(57)【要約】【課題】本発明は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）モジュレータ及び高分子ナノ担体成分を含む医薬組成物を提供する。【解決手段】本発明に係る高分子ナノ担体成分は、水溶媒質のＰＰＡＲモジュレータを可溶化することができ、高分子ナノ担体成分でミセルは、非イオン性活性剤を形成するものである。治療におけるその用途もまた提供される。【選択図】図１８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）モジュレータ及び高分子ナノ担体成分を備える医薬組成物であって、
前記高分子ナノ担体成分は、水溶媒質で前記ＰＰＡＲモジュレータを可溶化することができ、
前記高分子ナノ担体成分中において、ミセルが非イオン性界面活性剤を形成していることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
ミセル形成界面活性剤は、Ｄ―α―トコフェロール・ポリエテン・グリコール１０００コハク酸、ペグ化リン脂質誘導体（例えばＤＳＰＥ―ＰＥＧ、ＤＳＰＳ―ＰＥＧ、ＰＬＧＡ―ＰＥＧ等）、ポロクサマ（例えばルトロールＦ６８、ルトロールＦ１２７等）、乳酸―グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、又はキトサン誘導体（キトサン―ＰＥＧ等）、又は生分解性高分子―ＰＥＧのうち、１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記高分子ナノ担体成分は、エチルホスファチジルコリン及びカチオン脂質（例えばＮ―［１―（２，３―ジオレオイロキシ）プロピル］―Ｎ，Ｎ，Ｎ―トリメチルアンモニウム・メチル硫酸塩（ＤＯＴＡＰ））、１８：１  ＤＧＳ―ＮＴＡ（Ｎｉ）［１，２―ジオレオイル―ｓｎ―グリセロ―３―［（Ｎ―（５―アミノ―１―カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）サクシニル］、又はソルトールＨＳから選択される１つ以上の追加物質を更に備えることを特徴とする、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、ミセル組成の形態であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５】
前記ミセルの直径は、約３０ｎｍ以下であることを特徴とする、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、水性連続相を備える三成分系の形態であり、
前記ＰＰＡＲモジュレータ及び前記高分子ナノ担体成分は、そこで分布する分散相に主に存在することを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
請求項１乃至６記載の組成物であって、前記組成物は無菌であることを特徴とする組成物。
【請求項８】
前記ＰＰＡＲモジュレータは、ＰＰＡＲγアゴニストであるか、又はＰＰＡＲγアゴニスト活性を有する化合物であることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
前記ＰＰＡＲモジュレータは、チアゾリジンジオン、クルクミン、又はレスベラトロルであることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＰＰＡＲモジュレータは、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、ロベグリタゾン、シグリタゾン、ダルグリタゾン、エングリタゾン、ネトグリタゾン、リボグリタゾン、植物性カンナビノイドΔ９―ＴＨＣＡ、及びトログリタゾンのうち、１つ以上から選択されることを特徴とする請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
１つ以上の薬理学的に許容され得る担体又は賦形剤を更に備えることを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
非注射送達、例えば、局所送達、経口送達、又は非経口送達に適していることを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
鼻腔内送達に適していることを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
治療における使用のための、請求項１乃至１３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５】
ＣＮＳ疾患の治療又は予防における使用のための、請求項１乃至１４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１５記載の使用のための組成物であって、前記ＣＮＳ疾患は、神経変性疾患、網膜疾患、又は脳障害であることを特徴とする組成物。
【請求項１７】
請求項１６記載の使用のための組成物であって、前記神経変性の状態は、パーキンソン病、アルツハイマー病、又はハンチントン舞踏病であることを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求項１５乃至１７のいずれか一項記載の使用のための組成物であって、前記組成物は局所的に、例えば眼内又は鼻腔内に投与されることを特徴とする組成物。
【請求項１９】
ＣＮＳ疾患を治療する方法であって、患者に対して、請求１乃至１３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項２０】
前記ＣＮＳ疾患は、神経変性疾患、網膜疾患、又は脳障害であることを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記神経変性の状態は、パーキンソン病、アルツハイマー病、又はハンチントン舞踏病であることを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物は局所的に、例えば眼内、鼻腔内、又は経皮に投与されることを特徴とする、請求項１９乃至２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の、ＰＰＡＲアゴニスト組成物を調製する方法であって、前記方法は、以下のステップを含むことを特徴とする。
（１）１つ以上の高分子ナノ担体成分を第１の溶媒混合液に溶解させるステップ
（２）ＰＰＡＲモジュレータを第２の溶媒混合液に溶解させるステップ
（３）溶解した高分子ナノ担体成分及び溶解したＰＰＡＲモジュレータを結合させ、膜を形成するために、この結合物を乾燥させるステップ
（４）ミセル溶液を形成するために緩衝液で前記膜を再水和するステップ
（５）懸濁液を形成するために前記ミセル溶液を超音波で破壊するステップ
（６）前記懸濁液を安定させるステップ
（７）封入されていないＰＰＡＲモジュレータを取り除くために、前記懸濁液のろ過を行うステップ
【請求項２４】
前記第１の溶媒混合液は、エタノールであることを特徴とする、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の溶媒混合液および前記第２の溶媒混合液は同じものであることを特徴とする、請求項２３又は２４記載の方法。
【請求項２６】
実施例に記載の、請求項１乃至１３のいずれか一項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）モジュレータの新しい製剤と、治療におけるその用途に関する。本発明はまた、非注射又は局所投与経路による薬物送達を強化するためのアシルホモセリンラクトン（ＰＰＡＲモジュレータ）の用途にも関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は一態様では、肺動脈性肺高血圧症、癌、及び抗線維化疾患だけでなく、神経変性状態、網膜疾患、及び脳障害の治療又は予防にも関する。神経変性状態は、中枢及び末梢神経系のさまざまな部分に影響を及ぼし、これにはパーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン舞踏病が含まれる。網膜疾患は、例えば緑内障、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、及び視神経炎といった網膜変性状態を含み得る。脳障害は、外傷性脳損傷、脳卒中、（例えば新生児低酸素症によって生じるものとしての）脳性麻痺、及び癌（脳腫瘍を含む）を含み得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、核内ホルモン受容体の超科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属するリガンド活性化転写因子である。これらの受容体は１９９０年に齧歯動物の肝細胞にて同定され、名称はペルオキシゾーム増殖を誘発する能力に由来している。ＰＰＡＲは、脂質ホメオスタシスの検出及び制御により、ミトコンドリアの生合成の調節においてＰＰＡＲγ活性化補助因子１―α（ＰＧＣ―１α）及び１―β（ＰＧＣ―１β）と直接相互に作用する。これらの受容体はまた、脱共役タンパク質（ＵＣＰ）をコードする遺伝子の発現を調節する。ＵＣＰは、熱産生、ＲＯＳ産生、及び酸化機能の制御を担う、ミトコンドリア内膜の輸送体である。標的遺伝子のプロモータ領域の特異的な配列と結合することによって、ＰＰＡＲは、遺伝子転写を制御することが可能である。活性化されたＰＰＡＲは、転写因子を直接阻害することもできる。エネルギーを求める細胞要求があるとき、これらの機能によってＰＰＡＲがＡＴＰの産生における脂質消費を促進することができる。多くのＰＰＡＲモジュレータの水溶解度及び／又は生物活性は低く、治療用途は制限され得る。
【０００４】
ロシグリタゾンはＰＰＡＲ―γの外因性アゴニストであって、チアゾリジンジオン類に属し、インシュリン増感剤として作用する。ロシグリタゾンは当初、２型糖尿病のインスリン抵抗性に対抗するために用いられていたが、最近ではＰＤの動物モデルの治療としての将来性が示されている（Ｎｏｒｍａｎｄｏら、２０１６年）。ロシグリタゾン療法では、ミクログリア活性化、炎症誘発性サイトカインの放出、酸化ストレス、アストログリオーシス、及びモノアミン酸化酵素（ドーパミン代謝のための重要な酵素）の可逆阻害を弱め、抗炎症反応を促進することが報告されている。ＰＤ治療のためのチアゾリジンジオン療法の臨床試験の転帰は現時点では複雑であり、また、これらの薬剤の投与では疾患の進行を遅らせることはないと報告されている。
【０００５】
近年、クルクミン、レスベラトロル、及びアシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）はそれぞれ、ＰＰＡＲを結合すると報告された。そして、この相互作用がそれらの生物活性及び／又は治療効果に関与すると見出された。これには、ミクログリア活性化、炎症誘発性サイトカインの放出、及び酸化ストレスが弱まり、抗炎症反応が促進されることが含まれる。ＡＨＬは、ＰＰＡＲ―γの同じ位置に結合するＲＳＧと競合すると報告されている（Ｊａｈｏｏｒら、２００８年；Ｃｏｏｌｅｙら、２０１０年）。他のＰＰＡＲモジュレータの様に、これらの化合物の水溶解度及び／又は生物学的利用能は低い。
【０００６】
従って、生物学的利用能及び／又は生物活性を改良するために、ＰＰＡＲモジュレータのための改良された製剤を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様では、本発明は、高分子ナノ担体成分内に取り込まれるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）モジュレータを含む医薬組成物を提供する。高分子ナノ担体成分は、水性媒体においてＰＰＡＲモジュレータを可溶化することができる。ＰＰＡＲモジュレータは水への溶解度が低いことが知られており、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）といった溶媒を使用することが必要とされる。
しかし本発明の発明者は、生理的ｐＨ（約ｐＨ４〜約ｐＨ８）で、ＰＰＡＲモジュレータを可溶化するために高分子ナノ担体を用いることができると見出した。従って、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）といった、潜在的に有害な溶媒を使用する必要なく、本発明の組成物を調製することができる。驚くべきことに、本発明の組成物は、インビボで中枢神経系損傷モデルの神経保護効果を有することが認められた。更にこの種の組成物の全身投与において、網膜及び中枢神経系（ＣＮＳ）で神経保護効果を有すると認められた。本発明の組成物は、ＰＰＡＲモジュレータ単独の投与より優れた神経保護効果を呈することが示された。
【０００８】
ＰＰＡＲモジュレータは、内在性又は外因性分子であり得、実際の受容体活性が変更されるように、すなわち、化合物がＰＰＡＲアゴニスト又は抑制剤として作用することができるように、ＰＰＡＲの活性を調節する化合物を含む。ＰＰＡＲの活性は、例えば受容体と結合するＰＰＡＲアゴニスト、又は類似の活性を誘発するためにＰＰＡＲによって活性化される経路の下流成分に作用するＰＰＡＲアゴニストによって、調節が可能である。ＰＰＡＲアゴニストは、スーバーアゴニスト、部分活性薬又は完全作用薬でもよい。ＰＰＡＲモジュレータは、１００μＭ以下のＰＰＡＲへの結合アフィニティを有し得る（好ましくは１０μＭ以下、５μＭ以下、又はより多くの好ましくは、２μＭ以下又は１μＭ以下）。本発明の実施例では、ＰＰＡＲモジュレータは、１００ｎＭ以下又は１０ｎＭ以下のＰＰＡＲへの結合アフィニティを有することができる。
【０００９】
本明細書で使用される「高分子ナノ担体成分」とは、ポリマーを含む成分を意味する。例えば、高分子ナノ担体成分は、プロピレングリコール（ＰＥＧ）基及び／又は高分子系成分（例えばポロクサマー）を含んでもよい。高分子ナノ担体成分は、界面活性剤又はその合成誘導体であることが好ましい。
【００１０】
高分子ナノ担体成分は、非イオン性界面活性剤及び／又はミセル形成界面活性剤であってもよい。非イオン性ミセル形成界面活性剤は比較的軟らかく軟質のミセルを形成し、これは例えば粘模又は生物膜を通過する、非注射投与経路を越えた輸送を強化することができるので有利である。非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎｓ）、トリトンＸ―１００、ポリエトキシ化ひまし油、ソルトールＨＳ等が含まれる。
本発明の実施例において、ミセル形成界面活性剤は、Ｄ―α―トコフェロール・ポリエチレングリコール１０００コハク酸（ビタミンＥ  ＴＰＧＳ）、ペグ化リン脂質誘導体（例えばＤＳＰＥ―ＰＥＧ、ＤＳＰＳ―ＰＥＧ等）、ポロクサマ（例えばルトロールＦ６８、ルトロールＦ１２７等）、乳酸―グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、又はキトサン誘導体のうち、１つ以上から選択されてもよい。任意でＰＥＧ誘導体は、「クリック化学」反応性基を追加することにより、更に官能化され得る。これは例えば、チオール基への共有結合のためのマレイミド―ＰＥＧ、もしくはアルキン／アジド官能基の標的化部分（例えばＴＰＧＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＡＺＩＤＥ等）への共有結合のためのアジド―ＰＥＧ／アルキン―ＰＥＧである。
官能性の標的化部分には、タンパク質又はペプチドが含まれ得る。そして、ホスファチジルセリン結合タンパク質、例えばアネキシン、特にはアネキシンＶ、もしくは機能性フラグメント又はその機能性誘導体（好適にはアネキシンリピート備える）を含む。あるいは、Ｈｉｓタグタンパク質又はペプチドは、ニッケル官能化脂質（例えば１８：１  ＤＧＳ―ＮＴＡ（Ｎｉ））を用いて粒子面と非共有結合し得る。
【００１１】
本発明の好ましい実施例では、高分子ナノ担体成分は、任意でルトロールＦ１２７、ソルトールＨＳ、キトサン又はＤＳＰＥ―ＰＥＧと組み合わせた、ビタミンＥ  ＴＰＧＳを含む。ビタミンＥ  ＴＰＧＳは、濃度が０．０２％ｗ／ｗを超える安定したミセルを形成する非イオン性界面活性剤であり、臨界ミセル濃度は低い。α―トコフェロール成分は、Ｐ糖タンパク質拮抗作用と同様に、内在性性質及び抗酸化特性を有し、この物質を含む製剤の障壁通過能力を向上させることができる。本発明の高分子ナノ担体組成物は、約０．０２のｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、好適には約１０ｍｇ／ｍｌ〜約６５ｍｇ／ｍｌ、より好適には約２０ｍｇ／ｍｌ〜約５５ｍｇ／ｍｌの濃度で、ビタミンＥ  ＴＰＧＳを含み得る。
【００１２】
ルトロールＦ１２７は、親水性ポリオキシエチレン基に隣接する中央の疎水性ポリオキシプロピレン基からなる二官能基ブロックコポリマー界面活性剤であり、凝集を防ぐためにナノ担体を立体配置的に安定させることができる。本発明の高分子ナノ担体組成物は、約０．２％ｗ／ｖ〜約３０％ｗ／ｖ、好適には約５％ｗ／ｖ〜約２０％ｗ／ｖ、より好適には約１０％ｗ／ｖ〜約２０％ｗ／ｖの濃度で、ルトロールＦ１２７を含み得る。ルトロールＦ１２７は、単独で又はビタミンＥ  ＴＰＧＳと併用して用いてもよい。
【００１３】
ソルトールＨＳ（２―ヒドロキシエチル１２―ヒドロキシステアリン酸メチル）は非イオン性可溶化剤及び乳化剤であり、毒性は低い。本発明の高分子ナノ担体組成物は、約１００ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの濃度で、ソルトールＨＳを備えることができる。ソルトールＨＳは、ビタミンＥ  ＴＰＧＳと併用して用いることが好ましい。
【００１４】
高分子ナノ担体成分は、最高１００％のミセル形成界面活性剤でもよく、例えば、高分子ナノ担体の成分は最高１００％のビタミンＥ  ＴＰＧＳ又は最高１００％のルトロールＦ１２７でもよい。あるいは、ミセル形成界面活性剤は、例えばペグ化リン脂質誘導体（例えばＤＳＰＥ―ＰＥＧ）、非イオン性界面活性剤（例えばソルトールＨＳ）、又はポロクサマ（例えばルトロールＦ１２７）と組み合わせたビタミンＥ  ＴＰＧＳといった、界面活性剤の組み合わせを含んでもよい。
【００１５】
組成物は、カプセル製剤の形状であるのが好ましく、また、ミセルであるのが最も好ましい。発明者は理論に束縛されることなく、ＰＰＡＲモジュレータの封入（カプセル化）によりＰＰＡＲモジュレータの徐放化が行われ、この成分の生物学的利用能力を改良することができ、ＰＰＡＲモジュレータの加水分解を防ぐことができると考えている。本発明の組成物は、封入されていない形で投与されたＰＰＡＲモジュレータより神経保護効果が高いことが認められている。
【００１６】
本発明のミセル化ナノ担体の直径は、約１００ｎｍ以下であり、約７０ｎｍ以下もしくは約５０ｎｍ以下であるのが好ましい。本発明の好ましい実施例では、ミセル化ナノ担体の直径は約３０ｎｍ以下である。ミセル化ナノ担体の最小直径は約１０ｎｍであり得る。ミセル化ナノ担体の直径は約２０ｎｍであることが好ましい。サイジング（例えば押出プロセス）を行わないリポソームの大きさは不均一であり、その直径は１００ｎｍ〜１０００ｎｍとなる。対照的に本発明のミセル化ナノ担体の直径は実質的に均質である。例えば、本発明の組成物において、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％のミセル化ナノ担体の直径は、約１０ｎｍ〜約３０ｎｍであり得る。
【００１７】
ＰＰＡＲモジュレータの可溶化とは、好ましくはＰＰＡＲモジュレータの封入を意味しており、ＰＡＲモジュレータはカプセル化能により定量化され得る。生理的ｐＨで実施される場合、カプセル化能は好ましくは少なくとも５％、少なくとも１０％、又は少なくとも１５％である。本発明の実施例では、カプセル化能は、少なくとも２０％又は少なくとも２５％であり得る。本発明の実施例において、カプセル化能は、５０％以上、又は７０％以上、又は８０％以上であり、最高１００％であってもよい。
【００１８】
カプセル製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬＰ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの濃度のＰＡＲモジュレータを含むことが出来る。
【００１９】
本発明の好ましい実施例において、組成物は水性連続相から成る三成分系の形状であり、ＰＰＡＲモジュレータ及び高分子ナノ担体成分は、そこで分布する分散相に主に存在する。
【００２０】
ＰＰＡＲモジュレータは、ＰＰＡＲ―αモジュレータ、ＰＰＡＲ―γモジュレータ、ＰＰＡＲ―δモジュレータ、デュアルＰＰＡＲモジュレータ、又はｐａｎＰＰＡＲモジュレータでもあってもよい。本発明の好ましい実施例において、ＰＰＡＲモジュレータは、ＰＰＡＲγアゴニスト、もしくはＰＰＡＲγアゴニスト活性を有する化合物である。
本発明の発明者は理論に束縛されることなく、ＰＰＡＲγアゴニスト（又はこの種の活性を有する化合物）は酸化ストレスを緩和し、ミクログリア活性化及び炎症誘発性サイトカイン放出を減少させ、ミトコンドリアの生合成を促進するために、ニューロン及び網膜神経節細胞（ＲＧＣ）に作用すると考えている。これらの経路は、緑内障及びパーキンソン病を含む特定のＣＮＳ疾患の病因に関係しており、本明細書に記載されるこの種の疾患の治療における作用機序について示唆している。
【００２１】
ＰＰＡＲアゴニストは、チアゾリジンジオンであってもよい。本発明の実施例におけるＰＰＡＲアゴニストは、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、ロベグリタゾン、シグリタゾン、ダルグリタゾン、エングリタゾン、ネトグリタゾン、リボグリタゾン、植物性カンナビノイドΔ９―ＴＨＣＡ、及びトログリタゾンのうち１つ以上から選択され得る。
【００２２】
あるいは、上記したようにＰＰＡＲモジュレータは、受容体活性自体が増大するようなＰＰＡＲ活性を調節する化合物、すなわち、作用薬と同じ効果を有する化合物であってもよい。この種の化合物はクルクミン及びレスベラトロルを含み、これらはＰＰＡＲ―γ活性を有することが知られている。
【００２３】
あるいはＰＰＡＲモジュレータは、アシルホモセリンラクトン（ＡＨＳＬ）化合物であってもよい。この種の化合物は、ＰＰＡＲ調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）能力を有することを示している（Ｊａｈｏｏｒら）。ＡＨＳＬは、例えば炭素数４〜２０のアシル基を有することができる。ＡＨＳＬのテトラミン酸及びテトロン酸誘導体としては、３―オキソ及び３―ヒドロキシ誘導体が挙げられ得る。典型的なＡＨＳＬ化合物は、３―ヒドロキシドデカノイル・ホモセリン・ラクトン及び３―オキソドデカノイル・ホモセリン・ラクトンを含む。ＡＨＳＬ化合物は、生物学的障壁の透過率を上昇させるために、タイトジャンクション（密着結合）と関わり合うので更に有利である（カールソンら）。これにより、インビボで意図された組織への組成物送達が強化され得る。
【００２４】
例えば、本発明の適切な高分子ナノ担体組成物は、以下のミセル製剤でもよい：
約１０ｍｇ／ｍｌのビタミンＥ  ＴＰＧＳ
約２０ｍｇ／ｍｌのルトロールＦ１２７
約５ｍｇ／ｍｌのクルクミン
もしくは
約２５ｍｇ／ｍｌのビタミンＥ  ＴＰＧＳ
約１５０ｍｇ／ｍｌのソルトールＨＳ
約５ｍｇ／ｍｌのクルクミン又は約１５ｍｇ／ｍｌのレスベラトロル
もしくは
約５０ｍｇ／ｍｌのビタミンＥ  ＴＰＧＳ
約１５０ｍｇ／ｍｌのソルトールＨＳ
約５ｍｇ／ｍｌのクルクミン又は約１５ｍｇ／ｍｌのレスベラトロル
【００２５】
本発明の組成物は、２つ以上のＰＰＡＲモジュレータの組合せを含んでもよい。ＰＰＡＲモジュレータのうち少なくとも１つは、上記のように封入されることが好ましい。あるいは、両方のＰＰＡＲモジュレータが封入されてもよい。２つ以上のＰＰＡＲモジュレータが封入されるとき、封入のタイプは同じであっても、異なっていてもよい。例えば、両方のＰＰＡＲモジュレータが単一の高分子ナノ担体に封入されてもいいし、もしくは各ＰＰＡＲモジュレータが、投与より前に結合した別々の高分子ナノ担体に封入されてもよい。本発明の実施例における組成物は、レスベラトロル及びクルクミンの組合せを含んでもよい。
【００２６】
組成物は無菌であり得ると共に、１つ以上の薬理学的に許容され得る担体又は賦形剤を含んでもよい。適切な担体及び賦形剤は当業者によく知られており、意図される送達経路と同じ経路で最適化してもよい。例えば本発明の組成物は、緩衝液、バインダ、防腐剤、増粘剤、又は酸化防止剤（例えばトレハロース）を含んでもよい。
【００２７】
組成物は、眼内及び経鼻送達、経口、又は皮膚送達等の局所送達に適していることが好ましい。組成物の局所送達は、ＰＰＡＲモジュレータの全身曝露を低減するので有利となり得る。全身曝露は、心筋梗塞及び死亡のリスクを増大させる有害な副作用と関連がある。
【００２８】
局所製剤は、水性媒体（例えば溶液、ローション剤、ゲル、クリーム、軟膏、ゲル又はフォーム）の溶液または懸濁液の形態であることが好ましい。経口剤は、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、粉末、又は顆粒の形態であってもよい。非経口投与は、静脈、皮下、又は腹膜内投与等である。非経口製剤は特には、水性媒体中の溶液又は懸濁液の形態、又は凍結乾燥粉末として提供され得る。
【００２９】
本発明の実施例における組成物は鼻腔内送達に適している。この種の製剤は、吸入に適した溶液、懸濁液、又は乾燥粉末の形態であり得る。
【００３０】
通常は、そして特に組成物が液体状態で（上記のいずれかの経路を介して）投与される場合、本発明の組成物は凍結乾燥粉末として設けられ得る。本発明の組成物は、凍結乾燥で安定することが特定されており、例えば食塩水又は他の（好適には水性）ビヒクルを使用して再構成することができる。凍結乾燥とする場合は、トレハロースのような凍結防止剤材を組成物に含めることが好ましい。
【００３１】
本発明の組成物は治療に用いることができる。本発明の組成物は特に、ＣＮＳ疾患（例えば神経変性疾患、網膜疾患、又は脳障害）の治療又は予防に用いられ得る。
【００３２】
更なる態様では本発明は、ＣＮＳ疾患（例えば神経変性疾患、網膜疾患、又は脳障害）を治療する方法を提供し、この方法は、患者への本発明の組成物投与を含む。患者はヒトを含む哺乳類であることが好ましく、小児又は高齢であってもよい。
【００３３】
神経変性状態とは、パーキンソン病、アルツハイマー病、又はハンチントン舞踏病であり得る。網膜疾患は、網膜変性状態（例えば緑内障、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、及び視神経炎）を含み得る。脳障害は、外傷性脳損傷、脳卒中、脳性麻痺（例えば新生児低酸素症によって生じる）、及び癌（脳腫瘍を含む）を含み得る。本発明の実施例では組成物は、発症前のパーキンソン病の治療を目的としてもよい。
【００３４】
本発明の組成物は、例えば上記のように眼内又は鼻腔内に局所的に投与され得る。一実施例において本発明の組成物は、例えばインシュリン、メトホルミン、ジペプチジル・ペプチダーゼ―４（ＤＰＰ―４）抑制剤（例えばアログリプチン）、グルカゴン様のペプチド―１（ＧＬＰ―１）受容体作用薬、酸化防止剤（例えばレスベラトロル、コエンザイムＱ１０、イデベノン、ケルセチン等）、ビタミンＤ類の化合物又はその誘導体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）拮抗剤（例えばラニビズマブ、ベバシズマブ又はその機能性フラグメント）、Ｎ―メチル―Ｄ―アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体拮抗剤、グルタミン酸拮抗薬、又はメマンチンといった、１つ以上の追加の治療用薬剤と併用して投与してもよい。追加の治療薬剤は、本発明の組成物と同時に投与しても、順次投与してもよい。本発明の組成物と同時に追加の治療薬剤を投与する場合、ＰＰＡＲと同じ位相又は三元組成物の連続相で、本発明の組成物に含めるようにしてもよい。
特定の実施例における追加の治療薬剤は、ＰＰＡＲと一緒に分散相（すなわち共封入）に存在できるように疎水性を有する。本発明の実施例における組成物は、クルクミン及び酸化防止剤（例えばレスベラトロル）を含む。
【００３５】
更なる態様において本発明は、上記のようにＰＰＡＲモジュレータ・ミセル組成を調製するための方法を提供し、この方法は以下を含む。
（１）１つ以上の高分子ナノ担体成分を第１の溶媒混合液に溶解させる
（２）ＰＰＡＲモジュレータを第２の溶媒混合液に溶解させる
（３）溶解した高分子ナノ担体成分及び溶解したＰＰＡＲモジュレータを結合させ、膜を形成するためにこの結合物を乾燥させる
（４）ミセル溶液を形成するために緩衝液でこの膜を再水和する
（５）封入されていないＰＰＡＲモジュレータを取り除くために懸濁液のろ過を行う
第１の溶媒混合液は、短鎖第一級アルコール（例えばエタノール）であることが好ましい。また、クロロホルム／メタノールのような他の溶媒と比較して、エタノールの毒性は低い。これは、組成物に存在し得る残留溶媒によって問題が生じる可能性はあるが、その可能性が低いということを意味する。本発明の実施例における第１及び第２の溶媒混合液は、同じものでもよい。
本発明の方法の好ましい実施例では、ＰＰＡＲモジュレータはクルクミン、レスベラトロル、又はＡＨＳＬであり、これらは、他の溶媒混合液では可溶性が低いことが示された。懸濁液は、ポアサイズが約０．２２μｍのメンブランフィルタによりろ過を行うことが好ましい。これにより、すべての潜在的な生物学的汚染物を更に取り除くことができる。
【００３６】
更なる態様では本発明は、活性医薬成分（ＡＰＩ）とＡＨＳＬ化合物とを含む医薬組成物を提供する。ＡＨＳＬは、例えば、炭素数４〜２０のアシル基を有し得る。ＡＨＳＬのテトラミン酸及びテトロン酸誘導体として、３―オキソ及び３―ヒドロキシ誘導体が含まれてもよい。典型的なＡＨＳＬ化合物は、３―ヒドロキシドデカノイル・ホモセリン・ラクトン及び３―オキソドデカノイル・ホモセリン・ラクトンを含む。
【００３７】
前述したようにＡＨＳＬ化合物は、生物学的障壁の透過率を上昇させるために、タイトジャンクションと関わり合う。これらの化合物は、宿主の感染が確立する間、組織浸潤プロセスの一部として特定の細菌に用いられることが知られている。しかし、標的組織にＡＰＩを送達するための手段としてのこれらの化合物の可能性は、これまでは認められていなかった。そして本発明の発明者は、この種のアプローチが様々なＡＰＩで用いられ得ると究明した。そしてこれには、上述したＰＰＡＲモジュレータ（クルクミン、レスベラトロル等）と、例えばペプチド又は抗体といった分子量の大きいものが含まれ得る。
【００３８】
好ましい実施例において、この態様の組成物は、ＡＨＳＬ及び／又はＡＰＩをリポソーム又はミセルに封入する高分子ナノ担体成分を更に含む。高分子ナノ担体成分はリポソームの形態であることが好ましく、これは１つ以上のリン脂質を含み、ステロール（例えばコレステロール）及び／又はビタミンＥ誘導体（例えばＴＰＧＳ）を含み得る。適切なリン脂質は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルエタノールアミンを基礎とするものを含む。更に詳細には、本発明の組成物に用いられるリン脂質は、天然型リン脂質誘導体又は合成リン脂質誘導体を含んでもよい。
天然型リン脂質誘導体は、以下のうち１つ以上を含み得る。卵ホスファチジルコリン、水素化卵ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、水素化大豆ホスファチジルコリン、又はスフィンゴミエリン（例えば１―ミリストイル―２―パルミトイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン、１―ミリストイル―２―ステアロイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン、１―パルミトイル―２―ミリストイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン、１―パルミトイル―２―オレオイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン、１―パルミトイル―２―オレオイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホエタノールアミン、１―パルミトイル―２―ステアロイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン、１―ステアロイル―２―ミリストイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン、１―ステアロイル―２―オレオイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン及び１―ステアロイル―２―パルミトイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン）。
合成リン脂質誘導体は、以下のうち１つ以上を含み得る。１、２―ジドデカノイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン（ＤＤＰＣ）、１、２―ジエルコイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、１、２―ジエルコイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１、２―ジリノレオイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン（ＤＬＯＰＣ）、１、２―ジラウロイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１、２―ジラウロイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１、２―ジラウロイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホセリン（ＤＬＰ）、１、２―ジミリストイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１、２―ジミリストイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１、２―ジミリストイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホセリン（ＤＭＰ）、１、２―ジオレオイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１、２―ジオレオイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１、２―ジオレオイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホセリン（ドップ）、１、２―ジパルミトイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１、２―ジパルミトイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＣ）、１、２―ジパルミトイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホセリン（ＤＰＰＳ）、１、２―ジステアロイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１、２―ジステアロイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、及び１、２―ジステアロイル−ｓｎ―グリセロ―３―ホスホセリン（ＤＳＰ）。
本発明の実施例において、界面活性剤又は脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えばＰＬＧＡ―ＰＥＧ）と結合し得る。また、高分子ナノ担体成分は本発明の第１の態様で定めたものであってもよい。
【００３９】
ＡＨＳＬの中には、水性媒体でミセルのような構造を形成可能なものもあるので、成分を追加することなくＡＰＩのための送達システムとして作用することが可能である。しかし組成物の安定性は、例えば上記のように高分子ナノ担体成分の包含により、改善され得る。
【００４０】
この態様の組成物に含まれるＡＰＩは特に限定されないが、当業者であればどのＡＰＩを用いることができるか潜在的に直ちに特定することができる。しかし一例として第１の態様で記載したさまざまな種類のＡＰＩを考慮してもよい。
【００４１】
関連した態様において本発明は、ＡＰＩの送達を強化するためのＡＨＳＬの使用を提供する。特には、生物学的障壁（例えば血液脳関門、血液網膜関門等）を超える送達を強化する。
【００４２】
これより、単なる例としてだが、以下の図を参照して本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】吸光度スペクトルと、ＤＭＳＯ中のクルクミンのモル吸光係数と、安定した、ＤＭＳＯ中に分解されたクルクミンのモル吸光係数とを示す。［Ａ］ＤＭＳＯ中に溶解した公知の０．００５ｍｇ／ｍＬクルクミン濃度の検量線であり、波長４３５ｎｍで、ピーク吸光度（ＯＤ）が認められた。［Ｂ］４３５ｎｍの吸光度に対するクルクミン濃度の勾配が、モル吸光係数（ε）を示す。［Ｃ］水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）５ｍｇ／ｍＬ溶液に分解されたクルクミン（左）は、可溶化安定ミセル化クルクミン製剤（右）より暗い。［Ｄ］ＮａＯＨ中に分解されたＤＭＳＯ希釈クルクミン溶液のモル吸光係数を、エタノール中の５ｍｇ／ｍＬＤＭＳＯ希釈クルクミン溶液と比較した。７２時間以上の分解で、モル吸光係数は、２２，４６２Ｌ．ｍｏｌ―１．ｃｍ―１から２，４７７Ｌ．ｍｏｌ―１．ｃｍ―１まで低下した。これは、ＤＭＳＯ中に希釈されたクルクミンのモル吸光係数（５８，５４７Ｌ．ｍｏｌ―１．ｃｍ―１）の０．０４％となる。
【図２】真空補助回転蒸発を用いた薄膜水和技術について示しており、溶解物質を丸底フラスコへ追加し［Ａ．ｉ］、真空かつ高温下でエタノール（ＥｔＯＨ）を蒸発させ［Ａ．ｉｉ］、乾燥薄膜を残す［Ａ．ｉｉｉ］ことを含む。そして、クルクミンミセルを生成するためにこれを水性緩衝液に再懸濁させる［Ａ．ｉｖ］。回転蒸発［Ｂ．ｉ］及び残った薄膜［Ｂ．ｉｉ］の写真画像である。
【図３】ミセル製剤のクルクミンの可溶化について示す。２ｍｇ／ｍＬクルクミンは蒸留水にあまり十分に溶解せず［Ａ．ｉ］、沈殿物を形成する。この沈殿物は、水を残すように０．２２μｍポアメンブレンを用いて、フィルトレーションで除去される［Ａ．ｉｉ］［Ｂ．ｉ］。０．２２μｍポアメンブレンフィルタを通過させた［Ｂ．ｉｉ］、クルクミン内包ミセルの２ｍｇ／ｍＬ溶液であり［Ａ．ｉｉｉ］、クルクミンの良好な保持を示している。
【図４】クルクミン安定性評価を示しており、異なる環境におけるカプセル化能を測定する。［Ａ］２５℃と４℃の試料間での比較。ベースラインと比較すると、３週間目以降、４℃試料のＥＥは下降している。［Ｂ］２５℃と凍結乾燥にした（２５℃）試料間での比較。全期間で、凍結乾燥試料のＥＥは大きく下降した。データは、ＳＥＭで平均値として表されており、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後解析での２元配置分散分析、***p<0.001を使用して分析された。
【図５】経時的な、Ｚ直径及びクルクミン製剤のＰＤＩを示す。［Ａ］ミセルのサイズ（Ｚ直径）は、時間が経過しても目に見える有意な変化はないままだった。［Ｂ］ミセルの広がり（ＰＤＩ）は時間とともに増加したが、この変化は有意ではなかった。データはＳＥＭで平均値として表されており、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後解析での１元配置分散分析を使用して分析された。
【図６】レスベラトロル製剤の変色について、２週間に亘って示す（構成Ｂ）。画像［Ａ］―［Ｅ］は、保管した製剤の０、７、８、９、１４日目（の様子）である。［Ａ］初期製剤では、いずれの沈殿形成もないことが明らかであった。この製剤を乾燥した暗い環境で、２週間室温で保管した。［Ｂ］変色については、１週以内で製剤が徐々に暗くなっていく様子が観察された。［Ｅ］２週間で製剤は暗さが最も強くなったが、沈殿は形成されなかった。
【図７】レスベラトロル製剤を異なる環境で保管し、これを９日間に亘って示す（構成Ｃ）。図［Ａ］―［Ｅ］は、保管した製剤の０、２、３、８、９日目（の様子）である。［ｉ］室温（２５℃）で保管、［ｉｉ］４℃で保管。この間、製剤の保管は乾燥した暗い環境で行われた。２５℃及び４℃では、９日間に亘って脱色又は堆積は確認されなかった。
【図８】レスベラトロル安定性評価を示しており、異なる環境におけるカプセル化能を測定した。［Ａ］２５℃と４℃との試料間での比較。［Ｂ］２５℃と凍結乾燥とした（２５℃）試料間での比較。ベースラインと比較し、すべての試料において各時点で有意差が示された。［Ｂ］はまた、６週と９週時点で、２つの試料間で有意差があったことを示している。データは、ＳＥＭで平均値として表されており、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後解析での２元配置分散分析、*p<0.05 **p<0.01を使用して分析された。
【図９】経時的な、レスベラトロル製剤のＺ直径及びＰＤＩを示す。［Ａ］ミセルのサイズ（Ｚ直径）には、時間が経過しても目で見える有意な変化はないままだった。［Ｂ］ミセルの広がり（ＰＤＩ）は、時間が経過しても目で見える有意な変化はないままだった。データは、ＳＥＭで平均値として表されており、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後解析での２元配置分散分析を使用して分析された。
【図１０】酸化ストレス損傷（ｉｎｓｕｌｔ）を誘発するパラコート処理の前に、５０μＭのクルクミンミセル製剤、もしくは当量濃度のビヒクルのみによる、一次ＲＧＣ（ネズミ）のインビトロ前処理を示す。細胞生存度は、アラマーブルー（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ）アッセイを使用して評価した。［Ａ］用量反応曲線であり、パラコート濃度が増大すると、細胞生存度は減少する。クルクミン前処理を施した細胞の細胞生存度は有意に増大した。［Ｂ］クルクミン処理ＲＧＣのＩＣ５０は、ビヒクル処理ＲＧＣの２倍である。
【図１１】全網膜の処理群の、ＲＧＣ全体的密度を示す。ｐＯＩＮＴ＝視神経の部分切断、Ｃｕｒｃ＝クルクミン、Ｒｅｓｖ＝レスベラトロル。ＲＧＣ密度は、対照群対治療で有意に高かった。ｐＯＩＮＴのみの群と比較し、クルクミンのみ及び複合処理群において、ＲＧＣ密度における有意な改善が見られた。データは、ＳＥＭで平均値として表されており、１元配置分散分析及び事後Ｔｕｋｅｙ解析、*p<0.05 **p<0.01を使用して分析された。
【図１２】［Ａ］高眼圧症モデル（Ｍｏｒｒｉｓｏｎモデル）にクルクミンミセル（ＣＮ）点眼剤（３週間１日２回）を局所投与すると、ＯＨＴのみの対照群と比較して、有意な神経保護効果があったことを示しておいる。製剤化されていないクルクミン（ＦＣ）対照群では、このモデルのＲＧＣの母集団に対する有意な保護効果はなかった。このモデルは、緑内障の網膜神経節細胞変性モデルとして用いられることが多いが、神経変性の機序では、アルツハイマー病、ＰＤ等を含むＣＮＳの他の疾患と大きな類似点を共有するとますます認知度が上昇している。ＲＧＣ密度は、２０１６年にＤａｖｉｓらが記載したように、Ｂｒｎ３ａ評価を使用して組織学的に特定された。［Ｂ］クルクミン治療では、ＩＯＰに影響が及ばないことを示しており、神経保護効果がＩＯＰに依存しなかったことが示唆されている。
【図１３】ナノ担体製剤のクルクミン含有量の分光定量。［Ａ］ケト型とエノール型のクルクミン（１，７―ビス―（４―ヒドロキシ―３―メトキシフェニル）―１，６―ヘプタジエン―３，５―ジオン）。［Ｂ］ＰＢＳ中の４．５ｍｇ／ｍＬのクルクミンの懸濁液（左）、不溶性物質を除去するための０．２μｍフィルトレーション後のＰＢＳ（真ん中）、不溶性物質を除去するための０．２μｍフィルトレーション後のＴＰＧＳ／プルロニック（登録商標）Ｆ１２７ナノ粒子中（右）。［Ｃ］ＤＭＳＯへの溶解で、２２μＭクルクミンは４３５ｎｍで吸光度ピークを有する。［Ｄ］ＤＭＳＯ溶媒のクルクミンのモル吸光係数の特定（５８，５４７Ｌ．ｍｏｌ―１．ｃｍ―１）と、低いｐＨ６１でのクルクミンの加速した酸化分解は、モル吸光係数を減少させるという実証（１Ｍの水酸化ナトリウム溶液で７２時間培養した後、２１３３Ｌ．ｍｏｌ―１．ｃｍ―１）。そして、分光学的評価がクルクミンの封入及びその分解両方をモニタするために用いられ得ると示唆する。［Ｅ］１Ｍ水酸化ナトリウム溶液（右）に５ｍｇ／ｍＬクルクミンを溶解させた場合、クルクミン内包ナノ担体（左）と比較して急速な変色を生じた。［Ｆ］ＨＰＬＣで測定された公知濃度のクルクミンの検量線。
【図１４Ａ】経時的な、クルクミン内包ナノ粒子の特性分析及び安定性評価。［Ａ］１％酢酸ウラニルによってネガティブ染色されたクルクミン内包ナノ粒子（ＣＮ）の透過電子顕微鏡像。スケールバー＝５０ｎｍ。動的光散乱法により均質な粒子集団が認められたが、これは２５℃で保管の場合、もしくは凍結乾燥とし２５℃で保管、そして９週後に再懸濁した場合も、有意な変化はなかった［Ｂ］［Ｃ］。
【図１４Ｂ】［Ｄ］１０ｍＭのＨＥＰＥＳ中の、１ｍＬの凍結乾燥ＣＮの写真。５０ｍｇ／ｍＬトレハロース緩衝液は良好なケーキ構造を示している。ＣＮが凍結乾燥され再水和されたものに対して、２５℃（溶液）で保管された場合の、安定性調査における経時的なカプセル化能における変化を図示している［Ｅ］。［Ｆ］平均粒径及び［Ｇ］分散度インデックスは、いずれの場合も記録された。平均値±９５％ＣＩ。
【図１５Ａ】クルクミン内包ナノ担体製剤のＸ線回折及びＦＴ―ＩＲ特性分析。
【図１５Ｂ】［Ａ］ｎａｉｖｅクルクミン（青）と、空のナノ担体（黒）と、クルクミンナノ担体（赤）のＸ線回折パターン。［Ｂ］（１）トレハロース、（２）クルクミン内包ナノ粒子、（３）遊離クルクミン、（４）中空ナノ粒子の、ＦＴＩＲ分析。
【図１６】クルクミンのインビトロ放出。４．５ｍｇ／ｍＬクルクミンのインビトロ放出。［Ａ］９５％のエタノール溶液から、［Ｂ］３７℃でＰＢＳ中のクルクミン内包ナノ担体から（平均値±ＳＥ、ｎ＝３）。クルクミンが水性緩衝液に対して難溶性であるので、エタン酸溶液からのクルクミンの放出は、０．５時間時点から可視沈殿物の形成によって制限された。この種の凝集は、ナノ担体クルクミンを使用した実験では観察されなかった。
【図１７】クルクミンナノ粒子処理は、不死化網膜細胞の低酸素模倣の塩化コバルトに対して神経保護効果がある。アラマーブルー細胞生存率アッセイを用いたＣＮの濃度が変化するＲ２８細胞の共インキュベーションでは、グルタミン酸誘発損傷［Ａ、Ｂ］又は塩化コバルト誘発損傷［Ｃ、Ｄ］から細胞が有意に保護された（Ｔｕｋｅｙ事後テストでの１元配置分散分析、***p < 0.001）。ＴＰＧＳを含む中空ナノ粒子は、塩化コバルト誘発毒性［Ｄ］でなくグルタミン酸誘発毒性［Ｂ］に対して神経保護効果があると見出された。
【図１８】局所（投与の）クルクミンナノ粒子は、インビボでＲＧＣ体細胞をＯＨＴ誘導細胞喪失から保護する。［Ａ］模式的なインビボ実験計画。ＯＨＴラットはランダムに、処理なし、もしくは１日１回のクルクミンナノ粒子（ＣＮ）、又は遊離クルクミン（ＦＣ）点眼剤処理とし、これは、高いＩＯＰ誘導の２日前に開始した。手術の３週後に動物は切迫屠殺され、網膜平面は、Ｂｒｎ３ａで標識化する前にフラットマウントとした。ＲＧＣの母集団は、先述のように計数した。上半網膜の相当するＢｒｎ３ａの標識化領域の代表的な網膜像を示す。［Ｂ］ｎａｉｖｅ対照群の動物、［Ｃ］ＯＨＴ処理なしの動物、［Ｄ］ＯＨＴ＋ＣＮ処理の動物。［Ｅ］すべてのＯＨＴ動物は、手術後２１日まで、ベースラインと比較しＩＯＰが有意に上昇した（平均値±ＳＥ）（スチューデントのｔ検定対反対側の眼、**p<0.01）。いずれの時点でも、ＯＨＴ処理群の間でＩＯＰの有意差はなかった。これは、観察された神経保護活性はＩＯＰに依存しないことを示唆している。［Ｆ］ＯＨＴ（処理）のみの眼における高いＩＯＰは、以前の研究結果と一致しており、ＲＧＣ密度（〜２３％）における有意な減少と関連付けられた。ＦＣではなくＣＮ処理では、有意にＲＧＣ喪失を減少させた（Ｄｕｎｎｓ事後テストでのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓテスト、**p <0.01）。
【図１９】局所（投与の）クルクミンナノ粒子は、ＲＧＣ体細胞を視覚神経損傷から保護する。代表的なＢｒｎ３ａ標識化上半網膜部分を、２１日間毎日の局所ＣＮ処理の後、投薬を受けていない網膜［Ａ］、ｐＯＩＮＴ網膜［Ｂ］、ｐＯＩＮＴモデル網膜［Ｃ］の類似領域から採取した。［Ｄ］全網膜ＲＧＣ密度測定では、ｐＯＩＮＴによってＲＧＣ密度の有意な減少が生じた一方で、これが毎日のＣＮ投与によって減少したということが示された。（Ｔｕｋｅｙ事後テストでの１元配置分散分析、**p<0.01 and ***p < 0.0001）。［Ｅ］先述された方法（Ｄａｖｉｓら、２０１６年）を用いた、上側及び下側の象限への各網膜の更なる分割により、局所ＣＮが上側及び下側網膜両方のＲＧＣ密度損失をいくらか防ぐと実証されている（Ｔｕｋｅｙ事後テストでの２元配置分散分析***p<0.001）。
【図２０】アシルホモセリン誘導体３―ＨＯ―Ｃ１２  ＨＳＬ（３―ｏｘｏ―Ｃ１２  ＨＳＬより高い加水分解抵抗のため選択）による細胞毒性試験の結果を示す（Ｄａｖｉｓら、２０１１年）。この分子は、不死化ヒト角膜上皮細胞株（ＨＣＥ―Ｓ）において、３―ｏｘｏ―Ｃ１２  ＨＳＬ［Ａ及びＢ］及び一般の点眼剤及び透過性エンハンサ塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）［Ｃ］より、良好な耐容性を示すと見出された。
【図２１】フィルトレーション後の、３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬを内包したＴＰＧＳミセルのネガティブ染色されたＴＥＭ顕微鏡写真［Ａ］。３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬ内包ミセルは、ＴＰＧＳのみ［Ａ＆Ｄ］、ＴＰＧＳと５ｋａＤａのキトサン［Ｂ］、ＤＳＰＥ―ＰＥＧ／コレステロールミセル［Ｄ］と共に、１ｍｇ／ｍＬの３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬを含むよう調製した。３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬが低水溶性であるため、０．２２μｍフィルトレーションにより、封入されていない材料を除去した。最高３００μＭの３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬを含む３００μＭ濃度のミセルに２時間露出した後、３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬの封入は、ＨＣＥ―Ｓタイトジャンクションを可逆的に破壊する、分子のこの能力によって評価された。ビヒクルだけではＨＣＥ―Ｓ経上皮の抵抗の可逆的減少を誘発することができないので、ミセルは３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬを含まなければならない（ＴＥＲは対照群のパーセンテージとして表記され、対照群はＨＳＬを含まないミセルである）
【図２２Ａ】アシルホモセリンラクトン（３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬ、この図ではＱＳとして略記）がタイトジャンクションの可逆破壊を媒介するので、生物学的障壁を超えての治療用分子の送達のためにこれを用いることが可能であることを実証している。
【図２２Ｂ】Ｄａｖｉｓらが２０１４年に記載したようなインビトロＨＣＥ―Ｓトランスウェル障壁モデルを用いて、［Ａｉ―Ａｉｉｉ］４０ｋＤａのＦＩＴＣデキストラン及び［Ｂｉ―Ｂｉｉｉ］１４９ｋＤａのアバスチン（抗体ベバシズマブ）のトランスサイトーシスは、３００μＭの３―ＯＨ―Ｃ１２ＨＳＬによる２時間のＨＣＥ―Ｓの前処置後、有意に向上した。対照群はＡＨＳＬを含まない同等の製剤である（グラフの黒丸）。このことは、ＡＨＳＬの薬物送達強化の可能性について実証している。
【図２３】モデル薬剤分子と、３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬ含有ミセルの同時投与（４０ｋＤａのＡｎｘ―ＦＩＴＣ（色素フルオレセインイソチオシアネートと結合するアネキシンＶ）が、この薬剤の、生物学的バリアのＨＣＥ―Ｓトランスウェルモデルを超えての送達を促進するのに十分だったことが示されている。
【図２４】ＡＨＬ含有製剤（３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬ）が、ビヒクル対照（ＴＰＧＳミセル）に対して、０．３ｍＭ（Ｆ１）及び０．６ｍＭ（Ｆ２）濃度で、インビトロＨＥＴＣＡＭ試験［Ａ］及びインビボＤｒａｚｉｅ試験［Ｂ］で耐容性が良好であることが示される。これらの結果は、他の透過性エンハンサ（例えばウサギ及び人間で強力な眼球刺激を誘発することが公知である塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ））とは際立って対照的である。
【図２５】２５ｍｇ／ｍｌのＴＰＧＳと１５０ｍｇ／ｍｌのソルトールとから形成されるミセルに封入された４．５ｍｇ／ｍｌのクルクミンの製剤の安定性評価の結果を示しており、経時的にカプセル化能（Ａ）、粒径（Ｂ）、多分散性指数（ＰＤＩ）（Ｃ）を測定した。
【図２６】凍結乾燥及び次の再水和の後の、図２５の製剤のカプセル化能（Ａ）、粒径（Ｂ）、多分散性指数（ＰＤＩ）（Ｃ）の安定性評価の結果を示していりう。
【図２７】ビヒクル単独（Ａ）と比較した場合の、クルクミンミセルの鼻腔内投与が、３ｘＴｇ―ＡＤマウスモデルの網膜のＤＡＲＣカウントを減少させたことを示す（Ｂ、Ｃ）。
【図２８】ビヒクル単独（Ａ）と比較した場合の、クルクミンミセルの鼻腔内投与が、３ｘＴｇ―ＡＤマウスモデルの網膜神経節細胞（ＲＧＣ）損失を防いだことを示す（Ｂ、Ｃ）。
【図２９】ビヒクル単独（Ａ）と比較した場合の、クルクミンミセルの鼻腔内投与が、３ｘＴｇ―ＡＤマウスの海馬のアミロイドβ析出を減少させたことを示す（Ｂ、Ｃ）。
【図３０】２５ｍｇ／ｍｌのＴＰＧＳと１５０ｍｇ／ｍｌのソルトールとから形成されるミセルに封入された１５ｍｇ／ｍｌのレスベラトロルの製剤の安定性評価の結果を示しており、経時的にカプセル化能（Ａ）、粒径（Ｂ）、多分散性指数（ＰＤＩ）（Ｃ）を測定した。
【図３１】凍結乾燥及び次の再水和の後の、図３０の製剤のカプセル化能（Ａ）、粒径（Ｂ）、多分散性指数（ＰＤＩ）（Ｃ）の安定性評価の結果を示していいる。
【図３２】レスベラトロル・ナノ粒子治療は、不死化網膜細胞のグルタミン酸興奮性毒性に対して神経保護効果がある。アラマーブルー細胞生存率アッセイを用いた、ＲＮによるＲ２８細胞の共インキュベーションでは、細胞がグルタミン酸誘発損傷から有意に保護された（Ａ）（Ｔｕｋｅｙ事後テストでの１元配置分散分析、***p < 0.001）。グルタミン酸毒性（Ｂ）。ＴＰＧＳを含む中空ナノ粒子は、グルタミン酸誘発毒性に対して神経保護効果があると見出された（Ａ、Ｃ）。ＲＮの保護効果（Ａ、Ｄ）。
【図３３】レスベラトロル・ナノ粒子治療は、不死化網膜細胞の塩化コバルト誘発低酸素に対して神経保護効果はない（Ａ）。対照群（Ｂ）、中空ナノ粒子（Ｃ）、ＲＮ（Ｄ）。
【図３４】ビヒクル単独と比較した場合に、レスベラトロル・ミセルの鼻腔内投与が、３ｘＴｇ―ＡＤマウスモデルの網膜のＤＡＲＣカウントを減少させたことを示す。
【図３５】ビヒクル単独（Ａ）と比較した場合に、レスベラトロル・ミセルの鼻腔内投与が、３ｘＴｇ―ＡＤマウスの海馬のアミロイドβ析出を減少させたことを示す（Ｂ、Ｃ）。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
実験
＜実施例１＞
最高５ｍｇ／ｍＬまでのクルクミン又はレスベラトロルを用いて、ＴＰＧＳ及びルトロールＦ１２７を含むミセルを調製し、安定性試験を行った。また、ルトロールＦ１２７により、ＰＥＧ―コレステロールを用いてミセルも調製した。
【００４５】
図１では、製剤のクルクミンの濃度は分光器で特定した。加水分解されたクルクミン（治療には役立たない）を完全な薬剤と比較すると、４３５ｎｍで実質的には吸光度を有していないので、各製剤のクルクミン濃度だけでなく活性剤の量を特定することもできた。（水酸化ナトリウムを用いた処理で達成される強制クルクミン分解（図１Ｄ、赤線））。
【００４６】
製造方法
薄膜再水和方法によってクルクミンミセルを形成した（図２参照）。
まずはストック溶液を形成するために、クルクミンと、Ｐ１２７と、ＴＰＧＳとを、超音波処理により無水エタノールに溶かした（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国）。これらは、所望のモル比（表１）で丸底フラスコに加えられ、混合のためにボルテックスされた。エタノール溶媒は、溶解物質乾燥質の薄膜が残るまで、５０ｍｂａｒ真空下かつ所望の温度（表１）で、真空補助ロータリーエバポレータ（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ  Ｒ―２１０／真空コントローラＶ―８５０、Ｂｕｃｈｉ、スイス）を用いて蒸発させた。ロータリーエバポレータ（１ｂａｒ）を用いて、高温でさまざまな水性緩衝液溶液の中に乾燥膜を再懸濁させた。０．２２μｍフィルタ（３３ｍｍ  Ｍｉｌｌｅｘｆｉｌｔｅｒ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、米国）を介したフィルトレーションによって、得たミセルは、封入されていない（不溶性）クルクミンから分離された。それからこのミセル製剤は、経時的にクルクミン・カプセル化能、粒径、安定性が特定され、特性把握された。再水和緩衝液：蒸留水、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）、緩衝液を含んだトリス（２０ｍＭ）トレハロース（５０ｍｇ／ｍＬ）。局所滴下では中性ｐＨが好まれるので、ＰＢＳバッファーを用いて、薬剤安定性が調査された。
【００４７】
＜テーブル１＞個々の製剤プロトコル及び組成物の詳細
2021529748.tif 000003
この研究において生成された製剤の説明。
ｄＨ２０（蒸留水）、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝）、ＥｔＯＨ（エタノール）、Ｃｕｒ（クルクミン）、ＴＰＧＳ（Ｄ―α―トコフェリル・ポリエチングリコール１０００コハク酸）、Ｐ１２７（プルロニック（登録商標）Ｆ―１２７）
【００４８】
図３に示すようなフィルトレーションにより、封入されていないクルクミンを取り除いた。
【００４９】
＜テーブル２＞特性評価及び安定性結果（クルクミンミセル）
2021529748.tif 000004
【００５０】
＜テーブル３＞凍結乾燥：３つの工程
2021529748.tif 000005
凍結乾燥プロトコルには３つの段階が含まれる。１°（一次）、２°（二次）；ｈ（時間）。
【００５１】
＜テーブル４＞凍結乾燥及び再水和の長期安定性（ＰＢＳの予備結果）
2021529748.tif 000006
【００５２】
凍結防止剤は後に、以下の製剤で示されるような安定性がより高い、１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬのトレハロース（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）と置き換えた。
【００５３】
トレハロース凍結防止剤（１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬトレハロース）がある場合、クルクミンミセルの安定性は、室温でも凍結乾燥後も良好だった。ｐＨ４．５のミセルと、ｐＨ７．４のミセルとを調製した。図４及び５参照。
【００５４】
レスベラトロル・ミセル製剤（後にインビボでクルクミンミセルと同時投与）は、同じミセル製剤を使用して高い安定性を示した（表５を参照）。
【００５５】
＜テーブル５＞研究で生成した初期製剤の構成：製剤構成コード
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水、トレハロース：Ｈｅｐｅｓ―トレハロース（５０ｍｇ／ｍＬ）、ＴＰＧＳ：Ｄ―α―トコフェリルポリエチレングリコール１００コハク酸、Ｐ１２７：プルロニック（登録商標）Ｆ―１２７、Ｒｅｓ：レスベラトロル
2021529748.tif 000007
【００５６】
＜テーブル６＞初期濃度の異なる薬剤により生成した封入された（カプセル化）レスベラトロルの量
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【００５７】
緩衝組成物は、製品の進行性の変色を引き起こすＰＢＳと比較し、この酸化防止剤は保管中の製品の分解を経時的に防ぐので、トレハロース（１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ）を含むことが好ましい（図６及び７を参照）。
【００５８】
試料は最高１０週までであるが、高い安定性を示した（図８及び９参照）。
【００５９】
クルクミンミセル製剤が、インビトロで有意に神経を保護することが見出された（図１０参照）。
【００６０】
局所クルクミンミセル点眼剤（１日に２回、３週間）及びクルクミン／レスベラトロル・ミセル併用療法（１日に２滴）が、視覚神経障害（視神経部分切断）のラットモデルで、有意に神経を保護すると見出された（図１１）。この神経変性モデルは主に、網膜疾患に対する療法の有効性を評価するために用いられるが、網膜と脳との間の生成プロセスにおける類似点のため、他のＣＮＳ疾患の治療的な可能性についての情報を与えるために用いてもよい。これらの結果は、ＰＰＡＲ―ｇ活性モジュレータクルクミン及び我々のミセル製剤を用いた酸化防止剤レスベラトロルからの共力作用について示唆している。
【００６１】
クルクミン治療がＩＯＰに影響を及ぼすことはなく、神経保護効果はＩＯＰに依存しなかったことが示唆される（図１２参照）。
【００６２】
＜実施例２＞
方法及び材料
クルクミン内包ナノ担体の調製
クルクミン、Ｄ―α―トコフェロール・ポリエテン・グリコール１０００コハク酸（ＴＰＧＳ）、及びＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７については、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｋｅｎｔ、英国）から手に入る最高純度のものを取得した。クルクミン内包ナノ担体（ＣＮ）は、先述した薄膜水和技術を応用し調製した（Ｄａｖｉｓら、２０１４）。クルクミン、ＴＰＧＳ、及びＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７をエタノール中に溶解してそれぞれ５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ及び２０ｍｇ／ｍＬの濃度とした。透明にするため１０分間穏やかに加熱した後、浴超音波処理を行った。溶液は所望のモル比（それぞれ、２２．５５ｍＭ、１２．２２ｍＭ、７．９４ｍのＭＴＰＧＳ、クルクミン、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７）で丸底フラスコに等分し、よく混合した。光から保護する一方で、Ｖ８５０真空コントローラ（Ｂｕｃｈｉ、スイス）と一緒にＲｏｔａｖａｐｏｒ  Ｒ２１０を用いて、回転蒸発（５０ｍｂａｒ、６５℃、２時間）により溶媒を除去した。この時点以後に、所望の緩衝液（蒸留水、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）、又はＨＥＰＥＳトレハロース緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍｇ／ｍＬトレハロース、ｐＨ７．４））で薄膜を再水和した（５０℃、０．５時間）。それから図１３Ｂに示すように、０．２２μｍフィルトレーション（３３ｍｍマイレクスフィルタ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）により、封入されていないクルクミンを製剤から除去した。ＴＰＧＳ又はＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７を追加することなく、上記と同じプロトコルに従って遊離クルクミン（ＦＣ）を調製した。
【００６３】
クルクミン内包ナノ担体の凍結乾燥
ＨＥＰＥＳトレハロース緩衝液のＣＮ製剤の凍結乾燥は、２時間、７６０Ｔｏｒｒ、―６０℃で凍結する前に、２５℃で７ｍＬの頭部にネジ部のあるスクワット形ガラスバイアル（ＣａｍＬａｂ、Ｃａｍｂｒｉｇｅ  英国）のナノ担体の、１ｍＬのアリコートを平衡させ達成された。試料の第１乾燥は、２００ｍＴｏｒｒ、―３８℃の２４時間で完了し、第２乾燥工程が２００ｍＴｏｒｒ、２５℃で２時間続く。必要となるまで試料は光から保護し、２５℃で保管する前の第２乾燥が停止した直後に覆いをかぶせた。安定性評価のために、０．２２μｍフィルトレーションを通した１ｍＬの蒸留水を追加し、静かに混ぜ合わせ、３０分間試料を再水和させた。
【００６４】
製剤の含水量は、熱重量分析（ＴＧＡ）を使用して特定した。フリーズドライ（凍結乾燥）試料をアルミ製の受け皿に配置し、ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴＧＡ（ＴＡ計測器、米国）によって分析した。流量２５ｍＬ／ｍｉｎの窒素ガスにより試料をパージし、１０℃／分の速度で３０℃から２００℃まで加熱した。パーセント質量損失は、１２０℃でＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｔｒｉｏｓソフトウェアによって含水量に対して算出された。３つのフリーズドライ製剤を、試料ごとに３回測定した。
【００６５】
クルクミン内包効率
ＣＮの負荷効率を分光器により特定し、ＨＰＬＣを使用し結果を確認した。クルクミン内包の分光定量は、ＤＭＳＯで１：５００に希釈した４３５ｎｍで（ナノ担体を空にするための規格）達成された。それから、公知のクルクミン濃度の吸光度を特定する検量線を描くことによって求めたクルクミンのモル吸光係数を使用して、各製剤のクルクミンの濃度を特定した（図１３）。各製剤のカプセル化能は、式１を用いて算出した。
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式中［Ｃ］ｓは、製剤に最初に加えたクルクミンの濃度であり（通常４．５ｍｇ／ｍＬ）、［Ｃ］Ｅは、封入されていない材料を取り除くための０．２２μｍフィルトレーションの後に、ナノ担体内の分光器で検出したクルクミンの濃度である。結果は、確立済のＨＰＬＣ技術（Ｇｕｄｄａｄａｒａｎｇａｖｖａｎａｈａｌｌｙら）を応用して確認された。簡潔には、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２６０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＨＰＬＣシステムに接続し、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で、アセトニトリル：０．１％トリフルオロ酢酸（５０：５０）溶媒システムで、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｓｙｎｅｒｇｉ（サイズ２５０×４．６０ｍｍの４μｍ  Ｐｏｌａｒ―ＲＰ  ８０Ａ）カラムに、２０μＬ量を２５℃で注入する前に、クルクミンを含む試料をメタノールで希釈した。吸光度は４２０ｎｍで記録され、公知のクルクミン濃度の検量線と比較して、クルクミン溶出曲線下の領域であった。
【００６６】
動的光散乱法
粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用して特定した。粒子直径及び多分散性指数の測定は、各実験条件又は製造後時点での最低３つの製剤から記録した。ナノ担体は、記録に先立って適切な緩衝液で１／１０に希釈された。
【００６７】
透過電子顕微鏡法
１分間１％酢酸ウラニルによってナノ担体懸濁液を染色及び乾燥する前に、懸濁液から粒子を吸収するためにカーボングリッドを使用して処理した。Ｇａｔａｎ  Ｏｒｉｕｓデジタルカメラで得た画像を用いて、１００ｋＶで作動するＪｏｅｌ−１０１０透過型電子顕微鏡を使用して標本を観察した。
【００６８】
Ｘ線回折及びＦＴ―ＩＲ
薬剤のみ、中空ナノ粒子、又はＣＮのＸ線回折グラフを、Ｘ線回折装置（Ｒｉｇａｋｕ  ＭｉｎｉＦｌｅｘ  ６００）で作成し、２―ｔｈｅａ角は、０．０５°／秒の角増加で、５度から６５度に設定した。測定は、４０ｋＶ及び１５ｍＡの電圧で行った。４０００ｃｍ―１と６５０ｃｍ―１間の４つのスキャンで、遊離クルクミン、中空ナノ粒子、及びＣＮのＦＴ―ＩＲスペクトルを、４ｃｍ―１解像度でＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ１００  ＦＴ―ＩＲ分光装置を使用して記録した。
【００６９】
クルクミン放出アッセイ
インビトロ・クルクミン放出は、先述したプロトコルを利用して評価した（Ｗａｎｇら、２０１２年）。簡潔には、遊離クルクミン（９５％のエタノールに溶解）又は４．５ｍｇ／ｍＬのクルクミンを含むＣＮを、３．５―５ｋＤａ分画分子量で、１ｍＬ  Ｓｐｅｃｔｒａ―Ｐｏｒ  Ｆｌｏａｔ―Ａ―Ｌｙｚｅｒ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に装填した。５０ｒｐｍで撹拌しつつ、３７℃で保たれる放出クルクミンのためのシンク（ｓｉｎｋ）として作用するために、１０％Ｔｗｅｅｎ−８０を含む２００ｍＬのＰＢＳに対して試料を透析した。所定の時点で、試料を混合物から取り除き、新しい緩衝液と置き換えた。クルクミンの濃度は上記のように特定した。３つの複製した実験からの結果は単一位相結合（式２）と一致した。
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式中、Ｙ０＝０であり、Ｐｌａｔｅａｕは最大放出であり、Ｋはクルクミン放出（ｈ―１）の比率であり、これにより半減期（ｔ１／２）が算出された（ｔ１／２＝ｌｎ２／Ｋ）。
【００７０】
細胞培養
Ｒ２８細胞株（Ｋｅｒａｆａｓｔ、ボストン、ＭＡ）を、５％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び０．２９２ｍｇ／ｍＬグルタミン（Ｇｉｂｃｏ、英国）、７．５％無菌ｄＨ２０、及び１．５ｍＭ  ＫＣｌ（シグマアルドリッチ、英国）を追加し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）で培養した。媒体は一日おきに取り替え、培養組織は９０％のコンフルエンスで継代した。
【００７１】
細胞生存度評価
更に２４時間、濃度が変化する塩化コバルト又はグルタミン酸損傷と組み合わせ、濃度が変化するクルクミン（０〜２０μＭ）、もしくは当量濃度のＴＰＧＳ／プルロニック（登録商標）Ｆ１２７のナノ担体のみ（ビヒクル対照）での処理前に、Ｒ２８細胞を９６−ウェルプレートに４，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４時間平板培養した。細胞生存度はすべて、製造業者の指示に従ってアラマーブルー（Ａｌａｍａｒｂｌｕｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国）アッセイを使用して評価した。簡潔には、Ｓａｆｉｒｅ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（励起波長５３０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍ９１）を使用して蛍光を記録する前に、アラマーブルー溶液を各ウェルプレートに加え、４時間培養した。
【００７２】
動物
すべての動物実験は、英国内務省によって承認された手順と、視覚および眼科研究における動物の使用についてのＡＲＶＯ宣言に従って行われた。実験のインビボ評価のために、合計で１５０〜２００ｇの４８匹の成体の雄のＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット（ハーラン研究室、英国）を、１２時間の明暗サイクル（１４０―２６０ルクス）で空調管理された２１℃の環境に収容した。この環境では食品及び水は自由に利用できる。１３匹は、免疫組織染色前に追加操作は行わないｎａｉｖｅ対照群とした。
【００７３】
高眼圧（ＯＨＴ）モデル
先述されたように（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９９７年）、１８匹のＤａラット（５匹：ＯＨＴのみ、５匹：ＯＨＴ＋ＣＮ、８匹：ＯＨＴ＋ＦＣ）の左眼に対し、外科的に高眼圧を誘発した。処置は、３７．５％のケタミン（Ｐｆｉｚｅｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）、２５％Ｄｏｒｍｉｔｏｌ（Ｐｆｉｚｅｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）、及び３７．５％滅菌水の混合物を使用し、全身麻酔で２ｍＬ／ｋｇを腹膜内に投与し行われた。簡潔には、５０μＬの高張食塩水（１．８Ｍ）を、シリンジポンプを使用して、上強膜静脈２箇所に注入した（５０μＬ／ｍｉｎ；ＵＭＰ２；Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｏｒａｓｏｔａ、ＦＬ、米国）。注入した食塩水の流出が他の房水静脈の邪魔をしないように、外周から１ｍｍに裂け目を切り込んだプロピレンリングを赤道周辺に配置した。各ラットの両眼のＩＯＰは、吸入麻酔（０．４％イソフルレン／酸素中）で、ＴｏｎｏＬａｂトノメータ（Ｔｉｏｌａｔ  Ｏｙ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、フィンランド）を使用して一定間隔で測定した。
ＯＨＴのみの対照群である５匹のラットと共に、５匹のＤａラットに対して毎日ＣＮ局所投与を行った（３５μＬ点滴薬／１日、毎日午前１０時、５分間隔で２回）。これはモデル誘導の２日前に開始し、モデル終了（ＩＯＰ上昇後２１日）まで続けた。さらに８匹のラットは、ＴＰＧＳ又はＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７の追加することなく、ＣＮクルクミンと同じプロトコルを使用して調製した遊離クルクミン（ＦＣ）を受けた。ＣＮ用に記載したのと同じ投与計画に従い、ＯＨＴの動物にＦＣを投与した。動物は片側のＩＯＰ上昇の３週後に切迫屠殺され、網膜はＢｒｎ３ａ免疫組織染色前にフラットマウントとした。
【００７４】
視神経の部分切断（ＰＯＩＮＴ）モデル
先述の技術を用いて、視神経の部分切断を１７匹のＤａラットの左眼に対して行った（Ｌｅｖｏｋｏｖｉｔｃｈ―Ｖｅｒｂｉｎら、２００３年）。全身麻酔の上、上結膜を切り開き、視神経鞘を露出させた。次に硬膜のＯＮを露出させるために、縦方向に切り込みを形成し、そして、眼の後ろ２ｍｍに、スチールカッティングガード付きの眼科手術用メスを使用して、ＯＮの背面に０．２ｍｍの切り込みを入れた。主要眼の血管への損傷を回避し、検眼鏡検査法による手術を完成させ検査を行った。ｐＯＩＮＴのみの対照群としての残りの８匹で先述したのと同じ治療計画により、ｐＯＩＮＴモデル誘導後、９匹Ｄａラットに毎日ＣＮの局所投与を行った。
【００７５】
Ｂｒｎ―３ａ免疫組織染色及び共焦顕微鏡検査
網膜全マウントのＲＧＣのＢｒｎ―３ａ標識化は、先述されたように行った（Ｄａｖｉｓら、２０１６年）。簡潔には、（ラットは）切迫屠殺し眼を摘出した。そして網膜全マウントを解剖する前に、４℃で、４％パラホルムアルデヒドにて一晩固定した。マウス抗ｍＡｂ（１：５００、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を使用して、ＲＧＣ特異核局在転写因子Ｂｒｎ３ａのために全マウントを着色し、共焦顕微鏡検査（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いて調べた。各網膜の全組織は、次の分析のために各網膜のＲＧＣ層の単一面最大射影を生成するために用いた×１０倍率でタイル化Ｚ―ＳＴＡＣＫとして撮像した。参照のため、網膜血管系のインビボｃＳＬＯイメージングを使用して画像の上端に上網膜があるように、各全組織画像の方向を手動で合わせた。撮像したすべての網膜に対し網膜像取得設定を一定とした。これにより、先述したような各実験群のＢｒｎ３ａ発現の比較が可能となった。網膜全組織のＢｒｎ３ａ標識化ＲＧＣの９４自動定量化は、先述のように達成された（Ｄａｖｉｓ他、２０１６年）。
【００７６】
統計分析
すべてのデータは、適切に、スチューデントｔ検定（ＡＮＯＶＡ：分散分析）によって、もしくはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｏｌａ、カリフォルニア、米国）を使用した適切な事後検定により分析した。データは、平均値±標準偏差として提示し、ｐ＜０．０５は有意であるとみなす。分子構造はＡＣＤ／ＣｈｅｍＳｋｅｔｃｈ２０１５を用いて描画されており、すべての画像は著者が撮影した（ＢＭＤ）。
【００７７】
結果及び考察
クルクミン・カプセル化能及び酸化状態を評価するために分光器方法の使用が可能である
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の希釈で、クルクミンは、４３５ｎｍのピーク吸光度（図１３Ｃ）及び５８５４７Ｌ．ｍｏｌ―１．ｃｍ―１のモル吸光係数（図１３Ｄ＆Ｅ）を有し、これは以前に報告された値と同等であった。４３５ｎｍのＤＭＳＯに希釈されたクルクミンの吸光度は、４２μＭまでランベルト・ベールの法則に従い、クルクミンがない場合のＴＰＧＳ／ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７ナノ担体はこの波長で測定可能な吸光度は有しなかった。０．２２μｍフィルタレーションで、封入されていない材料を分離した後、クルクミンを含む製剤のカプセル化能（ＥＥ％）を特定するために分光学的評価を用いた。ＥＥ％の分光計測では、良好な一致を示す両方の技術で、確立したＨＰＬＣ技術（図１３Ｆ）により確認された（それぞれ４．３１±０．１８ｍｇ／ｍＬ対４．３２±０．３３ｍｇ／ｍＬ）。
【００７８】
ナノ担体のクルクミン濃度の分光定量は、クルクミン分解の範囲を示すために用いることも可能である。クルクミンはケト・エノール互変異性（図１３Ａ）を経る。そして、酸性又は中性条件下では安定したケト型で、アルカリ性条件下では水溶性のエノール型で存在する。ケト・エノール互変異性を経る他の分子と同じように、クルクミンのエノール形は、加水分解する傾向がある。アルカリ性緩衝液の溶解によるクルクミン分解プロセスの加速は、調製されたクルクミンと比較して、４３５ｎｍで劇的にクルクミン・モル吸光係数が劇的に減少した（図１３Ｃ―Ｄ、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液存在下で７２時間の培養後、２１３３Ｌ．ｍｏｌ―１．ｃｍ―１）。
さらにまた、アルカリ性条件のＣＮの培養では、オレンジから茶色への劇的な変色が誘発された（図１３Ｅ）。水酸化ナトリウムの溶解後のクルクミン濃度の分光学的評価は、クルクミン・モル吸光係数が急速に減少したことを示しており、この技術がクルクミンの捕捉効率を評価するために用いることができるだけでなく、クルクミン含有製剤の分解の範囲をモニタするために用いることもできることを示唆している。
【００７９】
ＴＰＧＳ／ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７ナノ担体は、クルクミン溶解性及び安定性を強化する
まずはＴＰＧＳナノ担体への取り込みにより、クルクミン内包ナノ担体を調製した。ＴＰＧＳは次の理由により選択された：この賦形剤の低い臨界ミセル濃度（０．０２％ｗ／ｗ）、α―トコフェロール成分の内因性及び抗酸化特性、及びＰ糖蛋白質拮抗作用（この薬剤を含む製剤の障壁通過能力を強化する）。
ＴＰＧＳは既存の眼用製剤に存在し、クルクミン及びＴＰＧＳは両方、エタノールに容易に可溶化することができる。そして、市販の点眼剤（Ｏｐｔｒｅｘ  ＡｃｔｉＭｉｘｔ  ２ｉｎ１アイ・スプレー／乾燥による炎症を起こした眼用）に濃度０．８％で存在する溶媒は、製造プロセスで残留する溶媒に関連する危険率を低減する。さらにまた、ＴＰＧＳの用途で、経口投与薬剤の生物学的利用能を強化することは、文書で十分に裏付けられている。よって、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７の食品研究の用途における近年の関心と共に、本明細書に記載されている新規のクルクミン製剤が経口投与に適し得ることを示唆している。
【００８０】
ＴＰＧＳミセルを用いたクルクミンの製剤は、動的光散乱法で特定されたような、直径１６ｎｍのナノ担体を生成すると見出された（データは示されていない）。残念なことにこれらの製剤は、２５℃で急速に凝集し、オストワルド熟成を示し得る再懸濁から数時間以内に沈殿物を形成した。クルクミン内包ＴＰＧＳナノ担体の安定化は、重合スタビライザＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７（ポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレンのトリブロック共重合体）を追加することによって成し遂げられ、そしてこれは、凝集に対してナノ担体を立体配置的に安定させるために以前から用いられてきた。
【００８１】
記載された方法に従って、クルクミン内包ナノ担体（ＣＮ）を、特定されたカプセル化能及び平均粒度で調製した（図１４）。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）又はＨＥＰＥＳトレハロース緩衝液（ｐＨ７．４）の再懸濁で、ナノ担体が、クルクミンの９６．０％±２．０％（４．３２ｍｇ／ｍＬ）及び９４．２％±４．１％（４．３１ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれ封入すると見出した。透過電子顕微鏡法により、ナノ担体が通常は直径２０ｎｍで、均一なサイズであることが明らかとなった（図１４Ａ）。これらの結果は、ミセル製剤を示唆する１６〜２０ｎｍＺ平均直径を有する均質な粒子分散液を同定する動的光散乱法（図１４Ｂ―Ｃ）によって確認された。
【００８２】
光から保護しつつ２５℃で保管した後、ＣＮ製剤のカプセル化能及び粒径を経時的に評価した。ＣＮ製剤は、製剤でＥＥ％の減少がない（図１４Ｅ）か、粒径で有意な変化がある（図１４Ｆ）か、もしくはこの期間は分散し（図１４Ｇ）、２５℃で９週間は優れた安定度を呈すると見出された。この安定性の研究は、光から保護しつつ２５℃で保管する前に、同じ緩衝液中に調製された凍結乾燥ＣＮを用いて繰り返された。１２０℃で算出された残余含水量は１．０８５±０．０５０％であり、凍結乾燥製剤が適切に調製されたことが示された。製剤は、分散性（図１４Ｅ―Ｇ）を記録する前に再懸濁させた。この分散性は一定しており、液状製剤で報告された結果（表７）と同様であると見出された。ＥＥ％は、評価の各時点で、ベースラインと比較して平均２０％低下すると分かった。これは凍結乾燥又は再水和処理の結果であるかもしれないと示唆している。
【００８３】
これまでに数グループが、クルクミン内包ナノ粒子製剤の調製を試みてきた。これには、ＰＬＧＡ―ナノ担体、固体脂質ナノ担体、リポソーム、及びエキソソームが含まれる。クルクミンの既存のナノ粒子製剤の安定性は限られており（引用したいかなる研究でも、７２時間を越えては評価していない）、適度なクルクミン内包しか成し遂げられておらず（＜０．７７ｍｇ／ｍＬ）、ほとんどのプロトコルは、有機溶剤を必要とする、複雑で多段階式の製造プロトコルのために、クリニックに移動させることが困難である。本明細書に記載されているＴＰＧＳ／ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７クルクミン製剤は、有利にも、既存の文献のものに匹敵する。
【００８４】
＜テーブル７＞クルクミン内包ナノ担体の特性及び経時的な安定性（ｎ＝３）
2021529748.tif 000011
【００８５】
ナノ担体に組み込まれたクルクミンの性質を確認するために、ＸＲＤ及びＦＴ―ＩＲスペクトルを取得した（図１５）。遊離クルクミンのＸ線回折パターンは、５度〜３０度の特性ピークを呈し、高い結晶性構造を表した。この特性はナノ担体製剤のクルクミンの包含で失われた。そして、クルクミンがアモルファスナノ担体構造にうまく組み込まれ、粒子面と結合していないことが示された。ＦＴ―ＩＲスペクトルは、３５０９ｃｍ―１、１６２６ｃｍ―１、１６０１ｃｍ―１、１５０５ｃｍ―１、１２７１ｃｍ―１、１０２４ｃｍ―１、９４８ｃｍ―１、及び７１３ｃｍ―１で遊離クルクミンの特性ピークを現し、これは以前に報告された値と緊密に適合する。ナノ担体への取り込みで、３５０９ｃｍ―１での特性クルクミン・ピーク（遊離ヒドロキシル基を表す）は、３３５２ｃｍ―１でＴＰＧＳ／ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７担体のブロードなＯＨピークと結合した。そしてこれは錯体生成を示唆し得る。さらにまた、芳香族Ｃ＝Ｃピーク（１６０１ｃｍ―１〜１５８８ｃｍ―１）及びＣ＝Ｏ伸縮、１５０５ｃｍ―１から１５１４ｃｍ―１への面内変角δ（ＣＣＣ）及びδ（ＣＣＯ）の特性シフトは、クルクミンの錯体への取り込みが成功した証拠であるとこれまで解釈されてきた。
【００８６】
ナノ担体へのクルクミンの調製により、３７℃では、遊離薬剤と比較して、薬剤放出速度を実質的に低下させた（それぞれｔ１／２＝２２．６時間対０．１５時間，図１６）。これは、ナノ担体からのクルクミンの遅い放出率に起因している。１０％未満の薬剤が、５時間の培養後に遊離した。これは、ＣＮ製剤からのバースト放出はほとんどなかったことを示唆する。この観察（結果）は、クルクミンが単にナノ担体面と結合しているだけでなく、アモルファス又は無秩序結晶相の疎水性内部内に局在する、ＦＴ―ＩＲ及びＸＲＤ観察を裏付けており、以前の研究と一致している。合わせてこれらの結果は、この研究に記載されているクルクミン内包ナノ担体製剤が徐放化能力を有することを示唆する。
【００８７】
クルクミン内包ナノ担体は、網膜細胞株をグルタミン酸及び低酸素誘発損傷から保護する。
グルタミン酸興奮性毒性は、緑内障におけるＲＧＣの喪失に至る潜在的機序を表す。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ細胞生存率アッセイを用いた、ＣＮ及び中空ナノ粒子両方との不死化Ｒ２８細胞の共インキュベーションでは、グルタミン酸誘発毒性（図１７Ａ及びＢ、ＥＭ及び損傷が治療されただけのグループではそれぞれＩＣ５０  ２８．３±３．４ｍＭ対５．９±１．２ｍＭ（Ｔｕｋｅｙ事後テストでの１元配置分散分析（ｐ＜０．００１））に対して著しく防御的であると見出された（Ｔｕｋｅｙ事後テストでの１元配置分散分析（ｐ＜０．００１）。また、ナノ粒子（２４．５±１．２ｍＭ、２０μＭのクルクミンを含むＣＮ）へのクルクミンの追加で観察される相加効果はなかった。この観察は、α―トコフェロール（ここでは、ＴＰＧＳの形態で現れる）がグルタミン酸誘発毒性に対して防御的であると示唆する以前の研究と一致しており、この分子の抗酸化機能の結果であることが示唆されている。ＴＰＧＳは、塩化コバルト誘発損傷に対しても防御的でなかったので、これはクルクミンとＴＰＧＳが相加治療効果を有し得ることを示唆している。
【００８８】
低酸素誘導性因子１α（ＨＩＦ―１α）のような低酸素関連因子のアップレギュレーションは、低酸素を緑内障病態に関与させるために示唆された。塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）は、インビトロ緑内障モデルとして使用するＨＩＦ―１α７５の低酸素症擬似及び誘導物質である。２４時間ＣｏＣｌ２に露出されたＲ２８細胞のＩＣ５０（図１７Ｃ及びＤ）は、ＣＮの形態（それぞれ２９６±５３μＭ対７５７±５１μＭ、Ｔｕｋｅｙ事後テストでの１元配置分散分析（ｐ＜０．００１））で２０μＭクルクミンとの同時のインキュベーションで著しく増加すると見出された。クルクミンがない場合の当量濃度でのナノ粒子の処理では、著しい効果はなかった（２９６±５３μＭ対３５４±８μＭ、Ｔｕｋｅｙ事後テストでの１元配置分散分析（ｐ＞０．０５））。これは、クルクミンにより、防御効果が観察されたことを示唆している。クルクミン濃度＜２０μＭでは、このモデルで神経保護効果があるかどうかは判断できなかった。クルクミンは以前に肝細胞癌細胞のＨＩＦ―１αを阻害することが報告されており、最近では、下垂体腺腫のＨＩＦ―１α合成を抑制することが報告されている。ＨＩＦ―１α抑制薬は以前より、更なる調査に値する、潜在的な緑内障治療として提案されてきた。
【００８９】
局所投与されたクルクミンナノ担体療法は、高眼圧及び視覚神経損傷の齧歯類モデルのＲＧＣを保護する
ビヒクルのみの処理では、生体内でのＣＮの神経保護作用が確立したので、我々は次に、生体内で確立した齧歯類モデル（ＲＧＣ喪失）を使用してＲＧＣの健全性におけるこの製剤の神経保護効果を評価した。我々は、局所適用のクルクミン内包ナノ粒子が局所及び全身的吸収の組合せにより、網膜に達すると予想する。この仮説の裏付けとして、Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎらは、そのデキサメタゾンの製剤（クルクミンに対して同程度の分子量（それぞれ３９２対３６８Ｄａ））が、局所浸透で６０％、全身的吸収で４０％網膜に取り込まれたと報告した。我々は、ペグ化ミセル製剤について先に報告された、強化された角膜浸透活性と組み合わせ、明確に文書化されたトコフェロールとクルクミンのＰ―ｇｐ阻害活性が、局所吸収経路により、網膜へのクルクミン送達を強化すると予想している。
【００９０】
モデル誘導後に複数時点で評価が行われたＯＨＴ及びｐＯＩＮＴモデルの自然発症歴について特性把握する我々の先の研究に基づいて、最適時点ｐｏｓｔモデル誘導（誘導後、最短時間での最大のＲＧＣ喪失）を選択した。我々は近年、ＴＰＧＳ含有ミセルの投与が、インビボでは神経保護効果がないと報告した。これは、我々のインビトロでの観察と組み合わせると、観察された神経保護効果はいずれもクルクミン治療の結果であったことを示唆している。ラットは、図１８Ａに図示される薬品注入法に従って局所的にＣＮ（投薬）を受けた。簡潔には、齧歯動物はＯＨＴモデル誘導の２日前から、１日につき５分間隔で２滴（それぞれ３５μＬ）のＣＮ投薬をモデル誘導の日から３週間受けた。ラットはＣＮの局所投与では、有資格眼科医がモニタする投薬を受けていない眼で報告された眼球刺激又は炎症の徴候もなく、良好な耐容性を示すと見出された。２本の強膜上静脈への高張食塩水の注入による、ＩＯＰ上昇後の齧歯動物のＩＯＰプロファイル（図１８Ｂ）は、投薬を受けていない目と比べ、モデル誘導後少なくとも７日間はＩＯＰが著しく上昇したままだったことを示している。ＣＮとＯＨＴのみのグループ間では、ＩＯＰプロファイルの有意差は観察されなかった。これは、クルクミンのいかなる神経保護効果もＩＯＰ非依存プロセスによると示唆している。ＲＧＣの健全性をｂｒｎ３ａ評価により、全網膜マウントから組織学的に評価した（図１８Ｃ）。Ｂｒｎ３ａは核制限された、ＲＧＣ固有の転写因子であるので、このアプローチが選択された。この転写因子は、ＲＧＣの母集団（光感受性ＲＧＣを除外する）の９７％を排他的に標識する。我々はまた近年、網膜症の齧歯類モデルの全ＲＧＣの母集団を正確かつ自動的に定量化するためのアルゴリズムを開発した。これにより、ＲＧＣの健全性を信頼性高く評価可能となる。このアプローチを用いることにより、ＯＨＴ誘導が反対側の眼と比較して〜２３％のグローバルなＲＧＣ密度の著しい減少を生じさせると見出された。これはこのモデルを使用した以前の研究に相当する。ＣＮ投与はＯＨＴの眼対反対側の未処置の眼の間で、ＲＧＣ密度比を大幅に向上させたが（Ｄｕｎｎｓ事後テストでのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験（**p < 0.01））、ＰＢＳに可溶化された封入されていないクルクミン（ＦＣ―遊離クルクミン）の投与ではこの効果はなかった（図１８Ｄ―Ｆ）。
【００９１】
更に局所適用におけるＣＮの神経を保護する可能性を調査するために、全網膜ｂｒｎ３ａ標識化ＲＧＣの母集団評価が、ｐＯＩＮＴモデルで行われた（図１９Ａ）。このモデルにおいて、ＣＮの１日２回の局所投与で、ＲＧＣが著しく保護されると見出された（１元配置分散分析、***p <0.001）。上側及び下側象限への全網膜マウントの区画では（図１９Ｂ）、ＣＮでの処置は、上側及び下側両方の象限におけるＲＧＣの母集団の保護が認められたが、この効果は、上半網膜で更に顕著であった（２元配置分散分析、***p < 0.001）。これは、クルクミン療法の保護効果が抗酸化であるのと同様に抗アポトーシス性機序により発揮されることを意味し得る。
Ｂｒｎ３ａ標識化網膜全マウント（図１９Ｃ―Ｅ）の上側象限からの代表的な領域は、ＲＧＣの母集団が網膜対象ｐＯＩＮＴ（図１９Ｄ）対ｎａｉｖｅ対照群（図１９Ｃ）で減少したことを示す。３週間ＣＮを投与したところ、ｐＯＩＮＴ誘発損傷からＲＧＣ体細胞が保護されることが見出された（図１９Ｅ）。ＲＧＣ体細胞の保持が上側及び下側両方の網膜象限で観察されたので、一次及び二次神経変性プロセス両方を含む複数の経路を介して、クルクミンが神経保護活性を引き出し得ることが示唆される。
【００９２】
グルタミン酸興奮性毒性の阻害による、ＴＰＧＳを用いた神経保護の可能性は、興味深いものであり、インビボで我々の製剤の神経保護効果に寄与し得る。この仮説及び我々の現在のインビトロでの調査結果の裏付けとして、Ｎｕｃｃｉらは、合計１０μＬの０．５％（ｗ／ｖ）のＴＰＧＳ（０．５ｍｇのＴＰＧＳの全量に等しい）の眼内投与により、ラットの虚血／再灌流障害から神経が保護されたと以前に報告した。我々はこれまでに、同じ濃度でのＴＰＧＳの局所投与がインビボで神経保護効果を有しないと報告している。この矛盾は、観血的適用と比較した場合の、網膜に達する低い濃度にありそうである。これは、局所適用の用量の〜３％であると通常推定される。このモデルを用いた我々のこれまでの研究が、ＴＰＧＳの投与のみでは、それ自体が神経保護効果を有するように見えなかったことを示唆するにもかかわらず、ＴＰＧＳ単独の神経保護効果を介してない場合は、おそらく、Ｐ−ｇｐ活性のＴＰＧＳを用いた調節により、クルクミンとＴＰＧＳ間の相乗作用は、極めて高そうであり、眼関門全体のクルクミン輸送を強化する。
【００９３】
この研究において観察されたクルクミン内包ナノ担体の神経保護効果は、モデル誘導の２日前に始まる治療の結果であるかもしれない。そして、この療法がＩＯＰスパイク（例えば以下の水晶体超音波吸引手術）のリスクがある患者にとって、もしくは緑内障（例えば高眼圧又は他の緑内障危険因子を有する症状）を進行させるリスクが高いと特定される患者に対する予防薬として、最も効果的かもしれないと示唆している。さらにまた、（例えば病気の進行における初期に緑内障を診断する可能性を有するＤＡＲＣ（アポトーシス網膜細胞の検出））といった新しい技術を発展させることにより（Ｃｏｒｄｅｉｒｏら、２０１７年）、初期の病期進行でＲＧＣの喪失を減速又は防止する療法は、緑内障を管理する上で大きな役割を果たす。
【００９４】
結論として、この調査ではこの難溶性薬剤の溶解性を約４００，０００倍増大させるＴＰＧＳ／プルロニック（商標）Ｆ１２７のクルクミンの新規ナノ担体製剤について記載する。この製剤は、室温で保管されるときは少なくとも２ヵ月間、液体又は凍結乾燥の形で、＞９０％の一貫したカプセル化能及び優れた安定度を備えた、４．３ｍｇ／ｍＬのクルクミンを取り込む（ＨＰＬＣ及び分光技術によって特定される）。この製剤は、インビトロの網膜培養のグルタミン酸及び塩化コバルト誘発損傷に対して神経保護効果があると見出された。そして２匹の眼損傷が確立した齧歯類モデルのＲＧＣ密度を有意に保った。結論として我々は、クルクミン内包ナノ粒子は眼関門を通過する素晴らしい潜在能力を有することを実証し、例えば緑内障といった眼症状の治療を行うクリニックに対し、クルクミンベースの療法への置き換えが容易にできるようにする。
【００９５】
＜実施例３＞アシルホモセリンラクトン（ＡＨＳＬ）は、薬物送達のエンハンサである
図２０〜２３に示される結果により、先に述べられた発明の更なる態様による組成物の薬物送達エンハンサとしての、ＡＨＳＬの安全性及び有効性について実証する。この結果は、２つの構造的に無関係なモデル物質、ＦＩＴＣ―デキストラン及びＦＩＴＣ―アネキシンＶ、及びＡＨＳＬ含有ミセルの抗体（ベバシズマブ）の強化された経上皮送達について実証する。ミセル（又は他の三元製剤システム）は、当業者は理解するような各種の方法により調製が可能である。しかし、薄膜水和は、水溶媒質の製剤成分の単純混合であり得るので、任意の加温について言及してもよい。
【００９６】
典型的な組成物の製剤
より詳細に、そして単なる一例だが、組成物は、以下のように調製可能である（製剤１〜３についてのレポートは図２１）。
製剤１．ＴＰＧＳ又はＤＳＰＥ―ＰＥＧ及びコレステロールミセルを用いた３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬ
（ａ）１００ｍｇのＴＰＧＳ（又はＤＳＰＥ―ＰＥＧ及びコレステロール）及び５ｍｇ．ｍＬ―１の３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬを、５：１（クロロホルム：メタノール）で可溶化した
（ｂ）所望量のＴＰＳＧ（又はＤＳＰＥ―ＰＥＧ及びコレステロール）及び３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬ（通常はそれぞれ０．５％及び０．１％ｗ／ｖ）を分取し、溶媒を回転蒸発（６５℃、５０ｍｂａｒで１時間）により蒸発させた
（ｃ）ケーキは、封入されていない材料を除去するために、フィルトレーション（０．２２μｍ）前に、６５℃で３０分間ＰＢＳバッファー中に再懸濁した
製剤２．ＴＰＧＳミセルを用いた３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬ
（ａ）ＴＰＧＳ粉末を、ＴＰＧＳミセルを生成するための０．５％（ｖ／ｖ）の終濃度まで、２時間６５℃まで加熱することによって、ＰＢＳバッファーに直接可溶化した
（ｂ）あるいは（ａ）の代わりに、ＴＰＧＳミセルを、Ａの溶液の超音波処理により調製した
（ｃ）３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬは、０．１％（ｖ／ｖ）を、一時間ＴＰＧＳミセル溶液と混ぜ合わせる前に、１０ｍｇ／ｍＬの濃度までＤＭＳＯで可溶化した
（ｄ）０．２２μｍフィルトレーションによって、封入されていない材料を除去した
製剤３．ＴＰＧＳ／５ｋのキトサンミセルを用いた３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬ
（ａ）３７℃まで１時間加熱し、２ｍＬの緩衝液に１１０ｍｇの５Ｋ  キトサン（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に溶解させることによって５５ｍｇ／ｍＬの５Ｋ  キトサンを調製した
（ｂ）ＴＰＧＳ溶液は、上記のように調製した（Ｆ１又はＦ２）
（ｃ）２５ｍｇの５Ｋ  キトサンを、上記の溶液からの２．７５ｍｇのＴＰＧＳと混合し、０．１ｍｇの３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬに加え、完全に溶解させるため短時間の超音波処理により３７℃で１時間培養した
（ｄ）フィルトレーション（０．２２μｍポア）によって、封入されていない材料を除去した
製剤４．３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬ内包リポソーム
（１）クロロホルム：メタノール（５：１）に溶解させることにより、３．２５ｍＭのＱＳＳＭと共にＰＣ５０％ＰＳ１５％Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ３０％ＱＳＳＭ５％―ＰＬＶｓ（６５ｍＭ）の以下の製剤を、調製する
ＰＣ７０％（２５ｍｇ／ｍｌ）：１００１μｌ
ＰＳ１５％（２５ｍｇ／ｍｌ）：３２２μｌ
コレステロール（５０ｍｇ／ｍｌ）：１５１μｌ
３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬ（５ｍｇ／ｍｌ）：９７２μｌ
（２）アルゴン化で、それから１時間真空下で蒸発させ、乾燥脂質ケーキを生成する
（３）一方で、１ｍｌのＡｎｘＶ―７７６（１３―０３、０．４７５ｍｇ／ｍｌ）を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５に対して３時間透析する
（４）穏やかに混合し（１５０回転数／分）、３７℃で１時間培養し、１ｍｌのＡｎｘＶ―７７６溶液の脂質ケーキを再水和する
（５）液体窒素で混合物を５回凍結融解させる
（６）４００ｎｍ、２００ｎｍ、最後に１００ｎｍポアフィルタを使用して順次押し出す
【００９７】
これらの典型的な組成物では、３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬは、いずれのＡＨＳＬとでも置換が可能である。
トランスウェルアッセイ・プロトコル（一部Ｄａｖｉｓらに基づく、２０１４年）
ＨＣＥ―Ｓ細胞（不死化ヒト角膜上皮細胞）は、１０％の熱失活させたＦＢ及びペニシリン―ストレプトマイシン（１００ｕ／ｍＬ）が追加された９０％のＤＭＥＭの単層として培養された。細胞は５％のＣＯ２の湿式インキュベータで、３７℃で培養し、増殖培地は３日毎に置き換えた。ＨＣＥ―Ｓ集団は、０．２５％のトリプシン―ＥＤＴＡを使用し、２０％への継代の前に、８０％のコンフルエンスまで生育させた。各実験の前に、ヘモ血球計算器及びトリパンブルー除外アッセイを使用して細胞集団を推定した。
【００９８】
先述の方法（Ｒｅｉｃｈｌ、２００８年）を適応させ、トランスサイトーシス・アッセイのためのＨＣＥ―Ｓ障壁モデルを調製した。ＨＣＥ―Ｓ細胞（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）は、トランズウェルインサート（ポリカーボネート、３μｍポアサイズ、１．１３ｃｍ２）に播種され、一日おきに先端（ａｐｉｃａｌ）及び基底（ｂａｓａｌ）チャンバの媒体を取り換え、７日間保管した。この時点以後、細胞は、多層障壁の発達を促すために、先端面の空気界面で更に１０日間培養された。各実験の前に、培地は、フェノールレッドフリーのＤＭＥＭと置き換えられ、障壁の完全性は、経上皮抵抗（ＴＥＲ）を介して測定した。ＴＥＲ値を３００〜６００Ωｃｍ２の範囲で得た。そして、ＴＥＲ＞３００Ω２（タイト上皮関門で認められている閾値）の上皮関門のみをトランスサイトーシス実験で使用した（Ｂｅｃｋｅｒら）。
【００９９】
図２１及び２２。フェノールレッドフリー培地に２時間溶解されたミセル（１００％を薬剤負荷とみなす）又は当量濃度のミセルのみ（ビヒクル対照）へ３００μＭの３００  ３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬを追加する前に、ベースラインＴＥＲを記録した。この時以後、培地を新しいものと置き換える前に、ＴＥＲを記録した。先端チャンバに、モデル薬剤分子（ＦＩＴＣ―デキストラン又はアバスチン）を加え、側底チャンバの薬剤の濃度を、ＦＩＴＣ蛍光（ＦＩＴＣ―デキストラン）対既知濃度の検量線をモニタするか、もしくは先述したような市販のアバスチン・サンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｄａｖｉｓら、２０１４年）を使用して測定した。各時点のＴＥＲ測定は、ビヒクル処理対照群に対し規格化されており、生物学的障壁を可逆的に破壊するＡＨＳＬの能力を、そして更に重要なことには、薬物送達応用のためのこの概念の利用を明らかに実証する。
【０１００】
図２３。生物学的障壁を越える治療効果により薬剤の送達を向上させるためには、ＡＨＳＬ含有製剤の同時投与ならびに前処置が役立ち得ると実証するために、ＦＩＴＣ  ＡＮＸＶ（例えばモデル蛋白性薬物）を、ＡＨＳＬ内包ミセルと共に３時間同時投与した。図２１及び２２に関して記載されるようなプロトコル。
【０１０１】
本明細書で用いられるＨＣＥ―Ｓトランスウェルモデルが角膜上皮のモデルであるにもかかわらず、アシルホモセリンラクトン媒介可逆障壁破壊の方法は、ＩＱＧＡＰ１との相互作用による［Ｋａｒｌｓｓｏｎら］。従って類似の効果は、他の生物学的障壁（すなわち血液脳関門、血液網膜関門、腸及び皮膚障壁）で観察される。
【０１０２】
現在まで、生物学的障壁を破壊するアシルホモセリンラクトンの能力は、細菌が宿主組織に侵入できるように、単にこれらの薬剤の能力（細菌によって生成され、３―ＯＨ―Ｃ１２  ＨＳＬは、３―ｏｘｏ―Ｃ１２  ＨＳＬの合成類似体である）だけが注目されてきた。この研究はまずは、治療学の送達を容易にするために、これらの薬剤の使用の実証を提示する。これは、多糖及び巨大タンパク質のような巨大分子を含むが（図２５および２６）、当業者であれはこの概念が、生物学的障壁を越える小分子ＡＰＩにも通用することを理解するであろう。
【０１０３】
＜実施例４＞  ＨＥＴ―ＣＡＭ試験
材料及び方法
インビトロで眼の許容度を研究するために、ＨＥＴＣＡＭ（登録商標）試験が、ＩＮＶＩＴＴＯＸ  ｎｏ１５プロトコルの記載のように展開された（Ｗａｒｒｅｎ、１９９０年）。
【０１０４】
この試験は、研究される製剤を０．３ｍｌずつ適用（適用は最初５分間）することによって誘導される、１０日齢の幼虫形成卵の絨毛尿膜（ＣＡＭ）の刺激物効果（出血、血管収縮、及び凝固）の観察に基づく。
【０１０５】
これらの卵（ｆａｒｍ  Ｇ．Ａ．Ｌ．Ｌ．Ｓ．Ａ，Ｔａｒｒａｇｏｎａ，スペイン）は、培養中は温度（３７．８℃）及び湿度（５０〜６０％）が制御されるインキュベータに配置する前に、少なくとも２４時間は１２±１℃で保管した。
【０１０６】
一連の制御が行われた：ＳＤＳ  １％（遅い刺激のための陽性対照群）、０．１  Ｎ  ＮａＯＨ（速い刺激のための陽性対照群）、ＮａＣｌ  ０．９％（陰性対照群）。
【０１０７】
損傷が発生した時間の平均値±ＳＤとして、データを分析した（ｎ＝３／群）。刺激性のスコアは、４つのカテゴリに分類可能である（表８）。
【０１０８】
＜テーブル８＞ＨＥＴ―ＣＡＭ算出及び分類
2021529748.tif 000012
【０１０９】
結果
分析された製剤は、インビトロで非刺激物であると示された（表９）。興味深いことに、すべての症例中で現れた唯一の現象は、わずかな血管収縮作用であった（図２４）。どの製剤においても、出血又は凝固は現れなかった。
【０１１０】
＜テーブル９＞製剤評価の結果
2021529748.tif 000013
【０１１１】
インビボ
材料及び方法
生体内での眼許容度は、ドレイズ刺激試験を使用して評価した。これは、Ｓａｎ  Ｂｅｒｎａｒｄｏ  ｆｉｒｍ（Ｂａｖａｒｒａ）から２．５ｋｇ（平均体重）のニュージーランド白色種雄ウサギを使用して行われた。この試験は、Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＢ及び現在の法律に従い行われた（Ｄｅｃｒｅｔ２１４／９７、Ｇｅｎｃａｔ）。
【０１１２】
試料は、左の眼の結膜嚢に置かれ、適切な循環血液を確実とするために穏やかなマッサージが施された（Ｎｏｂｒｇａら、２０１２年）。刺激の出現については、投与時に、そして１時間後、陰性対照群（ｎ＝３／群）としての右眼を用いて観察された。
【０１１３】
評価は眼の前眼部の直接観察によって行われ、結膜（炎症、結膜浮腫、発赤、又は毛細血管出血）、虹彩及び角膜（混濁及び影響のある面）の考えられる損傷に注意した。眼刺激指数（ＯＩＩ）は、観察された損傷に従って評価された（表１０及び１１）。
【０１１４】
＜テーブル１０＞ドレイズ試験算出及び分類
2021529748.tif 000014
【０１１５】
＜テーブル１１＞ドレイズ試験評価スコア
2021529748.tif 000015
【０１１６】
結果
どの製剤においても、刺激はなかった（ＯＩＩ＝０）。動物は、適用（点眼）時又は１時間後では、いずれのインビボ刺激の徴候も示さなかった（図２４）。これは製品が非刺激であることを示すインビトロ評価の結果との相互に関連がある。
【０１１７】
＜実施例５＞
２５ｍｇ／ｍｌのＴＰＧＳ及び１５０ｍｇ／ｍｌのソルトールから形成されるミセルに封入された４．５ｍｇ／ｍｌのクルクミンの製剤を、先述した薄膜再水和技術を使用して調製した。
【０１１８】
製剤は、９０日に亘って高いカプセル化能及び安定性を実証した（図２５Ａ〜Ｃ）。カプセル化能は、凍結乾燥及び続く再水和時も高いままであった（６５％）。その一方で、粒径及び多分散も９０日に亘って安定性を示した（図２６Ａ〜Ｃ）。
【０１１９】
それからアルツハイマー病の３ｘＴｇ―ＡＤマウスモデルで製剤の試験を行い、３ヵ月間、週に５日、鼻腔内投与した。ビヒクル単独と比較すると、クルクミンナノ粒子は網膜のＤＡＲＣカウント（ＤＡＲＣカウントに関する詳細は例えば国際公開第２０１１／０５５１２１号を参照）を減少させた。これは、その細胞死が減少したことを示している（図２７Ａ〜Ｃ）。クルクミンナノ粒子も、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を損失から保護し（図２８Ａ〜Ｃ）、海馬のアミロイドβ析出を減少させた（図２９Ａ〜Ｃ）。
【０１２０】
＜実施例６＞
２５ｍｇ／ｍｌのＴＰＧＳ及び１５０ｍｇ／ｍｌのソルトールから形成されたミセルに封入された１５ｍｇ／ｍｌのレスベラトロルの製剤を、先述した薄膜再水和技術を使用して調製した。
【０１２１】
製剤は、９０日に亘って高いカプセル化能（＞７０％）及び安定性を実証した（図２７Ａ〜Ｃ）。カプセル化能は、凍結乾燥及び続く再水和時も高いままであった。その一方で、粒径及び多分散も９０日に亘って安定性を示した（図２８Ａ〜Ｃ）。
【０１２２】
濃度が変化する塩化コバルト又はグルタミン酸損傷と組み合わせ、レスベラトロル（２０μｍ）含有ミセル又は当量濃度のＴＰＧＳ／ソルトールのみのミセル（すなわち空の）で処理する前に上記のようにＲ２８細胞を培養した。
【０１２３】
レスベラトロル含有ミセルでは、グルタミン酸興奮性毒性に対する神経の保護は認められたが（図２９Ａ―Ｄ）、塩化コバルト誘発低酸素に対して神経保護効果はなかった（図３０  Ａ―Ｄ）。
【０１２４】
それから、アルツハイマー病の３ｘＴｇ―ＡＤマウスモデルで製剤の試験が行われ、３ヵ月間週に５日、製剤を鼻腔内投与した。ビヒクル単独と比較すると、レスベラトロル・ナノ粒子は網膜のＤＡＲＣカウントを減少させた。これは、細胞死が減少したことを示しており（図３１）、海馬のアミロイドβ析出も減少した（図３２Ａ〜Ｃ）。
【０１２５】
＜参照＞
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【国際調査報告】
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