(57)【要約】  ８０〜２０重量％のブルーベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｃｙａｎｏｃｏｃｃｕｓ）種、ビルベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｉｓ）種、またはその両方のブルーベリーまたはビルベリーと；２０〜８０重量％のスピノサスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｐｉｎｏｓａ）種のスローベリーとの混合物のポリフェノールに富む抽出物を含む、下痢症治療のための組成物が提供される。その他の組成物、ならびに下痢症治療のための組成物の作製方法および使用方法が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）８０〜２０重量％のブルーベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｃｙａｎｏｃｏｃｃｕｓ）種、ビルベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｉｓ）種、またはその両方のブルーベリーまたはビルベリーと、
ｂ）２０〜８０重量％のスピノサスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｐｉｎｏｓａ）種のスローベリーと
の混合物のポリフェノールに富む抽出物を含む、下痢症治療のための組成物。
【請求項２】
前記混合物が、ｃ）ブラックチョークベリー（Ａｒｏｎｉａ  ｍｅｌａｎｏｃａｒｐａ）種のチョークベリーをさらに含む、請求項１または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。
【請求項３】
前記混合物が、７０〜３０重量％のブルーベリーまたはビルベリーを含む、請求項１または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。
【請求項４】
前記混合物が、６０〜４０重量％のブルーベリーまたはビルベリーを含む、請求項１または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。
【請求項５】
前記混合物が、５０：５０の重量比のブルーベリーまたはビルベリーとスローベリーとを含む、請求項１または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。
【請求項６】
前記混合物中の前記ブルーベリー、ビルベリー、スローベリー、またはチョークベリーのうちの１つまたは複数のものが粉末の形態である、請求項１または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。
【請求項７】
前記混合物中の前記ブルーベリー、ビルベリー、スローベリー、またはチョークベリーのうちの１つまたは複数のものが凍結乾燥粉末の形態である、請求項１または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。
【請求項８】
ブルーベリー、ビルベリー、スローベリー、またはチョークバリー（ｃｈｏｋｅｂａｒｒｙ）のうちの１つまたは複数のものが、生鮮ベリー、冷凍ベリー、乾燥ベリー、もしくは凍結乾燥ベリー、またはその組合せの形態である、請求項１または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。
【請求項９】
前記抽出物が、４０℃未満の温度で実施したエタノール抽出物である、請求項１または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。
【請求項１０】
シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、または没食子酸エピガロカテキンのうちの１つまたは複数のものを含む、請求項１または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容される担体または添加剤をさらに含む、請求項１または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。
【請求項１２】
ポリフェノールに富む抽出物を作製する方法であって、
１．５０〜７０％のアルコールとブルーベリー、ビルベリー、スローベリー、またはチョークベリーとを混合して混合物を形成することと、
２．前記混合物を室温で１時間〜９０日間の範囲の時間にわたって、毎日回転させながらインキュベートして、インキュベートした混合物を形成することと、
３．インキュベートした前記混合物から固形物をろ過または遠心分離し、インキュベートした前記混合物のフロースルーを収集することと、
４．任意選択で、段階３の前記フロースルーとベリー粉末とを混ぜ合わせて、第二の混合物を形成することと、
５．任意選択で、前記第二の混合物を室温で１〜３時間インキュベートして、第二のインキュベートした混合物を形成することと、
６．任意選択で、前記第二のインキュベートした混合物から固形物をろ過または遠心分離し、上清を収集することと、
７．段階３の前記フロースルーまたは段階４の前記上清から真空下、４０℃以下の温度で、２０％以下などの所望のアルコール濃度までアルコールを蒸発させて、前記ポリフェノールに富む抽出物を形成することと
を含む、方法。
【請求項１３】
シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、もしくは没食子酸エピガロカテキン、その塩もしくはそのグリコシラートをそれぞれ少なくとも０．２重量％と、薬学的に許容される担体または添加剤とを含む、下痢症治療のための組成物。
【請求項１４】
シアニジン：デルフィニジン：没食子酸エピカテキン：没食子酸エピガロカテキンの重量比が、３００〜７００：１００〜３０：０．５〜２：２００〜５０である、請求項１３または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記シアニジン：デルフィニジン：没食子酸エピカテキン：没食子酸エピガロカテキンの重量比が、４００〜６００：９０〜５０：０．７５〜１．５：１７５〜１００である、請求項１３または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記シアニジン：デルフィニジン：没食子酸エピカテキン：没食子酸エピガロカテキンの重量比が、５００：７０：１：１５０である、請求項１３または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記エピカテキン、エピガロカテキン、シアニジン、およびデルフィニジンがそれぞれ独立に、グリコシル化型、Ｌ−ラムノース、Ｄ−グルコース、グルコラムノース、ガラクトース、フルクトース、もしくはアラビノース型、アグリコン型、結晶化型、水溶液、アルコール溶液、塩、塩化物塩、没食子酸塩、またはその組合せであり得る、請求項１３または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。
【請求項１８】
下痢症に罹患している対象を治療する方法であって、請求項１もしくは１３、または特許請求の範囲の他の任意の請求項に記載の組成物を前記対象に投与して前記対象を治療することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２０１８年３月２３日に出願された米国特許出願第６２／６４７，６２２号の利益を主張するものであり、上記出願の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、下痢症治療のための組成物およびその下痢症治療への使用方法に関する。特定の組成物は、ポリフェノールに富むベリー抽出物と、特定のポリフェノールの混合物とを含む。組成物の作製方法についても記載する。
【背景技術】
【０００３】
下痢症は、世界の大きな社会経済上および医療上の負担となっている。世界保健機関（ＷＨＯ）は、下痢症が５歳未満の小児の死因の第２位であることを報告している。毎年、５歳未満の小児約５２５，０００人が下痢で死亡し、毎年１７億例の小児下痢症が認められている（２０１９年３月１９日にアクセスしたＷＨＯ公表ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｎｅｗｓ−ｒｏｏｍ／ｆａｃｔ−ｓｈｅｅｔｓ／ｄｅｔａｉｌ／ｄｉａｒｒｈｏｅａｌ−ｄｉｓｅａｓｅ）。
【０００４】
現在市販されている特化した止瀉治療薬は少なく、安全で有効な止瀉薬の開発という満たされていない必要性が存在する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】ポリフェノールに富む抽出物がＣＴｘによって誘発される液体貯留を有意に用量依存性に減少させることを示すデータを示す図である。
【図２】ポリフェノールに富む抽出物がＣＴｘによって誘発される液体貯留を有意に用量依存性に減少させることを示すデータを示す図である。
【図３】ポリフェノールに富む抽出物がＣＴｘによって誘発される液体貯留を有意に用量依存性に減少させることはなかったことを示すデータを示す図である。
【図４】ポリフェノールに富む抽出物がＣＴｘによって誘発される液体貯留を有意に用量依存性に減少させることはなかったことを示すデータを示す図である。
【図５】加水分解の前および後の特定のモノマーの含有量を示す質量分光測定実験の結果を示すデータを示す図である。
【図６】加水分解の前および後の特定のモノマーの含有量を示す質量分光測定実験の結果を示すデータを示す図である。
【図７】加水分解の前および後の特定のモノマーの含有量を示す質量分光測定実験の結果を示すデータを示す図である。
【図８】加水分解の前および後の特定のモノマーの含有量を示す質量分光測定実験の結果を示すデータを示す図である。
【図９】本試験のポリフェノールのＩＣ５０データを示す図である。
【図１０】本試験のポリフェノールのＩＣ５０データを示す図である。
【図１１】本試験のポリフェノールのＩＣ５０データを示す図である。
【図１２】本試験のポリフェノールのＩＣ５０データを示す図である。
【図１３】マウス腸のＣＴｘ誘発性液体分泌に対して相乗的阻害効果を示し、貯留液体の質量（平均貯留質量）を２５％減少させる例示的組成物を示すデータを示す図である。
【発明の概要】
【０００６】
（いくつかの実施形態の簡単な説明）
一実施形態は、
ａ）８０〜２０重量％のブルーベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｃｙａｎｏｃｏｃｃｕｓ）種、ビルベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｉｓ）種、またはその両方のブルーベリーまたはビルベリーと；
ｂ）２０〜８０重量％のスピノサスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｐｉｎｏｓａ）種のスローベリーと
の混合物のポリフェノールに富む抽出物を含む、下痢症治療のための組成物を提供する。
【０００７】
別の実施形態は、ポリフェノールに富む抽出物を作製する方法であって、
１．５０〜７０％のアルコールとブルーベリー、ビルベリー、スローベリー、またはチョークベリーとを混合して、混合物を形成することと；
２．混合物を室温で１時間〜９０日間の範囲の時間にわたって、毎日回転させながらインキュベートして、インキュベートした混合物を形成することと；
３．インキュベートした混合物から固形物をろ過または遠心分離し、インキュベートした混合物のフロースルーを収集することと；
４．任意選択で、段階３のフロースルーとベリー粉末とを混ぜ合わせて、第二の混合物を形成することと；
５．任意選択で、第二の混合物を室温で１〜３時間インキュベートして、第二のインキュベートした混合物を形成することと；
６．任意選択で、第二のインキュベートした混合物から固形物をろ過または遠心分離し、上清を収集することと；
７．段階３のフロースルーまたは段階４の上清から真空下、４０℃以下の温度で、２０％以下などの所望のアルコール濃度までアルコールを蒸発させて、ポリフェノールに富む抽出物を形成することと
を含む、方法を提供する。
【０００８】
別の実施形態は、シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキンもしくは没食子酸エピガロカテキン、またはその塩もしくはそのグリコシラートをそれぞれ少なくとも０．２重量％と；薬学的に許容される担体または添加剤とを含む、下痢症治療のための組成物を提供する。
【０００９】
別の実施形態は、下痢症に罹患している対象を治療する方法であって、本明細書に記載されるいずれかの組成物を対象に投与して、前記対象を治療することを含む、方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（いくつかの実施形態の詳細な説明）
一実施形態は、ａ）ブルーベリー（別名ビルベリー）、例えば、ブルーベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｃｙａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ビルベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｉｓ）種、もしくはその両方；ｂ）スローベリー、例えばスピノサスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｐｉｎｏｓａ）種；および／またはｃ）チョークベリー（Ａｒｏｎｉａ  ｍｅｌａｎｏｃａｒｐａ）種の混合物を含む、ポリフェノールに富む抽出物を提供する。
【００１１】
一実施形態は、エピカテキンと；エピガロカテキンと；シアニジンと；デルフィニジンとの混合物を含む、組成物を提供する。エピカテキン、エピガロカテキン、シアニジン、およびデルフィニジンはそれぞれ独立に、任意の形態、例えば、グリコシル化型（すなわち、Ｌ−ラムノース、Ｄ−グルコース、グルコラムノース、ガラクトース、フルクトース、もしくはアラビノース）もしくはアグリコン型；結晶化型；水溶液；アルコール溶液；塩化物塩、没食子酸塩などの塩；またはその組合せであり得る。
【００１２】
一実施形態は、下痢症に罹患している対象を治療する方法であって、下痢症、例えばコレラ、旅行者下痢症、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）性下痢症、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）およびその他のビブリオ菌による下痢症、ディフィシル菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）性下痢、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）性下痢症、ロトウイルス（Ｒｏｔｏｖｉｒｕｓ）性下痢症、アデノウィルス性下痢症、パルボウイルス性下痢症、ノーウォークウイルス（ノロウイルス）性下痢症、ジアルジア性下痢症、アストロウイルス性下痢症、カリシウイルス性下痢症、赤痢菌性下痢症、サルモネラ菌性下痢症、ブドウ球菌性、カンピロバクター性、エルシニア性、エロモナス性、シュードモナス性、トロウイルス性、コロナウイルス性、ピコビルナウイルス性、ペスチウイルス性、ＡＩＤＳ関連下痢；炎症性腸疾患、クローン病、過敏性腸症候群などの炎症性下痢障害などに罹患している対象に上記のいずれかの組成物を投与することを含む、方法を提供する。下痢は、毒素、例えばコレラ毒素、熱安定性エンテロトキシン、熱不安定性エンテロトキシン、志賀毒素、細胞毒素などによって誘発される、または悪化するものであり得る。一実施形態では、下痢症は、コレラ毒素によって誘発される、または悪化する、コレラである。
【００１３】
一実施形態は、予め混合し凍結乾燥したブルーベリー（別名ビルベリー）、スローベリー、またはチョークベリー粉末からポリフェノールを抽出する方法を提供し、ここでは、各ベリー粉末の質量分率は独立に１％から９９％まで様々であり得；抽出に使用するアルコールは濃度０％〜９９％のエチルアルコールであり；さらに、得られた抽出物からアルコールを除去し、アルコールは、液体の状態であっても、薄膜乾燥などの適切な方法によって乾燥させてもよく；抽出、アルコール除去、および脱水を光から保護しながら実施し；いずれの段階も摂氏４０度を超えない温度で実施する。
【００１４】
一実施形態では、抽出を以下の通りに実施し得る：
１．５０〜７０％のアルコール（エチルアルコール）とベリー混合物、例えば、生鮮または冷凍ブルーベリーとスローベリーの混合物とを所望のｗ／ｗ比で混合する。あるいは、５０〜７０％のアルコール（エチルアルコール）と乾燥ベリー、粉末化ベリー、または凍結乾燥ベリー粉末混合物、例えばブルーベリーとスローベリーの混合物とを所望のｗ／ｗ比で混合する。
２．室温で１時間〜９０日間、毎日回転させながらインキュベートする。
３．固形物をろ過または遠心分離で除去し、フロースルーを収集する。
４．任意選択で、段階３のフロースルーと凍結乾燥ベリー粉末などのベリー粉末とを、段階３のフロースルー１０ｍｌに対して所望のｗ／ｖ比のグラム数の粉末とを混ぜ合わせる。
５．室温で１〜３時間インキュベートする。
６．固形物をろ過し、上清を収集する。
７．真空下でアルコールを蒸発させる。蒸発させている間、上清の温度が４０℃を超えてはいけない。アルコール濃度が５％未満に減少するまで蒸発を継続する。
８．任意選択で、ポリフェノール含有量を測定し、粉末の量、蒸発時間を変化させることによってそれを所望のもの（例えば、１５ｍｇ／ｍｌ）に調節して、得られるポリフェノールに富む抽出物を調製する。
【００１５】
別の実施形態では、抽出を以下の通りに実施し得る：
１．５０〜７０％のアルコール（エチルアルコール）とスローベリーとを１：１のｗ／ｗ比で混合する。
２．室温で１時間〜９０日間、毎日回転させながらインキュベートする。
３．固形物をろ過または遠心分離で除去し、フロースルーを収集する。
４．フロースルーと、段階３のフロースルー１０ｍｌに対して３：１０のｗ／ｖ比のグラム数の粉末で加えたブルーベリー粉末とを混ぜ合わせる。
５．室温で２時間インキュベートする。
６．固形物をろ過し、上清を収集する。
７．真空下でアルコールを蒸発させる。蒸発させている間、上清の温度が４０℃を超えてはいけない。アルコール濃度が５％未満に減少するまで蒸発を継続する。
８．任意選択で、ポリフェノール含有量を測定し、必要に応じて粉末の量、蒸発時間を変化させることによってそれを所望のもの（例えば、１５ｍｇ／ｍｌ）に調節して、得られるポリフェノールに富む抽出物を調製する。
【００１６】
別の実施形態では、抽出を以下の通りに実施し得る：
１．５０％のアルコール（好ましくはテンサイアルコール）とスローベリーとを１：１のｗ／ｗ比で混合する。
２．９０日間、毎日回転させながらインキュベートする。
３．固形物をろ過して除去し、フロースルーを収集する。
４．フロースルーとブルーベリー粉末とを３：１０のｗ／ｗ比で混合する
５．段階３のフロースルー１０ｍｌに対するグラム数の粉末。
６．室温で２時間インキュベートする。
７．固形物をろ過し、上清を収集する。
８．真空下でアルコールを蒸発させる。蒸発させている間、上清の温度が４０℃を超えてはいけない。アルコール濃度が５％未満に減少するまで蒸発を継続する。
９．ポリフェノール含有量を測定し、粉末の量、蒸発時間を変化させることによってそれを所望のもの（例えば、１５ｍｇ／ｍｌ）に調節して、得られるポリフェノールに富む抽出物を調製する。
【００１７】
ブルーベリー、ビルベリー、スローベリー、またはチョークベリー（粉末または生鮮／冷凍などを問わず）と混合するアルコールの濃度は特に限定されないが、５０〜７０％アルコール水溶液が望ましい。この範囲には、５０％、５５％、６０％、６５％、および７０％を含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲のアルコール（水溶液）が含まれる。または、いくつかの場合には、１００〜１４０「プルーフ」のアルコール。アルコールは、製薬用途、食品および医薬グレード用途、およびそれと同等のものに適したものが好ましいが、必要条件であるというわけではない。アルコールは、必要に応じて、有機認証を受けたものであり得る。例としては、エチルアルコール、植物性アルコール、テンサイアルコール、またはその組合せが挙げられる。
【００１８】
諸実施形態では、組成物は独立に、８０〜２０重量％のブルーベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｃｙａｎｏｃｏｃｃｕｓ）種、ビルベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｉｓ）種、またはその両方のブルーベリーまたはビルベリーを含む。この範囲には、ポリフェノールに富む抽出物の重量に基づく８０重量％、７５重量％、７０重量％、６５重量％、６０重量％、５５重量％、５０重量％、４５重量％、４０重量％、３５重量％、３０重量％、２５重量％、および２０重量％、またはその中の任意の範囲を含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。
【００１９】
諸実施形態では、組成物は独立に、８０〜２０重量％のブルーベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｃｙａｎｏｃｏｃｃｕｓ）種、ビルベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｉｓ）種、またはその両方のブルーベリーを含む。この範囲には、ポリフェノールに富む抽出物の重量に基づく８０重量％、７５重量％、７０重量％、６５重量％、６０重量％、５５重量％、５０重量％、４５重量％、４０重量％、３５重量％、３０重量％、２５重量％、および２０重量％、またはその中の任意の範囲を含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。
【００２０】
諸実施形態では、組成物は独立に、２０〜８０重量％のスピノサスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｐｉｎｏｓａ）種のスローベリーを含む。この範囲には、ポリフェノールに富む抽出物の重量に基づく２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、および８０重量％、またはその中の任意の範囲を含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。
【００２１】
諸実施形態では、組成物は、８０〜２０重量％のブルーベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｃｙａｎｏｃｏｃｃｕｓ）種、ビルベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｉｓ）種、またはその両方のブルーベリーまたはビルベリー；および２０〜８０重量％のスピノサスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｐｉｎｏｓａ）種のスローベリーを含む。ここでは、これらの範囲にはそれぞれ、本明細書の他の箇所に記載される通り、あらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。
【００２２】
諸実施形態では、組成物は、ブラックチョークベリー（Ａｒｏｎｉａ  ｍｅｌａｎｏｃａｒｐａ）種のチョークベリーをさらに含み得る。チョークベリーは必要に応じて、０．１〜４０重量％で存在し得る。この範囲には、ポリフェノールに富む抽出物の重量に基づく０．１重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、および４０重量％を含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。
【００２３】
例えば、混合物（または抽出物）は、７０〜３０重量％（または７０重量％、６０重量％、５０重量％、４０重量％、３０重量％）のブルーベリーもしくはビルベリー；６０〜４０重量％（または６０重量％、５０重量％、４０重量％）のブルーベリーもしくはビルベリー；または重量比５０：５０のブルーベリーもしくはビルベリーとスローベリーを含み得る。
【００２４】
他の実施形態では、ポリフェノールに富む抽出物また混合物中のブルーベリーもしくはビルベリー：スローベリーの重量比は、８０〜２０：２０〜８０の範囲であり、それぞれの範囲には、あらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。例えば、８０：２０、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３４、４０、４２、４４、４６、５０、５２、５４、６０、６８、７０、７２、７６、８０：２０の比が企図される。
【００２５】
諸実施形態では、混合物中のベリー、例えば、ブルーベリー、ビルベリー、スローベリー、またチョークベリーは、ベリー粉末（粉末化ベリー）、凍結乾燥粉末、またはその組合せの形態である。
【００２６】
諸実施形態では、混合物中のベリー、例えば、ブルーベリー、ビルベリー、スローベリー、またはチョークベリーは、生鮮ベリー、冷凍ベリー、乾燥ベリー、もしくは凍結乾燥ベリー、またはその組合せの形態である。
【００２７】
アルコールとベリー混合物とを混合する１回目のインキュベーションは、１時間〜９０日間、好ましくは毎日回転させながら、振盪しながら、または攪拌しながら実施するのが望ましい。この時間の範囲には、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、２０日間、４０日間、５０日間、６０日間、７０日間、８０日間、９０日間を含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。
【００２８】
アルコールとベリー混合物とを混合するインキュベーションは、室温または約２５℃で実施するのが望ましい。
【００２９】
アルコールとベリー混合物とを混合するインキュベーションは、暗所で、例えば、可視光にも紫外線にも曝露せずに実施するのが望ましい。
【００３０】
１回目のインキュベーションの後、固形物をろ過または遠心分離により分離してよく；フロースルーを収集する。諸実施形態では、追加の粉末を加えることを望むのでない限り、この段階で抽出物をポリフェノールに富む抽出物とすることができる。
【００３１】
あるいは、上記のフロースルーをさらに、凍結乾燥ベリー粉末などのベリー粉末と所望のｗ／ｖ比で混ぜ合わせることができる。例えば、フロースルーにベリー粉末をフロースルーのｍｌ数に対して１〜５：１０のｗ／ｖ比のグラム数の粉末に相当する量で加え得る。この範囲には、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、および５：１０のｗ／ｖを含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。これに対応する量を所望の生産量に合わせてスケールアップし得ることは明らかである。
【００３２】
追加のベリー粉末を加える場合、必要に応じて、１〜３時間にわたる２回目のインキュベーションを室温で実施し得る。その後、固形物をろ過または遠心分離により収集し、上清を収集する。
【００３３】
１回目または２回目のインキュベーションの後、真空下でアルコールを蒸発させる。蒸発させている間、上清の温度が４０℃を超えてはいけない。アルコール濃度が２０％、１５％、１０％、または５％未満に減少するまで蒸発を継続する。
【００３４】
ポリフェノールに富む抽出物のポリフェノール濃度を本明細書に記載される通りに測定し得る。その濃度を所望に応じて、添加、希釈、またはさらなる蒸発によって調節し得る。例えば、ポリフェノールに富む抽出物のポリフェノール含有量は、０．２〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲内にあるのが適切であり得、この範囲には、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、５５ｍｇ／ｍｌ、および６０ｍｇ／ｍｌを含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。
【００３５】
諸実施形態では、ポリフェノールに富む抽出物は、シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、もしくは没食子酸エピガロカテキン、その塩、そのグリコシラート、またはその組合せのうちの１つまたは複数のものを含む。諸実施形態では、ポリフェノールに富む抽出物は、シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキン、その塩、そのグリコシラート、またはその組合せをそれぞれ含む。
【００３６】
一実施形態では、この方法は、ベリー粉末とエタノールとを接触させ、４０℃で一定時間インキュベートし、次いで、４０℃、約４０〜５０ｍｂａｒで真空蒸留によりアルコールを除去して、固体のポリフェノールに富む抽出物になるまで蒸発させることを含む。
【００３７】
本発明者らは、天然の安全で効果的な止瀉化合物を作出することを目的に、一般的な食用ベリー種の組合せに由来するポリフェノール抽出物が分泌性下痢症を打ち消す能力を試験した。
【００３８】
この組合せには、ブルーベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｃｙａｎｏｃｏｃｃｕｓ）とビルベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｉｓ）植物種のブルーベリー（一部の地域ではビルベリーとしても知られる）、スピノサスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｐｉｎｏｓａ）植物種のスローベリー、および／またはブラックチョークベリー（Ａｒｏｎｉａ  ｍｅｌａｎｏｃａｒｐａ）植物種のチョークベリーを含めた。上記のベリー種はいずれも、フラバン−３−オールおよびガロタンニンという化学物質類に由来するポリフェノールの豊富な天然源である。本発明者らの試験は、腸分泌の阻害に適用可能な抽出物の潜在的有益性を明らかにすることに焦点を当てたものである。
【００３９】
諸実施形態では、シアニジン重量％、デルフィニジン重量％、没食子酸エピカテキン重量％、または没食子酸エピガロカテキン重量％、その塩重量％、またはそのグリコシラートをそれぞれ少なくとも０．２重量％；および薬学的に許容される担体または添加剤を含む、下痢症治療のための組成物が提供される。この範囲には、シアニジン重量％、デルフィニジン重量％、没食子酸エピカテキン重量％、または没食子酸エピガロカテキン重量％、その塩重量％、またはそのグリコシラートそれぞれについて独立に、０．２重量％、０．４重量％、０．６重量％、０．８重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２２重量％、２５重量％、２７重量％、３０重量％、３３重量％、３５重量％、３７重量％、３９重量％、４０重量％、４４重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％、９８重量％、９９重量％、９９．１重量％、および９９．４重量％を含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。
【００４０】
諸実施形態では、組成物は、シアニジン：デルフィニジン：没食子酸エピカテキン：没食子酸エピガロカテキンが、３００〜７００：１００〜３０：０．５〜２：２００〜５０という重量比を有し得る。これらの範囲には、３００，３５０，４００，４５０，５００，５５０，６００，６５０，７００：１００，９０，８０，７０，６０，５０，４０，３０：０．５，０．７，０．９，１，１．５，２：２００，１７５，１５０，１２５，１００，７５，５０を含めた各数値およびその間の部分範囲がすべて含まれる。
【００４１】
一実施形態では、シアニジン：デルフィニジン：没食子酸エピカテキン：没食子酸エピガロカテキンの重量比は、４００〜６００：９０〜５０：０．７５〜１．５：１７５〜１００である。
【００４２】
別の実施形態では、シアニジン：デルフィニジン：没食子酸エピカテキン：没食子酸エピガロカテキンの重量比は、５００：７０：１：１５０である。
【００４３】
ここでは、シアニジン：デルフィニジン：没食子酸エピカテキン：没食子酸エピガロカテキンの重量比は、塩、グリコシル化型、またはその組合せのうちのいずれか１つまたは複数のものにも当てはまるものと考える。
【００４４】
エピカテキン、エピガロカテキン、シアニジン、およびデルフィニジンはいずれも独立に、グリコシル化型、Ｌ−ラムノース、Ｄ−グルコース、グルコラムノース、ガラクトース、フルクトース、もしくはアラビノース型、アグリコン型、結晶化型、水溶液、アルコール溶液、塩、塩化物塩、没食子酸塩、またはその組合せであり得る。
【００４５】
好ましい投与経路は経口であるが、経直腸、舌下、もしくはバッカル、またはその組合せを含めた他の投与経路も企図される。提案される投与スケジュールは、１日当たり３〜４回である。
【００４６】
適応症には、分泌成分が疾患の原因の一部としてみられる任意の下痢障害が含まれる。考えられる対象は、小児集団を含めたあらゆる年齢群のヒトおよび非ヒト動物である。疾患スペクトラムには、下痢の原因物質であるコレラ毒素の投与による実験で例示する細菌性、ウイルス性、または寄生虫性の感染性下痢がある。さらに、炎症性腸疾患、クローン病、および過敏性腸症候群などの炎症性下痢症にも抽出物での治療により臨床的利益がもたらされ得る。
【００４７】
抽出物は、純粋な形態で投与してもよく、あるいは、水、グリセロール、およびその他の添加剤、例えば保存剤（すなわち、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、およびその他の許容される等価物）；味覚変革物質（糖、すなわち、ソルビトール、エリスリトール、グルコース、フルクトースなど；他の植物（すなわち、チェリー、オレンジ、イチゴなど）の抽出物；グアーガム、キサンタンガム、メチルセルロース）などの粘度調整剤、および製薬分野の現時点での基準に合うその他の添加剤などと混合することによって経口液剤にさらに製剤化することも可能である。
【００４８】
（実施例）
以下の実施例は、説明を目的とし、本発明の有益性の一部をさらに理解するために記載するものであって、特に明記されない限り、限定的なものではない。
【００４９】
ポリフェノールを溶出および抽出することがわかっている一般的な溶媒を複数用いて抽出実験を実施した。本発明者らは、抽出剤として、アセトン、メタノール、エタノール、および水、ならびにその様々な組合せを試験した。生鮮、冷凍（ＳｔｏｐａｎｄＳｈｏｐ社、ハムデン、コネチカット州、米国）、または乾燥粉末果実（ＮｕｔｒｉＳｅｅｄ社、ロンドン、イギリス）の形態のブルーベリーを購入した。ＤＺ  Ｌｉｃｏｒｅｓ（ＤＺ  Ｌｉｃｏｒｅｓ社、Ｄｉｃｓａｔｉｌｌｏ、スペイン）からスローベリーおよび粉末を購入した。Ａｍａｚｏｎ．ｃｏｍ（Ａｍａｚｏｎ社、シアトル、ワシントン州、米国）からチョークベリーを購入した。抽出後、よく特徴付けられたフォリン・チオカルト（ＦＣ）比色法により混合物中の総ポリフェノール含有量を求めた。以下の２つの方法を用いたとき、ポリフェノールの収率が最も高かった。
【００５０】
実施例１−方法Ａ．
生鮮果実混合物または新鮮な状態で冷凍した果実混合物を９６％テンサイアルコール（ＤＺ  Ｌｉｃｏｒｅｓ社）と５０／５０のｖ／ｖ比で混ぜ合わせた。果実混合物は、予め重量を測定し、ｗ／ｗ比で５０％のスローベリー、４９％のブルーベリー、および１％のチョークベリーの組合せからなるものとした。アルコールを加えた後、抽出物混合物を定期的に攪拌しながら９０日間、暗所でインキュベートし、次いで、液相を分離し収集した。抽出物から残留アルコールを除去し、水相の総ポリフェノール濃度をＦＣ法により試験した。反応に含まれる水は、生鮮果実および新鮮な状態で冷凍した果実の主要構成要素であり、果実の総重量の最大９０％を占めることから、ベリーに由来するものであった。
【００５１】
このような抽出方法により、混合物中の総ポリフェノール濃度が最大１５ｍｇ／ｍｌ抽出物となった。
【００５２】
収率に負の影響を及ぼす主な因子は、光への曝露、および混合物を摂氏４０度超まで加熱することであることがわかった。
【００５３】
アセトンまたはメタノールを用いて同様に抽出したところ、効率が低くなった。
【００５４】
ポリフェノールの収率をさらに増大させるため、本発明者らは、抽出の限定要因がａ）生鮮果実の水含有量およびｂ）反応でのエチルアルコールの具体的割合であるとの仮説を立てた。
【００５５】
実施例２−方法Ｂ．
抽出反応での水分量の制御を改善するため、本発明者らは、乾燥粉末果実を使用することに戻った。全被験粉末のうち、凍結乾燥ベリーが抽出物中のポリフェノールの収率の点で優れていることが明らかになった。複数のｗ／ｗ比のベリー粉末を試験し、全体的には５０／５０のｗ／ｗ比のブルーベリーとスローベリーの粉末が最も効率が高いことがわかったが、各ベリーの重量パーセントは、得られた抽出物中のポリフェノール濃度をそれほど低下させずに５〜９５％まで大幅に変化させることができる。含水エチルアルコール（食品製造用）を９５％アルコールから純水までの濃度範囲で抽出剤として使用した。ベリー粉末と抽出剤が１：３のｖ／ｖ比になるよう抽出反応を設定した。暗所、室温にて常時攪拌しながら１〜２時間、反応を実施した。反応時間をさらに増大させたところ、反応効率が逓減した。インキュベーション後、反応から液相を分離し、収集した。蒸発によりアルコールを液相から除去した。いずれの相でも反応温度が４０℃を超えないよう制御した。ポリフェノール収率（ｍｇ／ｍｌ）をＦＣ法により測定した。
【００５６】
この抽出方法では、ポリフェノール濃度が３０ｍｇ／ｍｌ抽出物まで大幅に増大した。アルコールの割合の増大に伴って抽出効率が増大し、５０％〜７０％ｖ／ｖのアルコールでピークに達し、その後、効率が再び低下し始め、９５％アルコールで最小値に達した。
【００５７】
実施例３−ポリフェノール抽出物を用いたマウスモデル。抽出物をさらに、以下の通りに分泌性下痢のマウスモデルを用いた試験に供した：
【００５８】
ブルーベリーとスローベリー凍結乾燥粉末の１：１ｗ／ｗ混合物を用いた方法Ｂで得た抽出物を、以下に記載する通りに腸分泌マウスモデルを用いた試験に供した。実験に使用した抽出物のバッチはいずれも、総ポリフェノール濃度１５ｍｇ／ｍｌに標準化したものであり、さらに「ポリフェノール抽出物」と呼ぶ。
【００５９】
目的：コレラ毒素（ＣＴｘ）で刺激した腸液分泌マウスモデルを用いてポリフェノール抽出物の抗分泌効果を評価する。
マウス：成体Ｃ５７ＢＬ６系統
マウスの体重を測定し、Ａｖｅｒｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）（２５０ｍｇ／ｋｇのＩＰ誘導量、次いで、麻酔維持の必要に応じて３０〜４５分毎に２．６ｍｇ  ＩＰ）で麻酔した。腹部を開いた。小腸および大腸の一部を確認した。近位空腸にトライツ靱帯の直下から始まる１．５〜３ｃｍのループを結紮した。介在する１〜２ｃｍの小腸によってループが隔てられるようにした。結紮後、近位のループにＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）１００μｌを注入し（ループ１）、中央のループにＣＴｘのＰＢＳ溶液１００μｌを注入し（ループ２）、遠位のループにＣＴｘとポリフェノール抽出物（記載される通りに希釈したＰＰ抽出物）のＰＢＳ溶液１００μｌを注入した（ループ３）。注入を実施したループを写真撮影し、慎重に腹腔内に戻し、次いで、２回の縫合で腹部を閉じた。４〜６時間恒温放置した後、マウスを安楽死させ、小腸全体、盲腸、および上行横行結腸を単一標本として取り出した。ループを切り出し、脂肪を切り取り、寸法および重量を測定した。
【００６０】
結果：
Ａ．１ループ当たりＣＴｘ  １０μｇ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、（必要に応じてＰＢＳまたはＨ２Ｏで）１：１０部ｖ／ｖに希釈したポリフェノール抽出物、計１００μｌ、恒温放置４〜５時間、ｎ＝３
１．ＰＢＳはループ１から吸収され、外見上、空の腸の外観に戻った。重量／長さの比は３．７７±０．６６ｍｇ／ｍｍであった
２．ＣＴｘで刺激したループ２は、明らかに液体で膨張していた。重量／長さの比は９．５±２．２３ｍｇ／ｍｍであった
３．ＣＴｘで刺激しポリフェノール抽出物で処置したループ３は、濃い紫色を呈し、ループ２よりもはるかに膨張が少なかった。長さは３２ｍｍ、重量は０．１４７３ｇと測定された。重量／長さの比は５．３３±０．７０ｍｇ／ｍｍであった
【００６１】
多重比較に合わせて補正した一元配置ＡＮＯＶＡシダック検定を用いて統計解析を実施した。多重性調整ｐ値をＣＴｘ処置群に対するＰＢＳ処置群（ｐ＝０．００７４）、ＣＴｘ＋ＰＰ抽出物処置群に対するＣＴｘ処置群（ｐ＝０．０３２５）およびＣＴｘ＋ポリフェノール抽出物処置群に対するＰＢＳ処置群（ｐ＝０．５２７６）について算出した。処置群はそれぞれＮ＝３である（図１）。
【００６２】
Ｂ．１ループ当たりＣＴｘ  １μｇ（Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社、アナーバー、ミズーリ州、米国）、１ループ当たりポリフェノール抽出物１：１００、総体積１００μｌ、恒温放置５．５〜６時間、ｎ＝３
１．ＰＢＳはループ１から吸収され、外見上、空の腸の外観に戻った。重量／長さの比は３．１２８±０．１９０ｍｇ／ｍｍであった
２．ＣＴｘで刺激したループ２は、明らかに液体で膨張していた。重量／長さの比は７．３１６±１．０８９ｍｇ／ｍｍであった
３．ＣＴｘで刺激しポリフェノール抽出物で処置したループ３は、濃い紫色を呈し、ループ＃２よりもはるかに膨張が少なかった。重量／長さの比は３．８０４±０．７４３ｍｇ／ｍｍであった。
【００６３】
多重比較に合わせて補正した一元配置ＡＮＯＶＡシダック検定を用いて統計解析を実施した。多重性調整ｐ値をＣＴｘ処置群に対するＰＢＳ処置群（ｐ＝０．００１１）およびＣＴｘ＋ポリフェノール抽出物処置群に対するＣＴｘ処置群（ｐ＝０．００２８）について算出した。処置群はそれぞれＮ＝３である（図２）。
【００６４】
Ｃ．１ループ当たりＣＴｘ  １μｇ、１ループ当たりポリフェノール抽出物１：１０００、総体積１００μｌ、恒温放置４〜６時間。
１．ＰＢＳはループ１から吸収され、外見上、空の腸の外観に戻った。重量／長さの比は３．５１５±０．９９４ｍｇ／ｍｍであった
２．ＣＴｘで刺激したループ２は、明らかに液体で膨張していた。重量／長さの比は７．０１５±０．９７９ｍｇ／ｍｍであった
３．ＣＴｘで刺激しポリフェノール抽出物で処置したループ３は、濃い紫色を呈し、ループ＃２よりもはるかに膨張が少なかった。重量／長さの比は６．１３１±２．０４４ｍｇ／ｍｍであった。
【００６５】
多重比較に合わせて補正した一元配置ＡＮＯＶＡシダック検定を用いて統計解析を実施した。多重性調整ｐ値をＣＴｘ処置群に対するＰＢＳ処置群（ｐ＝０．０１８）およびＣＴｘ＋ポリフェノール抽出物処置群に対するＣＴｘ処置群（ｐ＝０．６４４）について算出した。処置群はそれぞれＮ＝４である（図３）。
【００６６】
Ｄ．１ループ当たりＣＴｘ  １μｇ、１ループ当たりポリフェノール抽出物１：１００００、総体積１００μｌ、恒温放置４〜６時間。
１．ＰＢＳはループ１から吸収され、外見上、空の腸の外観に戻った。重量／長さの比は３．１４７±０．０．０６９ｍｇ／ｍｍであった
２．ＣＴｘで刺激したループ２は、明らかに液体で膨張していた。重量／長さの比は７．６０２±２．１３４ｍｇ／ｍｍであった
３．ＣＴｘで刺激しポリフェノール抽出物で処置したループ３は、ＣＴｘで刺激したループ２と同程度またはそれ以上膨張していた。重量／長さの比は９．５７１±５．４９５ｍｇ／ｍｍであった。
【００６７】
多重比較に合わせて補正した一元配置ＡＮＯＶＡシダック検定を用いて統計解析を実施した。多重性調整ｐ値をＣＴｘ処置群に対するＰＢＳ処置群（ｐ＝０．２９５）およびＣＴｘ＋ポリフェノール抽出物処置群に対するＣＴｘ処置群（ｐ＝０．７５５）について算出した。処置群はそれぞれＮ＝３であり（図４）、処置群と未処置群との間に有意差はみられなかった。
【００６８】
結論：ポリフェノール抽出物は、ＣＴｘによって誘発される液体貯留を用量依存性に有意に減少させた（図１〜４）。ＣＴｘは、ｃＡＭＰ依存性腸内塩化物イオン輸送の上方制御を介して分泌を誘導するため、ＰＰ抽出物は、マウス近位小腸に対するＣＴｘの作用に拮抗できる抗分泌性止瀉薬として作用した。ＰＰ抽出物の効果は、希釈が１：１０００部ｖ／ｖに近づくにつれて減少し（図３）、１：１００００希釈で完全に消失する（図４）。
【００６９】
実施例３の結果から、マウスでは、コレラ毒素の腸分泌に対する作用を打ち消すのに適したポリフェノール抽出物の濃度範囲が６０マイクログラム／キログラム〜６００ミリグラム／キログラムであることがわかる。この範囲には、マウスに対する６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ、１８０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇを含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれ、必要に応じてヒトにスケールアップ可能である。
【００７０】
ヒト対象に対する用量の再計算から、ポリフェノール抽出物の作用範囲が５マイクログラム／キログラム〜５０ミリグラム／キログラムであることが示唆される。この範囲には、ヒトに対する５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇを含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。単回用量１０グラム／ｋｇまで毒性作用は予想されない。
【００７１】
実施例４−抽出物の化学的特徴付け。本発明者らは、液体クロマトグラフィーを質量分析とともに用いて抽出物を化学的に特徴付けた。
【００７２】
シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキンが抽出物中のフラボノイドおよびガロタンニンの主な形態であることがわかった。その構造は以下のものである。
【化１】
2021519344.tif 000002
【化２】
2021519344.tif 000003
【化３】
2021519344.tif 000004
【化４】
2021519344.tif 000005
【００７３】
本発明者らはまた、抽出物と、ブルーベリー（Ｖ．ｃｙａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、スピノサスモモ（Ｐ．ｓｐｉｎｏｓａ）、およびブラックチョークベリー（Ａ．ｍｅｌａｎｏｃａｒｐａ）の個々の種の両方の酸加水分解を実施することにより、抽出物中のポリマー化学形態とモノマー化学形態の相対比という極めて重要な問題に取り組んだ。
【００７４】
ポリフェノール抽出物の質量分析の結果から、本発明者らが試験した原料中のシアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキンの大部分がモノマーであることがわかった。加水分解前および加水分解後の特定のモノマーの含有量を示すＭＳ実験の結果を図５〜８に示す。
【００７５】
諸実施形態では、シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキンはそれぞれ独立に、モノマーである、実質的に全部がモノマーである、または９９％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、またはそれ以下がモノマー（ポリマー）である。
【００７６】
実施例５−マウスモデルを用いたシアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキンに関する試験。
同定後、シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキンの個々の試薬をＣｈｒｏｍａＤｅｘ（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ社、アーバイン、カリフォルニア州、米国）から購入し、上記のものと同じコレラ毒素誘発閉鎖ループマウス下痢モデルで試験した。本発明者らは、コレラ毒素誘発性腸分泌の治療に重要な各個々の成分のＩＣ５０濃度を求め、決定した。
【００７７】
本発明者らはさらに、モノマー型のシアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキンの組合せの相乗効果を観察し、それは予想外で驚くべきものであった。
【００７８】
目的：コレラ毒素（ＣＴｘ）刺激腸液分泌モデルを用いてポリフェノールの抗分泌効果を示す。
方法
マウス（１９〜３５ｇ）を２４〜４８時間絶食させ、体重を測定し、Ａｖｅｒｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）（２５０ｍｇ／ｋｇのＩＰ誘導量、次いで、麻酔維持の必要に応じて３０〜４５分毎に２．６ｍｇ  ＩＰ）で麻酔した。加温パッドを用いて体温を３７〜３８℃に維持した。
【００７９】
腹部を開き、小腸および大腸の一部を確認した。近位空腸にトライツ靱帯の直下から始まる２〜４ｃｍのループを結紮した。介在する１〜２ｃｍの小腸によってループが隔てられるようにした。結紮後、１つのループにＰＢＳ  １００μｌを注入し、２つ目のループにＣＴｘ溶液（Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、ＰＢＳ  １００μｌ中１μｇ）を注入し、３つ目のループにＰＢＳ  １００μｌに溶かしたＣＴｘとポリフェノールの溶液（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ社、アーバイン、カリフォルニア州、米国）を注入した。注入を実施したループを写真撮影し、慎重に腹腔内に戻し、次いで、２回の縫合で腹部を閉じた。４〜６時間恒温放置した後、マウスを安楽死させ、小腸全体、盲腸、および上行横行結腸を単一標本として取り出した。ループを切り出し、脂肪を切り取り、寸法および重量を測定した。頸椎脱臼またはＡｖｅｒｔｉｎの過量注射によってマウスを安楽死させた。いずれの動物プロトコルも、Ｖａｎｅｓｓａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の実験動物倫理委員会による承認を受けたものである。ループの重量／長さの比を算出した。
【００８０】
フラバン−３−オールとガロタンニンのストック溶液（ストック希釈物（−２０℃で保管））および作業希釈物（ＰＢＳ）を設計し、以下の通りに調製した：
Ｆ１Ａ−塩化シアニジン（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ社、ＡＳＢ−００００３９５５−００５、ロット番号００００３９５５−０４１）５ｍｇをメタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）１ｍｌに溶かして５ｍｇ／ｍｌのストックとした。実験に使用した元の濃度は０．０５ｍｇ／ｍｌである。実験には、１：１０〜１：１００，０００の１：１０ずつの段階希釈物を調製した。
【００８１】
Ｆ１Ｂ−塩化デルフィニジン（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ社、ＡＳＢ−００００４１２５−００１、ロット番号００００４１２５−５０４）１ｍｇをメタノール１４３ｕｌに溶かして７ｍｇ／ｍｌのストックとした。実験に使用した元の濃度は０．０７ｍｇ／ｍｌである。実験には、１：１０〜１：１００，０００の１：１０ずつの段階希釈物を調製した。
【００８２】
Ｆ１Ｃ−没食子酸エピカテキン（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ社、ＡＳＢ−００００５１３５−００５、ロット番号００００５１３５−５２３）５ｍｇをメタノール１ｍｌに溶かして５ｍｇ／ｍｌのストックとした。実験に使用した元の濃度は０．００１ｍｇ／ｍｌ（５ｍｇ／ｍｌのストックの１：５０希釈）である。実験には、１：１０〜１：１００，０００の１：１０ずつの段階希釈物を調製した。
【００８３】
Ｆ１Ｄ−没食子酸エピガロカテキン（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ社、ＡＳＢ−００００５１５０−００５、ロット番号００００５１５０−００８）５ｍｇをメタノール１ｍｌに溶かして５ｍｇ／ｍｌのストックとした。実験に使用した元の濃度は０．００１５ｍｇ／ｍｌ（５ｍｇ／ｍｌのストックの１：３３．４）である。実験には、１：１０〜１：１００，０００の１：１０ずつの段階希釈物を調製した。
【００８４】
結果
１．ＰＢＳはループから吸収され、外見上、空の腸の外観に戻った。重量／長さの比は２．５２±０．６１ｍｇ／ｍｍであった
２．ＣＴｘで刺激したループは、明らかに液体で膨張していた。重量／長さの比は１０．１４±２．１９ｍｇ／ｍｍであった
３．ＣＴｘで刺激しポリフェノール抽出物で処置したループには、処置濃度／希釈率に応じて重量／長さの比（ｍｇ／ｍｍ）の減少がみられた
４．図９〜１２に示されるように、試験Ｆ１Ａ、Ｆ１Ｂ、およびＦ１Ｂ  ＥＣ５０に使用した各ポリフェノールのＩＣ５０はｎＭ〜μＭの範囲（１×１０−７〜−５）内に収まり、Ｆ１ＣのＩＣ５０はｎＭの範囲（１×１０−８）の範囲内に収まっている。図９〜１２のｘ軸は、ｎｔｈをｘ軸の数値とする１×１０ｎｔｈとして読み取るべきである。
【００８５】
個々の化合物の以下の希釈率では、ＣＴｘ誘発性液体分泌に対して何ら効果はみられなかった：
【表１】
2021519344.tif 000006
【００８６】
一方、ＣＴｘによる液体分泌誘導後の抗分泌効果を発揮する際に、複数のポリフェノールの間に相乗効果があるとする考えを確認または除外するため、本発明者らは、表１に示す濃度の全４種類のポリフェノールの組合せを用いる処置を試みた。組合せの個々のメンバーの濃度（ｍｇ／ｍｌ）の比（シアニジング（ｃｙａｎｉｄｉｎｇ）：デルフィニジン：没食子酸エピカテキン：没食子酸エピガロカテキン）は、結果として、表１から５００：７０：１：１５０（重量比）と導き出した。
【００８７】
データ解析を以下の通りに実施した：
Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ．、１９７９を出典とする式を用いた：
貯留質量＝Ｔｍ−（Ｃｍ／ＣＬ）×ＴＬ
Ｔｍ＝処置または未処置ループの質量（ｍｇ）
Ｃｍ＝対照ループの質量（ｍｇ）
ＣＬ＝対照ループの長さ（ｃｍ）
ＴＬ＝処置または未処置ループの長さ（ｃｍ）
処置または未処置試料の液体貯留を求めた後、上の式から求めた質量を用いて、質量のパーセント減少を実施した
（Ｕｍ−Ｃｍ）−（Ｔｍ−Ｃｍ）／（Ｕｍ−Ｃｍ）
Ｕｍ＝未処置ループ（Ｃｔｘループ）の貯留質量
Ｃｍ＝対照ループの貯留質量
Ｔｍ＝処置ループ（Ｄｒｕｇ＋Ｃｔｘ）の貯留質量
＊この式に用いるのは、Ｙａｍａｍｏｔｏの方程式から求めた貯留質量であって、実験から明らかになったループの質量ではないことに留意されたい＊
５．データ除外基準に基づき、特定の変数を除去した：
ａ．Ｃｔｘループが７．００以下である場合。Ｃｔｘ−Ｃｔｘループ実験の結果に基づく
ｉ．７．００は、近位と遠位のＣＴｘ誘発性液体貯留を合わせたものの平均値の下限である
ｉｉ．一部のマウスがＣＴｘに対して低応答または無応答個体であったため、データの鑑別には下限のみを用いた。これらの低応答または無応答個体は腸分泌が認められず、考えられる作用機序に当てはまらないため、標的とする集団の特徴ではない。中間応答個体から高応答個体までの鑑別は不要であったため、上限の１１．８４ｍｇ／ｍｍを用いてそれより大きな数値を除外することはしなかった。
ｂ．マウスの術後生存時間が腸ループ切除前４．０時間未満である場合
ｃ．質量測定前の脂肪または結合組織のトリミング時、腸ループに著しい漏出がみられた場合
ｄ．ＰＢＳのループが３．９５ｍｇ／ｍｍを超えた場合
ｅ．ＣＴｘおよびＣＴｘと処置のループの長さが２ｃｍ未満であった場合
【００８８】
【表２】
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【００８９】
データから、シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキンの組合せには、マウス腸のＣＴｘ誘発性液体分泌に対する阻害効果があり、貯留液質量（平均貯留質量）が２５％減少することがわかった。
【００９０】
結果を図１３にさらにまとめる。
【００９１】
結論
１．コレラ毒素によりループ内部の分泌が激しくなった結果、生きた個体（マウス）の閉鎖腸ループに著しい液体貯留が認められた。
２．ポリフェノール（塩化シアニジン、塩化デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、没食子酸エピガロカテキン）は４種類とも、ＣＴｘによって誘発される液体貯留を用量依存性に有意に減少させた。ＣＴｘは、ｃＡＭＰ依存性腸内塩化物イオン輸送の上方制御を介して分泌を誘導するため、ポリフェノールは、マウス近位小腸に対するＣＴｘの作用に拮抗できる抗分泌性止瀉薬として作用した。ポリフェノールの効果は希釈因子に比例して低下し、このことは、薬物の用量応答効果を示している。
【００９２】
ポリフェノールの組合せは、コレラ毒素の刺激による腸分泌の発現および進行に対して個々のポリフェノールよりも効力が高く、効果的であることがわかった。４種類のポリフェノールを、単独では治療効果がみられなかった極めて低い濃度で混合したところ、分泌を阻害する効果がみられた。したがって、ポリフェノールの組合せは個々のポリフェノールよりも治療効力が高いことが明らかになり、このことは、諸成分の相乗効果を示している。ポリフェノールおよびポリフェノールの混合物は、コレラの治療に、可能性として予防にも安全で効果的な方法となるはずである。
【００９３】
本発明者らの実験から得た予想外で驚くべき観察結果は、個々の試薬（シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキンの個々の試薬）を４種類とも組み合わせると抗分泌効果を発揮したのに対し、同じ濃度の個々の成分単独では、分泌に対して観察可能な効果はみられなかったことである。したがって、ポリフェノールの組合せは、同じ濃度で使用するいずれの個々の薬剤よりも効果的である。
【００９４】
表３のＢ−フェノール環のＲ３’位、Ｒ４’位、およびＲ５’位に−ＯＨラジカルを有するポリフェノール、ならびに没食子酸残基は、分泌に対する阻害効果を得るのに特に望ましいものであり得る。さらに、表３のＲ３のグリコシル化は、分子の水への溶解性に有益な影響を及ぼし、製剤を容易にすることが知られている。
【００９５】
【表３】
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【００９６】
本発明者らの実験の結果に基づけば、混合物中の個々の成分の質量分率は、個々の成分の効力に応じて０．２％から９９．４％まで変化させることができる。
【００９７】
ヒト対象に対する用量の再計算からナノモル〜マイクロモルの有効ＩＣ５０範囲が示唆され、混合物の効果が極めて高いことがわかる。マウス実験から再計算して示唆される用量は、１マイクログラム／キログラム〜１０ミリグラム／キログラムの範囲内に収まる。この範囲には、１マイクログラム／キログラム、２マイクログラム／キログラム、３マイクログラム／キログラム、４マイクログラム／キログラム、５マイクログラム／キログラム、６マイクログラム／キログラム、７マイクログラム／キログラム、８マイクログラム／キログラム、９マイクログラム／キログラム、１０マイクログラム／キログラム、２０マイクログラム／キログラム、３０マイクログラム／キログラム、５０マイクログラム／キログラム、７０マイクログラム／キログラム、９０マイクログラム／キログラム、１００マイクログラム／キログラム、２００マイクログラム／キログラム、５００マイクログラム／キログラム、７００マイクログラム／キログラム、９００マイクログラム／キログラム、１ミリグラム／キログラム、２ミリグラム／キログラム、３ミリグラム／キログラム、４ミリグラム／キログラム、５ミリグラム／キログラム、６ミリグラム／キログラム、７ミリグラム／キログラム、８ミリグラム／キログラム、９ミリグラム／キログラム、１０ミリグラム／キログラムを含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。用量は、中毒のリスクを増大させることから、１００ｍｇ／ｋｇを超えてはならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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