(57)【要約】本発明は、細胞試料中の生細胞および死細胞を検出するために有用な組成物および方法を提供する。方法は、標識に結合したマレイミド部分を含む標識化化合物に依存する。方法は、細胞試料を標識化化合物と接触させるステップの後に、細胞中で細胞内標的を標識化するステップをさらに含んでもよい。細胞内標的を標識化するステップは、細胞を固定および透過処理することを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、追加の細胞標的を標識化するステップをさらに含む。
2021529317.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞試料中の死細胞を生細胞と区別するための方法であって、
前記細胞試料を式Ｉの標識化化合物
【化６】
2021529317.tif 000010
（式中、Ｒが、標識、またはリンカーを介して結合した標識である）と、
前記標識化化合物が、死細胞および生細胞上の細胞表面タンパク質上の遊離チオール基に結合し、死細胞の細胞膜を選択的に通過し、前記死細胞中の細胞内タンパク質上の遊離チオール基に結合する条件下で接触させるステップと、
前記細胞試料中の前記標識を検出し、それによって、生細胞と比較して前記死細胞の標識化の増加を検出することによって、前記細胞試料中の死細胞を生細胞と区別するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記方法が、前記細胞試料を前記標識化化合物と接触させる前記ステップの後に、前記細胞中で細胞内標的を標識化するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞内標的を標識化する前記ステップが、前記細胞を固定および透過処理することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、追加の細胞標的を標識化するステップをさらに含む、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記標識が、直接標識である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記直接標識が、蛍光標識である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記条件が、約６．５〜約７．５のｐＨを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
死細胞の前記標識化が、生細胞の前記標識化の少なくとも約２０倍である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記接触させるステップが、前記細胞試料を前記標識化化合物と約１０〜約６０分間インキュベートすることを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞試料中の前記標識を検出する前記ステップが、フローサイトメータを使用して実行される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞試料が、血球細胞試料である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞試料が、ヒト由来である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
細胞試料中の死細胞を生細胞と区別するためのキットであって、
式Ｉの標識化化合物
【化７】
2021529317.tif 000011
（式中、Ｒが、標識、またはリンカーを介して結合した標識である）を含む容器と、
前記試料中の細胞を固定および透過処理するための試薬を含む１つ以上の容器と、
前記標識化化合物を使用して、細胞試料中の死細胞を生細胞と区別する方法に関する説明書と、を備える、キット。
【請求項１４】
前記標識が、直接標識である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記直接標識が、蛍光標識である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記標識化化合物が、乾燥形態である、請求項１３〜１５のいずれかに記載のキット。
【請求項１７】
フローサイトメータを使用して、細胞試料中の死細胞を生細胞と区別するために適する、請求項１３〜１６のいずれかに記載のキット。
【請求項１８】
前記細胞試料中の細胞内標的および／または追加の細胞標的を検出するための標識された結合剤をさらに含む、請求項１３〜１７のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年７月１２日に出願されたインド特許出願第２０１８１１０２６０７４号に基づく優先権を主張する。前述の出願の全内容は、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、細胞試料中の生細胞を死細胞と区別するために有用な組成物および方法に関する。組成物および方法は、細胞試料からの細胞内標的ならびに細胞中の細胞外標的を染色する方法との使用に適している。
【背景技術】
【０００３】
フローサイトメトリ染色を実施する場合、生細胞と死細胞を識別するためにＤＮＡ結合色素が使用されることが多い。７−ＡＡＤおよびヨウ化プロピジウムなどのＤＮＡ結合色素は生細胞を染色しないが、死細胞のＤＮＡには、それらの細胞および核膜が透過処理されるため、到達して非共有結合することができる。しかしながら、細胞内染色が望まれる場合、ＤＮＡ結合色素は使用することができず、これは、細胞内染色手順に使用される固定および透過処理の後、色素が死細胞から切り離され、生細胞を染色するためである。
【０００４】
細胞生存率の検出と組み合わせた細胞内染色を可能にするために開発された１つのアプローチは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル色素を使用して細胞内染色の前に細胞を染色して、生細胞と死細胞を識別することである。ＮＨＳ−エステル色素は、遊離ＮＨ２基に共有結合する。ＮＨＳ−エステル色素が細胞表面で発現したタンパク質のみを染色するため、生細胞は「低強度」で染色され、一方で、細胞が透過処理され、色素が細胞内タンパク質および細胞表面タンパク質の両方を結合することができるため、死細胞は「高強度」で染色される。しかしながら、ＮＨＳ−エステル色素は水溶性ではなく、比較的不安定である。結果として、色素は、個々のアッセイに好適な体積に分割され、凍結乾燥組成物として−２０℃で保持され、使用直前にＤＭＳＯ中に再懸濁されなければならない。
【０００５】
フローサイトメトリを使用するアッセイなど、新しく改良された高速でハイスループットな細胞生存率アッセイの開発が、引き続き必要である。これらの用途で有用な試薬組成物の同定は、特に重要である。本発明は、これらおよび他のニーズに対応する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、細胞試料中の死細胞を生細胞と区別するための方法を提供する。方法は、細胞試料を式Ｉの標識化化合物
【化１】
2021529317.tif 000003
（式中、Ｒが、標識、またはリンカーを介して結合した標識である）と、標識化化合物が、死細胞および生細胞上の細胞表面タンパク質上の遊離チオール基に結合し、死細胞の細胞膜を選択的に通過し、死細胞中の細胞内タンパク質上の遊離チオール基に結合する条件下で接触させるステップと、細胞試料中の標識を検出し、それによって、生細胞と比較して死細胞の標識化の増加を検出することによって、細胞試料中の死細胞を生細胞と区別するステップと、を含む。
【０００７】
方法は、細胞試料を標識化化合物と接触させるステップの後に、細胞中で細胞内標的を標識化するステップをさらに含んでもよい。細胞内標的を標識化するステップは、細胞を固定および透過処理することを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、追加の細胞標的を標識化するステップをさらに含む。
【０００８】
多数の標識が、本発明の方法で使用され得る。標識は、蛍光標識などの直接標識であってもよい。
【０００９】
いくつかの実施形態では、方法は、約６．５〜約７．５のｐＨを含む条件下で実行される。
【００１０】
本発明の方法は、生細胞の標識化の少なくとも約２０倍、しばしば生細胞の標識化の少なくとも５００倍である、死細胞の標識化をもたらし得る。
【００１１】
いくつかの実施形態では、接触させるステップは、細胞試料を標識化化合物と約１０〜約６０分間インキュベートすることを含む。細胞試料中の標識を検出するステップは、フローサイトメータを使用して実行され得る。
【００１２】
細胞試料は、多数のタイプのうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、細胞試料は、例えば、ヒト由来の血球細胞試料である。
【００１３】
本発明は、細胞試料中の死細胞を生細胞と区別するためのキットも提供する。キットは、式Ｉの標識化化合物
【化２】
2021529317.tif 000004
（式中、Ｒが、標識、またはリンカーを介して結合した標識である）を含む容器と、試料中の細胞を固定および透過処理するための試薬を含む１つ以上の容器と、標識化化合物を使用して、細胞試料中の死細胞を生細胞と区別する方法に関する説明書と、を備える。
【００１４】
標識は、直接標識、例えば、蛍光標識であってもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、標識化化合物は、乾燥形態で提供される。キットは、フローサイトメータを使用して、細胞試料中の死細胞を生細胞と区別するのに好適であり得る。キットは、細胞試料中の細胞内標的および／または追加の細胞標的を検出するための標識された結合剤をさらに含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】（図１Ａ）本発明の標識化化合物、すなわち、ＶｉａＫｒｏｍｅ  ４０５、ＶｉａＫｒｏｍｅ  ５６１、ＶｉａＫｒｏｍｅ  ６３８、またはＶｉａＫｒｏｍ  ８０８を使用したフローサイトメトリによって検出されるように、生Ｊｕｒｋａｔ細胞と比較して、死Ｊｕｒｋａｔ細胞のより強い蛍光を示すヒストグラムを示す。（図１Ｂ）バイオレット染料、赤色染料、または遠赤色染料で標識化したＮＨＳ−エステルで染色した同じ試料の結果を示す。
【図２】末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を本発明の標識化化合物、ＶｉａＫｒｏｍｅ  ４０５、ＶｉａＫｒｏｍｅ  ５６１、ＶｉａＫｒｏｍｅ  ６３８、またはＶｉａＫｒｏｍｅ  ８０８で染色したとき、生存ＰＢＭＣと比較して、死ＰＢＭＣからのより強い蛍光が検出されたことを示す。
【図３Ａ】本発明の標識化化合物が、細胞内抗原染色と組み合わせて使用した場合でさえ、生細胞を死細胞と区別できたことを示す代表的なデータセットを示す。具体的には、図３Ａは、ＶｉａＫｒｏｍｅ  ４０５（「ＶＫ４０５」）単独で（Ｉ）、またはマルチカラー染色で（ＩＩ）、染色したＰＢＭＣの結果を示す。図３Ｂは、ＣＤ４５＋リンパ球［図３Ｂ（Ｉ）、ＣＤ４５＋細胞］、グランザイムＢを発現するＴ細胞［図３Ｂ（ＩＩ）、ＣＤ３＋ＧＢ＋細胞］、ＣＤ７９ａを発現するＢ細胞［図３Ｂ（ＩＩＩ）、ＣＤ１９＋ＣＤ７９ａ＋細胞）、および単球［図３Ｂ（ＩＶ）、ＣＤ１４＋細胞］などの集団の表現型解析が、ＶＫ４０５の存在下または非存在下で類似していることを示す。
【図３Ｂ】本発明の標識化化合物が、細胞内抗原染色と組み合わせて使用した場合でさえ、生細胞を死細胞と区別できたことを示す代表的なデータセットを示す。具体的には、図３Ａは、ＶｉａＫｒｏｍｅ  ４０５（「ＶＫ４０５」）単独で（Ｉ）、またはマルチカラー染色で（ＩＩ）、染色したＰＢＭＣの結果を示す。図３Ｂは、ＣＤ４５＋リンパ球［図３Ｂ（Ｉ）、ＣＤ４５＋細胞］、グランザイムＢを発現するＴ細胞［図３Ｂ（ＩＩ）、ＣＤ３＋ＧＢ＋細胞］、ＣＤ７９ａを発現するＢ細胞［図３Ｂ（ＩＩＩ）、ＣＤ１９＋ＣＤ７９ａ＋細胞）、および単球［図３Ｂ（ＩＶ）、ＣＤ１４＋細胞］などの集団の表現型解析が、ＶＫ４０５の存在下または非存在下で類似していることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、細胞試料中の生細胞を死細胞と区別するために有用な方法を提供する。方法は、標識に結合したマレイミド部分を含む標識化化合物に依存する。
【００１８】
標識化化合物
本発明の標識化化合物は、標識に結合したマレイミド部分を含み、式Ｉの一般式を有する。
【化３】
2021529317.tif 000005
式中、Ｒは、標識、またはリンカーに結合した標識である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、標識化化合物は、生細胞の細胞膜を通して受動的に拡散せず、すなわち、それらは、膜が透過処理されない限り、生細胞の細胞膜を通過しない。いくつかの実施形態では、Ｒは、式ＩＩの９−アミノアクリジンを含まない。
【化４】
2021529317.tif 000006
【００２０】
マレイミドとチオールの反応は、タンパク質およびペプチドなどの生体分子のバイオコンジュゲーションおよび標識化に有用である。マレイミドは、遊離チオールに対して高い選択性を示す求電子化合物である。遊離チオールは、システイン残基上のタンパク質中に存在する。システイン残基は一般に、シスチン架橋を形成し、これは、タンパク質の三次構造を安定化する。これらのジスルフィドは、マレイミドと反応しない。したがって、反応から酸素を排除するために、結合の前にジスルフィドを低減する必要がある場合がある。
【００２１】
本発明の標識化化合物は、固定剤で試料を処理した後でさえ、細胞タンパク質に結合したままである。したがって、それらは、細胞がさらなる分析（例えば、以下に記載される細胞内標的の標識化）のために固定されるアッセイでの使用に好適である。標識化化合物は、固定可能な標識化化合物または固定可能な生存率解析用色素と呼ばれることがある。
【００２２】
標識は、直接的または間接的に検出され得る分子または部分である。直接検出可能な標識は、その存在または非存在が検出され得るように、直接可視化および／もしく測定されるか、または別の方法で同定される。間接的に検出可能な標識は、それ自体が検出可能ではないが、標識化化合物が標的タンパク質中の遊離チオールと反応した後、検出可能な二次標識の結合を必要とする。標識の例としては、蛍光分子、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、粒子（例えば、磁性粒子）、金属タグ、発色団、蛍光体、化学発光体、間接的に検出可能な標識（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシン）として有用な特異的結合分子などが挙げられる。
【００２３】
典型的な実施形態では、標識は蛍光標識であり、これは、その固有の蛍光特性を介して検出され得る任意の分子である。好適な蛍光標識としては、フィコエリスリン（ＰＥ）、フィコエリスリンシアニン７（ＰＣ７）、フィコエリスリンテキサスレッド（ＥＣＤ（登録商標））、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣレッド６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣレッド７０５オレゴングリーン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、およびルシフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用するための追加の標識としては、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（ＡＰＣ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０（ＡＡ７５０）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０など）、結合したポリマーベースの色素、デンドリマーベースの色素、量子ドット、ならびにポリマードットが挙げられる。
【００２４】
標識は、マレイミド部分に直接、またはリンカーを介して結合され得る。好適なリンカーは、当業者に周知であり、例えば、特定の標識に依存する。好適なリンカーの例としては、ＳＭＣＣ、スルホＳＭＣＣなどが挙げられる。
【００２５】
したがって、標識化化合物は、比較的大きい分子量を有し、これにより標識化化合物は、透過処理なしでは細胞膜を通過することができなくなり、したがって、それらは、生細胞ではなく死細胞を主に染色する。陽性の読み取り値（死細胞の染色）は、死細胞を定量化するためにより効率的かつ正確である。したがって、フローサイトメトリなどのマルチパラメータ技術では、生細胞の低染色は、データセットの補正をより少なくして分析を容易にし、他のパラメータの測定の精度を高める。
【００２６】
標識化化合物は、参照により本明細書に組み込まれる当該技術分野で既知の方法（例えば、Ｄｏｌｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５６：５１２−５５６およびＳｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｏｒｇ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ  ７：３４００−３４０６）に従って調製され得る。代替的に、標識化化合物は、ＰｒｏｍｏＫｉｎｅおよびＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔなどの商業ベンダーから購入され得る。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本発明の標識化化合物は、以下のような合成スキームに従って、マレイミドを、ＳＭＣＣリンカーを介して標識に結合させることによって作製され得る。
【化５】
2021529317.tif 000007
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明の標識化化合物は、３００ｇ／ｍｏｌ超、例えば、４００ｇ／ｍｏｌ超、５００ｇ／ｍｏｌ超、または６００ｇ／ｍｏｌ超である分子量を有する。いくつかの実施形態では、標識化化合物は、３００ｇ／ｍｏｌ〜３０００ｇ／ｍｏｌ、例えば、６００ｇ／ｍｏｌ〜２０００ｇ／ｍｏｌ、または７００ｇ／ｍｏｌ〜１８００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。
【００２９】
場合によっては、いくつかの実施形態では、本発明で使用される標識化化合物は、ＶｉａＫｒｏｍｅ  ４０５、ＶｉａＫｒｏｍｅ  ５６１、ＶｉａＫｒｏｍｅ  ６３８、およびＶｉａＫｒｏｍｅ  ８０８のうちの１つである。これらの標識化化合物の各々は、上記のように標識に結合したマレイミドを含み、その分子量は以下のとおりである。
【表１】
2021529317.tif 000008
化合物の励起および発光波長は以下のとおりである。
【表２】
2021529317.tif 000009
【００３０】
生細胞および死細胞を検出するためのアッセイ
本発明の標識化化合物は、細胞試料中の生細胞を死細胞と区別するために便利に使用される。本発明のアッセイでは、生細胞および死細胞の両方の細胞表面タンパク質が、標識化化合物によって染色される。死細胞では、細胞膜が透過処理されるため、細胞内タンパク質も染色され、死細胞の細胞内標的へのアクセスの増加を標識化化合物にもたらす。結果として、死細胞は、生細胞と比較して、標識化およびシグナル強度が増加した。死細胞からのシグナルの強度は、典型的には、生細胞からのシグナルの少なくとも約１０倍、通常約５０倍超、およびしばしば約２５０倍超、および最も頻繁には約１５００倍超強い。
【００３１】
本発明の標識化化合物と遊離チオールとの間の反応は、中性ｐＨで最も効率的である。典型的な実施形態では、標識化化合物は、約６．０〜約８．０、通常約６．５〜約７．５、およびしばしば約７．２のｐＨで細胞試料と接触する。
【００３２】
典型的なアッセイでは、細胞試料からの細胞は沈降し、適切な緩衝液（例えば、ＰＢＳ）中で所望の細胞密度、例えば、約０．５×１０６〜約１０×１０６細胞／ｍｌ、しばしば約１×１０６〜約２×１０６細胞／ｍｌまで再懸濁される。染色体積は、約５０〜約１０００ｕｌに調節され得る。次いで、細胞を含む溶液は、本発明の標識化化合物と接触する。標識化化合物は、乾燥形態で（例えば、反応容器内の乾燥スポットとして）提供され得るか、または溶液中に添加され得、この溶液は、緩衝液、塩などの追加の構成成分を含んでもよい。標識化化合物が乾燥状態で提供される場合、典型的には凍結乾燥される
【００３３】
試料中の細胞の十分な標識化を確実にするために、細胞試料中の標識化化合物の最終濃度が選択される。典型的な実施形態では、標識化化合物の最終濃度は、約０．１５μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、通常約１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌである。次いで、試料は、十分な標識を確実にする時間にわたって、標識化化合物とインキュベートされる。インキュベーション時間は、典型的には約１０〜約６０分、通常約２０〜約３０分である。当業者であれば、例えば、細胞試料の性質、検出可能な標識などに依存する、使用に適切な溶液、十分な標識化を達成するために必要な標識化化合物の量およびインキュベーション時間を容易に決定することができる。
【００３４】
細胞試料は、生存率が試験される細胞を含む任意の試料であってもよい。試料は、真核細胞培養物（例えば、動物、植物、酵母、もしくは真菌細胞）、または原核細胞培養物（例えば、細菌細胞）を含み得る。試料はまた、対象由来であってもよい。対象由来の試料の非限定的な例としては、血漿、血清、全血、尿、精液、乳、涙液、唾液、唾、粘液、髄液、リンパ液、口腔スワブ、腟スワブ、直腸スワブ、吸引物、針生検、または例えば手術もしくは剖検によって得られた組織の組織切片が挙げられる。対象は、ヒト（例えば、疾患に罹患している患者）、例えば、サル、ウシ、またはウマを含む商業的に有意な哺乳動物であり得る。試料はまた、例えば、イヌまたはネコを含む、家庭用ペットからも得られ得る。いくつかの実施形態では、対象は、疾患の動物モデルとして使用されるか、または薬物スクリーニングのための実験動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットである。
【００３５】
本明細書に開示される標識化化合物は、生細胞および死細胞を区別するために有利である。例えば、調製中に溶媒としてＤＭＳＯを必要とするＮＨＳ−エステル色素など、この目的のために使用される多くの他の従来の染色剤とは異なり、本明細書に開示される標識化化合物は、使用前に水溶液に溶解され得る。ＤＭＳＯの代わりに水溶液を使用して標識化化合物を溶解することにより、ＤＭＳＯに関連する多くの有害な影響、例えば、ＤＭＳＯおよびそれに溶解した物質がユーザの皮膚に浸透することを回避することができる。さらに、本明細書に開示される標識化化合物は、比較的安定しており、少なくとも４日間室温で保存され得、したがって、使用直前の再懸濁を必要としない。
【００３６】
細胞内標的の標識化
本発明の方法は、細胞中で細胞内標的を標識化するステップをさらに含み得る。そのようなステップは、典型的には、タンパク質、脂質、および核酸分子を架橋するのに充分な量の固定剤と、試料を接触させることを含み得る、固定（または保存）ステップを含む。試料中の細胞を固定するための試薬は、当業者に周知である。例としては、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒドなどのアルデヒド系固定剤が挙げられる。その他の固定剤としては、エタノール、メタノール、四酸化オスミウム、二クロム酸カリウム、クロム酸、および過マンガン酸カリウムが挙げられる。いくつかの実施形態では、固定剤は、加熱、凍結、乾燥、架橋剤、または酸化剤であってもよい。
【００３７】
典型的な実施形態では、細胞は、細胞質膜および任意に核膜などの他の膜を破壊または溶解する透過処理試薬と接触する。細胞を透過処理するために使用される透過処理試薬（例えば、洗剤）は、様々な要因に基づいて選択され得、例えば、イオン性または非イオン性洗剤であり得る。好適な界面活性剤は、細胞を透過処理し、検出されるタンパク質の表面エピトープ完全性を保持するものである。洗剤は、典型的には非イオン性洗剤である。例示的な非イオン性洗剤としては、ジギトニンおよびエトキシル化（ｅｔｈｙｏｘｙｌａｔｅｄ）オクチルフェノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）  Ｘ−１００）が挙げられる。他の有用な透過処理剤（例えば、洗剤）としては、サポニン、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）、オクチルフェノキシポリ（エチレン−オキシ）エタノール（ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−６３０）、またはＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、Ｂｒｉｊ−５８、およびＰＬＵＲＡＦＡＣ（登録商標）Ａ−３８（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ）またはＰＬＵＲＡＦＡＣ（登録商標）Ａ−３９（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ）として市販されている直鎖アルコールエトキシレートが挙げられる。いくつかの実施形態では、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウム、またはＮ−ラウロイルサルコシンなどのイオン性洗剤が使用され得る。
【００３８】
細胞が固定および透過処理された後、それらは、所望の標的分析物に特異的に結合する標識された結合剤と接触する。これらの目的のために有用な結合剤（例えば、抗体）は、当業者に周知である。標識された結合剤は、その存在または非存在が、当業者に周知の手段を使用して検出可能なシグナルによって検出され得るように、可視化および／もしくは測定され得るか、または別の方法で同定され得る。例としては、蛍光分子、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、粒子（例えば、磁性粒子）、金属タグ、発色団、蛍光体、化学発光体、特異的結合分子（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシン）などが挙げられる。
【００３９】
固定ステップおよび透過処理ステップは、細胞内標的および細胞外標的の両方を染色するために使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞内標的および細胞外標的の両方の染色は、遠心分離の必要なく、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手可能なＰｅｒＦｉｘ−ｎｃ（登録商標）、Ｎｏ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ａｓｓａｙキットを使用して達成される。ＰｅｒＦｉｘ−ｎｃ（登録商標）、Ｎｏ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ａｓｓａｙキットを細胞内および／または細胞外染色で使用する手順は、ＵＳ２０１６／０２９９１３９に記載されており、その関連する開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
測定システム
細胞試料中の生細胞および死細胞を検出するために本発明の標識化化合物を使用した測定システムは周知である。そのようなシステムの例として、フローサイトメータ、スキャニングサイトメータ、イメージングサイトメータ、イメージングフローサイトメータ、蛍光顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡、および質量サイトメータが挙げられる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、フローサイトメトリを使用して蛍光を検出してもよい。この使用に好適な多数のデバイスが入手可能であり、当業者に既知である。非限定的な例としては、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｎａｖｉｏｓ（登録商標）、Ｇａｌｌｉｏｓ（登録商標）、Ａｑｕｉｏｓ（登録商標）、およびＣｙｔｏＦＬＥＸ（登録商標）フローサイトメータが挙げられる。
【００４２】
キット
本発明の方法で有用な試薬は、キットの形態でも生成され得る。そのようなキットは、乾燥形態（例えば、容器の壁上の乾燥スポットとして）または水溶液中の本発明の標識化化合物、ならびに生細胞および死細胞を検出し、かつ細胞中の細胞内標的を染色するために必要な他の試薬、緩衝液、固定剤、および透過処理溶液などを含む容器を備える、パッケージ化された組み合わせである。キットはまた、これらの試薬を使用して方法を実施する方法に関する説明書を含んでもよい。
【実施例】
【００４３】
以下の実施例は、例示のために提供されるが、請求項に係る発明を限定するものではない。
【００４４】
実施例１：生ＪＵＲＫＡＴ細胞および死ＪＵＲＫＡＴ細胞の染色
本発明のＶｉａＫｒｏｍｅ４０５、ＶｉａＫｒｏｍｅ５６１、ＶｉａＫｒｏｍｅ６３８、およびＶｉａＫｒｏｍｅ８０８の標識化化合物（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．Ｂｒｅａ，ＣＡから入手可能）を使用して、死Ｊｕｋａｔ細胞と生Ｊｕｋａｔ細胞を区別する。簡潔に述べると、プロトコルは以下のとおりであった。
１．５５℃の水槽で１０分間加熱したＪｕｒｋａｔ細胞を、５×１０６細胞／ｍｌで調製し、１００μｌ／試験（５×１０５細胞／試験）を使用した。
２．４つの異なる標識化化合物、すなわち、ＶｉａＫｒｏｍｅ  ４０５、ＶｉａＫｒｏｍｅ  ５６１、ＶｉａＫｒｏｍｅ  ６３８、およびＶｉａＫｒｏｍｅ  ８０８の各々を１Ｘ  ＰＢＳに溶解し、これらの溶液を試験当たり２．５μｇの標識化化合物の用量で細胞試料に添加した。
３．ステップ２の後に形成された混合物をボルテックスして混合した。
４．ステップ３からの試料を、光から保護して１８〜２５℃で２０分間インキュベートした
５．３ｍｌのＰＢＳ  １Ｘを各試料に添加した。
６．次いで、試料を３００Ｇで５分間遠心分離した。
７．試料からの上清を吸引によって除去した。
８．５００μｌのＰＢＳ  １Ｘ／ホルムアルデヒド（ＦＡ）０．５％を細胞に添加し、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメータ上で試料を分析した。
結果が図１に示される。結果は、実施例１に従って生成した４つの標識化化合物の各々で染色した場合、死Ｊｕｒｋａｔ細胞が、生Ｊｕｒｋａｔ細胞よりも強い蛍光を示したことを示す。色素：バイオレット染料、赤色染料、および遠赤色染料のうちの１つに結合したＮＨＳエステルである化合物を、商業的供給源から得て、加熱したＪｕｒｋａｔ細胞を染色するための対照として使用した。これらのＮＨＳエステル系化合物は、死細胞を選択的に染色することが知られている。これらの対照を使用した実験からの結果は、本発明の標識化化合物を使用した実験からの結果と類似していた。すなわち、死Ｊｕｒｋａｔ細胞は、生Ｊｕｒｋａｔ細胞よりも強い蛍光を示した。
【００４５】
実施例２：生ＰＢＭＣおよび死ＰＢＭＣの細胞内および細胞外染色
ＶｉａＫｒｏｍｅ  ４０５、ＶｉａＫｒｏｍｅ５６１、ＶｉａＫｒｏｍｅ  ６３８、またはＶｉａＫｒｏｍｅ  ８０８で標識された本発明の標識化化合物を使用して、生細胞を死んだ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と区別した。簡潔に述べると、プロトコルは以下のとおりであった。
１．５５℃の水槽で１０分間加熱したＰＢＭＣを、５×１０６細胞／ｍｌで調製し、そのうちの１００μｌを試験当たりに使用した（５×１０５細胞／試験）。
２．実施例１に記載される標識化化合物をＰＢＳ  １Ｘに溶解し、各細胞試料に試験当たり２．５μｇの標識化化合物の用量でこれらの溶液を添加した。
３．ステップ２から形成された混合物をボルテックスして混合した。
４．ステップ３からの試料を、光から保護して１８〜２５℃で２０分間インキュベートした。
５．３ｍｌのＰＢＳ  １Ｘを各試料に添加した。
６．次いで、試料を３００Ｇで５分間遠心分離した。
７．試料からの上清を吸引によって除去した。
８．５００μｌのＰＢＳ  １Ｘ／ホルムアルデヒド（ＦＡ）０．５％を添加して細胞を再懸濁し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ（登録商標）フローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）上で試料を分析した。
【００４６】
結果が図２に示され、これは、死ＰＢＭＣもまた、生ＰＢＭＣよりも強い蛍光シグナルを示したことを示す。
【００４７】
実施例３：生ＰＢＭＣおよび死ＰＢＭＣならびに細胞内および細胞外標的の染色
本実施例は、本発明の標識化化合物が、細胞内および／または細胞外標的の染色と組み合わせて使用され得ることを示す。標識化化合物は、ＰｅｒＦｉｘ−ｎｃ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ）を使用した固定および透過処理後でさえ、生細胞と死細胞を区別することができた。ＰＢＭＣ試料を標識化化合物で染色し、続いて洗浄して、結合していない標識化化合物を除去した。その後、以下のようなプロトコルに従って、細胞を固定および透過処理して、蛍光色素結合抗体で細胞内および細胞外抗原を染色した。
１．記載されるように加熱したＰＢＭＣを、１×１０７細胞／ｍｌで調製し、そのうちの１００μｌを試験当たりに使用した（５×１０５細胞／試験）。
２．実施例２に記載される標識化化合物を１Ｘ  ＰＢＳに溶解し、各細胞試料に試験当たり２．５μｇの標識化化合物の用量でこれらの溶液を添加した。
３．ステップ２の後に形成された混合物をボルテックスして混合した。
４．ステップ３からの試料を、光から保護して１８〜２５℃で（２０分間）インキュベートした
５．３ｍｌの１Ｘ  ＰＢＳを各試料に添加した。
６．次いで、ステップ５の後の試料を３００Ｇで５分間遠心分離した。
７．５０μｌの１００％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を各試料に添加した。
８．  ２．５μｌのＰｅｒＦｉｘ−ｎｃ試薬１（固定液）を各試料に添加して混合した。
９．ステップ８からの混合物を、光から保護して１８〜２５℃で１５分間インキュベートした
１０．１５０μｌのＰｅｒＦｉｘ−ｎｃ試薬２（透過処理溶液）と抗体複合体（１０μｌのグランザイムＢ−ＦＩＴＣ（ＰＮ  Ｂ４６０３８、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、１０μｌのＣＤ１９−ＰＥ（ＰＮ  Ａ０７７６９、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、５μｌのＣＤ１４−ＥＣＤ（ＰＮ  Ｂ９２３９１、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、５μｌのＣＤ７９ａ−ＰＣ５．５（ＰＮ  Ｂ４２０１８  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、５μｌのＣＤ３−ＰＣ７（ＰＮ７３７６５７、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、および５μｌのＣＤ４５−ＫｒＯ（ＰＮ  Ａ９６４１６、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を試料に添加し、混合した。
１１．ステップ１０で形成された混合物を、光から保護して１８℃〜２５℃で１５分間インキュベートした
１２．３ｍｌのＰｅｒＦｉｘ−ｎｃ試薬３（１０Ｘ）を１Ｘ（水中）に希釈し、上記の混合物に添加した。
１３．次いで、混合物を５００Ｇで５分間遠心分離した。
１４．各試料からの上清を吸引によって除去した。
１５．５００μｌのＰＢＳ  １Ｘ／ホルムアルデヒド（ＦＡ）０．５％を細胞に添加し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（登録商標）フローサイトメータ上で試料を分析した。
【００４８】
結果が図３Ａおよび図３Ｂに示される。図３Ａの左のパネルは、本発明の標識化化合物、ＶｉａＫｒｏｍｅ  ４０５で染色された細胞の結果を示す。図３Ａの右のパネルは、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１９、および抗ＣＤ１４のそれぞれの染色を示す。図３Ｂにおいて、細胞を標識化化合物で染色した後、複合体のうちの１つで染色した。結果は、本発明の標識化化合物が、細胞内染色用の緩衝液を使用して試料を処理した後でさえ、死細胞の検出を可能にすること、および本発明の標識化化合物を単独で、または抗体複合体と組み合わせて使用したときに、死細胞の割合が類似していたことを示す。さらに、特異的標的（例えば、ＣＤ４５）を発現する細胞の割合も、抗体複合体単独で染色された細胞試料と、抗体複合体およびＶｉａＫｒｏｍｅ  ４０５で染色された細胞試料との間で類似していた。したがって、本発明の標識化化合物を使用した染色手順は、特異的抗体／蛍光色素複合体によって、特異的抗原（細胞内および細胞外）を検出する可能性を変化させない。
【００４９】
本明細書に記載される実施例および実施形態が、例示のみを目的としており、その観点からの様々な修正または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものであることが理解される。本明細書で引用される全ての公表文献、特許、および特許出願は、あらゆる目的で参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2021529317.tif 000012
【図２】
2021529317.tif 000013
【図３Ａ】
2021529317.tif 000014
【図３Ｂ】
2021529317.tif 000015
【国際調査報告】
2021529317.tif 000016
2021529317.tif 000017
2021529317.tif 000018