(57)【要約】軟組織用具は、ゲルと、そのゲル内に配置された少なくとも１つのナノ構造体を含む複合材を導入できる。軟組織用具はさらに、細胞、組織などの生物活性剤を導入できる。軟組織の再生を促しながら、軟組織欠損部を治癒する方法は、軟組織用具を軟組織欠損部に適用することを含むことができ、その複合材は、ゲルと、そのゲル内に配置されたナノ構造体を含む。軟組織欠損部を治癒させる際に使用する軟組織用具の製造方法は、ゲルを用意すること、ナノファイバー及び生物活性剤をそのゲル内に配置することを含むことができる。【選択図】図１０Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物活性剤、ならびに平均長が約２００マイクロメートル未満である複数のポリカプロラクトン繊維に共有結合している官能化ヒアルロン酸の網目構造、及び約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する架橋剤を含む実質的に非球状のマイクロビーズの集団を含む軟組織用具であって、前記生物活性剤が、前記非球状のマイクロビーズ内に機能可能に封入されているか、前記生物活性剤が、前記非球状のマイクロビーズと機能可能に結合されているか、またはこれらが組み合わされており、
前記マイクロビーズの平均寸法が、最長寸法に沿って約５０マイクロメートル〜約３００マイクロメートルの範囲内である前記軟組織用具。
【請求項２】
前記マイクロビーズが、事前に反応されている、請求項１に記載の用具。
【請求項３】
前記マイクロビーズが実質的に、室温で少なくとも約６カ月安定している、請求項１または２に記載の用具。
【請求項４】
前記生物活性剤が、対象において、ｉ）宿主細胞の浸潤の漸増、ｉｉ）組織の成長の促進、及び／またはｉｉｉ）細胞もしくは組織の再生のうちの少なくとも１つを行うことができ、前記軟組織用具が、前記軟組織用具を必要とする対象の標的組織に移植または注射できる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の用具。
【請求項５】
前記マイクロビーズが、実質的に炎症を起こさない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の用具。
【請求項６】
前記生物活性剤が、成長因子、サイトカイン、抗体、細胞、組織、組織担体もしくは組織結合部分、核酸、細胞担体もしくは細胞結合部分、またはこれらを組み合わせたものからなる群から選択されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の用具。
【請求項７】
前記細胞結合部分または組織結合部分が、ペプチド、抗体、タンパク質、アプタマー、オリゴ糖または生体物質を含む、請求項６に記載の用具。
【請求項８】
前記生物活性剤が、脂肪細胞、自己脂肪細胞、同種異系細胞、遺伝子改変された同種異系細胞、幹細胞、間葉幹細胞、遺伝子改変された幹細胞、遺伝子改変された同種異系人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、及び遺伝子改変された低免疫原性多能性幹細胞、脂肪組織由来の間質血管画分、これらの誘導体またはこれらを組み合わせたものの集団を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の用具。
【請求項９】
前記生物活性剤が、前記用具内または前記用具の近位に永続的に存在できる細胞の集団を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の用具。
【請求項１０】
前記生物活性剤が、脂肪間質血管画分を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の用具。
【請求項１１】
前記生物活性剤が、脂肪組織を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の用具。
【請求項１２】
前記脂肪組織が、脂肪吸引物である、請求項１１に記載の用具。
【請求項１３】
前記脂肪組織が、自己脂肪組織である、請求項１１に記載の用具。
【請求項１４】
前記軟組織用具が、３７℃で安定している、請求項１１に記載の用具。
【請求項１５】
対象の標的組織に投与する前に、１時間、２時間、３時間、５時間、７時間または１０時間の期間にわたって、４０℃で保持される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の前記軟組織用具。
【請求項１６】
対象の標的組織に投与するための、請求項１〜１５いずれか１項に記載の用具を調製するためのキットであって、（ｉ）容積が約１ｃｃ〜約２０ｃｃまたは２０ｃｃ超のシリンジであって、実質的に非球状のマイクロビーズの集団の入った前記シリンジと、（ｉｉ）容積が約１ｃｃ〜約２０ｃｃまたは２０ｃｃ超のシリンジであって、前記脂肪吸引物の入った前記シリンジを含み、前記２本のシリンジが、ルアーコネクターを介して連結し合うことができ、それによって、前記脂肪吸引物が、前記マイクロビーズ内に機能可能に封入されるか、または前記脂肪吸引物が、前記マイクロビーズと機能可能に結合する前記キット。
【請求項１７】
対象の標的組織に投与するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の用具の調製方法であって、前記脂肪吸引物と前記マイクロビーズを好適な媒体中で、１日、２日、３日、４日、５日または７日混合することを含む前記方法。
【請求項１８】
対象の標的組織に投与するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の用具を調製するためのキットであって、（ｉ）凍結乾燥マイクロビーズの入ったシリンジと、（ｉｉ）水、生理食塩水または好適な再構成液の入ったバイアルであって、水、生理食塩水または好適な再構成液が、前記バイアルから前記シリンジに吸引することができ、それによって、前記凍結乾燥マイクロビーズが再水和される前記バイアルと、（ｉｉｉ）前記脂肪吸引物の入ったシリンジを含み、前記２本のシリンジが、ルアーコネクターを介して連結し合うことができ、それによって、前記脂肪吸引物が、前記水和マイクロビーズ内に機能可能に封入されるか、または前記脂肪吸引物が、前記水和マイクロビーズと機能可能に結合する前記キット。
【請求項１９】
ヒト対象での脂肪の移植方法であって、脂肪組織、ならびに平均長が約２００マイクロメートル未満である複数のポリカプロラクトン繊維に共有結合している官能化ヒアルロン酸の網目構造、及び約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する架橋剤を含む実質的に非球状のマイクロビーズの集団を含む軟組織用具をその組織または組織欠損部に注射または移植することを含み、その生物活性剤が、前記非球状のマイクロビーズ内に機能可能に封入されているか、前記生物活性剤が、前記非球状のマイクロビーズと機能可能に結合されているか、またはこれらが組み合わされており、
前記マイクロビーズの平均寸法が、最長寸法に沿って約５０マイクロメートル〜約３００マイクロメートルの範囲内であり、
前記マイクロビーズが、事前に反応されており、
前記マイクロビーズが実質的に、室温で少なくとも約６カ月安定しており、
前記生物活性剤が、対象において、ｉ）宿主細胞の浸潤の漸増、ｉｉ）組織の成長の促進、及び／またはｉｉｉ）細胞もしくは組織の再生のうちの少なくとも１つを行うことができ、前記軟組織用具が、前記軟組織用具を必要とする対象の標的組織に移植または注射できる前記方法。
【請求項２０】
複数の孔を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の用具。
【請求項２１】
対象の体内にある標的組織に移植または注射したときに、組織の成長及び細胞の浸潤を促すように、前記孔の少なくとも一部が、前記マイクロビーズの全体にわたり配置され得る、請求項２０に記載の用具。
【請求項２２】
前記複数の孔の面密度が、１ｃｍ２当たり約５０個以上であり、孔の少なくとも約８０％の平均寸法が、約５マイクロメートル以上である、請求項２０または２１に記載の用具。
【請求項２３】
前記官能化ヒアルロン酸が、アクリル化ヒアルロン酸を含み、前記架橋剤が、チオール化ポリ（エチレングリコール）またはその誘導体を含む、請求項１〜１５または２０〜２２のいずれか１項に記載の用具。
【請求項２４】
前記官能化ヒアルロン酸が、チオール化ヒアルロン酸を含み、前記架橋剤が、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）またはその誘導体を含む、請求項１〜１５または２０〜２２のいずれか１項に記載の用具。
【請求項２５】
前記複数のポリカプロラクトン繊維が、エレクトロスピニング紡糸繊維を含む、請求項１〜１５または２０〜２４のいずれか１項に記載の用具。
【請求項２６】
前記ポリカプロラクトン繊維の直径が、約１００ナノメートル〜約５マイクロメートルの範囲内である、請求項１〜１５または２０〜２４のいずれか１項に記載の用具。
【請求項２７】
前記マイクロビーズの平均貯蔵弾性率が、約５０Ｐａ〜約２５００Ｐａである、請求項１〜１５または２０〜２６のいずれか１項に記載の用具。
【請求項２８】
対象の標的組織に皮膚投与または皮下投与するために、移植可能または注射可能な用具として調合されている、請求項１〜１５または２０〜２７のいずれか１項に記載の用具。
【請求項２９】
請求項１〜１５または２０〜２８のいずれか１項に記載の用具が約０．１ｍＬ〜約２０ｍＬ入ったシリンジを含むキットであって、前記マイクロビーズが、ｉ）実質的に脱水されたビーズ、またはｉｉ）対象の標的組織に注射できる状態である水和ビーズとして調合されている前記キット。
【請求項３０】
請求項１〜１５または２０〜２８のいずれか１項に記載の用具を含む製剤であって、脱水マイクロビーズを形成するために、前記マイクロビーズが凍結乾燥されており、前記脱水マイクロビーズが、対象の標的組織に投与する前に水、生理食塩水または好適な再構成液で再構成して、失われた量（重量によって測定）の水を実質的に補充して、前記失われた量の水を補充したときに、前記再構成液中の前記マイクロビーズの濃度が、凍結乾燥前のマイクロビーズの濃度と同じまたは実質的に同じになるようにするのに適する前記製剤。
【請求項３１】
前記脱水マイクロビーズが、投与の必要な対象の標的組織に投与する前に水、生理食塩水または好適な再構成液によって再構成したときに、そのビーズ形態を維持または回復する、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３２】
前記脱水マイクロビーズが実質的に、室温で少なくとも約１２カ月安定している、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３３】
対象の標的組織に即時に投与するための、請求項１〜１５または２０〜２８のいずれか１項に記載の用具を調製するためのキットであって、前記キットが、前記マイクロビーズの入ったバイアルを含み、前記マイクロビーズが、凍結乾燥され、粉末ケーキに形成されており、前記凍結乾燥された粉末ケーキが、水、生理食塩水または好適な再構成液によって再構成できる前記キット。
【請求項３４】
対象の標的組織に即時に注射するための、請求項１〜１５または２０〜２８のいずれか１項に記載の用具を調製するためのキットであって、前記キットが、（ｉ）凍結乾燥ゲルビーズとして調合された前記マイクロビーズの入ったシリンジと、（ｉｉ）水、生理食塩水または好適な再構成液の入ったバイアルを含み、水、生理食塩水または好適な再構成液が、前記バイアルから前記シリンジに吸引することができ、それによって、前記凍結乾燥マイクロビーズが再水和される前記キット。
【請求項３５】
成長因子、血管新生を刺激する化合物、免疫調節剤、炎症抑制剤及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択した化合物をさらに含む、請求項１〜１５または２０〜２８のいずれか１項に記載の用具。
【請求項３６】
治療作用、血管新生作用、抗血管新生作用、抗炎症作用、抗菌作用、抗ヒスタミン作用またはこれらを組み合わせた作用を持つ化合物をさらに含む、請求項１〜１５または２０〜２８のいずれか１項に記載の用具。
【請求項３７】
処理した組織細胞外マトリックスをさらに含み、前記処理した組織細胞外マトリックスが、脂肪組織から抽出可能なものである、請求項１〜１５または２０〜２８のいずれか１項に記載の用具。
【請求項３８】
美顔手順または再建手順を行うか、あるいは外傷、外科的介入、または加齢性の疾患、障害もしくは状態に起因する組織欠損部を軽減または逆転させる方法であって、平均長が約２００マイクロメートル未満である複数のポリカプロラクトン繊維に共有結合している官能化ヒアルロン酸の網目構造と、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する架橋剤を含む実質的に非球状のマイクロビーズの集団内に機能可能に封入された生物活性剤を含む軟組織用具を前記組織及び／または組織欠損部に注射することを含み、
前記マイクロビーズの平均寸法が、最長寸法に沿って約５０マイクロメートル〜約３００マイクロメートルの範囲内であり、
前記マイクロビーズが、事前に反応されており、
前記マイクロビーズが実質的に、室温で少なくとも約６カ月安定しており、
前記生物活性剤が、対象において、ｉ）宿主細胞の浸潤の漸増、ｉｉ）組織の成長の促進、及び／またはｉｉｉ）細胞もしくは組織の再生のうちの少なくとも１つを行うことができ、前記軟組織用具が、前記軟組織用具を必要とする対象の標的組織に移植または注射できる前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１８年５月９日に出願した米国特許仮出願第６２／６６９，２８７号に基づく利益を主張するものであり、この仮出願は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
政府支援
本発明は、米国立衛生研究所によって付与された助成金番号１Ｒ２１ＮＳ０８５７１４、及び米国立科学財団によって付与された助成金番号ＤＭＲ１４１０２４０の下で、米国政府からの援助によって行われたものである。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
１．技術分野
本開示は、軟組織の再生を促しながら、失われた軟組織量を回復させる複合材及び方法に関するものである。本発明は、美顔、再建及び細胞療法の目的で細胞及び組織を送達する複合材及び方法に関するものでもある。
【０００４】
２．関連技術の説明
外傷、腫瘍切除術または先天性奇形に起因する軟組織欠損部は、従来の手段によって治療するのは難しい。組織の再構成または組織の移入を含む現行の療法は、ドナーの部位を欠損させる。補綴用インプラントのような他の療法では、線維化及びカプセル化が生じる。組織の侵入・成長を促すための既存の方策も、軟組織欠損部を治療するには不十分である。現行の無細胞マトリックスで得られるのは、理想的な再建に必要な柔らかい３次元組織ではなく、平らな線維性の組織シートである。そして、脂肪移植は、軟組織欠損部を回復できるが、脂肪移植のさらに広範な利用は、移植片生着率にばらつきがあるとともに、回復の体積が限られていることが妨げとなっている。軟組織再建の理想的なアプローチは、脂肪組織のような軟組織の再生をｉｎ  ｖｉｖｏで促してから、その組織を移植して、再生を促すものであろう。しかしながら、組織の再成長には、細胞が付着し、移動し、増殖し、分化して、新しい組織へと組織化する好適なマトリックスが必要となる。天然型の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の大半は、修復部位に欠失している。したがって、失われた組織量を速やかに回復させるのみならず、その微小環境を再調整し、宿主細胞の浸潤を補佐し、軟組織の再生を促すことも行う合成マトリックスを作り直すことは、脂肪組織ベースの再建を用いて軟組織欠損部を修復するときに不可欠な作業になる。
【０００５】
ハイドロゲルは、水溶性生体分子を容易に輸送可能にする高い水分量及び水膨潤性の網目構造により、ＥＣＭ模倣体として大きな注目を集めている。すなわち、ハイドロゲルは、軟組織の再建用のフィラー材として、いくつかの利点を提供する。ハイドロゲルは、フィラー材として機能する一方で、組織の再生をさらに促す目的で、細胞、組織のような生物活性剤を導入するのに好適なプラットフォームとしても機能する。例えば、細胞には、細胞移植プロセスの各段階において細胞を死なせて、細胞の機能（注射前、注射時、注射直後及び長期の生存性）を低下させ得る機械的及び構造的な課題が見られる。そして、これらの課題は、ハイドロゲルによって解決できる。ハイドロゲルは、宿主組織に移植した細胞の生存率及び生着率が上昇するように、注射の際に膜が損傷しないように細胞を保護できるからである。
【０００６】
いくつかのハイドロゲルでは、軟組織の再建及び幹細胞の移植においていくつか利点が見られるが、すべての機械的な課題に次々に対応できる材料は、現時点では存在しない。
【０００７】
充分な機械的特性を得るには、通常は、高めの架橋密度が必要とされる。しかしながら、これらの条件下では、宿主組織細胞（例えば、脂肪細胞の前駆細胞及び内皮前駆細胞）は、足場に浸透して、足場内に成長することはできない。分解性ハイドロゲルの場合には、瘢痕化及び線維組織の形成が典型である。宿主組織の侵入・成長が、非常に遅いか、または少なくともその線維物質の吸収よりも遅いペースで行われるからである。
【０００８】
最近、様々な細胞活性を補佐するためのＥＣＭ模倣体として機能するように、官能化ナノファイバーが開発された。ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）またはポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）のようなＦＤＡ準拠の合成生分解性ポリ−α−エステルを用いて、エレクトロスピニングとして知られるプロセスを通じて、ナノファイバーを作製できる。これらのポリマーから調製した生分解性の縫合糸及びインプラントは、生体適合性に関する優れた実績により、臨床で広く用いられている。幹細胞の操作用途用に、様々な直径及びトポグラフィーの様々なナノファイバーが開発されてきた。しかしながら、これらのナノファイバーは、巨視的な構造をもたらさないので、３Ｄ足場として使用するのは困難となっている。
【０００９】
多くの市販のハイドロゲルフィラーは、患者において中度から重度の炎症を引き起こす一方で、時間の経過とともに、完全な元々の体積が維持されない。
【００１０】
このような従来の方法及びシステムと関連する様々な問題を考慮すると、当該技術分野では、軟組織欠損部を治癒するための解決策の改善に対するニーズが依然として存在する。本開示は、このニーズに対する解決策であって、当該技術分野において認められている様々な問題を解消する解決策を提供する。
【発明の概要】
【００１１】
下記の開示における組成物及び方法は、特性が改善された（例えば、下にさらに詳述されているように、軟組織の再建の質が改善された）繊維−ハイドロゲル複合体マイクロビーズのような繊維−ハイドロゲル複合体を含む組成物を使用することによって、このニーズに対処するように設計されている。
【００１２】
したがって、一態様では、本発明で開示するのは、生物活性剤、ならびに平均長が約２００マイクロメートル未満である複数のポリマー繊維に共有結合しているハイドロゲルの網目構造、及び約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する架橋剤を含む実質的に非球状のマイクロビーズの集団を含む足場複合体（すなわち軟組織用具）であって、その生物活性剤が、その非球状のマイクロビーズ内に機能可能に封入されているか、その生物活性剤が、その非球状のマイクロビーズと機能可能に結合されているか、またはこれらが組み合わされており、そのマイクロビーズの平均寸法が、最長寸法に沿って約５０マイクロメートル〜約３００マイクロメートルの範囲内であり、そのマイクロビーズが、事前に反応されており、そのマイクロビーズが実質的に、室温で少なくとも約６カ月安定しており、その生物活性剤が、対象において、ｉ）宿主細胞の浸潤の漸増、ｉｉ）組織の成長の促進、及び／またはｉｉｉ）細胞もしくは組織の再生のうちの少なくとも１つを行うことができ、その軟組織用具が、その軟組織用具を必要とする対象の標的組織に移植または注射できる足場複合体である。
【００１３】
特定の態様では、本発明で開示するのは、生物活性剤、ならびに平均長が約２００マイクロメートル未満である複数のポリカプロラクトン繊維に共有結合している官能化ヒアルロン酸の網目構造、及び約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する架橋剤を含む実質的に非球状のマイクロビーズの集団を含む軟組織用具であって、その生物活性剤が、その非球状のマイクロビーズ内に機能可能に封入されているか、その生物活性剤が、その非球状のマイクロビーズと機能可能に結合されているか、またはこれらが組み合わされており、そのマイクロビーズの平均寸法が、最長寸法に沿って約５０マイクロメートル〜約３００マイクロメートルの範囲内であり、そのマイクロビーズが、事前に反応されており、そのマイクロビーズが実質的に、室温で少なくとも約６カ月安定しており、その生物活性剤が、対象において、ｉ）宿主細胞の浸潤の漸増、ｉｉ）組織の成長の促進、及び／またはｉｉｉ）細胞もしくは組織の再生のうちの少なくとも１つを行うことができ、その軟組織用具が、その軟組織用具を必要とする対象の標的組織に移植または注射できる軟組織用具である。
【００１４】
一実施形態では、そのマイクロビーズは、実質的に炎症を起こさない。
【００１５】
一実施形態では、その生物活性剤は、成長因子、サイトカイン、抗体、細胞、組織、組織担体もしくは組織結合部分、核酸、細胞担体もしくは細胞結合部分、またはこれらを組み合わせたものからなる群から選択されている。特定の実施形態では、その細胞結合部分または組織結合部分は、ペプチド、抗体、タンパク質、アプタマー、オリゴ糖または生体物質を含む。
【００１６】
一実施形態では、その生物活性剤は、脂肪細胞、自己脂肪細胞、同種異系細胞、遺伝子改変された同種異系細胞、幹細胞、間葉幹細胞、遺伝子改変された幹細胞、遺伝子改変された同種異系人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、及び遺伝子改変された低免疫原性多能性幹細胞、脂肪組織由来の間質血管画分、これらの誘導体またはこれらを組み合わせたものの集団を含む。
【００１７】
別の実施形態では、その生物活性剤は、その用具内またはその用具の近位に永続的に存在できる細胞の集団を含む。
【００１８】
特定の実施形態では、その生物活性剤は、脂肪間質血管画分を含む。
【００１９】
一実施形態では、その生物活性剤は、脂肪組織を含む。任意に、その脂肪組織は、脂肪吸引物である。任意に、その脂肪組織は、自己組織である。任意に、その脂肪組織は、同種異系組織である。一実施形態では、脂肪組織を含む本発明の軟組織用具は、３７℃で安定している。別の実施形態では、脂肪組織を含む本発明の軟組織用具は、対象の標的組織に投与する前に、１時間、２時間、３時間、５時間、７時間または１０時間の期間にわたって、４℃で保持する。
【００２０】
一態様では、提供するのは、対象の標的組織に投与するための、脂肪組織を含む本発明の用具を調製するためのキットであって、（ｉ）容積が約１ｃｃ〜約２０ｃｃまたは２０ｃｃ超のシリンジであって、実質的に非球状のマイクロビーズの集団の入ったシリンジと、（ｉｉ）容積が約１ｃｃ〜約２０ｃｃまたは２０ｃｃ超のシリンジであって、脂肪吸引物の入ったシリンジを含み、その２本のシリンジが、ルアーコネクターを介して連結し合うことができ、それによって、その脂肪吸引物が、そのマイクロビーズ内に機能可能に封入されるか、またはその脂肪吸引物が、そのマイクロビーズと機能可能に結合するキットである。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、対象の標的組織に投与するための、脂肪組織を含む本発明の用具の調製方法であって、その脂肪吸引物とそのマイクロビーズを好適な媒体中で、１日、２日、３日、４日、５日または７日混合することを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明の追加の態様は、対象の標的組織に投与するための、脂肪組織を含む本発明の用具を調製するためのキットであって、そのキットが、（ｉ）凍結乾燥マイクロビーズの入ったシリンジと、（ｉｉ）水、生理食塩水または好適な再構成液の入ったバイアルであって、水、生理食塩水または好適な再構成液が、そのバイアルからそのシリンジに吸引することができ、それによって、その凍結乾燥マイクロビーズが再水和されるバイアルと、（ｉｉｉ）その脂肪吸引物の入ったシリンジを含み、その２本のシリンジが、ルアーコネクターを介して連結し合うことができ、それによって、その脂肪吸引物が、そのマイクロビーズ内に機能可能に封入されるか、またはその脂肪吸引物が、その水和マイクロビーズと機能可能に結合するキットを提供する。
【００２３】
本発明の別の態様は、ヒト対象での脂肪の移植方法であって、脂肪組織、ならびに平均長が約２００マイクロメートル未満である複数のポリカプロラクトン繊維に共有結合している官能化ヒアルロン酸の網目構造、及び約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する架橋剤を含む実質的に非球状のマイクロビーズの集団を含む軟組織用具をその組織または組織欠損部に注射または移植することを含み、その生物活性剤が、その非球状のマイクロビーズ内に機能可能に封入されているか、その生物活性剤が、その非球状のマイクロビーズと機能可能に結合されているか、またはこれらが組み合わされており、そのマイクロビーズの平均寸法が、最長寸法に沿って約５０マイクロメートル〜約３００マイクロメートルの範囲内であり、そのマイクロビーズが、事前に反応されており、そのマイクロビーズが実質的に、室温で少なくとも約６カ月安定しており、その生物活性剤が、対象において、ｉ）宿主細胞の浸潤の漸増、ｉｉ）組織の成長の促進、及び／またはｉｉｉ）細胞もしくは組織の再生のうちの少なくとも１つを行うことができ、その軟組織用具が、その軟組織用具を必要とする対象の標的組織に移植または注射できる方法を提供する。
【００２４】
一実施形態では、その軟組織用具は、複数の孔を含む。別の実施形態では、対象の体内にある標的組織に移植または注射したときに、組織の成長及び細胞の浸潤を促すように、その孔の少なくとも一部が、そのマイクロビーズの全体にわたり配置されていてよい。特定の実施形態では、その複数の孔は、面密度が、１ｃｍ２当たり約５０個以上であり、孔の少なくとも約８０％の平均寸法が、約５マイクロメートル以上である。
【００２５】
一実施形態では、その官能化ヒアルロン酸は、アクリル化ヒアルロン酸を含み、その架橋剤は、チオール化ポリ（エチレングリコール）またはその誘導体を含む。
【００２６】
別の実施形態では、その官能化ヒアルロン酸は、チオール化ヒアルロン酸を含み、その架橋剤は、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）またはその誘導体を含む。任意に、その複数のポリカプロラクトン繊維は、エレクトロスピニング紡糸繊維を含む。
【００２７】
特定の実施形態では、そのポリカプロラクトン繊維の直径は、約１００ナノメートル〜約５マイクロメートルの範囲内である。
【００２８】
一実施形態では、そのマイクロビーズは、平均貯蔵弾性率が約５０Ｐａ〜約２５００Ｐａである。
【００２９】
別の実施形態では、本発明の用具は、対象の標的組織に皮膚投与または皮下投与するために、移植可能または注射可能な用具として調合されている。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、請求項１に記載の用具が約０．１ｍＬ〜約２０ｍＬ入ったシリンジを含むキットであって、前記マイクロビーズが、ｉ）実質的に脱水されたビーズ、またはｉｉ）対象の標的組織に注射できる状態である水和ビーズとして調合されているキットを提供する。
【００３１】
本発明の別の態様は、本発明の柔性用具を含む製剤であって、脱水マイクロビーズを形成するために、そのマイクロビーズが凍結乾燥されており、その脱水マイクロビーズが、対象の標的組織に投与する前に水、生理食塩水または好適な再構成液で再構成して、失われた量（重量によって測定）の水を実質的に補充して、その失われた量の水を補充したときに、その再構成液中のそのマイクロビーズの濃度が、凍結乾燥前のマイクロビーズの濃度と同じまたは実質的に同じになるようにするのに適する製剤を提供する。
【００３２】
本発明の追加の態様は、上記の製剤のうち、投与の必要な対象の標的組織に投与する前に水、生理食塩水または好適な再構成液によって再構成したときに、その脱水マイクロビーズが、そのビーズ形態を維持または回復する製剤を提供する。特定の実施形態では、その脱水マイクロビーズは実質的に、室温で少なくとも約１２カ月安定している。
【００３３】
本発明の一態様は、対象の標的組織に即時に投与するための柔性用具を調製するためのキットであって、そのキットが、そのマイクロビーズの入ったバイアルを含み、前記マイクロビーズが、凍結乾燥され、粉末ケーキに形成されており、その凍結乾燥された粉末ケーキが、水、生理食塩水または好適な再構成液によって再構成できるキットを提供する。
【００３４】
本発明の別の態様は、本発明で開示されているような用具のうち、対象の標的組織に即時に注射するための用具を調製するためのキットであって、そのキットが、（ｉ）凍結乾燥ゲルビーズとして調合されたマイクロビーズの入ったシリンジと、（ｉｉ）水、生理食塩水または好適な再構成液の入ったバイアルを含み、水、生理食塩水または好適な再構成液が、そのバイアルからそのシリンジに吸引することができ、それによって、その凍結乾燥マイクロビーズが再水和されるキットを提供する。
【００３５】
一実施形態では、本発明の軟組織用具は、成長因子、血管新生を刺激する化合物、免疫調節剤、炎症抑制剤及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択した化合物をさらに含む。
【００３６】
別の実施形態では、本発明の軟組織用具は、治療作用、血管新生作用、抗血管新生作用、抗炎症作用、抗菌作用、抗ヒスタミン作用またはこれらを組み合わせた作用を持つ化合物をさらに含む。
【００３７】
一実施形態では、本発明の軟組織用具は、処理した組織細胞外マトリックスをさらに含み、その処理した組織細胞外マトリックスは、脂肪組織から抽出可能なものである。
【００３８】
本発明の別の態様は、美顔手順または再建手順を行うか、あるいは外傷、外科的介入、または加齢性の疾患、障害もしくは状態に起因する組織欠損部を軽減または逆転させる方法であって、平均長が約２００マイクロメートル未満である複数のポリカプロラクトン繊維に共有結合している官能化ヒアルロン酸の網目構造と、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する架橋剤を含む実質的に非球状のマイクロビーズの集団内に機能可能に封入された生物活性剤を含む軟組織用具をその組織及び／または組織欠損部に注射することを含み、そのマイクロビーズの平均寸法が、最長寸法に沿って約５０マイクロメートル〜約３００マイクロメートルの範囲内であり、そのマイクロビーズが、事前に反応されており、そのマイクロビーズが実質的に、室温で少なくとも約６カ月安定しており、その生物活性剤が、対象において、ｉ）宿主細胞の浸潤の漸増、ｉｉ）組織の成長の促進、及び／またはｉｉｉ）細胞もしくは組織の再生のうちの少なくとも１つを行うことができ、その軟組織用具が、その軟組織用具を必要とする対象の標的組織に移植または注射できる方法を提供する。
【００３９】
適用可能であるか、または具体的に放棄されていない場合、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つは、他の実施形態が、本発明の異なる態様において説明されていても、そのいずれかの他の１つ以上の実施形態と組み合わせることができるように企図されている。
【００４０】
上記の実施形態及び他の実施形態は、下記の詳細な説明に開示されているか、または下記の詳細な説明から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】注射後の炎症性応答を示す画像である。チオール化ＨＡ（ＨＡ−ＳＨ）＋ジアクリル化ポリエチレングリコール（ＰＥＧＤＡ）（架橋剤）を含むゲル（上向きの矢印）と、アクリル化ＨＡ（ＨＡ−Ａｃ）＋チオール化ポリエチレングリコール（ＰＥＧＳＨ、下向きの矢印）を含むゲルについて、注射から１日目に炎症性応答を比較したものが示されている。
【図１Ｂ】注射後の炎症性応答を示す画像である。ブタ内ももモデルでの炎症試験から、施術後０日目（ＰＯＤ０）（中央パネル）及びＰＯＤ２（右パネル）に得られた画像が示されている。左パネルには、各皮下注射の際の複合体の内訳が示されており、内もも画像に示されているパターンに対応している。
【図１Ｃ】注射後の炎症性応答を示す画像である。移植から４８時間後のブタ内ももモデルにおける重要な群に対する組織学的応答が示されている。青色染色部は、ヒアルロン酸を示しており、赤色染色部は、免疫細胞染色部を示している。注射部位は、チオール化ＨＡ群では、注射部位の外縁での単球の活性化（このＨＡ群に対する強力な急性免疫応答を示す）によって可視化されているように、宿主組織と注射部位の境界が明瞭な状態でカプセル化されている。
【図１Ｄ】ＬＳの剛性複合体及び柔性複合体、ならびに関連する市販のコントロール材のせん断貯蔵弾性率（単位：Ｐａ）を示すグラフである。
【図１Ｅ】本発明の複合体の体積保持性を市販のコントロール材と比較したものを示すグラフである。
【図２Ａ】個々のビーズを画像化するために１００倍希釈した後のビーズ状複合体ＬＳの光学顕微鏡画像である。直径２５０μｍのビーズに微粒化した後の複合体を示している。
【図２Ｂ】個々のビーズを画像化するために１００倍希釈した後のビーズ状複合体ＬＳの光学顕微鏡画像である。凍結乾燥及び再水和を行った後の複合体を示しており、その複合体が、元の外観を保持していることが示されている。
【図２Ｃ】個々のビーズを画像化するために１００倍希釈した後のビーズ状複合体ＬＳの光学顕微鏡画像である。そのＬＳのビーズ状製剤のナノファイバー成分及びハイドロゲル成分を示す１０倍画像である。
【図２Ｄ】個々のビーズを画像化するために１００倍希釈した後のビーズ状複合体ＬＳの光学顕微鏡画像である。非希釈状態のそのビーズ状製剤の光学顕微鏡画像である。
【図２Ｅ】ビーズ化及び凍結乾燥が貯蔵弾性率に影響を及ぼさないことを示している。
【図３】塊状の複合体ゲルの貯蔵弾性率を１５０μｍ及び２５０μｍのビーズ状粒子と比較したもの示している。
【図４Ａ】複合体ＬＳ−１の解析結果を示すグラフである。ＭＲＩによる定量によって評価した場合の、ビーズ状複合体の体積保持を市販のコントロール材と比較したもの示している。
【図４Ｂ】複合体ＬＳ−１の解析結果を示すグラフである。４Ａで用いた複合体と同じＨＡ濃度及び繊維充填量で調製した複合体のせん断貯蔵弾性率に対して、ＨＡ分子量（ＭＷ）が及ぼす作用を示している。
【図４Ｃ】複合体ＬＳ−１の解析結果を示すグラフである。同じＨＡ  ＭＷ及び繊維充填条件で調製した複合体のせん断貯蔵弾性率に対して、ＨＡ濃度（ｍｇ／ｍｌ）が及ぼす作用を示している。
【図４Ｄ】複合体ＬＳ−１の解析結果を示すグラフである。同じＨＡ  ＭＷ及び繊維充填条件で調製した複合体の圧縮貯蔵弾性率に対して、ＨＡ濃度（ｍｇ／ｍｌ）が及ぼす作用を示している。
【図４Ｅ】複合体ＬＳ−１の解析結果を示すグラフである。特性の異なる足場（表１を参照されたい）の体積の保持を示しており、本発明の複合体の調整性が示されている。
【図５Ａ】競合他社製品と比べて、新たな組織が、ＬＳ９のビーズ状複合体の注射部位に浸潤していることを示す一連のＭＲＩ画像である。ＪＵＶＥＤＥＲＭ（登録商標）フィラーでは、注射から１４日目、３０日目及び５０日目に、組織の侵入・成長が０％であることを示しており、この製品では、宿主細胞組織の侵入・成長が見られないことが示されている。
【図５Ｂ】競合他社製品と比べて、新たな組織が、ＬＳ９のビーズ状複合体の注射部位に浸潤していることを示す一連のＭＲＩ画像である。ＬＳ−９製剤の注射後の組織の侵入・成長を示しており、１４日目には、新たな組織が１８％、３０日目には、新たな組織が５２％、５０日目には、新たな組織が８４％見られた。
【図５Ｃ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて複合体の持続性に最も大きな作用を及ぼすものを明らかにするために、変化させた５つのパラメーター、すなわち、ハイドロゲルの分子量、ハイドロゲルの変性度、ハイドロゲルの濃度、ナノファイバーの濃度及び架橋密度を示している。示されているように、その線形回帰モデルの線形予測能は、１４日目（Ｒ２＝０．９５）及び３０日目（Ｒ２＝０．８６）において、許容されるものである。ハイドロゲルの濃度及びナノファイバーの濃度が、最も大きな作用を及ぼすと見られた。
【図６Ａ】予め形成したビーズ状複合体ＬＳの膨潤評価結果を市販のコントロール材と比較したものを示している。画像（上パネル）及びＭＲＩ断面（下パネル）の両方とも、０日目及び２日目において、予め形成した複合体（左下に注射）をＪＵＶＥＤＥＲＭ（右下に注射）と比較した画像を示している。
【図６Ｂ】予め形成したビーズ状複合体ＬＳの膨潤評価結果を市販のコントロール材と比較したものを示している。ＪＵＶＥＤＥＲＭ（登録商標）ＶＯＬＵＭＡ  ＸＣ（登録商標）（左側の２本）、ＵＬＴＲＡ  ＰＬＵＳ  ＸＣ（登録商標）（中央の２本）及びＬＳビーズ（右側の２本）の０日目（左のバー）及び２日目（右のバー）の膨潤作用のペアワイズ比較結果をグラフ化したものを示している。
【図６Ｃ】予め形成したビーズ状複合体ＬＳの膨潤評価結果を市販のコントロール材と比較したものを示している。ＬＳ−９のビーズ状複合体が、施術後の膨潤を限定し、宿主組織の侵入・成長を最大限に高めることによって、市販の比較品と一線を画すことを示すグラフである。
【図７Ａ】軟組織注射剤の剛性を示すグラフである。
【図７Ｂ】軟組織注射剤のｔａｎδを示すグラフである（エネルギー損失とエネルギー貯蔵のバランスを定量したものである。弾性率または粘度にかかわらず、ｔａｎδが大きいほど、より液体に近い特性を示し、ｔａｎδが小さいほど、より固体に近い特性を示す）。
【図７Ｃ】複合体（左上）と天然型のヒト脂肪（左下）の比較を示す３つの画像である。これらの２つの材料は、右パネルに、並んだ状態で示されている。
【図８Ａ】合成軟組織の作製方法を示している。ウサギモデルにおいて鼠径部脂肪体に欠損部を作製するための一般的な手順を示している。
【図８Ｂ】合成軟組織の作製方法を示している。ＰＯＤ１４における、異なる移植片マトリックス（１５０Ｐａの複合体、１５０Ｐａのハイドロゲル及び８０Ｐａのハイドロゲル）への宿主血管の浸潤を示している。内皮細胞は、ＣＤ３１で赤色に染色し、細胞核は、ＤＡＰＩで青色に染色した。繊維は、Ｆ８ＢＴで緑色に染色した。スケールバーは１００μｍである。
【図９Ａ】複合体ＬＳを用いた、脂肪組織の送達を示す画像である。本発明の複合体マトリックスと脂肪吸引物を１：１の比率で組み合わせたもの（左）及び脂肪吸引物のみのもの（右）を示している。
【図９Ｂ】複合体ＬＳを用いた、脂肪組織の送達を示すいくつかの画像である。脂肪５０％：複合体５０％の群において、脂肪１００％の群と比べて血管新生が改善したことを肉眼で赤色及び血管系によって特定したものを示している。
【図９Ｃ】複合体ＬＳを用いた、脂肪組織の送達を示すいくつかの画像である。脂肪５０％：複合体５０％の群において、脂肪１００％の群と比べて血管新生が改善したことを顕微鏡でＣＤ３１染色によって特定したものを示している。内皮細胞は、ＣＤ３１で赤色に染色し、細胞核は、ＤＡＰＩで青色に染色した。繊維は、Ｆ８ＢＴで緑色に染色した。
【図１０Ａ】ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）を播種した複合体ＬＳ、及びそのＬＳのビーズ状製剤の全体にわたってｈＭＳＣが増殖したことを示すいくつかの画像である。９６ウェル懸濁プレートを用いて、ｈＭＳＣを一晩播種したＬＳ−１４の共焦点顕微鏡画像を示している。細胞をＬＳビーズとともに一晩培養したところ、主として、細胞からなる表面被覆層が得られた。ＬＳビーズをＣＤ３１で赤色に染色し、細胞核をＤＡＰＩで青色に染色した。繊維をＦ８ＢＴで緑色に染色した。
【図１０Ｂ】ＬＳビーズの作製及び細胞播種のプロトコールの概略を示している。塊状のハイドロゲル−繊維複合体を２５０μｍの篩目から押し出し、回収し、再び篩に通して、直径約５０〜３００μｍの粒子を作製した。図１０Ｂはさらに、異なるウェルプレートを用いることで、ＬＳビーズにおける細胞の分布にどの程度の影響が及ぶのかを示している。
【図１０Ｃ】細胞播種用の１２ウェルスピナーマウント具である。
【図１０Ｄ】スピナーフラスコを取り付けた１２ウェルを用いて、ｈＭＳＣを一晩播種したＬＳ−１４の共焦点顕微鏡画像を示している。スピナーフラスコを取り付けた１２ウェルを用いたところ、細胞がより均一に分布可能になり、細胞が、その微小粒子の多孔質の足場に浸透可能になった。ＬＳビーズは、ＣＤ３１で赤色に染色し、細胞核は、ＤＡＰＩで青色に染色した。繊維は、Ｆ８ＢＴで緑色に染色した。図１０Ｄから、ｈＭＳＣが、ＬＳビーズに接着し、凸凹の形状に沿った形態を取ったことは明らかである。図１０Ｄにより、ｈＭＳＣのアクチンフィラメントが、そのハイドロゲル内で、繊維成分の軸に沿って共局在することが示されている。
【図１０Ｅ】ｈＭＳＣがＬＳマイクロビーズ上で増殖して、２次元の細胞培養物を形成することを示している。ａは、ｈＭＳＣとともに、特定の期間（３日、６日及び１２日）にわたって、２００ｒｐｍの振盪機上の懸濁ウェル中で培養したＬＳ−１４の共焦点顕微鏡画像を示している。ＬＳビーズは、ＣＤ３１で赤色に染色し、細胞核は、ＤＡＰＩで青色に染色した。繊維は、Ｆ８ＢＴで緑色に染色した。ａにおいて、ｈＭＳＣが時間とともに、ＬＳ複合体マイクロビーズの全体にわたって増殖したことが明らかに観察された。ｂは、接着時（０日目）のＬＳビーズ上のｈＭＳＣの数、及び増殖後（１日目、３日目、１２日目）のＬＳビーズ上のｈＭＳＣの数を示すグラフである。細胞の定量は、画像解析を通じて行った。画像定量から得た測定値は、共焦点顕微鏡によって微小粒子−ｈＭＳＣ（５０個以上の粒子）を個々に画像化し、構造全体を通じてｚスタックを行うことによって求めた。粒子の面積にｚスタックの総厚を乗じる、ＩｍａｇｅＪによる解析によって、粒子の体積を求めた。これによって、細胞／体積の測定値を得て、細胞の定量図に示した。ｂに見られるように、ビーズの多孔質性により、表面積が増大することで、ｈＭＳＣは、ビーズの表面上、及びビーズのコア方向の両方において成長可能になる。ＲＧＤペプチドの付加により、ｈＭＳＣの細胞接着性が向上することが観察され、その粒子上の細胞の倍加時間が短縮された。ｂは、接着時（０日目）のＬＳビーズ上のｈＭＳＣの数、及び増殖後（１日目、３日目、１２日目）のＬＳビーズ上のｈＭＳＣの数を示すグラフである。
【図１０Ｆ】ＡＤ−ｈＭＳＣ（脂肪由来ｈＭＳＣ）とともに３日間培養したＬＳ−１４を心筋梗塞誘発ラットの心臓の心筋にＰＯＤ２８に注射したものの共焦点顕微鏡画像を示している。ＬＳ−１４／ｈＭＳＣビーズでは、ＧＳ４−イソレクチンＢ４染色陽性により、宿主組織による高度な細胞の浸潤及び血管の浸潤が示された。
【図１０Ｇ】マイクロビーズＬＳ−１４、ＬＳ−１４＋ｈＭＳＣ及びＰＢＳ緩衝液をＰＯＤ２８に注射したラット心筋梗塞モデルを示している（上画像：マッソントリクローム、下画像：Ｈ＆Ｅ）。施術及び処置から４週間目に、ラット心筋において、瘢痕組織の形成及びコラーゲン沈着の低下が見られ、ｈＭＳＣを付加することでさらに、心筋壁の一体性が向上した。
【図１０Ｈ】ｈＭＳＣとともに３日間培養したＬＳ−１４（ＬＳ−１４／ｈＭＳＣ）をラットの皮下空間にＰＯＤ７２に注射したものの共焦点顕微鏡画像を示している。ＰＯＤ７２には、細胞の浸潤によって、注射材のコアまでの完全な回復は示されなかったが、宿主組織と移植片との界面では、ＲＥＣＡ−１（内皮細胞）染色陽性であること、及びその領域における細胞の活発な成長が示されている。
【図１０Ｉ】ラットに皮下注射した場合（注射量：２００μＬ）の体積保持性を示すグラフである。ＭＲＩによる測定を通じて、各スライスにおいて注射材の面積を測定することによって、その材料の体積保持性を定量した。図１０Ｉには、Ｇ１（培養日数７日、ＬＳ−１４／ｈＭＳＣ、接着ペプチドＲＧＤ含有）、Ｇ２（培養日数１日、ＬＳ−１４／ｈＭＳＣ、接着ペプチドＲＧＤ含有）、Ｇ３（培養日数０日、ＬＳ−１４／ｈＭＳＣ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、接着ペプチドＲＧＤ含有）、Ｇ４（培養日数７日、ＬＳ−１４／ｈＭＳＣ、ペプチドなし）、Ｇ５（ＬＳ−１４のみ）のＰＯＤ７２における体積保持性が示されている。
【図１０Ｊ】ＬＳ−５の注射から１３週目のラットモデルにおける組織学的解析（Ｈ＆Ｅ染色）結果を示している。細胞の成長／浸潤パターンが明白に観察され、そのパターンでは、下地となるビーズの形態が再現されている。
【図１１Ａ】ビーズ状複合体の凍結乾燥形態の発生過程を示している。ビーズ状複合体ＬＳの光学顕微鏡画像を示している。ＨＡ−Ａｃ、ナノファイバー及び５ｋの２−アーム型ＰＥＧＳＨをＰＢＳ中で調合、一晩反応させる。図１１Ａは、一晩反応させる前（「ビーズ化前」）の複合体の画像である。
【図１１Ｂ】ビーズ状複合体の凍結乾燥形態の発生過程を示している。ビーズ状複合体ＬＳの光学顕微鏡画像を示している。ＨＡ−Ａｃ、ナノファイバー及び５ｋの２−アーム型ＰＥＧＳＨをＰＢＳ中で調合、一晩反応させる。図１１Ｂは、ビーズ形成後（「ビーズ」）の複合体の画像である。
【図１１Ｃ】ビーズ状複合体の凍結乾燥形態の発生過程を示している。ビーズ状複合体ＬＳの光学顕微鏡画像を示している。ＨＡ−Ａｃ、ナノファイバー及び５ｋの２−アーム型ＰＥＧＳＨをＰＢＳ中で調合、一晩反応させる。図１１Ｃは、凍結乾燥及び再水和を行った後（「凍結乾燥後」）の複合体の画像である。
【図１１Ｄ】１１Ａ〜１１Ｃのそれぞれのせん断貯蔵弾性率の測定結果を示すグラフであり、ビーズ状複合体の安定性が塊状の複合体よりも向上したことが示されている。
【図１２Ａ】ビーズ化前の試料、ビーズ状の試料及び改良した凍結乾燥プロセスによる凍結乾燥後の試料のせん断弾性率を示すグラフである。
【図１２Ｂ】ビーズ化前の試料、ビーズ状の試料及び改良した凍結乾燥プロセスによる凍結乾燥後の試料の圧縮弾性率を示すグラフである。
【図１３Ａ】低張製剤を用いる凍結乾燥法の進展過程を示す一連のグラフである。２５０μｍのビーズ試料（ビーズ化前のもの、ビーズ化後のもの、糖溶液中の凍結乾燥後ビーズ、ＰＢＳ中の凍結乾燥後ビーズを含む）の貯蔵弾性率を示している。
【図１３Ｂ】ビーズ化後のせん断弾性率を示している。
【図１３Ｃ】２５０μｍのビーズ及び１５０μｍのビーズのビーズ化後のｔａｎδを示している。
【図１３Ｄ】本明細書に記載されている複合体を含む市販の製剤のｔａｎδが低下していく動向を示している。
【図１４Ａ】複合体ＬＳについて、ビーズ寸法及び繊維長を特徴付けるデータを示している。ビーズ直径のヒストグラムである（平均＝２０９．４±６２．３μｍ、中央値＝２１０μｍ、ｎ＝５１）。ビーズの直径は、共焦点顕微鏡画像で、粒子の最長軸に沿って測定した。
【図１４Ｂ】複合体ＬＳについて、ビーズ寸法及び繊維長を特徴付けるデータを示している。７５μｍの篩（左）、１５０μｍの篩（中央）、２５０μｍの篩（右）を用いたビーズの顕微鏡画像である。粒子内の最長軸を測定することによって、約７５μｍ、約１５０μｍ及び約２００μｍの寸法のビーズであることが示されている。より堅実な測定のために、エッジ検出を利用する画像解析プログラムを用いて、ビーズ分布のさらなる特徴付けを行った。
【図１４Ｃ】複合体のビーズ寸法に応じて複合体の注入性を評価するために、特定の圧力下での変位を示す注入力曲線である。力学試験機ＭＴＳ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ４３に連結したシリンジ固定具（Ｉｎｓｔｒｏｎ）に、１５０μｍのビーズ及び７５μｍのビーズを充填したシリンジを取り付けた。シリンジから、２７ゲージの針（長さ１／２インチ、ＢＤ）を通じて、１ｍｍ／秒のクロスヘッド速度で、ゲルを注入した。１５０μｍ群及び７５μｍ群のいずれでも、許容される注入プロファイルが得られた。
【図１４Ｄ】ハイドロゲル全体に分散された繊維の長さ分布を示している（平均＝１１０．４±８５．５μｍ、範囲＝１２〜４４２μｍ、ｎ＝１０８）。
【図１４Ｅ】第１のＧｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＧＭＰ）（ロット０００１〜００２５）から得られた繊維であって、ハイドロゲル全体に分散させて配置した繊維の長さ分布を示している（平均＝３０．１±２６．９μｍ、範囲＝２．５〜２０５．００μｍ、ｎ＝９９３）。
【図１５Ａ】ＬＳ−１４／ｈＭＳＣ（３日培養したもの）を注射した後のＰＯＤ３０のウサギにおける組織学的解析結果を示す２枚の画像である。ＬＳ−１４／ｈＭＳＣ（３日培養したもの）を注射した後のＰＯＤ３０のウサギ脂肪体におけるＨ＆Ｅ染色（左）及びマッソントリクローム染色（右）により、組織及び細胞の活発な浸潤が示されている。
【図１５Ｂ】ＬＳ−１４／ｈＭＳＣ（３日培養したもの）を注射した後のＰＯＤ３０のウサギにおける組織学的解析結果を示す２枚の画像である。ＬＳ−１４／ｈＭＳＣ（３日培養したもの）を注射した後のＰＯＤ３０のウサギ皮下空間におけるＨ＆Ｅ染色（左）及びマッソントリクローム染色（右）により、組織及び細胞の中度の浸潤が示されている。
【図１６Ａ】複合体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの脂肪移植片の生存を高める能力を示す一連の画像を示している。上の図は、モールド内での２４時間のゲル化期間後の、複合体（Ｃ）またはハイドロゲル（Ｈ）に対する脂肪吸引物（Ｆ）のそれぞれ異なる比率を示している。脂肪吸引物１００％（１００Ｆ）、複合体５０％：脂肪吸引物５０％（５０Ｃ）、複合体２５％：脂肪吸引物７５％（２５Ｃ）、及びハイドロゲル１００％（１００Ｈ）である。比率（％）は、複合体（Ｃ）またはハイドロゲル（Ｈ）に対する脂肪吸引物（Ｆ）の体積比に基づき算出した。下の図は、Ａｒｅｓ  Ｇ２というレオメーターで試験した試料を示している。
【図１６Ｂ】複合体（Ｃ）またはハイドロゲル（Ｈ）に対する脂肪吸引物（Ｆ）の比率が異なる場合の、レオロジー解析による機械的特性を示している。左の図は、各試料群の代表的な歪スイープ結果である。左及び右の図の試料群は、脂肪吸引物１００％（１００Ｆ）、複合体１００％（１００Ｃ）、複合体５０％（５０Ｃ）、複合体２５％（２５Ｃ）、ハイドロゲル５０％（５０Ｈ）及びハイドロゲル１００％（１００Ｈ）として選択した。比率（％）は、複合体（Ｃ）またはハイドロゲル（Ｈ）に対する脂肪吸引物（Ｆ）の体積比に基づき算出した。右の図は、各試料群の平均せん断弾性率（Ｇ’）を示している。
【図１６Ｃ】脂肪吸引物、複合体またはハイドロゲルの異なる複合材を用いた場合のＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイの結果を示している。Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイを用いて、０日目、１日目、２日目、３日目及び７日目の生存細胞の相対量を定量した。結果は、７日間の期間にわたる生存脂肪細胞の割合（％）を、１日目に得られた値に対して正規化したものとして示されている。いずれの他の群においても、脂肪吸引物と比べて、生細胞の割合（％）が有意に高かった（ｐ値＜０．０５）。
【図１６Ｄ】様々な比率の脂肪吸引物（Ｆ）及び複合体（Ｃ）の免疫組織化学法（ＩＨＣ）による解析結果を示している。ＩＨＣのために、繊維をＦ８ＢＴで染色し、脂肪吸引物と組み合わせた。試料をペリリピンで染色して、形態を評価した（赤色で示されている）。脂肪細胞では、細胞構造の保存が見られた。ＤＡＰＩ染色により、細胞核が見られる（青色で示されている）。スケールバーは１００μｍである。ＬＳ複合体では、脂肪吸引物と組み合わせると、細胞レベルで、均一な一体化が見られた（緑色に示されている）。ペリリピン染色によると、複合体を含む両方の群（５０Ｃ及び２５Ｃ）において、脂肪吸引物１００％の試料と比べて、繊維が均一に分散していると見られ、脂肪細胞の形態を有害な形には変更しない。
【図１７Ａ】ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管の侵入・成長及び脂肪移植片の体積保持性に関して、様々な比率の脂肪吸引物（Ｆ）及び複合体（Ｃ）の能力を評価した画像を示している。試料群は、脂肪吸引物１００％（１００Ｆ）、複合体１００％（１００Ｃ）、複合体５０％（５０Ｃ）、複合体２５％（２５Ｃ）及びハイドロゲル５０％（５０Ｈ）として選択した。比率（％）は、複合体（Ｃ）またはハイドロゲル（Ｈ）に対する脂肪吸引物（Ｆ）の体積比に基づき算出した。図１７Ａは、各試料群についてのＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）による体積の解析結果を示している。体積保持性に関しては、ＰＯＤ８４の時点では、２５Ｃの群において最も良い結果が得られた。いずれの群でも、移植片の初期の移植体積が有意な量失われたが、２５Ｃでは、保持された体積が最も大きかった。１００Ｃでは、ＰＯＤ８４における体積保持率が最も低く、複合体のみでは、脂肪組織の充分な補填物として機能せず、脂肪移植に対する支持的な補助剤として機能するに過ぎないことが示されている。
【図１７Ｂ】血管の侵入・成長及び脂肪移植片の体積保持に関して、ｉｎ  ｖｉｖｏで、様々な比率の脂肪吸引物（Ｆ）及び複合体（Ｃ）の能力を評価した画像を示している。試料群は、脂肪吸引物１００％（１００Ｆ）、複合体１００％（１００Ｃ）、複合体５０％（５０Ｃ）、複合体２５％（２５Ｃ）及びハイドロゲル５０％（５０Ｈ）として選択した。比率（％）は、複合体（Ｃ）またはハイドロゲル（Ｈ）に対する脂肪吸引物（Ｆ）の体積比に基づき算出した。図１７Ｂは、形状の保持の解析結果を示している。ＰＯＤ２及びＰＯＤ８４に、移植片の最大高さを測定し、高さの変化率（％）を算出した。移植片は、時間の経過とともに平坦化し得るが、それでも、同程度の全体的体積を保持する。このため、移植片の最大高さを形状の保持のマーカーとして選択した。１００Ｆ及び２５Ｃは、移植片の最大高さの変化が最も小さかったことから、形状の保持性が最も高いことが示唆された。５０Ｃ、５０Ｈ及び１００Ｃは、対照としての１００Ｆと比べて、形状の保持性が有意に低かった。体積の解析及び形状の保持の解析は、ＩｍａｇｅＪというソフトウェアを用いて、盲検下で治験担当医によって行った。形状の保持は、この材料に欠かせないものである。自己脂肪移植の主な目的が、軟組織欠損部のフィラーとして機能することであるからである。
【図１７Ｃ】血管の侵入・成長及び脂肪移植片の体積保持に関して、ｉｎ  ｖｉｖｏで、様々な比率の脂肪吸引物（Ｆ）及び複合体（Ｃ）の能力を評価した画像を示している。試料群は、脂肪吸引物１００％（１００Ｆ）、複合体１００％（１００Ｃ）、複合体５０％（５０Ｃ）、複合体２５％（２５Ｃ）及びハイドロゲル５０％（５０Ｈ）として選択した。比率（％）は、複合体（Ｃ）またはハイドロゲル（Ｈ）に対する脂肪吸引物（Ｆ）の体積比に基づき算出した。図１７Ｃは、ＰＯＤ７におけるＩＨＣによるペリリピン染色の解析結果を示している。スケールバーは１００μｍである。ＰＯＤ７におけるＩＨＣによるペリリピン染色により、すべての群にわたって、脂肪細胞の形態が保持されたことが示されている。
【図１７Ｄ】血管の侵入・成長及び脂肪移植片の体積保持に関して、ｉｎ  ｖｉｖｏで、様々な比率の脂肪吸引物（Ｆ）及び複合体（Ｃ）の能力を評価した画像を示している。試料群は、脂肪吸引物１００％（１００Ｆ）、複合体１００％（１００Ｃ）、複合体５０％（５０Ｃ）、複合体２５％（２５Ｃ）及びハイドロゲル５０％（５０Ｈ）として選択した。比率（％）は、複合体（Ｃ）またはハイドロゲル（Ｈ）に対する脂肪吸引物（Ｆ）の体積比に基づき算出した。図１７Ｄは、ＰＯＤ２８におけるＩＨＣによるペリリピン染色の解析結果を示している。スケールバーは１００μｍである。図１７Ｄにより、２５Ｃの試料において、他の試料と比べて、脂肪細胞の構造が最も完全に保存されたことが示されている。繊維が、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件でも均一に分散するとともに、組織と充分に一体化することも認識される。
【図１７Ｅ】血管の侵入・成長及び脂肪移植片の体積保持に関して、ｉｎ  ｖｉｖｏで、様々な比率の脂肪吸引物（Ｆ）及び複合体（Ｃ）の能力を評価した画像を示している。試料群は、脂肪吸引物１００％（１００Ｆ）、複合体１００％（１００Ｃ）、複合体５０％（５０Ｃ）、複合体２５％（２５Ｃ）及びハイドロゲル５０％（５０Ｈ）として選択した。比率（％）は、複合体（Ｃ）またはハイドロゲル（Ｈ）に対する脂肪吸引物（Ｆ）の体積比に基づき算出した。図１７Ｅは、ＰＯＤ７におけるＩＨＣによるＣＤ３１染色の解析結果を示している。スケールバーは１００μｍである。ＩＨＣによるＣＤ３１染色の結果により、時間の経過とともに、血管新生が変化したことが明確に示されている。ＰＯＤ７には、すべての群において、血管新生が限定的であることが観察される。しかしながら、この時点で、２５Ｃ群内には、他の群と比較すると、少なくともわずかに多くかつ強固な血管が存在するように見える。
【図１７Ｆ】血管の侵入・成長及び脂肪移植片の体積保持に関して、ｉｎ  ｖｉｖｏで、様々な比率の脂肪吸引物（Ｆ）及び複合体（Ｃ）の能力を評価した画像を示している。試料群は、脂肪吸引物１００％（１００Ｆ）、複合体１００％（１００Ｃ）、複合体５０％（５０Ｃ）、複合体２５％（２５Ｃ）及びハイドロゲル５０％（５０Ｈ）として選択した。比率（％）は、複合体（Ｃ）またはハイドロゲル（Ｈ）に対する脂肪吸引物（Ｆ）の体積比に基づき算出した。図１７Ｆは、ＰＯＤ２８におけるＩＨＣによるＣＤ３１染色の解析結果を示している。スケールバーは１００μｍである。複合体を含むいずれの群（２５Ｃ、５０Ｃ及び１００Ｃ）でも、ＰＯＤ２８の時点に、血管が有意に発現している。これに対して、１００Ｆ及び５０Ｈの群では、強いＣＤ３１染色は見られないことから、血管新生速度が劣ることが示唆されている。充分な血液の供給は、移植片の生着に不可欠であり、このことは、複合体を含む群の体積保持率が最も高かった理由を説明する助けとなり得る。
【図１７Ｇ】血管の侵入・成長及び脂肪移植片の体積保持に関して、ｉｎ  ｖｉｖｏで、様々な比率の脂肪吸引物（Ｆ）及び複合体（Ｃ）の能力を評価した画像を示している。試料群は、脂肪吸引物１００％（１００Ｆ）、複合体１００％（１００Ｃ）、複合体５０％（５０Ｃ）、複合体２５％（２５Ｃ）及びハイドロゲル５０％（５０Ｈ）として選択した。比率（％）は、複合体（Ｃ）またはハイドロゲル（Ｈ）に対する脂肪吸引物（Ｆ）の体積比に基づき算出した。図１７Ｇは、ＰＯＤ８４の移植片の３Ｄ  ＣＴ（コンピュータ断層撮影）再構成画像から構成されており、ＭｉｃｒｏＦｉｌの灌流を利用してから、ＶｉｖｏＱｕａｎｔというソフトウェアで解析を行ったものである。カッコ内に、各移植片の血管新生率が、移植片の総体積に対する割合（％）として示されている。図１７Ｇに示されている３Ｄ画像により、複合体を含む移植片では、１００Ｆまたは５０Ｈの移植片よりも、血管新生が大幅に亢進していることが示されている。２５Ｃは、移植片の総体積に対する血管の割合（％）が最も高く、他の標本と比べて、血管新生レベルが高いことが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
下記の詳細な説明は、例として示されているが、本発明を限定するものではなく、記載されている具体的な実施形態を限定するように意図されているに過ぎず、添付の図面と併せれば、最も深く理解することができる。
【００４３】
本発明は、事前に反応させたビーズ状複合材であって、ハイドロゲル及びナノ構造体を含み、軟組織の再建方法で使用するためのものであるビーズ状複合材に関するものである。本発明は、美顔、再建及び細胞療法で細胞及び組織を送達するためのビーズ状複合材を含む軟組織用具にも関するものである。
【００４４】
本発明は、所定の組織成分（脂肪細胞、その他の間葉細胞または間葉幹細胞が挙げられるが、これらに限らない）を動員、捕捉、内包、結合及び／または包埋できる複合材にも関するものである。本発明はさらに、所定の組織（脂肪組織が挙げられるが、これに限らない）を動員、捕捉、内包、結合及び／または包埋できる複合材に関するものである。本発明は、生分解性繊維に共有結合している生体材料を含む足場複合体（軟組織用具など）を含む組成物を用いて、軟組織傷害を修復または再建する方法にも関するものである。本発明は、別の態様では、軟組織の再建で使用するための組成物を作製する方法であって、その組成物が、ハイドロゲル、及びそのハイドロゲル内に配置されたナノ構造体を含む方法にも関するものである。本発明は、特定の態様では、美顔、再建及び細胞療法で細胞及び組織を送達する際に使用するための組成物を作製する方法にも関するものである。
【００４５】
以下は、当業者が本発明を実施するのを補佐するために提供する、本発明の詳細な説明である。当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに、本明細書に記載されている実施形態に対して、修正及び改変を加えることができる。別段の定義のない限り、本明細書で用いられているすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味である。本明細書において、本発明の説明で用いられている専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明を限定するようには意図されていない。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許、図及びその他の参照文献は、参照により、その全体が明示的に援用される。
【００４６】
本明細書に記載されている方法及び材料と類似または同等のいずれの方法及び材料も、本発明の実施及び試験の際に使用できるが、以下では、好ましい方法及び材料を説明する。本明細書で言及されているすべての刊行物は、その刊行物の引用部分と関連する方法及び／または材料を開示及び説明する目的で、参照により、本明細書に援用される。
【００４７】
別段の定義のない限り、本明細書で用いられているすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味である。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）、Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）、Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）及びＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）という参照文献（参照により、その開示内容の全体が本明細書に援用される）により、当業者は、（本明細書で別段に定義されていない限り）本発明で用いられている多くの用語の一般的な定義を得られる。概して、本明細書に記載されているかまたは本発明にまつわる分子生物学的方法などの手順は、当該技術分野において用いられている一般的な方法である。このような標準的な技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ）のようなリファレンスマニュアルに見ることができる。
【００４８】
下記の用語は、別段の定めのない限り、以下でそれらの用語に割り当てられた意味である場合がある。しかしながら、当然のことながら、当業者によって知られているかまたは理解されている他の意味も可能であり、その他の意味も、本発明の範囲内である。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許及びその他の参照文献は、参照により、その全体が援用される。矛盾がある場合には、定義を含め、本明細書が優先されることになる。加えて、材料、方法及び例は、例示的なものに過ぎず、限定するようには意図されていない。
【００４９】
定義
「ａ」及び「ａｎ」という用語は、その冠詞の文法上の目的語が１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）であることを指す。例としては、「ａｎ」が付された「要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「約」は、状況に応じて、±１パーセント未満、または１パーセント、２パーセント、３パーセント、４パーセント、５パーセント、６パーセント、７パーセント、８パーセント、９パーセント、１０パーセント、１１パーセント、１２パーセント、１３パーセント、１４パーセント、１５パーセント、１６パーセント、１７パーセント、１８パーセント、１９パーセント、２０パーセント、２５パーセント、３０パーセントもしくは３０パーセント超を意味することができ、当業者によって知られているかまたは理解可能である。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「１人の対象」、「複数の対象」または「個体」としては、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物、例えば、飼育動物、畜産動物または野生動物のような哺乳動物、ならびに鳥類及び水生動物を挙げてよいが、これらに限らない。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「生物活性剤」という用語は、生物活性のあるいずれかの有機剤または無機剤を指し、すなわち、生物活性剤は、生体組織、臓器または生物において、統計的に有意な生体応答を誘導する。生物活性剤は、医薬、ペプチド、多糖またはポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡであることができる。生物活性剤は、消化／代謝領域、血液及び凝固領域、心血管領域、皮膚科学的領域、尿生殖器領域、ホルモン領域、免疫学的領域、感染領域、がん領域、筋骨格領域、神経学的領域、寄生性領域、眼科領域、呼吸器領域及び感覚器領域のような治療領域における疾患を治療するための薬剤であることができる。生物活性剤はさらに、骨粗しょう症、てんかん、パーキンソン病、疼痛及び認知機能障害のような疾患の治療用であることができる。生物活性剤は、ホルモン機能障害疾患の治療、またはホルモン治療、例えば、避妊のための治療、ホルモン補充療法もしくはステロイドホルモンによる治療のための薬剤であることができる。生物活性剤はさらに、抗生剤もしくは抗ウイルス剤、抗炎症剤、神経保護剤、予防ワクチン、記憶促進剤、鎮痛剤（もしくは混合鎮痛剤）、免疫抑制剤、抗糖尿病剤、または抗ウイルス剤のような薬剤であることができる。生物活性剤は、抗喘息剤、抗けいれん剤、抗うつ剤、抗糖尿病剤または抗腫瘍剤であることができる。生物活性剤は、抗精神病剤、鎮痙剤、抗コリン剤、交感神経様作用薬、抗不整脈剤、抗高血圧剤または利尿剤であることができる。生物活性剤は、鎮痛剤または鎮静剤であることができる。生物活性剤は、トランキライザーまたは認知機能障害用の薬物であることもできる。その薬剤は、遊離酸形態、遊離塩基形態、塩または中性化合物であることができる。生物活性剤は、ペプチド、例えばレボドパ、または抗体断片であることができる。生物活性剤は、ポリヌクレオチド、可溶性イオンまたは塩であることができる。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「足場複合体」は、ポリマー繊維及びハイドロゲル材という２つの成分のいずれかの共有結合を含む。足場複合体は、「機能的な網目構造」にポリマー繊維及びハイドロゲル材を含み、機能的な網目構造とは、成分間の相互作用により、化学的、生化学的、生物物理的、物理的または生理学的な利点が得られることを意味する。加えて、機能的な網目構造は、細胞、生体物質（例えば、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物）、治療用化合物、合成分子などを含む追加の成分を含み得る。特定の実施形態では、足場複合体は、ヒト対象に存在する標的組織に移植すると、組織の成長及び細胞の浸潤を促す。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「ハイドロゲル」という用語は、「ゲル」の一種であり、共有架橋または非共有架橋によって連結された巨大分子（例えば、親水性ポリマー、疎水性ポリマー、それらのブレンド）の３次元網目構造からなる水膨潤性のポリマーマトリックスであって、相当量の水（例えば、水以外の分子１単位当たり５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超）を吸収して、弾性ゲルを形成できるマトリックスを指す。そのポリマーマトリックスは、いずれかの好適な合成または天然のポリマー材で形成し得る。本明細書で使用する場合、「ゲル」という用語は、液体媒体内に広がって、表面張力作用を通じて液体媒体を捕らえる、固体の３次元網目構造を指す。この内部網目構造は、物理的結合（物理ゲル）または化学的結合（化学ゲル）、及び分散媒内で不変のままである微結晶またはその他の接合部に起因し得る。実質的には、水（ハイドロゲル）、油及び空気（エアロゲル）を含め、いずれの流体も分散媒として使用できる。重量の面でも体積の面でも、ゲルは、大半が流体の組成であるので、密度が、その構成物質である液体の密度と同程度である。ハイドロゲルは、水を液体媒体として用いる種類のゲルである。
【００５５】
「疎水性」ポリマー及び「親水性」ポリマーの定義は、１００％の相対湿度において、ポリマーによって吸収される水蒸気量に基づく。この分類によると、疎水性ポリマーは、１００％の相対湿度（「ｒｈ」）において、最大でも１％の水しか吸収しないが、中度の親水性ポリマーは、１〜１０％の水を吸収し、親水性ポリマーは、１０％超の水を吸収でき、吸湿性ポリマーは、２０％超の水を吸収する。「水膨潤性」ポリマーは、水性媒体に浸漬すると、そのポリマー自体の重量の少なくとも５０％超の量の水を吸収するポリマーである。
【００５６】
「架橋」という用語は、本明細書では、共有結合を通じて生じるか、または非共有結合を通じて生じるかにかかわらず、分子内架橋及び／または分子間架橋を含む組成物を指し、直接的な架橋であっても、架橋剤を含んでもよい。「非共有」結合には、水素結合及び静電（イオン）結合の両方が含まれる。
【００５７】
「ポリマー」という用語には、直鎖ポリマー構造及び分岐ポリマー構造が含まれ、架橋ポリマー及びコポリマー（架橋されいてもいなくてもよい）も含まれ、すなわち、ブロックコポリマー、交互コポリマー、ランダムコポリマーなどが含まれる。本明細書では「オリゴマー」と称されるこれらの化合物は、分子量が約１０００Ｄａ未満、好ましくは約８００Ｄａ未満のポリマーである。ポリマー及びオリゴマーは、天然のものであっても、合成の供給源から得てもよい。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「マイクロビーズ」という用語は、本発明の材料の粒子であって、最長寸法が３００μｍ未満の粒子を意味する。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「処理した組織細胞外マトリックス」という用語は、動物対象、好ましくはヒトから採取した細胞外マトリックス（ＥＣＭ）であって、殺菌して、細胞を除去する目的で処理したＥＣＭを意味する。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「生体材料」という用語は、生物系と相互作用するように操作した有機材料を意味する。本発明のいくつかの実施形態では、生体材料は、ハイドロゲルである。いくつかの実施形態では、生体材料は、細菌由来のヒアルロン酸である。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「生分解性」という用語は、対象において、生物的手段によって分解できる材料を指す。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「貯蔵弾性率」という用語は、その材料が変形または応力に対してどの程度応答するかを示す動的弾性率の弾性成分の測定値を定義する目的で使用する。実施形態では、「変形」とは、力の印加による、物体の形または寸法の変化を意味する。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「せん断弾性率」という用語は、剛性率としても知られており、Ｇで表され、せん断歪に対するせん断応力の比率として定義される。実施形態では、「せん断応力」とは、材料の断面と同一平面である応力の成分を意味する。実施形態では、「せん断歪」とは、材料の断面と垂直な力を意味する。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「移植可能な」という用語は、シリンジによって対象に移植するものとして調合できることを意味する。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「軟組織」という用語は、体の他の構造及び臓器と結合するか、それらを支持するか、またはそれらを包囲する組織を指す。軟組織としては、筋肉、腱、靭帯、筋膜、神経、線維組織、脂肪、血管及び滑膜が挙げられる。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「安定」という用語は、室温において分解しない材料を指す。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「脂肪吸引物」という用語は、脂肪吸引によって除去した材料を指す。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「自己」という用語は、後でその材料を再導入する個体と同じ個体に由来するいずれかの材料を指す。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）」あるいは「同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）」という用語は、その材料を導入する個体と同じ種の異なる動物、またはその個体と異なる患者に由来するいずれかの材料を指す。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「凍結乾燥された」という用語は、凍結乾燥を行った後の材料を指し、凍結乾燥とは、水を材料から除去することによって、材料を保存する際に用いるプロセスであり、まず、材料を凍結してから、その材料を真空下、超低温で乾燥することを伴う。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「官能化」という用語は、その材料に結合された機能的な化学部分を持つように均一または不均一に修飾された（例えば、化学修飾された）材料を指す。場合によっては、機能的な化学部分は、反応して、共有結合または非共有結合を形成させることができる。場合によっては、機能的な化学部分は、材料の特性を改善させることができる。
【００７２】
軟組織の再建
毎年、数百万人が、腫瘍の摘出、外傷、加齢または先天性奇形による重度の軟組織欠損により、影響を受けている。皮膚、脂肪及び筋肉を含む組織の欠損により、従来の手段によっては治療するのが難しい重度の機能的及び審美的な異常が生じる。例えば、米国では毎年、乳房の部分切除が３００，０００件余り行われ、乳房軟組織の欠損により、醜い乳房瘢痕が残る。軟組織の修復のための既存の選択肢には、重大な欠点がある。自己組織弁移動術には、長期の外科手術で、体の別の部分から軟組織を移動させる必要があり、その手術では、ドナー部位が欠損したままとなる｛ＬｏＴｅｍｐｉｏ  ２０１０．Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，１２６（２），３９３−４０１、Ｐａｔｅｌ  ２０１２．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，６９（２），１３９−１４４｝。補綴用インプラントは、線維化及びカプセル化をもたらす異物応答を起こす傾向がある｛Ｃａｌｏｂｒａｃｅ  ２０１４  Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，１３４（１  Ｓｕｐｐｌ），６Ｓ−１１、Ｔｓｏｉ  ２０１４．Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，１３３（２），２３４−２４９｝。脂肪吸引で採取した脂肪細胞の移植を伴う脂肪移植は、少量に限られ、移植片の生着不良が障害となっている｛Ｋａｋａｇｉａ  ２０１４  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，２１（３），３２７−３３６、Ｌａｒｇｏ  ２０１４  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，６７（４），４３７−４４８｝。
【００７３】
そして、注射可能なハイドロゲル軟組織フィラーを用いることができるが、これらは、小規模の欠損にのみ適する。しかしながら、既存のフィラーによって得られる、ボリュームの回復は、一過性である｛Ｙｏｕｎｇ  ２０１１．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，７（３），１０４０−１０４９、Ｖａｒｍａ  ２０１４  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，１０（１２），４９９６−５００４｝。当該技術分野では、加齢性の審美的欠損に対する解決策をもたらすことができる長持ちするフィラーを提供するニーズが存在する。ハイドロゲルの足場を鋳型として用いて、再建部位で、脂肪組織のような軟組織を再生することに焦点を当てた新世代のティッシュエンジニアリングソリューションが提案されてきた。
【００７４】
現行のティッシュエンジニアリングは、軟組織の再建に近づいている。
軟組織欠損部周辺の創傷床において、脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）が特定されている｛Ｓａｌｉｂｉａｎ  ２０１３  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｔｉｃ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ４０．６：６６６−６７５｝。これらの細胞は、好適なマトリックス微小環境によって支持すると、脂肪のような軟組織に分化できる。したがって、機能性物質で修復部位を充填する方策には、内因性ＡＳＣを用いるか、あるいは標準的な外科的処置を用いて容易に得ることができる脂肪吸引物に存在するＡＳＣ及び／またはその他の間葉細胞を用いて、新たな組織を再生可能にする可能性がある。ハイドロゲルは、軟組織の３次元（３Ｄ）の性質及び弾性特性と似ているその３Ｄの性質及び弾性特性により、組織欠損部の再生用の足場マトリックスとして、広く研究されている。周囲組織からの物理的応力に対して、その体積及び形状を維持しながら、弾性率が天然型の脂肪組織と同程度（約２ｋＰａ）であるハイドロゲル足場を作製するのに、様々な方法が用いられてきた｛Ａｌｋｈｏｕｌｉ  ２０１３  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，３０５（１２），Ｅ１４２７−３５、Ｓｏｍｍｅｒ  ２０１３  Ａｃｔａ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ  ９．１１（２０１３）：９０３６−９０４８｝。この場合には、架橋密度の上昇と、平均孔径の縮小が必要とされ｛Ｒｙｕ  ２０１１  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １２．７（２０１１）：２６５３−２６５９、Ｋｈｅｔａｎ  ２０１３  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１２（５），４５８−４６５、Ｌｉ  ２０１４  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，３１（１６），１４３１−１４３８｝、それにより、細胞浸潤性が低くなり、再生不良となる。ハイドロゲル足場が細胞浸潤を促す能力は、軟組織の修復がうまくいくための鍵である。大量の脂肪の移植及びティッシュエンジニアリングの他の試みがうまくいかないのは、血管浸潤が見られないことが原因である。軟組織を再生するために、早期の血管新生及びＡＳＣの分化を促しながら、軟組織欠損部で失われた体積分を充填できる材料は、現在はない。
【００７５】
ハイドロゲルマトリックス
せん断貯蔵弾性率（Ｇ’）が天然型の脂肪組織と同程度（１５０〜５００Ｐａ）であるハイドロゲルフィラーを作製して、そのフィラーが、周囲組織からの物理的応力に対して、特有の体積及び形状を維持し得るようにするのには、様々な方法が用いられてきている。今までは、これらの弾力のある構造的な特性は、ハイドロゲルの網目構造における架橋密度の高さと平均孔径の小ささを犠牲にして得てきたものであり、そのため、細胞浸潤が限定され、その結果、再生不良となる。
【００７６】
インプラント材の空隙率及び孔径は、マクロファージの浸潤及び活性に対する作用により、宿主の生体応答に影響を及ぼし得る。いくつかの研究により、その足場の孔の特徴及び機械的特性によって誘発される、マクロファージの偏った極性化が、血管新生及びマトリックスのリモデリング（Ｍ２マクロファージが優性の応答）に対する線維化及び瘢痕形成（Ｍ１マクロファージが優性の応答）の度合に影響を及ぼし得ることが示されている。軟組織に移植する多孔質材料では、非多孔性インプラントと比べて、マクロファージの再生誘発的な極性化が調節され、血管新生が促進され、線維化及び瘢痕の形成が軽減された。したがって、ハイドロゲル足場が、細胞の浸潤及び血管の侵入・成長を促す能力は、急性炎症及び慢性炎症を調節し、組織のリモデリング、血管新生及び再生を促し、軟組織の修復の長期持続を実現するための鍵である。
【００７７】
ここ数年間で、Ｌｉ及びＷｅｎは、ラミニン由来のループペプチド（ＣＣＲＲＩＫＶＡＶＷＬＣ（配列番号１）、１０μＭ）とコンジュゲートしたヒアルロン酸（ＨＡ）ハイドロゲルであって、幹細胞移植用に孔径及び弾性率（１０〜１００Ｐａ）が最適化されたハイドロゲルを開発した。このハイドロゲルが、活発な神経幹細胞（ＮＳＣ）の移動、及びその分化細胞からの神経突起の発芽を後押しすることを彼らは示した｛Ｌｉ  ２０１４  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，３１（１６），１４３１−１４３８｝。外傷性脳損傷に関する制御式皮質損傷（ＣＣＩ）ラットモデルで、このハイドロゲルは、ＣＣＩ損傷から３日目に注射したところ、移植から４週間〜６カ月で、病変部位（１０ｍｍ超）を充填する血管系網目構造の有意な形成を促した。この血管新生の改善は、このハイドロゲルが、組織から分泌される成長因子、特に血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を保持及び提示する能力によるものであった。文献での報告により、３〜１０個の二糖単位からなるＨＡ分解小断片が、内皮細胞の増殖、移動、小管形成及び血管新生の強力な制御因子であることも明らかにされた｛Ｓｌｅｖｉｎ  ２００２  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７７（４３），４１０４６−４１０５９｝。最近の研究では、このＨＡハイドロゲルが、ＣＣＩ損傷の後、脳病変部位において、ヒト胎児組織由来のＮＳＣスフェロイドを送達する有効性が試験された。このＨＡハイドロゲルは、移植後、足場マトリックスの内部で、活発な血管形成をもたらした。再生した血管は、病変内まで成長し、移植したマトリックスを透過し、ニューロン前駆細胞の生存及び成長を後押しした。これらの結果から、この最適化されたＨＡハイドロゲル組成物が宿主血管の侵入・成長を促進する特有の能力が確認された。さらに重要なことに、そのハイドロゲルマトリックスは、そのハイドロゲルマトリックス内部で細胞を活発に移動可能にするのに充分な多孔性を有している。しかしながら、このＨＡハイドロゲルを軟組織の再建に直接用いることは、現実的ではない。その機械的特性が、移植部位の完全性を保持するほど充分には高くないからである（周囲脂肪組織の弾性率は１０倍超高い）。その弾性率を改善するために、架橋密度を向上させると、細胞の浸潤及び移動には不十分な透過性となる。その塊状のハイドロゲルの平均孔径をあまり小さくせずに、機械的特性を向上させるには、新たな方策が必要である。実施形態では、本発明のハイドロゲルは、実質的に精製されたヒアルロン酸（ＨＡ）であって、好ましくは細菌によって産生されたＨＡである。
【００７８】
提供するのは、ハイドロゲル材または他の生体材料とポリマー繊維を組みわせ、充分な空隙率及び強度を維持しながら、密度、繊維に対するゲルの比率及びその他の特性が様々となるように調合した足場マトリックスである。提供するのは、脂肪組織から抽出した細胞外マトリックス及び／または脂肪組織から抽出可能な細胞外マトリックスなど、処理した組織細胞外マトリックスを含み、及び／または処理した組織細胞外マトリックスから単離される材料を含む足場マトリックスである。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ハイドロゲル材は、官能化されている。特定の実施形態では、ハイドロゲル材は、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、チオ、アクリレート、スルホネート、ホスフェート、アミド、及びこれらの改変形態（活性化形態または保護形態など）を含む基で官能化されている。好ましい実施形態では、ハイドロゲル材は、ヒアルロン酸（ＨＡ）を含む。より好ましい実施形態では、ハイドロゲル材は、官能化ヒアルロン酸（ＨＡ）を含む。別の好ましい実施形態では、ハイドロゲル材は、アクリル化ヒアルロン酸（ＨＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ハイドロゲル材は、チオール化ヒアルロン酸（ＨＡ）を含む。
【００８０】
足場複合体
提供するのは、例えば注射または移植によって足場複合体を投与されるヒト対象の組織に導入する医療用具で用いるのに適する足場複合体である。その足場複合体は、概して平均直径が約１０ｎｍ〜約１０，０００ｎｍ（約１００ｎｍ〜約８０００ｎｍもしくは約１５０ｎｍ〜約５，０００ｎｍなど）、または約１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１，０００ｎｍ、１，５００ｎｍ、２，０００ｎｍ、２，５００ｎｍ、３，０００ｎｍ、３，５００ｎｍ、４，０００ｎｍ、４，５００ｎｍ、５，０００ｎｍ、５，５００ｎｍ、６，０００ｎｍ、６，５００ｎｍ、７，０００ｎｍ、７，５００ｎｍもしくは８，０００ｎｍであるポリマー繊維を含む。そのポリマー繊維は概して、平均長が約１０μｍ〜約５００μｍ（約１０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０または５００μｍなど）である。実施形態では、その繊維の長さは、光学蛍光顕微鏡を用いて求める。実施形態では、その繊維の長さは、電子顕微鏡を用いて求める。
【００８１】
いくつかの実施形態では、繊維は、官能化されている。いくつかの実施形態では、繊維は、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、チオ、アクリレート、スルホネート、ホスフェート、マレイミド、アミド、及びこれらの改変形態（活性化形態または保護形態など）を含む基で官能化されている。
【００８２】
本明細書に示されているように、ハイドロゲル材に対するポリマー繊維の比率は、当該技術分野において知られているいずれかの手段によって求めることができる。例えば、ハイドロゲル材に対するポリマー繊維の比率は、成分質量ベースで約１：１００〜約１００：１（約１：５０〜約５０：１など）または１：１０〜約１０：１（１：５〜約５：１など、例えば約１：３〜約３：１）である。ハイドロゲル材に対するポリマー繊維の比率は、濃度ベースとして、例えば、ハイドロゲル材の体積当たりのポリマー繊維の定められた重量としても示される。例えば、その濃度は、約１〜５０ｍｇ／ｍＬである。ハイドロゲル材は概して、ポリマー繊維の外面（組成及び形状に応じた外面）に結合させるなど、ポリマー繊維に配置してよい。本発明の足場複合体は概して、均一な固体材料ではない。その代わりに、足場複合体は、その足場複合体の表面上または表面内にある複数の孔を含む。その孔の有無、寸法、分布、密度及びその他のパラメーターは、足場複合体の作製時に調節できる。孔径は、約１μｍ未満〜１００μｍ以下（１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０または１００μｍを含む）であることができ、孔の少なくとも４０％（５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９５％超など）が、所望の寸法となるか、または所望の寸法の範囲内になるように、その寸法を狭く調整してもよい。
【００８３】
本発明の足場複合体は、ヒト対象の組織に導入するのに適するので、概して「生体適合性」があり、生体適合性とは、生物系（ヒト対象で見られる系など）内の病態生理学的応答及び／またはその生物系による病態生理学的応答を誘発せずに、その生物系と相互作用できることを意味する。いくつかの実施形態では、本発明の足場複合体は、組織内で永続的に保持されるように供給する。あるいは、本発明の足場複合体は、ヒト対象において一過性に保持され、実質的に生分解性のものとして供給する。好ましくは、ポリマー繊維は、生体適合性の生分解性ポリエステルを含む。好ましい実施形態では、そのポリマー繊維は、ポリカプロラクトンを含む。
【００８４】
本明細書に示されているように、ポリマー繊維及びハイドロゲルを含む複合体の相互作用の好ましい一形態は、概して、ポリマー繊維とハイドロゲル材の間に結合を導入するのに有効な量、例えば、ポリカプロラクトン繊維とヒアルロン酸との架橋を誘導するのに有効な量で存在する架橋部分を含む。
【００８５】
軟組織の修復のための足場のデザイン
本発明の複合体の概念は、材料強化機構として広く用いられている。例えば、ヒドロキシアパタイト粒子をハイドロゲルに加えると、その剛性を向上させることができ｛Ｗｕ  ２００８  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １０７．２（２００８）：３６４−３６９｝、細長い粒子では、複合体の引張弾性率がさらに上昇する｛Ｙｕｓｏｎｇ  ２００７  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２（１３），５１２９−５１３４｝。エレクトロスピニング紡糸ナノファイバーのメッシュは、トポグラフィーが天然型のＥＣＭに似ているために、ティッシュエンジニアリングの基材として広く用いられている。特に興味深いことに、脂肪組織からなる脱細胞化ＥＣＭは本質的に、高度な繊維状及び多孔質状のものである（図６Ｇ）｛Ｙｏｕｎｇ  ２０１１．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，７（３），１０４０−１０４９｝。いくつかの最近の研究では、断片化したポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）繊維またはキトサン繊維をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミドまたはアルギネートのハイドロゲルに導入することによって、線維成分を再現することを目指している｛Ｃｏｂｕｒｎ  ２０１１  Ｓｍａｒｔ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７（３），２１３；＃３７、Ｚｈｏｕ  ２０１１  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，５４（１），１５５−１６２、Ｓｈｉｎ  ２０１５  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ｝。その断片化繊維をハイドロゲル前駆体溶液と混合して、ゲル化プロセスの間にハイドロゲルに導入し、３Ｄ構造を作製する。繊維が埋め込まれたこれらのハイドロゲルでは、対応するハイドロゲルよりも改善された機械的特性が示されている。しかしながら、宿主細胞の浸潤のｉｎ  ｖｉｖｏ試験に関する報告は存在しない。加えて、これらのハイドロゲルは、非分解性であり、脂肪細胞の接着及び分化には接着リガンドを要する。
【００８６】
ナノファイバー−生体材料複合体のデザイン
ハイドロゲル相において高い空隙率を維持しながら、繊維による強化作用を得るために、他の足場と比べて優れた特性をもたらすエレクトロスピニング紡糸繊維−ハイドロゲル複合体を提供する。以前報告された、ナノファイバー及びハイドロゲルマトリックスのブレンド｛Ｃｏｂｕｍ  ２０１１  Ｓｍａｒｔ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７（３），２１３｝を上回るものとして、本発明で導入するのは、繊維表面とハイドロゲルの架橋網目構造との界面結合である（図６）。このような複合体デザインにより、その固体繊維成分による機械的強化をさらに増強可能になるのみならず、ハイドロゲル相の塊状での機械的特性及び平均孔径／空隙率を独立して調整可能にもなり、最適な細胞浸潤特性及び構造的一体性の両方を得られる。繊維を、ＡＳＣ及び内皮前駆細胞の好ましい細胞接着基材として用いることができること、すなわち、細胞の移動及びＡＳＣの分化を補佐するためのガイドとして機能することがさらに企図されている。
【００８７】
所望の作用をさらに得られるように、本発明は、ナノファイバー間と、さらにはナノファイバーとハイドロゲルの間に架橋を導入するために、ＰＥＧ架橋剤を含む。これにより、製品の耐久期間を延ばす助けとなり、最適な他の特性をもたらす目的で、架橋密度を調整可能になる。
【００８８】
脂肪組織と組み合わせた繊維−ハイドロゲル複合体（複合体−脂肪）
本発明で提供するのは、例えば注射または移植によって複合体を投与されるヒト対象の組織に導入する医療用具で用いるために、脂肪組織と組み合わせた繊維−ハイドロゲル複合体（複合体−脂肪）である。複合体−脂肪は、当該技術分野において知られているいずれかの手段によって調製できる。所望の転帰のために最適な成果が得られるように、脂肪と繊維−ハイドロゲル複合体を様々な比率で組み合わせてよい。好ましい実施形態では、その脂肪組織は、脂肪吸引物である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、繊維−ハイドロゲル複合体と脂肪組織をｉｎ  ｓｉｔｕで組み合わせ、シリコーンモールド、シリンジまたはガラス容器内で、特定の期間（約１時間、３時間、５時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間または約１時間〜２４時間など）にわたってゲル化させる。
【００９０】
好ましい実施形態では、繊維−ハイドロゲル複合体と脂肪吸引物をｉｎ  ｓｉｔｕで組み合わせ、シリコーンモールド、シリンジまたはガラス容器内で、特定の期間（約１時間、３時間、５時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間または約１時間〜２４時間など）にわたってゲル化させる。複合体−脂肪吸引物は、脂肪吸引物単独の場合と比べて優れた特性をもたらす。複合体−脂肪吸引物は、脂肪移植片の維持及び血管新生を促す目的で、ヒト対象に投与（例えば注射）でき、天然型の細胞外マトリックスを模する組織足場として機能する。このアプローチは、移植不全及び線維化のリスクなしに、より体積の大きい再建を行うものとして期待される。この複合体−脂肪吸引物は、機械的特性が向上しており、その特性は、現在臨床で用いられている処理済み脂肪吸引物よりも、ｉｎ  ｖｉｖｏ脂肪に近い。
【００９１】
複合体に対する脂肪（例えば脂肪吸引物）の比率に応じて、その複合材の貯蔵弾性率（Ｇ’）を相乗的に向上させることができる。これは重要である。貯蔵弾性率は、材料がどの程度変形可能であるかを示す尺度であり、理想的な組織足場は、天然型の脂肪組織と同様の特性／強度を持つものであるからである。この脂肪／複合体の複合材は、貯蔵弾性率が高いほど、変形性が低いので、強度が向上しており、せん断力の影響を受けにくい。過去の研究により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、貯蔵弾性率が高いことは、脂肪分解の低下及び脂肪細胞の生存率の上昇につながることが示された｛Ｌｕａｎ，Ａｎｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｖｏｌ．１４０，ｎｏ．３，２０１７，ｐｐ．５１７−５２４｝。したがって、論理的には、貯蔵弾性率の高い、脂肪−複合体の複合材を有することは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、脂肪細胞及び脂肪移植片の生存率の上昇につながると推測できる。これには、大きな臨床的意味がある。軟組織の再建のために脂肪移植を受ける患者において、病的状態の低減及び手順の減少につながるからである。
【００９２】
複合体−脂肪には、脂肪吸引物よりも高い血管新生率及び血管の侵入・成長率を示す能力がある。脂肪移植片の生着には、充分な血液の供給が不可欠である。複合体−脂肪によってもたらされる、血管新生性及び血管の侵入・成長性の向上が、脂肪細胞の長期生存に必須であるのは、このためである。
【００９３】
加えて、複合体−脂肪は、脂肪細胞が、生存するために細胞培養培地を利用するのを妨げない。複合材は、脂肪細胞が、長期生存のために必要な血管新生成長因子を利用できるようにする。その一方で、脂肪吸引物単独の場合は、試料の周囲に脂質層を有するので、脂肪細胞が細胞培地を利用するのを妨げる。
【００９４】
非球状ビーズ状製剤
当該技術分野において知られている他のダーマルフィラー組成物では、複合体／ハイドロゲルは、粒子製剤に形成されており、より高い濃度での各成分の使用及び安定性の向上が可能である。例えば、いくつかの市販されているハイドロゲルベースのフィラーは、これらのビーズを形成するためのブレンド方法である。この方法は、理想的ではない。ビーズの寸法及び形状をほとんど制御できないからである。
【００９５】
本発明の変形形態では、ナノ粒子−ハイドロゲル足場マトリックスは、塊状の複合体ゲルとして形成される。提供するのは、その複合体をビーズ状ゲルとして導入することを含む改良策である。これにより、ユーザーが、所望の結果を得るために、ビーズ特性を変更可能になり（表１、図４Ｂ、４Ｃ及び４Ｄ）、複合体の貯蔵弾性率が改善する（図３）。本発明では、１個、２個、３個または４個以上のメッシュスクリーンに通し、互いに形状及び寸法が比較的近い非球状ビーズの集団を作製するなどによって、予め形成したハイドロゲル−ナノファイバー複合体を物理的に調節する粒子化システムを導入する。この二重スクリーンシステムによって、ビーズの寸法を厳格に制御可能になるので、ユーザーが、必要に応じて寸法を調節できるようになる（表１）。
表１：予め形成した複合体を高い架橋密度（剛性）または低い架橋密度で混合し、両方の種類の粒子の利点（高い剛性、遅い分解速度、長い持続期間に対して、高い多孔質性、優れた細胞浸潤性及び血管新生性）を組みわせた。これらの２つの種類の複合体粒子の比率を調整して、本発明の様々な望ましい特質を組み合わせることができる。これらの最適化パラメーターに基づき、１４個の製剤を作製し、試験が行われている。
【表１】
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【００９６】
事前に反応させた複合体
本明細書に記述されているように、記載されている本発明は、注射前または保存前に反応されている複合体を含む。本発明の以前の実施形態では、その製剤の成分は、対象に注射する直前に、エンドユーザーが混合するものであった。これにより、人的要因の煩雑さが生じ、例えば、ユーザーが調製及び作業を行わなければならなくなる。混合時間及び待機時間のばらつきにより、反応時間が変化し得るので、複合体の剛性が大きく変化する。これにより、シリンジによって注射するには、ゲルが硬くなり過ぎたり、または充分に硬くならなかったりする可能性があり、対象に注射するときに、望ましくない特性が生じることがある。この問題に対処するために、本発明者は、事前に反応させた組成物であって、保存前に、その反応（例えばゲル化）を行う組成物を開発した。
【００９７】
ＨＡ−Ａｃを７ｍｇ／ｍＬ、マレイミドを含む繊維を８〜１０ｍｇ／ｍＬ、及びＰＥＧＳＨを６．９ｍｇ／ｍＬ含む製剤を大量に、摂氏３７度で完全に反応させる。本発明者は、製造の際に、ゲルを事前に反応させることによって、不安定な官能基を保護する必要性を排除し、エンドユーザーがよく混合及び硬化させる必要性を排除した。
【００９８】
凍結乾燥
本発明は、本発明の複合体を保存する前に、凍結乾燥する工程を含む。凍結乾燥の導入により、機能を喪失せずに、製品を室温で長期間保存可能になる。実施形態では、本発明のビーズ状製品は、スクロース、トレハロース及び塩化ナトリウムの等張溶液で凍結乾燥する。これらの可変液は、乾燥プロセス中にミクロ構造を保護し、製品の貯蔵寿命を長くする。
【００９９】
実施形態では、その凍結乾燥ゲルビーズは、保存後、水で再構成し、すぐに注射できる状態にできる。
【０１００】
本発明の繊維−ハイドロゲル複合体のナノファイバー相の機械的特性は、大半のハイドロゲル成分とは対照的に、乾燥状態または凍結状態において実質的に変化しない。したがって、凍結または凍結乾燥中に、その繊維部分は、複合体のミクロ構造全体を保持するのを助けることができる。本発明の複合体は、正確な凍結乾燥サイクル及び調合により、再水和しても、個別のビーズとして維持される状態で、凍結乾燥することができる。
【０１０１】
新規性
特定の態様では、新規性は、事前に反応させた、ビーズ状のナノファイバー−ハイドロゲル複合体デザインであって、ナノファイバー表面とハイドロゲルの網目構造の間に架橋及び界面結合を有し、凍結乾燥できるとともに、再水和後にその組成を維持できる複合体デザインである。技術を駆使して作られたこの複合体には、そのハイドロゲル相の平均孔径を大きくは縮小させずに、そのハイドロゲルの機械的特性を大幅に改善させる可能性がある。界面結合の導入により、それらの２つの成分を物理的にブレンドするだけの場合と比べて、優れた機械的強度向上作用を得ることができる。今回の研究では、エレクトロスピニング紡糸ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）繊維−ＨＡハイドロゲル複合体で得られる機械的特性（密度、空隙率及びせん断弾性率）の範囲を、ブレンドの場合と比較して明らかにするつもりである。
【０１０２】
重大な新規性は、本発明の複合材をｉｎ  ｓｉｔｕで形成する際に、化学的性質を最適化することによって、炎症が軽減されることである。本発明者は、対象における炎症の原因となる化学的特性を特定し、この問題を軽減する新たな特性を有する組成物を作製することによって、本発明を先行研究よりも改善させた。本発明の以前の実施形態では、チオール化ＨＡ（ＨＡ−ＳＨ）及びアクリル化ＰＥＧ架橋剤（ＰＥＧＤＡ）を使用した。この実施形態では、対象において、図１Ｃに示されているような急性免疫応答、及び注射後の炎症（図１Ａ及び１Ｂ）を含む芳しくない応答が見られた。代替的な組成物は、アクリル化ＨＡ（ＨＡ−Ａｃ）及びチオール化ＰＥＧ架橋剤（ＰＥＧＳＨ）を含む。この反応性基の減少により、炎症問題に対する解決策が得られる。図１Ａ及び１Ｂには、本発明の以前の実施形態と比べて、及び他の市販のフィラーと比べて、このように改善されたことが示されている。
【０１０３】
別の新規性は、このようなナノファイバー−ハイドロゲル複合体が軟組織欠損部を回復させることが示された点である。予備的な特徴付けにより、本発明の複合体が、脂肪組織と構造的な特徴を共有していることが示された（図６）｛Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ，２０１２  ＵＳ  ２０１２０２６４１９０  Ａ１、Ｙｏｕｎｇ  ２０１１．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，７（３），１０４０−１０４９｝。この複合体によって、軟組織の再生にとって重要な構造的一体性及び機械的特性が得られるという仮説が立てられた。この研究により、複合体が、ハイドロゲルと比べて、汎用性があり、効率的であることも示されている。
【０１０４】
別の態様では、重大な新規性は、細胞結合部分または組織結合部分をナノファイバー−ハイドロゲル複合材に導入することである。ペプチド、アプタマー、抗体、小分子またはその他の結合試薬を含むこれらの部分により、本発明の複合体が、局所的な創傷環境に由来する細胞、または体外から供給される細胞を組み込む能力が増強される。得られた、結合ナノファイバー、ハイドロゲル及び細胞の一体構造は、ナノファイバー−ハイドロゲル複合体単独よりも、天然型の組織に近い挙動を見せる。組み込まれた細胞要素（脂肪細胞、内皮細胞、周皮細胞及びその他の間葉細胞を含む）は、ナノファイバー−ハイドロゲル複合体及び周囲組織とより密接に結び付き、それらをリモデリングして、より自然で、耐久性のある修復を行うことができる。
【０１０５】
別の態様では、重大な新規性は、細胞とナノファイバー−ハイドロゲル複合材の結合である。結合した細胞要素（脂肪細胞、内皮細胞、周皮細胞及びその他の間葉細胞を含む）は、ナノファイバー−ハイドロゲル複合体及び周囲組織とより密接に結び付き、それらをリモデリングして、より自然で、耐久性のある修復を行う一方で、好適な機械的強度をもたらして、ＥＣＭを模倣することができる。
【０１０６】
別の態様では、重大な新規性は、組織とナノファイバー−ハイドロゲル複合材の結合である。脂肪組織のような、結合した組織は、ナノファイバー−ハイドロゲル複合体及び周囲組織とより密接に結び付き、それらをリモデリングして、より自然で、耐久性のある修復を行う一方で、好適な機械的強度をもたらして、ＥＣＭを模倣することができる。
【０１０７】
本発明の重大な新規性は、室温（１５℃（５９°Ｆ）〜１８℃（６４°Ｆ））での複合体の安定性である。多くの市販のハイドロゲルまたはヒアルロン酸ベースのフィラーで見られる問題は、低温状態で保存しなければならないことである。これにより、保存できる時間の長さが限られるので、エンドユーザーがその製品を対象に投与できる時間枠が短くなる。この点における本発明の目的は、保存安定性の改善である。事前に反応させたビーズ状の製剤であって、凍結乾燥できるとともに、投与の際に再水和できる製剤を作ることで、この未充足ニーズが満たされる。
【０１０８】
このプロジェクトが成功を収めると、失われた軟組織量の回復のために、特に、血管網を確立し、組織の修復部位の完全性を維持し、細胞の移動及び構築を促し、宿主細胞を動員させることがすべて、持続可能な組織修復に欠かせない大規模な欠損に対して、画一的な解決策が得られることになる。この複合体デザインで用いられる材料成分、すなわち、ＨＡハイドロゲル及び生分解性ポリエステル繊維の臨床での大きな実績とともに、組織適合性に関するこれらの予備的データから、優れた組織適合性が得られ、臨床応用のための薬事認可が容易になることがうかがえる。
【０１０９】
特徴：
いくつかの実施形態では、本発明は、ハイドロゲル成分におけるナノファイバーとポリマーの網目構造との架橋及び界面結合を提供する。これは、「真の」複合体の形成に重要である。このような繊維とハイドロゲルをブレンドしても、同程度の機械的増強は得られないことが示された。ナノファイバー−ハイドロゲルブレンドの使用に関しては、過去の報告もある。換言すると、重要なことに、架橋及び界面結合によって、この新規研究は、先行技術とは一線を画すものとなる。さらに、本発明の界面結合は、本明細書に示されているような共有結合、ならびに水素結合及び静電相互作用のような第２の結合を含むことができる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、ナノファイバー−ハイドロゲル複合体内の間葉細胞結合要素であって、得られる複合体が間葉細胞を動員、捕捉及び／または包埋する能力を増強できる要素を提供する。細胞及びナノファイバー−ハイドロゲル複合体の両方からなる、得られる材料は、ナノファイバー−ハイドロゲル複合体単独よりも、天然型の組織に近い挙動を見せることができ、自然で、耐久性のある修復を行うことができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の複合体構造体に導入する間葉細胞を提供する。任意に、これらの細胞は、当業者による日常的な臨床診療において、脂肪吸引物から得ることができる。脂肪細胞、間葉幹細胞、内皮前駆細胞、脂肪細胞前駆細胞、内皮細胞及び周皮細胞を含むこのような細胞を本発明のナノファイバー−ハイドロゲル複合体に導入して、天然型の軟組織を模する新規材料を作製できる。
【０１１２】
これは、当該技術分野において、等方性の強化を示す初めての研究成果であり、すなわち、本発明の複合体は、任意の幾何学形状をした体積的欠損を補うのに必要とされるように、あらゆる方向で強度が増している。ナノファイバーマットまたは少数の整列したフィラメントによるデザインは、本質的には異方性である。本発明のデザインは、等方性の材料及び異方性の材料の両方を形成できる。
【０１１３】
本発明では、足場の他の重要な物理的特性（強度及び貯蔵弾性率など）を保持した状態で、各成分の化学組成が、患者において炎症を軽減する目的で改変されている。［［これに関する詳細は、実施例に開示するものとする。特に重要なのは、この製剤におけるチオール基の位置（本発明の開示における節Ａ２）が、感受性に大きな影響を有した点である。］］
【０１１４】
本明細書に示されている研究成果により、非球状マイクロビーズに調合される足場複合体が定められる。このビーズ化により、ゲルの保存安定性が改善され、その複合体の機能を改善できるとともに、それぞれ異なる目的のために、品質を変更できる他の特性を変動可能になる。
【０１１５】
本明細書に示されている研究成果により、エンドユーザーによる誤用の可能性を低下させるために、注射前に反応される足場複合体が定められる。複合体をｉｎ  ｓｉｔｕで形成すると、ユーザーが調製及び作業を行わなければならなくなることを含め、人的要因の煩雑さが生じる。分単位の混合時間及び待機時間により、望ましくない剛性及び弾性となるなど、製剤の特性が影響を受ける（図１２Ａ及び１２Ｂ）。
【０１１６】
この点において、本発明では、ビーズ状の足場複合体を凍結乾燥して、室温で保存したときに、その複合体が安定するようできる工程を導入する（図１１）。そのビーズは、その元々の特性を保持したままで、使用前にすぐに再水和できる。既存のＨＡフィラーは、滅菌のために照射を行うことはできない。その水性環境により、ＨＡ鎖が過剰に切断されるからである。本発明の製品を保存前に凍結乾燥することにより、その組成物をさらに長期間保存可能になるのみならず、追加の最終滅菌方式、すなわち、γ線または電子線の照射も可能になる。
【０１１７】
本明細書に示されている研究成果、少なくとも特定の態様における研究成果により、細胞の移動及び宿主組織の侵入・成長に充分な孔径及び空隙率（ビーズ周囲及びビーズ内）を備えるハイドロゲルの網目構造、ならびに直径が５０ｎｍ〜１０μｍの範囲であるポリマー繊維を概ね含むナノファイバーである複合体を形成する際に用いる成分が定められる。
【０１１８】
ゲル／ハイドロゲル成分
実施形態では、本発明の足場複合体は、ハイドロゲルを含む複合体である。そのハイドロゲルは、いずれのタイプの好適なハイドロゲル成分も含むことができる。本発明では、当該技術分野において知られているいずれかの好適なハイドロゲル成分を含むいずれかの好適なゲル成分を含むナノ構造体／ゲル複合体が企図されている。そのゲル及び／またはハイドロゲルは、いずれかの好適な合成または天然の材料で形成できる。
【０１１９】
例えば、そのゲル及び／またはハイドロゲルのポリマー成分は、セルロースエステル、例えば、酢酸セルロース、酢酸プロピオン酸セルロース（ＣＡＰ）、酢酸酪酸セルロース（ＣＡＢ）、プロピオン酸セルロース（ＣＰ）、酪酸セルロース（ＣＢ）、プロピオン酸酪酸セルロース（ＣＰＢ）、二酢酸セルロース（ＣＤＡ）、三酢酸セルロース（ＣＴＡ）などを含むことができる。これらのセルロースエステルは、米国特許第１，６９８，０４９号、同第１，６８３，３４７号、同第１，８８０，８０８号、同第１，８８０，５６０号、同第１，９８４，１４７号、同第２，１２９，０５２号及び同第３，６１７，２０１号に記載されており、当該技術分野において知られている技法を用いて調製するか、または市販のものを入手してよい。本発明に適する市販のセルロースエステルとしては、ＣＡ３２０、ＣＡ３９８、ＣＡＢ３８１、ＣＡＢ５５１、ＣＡＢ５５３、ＣＡＰ４８２、ＣＡＰ５０４が挙げられ、いずれも、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｋｉｎｇｓｐｏｒｔ，Ｔｅｎｎ．から入手可能である。このようなセルロースエステルは典型的には、数平均分子量が約１０，０００〜約７５，０００である。
【０１２０】
そのセルロースエステルは、セルロースモノマー単位とセルロースエステルモノマー単位の混合物を含み、例えば、市販の酢酸酪酸セルロースは、酢酸セルロースモノマー単位、ならびに酪酸セルロースモノマー単位及びエステル化されていないセルロース単位を含む。
【０１２１】
本発明のゲル／ハイドロゲルは、概してアクリル酸、メタクリル酸、酢酸メチル、酢酸エチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル及び／またはその他のビニルモノマーから形成されるアクリレートポリマーのような他の水膨潤性ポリマーで構成されていてもよい。好適なアクリレートポリマーは、上記のように、Ｒｏｈｍ  Ｐｈａｒｍａ（ドイツ）から「ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）」という商品名で入手可能なコポリマーである。ＥｕｄｒａｇｉｔシリーズＥ、Ｌ、Ｓ、ＲＬ、ＲＳ及びＮＥというコポリマーが、有機溶媒、水性分散液に可溶化されたものとして、または乾燥粉末として入手可能である。好ましいアクリレートポリマーは、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ及びＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｓシリーズのポリマーのような、メタクリル酸とメタクリル酸メチルのコポリマーである。特に好ましいこのようなコポリマーは、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ−３０Ｄ−５５及びＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ−１００−５５である（後者のコポリマーは、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ−３０Ｄ−５５の噴霧乾燥形態であり、水で再構成することができる）。Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ−３０Ｄ−５５及びＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ−１００−５５というコポリマーの分子量は、約１３５，０００Ｄａであり、遊離カルボキシル基とエステル基の比率は、約１：１である。このコポリマーは概して、ｐＨが５．５未満の水性流体に不溶である。別の特に好適なメタクリル酸−メタクリル酸メチルコポリマーは、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ−１００であり、このコポリマーは、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ−３０Ｄ−５５とは、遊離カルボキシル基とエステル基の比率が約１：２である点が異なる。Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ−１００は、ｐＨ５．５未満では不溶であるが、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ−３０Ｄ−５５とは異なり、ｐＨが５．５〜７．０の範囲である水性流体にはわずかに可溶である。このコポリマーは、ｐＨ７．０以上では可溶である。Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ−１００も使用してよく、このコポリマーは、ｐＨ６．０未満で不溶性である範囲内で、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ−３０Ｄ−５５及びＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ−１００の溶解プロファイルの中間のｐＨ依存性溶解プロファイルを有する。Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ−３０Ｄ−５５、Ｌ−１００−５５、Ｌ−１００及びＳ−１００は、同様のｐＨ依存性溶解特性を有する他の許容されるポリマーと置き換えることができるのは当業者には明らかであろう。
【０１２２】
ヒアルロン酸（ＨＡ）
他の各種実施形態では、本発明の複合材は、ハイドロゲル材としてのヒアルロン酸（ＨＡ）をベースとしたものであることができる。ＨＡは、ハイドロゲル成分を形成する二糖の繰り返し単位を有する直鎖状の非硫酸化多糖である。ＨＡは、ヒト組織における細胞外マトリックスの非免疫原性な天然型の成分でもあり、審美的な手順及び再建手順においてダーマルフィラーとして広く用いられている。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ヒアルロン酸は、官能化されている。特定の実施形態では、ヒアルロン酸は、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、チオ、アクリレート、スルホネート、ホスフェート、アミド、及びこれらの改変形態（活性化形態または保護形態など）を含む基で官能化されている。
【０１２４】
ＨＡの分解は、組織損傷及び炎症のある区域で発現が増加する天然型のヒアルロニダーゼによって促される。重要なことに、研究により、３〜１０個の二糖単位からなるＨＡ分解小断片が、内皮細胞の増殖、移動、小管の形成及び血管新生の強力な制御因子であることが示されている。ＨＡのこれらの生体機能は、Ｒａｓ及びＰＫＣが関与する経路において、ＣＤ４４によって媒介されると考えられている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、抗ＣＤ４４抗体を用いて、ＣＤ４４／ＨＡの相互作用を遮断したところ、ヒト微小血管内皮細胞の増殖及び移動が減少した。ＨＡハイドロゲルは、細胞送達のための潜在的なマトリックスとして、細胞傷害及び組織傷害の様々なモデルにおいて研究されている。これらのハイドロゲルは、細胞の保護用足場及び支持足場として機能でき、瘢痕化を低減することもできる。したがって、ＨＡには、細胞浸潤を促すとともに、血管新生を促すことによって、組織の再生を高める際の重要な役割があると考えられる。
【０１２５】
第１に、この材料は、天然型の脂肪組織と同程度の３次元完全性及び硬さを有する。これにより、失われた軟組織量を画一的に回復させるのに適する材料となっている。第２に、この材料は好ましくは、脂肪細胞及び内皮前駆細胞の移動のための基材として機能し得る複数の可撓性ナノファイバーとともに堆積し得る。第３に、この材料は、足場の周囲に線維性被膜を形成させるのではなく、これらの前駆細胞を足場に速やかに浸潤させて、その足場に組み込ませるのに充分な空隙率である。第４に、そのＨＡハイドロゲル成分は、圧縮及び体積膨張をもたらす一方で、重要な、血管形成のきっかけも供給する。第５に、そのナノファイバー成分及びハイドロゲル成分は、生分解性であり、再生された軟組織に置き換え可能である。第６に、すべての成分材料には、ＦＤＡから認可を受けた多くの用具において、優れた安全性の実績があり、臨床応用の際に規制上のハードルが下がる可能性がある。
【０１２６】
ヒアルロン酸の分子量は、複合体の全体的特性に影響を及ぼす（図４Ｂ）。Ａｌｌｅｒｇａｎ及びその他のダーマルフィラーメーカーも、製品の持続性に対するＨＡ分子量の重要性を認識している。ＡｌｌｅｒｇａｎのＪｕｖｅｄｅｒｍという製品は、分子量２．５ＭＤａのＨＡで製造される。さらに、Ｊｕｖｅｄｅｒｍの特許ＵＳ８４５０４７５Ｂ２において、Ａｌｌｅｒｇａｎは、「本発明の典型的な実施態様では、低分子量ＨＡに対する高分子量ＨＡの割合は、少なくとも約２、好ましくは２超であり（ｗ／ｗ≧２）、高分子量ＨＡの分子量は、１．０ＭＤａ超である。」と述べている。
【０１２７】
ＨＡの開示としては、米国特許出願第１２／３９３，８８４号、米国特許第６，９２１，８１９号（固体ヒアルロン酸（ＨＡ）の水和の際に、そのＨＡを多官能性リンカーと反応させることによって、そのＨＡを架橋するプロセス）、米国特許第６，６８５，９６３号（ＨＡのアクリル粒子）、米国特許出願公開第２００６１０１９４７５８号（高分子量及び低分子量のナトリウムＨＡを架橋することによって、ハイドロゲルを作製する方法）、米国特許出願公開第２００９／００３６４０３号（「調節可能に」架橋されたＨＡをもたらすための、４官能性ＰＥＧエポキシドによるＨＡの架橋）、米国特許出願公開第２００９／０１４３３３１号（持続時間の延長されたフィラーを提供するために、コンドロイチン硫酸のような分解阻害剤を含むＨＡダーマルフィラー）、米国特許出願公開第２００９／０１４３３４８号（ステロイドと組み合わせたＨＡ）、ならびに米国特許出願公開第２００９／０１５５３１４号（ボツリヌス毒素と組み合わせたＨＡ）が挙げられる。加えて、米国特許出願公開第２００９／０１４８５２７号には、マイクロスフェアのＨＡ、同第２００９／００９３７５５号には、コラーゲンを用いて架橋されたＨＡ、同第２００９／００２２８０８号には、タンパク質で被覆されたＨＡが開示されている。ＨＡのさらなる開示としては、ＷＯ２００９／０３４５５９（少なくとも１つのＣ−グリコシド誘導体を含む組成物で、皮膚を審美的及び／または修復的に治療するプロセス）、ＷＯ２００９／０２４７１９（ＨＡ及びＣ−グリコシド誘導体を含む化粧品組成物及び医薬組成物であって、皮膚の凹部／陥没を充填し、体または顔のボリュームを回復させ、加齢の徴候を軽減するのに有用な化粧品組成物及び医薬組成物）、ＷＯ２００７／１２８９２３（１つ以上の活性新油性及び／または両親媒性成分が制御放出される生体適合性ゲルを調製する方法）、米国特許出願公開第２００９／００１８１０２号（ＨＡ及び少なくとも１つのレチノイドまたはその塩／誘導体をオリゴ糖及びＨＡ分解阻害剤と組み合わせて含む組成物であって、しわ、線、線維芽細胞の枯渇及び瘢痕を治療するための組成物）、米国特許第３，７６３，００９号（アスコルビン酸、マルトース及び／またはオリゴ糖の混合物をＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属またはその他の菌に由来する酵素に暴露して、酵素によってその混合物をアスコルビン酸グルコシドに変換することによって、アスコルビン酸の酸化耐性を改善するプロセス）、米国特許第５，６１６，６１１号（直接還元活性を示さず、安定しており、医薬分野及び化粧品分野において安定剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理活性剤、紫外線吸収剤として有用であるａ−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸）、米国特許第５，８４３，９０７号（ビタミンＣ強化剤、食品、医薬及び化粧品に適する結晶性２−Ｏ−ａ−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の作製及び使用）、ＥＰ０５３９１９６（高純度の２−Ｏ−ａ−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の工業規模の調製）、ならびに米国特許出願公開第２００２／０１５１７１１号が挙げられる。ＨＡ及び／またはビタミンＣ剤が組み込まれた市販の製品としては、ＭＥＳＯＧＬＯＷ（登録商標）の製品、ＲＥＶＩＴＡＣＡＲＥ（登録商標）及びＮＣＴＦ（登録商標）１３５／１３５  ＨＡ  Ｍｅｓｏｔｈｅｒａｐｙの製品が挙げられる。上で引用した参照文献及び刊行物はそれぞれ個々に、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０１２８】
実施形態では、本発明のＨＡは、細菌発酵に由来する滅菌ＨＡである。ヒアルロン酸は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌のＡ群菌及びＣ群菌によって産生させることができる。ＨＡは免疫応答を開始させないので、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓのような細菌は、それらの細胞をカプセル化し、分子擬態を行って、宿主の免疫系による検出を回避する手段として、ＨＡを合成する（Ｂｏｙｃｅ  ＪＤ，Ｃｈｕｎｇ  ＪＹ，Ａｄｌｅｒ  Ｂ，  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００  Ｓｅｐ  ２９；８３（１−２）：１５３−６０．、Ｗｅｓｓｅｌｓ  ＭＲ，Ｍｏｓｅｓ  ＡＥ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＪＢ，ＤｉＣｅｓａｒｅ  ＴＪ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９１  Ｏｃｔ  １；８８（１９）：８３１７−２１）。ＨＡは、天然において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ及びＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓを含む他の病原菌によっても産生される（Ｂｌａｎｋ  ＬＭ，Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚ  Ｐ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＬＫＪ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ．２００８  Ｊｕｌ；６７（１）：１３−２２．、ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ  ＰＬ，Ｊｉｎｇ  Ｗ，Ｄｒａｋｅ  ＲＲ，Ａｃｈｙｕｔｈａｎ  ＡＭ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８  Ａｐｒ  ３；２７３（１４）：８４５４−８．、Ｊｏｎｇ  Ａ，Ｗｕ  ＣＨ，Ｃｈｅｎ  ＨＭ，Ｌｕｏ  Ｆ，Ｋｗｏｎ−Ｃｈｕｎｇ  ＫＪ，Ｃｈａｎｇ  ＹＣ，Ｌａｍｕｎｙｏｎ  ＣＷ，Ｐｌａａｓ  Ａ，Ｈｕａｎｇ  ＳＨ  Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｃｅｌｌ．２００７  Ａｕｇ；６（８）：１４８６−９６）。
【０１２９】
細菌発酵によるＨＡの産生は、この２０年にわたり、着実に進化してきた。開発の初期段階では、天然においてＨＡを産生するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  Ａ群及びＣ群を発酵槽で成長させ、ＨＡを精製した。しかしながら、これらの細菌は、多くの毒素を産生するので、代わりの細菌が模索された。ＨＡ生合成経路をコードする遺伝子を特定したら、多くの細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）を遺伝子改変して、これらの遺伝子を発現して、ＨＡを産生するようにした。その後の研究では、培養培地及び培養条件の最適化に焦点が当てられた（Ｍａｏ  Ｚ，Ｃｈｅｎ  ＲＲ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２００７  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；２３（５）：１０３８−４２．、Ｗｅｓｓｅｌｓ  ＭＲ，Ｍｏｓｅｓ  ＡＥ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＪＢ，ＤｉＣｅｓａｒｅ  ＴＪ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９１  Ｏｃｔ  １；８８（１９）：８３  １７−２１．、Ｗｉｄｎｅｒ  Ｂ，Ｂｅｈｒ  Ｒ，Ｖｏｎ  Ｄｏｌｌｅｎ  Ｓ，Ｔａｎｇ  Ｍ，Ｈｅｕ  Ｔ，Ｓｌｏｍａ  Ａ，Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  Ｄ，Ｄｅａｎｇｅｌｉｓ  ＰＬ，Ｗｅｉｇｅｌ  ｐＨ，Ｂｒｏｗｎ  Ｓ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５  Ｊｕｌ；７１（７）：３７４７−５２、Ｓｚｅ，Ｂｒｏｗｎｌｉｅ，Ｌｏｖｅ，３  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１６；６（１）：６７．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１３２０５−０１６−０３７９−９）。
【０１３０】
活性剤の送達
本明細書に記載のゲル／ハイドロゲル組成物のいずれかを用いて、活性剤を含めて、それにより、活性剤を体表（例えば組織修復部位）に送る関連で、体表に塗布したときに、活性剤送達システムとして機能するようにしてよい。本発明のハイドロゲル組成物に「充填した」活性剤の放出は典型的には、膨潤制御式の拡散機序による、水の吸収及び活性剤の脱着の両方を伴う。活性剤を含むハイドロゲル組成物は、例として、経皮薬物送達システム、創傷包帯剤、局所医薬製剤、埋め込み型薬物送達システム、経口剤形などで採用し得る。
【０１３１】
本発明のハイドロゲル組成物に導入して、全身送達（例えば、経皮送達、経口送達または薬物の全身投与に適する他の剤形によって送達）し得る好適な活性剤としては、蘇生薬、鎮痛剤、麻酔薬、抗関節炎剤、抗喘息剤を含む呼吸器薬、抗腫瘍薬を含む抗がん剤、抗コリン剤、抗けいれん剤、抗うつ剤、抗糖尿病剤、止瀉薬、駆虫薬、抗ヒスタミン剤、抗高脂血症剤、抗高血圧剤、抗生剤及び抗ウイルス剤のような抗感染症剤、抗炎症剤、抗片頭痛調製剤、制吐剤、抗パーキンソン薬、止痒剤、抗精神病剤、解熱剤、鎮痙剤、抗結核剤、抗潰瘍剤、抗ウイルス剤、抗不安剤、食欲抑制剤、注意欠陥障害（ＡＤＤ）及び注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）の薬物、カルシウムチャネル遮断薬、抗狭心症剤、中枢神経系（ＣＮＳ）剤、βブロッカー及び抗不整脈剤を含む心血管調整剤、中枢神経系刺激薬、うっ血除去剤を含む咳及び風邪に対する調整剤、利尿剤、遺伝物質、漢方薬、抗ホルモン薬、睡眠薬、血糖降下薬、免疫抑制剤、ロイコトリエン阻害剤、有糸分裂阻害剤、筋肉弛緩剤、麻薬拮抗薬、ニコチン、ビタミン、必須アミノ酸及び脂肪酸のような栄養剤、抗緑内障薬のような眼科薬、副交感神経遮断薬、ペプチド薬、精神刺激薬、鎮静薬、プロゲストゲン、エストロゲン、副腎皮質ステロイド、アンドロゲン及びタンパク同化剤を含むステロイド、禁煙剤、交感神経様作用薬、トランキライザー、ならびに心臓、末梢及び脳を含む血管の拡張剤が挙げられるが、これらに限らない。本発明の接着組成物が有用である具体的な活性剤としては、アナバシン、カプサイチン、硝酸イソソルビド、アミノスチグミン、ニトログリセリン、ベラパミル、プロプラノロール、シラボリン、フォリドン、クロニジン、シチシン、フェナゼパム、ニフェジピン、フルアシジン及びサルブタモールが挙げられるが、これらに限らない。
【０１３２】
局所薬物投与及び／または薬物添加クッション（例えば薬物添加フットパッド）用では、好適な活性剤としては、例として、以下のものが挙げられる。
【０１３３】
静菌剤及び殺菌剤：好適な静菌剤及び殺菌剤としては、例として、ヨウ素、ヨードポビドン複合体（すなわち、ＰＶＰとヨウ素の複合体、「ポビジン」ともいい、Ｂｅｔａｄｉｎｅという商品名でＰｕｒｄｕｅ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋから入手可能である）、ヨウ化物塩、クロラミン、クロロヘキシジン及び次亜塩素酸ナトリウムのようなハロゲン化合物、スルファジアジン、銀タンパク質アセチルタンネート、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、硫酸銀及び塩化銀のような銀及び銀含有化合物、トリ−ｎ−ブチルスズベンゾエートのような有機スズ化合物、亜鉛及び亜鉛塩、過酸化水素及び過マンガン酸カリウムのような酸化剤、ホウ酸フェニル水銀またはメルブロミンのようなアリール水銀化合物、チオマーサルのようなアルキル水銀化合物、チモール、ｏ−フェニルフェノール、２−ベンジル−４−クロロフェノール、ヘキサクロロフェン及びヘキシルレゾルシノールのようなフェノール、ならびに８−ヒドロキシキノリン、クロルキナルドール、クリオキノール、エタクリジン、ヘキセチジン、クロルヘキセジン及びアンバゾンのような有機窒素化合物が挙げられる。
【０１３４】
抗生剤：好適な抗生剤としては、リンコマイシン系抗生剤（元々はｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｎｃｏｌｎｅｎｓｉｓから回収された種類の抗生剤を指す）、テトラサイクリン系抗生剤（元々はｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓから回収された種類の抗生剤を指す）、及び硫黄ベースの抗生剤、すなわち、スルホンアミドが挙げられるが、これらに限らない。例示的なリンコマイシン系抗生剤としては、リンコマイシン、クリンダマイシン、例えば米国特許第３，４７５，４０７号、同第３，５０９，１２７号、同第３，５４４，５５１号及び同第３，５１３，１５５号に記載されているような関連化合物、ならびにそれらの薬理学的に許容される塩及びエステルが挙げられる。例示的なテトラサイクリン系抗生剤としては、テトラサイクリンそのもの、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ロリテトラサイクリン、メタサイクリン及びドキシサイクリン、ならびにそれらの薬学的に許容される塩及びエステル、特に、塩酸塩のような酸付加塩が挙げられる。例示的な硫黄ベースの抗生剤としては、スルホンアミド、スルファセタミド、スルファベンズアミド、スルファジアジン、スルファドキシン、スルファメラジン、スルファメタジン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、ならびにそれらの薬理学的に許容される塩及びエステル、例えばスルファセタミドナトリウムが挙げられるが、これらに限らない。
【０１３５】
鎮痛剤：好適な鎮痛剤は、局所麻酔剤であり、局所麻酔剤としては、アセトアミドオイゲノール、酢酸アルファドロン、アルファキサロン、アムブカイン、アモラノン、アミロカイン、ベノキシネート、ベトキシカイン、ビフェナミン、ブピバカイン、ブテタミン、ブタカイン、ブタンベン、ブタニリカイン、ブタリタール、ブトキシカイン、カルチカイン、２−クロロプロカイン、シンコカイン、コカエチレン、コカイン、シクロメチカイン、ジブカイン、ジメチソキン、ジメトカイン、ジペロドン、ダイクロニン、エクゴニジン、エクゴニン、アミノ安息香酸エチル、塩化エチル、エチドカイン、エトキサドロール，β−オイカイン、ユープロシン、フェナルコミン、フォモカイン、ヘキソバルビタール、ヘキシルカイン、ヒドロキシジオン、ヒドロキシプロカイン、ヒドロキシテトラカイン、イソブチルｐ−アミノベンゾエート、ケタミン、ロイシノカインメシレート、レボキサドロール、リドカイン、メピバカイン、メプリルカイン、メタブトキシカイン、メトヘキシタール、塩化メチル、ミダゾラム、ミルテカイン、ネパイン、オクタカイン、オルトカイン、オキセサゼイン、パレトキシカイン、フェナカイン、フェンシクリジン、フェノール、ピペロカイン、ピリドカイン、ポリドカノール、プラモキシン、プリロカイン、プロカイン、プロパニジド、プロパノカイン、プロパラカイン、プロピポカイン、プロポフォール、プロポキシカイン、プソイドコカイン、ピロカイン、リソカイン、サリチルアルコール、テトラカイン、チアルバルビタール、チアミラール、チオブタバルビタール、チオペンタール、トリカイン、トリメカイン、ゾラミン及びこれらを組み合わせたものが挙げられるが、これらに限らない。テトラカイン、リドカイン及びプリロカインは、本明細書では鎮痛剤と称する。
【０１３６】
本発明のハイドロゲル組成物を薬物送達システムとして用いて送達し得る他の局所剤としては、ウンデシレン酸、トルナフテート、ミコナゾール、グリセオフルビン、ケトコナゾール、シクロピロックス、クロトリマゾール及びクロロキシレノールのような抗真菌剤と、サリチル酸、乳酸及び尿素のような角質溶解剤と、カンタリジンのような発疱薬と、有機ペルオキシド（例えば過酸化ベンゾイル）、レチノイド（例えば、レチノイン酸、アダパレン及びタザロテン）、スルホンアミド（例えばナトリウムスルファセタミド）、レゾルシノール、副腎皮質ステロイド（例えばトリアムシノロン）、α−ヒドロキシ酸（例えば、乳酸及びグリコール酸）、α−ケト酸（例えばグリオキシル酸）、ならびにとりわけニキビ治療に適応される抗菌剤（アゼライン酸、クリンダマイシン、エリスロマイシン、メクロサイクリン、ミノサイクリン、ナジフロキサシン、セファレキシン、ドキシサイクリン及びオフロキサシンを含む）のような抗ニキビ剤と、ハイドロキノン、コジック酸、グリコール酸及び他のα−ヒドロキシ酸、アルトカルピン、ならびに特定の有機ペルオキシドのような皮膚美白剤及び脱色剤と、いぼを治療するための薬剤（サリチル酸、イミキモド、ジニトロクロロベンゼン、ジブチルスクアリン酸、ポドフィリン、ポドフィロトキシン、カンタリジン、トリクロロ酢酸、ブレオマイシン、シドフォビル、アデフォビル及びそれらの類似体を含む）と、副腎皮質ステロイド、ならびに非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）であって、このＮＳＡＩＤには、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ベノキサプロフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン、ブチブフェン、フェンブフェン及びチアプロフェン酸が含まれる。
【０１３７】
創傷包帯剤では、好適な活性剤は、創傷の治療に有用な活性剤であり、その活性剤としては、静菌化合物、殺菌化合物、抗生剤、鎮痛剤、血管拡張剤、組織治癒促進剤、アミノ酸、タンパク質、タンパク質分解酵素、サイトカイン及びポリペプチド成長因子が挙げられるが、これらに限らない。
【０１３８】
いくつかの活性剤の局所投与及び経皮投与、ならびに創傷包帯剤の場合には、薬剤が皮膚に浸透するかまたは皮膚を透過する速度を高めるために、透過促進剤を本発明のハイドロゲル組成物に導入するのが必要であるかまたは望ましいこともある。好適な促進剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びデシルメチルスルホキシドのようなスルホキシド、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌとして市販されている）及びジエチレングリコールモノメチルエーテルのようなエーテル、ラウリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ベンザルコニウム、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（２３１、１８２、１８４）、Ｔｗｅｅｎ（２０、４０、６０、８０）及びレシチン（米国特許第４，７８３，４５０号）のような界面活性剤、１−置換アザシクロヘプタン−２−オン、特に１−ｎ−ドデシルシクラザ−シクロヘプタン−２−オン（Ａｚｏｎｅという商標でＮｅｌｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆ．から市販されている。米国特許第３，９８９，８１６号、同第４，３１６，８９３号、同第４，４０５，６１６号及び同第４，５５７，９３４を参照されたい）、エタノール、プロパノール、オクタノール、デカノール、ベンジルアルコールなどのようなアルコール、ラウリン酸、オレイン酸及び吉草酸のような脂肪酸、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、プロピオン酸メチル及びオレイン酸エチルのような脂肪酸エステル、プロピレングリコール、エチレングリコール、グリセロール、ブタンジオール、ポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールモノラウレート（ＰＥＧＭＬ、例えば米国特許第４，５６８，３４３号を参照されたい）のようなポリオール及びそのエステル、尿素、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−ピロリドン、１−メチル−２−ピロリドン、エタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンのようなアミド及びその他の窒素化合物、テルペン、アルカノン、ならびに有機酸、特にサリチル酸、サリチル酸塩、クエン酸及びコハク酸が挙げられる。２つ以上の促進剤の混合物も使用し得る。
【０１３９】
特定の他の実施形態では、ゲル（例えばハイドロゲル成分）及びナノ構造体を含む本発明の複合体組成物は、追加の任意の添加成分も含んでよい。このような成分は、当該技術分野において知られており、その成分としては、例えば、充填剤、保存剤、ｐＨ調整剤、軟化剤、増粘剤、顔料、色素、屈折性粒子、安定剤、強化剤、不粘着剤、医薬剤（例えば、抗生剤、血管新生促進剤、抗真菌剤、免疫抑制剤、抗体など）及び透過促進剤を挙げることができる。これらの添加剤及びそれらの量は、本発明のハイドロゲル組成物の所望の化学的及び物理的特性に有意には干渉しないような形で選択する。
【０１４０】
有益には、吸収性充填物を組み込んで、その接着剤が皮膚またはその他の体表上にあるときの水和度を制御してよい。このような充填物としては、微結晶性セルロース、タルク、ラクトース、カオリン、マンニトール、コロイダルシリカ、アルミナ、酸化亜鉛、酸化チタン、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、疎水性デンプン、硫酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸カルシウム二水和物、織紙、不織紙及び木綿材を挙げることができる。他の好適な充填剤は、不活性、すなわち、実質的に非吸収性であり、この充填剤としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタンとポリエーテルアミドのコポリマー、ポリエステルとポリエステルのコポリマー、ナイロン及びレーヨンが挙げられる。
【０１４１】
本発明の組成物は、１つ以上の保存剤を含むことができる。保存剤としては、例として、ｐ−クロロ−ｍ−クレゾール、フェニルエチルアルコール、フェノキシエチルアルコール、クロロブタノール、４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、クロロヘキシジンジアセテート、クロロヘキシジングルコネート、エタノール及びプロピレングリコールが挙げられる。
【０１４２】
本発明の組成物は、ｐＨ調整化合物も含んでよい。ｐＨ調整剤として有用な化合物としては、グリセロール緩衝剤、クエン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、リン酸緩衝剤が挙げられるが、これらに限らず、または本発明のハイドロゲル組成物のｐＨが、個体の体表のｐＨと適合するようにする目的で、クエン酸−リン酸緩衝剤も含めてもよい。
【０１４３】
本発明の組成物は、好適な軟化剤も含んでよい。好適な軟化剤としては、クエン酸トリエチルもしくはクエン酸アセチルトリエチルのようなクエン酸エステル、酒石酸ジブチルのような酒石酸エステル、グリセロールジアセテート及びグリセロールトリアセテートのようなグリセロールエステル、フタル酸ジブチル及びフタル酸ジエチルのようなフタル酸エステル、及び／または親水性界面活性剤、好ましくは親水性非イオン性界面活性剤（例えば、糖の部分脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸アルコールエーテル及びポリエチレングリコールソルビタン−脂肪酸エステルなど）が挙げられる。
【０１４４】
本発明の組成物は、増粘剤も含んでよい。本発明における好ましい増粘剤は、天然化合物またはその誘導体であり、例として、コラーゲン、ガラクトマンナン、デンプン、デンプンの誘導体及び加水分解物、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体、コロイド状ケイ酸、ならびにラクトース、スクロース、フルクトース及びグルコースのような糖が挙げられる。ポリビニルアルコール、ビニルピロリドン−ビニルアセテート−コポリマー、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのような合成増粘剤も使用してよい。
【０１４５】
特定の実施形態では、ハイドロゲル及びナノ構造体を含む本発明のハイドロゲル複合体は、血管新生を促す成分をさらに含む。本発明前における、臨床的に有意義な軟組織再生を実現するための難題は、再生される組織を好ましくは血管再生しなければならない点である。したがって、軟組織の再生を促すいずれかの材料は好ましくは、血管新生も促さなければならない。これを達成する方法の１つは、ヘパリンを含むハイドロゲル成分を使用することと考えられ、この成分は、血管新生及び組織の形成を促す成長因子を濃縮及び保持するための成長因子結合部位として機能できる。
【０１４６】
実施形態では、本発明の組成物は、抗体をさらに含み、抗体を送達する。「抗体」という用語は、本明細書では、最も広い意味で用いられており、抗原またはエピトープに特異的に結合する１つ以上の抗原結合ドメインを含む特定の種類の免疫グロブリン分子を含む。具体的には、抗体には、インタクトな抗体（例えば、インタクトな免疫グロブリン）、抗体断片及び多特異性抗体が含まれる。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、その抗体は、１つの抗体を含む。いくつかの態様では、その抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、その抗体は、キメラ抗体である。いくつかの態様では、その抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの態様では、その抗体は、ヒト抗体である。いくつかの態様では、その抗体は、抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、その抗体は、代替足場を含む。
【０１４８】
「完全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」という用語は、本明細書では、天然の抗体の構造と実質的に同様の構造を有するとともに、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す目的で同義的に用いられている。例えば、「完全長抗体」は、ＩｇＧ分子を指す目的で使用するときには、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む抗体である。
【０１４９】
「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域であって、天然抗体において、Ｆｃ受容体及び補体系の特定のタンパク質と相互作用する領域を意味する。様々な免疫グロブリンのＦｃ領域、及びその領域に含まれる糖鎖付加部位の構造は、当該技術分野において知られている。Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｖａｃｉｎｉ，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１０，１２５：Ｓ４１−５２（参照により、その全体が援用される）を参照されたい。そのＦｃ領域は、天然のＦｃ領域、または当該技術分野または本開示の他の箇所で説明されているようにして改変されたＦｃ領域であってよい。
【０１５０】
ＶＨ領域及びＶＬ領域はさらに、より保存性の高い領域が間に挟み込まれた超可変性領域（「超可変領域（ＨＶＲ）」、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）ともいう）に細分し得る。その、より保存性の高い領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）という。それぞれのＶＨ及びＶＬは概して、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含み、これらは、（Ｎ末端からＣ末端に向かって）ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４という順に並んでいる。ＣＤＲは、抗原の結合に関与し、抗原の特異性及び抗体の結合親和性に影響を及ぼす。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  ５ｔｈ  ｅｄ．（１９９１）Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（参照により、その全体が援用される）を参照されたい。
【０１５１】
いずれの脊椎動物種に由来する軽鎖も、その定常ドメインの配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）という２つの種類のうちの１つに割り当てることができる。
【０１５２】
いずれの脊椎動物種に由来する重鎖も、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという５つの異なるクラス（すなわちアイソタイプ）のうちの１つに割り当てることができる。これらのクラスはそれぞれ、α、δ、ε、γ及びμとも称される。ＩｇＧ及びＩｇＡのクラスはさらに、配列及び機能の違いに基づき、サブクラスに分類される。ヒトは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２というサブクラスを発現する。
【０１５３】
当業者は、Ｋａｂａｔらの上記文献に記載のナンバリングスキーム（「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（「Ｃｏｎｔａｃｔ」ナンバリングスキーム）、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，２７：５５−７７（「ＩＭＧＴ」ナンバリングスキーム）及びＨｏｎｅｇｇｅ  ａｎｄ  Ｐｌｉｉｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１，３０９：６５７−７０（「ＡＨｏ」ナンバリングスキーム）に記載されているものを含む多くの既知のナンバリングスキームのうちのいずれかを用いて、ＣＤＲのアミノ酸配列境界を求めることができ、上記の各文献は、参照により、その全体が援用される。
【０１５４】
「抗体断片」は、インタクト抗体の抗原結合領域または可変領域のような、インタクト抗体の一部を含む。抗体断片としては、例えば、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ（ｓＦｖ）断片及びｓｃＦｖ−Ｆｃ断片が挙げられる。
【０１５５】
「Ｆｖ」断片は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが非共有結合で連結したダイマーを含む。
【０１５６】
「Ｆａｂ」断片は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインに加えて、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ断片は、例えば、組み換え法または完全長抗体のパパイン消化によって作製し得る。
【０１５７】
「Ｆ（ａｂ’）２」断片は、２つのＦａｂ’断片が、ヒンジ領域の近くで、ジスルフィド結合によって連結されたものを含む。Ｆ（ａｂ’）２断片は、例えば、組み換え法またはインタクト抗体のペプシン消化によって作製し得る。Ｆ（ａｂ’）断片は、例えば、１−メルカプトエタノールによる処理によって解離できる。
【０１５８】
「一本鎖Ｆｖ」、「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、１本のポリペプチド鎖にＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。そのＶＨ及びＶＬは概して、ペプチドリンカーによって連結されている。Ｐｌｉｉｃｋｔｈｕｎ  Ａ．（１９９４）の文献を参照されたい。いずれの好適なリンカーも使用し得る。いくつかの実施形態では、そのリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１２７）である。いくつかの実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５または６である。Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｉｎ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｍ．  ＆  Ｍｏｏｒｅ  Ｇ．Ｐ．（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｖｏｌ．１１３（ｐｐ．２６９−３１５）．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（参照により、その全体が援用される）を参照されたい。
【０１５９】
「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」断片は、ｓｃＦｖがＦｃドメインに結合されたものを含む。例えば、Ｆｃドメインは、ｓｃＦｖのＣ末端に結合し得る。そのＦｃドメインは、そのｓｃＦｖにおける可変ドメインの向き（すなわち、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）に応じて、ＶＨまたはＶＬの後に位置してもよい。当該技術分野において知られているかまたは本明細書に記載されているいずれの好適なＦｃドメインも使用し得る。場合によっては、そのＦｃドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む。
【０１６０】
「単一ドメイン抗体」という用語は、抗体の１つの可変ドメインが、他の可変ドメインの非存在下で、抗原に特異的に結合する分子を指す。単一ドメイン抗体及びその断片は、Ａｒａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，４１４：５２１−５２６及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２００１，２６：２３０−２４５に記載されており、この各文献は、参照により、その全体が援用される。単一ドメイン抗体は、ｓｄＡｂまたはナノボディとしても知られている。
【０１６１】
「多特異性抗体」は、２つ以上の異なるエピトープに一緒に特異的に結合する２つ以上の異なる抗原結合ドメインを含む抗体である。その２つ以上の異なるエピトープは、同じ抗原（例えば、細胞によって発現される単一のＴＩＧＩＴ分子）または異なる抗原（例えば、同じ細胞によって発現される異なるＴＩＧＩＴ分子、もしくはＴＩＧＩＴ分子及びＴＩＧＩＴ以外の分子）上のエピトープであってよい。いくつかの態様では、多特異性抗体は、２つの異なるエピトープと結合する（すなわち「二重特異性抗体」）。いくつかの態様では、多特異性抗体は、３つの異なるエピトープと結合する（すなわち「三重特異性抗体」）。いくつかの態様では、多特異性抗体は、４つの異なるエピトープと結合する（すなわち「四重特異性抗体」）。いくつかの態様では、多特異性抗体は、５つの異なるエピトープと結合する（すなわち「五重特異性抗体」）。いくつかの態様では、多特異性抗体は、６つ、７つ、８つまたは９つ以上の異なるエピトープと結合する。それぞれの結合特異性は、いずれかの好適な価数で存在し得る。
【０１６２】
「単特異性抗体」は、単一のエピトープに特異的に結合する１つ以上の結合部位を含む抗体である。単特異性抗体の例は、２価である（すなわち、２つの抗原結合ドメインを有する）が、その２つの抗原結合ドメインのそれぞれにおいて、同じエピトープを認識する天然のＩｇＧ分子である。結合特異性は、いずれかの好適な価数で存在し得る。
【０１６３】
「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得た抗体を指す。実質的に均一な抗体の集団は、モノクローナル抗体の作製中に通常発生し得るバリアントを除き、実質的に同種であり、同じエピトープ（複数可）と結合する抗体を含む。このようなバリアントは概して、微量しか存在しない。モノクローナル抗体は典型的には、複数の抗体から単一抗体を選択することを含むプロセスによって得られる。例えば、その選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、酵母クローン、細菌クローンまたはその他の組み換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンから特有のクローンを選択することであることができる。その選択した抗体をさらに改変して、例えば、標的に対する親和性を改善し（「親和性成熟」）、抗体をヒト化し、細胞培養の際のその産生を向上させ、及び／または対象でのその免疫原性を低下させることができる。
【０１６４】
「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖及び／または軽鎖の残部が、異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
【０１６５】
非ヒト抗体の「ヒト化」形態は、その非ヒト抗体に由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は概して、ヒト抗体（レシピエント抗体）の１つ以上のＣＤＲに由来する残基が、非ヒト抗体（ドナー抗体）の１つ以上のＣＤＲに由来する残基に置き換えられているヒト抗体である。そのドナー抗体は、所望の特異性、親和性または生体作用を有するマウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、トリ抗体またはヒト以外の霊長類動物抗体のようないずれの好適な非ヒト抗体であることができる。場合によっては、レシピエント抗体の所定のフレームワーク領域残基が、ドナー抗体由来の対応するフレームワーク領域残基によって置き換えられている。ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体のいずれでも見られない残基も含み得る。このような改変を行って、抗体機能をさらに高めてよい。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３−３２９及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１９９２，２：５９３−５９６を参照されたい（各文献は、参照により、その全体が援用される）。
【０１６６】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくはヒト抗体コード配列（例えば、ヒト供給源から得たかもしくはｄｅ  ｎｏｖｏ設計した配列）を利用する、ヒト以外の供給源から得られる抗体である。ヒト抗体からはヒト化抗体が明確に除外される。
【０１６７】
実施形態では、本明細書に記載されている組成物によって供給する抗体または抗原結合タンパク質は、特定の種類の宿主細胞を標的とする。実施形態では、その抗体は、細菌細胞または真菌細胞のような非宿主細胞に結合する。実施形態では、その抗体またはＡＤＰは、少なくとも二重特異性であり、少なくとも２つの宿主標的に結合する。実施形態では、その抗体またはＡＤＣは、少なくとも二重特異性であり、少なくとも１つの宿主標的及び１つの非宿主標的に結合する。実施形態では、その抗体またはＡＤＰは、単特異性または二重特異性である。実施形態では、その抗体は、三重特異性または四重特異性である。
【０１６８】
実施形態では、その抗体は、受容体をアゴナイズする。実施形態では、その抗体は、受容体をアンタゴナイズする。
【０１６９】
実施形態では、本発明で提供する組成物は、送達するための細胞を含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、その細胞を投与される対象に由来する。いくつかの態様では、その細胞は、その細胞を投与される対象以外の供給源に由来する。いくつかの態様では、その細胞は、細胞株に由来する。いくつかの態様では、その細胞は、ヒト供給源に由来する。いくつかの態様では、その細胞は、ヒト化動物供給源に由来する。
【０１７０】
いくつかの態様では、供給するその細胞は、幹細胞である。
【０１７１】
いくつかの態様では、供給するその細胞は、脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ）（脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ））である。いくつかの態様では、供給するその細胞は、筋肉細胞、神経細胞、皮膚細胞または臓器細胞である。いくつかの態様では、供給するその細胞は、肝臓細胞、膵臓細胞、心臓細胞、肺細胞、食道細胞、内皮細胞または上皮細胞である。
【０１７２】
いくつかの態様では、供給するその細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において供給する免疫細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞である。いくつかの実施形態では、その供給する細胞は、ＣＤ−８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、その供給する細胞は、ＣＤ−４＋Ｔ細胞である。
【０１７３】
いくつかの態様では、その供給する細胞は、インスリン、コラーゲンまたは抗体のような有用な物質を産生する。いくつかの実施形態では、この能力は、組み換えＤＮＡによって導入する。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本発明で提供する組成物は、送達するための小分子をさらに含み、その小分子は、生物活性剤である。いくつかの実施形態では、その小分子は、疾患の診断、治癒、緩和、治療もしくは予防における薬理活性もしくは別の直接的作用を引き起こすことができるか、または体の構造または機能に作用を及ぼすことができる。
【０１７５】
本発明のゲル／ハイドロゲル／ナノ構造体複合体は、上皮細胞成長因子（ＥＤＦ）、ＰＤＧＦ及び神経成長因子（ＮＧＦ）を含む数ある成長因子のような組織修復剤も含むことができる。例えば、本発明の組成物は、ＥＧＦを含んでよい。上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）は、実験用マウスの皮膚創傷が、そのマウスに創傷を舐めさせた方が速やかに治癒するように見えることが観察された後に発見された。これは単に、唾液中の何らかの殺菌作用物質（リゾチームなど）によるものではなかった。今日ではＥＧＦとして知られている特定の成長因子が原因であることが示された。ＥＧＦは、ウロガストロンと同一であり、血管新生特性を有する。トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦα）は、非常に似ており、同じ受容体に結合し、上皮細胞の再生（上皮形成）を刺激する効果がより一層高い。
【０１７６】
したがって、ＥＧＦ／ＴＧＦを含む本発明のハイドロゲルは有益なことに、創傷及び熱傷の治癒の加速、（特に熱傷の際の）ケロイド瘢痕の形成の低減、皮膚生着用包帯剤、ならびに慢性下腿潰瘍の治療で使用し得る。
【０１７７】
本発明で有用な組織修復剤としては、上皮細胞成長因子（ＥＤＦ）、ＰＤＧＦ及び神経成長因子（ＮＧＦ）を含む多くの成長因子が挙げられる。概して、成長促進ホルモンは、１〜４個の組織に作用することになる。このようなタンパク質から開発された製品の多くは、ある種の創傷修復を対象としているが、他の適応症が存在する。特に重要な組織成長因子のうちのいくつかについては、下記にさらに説明されている。
【０１７８】
本発明のゲル／ナノ構造体組成物は、組織の修復方法及び本発明の他の用途で有用であり得る１つ以上の成長因子も含んでよい。
【０１７９】
例えば、本発明では、ＰＤＧＦを本発明の組成物に含めることが企図されている。血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、ほぼすべての間葉由来細胞、すなわち、血液、筋肉、骨、軟骨及び結合組織細胞に対するマイトジェンである。ＰＤＧＦは、ＡＡホモダイマーもしくはＢＢホモダイマーとして、またはＡＢヘテロダイマーとして存在するダイマーの糖タンパク質である。多くの成長因子と同様に、ＰＤＧＦは今日では、より大きい因子ファミリーのメンバーとみなされている。ＰＤＧＦに加えて、このファミリーには、ホモダイマー因子である血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及び胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、ＶＥＧＦ／ＰＩＧＦヘテロダイマー、ならびにヒト血管内皮細胞及び線維芽細胞によって分泌されるＰＤＧＦ様因子である結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）が含まれる。ＰＤＧＦは今日では、ＮＧＦ、ＴＧＦβ、及びヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のような糖タンパク質ホルモンとともに、システインノット成長因子スーパーファミリーのメンバーとして分類されている。これらの因子のいずれも、本発明のハイドロゲルと併せて使用し得る。
【０１８０】
ＰＤＧＦは、血小板によって産生され、血液凝固の過程で放出される。ＰＤＧＦは、これらの細胞に由来する成長因子の１つに過ぎない。ＰＤＧＦは、線維芽細胞及び白血球を傷害部位に引き寄せるとともに、置換結合組織（主に線維芽細胞及び平滑筋細胞）の成長を刺激する。ＰＤＧＦは、コラーゲンを産生する細胞を含む様々な細胞において細胞分裂を刺激し、その結果、血管新生を促す。ＰＤＧＦは、有糸分裂誘発、血管収縮、走性、酵素活性及びカルシウム動員も刺激する。
【０１８１】
血小板由来成長因子を用いて、本発明の組成物を用いる特定の治療の際に、骨及び軟組織の再成長を回復するとともに、慢性創傷及び急性創傷の治癒プロセスを加速し得る。したがって、本発明のハイドロゲル／ナノ構造体組成物は有益なことに、血小板由来成長因子カクテルを含んでよい。
【０１８２】
本発明のハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、例えば、ＰＤＧＦ遺伝子を局所送達するための遺伝子療法で使用し得る。ＰＤＧＦをコードするプラスミドＤＮＡは、ハイドロゲルマトリックス及び肉芽組織線維芽細胞（創傷周囲の生組織に由来し、増殖し、マトリックスの中まで移動し、プラスミド遺伝子の移入及び発現の標的として働く）に組み込まれる。
【０１８３】
本発明のハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、血管新生を促すためにＶＥＧＦも含み得る。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ−−血管透過性因子としても知られている）は、多機能な血管新生サイトカインである別の血管成長因子である。ＶＥＧＦは、微小血管レベルで内皮細胞の増殖を刺激し、その細胞を移動させて、その遺伝子発現を変化させることによって、間接的にも直接的にも血管新生（血管成長）に寄与する。ＶＥＧＦは、これらの内皮細胞の透過性を亢進して、その細胞に血漿タンパク質を血管腔外に放出させ、これにより、その区域を変化させ、血管新生に寄与する。
【０１８４】
本発明の組成物は、ＦＧＦも含んでよい。線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は実際には、ヘパリン結合成長因子ファミリーに属する少なくとも１９個の１４〜１８ｋＤのペプチドからなるファミリーであり、培養した線維芽細胞及び血管内皮細胞に対してマイトジェン作用を示す。ＦＧＦは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて血管新生性でもあり、この血管新生性は、ＴＮＦによって増強される。ＦＧＦは、ＥＧＦと同様の形で使用し得る。ｂＦＧＦは、ＦＧＦ−２としても知られており、ヒトの巨核球造血の制御に関与し、ＦＧＦは、内皮細胞の形成を刺激するのに有効であるとともに、結合組織の修復を補佐するのに有効であることが示されている。
【０１８５】
ハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、創傷の治癒、及び上皮細胞の破壊を伴うその他の傷害に使用するために、ＦＧＦ−７としても知られるケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）も含んでよい。
【０１８６】
トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）は、様々な細胞株を形質転換する能力を有し、例えば、培養下で、制限を超えた世代数にわたって成長する能力、単層ではなく多層での成長、及び異常な核型の発生をもたらし得る。ＴＧＦファミリーには、少なくとも５つのメンバーが存在し、特に広く研究されている２つのメンバーは、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βである。ＴＧＦ−αは、線維芽細胞及び内皮細胞に対してマイトジェン作用を示し、血管新生性があり、骨吸収を促進する。組成物は、ＴＧＦも含んでよい。ＴＧＦ−βは、細胞調節の一般的なメディエーター、細胞成長の強力な阻害因子であり、多くの種類の細胞の増殖を阻害する。ＴＧＦ−βは、他のペプチド成長因子のマイトジェン作用をアンタゴナイズでき、多くの腫瘍細胞株の成長を阻害することもできる。ＴＧＦ−βは、血管新生作用も有し、線維芽細胞においてコラーゲンの形成を促す。本発明のハイドロゲルの適応症には、糖尿病患者における神経栄養性足潰瘍のような慢性皮膚潰瘍が含まれる。他の領域としては、創傷の治癒、骨の修復及び免疫抑制疾患が挙げられる。
【０１８７】
本発明のハイドロゲル／ナノ構造体組成物を用いて、例えば、好適な細胞を担持し得る。これら細胞は、創傷またはその他の好適な区域に適用する直前に、そのゲルに導入して、有効性を最大化し得る。好適な細胞としては、自己線維芽細胞及びケラチノサイトが挙げられ、これらは、真皮及び表皮の形成を主に担うものである。１種類の細胞をそれぞれ含む別々のゲルを連続してもしくは一緒に適用してよく、または１つのゲルが両方の種類の細胞を含んでもよいが、これは概して、前者よりも好ましくない。
【０１８８】
本発明のハイドロゲル／ナノ構造体組成物は有用なことに、例えばコラーゲンを含んでよい。コラーゲンは、この形態では、有用な構造的機能を発揮する可能性が低いが、望ましくないことにタンパク質分解活性が高い場合に、主として犠牲タンパク質として機能し、それにより、例えば、健常組織の浸軟を防ぐのを助ける。
【０１８９】
ハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、特定の酵素を含むこともできる。酵素は、急性創傷及び慢性創傷の両方の壊死組織除去で用いられている。壊死組織除去は、創傷から壊死組織及び異物を除去することであり、創傷修復プロセスにおいては天然の事象である。炎症期では、好中球及びマクロファージが、創傷区域の「使用済みの」血小板、細胞破片及び無血管の傷害組織を消化して、創傷区域から除去する。しかしながら、かなりの量の損傷組織が蓄積すると、この天然のプロセスは、追いつかなくなり、不十分になる。そして、壊死組織の増加により、創傷に対する食細胞の必要性が相当大きくなり、創傷の治癒が遅くなる。このため、壊死組織の除去は、局所療法の具体的な目標及び最適な創傷管理の重要な構成要素である。
【０１９０】
例えば、局所適用向けに、酵素を本発明のハイドロゲルに組み込んで、選択的な壊死組織除去法を行ってよい。好適な酵素は、オキアミ、カニ、パパイヤ、ウシ抽出物及び細菌のような様々な供給源に由来するものであってよい。好適な市販の酵素としては、コラゲナーゼ、パパイン／尿素、及びフィブリノリジンとデオキシリボヌクレアーゼを組み合わせたものが挙げられる。
【０１９１】
本発明で用いる酵素は概して、かさぶたの構成要素（例えば、フィブリン、細菌、白血球、細胞破片、漿液滲出液、ＤＮＡ）を直接消化することによる方法、または無血管組織を下の創傷床に固定するコラーゲン「アンカー」を溶解することによる方法という２つの方法のうちの１つで機能する。
【０１９２】
本発明のハイドロゲルは、所望の場合、概して、抗微生物作用及び臭気制御力を発揮するために、デーキン液を含み得る。壊死組織除去剤としては、デーキン液は、その細胞毒性特性により、非選択的なものである。デーキン液は、タンパク質を変性させ、そのタンパク質が創傷からさらに容易に除去されるようにする。かさぶたの密度を粗くすると、他の方法による壊死組織除去も容易になる。壊死組織除去が目的である場合、デーキン液を含むハイドロゲルは、１日に２回変更してよい。創傷周囲の皮膚の保護は概して、例えば、軟膏剤、液体皮膚バリア膜包帯剤または固体皮膚バリアウエハーで行うべきである。
【０１９３】
本発明のゲルは、シリンジもしくは蛇腹パック（単回用量送達システム）、または加圧式送達システムのような複数回投与システム、あるいは「バッグ内蔵式の缶」タイプのシステム（ＷＯ９８／３２６７５で公開されたようなシステム）による送達などのいずれかの好適な方法によって送達し得る。蛇腹パックの例は、英国意匠公開第２０８２６６５号に示されている。
【０１９４】
したがって、本発明は、創傷の治療用に、本発明によるゲルを含む単回用量送達システムにも及ぶ。本発明は、本発明によるゲルを含む加圧式送達システム、及びエアゾール容器内の、本発明による加圧ハイドロゲルであって、その容器から圧力が解放されると噴霧できるハイドロゲルにも及ぶ。このような送達手段の使用により、患者の区域のうち、直接的な塗布によっては届きにくい区域（患者が横たわっているときの患者の背中など）にゲルを送達可能になる。
【０１９５】
特定の実施形態では、生体用電極及びその他の電気療法の関連で使用するために、すなわち、電極またはその他の導電性部材を体表に取り付けるために、本発明のハイドロゲル組成物を導電性にするのが有益なことがある。例えば、本発明のハイドロゲル組成物を用いて、経皮的神経刺激電極、電気手術用リターン電極またはＥＫＧ電極を患者の皮膚または粘膜組織に取り付けてよい。これらの用途には、導電性の化学種を含むように、本発明のハイドロゲル組成物を改変することが伴う。好適な導電性の化学種は、イオン伝導性電解質、特に、通常、皮膚またはその他の体表に塗布するのに使われている導電性接着剤の製造に用いられるものであり、イオン化可能な無機塩、有機化合物またはこれらの両方を組み合わせたものが挙げられる。イオン伝導性電解質の例としては、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、酢酸モノエタノールアミン、酢酸ジエタノールアミン、乳酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸カルシウム、塩化リチウム、過塩素酸リチウム、クエン酸ナトリウム及び塩化カリウム、ならびに第二鉄塩及び第一鉄塩（硫酸塩及びグルコン酸塩など）の混合物のような酸化還元対が挙げられるが、これらに限らない。好ましい塩は、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム及び酢酸マグネシウムであり、ＥＫＧ用途では、塩化カリウムが最も好ましい。本発明の接着剤組成物には、実質的にいずれの量の電解質も存在してよいが、いずれの電解質も、本発明のハイドロゲル組成物の約０．１〜約１５重量％の範囲の濃度で存在するのが好ましい。Ｎｉｅｌｓｅｎらの米国特許第５，８４６，５５８号に記載されている、生体用電極の作製手順を、本発明のハイドロゲル組成物で用いるために改変してよく、その特許の開示内容は、参照により、製造法の詳細に関して援用される。当業者には明らかなように、他の好適な作製手順も使用し得る。
【０１９６】
架橋
特定の用途、特に、高い凝集力が所望されるときには、本発明のゲル／ハイドロゲルのポリマーは、共有架橋されていてよい。本開示では、架橋は、本発明のゲル／ハイドロゲル成分のポリマー間の架橋が望ましいこともあるが、架橋は、本発明の複合材のゲル／ハイドロゲルのポリマーとナノ構造体成分の間の架橋が望ましいこともあることが企図されている。本発明では、ポリマーを互いに架橋するとともに、本発明のゲル／ハイドロゲルポリマーと、本発明のナノ構造体成分を架橋するためのいずれの好適な手段も企図されている。本発明のゲル／ハイドロゲルポリマーは、他のポリマーまたは本発明のナノ構造体に、分子内におけるか、分子間におけるか、または共有結合を介するかのいずれかで共有架橋されていてもよい。前者の場合には、本発明のポリマーは、互いにまたは本発明のナノ構造体に共有結合されておらず、後者の場合には、本発明のポリマーは、互いにまたは本発明のナノ構造体に共有架橋結合されている架橋は、加熱、放射線照射または化学硬化（架橋）剤を使用することを含め、いずれかの好適な手段を用いて形成し得る。架橋度は、圧縮下でのコールドフローを排除するかまたは少なくとも最小限にするのに充分でなければならない。架橋には、架橋プロセスで使用する第３の分子である「架橋剤」の使用も含まれる。
【０１９７】
「架橋剤（Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）」または「架橋剤（Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」は好適なことに、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、例えば、チオール化ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）またはこれらの誘導体の群から選択し得る。
【０１９８】
熱架橋では、フリーラジカル重合開始剤を使用し、その開始剤は、従来からビニル重合で用いられている既知のフリーラジカル生成開始剤のうちのいずれであることもできる。好ましい開始剤は、有機ペルオキシド及びアゾ化合物であり、概して、重合可能な材料の約０．０１重量％〜１５重量％、好ましくは０．０５重量％〜１０重量％、より好ましくは約０．１重量％〜約５％、最も好ましくは約０．５重量％〜約４重量％の量で使用する。好適な有機ペルオキシドとしては、ｔ−ブチルペルオキシド及び２，２ビス（ｔ−ブチルペルオキシ）プロパンのようなジアルキルペルオキシド、ベンゾイルペルオキシド及びアセチルペルオキシドのようなジアシルペルオキシド、ｔ−ブチルペルベンゾエート及びｔ−ブチルペル−２−エチルヘキサノエートのようなペルエステル、ジセチルペルオキシジカーボネート及びジシクロヘキシルペルオキシジカーボネートのようなペルジカーボネート、シクロヘキサノンペルオキシド及びメチルエチルケトンペルオキシドのようなケトンペルオキシド、ならびにクメンヒドロペルオキシド及びｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドのようなヒドロペルオキシドが挙げられる。好適なアゾ化合物としては、アゾビス（イソブチロニトリル）及びアゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）が挙げられる。熱架橋温度は、実際の成分に左右されることになり、当業者が容易に推定し得るが、典型的には、約８０℃〜約２００℃の範囲である。
【０１９９】
架橋は、典型的には光開始剤の存在下で、放射線照射によって行ってもよい。その放射線照射は、紫外線、α線、β線、γ線、電子線及びＸ線の照射であってよいが、紫外線の照射が好ましい。有用な光増感剤は、「水素引き抜き」型の三重項増感剤であり、その光増感剤としては、ベンゾフェノン及び置換ベンゾフェノン、ベンジルジメチルケタール、４−アクリルオキシベンゾフェノン（ＡＢＰ）、１−ヒドロキシ−シクロヘキシルフェニルケトン、２，２−ジエトキシアセトフェノン及び２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノンのようなアセトフェノン、２−メチル−２−ヒドロキシプロピオフェノンのような置換α−ケトール、ベンゾインメチルエーテル及びベンゾインイソプロピルエーテルのようなベンゾインエーテル、アニソインメチルエーテルのような置換ベンゾインエーテル、２−ナフタレンスルホニルクロリドのような芳香族スルホニルクロリド、１−フェニル−１，２−プロパンジオン−２−（Ｏ−エトキシ−カルボニル）−オキシムのような光活性オキシム、アルキル置換チオキサントン及びハロゲン置換チオキサントンを含むチオキサントン（２−イソプロピルチオキサントン、２−クロロチオキサントン、２，４ジメチルチオキサントン、２，４ジクロロチオキサントン及び２，４−ジエチルチオキサントンなど）、ならびにアシルホスフィンオキシドが挙げられる。本発明で用いるには、波長が２００〜８００ｎｍ、好ましくは２００〜５００ｎｍである放射線が好ましく、大半の場合、架橋を誘導するには、低強度の紫外光で充分である。しかしながら、水素引き抜き型の光増感剤では、充分な架橋をもたらすには、高強度のＵＶへの暴露が必要な場合がある。このような暴露は、ＰＰＧ、Ｆｕｓｉｏｎ、Ｘｅｎｏｎなどから入手可能なような水銀ランププロセッサーによって行うことができる。架橋は、γ線または電子線の照射によっても誘導し得る。適切な照射パラメーター、すなわち、架橋を行うために用いる放射線の種類及び線量は、当業者には明らかであろう。
【０２００】
好適な化学硬化剤（化学架橋「促進剤」ともいう）としては、２，２−ジメルカプトジエチルエーテル、ジペンタエリトリトールヘキサ（３−メルカプトプロピオネート）、エチレンビス（３−メルカプトアセテート）、ペンタエリトリトールテトラ（３−メルカプトプロピオネート）、ペンタエリトリトールテトラチオグリコレート、ポリエチレングリコールジメルカプトアセテート、ポリエチレングリコールジ（３−メルカプトプロピオネート）、トリメチロールエタントリ（３−メルカプトプロピオネート）、トリメチロールエタントリチオグリコレート、トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピオネート）、トリメチロールプロパントリチオグリコレートのようなポリメルカプタン、ジチオエタン、ジチオプロパンまたはトリチオプロパン、及び１，６−ヘキサンジチオールが挙げられるが、これらに限らない。架橋促進剤は、未架橋の親水性ポリマーに加えて、その共有架橋を促すか、または未架橋の親水性ポリマーと相補的オリゴマーのブレンドに加えて、これらの２つの成分間の架橋をもたらす。
【０２０１】
本発明のポリマー及び／またはナノ構造体は、相補的オリゴマーに添加混合する前に架橋してもよい。このような場合には、多官能性コモノマーを有するポリマーにモノマー前駆体を添加混合し、共重合することによって、ポリマーを架橋形態で合成するのが好ましいこともある。モノマー前駆体及び対応するポリマー生成物の例は、Ｎ−ビニルアミド前駆体に対する生成物ポリ（Ｎ−ビニルアミド）、Ｎ−アルキルアクリルアミドに対する生成物ポリ（Ｎ−アルキルアクリルアミド）、アクリル酸に対する生成物ポリアクリル酸、メタクリル酸に対する生成物ポリメタクリル酸、アクリロニトリルに対する生成物ポリ（アクリロニトリル）、及びＮ−ビニルピロリドン（ＮＶＰ）に対する生成物ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）である。重合は、バルク、懸濁液、溶液またはエマルジョンで行ってよい。溶液重合が好ましく、酢酸エチル及び低級アルカノール（例えば、エタノール、イソプロピルアルコールなど）のような極性有機溶媒が特に好ましい。親水性ビニルポリマーの調製の際には、合成は典型的には、上記のようなフリーラジカル開始剤の存在下で、フリーラジカル重合プロセスによって行うことになる。多官能性コモノマーとしては、例えば、ビスアクリルアミド、ブタンジオール及びヘキサンジオールのようなジオールのアクリル酸エステルまたはメタクリル酸エステル（１，６−ヘキサンジオールジアクリレートが好ましい）、ペンタエリトリトールテトラアクリレート、１，２−エチレングリコールジアクリレート及び１，１２−ドデカンチオールジアクリレートのようなその他のアクリレートが挙げられる。他の有用な多官能性架橋モノマーとしては、オリゴマー及びポリマーの多官能性（メタ）アクリレート、例えば、ポリ（エチレンオキシド）ジアクリレートまたはポリ（エチレンオキシド）ジメタクリレート、置換及び非置換のジビニルベンゼンのようなポリビニル架橋剤、ＥＢＥＣＲＹＬ２７０（重量平均分子量１５００のアクリル化ウレタン）及びＥＢＥＣＲＹＬ２３０（重量平均分子量５０００のアクリル化ウレタン）（いずれもジョージア州スマーナのＵＣＳから入手可能）のような二官能性ウレタンアクリレート、ならびにこれらを組み合わせたものが挙げられる。化学架橋剤を用いる場合、その使用量は好ましくは、架橋剤と親水性ポリマーの重量比が、約１：１００〜１：５の範囲となるような量となる。望ましい場合、より高い架橋密度を得るには、化学架橋を放射線による硬化と組み合わせる。
【０２０２】
ナノ構造体
本発明のナノ構造体成分は、繊維、フィラメント、メッシュ切片、分岐フィラメントもしくは網目構造、シート、または成形粒子を含むいずれかの好適な形態であってよい。本発明のナノ構造体は、そのナノ構造体と本発明のハイドロゲルのポリマーとの共有架橋または非共有架橋を促すためのいずれの好適な化学官能基も含んでよい。ナノ構造体を作製及び官能化するための方法、技法及び材料は、当該技術分野において周知である。
【０２０３】
特定の実施形態では、微細加工法を用いて、本発明のナノ構造体を作製する。様々な実施形態において、いずれかの好適な微細加工技法を用いて、開示されている用具を組織化及び／または製造することができる。このような方法及び技法は、当該技術分野において広く知られている。
【０２０４】
本発明で開示するナノ構造体を作製するのに使用できる微細加工プロセスとしては、リソグラフィー、レーザーエッチング、プラズマエッチング、フォトリソグラフィーもしくは化学エッチング（ウェット化学エッチング、ドライエッチング及びフォトレジスト除去法など）のようなエッチング技法、３次元印刷（３ＤＰ）、ステレオリソグラフィー（ＳＬＡ）、選択的レーザー焼結（ＳＬＳ）、弾道粒子作製法（ＢＰＭ）及び溶融堆積モデリング法（ＦＤＭ）を含む無固形形態技法によるもの、微細機械加工によるもの、シリコンの熱酸化、電気メッキ及び無電解めっき、ホウ素拡散、リン拡散、ヒ素拡散及びアンチモン拡散のような拡散プロセス、イオン注入、蒸着（フィラメント蒸着、電子線蒸着、フラッシュ蒸着、シャドウイング蒸着及びステップカバレッジ法）、スパッタリング、化学気相堆積（ＣＶＤ）、エピタキシー法（気相エピタキシー法、液相エピタキシー法及び分子線エピタキシー法）、電気メッキ、スクリーン印刷、ラミネーション法のような膜堆積、またはこれらを組み合わせた技法によるものが挙げられる。Ｊａｅｇｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ（Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｍａｓｓ．１９８８）、Ｒｕｎｙａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｍａｓｓ．１９９０）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＥＥＥ  Ｍｉｃｒｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  １９８７−１９９８、Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，ｅｄ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ  ＆  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ（ＳＰＩＥ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｗａｓｈ．１９９７）を参照されたい。モールドとして用いる材料の選択によって、分岐構造を形成する際に表面がどのような形態になるのかが決まる。
【０２０５】
例えば、半導体分野から得られたフォトリソグラフィーのプロセス及び方法を用いて、微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）を作製するための最先端のプロセスを使用し得る。さらに最近になって開発された方法としては、「ソフトリソグラフィー」（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ  ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ  ｅｄ，３７；５５０−５７５，（１９９８））及びマイクロフルイディクステクトニクス（米国特許第６，４８８，８７２号、Ｂｅｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ；４０４：５８８−５９（２０００））が挙げられる。ポリマー製の微小デバイスの作製に関する論評及びその他の考察としては、Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚａｔｉｏｎ；２ｎｄ  ｅｄ．；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９７、Ｂｅｃｋｅｒ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｏｃａｓｃｉｏ，Ｌ．Ｅ．“Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ．”Ｔａｌａｎｔａ，５６（２）：２６７−２８７，２００２、Ｑｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ａ．“Ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏ−  ｔｏ  ｎａｎｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｏｆｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９０（５４９６）：１５３６−１５４０，２０００及びＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｔｒｏｏｃｋ，Ａ．Ｄ．“Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．”Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｔｏｄａｙ，５４（６）：４２−４８，２００１が挙げられ、これらの各文献は、参照により、本明細書に援用される。
【０２０６】
本発明のナノ構造体は、静電紡糸法（エレクトロスピニングともいう）によって作製してもよい。繊維を形成できる液体及び／または溶液をエレクトロスピニングする技法は、周知であり、例えば米国特許第４，０４３，３３１号及び同第５，５２２，８７９号のような多くの特許で説明されている。エレクトロスピニングのプロセスは概して、液体を電場に置いて、その液体によって繊維が作られるようにすることを伴う。これらの繊維は概して、静電引力で導体に引き寄せられ、集められる。液体が繊維に変換される間に、繊維は、硬化及び／または乾燥する。この硬化及び／または乾燥は、液体の冷却によるもの（すなわち、その液体が、通常、室温において固体である場合）、溶媒の蒸発、例えば、脱水（物理的誘導により硬化）によるもの、または硬化機構（化学的誘導による硬化）によるものであり得る。
【０２０７】
静電紡糸法のプロセスは典型的には、例えば米国特許第４，０４３，３３１号に開示されているように、繊維を使用してマットまたはその他の不織材を作製する目的で行われてきた。直径が５０ｎｍ〜５マイクロメートルの範囲のナノファイバーを、不織ナノファイバーメッシュまたは整列されたナノファイバーメッシュにエレクトロスピニング紡糸できる。繊維直径が短いために、エレクトロスピニング紡糸テキスタイルは本質的に、表面積が非常に広く、孔径が小さい。これらの特性により、エレクトロスピニング紡糸ファブリックは、膜、組織の足場及びその他の生物医学的用途を含む多くの用途用の有力な候補となっている。
【０２０８】
エレクトロスピニング紡糸繊維は、直径が非常に小さくなるように作製できる。エレクトロスピニング紡糸繊維の直径、粘度及び均一性に影響を及ぼすパラメーターとしては、繊維を形成する配合液内のポリマー材及び架橋剤の濃度（充填量）、印加電圧、ならびに針とコレクターの距離が挙げられる。本発明の一実施形態によれば、本発明のナノファイバーは、直径が約１ｎｍ〜約１００．０ｍｍの範囲である。別の実施形態では、本発明のナノファイバーは、直径が約１ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲である。さらに、本発明のナノファイバーは、アスペクト比が少なくとも約１０〜少なくとも約１００の範囲であってよい。本発明の繊維は、直径が非常に短いので、単位質量当たりの表面積が非常に大きいことは明らかであろう。質量に対する表面積の比率が大きいことにより、繊維を形成する溶液または液体をわずか数秒で、液体または溶媒和の繊維形成材から固体のナノファイバーに変換可能となる。
【０２０９】
本発明のナノファイバー／ナノ構造体を形成するのに用いるポリマー材は、架橋剤と適合するいずれの繊維形成材から選択してもよい。意図する用途に応じて、繊維を形成するポリマー材は、親水性であっても、疎水性であっても、両親媒性であってもよい。加えて、繊維を形成するポリマー材は、感熱性ポリマー材であってよい。
【０２１０】
合成または天然の生分解性または非生分解性のポリマーが、本発明のナノファイバー／ナノ構造体を形成してよい。「合成ポリマー」とは、合成によって調製されるとともに、非天然のモノマー単位を含むポリマーを指す。例えば、合成ポリマーは、アクリレート単位またはアクリルアミド単位のような非天然のモノマー単位を含むことができる。合成ポリマーは典型的には、付加重合、縮合重合またはフリーラジカル重合のような従来の重合反応によって形成する。合成ポリマーには、非天然のモノマー単位（例えば、合成のペプチド、ヌクレオチド及び単糖誘導体）と併せて、天然のペプチド、ヌクレオチド及び単糖のモノマー単位のような天然のモノマー単位を有するポリマーも含めることができる。これらの種類の合成ポリマーは、固相合成のような標準的な合成技法、または可能なときには組み換えによって作製できる。
【０２１１】
「天然ポリマー」とは、天然において、組み換えによってまたは合成によって調製されるとともに、ポリマー主鎖において天然のモノマー単位からなるポリマーを指す。場合によっては、天然ポリマーは、その天然ポリマーの化学的及び／または物理的特性を変更するために、改変、処理、誘導体化または別段の処理が行われていてもよい。これらの場合には、「天然ポリマー」という用語には、その天然ポリマーに対する変更を反映するように、修飾語が付されることになる（例えば、「誘導体化された天然ポリマー」または「糖鎖が除去された天然ポリマー」）。
【０２１２】
ナノファイバー材は例えば、ポリオレフィン、ポリアセタール、ポリアミド、ポリエステル、セルロースエーテル、セルロースエステル、ポリアルキレンスルフィド、ポリアリーレンオキシド、ポリスルホン、変性ポリスルホンポリマー及びこれらの混合物のように、付加ポリマー材及び縮合ポリマー材の両方を含んでよい。これらの一般的な種類の範囲内の例示的な材料としては、ポリエチレン、ポリ（ｅ−カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコレート）、ポリプロピレン、ポリ（塩化ビニル）、ポリメタクリル酸メチル（及びその他のアクリル樹脂）、ポリスチレン及びこれらのコポリマー（ＡＢＡ型のブロックコポリマーを含む）、ポリ（フッ化ビニリデン）、ポリ（塩化ビニリデン）、様々な加水分解度（８７％〜９９．５％）のポリビニルアルコールであって、架橋形態及び非架橋形態のものが挙げられる。例示的な付加ポリマーは、ガラス質である（Ｔｇが室温を上回る）傾向がある。この傾向は、ポリ塩化ビニル及びポリメタクリル酸メチル、ポリスチレンポリマーの組成物またはアロイの場合であり、あるいは、ポリフッ化ビニリデン及びポリビニルアルコールの材料では、結晶化度が低い。
【０２１３】
本発明のいくつかの実施形態では、ナノファイバー／ナノ構造体の材料は、ポリアミド縮合ポリマーである。より具体的な実施形態では、そのポリアミド縮合ポリマーは、ナイロンポリマーである。「ナイロン」という用語は、あらゆる長鎖合成ポリアミドの一般名称である。少量の水の存在下で、εカプロラクタムを重縮合させることによって、別のナイロンを作製できる。この反応により、直鎖ポリアミドであるナイロン−６（環状ラクタムから作られる。ε−アミノカプロン酸としても知られる）が形成される。さらに、ナイロンコポリマーも企図されている。コポリマーは、様々なジアミン化合物、様々な二酸化合物及び様々な環状ラクタム構造体を反応混合物で組み合わせてから、ポリアミド構造内にモノマー物質がランダムに配置されたナイロンを形成することによって作製できる。例えば、ナイロン６，６−６，１０という物質は、ヘキサメチレンジアミン、及びＣ６の二酸とＣ１０の二酸のブレンドから作られるナイロンである。ナイロン６−６，６−６，１０は、εアミノカプロン酸、ヘキサメチレンジアミン、及びＣ６の二酸材とＣ１０の二酸材のブレンドを共重合させることによって作られるナイロンである。
【０２１４】
ブロックコポリマーも、ナノファイバーの材料として使用できる。ナノファイバーを調製するための組成物の調製の際には、溶媒系は、両方のブロックが溶媒に溶解するように選択できる。一例は、塩化メチレン溶媒中のＡＢＡ（スチレン−ＥＰ−スチレン）またはＡＢ（スチレン−ＥＰ）ポリマーである。このようなブロックコポリマーの例は、ＫｒａｔｏｎタイプのＡＢ及びＡＢＡブロックポリマー（スチレン／ブタジエン及びスチレン／水素化ブタジエン（エチレンプロピレン）を含む）、Ｐｅｂａｘタイプのε−カプロラクタム／酸化エチレン、ならびにＳｙｍｐａｔｅｘタイプのポリエステル／酸化エチレン及び酸化エチレンとイソシアン酸塩のポリウレタンである。
【０２１５】
付加ポリマー（ポリフッ化ビニリデン、シンジオタクチックポリスチレン、フッ化ビニリデンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリビニルアルコール、酢酸ポリビニル、ポリ（アクリロニトリル）ならびにアクリル酸及びメタクリル酸塩とのそのコポリマー、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）及びその様々なコポリマー、ポリ（メタクリル酸メチル）及びその様々なコポリマーのような非結晶性付加ポリマーなど）は、低い圧力及び温度で溶解可能なので、比較的容易に溶液紡糸できる。ポリエチレン及びポリプロピレンのような高結晶性ポリマーは概して、溶液紡糸しなければならない場合には、高い温度及び高い圧力が必要となる。
【０２１６】
ナノファイバーは、ポリマー添加混合物、アロイ形態、または架橋された化学結合構造中に２つ以上のポリマー材を含むポリマー組成物からも形成できる。２つの関連するポリマー材をブレンドして、有益な特性を有するナノファイバーをもたらすことができる。例えば、高分子量ポリ塩化ビニルを低分子量ポリ塩化ビニルとブレンドできる。同様に、高分子量ナイロン材を低分子量ナイロン材とブレンドできる。さらに、一般的な種類のポリマーのうちの異なる種をブレンドできる。例えば、高分子量スチレン材を低分子量のハイインパクトポリスチレンとブレンドできる。ナイロン−６という材料は、ナイロン−６；６，６；６，１０コポリマーのようなナイロンコポリマーとブレンドできる。さらに、８７％加水分解されたポリビニルアルコールのように、加水分解度の低いポリビニルアルコールは、完全加水分解ポリビニルアルコールまたは加水分解度が９８〜９９．９％以上の超加水分解ポリビニルアルコールとブレンドできる。添加混合物中のこれらの材料のいずれも、適切な架橋機構を用いて架橋できる。ナイロンは、アミド結合における窒素原子と反応性のある架橋剤を用いて架橋できる。ポリビニルアルコール材は、モノアルデヒド（ホルムアルデヒドなど）、尿素、メラミンホルムアルデヒド樹脂及びその類似体、ホウ酸及びその他の無機化合物、ジアルデヒド、二酸、ウレタン、エポキシ、ならびにその他の既知の架橋剤のようなヒドロキシル反応材を用いて架橋できる。架橋試薬は、反応して、ポリマー鎖間に共有結合を形成して、分子量、耐薬品性、全体的強度、及び機械的劣化に対する耐性を実質的に向上させる。
【０２１７】
本発明のナノ構造体を調製する際には、生分解性ポリマーも使用できる。生分解性材料として研究されてきた種類の合成ポリマーの例としては、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリイミノカーボネート、脂肪族カーボネート、ポリホスファゼン、ポリアンハイドライド及びこれらのコポリマーが挙げられる。例えば移植可能な医療用具の関連で使用できる生分解性材料の具体例としては、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリジオキサノン、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−ポリジオキサノン）、ポリアンハイドライド、ポリ（グリコリド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）及びポリ（グリコリド−ｃｏ−カプロラクトン）が挙げられる。これらのポリマーと他の生分解性ポリマーのブレンドも使用できる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本発明のナノファイバーは、非生分解性ポリマーである。非生分解性とは、概して、非酵素的分解、加水分解的分解または酵素的分解ができないポリマーを指す。例えば、非生分解性ポリマーは、プロテアーゼによって引き起こすことのできる分解に対する耐性を有する。非生分解性ポリマーには、天然ポリマーまたは合成ポリマーのいずれも含めてよい。
【０２１９】
本発明のナノファイバーを形成する組成物内に架橋剤を含めると、そのナノファイバーが、広範な支持表面と適合可能になる。その架橋剤は、単独で用いることも、所望の表面特性をもたらすための他の材料と組み合わせることもできる。
【０２２０】
好適な架橋剤としては、放射線、電気エネルギーまたは熱エネルギーなどのエネルギー源に暴露されると、他の材料と共有結合を形成できる潜在反応性の活性化可能基を少なくとも２つ有するモノマー材（小分子物質）またはポリマー材のいずれかが挙げられる。概して、潜在反応性の活性化可能基は、印加された所定の外部エネルギーまたは刺激に応答して活性種を生成させて、その結果、隣接する化学構造への共有結合を形成させる化学的部分である。潜在反応性基は、保存条件下では、その共有結合を維持するが、外部エネルギー源により活性化すると、他の分子と共有結合を形成する基である。いくつかの実施形態では、潜在反応性基は、フリーラジカルのような活性種を形成する。これらのフリーラジカルとしては、ナイトレン、カルベン、または外部から印加した電気エネルギー、電気化学エネルギーもしくは熱エネルギーを吸収して励起状態となったケトンを挙げてよい。既知または市販の潜在反応性基の様々な例は、米国特許第４，９７３，４９３号、同第５，２５８，０４１号、同第５，５６３，０５６号、同第５，６３７，４６０号または同第６，２７８，０１８号に報告されている。
【０２２１】
例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｐｒｏｄｕｉｔｓ  Ｃｈｉｍｉｑｕｅｓ  Ａｕｘｉｌｉａｉｒｅｓ  ｅｔ  ｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ（Ｌｏｎｇｊｕｍｅａｕ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｓｈｉｎ−Ｎａｋａｍａｒａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｍｉｄｏｒｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．またはＰａｎｃｈｉｍ  Ｓ．Ａ．（Ｆｒａｎｃｅ）のいずれかから入手可能な、トリクロロメチルトリアジンベースの市販の多官能性光架橋剤を使用できる。その８個の化合物には、２，４，６−トリス（トリクロロメチル）−１，３，５トリアジン、２−（メチル）−４，６−ビス（トリクロロメチル）−１，３，５−トリアジン、２−（４−メトキシナフチル）−４，６−ビス（トリクロロメチル）−１，３，５−トリアジン、２−（４−エトキシナフチル）−４，６−ビス（トリクロロメチル）−１，３，５−トリアジン、４−（４−カルボキシルフェニル）−２，６−ビス（トリクロロメチル）−１，３，５−トリアジン、２−（４−メトキシフェニル）−４，６−ビス（トリクロロメチル）−１，３，５−トリアジン、２−（１−エテン−２−２’−フリル）−４，６−ビス（トリクロロメチル）−１，３，５−トリアジン及び２−（４−メトキシスチリル）−４，６−ビス（トリクロロメチル）−１，３，５−トリアジンが含まれる。
【０２２２】
使用方法及び例示的な実施形態
本発明で開示するゲル／ハイドロゲル／ナノ構造体組成物は有益なことに、組織修復の多くの状況、ならびにカテーテル、他の手術具、及びインプラントにコーティングを施す用途のような他の用途で使用できる。本発明のゲル／ハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、本明細書に記載されている活性剤（抗生剤、成長因子及び免疫抑制剤など）を送達するのにも用いることができる。
【０２２３】
特定の実施形態では、本発明は、軟組織欠損部の治癒方法であって、複合材を軟組織欠損部に適用することを含み、その複合材が、ゲルとそのゲル内に配置されたナノ構造体を含む方法を提供する。
【０２２４】
本明細書に記載されているハイドロゲル／ナノ構造体組成物の有益な特性には、１）容易な特徴付け及び品質制御を行える能力、２）既存の組織マトリックスと一体化する能力、３）新たに形成されるマトリックスに直接組み込まれる能力、４）細胞及び生理活性因子を直接含む能力、５）生体適合性を保持する能力、６）生体吸収性を制御する能力、７）そのナノ構造に起因する、構造的剛性の向上により、複雑な解剖学的形状に容易に成型できる能力、ならびに８）関節軟骨のような天然組織の機械的特性を呈する能力が含まれることは明らかであろう。
【０２２５】
用途の１つでは、本発明のハイドロゲル／ナノ構造体複合体組成物を用いて、軟骨組織を修復できる。軟骨修復のための、生物学に基づく現行の外科手術としては、自己軟骨細胞の移植、ドリリング、剥離軟骨形成術、マイクロフラクチャー法及びモザイク関節形成術が挙げられる。これらの手順はいずれも、限局性の関節軟骨損傷を治療するに過ぎず、重度の変形性関節症及び関節リウマチで見られるような、軟骨の露出した関節表面は治療しない。また、これらの手順は、軟骨組織プラグ、または患者から採取した増殖軟骨細胞のいずれかを用いて、軟骨欠損部を埋める。これらの組織または軟骨細胞は、既存の軟骨マトリックスと一体化したとともに、正常な軟骨の生物機械的特性を有する完全なｄｅ  ｎｏｖｏ物質（新たに合成される硝子軟骨など）を合成することによって、欠損を埋めると予想される。しかしながら、このような手順はいずれも、真の硝子軟骨ではなく、修復組織（線維軟骨）の形成を促進し、線維軟骨にさらなる機械的損傷を引き起こす（その機械的損傷は、その関節を変形性関節症に罹患しやすくすると考えられる）。さらに、修復材としての内因性軟骨の利用可能度は、かなり限られている。その軟骨を得ることにより、患者は、その取得によるリスクと病的状態を負うからである。上記の考察から明らかなように、本明細書に開示されている、得られたハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、軟骨変性疾患に罹患した患者において、新たな療法を期待させる実用的な材料をもたらす。
【０２２６】
本明細書に記載されているように、本発明のハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、いずれかの数の合成組織の移植または増大術、及びその他の臨床的用途に適する多種多様な特性を有するように調製できる。すでに述べたように、本発明の材料を用いて、傷害または疾患のいずれかが原因で発生した軟骨欠損部を修復できる。本発明の材料を用いて修復できる、傷害による欠損は、スポーツまたは事故に関連する欠損であることができ、表面の軟骨層のみに影響を及ぼすものであってもよく、または下層の軟骨下骨を含んでもよい。本明細書に記載されている組成物を用いて修復できる、疾患による欠損としては、変形性関節症及び関節リウマチに起因する欠損が挙げられる。傷害によるか疾患によるかにかかわらず、このような欠損は、成熟軟骨または成長板軟骨のいずれの欠損であってもよい。合成成長板軟骨用のハイドロゲルの製剤では、成長時に生体材料の生体吸収性を制御できるように、非置換の足場材を含めなければならない場合がある。
【０２２７】
本明細書に記載されているハイドロゲル／ナノ構造体組成物が有用であり得る別の分野は、頭頸部の軟骨組織及び軟組織の修復、再建または増大術である。軟組織増大術及び頭頸部再建術用の生体材料の利用可能度は、形成外科手術及び再建手術の分野において、依然として根本的な課題となっている。適切な生物学的適合性及び耐用期間を有する材料の開発のために、多大な研究及び投資が行われてきた。この研究の結果は、芳しくない。免疫応答性のある動物に留置したところ、現在提案されている材料の構造的一体性が得られなかったことが示されている。フレームワークが吸収されるためである。さらに、従来の合成材は、耐用期間の面で優れているが、一定の避けられない欠点がある。例えば、シリコーンには、安全性の懸念及び長期的な免疫関連作用が付きまとっている。合成ポリマーＰＴＦＥ（ゴアテックス）及びシラスティックでは、組織反応性は低いが、組織との一体化は見られず、異物感染症及び突出の長期的なリスクが発生し得る。本願に記載されている材料は、頭頸部の軟組織欠損の増大術または修復向けの合成軟組織足場材を調製するのに有用となる。特に、本発明のハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、炎症を起こさず、非免疫原性であり、適切な粘弾度を有するように調製でき（本明細書の説明を参照されたい）、有効な移植可能足場材として使用し得る。
【０２２８】
加えて、本発明のハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、例えば、外傷または先天性異常に続発する軟骨欠損または骨欠損を修復するために、頭頸部の再建手順で頻繁に使われる軟骨インプラントを調製するための新規な生体適合性かつ生体順応性材料として使用できる。耳に特有の用途としては、耳形成術及び耳介再建術が挙げられ、これらは、外傷、新生物（すなわち、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌及びメラノーマ）、ならびに小耳症のような先天性欠損による、軟骨の欠損を修復する目的で行う場合が多い。鼻に特有の用途としては、鼻及び鼻中隔の美容手順及び再建手順が挙げられる。鼻整形術では、鼻背部隆鼻術、チップグラフト、シールドグラフト及びスプレッダーグラフトを用いる場合が多い。外傷、新生物、ウェゲナー肉芽腫症のような自己免疫疾患、または先天性欠損を受けて行う鼻再建術には、修復のために軟骨が必要となる。鼻中隔せん孔は、管理が難しく、処置がうまくいかないことが多い。軟骨移植は、これらの用途では理想的である。自己軟骨またはドナー軟骨が利用できない場合が多いからである。咽喉に特有の用途としては、喉頭気管の再建が挙げられ、この再建では、小児においては通常、肋軟骨の摘出が必要となり、病的状態が生じないわけではない。耳介軟骨及び鼻中隔軟骨は、この用途には不充分である場合が多い。本発明で開示するハイドロゲルから調製した合成軟骨性材料は、試薬濃度、置換比率及び架橋比率のような、ハイドロゲルの合成パラメーターの調整に基づき、上記の各用途に適合するように合成できる。喉頭気管の再建は通常、声門下または気管の狭窄による気道狭窄に対して行う。その病因は、外傷性のもの（すなわち、挿管による外傷もしくは気管切開）、または特発性のものであり得る。他の可能性としては、頭蓋顔面での多くの用途に加えて、顎及び頬の増大術、ならびに下眼瞼外反の修復術での使用が挙げられる。これらの用途では、関節軟骨の厳密な機械的特性を有する軟骨が必要になるとは限らないことに留意されたい。細胞集団または生理活性剤を含めるのが望ましいこともある。
【０２２９】
本明細書に記載されているハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、通常、侵襲性が非常に高い外科的切除の後に、鼻道に流体が慢性的に貯留して、それにより、感染及び痂皮形成が起こるのを防ぐために、鼻腔の修復及び縮小を行うのにも使用できる。別の有望な用途は、小児及び成人の両方で、例えば、心血管手術のような外科手術の際の挿管を原因とする、喉頭気管の傷害により、喉頭気管を再建する際の用途である。本明細書に記載されているようなハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、がんのために頸部を切除した後に、頸動脈を保護するための輪状軟骨代替物を供給するのにも使用でき、本発明の組成物は、皮膚バリアの喪失に対する頸動脈保護バリアとして、頸動脈と皮膚の間に配置できる。本発明のハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、切除された神経のニューロンが再増殖している際の保護膜として使用できる。多くの場合、ニューロンの再増殖よりも速く、線維組織が形成され、最終的なニューロンの形成を妨げるからである。本発明のハイドロゲル／ナノ構造体組成物を事前にチューブに成型したものの中に、神経終末を配置すると、再増殖部位から線維組織が形成されないようにできる。
【０２３０】
本発明のハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、いずれの内臓または非内臓器官の軟組織欠損部の修復にも使用できる。例えば、本発明の材料は、頭蓋顔面での多くの用途に加えて、顎及び頬の増大術で使用できるとともに、下眼瞼外反の修復術に使用できる。本発明のハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、頭頸部以外の部位での美容目的及び再建目的で、例えば、乳房増大術用の乳房インプラントとしての用途、例えば、乳房または頸部のリンパ節の除去（すなわち、がんによる除去）の後に残った空隙を充填するため、リンパ管を封止したり、流体が切除部位内に無制御に排出される（この排出により、感染及び合併症が起きることがある）のを軽減したりするための創傷密封材としての用途で使用できる。
【０２３１】
上記の使用法に加えて、本明細書に記載されているハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、人工軟骨の合成に関して上記したようなものと同様の方策及び手法を用いて、整形外科用の合成組織（骨、腱、靭帯、半月板及び椎間板が挙げられるが、これらに限らない）を作製するための他のティッシュエンジニアリング用途で使用できる。本発明のハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、人工軟骨の合成に関して上記したようなものと同様の方策及び手法を用いて、整形外科用以外の合成組織（声帯、硝子体、心臓弁、肝臓、膵臓及び腎臓が挙げられるが、これらに限らない）を作製するのにも使用できる。
【０２３２】
本発明で開示するハイドロゲル／ナノ構造体組成物を使用できる別の分野は、腹部または胃腸の器官における瘢痕組織または狭窄の形成を治療または予防する必要がある胃腸用途の分野である。様々な臨床段階及びＦＤＡ認可段階にある製品であって、瘢痕化及び／または狭窄形成の治療及び予防に有用であるように設計または意図されている「ハイドロゲル」と概ね称されている製品は、すでに多く存在する。本発明で開示するハイドロゲルが、ハイドロゲル材に支持力、形状及び強度をもたらすことができるナノ構造体を含むことができる点で、本発明の材料は、他の既知のハイドロゲルよりも優れている。本発明で開示するハイドロゲル／ナノ構造体組成物は、すでに既知のハイドロゲルが使用されているか、または使用されるように意図されている用途（胃腸管の狭窄または瘢痕化の治療が挙げられる）と同様の用途で使用できる。その治療は、瘢痕化を予防するために、狭窄が予測される部位に、または、狭窄した胃腸管を広げるための療法を行った後に、狭窄の再発を予防するために、既存の狭窄部位に、そのハイドロゲル材を注射することを伴う。
【０２３３】
本発明の材料は、食道狭窄の治療にも使用できる。食道狭窄は、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）の一般的な合併症である。ＧＥＲＤは、食道に逆流して、食道の粘膜細胞を傷つける酸、胆汁及びその他の有害な胃内容物を原因とする。ＧＥＲＤ患者の約７〜２３％が、食道狭窄または食道の線維性瘢痕化を発現する。食道の瘢痕化は、バレット食道の治療に用いたアブレーション療法も原因とし得る。このようなアブレーション療法の主な合併症は、焼灼による損傷が、食道壁の奥深くにまで及び、それにより、食道の瘢痕または狭窄が起きることである。食道狭窄は、正常な嚥下を妨げ、患者の病的状態の主な原因となる。本明細書に記載されている材料は、ＧＥＲＤ、バレット食道及び食道アブレーション療法に起因する食道狭窄の治療または予防に使用し得る。
【０２３４】
本発明の複合材は、クローン病の治療にも使用し得る。クローン病は、腸の管腔を塞いだり、狭くしたりする狭窄または瘢痕を発生させて、腸の正常な機能を妨げる。本発明の材料は、このような狭窄の治療または予防に有用な場合もある。
【０２３５】
本発明の複合材は、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）の治療方法にも使用できる。ＰＳＣは、肝臓の胆管の希少疾患である。胆管は、肝臓内で枝分かれした樹状構造を形成し、２本の主枝によって肝臓から出て、それらの主枝が、肝臓及び胆嚢の胆汁を十二指腸に排出させる総胆管に合流する。胆管は、直径が非常に小さく、その測定値は、通常、最も大きい最遠位部でも２ｍｍ以下に過ぎず、しかも、通常、毎日数リットルの胆汁を肝臓から十二指腸に排出しなければならない。これらの胆管のいずれの閉塞によっても、大量の毒素、特にヘモグロビン分解産物を体内に蓄積させる黄疸として知られる重篤な状態に至ることがある。ＰＳＣは、肝臓内の胆管、及び肝臓を小腸につなぐ上記の肝外胆管が瘢痕化または狭窄する疾患である。ＰＳＣの胆管狭窄は、本発明のハイドロゲル／ナノ構造体組成物で治療または予防し得る。
【０２３６】
本発明の複合材は、慢性膵炎の治療にも使用できる。慢性膵炎は、膵管の瘢痕または狭窄によって合併し得る、膵臓の慢性炎症性疾患である。これらの狭窄は、通常は、膵臓から、膵管または排管のシステムを介して小腸に排出されなければならない膵液の排出を遮断する。膵液は、正常な消化及び栄養の吸収にとって重要な多くの消化酵素及びその他の要素を含む。慢性膵炎による膵管の閉塞または狭窄によって、膵臓が自己消化を起こし、命にかかわる腹部感染及びまたは膿瘍を発生させる重大な合併症が発生し得る。慢性膵炎の膵臓狭窄は、本発明のハイドロゲルで治療または予防し得る。
【０２３７】
本明細書に記載されている組成物は、胆石によって誘発される胆管狭窄及び膵管狭窄の治療にも使用し得る。胆石は、よく見られる障害であり、その主要な合併症は、胆管狭窄及び膵管狭窄の形成であり、それらは、本発明のハイドロゲルで治療または予防し得る。本発明のハイドロゲルは、虚血性腸疾患の治療に使用できる。腸は、血液の供給が低下すると、瘢痕または狭窄を形成する傾向がある。血流の低下は、虚血といい、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、低血圧、循環血液量の減少、腎疾患または肝疾患によって誘発される低アルブミン血症、血管炎、薬害疾患などを含む多くの病変を原因とし得る。これらのすべての病因の末期の症状により、腸を塞いで、その正常な機能を妨げる腸狭窄が発生し得る。本発明のハイドロゲル／ナノ構造体複合体は、虚血性腸狭窄の治療または予防に使用し得る。
【０２３８】
本発明の組成物は、放射線によって誘発される腸狭窄の治療にも使用し得る。がんに対する放射線療法は、多くの病的状態を伴い、その中でも重要なのは、腸狭窄の形成である。本発明のハイドロゲル複合体は、放射線によって誘発される腸狭窄の治療または予防にも使用し得る。
【０２３９】
本発明で開示するハイドロゲル／ナノ構造体複合体は、合成組織の作製または天然の組織の修復に加えて、手術または別段のｉｎ  ｖｉｖｏ移植で使用する非生物学的な構造体または用具（手術器具、またはセラミックもしくは金属製の義足など）にコーティングを施すのにも使用できる。このようなコーティングは、その非生物学的な用具の材料と生体組織の間にバリアをもたらすことになる。非生物学的な用具に対するバリアとしてのハイドロゲルの役割としては、１）非生物学的な用具の表面上での巨大分子及び／または細胞の吸収を予防すること（吸収により、用具表面において、タンパク質のファウリングまたは血栓症が発生し得る）、２）別段の非生体適合性材料から作られた用具に、無毒で、炎症を起こさず、非免疫原性な生体適合性表面をもたらすこと、３）グルコースセンサーにおけるグルコースの拡散、圧力センサーにおける機械的力の伝達、または血管グラフトもしくはステントの内皮化のような、用具の機能と適合すること、４）ＭＥＭＳベースの人工ネフロンにおいて、既存のサイズバリアにチャージバリアをもたらすなど、用具の機能を増強すること、５）水性の生理学的に適合可能な環境内に封入した生細胞集団を非生物学的な用具に導入すること、ならびに６）薬物または生理活性因子（成長因子、抗ウイルス剤、抗生剤、または血管新生、その用具の上皮化もしくは内皮化を促すように設計された接着分子など）を含めることが挙げられるが、これらに限らない。
【０２４０】
上記に基づき、本発明のハイドロゲル／ナノ構造体複合体は、糖尿病の管理のための移植可能なグルコースセンサーを含む様々な移植可能な用具に、アレルギーを起こさないコーティングを施すのに使用し得る。加えて、本発明のハイドロゲル／ナノ構造体複合体は、ＭＥＭＳベースの人工ネフロンの開発のためのチャージバリア、封入された腎細胞（有足突起など）をＭＥＭＳベースの人工ネフロンのデザインに導入できる水性の生理学的に適合可能な環境、ならびに様々な目的で設計された移植可能なＭＥＭＳ用具（薬物送達システム、機械的感知システム及び生物検出システムが挙げられるが、これらに限らない）をもたらすのに使用し得る。
【０２４１】
開示されているハイドロゲル／ナノ構造体複合体、特に、ヒアルロナンベースのハイドロゲルは、例えば、チラミンの第１級アミンをそのシリコン表面にまず共有結合させることを通じて、シリコンベースの用具に共有結合させて、ヒドロキシフェニル被覆表面の化学物質をもたらすこともできる。この際には、遊離アミンで修飾したＤＮＡをシリコン表面に結合するのに使用する化学反応と同じ化学反応を使用し得る。そして、ＨＡベースのハイドロゲルは、上記のその好ましい架橋様式で用いられる化学反応であって、ペルオキシダーゼによって促される化学反応と同じ化学反応によって、そのヒドロキシフェニル被覆表面に共有結合する。
【０２４２】
本発明のハイドロゲル／ナノ構造体複合体は、カテーテル、ステント及び血管グラフトのような非生物学的な心血管用具をコーティングするのにも使用できる。これらの用具には、従来は、生体不適合性のために用いられなかったが、現在使用されている上記の用具よりも、設計面で優れた特徴を持つ材料から作られた用具も含まれることになる。生理活性因子を本発明のハイドロゲルに導入して、そのハイドロゲルの内皮化または上皮化、すなわち埋め込んだ用具の内皮化または上皮化を促すことができる。
【０２４３】
本発明のハイドロゲル／ナノ構造体複合体の具体的な例及び使用法について本明細書で説明してきたが、そのような具体的な使用法は、限定するようには意図されていない。本発明のハイドロゲル／ナノ構造体複合体は、概して既知のハイドロゲルにおいて用いられているいずれの用途にも用いることができ、特に、体のあらゆる場所の軟組織の修復及び／または再生に有用である。
【実施例】
【０２４４】
実施例１．炎症プロファイルが軽減されたｉｎ  ｓｉｔｕ形成複合体
５ｍｇ／ｍＬのチオール化ＨＡ（ＨＡ−ＳＨ）、１０ｍｇ／ｍＬのポリカプロラクトン（ＰＣＬ）繊維、チオール濃度が、アクリレートとマレイミドを合わせた濃度と一致して１：１になるように設定した濃度のＰＥＧＤＡ（５ｍｇ／ｍＬ）を含むｉｎ  ｓｉｔｕ形成複合体を開発した。手術前に、ゲル化を開始させるために、これらの成分を一緒に混合して、約３０分反応させ、そのゲル化の大半をｉｎ  ｓｉｔｕで完了させた。
【０２４５】
チオール化ＨＡを用いた化学調製物では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ならびに動物（皮下（ｓ．ｃ．）注射による齧歯動物及びウサギ）において、ゲル化がうまく行われた一方で、皮下ウサギモデルで注射したところ、短期間、中程度の炎症が生じた。炎症が軽減された複合体製剤を作製するために、ＨＡとＰＥＧの間の反応性基を逆にし、繊維−マレイミド成分を含む上述の調合はそのままにした。
【０２４６】
図１Ａに示されているように、上向きの矢印は、ＨＡ−ＳＨ及びＰＥＧＤＡを含むゲルの注射部位を示し、下向きの矢印は、ＨＡ−Ａｃ及びＰＥＧＳＨを含む代替的な組成物の注射部位を含む。
【０２４７】
これらの化学物質をブタモデルで再度試験したところ、同様の炎症プロファイルが観察された。ゲル及び複合体をブタの内ももに、注射１回当たり４００μＬの体積で皮下注射した。その後４８時間にわたり、その組織を画像化してから、摘出した。いずれの群の皮膚炎症も、肉眼では軽度に見えた（図１Ｂ）。
【０２４８】
しかしながら、組織学的解析（マッソントリクローム染色）では、チオール化ＨＡ群において、注射部位の外縁での単球の活性化（赤色）によって可視化されているように、宿主組織と注射部位の境界が明瞭な状態で、注射部位がカプセル化していることから、強い急性（４８時間）免疫応答が見られた（図１Ｃ）。ＨＡアクリレート（ＨＡ−Ａｃ）群の方が、市販のＨＡであるネガティブコントロール群に近く、宿主とインプラントの界面において、カプセル化があまり見られなかった。
【０２４９】
その新規製剤では、５ｍｇ／ｍＬのＨＡ−Ａｃ及び６ｍｇ／ｍＬのＰＥＧＳＨ（ＰＥＧチオール、ＭＷ１０ｋの４−アーム型ＰＥＧＳＨ。アクリレート＋マレイミドに対して２倍量のチオールを含む（この比率により、最大の機械的強度が得られるからである））を使用した。ＨＡ−Ａｃは、分子量が７３１ｋＤａであり、アクリル化度が１０〜１２．５％であった。加えて、２００ｋのＨＡ−Ａｃも試したが、得られたゲルは、上記のものよりもかなり脆弱であった。
【０２５０】
ウサギにおける炎症プロファイルをさらに軽減するために、チオールとアクリレート＋マレイミドの化学量論組成が１：１の状態で、２−アーム型ＰＥＧＳＨ架橋剤を使用した。所望の貯蔵弾性率を得るために、７ｍｇ／ｍＬという少し高い初期濃度のＨＡ−Ａｃを使用した。繊維成分は、８〜１０ｍｇ／ｍＬに保ち、化学量論組成が１：１となるように２−アーム型ＰＥＧＳＨを設定した（５ｋのＰＥＧＳＨでは、６．９ｍｇ／ｍＬとなった）。分子量３．４ｋＤａ及び８ｋＤａのＰＥＧＳＨ試料も試験したが、これらの試料の方が、同じ化学量論組成において脆弱なゲルであったので、ＭＷ５ｋＤａをｉｎ  ｓｉｔｕゲル化製剤として選択した。
【０２５１】
核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて、この製剤の２つの変種（５．５ｍｇ／ｍＬのＨＡ−Ａｃベースの柔性製剤、及び７．５ｍｇ／ｍＬベースの剛性製剤、図１Ｄ、表２）を評価した。図で見られるように、コントロールである市販のＪｕｖｅｄｅｒｍ（登録商標）と比べて、施術後の腫脹は、あまり観察されなかった。試験したこれらの２つの複合体は、対象とする剛性レジメ（表１）の両端で調合した。これらの製剤は、剛性が、試験した２種類のＪｕｖｅｄｅｒｍ（登録商標）、すなわち、Ｕｌｔｒａ  ＸＣ（登録商標）及びＶｏｌｕｍａ（登録商標）と同程度であったことから、本発明で開示する複合体の調整性が示された。
表２：開示されているラット試験で試験した２つの複合体の配合の詳細
【表２】
2021522938.tif 000004
【０２５２】
図１Ｅに示されているように、本発明の複合体における体積保持についても、市販のコントロール材と比べて、ＭＲＩによる定量によって評価したところ、本発明の複合体での炎症は、市販のコントロールと比べて軽減されたことが示された。
【０２５３】
実施例２．新規組成物を含む複合体ビーズであって、事前に反応させた複合体ビーズ
保存安定性を向上させ、エンドユーザーにとって、より簡潔で一貫性の向上したゲルを作製するために、事前に反応させたビーズ状製剤を含むゲルを形成したが、その製剤（ＨＡ−Ａｃを７ｍｇ／ｍＬ、マレイミドを含む繊維を８〜１０ｍｇ／ｍＬ、及びＰＥＧＳＨを６．９ｍ／ｍＬ）は、塊状において、３７℃で完全に反応させたものである。製造時にゲルを事前に反応させることによって、不安定な官能基を保護する必要がなく、エンドユーザーがよく混合して硬化させる必要性が排除された。
【０２５４】
その塊状のゲルを１５０μｍまたは２５０μｍのビーズに形成してから、（乾燥プロセス中にミクロ構造を保護するとともに、製品の貯蔵寿命を長くする目的で、）スクロース、トレハロース及び塩化ナトリウムの等張溶液で凍結乾燥した。そして、そのゲルビーズは、水で再構成され、すぐに注射できる状態になり、その貯蔵弾性率は、凍結乾燥前と同じである。そのビーズ状複合体の光学顕微鏡画像は、図２に示されている。図２Ａには、直径２５０μｍのビーズに微粒化した後の複合体が示されており、図２Ｂには、さらに凍結乾燥及び再水和した後の複合体が示されており、その複合体が、元の外観を保持していることが示されている。図２Ｃは、ビーズ状製剤ＬＳのナノファイバー成分及びハイドロゲル成分を示す１０倍画像であり、図２Ｄは、非希釈状態であるそのビーズ状製剤の光学顕微鏡画像である。
【０２５５】
図２に示されているビーズは、ビーズを可視化できるように１００倍希釈されていることに留意されたい。非希釈状態では、得られたゲルは、肉眼では、ビーズ化前の状態（個々のビーズを識別できない）と同じように見える（図２Ｄ）。これを明確化することは、提案している作用機序にとって重要である。宿主由来の浸潤細胞は、天然型細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と同様の形で、複合材と相互作用する。そして、凍結乾燥ビーズは、すぐに再水和でき、長い作用時間とともに、エンドユーザーにとって一貫したゲル特性を有することができる。ビーズ寸法、凍結乾燥プロセス及び凍結乾燥の配合を評価して、細かくしてビーズ状にし、凍結乾燥してから、再水和した後に、最初の特性との一貫性を最も保持するようにした。凍結乾燥の配合は、重要な変動要素であった。ＰＢＳで乾燥した製剤の方が、貯蔵弾性率の変化がかなり大きかったことから、ミクロ構造レベルでの変化が示唆されたからである。一次乾燥期では、ビーズを個々の粒子として保つために、棚温を−３０℃以下に維持する必要があった。それよりも高い凍結乾燥温度では、シリンジに吸引できない固体プラグ材が生成された。ビーズ化及び凍結乾燥が、上記の複合体の貯蔵弾性率に影響を及ぼさないことは、図２Ｅに示されている。
【０２５６】
実施例３．異なる寸法の複合体ビーズのレオロジー特性の測定
メッシュ寸法１ｍｍ、２５０μｍ、１５０μｍ及び９０μｍのスクリーンを用いて、異なる寸法のビーズを調製した。それらの粒子の注入性（形成外科医からの評価）及びレオロジー特性について評価した。１０００μｍのビーズは、直径が、２５ゲージの針の孔径よりもかなり大きいため、注射不能であった一方で、９０μｍのビーズは、ビーズ化プロセスで大きく損傷したので、両方の寸法とも、それ以降の試験からは除外した。２５０μｍ及び１５０μｍのいずれのビーズ群も、２７ゲージの針でスムーズに注射が行われた。これらのビーズ寸法は、妥当な針寸法（２５ゲージ＝２５０μｍ、２７ゲージ＝２１０μｍ及び３０ゲージ針＝１６０μｍ）の内径と同程度である。２５０μｍ及び１５０μｍのビーズのレオロジー特性は、図３に示されている。固体プラグ材をビーズに形成すると、貯蔵弾性率が多少低下するが、得られるビーズは、本発明者が目標とする剛性の範囲内であり、最初の配合を変更することによって、剛性または柔性を高くすることができる。２５０μｍ及び１５０μｍのビーズでは、同程度のレオロジー特性が見られ、いずれも、さらなる試験用に適するものであった。
【０２５７】
実施例４．ウサギモデルでの皮下注射による皮内反応性
次に、ウサギ皮下注射モデルにおいて、本発明のビーズ状製剤とＪｕｖｅｄｅｒｍ  Ｖｏｌｕｍａ（登録商標）を１：１で試験した。組織診断の後、組織スライドの盲検評価を行った［ＣＲＯから方法を取り入れる必要があった］。表２には、切り出した試料を３つの異なるカテゴリー（炎症、浮腫及び線維化）について評価するのに用いた評価尺度が示されている。この試験は、皮内反応性を判定するためのＩＳＯ１０９９３試験パッケージで必要とされる試験形態と同様の試験形態である。表３に示されているように、本発明で開示するビーズ状製剤では、Ｊｕｖｅｄｅｒｍ  Ｖｏｌｕｍａと比べて、炎症、浮腫及び線維化に及ぼす全体的な作用が小さかった。
表２：（Ｍａｓｓ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）によって用いられている半定量的評価における評価尺度
【表２】
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表３：ビーズ状製剤ＬＳ及びＪｕｖｅｄｅｒｍ  Ｖｏｌｕｍａの皮内反応性の半定量的評価
【表３】
2021522938.tif 000006
【０２５８】
実施例５．ビーズ状複合体ＬＳ−１の特徴付け
最初のビーズ状製剤ＬＳ−１（７ｍｇ／ｍＬのＨＡ−Ａｃ、７．１ｍｇ／ｍＬのＰＥＧＳＨ、１０ｍｇ／ｍＬの繊維）のＭＲＩの結果は、実施例１に記載されているｉｎ  ｓｉｔｕゲル化製剤と同程度であり、ラットモデルにおいて持続性が不充分であった（図４Ａ）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ビーズ状製剤ＬＳ−１の持続性を高めるために、ＨＡ−Ａｃ成分及び繊維成分の濃度を上昇させ、ＨＡ−Ａｃの分子量を大きくして、最適な生体適合性プロファイルを維持しつつ、持続性を改善した。これらの変更は、以前の塊状のゲル製剤ではなく、予め形成したナノファイバー−ＨＡハイドロゲル複合体粒子でのみ行える点に留意されたい。ＨＡのＭＷを大きくすることの作用を試験するために、平均ＭＷが７３１ｋＤａのＨＡを用いた複合体を作製した。持続性を高める試みでは、分子量の大きいＨＡを用いた複合体は、元々の複合体に用いたものと同じＧＭＰ供給源から使用した。図４Ｂに示されているように、ＭＷの大きい複合体ゲル（１．５５ＭＤａ及び２．６７ＭＤａ）は、分子量の小さい最初のプロトタイプ（７３１ｋＤａ）と比べて、貯蔵弾性率が多少高いが、臨床的に有意義なゲージ針を通じて完全に注射可能な状態を保持する。ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＲＩ試験により、ＭＷの大きい方の複合体の持続性の向上が示された。
【０２５９】
ｉｎ  ｓｉｔｕ形成複合体製剤を最適化したとき、塊状のハイドロゲル複合体を３１Ｇの針で注射しやくするために、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）繊維の充填量を１％未満（膨潤複合体のｗ／ｖ）に維持した。予め形成した複合体粒子を最適化するときには、注入性は、あまり問題にならない。したがって、ＨＡハイドロゲルに対するＰＣＬ繊維の比率を高くした場合のＰＣＬナノファイバーの強化作用を調べる。また、繊維充填量を増やすと、細胞のマトリックス透過性移動も増大し、その浸潤細胞に由来するコラーゲンの沈着が増加し得る。さらに、ＰＣＬ繊維成分は、加水分解または酵素による分解プロセスに対する耐性が最も高い。
【０２６０】
ＨＡ濃度がせん断貯蔵弾性率に及ぼす作用を試験するために、さらに高い濃度のＨＡを（さらに高い濃度のＰＥＧ架橋剤とともに）使用して、架橋密度及び剛性を向上させて、耐久性を延ばすようにした。この方法は、ＰＥＧ架橋剤を用いる最初のものである。架橋密度は、細胞の浸潤が可能になるように最適化する必要がある。剛性を最適化した場合、微粉化した複合体粒子間の空間によっても、細胞の浸潤及び移動が促される。図４Ｃには、同じＨＡ  ＭＷ及び繊維充填条件で調製した複合体のせん断貯蔵弾性率にＨＡ濃度（ｍｇ／ｍｌ）が及ぼす作用が示されている。図４Ｄには、同じＨＡ  ＭＷ及び繊維充填条件で調製した複合体の圧縮貯蔵弾性率にＨＡ濃度（ｍｇ／ｍｌ）が及ぼす作用が示されている。
【０２６１】
架橋密度及び剛性の異なる複合体粒子を組み合わせるために、予め形成した複合体粒子であって、高い架橋密度（剛性）及び低い架橋密度を有する粒子を混合し、両方の種類の粒子の利点（高い剛性、遅い分解速度、長い持続期間に対して、高い多孔質性、優れた細胞浸潤性及び血管新生性）を組みわせる。これらの２つの種類の複合体粒子の比率は、もう１つの調整可能な新規パラメーターである。
【０２６２】
これらの最適化パラメーターに基づき、１４種類のＬＳ製剤を作製し、ＭＲＩ体積保持モデルで試験した（図６Ａ、表４）。出願人らは、齧歯類動物試験でこれらのパラメーターを最適化することによって、組織の侵入・成長性の向上及びより自然な感触は維持したままで、既存の市販されている標準物質に匹敵する耐久性を取り戻した。ＬＳ−２〜ＬＳ−１４の製剤の多くが、ビーズ化前の形態に変換することによって、最終的な製剤として検討するために実用化したに過ぎず、最初のｉｎ  ｓｉｔｕの反応化学物質では不可能であろう点に留意されたい。貯蔵弾性率（Ｐａ）によって認められたように、ゲル剛性が、（実質的にいくつかの場合において）元々のＬＳ−１製剤から上昇したからである。この試験の代表的な群が図４Ｅに示されている。この試験では、Ｊｕｖｅｄｅｒｍ（登録商標）Ｖｏｌｕｍａ  ＸＣ（登録商標）を市販のコントロールとした。
表４：ＬＳ１製剤の変形形態ＬＳ−２〜ＬＳ−１４の特徴付け
【表４】
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【０２６３】
実施例６．組織の侵入・成長のＭＲＩ及び組織学的解析による評価
組織の侵入・成長をフィラーＪｕｖｅｄｅｒｍ  Ｖｏｌｕｍａと比較して、ＭＲＩ画像法及び組織学的解析によって特徴付けた（図５Ａ〜５Ｂ）。ＭＲＩ解析によって示されているように、合成組織と宿主組織の水分量の違いから、足場は、明るい白色に見える。時間の経過とともに、注射部位の周囲の宿主組織は浸潤し始め、新たな組織を形成する。このことは、長期持続性の注入剤に置き換えることができ、その場合、足場は、宿主組織が欠損部位を修復するのに充分に長い期間存続するが、天然の宿主組織によってリモデリングされる。これは、体内でカプセル化し、そのフィラーが分解機構に耐えられる限りは存続する従来のＨＡハイドロゲル（Ｓａｎｓ  Ｆｉｂｅｒｓ）とは正反対である（図５Ｂ）。
【０２６４】
図５Ａ及び５Ｂに示されているように、５つの入力パラメーター（ハイドロゲルの分子量、ハイドロゲルの変性度、ハイドロゲルの濃度、ナノファイバーの濃度及び架橋密度）を変化させた。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて持続性及び性能を向上させるパラメーターがまだ明らかになっていなかったからである。７８日間にわたってデータを収集した後（現時点において、試験は続行中である）、体積保持に対する影響が最も大きい入力パラメーターを決定した。図５Ｃに示されているように、線形回帰モデルの線形予測能は、１４日目（Ｒ２＝０．９５）及び３０日目（Ｒ２＝０．８６）において、許容されるものである。これらの線形モデルに対する寄与要因は、時間とともに変化する。１４日の時間枠では、ハイドロゲル濃度が最も大きい入力寄与要因であった。この原因は、ハイドロゲルがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて膨潤すること、すなわち、高濃度のゲルが、低濃度のゲルよりも膨潤することである可能性が高い。最も興味深いのは、ナノファイバーの濃度の影響は、注射から３０日時点で最も大きかったことである。繊維は、組織の侵入・成長を誘導するのを助け、そのため、性能の最も高い複合体製剤で見られた、体積保持性の向上に不可欠である可能性が高い。
【０２６５】
実施例７．ラットモデルでのＭＲＩによる膨潤評価
上記のＬＳ複合体ビーズの完全に反応させた微粒化製剤では、Ｊｕｖｅｄｅｒｍのような市販の皮下フィラーと比べると、優れた膨潤特性が見られる。具体的には、齧歯類動物ＭＲＩモデルにおいて、Ｊｕｖｅｄｅｒｍを注射した場合に観察された、施術後の著しい膨潤は、ＬＳ複合体では見られず、臨床医が所望する「見たまま」以上の外観が可能になる。本発明の微粉化複合体形態のＨＡ濃度、繊維充填量及び架橋度の最適化の継続は今でも続いており、体積増大力の向上、膨潤性の低減及びより自然な感触を維持したままで、既存の市販の標準物質に匹敵する耐久性を取り戻すと予想される。膨潤度は、図６Ａ〜Ｃで特徴付け及びプロット化が行われている。
【０２６６】
ｔａｎδは、エネルギー損失とエネルギー貯蔵のバランスを定量するものである。弾性率または粘度にかかわらず、ｔａｎδが大きいほど、液体のような特性が強いことを示し、ｔａｎδが小さいほど、固体のような特性が強いことを示す。
タンデルタ（ｔａｎδ）＝Ｇ’’／Ｇ’
Ｇ’：貯蔵弾性率。弾性（材料がエネルギーを貯蔵する能力）を測定する。
Ｇ’’：損失弾性率。材料がエネルギーを消散する能力を測定する。
【０２６７】
そのビーズ状複合体は、ｔａｎδ測定値が、市販のフィラーよりも小さく（図７Ａ）、それと同時に、同程度の剛性プロファイルを保持している（図７Ｂ）。より固体に近いその特性には、ｉｎ  ｖｉｖｏの脂肪（軟組織再建の現在のゴールドスタンダードである）の特性が映し出されている（図７Ｃ）。
【０２６８】
実施例８．本発明のビーズ状複合体のデザインにより可能になる注射可能製剤
本発明のビーズ状のハイドロゲルのデザインによって、４つの有望な注射可能製剤が可能になる。
【０２６９】
一実施形態では、その注射可能製剤は、注射の前に速やかに再構成される凍結乾燥粉末ケーキの入ったバイアルを含む。これは、ボトックス注射で用いられているワークフローと同様のものである。
【０２７０】
別の実施形態では、２本のシリンジのシステムを用いて、複合体を再水和する。臨床医は、２本のシリンジを連結し、再水和してから、すぐに製剤を注射することになる。
【０２７１】
別の実施形態では、１本のシリンジによって使用する製剤を使用し、その場合、ビーズは、製造設備において、パッケージングの際に再水和されており、そのパッケージを空けると、すぐに注射できる状態になっている。
【０２７２】
別の実施形態では、再構成液の入ったバイアルとともに、凍結乾燥粉末の入ったシリンジを供給する。その再構成液をバイアルからシリンジまで吸い上げて、粉末と混合する。
【０２７３】
４つのすべての実施形態では、高度な開発試験で有望であることが示されている。
【０２７４】
実施例９．細胞送達による合成軟組織
大型動物の軟組織欠損モデル
上記の実施例では、皮下注射モデルに従って、有効性及び宿主組織応答性を調べた。これらのモデルは、本発明で開示する皮下フィラー製品に最適であるからである。この技術の用途をさらに発展させるために、再建手術を対象とするさらに大きい軟組織欠損部の修復が探求されている。
【０２７５】
ニュージーランドウサギの鼠径部脂肪体において、１０ｍｍの生検パンチを用いて、中程度の大きさの欠損部（円筒状：直径１０ｍｍ×高さ１３ｍｍ、約１ｃｃ）を作製し、塩析法を用いて、異なるウサギにおいて、除去される脂肪の体積の一貫性を確保した。１ｃｃの体積は、軟組織の修復で現在用いられている個々の脂肪移植片のボーラスサイズよりも大きく、有意義な概念実証として機能する。ｉｎ  ｓｉｔｕで形成したビーズ状複合体またはコントロールのハイドロゲルは、欠損形状を呈した（図８Ａ）。
【０２７６】
ＰＯＤ１４（術後１４日目）に採取した組織試料の予備的調査によって、ＰＯＤ１４に、宿主血管が１５０Ｐａの複合体に浸潤した程度が、８０Ｐａのハイドロゲルへの浸潤よりも大きかったことが確認された。対照的に、１５０Ｐａのハイドロゲルでは、血管の移植片への有意な侵入・成長は見られず、１５０Ｐａのハイドロゲルと宿主組織の間に明瞭な境界が見られた。この予備的な調査では、幹細胞を複合体に播種することも、自己脂肪移植片を複合体に混合することもしなかった。上記の結果によっては、血管の複合体のみへの侵入・成長が示されている。また、上記モデルは、今後、より体積の大きい軟組織の再建で、細胞を導入した状態で使用するモデルにもなる。図８Ｂには、ＰＯＤ１４における、異なる移植片マトリックス（１５０Ｐａの複合体、１５０Ｐａのハイドロゲル及び８０Ｐａのハイドロゲル）への宿主血管の浸潤が示されている。内皮細胞は、ＣＤ３１で赤色に染色し、細胞核は、ＤＡＰＩで青色に染色した。繊維は、Ｆ８ＢＴで緑色に染色した。スケールバーは、１００μｍである。
【０２７７】
下記に明らかにされている試験により、大型動物外傷モデルにおいて、さらに大きくて深い軟組織欠損部を修復する技術の進展が示されている。
【０２７８】
本発明の複合体を用いた、自己脂肪組織の送達
ｉｎ  ｓｉｔｕ形成複合体と自己採取脂肪の複合材を新たな合成軟組織製品として調査した。このアプローチは、移植不全及び線維化のリスクなしに、より体積の大きい再建を行うものとして期待される。その合成軟組織は、機械的特性が向上しており、その特性は、現在臨床で用いられている処理済み脂肪吸引物よりも、ｉｎ  ｖｉｖｏ脂肪に近い（図９Ａ）。場合によっては、その合成軟組織製品は、ｉｎ  ｓｉｔｕ形成複合体の代わりに、ビーズ状複合体と組み合わせてもよい。
【０２７９】
その合成軟組織は、体積保持、組織の侵入・成長及び加工性の面で最適化された製品形態を明らかにする目的で、脂肪と様々な比率で組み合わされている。データにより、脂肪５０％：複合体５０％の群では、脂肪１００％の群と比べて、血管新生が改善したことが示唆されている（肉眼で、赤色及び血管系によって確認し（図９Ｂ）、顕微鏡で、ＣＤ３１染色によって確認した（図９Ｃ））。
【０２８０】
実施例１０．本発明の複合体ビーズを用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏでの幹細胞の送達
複合体ビーズの合成
Ａｃｒ−ＨＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）、２アーム型ＰＥＧ−ＳＨ（１５ｍｇ／ｍｌ）及びＭＡＬ−ＰＣＬナノファイバー断片（３０ｍｇ／ｍＬ）の混合物を用いて、複合体ビーズＬＳ−１４を構築した。各成分は、脱水形態で得て、所要の貯蔵弾性率を得られるように、ＰＢＳにおいて、対応する終濃度で再水和した。繊維が分散されるように、よく混合した後、試料をシリンジに充填し、３７℃の調湿室に少なくとも４時間から一晩静置して、架橋（ゲル化）を完結させた。そのシリンジを用いて、完全にゲル化したその複合材を２５０μｍのメッシュスクリーンに通すことによって、その材料を処理した。
【０２８１】
続いて、その塊状のゲルを２５０μｍの篩目から押し出し、回収し、シリンジを用いて、その篩に再び通して、直径約５０〜３００μｍの粒子を作製した（図１０Ｂ）。
【０２８２】
複合体ビーズへのヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）の播種
２００ｒｐｍの振盪機上の超低接着９６ウェルプレート、またはより均一に細胞を播種可能にするために、スピナーフラスコを取り付けた低接着１２ウェルのいずれかに、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）を微小粒子１ｍＬ当たり１００万個で播種した（図１０Ｂ）。異なるウェルプレートを用いることで、ＬＳビーズにおける細胞の分布に影響が及ぶ（図１０Ｂ）。例えば、９６ウェル懸濁プレートを用いて、細胞を複合体ビーズとともに一晩培養したところ、主として、細胞からなる表面被覆層が得られた（図１０Ａ）。その一方で、スピナーフラスコを取り付けた１２ウェルを用いると（図１０Ｃ）、細胞がより均一に分布可能になり、細胞が、そのビーズの多孔質の足場に浸透可能になる（図１０Ｄ）。
【０２８３】
溶液相内で複合体ビーズに結合した細胞数の測定
マイクロビーズに結合する細胞の数を算出するために、マイクロビーズ１ｍＬ当たり１００万個のｈＭＳＣを播種した。続いて、ｈＭＳＣとマイクロビーズを充分に混合するようにピペッティングすることによって、それらを丸底の非接着９６ウェルプレートに、１ウェル当たり１００μＬで分配した。温めたＲｏｏｓｔｅｒＮｏｕｒｉｓｈ−ＭＳＣ−ＸＦ（ＫＴ−１６）を１００μＬ、各ウェルに加えて、そのプレートを培養期間にわたって、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内の２００ｒｐｍの振盪機に設置した。３０分〜１時間振盪した後、細胞−マイクロビーズの上清を複数のウェルから回収して、血球計算盤によって非接着細胞の数を測定したところ、有意性のない細胞数が記録された。したがって、最初の細胞はすべて、マイクロビーズ混合物に結合するかまたは捕捉されると推定された。
【０２８４】
複合体ビーズに結合した細胞数の、画像解析による測定
ｈＭＳＣは、時間の経過とともに、微小粒子上に結合して増殖することができる。図１０Ｅには、ｈＭＳＣがＬＳマイクロビーズ上で増殖して、２次元の細胞培養物を形成することが示されている。図１０Ｅ（ａ）に見られるように、ビーズの多孔質性により、表面積が増大することで、ｈＭＳＣは、ビーズの表面上、及びビーズのコア方向の両方において成長可能になる。
【０２８５】
細胞の定量を画像解析によって行った。画像での定量から得た測定値は、共焦点顕微鏡によって微小粒子−ｈＭＳＣ（５０個以上の粒子）を個々に画像化し、構造全体を通じてｚスタックを行うことによって求めた。ＤＡＰＩ染色を使用して、細胞の有無を求め、１粒子当たりの細胞数を表にした（図１０Ｅ（ａ））。粒子の面積にｚスタックの総厚を乗じる、ＩｍａｇｅＪによる解析によって、粒子の体積を求めた。これによって、細胞／体積の測定値を得て、細胞の定量図（図１０Ｅ（ｂ）及び（ｃ））に示した。ＲＧＤペプチドによって、ｈＭＳＣの細胞接着性が向上し、粒子上の細胞の倍加時間が短縮した。
【０２８６】
ラットの心臓の心筋への脂肪由来ｈＭＳＣの送達
複合体ビーズＬＳ−１４を、脂肪由来ｈＭＳＣであるＲｏｏｓｔｅｒＢｉｏ  ＭＳＣ−０２１とともに、丸底の非接着９６ウェルプレート中で、ビーズ１ｍＬ当たり１００万個という密度で、３日間培養した。３日目に、ｈＭＳＣ−ＬＳビーズを１５ｍＬのチューブに回収し、５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を吸引し、ｈＭＳＣ−ＬＳ−１４ビーズスラリーを１ｃｃのシリンジに回収した。
【０２８７】
イソフルランを用いて、２００ｇの雌のスプラーグドーリーラットを麻酔し、縫合糸を用いて、左冠動脈前下行枝を結紮して、心臓の左心室で梗塞体積を発現させた。２５Ｇの針を用いて、ＬＳ−１４−ｈＭＳＣ材を左心室壁の３カ所に、それぞれ２０μＬ注射した。その後、ラットを縫合し、４週間かけて回復させ、その４週間の時点に、組織学的試験のために、殺処分し、心臓組織を摘出した。ラットの心臓の心筋に、ＬＳ−１４ビーズ／ｈＭＳＣを２０μＬ注射したところ、ＧＳ４−イソレクチンＢ４染色陽性であったことにより、宿主組織による高度な細胞浸潤及び血管浸潤が示された（図１０Ｆ）。
【０２８８】
施術及び処置から４週間目に、組織学的解析によって、ラット心筋において、瘢痕組織の形成及びコラーゲン沈着の低下が見られ、ｈＭＳＣを付加することで、心筋壁の一体性がさらに向上することが示された（図１０Ｇ）。さらに、ＰＢＳ注射群と比べて、壁の菲薄化が軽減されたことにより、ＬＳ−１４と合わせてｈＭＳＣを送達すると、いかに、組織の損傷を低減し、構造的一体性を維持できるかが示されている。
【０２８９】
代替的な実施形態では、繊維密度の異なる様々な複合体ビーズにｈＭＳＣを１〜７日間播種してから、ラットの心臓の心筋に注射して、細胞の増殖、形態的変化、移動挙動を評価する。
【０２９０】
ラットの皮下空間へのｈＭＳＣの送達及び再生組織の形成
複合体ビーズＬＳ−１４を上記のようにして調製した。続いて、そのビーズにｈＭＳＣを１００万個／ｍＬで播種し、７日間、９６ウェルの丸底非接着プレートでｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養した。その後、ｈＭＳＣ−ＬＳ−１４ビーズを２５ゲージの針によって、１ｃｃのシリンジで、ラットの腹側に４カ所、それぞれ２００μＬ注射した。ＰＯＤ７２に、ラットを頸椎脱臼によって殺処分し、試料を摘出して、組織染色用に処理した（図１０Ｈ）。ＰＯＤ７２には、細胞の浸潤によっては、注射材のコアまでの完全な回復が見られなかったが、宿主組織と移植片との界面では、ＲＥＣＡ−１（内皮細胞）染色陽性であること、及びその領域における細胞の活発な成長が示されている（図１０Ｈ）。
【０２９１】
代替的な実施形態では、繊維密度の異なる様々な複合体ビーズにｈＭＳＣを１〜７日間播種してから、ラットに皮下注射して、細胞の増殖、形態的変化、移動挙動を評価する。
【０２９２】
移植部位における体積保持性のＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）による測定
ＭＲＩによる測定を通じて、各スライスにおいて注射材の面積を測定することによって、本発明の材料（例えば複合体ビーズ）の体積保持性を定量できる。ＭＲＩを７２日目に行って、注射したマイクロキャリアの体積保持性を評価した。体積を定量するために、ＩｍａｇｅＪを用いて、不透明な注射材が占める面積を測定し、その面積に各画像スライスの厚みを乗じた。総体積を求めるために、面積を積分した。図１０Ｉには、Ｇ１（７日、ＬＳ−１４／ｈＭＳＣ）、Ｇ２（１日、ＬＳ−１４／ｈＭＳＣ）、Ｇ３（０日、ＬＳ−１４／ｈＭＳＣ、ｉｎ  ｓｉｔｕ）、Ｇ４（７日、ＬＳ−１４／ｈＭＳＣ、ペプチドなし）、Ｇ５（ＬＳ−１４）のＰＯＤ７２における体積保持性が示されている。図１０Ｉには、そのかさ体積がほぼ保持されたことが示されている。
【０２９３】
実施例１１．ラットモデルにおける複合体ビーズの皮下移植
実施例５の実験から得た複合体ビーズＬＳ−５を含むラットから、ｉｎ  ｖｉｖｏで１３週間目に、組織試料を採取した。その組織試料を固定し、切片化し、Ｈ＆Ｅ染色及びマッソントリクローム染色で染色した。Ｈ＆Ｅ染色による組織像（図１０Ｊ）に、その細胞の成長／浸潤パターンが示されており、そのパターンでは、下地となるビーズの形態が再現されている。
【０２９４】
代替的な実施形態では、繊維密度の異なる様々な複合体ビーズを移植して、細胞の増殖、形態的変化、移動挙動を評価する。
【０２９５】
実施例１２．凍結乾燥方法及び調合の開発
上記の実施例に記載されている複合体構造の主な利点は、当該技術分野において知られている大半のハイドロゲル成分とは対照的に、本発明の繊維−ハイドロゲル複合体のナノファイバー相の機械的特性が、乾燥状態または凍結状態において、あまり変化しない点である。すなわち、凍結または凍結乾燥中に、その繊維部分は、複合体のミクロ構造全体を保持するのを助けることができる。正確な凍結乾燥サイクル及び調合により、その複合体は、再水和しても、個別のビーズとして維持される状態で凍結乾燥できる。
【０２９６】
この複合体構造においても、理想的な凍結乾燥の調合及びプロセスは、実験によって求める必要がある。この実施例では、ＭＷ７００ｋのＨＡ−アクリレートを７．３ｍｇ／ｍＬ、ナノファイバーを１０ｍｇ／ｍＬ、及びＰＥＧＳＨ（５ｋの２−アーム型）を８．１８ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ中で調合し、一晩、５ｃｃのシリンジにおいて、３７℃のインキュベーター内で反応させた。また、レオロジー試験のために、その溶液１４５μＬを直径８ｍｍの３個のモールドに入れる（図１１Ａ、図１１Ｄにおける「ビーズ化前」）。ゲル化後、その複合体ゲルを２５０μｍのスクリーンに通すことによって、そのゲルをビーズにする。そのビーズを直径８ｍｍの３個のモールドに注入し、すぐにレオロジーについて試験する（図１１Ｂ、図１１Ｄにおける「ビーズ」群）。残りの量のビーズを液体窒素で急速凍結し、Ｌａｂｃｏｎｃｏ（登録商標）のフラスコ凍結乾燥機（ＦｒｅｅＺｏｎｅ（登録商標）６）で４８時間凍結乾燥した。凍結乾燥後、凍結乾燥ケーキは、凍結溶液の体積よりも小さかったことから、その試料が、期間全体にわたっては凍結状態を保たなかったことが示された。そのビーズを再水和して、失われた量（重量によって測定）の水を正確に補充した。得られた再構成ゲルは、凍結乾燥前とは異なる特性を有しており、そのゲルは、二相性で、ゲル相に完全には吸収されなかった余剰の水相を含む状態であった。また、そのゲルは、シリンジに吸引によっては充填できなかった。ミクロ構造の変化により、個々のビーズが融合されたからである。レオロジーについて試験したところ（図１１Ｃ、図１１Ｄにおける「凍結乾燥後」群）、そのゲルは、剛性がかなり高く、貯蔵弾性率は、ビーズ化前のゲルよりも５．１９倍高く、ビーズ状のゲルよりも６．３９倍高かった。これは、拡散したハイドロゲル構造が縮んで、緻密性の増した二相性構造になったことが原因である。注入性、物理的特性及び空隙率はいずれも、凍結乾燥プロセスによる影響を受ける。
【０２９７】
実施例１３．改良された凍結乾燥方法及び調合の開発
凍結乾燥プロセス中、凍結乾燥する試料を、より低い温度（その凍結する試料のガラス転移温度未満）に維持するために、シェルフ内式凍結乾燥機を用いて、凍結乾燥に対する制御性を高めた以外は、上記と同じ手順に従った。ＭＷ７００ｋのＨＡ−アクリレートを７．３ｍｇ／ｍＬ、ナノファイバーを１０ｍｇ／ｍＬ、及びＰＥＧＳＨ（５ｋの２−アーム型）を８．１８ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ中で調合し、一晩、５ｃｃのシリンジにおいて、３７℃のインキュベーター内で反応させた。また、レオロジー試験のために、その溶液１４５μＬを直径８ｍｍの３個のモールドに入れる（図１２Ａ〜Ｂにおける「ビーズ化前」）。ゲル化後、その複合体ゲルを２５０μｍのスクリーンに通すことによって、そのゲルをビーズにする。そのビーズを直径８ｍｍの３個のモールドに注入し、すぐにレオロジーについて試験した（図１２Ａ〜Ｂにおける「ビーズ」群）。残った量のビーズを−８０℃のインキュベーターで凍結してから、予冷した凍結乾燥機Ｌａｂｃｏｎｃｏ（登録商標）Ｔｒｉａｄ（登録商標）に２４時間、−１０℃の棚温で置いた後、２４時間、２０℃で二次乾燥した。凍結乾燥後、凍結乾燥ケーキは、バイアル中で、凍結乾燥前の凍結試料と同じ容積を占めたことから、そのケーキが、凍結乾燥中に溶融し始めなかったことが示された。そのビーズを再水和して、失われた量（重量によって測定）の水を正確に補充した。再構成したゲルは、シリンジに吸引によっては充填できなかったが、ルアーロックコネクターによってシリンジ間を通すと、最初は互いに強くくっついていたゲルビーズを個々のビーズに分散させることができた。レオロジーについて試験したところ（図１２Ａ〜Ｂにおける「凍結乾燥後」群）、ビーズは、剛性がかなり大きく、貯蔵弾性率及びヤング率が大きく上昇した。これは、拡散したハイドロゲル構造が縮んで、緻密性の増した二相性構造になったことが原因である。注入性、物理的特性及び空隙率はいずれも、凍結乾燥プロセスによる影響を受ける。
【０２９８】
実施例１４．低張調合による凍結乾燥方法の開発
ＭＷ７００ｋのＨＡ−アクリレートを７．０ｍｇ／ｍＬ、ナノファイバーを１０ｍｇ／ｍＬ、及びＰＥＧＳＨ（５ｋの２−アーム型）を７．１８ｍｇ／ｍＬ、一晩、５ｃｃのシリンジにおいて、３７℃のインキュベーター内で反応させてから、１５０μｍまたは２５０μｍのスクリーンでビーズ化した。この実施例では、ビーズは、低張材として調合した（ＰＢＳの代わりに、脱イオン水を使用した）。
【０２９９】
そのビーズを１ｃｃ、Ｌａｂｃｏｎｃｏ（登録商標）凍結乾燥バイアルに充填し、そのバイアルに、等張溶液を１ｃｃ加え、さらに、脱イオン水を１ｃｃ加えて、バイアル中の溶液の総体積を３ｃｃにし、ビーズをその体積の全体にわたって分散させた。その等張溶液は、Ａ：３％スクロース、３％トレハロース、０．３％ＮａＣｌ及び７００ｋの遊離ＨＡを２ｍｇ／ｍＬ、またはＢ：ＰＢＳ及び７００ｋの遊離ＨＡを２ｍｇ／ｍｌのいずれかであった。そのバイアルを液体窒素で急速凍結してから、−３０℃の棚温及び１０Ｐａの減圧下で４８時間凍結乾燥し、２４時間、２０℃まで上昇させた温度で、シェルフ内式凍結乾燥機Ｌａｂｃｏｎｃｏ  Ｔｒｉａｄにおいて二次乾燥を行った。凍結乾燥後、そのビーズを再水和して、失われた量（重量によって測定）の水を正確に補充した。その複合体ゲルビーズは、シリンジに容易に吸引できたことから、個々のビーズ構造が保持されたことが示された（光学顕微鏡によって確認した）。スクロース−トレハロース溶液で凍結乾燥した群は、ビーズ化プロセスの直後、希釈及び凍結乾燥の前に行った群と、感触及びハンドリング性が同じであった。そのレオロジー特性も、実質的に同じで、その群は、貯蔵弾性率が最初のビーズ化前のゲルの９０％であり、凍結乾燥前のビーズ状のゲルよりも弾性率が２２％高かった（図１３Ａ）。ＰＢＳ緩衝液で希釈した群も、シリンジに容易に吸引され、スクロース−トレハロース群と同様の挙動を見せたが、貯蔵弾性率は上昇し、最初のビーズ化前の弾性率よりも８７％高く、凍結乾燥前のビーズ状のゲルよりも１５４％高かった。これにより、ＰＢＳ群では、粒子が別個のビーズを保持した場合でも、依然として、何らかのミクロ構造変化が起きたことが示されている。
【０３００】
ビーズ寸法の決定
ビーズ化プロセスで使用するスクリーンのメッシュ寸法を変えることによって、ビーズ寸法を変動させた。
【０３０１】
目開きが２５０μｍを超えるビーズスクリーンは除外した。得られるビーズは、少なくとも１つの寸法が、シリンジの針の内径よりも小さくなければならないからである。ダーマルフィラーの適用の際に一般的に用いられている針は、内径が２６０μｍ〜１６０μｍの２５ゲージ〜３０ゲージの範囲である。目開き９０μｍスクリーンによって、小さめのビーズを試したが、その小さいメッシュ寸法により、複合体ゲルのミクロ構造が破壊された。目開き９０μｍ寸法は、個々の繊維の多くの長さよりも小さく、そのため、均質なゲル−繊維複合体に分かれずに、繊維とゲルが引き裂かれた。９０μｍのスクリーンで処理しても、特徴付けに充分な材料は得られなかった。２５０μｍ及び１５０μｍのスクリーンによって作製したビーズ（図１３Ｂ）では、図１３Ａにおけるようにして形成したビーズと、レオロジー特性が同程度のゲル、特に、貯蔵弾性率及びタンデルタがダーマルフィラーに適するゲルが得られた。
【０３０２】
タンデルタ
タンデルタは、レオロジーに関して損失弾性率を貯蔵弾性率で除した値であり、タンデルタの数値が低いほど、より「固体に近い」とみなされ、その反対は、「液体に近い」材料であることを意味する。上記プロセスの試料（ビーズ化前、２５０μｍのビーズ、１５０μｍのビーズ）のタンデルタは、図１３Ｃに示されている。図１３Ｄに示されている動向に見られるように、ダーマルフィラー業界では、時間とともに、タンデルタ値が低下する傾向が示されてきた。これは、感触が固体に近づいていく傾向であり、この傾向では、皮膚欠損部を充填する際のリフティング力が向上している。本発明の繊維−ハイドロゲル複合材では、リフティング力が向上する傾向がさらに進み、ビーズ化プロセス後でも、その特質が維持される。レオメーターＡｒｅｓ  Ｇ２で、１Ｈｚ（０．１〜１０％の振幅）において振幅掃引中にタンデルタのデータを得て、その１〜１０％の振幅のタンデルタ値を平均した。複合体の値は、図１３Ｃに示されている、１５０μｍのビーズ群のものである。
【０３０３】
実施例１５．複合体ビーズの物理化学的な特徴付け
寸法分布の測定
複合体ビーズの直径を共焦点顕微鏡画像で、その粒子の最長軸に沿って測定した。解析は、５１個の粒子を計数して行った。それらの粒子のヒストグラム（図１４Ａ）から、平均ビーズ寸法は２０９．４１±６２．２７μｍであった。図１４Ｂには、粒子内の最長軸を測定することによって、寸法が約７５μｍ、約１５０μｍ及び約２００μｍであったビーズの共焦点顕微鏡画像が示されている。
【０３０４】
より堅実な測定のために、エッジ検出を利用する画像解析プログラムを用いて、ビーズ寸法分布のさらなる特徴付けを行う。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、塊状の複合体を処理するのに、目開きの異なる篩を用いることにより、ビーズ寸法に関して、それぞれ異なるヒストグラムを得ることができる。
【０３０６】
代替的な実施形態では、ＳＥＭ（走査電子顕微鏡）を使用して、複合体ビーズを画像化する。画像化プロセスの際には、ハイドロゲルまたは繊維の走査が必要となる場合がある。
【０３０７】
複合体ビーズの寸法に基づく注入性の評価
Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）ロットの余剰ゲルを再加工して、ビーズ寸法に応じた注入性を評価した。簡潔に述べると、ゲルを１０ｃｃのシリンジに充填し、そのゲルを所定のメッシュのステンレス鋼製メッシュスクリーン（ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｃａｒｒ製の２５ｍｍのステンレス鋼製メッシュをＳａｒｔｏｒｉｕｓ製の２５ｍｍのフィルターホルダーに配置したもの）に通すことによって微粉化した。ゲルは、２５０μｍのスクリーンの後に、１５０μｍのスクリーンに通した。続いて、このゲルを１ｃｃのＢＤ製ポリカーボネートシリンジに充填して、「１５０μｍ」群を作製した。次に、ロットの残りを追加の７５メッシュスクリーンに３回通し、１ｃｃのＢＤ製ポリカーボネートシリンジに充填して、「７５μｍ」群を形成させた。続いて、力学試験機ＭＴＳ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ４３に連結したシリンジ固定具（Ｉｎｓｔｒｏｎ）に、上記の充填済みのシリンジを取り付けた。シリンジから、２７ゲージの針（長さ１／２インチ、ＢＤ）を通じて、１ｍｍ／秒のクロスヘッド速度で、ゲルを注入した。代表的な変位曲線が図１４Ｃに示されている。１５０μｍ群及び７５μｍ群のいずれでも、許容される注入プロファイルが得られた。それらのプロファイルは似通っている。いずれの群でも、２７ゲージの針の内径２１０μｍを下回るゲルビーズが作られるからである。
【０３０８】
繊維の長さ分布の測定
ＩｍａｇｅＪを用いた位相差光学顕微鏡で見られる繊維の測定を通じて、本発明のハイドロゲル材の全体に分散している繊維の長さ分布を求めた（図１４Ｄ、Ｅ）。代替的な方法として、ＳＥＭ（走査電子顕微鏡）を用いて、繊維の長さ分布を求めることもできる。
【０３０９】
繊維及びハイドロゲルの官能基（化学的機能性）の定性的及び定量的な特徴付け
トルイジンブルー（ＴＢＯ）アッセイを用いて、プラズマ処理後の繊維の−ＣＯＯＨ基の特徴付けを行った。マイクロプレートリーダー：ＢｉｏＴｅｃｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ２を用いて、このアッセイを評価した。従ったプロトコールの工程は、以下に記載されている。
・直径０．８ｃｍのパンチを用いて、４片のアクリル酸変性繊維シートを打ち抜く。
・打ち抜いた繊維シートを２４ウェルプレートに入れる。
・その繊維シートを１ｍＬの０．１ｍＭ  ＮａＯＨで２回洗浄する。
・０．１ｍＭ  ＮａＯＨ中の０．５ｍＭトルイジンブルーＯ（ＴＢＯ）溶液を調製する。
・１ｍＬの０．５ｍＭ  ＴＢＯ溶液を各ウェルに加える。
・そのプレートを２００ｒｐｍの振盪機にかけ、室温で１２時間静置する。
・反応緩衝液を吸引除去する。
・その繊維シートを０．１ｍＭ  ＮａＯＨで洗浄する。
・１ｍＬの５０％（ｖ／ｖ）酢酸を各ウェルに加える。
・そのプレートを２００ｒｐｍの振盪機に、室温で３０分かける。
・その上清１００μＬを９６ウェルプレートに移す。
【０３１０】
５０％（ｖ／ｖ）酢酸中のＴＢＯを標準物質として、マイクロプレートリーダーを用いて、６３３ｎｍで測定した。これらの実施例で用いた繊維で見られた典型的な値は、７０〜１００ｎｍｏｌ／ｃｍ２のＣＯＯＨ密度である。
【０３１１】
ＥＤＣ−ＮＨＳ化学反応によって変性させて、マレイミド（ＭＡＬ）基を加えた後、エルマンアッセイを行って、消費されたチオール基を測定した。マイクロプレートリーダー：ＢｉｏＴｅｃｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ２を用いて、そのアッセイを評価した。従ったプロトコールの工程は、以下に記載されている。
・反応緩衝液、すなわち、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を調製する。
・その反応緩衝液中で４ｍｇ／ｍＬのエルマン試薬を調製する。
・その反応緩衝液中で０．５ｍＭアセチルシステイン溶液を調製する。
・直径０．８ｃｍの４片のマレイミド変性繊維シートをパンチで打ち抜く。
・その繊維シートを２４ウェルプレートに入れる。
・その繊維シートを１ｍＬの反応緩衝液で洗浄する。
・０．５ｍＬの０．５ｍＭアセチルシステイン溶液を各ウェルに加える。
・そのプレートを２００ｒｐｍの振盪機に、室温で４時間かける。
・２０μＬの上清を９６ウェルプレートに移す。
・その上清を反応緩衝液で５０倍に希釈することによって、エルマン反応溶液を調製する。
・２００μＬのエルマン反応溶液を９６ウェルプレートの各ウェルに加える。
【０３１２】
最後に、その９６ウェルプレートを２００ｒｐｍの振盪機に１５分かけ、反応緩衝液中のアセチルシステインを標準物質として、マイクロプレートリーダーを用いて、４１２ｎｍで測定する。そして、消費されたチオールを算出し、ＭＡＬ密度を求める。これらの実施例で用いた繊維で見られた典型的な値は、７０〜１００ｎｍｏｌ／ｃｍ２のＭＡＬ密度である。
【０３１３】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を用いて、修飾ヒアルロン酸のアクリル化の化学的定性及びアクリル化度の定量を行った。２０ｍｇのＨＡ−Ａｃを８００ｍｇの重水（Ｄ２Ｏ）に直接、ＮＭＲチューブにおいて加え、超音波処理によって６０℃で２時間溶解させた。続いて、得られたスペクトルをＶａｒｉａｎ  ＮＭＲ  Ｓｙｓｔｅｍというスペクトロメーターで、４００ＭＨｚの１Ｈ  ＮＭＲによって解析した。Ｖａｒｉａｎというソフトウェア、フーリエ変換、ベースラインのドリフト補正、位相合わせ、１ＨＮＭＲの積分及びベースラインのフラット化を用いて、得られた曲線を処理した。
【０３１４】
６ｐｐｍに対応する３つのピークを積分し、２ｐｐｍにおける積分値で除した。２ｐｐｍにおける積分値を３とした。６ｐｐｍにおける３つのピークは、アクリレート基において炭素と結合した３つの水素と一致する（アクリレート基１つ当たり、合計３個の水素が存在すると予想される）。２ｐｐｍのピークは、ヒアルロン酸の各繰り返し単位に存在するアセチル基と結合した水素（繰り返し単位１個当たり３個）に対応する。したがって、置換度は、３つの６ｐｐｍピークの合計積分面積を２ｐｐｍピークの積分面積で除して、アクリレート基を有するＨＡ繰り返し単位の割合を求めるたものである。アクリル化度（％）は、その割合に１００％を乗じてパーセントに変換したものである。
【０３１５】
実施例１６．ウサギの皮下空間への幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ送達
ウサギ試験では、実施例９におけるラット試験の注射と同様に、皮下注射を行った。３日培養したＬＳ−１４／ｈＭＳＣマイクロビーズを２００μｌ、２５Ｇの針によって注射した。試験群のうちの１つには、背部の頸部領域下の脂肪体に注射した。組織を摘出するために、ウサギをＰＯＤ３０に殺処分した。組織学的解析によって、３０日目のウサギ脂肪体における組織及び細胞の活発な浸潤（図１５Ａ）、ならびに３０日目のウサギ皮下空間における組織及び細胞の中度な浸潤（図１５Ｂ）が示されている。
【０３１６】
実施例１７．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの脂肪移植片の生着を高める繊維−ハイドロゲル複合体
この実施例に開示されている試験の目的は、レオロジー解析を通じて、ヒト脂肪組織と組み合わせたときの繊維−ハイドロゲル複合体の機械的特性の特徴付けることである。レオロジーは、流動及び変形に関する学問であり、印加した力に応答する、物体の塑性流動を測定するものである。貯蔵弾性率（Ｇ’）は、材料の弾性の程度、換言すると、材料が、せん断力に応答して変形可能である程度の尺度である。貯蔵弾性率が高いほど、変形またはせん断力に対する物体の耐性が高いことを示す。この概念を臨床分野に適用すると、貯蔵弾性率が高いほど、組織は、機械的力に続発する変形または外傷の影響を受けにくいと推測される。
【０３１７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養試験において、ナノファイバー−ハイドロゲル複合体を付加した場合及び付加しなかった場合の脂肪組織生存率を比較した（後で、これをｉｎ  ｖｉｖｏモデルに移植する予定であった）。ナノファイバー−ハイドロゲル複合体は、脂肪吸引物と組み合わせると、脂肪吸引物の貯蔵弾性率を上昇させ、細胞培養試験において、脂肪吸引物のみの場合と比較すると、同程度の脂肪組織生存率が得られ、脂肪吸引物と組み合わせると、均一に一体化すると予測される。
【０３１８】
脂肪吸引物と組み合わせた繊維−ハイドロゲル複合体（複合体−脂肪吸引物）の調製
肥満度指数が３５未満である１８〜７０歳の非喫煙女性から脂肪吸引物を得た。出血障害、ＨＩＶ、真性糖尿病及び脂肪組織萎縮障害の患者は、試験から除外した。この試験全体にわたって得られた脂肪吸引物は、Ｒｅｖｏｌｖｅのシステム（ｈｔｔｐ：／／ｈｃｐ．ｒｅｖｏｌｖｅｆａｔｇｒａｆｔｉｎｇ．ｃｏｍ）を用いて処理して、粒子にし、その粒子を乳酸リンゲル液で３回洗浄して、油及び結合組織を除去した。
【０３１９】
脂肪吸引物、ハイドロゲル及び複合体を異なる比率で組み合わせ（表５）、１４０μＬのシリコーンモールド内で２４時間の期間にわたってゲル化させた。この期間中、試料は、摂氏３８度のインキュベーター内に入れた。
表５：脂肪吸引物、繊維−ハイドロゲル複合体及びハイドロゲルを異なる比率で組み合わせ、レオロジー特性を試験した。
【表５】
2021522938.tif 000008
【０３２０】
脂肪吸引物と組み合わせた繊維−ハイドロゲル複合体（複合体−脂肪吸引物）のレオロジー試験
空隙の大きさが０．８〜１．２ｍｍの範囲である８ミリメートル（ｍｍ）のセレイテッド型パラレルプレートを備えたＡｒｅｓ  Ｇ２というレオメーターを用いて、動的レオロジー試験を行った（図１６Ａ）。各群は、試料が少なくとも４個であり、いずれの群も、２人の異なる患者から得た脂肪吸引物を用いて、２回試験した。
【０３２１】
各試料群の平均貯蔵弾性率が図１６Ｂに示されている。脂肪吸引物７５％及び複合体２５％という比率（２５Ｃ）によって、最も高い貯蔵弾性率が得られ、Ｇ’は３９５．２Ｐａであった（ＳＤ：１１２．１）。脂肪吸引物１００％（１００Ｆ）は、貯蔵弾性率が２番目に高く、平均値は３６１．８Ｐａであった（ＳＤ：７５．３）。複合体５０％及び脂肪吸引物５０％（５０Ｃ）の平均貯蔵弾性率は、２０８．７（ＳＤ：４５．４）であった。ハイドロゲル５０％及び脂肪吸引物５０％（５０Ｈ）の貯蔵弾性率は８０．３Ｐａ（１７．４）、複合体１００％（１００Ｃ）の貯蔵弾性率は９４．６Ｐａ（１６．３）、ハイドロゲル１００％（１００Ｈ）の貯蔵弾性率は３２．７Ｐａ（１２．３）であった。脂肪吸引物７５％及び複合体２５％という比率を除き、いずれの群の平均貯蔵弾性率も、脂肪吸引物１００％の平均貯蔵弾性と有意差があった（図１６Ｂ）。
【０３２２】
レオロジーデータにより、全試験群のうち、脂肪吸引物７５％及び複合体２５％という比率の複合材で、最も高い貯蔵弾性率（Ｇ’）が得られることが示されている。この特定の群は、Ｇ’を最も高くする最適な比率であると見られる。脂肪吸引物１００％と、脂肪吸引物７５％及び複合体２５％との間には、統計的な有意差はないことから、脂肪吸引物７５％及び複合体２５％という比率は、天然型の脂肪のレオロジー特性を模することが示唆されている。これについては、その複合材のＧ’が、脂肪吸引物のＧ’よりもかなり低いので、複合材を加えることにより、全体的なＧ’が低下するものと予想される。しかしながら、この比率により、脂肪組織とナノファイバー−ハイドロゲル複合体との架橋量を理想的な量にするのが可能になり、その結果、材料全体の強度が上昇すると見られる。これは重要である。貯蔵弾性率は、材料がどの程度変形に耐えられるかの尺度であり、理想的な組織足場は、天然型の脂肪組織と同様の特性／強度を有するものであるからである。脂肪／複合体の複合材は、貯蔵弾性率が高いほど、変形性が低いので、強度が向上しており、せん断力の影響を受けにくい。過去の研究により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、貯蔵弾性率が高いことは、脂肪分解の低下及び脂肪細胞の生存率の上昇につながることが示された｛Ｌｕａｎ，Ａｎｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｖｏｌ．１４０，ｎｏ．３，２０１７，ｐｐ．５１７−５２４｝。したがって、論理的には、貯蔵弾性率の比較的高い、脂肪−複合体の複合材を有することは、脂肪細胞及び脂肪移植片の生着性の向上につながると推測できる。
【０３２３】
細胞生存アッセイ
脂肪吸引物及び複合体を異なる比率で組み合わせ、１０％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（１：１０００）成長培地を含むダルベッコ改変イーグル培地で７日の期間をかけて培養した（表６）。これらの比率は、将来のｉｎ  ｖｉｖｏ実験で異なる実験群として使用する可能性が高いので、選択した。その成長培地は、少なくとも２日おきに、またはＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ試薬を細胞培地に加えるたびに交換した。Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイを用いて、０日目、１日目、２日目、３日目及び７日目に、細胞生存数の相対量を定量した。
【０３２４】
細胞の培養結果（図１６Ｃ）により、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ試験を用いた、７日の期間にわたる細胞生存能が示されている。脂肪吸引物と比べて、他のすべての群は、生存している細胞の割合（％）が有意に高かった（ｐ値＜０．０５）。
表６：細胞生存アッセイで含めたそれぞれ異なる比率の脂肪吸引物、繊維−ハイドロゲル複合体及びハイドロゲル
【表６】
2021522938.tif 000009
【０３２５】
細胞培養結果から、本開示のナノファイバー−ハイドロゲル複合体を加えることは、無害であり、脂肪細胞の生存を損なわないことが示唆されている。脂肪吸引物を１００％含む群と比べて、いずれの群も、細胞生存率が有意に高い（すべての群においてｐ＜０．００１）。本発明の組織足場は、脂肪細胞が、生存するために細胞培養培地を利用するのを阻止せず、実際には、細胞の生存率を高めると思われる。この阻止は、試料の周囲に脂質層を有する、脂肪吸引物１００％の群によっては生じると見られ、すなわち、脂肪細胞が細胞培地を利用するのが妨げられる。勘案すると、本発明の複合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルに移植すると、脂肪細胞が、長期生存に必要な血管新生成長因子を利用するのを妨げないと推測できる。
【０３２６】
細胞レベルでの複合体の一体化を解析するための免疫組織化学法（ＩＨＣ）
免疫組織化学法（ＩＨＣ）を行って、脂肪細胞の形態及び細胞レベルでの複合体の一体化を解析した。まず、ＩＨＣ試料を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定してから、それぞれ１０％、２０％及び３０％（ｗ／ｖ）スクロースを用いて漸次的に再水和した。続いて、それらの試料を最適切削温度化合物中で凍結し、１片当たり２０μｍで切片化した。充分に確立された脂肪細胞マーカーであるペリリピン抗体で各試料を染色した。共焦点顕微鏡を用いて画像を撮影してから、ＺＥＮソフトウェアを用いて処理した。記述統計学、ならびにパラメトリックな方法及びノンパラメトリックな方法を用いて、そのデータを解析した。統計解析は、Ｓｔａｔａ（登録商標）１３（ＳｔａｔａＣｏｒｐ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘａｓ）を用いて行った。図１６Ｄには、ＩＨＣのペリリピン染色を用いて、本発明のナノファイバー製組織足場が、細胞レベルで、ヒト脂肪組織と一体化したことが示されている。複合体を含む両方の群、及び脂肪吸引物１００％を染色した。上記のＩＨＣ解析によると、その複合体内のナノファイバーは、脂肪吸引物の組織と充分に一体化した（図１６Ｄ）。
【０３２７】
脂肪組織を構造的に模する本発明の複合材は、脂肪吸引物と組み合わせたときに、貯蔵弾性率が高く（すなわち、その複合材が、せん断力から保護される）、脂肪吸引物と、細胞レベルで充分に一体化することが示された。これらの考えを組み合わせると、本発明のナノファイバー−ハイドロゲル複合体は、自己脂肪移植を促す生存性の組織足場である。この概念を実現化するために、実施例１７において、本発明の複合体及び脂肪吸引物の複合材をマウスモデルに移植して、体積保持、組織の一体化及び血管新生をｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。
【０３２８】
実施例１８．ｉｎ  ｖｉｖｏで、血管の侵入・成長を誘導し、脂肪移植片の体積保持性を向上させるための繊維−ハイドロゲル複合体
出願人らは、本発明の新規ナノファイバー−ハイドロゲル複合体が、脂肪移植手順において、天然型の脂肪吸引物に対する補助剤として機能できるのを実証することを目指す。以前の目標では、本発明のナノファイバー−ハイドロゲル複合体が、天然型の脂肪組織と同程度の機械的強度であり、生体適合性であることを出願人らは示した。本発明の複合材は、体積保持及び血管新生の向上を促すことによって、脂肪移植の転帰を改善できると出願人らは仮定する。
【０３２９】
脂肪吸引物と組み合わせた繊維−ハイドロゲル複合体（複合体−脂肪吸引物）の調製
Ｒｅｖｏｌｖｅのシステムを用いて、自己脂肪移植を受けている１８〜７０歳の女性から脂肪吸引物を得た。参加者は、非喫煙者であり、肥満度指数が３５未満であった。出血障害、ＨＩＶ、真性糖尿病及び脂肪組織萎縮障害の患者は、試験から除外した。脂肪吸引物、複合体及びハイドロゲルを様々な比率で合わせて、摂氏３８度のインキュベーターにおける１ｃｃのシリンジ内で３時間ゲル化させた（表７）。
表７：脂肪吸引物、繊維−ハイドロゲル複合体及びハイドロゲルをそれぞれ異なる比率で組み合わせ、Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスの側腹部に注射した。
【表７】
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【０３３０】
ＭＲＩによる体積の解析及び形状の保持
イソフルランベースの麻酔後、Ｆｏｘｎ１ｎｕのいずれかの側腹部に、上記の材料を５００μＬ、マウス１匹当たり合わせて２回注射した。注射は、１６ゲージの鈍端カニューレを用いて行った。マウスは、表７に従って、各群において合計１３匹のマウスで、５つの群に分けた。施術後２日目（ＰＯＤ２）、ＰＯＤ２８、ＰＯＤ５６及びＰＯＤ８４に、ＭＲＩを行った。ＩｍａｇｅＪというソフトウェアを用いて、体積の解析及び形状の保持の解析を盲検下で治験担当医によって行った（図１７Ａ）。ＰＯＤ２、ＰＯＤ２８、ＰＯＤ５６及びＰＯＤ８４に移植片の最大高さを評価し、高さの変化率（％）を算出することによって、形状の保持を測定した（図１７Ｂ）。すべての群で、ＰＯＤ８４において、体積保持性がＰＯＤ２よりも有意に低下していた（図１７Ａ）。当初、ＰＯＤ２８には、脂肪吸引物１００％の群の方が、体積保持性が高かったが、ＰＯＤ８４においては、複合体２５％及び脂肪吸引物７５％を注射した群で、体積保持性が最も高かった。複合体を含む群の両方とも、保持率が非常に高かったことから、複合体が、脂肪移植片の吸収速度を低下させる役割を果たすことが示唆されている。複合体１００％のものを注射した群では一貫して、いずれの時点にも体積保持率が最も低く、複合体のみでは、脂肪組織の充分な補填物として機能せず、脂肪移植に対する支持的な補助剤として機能するに過ぎない可能性が示された。
【０３３１】
形状の保持に関しては、２５Ｃ及び１００Ｆの群で、ＰＯＤ８４における最大高さの変化が最も小さかった（図１７Ｂ）。脂肪吸引物１００％の群を対照として用いたところ、２５Ｃの脂肪吸引物群以外は、いずれの群でも、移植片の最大高さの低下率（％）が有意であった。ナノファイバー−ハイドロゲル複合体が形状の保持に及ぼす作用も調べた。全体的な体積保持性は、それぞれ異なる群にわたって、またさらには、それぞれ異なる時点にわたって同程度であり得る一方で、移植片が、その元々の意図されている形状を保持できることも重要である。移植片は、時間の経過とともに平坦化し得るが、それでも、同程度の全体的体積を保持する。このため、出願人らは、移植片の最大高さを形状保持のマーカーとして使用することを選択した。１００Ｆ及び２５Ｃの群以外のすべての群において、ある時点から次の時点までに、移植片の最大高さが有意に減少した（図１７Ｂ）。これにより、本発明の複合材及び脂肪吸引物を、複合体２５％、吸引物７５％という比率で組み合わせると、体積保持性が促進されることのみならず、この比率の複合体が、脂肪の元々の全体形状を補強する役割を果たすことも示唆されている。これは、本発明の材料の機能に欠かせないものである。自己脂肪移植の主な目的が、軟組織欠損部のフィラーとして機能することであるからである。このことは、顔及び乳房のような審美的に繊細な区域において特に重要であり、この区域では、満足した審美的成果を得るには、適切な移植片形状の保持が不可欠なのである。
【０３３２】
脂肪細胞の形態及び血管の侵入・成長を解析するための免疫組織化学法（ＩＨＣ）
免疫組織化学法（ＩＨＣ）を行う目的で、ＰＯＤ７、ＰＯＤ２８及びＰＯＤ８４という３つの異なる時点に、この実施例における上記マウスを殺処分した。ＩＨＣを行って、脂肪細胞の形態及び血管の侵入・成長を解析した。試料を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定してから、それぞれ、１０％、２０％及び３０％（ｗ／ｖ）スクロースを用いて漸次的に再水和した。続いて、それらの試料を最適切削温度化合物中で凍結し、１片当たり２０μｍで切片化した。ペリリピン抗体（充分に確立された脂肪細胞マーカー）及びＣＤ３１（充分に確立された血管マーカー）で各試料を染色した。共焦点顕微鏡を用いて画像を撮影してから、ＺＥＮソフトウェアを用いて処理した。記述統計学、ならびにパラメトリックな方法及びノンパラメトリックな方法を用いて、そのデータを解析した。統計解析は、Ｓｔａｔａ（登録商標）１３（ＳｔａｔａＣｏｒｐ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘａｓ）を用いて行った。
【０３３３】
図１７Ｃ〜Ｄには、施術後のそれぞれ異なる時点における、ＩＨＣによるペリリピン染色の結果が示されている。ＣＤ３１染色も行ったが、その結果は、図１７Ｅ〜Ｆで見られる。ＰＯＤ７におけるＩＨＣによるペリリピン染色により、すべての群にわたって、脂肪細胞の形態が保持されたことが示されている（図１７Ｃ）。ＰＯＤ２８の画像（図１７Ｄ）を評価すると、２５Ｃの群では、他のどの群よりも、脂肪細胞の構造が完全な形で保持されていることを出願人らは認識できる。本発明の繊維が、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件でも均一に分散するとともに、組織と充分に一体化することも出願人らは認識できる。
【０３３４】
ＩＨＣによるＣＤ３１染色結果から、時間の経過とともに、血管新生が変化することが明確に示されている。ＰＯＤ７には、すべての群において、血管新生が限定的であることが観察される（図１７Ｅ）。しかしながら、この時点で、２５Ｃ群内には、他の群と比較すると、少なくともわずかに多くかつ強固な血管が存在するように見える。ＰＯＤ２の画像をＰＯＤ２８の画像と比べると（図１７Ｆ）、群間の有意差を視覚できる。複合体を含むいずれの群（２５Ｃ、５０Ｃ及び１００Ｃ）でも、ＰＯＤ２８の時点に、血管が有意に発現している。これに対して、１００Ｆ及び５０Ｈの群では、強いＣＤ３１染色は見られないことから、血管新生速度が劣ることが示唆されている。充分な血液の供給は、移植片の生着に不可欠であり、このことは、複合体を含む群の体積保持率が最も高かった理由を説明する助けとなり得る。
【０３３５】
ＭｉｃｒｏＦｉｌの灌流による３Ｄ再構成
コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを用いて、移植片の微小血管系を評価するために、１群当たり１匹のマウスにおいて、マウス血管系にＭｉｃｒｏＦｉｌを灌流させた。
【０３３６】
簡潔に述べると、マウスを放血させ、右心房切開部からヘパリン加生理食塩水を灌流させた。続いて、ＭｉｃｒｏＦｉｌ  Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄをそのマウスに灌流させた。次に、移植標本を取り出し、ＣＴスキャンによって画像化した。ＶｉｖｏＱｕａｎｔというソフトウェアを用いて、移植片の血管系の３次元再構成を行い、移植片組織に対する血管の比率をコンピューターで算出した。再構成された血管系は、図１７Ｇに示されている。ソフトウェアＶｉｖｏＱｕａｎｔを用いて、移植片の総体積と比較した場合の移植片の血管系の割合を算出した。１００Ｆは、移植片体積に対する血管の比率が最も低く、２５Ｃが最も高かった。ＭｉｃｒｏＦｉｌの灌流後に、１群当たり及び１時点当たり１匹の代表的なマウスについて、ＶｉｖｏＱｕａｎｔによる解析を行うことによって、できる限り、本発明の移植片の血管新生に関する最も偏りのない調査によって、我々の観察結果を確認することを目標とした。図１７Ｇに示されている３Ｄ画像は、かなり顕著なものである。複合体を含む移植片が、１００Ｆまたは５０Ｈの移植片よりも、血管新生が大幅に亢進していることを明確に見ることができるからである。２５Ｃは、移植片の総体積に対する血管の割合（％）が最も高く、他の標本と比べて、血管新生レベルが高いことが示されている。
【０３３７】
今後の研究で、既存のｉｎ  ｖｉｖｏプロトコールに対して軽微な修正を施すことにより、さらに際立った成果が得られる可能性がある。例えば、ＩＨＣ解析において、再生誘発性及び炎症誘発性抗体による染色を用いて、本発明の足場の免疫調節能を解明できる。加えて、Ｋｉ−６７またはブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）による染色を採用して、本発明の移植片内での新たな細胞増殖を評価することができる。そして、ヌードマウス由来の大量かつ多様な組織標本で、ＭｉｃｒｏＦｉｌの灌流及びＶｉｖｏＱｕａｎｔを用いた、血管の３Ｄ視覚化及び定量を容易に繰り返すことができる。脂肪移植片の補強または再生に対する代替的なアプローチをウサギまたはブタの動物モデルで探求することもでき、それにより、さらに大きい既存の脂肪沈着または脂肪体における軟組織欠損部に、本発明の複合体を適用可能になり得る。
【０３３８】
実施例１９．脂肪吸引物と組み合わせた複合体ビーズ（複合体ビーズ−脂肪吸引物）の調製
脂肪移植プロトコールを改良し、血管の侵入・成長を誘導し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの脂肪移植片の体積保持性を向上させるために、複合体ビーズ−脂肪吸引物の試料を調製する。
【０３３９】
Ｒｅｖｏｌｖｅのシステムを用いて、自己脂肪移植を受けている１８〜７０歳の女性から脂肪吸引物を得る。参加者は、非喫煙者であり、肥満度指数が３５未満である。出血障害、ＨＩＶ、真性糖尿病及び脂肪組織萎縮障害の患者は、試験から除外した。脂肪吸引物、複合体ビーズ及びハイドロゲルを様々な比率で組み合わせて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験で試験する（表８）。そのビーズ状複合体は、ｉｎ  ｓｉｔｕで反応させた複合体で見られるようには、脂肪吸引物粒子の中及び周囲で真の相互侵入網目構造を形成しない場合もある一方で、そのビーズは、ｉｎ  ｖｉｖｏで形状の保持が見られること、及びレオロジーデータにおいてタンデルタ値が低い（ビーズ化後で０．１０未満）ことで明らかなように、ビーズ同士が強く接着し合う程度に起因して、凝集性ゲルボーラス剤を形成する能力を保持する。また、その複合体の繊維成分は、Ｖｅｌｃｒｏのように機能して、個々のビーズ間の絡み合いと接着を増大させ得る。体積比及びビーズ／脂肪吸引物の粒径により、個々のビーズ間に複数の接着点が得られる限りは、ビーズ間の凝集を保持する能力によって、複合体ビーズ−脂肪吸引物の混合物の凝集構造が維持される。
【０３４０】
複合体ビーズ及び脂肪吸引物の複合材を使用して、２つの異なる臨床ニーズに対処できる。第１に、患者は、利用可能なドナー脂肪の量が充分でないことがある（特に小児患者の場合）。脂肪吸引物への複合体ビーズの導入は、再建に利用できる体積量を大きくするように機能し得る一方で、脂肪吸引物は、血管再生及びリモデリングのための生物学的な刺激を供給する。この比率は、５０：５０の脂肪−複合体から、ほぼ全体が複合体ビーズで、微量の脂肪吸引物を含むものまでである。第２に、脂肪移植の臨床転帰は、移植した脂肪の生存不良によって制限される。９９：１という脂肪：複合体比から５０：５０という脂肪：複合体比で、複合体ビーズを導入して、構造的な支え、接着のきっかけ、免疫保護、ならびに移植した脂肪の生存性及び形状の保持性を向上させる追加の利点をもたらすことができる。
表８：脂肪吸引物、繊維−ハイドロゲル複合体ビーズ及びハイドロゲルを異なる比率で組み合わせて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。
【表８】
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【０３４１】
脂肪吸引物と複合体ビーズとの混合
複合体ビーズと脂肪吸引物は、いくつかの異なる方法で混合／複合できる。これらのプロトコールの鍵は、脂肪の「操作が最小限になる」ように、脂肪と複合体を組み合わせることである。方法の１つは、ルアー間コネクターを介して、複合体ビーズの入った５ｃｃ、１０ｃｃまたは２０ｃｃのシリンジと、処理済みの脂肪の入った５ｃｃ、１０ｃｃまたは２０ｃｃのシリンジを連結してから、シリンジ間でそれらの材料を混合するものである。このワークフローは、当業者である外科医にとっては常法である。別の方法は、１ｃｃ、５ｃｃまたは１０ｃｃのシリンジ内のビーズと、間質血管画分（吸引脂肪の遠心分離によって得たもの）を有するものである。これらの場合には、そのビーズは、ＯＲ内の脂肪と混合して、調製から数分以内に使用することになる。
【０３４２】
代替的な方法は、脂肪吸引物と複合体ビーズを媒体中で、数日間（１日、３日、５日、７日）撹拌しながら混合するものである。このプロトコールにより、図１０Ｅに示されているように、ビーズ上で増殖する幹細胞と同様に、内因性細胞が、ビーズ上で成長し、ビーズをリモデリング可能にもし得る。
【０３４３】
複合体ビーズ−脂肪吸引物は、増殖中には、３７℃に保つ必要があり、その後、数時間にわたり、氷上で４℃に保ってから、対象において、その構築物によって処置する必要がある。細胞レベルで複合体の一体化を解析するために、レオロジー試験、細胞生存アッセイ及び免疫組織化学法（ＩＨＣ）を行うプロトコールは、上記の実施例１８のプロトコールと同様である。加えて、どの比率のビーズ−脂肪吸引物であると、より良い結果が得られるかを判断するために、この実施例１９で設計したｉｎ  ｖｉｖｏ実験を、複合体ビーズ−脂肪吸引物の試料で繰り返す。
【０３４４】
実施例２０．複合体ビーズの安定性の測定
開示されている複合体ビーズの安定性を評価するために、マイクロビーズで、様々な時点に、レオロジー試験を行って、機械的安定性を求める。４℃の水和形態で、マイクロビーズが、６カ月安定していることが明らかになった。
【０３４５】
水和形態及び脱水形態のビーズで、構造的一体性を求めるためのレオロジー試験（せん断弾性率）を室温で、１カ月、３カ月、６カ月、９カ月、１２カ月及び２４カ月の時点に行う。ハイドロゲル分子量、アクリル化度、繊維濃度、マレイミド度及び架橋密度の異なる様々な複合体ビーズの安定性について試験する。
【０３４６】
細胞を播種したビーズに関しては、注射できる状態にするまでは、培地とともに、３７℃に保つ必要がある。細胞を播種するタイミングは、注射のタイミングと充分に合わせる必要がある。長期間培養するほど、細胞の増殖を増加可能であるからである。
【０３４７】
上記の実施例に記載されているように、本発明のビーズ状製剤は、臨床的に有意義な２７〜３１ゲージまたは１６〜３１ゲージの針を通じて容易に注射可能な状態を保ち、ｉｎ  ｓｉｔｕでゲル化するプロトタイプを上回るいくつかの改良点をもたらす。本発明のビーズ状製剤により、使いやすさが向上するように、シリンジによる単回送達システムが可能になる。表面積が大幅に増加することで、凍結乾燥ビーズは、さらに速く再水和するので、２本のシリンジをよく混合する必要がなくなる。本発明のビーズ状製剤により、その製剤で用いられるヒアルロン酸、ナノファイバー及び架橋剤の濃度の上昇が可能になる。以前は、最高濃度は、粘度及び注入力によって管理した。微粉化ビーズに移行することによって、構成成分の濃度は、律速要因ではなくなり、構成成分群はさらに、剛性を改変し、耐久性を高めることができる。本発明のビーズ状製剤により、安定性を向上可能になる。事前に反応させた本発明の複合体ビーズ形態は、反応させない形態よりも、温度、湿度及び変光に対する耐性がかなり大きく、国境を越えた輸送を複数回行った後も、特性が変化しない。そして、本発明のビーズ状製剤によって、強化された細胞足場及び組織送達足場が得られる。
【０３４８】
均等物
本明細書に記載されている詳細な実施例及び実施形態は、例として、例示目的で示されているに過ぎず、いかなる形においても、本発明を限定するものとしてはみなされないと理解する。本発明に鑑み、様々な改変または変更が当業者に示唆され、それらの改変または変更は、本願の趣旨及び範囲に含まれ、添付の請求項の範囲内とみなす。例えば、成分の相対量を変更して、所望の作用を最適化してもよく、追加の成分を加えてもよく、及び／または記載されいてる成分のうちの１つ以上を類似の成分に置き換えてもよい。本発明のシステム、方法及びプロセスと関連するさらなる有益な特徴及び機能は、添付の請求項から明らかになるであろう。さらに、当業者は、本明細書に記載されている本発明の具体的実施形態の多くの均等物を認識するか、または常法に過ぎない実験を用いて、それらの均等物を把握できるであろう。このような均等物は、添付の請求項に含まれるように意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2021522938.tif 000014
【図１Ｄ】
2021522938.tif 000015
【図１Ｅ】
2021522938.tif 000016
【図２Ａ】
2021522938.tif 000017
【図２Ｂ】
2021522938.tif 000018
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2021522938.tif 000020
【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４Ａ】
2021522938.tif 000023
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2021522938.tif 000029
【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2021522938.tif 000032
【図６Ｃ】
2021522938.tif 000033
【図７Ａ】
2021522938.tif 000034
【図７Ｂ】
2021522938.tif 000035
【図７Ｃ】
2021522938.tif 000036
【図８Ａ】
2021522938.tif 000037
【図８Ｂ】
2021522938.tif 000038
【図９Ａ】
2021522938.tif 000039
【図９Ｂ】
2021522938.tif 000040
【図９Ｃ】
2021522938.tif 000041
【図１０Ａ】
2021522938.tif 000042
【図１０Ｂ】
2021522938.tif 000043
【図１０Ｃ】
2021522938.tif 000044
【図１０Ｄ】
2021522938.tif 000045
【図１０Ｅ】
2021522938.tif 000046
【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
2021522938.tif 000048
【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
2021522938.tif 000050
【図１０Ｊ】
2021522938.tif 000051
【図１１Ａ】
2021522938.tif 000052
【図１１Ｂ】
2021522938.tif 000053
【図１１Ｃ】
2021522938.tif 000054
【図１１Ｄ】
2021522938.tif 000055
【図１２Ａ】
2021522938.tif 000056
【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2021522938.tif 000059
【図１３Ｃ】
2021522938.tif 000060
【図１３Ｄ】
2021522938.tif 000061
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【配列表】
2021522938000001.app
【国際調査報告】
2021522938.tif 000080
2021522938.tif 000081