬＴ／ＳＴ株の３６３個（６６．２％）が、主要ＣＦ抗原をコードし、２０．４％がＣＦＡ／Ｉをコードし、１４．１％がＣＦＡ／ＩＩをコードし（すなわち、ＣＳ３単独またはＣＳ１もしくはＣＳ２と組み合わせて）、３１．８％がＣＦＡ／ＩＶをコードした（すなわちＣＳ６単独またはＣＳ４もしくはＣＳ５と組み合わせて）。ＬＴのみの分離株中で一般に観察された唯一の主要ＣＦは、ＣＳ６のみであり、これは、２５８個のＬＴのみの株の４４個で記録された（１７．１％）。２５８個のＬＴのみの株の３個のみ（１．２％）が、ＣＦＡ／ＩまたはＣＦＡ／ＩＩをコードした。
【００８２】
主要ＣＦをコードするとＰＣＲにより示されたＭＳＤ症例からの１２３個のＥＴＥＣ分離株のサブセット中で、９６個が、ドットブロット免疫アッセイにより検出されたＣＦ表面抗原を表現型的に発現した。これらは、２４／２６ＣＦＡ／Ｉ（９２．３％）、４／７ＣＳ１（５７．１％）１０／１１ＣＳ２（９０．９％）、１３／１７ＣＳ３（７６．５％）、１９／２３ＣＳ５（８２．６％）および２６／３９ＣＳ６（６６．７％）分離株を含み、ＣＳ４をコードする分離株は試験しなかった。
【００８３】
【表４】
2021519789.tif 000008
2021519789.tif 000009
2021519789.tif 000010
2021519789.tif 000011
2021519789.tif 000012
ａＣＦＡ／ＩＩ株は、ＣＳ３を単独で、またはＣＳ１もしくはＣＳ２のいずれかと組み合わせてコードすると定義されるが、ＣＳ１とＣＳ２の両方との組み合わせは絶対にない。ＣＳ３なしでＣＳ１をコードする非常に希少な分離株が報告された。１９ＧＥＭＳで回収されたこの性質の希少なＣＦは、この表には含まれない。
ｂＣＦＡ／ＩＶ株は、ＣＳ６を単独で、またはＣＳ４もしくはＣＳ５のいずれかと組み合わせてコードすると定義されるが、ＣＳ４とＣＳ５の両方との組み合わせは絶対にない。ＣＳ６なしでＣＳ５をコードする非常に希少な分離株が報告された。ＧＥＭＳにおいて回収されたわずかなこのような分離株はこの表に含まれない。
【００８４】
実施例３．主要ＣＦを欠くＥＴＥＣ症例分離株中のマイナーＣＦ
ＳＴのみおよびＬＴ／ＳＴ株の３３．８％およびＬＴのみの株の約７５．２％が、主要ＣＦをコードしないことが認識され、以下の特徴付けられたマイナーＣＦ抗原：ＣＳ７、ＣＳ１２、ＣＳ１３、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１８、ＣＳ１９、ＣＳ２０、ＣＳ２１またはＣＳ３０の１つを単独でコードするこれらの分離株の割合を調査した。主要ＣＦの不在下でこれらのマイナーＣＦのうち１つをコードする分離株を有し、かつこの毒素遺伝子型の症例分離株全体の≧５．０％を占める、ＥＴＥＣ  ＭＳＤ症例の割合（表５）を決定した。ＳＴのみのＥＴＥＣを含むＭＳＤ症例中で、ＣＳ１４のみが、５８のＳＴのみの症例（１９．９％）において同定され、≧５％の保有率に達し（表５）；主要ＣＦを欠くＬＴ／ＳＴ分離株を有する８１症例の７例（２．７％）もＣＳ１４を単独でコードした。単一のＣＳとしてコードされた場合、他のマイナーＣＳ抗原はＳＴのみおよびＬＴ／ＳＴ分離株中でまれであった（＜５％）。以下の表５を参照のこと。
【００８５】
【表５】
2021519789.tif 000013
ａ１５０２個のＳＴのみ、さらにＬＴ／ＳＴ株のパーセント；ｂ全２５８個のＬＴのみの株のパーセント；ｃ２５２個のＬＴのみの株のパーセント（６株が試験用の−７０℃の貯蔵から回収できなかった）；ｃ１２２５個のＬＴのみの株のパーセント；ｄ全２９１個のＳＴのみの株のパーセント；ｅ２９０個のＳＴのみの株のパーセント（１株が試験用の−７０℃の貯蔵から回収できなかった）；ｅ１２６６個のＳＴのみの株のパーセント；ｆ全２５７ＬＴ／ＳＴ株のパーセント；ｇ２５５個のＬＴ／ＳＴ株のパーセント（２株が試験用の−７０℃の貯蔵から回収できなかった）；ｇ１２３６個のＬＴ／ＳＴ株のパーセント；ｈ全５４８個のＳＴのみ、さらにＬＴ／ＳＴ株のパーセント；ｉ５４５個のＳＴのみ、さらにＬＴ／ＳＴ株のパーセント（３株が試験用の−７０℃の貯蔵から回収できなかった）
【００８６】
実施例４．ＣＦ毒素遺伝子型とＭＳＤの間の関連の強固性を評価するための条件付ロジスティック回帰解析
単一のマイナーＣＦをコードするが主要ＣＦをコードしないＳＴのみおよびＬＴ／ＳＴ  ＥＴＥＣ株中で、ＣＳ１４のみが、ＭＳＤに有意に関連していた（表６）。
【００８７】
【表６】
2021519789.tif 000014
2021519789.tif 000015
2021519789.tif 000016
ａＧＥＭＳ地域全体で有意な異質性はなかった（異質性についてのカイ二乗検定による）；ｂ１ＳＴ−ＣＳ３のみは、バングラデシュにおいて検出されなかった；ｂ２ＳＴ−ＣＳ４およびＳＣ６はガンビア、モザンビークおよびバングラデシュにおいて見出されなかった；ｂ３ＳＴ−ＣＳ７のみは、ガンビアおよびインドに限定された；ｂ４ＳＴ−ＣＳ１２のみは、モザンビークにおいて見出されず、ＬＴのみ−ＣＳ１２は、ガンビアにおいて見出されなかった；ｂ５ＳＴ−ＣＳ１３のみは、マリおよびパキスタンにおいて見出されなかった；ｂ６ＬＴのみ−ＣＳ１４のみはマリおよびバングラデシュにおいて見出されなかった；ｂ７ＳＴ−ＣＳ１７のみはモザンビークおよびバングラデシュにおいてのみ見出された；ｂ８ＳＴ−ＳＣ１８のみはパキスタンにおいて見出されず、ＬＴのみ−ＣＳ１８のみはマリ、ケニヤおよびパキスタンにおいてのみ見出された；ｂ９ＳＴ−ＣＳ１９のみはマリ、インドおよびバングラデシュにおいて検出され、ＬＴのみ−ＣＳ１９はガンビアおよびインドにおいてのみ見出された；ｂ１０ＬＴのみ−ＣＳ２１のみは、ケニヤおよびパキスタンにおいてのみ検出された；ｃ主要定着因子、例えば、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＦＡ／ＩＩ、ＣＦＡ／ＩＶおよびすべての他のマイナー定着因子を共にコードする株を除外する。
【００８８】
実施例５．フレクスナー赤痢菌１ｂの欠失変異体
野生型（ＷＴ）フレクスナー赤痢菌１ｂ株１０３８４９または２０４５８４から分離されたゲノムＤＮＡを、プライマーＷｕ０４８（ＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＡＧＴ；配列番号４１）およびＷｕ０４９（ＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＴＧＣＧＧＴＴＡＣＧ；配列番号４２）と共にテンプレートとして使用して、無傷のｇｕａＢＡ遺伝子座を１．８ｋｂのバンドとして増幅した。ΔｇｕａＢＡ変異誘導体（２、７、９、１４、２、８、１１、１２および１３）からのゲノムＤＮＡを用いる増幅は、９００ｂｐの欠失を反映する８９１ｂｐのバンドを生じる。ＮＴＣ：テンプレート対照なし。結果については図１を参照のこと。ＰＣＲによるｇｕａＢＡ遺伝子座のこの増幅は、フレクスナー赤痢菌１ｂの２個の分離株の欠失を確認する。
【００８９】
フレクスナー赤痢菌１ｂΔｇｕａＢＡ株でのグアニン栄養要求性を確認するために、野生型または変異誘導体株を、０．０００５％グアニンを含む（図２のパネルＢ、ＤおよびＦ）または含まない（図２のパネルＡ、ＣおよびＥ）０．５％カザミノ酸を含む最小Ｍ９培地で増殖した。図２の結果は、野生型フレクスナー赤痢菌１ｂ株１０３８４９および２０４５８４が、付加されるグアニンを含むまたは含まない培地で増殖することを示している（図２Ａおよび図２Ｂ参照のこと）。フレクスナー赤痢菌１ｂ２０４５８４ΔｇｕａＢＡ変異誘導体（２、８、１１、１２および１３）は、付加されるグアニンのない培地で増殖せず（図２Ｃおよび図２Ｄを参照のこと）、フレクスナー赤痢菌１ｂ２０４５８４ΔｇｕａＢＡ変異誘導体（２、７、９、１０および１４）は、付加されるグアニンのない培地で増殖しない（図２Ｅおよび図２Ｆを参照のこと）。したがって、フレクスナー赤痢菌２ａワクチン株ＣＶＤ１２０８Ｓ（これは同じｇｕａＢＡ欠失を持つ）は、対照株となり得、付加されるグアニンのない培地で増殖しない（図２Ａ）。
【００９０】
フレクスナー赤痢菌１ｂΔｇｕａＢＡワクチン株での細胞内複製欠損を確認するために、野生型または変異誘導体株を、ＨＴ−２９細胞単層に９０分間適用し、ゲンタマイシンで洗浄し、さらに３０分（０時間）または２時間インキュベートした。細胞を溶菌し、細胞内細菌を定量した。各株について三重ウェルからの平均ＣＦＵ／ｍＬを図３に示す。野生型赤痢菌感染症の特徴は、宿主細胞内で複製する能力である。これらのデータは、ｇｕａＢＡワクチン株が、宿主細胞中で複製できず、したがってその病原性が弱毒化されていることを実証している。
【００９１】
実施例６．赤痢菌ワクチン株
Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７（１２）：６６４０〜６６４５、２０００に記載のラムダｒｅｄ系を用いて、２個の異なるフレクスナー赤痢菌１ｂ株に３つの欠失変異を導入した（これは任意のフレクスナー赤痢菌１ｂ株において行われ得る）。この欠失系を用いて、欠失される領域に隣接するＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、ＦＲＴ配列に隣接する抗生物質耐性コード遺伝子に融合した。（アクセサリープラスミドをＤａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒから得た）。この断片を、ゲノムコピーを有する断片の隣接領域間の組換えを触媒するヘルパープラスミドを含有するフレクスナー赤痢菌１ｂ中に、電気穿孔する。その結果は、欠失の標的である配列（例えば、ｇｕａＢＡまたはｓｅｎもしくはｓｅｔ）の代わりに、ゲノム中にＦＲＴ−抗生物質耐性遺伝子−ＦＲＴを有するフレクスナー赤痢菌である。抗生物質耐性マーカーを次いで、ＦＲＴ部位間の組換えを触媒する第２のヘルパープラスミドを導入することにより、欠失させる。その結果は、抗生物質耐性マーカーを含まないｇｕａＢＡ、ｓｅｎおよびｓｅｔでの欠失（３つの個別のステップで行われた）を有するフレクスナー赤痢菌１ｂである。
【００９２】
実施例７．ワクチン生産方法
生弱毒化赤痢菌ワクチン（フレクスナー赤痢菌１ｂ）を、ｇｕａＢＡオペロンで欠失を含有するように操作した。エンテロトキシンをコードする遺伝子ｓｅｎまたはｓｅｔの欠失が赤痢菌株に加えられ得る。生弱毒化フレクスナー赤痢菌７ａワクチン株も、ｇｕａＢＡおよびｓｅｎでの欠失を有して操作され得る。欠失は、対立遺伝子交換を用いてまたはラムダｒｅｄ組換えを用いて野生型株に導入され得る。
【００９３】
ＥＴＥＣ定着因子ＣＳ１４をコードするオペロンを、野生型ＥＴＥＣ株からＰＣＲを用いて増幅し、市販のクローニングプラスミド（ｐＢＡＤ）中にクローニングした。Ｔｎ７系の改変は、ＭｃＫｅｎｚｉｅおよびＣｒａｉｇ（ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ２００６）により記載されている。その後、オペロンを、プラスミドｐＧＲＧ２５−ＰｍＬｐｐ中に、制限消化を用いてｐＢＡＤからクローニングした。プラスミドｐＧＲＧ２５−ＰｍＬｐｐは、ｍＬｐｐプロモーターが挿入されたｐＧＲＧ２５プラスミドの改変体である。ｍＬｐｐプロモーターは、下流にクローニングされた遺伝子の高レベルの恒常的発現を駆動する。
【００９４】
フレクスナー赤痢菌生弱毒化株ＣＶＤ１２０８ＳへのｐＧＲＧ２５−ＰｍＬｐｐ−ＣＳ１４の導入を行って、ｇｌｍＳの下流のａｔｔＴｎ７部位で赤痢菌染色体へのＣＳ１４をコードするオペロンの転位を促進した。ＣＶＤ１２０８Ｓ：：ＣＳ１４は、染色体領域を増幅するＰＣＲを用いて、および染色体の挿入を配列決定することにより確認された。ＣＳ１４はまた、同じ方法により生弱毒化赤痢菌ワクチン株のいずれかの染色体に挿入され得る。
【００９５】
ＣＳ１４を発現するＥＴＥＣの結合を阻害する抗体を誘導する第２の戦略において、構造的サブユニットをコードする遺伝子ｃｓｕＡを、下流で、先端アドヘシンをコードする遺伝子ｃｓｕＤとタンデムにクローニングした。ｃｓｕＡおよびｃｓｕＤ遺伝子は融合されない；各々は独立のプロモーターを含有し、これらは個々のタンパク質として転写および翻訳される。目標は、構造的サブユニットの存在下で先端アドヘシン発現を安定化させることであった。２個の遺伝子を、遺伝子発現がアラビノースの添加により誘導される発現プラスミドｐＢＡＤ中にクローニングした。プラスミドｐＢＡＤ−ＣｓｕＡ２Ｄを、電気穿孔により赤痢菌ワクチン株ＣＶＤ１２０８Ｓ中に導入した。
【００９６】
実施例８．ワクチンの使用方法
現在、赤痢菌またはＥＴＥＣに対する認可ワクチンは存在しない。他の単一病原体ワクチン候補は、様々な治験段階にあるが、本ワクチンにより提供される広範なカバー率を提供できるものはない。本発明によるワクチンに対して、５つの推定主要ワクチン市場が企図される：
ａ．旅行者腸内ワクチン：本発明によるワクチンは、下痢症を引き起こす生物への暴露の可能性が高い地域に旅行する対象に経口投与される。ワクチンを使用するために、２用量が旅行前に約１０日離して投与され得る。
ｂ．赤痢菌のリスクを有する特定の集団において疾患を予防するためのワクチン：最適未満の衛生状態の保護施設、刑務所、全寮制の学校、クルーズ船、デイキャンプまたはデイケアセンターにおける個人は、感染用量が非常に低い（＜１００ＣＦＵで感染を引き起こす場合がある）ため人から人へ簡単に伝染し得る、赤痢菌のリスクを有する。特定の性的行為（例えば、男性と性行為を持つ男性（ＭＳＭ））に関与するさらなる集団は、赤痢菌の広く循環しているＭＤＲ株によるリスクを有する。ワクチンを使用するために、例えば、１用量（サイズ、暴露、全般的な健康、年齢または他の要因に応じて、約１０８ＣＦＵ〜約５×１０１０ＣＦＵ、有利には約１０７ＣＦＵ〜約１０１１ＣＦＵ、好ましくは約１０８ＣＦＵ〜約５×１０１０ＣＦＵ、もしくは約５×１０８ＣＦＵ〜約１０１０ＣＦＵ、もしくは約１０８ＣＦＵ〜約１０９ＣＦＵ、または施術者により決定された好適な任意の用量）が、暴露前または施設への収容前に投与される。
ｃ．発展途上国における腸疾患を予防するためのワクチン：発展途上国の子供の間で疾患負荷および死亡率を低下させるために、本発明の広域スペクトラムの赤痢菌／ＥＴＥＣ混合ワクチンは、対費用効果が高く、実用的な介入手段であると期待され、したがって、ＧＡＶＩ  Ａｌｌｉａｎｃｅにより採用が検討される可能性が高い。この使用については、１用量（サイズ、暴露、全般的な健康、年齢または他の要因に応じて、約１０８ＣＦＵ〜約５×１０１０ＣＦＵ、有利には約１０７ＣＦＵ〜約１０１１ＣＦＵ、好ましくは約１０８ＣＦＵ〜約５×１０１０ＣＦＵ、もしくは約５×１０８ＣＦＵ〜約１０１０ＣＦＵ、もしくは約１０８ＣＦＵ〜約１０９ＣＦＵ、または施術者により決定された好適な任意の用量）が、５歳未満のすべての子供に投与される。乳児においては、３用量レジメンを、各１用量を生後１０週、１４週および９か月で、投与することが推奨される。
ｄ．自然なアウトブレイクの場合での使用のためのワクチン：志賀毒素発現ソンネ赤痢菌株の最近のアウトブレイクに例証されるように、これらの腸病原体は、それらの病原性の可能性を高める新しい病原性因子を獲得できる。広域スペクトラムのワクチンは、病原性因子の新しい組み合わせを発現し得る新たに出現した株に対する防御を提供する可能性を有する。
ｅ．カテゴリーＢバイオテロ防御ワクチン：米国政府は、これらの病原体による意図的攻撃の場合に広範な年齢範囲の個人での使用のための安全かつ有効な予防手段の入手に関心がある。生物テロ防御において、または下痢症の自然発生によるアウトブレイクでの使用のために、１用量（サイズ、暴露、全般的な健康、年齢または他の要因に応じて、約１０８ＣＦＵ〜約５×１０１０ＣＦＵ、有利には約１０７ＣＦＵ〜約１０１１ＣＦＵ、好ましくは約１０８ＣＦＵ〜約５×１０１０ＣＦＵ、もしくは約５×１０８ＣＦＵ〜約１０１０ＣＦＵ、もしくは約１０８ＣＦＵ〜約１０９ＣＦＵ、または施術者により決定された好適な任意の用量）が、暴露前に投与される。
【００９７】
参考文献
以下または本明細書を通じて列挙された参考文献はすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
１． Ｋｏｔｌｏｆｆ  ＫＬ，  Ｎａｔａｒｏ  ＪＰ，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｄｅｒ  ＷＣ，  Ｎａｓｒｉｎ  Ｄ，  Ｆａｒａｇ  ＴＨ，  Ｐａｎｃｈａｌｉｎｇａｍ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｕｒｄｅｎ  ａｎｄ  ａｅｔｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｄｉａｒｒｈｏｅａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｉｎｆａｎｔｓ  ａｎｄ  ｙｏｕｎｇ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ  （ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｅｎｔｅｒｉｃ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｓｔｕｄｙ，  ＧＥＭＳ）：  ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ，  ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙ．  Ｌａｎｃｅｔ．  ２０１３；  ３８２（９８８８）：２０９−２２．
２． Ｈｙａｍｓ  ＫＣ，  Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ  ＡＬ，  Ｍｅｒｒｅｌｌ  ＢＲ，  Ｒｏｚｍａｈｅｌ  Ｒ，  Ｅｓｃａｍｉｌｌａ  Ｊ，  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＳＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｒｒｈｅａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｄｅｓｅｒｔ  Ｓｈｉｅｌｄ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  １９９１；  ３２５：１４２３−８．
３． Ｌｅｖｉｎｅ  ＭＭ．  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｈａｔ  ｃａｕｓｅ  ｄｉａｒｒｈｅａ：  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ，  ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ，  ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ，  ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ，  ａｎｄ  ｅｎｔｅｒｏａｄｈｅｒｅｎｔ．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  １９８７；  １５５：３７７−８９．
４．Ｌｅｖｉｎｅ  ＭＭ，  Ｒｉｓｔａｉｎｏ  Ｐ，  Ｍａｒｌｅｙ  Ｇ，  Ｓｍｙｔｈ  Ｃ，  Ｋｎｕｔｔｏｎ  Ｓ，  Ｂｏｅｄｅｋｅｒ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｌｉ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  １  ａｎｄ  ３  ｏｆ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＩＩ−  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９８４；  ４４：４０９−２０．
５． Ｓｉｎｃｏｃｋ  ＳＡ，  Ｈａｌｌ  ＥＲ，  Ｗｏｏｄｓ  ＣＭ，  Ｏ’Ｄｏｗｄ  Ａ，  Ｐｏｏｌｅ  ＳＴ，  ＭｃＶｅｉｇｈ  ＡＬ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｄｈｅｓｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２０１６；  ３４（２）：２８４−９１．
６．Ｌｕｎｄｇｒｅｎ  Ａ，  Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ  Ｌ，  Ｃａｒｌｉｎ  Ｎ，  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  Ｊ，  Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  Ｂ，  Ｈａｒｔｆｏｒｄ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｒａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  （ＥＴＥＣ）  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ａｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｔｏｇｅｔｈｅｒ  ｗｉｔｈ  ｄｍＬＴ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｎ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ．  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２０１４；  ３２（５２）：７０７７−８４．
７． Ｔｕｒｎｅｒ  ＡＫ，  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ＪＣ，  Ｂｅａｖｉｓ  ＪＣ，  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  Ｊ，  Ｇｅｗｅｒｔ  Ｃ，  Ｒａｎｄａｌｌ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｉｘ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｔｏｘｉｎ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｂ．  Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１１；  １８（１２）：２１２８−３５．
８． Ｂａｒｒｙ  ＥＭ，  Ａｌｔｂｏｕｍ  Ｚ，  Ｌｏｓｏｎｓｋｙ  Ｇ，  Ｌｅｖｉｎｅ  ＭＭ．  Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｉｍｂｒｉａｅ  ａｎｄ  ｍｕｔａｎｔ  ＬＴ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｉｎｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２００３；  ２１（５−６）：３３３−４０．
９． Ｄｕａｎ  Ｑ，  Ｌｕ  Ｔ，  Ｇａｒｃｉａ  Ｃ，  Ｙａｎｅｚ  Ｃ，  Ｎａｎｄｒｅ  ＲＭ，  Ｓａｃｋ  ＤＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  Ｔａｇ−Ｌｅｓｓ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ｆｕｓｉｏｎ  ３ｘＳＴａＮ１２Ｓ−ｍｎＬＴＲ１９２Ｇ／Ｌ２１１Ａ  ａｎｄ  ＣＦＡ／Ｉ／ＩＩ／ＩＶ  ＭＥＦＡ  （Ｍｕｌｔｉｅｐｉｔｏｐｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ）  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ７  Ａｄｈｅｓｉｎｓ  （ＣＦＡ／Ｉ，  ＣＳ１−ＣＳ６）  ａｎｄ  Ｂｏｔｈ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ  （ＬＴ，  ＳＴａ）  ｏｆ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  （ＥＴＥＣ）．  Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１８；  ９：１１９８．  ｄｏｉ：  １０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１８．０１１９８．  ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；％２０１８．：１１９８．
１０． Ｔａｘｔ  ＡＭ，  Ｄｉａｚ  Ｙ，  Ａａｓｌａｎｄ  Ｒ，  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  ＪＤ，  Ｎａｔａｒｏ  ＪＰ，  Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｏｗａｒｄｓ  Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  Ｈｅａｔ−Ｓｔａｂｌｅ  Ｔｏｘｉｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ２０１６；  ８４（４）：１２３９−４９．
１１． Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＪＢ，  Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ  Ｒ，  Ｓｚｕ  ＳＣ．  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ：  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ：  ｓｅｒｕｍ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｓ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏ  ｃｏｎｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｂｙ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｏｃｕｌｕｍ．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  １９９５；  １７１（６）：１３８７−９８．
１２． ＭｃＫｅｎｚｉｅ  Ｒ，  Ｐｏｒｔｅｒ  ＣＫ，  Ｃａｎｔｒｅｌｌ  ＪＡ，  Ｄｅｎｅａｒｉｎｇ  Ｂ，  Ｏ’Ｄｏｗｄ  Ａ，  Ｇｒａｈｅｋ  ＳＬ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｉｍｂｒｉａｅ  ＣＳ１７  ａｎｄ  ＣＳ１９．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２０１１；  ２０４（１）：６０−４．
１３． Ｓｔｅｉｎｓｌａｎｄ  Ｈ，  Ｖａｌｅｎｔｉｎｅｒ−Ｂｒａｎｔｈ  Ｐ，  Ｐｅｒｃｈ  Ｍ，  Ｄｉａｓ  Ｆ，  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＴＫ，  Ａａｂｙ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｉｎ  ａ  ｃｏｈｏｒｔ  ｏｆ  ｙｏｕｎｇ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｉｎ  Ｇｕｉｎｅａ−Ｂｉｓｓａｕ．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２００２；  １８６（１２）：１７４０−７．
１４． Ｍａｎｓｏｕｒ  Ａ，  Ｓｈａｈｅｅｎ  ＨＩ，  Ａｍｉｎｅ  Ｍ，  Ｈａｓｓａｎ  Ｋ，  Ｓａｎｄｅｒｓ  ＪＷ，  Ｒｉｄｄｌｅ  ＭＳ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｂｉｒｔｈ  ｃｏｈｏｒｔ  ｏｆ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｉｎ  ｒｕｒａｌ  Ｅｇｙｐｔ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１４；  ５２（２）：５８７−９１．
１５．Ｇａａｓｔｒａ  Ｗ，  Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ  ＡＭ．  Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  （ＥＴＥＣ）．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９６；  ４（１１）：４４４−５２．
１６． ｄｅｌ  Ｃａｎｔｏ  Ｆ．，  Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  Ｐ，  Ｃａｎｔｅｒｏ  Ｌ，  Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ  Ｊ，  Ｂｌａｎｃｏ  ＪＥ，  Ｂｌａｎｃｏ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｎｏｎｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｈｉｌｅａｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｎｄ  ｔＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｓｌａｎｄｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１１；  ４９（９）：３１９８−２０３．
１７．ｄｅｌ  Ｃａｎｔｏ  Ｆ．，  Ｏ’Ｒｙａｎ  Ｍ，  Ｐａｒｄｏ  Ｍ，  Ｔｏｒｒｅｓ  Ａ，  Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ  Ｄ，  Ｃａｄｉｚ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−Ｕｓｈｅｒ  Ｐｉｌｉ  Ｌｏｃｉ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１７；  ６：２００．  ｄｏｉ：  １０．３３８９／ｆｃｉｍｂ．２０１６．００２００．  ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；％２０１６．：２００．
１８． ｄｅｌ  Ｃａｎｔｏ  Ｆ．，  Ｂｏｔｋｉｎ  ＤＪ，  Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  Ｐ，  Ｐｏｐｏｖ  Ｖ，  Ｒｕｉｚ−Ｐｅｒｅｚ  Ｆ，  Ｎａｔａｒｏ  ＪＰ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｌｉ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ２３，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｄｈｅｓｉｎ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ２０１２；  ８０（８）：２７９１−８０１．
１９． ｖｏｎ  Ｍｅｎｔｚｅｒ  Ａ，  Ｔｏｂｉａｓ  Ｊ，  Ｗｉｋｌｕｎｄ  Ｇ，  Ｎｏｒｄｑｖｉｓｔ  Ｓ，  Ａｓｌｅｔｔ  Ｍ，  Ｄｏｕｇａｎ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＣＳ３０  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  （ＥＴＥＣ）．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２０１７；  ７（１）：１２５１４−７４３．
２０．Ｌｅｖｉｎｅ  ＭＭ，  Ｋｏｔｌｏｆｆ  ＫＬ，  Ｎａｔａｒｏ  ＪＰ，  Ｍｕｈｓｅｎ  Ｋ．  Ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｅｎｔｅｒｉｃ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  （ＧＥＭＳ）：  Ｉｍｐｅｔｕｓ，  Ｒａｔｉｏｎａｌｅ，  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２０１２；  ５５  Ｓｕｐｐｌ  ４：Ｓ２１５−２４．  ｄｏｉ：  １０．１０９３／ｃｉｄ／ｃｉｓ７６１．：Ｓ２１５−Ｓ２２４．
２１． Ｆａｒａｇ  ＴＨ，  Ｎａｓｒｉｎ  Ｄ，  Ｗｕ  Ｙ，  Ｍｕｈｓｅｎ  Ｋ，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｄｅｒ  ＷＣ，  Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｏｍｅ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃ，  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｕｍｐｔｉｏｎｓ  Ｔｈａｔ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｅｎｔｅｒｉｃ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  （ＧＥＭＳ）．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２０１２；  ５５  Ｓｕｐｐｌ  ４：Ｓ２２５−３１．  ｄｏｉ：  １０．１０９３／ｃｉｄ／ｃｉｓ７８７．：Ｓ２２５−Ｓ２３１．
２２． Ｐａｎｃｈａｌｉｎｇａｍ  Ｓ，  Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｍ，  Ｈｏｓｓａｉｎ  Ａ，  Ｍａｎｄｏｍａｎｄｏ  Ｉ，  Ｏｃｈｉｅｎｇ  Ｂ，  Ｏｕｎｄｏ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＧＥＭＳ−１  Ｃａｓｅ／Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｔｕｄｙ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２０１２；  ５５  Ｓｕｐｐｌ  ４：Ｓ２９４−３０２．  ｄｏｉ：  １０．１０９３／ｃｉｄ／ｃｉｓ７５４．：Ｓ２９４−Ｓ３０２．
２３． Ｋｏｔｌｏｆｆ  ＫＬ，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｄｅｒ  ＷＣ，  Ｎａｓｒｉｎ  Ｄ，  Ｎａｔａｒｏ  ＪＰ，  Ｆａｒａｇ  ＴＨ，  ｖａｎ  ＥＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｅｎｔｅｒｉｃ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  （ＧＥＭＳ）  ｏｆ  Ｄｉａｒｒｈｅａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｉｎｆａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｓｅ／Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｔｕｄｙ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２０１２；  ５５  Ｓｕｐｐｌ  ４：Ｓ２３２−４５．  ｄｏｉ：  １０．１０９３／ｃｉｄ／ｃｉｓ７５３．：Ｓ２３２−Ｓ２４５．
２４． Ｖｉｄａｌ  Ｒ，  Ｖｉｄａｌ  Ｍ，  Ｌａｇｏｓ  Ｒ，  Ｌｅｖｉｎｅ  Ｍ，  Ｐｒａｄｏ  Ｖ．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｒｒｈｅａｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００４；  ４２（４）：１７８７−９．
２５．Ｒｏｄａｓ  Ｃ，  Ｉｎｉｇｕｅｚ  Ｖ，  Ｑａｄｒｉ  Ｆ，  Ｗｉｋｌｕｎｄ  Ｇ，  Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ  ＡＭ，  Ｓｊｏｌｉｎｇ  Ａ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｎｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００９；  ４７（４）：１２１８−２０．
２６． Ｖｉｄａｌ  ＲＭ，  Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  Ｐ，  Ｂａｋｅｒ  Ｋ，  Ｌａｇｏｓ  Ｒ，  Ｅｓｐａｒｚａ  Ｍ，  Ｌｉｖｉｏ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｐｒｅｖａｌｅｎｔ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｅａｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．  Ｄｉａｇｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２００９；  ６５（３）：２１７−２３．
２７． Ｓｊｏｌｉｎｇ  Ａ，  Ｗｉｋｌｕｎｄ  Ｇ，  Ｓａｖａｒｉｎｏ  ＳＪ，  Ｃｏｈｅｎ  ＤＩ，  Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ  ＡＭ．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００７；  ４５（１０）：３２９５−３０１．
２８．Ｐｉｃｈｅｌ  ＭＧ，  Ｂｉｎｓｚｔｅｉｎ  Ｎ，  Ｑａｄｒｉ  Ｆ，  Ｇｉｒｏｎ  ＪＡ．  Ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｌｏｎｇｕｓ  ｐｉｌｕｓ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｏｘｉｎ  ｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｍｏｎｇ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｉｎ  Ａｒｇｅｎｔｉｎａ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００２；  ４０（２）：６９４−７．
２９． ＭｃＫｅｎｚｉｅ  Ｒ，  Ｐｏｒｔｅｒ  ＣＫ，  Ｃａｎｔｒｅｌｌ  ＪＡ，  Ｄｅｎｅａｒｉｎｇ  Ｂ，  Ｏ’Ｄｏｗｄ  Ａ，  Ｇｒａｈｅｋ  ＳＬ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｉｍｂｒｉａｅ  ＣＳ１７  ａｎｄ  ＣＳ１９．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２０１１；  ２０４（１）：６０−４．
３０．Ｑａｄｒｉ  Ｆ，  Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ  ＡＭ，  Ｆａｒｕｑｕｅ  ＡＳ，  Ｓａｃｋ  ＲＢ．  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ，  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００５；  １８（３）：４６５−８３．
３１．Ｇｏｎｚａｌｅｓ  Ｌ，  Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｓ，  Ｚａｍｂｒａｎａ  Ｓ，  Ｉｎｉｇｕｅｚ  Ｖ，  Ｗｉｋｌｕｎｄ  Ｇ，  Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ  ＡＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｄｕｒｉｎｇ  ａ  ４−ｙｅａｒ  ｐｅｒｉｏｄ  （２００７  ｔｏ  ２０１０）  ｉｎ  Ｂｏｌｉｖｉａ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１３；  ５１（４）：１２１９−２５．
３２．Ｔａｃｋｅｔ  ＣＯ，  Ｍａｎｅｖａｌ  ＤＲ，  Ｌｅｖｉｎｅ  ＭＭ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｆｉｍｂｒｉａｌ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５９：Ｈ４．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９８７；  ５５：１０６３−９．
３３．Ｇｉｒｏｎ  ＪＡ，  Ｌｅｖｉｎｅ  ＭＭ，  Ｋａｐｅｒ  ＪＢ．  Ｌｏｎｇｕｓ：  ａ  ｌｏｎｇ  ｐｉｌｕｓ  ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９４；  １２（１）：７１−８２．
３４．Ｇｉｒｏｎ  ＪＡ，  Ｖｉｂｏｕｄ  ＧＩ，  Ｓｐｅｒａｎｄｉｏ  Ｖ，  Ｇｏｍｅｚ−Ｄｕａｒｔｅ  ＯＧ，  Ｍａｎｅｖａｌ  ＤＲ，  Ａｌｂｅｒｔ  ＭＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｏｎｇｕｓ  ｐｉｌｕｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｇｅｎｅ  （ｌｎｇＡ）  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ，  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｔｙｐｅｓ，  ａｎｄ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９９５；  ６３：４１９５−８．
３５．Ｇｕｅｖａｒａ  ＣＰ，  Ｌｕｉｚ  ＷＢ，  Ｓｉｅｒｒａ  Ａ，  Ｃｒｕｚ  Ｃ，  Ｑａｄｒｉ  Ｆ，  Ｋａｕｓｈｉｋ  ＲＳ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＣＳ２１  ｐｉｌｕｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｏ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｎｄｅｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ２０１３；  １５９（Ｐｔ  ８）：１７２５−３５．
３６．Ｎｕｃｃｉｏ  ＳＰ，  Ｂａｕｍｌｅｒ  ＡＪ．  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ／ｕｓｈｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｐａｔｈｗａｙ：  ｆｉｍｂｒｉａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｇｏｅｓ  Ｇｒｅｅｋ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００７；  ７１（４）：５５１−７５．
３７． Ｍａｄｈａｖａｎ  ＴＰ，  Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ  Ｈ．  Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１５；  ９０：１５５−９７．  ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｂｓ．ａａｍｂｓ．２０１４．０９．００３．  Ｅｐｕｂ；％２０１４  Ｎｏｖ  １２．：１５５−９７．
３８．Ｉｓｉｄｅａｎ  ＳＤ，  Ｒｉｄｄｌｅ  ＭＳ，  Ｓａｖａｒｉｎｏ  ＳＪ，  Ｐｏｒｔｅｒ  ＣＫ．  Ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ＥＴＥＣ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｏｎ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２０１１；  ２９（３７）：６１６７−７８．
３９．Ｂｌａｃｋｗｅｌｄｅｒ  ＷＣ，  Ｂｉｓｗａｓ  Ｋ，  Ｗｕ  Ｙ，  Ｋｏｔｌｏｆｆ  ＫＬ，  Ｆａｒａｇ  ＴＨ，  Ｎａｓｒｉｎ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｅｎｔｅｒｉｃ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  （ＧＥＭＳ）．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２０１２；  ５５  Ｓｕｐｐｌ  ４：Ｓ２４６−５３．  ｄｏｉ：  １０．１０９３／ｃｉｄ／ｃｉｓ７８８．：Ｓ２４６−Ｓ２５３．
４０．Ｆｉｒｔｈ  Ｄ．  Ｂｉａｓ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｅｓｔｉｍａｔｅｓ．  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｋａ．  １９９３；  ８０：２７−３８．
４１．Ｒｏｔｈｍａｎ  ＫＪ．  Ｎｏ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ  ａｒｅ  ｎｅｅｄｅｄ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ．  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ．  １９９０；  １（１）：４３−６．
４２．Ｓａｖｉｔｚ  ＤＡ，  Ｏｌｓｈａｎ  ＡＦ．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ  ｄａｔａ．  Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．  １９９５；  １４２（９）：９０４−８．
４３．Ｓａｖｉｔｚ  ＤＡ，  Ｏｌｓｈａｎ  ＡＦ．  Ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ｄａｔａ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｎｏ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：  ａ  ｒｅｐｌｙ  ｆｒｏｍ  Ｓａｖｉｔｚ  ａｎｄ  Ｏｌｓｈａｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．  １９９８；  １４７（９）：８１３−４．
４４．Ｐｅｒｎｅｇｅｒ  ＴＶ．  Ｗｈａｔ’ｓ  ｗｒｏｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ．  ＢＭＪ．  １９９８；  ３１６（７１３９）：１２３６−８．
４５．Ｅｖａｎｓ  ＤＪ，  Ｊｒ．，  Ｅｖａｎｓ  ＤＧ，  ＤｕＰｏｎｔ  ＨＬ，  Ｏｒｓｋｏｖ  Ｆ，  Ｏｒｓｋｏｖ  Ｉ．  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｂｙ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｒｒｈｅａ：  ｓｕｇｇｅｓｔｉｖｅ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９７７；  １７（１）：１０５−１１．
４６．Ｔｏｂｉａｓ  Ｊ，  ｖｏｎ  ＭＡ，  Ｌｏａｙｚａ  ＦＰ，  Ａｓｌｅｔｔ  Ｍ，  Ｐａｇｅ  ＡＪ，  Ｓｊｏｌｉｎｇ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＳ６  Ｄｉｆｆｅｒｓ  ｉｎ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  （ＥＴＥＣ）  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｅａｔ−Ｓｔａｂｌｅ  （ＳＴ）  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ  （ＳＴｈ  ａｎｄ  ＳＴｐ）．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．  ２０１６；  １１（４）：ｅ０１５２８９９．
４７．Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ  Ｐ，  Ｓｅｒｉｗａｔａｎａ  Ｊ，  Ｔａｙｌｏｒ  ＤＮ，  Ｃｈａｎｇｃｈａｗａｌｉｔ  Ｓ，  Ｓｍｙｔｈ  ＣＪ，  Ｔｗｏｈｉｇ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ，  ａｎｄ  ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ａ２  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９８６；  ５１（２）：６２６−３０．
４８．Ｅｖａｎｓ  ＤＧ，  Ｅｖａｎｓ  ＤＪ，  Ｊｒ．  Ｎｅｗ  ｓｕｒｆａｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＣＦＡ／ＩＩ）  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｆ  ｓｅｒｏｇｒｏｕｐｓ  Ｏ６  ａｎｄ  Ｏ８．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９７８；  ２１（２）：６３８−４７．
４９．Ｌｉｕ  Ｊ，  Ｐｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓ  ＪＡ，  Ｊｕｍａ  Ｊ，  Ｋａｂｉｒ  Ｆ，  Ｎｋｅｚｅ  Ｊ，  Ｏｋｏｉ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｃａｕｓｅｓ  ｏｆ  ｄｉａｒｒｈｏｅａ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ：  ａ  ｒｅａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＥＭＳ  ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙ．  Ｌａｎｃｅｔ．  ２０１６；  ３８８（１００５１）：１２９１−３０１．
５０．Ｌｅｖｉｎｅ  ＭＭ，  Ｆｅｒｒｅｃｃｉｏ  Ｃ，  Ｐｒａｄｏ  Ｖ，  Ｃａｙａｚｚｏ  Ｍ，  Ａｂｒｅｇｏ  Ｐ，  Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｌｏｗ  ｓｏｃｉｏｅｃｏｎｏｍｉｃ  ｌｅｖｅｌ  ｐｅｒｉｕｒｂａｎ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ｓａｎｔｉａｇｏ，  Ｃｈｉｌｅ．  Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．  １９９３；  １３８：８４９−６９．
５１． Ｐｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓ  ＪＡ，  Ｂａｂｊｉ  Ｓ，  Ｂｏｄｈｉｄａｔｔａ  Ｌ，  Ｇｒａｔｚ  Ｊ，  Ｈａｑｕｅ  Ｒ，  Ｈａｖｔ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｕｒｄｅｎｓ  ｏｆ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｄｉａｒｒｈｏｅａ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：  ａ  ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ  ｂｉｒｔｈ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ  （ＭＡＬ−ＥＤ）．  Ｌａｎｃｅｔ  Ｇｌｏｂ  Ｈｅａｌｔｈ．  ２０１５；  （１５）：１０−１０９Ｘ．
５２． Ｓａｔｔｅｒｗｈｉｔｅ  ＴＫ，  Ｅｖａｎｓ  ＤＧ，  ＤｕＰｏｎｔ  ＨＬ，  Ｅｖａｎｓ  ＤＪ，  Ｊｒ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｃｏｌｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｄｉａｒｒｈｏｅａ．  Ｌａｎｃｅｔ．  １９７８；  ２（８０８２）：１８１−４．
５３．Ｖｉｂｏｕｄ  ＧＩ，  Ｊｏｕｖｅ  ＭＪ，  Ｂｉｎｓｚｔｅｉｎ  Ｎ，  Ｖｅｒｇａｒａ  Ｍ，  Ｒｉｖａｓ  Ｍ，  Ｑｕｉｒｏｇａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｒｇｅｎｔｉｎｅａｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９９；  ３７（９）：２８２９−３３．
５４．Ｌｕｍｉｓｈ  ＲＭ，  Ｒｙｄｅｒ  ＲＷ，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＤＣ，  Ｗｅｌｌｓ  ＪＧ，  Ｐｕｈｒ  ＮＤ．  Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ａｂｏａｒｄ  ａ  Ｍｉａｍｉ−ｂａｓｅｄ  ｃｒｕｉｓｅ  ｓｈｉｐ．  Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．  １９８０；  １１１（４）：４３２−６．
５５．Ｌｅｖｉｎｅ  ＭＭ，  Ｎａｌｉｎ  ＤＲ，  Ｈｏｏｖｅｒ  ＤＬ，  Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔ  ＥＪ，  Ｈｏｒｎｉｃｋ  ＲＢ，  Ｙｏｕｎｇ  ＣＲ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９７９；  ２３：７２９−３６．
５６． Ｌｅａｃｈ  Ｓ，  Ｌｕｎｄｇｒｅｎ  Ａ，  Ｃａｒｌｉｎ  Ｎ，  Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ  Ｍ，  Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ  ＡＭ．  Ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ａｖｉｄｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｏｒａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  （ＥＴＥＣ）  ｖａｃｃｉｎｅ  ＥＴＶＡＸ．  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２０１７；  （１７）：１０．
５７． Ｂａｒｒｙ  ＥＭ，  Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｗｕ  Ｔ，  Ｄａｖｉｓ  Ｔ，  Ｌｅｖｉｎｅ  ＭＭ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ−ＥＴＥＣ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｍｏｄｅｌ．  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２００６；  ２４（１８）：３７２７−３４．
５８．Ａｎａｎｔｈａ  ＲＰ，  ＭｃＶｅｉｇｈ  ＡＬ，  Ｌｅｅ  ＬＨ，  Ａｇｎｅｗ  ＭＫ，  Ｃａｓｓｅｌｓ  ＦＪ，  Ｓｃｏｔｔ  ＤＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｃｌａｓｓ  ５  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｆｉｍｂｒｉａｅ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ２００４；  ７２（１２）：７１９０−２０１．
５９．Ｇａａｓｔｒａ  Ｗ，  Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  Ｈ，  ｖａｎ  ＤＬ，  Ｋｕｓｔｅｒｓ  ＪＧ，  Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ  ＡＭ，  Ｇｒｅｗａｌ  ＨＭ．  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｆｉｍｂｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００２；  ２９２（１）：４３−５０．
６０．Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ  Ｊ，  Ｓｈｅｉｋｈ  Ａ，  Ｑａｄｒｉ  Ｆ．  Ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｆｏｒ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．  ２０１４；  １３（５）：６３１−９．
６１．Ｃａｒｏｎ  Ｊ，  Ｓｃｏｔｔ  Ｊ．  Ａ  ｒｎｓ−ｌｉｋｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ＣＦＡ／Ｉ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＦＡ／Ｉ  ｐｉｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９９０；  ５８：８７４−８．
６２．Ｃａｒｏｎ  Ｊ，  Ｃｏｆｆｉｅｌｄ  ＬＭ，  Ｓｃｏｔｔ  ＪＲ．  Ａ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅ，  ｒｎｓ，  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＳ１  ａｎｄ  ＣＳ２  ａｄｈｅｓｉｎｓ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ−ｃｏｌｉ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １９８９；  ８６：９６３−７．
６３．Ｂｏｄｅｒｏ  ＭＤ，  Ｍｕｎｓｏｎ  ＧＰ．  Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ｒｎｓ  Ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＳ１４  Ｐｉｌｉ．  Ｇｅｎｅｓ  （Ｂａｓｅｌ）．  ２０１６；  ７（１２）：ｇｅｎｅｓ７１２０１２０．
６４． Ｈａｉｎｅｓ  Ｓ，  Ｇａｕｔｈｅｒｏｎ  Ｓ，  Ｎａｓｓｅｒ  Ｗ，  Ｒｅｎａｕｌｄ−Ｍｏｎｇｅｎｉｅ  Ｇ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．  ２０１５；  １０（１０）：ｅ０１４１４６９．
６５． Ｈａｉｎｅｓ  Ｓ，  Ａｒｎａｕｄ−Ｂａｒｂｅ  Ｎ，  Ｐｏｎｃｅｔ  Ｄ，  Ｒｅｖｅｒｃｈｏｎ  Ｓ，  Ｗａｗｒｚｙｎｉａｋ  Ｊ，  Ｎａｓｓｅｒ  Ｗ，  ｅｔ  ａｌ．  ＩｓｃＲ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉ  Ｆｉｍｂｒｉａｅ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｉｒｏｎ  Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ２０１５；  １９７（１８）：２８９６−９０７．
６６．Ｈｏｄｓｏｎ  Ｃ，  Ｙａｎｇ  Ｊ，  Ｈｏｃｋｉｎｇ  ＤＭ，  Ａｚｚｏｐａｒｄｉ  Ｋ，  Ｃｈｅｎ  Ｑ，  Ｈｏｌｉｅｎ  ＪＫ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ，  ＣｆａＤ，  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃａｌ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓｔｒａｉｎ，  Ｈ１０４０７．  Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１７；  ８：１５２５．  ｄｏｉ：  １０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１７．０１５２５．  ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；％２０１７．：１５２５．
６７．Ｗｏｌｆ  ＭＫ，  Ａｎｄｒｅｗｓ  ＧＰ，  Ｔａｌｌ  ＢＤ，  ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  ＭＭ，  Ｌｅｖｉｎｅ  ＭＭ，  Ｂｏｅｄｅｋｅｒ  ＥＣ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＳ４  ａｎｄ  ＣＳ６  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ＰＣＦ８７７５，  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｒｏｍ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｅ８７７５．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９８９；  ５７：１６４−７３．
６８．Ｃａｒｏｎ  Ｊ，  Ｍａｎｅｖａｌ  ＤＲ，  Ｋａｐｅｒ  ＪＢ，  Ｓｃｏｔｔ  ＪＲ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮｓ  Ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ−Ｃｏｌｉ  Ｉｓｏｌａｔｅｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９９０；  ５８：３４４２−４．
６９．Ｆａｖｒｅ  Ｄ，  Ｌｕｄｉ  Ｓ，  Ｓｔｏｆｆｅｌ  Ｍ，  Ｆｒｅｙ  Ｊ，  Ｈｏｒｎ  ＭＰ，  Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ．  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２００６；  ２４（２０）：４３５４−６８．
７０．Ｎｉｃｋｌａｓｓｏｎ  Ｍ，  Ｓｊｏｌｉｎｇ  Ａ，  ｖｏｎ  ＭＡ，  Ｑａｄｒｉ  Ｆ，  Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ  ＡＭ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＣＳ５  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  （ＥＴＥＣ）  ｉｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｂｉｌｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｎａ  ｇｌｙｃｏｃｈｏｌａｔｅ  ｈｙｄｒａｔｅ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．  ２０１２；  ７（４）：ｅ３５８２７．
７１． Ｎｉｃｋｌａｓｓｏｎ  Ｍ，  Ｓｊｏｌｉｎｇ  Ａ，  Ｌｅｂｅｎｓ  Ｍ，  Ｔｏｂｉａｓ  Ｊ，  Ｊａｎｚｏｎ  Ａ，  Ｂｒｉｖｅ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＣＳ６  ｉｎ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  （ＥＴＥＣ）  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐａｔｈｏｇ．  ２００８；  ４４（３）：２４６−５４．
７２．Ｄａｒｓｌｅｙ  ＭＪ，  Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ  Ｓ，  Ｄｅｎｅａｒｉｎｇ  Ｂ，  Ｓａｃｋ  ＤＡ，  Ｆｅｌｌｅｒ  Ａ，  Ｂｕｃｈｗａｌｄｔ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｏｒａｌ，  ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｖａｃｃｉｎｅ  ＡＣＥ５２７  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｄｉａｒｒｈｅａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１２；  １９：１９２１−３１．
７３． Ｌｅｖｉｎｅ  ＭＭ，  Ｆｅｒｒｅｃｃｉｏ  Ｃ，  Ｐｒａｄｏ  Ｖ，  Ｃａｙａｚｚｏ  Ｍ，  Ａｂｒｅｇｏ  Ｐ，  Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｊｅｔ  ａｌ．  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｌｏｗ  ｓｏｃｉｏｅｃｏｎｏｍｉｃ  ｌｅｖｅｌ  ｐｅｒｉｕｒｂａｎ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ｓａｎｔｉａｇｏ，  Ｃｈｉｌｅ．  Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．  １９９３；  １３８：８４９−６９．
７４．ｖｏｎ  Ｍｅｎｔｚｅｒ  Ａ，  Ｃｏｎｎｏｒ  ＴＲ，  Ｗｉｅｌｅｒ  ＬＨ，  Ｓｅｍｍｌｅｒ  Ｔ，  Ｉｇｕｃｈｉ  Ａ，  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＮＲ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  （ＥＴＥＣ）  ｃｌａｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｇｌｏｂａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．  ２０１４；  ４６：１３２１−６．
７５．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７９（１２）：４９１２−４９２２，  ２０１１  ＰＭＣ３２３２６４６． 
７６．Ｄｅｌａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐａｔｈｏｇ．  Ｄｉｓ．  ７４（５），  ２０１６  ＰＭＣ５９８５４７８． 
７７．Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９７（１２）：６６４０−６６４５，  ２０００．  
【図１】
2021519789.tif 000017
【図２】
2021519789.tif 000018
【図３】
2021519789.tif 000019
【国際調査報告】
2021519789.tif 000020
2021519789.tif 000021