(57)【要約】  ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ１６並びにｃ−ＭＥＴ、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する多特異性結合性タンパク質のほか、がんの処置に有用な、医薬組成物及び治療法について記載される。
2021533159.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位；
（ｂ）腫瘍関連抗原であるｃ−ＭＥＴに結合する第２の抗原結合性部位及び
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体のＦｃドメイン若しくはその部分、又はＣＤ１６に結合する第３の抗原結合性部位
を含むタンパク質。
【請求項２】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位；
（ｂ）ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬからなる群から選択される腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位、並びに
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体のＦｃドメイン若しくはその部分、又はＣＤ１６に結合する第３の抗原結合性部位
を含むタンパク質。
【請求項３】
第２の腫瘍関連抗原結合性部位と同じ腫瘍関連抗原に結合する、追加の抗原結合性部位をさらに含む、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位及び／又は追加の抗原結合性部位が、Ｆａｂ断片である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、ｓｃＦｖであり、腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位及び／又は追加の抗原結合性部位が、ｓｃＦｖである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、Ｆａｂ断片であり、腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位が、ｓｃＦｖである、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項７】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、ｓｃＦｖであり、腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位が、Ｆａｂ断片である、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項８】
第１の抗原結合性部位が、ヒトにおけるＮＫＧ２Ｄに結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９】
第１の抗原結合性部位、第２の抗原結合性部位及び／又は追加の抗原結合性部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
腫瘍関連抗原に結合するｓｃＦｖ及び／又はＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖが、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体の定常ドメイン又はその部分へと連結され、ｓｃＦｖが、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項４〜７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１１】
重鎖可変ドメインが、軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、請求項９又は１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
ジスルフィド架橋が、重鎖可変ドメインに由来するＣ４４と、軽鎖可変ドメインに由来するＣ１００との間において形成される、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
ｓｃＦｖ内において、重鎖可変ドメインが、可撓性リンカーを介して、軽鎖可変ドメインへと連結されている、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１４】
ｓｃＦｖ内において、可撓性リンカーが、（Ｇ４Ｓ）４を含む、請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１５】
ｓｃＦｖ内において、重鎖可変ドメインが、軽鎖可変ドメインの、Ｎ末端又はＣ末端に位置する、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１６】
ｓｃＦｖ内において、ヒンジが、アミノ酸配列であるＴｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙをさらに含む、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１７】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、
（１）それぞれ、配列番号３８７、８８、及び３９０のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変ドメイン；並びにそれぞれ、配列番号９０、９１、及び９２のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（２）それぞれ、配列番号３８７、８８、及び４１２のアミノ酸配列により表された相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）及び相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の配列を含む重鎖可変ドメイン；並びにそれぞれ、配列番号９０、９１、及び９２のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（３）それぞれ、配列番号４３５、６４及び４３６のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変ドメイン；並びにそれぞれ、配列番号６６、６７及び６８のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（４）それぞれ、配列番号４３７、７２及び４０８のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変ドメイン；並びにそれぞれ、配列番号７４、７５及び７６のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（５）それぞれ、配列番号４０９、８０及び４１１のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変ドメイン；並びにそれぞれ、配列番号８２、８３及び８４のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（６）それぞれ、配列番号４２１、９６及び４２２のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変ドメイン；並びにそれぞれ、配列番号９８、９９及び１００のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（７）それぞれ、配列番号８７、８８及び８９のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変ドメイン；並びにそれぞれ、配列番号９０、９１及び９２のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（８）それぞれ、配列番号３８７、８８及び３９３のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変ドメイン；並びにそれぞれ、配列番号９０、９１及び９２のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（９）それぞれ、配列番号３８７、８８及び３９６のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変ドメイン；並びにそれぞれ、配列番号９０、９１及び９２のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（１０）それぞれ、配列番号３８７、８８及び３９９のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変ドメイン；並びにそれぞれ、配列番号９０、９１及び９２のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（１１）それぞれ、配列番号３８７、８８及び４０２のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変ドメイン；並びにそれぞれ、配列番号９０、９１及び９２のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（１２）それぞれ、配列番号３８７、８８及び４０５のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変ドメイン；並びにそれぞれ、配列番号９０、９１及び９２のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変ドメイン；又は
（１３）それぞれ、配列番号８７、８８、及び３８９のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変ドメイン；並びにそれぞれ、配列番号９０、９１、及び９２のアミノ酸配列により表されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１８】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、
（１）配列番号３８８と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号８６と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（２）配列番号８５と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号８６と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（３）配列番号６１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号６２と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（４）配列番号６９と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号７０と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（５）配列番号７７と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号７８と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（６）配列番号９３と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号９４と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（７）配列番号３９１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号８６と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（８）配列番号３９４と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号８６と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（９）配列番号３９７と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号８６と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（１０）配列番号４００と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号８６と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；又は
（１１）配列番号４０３と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号８６と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１９】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、配列番号１、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５及び配列番号９３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２０】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、配列番号４１と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号４２と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２１】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、配列番号４９と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号５０と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２２】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、配列番号５７と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号５８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２３】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、配列番号５９と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号６０と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２４】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、配列番号６１と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号６２と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２５】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、配列番号６９と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号７０と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２６】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、配列番号７７と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号７８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２７】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、配列番号８５と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号８６と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２８】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、配列番号９３と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９４と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２９】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、配列番号１０１と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１０２と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３０】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、配列番号１０３と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１０４と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３１】
ｃ−ＭＥＴに結合する第２の抗原結合性部位が、重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）及び重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）を含む重鎖可変ドメイン並びに軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）及び軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含む軽鎖可変ドメインを含み、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号２９２、４０６、２９４、２９６、４０７及び２９８；３００、３０１、３０２、４１０、３０５及び３０６又は４１４、４１５、４１６、４１８、４１９及び４２０に示されている、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３２】
ｃ−ＭＥＴに結合する第２の抗原結合性部位が、
（ａ）配列番号２９１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号２９５と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号２９９と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号３０３と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン又は
（ｃ）配列番号４１３と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号４１７と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３３】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＫＩＴに結合し、配列番号１０９と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１３と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３４】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＫＩＴに結合し、配列番号１１７と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１２１と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３５】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＦ３に結合し、配列番号１２６と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１３０と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３６】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＦ３に結合し、配列番号１４０と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１４４と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３７】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＩＧＦ１Ｒに結合し、配列番号１４９と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１５３と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３８】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＩＧＦ１Ｒに結合し、配列番号１５７と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１６１と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３９】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＬｅｗｉｓ  Ｙに結合し、配列番号１６６と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１７０と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４０】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＬｅｗｉｓ  Ｙに結合し、配列番号１７４と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１７８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４１】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＭＵＣ１３に結合し、配列番号１８２と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１８６と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４２】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＭＣＡＭに結合し、配列番号１９２と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１９６と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４３】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＭＣＡＭに結合し、配列番号２００と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号２０４と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４４】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＬＲＲＣ３２に結合し、配列番号２０９と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号２１３と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４５】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＬＲＲＣ３２に結合し、配列番号２１７と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号２２１と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４６】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるシアリルＴｎに結合し、配列番号２２６と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号２３０と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４７】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるシアリルＴｎに結合し、配列番号２３４と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号２３８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４８】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるｇｐＡ３３に結合し、配列番号２４２と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号２４６と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４９】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるｇｐＡ３３に結合し、配列番号２５０と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号２５４と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５０】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＧＤ３に結合し、配列番号２５９と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号２６３と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５１】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＧＤ３に結合し、配列番号２６７と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号２７１と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５２】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＧＭ２に結合し、配列番号２７５と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号２７９と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５３】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＧＭ２に結合し、配列番号２８３と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号２８７と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５４】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＥＰＨＡ３に結合し、配列番号３０８と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号３１２と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５５】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＴＮＦＲＳＦ１０に結合し、配列番号３１７と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号３２１と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５６】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＴＮＦＲＳＦ１０に結合し、配列番号３２５と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号３２９と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５７】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＴＮＦＳＦ１１に結合し、配列番号３３４と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号３３８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５８】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＴＮＦＳＦ１１に結合し、配列番号３４２と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号３４６と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５９】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＣＤ７４に結合し、配列番号３５１と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号３５５と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６０】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＣＤ７４に結合し、配列番号３５９と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号３６３と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６１】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＰＭＥＬに結合し、配列番号３６９と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号３７３と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６２】
第２の抗原結合性部位が、腫瘍関連抗原であるＰＭＥＬに結合し、配列番号３７７と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号３８１と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６３】
ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体のＦｃドメイン又はその部分を含み、抗体のＦｃドメインが、ヒンジ及びＣＨ２ドメインを含む、請求項１〜６２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６４】
抗体のＦｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ及びＣＨ２ドメインを含む、請求項６３に記載のタンパク質。
【請求項６５】
抗体のＦｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項６３又は６４に記載のタンパク質。
【請求項６６】
抗体のＦｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃドメインと少なくとも９０％同一であり、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１及びＫ４３９からなる群から選択される１つ以上の位置において異なるアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載のタンパク質。
【請求項６７】
配列番号４２３及び配列番号４２４と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６８】
配列番号４２５及び配列番号４２６、配列番号４２７及び配列番号４２８、又は配列番号４２９及び配列番号４３０と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項６７に記載のタンパク質。
【請求項６９】
請求項１〜６８のいずれか一項に記載のタンパク質及び薬学的に許容される担体を含む製剤。
【請求項７０】
請求項１〜６８のいずれか一項に記載のタンパク質を発現させる１つ以上の核酸を含む細胞。
【請求項７１】
腫瘍細胞死を増強する方法であって、腫瘍細胞及びナチュラルキラー細胞を、有効量の、請求項１〜６８のいずれか一項に記載のタンパク質へと曝露することを含み、腫瘍細胞が、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬからなる群から選択される腫瘍関連抗原を発現する、方法。
【請求項７２】
がんを処置する方法であって、有効量の、請求項１〜６８のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項６９に記載の製剤を、患者へと投与することを含む、方法。
【請求項７３】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、ｃ−ＭＥＴに結合し、処置されるがんが、腎がん、甲状腺がん、黒色腫、肺がん、黒色腫、肝がん、膵がん、結腸直腸がん及び頭頸部がんからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、ＫＩＴに結合し、処置されるがんが、結腸直腸がん、急性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、黒色腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、腎がん、肝がん及び精巣がんからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、Ｆ３に結合し、処置されるがんが、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、膠芽腫、頭頸部がん、肺がん、膵がん、前立腺がん、肉腫及び結腸直腸がんからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、ＩＧＦ１Ｒに結合し、処置されるがんが、乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肺がん、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、前立腺がん、肉腫、甲状腺がん、腎がん、結腸直腸がん、膵がん、膠芽腫及び肝がんからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、Ｌｅｗｉｓ  Ｙに結合し、処置されるがんが、卵巣がん、肺がん、結腸直腸がん、胃がん、乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、多発性骨髄腫及び急性骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、ＭＵＣ１３に結合し、処置されるがんが、卵巣がん、肝がん、肺がん、黒色腫、肝がん、胃がん、膵がん、腎がん、食道がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮頸がん及び胆管癌からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、ＭＵＣ４に結合し、処置されるがんが、乳がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、急性リンパ芽球性白血病、膀胱がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、頭頸部がん及び前立腺がんからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８０】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、ＭＣＡＭに結合し、処置されるがんが、黒色腫、乳がん、小細胞肺がん、肉腫、結腸直腸がん、膵がん及び腎がんからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８１】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、ＬＲＲＣ３２に結合し、処置されるがんが、腎がん、膵がん、肉腫、卵巣がん、肺がん、膠芽腫、頭頸部がん、前立腺がん、肝がん、乳がん及び子宮頸がんからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８２】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、シアリルＴｎに結合し、処置されるがんが、卵巣がん、膵がん、膀胱がん、胃がん、前立腺がん、結腸直腸がん及び乳がんからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８３】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、ｇｐＡ３３に結合し、処置されるがんが、結腸直腸がん、胃がん及び食道がんからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８４】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、ＧＤ３に結合し、処置されるがんが、肺がん、神経膠腫、乳がん、黒色腫、卵巣がん、膵がん及び神経芽細胞腫からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８５】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、ＧＭ２に結合し、処置されるがんが、胃がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、神経芽細胞腫、黒色腫、肺がん、中皮腫及び肝がんからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８６】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、ＥＰＨＡ３に結合し、処置されるがんが、子宮頸がん、頭頸部がん、胃がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、結腸直腸がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、膵がん、肺がん及び肉腫からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８７】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａに結合し、処置されるがんが、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん及び頭頸部がんからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８８】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、ＴＮＦＳＦ１１に結合し、処置されるがんが、乳がん、前立腺がん及び骨転移性がんからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８９】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、ＣＤ７４に結合し、処置されるがんが、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん、Ｂ細胞悪性腫瘍、腎がん、肺がん、卵巣がん、黒色腫、肉腫、頭頸部がん、肝がん、膀胱がん、神経膠腫、乳がん及び白血病からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項９０】
タンパク質の第２の抗原結合性部位が、ＰＭＥＬに結合し、処置されるがんが、黒色腫及び肉腫からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示が、参照によりその全体において、全ての目的のために、本明細書に組み込まれた、２０１８年８月８日に出願された、米国特許仮出願第６２／７１６，１１０号の利益及びこれに対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて、電子的に提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれた配列表を含む。２０１９年８月６日に作成された、前記ＡＳＣＩＩコピーは、「ＤＦＹ−０６ｌＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられており、３４２，００８バイトのサイズである。
【０００３】
本発明の分野
本発明は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６及び少なくとも１つの腫瘍関連抗原に結合する多特異性結合性タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００４】
この疾患の処置について、文献において報告されている、相当な研究の試み及び科学的進歩にもかかわらず、がんは、重大な健康問題であり続けている。多発性骨髄腫、白血病及びリンパ腫を含む、血液がん及び骨髄がんは、診断が高頻度である、がんの種類である。これらのがんのための、現行の処置選択肢は、全ての患者に効果的なわけではない、及び／又は実質的な有害副作用を及ぼしうる。他の種類のがんもまた、既存の治療選択肢を使用して処置することが、依然として困難である。
【０００５】
がん免疫療法は、高度に特異的であり、患者自身の免疫系を使用して、がん細胞の破壊を容易としうるため、望ましい。二特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの融合タンパク質は、腫瘍細胞及びＴ細胞に結合して腫瘍細胞の破壊を容易とする、文献に記載されたがん免疫療法である。ある特定の腫瘍関連抗原と、ある特定の免疫細胞とに結合する抗体は、文献において記載されている。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１及びＷＯ２０１５／０９５４１２を参照されたい。
【０００６】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の構成要素であり、循環リンパ球のうちの、約１５％を占める。ＮＫ細胞は、事実上、全ての組織に浸潤し、元来、事前の感作を必要とせずに、腫瘍細胞を効果的に死滅させるこれらの能力により特徴づけられている。活性化ＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と同様の手段（すなわち、パーフォリン及びグランザイムを含有する細胞溶解性顆粒を介するほか、死受容体経路を介する）により、標的細胞を死滅させる。活性化ＮＫ細胞はまた、ＩＦＮ−γなどの炎症性サイトカイン及び他の白血球の、標的組織への動員を促進するケモカインも分泌する。
【０００７】
ＮＫ細胞は、これらの表面上の、様々な活性化受容体及び阻害性受容体を介するシグナルに応答する。例えば、ＮＫ細胞が、健常な自己細胞に遭遇すると、これらの活性は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化を介して阻害される。代替的に、ＮＫ細胞が、外来細胞又はがん細胞に遭遇すると、これらは、これらの活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ１）を介して活性化される。ＮＫ細胞はまた、一部の免疫グロブリンの定常領域によっても、これらの表面上のＣＤ１６受容体を介して活性化される。ＮＫ細胞の、活性化への全体的な感受性は、刺激性シグナル及び阻害性シグナルの合計に依存する。ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫＧ２Ｄが活性化受容体として用いられる場合に、本質的に全てのナチュラルキラー細胞により発現されるＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＮＫＧ２Ｄは、また、共刺激性受容体として作用する場合に、Ｔ細胞上においても見出される。ＮＫＧ２Ｄを介して、ＮＫ細胞機能をモジュレートする能力は、悪性腫瘍を含む、多様な治療状況において有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１３４３７１号
【特許文献２】国際公開第２０１５／０９５４１２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体並びにＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する多特異性結合性タンパク質を提供する。このようなタンパク質は、１種類を超えるＮＫ活性化受容体にエンゲージメントすることが可能であり、天然リガンドの、ＮＫＧ２Ｄへの結合を遮断しうる。ある特定の実施形態において、タンパク質は、ヒトにおけるＮＫ細胞をアゴナイズしうる。一部の実施形態において、タンパク質は、ヒト並びに齧歯動物及びカニクイザルなど、他の種におけるＮＫ細胞をアゴナイズしうる。本発明の、多様な態様及び実施形態について、下記において、さらに詳細に記載される。
【００１０】
したがって、本発明の一態様は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位；ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位、並びにＣＤ１６に結合するのに十分な、抗体のＦｃドメイン若しくはその部分、又はＣＤ１６に結合する第３の抗原結合性部位が組み込まれているタンパク質を提供する。
【００１１】
抗原結合性部位は、各々が、抗体の重鎖可変ドメイン及び抗体の軽鎖可変ドメイン（例えば、抗体内と同様に配置された、又はｓｃＦｖを形成するように、一体に融合させた）が組み込まれている場合もあり、抗原結合性部位のうちの１つ以上が、ラクダ科動物抗体のようなＶＨＨ抗体又は軟骨魚類において見出されたＶＮＡＲ抗体などの、単一ドメイン抗体である場合もある。
【００１２】
一態様において、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位；ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位；ＣＤ１６に結合するのに十分な、抗体のＦｃドメイン若しくはその部分、又はＣＤ１６に結合する第３の抗原結合性部位、並びに第２の腫瘍関連部位（例えば、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原）と同じ腫瘍関連抗原に結合する、追加の抗原結合性部位を含む多特異性結合性タンパク質を提供する。
【００１３】
本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位及び／又は追加の抗原結合性部位が、Ｆａｂ断片であるタンパク質を提供する。本開示はまた、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、ｓｃＦｖであり、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位及び／又は追加の抗原結合性部位が、ｓｃＦｖであるタンパク質も提示する。
【００１４】
本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、Ｆａｂ断片であり、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位が、ｓｃＦｖであるタンパク質を提供する。
【００１５】
本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位が、ｓｃＦｖであり、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位が、Ｆａｂ断片であるタンパク質を提供する。
【００１６】
抗原結合性部位は、各々が、抗体の重鎖可変ドメイン及び抗体の軽鎖可変ドメイン（例えば、抗体内と同様に配置された、又はｓｃＦｖを形成するように、一体に融合させた）が組み込まれている場合もあり、抗原結合性部位のうちの１つ以上が、ラクダ科動物抗体のようなＶＨＨ抗体又は軟骨魚類において見出されたＶＮＡＲ抗体などの、単一ドメイン抗体である場合もある。
【００１７】
一態様において、本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体並びにＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する多特異性結合性タンパク質を提供する。ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位は、配列番号１、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５及び配列番号９３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメインを含みうる。
【００１８】
一部の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位は、配列番号１と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一なアミノ酸配列を有すること並びに／又は配列番号１のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１０５）、ＣＤＲ２（配列番号１０６）及びＣＤＲ３（配列番号１０７）の配列と同一なアミノ酸配列を組み込むことなどにより、配列番号１と類縁の、重鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。配列番号１と類縁の、重鎖可変ドメインは、ＮＫＧ２Ｄ結合性部位を形成するように、様々な軽鎖可変ドメインとカップリングされうる。例えば、配列番号１と類縁の、重鎖可変ドメインが組み込まれている第１の抗原結合性部位は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８及び４０と類縁の配列のうちのいずれか１つから選択される軽鎖可変ドメインがさらに組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合性部位は、配列番号１と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一なアミノ酸配列を伴う重鎖可変ドメイン並びに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８及び４０から選択される配列のうちのいずれか１つと、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一なアミノ酸配列を伴う軽鎖可変ドメインが組み込まれている。
【００１９】
代替的に、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位は、配列番号４１と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号４２と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号４１と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号４１のうちの、ＣＤＲ１（配列番号４３又は４３１）、ＣＤＲ２（配列番号４４）及びＣＤＲ３（配列番号４５又は４３２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号４２と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号４２のうちの、ＣＤＲ１（配列番号４６）、ＣＤＲ２（配列番号４７）及びＣＤＲ３（配列番号４８）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２０】
他の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位は、配列番号４９と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号５０と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号４９と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号４９のうちの、ＣＤＲ１（配列番号５１又は４３３）、ＣＤＲ２（配列番号５２）及びＣＤＲ３（配列番号５３又は４３４）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号５０と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号５０のうちの、ＣＤＲ１（配列番号５４）、ＣＤＲ２（配列番号５５）及びＣＤＲ３（配列番号５６）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２１】
代替的に、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位は、それぞれ、配列番号５７と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一なアミノ酸配列及び配列番号５８と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一なアミノ酸配列を有することなどにより、配列番号５７と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号５８と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。
【００２２】
別の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位は、配列番号５９と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号６０と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号５９と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号５９のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１３４）、ＣＤＲ２（配列番号１３５）及びＣＤＲ３（配列番号１３６）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号６０と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号６０のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１３７）、ＣＤＲ２（配列番号１３８）及びＣＤＲ３（配列番号１３９）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２３】
一部の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位は、配列番号６１と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号６２と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号６１と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号６１のうちの、ＣＤＲ１（配列番号６３又は４３５）、ＣＤＲ２（配列番号６４）及びＣＤＲ３（配列番号６５又は４３６）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号６２と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号６２のうちの、ＣＤＲ１（配列番号６６）、ＣＤＲ２（配列番号６７）及びＣＤＲ３（配列番号６８）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２４】
一部の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位は、配列番号６９と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号７０と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号６９と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号６９のうちの、ＣＤＲ１（配列番号７１又は４３７）、ＣＤＲ２（配列番号７２）及びＣＤＲ３（配列番号７３又は４０８）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号７０と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号７０のうちの、ＣＤＲ１（配列番号７４）、ＣＤＲ２（配列番号７５）及びＣＤＲ３（配列番号７６）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２５】
一部の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位は、配列番号７７と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号７８と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号７７と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号７７のうちの、ＣＤＲ１（配列番号７９又は４０９）、ＣＤＲ２（配列番号８０）及びＣＤＲ３（配列番号８１又は４１１）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号７８と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号７８のうちの、ＣＤＲ１（配列番号８２）、ＣＤＲ２（配列番号８３）及びＣＤＲ３（配列番号８４）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２６】
一部の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位は、配列番号８５と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号８６と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号８５と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号８５のうちの、ＣＤＲ１（配列番号８７又は３８７）、ＣＤＲ２（配列番号８８）及びＣＤＲ３（配列番号８９又は４１２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号８６のうちの、ＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）及びＣＤＲ３（配列番号９２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２７】
一部の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位は、配列番号９３と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号９４と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号９３と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号９３のうちの、ＣＤＲ１（配列番号９５又は４２１）、ＣＤＲ２（配列番号９６）及びＣＤＲ３（配列番号９７又は４２２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号９４と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号９４のうちの、ＣＤＲ１（配列番号９８）、ＣＤＲ２（配列番号９９）及びＣＤＲ３（配列番号１００）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００２８】
一部の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位は、それぞれ、配列番号１０１と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一なアミノ酸配列及び配列番号１０２と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一なアミノ酸配列を有することなどにより、配列番号１０１と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号１０２と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。
【００２９】
一部の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位は、それぞれ、配列番号１０３と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一なアミノ酸配列及び配列番号１０４と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一なアミノ酸配列を有することなどにより、配列番号１０３と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号１０４と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。
【００３０】
一部の実施形態において、第１の抗原結合性部位は、配列番号３８８と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号８６と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号３８８と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３８８のうちの、ＣＤＲ１（配列番号８７又は３８７）、ＣＤＲ２（配列番号８８）及びＣＤＲ３（配列番号３８９又は３９０）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号８６のうちの、ＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）及びＣＤＲ３（配列番号９２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００３１】
一部の実施形態において、第１の抗原結合性部位は、配列番号３９１と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号８６と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号３９１と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３９１のうちの、ＣＤＲ１（配列番号８７又は３８７）、ＣＤＲ２（配列番号８８）及びＣＤＲ３（配列番号３９２又は３９３）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号８６のうちの、ＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）及びＣＤＲ３（配列番号９２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００３２】
一部の実施形態において、第１の抗原結合性部位は、配列番号３９４と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号８６と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号３９４と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３９４のうちの、ＣＤＲ１（配列番号８７又は３８７）、ＣＤＲ２（配列番号８８）及びＣＤＲ３（配列番号３９５又は３９６）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号８６のうちの、ＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）及びＣＤＲ３（配列番号９２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００３３】
一部の実施形態において、第１の抗原結合性部位は、配列番号３９７と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号８６と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号３９７と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３９７のうちの、ＣＤＲ１（配列番号８７又は３８７）、ＣＤＲ２（配列番号８８）及びＣＤＲ３（配列番号３９８又は３９９）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号８６のうちの、ＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）及びＣＤＲ３（配列番号９２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００３４】
一部の実施形態において、第１の抗原結合性部位は、配列番号４００と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号８６と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号４００と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号４００のうちの、ＣＤＲ１（配列番号８７又は３８７）、ＣＤＲ２（配列番号８８）及びＣＤＲ３（配列番号４０１又は４０２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号８６のうちの、ＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）及びＣＤＲ３（配列番号９２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００３５】
一部の実施形態において、第１の抗原結合性部位は、配列番号４０３と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号８６と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号４０３と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号４０３のうちの、ＣＤＲ１（配列番号８７又は３８７）、ＣＤＲ２（配列番号８８）及びＣＤＲ３（配列番号４０４又は４０５）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号８６のうちの、ＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）及びＣＤＲ３（配列番号９２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００３６】
一部の実施形態において、ＫＩＴに結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号１０９と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号１１３と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号１０９と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１０９のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１１）及びＣＤＲ３（配列番号１１２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号１１３と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１１３のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１１４）、ＣＤＲ２（配列番号１１５）及びＣＤＲ３（配列番号１１６）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００３７】
代替的に、ＫＩＴに結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号１１７と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号１２１と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号１１７と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１１７のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１１８）、ＣＤＲ２（配列番号１１９）及びＣＤＲ３（配列番号１２０）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号１２１と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１２１のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１２２）、ＣＤＲ２（配列番号１２３）及びＣＤＲ３（配列番号１２４）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００３８】
一部の実施形態において、Ｆ３に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号１２６と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号１３０と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号１２６と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１２６のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１２７）、ＣＤＲ２（配列番号１２８）及びＣＤＲ３（配列番号１２９）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号１３０と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１３０のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１３１）、ＣＤＲ２（配列番号１３２）及びＣＤＲ３（配列番号１３３）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００３９】
一部の実施形態において、Ｆ３に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号１４０と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号１４４と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号１４０と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１４０のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１４１）、ＣＤＲ２（配列番号１４２）及びＣＤＲ３（配列番号１４３）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号１４４と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１４４のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１４５）、ＣＤＲ２（配列番号１４６）及びＣＤＲ３（配列番号１４７）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４０】
一部の実施形態において、ＩＧＦ１Ｒに結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号１４９と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号１５３と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号１４９と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１４９のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１５０）、ＣＤＲ２（配列番号１５１）及びＣＤＲ３（配列番号１５２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号１５３と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１５３のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１５４）、ＣＤＲ２（配列番号１５５）及びＣＤＲ３（配列番号１５６）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４１】
一部の実施形態において、ＩＧＦ１Ｒに結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号１５７と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号１６１と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号１５７と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１５７のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１５８）、ＣＤＲ２（配列番号１５９）及びＣＤＲ３（配列番号１６０）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号１６１と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１６１のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１６２）、ＣＤＲ２（配列番号１６３）及びＣＤＲ３（配列番号１６４）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４２】
一部の実施形態において、Ｌｅｗｉｓ  Ｙに結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号１６６と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号１７０と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号１６６と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１６６のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１６７）、ＣＤＲ２（配列番号１６８）及びＣＤＲ３（配列番号１６９）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号１７０と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１７０のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１７１）、ＣＤＲ２（配列番号１７２）及びＣＤＲ３（配列番号１７３）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４３】
一部の実施形態において、Ｌｅｗｉｓ  Ｙに結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号１７４と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号１７８と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号１７４と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１７４のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１７５）、ＣＤＲ２（配列番号１７６）及びＣＤＲ３（配列番号１７７）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号１７８と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１７８のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１７９）、ＣＤＲ２（配列番号１８０）及びＣＤＲ３（配列番号１８１）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４４】
一部の実施形態において、ＭＵＣ１３に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号１８２と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号１８６と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号１８２と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１８２のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１８３）、ＣＤＲ２（配列番号１８４）及びＣＤＲ３（配列番号１８５）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号１８６と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１８６のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１８７）、ＣＤＲ２（配列番号１８８）及びＣＤＲ３（配列番号１８９）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４５】
一部の実施形態において、第２の抗原結合性部位は、ＭＵＣ４の部分（配列番号１９１）に結合する。
【００４６】
一部の実施形態において、ＭＣＡＭに結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号１９２と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号１９６と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号１９２と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１９２のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１９３）、ＣＤＲ２（配列番号１９４）及びＣＤＲ３（配列番号１９５）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号１９６と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号１９６のうちの、ＣＤＲ１（配列番号１９７）、ＣＤＲ２（配列番号１９８）及びＣＤＲ３（配列番号１９９）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４７】
一部の実施形態において、ＭＣＡＭに結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号２００と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号２０４と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号２００と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２００のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２０１）、ＣＤＲ２（配列番号２０２）及びＣＤＲ３（配列番号２０３）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号２０４と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２０４のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２０５）、ＣＤＲ２（配列番号２０６）及びＣＤＲ３（配列番号２０７）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４８】
一部の実施形態において、ＬＲＲＣ３２に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号２０９と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号２１３と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号２０９と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２０９のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２１０）、ＣＤＲ２（配列番号２１１）及びＣＤＲ３（配列番号２１２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号２１３と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２１３のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２１４）、ＣＤＲ２（配列番号２１５）及びＣＤＲ３（配列番号２１６）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４９】
一部の実施形態において、ＬＲＲＣ３２に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号２１７と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号２２１と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号２１７と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２１７のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２１８）、ＣＤＲ２（配列番号２１９）及びＣＤＲ３（配列番号２２０）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号２２１と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２２１のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２２２）、ＣＤＲ２（配列番号２２３）及びＣＤＲ３（配列番号２２４）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５０】
一部の実施形態において、シアリルＴｎに結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号２２６と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号２３０と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号２２６と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２２６のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２２７）、ＣＤＲ２（配列番号２２８）及びＣＤＲ３（配列番号２２９）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号２３０と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２３０のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２３１）、ＣＤＲ２（配列番号２３２）及びＣＤＲ３（配列番号２３３）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５１】
一部の実施形態において、シアリルＴｎに結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号２３４と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号２３８と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号２３４と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２３４のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２３５）、ＣＤＲ２（配列番号２３６）及びＣＤＲ３（配列番号２３７）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号２３８と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２３８のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２３９）、ＣＤＲ２（配列番号２４０）及びＣＤＲ３（配列番号２４１）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５２】
一部の実施形態において、ｇｐＡ３３に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号２４２と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号２４６と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号２４２と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２４２のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２４３）、ＣＤＲ２（配列番号２４４）及びＣＤＲ３（配列番号２４５）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号２４６と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２４６のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２４７）、ＣＤＲ２（配列番号２４８）及びＣＤＲ３（配列番号２４９）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５３】
一部の実施形態において、ｇｐＡ３３に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号２５０と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号２５４と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号２５０と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２５０のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２５１）、ＣＤＲ２（配列番号２５２）及びＣＤＲ３（配列番号２５３）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号２５４と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２５４のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２５５）、ＣＤＲ２（配列番号２５６）及びＣＤＲ３（配列番号２５７）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５４】
一部の実施形態において、ＧＤ３に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号２５９と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号２６３と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号２５９と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２５９のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２６０）、ＣＤＲ２（配列番号２６１）及びＣＤＲ３（配列番号２６２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号２６３と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２６３のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２６４）、ＣＤＲ２（配列番号２６５）及びＣＤＲ３（配列番号２６６）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５５】
一部の実施形態において、ＧＤ３に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号２６７と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号２７１と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号２６７と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２６７のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２６８）、ＣＤＲ２（配列番号２６９）及びＣＤＲ３（配列番号２７０）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号２７１と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２７１のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２７２）、ＣＤＲ２（配列番号２７３）及びＣＤＲ３（配列番号２７４）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５６】
一部の実施形態において、ＧＭ２に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号２７５と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号２７９と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号２７５と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２７５のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２７６）、ＣＤＲ２（配列番号２７７）及びＣＤＲ３（配列番号２７８）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号２７９と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２７９のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２８０）、ＣＤＲ２（配列番号２８１）及びＣＤＲ３（配列番号２８２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５７】
一部の実施形態において、ＧＭ２に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号２８３と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号２８７と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号２８３と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２８３のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２８４）、ＣＤＲ２（配列番号２８５）及びＣＤＲ３（配列番号２８６）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号２８７と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２８７のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２８８）、ＣＤＲ２（配列番号２８９）及びＣＤＲ３（配列番号２９０）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５８】
一部の実施形態において、ｃ−ＭＥＴに結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号２９１と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号２９５と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号２９１と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２９１のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２９２）、ＣＤＲ２（配列番号２９３又は４０６）及びＣＤＲ３（配列番号２９４）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号２９５と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２９５のうちの、ＣＤＲ１（配列番号２９６）、ＣＤＲ２（配列番号２９７又は４０７）及びＣＤＲ３（配列番号２９８）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５９】
一部の実施形態において、ｃ−ＭＥＴに結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号２９９と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号３０３と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号２９９と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号２９９のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３００）、ＣＤＲ２（配列番号３０１）及びＣＤＲ３（配列番号３０２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号３０３と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３０３のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３０４又は４１０）、ＣＤＲ２（配列番号３０５）及びＣＤＲ３（配列番号３０６）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００６０】
一部の実施形態において、ｃ−ＭＥＴに結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号４１３と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号４１７と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号４１３と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号４１３のうちの、ＣＤＲ１（配列番号４１４）、ＣＤＲ２（配列番号４１５）及びＣＤＲ３（配列番号４１６）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号４１７と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号４１７のうちの、ＣＤＲ１（配列番号４１８）、ＣＤＲ２（配列番号４１９）及びＣＤＲ３（配列番号４２０）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００６１】
一部の実施形態において、ＥＰＨＡ３に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号３０８と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号３１２と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号３０８と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３０８のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３０９）、ＣＤＲ２（配列番号３１０）及びＣＤＲ３（配列番号３１１）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号３１２と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３１２のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３１３）、ＣＤＲ２（配列番号３１４）及びＣＤＲ３（配列番号３１５）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００６２】
一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１０に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号３１７と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号３２１と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号３１７と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３１７のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３１８）、ＣＤＲ２（配列番号３１９）及びＣＤＲ３（配列番号３２０）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号３２１と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３２１のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３２２）、ＣＤＲ２（配列番号３２３）及びＣＤＲ３（配列番号３２４）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００６３】
一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１０に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号３２５と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号３２９と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号３２５と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３２５のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３２６）、ＣＤＲ２（配列番号３２７）及びＣＤＲ３（配列番号３２８）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号３２９と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３２９のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３３０）、ＣＤＲ２（配列番号３３１）及びＣＤＲ３（配列番号３３２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００６４】
一部の実施形態において、ＴＮＦＳＦ１１に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号３３４と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号３３８と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号３３４と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３３４のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３３５）、ＣＤＲ２（配列番号３３６）及びＣＤＲ３（配列番号３３７）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号３３８と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３３８のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３３９）、ＣＤＲ２（配列番号３４０）及びＣＤＲ３（配列番号３４１）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００６５】
一部の実施形態において、ＴＮＦＳＦ１１に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号３４２と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号３４６と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号３４２と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３４２のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３４３）、ＣＤＲ２（配列番号３４４）及びＣＤＲ３（配列番号３４５）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号３４６と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３４６のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３４７）、ＣＤＲ２（配列番号３４８）及びＣＤＲ３（配列番号３４９）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００６６】
一部の実施形態において、ＣＤ７４に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号３５１と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号３５５と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号３５１と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３５１のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３５２）、ＣＤＲ２（配列番号３５３）及びＣＤＲ３（配列番号３５４）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号３５５と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３５５のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３５６）、ＣＤＲ２（配列番号３５７）及びＣＤＲ３（配列番号３５８）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００６７】
一部の実施形態において、ＣＤ７４に結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号３５９と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号３６３と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号３５９と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３５９のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３６０）、ＣＤＲ２（配列番号３６１）及びＣＤＲ３（配列番号３６２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号３６３と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３６３のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３６４）、ＣＤＲ２（配列番号３６５）及びＣＤＲ３（配列番号３６６）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００６８】
一部の実施形態において、ＰＭＥＬに結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号３６９と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号３７３と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号３６９と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３６９のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３７０）、ＣＤＲ２（配列番号３７１）及びＣＤＲ３（配列番号３７２）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号３７３と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３７３のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３７４）、ＣＤＲ２（配列番号３７５）及びＣＤＲ３（配列番号３７６）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００６９】
一部の実施形態において、ＰＭＥＬに結合する第２の抗原結合性部位は、配列番号３７７と類縁の、重鎖可変ドメイン及び配列番号３８１と類縁の、軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合性部位の、重鎖可変ドメインは、配列番号３７７と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３７７のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３７８）、ＣＤＲ２（配列番号３７９）及びＣＤＲ３（配列番号３８０）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合性部位の、軽鎖可変ドメインは、配列番号３８１と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一でありうる、並びに／又は配列番号３８１のうちの、ＣＤＲ１（配列番号３８２）、ＣＤＲ２（配列番号３８３）及びＣＤＲ３（配列番号３８４）の配列と同一なアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００７０】
一部の実施形態において、第２の抗原結合性部位は、第１の抗原結合性部位に存在する、軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインが組み込まれている。
【００７１】
一部の実施形態において、タンパク質は、抗体のＦｃドメインの部分（例えば、ＣＤ１６に結合するのに十分な、抗体のＦｃドメインの部分）が組み込まれており、この場合、抗体のＦｃドメインは、ヒンジ及びＣＨ２ドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ及びＣＨ２ドメイン）並びに／又はヒトＩｇＧ抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。変異は、別の抗体の定常ドメインとのヘテロ二量体化を可能とするように、抗体の定常ドメインへと導入されうる。例えば、一部の実施形態において、抗体のＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃドメインと少なくとも９０％同一であり、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１及びＫ４３９からなる群から選択される１つ以上の位置において異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗体のＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むことが可能であり、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ及びＫ４３９Ｅからなる群から選択される１つ以上の置換により異なる。
【００７２】
本明細書において記載されたタンパク質のうちのいずれか１つを含有する製剤；タンパク質を発現させる１つ以上の核酸を含有する細胞、及びタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増強する方法もまた、提供される。
【００７３】
本発明の別の態様は、患者におけるがんを処置する方法を提供する。方法は、それを必要とする患者へと、治療有効量の、本明細書において記載された多特異性結合性タンパク質を投与することを含む。多特異性結合性タンパク質を使用して処置される、例示的ながんは、白血病、例えば、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病及び有毛細胞白血病を含む。
【００７４】
一態様において、本発明のタンパク質は、ヒンジ配列を介して、抗体の定常ドメインへと連結されている単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態において、ヒンジは、アミノ酸である、Ａｌａ−Ｓｅｒを含む。他の一部の実施形態において、ヒンジは、アミノ酸である、Ａｌａ−Ｓｅｒ及びＴｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙを含む。ｓｃＦｖは、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含みうる。一部の実施形態において、ｓｃＦｖは、ＮＫＧ２Ｄ又は腫瘍関連抗原に結合する。ヒンジ配列は、標的抗原、例えば、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原への結合の可撓性をもたらす。
【００７５】
ｓｃＦｖについての、一部の実施形態において、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する。例えば、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４残基と、軽鎖可変ドメインＣ１００残基との間に形成されうる。一部の実施形態において、重鎖可変ドメインは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（「（Ｇ４Ｓ）４」）（配列番号３８６）のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーなどの可撓性リンカーを介して、軽鎖可変ドメインへと連結されている。ｓｃＦｖについての、一部の実施形態において、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＮ末端に位置する。ｓｃＦｖについての、一部の実施形態において、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する。
【００７６】
一部の実施形態において、ｓｃＦｖ又はＦａｂ断片へと連結された抗体の定常ドメインは、ＣＤ１６に結合することが可能である。一部の実施形態において、抗体の定常ドメインは、ＩｇＧ抗体、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。一部の実施形態において、抗体の定常ドメインは、ヒンジ及びＣＨ２ドメイン並びに／又はヒトＩｇＧ抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、変異は、別の抗体の定常ドメインとのヘテロ二量体化を可能とするように、抗体の定常ドメインへと導入されうる。例えば、抗体の定常ドメインが、ヒトＩｇＧ１の定常ドメインに由来する場合、抗体の定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むことが可能であり、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１及びＫ４３９からなる群から選択される１つ以上の位置において異なる。一部の実施形態において、抗体の定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むことが可能であり、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ及びＫ４３９Ｅからなる群から選択される１つ以上の置換により異なる。
【００７７】
一部の実施形態において、本発明のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位；ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬからなる群から選択される腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位、並びにＣＤ１６に結合するのに十分な、抗体のＦｃドメイン若しくはその部分、又はＣＤ１６に結合する第３の抗原結合性部位を含む。一部の実施形態において、タンパク質は、第２の抗原結合性部位（例えば、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬからなる群から選択される腫瘍関連抗原）と同じ腫瘍関連抗原に結合する、追加の抗原結合性部位を含む。一部の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位及び／又は追加の抗原結合性部位は、Ｆａｂ断片である。一部の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位は、ｓｃＦｖであり、腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位及び／又は追加の抗原結合性部位は、ｓｃＦｖである。一部の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位は、Ｆａｂ断片であり、腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位は、ｓｃＦｖである。
【００７８】
本明細書において記載されたタンパク質についての、一部の実施形態において、第１の抗原結合性部位は、ヒトにおけるＮＫＧ２Ｄに結合する。
【００７９】
一部の実施形態において、第１の抗原結合性部位、第２の抗原結合性部位及び／又は追加の抗原結合性部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態において、ｓｃＦｖ内において、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインの、Ｎ末端又はＣ末端に位置する。一部の実施形態において、ｓｃＦｖは、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な、抗体の定常ドメイン又は抗体の定常ドメインの部分へと連結され、この場合、ｓｃＦｖは、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態において、ｓｃＦｖ内において、ヒンジは、アミノ酸配列であるＴｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙをさらに含む。
【００８０】
タンパク質についての一部の実施形態において、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する。一部の実施形態において、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインに由来するＣ４４と、軽鎖可変ドメインに由来するＣ１００との間において形成される。
【００８１】
一部の実施形態において、ｓｃＦｖ内において、重鎖可変ドメインは、可撓性リンカーを介して、軽鎖可変ドメインへと連結されている。一部の実施形態において、ｓｃＦｖ内において、可撓性リンカーは、（Ｇ４Ｓ）４を含む。
【００８２】
別の態様において、本明細書において記載されたタンパク質と及び薬学的に許容される担体を含む製剤が、本明細書において提示される。
【００８３】
さらに別の態様において、本明細書において記載されたタンパク質を発現させる１つ以上の核酸を含む細胞が、本明細書において提示される。
【００８４】
さらなる態様において、本開示は、腫瘍細胞及びナチュラルキラー細胞を、有効量の、本明細書において記載されたタンパク質へと曝露することにより、腫瘍細胞死を増強する方法を提示するが、この場合、腫瘍細胞は、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬからなる群から選択される腫瘍関連抗原を発現する。
【００８５】
本明細書において、有効量の、本明細書において記載されたタンパク質又は製剤を、患者へと投与することにより、がんを処置する方法もまた提示される。例えば、本開示は、有効量の、タンパク質又はこのようなタンパク質を含む製剤を、患者へと投与することにより、がんを処置する方法を提示するが、この場合、タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合性部位；ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位、並びにＣＤ１６に結合するのに十分な、抗体のＦｃドメイン（又は抗体のＦｃドメインの部分）、又はＣＤ１６に結合する第３の抗原結合性部位を含む。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、ＫＩＴに結合し、処置されるがんは、結腸直腸がん、急性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、黒色腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、腎がん、肝がん及び精巣がんからなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、Ｆ３に結合し、処置されるがんは、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、膠芽腫、頭頸部がん、肺がん、膵がん、前立腺がん、肉腫及び結腸直腸がんからなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、ＩＧＦ１Ｒに結合し、処置されるがんは、乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肺がん、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、前立腺がん、肉腫、甲状腺がん、腎がん、結腸直腸がん、膵がん、膠芽腫及び肝がんからなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、Ｌｅｗｉｓ  Ｙに結合し、処置されるがんは、卵巣がん、肺がん、結腸直腸がん、胃がん、乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、多発性骨髄腫及び急性骨髄性白血病からなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、ＭＵＣ１３に結合し、処置されるがんは、卵巣がん、肝がん、肺がん、黒色腫、肝がん、胃がん、膵がん、腎がん、食道がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮頸がん及び胆管癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、ＭＵＣ４に結合し、処置されるがんは、乳がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、急性リンパ芽球性白血病、膀胱がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、頭頸部がん及び前立腺がんからなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、ＭＣＡＭに結合し、処置されるがんは、黒色腫、乳がん、小細胞肺がん、肉腫、結腸直腸がん、膵がん及び腎がんからなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、ＬＲＲＣ３２に結合し、処置されるがんは、腎がん、膵がん、肉腫、卵巣がん、肺がん、膠芽腫、頭頸部がん、前立腺がん、肝がん、乳がん及び子宮頸がんからなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、シアリルＴｎに結合し、処置されるがんは、卵巣がん、膵がん、膀胱がん、胃がん、前立��がん、結腸直腸がん及び乳がんからなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、ｇｐＡ３３に結合し、処置されるがんは、結腸直腸がん、胃がん及び食道がんからなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、ＧＤ３に結合し、処置されるがんは、肺がん、神経膠腫、乳がん、黒色腫、卵巣がん、膵がん及び神経芽細胞腫からなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、ＧＭ２に結合し、処置されるがんは、胃がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、神経芽細胞腫、黒色腫、肺がん、中皮腫及び肝がんからなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、ｃ−ＭＥＴに結合し、処置されるがんは、腎がん、甲状腺がん、黒色腫、肺がん、黒色腫、肝がん、膵がん、結腸直腸がん及び頭頸部がんからなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、ＥＰＨＡ３に結合し、処置されるがんは、子宮頸がん、頭頸部がん、胃がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、結腸直腸がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、膵がん、肺がん及び肉腫からなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａに結合し、処置されるがんは、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん及び頭頸部がんからなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、ＴＮＦＳＦ１１に結合し、処置されるがんは、乳がん、前立腺がん及び骨転移性がんからなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、ＣＤ７４に結合し、処置されるがんは、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん、Ｂ細胞悪性腫瘍、腎がん、肺がん、卵巣がん、黒色腫、肉腫、頭頸部がん、肝がん、膀胱がん、神経膠腫、乳がん及び白血病からなる群から選択される。一部の実施形態において、タンパク質の第２の抗原結合性部位は、ＰＭＥＬに結合し、処置されるがんは、黒色腫及び肉腫からなる群から選択される。
【００８６】
別の態様において、本発明は、上記において記載された抗体の定常領域へと連結されたｓｃＦｖ、又は上記において記載された抗体の定常領域へと連結されたＦａｂ断片を含有するタンパク質を提供する。一部の実施形態において、タンパク質は、抗体の定常領域へと連結されたｓｃＦｖ、又は抗体の定常領域へと連結されたＦａｂ断片を含む、第１の抗原結合性部位；本明細書において記載されたＦａｂ断片又はｓｃＦｖのフォーマットを取りうる、第２の抗原結合性部位；及び第２の抗原結合性部位へと連結された抗体の第２の定常ドメインを含む。一部の実施形態において、タンパク質は、多特異性であり、この場合、第１の抗原結合性部位は、ＮＫＧ２Ｄに結合し、第２の抗原結合性部位は、腫瘍関連抗原（例えば、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原）に結合し、抗体の定常領域は、ＣＤ１６に結合する。
【００８７】
一部の実施形態において、タンパク質は、多特異性であり、この場合、第１の抗原結合性部位は、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合し、第２の抗原結合性部位は、ＮＫＧ２Ｄに結合し、抗体の定常領域は、ＣＤ１６に結合する。ｓｃＦｖ又はＦａｂ断片へと連結された抗体の定常領域は、第２の抗体の定常領域とヘテロ二量体化しうる。これらの実施形態における、多特異性結合性タンパク質は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体並びにがん細胞上の腫瘍関連抗原（例えば、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原）に結合する。このようなタンパク質は、１種類を超えるＮＫ活性化受容体にエンゲージすることが可能であり、天然リガンドの、ＮＫＧ２Ｄへの結合を遮断しうる。ある特定の実施形態において、タンパク質は、ヒトにおけるＮＫ細胞をアゴナイズしうる。一部の実施形態において、タンパク質は、ヒト並びに／又は齧歯動物及び／若しくはカニクイザルなど、他の種におけるＮＫ細胞をアゴナイズしうる。
【００８８】
別の態様において、本発明は、多特異性結合性タンパク質を提供し、タンパク質は、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する第１の抗原結合性部位；第１の抗原結合性部位と、同じ腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合性部位；ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合性部位及びＣＤ１６に結合するのに十分な、抗体の定常領域若しくはその部分、又はＣＤ１６に結合する第４の抗原結合性部位を含有する。抗原結合性部位のうちのいずれか１つは、上記において記載されたＦａｂ断片又はｓｃＦｖなど、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖの形態を取りうる。本明細書において提示された多特異性タンパク質は、腫瘍関連抗原の、二価のエンゲージメントをもたらし、これにより、がん細胞表面上の腫瘍関連抗原を安定化させ、ＮＫ細胞による、がん細胞に対する、細胞傷害作用を増強する。
【００８９】
一部の実施形態において、本明細書において記載された多特異性タンパク質による、腫瘍関連抗原の、二価のエンゲージメントは、多特異性タンパク質の、がん細胞への、より強い結合を付与し、これにより、ＮＫ細胞の、がん細胞に対する、より強力な細胞傷害性応答、とりわけ、低レベルのＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原を発現するがん細胞に対する、より強力な細胞傷害性応答を容易とする。
【００９０】
上記において記載された腫瘍関連抗原結合性部位は、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する部位でありうる。
【００９１】
本明細書において記載されたタンパク質のうちのいずれか１つを含有する製剤；タンパク質を発現させる１つ以上の核酸を含有する細胞、及びタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増強する方法もまた、提供される。
【００９２】
本発明の別の態様は、患者におけるがんを処置する方法を提供する。方法は、それを必要とする患者へと、治療有効量の、本明細書において記載された多特異性タンパク質を投与することを含む。処置されるがんは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、膀胱がん、骨転移性がん、乳がん、子宮頸がん、胆管癌、結腸直腸がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道がん、ユーイング肉腫、濾胞性リンパ腫、胃がん、消化器がん、消化管間葉系腫瘍、膠芽腫、神経膠腫、頭頸部がん、肝がん、肺がん、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、腎がん、腎細胞癌腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺がん、神経内分泌腫瘍、卵巣がん及び膵がん、前立腺がん、肉腫、小細胞肺がん、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、胸腺癌、甲状腺がん、尿路上皮がん、子宮がん、骨髄由来抑制細胞により浸潤されたがん、調節性Ｔ細胞により浸潤されたがん、細胞外マトリックスの沈着を伴うがん、高レベルの反応性間質を伴うがん及び新血管形成を伴うがんを含みうる。
【００９３】
本発明の別の態様は、患者におけるがんを処置する方法を提供する。方法は、それを必要とする患者へと、治療有効量の、本明細書において記載された多特異性結合性タンパク質を投与することを含む。ＫＩＴをターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、ＫＩＴを発現する任意のがん、例えば、結腸直腸がん、急性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、黒色腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、腎がん、肝がん及び精巣がんを含む。Ｆ３をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、Ｆ３を発現する任意のがん、例えば、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、膠芽腫、頭頸部がん、肺がん、膵がん、前立腺がん、肉腫及び結腸直腸がんを含む。ＩＧＦ１Ｒをターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、ＩＧＦ１Ｒを発現する任意のがん、例えば、乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肺がん、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、前立腺がん、肉腫、甲状腺がん、腎がん、結腸直腸がん、膵がん、膠芽腫及び肝がんを含む。Ｌｅｗｉｓ  Ｙをターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、Ｌｅｗｉｓ  Ｙを発現する任意のがん、例えば、卵巣がん、肺がん、結腸直腸がん、胃がん、乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、多発性骨髄腫及び急性骨髄性白血病を含む。ＭＵＣ１３をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、ＭＵＣ１３を発現する任意のがん、例えば、卵巣がん、肝がん、肺がん、黒色腫、肝がん、胃がん、膵がん、腎がん、食道がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮頸がん及び胆管癌を含む。ＭＵＣ４をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、ＭＵＣ４を発現する任意のがん、例えば、乳がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、急性リンパ芽球性白血病、膀胱がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、頭頸部がん及び前立腺がんを含む。ＭＣＡＭをターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、ＭＣＡＭを発現する任意のがん、例えば、黒色腫、乳がん、小細胞肺がん、肉腫、結腸直腸がん、膵がん及び腎がんを含む。ＬＲＲＣ３２をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、ＬＲＲＣ３２を発現する任意のがん、例えば、腎がん、膵がん、肉腫、卵巣がん、肺がん、膠芽腫、頭頸部がん、前立腺がん、肝がん、乳がん及び子宮頸がんを含む。シアリルＴｎをターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、シアリルＴｎを発現する任意のがん、例えば、卵巣がん、膵がん、膀胱がん、胃がん、前立腺がん、結腸直腸がん及び乳がんを含む。ｇｐＡ３３をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、ｇｐＡ３３を発現する任意のがん、例えば、結腸直腸がん、胃がん及び食道がんを含む。ＧＤ３をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、ＧＤ３を発現する任意のがん、例えば、肺がん、神経膠腫、乳がん、黒色腫、卵巣がん、膵がん及び神経芽細胞腫を含む。ＧＭ２をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、ＧＭ２を発��する任意のがん、例えば、胃がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、神経芽細胞腫、黒色腫、肺がん、中皮腫及び肝がんを含む。ｃ−ＭＥＴをターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、ｃ−ＭＥＴを発現する任意のがん、例えば、腎がん、甲状腺がん、黒色腫、肺がん、黒色腫、肝がん、膵がん、結腸直腸がん又は頭頸部がんを含む。ＥＰＨＡ３をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、ＥＰＨＡ３を発現する任意のがん、例えば、子宮頸がん、頭頸部がん、胃がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、結腸直腸がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、膵がん、肺がん及び肉腫を含む。ＴＮＦＲＳＦ１０Ａをターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａを発現する任意のがん、例えば、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん及び頭頸部がんを含む。ＴＮＦＳＦ１１をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、ＴＮＦＳＦ１１を発現する任意のがん、例えば、乳がん、前立腺がん及び骨転移性がんを含む。ＣＤ７４をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、ＣＤ７４を発現する任意のがん、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん、Ｂ細胞悪性腫瘍、腎がん、肺がん、卵巣がん、黒色腫、肉腫、頭頸部がん、肝がん、膀胱がん、神経膠腫、乳がん及び白血病を含む。ＰＭＥＬをターゲティングする、多特異性結合性タンパク質を使用して処置されるがんは、ＰＭＥＬを発現する任意のがん、例えば、黒色腫及び肉腫を含む。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ヘテロ二量体の、多特異性抗体、例えば、三特異性結合性タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）を表示する図である。各アームは、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン又はＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に対応する結合性ドメインを表しうる。一部の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインと、腫瘍関連抗原結合性ドメインとは、共通の軽鎖を共有しうる。
【図２Ａ】多特異性結合性タンパク質、例えば、三特異性結合性タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の、５つの例示的なフォーマットを例示する図である。示される通り、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン又は腫瘍関連抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖフォーマット（左アーム）を取りうる。本明細書において、ＮＫＧ２ＤターゲティングｓｃＦｖ、腫瘍関連抗原ターゲティングＦａｂ断片及びヘテロ二量体化抗体定常領域を含有する抗体は、Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴと称される。ある特定の、例示的な多特異性結合性タンパク質において、抗体定常領域上のヘテロ二量体化変異は、１つの定常ドメイン上の、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ；並びに反対側の定常ドメイン上の、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔ（ＣＤドメイン内に、三角形の、鍵と鍵穴形状として示された）を含む。Ｆａｂ断片の、重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインとの間の太線は、ジスルフィド結合を表す。
【図２Ｂ】多特異性結合性タンパク質、例えば、三特異性結合性タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の、５つの例示的なフォーマットを例示する図である。示される通り、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン及び腫瘍関連抗原結合性ドメインのいずれも、ｓｃＦｖフォーマットを取りうる。ある特定の、例示的な多特異性結合性タンパク質において、抗体定常領域上のヘテロ二量体化変異は、１つの定常ドメイン上の、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ；並びに反対側の定常ドメイン上の、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔ（ＣＤドメイン内に、三角形の、鍵と鍵穴形状として示された）を含む。Ｆａｂ断片の、重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインとの間の太線は、ジスルフィド結合を表す。
【図２Ｃ】多特異性結合性タンパク質、例えば、三特異性結合性タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の、５つの例示的なフォーマットを例示する図である。腫瘍関連抗原に結合する、２つの抗原結合性部位及びヘテロ二量体化抗体定常領域へと融合させた、ＮＫＧ２Ｄ結合性部位を含む、３つの抗原結合性部位を伴う抗体についての例示である。本明細書において、これらの抗体フォーマットは、Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴと称される。２つの腫瘍関連抗原結合性部位が、Ｆａｂ断片フォーマットにあり、ＮＫＧ２Ｄ結合性部位が、ｓｃＦｖフォーマットにあることを例示する。ある特定の、例示的な多特異性結合性タンパク質において、抗体定常領域上のヘテロ二量体化変異は、１つの定常ドメイン上の、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ；並びに反対側の定常ドメイン上の、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔ（ＣＤドメイン内に、三角形の、鍵と鍵穴形状として示された）を含む。Ｆａｂ断片の、重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインとの間の太線は、ジスルフィド結合を表す。
【図２Ｄ】多特異性結合性タンパク質、例えば、三特異性結合性タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の、５つの例示的なフォーマットを例示する図である。腫瘍関連抗原に結合する、２つの抗原結合性部位及びヘテロ二量体化抗体定常領域へと融合させた、ＮＫＧ２Ｄ結合性部位を含む、３つの抗原結合性部位を伴う抗体についての例示である。本明細書において、これらの抗体フォーマットは、Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴと称される。腫瘍関連抗原結合性部位が、ｓｃＦｖフォーマットにあり、ＮＫＧ２Ｄ結合性部位が、ｓｃＦｖフォーマットにあることを例示する。ある特定の、例示的な多特異性結合性タンパク質において、抗体定常領域上のヘテロ二量体化変異は、１つの定常ドメイン上の、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ；並びに反対側の定常ドメイン上の、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔ（ＣＤドメイン内に、三角形の、鍵と鍵穴形状として示された）を含む。Ｆａｂ断片の、重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインとの間の太線は、ジスルフィド結合を表す。
【図２Ｅ】多特異性結合性タンパク質、例えば、三特異性結合性タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の、５つの例示的なフォーマットを例示する図である。本明細書において、腫瘍関連抗原ターゲティングｓｃＦｖ、ＮＫＧ２ＤターゲティングＦａｂ断片及びＣＤ１６に結合する、ヘテロ二量体化抗体定常領域／ドメインを含有する抗体は、Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴと称される。腫瘍ターゲティングｓｃＦｖ、ＮＫＧ２ＤターゲティングＦａｂ断片及びＣＤ１６に結合する、ヘテロ二量体化抗体定常領域／ドメイン（「ＣＤドメイン」）を含有する三特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）を表す。本明細書において、これらの抗体フォーマットは、Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴと称される。ある特定の、例示的な多特異性結合性タンパク質において、抗体定常領域上のヘテロ二量体化変異は、１つの定常ドメイン上の、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ；並びに反対側の定常ドメイン上の、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔ（ＣＤドメイン内に、三角形の、鍵と鍵穴形状として示された）を含む。Ｆａｂ断片の、重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインとの間の太線は、ジスルフィド結合を表す。
【図３】ＥＬＩＳＡアッセイにおける、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン（クローンとして列挙された）の、組換えヒトＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性を裏付ける、折れ線グラフである。
【図４】ＥＬＩＳＡアッセイにおける、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン（クローンとして列挙された）の、組換えカニクイザルＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性を裏付ける、折れ線グラフである。
【図５】ＥＬＩＳＡアッセイにおける、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン（クローンとして列挙された）の、組換えマウスＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性を裏付ける、折れ線グラフである。
【図６】平均値蛍光強度（ＭＦＩ）の、バックグラウンドに対する倍数（ＦＯＢ）を示す、フローサイトメトリーにより、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン（クローンとして列挙された）の、ＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞への結合を裏付ける、棒グラフである。
【図７】平均値蛍光強度（ＭＦＩ）の、バックグラウンドに対する倍数（ＦＯＢ）を示す、フローサイトメトリーにより、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン（クローンとして列挙された）の、ＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞への結合を裏付ける、棒グラフである。
【図８】天然リガンドである、ＵＬＢＰ−６との競合により、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン（クローンとして列挙された）の、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対する、特異的結合親和性を裏付ける、折れ線グラフである。
【図９】天然リガンドである、ＭＩＣＡとの競合により、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン（クローンとして列挙された）の、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対する、特異的結合親和性を裏付ける、折れ線グラフである。
【図１０】天然リガンドである、Ｒａｅ−１デルタとの競合により、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン（クローンとして列挙された）の、組換えマウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対する、特異的結合親和性を裏付ける、折れ線グラフである。
【図１１】ヒトＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ−α陽性細胞の百分率を定量することを介して、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン（クローンとして列挙された）による、ヒトＮＫＧ２Ｄの活性化を示す棒グラフである。
【図１２】マウスＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ−α陽性細胞の百分率を定量することを介して、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン（クローンとして列挙された）による、マウスＮＫＧ２Ｄの活性化を示す棒グラフである。
【図１３】ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン（クローンとして列挙された）による、ヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
【図１４】ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン（クローンとして列挙された）による、ヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
【図１５】ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン（クローンとして列挙された）による、マウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
【図１６】ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン（クローンとして列挙された）による、マウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
【図１７】ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン（クローンとして列挙された）の、腫瘍細胞に対する細胞傷害性効果を示す棒グラフである。
【図１８】示差走査蛍光測定により測定された、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン（クローンとして列挙された）の融点を示す棒グラフである。
【図１９Ａ】ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄへの結合を使用する、ＮＫ細胞の相乗的活性化についての棒グラフである。ＣＤ１０７ａのレベルを裏付ける。グラフは、平均値（ｎ＝２）±ＳＤを示す。データは、５例の、異なる健常ドナーを使用する、５つの独立の実験を表す。
【図１９Ｂ】ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄへの結合を使用する、ＮＫ細胞の相乗的活性化についての棒グラフである。ＩＦＮ−γのレベルを裏付ける。グラフは、平均値（ｎ＝２）±ＳＤを示す。データは、５例の、異なる健常ドナーを使用する、５つの独立の実験を表す。
【図１９Ｃ】ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄへの結合を使用する、ＮＫ細胞の相乗的活性化についての棒グラフである。ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γのレベルを裏付ける。グラフは、平均値（ｎ＝２）±ＳＤを示す。データは、５例の、異なる健常ドナーを使用する、５つの独立の実験を表す。
【図２０】ＩｇＧ様形状を維持する、三機能性の、二特異性抗体である、Ｔｒｉｏｍａｂ形態にあるＴｒｉＮＫＥＴを表示する図である。このキメラは、各々、２つの親抗体に由来する、１つの軽鎖及び１つの重鎖を伴う、２つの半抗体からなる。Ｔｒｉｏｍａｂ形態は、ラット抗体の２分の１及びマウス抗体の２分の１を含有する、ヘテロ二量体の構築物でありうる。
【図２１】ＫＩＨ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）技術を伴う、ＫｉＨ共通軽鎖形態にある、ＴｒｉＮＫＥＴを表示する図である。ＫｉＨとは、標的１及び標的２に結合する、２つのＦａｂ断片並びにヘテロ二量体化変異により安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。ＫｉＨフォーマットにあるＴｒｉＮＫＥＴは、２つの異なる重鎖及び両方の重鎖と対合する共通軽鎖を含有する、標的１及び標的２に結合する、２つのＦａｂ断片を伴う、ヘテロ二量体の構築物でありうる。
【図２２】天然に存在する可撓性リンカーを介して、２つのモノクローナル抗体の標的結合性ドメインを組み合わせ、四価のＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））形態にあるＴｒｉＮＫＥＴを表示する図である。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、抗原２をターゲティングする可変ドメインが、抗原１をターゲティングするＦａｂ断片の可変ドメインのＮ末端へと融合させた、ホモ二量体の構築物である。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）形態は、通常のＦｃを含有する。
【図２３】Ｆｃへと融合させた、標的１及び標的２に結合する、２つのＦａｂ断片を含有する、ヘテロ二量体の構築物である、直交型Ｆａｂ界面断片（Ｏｒｔｈｏ−Ｆａｂ）形態にあるＴｒｉＮＫＥＴを表示する図である。軽鎖（ＬＣ）−重鎖（ＨＣ）間対合は、直交界面により確保される。ヘテロ二量体化は、Ｆｃ内の変異により確保される。
【図２４】２イン１のＩｇフォーマットにあるＴｒｉＮＫＥＴを表示する図である。
【図２５】Ｆｃへと融合させた、標的１及び標的２に結合する、２つの異なるＦａｂ断片を含有する、ヘテロ二量体の構築物である、ＥＳ形態にあるＴｒｉＮＫＥＴを表示する図である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃ内の、静電ステアリング型変異により確保される。
【図２６】Ｆａｂアーム交換形態：重鎖及び接合された軽鎖（半分子）を、別の分子に由来する重鎖−軽鎖対とスワッピングすることにより、Ｆａｂ断片アームを交換する結果として、二特異性抗体をもたらす抗体の形態にあるＴｒｉＮＫＥＴを表示する図である。Ｆａｂアーム交換形態（ｃＦａｅ）は、標的１及び標的２に結合する、２つのＦａｂ断片並びにヘテロ二量体化変異により安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。
【図２７】標的１及び標的２に結合する、２つのＦａｂ断片並びにヘテロ二量体化変異により安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である、ＳＥＥＤボディー形態にあるＴｒｉＮＫＥＴを表示する図である。
【図２８】２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するのに、ロイシンジッパーが使用される、ＬｕＺ−Ｙ形態にあるＴｒｉＮＫＥＴを表示する図である。ＬｕＺ−Ｙ形態とは、Ｆｃへと融合させた、標的１及び標的２に結合する、２つの異なるｓｃＦａｂを含有するヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦｃのＣ末端へと融合させた、ロイシンジッパーモチーフを介して確保される。
【図２９】Ｃｏｖ−Ｘボディー形態にあるＴｒｉＮＫＥＴを表示する図である。
【図３０Ａ】ヘテロ二量体化変異により安定化されたＦｃへと融合させた、２つの異なるＦａｂ断片であって、抗原１をターゲティングする、１つのＦａｂ断片が、カッパＬＣを含有し、抗原２をターゲティングする、第２のＦａｂ断片が、ラムダＬＣを含有する、２つの異なるＦａｂ断片を伴う、ヘテロ二量体の構築物である、κλボディー形態にあるＴｒｉＮＫＥＴを表示する図である。κλボディーの１つの形態についての、例示的な表示である。
【図３０Ｂ】ヘテロ二量体化変異により安定化されたＦｃへと融合させた、２つの異なるＦａｂ断片であって、抗原１をターゲティングする、１つのＦａｂ断片が、カッパＬＣを含有し、抗原２をターゲティングする、第２のＦａｂ断片が、ラムダＬＣを含有する、２つの異なるＦａｂ断片を伴う、ヘテロ二量体の構築物である、κλボディー形態にあるＴｒｉＮＫＥＴを表示する図である。別のκλボディーについての、例示的な表示である。
【図３１】それらのいずれもが、Ｆｃドメインへと融合させた、標的１に結合するＦａｂ断片及び標的２に結合するｓｃＦａｂを含む、Ｏａｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体構築物を示す図である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃドメイン内の変異により確保される。
【図３２】抗原１及び抗原２に結合する、２つの異なるＦａｂ断片、並びにヘテロ二量体化変異により安定化されたＦｃを含有する、ヘテロ二量体の構築物である、ＤｕｅｔＭａｂを示す図である。Ｆａｂ断片１及びＦａｂ断片２は、軽鎖と重鎖との適正な対合を確保する、示差的Ｓ−Ｓ架橋を含有する。
【図３３】２つの異なる、標的１及び標的２に結合するＦａｂ断片並びにヘテロ二量体化変異により安定化されたＦｃを伴う、ヘテロ二量体の構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂを示す図である。ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとは切り替えられ、ＶＨドメインとＶＬドメインとは切り替えられる、例えば、ＣＨ１が、ＶＬと直列的に融合される一方、ＣＬは、ＶＨと直列的に融合される。
【図３４】抗原２に結合するＦａｂ断片が、抗原１に結合するＦａｂ断片のＨＣのＮ末端へと融合させた、ホモ二量体の構築物である、Ｆｉｔ−Ｉｇを示す図である。構築物は、野生型Ｆｃを含有する。
【図３５】抗ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体及びｃ−ＭＥＴターゲティングＴｒｉＮＫＥＴの、ｃ−ＭＥＴ陽性ＨＴ２９結腸がん細胞への結合を示す、折れ線グラフである。
【図３６】抗ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体及びｃ−ＭＥＴターゲティングＴｒｉＮＫＥＴの、ｃ−ＭＥＴ陽性ＨＣＴ−１１６結腸がん細胞への結合を示す、折れ線グラフである。
【図３７Ａ】抗ｃ−ＭＥＴ  ｍＡｂ又はｃ−ＭＥＴターゲティングＴｒｉＮＫＥＴの存在下における、３例の、異なる健常ヒトドナーに由来するＮＫ細胞による、ｃ−ＭＥＴを発現するＨＴ２９結腸がん細胞の溶解を示す、折れ線グラフ（図３７Ａは、ドナー１に由来するＮＫ細胞による、ｃ−ＭＥＴを発現するＨＴ２９結腸がん細胞の溶解を示す、折れ線グラフである）である。
【図３７Ｂ】抗ｃ−ＭＥＴ  ｍＡｂ又はｃ−ＭＥＴターゲティングＴｒｉＮＫＥＴの存在下における、３例の、異なる健常ヒトドナーに由来するＮＫ細胞による、ｃ−ＭＥＴを発現するＨＴ２９結腸がん細胞の溶解を示す、折れ線グラフ（図３７Ｂは、ドナー２に由来するＮＫ細胞による、ｃ−ＭＥＴを発現するＨＴ２９結腸がん細胞の溶解を示す、折れ線グラフである）である。
【図３７Ｃ】抗ｃ−ＭＥＴ  ｍＡｂ又はｃ−ＭＥＴターゲティングＴｒｉＮＫＥＴの存在下における、３例の、異なる健常ヒトドナーに由来するＮＫ細胞による、ｃ−ＭＥＴを発現するＨＴ２９結腸がん細胞の溶解を示す、折れ線グラフ（図３７Ｃは、ドナー３に由来するＮＫ細胞による、ｃ−ＭＥＴを発現するＨＴ２９結腸がん細胞の溶解を示す、折れ線グラフである）である。
【図３８】抗ｃ−ＭＥＴ  ｍＡｂ又はｃ−ＭＥＴターゲティングＴｒｉＮＫＥＴの存在下における、ＮＫ細胞による、ｃ−ＭＥＴ陽性ＨＣＴ−１１６結腸がん細胞の溶解を示す、折れ線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体並びにＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する多特異性結合性タンパク質を提供する。一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原又は別の腫瘍関連抗原に結合する、追加の抗原結合性部位をさらに含む。本発明はまた、このような多特異性結合性タンパク質を含む医薬組成物並びにこのような多特異性タンパク質及び医薬組成物を、がんの処置などの目的のために使用する治療法も提供する。
【００９６】
本発明はまた、ヒンジ配列を介して、抗体の定常ドメインへと連結されている単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）上の改善も提供する。ヒンジ配列は、ｓｃＦｖの、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原への結合の可撓性をもたらす。本発明はまた、ｓｃＦｖのうちの１つ以上を含む多特異性結合性タンパク質も提供するが、この場合、多特異性結合性タンパク質は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体並びにＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する。本発明はまた、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される同じ腫瘍関連抗原に結合する２つの腫瘍関連抗原結合性部位を含有し、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に結合する多特異性結合性タンパク質も提供する。このような多特異性結合性タンパク質を含む医薬組成物並びにこのような多特異性タンパク質及び医薬組成物を、がんの処置などの目的のために使用する治療法もまた提供される。
【００９７】
下記の節において、本発明の多様な態様が示されるが、１つの特定の節において記載された本発明の態様は、いかなる特定の節にも限定されない。
【００９８】
本発明の理解を容易とするために、下記において、多数の用語及び語句が規定される。
【００９９】
本明細書において使用された「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」という用語は、「１つ以上の」を意味し、文脈が不適切でない限りにおいて、複数形を含む。
【０１００】
本明細書で使用された、「抗原結合性部位」という用語は、抗原への結合に参与する免疫グロブリン分子の一部を指す。ヒト抗体において、抗原結合性部位は、重（「Ｈ」）鎖及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基により形成される。重鎖及び軽鎖のＶ領域内の、３つの高度に多様なストレッチは、「超可変領域」と称され、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」として公知である、これらを挟むより保存的なストレッチの間に介在する。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間に、天然に見出され、これと隣接して、天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域と、重鎖の３つの超可変領域とは、三次元空間内において、抗原結合性表面を形成するように、互いに対して配置される。抗原結合性表面は、結合した抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の、３つずつの超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と称される。ラクダ及び軟骨魚類など、ある特定の動物において、抗原結合性部位は、「単一ドメイン抗体」をもたらす、単一の抗体鎖により形成される。抗原結合性部位は、無傷抗体、抗原結合性表面を保持する、抗体の抗原結合性断片又はペプチドリンカーを使用して、重鎖可変ドメインを、単一のポリペプチド内において、軽鎖可変ドメインへと接続する、ｓｃＦｖなどの組換えポリペプチドにおいて存在しうる。
【０１０１】
本明細書で使用された「腫瘍関連抗原」という用語は、がんと関連する、タンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、脂質を含むがこれらに限定されない、任意の抗原を意味する。このような抗原は、悪性細胞上において発現される場合もあり、腫瘍関連血管上、細胞外マトリックス上、間葉間質上若しくは免疫浸潤物上など、腫瘍微小環境内において発現される場合もある。
【０１０２】
本明細書で使用された、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において記載された方法及び組成物により処置される生物を指す。このような生物は、好ましくは、哺乳動物（例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）を含むがこれらに限定されず、より好ましくは、ヒトを含む。
【０１０３】
本明細書で使用された、「有効量」という用語は、有益な結果又は所望の結果をもたらすのに十分な、化合物（例えば、本発明の化合物）の量を指す。有効量は、１回以上の投与、塗布又は投薬により投与される場合があり、特定の製剤又は投与経路に限定されることが意図されない。本明細書で使用された、「〜を処置する」という用語は、状態、疾患、障害などの改善を結果としてもたらす、又はこれらの症状を改善する、任意の効果、例えば、これらを減少させる、軽減する、モジュレートする、改善する、又は消失させることを含む。
【０１０４】
本明細書で使用された、「医薬組成物」という用語は、組成物を、とりわけ、インビボ又はエクスビボにおける、診断的使用又は治療的使用に適するようにする、不活性又は活性の担体との、活性薬剤の組合せを指す。
【０１０５】
本明細書で使用された、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩液溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン又は水／油エマルジョンなど）及び多様な種類の保湿剤など、標準的な医薬担体のうちのいずれかを指す。組成物はまた、安定化剤及び保存剤も含みうる。担体、安定化剤及びアジュバントの例について、例えば、Ｍａｒｔｉｎ、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ［１９７５］を参照されたい。
【０１０６】
本明細書で使用された、「薬学的に許容される塩」という用語は、対象へと投与されると、本発明の化合物又はその活性代謝物若しくは残留物をもたらすことが可能な、本発明の化合物の、任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸又は塩基）を指す。当業者に公知の通り、本発明の化合物の「塩」は、無機又は有機の酸及び塩基に由来しうる。例示的な酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などを含むがこれらに限定されない。シュウ酸など、他の酸は、それ自体は薬学的に許容されないが、本発明の化合物及びこれらの薬学的に許容される酸付加塩を得るときに、中間体として有用な塩の調製において用いられる場合がある。
【０１０７】
例示的な塩基は、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア及び式ＮＷ４＋［式中、Ｗは、Ｃ１〜４アルキルである］などの化合物を含むがこれらに限定されない。
【０１０８】
例示的な塩は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などを含むがこれらに限定されない。塩の他の例は、Ｎａ＋、ＮＨ４＋及びＮＷ４＋［式中、Ｗは、Ｃ１〜４アルキルである］など、適切なカチオンと合わせた、本発明の化合物のアニオンを含む。
【０１０９】
治療的使用のために、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されると想定される。しかし、薬学的に許容されない酸及び塩基による塩もまた、例えば、薬学的に許容される化合物の調製又は精製において、使用されうる。
【０１１０】
本明細書で使用された「ＫＩＴ」（また、ＰＢＴ、ＳＣＦＲ、Ｃ−ＫｉＴ、ＣＤ１１７及びＭＡＳＴＣとしても公知である）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ１０７２１及び類縁のアイソフォームのタンパク質を指す。
【０１１１】
本明細書で使用された「Ｆ３」（また、ＴＦ；ＴＦＡ及びＣＤ１４２としても公知である）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ１３７２６及び類縁のアイソフォームのタンパク質を指す。
【０１１２】
本明細書で使用された「ＩＧＦ１Ｒ」（また、ＩＧＦＲ；ＣＤ２２１；ＩＧＦＩＲ；ＪＴＫ１３としても公知である）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ０８０６９及び類縁のアイソフォームのタンパク質を指す。
【０１１３】
本明細書で使用された「Ｌｅｗｉｓ  Ｙ」（また、Ｌｅ（ｙ）；Ｌｅｗｉｓ  ｙ四糖；Ｆｕｃアルファ１−３（Ｆｕｃアルファ１−２Ｇａｌベータ１−４）ＧｃｌＮＡｃ；ＣＨＥＢＬ５９０４５及びＦｕｃアルファ１−２Ｇａｌベータ１−４（Ｆｕｃアルファ１−３）としても公知である）は、ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：４５２６６９０８のＬｅｗｉｓ  Ｙ炭水化物及び類縁の変異体を指す。
【０１１４】
本明細書で使用された「ＭＵＣ１３」（また、ＤＲＣＣ１及びＭＵＣ−１３としても公知である）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９Ｈ３Ｒ２及び類縁のアイソフォームのタンパク質を指す。
【０１１５】
本明細書で使用された「ＭＵＣ４」（また、ＡＳＧＰ；ＭＵＣ−４及びＨＳＡ２７６３５９としても公知である）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９９１０２及び類縁のアイソフォームのタンパク質を指す。
【０１１６】
本明細書で使用された「ＭＣＡＭ」（また、ＣＤ１４６及びＭＵＣ１８としても公知である）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ４３１２１及び類縁のアイソフォームのタンパク質を指す。
【０１１７】
本明細書で使用された「ＬＲＲＣ３２」（また、Ｄ１１Ｓ８３３Ｅ及びＧＡＲＰとしても公知である）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ１４３９２及び類縁のアイソフォームのタンパク質を指す。
【０１１８】
本明細書で使用された「シアリルＴｎ」（また、Ｔｎ抗原、ＮｅｕＡｃ（アルファ→６）ＧａｌＮＡｃ（アルファ１→０）Ｓｅｒ、Ａａｎｄｇｓ、３−Ｏ−（２−アセトアミド−６−０−（Ｎ−アセチルノイラミニル）−２−デオキシガラクトシル）セリン、１１４６６１−０１−７、Ｏ−［Ｎ−アセチル−アルファ−ノイラミニル−（２→６）−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−ガラクトサミニル］−Ｌ−セリン、Ｏ−［（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−アルファ−Ｄ−ガラクト−ノヌロピラノシル酸）−（２→６）−２−アセトアミド−２−デオキシ−アルファ−Ｄ−ガラクトピラノシル］−Ｌ−セリン、ＡＣ１Ｌ４ＺＦＬ、ＣＨＥＢＩ：５３６１０及びＺＩＮＣ７７３１３１１３としても公知である）は、ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：１９５１０３及び類縁の変異体の化合物を指す。
【０１１９】
本明細書で使用された「ｇｐＡ３３」（また、Ａ３３としても公知である）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９９７９５及び類縁のアイソフォームのタンパク質を指す。
【０１２０】
本明細書で使用された「ＧＤ３」（また、ガングリオシドＧＤ３（ｄ１８：１／１６：０）及びＣＨＥＢＩ：８９６３６としても公知である）は、ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：２００５７３２３及び類縁の変異体のガングリオシドを指す。
【０１２１】
本明細書で使用された「ＧＭ２」（また、Ｇ（Ｍ２）ガングリオシド、ガングリオシドＧＭ２、ＧＭ２脂質、ＣＨＥＢＩ：６０３２７、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−３−ヒドロキシ−２−（オクタデカノイルアミノ）オクタデク−４−エン−１−イル  ２−アセトアミド−２−デオキシ−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−［５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−アルファ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−ウロピラノノシル−（２→３）］−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、ベータ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−（１→４）−［アルファ−Ｎｅｕ５Ａｃ−（２→３）］−ベータ−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４）−ベータ−Ｄ−Ｇｌｃ−（１←→１）−Ｎ−オクタデカノイルスフィンゴシン、Ｇ（Ｍ２）ガングリオシド、ＧＭ２ガングリオシド、モノシアロガングリオシドＧＭ２、エピトープＩＤ：１３９９７２及びガングリオシドＧＭ２（１８：１／１８：０）としても公知である）は、ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：９８９８６３５及び類縁の変異体のタンパク質を指す。
【０１２２】
本明細書で使用された「ｃ−ＭＥＴ」（また、ＨＧＦＲ；ＡＵＴＳ９；ＲＣＣＰ２及びｃ−Ｍｅｔ；ＤＦＮＢ９７としても公知である）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ０８５８１及び類縁のアイソフォームのタンパク質を指す。
【０１２３】
本明細書で使用された「ＥＰＨＡ３」（また、ＥＫ４；ＥＴＫ；ＨＥＫ；ＥＴＫ１；ＨＥＫ４及びＴＹＲ０４としても公知である）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ２９３２０及び類縁のアイソフォームのタンパク質を指す。
【０１２４】
本明細書で使用された「ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ」（また、ＤＲ４；ＡＰ０２；ＣＤ２６１；ＴＲＡＩＬＲ１及びＴＲＡＩＬＲ−１としても公知である）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｏ００２２０及び類縁のアイソフォームのタンパク質を指す。
【０１２５】
本明細書で使用された「ＴＮＦＳＦ１１」（また、ＯＤＦ；ＯＰＧＬ；ｓＯｄｆ；ＣＤ２５４；ＯＰＴＢ２；ＲＡＮＫＬ；ＴＮＬＧ６Ｂ；ＴＲＡＮＣＥ及びｈＲＡＮＫＬ２としても公知である）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｏ１４７８８及び類縁のアイソフォームのタンパク質を指す。
【０１２６】
本明細書で使用された「ＣＤ７４」（また、Ｉｉ；ＣＬＩＰ；ＤＨＬＡＧ；ＨＬＡＤＧ及びＩａ−ガンマとしても公知である）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ０４２３３及び類縁のアイソフォームのタンパク質を指す。
【０１２７】
本明細書で使用された「ＰＭＥＬ」（また、メラノソームタンパク質；Ｐ１；ＳＩ；ＳＩＬ；ＭＥ２０；Ｐ１００；ＳＩＬＶ；ＭＥ２０Ｍ；ｇｐ１００；ＭＥ２０−Ｍ；ＰＭＥＬ１７及びＤ１２Ｓ５３Ｅとしても公知である）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ４０９６７及び類縁のアイソフォームのタンパク質を指す。
【０１２８】
組成物が、具体的構成要素を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）若しくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）ものとして記載される、又は工程及び方法が、具体的ステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）若しくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）ものとして記載される記載を通して、加えて、列挙された構成要素から本質的になる、又はこれらからなる、本発明の組成物も存在し、列挙された処理ステップから本質的になる、又はこれらからなる、本発明に従う工程及び方法も存在することが想定される。
【０１２９】
一般的な主題として、百分率を指定する組成物は、そうでないことが明記されない限りにおいて、重量により指定する。さらに、変数が定義を伴わない場合、先行する変数の定義に従う。
【０１３０】
Ｉ．タンパク質
本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体並びにＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する多特異性結合性タンパク質を提供する。多特異性結合性タンパク質は、本明細書において記載された医薬組成物及び治療法において有用である。多特異性結合性タンパク質の、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体への結合は、ナチュラルキラー細胞の活性を、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の破壊に向けて増強する。多特異性結合性タンパク質の、腫瘍関連抗原発現細胞への結合は、がん細胞を、ナチュラルキラー細胞と近接させることから、ナチュラルキラー細胞による、がん細胞の、直接的な破壊及び間接的な破壊を容易とする。一部の例示的な多特異性結合性タンパク質についてのさらなる記載は、下記において提示される。
【０１３１】
多特異性結合性タンパク質の第１の構成要素は、ＮＫ細胞、γδ  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  αβ  Ｔ細胞を含みうるがこれらに限定されない、ＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合する。ＮＫＧ２Ｄに結合すると、多特異性結合性タンパク質は、ＵＬＢＰ６及びＭＩＣＡなどの天然リガンドが、ＮＫＧ２Ｄに結合することを遮断し、ＮＫ細胞を活性化しうる。
【０１３２】
多特異性結合性タンパク質の第２の構成要素は、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する。腫瘍関連抗原発現細胞は、白血病、例えば、急性骨髄性白血病及びＴ細胞白血病において見出されうる。腫瘍関連抗原発現細胞は、例えば、結腸直腸がん、消化管間質腫瘍、黒色腫、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、腎がん、肝がん、精巣がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、子宮がん、神経膠腫、膠芽腫、神経芽細胞腫、頭頸部がん、肺がん、膵がん、前立腺がん、肉腫、中皮腫、卵巣がん、甲状腺がん、胃がん、多発性骨髄腫、食道がん、胆管癌、急性リンパ芽球性白血病、骨転移性がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん及びＢ細胞悪性腫瘍であるがこれらに限定されない、他のがん及び腫瘍の種類と関連して見出されうる。ＫＩＴを発現する細胞は、例えば、結腸直腸がん、急性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、黒色腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、腎がん、肝がん及び精巣がんにおいて見出されうる。Ｆ３を発現する細胞は、例えば、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、膠芽腫、頭頸部がん、肺がん、膵がん、前立腺がん、肉腫及び結腸直腸がんにおいて見出されうる。ＩＧＦ１Ｒを発現する細胞は、例えば、乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肺がん、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、前立腺がん、肉腫、甲状腺がん、腎がん、結腸直腸がん、膵がん、膠芽腫及び肝がんにおいて見出されうる。Ｌｅｗｉｓ  Ｙを発現する細胞は、例えば、卵巣がん、肺がん、結腸直腸がん、胃がん、乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、多発性骨髄腫及び急性骨髄性白血病において見出されうる。ＭＵＣ１３を発現する細胞は、例えば、卵巣がん、肝がん、肺がん、黒色腫、肝がん、胃がん、膵がん、腎がん、食道がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮頸がん及び胆管癌において見出されうる。ＭＵＣ４を発現する細胞は、例えば、乳がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、急性リンパ芽球性白血病、膀胱がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、頭頸部がん及び前立腺がんにおいて見出されうる。ＭＣＡＭを発現する細胞は、例えば、黒色腫、乳がん、小細胞肺がん、肉腫、結腸直腸がん、膵がん及び腎がんにおいて見出されうる。ＬＲＲＣ３２を発現する細胞は、例えば、腎がん、膵がん、肉腫、卵巣がん、肺がん、膠芽腫、頭頸部がん、前立腺がん、肝がん、乳がん及び子宮頸がんにおいて見出されうる。シアリルＴｎを発現する細胞は、例えば、卵巣がん、膵がん、膀胱がん、胃がん、前立腺がん、結腸直腸がん及び乳がんにおいて見出されうる。ｇｐＡ３３を発現する細胞は、例えば、結腸直腸がん、胃がん及び食道がんにおいて見出されうる。ＧＤ３を発現する細胞は、例えば、肺がん、神経膠腫、乳がん、黒色腫、卵巣がん、膵がん及び神経芽細胞腫において見出されうる。ＧＭ２を発現する細胞は、例えば、胃がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、神経芽細胞腫、黒色腫、肺がん、中皮腫及び肝がんにおいて見出されうる。ｃ−ＭＥＴを発現する細胞は、例えば、腎がん、甲状腺がん、黒色腫��肺がん、黒色腫、肝がん、膵がん、結腸直腸がん又は頭頸部がんにおいて見出されうる。ＥＰＨＡ３を発現する細胞は、例えば、子宮頸がん、頭頸部がん、胃がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、結腸直腸がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、膵がん、肺がん及び肉腫において見出されうる。ＴＮＦＲＳＦ１０Ａを発現する細胞は、例えば、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん及び頭頸部がんにおいて見出されうる。ＴＮＦＳＦ１１を発現する細胞は、例えば、乳がん、前立腺がん及び骨転移性がんにおいて見出されうる。ＣＤ７４を発現する細胞は、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん、Ｂ細胞悪性腫瘍、腎がん、肺がん、卵巣がん、黒色腫、肉腫、頭頸部がん、肝がん、膀胱がん、神経膠腫、乳がん及び白血病において見出されうる。ＰＭＥＬを発現する細胞は、例えば、黒色腫及び肉腫において見出されうる。
【０１３３】
多特異性結合性タンパク質の第３の構成要素は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞及び濾胞樹状細胞を含む白血球の表面上において、Ｆｃ受容体である、ＣＤ１６を発現する細胞に結合する。
【０１３４】
本明細書において記載された多特異性結合性タンパク質は、多様なフォーマットを取りうる。例えば、１つのフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖を含む、ヘテロ二量体の、多特異性抗体である（図１）。第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第１の重鎖可変ドメインを含み、任意選択的に、第１のＣＨ１重鎖ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の軽鎖可変ドメインを含み、任意選択的に、第１の軽鎖定常ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と併せて、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合性部位を形成する。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第２の重鎖可変ドメインを含み、任意選択的に、第２のＣＨ１重鎖ドメインを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の軽鎖可変ドメインを含み、任意選択的に、第２の軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン重鎖と併せて、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する抗原結合性部位を形成する。第１のＦｃドメインと、第２のＦｃドメインとは、併せて、ＣＤ１６に結合することが可能である（図１）。一部の実施形態において、第１の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン軽鎖と同一である。
【０１３５】
別の例示的なフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含む、ヘテロ二量体の、多特異性抗体を伴う（図２Ａ）。第１の免疫グロブリン重鎖は、リンカー又は抗体のヒンジを介して、ＮＫＧ２Ｄと対合し、これに結合する、又はＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインから構成された、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）へと融合させた、第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第２の重鎖可変ドメイン及びＣＨ１重鎖ドメインを含む。免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン軽鎖と対合し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、又はＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する。第１のＦｃドメインと、第２のＦｃドメインとは、併せて、ＣＤ１６に結合することが可能である（図２Ａ）。
【０１３６】
別の例示的なフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン重鎖を含む、ヘテロ二量体の、多特異性抗体を伴う（図２Ｂ）。第１の免疫グロブリン重鎖は、リンカー又は抗体のヒンジを介して、ＮＫＧ２Ｄと対合し、これに結合する、又はＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインから構成された、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）へと融合させた、第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、リンカー又は抗体のヒンジを介して、ＮＫＧ２Ｄと対合し、これに結合する、又はＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインから構成された、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）へと融合させた、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを含む。第１のＦｃドメインと、第２のＦｃドメインとは、併せて、ＣＤ１６に結合することが可能である（図２Ｂ）。
【０１３７】
一部の実施形態において、上記において記載された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、ヒンジ配列を介して、抗体の定常ドメインへと連結されている。一部の実施形態において、ヒンジは、アミノ酸である、Ａｌａ−Ｓｅｒを含む。他の一部の実施形態において、ヒンジは、アミノ酸である、Ａｌａ−Ｓｅｒ及びＴｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙを含む。ヒンジ配列は、標的抗原への結合の可撓性及び可撓性と最適の形状との均衡をもたらしうる。
【０１３８】
一部の実施形態において、上記において記載された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態において、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成して、ｓｃＦｖの安定性を増強する。例えば、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４残基と、軽鎖可変ドメインＣ１００残基との間の、Ｋａｂａｔ下において番号付けされたアミノ酸位置に形成されうる。一部の実施形態において、重鎖可変ドメインは、可撓性リンカーを介して、軽鎖可変ドメインへと連結されている。任意の適切なリンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）４リンカーが使用されうる。ｓｃＦｖについての、一部の実施形態において、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＮ末端に位置する。ｓｃＦｖについての、一部の実施形態において、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する。
【０１３９】
本明細書において記載された多特異性結合性タンパク質は、１つ以上の、追加の抗原結合性部位をさらに含みうる。追加の抗原結合性部位（複数可）は、任意選択的に、リンカー配列を介して、定常領域のＣＨ２ドメインのＮ末端へと融合される場合もあり、定常領域のＣＨ３ドメインのＣ末端へと融合される場合もある。ある特定の実施形態において、追加の抗原結合性部位（複数可）は、任意選択的に、ジスルフィドにより安定化される結果として、四価又は三価の多特異性結合性タンパク質をもたらす、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）の形態を取る。例えば、多特異性結合性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合性部位、腫瘍関連抗原が、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原結合性部位、腫瘍関連抗原に結合する第３の抗原結合性部位、並びにＣＤ１６に結合するのに十分な、抗体の定常領域若しくはその部分、又はＣＤ１６に結合する第４の抗原結合性部位を含む。これらの抗原結合性部位のうちのいずれか１つは、Ｆａｂ断片又は上記において記載されたｓｃＦｖなどのｓｃＦｖの形態を取りうる。
【０１４０】
一部の実施形態において、第３の抗原結合性部位は、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する腫瘍関連抗原結合性部位と異なる腫瘍関連抗原に結合する。一部の実施形態において、第３の抗原結合性部位は、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する腫瘍関連抗原結合性部位と同じ腫瘍関連抗原に結合する。一部の実施形態において、第３の抗原結合性部位は、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する腫瘍関連抗原結合性部位と同じ、重鎖ＣＤＲ配列及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、第３の抗原結合性部位は、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する腫瘍関連抗原結合性部位と同じ、重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。一部の実施形態において、第３の抗原結合性部位は、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する腫瘍関連抗原結合性部位と同じ、アミノ酸配列（複数可）を有する。例示的なフォーマットは、図２Ｃ及び２Ｄに示される。したがって、多特異性結合性タンパク質は、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原の、二価のエンゲージメントをもたらしうる。多特異性タンパク質による、腫瘍関連抗原の、二価のエンゲージメントは、がん細胞表面上の腫瘍関連抗原を安定化させ、ＮＫ細胞の、がん細胞に対する、細胞傷害作用を増強する。多特異性タンパク質による、腫瘍関連抗原の、二価のエンゲージメントは、多特異性タンパク質の、がん細胞への、より強い結合を付与し、これにより、ＮＫ細胞の、がん細胞に対する、より強力な細胞傷害性応答、とりわけ、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥ���から選択される低レベルの腫瘍関連抗原を発現するがん細胞に対する、より強力な細胞傷害性応答を容易とする。
【０１４１】
多特異性結合性タンパク質は、さらなるフォーマットを取りうる。一部の実施形態において、多特異性結合性タンパク質は、ＩｇＧ様形状を維持する、三機能性の、二特異性抗体である、Ｔｒｉｏｍａｂ形態にある。このキメラは、各々、２つの親抗体に由来する、１つの軽鎖及び１つの重鎖を伴う、２つの半抗体からなる。
【０１４２】
一部の実施形態において、多特異性結合性タンパク質は、ＫｉＨ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）技術を伴う、ＫｉＨ形態である。ＫｉＨは、ヘテロ二量体化を促進するように、ＣＨ３ドメインを操作して、各重鎖内の「ノブ」又は「ホール」を創出することを伴う。「ＫｉＨ（Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ）」Ｆｃ技術の背後にある概念は、１つのＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）内に、小型の残基の、バルク残基による置換（例えば、ＥＵ番号付けにおける、Ｔ３６６ＷＣＨ３Ａ）を介して、「ノブ」を導入することであった。「ノブ」を収容するために、ノブに最も近接する近傍残基を、小型の残基により置きかえること（例えば、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７ＶＣＨ３Ｂ）により、相補的な「ホール」表面を、他のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）上に創出した。「ホール」変異は、構造化誘導型ファージライブラリースクリーニング（Ａｔｗｅｌｌ  Ｓ、Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．、Ｓｔａｂｌｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｏｆ  ａ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）、２７０（１）：２６〜３５）により最適化された。ＫｉＨ  Ｆｃ変異体のＸ線結晶構造（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＪＭ、Ｕｌｔｓｃｈ  Ｍ、Ｌｅｅ  Ｊ、Ｔｏｎｇ  Ｒ、Ｔａｋｅｄａ  Ｋ、Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃら、Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｎｏｂ  ａｎｄ  ｈｏｌｅ  ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ＣＨ２−ＣＨ３  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１４）、４２６（９）：１９４７〜５７；Ｍｉｍｏｔｏ  Ｆ、Ｋａｄｏｎｏ  Ｓ、Ｋａｔａｄａ  Ｈ、Ｉｇａｗａ  Ｔ、Ｋａｍｉｋａｗａ  Ｔ、Ｈａｔｔｏｒｉ  Ｋ、Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｃ  ｖａｒｉａｎｔ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ＦｃγＲｓ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１４）、５８（１）：１３２〜８）は、ヘテロ二量体化が、ＣＨ３ドメイン間のコア界面における立体的相補性により駆動される疎水性相互作用により熱力学的に優先されるのに対し、ノブ−ノブ界面及びホール−ホール界面は、それぞれ、立体障害及び好適な相互作用の破壊のために、ホモ二量体化を優先しないことを裏付けた。
【０１４３】
一部の実施形態において、多特異性結合性タンパク質は、天然に存在する可撓性リンカーを介して、２つのモノクローナル抗体の標的結合性ドメインを組み合わせ、四価のＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））形態にある。
【０１４４】
一部の実施形態において、多特異性結合性タンパク質は、直交型Ｆａｂ界面（Ｏｒｔｈｏ−Ｆａｂ）形態にある。ｏｒｔｈｏ−Ｆａｂ  ＩｇＧ法（Ｌｅｗｉｓ  ＳＭ、Ｗｕ  Ｘ、Ｐｕｓｔｉｌｎｉｋ  Ａ、Ｓｅｒｅｎｏ  Ａ、Ｈｕａｎｇ  Ｆ、Ｒｉｃｋ  ＨＬら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｆａｂ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）、３２（２）：１９１〜８）では、構造ベースの領域デザインは、一方のＦａｂ断片だけにおいて、ＬＣとＨＣＶＨ−ＣＨ１との界面に、相補性変異を導入するが、他方のＦａｂ断片への変化を施さない。
【０１４５】
一部の実施形態において、多特異性結合性タンパク質は、２イン１のＩｇフォーマットにある。一部の実施形態において、多特異性結合性タンパク質は、Ｆｃへと融合させた、標的１及び標的２に結合する、２つの異なるＦａｂ断片を含有する、ヘテロ二量体の構築物である、ＥＳ形態にある。ヘテロ二量体化は、Ｆｃ内の、静電ステアリング型変異により確保される。
【０１４６】
一部の実施形態において、多特異性結合性タンパク質は、ヘテロ二量体化変異により安定化されたＦｃへと融合させた、２つの異なるＦａｂ断片であって、抗原１をターゲティングする、Ｆａｂ断片１が、カッパＬＣを含有する一方、抗原２をターゲティングする、第２のＦａｂ断片が、ラムダＬＣを含有する、２つの異なるＦａｂ断片を伴うヘテロ二量体の構築物であるκλボディー形態にある。図３０Ａは、κλボディーの１つの形態についての、例示的な表示であり；図３０Ｂは、別のκλボディーについての、例示的な表示である。
【０１４７】
一部の実施形態において、多特異性結合性タンパク質は、Ｆａｂアーム交換形態（重鎖及び接合された軽鎖（半分子）を、別の分子に由来する重鎖−軽鎖対とスワッピングすることにより、Ｆａｂ断片アームを交換する結果として、二特異性抗体をもたらす抗体）にある。
【０１４８】
一部の実施形態において、多特異性結合性タンパク質は、ＳＥＥＤボディー形態にある。鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）プラットフォームは、非対称であり二特異性である抗体様分子を作出するためにデザインされた。これにより、天然抗体の治療適用を拡大することができる。このタンパク質操作プラットフォームは、保存的ＣＨ３ドメイン内において、免疫グロブリンの、構造的に類縁の配列を交換することに基づく。ＳＥＥＤデザインは、ｈＩｇＡ−ｈＩｇＧ  ＳＥＥＤ  ＣＨ３ドメイン及びｈＩｇＧ−ｈＩｇＡ  ＳＥＥＤ  ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避しながら、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の、効率的な作出を可能とする（Ｍｕｄａ  Ｍ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１１）、２４（５）：４４７〜５４）。
【０１４９】
一部の実施形態において、多特異性結合性タンパク質は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するのに、ロイシンジッパーが使用される、ＬｕＺ−Ｙ形態にある（Ｗｒａｎｉｋ，ＢＪ．ら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１２）、２８７：４３３３１〜９）。
【０１５０】
一部の実施形態において、多特異性結合性タンパク質は、Ｃｏｖ−Ｘボディー形態にある。二特異性Ｃｏｖ−Ｘボディーにおいて、２つの異なるペプチドは、分枝状アゼチジノンリンカーを使用して、一体に接合され、穏和な条件下において、足場抗体へと、部位特異的に融合される。薬理作用団が、機能活性の一因となるのに対し、抗体の足場は、半減期の延長及びＩｇ様分布を付与する。薬理作用団は、最適化された、又は固有の二特異性抗体を作出するように、化学的に最適化される場合もあり、他の薬理作用団により置きかえられる場合もある（Ｄｏｐｐａｌａｐｕｄｉ  ＶＲら、ＰＮＡＳ（２０１０）、１０７（５２）；２２６１１〜２２６１６）。
【０１５１】
一部の実施形態において、多特異性結合性タンパク質は、Ｆｃへと融合させた、標的１に結合するＦａｂ断片及び標的２に結合するｓｃＦａｂを含む、Ｏａｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体形態にある。ヘテロ二量体化は、Ｆｃ内の変異により確保される。
【０１５２】
一部の実施形態において、多特異性結合性タンパク質は、抗原１及び抗原２に結合する、２つの異なるＦａｂ断片、並びにヘテロ二量体化変異により安定化されたＦｃを含有する、ヘテロ二量体の構築物である、ＤｕｅｔＭａｂ形態にある。Ｆａｂ断片１及びＦａｂ断片２は、ＬＣとＨＣとの適正な対合を確保する、示差的Ｓ−Ｓ架橋を含有する。
【０１５３】
一部の実施形態において、多特異性結合性タンパク質は、２つの異なる、標的１及び標的２に結合するＦａｂ断片が、ヘテロ二量体化により安定化されたＦｃへと融合させた、ヘテロ二量体の構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂ形態にある。ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとは切り替えられ、ＶＨドメインとＶＬドメインとは切り替えられる、例えば、ＣＨ１が、ＶＬとインフレームに融合される一方、ＣＬは、ＶＨとインフレームに融合される。
【０１５４】
一部の実施形態において、多特異性結合性タンパク質は、抗原２に結合するＦａｂ断片が、抗原１に結合するＦａｂ断片のＨＣのＮ末端へと融合させた、ホモ二量体の構築物である、Ｆｉｔ−Ｉｇ形態にある。構築物は、野生型Ｆｃを含有する。
【０１５５】
表１は、組合せにより、ＮＫＧ２Ｄに結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列挙する。ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに対する、これらの結合親和性が変動しうるが、それにもかかわらず、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインは、全てが、ヒトＮＫ細胞を活性化する。
【０１５６】
【表１】
2021533159.tif 000003
2021533159.tif 000004
2021533159.tif 000005
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2021533159.tif 000014
2021533159.tif 000015
【０１５７】
代替的に、配列番号１０１により表された重鎖可変ドメインは、配列番号１０２により表された軽鎖可変ドメインと対合して、ＵＳ９，２７３，１３６において例示された、ＮＫＧ２Ｄに結合しうる抗原結合性部位を形成しうる。
【０１５８】
【化１】
2021533159.tif 000016
【０１５９】
【化２】
2021533159.tif 000017
【０１６０】
代替的に、配列番号１０３により表された重鎖可変ドメインは、配列番号１０４により表された軽鎖可変ドメインと対合して、ＵＳ７，８７９，９８５において例示された、ＮＫＧ２Ｄに結合しうる抗原結合性部位を形成しうる。
【０１６１】
【化３】
2021533159.tif 000018
【０１６２】
【化４】
2021533159.tif 000019
【０１６３】
一態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるＫＩＴに結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表２は、組合せにより、ＫＩＴに結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０１６４】
【表２】
2021533159.tif 000020
【０１６５】
代替的に、ＫＩＴに結合しうる、新規の抗原結合性部位は、配列番号１２５又はその成熟細胞外断片により規定されたアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０１６６】
【化５】
2021533159.tif 000021
【０１６７】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるＦ３に結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表３は、組合せにより、Ｆ３に結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０１６８】
【表３】
2021533159.tif 000022
2021533159.tif 000023
【０１６９】
代替的に、Ｆ３に結合しうる、新規の抗原結合性部位は、配列番号１４８又はその成熟細胞外断片により規定されたアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０１７０】
【化６】
2021533159.tif 000024
【０１７１】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるＩＧＦ１Ｒに結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表４は、組合せにより、ＩＧＦ１Ｒに結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０１７２】
【表４】
2021533159.tif 000025
2021533159.tif 000026
【０１７３】
代替的に、ＩＧＦ１Ｒに結合しうる、新規の抗原結合性部位は、配列番号１６５又はその成熟細胞外断片により規定されたアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０１７４】
【化７】
2021533159.tif 000027
【０１７５】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるＬｅｗｉｓ  Ｙに結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表５は、組合せにより、Ｌｅｗｉｓ  Ｙに結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０１７６】
【表５】
2021533159.tif 000028
2021533159.tif 000029
【０１７７】
代替的に、Ｌｅｗｉｓ  Ｙに結合しうる、新規の抗原結合性部位は、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ抗原又はその成熟細胞外断片への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０１７８】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるＭＵＣ１３に結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表６は、組合せにより、ＭＵＣ１３に結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０１７９】
【表６】
2021533159.tif 000030
【０１８０】
代替的に、ＭＵＣ１３に結合しうる、新規の抗原結合性部位は、配列番号１９０又はその成熟細胞外断片により規定されたアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０１８１】
【化８】
2021533159.tif 000031
【０１８２】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるＭＵＣ４に結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。ＭＵＣ４に結合しうる、新規の抗原結合性部位は、配列番号１９１又はその成熟細胞外断片により規定されたアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定されうる。
【０１８３】
【化９】
2021533159.tif 000032
2021533159.tif 000033
【０１８４】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるＭＣＡＭに結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表７は、組合せにより、ＭＣＡＭに結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０１８５】
【表７】
2021533159.tif 000034
2021533159.tif 000035
【０１８６】
代替的に、ＭＣＡＭに結合しうる、新規の抗原結合性部位は、配列番号２０８又はその成熟細胞外断片により規定されたアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０１８７】
【化１０】
2021533159.tif 000036
【０１８８】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるＬＲＲＣ３２に結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表８は、組合せにより、ＬＲＲＣ３２に結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０１８９】
【表８】
2021533159.tif 000037
2021533159.tif 000038
【０１９０】
代替的に、ＬＲＲＣ３２に結合しうる、新規の抗原結合性部位は、配列番号２２５又はその成熟細胞外断片により規定されたアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０１９１】
【化１１】
2021533159.tif 000039
【０１９２】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるシアリルＴｎに結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表９は、組合せにより、シアリルＴｎに結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０１９３】
【表９】
2021533159.tif 000040
【０１９４】
代替的に、シアリルＴｎに結合しうる、新規の抗原結合性部位は、シアリルＴｎ抗原又はその成熟細胞外断片への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０１９５】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるｇｐＡ３３に結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表１０は、組合せにより、ｇｐＡ３３に結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０１９６】
【表１０】
2021533159.tif 000041
2021533159.tif 000042
【０１９７】
代替的に、ｇｐＡ３３に結合しうる、新規の抗原結合性部位は、配列番号２５８又はその成熟細胞外断片により規定されたアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０１９８】
【化１２】
2021533159.tif 000043
【０１９９】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるＧＤ３に結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表１１は、組合せにより、ＧＤ３に結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０２００】
【表１１】
2021533159.tif 000044
2021533159.tif 000045
【０２０１】
代替的に、ＧＤ３に結合しうる、新規の抗原結合性部位は、ＧＤ３ガングリオシド又はその成熟細胞外断片への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０２０２】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるＧＭ２に結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表１２は、組合せにより、ＧＭ２に結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０２０３】
【表１２】
2021533159.tif 000046
【０２０４】
代替的に、ＧＭ２に結合しうる、新規の抗原結合性部位は、ＧＭ２ガングリオシド又はその成熟細胞外断片への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０２０５】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるｃ−ＭＥＴに結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表１３は、組合せにより、ｃ−ＭＥＴに結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０２０６】
【表１３】
2021533159.tif 000047
2021533159.tif 000048
2021533159.tif 000049
【０２０７】
代替的に、ｃ−ＭＥＴに結合しうる、新規の抗原結合性部位は、配列番号３０７又はその成熟細胞外断片により規定されたアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０２０８】
【化１３】
2021533159.tif 000050
【０２０９】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるＥＰＨＡ３に結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表１４は、組合せにより、ＥＰＨＡ３に結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０２１０】
【表１４】
2021533159.tif 000051
【０２１１】
代替的に、ＥＰＨＡ３に結合しうる、新規の抗原結合性部位は、配列番号３１６又はその成熟細胞外断片により規定されたアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０２１２】
【化１４】
2021533159.tif 000052
【０２１３】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるＴＮＦＲＳＦ１０に結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表１５は、組合せにより、ＴＮＦＲＳＦ１０に結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０２１４】
【表１５】
2021533159.tif 000053
2021533159.tif 000054
【０２１５】
代替的に、ＴＮＦＲＳＦ１０に結合しうる、新規の抗原結合性部位は、配列番号３３３又はその成熟細胞外断片により規定されたアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０２１６】
【化１５】
2021533159.tif 000055
【０２１７】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるＴＮＦＳＦ１１に結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表１６は、組合せにより、ＴＮＦＳＦ１１に結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０２１８】
【表１６】
2021533159.tif 000056
【０２１９】
代替的に、ＴＮＦＳＦ１１に結合しうる、新規の抗原結合性部位は、配列番号３５０又はその成熟細胞外断片により規定されたアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０２２０】
【化１６】
2021533159.tif 000057
【０２２１】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるＣＤ７４に結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表１７は、組合せにより、ＣＤ７４に結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０２２２】
【表１７】
2021533159.tif 000058
2021533159.tif 000059
【０２２３】
代替的に、ＣＤ７４に結合しうる、新規の抗原結合性部位は、配列番号３６７又は配列番号３６８又はその成熟細胞外断片により規定されたアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０２２４】
【化１７】
2021533159.tif 000060
【０２２５】
【化１８】
2021533159.tif 000061
【０２２６】
別の態様において、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、並びに抗原であるＰＭＥＬに結合する多特異性結合性タンパク質を提示する。表１８は、組合せにより、ＰＭＥＬに結合しうる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの、一部の例示的な配列を列挙する。
【０２２７】
【表１８】
2021533159.tif 000062
【０２２８】
代替的に、ＰＭＥＬに結合しうる、新規の抗原結合性部位は、配列番号３８５又はその成熟細胞外断片により規定されたアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによっても同定されうる。
【０２２９】
【化１９】
2021533159.tif 000063
【０２３０】
Ｆｃドメイン内において、ＣＤ１６への結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメインにより媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内において、ＣＤ１６との相互作用は、主に、ＣＨ２ドメイン内の、アミノ酸残基である、Ａｓｐ２６５〜Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７〜Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７〜Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４〜Ｓｅｒ２３９及び炭水化物残基Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに焦点が当てられる（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４０６（６７９３）：２６７〜２７３を参照されたい）。公知のドメインに基づき、変異は、ファージディスプレイライブラリー又は酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリーを使用することなどにより、ＣＤ１６に対する結合親和性を増強又は低減するように選択される場合もあり、相互作用についての、公知の三次元構造に基づきデザインされる場合もある。
【０２３１】
抗体重鎖のヘテロ二量体のアセンブリーは、２つの異なる抗体重鎖配列を同じ細胞内において発現させることにより達成することができ、これは、各抗体重鎖のホモ二量体のアセンブリーのほか、ヘテロ二量体のアセンブリーももたらしうる。優先的なヘテロ二量体のアセンブリーの促進は、異なる変異を、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０及びＵＳ１４／８３０３３６において示される通り、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメイン内に組み込むことにより達成することができる。例えば、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの２つの鎖が互いと選択的にヘテロ二量体化することを可能とする、顕著に異なるアミノ酸置換の対を、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの内に組み込むことによって、ヒトＩｇＧ１に基づくＣＨ３ドメイン内に変異を施しうる。下記において例示されるアミノ酸置換の位置は、全て、Ｋａｂａｔにおける通り、ＥＵインデックスに従い番号付けされる。
【０２３２】
１つの状況において、第１のポリペプチド内のアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）から選択される大型のアミノ酸により置きかえ、第２のポリペプチド内の、少なくとも１つのアミノ酸置換は、大型のアミノ酸置換（突出部）が、小型のアミノ酸置換（空隙部）の表面にはまるように、元のアミノ酸（複数可）を、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）又はバリン（Ｖ）から選び出された、小型のアミノ酸（複数可）により置きかえる。例えば、１つのポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換が組み込まれていることがあり、他のポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む、３つの置換が組み込まれていてもよい。
【０２３３】
本発明の抗体重鎖可変ドメインは、任意選択的に、ＣＨ１ドメインを伴う、又は伴わない、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、ＩｇＧ定常領域など、抗体の定常領域と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列へとカップリングされうる。一部の実施形態において、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトのＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、又はＩｇＧ４定常領域など、ヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。他の一部の実施形態において、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス又はウマなど、別の哺乳動物に由来する抗体の定常領域と少なくとも９０％同一である。ヒトＩｇＧ１定常領域と比較した、１つ以上の変異が、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１及び／又はＫ４３９において、定常領域へと組み込まれうる。例示的な置換は、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｒ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅを含む。
【０２３４】
ある特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１へと組み込まれうる変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１及び／又はＶ１７３における変異でありうる。ある特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκへと組み込まれうる変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４及び／又はＴ１６４における変異でありうる。
【０２３５】
代替的に、アミノ酸置換は、表１９に示された、以下の置換のセットから選択されうる。
【０２３６】
【表１９】
2021533159.tif 000064
【０２３７】
代替的に、アミノ酸置換は、表２０に示された、以下の置換のセットから選択されうる。
【０２３８】
【表２０】
2021533159.tif 000065
【０２３９】
代替的に、アミノ酸置換は、表２１に示された、以下の置換のセットから選択されうる。
【０２４０】
【表２１】
2021533159.tif 000066
【０２４１】
代替的に、各ポリペプチド鎖内の、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表２２から選択されうる。
【０２４２】
【表２２】
2021533159.tif 000067
【０２４３】
代替的に、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表２３内の、以下の置換のセットから選択されることが可能であり、この場合、第１のポリペプチド欄に表示の位置（複数可）は、任意の公知の、負に帯電したアミノ酸により置きかえられ、第２のポリペプチド欄に表示の位置（複数可）は、任意の公知の、正に帯電したアミノ酸により置きかえられる。
【０２４４】
【表２３】
2021533159.tif 000068
【０２４５】
代替的に、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表２４内の、以下のセットから選択されることが可能であり、この場合、第１のポリペプチド欄に表示の位置（複数可）は、任意の公知の、正に帯電したアミノ酸により置きかえられ、第２のポリペプチド欄に表示の位置（複数可）は、任意の公知の、負に帯電したアミノ酸により置きかえられる。
【０２４６】
【表２４】
2021533159.tif 000069
【０２４７】
代替的に、アミノ酸置換は、表２５内の、以下のセットから選択されうる。
【０２４８】
【表２５】
2021533159.tif 000070
【０２４９】
代替的に、又は加えて、ヘテロ多量体タンパク質の構造的安定性は、第１のポリペプチド鎖又は第２のポリペプチド鎖に、Ｓ３５４Ｃを導入し、反対側のポリペプチド鎖に、Ｙ３４９Ｃを導入し、これらが、２つのポリペプチドの界面内において、ジスルフィド架橋を形成することにより増大させうる。
【０２５０】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６位において異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６、Ｌ３６８及びＹ４０７からなる群から選択される１つ以上の位置において異なる。
【０２５１】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６、Ｌ３６８及びＹ４０７からなる群から選択される１つ以上の位置において異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６位において異なる。
【０２５２】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置において異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置において異なる。
【０２５３】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置において異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置において異なる。
【０２５４】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００及びＹ４０７からなる群から選択される１つ以上の位置において異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置において異なる。
【０２５５】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置において異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００及びＹ４０７からなる群から選択される１つ以上の位置において異なる。
【０２５６】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０及びＫ４０９からなる群から選択される１つ以上の位置において異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９及びＦ４０５からなる群から選択される１つ以上の位置において異なる。
【０２５７】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９及びＦ４０５からなる群から選択される１つ以上の位置において異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７及びＫ４０９からなる群から選択される１つ以上の位置において異なる。
【０２５８】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＫ４３９からなる群から選択される１つ以上の位置において異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｄ３５６、Ｅ３５７及びＤ３９９からなる群から選択される１つ以上の位置において異なる。
【０２５９】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｄ３５６、Ｅ３５７及びＤ３９９からなる群から選択される１つ以上の位置において異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＫ４３９からなる群から選択される１つ以上の位置において異なる。
【０２６０】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６及びＤ３９９からなる群から選択される１つ以上の位置において異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２及びＫ４０９からなる群から選択される１つ以上の位置において異なる。
【０２６１】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２及びＫ４０９からなる群から選択される１つ以上の位置において異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６及びＤ３９９からなる群から選択される１つ以上の位置において異なる。
【０２６２】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｓ３５４Ｃ置換により異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９Ｃ置換により異なる。
【０２６３】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９Ｃ置換により異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｓ３５４Ｃ置換により異なる。
【０２６４】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗの置換により異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔの置換により異なる。
【０２６５】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔの置換により異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗの置換により異なる。
【０２６６】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６Ｗ置換により異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの置換により異なる。
【０２６７】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの置換により異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６Ｗ置換により異なる。
【０２６８】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖの置換により異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ及びＴ３９４Ｗの置換により異なる。
【０２６９】
一部の実施形態において、抗体の定常領域の、１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ及びＴ３９４Ｗの置換により異なり、この場合、抗体の定常領域の、他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖの置換により異なる。
【０２７０】
例示的な多特異性結合性タンパク質
本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９ＭＩ−デュオボディー−ＴｒｉＮＫＥＴ−オナルツズマブである。Ａ４９ＭＩ−デュオボディー−ＴｒｉＮＫＥＴ−オナルツズマブは、４つのポリペプチド鎖：（ａ）オナルツズマブＨＣ：抗ｃ−ＭＥＴ抗体である、オナルツズマブの重鎖部分（配列番号４２５）；（ｂ）オナルツズマブＬＣ：抗ｃ−ＭＥＴ抗体である、オナルツズマブの軽鎖部分（配列番号４２６）；（ｃ）Ａ４９ＭＩ−ＨＣ：抗ＮＫＧ２Ｄ抗体である、Ａ４９ＭＩの重鎖部分（配列番号４２３）及び（ｄ）Ａ４９ＭＩ−ＬＣ：抗ＮＫＧ２Ｄ抗体である、Ａ４９ＭＩの軽鎖部分（配列番号４２４）を含む。配列番号４２５のＦｃドメインは、変異である、Ｆ４０５Ｌを含み、配列番号４２３のＦｃドメインは、変異である、Ｋ４０９Ｒを含み、これにより、Ｆｃのヘテロ二量体化を容易とする。Ａ４９ＭＩ−デュオボディー−ＴｒｉＮＫＥＴ−オナルツズマブの配列は、下記に提示される。これらの配列の、Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けの下におけるＣＤＲは、下線を付される。
【０２７１】
【化２０】
2021533159.tif 000071
【０２７２】
【化２１】
2021533159.tif 000072
【０２７３】
【化２２】
2021533159.tif 000073
【０２７４】
【化２３】
2021533159.tif 000074
【０２７５】
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９ＭＩ−デュオボディー−ＴｒｉＮＫＥＴ−エミベツズマブである。Ａ４９ＭＩ−デュオボディー−ＴｒｉＮＫＥＴ−エミベツズマブは、４つのポリペプチド鎖：（ａ）エミベツズマブＨＣ：抗ｃ−ＭＥＴ抗体である、エミベツズマブの重鎖部分（配列番号４２７）；（ｂ）エミベツズマブＬＣ：抗ｃ−ＭＥＴ抗体である、エミベツズマブの軽鎖部分（配列番号４２８）；（ｃ）Ａ４９ＭＩ−ＨＣ：抗ＮＫＧ２Ｄ抗体である、Ａ４９ＭＩの重鎖部分（配列番号４２３）及び（ｄ）Ａ４９ＭＩ−ＬＣ：抗ＮＫＧ２Ｄ抗体である、Ａ４９ＭＩの軽鎖部分（配列番号４２４）を含む。配列番号４２７のＦｃドメインは、変異である、Ｆ４０５Ｌを含み、配列番号４２３のＦｃドメインは、変異である、Ｋ４０９Ｒを含み、これにより、Ｆｃのヘテロ二量体化を容易とする。Ａ４９ＭＩ−デュオボディー−ＴｒｉＮＫＥＴ−エミベツズマブの配列は、下記に提示される。これらの配列の、Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けの下におけるＣＤＲは、下線を付される。
【０２７６】
【化２４】
2021533159.tif 000075
【０２７７】
【化２５】
2021533159.tif 000076
【０２７８】
【化２６】
2021533159.tif 000077
【０２７９】
【化２７】
2021533159.tif 000078
【０２８０】
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９ＭＩ−デュオボディー−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＡＢＴ−７００である。Ａ４９ＭＩ−デュオボディー−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＡＢＴ−７００は、４つのポリペプチド鎖：（ａ）ＡＢＴ−７００−ＨＣ：抗ｃ−ＭＥＴ抗体である、ＡＢＴ−７００の重鎖部分（配列番号４２９）；（ｂ）ＡＢＴ−７０ＯＬＣ：抗ｃ−ＭＥＴ抗体である、ＡＢＴ−７００の軽鎖部分（配列番号４３０）；（ｃ）Ａ４９ＭＩ−ＨＣ：抗ＮＫＧ２Ｄ抗体である、Ａ４９ＭＩの重鎖部分（配列番号４２３）及び（ｄ）Ａ４９ＭＩ−ＬＣ：抗ＮＫＧ２Ｄ抗体である、Ａ４９ＭＩの軽鎖部分（配列番号４２４）を含む。配列番号４２９のＦｃドメインは、変異である、Ｆ４０５Ｌを含み、配列番号４２３のＦｃドメインは、変異である、Ｋ４０９Ｒを含み、これにより、Ｆｃのヘテロ二量体化を容易とする。Ａ４９ＭＩ−デュオボディー−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＡＢＴ−７００の配列は、下記に提示される。これらの配列の、Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けの下におけるＣＤＲは、下線を付される。
【０２８１】
【化２８】
2021533159.tif 000079
【０２８２】
【化２９】
2021533159.tif 000080
【０２８３】
【化３０】
2021533159.tif 000081
【０２８４】
【化３１】
2021533159.tif 000082
【０２８５】
上記において記載された多特異性タンパク質は、当業者に周知の、組換えＤＮＡ技術を使用して作られうる。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする、第１の核酸配列は、第１の発現ベクターへとクローニングされる場合があり；第２の免疫グロブリン重鎖をコードする、第２の核酸配列は、第２の発現ベクターへとクローニングされる場合があり；免疫グロブリン軽鎖をコードする、第３の核酸配列は、第３の発現ベクターへとクローニングされる場合があり；宿主細胞は、多量体タンパク質を作製するように、第１の発現ベクター、第２の発現ベクター及び第３の発現ベクターを、安定的に、まとめてトランスフェクトされうる。
【０２８６】
多特異性タンパク質の、最高の収率を達成するために、第１の発現ベクター、第２の発現ベクター及び第３の発現ベクターの、宿主細胞のトランスフェクションに最適の比を決定するように、これらの異なる比が探索されうる。トランスフェクションの後、細胞バンクの作出のために、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡法又はＣｌｏｎｅｐｉｘなど、当技術分野で公知の方法を使用して、単一のクローンが単離されうる。
【０２８７】
クローンは、バイオリアクターによるスケールアップに適する条件下において培養され、多特異性タンパク質の発現のために維持されうる。多特異性タンパク質は、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、ホモジナイゼーション、凍結融解、親和性精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー及び混合モード型クロマトグラフィーを含む、当技術分野において公知の方法を使用して、単離及び精製されうる。
【０２８８】
ＩＩ．多特異性タンパク質の特徴
本明細書において記載された多特異性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合性部位、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する腫瘍関連抗原結合性部位、並びにＣＤ１６に結合するのに十分な、抗体のＦｃドメイン又はその部分、又はＣＤ１６に結合する抗原結合性部位を含む。一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴフォーマットにおいて例示された、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する、追加の抗原結合性部位を含有する。
【０２８９】
一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、対応するモノクローナル抗体、すなわち、多特異性タンパク質内に組み込まれた腫瘍関連抗原結合性部位（例えば、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する抗原結合性部位）と同じ腫瘍関連抗原結合性部位を含有するモノクローナル抗体と同様の熱安定性を提示する。
【０２９０】
一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞など、ＮＫＧ２Ｄ及び／又はＣＤ１６を発現する細胞並びに腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞に、同時に結合する。多特異性タンパク質の、ＮＫ細胞への結合は、ＮＫ細胞の活性を、腫瘍細胞の破壊に向けて増強しうる。
【０２９１】
一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、腫瘍関連抗原に対する、対応するモノクローナル抗体（すなわち、多特異性タンパク質内に組み込まれた腫瘍関連抗原結合性部位と同じ腫瘍関連抗原結合性部位を含有するモノクローナル抗体、例えば、多特異性タンパク質内に組み込まれたＫＩＴ結合性部位と同じＫＩＴ結合性部位を含有するモノクローナル抗体）と同様の親和性で、腫瘍関連抗原に結合する。一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の殺滅において、腫瘍関連抗原に対する、対応するモノクローナル抗体より効果的である。
【０２９２】
ある特定の実施形態において、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に対する結合性部位を含む、本明細書において記載された多特異性タンパク質は、腫瘍関連抗原を発現する細胞と共培養する場合、初代ヒトＮＫ細胞を活性化する。ＮＫ細胞の活性化は、ＣＤ１０７ａの脱顆粒及びサイトカインであるＩＦＮ−γの産生の増大を特徴とする。さらに、腫瘍関連抗原に対する、対応するモノクローナル抗体と比較して、多特異性タンパク質は、腫瘍関連抗原を発現する細胞の存在下において、ヒトＮＫ細胞の、優れた活性化を示しうる。
【０２９３】
一部の実施形態において、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に対する結合性部位を含む、本明細書において記載された多特異性タンパク質は、選択された腫瘍関連抗原を発現する細胞と共培養する場合、休眠ヒトＮＫ細胞及びＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞の活性を増強する。
【０２９４】
一部の実施形態において、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する、対応するモノクローナル抗体と比較して、多特異性タンパク質は、中レベル及び低レベルの腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞のターゲティングにおいて、利点をもたらす。
【０２９５】
一部の実施形態において、ＴｒｉＮＫＥＴの二価Ｆ４フォーマット（すなわち、ＴｒｉＮＫＥＴは、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合する、追加の抗原結合性部位を含む）は、ＴｒｉＮＫＥＴが、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原に結合するアビディティーを改善し、これは、実際に、腫瘍細胞表面において、高レベルの、選択された腫瘍関連抗原（例えば、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４又はＰＭＥＬ）の発現及び維持を安定化させる。一部の実施形態において、Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴは、選択された腫瘍関連抗原（例えば、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４又はＰＭＥＬ）を発現する腫瘍細胞の、対応する、Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ又はＦ３’−ＴｒｉＮＫＥＴより強力な殺滅を媒介する。
【０２９６】
ＩＩＩ．治療適用
本発明は、本明細書において記載された多特異性結合性タンパク質及び／又は本明細書において記載された医薬組成物を使用して、がんを処置するための方法を提供する。方法は、ＫＩＴ、Ｆ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４、ＭＣＡＭ、ＬＲＲＣ３２、シアリルＴｎ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ｃ−ＭＥＴ、ＥＰＨＡ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤ７４及びＰＭＥＬから選択される腫瘍関連抗原を発現する様々ながんを処置するのに使用されうる。ＫＩＴをターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、結腸直腸がん、急性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、黒色腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、腎がん、肝がん及び精巣がんでありうる。Ｆ３をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、膠芽腫、頭頸部がん、肺がん、膵がん、前立腺がん、肉腫及び結腸直腸がんでありうる。ＩＧＦ１Ｒをターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肺がん、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、前立腺がん、肉腫、甲状腺がん、腎がん、結腸直腸がん、膵がん、膠芽腫及び肝がんでありうる。Ｌｅｗｉｓ  Ｙをターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、卵巣がん、肺がん、結腸直腸がん、胃がん、乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、多発性骨髄腫及び急性骨髄性白血病でありうる。ＭＵＣ１３をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、卵巣がん、肝がん、肺がん、黒色腫、肝がん、胃がん、膵がん、腎がん、食道がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮頸がん及び胆管癌でありうる。ＭＵＣ４をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、乳がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、急性リンパ芽球性白血病、膀胱がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、頭頸部がん及び前立腺がんでありうる。ＭＣＡＭをターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、黒色腫、乳がん、小細胞肺がん、肉腫、結腸直腸がん、膵がん及び腎がんでありうる。ＬＲＲＣ３２をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、腎がん、膵がん、肉腫、卵巣がん、肺がん、膠芽腫、頭頸部がん、前立腺がん、肝がん、乳がん及び子宮頸がんでありうる。シアリルＴｎをターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、卵巣がん、膵がん、膀胱がん、胃がん、前立腺がん、結腸直腸がん及び乳がんでありうる。ｇｐＡ３３をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、結腸直腸がん、胃がん及び食道がんでありうる。ＧＤ３をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、肺がん、神経膠腫、乳がん、黒色腫、卵巣がん、膵がん及び神経芽細胞腫でありうる。ＧＭ２をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、胃がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、神経芽細胞腫��黒色腫、肺がん、中皮腫及び肝がんでありうる。ｃ−ＭＥＴをターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、腎がん、甲状腺がん、黒色腫、肺がん、黒色腫、肝がん、膵がん、結腸直腸がん及び頭頸部がんでありうる。ＥＰＨＡ３をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、子宮頸がん、頭頸部がん、胃がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、結腸直腸がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、膵がん、肺がん及び肉腫でありうる。ＴＮＦＲＳＦ１０Ａをターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん及び頭頸部がんでありうる。ＴＮＦＳＦ１１をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、乳がん、前立腺がん及び骨転移性がんでありうる。ＣＤ７４をターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん、Ｂ細胞悪性腫瘍、腎がん、肺がん、卵巣がん、黒色腫、肉腫、頭頸部がん、肝がん、膀胱がん、神経膠腫、乳がん及び白血病でありうる。ＰＭＥＬをターゲティングする、多特異性結合性タンパク質により処置される、例示的ながんは、黒色腫及び肉腫でありうる。
【０２９７】
他の一部の実施形態において、がんは、乳がん、卵巣がん、食道がん、膀胱がん又は胃がん、唾液腺導管癌、肺腺癌又は漿液性子宮内膜癌など、子宮がんの侵襲性形態である。他の一部の実施形態において、がんは、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、白血病、肺がん、肝がん、黒色腫、卵巣がん、膵がん、直腸がん、腎がん、胃がん、精巣がん又は子宮がんである。さらに他の実施形態において、がんは、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肉腫（例えば、血管肉腫又は軟骨肉腫）、喉頭がん、耳下腺がん、胆道がん、甲状腺がん、末端性黒子性黒色腫、光線性角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管がん、肛門がん、肛門直腸がん、星状細胞腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆管がん、骨がん、骨髄がん、気管支がん、気管支腺癌、カルチノイド、胆管癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫／癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織がん、嚢胞腺腫、消化器系がん、十二指腸がん、内分泌系がん、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞がん、上衣がん、上皮細胞がん、ユーイング肉腫、眼球眼窩がん、女性生殖器がん、限局性結節性過形成、胆嚢がん、胃前庭部がん、胃底部がん、ガストリノーマ、膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓がん、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝細胞腺腫、肝細胞腺腫症、肝胆道がん、肝細胞癌、ホジキン病、回腸がん、膵島細胞腫、上皮内新生物、扁平上皮内新生物、肝内胆管がん、浸潤性扁平上皮癌、空腸がん、関節がん、カポジ肉腫、骨盤内がん、大細胞癌、大腸がん、平滑筋肉腫、悪性黒子型黒色腫、リンパ腫、男性生殖器がん、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄様上皮種、髄膜がん、中皮がん、転移性癌、口内がん、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉がん、鼻腔がん、神経系がん、神経上皮腺癌、結節型黒色腫、非上皮皮膚がん、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、希突起膠細胞がん、口腔がん、骨肉腫、漿液性乳頭状腺癌、陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽細胞腫、直腸がん、腎細胞癌、呼吸器系がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、副鼻腔がん、皮膚がん、小細胞癌、小腸がん、平滑筋がん、軟部組織がん、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎がん、扁平上皮がん、横紋筋がん、中皮下がん、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌がん、未分化癌腫、尿管がん、尿道がん、泌尿器膀胱がん、泌尿器系がん、子宮頸がん、子宮体がん、ブドウ膜黒色腫、膣がん、疣状癌、ビポーマ、外陰がん、高分化癌又はウィルムス腫瘍である。
【０２９８】
他の一部の実施形態において、処置されるがんは、Ｂ細胞リンパ腫又はＴ細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫である。ある特定の実施形態において、非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発縦隔Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫などのＢ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、又は原発中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫である。ある特定の、他の実施形態において、非ホジキンリンパ腫は、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫又は末梢Ｔ細胞リンパ腫などのＴ細胞リンパ腫である。
【０２９９】
一部の実施形態において、ＫＩＴに結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、結腸直腸がん、急性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、黒色腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、腎がん、肝がん又は精巣がんを処置するのに使用されうる。
【０３００】
一部の実施形態において、Ｆ３に結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、膠芽腫、頭頸部がん、肺がん、膵がん、前立腺がん、肉腫又は結腸直腸がんを処置するのに使用されうる。
【０３０１】
一部の実施形態において、ＩＧＦ１Ｒに結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肺がん、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、前立腺がん、肉腫、甲状腺がん、腎がん、結腸直腸がん、膵がん、膠芽腫又は肝がんを処置するのに使用されうる。
【０３０２】
一部の実施形態において、Ｌｅｗｉｓ  Ｙに結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、卵巣がん、肺がん、結腸直腸がん、胃がん、乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、多発性骨髄腫又は急性骨髄性白血病を処置するのに使用されうる。
【０３０３】
一部の実施形態において、ＭＵＣ１３に結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、卵巣がん、肝がん、肺がん、黒色腫、肝がん、胃がん、膵がん、腎がん、食道がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮頸がん又は胆管癌を処置するのに使用されうる。
【０３０４】
一部の実施形態において、ＭＵＣ４に結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、乳がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、急性リンパ芽球性白血病、膀胱がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、頭頸部がん又は前立腺がんを処置するのに使用されうる。
【０３０５】
一部の実施形態において、ＭＣＡＭに結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、黒色腫、乳がん、小細胞肺がん、肉腫、結腸直腸がん、膵がん又は腎がんを処置するのに使用されうる。
【０３０６】
一部の実施形態において、ＬＲＲＣ３２に結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、処置するのに使用されうる。一部の実施形態において、結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、腎がん、膵がん、肉腫、卵巣がん、肺がん、膠芽腫、頭頸部がん、前立腺がん、肝がん、乳がん又は子宮頸がんを処置するのに使用されうる。
【０３０７】
一部の実施形態において、シアリルＴｎに結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、卵巣がん、膵がん、膀胱がん、胃がん、前立腺がん、結腸直腸がん又は乳がんを処置するのに使用されうる。
【０３０８】
一部の実施形態において、ｇｐＡ３３に結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、結腸直腸がん、胃がん又は食道がんを処置するのに使用されうる。
【０３０９】
一部の実施形態において、ＧＤ３に結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、肺がん、神経膠腫、乳がん、黒色腫、卵巣がん、膵がん又は神経芽細胞腫を処置するのに使用されうる。
【０３１０】
一部の実施形態において、ＧＭ２に結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、胃がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、神経芽細胞腫、黒色腫、肺がん、中皮腫又は肝がんを処置するのに使用されうる。
【０３１１】
一部の実施形態において、ｃ−ＭＥＴに結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、腎がん、甲状腺がん、黒色腫、肺がん、黒色腫、肝がん、膵がん、結腸直腸がん又は頭頸部がんを処置するのに使用されうる。
【０３１２】
一部の実施形態において、ＥＰＨＡ３に結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、子宮頸がん、頭頸部がん、胃がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、結腸直腸がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、膵がん、肺がん又は肉腫を処置するのに使用されうる。
【０３１３】
一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａに結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、頭頸部がんを処置するのに使用されうる。
【０３１４】
一部の実施形態において、ＴＮＦＳＦ１１に結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、乳がん、前立腺がん又は骨転移性がんを処置するのに使用されうる。
【０３１５】
一部の実施形態において、ＣＤ７４に結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、びまん性大細胞型Ｂ細胞がん、Ｂ細胞悪性腫瘍、腎がん、肺がん、卵巣がん、黒色腫、肉腫、頭頸部がん、肝がん、膀胱がん、神経膠腫、乳がん又は白血病を処置するのに使用されうる。
【０３１６】
一部の実施形態において、ＰＭＥＬに結合する抗原結合性部位を含むタンパク質は、黒色腫又は肉腫を処置するのに使用されうる。
【０３１７】
ＩＶ．組合せ療法
本発明の別の態様は、組合せ療法を提供する。本明細書において記載された多特異性結合性タンパク質は、追加の治療剤と組み合わせて、がんを処置するのに使用されうる。
【０３１８】
がんの処置において、組合せ療法の一部として使用されうる、例示的な治療剤は、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリックス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、ホテムスチン、チマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミソール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロンアルファ、インターフェロン２アルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、コロニー刺激因子１、コロニー刺激因子２、デニロイキンディフチトクス、インターロイキン２、黄体形成ホルモン放出因子及びそのコグネイト受容体への示差的結合又は血清半減期の延長若しくは短縮を呈しうる、前述の薬剤の変化形を含む。
【０３１９】
がんの処置において、組合せ療法の一部として使用されうる薬剤の、さらなるクラスは、免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤は、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７−Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７−Ｈ４及び（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうちの１つ以上を阻害する薬剤を含む。ＣＴＬＡ４阻害剤である、イピリムマブは、米国食品医薬品局により、黒色腫の処置について承認されている。
【０３２０】
がんの処置において、組合せ療法の一部として使用されうる、さらに他の薬剤は、チェックポイント以外の標的をターゲティングする、モノクローナル抗体剤（例えば、ハーセプチン）及び非細胞傷害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）である。
【０３２１】
抗がん剤の、さらに他の類別は、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ−Ａｂｌ型チロシンキナーゼ阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫ及びｍＴＯＲの両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤及び２−クロロ−デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１及びＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤及びＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤；（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５又はＩＣＯＳのアゴニスト並びに（ｉｉｉ）ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦから選択されるサイトカインを含む。
【０３２２】
本発明のタンパク質はまた、原発病変の、手術による除去に対する補助物質としても使用されうる。
【０３２３】
所望の組合せた治療効果を達成するために、多特異性結合性タンパク質及び追加の治療剤の量並びに投与の相対的タイミングが選択されうる。例えば、組合せ療法を、このような投与を必要とする患者へと投与する場合、組み合わされた治療剤又は治療剤を含む１つ以上の医薬組成物は、例えば、逐次的に、共時的に、併せて、同時になど、任意の順序において投与されうる。さらに、例えば、多特異性結合性タンパク質は、追加の治療剤（複数可）が、これらの予防効果又は治療効果を及ぼしている間に投与される場合もあり、この逆の場合もある。
【０３２４】
Ｖ．医薬組成物
本開示はまた、治療有効量の、本明細書において記載されたタンパク質を含有する医薬組成物も特色とする。組成物は、様々な薬物送達系における使用のために製剤化されうる。１つ以上の生理学的に許容される賦形剤又は担体もまた、適正な製剤化のために、組成物中に含まれうる。本開示における使用に適する製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．、１７版、１９８５において見出される。薬物送達のための方法の総説について、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７〜１５３３、１９９０）を参照されたい。
【０３２５】
本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ内、ペン内又はシリンジ内に含有されうる。ある特定の実施形態において、バッグは、チューブ及び／又は注射針を含むチャネルへと接続されうる。ある特定の実施形態において、製剤は、凍結乾燥製剤又は液体製剤でありうる。ある特定の実施形態において、製剤は、凍結乾燥され（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））、バイアル約１２〜６０本中に含有されうる。ある特定の実施形態において、製剤は、凍結乾燥される場合があり、４５ｍｇの凍結乾燥製剤は、バイアル１本中に含有されうる。ある特定の実施形態において、約４０ｍｇ〜約１００ｍｇの凍結乾燥製剤は、バイアル１本中に含有されうる。ある特定の実施形態において、バイアル１２、２７又は４５本からの凍結乾燥製剤が、静脈内薬物製剤中に治療用量のタンパク質が得られるように組み合わされる。ある特定の実施形態において、製剤は、液体製剤であることが可能であり、バイアル１本当たり約２５０ｍｇ〜バイアル１本当たり約１０００ｍｇとして保管されうる。ある特定の実施形態において、製剤は、液体製剤であることが可能であり、バイアル１本当たり約６００ｍｇとして保管されうる。ある特定の実施形態において、製剤は、液体製剤であることが可能であり、バイアル１本当たり約２５０ｍｇとして保管されうる。
【０３２６】
タンパク質は、製剤を形成する緩衝液中に、治療有効量のタンパク質を含む、液体の水性医薬製剤中に存在しうる。
【０３２７】
これらの組成物は、従来の滅菌法により滅菌される場合もあり、滅菌濾過される場合もある。結果として得られる水溶液は、そのままの形における使用のためにパッケージングされる場合もあり、凍結乾燥され、凍結乾燥された調製物が、投与の前に、滅菌水性担体と組み合わされる場合もある。調製物のｐＨは、典型的に、３〜１１の間、より好ましくは５〜９の間又は６〜８の間であり、最も好ましくは７〜７．５など、７〜８の間である。結果として得られる、固体形態の組成物は、各々が、一定量の、上述の、１つ以上の薬剤を含有する、複数の単一用量単位にパッケージングされうる。固体形態の組成物はまた、可変数量のための容器内にもパッケージングされうる。
【０３２８】
ある特定の実施形態において、本開示は、本開示のタンパク質を、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水及び水酸化ナトリウムと組み合わせて含む、保管寿命が延長された製剤を提示する。
【０３２９】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質を、ｐＨ緩衝液中に含む水性製剤が調製される。本発明の緩衝液は、約４〜約８、例えば、約４．５〜約６．０又は約４．８〜約５．５の範囲のｐＨを有する場合もあり、約５．０〜約５．２のｐＨを有する場合もある。上記において列挙されたｐＨの中間の範囲もまた、本開示の一部であることが意図される。例えば、上記において列挙された値のうちのいずれかの組合せを、上限及び／又は下限として使用する値の範囲が含まれることが意図される。ｐＨを、この範囲内に制御する緩衝液の例は、酢酸（例えば、酢酸ナトリウム）緩衝液、コハク酸（コハク酸ナトリウムなど）緩衝液、グルコン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液及び他の有機酸緩衝液を含む。
【０３３０】
ある特定の実施形態において、製剤は、ｐＨを、約４〜約８の範囲内に維持する、クエン酸塩及びリン酸塩を含有する緩衝液系を含む。ある特定の実施形態において、ｐＨ範囲は、約４．５〜約６．０又は約ｐＨ４．８〜約５．５の場合もあり、約５．０〜約５．２のｐＨ範囲内にある場合もある。ある特定の実施形態において、緩衝液系は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物及び／又はリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。ある特定の実施形態において、緩衝液系は、約１．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約０．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約１．５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、１．５３ｍｇ／ｍＬ）、約０．９ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば、０．８６）及び約６．２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍＬ）を含む。ある特定の実施形態において、緩衝液系は、１〜１．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸、０．２５〜０．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム、１．２５〜１．７５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物、０．７〜１．１ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物及び６．０〜６．４ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムを含む。ある特定の実施形態において、製剤のｐＨは、水酸化ナトリウムにより調整される。
【０３３１】
等張剤として作用し、抗体を安定化させうるポリオールもまた、製剤中に含まれうる。ポリオールは、製剤へと、製剤の所望の等張性に関して変動しうる量において添加される。ある特定の実施形態において、水性製剤は、等張性でありうる。添加されるポリオールの量はまた、ポリオールの分子量に関しても変更されうる。例えば、二糖（トレハロースなど）と比較して、低量の単糖（例えば、マンニトール）が添加されうる。ある特定の実施形態において、製剤中において、等張剤として使用されうるポリオールは、マンニトールである。ある特定の実施形態において、マンニトール濃度は、約５〜約２０ｍｇ／ｍＬでありうる。ある特定の実施形態において、マンニトールの濃度は、約７．５〜１５ｍｇ／ｍＬでありうる。ある特定の実施形態において、マンニトールの濃度は、約１０〜１４ｍｇ／ｍＬでありうる。ある特定の実施形態において、マンニトールの濃度は、約１２ｍｇ／ｍＬでありうる。ある特定の実施形態において、ポリオールである、ソルビトールが、製剤中に含まれうる。
【０３３２】
デタージェント又は界面活性剤もまた、製剤へと添加されうる。例示的なデタージェントは、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０など）又はポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）などの非イオン性デタージェントを含む。添加されるデタージェントの量は、それが、製剤化された抗体の凝集を低減する、及び／又は製剤中の微粒子の形成を最小化する、及び／又は吸着を低減するように添加される。ある特定の実施形態において、製剤は、ポリソルベートである界面活性剤を含みうる。ある特定の実施形態において、製剤は、デタージェントである、ポリソルベート８０又はＴｗｅｅｎ  ８０を含有しうる。Ｔｗｅｅｎ  ８０とは、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンについて記載するのに使用された用語である（Ｆｉｅｄｌｅｒ、Ｌｅｘｉｋｏｎ  ｄｅｒ  Ｈｉｆｓｓｔｏｆｆｅ、Ｅｄｉｔｉｏ  Ｃａｎｔｏｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ、４版、１９９６を参照されたい）。ある特定の実施形態において、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの間又は約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの間のポリソルベート８０を含有しうる。ある特定の実施形態において、約０．１％のポリソルベート８０が、製剤中に添加されうる。
【０３３３】
複数の実施形態において、本開示のタンパク質生成物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム製止栓により閉止され、アルミニウム製圧着シール型封止によりシーリングされた、米国薬局方／欧州薬局方によるＩ型５０Ｒバイアル内、１０ｍｇ／ｍＬの濃度において提示されうる。止栓は、米国薬局方及び欧州薬局方に準拠するエラストマーから作られうる。ある特定の実施形態において、バイアルは、６０ｍＬの抽出容量を可能とするために、タンパク質生成物溶液６１．２ｍＬにより充填されうる。ある特定の実施形態において、液体製剤は、０．９％の生理食塩液により希釈されうる。
【０３３４】
ある特定の実施形態において、本開示の液体製剤は、安定化レベルの糖と組み合わせた、濃度を１０ｍｇ／ｍＬとする溶液として調製されうる。ある特定の実施形態において、液体製剤は、水性担体中において調製されうる。ある特定の実施形態において、安定化剤は、静脈内投与に所望されない、又は適さない粘度を結果としてもたらしうる量以下の量において添加されうる。ある特定の実施形態において、糖は、二糖、例えば、スクロースでありうる。ある特定の実施形態において、液体製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤及び保存剤のうちの１つ以上も含みうる。
【０３３５】
ある特定の実施形態において、液体製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸及び／又は塩基の添加により設定されうる。ある特定の実施形態において、薬学的に許容される酸は、塩酸でありうる。ある特定の実施形態において、塩基は、水酸化ナトリウムでありうる。
【０３３６】
凝集に加えて、脱アミド化も、発酵、採取／細胞の透明化、精製、原薬／医薬品の保存時に、及び試料解析時に生じうる、ペプチド及びタンパク質の、一般的な生成物変異体である。脱アミド化は、タンパク質からのＮＨ３の喪失であり、加水分解を経うる、スクシンイミド中間体を形成する。スクシンイミド中間体は、親ペプチドの、１７ダルトンの質量減少を結果としてもたらす。後続の加水分解は、１８ダルトンの質量増大を結果としてもたらす。スクシンイミド中間体の単離は、水性状態下における不安定性のために、困難である。このように、脱アミド化は、典型的に、１ダルトンの質量増大として、検出可能である。アスパラギンの脱アミド化は、アスパラギン酸又はイソアスパラギン酸を結果としてもたらす。脱アミド化率に影響を及ぼすパラメータは、ｐＨ、温度、溶媒の誘電定数、イオン強度、一次配列、局所的なポリペプチドコンフォメーション及び三次構造を含む。ペプチド鎖内において、Ａｓｎに隣接するアミノ酸残基は、脱アミド化率に影響を及ぼす。タンパク質配列内の、Ａｓｎに後続するＧｌｙ及びＳｅｒは、脱アミド化に対する、高感受性を結果としてもたらす。
【０３３７】
ある特定の実施形態において、本開示の液体製剤は、タンパク質生成物の脱アミン化を防止する、ｐＨ及び湿度の条件下において保存されうる。
【０３３８】
本明細書における、目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与に安全及び非毒性であり）、液体製剤の調製に有用な、水性担体である。例示的な担体は、滅菌注射用水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩液）、滅菌生理食塩液、リンゲル液又はデキストロース液を含む。
【０３３９】
細菌の作用を低減するように、任意選択的に、保存剤も、本明細書の製剤へと添加されうる。保存剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回投与）用製剤の作製を容易としうる。
【０３４０】
静脈内（ＩＶ）製剤は、患者が、入院しており、移植の後、ＩＶ経路を介して、全ての薬物を施される場合など、特定の場合において、好ましい投与経路でありうる。ある特定の実施形態において、液体製剤は、投与の前に、０．９％の塩化ナトリウム溶液により希釈される。ある特定の実施形態において、希釈された注射用医薬品は、等張性であり、静脈内注入による投与に適する。
【０３４１】
ある特定の実施形態において、塩又は緩衝液成分は、１０ｍＭ〜２００ｍＭの量において添加されうる。塩及び／又は緩衝液は、薬学的に許容され、「塩基形成」金属又はアミンを伴う、多様な公知の酸（無機及び有機）に由来する。ある特定の実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝液でありうる。ある特定の実施形態において、緩衝液は、グリシン酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液であることが可能であり、この場合、ナトリウムイオン、カリウムイオン又はアンモニウムイオンが、対イオンとして用いられうる。
【０３４２】
細菌の作用を低減するように、任意選択的に、保存剤も、本明細書の製剤へと添加されうる。保存剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回投与）用製剤の作製を容易としうる。
【０３４３】
本明細書における、目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与に安全及び非毒性であり）、液体製剤の調製に有用な、水性担体である。例示的な担体は、滅菌注射用水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩液）、滅菌生理食塩液、リンゲル液又はデキストロース液を含む。
【０３４４】
本開示のタンパク質は、タンパク質と凍結乾燥保護剤とを含む、凍結乾燥製剤中に存在しうる。凍結乾燥保護剤は、糖、例えば、二糖でありうる。ある特定の実施形態において、凍結乾燥保護剤は、スクロース又はマルトースでありうる。凍結乾燥製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、増量剤及び／又は保存剤のうちの１つ以上も含みうる。
【０３４５】
凍結乾燥医薬品の安定化に有用な、スクロース又はマルトースの量は、タンパク質の、スクロース又はマルトースに対する、少なくとも１：２の重量比でありうる。ある特定の実施形態において、タンパク質の、スクロース又はマルトースに対する重量比は、１：２〜１：５でありうる。
【０３４６】
ある特定の実施形態において、製剤のｐＨは、凍結乾燥の前に、薬学的に許容される酸及び／又は塩基の添加により設定されうる。ある特定の実施形態において、薬学的に許容される酸は、塩酸でありうる。ある特定の実施形態において、薬学的に許容される塩基は、水酸化ナトリウムでありうる。
【０３４７】
凍結乾燥の前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のｐＨは、６〜８の間に調整されうる。ある特定の実施形態において、凍結乾燥医薬品のためのｐＨ範囲は、７〜８でありうる。
【０３４８】
ある特定の実施形態において、塩又は緩衝液成分は、１０ｍＭ〜２００ｍＭの量において添加されうる。塩及び／又は緩衝液は、薬学的に許容され、「塩基形成」金属又はアミンを伴う、多様な公知の酸（無機及び有機）に由来する。ある特定の実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝液でありうる。ある特定の実施形態において、緩衝液は、グリシン酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液であることが可能であり、この場合、ナトリウムイオン、カリウムイオン又はアンモニウムイオンが、対イオンとして用いられうる。
【０３４９】
ある特定の実施形態において、「増量剤」が添加されうる。「増量剤」とは、凍結乾燥混合物に、質量を付加し、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開放小孔構造を維持する、本質的に一様な、凍結乾燥ケーキの作製を容易とする）化合物である。例示的な増量剤は、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール及びソルビトールを含む。本発明の凍結乾燥製剤は、このような増量剤を含有しうる。
【０３５０】
細菌の作用を低減するように、任意選択的に、保存剤も、本明細書の製剤へと添加されうる。保存剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回投与）用製剤の作製を容易としうる。
【０３５１】
ある特定の実施形態において、凍結乾燥医薬品は、水性担体により復元されうる。本明細書における、目的の水性担体は、薬学的に許容され（例えば、ヒトへの投与に安全及び非毒性であり）、凍結乾燥の後における、液体製剤の調製に有用な、水性担体である。例示的な希釈剤は、滅菌注射用水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩液）、滅菌生理食塩液、リンゲル液又はデキストロース液を含む。
【０３５２】
ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥医薬品は、米国薬局方による滅菌注射用水（ＳＷＦＩ）又は米国薬局方による、０．９％の塩化ナトリウム注射液により復元される。復元時に、凍結乾燥粉末は、溶液へと溶解する。
【０３５３】
ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥タンパク質生成物は、注射用水約４．５ｍＬへと復元され、０．９％の生理食塩液（塩化ナトリウム溶液）により希釈される。
【０３５４】
本発明の医薬組成物中の、有効成分の、実際の投与量レベルは、患者に対して毒性とならずに、特定の患者、組成物及び投与方式に所望される治療応答を達成するのに効果的な、有効成分の量を得るように変更されうる。
【０３５５】
具体的用量は、各患者に均一の用量、例えば、タンパク質５０〜５０００ｍｇでありうる。代替的に、患者の用量は、患者の近似的な体重又は体表面積に照らして微調整されうる。適切な投与量の決定における他の因子は、処置又は防止される、疾患又は状態、疾患の重症度、投与経路並びに患者の年齢、性別及び病状を含みうる。処置に適切な投与量を決定するのに必要な、計算のさらなる精緻化は、当業者により、とりわけ、本明細書で開示された投与量情報及びアッセイに照らして、常套的になされる。投与量はまた、適切な用量反応データと共に使用される投与量を決定するための、公知のアッセイの使用を介しても決定されうる。個々の患者の投与量は、疾患の進行がモニタリングされるのに応じて調整されうる。有効濃度に達する、又はこれを維持するように、投与量が調整される必要があるのか否かを見極めるために、患者における、ターゲティング型構築物又はターゲティング型複合体の血中レベルが測定されうる。どのターゲティング型構築物及び／又はターゲティング型複合体及びその投与量が、所与の個人に効果的である可能性が最も高いのかを決定するのに、薬理ゲノム学が使用されうる（Ｓｃｈｍｉｔｚら、Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、３０８：４３〜５３、２００１；Ｓｔｅｉｍｅｒら、Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、３０８：３３〜４１、２００１）。
【０３５６】
一般に、体重に基づく投与量は、体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜約５０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜約１ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜約１００μｇ、体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜約５０μｇ、体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜約１０μｇ、体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜約１μｇ、体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜約０．１μｇ、体重１ｋｇ当たり約０．１μｇ〜約１００ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．１μｇ〜約５０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．１μｇ〜約１０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．１μｇ〜約１ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．１μｇ〜約１００μｇ、体重１ｋｇ当たり約０．１μｇ〜約１０μｇ、体重１ｋｇ当たり約０．１μｇ〜約１μｇ、体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約１００ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約５０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約１０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約１ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約１００μｇ、体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約５０μｇ、体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約１０μｇ、体重１ｋｇ当たり約１０μｇ〜約１００ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１０μｇ〜約５０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１０μｇ〜約１０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１０μｇ〜約１ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１０μｇ〜約１００μｇ、体重１ｋｇ当たり約１０μｇ〜約５０μｇ、体重１ｋｇ当たり約５０μｇ〜約１００ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約５０μｇ〜約５０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約５０μｇ〜約１０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約５０μｇ〜約１ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約５０μｇ〜約１００μｇ、体重１ｋｇ当たり約１００μｇ〜約１００ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１００μｇ〜約５０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１００μｇ〜約１ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約５０ｍｇ〜約１００ｍｇなど、体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜約１００ｍｇである。
【０３５７】
投与は、毎日、毎週、毎月若しくは毎年１回以上又は２〜２０年ごとに１回でさえ施されうる。当業者は、ターゲティング型構築物又はターゲティング型複合体の、体液中又は組織内の滞留時間及び濃度の測定に基づき、投与のための反復率を、容易に推定しうる。本発明の投与は、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋内投与、皮下投与、胸膜腔内投与、髄腔内投与、腔内投与、カテーテルを介する灌流又は直接的な病変内注射による投与でありうる。これは、毎日１回以上、毎週１回以上、毎月１回以上及び毎年１回以上投与されうる。
【０３５８】
上記の記載は、本発明の、複数の態様及び実施形態について記載する。本特許出願は、態様及び実施形態の、全ての組合せ及び入れ替えを、具体的に想定する。
【実施例】
【０３５９】
ここで、概して記載されている本発明は、以下の実施例を参照することにより、よりたやすく理解されるが、実施例は、本発明のある特定の態様及び実施形態の例示だけを目的として含まれるものであり、本発明を限定することが意図されるのではない。
【０３６０】
［実施例１］  ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合する
ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインは、精製組換えＮＫＧ２Ｄに結合する
ヒトＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメイン、マウスＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメイン又はカニクイザルＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインの核酸配列を、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインをコードする核酸配列と融合させ、哺乳動物細胞へと導入して発現させる。精製の後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質を、マイクロプレートのウェルへと吸着させた。非特異的結合を防止するように、ウェルを、ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインを滴定し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質をあらかじめ吸着させたウェルへと添加した。一次抗体の結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼへとコンジュゲートされ、ヒトカッパ軽鎖を特異的に認識して、Ｆｃ交差反応性を回避する二次抗体を使用して検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼの基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、ウェルへと添加して、その吸光度を、４５０ｎｍにおいて測定し、５４０ｎｍにおいて補正した結合シグナルを視覚化した。ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインクローン、アイソタイプ対照又は陽性対照（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン又はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにおいて市販されている、抗マウスＮＫＧ２ＤクローンであるＭＩ−６及びＣＸ−５を含む）を、各ウェルへと添加した。
【０３６１】
アイソタイプ対照が、組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質への、最小限の結合を示す一方、陽性対照は、組換え抗原に、最も強力に結合した。全てのクローンにより作製された、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインは、ヒト、マウス及びカニクイザルの組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質にわたり、結合を裏付けたが、クローンにより、親和性が変動した。一般に、各抗ＮＫＧ２Ｄクローンは、ヒト（図３）及びカニクイザル（図４）の組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに、同様の親和性で結合したが、マウス組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ（図５）に、低親和性で結合した。
【０３６２】
ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインは、ＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合する
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞系を、ヒト又はマウスのＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインキメラ抗原受容体を発現するように操作した。ＮＫＧ２Ｄ結合性クローン、アイソタイプ対照又は陽性対照を、１００ｎＭの濃度において使用して、ＥＬ４細胞上において発現された細胞外ＮＫＧ２Ｄを染色した。抗体の結合は、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞を、フローサイトメトリーにより解析し、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞の、親ＥＬ４細胞と比較した、平均値蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して、バックグラウンドに対する倍数（ＦＯＢ）を計算した。
【０３６３】
全てのクローンにより作製された、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインは、ヒト及びマウスのＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に結合した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン又はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにおいて市販されている、抗マウスＮＫＧ２Ｄクローンである、ＭＩ−６及びＣＸ−５を含む）は、ＦＯＢが最良の結合シグナルをもたらした。各クローンについての、ＮＫＧ２Ｄ結合親和性は、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（図６）及びマウスＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（図７）の間において同様であった。
【０３６４】
［実施例２］  ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインは、天然リガンドの、ＮＫＧ２Ｄへの結合を遮断する
ＵＬＢＰ−６との競合
組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質を、マイクロプレートのウェルへと吸着させ、ウェルを、ウシ血清アルブミンによりブロッキングして、非特異的結合を低減した。飽和濃度のＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンを、ウェルへと添加するのに続き、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインクローンを添加した。２時間にわたるインキュベーションの後、ウェルを洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃコーティングウェルへの結合を維持する、ＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンを、ストレプトアビジンをコンジュゲートさせた西洋ワサビペルオキシダーゼ及びＴＭＢ基質により検出した。吸光度は、４５０ｎｍにおいて測定し、５４０ｎｍにおいて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインの、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質への特異的結合を、ウェル内において、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質への結合から遮断されたＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンの百分率から計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む）及び多様なＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインが、ＵＬＢＰ−６の、ＮＫＧ２Ｄへの結合を遮断したのに対し、アイソタイプ対照は、ＵＬＢＰ−６との競合を、ほとんど示さなかった（図８）。
【０３６５】
ＵＬＢＰ−６配列は、配列番号１０８により表される。
【０３６６】
【化３２】
2021533159.tif 000083
【０３６７】
ＭＩＣＡとの競合
組換えヒトＭＩＣＡ−Ｆｃタンパク質を、マイクロプレートのウェルへと吸着させ、ウェルを、ウシ血清アルブミンによりブロッキングして、非特異的結合を低減した。ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを、ウェルへと添加するのに続き、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインを添加した。インキュベーション及び洗浄の後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を使用して、ＭＩＣＡ−Ｆｃコーティングウェルへの結合を維持する、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを検出した。吸光度は、４５０ｎｍにおいて測定し、５４０ｎｍにおいて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインの、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質への特異的結合を、ＭＩＣＡ−Ｆｃコーティングウェルへの結合から遮断されたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンの百分率から計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む）及び多様なＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインが、ＭＩＣＡの、ＮＫＧ２Ｄへの結合を遮断したのに対し、アイソタイプ対照は、ＭＩＣＡとの競合を、ほとんど示さなかった（図９）。
【０３６８】
Ｒａｅ−１デルタとの競合
組換えマウスＲａｅ−１デルタ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した）を、マイクロプレートのウェルへと吸着させ、ウェルを、ウシ血清アルブミンによりブロッキングして、非特異的結合を低減した。マウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを、ウェルへと添加するのに続き、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインを添加した。インキュベーション及び洗浄の後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を使用して、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃコーティングウェルへの結合を維持する、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを検出した。吸光度は、４５０ｎｍにおいて測定し、５４０ｎｍにおいて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインの、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質への特異的結合を、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃコーティングウェルへの結合から遮断されたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンの百分率から計算した。陽性対照（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン又はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにおいて市販されている抗マウスＮＫＧ２ＤクローンであるＭＩ−６及びＣＸ−５を含む）及び多様なＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインクローンが、Ｒａｅ−１デルタの、マウスＮＫＧ２Ｄへの結合を遮断したのに対し、アイソタイプ対照抗体は、Ｒａｅ−１デルタとの競合を、ほとんど示さなかった（図１０）。
【０３６９】
［実施例３］  ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインクローンは、ＮＫＧ２Ｄを活性化する
ヒトＮＫＧ２Ｄ及びマウスＮＫＧ２Ｄの核酸配列を、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と融合させて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を得た。次いで、ギブソンアセンブリーを使用して、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ構築物を、レトロウイルスベクターへとクローニングし、レトロウイルスの産生のための、ｅｘｐｉ２９３細胞へとトランスフェクトした。ＥＬ４細胞に、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを、８μｇ／ｍＬのポリブレンと併せて含有するウイルスを感染させた。感染の２４時間後、ＥＬ４細胞内のＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲの発現レベルを、フローサイトメトリーにより解析し、細胞表面上において、高レベルのＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを発現するクローンを選択した。
【０３７０】
ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインがＮＫＧ２Ｄを活性化するのか否かを決定するために、これらを、マイクロプレートのウェルへと吸着させ、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ  ＥＬ４細胞を、抗体断片をコーティングしたウェル上、ブレフェルディンＡ及びモネンシンの存在下において、４時間にわたり培養した。ＮＫＧ２Ｄ活性化についての指標である細胞内ＴＮＦ−α産生について、フローサイトメトリーによりアッセイした。ＴＮＦ−α陽性細胞の百分率を、陽性対照により処置された細胞に照らして正規化した。全てのＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインは、ヒトＮＫＧ２Ｄ（図１１）及びマウスＮＫＧ２Ｄ（図１２）の両方を活性化した。
【０３７１】
［実施例４］  ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインは、ＮＫ細胞を活性化する
初代ヒトＮＫ細胞
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヒト末梢血バフィーコートから単離した。磁気ビーズによる陰性選択を使用して、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を、ＰＢＭＣから単離したところ、単離されたＮＫ細胞の純度は、典型的に、＞９５％であった。次いで、単離されたＮＫ細胞を、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインを吸着させた、マイクロプレートのウェルへと移す前に、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地において、２４〜４８分間にわたり培養し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルディンＡ及びモネンシンを含有する培地中において培養した。培養の後、ＣＤ３、ＣＤ５６及びＩＦＮ−γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用するフローサイトメトリーにより、ＮＫ細胞についてアッセイした。ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γについての染色を、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞内において解析して、ＮＫ細胞の活性化について評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−γ二重陽性細胞の増大は、１つの受容体ではなく、２つの活性化受容体のエンゲージメントを介して、より良好なＮＫ細胞の活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン及び陽性対照（例えば、配列番号１０１又は配列番号１０３により表される重鎖可変ドメイン及び配列番号１０２又は配列番号１０４により表される軽鎖可変ドメイン）は、アイソタイプ対照より高い、ＣＤ１０７ａ＋／ＩＦＮ−γ＋となるＮＫ細胞の百分率を示した（図１３及び図１４は、各々が、異なるドナーのＰＢＭＣを、ＮＫ細胞調製物のために使用する、２つの独立の実験からのデータを表す）。
【０３７２】
初代マウスＮＫ細胞
脾臓を、Ｃ５７Ｂ１／６マウスから得、７０μｍの細胞ストレーナーにより破砕して、単一の細胞懸濁液を得た。細胞をペレット化し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：＃Ａ１０４９２０１から購入した；１５５ｍＭの塩化アンモニウム、１０ｍＭのカリウム重炭酸、０．０１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁させて、赤血球を除去した。残りの細胞を、採取する前に、１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２と共に、７２時間にわたり培養し、ＮＫ細胞を単離するために調製した。次いで、磁気ビーズによる陰性枯渇法を使用して、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＮＫ１．１＋）を、脾臓細胞から単離したところ、典型的に、＞９０％の純度であった。精製されたＮＫ細胞を、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインを吸着させた、マイクロプレートのウェルへと移す前に、１００ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ−１５を含有する培地において、４８時間にわたり培養し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルディンＡ及びモネンシンを含有する培地中において培養した。ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインコーティングウェル内での培養後、ＣＤ３、ＮＫ１．１及びＩＦＮ−γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用するフローサイトメトリーにより、ＮＫ細胞についてアッセイした。ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γについての染色を、ＣＤ３−ＮＫ１．１＋細胞内において解析して、ＮＫ細胞の活性化について評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−γ二重陽性細胞の増大は、１つの受容体ではなく、２つの活性化受容体のエンゲージメントを介して、より良好なＮＫ細胞の活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン及び陽性対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにおいて市販されている抗マウスＮＫＧ２ＤクローンであるＭＩ−６及びＣＸ−５から選択）は、アイソタイプ対照より高い、ＣＤ１０７ａ＋／ＩＦＮ−γ＋となるＮＫ細胞の百分率を示した（図１５及び図１６は、各々が、異なるマウスを、ＮＫ細胞調製物のために使用する、２つの独立の実験からのデータを表す）。
【０３７３】
［実施例５］  ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインは、標的腫瘍細胞に対する細胞傷害作用を可能とする
ヒト及びマウスの初代ＮＫ細胞活性化アッセイは、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインを伴うインキュベーションの後において、ＮＫ細胞上の細胞傷害作用マーカーの増大を裏付けた。これが、腫瘍細胞溶解の増大へと橋渡しされるのか否かについて取り組むために、各ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインを、単一特異性抗体へと開発した、細胞ベースのアッセイを利用した。ＮＫ細胞を活性化するために、Ｆｃ領域が、１つのターゲティングアームとして使用される一方、Ｆａｂ断片領域（ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメイン）は、別のターゲティングアームとして作用した。ヒト由来であり、高レベルのＦｃ受容体を発現するＴＨＰ−１細胞を、腫瘍標的として使用し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＤＥＬＦＩＡ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｋｉｔを使用した。ＴＨＰ−１細胞を、ＢＡＴＤＡ試薬により標識し、培養培地中１ｍＬ当たり１０５個において再懸濁させた。次いで、標識付けされたＴＨＰ−１細胞を、マイクロ滴定プレートのウェル内、３７℃において、３時間にわたり、ＮＫＧ２Ｄ抗体及び単離マウスＮＫ細胞と組み合わせた。インキュベーション後、２０μＬの培養物上清を除去し、２００μＬのユーロピウム溶液と混合し、暗所内において、振とうしながら、１５分間にわたりインキュベートした。時間分解蛍光モジュールを装備した、ＰｈｅｒａＳｔａｒプレートリーダー（励起波長：３３７ｎｍ、発光波長：６２０ｎｍ）により、蛍光を、時間の経過とともに測定し、キットの指示書に従い、特異的溶解を計算した。
【０３７４】
陽性対照であるＵＬＢＰ−６（ＮＫＧ２Ｄに対する天然リガンドである）は、マウスＮＫ細胞による、ＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解の増大を示した。ＮＫＧ２Ｄ抗体がまた、ＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解も増大させたのに対し、アイソタイプ対照抗体は、特異的溶解の低減を示した。点線は、抗体を添加しない場合の、マウスＮＫ細胞による、ＴＨＰ−１細胞による特異的溶解を示す（図１７）。
【０３７５】
［実施例６］  ＮＫＧ２Ｄ抗体は、高度の熱安定性を示す
示差走査蛍光測定を使用して、ＮＫＧ２Ｄ結合性ドメインの融点についてアッセイした。外挿された見かけの融点は、典型的なＩｇＧ１抗体と比べて高い（図１８）。
【０３７６】
［実施例７］  ＮＫＧ２Ｄと、ＣＤ１６との架橋による、ヒトＮＫ細胞の、相乗的活性化
初代ヒトＮＫ細胞についての活性化アッセイ
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヒト末梢血バフィーコートから単離した。陰性磁気ビーズを使用して、ＮＫ細胞を、ＰＢＭＣから精製した（ＳｔｅｍＣｅｌｌ：＃１７９５５）。ＮＫ細胞は、フローサイトメトリーにより決定された通り、＞９０％のＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。次いで、活性化アッセイにおける使用の前に、１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ：＃２００−０２）を含有する培地中において、細胞を、４８時間にわたり拡大した。４℃において、一晩にわたり、１００ｐＬの滅菌ＰＢＳ中に、２μｇ／ｍＬ（抗ＣＤ１６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：＃３０２０１３）及び５μｇ／ｍＬ（抗ＮＫＧ２Ｄ、Ｒ＆Ｄ：＃ＭＡＢ１３９）の濃度で、９６ウェル平底プレートに抗体をコーティングするのに続き、過剰量の抗体を除去するために、ウェルを、十分完全に洗浄した。脱顆粒を評価するために、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２（ｈＩＬ２）及び１μｇ／ｍＬのＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：＃３２８６１９）を補充した培養培地中、１ｍＬ当たりの細胞５×１０５個において再懸濁させた。次いで、ウェル１つ当たりの細胞１×１０５個を、抗体によりコーティングしたプレートへと添加した。タンパク質輸送阻害剤である、ブレフェルディンＡ（ＢＦＡ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：＃４２０６０１）及びモネンシン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：＃４２０７０１）を、それぞれ、１：１０００及び１：２７０の最終希釈率において添加した。播種された細胞は、５％のＣＯ２中、３７℃において、４時間にわたりインキュベートした。ＩＦＮ−γについての細胞内染色のために、ＮＫ細胞を、抗ＣＤ３  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：＃３００４５２）及び抗ＣＤ５６  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：＃３１８３２８）により標識し、その後、固定し、透過処理し、抗ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：＃５０６５０７）により標識した。ＣＤ５６＋ＣＤ３−生細胞についてゲートをかけた後に、フローサイトメトリーにより、ＮＫ細胞を、ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γの発現について解析した。
【０３７７】
受容体組合せの相対効力について探索するために、プレート結合刺激による、ＮＫＧ２Ｄ又はＣＤ１６の架橋及び両方の受容体の共架橋を実施した。図１９（図１９Ａ〜１９Ｃ）に示される通り、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄの組合せ刺激は、ＣＤ１０７ａ（脱顆粒）レベル（図１９Ａ）及び／又はＩＦＮ−γ産生レベル（図１９Ｂ）の高度な上昇を結果としてもたらした。点線は、各受容体の、個々の刺激の相加効果を表す。
【０３７８】
ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞による、ＣＤ１０７ａレベル及び細胞内ＩＦＮ−γ産生は、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体、抗ＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体又は両方のモノクローナル抗体の組合せによるプレート結合刺激の４時間後に解析した。グラフは、平均値（ｎ＝２）±ＳＤを示す。図１９Ａは、ＣＤ１０７ａのレベルを裏付け、図１９Ｂは、ＩＦＮ−γのレベルを裏付け、図１９Ｃは、ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γのレベルを裏付ける。図１９Ａ〜１９Ｃに示されたデータは、５例の、異なる健常ドナーを使用する、５つの独立の実験を表す。
【０３７９】
［実施例８］  ｃ−ＭＥＴ  ＴｒｉＮＫＥＴは、腫瘍細胞上のｃ−ＭＥＴに結合する
ＨＴ２９ヒト結腸がん細胞系及びＨＣＴ−１１６ヒト結腸がん細胞系を使用して、ＴｒｉＮＫＥＴの、細胞表面ｃ−ＭＥＴへの結合について評価した。Ａ４９ＭＩ−デュオボディー−ＴｒｉＮＫＥＴを希釈し、ＨＴ２９細胞及びＨＣＴ−１１６細胞と共にインキュベートした。フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して、ＴｒｉＮＫＥＴ及び親モノクローナル抗体の結合パターンを検出した。フローサイトメトリーにより細胞について解析し、二次抗体だけの対照に対するＭＦＩ倍数を報告した。図３５及び図３６は、抗ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体、及び同じ抗ｃ−ＭＥＴに結合性Ｆａｂが組み込まれている対応するＴｒｉＮＫＥＴのそれぞれの、結腸がん細胞系であるＨＴ２９及びＨＣＴ−１１６への用量依存的結合を示す。ＴｒｉＮＫＥＴは、各細胞系に、対応するモノクローナル抗体と比較して、高度な最大結合レベルで、しかし最大半量結合濃度をわずかに増大させて（すなわち、親和性をわずかに低減して）結合したが、これらの差違は、ＨＴ２９について、より顕著であった。
【０３８０】
［実施例９］  ＴｒｉＮＫＥＴにより媒介された、短期のＮＫ細胞傷害作用
ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害作用アッセイを使用して、ｃ−ＭＥＴターゲティングＴｒｉＮＫＥＴが、初代ＮＫ細胞の、ｃ−ＭＥＴ陽性がん細胞に対する細胞傷害作用を誘発する能力を評価した。略述すると、密度勾配遠心分離を使用して、ＰＢＭＣを、ヒト末梢血バフィーコートから単離した。単離されたＰＢＭＣを洗浄し、磁気ビーズによる陰性選択技法を使用して、ＮＫ細胞を単離した。単離されたＮＫ細胞の純度は、典型的に、＞９０％のＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。単離されたＮＫ細胞は、サイトカインを伴わずに、一晩にわたり休眠させた。
【０３８１】
翌日、ｃ−ＭＥＴ陽性ヒトがん細胞系である、ＨＴ２９及びＨＣＴ−１１６を、培養物から採取した。がん細胞を、ＨＢＳにより洗浄し、製造元の指示書に従い、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡＤＯ  １１６）による標識付けのために、増殖培地中に、１ｍＬ当たりの細胞１０６個において再懸濁させた。標識付けの後、がん細胞を、ＨＢＳにより、３回にわたり洗浄し、培養培地中に、１ｍＬ当たりの細胞０．５〜１．０×１０５個において再懸濁させた。ＢＡＴＤＡにより標識付けされた細胞１００μｌを、９６ウェルプレートの各ウェルへと添加した。
【０３８２】
被験ＴｒｉＮＫＥＴ又は被験ｍＡｂを、培養培地中において希釈し、希釈されたＴｒｉＮＫＥＴ又はｍＡｂ  ５０μｌを、各ウェルへと添加した。休眠ＮＫ細胞を、培養物から採取し、洗浄し、所望のＥ：Ｔ比である、５：１を達成するように、培養培地中に、１ｍＬ当たりの細胞１０５〜２．０×１０６個において再懸濁させた。ＮＫ細胞５０μｌを、プレートの各ウェルへと添加して、各ウェル内の総培養物容量を、２００μｌとした。５％のＣＯ２と共に、３７℃において、２〜３分間にわたり、プレートをインキュベートした。
【０３８３】
培養の後、プレートをインキュベーターから取り出し、２００×ｇにおいて、５分間にわたる遠心分離により、細胞をペレット化した。培養物上清２０μｌを、製造元から提供された、清浄なマイクロプレートへと移した。単独でインキュベートされた標識付け細胞に由来する上清を使用して、ＴＤＡの自然放出を測定した。１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘと共にインキュベートされた標識付け細胞に由来する上清を使用して、標的細胞の最大溶解を測定した。インキュベーション２〜３時間前における、標識付け細胞に由来する上清を使用して、バックグラウンドを測定し、品質管理を目的として測定した。
【０３８４】
室温のユーロピウム溶液２００μｌを、培養物上清を含有する各ウェルへと添加した。プレートを、光から保護し、プレートシェーカー上、２５０ｒｐｍにおいて、１５分間にわたりインキュベートした。Ｖｉｃｔｏｒ  ３測定器又はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３Ｘ測定器を使用して、蛍光を測定した。
【０３８５】
蛍光レベルは、標的細胞の溶解を表した。特異的溶解％の値は、特異的溶解％＝（（試験放出量−自然放出量）／（最大放出量−自然放出量））×１００％の通りに計算した。
【０３８６】
図３７Ａ〜図３７Ｃ及び図３８は、抗ｃ−ＭＥＴ  ＴｒｉＮＫＥＴ又は抗ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体の存在下において、２時間以内の、ヒトＮＫ細胞による、ｃ−ＭＥＴ陽性標的細胞系の溶解を示す。図３７Ａ〜図３７Ｃ（図３７Ａは、ドナー１に由来するＮＫ細胞による、ｃ−ＭＥＴを発現するＨＴ２９結腸がん細胞の溶解を示す、折れ線グラフであり；図３７Ｂは、ドナー２に由来するＮＫ細胞による、ｃ−ＭＥＴを発現するＨＴ２９結腸がん細胞の溶解を示す、折れ線グラフであり；図３７Ｃは、ドナー３に由来するＮＫ細胞による、ｃ−ＭＥＴを発現するＨＴ２９結腸がん細胞の溶解を示す、折れ線グラフである）において、ＨＴ２９細胞を、３例の、異なる健常ヒトドナーに由来するＮＫエフェクター細胞による標的細胞として使用した。図３８は、単一のドナーに由来するＮＫ細胞により媒介された、ＨＣＴ−１１６標的細胞の溶解を示す。いずれの細胞系に対しても、複数のドナーにわたっても、ｃ−ＭＥＴ−ＴｒｉＮＫＥＴは、ナノモル未満のＥＣ５０値を示した。ＴｒｉＮＫＥＴは、対応するモノクローナル抗体が低活性である乃至は活性がないことと比較して、大きな最大特異的溶解及び最大効力をもたらした。
【０３８７】
参照による組込み
本明細書で参照された、特許文献及び学術論文の各々の全開示は、全ての目的のために、参照により、組み込まれる。
【０３８８】
均等物
本発明は、この精神又は本質的特徴から逸脱しない限りにおいて、他の特異的形態においても実施されうる。したがって、前出の実施形態は、全ての点において、本明細書において記載された本発明を限定するものではなく、例示的なものであると考えられるべきである。したがって、本発明の範囲は、前出の記載ではなく、付属の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の意味の中及び均等性の範囲内に収まる、全ての変化は、この中に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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