(57)【要約】  式ＴｉｘＡｌｙＺｒｚＯｎを有するＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物［式中、ｘは独立して２〜１０であり、ｙは独立して０．５〜６であり、ｚは独立して２〜１０であり、ｎは独立して２ｘ＋３ｙ／２＋２ｚである］を有する、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物である。Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物を使用してマトリックスからマイコトキシンを分離する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＴｉｘＡｌｙＺｒｚＯｎ［式中、ｘは独立して２〜１０であり、ｙは独立して０．５〜６であり、ｚは独立して２〜１０であり、ｎは独立して２ｘ＋３ｙ／２＋２ｚである］を有する、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
【請求項２】
ｘが３〜５である、請求項１に記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
【請求項３】
ｙが０．７５〜３である、請求項１又は２に記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
【請求項４】
ｙが２〜５である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
【請求項５】
ｚが７〜９である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
【請求項６】
ｚが７．５〜８．５である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
【請求項７】
前記Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物が、化学式Ｔｉ８Ａｌ２Ｚｒ８Ｏ３５を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
【請求項８】
マイコトキシンを含むマトリックスから前記マイコトキシンを分離する方法であって、
前記マトリックスを、短鎖アルコール及び水と短鎖アルコールとの混合物から選択される抽出剤と接触させて、前記マトリックスから前記マイコトキシンの一部を前記抽出剤に抽出して、溶解又は分散したマイコトキシンを含む上清を形成することと、
上清の少なくとも一部をＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物と接触させることと、を含む、方法。
【請求項９】
前記Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物が、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上清の少なくとも一部をＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物と接触させる前記工程が、前記Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物のカラムを通して前記上清の少なくとも一部を溶離させることを含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記マトリックスが、穀物マトリックスを含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記穀物マトリックスが、トウモロコシマトリックスを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マイコトキシンが、アフラトキシンである、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アフラトキシンが、アフラトキシンＢ１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記上清の少なくとも一部を、マイコトキシンの存在又は量について分析する工程を更に含み、
分析される前記上清の少なくとも一部が、前記Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物と接触させられる前記上清の少なくとも一部の全て又は一部分であり、
前記上清の少なくとも一部を分析する工程が、前記上清をＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物と接触させる工程の後に行われ、
前記分析する工程に供される前記上清の少なくとも一部の液体成分が、前記分析する工程の前に蒸発させられていない、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
アフラトキシンなどのマイコトキシンは、有機マトリックス、例えば、穀物マトリックスなどの食品マトリックスで見出される非常に危険な物質である。マイコトキシンは、低濃度であっても、ヒト又は非ヒト動物に有害であるか、又は更に致死的であり得る。
【０００２】
元素Ｔｉ及びＯを含有する混合金属吸着剤は、米国特許第７，７３１，８３７号に記載されている。
【発明の概要】
【０００３】
Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物は、式ＴｉｘＡｌｙＺｒｚＯｎ［式中、ｘは独立して２〜１０であり、ｙは独立して０．５〜６であり、ｚは独立して２〜１０であり、ｎは独立して２ｘ＋３ｙ／２＋２ｚである］を有することができる。
【０００４】
マイコトキシンを含むマトリックスからマイコトキシンを分離する方法は、マトリックスを、短鎖アルコール及び水と短鎖アルコールとの混合物から選択される抽出剤と接触させて、マトリックスからマイコトキシンの一部を抽出剤に抽出して上清を形成することを含むことができ、上清は溶解又は分散したマイコトキシンを含む。次いで、上清の少なくとも一部をＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物と接触させることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本開示を通じて、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」などの単数形は、しばしば便宜上使用されるが、単数のみであることが明示的に指定されている場合又は文脈によって明確に示されている場合を除いて、単数形は複数を含むよう意図される。単数のみに言及する場合、典型的には「１つ、かつ１つのみ」などの用語が使用される。
【０００６】
本開示におけるいくつかの用語が、以下に定義される。他の用語は、当業者によく知られており、それらの用語には当業者がそれらに割り当ててきた意味を与えるものとする。
【０００７】
用語「一般的な」、「典型的な」、及び「通常の」、並びに「一般的に」、「典型的に」、及び「通常は」という用語は、本明細書では、本発明でしばしば用いられる特徴を指し、先行技術を参照して具体的に使用されない限りは、特徴が先行技術に存在することを意味することを意図するものではなく、これらの特徴が従来技術において、一般的、通常、又は典型的であることを意味することを意図するものではない。
【０００８】
「短鎖アルコール」、並びにその複数形は、直鎖、環状、又は分枝鎖低級アルキル若しくは低級アルケンアルコール化合物を指す。短鎖アルコールは、典型的には、低級直鎖又は分枝鎖低級アルキルアルコールである。一般的な低級アルキルアルコールは、４個以下の炭素原子を有し、例えば、ブタノール、例えばｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソ−ブタノール、及びｔｅｒｔ−ブタノール、プロパノール、例えばｎ−プロパノール及びイソプロパノール、エタノール及びメタノールなどである。メタノール及びエタノールは、本開示において最も一般的に用いられ、メタノールは、本開示においてエタノールよりも頻繁に使用される。
【０００９】
「ｐｐｂ」は、当該技術分野において既知の用語である「十億分率」の略語である。
【００１０】
「ｐｐｍ」は、当該技術分野において既知の用語である「百万分率」の略語である。
【００１１】
本開示において、全ての百分率は、単語「パーセント」、パーセント記号（％）、ないしは別の方法で指定されているか否かに関わらず、特に指定しない限り重量パーセントである。
【００１２】
本開示において、液体の全ての比率は、特に指定しない限り、体積比である。
【００１３】
有機マトリックス、例えば、穀物マトリックスなどの食品マトリックス中での、アフラトキシンなどのマイコトキシンの量を検出し、特に定量化することは、多くの理由で困難である。１つの理由は、何千、数千、又は更にそれ以上のマイコトキシン以外の有機化合物の存在である。２０ｐｐｂ以下、１０ｐｐｂ以下、又は更には５ｐｐｂ以下のアフラトキシンなどのマイコトキシンなどの、異常に低いレベルを検出又は定量化することが可能であり得る分析技術であっても、マイコトキシンが分散液又は溶液中に存在する唯一の化合物である場合、有機マトリックス、例えば、穀物マトリックスなどの食品マトリックスに適用することが困難である。
【００１４】
したがって、更なる分析を行う前に、アフラトキシンなどのマイコトキシン以外の化合物の一部、好ましくは大部分を除去することが有利であり、ほとんどの場合必要である。これは、有機マトリックス、例えば、穀物マトリックスなどの食品マトリックスから、アフラトキシンなどのマイコトキシンを分離することによって達成することができる。
【００１５】
このような分離を行う既知の方法が存在する。例えば、ＭＹＣＯＳＥＰ  ２２６  ＡＦＬＡＺＯＮ＋システム（Ｒｏｍｅｒ  Ｌａｂｓ，ＭＯ，ＵＳＡから入手可能）は、食品マトリックスを溶媒アセトニトリル（ＡｃＮと呼ばれることもある）で抽出することを必要とし、溶媒アセトニトリルは、分離後、何らかの分析が行えるようになる前に、蒸発乾固させなければならない。同様に、ＰｕｒｉＴｏｘ  Ｔｏｔａｌ  Ｍｙｃｏ−ＭＳシステム（Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｒｈｏｎｅ，ＬＴＤ，Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫから入手可能）は、アセトニトリル及び氷酢酸の両方を使用して試料を調製することを必要とし、それに加えて、クロマトグラフィーカラムを通過させた後に試料に追加の希酢酸及びアセトニトリルを添加する必要がある。
【００１６】
本発明者らは、これらの既知の方法に伴ういくつかの技術的課題を特定した。第１に、既知の方法は非常に労働集約的であり、分離カラムを介して試料を溶離する前及び後の両方に複数の工程を必要とすることである。第２に、既知の方法は、酢酸、アセトニトリルなどの使用者にとって高価であるか、又は危険である溶媒及び他の試薬の使用を必要とすることである。したがって、解決され得る１つの技術的問題は、食品マトリックス、すなわち一般的に穀物マトリックスにおいて、高価な又は危険な溶媒を必要とせずに、代わりに主に水及び短鎖アルコールなどの一般的な溶媒を使用して、残留化合物（すなわち、マイコトキシン、典型的にはアフラトキシン以外の化合物、検体）の数を低減することである。解決され得る別の技術的問題は、食品マトリックス、典型的には穀物マトリックスからの、アフラトキシンなどのマイコトキシンの分離を、より労働集約的でない方法で行うことである。解決され得る別の関連技術的問題は、試料にクロマトグラフィーカラムを通過させた後に追加の工程を必要とせずに、食品マトリックスなどのマトリックスから、アフラトキシンなどのマイコトキシンを分離する方法である。解決され得る別の技術的問題は、穀物マトリックスなどの食品マトリックスからのアフラトキシンなどのマイコトキシンの分離に必要とされる量、及び特に必要とされる希釈量を低減する方法である。解決され得る更に別の関連する技術的問題は、食品マトリックスからのマイコトキシン分離において、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ酸化物を使用する方法である。
【００１７】
簡単に言えば、これらの技術的問題、並びに他の技術的問題は、本明細書に記載されるようなチタン−アルミニウム−ジルコニウム酸化物（Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物）吸着剤の使用によって、特にクロマトグラフィーカラム内の固定相としてのその使用によって解決することができる。この材料を使用すると、抽出のためアルコール又は水−アルコール混合物を使用するときに、マトリックスからマイコトキシン又はアフラトキシンを良好な回収率で分離することが可能になる。Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物を使用する場合、抽出物の高希釈溶液は必須ではなく、カラムを通して抽出物を溶離させた後、更なる処理工程を必要とせずに、ＨＰＬＣ分析などの更なる分析のために溶離液を直接使用することができる。
【００１８】
吸着剤は、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物である。典型的には、これは化学式ＴｉｘＡｌｙＺｒｚＯｎ［式中、ｘは独立して２〜１０であり、ｙは独立して０．５〜６であり、ｚは独立して２〜１０であり、ｎは独立して２ｘ＋３ｙ／２＋２ｚである］を有する。場合によっては、ｘは独立して６〜１０であり、ｙは独立して０．５〜４であり、ｚは独立して６〜１０であり、ｎは独立して２ｘ＋３ｙ／２＋２ｚである。この式において、ｘの特定の値は、２以上、２．５以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、５以上、５．５以上、６以上、６．５以上、７以上、７．５以上、８以上、８．５以上、９以上、９．５以上であってもよく；ｘの特定の値はまた、１０以下、９．５以下、９以下、８．５以下、８以下、７．５以下、７以下、６．５以下、６以下、５．５以下、５以下、４．５以下、４．０以下、３．５以下、３．０以下、又は２．５以下であってもよい。ｙの特定の値は、０．５以上、１以上、１．５以上、２以上、２．５以上、３以上、３．５以上、４．０以上、４．５以上、５．０以上、又は５．５以上とすることができる。ｙの特定の値は、６以下、５．５以下、５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、又は１以下とすることができる。この式において、ｚの特定の値は、２以上、２．５以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、５以上、５．５以上、６以上、６．５以上、７以上、７．５以上、８以上、８．５以上、９以上、９．５以上であってもよく；ｘの特定の値はまた、１０以下、９．５以下、９以下、８．５以下、８以下、７．５以下、７以下、６．５以下、６以下、５．５以下、５以下、４．５以下、４．０以下、３．５以下、３．０以下、又は２．５以下であってもよい。最も一般的には、ｘは３〜５であり、特定の場合には、４〜５である。最も一般的には、ｙは０．７５〜３であり、更により一般的には、０．７５〜２．５である。最も一般的には、ｚは２〜５であり、更により一般的には、２〜４である。ある場合には、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物は、化学式Ｔｉ８Ａｌ２Ｚｒ８Ｏ３５を有する。ある場合には、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物は、化学式Ｔｉ４．７ＡｌＺｒ２．５Ｏ１５．９を有する。
【００１９】
Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物吸着剤は、任意の好適な方法によって調製することができる。典型的には、吸着剤は、Ｔｉ、Ａｌ、及びＺｒの塩の反応によって、水溶液中などの溶液中で調製される。多くの場合、還元剤も使用される。尿素は典型的な還元剤であるが、ＬＡｌＨ、水素化ホウ素ナトリウム、又はリンドラー触媒、アンモニア、ジボラン、ジチオネート、チオスルフェート、ヒドラジン、ＤＩＢＡＬ−Ｈ、還元糖、次亜リン酸塩などの亜リン酸塩、ジチオスレイトール、シアン化物、及びトリス−２−カルボキシエチルホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）などの他の還元剤も、場合によっては使用することができる。最も一般的には、水溶性還元剤は、生成物を水で洗浄することによって任意の残留還元剤を除去することができるように使用される。尿素は、還元剤として最も一般的に使用される。
【００２０】
ほとんどの場合尿素である還元剤と共に、金属の塩の水性分散液を室温で作製することができる。金属塩は、典型的には、適切な化学量論で、Ｔｉ（ＩＶ）、Ａｌ（ＩＩＩ）、及びＺｒ（ＩＶ）の酸化状態を有する金属を含有する。しかしながら、これらの金属の他の酸化状態を使用することが可能であり、その場合、金属をその場で酸化又は還元して最終生成物を形成することができる。分散液は、試薬間の化学反応を支持するのに十分な温度まで加熱することができる。分散液は、典型的には、７５℃から水の沸点（溶解した材料のために１００℃を超えてもよい）までの温度に加熱される。最も一般的には、温度は９０℃〜１００℃である。分散液は、反応を完了するのに十分な時間、典型的には１〜６時間維持することができるが、使用される特定の塩、塩の濃度、水のイオン強度、及び他の要因に応じて、より長い又はより短い時間が必要であり得る。反応が完了した後、分散液を室温まで冷却し、得られた粉末を、例えばデカント又は濾過によって収集することができる。次いで、粉末を、例えば有機溶媒、周囲温度脱イオン水、又はその両方で洗浄して不純物を除去することができる。最後に、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物を得るために、粉末を、典型的には２００℃〜８００℃の温度で１〜８時間か焼することができる。
【００２１】
Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物は、マトリックス、例えば、穀物マトリックスなどの食品マトリックスから、アフラトキシンなどのマイコトキシンを分離する方法で使用することができる。食品マトリックスが穀物マトリックスであるとき、マトリックスは、多くの場合、トウモロコシマトリックス、小麦マトリックス、大麦マトリックス、スペルトマトリックス、米マトリックス、ライ麦マトリックス、オート麦マトリックスなどのうちの１つ以上を含む。この方法は、これら又は他の食品マトリックスと共に使用することができるが、トウモロコシマトリックスは、動物飼料としてのその工業的重要性のために最も一般的に用いられている。
【００２２】
アフラトキシンなどのマイコトキシンの分離は、アフラトキシンなどのマイコトキシン以外の全ての化合物が吸着剤上に保持されることを必要とせず、また、アフラトキシンなどのマイコトキシンが任意の特定の純度を有することも必要としない。その代わりに、アフラトキシンなどのマイコトキシンが、それを別の化合物と間違える不当な可能性を伴わずに、確実に検出及び分析され得るという点で、十分に純粋であるならば、分離は成功したと見なされる。
【００２３】
分離を行うために、マトリックスは、任意に、小さな粒子に粉砕することができる。マトリックスの質量、最も一般的には、任意に粉砕することができる既知の質量は、短鎖アルコール、又はより一般的には、水と短鎖アルコールとの混合物と接触させる。水と短鎖アルコールとの混合物は、マトリックスからのアフラトキシンなどのマイコトキシンを確実に抽出するのに好適な任意の混合物であり得る。好適な混合物は、多くの場合、２０％〜８０％の短鎖アルコールを有する。例示的な混合物は、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、又は更には７５％以上の短鎖アルコールを有することができる。例示的な混合物は、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、又は更には２５％以下の短鎖アルコールを有することができる。典型的な混合物は、３０％〜７０％の短鎖アルコール、ｒを有し、更により典型的には４０％〜６０％、例えば４５％〜５５％、又は更には５０％の短鎖アルコールを有する。
【００２４】
任意の好適な短鎖アルコールを使用することができる。短鎖アルコールは、通常、短鎖アルコール／水混合物中の水と溶液を形成するように選択される。典型的には、メタノール又はエタノールが使用される。メタノールは最も一般的である。
【００２５】
少量の他の化学物質又は溶媒が、水と短鎖アルコールとの混合物中に存在することが可能である。例えば、両方とも、少量の、ベンゼン又はトルエンなどの芳香族溶媒、アセトン又はメチルエチルケトンなどのケトン溶媒、又は酢酸エチル又は酢酸ブチルなどのエステル溶媒などの他の溶媒を含有することが多い変性エタノール又は消毒用アルコールは、短鎖アルコールとして使用され、次いで、使用前に変性エタノール又は消毒用アルコールからこのような追加の溶媒を除去する必要はない。したがって、短鎖アルコール又は水と短鎖アルコールとの混合物をコールする場合、他のいくつかの溶媒も、通常、それらが短鎖アルコール中に不純物として存在するため、典型的には微量以下の量で同様に存在し得ることが理解されるべきである。
【００２６】
マトリックスを短鎖アルコール又は水と短鎖アルコールとの混合物と接触させることは、典型的には、短鎖アルコール又は水と短鎖アルコールとの混合物と、マトリックスとを容器内配置することと、容器を撹拌することと、を含む。撹拌は、手動の振盪又は自動振盪器での振盪、超音波処理、撹拌、又は同様のものなどの振盪によって行うことができる。短鎖アルコール又は水と短鎖アルコールとの混合物の量は、任意の好適な量であり得る。最も好適な量は、マトリックスから、アフラトキシンなどのマイコトキシンの全て又は本質的に全てを確実に抽出するであろう。固形分から材料を抽出するための分離技術におけるソックスレー抽出並びに他の技術がそうすることができるように、複数の抽出を使用することができる。
【００２７】
マトリックスからの固形分は、任意の好適な手段によって上清から分離することができる。場合によっては、デカント又は濾過を使用することができる。デカントが使用される場合、遠心分離又は超遠心分離の後に行われ得る。
【００２８】
上清は、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物と接触させることができる。これは、任意の好適な方法で行うことができる。例えば、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物の粉末を上清と混合し、例えば、振盪又は超音波処理によって混合物を撹拌することが可能である。次いで、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏを、液体上清から、例えば、デカント又は濾過によって除去することができる。
【００２９】
より一般的には、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物を上清と接触させる工程は、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物からカラムを作製し、上清にカラムを通過させることによって達成される。Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ材料のカラムは、任意の好適な方法によって調製することができる。典型的には、カラムは、乾燥充填されるか、又は溶媒充填されるかのいずれかである。溶媒充填が採用される場合、使用することができる典型的な溶媒としては、水又は水と酢酸エチルとの混合物、水と酢酸ブチルとの混合物、又は水とアセトニトリルとの混合物が挙げられる。
【００３０】
カラムは、十分な質量のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物を有するべきであり、本明細書に記載されるように、アフラトキシンなどのマイコトキシンの良好な分離をもたらすのに十分な長さであるべきである。カラム中のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物の質量は、アフラトキシンなどのマイコトキシンを分離するのに十分な任意の質量であり得る。Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物の質量は、アフラトキシンなどのマイコトキシンが分離されるマトリックスの質量に依存するであろう。ほとんどの場合、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物の質量は、マトリックスの質量の２倍以上である。良好な分離をもたらすことが必要とされる場合、例えば、マトリックスの質量の３倍以上、４倍以上、又は更には５倍以上の質量のより大きな質量のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物を使用することができる。場合によっては、より少ない質量のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物を使用することもできる。カラムの高さは変化させることができるが、典型的には、カラム上に配置される液体１ｍＬ当たり少なくとも２ｍｍ高い。多くの場合、カラムの高さは、カラム上に配置される液体１ｍＬ当たり５ｍｍ〜７ｍｍであり得る。
【００３１】
カラム分離のための移動相は、カラムを通して、アフラトキシンなどのマイコトキシンを溶離するのに十分な任意の溶媒系であり得る。しかしながら、溶媒は、好ましくは、アフラトキシンなどのマイコトキシンの分離が達成されないように、カラムを介して多数又は多量の他の化合物を溶離しないように選択されるべきである。しかしながら、場合によっては、多数の又は多量の他の化合物が、カラムを通過する溶離液の画分を異なる時間に回収し、かつ、アフラトキシンなどのマイコトキシンを含有する画分のみを保持することにより依然としてマイコトキシンから分離され得るために、多数の又は多量の他の化合物がカラムから溶離することが許容される。また、マイコトキシン検出を妨害しないか、又はマイコトキシンと間違える可能性がない化合物は、その存在がマイコトキシンの検出又は定量を妨害しない場合に、カラムから溶離してもよい。このような化合物の特性及び許容可能な量は、使用される検出方法に依存する。
【００３２】
移動相に使用される典型的な溶媒は、水と極性有機溶媒との混合物である。典型的には、有機溶媒の特性及び量は、水との溶液を形成するように選択されるであろう。例示的な有機溶媒としては、アセトン、酢酸エチル、酢酸ブチル、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどが挙げられる。最も一般的には、水と極性有機溶媒との混合物は、主に水であり、例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は更には９５％以上の含水率を有する混合物である。アセトニトリルは、最も一般的に使用される極性有機溶媒である。水アセトニトリル混合物中の水の量は、典型的には、８０％〜９９％、最も一般的には８５％〜９５％、及び多くの場合９０％である。
【００３３】
追加の吸着剤は、カラム内でＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物と混合することができる。使用される場合、追加の吸着剤は、典型的には他の金属化合物である。使用することができる例示的な追加の吸着剤としては、米国特許第７，７３１，８３７号に開示されているものが挙げられる。使用される場合、追加の吸着剤は、例えば、吸着、吸収、又は他の物理的若しくは化学的プロセスによって、上清からアフラトキシンなどのマイコトキシンを除去しないように選択される。使用される場合、追加の吸着剤は、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物と追加の吸着剤との混合物の割合として任意の好適な量で存在し得る。使用される場合、追加の吸着剤の例示的な量は、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物及び追加の吸着剤の総質量に基づいて、０．５％以上、１％以上、２．５％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、又は更には２５％以上である。使用される場合、追加の吸着剤の例示的な量は、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物及び追加の吸着剤の総質量に基づいて、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、２．５％以下、１％以下、又は更には０．５％以下である。
【００３４】
本明細書に記載される分離後、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物のカラムが使用される場合には、溶離液として記述することができる上清を、アフラトキシンなどのマイコトキシンの存在又は量について分析することができる。多くの場合、上清の一部のみを分析する必要があり、これは、上清中のアフラトキシンなどのマイコトキシンの濃度、及び使用される特定の分析方法に依存するであろう。
【００３５】
マイコトキシンの量は、上清中のマイコトキシンの質量であり得るが、多くの場合、上清中のマイコトキシンの濃度である。上清が抽出液の既知の画分であり、マトリックスの質量が既知である場合、マトリックス中のアフラトキシンなどのマイコトキシンの量は、上清中のアフラトキシンなどのマイコトキシンの量が決定されると、寸法分析によって決定することができる。
【００３６】
任意の好適な分析方法を使用することができる。ＨＰＬＣを含む液体クロマトグラフィー法が一般的に使用される。ＨＰＬＣは、カラム及び移動相の任意の好適な組み合わせで実施することができる。Ｃ−１８カラムなどの疎水性カラムは、多くの場合使用され、移動相は、一般に、水とアセトニトリルとの混合物である。特定のマイコトキシン、上清中に残存する他の化合物の性質、及び他の関連する因子に応じて、他のカラム及び移動相を使用することができる。検出は、任意の好適な手段、最も一般的にはＵＶ／Ｖｉｓ吸光度によるものであり得るが、発光検出、屈折率検出などの他の技術を使用することができる。
【００３７】
分析は、ＨＰＬＣ以外の技術、例えば質量分析法（ＭＳ）、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、赤外分光法（ＩＲ）、又はＨＰＬＣ−ＭＳなどの組み合わせ分析技術によるものであってもよい。
【００３８】
以下の実施形態は、本開示の特定の態様を例示するために提示しており、限定することを意図するものではない。他の例示的な実施形態も開示する。
１．式ＴｉｘＡｌｙＺｒｚＯｎを有するＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物［式中、ｘは独立して２〜１０であり、ｙは独立して０．５〜６であり、ｚは独立して２〜１０であり、ｎは独立して２ｘ＋３ｙ／２＋２ｚである］を有する、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
２．ｘが独立して６〜１０であり、ｙが独立して０．５〜４であり、ｚが独立して６〜１０であり、ｎが独立して２ｘ＋３ｙ／２＋２ｚである、実施形態１に記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
３．ｘが、２以上、２．５以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、５以上、５．５以上、６以上、６．５以上、７以上、７．５以上、８以上、８．５以上、９以上、９．５以上である、実施形態１〜２のいずれか１つに記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
４．ｘが、１０以下、９．５以下、９以下、８．５以下、８以下、７．５以下、７以下、６．５以下、６以下、５．５以下、５以下、４．５以下、４．０以下、３．５以下、３．０以下、又は２．５以下である、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
５．ｙが、０．５以上、１以上、１．５以上、２以上、２．５以上、３以上、３．５以上、４．０以上、４．５以上、５．０以上、又は５．５以上である、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
６．ｙが、６以下、５．５以下、５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、又は１以下である、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
７．ｚが、２以上、２．５以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、５以上、５．５以上、６以上、６．５以上、７以上、７．５以上、８以上、８．５以上、９以上、９．５以上である、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
８．ｚが、１０以下、９．５以下、９以下、８．５以下、８以下、７．５以下、７以下、６．５以下、６以下、５．５以下、５以下、４．５以下、４．０以下、３．５以下、３．０以下、又は２．５以下である、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
９．ｘが、３〜５であり、任意に４〜５である、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
１０．ｙが、０．７５〜３であり、任意に０．７５〜２．５である、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
１１．ｚが、２〜５であり、任意に２〜４である。実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
１２．Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物が、化学式Ｔｉ４．７ＡｌＺｒ２．５Ｏ１５．９を有する、実施形態１〜１１のいずれか１つ記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
１３．マイコトキシンを含むマトリックスからマイコトキシンを分離する方法であって、
マトリックスを、短鎖アルコール及び水と短鎖アルコールとの混合物から選択される抽出剤と接触させて、マトリックスからマイコトキシンの一部を抽出剤に抽出して上清を形成することであって、
上清が、溶解又は分散したマイコトキシンを含む、ことと、
上清の少なくとも一部を、前述の実施形態のいずれかに記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物と接触させることと、を含む、方法。
１４．マトリックスを粉砕する工程を更に含み、粉砕工程が、マトリックスを抽出剤と接触させる工程の前に行われる、実施形態１３に記載の方法。
１５．マトリックスが、食品マトリックスである、実施形態１３〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．マトリックスが、穀物マトリックスである、実施形態１５に記載の方法。
１７．穀物マトリックスが、トウモロコシマトリックス、小麦マトリックス、大麦マトリックス、スペルトマトリックス、米マトリックス、ライ麦マトリックス、オート麦マトリックスのうちの１つ以上を含む、実施形態１６に記載の方法。
１８．穀物マトリックスが、トウモロコシマトリックスを含む、実施形態１７に記載の方法。
１９．穀物マトリックスが、小麦マトリックスを含む、実施形態１７に記載の方法。
２０．穀物マトリックスが、大麦マトリックスを含む、実施形態１７に記載の方法。
２１．穀物マトリックスが、スペルトマトリックスを含む、実施形態１７に記載の方法。
２２．穀物マトリックスが、ライ麦マトリックスを含む、実施形態１７に記載の方法。
２３．穀物マトリックスが、オート麦マトリックスを含む、実施形態１７に記載の方法。
２４．マイコトキシンが、アフラトキシンである、実施形態１３〜２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．アフラトキシンが、アフラトキシンＢ１である、実施形態２４に記載の方法。
２６．マイコトキシンが、デオキシニバレノールである、実施形態１３〜２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．上清の少なくとも一部をＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物と接触させる工程が、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物のカラムを通して上清の少なくとも一部を溶離させることを含む、実施形態１３〜２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．上清の少なくとも一部を、マイコトキシンの存在又は量につい分析する工程を更に含み、分析される上清の少なくとも一部が、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物と接触させられる上清の少なくとも一部の全て又は一部分であり、
分析工程が、上清をＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物と接触させる工程の後に行われる、実施形態１３〜２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．分析工程に供される上清の少なくとも一部の液体成分が、分析工程の前に蒸発させられていない、実施形態２８に記載の方法。
【実施例】
【００３９】
調製例１
乾燥した飼料用トウモロコシをミル（商品名「Ｒｏｍｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  Ｍｉｌｌ」でＲｏｍｅｒ  Ｌａｂｓ  ＧｍｂＨ，Ａｕｓｔｒｉａから入手可能）で粉砕した。５グラムの粉砕トウモロコシを２５ｍＬの１：１メタノール水溶液に加え、５分間繰り返し反転させることにより振盪した。アリコートを＞５，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を使用前にデカントして固形分を除去した。
【００４０】
実施例１〜４
尿素（６０．０ｇ）を、６００ｍＬの溶液を作製するのに十分な水と共にビーカーに添加した。ＴｉＯＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、Ａｌ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ、及びＺｒＯ（ＮＯ３）２・ｘＨ２Ｏの化学量論量をビーカーに添加し、反応物を撹拌しながら９４℃に加熱した。９４℃で２時間後、反応混合物を室温まで冷却し、固形分を濾過により回収し、脱イオン水で洗浄し、乾燥させた。次いで、粉末を５００℃で４時間か焼して、生成物を得た。生成物中の金属イオンの化学量論比（反応混合物中の金属のモル比に基づく）を表１に示す。
【表１】
2021523002.tif 000002
【００４１】
実施例３のＩＣＰ分析により、Ｔｉ４．７ＡｌＺｒ２．５Ｏ１５．９の実際の化学式が得られた。
【００４２】
実施例５
５．５ｍｍのポリプロピレン管を取り、一方の端部を粉末を含有するポリプロピレン膜で封止し、１００ｍｇの実施例３の生成物を乾燥させることにより、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物カラムを調製した。１ｍＬの脱イオン水を添加し、＞２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１ｍＬの５０％メタノールを加え、＞２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによってカラムを洗浄した。使用前にカラムを乾燥させた。
【００４３】
調製例１からのトウモロコシ抽出物の１ｍＬのアリコートに、１０ｐｐｍのデキシニバレノールを添加し、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物カラムに加えた。カラムを受容管に入れ、全ての液体がベッドを通過するまで＞５，０００ｒｐｍで遠心分離した。次いで、溶離液を、以下の条件を用いてＨＰＬＣにより分析した。
流速：０．６００ｍＬ／分
注入量：３５マイクロリットル
カラム：Ｃ１８  ３×１５０ｍｍ  ３．５ミクロン（商品名Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓで入手可能）
カラム温度：２５℃
検出器：ＵＶ（２１８ｎｍ）
移動相：９：１水：アセトニトリル
測定時間：７分
【００４４】
エルグラム（elugram）は、デキシニバレノールに対応する４．１分で明確なピークを示した。ピークは、ピークの立ち上がり又は立ち下り端とエルグラム中の任意の他のピークとの間に重なり合わないベースラインまでの可視のベースラインであった。分析されたアリコート中のデキシニバレノール濃度は、分析技術のエラー内でのデキシニバレノールの完全な回収に等しい１０．３９１であった（回収率の計算値１０５％）。
【００４５】
比較例１
乾燥した飼料用トウモロコシを、Ｒｏｍｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  Ｍｉｌｌで粉砕した。５グラムの粉砕トウモロコシを２５ｍＬのＳＤＳ抽出溶液に添加した（Ｍａｒａｇｏｓ，Ｃ．Ｍ．，２００８  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｆｌａｔｏｘｉｎ  Ｂ１  ａｎｄ  Ｇ１  ｆｒｏｍ  Ｍａｉｚｅ  ｕｓｉｎｇ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｉｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，９１（４）：７６２−７６７に記載）。混合物を５分間繰り返し反転させることにより振盪し、１０ｐｐｍのデオキシニバレノールを添加した。抽出物のアリコートを＞５，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清をデカントしていかなる固形分も除去した。上清の１ｍＬの部分を、１ｍＬのＨＰＬＣグレードのアセトニトリルに添加した。得られた混合物の１ｍＬを、商品名「Ｍｙｃｏｓｅｐ」でカタログ番号ＣＯＣＭＹ２２３０としてＲｏｍｅｒから入手可能なカラムに適用した。カラムを受容管に入れ、液体の全てがカラムを通過するまで＞５，０００ｇで遠心分離した。溶離液を１：１に５０％メタノールで希釈した後、実施例２に関して記載したのと同じ条件を使用してＨＰＬＣにより分析した。
【００４６】
エルグラムは、４．１分でデオキシニバレノールのピークを示し、これは前側のピークと強く重なり合ったことを示した。この重複により、デオキシニバレノール濃度の定量化は実施されなかった。
【００４７】
実施例６
１００ｍｇの代わりに２４０ｍｇの実施例４の生成物を用いた以外は、実質的に実施例２に記載したように、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏカラムを調製した。
【００４８】
調製例１のトウモロコシ抽出物に、５００ｐｐｂのアフラトキシンＢ１を添加した。得られた溶液の１ｍＬの部分を、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏカラムに加えた。カラムを受容管に入れ、液体の全てがカラムを通過するまで＞５，０００ｒｐｍで遠心分離した。溶離液を、以下の条件下でＨＰＬＣにより分析した。
流速：０．５００ｍＬ／分
注入量：２０マイクロリットル
カラム：Ｃ１８  ３×１５０ｍｍ  ３．５ミクロン（商品名Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓで入手可能）
カラム温度：２５℃
検出器：蛍光（３６５ｎｍ励起、４３５ｎｍ検出）
移動相：１：１：２メタノール：アセトニトリル：水
測定時間：１０分
【００４９】
得られたエルグラムは、７分後に、アフラトキシンＢ１に対応する明確に検出可能なピークを示した。ピークは、ピークの立ち上がり又は立ち下り端とエルグラム中の任意の他のピークとの間に重なり合わないベースラインまでの可視のベースラインであった。分析されたアリコート中のアフラトキシンＢ１の濃度は、スパイク抽出物の元の濃度の９７％であった。
【００５０】
比較例２
乾燥トウモロコシマトリックスを調製し、抽出し、処理し、実質的に比較例１に記載の通りにカラムを通過させたが、ただし、カラムは、商品名ＭｙｃｏＳｅｐ  ２２６  ＡｆａｌＺＯＮ＋で入手した。溶離液を比較例１に記載の通りに希釈し、実施例３に記載の条件下でＨＰＬＣにより分析した。
【００５１】
得られたエルグラムは、７分後に、アフラトキシンＢ１に対応する明確に検出可能なピークを示した。ピークは、ピークの立ち上がり又は立ち下り端とエルグラム中の任意の他のピークとの間に重なり合わないベースラインまでの可視のベースラインであった。分析されたアリコート中のアフラトキシンＢ１の濃度は、スパイク抽出物の元の濃度の１００％であった。
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月8日(2021.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＴｉｘＡｌｙＺｒｚＯｎ［式中、ｘは独立して２〜１０であり、ｙは独立して０．５〜６であり、ｚは独立して２〜１０であり、ｎは独立して２ｘ＋３ｙ／２＋２ｚである］を有する、Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
【請求項２】
ｘが３〜５であり、ｙが０．７５〜３であり、ｚが７〜９である、請求項１に記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
【請求項３】
ｚが７．５〜８．５である、請求項１又は２に記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
【請求項４】
前記Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物が、化学式Ｔｉ８Ａｌ２Ｚｒ８Ｏ３５を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物。
【請求項５】
マイコトキシンを含むマトリックスから前記マイコトキシンを分離する方法であって、
前記マトリックスを、短鎖アルコール及び水と短鎖アルコールとの混合物から選択される抽出剤と接触させて、前記マトリックスから前記マイコトキシンの一部を前記抽出剤に抽出して、溶解又は分散したマイコトキシンを含む上清を形成することと、
上清の少なくとも一部をＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物と接触させることと、を含む、方法。
【請求項６】
前記Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物が、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上清の少なくとも一部をＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物と接触させる前記工程が、前記Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物のカラムを通して前記上清の少なくとも一部を溶離させることを含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記マイコトキシンが、アフラトキシンである、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記アフラトキシンが、アフラトキシンＢ１である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記上清の少なくとも一部を、マイコトキシンの存在又は量について分析する工程を更に含み、
分析される前記上清の少なくとも一部が、前記Ｔｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物と接触させられる前記上清の少なくとも一部の全て又は一部分であり、
前記上清の少なくとも一部を分析する工程が、前記上清をＴｉ−Ａｌ−Ｚｒ−Ｏ金属酸化物と接触させる工程の後に行われ、
前記分析する工程に供される前記上清の少なくとも一部の液体成分が、前記分析する工程の前に蒸発させられていない、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2021523002.tif 000003
2021523002.tif 000004