(57)【要約】  本技術は、概して、代謝疾患のモジュレーションのための、インスリン様成長因子結合タンパク質-2(IGFBP-2)のヘパリン結合ドメイン(HBD)を含む化合物、特にペプチドに関する。本技術は、概して、代謝疾患を予防及び/又は治療するための方法及び組成物における、そのような化合物の使用、並びにそのような使用のための製剤にも関する。
2021525261.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における代謝疾患をモジュレートするための方法であって、i)配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)又はその類似体、ii)i)に記載のペプチドの断片、又はiii)i)及びii)に記載のペプチドのいずれか1つの薬学的に許容される塩からなるペプチドの治療上有効な量を該対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２】
代謝疾患は、グルコース代謝障害に伴う疾患である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
代謝疾患は、更にインスリン代謝障害に伴うものである、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
代謝疾患は、レプチン代謝障害に更に伴うものである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
代謝疾患は、稀な遺伝的肥満疾患である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
代謝疾患は、症候性肥満である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
代謝疾患は、レプチン受容体(LEPR)欠損に又はレプチン欠損に伴う疾患である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
代謝疾患は、低血糖症、高血糖症、炭水化物不耐症、耐糖能異常、空腹時血糖異常、耐糖能障害、炭水化物-脂質代謝障害、高インスリン血症、IV型高リポ蛋白血症、インスリン抵抗症、I型糖尿病、II型糖尿病、肥満、β細胞機能障害、先端巨大症、メラノコルチン-4(MC4)シグナル伝達経路障害に伴う疾患、レプチン受容体(LEPR)欠損に伴う疾患、LEPR変異に伴う疾患、レプチン受容体関連単一遺伝子肥満、極度のインスリン抵抗症候群、プロオピオメラノコルチン(POMC)欠損、POMCヘテロ接合、アルストレーム症候群、バルデ・ビードル症候群(BBS)、ドナヒュー症候群(妖精症)、ラブソン・メンデンホール症候群、極度のA型インスリン抵抗症候群、極度のB型インスリン抵抗症候群、極度のC型インスリン抵抗症候群、HAIR-AN、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)、先天性脂肪委縮症症候群、先天性全身性脂肪委縮症(Beradinelli-Seip syndrome)、後天性脂肪委縮症症候群、全身性脂肪委縮症、及び部分型脂肪委縮症のうちの1つ又は複数である、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
HBDはHBD1である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドはペグ化されている、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ペプチドはアシル化されている、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドは環状である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
その類似体は、その保存的類似体である、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
その類似体は、その構造的類似体、その機能的類似体、又は両方である、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ペプチドは、配列番号73に記載の通りであるか又はその類似体である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ペプチドは、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号17、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113に記載の通りであるか又はその任意の類似体である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記投与は、髄腔内、皮下、皮膚、経口、静脈内、鼻腔内、腹腔内、筋肉内、インプラントを介した、マトリックスを介した、ゲルを介した、又はその任意の組み合わせである、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
治療上有効な量は、約0.01μg/kg〜約100mg/kgである、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
治療上有効な量は、約0.3mg/kg〜約3mg/kgである、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与する工程は、1日1回、2回、又は3回実施される、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与する工程は、週に1回、2回、又は3回実施される、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記投与する工程は、少なくとも約1週又は約28週間の期間続く、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記投与する工程は約28週間を超える期間続く、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
対象におけるグルコース恒常性を回復させる方法であって、i)配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)又はその類似体、ii)i)に記載のペプチドの断片、又はiii)i)及びii)に記載のペプチドのいずれか1つの薬学的に許容される塩からなるペプチドの治療上有効な量を該対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２５】
グルコース恒常性の回復は、インスリン若しくはインスリン様成長因子-1(IGF1)、又はその両方に無関係に達成される、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
a)i)配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)又はその類似体、ii)i)に記載のペプチドの断片、又はiii)i)及びii)に記載のペプチドのいずれか1つの薬学的に許容される塩;及び1つ又は複数の薬学的に許容される担体からなるペプチドの治療上有効な量を含む薬学的組成物と、
b)前記薬学的組成物用の1つ又は複数の容器と、
c)代謝疾患をモジュレートすることにおけるその使用のための指示書
とを含む、キット。
【請求項２７】
対象におけるグルコース制御を改善するための方法であって、i)配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)又はその類似体、ii)i)に記載のペプチドの断片、又はiii)i)及びii)に記載のペプチドのいずれか1つの薬学的に許容される塩からなるペプチドの治療上有効な量を該対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２８】
対象におけるグルコース制御を改善することにおけるその使用のための、i)配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)若しくはその類似体、ii)i)に記載のペプチドの断片、又はiii)i)及びii)に記載のペプチドのいずれか1つの薬学的に許容される塩からなる、単離されたペプチド。
【請求項２９】
対象におけるインスリン感受性を改善するための方法であって、i)配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)若しくはその類似体、ii)i)に記載のペプチドの断片、又はiii)i)及びii)に記載のペプチドのいずれか1つの薬学的に許容される塩からなるペプチドの治療上有効な量を該対象に投与する工程を含む方法。
【請求項３０】
対象におけるインスリン感受性を改善することにおけるその使用のための、i)配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)若しくはその類似体、ii)i)に記載のペプチドの断片、又はiii)i)及びii)に記載のペプチドのいずれか1つの薬学的に許容される塩からなる、単離されたペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2018年5月24日に出願した米国仮特許出願第62/676,087号の優先権及び恩典を主張するものであり、その開示は参照によりその全体として本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本技術は、概して、代謝疾患の予防及び/又は治療のためのインスリン様成長因子結合タンパク質-2(IGFBP-2)のヘパリン結合ドメイン(HBD)を含む化合物、特にペプチドに関する。本技術は、概して、代謝疾患を予防又は治療するための方法におけるそのような化合物の使用、並びにそのような使用のための組成物及び製剤にも関する。
【背景技術】
【０００３】
インスリン様成長因子結合タンパク質-2(IGFBP-2)は、IGFBPファミリーのメンバーである36,000ダルトンのタンパク質である。六(6)種の形態の高親和性IGF結合タンパク質が存在する。これらのタンパク質は、インスリン様成長因子I及びIIに結合し、輸送タンパク質として働くことに加えて、とりわけ血中で、IGFに結合するそれらの能力とは無関係であるいくつかの直接的組織効果を有することが示されている。
【０００４】
IGFBP-2は、血清中の2番目に豊富な結合タンパク質である。IGFBP-2は、ヒトにおいて、健常対象者においては100〜600ng/mlの間の様々な濃度で循環している。タンパク質濃度は胎児期及び出生時に高く、小児期及び青年期に次第に下がる。60〜80歳の間でおよそ25%の増加が生じる。IGFBP-2の血清濃度は、ホルモン及び栄養素によって調節される。絶食はIGFBP-2の大幅な増加を引き起こし、摂食(特にタンパク質摂食)は濃度を正常に戻す。
【０００５】
IGFBP-2は、インスリン様成長因子の担体タンパク質としての役割に加えて、骨量、脂肪代謝、及びグルコース代謝を調節する。IGFBP-2ノックアウトマウス(IGFBP-2-/-)では、骨量が低下し脂肪量が増加した(DeMambro、Endocrinology、2008)。対照的に、マウスにおけるIGFBP-2の過剰発現は、食餌性肥満に対する感受性の低下及びインスリン感度の向上をもたらした(Wheatcroft、Diabetes、2007;Hedbacker、Cell Metab、2010)。インビトロにおいて、IGFBP-2は、マウス及びヒト骨芽細胞分化を直接刺激し(Xi、JBMR、2014)、対照的に前脂肪細胞分化を阻害する(Wheatcroft、Diabetes、2007)。他のIGFBPに関しては、IGFBP-2のN末端領域はIGF-I結合部位を含有し、一方でC末端領域はIGF-I結合を促し、細胞外マトリックスに結合する能力の主要因である。
【０００６】
IGFBP-2は、IGF結合非依存的機能を付与する2つのヘパリン結合ドメイン(HBD)も含む。HBD1は、リンカー領域に位置する固有のHBDであり、一方でHBD2はC末端領域に位置する。HBD1及びHBD2の両方とも、脂質生成を阻害するIGFBP-2の能力の主要因であるものの(Xi、Endocrinology、2013)、HBD1のみが骨量獲得及び骨芽細胞分化に関する特性を媒介する(Kawai、JBC、2011;Xi、JBMR、2014)。
【０００７】
先行研究は、HBDを含むペプチドを開示している。例えば、WO 2005/014635は、HBD1とアミノ酸配列類似性を共有する心血管障害血漿ポリペプチド(CPP)を開示し、そのようなCPPに関する潜在的診断機能を示唆している。また米国特許第9,220,746号は、IGFBP-2の骨芽細胞生成活性を保存するHBD1ペプチドを開示し、骨関連病状の治療におけるこれらのペプチドの役割を提案している。最近、WO 2018/145006は、インビボで骨形成を誘導するHBDの様々な断片を提案している。
【０００８】
現在のところ、入手できる実験データは、IGFBP-2の生物学的効果、つまり骨芽細胞分化の刺激及び脂肪細胞分化の阻害が、少なくとも部分的に、該分子のHBDによって媒介されることを示している(Xi、2013;Kawai、2013)。これらの特性は、米国特許第9,220,746号及びWO 2018/145006において得られ、記載されているHBDの様々なペプチド断片及び類似体によって共有されている。骨芽細胞及び脂肪細胞はどちらも間葉系幹細胞(MSC)に由来することから、このことは、IGBP-2のHBDが、脂肪細胞への分化よりも骨芽細胞へのMSC分化を促進することを示唆している。
【０００９】
報告されているIGFBP-2の別の生物学的役割は、グルコース制御に関するものである。IGFBP-2の過剰発現は、レプチン欠損の様々な動物モデル、並びに肥満及び糖尿病のその他のモデルにおいて、グルコース制御の改善をもたらす(Weathcroft、2007;Hedbacker、Cell Metab、2010)。この効果は、少なくとも部分的に、インスリン感受性上昇に起因するようである(Hedbacker、Cell Metab、2010)。加えて、IGFBP-2は、インビトロにおいて脂肪細胞及び筋肉細胞によるグルコース取込みを増加させること、並びに、インスリン及びインスリン様成長因子-1(IGF1)の両方が利用するシグナル発生経路を介して且つインスリン及びIGF1非依存的機序を介してこれを行うことも示されている(Assefa、2018;Yau、2013)。興味深いことに、IGFBP-2遺伝子発現はレプチンによって刺激されており、IGFBP-2はレプチンの代謝効果のメディエーターであることが示唆されている(Hedbacker、2010)。
【００１０】
グルコース制御に関するIGFBP-2の生物学は実証されているとはいえ、HBDドメインがこれらの生物学的効果に関係しているのか否かは依然として不明である。ある論文で、HBD1及びHBD2はマウスにおいて体重及び脂肪蓄積を減少させることが示され、HBD1及びHBD2は耐糖能に対して作用しないことが示され、これによって、HBDのグルコース代謝に対する関与がないことが示唆されている(Xi、2013)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO 2005/014635
【特許文献２】米国特許第9,220,746号
【特許文献３】WO 2018/145006
【特許文献４】米国特許第7,323,543号
【特許文献５】米国特許第7,482,171号
【特許文献６】米国特許第7,459,152号
【特許文献７】米国特許第7,393,919号
【特許文献８】米国特許第7,468,418号
【特許文献９】米国特許第7,402,652号
【特許文献１０】米国特許第7,351,797号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】DeMambro、Endocrinology、2008
【非特許文献２】Wheatcroft、Diabetes、2007
【非特許文献３】Xi、JBMR、2014
【非特許文献４】Xi、Endocrinology、2013
【非特許文献５】Kawai、JBC、2011
【非特許文献６】Remington、The Science And Practice of Pharmacy(第9編、1995)
【非特許文献７】Pharmaceutical Research 3(6):318(1986)
【非特許文献８】Hedbacker、Cell Metab、2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ゆえに、例えば対象におけるグルコース制御を改善する等のグルコース代謝をモジュレートする能力を有する治療的ペプチドを得ることが、非常に興味深いこととなる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
様々な態様によると、本技術は、対象における代謝疾患をモジュレートするための方法であって、i)配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)若しくはその類似体、ii)i)に記載のペプチドの断片、又はiii)i)及びii)に記載のペプチドのいずれか1つの薬学的に許容される塩からなるペプチドの治療上有効な量を該対象に投与する工程を含む方法に関する。
【００１５】
様々な態様によると、本技術は、代謝疾患を有する対象における代謝疾患のモジュレーションにおけるその使用のための、i)配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)若しくはその類似体、ii)i)に記載のペプチドの断片、又はiii)i)及びii)に記載のペプチドのいずれか1つの薬学的に許容される塩からなる、単離されたペプチドに関する。
【００１６】
様々な態様によると、本技術は、a)i)配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)若しくはその類似体、ii)i)に記載のペプチドの断片、又はiii)i)及びii)に記載のペプチドのいずれか1つの薬学的に許容される塩、及び1つ又は複数の薬学的に許容される担体からなるペプチドの治療上有効な量を含む薬学的組成物と、b)前記薬学的組成物用の1つ又は複数の容器と、c)代謝疾患をモジュレートすることにおけるその使用のための指示書とを含む、キットに関する。
【００１７】
様々な態様によると、本技術は、対象におけるグルコース制御を改善するための方法であって、i)配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)若しくはその類似体、ii)i)に記載のペプチドの断片、又はiii)i)及びii)に記載のペプチドのいずれか1つの薬学的に許容される塩からなるペプチドの治療上有効な量を該対象に投与する工程を含む方法に関する。
【００１８】
様々な態様によると、本技術は、対象におけるグルコース制御を改善することにおけるその使用のための、i)配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)若しくはその類似体、ii)i)に記載のペプチドの断片、又はiii)i)及びii)に記載のペプチドのいずれか1つの薬学的に許容される塩からなる、単離されたペプチドに関する。
【００１９】
様々な態様によると、本技術は、対象におけるインスリン感受性を改善するための方法であって、i)配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)若しくはその類似体、ii)i)に記載のペプチドの断片、又はiii)i)及びii)に記載のペプチドのいずれか1つの薬学的に許容される塩からなるペプチドの治療上有効な量を該対象に投与する工程を含む方法に関する。
【００２０】
様々な態様によると、本技術は、対象におけるグルコース恒常性を回復させる方法であって、i)配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)若しくはその類似体、ii)i)に記載のペプチドの断片、又はiii)i)及びii)に記載のペプチドのいずれか1つの薬学的に許容される塩からなるペプチドの治療上有効な量を該対象に投与する工程を含む方法に関する。ある場合には、グルコース恒常性を回復させるための方法は、インスリン及びインスリン様成長因子-1(IGF1)と無関係に達成される。
【００２１】
様々な態様によると、本技術は、対象におけるインスリン感受性を改善することにおけるその使用のための、i)配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)若しくはその類似体、ii)i)に記載のペプチドの断片、又はiii)i)及びii)に記載のペプチドのいずれか1つの薬学的に許容される塩からなる、単離されたペプチドに関する。
【００２２】
本技術の他の態様及び特質は、添付の図面とともに具体的な実施形態についての以下の説明を概観すれば、当業者に明白になるであろう。
【００２３】
本開示において記載される実施形態のすべての特質は、相互排他的ではなく互いに組み合わせられ得る。例えば、1つの実施形態の要素は、更に言及することなく他の実施形態において利用され得る。具体的な実施形態についての詳細な説明は、添付の図面を参照して、本明細書において下記で提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本技術の1つの実施形態に従ったHBD1断片が、アシル化HBD1(3〜11)断片処理の2週間後、インスリン抵抗症をもたらすレプチン欠損を有するマウスモデルob/obマウスにおける耐糖能異常を改善することを示したグラフである。示したデータは、腹腔内グルコース負荷試験(IPGTT)の45分後の血糖値(平均±SEM)である。(各群ともn=5;***:p値<0.001)。
【図２】図2Aは、本技術の1つの実施形態に従ったHBD1断片が、グルコースを遠隔測定された、インスリン抵抗症をもたらすレプチン欠損を有するマウスモデルであるob/obマウスにおける耐糖能障害を改善することを示したグラフである。アシル化HBD1(3〜11)断片処理の28日後の、3時間の腹腔内グルコース負荷試験プロファイル。(各群ともn=5〜8;両用量とも対VHLのp値<0.0001)、多重比較による二元配置ANOVA、****p<0.0001  図2Bは、本技術の1つの実施形態に従ったHBD1断片が、グルコースを遠隔測定された、インスリン抵抗症をもたらすレプチン欠損を有するマウスモデルであるob/obマウスにおける耐糖能異常を改善することを示したグラフである。アシル化HBD1(3〜11)断片処理の28日後の、空腹時血糖値(IPGTT前10分以内の平均値)。(各群ともn=5〜8;3mg/kg用量対VHLのp値<0.005)、対VHLの独立両側t検定、***p<0.005  図2Cは、本技術の1つの実施形態に従ったHBD1断片が、グルコースを遠隔測定された、インスリン抵抗症をもたらすレプチン欠損を有するマウスモデルであるob/obマウスにおける耐糖能異常を改善することを示したグラフである。アシル化HBD1(3〜11)断片処理の28日後の、3時間の腹腔内グルコース負荷試験プロファイルの曲線下面積。(各群ともn=5〜8)、対VHLの独立両側t検定、*p<0.05、****p<0.0001。
【図３】図3Aは、本技術の1つの実施形態に従ったHBD1断片が、遠隔でグルコース測定された、インスリン抵抗症をもたらすレプチン欠損を有するマウスモデルであるob/obマウスにおける耐糖能異常を改善することを示したグラフである。アシル化HBD1(3〜11)断片処理の前(1日目)及び27日後の、16時間の平均血糖値。(各群ともn=5〜8;**3mg/kg用量対VHLのp値<0.001)  図3Bは、本技術の1つの実施形態に従ったHBD1断片が、遠隔でグルコース測定された、インスリン抵抗症をもたらすレプチン欠損を有するマウスモデルであるob/obマウスにおける耐糖能異常を改善することを示したグラフである。アシル化HBD1(3〜11)断片処理の27日後の、16時間の平均血糖値のベースラインからの変動。(各群ともn=5〜8;**3mg/kg用量対VHLのp値<0.01)。
【図４】本技術の一部の実施形態に従ったHBD1断片で処理された完全に分化した3T3脂肪細胞によるグルコース取込みの増加を例示したグラフである。細胞を、3μg/mlの濃度の試験化合物に、[3H]-2-デオキシグルコース取込みの試験前の24時間曝露させた。すべての被験HBD1ペプチドは、3T3-LI脂肪細胞によるグルコース取込みの増加を刺激した。
【図５】図5Aは、本技術の一部の実施形態に従ったHBD1断片で処理された場合の、完全に分化したC2C12マウス骨格筋筋管によるグルコース取込みの用量依存的増加を例示したグラフである。具体的には、0.8μM、1.5μM、及び2.3μMのHBD1配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)。  図5Bは、本技術の一部の実施形態に従ったHBD1断片で処理された場合の、完全に分化したC2C12マウス骨格筋筋管によるグルコース取込みの時間依存的増加を例示したグラフである。具体的には、1.5μM配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)をグルコース取込み試験の2、4、及び16時間前に。  図5Cは、更に、インスリンと組み合わせたHBD1ペプチド配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)の付加が、グルコース取込みの相加的増加をもたらしたことを例示したグラフである。
【図６】本技術の実施形態に従ったHBD1断片で処理された場合の、完全に分化したC2C12マウス骨格筋筋管によるAkt経路の用量依存的なリン酸化(活性化)を例示したグラフである。具体的には、HBD1配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)。Akt経路は、インスリン及びIGF1の両方によって、最終的に細胞膜へのGLUT4移行を誘導してグルコースの取込み及び代謝を促進するために利用される。HBD1ペプチド配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)によるAktの活性化は、IGFBP2のRPTPβ受容体への結合及びAkt経路の活性化を妨げることが以前に示されている、抗フィブロネクチン抗体での処理によって妨げられた。
【図７】本技術の1つの実施形態に従ったHBD1断片で処理された場合の、完全に分化したC2C12マウス骨格筋筋管によるAMPK経路の用量依存的なリン酸化(活性化)を例示したグラフである。具体的には、HBD1配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)。AMPK経路は、インスリン及びIGF1の両方に非依存的であるが、最終的に細胞膜へのGLUT4移行を誘導してグルコースの取込み及び代謝を促進するように作用する。HBD1ペプチド配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)によるAMPKの活性化は、IGFBP2のRPTPβ受容体への結合及びAkt経路の活性化を妨げることが以前に示されている抗フィブロネクチン抗体での処理、及びAMPK特異的阻害剤である化合物C(CC)での処理の両方によって妨げられた。
【図８】本技術の1つの実施形態に従ったHBD1断片で処理された場合の、完全に分化したC2C12マウス骨格筋筋管によるグルコース取込みの増加を例示したグラフである。具体的には、1.5μMの配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)、単独及びインスリンの相加的方法の両方。HBD1ペプチド配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)によるグルコース取込みの増加は、IGFBP2のRPTPβ受容体への結合を妨げることが以前に示されている抗フィブロネクチン抗体での処理、及びAMPK特異的阻害剤である化合物C(CC)での処理の両方によって妨げられた。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
技術についてのこの本説明は、本技術が実行され得るすべての異なる手法又は本技術に付加され得るすべての特質についての詳細な目録であることを意図されるものではない。例えば、1つの実施形態に関して例示される特質は他の実施形態に組み込まれ得、特定の実施形態に関して例示される特質はその実施形態から取り除かれ得る。加えて、本明細書において示唆される様々な実施形態に対する数々の変形及び付加は、本技術から逸脱しない本開示に照らせば当業者に明白であろう。それゆえ、以下の明細書は、本技術の一部の特定の実施形態を例示することを意図されるものであり、そのすべての順列、組み合わせ、及び変形を徹底的に指定することを意図されるものではない。別様に定義されていない限り、本明細書において用いられるすべての技術的及び科学的な用語は、本技術が属する技術分野における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。
【００２６】
本明細書において使用する場合、文脈で別様に明示されていない限り、単数形「a」、「an」、及び「the」は、複数の指示対象を含む。
【００２７】
端点による数値範囲の本明細書における記載は、その範囲内に包括されるすべての数を含むものとする(例えば、1〜5の記載は、1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、4.32、及び5を含む)。
【００２８】
「約」という用語は、明示的か否かに拘わらず本明細書において使用され、本明細書において所与の量はいずれも、実際の所与の値を指すことを意味し、また、そのような所与の値についての実験及び/又は測定条件による同値及び近似値を含む、当技術分野の通常の技術に基づき合理的に推測されるそのような所与の値の近似値を指すことも意味する。例えば、所与の値又は範囲の関連における「約」という用語は、所与の値又は範囲の20%以内、好ましくは15%以内、より好ましくは10%以内、より好ましくは9%以内、より好ましくは8%以内、より好ましくは7%以内、より好ましくは6%以内、及びより好ましくは5%以内である値又は範囲を指す。
【００２９】
本明細書において使用する「及び/又は」という表現は、2つの明記した特徴又は構成成分のそれぞれの、他方を含んだ又は含まない具体的な開示として取り上げられるべきものである。例えば「A及び/又はB」は、本明細書にまるでそれぞれが個々に呈示されているかのように、(i)A、(ii)B、並びに(iii)A及びBのそれぞれの具体的な開示として取り上げられるべきものである。
【００３０】
本開示は、本発見者らによって実施された、IGFBP-2のペプチド断片、特にIGFBP-2のヘパリン結合ドメイン(HBD)のペプチド断片に関し、またこれらのペプチド断片が、代謝疾患を予防及び/又は治療する方法等の対象における代謝疾患をモジュレートする方法においてどのように使用され得るのかについての研究に関する仕事に端を発する。特に、発見者らは、IGFBP-2のヘパリン結合ドメイン1(HBD1)のペプチド断片がインスリンに対して抵抗性のある動物モデルにおける耐糖能異常全般を改善することを実証することによって、これらのペプチドが、とりわけ、対象におけるグルコース代謝をモジュレートするために使用され得ることを明らかにした。
【００３１】
A.化合物、ペプチド、その断片及び類似体
本明細書において使用する場合、「ヘパリン結合ドメイン」及び「HBD」という表現及び用語は、IGFBP-2のヘパリン結合ドメインを指し、一方で「HBD2」という用語は、IGFBP-2のヘパリン結合ドメイン2を指す。HBD1は、配列番号1に記載のアミノ酸配列、つまり:1-KHHLGLEEPKKLR-13を有するペプチドを指すことを意図され、式中、「1」は、このHBD1ペプチドの5'末端又はN末端におけるアミノ酸残基を指し、「13」は、このHBD1ペプチドの3'末端又はC末端におけるアミノ酸残基を指す。したがって、HBD1のアミノ酸は、以下の位置:
1KH2H3L4G5L6E7E8P9K10K11L12R13
を占有する。
【００３２】
当技術分野において十分に認識された略語を用いて、左旋性アミノ酸(L-アミノ酸又はL又はL型)及び右旋性アミノ酸(D-アミノ酸又はD又はD型)、アラニン(Ala又はA)、アルギニン(Arg又はR)、アスパラギン(Asn又はN)、アスパラギン酸(Asp又はD)、システイン(Cys又はC)、グルタミン酸(Glu又はE)、グルタミン(Gln又はQ)、グリシン(Gly又はG)、ヒスチジン(His又はH)、イソロイシン(Ile又はI)、ロイシン(Leu又はL)、リジン(Lys又はK)、メチオニン(Met又はM)、フェニルアラニン(Phe又はF)、プロリン(Pro又はP)、セリン(Ser又はS)、トレオニン(Thr又はT)、トリプトファン(Trp又はW)、チロシン(Tyr又はY)、及びバリン(Val又はV)を含めたアミノ酸を記載する。天然ペプチド配列内のL-アミノ酸残基は、タンパク質においてよく見い出される20種のL-アミノ酸のいずれか1種、或いは対応するD-アミノ酸、4-ヒドロキシプロリン若しくはヒドロキシリシン等であるがそれらに限定されない希少アミノ酸、又はP-アラニン若しくはホモセリン等の非タンパク性アミノ酸のいずれか1種に変更され得る。別様に示されていない限り、本明細書において名前を挙げられるアミノ酸はL型を指す。
【００３３】
本明細書において規定されるペプチドの天然に存在する変異は、コード遺伝子若しくはその対立遺伝子のヌクレオチド配列における個別の変化により生じる、又は転写されたRNAの選択的スプライシングにより生じる、1つ又は複数のアミノ酸の置換、付加、又は欠失を含み得るものである。これらの変化は、ペプチド変種の特性、薬理学的及び生物学的な特徴に実質的に影響を及ぼさないと理解される。
【００３４】
本開示のペプチドは塩の形態であり得る。特に、分子の酸性官能基は、トリフルオロ酢酸塩等であるがそれに限定されないその塩誘導体によって置き換えられ得る。
【００３５】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」によって、長さ若しくは翻訳後修飾(例えば、グリコシル化又はリン酸化)若しくは化学的修飾にかかわらないアミノ酸の任意の鎖、又はD-Tyr、オルニチン、アミノアジピン酸等の非天然若しくは異常アミノ酸を含有するものを意味する。
【００３６】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、HBD1の断片を含む。一部の実施形態において、ペプチドは13アミノ酸長である。一部の実施形態において、ペプチドは12アミノ酸長である。一部の実施形態において、ペプチドは11アミノ酸長である。一部の実施形態において、ペプチドは10アミノ酸長である。一部の実施形態において、ペプチドは9アミノ酸長である。一部の他の実施形態において、ペプチドは8アミノ酸長である。一部の他の実施形態において、ペプチドは7アミノ酸長である。一部の他の実施形態において、ペプチドは6アミノ酸長である。一部の実施形態において、ペプチドは5アミノ酸長である。一部の実施形態において、ペプチドは4アミノ酸長である。
【００３７】
本明細書において使用する場合、「断片」又は「その断片」という用語及び表現は、IGFBP-2等のペプチドのアミノ酸断片、又はIGFBP-2のHBDのアミノ酸断片、又はIGFBP-2のHBD1のアミノ酸断片を指す。HBD1の断片は、13アミノ酸残基よりも短い。したがって、HBD1の断片は、12、11、10、9、8、7、6、5、又は4アミノ酸残基長であり得る。一部の実施形態において、HBD1の断片は12アミノ酸長である。一部の実施形態において、HBD1の断片は11アミノ酸長である。一部の実施形態において、HBD1の断片は10アミノ酸長である。一部の実施形態において、HBD1の断片は9アミノ酸長である。一部の他の実施形態において、HBD1の断片は8アミノ酸長である。一部の他の実施形態において、HBD1の断片は7アミノ酸長である。一部の他の実施形態において、HBD1の断片は6アミノ酸長である。一部の他の実施形態において、HBD1の断片は5アミノ酸長である。一部の他の実施形態において、HBD1の断片は4アミノ酸長である。
【００３８】
1つの実施形態において、本開示は、Table 1(表1)に描写されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。HBD1(1〜13)は全長HBD1を表す。Table 1(表1)に提示される残りのペプチドは、HBD1(1〜13)の断片であり、N末端における又はC末端における又はN末端及びC末端の両方におけるアミノ酸残基が欠けている。
【００３９】
【表１】
2021525261.tif 000003
【００４０】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、「精製されている」、「単離されている」、又は「実質的に純粋である」。ペプチドは、それらに天然に付随する成分からそれらが分離されている場合、「精製されている」、「単離されている」、又は「実質的に純粋である」。典型的に、化合物は、それがサンプルにおける全材料の少なくとも約60質量%、少なくとも約65質量%、少なくとも約70質量%、少なくとも約75質量%、少なくとも約80質量%、少なくとも約85質量%、少なくとも約90質量%、少なくとも約91質量%、少なくとも約92質量%、少なくとも約93質量%、少なくとも約94質量%、少なくとも約95質量%、少なくとも約96質量%、少なくとも約97質量%、少なくとも約98質量%、又は少なくとも約99質量%である場合、実質的に純粋である。ペプチドを精製する又は単離するための技法は、当技術分野においてよく知られ、用いられており、当業者に公知であろう。
【００４１】
一部の他の実施形態において、本開示に従ったある特定のペプチドは環化形態でもあり得、それによりN末端又はC末端は直接的に又はリンカー部分の挿入によって頭尾連結されており、そのような部分自体は、一般的に、非環化形態に関してペプチドの三次元構造を変更するのを回避するような様式で、骨格に接合するのに要される1つ又は複数のアミノ酸残基を含む。そのようなペプチド誘導体は、非環化ペプチドと比べて、改善された安定性及び生体利用率を有し得る。
【００４２】
ペプチドを環化するための方法は、当技術分野において周知である。環化は、2つの側鎖官能基の間でのジスルフィド結合形成、1つの側鎖官能基と骨格α-アミノ基若しくはカルボキシル基との間でのアミド若しくはエステル結合形成、2つの側鎖官能基の間でのアミド若しくはエステル結合形成、又は骨格アルファ-アミノ基及びカルボキシル基の間でのアミド結合形成によって達成され得る。これらの環化反応は、溶液中での高希釈で伝統的に行われている。環化は、一般に、ペプチドが樹脂に付着している間に達成される。固体支持体上で環状ペプチドを合成する最もよく見られる手法の1つは、アミノ酸の側鎖を樹脂に付着させることによるものである。適当な保護戦略を用いると、鎖会合の後、C末端及びN末端は選択的に脱保護され得、樹脂上で環化され得る。この戦略は広く用いられており、tert-ブチルオキシカルボニル(Boc)又は9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)プロトコールのいずれかと適合性である。しかしながら、それは、固体支持体に付着する適当な側鎖官能基を含有するペプチドに制限される。いくつかのアプローチを用いて、環状ペプチドの効率的な合成を達成し得る。環状ペプチドを合成するための1つの手順は、樹脂からの同時切断による環化に基づく。適当なペプチド配列が固相合成によって樹脂上に会合した後、又は直鎖状配列が樹脂に付された後、脱保護されたアミノ基は、そのアンカリング活性を有する連結と反応して、保護された環状ペプチドを産生し得る。一般的に、最終脱保護工程は、標的環状ペプチドを生成するために要される。環状ペプチドを合成するための手順は、当技術分野において周知である。
【００４３】
他の実施形態において、本開示は、本明細書において規定されるペプチドの類似体を提供する。本明細書において使用する場合、「類似体」という用語は、その親化合物の生理学的活性を有し、天然に存在する親ペプチドのアミノ酸配列とは異なる1つ又は複数(例えば、2、3、4、5、又は6個以上)のアミノ酸を含むペプチドを指す。そのような類似体は、好ましくは、親ペプチドの生理学的活性の少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%を有する。
【００４４】
一部の他の実施形態において、類似体は、親と同じくらい生理学的に活性であり得る(すなわち、親ペプチドの生理学的活性の100%を有する)、又は親ペプチドよりも約100%を上回って、約110%を上回って、約120%を上回って、約130%を上回って、約140%を上回って、約150%を上回って、約160%を上回って、約170%を上回って、約180%を上回って、約190%を上回って、約200%を上回って、若しくは約300%を上回って生理学的に活性であり得る。
【００４５】
一部の他の実施形態において、類似体は、親より生理学的に低い活性であり得るが(例えば、親ペプチドの生理学的活性の95%)、一部の治療的適用に関連する且つ/又は望ましい活性のレベルをなお提供し得る。
【００４６】
そのような種々のアミノ酸は、非天然の側鎖基及び骨格連結の付加を含めた、付加、置換、欠失、又はその組み合わせであり得る。その類似体を産生するためのペプチドの修飾は公知である。例えば、米国特許第7,323,543号;第7,482,171号;第7,459,152号;及び第7,393,919号を参照。それらはすべて参照により本明細書に組み込まれている。例えば、HBD1を含むペプチドの類似体又はHBD1の断片の類似体は、とりわけ、例えばグルコース代謝障害及び/又はインスリン代謝障害に伴う代謝疾患を予防及び/又は治療することにおいて等、グルコース代謝をモジュレートすることにおいてHBD1を置き換え得る、HBD1の、i)構造類似体、ii)機能類似体、又はiii)構造及び機能類似体のいずれかを指す。
【００４７】
本開示のペプチドの類似体は、その全長にわたって、本明細書において記載されるアミノ酸配列と少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%の配列相同性を有し、HBD1の代謝効果又は生物学的活性の少なくとも一方を共有する。当業者であれば、HBD1の類似体配列又はHBD1の断片の類似体配列を容易に同定するであろう。例えば、HBD1の類似体は、配列番号1(KHHLGLEEPKKLR)に記載のアミノ酸配列を有するペプチドであって、式中、位置1、2、若しくは3のK又はHは、R又はKで置換され、位置4又は6のLは、I又はVで置換され、位置10又は11のKは、H又はRで置換され、位置12のLは、I又はVで置換され、且つ/又は位置13のRは、K又はHで置換されているペプチドを含むが、それらに限定されるわけではない。
【００４８】
HBD1の類似体又はHBD1の断片の類似体は、例えば、アラニンスキャンによって又はアミノ酸置換によって獲得される類似体である。ある場合には、HBD1の類似体又はその断片の類似体は非天然コードアミノ酸を含み得、該非天然コードアミノ酸とは、一般アミノ酸若しくはピロリシン若しくはセレノシステインのうちの1つではないアミノ酸、又は天然コードアミノ酸(20種の一般アミノ酸又はピロリシン及びセレノシステインを含むがそれらに限定されない)の修飾(例えば、翻訳後修飾)によって生じるが、それ自体は翻訳複合体によって成長中のポリペプチド鎖内に組み込まれないアミノ酸を指す。そのような天然に存在しないアミノ酸の例は、N-アセチルグルコサミニル-L-セリン、N-アセチルグルコサミニル-L-トレオニン、及びO-ホスホチロシンを含むが、それらに限定されるわけではない。Table 2(表2)は、種々のアミノ酸位置にアラニン置換を有するHBD1(3〜11)の類似体の例を提示している。
【００４９】
【表２】
2021525261.tif 000004
【００５０】
Table 3(表3)は、HBD1(3〜11)の種々のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含むHBD1断片の類似体の他の例を提示している。
【００５１】
【表３Ａ】
2021525261.tif 000005
【００５２】
【表３Ｂ】
2021525261.tif 000006
【００５３】
ある場合には、HBD1又はその断片の類似体は、1、2、3、4、5、6、7、8、又は9個のアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加、又はその組み合わせによって、HBD1とは配列が異なり得る。ある場合には、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。本明細書において使用する場合、「保存的アミノ酸置換」という表現は、類似した特徴の別のもので残基を置換する置換を指す。典型的な保存的アミノ酸置換には、Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、及びIle(I)の間でのもの;Ser(S)、Cys(C)、Met(M)、及びThr(T)の間でのもの;酸性残基Asp(D)及びGlu(E)の間でのもの;Asn(N)及びGln(Q)の間でのもの;塩基性残基His(H)、Lys(K)、及びArg(R)の間でのもの;並びに芳香族残基Phe(F)、Try(W)、及びTyr(Y)の間でのものが含まれる。一部の実施形態において、本技術は、配列番号1に記載のHBD1の断片を有する単離されたペプチドを提供する。ある場合には、断片は、6〜10アミノ酸長であり、HBD1の残基3〜10、つまり配列番号7に記載のHLGLEEPK、又はその類似体を含む。アミノ酸配列HLGLEEPKを有するペプチドの類似体の例は、Table 4(表4)に提示されるペプチドを含むが、それらに限定されるわけではない。
【００５４】
【表４】
2021525261.tif 000007
【００５５】
一部の実施形態において、本技術は、配列番号1に記載のHBD1の断片を有する単離されたペプチドを提供する。ある場合には、断片は、6〜10アミノ酸長であり、HBD1の残基5〜10、つまり配列番号14に記載のGLEEPK、又はその類似体を含む。一部の他の実施形態において、断片は、6〜9アミノ酸長であり、HBD1の残基5〜10、つまり配列番号14に記載のGLEEPK、又はその類似体を含む。アミノ酸配列GLEEPKを有するペプチドの類似体の例は、Table 5(表5)に提示されるペプチドを含むが、それらに限定されるわけではない。
【００５６】
【表５】
2021525261.tif 000008
【００５７】
一部の他の実施形態において、本開示のペプチドは修飾され得る。本明細書において使用する場合、ペプチドに条件を付けるために用いられる場合の「修飾される」という用語は、ペプチドの長さ、ペプチドのアミノ酸配列、化合構造、翻訳時修飾、又は翻訳後修飾の変化等、ペプチドに加えられた任意の変化を指す。ある場合には、本開示のペプチドは、修飾されている1つ又は複数のアミノ酸残基を含む。
【００５８】
本明細書において使用する場合、「翻訳後修飾」という表現は、天然又は非天然アミノ酸の、それがペプチド鎖に組み込まれた後にそのようなアミノ酸に生じる、任意の修飾を指す。該用語は、ほんの一例として、翻訳時インビボ修飾、翻訳時インビトロ修飾(無細胞翻訳系等)、翻訳後インビボ修飾、及び翻訳後インビトロ修飾を包含する。翻訳後修飾の例は、グリコシル化、ペグ化、アセチル化、アシル化、アミド化、メチル化、カルボキシル化、リン酸化、塩、アミド、又はエステル、特にC末端エステルの付加、及び本開示のペプチドのN-アシル誘導体であるが、それらに限定されるわけではない。翻訳後修飾のこれらのタイプは、当技術分野において周知である。
【００５９】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、該ペプチドのN又はC末端のいずれかにカップリングした、分子量約10,000〜約40,000の1つ又は複数のポリ(エチレングリコール)(つまり「PEG」)部分を含む。「ポリアルキレングリコール」は、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、及びポリブチレングリコール(PBG)、並びに任意の組み合わせでのPEG、PPG、及びPBGのコポリマーを含むがそれらに限定されない直鎖又は分岐ポリアルキレングリコールポリマーを意味し、ポリアルキレングリコールのモノアルキルエーテルを含む。ゆえに、本技術の様々な実施形態において、本開示のペプチドにおけるポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、及びその任意の組み合わせであり得るが、それらに限定されるわけではない。ある特定の実施形態において、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール、つまり「PEG」である。「PEGサブユニット」という用語は、単一のポリエチレングリコール単位、すなわち-(CH2CH2O)-を指す。
【００６０】
一部の実施形態において、ポリアルキレングリコール(例えば、PEG)は、非多分散系、単分散系、実質的に単分散系、純粋な単分散系、又は実質的に純粋な単分散系であり得る。「単分散系」は、混合物中の化合物の約100パーセントが同じ分子量を有する、化合物の混合物を記載するために用いられる。「実質的に単分散系」は、混合物中の化合物の少なくとも約95パーセントが同じ分子量を有する、化合物の混合物を記載するために用いられる。「純粋な単分散系」は、混合物中の化合物の約100パーセントが同じ分子量を有し、同じ分子構造を有する、化合物の混合物を記載するために用いられる。ゆえに、純粋な単分散系混合物は単分散系混合物であるが、単分散系混合物は、必ずしも純粋な単分散系混合物ではない。「実質的に純粋な単分散系」は、混合物中の化合物の少なくとも約95パーセントが同じ分子量を有し、同じ分子構造を有する、化合物の混合物を記載するために用いられる。ゆえに、実質的に純粋な単分散系混合物は実質的に単分散系の混合物であるが、実質的に単分散系の混合物は、必ずしも実質的に純粋な単分散系混合物ではない。Table 6(表6)は、ペグ化によって修飾されている本開示のペプチドの例を提示している。
【００６１】
【表６】
2021525261.tif 000009
【００６２】
他のある場合には、本開示のペプチドは、該ペプチドの任意のアミノ酸にカップリングした1つ又は複数のアシル基を含む。ある場合には、1つ又は複数のアシル基は、N末端若しくはC末端アミノ酸に、又はその両方にカップリングしている。ある場合には、本開示のペプチドのアシル化は、脂肪酸が該ペプチドの1つ又は複数の特定のアミノ酸に付加される脂肪酸アシル化である。脂肪酸アシル化の例は、本開示のペプチドの1つ又は複数のアミノ酸への、ラウリン酸(C12:0)、トリデシル酸(C13:0)、ミリスチン酸(C14:0)、ペンタデシル酸(pentadecyclic acid)(C15:0)、パルミチン酸(C16:0)、マルガリン酸(C17:0)、ステアリン酸(C18:0)、ノナデシル酸(C19:0)、アラキドン酸(arachidinic acid)(C20:0)、ヘンイコシル酸(C21:0)、ベヘン酸(C22:0)、トリコシル酸(C23:0)、若しくはリグノセリン酸(C24:0)、又はその混合物の付加を含む。
【００６３】
一部の変種において、付加される対象となる脂肪酸は不飽和(例えば、一価不飽和又は多価不飽和)であり得る。不飽和脂肪酸の例は、i)一価不飽和脂肪酸:クロトン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、ネルボン酸;ii)二価不飽和脂肪酸:リノール酸、エイコサジエン酸、ドコサジエン酸;iii)三価不飽和脂肪酸:リノレン酸、ピノレン酸、エレオステアリン酸、ミード酸、ジホモ-γ-リノレン酸、エイコサトリエン酸;iv)四価不飽和脂肪酸:ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸;v)五価不飽和脂肪酸:ボセオペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、オズボンド(ozubondo)酸、イワシ酸(sardine acid)、テトラコサノールペンタエン酸(tetracosanolpentaenoic acid);並びにvi)六価不飽和脂肪酸:ドコサヘキサエン酸及びニシン酸(herring acid)を含むが、それらに限定されるわけではない。一部の実施形態において、本開示のペプチドは、1つ又は複数のカルボン酸官能基(-COOH)を含む脂肪酸にカップリングし得る。ペプチドのアシル化を行うための方法は、当技術分野において周知である。Table 7(表7)は、アシル化によって修飾されている本開示のペプチドの例を提示している。
【００６４】
【表７】
2021525261.tif 000010
【００６５】
一部の付加的な実施形態において、本開示のペプチドは、リンカー又はリンカー基(例えば、リンカー部分)にカップリングし得る。本明細書において使用する場合、「リンカー」又は「連結基」という表現は、当技術分野において公知であるもの等の非アミノ酸連結基(例えば、米国特許第7,468,418号;第7,402,652号;及び第7,351,797号を参照されたく、それらはすべて参照により本明細書に組み込まれている)、又は当業者に明白であろうその変形体を含む。
【００６６】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、1種を上回る修飾を含み得る(例えば、PEG基及びアシル基を含み得る)。
【００６７】
一部の他の実施形態において、本開示のペプチドは、それ自体が修飾される修飾基にカップリングし得る。例えば、本開示のペプチドは、それ自体が修飾される脂肪酸にカップリングし得る。修飾された脂肪酸は、例えばリンカー又はリンカー基にカップリングし得、該リンカー又はリンカー基それ自体は、PEG基又は1つ若しくは複数のカルボン酸官能基(-COOH)等、別の修飾基にカップリングし得る。修飾の様々な組み合わせ及びそれらを達成するための方法は、当業者によって認識され、解されるであろう。
【００６８】
本技術のある特定の態様はポリヌクレオチドを使用する。これらのポリヌクレオチドには、本明細書において規定されるHBD1ペプチド、断片、及び類似体をコードする単離されたポリヌクレオチドが含まれる。
【００６９】
本明細書において使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、複数のデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオシドサブユニットから構成される分子を指す。ヌクレオシドサブユニット間の連結は、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート等によって、又はペプチド核酸(PNA)において利用されるペプトイド型連結等の当技術分野において公知である非ホスフェート基によって提供され得る。連結基はキラル又はアキラルであり得る。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、2ヌクレオシドサブユニット〜数百又は数千ヌクレオシドサブユニット長に及び得る。オリゴヌクレオチドは、好ましくは5〜100サブユニット長、より好ましくは5〜60サブユニット長であるのに対し、ポリヌクレオチドの長さははるかにより大きくあり得る(例えば、最高で100個)。ポリヌクレオチドは、DNA及びRNAのいずれかであり得る。DNAは、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、細胞又は組織に由来するcDNA、及び合成DNAの任意の形態であり得る。更には、本開示は、ある特定の態様において、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、又はファージミドを含むベクターを使用し得る。
【００７０】
本技術において有用であるポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の適切な様式で調製され得る。そのようなポリペプチドには、単離された天然に存在するポリペプチド、組換えにより産生されたポリペプチド、合成により産生されたポリペプチド、又はこれらの方法の組み合わせによって産生されたポリペプチドが含まれる。そのようなポリペプチドを調製するための手段及び方法は、当技術分野において周知である。
【００７１】
B.治療作用
本明細書において使用する場合、本明細書において用いられる「治療する」、「治療すること」、及び「治療」という用語はすべて、患者の病状の改善(例えば、1つ又は複数の症状における)、疾患の進行の遅延等を含めた、疾患を患う対象に利益を与える任意のタイプの治療を指す。
【００７２】
本明細書において使用する場合、「モジュレーション」という用語又は「モジュレートする」という用語は、ある応答の上方調節(すなわち、活性化又は刺激)と下方調節(すなわち、阻害又は抑制)との両方、又はその2つを組み合わせて若しくは別々に指す。
【００７３】
本明細書において使用する場合、「対象」又は「患者」という用語は、概して、例えば、限定はしないが、ヒト、ラット、マウス、又は家畜を含む哺乳動物又は非哺乳動物に関する。対象への言及は、必ずしも疾患又は障害の存在を意味するものではない。「対象」という用語は、例えば、実験の一部として本技術のペプチドを投薬される哺乳動物又は非哺乳動物、疾患又は障害を軽減させるために処置される哺乳動物又は非哺乳動物、及び疾患若しくは障害の発生を遅延させる又は予防するために予防的に処置される哺乳動物又は非哺乳動物を含む。対象となる哺乳動物は、幼児、小児、成人、又は高齢成人等、任意の年齢のヒト対象であり得る。
【００７４】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、代謝疾患を制御する、調節する、モジュレートする、予防する、改善する、寛解させる、且つ/又は治療するために使用され得る。本明細書において使用する場合、「代謝疾患」という表現は、代謝過程異常又は障害に伴う疾患を指すが、それだけに限定されない。代謝疾患の例は、酸塩基平衡異常に伴う疾患、カルシウム代謝障害に伴う疾患、グルコース代謝障害に伴う疾患、炭水化物代謝障害に伴う疾患、鉄代謝障害に伴う疾患、脂質代謝障害に伴う疾患、吸収不良症候群、メタボリックシンドローム、レプチン代謝障害に伴う疾患、インスリン代謝障害に伴う疾患、及びインスリン様成長因子代謝障害に伴う疾患を含むが、それらに限定されるわけではない。
【００７５】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、グルコース代謝をモジュレートするために使用され得る。これらの実施形態の一部の実施態様において、本技術のペプチドは、グルコース代謝障害に伴う疾患を患う対象におけるグルコース代謝をモジュレートするために使用され得る。これらの実施形態一部の他の実施態様において、本技術のペプチドは、対象におけるグルコース代謝障害に伴う疾患を制御する、調節する、モジュレートする、予防する、改善する、寛解させる、且つ/又は治療するために使用され得る。
【００７６】
本明細書において使用する場合、「グルコース代謝障害に伴う疾患」という表現は、血漿グルコースが正常範囲内で維持されていない疾患を指す。グルコース代謝障害に伴う疾患の例は、低血糖症;高血糖症;炭水化物不耐症;耐糖能異常;空腹時血糖異常;耐糖能障害;炭水化物-脂質代謝障害;高インスリン血症;IV型高リポ蛋白血症;インスリン抵抗症;I型糖尿病;II型糖尿病;肥満;β細胞機能障害及び先端巨大症;:メラノコルチン-4(MC4)シグナル伝達経路障害に伴う疾患、レプチン受容体(LEPR)欠損、LEPR変異、レプチン受容体関連単一遺伝子肥満、極度のインスリン抵抗症候群等であるがそれらに限定されない肥満の稀な遺伝性障害;プロオピオメラノコルチン(POMC)欠損、POMCヘテロ接合、アルストレーム症候群、バルデ・ビードル症候群(BBS)、ドナヒュー症候群(妖精症)、ラブソン・メンデンホール症候群、極度のA型、B型、C型インスリン抵抗症候群、HAIR-AN、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)、先天性脂肪委縮症症候群、先天性全身性脂肪委縮症、後天性脂肪委縮症症候群、全身性脂肪委縮症、及び部分型脂肪委縮症を含むが、それらに限定されるわけではない。
【００７７】
ある場合には、代謝疾患は、インスリン代謝障害に伴う疾患である。本明細書において使用する場合、「インスリン代謝障害に伴う疾患」という表現は、インスリンの合成、循環、及び分解のうちの1つと関連した疾患、並びに膵臓機能障害に伴う疾患を指す。インスリン代謝障害に伴う疾患の例は、メタボリックシンドローム、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、肥満、高インスリン血症、耐糖能異常、高血圧症、末梢動脈疾患、A型症候群、B型症候群、内皮機能障害、糖尿病、微量アルブミン尿症、及び線維素溶解障害を含むが、それらに限定されるわけではない。
【００７８】
本明細書において使用する場合、「メタボリックシンドローム」という表現は、異常な脂肪沈着及び機能に付随するインスリン抵抗性から生じる複合的なリスク因子を指す。これは、冠動脈心疾患のリスク因子と、糖尿病、脂肪肝、及びいくつかのがんのリスク因子の組合せから構成される。メタボリックシンドローム臨床症状は、高血圧症、高血糖症、高トリグリセリド血症、高密度リポ蛋白コレステロール(HDL-C)の減少、腹部肥満、心臓血管系及び他の合併症が起きていることを示唆する胸痛又は息切れ、黒色表皮腫、多毛症、末梢神経障害、網膜症、黄色腫、並びに黄色板腫を含む。
【００７９】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、対象における血漿グルコースレベルを下げるために、且つ/又はグルコースに対する対象の耐性及び/又は抵抗性全般を改善するために使用され得る。これらの実施形態の一部の実施態様において、本開示のペプチドは、対象における糖尿病の管理において使用され得る。これらの実施形態の一部の実施態様において、本開示のペプチドは、対象における糖尿病の予防において使用され得る。これらの実施形態の一部の実施態様において、本開示のペプチドは、対象における糖尿病の治療において使用され得る。これらの実施形態の一部の実施態様において、糖尿病はI型糖尿病である。これらの実施形態の一部の他の実施態様において、糖尿病はII型糖尿病である。
【００８０】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、インスリン代謝を調節するために使用され得る。例えば、本開示のペプチドは、インスリン分泌を増加させる、インスリン感受性を高める、インスリン抵抗性を低下させる、且つ/又はインスリン欠損を克服するために使用され得る。
【００８１】
一部の実施形態において、本技術のペプチドは、低血糖症;高血糖症;炭水化物不耐症;耐糖能異常;空腹時血糖異常;耐糖能障害;炭水化物-脂質代謝障害;高インスリン血症;IV型高リポ蛋白血症;インスリン抵抗症;I型糖尿病;II型糖尿病;肥満;β細胞機能障害及び先端巨大症:メラノコルチン-4(MC4)シグナル伝達経路障害に伴う疾患、レプチン受容体(LEPR)欠損、LEPR変異、レプチン受容体関連単一遺伝子肥満、極度のインスリン抵抗症候群等であるがそれらに限定されない肥満の稀な遺伝性障害;プロオピオメラノコルチン(POMC)欠損、POMCヘテロ接合、アルストレーム症候群、バルデ・ビードル症候群(BBS)、ドナヒュー症候群(妖精症)、ラブソン・メンデンホール症候群、極度のA型、B型、C型インスリン抵抗症候群、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)、先天性脂肪委縮症症候群、先天性全身性脂肪委縮症、後天性脂肪委縮症症候群、全身性脂肪委縮症、及び部分型脂肪委縮症を制御する、調節する、モジュレートする、予防する、改善する、寛解させる、及び/又は治療するために使用され得る。
【００８２】
一部の実施形態において、本明細書において規定される使用及び方法は、対象に本明細書において規定されるペプチドの治療上有効な量を投与して、本明細書で論じられる効果を達成する工程を含む。本明細書において使用する場合、「治療上有効な量」という表現は、あらゆる医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット・リスク比で本明細書において規定されるなんらかの所望の治療効果をもたらすために有効な、本開示のペプチドの量を指す。
【００８３】
本開示の任意の具体的なペプチドの治療上有効な投薬量は、ペプチドによって、対象によって、更には患者によって異なり、数ある中でも、達成されるべき効果又は結果、患者の病状、及び送達の経路に依存する。一部の実施形態において、投薬量は、約0.01μg/kgから約100mg/kgまで、約0.01μg/kgから約50mg/kgまで、約0.01μg/kgから約10mg/kgまで、約0.01μg/kgから約5mg/kgまで、約0.1μg/kgから約100mg/kgまで、約0.1μg/kgから約50mg/kgまで、約0.1μg/kgから約10mg/kgまで、約0.1μg/kgから約5mg/kgまで、約1μg/kgから約100mg/kgまで、約1μg/kgから約50mg/kgまで、約1μg/kgから約10mg/kgまで、約1μg/kgから約5mg/kgまで、約10μg/kgから約100mg/kgまで、約10μg/kgから約50mg/kgまで、約10μg/kgから約10mg/kgまで、約10μg/kgから約5mg/kgまで、約100μg/kgから約100mg/kgまで、約100μg/kgから約50mg/kgまで、約100μg/kgから約10mg/kgまで、約100μg/kgから約5mg/kgまでである。
【００８４】
ある場合には、投薬量は、約0.001mg/kg、約0.05mg/kg、約0.1mg/kg、約0.2mg/kg、約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、又は約1.0mg/kgから、最高で約30mg/kg又は約40mg/kgまでである。他のある場合には、投薬量は、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg、約10mg/kg、約11mg/kg、約12mg/kg、約13mg/kg、約14mg/kg、約15mg/kg、約16mg/kg、約17mg/kg、約18mg/kg、約19mg/kg、約20mg/kg、約21mg/kg、約22mg/kg、約23mg/kg、約24mg/kg、約25mg/kg、約26mg/kg、約27mg/kg、約28mg/kg、約29mg/kg、約30mg/kg、約31mg/kg、約32mg/kg、約33mg/kg、約34mg/kg、約35mg/kg、約36mg/kg、約37mg/kg、約38mg/kg、約39mg/kg、約40mg/kg、約41mg/kg、約42mg/kg、約43mg/kg、約44mg/kg、約45mg/kg、約46mg/kg、約47mg/kg、約48mg/kg、約49mg/kg、若しくは約50mg/kgである、又はそれを上回る量が用いられ得る。治療上有効な投薬量の付加的な例は、約1〜約50mg/kg/96hr;約1〜約50mg/kg/48hr;約1〜約50mg/kg/36hr;約1〜約50mg/kg/24hr;約1〜約50mg/kg/12hr;約1〜約25mg/kg/96hr;約1〜約25mg/kg/48hr;約1〜約25mg/kg/36hr;約1〜約25mg/kg/24hr;約1〜約25mg/kg/12hr;約1〜約10mg/kg/96hr;約1〜約10mg/kg/48hr;約1〜約10mg/kg/36hr;約1〜約10mg/kg/24hr;約1〜約10mg/kg/12hr;約1〜約5mg/kg/96hr;約1〜約5mg/kg/48hr;約1〜約5mg/kg/36hr;約1〜約5mg/kg/24hr;約1〜約5mg/kg/12hr;約0
.001〜約1mg/kg/96hr;約0.001〜約1mg/kg/48hr;約0.001〜約1mg/kg/36hr;約0.001〜約1mg/kg/24hr;及び約0.001〜約1mg/kg/12hrを含む。
【００８５】
本明細書において用いられる「並行投与すること」又は「並行投与する」は、2種以上のペプチド、化合物、又は組成物を、組み合わせ効果をもたらすのに間に合うように十分に近接して投与することを意味する(つまり、並行とは同時であり得る、又はそれは、互いの前若しくは後の短時間のうちに生じる2つ以上の事象であり得る、例えば逐次的)。同時並行投与は、例えば、投与前に化合物を混合することによって、又は同じ時点ではあるが異なる解剖学的部位に化合物を投与することによって、及び/又は投与の異なる経路を用いることによって行われ得る。
【００８６】
C.薬学的組成物
本明細書において使用する場合、「活性剤」という表現は、本明細書において規定されるペプチドを指す。
【００８７】
「治療上許容される」、「治療上適切な」、「薬学的に許容される」、及び「薬学的に適切な」という表現は、本明細書において互換可能に用いられ、疾患の重症度及び治療の必要性に照らして過度に有害な副作用なく、本明細書において規定される治療等、本明細書において記載される効果を達成するための対象への投与に適切であるペプチド、化合物、又は組成物を指す。
【００８８】
上記で記載されるペプチドは、公知の技法に従って、薬学的担体中に投与のために製剤化され得る。例えば、Remington、The Science And Practice of Pharmacy(第9編、1995)を参照されたい。本開示に従った薬学的組成物の製造において、ペプチド(生理学的に許容されるその塩を含む)は、典型的に、とりわけ、許容される担体と混和される。担体は、当然、組成物中の他の任意の成分と適合性であるという意味で許容されなければならず、患者に有害であってはならない。担体は、固体若しくは液体、又はその両方であり得、好ましくは、ペプチドとともに、単位用量製剤として、例えば該ペプチドの約0.01又は約0.5質量%〜約95質量%又は約99質量%を含有し得る錠剤として製剤化される。1種又は複数の活性化合物が本開示の組成物中に組み込まれ得、それは、任意で1種又は複数の付属成分を含めた成分を混和する工程を含む、薬学の周知の技法のいずれかによって調製され得る。
【００８９】
本開示の組成物は、経口、直腸、局所、口腔(例えば、舌下)、膣内、非経口(例えば、皮下、筋肉内、皮内、又は静脈内)、局所(すなわち、気道表面を含めた皮膚及び粘膜表面の両方)、及び経皮投与に適したものを含むが、とはいえ最も適切な経路は、どんな場合でも、治療されている病状の性質及び重症度に、並びに用いられている特定のペプチドの性質に依存する。
【００９０】
経口投与に適した組成物は、カプセル、カシェー、ドロップ、又は錠剤等、個別の単位で提示され得、それぞれは、粉末又は顆粒として;溶液、又は水性若しくは非水性液体中の懸濁液として;或いは水中油型又は油中水型エマルジョンとして、所定量のペプチドを含有する。そのような組成物は、ペプチド及び適切な担体を会合させる工程を含む薬学の任意の適切な方法によって調製され得る(それは、上述される1種又は複数の付属成分を含有し得る)。一般的に、本開示の組成物は、ペプチドと、液体若しくは微粉化した固体担体、又はその両方とを均一且つ密に混和し、次いで必要に応じて、結果として生じた混合物を形作ることによって調製される。例えば、錠剤は、任意で1種又は複数の付属成分とともに、ペプチドを含有する粉末又は顆粒を圧縮又は成形することによって調製され得る。圧縮された錠剤は、任意で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、及び/又は表面活性/分散剤と混合した粉末又は顆粒等の流動性のある形態に、化合物を適切な機械で圧縮することによって調製され得る。成形された錠剤は、不活性液体結合剤で湿らせた粉末化合物を適切な機械で成形することによって作製され得る。
【００９１】
口腔(舌下)投与に適した組成物には、風味のある基剤、通常ではスクロース及びアカシア又はトラガカント中にペプチドを含むドロップ;並びに、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア等の不活性基剤中にペプチドを含むトローチが含まれる。
【００９２】
非経口投与に適した本開示の組成物は、ペプチドの無菌の水性及び非水性注射液を含み、その調製物は、好ましくは、意図されるレシピエントの血液と等張である。これらの調製物は、抗酸化物質、バッファー、静菌剤、及び組成物を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る。水性及び非水性の無菌懸濁液は、懸濁化剤及び増粘剤を含み得る。組成物は、単位-用量又は複数回-用量の容器、例えば密封アンプル及びバイアルで提示され得、使用の直前に無菌液体担体、例えば生理食塩水又は注射用水の添加のみを要するフリーズドライ(凍結乾燥)条件で保管され得る。即席の注射液及び懸濁液は、以前に記載された種類の無菌の粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。例えば、本開示の1つの態様において、密封容器内での単位剤形で、本明細書において規定されるペプチド又はその塩を含む、注射可能な安定した無菌の組成物が提供される。ペプチド又は塩は、適切な薬学的に許容される担体で復元されて対象へのその注射に適した液体組成物を形成し得る凍結乾燥物の形態で提供される。単位剤形は、典型的に、約10mg〜約10グラムのペプチド又は塩を含む。ペプチド又は塩が実質的に非水溶性である場合、生理学的に許容される十分な量の乳化剤が、水性担体中に化合物又は塩を乳化するのに十分な分量で採用され得る。1つのそのような有用な乳化剤はホスファチジルコリンである。
【００９３】
直腸投与に適した組成物は、好ましくは単位用量の坐薬として提示される。これらは、本明細書において規定されるペプチドと、1種又は複数の従来の固体担体、例えばココアバターとを混和し、次いで、結果として生じた混合物を形作ることによって調製され得る。
【００９４】
皮膚への局所適用に適した組成物は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、又は油の形態を取る。用いられ得る担体には、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮増強剤、及びその2種以上の組み合わせが含まれる。
【００９５】
経皮投与に適した組成物は、長期間にわたってレシピエントの表皮と密に接触したままの状態であることに適合した個別のパッチとして提示され得る。経皮投与に適した組成物は、イオントフォレシス(例えば、Pharmaceutical Research 3(6):318(1986)を参照されたい)によっても送達され得、典型的に、本明細書において規定されるペプチドの任意で緩衝化された水溶液の形態を取る。適切な組成物は、シトレート又はビス/トリスバッファー(pH6)又はエタノール/水を含み、0.1M〜0.2Mの活性成分を含有する。
【００９６】
更に、本開示は、本明細書において開示されるペプチド及びその塩のリポソーム製剤を提供する。リポソーム懸濁液を形成するための技術は、当技術分野において周知である。本明細書において規定されるペプチド又はその塩が水溶性の塩である場合、従来のリポソーム技術を用いると、それは脂質小胞内に組み込まれ得る。そのような場合、ペプチド又は塩の水溶解度により、該ペプチド又は塩は、リポソームの親水性の中心部又はコア内に実質的に引き込まれる。採用される脂質層は、任意の従来の組成物のものであり得、コレステロールを含有し得る又はコレステロール不含であり得る。関心対象のペプチド又は塩が非水溶性である場合、再度従来のリポソーム形成技術を採用すると、該塩は、リポソームの構造を形成する疎水性脂質二重層内に実質的に引き込まれ得る。いずれの場合でも、産生されるリポソームは、あたかも標準的な超音波処理及びホモジナイゼーション技法の使用であるかのように、サイズが低下し得る。
【００９７】
本明細書において開示される活性剤又はその塩を含有するリポソーム製剤を凍結乾燥して、水等の薬学的に許容される担体で復元され得る凍結乾燥物を産生して、リポソーム懸濁液を再生し得る。
【００９８】
他の薬学的組成物は、水性基剤エマルジョン等、本明細書において開示される非水溶性活性剤又はその塩から調製され得る。そのような場合、組成物は、所望の量の活性剤又はその塩を乳化するのに十分な量の薬学的に許容される乳化剤を含有する。特に有用な乳化剤には、ホスファチジルコリン及びレシチンが含まれる。
【００９９】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、医療機器を使用して、特に整形外科用医療機器を使用して、それを必要とする対象に送達され得る。本開示のペプチドを送達するのに有用であり得る医療機器の例は、スポンジ(例えば、コラーゲンスポンジ、ゼラチンスポンジ等)、包帯、ゲージ、ステント、ケージ(例えば、椎間ケージ、固定ケージ等)、骨セメント、骨ミキサー、骨代用品、ピン、アンカー、ボタン、プロテーゼ、ネジ(例えば、椎間関節スクリュー、椎弓根スクリューシステム、骨ネジ等)、スペーサー、髄内くぎ、ステム(例えば、股関節ステム等)、特注インプラント、プレート(例えば、上腕(humerous)プレート、手首プレート、橈骨プレート、頸部プレート、腰椎プレート等)、及び外傷用製品を含むが、それらに限定されるわけではない。これらの実施形態において、本開示のペプチドは、医療機器を作製するために使用される材料の中に組み込まれ得る、又は医療機器を作製するために使用される材料の上に若しくは医療機器それ自体の上に適用され得る。
【０１００】
一部の他の実施形態において、本開示のペプチドは、粒子(例えば、ナノ粒子又はマイクロ粒子)又はカプセル化システム(例えば、マイクロカプセル、ミクロスフェア)等の送達機器を使用して、それを必要とする対象に送達され得る。ある場合には、本開示のペプチドは、例えばポリマー鎖等、送達システムを形成する材料全体に分散され得る、又は送達システム内に形成される細孔若しくは空洞内に配置され得る。ある場合には、そのような送達システムからのペプチドの放出は制御され得る(すなわち、徐放、持続放出、又は制御放出)。本開示のペプチドを送達するために使用され得る粒子、並びに粒子及びカプセル化システムの例は、当技術分野において周知である。
【０１０１】
活性化合物に加えて、薬学的組成物は、pHを調整する添加物等、他の添加物を含有し得る。特に、有用なpH調整剤には、塩酸等の酸、乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、又はグルコン酸ナトリウム等の塩基又はバッファーが含まれる。更に、組成物は微生物防腐剤を含有し得る。有用な微生物防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、及びベンジルアルコールが含まれる。微生物防腐剤は、典型的に、複数回用量使用のために設計されたバイアル中に製剤が入れられる場合に採用される。
【０１０２】
一部の実施形態において、本技術は、本明細書において規定される1種又は複数のペプチドを、本明細書において規定される適用に従ったキットの使用のための指示書とともに含むキットを提供する。
【０１０３】
等価のペプチド、化合物、組成物、方法、使用、及びキットの同定は、通常の実践者の技能の十分に範囲内にあり、本開示の教示に照らして、単なる日常的実験しか要しないであろう。本開示の実践は、以下の実施例から更により完全に理解されるであろうが、それは、単に例示のために提示されるものであり、決して本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１０４】
下記の実施例は、本技術の様々な実施形態の実践を例示するために与えられる。それらは、本技術の全範囲を限定する又は規定すること意図されるものではない。本技術は、本明細書において記載され、例示される特定の実施形態に限定されるわけではないが、添付の実施形態において規定される本開示の範囲内に入るすべての改変形態及び変形形態を含むと解されるべきである。
【０１０５】
(実施例1)
HBD1ペプチドはインビボにおいて耐糖能を改善する
9週齢の雄性B6.V-Lepob/J.マウス(Charles River)に、実験条件に7日間順化させた後、15日間、ビヒクル(NaCl 0.9%)又は3mg/kgの配列番号73に記載のペプチド(C18:0-HLGLEEPKK)を1日2回皮下投与した(各群ともn=5の動物)。15日目に、絶食させた(一晩)マウスに1g/kgのグルコースを腹腔内に注射した。血漿血糖(mmol/Lとして表した)を、グルコース注射の45分後に記録した。結果を図1に示す。結果は、HBD1ペプチドの投与が、IPグルコース負荷試験に応じて血漿グルコースレベルを低下させたことを示しており、これは、血糖コントロールにおけるHBD1ペプチドの役割を示唆している。これらの結果は、2型糖尿病、レプチン欠損、レプチン受容体欠損、及び極度のインスリン抵抗症候群等であるがそれらに限定されない耐糖能異常又はインスリン抵抗症に伴う臨床状態の治療のための、HBD1ペプチドの使用を支持するものである。
【０１０６】
(実施例2)
レプチン欠損マウスにおける耐糖能に対するHBD1ペプチドの効果
グルコース及びインスリン代謝に対するHBD1ペプチドの効果を更に査定するために、グルコースを遠隔測定された肥満ob/obマウスにおいて、HBDペプチドを1日2回、28日間連続して投与した後、基礎血糖及び腹腔内グルコース負荷試験(IPGTT)に対するグルコース応答を査定した。グルコース遠隔測定装置(HD-XG、Data Science International社)の埋入は、既知のプロトコールに従って行った。
【０１０７】
配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)のHBDペプチド断片を、1日2回、1日の2回の投与の間に8時間±1時間の間隔をあけて投与した。24匹のV-Lepob/J(Ob/Ob)雄性マウス(The Jackson Laboratory社、Farmington、CT USA)に、ビヒクル(NaCl 0.9%)(対照群)又は1及び3mg/kgのペプチド(試験群)(各群ともn=5〜8の動物)を、28日間、1日2回皮下投与した。投薬初日を1日目と表わした。滅菌シリンジを使用してボーラス注入を行い、針を皮下に差し込み、2〜4箇所の注入部位を交替で使用した。注入領域の動物の毛を、最初の注入の前、次いで必要に応じて処理期間中に刈った。投与された量は、5ml/kg/投与であった。個々の投薬量は、最終体重を用いて算出した。27日目に、通常の摂食条件において16時間の平均血糖値を評価した。28日目に、絶食させた(4時間)マウスに、1g/kgのグルコースを腹腔内注射した。血漿血糖プロファイル(mg/dLとして表した)を、グルコース注入の3時間後まで1分ごとに記録した。
【０１０８】
腹腔内グルコース負荷試験(IPGTT) - IGPTT当日(28日目)の朝に、2時間絶食させた動物を、ビヒクル又はHBD断片で処理した。グルコース液を、投薬(ビヒクル又は配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)に記載のペプチド)の2時間±15分後に投与した。血糖を、(絶食条件の)10分前からグルコースチャレンジの3時間後までモニタリングした。グルコースチャレンジの4時間後に、食物を再導入した。食物の再導入から2時間後に、その日の2回目の処理(HBD断片又はビヒクル)を実施した。
【０１０９】
図2及び図3A〜図3Bに示される結果は、HBD1断片配列番号73が、グルコースを遠隔測定された、インスリン抵抗症及び耐糖能異常をもたらすレプチン欠損を有するマウスモデルであるob/obマウスにおいて、耐糖能異常を用量依存的に改善したことを示している。図2は、試験ペプチドが、投与から4週間後、空腹時グルコースレベル及びIPGTT後のグルコース変動(glucose excursion)を低減させたことを示している。顕著な効果が、3mg/kgの用量で観察された。図3A〜図3Bはまた、試験ペプチドが、ベースラインで重度の高血糖を示すこれらのマウスにおいて16時間の平均血糖値を著しく低下させ得たように、グルコース制御に対する好ましい効果も示している。
【０１１０】
(実施例3)
インビトロにおける脂肪細胞によるグルコース取込みに対するHBD1ペプチドの効果
グルコース代謝に対するHBD1ペプチドの効果を更に試験するために、培養された完全に分化した3T3-LI脂肪細胞によるグルコース取込みを高めるHBD1ペプチドの能力を検討した。3T3-LI細胞は、特定の条件下で培養されると脂肪細胞へ分化するマウス線維芽細胞株である。
【０１１１】
3T3-LI細胞の脂肪細胞への分化は、以下のプロトコールを使用して達成された。3T3-L1細胞を、24ウェルプレートに播種し、3T3-L1維持培地(10%胎仔ウシ血清、4mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムを含有するDMEM)中で、細胞が100%コンフルエントになるまで培養した。次いで、細胞に3T3-L1維持培地を与え、更に48時間培養した。脂肪細胞への分化を開始させるために、培地を分化培地1(10%胎仔ウシ血清、4mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.5mM IBMX、0.25mMデキサメタゾン、1mg/mlインスリンを含有するDMEM)に変え、更に2日間培養した。次いで培地を分化培地2(10%胎仔ウシ血清、4mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mg/mlインスリンを含有するDMEM)に変え、更に2日間培養した。次いで、培地を脂肪細胞維持培地(10%胎仔ウシ血清、4mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムを含有するDMEM)に変え、更に7日間培養した。この間、培地は1日おきに変えた。今や完全に分化した脂肪細胞を、グルコース取込み実験に利用した(分化開始から11日目)。試験されるべきHBD1ペプチドの保存液を、正味ペプチド含有量に基づき1mg/mlの濃度まで、層流キャビネット中の無菌条件下の0.9%NaCl液で希釈することによって調製した。該液を、穏やかに反転させることによってホモジナイズした。試験品を、該保存液から調製し、残りの保存液を等分し、-20℃で保管し、凍結融解サイクルを繰り返すことなく使用した。
【０１１２】
グルコース取込み実験を、以下のプロトコールを使用して行った。実験を開始する前に、100mlのクレブス・リンガー重炭酸塩バッファー(KRBB)(25mMへぺス pH7.4、118mM NaCl、5mM NaHCO3、4.7mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、2.5mM CaCl2、0.2μmフィルターを使用して濾過済み0.2%BSA)及び100mlのインキュベーション培地(4mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1%ペニシリン・ストレプトマイシン、0.2μmフィルターを使用して濾過済み0.2%BSAを含有するDMEM)を37℃に予熱し、500mlのKRBBを氷上で冷却した。試験化合物の保存液を、予熱したインキュベーション培地で、また予熱したKRBBで、3μg/mlの最終濃度まで希釈した。無菌0.9%NaClで1:1000に予め希釈されたインスリン(陽性対照)を、10mlの培地及びバッファーの両方で更に最終濃度1nMまで希釈した。微細なチップを使用して、細胞から微量の培地をすべて注意深く除去した。試験化合物又はビヒクルを含有するインキュベーション培地1mlを、適切なウェルに加えた。この時、インスリンを加えなかった。プレートを、37℃で24時間インキュベートした。インキュベーション期間が終了した後、培地をウェルから除去し、適切なウェル中の細胞を、適切な試験物質又はビヒクルのいずれかを含有する予熱したKRBB 300μlで洗浄した。次いで、適切なウェル中の洗浄バッファーを細胞から除去し、試験物質、ビヒクル、又はインスリンを含有する予熱した270μlのKRBBで置き換え、37℃で20分間、インキュベーションを続けた。インキュベーション中に、10×2-デオキシグルコースの混合物を、以下のように調製した:KRBB 985μl、10mM 2-デオキシグルコース 10μl、[3H]-2-デオキシグルコース(1mCi/ml) 5μl。20分のインキュベーション期間の終了時に、30μlの10×2-デオキシグルコース混合物をすべてのウェルに加え、37℃で更に10分間インキュベートした。バッファーをウェルから除去し、細胞を1mlの氷冷KRBBで3回洗浄した。100μlの0.5N NaOHをすべてのウェルに加え、室温で30分間インキュベートした。50μlの得られた細胞ライセートを、白色の96ウェルプレートに移した。すべてのウェルに200μlのMicroscint 20を加え、トップシールで覆い、室温で30分間振盪した。[3H]-2-デオキシグルコース含有量の定量化は、各ウェルについて、シンチレーション計数によって測定した。
【０１１３】
以下のHBD1ペプチド:配列番号1(KHHLGLEEPKKLR)、配列番号10(HLGLEEPKK)、配列番号16(HHLGLEEPKK)、及び配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)を、記載されるアッセイにおいて試験して、3T3-LI脂肪細胞によるグルコース取込みに対する効果を測定した。分化した3T3-LI脂肪細胞によるグルコース取込みに対するHBD1ペプチドのインキュベーションの結果を図4に示す。まとめると、すべての被験HBD1ペプチドが、3T3-LI脂肪細胞によるグルコース取込みの増加を刺激した。
【０１１４】
(実施例4)
インビトロにおける骨格筋細胞によるグルコース取込みに対するHBD1ペプチドの効果の実証、及びHBD1ペプチドがIGFBP2と同じグルコース取込みを増加させる受容体及び機序を利用することの実証
以前の研究では、インスリン様成長因子2(IGFBP2)が、細胞表面受容体である受容体型プロテインチロシンホスファターゼ-β(RPTPβ)を介して作用して、Akt及びAMPK経路の両方を活性化して、グルコース取込みを増加させることが実証されている(Assefa等、2017)。HBD1ペプチドが同じ受容体及び伝達経路を利用してグルコース取込みを増加させるかどうか確定するために、次の研究を行った。これらの研究は、培養された完全に分化したC2C12マウス骨格筋筋管を用いて実施した。C2C12細胞を24ウェルプレートにおいて25mMグルコース及び10%胎仔ウシ血清を含むDMEM中でコンフルエントな密度まで増殖させることによって、細胞を準備した。この時、6日間、2日おきに培地を変えながら、培地を分化培地(25mMグルコース及び2%ウマ血清を含むDMEM)に変えた。様々な処理剤を、無血清培地で希釈し、細胞を無血清培地で洗浄した後、細胞に加え、2時間又は処理によって異なる時間、インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、培地を除去し、同じ処理剤を含有する1.0mlのグルコースフリーのクレブス・リンガー重炭酸塩バッファー(pH7.4)を加え、インキュベーションを10分間続けた。10分のインキュベーション期間の終了時に、3H-2-デオキシグルコース(0.5mCi/ウェル)(比放射能=8Ci/mmole)を、すべてのウェルに直接加え、更に10分間、インキュベーションを続けた。次いで、ウェルを氷冷したリン酸緩衝食塩水で3回洗い流し、細胞を0.5N NaOHで抽出し、細胞ライセートの3H-2-デオキシグルコース含有量を、シンチレーション計数によって定量化した。
【０１１５】
シグナル伝達の研究のために、細胞を、6ウェルプレートを使用したこと以外は同じ方法で準備した。細胞を、分化培地中で6日間インキュベートした後、無血清培地で洗浄した。次いで、様々な処理剤を、0.1%BSAを含有する無血清培地に加えた。HBD1ペプチドを加え、8時間インキュベートした。IGF-Iを利用する場合、インキュベーションは、IGF-1付加後15分間であった。インキュベーションの後、細胞を、RIPAバッファー中で溶解し、超音波処理した。細胞ライセートを遠心分離し、上清を、10%ゲルを用いるSDS-PAGE、続いて適切な抗体でのイムノブロッティングによって、Akt又はAMPKのいずれかについて分析した。
【０１１６】
HBD1ペプチド配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)は、完全に分化したC2C12マウス骨格筋筋管によるグルコース取込みを増加させる能力について試験した場合、用量及び時間の両方に依存的に、ビヒクル処置対照群と比べてグルコース取込みの増加を刺激した(図5A-5B)。更に、インスリンと組み合わせたHBD1ペプチド配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)の付加は、グルコース取込みの相加的増加をもたらした(図5C)。
【０１１７】
HBD1ペプチドによって利用される細胞内伝達経路を検討するために、HBD1ペプチド配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)による処理の後、細胞ライセートタンパク質を、SDS-PAGEによって分離し、抗Akt pS473抗体でイムノブロットした。HBD1ペプチド配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)は、リン酸化されたAktの用量関連の増加を誘導したことが観察された(図6)。リン酸化されたAktの検出は、RPTPβ受容体との相互作用を妨げることが実証され、IGFBP2のRPTPβとの相互作用を遮断することが以前に実証されている抗フィブロネクチン抗体(FN3)(Shen等、2012)での処理によって、完全に消失した。
【０１１８】
HBD1ペプチドによって利用される細胞内伝達経路を更に検討するために、HBD1ペプチド配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)による処理の後、細胞ライセートタンパク質を、SDS-PAGEによって分離し、抗pAMPK T172でイムノブロットした。HBD1ペプチド配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)による処理が、リン酸化されたAMPKの用量依存的増加をもたらしたことが観察された(図7)。リン酸化されたAMPKの検出は、RPTPβ受容体との相互作用を妨げることが実証され、IGFBP2のRPTPβとの相互作用を遮断することが以前に実証されている抗フィブロネクチン抗体(FN3)(Shen等、2012)、又はAMPK活性化の特異的阻害剤であり、やはり培養した脂肪細胞においてIGFBP2に刺激されるグルコース取込みを遮断することが以前に実証されている化合物C(Assefa等、2017)のいずれかでの処理によって、完全に消失した。
【０１１９】
別の実験において、HBD1ペプチド配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)による処理は、完全に分化したマウス骨格筋筋管によるグルコース取込みを増加させること、並びにインスリンと相加的に作用することが再度実証された(図8)。細胞内伝達経路に対して観察された効果と一致して、RPTPβ受容体との相互作用を妨げることが実証され、IGFBP2のRPTPβとの相互作用を遮断することが以前に実証されている抗フィブロネクチン抗体(FN3)(Shen等、2012)、又はAMPK活性化の特異的阻害剤であり、やはり培養した脂肪細胞においてIGFBP2に刺激されるグルコース取込みを遮断することが以前に実証されている化合物C(Assefa等、2017)のいずれかでの処理は、HBD1ペプチド配列番号73(C18:0-HLGLEEPKK)がグルコース取込みを増加させる能力を、単独又はインスリンと共に付加された場合のいずれでも、完全に消失させた。
【０１２０】
全体として、本明細書において示したデータは、グルコース代謝、インスリン代謝、及びレプチン代謝をモジュレートすることにおける、HBD1、HBD1断片、及びそれらの類似体の潜在性を確証するものである。HBD1の骨芽細胞分化に対する作用機序及びグルコース取込みに対する作用機序は、同じ受容体(RPTPβ)及び同じ細胞内経路(Akt)を共有するという点で類似している。したがって、(以前に例えばWO 2018/145006で報告された骨芽細胞分化アッセイにより)骨芽細胞分化における効力が示されたHBD1類似体もまた、グルコース代謝に対して有効となることが想定され得る。
【０１２１】
本明細書において報告されるデータは、単に本開示を例示するために与えられるものであり、その限定をなすものとして見なされ得ないことが理解される。
【０１２２】
本開示は、その具体的な実施形態と関連付けて記載されているものの、それはさらなる改変が可能であり、本出願は、概して本開示の原則に従い、本開示が関連する技術分野のうちの公知の又は慣習的な実践に入るような、及び上記に記載の必須の特質に適用され得るような、及び添付の特許請求の範囲に従うような、本開示からの逸脱を含む、本開示の任意の変形、使用、又は適合を網羅することを意図されることが理解されるであろう。
【０１２３】
参照による組み込み
本明細書において引用されたすべての参考文献、更にそれらの参考文献は、追加的又は代替的な詳細、特徴、及び/又は技術的背景の教示のために適切に全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【０１２４】
均等物
本開示は、特定の実施形態に関して特に示し記載しているが、上記に開示のまたその他の特徴及び機能の変形又はそれらの代替が、多くの別の様々な体系又は適用に望ましく組み合わされ得ることが理解されるであろう。また、その中での様々な現在は予想されない又は予期されない代替、修正、変形、又は改良が、その後当業者によってなされ得、以下の実施形態によって包含されるものとすることも理解されるであろう。
【０１２５】
[参考文献]
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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